(57)【要約】本開示は、概して、一塩基多型(SNP)座位を増幅し、標的対立遺伝子の存在または不存を含む、SNPの二つ以上の対立遺伝子バリアントを区別するように構成される分子診断装置に関する。一部の実施形態では、分子診断装置は、細菌感染症の抗生物質治療に対する耐性または感受性と関連するSNPを、ポイントオブケアで検出することができる。他の態様では、本開示は、疾患または障害(例えば、細菌感染)の治療方法を提供し、治療は、かかる分子診断装置により決定されるSNP座位における対立遺伝子の存在または非存在により誘導される。
2021534804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを含む生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュール;
前記ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール;
反応体積およびヒーターを含む増幅モジュールであって、前記反応体積は、前記生物学的試料および前記プライマーセットを含む増幅溶液を受け取るよう構成され、前記ヒーターは、熱エネルギーを前記反応体積に伝達して、前記ポリヌクレオチドを増幅して、前記SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生じさせるよう構成される増幅モジュール;および
前記標的アンプリコンを受け取るように構成された検出モジュールであって、前記SNP座位が別の対立遺伝子を含む場合、前記標的アンプリコンの前記SNP座位への結合を最小にしながら、前記SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、前記標的アンプリコンの前記SNP座位に結合するように設計されたプローブを含む、検出モジュールを含む、分子診断装置。
【請求項２】
前記プライマーセットが、前記SNP座位に隣接するように設計される、請求項1に記載の分子診断装置。
【請求項３】
前記プライマーセットが隣接する標的領域の長さが、約60〜約140塩基対である、請求項2に記載の分子診断装置。
【請求項４】
前記プライマーセットが隣接する標的領域の長さが、約80〜約120塩基対である、請求項3に記載の分子診断装置。
【請求項５】
前記標的アンプリコンが、最小の二次構造を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項６】
SNP座位を標的とするように設計された前記プライマーセットが、
i)アンチセンス鎖上の前記標的領域の5’末端における上流プライマー結合部位に実質的に相補的な上流オリゴヌクレオチドプライマー;および
ii)センス鎖上の前記標的領域の3’末端における下流プライマー結合部位に実質的に相補的な下流オリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項７】
前記分子診断装置が、前記検出モジュールの温度を、第一のプローブの融解温度よりも約5℃、約10℃、または約15℃低い温度で維持するように構成された温度コントローラを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項８】
前記検出モジュールが、前記検出モジュールについて予め決定された温度を維持するように構成された温度コントローラを備え、前記第一のプローブが、前記予め決定された温度より約5℃、約10℃、または約15℃低い融解温度を有するように設計される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項９】
前記プローブが、前記SNP座位を含むプローブ結合部位に実質的に相補的であり、前記標的対立遺伝子と一致したヌクレオチドを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項１０】
前記プローブが、前記プローブ結合部位に対して最大二つのヌクレオチドミスマッチを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項１１】
前記プローブが、前記プローブ結合部位に対して完全に相補的である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項１２】
前記プローブが、前記SNP座位を標的とするように設計された前記プライマーセットと重複しない、請求項1〜11のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項１３】
前記検出モジュールが、第二のプローブ結合部位に実質的に相補的な第二のプローブを含み、前記第二のプローブ結合部位が、前記SNP座位を含まない、請求項1〜12のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項１４】
前記第二のプローブ結合部位が、前記第一のプローブの前記結合部位と重複しない、請求項13に記載の分子診断装置。
【請求項１５】
前記検出モジュールが、前記標的アンプリコン内の第二のプローブ結合部位に実質的に相補的な第二のプローブを含み、前記第二のプローブ結合部位が、前記第一のプローブの前記結合部位と重複しない、請求項1〜12のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項１６】
前記標的対立遺伝子が、薬物耐性対立遺伝子である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項１７】
前記分子診断装置が、前記生物学的試料中の前記薬物耐性対立遺伝子を特異的に検出する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項１８】
前記対立遺伝子が、薬物感受性対立遺伝子である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項１９】
前記分子診断装置が、前記生物学的試料中の前記薬物耐性対立遺伝子を特異的に検出する、請求項1〜15または請求項18のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項２０】
前記SNP座位が、gyrA領域内にある、請求項1〜19のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項２１】
前記プライマーセットが、前記gyrA91座位に隣接するように設計される、請求項1〜20のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項２２】
前記プライマーセットが隣接する前記gyrA領域の長さが、約60〜約140塩基対である、請求項21に記載の分子診断装置。
【請求項２３】
前記プライマーセットが隣接する前記gyrA領域の長さが、約80〜約120塩基対である、請求項22に記載の分子診断装置。
【請求項２４】
前記プライマーセットが隣接する前記gyrA領域の長さが、二次構造を含む、請求項21〜23のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項２５】
前記第一のプローブが、薬物耐性を付与するgyrA Ser-91部位での他のSNPへの結合を最小にしながら、野生型のシプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型への結合を最大化するように設計される、請求項1〜24のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項２６】
前記第一のプローブが、gyrA Ser-91をコードするコドンを含む第一のプローブ結合部位に実質的に相補的であり、前記第一のプローブが、シプロフロキサシン感受性gyrASer-91遺伝子型をコードする対立遺伝子に一致するヌクレオチドを含む、請求項1〜25のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項２７】
前記第一のプローブが、前記シプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型をコードする対立遺伝子と、シプロフロキサシンに対する耐性を付与するgyrA Phe-91部位をコードする抗対立遺伝子とを識別する、請求項1〜26のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項２８】
前記第一のプローブが、約52℃の熱力学的支点および／または融解温度により特徴付けられる、請求項1〜27のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項２９】
前記第一のプローブが、12〜25ヌクレオチドを含む、請求項1〜28のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項３０】
前記第一のプローブが、18〜22ヌクレオチドを含む、請求項29に記載の分子診断装置。
【請求項３１】
前記第一のプローブが、50℃〜60℃の融解温度を有する、請求項1〜30のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項３２】
前記第一のプローブが、配列番号14〜20のいずれか一つから選択される配列を含む、本質的にからなる、またはからなる、請求項1〜31のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項３３】
前記第二のプローブが、12〜25ヌクレオチドを含む、請求項1〜32のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項３４】
前記第二のプローブが、50℃〜60℃の融解温度を有する、請求項1〜33のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項３５】
前記第二のプローブが、配列番号6または22のいずれか一つから選択される配列を含む、本質的にからなる、またはからなる、請求項1〜34のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項３６】
前記分子診断装置が、前記SNP座位が前記対立遺伝子を含む場合、少なくとも約0.5nM、少なくとも約1nM、少なくとも約1.5nM、少なくとも約2nM、少なくとも約6nM、少なくとも約8nM、少なくとも約10nM、または少なくとも約15nMの前記SNP座位を含む前記ポリヌクレオチドを含む生物学的試料中の前記対立遺伝子を検出する、請求項1〜35のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項３７】
前記分子診断装置が、薬物感受性細菌感染症を有する疑いのある対象が、薬物感受性細菌感染症を有するかどうかを決定する、請求項1〜36のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項３８】
前記分子診断装置が、薬物耐性細菌感染症を有する疑いのある対象が、薬物耐性細菌感染症を有するかどうかを決定する、請求項1〜37のいずれか1項に記載の分子診断装置。
【請求項３９】
a)請求項1〜38のいずれか1項に記載の分子診断装置に、治療に対する感受性と関連する一つまたは複数のSNPにより特徴付けられる疾患または障害を有するか、または有することが疑われる対象由来の生物学的試料を導入することであって、前記生物学的試料は、前記対象由来のポリヌクレオチドを含む、導入すること、
b)前記分子診断装置が、前記ポリヌクレオチドが、前記治療に対する感受性と関連する対立遺伝子を含むSNP座位を含むことを示す場合、前記治療を施すこと、を含む、方法。
【請求項４０】
前記疾患または障害が、細菌感染である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュールであって、前記生物学的試料が、標的細菌由来のポリヌクレオチドを含む、試料調製モジュール;
前記ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール;
反応体積およびヒーターを含む増幅モジュールであって、前記反応体積は、前記生物学的試料および前記プライマーセットを含む増幅溶液を受け取るよう構成され、前記ヒーターは、熱エネルギーを前記反応体積に伝達して、前記ポリヌクレオチドを増幅して、前記SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生じさせるよう構成される、増幅モジュール;および
前記標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールであって、前記SNP座位が別の対立遺伝子を含む場合、前記標的アンプリコンの前記SNP座位への結合を最小にしながら、前記SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、前記標的アンプリコンの前記SNP座位に結合するよう設計されたプローブを含む、検出モジュールを含む分子診断装置において行われる方法であって、
前記方法が、
前記標的細菌由来の前記ポリヌクレオチドから標的アンプリコンを増幅すること；
任意で、前記標的細菌由来の前記ポリヌクレオチドから第二の標的アンプリコンを増幅する工こと；
前記第一の標的アンプリコンを第一のプローブと反応させて、前記標的細菌の薬物に対する感受性を示す第一のシグナルを生じさせること；
任意で、前記第一の標的アンプリコンを第二のプローブと反応させて、前記生物学的試料中の前記標的細菌の存在および/または前記標的アンプリコンの増幅を示す第二のシグナルを生じさせること；および
任意で、前記第二の標的アンプリコンを第三のプローブと反応させて、前記生物学的試料中の前記標的細菌の存在および/または前記第一の標的アンプリコンと前記第二の標的アンプリコンのいずれかまたは両方の増幅を示す第三のシグナルを生じさせることを含む、方法。
【請求項４２】
前記第一の遺伝子を前記増幅することおよび前記第二の遺伝子を前記増幅することが、独立型の装置内で同時に行われる、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記第一のシグナル、第二のシグナル、および/または第三のシグナルが、融解曲線分析を行うことなく生じる、請求項41または請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的細菌が、ナイセリア・ゴノレー(NG)であり；
前記SNP座位が、NGの前記gyrA遺伝子内にあり；
前記標的アンプリコンを前記増幅することが、
生物学的試料をgyrA領域を標的とするように設計されたプライマーセットと混合すること；および
前記生物学的試料と前記プライマーセットとの前記混合物を、第一の温度と第二の温度の間で、前記第一の標的アンプリコンおよび任意で前記第二の標的アンプリコンを生成するのに十分な速度で熱サイクルすることを含む、請求項41〜43のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４５】
生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュールであって、前記生物学的試料が、標的細菌由来のポリヌクレオチドを含む、試料調製モジュール;
前記ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール;
反応体積およびヒーターを含む増幅モジュールであって、前記反応体積は、前記生物学的試料および前記プライマーセットを含む増幅溶液を受け取るよう構成され、前記ヒーターは、熱エネルギーを前記反応体積に伝達して、前記ポリヌクレオチドを増幅して、前記SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生じさせるよう構成される、増幅モジュール;および
前記標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールであって、前記SNP座位が別の対立遺伝子を含む場合、前記標的アンプリコンの前記SNP座位への結合を最小にしながら、前記SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、前記標的アンプリコンの前記SNP座位に結合するよう設計されたプローブを含む、検出モジュールを含む分子診断装置において行われる方法であって、
前記方法が、
A)標的細菌の存在およびB)第一の抗生物質に対する耐性を与える前記標的細菌内の前記標的対立遺伝子の存在を決定するために、前記生物学的試料に対して分子診断検査を行うこと；および
前記分子診断検査の結果に基き、第二の抗生物質を投与することを含む、方法。
【請求項４６】
前記標的細菌が、ナイセリア・ゴノレー(NG)である、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記プライマーセットが、前記SNP座位に隣接するように設計される、請求項41〜46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４８】
前記プライマーセットが隣接する標的領域の長さが、約60〜約140塩基対である、請求項41〜47のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４９】
前記プライマーセットが隣接する標的領域の長さが、約80〜約120塩基対である、請求項41〜48のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的アンプリコンが、最小の二次構造を含む、請求項41〜49のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５１】
SNP座位を標的とするように設計される前記プライマーセットが、
i)アンチセンス鎖上の前記標的領域の5’末端における上流プライマー結合部位に実質的に相補的な上流オリゴヌクレオチドプライマー;および
ii)センス鎖上の前記標的領域の3’末端における下流プライマー結合部位に実質的に相補的な下流オリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項41〜50のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法が、前記検出モジュールの温度を、前記第一のプローブの融解温度よりも約5℃、約10℃、または約15℃低い温度で維持するように構成された温度コントローラを含む、請求項41〜51のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５３】
前記検出モジュールが、前記検出モジュールについて予め決定された温度を維持するように構成された温度コントローラを備え、前記第一のプローブが、前記予め決定された温度より約5℃、約10℃、約15℃低い融解温度を有するように設計される、請求項41〜52のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５４】
前記プローブが、前記SNP座位を含むプローブ結合部位に実質的に相補的であり、前記標的対立遺伝子と一致したヌクレオチドを含む、請求項41〜53のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５５】
前記プローブが、前記プローブ結合部位に対して最大二つのヌクレオチドミスマッチを含む、請求項41〜54のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５６】
前記プローブが、前記プローブ結合部位に対して完全に相補的である、請求項41〜55のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５７】
前記プローブが、前記SNP座位を標的とするように設計された前記プライマーセットと重複しない、請求項41〜56のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５８】
前記検出モジュールが、第二のプローブ結合部位に実質的に相補的な第二のプローブを含み、前記第二のプローブ結合部位が、前記SNP座位を含まない、請求項41〜57のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５９】
前記第二のプローブ結合部位が、前記第一のプローブの前記結合部位と重複しない、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
前記検出モジュールが、前記標的アンプリコン内の第二のプローブ結合部位に実質的に相補的な第二のプローブを含み、前記第二のプローブ結合部位が、前記第一のプローブの前記結合部位と重複しない、請求項41〜57のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６１】
前記標的対立遺伝子が、薬物耐性対立遺伝子である、請求項41〜60のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６２】
前記方法が、前記生物学的試料中の前記薬物耐性対立遺伝子を特異的に検出する、請求項41〜61のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６３】
前記対立遺伝子が、薬物感受性対立遺伝子である、請求項41〜60のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法が、前記生物学的試料中の前記薬物耐性対立遺伝子を特異的に検出する、請求項41〜60または請求項63のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６５】
前記SNP座位が、gyrA領域内にある、請求項41〜64のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６６】
前記プライマーセットが、前記gyrA91座位に隣接するよう設計されている、請求項41〜65のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６７】
前記プライマーセットが隣接する前記gyrA領域の長さが、約60〜約140塩基対である、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
前記プライマーセットが隣接する前記gyrA領域の長さが、約80〜約120塩基対である、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
前記プライマーセットが隣接する前記gyrA領域の長さが、二次構造を含む、請求項66〜68のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７０】
前記第一のプローブが、薬物耐性を付与するgyrA Ser-91部位における他のSNPへの結合を最小にしながら、野生型のシプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型への結合を最大化するように設計される、請求項41〜69のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７１】
前記第一のプローブが、gyrA Ser-91をコードするコドンを含む第一のプローブ結合部位に対し実質的に相補的であり、前記第一のプローブが、シプロフロキサシン感受性gyrASer-91遺伝子型をコードする対立遺伝子と一致するヌクレオチドを含む、請求項41〜70のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７２】
前記第一のプローブが、前記シプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型をコードする対立遺伝子と、シプロフロキサシンに対する耐性を付与する前記gyrA Ser-91部位をコードする抗対立遺伝子とを識別する、請求項41〜71のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７３】
前記第一のプローブが、約52℃の熱力学的支点および/または融解温度により特徴付けられる、請求項41〜72のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７４】
前記第一のプローブが、12〜25ヌクレオチドを含む、請求項41〜73のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７５】
前記第一のプローブが、18〜22ヌクレオチドを含む、請求項74に記載の方法。
【請求項７６】
前記第一のプローブが、50℃〜60℃の融解温度を有する、請求項41〜75のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７７】
前記第一のプローブが、配列番号14〜20のいずれか一つから選択される配列を含む、本質的にからなる、またはからなる、請求項41〜76のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７８】
前記第二のプローブが、12〜25ヌクレオチドを含む、請求項41〜77のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７９】
前記第二のプローブが、18〜22ヌクレオチドを含む、請求項78に記載の方法。
【請求項８０】
前記第二のプローブが、50℃〜60℃の融解温度を有する、請求項41〜79のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８１】
前記第二のプローブが、配列番号6または22のいずれか一つから選択される配列を含む、本質的にからなる、またはからなる、請求項41〜80のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８２】
前記分子診断装置が、前記SNP遺伝子座が前記対立遺伝子を含む場合、少なくとも約0.5nM、少なくとも約1nM、少なくとも約1.5nM、少なくとも約2nM、少なくとも約6nM、少なくとも約8nM、少なくとも約10nM、または少なくとも約15nMの前記SNP座位を含む前記ポリヌクレオチドを含む生物学的試料中の前記対立遺伝子を検出する、請求項41〜79のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８３】
前記分子診断装置が、薬物感受性細菌感染症を有する疑いのある対象が、薬物感受性細菌感染症を有するかどうかを決定する、請求項41〜82のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８４】
前記分子診断装置が、薬物耐性細菌感染症を有する疑いのある対象が、薬物耐性細菌感染症を有するかどうかを決定する、請求項41〜83のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2019年3月19日に出願された、名称「Devicesand Methods for Antibiotic Susceptibility Testing」の米国仮出願番号第62/820,359号、ならびに2018年9月3日に出願された、名称「Devicesand Methods for Detecting Single-Nucleotide Polymorphisms」の米国仮出願番号第62/726,379号の優先権を主張し、当該仮出願の各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本明細書に記載される実施形態は、分子診断検査のための装置および方法に関する。より具体的には、本明細書に記載の実施形態は、抗生物質感受性検査のための使い捨ての自己収容型装置および方法に関する。
【０００３】
一塩基多型(SNP)は、生物のゲノム内の特定の位置での単一のヌクレオチドの置換であり、集団において関連する頻度で観察される。その位置で観察されたバリアントヌクレオチドは、対立遺伝子と称される。SNPの特定の対立遺伝子の検出は、医薬において幅広い有用性を有する。特に、特定の対立遺伝子の検出は、遺伝性の遺伝子障害の存在または重症度を診断し、癌の治療を個別化し、または感染疾患に対する適切な治療を選択するのに役立つ。本明細書において開示される装置および方法は、SNP検出のこれらおよび他の用途に適用可能である。
【０００４】
薬物耐性の診断は、一般的に、感染症医薬において重要な問題である。臨床実施では、例えば、Stratton, CW.、Advanced Phenotypic Antimicrobial SusceptibilityTesting Methods, Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology (Tangら編、2018年)で概説されるように、薬物耐性または感受性決定の非遺伝子的方法が使用される。
【０００５】
CDCは、薬物耐性ナイセリア・ゴノレー（Neisseriagonorrhoeae）(drNG)を緊急の脅威と特定し、毎年約82万人の新規ナイセリア・ゴノレー(NG)感染症の約20%が、抗生物質耐性であり、事実上治療することができない。さらに、全淋病感染数は劇的に増加している。最近の米国疾病管理予防センター(CDC)のプレスリリースによると、淋病診断の毎年の増加は、50%を超える。専門家は、それらの感染症に対して、適用範囲は最も狭いが、依然として有効な抗生物質で患者を治療することで、より古い抗生物質の有用性を引き伸ばしながら、広域スペクトルのセファロスポリンに対する耐性の発生を遅らせることと同意見である。しかしながら、このような治療は、臨床医が、リアルタイムで薬物耐性または感受性を評価して、処方決定を知らせることを必要とする。不運にも、性行為感染症(STI)についての既知の検査の多くは、試料採取から結果、そして患者へのタイムラインが3〜5日である、検査室ベースの検査である。多くの患者が、検査結果が利用可能になるまで「ケアを逃し」、治療しないため、疾患が広がり続けるため、これは、重大な問題である。患者がケアを逃すことを防ぐために、多くの医師が、検査結果を受け取る前に抗生物質を処方し、これにより、抗微生物剤耐性が促進されている。
【０００６】
問題を悪化させると、現在の検査室での検査は、治療を進めるための薬物感受性情報をもたらさない。既存のSTI検査室の検査が、薬物感受性情報をもたらしたとしても、日という結果までの長い時間は、患者治療のための意義のあるリアルタイムの臨床指導を医師に提供することを不可能にする。例えば、NG抗生物質感受性を決定するための寒天希釈検査は、48〜72時間かかることが知られている。結果として、NG患者の治療ケアの標準は、耐性の状態に関わらず、NGの全症例に対して、最終手段の抗生物質である、非経口セフトリアキソン(CRO)と経口アジスロマイシン(AZI)での治療を含む。二重CRO+AZI療法による治療failurRseeは、米国では未だ見られていないが、特に、推奨される二重CRO+AZI治療方針に抵抗している英国での淋病の最近の2018症例を考えると、防御のこの最終ラインに対する耐性が発生するまでの時間の問題である。
