(57)【要約】  室温で注入可能な熱応答性ヒドロゲルは、Ｐ４０７ポロキサマーのベースヒドロゲル、キトサン、２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン、およびゲニピンを含む。キトサンおよびゲニピンは、キトサンがゲニピンと架橋されるヒドロゲル内で、相互貫入骨格を形成する。化学療法薬は、ヒドロゲルの熱応答性を失うことなく、単独または組み合わせで、有効量でヒドロゲルに加えることができる。固形癌の腫瘍内治療における熱応答性ヒドロゲルの治療的使用も、記載する。
2021501804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱応答性ヒドロゲルであって、
場合によりポロキサマーＰ１８８と組み合わされるポロキサマーＰ４０７から選択される、１５〜２５％のポロキサマーポリマー（ｗ／ｗ）と、
０．１〜１．０％のキトサン（ｗ／ｗ）と、
０．０５〜０．２０％のゲニピン（ｗ／ｗ）と、
５〜２０％の包接複合体化剤（ｗ／ｗ）と、
水性基剤と、
を含み、未硬化である、熱応答性ヒドロゲル。
【請求項２】
前記包接複合体化剤がβ−シクロデキストリンである、請求項１に記載の熱応答性ヒドロゲル。
【請求項３】
１５〜１８％のポロキサマーポリマー（ｗ／ｗ）を含む、請求項１または２に記載の熱応答性ヒドロゲル。
【請求項４】
０．０５〜０．１５％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の熱応答性ヒドロゲル。
【請求項５】
１つの化学療法剤または複数の化学療法剤の組み合わせを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の熱応答性ヒドロゲル。
【請求項６】
前記化学療法剤が、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチンとパクリタキセルとの組み合わせ、またはゲムシタビンとパクリタキセルとの組み合わせ、から選択される、請求項５に記載の熱応答性ヒドロゲル。
【請求項７】
造影剤を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の熱応答性ヒドロゲル。
【請求項８】
凍結乾燥された形態の、請求項１〜７のいずれかに記載の熱応答性ヒドロゲル。
【請求項９】
約０．１％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の熱応答性ヒドロゲル。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の熱応答性ヒドロゲルであって、
１５〜２５％の熱応答性ベースヒドロゲル（ｗ／ｗ）と、
０．１〜１．０％のキトサン（ｗ／ｗ）と、
０．０５〜０．１５％のゲニピン（ｗ／ｗ）と、
５〜２０％の２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ｗ／ｗ）と、
化学療法剤と、
水性基剤と、
を含む熱応答性ヒドロゲル。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の熱応答性ヒドロゲルであって、
１５〜１８％の熱応答性ベースヒドロゲル（ｗ／ｗ）と、
０．１〜１．０％のキトサン（ｗ／ｗ）と、
０．０５〜０．１５％ゲニピン（ｗ／ｗ）と、
５〜２０％の２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ｗ／ｗ）と、
化学療法剤と、
水性基剤と、
を含む熱応答性ヒドロゲル。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の熱応答性ヒドロゲルであって、
１５〜１８％の熱応答性ベースヒドロゲル（ｗ／ｗ）と、
０．１〜１．０％のキトサン（ｗ／ｗ）と、
０．０５〜０．１５％のゲニピン（ｗ／ｗ）と、
５〜２０％の２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ｗ／ｗ）と、
化学療法剤と、
造影剤と、
水性基剤と、
を含む熱応答性ヒドロゲル。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の熱応答性ヒドロゲルであって、前記ヒドロゲルを対象の腫瘍内に投与されるかまたは腫瘍切除部位に投与される、前記対象の固形腫瘍の治療方法で使用するための、熱応答性ヒドロゲル。
【請求項１４】
化学療法剤の効果に対して対象の固形腫瘍を感作する方法で使用するための、請求項１〜１２のいずれかに記載の熱応答性ヒドロゲル。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれかに記載の熱応答性ヒドロゲルであって、前記ヒドロゲルが対象の腫瘍内に投与されるかまたは腫瘍切除部位に投与される、前記対象の固形腫瘍の成長を阻害する方法で使用するための、熱応答性ヒドロゲル。
【請求項１６】
熱応答性ヒドロゲルの製造方法であって
包接複合体化剤およびキトサンの水性基剤中の第一溶液を準備する工程と、
前記溶液を１０℃未満に冷却する工程と、
ポロキサマーを前記溶液に加えて、１０℃未満の温度で混合する工程と、
前記溶液を１０℃未満の温度で、少なくとも４時間保存して水和させる工程と、
少なくとも４時間攪拌しながら前記水和溶液にゲニピンを加えて、前記熱応答性ヒドロゲルを形成する工程と、
任意で、前記熱応答性ヒドロゲルを凍結乾燥する工程と、
を含む方法。
【請求項１７】
前記包接複合体化剤が２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記熱応答性ヒドロゲルが凍結乾燥され、水溶性化学療法剤を含む、請求項１６または１７に記載の方法であって、前記水溶性化学療法剤を水性基剤に溶解して水性化学療法剤溶液を形成する工程、および、前記水性化学療法剤溶液中で前記凍結乾燥した熱応答性ヒドロゲルを再水和する工程、を含む方法。
【請求項１９】
