(57)【要約】  微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）灌流フィルタは、近位端部および遠位端部を有する中空シリンダーを備える。近位端部は、直列に透過容器に接続されたあと、保持容器に接続される。近位端部は、（ｉ）透過容器内または透過容器で終端するか、（ｉｉ）保持容器内または保持容器で終端する。（ｉｉ）の場合、透過容器内の近位端部の一部は、中空シリンダーの内部と透過容器との間の流体連通を可能にする少なくとも１つの開口部をもつ。Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタは、正圧または負圧の供給源と連通するために、保持容器の上に配置された注入口と、透過容器の壁に位置づけられた排出口とをさらに含み、この排出口が逆止弁に接続可能であり、次にこの逆止弁が疎水性流体ベントフィルタに接続可能である。【選択図】図３
2021500057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）灌流フィルタ：
近位端部と遠位端部をもつ中空シリンダーであって、前記近位端部は直列に透過容器に接続されたあと、保持容器に接続され、前記近位端部は（ｉ）前記透過容器内または前記透過容器で終端するか、（ｉｉ）前記保持容器内または前記保持容器で終端し、（ｉｉ）の場合、前記透過容器内の前記近位端部の一部が、前記中空シリンダーの内部と前記透過容器との間の流体連通を可能にする少なくとも１つの開口部をもつ、中空シリンダー；
前記保持容器の上に配置された、正圧または負圧の供給源と連通するための注入口；
前記透過容器の壁に位置づけられた排出口であって、前記排出口が逆止弁に接続可能であり、次に前記逆止弁が疎水性流体ベントフィルタに接続可能である、排出口。
【請求項２】
前記排出口が、ガスを進入させずにガスの前記透過容器からの漏出を可能にする逆止弁でキャップされている、請求項１に記載のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ。
【請求項３】
前記近位端部が、前記透過容器内または前記透過容器で終端している、請求項１に記載のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ。
【請求項４】
各々が第１端部および第２端部をもつ１つ以上の中空繊維フィルタをさらに有し、前記１つ以上の中空繊維フィルタは、前記中空シリンダーの遠位端部の方向に沿って延びる前記第１端部と、前記保持容器内または前記保持容器で終端する前記第２端部とを有し、前記中空シリンダー内の長手方向に配置されている、請求項１に記載のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ。
【請求項５】
前記１つ以上の中空繊維フィルタの前記第１端部が、前記中空シリンダーの長さにわたって下方へ延在し、前記中空シリンダーの遠位端部またはその近くで終端している、請求項４に記載のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ。
【請求項６】
前記１つ以上の中空繊維フィルタが、約０．５ｍｍ〜約１ｍｍの範囲の内径をもつ、請求項４に記載のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ。
【請求項７】
前記１つ以上の中空繊維フィルタが、約０．２μｍ〜約２．０μｍの範囲の平均孔径をもつ中空繊維フィルタ媒体を含む、請求項４に記載のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ。
【請求項８】
前記１つ以上の中空繊維フィルタが、約０．６５μｍの平均孔径をもつ、請求項４に記載のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ。
【請求項９】
前記１つ以上の中空繊維フィルタが、約２０ｋＤａ〜約７０ｋＤａの範囲の分子量をもつ分子の通過を許容しない平均孔径をもつ、請求項４に記載のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ。
【請求項１０】
前記１つ以上の中空繊維フィルタが、約３０ｋＤａ以上の分子量をもつ分子の通過を許容しない平均孔径をもつ、請求項９に記載のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ。
【請求項１１】
前記１つ以上の中空繊維フィルタが、約５０ｋＤａ以上の分子量をもつ分子の通過を許容しない平均孔径をもつ、請求項９に記載のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ。
【請求項１２】
以下を備えたシステム：
約１５ｍＬ以下の細胞培養培地中にある体積の細胞を保持できるハウジング；
以下を備えた微小交互接線灌流フィルタ（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）：
（ａ）近位端部と遠位端部を備えた中空シリンダーであって、前記近位端部が（ｉ）透過容器、および（ｉｉ）フィルタ要素によって前記透過容器から分離された保持容器に接続される、中空シリンダー；  （ｂ）前記保持容器の上に配置された、正負交互の圧力源と連通するための注入口；  （ｃ）前記透過容器の壁に位置づけられた排出口；および、
前記ハウジングの少なくとも１つのウェルを前記ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦの近位端部に接続する流体導管。
【請求項１３】
前記ハウジングが、０．２ｍＬ、０．５ｍＬ、１．０ｍＬ、２．０ｍＬ、５．０ｍＬ、１０ｍＬ、または１５ｍＬの容量のマルチウェルプレートである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記排出口が、フィルタを通って前記保持容器に逆流するのを防ぐ一方で、流体がフィルタを通って前記透過容器に流れ込むことを可能にする、逆止弁でキャップされている、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記フィルタ要素が、管状膜または少なくとも１つの中空繊維膜を含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
前記フィルタ要素は、サイクル当たり５０〜１００μｌのフィルタフラックスによって特徴付けられる、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記ハウジングが、細胞培養培地中に約１０ｍＬ以下の体積の細胞を保持する、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１８】
前記ハウジングが、細胞培養培地中に約５ｍＬ以下の体積の細胞を保持する請求項１２に記載のシステム。
【請求項１９】
前記逆止弁が疎水性流体ベントフィルタに接続されている、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２０】
前記マルチウェルプレートの複数のウェルを複数のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦと接続する複数の流体導管を含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項２１】
前記正圧または負圧の供給源がピペットである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項２２】
前記ピペットが手動で操作される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記ピペットがロボットで操作される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記透過容器に堆積された細胞培養培地の体積が、約５０μＬ〜約５００μＬの範囲である、請求項１２に記載のシステム。
【請求項２５】
前記透過容器に堆積された細胞培養培地の体積が、約１００μＬ〜約３００μＬの範囲である、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
以下の工程を含む交互接線流灌流フィルタを通る細胞培養培地中の細胞の断続的な灌流の実施方法：
体積が約０．５ｍＬ〜約５ｍＬの範囲の細胞培養培地中の細胞を、１つ以上の中空繊維フィルタの内腔を経由して透過容器を通り越して、保持容器内に引き抜く工程；
前記１つ以上の中空繊維フィルタの前記内腔を経由して細胞培養培地中の前記細胞を戻す工程であって、それにより、ある体積の細胞培養培地が前記１つ以上の中空繊維フィルタの多孔性壁を通過し、前記透過容器に集まる、戻す工程。
【請求項２７】
前記透過容器に集まる細胞培養培地の体積が、約２５μＬ〜約１０００μＬの範囲である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記透過容器に集まる細胞培養培地の体積が、約０．１ｍＬ〜約０．５ｍＬの範囲である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記透過容器が、逆止弁でキャップされた排出口を備える、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
以下の工程を含む、培養培地中に約１５ｍＬ以下の細胞を保持する処理容器に保持された細胞培養培地中で細胞を灌流する方法：
