(57)【要約】  標的特異的なリガンド、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンド、およびＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドを含む、三官能性分子が提供される。ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドは、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１である。この新規な受容体でＴ細胞を操作することは、サイトカイン産生、脱顆粒、および細胞溶解を含む、多くのＴ細胞機能の抗原特異的活性化を引き起こす。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列であって、前記核酸配列は：
（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；
（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む、
核酸配列。
【請求項２】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項３】
Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列であって、前記核酸配列は：
（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；
（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む、
核酸配列。
【請求項４】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む、請求項３に記載の核酸配列。
【請求項５】
Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列であって、前記核酸配列は：
（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；
（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む、
核酸配列。
【請求項６】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む、請求項５に記載の核酸配列。
【請求項７】
リガンドは標的抗原に特異的に結合する、請求項１−６のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項８】
リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである、請求項１−７のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項９】
リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１−７のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項１０】
標的抗原は腫瘍抗原である、請求項１−９のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項１１】
腫瘍抗原はＨＥＲ−２抗原である、請求項１−１０のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項１２】
腫瘍抗原はＢＣＭＡ抗原である、請求項１−１０のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項１３】
ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである、請求項１−１３のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項１４】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項１−１３のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項１５】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項１−１４のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項１６】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である、請求項１５に記載の核酸配列。
【請求項１７】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである、請求項１６に記載の核酸配列。
【請求項１８】
第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される、請求項１−１７のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項１９】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される、請求項１−１７のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項２０】
第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される、請求項１−１７のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項２１】
リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーである、請求項１９−２０のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項２２】
ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む、請求項２１に記載の核酸配列。
【請求項２３】
抗−ＨＥＲ−２の三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（抗−ＨＥＲ−２のＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列であって、前記核酸配列は：
（ａ）ＨＥＲ−２抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；
（ｂ）第２のポリヌクレオチド配列であって：
（ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンド、
（ｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンド、または、
（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンド、
をコードする、第２のポリヌクレオチド配列と；
（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む、
核酸配列。
【請求項２４】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む、請求項２３に記載の核酸配列。
【請求項２５】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む、請求項２３に記載の核酸配列。
【請求項２６】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む、請求項２３に記載の核酸配列。
【請求項２７】
リガンドはＨＥＲ−２抗原に特異的に結合する、請求項２３−２６のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項２８】
リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである、請求項２３−２７のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項２９】
ＨＥＲ−２抗原は癌細胞上で発現される、請求項２３−２８のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項３０】
ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである、請求項２３−２９のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項３１】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項２３−３０のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項３２】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項２３−３１のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項３３】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である、請求項３２に記載の核酸配列。
【請求項３４】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである、請求項３２に記載の核酸配列。
【請求項３５】
第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される、請求項２３−３４のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項３６】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される、請求項２３−３４のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項３７】
第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される、請求項２３−３４のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項３８】
リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーである、請求項３５−３７のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項３９】
ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む、請求項３８に記載の核酸配列。
【請求項４０】
抗−ＢＣＭＡの三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（抗−ＢＣＭＡのＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列であって、前記核酸配列は：
（ａ）ＢＣＭＡ抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；
（ｂ）第２のポリヌクレオチド配列であって：
（ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンド、
（ｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンド、または
（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンド、
をコードする、第２のポリヌクレオチド配列と；
（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む、
核酸配列。
【請求項４１】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む、請求項４０に記載の核酸配列。
【請求項４２】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む、請求項４０に記載の核酸配列。
【請求項４３】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む、請求項４０に記載の核酸配列。
【請求項４４】
リガンドはＢＣＭＡ抗原に特異的に結合する、請求項４０−４３のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項４５】
リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項４０−４４のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項４６】
ＢＣＭＡ抗原は癌細胞上で発現される、請求項４４に記載の核酸配列。
【請求項４７】
ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである、請求項４０−４６のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項４８】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項４０−４７のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項４９】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項４０−４８のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項５０】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である、請求項４９に記載の核酸配列。
【請求項５１】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである、請求項４９に記載の核酸配列。
【請求項５２】
第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される、請求項４０−５１のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項５３】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される、請求項４０−５１のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項５４】
第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される、請求項４０−５１のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項５５】
リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーである、請求項５３−５４のいずれか１つに記載の核酸配列。
【請求項５６】
ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む、請求項５６に記載の核酸配列。
【請求項５７】
請求項１−５６のいずれか１つの核酸配列を含むベクター。
【請求項５８】
プロモーター、好ましくは哺乳動物細胞において機能的なプロモーターをさらに含む、請求項５７に記載のベクター。
【請求項５９】
請求項５７−５８のいずれか１つに記載のベクターでトランスフェクトされたＴ細胞。
【請求項６０】
請求項１−５６のいずれか１つに記載の核酸配列、あるいは請求項５７−５８のいずれか１つに記載のベクターを含む、操作されたＴ細胞。
【請求項６１】
請求項６０に記載の操作されたＴ細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項６２】
個体において標的抗原を発現する癌を処置する方法であって、前記方法は、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、前記核酸配列は：
（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；
（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む、
方法。
【請求項６３】
個体において標的抗原を発現する癌を処置する方法であって、前記方法は、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、前記核酸配列は：
（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；
（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む、
方法。
【請求項６４】
個体において標的抗原を発現する癌を処置する方法であって、前記方法は、Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、前記核酸配列は：
（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；
（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；
（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む、
方法。
【請求項６５】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
リガンドは標的抗原に特異的に結合する、請求項６２−６７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６９】
リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである、請求項６２−６８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７０】
リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項６２−６７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７１】
標的抗原は腫瘍抗原である、請求項６２−７０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７２】
抗原はＨＥＲ−２抗原である、請求項６２−７１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７３】
抗原はＢＣＭＡ抗原である、請求項６２−７１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７４】
ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである、請求項６２−７３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７５】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項６２−７４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７６】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項６２−７５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７７】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される、請求項６２−７８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８０】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される、請求項６２−７８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８１】
第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される、請求項６２−７８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８２】
リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーである、請求項８０−８１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８３】
ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
癌は固形癌あるいは液性癌である、請求項６２−８３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８５】
癌は、肺癌、乳癌、結腸癌、多発性骨髄腫、膠芽腫、胃の癌腫、卵巣癌、胃癌、大腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、あるいは黒色腫である、請求項６２−８４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８６】
個体においてＨＥＲ−２抗原を発現する癌を処置する方法であって、前記方法は、抗−ＨＥＲ−２の三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（抗−ＨＥＲ−２のＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、前記核酸配列は：
（ａ）ＨＥＲ−２抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；
（ｂ）第２のポリヌクレオチド配列であって：
（ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンド、
（ｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンド、または
（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンド、
をコードする、第２のポリヌクレオチド配列と；
（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む、
方法。
【請求項８７】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
リガンドはＨＥＲ−２抗原に特異的に結合する、請求項８６−８９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９１】
リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである、請求項８６−９０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９２】
ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである、請求項８６−９１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９３】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項８６−９２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９４】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項８６−９３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９５】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される、請求項８６−９６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９８】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される、請求項８６−９６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９９】
第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される、請求項８６−９６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１００】
リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーである、請求項９８−９９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０１】
ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
癌は固形癌あるいは液性癌である、請求項８６−１０１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０３】
癌は、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、膠芽腫、胃の癌腫、卵巣癌、胃癌、大腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、あるいは結腸癌である、請求項８６−１０２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０４】
個体においてＢＣＭＡ抗原を発現する癌を処置する方法であって、前記方法は、抗−ＢＣＭＡの三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（抗−ＢＣＭＡのＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、前記核酸配列は：
（ａ）ＢＣＭＡ抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；
（ｂ）第２のポリヌクレオチド配列であって：
（ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンド、
（ｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンド、または
（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンド、
をコードする、第２のポリヌクレオチド配列と；
