(57)【要約】  様々な態様において、本開示は、がんを有する対象における骨への転移を防止する方法、ならびにそれに使用するための組成物およびキットを提供する。  様々な態様において、本開示は、がんを有する対象における骨転移を治療する方法、ならびにそれに使用するための組成物およびキットを提供する。実施形態において、組成物はＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を含む。【選択図】なし
2021501131.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを有する対象における骨への転移を防止する方法であって、
ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を含む組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
がんを有する対象における骨転移を治療する方法であって、
ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を含む組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が精製タンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が成熟タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記投与が、前記対象の骨に投与することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記がんが前立腺がんである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記前立腺がんが、正常な前立腺細胞と比較して、Ｍｃｌ−１、ＲＡＮＫＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＡｋｔの１つまたは複数の発現が増加しているがん細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物がＭｃｌ−１阻害剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｍｃｌ−１阻害剤がＢＩ−９７Ｄ６である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記有効量が、初代骨髄細胞または正常な初代ヒト前立腺上皮細胞に対して実質的に非毒性な量である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記有効量が破骨細胞分化を阻害する量である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が、配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が、前記対象におけるがん細胞のＩＬ−２０／ＩＬ−２２受容体複合体を活性化することができる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質、ならびに、Ｍｃｌ−１阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の一方または両方を含む、組成物。
【請求項１９】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が精製されたタンパク質である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が成熟タンパク質である、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物がＭｃｌ−１阻害剤を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記Ｍｃｌ−１阻害剤がＢＩ−９７Ｄ６である、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物がＰＩ３Ｋ阻害剤を含む、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２である、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が、配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質ががん細胞のＩＬ−２０／ＩＬ−２２受容体複合体を活性化することができる、請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項２９】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
がんを有する対象における骨転移の予防または治療に使用するための、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記がんが前立腺がんである、請求項２６記載の組成物。
【請求項３２】
前記前立腺がんが、正常な前立腺細胞と比較して、Ｍｃｌ−１、ＲＡＮＫＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＡｋｔの１つまたは複数の発現が増加しているがん細胞を含む、請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
がんを有する対象における骨転移の予防または治療のための薬剤の製造における、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３４】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法による骨転移の予防または治療のための薬剤の製造における、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の組成物のＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質、ならびに、Ｍｃｌ−１阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の一方または両方を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月２７日に提出された米国仮出願第６２／５７７，９３２号、および２０１８年６月２１日に提出された米国仮出願第６２／６８７，９０５号の利益を主張するものであり、上記特許出願の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
配列表
２０１８年１０月２５日に５，６９４バイト、マシンフォーマットＩＢＭ−ＰＣ、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムにより作成されたファイル０５３１５１−５０３００１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記述された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
多くの悪性腫瘍について、死亡率は骨への転移などの広範囲の転移に起因する。骨転移は、重度の罹患率、痛み、機能障害にも関連する。現在の単一または組み合わせの治療アプローチは、罹患率を低下させる、または骨への転移の治癒をもたらすことにおいて効果的ではなかった。
【０００４】
前立腺がん（ＰＣ）は、骨転移の強い傾向を有する世界中の男性に影響を与える最も一般的ながんの１つであり、従来の治療アプローチでは難治性である（１）。現在、重度のＰＣは不治であり、重度の病態と死亡率をもたらす（２）。骨転移は、骨への腫瘍細胞の播種、骨髄細胞への付着、石灰化マトリックスへの骨髄への浸透／浸潤、および微小転移病変の成長から始まる（３）。骨内のがん細胞のコロニー形成は、がん細胞が骨髄、特に腫瘍骨モデリングの２つの主要な構成要素である骨芽細胞および破骨細胞に関与し、骨髄とやりとりできる程度を決定するさまざまな要因によって制御される（４）。この多段階プロセスおよび関連するシグナル伝達経路に影響を与える分子因子を理解することは、骨転移を抑制および治療する効果的な治療法を設計する上で重要な課題のままである。
【発明の概要】
【０００５】
上述の課題に鑑み、がんの骨転移を予防および治療するための改善された方法が必要とされている。本開示は、この必要性に対処する方法および組成物を提供し、追加の利点も提供する。
【０００６】
いくつかの態様では、本開示は、がんを有する対象における骨への転移を防止する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、がんを有する対象における骨転移を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を含む組成物の有効量を当該対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、精製されたタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は成熟タンパク質である。いくつかの実施形態において、投与は、対象の骨に投与することを含む。いくつかの実施形態において、がんは前立腺がんである。いくつかの実施形態において、前立腺がんは、正常な前立腺細胞と比較して、Ｍｃｌ−１、ＲＡＮＫＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＡｋｔのうちの１つまたは複数の発現が増加しているがん細胞を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＢＩ−９７Ｄ６などのＭｃｌ−１阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＬＹ２９４００２などのホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、有効量は、初代骨髄細胞または正常な初代ヒト前立腺上皮細胞に対して実質的に非毒性である量である。いくつかの実施形態において、有効量は、破骨細胞の分化を阻害する量である。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号３と少なくとも９０％同一である（例えば、少なくとも９５％同一である）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、対象のがん細胞のＩＬ−２０／ＩＬ−２２受容体複合体を活性化することができる。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【０００７】
いくつかの態様では、本開示は組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質と、Ｍｃｌ−１阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の一方または両方とを含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、精製されたタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は成熟タンパク質である。いくつかの実施形態において、組成物は、Ｍｃｌ−１阻害剤（例えば、ＢＩ−９７Ｄ６）を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば、ＬＹ２９４００２）を含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号３と少なくとも９０％同一である（例えば、少なくとも９５％同一である）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、がん細胞のＩＬ−２０／ＩＬ−２２受容体複合体を活性化することができる。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は、がんを有する対象における骨転移の予防または治療に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、がんは前立腺がんである。いくつかの実施形態において、前立腺がんは、正常な前立腺細胞と比較して、Ｍｃｌ−１、ＲＡＮＫＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＡｋｔの１つまたは複数の発現が増加しているがん細胞を含む。
【０００８】
いくつかの態様では、本開示は、医薬品の製造における、本明細書に記載されている組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態において、薬剤は、がんを有する対象における骨転移の予防または治療のためのものである。いくつかの実施形態では、薬剤は、本明細書に記載の方法に従って使用するためのものである。
【０００９】
いくつかの態様では、本開示はキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質と、本明細書に記載されるＭｃｌ−１阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の一方または両方とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｈｉｓタグ付きＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を産生するための例示的な方法の概略図を図示する。
【００１１】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の産生を確認する例示的なウエスタンブロットを図示する。
【００１２】
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＭＴＴアッセイによって測定された、ＰＣ３−ＭＬ細胞の増殖に対するＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の効果の例示的な結果を示す棒グラフである。これらの結果は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質による細胞増殖の有意な阻害を示す。
【００１３】
【図１Ｄ】図１Ｄは、未処理の対照（“コントロール”）と比較して、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質（“ＭＤＡ−７”）で処理した細胞における下流ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４シグナル伝達カスケード分子ｐ２７、ベクリン−１、およびＢｉＰ／ＧＲＰ７８の発現のアップレギュレーションを示すウエスタンブロットの例を示す。ＥＦ１αはローディングコントロールを表す。
【００１４】
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質（“ＭＤＡ−７”）で処理された細胞と未処理の対照（“コントロール”）を比較した、異なる前立腺がん細胞で３回行われたコロニー形成アッセイの結果の例を示す棒グラフである。約２００個の細胞を播種し、Ｈｉｓ−ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４で処理し、処理の２週間後にクリスタルバイオレットで染色した。コロニーの数を数え、データをプロットした。データは、２つの独立した実験について平均±Ｓ．Ｄ．；＊＊、Ｐ＜０．０１；  ＊＊＊、Ｐ  ＜０．００１対コントロールを示す。
【００１５】
【図２Ａ−Ｅ】図２Ａ〜Ｅは、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質による抗転移活性および破骨細胞分化阻害を示す。図２Ａは、５ｍｇ／ｋｇのＨｉｓ−ＭＤＡ−７タンパク質を１週間に２回、３週間（各グループでｎ＝５）投与され治療されたマウス（“ＭＤＡ−７”）において、骨転移発達に対するＨｉｓ−ＭＤＡ−７の効果を評価するためのインビボ骨転移アッセイの結果の例を示す画像を提供する。図２Ｂは、図２Ａのマウスにおけるルシフェラーゼ強度を定量化する棒グラフである。図２Ｃは、がんを有するマウスの生存の改善におけるＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質治療の役割を示す生存プロットの例である。データは、２つの独立した実験について平均±Ｓ．Ｄ．：＊＊、Ｐ＜０．０１対コントロールを示す。図２Ｄおよび図２Ｅは、対照およびＭＤＡ−７／ＩＬ−２４処置マウスの骨髄細胞における破骨細胞（Ｄ）および破骨細胞活性（Ｅ）の数を比較する棒グラフである。各グループにおいて５回の試験を行い、データは２つの独立した実験について平均値±Ｓ．Ｄ．；  ＊、Ｐ＜０．０５；  ＊＊＊、Ｐ＜０．００１対コントロールを示す。
【００１６】
