(57)【要約】  本発明は、キューティバクテリウムアビダム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ）ＧＥＮＳＣ０１菌株（ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）に関する。また、本発明は、前記菌株またはその培養物を含む組成物及びその用途に関する。本発明は、アトピー皮膚炎、にきびまたは細塵による皮膚炎症の改善、予防または治療に効果的である。
2021534775.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キューティバクテリウムアビダム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ）ＧＥＮＳＣ０１菌株（ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）。
【請求項２】
前記キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物は、黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネスに対して抗菌活性を有するか又は黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネが形成するバイオフィルムの除去または形成抑制活性を有する、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
前記キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株は、アトピー皮膚炎または炎症性皮膚疾患の抑制、改善または治療活性を有する、請求項１に記載の菌株。
【請求項４】
前記炎症性皮膚疾患は、細塵による皮膚炎症を含む、請求項３に記載の菌株。
【請求項５】
キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株（ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）またはその培養物を含むアトピー皮膚炎、にきびまたは炎症性皮膚疾患の抑制または改善用の化粧料組成物。
【請求項６】
前記炎症性皮膚疾患は、細塵による皮膚炎症を含む、請求項５に記載の化粧料組成物。
【請求項７】
黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネスに対して抗菌活性を有するか又は黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネが形成するバイオフィルムの除去または形成抑制活性を有する、請求項５に記載の化粧料組成物。
【請求項８】
ロスマリン酸をさらに含む、請求項５に記載の化粧料組成物。
【請求項９】
前記キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物と前記ロスマリン酸とを１：０．０００００１〜１：０．０１の重量比で含む、請求項８に記載の化粧料組成物。
【請求項１０】
キューティバクテリウムアビダム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ）ＧＥＮＳＣ０１菌株（ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）またはその培養物を含む抗菌用組成物であって、黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネスに対して抗菌活性を有する抗菌用組成物。
【請求項１１】
ロスマリン酸をさらに含む、請求項１０に記載の抗菌用組成物。
【請求項１２】
キューティバクテリウムアビダム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ）ＧＥＮＳＣ０１菌株（ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）またはその培養物を含む皮膚保湿用化粧料組成物。
【請求項１３】
ロスマリン酸をさらに含む、請求項１２に記載の皮膚保湿用化粧料組成物。
【請求項１４】
キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株（ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）またはその培養物を含むアトピー皮膚炎、にきびまたは炎症性皮膚疾患の抑制、改善または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに分離、同定及びその効能が評価された新たな菌株及びその培養物に関する。また、本発明は、このような新菌株またはその培養物を含む組成物に関する。より具体的には、本発明は、新規菌株またはその培養物を含む、皮膚改善効能など多様な効能を有する化粧料組成物に関する。
【０００２】
本出願は、２０１８年８月２３日出願の韓国特許出願第１０−２０１８−００９８８７９号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
皮膚における炎症反応（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、物理的な刺激や化学物質、細菌などによって皮膚損傷が誘発されるとき、それを防御するための作用として始まり、多様な兔疫細胞と炎症誘導サイトカインが関与する。ＩＬ−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、ＩＬ−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）、ＩＬ−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−β）などが代表的な炎症誘導サイトカインである。
【０００４】
