(57)【要約】  本発明は、百日咳菌（Bordetella pertussis）によって引き起こされる疾患を治療および予防するためのタンパク質および組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
A-X-B
を含むポリペプチドであって、
式中、Xは、配列番号2、3、または4と少なくとも99%の同一性を有する配列からなるアミノ酸配列であり；Aは場合によって存在してもよいN末端アミノ酸配列であり；Bは場合によって存在してもよいC末端アミノ酸配列であり、式中AおよびBは、アデニル酸シクラーゼもしくはその断片に由来しない、ポリペプチド。
【請求項２】
AがN末端メチオニン残基であり、Xが配列番号2、3および4からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、Bが存在しない、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号23と99%の同一性を有する配列からなる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Aおよび／またはBがヒスチジンタグである、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号5、6、7、または8と少なくとも99%の同一性を有する配列からなる、請求項4に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号5、6、7、または8と100%の同一性を有する配列からなる、請求項5に記載のポリペプチド。
【請求項７】
たとえばアデニル酸シクラーゼ毒素中和アッセイによって測定される、配列番号1のアミノ酸配列を有するアデニル酸シクラーゼタンパク質に結合する抗体を含む、抗体応答を引き起こすことができる、請求項1〜6のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
請求項8に記載の核酸を含有する、および／または、請求項1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチドを発現する、細菌。
【請求項１０】
請求項1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、または請求項8に記載の核酸を含有する、免疫原性組成物。
【請求項１１】
アジュバントを含有する、請求項10に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
2価金属塩を含有する、請求項10または11に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
2価金属塩がカルシウム塩、たとえば塩化カルシウムである、請求項12に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
治療に使用するための、請求項1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、請求項8に記載の核酸、または請求項10〜13のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
百日咳菌（Bordetella pertussis）によって引き起こされる疾患および／または感染の、治療または予防に使用するための、請求項1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、請求項8に記載の核酸、または請求項10〜13のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
有効な量の、請求項1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、請求項8に記載の核酸、または請求項10〜13のいずれか1つに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳動物、たとえばヒトにおいて百日咳菌による疾患および／または感染を治療または予防する方法。
【請求項１７】
哺乳動物、たとえばヒトにおいて百日咳菌による疾患および／または感染を治療または予防する方法に使用するための、請求項1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、請求項8に記載の核酸、または請求項10〜13のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、百日咳菌（Bordetella pertussis）によって引き起こされる疾患の治療および予防のためのタンパク質および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ワクチン接種率の高い国においても百日咳菌による疾患の再流行が見られるようになった。再流行の明確な理由は不明であるが、可能性のある原因としては、免疫の漸減および流行株の疫学的変化などが挙げられる。
【０００３】
アデニル酸シクラーゼは、正常な細胞機能を妨げる、百日咳菌の主要な病原性因子であり、定着のためにきわめて重要である。アデニル酸シクラーゼは、百日咳菌の異なる菌株間で広範に保存されており、実際、1920年から2010年の間に分離された臨床株の間では、ただ1つのヌクレオチド多型が観察されているだけである（Bart et al 2014）。それに加えて、百日咳菌（Bordetella pertussis）およびパラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）に感染して回復した患者の血清サンプル中に、アデニル酸シクラーゼに対する抗体が見出されている。ワクチン接種を受けた小児における抗アデニル酸シクラーゼ抗体の存在が、ワクチン接種に起因するのか、または以前の認識されていないボルデテラ属細菌（Bordetella）感染に起因するのかは明らかでないが（Farfel et al 1989、Arciniega et al 1991）、全細胞および無細胞百日咳ワクチンが機能していない患者のアデニル酸シクラーゼ抗体反応はごくわずかであった（Cherry et al 2004）。
【０００４】
マウスにおいて、抗アデニル酸シクラーゼ抗体による受動免疫は、全細胞百日咳ワクチンを用いたワクチン接種後に認められるのと同様のレベルまで、百日咳菌またはパラ百日咳菌による致死的な呼吸器チャレンジからマウスを防御した(Guiso et al 1989)。さらに、大腸菌（E. coli）由来の組換えアデニル酸シクラーゼの活性型は、マウス肺の百日咳感染を防御した（Cheung et al 2006、Mac Donald-Fyall et al 2004）。
【０００５】
アデニル酸シクラーゼは抗原としての可能性を有するが、現在のところ無細胞百日咳ワクチンの構成要素となっておらず、それに加えて、アデニル酸シクラーゼは、宿主の免疫細胞機能を損なうことが知られている、酵素活性を有する溶血素である。
【０００６】
したがって、ボルデテラ属細菌による感染に対する改善されたワクチンが依然として必要であって、そのようなワクチンの開発に使用することができるタンパク質および免疫原性組成物を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は概して、ボルデテラ属細菌（Bordetella sp.）アデニル酸シクラーゼ（CyaAもしくはACT）の新規断片に関する。新規断片は、配列番号2、3、4、5、6、7、15、16、17、18、19、20、21、22または23に対して配列同一性を有するアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含む。
【０００８】
本発明の第1の態様において、アミノ酸配列：
A-X-B
からなるか、またはそれを含むポリペプチドが提供されるが、ここでXは、配列番号2、3、4、15、16または17と同一性を有する配列からなるアミノ酸配列である；Aは場合によって存在してもよいN末端アミノ酸配列である；Bは場合によって存在してもよいC末端アミノ酸配列である。詳細には、配列同一性のレベルは、90%から100%である。より詳細には、配列同一性のレベルは、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%である。さらにより詳細には、配列番号2、3または4との配列同一性レベルは100%である。具体的には、AおよびBは、アデニル酸シクラーゼに由来しない場合によって存在してもよい配列であり、特に配列番号1のアデニル酸シクラーゼ、またはその３つ以上連続するアミノ酸断片、たとえば4、5、6、7、8、9、10個の連続するアミノ酸の断片に由来しない場合によって存在してもよい配列である。本明細書で使用される場合、本発明との関連において「由来しない」という表現は、場合によって存在してもよい配列Aおよび／またはBが、配列番号1として提供されるアデニル酸シクラーゼの天然に存在する配列と一致しないこと、その配列を起源としていないこと、または、そうでなくても、有意な配列同一性、たとえば、50%未満、45%未満、40%未満、35%未満、または30%未満の配列同一性を共有していないことを意味する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、AおよびBは存在しない。そのような実施形態において、第1の態様のポリペプチドは、配列番号2、3、4、15、16または17と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性、または100%の同一性を有する配列からなるとすることができる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、AまたはBのうち少なくとも1つが存在し、たとえば、Aのみ、Bのみ、またはAおよびBの両方が存在する。いくつかの実施形態において、Aおよび／またはBはヒスチジンタグであって、たとえば、Aおよび／またはBはHisnであり、このnは3、4、5、6、7、8、9、または10以上である。したがって、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号5、6、7、8、21、22または23と、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の同一性を有する配列からなる。特に、ポリペプチドは、配列番号23と、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する配列からなる。
【００１１】
特に、第1の態様のポリペプチドは、免疫化後に、配列番号1のアミノ酸配列を有するアデニル酸シクラーゼタンパク質に結合する抗体を含む抗体応答を引き出すことができる。
【００１２】
本発明の第2の態様において、第1の態様のポリペプチドをコードする核酸が提供される。
【００１３】
本発明の第3の態様において、第2の態様の核酸を含有する細菌が提供される。より詳細には、第2の態様の核酸を含有する細菌であって、第1の態様のポリペプチドを発現する、または発現する能力を有する、前記細菌が提供される。
【００１４】
本発明の第4の態様において、第1の態様のポリペプチド、または第2の態様の核酸を含有する、免疫原性組成物が提供される。詳細には、免疫原性組成物はアジュバントを含有する。より詳細には、免疫原性組成物は2価金属塩を含有する。さらにより詳細には、免疫原性組成物は、前記2価金属塩が、たとえば、塩化カルシウム等のカルシウム塩のような2価金属塩を含有するものである。
【００１５】
本発明の第5の態様において、治療に使用するための、第1の態様のポリペプチド、第2の態様の核酸、または第4の態様の免疫原性組成物が提供される。より詳細には、第1の態様のポリペプチド、第2の態様の核酸、または第4の態様の免疫原性組成物は、ボルデテラ属細菌、たとえば百日咳菌によって引き起こされる疾患および／または感染の治療または予防に使用するために提供される。
【００１６】
本発明の第6の態様において、有効量の第1の態様のポリペプチド、第2の態様の核酸、または第4の態様の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳動物において百日咳菌に起因する疾患および／または感染を治療または予防する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】百日咳菌アデニル酸シクラーゼの構造。強調表示されている2つのリジン残基は、共発現されたタンパク質、アシルトランスフェラーゼCyaCによるパルミトイル化が可能である。断片(1)：アデニル酸シクラーゼのACドメイン、残基1から残基400まで（配列番号15）；断片(2)：アデニル酸シクラーゼのACドメイン、残基1から残基400までであって、残基188と189の間にGS挿入を示す（配列番号16）；断片(3)：アデニル酸シクラーゼのACドメイン、残基360から残基493まで（配列番号17）；断片(4)：アデニル酸シクラーゼのRTX断片、残基985から残基1681まで（配列番号2）。
【図２】ポリペプチド断片は、pH7.4においてAl(OH)3によく吸着する。キー：1,2 - 断片単独（NC,C）；3,4 - Al(OH)3中の断片（NC,C）；5,6 - AL(OH)3とともに調製する場合と同様に処理された断片単独（NC,C）；NC - 遠心分離なし；C - 遠心分離（上清）。Al(OH)3を有する製剤の上清中に断片が存在しないこと（3列目および4列目）は、断片が十分に吸着していることを示している。5列目および6列目は、Al(OH)3を用いた調製条件において、ポリペプチド断片の目に見える分解がないことを示す。
【図３】AS01の存在下であっても、EGTAあり／なしで、ポリペプチド断片のフォールド/アンフォールド立体構造が検出される。(1) 断片単独の典型的なピークが観察される（Tm約70℃）；(2) AS01またはAS01バッファーの存在下で、断片のピークは保存される（Tmはやや低い）→AS01バッファーは断片に最適ではないが、二次構造（フォールドされた状態）は保存される；(3) EGTAの存在下では、AS01が存在しても断片のピークおよび典型的なTmの消失が観察される-二次構造は保存されない；(4) Al(OH)3とともに調製すると、断片のピークの消失が観察される-ポリペプチド断片はその表面に吸着する。
【図４】ポリペプチド断片の精製結果（実施例1）。
【図５】アデニル酸シクラーゼ毒素の細胞毒性血清中和アッセイの結果（実施例3）。
【図６】実施例4に記載の免疫スケジュールの模式図を提供する。
【図７】全長アデニル酸シクラーゼまたはRTX断片のいずれかで免疫化した後、7PII（28日目）においてELISAにより測定された個々の血清抗体価（抗ACT IgG）。
【図８】7PII（28日目）においてELISAにより測定された個々の血清抗体価（抗ACT IgG）。
【図９Ａ】図9 (a)および(b)：異なるワクチンによって誘導される、百日咳菌の鼻腔内チャレンジに対する予防効果。図9(a)に示すように、PRNの量は完全な防御を誘導するのに十分な量である。検討したすべての製剤ならびにInfanrixは、ワクチン未接種群と比較してCFU数を減少させた。図9(b)に示すように、検討したすべての製剤ならびにInfanrix 1/4th HD群（陽性対照）は、ワクチン未接種群と比較してCFU数を減少させた。Infanrix 1/4th HD群（陽性対照）と断片RTXあり／なしでのDTPa 1/80HD群の間には高い有意差が認められた（GMRは500以上）。