【図３Ａ−Ｃ】図３Ａ〜Ｃは、ＲＡＷ  ２６４．７細胞におけるシグナル伝達カスケードに対するＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の例示的な効果を図示する。細胞は未処理（“Ｃ”）、または指示された試薬で処理した。試薬には、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質（“ＭＤＡ−７；”１０μｇ／ｍＬ）、核因子κ−Βリガンドの受容体活性化因子（“ＲＡＮＫＬ；”  １００ｎｇ／ｍＬ）」、ＬＹ２９４００２（“ＬＹ；”１０μｍｏｌ／Ｌ）、および構成的に活性型のＡｋｔをコードするプラスミド（「ＭＹＲ−Ａｋｔ」）を含む。蛍光体−ＧＳＫ３β、ＮＦＡＴｃ１、およびＭｃｌ−１の発現は、Ｈｉｓ−ＭＤＡ−７による処理によって阻害された、構成的に活性なＡｋｔの過剰発現とともに増加した。ＥＦ１αはローディングコントロールとして使用した。
【００１７】
【図４Ａ−Ｄ】図４Ａ〜図４Ｄは前立腺がんの骨転移および破骨細胞分化に対するＨｉｓ−ＭＤＡ−７およびＢＩ−９７Ｄ６の組み合わせによる効果を示す。図４Ａは、Ｈｉｓ−ＭＤＡ−７およびＢＩ−９７Ｄ６の効果を評価するインビボ骨転移アッセイの結果の例を示す画像を提供する。図４Ｂは、図４Ａとして画像化されたマウスについて、トリプリケートに定量化されたルシフェラーゼ強度の棒グラフである。図は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４処理動物におけるルシフェラーゼ強度の有意な阻害を示す。ＢＩ−９７Ｄ６を追加すると、骨転移の発生に対するＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の阻害効果がさらに高まった。図４Ｃおよび図４Ｄは、対照および処置マウスの骨髄細胞における破骨細胞（Ｃ）および破骨細胞活性（Ｄ）の数を比較する棒グラフである。破骨細胞はＴＲＡＰ染色キットで染色し、破骨細胞活性はＴＲＡＣＰ酵素アッセイキットを使用して測定した。各グループについて４回試験を行った。データは、２つの独立した実験について平均±Ｓ．Ｄ．；  ＊、Ｐ＜０．０５；  ＊＊、Ｐ  ＜０．０１；  ＊＊＊、Ｐ＜０．００１対コントロールを示す。
【００１８】
【図５Ａ−Ｅ】図５Ａ〜Ｅは、前立腺がん骨転移ならびにＭＤＡ−７／ＩＬ−２４および破骨細胞分化に対する応答についてのＡｋｔ発現の効果を示す。図５Ａは、対照ＰＣ３−ＭＬ細胞（“Ｃ”）およびＣＡ−Ａｋｔ（“ＰＣ３−ＭＬＡｋｔ”）を安定的に過剰発現するＰＣ３−ＭＬ細胞における蛍光体−Ａｋｔ発現を比較するウエスタンブロットの例を図示する。図５Ｂは、インビボ骨転移アッセイの結果の例を図示する画像を提供し、Ａｋｔの構成的活性化が、前立腺がんの骨転移に対するＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の阻害効果を減少させたことを示す。図５Ｃは、図５Ｂとして画像化されたマウスのルシフェラーゼ強度の棒グラフである。図５Ｄおよび図５Ｅは、対照および処置マウスの骨髄細胞における破骨細胞活性（Ｄ）および破骨細胞数（Ｅ）を比較する棒グラフである。マウスから骨髄細胞を収集し、破骨細胞分化のために５×１０５細胞を誘導した。データは、２つの独立した実験について平均±Ｓ．Ｄ．；  ＊、Ｐ＜０．０５；  ＊＊＊、Ｐ＜０．００１対コントロールを示す。
【００１９】
【図６】図６は、骨微小環境の制御を介した前立腺がん由来の骨転移の進行におけるＭＤＡ−７／ＩＬ−２４媒介阻害の例示的な略図である。
【００２０】
【図７】図７は、様々な用量のＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質および／またはＢＩ−９７Ｄ６を投与したマウスにおけるインビボ骨転移アッセイの結果の例を示す画像である。ＰＣ３−ＭＬ  ｌｕｃ細胞（１Ｘ１０５）を心臓内注射にてマウスに投与し、ＢＩ−９７Ｄ６（１．５  ｍｇ／ｋｇ−ｉｐ）の有無に応じて、組換えＭＤＡ−７タンパク質（ｉｖ）で治療した（試験期間−３週間において、両方の合計６用量）。マウスは、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムで画像化した。
【００２１】
【図８】図８は、正常な初代マウス骨髄細胞に対するＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の効果を示す細胞の画像を提供する。マウス骨髄の初代細胞を分離し、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の存在下で培養した。生死アッセイを実施し、初代骨髄細胞に対してＭＤＡ−７／ＩＬ−２４は影響がないことを示す画像を取得した。
【００２２】
【図９】図９Ａ−Ｃは、破骨細胞分化に対するＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の例示的な効果を示す。図９Ａは、１０μｇ／ｍＬのＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の非存在下（“コントロール”）または存在下（“ＭＤＡ−７”）で破骨細胞分化を誘導した正常マウスからの骨髄細胞の画像を提供する。図９Ｂ〜Ｃは、対照および処置マウスの骨髄細胞における破骨細胞（Ｂ）および破骨細胞活性（Ｃ）の数を比較する棒グラフである。５日後、分化した破骨細胞をＴＲＡＰ染色キットで染色し、破骨細胞活性を３回測定した。破骨細胞の数は、Ｈｉｓ−ＭＤＡ−７処理細胞で有意に減少した。また、ＴＲＡＣＰ酵素活性は、Ｈｉｓ−ＭＤＡ−７処理細胞では有意に低い。
【００２３】
【図１０Ａ−Ｃ】図１０Ａ〜Ｃは、破骨細胞遺伝子調節パターンおよびＲＡＷ  ２６４．７細胞およびＤＵ−１４５細胞の増殖に対するＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の効果の例を示す。図１０Ａは、未処理の対照細胞と比較した際の、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質（１０  μｇ／ｍＬ）またはＲＡＮＫＬ（１００  ｎｇ／ｍＬ）の一方または両方での処置から５日後に単離したＲＮＡについてＲＱ−ＰＣＲにより測定した、ＴＲＡＰ、カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）遺伝子およびカルシトニンＲ（ＣＴＲ）遺伝子の発現レベルの棒グラフを示す。図１０Ｂ−Ｃは、未処理のコントロールと比較したＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質で処理したＲＡＷ  ２６４．７細胞（Ｂ）およびＤＵ−１４５細胞（Ｃ）の増殖アッセイの結果の棒グラフを提供する。２０００細胞を９６ウェルプレートに４区分で播種し、Ｈｉｓ−ＭＤＡ−７（１０  μｇ／ｍＬ）で処理し、５日後にＭＴＴアッセイを行いました。データは、２つの独立した実験について平均±Ｓ．Ｄ．；＊＊、Ｐ＜０．０１；  ＊＊＊、Ｐ＜０．００１  対コントロールを示す。
【００２４】
【図１１Ａ−Ｃ】図１１Ａ〜Ｃは、ｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔ、ｐ−ＧＳＫ３β／ＧＳＫ３β、ＮＦＡＴｃ１／ＥＦ１α、およびＭｃｌ−１  ／ＥＦ１α（ｎ＝３）のそれぞれに関する図３Ａ〜図３Ｃに示される結果のデンシトメトリー定量化を示す棒グラフである。統計分析は、対応のないｔ検定によって行った。ａ、Ｐ  ＜０．０５対コントロール；ｂ、Ｐ＜０．０５対ＲＡＮＫＬ（Ａ）、ＬＹ（Ｂ）、およびＭＹＲ−Ａｋｔ（Ｃ）；  ｎｓ＝有意でない。
【００２５】
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ〜Ｂは、破骨細胞分化に対するＭｃｌ−１阻害剤およびＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の例示的な効果を示す棒グラフである。図１２Ａは、２つのＭｃｌ−１阻害剤（ＢＩ−９７Ｃ１およびＢＩ−９７Ｄ６）の結果を示す。マウスから骨髄細胞を採取し、示された用量の阻害剤の存在下または非存在下で、４つの区において５×１０５細胞を破骨細胞分化のために誘導した。図１２Ｂは、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４および／またはＢＩ−９７Ｄ６で処理した破骨細胞分化のために誘導された初代骨髄細胞の結果を示す。データは、２つの独立した実験について平均±Ｓ．Ｄ．；＊、Ｐ  ＜０．０５；  ＊＊＊、Ｐ  ＜０．００１  対コントロールを示す。
【００２６】
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、破骨細胞分化におけるＡｋｔおよびＭｃｌ−１発現の例示的な効果を示す棒グラフである。図１３Ａは、マウス骨髄からの初代細胞を単離し、ＭＣＳＦ（１０  ｎｇ／ｍＬ）およびＲＡＮＫＬ（１００  ｎｇ／ｍＬ）の存在下で３区分ごと培養し、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質（１０  μｇ／ｍＬ）および／または指定量のＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２で処理したときに得られた破骨細胞の数を未処理のコントロールと比較とともに示す。図１３Ｂは、構成的Ａｋｔ（ＣＡ−Ａｋｔ）、ドミナントネガティブＡｋｔ（ＤＮ−Ａｋｔ）、またはＭｃｌ−１過剰発現プラスミド（ＭＣＬ１）で安定的にトランスフェクトされたＲＡＷ  ２６４．７細胞における破骨細胞活性（３回測定）を示す。
【００２７】
【図１４】図１４は、対照細胞（“Ｃ”）と比較して、Ａｋｔを過剰発現する安定したＰＣ３−ＭＬ細胞（“Ｃｌ．１”および“Ｃｌ．２”）における下流シグナル伝達カスケードを示すウエスタンブロットの例を図示する。クローン１（“Ｃｌ．１”）は、ｐ−Ａｋｔ、ｐ−ＧＳＫ３β、およびサイクリン−Ｄ１の発現において有意な上方制御を示した。
【００２８】
【図１５】図１５は、ＰＣ３−ＭＬルシフェラーゼ細胞（１×１０５）の心臓内注射を受け、未処理（コントロール）または６用量のＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質（５ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスの画像である。マウスは、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステムで画像化した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書では本発明の様々な実施形態および態様が示され説明されているが、そのような実施形態および態様が例示としてのみ開示されていることは当業者には明らかであろう。当業者は、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換を思いつくであろう。本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替形態が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。
【００３０】
本明細書で使用されるセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、記載された主題を限定するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、マニュアル、および論文を含むがこれらに限定されない、本出願で引用されたすべての文書または文書の一部は、参照により、あらゆる目的において全体として明示的に組み込まれている。
【００３１】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ２ｎｄ  ｅｄ、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  １９９４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）を参照する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法、装置および材料を、本発明の実施において使用することができる。以下の定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供されており、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者が指定された値と合理的に類似していると考えるであろう指定された値を含む値の範囲を意味する。いくつかの実施形態において、「約」という用語は、当技術分野で一般に許容される測定を使用した標準偏差内を意味する。いくつかの実施形態においては、約は、指定された値の＋／−  １０％に及ぶ範囲を意味する。いくつかの実施形態では、約は指定された値を意味する。
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように記載されてもよいことに留意されたい。そのため、この陳述は、クレーム要素の記述に関連する「単独」、「のみ」などの排他的な用語の請求項における記載、または“［特定の機能または要素］が欠けている”、“［特定の機能または要素］を除く”、“［特定の機能または要素］が存在しない（含まれているなど）…”などの「否定的な」限定の使用をサポートすることを意図する。
【００３４】
「核酸」、「核酸分子」、「核酸オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体、誘導体もしくは修飾のいずれかである、様々な長さを有し得る、共有結合で連結されたヌクレオチドのポリマー形態を含むことが意図されるが、これらに限定されない。異なるポリヌクレオチドは、異なる三次元構造を有し、既知または未知の様々な機能を果たし得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（ヘテロクロマチンＤＮＡを含むが、これらに限定されない）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、特定配列の単離されたＤＮＡ、特定配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含む。本開示の方法において有用なポリヌクレオチドは、天然の核酸配列およびその変異体、人工的な核酸配列、またはそのような配列の組み合わせを含み得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分が含まれていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどにより、重合後にさらに修飾することができる。
【００３５】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコード化されたもの、ならびに例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンなど、後で修飾されるアミノ酸である。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を持つ化合物、つまり、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持つが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指します。「非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）アミノ酸」および「非天然（ｕｎｎａｔｕｒａｌ）アミノ酸」という用語は、天然には見られないアミノ酸類似体、合成アミノ酸、およびアミノ酸模倣体を指す。
【００３６】
本明細書では、アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨されており、一般に知られている３文字記号または１文字記号のいずれかによって言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受け入れられている一文字コードによって言及されてもよい。
【００３７】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状または分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、そして非アミノ酸が含まれていても良い。この用語には、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの他の操作により修飾されたアミノ酸ポリマーも含まれる。「融合タンパク質」は、２つまたはそれ以上の別個のタンパク質配列をコードし、単一部分として組換えにより発現されるキメラタンパク質を指す。
