(57)【要約】  本発明は、改良されたレンチウイルスベクター、その製造方法及びその使用を開示する。具体的には、本発明は、治療用Ｔ細胞の製造に適したレンチウイルスベクターを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レンチウイルスベクターであって、
目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の宿主細胞における発現を指導するためのトランケートＥＦ１αプロモーター、たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示されるヌクレオチド配列を含むＥＦ１αコアプロモーターを含み、
前記レンチウイルスベクターは非複製型レンチウイルスベクターであり、
前記レンチウイルスベクターは、操作可能に連結された、５’ＬＴＲ、ψエレメント、ＲＲＥエレメント、ｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメント、前記トランケートＥＦ１αプロモーター、ＷＰＲＥエレメント、及び３’ＬＴＲ、及び場合によって、目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するためのマルチクローニング部位を含む、レンチウイルスベクター。
【請求項２】
前記５’ＬＴＲはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又は１１で示されるヌクレオチド配列を含み、前記ψエレメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又は１２で示されるヌクレオチド配列を含み、前記ＲＲＥエレメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるヌクレオチド配列を含み、前記ＷＰＲＥエレメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又は１４で示されるヌクレオチド配列を含み、前記３’ＬＴＲはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０又は１５で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項３】
操作可能に連結された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で示されるヌクレオチド配列を含む５’ＬＴＲ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で示されるヌクレオチド配列を含むψエレメント、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示されるヌクレオチド配列を含むＲＲＥエレメント、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるヌクレオチド配列を含むｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメント、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示されるヌクレオチド配列を含むトランケートＥＦ１αプロモーター、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示されるヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥエレメント、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で示されるヌクレオチド配列を含む３’ＬＴＲ、及び場合によって、目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するためのポリクローニング部位を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項４】
目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項５】
前記目的ポリペプチドは、複数のタンパク質を含む融合ポリペプチドであり、前記融合ポリペプチド中の前記複数のタンパク質は、自己切断ペプチドによって分離されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項６】
前記目的ポリペプチドは、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを含む融合ポリペプチドであり、前記融合ポリペプチドは、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に自己切断ペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項７】
前記自己切断ペプチドは２Ａポリペプチドであり、たとえばＰ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＴ２Ａポリペプチド、又はその機能的バリアントから選択される、請求項５又は６のレンチウイルスベクター。
【請求項８】
前記第１のタンパク質は、癌関連抗原特異的受容体タンパク質、たとえばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項６又は７に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項９】
前記第２タンパク質は優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体である、請求項６〜８のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１０】
前記優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体は、ＴＧＦ-βＩＩ型受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを欠失しており、たとえば、前記優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１１】
レンチウイルスベクター粒子の製造方法であって、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター、Ｇａｇ及び／又はＰｏｌを発現する１種又は複数種のパッケージングベクター、ＶＳＶ−Ｇなどのエンベロープタンパク質を発現するエンベロープベクターを適切な宿主細胞に共トランスフェクションさせるステップａ）と、
トランスフェクションされた前記宿主細胞を培養して、前記レンチウイルスベクターをレンチウイルスベクター粒子にパッケージングングするステップｂ）と、
ステップｂ）で生成されたレンチウイルスベクター粒子を取得するステップｃ）と、を含む製造方法。
【請求項１２】
レンチウイルスベクター粒子であって、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターを含むか、又は請求項１１の方法により製造されるレンチウイルスベクター粒子。
【請求項１３】
治療用Ｔ細胞の製造における、請求項１２に記載のレンチウイルスベクター粒子の使用であって、
前記治療用Ｔ細胞は、癌関連抗原特異的受容体タンパク質、たとえばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）、及び場合によって優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体を発現する使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載のレンチウイルスベクター粒子をＴ細胞に形質導入することを含む、治療用Ｔ細胞の製造方法。
【請求項１５】
