(57)【要約】  脱制御されたヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１／ヒトＥＧＦＲ）によって誘導されたがんを患う患者を治療する方法は、ＥＧＦ−ＥＧＦＲ結合（ｍＡｂ）によって活性化した経路の抑制のために、未分化リンパ腫キナーゼ阻害剤（ＡＬＫ阻害剤）と抗ＥＧＦ抗体とを併用するための柔軟かつ積極的なレジメンをそのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む。抗ＥＧＦ抗体は、能動免疫によって生成されるか、抗ＥＧＦである抗体の投与によって受動的に提供できる。この方法は、１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンに従って投与されるＡＬＫ阻害剤を含み、ｍＡｂは、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量を達成する投薬計画に従って能動的または受動的に同時投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＬＭ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現する非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を患う患者を治療する方法であって、
前記患者は、ＥＧＦＲの突然変異型を発現する腫瘍を有し、前記方法は、未分化リンパ腫キナーゼ阻害剤（ＡＬＫ阻害剤）とＥＧＦを標的とする能動免疫とを併用するための柔軟かつ積極的なレジメンをそのような治療を必要とする患者に投与するステップを含み、前記方法において、ＡＬＫ阻害剤は、治療学的に有効な１日投与量で投与し、能動免疫は、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量に従って同時に施す方法。
【請求項２】
ＡＬＫ阻害剤は、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブおよびロルラチニブ、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択され、ＥＧＦＲの突然変異型を発現する腫瘍を有する患者の治療のために、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンに従って投与し、ＥＧＦを標的とする能動免疫は、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量に従って同時に施す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記がんは、その転移性型を含むＥＬＭ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現するＮＳＣＬＣであり、ＡＬＫ阻害剤は、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブおよびロルラチニブ、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択され、ＥＧＦＲ突然変異およびＡＬＫ阻害剤治療に対する耐性を獲得した患者に、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンに従って投与し、ＥＧＦを標的とする能動免疫は、１週間に２回もしくは１回、または２週間に１回繰り返される治療有効量に従って同時に施し、
前記方法は、ＡＬＫ阻害剤治療に対する耐性の克服をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記がんは、その転移性型を含むＥＬＭ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現するＮＳＣＬＣであり、ＡＬＫ阻害剤は、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブおよびロルラチニブ、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択され、ＡＬＫ阻害剤治療に対する耐性を獲得した患者に、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンに従って投与し、ＥＧＦを標的とする能動免疫は、１週間に２回もしくは１回、または２週間に１回繰り返される治療有効量に従って同時に施す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＥＬＭ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現する非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を患う患者を治療する方法であって、ＡＬＫ阻害剤とモノクローナル抗ＥＧＦ抗体の受動投与とを併用するための柔軟かつ積極的なレジメンをそのような治療を必要とする患者に投与するステップを含み、ここで、ＡＬＫ阻害剤は、治療学的に有効な１日投与量で連続したレジメンに従って投与し、能動免疫は、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量に従って同時に施す方法。
【請求項１０】
ＥＬＭ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現する脱制御されたヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ／ヒトＥＧＦＲ）によって誘導された非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を患う患者を治療する方法であって、
前記患者は、ＥＧＦＲの突然変異型を発現する腫瘍を有し、前記方法は、ＡＬＫ阻害剤とモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体の受動投与とを併用するための柔軟かつ積極的なレジメンをそのような治療を必要とする患者に投与するステップを含み、ここで、ＡＬＫ阻害剤は、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンに従って投与し、能動免疫は、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量に従って同時に施し、ＡＬＫ阻害剤治療に対する耐性の獲得を防止する、方法。
【請求項１３】
脱制御されたヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ／ヒトＥＧＦＲ）によって誘導された非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を患う患者を治療する方法であって、
前記患者は、突然変異したＥＬＭ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現する腫瘍を有し、前記方法は、ＡＬＫ阻害剤とモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体の受動投与とを併用するための柔軟かつ積極的なレジメンをそのような治療を必要とする患者に投与するステップを含み、前記方法において、ＡＬＫ阻害剤は、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンに従って投与し、能動免疫は、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量に従って同時に施し、ＡＬＫ阻害剤およびモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体の投与は、その後に行われる方法。
【請求項１４】
ＥＬＭ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現する脱制御されたヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１／ヒトＥＧＦＲ）ＮＳＣＬＣによって誘導された非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を患う患者を治療する方法であって、
前記患者は、ＥＧＦＲの突然変異型を発現する腫瘍を有し、前記方法は、ＡＬＫ阻害剤とＥＧＦを標的とする能動免疫とを併用するための柔軟かつ積極的なレジメンをそのような治療を必要とする患者に投与するステップを含み、能動免疫は、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンによりＡＬＫ阻害剤を投与する前に、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量に従って施し、ＡＬＫ阻害剤治療に対する耐性の獲得を防止する、方法。
【請求項１５】
免疫原性タンパク質は、ＳＴＡＴ３活性化を減少させるために治療量で投与される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年８月７日に出願された米国仮特許出願第６２／７１５，３５１号、２０１８年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／７２７，０５６号、２０１８年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／７４８，７７２号、２０１８年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／７６０，５２９号、および２０１９年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２/８２２，２９０号の優先権および利益を主張し、全ての目的のためにその内容全体を本明細書に参照として含む。
【０００２】
本発明の実施形態は、特に未分化リンパ腫キナーゼ阻害剤（ＡＬＫ阻害剤）療法に反応しない、あるいは耐性ができたヒトにおいてがんなどの病状を治療し、予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、全世界のがん関連死亡の主要因であり、最近の治療や診断の発展にもかかわらず、５年間の生存率は〜１６％にとどまっている。かかる不良転帰は、大半が診断時には進行した病期、疾病の強力な特性や転移の程度によるものである。著しい発展により、悪性のがん細胞を引き起こすゲノム異常を明らかにしたが、現在、利用可能な化学療法は依然として満足できるものではなく、大多数のがん診断患者に対する予後が問題として残されている。
【０００４】
大半の化学療法製剤は、悪性表現型の発達と関連があると思われる特定の分子標的に作用する。しかし、シグナル伝達経路の複雑なネットワークが細胞の増殖を調節し、大半の悪性がんがこのような経路の多様な遺伝的奇形によって促進する。標準細胞毒性化学療法による肺がんの治療は、効能では最適化されているが、ＮＳＣＬＣ治療法の最近のアプローチは、ＮＳＣＬＣをこれら特有の腫瘍ドライバー遺伝子に基づく分子サブセットに分類することに基づく。ＮＳＣＬＣのかかる分子ドライバーは、治療的に特定の腫瘍遺伝子に対して標的薬剤によって攻撃され得る。
【０００５】
がんに対する従来の大半の化学療法薬は、これらの活動において非選択的であった。その的確な作用機序は多様且つ複雑であるが、一般に、大半の正常組織からよりも悪性腫瘍で通常多く見られる有糸分裂を行う細胞を損傷させることで作用していた。標的薬剤は、がんの発生および維持に必要且つ必須のタンパク質、特に悪性腫瘍の制御されない成長や血管新生、侵襲性および転移の特性を誘導する酵素の活性化を調節することにより、その効力を選択するように設計されている。通常、改善された差次的活性は、がん患者に対して問題となる副作用を減らし、特に、悪心や嘔吐、骨髄と胃腸管の細胞死を減少させて、腫瘍細胞に対する効果を増大させる。
【０００６】
がん治療における治療的介入のための有望な標的セットは、ＨＥＲ−キナーゼ軸の要素を含む。これらは、例えば、前立腺、肺および乳房の堅固な上皮腫瘍で上向き調節される場合が多く、膠芽腫腫瘍でも上向き調節される。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＨＥＲ−キナーゼ軸の要素であり、他の様々ながん治療法の開発のための選択の標的となってきた。チロシン残基の可逆的リン酸化がＥＧＦＲ経路の活性化に求められるため、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）がこれらの治療法の１つである。即ち、ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、腫瘍細胞の成長や分裂を誘導する細胞シグナル伝達経路を誘発および／または維持させる役割をする細胞表面受容体を遮断する。具体的に、これらの阻害剤は、ＥＧＦＲキナーゼドメインを干渉するものとみられる。
【０００７】
近年、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者のサブセットで未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）受容体チロシンキナーゼのゲノム再編成が同定された。その後すぐに、低分子ＡＴＰ競合ＡＬＫ阻害剤であるクリゾチニブが、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣ患者における化学療法よりもさらに効果的であることが立証された。クリゾチニブおよび他の２つのＡＴＰ競合ＡＬＫ阻害剤であるセリチニブとアレクチニブは、かかる患者において第一治療法として使用するように承認され、ＡＬＫ再編成は、現在、免疫組織化学およびインサイチュハイブリダイゼーション法により診断される。これら３つのＡＬＫ阻害剤の臨床的成功は、さらに大きな効能と選択性を備えた次世代のＡＬＫ阻害剤の開発につなかった。しかし、不幸にも、患者には、ＡＬＫ阻害剤に対する耐性が必然的に生じて、一般的に脳転移の形で現れる腫瘍の再発につながる。
【０００８】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）再編成は、非小細胞肺がんのはっきりとした分子亜型を規定する。最近、進行したＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣに対する治療環境は、ますます強力かつ選択的なＡＬＫ阻害剤の開発によって変化している。クリゾチニブは、臨床開発に入った初めてのＡＬＫ阻害剤である。クリゾチニブは、無作為の第３相試験で、細胞毒性の化学療法に比べて、客観的奏効率（ＯＲＲ）と無進行生存率（ＰＦＳ）とにおいて相当な改善を示し、進行したＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの標準的治療として確立されている。
【０００９】
大半の患者は、クリゾチニブに反応するが、患者は一般的に１〜２年以内に再治療を受けることになる。進行後の生検標本の分析は、クリゾチニブ耐性の分子メカニズムへのより大きな理解を促す非常に価値あるものであることが立証されている。一般に、かかるメカニズムは、標的遺伝子変化（例えば、ＡＬＫ耐性突然変異、ＡＬＫ遺伝子増幅）または耐性の標的外メカニズム（例えば、ＥＧＦＲ、ＫＩＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＳＲＣ、ＭＥＫ／ＥＲＫなどのバイパスシグナル伝達経路の上向き調節）の何れか１つを含むものに分類されている。通常、標的内抵抗メカニズムは、クリゾチニブで進行中の患者の約１／３から発見される。
【００１０】
最近、複数の第二世代ＡＬＫ阻害剤がＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣにおいて印象的な活性を示した。これらの製剤のうちの２つであるセリチニブとアレクチニブは、クリゾチニブ不応性ＡＬＫ再編成ＮＳＣＬＣの治療に対して米国食品医薬局（ＦＤＡ）の承認を受けた。３番目の製剤であるブリガチニブは、ＦＤＡから画期的治療薬に指定され、最近承認された。前臨床モデルにおいて、第二世代ＡＬＫ阻害剤は、複数のクリゾチニブ耐性ＡＬＫ突然変異を克服する。また、第１、２相研究において、これらの製剤は、クリゾチニブ耐性患者において、高いＯＲＲ（４８〜７１％）が立証された。重要なことに、第二世代ＡＬＫ阻害剤がＡＬＫ耐性突然変異や融合遺伝子増幅がない患者でも活性化するという点で、多くのがんがＡＬＫの不適切な抑制によりクリゾチニブへの耐性を有することになることを示唆している。しかし、第二世代ＡＬＫ阻害剤の効力にもかかわらず、患者は常に再発する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
新たな様々なアプローチは、相違するＡＬＫ阻害剤の知識ベースの代替や連続的な使用だけでなく、ＡＬＫと代替となるシグナル伝達経路を標的とする併用療法を含み、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣで発生する多様な耐性機序を克服することを目標としているが、耐性を解決するための新たなアプローチが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、ＥＧＦ−ＥＧＦＲによって活性化した経路の抑制のために、能動ＥＧＦ経路免疫（ＥＧＦ  ＰＴＩ）と未分化リンパ腫キナーゼ阻害剤（ＡＬＫ阻害剤）とを併用するための柔軟かつ積極的なレジメンをそのような治療を必要とする患者に投与するステップを含むＡＬＫ突然変異およびＲＯＳ１再編成によって誘導されたがんを患う患者を治療する方法に関し、前記方法において、ＡＬＫ阻害剤は、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンに従って投与し、ＥＧＦ  ＰＴＩは、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量を達成する投薬計画に従って同時に施す。