【００３８】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一」または部分的「同一性」は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指すか、または、以下で説明するデフォルトのパラメーターによるＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ  ２．０シーケンス比較アルゴリズムを使用した測定もしくは手動での位置合わせと目視により測定した際に（たとえば、ＮＣＢＩ  Ｗｅｂサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴなどを参照）、同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定の割合（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域全体で最大の対応が得られるように比較および配列した際に、特定の領域に対して約６０％同一、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い同一性）を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。いくつかの実施形態において、「実質的に同一」である配列は、少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上同一である。核酸の場合、部分的同一性は、試験配列の相補鎖を指す、もしくは適用される場合がある。以下に説明するように、好ましいアルゴリズムはギャップなどを説明することができる。いくつかの実施形態において、同一性は、長さが少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって存在し、またはより好ましくは長さが５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００３９】
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントための参照配列（これは、付加または欠如を含まない）と比較して付加または欠如を含み得る。パーセンテージは、一致した位置の数を得るように両方の配列において、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り（例えば、参照配列に関して）、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。配列同定を決定するためのプログラムは当業者に知られており、ＢＬＡＳＴ（上記のように、任意でデフォルトのパラメーターを使用できる）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ  ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅ  ａｌｉｇｎｅｒ、任意でデフォルト設定を用いる、などを参照）。
【００４０】
用語「ＭＤＡ−７」、「ＩＬ−２４」または「ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４」は、ＭＤＡ−７活性を有するタンパク質（そのホモログ、アイソフォーム、および機能的フラグメントを含む）を指す。この用語は、ＭＤＡ−７活性を維持する（例えば、野生型ＭＤＡ−７と比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％  、９０％、９５％、または１００％の活性）任意の組換え型または天然型のＭＤＡ−７またはその変異体、ホモログ、アイソフォームを含む。いくつかの実施形態において、変異体、ホモログ、またはアイソフォームは、天然型のＭＤＡ−７タンパク質の配列全体または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、または２００の連続したアミノ酸部分）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施例において、ＭＤＡ−７タンパク質は、アクセッション番号ＮＰ＿００６８４１によって同定されるタンパク質に実質的な同一であるか、または、それに実質的に同一である変異体もしくはホモログである。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ１３００７によって同定されたタンパク質と実質的に同一であるか、またはそれに実質的に同一性を有する変異体もしくはホモログである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２４遺伝子は、ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）ＮＭ＿００６８５０に示される核酸配列に実質的に同一であるか、または、それに対して実質的に同一性を有する変異体もしくはホモログである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２４遺伝子は、Ｅｎｓｅｍｂｌの参照番号ＥＮＳＧ０００００１６２８９２に示される核酸配列に実質的に同一であるか、または、それに対して実質的に同一性を有する変異体もしくはホモログである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列または核酸配列は、本出願の時点で知られている配列である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＭＤＡ−７の成熟型であり、タンパク質の前駆体型のＮ末端のシグナル配列は存在しない。成熟型は、シグナル配列を含む前駆型から翻訳後に生成することができ、または、成熟型ＭＤＡ−７の配列に関するシグナル配列Ｎ末端のない成熟型をコードするポリヌクレオチドから直接翻訳することができる。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は配列番号２を含むか、または、ＭＤＡ−７活性を維持するその変異体、ホモログ、もしくはアイソフォームを含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は配列番号３を含むか、または、ＭＤＡ−７活性を維持するその変異体、ホモログ、もしくはアイソフォームを含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号２の最初の４９アミノ酸を含まない。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号４を含むか、またはＭＤＡ−７活性を維持するその変異体、ホモログもしくはアイソフォームを含む。
【００４１】
当業者は、コードされた配列において単一のアミノ酸または少量のアミノ酸を変更、付加または削除する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、削除または付加を「保存的に改変された変異体」であり、その変更はあるアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸と置換することによりもたらされることを認識する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野でよく知られている。そのような保存的に改変された変異体は、本開示の多型変異体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えられ、またそれらを排除しない。次の８つのグループには、それぞれ保存的な置換であるアミノ酸が含まれる。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；  そして
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
【００４２】
特定のアミノ酸は、殺腫瘍効果をそれほど失うことなく、タンパク質構造の他のアミノ酸と置換することができる。そのタンパク質の生物学的機能活性を定義するのはタンパク質の相互作用能力と性質であるため、特定のアミノ酸置換をタンパク質配列で、もちろんそのＤＮＡコーディング配列で行うことができ、それでも同様の特性を持つタンパク質を得ることができる。そのため、本開示のポリペプチド配列、または前記ポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に、それらの生物学的活性の少なくともいくつかを保持しながら、様々な変更を加えることができると考えられる。そのような生物活性は、例えば、本明細書の実施例に記載されているアッセイなどの様々な技術によって評価することができる。
【００４３】
用語「精製された」は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然状態または全細胞溶解物中において関連している１つまたは複数の他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。それは、例えば、均質な状態、または、１つまたは複数の他の化合物との混合物の状態であってもよく、乾燥状態または水溶液状態のいずれかであってもよい。例えば、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、細胞溶解物から精製することができ、次いで、１つまたは複数の他の薬剤（例えば、Ｍｃｌ−１阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤）と組み合わせることができる。このように、精製されたＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を含む組成物は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質に加えて化合物を含む場合があるが、通常、ＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が最初に単離される溶解物または培地中には、１つまたは複数の不純物を欠いているか、または減少している。純度と均一性は、通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動や高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して決定される。調製物中に存在する主要な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、白血病、リンパ腫、がん腫および肉腫を含む、哺乳動物（例えば、ヒト）に見られるあらゆる種類のがん、新生物または悪性腫瘍を指す。本明細書で提供される化合物または方法で治療できる例示的ながんには、脳がん、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、前立腺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、髄芽腫、黒色腫、子宮頸がん、胃がん、卵巣がん、肺がん、頭、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫。本明細書で提供される化合物または方法で治療することができる例示的ながんには、甲状腺、内分泌系、脳、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、肝臓、腎臓、肺、卵巣、膵臓、直腸、胃、および子宮のがんが含まれる。追加の例には、甲状腺がん、胆管がん、膵臓腺がん、皮膚皮膚黒色腫、結腸腺がん、直腸腺がん、胃腺がん、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、乳房浸潤がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん、非小細胞肺がん、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、多形性膠芽腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、悪性膵臓インスラノーマ、悪性カルチノイド、膀胱がん、前がん性皮膚病変、がん、神経芽細胞腫、食道がん、泌尿生殖器がん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、膵内分泌腺または外分泌腺の腫瘍、甲状腺髄様がん、甲状腺髄様がん、黒色腫、結腸直腸がん、甲状腺乳頭がん、肝細胞がんａ、または前立腺がん。実施形態では、がんは骨に転移したがんである。実施形態では、がんは、前立腺がん由来の骨転移などの前立腺がんである。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「転移」、「転移性」、および「転移性がん」という用語は、互換的に使用でき、例えばある臓器もしくは隣接しない別の臓器または身体の一部からのがんのような、増殖性疾患または障害の広がりを指す。「転移性がん」は「ステージＩＶがん」とも呼ばれる。がんは、例えば前立腺のような発生部位に発生し、これを例えば原発性前立腺がんのように、原発腫瘍と呼ぶ。原発腫瘍または発生部位の一部のがん細胞は、局所領域の周囲の正常組織に浸透および浸潤する能力、および／またはリンパ系または他の部位や体内の組織に循環する血管系の壁に浸透する能力を獲得する。原発腫瘍のがん細胞から形成された臨床的に検出可能な第二の腫瘍は、転移性または二次性腫瘍と呼ばれる。がん細胞が転移する場合、転移性腫瘍およびその細胞は、元の腫瘍のものと同様であると推定される。したがって、前立腺がんが骨に転移した場合、骨の部位の二次腫瘍は異常な前立腺細胞からなり、異常な骨細胞ではない。骨の二次腫瘍は転移性骨がんと呼ばれる。したがって、転移性がんという語句は、対象が原発性腫瘍を有していたかまたは有し、１つまたは複数の続発性腫瘍を有する疾患を指す。非転移性がんまたは転移性ではないがんを有する対象という語句は、対象が原発性腫瘍を有するが１つ以上の続発性腫瘍を有しない疾患を指す。例えば、転移性肺がんは、対象が原発性肺腫瘍を有するかもしくはその病歴を有し、例えば骨などの第２の場所または複数の場所に１つまたは複数の続発性腫瘍を有する疾患を指す。
【００４６】
「破骨細胞分化」および「破骨細胞形成」という用語は、破骨細胞前駆細胞（前駆細胞）が造血部分から動員され、その後、増殖し、成熟破骨細胞へ分化するプロセスを指す。この多段階の分化プロセス中に、分裂後の破骨細胞前駆体は、カテプシンＫ、ＭＭＰ−９、カルシトニン受容体、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）などの破骨細胞関連マーカーを徐々に発現し、マクロファージの特性の一部を失う。次に、単核の前破骨細胞が融合して、多核巨細胞が形成される。破骨細胞分化は、最終的に活動的な骨吸収細胞をもたらす。破骨細胞はいったん形成されると、大きな破骨細胞と呼ばれる場合があり、これは通常、数個の核（たとえば、最大数十個）または少数の核（たとえば、わずか３個）を含む小さな破骨細胞によって特徴付けられる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「対象」は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（例えば、サルおよびヒト）などの哺乳動物であり得る。実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、本明細書に記載の転移性がんなどのがんを有するか、またはがんを有する可能性のある哺乳動物（例えば、ヒト）である。いくつかの実施形態において、対象は、本明細書に記載の転移性がんなどのがんを発症するリスクがある哺乳動物（例えば、ヒト）である。
【００４８】
本明細書で使用される「治療する」または「治療」は、臨床結果を含む、対象の状態において有益なまたは所望の結果を得るためのあらゆるアプローチを広く含む。有益なまたは望ましい臨床結果には、以下に限定れないが、１つまたは複数の症状または状態の緩和または改善、疾患の程度の軽減、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の進行を遅らせるまたは遅延、疾患の状態の改善または緩和、疾患の再発の減少、および寛解が含まれ、これらは部分的または全体的であり、かつ、検出可能であるかまたは検出不可能である。言い換えると、本明細書で使用される「治療」は、疾患の治癒または改善を含む。治療により、疾患の症状が完全にまたは部分的に緩和され、疾患の根本的な原因が取り除かれたり、疾患の期間が短くなったり、これらの組み合わせがもたらされる場合があります。がんの場合、治療は、がん細胞の増殖の減速、停止、または逆転を含み得る（例えば、腫瘍の成長において、腫瘍のサイズまたはその変化率により測定される）。
【００４９】
本明細書で使用される「予防する」は、患者における１つまたは複数の疾患症状の発生または発生率の減少を指す。予防は完全である（検出可能な症状がない）か部分的であってよく、その結果、治療がなければ生じたであろう症状よりも少ない症状が観察される。予防には予防的治療が含まれる。
【００５０】
治療期間の長さは、状態の重症度、患者の年齢、活性剤の濃度、治療で使用される組成物の活性、またはそれらの組み合わせなどの様々な要因に依存する。治療または予防のために使用される薬剤の有効投与量は、特定の治療または予防計画の過程で増加または減少し得ることもまた理解されるであろう。投与量の変化は、当技術分野で知られている標準的な診断アッセイによって決定し、明らかとしてもよい。場合によっては、慢性的な投与が必要になることがある。例えば、組成物は、患者を治療するのに十分な量および期間にわたって対象に投与される。いくつかの実施形態において、本開示の組成物の投与は、対象のがん（例えば、転移性骨がん）を治療すること、およびさらなる疾患系（例えば、骨転移）を防止することの両方である。
【００５１】