（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む、
方法。
【請求項１０５】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
リガンドはＢＣＭＡ抗原に特異的に結合する、請求項１０４−１０７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０９】
リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１０４−１０８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１０】
ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである、請求項１０４−１０９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１１】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項１０４−１１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１２】
ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む、請求項１０４−１１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１３】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される、請求項１０４−１１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１６】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される、請求項１０４−１１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１７】
第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される、請求項１０４−１１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１８】
リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーである、請求項１１６−１１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１９】
ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
癌は固形癌あるいは液性癌である、請求項１０４−１１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２１】
癌は多発性骨髄腫である、請求項１０４−１２０のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本発明は、２０１７年１０月１２日に出願された、米国仮特許出願第６２／５７１，３５４号の利益を主張し、これは引用によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１８年１０月１１日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、００３４９２３−００００６＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、４０，４３５バイトのサイズである。
【０００３】
本開示は、特定の標的細胞に対する高い細胞毒性および減少したオフターゲット毒性を有するＴ細胞を操作することにより、癌を処置する方法に関する。特に、本開示は、天然のＴ細胞活性化プロセスを引き起こす新規な生物学的因子を発現するようにＴ細胞を操作することに関する。
【発明の概要】
【０００４】
いくつかの実施形態では、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｕｐｌｅｒ）（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列が本明細書に開示され、上記核酸配列は：（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＹ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む。いくつかの実施形態において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、標的抗原は腫瘍抗原である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原はＨＥＲ−２抗原である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原はＢＣＭＡ抗原である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質は、ＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体は、ＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。
【０００５】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列が本明細書に開示され、上記核酸配列は：（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む。いくつかの実施形態において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、標的抗原は腫瘍抗原である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原はＨＥＲ−２抗原である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原はＢＣＭＡ抗原である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列が本明細書に開示され、上記核酸配列は：（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む。いくつかの実施形態において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、標的抗原は腫瘍抗原である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原はＨＥＲ−２抗原である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原はＢＣＭＡ抗原である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体は、ＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、抗−ＨＥＲ−２の三官能性Ｔ細胞抗原カプラ（抗−ＨＥＲ−２のＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列が本明細書に開示され、上記核酸配列は：（ａ）ＨＥＲ−２抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンドをコードする、第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＨＥＲ−２抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ−２抗原は癌細胞上で発現される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体は、ＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、抗−ＨＥＲ−２の三官能性Ｔ細胞抗原カプラ（抗−ＨＥＲ−２のＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列が本明細書に開示され、上記核酸配列は：（ａ）ＨＥＲ−２抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＨＥＲ−２抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ−２抗原は癌細胞上で発現される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、抗−ＨＥＲ−２の三官能性Ｔ細胞抗原カプラ（抗−ＨＥＲ−２のＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列が本明細書に開示され、上記核酸配列は：（ａ）ＨＥＲ−２抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＨＥＲ−２抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ−２抗原は癌細胞上で発現される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、抗−ＢＣＭＡの三官能性Ｔ細胞抗原カプラ（抗−ＢＣＭＡのＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列が本明細書に開示され、上記核酸配列は：（ａ）ＢＣＭＡ抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＢＣＭＡ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ抗原は癌細胞上で発現される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、抗−ＢＣＭＡの三官能性Ｔ細胞抗原カプラ（抗−ＢＣＭＡのＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列が本明細書に開示され、上記核酸配列は：（ａ）ＢＣＭＡ抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＢＣＭＡ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ抗原は癌細胞上で発現される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、抗−ＢＣＭＡの三官能性Ｔ細胞抗原カプラ（抗−ＢＣＭＡのＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列が本明細書に開示され、上記核酸配列は：（ａ）ＢＣＭＡ抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＢＣＭＡ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ抗原は癌細胞上で発現される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体は、ＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸配列を含むベクターが本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、ベクターは、プロモーター、好ましくは哺乳動物細胞において機能的なプロモーターをさらに含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクターでトランスフェクトされたＴ細胞が本明細書で開示される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸配列あるいは本明細書に開示されるベクターを含む、操作されたＴ細胞が本明細書で開示される。
【００１６】
本明細書に開示される、いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞あるいは薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が本明細書で開示される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、個体において標的抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）上記標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む。いくつかの実施形態において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、標的抗原は腫瘍抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＨＥＲ−２抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＢＣＭＡ抗原である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌あるいは液性癌である。いくつかの実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、結腸癌、多発性骨髄腫、膠芽腫、胃の癌腫、卵巣癌、胃癌、大腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、あるいは黒色腫である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、必要とする個体において標的抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）上記標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む。いくつかの実施形態において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、標的抗原は腫瘍抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＨＥＲ−２抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＢＣＭＡ抗原である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌あるいは液性癌である。いくつかの実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、結腸癌、多発性骨髄腫、膠芽腫、胃の癌腫、卵巣癌、胃癌、大腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、あるいは黒色腫である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、必要とする個体において標的抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）上記標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む。いくつかの実施形態において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、標的抗原は腫瘍抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＨＥＲ−２抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＢＣＭＡ抗原である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌あるいは液性癌である。いくつかの実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、結腸癌、多発性骨髄腫、膠芽腫、胃の癌腫、卵巣癌、胃癌、大腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、あるいは黒色腫である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、個体においてＨＥＲ−２抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、抗−ＨＥＲ−２の三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（抗−ＨＥＲ−２のＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＨＥＲ−２抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＨＥＲ−２抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質は、ＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体は、ＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌あるいは液性癌である。いくつかの実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、膠芽腫、胃の癌腫、卵巣癌、胃癌、大腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、あるいは結腸癌である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、個体においてＨＥＲ−２抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、抗−ＨＥＲ−２の三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（抗−ＨＥＲ−２のＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＨＥＲ−２抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＨＥＲ−２抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体は、ＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌あるいは液性癌である。いくつかの実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、膠芽腫、胃の癌腫、卵巣癌、胃癌、大腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、あるいは結腸癌である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、個体においてＨＥＲ−２抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、抗−ＨＥＲ−２の三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（抗−ＨＥＲ−２のＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＨＥＲ−２抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＨＥＲ−２抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドはアンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌あるいは液性癌である。いくつかの実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、膠芽腫、胃の癌腫、卵巣癌、胃癌、大腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、あるいは結腸癌である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、個体においてＢＣＭＡ抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、抗−ＢＣＭＡの三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（抗−ＢＣＭＡのＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＢＣＭＡ抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＢＣＭＡ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌あるいは液性癌である。いくつかの実施形態では、癌は多発性骨髄腫である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、個体においてＢＣＭＡ抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、抗−ＢＣＭＡの三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（抗−ＢＣＭＡのＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＢＣＭＡ抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＢＣＭＡ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌あるいは液性癌である。いくつかの実施形態では、癌は多発性骨髄腫である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、個体においてＢＣＭＡ抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、抗−ＢＣＭＡの三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（抗−ＢＣＭＡのＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＢＣＭＡ抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するＵＣＨＴ１のヒト化変異体（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む。いくつかの実施形態において、リガンドはＢＣＭＡ抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３であり、好ましくはＣＤ３εである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８であり、好ましくはＣＤ８αである。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、直接融合され、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、好ましくは５〜３０のアミノ酸、より好ましくは５のアミノ酸、１０のアミノ酸、あるいは１５のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの実施形態では、癌は、固形癌あるいは液性癌である。いくつかの実施形態では、癌は多発性骨髄腫である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【００２７】
【図１Ａ】天然のＴ細胞活性化の概略図である。
【図１Ｂ】ＣＡＲベースのＴ細胞活性化の概略図である。
【図１Ｃ】三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）ベースのＴ細胞活性化の概略図である。
【図２Ａ】一般的な抗原結合ドメインを有するＴｒｉ−ＴＡＣ分子の概略図である。
【図２Ｂ】抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎの抗原結合ドメインを有するＴｒｉ−ＴＡＣ分子の概略図である。
【図２Ｃ】抗−ＢＣＭＡのｓｃＦｖの抗原結合ドメインを有するＴｒｉ−ＴＡＣ分子の概略図である。
【図３】ＤＡＲＰｉｎを使用して、ＨＥＲ−２に対して向けられるＴｒｉ−ＴＡＣあるいはＣＤ２８ベースのＣＡＲで操作されたＴ細胞を例証する。Ａは、キメラ受容体を発現しないＴ細胞と比較した、Ｔｒｉ−ＴＡＣおよびＣＡＲの表面発現を例証する。Ｂは、３つの細胞集団の成長を例証する。
【図４】様々な抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣ対照の受容体の表面発現および活性化を例証する。Ｔ細胞は、標的化要素（−ＤＡＲＰｉｎ）を欠くＴｒｉ−ＴＡＣ変異体、あるいはＵＣＨＴ１または完全長のＴｒｉ−ＴＡＣを欠くＴｒｉ−ＴＡＣ変異体で操作された。Ａは、細胞表面発現（左）、脱顆粒（中）、およびサイトカイン産生（右）を例証し、Ｂは、完全長の抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣしか細胞毒性応答を誘発することができないことを例証する。
【図５】抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣ変異体とのＬｃｋ相互作用を例示する。Ａは、完全長のＴＡＣおよびサイトゾルの欠失がＬｃｋをプルダウンする能力を例証し、Ｂは、Ａのペレット中で検出されたＬｃｋのデンシトメトリー分析を例示する。
【図６】抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣあるいは抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  ＣＤ２８ベースのＣＡＲのいずれかで操作されたＴ細胞の抗腫瘍活性および毒性を例示する。確立されたＯＶＣＡＲ−３腫瘍を有するマウスは、抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣあるいは抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  ＣＡＲで操作されたＴ細胞で処置された。Ａは、Ｔ細胞注入日（３５日目）に対する腫瘍成長の変化を例証し、Ｂは、同じマウスにおける、毒性の尺度である体重の変化を例証する。
【図７Ａ】ＣＤ３に結合すると予測される部位でＵＣＨＴ１配列がランダムに変異誘発された、Ｔｒｉ−ＴＡＣ変異体のライブラリと比較した、野生型抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣを例示する。図７Ａは突然変異体の例示的な略図である。