【００１３】
本発明の他の目的は、ＡＬＫ突然変異およびＲＯＳ１再編成によって誘導された非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を患う患者を治療する方法に関し、ここで、患者は、ＥＧＦＲの突然変異型を発現する腫瘍を有し、前記方法は、ＥＧＦを標的とする能動免疫を併用するための柔軟かつ積極的なレジメンをそのような治療を必要とする患者に投与するステップを含み、前記方法において、ＡＬＫ阻害剤は、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量および能動免疫に基づく連続したレジメンに従って投与し、ＥＧＦ  ＰＴＩは、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量に従って同時に施し、前記方法は、ＡＬＫ阻害剤治療に対する耐性が生じることを防止する。
【００１４】
本発明の他の目的は、有効量の抗ＥＧＦ標的抗体を含む第１の区画と、有効量のＡＬＫ阻害剤を含む第２の区画とを含む薬剤キットに関する。
【００１５】
本発明の他の目的は、ＥＧＦに対する免疫反応を生成する有効量のワクチンを含む第１の区画と、有効量のＡＬＫ阻害剤を含む第２の区画とを含む薬剤キットに関する。
【００１６】
本発明の他の目的は、ＥＧＦＲに対する免疫反応を生成する有効量のワクチンを含む第１の区画と、有効量のＡＬＫ阻害剤を含む第２の区画とを含む薬剤キットに関する。
【００１７】
本発明の他の目的は、ＥＧＦに対する免疫反応を生成するワクチンとの同時投与によって、ＡＬＫ突然変異およびＲＯＳ１再編成によって誘導されたがんを患う患者の治療方法に用いるためのＡＬＫ阻害剤に関し、ここで、ＡＬＫ阻害剤は、そのような治療が必要な患者に、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンに従って投与し、ＥＧＦに対する免疫反応を生成するワクチンは１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量に従って同時投与する。
【００１８】
本発明の他の目的は、ＥＧＦに対する免疫反応を生成する有効量のワクチンを含む第１の区画と、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンに従って投与される有効量のＡＬＫ阻害剤を含む第２の区画とを含む、ＡＬＫ突然変異およびＲＯＳ１再編成によって誘導されたがんを患う患者の治療のための薬剤キットを製造するためのＡＬＫ阻害剤の用途に関し、前記ワクチンは、そのような治療が必要な患者に、ＡＬＫ阻害剤療法を開始する前に、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量で、週平均の投与量の範囲とする投薬計画に従って投与する。
【００１９】
本発明は、以下、本発明の実施形態の非制限的な例により示された複数の図面を参照とする詳細な説明によってより詳しく記載されており、図面の同一類似する参照番号は同様の部分を示している。本発明は、以下の図面と共に詳細な説明を参照してより完全に理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】患者に見つかるＡＬＫ再編成の約７５％を占めるＮＳＣＬＣ細胞株を示す。Ｈ３１２２はＥＭＬ４−ＡＬＫ  ｖ１融合を伝達し、Ｈ２２２８はＥＭＬ４−ＡＬＫ  ｖ３融合を伝達する。
【図２Ａ】Ｈ３１２２細胞株において、ＥＧＦの有無におけるブリガチニブおよびアレクチニブの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図２Ｂ】Ｈ３１２２細胞株において、ＥＧＦの有無におけるブリガチニブおよびアレクチニブの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図３】７２時間培養後のＨ３１２２細胞株において、ＥＧＦの有無におけるクリゾチニブの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図４】Ｈ３１２２細胞株において、７２時間培養されたＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。Ｃ−Ａｂは対照抗体である。
【図５】Ｈ３１２２細胞において、７２時間培養後のＢＶＮ２２Ｅ抗体とアレクチニブとの組み合わせの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図６】Ｈ３１２２細胞において、７２時間培養後のＢＶＮ２２Ｅ抗体とクリゾチニブとの組み合わせの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図７Ａ】Ｈ３１２２およびＨ２２２８細胞において、ブリガチニブおよびアレクチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図７Ｂ】Ｈ３１２２およびＨ２２２８細胞において、ブリガチニブおよびアレクチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図８】Ｈ３１２２細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体との２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図９】Ｈ３１２２細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体との２４時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図１０】Ｈ３１２２細胞において、クリゾチニブとの２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図１１Ａ】Ｈ２２２８細胞株において、ＥＧＦの有無におけるブリガチニブおよびアレクチニブの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図１１Ｂ】Ｈ２２２８細胞株において、ＥＧＦの有無におけるブリガチニブおよびアレクチニブの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図１２】７２時間培養後のＨ２２２８細胞株において、ＥＧＦの有無におけるクリゾチニブの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図１３】Ｈ２２２８細胞株において、７２時間培養されたＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。Ｃ−Ａｂは対照抗体である。
【図１４】Ｈ２２２８細胞において、７２時間培養後のＢＶＮ２２Ｅ抗体とアレクチニブとの組み合わせの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図１５】Ｈ２２２８細胞において、７２時間培養後のＢＶＮ２２Ｅ抗体とクリゾチニブとの組み合わせの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図１６Ａ】Ｈ２２２８細胞において、ブリガチニブおよびアレクチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図１６Ｂ】Ｈ２２２８細胞において、ブリガチニブおよびアレクチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図１７】Ｈ２２２８細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体との２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図１８】Ｈ２２２８細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体との２４時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図１９】Ｈ２２２８細胞において、クリゾチニブとの２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図２０】Ｈ２２２８細胞において、ブリガチニブとの２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図２１】Ｈ２２２８細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体およびブリガチニブの組み合わせとの２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図２２】Ｈ３１２２細胞において、ブリガチニブとの２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図２３】Ｈ３１２２細胞において、高濃度のブリガチニブとの２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図２４】Ｈ３１２２細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体およびブリガチニブの組み合わせとの２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図２５】耐性コロニーの出現（上段のパネル）および細胞死遅延（下段のパネル）で表される、相違する成長条件下でのＢＶＮ２２Ｅ抗体の有無におけるＨ２２２８細胞において、クリゾチニブおよびアレクチニブに対する耐性が発現するまでの時間を示す。
【図２６】ＢＶＮ２２Ｅ抗体の有無におけるＨ３１２２細胞において、クリゾチニブ０．１μＭに対する耐性の出現を示す。
【図２７】ＢＶＮ２２Ｅ抗体の有無におけるＨ３１２２細胞において、クリゾチニブ０．２μＭに対する耐性の出現を示す。
【図２８】本発明に用いられたＢＲＡＦ突然変異細胞株を示す。ＨＴ２９株は結腸腺がん由来であり、Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦ突然変異を含む。
【図２９】ＨＴ２９細胞生存能力に対するＥＧＦの効果を示す。
【図３０】ＨＴ２９細胞において、ＥＧＦの有無におけるＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図３１】ＨＴ２９細胞株において、トラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図３２】ＨＴ２９細胞において、トラメチニブとの２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図３３】ＨＴ２９細胞において、トラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体との２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図３４】フローサイトメトリーにより個別細胞の細胞周期およびアポトーシス状態を決定するためのヨウ化プロピジウム染色の使用を示す図式を例示する。この方法は、ＫＲＡＳ突然変異（Ａ５４９およびＤＬＤ１）およびＡＬＫ転座（Ｈ２２２８およびＨ３１２２）細胞株に適用される。
【図３５】ＤＬＤ１細胞において、細胞周期のＳ期およびＧ２Ｍ期にある細胞の相対数に対するトラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果を示す。
【図３６】Ａ５４９細胞において、細胞周期のＳ期およびＧ２Ｍ期にある細胞の相対数に対するトラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果を示す。
【図３７】Ｈ２２２８細胞において、細胞周期のＳ期およびＧ２Ｍ期にある細胞の相対数に対するブリガチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果を示す。
【図３８】Ｈ３１２２細胞において、細胞周期のＳ期およびＧ２Ｍ期にある細胞の相対数に対するブリガチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果を示す。
【図３９】本発明に用いられた細胞株のＫＲＡＳ突然変異を例示する。Ａ５４９細胞はＧ１２Ｓ  ＫＲＡＳ突然変異を含み、Ｈ２３細胞はＧ１２Ｃ  ＫＲＡＳ突然変異を含み、ＤＬＤ１細胞はＧ１３Ｄ  ＫＲＡＳ突然変異を含み、ＬＳ１７４Ｔ細胞はＧ１２Ｃ  ＫＲＡＳ突然変異を含む。
【図４０】ＤＬＤ１細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図４１】ＤＬＤ１細胞において、７２時間培養後のトラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図４２】ＤＬＤ１細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の２時間の培養に対する反応としてのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図４３】ＤＬＤ１細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の２４時間の培養に対する反応としてのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図４４】ＤＬＤ１細胞において、ＥＧＦの有無におけるトラメチニブの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図４５】ＤＬＤ１細胞において、トラメチニブの２時間の培養に対する反応としてのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図４６】ＤＬＤ１細胞において、トラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図４７】ＤＬＤ１細胞において、ＥＧＦの有無におけるトラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図４８】ＤＬＤ１細胞において、トラメチニブに対する耐性の発現に対するＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果を示す。
【図４９】Ａ５４９細胞株において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図５０】Ａ５４９細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体との２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図５１】Ａ５４９細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体との２４時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図５２】Ａ５４９細胞株において、ＥＧＦの有無におけるトラメチニブの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図５３】Ａ５４９細胞において、トラメチニブの２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図５４】Ａ５４９細胞において、トラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図５５】Ａ５４９細胞において、ＥＧＦの有無におけるトラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ(ＴＹＲ  １０６８)、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図５６】Ｈ２３細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図５７】Ｈ２３細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図５８】Ｈ２３細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の２４時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図５９】Ｈ２３細胞において、ＥＧＦの有無におけるトラメチニブの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図６０】Ｈ２３細胞において、トラメチニブの２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図６１】Ｈ２３細胞において、トラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図６２】Ｈ２３細胞において、ＥＧＦの有無におけるトラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図６３】ＬＳ１７４Ｔ細胞株において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。
【図６４】ＬＳ１７４Ｔ細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図６５】ＬＳ１７４Ｔ細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の２４時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図６６】ＬＳ１７４Ｔ細胞株において、ＥＧＦの有無におけるトラメチニブの細胞生存能力に対する効果を示す。