【図９Ｂ】図9 (a)および(b)：異なるワクチンによって誘導される、百日咳菌の鼻腔内チャレンジに対する予防効果。図9(a)に示すように、PRNの量は完全な防御を誘導するのに十分な量である。検討したすべての製剤ならびにInfanrixは、ワクチン未接種群と比較してCFU数を減少させた。図9(b)に示すように、検討したすべての製剤ならびにInfanrix 1/4th HD群（陽性対照）は、ワクチン未接種群と比較してCFU数を減少させた。Infanrix 1/4th HD群（陽性対照）と断片RTXあり／なしでのDTPa 1/80HD群の間には高い有意差が認められた（GMRは500以上）。
【図１０】以下の条件下での配列番号21の発現：大腸菌株：B834(DE3)、IPTG濃度：1mM、誘導：16℃、一晩。(1)分子量マーカー；(2)非誘導；(3)誘導。
【図１１】配列番号21の精製。(1)分子量マーカー；(2)5μgタンパク質；(3)2μgタンパク質；(4)1μgタンパク質；(6)大腸菌溶解物1μl。
【図１２】以下の条件での配列番号22の発現：発現条件：大腸菌株：B834(DE3)、IPTG濃度：1mM、誘導：37℃、3h。(1)分子量マーカー；(2)非誘導；(3)誘導；(4)非誘導；(5)誘導。
【図１３】配列番号22の精製。(1)分子量マーカー；(2)5μgタンパク質；(3)2μgタンパク質；(4)1μgタンパク質；(5)大腸菌溶解物1μl。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本発明は、特に、抗原として使用するためのアデニル酸シクラーゼの断片に関する。アデニル酸シクラーゼは、1706アミノ酸長を有する多機能タンパク質である（Sebo et al, 2014）。これは、N末端の酵素的アデニル酸シクラーゼ（AC）ドメイン（残基1〜400）、疎水性ポア形成ドメイン（残基500〜700）、脂肪酸アシル修飾ドメイン（残基800〜1000）、カルシウム結合RTX（repeat-in-toxin）ドメイン（残基1000〜1600）、およびC末端、未切断分泌シグナルから構成される（図1）。C末端の1300残基は、溶血素（Hly）部分とも呼ばれる。Hly部分は、RTXドメイン内のインテグリン結合領域を介して宿主細胞上の補体受容体3に結合し、宿主細胞の細胞質内へのACドメインの移動を可能にし、その結果としてATPのcAMPへの無秩序な変換をもたらす。さらに、ポア形成ドメインは、オリゴマー化して、宿主細胞の膜に小さなカチオン選択的ポアを形成しうるため、結果として中程度の溶血が生じる。
【００１９】
本発明者らは、このたび、全長アデニル酸シクラーゼタンパク質に付随する溶血などの毒性を回避しながら免疫原性を保持している、全長アデニル酸シクラーゼ（配列番号1）の断片を同定することに成功した。
【００２０】
防御を担うエピトープを含有するアデニル酸シクラーゼの断片は、本明細書において配列番号2、3、4、15、16、17、18、19、20、21、22、または23として与えられる。
【００２１】
配列番号2のアミノ酸配列は、配列番号1で与えられる野生型アデニル酸シクラーゼ配列の残基985から残基1681までのアミノ酸と一致する696アミノ酸断片である。配列番号3および4は、それぞれ1つまたは2つの追加のグリシン残基を含む。配列番号23は、N末端メチオニン残基を含む。
【００２２】
配列番号15のアミノ酸配列は、配列番号1で与えられる野生型アデニル酸シクラーゼ配列の残基1から残基400までのアミノ酸に一致するアミノ酸断片である（配列番号1の1位に対応するメチオニン残基は、配列番号15には示されていないが、本発明のいくつかの実施形態において、N末端配列'A'として含まれていてもよい）。
【００２３】
配列番号16のアミノ酸配列は、配列番号1で与えられる野生型アデニル酸シクラーゼ配列の残基1から残基400までのアミノ酸に一致するアミノ酸断片であって、さらに配列番号1の残基188と189の間にGS挿入を含む、前記アミノ酸断片である（配列番号1の1位に対応するメチオニン残基は、配列番号16には示されていないが、本発明のいくつかの実施形態において、N末端配列'A'として含まれていてもよい）。
【００２４】
配列番号17のアミノ酸配列は、配列番号1で与えられる野生型アデニル酸シクラーゼ配列の残基360から残基493までのアミノ酸に一致するアミノ酸断片である（本発明のいくつかの実施形態において、N末端配列'A'としてメチオニン残基が含まれていてもよい）。
【００２５】
したがって、本発明によれば、アミノ酸配列
A-X-B
を含むポリペプチドが提供されるが、式中、Xは配列番号2、3、4、15、16または17と少なくとも90%の同一性を有する配列からなるアミノ酸配列である；Aは、場合によって存在してもよいN末端アミノ酸配列である；Bは、場合によって存在してもよいC末端アミノ酸配列であるが、このAおよびBは、アデニル酸シクラーゼまたはその断片に由来しない。
【００２６】
RTX断片に関する実施形態において、特にXは、配列番号1からの698個以下の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列である。より詳細には、Xは、配列番号1の691個から698個までの連続アミノ酸を有するアミノ酸配列である。さらにより詳細には、Xは、配列番号1の少なくとも691個から多くとも698個までの連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列である。さらにまたより詳細には、そのようなRTX断片は、配列番号2、3または4に対して、少なくとも90%の同一性、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する。
【００２７】
ACドメイン断片に関する実施形態において、特にXは、配列番号1からの400個以下の連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列である。より詳細には、Xは、配列番号1の400個未満の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列である。さらにより詳細には、Xは、配列番号15、16または17に対して、少なくとも90%の同一性、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する。
【００２８】
配列同一性は、ペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムを用いて決定することができるが、N末端からC末端までx個のアミノ酸の動作ウィンドウはそれぞれ、（p>xの場合p個のアミノ酸まで伸びるアラインメントのために、p-x+1個のこのようなウィンドウが存在するように）少なくともx・y個のアラインされた同一アミノ酸を有し、ここで、xは20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200から選択され、yは0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99から選択され；x・yが整数でない場合、それは最も近い整数に切り上げられる。好ましいペアワイズ・アラインメント・アルゴリズムは、デフォルトのパラメータ（たとえば、ギャップ・オープニング・ペナルティ＝10.0、ギャップ・エクステンション・ペナルティ＝0.5、EBLOSUM62スコアリング・マトリクスを使用）を用いたNeedleman-Wunschグローバル・アラインメント・アルゴリズム［1］である。このアルゴリズムはEMBOSSパッケージの中のneedleツールによりうまく実行される[2]。本発明の配列に関して、これらがアデニル酸シクラーゼの断片である場合、配列同一性は、より長い配列、たとえば全長または野生型配列の完全長（すなわち全長）に対して、その全長に沿って計算されるべきである。
【００２９】
疑義を回避するために、百日咳菌の全長、天然のアデニル酸シクラーゼのアミノ酸配列、たとえば配列番号1、は本発明の範囲から明確に除外される。
【００３０】
-A-または-B-のアミノ酸配列は、典型的には短いものである（たとえば、20個以下のアミノ酸、すなわち、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個のアミノ酸）。例としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、n = 2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上であるGlynを含む）、およびヒスチジンタグ（すなわち、n = 3、4、5、6、7、8、9、または10以上であるHisn）が挙げられる。他の適切なリンカーのアミノ酸配列は、当業者には明らかである。有用なリンカーは、GSGS（配列番号9）、GSGGGG（配列番号10）またはGSGSGGGG（配列番号11）であるが、Gly-Serジペプチドは、BamHI制限酵素部位から形成されるので、クローニングおよび操作を助けるものであり、(Gly)4テトラペプチドは典型的なポリグリシンリンカーである。他の適切なリンカーには、Leu-GluジペプチドまたはGly-Serがある。リンカーは、構造的可動性を高めるために少なくとも1つのグリシン残基、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個または11個以上のグリシン残基を含有することができる。そのようなグリシンは、Gly-Glyジペプチド配列、またはより長いオリゴGly配列、すなわちn = 2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のGlynとして少なくとも2つの連続するグリシンを含むように配置することができる。
【００３１】
-A-は、場合によって存在してもよいN末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短いものである（たとえば、40個以下のアミノ酸、すなわち40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個のアミノ酸）。例としては、タンパク質輸送を指示するリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（たとえば、ヒスチジンタグ、すなわちHisnであり、この場合n = 3、4、5、6、7、8、9、または10以上）が挙げられる。いくつかの実施形態において、-A-は、NspA（髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）の外膜タンパク質）に由来する異種シグナルペプチドである。シグナルペプチドは、シグナルペプチドの切断を最適化するために、NspA由来の1つまたは2つの追加のアミノ酸を含んでいてもよい。他の適当なN末端アミノ酸配列は、当業者には明らかである。Xがそれ自体のN末端メチオニンを欠いている場合、-A-は、N末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（たとえば、1、2、3、4、5、6、7または8アミノ酸を有する）、たとえばMet-Ala-Ser、または単一のMet残基であることが好ましい。新生ポリペプチドにおいて、-A-部分は、ポリペプチドのN末端メチオニン（細菌ではホルミルメチオニン、fMet）を提供することができる。たとえば、Xが配列番号2、3、4、5、6、7、15、16または17である場合、特定の実施形態において、-A-はこのようなN末端メチオニンであるか、またはそれを提供することができる（たとえば、配列番号18、19、20、21または22として）。しかしながら、１以上のアミノ酸が、新生-A-部分のN末端から切断されることもあり、本発明の成熟ポリペプチド中の-A-部分は、必ずしもN末端メチオニンを含むとは限らない。
【００３２】
-B-は、場合によって存在してもよいC末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短いものである（たとえば、40個または39個以下のアミノ酸、すなわち39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個のアミノ酸）。例としては、タンパク質輸送を指示する配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（たとえば、ヒスチジンタグ、すなわちHisnであり、この場合n = 3、4、5、6、7、8、9、または10以上）、またはタンパク質の安定性を高める配列が挙げられる。本発明において使用するのに適した具体的なHisタグとしては、GGHHHHHH（配列番号12）、GHHHHHH（配列番号13）、HHHHHH（配列番号14）などが挙げられる。他の好適なC末端アミノ酸配列は、当業者には明らかであって、たとえば、グルタチオンSトランスフェラーゼ、チオレドキシン、黄色ブドウ球菌（S.aureus）プロテインAの14kDa断片、ビオチン化ペプチド、マルトース結合タンパク質、エンテロキナーゼFLAGなどである。
【００３３】
-A-および／または-B-を含む本発明のポリペプチド断片には、配列番号5、6、7、8、18、19、20、21、22または23などがある。-A-および／または-B-を含む好適な断片もしくはポリペプチドは、配列番号5、6、7、8、18、19、20、21、22または23に対して、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するポリペプチドからなるとすることができる。
【００３４】
上記のように、本発明のポリペプチドは、配列番号1のアデニル酸シクラーゼに由来しない追加のポリペプチド配列を-N末端および／または-C末端に含有することができる。したがって、そのようなアデニル酸シクラーゼに由来しないポリペプチド配列への言及は、追加のポリペプチド配列が、配列番号1の3個以上の連続するアミノ酸配列、たとえば4、5、6、7、8、9、または10個の連続するアミノ酸配列を含まないことを意味すると理解することができる。
【００３５】
「エピトープ」とは、免疫系によって認識され、免疫応答を誘発する、ポリペプチドの一部分である。したがって、本発明のポリペプチドは、被験体に投与されると、配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型アデニル酸シクラーゼタンパク質に結合する抗体を含む抗体応答を誘発するエピトープを含む。したがって、本発明のポリペプチドは、配列番号1に対して生じた抗体に結合するために、配列番号1とも競合する能力を有する。
【００３６】