前記治療用Ｔ細胞は、前記レンチウイルスベクター粒子の形質導入により、癌関連抗原特異的受容体タンパク質、たとえばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）、及び場合によって優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体を発現する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオ医薬品の分野に属する。具体的には、本発明は、改良されたレンチウイルスベクター、その製造方法及びその使用に関する。具体的には、本発明は、治療用Ｔ細胞の製造に特に適したレンチウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は腫瘍細胞殺傷とウイルス感染細胞殺傷を体内で行う重要な免疫細胞である。近年、インビトロ誘導や腫瘍浸潤リンパ球由来の抗原特異的Ｔ細胞、遺伝子改変キメラ型抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ-Ｔ細胞）、遺伝子改変Ｔ細胞受容体Ｔ細胞（ＴＣＲ-Ｔ細胞）を含むＴ細胞を用いて悪性腫瘍の治療を行ったところ、一部の臨床患者において顕著な腫瘍除去や制御作用を示した。しかしながら、患者体内の腫瘍の免疫逃避作用により、一部の腫瘍患者は輸液したＴ細胞に対して抵抗作用を産生し、Ｔ細胞が期待の抗腫瘍作用を発揮できないことを招く。
【０００３】
インビボ及びインビトロ研究の両方により、ＴＧＦ-βは重要なＴ細胞抑制因子であり、標的細胞に対するＴ細胞の殺傷作用を弱めたり消失させたりすることが示された。臨床上、ＴＧＦ-βは多くの腫瘍組織に広く発現し、腫瘍細胞に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の殺傷活性を著しく抑制し、免疫治療が失敗する重要な原因である。一方、優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＴＧＦ-βｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ＩＩ、ＤＮＲＩＩ）はＴＧＦ-βのネガティブ調節受容体であり、Ｔ細胞に対するＴＧＦ-βの抑制作用を抑制することができる。動物体内では、Ｔ細胞特異的なＤＮＲＩＩを投与又は発現させたり、可溶性ＴＧＦ-β  ＲＩＩを投与してＴＧＦ-βシグナル経路を妨害したりすることにより、腫瘍に対するＴ細胞の殺傷作用を有意に高めることができる。米国ベイラー医科大学のＣａｔｈｅｒｉｎ  Ｍ  Ｂｏｌｌａｒｄ氏が率いる研究チームは、ＥＢウイルスに特異的なＴ細胞（ＥＢＶ−ＣＴＬ）治療を患者に与えると、ＥＢＶ感染によるホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫の両方に一定の効果があることを発見した。しかしながら、これらの疾患では、腫瘍組織がＴＧＦ-βを発現するため、ＥＢＶ-ＣＴＬの治療効果が阻害される。この研究チームは、再発したホジキンリンパ腫の治療のために、ＥＢＶ−ＣＴＬ細胞の表面にＤＮＲＩＩを遺伝子形質導入により発現させた。評価可能な７人の患者のうち、４人が完全寛解を得ており、そのうち２人は完全寛解が４年間持続し、そのうち１人はＤＮＲＩＩ遺伝子で修飾されていないＥＢＶ-ＣＴＬ治療後に完全寛解を得られなかった患者であった。しかしながら、これらのＥＢＶ-ＣＴＬは、ＤＮＲＩＩという外来タンパク質しか発現していない。
【０００４】
現在、臨床的に応用されているＣＡＲ-Ｔ細胞及びＴＣＲ-Ｔ細胞の治療においても、腫瘍細胞がＴＧＦ-βを発現し、ＣＡＲ-Ｔ細胞及びＴＣＲ-Ｔ細胞の機能が抑制されるという問題に直面している。本分野においても、ＣＡＲ-Ｔ細胞及びＴＣＲ-Ｔ細胞へのＤＮＲＩＩの導入が期待される。しかしながら、これまで、ＣＡＲ／ＴＣＲとＤＮＲＩＩを同一Ｔ細胞に共発現させ、腫瘍治療に用いた報告はない。これは、既存の発現系が２種の蛋白に対する共発現効率が低いため、臨床のニーズを満たすことが困難であるためであると考えられる。
【０００５】
この課題を解決するために、２種以上のタンパク質の効率的な共発現に特に適した新規な改良された発現ベクター、たとえば改良されたレンチウイルスベクターが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
別段の指示又は定義がない限り、使用される用語はすべて当業者に理解される本分野における通常の意味を有する。たとえば、Sambrook et al.,「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」；Lewin,「Genes VIII」；及びRoitt et al.,「Immunology」(第8版)などの標準マニュアル、及び本明細書に引用された一般的な先行技術を参照する。さらに、特に明記されていない限り、特に詳細に説明されていないすべての方法、ステップ、技術、及び操作は、当業者に理解される、知られている方法で実行されてもよい。たとえば、標準マニュアル、上述の一般的な従来技術や本明細書に引用されたその他の参考文献も参照できる。
【０００７】
本発明者らは、意外にも、ロングＥＦ１αプロモーター（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を含むレンチウイルスベクターをＴ細胞などの細胞に形質導入すると、そのプロモーター領域に異常が生じ、細胞に導入された外来遺伝子（特にＣＡＲ又はその融合タンパク質をコードする遺伝子）の発現率が低下することを見出した。さらに意外なことに、トランケートＥＦ１αプロモーターを用いることで、この現象を回避し、導入された外来遺伝子の発現率を著しく向上できる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、第１の態様において、本発明は、目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の宿主細胞における発現を指導するためのトランケートＥＦ１αプロモーターを含むレンチウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、前記トランケートＥＦ１αプロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示されるヌクレオチド配列を含むＥＦ１αコアプロモーターである。
【０００９】
本発明の範囲では、「レンチウイルスベクター」とは、シス作用レンチウイルスＲＮＡ又はＤＮＡ配列を含むトランスジェニックを宿主細胞に形質導入することに用いられ、レンチウイルスタンパク質（たとえばＧａｇ、Ｐｏｌ及び／又はＥｎｖ）をトランスの形で提供する必要があるための非複製型ベクターを指す。レンチウイルスベクターは機能性Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖ蛋白のコード配列を欠失している。レンチウイルスベクターは、前記レトロウイルスベクターの産生又は発達の段階に応じて、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子の形態で存在し得る。
【００１０】
レンチウイルスベクターは、プラスミド（たとえば、トランスファープラスミドベクター）のような組換えＤＮＡ分子の形態であってもよい。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスと他のタンパク質との複合体におけるＲＮＡ分子のようなレンチウイルス粒子ベクターの形態であってもよい。通常、修飾又は組換えされたレンチウイルス粒子に対応するレンチウイルスベクターは、２つの一本鎖ＲＮＡコピーからなるゲノムを含む。これらのＲＮＡ配列は、宿主細胞ゲノムに挿入された二本鎖ＤＮＡ配列（プロトウイルスベクターＤＮＡ）から転写することにより得られるか、又は形質転換宿主細胞におけるプラスミドＤＮＡ（プラスミドベクターＤＮＡ）の一過性発現により得られる。レンチウイルスベクターは宿主細胞に組み込まれたＤＮＡ配列を指すこともできる。
【００１１】