本明細書に記載の組成物は、抗がん剤などのがんの治療に有用であることが知られている他の活性剤と互いに組み合わせて使用することができる。「抗がん剤」は、その明確な通常の意味に従って使用され、抗腫瘍特性またはがん細胞の成長または増殖を阻害する能力を有する組成物（例えば、化合物、薬物、アンタゴニスト、阻害剤、モジュレーター）を指す。いくつかの実施形態において、抗がん剤は化学療法剤である。いくつかの実施形態において、抗がん剤は、がんを治療する方法において有用性を有する、本明細書で同定された薬剤である。いくつかの実施形態において、抗がん剤は、がんを治療するための、ＦＤＡまたは米国以外の国の同様の規制機関によって承認された薬剤である。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、対象に対して経口投与、座剤としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病変内、くも膜下腔内、鼻腔内もしくは皮下投与、または、ミニ浸透圧ポンプなどの徐放デバイスの移植を包含する。投与は、非経口および経粘膜（例えば、頬側、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路による。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内が含まれる。他の送達様式には、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれるが、これらに限定されない。「同時投与」とは、本明細書に記載の組成物が、１つまたは複数の追加療法、例えば化学療法、ホルモン療法、放射線療法、または免疫療法などのがん療法と同時に、直前に、または直後に投与されることを意味する。本発明の化合物は、単独で投与することができ、または患者に同時投与することができる。同時投与は、化合物の個別または組み合わせ（複数の化合物）の同時または逐次投与を含むことを意味する。したがって、調製物はまた、所望される場合、（例えば、代謝分解を低減するために）他の活性物質と組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、タンパク質またはタンパク質を含む組成物を「投与すること」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドではなく、タンパク質自体（例えば、ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質）を投与することを指す。
【００５３】
「有効量」は、化合物が存在しない場合と比較して、化合物が所定の目的を達成するのに十分な量である（例えば、それが投与される効果を達成する、疾患を治療する、酵素活性を低下させる、酵素活性を増大させる、シグナル伝達経路を減らす、または、疾患または状態の１つ以上の症状を減らす）。「有効量」の例は、疾患の症状または症状の治療、予防、または軽減に寄与するのに十分な量であり、「治療的有効量」とも呼ばれ得る。１つまたは複数の症状（および文法的に同等物）の「軽減」とは、症状の重症度または頻度の減少、または症状の排除を意味する。薬剤の「予防的有効量」は、対象に投与されたときに、意図した予防効果、例えば、傷害、疾患、病理または状態の発症（または再発）を防止または遅延させる薬物の量であるか、または、障害、疾患、病理、または状態もしくはそれらの症状の発症（または再発）の可能性を減らす薬剤の量である。完全な予防効果は、必ずしも１回の投与で起こるとは限らず、一連の投与後に起こる場合もある。したがって、予防的有効量は、１回以上の投与で投与してもよい。本明細書で使用される「活性低下量」は、アンタゴニストが存在しない場合と比較して酵素の活性を低下させるのに必要なアンタゴニストの量を指す。本明細書で使用される「機能破壊量」は、アンタゴニストが存在しない場合と比較して酵素またはタンパク質の機能を破壊するのに必要なアンタゴニストの量を指す。正確な量は、治療の目的に依存し、当業者が既知の技術を使用して確認することができる（例えば、リーバーマン、医薬剤形（第１〜３巻、１９９２年参照）；ロイド、アート、製薬調合の科学と技術（１９９９）；ピッカー、投与量計算（１９９９）；およびレミントン：薬局の科学と実践、第２０版、２００３、ジェンナロ編、リピンコット、ウィリアムズ＆ウィルキンス）。
【００５４】
本明細書に記載される任意の化合物について、治療的有効量は、細胞培養アッセイから最初に決定され得る。標的濃度は、本明細書に記載されているか、または、当技術分野で知られている方法を使用して測定され、本明細書に記載の方法を達成することができる活性化合物の濃度である。
【００５５】
当技術分野でよく知られているように、ヒトで使用するための治療有効量は、動物モデルから決定することもできる。例えば、ヒトのための用量は、動物において効果的であることが見出されている濃度を達成するように処方され得る。上記のように、化合物の有効性を監視し、用量を上方または下方に調整することにより、ヒトにおける用量を調整することができる。上記の方法および他の方法に基づいて、ヒトにおいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００５６】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、上記のように障害を改善するのに十分な治療薬の量を指す。たとえば、特定のパラメーターの場合、治療上有効な量は、与えられた数値に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、または１００％の増加または減少を示す。。治療効果は「倍」の増加または減少として表すこともできる。例えば、治療的有効量は、対照に対して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、またはそれ以上の効果を有することができる。
【００５７】
投薬量は、患者の要件および使用されている化合物に応じて変動し得る。本開示の文脈において、患者に投与される用量は、経時的に患者に有益な治療反応をもたらすのに十分でなければならない。用量の大きさはまた、有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。特定の状況に対する適切な投与量の決定は、開業医のスキルの範囲内である。一般に、治療は化合物の最適用量よりも少ない少量で開始される。その後、状況下で最適な効果が得られるまで、投与量を少しずつ増やす。投与量および間隔は、治療される特定の臨床的症状に有効な投与される化合物のレベルを提供するために、個別に調整することができる。これは、個人の病状の重症度に見合った治療計画を提供する。
【００５８】
本明細書で使用される「組み合わされた相乗量」は、第一の量（例えば、組換えＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の量）および第二の量（例えば、Ｍｃｌ−１阻害剤の量）の合計を指し、それは相乗効果（すなわち、相加効果よりも大きな効果）をもたらす。したがって、本明細書で互換的に使用される「相乗作用」、「相乗作用」、「相乗作用の」、「組み合わせ相乗作用量」、および「相乗作用の治療効果」という用語は、測定された効果が、単剤として単独で投与された各化合物の個々の効果の合計よりもより大きい組み合わせで投与される化合物の測定された効果を指す。
【００５９】
いくつかの実施形態において、組み合わされた相乗量は、第二の量（Ｍｃｌ−１阻害剤など）と別に使用された際に、第一の量（例えば、ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質）の約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％である。いくつかの実施形態において、組み合わせた相乗量は、第一の量（例えば、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質）と別に使用された際に、第二の量（Ｍｃｌ−１阻害剤など）の約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、��３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％である。
【００６０】
本明細書で定義されるように、タンパク質−阻害剤相互作用に関して「阻害」、「阻害する」、「阻害している」などの用語は、阻害剤が存在しない場合のタンパク質の活性または機能と比較して、タンパク質の活性または機能に消極的な影響を与える（例えば、低下させる）ことを意味する。いくつかの実施形態においては、阻害は、阻害剤の非存在下でのタンパク質の濃度またはレベルと比較して、タンパク質の濃度またはレベルに消極的な影響を与える（例えば、低下させる）ことを意味する。いくつかの実施形態において、阻害は、疾患または疾患の症状の軽減を指す。いくつかの実施形態において、阻害は、特定の標的タンパク質の活性の低下を指す。したがって、阻害は、少なくとも部分的に、活性を一部または完全に遮断、刺激、減少、防止、もしくは、遅延させる、または、シグナル伝達もしくはタンパク質の酵素活性もしくは量を不活性化、鈍くするまたはダウンレギュレートすることを含む。いくつかの実施形態では、阻害は、直接的な相互作用から生じる標的タンパク質の活性の低下を指す（例えば、標的タンパク質に結合する阻害剤）。いくつかの実施形態において、阻害は、間接的相互作用による標的タンパク質の活性の低下を指す（例えば、標的タンパク質を活性化するタンパク質に結合し、それにより標的タンパク質の活性化を妨げる阻害剤）。「Ｍｃｌ−１阻害剤」は、阻害剤の非存在下におけるＭｃｌ−１の活性もしくは機能またはＭｃｌ−１シグナル伝達経路に関与する他のシグナル伝達経路成分（例えば、タンパク質、遺伝子）の活性または機能と比較して、Ｍｃｌ−１の活性もしくは機能またはＭｃｌ−１シグナル伝達経路に関与する他のシグナル伝達経路成分（例えば、タンパク質、遺伝子）の活性または機能に消極的な影響を与える（例えば、低下させる）化合物を含む。いくつかの実施の形態において、Ｍｃｌ−１阻害剤は、Ｍｃｌ−１の活性を阻害するために直接結合する薬剤である。
【００６１】
本明細書で使用される「シグナル伝達経路」という用語は、ある成分が１つまたは複数の他の成分へ変化を伝達する細胞成分間および任意で細胞外成分（例えばタンパク質、核酸、小分子、イオン、脂質）間の一連の相互作用を指し、これは追加の成分への変化を伝達し、任意に他のシグナル伝達経路成分に伝播される。例えば、本明細書に記載される化合物（例えば、Ｍｃｌ−１阻害剤）とのＭｃｌ−１の結合は、Ｍｃｌ−１触媒反応の産物のレベルまたは当該産物の下流誘導体のレベルを低下させることができ、または、結合は、Ｍｃｌ−１またはＭｃｌ−１反応生成物と下流のエフェクターまたはシグナル伝達経路成分との間の相互作用を低減し、細胞の成長、増殖、または生存に変化をもたらすことができる。
【００６２】
「阻害剤」、「リプレッサー」または「アンタゴニスト」または「ダウンレギュレーター」という用語は、互換可能に、所与の遺伝子またはタンパク質の発現または活性を検出可能に減少させることができる物質を指す。アンタゴニストは、アンタゴニストの非存在下の対照と比較して、発現または活性を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少させることができる。特定の例において、当該発現または活性は、アンタゴニストの非存在下での発現または活性よりも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれより低い。
【００６３】
用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書に記載の化合物に見られる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基で調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。本開示の化合物が相対的に酸性の官能基を含む場合、そのような化合物の中性形態を、溶媒または適切な不活性溶媒中で、十分な量の所望の塩基と接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウムの塩、または類似の塩が含まれる。本開示の化合物が比較的塩基性の官能基を含む場合、そのような化合物の中性形態を、溶媒または適切な不活性溶媒中で、十分な量の所望の酸と接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などの無機酸に由来する塩、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、メタンスルホン酸などの比較的無毒の有機酸に由来する塩を含む。アルギン酸などのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツノール酸などのような有機酸の塩も含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ。、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７７、  ６６、１−１９）。本開示のある特定の化合物は、化合物が塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換されることを可能にする塩基性および酸性官能基の両方を含む。
【００６４】
本開示の化合物は、例えば、薬学的に許容される酸との塩として存在し得る。本開示はそのような塩を含む。そのような塩の非限定的な例には、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩（例えば、（＋）−酒石酸塩、（−）−酒石酸塩、またはそれらの混合物が含まれるラセミ混合物）、コハク酸塩、安息香酸塩、およびグルタミン酸などのアミノ酸との塩、および第四級アンモニウム塩（たとえばヨウ化メチル、ヨウ化エチルなど）が含まれる。これらの塩は、当業者に知られている方法によって調製することができる。
【００６５】
化合物の中性形態は、好ましくは、塩を塩基または酸と接触させ、従来の方法で親化合物を単離することによって再生される。化合物の親形態は、極性溶媒への溶解度などの特定の物理的特性がさまざまな塩形態と異なる場合がある。
【００６６】
塩の形態に加えて、本開示は、プロドラッグ形態である化合物を提供する。本明細書に記載される化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で容易に化学変化を受けて、本開示の化合物を提供する化合物である。本明細書に記載される化合物のプロドラッグは、投与後にインビボで変換され得る。さらに、プロドラッグは、例えば、適切な酵素または化学試薬と接触したときなどの、エクスビボ環境での化学的または生化学的方法によって、本開示の化合物に変換することができる。
【００６７】
本開示の特定の化合物は、非溶媒和形態ならびに水和形態を含む溶媒和形態で存在することができる。一般に、溶媒和形態は非溶媒和形態と同等であり、本開示の範囲内に含まれる。本開示の特定の化合物は、複数の結晶形態またはアモルファス形態で存在し得る。一般に、すべての物理的形態は、本開示によって企図される使用に関して同等であり、本開示の範囲内であることが意図されている。
【００６８】
「薬学的に許容される賦形剤」および「薬学的に許容される担体」は、対象への活性剤の投与および対象による吸収を補助し、患者に有意な有害な毒性効果を引き起こすことなく本開示の組成物に含めることができる物質を指す。薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例には、水、塩化ナトリウム、通常の生理食塩水、乳酸加リンガー液、通常のスクロース、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング、甘味料、香料、塩溶液（リンガー液など）、アルコール、油、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン、および着色料などが含まれる。そのような調製物は滅菌することができ、必要に応じて、本開示の化合物と有害に反応しない潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色剤、および／または有害に反応しない芳香族物質などの補助剤と混合することができる。当業者は、他の医薬賦形剤が本開示において有用であることを認識するであろう。
【００６９】
「調製物」という用語は、他の担体を伴うまたは伴わない活性成分が担体によって取り囲まれるカプセルを提供するカプセルを提供する、担体としてのカプセル化材料を伴う活性化合物の製剤を含むことが意図される。同様に、カシェとトローチ剤が含まれる。錠剤、粉末、カプセル、ピル、カシェ、およびトローチ剤は、経口投与に適した固体剤形として使用することができる。
【００７０】
医薬製剤は、場合により、単位剤形である。そのような形態では、製剤は、適切な量の活性成分を含む単位用量に細分される。単位剤形は、包装された調製物であり得、包装物は、バイアルまたはアンプル中のパケット化された錠剤、カプセル、および粉末などの、個別の量の調製物を含む。また、単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤、またはトローチ竿自体であるか、またはこれらのいずれかが適切な数でパッケージされた形態であり得る。単位剤形は、凍結分散体であり得る。
【００７１】
方法