したがって、分子診断検査のための改善された装置および方法に対するニーズが存在する。特に、臨床医に迅速な使える結果を提供する、高感度かつ特異的で、入手可能なポイントオブケア(POC)診断に対するニーズが存在する。こうした改善された装置および方法は、患者が適切な抗生物質を投与されることを確実にし、これにより、広域スペクトルのセフトリアキソンの使用を最低限にし、最終ラインの抗生物質に対する展開的な選択プレッシャーを少なくし、より古い抗生物質の有用性を引き延ばす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Stratton,CW.、Advanced Phenotypic Antimicrobial Susceptibility Testing Methods, AdvancedTechniques in Diagnostic Microbiology
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
分子診断検査装置および方法が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、方法は、使い捨て分子診断検査装置内で単一の泌尿生殖器試料から、病原体(例えば、NG)の存在を検出すること、および感染している株が特定の抗生物質に感受性であるかどうかを決定することを含む。例えば、一部の実施形態では、方法は、感染している株が、3種類の抗生物質、シプロフロキサシン、セフィキシム、またはゾリフロダシンに耐性であるかどうかを決定することを含む。一部の実施形態では、方法は、限定するものではないが、WT-gyraseA-Ser91(シプロフロキサシン感受性)またはpenA-モザイク-XXXIV(セフィキシム感受性の低下)のような、感染している株の遺伝子型を決定すること、および決定に基づき、患者に個別化された治療を提供することを含む。このように、抗生物剤(例えば、セフトリアキソン)の効果的でない使用を最小限にすることができる。
【０００９】
一態様では、本開示は、分子診断装置であって、ポリヌクレオチドを含む生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュール；ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール；反応体積およびヒーターを含む増幅モジュールであって、反応体積は、生物学的試料およびプライマーセットを含む増幅溶液を受け取るよう構成され、ヒーターは、熱エネルギーを反応体積に伝達して、ポリヌクレオチドを増幅して、SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生成するように構成される、増幅モジュール；ならびに標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールであって、SNP座位が別の対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位への結合を最小にしながら、SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位に結合するよう設計されたプローブを含む、検出モジュールを含む、分子診断装置を提供する。
【００１０】
別の態様では、本開示は、a)本開示の分子診断装置に、治療に対する感受性と関連する一つまたは複数のSNPにより特徴付けられる疾患または障害を有するか、または有することが疑われる対象由来の試料を導入することであって、生物学的試料は、対象由来のポリヌクレオチドを含む、導入すること、b)分子診断装置が、ポリヌクレオチドが、治療に対する感受性と関連する対立遺伝子を含むSNP座位を含む場合、治療を施すことを含む、方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本開示は、生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュールであって、生物学的試料は、標的細菌由来のポリヌクレオチドを含む、試料調製モジュール;ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール;反応体積およびヒーターを含む増幅モジュールであって、反応体積は、生物学的試料を受け取るよう構成され、増幅溶液は、プライマーセットを含み、ヒーターは、熱エネルギーを反応体積に伝達して、ポリヌクレオチドを増幅して、SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生成するよう構成される、増幅モジュール;ならびに標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールであって、SNP座位が別の対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位への結合を最小にしながら、SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位に結合するよう設計されたプローブを含む、検出モジュールを含む分子診断装置において行われる、方法であって、標的アンプリコンを標的細菌由来のポリヌクレオチドから増幅すること;任意で、第二の標的アンプリコンを標的細菌由来のポリヌクレオチドから増幅すること;第一の標的アンプリコンを第一のプローブと反応させて、標的細菌の薬物に対する感受性を示す第一のシグナルを生じさせること;任意で、第一の標的アンプリコンを第二のプローブと反応させて、生物学的試料における標的細菌の存在および／または標的アンプリコンの増幅を示す第二のシグナルを生じさせること;ならびに任意で、第二の標的アンプリコンを第三のプローブと反応させて、生物学的試料における標的細菌の存在および／または第一の標的アンプリコンと第二の標的アンプリコンのいずれかもしくは両方の増幅を示す第三のシグナルを生じさせることを含む、方法を提供する。
【００１２】
別の態様では、本開示は、生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュール、生物学的試料は、標的細菌由来のポリヌクレオチドを含む;ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール;反応体積およびヒーターを含む増幅モジュール、生物学的試料およびプライマーセットを含む増幅溶液を受け取るよう構成された反応体積、熱エネルギーを反応体積に伝達して、ポリヌクレオチドを増幅して、SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生じさせるよう構成されたヒーター;ならびにSNP座位が、別の対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位への結合を最小にしながら、SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位に結合するよう設計されたプローブを含む、標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールを含む分子診断装置において行われる方法であって、生物学的試料で分子診断検査を行い、A)標的細菌の存在およびB)第一の抗生物質に対する耐性を与える標的細菌内の標的対立遺伝子の存在を決定すること;ならびに分子診断検査の結果に基づき、第二の抗生物質を投与することを含む、方法を提供する。
【００１３】
一部の実施形態では、分子診断装置は、生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュール、試薬モジュール、および増幅モジュールを含む。試薬モジュールは、gyrA領域を標的にするよう設計されたプライマーセットを含有する。増幅モジュールは、反応体積およびヒーターを含む。反応体積は、生物学的試料およびプライマーセットを受け取るよう構成される。ヒーターは、熱エネルギーを反応体積に伝達して、gyrA領域を増幅して、標的アンプリコンを含有する出力を生じさせるよう構成される。検出モジュールは、標的アンプリコンを受け取るよう構成され、標的アンプリコンの薬物耐性部分への結合を最小にしながら、標的アンプリコンの薬物感受性部分への結合を最大にするよう設計されたプローブを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、プライマーセットは、gyrA 91座位に隣接するように設計される。一部の実施形態では、プローブは、薬物耐性一塩基多型(SNP)を含有するgyrA91配列のバリアントへの結合を最小にしながら、gyrASer-91野生型への結合を最大にするよう設計される。さらに、一部の実施形態では、プローブは、約52℃の熱力学的支点により特徴付けられる。
【００１５】
一部の実施形態では、方法は、第一の遺伝子を増幅して、細菌と関連する第一の標的アンプリコンを生じさせることを含む。第二の遺伝子を増幅させて、薬物感受性変異と関連する第二の標的アンプリコンを生成する。方法は、第一の標的アンプリコンを第一のプローブと反応させて、最近の存在を示す第一のシグナルを生じさせること、および第二の標的アンプリコンを第二のプローブと反応させて、細菌が、薬物に対する感受性を示す第二のシグナルを生じさせることをさらに含む。
【００１６】
一部の実施形態では、第一の遺伝子を増幅させることおよび第二の遺伝子を増幅することは、独立型の装置内で同時に行われる。一部の実施形態では、第一の標的アンプリコンを反応させることも、第二の標的アンプリコンを反応させることも、融解曲線を生じさせることを含まない。同様に述べると、第二のシグナルは、融解曲線分析を行うことなく生じる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、一実施形態による、複合検査においてNG、シプロフロキサシン感受性NG、および／またはセフトリアキソン感受性NGを検出する方法の概略図である。
【００１８】
【図２】図2は、一実施形態による、反射検査を必要とする現在の検査方法と複合検査の間の比較を示すフローチャートである。
【００１９】
【図３】図3は、gyrA遺伝子のコドン91での一塩基多型(SNP)(gyrASer91)(Genbank U08817.1)(配列番号1)を説明する。
【００２０】
【図４】図4は、一実施形態による、フォワードおよびリバースPCRプライマーを説明する。
【００２１】
【図５Ａ】図5Aは、一実施形態による、プライマーセット、シプロフロキサシン感受性検出プローブ、およびgyrA陽性対照の概略図である。示される配列は、配列番号2〜6である。
【００２２】
【図５Ｂ】図5Bは、一実施形態による、検出および抗生物質感受性についての複合検査方法を行う、分子診断検査装置の写真である。
【００２３】
【図６】図6は、予備的な検出限界(LoD)決定について行われた検査結果を示す写真である。
【００２４】
【図７】図7は、競合阻害を評価するために行われた検査結果を示す写真である。
【００２５】
【図８】図8〜10は、一実施形態による、それぞれ、第一の配置、第二の配置、および第三の配置における一塩基多型(SNP)を検出するよう構成された分子診断検査装置の概略図である。
【図９】同上。
【図１０】同上。
【００２６】
【図１１】図11は、一実施形態による、分子診断検査装置の概略図である。
【００２７】
【図１２】図12および13は、一実施形態による、分子診断検査装置の、それぞれ、透視図および平面図である。
【図１３】同上。
【００２８】
【図１４】図14は、試料投入口を示すために蓋を取り除いた、図12および13に示した分子診断検査装置の透視図である。
【００２９】
【図１５】図15は、内部構成要素を示すために覆いの上部を取り除いた、図12および13に示した分子診断検査装置の透視図である。
【００３０】
【図１６】図16は、図12および13に示した分子診断検査装置の分解立体図である。
【００３１】
【図１７】図17は、濾過部およびそれに結びついた不活化部を含む、図12および13に示した分子診断検査装置の透視図である。
【００３２】
【図１８】図18および19は、図12および13に示した分子診断検査装置の検出モジュールの、それぞれ、透視分解立体図および正面図である。
【図１９】同上。
【００３３】
【図２０Ａ】図20Aおよび図20Bは、様々なナイセリア・ゴノレー株由来のポリヌクレオチド試料を鋳型として使用した、PCRにより産生された標的アンプリコンのキャピラリー電気泳動分析を示す。
【図２０Ｂ】同上。
【００３４】
【図２１】図21は、様々なナイセリア・ゴノレー株由来のポリヌクレオチド試料を鋳型として使用した、PCRにより産生された標的アンプリコンのキャピラリー電気泳動分析を示す。
【００３５】
【図２２】図22は、マイクロタイタープレート形式の表面に結合したプローブ1〜4に対する108bpまたは34bpのアンプリコンの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを示す。
【００３６】
【図２３】図23は、マイクロタイタープレート形式の表面に結合したプローブ1〜5および7〜8に対する108bpまたは34bpのアンプリコンの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを示す。
【００３７】
【図２４】図24は、プローブ設計の実験評価に使用される五つの検出面の位置を示す検出モジュールの概略図である。
【００３８】
【図２５】図25は、対立遺伝子特異的プローブ3に結合する、感受性(Cipro-S)および耐性(Cipro-R)株の淋菌由来の標的アンプリコンの比色分析検出を示す。
【００３９】
【図２６】図26および図27は、Cipro感受性株とCipro耐性株の間の識別を示す例示の装置の検査を示す。
【図２７】同上。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
一部の実施形態では、装置は、使い捨て、携帯用、単回使用、安価、分子診断アプローチ用に構成される。装置は、試料調製、核酸増幅(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅などを介して)、および検出を含むが、これらに限定されない、高品質の分子診断検査を行うように構成された一つまたは複数のモジュールを含み得る。
【００４１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、用語「試薬」は、本明細書に記載される反応のいずれかに関連して使用される任意の物質を含む。例えば、試薬は、溶出バッファー、PCR試薬(例えば、プライマー)、酵素、基質、洗浄溶液などを含み得る。試薬は、一つまたは複数の成分の混合物を含み得る。試薬は、物質のこれらの状態(例えば、固体、液体、または気体)に関係なく、こうした成分を含み得る。さらに、試薬は、混合状態にある物質、非混合状態にある物質、および/または部分的に混合状態にある物質に含まれ得る複数の成分を含み得る。試薬は、活性成分と不活性成分の両方を含み得る。したがって、本明細書で使用される場合、試薬は、水、着色剤などのような非活性および/または不活性成分を含み得る。
【００４２】
別段示されない限り、用語「核酸分子」、「核酸」、または「ポリヌクレオチド」は、本明細書で互換的に使用されてもよく、公知の類似体またはその組み合わせを含む、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)を指してもよい。本明細書において特定されるべき核酸分子は、核酸の任意の供給源から得ることができる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。ある場合には、核酸分子はDNAである。DNAは、ミトコンドリアDNA、相補的DNA(cDNA)、またはゲノムDNAであり得る。ある場合には、核酸分子はゲノムDNA(gDNA)である。DNAは、プラスミドDNA、コスミドDNA、細菌人工染色体(BAC)、または酵母人工染色体(YAC)であり得る。DNAは、一つまたは複数の染色体からもたらされ得る。例えば、DNAがヒト由来のものである場合、DNAは、染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X、またはYのうちの一つまたは複数からもたらされ得る。ある場合には、核酸分子は、mRNA、tRNA、snRNA、rRNA、レトロウイルス、小分子非コードRNA、マイクロRNA、ポリソームRNA、前mRNA、イントロンRNA、ウイルスRNA、細胞を含まないRNAおよびそれらのフラグメントを含むが、これらに限定されない。非コードRNA、またはncRNAは、snoRNA、マイクロRNA、siRNA、piRNA、および長いncRNAを含み得る。本明細書に記載される装置、方法、および組成物において使用するための核酸の供給源は、核酸を含む生物学的試料であり得る。
【００４３】
本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、当該技術分野の標準的な論文および教科書、例えば、KombergおよびBaker、DNA Replication、第二編(W. H. Freeman、New York、1992年);Lehninger、Biochemistry、第二編(WorthPublishers、New York、1975年);StrachanおよびRead、Human Molecular Genetics、第二編(Wiley-Liss、NewYork、1999年);Eckstein編集長、Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach(Oxford University Press、New York、1991年);Gait編集長、Oligonucleotide Synthesis: APractical Approach (IRL Press、Oxford、1984年)などの用語および記号に従う。
【００４４】
多型は、概して、核酸上の単一の塩基対の位置におけるヌクレオチドの変更を指す。多型とは、遺伝子座位における一つまたは複数のヌクレオチドの置換、逆位、挿入、もしくは欠失、またはある遺伝子座位から別の遺伝子座位へのDNAの転座を意味する。本明細書で使用される場合、「一塩基多型」または「SNP」は、参照配列(例えば、生物の野生型配列、または同じ種の生物の集団に存在する任意の代替配列バリアント)に関して、生物のゲノムのポリヌクレオチド配列中の一つのヌクレオチドの置換を指す。例えば、細菌におけるSNPは、その種の代表で異なるヌクレオチド位置であり、ヒト集団におけるSNPは、個人間の代表で異なるヌクレオチド位置であり、癌の文脈におけるSNPは、対象のゲノムと対象内の腫瘍細胞のゲノムとの間で異なるヌクレオチド位置である。
【００４５】
「対立遺伝子」は、検出が望まれるSNPにおける特定のヌクレオチドを指す。SNPがコード配列にある場合、対立遺伝子は、ポリヌクレオチド(または「標的領域」)によりコードされるタンパク質における変更をコードしてもよい。「抗対立遺伝子」は、参照配列中の同じ位置(すなわち、SNP座位)に存在するヌクレオチドを指す。薬剤耐性検出の場合、薬剤耐性対立遺伝子は、ポリヌクレオチドにおけるその存在が、細菌に対する耐性の表現型を与えるヌクレオチドである。抗対立遺伝子は、細菌に対して感受性の表現型を与えるヌクレオチドを指す。反対に、薬剤感受性の検出において、「対立遺伝子」は、薬物に対する感受性をカバーするSNP座位におけるヌクレオチドであり、「抗対立遺伝子」は、薬物に対する耐性を有する同じ生物である、参照配列のSNP座位におけるヌクレオチドである。配列(SNP座位)の同じ位置で、二つより多くの代替ヌクレオチドが観察される場合、「対立遺伝子」は、検出されるべきヌクレオチドであり、二つまたは三つの代替ヌクレオチドは、「抗対立遺伝子」である。
【００４６】
このようなSNPは、一般的に病原体などの、高度に可変性のゲノムを有する生物において起こり得る。当業者は、一般的に病原体、および高度に可変性のゲノムで特徴付けられる病原体を容易に理解し、同定するであろう。このような病原体としては、ウイルス、細菌、寄生虫および真菌が挙げられる。本明細書に記載される装置および方法は、本明細書に記載される装置および方法が、様々なSNPの存在を決定することを意図しているため、任意の特定のSNPに限定されない。SNPは、様々な生物において、文献で容易に同定することができる。
【００４７】
生物が選択されると、生物についての標的核酸配列、例えば、SNP座位は、文献で既知であると決定されてもよく、または配列決定方法(例えば、薬物耐性および薬物感受性生物の比較分析により)により決定されてもよい。標的SNP座位が同定されると、5’および3’隣接配列は、様々な公開データベース(例えば、GenBank)のいずれかから配列を取り出すか、または座位を新たに配列決定することにより同定することができる。5’隣接領域は、標的ヌクレオチド位置の5’に位置する核酸配列である。3’隣接領域は、標的ヌクレオチド位置の3’に位置する核酸配列である。ある場合には、5’隣接領域は、SNP座位に直接隣接しているか、または約20bp、40bp、60bp、80bp、もしくは100bp以内にある。ある場合には、3’隣接領域は、標的ヌクレオチド位置に直接隣接しているか、または約20bp、40bp、60bp、80bp、もしくは100bp以内にある。標的ヌクレオチド位置(すなわち、SNP座位)ならびに5’および3’隣接領域の標的ヌクレオチド(すなわち、対立遺伝子)の配列情報から、プローブを含むものが、本明細書に記載されるように、設計することができる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「プローブ」は、標的アンプリコンを捕捉するために使用される非標識オリゴヌクレオチドを指す。概して、プローブは、検出モジュールの表面と共有結合するが、非共有結合方法がまた、利用されてもよい。プローブを基材に結合させるための例示の非限定的な手段は、アミド結合である。一部の実施形態では、検出モジュールの表面は、非結晶性ポリマー(例えば、環状オレフィンコポリマー(COC))を含む。COC基材表面の表面修飾は、Hwangら、Surface and CoatingsTechnology 202:3669〜74 (2008年); Gubalaら、Colloids and Surfaces B: Biointerfaces81:544〜48 (2010年);またはCarvalhoら、ACS Applied Materials and Interfaces 9:16644〜50(2017年)において記載されるような、酸素プラズマにより達成することができる。アミン反応性基材(例えば、カルボキシル化COC)を生成するための基材(例えば、COC基材)の活性化に続いて、アミノ修飾オリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、アクリルホスホラミダイト(Acrydite(商標))、アデニル化、アジド(NHSエステル)、I-Linker(商標)(アルデヒドもしくはケトン修飾基材に)、またはアミノ修飾剤を含むが、これらに限定されない様々な付着性化学物質により表面に結合され得る。第一アミノ基を使用して、オリゴヌクレオチドプローブを表面に結合させることができる。アミノ修飾剤は、標準(C6)またはより長い(C12)スペーサーアームのいずれかで5’末端に置くことができる。アミノ修飾はまた、3’末端に置くことができる。内部アミノ修飾は、アミノdT塩基を使用して導入することができる。例示的アミノ修飾剤には、3’アミノ修飾剤C6、3’アミノ修飾剤C12、5’アミノ修飾剤C6、および5’アミノ修飾剤C12が含まれる。
【００４９】
本明細書に記載される装置および方法は、一つのSNPの検出に限定されない。むしろ、同じ標的アンプリコン内のSNP座位の二つ以上または複数が、検出され得る。一部の実施形態では、単一のオリゴヌクレオチドプローブは、二つまたは三つのSNP座位を含むプローブ結合領域に特異的に結合するよう設計される。一部の実施形態では、装置は、単一の標的アンプリコン上に存在する一つ、二つ、三つ、またはそれ以上の部位に対するプローブを有する検出モジュールを含む。一部の実施形態では、装置は、同じおよび/または異なる生物由来の複数の標的アンプリコン中のSNPを検出するように構成される。特定の実施形態では、装置は、同じ生物体中の一つ、二つ、三つ、または四つのSNPを検出するように構成される。特定の実施形態では、装置は、異なる生物中の一つ、二つ、三つ、または四つのSNPを検出するように構成される。例えば、限定されるものではないが、一部の実施形態では、本開示の装置は、クラミジア、ゴノレー、および/またはトリコモナスのうちの一つ以上を検出するためのプローブを含む。一部の実施形態では、各病原体についてのプローブは、薬物耐性SNPまたは薬物感受性SNPに特異的である。一部の実施形態では、本開示の装置は、標的アンプリコンの非重複領域に特異的な(例えば、実質的に相補的な)第二のプローブをさらに含む。一部の実施形態では、この第二のプローブは、生物学的試料中の生物の存在または不存在についての対照としての役割を果たす。
【００５０】
「遺伝子座位」または「座位」は、ゲノムの連続的なサブ領域またはセグメントを指す。本明細書で使用される場合、「SNP座位」は、一塩基多型が生じるゲノム内のヌクレオチド位置を指す。SNP座位は、ゲノム内のその位置に従って、または生物のゲノムによってコードされるタンパク質遺伝子産物のコード配列内のその位置により命名することができる。例えば、gyrASer-91部位のSNPは、gyrA遺伝子から転写されたメッセンジャーRNAの翻訳中、リボソームに、gyrA遺伝子産物中の91番目のアミノ酸としてセリンを加えるよう指示するコドンに対応する生物のゲノム中の三つのヌクレオチド位置のうちの一つにおけるSNPを指す。
【００５１】
標的核酸配列には、特定の生物のゲノム核酸が含まれる。このような標的核酸配列は、一本鎖または二本鎖であってもよく、センス鎖および/またはアンチセンス鎖を含んでもよい。このような標的核酸配列は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)であってもよい。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「生物学的試料」は、本明細書に記載される装置により増幅および/または検出され得るポリヌクレオチド(例えば、DNAまたはRNA)を含有する生物(例えば、対象、例えば、ヒトまたは動物対象)から得られる任意の組織または液体を指す。一部の実施形態では、本明細書に記載される装置および方法のいずれかは、様々な異なるタイプの試料上で実施することができる。こうした試料タイプには、例えば、膣スワブ、陰茎管スワブ試料、口腔スワブ、糞便、唾液、鼻腔洗浄、鼻腔吸引液、喉のスワブ、気管支洗浄液、血液、血液細胞(例えば、白血球)、細針生検試料、復水、内臓体液、胸膜液、尿試料、直腸スワブ試料および/または咽頭スワブ試料、またはそれら由来の細胞が含まれ得る。膣スワブ試料を用いて一連の検査を行った。本発明に有用な他の生物学的試料としては、腫瘍試料(例えば、生検)およびリンパ増殖性障害を有するか、またはその疑いがある対象由来の血液試料が挙げられる。
【００５３】
一部の実施形態では、本開示の方法を利用して、抗微生物薬物治療に耐性である可能性がある微生物による感染を検出する。微生物の非限定的な例には、例えば、アシネトバクター（Acinetobacter）、エシェリキア（Escherichia）、例えば、大腸菌、エンテロバクター（Enterobacter）、クレブシエラ（Klebsiella）、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiellapneumonia）および／もしくはクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacteriumtuberculosis）、ナイセリア（Neisseria）、例えば、髄膜炎菌および／もしくはナイセリア・ゴノレー、プロテウス（Proteus）、例えば、プロテウス・ミラビリス（Proteusmirabilis）、シュードモナス（Pseudomonas）、例えば、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、サルモネラ（Salmonella）、例えば、サルモネラ・エンテリカ（Salmonellaenterica）、セラチア（Serratia）、例えば、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、例えば、黄色ブドウ球菌、ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）、例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonoasmaltophilia）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、例えば、肺炎連鎖球菌および／もしくはストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcuspyogenes）および／もしくはストレプトコッカス・パラウベリス（Streptococcus parauberis）、シゲラ（Shigella）、ヘモフィルス（Haemophilus）、例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilusinfluenza）、ビブリオ（Vibrio）、例えば、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、ならびに／またはエドワージエラ（Edwardsiella）、例えば、エドワージエラ・タルダ（Edwardsiellatarda）の一つまたは複数が挙げられる。
【００５４】
一部の実施形態では、生物の同定は、抗微生物処置治療方針を規定する。例えば、グラム陽性生物が主要病原体と決定される場合、患者は、バンコマイシンなどのグラム陽性の適切な抗生物質を投与されるだろう。さらに、アッセイが、多数の抗生物質に対する耐性決定因子を有する特定の生物が存在すると決定する場合、これらの治療オプションは、その特定の患者に対しては避けられる。
【００５５】
抗菌剤の非限定的な例としては、β-ラクタム、β-ラクタムインヒビター、キノロンおよびその誘導体、例えば、フルオロキノロン類、アミノグリコシド類、グリコペプチド類、リンコサミド類、マクロライド類、ニトロフラン類、オキサゾリジノン類、ポリケチド類、それぞれ、テトラサイクリン類、および葉酸合成インヒビター、例えばベンゼン誘導体化/スルホンアミド抗生物質が挙げられる。特定の実施形態によれば、抗微生物薬、例えば、抗生物質は、アモキシシリン/Kクラブラン酸(AUG)、アンピシリン(AM)、アズトレオナム(AZT)、セファゾリン(CFZ)、セフェピム(CPE)、セフォタキシム(CFT)、セフタジジム(CAZ)、セフトリアキソン(CAX)、セフロキシム(CRM)、セファロチン(CF)、シプロフロキサシン(CP)、エルタペネム(ETP)、ゲンタマイシン(GM)、イミペネム(IMP)、レボフロキサシン(LVX)、メロペネム(MER)、ピペラシリン/タゾバクタム(P/T)、アンピシリン/スルバクタム(A/S)、テトラサイクリン(TE)、トブラマイシン(TO)、およびトリメトプリム/スルファメトキサゾール(T/S)からなる群から選択される。