例えば、炎症性サイトカインによる刺激に反応した末梢血単核、組織マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞などの様々な細胞でＩＬ−８の発現が誘導される。上昇した（例えば、過剰な）ＩＬ−８レベルに関連する炎症性疾患としては、炎症性角化症（例えば、乾癬）、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患などが挙げられる。
【０００５】
アトピー皮膚炎（ＡＤ、Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）は、痒みを伴う炎症性皮膚疾患であって、慢性的であり、通常は幼児期に始まる。ＡＤは、継続的な痒みを主な症状とし、特別な理由なく回復と悪化を繰り返す特徴を有する。ＡＤに関する近年の多くの研究にもかかわらず、未だにＡＤの原因については明確に知られていない。
【０００６】
１９７０年代の研究でアトピー皮膚炎における黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖が初めて記述された。多数の研究において、３０％〜１００％のアトピー皮膚炎患者の病変部で黄色ブドウ球菌の増殖が見つかったと報告されている。
【０００７】
黄色ブドウ球菌は、表皮細胞に作用して皮膚障壁機能を破壊するか、又は、Ｔ細胞にスーパー抗原として働いて炎症反応を誘導すると知られている。
【０００８】
前記黄色ブドウ球菌の集落と感染は、代表的に、アトピー皮膚炎の悪化及び湿疹性皮膚炎を誘発し、長期間慢性炎症に進行すれば、喘息及び食品アレルギーをもたらすとの研究が報告されている。さらに、毛包炎（ｆｏｌｌｉｃｕｌｉｔｉｓ）、せつ腫（ｆｕｒｕｎｃｕｌｏｓｉｓ）、膿痂疹（ｉｍｐｅｔｉｇｏ）、手足の爪周囲炎（ｐａｒｏｎｙｃｈｉａ）、壊疽性膿瘡（ｅｃｔｈｙｍａ）などの皮膚疾患を持っている患者を対象にした微生物培養で黄色ブドウ球菌が多量検出されたと報告されている。アトピー疾患の外にも、多様な感染性皮膚疾患において黄色ブドウ球菌が臨床的に関連性を有することが知られている（1. Atopic dermatitis and the atopic march. J. Allergy Clin. Immunol.2003, 2. Antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus strains responsible for community-acquired skin infections. Ann Dermatol Venereol. 2008）。
【０００９】
したがって、アトピー皮膚炎患者においては、黄色ブドウ球菌の増殖を事前に抑制することが疾患の悪化を阻止するか又は重症度を下げるなどの肯定的な役割をすると予想される。
【００１０】
アトピー皮膚炎の発病及び進行において、フィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）の欠乏及びフィラグリン遺伝子の変形が密接に関連することが当業界に周知されている。フィラグリンは、皮膚障壁を構成する角質細胞に含まれた保湿成分であって、ケラチン、インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）、ロリクリン（ｌｏｒｉｃｒｉｎ）などのタンパク質とともに角質層（ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ）の形成に重要な役割をするタンパク質である。フィラグリン発現量の減少は、皮膚障壁の機能と保湿に変化をもたらして様々な病変につながる。特に、正常な皮膚障壁の形成は外部の刺激に対する防御において重要な役割を果たすが、この機能が喪失された場合は、アトピーの進行に核心的な役割をするようになる。経皮的な抗原の吸収がアトピー性皮膚炎の増加に重要な原因になるという点で、フィラグリンは効果的なアトピー性皮膚炎改善のターゲットになる。
【００１１】
また、近年の研究において、アトピー皮膚炎患者のフィラグリンタンパク質による影響だけでなく、クローディン１遺伝子（ｃｌａｕｄｉｎ １、ＣＤＮ１）の異常発現がアトピー皮膚炎と密接に関連すると報告されている。前記フィラグリン及びクローディン１遺伝子の正常発現によって皮膚障壁機能を強化し、皮膚の水分保持力と皮膚保湿効果を向上させることができる。
【００１２】
一方、キューティバクテリウムアビダム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ）は、皮膚常在由来菌の一つとして知られ、今までは数多くの感染を誘発する原因菌（病源菌）として知られていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記のような問題点を解決するため、従来単に病源菌として知られていたキューティバクテリウムアビダムの新規菌株を提供する。
【００１４】
本発明は、従来単に病源菌として知られていたキューティバクテリウムアビダムの新規菌株またはその培養物を用いた皮膚症状改善用組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物、それを含む組成物を提供し、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物の新規用途を提供する。
【００１６】
本発明は、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物のアトピー皮膚炎、にきびまたは炎症性皮膚疾患の改善、治療または緩和用途を提供する。本発明は、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物を含むアトピー皮膚炎、にきびまたは炎症性皮膚疾患の改善、治療または緩和用組成物を提供する。具体的には、細塵による炎症性皮膚疾患の改善、治療または緩和用組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、ロスマリン酸（ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ）とともに使用することで前記菌株の特異臭を除去して化粧料組成物として使用しようとする。
【００１８】