様々な態様において、本開示は、がんを有する対象における骨への転移を防止する方法、およびがんを有する対象における骨転移を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。対象のがんは、投与前に転移していても、転移していなくてもよい。いくつかの実施形態において、骨転移は、骨転移がまだ検出されていない対象において予防される。いくつかの実施形態において、対象は、１つまたは複数の骨転移を有し、骨への転移を防止することは、さらなる骨転移を防止することを含む。いくつかの実施形態において、対象は１つまたは複数の骨転移を有し、骨転移の治療は、１つまたは複数のそのような転移の成長を遅延、停止、または逆転させることを含む。いくつかの実施形態において、対象は、転移性がんを発症するリスクまたは追加の骨転移を発症するリスクがあり、骨への転移を防止することは、そのような防止がない場合のリスクまたは予想発生率と比較して、そのような転移のリスクまたは発生率を低減することを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、組換えにより産生されたタンパク質である。組換えタンパク質の生産にはさまざまな方法が利用可能である。非限定的な例には、インビトロ翻訳、および宿主細胞における産生が含まれる。いくつかの実施形態において、組換えタンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、タンパク質またはその前駆体をコードするポリヌクレオチドを発現する。そのようなポリヌクレオチドは、（例えば、プラスミドまたはウイルスベクターによって）宿主細胞に一過性にトランスフェクトされ得るか、または宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。様々な適切な宿主細胞が利用可能である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不死化された初代ヒト胎児星状細胞（ＩＭ−ＰＨＦＡ）細胞である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を産生することは、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスで宿主細胞を形質転換することを含む。いくつかの実施形態において、ウイルスはアデノウイルスである。さまざまな適切なアデノウイルスが利用可能である。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の産生に使用できるアデノウイルスの非限定的な例には、ＷＯ２０１８０８９９９５Ａ１、ＷＯ２０１７０６２７０８Ａ１、ＵＳ２０１８０２４３３８２Ａ１、ＵＳ２０１６０００８４１３Ａ１、およびＤａｓｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１４；  ７４：５６３−７４に記載されているものが含まれる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、精製されたタンパク質である。様々な精製方法が利用可能であり、それらはある程度、製造方法に依存する。例えば、宿主細胞が使用され、タンパク質が宿主細胞によって分泌されない場合、精製は、宿主細胞を溶解してタンパク質を放出する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は宿主細胞から分泌され、精製は細胞溶解を伴わない精製を含み得る。精製方法は、生産されるタンパク質の性質にも依存する。例えば、宿主細胞によって産生されたＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、精製を容易にするタンパク質タグ（例えば、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、またはＨＡタグ）などの追加の要素を含むことができる。タンパク質タグは、同種の結合パートナー（Ｈｉｓタグの場合はニッケルなど）を使用した精製を容易にし、タンパク質タグは基質に付着させてもよい。いくつかの実施形態において、最初に精製タグを用いて生成されたＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、対象への投与前にタグを除去するために処理される。いくつかの実施形態において、宿主細胞によって産生されるＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、精製タグを含まない。そのような場合、精製は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質に結合する試薬（例えば、基質に付着した抗体）を使用した精製を含み得る。いくつかの実施形態において、精製は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質以外の培地または溶解物の成分の除去を含む。例えば、溶解物または細胞懸濁液を遠心分離して、細胞または細胞破片のペレットを生成し、上清を別の容器に分離し、それにより、そのような細胞または細胞破片の分離によりＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を精製する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、生物学的活性を保持する。サイトカインおよびＩＬ−１０サイトカイン遺伝子ファミリーのメンバーとして、下流のシグナル伝達イベントを活性化するため、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４は、Ｒ１タイプの受容体とＲ２タイプの受容体（ＩＬ−２０Ｒ１およびＩＬ−２０Ｒ２；ＩＬ−２２Ｒ１およびＩＬ−２０Ｒ２）で構成される受容体ダイマー、または、２つのＲ１タイプの受容体（ＩＬ−２０Ｒ１およびＩＬ−２２Ｒ１）からなるユニークな受容体ペアを介して本来的にシグナルを発信する。そのような活性を測定するためのアッセイが利用可能である（例えば、ＷＯ２０１８０８９９９５Ａ１を参照）。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号２または配列番号３のＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の生物学的活性について少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上を保持する変異体、ホモログ、またはアイソフォームである。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号３のＭＤＡ−７の生物学的活性の少なくとも８０％を保持する。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号３のＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の生物学的活性の少なくとも９０％を保持する。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、対象のがん細胞の、または参照細胞株（例えば、ＤＵ−１４５細胞）のＩＬ−２０／ＩＬ−２２受容体複合体を活性化することができる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、シグナル配列を含む前駆体タンパク質である。例えば、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号２のポリペプチドからなるか、または、実質的に配列番号２のポリペプチドからなる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質は、成熟ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号３のポリペプチドからなるか、または実質的に配列番号３のポリペプチドからなる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、生物学的活性を保持する短縮型のＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質である。例えば、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号３の最初の５４アミノ酸を欠く場合がある。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号４を含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、配列番号４のポリペプチドからなる、または、実質的に配列番号４のポリペプチドからなる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を含む組成物の投与は、腫瘍、腫瘍が外科的に除去された部位、および／または対象の骨のような標的組織に投与することを含む。いくつかの実施形態において、標的組織への投与は、標的組織内へのまたは標的組織隣接部へ注射、または標的組織への局所適用を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、標的組織の遠位に送達されるが、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を標的組織に輸送するように処方される。いくつかの実施形態において、がん組織および／または骨組織などの特定の組織に移動する部分は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質と複合体化される。複合化は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質と標的部の間の共有または非共有相互作用などにより、標的部と直接行うことができる。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質と標的部が共有結合または非共有相互作用を介して２つを結合する１つ以上の他の分子によって分離されるように、複合化は間接的であってもよい。一般に、標的部は、複数の非標的生物学的実体（例えば、１つまたは複数の異なる組織の細胞表面成分）よりも高い親和性を有する生物学的実体（例えば、膜成分、細胞表面受容体、細胞特異的膜抗原など）に結合するか、さもなければ会合することができる部分である。標的部は、典型的には、対象の身体の他の場所よりも高度に、または、局在化することを可能にする標的部がない場合に達成されるよりもより高度に、積荷（例えば、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質）を特定の標的部位に局在させることができる。標的部の非限定的な例には、抗体、抗原結合抗体断片、アプタマー、ペプチド、ホルモン、成長因子、リガンド（例えば、受容体リガンド）、小分子などが含まれる。骨に移動する標的部についての実例は、ＵＳ２０１２００２８３５０Ａ１、ＵＳ２０１６００５２９６８Ａ１、ＵＳ２００４００３８９４６Ａ１、およびＵＳ２０１８０２０８６５０Ａ１に記載されている。
【００８０】
いくつかの実施形態において、投与は、超音波標的マイクロバブル破壊（ＵＴＭＤ）を含み、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の標的組織への直接送達を可能にする。例えば、本開示の組成物は、マイクロバブルと複合化され得、静脈内に投与され、次いで、標的組織に超音波を適用することによって標的組織に放出され得る。ＵＳ２０１８０２４３３８２Ａ１は、マイクロバブルデリバリーテクノロジーの例を示す。
【００８１】
いくつかの実施形態において、様々ながんのいずれかの骨転移が治療または予防される。一部のがんは骨に転移する傾向が高い。例には、前立腺がん、乳がん、肺がん、腎臓がん、および甲状腺がんが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、がんは前立腺がんである。さまざまな遺伝子発現の兆候を使用して、がん細胞と非がん細胞、ある組織のがんと別の組織のがん、および転移性がんと非転移性がんを区別できる。いくつかの実施形態において、がんは、前立腺がんを有する対象の参照用前立腺細胞株または非がん化前立腺細胞株などの正常な前立腺細胞と比較して、Ｍｃｌ−１、ＲＡＮＫＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＡｋｔの１つまたは複数が増加した発現を有する前立腺がんである。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を含む組成物は、１つまたは複数の追加の薬剤をさらに含むか、または１つまたは複数の追加の薬剤と同時投与される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の追加の薬剤は、Ａｋｔ阻害剤、Ｍｃｌ−１阻害剤、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の追加の薬剤は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、Ｍｃｌ−１阻害剤、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、追加の薬剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば、ＬＹ２９４００２）である。いくつかの実施形態において、追加の薬剤は、Ｍｃｌ−１阻害剤（例えば、ＢＩ−９７Ｄ６）である。
【００８３】
様々なＡｋｔ阻害剤が利用可能であり、いくつかのクラスに細分することができる。最初のクラスには、ＡｋｔのＡＴＰ競合阻害剤が含まれ、Ａｋｔ２とＡｋｔ１を阻害するＣＣＴ１２８９３０やＧＤＣ−００６８などの化合物が含まれる。このカテゴリーには、ＧＳＫ２１１０１８３（ａｆｕｒｅｓｅｒｔｉｂ）、ＧＳＫ６９０６９３、ＡＴ７８６７などのｐａｎ−Ａｋｔキナーゼ阻害剤も含まれる。２番目のクラスには、ＰＩ３ＫによるＰＩＰ３の生成を阻害することにより作用する脂質ベースのＡｋｔ阻害剤が含まれる。このメカニズムは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ａｋｔ阻害剤Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩなどのホスファチジルイノシトール類似体、またはＰＸ−８６６などの他のＰＩ３Ｋ阻害剤に採用されている。このカテゴリーには、ペリフォシン（ＫＲＸ−０４０１）（Ａｅｔｅｒｎａ  Ｚｅｎｔａｒｉｓ  ／  Ｋｅｒｙｘ）などの化合物も含まれる。３番目のクラスには、偽基質阻害剤と呼ばれる化合物のグループが含まれる。これらには、ＡＫＴｉｄｅ−２  ＴおよびＦＯＸＯ３ハイブリッドなどの化合物が含まれる。４番目のクラスは、ＡＫＴキナーゼドメインのアロステリック阻害剤で構成され、ＭＫ−２２０６（８−  ［４−（１−アミノシクロブチル）フェニル］  −９−フェニル−２Ｈ−  ［１，２，４］トリアゾロ［３  、４−ｆ］  ［１，６］ナフチリジン−３−オン；二塩酸塩）（メルク社）（例えば、米国特許第７，５７６，２０９号を参照）が含まれる。５番目のクラスには、ＧＳＴ−ａｎｔｉ−Ａｋｔ１−ＭＴＳなどの抗体が含まれる。第６のクラスは、ＡｋｔのＰＨドメインと相互作用する化合物を含み、トリシリビンおよびＰＸ−３１６を含む。ＡＫＴ阻害剤として機能する他の化合物には、例えば、ＧＳＫ−２１４１７９５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＶＱＤ−００２、ミルテフォシン、ＡＺＤ５３６３、ＧＤＣ−００６８、ＲＸ−０２０１（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ＰＢＩ−０５２０４、ＳＲ１３６６８、ＡＰＩ−１などがある。
【００８４】
様々なＰＩ３Ｋ阻害剤が利用可能であり、それらのいくつかは上記で言及されている。追加の例には、これらに限定されないが、ワートマニン（ＰＩ３Ｋの不可逆的阻害剤）、デメトキシビリジン（ワートマニンの誘導体）、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋの可逆的阻害剤）；  ＢＫＭ１２０（ブパリシブ）、イデラリシブ（ＰＩ３Ｋデルタ阻害剤）、デュベリシブ（ＩＰＩ−１４５、ＰＩ３Ｋデルタおよびガンマの阻害剤）、アルペリシブ（ＢＹＬ７１９、アルファ特異的ＰＩ３Ｋ阻害剤）、ＴＧＲ  １２０２（ＲＰ５２６４とも呼ばれる、経口ＰＩ３Ｋデルタ阻害剤）、コパンリシブ（ＢＡＹ  ８０−６９４６、阻害剤ＰＩ３Ｋα、δ）、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ  １２０１、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＧＤＣ−０９４１、ＸＬ１４７（ＳＡＲ２４５４０８）、ＸＬ７６５（ＳＡＲ２４５４０９）、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４  、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００−１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ−１０３、ＧＮＥ−４７７、ＣＵＤＣ−９０７、ＡＥＺＳ−１３６、ＧＤＣ−０９８０、ＧＤＣ−００３２が含まれる。いくつかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＬＹ２９４００２である。
