(57)【要約】  対象からの体液試料中のビタミンＤ及びその代謝物を測定する試験キット、組成物及び方法であって、該試料はビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）を含有し、結合条件下で前記試料をメガリン及び／又はその断片と接触させてＤＢＰ、ビタミンＤ代謝物及びメガリン又はその断片を含有する三元複合体を形成する工程と、メガリンによって結合したＤＢＰの量を測定する工程と、メガリン結合ＤＢＰの量を前記対象の循環中のビタミンＤの有効な状態と関連付ける工程と、を含む試験キット、組成物及び方法。
2021509952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象からの体液試料中のビタミンＤ及びその代謝物を測定する方法であって、前記試料は、内因性ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）を含有し得、前記方法は、
ａ）結合条件下で前記試料をメガリン及び／又はその断片と接触させてＤＢＰ、ビタミンＤ代謝物及びメガリン又はその断片を含む三元複合体を形成する工程と、
ｂ）メガリン又はその断片によって結合したＤＢＰの量を測定する工程と、
ｃ）メガリン結合ＤＢＰの量を前記対象の前記ビタミンＤの状態と関連付ける工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
メガリンの前記断片が、配列番号０１〜配列番号１０のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３】
メガリンの前記断片が、アミノ酸配列番号１若しくは配列番号２又はそれらの組み合わせを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
メガリンの前記断片が、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）のみと結合し、メガリンの他のリガンドのいずれとも結合しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記結合ビタミンＤ代謝物を決定することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２又は２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の存在下で、２５−ヒドロキシビタミンＤ３を示差測定することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
既知の量のビタミンＤ結合タンパク質を前記試料に添加することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料をキュービリン及び／又はその可溶性断片と接触させることをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＤＢＰとの前記複合体が、粒子増強免疫比濁法又はネフェロメトリーによって決定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＤＢＰとの前記複合体が、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＦＩＡ（蛍光イムノアッセイ）、Ｌ１Ａ（発光イムノアッセイ）又はＩＬＭＡの群から選択されるイムノアッセイによって決定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）固相に結合した規定量のメガリン及び／又はその可溶性断片を提供する工程と、
（ｂ）前記試料を、メガリン及び／又はその可溶性断を結合した前記固相と接触させる工程と、
（ｃ）ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）及びビタミンＤ代謝物によって形成される複合体にメガリン及び／又はその可溶性断が結合することを可能にする条件を作成する工程であって、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）単独ではメガリン及び／又はその可溶性断片に結合しない工程と、前記固相を洗浄する工程と、
（ｅ）ＤＢＰ、ビタミンＤ又はその代謝物及びメガリン又はその可溶性断片を含む複合体を認識する抗体複合体を提供する工程と、
（ｆ）ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）及びビタミンＤ代謝物に結合した前記メガリン及び／又はその可溶性断片を、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）に対する抗体と接触させ、前記複合体を前記固相上に固定化する工程と、
（ｇ）前記固相に結合した抗体の量を測定し、標準試料との相関により前記血漿又は血清中の前記ビタミンＤ代謝物を定量する工程と、
を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
体液試料中のビタミンＤ状態を決定する方法において使用するための試験キットであって、ＤＢＰに対する抗体及び任意選択で担体に結合された、メガリンの断片又はアミノ酸配列を含む、キット。
【請求項１３】
体液試料中のビタミンＤ代謝物を測定するための組成物であって、ＤＢＰのエピトープに対する抗体及びメガリンの断片を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、特定の性質の生物学的材料を含むアッセイに関し、特に、対象の生物学的試料、特に血液又は血清中のエンドサイトーシス可能ビタミンＤの濃度を測定するためのアッセイ及び血液又は血清中のビタミンＤの状態に関する疾患又は状態の検出又は診断のためのアッセイに関する（Ｇ０１Ｎ２３３３／００、Ｇ０１Ｎ２８００／００）。
【背景技術】
【０００２】
活性ビタミンＤの合成につながる代謝経路には、様々な組織で起こる３つの反応がある。ヒトでは、紫外線を媒介とした開裂により皮膚で合成が開始され、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３、ＶＤ３）が生成される。他のビタミンＤ異性体「エルゴカルシフェロール」（ビタミンＤ２、ＶＤ２）は植物に存在し、食物と一緒に取り込まれる。どちらのビタミンＤ異性体も肝臓で２５−ヒドロキシビタミンＤ［２５（ＯＨ）Ｄ］に代謝されるが、これも主要な循環型（プロホルモン）である。この第２段階はチトクロームＰ４５０酵素であるＮＡＰＨ−ヘモタンパク質還元酵素によって触媒されるが、肝２５−ヒドロキシラーゼの正体はまだ解明が必要である。２５（ＯＨ）Ｄはその後、腎臓で１α−水酸化されて１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ又は生理活性型（Ｄ−ホルモン）であるカルシトリオールになる。カルシトリオールは、腸内でのカルシウムの吸収、骨のミネラル化、骨芽細胞の分化、骨母細胞の合成及び神経筋機能を調節する。血清中の２５（ＯＨ）Ｄ濃度が血清１ｍＬあたり１５ｎｇ（３７．５ｎｍｏｌ／Ｌ）未満では副甲状腺ホルモンの値が上昇し、骨吸収の増加につながることは医学的にも一般的に知られている（Ｃｈａｐｕｙ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １９９６；８１：１１２９−３３）。ビタミンＤ欠乏は、消化器系疾患、肝機能障害、吸収不良の薬物による代謝の亢進、遺伝的な欠陥又は日光への曝露不足が原因と考えら得る。ビタミンＤ欠乏は老人性骨粗鬆症の危険因子として知られている。一般に、血清１ｍＬあたり５ｎｇ２５（ＯＨ）Ｄ（１２．５ｎｍｏｌ／Ｌ）未満の欠乏は重症とされ、小児ではくる病、成人では骨軟化症を引き起こす（Ｓｃｈａｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９６，１０４：２８９−２９２）。過剰摂取による過剰のビタミンＤは、高カルシウム血症を引き起こす。ＶＤ２とＶＤ３の効果に決定的な違いがあるのか又は血清２５（ＯＨ）Ｄの上昇、特に低用量のビタミンＤではそれらは同等の効果があるのかは明らかではない（Ｔｒｉｐｋｏｖｉｃ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２０１２  Ｊｕｎ；９５（６）：１３５７−１３６４；Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２０１７  Ａｕｇ；１０６（２）：４８１−４９０を参照）。
【０００３】
ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）は、アルビノイドスーパーファミリーのメンバーである。５６〜５８ｋＤａのグルコタンパク質は、ビタミンＤ代謝物だけでなく、脂肪酸や他のエンドトキシンと結合し得る。ＤＢＰはビタミンＤの半減期を延ばし、欠乏時には貯蔵器として機能すると考えられているが、ビタミンＤの中毒からも保護する。血中ＤＢＰ濃度は、健常者では病的状態やカルシウム代謝の障害があっても、比較的狭い範囲（３２３〜４６０ｍｇ／Ｌ（５．５２〜７．９３ｍｏｌ／Ｌ））に安定的に維持されている。妊娠中を除き、高いＤＢＰ濃度は観察されていない。血清中のＤＢＰは、免疫比濁法を含む多くの方法で測定され得る（Ｈａｍａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３２１（２００２）２３−２８）。ＤＢＰは好中球顆粒球に対して化学運動効果を発揮し、マクロファージを活性化させ、組織損傷時にアクチンを隔離することが知られている。
【０００４】
血清中のＤＢＰ濃度はビタミンＤの約２０倍超であるため、２〜５％のみがビタミンＤ代謝物によって占められる。測定には、酵素消化、変性及び／又はリガンド置換により、ビタミンＤ代謝物がＤＢＰから放出される（ＥＰ２１２６５８６Ｂ１、ＷＯ９９／６７２１１；ＥＰ０７５３７４３、ＷＯ２００４／０６３７０４）。離型剤としては、あらゆる種類の洗浄剤及び界面活性剤（ＥＰ２９５５５１６Ｂ１）並びにビタミンＤの構造類似体、例えばワルファリン、サリチル化合物、特定のスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、アニリノナフタレンスルホン酸などが挙げられる（ＷＯ０３／０２３３９１）。特に、ビタミンＤの代謝物が疎水性でコレステロールに似ており、多数の血清タンパク質と結合しているため、その定量的な測定は技術的に困難であり、結果は解釈の余地があるがゆえに、ＤＢＰからのビタミンＤの放出は、ほとんどの実験において決定的に重要な工程である。ビタミンＤの状態に関する混乱は、米国国立衛生研究所の栄養補助食品室が主導する共同イニシアチブを生じさせ、最近では血清中の「遊離２５（ＯＨ）Ｄ」（ＤＢＰ又はアルブミンによって結合されていない２５（ＯＨ）Ｄを言う）の決定を介してビタミンＤの状態を評価するための提案がある（総説として：Ｔｈｅ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ２５−Ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  Ａｓｓａｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ．Ｊ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．２０１７，１００（５）：１２２３−１２２４；及びＭａｌｍｓｔｒｏｅｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．２０１７，１００（５）：１３２３−７）。
【０００５】