本発明は、ロスマリン酸とともに使用することで黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）またはキューティバクテリウムアクネス（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ：Ｃ．ａｃｎｅｓ）に対してより向上した抗菌活性を提供し、黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネスによって形成されたバイオフィルムの除去活性を提供する。
【００１９】
本発明は、ロスマリン酸とともに使用するとき、細胞生存力に優れたキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株を提供する。
【００２０】
本発明は、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物を含む皮膚保湿用化粧料組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の一態様は、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）を提供する。
【００２２】
また、本発明の一態様は、前記キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）の培養物を提供する。
【００２３】
今までキューティバクテリウムアビダムは、感染症を起こす病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）として知られていた。しかし本発明者は、ＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物が皮膚状態改善効果を有するという驚くべきことを確認し、本発明の完成に至った。
【００２４】
前記菌株は、微生物によって形成されるバイオフィルムの除去または形成抑制効果を奏し、抗菌活性を有し得る。
【００２５】
前記菌株は、皮膚の水分保持力の向上に役立ち、皮膚保湿力の向上に役立ち得る。
【００２６】
本発明のキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株は、皮膚に常在する微生物であって、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析及びＡＰＩテストを経てキューティバクテリウムアビダムに属する新規な菌株であることが確認された。該菌株は、２０１８年７月２４日付で韓国生命工学研究院微生物資源センター（ＫＣＴＣ）に寄託されて受託番号ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰが付与された。
【００２７】
本発明の一態様によるキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物は、黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネスに対して抗菌活性を有し得る。また、一態様によれば、前記黄色ブドウ球菌が形成するバイオフィルムの除去または形成抑制活性を有し得る。
【００２８】
前記黄色ブドウ球菌の集落と感染は、アトピー皮膚炎、膿痂疹、アトピー皮膚炎の悪化、湿疹の２次感染、多様な皮膚炎症を誘発し得る。前記黄色ブドウ球菌の集落と感染はアトピー皮膚炎、毛包炎、膿痂疹、蜂窩織炎、脱毛性毛包炎、壊疽性膿瘡、乳腺炎などを誘発又は悪化させ得るが、本発明のキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物は、前記黄色ブドウ球菌の生長を抑制し、黄色ブドウ球菌によるバイオフィルムの形成を抑制することができる。
【００２９】
本発明の一態様によるキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物は、微生物の生長抑制効果だけでなく、微生物によって形成されたバイオフィルムの除去または形成抑制効果を奏することができる。
【００３０】
一態様によれば、前記キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物は、アトピー皮膚炎、にきびまたは炎症性皮膚疾患の抑制、改善または治療活性を有し得る。具体的には、細塵による炎症性皮膚疾患の改善、治療または緩和用組成物を提供する。
【００３１】
他の一態様によれば、本発明は、前記キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物を有効成分として含む抗菌用組成物を提供する。
【００３２】
さらに他の一態様によれば、本発明は、前記キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物を有効成分として含むアトピー皮膚炎、にきびまたは炎症性皮膚疾患の治療、予防または改善用組成物を提供する。具体的には、細塵による炎症性皮膚疾患の改善、治療または緩和用組成物を提供する。
【００３３】
本明細書において、用語「培養物」とは、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株が成長及び生存できるように栄養分を供給する培地に前記菌株を一定期間培養して収得する前記菌株、菌抽出物、その代謝物、余分の栄養分などを含む全体培地を意味するが、菌株培養の後、菌株を除去した培養液も含む。
【００３４】
前記培養液は、一定時間静置して下層に沈んだ部分を除いた上層の液体のみ、若しくは、濾過によって菌体を除去するか又は培養液を遠心分離して下部の沈澱を除去した上部の液体のみを意味することもある。
【００３５】
前記培養液は、常法で濃縮して濃縮液としても用いられ得る。
【００３６】
前記培養液または培養液の濃縮物は、常法で乾燥して乾燥物としても提供され得る。
【００３７】
本明細書における「培養物」は、特に言及しない限り、菌体の培養液、培養液の濃縮物、前記培養液または濃縮物の乾燥物を含み得る。前記培養物には、場合によって菌体が含まれてもよく、含まれなくてもよく、菌体の有無は特に問題にならない。
【００３８】
用語「菌体」とは、本発明の菌株そのものを意味し、分離して選別した菌株自体または該菌株を培養して培養液から分離した菌株を含む。前記菌体は、培養液を遠心分離して下層に沈んだ部分を採取して収得してもよく、または、重力によって培養液の下層に沈むため、一定時間静置してから上部の液体を除去することで収得してもよい。
