(57)【要約】本発明は、官能化ヒアルロン酸およびその誘導体、ならびにその調製のためのプロセス、および生体材料としておよび医薬組成物の成分としてのその使用を開示する。本発明はさらに、改変されたガレクチン発現に起因する病理の治療における、該官能化ヒアルロン酸またはその誘導体の使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
官能化ヒアルロン酸またはその誘導体であって、式（Ｉ）：
【化６】
2021500436.tif 000008
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、互いに独立して、Ｈ；ＳＯ３−；脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式シリーズ、−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＹのカルボン酸に由来するアシル基であり、ここで、Ｙは、負電荷またはＨであり、
かつ
Ｒは、Ｚ（１）またはＺ（２）であり、かつＲ５は、−ＣＯ−ＣＨ３；Ｈ；ＳＯ３−；脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式シリーズのカルボン酸に由来するアシル基；酸性ヒアルロン酸のアシル基であり、
ここで、Ｚ（１）は、式（１）：
【化７】
2021500436.tif 000009
の成分であり、
これにおいて、Ｚ１は、−ＮＲ６ＣＨ２−であり、かつＲ６は、Ｈ、または、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式の、置換または未置換の基であり、
Ｚ２は、−ＯＨ、または−ＮＨＣＯＣＨ３であり、
Ｚ３は、Ｈ、単糖、二糖、またはオリゴ糖であり、
あるいはＺ（２）は、式（２）：
【化８】
2021500436.tif 000010
の成分であり、
これにおいて、Ｚ４は、−ＮＲ６ＣＨ−であり、かつＲ６は、Ｈ、または、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式の、置換または未置換の基であり、
Ｚ５およびＺ６は、互いに独立して、Ｈ、単糖、二糖、またはオリゴ糖であり、
あるいは
Ｒ５は、Ｚ（３）またはＺ（４）であり、かつＲは、ＮＲ６Ｒ７、または、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式シリーズのアルコール基、ＯＨ、Ｏ−、ヒアルロン酸のアルコール基、ヒアルロン酸のアミノ基であり、かつＲ６、Ｒ７は、互いに独立して、Ｈ、または、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式の、置換または未置換の基であり、
ここでＺ（３）は、式（３）：
【化９】
2021500436.tif 000011
の成分であり、
これにおいて、Ｚ１は、−ＣＨ２−または−ＣＯ−であり、
Ｚ２は、−ＯＨ、または−ＮＨＣＯＣＨ３であり、
Ｚ３は、Ｈ、単糖、二糖、またはオリゴ糖であり、
あるいはＺ（４）は、式（４）：
【化１０】
2021500436.tif 000012
の成分であり、
これにおいて、Ｚ４は、−ＣＨ−であり、
Ｚ５およびＺ６は、互いに独立して、Ｈ、単糖、二糖、またはオリゴ糖であり、
あるいは
Ｒは、Ｚ（１）またはＺ（２）であり、かつＲ５は、Ｚ（３）またはＺ（４）である］
を有する、官能化ヒアルロン酸またはその誘導体。
【請求項２】
Ｚ３、Ｚ５、およびＺ６が、互いに独立して、Ｈ；グルコース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、マンノース、ラクトース、トレハロース、ゲンチオビオース、セロビオース、セロトリオース、マルトース、マルトトリオース、キトビオース、キトトリオース、マンノビオース、メリビオース、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンの成分、またはそれらの組合せである、請求項１に記載の官能化ヒアルロン酸またはその誘導体。
【請求項３】
Ｚ３が、Ｈ；グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンの成分、またはそれらの組合せである、請求項１または２に記載の官能化ヒアルロン酸またはその誘導体。
【請求項４】
Ｚが、ラクトースまたはガラクトースの成分であり、これにおいて、Ｚが、Ｚ（１）、Ｚ（２）、Ｚ（３）、およびＺ（４）のいずれか１つである、請求項１から３のいずれか１項に記載の官能化ヒアルロン酸またはその誘導体。
【請求項５】
請求項１に記載の官能化ヒアルロン酸またはその誘導体を調製するためのプロセスであって、前記プロセスが以下の工程：
ｉ）ヒアルロン酸またはその部分的もしくは完全に脱アセチル化された誘導体を提供すること；
ｉｉ）還元的アミノ化反応により、単糖、二糖、オリゴ糖のアミン誘導体を提供すること；
ｉｉｉ）以下を反応させることであって：
ａ）工程ｉ）の前記ヒアルロン酸を、カルボジイミドの存在下、および／またはカルボキシ基活性化剤の存在下で、工程ｉｉ）の前記アミン誘導体と、
または
ｂ）工程ｉ）の前記部分的もしくは完全に脱アセチル化された誘導体を、アミノボランの存在下で、単糖、二糖、オリゴ糖と；
または
ｃ）工程ｉ）の前記部分的もしくは完全に脱アセチル化された誘導体を、カルボジイミドの存在下、および／またはカルボキシ基活性化剤の存在下で、単糖、二糖、オリゴ糖のカルボキシリック誘導体と；
または
ｄ）工程ｉｉｉ−ｂ）から得られた前記誘導体を、カルボジイミドの存在下、および／またはカルボキシ基活性化剤の存在下で、工程ｉｉ）の前記アミン誘導体と；
または
ｅ）工程ｉｉｉ−ｃ）から得られた前記誘導体を、カルボジイミドの存在下、および／またはカルボキシ基活性化剤の存在下で、工程ｉｉ）の前記アミン誘導体と反応させること；
および
ｉｖ）そのようにして得られた前記官能化ヒアルロン酸またはその誘導体を、有機溶媒を用いて沈殿させること、
を含む、該プロセス。
【請求項６】
前記工程ｉｉｉ）の、単糖、二糖、オリゴ糖の、ヒアルロン酸またはその誘導体に対するモル比が、０．５から３０、好ましくは、１から２０、より好ましくは、１から１０である、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
改変されたガレクチン発現に起因する病理の治療における使用のための、請求項１に記載の官能化ヒアルロン酸またはその誘導体であって、前記病理が、非アルコール性脂肪性肝炎、局面型乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、新生物、ならびに肺、腎臓、および心臓血管系の線維症プロセスである、官能化ヒアルロン酸またはその誘導体。
【請求項８】
整形外科的疾患の治療における、生体材料または細胞増殖のための足場としての使用のための、請求項１に記載の官能化ヒアルロン酸またはその誘導体。
【請求項９】
少なくとも１つの、請求項１に記載の官能化ヒアルロン酸またはその誘導体と、少なくとも１つの薬理活性物質および／または少なくとも１つの生物活性物質とを含む、医薬組成物であって、
−前記薬理活性物質が、抗生物質、抗感染薬、抗菌剤、抗ウイルス薬、細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤、抗腫瘍薬、抗炎症薬、瘢痕形成薬、麻酔薬、鎮痛剤、血管収縮薬、コリン作動性またはアドレナリン作動性のアゴニストおよびアンタゴニスト、抗血栓薬、抗凝固薬、止血薬、線溶薬、血栓溶解薬、タンパク質およびそのフラグメント、ペプチド、ポリヌクレオチド、増殖因子、酵素、ワクチン、およびそれらの組合せから選択され、かつ
−前記生物活性物質が、コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブリン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸マグネシウム、セルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ゼラチン、アルブミン、グリコリド−カプロラクトン共重合体、グリコリド−トリメチレンカーボネート共重合体、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、リン酸二カルシウム、脱灰骨基質、およびそれらの混合物から選択される、医薬組成物。
【請求項１０】