【図７Ｂ】ＣＤ３に結合すると予測される部位でＵＣＨＴ１配列がランダムに変異誘発された、Ｔｒｉ−ＴＡＣ変異体のライブラリと比較した、野生型抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣを例示する。図７Ｂはライブラリの表面発現を示すヒストグラムを例示す。
【図７Ｃ】ＣＤ３に結合すると予測される部位でＵＣＨＴ１配列がランダムに変異誘発された、Ｔｒｉ−ＴＡＣ変異体のライブラリと比較した、野生型抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣを例示する。図７ＣはＴ細胞を活性化してサイトカインを産生するライブラリの能力を例示する。
【図８Ａ】図７Ｂに開示される変異誘発ライブラリの選別に従って選択された、野生型ＵＣＨＴ１（ＵＣＨＴ１ｗｔ）あるいは突然変異ＵＣＨＴ１（ＵＣＨＴ１Ａ８５Ｖ／Ｔ１６１Ｐ）のいずれかを有する、抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣの比較を例示する。図８Ａは、製造プロセスの終わりのＣＤ８／ＣＤ４のＴ細胞の分布を例示する。
【図８Ｂ】図７Ｂに開示される変異誘発ライブラリの選別に従って選択された、野生型ＵＣＨＴ１（ＵＣＨＴ１ｗｔ）あるいは突然変異ＵＣＨＴ１（ＵＣＨＴ１Ａ８５Ｖ／Ｔ１６１Ｐ）のいずれかを有する、抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣの比較を例示する。図８Ｂは、形質導入のレベルを例示する。
【図８Ｃ】図７Ｂに開示される変異誘発ライブラリの選別に従って選択された、野生型ＵＣＨＴ１（ＵＣＨＴ１ｗｔ）あるいは突然変異ＵＣＨＴ１（ＵＣＨＴ１Ａ８５Ｖ／Ｔ１６１Ｐ）のいずれかを有する、抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣの比較を例示する。図８Ｃは、ＨＥＲ−２を発現する細胞で刺激した後のサイトカイン産生を例証する。
【図９】図７Ｂのスクリーンから単離されたＵＣＨＴ１点突然変異体を有する様々な抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣの表現型および機能分析を例示する。Ａは、ＣＤ４およびＣＤ８の細胞の抗−ＨＥＲ−２のＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣ変異体の表面発現を例証する。Ｂは、ＨＥＲ−２を発現するＳＫＯＶ３細胞で刺激された後に、Ｔ細胞の機能性のインジケータの発現を誘発する、Ｔｒｉ−ＴＡＣ変異体の能力を例示する。Ｃは、ＳＫＯＶ３細胞に対して細胞毒性を発現するＴｒｉ−ＴＡＣ変異体の能力を説明する。
【図１０】ランダムに変異誘発されたライブラリの選択後の特定のアミノ酸の濃縮についての分析の結果を例証する。選択後のＵＣＨＴ１ ライブラリの配列を、（ｉ）図８Ａ−図８Ｃに記載される元のライブラリ、および（ｉｉ）レンチウイルスにパッケージングした後の同じライブラリと比較することによって、濃縮が定義される。
【図１１】様々なＵＣＨＴ１変異体の配列アラインメントを示す。Ａは、エンリッチメント解析により同定された、ＵＣＨＴ１  Ｙ１８２Ｔとアライメントされた野生型ＵＣＨＴ１である。Ｂは、ヒト化ＵＣＨＴ１（ｈｕＵＣＨＴ１）とアライメントされた野生型ＵＣＨＴ１である。Ｃは、ｈｕＵＣＨＴ１  Ｙ１７７Ｔと名付けられた、ＵＣＨＴ１  Ｙ１８２Ｔからの対応する突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１変異体とアライメントされたｈｕＵＣＨＴ１である。
【図１２】変異していないＵＣＨＴ１／ｈｕＵＣＨＴ１と比較した、ｈＹ１８２Ｔ／Ｙ１７７Ｔ突然変異体の表面発現を例示する。
【図１３】対照レンチウイルス（ＮＧＦＲ）、あるいは野生型ＵＣＨＴ１、ＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）、ｈｕＵＣＨＴ１、またはｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣをコードするレンチウイルスのいずれかで操作されたＴ細胞培養物の成長を例示する。
【図１４】対照レンチウイルス（ＮＧＦＲ）、あるいは野生型ＵＣＨＴ１、ＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）、ｈｕＵＣＨＴ１、またはｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣをコードするレンチウイルスのいずれかで操作されたＴ細胞培養物を比較する、細胞毒性アッセイを例示する。Ｔｒｉ−ＴＡＣはすべてＨＥＲ−２に特異的であった。ＳＫＯＶおよびＡ５４９はＨＥＲ−２−陽性標的である。ＲａｊｉはＨＥＲ−２−陰性標的である。
【図１５Ａ】野生型ＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣおよびＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣで操作されたＴ細胞の機能を例示する。両方のＴｒｉ−ＴＡＣは、骨髄腫標的であるＢＣＭＡに対してｓｃＦｖを有する。図１５Ａは、Ｔｒｉ−ＴＡＣ発現の表現型の分析を例証する。
【図１５Ｂ】野生型ＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣおよびＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣで操作されたＴ細胞の機能を例示する。両方のＴｒｉ−ＴＡＣは、骨髄腫標的であるＢＣＭＡに対してｓｃＦｖを有する。図１５Ｂは、ＫＭＳ−１１骨髄細胞（ＢＣＭＡ陽性）あるいはＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞（ＢＭＣＡ陰性）での共培養後のサイトカイン産生を例示する。
【図１５Ｃ】野生型ＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣおよびＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣで操作されたＴ細胞の機能を例示する。両方のＴｒｉ−ＴＡＣは、骨髄腫標的であるＢＣＭＡに対してｓｃＦｖを有する。図１５Ｃは、Ｔｒｉ−ＴＡＣがＫＭＳ−１１あるいはＳＫＯＶ−３での共培養後の２つのＴｒｉ−ＴＡＣによって引き起こされた細胞毒性を例示する。
【図１６】野生型ＵＣＨＴ１あるいはＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）のいずれかを有する、ＢＣＭＡに特異的なＴｒｉ−ＴＡＣで処置されたＴ細胞の抗骨髄腫活性を例示する。ＫＭＳ−１１骨髄腫を有するマウスは、ＮＧＦＲ、野生型ＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣ、あるいはＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣを発現するように操作されたＴ細胞で処置された。腫瘍成長は生物発光によってモニタリングされ、図中で報告される。対照Ｔ細胞は、キメラ受容体のないレンチウイルスで操作された。
【図１７】ｈｕＵＣＨＴ１あるいはｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）を有する抗−ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣのいずれかで操作されたＴ細胞の抗腫瘍活性を例示する。確立されたＯＶＣＡＲ−３腫瘍を有するマウスは、腫瘍結合ドメインを有しない対照Ｔｒｉ−ＴＡＣ（パネルＡおよびＤ）、ｈｕＵＣＨＴ１を有する抗−ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣ（パネルＢおよびＥ）、ｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）を有する抗−ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣ（パネルＣおよびＦ）で操作されたＴ細胞を用いて処置された。Ｙ軸は、Ｔ細胞注入日に対する腫瘍成長の変化を表す。Ｘ軸は、Ｔ細胞注入日に対する時間を表す。Ｔ細胞産物は２人の異なるドナーから産生された。
【図１８】ｈｕＵＣＨＴＩのヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
癌は、主要な健康上の課題であり、２０１３年だけで、１５０，０００を超える癌の症例がカナダで診断されると予想される。初期段階の疾患を患う患者は、既存の療法（手術、放射線、化学療法）によって有効に治療することができるが、進行した疾患を患う患者に利用可能な選択肢はほとんどなく、それらの選択肢は典型的に、本質的に一時的なものである。
【００２９】
能動免疫療法は、患者の免疫系を使用して腫瘍沈着を取り除くことを目指し、既存の療法に失敗した患者に刺激的な選択肢を提示する。通常、この処置は、多くの腫瘍特異的Ｔ細胞を患者に注入することを含む。このアプローチは、黒色腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫および滑膜肉腫を含む、多くの疾患の初期段階の臨床試験で成功することが分かっている。特定の例として、いくつかの臨床研究は、Ｔ細胞を用いた免疫療法が、進行した黒色腫を患う患者の治療に有効であり得ることを示しており、このアプローチの有用性が確認されている。さらに、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）に苦しむ患者も、Ｔ細胞免疫療法により有効に処置され、治癒された。
【００３０】
養子Ｔ細胞療法の臨床応用が直面する重要な課題は、Ｔ細胞のソースである。典型的には、癌を有する患者から単離されたＴ細胞を、エクスビボで多数に成長させ、強い抗腫瘍免疫応答を誘発するために患者に投与し戻す。腫瘍特異性は：（ｉ）自然発生の腫瘍特異的Ｔ細胞を患者から単離すること；あるいは（ｉｉ）腫瘍特異的受容体を発現するように末梢血のバルクＴ細胞を操作することのいずれかによって達成することができる。自然発生の腫瘍特異的Ｔ細胞はまれであり、治療量のそのような細胞を癌患者から単離することは困難かつ費用のかかる手法である。これに対して、遺伝子操作によって、腫瘍特異的受容体を有する容易に利用可能な末梢Ｔ細胞を操作することは、より効率的になってきている。この操作プロセスのための臨床的に実行可能な技術が開発されており、いくつかの臨床試験では、癌の処置のための遺伝子操作されたＴ細胞の実現可能性および有効性が実証されている。
【００３１】
現時点まで、Ｔ細胞の遺伝子改変を含むほとんどの操作されたＴ細胞療法は：（ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の強制発現；あるいは（ｉｉ）腫瘍上の抗原標的に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をもたらす。現在まで、Ｔ細胞を操作するのに使用されているキメラ抗原受容体は：（ｉ）標的ドメイン、通常、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；および、（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体および関連タンパク質のシグナル伝達要素を含む、サイトゾルドメインからなる。そのようなキメラ抗原受容体は「Ｔ−ｂｏｄｙ」あるいは「キメラ免疫受容体」（ＣＩＲ）とも呼ばれているが、現在、ほとんどの研究者は用語「ＣＡＲ」を使用している。ＣＡＲアプローチの１つの利点は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に依存しないやり方で、任意の患者の免疫細胞を任意の望ましい標的に対して標的化することを可能にするということである。ＭＨＣ提示がしばしば腫瘍細胞を欠いているので、これは魅力的である。
【００３２】
ＣＡＲはモジュール式（ｉｎ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｔｅｒｍｓ）で考慮され、科学者は、ＣＡＲ機能に対する様々な細胞質シグナル伝達ドメインの影響を調査するのに相当な時間を費やしている。従来のＣＡＲは通常、２つの主要成分を共有する：（ｉ）Ｔ細胞活性化に重要な免疫チロシン活性化モチーフを含む、ＣＤ３ゼータの細胞質ドメイン；および、（ｉｉ）Ａｋｔ経路などの重要な生存経路をもたらす、共刺激受容体の成分。第一世代ＣＡＲは、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγの単一のシグナル伝達ドメインを使用した。
【００３３】
第２世代ＣＡＲは、受容体のＣＤ２８またはＴＮＦＲファミリーいずれかの共刺激受容体の細胞質ドメインと、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを組み合わせた。病院で現在試験されているほとんどのＣＡＲで操作されたＴ細胞は、ＣＤ３ζがＣＤ２８またはＣＤ１３７のいずれかの細胞質ドメインに結合される第２世代ＣＡＲを使用する。これらの第２世代ＣＡＲは、ＣＤ１９陽性腫瘍における抗腫瘍活性を実証した。第３世代のＣＡＲは、複数の共刺激ドメインを組み合わせたが、抗原特異性を失う可能性があるという懸念がある。
【００３４】
ＣＡＲで操作されたＴ細胞は、臨床応用において相当な見込みを示しているが、それらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって提供される天然の活性化シグナルを置き換えるための合成方法に依存する。この合成受容体は、ＴＣＲ（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε上のＩＴＡＭ）に関連するシグナル伝達成分のすべてを送達しないので、Ｔ細胞がＣＡＲによって最適に活性化されるか否か、あるいはＣＡＲ活性化がどのようにＴ細胞分化（例えば、記憶への進行）に影響するかどうかは不明なままである。さらに、ＣＡＲシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ構造のまさにその性質によって天然の調節パートナーから分離されることから、ＣＡＲが低レベルの構成的活性化をもたらし、結果としてオフターゲット毒性をもたらす可能性があるという、固有のリスクも存在する。したがって、プロトタイプＣＡＲの合成性質は、基準メカニズムを妨害して、ＴＣＲ作用を制限することがあり、治療量の従来のＣＡＲのＴ細胞にしばしば関連する重度の毒性を補強する可能性がある。
【００３５】
これらの制限を考慮すると、Ｔ細胞に再度、それらの天然のＴＣＲによって腫瘍を攻撃させることが好ましい。そのために、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」（ＢｉＴＥ）と名付けられた組換えタンパク質のクラスが作られた。これらのタンパク質は、Ｔ細胞ＴＣＲ受容体を標的抗原と架橋するために二重特異性抗体フラグメントを使用する。これは効率的なＴ細胞活性化につながり、細胞毒性を引き起こす。同様に、この目的を遂行する二重特異性抗体が生成され、一部の科学者は、化学結合を使用して、抗ＣＤ３抗体を腫瘍特異的抗体に単に連結した。これらの二重特異性のタンパク質はインビトロでいくつかの活性を示しているが、ＧＭＰ産生、短い生物学的半減期、およびバイオアベイラビリティは、癌治療でのこれらの分子の有効な使用に対する重要な課題を表している。さらに、これらの分子はＴＣＲ共受容体（ＣＤ８およびＣＤ４）に関与しないため、天然のＴＣＲシグナル伝達を適切に再現することもできない。
【００３６】
最近では、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣあるいはＴＡＣ）受容体と名付けられた、代替的なキメラ受容体が開発されており、それは、Ｔ細胞に腫瘍を攻撃させるための別個の生物学を使用する。ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達複合体の成分をつなぎ合わせる完全な合成受容体であるが、ＴＡＣ受容体は、ＴＣＲを腫瘍標的へと向け直し、天然のＴＣＲシグナル伝達構造を再現する。
【００３７】
上記を考慮すると、従来のＣＡＲおよび第一世代のＴＡＣ受容体と比較して、活性および安全性が増強されたキメラ受容体の必要性が残っている。
【００３８】
特定の用語
用語「細胞」は本明細書で使用される場合、単一の細胞ならびに複数の細胞を含む。
【００３９】
用語「Ｔ細胞」は、本明細書で使用される場合、細胞性免疫において中心的役割を果たす一種のリンパ球を指す。Ｔリンパ球とも呼ばれるＴ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球と識別することができる。異なる機能を有するＴ細胞のいくつかのサブセットがあり、それは、限定されないが、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、およびナチュラルキラーＴ細胞を含む。
【００４０】
用語「Ｔ細胞抗原カプラ」あるいはＴＡＣは、「三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ」またはＴｒｉ−ＴＡＣと交換可能に使用され、および、Ｔ細胞上で発現された時に、特定の抗原へのＴ細胞の標的化を促進するのを助ける、操作された核酸構築物あるいはポリペプチドを指す。
【００４１】
用語「ポリヌクレオチド」および／または「核酸配列」および／または「核酸」は、本明細書で使用される場合、塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドあるいはヌクレオチド単量体の配列を指す。上記用語は、非自然発生の単量体あるいはその一部を含む修飾あるいは置換された配列をさらに含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む自然発生の塩基を含む場合がある。配列はさらに修飾塩基を含んでいてもよい。そのような修飾塩基の例は、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシル；ならびに、キサンチンおよびヒポキサンチンを含む。本開示の核酸は、生物から単離されるか、遺伝的組換えの実験室的方法によって形成されるか、または、核酸を生成するための化学合成あるいは他の既知のプロトコルによって得られ得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」あるいは「単離された核酸配列」は、組換ＤＮＡ技術よって生産される場合に細胞物質または培地を実質的に含まない核酸、あるいは化学的に合成される場合に化学前駆物質または他の化学製品を実質的に含まない核酸を指す。単離された核酸はさらに、核酸が由来する核酸に自然に隣接する配列（つまり、核酸の５’および３’の末端にある配列）を実質的に含まない。用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むように意図され、二本鎖あるいは単鎖のいずれかであってもよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、用語「核酸」は相補的な核酸配列を含む。
【００４３】
用語「組換え核酸」あるいは「操作された核酸」は、本明細書で使用される場合、生物では見つからない核酸またはポリヌクレオチドを指す。例えば、組換え核酸は遺伝的組換え（分子クローニングなど）の実験室的方法によって形成され、他に自然界では見られない配列を作ることができる。組換え核酸はさらに、核酸を生成するための化学合成あるいは他の既知のプロトコルによって作られてもよい。
【００４４】
用語「ポリペプチド」あるいは「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、核酸によってコードされるアミノ酸に対応するアミノ酸の鎖を表す。この開示のポリペプチドまたはタンパク質はペプチドであってもよく、それは通常、２〜約３０のアミノ酸のアミノ酸の鎖を表す。本明細書で使用される場合、タンパク質という用語はさらに、３０を超えるアミノ酸を有するアミノ酸の鎖を説明し、タンパク質のフラグメントまたはドメインあるいは完全長のタンパク質であり得る。さらに、本明細書で使用される場合、タンパク質という用語は、アミノ酸の直鎖を指すこともあり、あるいは、処理されて、機能タンパク質に折り畳まれたアミノ酸の鎖を指す場合もある。しかし、３０が、ペプチドおよびタンパク質の識別に関して任意の数であることが理解され、および、その用語は、アミノ酸の鎖と交換可能に使用することができる。本開示のタンパク質は、酵素学的（例えば、タンパク質分解）切断によって自然に産生されるか、および／または、本開示のタンパク質あるいはフラグメントをコードする核酸の組換え発現によって産生される細胞からのタンパク質の単離および精製によって、得ることができる。本開示のタンパク質および／またはフラグメントは、タンパク質およびフラグメントの産生のための化学合成あるいは他の既知のプロトコルによって得ることもできる。
【００４５】
用語「単離されたポリペプチド」は、組換ＤＮＡ技術によって生成される場合に細胞物質または培地を実質的に含まないポリペプチド、あるいは化学的に合成される場合に化学前駆物質あるいは他の化学製品を実質的に含まないポリペプチドを指す。
【００４６】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、および抗体融合を含むように意図される。上記抗体は、組換えソースに由来するか、および／または、遺伝子組換え動物において産生され得る。用語「抗体フラグメント」は、本明細書で使用される場合、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、およびその多量体、ならびに多特異性抗体フラグメントおよびドメイン抗体を含むように意図される。
【００４７】
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、細胞の内部に核酸を送達するために使用され得るポリヌクレオチドを指す。一実施形態では、ベクターは、細胞中で発現される核酸に作動可能に連結された発現調節配列（例えば、プロモーター）を含む発現ベクターである。当技術分野で既知のベクターとしては、限定されないが、プラスミド、ファージ、コスミド、およびウィルスが挙げられる。
【００４８】
用語「腫瘍抗原」あるいは「腫瘍関連抗原」は、本明細書で使用される場合、宿主（例えば、それはＭＨＣ複合体によって表すことができる）の免疫応答を誘発する、腫瘍細胞において産生された抗原物質を指す。
【００４９】
用語「Ｔ細胞受容体」あるいはＴＣＲは、本明細書で使用される場合、抗原の結合に応答して、Ｔ細胞の活性化に関与する内在性膜タンパク質の複合体を指す。ＴＣＲは、不変のＣＤ３（分化３のクラスタ）鎖状分子を有する複合体の一部として発現された、非常に可変のアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖から通常構成されるジスルフィド結合膜固定ヘテロ二量体である。この受容体を発現するＴ細胞は、α：β（あるいは、αβ）Ｔ細胞と呼ばれるが、少数のＴ細胞は、γδＴ細胞と呼ばれる、可変のガンマ（γ）鎖およびデルタ（δ）鎖によって形成された代替的受容体を発現する。ＣＤ３は４つの異なる鎖からなるタンパク質複合体である。哺乳動物では、複合体は、１つのＣＤ３γ鎖、１つのＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、および２つのＣＤ３ζ鎖を含有している。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「膜貫通および細胞質ドメイン」は、限定されないが、（ａ）脂質ラフトと関連する、および／または（ｂ）Ｌｃｋを結合する、タンパク質ドメインを含み得るポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、「タンパク質ドメイン」とは、タンパク質鎖の残りとは独立して機能し、存在する所与のタンパク質配列構造の保存された部分を指す。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ共受容体」とは、抗原提示細胞との連絡においてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を助ける分子を指す。ＴＣＲ共受容体の例としては、限定されないが、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５、ＣＤ９、およびＣＤ２２が挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ共刺激物」とは、抗原に対するＴ細胞の反応を増強する分子を指す。ＴＣＲ共刺激物の例としては、限定されないが、ＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ  １３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、および特異的にＣＤ８３に結合するリガンドを含む。
【００５３】
本明細書で使用される場合「ＴＣＲ共阻害剤」とは、抗原に対するＴ細胞の応答を阻害する分子を指す（チェックポイント受容体としても知られる）。ＴＣＲ共刺激物の例としては、限定されないが、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、およびＣＤ３７が挙げられる。
【００５４】
用語「レシピエント」、「個体」、「被験体」、「宿主」、および「患者」は、本明細書では互換的に使用され、ある場合には、診断、処置、または治療が所望される任意の哺乳動物被験体、特にヒトを指す。処置目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭動物と家畜、および、研究室、動物園、スポーツ、またはペットの動物として分類される動物を指し、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、カウ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルなどである。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「処置」、「処置する」などは、ある場合には、効果を得る目的のために、薬剤の投与あるいは手順の実行を指す。効果は、疾患またはその症状の完全または部分的な予防に関して予防的な場合もあり、および／または、疾患および／またはその症状の部分的または完全な治癒の達成に関して治療的な場合もある。「処置」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトの疾患あるいは疾病の処置を含むことがあり：（ａ）（例えば、原発性疾患に関連するか、あるいはそれにより引き起こされ得る疾患を含む）疾患にかかりやすいが、まだ疾患にかかっていると診断されていない被験体に生じる疾患またはその症状を予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、疾患の進行を阻止すること；および（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。処置は、癌の処置または改善あるいは予防おける成功の任意の徴候を指し、以下の任意の客観的あるいは主観的なパラメータ：症状を緩和、寛解、軽減するか、あるいは疾状を患者にとってより許容できるようにすること；変性または減退の速度を遅らせること；あるいは、変性の最終ポイントをそれほど損なわないようにすること、を含む。症状の処置または改善は、医師による検査の結果を含む、１つ以上の客観的または主観的なパラメータに基づく。従って、用語「処置する」は、癌に関連する症状または状態の進行を予防または遅らせるために、緩和するために、或いは阻止または阻害するために、本発明の化合物または薬剤を投与することを含む。用語「治療効果」は、被験体の疾患、疾患の症状、または疾患の副作用の低減、排除、または予防を指す。
