(57)【要約】  本願は、転写因子の異所性発現に依存することなく、内因性遺伝子座を標的とし、再構築することにより、成体の体細胞を人工多能性幹細胞に再プログラミングするための方法および組成物に関する。【選択図】図１−１
2021509577.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する方法であって、
（ａ）非ｉＰＳＣにおいて、少なくとも１つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用して、少なくとも１つの内因性遺伝子座を標的にすることと、
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ活性化系および前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡを使用して、前記非ｉＰＳＣ中の前記内因性遺伝子座を再構築すること、を含み、
これにより、ｉＰＳＣを生成する、方法。
【請求項２】
（ａ）前記少なくとも１つの内因性遺伝子座は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎｒ５ａ２、Ｇｌｉｓ１、Ｃｅｂｐａ、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、またはそれらの任意の組み合わせであり、
（ｂ）前記少なくとも１つの内因性遺伝子座は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、およびＮａｎｏｇの組み合わせを含み、
（ｃ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡは、Ｏｃｔ４プロモーター、Ｏｃｔ４エンハンサー、Ｓｏｘ２プロモーター、Ｋｌｆ４プロモーター、ｃ−Ｍｙｃプロモーター、Ｌｉｎ２８プロモーター、Ｎａｎｏｇプロモーター、ＥＥＡモチーフ、またはそれらの組み合わせを標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）前記内因性遺伝子座はＯｃｔ４であり
（ｂ）前記内因性遺伝子座はＳｏｘ２であり、
（ｃ）Ｏｃｔ４プロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号１〜６、５７、および５８から選択され、
（ｄ）Ｏｃｔ４エンハンサーを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号７〜１１から選択され、
（ｅ）Ｓｏｘ２プロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号１２〜２１および５９から選択され、
（ｆ）Ｋｌｆ４プロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号２２〜３１、および６０から選択され、
（ｇ）ｃ−Ｍｙｃプロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号３２〜４１および６１から選択され、
（ｈ）Ｎｒ５ａ２遺伝子を標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号４２〜４５から選択され、
（ｉ）Ｇｌｉｓ１遺伝子を標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号４６〜５０から選択され、
（ｊ）Ｃｅｂｐａ遺伝子を標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号５１〜５６から選択され、
（ｋ）Ｌｉｎ２８プロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号６２を含み、
（ｌ）Ｎａｎｏｇプロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号６３を含み、および／または
（ｍ）ＥＥＡモチーフを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号６４を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、
（ａ）少なくとも１つの転写活性化因子と融合した、不活性化ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼと、任意選択で、
（ｂ）不活性化ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼを前記少なくとも１つの転写活性化因子に連結するペプチドのタンデムアレイと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含み、
（ｂ）ペプチドの前記タンデムアレイはＳｕｎＴａｇアレイであり、
（ｃ）前記少なくとも１つの転写活性化因子は、単純ヘルペスＶＰ１６、ＶＰ１６の四量体（ＶＰ６４）、またはｐ６５を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非ｉＰＳＣは、
（ａ）線維芽細胞、皮膚細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、または腎上皮細胞、
（ｂ）哺乳動物細胞、および／または
（ｃ）ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｃ）工程（ｂ）の前記細胞を、ＴＧＦβＲ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子と接触させることと、任意選択で、
（ｄ）前記生成されたｉＰＳＣを、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含むがＴＧＦβＲ阻害剤を含まない小分子と接触させることと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記内因性遺伝子座の前記再構築は、前記再構築なしの場合と比較して、１００倍以上のレベルの遺伝子発現をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ｉＰＳＣを生成する方法であって、
（ａ）非ｉＰＳＣにおいて、Ｓｏｘ２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ、Ｏｃｔ４プロモーターを標的とするｓｇＲＮＡ、および任意選択でＯｃｔ４エンハンサーを標的とするｓｇＲＮＡまたはＥＥＡモチーフを標的とするｓｇＲＮＡのうちの少なくとも１つを使用して、少なくとも１つの内因性遺伝子座を標的とすることと、
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ活性化系と、Ｓｏｘ２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ、Ｏｃｔ４プロモーターを標的とするｓｇＲＮＡ、および任意選択でＯｃｔ４エンハンサーを標的とするｓｇＲＮＡまたはＥＥＡモチーフを標的とするｓｇＲＮＡのうちの前記少なくとも１つを使用して、前記内因性遺伝子座を再構築することと、を含み、
これにより、ｉＰＳＣが生成される、方法。
【請求項１０】
ＣＲＩＳＰＲ活性化系の組成物であって、
（ａ）ｄＣａｓ９と、
（ｂ）前記ｄＣａｓ９に融合されたＳｕｎＴａｇアレイと、
（ｃ）前記ＳｕｎＴａｇアレイと結合したｐ３００の少なくとも１つのアセチルトランスフェラーゼ活性ドメイン（ｐ３００コア）と、を含む、組成物。
【請求項１１】
ｉＰＳＣを生成する方法であって、
（ａ）非ｉＰＳＣにおいて、少なくとも１つのｓｇＲＮＡを使用して、少なくとも１つの内因性遺伝子座を標的とすることと、
（ｂ）請求項１０に記載のＣＲＩＳＰＲ活性化系および前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡを使用して、前記非ｉＰＳＣ中の前記内因性遺伝子座を再構築し、ｉＰＳＣを生成することと、を含む、方法。
【請求項１２】
（ａ）前記少なくとも１つの内因性遺伝子座は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｎｒ５ａ２、Ｇｌｉｓ１、Ｃｅｂｐａ、またはそれらの任意の組み合わせであり、
（ｂ）前記内因性遺伝子座はＯｃｔ４であり、
（ｃ）前記内因性遺伝子座はＳｏｘ２であり、
（ｄ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡはＯｃｔ４プロモーター、Ｓｏｘ２プロモーター、またはそれらの組み合わせを標的とし、
（ｅ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡはＯｃｔ４プロモーターを標的とし、配列番号１〜６、５７、および５８から選択され、
（ｆ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡはＯｃｔ４エンハンサーを標的とし、配列番号７〜１１から選択され、
（ｇ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡは、Ｓｏｘ２プロモーターを標的とし、配列番号１２〜２１、および５９から選択され、
（ｈ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡはＫｌｆ４プロモーターを標的とし、任意選択で配列番号２２〜３１および６０から選択され、
（ｉ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡはｃ−Ｍｙｃプロモーターを標的とし、任意選択で配列番号３２〜４１、および６１から選択され、
（ｊ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡはＮｒ５ａ２遺伝子を標的とし、任意選択で配列番号４２〜４５から選択され、
（ｋ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡはＧｌｉｓ１遺伝子を標的とし、任意選択で配列番号４６〜５０から選択され、
（ｌ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡはＣｅｂｐａ遺伝子を標的とし、任意選択で配列番号５１〜５６から選択され、
（ｍ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡはＬｉｎ２８プロモーターを標的とし、任意選択で配列番号６２を含み、
（ｎ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡはＮａｎｏｇプロモーターを標的とし、任意選択で配列番号６３を含み、
（ｏ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡはＥＥＡモチーフを標的とし、任意選択で配列番号６４を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）前記非ｉＰＳＣは、線維芽細胞、皮膚細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、または腎上皮細胞であり、
（ｂ）前記非ｉＰＳＣは、哺乳動物細胞であり、および／または
（ｃ）前記非ｉＰＳＣは、ヒト細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ｉＰＳＣを生成する方法であって、
（ａ）非ｉＰＳＣにおいて、Ｏｃｔ４プロモーターを標的とするｓｇＲＮＡ、またはＯｃｔ４エンハンサーを標的とするｓｇＲＮＡのうちの少なくとも１つを使用して、少なくとも１つの内因性遺伝子座を標的とすることと、
（ｂ）請求項２３に記載のＣＲＩＳＰＲ活性化系およびＯｃｔ４プロモーターを標的とするｓｇＲＮＡまたはＯｃｔ４エンハンサーを標的とするｓｇＲＮＡのうちの前記少なくとも１つを使用して前記内因性遺伝子座を再構築し、ｉＰＳＣを生成することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１７年１２月２８日に提出された米国仮出願第６２／６１１，２０２号の優先権を主張し、その開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
特定の転写因子の調節を通じて成体の体細胞を多能性幹細胞に再プログラムする能力は、基本的な生物学的研究にとって非常に重要であり、多数の疾患および障害を治療するために、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を身体のいかなる細胞型にも分化させることができる再生医療にも大きな期待を抱かせる。この分野における継続的な課題は、転写因子の異所性発現に依存することなくｉＰＳＣを生成することであった。本開示は、内因性遺伝子座を標的化および再構築することにより、多能性幹細胞を誘導するための新規の方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
多能性幹細胞は、再生医療にかなり有望である。内因性クロマチンの再構築が多能性誘導にどのようにつながるかをよりよく理解することは、非常に重要である。従来、分化した体細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）の異所性発現によって人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラムできる（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，２００６）。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４の過剰発現は、最初にゲノム全体の内因性遺伝子座に結合し、全体的に再構築し（Ｓｏｕｆｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、最終的に多能性制御回路の確立につながる。
【０００４】
しかし、内因性クロマチンへのまさにどの再構築事象が多能性に向けた再プログラミングをトリガーするかが、ほとんどわかっていない。一例として、多数の多能性関連遺伝子座の同時再構築が必要かどうか、または単一遺伝子座のまさにその再構築がｉＰＳＣ誘導に十分であるかどうかが明らかではない。加えて、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４は、再プログラミングに必要な多くの遺伝子の遠位要素を標的とするが（Ｓｏｕｆｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、これらの遠位要素の再構築が多能性誘導にどのように影響するかはよくわかっていない。さらに、エピジェネティックな再構築は細胞再プログラミングの中心的なメカニズムであるが（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、ｉＰＳＣ誘導が任意の規定された内因性遺伝子座のエピジェネティックな操作によって開始できるかどうかは決定されていない。最後に、方法論的限界により、内因性遺伝子座のまさにその再構築によって多能性を誘導できるかどうかの直接的な証拠は存在しない。
【０００５】
最近、細菌由来の、タイプＩＩクラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）とＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）が、哺乳動物細胞における遺伝子編集のための強力なツールとして、再度目的を果たされた（Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｍａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ｂ）。Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のヌクレアーゼ不活性化型は、トランス活性化ドメインと融合したときにプログラム可能な合成転写因子として設計されてきた。この系は、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）系と呼ばれている（Ｃｈａｖｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｔａｎｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｚａｌａｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。この系は、サイレンシングされた染色体遺伝子座を高精度で標的とし、下流の遺伝子転写を促進する先駆的因子として機能できると報告されている（Ｐｏｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。これらの特徴により、ＣＲＩＳＰＲａ系は、ある系統から別の系統特異的細胞への細胞再プログラミングのための内因性クロマチン遺伝子座を正確に再構築するための有利なツールを提供する（Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかし、この系が、すべての系統の細胞に対してあらゆる範囲の分化能を有する人工多能性幹細胞を生成できるかどうか、および／またはこの系をどのように機能させることができるかは不明である。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が体細胞の選択的内因性遺伝子座を標的化することおよび再構築することによって生成できるという本発明の発見に基づいており、そして本開示は、部分的に、非ｉＰＳＣにおいて少なくとも１つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用して、少なくとも１つの内因性遺伝子座を標的にすることと、ならびに、ｉＰＳＣを生成するために、ＣＲＩＳＰＲ活性化系および少なくとも１つのｓｇＲＮＡを使用して、非ｉＰＳＣ中の選択的内因性遺伝子座を再構築することを含む、ｉＰＳＣを生成する方法に向けられている。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを生成する上記の方法は、再プログラミングを受けている非ｉＰＳＣ細胞を、ＴＧＦβＲ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子と接触させることをさらに含み、および任意で、生成されたｉＰＳＣを、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含むがＴＧＦβＲ阻害剤を含まない小分子と接触させることをさらに含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、少なくとも１つの転写活性化因子と融合したヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、ｄＣａｓ９を少なくとも１つの転写活性化因子に連結するペプチドのタンデムアレイをさらに含む。一実施形態では、ペプチドのタンデムアレイはＳｕｎＴａｇアレイである。一実施形態では、少なくとも１つの転写活性化因子は、単純ヘルペスＶＰ１６転写活性化因子ドメイン（ＶＰ６４）の四量体である。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４である。
【０００８】
他の態様では、本開示は、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９に融合されたＳｕｎＴａｇアレイ、およびＳｕｎＴａｇアレイと結合したｐ３００の少なくとも１つのアセチルトランスフェラーゼ活性ドメイン（ｐ３００コア）を含むＣＲＩＳＰＲ活性化系を提供する。
【０００９】
他の態様では、本開示は、ｄＣａｓ９、ＳｕｎＴａｇアレイ、およびｐ３００コアを含むＣＲＩＳＰＲ活性化系を使用してｉＰＳＣを生成する方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子座は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｎｒ５ａ２、Ｇｌｉｓ１、Ｃｅｂｐａ、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、単一の内因性遺伝子座が標的化され、再構築される。いくつかの実施形態では、単一の内因性遺伝子座は、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡを標的とするＯｃｔ４プロモーター、ｓｇＲＮＡを標的とするＯｃｔ４エンハンサー、ｓｇＲＮＡを標的とするＳｏｘ２プロモーター、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＯｃｔ４プロモーターは、配列番号１〜６、５７、および５８から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＯｃｔ４エンハンサーは、配列番号７〜１１から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＳｏｘ２遺伝子は、配列番号１２〜２１および５９から選択される。