１つ以上の中空繊維フィルタ、排出口を備えた透過容器、保持容器、および、微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）フィルタを正圧または負圧の供給源に接続するための注入口を備えた微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）フィルタを用いて、細胞培養培地中に細胞を保持するハウジングを含む処理容器から、細胞培養培地中の前記細胞を引き抜く工程；および
細胞培養培地中の前記細胞を前記処理容器に戻す工程。
【請求項３１】
細胞培養培地中の前記細胞を前記処理容器に戻すときに、ある体積の細胞培養培地が前記透過容器内に堆積される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記処理容器から引き抜かれた細胞培養培地中の細胞は、約０．５ｍＬ〜約５ｍＬの体積の範囲である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記処理容器から引き抜かれた細胞培養培地中の前記細胞が、約１．０ｍＬ〜約３．０ｍＬの体積の範囲である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記処理容器から引き抜かれた細胞培養培地中の前記細胞が、体積で約２．０ｍＬになる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記透過容器に堆積される細胞培養培地の体積が、約１０μＬ〜約３００μＬの範囲である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記透過容器に堆積される細胞培養培地の体積が、約５０μＬ〜約２５０μＬの範囲である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記透過容器に堆積される細胞培養培地中の細胞の体積が、約１００μＬ〜約２００μＬの範囲である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
細胞培養培地中の前記細胞が、前記１つ以上の中空繊維フィルタの多孔性壁上の細胞培養培地中の細胞の交互接線流の複数サイクルにわたって、引き抜かれ、戻される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
交互接線流の複数サイクルにわたって細胞培養培地中の細胞の引き抜きおよび返戻が断続的に繰り返される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
新鮮な細胞培養培地を前記処理容器に導入することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
交互接線流の複数サイクルにわたる細胞培養培地中の細胞の引き抜きおよび返戻が、約１ｐｓｉの圧力下にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
導入される前記新鮮な細胞培養培地が、おおよそ細胞培養培地の体積に達し、交互接線流の前記複数サイクルにわたって前記透過容器内に堆積される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
約１ｍＬ〜約３ｍＬの新鮮な細胞培養培地が導入される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
約１．５ｍＬ〜約２．５ｍＬの新鮮な細胞培養培地が導入される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
約２ｍＬの新鮮な細胞培養培地が導入される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
以下の工程を含む、細胞培養物から細胞産物を採取する方法：細胞が培養培地中の収集濃度で細胞産物を産生するまで、培養培地の開始容量１５ｍＬ以下で細胞を培養する工程であって、ここで、前記細胞は、微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）装置に接続された処理容器を含む細胞培養システムで培養される、培養する工程；前記処理容器と前記ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ装置との間で前記培養培地を交互に流すことで、それらの間で前記培養培地を移す工程であって、ここで、交互の流れは、細胞産物を含む流体をｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ装置を通過させて透過容器内に入れ、前記培養培地中の細胞産物の濃度を前記収集濃度未満に低下させる、移す工程；
前記透過容器から細胞産物を含む液体を抽出する工程。
【請求項４７】
所望の容量まで流体を前記処理容器に補充し、前記方法の工程を繰り返す工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記処理容器は、マルチウェルプレートである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記開始容量は、０．２、０．５、１．０、１．５、２．０ｍＬである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
複数の流体導管が、前記マルチウェルプレートの複数のウェルを複数のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦと接続する、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、  発明の名称を「Ｍｉｃｒｏ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒ，Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  ｏｆ」とし、２０１７年１０月２６日を出願日とする米国仮特許出願第６２／５７７，４３６号を基礎として米国特許法１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張するものであり、当該米国仮特許出願の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、概して微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）灌流フィルタ、より具体的にはその使用にあたり必要となる装置、システム、および使用法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
通常、ろ過は、流体溶液、混合物または懸濁液を分離、清澄化、改質および／または濃縮するために行われる。バイオテクノロジーや製薬業界では、ろ過は新薬、診断薬、およびその他の生物学的製品の製造、処理、およびテストを成功させるために不可欠な工程である。例えば、動物の細胞培養を使用して生物学的製剤を製造するプロセスでは、培養培地から特定の成分を清澄化し、選択的に除去、濃縮するために、または、次処理を行う前に培地を改質するために、ろ過を行う。ろ過は、培養物を灌流状態で高細胞濃度に維持することで、生産性を高めるためにも使用できる。多くの特許出願により、大規模な培地ろ過に適した様々なろ過システムが実在する。しかしながら、一般に従来のシステムは、マイクロスケール実装での微量の培地をろ過するのには不向きである。さらに、少量培地の濃縮および／またはサンプリング、あるいは細胞培養培地における細胞の灌流を実現するには、従来のシステムは、製造や保守が難しい複雑な構造を有しているか、もしくは小容量（例えば、３０ｍＬ以下や２０ｍＬ以下の液体、時には１５ｍＬ以下の液体を保持するマイクロバイオリアクター）への応用には不向きであることが多い。当業者は、そのような小容量の処理を目的とする場合、遠心分離機の使用に頼ってきた。
【０００４】
しかし、遠心分離機は、特にバイオテクノロジーなどの高度な規制のある分野において、商業的なろ過プロセスの検証の代用になり得ない。従来のバイオプロセッシングベッセルの容量の下限は通常、約１Ｌである。既存のろ過ベッセルに必要な比較的大きな容量には、それ相応の大量の材料と専門のスタッフが必要となる。バイオテクノロジーに関連する製品の商業化を目指す中小企業にとって、既存のプロセスに関連するコストは法外に高くなる可能性がある。効果的なろ過に必要な容量を減らすことは、小規模ろ過のプロセスにおける全体的なコストに大きな影響を与える一方、そのようなプロセスで生成されるデータと大規模のろ過プロセスとの比較可能性の維持も期待できる。
【発明の概要】
【０００５】
本出願は、近位端部および遠位端部をもつ中空シリンダーを含む、微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）灌流フィルタを開示するものである。Mｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタは、μＡＴＦ灌流フィルタとも称される。近位端部は、透過容器に直列に接続されたあと、保持容器に接続される。近位端部は、（ｉ）透過容器内または透過容器で終端するか、（ｉｉ）保持容器内または保持容器で終端する。（ｉｉ）の場合、透過容器内の近位端部の一部は、中空シリンダーの内部と透過容器との間の流体連通を可能にする少なくとも１つの開口部をもつ。Mｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタはさらに、正圧または負圧の供給源と連通するために保持容器の上に配置された注入口と、透過容器の壁部に位置づけられた排出口であって、この排出口が逆止弁に接続可能であり、次にこの逆止弁が疎水性流体ベントフィルタに接続可能であるような排出口とを備える。