【００５６】
本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」への言及は複数の抗体を含み、いくつかの実施形態では、「抗体」への言及は多数の抗体などを含む。
【００５７】
本明細書で使用されるように、数値あるいは数値の範囲はすべて、文脈が他に明らかに示していない限り、そのような範囲内あるいはそのような範囲を包含する全ての整数と、範囲内およびその範囲を包含する値または整数の分数とを含む。したがって、例えば、９０−１００％の範囲への言及は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％など、ならびに９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％などを含む。別の例では、１−５，０００倍の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍など、ならびに、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５倍など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、倍などを含む。
【００５８】
「約」の数は、本明細書で使用される場合、その数を含み、その数の１０％以下〜その数の１０％以上に及ぶ範囲を指す。「約」の範囲は、その範囲の下限の１０％以下〜その範囲の上限の１０％以上を指す。
【００５９】
「パーセント（％）同一性」とは、２つの配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）がアライメントの同じ位置で同じ残基を有する程度を指す。例えば、「アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙに対してＸ％同一性である」ということは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙに対するアミノ酸配列の％同一性を指し、および、アミノ酸配列の残基のＸ％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙに開示される配列の残基と同一であるとして詳述される。通常、そのような計算のためにコンピュータ・プログラムが使用される。配列の対を比較およびアライメントさせる例示的なプログラムは、ＡＬＩＧＮ  （Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  １９８８），  ＦＡＳＴＡ  （Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  １９８８；  Ｐｅａｒｓｏｎ，  １９９０）、およびｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７），  ＢＬＡＳＴＰ，  ＢＬＡＳＴＮ，またはＧＣＧ  （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）を含む。
【００６０】
本明細書で使用されるように、用語「選択的に結合する」とは、タンパク質（例えば、ＴＡＣの標的結合リガンド）が、他の抗原ではなくその標的抗原（例えば、ＨＥＲ−２あるいはＢＣＭＡ）に結合する程度を指す。
【００６１】
Ｔ細胞抗原カプラ（ＴＡＣ）
いくつかの実施形態では、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸が本明細書に開示され、それは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって天然のシグナル伝達を活性化する一方、ＭＨＣの非制限標的化（ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を保持する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣあるいはＴＡＣ）をコードする核酸が本明細書に開示され、上記核酸は：（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するマウスＵＣＨＴ１リガンド（ｍｕＵＣＨＴ１）をコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６との、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリペプチド配列のパーセント配列同一性は、Ｙ１８２Ｔ突然変異以外のアミノ酸を指す。
【００６３】
いくつかの実施形態では、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣあるいはＴＡＣ）をコードする核酸が本明細書に開示され、上記核酸は：（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヒト化ＵＣＨＴ１（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のアミノ酸配列を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣあるいはＴＡＣ）をコードする核酸が本明細書に開示され、上記核酸は：（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質を結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するヒト化ＵＣＨＴ１（ｈｕＵＣＨＴ１）のリガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８との、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリペプチド配列のパーセント配列同一性は、Ｙ１７７Ｔ突然変異以外のアミノ酸を指す。
【００６５】
いくつかの実施形態において、標的抗原に選択的に結合するリガンド（あるいは、標的特異的リガンド）は、Ｔ細胞抗原カプラ（ＴＡＣ）を標的細胞に向ける。いくつかの例では、標的特異的リガンドは抗原結合ドメインと呼ばれる。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、標的細胞に直接あるいは間接的に結合する任意の物質を指す。いくつかの実施形態において、標的特異的リガンドは、標的細胞上の抗原（免疫応答を誘発することができる細胞によって産生されたタンパク質）に結合する。いくつかの例では、標的特異的リガンドとしては、限定されないが、抗体およびそのフラグメント、例えば、標的細胞および／または抗原に制限する、単鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）、単一ドメイン抗体、ペプチド、ペプチド模倣薬、タンパク質、糖タンパク質あるいはプロテオグリカンなどの単鎖抗体が挙げられる。いくつかの例では、標的特異的リガンドとしては、限定されないが、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）、レクチン、ノッチン、セントリリン（ｃｅｎｔｒｙｒｉｎｓ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、あるいは腫瘍抗原の自然発生のリガンド、例えば、成長因子、酵素基質、受容体、あるいは結合タンパク質が挙げられる。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、標的細胞および／または標的抗原に結合する非タンパク質化合物を含み、限定されないが、炭水化物、脂質、核酸、あるいは小分子を含む。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、特定の細胞および／または抗原に標的化された設計アンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）である。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）抗原に選択的に結合するＤＡＲＰｉｎである。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）抗原に特異的に結合するＤＡＲＰｉｎである。いくつかの例では、ＨＥＲ−２（ｅｒｂ−２）に標的化されたＤＡＲＰｉｎは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、特定の細胞および／または抗原に標的化された単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの例では、標的特異的リガンドはＢＣＭＡに選択的に結合するｓｃＦｖである。いくつかの例では、標的特異的リガンドはＢＣＭＡに特異的に結合するｓｃＦｖである。いくつかの例では、ＢＣＭＡに制限するｓｃＦｖは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２を含む。
【００６６】
いくつかの例では、標的細胞は、限定されないが癌を含む疾状に関連した細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は腫瘍細胞である。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原または腫瘍関連抗原に結合することができる。いくつかの例において、標的抗原は腫瘍抗原である。いくつかの例では、腫瘍抗原がタンパク質性である場合、８つ以上のアミノ酸〜完全なタンパク質の配列である。いくつかの例では、腫瘍抗原は、ＭＨＣ複合体で表される完全長のタンパク質の少なくとも１つの抗原フラグメントを含む、８〜完全長のタンパク質の間の任意の数のアミノ酸である。腫瘍抗原の例としては、限定されないが、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、神経膠腫関連抗原、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、サバイビン  およびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ならびにメソテリンが挙げられる。いくつかの例では、腫瘍抗原はＨＥＲ−２抗原である。いくつかの例では、ＨＥＲ−２の特定のリガンドは、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、ネラチニブ、トラスツズマブ  エムタンシン、Ｇａｎｃｏｔａｍａｂ、マルゲツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、Ｔｉｍｉｇｕｔｕｚｕｍａｂ、およびエルツマキソマブから選択される抗体の抗原結合ドメインを含む。場合によっては、腫瘍抗原はＢＣＭＡ抗原である。いくつかの例では、ＢＣＭＡ特異的リガンドは、Ｂｅｌａｎｔａｍａｂ  ｍａｆｏｄｏｔｉｎおよびＧＳＫ２８５７９１６から選択される抗体の抗原結合ドメインを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ＴＡＣは、共受容体刺激と組み合わせてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を動員する。いくつかの例では、ＴＡＣは、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドは、ＴＣＲのタンパク質に直接あるいは間接的に結合する物質を含む。ＴＣＲに関連するタンパク質としては、限定されないが、ＴＣＲアルファ（α）鎖、ＴＣＲベータ（β）鎖、ＴＣＲガンマ（γ）鎖、ＴＣＲデルタ（δ）鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドは、ＴＣＲアルファ（α）鎖、ＴＣＲベータ（β）鎖、ＴＣＲガンマ（γ）鎖、ＴＣＲデルタ（δ）鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および／またはＣＤ３ε鎖に対する抗体である。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＣＤ３に結合する抗体またはそのフラグメントである。ＣＤ３抗体の例としては、限定されないが、ムロモナブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、およびビジリズマブが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３に結合する抗体は、単鎖抗体、例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの例では、ＣＤ３に結合するリガンドはＵＣＨＴ１である。いくつかの例では、ＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、ＵＣＨＴ１リガンドはマウスのリガンドである。いくつかの例では、マウスＵＣＨＴ１リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４を含む。いくつかの例では、マウスＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するマウスＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、ＵＣＨＴ１リガンドのヒト化された変異体はＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するヒト化されたＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７および１８を含むＣＤ４の共受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８αである。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ５である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ９である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ５である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ２２である。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共刺激物の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＩＣＯＳである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２７である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２８である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物は４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＯＸ４０（ＣＤ１３４）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ３０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ４０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はリンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ７である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＬＩＧＨＴである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＮＫＧ２Ｃである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＢ７−Ｈ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共阻害剤の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＰＤ−１である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＴＩＭ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＬＡＧ−３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＴＩＧＩＴである。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＢＴＬＡである。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＣＤ１６０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＣＤ３７である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体または共刺激物タンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメインの両方を含む。いくつかの例では、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインは、同じ共受容体あるいは共刺激物に由来するか、または異なる共受容体あるいは共刺激物に由来する。いくつかの例では、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインは、リンカーによって随意に結合される。いくつかの実施形態において、ＴＡＣは、直接あるいは間接的に作用してＴ細胞を標的化または活性化する他のポリペプチドをさらに含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、少なくとも１つのリンカーによって結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは直接融合されて、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは直接融合されて、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜４のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜１５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜１０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜６のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３０〜４０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３２〜３６のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは５〜３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは２０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは２５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの例において、ＴＡＣで使用されるリンカーの他の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１５、１６、１９、および２０に対応するペプチド、ならびにそれらの変異体およびフラグメントである。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４共受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、ＣＤ３に結合する単鎖抗体に融合される。いくつかの例では、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）を生成するために、設計アンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）は、ＣＤ４−ＵＣＨＴ１キメラに連結される。いくつかの例では、Ｔｒｉ−ＴＡＣはＣＤ３分子およびＴＣＲを脂質ラフトの領域へと導き、ＬｃｋをＴＣＲの近接に移動させ、これは、天然のＭＨＣ結合に類似する。
【００７１】
いくつかの例では、Ｔｒｉ−ＴＡＣで操作されたＴ細胞は、インビトロで従来のＣＡＲと同等の機能を示す。いくつかの例では、Ｔｒｉ−ＴＡＣで操作されたＴ細胞は、インビトロで従来のＣＡＲよりも優れている機能を示す。いくつかの例では、Ｔｒｉ−ＴＡＣは、活性化ドメインがタンパク質の一部でないため、従来のＣＡＲと比較して、向上した安全性を提供する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、核酸は、組換え核酸あるいは操作された核酸である。いくつかの実施形態において、第１、第２、および／または第３のポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドあるいは操作されたポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチドの機能および／またはＴ細胞抗原カプラの活性および／または発現の機能を最適化するために、改変あるいは変異される場合がある。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ＴＡＣの表面発現を増強したＵＣＨＴ１突然変異体が生成される（図８Ａ−Ｃ、９、１０、１２）。いくつかの例では、ＴＡＣは、ＴＣＲ複合体に結合する修飾あるいは変異されたリガンドを含み、ここで、修飾あるいは変異された抗体を含むＴＡＣは、ＴＣＲ複合体に結合する野生型または修飾あるいは変異されていないリガンドを含むＴＡＣと比較して、表面発現および／または活性を増大させた。ＣＤ３に結合する突然変異体または修飾抗体の一例は、本明細書に開示されるＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）突然変異体である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５および２６）。
【００７４】
Ｔｒｉ−ＴＡＣは様々な構成で存在することが企図される。いくつかの実施形態において、標的特異的リガンドおよびＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは両方とも、ＴＣＲ複合体に結合するリガンドに融合される。例えば、本明細書に開示される抗−ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣ（構成１とも呼ばれる；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２）は、以下を順に含む：
ｉ）抗−ＨＥＲ−２  Ｔｒｉ−ＴＡＣリーダー配列（分泌シグナル）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６）
ｉｉ）ＨＥＲ−２抗原（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８）に特異的なＤＡＲＰｉｎ
ｉｉｉ）Ｍｙｃタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０）
ｉｖ）リンカー１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２）
ｖ）ＵＣＨＴ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４）
ｖｉ）リンカー２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５および１６）
ｖｉｉ）ＣＤ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７および１８）。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＤＡＲＰｉｎは、ＢＣＭＡ抗原に特異的なｓｃＦｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および２２）で置き換えられる。
【００７６】
ポリペプチドおよびベクター構築物
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸配列によってコードされるポリペプチドが本明細書に開示される。本明細書に開示される核酸配列を含むベクターが本明細書にさらに開示される。いくつかの例では、ベクターはプロモーターをさらに含む。いくつかの例では、プロモーターは哺乳動物細胞において機能的である。本明細書に記載される核酸を細胞に導入するために、様々な送達ベクターおよび発現ビヒクルが使用される。
【００７７】
プロモーター（特定の核酸配列の転写を開始するＤＮＡの領域）は、当技術分野において公知である。「哺乳動物細胞において機能的なプロモーター」とは、哺乳動物細胞において関連する核酸配列の発現を駆動するプロモーターを指す。核酸配列の発現を駆動するプロモーターは、核酸配列に「動作可能に結合される」と言及される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに融合されてＴｒｉ−ＴＡＣ融合をもたらし、Ｔｒｉ−ＴＡＣ融合のコード配列はプロモーターに動作可能に結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドに融合されてＴｒｉ−ＴＡＣ融合をもたらし、Ｔｒｉ−ＴＡＣ融合のコード配列はプロモーターに動作可能に結合される。いくつかの実施形態において、ベクターは、Ｔ細胞などの哺乳動物細胞における発現のために設計される。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの例では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。