【図６７】ＬＳ１７４Ｔ細胞において、トラメチニブの２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）及びｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図６８】ＬＳ１７４Ｔ細胞において、ＥＧＦの有無におけるトラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の２時間の培養に対する反応でのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を示す。
【図６９】ＬＳ１７４Ｔ細胞生存能力に対するトラメチニブ単独とＢＶＮ２２Ｅ抗体との組み合わせによる効果を示す。
【図７０】ＥＧＦの存在下でのＳＷ９００細胞において、ｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）に対するヒト患者の抗ＥＧＦ血清の効果を示す。
【図７１】ＥＧＦの存在下でのＳＷ９００細胞において、ｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する２人のヒト患者の抗ＥＧＦ血清の効果を示す。
【図７２】ＥＧＦの存在下でのＳＷ９００細胞において、ｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する３人のヒト患者の抗ＥＧＦ血清の効果を示す。
【図７３Ａ】図６９−７１に示す患者の抗ＥＧＦ血清からのウェスタンブロットの定量化の概要を示す。
【図７３Ｂ】図６９−７１に示す患者の抗ＥＧＦ血清からのウェスタンブロットの定量化の概要を示す。
【図７４Ａ】図６９−７１に示すＳＷ９００細胞において、患者の抗ＥＧＦ血清からのウェスタンブロットの定量化を示す。
【図７４Ｂ】図６９−７１に示すＳＷ９００細胞において、患者の抗ＥＧＦ血清からのウェスタンブロットの定量化を示す。
【図７４Ｃ】図６９−７１に示すＳＷ９００細胞において、患者の抗ＥＧＦ血清からのウェスタンブロットの定量化を示す。
【図７４Ｄ】図６９−７１に示すＳＷ９００細胞において、患者の抗ＥＧＦ血清からのウェスタンブロットの定量化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
２００７年、非小細胞肺がん（ＮＳＬＣ）患者から、ＥＭＬ４−ＡＬＫ（棘皮動物微小管関連タンパク質４）融合がん遺伝子が初めて発見された。前記融合は、ＥＭＬ４遺伝子プロモータのＮ末端および未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子のキナーゼドメインを並べた２番染色体短腕における逆位の結果である。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の形成後、ＥＭＬ４の融合パートナーは、ＡＬＫのリガンド非依存性活性化及び構成的キナーゼ活性を媒介して、ＮＳＬＣの３〜７％を担当するがん細胞の増殖や生存を誘導する。
【００２２】
ＡＬＫ阻害剤は、ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座などの腫瘍成長を誘導する（ＡＬＫの）変異を標的とする。クリゾチニブは、２０１１年８月にＦＤＡの承認を受けた初めてのＡＬＫ阻害剤であり、現在、転移性ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣ患者への標準治療である。不幸にも、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が初期にクリゾチニブに反応した大半の患者は、治療を始めてから１年以内に耐性が生じて再び病気が進行する。ＮＳＣＬＣ細胞がさらにＡＬＫ突然変異を獲得するため、クリゾチニブに対して耐性が現れると思われる。ＦＤＡの承認を受けた次世代のＡＬＫ阻害剤であるセリチニブ（Ｚｙｋａｄｉａ）およびアレクチニブ（Ａｌｅｃｅｎｓａ）は、クリゾチニブ耐性を誘発する臨床的に観察されたＡＬＫ突然変異の大半を抑制することができ、この２つの治療剤は、現在クリゾチニブでの治療後に進行したり、そもそもクリゾチニブに反応しなかった転移性ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣ患者の治療用として承認されている。
【００２３】
セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ、およびロルラチニブは、何れもＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣに対してＦＤＡから承認された次世代阻害剤である。ＡＬＫ阻害剤は、セリチニブ（ＬＤＫ３７８）、アレクチニブ（ＲＯ５４２４８０２／ＣＨ５４２４８０２）、ブリガチニブ（ＡＰ２６１１３）、ＡＳＰ３０２６、ベリザチニブ（ＴＳＲ−０１１）、ロルラチニブ（ＰＦ−０６４６３９２２）、エントレクチニブ（ＲＸＤＸ−１０１）、エンサルチニブ（Ｘ−３９６）、およびＣＥＰ−３７４４０を含む。
【００２４】
クリゾチニブは、細胞ベース分析で、それぞれ１１ｎＭおよび２４ｎＭのＩＣ５０を有する、ｃ−ＭｅｔおよびＡＬＫの強力な阻害剤である。セリチニブ（ＬＤＫ３７８）は、０．２ｎＭのＩＣ５０を有する強力且つ特異的なＡＬＫ阻害剤である。アレクチニブ（ＣＨ５４２４８０２；ＲＯ５４２４８０２；ＡＦ８０２）は、１．９ｎＭのＩＣ５０を有する経口投与可能な強力且つ選択的なＡＬＫ阻害剤である。ブリガチニブは、０．６ｎＭのＩＣ５０を有する非常に強力且つ選択的なＡＬＫ阻害剤である。ＡＳＰ３０２６は、３．５ｎＭのＩＣ５０を有するＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）に対する新規且つ選択的な阻害剤である。ベリザチニブは、野生型組換えＡＬＫキナーゼに対して０．７ｎＭのＩＣ５０を有する、ＡＬＫおよびＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣの強力な経口二重阻害剤である。ロルラチニブ（ＰＦ−０６４６３９２２）は、ＲＯＳＩ、野生型ＡＬＫおよびＡＬＫ−Ｌ１１９６Ｍに対して、それぞれ０．０２ｎＭ、０．０７ｎＭ、および０．７ｎＭのＫｉｓを有する、ＡＬＫ／ＲＯＳ１の強力な二重阻害剤である。エントレクチニブは、強力且つ経口投与可能なＴｒｋ、ＲＯＳ１およびＡＬＫ阻害剤であって、それぞれ１、３、５、１２および７ｎＭのＩＣ５０値を有するＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ＲＯＳ１およびＡＬＫを抑制する。エンサルチニブ（Ｘ−３９６）は、それぞれ＜０．４ｎＭおよび０．７４ｎＭのＩＣ５０を有するＡＬＫ／ＭＥＴの強力な二重阻害剤である。ＣＥＰ−３７４４０は、２．３ｎＭ（ＦＡＫ）および１２０ｎＭ（７５％ヒト血漿におけるＡＬＫ細胞ＩＣ５０）のＩＣ５０を有するＦＡＫ／ＡＬＫの新規且つ強力な選択的二重阻害剤である。なお、ＩＣ５０値は、２．３ｎＭ（ＦＡＫ）、１２０ｎＭ（７５％ヒト血漿におけるＡＬＫ細胞ＩＣ５０）（ＷＯ２０１３１３４３５３Ａ１、２０１３．０９．１２．）。
【００２５】
（クリゾチニブ）
クリゾチニブを標準化学療法と比較する２つの後続の無作為第３相研究は、クリゾチニブの完全な承認を導き、最近まで、ＡＬＫ陽性ＮＳＬＣの第一治療のための「ゴールドスタンダート」と位置付けられてきた。第２相研究データと一致して、クリゾチニブは、化学療法と比較して印象的な結果を示し、ｏｒｒ（６５％対２０％）およびｐｆｓ［ハザード比（ｈｒ）：０．４９；７．７ヶ月対３ヶ月］の改善を示した。その後、クリゾチニブは、ＡＬＫ陽性未治療患者において、白金−ペメトレキセド化学療法と比較した。再度、クリゾチニブは、化学療法と比較して、ｏｒｒ（７４％対４５％）、ｍｐｆｓ（時間：０．４５、１０．９ヶ月対７ヶ月）及び重要な生活の質の改善と関連があった。全生存率には差がなかった。（Ｒｏｔｈｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１８）
（セリチニブ）
セリチニブは、クリゾチニブ耐性のＡＬＫ陽性ＮＳＬＣの治療において利点を示した初めての次世代阻害剤である。セリチニブは、クリゾチニブと比較して、アルクを抑制する効能が２０倍高く、クリゾチニブ耐性が発生した患者の生検の細胞株研究では、セリチニブが、一部発見された耐性突然変異の強力な阻害剤であることを示している。
【００２６】
（アレクチニブ）
アレクチニブは、クリゾチニブ耐性ＡＬＫ突然変異に対する活性を有するまた別の高度に選択的なＡＬＫ阻害剤である。アレクチニブの独特な特徴の１つに、クリゾチニブを服用する患者のＣＮＳ耐性機序と関係しているＰ糖タンパク質のための基質ではないというものがある。アレクチニブは現在、進行したＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣ患者のための新規な標準の第一治療剤として確立されている。第一治療剤としてのアレクチニブに対する殆どの反応は恒久性があるが、本質的に、全ての患者に耐性が生じて臨床的再発につながる。他の２つの第二世代ＡＬＫ阻害剤であるセリチニブとブリガチニブは、クリゾチニブ未投与および／またはクリゾチニブ耐性の環境でのみ試験される。
【００２７】
第三世代ＡＬＫ／ＲＯＳ１阻害剤であるロルラチニブは、第１相および第２相試験を完了し、ＡＬＫ  ＴＫＩ未投与、クリゾチニブ耐性、または１つ以上の第二世代ＡＬＫ  ＴＫＩに耐性のある患者を含む数多くの環境で試験される。ロルラチニブは、アレクチニブなどの第二世代ＡＬＫ阻害剤で失敗した患者を含み、かかる全ての環境において抗腫瘍活性が立証された。ロルラチニブは、ＣＮＳ浸透性が高く、アレクチニブなどの脳浸透性ＴＫＩで失敗した患者でも強力な頭蓋内活動を示す。ロルラチニブは、１／２相研究で確認された効力と安全性に基づいて、昨年ＦＤＡから画期的治療薬に指定され、今度は１つ以上のＡＬＫ阻害剤で治療を受けたＡＬＫ陽性患者に対する承認が加速化することが予想される。よって、クリゾチニブに続く第二世代ＡＬＫ阻害剤を用いた順次療法のパラダイムは、アレクチニブに続くロルラチニブの新規なパラダイムに置き換えられている。
【００２８】
本明細書に記載する技術の実施形態は、生理学的濃度で抗ＥＧＦ抗体が有するＥＧＦＲ、ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２のリン酸化に対する抑制効果が、少なくともこれらのシグナル伝達分子に及ぼすＡＬＫ阻害剤の効果と同じくらい重要であるという発見に少なくとも部分的に基づいている。抗ＥＧＦ抗体とＡＬＫ阻害剤の併用法がｐＥＧＦＲ、ｐＡｋｔ、ｐＥＲＫ１／２およびｐＳＴＡＴ−３抑制に対するさらなる効果を表すということがさらに発見された。一部の実施形態において、かかる抗体あるいはその抗原結合断片は、ＮＳＬＣを治療する方法に用いることができる。本発明の範囲内で、抗ＥＧＦ抗体がＥＧＦに対する免疫反応を生成するワクチンの投与により、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で能動的に生成され得ることが考慮される。また、本発明の範囲内で、受動モノクローナル抗ＥＦＧ抗体が投与できるということがさらに考慮される。
【００２９】
ＡＬＫ陽性（未分化リンパ腫キナーゼ陽性、またはＡＬＫ＋）肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ−最もよく見られる肺がん）患者の２５人に１人に発生する。喫煙歴のない若い患者大体５５歳以下は、ＡＬＫ＋と診断される可能性が最も高い。
【００３０】
未分化リンパ腫キナーゼ阻害剤（ＡＬＫ阻害剤）は、ＡＬＫシグナル伝達経路を妨害（または抑制）することで作動する。１つのキナーゼ（キー）から他のキナーゼ（ロック）にシグナルを伝達するためには、２つのキナーゼが一時的にぴったり合う必要がある。キナーゼ阻害剤は、一時的に一方のキナーゼを遮断して、他方のキナーゼが１番目のキナーゼを受けることができないようにする。よって、キナーゼが特定の遺伝子の発現を調節することを防ぐために、シグナルが十分頻繁に（おそらく９０％以上）伝達されるのを遮断するには、特定濃度のキナーゼ阻害剤に達しなければならない。
【００３１】
ＡＬＫベースの腫瘍に対抗するために開発されている薬物の大半は、（ＡＬＫのシグナル伝達を中止するか、経路にある他のキナーゼのシグナル伝達を中止することにより、）ＡＬＫのシグナル伝達経路を妨害（または抑制）するように設計される。例えば、１つのＡＬＫ阻害剤は、ＡＬＫの下流にあるＡＫＴキナーゼを抑制するように設計される。よって、他のタイプの腫瘍とともにＡＬＫベースの腫瘍に対して効果的かを確認するために試験されている。
【００３２】
他のキナーゼ阻害剤と同様に、耐性が問題となる。次世代ＡＬＫ阻害剤に対する耐性機序に関するデータは制限的であり、データの殆どは、クリゾチニブ治療後にこれらの製剤を受けた患者に関するものである。他のＴＫＩと同様に、標的の変更、代替となるシグナル伝達経路の活性化および腫瘍の表現型の変化は、次世代ＡＬＫ阻害剤に耐性のある腫瘍において観察された。ＡＬＫによる標的変更は、クリゾチニブで治療を受けた患者の腫瘍に比べて、次世代ＡＬＫ阻害剤を受けた後の腫瘍においてさらに頻繁に観察されることが示されている。観察された最もよく見られる突然変異は、ＡＬＫの溶媒露出領域における突然変異Ｇ１２０２Ｒであって、大半のＡＬＫ阻害剤に立体障害をもたらす。最初のＡＬＫ阻害剤として、次世代ＡＬＫ阻害剤で治療を受けた患者の腫瘍で同じ耐性機序や同じ割合が観察されるかは不明である。
【００３３】
ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣは、結局のところ、第一世代ＡＬＫ阻害剤であるクリゾチニブに対する耐性が１年〜２年内に発生するがんとして、可変ＰＦＳを示す。ＥＧＦＲと同様に、ＡＬＫのＴＫドメイン、通常Ｌ１１９６Ｍ内の耐性突然変異がある。この突然変異は結合部位で立体障害を引き起こし、クリゾチニブへの反応の効能を減少させる。しかし、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性とは異なり、多数のキナーゼドメイン突然変異（Ｇ１２６９Ａ、Ｇ１２０２Ｒ、Ｓ１２０６Ｙ、Ｆ１１７４Ｃ／Ｌ、Ｄ１２０３Ｎ）のみならず、ＡＬＫ−ＴＫＩ耐性の環境で確認され得る結合部位から離れた突然変異（１１５１にトレオニン挿入、Ｃ１１５６Ｙ、Ｌ１１５２Ｒ）がある。試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）研究によると、相違する耐性突然変異は、構造的に相違するＴＫＩに対して異なるレベルの耐性を与えることが示され、これは、耐性を獲得する際の繰り返しのがんサンプル、およびＦＩＳＨ分析よりもさらに詳細なシーケンシング方法を通じて二次耐性突然変異を確認する必要があることを強調している［６９、７０］。また、ＦＩＳＨ試験により融合生成物の増幅のみを表すＡＬＫ−ＴＫＩ耐性の他のケースもあり、一部は確認された耐性突然変異の１つを表し、他のものは増幅のみ表す場合もある。
【００３４】
クリゾチニブは、ＡＬＫ再編成を含む進行したＮＳＣＬＣの治療において第一治療法として用いられる経口用ＭＥＴ／ＡＬＫ阻害剤である。また、ＡＬＫに対して効能および選択性が増加した新規な第二世代ＡＬＫ阻害剤が臨床試験で評価中にある。クリゾチニブと同様に、これらの製剤は、クリゾチニブと構造的に区別されるが、ＡＬＫチロシンキナーゼのＡＴＰ競合阻害剤である。セリチニブは、クリゾチニブに対する耐性を獲得した個人を含み、ＡＬＫ陽性肺がん患者で活性を示した第二世代阻害剤である。セリチニブは、既にクリゾチニブで治療を受けた進行したＡＬＫ再編成ＮＳＣＬＣ患者に用いるために、ＦＤＡから承認を受けた。しかし、ＡＬＫ阻害剤に対する反応は寿命が短く、通常１年以内に耐性が発生する。
【００３５】
ＡＬＫ誘発ＮＳＣＬＣの治療にクリゾチニブを導入して以来、クリゾチニブに耐性を有する腫瘍の約１／３において、ＥＭＬ４−ＡＬＫの遺伝子増幅または二次突然変異が確認されている。二次突然変異は、試験管内クリゾチニブに対して耐性を誘発することが示されているが、その全てが、構造的に区別される第二世代ＡＬＫ阻害剤に耐性を与えるわけではない。また、クリゾチニブに対する耐性がある腫瘍のサブセットから、ＥＧＦＲ、ＫＩＴおよびＩＧＦ−１Ｒの活性化が別途確認された。ＥＭＬ４−ＡＬＫの二次突然変異がセリチニブに対する後天的耐性のある腫瘍のサブセットから確認されたものの、これらの製剤はクリニックに最近導入されたため、第二世代ＡＬＫ阻害剤に対する耐性は、より少ない特性化を示す。
【００３６】
ＥＧＦＲの突然変異は、免疫チェックポイント阻害剤に対する反応不全と関連があり、ＥＧＦＲ突然変異ＮＳＣＬＣへの新規な免疫治療アプローチの開発が特に重要である。上皮成長因子（ＥＧＦ）に対する免疫は、任意抽出のＮＳＣＬＣ患者を含む第３相試験で効力を示したが、ワクチン接種（抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂ）により生成された抗ＥＧＦ抗体の効果に関するメカニズム、または、ＥＧＦＲ突然変異がある腫瘍細胞における活性に関するメカニズムについては殆ど知られていない。
【００３７】
ＥＧＦに対するワクチン接種は、ＰＤ１遮断とは異なり、Ｔ細胞を活性化することで腫瘍による免疫抑制を逆転させる目的ではない、新規な戦略を構成する。代わりに、Ｂ細胞を刺激して、循環するＥＧＦを隔離させる中和抗体を生成することで、ＥＧＦＲへの結合を防止することを目標とする。ＥＧＦ経路を標的とした免疫といわれるＥＧＦに対するワクチン接種は、耐性に優れ、深刻な副作用を引き起こすケースが殆どなく、任意抽出の進行したＮＳＣＬＣ患者（１１、１２、２１）を登録する２件の試験において期待できる結果を示した。しかし、ＥＧＦＲのリガンド結合およびリン酸化を遮断する能力以外に、抗ＥＧＦ抗体の効果に関する分子および細胞のメカニズムについてや、ＥＧＦＲ突然変異またはその他の遺伝子変化のある腫瘍におけるそれらの異なる活性については殆ど知られていない（２２）。