カルシウム及びリンは、細胞のシグナル伝達、エネルギー代謝、骨格の成長及び完全性を含む多くの重要な生物学的機能に必要な必須ミネラルである。カルシウム及びフォスフェートの恒常性は、主に腎臓及び腸における上皮カルシウム及びフォスフェートのコトランスポートの調節によって維持されるが、この方法は、カルシトリオール、線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含むホルモンによって厳密に調節されている。慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者では、腎機能が低下すると、これらのホルモン間のフィードバックループが乱れることで、骨格、心臓及び血管系を含むいくつかの臓器系に悪影響を及ぼす。合併症としては、血管石灰化、脳卒中、骨格骨折及び死亡リスクの増加がある。ＦＧＦ２３及びＰＴＨ濃度の上昇並びにビタミンＤ欠乏が病態に寄与する。したがって、患者の処置は、骨格及び心血管系の合併症を予防するために、正常なカルシウム及びフォスフェートのバランスを維持するためのフィードバックループを回復させることに焦点を当てている。最近の証拠は、ビタミンＤの状態とがん、糖尿病、うつ病などの障害との関連性をさらに示しており、健康な患者でもビタミンＤ濃度のルーチン検査の需要が高くなっている。そのため、研究及び健康におけるビタミンＤ状態の重要性は誇張されているわけではなく、臨床検査室は検査数の増加と、低いビタミンＤ状態に本当に苦しんでいる人を特定する必要性といった課題に直面している。現状技術では問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許第２１２６５８６号明細書
【特許文献２】国際公開第９９／６７２１１号
【特許文献３】欧州特許出願公開第０７５３７４３号明細書
【特許文献４】国際公開第２００４／０６３７０４号
【特許文献５】欧州特許第２９５５５１６号明細書
【特許文献６】国際公開第２００３／０２３３９１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｈａｐｕｙ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １９９６；８１：１１２９−３３
【非特許文献２】Ｓｃｈａｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９６，１０４：２８９−２９２
【非特許文献３】Ｔｒｉｐｋｏｖｉｃ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２０１２  Ｊｕｎ；９５（６）：１３５７−１３６４
【非特許文献４】Ｔｒｉｐｋｏｖｉｃ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２０１７  Ａｕｇ；１０６（２）：４８１−４９０
【非特許文献５】Ｈａｍａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３２１（２００２）２３−２８
【非特許文献６】Ｔｈｅ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ２５−Ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  Ａｓｓａｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ．Ｊ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．２０１７，１００（５）：１２２３−１２２４
【非特許文献７】Ｍａｌｍｓｔｒｏｅｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．２０１７，１００（５）：１３２３−７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願は、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）の存在下で、体液試料中の有効ビタミンＤ濃度（貯蔵形態のビタミンＤ代謝物を含む）を測定するアッセイ及び方法を提供し、該アッセイ及び方法は、ａ）前記試料をメガリン／ＬＲＰ２（低密度リポタンパク質関連タンパク質２）及び／又はその可溶性断片と結合条件下で接触させ、ＤＢＰ、ビタミンＤ又はその代謝物とメガリン／ＬＲＰ２又はその断片とを含有する複合体を形成する工程と、ｂ）ＤＢＰ：ビタミンＤ及び／又はその成分のいずれか１つの量を測定する工程と、ｃ）ＤＢＰ：ビタミンＤのメガリン結合複合体の量を前記対象の有効ビタミンＤ状態に関連付ける工程と、を含む。
【０００９】
好ましい実施形態では、アッセイ及び方法は、メガリン／ＬＲＰ２の他のリガンドのいずれにも結合しないメガリンの断片及び／又はＤＢＰ：ＶＤ複合体に結合し得る前記メガリンの断片との融合タンパク質の使用を含む。前記方法の好ましい実施形態は、ヒドロキシル化エルゴカルシフェロール（２５−ヒドロキシビタミンＤ２）、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２及び／又は２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の存在下でのヒドロキシル化コレカルシフェロール（２５−ヒドロキシビタミンＤ３）の示差測定を含む。
【００１０】
本開示は、血清中に存在する内因性ＤＢＰの使用を包含するが、試験試料中のＤＢＰの標準濃度を得るためにＤＢＰを添加することを含み得る。本開示は、さらに、キュービリンがエンドサイトーシス工程を促進することが知られているので、追加的にキュービリン及び／又はその可溶性断片を前記試料に接触させることを包含し得る（Ｎｙｋｊａｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ  Ｃｕｂｉｌｉｎ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ２５（ＯＨ）ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（２００１）９８（２４）：１３８９５−９００［ＰＵＢＭＥＤ：１１７１７４４７］）。
【００１１】
一実施形態では、メガリンによって結合されたＤＢＰ：ＶＤの量は、濁度計若しくはネフェロメトリーによって又は特にＤＢＰのためのイムノアッセイによって決定される。別の実施形態では、メガリン及び／又はその前記可溶性断片は、５０〜２００ｎｍの範囲の直径を有する粒子又はビーズに結合してもよい。又は、本開示は、完成のために、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＦＩＡ（蛍光イムノアッセイ）、ＬＩＡ（発光イムノアッセイ）又はＩＬＭＡ群から選択されるイムノアッセイを教示する。
【００１２】
別の実施形態では、方法は、（ａ）固相に結合した規定量のメガリン及び／又はその断片を提供する工程と、（ｂ）試料を固相に接触させる工程と、（ｃ）ＤＢＰとビタミンＤ代謝物との間に形成された複合体にメガリン及び／又はその断片を結合させる条件を作成する工程であって、ＤＢＰ単独ではメガリン及び／又はその断片に結合されない工程と、固相を洗浄する工程と、（ｅ）ＤＢＰ：ＶＤの複合体又は通性にメガリン若しくはその可溶性断片を認識する抗体を提供する工程と、（ｆ）ＤＢＰ：ＶＤに結合した前記メガリン及び／又はその断片を抗ＤＢＰ抗体と接触させ、任意選択的に、複合体を固相に固定化する工程と、（ｇ）固相に結合した抗体の量を決定し、基準値との相関により血漿又は血清中のビタミンＤの状態を定量する工程を含み得る。
【００１３】
本開示はまた、ＤＢＰに特異的な抗体と、メガリン又はその断片を含む結合パートナーを含む試験キットとを提供する。抗体は、前記複合体中のＤＢＰ又はビタミンＤ代謝物に結合したものであり得る。別の実施形態では、試験キットは、結合メガリン及び／又はその可溶性断片を有するナノ粒子を含み得る。
【００１４】
本開示は、血清又は血漿中の有効なビタミンＤの状態を直接定量的に決定する方法を提供するので、記載の目的は達成される。状態は、プロホルモン（２５（ＯＨ）Ｄ）が生理的に活性なＤ−ホルモン（カルシトリオール）に１α−水酸化されるように、腎臓の細胞への又はエンドサイトーシスメガリン輸送経路を有する細胞へのエンドサイトーシス及び内包化の準備ができている主要な循環ビタミンＤ代謝物に基づく。エルゴカルシフェロール及びコレカルシフェロールは共にＤＢＰに結合しているが、ＤＢＰ：ＶＤ３の複合体はメガリンに優勢に結合しているので、開示された方法は、活性ホルモンとなり得るプロホルモンの状態を提供する。２４，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３などのビタミンＤ代謝物は、ＤＢＰとの複合体を形成することができるが、メガリンによってほとんど結合されていないか又はそれらの濃度は、決定された有効なビタミンＤの状態に影響を与えるために循環の中であまりにも低い。
【００１５】
ＤＢＰ：ＶＤ３複合体は、メガリンキューブリン経路により、Ｐ４５０  １α−ヒドロキシラーゼ（Ｃｙｐ２７Ｂ１）がミトコンドリア膜の外側に位置する細胞内にエンドサイトーシスされるのみである。その結果、他のビタミンＤ代謝物は活性化されないか又は循環中のそれらの濃度が低すぎて、測定されたビタミンＤの状態に関連するものではない。これは、ＤＢＰとの複合体がメガリンによって結合されていないか又はほとんど結合されていない２５−ヒドロキシル化エルゴカルシフェロール［２５（ＯＨ）Ｄ２］に特に当てはまる（図８Ｂを参照）。したがって、本開示は、ビタミンＤ代謝物の非タンパク質結合画分（遊離画分）のみが細胞に入り、生物学的効果を発揮することができるという遊離ホルモン仮説と矛盾する。
【００１６】
ビタミンＤ代謝物の親油性にもかかわらず、有効なビタミンＤの状態の決定は水溶液中で行われ得る。メガリン又はその可溶性断片によって結合又は識別されるＤＢＰ：ＶＤの複合体の測定に基づく方法であるため、ビタミンＤの代謝物をそれらの結合パートナー（ＤＢＰ、アルブミン、アルビノイドスーパーファミリーのタンパク質など）から放出する必要はない。ビタミンＤと結合したビタミン結合タンパク質の信頼性の高い識別が可能である。メガリン又はその断片は、本発明者らが提出する循環中のもっぱら生物活性化可能なプロホルモンを表すエンドサイトーシスＤＢＰ：ＶＤ複合体に基づいてビタミンＤの状態を識別するために使用される。
【００１７】
可溶性メガリンは、組換え法により哺乳類細胞内で産生し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。水溶液（血清、血漿）に可溶なメガリン断片は、生理的に近いＤＢＰ：ＶＤ複合体の形成条件を可能にするので好ましい。
【００１８】
開示されているように、先行技術の方法によるように、ビタミンＤを結合パートナーから放出する必要はない。したがって、ハロゲン系溶媒、テンシド（ｔｅｎｓｉｄ）、界面活性剤（ＰＦＯＡ、ＣＴＡＢ）を必要としないため、環境に優しい方法となっている。分析前の精製及び調製工程がないことにより、さらに、試料採取直後の有効なビタミンＤの状態を直接決定し得る。前記メガリン結合複合体の形成を決定するという概念は、ＥＬＩＳＡ、濁度測定及びネフェロメトリーなどのプラットフォームに容易に適合させ得る。前記複合体のタンパク質性成分を確実に定量し得る。
【００１９】
本開示は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３が２５−ヒドロキシビタミンＤ２よりも効果的であるという臨床報告にさらに適合する。本開示は、活性化のために利用できるであろうエンドサイトーシス可能プロホルモンに基づく有効な状態を提供する。２５−ヒドロキシ化ビタミンＤ２及びＤ３の異性体が等しくＤＢＰによって結合されている間、提供された方法は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３との相互作用でＤＢＰへのメガリンの異なる結合親和性を利用する。結合親和性の違いが、印象的である。生理的な関連性が見過ごせない基本的な生物学的メカニズムが発見されたことが、報告されている。本方法は、したがって、活性化可能な循環ビタミンＤ代謝物の識別を可能にし、したがって、容易に活性化可能なビタミンＤ代謝物（プロホルモン）の状態を提供する。提供される情報により、ビタミンＤ補給療法は、毒性又は非効率的な療法を避けて、対象の真の生理的状態に適合させ得る。