【００３９】
一態様によれば、本発明のキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株の培養物は、微生物の培養に使用される培地のうち通常の技術者が目的に応じて容易に選択した培地を使用でき、望ましくはキューティバクテリウム培養に使用される培地、より望ましくはＲＣＭ（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培地、ＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）またはＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地を使用できるが、これに制限されない。
【００４０】
一態様によれば、本発明のキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株の培養物は、微生物培養培地に本発明の菌株を接種し、当業界で公知の微生物培養方法（例えば、静置培養など）によって製造することができる。
【００４１】
前記キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株の培養物は、培養液、培養液の濃縮物、若しくは培養液または濃縮物の乾燥物を含むことができ、前記濃縮物または乾燥物は当業界で公知の微生物または培養液の濃縮または乾燥方法によって容易に製造することができる。
【００４２】
本発明の一態様は、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物を含む組成物、望ましくは化粧料組成物、食品組成物または薬学組成物を提供する。
【００４３】
前記化粧料組成物または薬学組成物は、皮膚外用剤として使用でき、患部に直接塗布することができる。例えば、軟膏、クリーム、エマルションなどの多様な剤形で製造され得る。
【００４４】
また、前記薬学組成物は、経口または非経口投与されて体内に吸収でき、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤などの非制限的な形態で投与され得る。
【００４５】
前記化粧料組成物または薬学組成物の形態は特に制限されない。
【００４６】
前記化粧料組成物は、アトピー皮膚炎または炎症性皮膚疾患を抑制するか又は改善することができる。
【００４７】
前記化粧料組成物は、アトピー皮膚炎または炎症性皮膚疾患を抑制するか又は改善することができる。前記炎症性皮膚疾患の例としては、炎症性角化症（例えば、乾癬）、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、接触性皮膚炎、細菌性皮膚炎、膿痂疹、アトピー皮膚炎の悪化、湿疹の二次感染、脱毛性毛包炎、壊疽性膿瘡、乳腺炎、毛包炎などが挙げられる。
【００４８】
前記化粧料組成物は、黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネスに対して抗菌活性を有するか、若しくは、前記黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネが形成するバイオフィルムの除去または形成抑制活性を有し得る。
【００４９】
本発明の一態様は、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株（ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）またはその培養物を含む抗菌用組成物を提供する。
【００５０】
前記抗菌用組成物は、黄色ブドウ球菌またはキューティバクテリウムアクネスに対して抗菌活性を有し得る。
【００５１】
本発明の一態様によれば、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株（ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）またはその培養物をロスマリン酸とともに使用することができる。
【００５２】
本発明の一態様は、ロスマリン酸をともに使用してＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物が有する特異臭を減少させることができる。
【００５３】
本発明の一態様によれば、ロスマリン酸をともに使用して黄色ブドウ球菌の生長をより効果的に抑制することができる。
【００５４】
驚くべきことに、ロスマリン酸は、特に本発明のＧＥＮＳＣ０１菌株とともに使用するとき、毒性がなくて抗菌活性に優れた。
【００５５】
本発明の一態様は、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株（ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）またはその培養物とロスマリン酸とを含む化粧料組成物を提供する。
【００５６】
前記組成物は、本発明の目的に応じて、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株またはその培養物とロスマリン酸とを１：０．０００００１〜１：０．０１の重量比で含むことができる。
【００５７】
前記化粧料組成物は、前記菌株が有する特異臭が除去されて多様な化粧品に用いることができる。
【００５８】
本発明の一態様は、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株（ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）またはその培養物を含む皮膚保湿用化粧料組成物を提供する。前記化粧料組成物は、ロスマリン酸をさらに含むことができる。
【発明の効果】
【００５９】
本発明では、キューティバクテリウムアビダムの新規菌株及びその培養物がアトピー皮膚炎症状の改善、抑制または治療に効果的であることを確認した。さらに、前記キューティバクテリウムアビダムの新規菌株及びその培養物がにきびの改善に効果的であることを確認した。本発明は、キューティバクテリウムアビダムの新規菌株及びその培養物を含む組成物であって、細塵による炎症性皮膚疾患の改善、治療または緩和用組成物を提供する。