標準的な免疫法を用いて、本発明のポリペプチドに対する抗体を容易に生成させることができ、これらの抗体が配列番号1の野生型アデニル酸シクラーゼタンパク質に結合する能力は、ELISAアッセイなどの標準的なアッセイを用いて評価することができる。同様に、野生型アデニル酸シクラーゼタンパク質に対して生じた抗体と競合しうるポリペプチドの能力は、ELISAなどの平衡法、BIACORE（登録商標）などの速度論的方法、およびフローサイトメトリー法などの、当技術分野で知られている競合アッセイ法を用いて容易に測定することができる。抗体に結合するために配列番号1の野生型アデニル酸シクラーゼタンパク質と競合するポリペプチドは、そのポリペプチドが存在しない場合と比較して、観察される野生型タンパク質の抗体との結合全体の減少を引き起こす。典型的には、配列番号1を有するタンパク質について観察される抗体結合と比較して、本発明のポリペプチドの存在下では、この結合減少は、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、60%以上であり、たとえば70%以上の結合減少である。百日咳菌の菌株に対する防御を誘導しうる本発明のポリペプチドの能力は、当技術分野で知られている動物モデルにおいても確認することができる。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、配列番号1と比較して、少なくとも1個、たとえば1、2、3、4、5、6または7個の保存的アミノ酸置換、すなわち、１つのアミノ酸を、関連する側鎖を有する別のアミノ酸で置き換えること、を含んでいてもよい。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に4つのファミリーに分けられる：(1)酸性、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸；(2)塩基性、すなわちリジン、アルギニン、ヒスチジン；(3)非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および(4)非荷電極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類されることもある。一般に、これらのファミリー内での単一アミノ酸の置換は、生物活性に大きな影響を与えない。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、配列番号1の断片に対して、少なくとも1個、たとえば1、2、3、4、5、6または7個の単一アミノ酸欠失を有していてもよい。
【００３９】
ポリペプチドはまた、配列番号1の同等配列に対して、少なくとも1個、たとえば、1、2、3、4、5、6、または7個の挿入を含んでいてもよい。たとえば、アデニル酸シクラーゼのACドメインの断片に関する特定の実施形態は、このドメインの機能または活性、たとえばカルモデュリン活性、をノックアウトまたは低減するための修飾を含むものである（Ladant D, Glaser P, Ullmann A. J. Biol. Chem. 1992, 267:2244-50）。挿入を含む、本発明の断片およびポリペプチドの具体的な例としては、配列番号16、19および21が挙げられる。これらの配列は、配列番号1に対して残基188と189の間にGS（グリシン-セリン）の挿入を含む。ACドメインの活性または機能は、当技術分野で知られているアッセイ、たとえば、Fiser et al. J Biol Chem. 2007 Feb 2;282(5):2808-20に開示されているように、測定することができる。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、当業者に知られている多くの方法で、たとえば、化学合成（全合成または部分合成）によって、プロテアーゼを用いたより長いポリペプチドの消化によって、RNAからの翻訳によって、細胞培養からの精製（たとえば、組換え発現からの精製）、生物体それ自体からの精製（たとえば、細菌培養後、または患者からの直接の精製）などによって、調製することができる。特に、生物学的合成を用いることができるが、たとえば、ポリペプチドは翻訳によって生産されてもよい。これは、in vitroまたはin vivoで行うことができる。ポリペプチドは、C末端および／またはN末端において共有結合的修飾を有していてもよい。ポリペプチドは、さまざまな形態（たとえば、天然型、融合物、グリコシル化型、非グリコシル化型、脂質付加型、非脂質付加型、リン酸化型、非リン酸化型、ミリストイル化型、非ミリストイル化型、単量体型、多量体型、微粒子、変性型など）をとることができる。
【００４１】
ポリペプチドは、精製された、または実質的に精製された形態、すなわち実質的に他のポリペプチドを含まない（たとえば天然に存在するポリペプチドを含まない）、特に他のボルデテラ属または宿主細胞ポリペプチドを含まない形態で提供されることが好ましく、概して、少なくとも約50%の純度（重量比）、通常は少なくとも約90%の純度、たとえば、少なくとも約91%の純度（重量比）、少なくとも約92%の純度（重量比）、少なくとも約93%の純度（重量比）、少なくとも約94%の純度（重量比）、少なくとも約95%の純度（重量比）、少なくとも約96%の純度（重量比）、少なくとも約97%の純度（重量比）、少なくとも約98%の純度（重量比）、少なくとも約99%の純度（重量比）、少なくとも約99.5%の純度（重量比）、少なくとも約99.9%の純度（重量比）であって、すなわち組成物のうち約50%未満、より好ましくは約10%未満（たとえば5%以下）が他の発現ポリペプチドで構成されている。
【００４２】
ポリペプチドは、固体支持体に付着していてもよい。ポリペプチドは、検出可能な標識（たとえば、放射性もしくは蛍光標識、またはビオチン標識）を含んでいてもよい。ポリペプチドは、天然または非天然にグリコシル化されていてもよい（すなわち、ポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチドに見られるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）。
【００４３】
本発明はまた、ポリペプチドの発現を誘導する条件下で本発明の細菌を培養することを含む、本発明のポリペプチドを製造するための方法を提供する。ポリペプチドの発現は、ボルデテラ属細菌で行われてもよいが、本発明は、発現用の異種宿主を使用することができる。異種宿主は、原核生物（たとえば細菌）であっても、真核生物であってもよい。通常は大腸菌であるが、他の好適な宿主としては、枯草菌（Bacillus subtilis）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、チフス菌（Salmonella typhi）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica）、ナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）、マイコバクテリア（たとえば結核菌（M.tuberculosis））、酵母などがある。
【００４４】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを製造するための方法を提供するが、このポリペプチドは、化学的手段を用いてその一部または全部が合成される。
【００４５】
本発明はまた、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００４６】
核酸
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００４７】
たとえば、本発明は、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、および配列番号23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。疑義を回避するために、全長アデニル酸シクラーゼ、たとえば配列番号1をコードする核酸配列は本発明の一部ではなく、除外される。本発明はまた、このようなヌクレオチド配列に対して配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。このような核酸には、同一アミノ酸をコードする別の代わりとなるコドンを用いたものを含める。具体的には、核酸は、特定の微生物、たとえば大腸菌における発現に最適化された代替コドンを含有することができる。
【００４８】
また、本発明は、これらの核酸とハイブリダイズしうる核酸を提供する。ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は、当技術分野で広く知られており、公表されている。適切な条件の例としては、（ストリンジェンシーを高める順に）：25℃、37℃、50℃、55℃および68℃のインキュベーション温度；10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSCのバッファー濃度（このSSCは0.15 M NaClおよび15 mMクエン酸緩衝液）および他のバッファー系を用いたそれらの同等物；0%、25%、50%、および75%のホルムアミド濃度；5分から24時間までのインキュベーション時間；1回または2回以上の洗浄ステップ；1分、2分、または15分の洗浄インキュベーション時間；および6×SSC、1× SSC、0.1×SSC、または脱イオン水の洗浄溶液。ハイブリダイゼーション法およびその最適化は、当技術分野でよく知られている［たとえば、参考文献3および32などを参照されたい］。
【００４９】
本発明は、これらの配列に相補的な配列を含む核酸を含める（たとえば、アンチセンスもしくはプローブ検出用、またはプライマーとして使用するために）。
【００５０】
本発明の核酸は、さまざまな形態（たとえば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識化など）をとることができる。本発明の核酸は、環状または分枝状であってもよいが、一般的には直鎖状である。他に特に指定または要求されない限り、核酸を利用する本発明の任意の実施形態は、二本鎖型も、二本鎖型を構成する2本の相補的一本鎖型のそれぞれも、両方とも利用することができる。プライマーおよびプローブは、アンチセンス核酸と同様に、一般に一本鎖である。
【００５１】
本発明の核酸は、好ましくは、精製された形、または実質的に精製された形で、すなわち実質的に他の核酸を含まない（たとえば、天然に存在する核酸を含まない）、特に他のボルデテラ属または宿主細胞核酸を含まない形で提供され、概して、少なくとも約50%（重量比）の純度であり、通常は少なくとも約90%の純度である。
【００５２】
本発明の核酸は、多くの方法、たとえば、全体的または部分的化学合成（たとえばDNAのホスホロアミダイト合成）による方法、ヌクレアーゼ（たとえば制限酵素）を用いたより長い核酸の消化による方法、（たとえばリガーゼまたはポリメラーゼを用いた）より短い核酸またはヌクレオチドの結合による方法、ゲノムライブラリーもしくはcDNAライブラリーからの方法、などといった多くの方法で調製することができる。
【００５３】
本発明の核酸は、固体支持体（たとえば、ビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライド、マイクロアレイ支持体、樹脂など）に付着していてもよい。本発明の核酸は、たとえば、放射性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識で標識されていてもよい。これは、核酸が検出技術に使用される場合、たとえば、核酸がプライマーであるか、またはプローブとして使用される場合に、特に有用である。
【００５４】
本発明の核酸は、ベクターの一部、すなわち、1以上の細胞型の形質導入／トランスフェクションのためにデザインされた核酸構築物の一部であってもよい。ベクターは、たとえば、挿入されたヌクレオチドの単離、増幅および複製のためにデザインされた「クローニングベクター」、宿主細胞においてヌクレオチド配列を発現させるためにデザインされた「発現ベクター」、組換えウイルスもしくはウイルス様粒子の産生をもたらすようにデザインされた「ウイルスベクター」、または2種以上のベクターの属性を含む「シャトルベクター」とすることができる。好ましいベクターはプラスミドである。「宿主細胞」は、外来核酸のレシピエントとなりうるか、またはレシピエントとなった、個々の細胞を包含する。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含むが、その子孫は、自然的、偶発的もしくは意図的な変異および／または変化に起因して、（形態的に、または全DNA相補体として）必ずしも元の親細胞と完全に同一であるとは限らない。宿主細胞には、本発明の核酸によりin vivoまたはin vitroでトランスフェクトまたは感染させた細胞が含まれる。
【００５５】
本発明の核酸は、たとえば、in vitroもしくはin vivoでポリペプチドを産生するために；生体サンプル中の核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして；核酸の追加コピーを生成するために；リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するために；一本鎖DNAプライマーもしくはプローブとして；または三本鎖形成オリゴヌクレオチドとして、使用することができる。
【００５６】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含有するベクター（たとえば、クローニングベクターまたは発現ベクター）、ならびにそのようなベクターで形質転換された細菌および他の宿主細胞を提供する。
【００５７】
免疫原性組成物
本発明のポリペプチドは、免疫原性組成物中の活性成分として有用である。「免疫原性組成物」という用語は、概括的に言えば、組成物中に存在する抗原に対する免疫応答、たとえば抗体または細胞性免疫応答など、を引き起こすために投与することができる、任意の組成物を指す。したがって、本発明の組成物は免疫原性である。免疫原性組成物が、被験体から疾患を予防、改善、緩和、または除去する場合、そのような組成物は、ワクチンと称することができる。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防する）であっても、治療的（すなわち、感染を治療する）であってもよいが、典型的には予防的である。本発明に関連して使用される「感染を予防する」という用語は、被験体の免疫系が（たとえば、ワクチン接種によって）プライミングを受けたことで、免疫応答が誘発され、感染が斥けられることを意味する。したがって、ワクチン接種を受けた被験体が感染する可能性はあるが、対照の被験体よりも感染を撃退する能力が高いことは、当業者には明白である。特定の実施形態において、免疫原性組成物はワクチンである。「抗原」という用語は、被験体に投与されると、その物質に対する免疫応答を引き起こす物質を指す。本発明の文脈において、本発明のポリペプチドは抗原である。好ましくは、抗原は、組換えDNA技術を用いて調製または製造された組換え抗原である。詳細には、免疫原性組成物は、被験体に投与されると、ボルデテラ属細菌、より詳細には配列番号1の断片、に対する免疫応答を引き起こす。特に、ボルデテラ属細菌に対する免疫応答は、防御的であり、すなわち、ボルデテラ属細菌、特に百日咳菌によって引き起こされる感染、疾患または定着を予防し、または減少させることができる。したがって、組成物は、薬剤として許容できるといえる。それらは通常、抗原のほかに成分を含むものであって、たとえば、それらは通常、1つもしくは複数の製薬基剤および／または添加剤を含む。組成物は、一般に、水性形態で哺乳動物に投与される。しかしながら、投与前には、組成物は非水性の形態であってもよい。たとえば、ワクチンの中には、水性形態で製造された後、充填して配布され、やはり水性の形で投与されるものもあるが、製造時に凍結乾燥され、使用時に水性形態に再構成されるワクチンもある。したがって、本発明の組成物は、凍結乾燥製剤のように、乾燥されていてもよい。