【００２０】
発明の原理を、その利点、代表的な実施例及び図面を参照して説明するが、特許請求の範囲に含有される開示から導き出すことができる本発明の要旨を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ペップサイト２により予測されるヒトＤＢＰ（ダイマー）のメガリンへの潜在的な結合部位を示す模式図である（Ｔｒａｂｕｃｏ  ＬＧ  ｅｔ  ａｌ，ＰｅｐＳｉｔｅ：ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１２；４０（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ４２３−４２６）。
【図１Ｂ】メガリン／ＬＲＰ２、キューブリン及びそれらの既知のリガンドとの間の腔内形質膜の外側での相互作用を示す図である。
【図１Ｃ】プロホルモン（２５（ＯＨ）Ｄ）を介したビタミンＤから活性ホルモン（１，２５（ＯＨ）２Ｄ−カルシトリオール）への経路及び排泄経路を示す図である。
【図２Ａ】ビタミンＤ結合タンパク質の結合について試験された選択されたメガリン断片の概略図：定常Ｍ１：Ｍ１−Ｋ３８６（シグナルペプチド＋Ａ１−７＋ＥＧＦ様１／２）；Ｍ２：（Ｍ１−２５シグナルペプチド＋Ｅ１０２４−Ｋ１４２９）；Ｍ３：（Ｍ１−２５シグナルペプチド＋Ｅ２６９８−Ｒ３１９２；Ｍ４：（Ｍ１−２５シグナルペプチド＋Ｐ３５１０−Ａ４０４８−詳細な調査なし）。
【図２Ｂ】発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングされたメガリン断片（Ｍ１、Ｍ２及びＭ３）のｃＤＮＡ構築物の概略図。
【図２Ｃ】分泌されたメガリン断片（Ｍ１〜Ｍ３ダイマー）及びＭ２モノマー：ＨＥＫ細胞溶解物のウエスタンブロット及び培養上清からのＮｉ−ＮＴＡ親和性精製後のウエスタンブロットである。
【図３Ａ】トランスフェクトしたＨＥＫ細胞溶解物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３＋対照／なし；約２０μｇ）からのメガリン断片のウエスタンブロットを示す。
【図３Ｂ】抗Ｈｉｓ抗体（ＷＢ染色：抗ＤＢＰ  Ａｂ）を用いて、ＶＤ３（０、２μｇ）の存在下又は非存在下でのメガリン結合（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）ＤＢＰ（０、５μｇ）の共免疫沈降を示す。
【図４Ａ】Ｎｉ−ＮＴＡ精製メガリン断片（Ｍ１、Ｍ２及びＭ３＋対照としての抗ＩｇＧ  ＡＢ；約３μｇ）のウエスタンブロットを示す。
【図４Ｂ】抗Ｈｉｓ抗体（ＷＢ染色：抗ＤＢＰ  Ａｂ）を用いたＶＤ３（０、５μｇ）の存在下又は非存在下でのメガリン結合ＤＢＰ（２μｇ）の複合体の共免疫沈降を示す。
【図５Ａ】ＶＤ３（５０ｎＭ）の存在下又は非存在下でのメガリン断片Ｍ１、Ｍ２及びＭ３並びにＤＢＰ（５０ｎＭ）のマイクロスケール熱泳動分析を示す。
【図５Ｂ】アフィニティー分析に対するＶＤ３濃度の効果を示す。
【図６Ａ】精製メガリン断片Ｍ１（３μｇ）を用いた、異なるヒト血清又は血漿からの共免疫沈降ＤＢＰのウエスタンブロットを示す。
【図６Ｂ】表面コーティングメガリン断片（Ｍ１又はＭ２）によって結合された総ＤＢＰ及び形成されたＤＢＰ／ＶＤ３のＥＬＩＳＡの結果を示す棒グラフを示す。
【図７Ａ】対象のヒト血清の試料（ＲＭＳ）中のＭ２−メガリン結合ＤＢＰ：２５（ＯＨ）Ｄ３の形成に対する添加された精製ＤＢＰの効果を示すグラフである。
【図７Ｂ】２５（ＯＨ）Ｄ３血清濃度とＤＢＰ：２５（ＯＨ）Ｄ３のヒト血清中のメガリンＭ２断片への結合の間の相関関係である。
【図７Ｃ】２５（ＯＨ）Ｄ３濃度と三元複合体ＤＢＰ／２５（ＯＨ）Ｄ３／Ｍ２の間の相関関係、並びにそれぞれ２５（ＯＨ）Ｄ２及び２４，２５（ＯＨ）ＶＤを含む三元複合体の相関関係である。
【図８Ａ】ＤＢＰ及び様々な２５（ＯＨ）Ｄ代謝物のマイクロスケール熱泳動分析：（２５（ＯＨ）Ｄ３、２５（ＯＨ）Ｄ２、２４，２５（ＯＨ）Ｄを示す。
【図８Ｂ】メガリンＭ２断片によって結合された場合のＤＢＰ：ＶＤ代謝物のマイクロスケール熱泳動分析を示す。
【図９Ａ】メガリン結合ＤＢＰ：２５（ＯＨ）Ｄ３の直線性範囲を示すグラフであり、高濃度（５０ｎｇ／ｍＬまで）での２４，２５（ＯＨ）ＶＤ及び２５（ＯＨ）ＶＤ２の濃度を変化させた存在下でのグラフである。
【図９Ｂ】メガリン結合ＤＢＰ：２５（ＯＨ）Ｄ３の直線性範囲を示すグラフであり、高濃度（５０ｎｇ／ｍＬまで）での２４，２５（ＯＨ）ＶＤ及び２５（ＯＨ）ＶＤ２の濃度を変化させた存在下でのグラフである。
【図１０Ａ】メガリン結合ＤＢＰ：２５（ＯＨ）Ｄ３の直線性範囲を示すグラフであり、下濃度（１９ｎｇ／ｍＬまで）での２４，２５（ＯＨ）ＶＤ及び２５（ＯＨ）ＶＤ２の濃度を変化させた存在下でのグラフである。
【図１０Ｂ】メガリン結合ＤＢＰ：２５（ＯＨ）Ｄ３の直線性範囲を示すグラフであり、下濃度（１９ｎｇ／ｍＬまで）での２４，２５（ＯＨ）ＶＤ及び２５（ＯＨ）ＶＤ２の濃度を変化させた存在下でのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書は、対象からの体液試料中の生物学的に有効なビタミンＤの量を決定する方法を提供する。方法は、前記試料をＤＢＰとメガリン又はその機能性断片と結合条件下で接触させてメガリン又はその機能性断片によって特異的に結合されるＤＢＰ：ビタミンＤ（又はビタミンＤの代謝物）の複合体を形成し、ＤＢＰ：ビタミンＤ：メガリンを含む三元複合体を形成する工程を含む。次に、前記体液試料中の前記三元複合体の形成された量を、前記体液試料中の前記ビタミンＤの生物学的に有効な量と相関させ得る。
【００２３】
この文脈では、用語「生物学的に有効なビタミンＤ」又は「有効なビタミンＤ」は、メガリン又はその機能性断片によって認識され、結合されて三元複合体を形成するＤＢＰとの複合体を形成する全ての構造的ビタミンＤ分子を定義し、これを含む。したがって、これらの構造的ビタミンＤ分子は、ビタミンＤ（コレカルシフェロール及びエルゴカルシフェロール）だけでなく、それぞれのエピマーを含む２５−ヒドロキシル化されたビタミンＤ代謝物をも含む。長年にわたり、２５−ヒドロキシビタミンＤ［２５（ＯＨ）Ｄ］の総濃度を測定することに重点が置かれてきた。測定値は生理学的には一致していなかったため、最近では「遊離２５（ＯＨ）Ｄ」がビタミンＤの状態を示すより良いマーカーになる可能性があるという仮説が立てられている。しかし、提案されている「遊離２５（ＯＨ）Ｄ」の評価は、総２５（ＯＨ）Ｄ、アルブミン、ＤＢＰを用いた計算と、ビタミンＤ代謝物に対するＤＢＰの親和性が一定であるという仮定に依存する。この仮説は、親油性ビタミンＤ代謝物が細胞膜を介して受動的に拡散することができ、血清ＤＢＰとアルブミンは、ビタミンＤの利用可能な量とビタミンＤの状態を容易に減少させるだろうという仮定で働く。「２５（ＯＨ）Ｄの遊離ＤＢＰ未結合画分」の決定は、「実質遊離かつ利用可能なビタミンＤの状態」を与えるものとする。
【００２４】
ビタミンＤの状態は、正常な腎臓機能及び骨の健康に欠かせないだけでなく、がんの発生及び一部の自己免疫疾患にも関連し得る。ビタミンＤの状態がヒトの健康に与える影響を考えると、臨床現場では信頼性の高い方法が求められる。
【００２５】
血清中の総「２５−ヒドロキシビタミンＤ」の濃度は、臨床現場ではほとんど使われているが、「遊離若しくは利用可能な」又は隠れた２５−ヒドロキシビタミンＤ」の量又は割合についての議論は無視できない。しかし、この仮説では、上皮細胞及び他の組織（腎尿細管、副甲状腺、胎盤など）の細胞が、ＤＢＰ結合ビタミンＤ代謝物のエンドサイトーシス内在化を可能にするエンドサイトーシス経路を持っていることは考慮されていない。２５（ＯＨ）Ｄは、カルシトリオールへの取り込み及び細胞内変換のためのプロホルモンの主要な形態である。ビタミンＤ代謝物は、主に輸送され、ビタミンＤ結合タンパク質によって循環中に結合される。先行技術の測定方法では、活性化された状態になり得るビタミンＤ代謝物の量は知られておらず、さらに知られていないのは、エンドサイトーシス内在化及び活性Ｄ−−ホルモンへの１α−水酸化のために利用可能なプロホルモンの量である。
【００２６】
本方法は、ビタミンＤ代謝物がエンドサイトーシスによって内包化され得る前に、ビタミンＤ、ＤＢＰ及びメガリンの三元複合体を形成しなければならないことを利用している（図１Ａ〜Ｃ）。ビタミンＤ（コレカルシフェロール又はエルゴカルシフェロール）は、最初に肝臓でその２５位でプロホルモンに水酸化され、その後、循環中に存在することが十分に確立されている。また、活性Ｄ−ホルモン［１，２５（ＯＨ）２Ｄ］は、細胞内のミトコンドリア膜の外側に位置する酵素１α−ヒドロキシラーゼ（Ｃｙｐ２７Ｂ１−シトクロムＰ４５０）によって合成されることも十分に確立されている（図１Ｃ参照）。２５−水酸化ビタミンＤ代謝物は、最初に肝臓から腎臓の各細胞に輸送されなければならない。カルシトリオール（１，２５（ＯＨ）２Ｄ）の主な供給源は腎臓であるが、リンパ球、マクロファージ、ケラチノサイト並びに副甲状腺及び膵臓の細胞を含む腎外細胞もカルシトリオールを生成し得る。
【００２７】
２５−ヒドロキシビタミンＤ３は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２に比べて３００％の効果があることが知られている。それに伴い、本開示は、エンドサイトーシス可能ＤＢＰの識別を提供し、ここで、エンドサイトーシス可能ＤＢＰとは、結合したビタミンＤ３代謝物を有するＤＢＰと言う。メガリン又はその断片は、生理的に活性化されたビタミンＤ３代謝物を識別するために使用される。組換えメガリン断片は、哺乳類細胞株で生産し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。ビタミンＤの状態を直接及び迅速に測定することができ、追加の前処理又は試料の前処理は必要ない。このように、アッセイのタイムスケールは、生理的に正確及び有効な測定値を提供しながら、短縮されている。開示されたアプローチは、ＥＬＩＳＡ、濁度測定及びネフェロメトリーのような異なるプラットフォームに容易に適合させ得る。
【００２８】
新規なビタミンＤの状態は、生理的に活性化されたエンドサイトーシス可能なビタミンＤ、特に血清又は血漿中の２５−ヒドロキシビタミンＤ３に対応する。他のエンドサイトーシス可能ビタミンＤ代謝物の濃度は、はるかに低い。２５−ヒドロキシ化ビタミンＤ２及びＤ３異性体は、ＤＢＰによって等しく結合しているが（図８Ａ）、ＤＢＰ：２５（ＯＨ）ＶＤ２及び２４，２５−ヒドロキシビタミンＤと比較して、ＤＢＰ：２５（ＯＨ）ＶＤ３に対するメガリンのより高い結合親和性は印象的である。２５−ヒドロキシビタミンＤ３［３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ３］のＣ３−エピマーが特別な役割を果たしているようであるが、その臨床的意義についてのデータはほとんどない。３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ３のｉｎ  ｖｉｖｏでの重要性についてはほとんど知られていないが、臨床検査ではビタミンＤの状態の測定に３−ｅｐｉ−２５（ＯＨ）Ｄ３を含めるかどうかの判断に直面している。図８Ａ、Ｂのデータは、記載された方法が、２５（ＯＨ）Ｄ３のＣ−３エピマー形態を十分に検出して解明し得ることを示す。したがって、本発明の方法は、最も強力なビタミンＤ代謝物を決定するための区別を可能にし、ひいては、活性の低い形態を含まない、より正確で生理的に有効なビタミンＤの状態を提供する。したがって、本開示により提供される情報により、ビタミンＤ補給療法は、毒性又は非効率的な療法を回避して、対象の生理的状態に適合させ得る。