【００８５】
様々なＭｃｌ−１阻害剤が利用可能である。Ｍｃｌ−１阻害剤の非限定的な例には、ＢＩ９７Ｃ１０、ＢＩ１１２Ｄ１、ゴシポール（ＡＴ−１０１、Ａｓｃｅｎｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ｏｂａｔｏｃｌａｘ（ＧＸ１５−０７０、Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、ＭＧ−１３２、ＭＩＭ１、ｓａｂｕｔｏｃｌａｘ（ＢＩ９７Ｃ１、Ｏｎｃｏｔｈｙｒｅｏｎ）、およびＴＷ−３７が含まれる。Ｍｃｌ−１阻害剤のさらなる例は、Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ２０１３  Ｎｏｖ；  ２０（１１）：  １４７５−１４８４），  Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５６（２３）：９６３５−９６４５  （２０１３）），  Ｆｒｉｂｅｒｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５６（１）：１５−３０  （２０１３）），  ＵＳ２０１５００４５３５７Ａ１，  ＵＳ２０１５００５１２４９Ａ１，  ＵＳ２０１３００３５３０４Ａ１，  ＵＳ２００９００５４４０２Ａ１，  ａｎｄ  ＵＳ２０１１０１１２１１２Ａ１に開示されている。いくつかの実施形態において、Ｍｃｌ−１阻害剤はＢＩ−９７Ｄ６である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、有効量は、骨転移を予防または治療するのに有効な組成物の量である。いくつかの実施形態において、有効量は、初代骨髄細胞または正常初代ヒト前立腺上皮細胞に対して実質的に非毒性である組成物（またはその成分、例えばＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質）の量を含む。いくつかの実施形態において、化合物の量は、化合物の非存在の場合と比較して増加した細胞死を誘発しない量である場合か、または、化合物の非存在の場合と比較して細胞死の増加が２０％、１５％、１０％、５％またはそれ未満である場合に、初代骨髄細胞に対して実質的に無毒である。毒性の影響は、例えば、市販の生死細胞染色アッセイを使用して測定できまる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、有効量は、破骨細胞分化を阻害する量である組成物（またはその成分、例えばＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質）の量を含む。いくつかの実施形態において、破骨細胞分化の阻害は、破骨細胞に分化する骨髄細胞の数の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、またはそれ以上の減少を含む。いくつかの実施形態において、破骨細胞への骨髄細胞の分化は、少なくとも２５％減少する。破骨細胞分化への影響は、例えば、培養中の処理済み細胞と未処理細胞を比較することにより、または処理済み被験者の骨髄サンプル中の破骨細胞数を未処理の骨髄サンプル中の破骨細胞数と比較することにより測定できる。破骨細胞数への影響および破骨細胞活性への影響を含む、破骨細胞分化への影響を測定するためのアッセイの例は、本明細書に記載されている。
【００８８】
いくつかの実施形態において、対象に投与されるＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質の量は、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇの１回または複数回以上の用量である。いくつかの実施形態において、対象に投与されるＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の量は、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇ〜７．５ｍｇ／ｋの１回または複数回の投与量である。いくつかの実施形態において、対象に投与されるＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の量は、約５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、有効量は、単回投与で、または複数の用量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５またはそれ以上の用量）で投与される。複数の用量は、週に１回以上（例えば、週に２、３、４、５回、またはそれ以上）、一定週毎（例：週１回、または２週毎、３週毎、４週毎、５週毎またはそれ以上の週毎に１回）、または日ごとに１回（たとえば、毎日、または２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、またはそれ以上の日ごと）など、規則的または不規則な間隔で投与することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、所望の治療結果が達成される（例えば、一定期間骨転移がない）まで間隔を置いて投与される。
【００８９】
いくつかの実施形態において、組成物は、対象に投与される阻害剤が少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇとなるような量のＭｃｌ−１阻害剤（例えば、ＢＩ−９７Ｄ６）を含む。いくつかの実施形態において、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇで対象に投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、約１．５ｍｇ／ｋｇの用量でＭｃｌ−１阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、Ｍｃｌ−１阻害剤は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質とは別個に投与されるが、同じ投与計画に従って投与される。
【００９０】
組成物
様々な態様において、本開示は、上記の様々な実施形態のいずれかに関し、本明細書に記載の方法で使用または生成される組成物、および本明細書に記載の方法で使用する医薬品の製造で使用する組成物を提供する。本開示の組成物は、本明細書に記載される要素のいずれか１つまたは複数を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、がんを有する対象における骨への転移を防止する際に使用するための組成物、およびがんを有する対象における骨転移を治療する際に使用するための組成物を提供する。
【００９１】
いくつかの実施形態において、組成物は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質および１つ以上のＭｃｌ−１阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、またはＰＩ３Ｋ阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質と、Ｍｃｌ−１阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の一方または両方とを含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、例えば、本開示の様々な方法に関して、本明細書に記載されているＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ａｋｔ阻害剤は、本開示の様々な方法に関して、本明細書に記載されているＡｋｔ阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、本開示の様々な方法に関して、本明細書に記載されているＰＩ３Ｋ阻害剤である（例えば、ＬＹ２９４００２）。いくつかの実施形態において、Ｍｃｌ−１阻害剤は、本開示の様々な方法に関して、本明細書に記載されているＭｃｌ−１阻害剤である（例えば、ＢＩ−９７Ｄ６）。いくつかの実施形態において、組成物は医薬組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００９２】
キット
様々な態様では、本開示は、上記の様々な実施形態のいずれかを含む、本明細書に記載されている方法のいずれかで使用するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載される１つまたは複数の組成物を含む。キットの要素は、任意の量および／または組み合わせで提供される（同じキットまたは同じ包装内など）。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法に従って使用するための追加の薬剤を含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質と、１つまたは複数のＭｃｌ−１阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、またはＰＩ３Ｋ阻害剤とを含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質と、Ｍｃｌ−１阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の一方または両方とを含む。いくつかの実施形態において、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質は、例えば、本開示の様々な方法に関して、本明細書に記載されているＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ａｋｔ阻害剤は、本開示の様々な方法に関して、本明細書に記載されているＡｋｔ阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、本開示の様々な方法に関して、本明細書に記載されているＰＩ３Ｋ阻害剤である（例えば、ＬＹ２９４００２）。いくつかの実施形態において、Ｍｃｌ−１阻害剤は、本開示の様々な方法に関して、本明細書に記載されているＭｃｌ−１阻害剤である（例えば、ＢＩ−９７Ｄ６）。
【００９３】
配列
配列番号１（ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質をコードするヌクレオチド配列）
atgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtggactttagccagacccttctgccctcctttgctggcgacagcctctcaaatgcagatggttgtgctcccttgcctgggttttaccctgcttctctggagccaggtatcaggggcccagggccaagaattccactttgggccctgccaagtgaagggggttgttccccagaaactgtgggaagccttctgggctgtgaaagacactatgcaagctcaggataacatcacgagtgcccggctgctgcagcaggaggttctgcagaacgtctcggatgctgagagctgttaccttgtccacaccctgctggagttctacttgaaaactgttttcaaaaactaccacaatagaacagttgaagtcaggactctgaagtcattctctactctggccaacaactttgttctcatcgtgtcacaactgcaacccagtcaagaaaatgagatgttttccatcagagacagtgcacacaggcggttcctgctattccggagagcatttaaacagttggacgtagaagcagctctgaccaaagcccttggggaagtggacattcttctgacctggatgcagaaattctacaagctctga
【００９４】
配列番号２（ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質のアミノ酸配列）
MNFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFALKLDQRQVLDKLDQLDKALQRQVALQLDQRVALQALVALQRVALKVALQRVALKVALQLVLAQVALKVALQRVLAQLAQVALK
【００９５】
配列番号３（ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質のアミノ酸配列）
QGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL
【００９６】
配列番号４（ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質のアミノ酸配列）
ESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL
【００９７】
本明細書に記載の例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の主旨および添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９８】
実施例１：組換えＭＤＡ−７／ＩＬ−２４による前立腺がん骨転移の抑制
【００９９】
前立腺がん（ＰＣ）は、男性におけるがん関連罹患率の主な原因である。限局性ＰＣ患者の５年生存率は１００％に近づくが、転移後に生存率は急激に低下する。骨は播種性ＰＣ細胞のコロニー形成に適した部位であり、骨の恒常性の平衡を変化させて、弱くて壊れやすい骨をもたらす。現在、ＰＣ骨転移の治療法は存在しない。精製されたＭＤＡ−７／ＩＬ−２４組換えタンパク質の治療特性は、ＰＣまたは転移では評価されていない。
【０１００】
この実施例では、組換えタンパク質として送達されたＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の抗がん特性について試験した。骨転移実験モデルを使用して、組換えＭＤＡ−７／ＩＬ−２４で治療した動物は、コントロールと比較して大腿骨の転移病変が有意に少なかった。骨転移に対するＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の阻害効果は、ＰＣ選択的殺傷と、骨吸収の役割を果たす破骨細胞分化阻害からもたらされた。機能獲得および機能喪失の遺伝的アプローチは、ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ＡｋｔおよびＭｃｌ−１経路がＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の抗骨転移活性において極めて重要であることを示した。ＭＣＬ−１小分子阻害剤はＭＤＡ−７／ＩＬ−２４と相乗作用を示し、強力な抗骨転移活性を誘導した。これらの結果は、抗がん分子としてのＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の潜在的な用途を拡大し、精製された組換えタンパク質が前臨床動物モデルで非毒性であり、骨転移に深刻な抑制効果があることを実証するものであり、Ｍｃｌ−１阻害性小分子と組み合わせるとさらに効果が促進されうる。
【０１０１】
細胞株、プラスミド、およびＭｃｌ−１阻害剤：ＰＣ細胞株ＰＣ３の転移性変異体であるＰＣ３−ＭＬを、以前に記載されたように（２０）増殖させた。この細胞株は、無胸腺の雄ヌードマウスでＰＣ誘発骨転移を引き起こすために使用した。ＤＵ−１４５、ＰＣ３、ＲＷＰＥ−１（不死化正常ヒト前立腺上皮細胞）、およびＲＡＷ  ２６４．７（マウスマクロファージ）細胞は、ＡＴＣＣ（アメリカタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナッサス）から入手し、ベンダーの提案どおりに維持した。ＡＲＣａＰ−ＥおよびＡＲＣａＰ−Ｍ細胞株と特定の培地はＮｏｖｉｃｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国アラバマ州バーミンガム）から購入した。破骨細胞分化アッセイのために、ＲＡＷ  ２６４．７細胞株を使用した。不死化初代ヒト胎児星状細胞（ＩＭ−ＰＨＦＡ）は、以前に説明されているように調製し、維持した（２１）。ＡＴＣＣおよび他のベンダーからのすべての細胞株は２０１２〜２０１６年に購入し、ＳＴＲ（ショートタンデムリピート）分析を使用して確認した。実験は初期継代細胞で行った。マイコプラズマ検出キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して、マイコプラズマを含む汚染について細胞を定期的に監視した。Ｍｙｒ−Ａｋｔ、ＤＮ−Ａｋｔ、およびＭｃｌ−１プラスミドはＡｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）からのものを使用した。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）の阻害剤であるＬＹ２９４００２は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。Ｍｃｌ−１阻害剤であるＢＩ−９７Ｄ６化合物は、前述のように（２２、２３）合成および評価し、Ｍａｕｒｉｚｉｏ  Ｐｅｌｌｅｃｃｈｉａ博士（カリフォルニア州カリフォルニア州リバーサイド大学）から提供された。ＢＩ−９７Ｄ６は、ＢＨ３ペプチドのＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＭｃｌ−１への結合を阻害する（２２）。