【００１３】
一実施形態では、少なくとも１つのｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡを標的とするＫｌｆ４遺伝子である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＫｌｆ４遺伝子は、配列番号２２〜３１および６０から選択される。一実施形態では、少なくとも１つのｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡを標的とするｃ−Ｍｙｃ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするｃ−Ｍｙｃ遺伝子は、配列番号３２〜４１および６１から選択される。一実施形態では、少なくとも１つのｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡを標的とするＮｒ５ａ２遺伝子である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＮｒ５ａ２遺伝子は、配列番号４２〜４５から選択される。一実施形態では、少なくとも１つのｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡを標的とするＧｌｉｓ１遺伝子である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＧｌｉｓ１遺伝子は、配列番号４６〜５０から選択される。一実施形態では、少なくとも１つのｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡを標的とするＣｅｂｐａ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＣｅｂｐａ遺伝子は、配列番号５１〜５６から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡはＬｉｎ２８プロモーターを標的とする。いくつかの実施形態では、Ｌｉｎ２８を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号６２を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡはＮａｎｏｇプロモーターを標的とする。いくつかの実施形態では、Ｎａｎｏｇを標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号６３を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡはＥＥＡモチーフを標的とする。いくつかの実施形態では、ＥＥＡモチーフを標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号６４を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、非ｉＰＳＣは、体細胞、例えば、線維芽細胞、皮膚細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、または腎上皮細胞である。いくつかの実施形態では、非ｉＰＳＣは哺乳動物細胞である。他の実施形態では、非ｉＰＳＣはヒト細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】遺伝子活性化によるマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）における多能性ネットワークの確立を示す。（Ａ）遺伝子活性化におけるｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４複合体を示すスキーム。（Ｂ）ＯＧ２  ＭＥＦの再プログラミング手順を示すスキーム。（Ｃ）ＯＧ２  ＭＥＦは、ＥＧＦＰ陽性コロニーを形成するように再プログラムされた。０日目のＭＥＦの形態と、７日目と１５日目の再プログラムされたコロニーを示した（スケールバー、２００μｍ）。（Ｄ）１２日間にわたる内因性Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２転写。データは平均±ＳＤを表す（ｎ＝４）。ｐ値は、ダネット検定を使用した一元配置分散分析によって決定された。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｅ）インサイチュおよび継代１および２０でＥＧＦＰシグナルを示すコロニー（スケールバー、２００μｍ）。（Ｆ）ＥＧＦＰ陽性コロニーにおけるＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ−１染色（スケールバー、２００μｍ）。（Ｇ）確立されたＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣおよびＲ１マウス胚性幹（Ｒ１  ＥＳ）細胞における多能性遺伝子発現。
【図１−２】同上。
【図２−１】Ｓｏｘ２遺伝子の活性化がＭＥＦにおいてｉＰＳＣを生成するのに十分であることを示す。（Ａ）転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００、メディエーター複合体、およびヒストンＨ３Ｋ２７ａｃの分布（Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）の結合ピークとともに、Ｓｏｘ２プロモーターのｓｇＲＮＡ標的化部位を示すスキーム。（Ｂ）４日目の免疫蛍光染色によるＳｏｘ２タンパク質の検出（スケールバー：１００μｍ）。（Ｃ）指定されたｓｇＲＮＡの存在下でのＳｏｘ２の活性化。Ｏ−７１およびＯ−１２７はＯｃｔ４プロモーターを標的とし、Ｓ−８４、Ｓ−１３６、およびＳ−１４８はＳｏｘ２プロモーターを標的とする。データは平均±ＳＤを表す（ｎ＝４）。ｐ値は、対応のないｔ検定によって決定された。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）ｓｇＲＮＡ  Ｏ−７１、Ｏ−１２７、Ｓ−８４、Ｓ−１３６、またはＳ−１４８を使用して、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２プロモーターを標的として生成されたコロニーの数。３つの独立した実験が示される。（Ｅ）Ｓ−８４でＳｏｘ２遺伝子を活性化することによる、インサイチュでのＥＧＦＰ陽性コロニーおよびｉＰＳＣ系統の生成（スケールバー、２００μｍ）。（Ｆ）Ｓ−８４を用いて生成されたＥＧＦＰ陽性コロニーにおけるＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＳＳＥＡ−１染色（スケールバー、２００μｍ）。（Ｇ）Ｓ−１７細胞系統およびＲ１  ＥＳ細胞における多能性遺伝子発現の比較。（Ｈ）Ｓ−１７系統の雄核型。（Ｉ）−（Ｋ）多能性Ｓ−１７系のインビボでの特性。キメラマウスはＳ−１７細胞（Ｊ）を用いて生成され、これらの細胞は強いＥＧＦＰシグナル（Ｉ）によって表される性腺組織に寄与し、生殖系列伝達（Ｋ）に適していた。
【図２−２】同上。
【図３−１】Ｓｏｘ２プロモーターの再構築がＳ−１７  ＭＥＦの多能性に向けた再プログラミングをトリガーすることを実証する。（Ａ）Ｓ−１７  ＭＥＦの生成を示すスキーム。（Ｂ）Ｓ−１７  ＭＥＦにおけるドキシサイクリンの有無による１２日間わたるＳｏｘ２活性化。（Ｃ）０、４、８、および１２日目のＳｏｘ２プロモーターでのヒストンＨ３Ｋ２７アセチル化レベル。（Ｄ）ドキシサイクリンの存在下での免疫蛍光染色によるＳｏｘ２発現の検出（スケールバー：１００μｍ）。（Ｅ）Ｓ−１７  ＭＥＦは、ＥＧＦＰ陽性コロニーを形成するように再プログラムされ、ｉＰＳＣ系統が確立された（スケールバー：２００μｍ）。（Ｆ）レンチウイルスのＳｕｎＴａｇ再プログラミングおよびＳ−１７  ＭＥＦ再プログラミングの効率の比較。（Ｇ）Ｓ−１７  ＭＥＦ再プログラミングにおけるＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＲｅｘ１の１２日間にわたる遺伝子発現。（Ｈ）０、４、８、および１２日目のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＲｅｘ１プロモーターにおけるヒストンＨ３Ｋ２７アセチル化レベル。（Ｉ）０、４、８、および１２日目のＯｃｔ４エンハンサーにおけるヒストンＨ３Ｋ２７アセチル化レベル。（Ｊ）Ｓ−１７  ＭＥＦ再プログラミングにおけるＳｏｘ２依存性。４つの異なる濃度（０、０．０１、０．１、および１μｇ／ｍｌ）のドキシサイクリンが使用され、Ｓｏｘ２の活性化（左）および再プログラミング効率（右）が示される。（Ｋ）Ｓ−１７  ＭＥＦ再プログラミングにおけるＯｃｔ４およびＳｏｘ２再構築の相乗効果。Ｏｃｔ４遺伝子活性化（左）および再プログラミング効率（右）を調べた。（Ｌ）多能性遺伝子が過剰発現された（ＯＥ）４日目および１２日目の合計（左）および内因性Ｓｏｘ２（右）発現。Ｏｃｔ４のみ、Ｓｏｘ２のみ、ＯＳＫ（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４）の３つの条件がテストされ、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈ）の過剰発現が対照として使用された。（Ｍ）Ｓ−１７  ＭＥＦの再プログラミング効率と多能性遺伝子の過剰発現の比較。（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、および（Ｋ）のデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）を表す。（Ｂ）のｐ値は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定による二元配置分散分析によって決定され、（Ｃ）、（Ｇ）、（Ｈ）、および（Ｉ）のｐ値は、ダネット検定を使用する一元配置分散分析によって決定され、ｐ値（Ｋ）は対応のないｔ検定によって決定された。＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図４−１】Ｏｃｔ４プロモーターおよびエンハンサーの同時再構築を実証し、ＭＥＦをｉＰＳＣに再プログラミングする。（Ａ）転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００、メディエーター複合体、ならびにヒストンＨ３Ｋ２７ａｃの分布の結合ピークおよびＤＮａｓｅ過敏性部位（ＤＨＳ）とともに、Ｏｃｔ４プロモーターおよびエンハンサーのｓｇＲＮＡ標的化部位を示すスキーム（Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。（Ｂ）４日目のＯｃｔ４エンハンサーおよびプロモーターにおけるヒストンＨ３Ｋ２７アセチル化レベル。転写開始部位の上流２．７ｋｂ、１．４ｋｂ、および０．２ｋｂの３つの異なる部位を調べた。（Ｃ）１６日間にわたるＯ−１２７、Ｏ−２０６６、またはＯ−１２７−２０６６  ｓｇＲＮＡの存在下での内因性Ｏｃｔ４転写。（Ｄ）Ｏｃｔ４プロモーター（Ｏ−１２７）、エンハンサー（Ｏ−２１３５、Ｏ−２０６６、Ｏ−１９６５）、またはプロモーターおよびエンハンサーの同時（Ｏ−１２７−２１３５、Ｏ−１２７−２０６６、Ｏ−１２７−１９６５）の再構築から生成されたコロニーの数。４つの独立した実験が示される。実験３のＯ−１２７−２１３５培養および実験４のＯ−１２７−２０６６／１９６５ではコロニーは観察されなかった。（Ｅ）Ｏｃｔ４プロモーターおよびエンハンサー（Ｏ−１２７−２０６６）の同時再構築からのインサイチュおよびＰ０  ｉＰＳＣでのＥＧＦＰ陽性コロニーの形態（スケールバー、２００μｍ）。（Ｆ）Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ陽性コロニーにおけるＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＲｅｘ１の発現（スケールバー、２００μｍ）。（Ｇ）Ｄ−９細胞系統およびＲ１  ＥＳ細胞における多能性遺伝子発現の比較。（Ｈ）Ｄ−９系統の核型分析。（Ｉ）−（Ｋ）多能性Ｄ−９系統のインビボでの特性。キメラマウスはＤ−９細胞（Ｊ）を用いて生成され、これらの細胞は強いＥＧＦＰシグナル（Ｉ）によって表される生殖腺組織に寄与し、生殖系列伝達（Ｋ）に適していた。（Ｂ）および（Ｃ）のデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）を表す。ｐ値は、対応のないｔ検定によって決定された。＊＊ｐ＜０．０１。
【図４−２】同上。
【図５−１】マウスＥＳ細胞およびＭＥＦの分化におけるＳｕｎＴａｇ系による遺伝子活性化を示す。（Ａ）、（Ｂ）転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００、メディエーター複合体、およびヒストンＨ３Ｋ２７ａｃの分布の結合ピークとともに、Ｏｃｔ４プロモーターおよびエンハンサー（Ａ）ならびにＳｏｘ２プロモーター（Ｂ）のｓｇＲＮＡ標的化部位を示すスキーム（Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。（Ｃ）Ｓｏｘ２転写開始部位の上流５００ｂｐおよび下流１００ｂｐのゲノムＤＮＡ配列（配列番号１７５）。ｓｇＲＮＡ（青）および転写因子（陰影）の結合部位が強調表示される。（Ｄ）、（Ｅ）マウスＥＳ細胞の分化においてｓｇＲＮＡを使用する、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎｒ５ａ２、Ｇｌｉｓ１、およびＣｅｂｐａの転写活性化。実験手順（Ｄ）および各ｓｇＲＮＡを使用する倍数転写活性化（Ｅ）を示す略図を示す。Ｇａｌ４  ｓｇＲＮＡを陰性対照として使用した。（Ｆ）、（Ｇ）ＭＥＦにおいてｓｇＲＮＡを使用するＯｃｔ４およびＳｏｘ２の転写活性化。実験手順（Ｆ）および選択したｓｇＲＮＡ（Ｇ）を使用する倍数転写活性化を示す。Ｇａｌ４  ｓｇＲＮＡを陰性対照として使用した。Ｏｃｔ４プロモーター（Ｏｃｔ４  Ｐｒｏ）を標的とするｓｇＲＮＡにはＯ−７１とＯ−１２７が含まれ、Ｏｃｔ４エンハンサー（Ｏｃｔ４  Ｅｎｈ）を標的とするｓｇＲＮＡにはＯ−１９６５、Ｏ−２０６６、Ｏ−２１３５が含まれる。ｓｇＲＮＡを標的とするＳｏｘ２プロモーター（Ｓｏｘ２  Ｐｒｏ）には、Ｓ−８４、Ｓ−１３６、およびＳ−１４８が含まれる。（Ｈ）パルナート、Ｃｈｉｒ９９０２１、Ａ８３−０１、およびフォルスコリン（ＰＣＡＦ）の小分子の組み合わせを用いるＯｃｔ４およびＳｏｘ２の活性化。（Ｅ）、（Ｇ）、および（Ｈ）のデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）を表す。（Ｅ）および（Ｇ）のｐ値は、ダネット検定を用いる一元配置分散分析によって決定され、（Ｈ）のｐ値は、対応のないｔ検定によって決定された。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意ではない。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図６−１】Ｓｏｘ２遺伝子の活性化がＭＥＦにおいてｉＰＳＣを生成するのに十分であることを示す。（Ａ）示された遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡがｓｇＲＮＡプールから取り出されたときのＥＧＦＰ陽性コロニーの数。（Ｂ）３日目のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＧｌｉｓ１の１つのｓｇＲＮＡおよび複数のｓｇＲＮＡを使用する活性化の比較。（Ｃ）３日目にＯ−１２７、Ｓ−８４、Ｇ−２１５、またはすべて（ＯＳＧ）を使用するＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＧｌｉｓ１の転写活性化。（Ｄ）ＥＧＦＰ陽性コロニーのインサイチュおよびＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｇｌｉｓ１プロモーターを一緒に標的化したＰ０  ｉＰＳＣの形態（スケールバー、２００μｍ）。（Ｅ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＧｌｉｓ１プロモーターを一緒に標的化することからのＥＧＦＰ陽性コロニーのＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＳＳＥＡ−１染色（スケールバー：２００μｍ）。（Ｆ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＧｌｉｓ１プロモーターの標的化から生成されたＥＧＦＰ陽性コロニーの数。３つの独立した実験が示される。（Ｇ）Ｓ−８４  ｓｇＲＮＡのオフターゲット効果の検査。上位１０の予測された標的の転写を調べた。（Ｂ）および（Ｃ）のデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）を表す。ｐ値は、対応のないｔ検定によって決定された。＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意ではない。
【図６−２】同上。
【図７−１】Ｓｏｘ２プロモーターの再構築がＭＥＦの多能性に向けた再プログラミングをトリガーすることを実証する。（Ａ）ＯＧ２および１２９ＭＥＦにおけるＳｏｘ２活性化とＳ−８４との比較。データは平均±ＳＤを表す（ｎ＝４）。ｐ値は、対応のないｔ検定によって決定された。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）４日目の１２９ＭＥＦにおけるＳｏｘ２タンパク質の染色（スケールバー：２００μｍ）。（Ｃ）１２９ＭＥＦにおける再プログラミングされたコロニーの生成（スケールバー：２００μｍ）。（Ｄ）１２の確立されたＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣ系統におけるｓｇＲＮＡカセットのコピー数の決定。クローン８は示されているようにＳ−１７系統である。（Ｅ）Ｓ−１７  ＭＥＦにおけるＢＦＰのフローサイトメトリー検査。（Ｆ）Ｓ−１７  ＭＥＦ再プログラミングのためのドキシサイクリンの有無による４日目のＳｏｘ２陽性細胞のパーセンテージ。（Ｇ）Ｓ−１７  ＭＥＦ再プログラミングにおけるＳ−８４  ｓｇＲＮＡのオフターゲット効果の検査。トップ１０の予測された標的の転写は、ｑＰＣＲによって調べられた。（Ｈ）レンチウイルスのＳｕｎＴａｇおよびＳ−１７  ＭＥＦの再プログラミング効率の変動係数（ＣＶ）比較。（Ｉ）ＰＣＡＦカクテルの有無による再プログラミング効率の比較。（Ｊ）多能性遺伝子が過剰発現された（ＯＥ）４日目のＳｏｘ２プロモーターにおけるヒストンＨ３Ｋ２７アセチル化レベル。３つの条件、Ｏｃｔ４のみ、Ｓｏｘ２のみ、ＯＳＫ（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４）がテストされ、およびｍＣｈｅｒｒｙ過剰発現（ｍＣｈ  ＯＥ）が陰性対照として使用された。（Ｋ）ＯＳＫ過剰発現およびＳ−１７  ＭＥＦの再プログラミング効率の変動係数（ＣＶ）比較。（Ｌ）Ｓ−１７  ＴＴＦは再プログラム可能であった。０日目のＳ−１７  ＴＴＦの形態、ならびに、７日目および１４日目の再プログラムされたコロニーが、Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰの活性化とともに示される（スケールバー：２００μｍ）。
【図７−２】同上。
【図８−１】Ｏｃｔ４プロモーターおよびエンハンサーの同時再構築は、ＭＥＦをｉＰＳＣに再プログラミングすることを実証する。（Ａ）Ｓｏｘ２（Ｓ−１４８）およびｃ−Ｍｙｃ（Ｍ−１５４）を標的とする２つのｓｇＲＮＡを導入することによる、分化中のＥＳ細胞におけるデュアルｓｇＲＮＡカセットの機能検証。（Ｂ）再プログラミングの８日目のＯｃｔ４タンパク質染色（スケールバー：２００μｍ）。（Ｃ）Ｏ−１２７（左）およびＯ−２０６６（右）のオフターゲット効果の検査。各ｓｇＲＮＡの上位１０の予測標的の転写をｑＰＣＲで調べた。（Ｄ）多能性遺伝子が過剰発現された（ＯＥ）４日目と１２日目の合計（左）および内因性（右）Ｏｃｔ４の転写。Ｏｃｔ４単体とＯＳＫ（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４）の２つの条件がテストされた。ｍＣｈｅｒｒｙを陰性対照として使用した。（Ｅ）ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ｐ３００コアおよびその機能を表すスキーム。（Ｆ）ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４およびｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ｐ３００コア系についての５日目のＯｃｔ４エンハンサーおよびプロモーターにおけるヒストンＨ３Ｋ２７アセチル化レベル。転写開始部位の上流２．７ｋｂ、１．４ｋｂ、および０．２ｋｂの３つの異なる部位を調べた。（Ｇ）１５日間にわたるｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４またはｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ｐ３００コアを用いるＯｃｔ４の転写活性化。（Ｈ）ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ｐ３００コアを用いてＯｃｔ４プロモーターおよびエンハンサーのアセチル化を操作することによって生成された、インサイチュのＥＧＦＰ陽性コロニーおよびＰ１  ｉＰＳＣ（Ｄ−１６）の形態（スケールバー、２００μｍ）。（Ｉ）Ｄ−１６細胞系統およびＲ１  ＥＳ細胞における多能性遺伝子発現の比較。（Ａ）、（Ｄ）、および（Ｇ）のデータは、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）を表す。（Ａ）および（Ｄ）のｐ値は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定による二元配置分散分析によって決定され、（Ｇ）のｐ値は、対応のないｔ検定によって決定された。＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意ではない。