【００２９】
好ましい実施形態では、方法は、メガリンの可溶性断片及び／又はＤＢＰ：ＶＤ代謝物の複合体を結合するが、ＬＰＲ２／メガリンの他の多数のリガンドのいずれも結合しない、前記可溶性メガリン断片の融合体の使用を含む。より正確には、アルブミン又は抗ＤＢＰ抗体と親和性を有しないメガリンの可溶性断片（Ａｂ交差反応性なし）。このような実施形態は、表面結合ＤＢＰ結合メガリン断片又はその融合タンパク質を含み、その中には以下のようなエピトープを含み得る。
【００３０】
【化１】
2021509952.tif 000003
又は
【００３１】
【化２】
2021509952.tif 000004
又は両方のエピトープ。
【００３２】
ヒトＤＢＰ：ＶＤ複合体の親和性結合のための配列は、
【００３３】
【化３】
2021509952.tif 000005
又は
【００３４】
【化４】
2021509952.tif 000006
を含有するようである。
【００３５】
メガリンＭ２領域（Ｅ１０２４−Ｋ１４２９）内の他の有用なＤＢＰ結合エピトープは、ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓ（ＴＭ）ペプチドアレイを使用して、ＤＢＰとメガリンＭ２（Ｅ１０２４−Ｋ１４２９）（配列番号０９）との相互作用によって決定されるような、
【００３６】
【化５】
2021509952.tif 000007
【００３７】
【化６】
2021509952.tif 000008
【００３８】
【化７】
2021509952.tif 000009
【００３９】
である。
【００４０】
好ましい実施形態は、ＤＢＰ：ＶＤ代謝物のメガリン結合複合体の決定を含み得る。これは、ＤＢＰ：ＶＤの複合体を認識する抗体を用いて又はＤＢＰ、ビタミンＤ若しくはその代謝物又はメガリン若しくはその可溶性断片を単離した後に行ってもよい。本開示の一態様では、方法は、標準試料を確立するためのビタミンＤ代謝物及びＤＢＰの混合物を提供することを含み得る。
【００４１】
好ましい実施形態では、本開示は、プロホルモンの結合のための標準条件又は一定の過剰なＤＢＰを作製するために添加された量のＤＢＰを前記試料に接触させることを含み得る。本開示は、キュービリン及び／又はその可溶性断片を試料に接触させることをさらに包含し得る。
【００４２】
前記実施形態は、配列番号０１から配列番号１０までのアミノ酸配列のいずれか１つ以上を有するエピトープを含有する、表面結合ＤＢＰ結合メガリン断片又はその融合タンパク質を含み得る。
【００４３】
一実施形態では、本開示の方法は、濁度測定又はネフェロメトリックイムノアッセイに関し得る。前記メガリン及び／又はその可溶性断片は、ＤＢＰ：ＶＤの複合体が前記ナノ粒子に結合するように、５０〜２００ｎｍの範囲の直径を有するナノ粒子に結合され得る。本開示はまた、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＦＩＡ（蛍光イムノアッセイ）、Ｌ１Ａ（発光イムノアッセイ）又はＩＬＭＡ群から選択されるイムノアッセイを提供する。
【００４４】
従って、方法は、（ａ）固相に結合した規定量のメガリン及び／又はその可溶性断片を提供する工程と、（ｂ）結合したメガリン及び／又はその可溶性断片を有する固相と試料を接触させる工程と、（ｃ）ＤＢＰ及びビタミンＤ代謝物によって形成された複合体の結合を可能にする条件を作製する工程であって、ＤＢＰ単独ではメガリン及び／又はその可溶性断片に結合しない工程と、固相を洗浄する工程と、（ｅ）ＤＢＰ、ビタミンＤ又はその代謝物を含む三元複合体を認識する抗体を提供する工程と、（ｆ）前記三元複合体を抗体、任意にＤＢＰに対する抗体、と接触させ、免疫複合体を固相上に固定化する工程と、（ｇ）固相に結合した抗体の量を測定し、結合した抗体の量を、標準物質を参照することにより、血液、血漿又は血清中のエンドサイトーシスビタミンＤ又は活性化可能なビタミンＤの状態と相関させる工程と、を含む。
【００４５】
本開示は、さらに、三元複合体、メガリン又はその断片、ＤＢＰ又はビタミンＤ及びその代謝物に特異的な抗体を含む、有効なビタミンＤの状態を測定する方法で使用するための試験キットを含む。開示はまた、結合したメガリン及び／又はその可溶性断片を有するナノ粒子を含む、体液試料中のビタミンＤ代謝物を測定する方法で使用するための試験キットに関する。
【００４６】
達成された目的は、試料中のビタミンＤ及びその代謝物の有効状態を直接定量的に決定するための簡単で信頼性の高い方法である。体液が、血液、血清又は血漿などの場合、状態は、循環中のビタミンＤ代謝物のエンドサイトーシス可能な画分を表し、任意選択的にそれぞれの標的細胞及び組織が活性ホルモンに細胞内で処理できる画分を言う。ビタミンＤの親油性が高いにもかかわらず、水溶液中でビタミンＤの状態を判定することができる新規なビタミンＤの開発に成功した。
【００４７】
ビタミンＤ３は生体内で容易に吸収及び処理され、半減期が短く、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）との親和性が低く結合するビタミンＤ２よりも強力であると考えられる。１α，２５（ＯＨ）Ｄ３及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、１α−ヒドロキシラーゼ及び２４−ヒドロキシラーゼの活性の正又は負の調節によってビタミンＤ代謝に影響を与える（図１Ｃ参照）。ここでも、ビタミンＤは肝臓で２５−水酸化されて２５（ＯＨ）Ｄ３又は２５（ＯＨ）Ｄ２になり、腎臓細胞でさらに水酸化されてその生物学的に活性な形態１α，２５（ＯＨ）Ｄになる。２４，２５（ＯＨ）Ｄは２５（ＯＨ）Ｄ３のさらなる代謝物であるが、不活性であり、排泄される運命にある。循環の中では、ビタミンＤの代謝物はＤＢＰと強固に結合している。少量であればアルブミン及びリポタンパク質と結合する。アルブミンに対する２５（ＯＨ）Ｄ（Ｋａ＝６×１０５Ｍ−１）及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ（Ｋａ＝５．４×１０４Ｍ−１）の親和性は、ＤＢＰ（２５（ＯＨ）Ｄ（Ｋａ＝７×１０８Ｍ−１）及び１，２５（ＯＨ）２Ｄ（Ｋａ＝４×１０７Ｍ−１）の親和性よりも実質的に低い。ＤＢＰ（５μＭ）と比較して血清中のアルブミン（６５０μＭ）の豊富さのために、いくつかのビタミンＤは、エンドサイトーシスのために効果的に利用できないが、アルブミンによって結合される可能性が高いであろう。さらに、血清中のＤＢＰの大部分は、ビタミンＤ代謝物によって占められていない。ＤＢＰへの結合に基づいてビタミンＤ代謝物のバイオアベイラビリティに対処するパラメータを定義する先行技術内の開示及び以下のエンドサイトーシス経路内の開示はない。ＤＢＰは循環中に高濃度で存在するため、これまでビタミンＤの状態を評価する際には考慮されていなかった。先行技術では、別々に、合計（結合及び遊離）又は遊離循環ビタミンＤのいずれかが、ビタミンＤの状態を確立するための情報源と考えられていた。
【００４８】
メガリン（低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質２、ＬＲＰ２としても知られている）は、ＬＤＬレセプター（ＬＤＬＲ）と構造的に類似しているマルチリガンド結合細胞レセプターである。メガリンは、多数の細胞及び組織、特に吸収性上皮細胞の形質膜中に見出され得る（Ｆａｒｑｕｈａｒ  ＭＧ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  ６（１）：３５−４７）。ＬＲＰ２／メガリンは、そのリガンドのエンドサイトーシスを媒介することが知られており、キューブリン：メガリン複合体が再び分子を（再）吸収することができるキュービリンとの複合体を形成し得る。キューブリン：メガリン複合体は、脂質、ＶＬＤＬ、特定のタンパク質（アルブミン、ラクトフェリン）、コバラミン（ビタミンＢ１２）及びカルシドールの細胞内取り込みに対してとりわけ責任がある。本開示は、メガリンが結合するＤＢＰ：ＶＤの量を決定することを提案する。これは、例えば、前記三元複合体の「単離又は分離」後のヒトＤＢＰに対するＥＬＩＳＡによって行われ得る。これが好ましく、ＥＬＩＳＡは既に市販されている（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ＡＧ，Ｂｅｎｓｈｅｉｍ）。用語「有効なビタミンＤ」は、メガリン（又はその断片）が結合したＤＢＰ：ＶＤの形成された複合体を意味する。メガリンとの複合体は、「活性化されたビタミンＤ代謝物」がエンドサイト化され、その後１α−水酸化されて活性ホルモンになるように、キューブリンと相互作用すると考えられている。
【００４９】
効果的なビタミンＤの状態は、生理的な情報とＤホルモンに処理される循環ビタミンＤの濃度の読み取りを提供するので、先行技術に対する改善を表す。この状態は、２５（ＯＨ）Ｄ２のような活性の低い形態は、有効なビタミンＤの状態に寄与しないか又ははるかに少ないので、主要な循環貯蔵形態とは異なる。本開示は、メガリン及び／又はキューブリンによって選択的及び識別的に結合されたＤＢＰ：ＶＤの量に基づくビタミンＤの状態を提供する。したがって、このエンドサイトーシス複合体は、血清又は血漿中の有効なビタミンＤの状態に対応する。しかし、先行技術で使用されている用語「生物学的に利用可能な」は、「完全に遊離した」ビタミンＤを指しており、これは、細胞の形質膜を横切る推測される拡散を前提としている。
【００５０】
ＤＢＰの役割に関しては、先行技術において矛盾した見解がある。一方では、ＤＢＰへのビタミンＤの結合は、遊離ビタミンの過剰な量に対する保護メカニズムと考えられてきた。この見解には、「自由ホルモン仮説」を支持するグループが続く。一方、ＤＢＰノックアウトマウスを用いた研究では、これらの動物は２５（ＯＨ）Ｄ３及び１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の血漿中濃度が有意に低下していることが示された。ビタミンＤ枯渇食では、動物はビタミンＤ欠乏及び骨形成不全に悩まされた。これらの結果は、ＤＢＰが循環中に存在する場合には関係のない代替経路の展開を示唆する。
【００５１】
ビタミンＤなどのステロイドホルモン及びステロールは脂溶性であり、効果的な送達のためにキャリアタンパク質を必要とするのが一般的である。ステロイドホルモン及びステロールのリガンド特異的な血清キャリアとしては、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）（グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド）、ビタミンＡ（レチノール）結合タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）（エストロゲン、アンドロゲン）及び甲状腺ホルモン結合グロブリンなどの多くのものが挙げられる。例えば、ＣＢＧ及びＳＨＢＧは高親和性の血清輸送体として作用するだけでなく、それらのリガンド形態で細胞膜に結合することができ、シグナル伝達物質としての代替的な作用を示唆する。同様に、ＤＢＰはマクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）及びアクチン結合体であり、ビタミンＤ代謝物との結合とは無関係に機能しているようである。結合グロブリンからリガンドが放出され、標的細胞によって獲得されるメカニズムは、ステロイドホルモンのシグナル伝達経路に重要な役割を果たす。
【００５２】
