(57)【要約】  ＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するためのペプチド。
2021500415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含み、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するためのペプチド。
【請求項２】
前記がんは、前立腺がん、乳がん、結腸がん、卵巣がん、甲状腺がん、肝臓がん、又は血液悪性腫瘍からなる一覧から選択される、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
がん細胞におけるＷＮＴ５Ａの発現が周囲の非がん細胞における発現の３５％以下である、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
１位のＸはＭ又はノルロイシンで、４位のＸはＣ又はＡである、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、
ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）、
ＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号４）、
ＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号５）、
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号６）、
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号７）、
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号８）、
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号９）、
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１０）、
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１１）、
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１２）、
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１３）、
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１４）、
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１５）、
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１６）、及び
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１７）、
又はそのホルミル化誘導体からなる群より選択される、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドはＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）又はそのホルミル化誘導体である、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
予防、低減又は排除が以下の工程：
ａ）がんの診断直後及び／又は手術中及び／又は手術による腫瘍の除去後に、有効量の前記ペプチドを投与することを含み、任意に、工程ａ）は２週間以上にわたって週に少なくとも３回繰り返される、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
予防、低減、又は排除が以下の工程：
ａ）有効量の腫瘍抑制化学療法薬を投与し；
ｂ）前記少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬による処置の前に、同時に、及び／又は後に、有効量の前記ペプチドを投与することを含み、任意に、工程ｂ）は２週間以上にわたって週に少なくとも３回繰り返される、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者における低減若しくは排除に使用するための、少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬と併用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含み、少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬と組み合わせたペプチド。
【請求項１０】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含むペプチドと、少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬の組合せであって、前記ペプチド及び前記腫瘍抑制化学療法薬は、混合されているか若しくは別々であるかのいずれかであり、及び／又は同時に若しくは逐次的に投与される、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための組合せ。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬は、5-フルオロウラシル（5-ＦＵ）、ロイコボリン及びオキサリプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＯＸ）、アントラサイクリン又はタキサンである、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１２】
前記アントラサイクリンはエピルビシン若しくはドキソルビシンである、又は前記タキサンはドセタキセル若しくはパクリタキセルである、請求項１０又は１１に記載の組合せ。
【請求項１３】
前記腫瘍抑制化学療法薬は5-フルオロウラシル（5-ＦＵ）、ロイコボリン及びオキサリプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＯＸ）である、結腸がんと診断された患者の治療用の、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１４】
前記腫瘍抑制化学療法薬はアントラサイクリン又はタキサンである、乳がんと診断された患者の治療用の、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１５】
前記アントラサイクリンはエピルビシン若しくはドキソルビシンである、又は前記タキサンはドセタキセル若しくはパクリタキセルである、請求項１０又は１４に記載の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するためのＷＮＴ５Ａ由来ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
原発腫瘍が、がん患者の死因となることは稀である。多くの場合、死亡率は、原発腫瘍の外科的除去に続く、再発のない様々な生存期間後のがん再燃の結果である。乳がん、結腸がん又は前立腺がん患者の現在の治療には、手術、化学療法薬、内分泌治療及びいくつかの新しい生物学的な処置がある。後者の治療法は、主として増殖性のがん細胞を標的とし、したがって、がんの増殖を標的とする。これらの治療は、原発腫瘍自体及び手術後に残存する腫瘍細胞の大部分に対して効果的であるかもしれないが、患者の大半は、その後、再発する。
【０００３】
このようながん再燃の本質的な理由は、「幹様」特性を有する腫瘍細胞のサブセットの存在である。非悪性幹細胞とは異なるこれらの腫瘍開始細胞は、低い増殖速度、高い自己複製能、複能性又は多能性、活発に増殖する腫瘍細胞に分化する能力を示し、化学療法又は放射線に対する耐性によって更に特徴付けられる。これらの幹様細胞は、がん幹細胞（ＣＳＣ）とも呼ばれる。ＣＳＣの排除は、がん疾患を根絶し、したがって、この疾患の再燃を根絶する可能性があると考えられている。それゆえ、がん研究における基本的な問題は、再発性疾患の原因となっているＣＳＣの同定、特に標的化である。腫瘍マーカーは、１つ以上の型のがんの存在によって上昇する可能性がある、血液、尿、又は身体の組織において見出されるバイオマーカーである。多くの異なる腫瘍マーカーが存在し、それぞれがある特定のがんを示し、それらはがんの存在を診断するため、及びその特異的な型のがんを特定するために使用される。したがって、高レベルの腫瘍マーカーは、がんを示す可能性がある。