【００６０】
本発明は、キューティバクテリウムアビダムの新規菌株を確認し、該菌株またはその培養物を用いた皮膚症状改善効果を明らかにした。これによって、本発明は、皮膚改善機能を有するキューティバクテリウムアビダム新菌株を提供することができる。また、本発明は、キューティバクテリウムアビダム新規菌株またはその培養物を含むアトピー皮膚炎及び炎症性皮膚疾患の改善、治療または緩和用組成物を提供する。また、本発明は、ロスマリン酸とともに使用することで、本発明の用途に対して相乗効果を期待できるだけでなく、前記菌株が有する特異臭を除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明のキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ）の１６ｓ ｒＲＮＡ塩基配列である。
【図２】本発明のキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株をヒツジ血液寒天培地（ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ）に塗抹して培養した結果である。菌体の周囲に透明なリングが見られないことから、溶血性がなくて人体に無害であるということが分かる。
【図３】キューティバクテリウムアビダム菌株毎のバイオフィルム形成抑制効果を比べた結果である。
【図４】キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株による黄色ブドウ球菌ＫＣＴＣ１６２１に対する生長抑制結果である。
【図５】キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株によるキューティバクテリウムアクネスＡＴＣＣ６９１９に対する生長抑制結果である。
【図６】キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株の発酵濾過物の細胞毒性テスト結果を示した図である。
【図７】キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株の発酵濾過物のフィラグリン発現促進効能を示した図である。
【図８】キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株の発酵濾過物のクローディン１発現促進効能を示した図である。
【図９】キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株の発酵濾過物によるＴＳＬＰ発現減少を示した結果である。
【図１０】キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株の発酵濾過物とロスマリン酸とを一緒に処理したとき、それぞれ単独で処理する場合よりもバイオフィルム形成抑制効果に優れたことを示した結果である。
【図１１】キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株の発酵濾過物とロスマリン酸とを単独でまたは一緒に処理したときのＩＬ−８発現率を確認した結果である。
【図１２】キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株の発酵濾過物とロスマリン酸とを単独でまたは一緒に処理したときのＩＬ−６発現率を確認した結果である。
【図１３】キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株の発酵濾過物が細塵による炎症減少に効果的であることを確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
以下、実施例などを挙げて本発明をより具体的に説明する。しかし、本発明による実施例は多くの他の形態に変形でき、本発明の範囲が後述する実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は本発明の具体的な理解を助けるために例示的に提供されるものである。
［実施例１］キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１の分離及び同定
１−１．菌株の分離
アトピー、乾癬、にきびなどの皮膚疾患を患ったことがないか又は最近６ヶ月以内にこれらに関連する治療を受けた履歴がない成人を対象にして皮膚由来菌の分離を行った。皮膚サンプルを採取するため、滅菌生理水で濡らした滅菌綿棒で洗顔していない両頬と鼻翼を力を加えて擦った。綿棒を直ちにＲＣＭの入っている試験管内に入れて密封し、試験管を窒素で充填して３７℃で４８〜７２時間培養した。培養された綿棒が入っている試験管の培地を白金耳で採取してＲＣＭ寒天培地に画線塗抹し、該作業を３〜４回繰り返して純粋なコロニーを分離した。
１−２．菌株の同定
１）ＡＰＩキットを用いた生化学的同定
分離した菌株を同定する生化学的同定方法として、嫌気性菌ＡＰＩ ２０Ａキット（ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ社製、フランス）を用いた。１０ｍｌのＲＣＭ液体培地に３７℃で２４時間培養した後、遠心分離してから培地を除去した。ＰＢＳで２〜３回洗浄した後、メーカーで提供したプロトコルに従ってキットに含まれた培地でＯＤ６００＝３再懸濁し、ＡＰＩ ２０Ａキットの各ウェルに適量分注して、３７℃で２４時間嫌気的に培養した後判読した。
【００６３】
最終結果は同定用プログラムであるＡＰＩ ｗｅｂで同定し、その結果を下記の表１に示した。ＡＰＩ ２０Ａの同定結果、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（＝キューティバクテリウム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ））プロピオニカム／アビダム（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ／ａｖｉｄｕｍ）と同定され、ＡＰＩ ＩＤ３２の結果、プロピオニバクテリウムアビダムと同じ生化学的特定を見せた。
【００６４】