【００５６】
一部の実施形態では、抗微生物耐性は、細菌遺伝子中のSNPを検出することにより同定される。SNP標的は、耐性の決定因子とみなされるそれらの遺伝子において変異を生じる細菌抗生物質耐性と関連することが知られている選択された遺伝子を表す。
【００５７】
一部の実施形態では、本開示の方法は、16S rRNA、ethA、ndh、23S rRNA、fabG1、parC、ahpC、folP、parE、alr、gyrA、pncA、embA、gyrB、rlmN、embB、kasA、rpoB、embC、katG、rpsL、vraR、vraS、parC、mtrR、penA、penB、mtrR、ponA、rpsJ、およびatpEからなる群から選択される遺伝子中の一つまたは複数の細菌SNPを検出する。
【００５８】
一部の実施形態では、本開示の方法は、mtrRをコードする遺伝子中の一つまたは複数のSNPと関連するスペクチノマイシン耐性を検出する。
【００５９】
一部の実施形態では、本開示の方法は、bla、penA、ponA、penB、およびmtrRからなる遺伝子の群において、一つまたは複数のSNPと関連するペニシリン耐性を検出する。
【００６０】
一部の実施形態では、本開示の方法は、vraRおよび/またはvraS中の一つまたは複数のSNPと関連するバンコマイシン耐性を検出する。
【００６１】
一部の実施形態では、本開示の方法を使用して、rpsJ、mtrR、およびtet(M)における一つまたは複数のSNPと関連するテトラサイクリン耐性を検出する。
【００６２】
一実施形態では、本開示の方法は、penA、penB、mtrR、およびponAからなる群から選択される一つまたは複数のSNPと関連するセファロスポリン耐性を検出する。
【００６３】
一実施形態では、本開示の方法を利用して、gyrA、parC、およびmtrRにおける一つまたは複数の変異と関連するキノロン耐性を検出する。
【００６４】
一部の実施形態では、本開示は、16S rRNAをコードする遺伝子のSNPと関連するアジスロマイシン耐性を検出する。
【００６５】
標的核酸配列は、当業者に公知の方法を使用して増幅されてもよい。かかる方法は、ポリメラーゼ、プライマー、およびヌクレオチドを使用することを含む。「増幅」は、主要な酵素合成ラウンドの繰り返しを介した核酸分子のコピーの生成を含む。
【００６６】
増幅方法は、核酸を、ハイブリダイゼーションおよび鎖伸長を促進する条件下で、核酸に特異的にハイブリダイズする一つまたは複数のプライマーと接触させることを含んでもよい。核酸を増幅するための典型的な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば、Mullisら(1986年) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 Pt1:263およびClearyら (2004年) Nature Methods 1:241;ならびに米国特許第4,683,195号および第4,683,202号を参照）、アンカーPCR、RACEPCR、ライゲーション連鎖反応(LCR)(例えば、Landegranら(1988年) Science 241:1077〜1080;およびNakazawaら(1994年)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:360〜364を参照）、自己持続配列複製(Guatelliら(1990年) Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874）、転写増幅システム(Kwohら(1989年) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 86:1173）、Qβレプリカーゼ(Lizardiら(1988) BioTechnology 6:1197)、再帰PCR(Jaffeら(2000年)J. Biol. Chem. 275:2619;およびWilliamsら(2002年) J. Biol. Chem. 277:7790）、米国特許第6,391,544号、第6,365,375号、第6,294,323号、第6,261,797号、第6,124,090号および第5,612,199号に記載される増幅方法、または当業者に周知の技術を使用した任意の他の核酸増幅方法が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書において開示される方法は、線形増幅を利用する。一部の実施形態では、本明細書において開示される方法は、PCR幅を利用する。
【００６７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、DNAの相補鎖の同時プライマー伸長による特定のDNA配列のインビトロ増幅のための反応を指す。言い換えると、PCRは、プライマー結合部位に隣接した標的核酸の複数のコピーまたは複製を作製するための反応であり、このような反応は、(i)標的核酸を変性させること、(ii)プライマーをプライマー結合部位にアニーリングさせること、および(iii)ヌクレオシド三リン酸の存在下での核酸ポリメラーゼによりプライマーを伸長させることを含む。通常、反応は、サーマルサイクラー機器で各工程に対して最適化された異なる温度を通してサイクル化される。特定の温度、各工程での持続時間、および工程間の変化速度は、例えば、参考文献：編集者McPhersonら、PCR:A Practical ApproachおよびPCR2: A Practical Approach (IRL Press、Oxford、それぞれ、1991および1995)により例示される、当業者に周知の多くの要因に依存する。例えば、TaqDNAポリメラーゼを使用した従来のPCRでは、二本鎖標的核酸は、90℃より高い温度で変性され、プライマーは、50〜75℃の範囲の温度でアニーリングされ、プライマーは、72〜78℃の範囲の温度で伸長されてもよい。
【００６８】
「PCR」という用語は、逆転写(RT)-PCR、ネステッドPCR、定量的PCR、多重化PCRなどを含むが、これらに限定されない、誘導形態の反応を包含する。「逆転写PCR」または「RT-PCR」は、標的RNAを相補的な一本鎖DNAに変換する逆転写反応が先行し、次に、Tecottら、米国特許第5,168,038号により増幅される、PCRを意味する。例えば、「ネステッドPCR」は、2段階PCRを意味し、第一のPCRのアンプリコンが、少なくとも一つは、第一のアンプリコンの内部位置に結合するプライマーの新しいセットを使用した第二のPCR用の試料となる。本明細書で使用される場合、ネステッド増幅反応に関連した「最初のプライマー」は、第一のアンプリコンを生成するために使用されるプライマーを意味し、「第二のプライマー」は、第二、またはネスティッドアンプリコンを生成するために使用される一つまたは複数のプライマーを意味する。「多重化PCR」は、複数の標的配列(または単一の標的配列および一つまたは複数の参照配列)が、同じ反応混合物において同時に行われ、例えば、Bernardら(1999年)Anal.Biochem., 273:221〜228を参照されたい。通常は、増幅されている各配列について別個のプライマーセットが利用される。「定量的PCR」は、試料または標本中の一つまたは複数の特定の標的配列の存在量を測定するように設計されたPCRを意味する。定量的PCRの技術は、以下の参考文献：Freemanら、Biotechniques、26:112〜126(1999年); Becker-Andreら、Nucleic Acids Research, 17:9437〜9447 (1989年); Zimmermanら、Biotechniques,21:268〜279 (1996年); Diviaccoら、Gene, 122:3013〜3020 (1992年); Becker-Andreら、NucleicAcids Research、17:9437〜9446 (1989年)などに例示されるように、当業者に周知である。
【００６９】
同義で使用される「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合により結合された天然もしくは修飾されたヌクレオシドモノマーの直鎖ポリマーまたはその類似体を意味する。したがって、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、天然または修飾されたヌクレオチドのポリマーとみなされてもよい。用語「オリゴヌクレオチド」は通常、例えば、約3〜約100個のモノマーを含む、短めのポリマーを指し、用語「ポリヌクレオチド」は、通常、例えば、約100個〜数千個のモノマー、例えば、10,000個のモノマーまたはそれ以上を含む長めのポリマーを指す。プローブまたはプライマーを含むオリゴヌクレオチドは、通常、12〜60ヌクレオチドの範囲の長さを有し、より一般的には、18〜40ヌクレオチドの長さを有する。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、天然または合成であってもよい。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、およびその非天然類似体、例えば、そのアノマー形態、ペプチド核酸(PNA)などを含み、但し、それらは、例えば、ワトソン-クリック型の塩基対形成、塩基スタッキング、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の塩基対形成などの、モノマーとモノマーの相互作用の通常のパターンにより標的ゲノムに特異的に結合する能力がある。
【００７０】
「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型と二本鎖を形成する際に、核酸合成の開始点として作用し、伸長された二本鎖が形成されるように鋳型に沿ってその3’末端から伸長される能力がある、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを含む。伸長プロセス中に付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列により決定される。通常、プライマーは、DNAポリメラーゼにより伸長される。プライマーは、通常、3〜36ヌクレオチド、5〜24ヌクレオチド、また14〜36ヌクレオチドの範囲の長さを有する。本発明の範囲内のプライマーには、直交プライマー、増幅プライマー、構築プライマーなどが含まれる。プライマー対は、対象の配列または対象の配列セットに隣接することができる。プライマーおよびプローブは、配列決定中に変性させることができる。本発明の範囲内のプライマーは、標的配列(例えば、オリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチド配列または対象の核酸配列)に隣接して結合する。
【００７１】
用語「プライマーセット」は、PCRなどによるポリヌクレオチドの標的領域の増幅のために構成された一つまたは複数のプライマーを指す。「標的領域」は、ポリヌクレオチド配列(例えば、遺伝子または遺伝子フラグメント、例えば、抗生物質に対する耐性または感受性と関連する遺伝子または遺伝子フラグメント)中の所定の領域を指す。本開示の方法によれば、標的領域は、対象のSNP座位を含むように選択される。プライマーセットを使用した標的領域の増幅は、「標的アンプリコン」を生じる。標的アンプリコンは、標的領域と同じポリヌクレオチド配列を有し(ポリメラーゼエラーによるヌクレオチドのいくつかの挿入、欠失、または置換が生じ得、本開示の方法が、このようなエラーに寛容であるにもかかわらず)、但し、ある場合には、プライマーセットのプライマーが、プライマー結合部位に対し実質的に相補的であるが完全に相補的ではなく、故に、標的アンプリコンにおいて変更を導入する。プライマーセットが、プローブ結合部位と重複するプライマーを含有しない場合、こうした置換は、プローブを使用した標的アンプリコンの検出に影響を与えない(または衝撃を設けない)。アッセイが、プライマー結合部位とプローブ結合部位との間の重複を有するように設計される場合、プローブ設計は、そのような場合、二つが異なっているように、標的領域配列に対してよりむしろ、公知または予測される標的アンプリコン配列に対してプローブを設計することにより一般的に適合される。プライマーセットは、1、2、3、4、5、6個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよい。例えば、単一のプライマーは、線形増幅(例えば、ローリングサークル増幅)に使用してもよく、一つはフォワード(5’→3’)向きであり、一つはリバース(3’→5’)向きである、二つのプライマーは、PCR増幅に使用することができる。当業者であれば、ポリヌクレオチドが二本鎖(例えば、二本鎖DNA)であるとき、命名「フォワード」および「リバース」は、任意であることを理解する。特定の実施形態では、3個、4個、またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーが、、プライマーセットを形成し、例えば、分子診断装置が、ネストPCR反応を行うように構成される。
【００７２】
一部の実施形態では、プライマーセットは、分子診断装置に含まれる。例えば、プライマーセットは、装置において固体(例えば、凍結乾燥粉末もしくはテーブル)として、または液体(例えば、装置内に提供される溶液もしくは懸濁液)として提供されてもよい。プライマーセットは、別個の試薬チャンバー、流路内のインライン、または装置の別の適切な部分において提供されてもよい。一部の実施形態では、分子診断装置は、使用前に、プライマーセットを含まない。プライマーセットは、生物学的試料が装置に加えられる前に、生物学的試料に加えられてもよく、またはプライマーセットは、生物学的試料の装置への導入前、同時、または後に装置に導入されてもよい。したがって、様々な実施形態では、分子診断装置は、プライマーセットを含むか、またはプライマーセットを含有する試薬モジュールを含むか、またはプライマーセットを受け取るように構成される。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「標的化」(SNP座位を標的とするプライマーセットのように)は、分子診断装置の操作下で、分子診断装置においてポリヌクレオチド(例えば、遺伝子または遺伝子フラグメント)の増幅を生じさせてSNP座位を含む標的アンプリコンを生成し、これにより、検出モジュール中のSNP座位に存在する対立遺伝子の検出を可能にする、プライマーセット中のプライマーのアッセイ開発における選択を指す。一部の実施形態では、SNP座位は、二つ以上のオリゴヌクレオチド(例えば、少なくとも一つのフォワードプライマーおよび少なくとも一つのリバースプライマー)を含むプライマーセットの設計により標的化される。一方のプライマー(例えば、フォワードプライマー)が、SNP座位の上流(または5’)にあり、他方のプライマー(例えば、リバースプライマー)は、SNP座位の下流(または3’)である場合、プライマーセットは、SNP座位に「隣接する」と言われる。プライマーセットは、SNP座位の上流(または5’)の第一のプライマー結合部位、およびSNP座位の下流(または3’)の第二のプライマー結合部位を選択することにより、「SNP座位に隣接するように設計され」てもよい。プライマーは、選択された結合部位の各々に(例えば、プライマー結合部位に実質的に相補的であるか、または相補的であることにより)アニーリングする能力があるように設計される。当技術分野で周知の方法を使用して、プライマー結合部位および対応するオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅反応の性能を最適化するように選択することができる。
【００７４】
本開示の一部の実施形態では、プライマー結合部位の正確な位置は、続く検出工程に悪影響を及ぼすことなく、変更されてもよい。特定の実施形態では、本発明者らは、得られた標的アンプリコンの長さが、驚くべきことに、検出工程に対して結果有効の変数であることを観察した。したがって、一部の実施形態では、プライマーセットが隣接した標的領域は、約30塩基対(bp)〜約500bp、約30bp〜約400bp、約30bp〜約300bp、約30bp〜約200bp、または約30bp〜約150bpである。一部の実施形態では、プライマーセットが隣接した標的領域は、約40bp〜約500bp、約40bp〜約400bp、約40bp〜約300bp、約40bp〜約200bp、または約40bp〜約150bpである。一部の実施形態では、プライマーセットが隣接した標的領域は、約50bp〜約500bp、約50bp〜約400bp、約50bp〜約300bp、約50bp〜約200bp、または約50bp〜約150bpである。一部の実施形態では、プライマーセットが隣接した標的領域は、約60bp〜約500bp、約60bp〜約400bp、約60bp〜約300bp、約60bp〜約200bp、または約60bp〜約150bpである。一部の実施形態では、プライマーセットが隣接した標的領域は、約70bp〜約500bp、約70bp〜約400bp、約70bp〜約300bp、約70bp〜約200bp、または約70bp〜約150bpである。
【００７５】
一部の実施形態では、標的アンプリコンは、約30塩基対(bp)〜約500bp、約30bp〜約400bp、約30bp〜約300bp、約30bp〜約200bp、または約30bp〜約150bpである。一部の実施形態では、標的アンプリコンは、約40bp〜約500bp、約40bp〜約400bp、約40bp〜約300bp、約40bp〜約200bp、または約40bp〜約150bpである。一部の実施形態では、標的アンプリコンは、約50bp〜約500bp、約50bp〜約400bp、約50bp〜約300bp、約50bp〜約200bp、または約50bp〜約150bpである。一部の実施形態では、標的アンプリコンは、約60bp〜約500bp、約60bp〜約400bp、約60bp〜約300bp、約60bp〜約200bp、または約60bp〜約150bpである。一部の実施形態では、標的アンプリコンは、約70bp〜約500bp、約70bp〜約400bp、約70bp〜約300bp、約70bp〜約200bp、または約70bp〜約150bpである。
【００７６】
一部の実施形態では、プライマーセットが隣接した標的領域は、約30bp、約40bp、約50bp、約60bp、約70bp、約80bp、約90bp、約100bp、約110bp、約120bp、約130bp、約140bp、約150bp、約160bp、約170bp、約180bp、約190bp、約200bp、約210bp、約220bp、約230bp、約240bp、約250bp、約260bp、約270bp、約280bp、約290bp、またはその間の任意の長さである。一部の実施形態では、標的アンプリコンは、約30bp、約40bp、約50bp、約60bp、約70bp、約80bp、約90bp、約100bp、約110bp、約120bp、約130bp、約140bp、約150bp、約160bp、約170bp、約180bp、約190bp、約200bp、約210bp、約220bp、約230bp、約240bp、約250bp、約260bp、約270bp、約280bp、約290bp、またはその間の任意の長さである。
【００７７】
本明細書において開示される方法での使用に適したプライマーは、例えば、DNAWorks、Gene2Oligoなどのコンピュータプログラムの助けを借りて、または本明細書に記載されるパラメータソフトウェアを使用して設計されてもよい。典型的には、プライマーは、約5〜約500、約10〜約100、約10〜約50、または約10〜約30ヌクレオチド長である。特定の例示的な実施形態では、プライマーのセットは、複雑な反応混合物の操作を容易にするために、実質的に類似した融解温度を有するように設計される。融解温度は、例えば、プライマー長およびヌクレオチド組成により影響され得る。
【００７８】
ある分子の別の分子への結合、例えば、標的配列のプローブへの結合に関する「特異的」または「特異性」は、その分子と他の分子の認識、結合、または複合体形成を実質的に含まない、二つの分子間での認識、結合、およびの安定な複合体の形成を意味する。
【００７９】
「実質的に相補的」は、ヌクレオチドまたは核酸の間、例えば、二本鎖DNA分子の二本鎖の間、またはオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖核酸上のプライマー結合部位の間、またはオリゴヌクレオチドプローブと一本鎖核酸上のプローブ結合部位との間での、二本鎖のハイブリダイゼーションまたは塩基対形成または形成を指す。相補的ヌクレオチドは、概して、AおよびT(もしくはAおよびU)、またはCおよびGである。二つの一本鎖RNAまたはDNA分子は、一つの鎖のヌクレオチドが、最適に整列され、適切なヌクレオチド挿入または欠失と比較され、他の鎖のヌクレオチドの少なくとも約80%、通常、少なくとも約90%〜95%、より好ましくは約98〜100%と対形成するとき、実質的に相補的であると言われる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるプローブは、それらの対応するプローブ結合部位と100%相補性を有する。あるいは、RNA鎖またはDNA鎖が、選択的なハイブリダイゼーション条件下でその相補鎖にハイブリダイゼーションする場合、実質的な相補性が存在する。典型的には、選択的なハイブリダイゼーションは、少なくとも14〜25個のヌクレオチドの区間にわたって少なくとも約65%が相補的であり、好ましくは、少なくとも約75%、より好ましくは、少なくとも約90%が相補的である場合、生じる。Kanehisa(1984年) Nucl. Acids Res. 12:203を参照のこと。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」は、「相補的」を含む。「相補的」は、配列の全長に渡り100%の配列同一性を有することを意味する。I配列は、一つ以上のヌクレオチド位置が人工ヌクレオチド(例えば、ロックド核酸)を含む場合であっても、依然として「実質的に相補的」または「相補的」である。例えば、相補的なポリヌクレオチドは、修飾されていないCの代わりに、化学的に修飾されたC(例えば5-メチルシトシン)を含有してもよい。
【００８１】
本明細書において提供される実施形態のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、一つまたは複数のロックド核酸(LNA)を含んでもよい。ロックド核酸は、2’から4’のメチレン架橋を含有するヌクレオチド酸性を含むが、これらに限定されない。本明細書において提供される一部の実施形態では、第二のヌクレオチド位置のDNAヌクレオチドは、化学的に修飾された窒素性塩基を含有する。本明細書において提供される実施形態のいずれかでは、化学修飾された窒素性塩基は、5-メチルシトシンである。一部では、オリゴヌクレオチドは、2’-デオキシ、2’-O-アルキル、または2’-ハロ修飾である少なくとも一つのヌクレオチドを含む。一部では、オリゴヌクレオチドは、5’キャップ構造、3’キャップ構造、または5’および3’キャップ構造を有する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、1または複数のホスホロチオエート架橋を含む。
【００８２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、一つまたは複数のロックド核酸(LNA)残基、または「ロックドヌクレオチド」を含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、一つまたは複数のロックド核酸(LNA)残基、または「ロックドヌクレオチド」を含有することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、他の糖または塩基の修飾を含有する一つまたは複数のヌクレオチドを含んでもよい。用語「ロックドヌクレオチド」、「ロックド核酸ユニット」、「ロックド核酸残基」、「LNA」または「LNA単位」は、本開示全体を通じて互換的に使用されてもよく、二環式ヌクレオシド類似体を指す。例えば、適当なオリゴヌクレオチドインヒビターは、BSNを含有するオリゴヌクレオチドとその相補的な標的鎖の間で形成された複合体に強化された熱安定性を与える、一つまたは複数の「立体構造的に強制された」または二環式糖ヌクレオシド修飾(BSN)からなり得る。LNAは、例えば、米国特許第6,268,490号、第6,316,198号、第6,403,566号、第6,770,748号、第6,998,484号、第6,670,461号、および第7,034,133号に記載されており、それら全てが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。LNAは、「ロックド」構造および/または二環構造をもたらす、リボース糖部分の2’と4’の炭素の間に余分な架橋を含有する修飾ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。用語「対応するロックドヌクレオチド」は、ヌクレオチドが、同じ塩基を含有するロックドヌクレオチドにより置換されたことを意味することが意図される。
【００８３】
「一致した」ヌクレオチドは、プローブの対向する鎖または結合部位上のヌクレオチドのワトソンクリック対であるヌクレオチドを指す。例えば、SNP座位として「A」を有する標的対立遺伝子に対するプローブは、プローブ中の対応するヌクレオチドが、「T」である場合、標的対立遺伝子と一致し、同様に、対応するヌクレオチドが、「A」である場合、SNP座位で「T」に、「C」について「G」、「G」について「C」に一致する。当技術分野で公知であるように、非天然のヌクレオチドを含む他のヌクレオチドを使用して、SNP座位と一致してもよい。
【００８４】
「二重鎖」は、完全または部分的に相補的である少なくとも二つのオリゴヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドを指し、安定な複合体が、センス鎖およびアンチセンス鎖で形成されるように、それらのヌクレオチドの全てまたは大部分の間でワトソンクリック型塩基対形成を行う。センス鎖は、ハイブリダイズされた二本鎖において5’から3’方向の鎖として識別されてもよく、一方、アンチセンス鎖は、ハイブリダイズされた二本鎖において3’から5’方向の鎖として同定されてもよい。用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」を互換的に使用して、安定な二本鎖の形成を意味する。安定な二重鎖は、二重鎖構造が、ストリンジェントな洗浄、例えば、二重鎖のTmより約5℃低い温度および低い1価の塩濃度、例えば、0.2M未満、または0.1M未満を含む状態により、破壊されないことを意味する。二重鎖に関して「完全一致」または「100%相補性」は、各鎖中の全てのヌクレオチドが、他の鎖中のヌクレオチドとワトソン-クリック塩基対形成を受けるように、すなわち、より短い鎖中の全てのヌクレオチドが、他のより長い鎖中のヌクレオチドとワトソンクリック塩基対形成を受けるように、二重鎖を構成するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド鎖が、互いと二重鎖構造を形成することを意味する。用語「二重」は、デオキシイノシン、2-アミノプリン塩基を含むヌクレオシド、PNAなどのヌクレオシド類似体の対形成と理解し、これらが利用され得る。二つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド間の二重鎖における「不一致」は、二重鎖中の1対のヌクレオチドがワトソン-クリック結合を経験しないことを意味する。
【００８５】
「ハイブリダイゼーション」は、二つの一本鎖ポリヌクレオチドが、非共有結合で結合して、安定な2本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指す。用語「ハイブリダイゼーション」はまた、3本鎖ハイブリダイゼーションを指し得る。生じた(通常)二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「二重」である。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、約1M未満、より通常には、約500mM未満、さらにより通常には、約200mM未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、5℃と低くてもよいが、典型的には、22℃より高く、より典型的には、約30℃より高く、約37℃を超過し得る。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件、すなわち、プローブがその標的サブ配列にハイブリダイズする条件下で行われる。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なる。フラグメントが長いほど、特異的なハイブリダイゼーションのため高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。他の要因が、塩基組成および相補鎖の長さ、有機溶媒の存在、および塩基ミスマッチの程度を含む、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与え得るため、パラメータの組み合わせは、任意の一つ単独の絶対尺度よりも重要である。概して、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびpHでの特定の配列のTmよりも約5℃低いように選択される。典型的なストリンジェントな条件には、pH7.0〜8.3における少なくとも0.01Mから1M以下のNaイオン濃度(または他の塩)の塩濃度、および少なくとも25℃の温度が含まれる。例えば、5×SSPE(750mMNaCl、50mMリン酸Na、5mM EDTA、pH7.4)および温度25〜30℃の条件は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適している。ストリンジェントな条件については、例えば、Sambrook、FritscheおよびManiatis、MolecularCloning A Laboratory Manual、第二編、Cold Spring Harbor Press (1989年)およびAndersonNucleic Acid Hybridization、第一編、BIOS Scientific Publishers Limited (1999年)を参照のこと。「特異的にハイブリダイズする（Hybridizingspecifically to）」または「特異的にハイブリダイズする（specifically hybridizing to）」などの発現は、その配列が、複合体混合物(例えば、全細胞の)DNAまたはRNAに存在するとき、ストリンジェントな条件下での、分子の、実質的に、特定のヌクレオチド配列もしくは配列への結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズを指す。
【００８６】