改変されたガレクチン発現に起因する病理の治療における使用のための、請求項９に記載の医薬組成物であって、前記病理が、非アルコール性脂肪性肝炎、局面型乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、新生物、ならびに肺、腎臓、および心臓血管系の線維症プロセスである、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、官能化ヒアルロン酸またはその誘導体、ならびにその調製のためのプロセス、および生体材料としておよび医薬組成物の成分としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガレクチンは、Ｎ−アセチル−ラクトサミンなどの、Ｎ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化によりタンパク質に結合され得る、β−ガラクトシド糖への特異的な結合によって定義されるタンパク質のファミリーである。哺乳類では１５のガレクチンが知られており、それらはＬＧＡＬＳ遺伝子によりコードされ、連続番号が付されているが、ヒトではガレクチン−１、−２、−３、−４、−７、−８、−９、−１０、−１２、および−１３のみが同定されている。
【０００３】
これらは、細胞内または細胞外のレベルにおいて局在する。後者の場合、それらは細胞表面上のグリカンと二価または多価の相互作用を行なって、サイトカインおよび他の炎症メディエイターの産生、細胞接着、移動、およびアポトーシスを含む、様々な細胞応答を誘導する。さらに、膜糖タンパク質受容体とラティスを形成することが可能であり、受容体の特性を調節する。細胞内ガレクチンはシグナリング経路に関与することが可能であり、アポトーシス、細胞分化、および細胞運動性を含む、生物学的応答を改変する。最新のエビデンスは、ガレクチンが急性および慢性の炎症応答において、ならびに他の様々な病理学的プロセスにおいて、重要な役割を果たすことを示している。
【０００４】
最近の研究は、いくつかのガレクチンが、関節リウマチ、変形性関節症などの、いくつかの骨格筋障害の炎症応答に関与することを示している（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。ガレクチンは、多くの炎症病理において過剰発現されており、それ故、メタロプロテアーゼ活性の阻害が、結果として炎症カスケートの著しい阻害を決定し得る。
【０００５】
さらに、ガレクチンは腫瘍の発生および進行において活発な役割を果たすことが知られている。このため、ガレクチンの阻害剤／調節剤が、新生物の診断および治療の双方を改善する目的で現在研究されている。（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄ．Ｗｅｉｎｍａｎｎら、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ」ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３９１１２
【非特許文献２】Ｔｏｅｇｅｌ  Ｓ．ら、「Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」、２０１４年、第１４２巻、Ｐ．３７３、
【非特許文献３】Ｔｏｅｇｅｌ  Ｓ．、「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、２０１６年、Ｐ．１９１０
【非特許文献４】Ｌｉ  Ｓ．ら、「Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」、２０１３年、第４巻、第５号、Ｐ．１０００１６４
【非特許文献５】Ｅｂｒａｈｉｍ  ＡＨ，ら、Ｇａｌｅｃｔｉｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ（癌におけるガレクチン：発癌、診断、および治療）、「Ａｎｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ」、２０１４年、第２巻、第９号、Ｐ．８８．ｄｏｉ：１０．３９７８／ｊ．ｉｓｓｎ．２３０５−５８３９．２０１４．０９．１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それ故、本発明の目的は、これらの受容体の発現を調節する製品であって、改変されたガレクチン発現に起因する病理に対し治療的に作用するようにするとともに、それらに医学および薬学の観点から高い受容性プロフィールを与える、該製品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の目的は、請求項１に記載されたような、官能化ヒアルロン酸またはその誘導体によって達成された。
【０００９】
別の態様においては、本発明は、官能化ヒアルロン酸またはその誘導体を調製するためのプロセスに関する。
【００１０】
さらなる態様においては、本発明は、改変されたガレクチン発現に起因する病理の治療における、官能化ヒアルロン酸またはその誘導体の使用に関する。前記受容体の過剰／過少調節によって影響を受ける病理の非限定的例は、非アルコール性脂肪性肝炎、局面型乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、新生物、ならびに肺、腎臓、および心臓血管系の線維症プロセスである。
【００１１】
さらなる態様においては、本発明は、整形外科的疾患の治療における、生体材料または細胞増殖のための足場としての、前記官能化ヒアルロン酸またはその誘導体の使用に関する。
【００１２】
なおさらなる態様においては、本発明は、成形／美容外科、血液透析、心臓病学、血管学、眼科学、耳鼻科、歯科学、婦人科学、泌尿器科学、皮膚科学、腫瘍学、および組織修復における、生体材料または細胞増殖のための足場としての、前記官能化ヒアルロン酸またはその誘導体の使用に関する。
【００１３】
さらなる態様においては、本発明は、少なくとも１つの官能化ヒアルロン酸またはその誘導体と、少なくとも１つの薬理活性物質および／または少なくとも１つの生物活性物質とを含む、医薬組成物に関する。
【００１４】
なおさらなる態様においては、本発明は、改変されたガレクチン発現に起因する病理の治療における、前記医薬組成物の使用に関する。前記受容体の過剰／過少調節によって影響を受ける病理の非限定的例は、非アルコール性脂肪性肝炎、局面型乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、新生物、ならびに肺、腎臓、および心臓血管系の線維症プロセスである。
【００１５】
なおさらなる態様においては、本発明は、成形／美容外科、血液透析、心臓病学、血管学、眼科学、耳鼻科、歯科学、婦人科学、泌尿器科学、皮膚科学、腫瘍学、および組織修復における、前記医薬組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の特徴および利点は、以下の詳細な記載、非限定的例として提供された実施形態、およびここに添付された図面から明らかとなるであろう。
【図１】ラクトース、脱アセチル化ヒアルロン酸、およびヒアルロン酸誘導体の、赤外スペクトル間の比較を示す図であり、ここでは、Ｒ５はＺ（３）であり、かつＺ３はガラクトース成分である。
【図２】ヒアルロン酸、還元的アミノ化により得られた還元糖のアミン誘導体、およびヒアルロン酸誘導体の、赤外スペクトル間の比較を示す図であり、ここでは、ＲはＺ（１）であり、かつＺ３はガラクトース成分である。
【図３】１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、３４３Ｋ）を示す図である：１）ヒアルロン酸ナトリウム；２）実施例６によって得られたヒアルロン酸ナトリウム；３）実施例１３によって得られた部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミン誘導体（還元糖を用いた還元的アミノ化）。
【図４】１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、２９８Ｋ）を示す図である：１）ヒアルロン酸ナトリウム；２）実施例３によって得られた還元糖のアミン誘導体；３）実施例１３によって得られた部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミド誘導体（還元糖を用いたアミン誘導体のアミド化）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明はそれ故、式（Ｉ）：
【化１】
2021500436.tif 000002
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、互いに独立して、Ｈ；ＳＯ３−；脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式シリーズ、−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯＹのカルボン酸に由来するアシル基であり、ここで、Ｙは、負電荷またはＨであり、