ＡＰＩ ２０Ａ判読結果を下記の表１に示した。
【００６５】
【表１】
2021534775.tif 000003
【００６６】
２）１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を通じて同定分離された菌株の純粋培養液１ｍｌを採取してマクロゼン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）に依頼して１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定した。ＰＣＲのためのプライマーは、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のユニバーサルプライマーである２７Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）と１４９２Ｒ（５’−ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）を使用し、シーケンシングには７８５Ｆ（５’−ＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡ−３’）と９０７Ｒ（５’−ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＭＴＴＴＲＡＧＴＴＴ−３’）を用いた。分離した菌株の１６ｓ ｒＲＮＡ塩基配列は図１及び配列番号１に示した。該菌株はキューティバクテリウムアビダムと９９％の相同性を見せた。以上の結果に基づいて前記菌株を「キューティバクテリウムアビダム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ）ＧＥＮＳＣ０１」菌株と命名し、２０１８年７月２４日付で韓国特許菌株寄託機関である韓国生命工学研究院微生物資源センター（ＫＣＴＣ）に寄託して受託番号ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰの付与を受けた。
［実施例２］キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１の溶血性テスト
相当数のキューティバクテリウムアビダム菌株は溶血性毒性を有し、菌株によって人体に有害である。キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１の安全性を確認するため、溶血毒性の有無を確認した。液体培地で純粋培養されたキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１を白金耳で採取してヒツジ血液寒天培地に画線塗抹し、３７℃で４８時間嫌気的に培養した。菌体の周囲に透明なリングが生成されるか否かで溶血性を判断した。キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１の場合、図２から確認されるように、ヒツジ血液に対して溶血性がなくて人体に無害であると判断された。
［実施例３］本発明による菌株の発酵濾過物の製造
キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１菌株をＲＣＭ寒天培地で７２時間３７℃で嫌気的に培養した。固体培地に現れた単一コロニーは１０ｍｌのＲＣＭ液体培地に継代培養して同じ条件で培養した。７２時間後、同じ液体培地に０．１％接種して７２時間同じ条件で培養し、上澄み液を遠心分離してポアサイズ０．２２μｍのフィルターで濾過した。
［実施例４］バイオフィルム形成抑制効果の測定（有益菌の選別）
黄色ブドウ球菌ＫＣＴＣ１６２１を適正培地（ＴＳＢ＋０．２％グルコース）で１６〜２４時間液体培養した。６−ウェルプレート（ポリスチレン）に０．２％グルコースが含有されたＴＳＢを入れた後、各ウェルに約５〜１０ｖｏｌ％で試験群を入れた。その後、前記培養菌液を各ウェルに接種し、最終菌株濃度が２×１０６ＣＦＵ／ｗｅｌｌになるようにした。次いで、３７℃のインキュベーターで２４時間静置培養した。培養の後、培養液を除去し、各ウェルを１〜２ｍｌの滅菌ＰＢＳを用いて２回洗浄した。洗浄の後、２ｍｌのＰＢＳを添加してスクレーパーでバイオフィルムを掻き出し、十分に懸濁した後、６００ｎｍで吸光度を測定した。吸光度の測定はバイオフォトメーターＤ３０を用いて行った。処理していないウェルを陰性対照群とし、バイカレン（２５μｍ／ｍｌ）が接種されたウェルを陽性対照群としてバイオフィルム形成抑制能を計算した。
【００６７】
図３に菌株毎のバイオフィルム形成抑制効果を比べて示した。図３から確認できるように、ＧＥＮＳＣ０１菌株は他の菌株に比べて優れたバイオフィルム形成抑制能を有することが分かる。
【００６８】
すなわち、同種の微生物と比べたとき、本発明のＧＥＮＳＣ０１は、他の菌株よりもバイオフィルム形成抑制効果に優れた。したがって、本発明の菌株またはその培養物は、他の菌株を用いた場合よりも、アトピー皮膚炎、にきびまたは炎症性皮膚疾患の治療、改善または予防に優れた効果を奏することができる。
［実施例５］黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＫＣＴＣ１６２１及びキューティバクテリウムアクネス（Ｃ．ａｃｎｅｓ）ＡＴＣＣ６９１９に対する生長抑制（オーバーレイクリアゾーンテスト）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＣ．ａｃｎｅｓの生長抑制に対する効果はクリアゾーンの形成を観察することで確認した。寒天培地にこれら菌を接種すれば、淡色で菌が生長して培地の色が濁り、生長できなければ透明に見える。もしキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１がこれら菌の生長を抑制する効果を有すれば、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１周辺のＳ．ａｕｒｅｕｓ及びＣ．ａｃｎｅｓが生長できず透明になるはずと予想して実験を行った。キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１培養液を白金耳で採取して薄いＲＣＭ寒天培地に２．