【０００４】
ＣＳＣを死滅させる問題を克服するために、自己複製及びＣＳＣへの分化に関与する胚性シグナル伝達経路に影響を及ぼす治療剤、すなわち、小分子、ｓｉＲＮＡ、又は抗体の送達など、多くの様々な試みがなされてきた。しかしながら、ＣＳＣを排除する現在の試みには多くの欠点がある。第一に、マーカーは、ある型のがんと他の型のものとで異なり、全てのがんに使用され得る普遍的マーカーはない。第二に、生物学的に異質なＣＳＣは、急性骨髄性白血病といくつかの固形腫瘍の両者で知られる、決まった腫瘍に存在する可能性がある。最後に、ＣＳＣは正常幹細胞と同じ発現プロファイルを示すので、薬物の標的をＣＳＣにした場合に正常な幹細胞に影響を及ぼすリスクがある。
【０００５】
このため、本発明の目的は、ＣＳＣの残存によるがん疾患の再燃を予防するか又は著しく遅延させる、非毒性かつ安全な治療剤を提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第一の側面において、がんの再燃を予防又は遅延させるという目的は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含むペプチドにより達成され、このペプチドは、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防用、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞（ＣＳＣ）の低減若しくは排除用である。本発明において、再発又は再燃は同じ意味である。再発性疾患はＣＳＣによって引き起こされる可能性があると現在考えられているが、ＣＳＣの排除はがんを根絶し、したがって、がんの再燃を根絶する可能性があると考えられているので、がん幹細胞の低減又は根絶によるがんの再発の遅延又は予防がもくろまれている。
【０００７】
ある態様では、本発明に係るペプチドは、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防用、又はがんと診断された患者におけるＣＳＣの低減若しくは排除用であり、このがんは、前立腺がん、乳がん、結腸がん、卵巣がん、甲状腺がん、肝臓がん、又は血液悪性腫瘍からなる一覧から選択される。
【０００８】
さらなる態様では、患者のがん細胞におけるタンパク質ＷＮＴ５Ａの発現は、周囲の非がん細胞における発現の３５％以下である。がん細胞と非がん細胞の両者におけるＷＮＴ５の発現レベルは、ＷＮＴ５に対する特異的一次抗体と、その検出及び定量のための二次抗体と組み合わせて使用する免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される。
【０００９】
乳がん、結腸がん、及び前立腺がんの腫瘍におけるＷＮＴ５Ａの低い発現は、疾患再発の数の増加及び患者の生存期間の短縮と相関している。しかし、ＷＮＴ５Ａシグナル伝達のこの効果は、がん細胞の増殖に対する効果によると考えられるはずはなく、β-カテニンシグナル伝達が上昇した腫瘍ではしばしば存在しないか又は限定される、（Dejmek et al., The Expression and Signaling Activity of Wnt-5a/DDR1 and Syk Play Distinct but Decisive Roles in Breast Cancer Patient Survival. Clinical Cancer Research. 11:520-528, 2005, Saefholm et al., The Wnt-5a-derived hexapeptide Foxy-5 inhibits breast cancer metastasis in vivo by targeting cell motility. Clinical Cancer Research 14(20):6556-6563, 2008, Mehdawi et al., Non-canonical WNT5A signaling up-regulates the expression of the tumour suppressor 15-PGDH and induces differentiation of colon cancer cells, Molecular Oncology 10:1415-1429, 2016, Canesi et al., Treatment with the Wnt5a-mimicking peptide Foxy5 effectively reduces the metastatic spread of Wnt5a-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS ONE doi.org/10.1371/journal.pone.084418, 2017）。
【００１０】
ＷＮＴ５Ａタンパク質及びＦｏｘｙ-５と呼ばれる既知のＷＮＴ５Ａヘキサペプチドは、結腸がん細胞で、ＰＧＥ２生成酵素ＣＯＸ-２の発現を減少させ、ＰＧＥ２及びリポキシン分解酵素15-ＰＧＤＨを上方制御することが、インビトロの実験において示された（Mehdawi et al., 2016）。この研究において、この著者らはまた、組換えＷＮＴ５Ａ及びＦｏｘｙ-５ペプチドの両者がβ-カテニンシグナル伝達の低減を誘導することを示した。驚くべきことに、本発明者らは、そのようなインビトロの条件では、ＣＳＣの数の低減を見いだすことができなかった。
【００１１】
当業者は、がん又は腫瘍を診断する方法、腫瘍成長を測定する方法、腫瘍組織を正常組織と識別又は区別する方法、及びＷＮＴ５Ａを定量する方法を知っている。がんは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）イメージングによって診断することができる。ＷＮＴ５Ａタンパク質の低発現は、周囲の非がん細胞におけるＷＮＴ５Ａ発現の３５％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、２％若しくは１％、又はＷＮＴ５Ａの非発現であってもよい。
【００１２】
薬物は大規模に生産されなければならないので、全長のＷＮＴ５Ａタンパク質は薬物候補としていくつかの欠点を有する。ＷＮＴ５Ａタンパク質は、大きなタンパク質であるため、正確な一次アミノ酸配列を作り出すためだけに複雑で時間のかかる合成及び翻訳後修飾を必要とし、加えて、ＷＮＴ５Ａは、体内でその分布を制限する可能性のあるヘパラン硫酸結合ドメインを有する。したがって、ＷＮＴ５Ａの効果を模したより小さいペプチドがより好ましい。アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬを含むＷＮＴ５Ａペプチドも、ＷＮＴ５Ａ模倣効果を有する。配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２）を含む様々な長さのペプチドは、合成によって、例えば液相又は固相ペプチド合成によって製造することができる。様々な長さのペプチドは、２０個以下のアミノ酸、より好ましくは１０個以下のアミノ酸を有する。最も好ましくは、このペプチドは、６個のアミノ酸からなるヘキサペプチドである。ある態様では、アミノ酸配列はＸＤＧＸＥＬであり、１位のＸはＭ又はノルロイシンで、４位のＸはＣ又はＡである。有利には、本発明に係るＷＮＴ５Ａペプチドは、
ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）、
ＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号４）、
ＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号５）、
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号６）、
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号７）、
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号８）、
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号９）、
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１０）、
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１１）、