【図８−２】同上。
【図９】ＣＲＩＳＰＲａが多能性形態を採用し、維持するヒトｉＰＳＣコロニーを生成したことを実証する。上のパネルは、ＥＥＡなしで生成されたｈｉＰＳＣと比較して、ＥＥＡがｉＰＳＣ生成に含まれている場合、ｈｉＰＳＣの形態的痕跡がより堅牢であることを示す（２８日目の下のパネル）。
【図１０】は、ＣＲＩＳＰＲａが生成したヒトｉＰＳＣコロニーにおける多能性遺伝子の発現を実証する。Ａ：ＥＥＡなし、およびＭＯＩ＝１．２で生成された２８日目のｈｉＰＳＣ。ならびにＢ：ＥＥＡおよびＭＯＩ＝１．２で生成された２８日目のｈｉＰＳＣ。Ｃ：ＥＥＡ、およびＭＯＩ＝６で生成された２１日目のｈｉＰＳＣ。
【図１１】Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１を含む標的または非標的内因性遺伝子の両方の発現の増加によって示される、内因性多能性プログラムが再プログラムされた集団で経時的に活性化されることを実証する。
【図１２】フローサイトメトリーによって示されるように、多能性遺伝子ＴＲＡ−１−８１の発現が再プログラムされた集団内で経時的に増加することを実証する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
この開示は、ＣＲＩＳＰＲ活性化系を用いて内因性遺伝子座を標的化および再構築することによる人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成に関する。
【００１７】
本開示は、記載された特定の実施形態に限定されず、したがって、変化し得ることが理解されるべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【００１８】
本開示の詳細な説明は、読者の便宜のためにのみ様々なセクションに分割されており、任意のセクションにある開示は、別のセクションのそれと組み合わせることができる。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本開示の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料がここで記載される。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用されることに関連する方法および／または材料を開示および説明するために、参照により組み込まれる。
【００１９】
Ｉ．定義
この開示の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「それ（ｔｈｅ）」などの用語は、単一の実体のみを指すことを意図したものではなく、特定の例を説明に使用できる一般的なクラスを含む。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「生成する」という用語は、染色体構造、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）のヌクレオチド配列、ポリペプチド（例えば、タンパク質）のアミノ酸配列、遺伝子の転写レベル、染色体領域のエピジェネティックな修飾、タンパク質の転写レベル、およびＲＮＡの転写レベルを変更することを含むがこれに限定されない任意の操作による、その天然に存在する状態からの生物学的組成物（例えば、細胞）の生成および／または変更を指す。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「再プログラミング」または「脱分化」または「細胞能力の増加」または「発生能力の増加」という用語は、細胞の能力を増加させるか、または細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、細胞能力が増加した細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より多くの発生可塑性を有する（すなわち、より多くの細胞型に分化することができる）。言い換えると、再プログラミングされた細胞は、再プログラミングされていない状態の同じ細胞よりも分化が進んでいない状態の細胞である。
【００２２】
「多能性がある」または「多能性」という用語は、細胞が自己再生し、体内の複数の組織またはすべての系列細胞型に分化する能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、内胚葉のそれぞれから細胞を形成できる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生じさせることができない不完全なまたは部分的な多能性細胞（例えば、エピブラスト幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生物（例えば、胚性幹細胞）を生じさせることができるより原始的でより多能性の細胞までの範囲に及ぶ一連の発生能である。
【００２３】
多能性は、細胞の多能性特性を評価することにより、部分的に決定することができる。多能性の特徴には、以下が含まれるが、これらに限定されない（ｉ）多能性幹細胞の形態。（ｉｉ）無制限の自己更新の可能性。（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１−６０／８１、ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０および／またはＣＤ５０などの多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３つすべての体細胞系統（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化する能力、（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫の形成、および（ｖｉ）３つの体細胞系列の細胞からなる胚様体の形成。
【００２４】
これまでに２つのタイプの多能性が説明されており、後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似した「プライミング」または「準安定」状態の多能性と、多能性初期／着床前の胚盤胞の内部細胞塊に類似した「ナイーブ」または「基底」状態である。両方の多能性状態は上記のような特性を示すが、ナイーブまたは基底状態はさらに、（ｉ）雌性細胞におけるＸ染色体の前不活性化または再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性と生存率の向上、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な減少、（ｉｖ）発生調節遺伝子プロモーター上のＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の減少、（ｖ）プライミング状態の多能性細胞と比較した分化マーカーの発現の低下を示す。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、得られる多能性細胞からサイレンシングされるかまたは除去されるかのいずれかである細胞再プログラミングの標準的な方法論は、一般に、多能性の準備状態の特徴を有するようである。標準的な多能性細胞培養条件下で、そのような細胞は、外因性導入遺伝子発現が維持されない限り、準備状態に留まり、基底状態の特徴が観察される。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「人工多能性幹細胞」またはｉＰＳＣとは、幹細胞が、誘導または変更された、分化した成体、新生児、または胎児の細胞から生成されること、すなわち分化状態がより少なく、多能性の特性を示し、特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成などの多能性の特徴を示し、３つすべての胚葉、内胚葉（例えば、胃の内壁、消化管、肺）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（例えば、表皮組織および神経系）、または真皮層の組織に分化することができる細胞に、人工的に再プログラミングされることを意味する。生成されたｉＰＳＣは、天然に存在する細胞を指していない。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、核対細胞質の比率が高く、核小体が顕著に存在し、典型的な細胞間間隔がある、形状が丸くて小さいことを特徴としている。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「非ｉＰＳＣ」という用語は、分化したかまたは部分的に分化した状態の任意の細胞を指し、胚性幹細胞（ＥＳＣ）またはｉＰＳＣではない。非ｉＰＳＣは、内臓、皮膚、骨、血液、神経組織、結合組織を含む、身体の任意の非生殖系列組織に由来する可能性がある。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」は、外来核酸に対する防御のための細菌に由来する系を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、幅広い真正細菌および古細菌生物に見られ、タイプＩ、ＩＩ、およびＩＩＩのサブタイプが含まれる。ＣＲＩＳＰＲ関連のヌクレアーゼは、ｃａｓ、ｃｐｆ、ｃｓｅ、ｃｓｙ、ｃｓｎ、ｃｓｄ、ｃｓｔ、ｃｓｈ、ｃｓａ、ｃｓｍ、およびｃｍｒを含むファミリーに由来する。野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＲＮＡを介したヌクレアーゼをＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と複合して利用し、ならびに、時にはｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をトランス活性化して、外来核酸を認識および切断する。例えば、Ｃａｓ９の場合、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要なときには、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９と組み合わせると相補的にｓｇＲＮＡ内のガイド配列と標的ＤＮＡ配列間の塩基対を通じてＤＮＡ標的を発見および切断するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子に組み込むことができる。本明細書で使用する場合、「ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９」または「ｄＣａｓ９」という用語は、その触媒性ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインの残基を変異させることによりヌクレアーゼ活性が無効にされた修飾Ｃａｓ９ヌクレアーゼを指す。触媒ドメインを無効にすると、Ｃａｓ９をＲＮＡプログラム可能なヌクレアーゼからＲＮＡプログラム可能なＤＮＡ認識複合体に変換し、エフェクターまたはマーカーを特定の標的ＤＮＡ配列に送達できる。同様の操作は、他のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼにも適用できる。本明細書で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ活性化系」または「ＣＲＩＳＰＲａ」という用語は、遺伝子転写をアップレギュレートするように修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を指し、ここでは、不活性化されたＣａｓヌクレアーゼは、単純ヘルペスＶＰ１６転写活性化ドメイン、ＶＰ６４活性化因子（ＶＰ１６の人工四量体）、ｐ６５の活性化ドメイン、複数の転写活性化因子の相乗的組み合わせ、転写活性化因子の複数のコピーをリクルートする足場ペプチド、またはヒストンアセチルトランスフェラーゼなどの転写活性化因子と融合している。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「シングルガイドポリヌクレオチド」または「ｓｇＰＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と組み合わせて使用されるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡ混合配列を指す。「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と組み合わせて使用されるＲＮＡ配列を指す。ｓｇＰＮＡには、Ｃａｓ９を含むＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼの結合部位、および所望の標的ＤＮＡ配列に相補的なガイド配列が含まれている。ｓｇＰＮＡと標的ＤＮＡ配列の塩基対は、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼをＤＮＡ配列に動員させる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「標的とする」は、遺伝子、プロモーター、エンハンサー、オープンリーディングフレーム、またはその他の染色体領域を含むがこれらに限定されない染色体遺伝子座における任意の組成および／または長さの核酸配列（すなわち、標的）を同定するプロセスを指す。次に、事前に特定された核酸配列に相補的なガイド配列を含むｓｇＲＮＡが設計され、合成される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ活性化系を、事前に同定された核酸配列へのｓｇＲＮＡの相補的塩基対形成に基づいて、事前に同定された核酸配列を有する内因性遺伝子座の近傍に向ける。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「再構築する」または「再構築」という用語は、転写レベルでの遺伝子の発現の任意の改変を指す。例示的な遺伝子再構築には、遺伝子のクロマチン構造の変更、遺伝子のプロモーターへの転写活性化因子の補充、遺伝子のエンハンサーへの転写活性化因子の補充、および特定の酵（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ）による遺伝子のヒストン修飾の変更が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
ＩＩ．細胞
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ活性化を通じて内因性遺伝子座で多能性関連遺伝子を単独または組み合わせて活性化することにより、非ｉＰＳＣ、例えば体細胞が、多能性に再プログラムできるという発見に基づいている。
【００３３】
本開示の非ｉＰＳＣには、幹細胞、生殖細胞、またはｉＰＳＣではない身体の任意の細胞が含まれる非ｉＰＳＣの非限定的な例は、内臓、皮膚、骨、血液、神経組織、および結合組織を含む、身体の非生殖系列組織に由来する体細胞である。いくつかの実施形態では、体細胞は胎児体細胞である。いくつかの実施形態では、体細胞は成体体細胞である。いくつかの実施形態では、非ｉＰＳＣは、線維芽細胞、皮膚細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、および腎上皮細胞など、容易にアクセス可能であり、最小限の侵襲を必要とする細胞型に由来する。
【００３４】
本開示の非ｉＰＳＣは、哺乳動物、好ましくはヒトに由来し得るが、非ヒト霊長類、ネズミ科（すなわち、マウスおよびラット）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、非ｉＰＳＣはヒト非ｉＰＳＣである。
【００３５】
ＩＩＩ．内因性遺伝子座の標的化と再構築
本開示は、所望の遺伝子座を標的とする少なくとも１つのｓｇＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ活性化系を使用して内因性遺伝子座を標的化および再構築することに関する。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子座は、多能性関連遺伝子である。他の実施形態では、内因性遺伝子座は、非多能性関連遺伝子である。多能性関連遺伝子の非限定的な例は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎｒ５ａ２、Ｇｌｉｓ１、Ｃｅｂｐａ、Ｅｓｒｒｂ、Ｒｅｘ１である。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子座は、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２である。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子座は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＬｉｎ２８の組み合わせである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを生成する方法は、多能性関連遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ活性化系と併せて少なくとも１つのｓｇＲＮＡを使用することを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎｒ５ａ２、Ｇｌｉｓ１、Ｃｅｂｐａ、Ｅｓｒｒｂ、およびＲｅｘ１からなる群から選択される多能性関連遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎｒ５ａ２、Ｇｌｉｓ１、およびＣｅｂｐａからなる群から選択される多能性関連遺伝子を標的とする。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、多能性関連遺伝子のプロモーター領域を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、多能性関連遺伝子のエンハンサー領域を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｏｃｔ４遺伝子のプロモーター領域、Ｏｃｔ４遺伝子のエンハンサー領域、Ｓｏｘ２遺伝子のプロモーター領域、またはそれらの組み合わせを標的とする。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｏｃｔ４転写開始部位（ＴＳＳ）の約１から約５０００−ｂｐ上流、Ｏｃｔ４  ＴＳＳの約１００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｏｃｔ４  ＴＳＳの約２００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｏｃｔ４  ＴＳＳの約４００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｏｃｔ４の約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流ＴＳＳ、Ｏｃｔ４  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｏｃｔ４  ＴＳＳの約６００−ｂｐから約２０００−ｂｐ上流、またはＯｃｔ４  ＴＳＳの約７００−ｂｐから約１０００−ｂｐ上流のＯｃｔ４プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｏｃｔ４転写開始部位（ＴＳＳ）またはその間の任意の領域の約１０−ｂｐ、約２０−ｂｐ、約３０−ｂｐ、約４０−ｂｐ、約５０−ｂｐ、約６０−ｂｐ、約７０−ｂｐ、約８０−ｂｐ、約９０−ｂｐ、約１００−ｂｐ、約１１０−ｂｐ、約１２０−ｂｐ、約１３０−ｂｐ、約１４０−ｂｐ、約１５０−ｂｐ、約１６０−ｂｐ、約１７０−ｂｐ、約１８０−ｂｐ、約１９０−ｂｐ、約２００−ｂｐ、約３００−ｂｐ、約４００−ｂｐ、約５００−ｂｐ、約６００−ｂｐ、約７００−ｂｐ、約８００−ｂｐ、約９００−ｂｐ、約１０００−ｂｐ、約１５００−ｂｐ、約２０００−ｂｐ、２５００−ｂｐ、約３０００−ｂｐ、３５００−ｂｐ、約４０００−ｂｐ、４５００−ｂｐ、約５０００−ｂｐ上流のＯｃｔ４プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、上記のｓｇＲＮＡのいずれかは、ヒトＯｃｔ４プロモーターの領域および／またはエンハンサー領域を標的とする。