これは、プロホルモン（２５（ＯＨ）Ｄ）の活性Ｄホルモンへの腎外、頭蓋内変換の証拠が増加しているビタミンＤについて特に重要である。ビタミンＤの影響は、その後、１α−ヒドロキシラーゼの組織特異的発現と、核内ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）である１，２５（ＯＨ）２Ｄのレセプターの組織特異的発現に非常に依存する。血清中の遊離１，２５（ＯＨ）２Ｄの濃度は、約１０−１３Ｍと推定されており、これはビタミンＤレセプターに結合するために引用された濃度（解離定数（Ｋｄ）＝約１０−１０Ｍ）よりもはるかに低い。（おそらく）受動的な拡散に利用可能な遊離ホルモンの量と細胞内の標的レセプターを効率的に占有するために必要な濃度との間の明らかな格差のために、「遊離ホルモン仮説」は、生理的に関連する（「真の」）ビタミンＤの状態の基礎としての疑問を提起する。
【００５３】
全２５（ＯＨ）Ｄは現在、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（標準技術研究所及びアメリカ疾病予防管理センター）で測定されている。総２５（ＯＨ）Ｄ及び他のビタミンＤ代謝物の濃度を測定するために、様々な免疫測定法が使用されている。しかし、これらの方法は全て、ビタミンＤ代謝物をそれらの担体タンパク質から放出する必要があるため、結果が大きく変動するようである。これは、偽の（低い）ビタミンＤ濃度が決定されるように、血管表面に結合してビタミンＤが失われるリスクを含む。固定化ＤＢＰ及び可溶化ウサギ腎臓膜を用いたアフィニティークロマトグラフィー研究により、腎尿細管内での２５（ＯＨ）Ｄ３−ＤＢＰ複合体の取り込みのための共レセプター、すなわち６００ｋＤａのタンパク質（メガリン）及び４６０ｋＤａのタンパク質（キュービリン）が同定された。これらの研究は、ＤＢＰとキュービリンとのＣａ２依存的な結合を示す。著者らは、いずれの共レセプターとのＤＢＰの結合が、ＤＢＰと２５（ＯＨ）Ｄ３との複合体の形成に先行し、影響を受け又は依存していることを示唆しておらず、また、ＤＢＰにより結合したビタミンＤ代謝物の種類にも先行し、影響を受け又は依存していることを示唆していない（Ｎｙｋｊａｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｂｉｌｉｎ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ２５（ＯＨ）ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００１  Ｎｏｖ  ２０；９８（２４）：１３８９５−１３９００）。
【００５４】
メガリンは、４４００アミノ酸の細胞外アミノ末端ドメイン、２２アミノ酸の膜貫通ドメイン及び２１３アミノ酸のカルボキシ末端細胞質テールの３つのドメインを持ち、Ｉ型細胞表面レセプターであることを示す。細胞外ドメインは、ＬＤＬＲ型Ａ（補体型）リピートの４つのシステインリッチなクラスターを含有する。補体型リピートは、ＬＤＬＲのリガンド中の正電荷配列の高親和性結合に関与する、６つのシステイン残基及びＳＤＥ（Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ）モチーフを含む約４０個のアミノ酸からなる。４つのシステインリッチなクラスターは、上皮成長因子（ＥＧＦ）型リピート及びエンドソームコンパートメントにおけるリガンドのｐＨ依存性解離に関与するＹＷＴＤ（Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ）モチーフを含有するスペーサー領域に挟まれている。メガリンの細胞質ドメインは３つのテトラアミノ酸ＮＰＸＹモチーフを含有し、これらのモチーフはクラスリンで被覆されたピットを介したリガンド−レセプター複合体のエンドサイトーシスに不可欠である。
【００５５】
メガリンには、様々な種類のリガンドがあり、ビタミン結合タンパク質及びその他の結合タンパク質、アポリポタンパク質、ホルモン及びホルモン前駆体、薬物及び毒素、酵素及び酵素阻害剤、免疫及びストレス応答関連タンパク質並びにカルシウムを含むその他である。メガリンノックアウトマウスは、糸球体濾液からＤＢＰを回収することができず、尿中のビタミンＤカーゴとともにＤＢＰを失ってしまう。その結果、メガリンノックアウトマウスは２５（ＯＨ）Ｄを１，２５（ＯＨ）２Ｄに十分に代謝することができず、ビタミンＤ欠乏くる病に似た骨の表現型になってしまう。
【００５６】
キュービリンは、末期回腸における内因性因子Ｂ１２（ＩＦ−Ｂ）複合体のレセプターとして同定されている。４６０ｋＤａのレセプターであり、膜貫通ドメインを持たず、エンドサイトーシスのシグナルを持たない。キュービリンは、リガンド結合を担う２７個のＣＵＢドメイン及び１１０個のアミノ酸のストレッチによって先行する８つのＥＧＦ型リピートを含有し、ここでは、Ｎ末端領域は膜の固定に必須であると考えられている。キュービリン及びメガリンの間の直接的な関連が実証されており、それによって分子協力は、キュービリンに結合したリガンドの内部移行の基礎を提供する。したがって、キュービリン結合リガンドは、メガリン媒介エンドサイトーシスを受け、そのカーゴをリソソームに降ろし、メガリンとともに形質膜にリサイクルし得る。
【００５７】
ＤＢＰのメガリン依存的な取り込みは、腎臓のビタミンＤ内分泌学において明確な役割を果たしているが、他のビタミンＤ標的組織においても同様のメカニズムが存在するかどうかはまだ明らかではない。腎外では、メガリンは胎盤、乳腺及び副甲状腺を含むいくつかの組織で発現しており、これらの組織では１α−ヒドロキシラーゼ活性を有することが知られており、腎外ＤＢＰ−メガリン相互作用が示唆されている。
【００５８】
本開示は、ＤＢＰ、ビタミンＤ並びにメガリン及びキューブリンのいずれか一方又は両方を含む複合体の検出及び定量に基づいてビタミンＤの状態を決定する方法を記載する。先行技術とは異なり、本方法は、ＤＢＰからのビタミンＤ代謝物の特異的な放出を必要とせず、エンドサイトーシス及び活性化の対象となるビタミンＤ代謝物の画分のみを評価するであろう。理論に縛られることなく、メガリンに結合したＤＢＰの測定は、エンドサイトーシス可能ビタミンＤ代謝物のパラメータを提供する。したがって、提供される方法は、血清又は血漿中の生理的に活性及びエンドサイトーシス可能なビタミンＤ濃度に対応するビタミンＤの状態を確立するために使用され得る。
【００５９】
本方法を用いることで、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）又はエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）のいずれかを補給した後の対象の２５ＯＨＤ、１，２５（ＯＨ）２Ｄ及びＤＢＰの総血清濃度の変化と共に、様々なビタミンＤ代謝物、特に２５（ＯＨ）Ｄ３を識別し得る。補給は、エンドサイトーシス及び水酸化の対象となるであろう活性型ビタミンＤ分子の測定を妨げることがなくなるであろう。それ故、真に生物学的に利用可能なビタミンＤ分子の画分は、循環中の他のタンパク質によって結合された補充されたビタミンＤ２又はビタミンＤ分子と容易に識別され得る。
【００６０】
イムノネフェロメトリーは、試料中のＤＢＰ濃度を測定するために使用され得る。イムノネフェロメトリーは、抗体が適度に過剰な条件下で、大きな可溶性抗原抗体複合体による入射光源の散乱を定量化する。これらの条件下で、複合体は安定した格子を形成し、抗原の濃度の増加と散乱光強度の増加との間に直接的な線形関係が確立される。自動比濁計は、ＤＢＰ濃度の敏感及び正確な測定を迅速及び技術的なスキルの必要条件を最小限にして提供する。これらは、ＤＢＰ濃度を分析するために臨床化学研究所で使用され得る。好ましい実施形態では、ＤＢＰ、ビタミンＤ及びメガリンによって形成される三元複合体のみが抗体によって認識される。
【００６１】
別の態様では、免疫比濁法を使用して、試料中のＤＢＰ濃度を測定し得る。濁度測定は、そこで懸濁された粒子の散乱効果による透過光の強度の損失を測定する方法である。光はフィルターを通過し、既知の波長の光を生成し、そして、この光は、例えば、溶液を含むキュベットを通過する。光電セルは、キュベットを通過する光を集める。次に、吸収された光の量を測定する。免疫比濁法は、抗原抗体反応が行われるバリアントである。抗原抗体複合体は、光度計で光学的に検出できる粒子である。好ましい実施形態では、抗体は、ＤＢＰ、ビタミンＤ及びメガリンによって形成される三元複合体を認識する。別の態様では、メガリン又はその断片で被覆されたナノ粒子を、ＤＢＰ／ビタミンＤ複合体を含む試料と接触させる。試料中のＤＢＰ／ビタミンＤ／メガリン三元複合体の濃度が増加すると、濁度が増加する。
【実施例】
【００６２】
［実施例１］
複雑な生物学的機能は、複雑なタンパク質間相互作用ネットワークを通じて現れる。タンパク質間相互作用の重要なクラスは、ペプチドを介した相互作用に対応し、１つのパートナーからの短いペプチドストレッチが他のパートナーからの大きなタンパク質表面と相互作用する。タンパク質−ペプチド相互作用は、一般的に親和性が低く、タンパク質相互作用ネットワークを動的に再形成する調節メカニズムに関与する。比較的小さい相互作用表面のため、タンパク質−ペプチド相互作用の調節は、例えば治療目的のために、実行可能であり及び非常に魅力的であると考えられてきた。残念ながら、利用可能なタンパク質−ペプチド界面の三次元構造の数は非常に限られている。しかしながら、ビタミンＤの輸送及び代謝の文脈におけるＤＢＰと他のタンパク質、特にメガリン／ＬＲＰ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、タンパク質アクセッション番号Ｐ９８１６４、ヒト）との相互作用に関する情報は、限定的であるか又は全くなかった。ＤＢＰとメガリンのペプチドレベルでの潜在的な相互作用を調べるために、ＰｅｐＳｉｔｅ２プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｐｅｐｓｉｔｅ２．ｒｕｓｓｅｌｌｌａｂ．ｏｒｇ）を用いてペプチド結合スポットを予測した。ＰｅｐＳｉｔｅ法は、既知のタンパク質−ペプチド三次元構造のセットから計算された好ましいペプチド結合環境と、既知のペプチドから得られる距離制約とを組み合わせたものに依存する。Ｐｅｐｓｉｔｅの予測によれば、メガリンは、ドメイン２及び３に位置するリガンド結合性リピート９、１３−１５、１６、１９、２２−２５；２７及び２９を介してヒトビタミンＤ結合タンパク質と相互作用する可能性が高い（図１Ａを参照のこと）。
【００６３】
上記予測と一致し、本発明者らは、ＤＢＰ−メガリン相互作用の解析のために、システインリッチな補体型リガンド結合性リピート（ＬＤＬＲクラスＡ）を選択した。また、ＥＧＦ様モジュールは、エンドソームコンパートメントでの受容体のフォールディング及びリガンドの解離に重要であると考えられているため、ＥＧＦ様モジュールも含まれていた。補体型リピートのＮ末端にシグナルペプチド（Ｍ１−Ｇ２５）を導入し、分泌経路へのソーティングを可能にした。Ｃ末端に６ｘＨｉｓ−タグを付加して親和性精製を行い、共免疫沈降及びウエスタンブロット法でタンパク質を解析した。各々のｃＤＮＡ配列をＰＣＲにより得て、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に挿入した。カルシウムはＬＤＬＲ−Ａドメインの正しいフォールディングに必要であるため、ＨＥＫ細胞は内因性カルシウムチャネルを有するため、メガリンｃＤＮＡ配列（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）で安定にトランスフェクトした。タンパク質の精製は、Ｈｉｓ−タグ及び市販のＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて行った。哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１へのメガリン断片（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）のクローニング戦略を図２Ａ〜Ｂに示す。
【００６４】