レンチウイルスベクターは、レンチウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ-１又はＨＩＶ-２）、猿免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、馬伝染性脳炎ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）及びネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）に由来することができ、病原性に関わる遺伝的決定クラスターを除去し、外来発現カセットに導入するように修飾されている。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記レンチウイルスベクターは、５’ＬＴＲ、ψエレメント、ＲＲＥエレメント、ｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメント、目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するためのマルチクローニング部位、ＷＰＲＥエレメント、及び３’ＬＴＲから選択される少なくとも１つのエレメントをさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、前記レンチウイルスベクターは、動作可能に連結された５’ＬＴＲ、ψエレメント、ＲＲＥエレメント、前記ｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメント、トランケートＥＦ１αプロモーター、ＷＰＲＥエレメント、及び３’ＬＴＲ、及び場合によって、目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するためのマルチクローニング部位を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前記５’ＬＴＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又は１１で示されるヌクレオチド配列を含み、前記ψエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又は１２で示されるヌクレオチド配列を含み、前記ＲＲＥエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるヌクレオチド配列を含み、前記ＷＰＲＥエレメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又は１４で示されるヌクレオチド配列を含み、ここで、前記３’ＬＴＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０又は１５で示されるヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、前記レンチウイルスベクターは、操作可能に連結された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で示されるヌクレオチド配列を含む５’ＬＴＲ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で示されるヌクレオチド配列を含むψエレメント、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示されるヌクレオチド配列を含むＲＲＥエレメント、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示されるヌクレオチド配列を含むｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメント、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示されるヌクレオチド配列を含むトランケートＥＦ１αプロモーター、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示されるヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥエレメント、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で示されるヌクレオチド配列を含む３’ＬＴＲ、及び場合によって、目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するためのポリクローニング部位を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記レンチウイルスベクターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２から誘導される。ここで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の２，０４２〜３，４９９位のＣＡＲ-１９をコードするヌクレオチド配列は、他の目的ポリペプチドのコード配列に置換されていてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記レンチウイルスベクターは、目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、前記目的ポリペプチドは、複数のタンパク質を含む融合ポリペプチドであり、前記融合ポリペプチド中の前記複数のタンパク質は、自己切断ペプチドによって分離される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記目的ポリペプチドは、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを含む融合ポリペプチドであり、前記融合ポリペプチドは、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に自己切断ペプチドを含む。
【００２０】
したがって、いくつかの実施形態では、前記レンチウイルスベクターは、自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。前記自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記レンチウイルスベクターを介して２種以上の異なるタンパク質を共発現することに用いられる。
【００２１】
本明細書で使用される「自己切断ペプチド」とは、細胞内で自己切断ができるペプチドを意味する。たとえば、前記自己切断ペプチドは、細胞内のプロテアーゼによって認識され、特異的に切断されるようにプロテアーゼ認識部位を含むことができる。
【００２２】
あるいは、前記自己切断ペプチドは２Ａポリペプチドであってもよい。２Ａポリペプチドは、翻訳中に自己切断が起こるウイルス由来の短いペプチドの一種である。２つの異なる目的タンパク質を２Ａポリペプチドで連結して同一のコードフレームで発現させると、２つの目的タンパク質がほぼ１：１の割合で生成される。一般的に使用されている２Ａポリペプチドはブタテスコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｃｈｏｖｉｒｕｓ−１）由来のＰ２Ａ、ゾーシー・アシグナウイルス（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ）由来のＴ２Ａ、馬鼻炎Ａウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）由来のＥ２Ａ、及び口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａである。これらのうち、Ｐ２Ａの切断効率が最も高いので、好ましい。本分野では、これら２Ａポリペプチドの機能的バリアントの多くも知られており、これらの変異体も本発明に使用できる。
【００２３】
たとえば、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを２Ａポリペプチドで分離し、同一のオープンコードフレームに配置し、同一のプロモーターで発現を駆動することにより、得られた形質導入細胞が２種のタンパク質を同時に発現することを最大限に確保することができる。２種のタンパク質が異なるベクターでそれぞれ細胞に形質導入されると、一部の細胞は第１のタンパク質のみを発現し、一部の細胞は第２のタンパク質のみを発現する可能性があり、その結果、２種のタンパク質を共発現する細胞の割合は非常に低くなるからである。また、２種のタンパク質の発現が同一ベクター中の異なるプロモーターによって駆動されると、プロモーター効率の違いにより、２種のタンパク質を同時に発現する細胞の割合は同様に低下する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、前記第１のタンパク質は、癌関連抗原特異的受容体タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記第２のタンパク質は、優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体である。