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１２）、
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１３）、
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１４）、
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１５）、
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１６）、及び
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１７）、
又はそのホルミル化誘導体からなる群より選択される。
【００１３】
好ましい態様では、ＷＮＴ５ＡペプチドはＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）である。より好ましい態様では、１位のメチオニンは、ホルミル化メチオニン（N-ホルミルメチオニン）として誘導体化される。このホルミル化ヘキサペプチドをＦｏｘｙ-５と表す。１つのアミノ酸の修飾／誘導体化（ホルミル化）は、ペプチドの効果を改善し、より効果的かつインビボにおいて分解しにくくする。
【００１４】
別の態様では、ＣＳＣの増殖又はニッチが、活性β-カテニン、増加したＣＯＸ-２発現、及び減少した15-ＰＧＤＨ発現によって促進する。活性β-カテニンシグナル伝達並びに増加したＣＯＸ-２発現及び減少した15-ＰＧＤＨ発現は、活性β-カテニン、ＣＯＸ-２又は15-ＰＧＤＨに対する特異的一次抗体と、それらの検出及び定量のための対応する二次抗体を組み合わせて使用するＩＨＣによって最も簡単に測定される。
【００１５】
さらなる態様では、標的がん細胞は、正常周囲組織と比較して３５％、４０％、５０％、６５％、７０％、９０％以上若しくは１００％以上増加したβ-カテニンシグナル伝達若しくはＣＯＸ-２発現を有し、及び／又は正常周囲組織と比較して３５％、４０％、５０％、６５％、７０％、９０％以上若しくは１００％まで低減した15-ＰＧＤＨ低減発現を有する。正常周囲組織は、がん細胞と同じタイプの正常細胞であってそれを直接囲む組織と理解される。
【００１６】
更に別の態様では、本発明に係るペプチドは、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防用、又はがんと診断された患者におけるＣＳＣの低減若しくは排除用であり、その予防、低減又は排除は、以下の工程：がんの診断直後及び／又は手術中及び／又は手術による腫瘍の除去後に、有効量のペプチドを投与する工程を含み、任意に、上記工程は、２週間以上にわたって週に少なくとも３回繰り返されることが企図される。上記ペプチドによるがん幹細胞の治療期間は、４、６、８、１２週間、又は最長で１、２若しくは３か月、又はそれ以上であってもよい。Ｆｏｘｙ-５は化学療法の細胞毒性を損なわないので、上記ペプチドは腫瘍抑制化学療法薬による治療期間中に投与することもできる。一般に、腫瘍抑制化学療法薬は非常に毒性で、腫瘍細胞の他に正常な細胞も滅ぼす。腫瘍抑制化学療法薬の有害作用は良い作用より勝るので、その毒性に起因して、全てのがん細胞若しくはＣＳＣを破壊若しくは排除するのに十分に長く、又は十分に多い投与量で投与されないことがある。
【００１７】
腫瘍抑制薬による治療後に上記ペプチドを投与する利点は、ペプチドが正常な細胞に対して非毒性である一方で、腫瘍抑制化学療法に耐性を有し、当該治療後に残っているＣＳＣを排除又は低減することである。
【００１８】
本発明に係るペプチド及び腫瘍抑制化学療法薬の投与は同時であってもよいか、又は、ペプチドは、原発腫瘍の外科的除去の前、間及び後、化学療法が開始されるまで、若しくは腫瘍抑制化学療法治療の終了後に、投与されてもよい。
【００１９】
したがって、そのような併用治療は、副作用を増加させることなく、改善されたがん治療をもたらすことができる。
【００２０】
組み合わせて投与することは、治療が行われる期間が短縮される可能性があるので、患者のコンプライアンスに有益であるかもしれない。
【００２１】
ペプチドを連続的、すなわち、腫瘍抑制化学療法薬の前又は後に投与することは、ペプチドが高価であるため、コストの観点からより効率的であるかもしれない。
【００２２】
ある態様では、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含み、がんと診断された患者におけるＣＳＣの低減又は排除用のペプチドを提供する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、以下の番号付けされた対象を提供する。
１．配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含み、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するためのペプチド。
２．上記がんは、前立腺がん、乳がん、結腸がん、卵巣がん、甲状腺がん、肝臓がん、又は血液悪性腫瘍からなる一覧から選択される、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、対象１に記載のペプチド。
３．がん細胞におけるＷＮＴ５Ａの発現が、周囲の非がん細胞における発現の３５％以下である、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、対象１又は２に記載のペプチド。
４．１位のＸはＭ又はノルロイシンで、４位のＸはＣ又はＡである、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、対象１〜３のいずれか１つに記載のペプチド。
５．上記ペプチドは、
ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）、
ＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号４）、
ＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号５）、
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号６）、
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号７）、
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号８）、
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号９）、
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１０）、
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１１）、
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１２）、
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１３）、
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１４）、
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１５）、
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１６）、及び
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１７）、
又はそのホルミル化誘導体からなる群より選択される、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、対象１〜４のいずれか１つに記載のペプチド。
６．上記ペプチドはＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）又はそのホルミル化誘導体である、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、対象１〜７のいずれか１つに記載のペプチド。
９．上記がん細胞はβ-カテニンの上昇を示す、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、対象１〜８のいずれか１つに記載のペプチド。