５ｃｍ程度になるように線を描き、３７℃で７２時間嫌気的に培養した。キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１が十分に成長したことを確認した後、１０４ｃｆｕ／ｍｌに調整されたＳ．ａｕｒｅｕｓ及びＣ．ａｃｎｅｓ菌株を４５℃程度のまだ固まっていない１０ｍｌのＲＣＭ寒天に接種し、培地が固まる前によく懸濁してキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１が成長している寒天培地上に平たく注いで固めた。固まった寒天培地は３７℃で嫌気的にＳ．ａｕｒｅｕｓは４０時間ほど、Ｃ．ａｃｎｅｓは７２時間ほどさらに培養して、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１が成長した周辺に生じるクリアゾーンの大きさを観察した。陰性対照群としてリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を使用し、陽性対照群としてトリクロサン（ｔｒｉｃｌｏｓａｎ）を使用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは１０ｍｇ／ｍｌ、Ｃ．ａｃｎｅｓは２００ｍｇ／ｍｌをそれぞれ処理した。その結果、図４のようにキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１が成長した周辺で透明に見える領域が観察され、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１から遠くなるにつれて透明度が低下し、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１がＳ．ａｕｒｅｕｓの生長抑制能を有することが確認できた。陰性対照群であるＰＢＳを処理したときはクリアゾーンが観察されず、陽性対照群として殺菌剤であるトリクロサンを処理したときはクリアゾーンが観察されたものの、ＧＥＮＳＣ０１処理に比べて遥かに少ない面積であることが分かる。結果は図４に示した。
【００６９】
また、図５に示されたように、Ｃ．ａｃｎｅｓを接種した結果においても、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１が成長した周辺で透明に見える領域が観察され、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１から遠くなるにつれて透明度が低下し、キューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１がＣ．ａｃｎｅｓの生長抑制能を有することが確認できた。また、陰性対照群であるＰＢＳを処理したときはクリアゾーンが観察されず、陽性対照群として殺菌剤であるトリクロサンを処理したときはクリアゾーンが観察されたものの、ＧＥＮＳＣ０１処理に比べて遥かに少ない面積であることが分かる。
【００７０】
このような結果を通じて、本発明のキューティバクテリウムアビダムＧＥＮＳＣ０１がにきび誘発菌であるＣ．ａｃｎｅｓを抑制してにきびの改善、予防または治療効果を提供できることを確認した。
［実施例６］細胞毒性の確認
実施例３で製造した発酵濾過物の細胞毒性を評価するため、以下の実験を行った。９６−ウェル細胞培養プレートにＨａＣａＴ細胞をそれぞれ５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４時間付着した後、試験群試料を濃度毎に添加して５％ＣＯ２、３７℃の条件で４８時間培養した。４８時間後、培養された細胞培地を除去し、０．５ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２−５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）ホルマザン溶液を細胞に処理して４時間反応させた。時間が経過した後、細胞培地をすべて除去し、ホルマザン溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶かしてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２を用いて５７０ｎｍで吸光度を測定した。その後、Ｏ．Ｄｓａｍｐｌｅ／Ｏ．Ｄｃｏｎｔｒｏｌ×１００の式で換算してＨａＣａＴ細胞株の生存率を計算した。
【００７１】
図６から確認できるように、ＧＥＮＳＣ０１処理時にもＨａＣａＴ細胞株の生存率に有意な影響はなかった。したがって、ＧＥＮＳＣ０１は細胞毒性がないことを確認できた。
【００７２】
一方、ロスマリン酸を加えた実験群の場合、興味深いことに、細胞生存率を増加させることを確認した。すなわち、ロスマリン酸の添加により細胞毒性の減少効果までも期待できることを確認した。
［実施例７］皮膚障壁機能強化効能の確認
黄色ブドウ球菌のバイオフィルムを抑制する効能の外にも、ＧＥＮＳＣ０１の発酵濾過物によってＨａＣａＴ細胞株に対する皮膚障壁強化機能が奏されるかを確認するため、ＨａＣａＴ細胞株にＧＥＮＳＣ０１の発酵濾過物を細胞培養液に対する％毎に処理した後、２４時間反応させて皮膚障壁機能のマーカーであるフィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）とクローディン（ｃｌａｕｄｉｎ−１）の発現をＲＮＡ上で確認した。
７−１．フィラグリン発現促進効能の確認
図７に示されたように、陽性対照群であるレチノイン酸（ＲＡ’、１μＭ）と比べて発酵濾過物のフィラグリン発現程度が増加することを確認した。図７は発酵濾過物のフィラグリン発現促進効能を示している。それぞれＧＥＮＳＣ０１を０．０１％、０．１％、１％で処理した。
【００７３】
図７から確認できるように、ＧＥＮＳＣ０１は、優れたフィラグリン発現効果を有すると知られたレチノイン酸（陽性対照群）に比べてフィラグリン発現効果に優れることが分かる。このことから、ＧＥＮＳＣ０１はフィラグリン発現を増加させてアトピー皮膚炎の改善効果、にきびの改善効果、皮膚障壁の強化効果、及び皮膚水分量の維持または増加効果を提供できることを確認した。
７−２．クローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ−１）発現促進効能の確認