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｓｏｘ２転写開始部位（ＴＳＳ）の約１から約５０００−ｂｐ上流、Ｓｏｘ２  ＴＳＳの約１００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｓｏｘ２  ＴＳＳの約２００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｓｏｘ２  ＴＳＳの約４００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｓｏｘ２  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、約Ｓｏｘ２  ＴＳＳの５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｓｏｘ２  ＴＳＳの約６００−ｂｐから約２０００−ｂｐ上流、またはＳｏｘ２  ＴＳＳの約７００−ｂｐから約１０００−ｂｐ上流のＳｏｘ２プロモーター領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｓｏｘ２転写開始部位（ＴＳＳ）またはその間の任意の領域の約１０−ｂｐ、約２０−ｂｐ、約３０−ｂｐ、約４０−ｂｐ、約５０−ｂｐ、約６０−ｂｐ、約７０−ｂｐ、約８０−ｂｐ、約９０−ｂｐ、約１００−ｂｐ、約１１０−ｂｐ、約１２０−ｂｐ、約１３０−ｂｐ、約１４０−ｂｐ、約１５０−ｂｐ、約１６０−ｂｐ、約１７０−ｂｐ、約１８０−ｂｐ、約１９０−ｂｐ、約２００−ｂｐ、約３００−ｂｐ、約４００−ｂｐ、約５００−ｂｐ、約６００−ｂｐ、約７００−ｂｐ、約８００−ｂｐ、約９００−ｂｐ、約の１０００−ｂｐ、約１５００−ｂｐ、約２０００−ｂｐ、２５００−ｂｐ、約３０００−ｂｐ、３５００−ｂｐ、約４０００−ｂｐ、４５００−ｂｐ、約５０００−ｂｐ上流のＳｏｘ２プロモーター領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、上記のｓｇＲＮＡのいずれかは、ヒトＳｏｘ２プロモーターの領域および／またはエンハンサー領域を標的とする。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｎａｎｏｇ転写開始部位（ＴＳＳ）の約１から約５０００−ｂｐ上流、Ｎａｎｏｇ  ＴＳＳの約１００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｎａｎｏｇ  ＴＳＳの約２００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｎａｎｏｇ  ＴＳＳの約４００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｎａｎｏｇ  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｎａｎｏｇ  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｎａｎｏｇ  ＴＳＳの約６００−ｂｐから約２０００−ｂｐ上流、またはＮａｎｏｇ  ＴＳＳの約７００−ｂｐから約１０００−ｂｐ上流のＮａｎｏｇプロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｎａｎｏｇ転写開始部位（ＴＳＳ）またはその間の任意の領域の約１０−ｂｐ、約２０−ｂｐ、約３０−ｂｐ、約４０−ｂｐ、約５０−ｂｐ、約６０−ｂｐ、約７０−ｂｐ、約８０−ｂｐ、約９０−ｂｐ、約１００−ｂｐ、約１１０−ｂｐ、約１２０−ｂｐ、約１３０−ｂｐ、約１４０−ｂｐ、約１５０−ｂｐ、約１６０−ｂｐ、約１７０−ｂｐ、約１８０−ｂｐ、約１９０−ｂｐ、約２００−ｂｐ、約３００−ｂｐ、約４００−ｂｐ、約５００−ｂｐ、約６００−ｂｐ、約７００−ｂｐ、約８００−ｂｐ、約９００−ｂｐ、約１０００−ｂｐ、約１５００−ｂｐ、約２０００−ｂｐ、２５００−ｂｐ、約３０００−ｂｐ、３５００−ｂｐ、約４０００−ｂｐ、４５００−ｂｐ、約５０００−ｂｐ上流のＮａｎｏｇプロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、上記のｓｇＲＮＡのいずれかは、ヒトＮａｎｏｇプロモーターの領域および／またはエンハンサー領域を標的とする。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｋｌｆ４転写開始部位（ＴＳＳ）の約１から約５０００−ｂｐ上流、Ｋｌｆ４  ＴＳＳの約１００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｋｌｆ４  ＴＳＳの約２００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｋｌｆ４  ＴＳＳの約４００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｋｌｆ４  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｋｌｆ４  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｋｌｆ４  ＴＳＳの約６００−ｂｐから約２０００−ｂｐ上流、またはＫｌｆ４  ＴＳＳの約７００−ｂｐから約１０００−ｂｐ上流のＫｌｆ４プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｋｌｆ４転写開始部位（ＴＳＳ）またはその間の任意の領域の約１０−ｂｐ、約２０−ｂｐ、約３０−ｂｐ、約４０−ｂｐ、約５０−ｂｐ、約６０−ｂｐ、約７０−ｂｐ、約８０−ｂｐ、約９０−ｂｐ、約１００−ｂｐ、約１１０−ｂｐ、約１２０−ｂｐ、約１３０−ｂｐ、約１４０−ｂｐ、約１５０−ｂｐ、約１６０−ｂｐ、約１７０−ｂｐ、約１８０−ｂｐ、約１９０−ｂｐ、約２００−ｂｐ、約３００−ｂｐ、約４００−ｂｐ、約５００−ｂｐ、約６００−ｂｐ、約７００−ｂｐ、約８００−ｂｐ、約９００−ｂｐ、約１０００−ｂｐ、約１５００−ｂｐ、約２０００−ｂｐ、２５００−ｂｐ、約３０００−ｂｐ、３５００−ｂｐ、約４０００−ｂｐ、４５００−ｂｐ、約５０００−ｂｐ上流のＫｌｆ４プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、上記のｓｇＲＮＡのいずれかは、ヒトＫｌｆ４プロモーターの領域および／またはエンハンサー領域を標的とする。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃ−Ｍｙｃ転写開始部位（ＴＳＳ）の約１から約５０００−ｂｐ上流、ｃ−Ｍｙｃ  ＴＳＳの約１００から約４０００−ｂｐ上流、ｃ−Ｍｙｃ  ＴＳＳの約２００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、ｃ−Ｍｙｃ  ＴＳＳの約４００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、ｃ−Ｍｙｃ  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、ｃ−Ｍｙｃ  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、ｃ−Ｍｙｃ  ＴＳＳの約６００−ｂｐから約２０００−ｂｐ上流、またはｃ−Ｍｙｃ  ＴＳＳの約７００−ｂｐから約１０００−ｂｐ上流のｃ−Ｍｙｃプロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｍｙｃ転写開始部位（ＴＳＳ）またはその間の任意の領域の約１０−ｂｐ、約２０−ｂｐ、約３０−ｂｐ、約４０−ｂｐ、約５０−ｂｐ、約６０−ｂｐ、約７０−ｂｐ、約８０−ｂｐ、約９０−ｂｐ、約１００−ｂｐ、約１１０−ｂｐ、約１２０−ｂｐ、約１３０−ｂｐ、約１４０−ｂｐ、約１５０−ｂｐ、約１６０−ｂｐ、約１７０−ｂｐ、約１８０−ｂｐ、約１９０−ｂｐ、約２００−ｂｐ、約３００−ｂｐ、約４００−ｂｐ、約５００−ｂｐ、約６００−ｂｐ、約７００−ｂｐ、約８００−ｂｐ、約９００−ｂｐ、約１０００−ｂｐ、約１５００−ｂｐ、約２０００−ｂｐ、２５００−ｂｐ、約３０００−ｂｐ、３５００−ｂｐ、約４０００−ｂｐ、４５００−ｂｐ、約５０００−ｂｐ上流のｃ−Ｍｙｃプロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、上記のｓｇＲＮＡのいずれかは、ヒトｃ−Ｍｙｃプロモーター領域および／またはエンハンサー領域を標的とする。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｎｒ５ａ２転写開始部位（ＴＳＳ）の約１から約５０００−ｂｐ上流、Ｎｒ５ａ２  ＴＳＳの約１００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｎｒ５ａ２  ＴＳＳの約２００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｎｒ５ａ２  ＴＳＳの約４００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｎｒ５ａ２  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｎｒ５ａ２  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｎｒ５ａ２  ＴＳＳの約６００−ｂｐから約２０００−ｂｐ上流、またはＮｒ５ａ２  ＴＳＳの約７００−ｂｐから約１０００−ｂｐ上流のＮｒ５ａ２プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｎｒ５ａ２転写開始部位（ＴＳＳ）またはその間の任意の領域の約１０−ｂｐ、約２０−ｂｐ、約３０−ｂｐ、約４０−ｂｐ、約５０−ｂｐ、約６０−ｂｐ、約７０−ｂｐ、約８０−ｂｐ、約９０−ｂｐ、約１００−ｂｐ、約１１０−ｂｐ、約１２０−ｂｐ、約１３０−ｂｐ、約１４０−ｂｐ、約１５０−ｂｐ、約１６０−ｂｐ、約１７０−ｂｐ、約１８０−ｂｐ、約１９０−ｂｐ、約２００−ｂｐ、約３００−ｂｐ、約４００−ｂｐ、約５００−ｂｐ、約６００−ｂｐ、約７００−ｂｐ、約８００−ｂｐ、約９００−ｂｐ、約１０００−ｂｐ、約１５００−ｂｐ、約２０００−ｂｐ、２５００−ｂｐ、約３０００−ｂｐ、３５００−ｂｐ、約４０００−ｂｐ、４５００−ｂｐ、約５０００−ｂｐ上流のＮｒ５ａ２プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、上記のｓｇＲＮＡのいずれかは、ヒトＮｒ５ａ２プロモーターの領域および／またはエンハンサー領域を標的とする。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃｅｐｐａ転写開始部位（ＴＳＳ）の約１から約５０００−ｂｐ上流、Ｃｅｂｐａ  ＴＳＳの約１００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｃｅｂｐａ  ＴＳＳの約２００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｃｅｂｐａ  ＴＳＳの約４００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｃｅｂｐａ  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｃｅｂｐａ  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｃｅｂｐａ  ＴＳＳの約６００−ｂｐから約２０００−ｂｐ上流、またはＣｅｂｐａ  ＴＳＳの約７００−ｂｐから約１０００−ｂｐ上流のＣｅｂｐａプロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃｅｂｐａ転写開始部位（ＴＳＳ）またはその間の任意の領域の約１０−ｂｐ、約２０−ｂｐ、約３０−ｂｐ、約４０−ｂｐ、約５０−ｂｐ、約６０−ｂｐ、約７０−ｂｐ、約８０−ｂｐ、約９０−ｂｐ、約１００−ｂｐ、約１１０−ｂｐ、約１２０−ｂｐ、約１３０−ｂｐ、約１４０−ｂｐ、約１５０−ｂｐ、約１６０−ｂｐ、約１７０−ｂｐ、約１８０−ｂｐ、約１９０−ｂｐ、約２００−ｂｐ、約３００−ｂｐ、約４００−ｂｐ、約５００−ｂｐ、約６００−ｂｐ、約７００−ｂｐ、約８００−ｂｐ、約９００−ｂｐ、約１０００−ｂｐ、約１５００−ｂｐ、約２０００−ｂｐ、２５００−ｂｐ、約３０００−ｂｐ、３５００−ｂｐ、約４０００−ｂｐ、４５００−ｂｐ、約５０００−ｂｐ上流のＣｅｂｐａプロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、上記のｓｇＲＮＡのいずれかは、ヒトＣｅｂｐａプロモーターの領域および／またはエンハンサー領域を標的とする。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｅｓｒｒｂ転写開始部位（ＴＳＳ）の約１から約５０００−ｂｐ上流、Ｅｓｒｒｂ  ＴＳＳの約１００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｅｓｒｒｂ  ＴＳＳの約２００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｅｓｒｒｂ  ＴＳＳの約４００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｅｓｒｒｂ  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｅｓｒｒｂ  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｇｌｉｓ１  ＴＳＳの約６００−ｂｐから約２０００−ｂｐ上流、またはＥｓｒｒｂ  ＴＳＳの約７００−ｂｐから約１０００−ｂｐ上流のＥｓｒｒｂプロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｅｓｒｒｂ転写開始部位（ＴＳＳ）またはその間の任意の領域の約１０−ｂｐ、約２０−ｂｐ、約３０−ｂｐ、約４０−ｂｐ、約５０−ｂｐ、約６０−ｂｐ、約７０−ｂｐ、約８０−ｂｐ、約９０−ｂｐ、約１００−ｂｐ、約１１０−ｂｐ、約１２０−ｂｐ、約１３０−ｂｐ、約１４０−ｂｐ、約１５０−ｂｐ、約１６０−ｂｐ、約１７０−ｂｐ、約１８０−ｂｐ、約１９０−ｂｐ、約２００−ｂｐ、約３００−ｂｐ、約４００−ｂｐ、約５００−ｂｐ、約６００−ｂｐ、約７００−ｂｐ、約８００−ｂｐ、約９００−ｂｐ、約１０００−ｂｐ、約１５００−ｂｐ、約２０００−ｂｐ、２５００−ｂｐ、約３０００−ｂｐ、３５００−ｂｐ、約４０００−ｂｐ、４５００−ｂｐ、約５０００−ｂｐ上流のＥｓｒｒｂプロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、上記のｓｇＲＮＡのいずれかは、ヒトＥｓｒｒｂプロモーターの領域および／またはエンハンサー領域を標的とする。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｒｅｘ１転写開始部位（ＴＳＳ）の約１から約５０００−ｂｐ上流、Ｒｅｘ１  ＴＳＳの約１００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｒｅｘ１  ＴＳＳの約２００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｒｅｘ１  ＴＳＳの約４００−ｂｐから約４０００−ｂｐ上流、Ｒｅｘ１  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｒｅｘ１  ＴＳＳの約５００−ｂｐから約３０００−ｂｐ上流、Ｒｅｘ１  ＴＳＳの約６００−ｂｐから約２０００−ｂｐ上流、またはＲｅｘ１  ＴＳＳの約７００−ｂｐから約１０００−ｂｐ上流のＲｅｘ１プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｒｅｘ１転写開始部位（ＴＳＳ）またはその間の任意の領域の約１０−ｂｐ、約２０−ｂｐ、約３０−ｂｐ、約４０−ｂｐ、約５０−ｂｐ、約６０−ｂｐ、約７０−ｂｐ、約８０−ｂｐ、約９０−ｂｐ、約１００−ｂｐ、約１１０−ｂｐ、約１２０−ｂｐ、約１３０−ｂｐ、約１４０−ｂｐ、約１５０−ｂｐ、約１６０−ｂｐ、約１７０−ｂｐ、約１８０−ｂｐ、約１９０−ｂｐ、約２００−ｂｐ、約３００−ｂｐ、約４００−ｂｐ、約５００−ｂｐ、約６００−ｂｐ、約７００−ｂｐ、約８００−ｂｐ、約９００−ｂｐ、約１０００−ｂｐ、約１５００−ｂｐ、約２０００−ｂｐ、２５００−ｂｐ、約３０００−ｂｐ、３５００−ｂｐ、約４０００−ｂｐ、４５００−ｂｐ、約５０００−ｂｐ上流のＲｅｘ１プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の領域を標的とする。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＯｃｔ４プロモーターは、配列番号１〜６、５７、および５８から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＯｃｔ４エンハンサーは、配列番号７〜１１から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＳｏｘ２プロモーターは、配列番号１２〜２１および５９から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＫｌｆ４遺伝子は、配列番号２２〜３１および６０から選択される。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするｃ−Ｍｙｃ遺伝子は、配列番号３２〜４１および６１から選択される。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＮｒ５ａ２遺伝子は、配列番号４２〜４５から選択される。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＧｌｉｓ１遺伝子は、配列番号４６〜５０から選択される。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＣｅｂｐａ遺伝子は、配列番号５１〜５６から選択される。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＬｉｎ２８遺伝子は、配列番号６２を含む。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡを標的とするＮａｎｏｇ遺伝子は、配列番号６３を含む。別の実施形態では、ＥＥＡモチーフ標的化ｓｇＲＮＡは、配列番号６４を含み、ここで、ＥＥＡモチーフは、ＰＲＤ様ホメオドメインＴＲ結合部位を含むがこれに限定されない、多能性遺伝子の転写に関連する調節領域である。
【００４８】
ＩＶ．ＣＲＩＳＰＲ活性化系
本開示は、細菌のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来するＣＲＩＳＰＲ活性化系に基づいている。ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、ヌクレアーゼ活性が不活性化され、エフェクターと融合して遺伝子転写を調節するタイプＩＩ  Ｃａｓを含む。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓは、少なくとも１つの転写活性化因子と融合される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓは、ｄＣａｓを複数の転写活性化因子と連結するための足場構造として機能するペプチドのタンデムアレイと融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドのタンデムアレイはＳｕｎＴａｇアレイである。他の実施形態では、トランス活性化因子は、単純ヘルペスＶＰ１６転写活性化因子ドメイン（ＶＰ６４）の四量体である。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、ＳｕｎＴａｇ  ＣＲＩＳＰＲ活性化系としても知られているｄＣａｓ−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、ＳｕｎＴａｇアレイと融合したｄＣａｓ９、およびＳｕｎＴａｇアレイに結合したｐ３００（ｐ３００コア）の少なくとも１つのアセチルトランスフェラーゼ活性ドメインを含む。他の実施形態では、ｉＰＳＣを生成する方法は、ｄＣａｓ９、ＳｕｎＴａｇアレイ、およびｐ３００コアを含むＣＲＩＳＰＲ活性化系を使用して、内因性遺伝子座のヒストンアセチル化を改変し、したがって遺伝子の転写を調節することを含む。当業者に知られている他のＣＲＩＳＰＲ活性化系および／またはトランスアクチベーターを使用してｉＰＳＣを生成できることが理解される。