かつ
Ｒは、Ｚ（１）またはＺ（２）であり、かつＲ５は、−ＣＯ−ＣＨ３；Ｈ；ＳＯ３−；脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式シリーズのカルボン酸に由来するアシル基；酸性ヒアルロン酸のアシル基であり、
ここで、Ｚ（１）は、式（１）：
【化２】
2021500436.tif 000003
の成分であり、
これにおいて、Ｚ１は、−ＮＲ６ＣＨ２−であり、かつＲ６は、Ｈ、または、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式の、置換または未置換の基であり、
Ｚ２は、−ＯＨ、または−ＮＨＣＯＣＨ３であり、
Ｚ３は、Ｈ、単糖、二糖、またはオリゴ糖であり、
あるいはＺ（２）は、式（２）：
【化３】
2021500436.tif 000004
の成分であり、
これにおいて、Ｚ４は、−ＮＲ６ＣＨ−であり、かつＲ６は、Ｈ、または、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式の、置換または未置換の基であり、
Ｚ５およびＺ６は、互いに独立して、Ｈ、単糖、二糖、またはオリゴ糖であり、
あるいは
Ｒ５は、Ｚ（３）またはＺ（４）であり、かつＲは、ＮＲ６Ｒ７、または、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式シリーズのアルコール基、ＯＨ、Ｏ−、ヒアルロン酸のアルコール基、ヒアルロン酸のアミン基であり、かつＲ６、Ｒ７は、互いに独立して、Ｈ、または、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式の、置換または未置換の基であり、
ここでＺ（３）は、式（３）：
【化４】
2021500436.tif 000005
の成分であり、
これにおいて、Ｚ１は、−ＣＨ２−または−ＣＯ−であり、
Ｚ２は、−ＯＨ、または−ＮＨＣＯＣＨ３であり、
Ｚ３は、Ｈ、単糖、二糖、またはオリゴ糖であり、
あるいはＺ（４）は、式（４）：
【化５】
2021500436.tif 000006
の成分であり、
これにおいて、Ｚ４は、−ＣＨ−であり、
Ｚ５およびＺ６は、互いに独立して、Ｈ、単糖、二糖、またはオリゴ糖であり、
あるいは
Ｒは、Ｚ（１）またはＺ（２）であり、かつＲ５は、Ｚ（３）またはＺ（４）である］
の官能化ヒアルロン酸またはその誘導体に関する。
【００１８】
用語「脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式」は、好ましくは：Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ４−Ｃ１０ジエニル、置換Ｃ４−Ｃ１０ジエニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換Ｃ１−Ｃ６カルボニル、カルボキシル、置換Ｃ１−Ｃ６カルボキシル、アミノ、置換Ｃ１−Ｃ６アミノ、アミド、置換Ｃ１−Ｃ６アミド、スルホニル、置換Ｃ１−Ｃ６スルホニル、スルホン酸、ホスホニル、置換Ｃ１−Ｃ６ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、置換Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ２−Ｃ１０シクロアルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１０シクロアルケニル、Ｃ４−Ｃ１０シクロジエニル、置換Ｃ４−Ｃ１０シクロジエニル、またはアミノ酸から選択される、飽和または不飽和の、脂肪族または芳香族の、直鎖、分枝鎖、または環式の成分を意味する。用語「置換（された）」は、少なくとも１つのハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４アルキル、カルボキシル、またはそれらの組合せに結合されたことを意味する。
【００１９】
好ましくは、Ｚ３、Ｚ５、およびＺ６は、互いに独立して、Ｈ；グルコース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、マンノース、ラクトース、トレハロース、ゲンチオビオース、セロビオース、セロトリオース、マルトース、マルトトリオース、キトビオース、キトトリオース、マンノビオース、メリビオース、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンの成分、またはそれらの組合せである。
【００２０】
より好ましくは、Ｚ３は、Ｈ；グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンの成分、またはそれらの組合せである。
【００２１】
特に好ましい実施形態においては、式Ｚの成分は、ラクトースまたはガラクトースの成分であり、これにおいて、Ｚは、Ｚ（１）、Ｚ（２）、Ｚ（３）、およびＺ（４）のいずれか１つである。
【００２２】
上記に示した構造式から分かるように、ヒアルロン酸またはその誘導体は、以下の：
１）ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシル基と、アミンとの間の、Ｚの前駆体と第一級アミンまたはアンモニア供給源との還元的アミノ化を介した、アミド結合、
２）予め脱アセチル化されたヒアルロン酸またはその誘導体のアミン基と、成分Ｚとの間の、還元的アミノ化を介した、アミド結合、
３）予め脱アセチル化されたヒアルロン酸またはその誘導体のアミン基と、成分Ｚの前駆体のカルボキシル基との間の、アミド結合、
により、Ｚ（１）、Ｚ（２）、Ｚ（３）であろうと、またはＺ（４）であろうと、式Ｚの成分とのコンジュゲーションによって官能化される。
【００２３】
それ故、別の態様においては、本発明は、官能化ヒアルロン酸またはその誘導体を調製するためのプロセスであって、前記プロセスが以下の工程：
ｉ）ヒアルロン酸またはその部分的もしくは完全に脱アセチル化された誘導体を提供すること；
ｉｉ）還元的アミノ化反応により、単糖、二糖、オリゴ糖のアミン誘導体を提供すること；
ｉｉｉ）以下を反応させることであって：
ａ）工程ｉ）の前記ヒアルロン酸を、カルボジイミドの存在下、および／またはカルボキシ基活性化剤の存在下で、工程ｉｉ）の前記アミン誘導体と、
または
ｂ）工程ｉ）の前記部分的もしくは完全に脱アセチル化された誘導体を、アミノボランの存在下で、単糖、二糖、オリゴ糖と；
または
ｃ）工程ｉ）の前記部分的もしくは完全に脱アセチル化された誘導体を、カルボジイミドの存在下、および／またはカルボキシ基活性化剤の存在下で、単糖、二糖、オリゴ糖のカルボキシリック誘導体と；
または
ｄ）工程ｉｉｉ−ｂ）から得られた前記誘導体を、カルボジイミドの存在下、および／またはカルボキシ基活性化剤の存在下で、工程ｉｉ）の前記アミン誘導体と；
または
ｅ）工程ｉｉｉ−ｃ）から得られた前記誘導体を、カルボジイミドの存在下、および／またはカルボキシ基活性化剤の存在下で、工程ｉｉ）の前記アミン誘導体と反応させること；
および
ｉｖ）そのようにして得られた前記官能化ヒアルロン酸またはその誘導体を、有機溶媒を用いて沈殿させること、
を含む、該プロセスに関する。
【００２４】
驚くべきことに、アミノ−ボランが、イミノ基の還元においてカルボニル基に比べて著しい選択性を示すこと、および水性媒体と適合性があり、それにより第一級アミン、アンモニア供給源、多糖のアミン成分の存在下で、還元糖の有効なアミン還元を可能にすることが観察された。同時に、カルボジイミドおよび／またはカルボキシリック基活性化剤の存在が、エステル誘導体の生成に関する優れた選択性により、ヒアルロン酸のアミド誘導体の生成を促進する。それ故、プロセスは全体として、有利には、単糖、二糖、およびオリゴ糖を、化学スペーサーの導入を必要とすることなくヒアルロン酸主鎖へ結合する可能性を与える。
【００２５】
本発明に従って官能化誘導体の調製において使用され得るヒアルロン酸の誘導体は、好ましくは以下の通りである：
−ヒアルロン酸塩、例えばヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルト、ヒアルロン酸アンモニア、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム、およびそれらの混合物、
−欧州特許第０２１６４５３号明細書にも記載された通りの、そのカルボキシリック基の一部または全てが、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、複素環式シリーズのアルコールを用いてエステル化される、ヒアルロン酸エステル、