１０．上記β-カテニンシグナル伝達が、周囲の非がん細胞におけるβ-カテニンシグナル伝達の３５％以上上昇する、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、対象１〜９のいずれか１つに記載のペプチド。
１１．配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含むペプチドと、腫瘍抑制薬との組合せであって、上記ペプチド及び上記腫瘍抑制薬は、混合されているか若しくは別々であるかのいずれかであり、及び／又は同時に若しくは逐次的に投与される、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための組合せ。
１２．上記腫瘍抑制薬は、5-フルオロウラシル（5-ＦＵ）、ロイコボリン及びオキサリプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＯＸ）、アントラサイクリン、例えば、エピルビシン若しくはドキソルビシン、又は、タキサン、例えば、ドセタキセル若しくはパクリタキセルの組合せである、対象１１に記載の組合せ。
１３．上記腫瘍抑制薬は、5-ＦＵ、ロイコボリン及びオキサリプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＯＸ）である、結腸がんと診断された患者の治療用の、対象１１に記載の組合せ。
１４．上記腫瘍抑制薬物治療は、アントラサイクリン、例えば、エピルビシン若しくはドキソルビシン、又はタキサン、例えば、ドセタキセル若しくはパクリタキセルの組合せである、乳がんと診断された患者における治療用の、対象１１に記載の組合せ。
【００２４】
以下に説明する図は、詳細な説明を支持するものである。図を参照して本発明を説明する：
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、実施例１〜３に記載の動物実験の概略図である。
【図２】図２は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって可視化された、結腸がん組織におけるＡＬＤＨタンパク質発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を示す。食塩水又はＦｏｘｙ-５で処置した動物の代表的な写真を示す。各スライドで、４つのボックスを染色組織の上に置き、それぞれについて、ＡＬＤＨ染色を、染色強度を乗じた染色細胞のパーセンテージとしてスコア化した。染色細胞のパーセンテージは、以下のスコアを使用した；陽性染色細胞＜５％  ０、陽性細胞５〜２５％  １、陽性細胞２６〜５０％  ２、陽性細胞５１〜７５％  ３、陽性細胞＞７５％  ４。  染色強度は、染色された領域を、弱い染色  １、中程度の染色  ２、及び強い染色  ３とスコア付けした。各ボックスで、陽性染色細胞のパーセンテージのスコアを染色強度のスコアと掛け算することにより、最終スコアを得た。最後に、各腫瘍で４つのボックスから平均値を得た。以下、本明細書で提示される全てのＩＨＣ分析に同じスコアリングプロトコルを使用した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２と同様の反復及び拡張分析に基づき、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって可視化された、結腸がん異種移植組織におけるＡＬＤＨタンパク質発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を示す。ビヒクル（食塩水）処置及びＦｏｘｙ-５処置動物の代表的な画像を示す。各スライドで、６つのボックスを染色組織の上にランダムに置き、それぞれについて、ＡＬＤＨ染色を、染色強度を乗じた染色細胞のパーセンテージとしてスコア化した。染色細胞のパーセンテージは、以下のスコアを使用した；陽性染色細胞＜５％  ０、陽性細胞５〜２５％  １、陽性細胞２６〜５０％  ２、陽性細胞５１〜７５％  ３、陽性細胞＞７５％  ４。  染色強度は、染色された領域を、弱い染色  １、中程度の染色  ２、及び強い染色  ３とスコア付けした。各ボックスで、陽性染色細胞のパーセンテージのスコアを染色強度のスコアと掛け算することにより、最終スコアを得た。最後に、各腫瘍試料で６つのボックスから平均値を得た。以下、本明細書で提示される全てのＩＨＣ分析に同じスコアリングプロトコルを使用した。
【図３】図３は、ＩＨＣによって可視化された、結腸がん組織におけるＤｃｋ１（ＤＣＡＭＫＬ１ともいう）タンパク質発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を示す。食塩水又はＦｏｘｙ-５で処置した動物の代表的な写真を示す。各スライドで、４つのボックスを染色組織の上に置き、それぞれについて、Ｄｃｋ１（ＤＣＡＭＫＬ１）染色を、図２について詳細に記載したように、染色強度を乗じた染色細胞のパーセンテージとしてスコア化した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３と同様の反復及び拡張分析に基づき、ＩＨＣによって可視化された、結腸がん異種移植組織におけるＤｃｋ１（ＤＣＡＭＫＬ１ともいう）タンパク質発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を示す。ビヒクル処置及びＦｏｘｙ-５処置動物の代表的な画像を示す。各スライドで、６つのボックスを染色組織の上に置き、それぞれについて、図２について詳細に記載したように、Ｄｃｋ１染色を染色強度についてスコア化した。
【図４】図４は、結腸がん異種移植組織におけるＡＬＤＨ及びＤｃｋ１（ＤＣＡＭＫＬ１）ｍＲＮＡ発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を、ビヒクル処置対照マウス由来の腫瘍と比較して示す。
【図５】図５は、ＩＨＣによって可視化された、結腸がん組織におけるＣｏｘ-２及び15-ＰＧＤＨタンパク質発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を示す。ＩＨＣ染色は、図１のＩＨＣ染色について詳細に記載したとおりに厳密にスコア化した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５と同様の反復及び拡張分析に基づき、ＩＨＣによって可視化された、結腸がん異種移植組織におけるＣｏｘ-２タンパク質発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を示す。ビヒクル処置及びＦｏｘｙ-５処置動物の代表的な画像を示す。各スライドで、６つのボックスを染色組織の上に置き、それぞれについて、Ｃｏｘ-２染色を、図２について詳細に記載したように、染色強度を乗じた染色細胞のパーセンテージとしてスコア化した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、図５と同様の反復及び拡張分析に基づき、ＩＨＣによって可視化された、結腸がん異種移植組織における15-ＰＧＤＨタンパク質発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を示す。ビヒクル処置及びＦｏｘｙ-５処置動物の代表的な画像を示す。各スライドで、６つのボックスを染色組織の上に置き、それぞれについて、15-ＰＧＤＨ染色を、図２について詳細に記載したように、染色強度を乗じた染色細胞のパーセンテージとしてスコア化した。
【図６】図６は、ＩＨＣによって可視化された、ＨＴ-２９結腸がん組織における活性β-カテニン核発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を示す。ＩＨＣ染色は、図１のＩＨＣ染色について詳細に記載したとおりに厳密にスコア化した。右下の区画に、食塩水処置した動物とＦｏｘｙ-５処置した動物の腫瘍のサイズを示す。  図６は、ＨＴ-２９結腸がん異種移植組織における腫瘍体積に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を更に示す。結腸がんがβ-カテニンシグナル伝達を高めるという学識により、図６に示される効果は、腫瘍体積の変化に対するその関係を決定することで正しいと確認することができる。図は、対照（ビヒクル処置）マウスからのものと比較した、ＨＴ２９由来腫瘍の腫瘍体積に対するＦｏｘｙ-５処置の効果を示す。