【００５８】
組成物は、チメロサールまたは2-フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでいてもよい。しかしながら、ワクチンは、実質的に水銀物質を含まないこと（すなわち、5μg/mL未満）、たとえばチメロサールフリーであることが好ましい。水銀を含まないワクチンがより好ましい。保存剤を含まないワクチンが特に好ましい。
【００５９】
浸透圧を調節するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（NaCl）を使用することができるが、これは1及び20mg/mLの間で、たとえば約10±2mg/mL NaClとして存在しうる。存在しうる他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００６０】
本発明の免疫原性組成物は、2価の金属塩、より詳細には、カルシウム塩、さらにより詳細には塩化カルシウムを含んでいてもよい。Ca2+の存在は、本発明のポリペプチド断片の立体構造を維持するのに役立ち得る。
【００６１】
組成物は、一般に、200 mOsm/kg及び400 mOsm/kgの間、好ましくは240〜360 mOsm/kgの間の浸透圧を有し、より好ましくは290〜310 mOsm/kgの範囲内に収まる。いくつかの実施形態において、組成物は高浸透圧性であってもよく、たとえば、約700 mOsm/Kgの浸透圧を有していてもよい。
【００６２】
組成物は、1以上のバッファーを含有することができる。典型的なバッファーとしては：リン酸バッファー；Trisバッファー；ホウ酸バッファー；コハク酸バッファー；ヒスチジンバッファー（特に水酸化アルミニウムアジュバントを含む）；またはクエン酸バッファーが挙げられる。バッファーは、典型的には5〜20 mMの範囲内に含まれる。
【００６３】
組成物のpHは、一般に、5.0及び8.1の間、より典型的には6.0及び8.0の間、たとえば6.5及び7.5の間、または7.0及び7.8の間である。
【００６４】
組成物は、好ましくは無菌である。組成物は、好ましくは非発熱性であり、たとえば、1回の投与量あたりに含まれるエンドトキシン量が<1 EU（エンドトキシン単位、標準的な測定法）であり、より好ましくは1回の投与量あたりのエンドトキシン量が<0.1 EUである。組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【００６５】
組成物は、単回の免疫接種用の材料を含んでいてもよく、複数回の免疫接種のための材料を含んでいてもよい（すなわち、「複数回投与」キット）。保存剤を含むことは、複数回投与の構成においては好ましい。複数回投与用組成物中に保存剤を含めることに代わる手段として（またはそれに加えて）、組成物は、材料を取り出すための無菌アダプターを有する容器内に収められていてもよい。
【００６６】
ヒトワクチンは、典型的には約0.5mLの投与量で投与されるが、小児には半量(すなわち約0.25mL)を投与してもよい。
【００６７】
本発明の免疫原性組成物はまた、1以上の免疫調節薬を含んでいてもよい。好ましくは、1以上の免疫調節薬は、1以上のアジュバントを含む。アジュバントには、下記でさらに検討されるTH1アジュバントおよび／またはTH2アジュバントを含めることができる。
【００６８】
本発明の組成物に使用することができるアジュバントには、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機物含有組成物がある。本発明の組成物は、水酸化物（たとえばオキシ水酸化物）、リン酸塩（たとえば水酸化リン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などの無機塩[たとえば参考文献4の第8および9章を参照されたい]、または異なる無機化合物の混合物を含有してもよく、その化合物は任意の適切な形態（たとえば、ゲル、結晶質、非晶質など）をとる。無機物含有組成物はまた、金属塩の粒子として製剤されてもよい。
【００６９】
「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、通常は少なくとも部分的に結晶性である。式AlO(OH)で表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（IR）分光法によって、特に1070cm-1に吸収バンドが存在し、3090〜3100cm-1に強いショルダーが存在することによって、たとえば水酸化アルミニウムAl(OH)3となどの他のアルミニウム化合物と区別することができる［参考文献4の第9章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶性の程度は、回折バンドの半値幅（WHH）に反映されており、結晶性の低い粒子は、結晶サイズが小さいためにより大きな線幅拡大を示す。WHHが増加するにつれて表面積は増加するが、アジュバントがより高いWHH値を有するほど、抗原吸着能力が高いことが確認されている。繊維状形態（たとえば、透過型電子顕微鏡写真で見られる）は、水酸化アルミニウムアジュバントの典型的な形態である。水酸化アルミニウムアジュバントのpIは、典型的には約11であって、すなわちアジュバントはそれ自体が生理的pHにおいて正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントについては、pH7.4において、Al+++ 1mgあたり1.8〜2.6mgの間のタンパク質の吸着能が報告されている。
【００７０】
「リン酸アルミニウム」として知られるアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、しばしば少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）も含有する。それらは沈殿によって得られるが、沈殿の際の反応条件および濃度は、塩のヒドロキシル基に対するリン酸基の置換の程度に影響を与える。ヒドロキシリン酸塩は、一般的にPO4/Alモル比が0.3及び1.2の間である。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在によって厳密なAlPO4から区別することができる。たとえば、3164cm-1におけるIRスペクトルバンド（たとえば、200℃に加熱した場合）は、構造的ヒドロキシル基の存在を示している[参考文献4の第9章]。
【００７１】
リン酸アルミニウムアジュバントのPO4/Al3+モル比は、一般に0.3及び1.2の間であるが、好ましくは0.8及び1.2の間、より好ましくは0.95±0.1である。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩の場合、一般に非晶質となる。典型的なアジュバントは、0.6mg Al3+/mLにおいて含まれるPO4/Alモル比が0.84及び0.92の間である、非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、一般に粒子状（たとえば、透過型電子顕微鏡写真で見られるような板状形態）である。粒子の典型的な直径は、任意の抗原の吸着後に、0.5〜20μm（たとえば、約5〜10μm）の範囲にある。リン酸アルミニウムアジュバントについては、pH7.4においてAl+++ 1mgあたり0.7〜1.5mgの間のタンパク質の吸着能力が報告されている。
【００７２】
リン酸アルミニウムのゼロ電荷電位（PZC）は、ヒドロキシル基に対するリン酸基の置換の程度に反比例しており、この置換の程度は、沈殿による塩の調製に使用される反応条件および反応物の濃度に応じて変動しうる。PZCはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度の変化よって（より多くのリン酸イオン＝より酸性のPZC）、またはヒスチジンバッファーなどのバッファーの添加によって（PZCをより塩基性にする）、変化する。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に4.0及び7.0の間、より好ましくは5.0及び6.5の間、たとえば約5.7のPZCを有する。
【００７３】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液は、バッファー（たとえば、リン酸またはヒスチジンまたはTrisバッファー）を含有することができるが、これは必ずしも必要ではない。懸濁液は、好ましくは無菌で発熱物質を含まない。懸濁液は、遊離の水性リン酸イオンを含んでいてもよく、たとえば1.0及び20mMの間、好ましくは5及び15mMの間、より好ましくは約10mMの濃度で存在する。懸濁液はまた、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。
【００７４】
ある実施形態において、アジュバント成分は、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両者の混合物を含む。この場合、リン酸アルミニウムが水酸化物よりも多く存在してもよく、たとえば、少なくとも2：1の重量比、たとえば、≧5:1、≧6:1、≧7:1、≧8:1、≧9:1等の重量比とすることができる。
【００７５】
患者に投与するための組成物中のAl+++の濃度は、好ましくは10mg/mL未満、たとえば、≦5mg/mL、≦4mg/mL、≦3mg/mL、≦2mg/mL、≦1mg/mL等である。好ましい範囲は、0.3及び1mg/mLの間である。最大で<0.85mg/投与量が好ましい。
【００７６】
本発明のポリペプチドは、Al(OH)3などのアルミニウムアジュバントに吸着していてもよい。
【００７７】
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した油エマルション組成物には、MF59のようなスクアレン−水エマルションがある［参考文献4の第10章；参考文献5も参照されたい］（5%スクアレン、0.5%Tween 80、および0.5%Span 85、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤された）。完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)も使用することができる。
【００７８】
AS01は、MPL（3-O-脱アシル化-4'-モノホスホリルリピドA）、QS21（(Quillaja saponaria Molina、フラクション21)Antigenics, New York, NY, USA）およびリポソームを含むアジュバント系である。AS01Bは、MPL、QS21およびリポソーム（50μg MPLおよび50μg QS21）を含有するアジュバント系である。AS01Eは、MPL、QS21およびリポソーム（25μg MPLおよび25μg QS21）を含有するアジュバント系である。ある実施形態において、免疫原性組成物もしくはワクチンは、AS01を含む。別の実施形態において、免疫原性組成物もしくはワクチンは、AS01BまたはAS01Eを含む。特定の実施形態において、免疫原性組成物もしくはワクチンは、AS01Eを含む。
【００７９】
サポニン製剤もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。サポニンは、ステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の多様な成分からなる混成群であり、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根、および花にも含まれている。Quillaia saponaria Molina樹木の樹皮から得られるサポニンは、アジュバントとして幅広く研究されてきた。また、サポニンは、Smilax ornata（サルトリイバラ科シオデ属の植物）（サルサパリラ）、シュッコンカスミソウ（Gypsophila paniculata）(ブライド・ベール(brides veil))、およびサボンソウ（Saponaria officinalis）(カスミソウ(soap root))からも商業的に得ることができる。サポニンアジュバント製剤には、QS21のような精製製剤、およびISCOMのような脂質製剤が含まれる。QS21はStimulon（商標）として販売されている。
【００８０】
サポニン組成物は、HPLCおよびRP-HPLCを用いて精製されている。これらの技術を用いて精製された特定の画分は、QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B、およびQH-Cなどが確認されている。好ましくは、サポニンはQS21である。QS21の製造方法は、参照文献6に開示されている。サポニン製剤はまた、ステロール、たとえばコレステロールを含んでいてもよい[7]。
【００８１】
サポニンおよびコレステロールの組み合わせは、免疫刺激複合体（ISCOM）と呼ばれるユニークな粒子を形成するために使用することができる［参考文献4の第23章］。ISCOMはまた、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質を含む。任意の公知のサポニンをISCOMに使用することができる。好ましくは、ISCOMは、QuilA、QHAおよびQHCのうちの1つまたは2つ以上を含む。ISCOMは参考文献7-9にさらに記載されている。必要に応じて、ISCOMは、追加の界面活性剤を欠いていてもよい[10]。
【００８２】
サポニンベースのアジュバント開発の総説は、参考文献11および12に見出すことができる。
【００８３】
本発明における使用に適した他のアジュバントとしては、細菌性または微生物性の誘導体、たとえば腸内細菌リポ多糖類（LPS）の非毒性誘導体、リピドA誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ADPリボシル化毒素およびそれらの無毒化誘導体、ならびに細菌外膜小胞（OMV）が挙げられる。
【００８４】
LPSの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドA（MPL）および3-O-脱アシル化MPL（3dMPL）がある。3dMPLは、4、5または6つのアシル化鎖を有する3脱-O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。3脱-O-アシル化モノホスホリルリピドAの好ましい「小粒子」の形態は、参考文献13に開示されている。3dMPLのそのような「小粒子」は、0.22μmの膜を通して無菌濾過することができるほど小さい[13]。他の非毒性LPS誘導体には、アミノアルキルグルコサミニドリン酸誘導体などの、モノホスホリルリピドAミミック、たとえばRC-529 [14、15]が含まれる。
【００８５】