−欧州特許第０３４１７４５号明細書にも記載された通りの、そのカルボキシリック基の一部または全てが、同じ多糖鎖または別の鎖からのアルコール性基を用いてエステル化される、自己架橋ヒアルロン酸エステル、
−欧州特許第０２６５１１６号明細書にも記載された通りの、そのカルボキシリック基の一部または全てが、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、または複素環式シリーズのポリアルコールを用いてエステル化されて、スペーサー鎖による架橋を生じる、架橋ヒアルロン酸化合物、
−国際公開第９６／３５７２０７号にも記載された通りの、ヒアルロン酸との、または部分的もしくは完全なヒアルロン酸エステルとの、コハク酸ヘミエステルもしくはコハク酸重金属塩、
−国際公開第９５／２５７５１号にも記載された通りの、Ｏ−硫酸化誘導体、または国際公開第９８／０４５３３５号にも記載された通りの、Ｎ−硫酸化誘導体。
【００２６】
前記の単糖、二糖、およびオリゴ糖は、成分Ｚについて上記に示した定義に対応する。
【００２７】
前記アミノボランは、好ましくは、２−メチルピリジンボラン、５−エチル−２−メチルピリジンボラン、ピリジンボラン、トリメチルアミンボラン、トリエチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、ｔｅｒｔ−ブチルアミンボラン、またはそれらの混合物である。より好ましくは、前記アミノボランは、２−メチルピリジンボラン、５−エチル−２−メチルピリジンボラン、またはそれらの混合物である。
【００２８】
アミノボランは、そのまま使用されてもよく、または予めアルコールなどの水混和性有機溶媒中に溶解もしくは分散されてもよい。前記アルコールの中で最も好ましいのは、メタノール、エタノール、２−プロパノール、またはそれらの混合物である。
【００２９】
用語「有機溶媒」は、水性反応溶液の比誘電率を低下させることができる、有機水混和性溶媒を意味する。適当な有機溶媒は、アセトン、メタノール、エタノール、２−プロパノール、またはそれらの混合物であり、好ましくは、有機溶媒は、エタノール、２−プロパノール、またはそれらの混合物である。
【００３０】
用語「カルボキシル基活性化剤」は、前記基のヒドロキシル官能基を修飾する試薬であって、それ故置換反応におけるその除去を促進する、該試薬を意味する。
【００３１】
カルボキシル基の活性化剤は、ヒドロキシベンゾトリアゾール、１，１’−カルボジイミダゾール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、およびそれらの混合物を包含する。
【００３２】
適当なカルボジイミドは、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、およびそれらの混合物を包含する。
【００３３】
任意で、工程ｉｖ）において分離された沈殿は、３０％までの、および好ましくは１０％までのパーセントの水を用いた、水と有機溶媒との混合物を用いて洗浄される。
【００３４】
好ましくは、工程ｉｉｉ）において、単糖、二糖、オリゴ糖の、ヒアルロン酸またはその誘導体に対するモル比は、０．５から３０、より好ましくは、１から２０、なおより好ましくは、１から１０である。
【００３５】
さらなる態様においては、本発明は、改変されたガレクチン発現に起因する病理の治療における、前記官能化ヒアルロン酸またはその誘導体の使用に関する。前記受容体の過剰／過少調節によって影響を受ける病理の非限定的例は、非アルコール性脂肪性肝炎、局面型乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、新生物、ならびに肺、腎臓および心臓血管系の線維症プロセスである。
【００３６】
新生物および線維症プロセスの例は、急性リンパ性白血病、突発性肺線維症、肝線維症、心臓線維症、腎線維症、および卵巣、前立腺、肺、胃、皮膚、甲状腺、および膵臓の腫瘍を包含する。
【００３７】
さらなる態様においては、本発明は、整形外科的疾患の治療における、生体材料または細胞増殖のための足場としての、前記官能化ヒアルロン酸またはその誘導体の使用に関する。
【００３８】
なおさらなる態様においては、成形／美容外科、血液透析、心臓病学、血管学、眼科学、耳鼻科、歯科学、婦人科学、泌尿器科学、皮膚科学、腫瘍学、および組織修復における生体材料または細胞増殖のための足場としての、前記官能化ヒアルロン酸またはその誘導体の使用に関する。
【００３９】
官能化ヒアルロン酸またはその誘導体はまた、医学分野において、および別の業種において使用される、物体をコーティングするための生体材料としても使用可能であり、新規な生物学的特性をもつ媒体として使用される物体の表面を提供する。
【００４０】
コートされ得る物体は、例えば、カテーテル、チューブ、プローブ、心臓弁、軟部組織人工補綴物、動物由来の人工補綴物、人工腱、骨および心血管補綴物、コンタクトレンズ、血液酸素付加装置、人工腎臓、心臓、膵臓、肝臓、血液バッグ、シリンジ、外科用器具、濾過システム、研究室用機器、細胞および組織の培養用および再生用の容器、ペプチド、タンパク質、および抗体用の媒体、を包含する。
【００４１】
官能化ヒアルロン酸またはその誘導体はまた、化粧品分野および皮膚科学においても使用可能である。
【００４２】
なおさらなる態様においては、本発明は、少なくとも１つの官能化ヒアルロン酸またはその誘導体と、少なくとも１つの薬理活性物質および／または少なくとも１つの生物活性物質とを含む、医薬組成物に関する。
【００４３】
適当な薬理活性物質は、抗生物質、抗感染薬、抗菌剤、抗ウイルス薬、細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤、抗腫瘍薬、抗炎症薬、瘢痕形成薬、麻酔薬、鎮痛剤、血管収縮薬、コリン作動性またはアドレナリン作動性のアゴニストおよびアンタゴニスト、抗血栓薬、抗凝固薬、止血薬、線溶薬、血栓溶解薬、タンパク質およびそのフラグメント、ペプチド、ポリヌクレオチド、増殖因子、酵素、ワクチン、またはそれらの組合せを包含する。
【００４４】
好ましくは、前記生物活性物質は、コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブリン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸マグネシウム、セルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ゼラチン、アルブミン、グリコリド−カプロラクトン共重合体、グリコリド−トリメチレンカーボネート共重合体、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、リン酸二カルシウム、脱灰骨基質、およびそれらの混合物から選択される。
【００４５】
好ましくは、前記少なくとも１つの官能化ヒアルロン酸またはその誘導体、および前記少なくとも１つの生物活性物質は、１００：１から１：１５０の重量比にある。
【００４６】
なおさらなる態様においては、本発明は、改変されたガレクチン発現に起因する病理の治療における前記医薬組成物の使用に関する。
【００４７】
前記受容体の過剰／過少調節によって影響を受ける病理の非限定的例は、非アルコール性脂肪性肝炎、局面型乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、新生物、ならびに肺、腎臓、および心臓血管系の線維症プロセスである。
【００４８】
なおさらなる態様においては、本発明は、成形／美容外科、血液透析、心臓病学、血管学、眼科学、耳鼻科、歯科学、婦人科学、泌尿器科学、腫瘍学、皮膚科学、および組織修復における、前記医薬組成物の使用に関する。
【００４９】
好ましくは、本発明による医薬組成物は、医薬組成物の重量を基準にして、１０重量％までの前記少なくとも１つの官能化ヒアルロン酸またはその誘導体、好ましくは５重量％までの前記少なくとも１つの官能化ヒアルロン酸またはその誘導体を含む。特に好ましいのは、前記少なくとも１つの官能化ヒアルロン酸またはその誘導体の量が、医薬組成物の重量を基準にして、０．５−５重量％である医薬組成物である。
【００５０】
特に好ましい実施形態においては、本発明は、上記に記載の少なくとも１つの官能化ヒアルロン酸またはその誘導体と、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、またはその混合物とを含む、医薬組成物に関する。前記組成物は、骨格系に関する整形外科的適用において有利な利用法がある。
【００５１】
医薬組成物は、経口的、筋肉内、静脈内、関節内、経皮的、真皮下、または外部および内部局所的に、例えば外科的手段により投与され得る。
【００５２】
好ましくは、前記約組成物は、関節内、経皮的、または内部局所的に投与される。