【図７】図７は、ＩＨＣによって可視化された、Ｃａｃｏ-２結腸がん組織における活性β-カテニン核発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を示す。ＩＨＣ染色は、図２のＩＨＣ染色について詳細に記載したとおりに厳密にスコア化した。右下の区画には、食塩水又はＦｏｘｙ-５で処置した動物の腫瘍サイズを示す。  図７は、Ｃａｃｏ-２結腸がん異種移植組織における腫瘍体積に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を更に示す。結腸がんがβ-カテニンシグナル伝達を高めるという学識により、図７に示される効果は、腫瘍体積の変化に対するその関係を決定することで正しいと確認することができる。図は、対照（ビヒクル処置）マウスからのものと比較した、Ｃａｃｏ-２由来腫瘍の腫瘍体積に対するＦｏｘｙ-５処置の効果を示す。
【図８】図８は、図６及び７と同様の反復及び拡張分析に基づき、ＩＨＣによって可視化された、ＨＴ-２９及びＣａｃｏ-２結腸がん異種移植組織における活性β-カテニン核発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を示す。ビヒクル処置及びＦｏｘｙ-５処置動物の代表的な画像を示す。各スライドで、６つのボックスを染色組織の上に置き、それぞれについて、活性β-カテニン核染色を、図２について詳細に記載したように、染色強度を乗じた染色細胞のパーセンテージとしてスコア化した。
【図９】図９は、ＩＨＣによって可視化された、ＨＴ-２９及びＣａｃｏ-２結腸がん異種移植組織におけるＡｓｃｌ２タンパク質発現に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果を示す。Ａｓｃｌ２タンパク質は、ＣＳＣニッチを促進することが示されているβ-カテニンシグナル伝達によって活性化される転写因子である。ビヒクル処置及びＦｏｘｙ-５処置動物の代表的な画像を示す。各スライドで、６つのボックスを染色組織の上に置き、それぞれについて、Ａｓｃｌ２染色を、図２について詳細に記載したように、染色強度を乗じた染色細胞のパーセンテージとしてスコア化した。
【図１０】図１０は、ＦＯＬＦＯＸ誘導細胞毒性に対してＦｏｘｙ-５の影響がないことを示す。結腸がんＨＴ２９細胞を、ＦＯＬＦＯＸ単独（緑色三角）、5-ＦＵ単独（オレンジ色三角）、オキサリプラチン単独（黒色四角）、Ｆｏｘｙ-５単独（赤色四角）又はＦＯＬＦＯＸ＋Ｆｏｘｙ-５（青色丸）のいずれかで処置した。これらの異なる処置の細胞毒性効果を、CellTiter-Blue（商標）蛍光細胞生存率アッセイによって評価した。ＨＴ２９における全てのこれらの異なる処置の用量反応曲線を図に示す。データを標準化し、平均±ＳＥＭとして示す。
【発明の詳細な説明】
【００２６】
Ｗｎｔ（Wingless-related integration site）タンパク質ファミリーは、体軸のパターン形成のような胚発生、細胞増殖及び遊走において役割を果たす、高度に保存されたタンパク質を含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路は古典的又は非古典的のいずれかであり、それらは主に、古典的シグナル伝達を介した遺伝子転写と亢進した増殖の増加、又は、細胞における異なる非古典的シグナル伝達経路の活性化を介したいくつかの非増殖性機能の調節を誘発する。Ｗｎｔタンパク質は、成体骨髄、皮膚及び腸での組織再生に更に関与する。Ｗｎｔシグナル伝達経路における遺伝子変異は、乳がん、前立腺がん、神経膠芽腫、ＩＩ型糖尿病及び他の疾患を引き起こす可能性がある。
【００２７】
古典的Ｗｎｔ経路はβ-カテニンを活性化し、正常な幹細胞の自己再生の調節に不可欠で、かつ、古典的Ｗｎｔシグナル伝達の破壊は腫瘍形成に関与している。対照的に、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達は、β-カテニンシグナル伝達の増加がないことを特徴とし、胚のパターン形成、原腸形成及び器官形成における役割が研究されてきた。更に、非古典的Ｗｎｔは、古典的シグナル伝達に拮抗することが提案されている。ＷＮＴ５Ａは、非古典的Ｗｎｔリガンドの一例である。ＷＮＴ５Ａは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、結腸がん、乳がん、前立腺がん、及び卵巣がんにおいて腫瘍抑制性である。ＷＮＴ５Ａホモ接合のモデルマウスにおけるＷＮＴ５Ａの過剰発現が、乳がんＣＳＣの数の低減と相関することが、Borcherding et al., Paracrine WNT5A signalling inhibits expansion of tumour-initiating cells, Cancer Research 75:1972-1982, 2015による研究で示され、ＷＮＴ５Ａのヘテロ接合喪失が、乳がん患者の生存の短縮と相関することが示唆された。興味深いことに、原発性悪性黒色腫におけるＷＮＴ５Ａの高発現が生存期間の短縮と相関するという事実によって例示されるように、ＷＮＴ５Ａは、悪性黒色腫、胃がん、及びいくつかの他の型のがんにおいて反対の効果を有する。
【００２８】
ＷＮＴ５Ａは、体内の多くの正常細胞で発現するタンパク質である。ＷＮＴ５Ａは細胞から分泌され、主にＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を含む受容体複合体に結合し、それを活性化することによって、同じ又は隣接する細胞に対してその作用を発揮する。ＷＮＴ５Ａタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５と呼ばれる受容体を活性化することが知られている。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５受容体の活性化で、細胞内の一連のシグナル伝達事象が活性化され、最初の事象の１つは、細胞内のカルシウムの一時的な増加、いわゆるカルシウムシグナルである。カルシウムシグナルは、次に、接着及び遊走のような細胞の機能の変化につながる一連のシグナル伝達事象を誘発する。したがって、このようなＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の活性化は、細胞内のシグナル伝達事象につながり、細胞の隣接細胞への付着をもたらし、周囲の結合組織への接着により腫瘍細胞がリンパ節及び血管のような近接した構造に移動する能力の低下をもたらす。例えば、正常な乳房上皮細胞では、ＷＮＴ５Ａが高度に発現し、細胞間及び周囲の基底膜への強固な付着を確保し、それにより細胞の遊走を制限する。
【００２９】
ＷＮＴ５Ａの内因性発現を欠くがん組織でＷＮＴ５Ａシグナル伝達を再現するために、ＷＮＴ５Ａ分子のアミノ酸配列に由来する、低分子、すなわち２０個以下のアミノ酸を有するペプチドが開発され、次いで更に修飾された。このようなペプチドの例としてＦｏｘｙ-５があり、これは、ＷＮＴ５Ａと同じシグナル伝達事象及び機能的応答を誘発するという点で、真のＷＮＴ５Ａアゴニストであり、ＷＮＴ５Ａと比較してはるかに単純な分子で、全身投与することができ、更に腫瘍組織に到達することができる。したがって、本明細書におけるシグナル伝達特性という用語は、ＷＮＴ５Ａ又はＦｏｘｙ-５ペプチドの、主にＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体タンパク質（Ｆｚ）への結合と、最終的に、ＣＳＣの低減又は排除につながる細胞内シグナル伝達カスケードのことを意味する。
【００３０】
本明細書における周囲の非がん細胞という用語は、腫瘍組織を包囲する又は取り囲む、腫瘍細胞と同じ型の形態学的に正常な細胞を意味する。
【実施例】
【００３１】
実施例１
２つの異なるヒト結腸がんの細胞であるＨＴ２９及びＣａｃｏ-２由来の腫瘍を、免疫組織化学（ＩＨＣ）及びｍＲＮＡによって試験した（図１参照）。
０日目：ＨＴ２９又はＣａｃｏ-２結腸がんの細胞をヌードマウスの皮下に注射。
７日目：このマウスで腫瘍が定着した後、ビヒクル（食塩水）単独（群１）又はＦｏｘｙ-５（２μｇ／ｇ；群２）の腹腔内（Ｉ．Ｐ）注射を行った。
９−２３日目：腫瘍成長及び動物体重の測定 ＋ ビヒクル単独（群１）又はＦｏｘｙ-５（２μｇ／ｇ；群２）のいずれかの２日ごとのＩ．Ｐ．注射（８回）。
２４日目：２つの型の腫瘍（Ｃａｃｏ-２及びＨＴ２９由来）（２つに分割し、一方は固定、他方は−８０℃で凍結）を、ＣＯＸ-２、15ＰＧＤＨ、β-カテニン、Ａｓｃｌ２、ＡＬＤＨ及びＤｃｋｌ１のタンパク質発現について、並びにＡＬＤＨ及びＤｃｋｌ１のｍＲＮＡ含量についてＩＨＣによって分析した（ＡＬＤＨは一般的な幹細胞マーカーで、Ｄｃｋ１は結腸ＣＳＣの特異的マーカーである）。
【００３２】
Ｆｏｘｙ-５は、Ｃａｃｏ-２とＨＴ２９に由来する結腸がんの両者で、２つの幹細胞バイオマーカーの発現を有意に低減することが示された（図２〜４参照）。
【００３３】
実施例２