【０１０２】
組換えＨｉｓ−ＭＤＡ−７タンパク質の精製：ＩＭ−ＰＨＦＡ細胞を、公表されたプロトコル（２４）を使用してＡｄ．５−Ｈｉｓ−ｍｄａ−７で感染させた。細胞上清をＮｉ−ＮＴＡ（ニッケルニトリロ三酢酸）酸スラリーと混合して、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４をＮｉ−ＮＴＡビーズに結合させた。２４時間のインキュベーション後、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを回収、洗浄し、精製されたＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質をイミダゾールバッファーで溶出した。タンパク質は、抗ＭＤＡ−７抗体（Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、テネシー州ナッシュビル）を使用したウエスタンブロッティングによって検証した。ＰＣ３−ＭＬ細胞の生物学的活性をＭＴＴアッセイで確認しました（２５）。
【０１０３】
ＭＴＴ細胞増殖およびクローンアッセイ：細胞増殖アッセイは、以前に記載されたように行われた（２５）。すなわち、２，０００細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、一晩付着させた。細胞は、異なる濃度のＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の存在下または非存在下、完全培地で処理した。適切な時点で、細胞をさらにＭＴＴ（３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２、５ジフェニルテトラゾリウムブロミド）試薬とインキュベートした。最後に、ＤＭＳＯを適用してｂｌｕｅ  ｓａｌｔを溶解し、ＯＤを５６０  ｎｍで測定した（２５）。長期的な影響を決定するために、コロニー形成（クローニング）アッセイを前述のように実施した（２６）。すなわち、２００個の細胞を播種し、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の存在下または非存在下でさらに１５日間増殖させた。培地を、週に１回、合計２回、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を含む新鮮な培地と交換した。
【０１０４】
インビボ転移研究：すべての動物研究は、施設内動物管理および使用委員会（バージニア州連邦大学）により承認された。実験的骨転移アッセイでは、６−８週齢の無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ、米国から購入）に、心臓内経路を通じてホタルルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現する１×１０５  ＰＣ３−ＭＬ細胞を注入した。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の治療活性を測定するために、細胞移植の１日後に、マウスに組換えタンパク質（５  ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を行った。動物を治療薬で合計６回治療した（最初の３週間は週２回）。組み合わせ治療試験として、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質（５  ｍｇ／ｋｇ）とＢＩ−９７Ｄ６（１．５  ｍｇ／ｋｇ）を、それぞれ尾静脈と腹腔内経路で投与した。骨領域の画像は、ＩＶＩＳ（商標登録）イメージングシステムを使用したＢＬＩ（生物発光イメージング）法で監視した（１５、１９、２０）。
【０１０５】
リアルタイムｑ−ＰＣＲ：Ｑｉａｇｅｎ（バレンシア、カリフォルニア、米国）のＲＮＡ単離キットを用いて、細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲＱ−ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎプローブとＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）のマスターミックスを使用して実行した。データは、グラフパッドプリズムソフトウェアを使用して分析した。
【０１０６】
生死細胞アッセイ：生細胞および死細胞を、製造業者の指示に従って生／死染色試薬（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア、米国）で染色した後、共焦点レーザー顕微鏡（ツァイス、ドイツ）によって観察した。画像はＺｅｉｓｓソフトウェアによって分析した。
【０１０７】
ウエスタンブロッティング：ウエスタンブロッティングアッセイについては、標準的なプロトコルに従った（２４、２７）。一次抗体は、ｐＡｋｔ、Ａｋｔ、ｐＧＳＫ３β、ＧＳＫ３β、ＮＦＡＴｃ１、サイクリンＤ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＥＦ１α（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）を使用した。適切な二次抗体を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【０１０８】
破骨細胞形成アッセイ：骨髄細胞は、以前に記載されたプロトコルを使用して破骨細胞分化のために誘導した（２８）。すなわち、骨髄細胞を、ＭＣＳＦ（１０  ｎｇ／ｍＬ）および１０％ウシ胎児血清を含む最小必須培地（α−ＭＥＭ）で２４時間培養した。その後、ＲＡＮＫＬ（１００  ｎｇ／ｍＬ）で５日間処理した。培養細胞を固定し、ＴＲＡＰ（酒石酸耐性酸性ホスファターゼ）で染色した。ＴＲＡＰ染色は、キットに付属の特定のプロトコル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｃ．  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）に従って実施した。分化した破骨細胞と考えられる多核細胞を、明視野顕微鏡下で手動でカウントした。ＴＲＡＣＰ酵素アッセイは、製造元の指示に従って行った（Ｒ＆Ｄ、ミネアポリス、ミネソタ、米国）。
【０１０９】
統計分析：統計分析は、グラフパッドプリズムソフトウェアを使用して行われた。スチューデントのｔ検定を使用して、グループ間の平均差を比較しました。
【０１１０】
組換えＭＤＡ−７／ＩＬ−２４によるＰＣ細胞増殖の選択的阻害：組換えＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４は、上記のように（図１Ａ）に示されるＨｉｓベースのタンパク質精製システムを使用して精製された。精製後、抗ＭＤＡ−７抗体を用いてウエスタンブロッティングにより精製タンパク質の品質を確認した（図１Ｂ）。生物活性を確認するために、ＰＣ３−ＭＬ細胞をＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質で処理し、抗増殖性および潜在的な分子変化をそれぞれＭＴＴアッセイおよびウエスタンブロッティング分析で評価した（図１Ｃおよび１Ｄ）。細胞増殖は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４処理後に有意に損なわれた（図１Ｃ）。ｐ２７、ＧＲＰ７８、およびベクリン−１のレベルで有意な増加が観察され（図１Ｄ）、これは、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４がアデノウイルスを使用して送達された研究と一致している（２５）。次に、細胞増殖に対するＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の長期的な影響を評価するために、コロニー形成（クローン）アッセイをさまざまなＰＣ細胞株で実施した。図１Ｅに示す結果は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が、不死化正常初代ヒト前立腺上皮細胞（ＲＷＰＥ−１）の増殖能力に影響を与えることなく、ＰＣ細胞の増殖を有意に減少させたことを示す。
【０１１１】
組換えＭＤＡ−７／ＩＬ−２４によるインビボＰＣ骨転移の減少：ＰＣ骨転移を抑制するための組換えＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の使用は、試験用転移モデルを使用して試験した。このモデルでは、安定したルシフェラーゼを発現するＰＣ３−ＭＬ細胞を心臓内経路を介して雄性無胸腺ヌードマウスに注入し、骨転移を起こさせた。ＰＣ３−ＭＬ細胞の拡大、浸潤、遊走は、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングによって観察した（１５、２０、２３）。治療期間、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の最適用量、および注射回数（図７に示されている）を最適化するための予備試験に基づいて、動物を、尾静脈注射による５ｍｇ／ｋｇのＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を合計６回投与することにより３週間治療した。ＢＬＩイメージングは、骨の転移性病変の発生を追跡した。ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングを使用したＢＬＩ信号の減少によって示されるように（図２Ａ）、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４処理動物での転移の証拠は有意に少なかった一方で、強固な骨転移が未処理の対照群で観察された。動物の異なる群におけるルシフェラーゼ強度を図２Ｂに示す。これらＰＣ誘発骨転移のモデルにおける結果は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４処理動物で増加した生存率（図２Ｃ）が、組換えＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が骨転移を抑制するという治療的役割を支持している。動物の初代骨髄に対するＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の効果を確認するために、骨腔からの細胞を分離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで異なる用量のＨｉｓ−ＭＤＡ−７で処理した。Ｈｉｓ−ＭＤＡ−７で処理した初代骨髄細胞では明らかな毒性は観察されなかった（図８）。
【０１１２】
ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４によるＲＡＮＫＬ誘発破骨細胞分化の阻害：治療剤で処理または未処理の腫瘍を有する動物における破骨細胞活性を決定するために、骨髄細胞を大腿骨から単離し、破骨細胞分化を実験的に誘導した。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４処理動物は、対照群と比較して破骨細胞が有意に少なかった。これは、破骨細胞の数を数えることにより（図２Ｄ）、またＴＲＡＣＰ破骨細胞酵素活性を測定することにより（図２Ｅ）定量化した。これらの最初の結果は、破骨細胞分化の調節におけるＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の潜在的な機能を示した。
【０１１３】
破骨細胞分化に対するＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の効果を調査するために、無胸腺ヌードマウスからの骨髄細胞を単離し、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の存在下または非存在下でＲＡＮＫＬで分化誘導した。ＲＡＮＫＬによる誘導の５日後、多核細胞を数えることにより破骨細胞分化を測定した。ＴＲＡＰについて陽性に染色された細胞および多核細胞は、光学顕微鏡下で定量した（図９Ａ）。破骨細胞の数およびその活性は、対照と比較して、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４処置群で有意に減少した（図９Ｂ〜Ｃ）。この阻害効果への分子的考察を提供するために、ＲＡＮＫＬとインキュベートしたときに破骨細胞に分化するように誘導できるマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ  ２６４．７を使用した（３２）。ＲＡＷ  ２６４．７細胞を使用して、破骨細胞の分化に関連するさまざまな遺伝子マーカーをモニタリングした（３３）。ＲＡＷ  ２６４．７細胞は、ＲＡＮＫＬまたはＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の単独および組み合わせで処理した。ＲＮＡは５日間の処理後に単離し、リアルタイムＰＣＲによりＴＲＡＰ、カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）、およびカルシトニン受容体（ＣＴＲ）遺伝子の発現を定量化した。ＲＡＮＫＬは、ＴＲＡＰ、ＣＴＳＫおよびＣＴＲ遺伝子発現の発現を誘導した。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の添加は、これらの遺伝子のＲＡＮＫＬ誘導性調節を弱めた（図１０Ａ）。これらのデータは、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４がＲＡＮＫＬによって誘発される破骨細胞分化の阻害を媒介できるという仮説を確認するものである。ＭＴＴアッセイを行って、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４がこの細胞株で増殖抑制を引き起こしたかどうかを確認した。ＲＡＷ  ２６４．７の増殖はＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の影響を受けなかったため、このサイトカインの腫瘍特異性がさらに示された（図１０Ｂ）。ＤＵ−１４５（ＰＣ）細胞を陽性対照として使用した（図１０Ｃ）。
【０１１４】
ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４によるマウスマクロファージ細胞におけるＡＫＴシグナル伝達の調節：ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が我々のモデル系におけるＡｋｔ活性化に何らかの効果を及ぼすかどうかを決定するために、ＲＡＷ２６４．７細胞をＲＡＮＫＬの存在下または非存在下で、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質で処理した。ＲＡＮＫＬがＲＡＷ  ２６４．７細胞においてＡｋｔ活性化を誘導することが観察され、この活性化されたＡｋｔはＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質によって抑制された（図３Ａおよび１１Ａ）。このデータは、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４を介した破骨細胞分化のダウンレギュレーションにおけるＡｋｔ阻害の役割を示唆する。また、ＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤（ＬＹ２９４００２）によるＡｋｔ阻害の効果について、ＮＦＡＴ、Ｍｃｌ−１、およびＡｋｔが関与するシグナル伝達カスケードにおいて試験した（図３Ｂおよび１１Ｂ）。このデータは、ＲＡＮＫＬおよびＭＤＡ−７／ＩＬ−２４によって媒介されるＡｋｔ経路関連遺伝子の細胞シグナル伝達を示す。
【０１１５】
構成的に活性型のＡｋｔ（ＭＹＲ−Ａｋｔ）もまた試験した。細胞にＭＹＲ−Ａｋｔをトランスフェクトし、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４で処理しました。図３Ｃおよび１１Ｃに示すように、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４での処置はＭｃｌ−１発現を大きく阻害し、これは構成的に活性なＡｋｔ（ＭＹＲ−Ａｋｔ）の過剰発現によって救出された。これらの結果は、破骨細胞の分化におけるＭＤＡ−７／ＩＬ−２４を介した抑制におけるＡｋｔの役割を示す。
【０１１６】