【実施例】
【００５０】
以下の例は、本開示の特定の実施形態をさらに説明することを意図している。実施例は、当業者を提供するために提示され、その範囲を限定することを意図しない。
【００５１】
実施例１．ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４による内因性Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２の活性化
内因性遺伝子座の再構築が多能性に向けた再プログラミングを開始するかどうか、およびどのように開始するかを決定するために、ＳｕｎＴａｇ  ＣＲＩＳＰＲ活性化系を使用して、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の内因性多能性遺伝子座を正確に再構築した。ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４は、複数のＶＰ６４を１つの標的化部位に動員することにより、そのクロマチン再構築活性を高めるために選択された（図１Ａ）（Ｔａｎｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ｄＣａｓ９の発現は、Ｔｅｔ−Ｏｎプロモーターによって制御されていた。Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２遺伝子座は、多能性の誘導と維持におけるそれらの中心的な役割のため、標的として選択された。
【００５２】
ＭＥＦはＥ１３．５マウス胚から調製された。胚の回復後、頭部、四肢、内臓、特に生殖腺を解剖顕微鏡下で摘出した。胚の残りの本体を２枚の刃で細かく刻み、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで１５分間消化した。次に、ＭＥＦ培地を加えてトリプシン処理を停止させた。数回上下にピペッティングすることにより、組織のさらなる分離を行った。次に、遠心分離により細胞を回収し、１５ｃｍディッシュにプレーティングして増殖させた（Ｐ０）。ＭＥＦ細胞は、すべてのテストでＰ３の前に使用され、１０％ＦＢＳおよび非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭで培養された。
【００５３】
ｓｇＲＮＡは、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２プロモーター、ならびにＯｃｔ４エンハンサーを標的とするように設計された。ｓｇＲＮＡの活性化効果に加えて、標的とされるゲノム配列に関して、多能性因子および転写機構の結合部位に近接するが重複しないこと、多能性幹細胞におけるヒストンＨ３Ｋ２７アセチル化、およびメディエーター複合体によって媒介されるプロモーター−エンハンサーループを形成するそれらの潜在能力を含む、複数の因子が考慮された（図５Ａ−５Ｃ）。
【００５４】
ｓｇＲＮＡ構築物の場合、プライマーｓｇＲＮＡ−Ｆ（配列番号：１７３−ＧＴＡＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴ）およびｓｇＲＮＡ−Ｒ（配列番号：１７４−−ＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＡＧＣＴＣＴ）を用いるＰＣＲのために、特異的ｓｇＲＮＡを含む７２−ｂｐオリゴが合成された。増幅されたフラグメントを精製し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔプロトコル（ＮＥＢ）に従って、ＢｓｔＸＩおよびＢｌｐＩで消化したｐＳＬＱ１３７３構築物を用いて組換え反応のために使用した。
【００５５】
標的遺伝子の転写活性化のレベルを、分化中のマウス胚性幹（ＥＳ）細胞においてレンチウイルスによって送達されたそれぞれの設計されたＯｃｔ４およびＳｏｘ２  ｓｇＲＮＡを用いて調べた（図５Ｄ）。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１２６８）を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで培養し、トランスフェクション用に約７０％のコンフルエンシーに達するように前もって１日プレーティングし、そしてＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現プラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２５９）およびｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２６０）はレンチウイルスのパッケージングに使用された。目的の遺伝子を含むプラスミド（１．８μｇ）を、６ウェルプレートの各ウェルのｐｓＰＡＸ２（１．３５μｇ）およびｐＭＤ２．Ｇ（０．４５μｇ）と混合し、トランスフェクション用に１０．８μｌのＦＵＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。５時間後、培地を交換した。ウイルスを含む上清を４８時間で回収し、０．４５μＭフィルターに通して細胞片を取り除き、すぐに使用できるように１容量の新鮮な培地と混合した。ＳｕｎＴａｇ系では、３つの成分（ｄＣａｓ９、ＶＰ６４、およびＴｒｅ３Ｇ）のレンチウイルスが個別にパッケージ化され、使用時に混合された。ＳｕｎＴａｇ形質導入は、２ラウンドのレンチウイルス感染で実行された。１ラウンド目はＳｕｎｔａｇ系（ｄＣａｓ９、ＶＰ６４、およびＴｒｅ３Ｇ）で、２ラウンド目はｓｇＲＮＡである。感染ごとに培地を交換した。
【００５６】
マウスＥＳ細胞は、最初にｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４系およびｓｇＲＮＡを用いて形質導入された。Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２はＥＳ細胞で高発現しているため、ＥＳ細胞は１μＭレチノイン酸を補充したＭＥＦ培地で４日間分化誘導され、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２の発現が低下した。一方、ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４系はドキシサイクリンで誘導された。Ｏｃｔ４発現の分析は、転写開始部位（ＴＳＳ）に近い狭いプロモーター領域と遠位エンハンサーの２００−ｂｐ領域を標的とするｓｇＲＮＡが転写を増加できることを示した（図５Ｅ）。Ｓｏｘ２プロモーターに関しては、ｓｇＲＮＡ活性はＴＳＳにより近いｓｇＲＮＡでより高い遺伝子活性化の顕著な傾向を示した（図５Ｅ）。
【００５７】
選択されたｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４もまたＭＥＦに形質導入された（図５Ｆ）。ＭＥＦ細胞をレンチウイルス上清と５μｇ／ｍｌポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の存在下で８時間または一晩インキュベートした。Ｏｃｔ４  ＴＳＳの１２７−および７１−ｂｐ上流を標的とするｓｇＲＮＡ  Ｏ−１２７およびＯ−７１を組み合わせて、プロモーターを標的とした。同様に、Ｏ−１９６５、Ｏ−２０６６、およびＯ−２１３５を組み合わせてＯｃｔ４エンハンサーを標的とし、個別にＳ−８４、Ｓ−１３６、およびＳ−１４８を組み合わせてＳｏｘ２プロモーターを標的とした。ドキシサイクリンによるｄＣａｓ９誘導の４日後、Ｏｃｔ４プロモーターを標的化すると、Ｏｃｔ４転写が約１００倍に増加し、エンハンサーを標的化すると、適度な活性化が生じた（図５Ｇ）。Ｓｏｘ２プロモーターについては、約１５倍の活性化が検出された（図５Ｇ）。これは、特定のｓｇＲＮＡによってガイドされ、ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４がＭＥＦのサイレンシングされた内因性Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２遺伝子を活性化できることを示唆している。
【００５８】
ｓｇＲＮＡカセットから青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を検出することにより、初代ＭＥＦ細胞でウイルス力価決定が行われ、ポアソン分布（Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）を使用して感染多重度（ＭＯＩ）を計算できる。
Ｐ（ｋ）＝ｅ−ｍ  ｍｋ／ｋ！
ここで、ｍはＭＯＩ、ｋはウイルス粒子数、Ｐ（ｋ）はｋウイルス粒子に感染した細胞の割合である。開示された実験では、ＭＥＦの約７０％がＢＦＰに陽性であり、ＭＯＩは１．２０であった。同様に、示された数のｓｇＲＮＡウイルス粒子に感染した細胞の割合は次のとおりである。
【表１】
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【００５９】
実施例２．ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４による遺伝子活性化によるＭＥＦの多能性ネットワークの確立
次に、ＭＥＦで多能性ネットワークを完全に再活性化して確立できるかどうかを調べた。ＳｕｎＴａｇ再プログラミング系は、２つの方法で最適化された。まず、対応するｓｇＲＮＡを追加することで、より多くの遺伝子を標的とした。Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）、Ｎｒ５ａ２（Ｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、Ｇｌｉｓ１（Ｍａｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、Ｃｅｂｐａ（Ｄｉ  Ｓｔｅｆａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）が選択された。各プロモーターについて、４〜１０個のｓｇＲＮＡが設計され、分化中のＥＳ細胞でテストされた（図５Ｅ）。各プロモーターの１〜３個のｓｇＲＮＡは、以前のＯｃｔ４／Ｓｏｘ２  ｓｇＲＮＡプールに含まれていた（表１を参照）。次に、パルナート、Ｃｈｉｒ９９０２１、Ａ８３−０１、およびフォルスコリン（ＰＣＡＦ）からなる低分子カクテルを再プログラミング培地に加えた。この化学カクテルは、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２転写を４日目に３〜４倍さらに増加させた（図５Ｈ）。
【表２−１】
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【表２−２】
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【００６０】
多能性ネットワークの再活性化を監視するために、ＯＧ２マウス（Ｂ６；ＣＢＡ−Ｔｇ（Ｐｏｕ５ｆ１−ＥＧＦＰ）２Ｍｎｎ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）からのＭＥＦ細胞をＥ１３．５で使用した。ＯＧ２  ＭＥＦは安定したＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーターを保持し、内因性Ｏｃｔ４が活発に転写されると強いＥＧＦＰシグナルを示す（Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。形質導入の２４時間前に、ＭＥＦ細胞を１０，０００細胞／ｃｍ２の密度でゼラチン被覆プレートに播種した。ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ＶＰ６４およびｓｇＲＮＡプール（合計１８のｓｇＲＮＡ、表１を参照）の形質導入後、細胞をＭＥＦ培地で２４時間回復させた。再プログラミングを開始するために、ＭＥＦ培地を、１μｇ／ｍｌドキシサイクリンを補充した再プログラミング培地（１０μＭパルナート、３μＭ  Ｃｈｉｒ９９０２１、１μＭ  Ａ８３−０１、および１０μＭフォルスコリンを補充したＥＳ培地）に変更した。これは、０日目と呼ばれた（図１Ｂ）。３日目に、細胞を１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＢ（Ｒｏｃｈｅ）で２０分間処理した後、０．０５％トリプシンで５分間３７°Ｃで処理し、新しいウェル（３０，０００細胞／ｃｍ２）に再度播種し、再プログラミングの終わりまでさらに培養した。４日目から、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２の転写はますます強固になった（図１Ｄ）。７日目までに、再プログラミングクラスターが出現し、２週間後、ＥＧＦＰ陽性コロニーが見られた（図１Ｃ）。これらのコロニーは、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＳＳＥＡ−１にも陽性であった（図１Ｆ）。プロセス全体を通じて、培地は最初の１２日間、隔日で交換された。その後、通常のＥＳ培地が使用され、毎日交換され、ＥＧＦＰ陽性コロニーは通常、１６日から１８日の間にｉＰＳＣの誘導の準備ができていた。
【００６１】
次に、ＥＧＦＰ陽性コロニーをフィーダー細胞上で拡大し、ＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣ系統を作製した。ｉＰＳＣの誘導では、再プログラミング培養物を１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＢ（Ｒｏｃｈｅ）とともに３７℃で２０分間インキュベートした。単一のコロニーを顕微鏡下で拾い上げ、０．０５％トリプシンで５〜１０分間消化して、単一細胞の懸濁液にした。次に細胞を通常のＥＳ培地のフィーダーに播種し、これらの細胞はＰ０  ｉＰＳＣと見なす。ＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣは、強力なＥＧＦＰシグナルで典型的なマウスＥＳのようなドーム型コロニーを形成した（図１Ｅ）。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、およびＵｔｆ１を含む多能性遺伝子のパネルが高発現した（図１Ｇ）。これらの細胞は、ＥＧＦＰシグナルまたはＥＳ形態を失ういかなる兆候もなく、２０継代以上継代することができる（図１Ｅ）。これらのデータは、これらのＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣで多能性が確立されていることを示している。
【００６２】
すべてのｉＰＳＣ系統は、５％ＥＳ−ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１５％ＫＯ−血清代替品（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５５μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１０  ｎｇ／ｍｌ白血病抑制因子（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、および１μＭ  ＰＤ０３２５９０１を用いてＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のフィーダーで維持された。
【００６３】
実施例３．ＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣを確立するためのＳｏｘ２遺伝子の単一遺伝子座標的化
ＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣ生成に必要な必須遺伝子座を特定するために、個々の遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡをプールから１つずつ削除した。この１８−ｓｇＲＮＡプールでは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、またはＧｌｉｓ１プロモーターまたはＯｃｔ４エンハンサーを標的とするｓｇＲＮＡを除去すると、ＥＧＦＰ陽性コロニーの数が急激に減少し（図６Ａ）、多能性誘導におけるこれらの遺伝子座の潜在的な役割を示す。
【００６４】
次に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＧｌｉｓ１プロモーターを一緒に標的化することで、ｉＰＳＣを生成するのに十分かどうかが決定された。各遺伝子を標的とする単一のｓｇＲＮＡは、同じ遺伝子を標的とする２つまたは３つのｓｇＲＮＡの組み合わせと比較して６０％から１８０％の遺伝子活性化を達成できるため（図６Ｂ）、各遺伝子のプロモーターを標的として１つのｓｇＲＮＡが選択された。Ｏｃｔ４はＯ−１２７、Ｓｏｘ２はＳ−８４、Ｇｌｉｓ１はＧ−２１５。このアプローチにより、再プログラミングシステムが簡素化され、オフターゲット効果が減少する可能性がある。ＯＳＧ（Ｏ−１２７、Ｓ−８４、およびＧ−２１５）の組み合わせは、３つの遺伝子を適切に活性化できる（図６Ｃ）。２週間後、ＥＧＦＰ陽性コロニーが観察され、ｉＰＳＣ株を樹立できた（図６Ｄおよび６Ｅ）。
【００６５】
ＯＳＧの再プログラミング中に、驚くべきことに、Ｓ−８４のみが使用された場合にＥＧＦＰ陽性コロニーが出現することが気付かれ（図６Ｆ）、Ｓｏｘ２プロモーターのみを標的とするが多能性誘導に十分であり得ることを示唆した。Ｓ−８４のいかなるオフターゲット効果の可能性も除外するために、Ｓ−８４の上位１０の予測標的を調べた。ｓｇＲＮＡのオフターゲットは、ＣＣＴｏｐ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的オンライン予測因子によって予測された（Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。各予測で、コア配列は１２ｂｐに設定された。コア配列の最大ミスマッチは２ｂｐ、すべてのミスマッチの最大ミスマッチは４ｂｐであった。Ｓ−８４については、Ｓｏｘ２遺伝子のみが有意に活性化された（図６Ｇ）。Ｓｏｘ２タンパク質も４日目に検出された（図２Ｂ）。さらに、別の２つのＳｏｘ２−ターゲッティングｓｇＲＮＡ、Ｓ−１３６とＳ−１４８を使用して再プログラミング手順を繰り返した（図２Ａ）。これらの２つのｓｇＲＮＡは、内因性Ｓｏｘ２転写を個別に活性化し（図２Ｃ）、ＥＧＦＰ陽性コロニーが得られた（図２Ｄ）。
【００６６】
次に、これらのｉＰＳＣの多能性の信頼性を調べた。これらのＥＧＦＰ陽性コロニー内で、ＮａｎｏｇおよびＳＳＥＡ−１タンパク質も検出され、ＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣ系統が確立された（図２Ｅおよび２Ｆ）。系統Ｓ−１７について、主要な多能性因子の発現は、Ｒ１マウスＥＳ（Ｒ１  ＥＳ）細胞における発現と類似していた（図２Ｇ）。ｉＰＳＣ株の核型分析はＣｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓで行われ、ギムザ結合が分析された。生成されたｉＰＳＣも核型的に正常であった（図２Ｈ）。
【００６７】
Ｓ−１７細胞がＢ６アルビノ（Ｂ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）バックグラウンドの胚盤胞に注入される、多能性のより厳密なアッセイが行われた。ＥＧＦＰ陽性細胞は、７１．４％（７つのうち５つ）のＥ１３．５胚の性腺領域に見られた（図２Ｉ）。生産キメラは４６．２％の割合で生成された（図２Ｊ）（１３のうち６）。さらに重要なことに、Ｂ６アルビノ雌マウス（６週間）は、生殖系列伝達試験のためにキメラマウス（４−８週間）と交尾するために使用され、Ｓ−１７細胞も生殖系列に適していた（図２Ｋ）。これらのデータは、単一のｓｇＲＮＡによるＳｏｘ２プロモーターの単一遺伝子座標的化が、ＭＥＦを本物の多能性幹細胞に再プログラムするのに十分であると結論付けた。
【００６８】
Ｒ１  ＥＳ細胞は、５％ＥＳ−ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１５％ＫＯ−血清代替品（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５５μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌ白血病抑制因子（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、および１μＭ  ＰＤ０３２５９０１を含むＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のフィーダーで維持された。マイクロインジェクションでは、ｉＰＳＣはフィーダーフリーのＮ２Ｂ２７条件下で維持された（５０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０％  Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、０．５％Ｎ２培地、１％Ｂ２７培地、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍｌ白血病抑制因子、２５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、および１μＭ  ＰＤ０３２５９０１）。注入の日に、細胞を胚盤胞注入培地（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、ｐＨ７．４）に懸濁した。