【００５３】
医薬組成物はさらに、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。
【００５４】
適当な薬学的に許容される賦形剤は、例えば、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、溶媒、安定化剤、キレート剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、流動化剤、着色剤、懸濁化剤、界面活性剤、凍結保護剤、保存料、および酸化防止剤を包含する。
【００５５】
本発明はまた、上記に記載したような、官能化ヒアルロン酸またはその誘導体を、単独で、または上記記載の、少なくとも１つの薬理活性および／または生物活性物質と組合せて含む、生体材料にも関する。前記生体材料は、ミクロスフェア、ナノスフェア、膜、スポンジ、ワイヤ、フィルム、ガーゼ、ガイドウェイ、タンポン、ゲル、ヒドロゲル、ファブリック、不織布、カニューレ、またはそれらの組合せの形態にあってもよい。
【００５６】
また、官能化ヒアルロン酸またはその誘導体について好ましく有利として同定された全ての態様が、上記記載の調製プロセス、組成物、生体材料、および使用についてもまた好ましく有利であると考えられることも、理解されるべきである。
【００５７】
さらに、上記に開示された、官能化ヒアルロン酸またはその誘導体、調製プロセス、組成物、生体材料、および使用の、好ましい態様の全ての可能な組合せが、同様に好ましいことが理解されるべきである。
【００５８】
以下は、例示を目的として提示された、本発明の実施例である。
【実施例】
【００５９】
実施例１．還元糖の第一級アミン誘導体の合成
（４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシトール塩酸塩）
メタノール中の、ラクトース（６．２５％ｗ／ｖ）および酢酸アンモニウム（５６％ｗ／ｖ）の溶液を、撹拌下に室温で、ラクトースについて等モルである量の、５−エチル−２−メチルピリジンボラン複合体で処理した。かくて得られた混合物を、同じ条件下に１６時間維持し、次いで未処理の反応生成物を同体積のイソプロパノールと混合し、続いて６Ｎ塩酸を用いてｐＨ２−３に酸性化し、ラクトースのアミン誘導体の塩酸塩を沈殿させた。次いで沈殿を単離し、エタノール：水（９：１、３ｘ）の混合物で洗浄し、エタノール：６Ｎ水酸化ナトリウム（９５：５）でｐＨを９に等しくし、再度エタノール：水（９：１、２ｘ）で、そして最後にエタノール（１ｘ）で洗浄した。かくて得られた固体を、次に減圧下で乾燥させ、さらなる精製なしに、次に続く合成工程に使用した。誘導体を、ＩＲ（赤外）分光法により特性評価した。反応収率：９０％。
【００６０】
実施例２．還元糖のベンジルアミン誘導体の合成
水およびメタノール（３：１）中の、ラクトース（３％ｗ／ｖ）、ベンジルアミン（５％ｗ／ｖ）、および５−エチル−２−メチルピリジンボラン（６％ｗ／ｖ）の溶液を、５５℃の温度で撹拌し、２０時間にわたり反応させた。続いて、混合物を冷却し、ジクロロメタンで抽出し、最後に水性相を低圧で蒸発させて、白色結晶固体を得、これをエチルエーテルで洗浄し、最終的にデカンテーションにより回収し、減圧下に乾燥させた。生成物を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：９０％。
【００６１】
実施例３．還元糖の第一級アミン誘導体の合成
メタノールおよび水（１：１）中の、実施例２によって得られた誘導体の溶液（４％ｗ／ｖ）を、室温で磁気撹拌下に置いた。続いて、Ｐｄ−炭（０．４％ｗ／ｖ）を添加し、かくて生成された系を水素で加圧した。４８時間後、系を減圧し、同体積の水と混合し、固体をデカンテートし、溶液をセライト上で濾過した。かくて得られた溶液を、減圧下で乾燥させ、白色固体を生じた。かくて得られた生成物を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：９６％。
【００６２】
実施例４．ラクトビオン酸のイミダゾールアミドを主成分とするアシル化溶液の合成
ジメチルスルホキシド中のラクトビオン酸（１０％ｗ／ｖ）の溶液を、１，１−カルボジイミダゾール（１当量）と混合し、室温で２時間撹拌した。かくて得られた溶液を、その後さらなる精製無しに使用した。
【００６３】
実施例５．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウムの合成（４８時間）
ヒドラジン一水和物中の硫酸ヒドラジン溶液（１％ｗ／ｖ）を、ヒアルロン酸ナトリウム（２％ｗ／ｖ）と混合し、かくて得られた系を５５℃に加熱し、撹拌下に４８時間にわたり反応させた。続いて、未処理の反応生成物を冷却し、次いでエタノールで沈殿させ、次にエタノールで単離および洗浄し、その後減圧下に２４時間乾燥させた。その後、かくて得られた生成物（５％ｗ／ｖ）を、酢酸の水溶液（５％ｖ／ｖ）中に溶解し、溶液を４℃に冷却し、ＨＩＯ３の水溶液（０．５Ｍ、６０％ｖ／ｖ）を滴下添加した。混合物を同じ条件下で１時間にわたり反応させ、次いで塩酸の水溶液（５７％ｗ／ｖ、溶液については１１％ｖ／ｖ）を添加して、系をさらに１５分間にわたり反応させた。溶液を次に、エチルエーテルで完全に退色するまで抽出し、ＮａＯＨ（１Ｎ、０．１Ｎ）を用いて水性相のｐＨを７−７．５に修正し、最後に生成物をエタノールで沈殿させ、エタノールで洗浄し、そして乾燥させた。かくて得られた生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲ分光法により特性評価した。反応収率：８３％、脱アセチル化度：１１％。
【００６４】
実施例６．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウムの合成（７２時間）
ヒドラジン水和物中の、ヒアルロン酸ナトリウム（２％ｗ／ｖ）およびヒドラジン硫酸（１％ｗ／ｖ）の溶液を、５５℃の温度において７２時間にわたり磁気撹拌下に置いた。反応時間の終わりに、エタノールを添加してポリマーを沈殿させ、得られた固体を次にさらなるエタノールで洗浄し、窒素流下で乾燥させた。生成物を酢酸水溶液（６％ｗ／ｖ、５％酢酸）中に再度溶解し、サーモスタットで０−５℃とし、水中のヨウ素酸溶液（７．５％ｗ／ｖ）の一体積（体積で０．８当量）と混合した。かくて得られた系を、１時間にわたり撹拌下に置き、次いで一体積（体積で０．１１当量）のヨウ化水素酸水溶液（５７％）と混相し、さらに１５分間反応させた。その後、１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液の添加により、ｐＨを９に調整し、溶液をエチルエーテルで完全に退色するまで抽出した。この後、生成物をエタノールで沈殿させ、エタノールで洗浄し、減圧下に乾燥させ、そしてＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８６％、脱アセチル化度：２０％。
【００６５】
実施例７．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウムの合成（９６時間）
ヒドラジン一水和物中の硫酸ヒドラジン溶液（１％ｗ／ｖ）を、ヒアルロン酸ナトリウム（２％ｗ／ｖ）と混合し、かくて得られた系を５５℃に加熱して、撹拌下で９６時間にわたり反応させた。続いて、未処理の反応生成物を冷却し、次いでエタノールで沈殿させ、次にエタノールで単離および洗浄し、その後減圧下に２４時間乾燥させた。その後、かくて得られた生成物（５％ｗ／ｖ）を、酢酸の水溶液（５％ｖ／ｖ）中に溶解し、溶液を４℃に冷却し、ＨＩＯ３の水溶液（０．５Ｍ、６０％ｖ／ｖ）を滴下添加した。混合物を同じ条件下で１時間にわたり反応させ、次いで塩酸の水溶液（５７％ｗ／ｖ、溶液については１１％ｖ／ｖ）を添加して、系をさらに１５分間にわたり反応させた。溶液を次に、エチルエーテルで完全に退色するまで抽出し、ＮａＯＨ（１Ｎ、０．１Ｎ）を用いて水性相のｐＨを７−７．５に修正し、最後に生成物をエタノールで沈殿させ、エタノールで洗浄し、そして乾燥させた。生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲ分光法により特性評価した。反応収率：８６％、脱アセチル化度：２１％。
【００６６】
実施例８．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウムの合成（１２０時間）