【０００６】
本出願は、約１５ｍＬ以下の細胞培養培地中にある体積の細胞を保持できるハウジング、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ、および、ハウジングのウェルとｍｉｃｒｏ  ＡＴＦとの間の流体導管を備えたシステムを開示するものである。  ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦは、（ａ）近位端部および遠位端部をもつ中空シリンダーであって、前述の近位端部は、（ｉ）透過容器、および（ｉｉ）フィルタ要素によって透過容器から分離された保持容器に接続される、中空シリンダー；（ｂ）保持容器の上に位置づけられ、正・負交互の圧力源と連通するための注入口；および（ｃ）透過容器の壁に位置づけられた排出口を備える。いくつかの実施形態では、ハウジングは、０．２ｍＬ、０．５ｍＬ、１．０ｍＬ、２．０ｍＬ、５．０ｍＬ、１０ｍＬ、または１５ｍＬの容量をもつマルチウェルプレートである。いくつかの実施形態では、排出口は、流体がフィルタを通って透過容器に流れ込むことができる一方で、フィルタを通って保持容器への逆流を防止する逆止弁でキャップされている。
【０００７】
本出願はさらに、細胞培養培地中で細胞を灌流するための処理容器を開示する。処理容器は、約１５ｍＬ以下の細胞培養培地中にある体積の細胞を保持できるハウジングを備える。バイオリアクターのハウジングは、開口部またはコネクタを介して、微小交互接線灌流フィルタを備えており、該フィルタは以下を備える：（ａ）近位端部および遠位端部をもつ中空シリンダーであって、前述の近位端部は、透過容器に直列に接続され、その後保持容器が続く、中空のシリンダ；（ｂ）保持容器の上に配置された、正圧または負圧の供給源と連通するための注入口；および（ｃ）透過容器の壁に配置された排出口。
【０００８】
本出願はまた、交互接線流灌流フィルタを横切る細胞培養培地中の細胞の断続的な灌流の実施方法を開示する。この方法は、体積が約０．５ｍＬ〜約５ｍＬの細胞培養培地中の細胞を、１つ以上の中空繊維フィルタの内腔を経由して透過容器を通り越して、保持容器内に引き抜くことを含む。この方法は、前述の細胞培養培地中の細胞を、前述の１つ以上の中空繊維フィルタの内腔を経由して戻すことをさらに含み、それによって、ある体積の細胞培養培地が、前述の１つ以上の中空繊維フィルタの多孔性壁を通過し、前述の透過容器に集まる。
【０００９】
本出願はさらに、培養培地中に約１５ｍＬ以下の細胞を保持する処理容器中に保持された細胞培養培地の中で細胞を灌流する方法を開示する。この方法は、１つ以上の中空繊維フィルタ、排出口を備えた透過容器、保持容器、およびｍｉｃｒｏ  ＡＴＦフィルタを正圧または負圧の供給源に接続するための注入口を備えたｍｉｃｒｏ  ＡＴＦフィルタを使用して、細胞培養培地中に細胞を保持するハウジングを含む処理容器から細胞培養培地中の細胞を引き抜くことを含む。この方法はさらに、細胞培養培地中の細胞を処理容器に戻すことをも含む。
【００１０】
開示された実施形態は、変更され、様々な方法で使用されてもよい。例えば、複数の処理容器が提供され得るシステムを含め、様々な構成が容易に明確である。代替の例示的実施形態は、特許請求の範囲に記載され得るような他の特徴および特徴の組み合わせに関連したものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本明細書の開示内容は、以下の詳細な説明を、添付の図面と併用することで、より完全な理解を得られるものである。また、ここで、同様の参照番号、記号、または用語は、文脈により特に否定的な指示がない限り、基本的に同様のコンポーネントを指すものとする。
【００１２】
【図１】図１は、例示的実施形態に係る微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）灌流フィルタ装置を示すものである。
【００１３】
【図２】図２は、例示的実施形態に係る灌流フィルタを備えた処理容器を含むシステムを示すものである。
【００１４】
【図３】図３は、例示的実施形態に係る方法を示している。
【００１５】
【図４】図４は、例示的実施形態に係る方法を示している。
【００１６】
【図５ａ】図５ａは、例示的実施形態に係る微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）灌流フィルタ装置を示す。
【００１７】
【図５ｂ】図５ｂは、例示的実施形態に係るマルチウェルプレートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
近位端部および遠位端部をもつ中空シリンダーを含むｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタに関する一実施形態。近位端部は、透過容器に直列に接続されたあと、保持容器に接続される。近位端部は、（ｉ）透過容器内または透過容器で終端するか、（ｉｉ）保持容器内または保持容器で終端する。（ｉｉ）の場合、透過容器内の近位端部の一部は、中空シリンダーの内部と透過容器との間の流体連通を可能にする少なくとも１つの開口部をもつ。Mｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタは、正圧または負圧の供給源と連通するために、保持容器の上に配置された注入口と、透過容器の壁に位置づけられた排出口であって、この排出口が逆止弁に接続可能であり、次にこの逆止弁が疎水性流体ベントフィルタに接続可能であるような排出口とを、さらに備える。
【００１９】
Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタの一実施形態では、排出口は、ガスが進入できないようにしながら、ガスが透過容器から漏出することを可能にする逆止弁でキャップされている。
【００２０】
Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタの一実施形態では、近位端部は、透過容器内または透過容器で終端する。
【００２１】
Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタの一実施形態では、灌流フィルタは、それぞれが第１端部および第２端部をもつ１つ以上の中空繊維フィルタをさらに有し、当該１つ以上の中空繊維フィルタは、中空シリンダーの遠位端部の方向に沿って延びる第１端部と、保持容器内または保持容器で終端する第２端部とを有し、中空シリンダー内の長手方向に配置されている。
【００２２】
Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタの一実施形態では、１つまたは複数以上の中空繊維フィルタの第１端部は、中空シリンダーの長さにわたって下方へ延在し、中空シリンダーの遠位端部またはその近くで終端する。
【００２３】
Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタの一実施形態では、１つ以上の中空繊維フィルタは、約０．５ｍｍ〜約１ｍｍの範囲の内径をもつ。
【００２４】
Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタの一実施形態では、１つ以上の中空繊維フィルタは、約０．２μｍ〜約２．０μｍの範囲の平均孔径をもつ中空繊維フィルタ媒体を含む。
【００２５】
Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタの一実施形態では、１つ以上の中空繊維フィルタは、約０．６５μｍの平均孔径をもつ。
【００２６】
Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタの一実施形態では、１つ以上の中空繊維フィルタは、約２０ｋＤａ〜約７０ｋＤａの範囲の分子量をもつ分子の通過を許容しない平均孔径をもつ。
【００２７】
Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタの一実施形態では、１つ以上の中空繊維フィルタは、約３０ｋＤａ以上の分子量をもつ分子の通過を許容しない平均孔径をもつ。
【００２８】
Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタの一実施形態では、１つ以上の中空繊維フィルタは、約５０ｋＤａ以上の分子量をもつ分子の通過を許容しない平均孔径をもつ。
【００２９】
別の実施形態は、細胞培養培地における細胞の灌流システムに関する。このシステムは、約１５ｍＬ以下の細胞培養培地中にある体積の細胞を保持できるハウジングを備えている。システムは、開口部またはコネクタを介して、以下を含む微小交互接線灌流フィルタを備えている。（ａ）近位端部および遠位端部をもつ中空シリンダーであって、前述の近位端部は、（ｉ）透過容器、および（ｉｉ）フィルタ要素によって透過容器から分離された保持容器に接続される、中空シリンダー；（ｂ）保持容器の上に位置づけられ、正・負交互の圧力源と連通するための注入口；（ｃ）透過容器の壁に位置づけられた排出口。別の実施形態では、流体導管がハウジングの少なくとも１つのウェルをｍｉｃｒｏ  ＡＴＦの近位端部に接続する。別の実施形態では、ハウジングはマルチウェルプレートである。
【００３０】