【００６９】
キメラマウスの生成と生殖細胞伝達試験では、４週齢の過排卵のＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ（Ｂ６−ａｌｂｉｎｏ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、胚盤胞準備のためにＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ雄マウスと交配した。桑実胚（性交後２．５日）を収集し、ＫＳＯＭ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。翌朝、胚盤胞はｉＰＳＣ注入の準備ができており、胚盤胞ごとに約１０〜２０個の細胞が注入された。注入された胚盤胞をＫＳＯＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２で１〜２時間培養し、次に性交後２．５日間の偽妊娠ＣＤ１雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ストック＃０２２）の子宮に移植した。キメラマウスはモザイクコートの色で識別できる。雄のキメラマウスはさらに雌のＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊマウスと交配され、黒いコートの色の子マウスは生殖系列の伝達に成功したと見なされる。性腺の寄与については、注入された胚は、移植後１０日（Ｅ１３．５）で回復した。各胚の性腺領域を収集し、ＥＧＦＰシグナルを顕微鏡で視覚化した。すべての動物の手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の施設内動物管理使用委員会によって承認された。
【００７０】
実施例４．Ｓ−１７  ＭＥＦは再プログラム可能で、効率が高く、変動が少ない
レンチウイルス形質導入による再プログラミング効率は比較的低く、ＯＧ２と１２９マウス（１２９Ｓ２／ＳｖＰａｓＣｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の両方で変動し、ＭＥＦ（０−０．０１３％）を導き出した（図２Ｃ、６Ａ、６Ｆ、７Ａ−７Ｃ）。これは、ＳｕｎＴａｇ成分の非効率的な送達と、細胞に送達される成分のランダムなコピー数が原因である可能性がある。これは、確立されたｉＰＳＣ系統のゲノムにおけるｓｇＲＮＡカセットのさまざまなコピー数によって反映されており、細胞あたり１２系統のうち１〜５コピーが見つかった（図７Ｄ）。ゲノム内のｓｇＲＮＡカセットの定量化のために、ゲノム内のＳｏｘ２遺伝子およびｓｇＲＮＡカセットの増幅用に定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）プライマーが設計された（表２を参照）。Ｓｏｘ２の増幅を使用して、各細胞系統のゲノムを正規化した。標的を含むプラスミドを標準曲線の作成に使用した。検量線は、一連のプラスミド希釈液（１０ｐｇ、１ｐｇ、０．１ｐｇ、０．０１ｐｇ）のプラスミドコピー数に対してＣｔ値をプロットし、約３０ｎｇのＳｏｘ２遺伝子とｓｇＲＮＡカセットのコピー数をプロットして作成した。ゲノムＤＮＡは標準曲線に基づいて計算された。次に、Ｓｏｘ２遺伝子（２コピー／細胞）に正規化することにより、ｓｇＲＮＡコピー数を計算した。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【００７１】
ばらつきを減らして効率を高めるために、単一のコロニーに由来するＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣ系統を使用して二次ＭＥＦを生成した。Ｓ−１７  ｉＰＳＣは青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）で標識され、Ｂ６胚盤胞に注入され、二次ＭＥＦはＥ１３．５胚に由来した（図３Ａ）。ＭＥＦの約半分（５２．４％）は、Ｓ−１７  ｉＰＳＣに由来することがフローサイトメトリーによって明らかにされた（図７Ｅ）。このフローサイトメトリーの間、細胞をトリプシン処理して、ＦＡＣＳ緩衝液中の単一細胞の懸濁液を形成し、この懸濁液を４０μｍのセルストレーナーでろ過した後に、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  ＶＹＢフローサイトメーターで検査した。データはＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０で分析された。これらの派生した二次ＭＥＦは、Ｓ−１７  ＭＥＦと呼ばれていた。ドキシサイクリン誘導により、内因性Ｓｏｘ２はｑＰＣＲおよび免疫蛍光染色の両方で容易に検出され、Ｓｏｘ２はドキシサイクリンの非存在下では検出されなかった（図３Ｂおよび３Ｄ）。オフターゲット遺伝子は有意に上昇しなかった（図７Ｇ）。これらのデータは、ＳｕｎＴａｇ系がＳ−１７  ＭＥＦでＳｏｘ２を活性にするために適切に機能したことを示している。
【００７２】
次に、Ｓ−１７  ＭＥＦが再プログラム可能かどうかを調べた。Ｓｏｘ２転写は４日目に有意に上方制御され、８日目までにＲ１  ＥＳ細胞に匹敵するレベルまで急速に増加した（図３Ｂ）。Ｓｏｘ２のアップレギュレーションに続いて、他のコア多能性因子であるＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１も活性化された。それらの転写は８日目に検出され、その後劇的に上昇した（図３Ｇ）。一方、形態学的変化は４日目から観察され、ＥＧＦＰ陽性コロニーは７日目に見えた（図３Ｅ）。ｉＰＳＣ系統も確立できた（図３Ｅ）。Ｓ−１７  ＭＥＦを使用すると、再プログラミング効率（０．１％）がレンチウイルス法の４０倍に増加した（図３Ｆ）。予想通り、はるかに少ない変動性が観察された（図７Ｈ）。
【００７３】
ｑＰＣＲ（表２を参照）の場合、ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を含むＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓミニキットを使用して、指定された時間にサンプルから全ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ）で処理してゲノムＤＮＡを除去した。ＲＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して逆転写された。７５００Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でｉＱＴＭ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量的ＰＣＲを行った。すべての反応は四連で行われた。すべてのデータは、Ｐｒｉｓｍ７で統計的に分析された。免疫蛍光染色のために、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、４％ＰＦＡで４℃で３０分間固定した。ロバ血清（ＤＰＢＳ中１０％）を使用して、４℃で１時間ブロッキングした。抗体を、１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳで希釈した。染色には次の一次抗体を使用した：抗Ｓｏｘ２（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ５６０３）、抗Ｏｃｔ４（１：１０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−５２７９）、抗Ｎａｎｏｇ（１：５００、Ａｂｃａｍ、８０８９２）、および反ＳＳＥＡ−１（１：２００、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０９−００９５）。
【００７４】
さらに分化したテールチップ線維芽細胞（ＴＴＦ）が再プログラム可能かどうかもテストされた。Ｓ−１７  ＴＴＦは、１４ヶ月齢の成体キメラマウスに由来した。尾をはがし、１ｍｍに細かく刻み、６ｃｍディッシュで培養した。線維芽細胞が移植片から移動するまで、培地を３日ごとに半分交換した。誘導したＴＴＦは、１０％ＦＢＳと非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭで維持され、継代されてすぐに使用できた（Ｐ１）。ドキシサイクリンの存在下で、ＴＴＦは形態学的変化を受け、ＥＧＦＰ陽性コロニーが２週間で得られた（図７Ｌ）。これらの観察結果は、Ｓ−１７  ＭＥＦとＴＴＦの両方が再プログラム可能であることを示している。
【００７５】
Ｓ−１７  ＭＥＦまたはマウスＴＴＦによる再プログラミングのために、ＭＥＦまたはＴＴＦをゼラチンコーティングプレートに５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。２４時間後、培地を１μｇ／ｍｌドキシサイクリンを含む再プログラミング培地に切り替えた。これは、０日として示された。培地は１４日まで隔日で交換された。ＥＧＦＰ陽性コロニーは、再プログラミング効率の計算のためにカウントされるか、ｉＰＳＣ系統の派生に使用された。
【００７６】
実施例５．Ｓｏｘ２プロモーターの再構築は、Ｓ−１７  ＭＥＦの多能性に向けた再プログラミングをトリガーする
ドキシサイクリンなしでは、Ｓｏｘ２の活性化は検出できず、コロニーは得られなかった（図３Ｂおよび３Ｊ）。ＰＣＡＦカクテルを培地から除去しても、効率は低下するが、ＥＧＦＰ陽性コロニーが生成された（図７Ｉ）。この観察は、内因性のＳｏｘ２活性化がＳ−１７  ＭＥＦ再プログラミングのトリガーであると結論付けた。
【００７７】
次に、再プログラミングがＳｏｘ２レベルに用量依存的であったかどうかを調べた。Ｓｏｘ２は、一連のドキシサイクリン濃度、たとえば０、０．０１、０．１、および１μｇ／ｍｌで活性化された。Ｓｏｘ２レベルはドキシサイクリン濃度と正の相関を示し、再プログラミング効率は明らかにＳｏｘ２レベルに依存していた（図３Ｊ）。
【００７８】
ＶＰ６４は複数のエピジェネティック修飾因子（Ｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を採用することにより遺伝子転写とクロマチン再構築を促進するため、ＳｕｎＴａｇ系がＳｏｘ２プロモーターをエピジェネティックに再構築できるかどうか、およびいかにして再構築できるかを調べた。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）は、Ｓｏｘ２プロモーターに対するＨ３Ｋ２７アセチル化（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）抗体を用いて行われた。すべてのＣｈＩＰ実験は、ＥＺ−ＣｈＩＰクロマチン免疫沈降キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１７−３７１）を使用して、キットに付属のプロトコルに従って、変更を加えて行われた。簡単に言えば、約２×１０６個の細胞を０．２７５ｍｌの３７％ホルムアルデヒドで１０ｍｌの増殖培地に架橋した。１．２５Ｍグリシン（１０ｘ）１ｍｌを添加して、未反応のホルムアルデヒドをクエンチした。０．１２ｍｌのＳＤＳ溶解緩衝液を各サンプルに使用した。次に、ゲノムＤＮＡを、最適化された条件でＣｏｖａｒｉｓ  Ｓ２  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒで１００〜５００ｂｐの長さに剪断した。１．５μｇのＨ３Ｋ２７アセチル化抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ４７２９）および１５μＬの磁性タンパク質Ａ／Ｇビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  １６−６６３）を各サンプルに使用した。最後に、ＤＮＡフラグメントを５０μｌの溶出緩衝液Ｃで溶出し、下流ｑＰＣＲに使用した。
【００７９】
早くも４日目に、Ｈ３Ｋ２７ａｃレベルはすでに２倍に上昇しており、８日目と１２日目にさらに増加した（図３Ｃ）。これは、Ｓｏｘ２を標的とするＳｕｎＴａｇ系が、Ｓｏｘ２プロモーターで段階的かつ一定のエピジェネティックな再構築を引き起こしたことを示している。Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１のプロモーターのエピジェネティック再構築もテストされ、それらのＨ３Ｋ２７ａｃレベルは、遺伝子転写と同様に、４日間のレイテンシで大幅に増加した（図３Ｇおよび３Ｈ）。興味深いことに、Ｏｃｔ４のエンハンサーはＨ３Ｋ２７ａｃレベルの同時上昇を示した（図３Ｉ）。これらのデータは、Ｓｏｘ２の活性化が多能性確立のための他の重要な遺伝子のその後の誘導を促進したことを示唆している。
【００８０】
次に、Ｓ−１７  ＭＥＦにおけるＯｃｔ４プロモーターの追加標的化が再プログラミング効率を促進するかどうかをテストした。Ｏ−１２７の形質導入はＯｃｔ４転写の有意な増加をもたらし、再プログラミング効率も増加した（図３Ｋ）。この相乗効果により、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２が多能性誘導に協力したという考えが裏付けられた。
【００８１】
Ｓ−１７  ＭＥＦ再プログラミングと、過剰発現因子を使用した従来の再プログラミングも比較した。Ｓ−１７  ＭＥＦとは異なり、過剰発現した因子は４日目にＳｏｘ２プロモーターをエピジェネティックに再構築できず（図７Ｊ）、４日目と１２日目には内因性遺伝子座でのＳｏｘ２転写は効果的に検出されなかった（図３Ｌ）。３週間後、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２の過剰発現はコロニーの生成に失敗し、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４（ＯＳＫ）の過剰発現は、Ｓ−１７  ＭＥＦよりもわずかに多くのＥＧＦＰ陽性コロニーを生成し、実験間での変動が大きかった（図３Ｍおよび７Ｋ）。
【００８２】
実施例６．Ｏｃｔ４プロモーターおよびエンハンサーの同時再構築はＭＥＦをｉＰＳＣに再プログラミングする
Ｏｃｔ４のプロモーターとエンハンサーの両方の再構築は多能性誘導にとって重要であり、プロモーターのみを標的とするだけではＥＧＦＰ陽性コロニーの生成には不十分であった（図６Ａおよび２Ｃ）。主要な多能性因子ならびにｐ３００およびメディエーター複合体がマウスＥＳ細胞のＯｃｔ４遠位エンハンサーで濃縮されていることを考えると（図４Ａ）、Ｏｃｔ４プロモーターおよびエンハンサーの同時再構築が多能性誘導に必要であると仮定された。
【００８３】
仮説を検証するために、異なる部位を標的とする２つのｓｇＲＮＡを転写するデュアルｓｇＲＮＡカセットを使用した（図８Ａ）。Ｏ−１２７−２０６６カセットは、単一細胞レベルでＯｃｔ４プロモーター（Ｏ−１２７）およびエンハンサー（Ｏ−２０６６）を標的とした。デュアルｓｇＲＮＡ構築物を生成するために、２番目のｓｇＲＮＡを含むフラグメントを、プライマーｍＵ６−Ｔ２Ｈ−Ｆ（配列番号１６７  ｃｔａｇｇａｔｃｃａｔｔａｇｇｃＧＧＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡ）およびｍＵ６−Ｔ２Ｈ−Ｒ２（配列番号１６８  ａｔａｃｇｇｔｔａｔｃｃａｃｇｃＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴ）を使用して、テンプレートとして単一ｓｇＲＮＡ構築物を用いて増幅した。このフラグメントを精製し、ＮｏｔＩで消化した最初のｓｇＲＮＡを含む他の構築物との組換え反応に使用した。２番目のｍＵ６−ｓｇＲＮＡカセットは、同じ転写方向で最初のカセットの下流にある。
【００８４】
Ｏ−１２７−２０６６は、Ｈ３Ｋ２７ａｃのレベルが上昇したＯｃｔ４プロモーターおよびエンハンサーを同時に再構築した（図４Ｂ）。Ｏ−１２７−２０６６による遺伝子転写のレベルは、４日目と８日目でＯ−１２７と同様であった（図４Ｃ）。しかし、８日目以降、Ｏｃｔ４転写はＯ−１２７−２０６６培養でさらに上昇した。特に、細胞を７日目および１１日目に再播種して細胞増殖を可能にした場合、集団における全体的なＯｃｔ４発現が劇的に増加した（図４Ｃ）。Ｏ−１２７およびＯ−２０６６培養では、弱いＯｃｔ４発現は８日後もほとんど変化しなかった（図４Ｃ）。したがって、１２日目までに、Ｏ−１２７−２０６６培養でＥＧＦＰ陽性コロニーが観察され、それらのコロニーはＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ−１もまた発現し、獲得したコア多能性ネットワークを示した（図４Ｅおよび４Ｆ）。ｉＰＳＣ系統はこれらのコロニーから誘導することができた（図４Ｅ）。一方、Ｏ−１２７またはＯ−２０６６培養ではコロニーは見られなかった（図４Ｄ）。
【００８５】
潜在的なオフターゲットの活性化を調べた。ｓｇＲＮＡｓ  Ｏ−１２７およびＯ−２０６６の予測される上位１０の標的を調べたところ、標的外遺伝子の有意な活性化は検出されなかった（図８Ｃ）。別の２つのデュアルｓｇＲＮＡカセットＯ−１２７−１９６５およびＯ−１２７−２１３５も並行してテストされ、同様の結果が観察された（図４Ｄ）。これらのデータは、多能性が内因性Ｏｃｔ４プロモーターとエンハンサーの同時再構築によって誘導されることを強く支持した。
【００８６】
本物の多能性幹細胞系統もまた達成された。Ｄ−９系統は、Ｒ１  ＥＳ細胞と同様の多能性遺伝子の発現および正常な核型を示した（図４Ｇおよび４Ｈ）。Ｂ−６アルビノ胚盤胞にＤ−９細胞を注入した後、子孫の子の間で生きているキメラマウスが６０％の割合で生成された（１０匹中６匹）（図４Ｊ）。この系統は、７５％Ｅ１３．５胚の生殖腺領域に有意に寄与し（８匹のうち６匹）（図４Ｉ）、生殖系列伝達は、５０％の子マウス（４匹のうち２匹）で確認された（図４Ｋ）。
【００８７】
実施例７．Ｏｃｔ４プロモーターおよびエンハンサーでのヒストンアセチル化の後成的再構築はＭＥＦをｉＰＳ細胞に再プログラムする
ＶＰ６４によるクロマチンの再構築は、転写機構の採用におけるその主要な機能によるものである。エピジェネティックな再構築が再プログラミングを開始するのに十分かどうかをより厳密に判断するために、Ｏｃｔ４プロモーターとエンハンサーのヒストンのアセチル化は、特定の操作によって増加した。ヒストンのアセチル化は、ヒストンＨ３Ｋ２７のアセチル化がＯｃｔ４プロモーターとエンハンサー領域を同時にマークするため、操作された（図４Ａ）。ｐ３００コアはｐ３００のアセチルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを有し、標的のヒストンのアセチル化を増強することが証明された（Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。したがって、ＶＰ６４をｐ３００コアで置き換えて、ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ｐ３００コア系を生成した（図８Ｅ）。
【００８８】
ｐ３００コアのクローニングでは、バックボーンはｐＳＬＱ１７１１−ｐＰＧＫ−ＳｃＦＶ（ＧＣＮ４）−ｓｆＧＦＰ−ＶＰ６４からＳｂｆＩ−ＨＦおよびＲｓｒＩＩ（ＮＥＢ）で消化し、ゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して取得した。リンカーを備えた８３−ｂｐ  ＳＶ４０核局在化部位（ＮＬＳ）をクローン化し、ｓｆＧＦＰとフォワードプライマー（配列番号１６９  ＴＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＧＧＡＣＣＧａａｇｇｃａｇｃｇｇｃｔｃｃｃｃｃａａｇ）とリバースプライマー（配列番号１７０  ＡＡＡＴＣＧＴＣＴＡＡＡＧＣＡＴＣｃｇａｃｃｃｔｃｃｇｃｃｇｇａａｃｃｇｃｃｃａ）を有するｐ３００コアの間に追加した。ｐ３００コアは、テンプレートｐｃＤＮＡ−ｄＣａｓ９−ｐ３００コア（Ａｄｄｇｅｎｅ  ６１３５７）から、フォワードプライマー（配列番号１７１  ＡＧＴＧＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＧａｔｔｔｔｃａａａｃｃａｇａａｇａａｃｔａｃｇａｃ）およびリバースプライマー（配列番号１７２  ＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡｇｔｃｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｇｔｇｔｇｃａｇｃｔｃ）を有するＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を使用し、ＰＣＲ増幅された。次に、８３−ｂｐ  ＳＶ４  ＮＬＳとリンカーを含むバックボーン、およびｐ３００コアを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリクローニングキット（ＮＥＢ）を使用して組み立てた。