ヒドラジン一水和物中の硫酸ヒドラジン溶液（１％ｗ／ｖ）を、ヒアルロン酸ナトリウム（２％ｗ／ｖ）と混合し、かくて得られた系を５５℃に加熱して、撹拌下で１２０時間にわたり反応させた。続いて、未処理の反応生成物を冷却し、次にエタノールで沈殿させ、次いでエタノールで単離および洗浄し、その後減圧下に２４時間乾燥させた。その後、かくて得られた生成物（５％ｗ／ｖ）を、酢酸の水溶液（５％ｖ／ｖ）中に溶解し、溶液を４℃に冷却し、ＨＩＯ３の水溶液（０．５Ｍ、６０％ｖ／ｖ）を滴下添加した。混合物を同じ条件下で１時間にわたり反応させ、次いで塩酸の水溶液（５７％ｗ／ｖ、溶液については１１％ｖ／ｖ）を添加して、系をさらに１５分間にわたり反応させた。溶液を次に、エチルエーテルで完全に退色するまで抽出し、ＮａＯＨ（１Ｎ、０．１Ｎ）を用いて水性相のｐＨを７−７．５に修正し、最後に生成物をエタノールで沈殿させ、エタノールで洗浄し、そして乾燥させた。生成物を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＩＲ分光法により特性評価した。反応収率：８９％、脱アセチル化度：２６％。
【００６７】
実施例９．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウムの合成（２４時間）
ヒドラジン水和物中の、ヒアルロン酸ナトリウム（２％ｗ／ｖ）およびヨウ素化アンモニウム（０．７％ｗ／ｖ）の溶液を、６０℃の温度で２４時間にわたり磁気撹拌下に置いた。反応時間の終わりに、エタノールを添加してポリマーを沈殿させ、得られた固体を次にさらなるエタノールで洗浄し、窒素流下で乾燥させた。生成物を酢酸水溶液（６％ｗ／ｖ、５％酢酸）中に再度溶解し、サーモスタットで０−５℃とし、水中のヨウ素酸溶液（７．５％ｗ／ｖ）の一体積（体積で０．８当量）と混合した。かくて得られた系を、１時間にわたり撹拌下に置き、次いで一体積（体積で０．１１当量）のヨウ化水素酸水溶液（５７％）と混相し、さらに１５分間反応させた。１Ｍ  ＮａＯＨの水溶液の添加により、ｐＨを９に調整し、溶液をエチルエーテルで完全に退色するまで抽出した。この後、生成物をエタノールで沈殿させ、エタノールで洗浄し、減圧下に乾燥させた。かくて得られた固体を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８８％、脱アセチル化度：１５％。
【００６８】
実施例１０．テトラブチルアンモニウムを用いたヒアルロン酸塩の調製
ヒアルロン酸ナトリウムの水溶液（１．６％ｗ／ｖ）を、予めテトラブチルアンモニウム溶液（４０％ｗ／ｖ）で活性化された、テトラブチルアンモニウム塩（溶液について５０％ｖ／ｖ）の形態にあるスルホン酸樹脂を充填したカラムを通して濾過した。溶出された溶液を、次に凍結乾燥させた。
【００６９】
実施例１１．テトラブチルアンモニウムを用いた、部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸塩の調製
部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウムの水溶液（１．６％ｗ／ｖ）を、予めテトラブチルアンモニウム溶液（４０％ｗ／ｖ）で活性化された、テトラブチルアンモニウム塩（溶液について５０％ｖ／ｖ）の形態にあるスルホン酸樹脂を充填したカラムを通して濾過した。溶出された溶液を、次に凍結乾燥させた。
【００７０】
実施例１２．ヒアルロン酸のアミド誘導体（還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化）
水中の、ヒアルロン酸ナトリウムの溶液（０．２５％ｗ／ｖ）を、実施例１で得られたアミン誘導体（３０当量）と混合し、得られた溶液ｐＨを、水酸化ナトリウム（１Ｎ、０．１Ｎ）または塩酸（１Ｎ、０．１Ｎ）の適当な添加により６．８に調整した。その後、予め水：ジメチルスルホキシド（１．１：１）中に溶解された、（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（５当量、１１％ｗ／ｖ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（３．５当量、６％ｗ／ｖ）の溶液を滴下添加した。溶液のｐＨを、水酸化ナトリウム（１Ｎ、０．１Ｎ）の適当な添加により６．８に調整し、得られた未処理の生成物を、室温で１６時間にわたり反応させた。その後、ｐＨを、水酸化ナトリウム／塩酸（０．１Ｎ）を用いて適宜に７に調整し、得られた溶液を水に対し繰返し透析した（カットオフ：１２−１４０００）。その後、溶液を塩化ナトリウムと、５％ｗ／ｖ力価が達成されるまで混合し、所望の生成物をエタノールで沈殿させ、乾燥させて、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８８％、還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化：８８％。
【００７１】
実施例１３．ヒアルロン酸のアミド誘導体（還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化）
ヒアルロン酸ナトリウム（３％ｗ／ｖ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．４％ｗ／ｖ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．６％ｗ／ｖ）、および実施例３によって得られたラクトースのアミン誘導体（２％ｗ／ｖ）の水溶液を、０．１Ｍ  ＮａＯＨまたは０．１Ｍ  ＨＣｌの水溶液の添加によってｐＨを６．８に維持しながら、２２時間にわたり撹拌下に置いた。その後、ＮａＣｌ（５ｇ／１００ｍＬ）を添加して、生成物を、メタノールを用いて沈殿させた。かくて得られた固体を、デカンテーションにより回収し、メタノールおよび水（４：１）、きれいなメタノールで洗浄し、最後に減圧下に乾燥させた。生成物を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８６％、還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化：２７％。
【００７２】
実施例１４．ヒアルロン酸のアミド誘導体（還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化）
ヒアルロン酸ナトリウム（０．５％ｗ／ｖ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．３％ｗ／ｖ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．０％ｗ／ｖ）、および実施例３で得られたラクトースのアミン誘導体（２．１％ｗ／ｖ）を含有する水およびジオキサン（１：１）の溶液を、室温で１２時間にわたり撹拌した。反応時間の終わりに、炭酸水素ナトリウムを添加してｐＨを９−１０に調整して、そして溶液をさらに３時間にわたり撹拌下に置いた。混合物のｐＨを、酢酸（５０％、ｖ／ｖ）の添加により７に調整し、その後塩化ナトリウム（５ｇ／１００ｍＬ）を添加し、生成物を、エタノールを用いて沈殿させ、エタノールで、そしてエーテルで洗浄し、最後に減圧下に乾燥させた。生成物を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８５％、還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化：２１％。
【００７３】
実施例１５．有機媒体中でのヒアルロン酸のアミド誘導体（還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化）
ジメチルスルホキシド中の、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩（２％ｗ／ｖ）の溶液を、ｐＨ３に調整するため塩酸水溶液で処理し、続いて１，１−カルボニルジイミダゾール（１．５当量）と混合して、１２時間にわたり反応させた。その後、溶液を、グーチ（Ｇｏｏｃｈ）濾過器を用いて濾過して、固体成分を除去し、実施例１で得られたアミン誘導体（２当量）を添加し、かくて得られた混合物を４８時間にわたり反応させた。その後、飽和塩化ナトリウム溶液を、塩化ナトリウム５％ｗ／ｖの最終力価を得るべく充分な量で添加し、混合物を１時間にわたり撹拌下に置き、最後にアセトンの添加により生成物を沈殿させ、得られた固体を単離し、次いで乾燥させた。生成物を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８０％、還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化：１０％。
【００７４】
実施例１６．有機媒体中でのヒアルロン酸のアミド誘導体（還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化）