【００３８】
本発明は、ウサギで育てられた抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂがＥＧＦＲ−ｍｕｔ  ＮＳＣＬＣ細胞株、特に、未治療患者に由来する細胞株における細胞増殖、細胞周期およびシグナル変換経路に対するＥＧＦの効果を抑制したことを示している。実験に用いられたＥＧＦの濃度（１０ｎｇ／ｍＬ）は、ヒト研究で報告された濃度と近く、メジアンは約１ｎｇ／ｍＬであり、相当な個人間変動性を示す（１１、２３）。驚くことに、抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂは、ＰＣ９細胞だけでなくＰＣ９−ＧＲ４細胞においても外因性ＥＧＦがないとき、ｐＥｒｋ１／２のレベルを持続的に減少させることを発見し、成長要因はかなりの効果を示さなかった。この観察について考えられる説明の１つは、用いられた細胞株において受容体／リガンドフィードバックループが存在するというものである。抗ＥＧＦワクチンにより免疫化された患者からの血清も、ＥＧＦによるｐＥｒｋ１／２の活性化を効果的に遮断することが示された。非免疫化患者の対照血清は、Ｅｒｋ１／２に殆ど効果を与えなかったが、Ａｋｔは強く活性化し、健康な個人の血液にはＥＧＦＲ−ｍｕｔ細胞でｐＡｋｔを特異的に引き起こす成長因子が含まれていることを示している。対照的に、分析された４人の免疫化患者の血清は、Ａｋｔリン酸化誘導にあまり活性化しない。Ｅｒｋ１／２リン酸化を遮断してＡｋｔを活性化する程度は低いが、ワクチン接種された個人からの血清の効能において相当な差が観察された。第３相試験が完了しただけの新規な治療方法であるので、ＥＧＦワクチン接種された患者のサンプルの利用可能性は制限的であり、これを臨床結果と関連付けることはできなかった。
【００３９】
以前は、ＥＧＦＲ  ＴＫＩに対して感受性および耐性を両方有する複数のＥＧＦＲ−ｍｕｔ  ＮＳＣＬＣ細胞において、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブなどのＴＫＩの抗増殖効果を著しく減少させることが発見された。かかる発見は、ＥＧＦが存在する場合、ＥＧＦＲ  ＴＫＩで処理された細胞において、ｐＥｒｋ１／２のレベルがかなり高かったウェスタンブロットの実験結果と関連がある。
【００４０】
高いＥＧＦレベルを有するＥＧＦＲ−ｍｕｔ患者は、ＥＧＦＲ  ＴＫＩに対してより悪い結果を有し得る。成長因子αとアンフィレグリンを形質転換する２つのＥＧＦＲリガンドの増加した血清レベルは、任意抽出のＮＳＣＬＣ患者においてＥＧＦＲ  ＴＫＩに対するより悪い反応と関係があることが報告された。ＥＧＦに関して、現在まで発表された唯一の研究で、エルロチニブで治療を受けた１１人のＥＧＦＲ−ｍｕｔおよび２１人のＥＧＦＲ−ｗｔ  ＮＳＣＬＣ患者に対して、血清におけるＥＧＦは、より短い無進行生存率と関係がある。抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂと、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブおよびオシメルチニブとの組み合わせは、試験されたＥＧＦＲ−ｍｕｔ細胞株において、ＥＧＦＲ  ＴＫＩ単独に比べて強力な抗増殖効果を示し、これは、ｐＥｒｋ１／２の一貫した減少と関係性があることを示している。（図７８、レーンＴＫＩ＋ＥＧＦとＴＫＩ＋Ａｂ＋ＥＧＦとの比較）。前記組み合わせはまた、ＥＧＦの抗アポトーシスおよびＧ２／Ｍの刺激効果を遮断するのに優れている。
【００４１】
抗ＥＧＦＲモノクローナルセツキシマブはまた、ＥＧＦＲ−ｍｕｔ細胞株モデルで試験される。セツキシマブは、抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂと同様に、試験管内リガンド結合を遮断し、ＰＣ９およびＨ１９７５細胞においてリガンド誘導されたＥＧＦＲ、Ｅｒｋ１／２、Ａｋｔリン酸化を防止することが示されている。しかし、Ｈ３２５５またはＤＦＣＩＬＵ−０１１．２９などの他のＥＧＦＲ−ｍｕｔ株において、ＥＧＦＲ下流のシグナル伝達に相対的に少ない効果を示す。受容体の下向き調節に関して、２つの抗体の間に相当な差があると思われる。セツキシマブは、ＰＣ９、Ｈ１９７５またはＨ３２５５などのＥＧＦＲ−ｍｕｔ細胞で１〜２時間培養した後、全ＥＧＦＲレベルを著しく減少させることが示されたが、抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂは、２４時間の培養後、受容体の任意の相当な下向き調節も誘導しなかった。最後に、セツキシマブがＥＧＦＲ−ｗｔ、頭頸部がん細胞株、皮下腫瘍において、アポトーシスおよび腫瘍の退縮の誘導を増幅させることが報告されたが、ＰＣ９異種移植におけるゲフィチニブの効果を向上させることができなかった。
【００４２】
対照的に、抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂが、ＰＣ９および試験された残りのＥＧＦＲ−ｍｕｔ細胞株において、ＥＧＦＲ  ＴＫＩの抗増殖活性を強化することが以前発見された。この強化効果は、ＰＣ９−ＧＲ４細胞を除き、全てのケースにおいて統計的有意性に到達した。抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂが受容体の代わりにリガンドを標的とし、ＥＧＦＲ下向き調節を誘導しないという事実は、セツキシマブの効果と抗ＥＧＦ抗体の効果との間で発見された差に関して、考えられる説明を提供し得る。
【００４３】
また、抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂの添加は、ＰＣ９細胞株においてゲフィチニブやアファチニブに耐性のあるクローンの出現をかなり遅延させることが以前発見された。抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂの追加は、前記ＴＫＩ誘導ＳＴＡＴ３の活性化を持続的に抑制する。対照的に、ｐＳＴＡＴ３は、セツキシマブで進行する頭頸部ヒト腫瘍において上昇することが示され、これは、ＳＴＡＴ３の活性化がこの薬物への耐性に関係していることを示唆している。
【００４４】
要約すると、抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂは、ＥＧＦの効果を抑制し、ＥＧＦＲ突然変異ＮＳＣＬＣ細胞株においてＥＧＦＲ  ＴＫＩの抗腫瘍活性をかなり向上させた。これらはまた、ＳＴＡＴ３の活性化を遮断し、ＡＸＬの発現を減少させ、耐性の獲得を遅延させた。よって、ＡＬＫ阻害剤は、抗ＥＧＦ  ＶａｃＡｂの利点を得られることが考えられる。
【００４５】
ＡＬＫは、細胞外刺激に対する反応として細胞の増殖、生存および分化の基本的なメカニズムを制御する神経系の発達および機能において重要な役割を行うと考えられる。ヒトがんにおいて最も一般的なゲノムＡＬＫ異常は、染色体の再編成であって、融合遺伝子を生成する。ＡＬＫ融合は、キナーゼ触媒ドメインを維持する２番染色体に由来するＡＬＫの３’の半分およびプロモータを提供する異なる遺伝子の５’部分の融合から発生する。多数の異なる５’パートナーが確認されている。野生型ＡＬＫは、一般にリガンドがその細胞外ドメインに結合して活性化し、キナーゼドメインの二量体化や自己リン酸化をもたらす。構造的研究によると、多数の５’パートナーとの融合は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）でＮＰＭ１−ＡＬＫおよびＥＭＬ４−ＡＬＫにより立証されているように、かかる要求事項を迂回してＡＬＫの発がん可能性を増加させることを促進する。増加した複製数およびキナーゼ活性化をもたらす活性化点突然変異の存在はまた、ＡＬＫの発がん活性と関係している。かかる遺伝子変化は、肺がん、神経芽細胞腫・横紋筋肉腫、腎細胞がん、炎症性筋線維芽細胞腫（ＩＭＴ）、炎症性乳がんを含むがこれらに限定されない多発性悪性腫瘍から発見される。
【００４６】
便宜上、本明細書、実施例および添付の請求範囲で用いられる特定の用語は、以下にまとめる。他に明記したり文脈に内在していない限り、以下の用語と語句は、後述の意味を含む。明らかに他に明記したり、文脈で明らかでない限り、下記の用語と語句は、当該用語または語句が関連する技術分野で得た意味を排除しない。本発明の範囲は、請求範囲によってのみ限定されるため、その定義は、特定の実施形態の説明を助けるために提供され、請求された発明を限定するものではない。他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４７】
通常、本明細書において、用語「減少する」、「低減する」、「低減した」、「低減」、「減少」および「抑制される」は、いずれも基準に比べて統計的に有意な量の減少を意味するものに用いられる。しかし、疑念を回避するために、通常、「減少する」、「減少」、「低減する」または「抑制される」は、基準レベルと比較して、少なくとも１０％程度の減少を意味し、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、例えば、基準レベルと比較して提供された個体または媒介変数が全くなかったり、または提供された治療がない場合に比べて１０〜９９％減少した場合までを含む。
【００４８】
通常、本明細書で用いられる用語「増加した」、「増加する」、「強化する」または「活性化する」は、全て静的に有意な量による増加を意味するために用いられ、疑念を回避するために、「増加した」、「増加される」、「強化する」または「活性化する」という用語は、基準レベルと比較して、少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または１００％の増加、または１０〜１００％の間の任意の増加を含むか、または基準レベルと比較して、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍または少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍または２倍〜１０倍以上の任意の増加を意味する。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「単離した」または「部分的に精製された」は、核酸またはポリペプチドの場合において、その天然源で発見されるものと同じ核酸またはポリペプチドと共に存在したりおよび／または分泌されたポリペプチドの場合において、分泌されたり細胞によって発現される場合、核酸またはポリペプチドと存在する少なくとも１つの他の成分（例えば、核酸またはポリペプチド）から分離した核酸またはポリペプチドを意味する。化学的に合成された核酸またはポリペプチド、あるいは試験管内転写／翻訳を用いて合成された核酸またはポリペプチドは、「単離した」ものとみなされる。「精製された」または「実質的に精製された」という用語は、被験体の核酸またはポリペプチドを少なくとも９５重量％、例えば、少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９８重量％、少なくとも９９重量％以上単離した核酸またはポリペプチドをいう。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、隣接した残基のαアミノおよびカルボキシル基間のペプチド結合によって、他のアミノ酸残基に連結した一連のアミノ酸残基を表すために、本明細書において同一の意味で用いられる。本明細書にて同一の意味で用いられる用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、サイズまたは機能に関係なく、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含むタンパク質アミノ酸のポリマーを意味する。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関して用いられる場合が多く、用語「ペプチド」は、小さなポリペプチドに関して用いられる場合が多いが、技術分野でこれら用語の使用は重複する。本明細書において、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、エンコードされた遺伝子生成物およびその断片を言及する場合に、同一の意味で用いられる。
【００５１】
従って、例示的なポリペプチドまたはタンパク質は、遺伝子生成物、天然発生のタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片およびこれらの他の等価物、変異体、断片、並びに類似体を含む。
【００５２】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を通じてタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質などの標的を認識し、特異的に結合する任意の免疫グロブリン分子を含む。本明細書で用いられる用語は、最も広い意味で用いられ、抗体が所望の生物学的活性を表す限り、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖ断片など）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異、少なくとも２つの無傷抗体で生成された非特異的抗体などの多重特異的抗体、抗体部分を含む融合タンパク質および抗原認識部位を含むその他の修飾免疫グロブリン分子を含む。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれるこれらの重鎖定常ドメインの識別に基づく免疫グロブリンであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの任意の５つの主要部類、またはこれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）であり得る。様々な部類の免疫グロブリンは多様であり、公知のサブユニット構造および３次元の構成を有する。抗体は例えば、細胞毒性、毒素、放射性同位元素などといった他の分子と結合したり（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）、または、ありのままであり得る。抗体は、生体内でこれらを能動的に生成することで付与でき、またはモノクローナル抗体の受動投与によって付与できる。
【００５３】
本明細書にて同一の意味で用いられる「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡとＲＮＡを含む。前記ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは塩基、および／またはこれらの類似体、またはＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼ、または合成反応によってポリマーに組み合わせることができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびこれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【００５４】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造的特性を有する糖タンパク質である。抗体は、特定抗原に対する結合特異性を表す反面、免疫グロブリンは、一般に、抗原特異性が欠如した他の抗体類似分子および抗体を全て含む。例えば、後者の種類のポリペプチドは、リンパ系によって低いレベルで、また骨髄腫によって増加したレベルで生成される。
【００５５】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、広い意味で同様で用いられ、モノクローナル抗体（例えば、全長または無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、１価、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を表す二重特異性抗体）を含み、また、任意の抗体断片（以下に詳しく記載する）を含んでもよい。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化および／または親和性成熟し得る。
【００５６】
重鎖定常ドメインのアミノ酸配列によって、抗体（免疫グロブリン）が、様々な部類に割り当てられる。５つの主要免疫グロブリンであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの部類があり、これらのうち幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＡ−１、ＩｇＡ−２などにさらに区分され得る。様々な部類の免疫グロブリンに相応する前記重鎖定常ドメインはα、δ、ε、γおよびμとそれぞれ呼ばれる。様々な部類の免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構造は公知となっており、例えば、一般に、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４ｔｈ  ｅｄ．（２０００）に記載されている。抗体は、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドと、前記抗体の共有結合または非共有結合によって形成される、より大きな融合分子の一部であってもよい。
【００５７】
本明細書において、用語「全長抗体」、「無傷抗体」および「全抗体」は同一の意味で用いられ、実質的に無傷型の抗体を意味するものであって、以下に記載の抗体断片を意味するものではない。特に、前記用語は、前記Ｆｃ領域を含む重鎖を有した抗体を意味する。