【００８９】
再プログラミング実験は、ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ｐ３００コア系で実行された。ｐ３００コア培養は、Ｏｃｔ４プロモーターおよびエンハンサーでＶＰ６４と同等のＨ３Ｋ２７ａｃレベルを示したが、５日目のｐ３００コア培養ではＯｃｔ４転写の１／３０しか検出されなかった（図８Ｆおよび８Ｇ）。これは、ｐ３００コアが転写機構を採用できないことで説明できる。次に、培養物を９日目と１４日目に継代した。興味深いことに、１０日目までに、Ｏｃｔ４レベルはＶＰ６４とｐ３００コアの培養で同等であった（図８Ｇ）。したがって、ＥＧＦＰ陽性コロニーがｐ３００コア培養で生成され、ｉＰＳＣ系統が生成された（図８Ｈおよび８Ｉ）。これらの観察結果は、ｐ３００コアによるヒストンのアセチル化の操作が、ＶＰ６４と同様のクロマチンの再構築につながったことを示しているが、転写の活性化には顕著な潜時がある。一緒に、これらの結果は、ＶＰ６４またはｐ３００コアを介したＯｃｔ４プロモーターおよびエンハンサーのエピジェネティックな再構築が、多能性に向けた再プログラミングをトリガーするのに十分であることを示している。
【００９０】
異所性タンパク質の広範な結合により、多能性への再プログラミングをトリガーする内因性クロマチン上の再構築イベントを特定することは非常に困難である。これに対する洞察を得るために、ＣＲＩＳＰＲａ系、ｄＣａｓ９−ＳｕｇＴａｇ−ＶＰ６４またはｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ｐ３００コアを使用して、内因性クロマチンの特定の部位を正確に再構築した。初めて、Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２のいずれかの単一遺伝子の標的を絞った再構築が多能性に向けた再プログラミングを開始するのに十分であることが発見され、本物の多能性幹細胞系統が確立された。ＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣ由来のＳ−１７  ＭＥＦとＴＴＦも再プログラム可能であり、内因性Ｓｏｘ２の活性化が多能性誘導の重要なイベントであることを示唆している。Ｏｃｔ４のプロモーターとエンハンサーの同時再構築も、多能性を誘導するのに十分であった。最後に、ヒストンのアセチル化を増加させることによるＯｃｔ４プロモーターおよびエンハンサーのエピジェネティックな操作は、ｉＰＳＣ誘導を誘発するのに十分であった。
【００９１】
現在の研究では、ｉＰＳＣはＣＲＩＳＰＲａ系でＯｃｔ４またはＳｏｘ２の単一遺伝子を標的とすることで生成された。内因性多能性遺伝子の活性化は、これまでＣＲＩＳＰＲａ系で検査されていたが、ｉＰＳＣは確立されていなかった。以前の研究では、Ｏｃｔ４プロモーターの一時的な活性化のみが示されていた。エンハンサーが標的にされなかったため、ｉＰＳＣが少なくとも部分的に生成されなかったと考えられる。本開示において、ｓｇＲＮＡは新たに設計され、ｓｇＲＮＡ標的部位は、複数のパラメーターに基づいて選択された（図５Ａ〜５Ｃ）。使用されるＳｕｎＴａｇ系は、遺伝子の活性化とクロマチンの再構築において非常に効率的である。ＶＰ６４の２４ものコピーが標的化部位に採用される可能性があるためである。その結果、Ｏｃｔ４の活性化が１００倍に増加し、これは以前の研究よりもはるかに高かった（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。さらに、小分子は再プログラミング効率をさらに高めた（図７Ｈ）。最近、２つの研究が、ＶＰ６４ｄＣａｓ９ＶＰ６４系で内因性のＭｙｏＤまたはＢＡＭ（Ｂｒｎ２、Ａｓｃｌ１、およびＭｙｔ１Ｌ）を活性化することによる筋肉およびニューロン細胞の生成を報告した（Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。本開示は、ＣＲＩＳＰＲａ法を用いて初めて多能性幹細胞を確立した。
【００９２】
この開示は、内因性Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２の直接再構築が多能性に向けた再プログラミングをトリガーするのに十分であることを機構的に指定している。これは、ｉＰＳＣ生成の代替方法を提供するだけでなく、多能性誘導の分子メカニズムへの洞察も提供する。Ｓｏｘ２の研究は、内因性のＳｏｘ２の活性化が多能性誘導の重要なイベントであることを証明した。Ｓ−１７  ＭＥＦの再プログラミングにはＳｏｘ２の活性化が必要であり、Ｓｏｘ２の再構築は他の主要な多能性遺伝子の活性化に先行し、再プログラミングの効率はＳｏｘ２レベルに依存していたことが明らかであった（図３Ｂ、３Ｃ、３Ｇ−３Ｉ、および３Ｊ）。一方、Ｓ−１７集団の２０％が内因性Ｓｏｘ２を活性化したが、ＥＧＦＰ陽性コロニーに再プログラムできるのはわずか０．１％で（図３Ｆおよび７Ｆ）、内因性Ｓｏｘ２の唯一の活性化はＣＲＩＳＰＲａのコンテキストにおいて、多能性細胞の運命の決定因子ではないということを示唆した。Ｏｃｔ４プロモーターをさらに活性化すると、ＥＧＦＰ陽性コロニーの生成効率が高まり（図３Ｋ）、多能性誘導における複数の多能性遺伝子の再プログラミングの協同性がサポートされる。Ｏｃｔ４研究では、特に、多能性誘導にはエンハンサー領域の再構築が必要であった。プロモーターの再構築からの強力な転写活性化、およびエンハンサーの再構築からの適度な遺伝子活性化が観察された。しかしながら、エンハンサーの再構築は、後の段階でのＯｃｔ４のさらなる誘導に不可欠であると思われる（図４Ｃ）。これは、Ｏｃｔ４プロモーターが高速トリガーとして機能し、エンハンサーが潜在的でより高いＯｃｔ４転写に必要なレギュレーターであることを示唆している。エンハンサー再構築がナイーブマウスＥＳ細胞に見られるプロモーター−エンハンサーループの確立を促進したかどうかは、さらに調査する必要がある（Ｋａｇｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。別の興味深い点は、このエンハンサーが多能性幹細胞で特に見られる２３１スーパーエンハンサーの１つであることである（Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。この開示は、多能性誘導におけるスーパーエンハンサーの機能的証拠を提供した。
【００９３】
ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ｐ３００コアによるｉＰＳＣの生成により、ヒストンのアセチル化がｉＰＳＣの生成に重要な役割を果たすことが明らかになった。細胞の再プログラミングには動的なエピジェネティックな変化が含まれるが、定義されたゲノムサイトのエピジェネティックな操作を通じて再プログラミングを実現できるかどうかは、これまで知られていなかった。多能性幹細胞では、ヒストンＨ３Ｋ２７アセチル化はＯｃｔ４のプロモーターとエンハンサーの両方で非常に濃縮されており、エピジェネティックな修飾の１種類のみを操作することでこの問題に取り組むためのエントリーを提供する。本開示において、ｉＰＳＣは、プロモーターおよびエンハンサーのｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ−ｐ３００コア同時標的化を介して生成された。これはまた、エピジェネティックな修飾の部位固有の操作によって細胞の運命を変える方法を舗装した。ｐ３００のほかに、他のいくつかのエピジェネティックな要因（Ｔｅｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、ＫＲＡＢ、ＬＳＤ１など）が、活性化またはサイレンシング遺伝子のエピゲノム編集で機能することが確認されている（Ｋｅａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｔｈａｋｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。これらのＣＲＩＳＰＲツールの拡張により、さまざまな種類のＤＮＡとヒストン修飾を将来的に対象とすることにより、細胞運命を操作する可能性が高まる。
【００９４】
要約すると、これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲａ系、ここではＳｕｎＴａｇ系、内因性Ｏｃｔ４またはＳｏｘ２遺伝子座のまさにその再構築が多能性への再プログラミングを開始するのに十分であることを示している。これらの研究は、ＣＲＩＳＰＲ活性化によるｉＰＳＣの生成を実証するだけでなく、細胞再プログラミングの機構的理解に光を当てる。以下の例でさらに実証されるように、再プログラミング戦略は、他の細胞型の生成およびヒト細胞などの他のモデル系でも機能すると考えられる。
【００９５】
実施例８．ＣＲＩＳＰＲ活性化によるヒトｉＰＳＣの生成
線維芽細胞の培養と維持新生児包皮（ＦＴｃ１００７；ＤＦＭＦ０３０８１１）から分離されたヒト皮膚線維芽細胞を、０．１％ブタゼラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のヒト線維芽細胞（ｈＦｉｂ）増殖培地：ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％グルタグロ、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）。線維芽細胞の通常の酵素的継代は、Ａｃｃｕｔａｓｅ解離試薬（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して行われた。細胞を３７℃で５％ＣＯ２および５％Ｏ２に維持した。
【００９６】
ヒトｓｇＲＮＡの発現用プラスミドの構築レンチウイルスプラスミドを、ヒトＵ６プロモーター、特定のｇＲＮＡ、およびＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）用の適切な相同配列を含む合成ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を使用して構築し、および以前の実施例で使用されたｄＣａｓ９−Ｓｕｎｔａｇ−ＶＰ６４プラスミドにアセンブルされた。特定のｇＲＮＡ配列を表３に示す。
【表４】
2021509577.tif 000009
【００９７】
レンチウイルスのパッケージングＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−３２１６）を、トランスフェクションの２４時間前にプレートし、トランスフェクション時に７０〜８０％のコンフルエンスになるようにレンチウイルスパッケージングプラスミドを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して行った。培地は１６時間で交換した。ウイルスを含む上清をトランスフェクション後２日目と３日目に収集した。次に、上清を０．４５μＭフィルターに通し、２０，０００ｘｇで１．５時間、４℃で遠心分離した。濃縮されたウイルスをＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に再懸濁し、アリコートを−８０℃で保存した。すべてのウイルスは個別にパッケージ化され、２回の感染で使用されるときに合わされた。すべての構築物は、ｄＣａｓ９−Ｓｕｎｔａｇ−ＶＰ６４系で使用するためにパッケージ化されている。
【００９８】
ウイルス滴定ウイルスの滴定は、前日に播種された２９３Ｔ細胞で一連の希釈を使用して実行された。細胞を成長培地に感染させ、これは１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含むＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）であり、５μｇ／ｍＬポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）と１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）で補充されていた。細胞を６００ｘｇで９０分間遠心分離し、その後さらに４〜６時間インキュベートし、その時点で形質導入培地を新鮮な増殖培地と取り換えた。滴定は、ｓｇＲＮＡカセットから発現した青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を検出することで測定した。ＢＦＰ発現について１％から２０％の正の信号を示したサンプルは、次の式を使用して力価計算のために選択された。
【数１】
2021509577.tif 000010
【００９９】
ヒト線維芽細胞は、多能性遺伝子の転写と胚ゲノムの活性化に関連する制御ＤＮＡ要素を標的とするように設計された例示的なｄＣａｓ９−Ｓｕｎｔａｇ−ＶＰ６４系とｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ活性化アプローチを使用して再プログラムされた。Ｓｕｎｔａｇ系のすべてのレンチウイルス成分は個別にパッケージ化され、前の例で説明したように、最初のラウンドではｄＣａｓ９、ＶＰ６４、およびＴｒｅ３Ｇを組み合わせ、２番目のラウンドではｓｇＲＮＡを組み合わせて、２つの別々の感染ラウンドを通じて導入された。さまざまな濃度のウイルスを比較に使用した。２回目のラウンドの前に、１回目の感染細胞集団を濃縮するために、形質導入された細胞を１μｇ／ｍＬドキシサイクリンで２４時間処理し、ＧＦＰ−ＶＰ６４およびｄＣａｓ９−１０ＸＧＣＮ４−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙの発現のためにバルクソートした。感染の各ラウンドについて、細胞を５，０００または１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。播種から２４時間後、２０％ノックアウト血清置換（ＫＯＳＲ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、１％グルタグロ、１％ＮＥＡＡ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍＬの基本的なヒト線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、および１００μＭβ−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、４μｇ／ｍＬポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で形質導入を行った。感染後、細胞を６００ｘｇで９０分間遠心分離し、さらに４〜６時間インキュベートし、その時点で感染培地を１μｇ／ｍＬドキシサイクリンを含むｈＦｉｂ培地に取り換えて誘導を開始した（１日目）。５日目に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、０．１％ブタゼラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングした６ウェルプレートに密度７，５００細胞／ｃｍ２、ドキシサイクリン処理を中止し、培地をＴＧＦβ受容体阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含むものに変更した。１３日目と２１日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して細胞を再度継代し、７，５００細胞／ｃｍ２の密度でマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）コーティング６ウェルプレートに播種し、および培地を、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含むがＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない別の培地に変更した。例示的なＴＧＦβ受容体阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤は、当該技術分野で既知である（例えば、ＷＯ２０１５／１３４６５２を参照）。特定の例には、ＴＧＦβ受容体阻害剤のＳＢ４３１５４２およびＡ−８３−０１、ＭＥＫ阻害剤のＰ���０３２５９０１およびＰＤ９８０５９、ＧＳＫ３阻害剤のＣＨＩＲ９９０２１およびＢＩＯ、ＲＯＣＫ阻害剤のチアゾビビンおよびＹ２７６３２が含まれる。
【０１００】
早くも８日目および時間の経過とともに、核と細胞質の比率が高く、ＥＳＣに似たコロニー形態を示すと推定されるｉＰＳＣが観察された（図９）。図９に示すように、ＣＲＩＳＰＲ活性化系にＥＥＡ  ｓｇＲＮＡを含めると、ＥＥＡなしで取得したＣＲＩＳＰＲａ−ｈｉＰＳＣクローンと比較して、形態学的特徴がより強いｈｉＰＳＣクローンが生成されるようである。ＥＥＡの有無にかかわらず生成されたＣＲＩＳＰＲａ−ｈｉＰＳＣの形態の観察は、２つの条件下で見られる多能性遺伝子発現レベルと一致する（図１０ＡおよびＢを参照）。ＣＲＩＳＰＲａ系から生成されたｉＰＳＣコロニーは、多能性マーカーの発現と多分化能分化に基づいてさらに特徴付けられた。サンプルは、１０日目と２１日目のＲＮＡ分析と２１日目のフローサイトメトリーのために収集された。細胞は１９日目に免疫蛍光染色のために、そして２１日目にアルカリホスファターゼ染色のために固定された。培地の変更は毎日または他の日に行われた。細胞を３７℃で５％ＣＯ２および５％Ｏ２中で培養した。ＥＶＯＳ  ＦＬコアイメージングシステム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して位相コントラストイメージングを行った。図１０は、ＴＲＡ−１−８１、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ−４およびＯＣＴ４などの内因性多能性遺伝子の発現がＣＲＩＳＰＲＡ−ｈｉＰＳＣコロニーで確立されていることを示している。
【０１０１】
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して分離された。ＴａｑＭａｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ  １−ステップキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、９６ウェルプレートのウェルあたり２０μＬの反応容量で定量的ＰＣＲ反応を行い、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  ｑＰＣＲシステムとＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３で分析したｑＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。反応は２回行った。結果は、内部参照遺伝子としてのグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化された。相対遺伝子発現を２  ＾ΔΔＣｔメソッドを使用して定量化し、データをＳｔｅｐＯｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２．３およびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ１．４．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して統計学的に分析した。Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｌｉｎ２８、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、およびＧａｐｄｈのプライマーとプローブを、内因性遺伝子発現評価に使用した。図１１は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇなどの標的化された内因性遺伝子だけでなく、標的化されていないもの、たとえばＲｅｘ１も活性化することにより、再プログラムされた集団で内因性多能性プログラムが経時的に活性化されることを示している。図１２におけるＴＲＡ−１−８１発現のフローサイトメトリー分析はまた、様々なＭＯＩ条件でＣＲＩＳＰＲａを通じて得られたｈｉＰＳＣの確立された多能性状態を実証する。
【０１０２】
本発明は上記の実施形態に関連して説明されているが、前述の説明および例は、本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図していないことを理解されたい。本発明の範囲内の他の態様、利点および修正は、本発明が関係する当業者には明らかである。
【０１０３】
加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群に関して説明される場合、当業者は、本発明がマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはサブグループメンバーに関しても説明されることを認識する。
【０１０４】