システムの一実施形態では、少なくとも中空シリンダーの遠位端部は、マルチウェルプレートに保持され得る細胞培養培地中のある体積の細胞と接触している。別の実施形態では、マルチウェルプレートは、０．２ｍＬ、０．５ｍＬ、１．０ｍＬ、２．０ｍＬ、５．０ｍＬ、１０ｍＬ、または１５ｍＬの容量とする。
【００３１】
灌流フィルタを備えたシステムの一実施形態では、フィルタ排出口は、流体がフィルタを通って透過容器に流れ込むことを可能にし、フィルタを通って保持容器に戻る逆流を防止し得る逆止弁でキャップされている。
【００３２】
灌流フィルタを備えたシステムの一実施形態では、排出口は、必要に応じて、透過容器に堆積され得る細胞培養培地の除去を可能にするものである。
【００３３】
システムの一実施形態では、フィルタ要素は、管状膜または少なくとも１つの中空繊維膜を含む。システムの一実施形態では、フィルタ要素は、サイクル当たり５０〜１００μｌのフィルタフラックスが特徴である。システムの一実施形態では、ハウジングは、細胞培養培地中に約１０ｍＬ以下の体積の細胞を保持するものである。システムの一実施形態では、ハウジングは、細胞培養培地中に約５ｍＬ以下の体積の細胞を保持するものである。システムの一実施形態では、ハウジングは、細胞培養培地中に約２ｍＬ以下の体積の細胞を保持するものである。システムの一実施形態では、ハウジングは、細胞培養培地中に約１ｍＬ以下の体積の細胞を保持するものである。システムの一実施形態では、ハウジングは、細胞培養培地中に約０．５ｍＬ以下の体積の細胞を保持するものである。システムの一実施形態では、ハウジングは、細胞培養培地中に約０．２ｍＬ以下の体積の細胞を保持するものである。
【００３４】
灌流フィルタを備えたシステムの一実施形態では、灌流フィルタの逆止弁は、疎水性流体ベントフィルタに接続されている。
【００３５】
灌流フィルタを備えたシステムの一実施形態では、注入口が負圧の供給源と連通すると、細胞培養培地中の細胞がハウジングから保持容器へと引き抜かれる。
【００３６】
灌流フィルタを備えたシステムの一実施形態では、注入口が正圧の供給源と連通すると、細胞培養培地中の前述の細胞がハウジングに戻され、それにより、ある体積の細胞培養培地が透過容器に堆積される。
【００３７】
システムの一実施形態では、システムは、マルチウェルプレートの複数のウェルを複数のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦと接続する複数の流体導管を含む。
【００３８】
システムの一実施形態では、正圧または負圧の供給源は、ピペットを介して供給される。システムの実施形態では、正圧または負圧の供給源は、手動で操作されるピペットを介して供給される。システムの一実施形態では、正圧または負圧の供給源は、ロボットで操作されるピペットを介して供給される。
【００３９】
灌流フィルタを備えたシステムの一実施形態では、透過容器に堆積される細胞培養培地の容積は、約５０μＬ〜約５００μＬの範囲とする。
【００４０】
灌流フィルタを備えたシステムの実施形態では、透過容器に堆積される細胞培養培地の容積は、約１００μＬ〜約３００μＬの範囲とする。
【００４１】
さらに別の実施形態は、交互接線流灌流フィルタを横切って、細胞培養培地中の細胞の断続的な灌流を実施する方法についてである。この方法は、体積が約０．５ｍＬ〜約５ｍＬの細胞培養培地中の細胞を、１つ以上の中空繊維フィルタの内腔を経由して透過容器を通り越して、保持容器内へと引き抜くことを含む。この方法は、細胞培養培地中の前述の細胞を、前述の１つ以上の中空繊維フィルタの内腔を経由して戻すことをさらに含み、それによって、ある体積の細胞培養培地が、１つ以上の中空繊維フィルタの多孔性壁を通過し、透過容器に集まる。
【００４２】
断続的な灌流の実施方法の一実施形態では、前述の透過容器に集められた細胞培養培地の容量は、約２５μＬ〜約１０００μＬの範囲である。
【００４３】
断続的な灌流の実施方法の一実施形態では、前述の透過容器に集められた細胞培養培地の容量は、約０．１ｍＬ〜約０．５ｍＬの範囲である。
【００４４】
断続的な灌流の実施方法の一実施形態では、透過容器は、逆止弁でキャップされた排出口を備える。
【００４５】
さらなる実施形態は、培養培地中に約１５ｍＬ以下の細胞を保持する処理容器中に保持された細胞培養培地中の細胞を灌流する方法についてのものである。この方法は、１つ以上の中空繊維フィルタ、排出口を備えた透過容器、保持容器、およびｍｉｃｒｏ  ＡＴＦフィルタを正圧または負圧の供給源に接続するための注入口を備えたｍｉｃｒｏ  ＡＴＦフィルタを使用して、細胞培養培地中に細胞を保持するハウジングを含む処理容器から細胞培養培地中の細胞を引き抜くことを含む。この方法はさらに、細胞培養培地中の細胞を処理容器に戻すことをも含む。
【００４６】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、細胞培養培地中の細胞を処理容器に戻すときに、ある体積の細胞培養培地が透過容器に堆積される。
【００４７】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、処理容器から引き抜かれた細胞培養培地中の細胞は、約０．５ｍＬ〜約５ｍＬを容積範囲とする。
【００４８】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、処理容器から引き抜かれた細胞培養培地中の細胞は、約１．０ｍＬ〜約３．０ｍＬを容積範囲とする。
【００４９】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、処理容器から引き抜かれた細胞培養培地中の細胞は、約２．０ｍＬである。
【００５０】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、透過容器に堆積される細胞培養培地の体積は、約１０μＬ〜約３００μＬの範囲である。
【００５１】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、透過容器に堆積される細胞培養培地の体積は、約５０μＬ〜約２５０μＬの範囲である。
【００５２】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、透過容器に堆積される細胞培養培地中の細胞の体積は、約５０μＬ〜１００μＬ、または１００μＬ〜約２００μＬの範囲である。
【００５３】
細胞を灌流する方法の一実施形態において、細胞培養培地中の細胞は、前述の１つ以上の中空繊維フィルタの多孔性壁上の細胞培養培地中の細胞の交互接線流の複数サイクルにわたって引き抜かれ、戻される。供給／保持チャンネルから透過チャンネルにフィルタを通過する流体量として定義されるフィルタフラックスは、約５０μＬ〜１００μＬ、または１００μＬ〜約２００μＬの範囲である。  本開示におけるフィルタフラックスは、１つの交互のフローサイクル中に発生するフラックスとして定義される。
【００５４】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、交互接線流の複数サイクルにわたる細胞培養培地中の細胞の引き抜きおよび返戻が断続的に繰り返される。
【００５５】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、交互接線流の複数サイクルにわたる細胞培養培地中の細胞の引き抜きおよび返戻は、約１ｐｓｉの圧力下にある。
【００５６】
細胞を灌流する方法の一実施形態で、この方法はさらに、新鮮な細胞培養培地を処理容器に導入することを含む。
【００５７】
細胞を灌流する方法の一実施形態において、導入される新鮮な細胞培養培地は、細胞培養培地の体積にほぼなり、これは、前述の交互接線流の複数サイクルにわたって透過容器に堆積される。
【００５８】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、約１ｍＬ〜約３ｍＬの新鮮な細胞培養培地が導入される。
【００５９】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、約１．５ｍＬ〜約２．５ｍＬの新鮮な細胞培養培地が導入される。
【００６０】
細胞を灌流する方法の一実施形態では、約２ｍＬの新鮮な細胞培養培地が導入される。
【００６１】
追加の実施形態は、細胞培養物から細胞産物を採取する方法に関するものである。当該方法は、細胞が培養培地中の収集濃度で細胞産物を産生するまで、培養培地の１５ｍＬ以下の開始容量で細胞を培養する工程を含み、該細胞は、微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）装置に接続された処理容器を含む細胞培養システムで培養される。当該方法は、処理容器とｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ装置の間に培養培地を交互に流すことにより、それらの間で培養培地を移す工程を含み、ここで交互の流れは、細胞産物を含む流体がｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ装置を通って透過容器に入るようにし、培養培地中の細胞産物の濃度を収集濃度未満に減らす。当該方法は、細胞産物を含む液体を透過容器から抽出する工程を含む。
【００６２】
一例では、細胞培養物から細胞産物を採取する方法は、所望の容量まで流体で処理容器を補充する工程と、当該方法の工程を繰り返す工程を含む。
【００６３】
細胞培養物から細胞産物を採取する方法の一実施形態では、処理容器はマルチウェルプレートである。
【００６４】
細胞培養物から細胞産物を採取する方法の一実施形態では、開始容量は、０．２、０．５、１．０、１．５、２．０ｍＬである。