【００５８】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部のみを含み、前記部分は、無傷抗体に存在する場合、その部分と通常関連する機能のうち少なくとも１つ、好ましくは殆どまたは全てを維持することが望ましい。１つの実施形態において、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合部位を含み、そのため、抗原を結合する能力を維持する。別の実施形態において、例えばＦｃ領域を含む抗体断片は、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調整、ＡＤＣＣ機能および補体結合などの無傷抗体に存在する場合のＦｃ領域と一般に関連する生物学的機能のうち、少なくとも１つを維持する。１つの実施形態において、抗体断片は、無傷抗体と実質的に同一の生体内半減期を有する１価抗体である。例えば、このような抗体断片は、前記断片に対する生体内の安定性を付与できるＦｃ配列と連結した抗原結合アーム上に含んでもよい。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の個体群から得られた抗体を意味し、即ち、個体群を含むそれぞれの抗体は、少量で存在し得る自然発生する突然変異を除いては、本質的に同一のアミノ酸配列を含む。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一抗原に対して誘導される。また、通常、相違する決定基（エピトープ）に対して誘導された相違する抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは異なり、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して誘導される。
【００６０】
本明細書において、具体的に、モノクローナル抗体は、所望の生物学的な活性（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７；ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））を示す限り、前記のような抗体の断片だけでなく、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体中の相応する配列と同一もしくは相同である、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属するが、鎖の残部は他の種に由来する抗体に由来する抗体中の相応する配列と同一もしくは相同である、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する「キメラ」抗体を含む。
【００６１】
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成された抗体のアミノ酸配列に相応し、および/または、本明細書に開示しているようなヒト抗体を製造するための任意の技術を用いて製造されたアミノ酸配列を有するものである。具体的に、前記ヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。
【００６２】
本明細書に提供する範囲は、範囲内における全ての値に対する縮約型であることが理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０からなる群の任意の数、数の組み合わせ、下位範囲だけでなく、例えば、上述の整数との間に介在する１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８および１．９などの全ての十進数値を含むことが理解される。下位範囲に関して、その範囲の両側の終点から延びる「内包した下位範囲」が具体的に考慮される。例えば、１〜５０の例示的な範囲における内包した下位範囲は、一方向には１〜１０、１〜２０、１〜３０および１〜４０、他方向には５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０および５０〜１０を含み得る。
【００６３】
本明細書に用いられる用語「被験体」は、細菌感染を起こし得る任意の有機体を意味する。かかる有機体は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、サル、鳥類、爬虫類などを含むが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書で用いられる「腫瘍」は、悪性または良性の、全ての前がん性およびがん性細胞および組織を含む全ての腫瘍細胞の成長と増殖を意味する。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」という用語は、本明細書で言及されているように互いに排他的ではない。
【００６５】
用語「がん」および「がん性」は、一般に非調節の細胞の成長／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的条件を意味または説明する。がんの例としては、上皮がん、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫や白血病を含むが、これらに限定されない。かかるがんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん、すい臓がん、膠芽腫、子宮頸部がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、へパトーマ、乳がん、結腸がん、大腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん腫および各種の頭頸部がんが含まれる。
【００６６】
本明細書に用いられる「治療」は、治療される個人または細胞の自然経過を変更しようとする臨床的介入を意味し、予防または臨床病理学の過程の中で行うことができる。治療の望ましい効果は、疾病の発生または再発防止、症状の軽減、疾病の任意の直接または間接的な病理学的結果の減少、炎症および／もしくは組織／器官損傷の予防または減少、疾病進行率の緩和、病状の改善または緩和、並びに緩和または改善された予後を含む。一部の実施形態において、本発明の抗体は、疾病または障害の発現を遅延させるために用いられる。
【００６７】
「ＢＶＮ２２Ｅ核酸分子」は、ＢＶＮ２２Ｅポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＢＶＮ２２Ｅ核酸分子は、以下で再現される。
【００６８】
（配列番号１）：
【００６９】
【数１】
2021534094.tif 000002
【００７０】
「ＢＶＮ２２Ｅポリペプチド」は、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸類似性（以下のアミノ酸変化を除く：Ｔ２Ｓ、Ｅ３Ｄ、Ｎ４Ｓ、Ｄ５Ｅ、Ｅ１１Ｄ、Ａ１２Ｇ、Ｖ３８Ｉ、Ｆ４４Ｙ、Ｒ４８Ｋ、Ｄ５１ＥおよびＡ５２Ｌ）を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。
【００７１】
（配列番号２）：
【００７２】
【数２】
2021534094.tif 000003
【００７３】
「薬剤賦形剤」は、薬学業界で一般に用いられるものを意味し、特に「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．Ｒｏｗｅ,  Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｓｈｅｓｋｅｙ,  Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｗｅｌｌｅｒ−４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００３）の全体の内容を含む。
【００７４】
本発明の物質／分子の「治療学的有効量」は、患者に所望の反応性を導き出すために、患者の病状、年齢、性別および体重、並びに物質／分子の能力などの因子によって変わり得る。また、治療学的に有益な効果が物質／分子の任意の毒性または有害な効果よりも上回るものが治療学的有効量である。「予防的有効量」は、所望の予防的結果を得るために必要な投与量および必要な期間の効果的な量を意味する。疾病の初期段階または初期段階以前に被験体に予防量が使用されるため、前記予防的有効量は治療学的有効量よりも少なくてもいいのが一般的であるが、必須ではない。
【００７５】
「化学療法剤」は、がん治療に有用な化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパやＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）のシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブルスファン、インプロスルファンやピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボクオン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン並びにメチラメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチンおよび９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（これらのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エルウテロビン；パンクラティスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、チョロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミン・オキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンやラニムスチンなどのニトロスレア；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩ１およびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ,  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ、Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．,３３：１８３−１８６（１９９４）参照）などの抗生物質；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラミシン；また、ネオカルジノスタチン発色団および関連のクロモタンパク質エンジイン抗生発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アゼセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルチノフィルリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＬＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソームインジェクション（ＤＯＸＩＬ（登録商標））およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソラビシン（ｅｓｏｒａｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロ��イシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾトシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロンや５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝物；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎；フォリン酸などの葉酸補充剤；アセグルラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；エリプチニウム酢酸塩；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンやアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロゾキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）の多糖類錯体（米国オレゴン州ユージーンのＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）；レゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２,２’,２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン加工ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンやカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；レウコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；これらの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリ��チン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、並びにオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））と５−ＦＵおよびロイコボビンが組み合わされる治療計画の略語であるＦＯＬＦＯＸなどの前記の２つ以上の組み合わせが含まれる。
【００７６】
「患者の反応」は、（１）減速および完全な阻止を含む疾病進行の、ある程度までの抑制、（２）疾病発症および／または症状の数の減少、（３）病変サイズの減少、（４）隣接する抹消器官および／または組織への疾患細胞の浸潤の抑制（即ち、減少、減速または完全な停止）、（５）疾病拡散の抑制（即ち、減少、減速または完全な停止）、（６）病変の退行または切除をもたらし得る細胞の増殖、浸潤または転移の減少、（７）障害と関連する１つ以上の症状の、ある程度の軽減、（８）治療後の無病期間の増加；および／または（９）治療後の特定の時点での死亡率の減少を含む患者に利点を示す任意のエンドポイントを用いて評価できるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
「組織または細胞のサンプル」は、被験体または患者の組織から得られた類似細胞の集まりを意味する。組織または細胞サンプルの供給源は、新鮮な、凍結および／もしくは保存された臓器または組織サンプルまたは生検または吸引物から得られる固体組織；血液または任意の血液成分；脳脊髄液、羊水、腹水または間質液などの体液；被験体の妊娠期または発達期における任意の時期の細胞であってもよい。また、前記組織サンプルは、１次細胞、培養細胞または細胞株であってもよい。場合によっては、前記組織または細胞サンプルは、疾病組織／器官から得られる。前記組織サンプルは、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養剤、抗生剤などの、本来は組織と自然に混合しない化合物を含有してもよい。
【００７８】
（ＡＬＫ阻害剤）
ＡＬＫ遺伝子の変化に対する治療的意味は、主にＡＬＫ阻害剤に対する腫瘍の反応を予測するＡＬＫ遺伝子融合と関連がある。クリゾチニブ、セリチニブ、および最近のアレクチニブは、腫瘍がＡＬＫ融合に対して陽性である転移性ＮＳＣＬＣ患者の治療のためにＦＤＡから承認を受けた。初期の第１相研究では、クリゾチニブがＡＬＫ融合陽性転移性ＮＳＣＬＣ患者において一貫した反応をもたらすということを示す。クリゾチニブのＦＤＡ承認から続いた２つの第３相研究では、クリゾチニブが未治療の進行したＡＬＫ再編成ＮＳＣＬＣ患者において、標準の１次ペメトレキセド＋シスプラチン化学療法よりも優れていることがさらに確認された。
【００７９】
クリゾチニブは、ＡＬＫ融合陽性であるＮＳＣＬＣ患者において優れた活性を示したが、病気の進行につながる耐性の発達により、平均ＰＦＳが１３ヶ月である持続的な反応は依然として稀である。耐性機序は依然として明らかになっていないが、ＡＬＫキナーゼドメイン（Ｆ１１７４Ｌ、Ｆ１１７４Ｃ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｇ１２０２Ｒ、Ｓ１２０６Ｙ、Ｇ１２６９ＳおよびＧ１２６９Ａ）またはＡＬＫ遺伝子の増幅で得た２次突然変異が耐性に関係していることが知られている。耐性はまた、上皮成長因子経路、インスリン様成長因子経路、ＲＡＳ／ＳＲＣのシグナル伝達、およびＡＫＴ／ｍＴＯＲのシグナル伝達などを含むクリゾチニブの有効性を妨害する代替となるＡＬＫ独立生存経路の活性化により媒介できる。
【００８０】
ＡＬＫ阻害剤であるブリガチニブとロルラチニブは、公知の様々な耐性突然変異を抑制し、ロルラチニブは、Ｇ１２０２Ｒ突然変異に対して効果的な抑制を示す。かかる結果は、治療に対する反応を最適化するために、耐性機序への理解や適切なチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の選択が必要であり得ることを示唆している。
【００８１】