本開示によるプローブは、プローブ内の配列に対して相補的または実質的に相補的であるヌクレオチド配列(標的アンプリコン)の存在を検出するために、DNAまたはRNA試料において使用される可変長のDNAまたはRNAのフラグメントであるハイブリダイゼーションプローブと称されてもよい。プローブは、これにより、その塩基配列が、プローブと標的アンプリコンとの間の相補性に起因して、プローブが標的塩基対形成するのを可能にする一本鎖核酸(DNAまたはRNA)にハイブリダイズする。プローブは、共有結合化学結合、または本明細書に記載されるかもしくは当該技術分野で公知の基材とオリゴヌクレオチドを結合させる他の方法により、検出モジュール内の表面に連結される。
【００８７】
プローブへの標的アンプリコンのハイブリダイゼーションを検出するために、標的アンプリコンは、分子マーカーまたは標識、例えば、蛍光マーカーもしくは放射性部分などの他の検出可能な部分、または適切な酵素基質の存在下で着色または蛍光シグナルを生成する能力がある任意の酵素でタグ付け(または標識)される。
【００８８】
方法に応じて、プローブは、ホスホラミダイト法を使用して合成されてもよく、またはPCR増幅またはクローニングにより生成され、標識され得る。核酸プローブを作製する方法は、当業者に公知である。
【００８９】
本開示の装置および方法での使用に適した視覚的に検出可能なマーカーとしては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカーなどが挙げられる。好適な蛍光部分の例としては、黄色蛍光タンパク質(YFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、ウンベリフェロン、フルオレセリン、フルオレセリンイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリトリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。適切な生物発光マーカーの例としては、限定されないが、ルシフェラーゼ(例えば、細菌、ホタル、カブトムシなど)、ルシフェリン、エクオリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。視覚的に検出可能なシグナルを有する適切な酵素系の例としては、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの検出に有用な他の適切なマーカーは、当業者に公知である。
【００９０】
一部の実施形態では、本開示のプライマーセットは、検出可能な部分を含み、これにより、プライマーセットを使用した標的領域の増幅は、タグ付けされた標的アンプリコンの生成をもたらす。一部の実施形態では、検出可能な部分は、ビオチンタグである。フォワードプライマー、リバースプライマー、またはフォワードプライマーとリバースプライマーの両方は、ビオチン化であってもよい。一部の実施形態では、一方または両方のプライマーは、ビオチンタグ化される。標的アンプリコンをプローブにハイブリダイゼーションした後、第一の試薬の検出モジュールへの導入により検出が進行し、ビオチン標識マーカー(例えば、蛍光マーカーまたは酵素系)を含む第一の試薬が提供される。一部の実施形態では、第一の試薬は、ストレプトアビジンタグ付き西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を含む。検出チャンバーを洗浄することにより過剰な第一の薬剤を任意で除去した後、第二の試薬が提供されてもよい。一部の実施形態では、第二の試薬は、ペルオキシダーゼ(例えば、HRP)の基質である。
【００９１】
基質は、例えば、テトラメチルベンジジン(TMB)、3-エチルベンゾチアゾリン-6スルホン酸、o-フェニレンジアミン、Amplex Red、ホモバニリン酸、3,3’-ジアミノベンジジン、3-アミノ-9-エチルカルバゾール、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム、FastRed(Sigma)のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、基質は、TMBである。こうした実施形態では、検出モジュール2800中のTMBは、無色から青色に変化し、最終的に任意の陽性チャンバーで黄色に変化する。黄色は、検出モジュール2800が、検出作動中に、約40℃に加熱されたとき、生じる。対照的に、一部のELISAベースのフォーマットは、青色または緑色に変化する色変化を生じ、停止溶液に曝露されるまで黄色に進行しない。
【００９２】
他の実施形態では、基質の基質は、基質が酵素と接触している時に不溶性の色の付いた生成物を生じることにより、可視シグナルOPの産生を触媒するように処方された沈殿性基質である。こうした沈殿性基質としては、例えば、TMB(3,3',5,5'テトラメチルベンジジン)、DAB(3,3'ジアミノベンジジン)、または西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素用の4CN(4-クロロ-l-ナプトール)ベースのメンブレン基質、またはアルカリホスファターゼ用のBCIP(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート)ベースのメンブレン基質を挙げることができる。一部の実施形態では、沈殿性基質は、Surmodicsにより生産されるBioFX(登録商標)TMBHRPメンブレン基質であってもよい。一部の実施形態では、沈殿性基質は、室温で液体形態で最大1年間保存されたとき、安定性を維持することができる。他の実施形態では、沈殿性基質は、室温で液体形態で最大2年間保存されたとき、安定性を維持することができる。さらに、このような沈殿性基質は、可視化および判断をより容易にし得る、暗色を生じることができる。一部の実施形態では、沈殿性基質は、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、または少なくとも48時間持続する比色出力を生じることができる。さらなる例示の検出方法は、国際特許出願公開第2018005710A1号において提供されており、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９３】
検出可能な標識を核酸に取り込む方法は、周知である。典型的には、検出可能な標識(例えば、ハプテンまたは蛍光色素抱合デオキシリボヌクレオチド)は、例えば、PCR、ニック翻訳、ランダムプライマー標識、末端トランスフェラーゼテーリング(例えば、一つまたは複数の標識が、プライマー配列の切断後に加えられ得る)、およびその他(Ausubelら、1997年、CurrentProtocols In Molecular Biology、Greene Publishing and Wiley-Interscience、New Yorkを参照のこと)により、重合または増幅工程中に核酸に取り込まれる。
【００９４】
使用される検出方法は、核酸プローブで使用される特定の検出可能な標識に依存する。ある特定の例示的な実施形態では、標識は、顕微鏡、分光光度計、チューブルミノメーター、X線フィルム、シンチレーターなどにより検出されてもよい。
【００９５】
本明細書に記載される方法は、野生型生物または一つまたは複数の多型を有さない生物を含む、生物集団内の一つまたは複数の多型を有する生物の存在を決定するのに有用である。本開示の範囲内の生物としては、ウイルス、細菌および真菌が挙げられる。例示的なウイルスとしては、インフルエンザウイルス、C型肝炎ウイルス、デングウイルス、ウェストナイルウイルス、エボラウイルス、ラッサウイルスなどが挙げられる。当業者であれば、このリストが非限定的であり、他のウイルスが当業者に周知であり、当業者によって容易に特定できることを容易に理解するであろう。例示的な細菌としては、黄色ブドウ球菌/メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ボレリア種、肺炎連鎖球菌、クラミジア・トラコマチス、ナイセリア・ゴノレーなどが挙げられる。当業者は、このリストが、例示のみであること、および他の細菌が、当業者に周知であり、当業者により容易に特定できることを容易に理解するであろう。例示的な真菌としては、カンジダ種、アスペルギルス種、ヒストプラズマ・カプスラーツム、クリプトコッカス・ネオフォーマンス、クリプトコッカス・ガッティ、コクシジオイデス・イミチスなどが挙げられる。当業者は、このリストが、例示のみであること、および他の真菌が、当業者に周知であり、当業者により容易に特定できることを容易に理解するであろう。
【００９６】
「キット」は、本開示の方法を行うための任意のシステム、材料または試薬を指す。本明細書に記載される方法の文脈において、特定の生物の集団内の特定の多型を同定するためのキットは、アッセイ、反応試薬(例えば、適切な容器内のプライマー、酵素など)および/または支持材料(例えば、緩衝液、アッセイを行うための書面による指示など)を含んでもよい。例えば、キットは、本発明のアッセイまたは方法のための関連する反応試薬および/または支持材料を含有する一つまたは複数の囲い(例えば、箱)を含む。かかるコンテンツは、意図される受取人に一緒または別々にデリバリーされてもよい。例えば、第一の容器は、アッセイで使用するための酵素を含有してもよく、一方で第二の容器は、プライマーを含有してもよい。
【００９７】
対立遺伝子に対して「相補的」とは、オリゴヌクレオチドの配列が、対立遺伝子とワトソンクリック塩基対形成する能力があるヌクレオチドを含むことを意味する。プライマー結合部位は、SNP座位のアンチセンス鎖上にある場合。
【００９８】
Tmと省略される、用語「融解温度」は、二本鎖核酸分子の集団が、一本鎖に解離した半分になる温度を指す。核酸のTmを計算するためのいくつかの方程式は、当技術分野で周知である。標準参照によって示されるように、Tm値の単純な推定値は、方程式により計算されてもよい。核酸が、1MNaClで水溶液中にあるとき、Tm=81.5+0.41(%G+C)(例えば、AndersonおよびYoung、「QuantitativeFilter Hybridization」、in Nucleic Acid Hybridization (1985年)を参照されたい)。他の参考文献(例えば、Allawi,H. T.およびSanta Lucia, J., Jr.、Biochemistry 36、10581〜94 (1997年))には、Tmの計算のため構造特徴および環境特徴、ならびに配列特徴を考慮に入れた代替的な計算方法が含まれる。DNASoftware(商標)VisualOMP(商標）は、例えば、0.1Mの一価イオンの濃度および0.003Mのマグネシウムイオンの濃度を想定して、Tmを計算するために使用され得るプライマーおよびプローブを設計するためのソフトウェアである。標的アンプリコンの融解温度は、アンプリコン全体に及ぶオリゴヌクレオチドの計算融解温度、すなわち、隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを使用した増幅の完全な生成物の融解温度として定義される。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「熱力学的支点」は、プローブ結合を捕捉するためにアンプリコンの十分な結合が生じて、TMBを用いた比色検出を使用して目により検出可能なフローセルからシグナルを生成する、フローセル中の流体の温度を指す。例えば、熱力学的支点を超える温度でのフローセルからのシグナル強度は、熱力学的支点より5℃以上低い温度でフローセルからのシグナルより少なくとも10%、50%、100%、または200%強くてもよい。熱力学的支点を超える温度でのフローセルからのシグナル強度は、プローブを欠く検出表面でフローセルからのシグナルより少なくとも10%、50%、100%、または200%強くてもよい。概して、プローブの熱力学的支点は、プローブの計算されたプローブTmより少なくとも約10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、または4℃低い。熱力学的支点は、実験的に決定されてもよい。
【０１００】
別段示されない限り、用語装置、診断装置、診断システム、診断検査、診断検査システム、検査ユニット、およびそれらの変形は、互換的に使用され得る。
【０１０１】
一部の実施形態では、方法は、複合検査においてNG、シプロフロキサシン感受性NG、および／またはセフトリアキソン感受性NGを検出することを含む。一回の検査操作(すなわち、一回または複数回の追跡検査または「再検査」検査を必要とせずに)を介して個人化された検査を提供することにより、患者の結果は、AMRNG株の増殖を低減させながら改善することができる。「陰性」NG検査により、不必要な抗生物質の見込み処方が排除される。シプロフロキサシン感受性を示す「陽性」NG検査は、最後の頼みの綱のセフトリアキソンの処方を低減する。図1は、こうした個人化された(または個別化された)検査と関連する、短縮された時間および改善の概略図を示す。図2は、一実施形態による、反射検査を必要とする現在の検査方法と複合検査の間の比較を示す。例えば、上述のように、公知の検査は、大抵、非経口抗生物質となる。
【０１０２】
一部の実施形態では、方法は、A)標的細菌の存在およびB)第一の抗生物質に対する耐性を与える標的細菌内の遺伝子変異の存在を決定するために、生物学的試料に対して分子診断検査を行うことを含む。分子診断検査結果に基づき、第一の抗生物質または第二の抗生物質のいずれかが処方される。例えば、一部の実施形態では、標的細菌はNGであり、第一の抗生物質はシプロフロキサシンである。検査結果が、NGがシプロフロキサシンによる治療に対して感受性であることを示す場合、次に、シプロフロキサシンの処方が提供される。このように、NGを治療するためにもはや使用されていない特定の種類の抗生物質(例えば、シプロフロキサシン)を、治療プロトコルに再導入することができる。しかしながら、検査が、NGがシプロフロキサシンに耐性であることを示す場合、次に、セファロスポリンなどの第二の抗生物質が処方される。具体的には、「陰性」NG検査により、不必要な抗生物質の見込み処方が排除される。シプロフロキサシン感受性を示す「陽性」NG検査は、最後の頼みの綱のセフトリアキソンの処方を低減する。経口シプロフロキサシンに対する感受性を同定することは、広域スペクトルのセフトリアキソンの使用を最小限にし、最終系抗の生物質に対する進化的選択圧を低下させ、より古い抗生物質の有用性を引き延ばしながら、個人化された治療をもたらす。
【０１０３】
本明細書に記載される方法は、本明細書または各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第2016/109691号、名称「Devices and Methods for Molecular Diagnostic Testing」、国際特許出願公開第2017/185067号、名称「PrintedCircuit Board Heater for an Amplification Module」、国際特許出願公開第2018/005870号、名称「Devicesand Methods for Detection of Molecules Using a Flow Cell」、国際特許出願第PCT/US17/40112号、名称「Devicesand Methods for Nucleic Acid Extraction」、および国際特許出願公開第2019/060117号、名称「PortableMolecular Diagnostic Test Device and Methods for the Detection of TargetViruses」に示され、記載される診断装置のいずれかのような、任意の適当な分子診断装置上で行うことができる。
【０１０４】
図8〜10は、一実施形態による分子診断検査装置1000(「検査装置」または「装置」とも呼ばれる)の概略図である。検査装置1000は、ポリヌクレオチド内の一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有し、本明細書に記載される方法のいずれかに従って、生物学的試料を操作してSNPと関連する一つまたは複数の出力シグナルを生じるように構成される。一部の実施形態では、検査装置1000は、ポイントオブケア設定(例えば、医師のオフィス、薬局など)、分散検査施設、または使用者の自宅での使用に適している統合装置であり得る。同様に、一部の実施形態では、以下に記載される装置のモジュールは、検査装置が、さらなる機器、ドッキングステーションなどなしで完全に操作することができるように、単一の覆い内に収容される。さらに、一部の実施形態では、装置1000は、装置1000が、使用者の手で運ばれ、保持され、使用され、および/または操作され得るように、サイズ、形状および/または重量を有し得る(すなわち、それは「手持ち式」装置であり得る)。一部の実施形態では、検査装置1000は、自己完結型、単回使用装置であってもよい。
【０１０５】
一部の実施形態では、装置1000(および本明細書に示され、記載される装置のいずれか)は、CLIA-waived装置であってもよく、および/またはCLIA-waivedである方法に従い操作することができる。同様に、一部の実施形態では、装置1000(および本明細書に示され、記載される他の装置のいずれか)は、十分に単純な方法で操作されるように構成され、誤用の可能性を限定する、および/または不適切に使用された場合に危害のリスクを限定するのに十分な正確さで結果を生み出すことができる。一部の実施形態では、装置1000(および本明細書に示され、記載される他の装置のいずれか)は、使用者の判断をほとんど必要としない、および／または特定の操作工程が、容易および／または自動で制御される方法に従い、最小限の科学的訓練を受けた（または受けていない）使用者により操作され得る。一部の実施形態では、分子診断検査装置1000は、誤用(試薬の破損、試薬の期限切れ、試薬の漏出など)の限定された可能性をもたらす方法で、長期保存のために構成され得る。一部の実施形態では、分子診断検査装置1000は、最大約16か月、最大約12か月、最大約28か月、最大約24か月、最大約20か月、最大約18か月、最大12か月、最大6か月、またはそれらの間の任意の期間、保存されるように構成される。
【０１０６】
検査装置1000は、覆い1001、試料調製モジュール1200(試料ステージングモジュールとも呼ばれる)、増幅試薬モジュール1500、増幅モジュール1600、検出試薬モジュール1700、および検出モジュール1800を含む。一部の実施形態では、検査装置1000は、例えば、弁(例えば、弁4340などの試薬および/または試料の流れを制御する)、流体移動モジュール(例えば、流体移動モジュール4400)、および/または電子制御モジュール(例えば、電子制御モジュール4950)などの、本明細書に記載される任意の他の構成要素またはモジュールを含み得る。覆い1001は、試料調製モジュール1200または他の構成要素を含有(または部分的に含有)して、試料調製および/または分子検査のための統合装置を形成する、任意の構造であり得る。
【０１０７】
試料調製モジュール1200は、生物学的試料S1を受け取る試料投入体積を定義する。試料調製モジュール1200は、さらなる診断検査のため生物学的試料S1を操作し、および/または核酸の検出のため溶液を生じるための、本明細書に記載される任意の成分を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、試料調製モジュール1200は、一つまたは複数のヒーター、生物学的試料S1が操作され得る一つまたは複数のチャンバー、一つまたは複数の混合チャンバー、および/または特定のオンボード試薬(例えば、溶解緩衝液、RT酵素、対照生物など)を含み得る。一部の実施形態では、試料調製モジュール1200は、生物学的試料S1から核酸分子を抽出するように構成され、増幅試薬モジュール1500と共に、増幅モジュール1600に運ばれる入力溶液S2(図8を参照)を生成し得る。
【０１０８】
増幅試薬モジュール1500は、試料調製モジュール1200に流体的に結合され、本明細書に記載される方法のいずれかに従って所望される増幅を促進するための所望の増幅試薬を含有する。図8に示されるように、増幅試薬モジュール1500は、生物学的試料S1のポリヌクレオチド中に一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットPを含有する。SNPプライマーセットPは、本明細書において示され、記載されるSNPプライマーセットのいずれかを含み得る。プライマーセットPは、SNP座位を標的とする(例えば、SNP座位に隣接することにより)。SNPプライマーセットPに加えて、増幅試薬モジュール1500は、追加のプライマー、ヌクレオチド(例えば、dNTP)、およびDNAポリメラーゼなどの任意の他の適切な増幅試薬を含み得る。RT-PCR用途(例えば、ウイルス病原体用)では、増幅試薬モジュール1500は、逆転写酵素を含有してもよい。装置1000は、ポイントオブケア設定で単回使用のために構成されているため、増幅試薬は、増幅試薬モジュール1500のために製剤化され、および/または増幅試薬モジュール1500内にパッケージングされて、長期保存を強化することができる。したがって、一部の実施形態では、SNPプライマーセットPおよび他の増幅試薬は、最大約36か月、最大約32か月、最大約26か月、最大約24か月、最大約20か月、最大約18か月、またはその間の任意の期間の貯蔵寿命を有するように製剤化され得る。例えば、一部の実施形態では、SNPプライマーセットPは、凍結乾燥ペレットまたはビーズの形態であってもよい。
【０１０９】
一部の実施形態では、増幅試薬モジュール1500は、SNPプライマーセットPに流体連結されてもよく、SNPプライマーセットPを試料調製モジュール1200に(例えば、混合、再構成などのために)運ぶことができる。他の実施形態では、増幅試薬モジュール1500は、試料調製モジュール1200から出力を受け取り、出力をSNPプライマーセットPおよび他の増幅試薬と混合するように構成され得る。こうした実施形態では、増幅試薬モジュール1500は、全体積の試薬の局所濃度も確実にしながら、凍結乾燥ビーズを所与の入力体積で水和および/または再構成するように構成され得る。増幅試薬モジュール1500は、例えば、連続流混合チャネル、活性混合要素(例えば、攪拌ロッド)、および/または振動混合要素などの所望の溶液を生成するための任意の適切な機序を含み得る。次いで、混合した試料(増幅溶液S2と称される)を増幅モジュール1600に運ばれる。
【０１１０】
増幅モジュール1600は、流れ部材1610およびヒーター1630を含む。流れ部材(反応体積として機能する)1610は、増幅溶液S2が流れ得る、および/またはその中に標的核酸分子を増幅して検出されるべき標的アンプリコンを含有する出力検出溶液S3を生成するように維持され得る、体積または一連の体積を定義する、任意の適切な構造であり得る。ヒーター1630は、本明細書に記載の増幅動作のいずれかを行うために、流れ部材1610内の増幅溶液S2を加熱することができる、流れ部材1610に結合された任意の適切なヒーターまたはヒーターの群であり得る。例えば、一部の実施形態では、増幅モジュール1600(または本明細書に記載される増幅モジュールのいずれか)は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2017/0304829号、名称「PrintedCircuit Board Heater for an Amplification Module」に示され、記載される増幅モジュールに類似し得る。他の実施形態では、増幅モジュール1600(または本明細書に記載される増幅モジュールのいずれか)は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2016/109691号、名称「Devicesand Methods for Molecular Diagnostic Testing」に示され、記載される増幅モジュールに類似し得る。
【０１１１】
一部の実施形態では、流れ部材1610は、増幅溶液S2が維持され、加熱されて核酸分子を増幅し、これにより、検出溶液S2を生成する、単一体積を定義する。他の実施形態では、流れ部材1610は、増幅溶液S2が流れる、「スイッチバック」または蛇行動力伝達路を定義し得る。同様に、一部の実施形態では、流れ部材1610は、動力伝達路が、複数の位置でヒーター1630と交差するように蛇行した動力伝達路を定義する。このように、増幅モジュール1600は、増幅溶液S2が、複数の異なる温度領域を流れる、増幅反応の「フロースルー」を行うことができる。
【０１１２】
ヒーター1630は、調製された溶液を増幅するために本明細書に記載される機能を行うことができる、任意の適切なヒーターまたはヒーターの集合であり得る。一部の実施形態では、ヒーター1630は、調製された溶液が流れ、および/または所望の検査感度を確実にするための所望の数の増幅サイクル(例えば、少なくとも30サイクル、少なくとも34サイクル、少なくとも36サイクル、少なくとも38サイクル、または少なくとも40サイクル)を定義することができる、複数の温度ゾーンを確立することができる。ヒーター1630(および本明細書に記載されるヒーターのいずれか)は、任意の適切な設計のものであり得る。例えば、一部の実施形態では、ヒーター1630は、抵抗加熱ヒーター、熱電装置（例えば、ペルチェ装置)などであり得る。一部の実施形態では、ヒーター1630は、動力伝達路が複数の異なる点でヒーターを横切るように配置された一つまたは複数の直線状の「ストリップヒーター」であり得る。他の実施形態では、ヒーター1630は、動力伝達路において複数の異なる温度ゾーンを生じるための流れ部材1610のものに対応する幾何学的形状を有する一つまたは複数の蛇行したヒーターであり得る。
【０１１３】
増幅モジュール1600は、増幅溶液S2上でサーマルサイクル動作を行うと一般的に記載されるが、他の実施形態では、増幅モジュール1600(および本明細書に記載される増幅モジュールのいずれか)は、溶液内の核酸を増幅するために任意の適切な熱反応を行うことができる。一部の実施形態では、増幅モジュール1600(および本明細書に記載される増幅モジュールのいずれか)は、例えば、LoopMediated Isothermal Amplification（LAMP)、標的RNA分子を検出するのに有用であり得る核酸配列ベース増幅(NASBA)、鎖置換増幅(SDA)、多置換増幅(MDA)、分岐増幅(RAM)、または任意の他のタイプの等温プロセスを含む、任意の適切なタイプの等温増幅プロセスを行うことができる。
【０１１４】
検出試薬モジュール1700は、覆い1001内に配置され、第一の試薬容器1701、第一の試薬駆動装置1755、第二の試薬容器1702、および第二の試薬駆動装置1765を含む。検出試薬モジュール1700は、本明細書に記載される分子診断検査に関連して使用される第一の試薬R1(第一の試薬容器1701内)および第二の試薬R2(第二の試薬容器1702内)のオンボードストレージを提供する。一部の実施形態では、第一の試薬R1は、第一の試薬容器1701内に封印され、第二の試薬R2は、第二の試薬容器1702内に封印される。一部の実施形態では、検出試薬モジュール1700は、装置作動時に、使用のための試薬を放出することができる、一つまたは複数の穿孔器を含み得る。
【０１１５】
第一の試薬R1は、標的アンプリコン(例えば、増幅された溶液S3由来)の存在を示すシグナルの生成を促進するように製剤化された検出試薬である。一部の実施形態では、第一の試薬R1は、本明細書に示され、記載される組成物のストレプトアビジンタグ付き西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を含む。第二の試薬R2は、第一の試薬R1により触媒された時に出力信号(例えば、OP1、OP2）を生じるように製剤化された基質である。例えば、一部の実施形態では、第二の試薬R2は、本明細書に示され、記載されるタイプの基質(例えば、沈殿性基質)であり得る。検出モジュール1800は、生物学的試料S1における標的生物の存在もしくは不在、および/または標的生物のゲノム中のSNP座位での標的対立遺伝子の存在もしくは不在を示すための、増幅モジュール1600からの増幅された溶液S3を第一の試薬R1および第二の試薬R2と反応させて、一つまたは複数のシグナル(または出力)OP1、OP2を生じるように構成される。具体的には、検出モジュール1800は、検出チャネルを定義し、検出チャネル内に第一の検出表面1821および第二の検出表面1822を含む。第一の検出表面1821は、対立遺伝子が対立遺伝子特異的な方法で存在する(または存在しない)なら、標的アンプリコンの存在(または不在)の検出を可能にするのに十分な特異性を有する標的アンプリコンのアニーリングまたはハイブリダイゼーションを可能にするために、当該第一の検出表面1821に連結された第一のプローブを含む。第二の検出表面1822は、SNP座位での対立遺伝子の存在(または不在)に関係なく、標的アンプリコンの存在(または不在)の検出を可能にするのに十分な特異性を有する標的アンプリコンのアニーリングまたはハイブリダイゼーションを可能にするために、当該第二の検出表面1822に連結された第二のプローブを含む。検出モジュール1800はまた、第一の検出表面1821と第二の検出表面1822のいずれか、または両方に隣接する、取り囲む、または接触する非検出表面1826を含む。非検出表面1826は、装置1000からの出力シグナルの全体的な精度検出を強化することができるバックグラウンド領域を提供することができる。第一の検出表面1821および第二の検出表面1822は、検出モジュール1800内に定義された位置を有するものとして示され、記載されているが、他の実施形態では、検出モジュールは、モジュール内の任意の所望される順序または空間位置における任意の数の検出表面を含み得る。同様に、他の実施形態では、第一の検出表面1821および第二の検出表面1822は、本明細書に記載される標的アンプリコンのいずれかの存在または不在の検出を可能にするように構成され得る。さらに、一部の実施形態では、検出モジュール1800は、制御、追加の標的などのための追加の検出表面を含み得る。
【０１１６】
検出チャネルは、増幅モジュール1600および検出試薬モジュール1700のそれぞれと流体連通している(または流体連通し得る)。このように、標的アンプリコンを含有する増幅溶液S3は、検出チャネルに、検出表面1821、1822を横切って運ばれ得る。さらに、図9に示されるように、第一の試薬R1は、検出チャネルに、検出表面1821、1822を横切って運ばれ得る。検出面1821、1822は、増幅溶液S3が、検出表面1821、1822を横切って流れる時に標的アンプリコンが結合され得る一連の捕捉プローブを含む。プローブは、例えば、標的アンプリコンに捕捉されるか、または結合するよう製剤化された、本明細書に記載されるタイプの任意の適切なプローブであり得る。
【０１１７】