メガリンＭ１  ｃＤＮＡは、ヒトＬＲＰ２／メガリン（配列番号０８）のアミノ酸２６〜３８６の配列をコードした。構築物は、Ｎ末端２５アミノ酸シグナルペプチド及びＣ末端６ｘヒスチジンタグをコードするｃＤＮＡを含んだ。予測分子量は、モノマーで約４３ｋＤａ、ダイマーで約８６ｋＤａであった。
【００６５】
ＨＥＫ発現及び分泌された組換えメガリンＭ１断片は、以下のアミノ酸配列を有した（シグナル配列を含まない）。
【００６６】
【化８】
2021509952.tif 000010
【００６７】
メガリンＭ２  ｃＤＮＡは、ヒトＬＲＰ２／メガリン（配列番号０９）のアミノ酸１０２４−１４２９の配列をコードした。構築物は、Ｎ末端２５アミノ酸シグナルペプチド及びＣ末端ヒスチジン（６ｘ）タグをコードするｃＤＮＡを含んだ。予測分子量は、モノマーで約５０ｋＤａ、ダイマーで約１００ｋＤａであった。ＨＥＫ発現及び分泌された組換えタンパク質メガリンＭ２断片は、以下のアミノ酸配列を有した（シグナル配列を含まない）。
【００６８】
【化９】
2021509952.tif 000011
【００６９】
メガリンＭ３  ｃＤＮＡは、ヒトＬＲＰ２／メガリン（配列番号１０）のアミノ酸２６９８〜３１９２の配列をコードした。ｃＤＮＡは、２５アミノ酸シグナルペプチド及びＣ末端６ｘヒスチジンタグをコードした。予測分子量は、モノマーで約６０ｋＤａ、ダイマーで１２０ｋＤａであった。構築物は、ＨＥＫ２９３哺乳類細胞で発現させた。分泌されたメガリンＭ３断片。配列番号１０は以下のアミノ酸配列に対応する（シグナル配列を含まない）。
【００７０】
【化１０】
2021509952.tif 000012
【００７１】
メガリンＭ１、Ｍ２、Ｍ３断片のタンパク質解析は、６ｘＨｉｓ−タグに対する抗体を用いたウエスタンブロット法で行った。上記の構築物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）を導入した細胞を溶解し、溶解物をＨｉｓ−タグでタンパク質の分析を行った。また、Ｈｉｓタグを持つタンパク質（右）と結合するＮｉ／ＮＴＡ樹脂を用いて、細胞上清からメガリン断片を精製した。その結果を図２Ｃに示す。
【００７２】
ウエスタンブロットは、メガリンＭ１、Ｍ２、Ｍ３断片がＨＥＫ細胞で発現し及び分泌されたことを示す。メガリン断片を溶液中に保持することができた。沈降は観測されなかった。メガリン断片はダイマーを形成する傾向を示したが、分子量は全て予測されたサイズと一致していた。メガリンモノマー及びダイマー形成の分析には、２Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ及び２Ｘ  Ｕｒｅａ試料バッファーを使用したが、これらのバッファーを使用しても差は認められなかった。Ｍ２断片は、ほとんどがモノマーに解離しやすいものであった。
【００７３】
メガリン断片を、ビタミンＤ３（ＶＤ３）の存在下（＋）又は非存在下（−）でのＤＢＰとの相互作用についてさらに調べた。共免疫沈降を行い、その結果を図３Ａ、Ｂに示す。簡単に言えば、ＨＥＫ細胞を上記のｃＤＮＡ構築物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）でトランスフェクトし、共免疫沈降に使用した細胞溶解物を用いた。図３Ａは、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３を発現するＨＥＫ細胞の細胞溶解物（２０μｇ）のウエスタンブロットを示す。Ｈｉｓ−タグに対する抗体で検出。図３Ｂは、ＤＢＰ（０、５μｇ）及びＶＤ３（０、２μｇ）との共免疫沈降の結果を示す。
【００７４】
血清試料には、ＤＢＰ単独又はビタミンＤ３を添加したものが含まれていた。各試料は、メガリン断片を含む細胞溶解物と接触させた。インキュベーション後、Ｈｉｓ−タグに対する抗体をコーティングしたビーズを試料に接触させ、遠心分離によりＤＢＰをプルダウンした。結合したリガンド（ＤＢＰ）をビーズから解離させ、抗ＤＢＰ−抗体を用いてＤＢＰの発現をウエスタンブロットで分析した。対照として、純粋なＤＢＰ単独を分析した。図３Ｂは、ＤＢＰがメガリンＭ１及びＭ２断片でプルダウンされ得ることを確認した。注目すべきことに、ＤＢＰは、ビタミンＤ３の存在下（＋）でのみプルダウンされ得る。このことは、メガリン断片Ｍ１及びＭ２がＤＢＰと単独で相互作用するのではなく、ＤＢＰがビタミンＤの代謝物で占められている場合にのみ相互作用することを示す。すなわち、ビタミンＤ結合タンパク質、ビタミンＤ代謝物、メガリン断片を含む三元複合体がｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成され、メガリンＭ１又はＭ２断片とＤＢＰ単独との間には相互作用は起こらなかった。
【００７５】
追加の共免疫沈降は、上記と同様のセットアップでＤＢＰ及びＮｉ−ＮＴＡアガロース精製可溶性メガリンＭ１、Ｍ２、Ｍ３断片（３μｇ）の間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ相互作用を示す。その結果を図４Ａ、Ｂに示す。図４Ａは、抗Ｈｉｓ抗体による検出；メガリンＭ１、Ｍ２、Ｍ３断片のためのｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞によって分泌された培養上清（３μｇ）からの精製メガリンＭ１、Ｍ２、Ｍ３断片のウエスタンブロットである。図４Ｂは、精製メガリンＭ１、Ｍ２、Ｍ３断片との共免疫沈降の結果を示すウエスタンブロットである。血清試料は、ＤＢＰ単独又はビタミンＤ３の存在（＋）下でＤＢＰを含有した。インキュベーション後、６ｘＨｉｓ−タグに対する抗体をコーティングしたビーズを試料に接触させ、遠心分離によりプルダウンした。結合したタンパク質をビーズから解離させ、ビタミンＤ結合タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロット法で分析した。ここでも、図４Ｂは、ＤＢＰが精製された可溶性Ｍ１及びＭ２断片でプルダウンされ得ることを確認している。ＤＢＰはビタミンＤ３の存在下（＋）でのみプルダウンされた。このことは、可溶性精製メガリン断片Ｍ１及びＭ２は、ビタミンＤ３で占有されない限り、ＤＢＰと相互作用しないことを示す。ＤＢＰ、ビタミンＤ３及び精製メガリンＭ１又はＭ２断片を有する三元複合体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成した。可溶性精製メガリンＭ１又はＭ２断片及びＤＢＰ単独の間には、相互作用又は結合は観察されなかった。
【００７６】
［実施例２］
精製された可溶性メガリンＭ１又はＭ２断片とＤＢＰ単独又はビタミンＤ代謝物で占有されたＤＢＰとの形成された複合体のさらなる特性決定のために、得られた複合体をマイクロスケール熱泳動によってさらに分析し、その結果を図５Ａに示す。マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）は、ミクロな温度勾配（熱泳動）の中での粒子の方向性のある動きを調べる。生体分子の構造変化による水和シェルの変化は、温度勾配に沿った動きの相対的な変化をもたらす。この原理を利用して、２つの分子の結合親和性を決定し得る。この技術により、特に表面に固定化することなく、溶液中の相互作用を調べることができる。空間的な温度差は、高温領域での分子濃度の低下をもたらし、そしてこれが決定され得る。熱泳動は通常、蛍光標識された分子を用いて行われる。
【００７７】
分子の熱泳動の違いはさらに、一定のバッファー条件下での結合強度を定量化することである。蛍光標識された分子の熱泳動は、キャピラリー内の蛍光分布をモニターすることで測定される。微細な温度勾配をＩＲレーザーで発生させ、キャピラリー内に集光して水中に吸収させる。そのため、レーザースポット領域の水溶液の温度が上昇する。ＩＲ−レーザーのスイッチを入れる前に、キャピラリー内の均一な蛍光分布が観察される。ＩＲ−レーザーのスイッチを入れると、新たな蛍光分布が確立される。熱緩和時間は高速であり、温度の段階的上昇に対する局所的な環境依存的な応答により、色素の蛍光の結合依存的な低下を誘導する。分子はその後、局所的に加熱された領域から外側の寒冷領域に移動する。分子の局所的な濃度は、定常分布に達するまで加熱された領域で減少する。
【００７８】
正規化蛍光（Ｆｎｏｒｍ）は、温度の段階的上昇を考慮した濃度比を測定する。蛍光強度の直線性及び熱泳動による枯渇により、結合していない分子と結合した複合体からの正規化された蛍光は直線的に重畳する。結合基質の連続希釈を用いて定量的な結合パラメータを得た。Ｆｎｏｒｍを希釈系列の異なる濃度の対数に対してプロットすることで、シグモイド結合曲線が得られる。この結合曲線は、質量作用の法則の非線形解で直接フィットさせることができ、その結果として解離定数Ｋｄが得られる。
【００７９】
手短に言えば、精製ＤＢＰをＭｏｎｏｌｉｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｒｅｄ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて赤色蛍光色素ＮＴ−６４７で標識した。Ｎｉ−ＮＴＡ精製可溶性メガリン断片Ｍ１、Ｍ２及びＭ３断片を０．４８８〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲で滴定した。測定には、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５デバイス（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とＮＴ解析ソフトウェアバージョン１．４２７（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用した。
【００８０】
Ｈｉｓタグ精製可溶性メガリンＭ１、Ｍ２及びＭ３断片並びにＤＢＰの間の結合について、ビタミンＤ３の非存在下又は存在下でのマイクロスケール熱泳動分析を行った。その結果を図５Ａに示す。上記の共免疫沈降実験と同様に、Ｍ１及びＭ２はＤＢＰと相互作用したが、Ｍ３は相互作用しなかった。各実験について解離定数を算出した。メガリンＭ１及びＭ２断片はともに、２５−ＯＨビタミンＤ３の非存在下でＤＢＰへの弱い結合を示した（Ｍ１／ＤＢＰ：Ｋｄ＝４４２＋／−４４．９３ｎＭ；Ｍ２／ＤＢＰ：１３４．２＋／−２３．５７ｎＭ）。対照的に、２５（ＯＨ）Ｄ３の存在下では、解離定数Ｋｄが著しく低いため、両メガリン断片の高い結合親和性が見出された（Ｍ１／ＤＢＰ／ＶＤ３：Ｋｄ＝４５．６５＋／−４．５７ｎＭ；Ｍ２／ＤＢＰ／ＶＤ３：２３．７＋／−２．２８ｎＭ）。また、２５（ＯＨ）Ｄの存在下で、精製された可溶性メガリン断片Ｍ１又はＭ２へのＤＢＰの結合の増加を観察した。
【００８１】
この結果は、２５（ＯＨ）Ｄ３に依存してＤＢＰがメガリンに結合していることを示す良好な証拠である。メガリンＭ２断片は、ＤＢＰ：２５（ＯＨ）Ｄ３との複合体に対してより高い親和性を有していたため、さらなる研究に使用された。
【００８２】
可溶性メガリンＭ１及びＭ２断片のＤＢＰへの結合に対する２５（ＯＨ）Ｄ３濃度の影響を、有効なビタミンＤの状態のための提案された新しい複合体結合アッセイの実施形態を既に表しているＥＬＩＳＡを用いて、さらに評価した。その結果を図５Ｂに示す。簡単に言えば、マイクロタイタープレートを、精製可溶性メガリンＭ１又はＭ２断片（１μｇ／１００μｌのＰＢＳ）でコーティングした。ＤＢＰ及び２５（ＯＨ）Ｄ３の混合物は、１μｇのＤＢＰ及び２５（ＯＨ）Ｄ３（ＶＤ３）のＰＢＳ中での連続希釈（０、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０μｇ）を用いて調製した。各混合物をコーティングされたウェルに塗布し、三元複合体の形成を可能にするために生理的条件でインキュベートし及び洗浄した。メガリンに結合したＤＢＰ（可溶性断片Ｍ１及びＭ２）の検出及び定量は、ＤＢＰに対するポリクローナルウサギ抗体及びＨＲＰ共役ロバ抗ウサギ抗体を用いて行った。吸光度は４５０ｎｍで読み取った。
【００８３】