図２〜４に示された知見を更に検証するために、本実験でＣＳＣの数の減少に関与している可能性のある機構を分析した。結腸がんにおいて、シクロオキシゲナーゼ-２（ＣＯＸ-２）はしばしば上方制御される。ＣＯＸ-２の活性は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の生成及び放出につながる。ＰＧＥ２はがんの進行を促進し、結腸ＣＳＣの拡大に有利であることが示されている（Wang et al., Prostaglandin E2 promotes colorectal cancer stem cell expansion and metastasis in mice. Gastroenterology 149:1884-1895, 2015）。古典的ＷＮＴシグナル伝達経路の乱れが、結腸直腸腫瘍の開始を説明すると確信されているが、結腸直腸腫瘍の大部分において生じるシクロオキシゲナーゼ-２（ＣＯＸ-２）の発現の増加は、結腸直腸がんの進行に重要な役割を果たすと考えられる。ＣＯＸ-２発現の増加は、その主要な代謝産物であるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の量の増加につながる。本研究における動物のＦｏｘｙ-５による処置は、ＰＧＥ２生成酵素ＣＯＸ-２の発現の減少だけでなく（図５及び５Ｂ参照）、ＰＧＥ２分解酵素15-ＰＧＤＨの増加ももたらした（図５及び５Ｃ参照）。これらのデータは、Ｆｏｘｙ-５ペプチドによる処置が独特の二重作用によってＰＧＥ２の腫瘍内濃度の低減を引き起こし得ることを実証し、このことは、観察されたＣＳＣの低減を説明する（図２〜４及び２Ｂ〜３Ｂ）。
【００３４】
実施例３
ＨＴ-２９又はＣａｃｏ-２結腸がんの組織におけるβ-カテニンシグナル伝達に対するＦｏｘｙ-５処置のインビボ効果は、観察されたＣＳＣ数の低減についてのもう一つの考えられる説明となるかもしれない。Ｆｏｘｙ-５処置の結果、Ｃａｃｏ-２由来結腸がんの腫瘍とＨＴ２９由来結腸がんの腫瘍の両者で、活性β-カテニンの核での発現量の減少が観察された（図７及び８参照）。Ｆｏｘｙ-５によって低減されたβ-カテニンシグナル伝達は、腫瘍体積の低減により確認された（図６及び７）。β-カテニン下流標的であって、がん幹細胞ニッチを促進する転写因子であるＡｓｃｌ２のＦｏｘｙ-５により誘導された低減は、ＣＳＣの数を低減するＦｏｘｙ-５の能力が、β-カテニン／Ａｓｃｌ２シグナル伝達の低減にも依存することを示すことも観察されたという事実（図６〜９参照）は、本研究に極めて重要である。したがって、Ｆｏｘｙ-５ペプチドは、ＣＳＣを活性化する２つの別々のシグナル伝達経路の低減につながる３つの異なる要素（ＣＯＸ-２、15-ＰＧＤＨ及びβ-カテニン）を標的とすることによってＣＳＣの数を低減させる独自の特性を示す。
【００３５】
実施例４
この研究の目的は、ＦＯＬＦＯＸの細胞毒性効果に対するＦｏｘｙ-５ペプチドのインビトロでの影響を評価することにより、Ｆｏｘｙ-５及びＦＯＬＦＯＸによる同時処置の可能性を試験することであった。ＦＯＬＦＯＸは、２つの化学療法剤5-ＦＵ及びオキサリプラチンとフォリン酸との組合せであり、後者は、化学療法剤ではなくロイコボリンとも呼ばれるが、ヒトＨＴ２９結腸がんの細胞に対する5-ＦＵの効果を増強するために使用される。ＦＯＬＦＯＸは、結腸がん患者の処置において最も一般的に使用される化学療法である。
【００３６】
最初の実験は、Ｆｏｘｙ-５ペプチド、オキサリプラチン、及び5-ＦＵの単剤としての細胞毒性効果を評価することであった（図１０）。結果は、フォリン酸として、細胞生存率に対するＦｏｘｙ-５ペプチドの細胞毒性効果はなく、その結果、ＩＣ５０値を測定できないことを確認した。一方、オキサリプラチン及び5-ＦＵのＩＣ５０値は、用量反応曲線からそれぞれ３．４及び６．８μＭと計算された。
【００３７】
この組合せの結果は、Ｆｏｘｙ-５ペプチドが、細胞生存率に対するＦＯＬＦＯＸの阻害効果を高めることも低めることもないことを示す。ＦＯＬＦＯＸ処置単独のＩＣ５０値は１．５μＭであり、Ｆｏｘｙ-５ペプチドとＦＯＬＦＯＸとの併用処置は、図１０におけるそれらの重複した用量反応曲線からも明らかなように、同じＩＣ５０値を示した。
【００３８】
結論として、Ｆｏｘｙ-５の添加は、ヒトＨＴ２９結腸がんの細胞の生存率に対するＦＯＬＦＯＸ処理の効果を変化させず、したがって相互作用を予測することはできない。よって、Ｆｏｘｙ-５がＦＯＬＦＯＸ治療の細胞増殖抑制効果を小さくするという示唆はない。
【図１】
2021500415.tif 000003
【図２】
2021500415.tif 000004
【図２Ｂ】
2021500415.tif 000005
【図３】
2021500415.tif 000006
【図３Ｂ】
2021500415.tif 000007
【図４】
2021500415.tif 000008
【図５】
2021500415.tif 000009
【図５Ｂ】
2021500415.tif 000010
【図５Ｃ】
2021500415.tif 000011
【図６】
2021500415.tif 000012
【図７】
2021500415.tif 000013
【図８】
2021500415.tif 000014
【図９】
2021500415.tif 000015
【図１０】
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【配列表】
2021500415000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月25日(2020.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸がんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減又は排除に使用するための、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、
当該ぺプチドは、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含む、ペプチド。
【請求項２】
結腸がんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減又は排除に使用するための、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドアゴニストであって、
当該ぺプチドアゴニストは、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含む、ペプチドアゴニスト。
【請求項３】
がん細胞におけるＷＮＴ５Ａの発現が周囲の非がん細胞における発現の３５％以下である、請求項１又は２に記載の使用のためのペプチド。
【請求項４】
１位のＸはＭ又はノルロイシンで、４位のＸはＣ又はＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、
ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）、
ＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号４）、
ＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号５）、
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号６）、
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号７）、
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号８）、
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号９）、
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１０）、
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１１）、
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１２）、
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１３）、
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１４）、
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１５）、