第一の試薬R1は、矢印AAにより示されるように、第一の試薬駆動装置1755を動かすことにより運ぶことができる。示されるように、第一の試薬は、検出表面を横切って流れ得る。第の試薬R1(すなわち、検出試薬)は、検出チャネルに運ばれ、捕捉されたアンプリコンに結合する。一部の実施形態では、検出モジュール1700は、捕捉されたアンプリコンの存在下で検出試薬R1を検出チャネル内でインキュベートして、結合を促進するように構成されたヒーター(図3〜5では示されていない)を含む。一部の実施形態では、ヒーターは、検出モジュール1700の温度を捕捉プローブの融解温度の約5℃以内に保つように制御され得る。他の実施形態では、ヒーターは、検出モジュール1700の温度を捕捉プローブの融解温度の約10℃または約15℃以内に保つように制御され得る。このように、SNP座位での対立遺伝子の検出は、ポイントオブケアでの検査および治療介入を可能にするのに十分な感度および特異性で達成され得る。本発明者らは、プローブ設計のガイドでありながら、融解温度のコンピューター予測は、最適なプローブ設計を正確に決定するには十分ではないことを決定した。理論により結び付けられないが、融解温度計算は、溶液中でのポリヌクレオチド相互作用を想定するが、ここでは、プローブは、検出モジュールの表面に連結されると考えられる。所望される作動特徴を達成するための候補プローブの実験スクリーニングが必要とされる。こうしたスクリーニングの例示的な方法は、本開示の実施例において提供される。特に、マイクロタイタープレートアッセイを使用して、本開示による分子診断装置の構築前にプローブ設計を選択し、最適化することができる。
【０１１８】
第二の試薬R2は、矢印BBにより示されるように、第二の試薬駆動装置1765を動かすことにより運ぶことができる。第二の試薬R2が、捕捉されたアンプリコンおよび結合検出試薬と反応すると、第一のシグナルOP1が、第一の検出表面1821から生じ、第二のシグナルOP2が、第二の検出表面1822から生じる。
【０１１９】
図8〜10には示されていないが、一部の実施形態では、検出試薬モジュール1700は、本明細書に記載される方法のいずれかによる標的SNPの検出を容易にするための他の任意の適切な試薬を含有し得る。例えば、一部の実施形態では、検出試薬モジュール1700は、一つまたは複数の緩衝液、イオン化合物、賦形剤、界面活性剤、保存剤、またはブロッキング試薬を含む洗浄溶液を含み得る。一部の実施形態では、洗浄溶液は、結合していないPCR産物および/または任意の残りの溶液を除去するために、検出チャネルに運ばれ得る。一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、塩化カリウム(KCl)、塩化マグネシウム(MgCl2)、PROCLIN300(商標)、および/またはポリソルベート20(TWEEN(登録商標)20)を含む。任意で、洗浄緩衝液は、ブロッキング剤(例えば、ウシ血清アルブミン(BSA))をさらに含む。特定の実施形態では、洗浄緩衝液は、約0.5×、約1.0×、または約1.5×PBSを含み、1.0×PBSは、137mM NaCl、10mMリン酸塩、2.7mM KClの最終濃度、およびpH約7.4を有する。一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、(PBS中の任意のKClに加えて)約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mM、約110mM、または約120mMKClを含む。一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、(PBS中の任意のKClに加えて)約60mM〜約90mM、約70mM〜約80nM、または約75mM KClを含む。一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、約0.5mM〜約10mMMgCl2、約1mM〜約7.5mM MgCl2、約1mM〜約5mM MgCl2、約1mM〜約4mMMgCl2、約1mM〜約3mM MgCl2、または約1mM〜約2mM MgCl2を含む。一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、約1mM、約1.5mM、約2mM、約2.5mM、約3mM、約3.5mM、または約4.0mMMgCl2を含む。特定の実施形態では、洗浄緩衝液は、1×PBS、約70mM〜約80mM KCl、約1mM〜約3mM MgCl2、約0.01%(v/v)〜約0.5%(v/v)ポリソルベート20を、pH約7.0〜約7.5(またはpH約7.4)で含み、任意で、防腐剤(例えば、0.03%(v/v)PROCLIN300(商標)）を含む。本開示を任意の特定の洗浄緩衝液に限定するものではないが、発明者らは、驚くべきことに、ある場合では、本開示の洗浄緩衝液が、本開示の装置および方法に増加した感度および/または特異性をもたらすことを発見した。
【０１２０】
図13は、一実施形態による分子診断検査装置4000(「検査装置」または「装置」とも呼ばれる)の概略図である。概略図は、図12に示される通り、検査装置4000の任意の主要な構成要素を記載する。検査装置4000は、ポイントオブケア設定(例えば、医師のオフィス、薬局など)、分散検査施設、または使用者の自宅での使用に適している統合装置（すなわち、モジュールが単一の覆いに含まれる）であり得る。一部の実施形態では、装置4000は、装置4000が、使用者の手で運ばれ、保持され、使用され、および/または操作され得るように、サイズ、形状および/または重量を有し得る(すなわち、それは「手持ち式」装置であり得る)。他の実施形態では、検査装置4000は、自己完結型、単回使用装置であってもよい。一部の実施形態では、検査装置4000は、再使用または装置を再使用しようとする試みを防止するためのロックアウトまたは他の機構と共に構成することができる。
【０１２１】
さらに、一部の実施形態では、装置4000は、CLIA-waived装置であってもよく、および/またはCLIA-waivedである方法に従い操作することができる。同様に、一部の実施形態では、装置4000(および本明細書に示され、記載される他の装置のいずれか)は、十分に単純な方法で操作されるように構成され、誤用の可能性を限定する、および/または不適切に使用された場合に危害のリスクを限定するのに十分な正確さで結果を生み出すことができる。一部の実施形態では、装置4000(および本明細書に示され、記載される他の装置のいずれか)は、使用者の判断をほとんど必要としない、および／または特定の操作工程が、容易および／または自動で制御される方法に従い、最小限の科学的訓練を受けた（または受けていない）使用者により操作され得る。一部の実施形態では、分子診断検査装置4000は、誤用(試薬の破損、試薬の期限切れ、試薬の漏出など)の限定された可能性をもたらす方法で、長期保存のために構成され得る。一部の実施形態では、分子診断検査装置4000は、最大約36か月、最大約32か月、最大約26か月、最大約24か月、最大約20か月、最大約48か月、またはそれらの間の任意の期間、保存されるように構成される。
【０１２２】
検査装置4000は、生物学的試料S1を操作して、標的アンプリコン(例えば、標的SNP)と関連する一つまたは複数の出力シグナルを生成するように構成され、それを使用して、本明細書に記載される分子診断方法のいずれかを行うことができる。具体的には、装置4000は、試料調製モジュール4200、不活化モジュール4300(溶解モジュールとも呼ばれる)、流体駆動(または流体移送)モジュール4400、混合チャンバー(増幅試薬モジュールとして機能する)4500、増幅モジュール4600、検出モジュール4800、および電力制御モジュール(示されていない)を含む。検査装置およびその中の特定の構成要素は、本明細書または全体が参照により本明細書に組込まれる、国際特許出願公開第2016/109691号、名称「Devicesand Methods for Molecular Diagnostic Testing」に示され、記載される分子検査装置のいずれかに類似し得る。したがって、特定のモジュール(例えば、流体駆動モジュール4400)の詳細な説明は、本明細書において提供されない。
【０１２３】
診断検査装置4000は、覆い4001(上の部分4010および下の部分4030を含む)を含み、その中に本明細書に記載されるモジュールが完全または部分的に包含される。同様に、覆い4001(上の部分4010および/または下の部分4030を含む)は、モジュールを少なくとも部分的に囲い、および/または封入する。図11〜12に示されるように、装置4000は、試料投入モジュール4170、試料調製モジュール4200、不活化モジュール4300、流体駆動(または流体移送)モジュール4400、増幅試薬モジュール4500(図11を参照)、増幅モジュール4600、検出モジュール4800、試薬貯蔵モジュール4700、回転弁4340、および電力制御モジュール4950を含む。一部の実施形態では、試料調製モジュール4200は、試料投入モジュール4170および/または不活性化(溶解とも呼ばれる)モジュール4300を含むとみなされ得るが、他の実施形態では、これらのモジュールは、試料調製モジュール4200とは異なるとみなされ得る。一部の実施形態では、試料調製モジュール4200は、増幅試薬(または混合)モジュール4500を含むとみなされ得る。
【０１２４】
覆い部材4001は、上の覆い4010、下の覆い4040、垂直マニホールド4035、および試料移送マニホールド4100を含む。示されるように、上の覆い4010は、検出モジュール4800で整列された一連の検出開口部4011を定義する標識4020を含む。このように、検出モジュール4800の各検出表面により、および/またはそれら上で生じるシグナルは、適切な検出開口部4011を通して目に見える。一部の実施形態では、上の覆い4010および/または標識4020は、不透明(または半透明)であり、これにより、検出開口部を「構成する」または強調する。一部の実施形態では、例えば、上の覆い4010は、検出開口部4011を強調するための印4017(例えば、太い線、着色など)を含み得る。例えば、一部の実施形態では、上部ハウジング4010は、特定の疾患(例えば、クラミジア・トラコマチス（Chlamydiatrachomatis）(CT)、ナイセリア・ゴノレー（Neisseria gonorrheae）(NG)および膣トリコモナス(TV))または対照に対する検出開口部を同定するしるし4017を含み得る。
【０１２５】
上の覆い4010は、試料蓋4140が移動可能に結合される蓋部分を含む。上部ハウジング4010は、リッド4140が開位置にある時に、リッド4140および試料投入駆動装置4050の下向きの動きを防止するためにリッド4140が係合するロック面を含む。
【０１２６】
図16を参照すると、覆い部4001は、両方の構造的支持体をもたらし、装置4000内で運ばれる様々な流体の流路を定義する、垂直マニホールド4035を含む。特に、垂直マニホールド4035は、試薬が試薬モジュール4700から検出モジュール4800に運ばれる一連の試薬通路を定義する。さらに、垂直マニホールド4035は、通気が、装置4000全体に渡り流体移動を促進するのを可能にする一つまたは複数の通気通路を定義する。
【０１２７】
覆い部4001は、両方の構造的支持体をもたらし、装置4000内で運ばれる様々な流体の流路を定義する、試料位相マニホールド4100を含む。特に、試料移送マニホールド4100は、試料投入部4102、洗浄部4103、溶出部4104、および試薬部4105を含む。
【０１２８】
試料調製モジュール4200は、試料投入モジュール4170、洗浄モジュール4210、溶出モジュール4260、フィルター部4230、および様々な構成要素を結び付ける様々な流体導管(例えば、管、ライン、弁など)を含む。装置4000はまた、溶解モジュール4300および増幅試薬(または混合)モジュール4500を含み、これは、試料調製モジュール4200と一緒に、本明細書に記載される方法のいずれかに従い、核酸の抽出および増幅溶液の調製を行う。したがって、試料調製モジュール4200、試料投入モジュール4170、不活化モジュール4300、および増幅試薬モジュール4500は、別個のモジュールとして記載されているが、他の実施形態では、試料調製モジュール4200の構造および機能は、不活化モジュール4300、増幅試薬モジュール4500、および/または試料投入モジュール4170内に含まるか、または行われ、またその逆であり得る。同様に、本明細書に記載される試料投入モジュール、試料調製モジュール、不活化モジュールおよび/または溶解モジュールのいずれかは、本明細書に記載される試料調製または核酸抽出の方法のいずれかを行うための他のモジュールの構造のいずれか、および/または機能のいずれかを含み得る。外部試料調製および煩雑な器具の必要性を排除することにより、装置4000は、ポイントオブケア設定(例えば、医師のオフィス、薬局など)内または使用者の自宅での使用に適し、任意の適切な生物学的試料S1を受け取ることができる。生物学的試料S1(および本明細書に記載される投入試料のいずれか)は、本明細書に記載される試料のタイプのいずれかであり得る。
【０１２９】
試料投入モジュール4170は、生物学的実体を含有する生物学的試料S1を受け取り、試料調製モジュール4200(例えば、濾過部4230)の残りの要素に向かい生物学的試料を運ぶように構成される。試料投入モジュール4170は、試料移送マニホールド4100の試料導入部4102、試料投入(または第一の)駆動装置4050、および蓋4140を含む。図17を参照すると、試料移送マニホールド4100の試料投入部4102は、円筒形の覆い4172およびカバーを含む。示されるように、円筒形の覆い4172の上面(上面4173および/またはカバーの一部を含む)および第一の駆動装置4050の内部表面は、生物学的試料が検査開始時に運ばれる、試料投入体積4068を定義する。円筒形の覆い4172の外側の部分は、第一の駆動装置4050の内部表面をスライド可能に連動して、流体密封シールを形成する一つまたは複数のシール4177を含む。一部の実施形態では、試料投入体積4068または試料投入モジュール4170の他の部分は、試薬(例えば、本明細書に記載される陽性対照または他の試薬)を含み得る。
【０１３０】
円筒形の覆い4172は、試料移送マニホールド4100により定義される試料投入通路の間にあり(および流体連通し)、洗浄モジュール4210および濾過部4230と流体連通する、第一(または垂直)の流体通路4176を定義する。このようにして、生物学的試料が、第一の駆動装置4050により圧縮されるとき、これは、試料投入体積4068から、第一の流体通路を通って、濾過部4230に向かって運ばれる。
【０１３１】
洗浄モジュール4210は、試料調製モジュール4200(例えば、濾過部4230)の残りの要素に向かって洗浄溶液を運ぶように構成される。一部の実施形態では、洗浄モジュール4210は、所望される動作順序から起動できないように構成される。具体的には、一部の実施形態では、洗浄モジュール4210は、生物学的試料が、試料調製モジュール4200に運ばれるまで、ロックされるように構成される。洗浄モジュール4210は、試料移送マニホールド4100の洗浄部4103、洗浄(または第二の)駆動装置4070、および洗浄容器を含む。図17を参照すると、試料移送マニホールド4100の洗浄部4103は、円筒形の覆い4211および上部表面（またはカバー）（示されていない）を含む。円筒形の覆い4211の上の部分は、洗浄容器(示されていない)が配置される、体積4212を定義する。洗浄容器は、試料洗浄溶液が、長期間(例えば、6か月以上)保存されることを可能にする密封された洗浄容器であり得る。洗浄容器内の洗浄溶液は、任意の適切な溶液であり得る。洗浄モジュール4210は、洗浄(または第二の)駆動装置4070により起動される。
【０１３２】
本明細書に記載されるように、生物学的試料および洗浄溶液は、濾過部4230を通して運ばれる。濾過部は、所望される粒子(および溶出緩衝液)を溶解モジュール4300に運ぶための溶出緩衝液(バックフラッシュ動作を介して)を受け取るように構成される。濾過動作後、溶出緩衝液および捕捉された粒子は、濾過部4230から流れ出て、試料出口ポートを介して溶解モジュール4300に向かって流れる。
【０１３３】
試料調製モジュール4200の溶出モジュール(または部材)4260は、覆い内に収容され、溶出組成物が貯蔵される溶出体積を定義する。溶出組成物は、本明細書に記載される溶出組成物のいずれかであり得る。一部の実施形態では、溶出組成物は、フィルター膜からの任意の結合した細胞および/または核酸分子(例えば、DNA)の放出を可能にするプロテイナーゼKを含み得る。濾過部が、上で記載されるように、逆流構成にトグルで留められるとき、溶出モジュール4260からの出力は、濾過部4230と流体連通して選択的に配置され得る。したがって、溶出モジュール4260は、溶出体積の方への、および/または溶出体積への逆流を防止するためのチェック弁、ダックビル弁などの任意の適切な流れ制御装置を含み得る。
【０１３４】
一部の実施形態では、溶出モジュール4260は、所望される動作順序から起動できないように構成される。具体的には、一部の実施形態では、溶出モジュール4260は、生物学的試料が、試料調製モジュール4200に運ばれ、洗浄操作（上で記載された）が生じるまで、ロックされるように構成される。溶出モジュール4260は、試料移送マニホールド4100の溶出部4104、試薬(または第三の)駆動装置4080、および溶出プランジャー(示されていない)を含む。図17を参照すると、試料移動マニホールド4100の溶出部4104は、溶出緩衝液(または組成物)が含有される、溶出体積4263を定義する円筒形の覆い4262を含む。溶出モジュール4260は、試薬(または第三の)駆動装置4080により起動される。
【０１３５】
溶解モジュール4300は、チャンバー本体およびヒーターを含む。使用時に、試料(例えば、濾過された試料)は、チャンバー本体に運ばれ、溶解温度範囲内の第一の温度まで加熱されて、溶液中の特定の成分を溶解させるか、または溶解が生じた後に投入流体に存在する酵素を不活化する。一部の実施形態では、溶解モジュール4300は、RT-PCRと共に使用することができ、溶液内のリボ核酸(RNA)分子を放出する温度で溶液を加熱または維持することができる。
【０１３６】
溶解および/または不活化操作後、溶解モジュール4300からの出力は、不活化モジュール4300の出力を試薬と混合して、増幅溶液を生成する、混合モジュール(増幅試薬モジュールとも呼ばれる)4500に運ばれ得る。一部の実施形態では、増幅試薬モジュール4500は、生物学的試料S1のポリヌクレオチド中に一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する。SNPプライマーセットPは、本明細書において示され、記載されるSNPプライマーセットのいずれかを含み得る。一部の実施形態では、増幅試薬モジュール4500は、全体積中の試薬の局所濃度も確保しながら、予め決定された投入体積で試薬を再構成するように構成される。一部の実施形態では、混合チャンバーモジュール4500は、増幅モジュール4600に十分な体積の流体を生成し、および／または運んで、検出モジュール4800に十分なボリュームの出力をもたらすよう構成される。混合モジュール4500は、全体が参照により本明細書に取り込まれる、国際特許出願公開第2016/109691号、名称「Devicesand Methods for Molecular Diagnostic Testing」に示され、記載されるような、任意の適切な混合モジュールであり得る。
【０１３７】
流体駆動(または移動)モジュール4400は、診断検査装置4000内の溶液の圧力差および/または流れを生じるように構成されたポンプまたは一連のポンプであり得る。同様に、流体移送モジュール4400は、流体圧力、流体の流れを生じ、および/またはそうでなければ、装置4000の様々なモジュールを通して生物学的試料および試薬を運ぶように構成される。流体移送モジュール4400は、その中の試料流と接触する、および/または試料流を受け取るように構成される。したがって、一部の実施形態では、装置4000は、流体移送モジュール4400および/または試料調製モジュール4200の汚染が、以前の実行から汚染され、これにより、結果の制度にマイナスに影響する可能性を排除するために単回使用用に特別に構成される。流体移送モジュール4500は、全体が参照により本明細書に取り込まれる、国際特許出願公開第2016/109691号、名称「Devicesand Methods for Molecular Diagnostic Testing」に示され、記載されるような、任意の適切な流体移送モジュールであり得る。
【０１３８】
増幅試薬モジュール4500内で混合された後、次に、調製された試料は、増幅モジュール4600(図14において矢印EEにより示される)に運ばれる。増幅モジュール4600は、流れ部材4610およびヒーター4630を含む。流れ部材4610は、その調製された溶液が、流れ、および/または溶液内の標的核酸分子を増幅するために維持され得る体積または一連の体積を定義する、任意の適切な流れ部材であり得る。ヒーター4630は、本明細書において記載される増幅動作のいずれかを行うための流れ部材4610内の調製された溶液を加熱することができる流れ部材4610に連結された任意の適切なヒーターまたはヒーターの群であり得る。
【０１３９】
一部の実施形態では、流れ部材4610は、調製された溶液を維持し、加熱して、調製された溶液内の核酸分子を増幅する単一の体積を定義する。他の実施形態では、流れ部材4610は、調製された溶液が流れる「スイッチバック」または蛇行流路を定義し得る。同様に、流れ部材4610は、動力伝達路が、複数の位置でヒーター4630と交差するように、湾曲した動力伝達路を定義する。このように、増幅モジュール4600は、調製された溶液が、複数の異なる温度領域を流れる、増幅反応の「フロースルー」を行うことができる。
【０１４０】
増幅モジュール4600は、調製された溶液上で熱サイクル動作が行われると一般的に記載されるが、他の実施形態では、増幅モジュール4600は、溶液内の核酸を増幅するために任意の適切な熱反応を行うことができる。一部の実施形態では、増幅モジュール4600(および本明細書に記載される増幅モジュールのいずれか)は、例えば、LoopMediated Isothermal Amplification（LAMP)、標的RNA分子を検出するのに有用であり得る核酸配列ベース増幅(NASBA)、鎖置換増幅(SDA)、多置換増幅(MDA)、分岐増幅(RAM)、または任意の他のタイプの等温プロセスを含む、任意の適切なタイプの等温増幅プロセスを行うことができる。
【０１４１】
装置4000により可能にされる検出方法は、検出試薬および装置4000内の他の物質の順次送達を含む。さらに、装置4000は、ポイントオブケア位置(または他の分散された位置)で使用するための「既製の」製品であるように構成され、従って、長期貯蔵用に構成される。したがって、試薬貯蔵モジュール4700は、長期貯蔵容器から試薬を取り出すよう、使用者のための単純な非経験的工程、単一の使用者動作を使用してそれらの貯蔵容器から全ての試薬を取り出すため、構成される。一部の実施形態では、試薬貯蔵モジュール4700および回転選択弁4340は、試薬が、使用者が介入することなく、検出モジュール4800で一度に使用されることを可能にするよう構成される。
【０１４２】
具体的には、装置4000は、初期使用者操作の最後の工程(すなわち、試薬駆動装置4080の抑制)が、貯蔵された試薬の分注をもたらすように、構成される。この動作は、部材に存在する密封された試薬容器を粉砕し、および/または開封し、デリバリーのために液体を移動させる。回転切換弁4340は、試薬モジュール4700が、この工程のため通気されることを可能にし、これにより、試薬容器が開口するのを可能にするが、このプロセスが終了すると、タンクへの通気孔を閉鎖する。したがって、試薬は、検出モジュール4800において必要とされるまで、試薬モジュール4700に留まる。所望される試薬が、必要されるとき、回転弁4340は、試薬モジュール4700への適切な通気経路開口し、流体駆動モジュール4400は、試薬モジュール4700の出力ポートに(検出モジュール4800を介して)真空を適用し、これにより、試薬モジュール4700から試薬を運ぶ。試薬モジュール4700および弁4340は、全体が参照により本明細書に取り込まれる、国際特許出願公開第2016/109691号、名称「Devicesand Methods for Molecular Diagnostic Testing」に示され、記載されるような、試薬モジュールおよび弁に類似し得る。
【０１４３】
検出モジュール4800は、増幅モジュール4600から出力を、および試薬モジュール4700からの試薬を受け取り、初期投入試料における標的生物の存在または不存を示すための比色変化を生じるように構成される。検出モジュール4800はまた、検査の一般的な正しい動作を示す比色シグナル(陽性対照および陰性対照)を生じる。一部の実施形態では、反応により誘発される色の変化は、読みやすく、二進法であり、影または色調を解釈する必要はない。図13および14を参照すると、検出モジュールは、蓋(示されていない)、検出覆い4810およびヒーター4840を含む。ヒーター4840は、本明細書において、および全体が参照により本明細書に取り込まれる、国際特許出願公開第2016/109691号、名称「Devicesand Methods for Molecular Diagnostic Testing」に示され、記載されるような、配線基板ヒーターのいずれかに類似し得る。
【０１４４】
蓋および検出覆い4810は、検出のためのフローセルを形成する。覆い4810は、試料投入部4813、試薬投入部、検出部4821、および出口部4828を有する検出チャンバー/チャネル4812を定義する。試料投入部4813は、増幅モジュール4600の出口に流体連結され、増幅された試料を受け取る、試料投入ポート4814を含む。試薬投入部は、第一の試薬投入ポート4815、第二の試薬投入ポート4816、第三の試薬投入ポート4817、および第四の試薬投入ポート4818を含む。第一の試薬投入ポート4815は、垂直マニホールド4035を介して試薬モジュール4700に連結される。したがって、第一の試薬(例えば、試薬モジュール1700を参照して上で記載された第一の試薬R1などの検出試薬)は、第一の試薬投入ポート4815を介して検出チャネル4812に運ばれ得る。第二の試薬投入ポート4816は、垂直マニホールド4035を介して試薬モジュール4700に連結される。したがって、使用時に第二の試薬(例えば、洗浄溶液)は、第二の試薬投入ポート4816を介して検出チャネル4812に運ばれ得る。第三の試薬投入ポート4817は、垂直マニホールド4035を介して試薬モジュール4700に連結される。したがって、使用時に、第三の試薬(例えば、試薬モジュール1700を参照して上で記載された第二の試薬R2などの検出試薬)は、第三の試薬投入ポート4817を介して検出チャネル4812に運ばれ得る。第四の試薬投入ポート4818は、垂直マニホールド4035を介して試薬モジュール4700に連結される。したがって、使用時に、第四の試薬(例えば、試薬モジュール1700を参照して上で記載された第二の試薬R2などの検出試薬の第二の流れ)は、第一の試薬投入ポート4818を介して検出チャネル4812に運ばれ得る。
【０１４５】
検出チャネル4812は、入口部4811、検出部4821、および出口部4828を含む。検出部(または「読み取りレーン」)4821は、一連の検出表面により少なくとも部分的に定義され、および/または一連の検出表面を含む。検出表面4821は、検出溶液が、検出表面4821を横切って流れるとき、標的アンプリコンが結合され得る一連の捕捉プローブを含む。例えば、捕捉プローブは、一つまたは複数の対立遺伝子特異的プローブ、SNP座位の外側の標的アンプリコンに結合する一つまたは複数の捕捉プローブ、および/または同じ生物に対して第二の標的アンプリコンに結合する一つまたは複数の捕捉プローブを含んでもよい。一部の実施形態では、検出表面4821は、複数のSNP座位および/または複数の標的生物を使用した、多重検出および/または薬物感受性決定のため構成される。捕捉プローブは、検出モジュール1800に関して上で記載されたものなどの、標的アンプリコンを捕捉するか、または結合するために製剤化された任意の適切なプローブであり得る。
【０１４６】
装置4000を使用して、本明細書に記載される方法のいずれかを行うことができる。装置を使用するため、生物学的試料は、上で記載されるように、試料投入体積4068にまず配置される。次に、蓋4140は、それに密接した一に移動され、これにより、試料投入体積4068を封入する。蓋4140が閉じられた後、第一の駆動装置4050を操作して、試料投入モジュール4170を作動させることができる。第一の駆動装置4050の移動は、試料投入体積4068を圧縮し、試料を濾過部4230まで押し込む。次に、第二の駆動装置4070は、押し込まれ得る。これにより、上で記載されるように、洗浄溶液が濾過部4230に運ばれる。次に、第三の駆動装置4080を押し込み、濾過部4230が起動され、また、上で記載した通り、溶出溶液が、濾過部4230に運ばれる。第三の駆動装置4080の駆動はまた、試薬キャニスタから試薬を放出する。
【０１４７】
装置4000は、濾過部4230を含むと記載されるが、一部の実施形態では、試料調製装置は、濾過または濾過部を含む必要はない。例えば、一部の実施形態では、試料投入は、上で示された通り、溶解チャンバー4300と類似する溶解/不活化チャンバーに直接連結されてもよい。濾過部を有しない装置の利点は、装置における圧力がより低いこと、フィルターを破壊するリスクがないこと、部品がより少ないこと、必要な試薬がより少ないこと、臨床試料基質からの標的生物のより高い回収率および標的生物由来のDNAのより高い回収率を含む。こうした実施形態では、装置は、試料が、投入モジュール4170から溶解モジュール4300に直接流れるという点で装置4000とは異なる。一部の実施形態では、試料は、特殊溶解緩衝液または溶解酵素を必要とせずに加熱することにより、溶解されてもよい。試料の細胞から放出された任意のプロテアーゼまたはヌクレアーゼは、加熱により不活化される。例えば、試料は、溶解モジュールに流れ込み、モジュールが、設定温度(例えば90℃より高い)に到達するまで保持され、次に、不活化セグメントを通して流されてもよい。不活化セグメントでは、試料は、急速に95℃に加熱され、試料中の細胞が溶解され、細胞内のタンパク質が不活化される。
【０１４８】
一態様では、本開示は、分子診断装置であって、ポリヌクレオチドを含む生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュール；ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール；反応体積およびヒーターを含む増幅モジュールであって、反応体積は、生物学的試料およびプライマーセットを含む増幅溶液を受け取るよう構成され、ヒーターは、熱エネルギーを反応体積に伝達して、ポリヌクレオチドを増幅して、SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生成するように構成される、増幅モジュール；ならびに標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールであって、SNP座位が別の対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位への結合を最小にしながら、SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位に結合するよう設計されたプローブを含む、検出モジュールを含む、分子診断装置を提供する。
【０１４９】
一部の実施形態では、プライマーセットは、SNP座位に隣接するように設計される。