本明細書で言及されたすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、あたかもそれぞれが個別に参照により組み込まれたのと同じ程度に、参照により全体が明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。
【０１０５】
参考文献
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Ｂｕｇａｎｉｍ，Ｙ．，Ｆａｄｄａｈ，Ｄ．Ａ．，Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｗ．，Ｉｔｓｋｏｖｉｃｈ，Ｅ．，Ｍａｒｋｏｕｌａｋｉ，Ｓ．，Ｇａｎｚ，Ｋ．，Ｋｌｅｍｍ，Ｓ．Ｌ．，ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２０１２）．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ａｎｄ  ａ  ｌａｔｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃ  ｐｈａｓｅ．Ｃｅｌｌ  １５０，１２０９−１２２２．
Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｓ．，Ｊｉ，Ｈ．，Ｋａｂａｄｉ，Ａ．Ｍ．，Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｃ．Ａ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｏｕ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｌｅｏｎｇ，Ｋ．Ｗ．（２０１４）．Ａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３，９４０−９４７．
Ｃｈａｖｅｚ，Ａ．，Ｓｃｈｅｉｍａｎ，Ｊ．，Ｖｏｒａ，Ｓ．，Ｐｒｕｉｔｔ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｕｔｔｌｅ，Ｍ．，Ｅ，Ｐ．Ｒ．Ｉ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｋｉａｎｉ，Ｓ．，Ｇｕｚｍａｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，３２６−３２８．
Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｓｈｉ，Ｌ．，Ｋａｔｚ，Ｙ．，Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎ，Ｔ．Ｗ．，Ｒａｎｇａｒａｊａｎ，Ｓ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ，Ｃ．Ｓ．，Ｄａｄｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２０１３）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−ｏｎ，ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２３，１１６３−１１７１．
Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３．
Ｄｉ  Ｓｔｅｆａｎｏ，Ｂ．，Ｓａｒｄｉｎａ，Ｊ．Ｌ．，ｖａｎ  Ｏｅｖｅｌｅｎ，Ｃ．，Ｃｏｌｌｏｍｂｅｔ，Ｓ．，Ｋａｌｌｉｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｖｉｃｅｎｔ，Ｇ．Ｐ．，Ｌｕ，Ｊ．，Ｔｈｉｅｆｆｒｙ，Ｄ．，Ｂｅａｔｏ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒａｆ，Ｔ．（２０１４）．Ｃ／ＥＢＰａｌｐｈａ  ｐｏｉｓｅｓ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０６，２３５−２３９．
Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｍｏｒｓｕｔ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｂｒａｒ，Ｇ．Ａ．，Ｔｏｒｒｅｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ，Ｎ．，Ｂｒａｎｄｍａｎ，Ｏ．，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｅ．Ｈ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  １５４，４４２−４５１．
Ｈｅｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｅｎｇ，Ｂ．，Ｈａｎ，Ｊ．，Ｊｉａｎｇ，Ｊ．，Ｋｒａｕｓ，Ｐ．，Ｎｇ，Ｊ．Ｈ．，Ｏｒｌｏｖ，Ｙ．Ｌ．，Ｈｕｓｓ，Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｌｕｆｋｉｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｎｒ５ａ２  ｃａｎ  ｒｅｐｌａｃｅ  Ｏｃｔ４  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，１６７−１７４．
Ｈｉｌｔｏｎ，Ｉ．Ｂ．，Ｄ’Ｉｐｐｏｌｉｔｏ，Ａ．Ｍ．，Ｖｏｃｋｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｇ．Ｅ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｔ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｃ．Ａ．（２０１５）．Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３，５１０−５１７．
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Ｈｕ，Ｊ．，Ｌｅｉ，Ｙ．，Ｗｏｎｇ，Ｗ．Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｋ．Ｃ．，Ｈｅ，Ｘ．，Ｙｏｕ，Ｗ．，Ｚｈｏｕ，Ｒ．，Ｇｕｏ，Ｊ．Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｄｉｒｅｃｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  Ｏｃｔ４  ｇｅｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＴＡＬＥ  ａｎｄ  Ｃａｓ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４２，４３７５−４３９０．
Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．，Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．，Ｈａｕｅｒ，Ｍ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．（２０１２）．Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１．
Ｋａｇｅｙ，Ｍ．Ｈ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｉｌｏｄｅａｕ，Ｓ．，Ｚｈａｎ，Ｙ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｄ．Ａ．，ｖａｎ  Ｂｅｒｋｕｍ，Ｎ．Ｌ．，Ｅｂｍｅｉｅｒ，Ｃ．Ｃ．，Ｇｏｏｓｓｅｎｓ，Ｊ．，Ｒａｈｌ，Ｐ．Ｂ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｍｅｄｉａｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｏｈｅｓｉｎ  ｃｏｎｎｅｃｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６７，４３０−４３５．
Ｋｅａｒｎｓ，Ｎ．Ａ．，Ｐｈａｍ，Ｈ．，Ｔａｂａｋ，Ｂ．，Ｇｅｎｇａ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｍａｅｈｒ，Ｒ．（２０１５）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｃａｓ９−ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，４０１−４０３．
Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｍ．Ｄ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ａ．Ｅ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．，Ｂａｒｃｅｎａ，Ｃ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，５８３−５８８．
Ｌｉｕ，Ｘ．Ｓ．，Ｗｕ，Ｈ．，Ｊｉ，Ｘ．，Ｓｔｅｌｚｅｒ，Ｙ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｃｚａｕｄｅｒｎａ，Ｓ．，Ｓｈｕ，Ｊ．，Ｄａｄｏｎ，Ｄ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２０１６）．Ｅｄｉｔｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  １６７，２３３−２４７  ｅ２１７．
Ｍａｅｋａｗａ，Ｍ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｓｈｉｂｕｋａｗａ，Ｒ．，Ｋｏｄａｎａｋａ，Ｉ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｈ．，Ｇｏｓｈｉｍａ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２０１１）．Ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｂｙ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｇｌｉｓ１．Ｎａｔｕｒｅ  ４７４，２２５−２２９．
Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ａａｃｈ，Ｊ．，Ｓｔｒａｎｇｅｓ，Ｐ．Ｂ．，Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．，Ｍｏｏｓｂｕｒｎｅｒ，Ｍ．，Ｋｏｓｕｒｉ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．（２０１３ａ）．ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，８３３−８３８．
Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．，Ａａｃｈ，Ｊ．，Ｇｕｅｌｌ，Ｍ．，ＤｉＣａｒｌｏ，Ｊ．Ｅ．，Ｎｏｒｖｉｌｌｅ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．（２０１３ｂ）．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６．
Ｐｏｌｏ，Ｊ．Ｍ．，Ａｎｄｅｒｓｓｅｎ，Ｅ．，Ｗａｌｓｈ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｂ．Ａ．，Ｎｅｆｚｇｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｌｉｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｏｒｋｅｎｔ，Ｍ．，Ａｐｏｓｔｏｌｏｕ，Ｅ．，Ａｌａｅｉ，Ｓ．，Ｃｌｏｕｔｉｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｏａｄｍａｐ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １５１，１６１７−１６３２．
Ｐｏｌｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｒ．，Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．，Ｋｏｃａｋ，Ｄ．Ｄ．，Ｖｏｃｋｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｌｅｄｓｏｅ，Ｐ．，Ｓｏｎｇ，Ｌ．，Ｓａｆｉ，Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｇ．Ｅ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｔ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｃ．Ａ．（２０１５）．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ，ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｂｙ  ＴＡＬＥ−  ａｎｄ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２５，１１５８−１１６９．
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Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｍ．，Ｔｈｕｍｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．，Ｄｅｌ  Ｓｏｌ  Ｋｅｙｅｒ，Ｍ．，Ｗｉｔｔｂｒｏｄｔ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍａｔｅｏ，Ｊ．Ｌ．（２０１５）．ＣＣＴｏｐ：  Ａｎ  Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ，Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌｉａｂｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  Ｔａｒｇｅｔ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０，ｅ０１２４６３３．
Ｓｚａｂｏ，Ｐ．Ｅ．，Ｈｕｂｎｅｒ，Ｋ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｍａｎｎ，Ｊ．Ｒ．（２００２）．Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １１５，１５７−１６０．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００６）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １２６，６６３−６７６．
Ｔａｎｅｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｅ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．，Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｖａｌｅ，Ｒ．Ｄ．（２０１４）．Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔａｇｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １５９，６３５−６４６．
Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．，Ｄ’Ｉｐｐｏｌｉｔｏ，Ａ．Ｍ．，Ｓｏｎｇ，Ｌ．，Ｓａｆｉ，Ａ．，Ｓｈｉｖａｋｕｍａｒ，Ｎ．Ｋ．，Ｋａｂａｄｉ，Ａ．Ｍ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｔ．Ｅ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｇ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｃ．Ａ．（２０１５）．Ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｓｔａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，１１４３−１１４９．
Ｗｅｉ，Ｚ．，Ｇａｏ，Ｆ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｌｙｕ，Ｊ．，Ａｎ，Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｌｕ，Ｗ．（２０１３）．Ｋｌｆ４  ｏｒｇａｎｉｚｅｓ  ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｏｃｔ４  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １３，３６−４７．
Ｗｈｙｔｅ，Ｗ．Ａ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｄ．Ａ．，Ｈｎｉｓｚ，Ｄ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｋａｇｅｙ，Ｍ．Ｈ．，Ｒａｈｌ，Ｐ．Ｂ．，Ｌｅｅ，Ｔ．Ｉ．，ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｍａｓｔｅｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ｓｕｐｅｒ−ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｔ  ｋｅｙ  ｃｅｌｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌ  １５３，３０７−３１９．
Ｙｅｏｍ，Ｙ．Ｉ．，Ｆｕｈｒｍａｎｎ，Ｇ．，Ｏｖｉｔｔ，Ｃ．Ｅ．，Ｂｒｅｈｍ，Ａ．，Ｏｈｂｏ，Ｋ．，Ｇｒｏｓｓ，Ｍ．，Ｈｕｂｎｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｈ．Ｒ．（１９９６）．Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｃｔ−４  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２，８８１−８９４．
Ｚａｌａｔａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｅ．，Ａｌｍｅｉｄａ，Ｒ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｅ．Ｈ．，Ｌａ  Ｒｕｓｓａ，Ｍ．，Ｔｓａｉ，Ｊ．Ｃ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｄｕｅｂｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｃｅｌｌ  １６０，３３９−３５０．
【図１−１】
2021509577.tif 000011
【図１−２】
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【図２−１】
2021509577.tif 000013
【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
2021509577.tif 000019
【図５−１】
2021509577.tif 000020
【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
2021509577.tif 000023
【図６−２】
2021509577.tif 000024
【図７−１】
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【図７−２】
2021509577.tif 000026
【図８−１】
2021509577.tif 000027
【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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