【００６５】
細胞培養物から細胞産物を採取する方法の一実施形態では、複数の流体導管がマルチウェルプレートの複数のウェルを複数のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦと接続する。
【詳細な説明】
【００６６】
例示的実施形態を詳細に示す図にうつる前に、本出願は、明細書に記載され、または図に例示される詳細や方法論に限定されないことを理解されたい。また、文書中の用語は説明することのみを目的としており、限定的なものと見なされるべきではないことも理解されたい。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において記載されている説明的な実施形態は、限定することを意味するものではない。ここに提示された主題の精神または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することが認められ、またその他の変更が認められ得る。本明細書で一般的説明がなされ、図面で例説される本開示の態様は、多種多様な異なる構成になるように配置、置換、組み合わせ、および設計することができ、それらはすべて明示的に企図されており、本開示の一部とされることは容易に理解される。
【００６７】
本明細書および添付の特許請求で使用される「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの単数形の冠詞、および要素を説明する文脈（特に以下の特許請求の文脈）における同様の指示は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方網羅するものと解釈される。本明細書での値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示がない限り、範囲内の各個別の値を個別に参照する簡略な方法として機能することのみを意図しており、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているものと同様に解釈し、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行できる。本明細書に記載されているすべての実施例および例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、単に実施形態をより明らかにすることを意図しており、特に明記のない限り、特許請求の範囲を限定するものではない。本明細書の使用される用語の解釈において、特記のない要素を必須とするものではない。
【００６８】
別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される特性、パラメタ、条件などの量を表すすべての数は、「約」という用語によって、すべて変更可能なものとして理解されるべきである。したがって、反義の提示がない限り、以下の文書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメタは、概算である。数値パラメタは、報告された有効数字の値をもとに通常の概数を適用し、解釈するものとする。「約」という用語は、「温度」、「時間」、「量」、「範囲を含む濃度」などの数値指定の前に使用される場合、（＋）または（−）、１０％、５％、または１％変動する可能性がある概算を示す。
【００６９】
当業者に理解されるように、あらゆる目的に対して、特に書面による説明を提供するという観点から、本明細書に開示されるすべての範囲は、あらゆる可能な部分的な範囲とその部分的な範囲の組み合わせを包含する。挙げられた範囲は、同じ範囲を少なくとも等分割した半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などと説明し、有効にできるものと容易に認識できる。非限定的な例として、ここで説明する各範囲は簡単に上部３分の１、中部３分の１、下部３分の１と分類できる。また、当業者に理解される、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」は、列挙された数が含まれ、上記で説明したように、のちに部分的な範囲に分割でき得る範囲を指す。最後に、当業者に理解されるように、範囲は各構成要因を含んだものである。
【００７０】
生体液のろ過は、他の実装の中でもとりわけ、血液を血球と血漿に分離するために実行可能である。生物医学用途では、所望の正確な物質量を得るために、効果的にろ過を実施できることが重要である。
【００７１】
流体の交互接線流を使用して、ろ過の実行が可能である。より具体的には、フィルタ要素を通る流体の接線流を交互にすることにより、連続的なろ過を達成できる。交互接線流システムは、例えばシェビッツの米国特許第６，５４４，４２４号に記載されており、その全内容は、その背景、装置および技術的内容について本明細書に取り入れられている。一般に、交互接線流ろ過（ＡＴＦ）は、細胞培養培地などの流体を交互方向で膜または他の透過性構造物を通過させることを含む。流体の体積の一部は、その中に懸濁または溶解された１つ以上の成分を含み、膜を通過し、１つ以上の懸濁または溶解された成分が含まれるろ液または透過液（ここでは交換可能に使用）を元の流体より高濃度で生成する。フィルタを通過しない流体の体積は保持液と称され、保持液を含み、膜によって部分的に画定される空間は、供給チャンネルおよび／または保持容器と称される。膜の反対側の空間は、透過またはろ過容器ろ液と称される。
【００７２】
膜を通る交互方向の流れは、供給チャンネルの一部に正と負の圧力を交互に加えることによって生成される。交互圧力は、限定はしないが、ダイヤフラムポンプなどの可逆ポンプや、ピストンポンプやプランジャーポンプなどの適切な手段を使用して供給することができる。他のポンプは、可逆的な蠕動ポンプまたは磁気ポンプを含み得る。当業者の間では、適切なポンプ構造が、ポンピングまたはろ過専用ではない他の装置の部位であり得ることが周知である。これらの他の装置は、限定しないが、ピペッター（ピペットとも呼ばれる）およびシリンジを含め、使用者によって手動または自動的に作動され得る。  本開示のこれらの態様は、以下に詳細を説明するものである。
【００７３】
ろ過は、精製、望ましくない成分の選択的除去、および／または細胞培養培地中の細胞を高細胞濃度で維持または灌流するために実施される。一緒に束ねられた複数の中空繊維を含む中空繊維フィルタを含め、様々なタイプのフィルタが使用可能である。前述の交互接線流を使用するろ過は、例えば、ポンプおよび遠心分離機などのより大規模な装置によって実施可能である。このようなシステムは通常、複雑なアセンブリに多くのコンポーネントが含まれているため、維持が難しい。一方、本開示の実施形態は、とりわけ遠心分離を使用せずに少量の細胞培養培地の濃縮、細胞培養培地における細胞の灌流および／または細胞培養培地のサンプリングを可能にする。詳しくは以下の通りである。
【００７４】
図１は、微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）灌流フィルタ装置１００を示す。Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００は、近位端部１２および遠位端部１４を有する中空シリンダー１０を含む。中空シリンダー１０は、ポリマー材で形成されていてもよい。中空シリンダー１０は、少なくとも一実施形態において、実質的に均一な直径を有するように構成される。別の実施形態では、中空シリンダー１０は、近位端部１２から遠位端部１４まで先細になるようになっており、その結果、遠位端部１４の直径は、近位端部１２の直径よりも小さくなる。以下でより詳細な説明があるが、近位端部１２は、直接および／または間接的に、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００の他のコンポーネントに接続される。
【００７５】
図１に示す通り、中空シリンダー１０を再度参照すると、中空シリンダー１０は、その近位端部１２が透過容器３０に直列に接続されたあと、保持容器２０に接続されるように配置されている。近位端部１２は、（ｉ）透過容器３０内またはその中で終端するか、または（ｉｉ）保持容器２０内またはその中で終端するかのいずれかである。透過容器３０は、一般に液体および比較的低分子量の溶質を含むろ液を受け取るように構成され、保持容器２０は、比較的高分子量の懸濁固体および溶質を受容するように構成される。図１に示されるように、透過容器３０および保持容器２０は、中空シリンダーの近位端部１２、透過容器３０、および保持容器２０が直線的な順序で供給されるように、近位端部１２、透過容器３０、および保持容器２０は、中空シリンダー１０と共に配置される。さらに、中空シリンダー１０は、中空シリンダー１０の中心軸が透過容器３０の中心軸および保持容器２０の中心軸と整列するように、透過容器３０および保持容器２０と共に配置される。
【００７６】
さらに、近位端部１２の一部または全部は、透過容器３０の少なくとも一部と同一の広がりを持つように突出するように構成される。言い換えれば、中空シリンダー１０の近位端部１２の一部は、透過容器３０自体の中に伸ばすことができる。例えば、透過容器３０は、遠位端部１４から離れて透過容器３０内に伸びる近位端部１２の一部を受容できるように構成された開口部を備えるように構成されてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、近位端部１２は、透過容器３０を貫通して、保持容器２０に到達するように延びている。例えば、近位端部１２は、およそ透過容器３０と保持容器２０が相互に調和する場所で終了するように延びている。