【００７９】
有用なベクターは、レンチウイルス、ウス幹細胞ウィルス（ＭＳＣＶ）、ポックスウイルス、オンコレトロウイルス（ｏｎｃｏｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウィルスに由来するベクターを含む。有用な他の送達ベクターは、単純ヘルペスウイルス、トランスポゾン、ワクシニアウイルス、ヒトパピローマウイルス感染症、サル免疫不全ウィルス、ＨＴＬＶ、ヒト泡沫状ウィルス、およびその変異体に由来するベクターを含む。さらに、有用なベクターは、スプーマウイルス、哺乳類Ｂ型レトロウイルス、哺乳類Ｃ型レトロウイルス、トリＣ型レトロウイルス、哺乳類Ｄ型レトロウイルス、およびＨＴＬＶ／ＢＬＶ型レトロウイルスに由来するベクターを含む。開示される組成物および方法に有用なレンチウイルスベクターの１つの例は、ｐＣＣＬベクターである。
【００８０】
多くの修飾が、本明細書に開示されるベクター配列およびポリペプチド配列を含むポリヌクレオチド配列になされてもよい。修飾は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、挿入、あるいは欠失、またはヌクレオチドまたはアミノ酸の相対位置または順序の変更を含む。
【００８１】
配列同一性
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、開示された核酸分子に対して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％あるいは９９．５％の同一性を有する核酸分子（あるいはそのフラグメント）も含む。ポリペプチドは、開示されたポリペプチドに対して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％あるいは９９．５％の同一性を有するポリペプチド（あるいはそのフラグメント）をさらに含む。
【００８２】
配列同一性は、好ましくは、本明細書で提供されるヌクレオチド配列および／またはその相補的配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または、最も好ましくは、少なくとも９９％あるいは９９．５％の同一性に設定される。配列同一性はさらに、好ましくは、本明細書で提供されるポリペプチド配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または、最も好ましくは、少なくとも９９％あるいは９９．５％の同一性に設定される。
【００８３】
ハイブリダイゼーション
本明細書に開示されるのは、いくつかの例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするために、本明細書に記載される核酸分子に対して十分な同一性を有する配列を有するＤＮＡである。本明細書に記載される配列および／またはその相補的配列の１つ以上にハイブリダイズする核酸分子が本明細書にさらに開示される。そのような核酸分子は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするのが好ましい。高ストリンジェンシー洗浄は、好ましくは、低塩（好ましくは、約０．２％のＳＳＣ）および約５０−６５°Ｃの温度を有し、約１５分間随意に実施される。
【００８４】
Ｔ細胞での発現
三官能性Ｔ細胞−抗原カプラは、Ｔ細胞における発現のために設計される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸配列、あるいは本明細書に開示されるベクターを含む、操作されたＴ細胞が本明細書で開示される。いくつかの例では、Ｔ細胞は、本明細書に開示される三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）を発現する。さらに、Ｔ細胞抗原カプラあるいはＴｒｉ−ＴＡＣを含むベクターで形質導入されるか、またはトランスフェクトされたＴ細胞が本明細書に開示される。いくつかの例では、Ｔ細胞は単離されたＴ細胞である。
【００８５】
Ｔ細胞は、限定されないが、血液（例えば、末梢血単核細胞）、骨髄、胸腺組織、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、脾臓組織、および腫瘍を含む、多くのソースから得ることができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は自己Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＴ細胞の細胞株から得られる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はドナー（同種異系Ｔ細胞）から得られる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、胚または成体幹細胞の分化によって、あるいは人工多能性幹細胞から得られる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞のソースにかかわらず、Ｔ細胞は、内因性ＴＣＲを欠くように、および／または、ＭＨＣ／ＨＬＡ分子（万能ドナーのＴ細胞）の発現を永久にあるいは一時的に欠くように、改変された。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は被験体に対して自己由来であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、被験体に対して同種異系、同系、あるいは異種である。
【００８６】
Ｔ細胞は、一旦得られると、インビトロで随意に濃縮される。いくつかの例では、細胞の集団は、正または負の選択によって濃縮される。さらに、Ｔ細胞は随意に凝固あるいは凍結保存され、後日解凍される。
【００８７】
いくつかの例では、Ｔ細胞にＴｒｉ−ＴＡＣを導入する前あるいは後に、Ｔ細胞は、活性化および／または拡大される。いくつかの例では、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、およびＴ細胞の表面上の共刺激物分子を刺激するリガンドが結合する表面との接触によって拡大される。
【００８８】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、核酸配列で形質導入あるいはトランスフェクトされる。いくつかの例では、形質導入あるいはトランスフェクトされたＴ細胞が発現される。いくつかの例では、核酸は、物理的、化学的、あるいは生体学的手段によって細胞に導入することができる。物理的手段としては、限定されないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃、リポフェクションおよびリン酸カルシウム沈澱が挙げられる。生体学的手段は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターを含むウイルスベクターは、Ｔ細胞に核酸を導入し、発現するために使用される。ウイルスベクターは、レンチウイルス、マウスの幹細胞ウィルス（ＭＳＣＶ）、ポックスウイルス、単純疱疹ウィルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウィルスに由来するベクターを含む。ベクターは、Ｔ細胞において形質導入された核酸分子の発現を駆動するプロモーターを随意に含む。
【００９０】
様々なアッセイは、Ｔ細胞において形質導入された核酸配列および／または核酸によってコードされたポリペプチドの存在および／または発現を確認するために使用される。アッセイとしては、限定されないが、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞抗原カプラを発現するＴ細胞は、Ｔ細胞抗原カプラを発現しないＴ細胞と比較して、および／または、従来のＣＡＲを発現するＴ細胞と比較して、抗原の存在下でＴ細胞活性化を増大させた。Ｔ細胞活性化の増大は、多数の方法によって確認することができ、それは、限定されないが、腫瘍細胞株死滅の増大、サイトカイン産生の増大、細胞溶解の増大、脱顆粒の増大、および／または、ＣＤ１０７α、ＩＦＮγ、ＩＬ２、またはＴＮＦαなどの活性化マーカーの発現の増大を含む。増大は個々の細胞あるいは細胞の集団において測定され得る。
【００９２】
用語「増大」あるいは「増大する」は、本明細書で使用される場合、Ｔ細胞抗原カプラを発現しないＴ細胞あるいはＴ細胞の集団と比較して、および／または従来のＣＡＲを発現するＴ細胞あるいはＴ細胞の集団と比較して、Ｔ細胞抗原カプラを発現するＴ細胞またはＴ細胞の集団が、少なくとも１％、２％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％あるいは２００％増大することを指す。
【００９３】
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作されたＴ細胞（Ｔ細胞抗原カプラで形質導入されたおよび／またはＴ細胞抗原カプラを発現する）、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が、本明細書で開示される。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドあるいはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡあるいはグルタチオンなどのキレート剤；ポロキサマー（例えばポロキサマー）；および防腐剤を含むことができる。いくつかの例では、操作されたＴ細胞は、静脈内投与のための製剤化される。
【００９４】
医薬組成物は、処置される（または予防される）疾患に適切なやり方で投与される。投与の量および頻度は、患者の状態、および患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因によって決定されるが、適切な用量は臨床試験によって決定される。「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、あるいは「治療量」が示される場合、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の範囲、および患者（被験体）の状態の個体差を考慮する医師によって、投与される本発明の組成物の正確な量を決定することができる。例えば、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞および／または医薬組成物は、ｋｇ体重当たり１０４〜１０９の細胞、随意に、ｋｇ体重当たり１０５〜１０８の細胞、ｋｇ体重当たり１０６〜１０７の細胞、ｋｇ体重当たり１０５〜１０６の細胞の投与量で投与され、それらの範囲内の整数値をすべて含む。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与されることがある。投与量は、単回または複数回、例えば、毎日、毎週、隔週、あるいは毎月投与することができ、または、処置されている癌の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｒｅｌａｐｓｅ）あるいは進行時に投与することができる。細胞は、免疫療法中で一般的に知られている注入技術の使用により投与することができる（参照、例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄ．  ３１９：１６７６，  １９８８））。
【００９５】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、ミコプラズマ、複製能を有するレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残存する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコートされたビーズ、マウス抗体、プールヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択される、検知できるレベルの汚染物質を実質的に含まない。一実施形態では、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス、カンジダ・アルビカンス、大腸菌、ヘモフィルス・インフルエンザエ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、肺炎球菌、および化膿連鎖球菌群Ａからなる群から選択される少なくとも１つである。
【００９６】
いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞を被験体に投与し、その後、血液を取り直し（あるいはアフェレーシスを実施し）、そこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化および拡大したＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間毎に複数回行なうことができる。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。ある態様では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、あるいは１００ｃｃの採血から活性化される。
【００９７】
修飾されたＴ細胞および／または医薬組成物は、限定されないが、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、注入（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、あるいは移植を含む方法によって投与され得る。修飾されたＴ細胞および／または医薬組成物は、経動脈的、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄腔内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内で被験体に投与することができる。一態様では、その修飾されたＴ細胞および／または医薬組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。いくつかの態様では、修飾されたＴ細胞および／またはその医薬組成物は、ｉ．ｖ．注射により投与される。その修飾されたＴ細胞および／または医薬組成物は、腫瘍、リンパ節あるいは感染部位に直接注入され得る。
【００９８】
医薬組成物は、有効な量のＴ細胞が、薬学的に許容可能な担体との混合物に組み合わされるように、被験体に投与することができる薬学的に許容可能な組成物を調製するための既知の方法によって、調整され得る。適切な担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２０ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  ＵＳＡ，  ２０００）に記載される。これに基づいて、組成物は、排他的ではないが、１つ以上の薬学的に許容可能な担体あるいは希釈剤と関連する物質の溶液を含み、適切なｐＨおよび等浸透圧性を有する緩衝液中に生理液とともに含有される。
【００９９】
適切な薬学的に許容可能な担体は、医薬組成物の生物学的活性の有効性を妨げない、本質的に、化学的に不活性で無毒な組成物を含む。適切な医薬品担体の例としては、限定されないが、水、生理食塩水、グリセリン溶液、（Ｎ−（１（２，３−ジオレイルオキシ（ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ））プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）クロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスファチジル（ｄｉｏｌｅｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ）−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびリポソームが挙げられる。そのような組成物は、患者への直接投与のための形態を提供するために、適切な量の担体と共に、治療上有効な量の化合物を含有しなければならない。
【０１００】
医薬組成物はさらに、限定されないが、凍結乾燥された粉体あるいは水性または非水性の無菌注射液あるいは懸濁液を含む場合があり、それは、組成物を対象のレシピエントの組織あるいは血液と実質的に適合させる抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および溶質をさらに含み得る。そのような組成物中に存在し得る他の成分は、例えば、水、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎなど）、アルコール、ポリオール、グリセリン、および植物油を含む。即時の注射溶液および懸濁液は、無菌の粉体、顆粒、錠剤、あるいは濃縮された溶液または懸濁液から調製され得る。
【０１０１】
処置法および使用
いくつかの実施形態では、個体において標的抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、本明細書に開示される操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含む。個体の癌を処置するための薬物の調製における本明細書に開示される操作されたＴ細胞の使用が本明細書にさらに開示される。個体の癌の処置で使用するための、本明細書に開示される操作されたＴ細胞が本明細書にさらに開示される。改変された細胞と改変されていない細胞を含むＴ細胞の混合物、あるいは改変されていない細胞の有無に関わらず、改変された細胞の様々な集団を含むＴ細胞の混合物の使用が、本明細書にさらに開示される。治療量の改変されたＴ細胞が、本来均質である必要がないということを当業者は理解するだろう。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、必要とする個体において標的抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するマウスＵＣＨＴ１リガンド（ｍｕＵＣＨＴ１）をコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６との、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリペプチド配列のパーセント配列同一性は、Ｙ１８２Ｔ突然変異以外のアミノ酸を指す。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、必要とする個体において標的抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヒト化ＵＣＨＴ１（ｈｕＵＣＨＴ１）リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、必要とする個体において標的抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）標的抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質を結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するヒト化ＵＣＨＴ１（ｈｕＵＣＨＴ１）リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８との、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリペプチド配列のパーセント配列同一性は、Ｙ１７７Ｔ突然変異以外のアミノ酸を指す。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、標的抗原に選択的に結合するリガンド（あるいは、標的特異的リガンド）は、Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）を標的細胞に向ける。いくつかの例では、標的特異的リガンドは抗原結合ドメインと呼ばれる。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、標的細胞に直接あるいは間接的に結合する任意の物質を指す。いくつかの実施形態において、標的特異的リガンドは、標的細胞上の抗原（免疫応答を誘発することができる細胞によって産生されたタンパク質）に結合する。いくつかの例では、標的特異的リガンドとしては、限定されないが、抗体およびそのフラグメント、例えば、標的細胞および／または抗原に結合する、単鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）、単一ドメイン抗体、ペプチド、ペプチド模倣薬、タンパク質、糖タンパク質あるいはプロテオグリカンなどの単鎖抗体が挙げられる。いくつかの例では、標的特異的リガンドとしては、限定されないが、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）、レクチン、ノッチン、セントリリン（ｃｅｎｔｒｙｒｉｎｓ）、アンチカリン、あるいは腫瘍抗原の自然発生のリガンド、例えば、成長因子、酵素基質、受容体、あるいは結合タンパク質が挙げられる。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、標的細胞および／または標的抗原に結合する非タンパク質化合物を含み、限定されないが、炭水化物、脂質、核酸、あるいは小分子を含む。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、特定の細胞および／または抗原に標的化された設計アンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）である。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）抗原に選択的に結合するＤＡＲＰｉｎである。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）抗原に特異的に結合するＤＡＲＰｉｎである。いくつかの例では、ＨＥＲ−２（ｅｒｂ−２）に標的化されたＤＡＲＰｉｎは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、特定の細胞および／または抗原に標的化された単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの例では、標的特異的リガンドは選択的にＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖである。いくつかの例では、標的特異的リガンドは特異的にＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖである。いくつかの例では、ＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２を含む。
【０１０６】