ジメチルホルムアミド中のヒアルロン酸ナトリウム（２％ｗ／ｖ）の溶液を、１，１−カルボニルジイミダゾール（１当量）と混合した。かくて得られた溶液を、６時間にわたり反応させ、その後、実施例１で得られたアミン誘導体（５当量）を添加し、系をさらに３６時間にわたり反応させた。それに続き、生成物をアセトンで沈殿させ、次に単離し、アセトンで洗浄し、その後減圧下に乾燥させた。生成物を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８０％、還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化：５７％。
【００７５】
実施例１７．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミン誘導体（還元糖を用いた還元的アミノ化）
実施例７で得られた部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウム（１．５％ｗ／ｖ）の水溶液を、ラクトース（１０当量）と混合し、酢酸（１００％）を用いてｐＨを調整して約５．５の値に到達させた。かくて得られた系を、６０℃に加熱し、次いでメタノール中の２−メチルピリジンボラン溶液（１０当量、１０％ｗ／ｖ）と混合し、同じ条件下で２時間にわたり反応させた。それに続き溶液のｐＨを、塩酸水溶液（４Ｎ）を用いて約２−３の値に調整し、系を同じ条件下に１５分間維持した。その後、系を冷却し、ＮａＯＨ（１Ｎ）を用いてｐＨを７−７．５に調節し、得られた溶液を水に対し繰返し透析した（カットオフ：１２−１４０００）。最後に、溶液を塩化ナトリウムと、５％ｗ／ｖ力価が達成されるまで混合し、所望の生成物をエタノールで沈殿させ、乾燥させて、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８０％、還元糖を用いたアミン化：２１％。
【００７６】
実施例１８．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミン誘導体（還元糖を用いた還元的アミノ化）
実施例７によって得られた部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウム（１．５％ｗ／ｖ）の水溶液を、ラクトース（１０当量）と混合し、酢酸（１００％）を用いてｐＨを調整して約５．５の値に到達させた。かくて得られた系を、６０℃に加熱し、次いでメタノール中の２−メチルピリジンボラン溶液（１０当量、１０％ｗ／ｖ）と混合し、同じ条件下で２時間にわたり反応させた。それに続き溶液のｐＨを、塩酸水溶液（４Ｎ）を用いて約２−３の値に調整し、系を同じ条件下に１５分間維持した。その後、系を冷却し、ＮａＯＨ（１Ｎ）を用いてｐＨを７−７．５に調節し、塩化ナトリウムを、その力価５％ｗ／ｖに達するまで添加した。所望の生成物をエタノールで沈殿させ、乾燥させて、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８４％、還元糖のアミノ化：２１％。
【００７７】
実施例１９．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミン誘導体（還元糖を用いた還元的アミノ化）
実施例５によって得られた部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウム（１．５％ｗ／ｖ）の水溶液を、ラクトース（１０当量）と混合し、酢酸（１００％）を用いてｐＨを調整して約５．５の値に到達させた。かくて得られた系を、６０℃に加熱し、次いでメタノール中の２−メチルピリジンボラン溶液（１０当量、１０％ｗ／ｖ）と混合し、同じ条件下で２時間にわたり反応させた。それに続き溶液のｐＨを、塩酸水溶液（４Ｎ）を用いて約２−３の値に調整し、系を同じ条件下に１５分間維持した。その後、系を冷却し、ＮａＯＨ（１Ｎ）を用いてｐＨを７−７．５に調節し、得られた溶液を水に対し繰返し透析した（カットオフ：１２−１４０００）。最後に、溶液を塩化ナトリウムと、その力価５％ｗ／ｖが達成されるまで混合し、所望の生成物をエタノールで沈殿させ、乾燥させて、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：７８％、還元糖のアミノ化：１１％。
【００７８】
実施例２０．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミン誘導体（還元糖を用いた還元的アミノ化）
実施例６によって得られた部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウム（２％ｗ／ｖ）の水溶液を、ラクトース（３当量）と混合し、酢酸（１００％）を用いてｐＨを調整して約５．５の値に到達させた。かくて得られた系を、６０℃に加熱し、次いでイソプロパノール中の２−メチルピリジンボラン溶液（１当量、１０％ｗ／ｖ）と混合し、同じ条件下で３時間にわたり反応させた。それに続き、反応のｐＨを、塩酸水溶液（４Ｎ）を用いて約２−３の値に達するように調整し、系を同じ条件下に１５分間維持した。その後、系を冷却し、イソプロパノールの添加により生成物を沈殿させ、イソプロパノール：水（８０：２０および９０：１０）で洗浄して、減圧下に乾燥させた。生成物を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：９５％、還元糖を用いたアミノ化：２０％。
【００７９】
実施例２１．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミン誘導体（還元糖を用いた還元的アミノ化）
実施例９によって得られた部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウム（２％ｗ／ｖ）の水溶液を、ラクトース（３当量）と混合し、酢酸（１００％）を用いてｐＨを調整して約５．５の値に到達させた。かくて得られた系を、６０℃に加熱し、次いでイソプロパノール中の２−メチルピリジンボラン溶液（１当量、１０％ｗ／ｖ）と混合し、同じ条件下で３時間にわたり反応させた。それに続き、反応のｐＨを、塩酸水溶液（４Ｎ）を用いて約２−３の値に達するように調整し、系を同じ条件下に１５分間維持した。その後、系を冷却し、イソプロパノールの添加により生成物を沈殿させ、イソプロパノール：水（８０：２０および９０：１０）で洗浄して、減圧下に乾燥させた。生成物を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：９５％、還元糖を用いたアミノ化：１５％。
【００８０】
実施例２２．実施例１７−２１によって得られた化合物のアミド誘導体（還元糖を用いたヒアルロン酸の還元的アミノ化により得られた誘導体のアミド化）
水中の、実施例１７によって得られたヒアルロン酸のアミン誘導体（０．２５％ｗ／ｖ）の溶液を、実施例１で得られたアミン誘導体（３０当量）と混合し、得られた溶液ｐＨを、水酸化ナトリウム（１Ｎ、０．１Ｎ）または塩酸（１Ｎ、０．１Ｎ）の適当な添加により６．８に調整した。その後、予め水：ジメチルスルホキシド（１．１：１）中に溶解された、（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（５当量、１１％ｗ／ｖ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（３．５当量、６％ｗ／ｖ）の溶液を滴下添加した。溶液のｐＨを、水酸化ナトリウム（１Ｎ、０．１Ｎ）の適当な添加により６．８に調整し、得られた未処理の生成物を、室温で１６時間にわたり反応させた。その後、ｐＨを、水酸化ナトリウム／塩酸（０．１Ｎ）を用いて適宜に７に調整し、得られた溶液を水に対し繰返し透析した（カットオフ：１２−１４０００）。その後、溶液を塩化ナトリウムと、５％ｗ／ｖ力価が達成されるまで混合し、所望の生成物をエタノールで沈殿させ、乾燥させて、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：９０％、還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化：９０％。
【００８１】
実施例２３．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミド誘導体（還元糖のカルボキシリック誘導体を用いたアシル化）