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１６）、及び
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１７）、
又はそのホルミル化誘導体からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドはＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）又はそのホルミル化誘導体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項７】
低減又は排除が以下の工程：
ａ）がんの診断直後及び／又は手術中及び／又は手術による腫瘍の除去後に、有効量の前記ペプチドを投与することを含み、
任意に、工程ａ）は２週間以上にわたって週に少なくとも３回繰り返される、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項８】
予防、低減、又は排除が以下の工程：
ａ）有効量の腫瘍抑制化学療法薬を投与し；
ｂ）前記少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬による処置の前に、同時に、及び／又は後に、有効量の前記ペプチドを投与することを含み、
任意に、工程ｂ）は２週間以上にわたって週に少なくとも３回繰り返される、
少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬と組み合わせた、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含み、少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬と組み合わせたペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチド及び前記腫瘍抑制化学療法薬は、混合されているか若しくは別々であるかのいずれかであり、及び／又は同時に若しくは逐次的に投与される、少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬と組み合わせた、請求項１〜６又は７〜８のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬は、5-フルオロウラシル（5-ＦＵ）、ロイコボリン及びオキサリプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＯＸ）、アントラサイクリン又はタキサンである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の使用のための組合せ。
【請求項１２】
前記アントラサイクリンはエピルビシン若しくはドキソルビシンである、又は前記タキサンはドセタキセル若しくはパクリタキセルである、請求項１０又は１１に記載の使用のための組合せ。
【請求項１３】
前記腫瘍抑制化学療法薬は5-フルオロウラシル（5-ＦＵ）、ロイコボリン及びオキサリプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＯＸ）である、結腸がんと診断された患者の治療用の、請求項１０又は１１に記載の使用のための組合せ。
【請求項１４】
前記アントラサイクリンはエピルビシン若しくはドキソルビシンである、又は前記タキサンはドセタキセル若しくはパクリタキセルである、請求項１０又は１１に記載の使用のための組合せ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
結論として、Ｆｏｘｙ-５の添加は、ヒトＨＴ２９結腸がんの細胞の生存率に対するＦＯＬＦＯＸ処理の効果を変化させず、したがって相互作用を予測することはできない。よって、Ｆｏｘｙ-５がＦＯＬＦＯＸ治療の細胞増殖抑制効果を小さくするという示唆はない。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含み、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するためのペプチド。
［２］  前記がんは、前立腺がん、乳がん、結腸がん、卵巣がん、甲状腺がん、肝臓がん、又は血液悪性腫瘍からなる一覧から選択される、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、［１］に記載のペプチド。
［３］  がん細胞におけるＷＮＴ５Ａの発現が周囲の非がん細胞における発現の３５％以下である、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、［１］又は［２］に記載のペプチド。
［４］  １位のＸはＭ又はノルロイシンで、４位のＸはＣ又はＡである、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、［１］〜［３］のいずれか１つに記載のペプチド。
［５］  前記ペプチドは、
ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）、
ＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号４）、
ＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号５）、
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号６）、
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号７）、
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号８）、
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号９）、
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１０）、
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１１）、
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１２）、
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１３）、
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１４）、
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１５）、
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１６）、及び
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１７）、
又はそのホルミル化誘導体からなる群より選択される、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、［１］〜［４］のいずれか１つに記載のペプチド。
［６］  前記ペプチドはＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）又はそのホルミル化誘導体である、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、［１］〜［５］のいずれか１つに記載のペプチド。
［７］  予防、低減又は排除が以下の工程：
ａ）がんの診断直後及び／又は手術中及び／又は手術による腫瘍の除去後に、有効量の前記ペプチドを投与することを含み、
任意に、工程ａ）は２週間以上にわたって週に少なくとも３回繰り返される、
患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、［１］〜［７］のいずれか１つに記載のペプチド。
［８］  予防、低減、又は排除が以下の工程：
ａ）有効量の腫瘍抑制化学療法薬を投与し；
ｂ）前記少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬による処置の前に、同時に、及び／又は後に、有効量の前記ペプチドを投与することを含み、
任意に、工程ｂ）は２週間以上にわたって週に少なくとも３回繰り返される、