リピドA誘導体としては、OM-174などの大腸菌由来のリピドA誘導体が挙げられる。OM-174は、たとえば、参考文献16および17に記載されている。アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献18-20に記載されている。
【００８６】
特定の実施形態において、組成物中の抗原およびアジュバントは、患者に投与される時点で混和状態となっている。特定の実施形態において、アジュバントおよび抗原は、包装され、または配布されたワクチンの中で、別々に、使用時に最終製剤となる準備が整った状態に保たれていてもよい。抗原は、投与前に2つの成分を混合することによってワクチンが最終的に調製されるように、水性形態または凍結乾燥形態で存在しうる。混合するための2つの液体の体積比は、任意に設定できるが（たとえば、5:1から1:5まで）、一般的には約1:1である。
【００８７】
本発明はまた、上記のアジュバントのうち1以上のアジュバントの態様の組み合わせを含んでいてもよい。たとえば、以下のアジュバント組成物を本発明に使用することができる：(1)サポニンおよび水中油型エマルション[21]；(2)サポニン（たとえばQS21）＋非毒性LPS誘導体（たとえば3dMPL）[22]；(3)サポニン（たとえばQS21）＋非毒性LPS誘導体（たとえば3dMPL）＋コレステロール；(4)サポニン（たとえばQS21）＋3dMPL＋IL-12（必要に応じて＋ステロール）［23］；(5)3dMPLと、たとえば、QS21および／または水中油型エマルションとの組み合わせ［24］。
【００８８】
本発明の組成物は、さまざまな形態で調製することができる。たとえば、組成物は、注射剤として、溶液または懸濁液として調製することができる。注射前に液体溶媒中に溶解または懸濁するのに適した固体形態（たとえば、凍結乾燥された組成物または噴霧凍結乾燥組成物）を調製することも可能である。組成物は、たとえば軟膏、クリームまたは粉末として、局所投与用に調製されることもある。組成物は、たとえば、微粉末または噴霧剤を用いて、吸入剤として、肺投与用に調製されてもよい。組成物は、たとえば滴剤として、鼻、耳、または眼への投与用に調製することができる。組成物は、患者への投与直前に混合された組成物が再構成されるように設計された、キット形態であってもよい。このようなキットは、液体形態の1つもしくは複数の抗原、および1つもしくは複数の凍結乾燥抗原を含んでいてもよい。
【００８９】
組成物が使用前にその場で調製されるべき（たとえば、成分が凍結乾燥形態で与えられる場合）で、キットとして提供される場合、そのキットは、2つのバイアルを含むか、または、1つの充填済みシリンジおよび1つのバイアルを含み、そのシリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化するために使用されてもよい。
【００９０】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、必要に応じて、免疫学的に有効な量の抗原（1以上）およびその他の成分を含有する。「免疫学的に有効な量」とは、その量を単回投与または一連の投与の一部として個体に投与すると、治療または予防に有効であることを意味する。この量は、治療を受ける個体の健康状態および体調、年齢、治療を受ける個体の分類群（例：非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、求められる防御の程度、ワクチンの製剤、治療する医師の医学的状況の評価、およびその他の関連する要因によって変動する。その量は、日常的な試験で決定できる比較的広い範囲に収まることが期待される。
【００９１】
治療およびワクチン投与の方法
本発明はまた、上記のポリペプチド、核酸または免疫原性組成物の有効量を投与するステップを含む、哺乳動物において免疫応答を高めるための方法を提供する。免疫応答は、好ましくは防御的であり、好ましくは抗体および／または細胞性免疫を含む。この方法は、ブースター応答を上昇させることもできる。
【００９２】
本発明はまた、薬剤として使用するための、たとえば哺乳動物において免疫応答を高めるために使用するための、上記のポリペプチド、核酸または免疫原性組成物を提供する。
【００９３】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を高めるための薬剤の製造における、上記のポリペプチド、核酸または免疫原性組成物の使用を提供する。
【００９４】
これらの使用および方法によって哺乳動物での免疫応答を高めることにより、哺乳動物は、ボルデテラ属細菌、特に百日咳菌によって引き起こされる疾患および／または感染、たとえば百日咳、から防御されることが可能である。
【００９５】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を予め充填した投与デバイスを提供する。
【００９６】
哺乳動物は、好ましくはヒトである。ヒトは、小児、ティーンエイジャー、または成人とすることができる。小児は、１歳未満であってもよく、たとえば、生後0〜60日の新生児、生後0〜8週間、たとえば、生後7週間の乳児であってもよく、生後2〜18ヶ月、たとえば、生後2、3、4、5、6、15、16、17、18ヶ月であってもよい。本発明の免疫原性組成物は、ブースターワクチンとして使用するためのものであってもよく、たとえば、4〜6歳に投与されてもよい（米国スケジュール）。英国では、百日咳ワクチン接種は2、3、および4ヶ月で行われ、3歳4ヶ月で就学前ブースターが行われる。
【００９７】
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接投与は、非経口的な（たとえば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔への）注射によって行うことができる。一部の実施形態において、粘膜投与を用いてもよい。
【００９８】
投与は、単回投与スケジュールによるものでも、複数回投与スケジュールによるものであってもよい。複数回投与は、一次免疫スケジュールおよび／またはブースター免疫スケジュールで使用することができる。複数回投与スケジュールでは、さまざまな投与量が、同じ経路、または異なる経路、たとえば、非経口プライムおよび粘膜ブースト、粘膜プライムおよび非経口ブーストなど、で投与することができる。複数回投与は、典型的には、少なくとも1週間（たとえば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など）の間隔をあけて投与される。
【００９９】
本発明に従って調製されたワクチンは、小児および成人の両者を治療するために使用することができる。したがって、ヒト患者は、1歳未満、5歳未満、1〜5歳、5〜15歳、15〜55歳、または少なくとも55歳とすることができる。ワクチンを受けるのに好ましい患者は、青年（たとえば、13〜20歳）、妊婦、および高齢者（たとえば、50歳以上、60歳以上、好ましくは65歳以上）である。しかしながら、ワクチンは、これらのグループにのみ適しているわけではなく、より一般的に集団に使用することができる。
【０１００】
他の抗原との組み合わせ
本発明のポリペプチドは、他の抗原と組み合わせて使用することができる。したがって、本発明は、以下の組み合わせを含む免疫原性組成物を提供する：
(1)上記の本発明のポリペプチド；および
(2)ジフテリアトキソイド；破傷風トキソイド；1以上の百日咳抗原；B型肝炎ウイルス表面抗原；不活化ポリオウイルス抗原；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）血清型B由来の莢膜糖抗原のコンジュゲート；1以上のRSV抗原、からなる群から選択される1以上の抗原。
【０１０１】
ジフテリアトキソイドは、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）由来のジフテリア毒素を（たとえば、ホルムアルデヒドを用いて）処理することによって得ることができる。ジフテリアトキソイドは、たとえば、参考文献25の第13章に、より詳細に開示されている。
【０１０２】
破傷風トキソイドは、破傷風菌（Clostridium tetani）由来の破傷風毒素を（たとえば、ホルムアルデヒドを用いて）処理することによって得ることができる。破傷風トキソイドは、たとえば、参考文献25の第27章にさらに詳細に開示されている。
【０１０３】
ワクチンに含まれる百日咳抗原は、細胞性（全細胞、Pw）または無細胞性（Pa）のいずれかである。本発明は、いずれかの種類の百日咳抗原を使用することができる。細胞性百日咳抗原の調製はよく知られており（たとえば、参考文献25の第21章を参照されたい）、たとえば、百日咳菌の第I相培養物の熱不活化によって得ることができる。無細胞性百日咳抗原は、天然細菌から精製された、または組換え宿主での発現後に精製された、特異的な精製百日咳抗原を含む。2つ以上の無細胞抗原を使用することが通常であり、したがって、組成物は、周知の、特徴の明らかな、以下の百日咳抗原のうちの1つ、2つまたは3つを含むことができる：(1) 遺伝子的に無毒化された百日咳トキソイドなどの、無毒化百日咳毒素（百日咳トキソイド、または「PT」）；(2) 繊維状赤血球凝集素（「FHA」）；(3) パータクチン（「69キロダルトン外膜タンパク質」としても知られる）。FHAおよびパータクチンは、本発明に従って使用する前にホルムアルデヒドで処理してもよい。PTは、ホルムアルデヒドおよび／またはグルタルアルデヒドで処理することによって無毒化することができるが、この化学的無毒化手順の代わりに、変異誘発によって酵素活性が低下した変異型PTであってもよい[26]。使用することができるさらに他の無細胞百日咳抗原には、線毛（fimbriae）（たとえば、凝集原2および3）がある。
【０１０４】
B型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）は、B型肝炎ウイルスのカプシドの主成分である。これは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母において組換え発現させることによってうまく作製される。
【０１０５】
不活化ポリオウイルス（IPV）抗原は、細胞培養上で増殖させたウイルスから調製され、その後、（たとえば、ホルムアルデヒドを使用して）不活化される。参考文献25の第24章で説明されているように、3種類のポリオポリオウイルスのうち1つによって急性灰白髄炎が引き起こされる可能性があるので、組成物は、3種類のポリオウイルス抗原：ポリオウイルス1型（たとえば、Mahoney株）、ポリオウイル2型（たとえば、MEF-1株）、およびポリオウイルス3型（たとえば、Saukett株）を含むことができる。
【０１０６】
組成物が成分(2)の中にジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、または無細胞百日咳抗原の1つを含むならば、それは通常、それらの3つすべてを含んでおり、すなわち成分(2)はD-T-Paの組み合わせを含むことになる。
【０１０７】
組成物が成分(2)の中にジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、または細胞性百日咳抗原の1つを含むならば、それは通常、それらの3つすべてを含んでおり、すなわち成分(2)はD-T-Pwの組み合わせを含むことになる。
【０１０８】
本発明の特定の実施形態 - ACドメイン断片
本発明の実施形態において、アミノ酸配列：
A-X-B
を含むか、またはそれからなる、ポリペプチドが提供されるが、式中、Xは、配列番号15、16、または17との同一性を有する配列からなるアミノ酸配列であり；Aは場合によって存在してもよいN末端アミノ酸配列であり；Bは場合によって存在してもよいC末端アミノ酸配列である。詳細には、配列同一性のレベルは、90%から100%である。より詳細には、配列同一性のレベルは、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%である。さらにより詳細には、配列同一性レベルは100%である。詳細には、AおよびBは、アデニル酸シクラーゼ、特に配列番号1のアデニル酸シクラーゼ、またはその3つ以上連続するアミノ酸の断片に由来しない場合によって存在してもよい配列である。いくつかの実施形態において、新規断片は、配列番号15、16、17、18、19、20、21または22に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０１０９】
実施形態1
アミノ酸配列：
A-X-B
を含むポリペプチドであって、式中、Xは、配列番号15、16、または17と少なくとも99%の同一性を有する配列からなるアミノ酸配列であり；Aは場合によって存在してもよいN末端アミノ酸配列であり；Bは場合によって存在してもよいC末端アミノ酸配列である、ならびに式中AおよびBは、存在する場合、アデニル酸シクラーゼもしくはその断片に由来しない、前記ポリペプチド。
【０１１０】
実施形態2
配列番号15、16、17、18、19または20と少なくとも99%の同一性を有する配列からなる、実施形態1のポリペプチド。
【０１１１】
実施形態3
配列番号15、16、17、18、19または20と100%の同一性を有する配列からなる、実施形態2のポリペプチド。
【０１１２】
実施形態4
Aおよび／またはBがヒスチジンタグである、実施形態1のポリペプチド。
【０１１３】
実施形態5
配列番号21または22と少なくとも99%の同一性を有する配列からなる、実施形態4のポリペプチド。
【０１１４】
実施形態6
配列番号21または22と100%の同一性を有する配列からなる、実施形態5のポリペプチド。
【０１１５】
実施形態7
たとえば、アデニル酸シクラーゼ毒素中和アッセイによって、具体的には実施例に記載されるように測定される、配列番号1のアミノ酸配列を有するアデニル酸シクラーゼタンパク質に結合する抗体を含む、抗体応答を引き起こすことができる、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のポリペプチド。
【０１１６】
実施形態8
実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードする核酸。
【０１１７】
実施形態9
実施形態8の核酸を含有する、および／または実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチドを発現する、細菌。
【０１１８】
実施形態10
実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、または請求項８に記載の核酸を含有する、免疫原性組成物。
【０１１９】
実施形態11
アジュバントを含有する、実施形態10に記載の免疫原性組成物。
【０１２０】
実施形態12
治療に使用するための、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態8に記載の核酸、または実施形態10〜13に記載の免疫原性組成物。
【０１２１】
実施形態13
百日咳菌による疾患および／または感染の治療または予防に使用するための、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態8に記載の核酸、または実施形態10〜13に記載の免疫原性組成物。
【０１２２】
実施形態14