いくつかの例では、標的細胞は、限定されないが癌を含む疾状に関連した細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は腫瘍細胞である。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原または腫瘍関連抗原に結合することができる。いくつかの例において、標的抗原は腫瘍抗原である。いくつかの例では、腫瘍抗原がタンパク質性である場合、８つ以上のアミノ酸〜完全なタンパク質の配列である。いくつかの例では、腫瘍抗原は、ＭＨＣ複合体で表される完全長のタンパク質の少なくとも１つの抗原フラグメントを含む、８〜完全長のタンパク質の間の任意の数のアミノ酸である。腫瘍抗原の例としては、限定されないが、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、神経膠腫関連抗原、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、サバイビン  およびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ならびにメソテリンが挙げられる。いくつかの例では、腫瘍抗原はＨＥＲ−２抗原である。いくつかの例では、ＨＥＲ−２の特定のリガンドは、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、ネラチニブ、トラスツズマブ  エムタンシン、Ｇａｎｃｏｔａｍａｂ、マルゲツキシマブ、Ｔｉｍｉｇｕｔｕｚｕｍａｂ、およびエルツマキソマブから選択される抗体の抗原結合ドメインを含む。場合によっては、腫瘍抗原はＢＣＭＡ抗原である。いくつかの例では、ＢＣＭＡ特異的リガンドは、Ｂｅｌａｎｔａｍａｂ  ｍａｆｏｄｏｔｉｎおよびＧＳＫ２８５７９１６から選択される抗体の抗原結合ドメインを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、Ｔｒｉ−ＴＡＣは、共受容体刺激と組み合わせてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を動員する。いくつかの例では、ＴＡＣは、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドは、ＴＣＲのタンパク質に直接あるいは間接的に結合する物質を含む。ＴＣＲに関連するタンパク質としては、限定されないが、ＴＣＲアルファ（α）鎖、ＴＣＲベータ（β）鎖、ＴＣＲガンマ（γ）鎖、ＴＣＲデルタ（δ）鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドは、ＴＣＲアルファ（α）鎖、ＴＣＲベータ（β）鎖、ＴＣＲガンマ（γ）鎖、ＴＣＲデルタ（δ）鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および／またはＣＤ３ε鎖に対する抗体である。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＣＤ３に結合する抗体またはそのフラグメントである。ＣＤ３抗体の例としては、限定されないが、ムロモナブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、およびビジリズマブが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３に結合する抗体は、単鎖抗体、例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの例では、ＣＤ３に結合するリガンドはＵＣＨＴ１である。いくつかの例では、ＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、ＵＣＨＴ１リガンドはマウスのリガンドである。いくつかの例では、マウスＵＣＨＴ１リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４を含む。いくつかの例では、マウスＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するマウスＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、ヒトＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するヒト化されたＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７および１８を含むＣＤ４の共受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８αである。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ５である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ９である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ５である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ２２である。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共刺激物の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＩＣＯＳである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２７である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２８である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物は４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＯＸ４０（ＣＤ１３４）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ３０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ４０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はリンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ７である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＬＩＧＨＴである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＮＫＧ２Ｃである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＢ７−Ｈ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共阻害剤の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＰＤ−１である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＴＩＭ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＬＡＧ−３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＴＩＧＩＴである。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＢＴＬＡである。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＣＤ１６０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＣＤ３７である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体または共刺激物タンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメインの両方を含む。いくつかの例では、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインは、同じ共受容体あるいは共刺激物に由来するか、または異なる共受容体あるいは共刺激物に由来する。いくつかの例では、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインは、リンカーによって随意に結合される。いくつかの実施形態において、ＴＡＣは、直接あるいは間接的に作用してＴ細胞を標的化または活性化する他のポリペプチドをさらに含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、少なくとも１つのリンカーによって結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは直接融合されて、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは直接融合されて、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜４のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜１５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜１０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜６のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３０〜４０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３２〜３６のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは５〜３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは２０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは２５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの例において、Ｔｒｉ−ＴＡＣで使用されるリンカーの他の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１５、１６、１９、および２０に対応するペプチド、ならびにそれらの変異体およびフラグメントである。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４共受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、ＣＤ３に結合する単鎖抗体に融合される。いくつかの例では、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）を生成するために、設計アンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）は、ＣＤ４−ＵＣＨＴ１キメラに連結される。いくつかの例では、ＴＡＣはＣＤ３分子およびＴＣＲを脂質ラフトの領域へと導き、ＬｃｋをＴＣＲの近接に移動させ、これは、天然のＭＨＣ結合に類似する。
【０１１１】
処置される癌は、腫瘍性疾患のあらゆる形態を含む。処置される癌の例としては、限定されないが、乳癌、肺癌、および白血病、例えば、混合型白血病（ＭＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）が挙げられる。他の癌は、細胞腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、血液癌、リンパ性腫瘍、良性腫瘍と悪性腫瘍、悪性病変を含む。癌は非固形腫瘍あるいは固形腫瘍を含み得る。処置される癌は、血管新生化されていないか、あるいは実質的にまだ血管新生化されていない腫瘍、ならびに血管新生腫瘍を含む。いくつかの例では、癌は固形癌であるか、あるいは固形腫瘍を含む。いくつかの例では、癌は液性癌であるか、あるいは液性腫瘍を含む。いくつかの例において、癌は、肺癌、乳癌、結腸癌、多発性骨髄腫、膠芽腫、胃の癌腫、卵巣癌、胃癌、大腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、あるいは黒色腫である。いくつかの例において、癌は肺癌である。いくつかの例において、癌は乳癌である。いくつかの例において、癌は結腸癌である。いくつかの例において、癌は多発性骨髄腫である。いくつかの例において、癌は膠芽腫である。いくつかの例において、癌は胃の癌腫である。いくつかの例において、癌は卵巣癌である。いくつかの例において、癌は胃癌である。いくつかの例において、癌は大腸癌である。いくつかの例において、癌は尿路上皮癌である。いくつかの例において、癌は子宮内膜癌である。いくつかの例において、癌は黒色腫である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、個体においてＨＥＲ−２抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、抗−ＨＥＲ−２の三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（抗−ＨＥＲ−２のＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む操作されたＴ細胞を、個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＨＥＲ−２抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するマウスＵＣＨＴ１リガンド（ｍｕＵＣＨＴ１）をコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例では、リガンドはＨＥＲ−２抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６との、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリペプチド配列のパーセント配列同一性は、Ｙ１８２Ｔ突然変異以外のアミノ酸を指す。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、個体においてＨＥＲ−２抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書にさらに開示され、上記方法は、抗−ＨＥＲ−２のＴ細胞−抗原カプラ（抗−ＨＥＲ−２のＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＨＥＲ−２抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヒト化ＵＣＨＴ１（ｈｕＵＣＨＴ１）リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例では、リガンドはＨＥＲ−２抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、個体においてＨＥＲ−２抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書にさらに開示され、上記方法は、抗−ＨＥＲ−２のＴ細胞−抗原カプラ（抗−ＨＥＲ−２のＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＨＥＲ−２抗原に選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質を結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するヒト化ＵＣＨＴ１（ｈｕＵＣＨＴ１）リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例では、リガンドはＨＥＲ−２抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８との、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリペプチド配列のパーセント配列同一性は、Ｙ１７７Ｔ突然変異以外のアミノ酸を指す。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、標的抗原に選択的に結合するリガンド（あるいは、標的特異的リガンド）は、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）を標的細胞に向ける。いくつかの例では、標的特異的リガンドは抗原結合ドメインと呼ばれる。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、標的細胞に直接あるいは間接的に結合する任意の物質を指す。いくつかの実施形態において、標的特異的リガンドは、標的細胞上の抗原（免疫応答を誘発することができる細胞によって産生されたタンパク質）に結合する。いくつかの例では、標的特異的リガンドとしては、限定されないが、抗体およびそのフラグメント、例えば、標的細胞および／または抗原に結合する、単鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）、単一ドメイン抗体、ペプチド、ペプチド模倣薬、タンパク質、糖タンパク質あるいはプロテオグリカンなどの単鎖抗体が挙げられる。いくつかの例では、標的特異的リガンドとしては、限定されないが、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）、レクチン、ノッチン、セントリリン（ｃｅｎｔｒｙｒｉｎｓ）、アンチカリン、あるいは腫瘍抗原の自然発生のリガンド、例えば、成長因子、酵素基質、受容体、あるいは結合タンパク質が挙げられる。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、標的細胞および／または標的抗原に結合する非タンパク質化合物を含み、限定されないが、炭水化物、脂質、核酸、あるいは小分子を含む。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、特定の細胞および／または抗原に標的化された設計アンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）である。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）抗原に選択的に結合するＤＡＲＰｉｎである。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）抗原に特異的に結合するＤＡＲＰｉｎである。いくつかの例では、ＨＥＲ−２（ｅｒｂ−２）に標的化されたＤＡＲＰｉｎは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む。
【０１１６】
いくつかの例では、標的細胞は、限定されないが癌を含む疾状に関連した細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は腫瘍細胞である。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原または腫瘍関連抗原に結合することができる。いくつかの例において、標的抗原は腫瘍抗原である。いくつかの例では、腫瘍抗原がタンパク質性である場合、８つ以上のアミノ酸〜完全なタンパク質の配列である。いくつかの例では、腫瘍抗原は、ＭＨＣ複合体で表される完全長のタンパク質の少なくとも１つの抗原フラグメントを含む、８〜完全長のタンパク質の間の任意の数のアミノ酸である。腫瘍抗原の例としては、限定されないが、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、神経膠腫関連抗原、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、サバイビン  およびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ならびにメソテリンが挙げられる。いくつかの例では、腫瘍抗原はＨＥＲ−２抗原である。いくつかの例では、ＨＥＲ−２の特定のリガンドは、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、ネラチニブ、トラスツズマブ  エムタンシン、Ｇａｎｃｏｔａｍａｂ、マルゲツキシマブ、Ｔｉｍｉｇｕｔｕｚｕｍａｂ、およびエルツマキソマブから選択される抗体の抗原結合ドメインを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、Ｔｒｉ−ＴＡＣは、共受容体刺激と組み合わせてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を動員する。いくつかの例では、ＴＡＣは、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドは、ＴＣＲのタンパク質に直接あるいは間接的に結合する物質を含む。ＴＣＲに関連するタンパク質としては、限定されないが、ＴＣＲアルファ（α）鎖、ＴＣＲベータ（β）鎖、ＴＣＲガンマ（γ）鎖、ＴＣＲデルタ（δ）鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドは、ＴＣＲアルファ（α）鎖、ＴＣＲベータ（β）鎖、ＴＣＲガンマ（γ）鎖、ＴＣＲデルタ（δ）鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および／またはＣＤ３ε鎖に対する抗体である。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＣＤ３に結合する抗体またはそのフラグメントである。ＣＤ３抗体の例としては、限定されないが、ムロモナブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、およびビジリズマブが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３に結合する抗体は、単鎖抗体、例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの例では、ＣＤ３に結合するリガンドはＵＣＨＴ１である。いくつかの例では、ＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、ＵＣＨＴ１リガンドはマウスリガンドである。いくつかの例では、マウスＵＣＨＴ１リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４を含む。いくつかの例では、マウスＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するマウスＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、ヒトＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するヒト化されたＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７および１８を含むＣＤ４の共受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８αである。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ５である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ９である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ５である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ２２である。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共刺激物の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＩＣＯＳである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２７である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２８である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物は４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＯＸ４０（ＣＤ１３４）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ３０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ４０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はリンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ７である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＬＩＧＨＴである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＮＫＧ２Ｃである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＢ７−Ｈ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共阻害剤の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＰＤ−１である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＴＩＭ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＬＡＧ−３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＴＩＧＩＴである。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＢＴＬＡである。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＣＤ１６０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＣＤ３７である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体または共刺激物タンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメインの両方を含む。いくつかの例では、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインは、同じ共受容体あるいは共刺激物に由来するか、または異なる共受容体あるいは共刺激物に由来する。いくつかの例では、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインは、リンカーによって随意に結合される。いくつかの実施形態において、ＴＡＣは、直接あるいは間接的に作用してＴ細胞を標的化または活性化する他のポリペプチドをさらに含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、少なくとも１つのリンカーによって結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは直接融合されて、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは直接融合されて、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜４のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜１５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜１０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜６のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３０〜４０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３２〜３６のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは５〜３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは２０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは２５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの例では、ＴＡＣにおいて使用されるリンカーの他の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１５、１６、１９、および２０に対応するペプチド、ならびにそれらの変異体およびフラグメントである。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４共受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、ＣＤ３に結合する単鎖抗体に融合される。いくつかの例では、ＴＡＣはＣＤ３分子およびＴＣＲを脂質ラフトの領域へと導き、ＬｃｋをＴＣＲの近接に移動させ、これは、天然のＭＨＣ結合に類似する。いくつかの例では、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）を生成するために、設計アンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）は、ＣＤ４−ＵＣＨＴ１キメラに連結される。