ＡＬＫを直接標的とすることに加えて、間接標的を許容する薬理学的戦略がある。特に、肺がんにおいて熱ショックタンパク質、即ち、ＨＳＰ９０を標的とすることにより、ＡＬＫを間接的に抑制するのに成功した。ＡＬＫを含む多様なタンパク質を安定化させるシャペロン・タンパク質であるＨＳＰ９０の抑制は、肺がんモデルの２次耐性突然変異を含むクリゾチニブ耐性ＡＬＫ融合（ＥＭＬ４−ＡＬＫおよびＮＰＭ１−ＡＬＫ）で一部臨床前効力を示す。
【００８２】
ＡＬＫ再編成の腫瘍は、現在利用可能なＡＬＫ阻害剤により効果的に標的化できる腫瘍の特定のサブセットを示す。かかる理由により、このような分子異常があると知られている腫瘍のＡＬＫ変形に対する試験は、今や診断の必須の部分である。ＦＩＳＨ、腫瘍組織の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、および循環する腫瘍細胞のシーケンシングは、ＡＬＫの変化が見られる腫瘍を検出する代案の方法や種々補完的な方法を提供する。ＴＫＩ治療中に殆ど避けられない耐性の出現は、新たなＡＬＫ阻害剤およびその他の新規な治療戦略で標的化され得る耐性機序を識別するために、再発時の腫瘍の再生検を必要とする。
【００８３】
クリゾチニブは、アミノピリジン構造を有し、標的キナーゼのＡＴＰ結合ポケット内で競争的に結合することで、タンパク質キナーゼ阻害剤として機能する。非小細胞性肺がん患者の約４％は、ＥＭＬ４（「棘皮動物微小管関連タンパク質様４」）とＡＬＫ（「未分化リンパ腫キナーゼ」）との間に融合遺伝子を生成する染色体再編成を有しており、これは、発がんの一因となり、悪性の表現型を誘導すると見られる構成的キナーゼ活性をもたらす。融合タンパク質のキナーゼ活性は、クリゾチニブにより抑制される。この遺伝子融合患者は、一般に上皮成長因子受容体遺伝子（ＥＧＦＲ）またはＫ−Ｒａｓ遺伝子に突然変異がない若い非喫煙者である。ＡＬＫ突然変異は、非常に幼い子供にほぼ独占的に発生する珍しい形の末梢神経系がんである神経芽細胞腫のケースの約１５％で悪性の表現型を誘導するのに重要であると思われる。クリゾチニブは、様々な他の組織学的形態の悪性新生物の腫瘍形成に関与するｃ−Ｍｅｔ／肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）チロシンキナーゼを抑制する。
【００８４】
アレクチニブは、進行した非小細胞肺がんの選択された形態の治療に用いられるチロシンキナーゼ受容体阻害剤および抗腫瘍剤である。アレクチニブは、治療中に血清アミノトランスフェラーゼレベルの適度な一時的上昇率および臨床的に明らかな急性肝損傷の珍しいケースと関連がある。
【００８５】
アレクチニブは、抗腫瘍活性を有する経口投与可能な、受容体チロシンキナーゼ未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤である。投与時、アレクチニブは、ＡＬＫキナーゼ、ＡＬＫ融合タンパク質だけでなく、小分子キナーゼ阻害剤に対して得た耐性機序の１つとして知られているゲートキーパ突然変異ＡＬＫＬ１１９６Ｍに結合してこれを抑制する。抑制は、ＡＬＫ媒介シグナル伝達の乱れにつながり、結果、ＡＬＫ過発現腫瘍細胞において腫瘍細胞の成長を抑制する。ＡＬＫは、インスリン受容体スーパーファミリーに属し、神経系の発達に重要な役割をする。ＡＬＫ調節障害および遺伝子再編成は一連の腫瘍と関連がある。
【００８６】
アレクチニブは、６,６−ジメチル−５,６−ジヒドロ−１１Ｈ−ベンゾ［ｂ］カルバゾール−１１−オンである有機ヘテロテトラシクリック化合物であって、それぞれ３、８および９位で、シアノ、４−（モルホリン−４−イル）ピペリジン−１−イルおよびエチル置換基をさらに運搬する。未分化リンパ腫キナーゼ陽性の転移性非小細胞肺がん患者の治療に（塩酸塩として）用いられる。これは、ＥＣ  ２．７．１０．１（受容体タンパク質チロシンキナーゼ）阻害剤および抗腫瘍剤の役割をする。これは、有機ヘテロテトラシクリック化合物、モルホリンの要素、ピペリジンの要素、ニトリルおよび芳香族ケトンである。これは、アレクチニブ（１＋）の共役塩基である。
【００８７】
ブリガチニブは、広範囲なＡＬＫ突然変異およびＲＯＳ１再編成を標的とする次世代ＡＬＫ阻害剤である。現在はまた、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）をエンコードする遺伝子に突然変異がある細胞株において活性を有する唯一のＡＬＫ阻害剤である。クリゾチニブに不応性疾患のある２２２人の患者が参加したＡＰ２６１１３（ＡＬＴＡ）の肺がん試験におけるＡＬＫにおいて、（１１０人の患者に９０ｍｇで７日間誘導した期間を含む）１日１回１８０ｍｇの推奨容量で投与されたブリガチニブは、高い全身およびＣＮＳ反応率と、１６．７ヶ月のメジアン無進行生存率と関連があった。同一の療法が、第１、２相試験でクリゾチニブが投与された患者のうち同様の無進行生存（１６．３ヶ月）と関連があった。無進行生存率のメジアン率は、かかる患者のうち、他の次世代ＡＬＫ阻害剤（アレクチニブ、セリチニブ、エンサルチニブおよびロルラチニブを含む）と関連したものよりも高い。
【００８８】
シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、多くのヒトがんで活性化し、細胞周期の進行、抗アポトーシス、細胞生存および血管新生に関与する幾つかの遺伝子の転写を調節する発がん性転写因子である。
【００８９】
ＳＴＡＴ３は、ＥＧＦＲ、ＪＡＫ２、並びに、ＥＧＦ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および他のサイトカインによって活性が介在し得る他のチロシンキナーゼによって活性化し得る。従って、ＳＴＡＴ３は、多くのシグナル伝達経路の収束点であり、腫瘍形成および腫瘍転移において主要な役割をする。ＳＴＡＴ３は、多様な形態の突然変異ＥＧＦＲによって活性化し、線維芽細胞およびヒト肺がん細胞において、これらの突然変異の発がん作用の一因であると考えられる。
【００９０】
リガンド結合または突然変異による活性化後、ＥＧＦＲは、転写および翻訳後のメカニズムを介して細胞の生物学的特性を変化させるシグナル伝達経路のカスケードを開始する。これらの変更を媒介するシグナル伝達経路は、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ミトゲン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスホイノシチド３−キナーゼ−ＡＫＴ、並びにシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）３およびＳＴＡＴ５シグナル伝達経路が含まれる。ＳＴＡＴ系転写因子は、保存したチロシン残基のリン酸化によって活性化して、二量体化、核転座およびＤＮＡ結合を誘導する。また、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５は、ＣＯＯＨ末端のセリン残基上でリン酸化し、前記リン酸化は、二量体化、核転座およびＤＮＡ結合に必要でないが、一部遺伝子の最大の転写活性に求められると考えられる。
【００９１】
幾つかの非小細胞肺がん細胞株は、構成的活性型のＳＴＡＴ３を含んでいる。最近、遺伝的に定義されているシステムにおいて、ＳＴＡＴ３がかかるＥＧＦＲ突然変異の幾つかによって活性化することが確認された。しかし、突然変異ＥＧＦＲの下流のシグナル伝達経路のどれが発がん性を媒介するのに必要かは知られていないが、広範囲なヒト悪性腫瘍におけるＳＴＡＴ３の役割と、様々な細胞類型におけるＥＧＦによって活性化するという事実を考慮すると、ＳＴＡＴ３は、体細胞突然変異ＥＧＦＲの発がん作用において必須であると考えられる。ＳＴＡＴ３は、突然変異ＥＧＦＲを発現する線維芽細胞だけでなく、自然発生のＥＧＦＲ突然変異を有する２つのＮＳＣＬＣ株でも活性化し、かかる活性化は、これらの細胞の形質転換および生存に必要であることが報告されている。
【００９２】
ＳＴＡＴ３の活性化は、リガンド−受容体の相互作用を含む場合が多い。ＳＴＡＴ３は、インターフェロン、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびインターロイキン（ＩＬ−６）ファミリーのサイトカインを含む多くの様々なサイトカインによって活性化し得る。サイトカインがそれらの同族受容体に結合すると、ＪＡＫのリン酸化、ＳＴＡＴ３の二量体化、核の転座、ＤＮＡの結合および遺伝子の活性化につながる（１２、１３）。また、ＳＴＡＴ３のリン酸化は、Ｓｒｃファミリーキナーゼなどの細胞質チロシンキナーゼによって誘導されることもある（１４）。ＮＳＣＬＣ、乳がんおよび頭頚部がんを含む多くの原発性腫瘍標本および腫瘍由来の細胞株において、上昇したＥＧＦＲの活性およびＳＴＡＴ３の活性化は、正の相関関係があることが報告されている。
【００９３】
増加したＳＴＡＴ３の活性は、突然変異ＥＧＦＲを発現する肺腺がんおよび細胞株で観察される。特定の理論にしばられず、ＳＴＡＴ３は、突然変異ＥＧＦＲによって要求され、その下流の表現型効果において必須であると考えられる。線維芽細胞におけるＳＴＡＴ３の機能を抑制すると、突然変異ＥＧＦＲによる形質転換が中断される。残念ながら、ＴＫＩおよびＡＬＫ阻害剤などの標的療法は、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＳＴＡＴ３の活性を完全に除去することができない。
【００９４】
以前の研究では、突然変異ＥＧＦＲがＩＬ−６の上向き調節を通じて、ｇｐ１３０／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３経路の活性化を誘導することを主張していた。ＮＳＣＬＣ試料において、ＩＬ−６およびＩＬ−６受容体成分ｇｐ８０およびｇｐ１３０の腫瘍発現が見つかった（２０）。また、ＩＬ−６およびＩＬ−８などの炎症性サイトカインの増加したレベルがＮＳＣＬＣの腫瘍形成および予後と関連することも観察された。これは、ＩＬ−６およびその下流経路がＥＧＦＲ突然変異を有するＮＳＣＬＣ患者の標的となる可能性があることを示す。しかし、ＮＳＣＬＣにおいて、発がん性ＥＧＦＲ突然変異によるＩＬ−６誘導についてのメカニズムはまだ明らかでないが、肺がんにおいて、ＮＦ−ｋＢおよびＳＴＡＴ３シグナル伝達がＩＬ−６自己分泌を調節すると考えられる。
【００９５】
本発明の一態様によると、抗ＥＧＦ抗体は、ＥＧＦ−ＥＧＦＲ結合（ｍＡｂ）によって活性化した経路の抑制のために、本発明による未分化リンパ腫キナーゼ阻害剤（ＡＬＫ阻害剤）と抗ＥＧＦ抗体とを併用するための柔軟かつ積極的なレジメンをそのような治療を必要とする患者に投与することにより、ＥＬＭ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現する脱制御されたヒト上皮成長因子受容体によって誘導されたがんを患う患者の治療に用いられ、ここで、ＡＬＫ阻害剤は、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンに従って投与し、本発明によるＥＧＦ  ＴＰＩは、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量を達成する投薬計画に従って同時に施す。
【００９６】
本発明のさらなる一態様によると、抗ＥＧＦ抗体は、ＡＬＫ阻害剤と、ＥＧＦに対する免疫反応を生成するワクチンとを併用するための柔軟かつ積極的なレジメンをそのような治療を必要とする患者に投与することにより、ＥＬＭ４−ＡＬＫ融合遺伝子を発現する脱制御されたヒト上皮成長因子受容体によって誘導されたがんを患う患者のワクチン接種によって生成され、ここで、ＡＬＫ阻害剤は、約１０〜２５０ｍｇの範囲の１日平均投与量に基づく連続したレジメンに従って投与し、本発明によるワクチンは、１週間に３回、２回もしくは１回、２週間に１回、３週間に１回または少なくとも１ヶ月に１回繰り返される治療有効量を達成する投薬計画に従って同時投与する。
【００９７】
本発明の方法は、ＮＳＬＣの治療に限定されない。代わりに、本発明の方法によって証明された生体分子経路および本発明の方法によって取り除かれたＡＬＫ阻害剤耐性が、他の病状の治療に適用され得ることを容易に理解し、ＡＬＫ阻害剤を用いた治療の任意の病状は、治療中の患者に有益な結果をもたらし得る。「有益な結果」とは、病状の重症度の軽減、病状悪化の防止、病状の治療および患者の寿命や期待寿命の延びなどが含まれ得るが、これらに限定されない。これらの病状は、本発明の方法により臨床的に影響され得る任意の他のキナーゼまたはＥＧＦＲによって調節される、またはこれと関連し得る。
【００９８】
より具体的に、下記の実施例に記載の本発明者の実験研究は、ＥＧＦＲシグナルカスケードの効果的な抑制を立証するこれらの腫瘍に対する分子研究において、毎日の投薬計画でのＡＬＫ阻害剤の臨床活性を立証した。実施例は、分子研究が他のモデルシステムにおいて観察されたこれらのＡＬＫ阻害剤の挙動を適切に反映したことを確認した。また、驚くことに、本発明は、かかる抗体を産生するワクチンの投与によって受動的に投与されるか、能動的に産生される抗ＥＧＦ抗体と併用されたＡＬＫ阻害剤が、従来のＡＬＫ阻害剤の治療に対して耐性を示した腫瘍においても、分子モデルでの腫瘍の成長を効果的に抑制できることを立証する。
【００９９】
例示的な一実施形態において、前臨床研究に用いられた抗ＥＧＦ抗体は、ＰＣＴ出願のＷＯ２０１９／０１６５９７  Ａ２（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ．）に記載のように、ＢＶＮ２２Ｅワクチンにより免疫化することにより能動的に産生される。本発明の範囲内において、ＥＧＦまたはＥＧＦＲに対する免疫反応を生成する他のワクチン製剤を用い得ることが考慮されている。また、本発明の範囲内において、他の成長因子またはその受容体に対する免疫反応を生成するワクチンを用い得ることが考慮されている。特に、その全体の内容が参照として含まれるＷＯ２０１９／０１６５９７  Ａ２に記載されている免疫原性タンパク質ＢＶＮ２２Ｅは、本発明による抗ＥＧＦ抗体を産生するのに用いられ得る。
【０１００】
ＢＶＮ２２Ｅは分子量が約１２０ｋＤｔであり、そのＥＧＦドメインは、β−ループを示すまたは制限する領域、例えば、合成タンパク質配列の約システイン６〜約システイン４２によって規定された領域、または約システイン６〜約システイン３１によって規定された領域、またはシステイン２２〜約システイン３３によって規定された領域、またはシステイン２２〜システイン３１によって規定された領域、または約システイン１４〜約システイン６２によって規定された領域を含む。特定の理論にしばられず、システイン６とシステイン４２の間の相違する領域または下位領域が合成タンパク質／分子に統合されるとき、有益な効果を有し得ることが考えられる。システイン６とシステイン１４の間の領域、システイン６とシステイン２０の間の領域、システイン６とシステイン３１の間の領域、システイン６とシステイン３３の間の領域、およびシステイン６とシステイン４２の間の領域は、有益な効果を有し得る。また、逆順次配列が有益であり得ることも考慮される。例えば、システイン４２とシステイン３３の間の領域、システイン４２とシステイン３１の間の領域、システイン４２とシステイン２０の間の領域、システイン４２とシステイン１４の間の領域、およびシステイン４２とシステイン６の間の領域は、有益な効果を有し得る。本発明の範囲内において、システイン６とシステイン４２の間の領域内における特定間隔が本発明の合成タンパク質／分子に統合されるとき、有益な効果を提供し得ることがさらに考慮される（例えば、システイン６とシステイン１４の間の領域、システイン１４とシステイン２０の間の領域、システイン２０とシステイン３１の間の領域、およびシステイン３３とシステイン４２の間の領域）。
【０１０１】
ＢＶＮ２２Ｅおよびその成長因子エピトープの発現は、これらの天然立体構造が実質的に維持され、前記エピトープに対する強力な宿主免疫反応を誘導する方式で、宿主免疫系の成分に提示されるように折り畳まれる。合成タンパク質／分子のエピトープ支持ドメインをモデリングするのに好適な天然タンパク質モデルの例は、コレラ毒素Ｂサブユニット、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）熱不安定ＬＴおよびＬＴ−ＩＩエンテロトキシンＢサブユニット、ベラトキシン、百日咳毒素、カンピロバクター（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）エンテロトキシン、志賀毒素、リステリア毒素、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、髄膜炎菌（Ｎ．Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓｌ）外膜タンパク質、バクテリオファージ被膜タンパク質、アデノウイルスおよびその他ウイルス被膜タンパク質を含むが、これらに限定されない。また、タンパク質の非自己成分は小さいこともある。最小限として、非自己配列は、約９個、１０個、１１個またはそれ以上のアミノ酸長を含み、少なくとも１つのヒトＴ細胞エピトープを全体的に若しくは部分的に含まなければならない。コレラ毒素Ｂサブユニットは、タンパク質全体に免疫原性を付与し、宿主免疫系に成長因子、受容体、腫瘍抗原またはそのエピトープを適切に提示し得る要件を満たすのに用いられ得る。
【０１０２】
ＢＶＮ２２Ｅは、乳がん、肺がん（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、卵巣がん、外陰がん、結腸癌、肺がん（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、脳がん、大腸がん、腸がん、頭頸部がん、および食道がんなどの慢性疾患の治療に有用であり得る。異なる腫瘍抗原が発現し、前記疾患において多数の細胞受容体および成長因子が過剰に発現し得るため、本明細書に記載のタンパク質は、１つ以上の異なる腫瘍抗原、１つ以上の異なる受容体、または前記疾患に関する１つ以上の多数の細胞経路の成長因子を含有し得る。このようなタンパク質を多価という。