図５Ｂに示すように、可溶性メガリンＭ１及びＭ２断片のＤＢＰへの結合は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３に依存していた。より正確には、図９Ａ及び図１０Ａに示すように、吸光度はビタミンＤ３濃度に直線的に比例しており、この関係は、２５（ＯＨ）ＶＤＢＰ又は２４，２５（ＯＨ）ＶＤの濃度を増加させても影響を受けない（図９Ｂ、１０Ｂ参照）。重要なことに、これらの実験は、三元複合体に基づく簡単で信頼性の高いビタミンＤ測定の原理を実証している。
【００８４】
［実施例３］
種々のメガリン可溶性断片の結合特性を、ヒト対象の血清及び血漿試料を用いた共免疫沈降により、さらに分析した。その結果を図６Ａに示す。精製された可溶性メガリンＭ１タンパク質を、試料中に存在する可溶性メガリンＭ１断片及び内因性ＤＢＰとの相互作用を可能にするために、２つのヒト血清又は血漿試料と混合した。試料を、樹脂へのメガリンＭ１／ＤＢＰの相互作用を可能にするために、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂でインキュベートした。樹脂を洗浄した後、結合した複合体を樹脂から溶出させ、ウエスタンブロット法でアッセイした。図６Ａ（右）は、ＤＢＰが両方の試料に存在し、特異的な抗体を用いて検出することができたことを示す。図６Ａ（左、上側ブロット）は、プルダウンされたＤＢＰの存在によって示されるように、精製された可溶性メガリンＭ１断片が、全ての試料においてＤＢＰと溶液中で相互作用したことを示す。注目すべきことに、血清のみを含むがメガリンタンパク質を含まない対照試料を使用しても、ＤＢＰは検出されなかった。精製メガリンＭ１タンパク質の存在は、抗６ｘＨｉｓタグ抗体を用いて、全ての試料において検出された（図６Ａ、左、下側ブロット）。
【００８５】
要約すると、共免疫沈降は、ＤＢＰ及び２５（ＯＨ）Ｄ３の複合体が、適切な可溶性メガリン断片を用いて、特異的に結合し、血漿又は血清から単離され得ることを証明する。アミノ酸２６−３８６及び１０２４−１４２９を有するメガリン部分は、ＤＢＰ及び２５（ＯＨ）Ｄ３との三元複合体形成に関与することが示される。アミノ酸２６９８−Ｒ３１９２を有する外部メガリン領域は、記載された条件下では結合に加わらなかった。
【００８６】
本出願は、ＤＢＰの結合に使用できるメガリンの代表的なアミノ酸配列を含み、それらは、体液中のエンドサイトーシスビタミンＤ又は活性化可能なビタミンＤの状態を決定するためにさらに使用され得る。「エンドサイトーシス及び１α−水酸化に利用可能なビタミンＤの生理的状態」から「遊離ビタミンＤ」又は「総ビタミンＤ」を区別する必要がないため、エンドサイトーシス可能なビタミンＤの状態は、「遊離ビタミンＤ」又は「総ビタミンＤ」の状態よりも優先される。従来の方法では、活性ホルモンへの処理準備が整った代謝物を分析することができないため、通常、生理的に関連するビタミンＤの状態を決定することができない。このように、従来の方法では不十分であるのに対し、本研究では、腎臓及びおそらく他の組織で水酸化され得及び水酸化されるであろう循環プロホルモンの状態を対象とし、活性ホルモンを生成する。
【００８７】
［実施例４］
ＤＢＰ、ビタミンＤ３、メガリンの三元複合体（Ｍ１及びＭ２断片）の割合を詳細に測定するために、メガリンコートプレートを用いたＥＬＩＳＡを開発した。血清試料中のＤＢＰの総量は、市販のＤＢＰ用ＥＬＩＳＡを用いて測定した。その結果を図６Ｂに示す。アッセイは、血清中のＤＢＰの総量のわずかな割合（０．００２８％）のみが、水酸化ビタミンＤ３と結合しており、メガリンと結合し得ることを示す。メガリンＭ１断片を用いたアッセイでは、９．４５ｎｇ複合体／ｍＬの血清濃度値が得られた。メガリンＭ２断片の場合、約１２．８９ｎｇ複合体／ｍＬの血清の値が得られた。これは、メガリン断片がプロホルモンとの複合体のときにＤＢＰのみを行ったことを示す証拠である。このようにメガリンは、臨床試料中の生理的に活性化されたプロホルモン（ＤＢＰに結合している）を検出し及び定量するための手段と考えられ得る。
【００８８】
本発明者らは、ヒト血清中のメガリン、ＤＢＰ及びビタミンＤ代謝物の間の三元複合体を誘導するために、精製ＤＢＰ（ＤＢＰ、約５〜２５ｎｇ／ｍＬ）の量を添加することが必要な場合があることに留意した。添加したＤＢＰが三元複合体の形成に及ぼす影響を評価するために、精製したビタミンＤ結合タンパク質の量を増加させたＥＬＩＳＡも実施した。その結果を図７Ａに示す。血清試料（ＲＭＳ）において、２５ｎｇ／ｍＬまでの用量範囲での精製ＤＢＰの添加は、精製可溶性メガリンＭ２断片への複合体ＤＢＰ／ＶＤ３の結合に影響を与えなかった。８．６５ｎｇ／ｍＬの初期値は、精製ＤＢＰの添加量とは無関係に変化しなかった。精製ＤＢＰを４０ｎｇ／ｍＬまで添加した場合、複合体−メガリン相互作用がわずかに増加したことが観察された。この限界を超えると、三元複合体が指数関数的に形成されるようになった。したがって、限界内では、ＤＢＰ−ＶＤ３−メガリンの三元複合体の測定された濃度は、添加された精製ビタミンＤ結合タンパク質の量に依存しない。
【００８９】
比較のために、異なる対象からの５つの血清試料（Ｓ３、Ｓ６、Ｓ８、Ｓ９、ＲＭＳ）を分析し、全ＤＢＰ（ＤＢＰ）、２５（ＯＨ）Ｄ３及びＤＢＰ：２５（ＯＨ）ＶＤ：Ｍ２の三元複合体の濃度を決定した。ＤＢＰはＥＬＩＳＡにより測定した。２５（ＯＨ）Ｄ３の含有量は、独立した研究機関により従来通り定量した。三元複合体ＤＢＰ：２５（ＯＨ）ＶＤ：Ｍ２メガリンを、本開示に従ってＤＢＰ：ＶＤ３：メガリンＥＬＩＳＡにより分析した。比較のための結果を以下の表１にまとめた。
【００９０】
【表１】
2021509952.tif 000013
【００９１】
健康対照（四分位間）範囲の現在の基準値は、ｉ）血清ＤＢＰ  １９３．５〜４３４５．０μｇ／ｍｌ（中央値４２３．５μｇ／ｍｌ；３５４．１〜５８６μｇ／ｍｌ）及びｉｉ）血清２５（ＯＨ）Ｄ３  ３０〜１００ｎｇ／ｍＬ（正常範囲）、２０〜３０ｎｇ／ｍｌ（不足）、２０ｎｇ／ｍｌ未満（欠乏）である。したがって、試料Ｓ３は２５（ＯＨ）Ｄ３の正常濃度、Ｓ９は不足濃度、Ｓ８及びＳ６は欠乏濃度とした。すなわち、高い濃度から低い濃度に向かって、２５（ＯＨ）Ｄ３：Ｓ３＞Ｓ９＞Ｓ８＞Ｓ６とした。その結果、ヒト血清中の総ＤＢＰ濃度と２５（ＯＨ）Ｄ３濃度との間には相関性がないことが明らかになった。
【００９２】
異なる検体は異なる方法で測定されたため、直接の比較は厳密には不可能であるが、２５（ＯＨ）Ｄ３値と比較した場合、三元複合体ＤＢＰ：２５（ＯＨ）ＶＤ：Ｍ２メガリンの濃度の相関が試料中で見出だされることは注目に値する；２５（ＯＨ）Ｄ３濃度で決定されたものと同じく、高い濃度から低い濃度に向かって、三元複合体Ｓ３＞Ｓ９＞Ｓ８＞Ｓ６。このことは、メガリンはプロホルモンが結合しているときにのみｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＢＰと相互作用するという考えをさらに支持し、循環におけるプロホルモンのバイオアベイラビリティを記述する生理的に活性なエンドサイトーシス可能ルなビタミンＤの新しい状態を提供する。
【００９３】
２５（ＯＨ）ＶＤ３血清濃度及び三元複合体の間の相関をさらに分析した；図７Ｂのグラフを参照。２５（ＯＨ）ＶＤ３及びＤＢＰ：２５（ＯＨ）ＶＤ：Ｍ２メガリンの血清濃度間の線形相関が決定され（Ｒ２＝０．８８９７）、この方法は、標準値と比較又は関連できる正確な情報を提供し得、対象の活性化可能なビタミンＤ状態の測定値を取得することを示す。
【００９４】
さらに、メガリンとＤＢＰ間の相互作用の直線性の範囲は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５（ＯＨ）ＶＤ３）、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５（ＯＨ）ＶＤＢＰ）及び２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２４，２５（ＯＨ）ＶＤ）について請求された方法を用いて調べられた。開示されているように、ＤＢＰ：ＶＤ：メガリンの複合体のＥＬＩＳＡを行った。簡単に言うと、精製メガリンＭ２断片でコーティングされたマイクロタイタープレートを、ＤＢＰと２５（ＯＨ）ＶＤ２、２５（ＯＨ）ＶＤ３又は２４，２５（ＯＨ）ＶＤの連続希釈の混合物とインキュベートした。三元複合体の決定には、ポリクローナルウサギ抗ＤＢＰ抗体及びＨＲＰ共役ロバ抗ウサギ抗体を使用した。その結果を図７Ｃに示す。全てのビタミンＤ代謝物について、アッセイは５０ｎｇ／ｍｌまで直線的であった。決定された感度限界は２．０ｎｇ／ｍｌであった。
【００９５】
一方のＤＢＰと２５（ＯＨ）ＶＤ３、２５（ＯＨ）ＶＤ２、２４，２５（ＯＨ）ＶＤ及び２５（ＯＨ）Ｄ３の３Ｃ−エピマーと他方のメガリンの結合特性を、マイクロスケール熱泳動を使用してさらに調べた。結果を図８Ａ、Ｂに示す。精製ＤＢＰを赤色蛍光色素ＮＴ−６４７で標識した。ビタミンＤ代謝物を異なる濃度で滴定した。解離定数Ｋｄは相互作用相手ごとに計算した。結合親和性は、得られた解離定数Ｋｄを用いて評価した。結果は、ＤＢＰと２５（ＯＨ）ＶＤ３（Ｋｄ＝１．８８＋／−０．２８ｎＭ）又は２５（ＯＨ）ＶＤＢＰ（Ｋｄ＝２．８１＋／−０．６８１ｎＭ）との相互作用親和性が同等であったのに対し、２４，２５（ＯＨ）ＶＤとの相互作用はわずかに弱いように見えたことを示す。３Ｃ−ｅｐｉ２５（ＯＨ）ＶＤ３が最も強く結合した。
【００９６】
また、２５（ＯＨ）ＶＤ３、２５（ＯＨ）ＶＤ２又は２４，２５−２４，２５（ＯＨ）ＶＤ、２５（ＯＨ）Ｄ３の３Ｃ−エピマー及びメガリンＭ２と相互作用したときのＤＢＰの親和性をマイクロスケール熱泳動により解析した。その結果を図８Ｂに示す。精製ＤＢＰ（５０ｎＭ）を赤色蛍光色素ＮＴ−６４７で標識し、いずれかのビタミンＤ代謝物（３７．８ｎＭ）と混合した。精製メガリンＭ２を異なる濃度で滴定した。解離定数Ｋｄは、全ての条件について計算した。結合親和性は解離定数Ｋｄで評価した。分析は、複合体ＤＢＰ：２５（ＯＨ）ＶＤ３へのメガリンＭ２断片の結合親和性が、複合体ＤＢＰ：２５（ＯＨ）ＶＤ２（Ｋｄ＝１６０＋／−２２．７ｎＭ）又は−／ＤＢＰ−２４，２５ＶＤ（Ｋｄ＝１７１＋／−２４．６ｎＭ）よりもはるかに強い（Ｋｄ＝３３．７＋／−２０．７ｎＭ）ことを示す。３Ｃエピマーは非常に高い親和性を示したので、今後の検討が必要である。
【００９７】
これらの実験は、メガリンのＤＢＰへの結合がプロホルモンと結合したときにのみ行われることを示す。この三元複合体は、タンパク質の定量のための任意の方法で検出し、定量され得る。上記の観点から、メガリンの使用は、生理的に活性化されたビタミンＤ、例えば２５−ヒドロキシビタミンＤ３の信頼性の高い測定を可能にし、これは循環中のビタミンＤの最も活性な形態を表す。開示された方法は、食品サプリメント中のビタミンＤＢＰの観点からも関連する他のビタミンＤ代謝物の示差測定を提供する。
【００９８】
メガリン又はその断片は、有効なビタミンＤの状態を識別するために使用される。記載されたメガリン断片は、組換え法で容易に製造することができ、さらには化学的に合成されたものであってもよい。記載されたメガリン断片は、生理的に近い条件で使用できるように、水溶液に可溶性を保ったままであった。先行技術の方法で要求されるような、ビタミンＤの結合パートナーからの放出の必要性はもはやない。したがって、ビタミンＤの結合相手からの置換のための溶媒又は界面活性剤は不要である。したがって、ビタミンＤの状態の測定は、非生理的化学物質によって妨げられることはないであろう。精製工程又はＬＣ−ＭＳのような時間及びコストのかかる技術は必要ない。効果的なビタミンＤの状態を直接及び迅速に決定することができ、試料採取後すぐに行うことができる。開示された原理は、さらに、利用可能なプラットフォーム及びオートマットに容易に適合させることができる。
【００９９】
ＤＢＰ以外のリガンドもメガリンに結合する可能性があることから、Ｍ２領域内の結合領域又はエピトープをさらに詳細にマッピングした。結果は、結合エピトープのために提供された配列に含有される。最小結合エピトープがさらに試験される。