【０１５０】
一部の実施形態では、プライマーセットが隣接する標的領域の長さは、約60〜約140塩基対である。
【０１５１】
一部の実施形態では、プライマーセットが隣接する標的領域の長さは、約80〜約120塩基対である。
【０１５２】
一部の実施形態では、標的アンプリコンは、最小の二次構造を含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、SNP座位を標的とするよう設計されたプライマーセットが、i)アンチセンス鎖上の標的領域の5’末端の上流プライマー結合部位に実質的に相補的な上流オリゴヌクレオチドプライマー；およびii)センス鎖上の標的領域の3’末端の下流プライマー結合部位に実質的に相補的な下流オリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、分子診断装置は、検出モジュールの温度を、第一のプローブの融解温度よりも約5℃、約10℃、または約15℃低い温度で維持するように構成された温度コントローラを含む。
【０１５５】
一部の実施形態では、検出モジュールは、検出モジュールについて予め決定された温度を維持するように構成された温度コントローラを備え、第一のプローブは、予め決定された温度より約5℃、約10℃、約15℃低い融解温度を有するように設計される。
【０１５６】
一部の実施形態では、プローブは、SNP座位を含むプローブ結合部位に実質的に相補的であり、標的対立遺伝子と一致したヌクレオチドを含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、プローブは、プローブ結合部位に対して最大二つのヌクレオチドミスマッチを含む。
【０１５８】
一部の実施形態では、プローブは、プローブ結合部位に完全に相補的である。
【０１５９】
一部の実施形態では、プローブは、SNP座位を標的とするためにプライマーセット設計と重複しない。
【０１６０】
一部の実施形態では、検出モジュールは、第二のプローブ結合部位に実質的に相補的な第二のプローブを含み、第二のプローブ結合部位は、SNP座位を含まない。
【０１６１】
一部の実施形態では、第二のプローブ結合部位は、第一のプローブの結合部位と重複しない。一部の実施形態では、第一のプローブの結合部位と第二のプローブの結合部位は、部分重複(例えば、1nt、2nt、3nt、またはそれ以上)を有する。一部の実施形態では、第二のプローブは、SNP座位での対立遺伝子間を区別しないように設計されているため、第二のプローブの結合部位は、SNP座位を含まない。
【０１６２】
一部の実施形態では、検出モジュールは、標的アンプリコン内の第二のプローブ結合部位に実質的に相補的な第二のプローブを含み、第二のプローブ結合部位は、第一のプローブの結合部位を重複しない。
【０１６３】
一部の実施形態では、標的対立遺伝子は、薬物耐性対立遺伝子である。
【０１６４】
一部の実施形態では、分子診断装置は、生物学的試料中の薬物耐性対立遺伝子を特異的に検出する。
【０１６５】
一部の実施形態では、対立遺伝子は、薬物感受性対立遺伝子である。
【０１６６】
一部の実施形態では、分子診断装置は、生物学的試料中の薬物耐性対立遺伝子を特異的に検出する。
【０１６７】
一部の実施形態では、SNP座位は、gyrA領域内にある。
【０１６８】
一部の実施形態では、プライマーセットは、gyrA 91座位に隣接するように設計される。
【０１６９】
一部の実施形態では、プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さは、約60〜約140塩基対である。
【０１７０】
一部の実施形態では、プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さは、約80〜約120塩基対である。
【０１７１】
一部の実施形態では、プライマーセットが隣接したgyrA領域の長さは、二次構造を含む。
【０１７２】
一部の実施形態では、第一のプローブは、薬物耐性を付与するgyrA Ser-91部位での他のSNPへの結合を最小にしながら、野生型のシプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型への結合を最大化するように設計される。
【０１７３】
一部の実施形態では、第一のプローブは、gyrA Ser-91をコードするコドンを含む第一のプローブ結合部位に実質的に相補的であり、第一のプローブは、シプロフロキサシン感受性gyrASer-91遺伝子型をコードする対立遺伝子に一致するヌクレオチドを含む。
【０１７４】
一部の実施形態では、第一のプローブは、シプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型をコードする対立遺伝子と、シプロフロキサシンに対する耐性を付与するgyrA Ser-91部位をコードする抗対立遺伝子とを識別する。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、用語「識別」は、配列の増幅された領域内の対象の特定のSNPの存在を決定する装置の能力または力を指す。例えば、装置が、検出モジュールに導入される標的アンプリコン(または他のポリヌクレオチド)中のSNP座位における標的対立遺伝子の存在を示す(標的アンプリコンが、増幅と検出モジュールの両方を有する装置上で生成されるか;検出モジュールを有するが、増幅モジュールを有さない装置に供給されるか、または増幅モジュールを有する装置から検出モジュールを有する装置に伝達されるかどうか)、SNP特異的捕捉プローブからのシグナルの強度を生じてもよい。一部の実施形態では、捕捉プローブを有する検査スポット(例えば、検出表面検出表面4821)で装置により生成されるシグナル(例えば、比色変化)は、SNP座位で標的対立遺伝子を欠く標的アンプリコン(または他のポリヌクレオチド)が、検出モジュールに提供されるときに、同じまたは同等の装置により生成されるシグナルと比較される。言い換えると、反応基準は、同様に製造された装置からのシグナル強度の標準化により設定することができる。制御プローブは、装置の最適な特性である。一部の実施形態では、検査スポットから装置により生成されるシグナルは、制御捕捉プローブを有する制御スポット(例えば、検出表面4821)で装置により生成されるシグナルと比較される。例えば、装置を操作または較正して、標的対立遺伝子の存在についての指標として二つの検出表面(捕捉プローブおよび制御捕捉プローブ)で類似または実質的に等しいシグナルを生じ、標的アンプリコン(または他のポリヌクレオチド)が、SNP座位で標的対立遺伝子を欠く、対照捕捉プローブと比較して、捕捉プローブから低減されたシグナルを生じてもよい。言い換えると、二つの検出表面からのシグナルは、生物学的試料が、薬物感受性(または薬物耐性)病原体(例えば、抗生物質感受性細菌)由来のポリヌクレオチドを含むとき、類似するか、または実質的に等しく、生物学的試料が、薬物耐性(または薬剤感受性)病原体(例えば、抗生物質耐性細菌)由来のポリヌクレオチドを含むとき、異なり得る。したがって、本開示の装置および方法の一部の実施形態では、装置は、器具または使用者が、特徴を有する（例えば、対立遺伝子の存在）検査ポリヌクレオチドと、その特徴を有さない（例えば、対立遺伝子の不存）検査ポリヌクレオチドを区別されることを可能にする、参照シグナルと区別されるように、装置が、参照ポリヌクレオチドに応答して生成される参照シグナルとの比較において十分に異なる検査ポリヌクレオチドに応答して検査シグナルを生成する。理論により結び付けられないが、制御プローブは、一部の実施形態では、少なくとも三つの役割のうちの一つまたは複数:1)標的(例えば、gyrA)アンプリコンが、実際に装置により生成されたことを確認すること；2)「SNPの存在」または「SNPの不存」の出力を行うために、使用者(または装置自体)が、SNP特異的捕捉プローブと制御捕捉プローブとの間のシグナル強度を比較することを可能にすること；および3)(SNPの不在の有無に関わらず)生物の存在を検出するために役割を果たすこと(例えば、使用者が、薬物耐性を決定することを意図しないが、単に病原体の検出のため装置を利用することを望むとき)の��割を果たす。
【０１７６】
一部の実施形態では、第一のプローブは、約52℃の熱力学的支点および/または融解温度により特徴付けられる。
【０１７７】
一部の実施形態では、第一のプローブは、12〜25ヌクレオチドを含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、第一のプローブは、18〜22ヌクレオチドを含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、第一のプローブは、50℃〜60℃の融解温度を有する。
【０１８０】
一部の実施形態では、第一のプローブは、配列番号14〜20のいずれか一つから選択される配列を含む、本質的にからなる、またはからなる。
【０１８１】
一部の実施形態では、第二のプローブは、12〜25ヌクレオチドを含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、第二のプローブは、18〜22ヌクレオチドを含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、第二のプローブは、50℃〜60℃の融解温度を有する。
【０１８４】
一部の実施形態では、第二のプローブは、配列番号6または22のいずれか一つから選択される配列を含む、本質的にからなる、またはからなる。
【０１８５】
一部の実施形態では、分子診断装置は、SNP座位が対立遺伝子を含む場合、少なくとも約0.5nM、少なくとも約1nM、少なくとも約1.5nM、少なくとも約2nM、少なくとも約6nM、少なくとも約8nM、少なくとも約10nM、または少なくとも約15nMのSNP座位を含むポリヌクレオチドを含む生物学的試料中の対立遺伝子を検出する。
【０１８６】
一部の実施形態では、分子診断装置は、薬物感受性細菌感染症を有する疑いのある対象が、薬物感受性細菌感染症を有するかどうかを決定する。
【０１８７】
一部の実施形態では、分子診断装置は、薬物耐性細菌感染症を有する疑いのある対象が、薬物耐性細菌感染症を有するかどうかを決定する。
【０１８８】
別の態様では、本開示は、a)本開示の分子診断装置に、治療に対する感受性と関連する一つまたは複数のSNPにより特徴付けられる疾患または障害を有するか、または有することが疑われる対象由来の生物学的試料を導入することであって、生物学的試料は、対象由来のポリヌクレオチドを含む、導入すること、b)分子診断装置が、ポリヌクレオチドが、治療に対する感受性と関連する対立遺伝子を含むSNP座位を含む場合、治療を施すことを含む、方法を提供する。
【０１８９】
一部の実施形態では、疾患または障害は、細菌感染である。
【０１９０】
別の態様では、本開示は、生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュールであって、生物学的試料は、標的細菌由来のポリヌクレオチドを含む、試料調製モジュール;ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール;反応体積およびヒーターを含む増幅モジュールであって、反応体積は、生物学的試料を受け取るよう構成され、増幅溶液は、プライマーセットを含み、ヒーターは、熱エネルギーを反応体積に伝達して、ポリヌクレオチドを増幅して、SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生成するよう構成される、増幅モジュール;ならびに標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールであって、SNP座位が別の対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位への結合を最小にしながら、SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位に結合するよう設計されたプローブを含む、検出モジュールを含む分子診断装置において行われる、方法であって、標的アンプリコンを標的細菌由来のポリヌクレオチドから増幅すること;任意で、第二の標的アンプリコンを標的細菌由来のポリヌクレオチドから増幅すること;第一の標的アンプリコンを第一のプローブと反応させて、標的細菌の薬物に対する感受性を示す第一のシグナルを生じさせること;任意で、第一の標的アンプリコンを第二のプローブと反応させて、生物学的試料における標的細菌の存在および／または標的アンプリコンの増幅を示す第二のシグナルを生じさせること;ならびに任意で、第二の標的アンプリコンを第三のプローブと反応させて、生物学的試料における標的細菌の存在および／または第一の標的アンプリコンと第二の標的アンプリコンのいずれかもしくは両方の増幅を示す第三のシグナルを生じさせることを含む、方法を提供する。
【０１９１】
一部の実施形態では、第一の遺伝子を増幅させることおよび第二の遺伝子を増幅することは、独立型の装置内で同時に行われる。
【０１９２】
一部の実施形態では、第一のシグナル、第二のシグナル、および/または第三のシグナルは、いかなる融解曲線分析も行われることなく生成される。
一部の実施形態では、標的細菌は、ナイセリア・ゴノレー(NG)であり、SNP座位は、NGのgyrA遺伝子内にあり、標的アンプリコンを増幅することは、生物学的試料をgyrA領域を標的とするように設計されたプライマーセットと混合すること、および生物学的試料とプライマーセットの混合物を、第一の標的アンプリコンおよび任意で第二の標的アンプリコンを生成するのに十分な速度で、第一の温度と第二の温度との間で熱サイクルすることを含む。
【０１９３】
別の態様では、本開示は、生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュール、生物学的試料は、標的細菌由来のポリヌクレオチドを含む;ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール;反応体積およびヒーターを含む増幅モジュール、生物学的試料およびプライマーセットを含む増幅溶液を受け取るよう構成された反応体積、熱エネルギーを反応体積に伝達して、ポリヌクレオチドを増幅して、SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生じさせるよう構成されたヒーター;ならびにSNP座位が、別の対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位への結合を最小にしながら、SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位に結合するよう設計されたプローブを含む、標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールを含む分子診断装置において行われる方法であって、生物学的試料で分子診断検査を行い、A)標的細菌の存在およびB)第一の抗生物質に対する耐性を与える標的細菌内の標的対立遺伝子の存在を決定すること;ならびに分子診断検査の結果に基づき、第二の抗生物質を投与することを含む、方法を提供する。
【０１９４】
NGのシプロフロキサシン感受性PCRアッセイの方法および装置
NGのシプロフロキサシン感受性単離株は、gyrA遺伝子のコドン91において一塩基多型(SNP)(gyrASer91）を有する(配列番号1)(図3)。他のコドンにおける変異(gyrA Asp95）および遺伝子(parC)が検出されたが、gyrA Ser91コドンにおける変異は、シプロフロキサシン耐性を付与するのに必要かつ十分である。
【０１９５】
装置は、標的化されたプライマーを介した標的アンプリコンのPCR増幅を行い、続いて、捕捉プローブおよび酵素ベースのシグナル増幅を使用した終点検出を行う。この製品設計に基づき、PCR段階、捕捉段階のいずれか、またはその両方でSNPを区別することが可能である。本発明者らは、捕捉プローブを使用してSNPを区別することが、最も実行可能なアプローチであると経験的に決定した。したがって、プライマーセットは、後続のプローブが、シプロフロキサシン感受性SNPを区別するであろうgyrA領域を増幅するように設計された。
【０１９６】
フォワードおよびリバースPCRプライマーは、gyrA 91座位に隣接するように設計され、故に、それらは、全てのNG  gyrA遺伝子型バリアント(シプロフロキサシン感受性gyrASer-91野生型SNPを含有するもの、およびシプロフロキサシン耐性gyrA Phe-91、gyrA Tyr-91、gyrA Asn-95およびgyrAGly-95 SNPを含有するものを含む)を増幅する(図4)。シプロフロキサシン感受性検査は、現在のNT/TV製品と統合することが意図されるので、設計パラメータは、現在のSTIアッセイに一致するようにTm60℃を有するプライマー候補(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第2016/109691号、名称「Devicesand Methods for Molecular Diagnostic Testing」）、ならびに最小の二次構造を有する領域を標的にすること、および高G+C(グアニンおよびシトシン)含量の領域を回避することに焦点を当てる。ナイセリア・メニンギティディス（Neisseriameningitidis）などの他の関連するナイセリア種とのアライメントを評価して、NGのみを増幅するプライマーであることを確実にした。
【０１９７】
これらのプライマーのPCR性能は、CDC抗生物質耐性NG株単離株バンクから得られたシプロフロキサシン感受性およびシプロフロキサシン耐性NG株を使用して研究された。本発明者らは、single-plexおよび既存の4-plexSTIアッセイ用に最適化されたマスターミックス組成物を使用してTE緩衝液中のリアルタイムPCR実験を行い、Click湾曲PCRモジュールの高速サイクル性能をシミュレートする、サイクル条件の時間および温度をプログラム化した実験室サーモサイクラーを利用した。次に、最も性能の高いプライマーセットが、以下の節に記載されるように、対立遺伝子特異的プローブを用いたその後の実験でさらに評価され、最適化された。
【０１９８】
一部の実施形態では、本開示の装置および方法は、訓練された研究者によってでさえ読み取ることが困難である、溶融曲線を使用することなくSNPを検出する能力を有する。克服すべき課題は、SNPの周りに効率的なプライマーセットを設計することであった。これは、標的領域が、アンプリコンにおいて二次構造をもたらす配列を含有し得るため、問題となり得る。理論により結び付けられるものではないが、ある場合には、本明細書に記載される装置は、温度傾斜率が極めて速いため、この問題を解決することができると考えられる。理論に拘束されるものではないが、ある場合では、アンプリコンは、95℃〜60℃に冷却するので、プライマーは、干渉する構造が形成される前に、適切な部位に結合することができると考えられる。一部の実施形態では、増幅モジュールから検出モジュールに移される、アンプリコンを含有する溶液の流速は、約0.1μL〜約2μLである。一部の実施形態では、流速は、約0.1μL/秒、約0.2μL/秒、約0.3μL/秒、約0.4μL/秒、約0.5μL/秒、約0.6μL/秒、約0.7μL/秒、約0.8μL/秒、約0.9μL/秒、約1.0μL/秒、約1.1μL/秒、約1.2μL/秒、約1.3μL/秒、約1.4μL/秒、約1.5μL/秒、約1.6μL/秒、約1.7μL/秒、約1.8μL/秒、約1.9μL/秒、または約2.0μL/秒である。
【０１９９】
一部の実施形態では、方法および装置は、本明細書に記載される捕捉プローブを含み得る。捕捉プローブは、シプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型を含有するアンプリコンに特異的である。インシリコ設計ツールを使用して、プローブ候補を同定した。本発明者らは、当初、線形(単純)プローブおよび分子反転プローブを検討した。鍵となる設計目標は、薬物耐性SNPを含有するgyrA配列への結合から生じる偽陽性を最小化/排除しながら、シプロフロキサシン感受性gyrASer-91野生型への結合を最大化するプローブの開発であった。多数の設計反復を通して、本発明者らは、単純な線形プローブが、設計の複雑さを最小化しながら、適切な程度の特異性をもたらすと結論付けた。
【０２００】
一部の実施形態では、捕捉プローブハイブリダイゼーションは、52℃(本開示の装置の特定の実施形態におけるアンプリコン検出フローセルの初期設定温度)の熱力学的支点にあるよう設計されるか、または決定され、故に、一致SNPは、その温度よりも低いTmを有し、ミスマッチSNPは、その温度よりも高いTmを有する。一致およびミスマッチTM間の最大の区別の達成は、比色酵素反応が、シプロフロキサシン感受性株に対して最強の着色をもたらし、耐性株に対して色産生を最小/ゼロにすることを確実にするのに重要である。他の実施形態では、捕捉プローブは、52℃より高いまたは未満のいずれかの温度で熱力学的支点により、特徴付けられ得る。例えば、一部の実施形態では、捕捉プローブは、52℃未満(例えば、約35℃〜50℃、約38℃〜45℃、または約40℃)の熱力学的支点により、特徴付けられ得る。こうした実施形態では、捕捉プローブは、より少ない塩基で作製され、これにより、SNP位置により多くの相対的提供が与えられ得る。一部の実施形態では、方法は、その中の捕捉プローブの熱力学的支点温度に基づき、フローセル(例えば、検出モジュール)の動作温度を変更することを含み得る。こうした変更は、例えば、ファームウェア、ソフトウェア、またはハードウェアなどの任意の適切な機構により行われ得る。
【０２０１】
使用されたプライマーセット、シプロフロキサシン感受性検出プローブ、およびgyrA陽性対照は、図5Aに示される。このプローブ設計では、SNPを決定するシプロフロキサシン感受性に一致するプローブに加えて、意図的なミスマッチを起こして、ハイブリダイゼーション動態が改善された。
【０２０２】
三種の抗生物質感受性検査
一部の実施形態では、方法は、患者がNGに感染しているかどうかを決定すること、および同じ臨床サンプルを使用して、フルオロキノロン系(シプロフロキサシン)、延長スペクトルセファロスポリン系(セフィキシム)、および新規スピロピリミジンエトリオン(現在開発中のゾリフロダシン)の三種のクラスの抗生物質感受性情報を提供することを含む。表1は、潜在的な検査結果の全ての組み合わせに基づく臨床治療アルゴリズムを示す。臨床医は、感受性低下CFX単離株の存在は、患者が、多剤耐性NGを有する英国において患者を治療するために使用された、1)推奨用量のCRO+AZIと、1週間後の治癒検査による追跡、2)治癒検査が利用できない場合には、より高用量のCRO+AZI、または3)代替抗生物質(例えば、i.v.エルタペネン)を投与され得ることを意味することを理解するので、この検査は、ZOL耐性情報(ZOLは、まだFDAに承認されていない)がなくても依然有用である。抗微生物感受性検査に三種の抗生物剤を含めることにより、三種耐性株が1%の流行に達する時間は、最大6年間引き延ばし、NGを治療するための新規抗生物剤の開発および導入に必要な多くの時間をもたらすことができる。
表1：三種の薬物治療アルゴリズム
【表１】
2021534804.tif 000003
S=感受性、R=感受性低下、R=耐性
【０２０３】
シプロフロキサシン(CIP) CIPは、細菌DNA合成および修復に必須のDNAジラーゼおよびトポイソメラーゼIVタンパク質を阻害し、したがって、染色体複製を阻害する広域スペクトルのフルオロキノロンである。CIPは、淋病についてのCDC推奨療法であったが、もはやそうではない。CDCによると、CIP耐性率は、約30%で推移し、従って、2017年の米国のNGの約389,000症例が、CIP感受性株に感染していた。CIPは、感染が、生殖器外の部位に位置するときでさえ、表現型上、感受性株の治療において>99%有効であることが示されている。CIP感受性株の分子研究は、ジラーゼAタンパク質の野生型Ser91残基(gyrA91Serと呼ばれる）の変異の不存は、CIPに対する感受性を確実に予測することが示されていることを示す。しかし、このような株に対する経口CIPの低コストおよび有効性にもかかわらず、ほぼ全ての淋病患者は、CRO+AZIで治療される。したがって、現在の装置および方法は、分子抗微生物感受性検査に基づきCIPの判断力の確かな再導入を可能にする。このようにして、CRO耐性株の出現が、低減され得る。
【０２０４】
セフィキシム(CFX)。CFXは、CROと同様に、細菌細胞壁におけるムコペプチド合成を阻害する第三世代(広域スペクトル)セファロスポリン(ESC)である。CDCは、米国で淋病を治療するのにもはやCFXを推奨しないが、CFXは、WHOSTD治療ガイドラインの一部のままである。最新のCDC 2018年サーベイランスデータによると、セフィキシム最小阻害濃度(MIC)の上昇(>0.25ug/ml)を伴った単離株の割合は、2011年の1.4%から2017年の0.4%に低下し、一方で、単離株の0.2%は、CROに対してMICの上昇を示した。penAモザイク対立遺伝子XXXIVは、CFXに対して低減した感受性の十分であることが示され、一方、mtrRおよびporB遺伝子における追加の変異もまた、CROに対する低減した感受性をもたらす。したがって、一部の実施形態では、本方法は、ESCに感受性である(すなわち、WTpenA遺伝子を含有する)患者についてCFXを処方することを含む。このように、CROの使用は、正に最後の手段である抗生物質のままであり、これにより、CROに対する耐性の出現を遅らせる。具体的には、低減した感受性を付与するモザイクpenA対立遺伝子(penAXXXIVおよび関連配列)が検出された場合、臨床医は、三つの処置オプション:1)推奨用量のCRO+AZIで処置し、処置後7日間の治癒検査を行うこと;2)追跡治癒検査が不可能または利用できない場合、推奨用量より高いCRO+AZI1gで患者を処置すること;または3)i.v.エルタペネムのような代替抗生物質で処置すること、を有する。さらに、CFXの使用は、CFXが、より高価な注射可能なCROと比較して単回投与の経口抗生物質であるので、有利であり、患者により受け入れられる可能性が高い。
【０２０５】
ゾリフロダシン(ZOL)。ZOLは、CIPとは異なる作用機序を有すると考えられる新規のトポイソメラーゼII阻害剤であり、淋病を特異的に治療するために、EntasisTherapeuticsにより開発されている。ZOLは、フルオロキノロン類およびESCに対する耐性の単離株を含む、NGに対する強力なインビトロ活性を示し、最近の第II相臨床試験において、単回経口投与後の有望な安全性および有効性を示した(例えば、臨床試験政府識別子NCT02257918およびNCT0340416を参照のこと)。自然発生的な耐性の頻度は、インビトロ研究で非常に低かったが、gyrB遺伝子において三つの異なる変異を有する耐性単離株が回収された(D429N、K450T、S467N)。
【０２０６】
一部の実施形態では、診断プラットフォームは、泌尿生殖器臨床試料(男性または女性由来)中のNGを同時に検出し、NGの感染株が、シプロフロキサシン(CIP)、セフィキシム(CFX)、またはゾリフロダシン(ZOL)に感受性であるかどうかを決定するためのマルチプレックスアッセイを含む。具体的には、プラットフォームは、NG株が、CIPに感受性であるか、CFXに対して低減した感受性を有するか、またはZOLに耐性であるかを決定するための一つまたは複数の分子アッセイを行う。決定は、寒天希釈法を使用して決定される、対応する抗生物質感受性表現型に必要かつ十分であることが既に示された特定の遺伝子型の存在に基づき得る。これらの抗生物質感受性遺伝子型の各々について、抗生物質感受性表現型を決定する遺伝子の領域が増幅され、得られたアンプリコンが、フロー細胞の別個の位置に位置する二つの独立した捕捉プローブに曝露される。一つの捕捉プローブは、抗生物質感受性遺伝子型に対応するアンプリコン内の配列と選択的にハイブリダイズする。遺伝子型が、アンプリコンに存在するなら、次に、ハイブリダイゼーションは、図5Bにおいて説明されるように、着色（例えば、紫色）スポットを生じる。遺伝子型がアンプリコンに存在しないなら、次に、ハイブリダイゼーションは、図5Bにおいて説明されるように、わずかな色または無色により説明される通り、わずかに生じるか、または全く生じない。アンプリコンが正常に増幅された対照として、第二の捕捉プローブは、抗生物質感受性および抗生物質耐性NG株の両方に存在する同じアンプリコンの保存された配列を認識するように設計される。抗生物質感受性または耐性のNG株のいずれかからのアンプリコンの成功した生成は、着色した（例えば、紫色）のスポットにより示される。
【０２０７】
一部の実施形態では、アッセイは、少なくとも一つの線形捕捉プローブ(gyrA Ser91 SNP特異的捕捉プローブおよび/またはgyrAアンプリコン陽性対照捕捉プローブ)を含む。一部の実施形態では、gyrA遺伝子の保存された領域に対するプライマーを使用して、遺伝子の耐性決定領域の全てのバリアントが増幅される。得られたアンプリコンは、アンプリコンが、正確な相補配列を含む場合のみ、SNP特異的捕捉プローブにより捕捉され得る。一部の実施形態では、第二の対照捕捉プローブは、アンプリコンの全てのバリアントを、すなわち、それが、アンプリコンの抗生物質耐性または抗生物質感受性バージョンに由来するかどうかに関わらず、同様に良好に捕捉する。対照捕捉プローブによるアンプリコンのハイブリダイゼーションは、アンプリコンの成功した産生を示し、得られた着色強度は、二つの捕捉プローブ間の着色強度比の差を計算するための基礎を提供する。したがって、一部の実施形態では、方法は、二つの検査スポットの着色強度間の差または比を決定することを含み得る。着色強度比の差は、試料が、SNP存在またはSNP不在の結果として分類されるかを決定するさらなる方法の入力として使用することができる。
【０２０８】
一部の実施形態では、方法は、XXXIVモザイクモチーフを含有するNG penA遺伝子の領域を増幅するプライマーを同定するためのバイオインフォマティクスツールおよびNGpenA配列データベースを使用することを含む。ペニシリン結合タンパク質2をコードするpenA遺伝子における改変は、CFXおよびCROの様な広域スペクトルセファロスポリンに対する感受性および耐性の鍵となる決定因子である。penAモザイクXXXIV対立遺伝子は、CFXに対して低減した感受性に十分であり、一方、mtrR遺伝子およびporB遺伝子における追加の変異も、CROに対して低減した感受性をもたらす。具体的には、少なくとも一つの研究により、penAモザイクXXXIV遺伝子型を保有する株の検出が、それぞれ、98%および91%の感受性を有するCFXおよびCROに対するゴノコッカス株の低下した感受性と関連することを示した。O.一部の実施形態では、リアルタイムPCRアッセイは、penAアンプリコン内のpenAモザイクXXXIV配列(および関連する遺伝子型)を特異的に認識する、全てのNG株からpenA遺伝子(WTおよびモザイク)を増幅するように設計されたPCRプライマーおよび設計捕捉プローブを含む。
【０２０９】