【００２５】
本発明で使用される「優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体」とは、ＴＧＦ-βリガンド（たとえば、ＴＧＦ-β１）にＴＧＦ-βＲＩＩと競合的に結合することができるが、ＴＧＦ-βＲＩＩのシグナル伝達機能を実行できないＴＧＦ-βＩＩ型受容体のバリアントを指す。いくつかの実施形態では、前記優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインが突然変異され、それによって細胞内シグナル伝達能力が失われる。いくつかの実施形態では、前記優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体は、ＴＧＦ-βＩＩ型受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを欠失している。いくつかの特定の実施形態では、前記優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
本発明に記載の「癌関連抗原特異的受容体タンパク質」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）であってもよい。
【００２７】
前記癌関連抗原は、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアロガングリオシドＧＤ２、乳管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ−７２、スフィンゴ糖脂質、グリオーマ関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α−胎児グロブリン（ＡＦＰ）、外来レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ-ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、プロスターゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＬＡＧＡ-１ａ、ｐ５３、Ｐｒｏｓｔｅｉｎ、ＰＳＭＡ、生存及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-１（ＰＣＴＡ-１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ１）-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンの追加ドメインＡ（ＥＤＡ）及び追加ドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン-ＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ  Ａ１）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、Ｆｏｘｐ３、Ｂ７-１（ＣＤ８０）、Ｂ７-２（ＣＤ８６）、ＧＭ-ＣＳＦ、サイトカイン受容体、内皮因子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ０２２２３）、ＳＬＡＭＦ７（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ９ＮＱ２５）、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ９ＮＺＤ１）、ＦＫＢＰ１１（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ９ＮＹＬ４）、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｐ５３７０８）、及びＦＣＲＬ５（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ６８ＳＮ８）を含むが、これらに制限されない。
【００２８】
「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」はＴ細胞抗原受容体とも呼ばれ、Ｔ細胞が抗原ペプチド−ＭＨＣ分子を特異的に認識し結合する分子構造であり、通常ＣＤ３分子と複合体の形でＴ細胞表面に存在する。多くのＴ細胞のＴＣＲはαとβペプチド鎖からなり、少数のＴ細胞のＴＣＲはγとδペプチド鎖からなる。たとえば、前記ＴＣＲは、癌関連抗原に特異的に結合するＴＣＲ（通常はα及びβ鎖を含む）である。
【００２９】
「キメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）」は人工Ｔ細胞受容体、キメラ型Ｔ細胞受容体、キメラ型免疫受容体とも呼ばれ、人工的に設計された受容体であり、免疫エフェクター細胞にある特異性を付与できる。一般的に、この技術はＴ細胞に腫瘍表面抗原を特異的に認識する特性を与えることに用いられる。このような方法により、多数の標的腫瘍キラー細胞を産生することができる。
【００３０】
前記ＣＡＲは、癌関連抗原に対する細胞外抗原結合ドメインを含み得る。前記細胞外抗原結合ドメインは、たとえば、モノクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、抗体一本鎖可変領域（ｓｃＦＶ）、及びその抗原結合断片であり得る。たとえば、前記細胞外抗原結合ドメインは、商業的に入手可能な抗体を含む１種以上の既知の抗体、たとえば、ＦＭＣ６３、リツキシマブ(rituximab)、アレムツズマブ(alemtuzumab)、エプラツズマブ(epratuzumab)、トラスツズマブ(trastuzumab)、ビバツズマブ(bivatuzumab)、セツキシマブ(cetuximab)、ラベツズマブ(labetuzumab)、パリビズマブ(palivizumab)、セビルマブ(sevirumab)、ツビルマブ(tuvirumab)、バシリキシマブ(basiliximab)、ダクリズマブ(daclizumab)、インフリキシマブ(infliximab)、オマリズマブ(omalizumab)、エファリズマブ(efalizumab)、ケルキシマブ(Keliximab)、シプリズマブ(siplizumab)、ナタリズマブ(natalizumab)、クレノリキシマブ(clenoliximab)、ペムツモマブ(pemtumomab)、エドレコロマブ(Edrecolomab)、カンツズマブ(Cantuzumab)等に由来することができる。
【００３１】
本発明の各態様のいくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。本発明に係るＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインが標的に結合した後の細胞内シグナル伝達を担当し、免疫細胞の活性化及び免疫応答をもたらす。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫細胞の少なくとも１つの正常エフェクター機能を活性化する能力を有する。たとえば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含む補助活性であり得る。
【００３２】
ＣＡＲ用の細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞質配列、たとえばＴ細胞受容体及び共通受容体（これらは抗原受容体の結合後にシグナル伝達を開始するように一貫して機能する）の細胞質配列、及びこれらの配列のいずれかの誘導体又は変異体、並びに同じ機能的能力を有するいずれかの合成配列であってもよいが、これらに限定されない。細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原依存的な一次活性化を開始する配列と、抗原非依存的に作用して二次刺激シグナル又は共刺激シグナルを提供する配列との２つの異なるタイプの細胞質シグナル伝達配列を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭと呼ばれる免疫受容体チロシン活性化モチーフのシグナル伝達モチーフを含むことができる。本発明で使用されるＩＴＡＭの非限定的な例は、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄから誘導されるものを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記共刺激ドメインは、４１ＢＢ共刺激ドメイン又はＣＤ２８共刺激ドメインから選択される。