哺乳動物、たとえばヒトにおいて百日咳菌によって引き起こされる疾患および／または感染を治療する方法であって、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態8に記載の核酸、または実施形態10〜13に記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【０１２３】
実施形態15
哺乳動物、たとえばヒトにおいて百日咳菌によって引き起こされる疾患および／または感染を予防する方法であって、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態8に記載の核酸、または実施形態10〜13に記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【０１２４】
実施形態16
ポリペプチド、核酸または免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、哺乳動物、たとえばヒトにおいて百日咳菌による疾患および／または感染を治療または予防する方法に使用するための、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリペプチド、実施形態8に記載の核酸、または実施形態10〜13に記載の免疫原性組成物。
【０１２５】
本発明の特定の実施形態-RTX断片
本発明のいくつかの実施形態において、アミノ酸配列：
A-X-B
からなるか、またはそれを含むポリペプチドが提供されるが、式中、Xは、配列番号2、3または4と同一性を有する配列からなるアミノ酸配列であり；Aは場合によって存在してもよいN末端アミノ酸配列であり；Bは場合によって存在してもよいC末端アミノ酸配列である。詳細には、配列同一性のレベルは、90%〜100%である。より詳細には、配列同一性のレベルは、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%である。 さらにより詳細には、配列同一性のレベルは100%である。具体的には、AおよびBは、アデニル酸シクラーゼ、特に配列番号1のアデニル酸シクラーゼ、またはその3つ以上連続するアミノ酸の断片に由来しない、場合によって存在してもよい配列である。
【０１２６】
特に、本発明の断片は、配列番号1と比較して、少なくとも20個のアミノ酸、たとえば、少なくとも21個のアミノ酸、少なくとも22個のアミノ酸、少なくとも23個のアミノ酸、少なくとも24個のアミノ酸、または少なくとも25個のアミノ酸のC末端におけるトランケーションを含む。特に、本発明の断片は、配列番号1と比較して、少なくとも25個のアミノ酸のC末端におけるトランケーションを含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、新規断片は、配列番号2、3、4、5、6または7に対して配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【０１２８】
実施形態17
アミノ酸配列A-X-Bからなる単離されたポリペプチドであって、式中、AはN末端メチオニン残基であり、Xは配列番号2、3、および4からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、Bは存在しない、前記の単離されたポリペプチド。
【０１２９】
実施形態18
配列番号23と少なくとも95%の配列同一性を有する、単離されたポリペプチド。
【０１３０】
実施形態19
配列番号23のアミノ酸配列からなる、単離されたポリペプチド。
【０１３１】
実施形態20
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたポリペプチド。
【０１３２】
実施形態21。ボルデテラ属細菌、特に百日咳菌によって引き起こされる感染または定着の予防または低減に使用するための、実施形態17〜20のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチド。
【０１３３】
実施形態22
(i) 実施形態17〜20のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチド、(ii) ジフテリアトキソイド、(iii) 破傷風トキソイド、(iv) 無毒化百日咳毒素（百日咳トキソイド、または「PT」）、特に遺伝子的に無毒化された百日咳トキソイド（PTg）、(v) 繊維状赤血球凝集素（「FHA」）、および(vi) パータクチンを含む、免疫原性組成物。
【０１３４】
実施形態23
(i) 実施形態17〜20のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチド、(ii) ジフテリアトキソイド、(iii) 破傷風トキソイド、(iv) 無毒化百日咳毒素（百日咳トキソイド、または「PT」）、特に遺伝子的に無毒化された百日咳トキソイド（PTg）、（v） 繊維状赤血球凝集素（「FHA」）、（vi） パータクチン、および（vii） 不活化ポリオウイルス（「IPV」）を含む、免疫原性組成物。
【０１３５】
実施形態24
(i) 実施形態17〜20のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチド、(ii) ジフテリアトキソイド、(iii) 破傷風トキソイド、(iv) 無毒化百日咳毒素（百日咳トキソイド、または「PT」）、特に遺伝子的に無毒化された百日咳トキソイド（PTg）、（v） 繊維状赤血球凝集素（「FHA」）、（vi） パータクチン、（vii） 不活化ポリオウイルス（「IPV」）、および(viii) Hibコンジュゲートを含む、免疫原性組成物。
【０１３６】
実施形態25
(i) 実施形態17〜20のいずれか1つに記載の単離されたポリペプチド、(ii) ジフテリアトキソイド、(iii) 破傷風トキソイド、(iv) 無毒化百日咳毒素（百日咳トキソイド、または「PT」）、特に遺伝子的に無毒化された百日咳トキソイド（PTg）、（v） 繊維状赤血球凝集素（「FHA」）、（vi） パータクチン、（vii） 不活化ポリオウイルス（「IPV」）、(viii) Hibコンジュゲート、および(ix) B型肝炎ウイルス表面抗原を含む、免疫原性組成物。
【０１３７】
実施形態26
実施形態22〜25のいずれか1つに記載の免疫原性組成物であって、さらにアジュバント、たとえばAS01、アルミニウム塩アジュバント、および／またはTLRアゴニスト、たとえばTLR7アゴニスト、を追加して含む、前記免疫原性組成物。
【０１３８】
実施形態27
アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびヒドロキシリン酸硫酸アルミニウムからなる群から選択される、アルミニウム塩アジュバントである、実施形態26に記載の免疫原性組成物。
【０１３９】
実施形態28
単離されたポリペプチドが、配列番号23のアミノ酸配列からなる、実施形態22〜27のいずれか1つに記載の免疫原性組成物。
【０１４０】
実施形態29
哺乳動物、たとえばヒトにおいて百日咳菌によって引き起こされる疾患および／または感染を治療する方法であって、実施形態17〜20のいずれか1つに記載のポリペプチド、または実施形態22〜28のいずれか1つに記載の免疫原性組成物の、有効量を投与することを含む、前記方法。
【０１４１】
実施形態30
哺乳動物、たとえばヒトにおいて百日咳菌によって引き起こされる疾患および／または感染を予防する方法であって、実施形態17〜20のいずれか1つに記載のポリペプチド、または実施形態22〜28のいずれか1つに記載の免疫原性組成物の、有効量を投与することを含む、前記方法。
【０１４２】
実施形態31
哺乳動物、たとえばヒトにおいて、百日咳菌によって引き起こされる疾患および／または感染を治療または予防する方法に使用するための、実施形態17〜20のいずれか1つに記載のポリペプチドであって、その方法が、有効量の前記ポリペプチド、または実施形態22〜28のいずれか1つに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、前記ポリペプチド。
【０１４３】
総則
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当分野の技術の範囲内で、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬学の従来の方法を採用する。そのような技術は、文献において十分に説明されている。たとえば、参考文献27-34などを参照されたい。
【０１４４】
上記では「GI」ナンバリングが使用されている。GI番号、すなわち「GenInfo Identifier」とは、NCBIがデータベースに配列を追加する際に、NCBIが処理する各配列レコードに連続して割り当てられる一連の数字である。GI番号は、配列レコードのアクセッション番号とはまったく類似性がない。配列が更新された場合（たとえば、修正のため、またはアノテーションもしくは情報の追加）には、新しいGI番号が付与される。したがって、与えられたGI番号に関連付けられた配列が変更されることはない。
【０１４５】
本発明が「エピトープ」に関する場合、このエピトープは、B細胞エピトープおよび／またはT細胞エピトープとすることができる。そのようなエピトープは、実験に基づいて同定することができ（たとえば、PEPSCAN [35、36]または同様の方法を用いて）、または、予測することができる（たとえば、Jameson-Wolf抗原性指数[37]、マトリクスベースのアプローチ[38]、MAPITOPE [39]、TEPITOPE [40、41]、ニューラルネットワーク[42]、OptiMer & EpiMer [43、44]、ADEPT [45]、Tsites [46]、親水性[47]、抗原性指数 [48]、または参考文献49-53に記載の方法などを使用して）。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位によって認識され、それに結合する抗原の部分であり、「抗原決定基」と称されることもある。
【０１４６】
「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」ことを包含しており、たとえば、Xを「含む（comprising）」組成物は、追加的なもの、たとえば、X＋Yを含むことができる。「実質的に（substantially）」という語は、「完全に（completely）」を除外するものではなく、たとえば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まないこともある。いくつかの実施形態において、「含む（comprising）」という用語は、列挙されたポリペプチドなどの、指示された活性薬剤を含むこと、ならびに、他の活性薬剤、および製薬業界で知られている製薬上許容される基剤、添加剤、緩和剤、安定化剤などを含むことを指す。いくつかの実施形態において、「基本的に〜からなる（consisting essentially of）」という用語は、組成物の唯一の有効成分が、たとえば抗原などの指定された有効成分（1つもしくは複数）であるような組成物を指すものであるが、しかしながら、製剤を安定化し保存することなどを目的とするが指定の有効成分の治療効果には直接関与しない、他の化合物を含んでいてもよい。「基本的に〜からなる」という移行句の使用は、請求項の範囲が、その請求項に記載された特定の材料またはステップ、ならびに、請求項に関わる発明の基本的かつ新規な特性に実質的な影響を及ぼさないものを包含すると解釈できることを意味する。In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461,463 (CCPA 1976)を参照されたい(原文では強調)；MPEP§2111.03も参照されたい。したがって、「基本的に〜からなる」という用語は、本発明の請求項で使用される場合、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。「〜からなる（consisting of）」という用語およびその変化形は、特に明示的に指定されない限り、「〜に限定される（limited to）」ことを意味する。特定の領域においては、「基本的に〜からなる」の代わりに、「〜からなる有効成分を含む」という表現を使用することができる。
【０１４７】
数値xに関する「約」という用語は、たとえば、x±10%、x±5%、x±4%、x±3%、x±2%、x±1%を意味する。
【０１４８】
方法が、たとえば(a)、(b)、(c)などのような投与のステップを指す場合、これらは順に起こることが意図されており、すなわち、ステップ(a)がステップ(b)に先行し、そのステップ(b)の後にステップ(c)が続く。抗体は、一般に、その標的に対して特異的であり、すなわち、ウシ血清アルブミンのような無関係な対照タンパク質よりも標的に対して高い親和性を有するものである。したがって、特に明記されない限り、2つ以上の成分を混合するステップを含むプロセスは、なんら特定の混合順序を必要としない。したがって、成分は任意の順序で混合することができる。3つの成分がある場合には、2つの成分を互いに組み合わせ、その後、その組み合わせを第3の成分と組み合わせることなどができる。
【０１４９】
抗体は一般に標的に対して特異的である。したがって、抗体は、ウシ血清アルブミンのような無関係な対照タンパク質よりも標的に対して高い親和性を有するものである。
【０１５０】
2つのアミノ酸配列間のパーセント配列同一性への言及は、アラインメントされたときに、2つの配列を比較すると、そのパーセントのアミノ酸が同一であることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で知られているソフトウェアプログラム、たとえば参考文献54の7.7.18項に記載されているものを用いて決定することができる。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティ12およびギャップ拡張ペナルティ2、BLOSUM行列62によるアフィンギャップ検索を用いたSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムによって決定される。Smith-Waterman相同性検索アルゴリズムは、参照文献55に開示されている。しかしながら、断片に関しては、配列同一性は、最長の配列を基準として評価される。非限定的な説明として、10アミノ酸長の断片の配列は、100アミノ酸長の完全長配列の一部と同一であるかもしれないが、最長配列の長さに基づく配列同一性は10%となる（最短配列を基準として算出された場合の100%とはならない）。
【実施例】
【０１５１】
本発明を実施するための形態
実施例１
ポリペプチドの調製
発現プラスミドおよび組換え株
目的とするタンパク質およびC末端のHisタグをコードする遺伝子を、標準的な手順によりNdeI/XhoI制限部位を用いてpET24b(+)発現ベクター(Novagen)にクローニングした。最終的な構築物は、大腸菌B834(DE3)株を、CaCl2処理細胞を用いた標準的な方法に従って適当な組換え発現ベクターで形質転換することにより作製した（Hanahan D. "Plasmid transformation by Simanis." Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.).