患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者における低減若しくは排除に使用するための、少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬と併用するための、［１］〜［７］のいずれか１つに記載のペプチド。
［９］  配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含み、少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬と組み合わせたペプチド。
［１０］  配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含むペプチドと、少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬の組合せであって、前記ペプチド及び前記腫瘍抑制化学療法薬は、混合されているか若しくは別々であるかのいずれかであり、及び／又は同時に若しくは逐次的に投与される、患者におけるがんの再発若しくは再燃の予防に使用するための、又はがんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための組合せ。
［１１］  前記少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬は、5-フルオロウラシル（5-ＦＵ）、ロイコボリン及びオキサリプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＯＸ）、アントラサイクリン又はタキサンである、［１０］に記載の組合せ。
［１２］  前記アントラサイクリンはエピルビシン若しくはドキソルビシンである、又は前記タキサンはドセタキセル若しくはパクリタキセルである、［１０］又は［１１］に記載の組合せ。
［１３］  前記腫瘍抑制化学療法薬は5-フルオロウラシル（5-ＦＵ）、ロイコボリン及びオキサリプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＯＸ）である、結腸がんと診断された患者の治療用の、［１０］に記載の組合せ。
［１４］  前記腫瘍抑制化学療法薬はアントラサイクリン又はタキサンである、乳がんと診断された患者の治療用の、［１０］に記載の組合せ。
［１５］  前記アントラサイクリンはエピルビシン若しくはドキソルビシンである、又は前記タキサンはドセタキセル若しくはパクリタキセルである、［１０］又は［１４］に記載の組合せ。
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月26日(2020.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸がんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドであって、
当該ぺプチドは、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含む、ペプチド。
【請求項２】
結腸がんと診断された患者におけるがん幹細胞の低減若しくは排除に使用するための、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来するペプチドアゴニストであって、
当該ぺプチドアゴニストは、２０以下のアミノ酸長を有し、アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２、Ｘは任意のアミノ酸である）又はそのホルミル化誘導体を含む、ペプチドアゴニスト。
【請求項３】
がん細胞におけるＷＮＴ５Ａの発現が周囲の非がん細胞における発現の３５％以下である、請求項１又は２に記載の使用のためのペプチド。
【請求項４】
１位のＸはＭ又はノルロイシンで、４位のＸはＣ又はＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、
ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）、
ＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号４）、
ＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号５）、
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号６）、
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号７）、
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号８）、
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号９）、
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１０）、
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１１）、
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１２）、
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１３）、
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１４）、
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１５）、
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１６）、及び
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１７）、
又はそのホルミル化誘導体からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドはＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）又はそのホルミル化誘導体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項７】
低減又は排除が以下の工程：
ａ）がんの診断直後及び／又は手術中及び／又は手術による腫瘍の除去後に、有効量の前記ペプチドを投与することを含み、
任意に、工程ａ）は２週間以上にわたって週に少なくとも３回繰り返される、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項８】
予防、低減、又は排除が以下の工程：
ａ）有効量の腫瘍抑制化学療法薬を投与し；
ｂ）前記少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬による処置の前に、同時に、及び／又は後に、有効量の前記ペプチドを投与することを含み、
任意に、工程ｂ）は２週間以上にわたって週に少なくとも３回繰り返される、
少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬と組み合わせた、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項９】
前記ペプチド及び前記腫瘍抑制化学療法薬は、混合されているか若しくは別々であるかのいずれかであり、及び／又は同時に若しくは逐次的に投与される、少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬と組み合わせた、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの腫瘍抑制化学療法薬は、5-フルオロウラシル（5-ＦＵ）、ロイコボリン及びオキサリプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＯＸ）、アントラサイクリン又はタキサンである、請求項８又は９に記載の使用のための組合せ。
【請求項１１】
前記アントラサイクリンはエピルビシン若しくはドキソルビシンである、又は前記タキサンはドセタキセル若しくはパクリタキセルである、請求項９又は１０に記載の使用のための組合せ。
【請求項１２】
前記腫瘍抑制化学療法薬は5-フルオロウラシル（5-ＦＵ）、ロイコボリン及びオキサリプラチンの組合せ（ＦＯＬＦＯＸ）である、結腸がんと診断された患者の治療用の、請求項１０に記載の使用のための組合せ。
【国際調査報告】
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