一部の実施形態では、方法は、ZOL感受性とZOL耐性NG株の両方からNG gyrB遺伝子を選択的に増幅するプライマーを設計し、作製し、検査するためのバイオインフォマティクスツールおよびNGgyrB配列データベースを使用することを含む。一部の実施形態では、アッセイは、ZOLに対する耐性を付与する三つのNG gyrB SNP（D429N、K450T、S467N）を選択的に検出するように設計された少なくとも三つの捕捉プローブを含む。それ故、NGgyrBアンプリコンにおけるこれら三つの変異のうちの一つの存在さえ、検出フローセルにおいて色変化をもたらす。さらに、gyrBアンプリコンのインバリアントな領域に対応するNGgyrB陽性対照捕捉プローブは、フローセルの異なる位置に位置することができる。ZOL感受性およびZOL耐性のNG株由来のNG gyrBアンプリコンは、このgyrBアンプリコン陽性対照捕捉プローブを同様に良好に結合させ、これは、gyrBアンプリコンが良好に産生されたことを示している。対照捕捉プローブとD429NまたはK450TまたはS467N捕捉プローブとの間の着色強度比の差は、呼び出しアルゴリズムを介して、ZOL耐性の存在またはZOL耐性の不存を導く。
【０２１０】
一部の実施形態では、アッセイは、以下の基準に基づき、選択および/または最適化されたPCRプライマーならびに捕捉プローブを含む。1)SNP検出精度(>95%の感度および特異性)、ならび2) a)gyrA Ser91 CIPS株、b) penA CFXRS株、およびc) opaAアンプリコンおよび統合STI装置のフローセル上のその捕捉プローブを介してNG株の検出のためのベースライン装置のLoDと同等であるgyrBZOLR遺伝子操作された株由来のゲノムDNAについて決定された検出限界(LoD)。opaAプライマープローブセットの性能を標準として使用して、異なるNG株に対するNGLoDは、9〜114cfu/mlの範囲であると予想される。
【０２１１】
一部の実施形態では、最適化された多重PCRアッセイは、NS/NG/NGcips/NGcfxRS/NGzolRと命名された五つのプライマー対を含む。以下の表は、用語「NS/NG/NGcipS/NGcfxRS/NGzolR」を説明する。PCRアッセイ条件は、プライマー濃度、検出チップの温度、洗浄条件、および他の要因を調節することにより選択(および/または最適化)することができる。したがって、得られた5-plexアッセイは、>2Ct値には変動しないPCR効率の現在のSTIアッセイ(LoD9〜114cfu/ml)と同等の機能性を有する。
【表Ａ】
2021534804.tif 000004
【０２１２】
使い捨ての分子診断検査装置の検査結果
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかは、各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第2016/109691号、名称「Devices and Methods for Molecular Diagnostic Testing」、国際特許出願公開第2018/005710号、名称「Devicesand Methods for the Detection of Molecules Using a Flow Cell」、国際特許出願公開第2018/005870号、名称「Devicesand Methods for Nucleic Acid Extraction」、および米国特許出願第16/186,067号、名称「PortableMolecular Diagnostic Device and Methods for the Detection of Target Viruses」に示され、記載されるもののいずれかのような、単回使用の鎖単独分子診断検査装置で行うことができる。一部の実施形態では、単回使用の他に比を見ない分子診断検査装置は、臨床的に関連する低濃度のCT(4〜36EB/ml)、NG(9〜114cfu/ml)、およびTV(2〜6トロホゾイトs/ml)を検出することができる。さらに、装置は、多重増幅中の増幅を含む、90%以上の効率でCT、NG、およびTVDNAテンプレートを増幅することができる。このようにして、装置(およびその上で行われる方法)は、臨床的に関連する優れた検出限界を有し得る。例えば、一部の実施形態では、方法および装置は、およそ5EB/ml、18cfu/ml、および2troph/mlの単一標的試料から、CT、NGおよびTVに対する検出限界(LoD)値を生じ得る。他の実施形態では、一実施形態による方法および装置は、およそ5.25EB/mlおよび0.39cfu/mlの単一標的試料から、CT、NGおよびTVに対する検出限界(LoD)値を生じ得る。さらに他の実施形態では、一実施形態による方法および装置は、0.2troph/mlと同等に低いTVについての検出限界(LoD)値を生じることができる。
【０２１３】
具体的には、図6は、一実施形態による、分子診断検査装置上で行われた検査結果の写真を示す。検査は、3ロットに渡り計60個の装置(1ロット当たり20個の装置)に渡り多重反応を用いて行った。装置の包括性を評価するために、同じ三つの種の多様な二次株(70のNG、16のCT、および31のTV株)が、LoD研究において検査された二つの主要な一次株以外の標的生物の株で検査した。3×LoDで二重標的試料(CT+NGまたはTV+NGのいずれか)であった試料が、作製され、二回検査された。この包含性検査は、選択されたPCRプライマーセットが、検査された全ての二次株を検出することができることを示した(データは示されない)。
【０２１４】
装置の交差反応性を評価するために、32種の系統的に関連する非STI生物(すなわち、本発明者らの「最も近縁の」排他的な種のリスト)が、CT、NG、およびTVの存在下および不在下で検査された。試料は、それぞれ、およそ1,000,000生物/mLの濃度で、一つのプール当たり8種の生物のプールで検査された。2×LoDのCT、NG、およびTVを含有する試料は、これらの「最も近縁の」プールでとどめられ、三回検査された。検査結果は、三つの標的生物(NG、CT、またはTV)のみが増幅されたことを示し、系統的に関連する非STI生物のいずれも、CT、NG、またはTVプライマーセットを使用して増幅されなかった(データは示されていない)。
【０２１５】
一部の実施形態では、多重検査装置および/または方法は、一つの病原体の存在が、同じ試料中の別の病原体についての偽陰性結果を生じないことを確実にすることができる。図7は、全三つの標的生物を含有する試料が作製された検査の検査結果の写真を示し、二つの標的生物が高濃度であり、3番目の標的生物が3×LoDであった。これらの組み合わせの各々は、三ロットの装置に渡り三回検査された。装置は、病原体濃度の有意な差にもかかわらず、試料中のとどめられた病原体を首尾よく同定した。全ての組み合わせについて、低濃度(3×LoD)で存在する病原体は、高濃度で存在する他の二つの病原体の存在下で容易に検出された。
【０２１６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される装置および方法のいずれかは、様々な異なるタイプの試料上で実施することができる。こうした試料タイプには、例えば、膣スワブ、陰茎管スワブ試料、尿試料、直腸スワブ試料および／または咽頭スワブ試料が含まれ得る。膣スワブ試料を用いて一連の検査を行った。
【０２１７】
最初の検査は、医師により採取された試料を評価し、単一施設からの患者が、FDA承認のコンパレータ装置(コールバック検査)による最初の陽性結果からの「コールバック」後に、検査に登録された。もう一つは、米国全土に分布する三つの異なる部位(ベータ研究)からの症候性患者と無症候性患者(n=400)の両方を含む、自己採取膣スワブ試料を評価した。ベータ研究は、約1,700人の患者、4〜6か月の継続中の重要な臨床試験の上方となり、先行した。さらに、保存された膣(CTおよびNGについて30の試料)および子宮頸管内スワブ(CTについて8つの試料、NGについて18の試料)も評価した。各Click装置の結果は、2〜3つのFDA承認NAATコンパレータ機器により決定された患者の感染状態と比較された。二つのコンパレータが使用され、結果が不一致であるなら、その試料は、分析から除外された。三つのコンパレータが使用された場合、患者の感染状態(PIS)を決定するためには、3つのコンパレータのうち少なくとも2つの結果が一致していなければならなかった。検査結果が、表2に示される。結果を比較するために使用される機器は、Aptima、BDMax、およびBDProbeTecであった。以下の表は、全ての前臨床試験の概要、すなわち、ベータ、コールバック、および記録されたスワブ(膣および子宮頸管)試料を示す。
表2. 臨床実現可能性検査の感受性および特異性分析
【表２】
2021534804.tif 000005
【０２１８】
本明細書に示され、記載される試料投入モジュール、試料調製モジュール、増幅モジュール、ヒーター部、および検出モジュールのいずれかは、任意の適切な診断装置において使用され得る。こうした装置は、例えば、ポイントオブケア設定および/または使用者の自宅で使用され得る単回使用装置を含み得る。同様に、一部の実施形態では、装置(および本明細書に示され、記載される他の装置のいずれか)は、分散検査施設における使用のため構成され得る。さらに、一部の実施形態では、本明細書に示され、記載される試料投入モジュール、試料調製モジュール、増幅モジュール、ヒーター部、および検出モジュールのいずれかは、CLIA放棄装置内に含めることができ、および/またはCLIA放棄された方法に従った装置の操作を容易にし得る。同様に、一部の実施形態では、本明細書に示され、記載される試料投入モジュール、試料調製モジュール、増幅モジュール、および検出モジュールは、不適切に使用された場合、誤用の可能性を限定し、および/または不都合なリスクを限定するのに十分な精度で結果を生じ得る、十分に単純な方法で装置の動作を容易にすることができる。一部の実施形態では、本明細書に示され、記載される試料投入モジュール、試料調製モジュール、増幅モジュール、および検出モジュールは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第2016/109691号、名称「Devicesand Methods for Molecular Diagnostic Testing」に示され、記載される診断装置のいずれかで使用することができる。
【０２１９】
増幅モジュールは、調製された溶液上で熱サイクル動作が行われると本明細書に一般的に記載されるが、他の実施形態では、増幅モジュールは、溶液内の核酸を増幅するために任意の適切な熱反応を行うことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される増幅モジュールのいずれかは、例えば、Loop Mediated Isothermal Amplification（LAMP)、標的RNA分子を検出するのに有用であり得る核酸配列ベース増幅(NASBA)、鎖置換増幅(SDA)、多置換増幅(MDA)、分岐増幅(RAM)、または任意の他のタイプの等温プロセスを含む、任意の適切なタイプの等温増幅プロセスを行うことができる。
【０２２０】
本明細書に記載される装置および方法を使用して、組織試料(例えば、血液試料)などの、任意の適切なタイプの生物学的試料を分析することができる。ある場合には、生物学的試料は、対象から採取された体液を含む。ある場合には、体液は、核酸を含む一つまたは複数の細胞を含む。ある場合には、一つまたは複数の細胞は、細菌、考古細菌、原虫、および真菌を含むが、これらに限定されない、一つまたは複数の微生物細胞を含む。ある場合には、生物学的試料は、一つまたは複数のウイルス粒子を含む。ある場合には、生物学的試料は、性感染症を引き起こす一つまたは複数の微生物を含む。試料は、対象由来の試料、例えば、全血；血液産物；赤血球;白血球;バフィーコート；スワブ；尿;唾液;つば；精液；リンパ液；内リンパ;外リンパ;胃液；胆汁;粘液;皮脂；汗；涙液；膣分泌液;嘔吐;糞便；母乳;耳垢;羊水；脳脊髄液；腹水;胸水；生検試料；嚢胞からの流体;滑液；硝子体液;房水；嚢体液；洗眼液；眼吸引物；血漿;血清;肺洗浄液;肺吸引液；ヒトを含む動物、組織 以下を含むが、これらに限定されない。 肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓、細胞培養物、ならびに上で記載された試料から得られた溶解物、抽出物、または物質および分画または試料上もしくは試料中に存在し得る任意の細胞および微生物およびウイルスを含み得る。試料は、初代培養物または細胞株の細胞を含んでもよい。細胞株の例は、293-Tヒト腎臓細胞、A2870ヒト卵巣細胞、A431ヒト上皮、B35ラット神経芽細胞、BHK-21ハムスター腎臓細胞、BR293ヒト乳房細胞、CHOチャイニーズハムスター卵巣細胞、CORL23ヒト肺細胞、HeLa細胞、またはジャーカット細胞を含むが、これらに限定されない。試料は、ウイルス、細菌、原生生物、モネラ界、クロムアルベオラータ、古細菌、または真菌のうちの一つまたは複数を含む、微生物の均一または混合集団を含み得る。生物学的試料は、尿試料、膣スワブ、子宮頸部スワブ、肛門スワブ、または頬スワブであり得る。生物学的試料は、病院、研究室、臨床または医学研究室から得られ得る。
【０２２１】
一部の実施形態では、方法は、試料から、感染している微生物および抗微生物感受性と関連する(または決定する)SNPを検出することを含む。このような試料は、例えば、血液、尿、唾液、脳脊髄液、関節液、糞便、膿、組織、ならびに尿生殖器部位、直腸、咽頭(および鼻咽頭)、および結膜由来のスワブを含み得る。
【０２２２】
しかしながら、本明細書に記載される装置および方法は、ヒト試料で分子診断検査を行うことを含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載される装置および方法のいずれかは、獣医試料、食品試料、および/または環境試料と共に使用することができる。環境源の例としては、農地、湖、川、貯水池、通気孔、壁、屋根、土壌試料、植物、およびプールが挙げられるが、これらに限定されない。産業供給源の例としては、クリーンルーム、病院、食品加工エリア、食品製造エリア、食品原料、医学研究所、薬局、および医薬調合センターが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドが単離され得る対象の例としては、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、および哺乳類などの多細胞生物が挙げられる。哺乳類の例としては、霊長類(例えば、類人類、サル、ゴリラ)、齧歯類(例えば、マウス、ラット)、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、またはウサギが挙げられる。一部の例では、哺乳動物は、ヒトである。さらに、本発明の試料は、生物学的試料に限定されず、本発明の試料は、環境(空気、水、土壌など)、動物(上記を参照)、または植物(例えば、植物の種が制限なく、植物の任意の部分から得られた細胞)であってもよい。
【０２２３】
一部の実施形態では、試料は、加工食品または未加工食品である。他の態様では、食品試料は、肉、七面鳥、鶏肉および他の家禽、牛乳、卵、卵製品、乳製品、新鮮または乾燥果物および野菜、ならびにそれらのジュース、穀物、魚、魚介類、ペットフード、ベビーフードおよび乳児用乳製品のうちの少なくとも一つを含む。別の実施形態では、試料は、株およびその抗菌耐性特性を確認または同定するための細菌単離物である。アレイシステム内の生物特異的および抗生物質耐性(AR)プローブは、病院における臨床診断ツールとして使用され、疫学研究および追跡ならびに感染制御に役立つことが予想される。
【０２２４】
一部の実施形態では、記載される増幅モジュールのいずれかは、(例えば、約10分未満で少なくとも30サイクルを完了する)「迅速」PCR、および(例えば、検出モジュールを介して)出力シグナルの迅速な生成を行うように構成され得る。同様に、本明細書に記載される増幅モジュールは、本明細書に記載されるように、体積を処理し、次元サイズを有し、および/または約10分未満、約9分未満、約8分未満、約7分未満、約6分未満、またはその間の任意の範囲において迅速PCRまたは増幅を促進する材料から構築されるように構成され得る。
【０２２５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される装置および方法のいずれかは、外部機器を必要とすることなく、約27分、25分、22分、20分、またはそれ未満で試料対応答能力をもたらす、「迅速」PCR(例えば、約10分未満で少なくとも30サイクルを完了する)であり得る。同様に、装置は、試薬を追加し、駆動装置を操作し、構成要素を混合し、または検査結果を読み取るための外部機器を必要としない、独立型の装置であり得る。一部の実施形態では、装置は、外部電源(例えば、「外部機器」であるとはみなされない、A/C電源)に接続することができる。
【０２２６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される装置および方法のいずれか(および方法）が迅速に行われ得、試料から結果までの合計は、実践時間わずか10〜15秒を必要とし、約25分未満で検査結果をもたらす。本明細書に記載される装置および方法は、正確であり、市場をリードする研究室ベースのシステムと同じPCR技術を使用する。本明細書に記載される装置および方法は、複数の病原体の同時検出を可能にする。本明細書に記載される装置および方法は、器具の洗浄、点検、および除染を排除する単回使用/使い捨て検査である。本明細書に記載される装置および方法は、無制限の迅速検査に適用可能であり、一つまたは複数の検査が、同時/非同期的に行うことができる。
【０２２７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の装置のいずれかは、貯蔵で安定である。具体的には、本明細書に記載される装置は、輸送および保管のための特別な温度または湿度要件を有さず、したがって、備蓄が容易にすることができる。
【０２２８】
本明細書に記載される装置のいずれかは、容易かつ持ち運びできる状態で給電され得る。装置のいずれかは、壁のアダプタまたは電池により給電することができ、したがって現場での使用に理想的である。
【０２２９】
一部の実施形態では、NGおよび他のSTIの検出方法は、独立型の装置上で行うことができる。装置は、全てのFDA要求株(70株のNG、16株のCT、および31株のTV)を検出する(および本方法は検出を含む)ように構成される。さらに、装置(および方法)は、一般的に泌尿生殖器において見られる系統的に関連する非STI生物の142株に対して交差反応性を有さない。装置は、少ない微生物負荷量を有する患者において典型的に見られる、低濃度の50〜150EB/ml)、NG(50〜150cfu/ml)、およびTV(20trophs/ml)検出することができ、方法は、それを含む。例えば、CTまたはNGを含有する79個の患者試料、およびTVを含有する78個の試料からの特定の検査結果は、計画出産病院で行われるFDA承認NAAT装置と比較して、全ての病原体に渡り100%の感度、ならびにCTおよびNGについて98%の特異性、およびTVについて94%の特異性を示した。
【０２３０】
方法は、他の実施形態では、STIについての検査に適用可能であると本明細書において記載されるが、本明細書に記載される装置および方法を使用して、任意の感染症を検出することができる。例えば、本明細書に記載される方法および装置は、抗微生物に対する耐性または感受性を付与し、故に、最も有効な医薬の選択を誘導する、細菌、ウイルス、真菌、原生動物におけるSNPの検出に使用することができる。他の方法には、新規抗微生物の臨床試験を加速するための手引きまたは捕捉診断として感染微生物の遺伝子型解析するためのSNPの使用が含まれ得る。
【０２３１】
本明細書に記載される装置、組成物、および方法のいずれかは、任意の適用可能な疾患、障害、もしくは状態の診断および/または治療と関連して使用することができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載される装置、組成物、および方法のいずれかを使用して、組織生検および/または血液におけるSNPを検出して、診断、予後、治療(最適な癌薬物および生物製剤の選択)のため、癌の遺伝子型を決定し、および/または再発を検出することができる。一部の実施形態では、方法は、癌の遺伝性リスクを決定する(または定量する)ためのSNPの検出を含み得る。一部の実施形態では、方法は、検出に応答して治療プロトコルを修正することを含み得る。同様に、一部の実施形態では、方法は、検出されたSNPに応答して、強化されたスクリーニング(例えば、より頻繁な大腸内視鏡またはマンモグラム)を含み得る。
【０２３２】
一部の実施形態では、方法は、適応症の治療のための薬物の有効性を決定する(または定量する)ためのヒトDNA中のSNPの検出を含み得る。同様に、本明細書に記載される方法を使用して、特定の患者に対する特定の薬物の有効性を決定することができる。特に、SNPが薬物代謝(したがって、薬物投与)に影響を与え得るため、結果を使用して、有害な反応を予測するか、または予後有意性を有するため、本明細書に記載される方法は、薬物および/または投与処方計画を処方するための個人化医薬プロトコルの一部として使用することができる。
【０２３３】
一部の実施形態では、方法は、母体血液または羊水中のSNPの検出を含み得る。このように、方法は、胎児のリスクプロファイル(例えば、発達異常のリスクを評価すること)を予測または定量することを含み得る。
【０２３４】
方法は、診断、治療、または他の医療ケア用途に適用可能であると本明細書において記述されているが、他の実施形態では、本明細書に記載される装置、組成物、および方法のいずれかは、食品安全性、農業、環境保全、および法医学用途を含む、任意の適切な目的に使用することができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載される装置、組成物、および方法のいずれかを使用して、事件現場の試料が、対象の人物のリスト由来の試料と遺伝子型上同一であるかどうかを決定することができる。他の実施形態では、本明細書に記載される装置、組成物、および方法のいずれかを遺伝子型決定のため使用して、父子評価目的を含む、2人の人物が遺伝子的に関連しているかを決定することができる。
【０２３５】
列挙される実施形態
実施形態セットI
実施形態I-1。生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュール;gyrA領域を標的にするよう設計されたプライマーセットを含有する試薬モジュール;反応体積およびヒーターを含む増幅モジュール、反応体積は、生物学的試料およびプライマーセット増幅溶液を受け取るよう構成され、ヒーターは、熱エネルギーを反応体積に伝達して、gyrA領域を増幅して、標的アンプリコンを含有する出力を生じるよう構成される;ならびに標的アンプリコンの薬物耐性部分への結合を最小にしながら、標的アンプリコンの薬物感受性部分への結合を最大にするよう設計されたプローブを含む、標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールを含む、分子診断装置。
【０２３６】
実施形態I-2。プライマーセットが、gyrA91座位に隣接するように設計される、実施形態I-1の分子診断装置。
【０２３７】
実施形態I-3。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、約60〜約140塩基対である、実施形態I-2の分子診断装置。
【０２３８】
実施形態I-4。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、約80〜約120塩基対である、実施形態I-3の分子診断装置。
【０２３９】
実施形態I-5。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、二次構造を含む、実施形態I-2の分子診断装置。
【０２４０】
実施形態I-6。プローブが、薬物耐性を付与するgyrASer-91部位での他のSNPへの結合を最小にしながら、野生型のシプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型への結合を最大化するように設計される、実施形態I-1の分子診断装置。
【０２４１】
実施形態I-7。プローブが、約52℃の熱力学的支点により特徴付けられる、実施形態I-3の分子診断装置。
【０２４２】
実施形態I-8。第1の遺伝子を増幅して、標的細菌と関連する第一の標的アンプリコンを生成すること;第二の遺伝子を増幅して、薬物耐性変異と関連する第二の標的アンプリコンを生成すること;第一の標的アンプリコンを第一のプローブと反応させて、標的細菌の存在を示す第一のシグナルを生じさせること;および第二の標的アンプリコンを第二のプローブと反応させて、標的細菌が薬物に対して感受性があることを示す第二のシグナルを生じさせることを含む、方法。
【０２４３】
実施形態I-9。第一の遺伝子を増幅させることおよび第二の遺伝子を増幅することが、独立型の装置内で同時に行われる、実施形態I-8の方法。
【０２４４】
実施形態I-10。第二のシグナルが、任意の融解曲線分析を行うことなく生じる、実施形態I-8の方法。
【０２４５】
実施形態I-11。標的細菌が、ナイセリア・ゴノレー(NG)であり、第二の遺伝子が、NGのgyrA遺伝子であり、gyrA遺伝子を増幅することが、生物学的試料をgyrA領域を標的とするように設計されたプライマーセットと混合すること、および生物学的試料とプライマーセットの混合物を、第一の標的アンプリコンおよび第二の標的アンプリコンを生成するのに十分な速度で、第一の温度と第二の温度との間で熱サイクルすることを含む、実施形態I-8の方法。
【０２４６】
実施形態I-12。A)標的細菌の存在およびB)第一の抗生物質に対する耐性を与える標的細菌内の遺伝子変異の存在を決定するために、生物学的試料に対して分子診断検査を行うこと；および分子診断検査の結果に基づき、第二の抗生物質を処方することを含む、方法。
【０２４７】
実施形態I-13。標的細菌が、ナイセリア・ゴノレー(NG)であり、遺伝子変異が、一塩基多型である、実施形態I-12の方法。
【０２４８】
実施形態I-14。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、約20〜約240塩基対である、実施形態I-2の分子診断装置。
【０２４９】
実施形態I-15。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、約20〜約60塩基対である、実施形態I-14の分子診断装置。
【０２５０】
実施形態I-16。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、約140〜約240塩基対である、実施形態I-14の分子診断装置。
【０２５１】
実施形態セットII
実施形態II-1。
ポリヌクレオチドを含む生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュール;
ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール;
反応体積およびヒーターを含む増幅モジュールであって、反応体積は、生物学的試料およびプライマーセットを含む増幅溶液を受け取るよう構成され、ヒーターは、熱エネルギーを反応体積に伝達して、ポリヌクレオチドを増幅して、SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生じさせるよう構成される、増幅モジュール;および
標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールであって、SNP座位が別の対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位への結合を最小にしながら、SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位に結合するよう設計されたプローブを含む、検出モジュールを含む、分子診断装置。
【０２５２】
実施形態II-2。プライマーセットが、SNP座位に隣接するように設計される、実施形態II-1の分子診断装置。
【０２５３】
実施形態II-3。プライマーセットが隣接する標的領域の長さが、約60〜約140塩基対である、実施形態II-2の分子診断装置。
【０２５４】
実施形態II-4。プライマーセットが隣接する標的領域の長さが、約80〜約120塩基対である、実施形態II-3の分子診断装置。
【０２５５】
実施形態II-5。標的アンプリコンが、最小の二次構造を含む、実施形態II-1〜II-4のいずれか一つの分子診断装置。
【０２５６】
実施形態II-6。プライマーセットが、SNP座位を標的とするように設計され、
i)アンチセンス鎖上の標的領域の5’末端における上流プライマー結合部位に実質的に相補的な上流オリゴヌクレオチドプライマー;および
ii)センス鎖上の標的領域の3’末端における下流プライマー結合部位に実質的に相補的な下流オリゴヌクレオチドプライマーを含む、実施形態II-1〜II-5のいずれか一つの分子診断装置。
【０２５７】
実施形態II-7。分子診断装置が、検出モジュールの温度を、第一のプローブの融解温度よりも約5℃、約10℃、または約15℃低い温度で維持するように構成された温度コントローラを含む、実施形態II-1〜II-6の分子診断装置。
【０２５８】
実施形態II-8。検出モジュールが、検出モジュールについて予め決定された温度を維持するように構成された温度コントローラを備え、第一のプローブは、予め決定された温度より約5℃、約10℃、約15℃低い融解温度を有するように設計される、実施形態II-1〜II-7の分子診断装置。
【０２５９】
実施形態II-9。プローブが、SNP座位を含むプローブ結合部位に実質的に相補的であり、標的対立遺伝子と一致したヌクレオチドを含む、実施形態II-1〜II-8の分子診断装置。
【０２６０】
実施形態II-10。プローブが、プローブ結合部位に対して最大二つのヌクレオチドミスマッチを含む、実施形態II-1〜II-9のいずれか一つの分子診断装置。
【０２６１】
実施形態II-11。プローブが、プローブ結合部位に対して完全に相補的である、実施形態II-1〜II-10のいずれか一つの分子診断装置。
【０２６２】
実施形態II-12。プローブが、SNP座位を標的とするように設計されたプライマーセットと重複しない、実施形態II-1〜II-11のいずれか一つの分子診断装置。
【０２６３】
実施形態II-13。検出モジュールが、第二のプローブ結合部位に実質的に相補的な第二のプローブを含み、第二のプローブ結合部位が、SNP座位を含まない、実施形態II-1〜II-12のいずれか一つの分子診断装置。
【０２６４】
実施形態II-14。第二のプローブ結合部位が、第一のプローブの結合部位と重複しない、実施形態II-13の分子診断装置。
【０２６５】
実施形態II-15。検出モジュールが、標的アンプリコン内の第二のプローブ結合部位に実質的に相補的な第二のプローブを含み、第二のプローブ結合部位が、第一のプローブの結合部位と重複しない、実施形態II-1〜II-12のいずれか一つの分子診断装置。
【０２６６】
実施形態II-16。標的対立遺伝子が、薬物耐性対立遺伝子である、実施形態II-1〜II-15のいずれか一つの分子診断装置。
【０２６７】