【０１０３】
ＢＶＮ２２Ｅは、１つ以上の上皮成長因子（ＥＧＦ）中和ドメイン（例えば、ＴＳＰドメイン）を発現する均質な合成タンパク質／分子からなる合成タンパク質である。タンパク質は、合成タンパク質／分子の形態であり得、乳がん、肺がん（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、卵巣がん、外陰がん、結腸がん、肺がん（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、脳がん、大腸がん、頭頸部がん、および食道がんなどの慢性疾患の治療に有用であり得る。ＢＶＮ２２Ｅは、合成ＥＧＦ配列およびＣＴ−Ｂ配列を発現するか含む合成タンパク質／分子である。ＢＶＮ２２Ｅは、ＥＧＦと８０％未満の同一配列を含む合成タンパク質配列の成長因子成分を含有する。例えば、成長因子成分は、合成タンパク質配列の成長因子部分の免疫原性を増加させ得る１１のアミノ酸置換を有するＥＧＦ配列を含み得る。理論にしばられることなく、β−ループを「提示」するか制限するＥＧＦ領域（例えば、Ｃｙｓ６〜Ｃｙｓ３１によって規定された領域）は、合成タンパク質に含まさせることが重要であり、アミノ酸変形に対する標的になり得ると考えられる。
【０１０４】
ＢＶＮ２２Ｅは、１つ以上のリンカーまたはスペーサを含む。前記記載の１つ以上の実施形態は、合成分子のｓＥＧＦ部分がＧＧＳＧＧＴＳＧＧＧＧＧＳＧリンカーによってＣＴ−Ｂ部分から分離されるよう、ＣＴ−Ｂに融合されたｓＥＧＦを含む。このように得られた組換えタンパク質またはキメラタンパク質は、本質的にＣＴ−Ｂに直接融合されたｓＥＧＦを含む。他の実施形態において、キメラタンパク質のＥＧＦおよびＣＴ−Ｂ成分は、３〜１４のアミノ酸によって効果的に分離され、これにより、２つのドメインの間に柔軟なスペーサまたはリンカーを形成する。リンカーは、長さが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４のアミノ酸であり得ることが考慮される。成長因子がより大きなサイズ（例えば、ヒト成長因子）を有する一部の場合において、より長いリンカー配列を用いることが有用であり得る。また、ＳＳＧ、ＳＳＧＧＧ、ＳＧＧ、ＧＳＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＧＧＧＳ、ＳＳＧＧＧＳＧＧ、ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧ、ＴＳＧＧＧＳＧ、ＴＳＧＧＧＧＳＧＧ、ＳＳＧＧＧＳＧＧＳＳＧ、ＧＧＳＧＧＴＳＧＧＧＳＧ、ＳＧＧＴＳＧＧＧＧＳＧＧ、ＧＧＳＧＧＴＳＧＧＧＧＳＧＧ、ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳＧ、ＳＳＧＧＧＳＧＧＳＳＧＧＧおよびＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＳＧＧＧの例示的なリンカーが用いられ、これらを含むが、これらに限定されない。当業者は、有用なリンカー配列としても作用し得る主に「Ｇ」および「Ｓ」の他の多くの配列／組み合わせがあることを理解するであろう。
【０１０５】
ＢＶＮ２２Ｅは、相当な臨床的有益を提供すると考えられる。例えば、ＢＶＮ２２Ｅは、正確に折り畳まれ、機能的に安定したポリペプチドを生成しつつ、商業的な規模および純度によりバクテリアシステムで発現され得る。また、ＢＶＮ２２Ｅは、従来の技術の方法よりも必要な担体の量がかなり少ないので、ワクチン接種のために遥かに低いレベルのタンパク質を求める有利な特性を有している（例えば、Ｄａｖｉｌａ他、米国特許番号５，９８４，０１８）。これに関して、ＢＶＮ２２Ｅは、非常に少量のワクチンでより多くの成長因子を患者に伝達することができる。
【０１０６】
任意の理論にしばられることは望まないが、細胞増殖を担当する細胞シグナル伝達経路の刺激に必要なＳＴＡＴ３代謝経路のこうした抑制は、ＢＶＮ２２Ｅによって促進されると考えられる。また、本発明の併用投与計画によるＳＴＡＴ３のさらなる抑制は、細胞シグナル伝達の抑制または下向き調節に効果的であると考えられる。さらに、ＳＴＡＴ３も抑制されるので、従来のＡＬＫ阻害剤療法に耐性がある患者も、本発明の併用投与計画によって有利な抗腫瘍効果を得ることができる。本発明の併用療法は、通常のＡＬＫ阻害剤療法が失敗した疾状の障害と関連し得る。従って、本発明の方法は、細胞および分子レベルで従来の方法と異なって作動することで、ＡＬＫ阻害剤療法に対する耐性または非反応性を克服することができる。
【０１０７】
特定の実施形態において、ＡＬＫ阻害剤と抗ＥＧＦ抗体の併用投与量は、従来のＡＬＫ阻害剤療法に耐性のある個体において、がん、特に、肺がん、乳がん、および前立腺がんを治療するのに効果的であり得る。本発明の方法により治療され得る他の形態のがんとしては、胃がん、大腸がんおよび卵巣がんだけでなく、膠芽腫腫瘍を含むが、これらに限定されない。これらのがん形態それぞれは、相当なＥＧＦＲの発現を示すので、本発明の方法による治療のための好適な標的となる。
【０１０８】
本発明の方法により用いるのに好適なＡＬＫ阻害剤は、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブおよびロルラチニブ、またはその薬学的に許容される塩、若しくは等価物を含むが、これらに限定されず、全ては「ＡＬＫ阻害剤」という用語に含まれる。
【０１０９】
がんに対する所定の治療効能は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかし、本発明において、例えば、腫瘍の兆候や症状のいずれか、または全てが有益な方法で変更されたり、他の臨床的に許容される症状が本明細書に記載のような薬剤で治療した後、少なくとも１０％まで改善または向上する場合、治療は「効果的な治療」とみなされる。また、効能は、入院や医療介入の必要性により判定された個人の疾病が悪化しないこと（即ち、疾病の進行が止まること）によって評価され得る。かかる指標を測定する方法は、当業者に公知となっており、および／または本明細書に記載されている。
【０１１０】
疾病の治療のための有効量は、これを必要とする哺乳動物に投与される場合、本明細書で定義されているとおり、その疾病に対する効果的な治療をもたらすのに十分な量を意味する。薬剤の効能は、例えば、腫瘍サイズ、腫瘍質量、腫瘍密度、血管新生、腫瘍成長速度などのがんの物理的指標を評価することで決定され得る。また、本明細書に記載されている抗体もしくはその抗原結合部分を含む薬剤、または本明細書に記載されている抗体もしくはその抗原結合部分をエンコードする核酸で治療される被験体において、循環するＭＩＣペプチドまたはその断片の減少により薬剤の効能が測定され得る。
【０１１１】
本発明の実施形態に関する説明は、開示されている正確な形態に本発明を限定したり網羅的であることを意図してはいない。本発明の特定の実施形態および実施例は、説明を目的として本明細書に記載されているが、関連技術分野の当業者が分かるように、本発明の範囲内において様々な同等な修正が可能である。本明細書で提供する開示の教示は、他の手続きまたは方法に適切に適用され得る。本明細書で記載されている様々な実施形態を組み合わせて、また他の実施形態を提供することができる。必要に応じて、本発明の態様は、前記文献および出願の構成、機能および概念を用いるために修正され、また他の実施形態を提供することができる。本明細書の詳細な説明に照らして、本発明についてこのような変更およびその他の変更が行なわれ得る。
【０１１２】
上述した実施形態の任意の特定要素は、他の実施形態の要素と結合または代替され得る。また、本発明の特定の実施形態に関する利点がこれらの実施形態に関して説明されているが、他の実施形態もこのような利点を示すことができ、全ての実施形態が必ず本発明の範囲内に含まれるような利点を示す必要はない。
【実施例】
【０１１３】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これらに限定されるものではない。
【０１１４】
＜実施例１：非小細胞肺がん細胞株におけるＡＬＫ阻害剤と抗ＥＧＦ抗体との併用の効果＞
ＡＬＫ  ＴＫＩで治療を受けた患者は、ＥＧＦＲ  ＴＫＩで治療を受けたＥＧＦＲ突然変異の患者に比べて、より長い無進行生存期間を達成した。クリニックでは、患者の２０〜３０％が急速に耐性を有することになった。しかし、かかる患者に耐性が生じたり反応がないか否かは分かっていない。また、かかる患者においてＥＧＦが循環する効果が何なのかも明確でない。本発明は、ＴＫＩ耐性に対するＥＧＦの効果を扱っており、ＮＳＣＬＣ患者の主要ＡＬＫ再編成を含む２つの細胞株を用いる。
【０１１５】
以下のＡＬＫ  ＴＫＩ（クリゾチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ）と組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果は、ＮＳＣＬＣ患者の主要なＡＬＫ再編成を含む２つの細胞株において試験された。ＡＬＫ「再編成」は、多数の相違する突然変異を意味する。かかる株は図１に示しており、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合変異体ｖ１を含むＨ３１２２肺腺がんおよびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合変異体ｖ３を含むＨ２２２８肺腺がんは、ＡＬＫ再編成患者の約３０〜４０％を示す。
【０１１６】
全ての研究および得られた実施例は、ウサギで準備された抗ＢＶＮ２２Ｅ抗体で行われた後、精製された。２段階の精製過程において、免疫化されたウサギから収集した初期の血清を約１０倍希釈させた。全ての実験は、１〜１０倍の希釈が元々の力価の１〜１００倍希釈に相応するさらなる希釈で行われた。
【０１１７】
ブリガチニブとアレクチニブがＨ３１２２の細胞増殖に及ぼす効果を単独およびＥＧＦの存在下で測定した。結果は、図２Ａ−２Ｂのように、ブリガチニブおよびアレクチニブ単独はそれぞれ、ＥＧＦの存在下におけるブリガチニブおよびアレクチニブよりも、Ｈ３１２２の細胞増殖に対してさらに高い抑制効果を有していることを示す。同様に、クリゾチニブは、図３に示すように、ＥＧＦの存在下におけるクリゾチニブよりも、Ｈ３１２２の細胞増殖に対してさらに高い抑制効果を有した。図４に示すように、ＥＧＦの存在下において、Ｈ３１２２細胞におけるＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果は、７２時間の細胞増殖の分析で評価された。データは、対照抗体に比べて、ＢＶＮ２２Ｅ抗体がＨ３１２２の細胞生存能力の減少を誘発していることを立証した。
【０１１８】
次に、ＢＶＮ２２Ｅ抗体と組み合わせたＡＬＫ阻害剤の効果を測定した。Ｈ３１２２細胞の７２時間の細胞増殖に対する単一治療としてのアレクチニブの効果、またはＢＶＮ２２Ｅ抗体との組み合わせによるアレクチニブの効果を図５に示す。Ｈ３１２２細胞の７２時間の細胞増殖に対する単一治療としてのクリゾチニブの効果、またはＢＶＮ２２Ｅ抗体との組み合わせによるアレクチニブの効果を図６に示す。２つのＴＫＩ阻害剤ともに、阻害剤単独よりも、ＢＶＮ２２Ｅ抗体と阻害剤との併用により細胞生存能力が著しく減少したことを示しているが、ＢＶＮ２２Ｅ抗体と組み合わせたアレクチニブの効果の方が、クリゾチニブよりもさらに強かった。Ｈ３１１２２およびＨ２２２８の細胞生存能力に対する単一治療としてのブリガチニブおよびアレクチニブの効果、またはＢＶＮ２２Ｅ抗体との組み合わせによるブリガチニブおよびアレクチニブの効果を図７に示す。
【０１１９】
図８に示すように、Ｈ３１２２細胞におけるＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果は、１／２５、１／５０および１／２５０の濃度でＢＶＮ２２Ｅ抗体を２時間培養した後、ウェスタンブロットによって評価した。ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２の存在は特定のモノクローナル抗体で明らかになった。リン酸化された形態の分子に対する抗体も用いられた。Ｃは未処理の対照群細胞株のサンプルを示す。２番目のレーンは、ＥＧＦを受ける同一の対照細胞であり、他の全てのレーンは、対照抗体および抗ＢＶＮ２２Ｅ抗体の希釈である。これらのデータは、ｐＥＧＦＲの相当な抑制が生じているのに対し、ｐＡｋｔ、ｐＳｔａｔ３およびｐＥｒｋ１／２のレベルは変わらなかったことを示す。図９に示すように、Ｈ３１２２細胞におけるＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果は、１／２５、１／５０および１／２５０の濃度でＢＶＮ２２Ｅ抗体を２時間培養した後、ウェスタンブロットによって評価した。これらのデータは、ｐＥＧＦＲの相当な抑制が、ＢＶＮ２２Ｅ抗体と共に培養した後、２４時間維持されたことを立証している。図１０に示すように、Ｈ３１２２細胞におけるクリゾチニブの効果は、０．１、０．２５、０．５、１、２．５および５の濃度でクリゾチニブを２時間培養した後、ウェスタンブロットによって評価した。これらのデータは、ｐＳｔａｔ３の相当な抑制だけでなく、ｐＡｋｔの抑制が、クリゾチニブと共に培養した後、２時間観察されたことを立証している。
【０１２０】
ブリガチニブおよびアレクチニブがＨ２２２８の細胞増殖に及ぼす効果を単独およびＥＧＦの存在下で測定した。結果は、図１１のように、ブリガチニブおよびアレクチニブの単独はそれぞれ、ＥＧＦの存在下でのブリガチニブおよびアレクチニブよりも、Ｈ３１２２の細胞増殖に対してさらに高い抑制効果を有していることを示す。図１２は、Ｈ３１２２の７２時間の細胞増殖に対するクリゾチニブ単独およびＥＧＦの存在下での効果を示す。結果は、クリゾチニブ単独の方が、ＥＧＦの存在下でのクリゾチニブよりも、Ｈ３１２２の細胞増殖に対してさらに高い抑制効果を有していることを示す。図１３は、Ｈ２２２８細胞において、ＥＧＦの存在下でのＢＶＮ２２Ｅ抗体の細胞生存能力に対する効果を示す。さらに高い濃度のＢＶＮ２２Ｅ抗体で、細胞生存能力の相当な減少が観察された。
【０１２１】
次に、ＢＶＮ２２Ｅ抗体と組み合わせたＡＬＫ阻害剤の効果を測定した。Ｈ２２２８細胞の７２時間の細胞増殖に対するアレクチニブの単一治療またはＢＶＮ２２Ｅ抗体との組み合わせによる効果を評価した。図１５に示すように、アレクチニブは、細胞生存能力に最小限の効果を及ぼしたが、さらに高い濃度のアレクチニブとＢＶＮ２２Ｅ抗体との組み合わせは、細胞生存能力の相当な減少を誘導した。図１５に示すように、クリゾチニブの場合、ＢＶＮ２２Ｅ抗体と組み合わせた低濃度のクリゾチニブも細胞生存能力の相当な減少を誘導した。図１６Ａに示すように、ＢＶＮ２２Ｅ抗体と組み合わせたＡＬＫチロシンキナーゼ阻害剤であるブリガチニブおよびアレクチニブは、Ｈ２２２８細胞において細胞増殖の著しい抑制を誘導した。
【０１２２】
図１７に示すように、Ｈ２２２８細胞におけるＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果は、１／２５、１／５０および１／２５０の濃度でＢＶＮ２２Ｅ抗体を２時間培養した後、ウェスタンブロットによって評価した。これらのデータは、ｐＥＲＫ１／２の一部の抑制と共にｐＥＧＦＲの相当な抑制が生じているのに対し、ｐＡｋｔおよびｐＳｔａｔ３のレベルは変わらなかったことを示す。
【０１２３】
図１８に示すように、Ｈ２２２８細胞におけるＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果は、１／２５、１／５０および１／２５０の濃度でＢＶＮ２２Ｅ抗体を２４時間培養した後、ウェスタンブロットによって評価した。これらのデータは、ｐＥＧＦＲの相当な抑制が、ＢＶＮ２２Ｅ抗体と共に培養した後、２４時間維持されたことを立証している。
【０１２４】
図１９に示すように、Ｈ２２２８細胞におけるクリゾチニブの効果は、０．０２５、０．０５、０．１、０．５、１および２．５μＭの濃度でクリゾチニブを２時間培養した後、ウェスタンブロットによって評価した。これらのデータは、ｐＳｔａｔ３の相当な抑制がクリゾチニブと共に培養した２時間後に観察されたことを立証している。同様に、図２０に示すように、ブリガチニブはｐＳＴＡＴ３を相当抑制し、ブリガチニブの高濃度（１および２．５μＭ）は、ｐＥＧＦＲおよびｐＡＫＴの増加を誘導した。図２１に示すように、特に、ブリガチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体は、Ｈ２２２８細胞におけるｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫの活性化を抑制した。
【０１２５】
図２２に示すように、ブリガチニブは、Ｈ３１２２細胞において、ｐＳＴＡＴ３を相当抑制し、ｐＥＲＫ１／２の多少の抑制が観察された。さらに高い濃度のブリガチニブはまた、Ｈ３１２２細胞において、ｐＳＴＡＴ３を相当抑制し、ｐＥＲＫ１／２を多少抑制した。対照的に、図２４に示すように、ブリガチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体は、Ｈ２２２８細胞においてｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫの活性化を完全に抑制した。
【０１２６】
患者は、ＡＬＫ  ＴＫＩの単一治療に耐性を持つようになることが知られている。次に、クリゾチニブまたはアレクチニブとＢＶＮ２２Ｅ抗体との組み合わせがＨ２２２８細胞においてＡＬＫ  ＴＫＩに対する耐性の発現を遅延できるか否かを調査した。これらの研究において、１週間に１〜２回、細胞培養培地を交換するたびに、ＴＫＩ阻害剤とＢＶＮ２２Ｅ抗体とを組み合わせたものが細胞に添加された。耐性コロニーを含有するウェルの百分率を決定するために、顕微鏡でイメージ化した９６ウェルマイクロプレートで研究を行った。
【０１２７】