【００３３】
ＣＡＲは細胞の表面で発現する。したがって、ＣＡＲは膜貫通ドメインを含むことができる。本発明のＣＡＲの適切な膜貫通ドメインは、以下の能力を有する。ａ）細胞の表面、好ましくは、たとえばリンパ球又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むが、これらに制限されない免疫細胞で発現し、ｂ）リガンド結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用して、所定の標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指導する。膜貫通ドメインは、天然由来又は合成由来であってもよい。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質から誘導することができる。非限定的な例として、膜貫通ドメインはＴ細胞受容体のαサブユニット、βサブユニット、γ又はδサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ-２受容体のｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）又はγ、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖、特にＦｃγ受容体ＩＩＩ又はＣＤタンパク質から誘導することができる。あるいは、膜貫通ドメインは合成されていてもよく、ロイシンやバリンなどの疎水性残基を主に含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインはヒトＣＤ８α鎖から誘導される。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域をさらに含んでもよい。前記ヒンジ領域は、たとえば、ＣＤ８、ＣＤ４、又はＣＤ２８の細胞外領域から由来する。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、ヒトＣＤ８α鎖の一部である。
【００３４】
いくつかの特定の実施形態では、本発明で使用されるＣＡＲは、ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び４-１ＢＢ共刺激ドメインなど、癌関連抗原に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むことができる。
【００３５】
いくつかの特定の実施形態では、前記ＣＡＲはＣＤ１９に対する細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの特定の実施形態では、前記ＣＡＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３６】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）と優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体とをＴ細胞に共発現させることにより、ＴＧＦ-βによるＴ細胞の阻害を解除し、腫瘍殺傷活性など、ＴＣＲ-Ｔ細胞又はＣＡＲ-Ｔ細胞の活性を著しく向上させることができる。実施形態で示されるように、本発明のレンチウイルスベクターは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）と優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体とをＴ細胞で共発現させるのに特に適している。
【００３７】
別の態様では、本発明は、レンチウイルスベクター粒子の製造方法を提供し、前記方法は、本発明のレンチウイルスベクター、Ｇａｇ及び／又はＰｏｌを発現する１種又は複数種のパッケージングベクター、ＶＳＶ−Ｇなどのエンベロープタンパク質を発現するエンベロープベクターを適切な宿主細胞に共トランスフェクションさせるステップａ）と、
トランスフェクションされた前記宿主細胞を培養して、前記レンチウイルスベクターをレンチウイルスベクター粒子にパッケージングングするステップｂ）と、
ステップｂ）で生成されたレンチウイルスベクター粒子を取得するステップｃ）とを含む。
【００３８】
Ｇａｇ及び／又はＰｏｌを発現する１種又は複数種の適切なパッケージングベクター、ＶＳＶ-Ｇ等のエンベロープタンパク質を発現するエンベロープベクターは本分野で知られており、当業者により容易に入手できる。いくつかの実施形態では、前記ベクターはプラスミドである。
【００３９】
レンチウイルスベクター粒子を製造するための適切な宿主細胞は、２９３Ｔ細胞を含むが、これに限定されない。
【００４０】
別の態様では、本発明のレンチウイルスベクターを含むか、又は本発明の上記方法によって製造されたレンチウイルスベクター粒子を提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、治療用Ｔ細胞の製造における本発明のレンチウイルスベクター粒子の使用を提供し、前記治療用Ｔ細胞は、癌関連抗原特異的受容体タンパク質、たとえばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ型抗原受容体（ＣＡＲ）、及び場合によって優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体を発現する。
【００４２】
別の態様では、本発明のレンチウイルスベクター粒子をＴ細胞に形質導入することを含む、治療用Ｔ細胞の製造方法を提供する。前記治療用Ｔ細胞は、前記レンチウイルスベクター粒子の形質導入により、癌関連抗原特異的受容体タンパク質、たとえばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び場合によって優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体を発現する。
【００４３】
本発明のＴ細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、腹水、胸水、脾臓組織や腫瘍を含む多くの非制限的なソースから、様々な非制限的な方法によって取得することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、健康なドナー又は癌と診断された患者から誘導されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、異なる表現型の特徴を示す細胞の混合集団の一部であってもよい。たとえば、Ｔ細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、特異的抗体で活性化、増幅することで得ることができる。
【００４４】
本発明の各態様のいくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は、対象の自己細胞から誘導される。本明細書で使用される「自己」とは、治療対象に使用される細胞、細胞株、又は細胞集団が前記対象に由来することを意味する。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は異種細胞から誘導され、たとえば、前記対象となるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と適合性のあるドナーに由来する。ドナー由来の細胞は、標準プロトコルを用いて非同種異系反応性細胞に形質転換され、必要に応じて複製され、それにより、１人以上の患者に投与され得る細胞を産生することができる。
【００４５】
別の態様では、本発明のレンチウイルスベクター、適切なパッケージングングベクター、適切なエンベロープベクター、及び／又は２９３Ｔ細胞のような適切な宿主細胞を含むレンチウイルスベクター粒子を産生するためのキットを提供する。前記キットは、細胞トランスフェクション試薬をさらに含み得る。別の態様では、本発明のレンチウイルスベクター粒子を含む目的ポリペプチドを細胞内で発現させるためのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＣＡＲ-１９を発現するためのレンチウイルスベクターの構造及び完全性の同定戦略を示す。（Ａ）：ＰＥＦ１α-Ｌ（ロングプロモーター、５３１ｂｐ）を含む旧ベクターｐＰＶＬＶ１；（Ｂ）：ＰＥＦ１α-Ｓ（ショートプロモーター、２１２ｂｐ）を含む新ベクターｐＰＶＬＶ２。ランダム６量体プライマーを用いて逆転写されたｃＤＮＡから所望のＰＣＲ産物（Ｆ１-Ｆ５：ＰＣＲ断片）を生成し、ウイルスベクターの完全性を同定する。