【００７７】
近位端部１２が保持容器２０の中またはそこで終端するとき、近位端部１２の開口部は、中空シリンダー１０の内部と透過容器３０との間の流体連通を可能にするように構成される。このようにして、細胞培養培地は、中空シリンダー１０の内部から通過でき、透過容器３０に堆積できる。Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタはさらに、正圧または負圧の供給源と連通するために、保持容器２０の上に配置された注入口７０を含む。例えば、注入口７０は、ピペット（図示されていない）と連通するように構成されている。ピペットを注入口７０に挿入してｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００に取り付けることができる。ピペットは、流体を吸引して分注することで、測定された量の流体（例えば、細胞培養培地中の細胞など）の輸送に使用される。例えば、ピペットは、保持容器２０の上に部分的な真空を生成し、それが解放されると、以前に吸引された流体が分配される。
【００７８】
さらに、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００は、透過容器３０の壁３２に配置された排出口８０を含む。排出口８０は、透過容器３０の壁３２上の円形ポートとして形成されてもよい。いくつかの実施形態では、排出口８０は、透過容器３０の壁３２上の開口部と、壁３２と結合する管状部分を備えていてもよい。排出口８０は、逆止弁４０に接続できる。特に、排出口８０は、逆止弁４０が排出口８０を覆うように、逆止弁４０と共に配置される。排出口８０は、必要に応じて、透過容器３０に堆積され得る細胞培養培地の除去を可能にする。
【００７９】
逆止弁４０は、ガスが進入できないようにしながら、ガスが透過容器３０からの漏出を可能にする。言い換えれば、逆止弁４０は、一方向、すなわち、透過容器３０からの流体の流れを許容する単一方向の弁である。逆止弁４０は、自動作動するように構成されている。いくつかの実施形態では、逆止弁４０は、流体の流れを遮断する可動部分がボールであり、ばね式であり、逆止弁４０を閉じた状態に保つのに役立つボール逆止弁であってもよい。さらに、ピペットの真空モードの間、細胞は、以下に詳細に説明する中空繊維フィルタ６０に吸い込まれる。しかしながら、逆止弁４０が透過容器３０に接続されているため、消費された培地は、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００に吸い戻されない。分配中、ピペットは細胞を中空繊維フィルタ６０の内腔に押し戻し、逆止弁４０が開くと、使用済み培地の一部が透過容器３０に移される。
【００８０】
逆止弁４０は、疎水性流体ベントフィルタ５０に接続可能である。疎水性ベントフィルタ５０は水に濡れないが、表面張力の低い液体に濡れる。疎水性ベントフィルタ５０が濡れると、水溶液はベントフィルタ５０を通過できる。例えば、透過容器３０から排出口８０を通って逆止弁４０に流れる流体中の水分は、次にベントフィルタ５０を通過できる。疎水性ベントフィルタ５０は、液体がその膜と接触すると、液体がｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００を出るのを阻止する。疎水性ベントフィルタ５０は、透過容器３０内の液体の量に、計算により決定できる実際の最大限界を効果的に与える。次に、細胞培養物から採取した培地の量を、断続的な灌流を実施するための新鮮な培地としてバイオリアクター８０に再導入できる。
【００８１】
再び図１を参照すると、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００は、複数の中空繊維フィルタ６０をさらに含む。中空繊維フィルタ６０は、細胞ではなく細胞培養培地が透過し得る中空繊維の形態の半透過性障壁（すなわち、内腔）を含む。中空繊維フィルタ６０はそれぞれ、第１端部６２および第２端部６４をもつ。１つ以上の中空繊維フィルタ６０は、第２端部６４が中空シリンダーの遠位端部１４の方向に延在し、第１端部６２が保持容器２０内または保持容器２０で終端した状態で中空シリンダー１０の内部に長手方向に配置されている。
【００８２】
一実施形態では、中空繊維フィルタ６０は、３つの中空繊維フィルタを含んでおり、第１中空繊維フィルタおよび第２中空繊維フィルタが中空シリンダー１０内で互いに平行に位置づけられ、第３の中空繊維フィルタが、第１の方向にある第１中空繊維フィルタと第２中空繊維フィルタとの間に位置づけられ、第１の方向に直交する第２の方向に第１および第２の中空繊維フィルタからオフセットしている。中空繊維フィルタ６０は、中空シリンダー１０と同一の広がりまたは部分的に同一の広がりであり得、その結果、１つ以上の中空繊維フィルタ６０は、中空シリンダー１０の長さに沿って延び、遠位端部１４またはその近辺で終端するように配置される。少なくとも１つの実施形態では、中空繊維フィルタ６０は、接着剤を使用して、中空シリンダー１０の遠位端部１４および保持容器２０の適所に固定してもよい。
【００８３】
少なくとも１つの実施形態では、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００の中空繊維フィルタ６０は、約０．５ｍｍ〜約１ｍｍの内径をもつ。少なくとも１つの実施形態では、中空繊維フィルタ６０は、約０．２μｍ〜約２．０μｍの平均孔径をもつ。より具体的には、少なくとも１つの実施形態では、１つ以上の中空繊維フィルタ６０は、約０．６５μｍの平均孔径をもつ。さらに、少なくとも１つの実施形態では、１つ以上の中空繊維フィルタ６０は、約２０ｋＤａ〜約７０ｋＤａの分子量をもつ分子の通過を許容しない平均孔径をもつ。より具体的には、少なくとも１つの実施形態では、１つ以上の中空繊維フィルタ６０は、約３０ｋＤａ以上の分子量をもつ分子の通過を許容しない平均孔径をもつ。さらに、少なくとも１つの実施形態では、１つ以上の中空繊維フィルタ６０は、約５０ｋＤａ以上の分子量をもつ分子の通過を許容しない平均孔径をもつ。
【００８４】
いくつかの実施形態においては、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００は、追加の構成要素を含む。例えば、図１に示されるように、１つ以上のシール１６は、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ内の各界面に設置される。特に、第１のシール１６は、近位端部１２の第１部分と透過容器３０との間に、第２のシール１６は、透過容器３０と保持容器２０との間に、第３のシール１６は、保持容器２０および注入口７０との間にそれぞれ設置する。シール１６は、それぞれの界面間の液密接続を確実にし、中空シリンダー１０、透過容器３０、保持容器２０および注入口７０の内容物を外部環境から隔離するように作用する。シール１６は、それぞれの構成要素をシールおよび隔離する可撓性膜であり得る。シール１６は、エラストマーを含んでもよく、接着剤をさらに含んでもよい。
【００８５】
次に図２は、処理容器およびｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタを含むシステムが示されている。より具体的には、図２は、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００を備えた処理容器８０を示す。Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００は、処理容器８０から細胞培養培地中の細胞を抽出するように構成されている。特に、中空シリンダー１０は処理容器８０と連通しており、ピペッティングを使用して、処理容器８０から中空シリンダー１０内に培地を引き込むことができる。Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００は、処理容器８０での使用に限定されず、既存の市販の小規模処理容器で使用されてもよい。
【００８６】
処理容器８０は、約１５ｍＬ以下の細胞培養培地中にある体積の細胞を保持することができるハウジング８２を含む。少なくとも１つの実施形態では、ハウジング８２は、細胞培養培地中に約１０ｍＬ以下の体積の細胞を保持する。より具体的には、ハウジング８２は、細胞培養培地中に約５ｍＬ以下の体積の細胞を保持する。少なくとも１つの実施形態では、ハウジング８２は、細胞培養培地中に約２ｍＬ以下の体積の細胞を保持する。少なくとも１つの実施形態では、ハウジング８２は、細胞培養培地中に約１ｍＬ以下の体積の細胞を保持する。少なくとも１つの実施形態では、ハウジング８２は、細胞培養培地中に約０．５ｍＬ以下の体積の細胞を保持する。少なくとも１つの実施形態では、ハウジング８２は、細胞培養培地中に約０．２ｍＬ以下の体積の細胞を保持する。少なくとも１つの実施形態では、処理容器８０から透過容器３０に堆積される細胞培養培地の体積は、約５０μＬ〜約５００μＬの範囲である。特に、処理容器８０から透過容器３０に堆積される細胞培養培地の体積は、約１００μＬ〜約３００μＬの範囲である。
【００８７】
ハウジング８２は、開口部またはコネクタ８４を介して、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００などのフィルタ装置と連通している。ハウジング８２がｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００と連通しているとき、少なくとも中空シリンダー１０の遠位端部１４は、ハウジング８２内に保持可能な細胞培養培地中のある体積の細胞と接触している。したがって、注入口７０が負圧の供給源と連通するとき、細胞培養培地中の細胞は、ハウジング８２から保持容器２０内に引き抜かれることができる。対照的に、細胞培養培地中の細胞は、注入口７０が正圧の供給源と連通するとき、ハウジング８２に戻される。