【０１２１】
処置される癌は、腫瘍性疾患のあらゆる形態を含む。処置される癌の例としては、限定されないが、乳癌、肺癌、および白血病、例えば、混合型白血病（ＭＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）が挙げられる。他の癌は、細胞腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、血液癌、リンパ性腫瘍、良性腫瘍と悪性腫瘍、悪性病変を含む。癌は、非固形腫瘍あるいは固形腫瘍を含み得る。処置される癌は、血管新生化されていないか、あるいは実質的にまだ血管新生化されていない腫瘍、ならびに血管新生腫瘍を含む。いくつかの例では、癌は固形癌であるか、あるいは固形腫瘍を含む。いくつかの例では、癌は液性癌であるか、あるいは液性腫瘍を含む。いくつかの例において、癌は、肺癌、乳癌、結腸癌、多発性骨髄腫、膠芽腫、胃の癌腫、卵巣癌、胃の癌腫、大腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、または黒色腫である。いくつかの例において、癌は肺癌である。いくつかの例において、癌は乳癌である。いくつかの例において、癌は結腸癌である。いくつかの例において、癌は多発性骨髄腫である。いくつかの例において、癌は膠芽腫である。いくつかの例において、癌は胃の癌腫である。いくつかの例において、癌は卵巣癌である。いくつかの例において、癌は胃癌である。いくつかの例において、癌は大腸癌である。いくつかの例において、癌は尿路上皮癌である。いくつかの例において、癌は子宮内膜癌である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、個体においてＢＣＭＡ抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、抗−ＢＣＭＡのＴ細胞−抗原カプラ（抗−ＢＣＭＡのＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＢＣＭＡ抗原を選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するマウスのＵＣＨＴ１（ｍｕＵＣＨＴ１）リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６との、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｍｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリペプチド配列のパーセント配列同一性は、Ｙ１８２Ｔ突然変異以外のアミノ酸を指す。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、個体においてＢＣＭＡ抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書にさらに開示され、上記方法は、抗−ＢＣＭＡのＴ細胞−抗原カプラ（抗−ＢＣＭＡのＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＢＣＭＡ抗原を選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヒト化ＵＣＨＴ１（ｈｕＵＣＨＴ１）リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、個体においてＢＣＭＡ抗原を発現する癌を処置する方法が本明細書にさらに開示され、上記方法は、抗−ＢＣＭＡのＴ細胞−抗原カプラ（抗−ＢＣＭＡのＴｒｉ−ＴＡＣ）をコードする核酸配列を含む、操作されたＴ細胞を個体に投与する工程を含み、上記核酸配列は：（ａ）ＢＣＭＡ抗原を選択的に結合するリガンドをコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に関連するタンパク質を結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するヒト化ＵＣＨＴ１（ｈｕＵＣＨＴ１）リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列と；（ｃ）ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド配列と、を含む。いくつかの例において、リガンドは標的抗原に特異的に結合する。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１１リガンドをコードする第２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８との、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するｈｕＵＣＨＴ１リガンドをコードする第２のポリペプチド配列のパーセント配列同一性は、Ｙ１７７Ｔ突然変異以外のアミノ酸を指す。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、標的抗原に選択的に結合するリガンド（あるいは、標的特異的リガンド）は、Ｔ細胞−抗原カプラ（ＴＡＣ）を標的細胞に向ける。いくつかの例では、標的特異的リガンドは抗原結合ドメインと呼ばれる。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、標的細胞に直接あるいは間接的に結合する任意の物質を指す。いくつかの実施形態において、標的特異的リガンドは、標的細胞上の抗原（免疫応答を誘発することができる細胞によって産生されたタンパク質）に結合する。いくつかの例では、標的特異的リガンドとしては、限定されないが、抗体およびそのフラグメント、例えば、標的細胞および／または抗原に結合する、単鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）、単一ドメイン抗体、ペプチド、ペプチド模倣薬、タンパク質、糖タンパク質あるいはプロテオグリカンなどの単鎖抗体が挙げられる。いくつかの例では、標的特異的リガンドとしては、限定されないが、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）、レクチン、ノッチン、セントリリン（ｃｅｎｔｒｙｒｉｎｓ）、アンチカリン、あるいは腫瘍抗原の自然発生のリガンド、例えば、成長因子、酵素基質、受容体、あるいは結合タンパク質が挙げられる。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、標的細胞および／または標的抗原に結合する非タンパク質化合物を含み、限定されないが、炭水化物、脂質、核酸、あるいは小分子を含む。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、特定の細胞および／または抗原に標的化された設計アンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）である。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、特定の細胞および／または抗原に標的化された単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの例では、標的特異的リガンドは選択的にＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖである。いくつかの例では、標的特異的リガンドは特異的にＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖである。いくつかの例では、ＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２を含む。
【０１２６】
いくつかの例では、標的細胞は、限定されないが癌を含む疾状に関連した細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は腫瘍細胞である。いくつかの例では、標的特異的リガンドは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原または腫瘍関連抗原に結合することができる。いくつかの例において、標的抗原は腫瘍抗原である。いくつかの例では、腫瘍抗原がタンパク質性である場合、８つ以上のアミノ酸〜完全なタンパク質の配列である。いくつかの例では、腫瘍抗原は、ＭＨＣ複合体で表される完全長のタンパク質の少なくとも１つの抗原フラグメントを含む、８〜完全長のタンパク質の間の任意の数のアミノ酸である。腫瘍抗原の例としては、限定されないが、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、神経膠腫関連抗原、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、サバイビン  およびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ならびにメソテリンが挙げられる。場合によっては、腫瘍抗原はＢＣＭＡ抗原である。いくつかの例では、ＢＣＭＡ特異的リガンドは、Ｂｅｌａｎｔａｍａｂ  ｍａｆｏｄｏｔｉｎおよびＧＳＫ２８５７９１６から選択される抗体の抗原結合ドメインを含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、ＴＡＣは、共受容体刺激と組み合わせてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を動員する。いくつかの例では、ＴＡＣは、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドは、ＴＣＲのタンパク質に直接あるいは間接的に結合する物質を含む。ＴＣＲに関連するタンパク質としては、限定されないが、ＴＣＲアルファ（α）鎖、ＴＣＲベータ（β）鎖、ＴＣＲガンマ（γ）鎖、ＴＣＲデルタ（δ）鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するリガンドは、ＴＣＲアルファ（α）鎖、ＴＣＲベータ（β）鎖、ＴＣＲガンマ（γ）鎖、ＴＣＲデルタ（δ）鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および／またはＣＤ３ε鎖に対する抗体である。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質はＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＣＤ３に結合する抗体またはそのフラグメントである。ＣＤ３抗体の例としては、限定されないが、ムロモナブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、およびビジリズマブが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３に結合する抗体は、単鎖抗体、例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの例では、ＣＤ３に結合するリガンドはＵＣＨＴ１である。いくつかの例では、ＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、ＵＣＨＴ１リガンドはマウスリガンドである。いくつかの例では、マウスＵＣＨＴ１リガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４を含む。いくつかの例では、マウスＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、Ｙ１８２Ｔ突然変異を有するマウスＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、ヒトＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。いくつかの例では、Ｙ１７７Ｔ突然変異を有するヒト化されたＵＣＨＴ１リガンドはＣＤ３εに結合する。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ４である。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７および１８を含むＣＤ４の共受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ８αである。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ５である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ９である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ５である。いくつかの例では、ＴＣＲ共受容体はＣＤ２２である。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共刺激物の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＩＣＯＳである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２７である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２８である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物は４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＯＸ４０（ＣＤ１３４）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ３０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ４０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はリンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ２である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ７である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＬＩＧＨＴである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＮＫＧ２Ｃである。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＢ７−Ｈ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共刺激物はＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。いくつかの例では、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共阻害剤の膜貫通ドメインおよび／またはサイトゾルドメインを含む。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＰＤ−１である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＴＩＭ３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＬＡＧ−３である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＴＩＧＩＴである。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＢＴＬＡである。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＣＤ１６０である。いくつかの例では、ＴＣＲ共阻害剤はＣＤ３７である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＴＣＲ共受容体または共刺激物タンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメインの両方を含む。いくつかの例では、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインは、同じ共受容体あるいは共刺激物に由来するか、または異なる共受容体あるいは共刺激物に由来する。いくつかの例では、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインは、リンカーによって随意に結合される。いくつかの実施形態において、ＴＡＣは、直接あるいは間接的に作用してＴ細胞を標的化または活性化する他のポリペプチドをさらに含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、直接融合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドは、少なくとも１つのリンカーによって結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは直接融合されて、リンカーによって第３のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは直接融合されて、リンカーによって第１のポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜４のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜１５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜１０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１〜６のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３０〜４０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３２〜３６のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは５〜３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは２０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは２５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーはＧ４Ｓ３リンカーを含む。いくつかの例では、ＴＡＣにおいて使用されるリンカーの他の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１２、１５、１６、１９、および２０に対応するペプチド、ならびにそれらの変異体およびフラグメントである。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４共受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、ＣＤ３に結合する単鎖抗体に融合される。いくつかの例では、三官能性Ｔ細胞−抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）を生成するために、設計アンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）は、ＣＤ４−ＵＣＨＴ１キメラに連結される。いくつかの例では、Ｔｒｉ−ＴＡＣはＣＤ３分子およびＴＣＲを脂質ラフトの領域へと導き、ＬｃｋをＴＣＲの近接に移動させ、これは、天然のＭＨＣ結合に類似する。
【０１３１】
処置される癌は、腫瘍性疾患のあらゆる形態を含む。処置される癌の例としては、限定されないが、乳癌、肺癌、および白血病、例えば、混合型白血病（ＭＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）が挙げられる。他の癌は、細胞腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、血液癌、リンパ性腫瘍、良性腫瘍と悪性腫瘍、悪性病変を含む。癌は、非固形腫瘍あるいは固形腫瘍を含み得る。処置される癌は、血管新生化されていないか、あるいは実質的にまだ血管新生化されていない腫瘍、ならびに血管新生腫瘍を含む。いくつかの例では、癌は固形癌であるか、あるいは固形腫瘍を含む。いくつかの例では、癌は液性癌であるか、あるいは液性腫瘍を含む。いくつかの例において、癌は黒色腫である。
【０１３２】
【表１】
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【実施例】
【０１３３】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられ、いかなる方法でも本発明を制限するようには意図されていない。本明細書に記載される方法とともに、本実施例は、好ましい実施形態の代表例であり、かつ典型的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして意図されない。請求の範囲によって定義される本発明の趣旨に包含される変化および他の用途が、当業者に想定される。
【０１３４】
実施例１．Ｔｒｉ−ＴＡＣ技術の特徴づけ
【０１３５】
Ｔｒｉ−ＴＡＣ技術の概要を図１Ａ−図１Ｃに提供する。
【０１３６】
図１Ａは、様々な受容体とその関連タンパク質パートナーの結合（ｃｏ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）に基づく、ＣＤ８  Ｔ細胞活性化の例を示す。最初に、主要組織適合遺伝子複合体Ｉは抗原（螺旋）を示している。これは、抗原に結合可能なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体により認識される。ＴＣＲ複合体には、様々な個別のサブユニットが含まれている。α／βドメインは、ＭＨＣ−Ｉ上で示された抗原と直接相互作用できる。その後、α／βドメインは、様々な他のドメイン（ε、γ、δ、およびζ）と相互に作用し、そのすべてが、様々な細胞内の活性化ドメインを介してＴ細胞活性化に関与する。ＴＣＲ複合体は、ＣＤ８共受容体と同時にＭＨＣ−Ｉと相互作用する。ＣＤ８共受容体は、抗原に依存しない様式でＭＨＣ−Ｉに結合する。ＣＤ８は、ＴＣＲ受容体複合体の活性化に重要なプロテインキナーゼであるＬｃｋと直接相互作用する。ＣＤ８とＬｃｋとの相互作用はまた、脂質ラフト（膜部分）微小ドメインとの会合を確実なものとし、前記微小ドメインは、他の関連シグナル伝達部分（暗い球体）を構造化・封入すると仮定されている。その後、後期段階の活性化によりＣＤ２８が動員される。この相互作用カスケードが並行して数回現われる場合、Ｔ細胞は活性化され、その細胞毒性が発揮されかねない。
【０１３７】
図１Ｂは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の概要を提供する。ＣＡＲは、合成的に操作された単一分子中の、ζおよびＣＤ２８などの様々な主要な活性化ドメインを組み合わせることにより、Ｔ細胞活性化の複雑な機構を再生しようする。その後、ＣＡＲは、特異的結合ドメインを使用して、選択した抗原と直接相互作用する。本明細書ではアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を表す。並行して現われるそのような様々な相互作用はＴ細胞活性化を引き起こすと考えられている。
【０１３８】
図１Ｃは、自然な活性化プロセスを模倣するＴｒｉ−ＴＡＣ技術の概要である。Ｔｒｉ−ＴＡＣは、ＴＣＲを介して自然なシグナル伝達を上手く反復するよう発達され、一方でＭＨＣの無制限の標的化を保持する。Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲによるＭＨＣのライゲーション後に生じ、Ｔ細胞（ＣＤ４またはＣＤ８のいずれか）の共受容体は、同時にＭＨＣ分子内の保存領域に結合する。共受容体は特異的に、ＴＣＲシグナル複合体形成に特に重要な膜微小ドメインである「脂質ラフト」内にある。ＴＣＲ活性化複合体の正確な微小ドメイン局在化の確保に加えて、これら共受容体はまた、Ｔ細胞活性化に重要なプロテインキナーゼであるＬｃｋに直接結合する。前述のように、従来のキメラ受容体も二官能性タンパク質も、共受容体分子やＬｃｋに結合しない。脂質ラフトに局在化し、かつＬｃｋに結合する、ＣＤ４共受容体の膜貫通領域と細胞内領域がそれぞれ、ＣＤ３（ＵＣＨＴ１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４）に結合する単鎖抗体に縮合された場合に、分子が作成された。この構築物は、Ｔｒｉ−ＴＡＣはＣＤ３分子およびＴＣＲを脂質ラフトの領域へと導き、ＬｃｋをＴＣＲの近傍に移動させるように設計され、これは、天然のＭＨＣ結合に類似する。この受容体を標的とするために、設計アンキリンリピート（ＤＡＲＰｉｎ）は、ＣＤ４−ＵＣＨＴ１キメラに連結されることで、三官能性Ｔ細胞抗原カプラ（Ｔｒｉ−ＴＡＣ）を生成する。この例において、ＤＡＲＰｉｎはプロトオンコジーン、ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）に特異的であった。
【０１３９】
多数の分類のリガンド結合ドメインを、Ｔｒｉ−ＴＡＣ分子に組み込むことができる（図２Ａ）。この実施例は、Ｔｒｉ−ＴＡＣが、ＨＥＲ−２に特異的なＤＡＲＰｉｎ（図２Ｂ）またはＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ（図２Ｃ）を持つことを例示している。
【０１４０】
図３は、ＨＥＲ−２に特異的なＤＡＲＰｉｎを持つＴｒｉ−ＴＡＣの機能を例示する。ヒトＴ細胞を操作して、本明細書に開示されるようなＴｒｉ−ＴＡＣ、または同じＤＡＲＰｉｎを持つ従来のＣＡＲのいずれかを発現させた。判定されたところでは、全ての態様において、Ｔｒｉ−ＴＡＣで操作されたＴ細胞は、従来のＣＡＲと少なくとも同等の機能を実証した。興味深いことに、２つのパラメータ（ＴＮＦ−α産生とＣＤ１０７ａ動員）に関して観察されたところでは、Ｔｒｉ−ＴＡＣは一部の状況下で従来のＣＡＲよりも活性であった。
【０１４１】