水中の、実施例７によって得られた脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウム（０．３０％  ｗ／ｖ）の溶液を、ラクトビオン酸（３０当量）と混合し、得られた溶液ｐＨを、水酸化ナトリウム（１Ｎ、０．１Ｎ）または塩酸（１Ｎ、０．１Ｎ）の適当な添加により６．８に調整した。その後、予め水：ジメチルスルホキシド（１．１：１）中に溶解された、（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（５当量、１１％ｗ／ｖ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（３．５当量、６％ｗ／ｖ）の溶液を滴下添加した。溶液のｐＨを、水酸化ナトリウム（１Ｎ、０．１Ｎ）の適当な添加により６．８に調整し、得られた未処理の生成物を、室温で１６時間にわたり反応させた。その後、ｐＨを、水酸化ナトリウム／塩酸（０．１Ｎ）を用いて適宜に７に調整し、得られた溶液を水に対し繰返し透析した（カットオフ：１２−１４０００）。その後、溶液を塩化ナトリウムと、５％ｗ／ｖ力価が達成されるまで混合し、所望の生成物をエタノールで沈殿させ、乾燥させて、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：７９％、ラクトビオン酸を用いたアシル化：５％。
【００８２】
実施例２４．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミド誘導体（還元糖のカルボキシリック誘導体を用いたアシル化）
実施例４によって調製されたラクトビオン酸の溶液を、水中の、実施例７によって得られた脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウム（０．５当量、０．３０％ｗ／ｖ）の溶液に添加し、かくて得られた未処理の生成物を、室温で１６時間にわたり反応させた。その後、ｐＨを、水酸化ナトリウム／塩酸（０．１Ｎ）を用いて適宜に７に調整し、得られた溶液を水に対し繰返し透析した（カットオフ：１２−１４０００）。その後、溶液を塩化ナトリウムと、５％ｗ／ｖ力価が達成されるまで混合し、所望の生成物をエタノールで沈殿させ、乾燥させて、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８７％、ラクトビオン酸を用いたアシル化：１６％。
【００８３】
実施例２５．部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミド誘導体（還元糖のカルボキシリック誘導体を用いたアシル化）
実施例４によって調製されたラクトビオン酸の溶液を、水中の、実施例７によって得られた脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウム（０．５当量、０．３０％ｗ／ｖ）の溶液に添加し、かくて得られた未処理の生成物を、室温で１６時間にわたり反応させた。その後、飽和塩化ナトリウム溶液を、塩化ナトリウム５％ｗ／ｖの最終力価を得るべく充分な量で添加し、混合物を１時間にわたり撹拌下に置き、最後にアセトンの添加により生成物を沈殿させ、得られた固体を単離し、次いで乾燥させた。生成物を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８５％、ラクトビオン酸を用いたアシル化：１６％。
【００８４】
実施例２６．有機媒体中の、部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミド誘導体（還元糖のカルボキシリック誘導体を用いたアシル化）
実施例４によって調製されたラクトビオン酸の溶液を、ジメチルスルホキシド中の、実施例１１によって得られた脱アセチル化されたテトラブチルアンモニウムヒアルロン酸塩（０．５当量、２％ｗ／ｖ）の溶液に添加し、かくて得られた未処理の生成物を、室温で１６時間にわたり反応させた。その後、飽和塩化ナトリウム溶液を、塩化ナトリウム５％ｗ／ｖの最終力価を得るべく充分な量で添加し、混合物を１時間にわたり撹拌下に置き、最後に生成物をアセトンの添加により沈殿させ、得られた固体を単離し、次いで乾燥させた。生成物を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８０％、ラクトビオン酸を用いたアシル化：１０％。
【００８５】
実施例２７．有機媒体中の、部分的に脱アセチル化されたヒアルロン酸のアミド誘導体（還元糖のカルボキシリック誘導体を用いたアシル化）
実施例４によって調製されたラクトビオン酸の溶液を、ジメチルホルムアミド中の、実施例７によって得られた脱アセチル化されたヒアルロン酸ナトリウムの溶液（０．５当量、２％ｗ／ｖ）の溶液に添加し、かくて得られた未処理の生成物を、室温で１６時間にわたり反応させた。その後、飽和塩化ナトリウム溶液を、塩化ナトリウム５％ｗ／ｖの最終力価を得るべく充分な量で添加し、混合物を１時間にわたり撹拌下に置き、最後に生成物をアセトンの添加により沈殿させ、得られた固体を単離し、次いで乾燥させた。生成物を、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８８％、ラクトビオン酸を用いたアシル化：１９％。
【００８６】
実施例２８．実施例２３−２７によって得られた化合物のアミド誘導体（還元糖のアミン誘導体を用いたヒアルロン酸のアシル化により得られた誘導体のアミド化）
水中の、実施例２４によって得られたヒアルロン酸のアミド誘導体（０．２５％ｗ／ｖ）の溶液を、実施例１で得られたアミン誘導体（３０当量）と混合し、得られた溶液ｐＨを、水酸化ナトリウム（１Ｎ、０．１Ｎ）または塩酸（１Ｎ、０．１Ｎ）の適当な添加により６．８に調整した。その後、予め水：ジメチルスルホキシド（１．１：１）中に溶解された、（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（５当量、１１％ｗ／ｖ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（３．５当量、６％ｗ／ｖ）の溶液を滴下添加した。溶液のｐＨを、水酸化ナトリウム（１Ｎ、０．１Ｎ）の適当な添加により６．８に調整し、得られた未処理の生成物を、室温で１６時間にわたり反応させた。その後、ｐＨを、水酸化ナトリウム／塩酸（０．１Ｎ）を用いて適宜に７に調整し、得られた溶液を水に対し繰返し透析した（カットオフ：１２−１４０００）。その後、溶液を塩化ナトリウムと、５％ｗ／ｖ力価が達成されるまで混合し、所望の生成物をエタノールで沈殿させ、乾燥させて、ＩＲおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した。反応収率：８４％、還元糖のアミン誘導体を用いたアミド化：９３％。
【００８７】
実施例２９．炎症マーカーの減少
ＮＩＨ−３Ｔ３系マウス線維芽細胞を、ＤＭＥＭ中で、１０％ウシ胎児血清ＦＣＳの存在下で増殖させ、ＩＬ１β  １ｎｇ／ｍｌで２４時間処理した。その後、いくつかの培養物を、実施例１３によって得られた濃度１．２５ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸のアミド誘導体とインキュベートした。細胞ＲＮＡを、処理から６、１２、および２４時間で抽出し、その後のｑＰＣＲによる前炎症性サイトカインＴＧＦ−β１の発現の分析用とした。前記分析は、増幅反応中に遺伝子発現が定量化されるようにする、ロータージーン（ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ）Ｑシリーズを用いて実施した。ｑＰＣＲ用の反応混合物中には、二重鎖ＤＮＡ分子の副溝に結合する蛍光分子が存在する。各反応につき、ネガティブコントロールもまた実施した（ｃＤＮＡなしの反応混合物）。実験は、二重に行い、統計分析を両側ｔ検定により実施した。ｔ検定値＜０．０５をもつ差異が、有意と見なされた。表に提示された値は、Ｐｆａｆｆｌ  ２＾−ΔΔＣｔ法（Ｐｆａｆｆｌ  Ｍ．Ｖ．「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、２００１年、第２９巻、第９号、ｅ４５）を用いた比較定量法によって得られた、２＾−ΔΔＣｔに対応する：
ΔＣｔ＝Ｃｔハウスキーピング−Ｃｔ遺伝子標的
ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ試料−ΔＣｔコントロール
２＾−ΔΔＣｔ
【００８８】
【表１】
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【００８９】
ガレクチンによって影響される病理学的プロセスを調節する能力は、本発明によって得られたヒアルロン酸誘導体の、線維症などのガレクチン３により調節されるプロセスにおける炎症カスケードのサイトカインダウンストリーム、ＴＧＦ−β１の発現を低減する著しい能力を実証している、実施例２９によって充分に裏付けられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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