【００８８】
これらの状況下では、ある体積の細胞培養培地が透過容器３０内に堆積される。透過容器３０は、逆止弁４０と連通している。導管４２は、透過容器３０の壁３２から離れる方向に逆止弁４０から伸びることができる。疎水性ベントフィルタ５０（図２には示されていない）は、導管４２上に提供されてもよい。透過容器３０からの流体が逆止弁４０の下流の疎水性ベントフィルタ５０に接触すると、透過容器３０からの流れが停止し、正確な量の流体が確実に除去される。
【００８９】
正圧または負圧の供給源は、ピペット（図示されていない）を介して提供される。たとえば、負圧の発生源は、ピペットが第１方向に移動したときにピペットによって作られた真空であり、正圧の供給源は、ピペットが第１方向と反対の第２方向に移動したときのピペットである。正圧または負圧の供給源は、手動またはロボットで操作されるピペットを介して供給される。ピペットは、「片手」ピペットまたは多手ピペットであってもよい。
【００９０】
特に、ロボットコントローラを使用して、ピペットを自動的に操作し、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００による処理容器８０からの細胞培養培地中の細胞の抽出を制御することができる。ロボットコントローラは、ピペットの動作を調整することにより、正および負の空気源を制御するようにプログラムされた１つ以上のコントローラを含むことができる。さらに、コントローラ５は、プロセスの要件を満たすためにピペットの動作を調整することができる。少なくとも１つの実施形態では、ロボットコントローラは、英国、ハートフォードシャー、ロイストンのザルトリウス・ステディム・バイオテック・グループによって製造されたａｍｂｒ（登録商標）１５の細胞培養処理容器システムを備えたコントローラであり得る。コントローラは、コントローラのプロセッサによって実行される命令に従って、マイクロスケール量で液体移送を実行するようにプログラムされてもよい。
【００９１】
ロボットコントローラは、オペレーティングシステム、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）など、またはそれらの組み合わせを実行するように構成されたプロセッサまたはマイクロプロセッサを含み得る。コントローラは、電子的、光学的、磁気的、またはプロセッサ、ＡＳＩＣ、ＦＰＧＡなどにプログラム指令を提供することができる任意の他の記憶装置または伝送装置を含み得るがこれらに限定されないメモリを含み得る。メモリは、メモリチップ、電気的消去可能プログラム可能読み取り専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、消去可能プログラム可能読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、フラッシュメモリ、またはコントローラが命令を読み取ることができる他の任意の適切なメモリを含み得る。命令は、任意の適切なプログラミング言語からのコードを含み得る。
【００９２】
さらに、特定の実施形態では、ユーザーがピペット、処理容器８０、およびｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００の様々なファセットを制御および／または監視できるユーザーインターフェースが供給される。ユーザーインターフェースはまた、複数の各段階における、ピペットおよびｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００の動作に関するデータをそれぞれ含み、コントローラ５のメモリに保存された他のデータを表示することもできる。
【００９３】
ロボットピペットシステムは、システムとネットワークとの間の通信リンクを提供するために、スイッチおよびルーターに結合され得る少なくとも１つの通信ユニットを含み得る。したがって、通信ユニットは、プロセッサが有線または無線でネットワークに結合された他の電子システムと通信できるようなっている。例えば、通信ユニットは、システムをインターネットまたは別のネットワークに接続するイーサネット回線に結合されてもよい。他の実装例では、通信ユニットは、アンテナ（図示されていない）に結合可能であり、ネットワークとの無線通信インターフェースを介して情報を送受信する機能を提供している。
【００９４】
様々な実装において、通信ユニットは、ＷＬＡＮプロトコルを含むが、これらに限定されない１つ以上の通信プロトコルに従ってデータ通信を実行するように構成される１つ以上のトランシーバを付帯しうる。（例えば、ＩＥＥＥ８０２．１１  ａ／ｂ／ｇ／ｎ／ａｃ／ａｄ、ＩＥＥＥ  ８０２．１６、ＩＥＥＥ  ８０２．２０など）。
【００９５】
ロボットシステムの特定の実施形態は、プロセッサをもつ１つ以上のリモートコンピュータへの論理接続を使用してネットワーク化された環境で実施できる。当業者は、そのようなネットワークコンピューティング環境が、パーソナルコンピュータ、ハンドヘルド装置、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベースまたはプログラム可能な家電、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、などを含む様々なタイプのコンピュータを包含することを理解する。実装は、通信ネットワークを介してリンクされたローカルおよびリモート処理装置（ハードワイヤードリンク、ワイヤレスリンク、またはハードワイヤードまたはワイヤレスリンクの組み合わせのいずれか）によってタスクが実行される分散コンピューティング環境でも実施可能である。分散コンピューティング環境では、プログラムモジュールはローカルとリモートの両方のメモリストレージ装置に配置できる。
【００９６】
図３は、例示的実施形態による、交互接線流灌流フィルタを横切る細胞培養培地中の細胞の断続的な灌流の実施方法を示す。具体的には、図３は、上述のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ  灌流フィルタ１００を使用して実行することができる方法３００を示している。方法３００は、細胞培養培地中の細胞の引き抜きを含む（ステップ３０１）。細胞は、約０．５ｍＬ〜約５ｍＬの体積の範囲であり得る。細胞を引き抜くことは、１つ以上の中空繊維フィルタ６０の内腔を通して細胞をろ過することを含む。細胞は、中空繊維フィルタ６０を通してろ過され、透過容器３０を通過して保持容器２０に向けられる（ステップ３０２）。この方法はさらに、前述の１つ以上の中空繊維フィルタ６０の内腔を通して細胞培養培地中の細胞を戻すことを含む（ステップ３０３）。内腔を通して細胞を戻す際に、細胞培養培地の量は、前述の１つ以上の中空繊維フィルタ６０の多孔性壁を通過し、透過容器３０に収集される（ステップ３０４）。
【００９７】
少なくとも１つの実施形態の方法では、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００を備えた処理容器８０を含むシステムで実施してもよい。特に、灌流は、細胞が処理容器８０内に保持されている間に、等量の培地が処理容器８０に追加および除去されるように処理容器８０を維持するために実行されてもよい。したがって、新鮮な栄養素の安定した供給源および廃棄物の効率的な除去を行うことができる。少なくとも１つの実施形態では、灌流は、例えば、所定の間隔で断続的に行われ得る。
【００９８】
少なくとも１つの実施形態では、方法３００は、透過容器３０に集まる細胞培養培地の体積が約２５μＬ〜約１０００μＬの範囲となるように実行している。断続的灌流を生成する少なくとも１つの実施形態では、前述の透過容器に集まる細胞培養培地の容量は、約０．１ｍＬ〜約０．５ｍＬの範囲である
【００９９】
図４は、例示的実施形態に係る方法を示している。特に、図４は、処理容器に保持された細胞培養培地中の細胞を灌流する方法４００を示す。処理容器は、例えば、処理容器８０であり得、細胞培養培地中に約１５ｍＬ以下の細胞を保持し得る。方法４００は、細胞培養培地中の細胞を処理容器８０から引き抜くことを含む（ステップ４０１）。上記のように、処理容器８０は、細胞培養培地中に細胞を保持するハウジング８２を含む。細胞は、上述のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００などの微小交互接線流灌流フィルタを使用してハウジング８２から引き出すことができる。方法４００では、さらに中空繊維フィルタを通して細胞を方向付けることをも含み得る。さらに、この方法は、細胞培養培地中の細胞の少なくとも一部を処理容器に戻すことを含む（ステップ４０２）。方法４００は、以下の説明通り、オプションで追加のステップを含み得る。
【０１００】
少なくとも１つの実施形態では、方法４００はさらに、細胞培養培地中の細胞を処理容器８０に戻すときに、ある体積の細胞培養培地を透過容器３０に堆積させることを含む（ステップ４０３）。さらにまた、少なくとも１つの実施形態では、処理容器８０から引き出された細胞培養培地中の細胞は、約０．５ｍＬ〜約５ｍＬの体積の範囲とする。少なくとも１つの実施形態においては、処理容器８０から引き出された細胞培養培地中の細胞は、体積が約１．０ｍＬ〜約３．０ｍＬの範囲であり、より具体的には、体積が約２．０ｍＬになる場合がある。さらに、少なくとも１つの実施形態では、透過容器３０に入れられる細胞培養培地の容量は、約１０μＬ〜約３００μＬの範囲である。さらに、少なくとも１つの実施形態では、透過容器３０に入れられる細胞培養培地の体積は、約５０μＬ〜約２５０μＬ、より具体的には、約１００μＬ〜約２００μＬの範囲である。