【図２】ｐＰＶＬＶ１とｐＰＶＬＶ２の違いを示す。（Ａ）：ウイルスゲノムの逆転写ｃＤＮＡから所望のＤＮＡ断片を増幅する。ＰＥＦ１α-Ｌを含有するウイルス遺伝子断片に欠陥遺伝子座が観察された。予期しないサイズのＤＮＡ断片（左）を矢印で示す。（Ｂ）：ＣＡＲ-１９を発現する細胞の百分率と、（Ｃ）：２９３Ｔ細胞形質導入４８時間後の各ベクターの力価とを比較する。
【図３】ＣＡＲ-１９-Ｆｌｕｃの構造とルシフェラーゼ活性を示す。（Ａ）：及び（Ｂ）：Ｐ２Ａ−Ｆｌｕｃカセットの上流にクローニングされたＣＡＲ−１９をコードするジシストロン構築物を使用する。（Ｃ）：発現したＣＡＲ-１９及びＦｌｕｃ分子の模式図。（Ｄ）：レンチウイルスベクターを２９３Ｔ細胞に形質導入してから４８時間後に測定したルシフェラーゼの活性。
【図４】ＣＡＲ−１９-ＤＮＲＩＩの構造及びウイルスベクターを示す。（Ａ）及び（Ｂ）：トランケートＴＧＦＢＲＩＩ（ＤＮＲＩＩ）を共発現するＣＡＲ-１９のベクターマップを示す。（Ｃ）：共発現したＣＡＲ−１９及びＤＮＲＩＩ分子の構造模式図。
【図５】形質導入された２９３Ｔ細胞におけるＣＡＲ-１９及びＤＮＲＩＩ発現の形質導入効率を示す。図中の数字は、形質導入されていない２９３Ｔ細胞の陰性対照に対するＣＡＲ−１９（上）又はＤＮＲＩＩ（下）の陽性細胞の百分率を示す。１０個の独立した実験の代表的な実験結果を示した。
【図６】形質導入されたＴ細胞におけるＣＡＲ-１９及びＤＮＲＩＩの発現を示す。活性化Ｔ細胞をレンチウイルスベクターで形質導入してＣＡＲ-１９又はＣＡＲ-１９-ＤＮＲＩＩを発現させ、フローサイトメトリーにより評価する。図中の数字は、形質導入されていないＴ細胞の陰性対照に対する、ＣＡＲ−１９（上）又はＤＮＲＩＩ（下）の陽性細胞の百分率を示す。結果は３つの独立した実験を表す。
【図７】ＣＡＲ−１９又はＣＡＲ−１９−ＤＮＲＩＩベクター形質導入後の細胞生存率及びカウントを示す。データは平均値±ＳＤで表される。
【図８】ＤＮＲＩＩがＴＧＦ-β１によって誘導されるＳＭＡＤ２リン酸化を減少させることを示す。
【図９】ＣＡＲ-Ｔ-１９及びＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞におけるＩＦＮ-γ及びＴＮＦ-αのｍＲＮＡレベルを示す。データは平均値±ＳＥＭで表される。
【図１０】ＴＧＦ-β１の存在下でのＣＡＲ-Ｔ-１９及びＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞のＣＤ１９＋腫瘍細胞に対する抗原特異的な殺滅を示す。ＣＡＲ  Ｔで細胞を初期活性化１２日後、ＤＥＬＦＩＡ（R）ＥｕＴＤＡ細胞毒性測定法により細胞溶解活性を測定する。測定３日前にＴ細胞を採取し、ｒｈＴＧＦ-β１（１０ｎｇ／ｍｌ）で７２時間培養する。標的細胞をＢＡＴＤＡ試薬で１５分間標識した後、エフェクター細胞として形質導入Ｔ細胞を特定のＥ：Ｔ比で添加する。４時間インキュベートした後、溶解を測定する。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
実施例
実施例における統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（GraphPad Prism v5.0；GraphPad Software，San Diego，CA，USA）を使用して行う。対応のあるｔ検定を行った後、Ｎｅｗｍａｎ-Ｋｅｕｌｓ検定を行ってデータを解析する。結果を平均値±ＳＥＭとして示す。ｐ値＜０．０５が有意であると考えられる。
【００４８】
実施例１、ＣＡＲ発現用レンチウイルスベクターの最適化
ＣＡＲ形質導入用レンチウイルスベクターは、所望のＣＡＲトランスジェニックを含み、細胞内で発現できるものでなければならない。それぞれ旧ベクターｐＰＶＬＶ１（図１Ａ）と新ベクターｐＰＶＬＶ２（図１Ｂ）である、ＣＡＲを発現するための第三世代レンチウイルスベクターを２種類設計した。ｐＰＶＬＶ１は５３１ｂｐの長いヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターを含み、ｐＰＶＬＶ１は２１２ｂｐの短いヒトＥＦ１αプロモーターを含む。２種類のベクターに含まれる各エレメント及びその説明は、次の表１に記載される。
【００４９】
本出願の実施例では、発現対象のＣＡＲは、ＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８のヒンジ及び膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン４-１ＢＢ及びＣＤ３ζを含む。このＣＤ１９を標的とするＣＡＲのアミノ酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で示され、ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示される。
【００５０】
【表１−１】
2021534791.tif 000002
【表１−２】
2021534791.tif 000003
【００５１】
ｇａｇ／ｐｏｌパッケージングプラスミド、ＶＳＶ-Ｇエンベローププラスミド、及び上述したレンチウイルスベクター配列を含むトランスフェクション構築物を用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることにより、レンチウイルス上澄みを産生した。簡単に言えば、ＤＮＡ混合物をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）に混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する同体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合した。室温で１５分間インキュベートした後、得られた混合物を２９３Ｔ細胞に適用した。トランスフェクションの２４時間後にレンチウイルスを含有する培地を収集した。収集するたびに、上澄みをＰＶＤＦ膜（０．４５μｍ）でろ過した。レンチウイルス取得物を合併し、４℃で貯蔵した後、２０,０００ｘｇで１時間３０分超遠心分離した。レンチウイルス粒子をＰＢＳに再懸濁させた。
【００５２】
図１は、２種のレンチウイルスベクターの構造模式図、及び重複ＰＣＲ産物を介してレンチウイルスの完全性を検査するためのストラテジーを示す。適当なプライマーを設計し、ランダムプライマーを用いて逆転写されたｃＤＮＡから重複断片Ｆ１〜Ｆ５を増幅した。予想される大きさのＰＣＲ産物は、レンチウィルスの完全性を証明することができる。
【００５３】
図２Ａは、ウイルスゲノムから逆転写されたｃＤＮＡから増幅された各ＤＮＡ断片を示す。意外なことに、ＰＥＦ１α-Ｌ（ロングプロモーター）を含むウイルス遺伝子断片に重複欠陥遺伝子座が観察された。矢印は、所望ではないＤＮＡ断片があることを示す（左）。ＰＥＦ１α-Ｓ（ショートプロモーター）を含むウイルス遺伝子断片にはこの現象は観察されなかった。このような欠失ウイルスゲノムは力価及び形質導入効率に影響を与える可能性がある。
【００５４】
そのため、２種のレンチウイルスの力価と形質導入効率を試験した。レンチウイルス滴定において、２×１０６個の２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートの各ウェルに接種し、一連の体積の濃縮のレンチウイルスを用いて形質導入した。形質導入してから４８時間後、２９３Ｔ細胞をプレートから分離した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ）２を用いてフローサイトメトリーによりＣＡＲの存在を検出した。従来のＰＣＲを用いて、５’ＬＴＲ〜３’ＬＴＲのウイルスゲノムＲＮＡを検査した。
【００５５】