【０１００】
［実施例５］
組換えメガリン断片の製造。メガリン（ＬＲＰ２）ｃＤＮＡ断片は、Ｃａｃｏ−２細胞（ヒト大腸癌上皮細胞）由来のｍＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅させた。ｃＤＮＡ転写合成には、Ｍａｘｉｍａ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。本キットは２０ｋｂまでのｃＤＮＡを合成し得る。オリゴｄｔ１８プライマー及び６５Ｃを用いた。ＰＣＲ反応には、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒｍｉｘハイフィデリティＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。メガリンＭ１  ｃＤＮＡ：１１５８ｂｐ；メガリンＭ２  ｃＤＮＡ：１２１５ｂｐ；メガリンＭ３  ｃＤＮＡ：１４８２ｂｐ。
【０１０１】
メガリンｃＤＮＡ断片をＣ末端ＨｉｓタグでｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、クローニングしたプラスミドを哺乳類ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ヒトＬＲＰ２／メガリン（配列番号０９）のアミノ酸１０２４〜１４２９の配列をコードするメガリンＭ２  ｃＤＮＡを以下のクローニング戦略でクローニングし、シグナルペプチド（２５アミノ酸）＋Ｅ１０２４−Ｋ１４２９＋６ｘＨｉｓタグを有する構築物を得た。ＰＣＲで生成した配列を用いてクローニングを行った。
【０１０２】
ネオマイシン（Ｇ４１８、８００μｇ／ｍｌ）を用いて安定な細胞株選択を行った。細胞培養上清又は細胞溶解物をＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製した。６ｘＨｉｓ−タグを有するメガリンタンパク質Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３断片の解析は、６ｘＨｉｓ−タグに対する抗体（Ｃｏｈｅｓｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたウエスタンブロットにより行った。細胞培養上清又は細胞溶解物をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製した。細胞溶解物又は培養上清（０．５〜２ｍＬ）を、５０μｌの前平衡化Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂と４℃で一晩インキュベートした。樹脂をＨ−バッファー＋２０ｍＭイミダゾールで３回洗浄した。メガリンタンパク質複合体を２００ｍＭイミダゾールを含むＨ−バッファーで溶出し、バッファーをＰＢＳ  １Ｘで交換した。タンパク質溶液は、使用前に凍結乾燥させるか、４℃で保存した。
【０１０３】
断片Ｍ２は、ヒトＤＢＰを結合するメガリンの領域であるＭ２領域内のメガリンリガンドの主要な結合エピトープについてさらにマッピングされた。他のメガリンリガンドの結合部位を除去し、ヒトＤＢＰの結合のためのエピトープを同定した。そのためには、最小エピトープがメガリン以外のリガンドの結合エピトープと重ならないことが重要である。結果は以下の表の通りである。
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
ヒトＤＢＰの結合のためのメガリンＭ２領域内の最小エピトープは、以下の表３に記載されている。
【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
［実施例６］
メガリン複合ＥＬＩＳＡ結合アッセイ。マイクロタイタープレートに可溶性精製メガリンＭ１又はＭ２断片（ＰＢＳ１Ｘで希釈した１μｇ／１００μｌ）をコーティングし、２時間、室温でインキュベートした。２５−ヒドロキシビタミンＤ３（ＶＤ３）０、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０ｎｇを１００μｌのＰＢＳで連続希釈し、それぞれ１μｇのＤＢＰ（ＤＢＰ）を混合した。この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。非特異的な結合部位をブロッキングバッファー（ＰＢＳ１Ｘ中の１％ＢＳＡ）で１時間室温でブロッキングした。ＤＢＰ−ＶＤ３混合物又は血清試料をメガリンコートウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴ−バッファー（ＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄後、１００μｌのウサギ抗ＤＢＰ抗体（１：３５００で希釈したブロッキングバッファー）を添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ共役ロバ抗ウサギ第２抗体（ブロッキングバッファーで１：５００希釈）１００μｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１００μｌの基質試薬Ａ＋Ｂ（１：１）（Ｒ＆Ｄ）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。その後、１００μｌの停止液をウェルに添加した。吸光度は４５０ｎｍで読み取った。その値を、既知の２５−ヒドロキシビタミンＤ３濃度の標準値と比較した。
【０１０９】
［実施例７］
組換え精製可溶性メガリン及びヒト血清からのＤＢＰの共免疫沈降。Ｎｉ−ＮＴＡ精製可溶性メガリンＭ１又はＭ２タンパク質断片（３μｇ）を、最初にヒト血清又は血漿試料（３０μｌ）と混合した。これらの試料を５０μｌの前平衡化Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂で４℃で一晩インキュベートした。樹脂をＨ−バッファー＋２０ｍＭイミダゾールで３回洗浄した。結合した複合体を２００ｍＭイミダゾールを含有するＨ−バッファーで溶出し、ＤＢＰに対するポリクローナルウサギ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いたウエスタンブロットで分析した。
【０１１０】
［実施例８］
可溶性メガリンを用いたビタミンＤの状態を決定するための免疫比濁法アッセイ。Ｎｉ−ＮＴＡ精製可溶性メガリンＭ１又はＭ２タンパク質断片（３μｇ）を、最初にヒト血清又は血漿試料（３０μｌ）と混合する。試料を５０μｌの前平衡化Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂で４℃で一晩インキュベートする。樹脂をＨ−バッファー＋２０ｍＭイミダゾールで３回洗浄する。結合した複合体を２００ｍＭイミダゾール含有Ｈ−バッファーで溶出する。溶出した複合体をビタミンＤ結合タンパク質に対する抗体を水溶液に接触させる。濁度の増加は、標準の濁度計で測定され、既知の２５−ヒドロキシビタミンＤ３濃度の標準値と比較される。
【０１１１】
あるいは、ナノ粒子、例えば、ラテックスナノ粒子（約１５０ｎｍ）、メガリンＭ１又はＭ２断片でコーティングされ、血清又は血漿試料とインキュベートされる。次に濁度の増加を測定し、既知の２５−ヒドロキシビタミンＤ３濃度の標準値と比較する。
【０１１２】
［実施例９］
直線性の範囲を決定するためのＥＬＩＳＡ結合アッセイ。マイクロタイタープレートに、精製メガリンＭ１又はＭ２タンパク質断片（ＰＢＳ１Ｘで希釈した１μｇ／１００μｌ）を２時間、室温でインキュベートすることによりコーティングした。ＤＢＰと２５−ヒドロキシビタミンＤ３（ＶＤ３）、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（ＶＤ２）又は２４，２５−ヒドロキシビタミンＤ（２４，２５ＶＤ）の混合物を、２０μｇのＤＢＰ及び１００μｌのＰＢＳ中の連続希釈ＶＤ（０、０．７８、１．５６、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０ｎｇ）と混合することによって調製した。混合物を３７℃で１時間インキュベートした。プレートブロッキング後、上記調製したＤＢＰ−ＶＤ混合物をメガリンコートウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを１００μｌ希釈したウサギ抗ＤＢＰ抗体（ブロッキングバッファーで希釈した１：１０００）で２時間、室温でインキュベートし、次いで、１００μｌのＨＲＰ共役ロバ抗ウサギ抗体（ブロッキングバッファーで希釈した１：５００）で３７℃で１時間インキュベートした。基質反応後、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。アッセイは５０ｎｇ／ｍｌまで直線的であった。感度限界は２．０ｎｇ／ｍｌとした。
【０１１３】
［実施例１０］
マイクロスケール熱泳動アッセイ。精製ＤＢＰ（Ｍｅｒｃｋ，３４５８０２）をＭｏｎｏｌｉｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｒｅｄ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｕｎｉｃｈ，ＤＥ）を用いて赤色蛍光色素ＮＴ−６４７で標識した。Ｎｉ−ＮＴＡ精製メガリン断片（Ｍ１、Ｍ２）を０．４８８〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲で滴定した。精製ＤＢＰ（Ｍｅｒｃｋ，３４５８０２）を、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｒｅｄを用いて赤色蛍光色素ＮＴ−６４７で標識した。２５−ヒドロキシビタミンＤ３（ＶＤ３）を０．０４８８〜１００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度で滴定した。２５−ヒドロキシビタミンＤ２（ＶＤ２）、２４，２５−ヒドロキシビタミンＤ（２４，２５ＶＤ）及び３ｅｐｉ２５（ＯＨ）ＶＤ３を０．０１６３〜３７ｎｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度で滴定した。５０ｎＭのＮＴ−６４７標識ＤＢＰにＶＤ３、ＶＤ２、２４，２５ＶＤをそれぞれ３７．８ｎＭ添加した。測定には、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５デバイス（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。解析には、ＮＴ解析ソフトウェアバージョン１．４２７（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。変数：レーザーパワー、１００％；ＬＥＤ、８０；レーザーのオンタイム、３０秒；レーザーのオフタイム、５秒；温度、２５℃。ＦＮｏｒｍ：正規化蛍光；Ｋｄ：解離定数。
【０１１４】
ビタミンＤ代謝物のＤＢＰに対する解離定数Ｋｄから、結合親和性の順位は以下のようになった。３ｅｐｉ２５（ＯＨ）２ＶＤ３＞２５（ＯＨ）２ＶＤ３≧２５（ＯＨ）２ＶＤ２＞２４，２５（ＯＨ）２ＶＤ３＞１，２５（ＯＨ）２ＶＤ３。ＤＢＰ−ＶＤ２の結合親和性はＤＢＰ−ＶＤ３のＫｄに匹敵する。２４，２５（ＯＨ）ＶＤのＤＢＰへの結合はわずかに低い。２５（ＯＨ）Ｄ３の３Ｃエピマーの高い結合親和性は驚くべきものであり、したがって、このエピマーは、他の理由のために有毒でない場合、食品サプリメントとして特に有用であると思われるので、さらなる調査を必要とするであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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