【０１０１】
さらに、特定の実施形態によれば、灌流は、図１および２に示される中空繊維フィルタ６０などの１つ以上の中空繊維フィルタを介して、細胞培養培地中の細胞の交互接線流の複数サイクルにわたって実行され得る（ステップ４０４）。特に、細胞培養培地中の細胞は、前述の１つ以上の中空繊維フィルタの多孔性壁を横切る細胞の交互接線流の複数サイクルにわたって引き抜かれ、戻される。交互接線流の複数サイクルにわたる細胞培養培地中の細胞の引き抜きおよび返戻は、断続的に繰り返される。例えば、細胞の引き抜きおよび返戻は、３０分ごとまたは１時間ごとに実行されてもよい。ロボットコントローラを使用して、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ１００からのピペッティングを制御する場合、コントローラへの入力を使用して、細胞の引き抜きおよび返戻のタイミングを確立できる。
【０１０２】
さらに、方法４００は、新鮮な細胞培養培地を処理容器へ導入することを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、導入される新鮮な細胞培養培地は、細胞培養培地のおおよその体積に達し、これは、交互接線流の前記複数サイクルにわたって透過容器３０に堆積される。少なくとも１つの実施形態では、約１ｍＬ〜約３ｍＬの新鮮な細胞培養培地が処理容器８０に導入される。さらに、少なくとも１つの実施形態では、約１．５ｍＬ〜約２．５ｍＬの新鮮な細胞培養培地が導入され、より具体的には、約２ｍＬである。
【０１０３】
図５ａは、例示的実施形態による微小交互接線流（ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）灌流フィルタ装置５００を示す。Ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ灌流フィルタ５００は、ロボット、ピペッターまたは他の正・負交互の圧力源のための取り付け点５０１と、そのようなロボット、ピペッターなどのためのオプションとなるピペットチップ５０２を含む。ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ５００は、アタッチメントポイント５０１と流体連通するフィルタハウジング５０４をさらに含む（例えば、オプションのピペットチップ５０２による）。フィルタハウジング５０４内にはフィルタ要素（図示されていない）があり、フィルタハウジング５０４の少なくとも一部が供給／保持および透過容器に分離する。ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦチップ５０５は、供給／保持容器と流体連通してハウジングの第２端部に配置され、本開示による処理容器と（例えば、管または他の適切な導管を介して）流体連通する手段となる。一方向または逆止弁を含む透過液出口５０３は、透過容器に統合または接続されている。逆止弁は、交互圧力サイクルの負圧部分の間、フィルタ要素を横切る逆流を防ぐ働きをする。
【０１０４】
図５ｂは、マルチウェルプレートを含む処理容器５０６の実施形態を示す。処理容器５０６は、上述のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ（例えば、図５ａに示されているｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ）を備えたシステムまたは方法で使用できる。使用中、処理容器５０６の複数の各ウェルは、別々のｍｉｃｒｏ  ＡＴＦに流体接続されて、並行灌流培養および／または複数のシステムからの同時採取を可能にする。
【０１０５】
上記の処理容器およびｍｉｃｒｏ  ＡＴＦは、当業者とっては明らかな多数の有用な特徴をもつ。非限定的な一例として、本明細書に記載されるｍｉｃｒｏ  ＡＴＦフィルタは、１ｍｌ以下（例えば、２００μｌ、５００μｌなど）の体積を効果的にろ過できる。これらの少量での実施は、治療法のスクリーニング、およびろ過システムと方法の開発、最適化、および／または検証などの並行および／または大規模アプリケーションでの使用に役立つ。本開示のＭｉｃｒｏ  ＡＴＦシステムは、ＡＭＢＲ（商標）パラレルバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ、ゲッティンゲン、ドイツ）などの自動細胞培養システムまたはエッペンドルフｅｐＭｏｔｉｏｎ（登録商標）装置（エッペンドルフＡＧ、ハンブルク、ドイツ）などのマルチチャンネルピペッターでの流体処理に現在利用されているアレイと同様のアレイで実装できる。
【０１０６】
様々な代替実施形態が企図され、本開示の一部を形成する。例えば、一実施形態では、中空繊維フィルタ６０は、中空シリンダー１０内に提供されないが、ｍｉｃｒｏ  ＡＴＦ装置内で開いており、注入口７０および保持容器２０で接着剤を使用して接着されている。さらに１つ以上の実施形態では、透過容器３０および／または保持容器２０を省略してもよいことが実証されている。
【０１０７】
この仕様には特定の実装の詳細が含まれているが、これらは主張対象の範囲を制限するものではなく、特定の実装における固有機能の説明として解釈するものである。個別の実装のコンテキストにおいて、この仕様で説明されている特定の機能は、単一の実装で組み合わせて実装することも可能である。逆に、単一の実装のコンテキストで説明されている複数の機能は、複数の実装において個別または任意の適切なサブコンビネーションで実装することも可能である。さらに、特徴は特定の組み合わせで機能するものとして上記で説明され、最初にそのように主張されていても、請求項の組み合わせからの１つ以上の特徴は、場合によっては組み合わせから削除され、サブコンビネーションについて請求項の組み合わせはサブコンビネーションまたはバリエーションに向けられる。
【０１０８】
同様に、動作は特定の順序で図面に描かれているが、望ましい結果を得るために、それらの動作を特定の順序で、または順次に実行すること、またはすべての例示された動作を実行することが要求されるものとして理解するものではない。特定の状況では、上記の実装におけるさまざまなシステムコンポーネントの分離は、すべての実装においてそのような分離が必要であると理解されるべきではなく、説明されたコンポーネントおよびシステムは、一般に単一製品に統合されるか、複数にパッケージ化できることを理解されたい。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「実質的に」および類似の用語は、本開示の主題に関係する当業者によって一般的に受け入れられている使用法と調和した広い意味をもつことが意図されている。これらの用語は、提供された正確な数値範囲にこれらの特徴の範囲を制限することなく、記載および主張された特定の特徴の説明を可能にすることを意図していることを、本開示を検討する当業者に理解されるものである。したがって、これらの用語は、説明および主張されている主題の実質的または重要でない修正や変更が本開示の範囲内であると見なされることを示すものとして解釈されるものである。
【０１１０】
本明細書で使用される「結合された」、「接続された」などの用語は、２つの構成要素を互いに直接的または間接的に結合することを意味する。そのような接合は、静止（例えば、永久的）または可動（例えば、取り外し可能または解放可能）であり得る。このような接合は、２つの構成要素または２つの構成要素および任意の追加の中間構成要素を互いに単一の本体として一体に形成するか、または２つの構成要素または２つの構成要素および任意の追加の中間構成要素を互いに取り付けて達成できる。
【０１１１】
本明細書で使用される「流体結合」、「流体連通」などの用語は、２つの構成要素または物体が、水、空気、生体液などの流体が流れる２つの構成要素または物体の間に介在するコンポーネントまたはオブジェクトの有無にかかわらず、流れ形成される経路をもつことを意味する。流体連通を可能にするための流体継手または構成の例は、配管、チャンネル、または１つの構成要素または物体から別の構成要素への流体の流れを可能にするための他の任意の適切な構成要素を含み得る。
【０１１２】
様々な例示的な実施態様に示されるシステムの構築および配置は、単なる例示であり、性質を限定するものではないことに留意することが重要である。説明されている実装の精神および／または範囲内にあるすべての変更および修正は、保護することが望ましい。いくつかの特徴は必要でない場合があり、様々な特徴を欠く実装も本出願の範囲内であると考えられ、その範囲は以下の請求項によって定義されるものと理解する。特許請求の範囲を読む際に、「ａ」、「ａｎ」、「少なくとも１つ」、または「少なくとも１つの部分」などの単語が使用されている場合、特に当該請求項で反対の言明がされていない限り、１つの項目のみに限定する意図はない。「少なくとも一部」および／または「一部」という用語が使用される場合、特に反対の言明がされていない限り、その項目は、一部および／または全体を含むことができる。
【図１】
2021500057.tif 000003
【図２】
2021500057.tif 000004
【図３】
2021500057.tif 000005
【図４】
2021500057.tif 000006
【図５ａ】
2021500057.tif 000007
【図５ｂ】
2021500057.tif 000008
【国際調査報告】
2021500057.tif 000009