結果を図２Ｂと図Ｃに示す。ＰＥＦ１α−Ｌを有するウイルス（ｐＰＶＬＶ１ベクターに基づく）の形質導入効率（ＣＡＲを発現している細胞の割合）はわずか９．９５％であり、ＰＥＦ１α−Ｓを有するウイルス（ｐＰＶＬＶ２ベクターに基づく）の７０．４％を大きく下回っている。さらに、ＰＥＦ１α-Ｌを有するウイルス（ｐＰＶＬＶ１ベクターに基づく）の力価も、ＰＥＦ１α-Ｓを有するウイルス（ｐＰＶＬＶ２ベクターに基づく）のレンチウイルスに比べて有意に低かった。ｐＰＶＬＶ２ベクターはｐＰＶＬＶ１ベクターより優れており、これは異なる長さのＥＦ１αプロモーターによる可能性があることを示した。
【００５６】
実施例２、ＣＡＲ遺伝子の形質導入及び発現に対するプロモーターの影響
異なるプロモーターの影響をさらに証明するために、図３の２種のＣＡＲ-ルシフェラーゼレポーターベクターはｐＰＶＬＶ２に基づいて構築され、それらの違いはトランスジェニック発現を駆動するプロモーターのみであり、ここで、ＣＡＲ−１９はＰ２Ａ−Ｆｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ）カセットの上流にクローニングされ、ジシストロンを形成している（図３ＡとＢ）。
【００５７】
前記ベクターを細胞に形質導入した後、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドのコード配列が存在するため、同じ細胞でＣＡＲ−１９とルシフェラーゼの２つの分子が約１：１の割合で発現し、蛍光強度はＣＡＲ−１９形質導入効率を反映することができる（図３Ｃの原理模式図を参照）。図３Ｄは、２９３Ｔ細胞に２種のレンチウイルスベクターを形質導入して４８時間後に測定したルシフェラーゼ活性を示す。その結果、ＰＥＦ１α-Ｓを有するレンチウイルスベクターで形質導入された細胞は、ＰＥＦ１α-Ｌを有するレンチウイルスベクターで形質導入された細胞よりも蛍光が有意に強いことが示された。さらに、ＰＥＦ１α-Ｓが細胞におけるトランスジェニック発現を有意に改善したことが証明された。
【００５８】
本実施例は、従来の強力なプロモーターである５３１ｂｐのＥＦ１αプロモーターが、レンチウイルスベクターでタンパク質発現に使用された場合、意外に低い形質導入効率をもたらすことを証明した。トランケートＥＦ１αプロモーター（２１２ｂｐ）を使用することにより、形質導入効率を著しく向上させ、ＣＡＲなどの外来タンパク質の細胞内での発現を改善することができる。
【００５９】
実施例３、細胞におけるＣＡＲとＤＮＲＩＩの共発現
ＴＧＦ-βは重要なＴ細胞抑制因子であり、標的細胞に対する治療用Ｔ細胞の殺傷作用を弱めたり消失させたりする可能性がある。臨床上、ＴＧＦ-βは多くの腫瘍組織に広く発現し、腫瘍細胞に対する腫瘍特異的Ｔ細胞の殺傷活性を著しく抑制し、免疫治療が失敗する重要な原因である。一方、優性ネガティブＴＧＦ-βＩＩ型受容体（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＴＧＦ-βｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ＩＩ、ＤＮＲＩＩ）はＴＧＦ-βのネガティブ調節受容体であり、Ｔ細胞に対するＴＧＦ-βの抑制作用を抑制する。以下の実施例は、Ｔ細胞におけるＣＡＲとＤＮＲＩＩの共発現の効果を検討する。ＤＮＲＩＩのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で示され、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で示される。
【００６０】
まず、実施例２と同様に、ｐＰＶＬＶ２に基づいて、図４（Ａ及びＢ）の２種のＣＡＲ-１９-ＤＮＲＩＩベクターを構築し、これらの違いは、トランスジェニック発現を駆動するプロモーターのみである。ここで、ＣＡＲ-１９とＤＮＲＩＩは同一のオープンコードフレームに位置し、中間に２Ａポリペプチドコード配列を含む。図４Ｃは、ＣＡＲ-１９及びＤＮＲＩＩ分子の構造模式図を示す。ＤＮＲＩＩはＴＧＦＢＲＩＩの細胞内セリン／スレオニンキナーゼドメインを欠失し、下流にシグナルを伝導できない。
【００６１】
ＣＡＲ−１９とＤＮＲＩＩのコード配列を２Ａコード配列で分離し、同一のオープンコードフレームに配置し、同一のプロモーターで発現を駆動することにより、得られた形質導入細胞がＣＡＲ−１９とＤＮＲＩＩを同時に発現することを最大限に確保することができる。ＣＡＲ−１９とＤＮＲＩＩが異なるベクターでそれぞれ細胞に形質導入されると、一部の細胞はＣＡＲ−１９のみを発現し、一部の細胞はＤＮＲＩＩのみを発現する可能性があり、その結果、２種のタンパク質を共発現する細胞の割合は非常に低くなるからである。また、２種のタンパク質の発現が同一ベクター中の異なるプロモーターによって駆動されると、プロモーター効率の違いにより、２種のタンパク質を同時に発現する細胞の割合は同様に低下する。
【００６２】
２種のＣＡＲ−１９−ＤＮＲＩＩレンチウイルスベクターを同等のＭＯＩ（多重感染度）で２９３Ｔ細胞に形質導入した。標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ）２又は抗ＤＮＲＩＩ抗体を用いて、ＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザ１０を用いてフローサイトメトリーによりＣＡＲ又はＤＮＲＩＩの発現を検出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてデータを解析した。
【００６３】
図５の結果に示すように、ＰＥＦ１α−Ｓを有するレンチウイルスベクターで形質導入された２９３Ｔ細胞におけるＣＡＲ-１９及びＤＮＲＩＩの発現は、ＰＥＦ１α−Ｌを有するレンチウイルスベクターで形質導入された２９３Ｔ細胞よりも有意に高かった。
【００６４】
さらに、２種のＣＡＲ−１９レンチウイルスベクター、及び２種のＣＡＲ−１９−ＤＮＲＩＩレンチウイルスベクターをＴ細胞に形質導入した後のＣＡＲ−１９及びＤＮＲＩＩの発現も試験した。
【００６５】
健康ドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を抗ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ磁気ビーズで２日間活性化し（ビーズ：細胞＝３：１）、１×１０６個細胞／ｍｌでｒｈＩＬ-２（２００ＩＵ／ｍＬ）を補充したＩＭＳＦ１００無血清培地（ＬＯＮＺＡ、ベルギー）に重懸濁させた。ＣＡＲ-１９及びＣＡＲ-１９-ＤＮＲＩＩレンチウイルス上澄みをそれぞれ添加して形質導入した。その後、３２℃で２時間１,２００×ｇで遠心分離した。２４時間後、ウイルスベクターを含有する上澄み液を除去した。ｒｈＩＬ-２（２００ＩＵ／ｍＬ）を含む培地に細胞を３×１０５個細胞／ｍＬで懸濁させ、２〜３日毎に新鮮な培地を入れ替えて１２日間増幅培養することにより、ＣＡＲ-１９分子を発現するＣＡＲ-Ｔ-１９細胞、及びＣＡＲ-１９分子とＤＮＲＩＩ分子とを共発現するＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞を得た。同じ培養条件で培養したが遺伝子形質導入を行わなかったＰＢＭＣを対照（ＮＣ）とした。形質導入して得られたＣＡＲ-Ｔ細胞の各タンパク質分子の発現をフローサイトメーターにより検出した。２〜３日ごとにヨウ化プロピリジン（ＰＩ）染色を行い、フローサイトメーターにより細胞活性を検出した。細胞培養中は、２〜３日ごとにトリパンブルー染色法を用いて細胞数をカウントし（サンプルごとに３回繰り返し）、細胞数（平均値±ＳＤ）を算出した。
【００６６】
図６の結果に示すように、形質導入されていない細胞（ＮＣ）はＣＡＲ−１９やＤＮＲＩＩを発現しなかった。ＰＥＦ１α-Ｓを含むｐＰＶＬＶ２ベクターのＣＡＲ-Ｔ-１９を用いてＣＡＲ-１９を発現させ（発現率６７．４％）、ＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞は、ＣＡＲ-１９（発現率６２．９％）とＤＮＲＩＩ（発現率６２．３％）の両方を発現した。ＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞におけるＣＡＲ-１９とＤＮＲＩＩは共発現であり、形質導入効率はＣＡＲ-１９単独形質導入の場合と同等であることが示された。ＰＥＦ１α-Ｌベクターを用いた場合、ＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞においてもＣＡＲ-１９とＤＮＲＩＩは共発現したが、発現率は有意に低下した。ＣＡＲ-Ｔ-１９細胞においてもＣＡＲ-１９の発現率は有意に低下した。
【００６７】