図８に示されたように、陽性対照群であるレチノイン酸（ＲＡ’、１μＭ）と比べて発酵濾過物のクローディン発現程度が濃度に比例して増加することを確認した。図８は発酵濾過物のクローディン発現促進効能を示している。
【００７４】
図８から確認できるように、ＧＥＮＳＣ０１は、優れたクローディン発現効果を有すると知られたレチノイン酸（陽性対照群）に比べてクローディン発現効果に優れることが分かる。このことから、ＧＥＮＳＣ０１はクローディン発現を増加させてアトピー皮膚炎の改善効果、にきびの改善効果、皮膚障壁の強化効果、及び皮膚水分量の維持または増加効果を提供できることを確認した。
［実施例８］痒み緩和効能の確認
ＨａＣａＴ細胞株にＧＥＮＳＣ０１の発酵濾過物を細胞培養液に対する％毎に処理した後、４時間反応させ、アトピー皮膚炎の原因の一つとして作用するサイトカインであるＴＳＬＰの発現をＲＮＡ上で確認した。図９に示されたように、発酵濾過物のＴＳＬＰ発現程度が減少することを確認した。したがって、本発明のＧＥＮＳＣ０１培養物は、ＴＳＬＰの発現を抑制し、皮膚の痒みを解消してアトピー皮膚炎の改善に効果があることを確認した。
［実施例９］ロスマリン酸の消臭効果
９−１．製剤の製造
まず、前記発酵濾過物とロスマリン酸とを使用して表２に示した製剤（比較１、サンプル１〜３）を製造し、消臭機能を調査した。官能試験は、パネル５７名が行い、試験結果は発酵濾過物（５％）を基準にして実施した後、平均値で示した。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
９−２．評価結果
［評価基準］
１：匂いが消える。
【００７７】
２：匂いが少し残っている。
【００７８】
３：匂いが残っている。
【００７９】
４：匂いが殆ど残っている
５：変化なし
【００８０】
【表３】
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【００８１】
表３に示されたように、ＧＥＮＳ０１発酵濾過物の単独処理に比べて、ロスマリン酸を一緒に処理した場合、不快臭の除去に効果的であった。
［実施例１０］バイオフィルム形成抑制効果の測定（ロスマリン酸含有）
実験の方法は実施例４の方法と同様であるが、ロスマリン酸のバイオフィルム形成抑制能と前記発酵濾過物のバイオフィルム形成抑制能とのプラス併用効果を測定しようとした。
【００８２】
ロスマリン酸水溶液及び発酵濾過物をそれぞれ処理したとき、何も処理しない群に比べて約３５％の黄色ブドウ球菌菌株のバイオフィルム形成を阻害する効果を見せた。陽性対照として設定したバイカレン（Ｂａｉｃａｌｅｉｎ）処理群が約３０％の阻害能を見せ、ロスマリン酸水溶液及び発酵濾過物の効果は同等であるか又は陽性対照群より阻害能が良いという結果を示した。また、ブランク群に対する、発酵濾過物とロスマリン酸水溶液とを混合した実験群（Ａ＝０．０１、Ｂ＝０．１、Ｃ＝０．５ｍｇ／ｍｌのロスマリン酸含有）では、それぞれ５０％、５７％、６２％のバイオフィルム形成抑制効果を見せた。
【００８３】
図１０に示されたように、ロスマリン酸水溶液と発酵濾過物をそれぞれ単独で処理したときよりも遥かに効果的に黄色ブドウ球菌菌株のバイオフィルム形成能力を阻害することを確認した。
［実施例１１］抗炎症効能の評価
まず、それぞれ６−ウェルプレートに２×１０５個のＨａＣａＴヒト角質細胞株を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養することで付着させた細胞に、ＧＥＮＳＣ０１の発酵濾過物を１時間前処理した。その後、熱処理されたＣ．ａｃｎｅｓを１００ＭＯＩ処理して４時間反応させた。各サンプルに対してＲＮＡを抽出した後、炎症反応サイトカイン因子であるＩＬ−６、ＩＬ−８に対してＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで確認した。
１．ＩＬ−８発現率の確認
その結果、図１１に示されたように、Ｃ．ａｃｎｅｓに誘導された対照群に比べて前記培養濾過物及びロスマリン酸水溶液を単独で処理した群で炎症反応が減少したことが証明された。また、前記培養濾過物とロスマリン酸水溶液との混合組成物では、単独で処理したときよりもさらに炎症反応が起きなかったことが示された。
２．ＩＬ−６発現率の確認
その結果を図１２に示した。ＩＬ−６は、ＧＥＮＳＣ０１の培養濾過物、ロスマリン酸水溶液、そして前記培養濾過物とロスマリン酸水溶液との混合組成物において同等の水準で発現が減少することを確認した。
［実施例１２］細塵に対する抗炎症効能の評価
まず、それぞれ６−ウェルプレートに６．５×１０５個のＨａＣａＴヒト角質細胞株を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養することで付着させた細胞に、細塵（Ａｌｄｒｉｃｈ製）５０μｇ／ｍｌを２時間処理して炎症を誘導した後、３回洗浄した。その後、ＧＥＮＳＣ０１の発酵濾過物を１時間及び２時間処理し、各サンプルに対してＲＮＡを抽出した後、炎症反応サイトカイン因子であるＩＬ−６に対してＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで確認した。その結果を図１３に示した。ＩＬ−６の発現は、ＧＥＮＳＣ０１の培養濾過物によって有意に減少し、２時間処理する場合、さらに減少することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明は、化粧料組成物として利用可能な新たなキューティバクテリウムアビダム菌株またはその培養物を提供する。本発明の菌株または培養物は、化粧料組成物として利用可能である。
【受託番号】
【００８５】
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１３５９６ＢＰ
受託日：２０１８０７２４
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2021534775.tif 000014
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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