【０１５２】
宿主株
B834(DE3)：プロテアーゼ欠損およびメチオニン要求株。(DE3)という指示がある株は、IPTG誘導性T7 RNAポリメラーゼを含有するλプロファージに対して溶原性である。λDE3溶原菌は、pETベクターからタンパク質を発現させるように設計されている。また、この株はlonおよびompTプロテアーゼを欠損している。
遺伝子型：B834::DE3株、F- ompT hsdSB(rB - mB-) gal dcm met (DE3)
【０１５３】
RTX断片（配列番号8）
野生型アデニル酸シクラーゼの残基985から残基1681に対応する組換えRTX断片を下記のように調製した。このタンパク質は、ヒスチジンタグ（GGHHHHHH）が付けられており、分泌された。この配列は、NspA（髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）の外膜タンパク質）に由来する異種シグナルペプチドを含有した。シグナルペプチド切断を最適化するために、このNspAに由来する2つの追加アミノ酸を含めた。
【０１５４】
組換えタンパク質の発現 - RTX断片
大腸菌形質転換体を寒天プレートから採取し、それを用いて、1%（w/v）グルコースおよびカナマイシン（50μg/mL）を添加したLBTブロスに、620 nmにおける光学密度（O.D620 nm）が0.1〜0.2の間となるように植菌した。培養物は37℃にて250rpmの攪拌速度で一晩インキュベートした。一晩培養した培養物を、カナマイシン(50μg/mL)含有LBT培地で1:20に希釈し、O.D.620nmが0.5〜0.8に達するまで、37℃、250rpmで増殖させた。
【０１５５】
0.5〜0.8程度のO.D620nmにおいて、1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドを添加してタンパク質発現を誘導し、37℃、250rpmにて3時間インキュベートした。3時間後にO.D620nmを調べて、培養物を14,000 rpmにて15分間遠心分離した。ペレットを別々に-20℃で凍結した。
【０１５６】
ポリペプチド断片の精製 - RTX断片
細菌ペレットを、プロテアーゼ阻害薬（Complete、EDTAなし）（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を添加した溶解バッファー（50mM Tris pH 8.3、300mM NaCl、10%グリセロール、2mM CaCl2、2mM Tris(2-カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP））（Sigma, St. Louis, MO）に再懸濁した。細菌をフレンチプレス（3回）により1200 PSIで溶解し、4℃にて15 000gで60分間遠心分離することによりペレット化した。上清に硫酸アンモニウム（終濃度18%）を添加し、室温で20分間攪拌した。この溶液を室温にて15 000gで15分間遠心分離した。上清を、バッファーA（20mM HEPES pH 7.6、500mM NaCl、20mMイミダゾール、10%グリセロール、2mM CaCl2、2mM TCEP）であらかじめ平衡化した5mL His Trap HPl（GE Healthcare, Piscataway, NJ）上に、AKTA（商標）Avant精製システムを用いてロードした。その後、カラムを、5カラム容（CV）のバッファーAで洗浄し、次いで6CVのバッファーAで洗浄した。3CVのバッファーB（20mM HEPES pH 7.6、500mM NaCl、500mMイミダゾール、10%グリセロール、2mM CaCl2、2mM TCEP）を用いて、タンパク質を溶出した。目的とするタンパク質を含有する画分を合わせてプールし、SUPERDEX（商標）200 26/60(GE Healthcare, Piscataway, NJ)上にロードした。タンパク質を1.5CVのバッファーC B（20mM HEPES pH 7.6、150mM NaCl、500mMイミダゾール、5%グリセロール、2mM CaCl2、1mM TCEP）で溶出した。タンパク質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により評価した。抗原を含む画分を選択し、SDS-PAGEによる純度に基づいて、合わせてプールした。最後に、タンパク質を無菌濾過し、-80℃で保存した。タンパク質濃度は、RC DC（商標）（還元剤および界面活性剤の共存可能な）タンパク質アッセイ（Biorad, Hercules, CA）を用いて測定した（図4）。
【０１５７】
組換えタンパク質の発現 - ACドメイン断片
大腸菌形質転換体を寒天プレートから採取し、それを用いて、1%（w/v）グルコースおよびカナマイシン(50μg/mL)を添加したLBTブロスに、O.D.620nmが0.1〜0.2の間となるように植菌した。培養物を37℃にて一晩、250rpmの撹拌速度でインキュベートした。一晩培養した培養物を、カナマイシン(50μg/mL)を含有するLBT培地で1:20に希釈し、O.D.620nmが0.5〜0.8に達するまで37℃、250rpmで増殖させた。0.5〜0.8程度のO.D620nmにおいて、i)タンパク質の発現を1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドの添加によって誘導し、37℃、250rpmで3時間インキュベートした、ii) 1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドの添加によって組換えタンパク質の発現を誘導する前に、培養物を冷却し、16℃にて250rpmで一晩インキュベートした。3時間／一晩（約16時間）インキュベートした後、O.D620nmを評価し、培養物を14,000rpmで15分間遠心分離し、ペレットを別々に-20℃で凍結した。
【０１５８】
以下の条件下での配列番号21の発現を図10に示す：大腸菌株：B834(DE3)、IPTG濃度：1mM、誘導：16℃、一晩。(1)分子量マーカー；(2)非誘導；(3)誘導。以下の条件下での配列番号22の発現を図12に示す：発現条件：大腸菌株：B834(DE3)、IPTG濃度：1mM、誘導：37℃、3時間。(1)分子量マーカー；(2)非誘導；(3)誘導；(4)非誘導；(5)誘導。
【０１５９】
ポリペプチド断片の精製 - ACドメイン断片
細菌ペレットを、プロテアーゼ阻害薬（Complete、EDTAなし）（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）および125ユニット/mLのBenzonase（Sigma, St. Louis, MO）を添加した溶解バッファー（20mM HEPES pH 7.6、500mM NaCl、10％グリセロール、20mMイミダゾール、5mM MgCl2（Sigma, St. Louis, MO）に再懸濁した。細菌をフレンチプレス（3回）により1200 PSIで溶解し、4℃にて15,000gで30分間遠心分離することによりペレット化した。上清は、バッファーA（20mM HEPES pH 7.6、500mM NaCl、20mM イミダゾール、10%グリセロール）であらかじめ平衡化した5mLのHis Trap HP（GE Healthcare, Piscataway, NJ）上にAKTA（商標）Avant精製システムを用いてロードした。次いで、カラムを10カラム容（CV）のバッファーAで洗浄した。3CVのバッファーB（20mM HEPES pH 7.6、500mM NaCl、500mMイミダゾール、10%グリセロール）を用いてタンパク質を溶出した。目的のタンパク質を含む画分を合わせてプールし、SUPERDEX（商標）75 26/60(GE Healthcare, Piscataway, NJ)上にロードした。タンパク質を1.5CVのバッファーC B（20mM HEPES pH 7.6、150mM NaCl、5%グリセロール）で溶出した。タンパク質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により評価した。抗原を含む画分を選択し、SDS-PAGEによる純度に基づいて、合わせてプールした。最後に、タンパク質を無菌濾過し、-80℃で保存した。タンパク質濃度は、RC DC（商標）（還元剤および界面活性剤の共存可能な）タンパク質アッセイ（Biorad, Hercules, CA）を用いて測定した。配列番号21の精製結果を図11に示す。配列番号22の精製結果を図13に示す。
【０１６０】
実施例２
Al(OH)3またはAS01を含有するRTXポリペプチドの製剤
6つの製剤を調製した：
製剤1  RTX 500μg/mL+AS01E Ca 2mM（フォールドされたRTX）
製剤2  RTX 50μg/mL+AS01E Ca 2mM（フォールドされたRTX）
製剤3  RTX 500μg/mL+AS01E Ca 2mM+5mM EGTA（アンフォールドされたRTX）
製剤4  RTX 50μg/mL+AS01E Ca 2mM+5mM EGTA（アンフォールドされたRTX）
製剤5  RTX 500μg/mL+ Al(OH)3 Ca 2mM
製剤6  RTX 50μg/mL+ Al(OH)3 Ca 2mM
[注: RTXはRTXポリペプチド断片のことを指す]
各製剤は以下の成分を含有した：
【０１６１】
2021534761.tif 000002
【０１６２】
2000uLの製剤1〜4を調製するために、製剤バッファー（150mM NaCl、1mM TCEP、20mM HEPES、5% Glycerol、2mM CaCl2、563mM NaCl）中のRTXポリペプチド断片をCaCl2およびPBS（pH7.4）と混合し、室温にて5〜30分間撹拌した。EGTA(エグタズ酸、もしくはエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸とも称される)を終濃度5mMとなるように製剤3および4に添加した。最後のステップで、AS01アジュバントを添加し、製剤を室温でさらに5〜30分間撹拌した。200uLの製剤5および6を調製するために、製剤バッファー中のRTXポリペプチド断片をCaCl2およびPBSと混合した。最後のステップでAl(OH)3を添加してから、室温にて60〜120分間撹拌した。
【０１６３】
Al(OH)3へのポリペプチド断片の吸着
Al(OH)3を含有する製剤の上清中にポリペプチド断片が存在しないことから、ポリペプチド断片がよく吸着していると考えられる（図2）。これらの結果は、NanoDSFおよびUPLC-SECで確認された。
【０１６４】
AS01とポリペプチド断片および／またはEGTAとの適合性
AS01の粒径は維持され、すべての条件において溶血は見られなかった。
【０１６５】
AS01および／またはEGTAの存在下でのポリペプチド断片の立体構造