また、図７に示すように、ＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞の活性と数はＣＡＲ-Ｔ-１９と差がなかった。
【００６８】
したがって、本実施例は、ｐＰＶＬＶ２ベクターの骨格（ＰＥＦ１α-Ｓを含む）が、細胞、たとえばＴ細胞におけるＣＡＲの発現、特にＣＡＲとＤＮＲＩＩのような他のタンパク質との共発現に特に適していることを判定した。さらに、ＣＡＲとＤＮＲＩＩのコード配列を同一のオープンリードコードフレームに配置することにより、２種の分子の高い共発現率を実現できる。
【００６９】
実施例４、ＤＮＲＩＩの発現によるＴＦＧ-β１誘導ＳＭＡＤ２分子のリン酸化低下
Ｔ細胞に対するＴＦＧ-βの抑制作用は、ＴＦＧ-βがその受容体に結合した後、ＳＭＡＤ２分子のリン酸化を行うことにより達成される。
【００７０】
形質導入９日後のＣＡＲ-Ｔ-１９細胞とＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞を組換えヒトＴＦＧ-β１（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに２４時間インキュベートし、リン酸化されたＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）の発現レベルの解析を行った。ＧＡＰＤＨとリン酸化されていないＳＭＡＤ２分子を対照とし、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによりｐＳＭＡＤ２分子の相対定量を行った。
【００７１】
具体的には、Ｂｒａｄｆｏｒｄ測定キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて全細胞溶解物のタンパク質濃度を測定した。同量のタンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルの細孔に装填し、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。ＴＢＳＴ中の１０％（ｗ／ｖ）脱脂ミルクで膜を密閉させ、次に、一次抗体（抗ｐＳＭＡＤ２と抗ＳＭＡＤ２；Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ；すべて１：１０００で希釈）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。その後、ＴＢＳＴで膜を洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートのヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２０００で希釈；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を室温で２時間インキュベートした。その後、膜をＥＣＬ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に曝露し、得られた信号を発光画像分析装置（ＬＡＳ−４０００、Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて検出した。
【００７２】
図８の結果に示すように、ＣＡＲ−Ｔ−１９-ＤＮＲＩＩ細胞におけるｐＳＡＭＤ２のレベルはＣＡＲ−Ｔ−１９細胞と比較して有意に低下した。ＤＮＲＩＩの発現はＴＧＦ-βシグナル経路のキーシグナル伝達分子ＳＭＡＤ２のリン酸化を抑制することを示した。
【００７３】
実施例５、組換えヒトＴＧＦ-β１で処理されたＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞及びＣＡＲ-Ｔ-１９細胞におけるＩＦＮ-γとＴＮＦ-αの発現
ＩＦＮ-γとＴＮＦ-αはＴ細胞が標的細胞を殺傷するマーカーサイトカインである。この２種のサイトカインの発現レベルが高いことは、標的細胞に対するＴ細胞の殺傷能力が高いことを示し、逆の場合は、殺傷能力が低いことを示している。
【００７４】
形質導入９日後のＣＡＲ-Ｔ-１９細胞及びＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞を、組換えヒトＴＧＦ-β１（１０ｎｇ／ｍｌ）と、又は組換えヒトＴＧＦ-β１（１０ｎｇ／ｍｌ）と共培養しないで２４時間培養した後、２種の細胞のそれぞれを、ＣＤ１９分子を発現するＣＤ１９＋−Ｋ５６２標的細胞と共培養した。ＩＦＮ-γとＴＮＦ-αのｍＲＮＡレベルを定量するために、各混合細胞を採取し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅの消化とＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００生物分析装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＵＳＡ）による濃度測定を行った後、特異的プライマーとＯｎｅ-ｓｔｅｐ  ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ  ＳＹＢＲ  Ｌｏｗ-ＲＯＸキット（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）を用いて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲ検出系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、全ＲＮＡサンプルについてリアルタイム定量ＲＴ-ＰＣＲ分析を行った。１８ｓ  ｒＲＮＡを増幅し、内部コントロールとした。ΔΔＣｔ法により発現レベルを計算し、式２-ΔΔＣｔを用いて発現倍数を得た。すべての実験は３回行われた。
【００７５】
その結果、組換えヒトＴＧＦ-β１処理後、ＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞におけるＩＦＮ-γとＴＮＦ-αの発現がＣＡＲ-Ｔ-１９細胞より有意に高かった（図９）。
【００７６】
実施例６、組換えヒトＴＧＦ-β１で処理されたＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞とＣＡＲ-Ｔ-１９細胞による腫瘍標的細胞への特異的殺傷
１２日間形質導入したＣＡＲ-Ｔ-１９細胞とＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞を用いて標的細胞殺傷実験を行った。
【００７７】
ＴＤＡ放出測定を行うことで、ＴＧＦ-β１の存在下のＫ５６２又はＣＤ１９＋−Ｋ５６２に対するＣＡＲ−Ｔ-１９細胞及びＣＡＲ−Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞の細胞傷害活性を決定した。ＣＡＲ-Ｔ-１９細胞及びＣＡＲ-Ｔ-１９-ＤＮＲＩＩ細胞を組換えヒトＴＧＦ-β１（１０ｎｇ／ｍｌ）とそれぞれ７２時間インキュベートした。標的細胞をＢＡ-ＴＤＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、ＵＳＡ）で１５分間標識した後、それぞれ２０：１、１０：１、５：１、２．５：１のエフェクター細胞（Ｔ細胞）：標的細胞（腫瘍細胞）割合でエフェクター細胞と混合し、計４時間インキュベートした後、ＴＤＡの放出を検出した（標的細胞溶解）。時間分解蛍光（ＴＲＦ）リーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて上澄み液のＴＤＡ放出を測定した。特異的溶解は、％溶解＝（実験的溶解-自発的溶解）／（最大溶解-自発的溶解）×１００で算出される。
【００７８】
図１０の結果に示すように、組換えヒトＴＧＦ-β１処理後、ＣＡＲ−Ｔ−１９細胞はＣＤ１９を発現するＫ５６２標的細胞に対する殺傷作用がＣＡＲ−Ｔ細胞を添加しないバックグラウンドレベルまで低下した（図１０Ａ）。一方、ＣＡＲ−Ｔ−１９−ＤＮＲＩＩ細胞は、ＣＤ１９を発現するＫ５６２標的細胞に対する殺傷作用がほとんど低下せず、ＣＡＲ−Ｔを添加しない細胞と有意な差があった（図１０Ｂ）。ＤＮＲＩＩはＴ細胞殺傷に対するＴＧＦ-βの抑制作用を有効に逆転させたことが示された。
【００７９】
配列表
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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