ＢＶＮ２２Ｅ抗体は、ＡＬＫ  ＴＫＩに対する耐性の試験管内発現を遅延させた。クリゾチニブ（図２５Ａ）およびより大きな範囲のアレクチニブ（図２５Ｂ）を用いた実験は、併用治療がより長い期間の間増殖抑制状態を維持し、耐性の発現を遅延させることを示した。アレクチニブ単独では、全てのウェルが１０週後に活性複製を示したのに対し、組み合わせたものでは、より長い期間複製を遅延させた。特に、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の最高濃度をアレクチニブと組み合わせて用いたとき、２５週まで１００％の耐性に到達しなかった。図２５Ｃ（クリゾチニブ）および図２５Ｄ（アレクチニブ）は同一の実験を示しているが、陽性ウェル百分率の代わりに腫瘍細胞のないウェルの百分率を示し、これは、臨床試験において、カプランマイヤー曲線と同様の方法で本発明の結果を示し、ｙ軸切片は患者の生存が０である点に相応した。同様に、図２６および図２７に示すように、Ｈ３１２２細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体は、Ｈ３１２２細胞における０．１μＭおよび０．２μＭのクリゾチニブに対する耐性の出現を遅延させた。
【０１２８】
特に、３日間の増殖分析において、ＡＬＫ  ＴＫＩとＢＶＮ２２Ｅ抗体との併用は、細胞増殖の試験管内抑制およびＥＧＦシグナル伝達経路の調節という側面から、ＡＬＫ  ＴＫＩ単独に比べて相当な改善を立証した。組み合わせは、ＡＬＫ  ＴＫＩの効果を強化し、ＡＬＫ  ＴＫＩの否定的な効果を中和させ、評価された全てのシグナル伝達分子の抑制を拡大した。かかるＥＧＦシグナル伝達のより強力かつ広範囲な抑制は、ＡＬＫ  ＴＫＩ単独に比べて、ＡＬＫ  ＴＫＩおよびＢＶＮ２２Ｅ抗体の存在下で、Ｈ２２８細胞によるＡＬＫ  ＴＫＩ耐性の発現を最大２倍まで遅延させたことにより裏付けられた。
【０１２９】
＜実施例２：ＢＲＡＦおよびＫＲＡＳ突然変異細胞株における抗ＥＧＦ抗体とトラメチニブとの併用の効果＞
大腸がん（ＣＲＣ）は、最も広く知られている腫瘍性がんであるだけでなく、特に治療が難しいことで知られている。ＫＲＡＳ突然変異のないＣＲＣ患者は、クリニックでセツキシマブやエルロチニブなどのＥＧＦを標的とする療法により治療できる。しかし、ＫＲＡＳ突然変異、ＢＲＡＦ突然変異またはＰＩＫ３ＣＡ突然変異を保有する大規模なＣＲＣ患者群がある。現在、かかる患者のための効果的な治療法はない。化学療法や血管新生標的化が一般に用いられているが、大きな欠点がある。
【０１３０】
ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦまたはＰＩＫ３ＣＡ突然変異を有するＣＲＣ患者の治療の必要性を解決するために、ＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブと組み合わせたＥＧＦ抗体を上述の突然変異を有する細胞株において試験管内で試験した。全ての実験は、ＢＶＮ２２Ｅに対する抗体と共に行った。
【０１３１】
図２８に示すように、大腸腺がん細胞株であるがＢＲＡＦ  Ｖ６６Ｅ突然変異を有する、ＨＴ２９の細胞生存能力を調査した。図２９に示すように、ＨＴ２９の細胞生存能力はＥＧＦにより強化され得る。図３０および図３１に示すように、単独および併用による、ＢＶＮ２２Ｅ抗体およびトラメチニブの細胞生存能力に対する効果をＨＴ２９細胞において評価した。トラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体は、トラメチニブ単独に比べて、細胞増殖において相当高い抑制を示した。
【０１３２】
ＢＶＮ２２Ｅ抗体とトラメチニブがＨＴ２９細胞シグナル伝達に及ぼす効果を理解するために、ＨＴ２９細胞で２時間培養した後、ウェスタンブロットを行った。ＢＶＮ２２Ｅ抗体は１／１０の希釈で用いた。ウェスタンブロットの結果（図３２および図３３）は、トラメチニブとＢＶＮ２２Ｅ抗体との組み合わせが、ＥＧＦによって誘導されたｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫ１／２の抑制を強化したことを示す。かかる結果は、ＨＴ２９細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体とトラメチニブとの相当な併用効果の細胞増殖分析から観察された顕著な効果を確認する。
【０１３３】
図３４に示すように、フローサイトメトリーにより個別細胞の細胞周期およびアポトーシス状態を決定するために、ヨウ化プロピジウム染色を用いた。この方法は、ＫＲＡＳ突然変異（Ａ５４９およびＤＬＤ１）並びにＡＬＫ転座（Ｈ２２２８およびＨ３１２２）細胞株に適用された。
【０１３４】
図３５に示すように、ＤＬＤ１細胞において、ＥＧＦ単独は、ＥＧＦを有するＢＶＮ２２Ｅ抗体またはトラメチニブと組み合わせたＥＧＦを有するＢＶＮ２２Ｅ抗体よりも、相当高い百分率のＳおよびＧ２／Ｍ状態の細胞を誘導した。図３６に示すように、Ａ５４９細胞において、トラメチニブと組み合わせたＥＧＦを持つＢＶＮ２２Ｅ抗体を有する細胞周期状態では、非常に小さい差が観察された。図３７に示すように、対照的に、Ｈ２２８細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体単独またはトラメチニブ単独のうちの１つに比べて、トラメチニブと組み合わせたＥＧＦを持つＢＶＮ２２Ｅ抗体を有するＳおよびＧ２／Ｍ細胞において相当な減少があった。図３８に示すように、Ｈ３１２２細胞では、細胞周期状態において非常に小さい差が観察された。かかるデータは、ＴＫＩ阻害剤と組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体がＥＧＦによって調節される細胞周期の進行を潜在的に抑制することを示す。
【０１３５】
ＫＲＡＳ突然変異を有する４つの細胞株を図３９に示す。Ａ５４９は、Ｇ１２Ｓ突然変異を有する肺腺がん株である。Ｈ２３は、Ｇ１２Ｃ突然変異を有する肺腺がん株である。ＤＬＤ１は、Ｇ１３Ｄ突然変異を有する結腸腺がん株である。ＬＳ１７４Ｔは、Ｇ１２Ｃ突然変異を有する結腸腺がん株である。
【０１３６】
次に、ＢＶＮ２２Ｅ抗体単独の効果をＤＬＤ１細胞株において評価した。図４０に示すように、より高い濃度のＢＶＮ２２Ｅ抗体は、対照抗体に比べてＤＬＤ１の細胞生存能力を相当抑制した。同様に、図４１に示すように、ＢＶＮ２２Ｅ抗体と組み合わせたトラメチニブは、ＤＬＤ１細胞において、トラメチニブ単独よりも、遥かに高い細胞生存能力の抑制を誘導した。
【０１３７】
図４２および図４３に示すように、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の効果をウェスタンブロットを通じてＤＬＤ１細胞において調査した。ＢＶＮ２２Ｅ抗体単独は、ＤＬＤ１細胞において限られた効果を有していた。予想通り、試験された全ての希釈において、ＥＧＦＲリン酸化は強く抑制された。ＡＫＴのリン酸化が僅かに抑制されただけで、ＥＲＫ１／２の活性化には影響を及ぼさなかった。
【０１３８】
試験された全ての濃度のトラメチニブにおいて、トラメチニブ単独に比べて、ＥＧＦの存在下で細胞生存能力が強化された。図４４に示すように、より高い細胞生存能力は腫瘍細胞の複製を示し、トラメチニブ過程は抑制を目標とするので、トラメチニブの効力は、ＥＧＦの存在下でより低いものであった。
【０１３９】
また、ＤＬＤ１細胞株におけるトラメチニブ治療の効果をウェスタンブロット分析により評価し、その結果を図４５に示している。ｐＥＧＦＲにもｐＡＫＴにも何ら影響を与えなかった。ｐＳｔａｔ３およびｐＥＲＫ１／２の抑制は、患者に用いられたトラメチニブの生理学的濃度を超える濃度でのみ観察された。
【０１４０】
次に、図４６に示すように、トラメチニブとＢＶＮ２２Ｅ抗体との組み合わせをＤＬＤ１細胞株において調査した。ＢＶＮ２２Ｅ抗体と組み合わせたトラメチニブを用いた細胞生存率は、トラメチニブ単独または対照抗体との組み合わせに比べて、非常に低いものであった。かかる結果は、ＢＶＮ２２Ｅ抗体でＥＧＦを抑制することが、トラメチニブの効果を非常に強化させたことを立証している。
【０１４１】
図４７に示すように、ＢＶＮ２２Ｅ抗体と組み合わせたトラメチニブの強化された効果の裏にあるメカニズムを理解するために、ＤＬＤ１細胞株においてウェスタンブロット実験を行った。トラメチニブ単独による治療は、ｐＥＲＫ１／２の抑制を除けば、分析されたシグナル伝達分子に効果を与えなかった。ＢＶＮ２２Ｅ抗体単独によりＥＧＦＲのリン酸化を抑制した。特に、ＢＶＮ２２Ｅ抗体とトラメチニブとの併用は、個別の治療に比べて、シグナル伝達の抑制においてより大きな効果を示した。トラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体は、ｐＥＲＫ１／２およびｐＥＧＦＲの他、ｐＳＴＡＴ３およびｐＡＫＴを抑制した。図４８に示すように、トラメチニブ単独に比べて、トラメチニブの存在下におけるＢＶＮ２２Ｅ抗体との組み合わせの方でトラメチニブに対する耐性の発現が遅れた。
【０１４２】
結論として、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の添加は、ＤＬＤ１  ＫＲＡＳ突然変異細胞株におけるトラメチニブの抗増殖効果を向上させた。細胞生存能力に対するトラメチニブ単独の効果は、ＥＧＦの存在により相当抑制された。トラメチニブ単独による治療は、ｐＥＲＫ１／２の抑制を除けば、分析されたシグナル伝達分子に効果を与えなかった。ＢＶＮ２２Ｅ抗体単独によりＥＧＦＲのリン酸化を抑制した。特に、ＢＶＮ２２Ｅ抗体とトラメチニブとの併用は、ＤＬＤ１細胞において、個別の治療に比べて、シグナル伝達の抑制においてより大きな効果を示した。ＢＶＮ２２Ｅ抗体とトラメチニブとの併用は、ｐＥＲＫ１／２およびｐＥＧＦＲの他、ｐＳＴＡＴ３およびｐＡＫＴを抑制した。
【０１４３】
図４９に示すように、より高い濃度のＢＶＮ２２Ｅ抗体は、Ａ５４９細胞株の細胞生存能力を抑制した。Ａ５４９細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体との２時間の培養に対する反応としてのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を図５０に示す。ｐＥＲＫ１／２の多少の抑制が観察され、ＥＧＦによるｐＥＧＦＲ活性化の完全な抑制が観察された。Ａ５４９細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体との２４時間の培養に対する反応としてのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を図５１に示す。２４時間で、この細胞株において細胞シグナル伝達に対する効果が減少した。Ａ５４９細胞株において、ＥＧＦの有無におけるトラメチニブの細胞生存能力に対する効果を図５２に示しており、ＥＧＦは細胞生存能力を相当強化させた。Ａ５４９細胞において、トラメチニブ単独の２時間の培養に対する反応としてのｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果を図５３に示し、この初期時点で、ｐＥＲＫ１／２の完全な抑制が観察された。図５４は、Ａ５４９細胞において、トラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体で細胞生存能力が相当減少したものの、この減少は、本発明に示す他の細胞型に比べてより低いものであったことを示している。
【０１４４】
ＥＧＦの有無におけるトラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体に対する反応として、ｐＥＧＦＲ(ＴＹＲ  １０６８)、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果は、２時間の培養後にＡ５４９細胞で観察された。図５５に示すように、ＥＧＦの存在下で、ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫ１／２シグナル伝達に対する最も強力な効果は、ＢＶＮ２２Ｅ抗体単独またはトラメチニブとの組み合わせで観察された。
【０１４５】
図５６に示すように、ＢＶＮ２２Ｅ抗体はまた、Ｈ２３細胞における細胞生存能力を相当抑制した。図５７に示すように、Ｈ２３細胞において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体の２時間の培養に対する反応として、ｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）に対する効果は、２時間の培養後に観察された。ＢＶＮ２２Ｅ抗体は、Ｈ２３細胞でＥＧＦに対する反応として観察されたｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫ１／２の増加を完全に除去した。ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫ１／２のかかる抑制は、図５８に示すように、２４時間維持された。
【０１４６】
図５９に示すように、トラメチニブの細胞生存能力の抑制は、Ｈ２３細胞でＥＧＦの存在下によって相当抑制された。図６０に示すように、Ｈ２３細胞において、トラメチニブに対する反応として、ｐＥＧＦＲ（ＴＹＲ  １０６８）、ｐＳＴＡＴ３（ＴＹＲ  ７０５）、ｐＡＫＴ（ＳＥＲ  ４７３）およびｐＥＲＫ１／２（ＴＨＲ  ２０２／ＴＹＲ  ２０４）の効果は、２時間の培養後に観察された。図６０に示すように、ｐＥＲＫ１／２は、より高い濃度のトラメチニブで相当抑制された。図６１に示すように、トラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体は、トラメチニブ単独に比べて、Ｈ２３細胞の細胞生存能力を相当抑制した。Ｈ２３細胞において、トラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体の２時間の培養に対する反応として、ｐＥＧＦＲの相当な抑制が観察された。
【０１４７】
図６３に示すように、ＢＶＮ２２Ｅ抗体は、対照抗体に比べて、ＬＳ１７４Ｔの細胞生存能力を相当抑制した。図６４および図６５に示すように、ＢＶＮ２２Ｅ抗体はまた、ＬＳ１７４Ｔ細胞においてｐＥＧＦＲとｐＡＫＴのシグナル伝達を共に抑制した。図６６に示すように、トラメチニブ単独はＬＳ１７４Ｔの細胞増殖を抑制し、この効果は、ＥＧＦが存在するときに減少した。図６７に示すように、ＬＳ１７４Ｔ細胞株におけるトラメチニブの効果は、２時間培養のウェスタンブロット分析で評価された。トラメチニブは、１〜１０ｎＭの生理学的範囲内で試験された分子のリン酸化に影響を与えなかった。臨床的に関連がないより高い濃度でｐＥＲＫ１／２に対する効果が観察された。しかし、図６８に示すように、抗ＢＶＮ２２Ｅと組み合わせたトラメチニブは、ｐＡＫＴ、ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫ１／２を抑制するとともに、ｐＳＴＡＴ３も抑制した。よって、ＢＶＮ２２Ｅ抗体は、シグナル伝達の抑制に対するトラメチニブの効果を拡大させた。
【０１４８】
ＬＳ１７４Ｔの細胞生存能力に対するＢＶＮ２２Ｅ抗体とトラメチニブとの併用を調査した。図６９に示すように、トラメチニブと組み合わせたＢＶＮ２２Ｅ抗体は、トラメチニブの１〜１０ｎＭの範囲、即ち、患者のトラメチニブの生理学的レベルで、トラメチニブ単独に比べて細胞生存能力に対する効果を相当増加させた。しかし、ＤＬＤ１細胞におけるＢＶＮ２２Ｅ抗体とトラメチニブとの併用の効果に比べて、ＬＳ１７４Ｔ細胞における併用の効果は顕著でなかった。
【０１４９】
ＬＳ１７４Ｔ  ＫＲＡＳ突然変異細胞株において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体は、トラメチニブの抗増殖効果を強化した。細胞生存能力に対するトラメチニブの抑制効果は、ＥＧＦの存在によって著しく減少した。ＢＶＮ２２Ｅ抗体単独では、ｐＥＧＦＲとｐＡＫＴを共に抑制した。しかし、抗ＢＶＮ２２Ｅと組み合わせたトラメチニブは、ｐＡＫＴ、ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫ１／２を抑制するとともに、ｐＳＴＡＴ３も抑制した。よって、２つのＫＲＡＳ突然変異細胞株において、ＢＶＮ２２Ｅ抗体は、細胞増殖を抑制するトラメチニブの効果を強化し、シグナル伝達の抑制に対するトラメチニブの効果を拡大させた。
【０１５０】
＜実施例３：ＳＷ９００細胞において、ＥＧＦがんワクチンで免疫化された患者の血清の評価＞
ＳＷ９００野生型細胞において、ｐＥＧＦＲに対するヒト患者（２２１８０００４）抗ＥＧＦ血清の効果は、ＥＧＦの存在下で観察された。２ａ＝ワクチン接種前の患者。３ｄ＝ワクチン接種後の患者。図７０に示すように、ｐＥＧＦＲ活性化の完全な抑制は、抗ＥＧＦ血清の存在下で観察され、ｐＥＲＫ１／２の一部減少も観察された。図７１に示すように、ＳＷ９００野生型細胞において、ｐＥＧＦＲに対する２人のさらなる患者からのヒト患者抗ＥＧＦ血清の効果は、ＥＧＦの存在下で観察された。患者２７０３０００４において、ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫ１／２活性化の顕著な抑制が観察されたのに対し、患者２９０８０００５では、両方とも少ない抑制が観察された。３人のさらなる患者からの抗ＥＧＦ血清の結果は、図７２に示している。２９０４０００７および３３０８００２０の２人の患者において、ｐＥＧＦＲおよびｐＥＲＫ１／２のシグナル伝達の相当な抑制が観察された。患者３１０７０００４において、最小限の変化が観察された。図７０〜図７２の結果は図７３および図７４に要約している。
【０１５１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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