AS01またはAS01バッファーの存在下において、断片ピーク（NanoDSF）は維持される。このデータは、アデニル酸シクラーゼ断片の二次構造が維持されることを確認する（フォールドされた状態）。EGTAの存在下においては、AS01の存在下であっても断片ピークが消失し、典型的なTmが観察される。このデータは、断片の二次構造がCa++の存在なしには維持されないことを示している。Al(OH)3とともに製剤すると、ポリペプチド断片はその表面に吸着するため、断片ピークの消失が観察される。
結果を図3に示す。
【０１６６】
実施例３
RTX断片のフォールド／アンフォールド状態における免疫原性の評価
15匹の雌マウス（BALB/cOlaHsd、6週齢）の6群に、表1に示すように、1日目、14日目、および28日目に各ワクチン製剤50μLを用いて筋肉内に免疫接種した。28日目（14PII）に部分的な採血を行い、42日目（14PIII）に最終的な採血を行った。表1：
【０１６７】
【表１】
2021534761.tif 000003
【０１６８】
アデニル酸シクラーゼ毒素の血清中和アッセイ
アデニル酸シクラーゼ毒素の細胞毒性中和アッセイは、ACTの濃度に若干の変更を加えたほかは、Ebyら（Clinical and Vaccine Immunology, January 2017 Volume 24 Issue 1、1-10ページ）に記載のように行った：
【０１６９】
【表２】
2021534761.tif 000004
【０１７０】
それぞれの投与量において、Ca++あり、およびなしの両者のAS01E（MPL、QS21およびリポソーム（25μg MPLおよび25μg QS21）を含有するアジュバント系）アジュバント製剤の間で、同等性が認められた。しかしながら、AL(OH)3をアジュバントとする製剤の反応は、いずれの投与量においても他の製剤と比べて低かった（図5）。
【０１７１】
実施例４
RTX断片とDTaPワクチンとの組み合わせ
本研究で評価されたすべての無細胞百日咳（PaもしくはaPと称される）ワクチンは、グラクソ・スミスクライン・バイオロジカルズ社（GSK, Rixensart, Belgium）製であった。4つのグループで使用された1回用量あたりの異なる百日咳菌抗原成分の量を以下の表3に示す：
【０１７２】
【表３】
2021534761.tif 000005
【０１７３】
動物モデル
すべての実験およびアッセイは、European Directive 2010/63/EUおよびグラクソ・スミスクライン・バイオロジカルズの動物のケア、福祉、および取り扱いに関する方針に従って、GSKの研究所（Rixensart, Belgium）で実施された。動物は、水および維持飼料を自由に利用することができた。AAALAC（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care）のグローバルエンリッチメントプログラムに従って、環境は巣材を含み（Envirodry）、社会的居住が適用された。
【０１７４】
in vivoマウス百日咳菌肺クリアランスアッセイは、ワクチン接種マウスへの標準的な亜致死経鼻チャレンジ後のボルデテラ属菌株による肺侵襲の分析に基づくものである[20]。18匹または20匹のBALB/c OlaHsdマウス（雌、6週齢）のグループに、3週間間隔で2回ワクチンを投与した。血液サンプルは28日目に採取した。ブースターの1週間後（29日目）に、イソフルラン（2.5％）による軽い麻酔下で、50μlの細菌懸濁液（合計約5×106コロニー形成単位[CFU]に相当）を左鼻孔内に注入することによって、マウスは抗原チャレンジを受けた。鼻腔内チャレンジモデルのために、上記のようにBordet-Gengou寒天平板（BGA）およびStainer-Scholte液体培地で増殖させた百日咳菌の細菌懸濁液をStainer-Scholte培地で希釈し、亜致死チャレンジ用の約1×108CFU/mLのチャレンジ接種液が与えられた。細菌懸濁液の50μLアリコートは、マイクロピペットを用いて鼻孔内にゆっくりと投与され、動物の呼吸によって直ちに吸引された。亜致死チャレンジ後、3匹もしくは5匹の感染マウスを、曝露の2時間後、2日後、5日後、および8日後（29日+2時間後、D31、D34、およびD37と表示）に、麻酔により屠殺した。
【０１７５】
肺を摘出し、2mLカザミノ酸（1％）緩衝生理食塩水中で組織粉砕機を用いてホモジナイズした。ホモジネートの10倍段階希釈液をBGA上にプレーティングし、36〜37℃で4〜6日間培養した後、CFUをカウントした。各時点での、肺あたりの加重平均CFU数の対数log10（CFUw/lung）および標準偏差を算出した。免疫スケジュールの模式図を図6に示す。
【０１７６】
百日咳菌抗原の血清学的分析：
百日咳トキソイド（PT）、繊維状赤血球凝集素（FHA）、パータクチン（PRN）およびアデニル酸シクラーゼ（ACT）
2回目の免疫接種から7日後（28日目-チャレンジ前日）に全マウスの血清を個別に採取し、以下のプロトコールに従って抗PT、抗FHA、および抗PRN IgG抗体の存在を検査した：
【０１７７】
PT、PRNおよびFHAの血清学的プロトコール
炭酸-重炭酸バッファー(50mM)中のFHA（2μg/mL）、PT（2μg/mL）またはPRN（3μg/mL）を用いて96ウェルプレートをコーティングし、4℃にて一晩インキュベートした。PBS-BSA 1%バッファーによる飽和ステップの後、マウス血清をPBS-BSA 0.2% Tween 0.05%で1/100に希釈し、プレートからウェル内で段階希釈した（12回希釈、1段階1/2）。ペルオキシダーゼと結合した抗マウスIgGを添加した（最終希釈率1/3000）。ペルオキシダーゼ基質（OPDA）を添加した後、呈色反応を観察し、1M塩酸により停止させた後、分光光度法により測定した（波長：490〜620nm）。各プレート上で検査された各血清および添加された標準物質について、OD値と希釈率との関係に4パラメータロジスティック曲線を当てはめた（Softmaxpro）。これにより、それぞれのサンプル力価の誘導をSTD力価で表すことができた。
【０１７８】
ACTの血清学的プロトコール
炭酸-重炭酸バッファー(50mM)中のACT（0.3μg/mL）を用いて96ウェルプレートをコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。バッファーTR020（飽和バッファーELISA - NBC Serum 4% V/V)による飽和ステップの後、マウス血清をTR020で1/100に希釈し、プレートからウェル内で段階希釈した（12回希釈、1段階1/2）。ペルオキシダーゼと結合した抗マウスIgGを添加した（最終希釈率1/1000）。ペルオキシダーゼ基質（OPDA）を添加した後、呈色反応を観察し、1M塩酸により停止させた後、分光光度法により測定した（波長：490〜620nm）。各プレート上で検査された各血清および添加された標準物質について、ODと希釈率との関係に4パラメータロジスティック曲線を当てはめた（Softmaxpro）。これにより、それぞれのサンプル力価の誘導をSTD力価で表すことができた。
【０１７９】
アデニル酸シクラーゼ毒素の血清中和アッセイ
毒素の中和アッセイは、J774.A1マクロファージ様細胞に対するACTの細胞毒性に基づく。D-MEM中のJ774.A1細胞（50μl中250,000細胞）を96ウェルプレートの各ウェルに播種し、37℃、5％CO2で一晩放置して付着させた。翌日、mAb 3D1（Kerafast）および採取した血清のプールをD-MEMで段階希釈し、細胞に移す前にACTと混合し、ACTの最終濃度を0.8または2または3μg/mLとした。37℃にて2時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8（CCK-8, Dojindo）を用いて、黄色のフォルマザン色素を生成する、生細胞内の脱水素酵素による水溶性テトラゾリウム塩（WST-8）の還元に基づく比色分析により、細胞生存率を測定した。各プレートで検査された各標準物質（mAb 3D1）およびプール血清について、ODと希釈率との関係に4パラメータロジスティック曲線を当てはめた（Softmaxpro）。力価は、各プレートの標準物質の「中央」から導き出される「中心点」によって表された。
【０１８０】
統計学的方法
コロニー形成単位（CFU）数の平均値の分布は対数正規分布であると仮定する。統計的手法は、異質分散モデルを用いた、2つの因子（群および日）を含むlog10値の分散分析（ANOVA）とし、すなわち、異なるレベルの要因の組み合わせについては、同一の分散を仮定しなかった。製剤と用量との間の相互作用は、モデルに含めなかった（仮定：有意でない相互作用）。探索的分析として、調整は行わない。このモデルは、幾何平均およびその95％CI、ならびに幾何平均比およびその95％CIの推定に用いられる。
【０１８１】
IgG力価の分布は対数正規分布であると仮定した。統計的手法は、1因子（群）のlog10値に関する抗原ごとの分散分析（ANOVA）とする。このモデルを用いて、幾何平均およびその95％CI、ならびに幾何平均比およびその95％CIを推定した。
【０１８２】
すべての条件において抗PRN抗体が検出され、ワクチン接種が成功したことが確認された。予想通り、1/4HDを接種したマウスに対して1/80HDを接種したマウスでは、抗PRN抗体のレベルが低かった。
【０１８３】
図7に示すように、RTX断片による免疫接種は、無毒化されていない全長アデニル酸シクラーゼで得られたのと同様のレベルの抗ACT IgGを誘導することができる。
【０１８４】
個々の抗体価（抗ACT IgG）を28日目にELISAにより測定した（図8）。RTX断片は、高レベルの抗ACT IgGを誘導した。
【０１８５】
異なるワクチンによって誘導された、百日咳菌の鼻腔内チャレンジに対する予防効果を図9(a)および(b)に示す。
【０１８６】
Infanrix 1/4th HD群（陽性対照）を含む各製剤は、未接種群と比較してCFU数を減少させた。Infanrix 1/4th HD群（陽性対照）とDTPa 1/80HD（RTX断片あり／なし）との間には高い有意差が認められた。しかしながら、RTX断片は明らかに免疫原性があり、ワクチン未接種群と比較してCFU数を減少させ、抗体を誘導することができるが、使用した実験モデルにおいて、RTX断片をDTPaと併用した場合、DTPa単独（1/80HD）と比較して、識別可能な予防効果の向上は認められなかった。したがって、RTX断片は、コロニー形成を抑制するという観点から、DTPaワクチンへの配合が有用であると考えられる。
【０１８７】
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【０１８８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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