Ｍｃｌ−１阻害剤、ＢＩ−９７Ｄ６のＰＣ骨転移抑制におけるＭＤＡ−７／ＩＬ−２４との相乗作用：小分子Ｍｃｌ−１阻害剤であるＭｃｌ−ＢＩ−９７Ｄ６と組み合わせたＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の効果を骨転移のモデルとして、心臓内経路でＰＣ３−ＭＬ細胞を注射された雄の無胸腺ヌードマウスで試験した。動物を、尾静脈注射によりＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を３週間投与し、５ｍｇ／ｋｇで合計６回投与した。ＢＩ−９７Ｄ６は、腹腔内経路を介して１．５ｍｇ／ｋｇ（体重）で、合計６回の投与で投与した（図４Ａ）。有意なレベルの骨転移が対照群で明らかであったが、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質治療は、有意に少ない転移性病変をもたらした（図４Ａ）。ＢＩ−９７Ｄ６のみでの治療も骨転移の発達にいくらかの抑制効果を示した。しかしながら、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４と組み合わせると、骨転移発生の劇的な阻害が見られ、骨転移におけるＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質とＭｃｌ−１阻害剤の組み合わせの治療的役割を示している（図４Ａ）。ルシフェラーゼ強度を図４Ｂに示す。この組み合わせにより、破骨細胞の分化も減少した。用量反応アッセイは、初代骨髄細胞がＭＣＳＦおよびＲＡＮＫＬで誘導され、Ｍｃｌ−１阻害剤で処理された場合、破骨細胞数のダウンレギュレーションを示した（図１２Ａ）。破骨細胞分化の阻害における相乗効果は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４とＢＩ−９７Ｄ６の組み合わせによる治療後にも明らかであった（図１２Ｂ）。
【０１１７】
破骨細胞分化の抑制はまた、インビボ転移モデルを使用して評価した（図４Ｃ）。骨髄細胞をマウスの屠殺後に単離し、破骨細胞の分化を誘導した。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４またはＢＩ−９７Ｄ６で処理した動物群は、対照群と比較して破骨細胞が有意に少なかった。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４およびＢＩ−９７Ｄ６動物から単離した骨髄細胞は、ＲＡＮＫＬによる誘導後、破骨細胞の形成が統計的に少なかった。これは、破骨細胞を数えることにより（図４Ｃ）、またＴＲＡＣＰ破骨細胞酵素活性を測定することにより（図４Ｄ）明らかとなった。
【０１１８】
ＡｋｔのインビボにおけるＰＣ細胞の骨転移調節：ＰＣ骨転移におけるＡｋｔの役割を評価するために、ＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（３８）を使用してＡｋｔの活性を阻害し、破骨細胞分化に対する効果を決定した。ＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２は、破骨細胞分化の減少についてＭＤ３−７／ＩＬ−２４タンパク質と相乗作用を示した（図１３Ａ）。さらに、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質と組み合わせたＬＹ２９４００２での処理は、ＮＦＡＴおよびＭｃｌ−１を含む下流分子の発現の低下をもたらした（図３Ｂおよび１１Ｂ）。さらなるテストとして、ＲＡＷ  ２６４．７細胞にＣＡ−Ａｋｔ、ＤＮ−Ａｋｔ、およびＭｃｌ−１を安定的にトランスフェクトし、破骨細胞の分化を測定した。ＡｋｔおよびＭｃｌ−１を過剰発現するクローンは、対照と比較してより多くの破骨細胞を形成したが、ＤＮ−Ａｋｔを過剰発現したＲＡＷ  ２６４．７細胞はより少ない破骨細胞を形成した（図１３Ｂ）。これらの結果は、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質とＰＩ３Ｋ阻害剤またはＡｋｔ阻害剤の組み合わせによる相乗効果を示す。
【０１１９】
インビボでのＡｋｔの役割を評価するために、ホタルルシフェラーゼを備えた構成的に活性なＡｋｔ（ＰＣ３−ＭＬＡｋｔ）（図５Ａ）を過剰発現する転移性ＰＣ３−ＭＬ細胞およびＰＣ３−ＭＬ細胞を、心臓内を介して雄性無胸腺ヌードマウスに注入した。クローン１をｉｎ  ｖｉｖｏ試験に使用し、ウエスタンブロッティングによりＡｋｔ下流経路遺伝子発現の発現を検証した（図１４）。腫瘍細胞の増殖、浸潤、遊走は、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングによって観察した。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質による治療は３週間続け、尾静脈から５  ｍｇ／ｋｇで合計６回投与した。有意な骨転移は対照群で明らかであったが、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４処置動物では転移が有意に減少した。Ａｋｔを過剰発現するＰＣ３−ＭＬ細胞は、対照のＰＣ３−ＭＬ細胞よりも転移性が高かった。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４による治療は、ＰＣ３−ＭＬＡｋｔグループによる転移を抑制した；しかしながら、この効果は、Ｈｉｓ−ＭＤＡ−７処理した親ＰＣ３−ＭＬ細胞と比較して減少していた。これらの観察結果は、ＰＣを介した骨転移の発生におけるＡｋｔの重要性を示しており、これはＭＤＡ−７／ＩＬ−２４処理によって部分的に無効にできることを示す（図５Ｂ）。これらのデータは、異なる実験動物群におけるルシフェラーゼ強度の定量化によってさらに実証された（図５Ｃ）。これらの動物の破骨細胞分化を調査するために、試験完了後に骨髄細胞を単離した。上記のように破骨細胞分化を誘導した。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４処理動物から単離した骨髄は、対照群と比較して破骨細胞活性が低かった。上昇したＡｋｔ安定発現細胞を注入された動物の骨髄は、より多くの破骨細胞活性を示し、続くＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質による処理後に減少した。破骨細胞分化アッセイは、ＰＣ媒介性骨転移におけるＡｋｔの重要性をさらに示した（図５Ｄおよび５Ｅ）。骨微小環境の調節を介したＰＣ媒介性骨転移におけるＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の提案する役割の略図を図６に示す。ＰＣ誘発骨転移の抑制に寄与する可能性があるＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の追加の効果には、ＰＣ細胞の直接的な殺傷（アポトーシスまたは有毒なオートファジーによる）、血管新生の抑制、および免疫介在性の抗ＰＣ活性が含まれる（２９、３０）。
【０１２０】
これらの結果は、精製されたＭＤＡ−７／ＩＬ−２４組換えタンパク質がＰＣ細胞の骨への転移を阻害することを示している。組換えＭＤＡ−７／ＩＬ−２４による治療は、実験的なｉｎ  ｖｉｖｏモデルで骨転移の発生を有意に減少させ、Ｍｃｌ−１阻害剤と組み合わせると、その効果はより強いものとなった。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究では、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４が、部分的にリン酸化ＡｋｔとＭｃｌ−１の阻害を介して、ＲＡＮＫＬにより誘発された破骨細胞の分化を低下させることを示唆する。したがって、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質とＭｃｌ−１を標的とした小分子阻害剤は、ＰＣ骨転移に対する有効な治療法としての可能性を秘める。さらに、上記の結果は、組換えＭＤＡ−７／ＩＬ−２４が毒性を促進することなくマウスで全身に繰り返し与えることができ、ＰＣ骨転移の発生を阻害できることを示す。
【０１２１】
ＰＣ３−ＭＬ細胞の心臓内送達を受ける動物の治療もまた肺転移の発生を抑制したため（図１５）、転移に対するＨｉｓタグ付きＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の効果もより包括的であることが観察された。また、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質の骨への影響を考慮すると、他の種類のがんから骨への転移（肺がん、乳がんなど）も同様に予防／治療されると期待できる。
【０１２２】
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実施例
【０１２３】
実施形態１．がんを有する対象における骨への転移を予防する方法であって、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
【０１２４】
実施形態２．がんを有する対象における骨転移を治療する方法であって、ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質を含む有効量の組成物を対象に投与することを含む方法。
【０１２５】
実施形態３．前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が精製タンパク質である、実施形態１または２に記載の方法。
【０１２６】
実施形態４．前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が成熟タンパク質である、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【０１２７】
実施形態５．前記投与が、前記対象の骨に投与することを含む、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
【０１２８】
実施形態６．前記がんが前立腺がんである、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法。
【０１２９】
実施形態７．前記前立腺がんが、正常な前立腺細胞と比較して、Ｍｃｌ−１、ＲＡＮＫＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＡｋｔの１つまたは複数の発現が増加しているがん細胞を含む、実施形態６に記載の方法。
【０１３０】
実施形態８．  前記組成物がＭｃｌ−１阻害剤をさらに含む、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。
【０１３１】
実施形態９．前記Ｍｃｌ−１阻害剤がＢＩ−９７Ｄ６である、実施形態８記載の方法。
【０１３２】
実施形態１０．前記組成物が、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤をさらに含む、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
【０１３３】
実施形態１１．前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２である、実施形態１０に記載の方法。
【０１３４】
実施形態１２．前記有効量が、初代骨髄細胞または正常な初代ヒト前立腺上皮細胞に対して実質的に非毒性な量である、実施形態１〜１１のいずれかに記載の方法。
【０１３５】
実施形態１３．前記有効量が破骨細胞分化を阻害する量である、実施形態１〜１２のいずれかに記載の方法。
【０１３６】
実施形態１４．前記ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１３のいずれかに記載の方法。
【０１３７】
実施形態１５．前記ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質が、配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１４に記載の方法。
【０１３８】
実施形態１６．前記ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質が、前記対象におけるがん細胞のＩＬ−２０  ／  ＩＬ−２２受容体複合体を活性化することができる、実施形態１４または１５に記載の方法。
【０１３９】
実施形態１７．前記ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態１４に記載の方法。
【０１４０】
実施形態１８．ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質、ならびに、Ｍｃｌ−１阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の一方または両方を含む、組成物。
【０１４１】
実施形態１９．前記ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質が精製されたタンパク質である、実施形態１８に記載の組成物。
【０１４２】
実施形態２０．前記ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質が成熟タンパク質である、実施形態１８または１９に記載の組成物。
【０１４３】
実施形態２１．前記組成物がＭｃｌ−１阻害剤を含む、実施形態１８〜２０のいずれかに記載の組成物。
【０１４４】
実施形態２２．前記Ｍｃｌ−１阻害剤がＢＩ−９７Ｄ６である、実施形態２１記載の組成物。
【０１４５】
実施形態２３．前記組成物がＰＩ３Ｋ阻害剤を含む、実施形態１８〜２２のいずれかに記載の組成物。
【０１４６】
実施形態２４．前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２である、実施形態２３記載の組成物。
【０１４７】
実施形態２５．前記ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質が、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１８〜２４のいずれかに記載の組成物。
【０１４８】
実施形態２６．前記ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質が、配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２５に記載の組成物。
【０１４９】
実施形態２７．前記ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質ががん細胞のＩＬ−２０  ／  ＩＬ−２２受容体複合体を活性化することができる、実施形態２５または２６に記載の組成物。
【０１５０】
実施形態２８．前記ＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態２５記載の組成物。
【０１５１】
実施形態２９．薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態１８〜２８のいずれかに記載の組成物。
【０１５２】
実施形態３０．がんを有する対象における骨転移の予防または治療に使用するための、実施形態１８〜２９のいずれかに記載の組成物。
【０１５３】
実施形態３１．前記がんが前立腺がんである、実施形態２６記載の組成物。
【０１５４】
実施形態３２．前記前立腺がんが、正常な前立腺細胞と比較して、Ｍｃｌ−１、ＲＡＮＫＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、およびＡｋｔの１つまたは複数の発現が増加しているがん細胞を含む、実施形態３１記載の組成物。
【０１５５】
実施形態３３．がんを有する対象における骨転移の予防または治療のための薬剤の製造における、実施形態１８〜２９のいずれかに記載の組成物の使用。
【０１５６】
実施形態３４．実施形態１〜１７のいずれかに記載の方法による骨転移の予防または治療のための薬剤の製造における、実施形態１８〜２９のいずれかに記載の組成物の使用。
【０１５７】
実施形態３５．実施形態１８〜２９のいずれかに記載の組成物のＭＤＡ−７  ／  ＩＬ−２４タンパク質、ならびに、Ｍｃｌ−１阻害剤およびＰＩ３Ｋ阻害剤の一方または両方を含む、キット。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２ＢＣ】
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【図２ＤＥ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４ＡＢＣ】
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【図４Ｄ】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９ＢＣ】
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【図１０Ａ】
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【図１０ＢＣ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２ＡＢ】
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【図１３ＡＢ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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