図３のＡは、抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  ＣＡＲと比較された抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣの表面発現、および対照Ｔ細胞を示す。キメラ受容体を、組換えＨＥＲ−２でのインキュベーションにより検出した。抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣを、操作したＴ細胞表面上で十分に発現させた。しかし、その最大表面発現は、抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  ＣＡＲ構築物に比べて低かった。図３のＢは、操作されたＴ細胞培養物の成長を示す。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８のダイナビーズにより活性化され、Ｔｒｉ−ＴＡＣまたはＣＡＲをコードする、または受容体をコードしない（対照）レンチウイルスにより操作された。２週間後、ＣＡＲと対照培養物は同様の数にまで成長したが、Ｔｒｉ−ＴＡＣ培養物はわずかにゆっくりと成長した。
【０１４２】
図４は、Ｔｒｉ−ＴＡＣ機能に対するリガンド結合ドメインとＵＣＨＴ１  ＣＤ３結合ドメインの両方の重要性を確かにする、データを提供する。ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎを有する完全長のＴｒｉ−ＴＡＣ（図４のＡ、下部の列）、ＤＡＲＰｉｎを欠くＴｒｉ−ＴＡＣ変異体（図４のＡ、上部の列）、またはＵＣＨＴ１を欠くＴｒｉ−ＴＡＣ変異体（図４のＡ、中央の列）により、Ｔ細胞を操作した。３つすべての操作されたＴ細胞集団を、ＨＥＲ−２陽性の腫瘍細胞により刺激した。完全長のＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞は、刺激後にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生できた一方、変異体は刺激後にどのサイトカインも産生できなかった。３つのＴ細胞集団も、４：１のエフェクター：標的において、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞（ＨＥＲ−２発現）またはＤ２Ｆ２細胞（ＨＥＲ−２陰性）と共に培養した（図４のＢ）。完全長のＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞は、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２細胞に対する強固な死滅を実証したが、Ｄ２Ｆ２細胞を死滅させなかった。ＤＡＲＰｉｎまたはＵＣＨＴ１を欠く、他のＴｒｉ−ＴＡＣ変異体は、死滅を示さなかった。
【０１４３】
図５は、ＬｃｋとＴｒｉ−ＴＡＣとの相互作用を例示する。図５のＡにおいて、２９３ＴＭ細胞を操作して、Ｌｃｋと相互作用するサイトゾルドメインを欠いた、完全長のＴｒｉ−ＴＡＣまたはＴｒｉ−ＴＡＣ変異体のいずれかと組み合わせて、Ｌｃｋを発現させた。Ｔｒｉ−ＴＡＣ受容体を、組換えＨＥＲ−２タンパク質を有するビーズで免疫沈殿させた。沈降したＴｒｉ−ＴＡＣを、ｍｙｃタグに対する抗体を用いたウェスタンブロットにより測定した。共沈降したＬｃｋを、Ｌｃｋに対する抗体を用いたウェスタンブロットにより同定した。β−アクチンはプルダウンされず、上清（Ｓ）中で検出されただけであった。完全長のＴｒｉ−ＴＡＣと、サイトゾルドメインを欠いたＴｒｉ−ＴＡＣとの両方が、効率的にプルダウンされ、結合分画（Ｂ）中で検出された。ベクター対照、およびサイトゾルドメインの無いＴＡＣは、同レベルのバックグラウンドＬｃｋシグナルを示す。大量のＬｃｋを、対照に比べて完全長のＴｒｉ−ＴＡＣと同時に免疫沈降させた。図５のＢは、結合分画中で検出されたＬｃｋのデンシトメトリー解析を示す。シグナルを陰性対照に対して調整した。このデータが裏付けるものは、Ｌｃｋが完全長のＴｒｉ−ＴＡＣと相互作用可能であるということである。
【０１４４】
図６は、ベクター対照（ＮＧＦＲ）、抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  ＣＡＲ、または抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣによりマウスを処置した結果を示す。異種移植片マウスモデルを使用した。ＯＶＣＡＲ−３腫瘍細胞をマウスに皮下投与し、腫瘍が１００−２００ｍｍ３のサイズに達するまで成長させた。その後、操作されたＴ細胞を静脈内投与した。図６のＡは、処置日における腫瘍サイズまで標準化された相対的な腫瘍進行を示す。抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞は、腫瘍体積の急速な減少を引き起こし、対照には効果がなく、ＣＡＲ細胞は腫瘍成長を遅くし、腫瘍サイズの減少の遅延を示す。図６のＢは、Ｔ細胞注入後の体重の相対的な変化を用いて、動物の相対的な健康がモニタリングされたことを例示する。対照と、抗−ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣで操作された細胞の両方は、処置後のマウスの体重に有意な変化はなかったことを示す。対照的に、抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  ＣＡＲで処置したマウスは、重度の毒性を示す、著しい体重損失を示す。
【０１４５】
考察
ＭＨＣに依存しない様式で特異的な標的へとＴ細胞を再配向するべくキメラ受容体を使用することは、癌を処置するための新規な方法であり、病原体の抗原が細胞膜に見出される感染症に適用可能であり得る。キメラ受容体は結果として（１）標的細胞に対する特異的な細胞毒性、および（２）最小のオフターゲット毒性をもたらす。従来のＣＡＲはこの点に関して限定的なものであり、なぜならば、従来のＣＡＲは、適切な調整を受けないことから特異的な活性の細胞調節が減少される不自然な位置にシグナル伝達ドメインが存在する、合成構造に依存するからである。
【０１４６】
Ｔｒｉ−ＴＡＣは、シグナル伝達ドメインの異所性の局在化を利用することなく、自然なＴＣＲのシグナル伝達成分を再配向するよう設計された。Ｔｒｉ−ＴＡＣは、以下の原理を用いて設計された：（１）キメラ受容体は、主要な活性化タンパク質複合体の正しく並べられたアセンブリに相互作用し、かつそれを容易にせねばならない、（２）キメラ受容体は、微小ドメイン環境など、既存の細胞順応を利用せねばならない、および（３）キメラ受容体はあらゆる活性化ドメインを有してはならない。Ｔｒｉ−ＴＡＣは、これを効率的に達成することができ、データにより実証されるところでは、活性化の速度は、第二世代ＣＡＲより優れているとは言わないまでも、それに等しい。
【０１４７】
Ｔｒｉ−ＴＡＣは、Ｔ細胞活性化をさらに細かく調整するべく付加的に設計された共受容体をさらに統合するのに適している。Ｔｒｉ−ＴＡＣは、既存のＣＡＲよりも低い毒性を提示すると考えられる。抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  ＣＡＲは、細胞と標的との大きな比率において軽度のオフターゲット死滅を示し、このことは、治療での使用時に問題となりかねない。しかし、従来のＣＡＲと同じ機能である、抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣは、オフターゲット効果を表示しなかった。ＤＡＲＰｉｎは高親和性で標的に結合するので、オフターゲット効果は、ＤＡＲＰｉｎを利用する高レベルのキメラ受容体を発現する細胞上ではかなり一般的となり得る。それゆえ、理論により縛られるものではないが、Ｔｒｉ−ＴＡＣの低表面発現は、そのようなオフターゲット効果の可能性を減らすことから効果的であり得る。
【０１４８】
Ｔｒｉ−ＴＡＣ技術のモジュラー性質は、Ｔ細胞活性化プロセスの微調整を可能にする。例えば、ＴＣＲ複合体の動員は、低いＣＤ３親和性によりＴｒｉ−ＴＡＣ分子を操作することにより調節される。これは、自然の低ＴＣＲ親和性を模倣する一方、癌標的を検出するための高親和性標的ドメインを保持する。古典的なＣＡＲとは異なり、Ｔｒｉ−ＴＡＣ技術は、自然の低ＴＣＲ親和性とよく似せるために操作される。
【０１４９】
示されたＴｒｉ−ＴＡＣ技術は非常に効率的な分子ツールであり、（１Ｔ細胞活性化および細胞毒性を効率的に誘発可能であり、（２）自然のＴ細胞活性化の模倣によりこれを実行可能であり、および（３）それ自体の活性化ドメインを必要としない。
【０１５０】
実施例２．ＵＣＨＴ１の突然変異はＴｒｉ−ＴＡＣ機能に影響を及ぼす
【０１５１】
図７Ａ〜７Ｃは、ＣＤ３に結合すると予測される部位でＵＣＨＴ１配列がランダムに変異誘発されたＴｒｉ−ＴＡＣ変異体のライブラリと比較した、野生型抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣを示す。ライブラリを構築するために、ＵＣＨＴ１とＣＤ３イプシロンの結合表面上に見出されるＵＣＨＴ１内の２４のアミノ酸をランダムに変位誘発させ、これにより、理論数として４８０の固有のクローンをもたらした。図７Ａは、突然変異体ライブラリの概略図を示す。表面発現の解析により、突然変異体Ｔｒｉ−ＴＡＣが、本来のＴｒｉ−ＴＡＣよりも高レベルで発現されたことが明らかとなった（図７Ｂ）。本来のＴｒｉ−ＴＡＣまたは突然変異体ライブラリにより操作されたＴ細胞を、機能について試験した。突然変異体ライブラリにより操作されたＴ細胞は機能を保持し、Ｔｒｉ−ＴＡＣ機能を保持するＵＣＨＴ１突然変異体の存在が示された（図７Ｃ）。
【０１５２】
図８Ａ〜Ｃは、ライブラリから選択されたＵＣＨＴ１突然変異体を有するＴｒｉ−ＴＡＣの表面発現の増強を示す。Ｔｒｉ−ＴＡＣライブラリにより操作されたＴ細胞を、Ｔｒｉ−ＴＡＣがＴ細胞を刺激する能力に対して選択されたスクリーンにさらした。選択されたライブラリから配列をランダムに選択することで突然変異体、ＵＣＨＴをもたらし、そこでは、Ａ８５がＶと置き換えられ、Ｔ１６１がＰと置き換えられる（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２４）。Ｔ細胞は、本来の抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｒｉ−ＴＡＣ、またはＡ８５ＶとＴ１６１Ｐの突然変異を伴うＵＣＨＴ１を有する変異体のいずれかにより操作された。注目されたことは、本来のＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞培養物が、対照Ｔ細胞に対してＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大に向けて偏向されたことであった。Ａ８５Ｖにより操作されたＴ細胞、Ｔ１６１Ｐ突然変異体Ｔｒｉ−ＴＡＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞拡大への偏向を明らかにしなかった（図８Ａ）。表面発現の比較により、Ａ８５Ｖを有するＴｒｉ−ＴＡＣ、Ｔ１６１Ｐ突然変異体Ｔｒｉ−ＴＡＣが、本来のＴｒｉ−ＴＡＣに比べて高いレベルのＴ細胞の表面上で発現されたことが明らかになった（図８Ｂ）。機能に関して、Ａ８５Ｖにより操作されたＴ細胞、Ｔ１６１Ｐ突然変異体Ｔｒｉ−ＴＡＣは、低レベルのサイトカインを産生し、ＨＥＲ−２での刺激後に脱顆粒が減少した。これらの結果が実証するところによると、ＵＣＨＴ１の突然変異は、Ｔｒｉ−ＴＡＣ機能の多数の態様に影響を及ぼすことができる。
【０１５３】
図９において、７つの追加の点突然変異を検査した。突然変異体のうち４つ（Ｔ１６１Ｒ、Ｔ１７８Ｒ、Ｎ１８０Ｒ、およびＮ１８０Ｇ）は結果として、Ｔｒｉ−ＴＡＣの表面発現の増強をもたらした（図９Ａ）。様々な突然変異体を、Ａ５４９またはＳＫＯＶ−３細胞のいずれかでの刺激後、機能に関して検査した。Ｔ１７８Ｐを除くすべての突然変異体は、サイトカイン産生の重度の損失を実証し（図９Ｂ）、どの突然変異体も、ＨＥＲ−２陽性の標的細胞に対する細胞毒性を実証しなかった（図９Ｃ）。これらの結果は、個々の突然変異が完全にＴｒｉ−ＴＡＣ機能を抑制可能であることを例証する。
【０１５４】
図１０は、ランダムに変異誘発されたライブラリの選択後の特異的なアミノ酸の富化のための解析の結果を示す。富化は、選択後のＵＣＨＴ１ライブラリの配列を、（ｉ）図７Ａ−Ｃに記載される本来のライブラリ、および（ｉｉ）レンチウイルスへのパッケージング後の同じライブラリと比較することにより定められる。選択後に富化された突然変異は、（ｉ）図８Ａ−Ｃに記載される本来のライブラリ（黒い線）；（ｉｉ）レンチウイルスへとパッケージングされたライブラリ（灰色の線）；および（ｉｉｉ）選択後ライブラリ（円）における頻度の比較により判定された。完全な円により示されるように、別個の富化を示した突然変異が、候補と考慮される（図１０）。空円は、少数の読み取りを表した。見出される１つの最も明白な突然変異は、位置８８−９０でのチロシン（Ｙ）のトレオニン（Ｔ）への置き換えであった。
【０１５５】
図１１は、ＵＣＨＴ１およびＵＣＨＴ１の変異体の配列アライメントを示す。ＵＣＨＴ１およびＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）は図１１のＡに示される。ＵＣＨＴ１およびヒト化ＵＣＨＴ１（ｈｕＵＣＨＴ１）の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）は図１１のＢに示される。Ｙ−＞Ｔの突然変異は、ｈｕＵＣＨＴ１中の対応部位に挿入され、ｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）（図１１のＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を産生した。
【０１５６】
Ｙ１８２ＴおよびＹ１７７Ｔの突然変異体は、それらの表面の発現表現型、および他の機能特性、すなわち細胞増殖や細胞毒性に基づいて、インビトロで分析された。
【０１５７】
図１２は、Ｙ−＞Ｔ突然変異を有するＴｒｉ−ＴＡＣ、ＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）またはｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）のいずれかが、それぞれＵＣＨＴ１およびｈｕＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣに比べて高レベルの、操作されたＴ細胞の表面上に発現される。ヒトＰＢＭＣは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により活性化され、レンチウイルス（ＭＯＩ＝１０）により形質導入され、（ｉ）ＮＧＦＲ、（ｉｉ）原型Ｔｒｉ−ＴＡＣ分子、（ｉｉｉ）ＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣ、（ｉｖ）ｈｕＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣ、および（ｖ）ｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣのみを発現する。１４日後、細胞を、ＮＧＦＲ（形質導入マーカー）に対する抗体、ＴＡＣ受容体、およびＴ細胞マーカーＣＤ８とＣＤ４により染色した。ＣＤ８（上部パネル）とＣＤ４（下部パネル）に対して細胞をゲートした（ｇａｔｅｄ）。いずれの場合も、Ｙ１８２Ｔ／Ｙ１７７Ｔ突然変異の存在は、ＴＡＣ受容体の表面発現を改善した。これは多数のドナーを介して観察され、代表的なプロットが示される。
【０１５８】
図１２はまた、ＵＣＨＴ１を運んだ本来のＴｒｉ−ＴＡＣと比較した、ｈｕＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣの表面発現の増強を明らかにし、このことは、ヒト化中にＵＣＨＴ１に組み込まれた突然変異が、表面発現に影響を及ぼした特質を導入したことを示す。
【０１５９】
図１３において実証されるように、ｈｕＵＣＨＴ１、ｍｕＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）、またはｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞は、ＵＣＨＴ１を有する本来のＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞よりも高い範囲にまで拡大した。ヒトＰＢＭＣは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により活性化され、レンチウイルス（ＭＯＩ＝１０）により形質導入され、（ｉ）ＮＧＦＲ、（ｉｉ）原型Ｔｒｉ−ＴＡＣ分子、（ｉｉｉ）ＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣ、（ｉｖ）ｈｕＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣ、および（ｖ）ｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣのみを発現する。成長して１４日後、細胞を数え上げ、ベースラインを超える倍率拡大を判定した。倍率拡大は、ＮＧＦＲレンチウイルス単独により操作された対照細胞の拡大にまで標準化された。２つの異なるドナーの平均を図１３に示す。ＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を持つＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞は、ＵＣＨＴ１を有する本来のＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞よりも高い範囲にまで拡大した。ｈｕＵＣＨＴ１およびｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）を持つＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞は、同じ範囲にまで拡大し、どちらもＵＣＨＴ１を有する本来のＴｒｉ−ＴＡＣよりも高い拡大を表示した。
【０１６０】
再び、ＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣは、対照Ｔ細胞に比べて拡大を損なったことを実証し、ｈｕＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣは、対照に比べて拡大の損失がなかったことを明らかにしたことに、留意されたい。
【０１６１】
図１４は、Ｔｒｉ−ＴＡＣ変異体の細胞毒性を記載する。Ｔ細胞を、本来のＴｒｉ−ＴＡＣ、ｈｕＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣ、およびＹ−＞Ｔ突然変異を持つＵＣＨＴ１変異体を有するＴｒｉ−ＴＡＣにより操作した。すべてのＴｒｉ−ＴＡＣを抗−ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎにより標的とした。細胞毒性を、ＨＥＲ−２陽性の標的（ＳＫＯＶ−３およびＡ５４９）またはＨＥＲ−２陰性の標的ＬＯＸＩＭＶＩを持つ、操作されたＴ細胞のインキュベーションにより評価した。２つの異なるドナーの平均を示す。すべてのＴ細胞集団が同等の細胞毒性を明らかにした。
【０１６２】
図１４におけるように、Ｔ細胞を、ｈｕＵＣＨＴ１を有するＴｒｉ−ＴＡＣ、またはＹ−＞Ｔ突然変異Ｔ突然変異［ｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）］を持つｈｕＵＣＨＴ１変異体を有するＴｒｉ−ＴＡＣにより操作した。両方のＴｒｉ−ＴＡＣを、抗ＨＥＲ−２  ＤＡＲＰｉｎにより標的とした。対照Ｔ細胞を、腫瘍結合ドメインではなくｈｕＵＣＨＴ１（Ｙ１７７Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣにより操作した。Ｔ細胞を使用して、図６に記載されるＯＶＣＡＲ−３異種移植片マウスモデルを処置した。操作されたＴ細胞を静脈内投与し、腫瘍は１００−２００ｍｍ３のサイズに達した。データは、処置日における腫瘍サイズに標準化された相対的な腫瘍進行を示す。図１７（パネルＡ−Ｃ）は、ドナーＡから産生したＴ細胞に対する結果を例示する。図１７（パネルＤ−Ｆ）は、ドナーＢから産生したＴ細胞に対する結果を示す。
【０１６３】
図１５Ａ〜Ｃは、骨髄腫標的であるＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖを有するＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞の、インビトロの特徴づけを示す。Ｔ細胞を、本来のＴｒｉ−ＴＡＣ、またはＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を持つＴｒｉ−ＴＡＣのいずれかにより操作した。Ｔ細胞を、対照レンチウイルス、本来のＴｒｉ−ＴＡＣを発現するレンチウイルス、または、５のＭＯＩにてＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を持つＴｒｉ−ＴＡＣを発現するレンチウイルスにより操作した。Ｔｒｉ−ＴＡＣの細胞表面発現を、後にフローサイトメトリーにより測定される組換えＢＣＭＡ−Ｆｃによる操作された細胞のインキュベーションにより評価した。サイトカイン産生を、ＢＣＭＡ陽性（ＫＭＳ−１１）細胞株またはＢＣＭＡ陰性（ＳＫＯＶ−３）細胞株と共に操作された細胞または対照細胞を共培養することにより評価した。共培養の４時間後、サイトカインの細胞内染色のために細胞を処理し、サイトカイン産生をフローサイトメトリーによって測定した。ＢＣＭＡ陽性（ＫＭＳ−１１）細胞株またはＢＣＭＡ陰性（ＳＫＯＶ−３）細胞株と共に操作された細胞または対照細胞を共培養することにより細胞毒性を評価し、共培養の６時間後に生存率を評価した。前述のように、本来のＴｒｉ−ＴＡＣに比べて高い分画のＴ細胞をＴｒｉ−ＴＡＣ  ＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）により操作し、Ｔｒｉ−ＴＡＣ  ＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）も、本来のＴｒｉ−ＴＡＣより高いレベルで発現させた（図１５Ａ）。より高い発現レベルにもかかわらず、本来のＴｒｉ−ＴＡＣおよびＴｒｉ−ＴＡＣ  ＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）により操作されたＴ細胞は、サイトカイン産生（図１５Ｂ）およびＢＣＭＡを発現する標的（ＫＭＳ−１１；図１５Ｃ）上の細胞毒性に関する同様の機能を実証した。
【０１６４】
図１６は、ＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞の抗腫瘍効果の増強を例示する。図１５Ａ−Ｃにおけるように、Ｔ細胞を、対照レンチウイルス、本来のＴｒｉ−ＴＡＣを発現するレンチウイルス、または、５のＭＯＩにてＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を持つＴｒｉ−ＴＡＣを発現するレンチウイルスにより操作した。多発性骨髄腫腫瘍を、ＫＭＳ−１１細胞株の摂取により免疫不全ＮＲＧマウスに確立させ、増強したホタルルシフェラーゼ（ＫＭＳ−１１ｅｆｆ）を用いて操作した。骨髄腫を確立させて７日後、マウスに、分割投与量の操作されたＴ細胞を４８時間間隔で投与して処置した。マウスは、対照Ｔ細胞、または２つのＢＣＭＡに特異的なＴｒｉ−ＴＡＣ（ＵＣＨＴ１を持つ本来のＴｒｉ−ＴＡＣ、およびＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を持つ変異体Ｔｒｉ−ＴＡＣ）により操作されたＴ細胞の投与を、同じ量で受けた。マウスの腫瘍負荷を、インビボでの生物発光画像化により一定時間ごとにモニタリングした。図中のデータは、生物発光の増加により評価されるような、経時的な腫瘍成長を反映する。腫瘍成長は、処置を受けていないマウスおよび対照Ｔ細胞を受けたマウスに匹敵した。腫瘍成長は最初に、本来のＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞で処置したマウスでは遅くされたが、これらのマウスにおける腫瘍制御は、処置後約２週間で消失した。対照的に、ＵＣＨＴ１（Ｙ１８２Ｔ）を有するＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞は、腫瘍退縮および長期の腫瘍制御を提示した。
【０１６５】
考察
Ｔｒｉ−ＴＡＣを、様々な成分の改質が受容体機能を修飾できる哲学に基づいて設計した。ここで、ＵＣＨＴ１とＣＤ３との間の接触領域の修飾を、ＵＣＨＴ１中の個々のアミノ酸を変異させることにより調べた。まず、実証されたところによると、ＵＣＨＴ１における点突然変異は、受容体の表面発現に影響を及ぼす。大半の突然変異は表面発現を増大させたが、一部の突然変異は表面発現（例えば、Ｔ１６１Ｗ、Ｔ１７８Ｐ）を縮小した。次に、ＵＣＨＴ１への突然変異は、製造プロセス中にＴ細胞の全収率も改善することに留意されたい。最後に、ＵＣＨＴ１への突然変異は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の方へと製造産物の歪みを逆転できたことが分かった。この歪みは、本来のＴｒｉ−ＴＡＣ受容体の一般的な特徴である。
【０１６６】
多くの場合、突然変異は、サイトカイン類ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２の産生だけでなく、細胞毒性の産生をも損ねた。特異的な突然変異（Ｙ１８２Ｔ）が明らかとなり、これにより、受容体の機能を損なうことなく、製造に対し大いに魅力的な特性（Ｔ細胞拡大が損なわれない、ＣＤ４＋Ｔ細胞拡大が抑制されない）を持つＴｒｉ−ＴＡＣが得られる。さらに、Ｔｒｉ−ＴＡＣ（ＵＣＨＴ１  Ｙ１８２Ｔ）により操作されたＴ細胞は、本来のＴｒｉ−ＴＡＣにより操作されたＴ細胞よりも高い抗腫瘍活性を表示した。
【０１６７】
ＵＣＨＴ１（ｈｕＵＣＨＴ１）のヒト化変異体を有するＴｒｉ−ＴＡＣはまた、本来のＴｒｉ−ＴＡＣに比べて増強された製造特性を実証した。これら増強された特徴は、ヒト化に関連付けられるｈｕＵＣＨＴ１の突然変異によるものである。
【０１６８】
総じて、これらのデータにより実証されるものによれば、ＵＣＨＴ１のわずかな突然変異によりＴｒｉ−ＴＡＣの機能に劇的な影響が及ぼされる。今日までのこれらの試験は、腫瘍学的な用途に焦点を置いているが、この考えは、他の用途（例えば、自己免疫、アレルギー）に対するＴｒｉ−ＴＡＣ受容体の使用にも適用される。この場合、本明細書に記載されるものを除く突然変異が、そのような特定用途に相応しい場合がある。
【０１６９】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され、かつ記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。多数の変形、変更、および置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施に利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法と構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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