実施形態II-17。分子診断装置が、生物学的試料中の薬物耐性対立遺伝子を特異的に検出する、実施形態II-1〜II-16のいずれか一つの分子診断装置。
【０２６８】
実施形態II-18。対立遺伝子が、薬物感受性対立遺伝子である、実施形態II-1〜II-15のいずれか一つの分子診断装置。
【０２６９】
実施形態II-19。分子診断装置が、生物学的試料中の薬物耐性対立遺伝子を特異的に検出する、実施形態II-1〜II-15または実施形態II-18のいずれか一つの分子診断装置。
【０２７０】
実施形態II-20。SNP座位が、gyrA領域内にある、実施形態II-1〜II-19のいずれか一つの分子診断装置。
【０２７１】
実施形態II-21。プライマーセットが、gyrA91座位に隣接するように設計される、実施形態II-1〜II-20のいずれか一つの分子診断装置。
【０２７２】
実施形態II-22。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、約60〜約140塩基対である、実施形態II-21の分子診断装置。
【０２７３】
実施形態II-23。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、約80〜約120塩基対である、実施形態II-22の分子診断装置。
【０２７４】
実施形態II-24。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、二次構造を含む、実施形態II-21〜II-23のいずれか一つの分子診断装置。
【０２７５】
実施形態II-25。第一のプローブが、薬物耐性を付与するgyrASer-91部位での他のSNPへの結合を最小にしながら、野生型のシプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型への結合を最大化するように設計される、実施形態II-1〜II-24の分子診断装置。
【０２７６】
実施形態II-26。第一のプローブが、gyrASer-91をコードするコドンを含む第一のプローブ結合部位に実質的に相補的であり、第一のプローブが、シプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型をコードする対立遺伝子に一致するヌクレオチドを含む、実施形態II-1〜II-25のいずれか一つの分子診断装置。
【０２７７】
実施形態II-27。第一のプローブが、シプロフロキサシン感受性gyrASer-91遺伝子型をコードする対立遺伝子と、シプロフロキサシンに対する耐性を付与するgyrA Phe-91部位をコードする抗対立遺伝子とを識別する、実施形態II-1〜II-26のいずれか一つの分子診断装置。
【０２７８】
実施形態II-28。第一のプローブが、約52℃の熱力学的支点および／または融解温度により特徴付けられる、実施形態II-1〜II-27のいずれか一つの分子診断装置。
【０２７９】
実施形態II-29。第一のプローブが、12〜25ヌクレオチドを含む、実施形態II-1〜II-28のいずれか一つの分子診断装置。
【０２８０】
実施形態II-30。第一のプローブが、18〜22ヌクレオチドを含む、実施形態II-29の分子診断装置。
【０２８１】
実施形態II-31。第一のプローブが、50℃〜60℃の融解温度を有する、実施形態II-1〜II-30のいずれか一つの分子診断装置。
【０２８２】
実施形態II-32。第一のプローブが、配列番号14〜20のいずれか一つから選択される配列を含む、本質的にからなる、またはからなる、実施形態II-1〜II-31のいずれか一つの分子診断装置。
【０２８３】
実施形態II-33。第二のプローブが、12〜25ヌクレオチドを含む、実施形態II-1〜II-32のいずれか一つの分子診断装置。
【０２８４】
実施形態II-34。第二のプローブが、18〜22ヌクレオチドを含む、実施形態II-33の分子診断装置。
【０２８５】
実施形態II-35。第二のプローブが、50℃〜60℃の融解温度を有する、実施形態II-1〜II-34のいずれか一つの分子診断装置。
【０２８６】
実施形態II-36。第二のプローブが、配列番号6または22のいずれか一つから選択される配列を含む、本質的にからなる、またはからなる、実施形態II-1〜II-35のいずれか一つの分子診断装置。
【０２８７】
実施形態II-36。分子診断装置は、SNP座位が対立遺伝子を含む場合、少なくとも約0.5nM、少なくとも約1nM、少なくとも約1.5nM、少なくとも約2nM、少なくとも約6nM、少なくとも約8nM、少なくとも約10nM、または少なくとも約15nMのSNP座位を含むポリヌクレオチドを含む生物学的試料中の対立遺伝子を検出する、実施形態II-1〜II-34のいずれか一つの分子診断装置。
【０２８８】
実施形態II-37。分子診断装置が、薬物感受性細菌感染症を有する疑いのある対象が、薬物感受性細菌感染症を有するかどうかを決定する、実施形態II-1〜II-36のいずれか一つの分子診断装置。
【０２８９】
実施形態II-38。分子診断装置が、薬物耐性細菌感染症を有する疑いのある対象が、薬物耐性細菌感染症を有するかどうかを決定する、実施形態II-1〜II-37のいずれか一つの分子診断装置。
【０２９０】
実施形態II-39。
a)実施形態II-1〜II-38のいずれか一つの分子診断装置を、治療に対する感受性と関連する一つまたは複数のSNPにより特徴付けられる疾患または障害を有するか、または有することが疑われる対象由来の生物学的試料に導入することであって、生物学的試料は、対象由来のポリヌクレオチドを含む、導入すること、
b)分子診断装置が、ポリヌクレオチドが、治療に対する感受性と関連する対立遺伝子を含むSNP座位を含むことを示す場合、治療を施すこと、を含む、方法。
【０２９１】
実施形態II-40。疾患または障害が、細菌感染である、実施形態II-39の方法。
【０２９２】
実施形態II-38。
生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュールであって、生物学的試料が、標的細菌由来のポリヌクレオチドを含む、試料調製モジュール;
ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール;
反応体積およびヒーターを含む増幅モジュールであって、反応体積は、生物学的試料およびプライマーセットを含む増幅溶液を受け取るよう構成され、ヒーターは、熱エネルギーを反応体積に伝達して、ポリヌクレオチドを増幅して、SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生じさせるよう構成される、増幅モジュール;および
標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールであって、SNP座位が別の対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位への結合を最小にしながら、SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位に結合するよう設計されたプローブを含む、検出モジュールを含む分子診断装置において行われる方法であって、
方法が、
標的細菌由来のポリヌクレオチドから標的アンプリコンを増幅すること；
任意で、標的細菌由来のポリヌクレオチドから第二の標的アンプリコンを増幅すること；
第一の標的アンプリコンを第一のプローブと反応させて、標的細菌の薬物に対する感受性を示す第一のシグナルを生じさせること；
任意で、第一の標的アンプリコンを第二のプローブと反応させて、生物学的試料中の標的細菌の存在および/または標的アンプリコンの増幅を示す第二のシグナルを生じさせること；および
任意で、第二の標的アンプリコンを第三のプローブと反応させて、生物学的試料中の標的細菌の存在および/または第一の標的アンプリコンと第二の標的アンプリコンのいずれかまたは両方の増幅を示す第三のシグナルを生じさせることを含む、方法。
【０２９３】
実施形態II-42。第一の遺伝子を増幅させることおよび第二の遺伝子を増幅することが、独立型の装置内で同時に行われる、実施形態II-41の方法。
【０２９４】
実施形態II-43。第一のシグナル、第二のシグナル、および/または第三のシグナルが、融解曲線分析を行うことなく生じる、実施形態II-41または実施形態II-42の方法。
【０２９５】
実施形態II-44。
標的細菌が、ナイセリア・ゴノレー(NG)であり；
SNP座位が、NGのgyrA遺伝子内にあり；
標的アンプリコンを増幅することが、
生物学的試料をgyrA領域を標的とするように設計されたプライマーセットと混合すること；および
生物学的試料とプライマーセットとの混合物を、第一の温度と第二の温度の間で、第一の標的アンプリコンおよび任意で第二の標的アンプリコンを生成するのに十分な速度で熱サイクルすることを含む、実施形態II-41〜II-43のいずれか一つの方法。
【０２９６】
実施形態II-45。
生物学的試料を受け取るよう構成された試料調製モジュールであって、生物学的試料が、標的細菌由来のポリヌクレオチドを含む、試料調製モジュール;
ポリヌクレオチドにおける一塩基多型(SNP)座位を標的とするプライマーセットを含有する試薬モジュール;
反応体積およびヒーターを含む増幅モジュールであって、反応体積は、生物学的試料およびプライマーセットを含む増幅溶液を受け取るよう構成され、ヒーターは、熱エネルギーを反応体積に伝達して、ポリヌクレオチドを増幅して、SNP座位を含む標的アンプリコンを含有する出力を生じさせるよう構成される、増幅モジュール;および
標的アンプリコンを受け取るよう構成された検出モジュールであって、SNP座位が別の対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位への結合を最小にしながら、SNP座位が標的対立遺伝子を含む場合、標的アンプリコンのSNP座位に結合するよう設計されたプローブを含む、検出モジュールを含む分子診断装置において行われる方法であって、
方法が、
A)標的細菌の存在およびB)第一の抗生物質に対する耐性を与える標的細菌内の標的対立遺伝子の存在を決定するために、生物学的試料に対して分子診断検査を行うこと；および
分子診断検査の結果に基き、第二の抗生物質を投与することを含む、方法。
【０２９７】
実施形態II-46。標的細菌が、ナイセリア・ゴノレー(NG)である、実施形態II-46の方法。
【０２９８】
実施形態II-47。プライマーセットが、SNP座位に隣接するように設計される、実施形態II-42〜II-46のいずれか一つの方法。
【０２９９】
実施形態II-48。プライマーセットが隣接する標的領域の長さが、約60〜約140塩基対である、実施形態II-42〜II-47のいずれか一つの方法。
【０３００】
実施形態II-49。プライマーセットが隣接する標的領域の長さが、約80〜約120塩基対である、実施形態II-42〜II-48のいずれか一つの方法。
【０３０１】
実施形態II-50。標的アンプリコンが、最小の二次構造を含む、実施形態II-42〜II-49のいずれか一つの方法。
【０３０２】
実施形態II-51。SNP座位を標的とするように設計されるプライマーセットが、
i)アンチセンス鎖上の標的領域の5’末端における上流プライマー結合部位に実質的に相補的な上流オリゴヌクレオチドプライマー;および
ii)センス鎖上の標的領域の3’末端における下流プライマー結合部位に実質的に相補的な下流オリゴヌクレオチドプライマーを含む、実施形態II-42〜II-50のいずれか一つの方法。
【０３０３】
実施形態II-52。方法が、検出モジュールの温度を、第一のプローブの融解温度よりも約5℃、約10℃、または約15℃低い温度で維持するように構成された温度コントローラを含む、実施形態II-42〜II-51のいずれか一つの方法。
【０３０４】
実施形態II-53。検出モジュールが、検出モジュールについて予め決定された温度を維持するように構成された温度コントローラを備え、第一のプローブは、予め決定された温度より約5℃、約10℃、約15℃低い融解温度を有するように設計される、実施形態II-42〜II-52のいずれか一つの方法。
【０３０５】
実施形態II-54。プローブが、SNP座位を含むプローブ結合部位に実質的に相補的であり、標的対立遺伝子と一致したヌクレオチドを含む、実施形態II-42〜II-53のいずれか1の方法。
【０３０６】
実施形態II-55。プローブが、プローブ結合部位に対して最大二つのヌクレオチドミスマッチを含む、実施形態II-42〜II-54のいずれか一つの方法。
【０３０７】
実施形態II-56。プローブが、プローブ結合部位に対して完全に相補的である、実施形態II-42〜II-55のいずれか一つの方法。
【０３０８】
実施形態II-57。プローブが、SNP座位を標的とするように設計されたプライマーセットと重複しない、実施形態II-42〜II-56のいずれか一つの方法。
【０３０９】
実施形態II-58。検出モジュールが、第二のプローブ結合部位に実質的に相補的な第二のプローブを含み、第二のプローブ結合部位が、SNP座位を含まない、実施形態II-42〜II-57のいずれか一つの方法。
【０３１０】
実施形態II-59。第二のプローブ結合部位が、第一のプローブの結合部位と重複しない、実施形態II-58の方法。
【０３１１】
実施形態II-60。検出モジュールが、標的アンプリコン内の第二のプローブ結合部位に実質的に相補的な第二のプローブを含み、第二のプローブ結合部位が、第一のプローブの結合部位と重複しない、実施形態II-42〜II-57のいずれか一つの方法。
【０３１２】
実施形態II-61。標的対立遺伝子が、薬物耐性対立遺伝子である、実施形態II-42〜II-60のいずれか一つの方法。
【０３１３】
実施形態II-62。方法が、生物学的試料中の薬物耐性対立遺伝子を特異的に検出する、実施形態II-42〜II-61のいずれか一つの方法。
【０３１４】
実施形態II-63。対立遺伝子が、薬物感受性対立遺伝子である、実施形態II-42〜II-60のいずれか一つの方法。
【０３１５】
実施形態II-64。方法が、生物学的試料中の薬物耐性対立遺伝子を特異的に検出する、実施形態II-42〜II-60または実施形態II-63のいずれか一つの方法。
【０３１６】
実施形態II-65。SNP座位が、gyrA領域内にある、実施形態II-42〜II-64のいずれか一つの方法。
【０３１７】
実施形態II-66。プライマーセットが、gyrA91座位に隣接するように設計される、実施形態II-42〜II-65のいずれか一つの方法。
【０３１８】
実施形態II-67。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、約60〜約140塩基対である、実施形態II-66の方法。
【０３１９】
実施形態II-68。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、約80〜約120塩基対である、実施形態II-67の方法。
【０３２０】
実施形態II-69。プライマーセットが隣接するgyrA領域の長さが、二次構造を含む、実施形態II-66〜II-68のいずれか一つの方法。
【０３２１】
実施形態II-70。第一のプローブが、薬物耐性を付与するgyrASer-91部位での他のSNPへの結合を最小にしながら、野生型のシプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型への結合を最大化するように設計される、実施形態II-42〜II-69の方法。
【０３２２】
実施形態II-71。第一のプローブが、gyrASer-91をコードするコドンを含む第一のプローブ結合部位に実質的に相補的であり、第一のプローブが、シプロフロキサシン感受性gyrA Ser-91遺伝子型をコードする対立遺伝子に一致するヌクレオチドを含む、実施形態II-42〜II-70のいずれか一つの方法。
【０３２３】
実施形態II-72。第一のプローブが、シプロフロキサシン感受性gyrASer-91遺伝子型をコードする対立遺伝子と、シプロフロキサシンに対する耐性を付与するgyrA Phe-91部位をコードする抗対立遺伝子とを識別する、実施形態II-42〜II-71のいずれか一つの方法。
【０３２４】
実施形態II-73。第一のプローブが、約52℃の熱力学的支点および／または融解温度により特徴付けられる、実施形態II-42〜II-72のいずれか一つの方法。
【０３２５】
実施形態II-74。第一のプローブが、12〜25ヌクレオチドを含む、実施形態II-42〜II-73のいずれか一つの方法。
【０３２６】
実施形態II-75。第一のプローブが、18〜22ヌクレオチドを含む、実施形態II-74の方法。
【０３２７】
実施形態II-76。第一のプローブが、50℃〜60℃の融解温度を有する、実施形態II-42〜II-75のいずれか一つの方法。
【０３２８】
実施形態II-77。第一のプローブが、配列番号14〜20のいずれか一つから選択される配列を含む、本質的にからなる、またはからなる、実施形態II-42〜II-76のいずれか一つの方法。
【０３２９】
実施形態II-78。第二のプローブが、12〜25ヌクレオチドを含む、実施形態II-42〜II-77のいずれか一つの方法。
【０３３０】
実施形態II-79。第二のプローブが、18〜22ヌクレオチドを含む、実施形態II-78の方法。
【０３３１】
実施形態II-80。第二のプローブが、50℃〜60℃の融解温度を有する、実施形態II-42〜II-79のいずれか一つの方法。
【０３３２】
実施形態II-81。第二のプローブが、配列番号6または22のいずれか一つから選択される配列を含む、本質的にからなる、またはからなる、実施形態II-42〜II-80のいずれか一つの方法。
【０３３３】
実施形態II-82。分子診断装置は、SNP座位が対立遺伝子を含む場合、少なくとも約0.5nM、少なくとも約1nM、少なくとも約1.5nM、少なくとも約2nM、少なくとも約6nM、少なくとも約8nM、少なくとも約10nM、または少なくとも約15nMのSNP座位を含むポリヌクレオチドを含む生物学的試料中の対立遺伝子を検出する、実施形態II-42〜II-79のいずれか一つの方法。
【０３３４】
実施形態II-83。分子診断装置が、薬物感受性細菌感染症を有する疑いのある対象が、薬物感受性細菌感染症を有するかどうかを決定する、実施形態II-42〜II-82のいずれか一つの方法。
【０３３５】
実施形態II-84。分子診断装置が、薬物耐性細菌感染症を有する疑いのある対象が、薬物耐性細菌感染症を有するかどうかを決定する、実施形態II-42〜II-83のいずれか一つの方法。
【０３３６】
様々な実施形態が、特定の特性および／または構成要素の組合せを有するとして記載されたが、上で記載された実施形態のいずれかの任意の特性および／または構成要素の組合せを有する他の実施形態が可能である。
【実施例】
【０３３７】
実施例1：Cipro耐性SNP座位を含むGyrA領域を増幅するためのプライマーの設計および評価
108bpのアンプリコン
いくつかのプライマーセットを、gyrA遺伝子(配列番号1)中のセリン91(Ser-91)のSNP座位を標的とするように設計した。第一のプライマーセット設計を、下線付きで下に示す。標的アンプリコン(大文字)は、63℃の計算融解温度および108bpの長さを有する。野生型株におけるセリンをコードするコドンTCC(括弧内)は、フェニルアラニンをコードするTTCコドンを生じる中間のTでSNPを有する。置換により、Cipro耐性が生じる。
【化３−１】
2021534804.tif 000006
【化３−２】
2021534804.tif 000007
【０３３８】
したがって、108bpの標的アンプリコンは、配列を有する。
【化４】
2021534804.tif 000008
【０３３９】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を、以下のパラメータを用いて、以下に列挙するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行った。リバースプライマーを5’標識して、標的アンプリコンの検出を可能にした。「/5BiosG/」は、以下に表す式を有する、リンカーを介してリバースプライマーに結合したビオチンを指す。
【化１】
2021534804.tif 000009
最終反応濃度:
500nMフォワードプライマー:5’-GCGCATCGTCG-3’(配列番号8)
500nMリバースプライマー:5’-/5BiosG/TCAGCACATAACGCATAGC-3’(配列番号9)
10,000コピーのgDNA
75mM KCl、4mMMgCl2、0.06U/μL KAPA、200uM dNTP
熱サイクリングパラメータ
【表Ｂ−１】
2021534804.tif 000010
【表Ｂ−２】
2021534804.tif 000011
【０３４０】
所望のアンプリコン(配列番号7)の増幅を、キャピラリー電気泳動により確認した(図20A)。同様の結果を、四つの実験株で達成した。(WT) Ser91ATCC 49226; (WT) Ser91 CDC 167;(AR) Phe91 CDC 165;および(AR) Phe91 CDC 166 (図20B) 標的アンプリコンの配列決定により、正しいヌクレオチドが存在することを確認した(データは示していない)。
34bpのアンプリコン
【０３４１】
類似するPCR条件を使用して、より短いアンプリコン(配列番号10)を生成した。
最終反応濃度:
300nMフォワードプライマー5’-CCCCCACGGCGATTCC-3’(配列番号11)
300nMリバースプライマー5’-/5BiosG/GATGGTGTCGTAAACTGCGGA-3’(配列番号12)
10,000コピーのgDNA
75mM KCl、4mMMgCl2、0.06U/μL KAPA、200uM dNTP
熱サイクリングパラメータ:
【表Ｃ】
2021534804.tif 000012
【０３４２】
標的アンプリコン(配列番号10)を生成するために使用した、フォワードプライマー(配列番号11)およびリバースプライマー(配列番号12)のリバース相補鎖(配列番号13)の構成を以下に示す。
【化５】
2021534804.tif 000013
【０３４３】
Ser-91gyrAと重複するため、プライマーは、配列特異的である。34bpの標的アンプリコンの増幅を、キャピラリー電気泳動により確認した（図21）。
実施例2：Ser-91gyrAでのSNP検出のための四つのプローブの設計および評価
【０３４４】
108bpおよび34bpのアンプリコンについて、融解温度分析を行った(表3)。
表3
【表３】
2021534804.tif 000014
【０３４５】
四つのプローブを、Ser91 gryA SNP座位のCipro感受性対立遺伝子に一致するように設計した(表4)。プローブ3および4は、プローブの融解温度を低下させるための意図的な不一致を含んでいた。gyrA配列との不一致を、イタリック体および不一致の塩基を指す矢印により示す(不一致は上向きの矢印)。融解温度を、DNASoftware(商標)VisualOMP(商標)を使用して計算した。
表4
【表４】
2021534804.tif 000015
【０３４６】
「/5AmMC6/」は、検出モジュールの表面上の活性化カルボン酸基との反応を介して検出モジュールの表面へのプローブの結合を可能にするために、リンカーを介してプローブに結合したアミン反応部分を指す。5AmMC6は、以下で表す式を有する。
【化２】
2021534804.tif 000016
【０３４７】
各プローブを、アミン反応性架橋剤化学によりマイクロタイタープレートの表面に共有結合させた:
1.  プローブ(アミノリンカーを含む)を、炭酸水素ナトリウム緩衝液で0.25μMに希釈する。
2.  プレートのウェルに希釈したプローブを100μL加える。
3.  プレートを密封フィルムで密封し、室温で30分間インキュベートする。
4.  プローブ溶液を取り除く。
5.  1×PBSで二回洗浄する。
6.  Stabilcoat(登録商標)イムノアッセイブロッカー/安定化剤200μLを加え、密封フィルムで覆い、室温で2時間インキュベートする。
7.  ブロッキング溶液を取り除く。
8.  乾燥剤入りのホイルバッグ内にプレートを保存する。2〜6℃で保存する。
【０３４８】
実施例1のアンプリコンの各々への結合を、以下の条件に従い行った。
アンプリコン:20nM
プローブ:0.25μM
プレート温度:48.8〜49.8℃
NTC:プローブなし+NSアンプリコン
位置: NSプローブ+NSアンプリコン(反応陽性対照)
工程:
9.  アンプリコンを加え、10分間インキュベートする。
10.  洗浄する(1×PBS中の0.02%TWEEN(登録商標)-20)。
11.  HRP(1μg/mL)を加える。
12.  洗浄する(1×PBS中の0.02%TWEEN(登録商標)-20)。
13.  基質(TMBPLUS2）を加える。
【０３４９】
プローブへの標的アンプリコンの結合(TMBの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンジイミンへのHRP触媒変換により検出する)を、図22に示す。108bpの鋳型の各々のプローブへの結合は、Ser91gyrA SNP座位でCipro-R対立遺伝子とCipro-S対立遺伝子を識別する。
【０３５０】
実施例3：強化洗浄緩衝液を使用したSer-91gyrAでのSNP検出のための四つのプローブの設計および評価
三つのプローブを、Ser91 gryA SNP座位のCipro感受性対立遺伝子に一致するように設計した(表5)。プローブ5、6および8は(プローブ3および4のように)、プローブの融解温度を低下させるための意図的な不一致を含んでいた。gyrA配列との不一致を、イタリック体および不一致の塩基を指す矢印により示す(不一致は上向きの矢印)。
表5
【表５】
2021534804.tif 000017
【０３５１】
以下のプロトコルによるこれらのプローブの検査結果を、表6および表7および図23に示す。108bpの鋳型の各々のプローブへの結合は、Ser91 gyrA SNP座位でCipro-R対立遺伝子とCipro-S対立遺伝子を識別する。
条件
アンプリコン:20nM
プローブ:0.25μM
プレート温度:48.5〜49.8℃
陰性: 検査プローブ+NSアンプリコン
NTC:プローブなし+NSアンプリコン
位置: NSプローブ+NSアンプリコン(反応陽性対照)
強化洗浄緩衝液
1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)
76.92mM KCl
1.92 mM MgCl2
0.03%ProClin300 (v/v)
0.02% Tween-20(v/v)、pH7.4
工程
1.  アンプリコンを加え、10分間インキュベートする。
2.  洗浄する(強化洗浄緩衝液)。
3.  HRP(1μg/mL)を加える。
4.  洗浄する(強化洗浄緩衝液)。
5.  基質(TMB PLUS2）を加える。
表6：640nmの吸光度
【表６】
2021534804.tif 000018
表7：シグナル:バックグラウンド
【表７】
2021534804.tif 000019
【０３５２】
実施例4：第二のプローブを内部対照として使用した68bpの標的アンプリコンの設計および評価
gryA-Ser91SNP座位に隣接し、68bpの産物を生成するように設計したプライマーを使用して、追加の標的アンプリコンを検査した:
【化６−１】
2021534804.tif 000020
【化６−２】
2021534804.tif 000021
【０３５３】
対照プローブ(配列番号22)を、対立遺伝子特異的プローブ1〜5および7〜8と同じ標的アンプリコン内に結合するように設計した。対照プローブおよび対立遺伝子特異的プローブ結合部位は、重複しない。Cipro感受性株CDC167およびCDC175、またはCipro耐性株CDC166およびCDC168由来の鋳型を、標準パラメータを使用してPCR増幅した。
【０３５４】
検出モジュール(フローセルとも呼ばれる)を、図24に示す通り構成させた。各株由来の68bpのアンプリコンを、フローセルを通過させ、次に、検出試薬1(HRP)を加え、続いて、強化洗浄緩衝液を加え、以下の体積および流速を使用して基質(TMB)を加えた。全ての工程を、52℃で行った。
1.  アンプリコンハイブリダイゼーション。60μL。0.35μL/秒。
2.  酵素(HRP)。270μL。5μL/秒。
3.  洗浄液(強化洗浄緩衝液)270μL。5μL/秒。
4.  基質。270μL。5μL/秒。2×
【０３５５】
実験は、対照プローブ(配列番号22)および対立遺伝子特異的プローブ3(配列番号16)が、Cipro感受性(Cipro-S)株とCipro-耐性(Cipro-R)株を区別することを示す(図25)。
【０３５６】
検出限界を決定するために、類似の条件下で、一回の反応当たり100,000種のと同等に少ない細菌ゲノムを投入物質として使用して実験を行った。図26および図27は、装置が、この低い試料濃度でさえ感受性株と耐性株を区別することを示す。対立遺伝子特異的プローブからのシグナルは、Cipro耐性株由来の鋳型を検査したとき、対照プローブからのシグナルと比較して低減する。Cipro感受性株由来の鋳型を検査したとき、両方のプローブからの強力なシグナルを観察した。
【０３５７】
前述の実施例は、本発明の例示のみを目的としており、以下の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を制限しない。
【図１】
2021534804.tif 000022
【図２】
2021534804.tif 000023
【図３】
2021534804.tif 000024
【図４】
2021534804.tif 000025
【図５Ａ】
2021534804.tif 000026
【図５Ｂ】
2021534804.tif 000027
【図６】
2021534804.tif 000028
【図７】
2021534804.tif 000029
【図８】
2021534804.tif 000030
【図９】
2021534804.tif 000031
【図１０】
2021534804.tif 000032
【図１１】
2021534804.tif 000033
【図１２】
2021534804.tif 000034
【図１３】
2021534804.tif 000035
【図１４】
2021534804.tif 000036
【図１５】
2021534804.tif 000037
【図１６】
2021534804.tif 000038
【図１７】
2021534804.tif 000039
【図１８】
2021534804.tif 000040
【図１９】
2021534804.tif 000041
【図２０Ａ】
2021534804.tif 000042
【図２０Ｂ】
2021534804.tif 000043
【図２１】
2021534804.tif 000044
【図２２】
2021534804.tif 000045
【図２３】
2021534804.tif 000046
【図２４】
2021534804.tif 000047
【図２５】
2021534804.tif 000048
【図２６】
2021534804.tif 000049
【図２７】
2021534804.tif 000050
【配列表】
2021534804000001.app
【国際調査報告】
2021534804.tif 000051
2021534804.tif 000052