前記熱応答性ヒドロゲルが難水溶性化学療法剤を含む、請求項１６または１７に記載の方法であって、前記包接複合体化剤の一部および前記難水溶性化学療法剤を含む包接複合体を形成する工程、ならびに、前記包接複合体を前記包接複合体化剤の残りと共に前記第一溶液に加える工程、を含む方法。
【請求項２０】
熱応答性ヒドロゲルであって、
場合によりポロキサマーＰ１８８と組み合わされるポロキサマーＰ４０７から選択される、１５〜２５％のポロキサマーポリマー（ｗ／ｗ）と、
０．１〜１．０％のキトサン（ｗ／ｗ）と、
０．０５〜０．２０％のゲニピン（ｗ／ｗ）と、
５〜２０％の包接複合体化剤（ｗ／ｗ）と、
水性基剤と、
を含む熱応答性ヒドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱応答性ヒドロゲルに関するさらに、熱応答性ポリマー溶液の腫瘍内投与により、増殖性障害を治療する方法も企図されている。
【背景技術】
【０００２】
全身化学療法は、放射線および手術と共に、様々な固形癌の治療のための最も一般的なアプローチである。しかしながら、全身化学療法は一般に、例えば免疫抑制および臓器障害など、多くの場合で用量制限となり得る、様々な中毒性オフサイト副作用を伴う。オフターゲット副作用による、従来の化学療法治療中の生活の質の低下は、十分に報告されており、患者に身体的、心理的および社会的な影響をもたらす。全身投与された化学療法剤が標的部位に到達すると、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）が変化するため、腫瘍塊への浸透が困難になる。腫瘍の３次元構造は、全身化学療法に対する反応を判定できる。薬物は、有意な細胞毒性を発揮するのに十分な濃度で、腫瘍内のできるだけ多くの生存細胞にアクセスしなければならない。しかしながら、これは、異常な血管の増殖および腫瘍の不安定な血流によって妨げられる可能性がある。これはさらに、腫瘍内に酸性領域および低酸素領域をもたらし得る。腫瘍の細胞内ｐＨは、中性からアルカリ性まで変化する可能性がある一方で、細胞外ｐＨは通常、正常組織よりも低いため、ドキソルビシンなどの弱塩基性で正に帯電した薬物は、膜透過性が低いために、細胞への取り込みが悪い場合がある。さらに、腫瘍の芯での間質圧が上昇すると、薬物分子の組織浸潤が低下する可能性がある。全身投与された薬物分子が、従来の静脈内化学療法を介してその目標に到達して、効果を発揮するために克服しなければならない、ＴＭＥの固有の複雑さおよび生理学的バリアを考慮すると、より対象を絞った、制御可能なアプローチが必要である。
【０００３】
生理食塩水中の化学療法剤を腫瘍塊内へ直接注入（ＩＴ点滴注入）することは、より目標を絞った、作用部位への化学療法剤送達を達成する方法として検討されてきた。しかしながら、化学療法剤溶液の直接ＩＴ点滴注入は、これらの薬物の、腫瘍部位からの急速なクリアランスによって制約され、その結果、不正確で予測不可能な投薬、および周辺組織への毒性が生じる。
【０００４】
したがって、腫瘍内での滞留および腫瘍内部からの化学療法剤の放出制御を促進できる薬物送達システムの開発が、注目されてきた。熱応答性ヒドロゲルに組み込まれた化学療法剤の腫瘍内投与により、腫瘍内に局所的かつ持続的な薬物の放出を直ちにもたらすことができ、反復投与の必要性がなくなる可能性がある。そのようなヒドロゲルは、標的組織に直接移植可能であるため、組織浸透に対するＴＭＥバリアを回避し、非標的組織への暴露ならびに全身送達およびＩＴ注入に関連する急速な薬物クリアランスを減らすのに役立ち得る。
【０００５】
しかしながら、腫瘍内送達のための熱応答性ヒドロゲルへの関心は顕著であるものの、部位の治療へアクセスできないこと、送達後に画像化できないこと、多くの場合における作用部位での急速な崩壊に関連する課題、および非水性薬物システムを可溶化しにくいことによって、これまでそのトランスレーショナルプログレス（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ）が制限されてきた。
【０００６】
局所領域への化学療法薬送達の問題に対処しようとする、現在利用可能なシステムの数は、限定されている。現在利用可能な製品の大部分は、薬物送達および塞栓形成アプローチの組み合わせの使用による、肝細胞癌（ＨＣＣ）および結腸直腸肝転移の治療に重点を置いている。これは、主要な肝動脈から発生する腫瘍供給動脈に、塞栓剤＋／−化学療法薬を送達して腫瘍塊への血液供給を遮断するためにカテーテルを配置することを含む。それは、ＴＡＥ（肝動脈塞栓術）またはＴＡＣＥ（肝動脈化学塞栓術）としても知られ、虚血および細胞死をもたらす（動脈内療法）。肝臓は、十分に血管が発達した器官であるので、他の血管によって、健康な他の組織への適切な血液供給が維持され得る。一般的に使用される塞栓剤には、ヨウ化油（リピオドール）および、例えばＤＣ  Ｂｅａｄｓ、ＤＣ  Ｌｕｍｉ  Ｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｐｅａｒｌ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓなどの塞栓ビーズが含まれ、これに薬物、例えばドキソルビシン、イリトネタカンまたは、例えばイットリウムなどのガンマ線放出剤を搭載することができる。これは、この技術を他の腫瘍へトランスレーション（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）する際に制約要因となり得る。健康な組織が損なわれないことを確認するために、十分に血管が発達した器官が必要とされるからである。
【０００７】
別の局所領域薬物送達システムは、神経膠芽腫患者の切除部位に化学療法薬カルムスチンを送達するために使用されるウェーハーである、グリアデルウェハーである。これらのアプローチは、化学療法薬の局所領域薬物送達に重点を置いているが、製剤の種類は、すべての場合において提案された発明とは著しく異なる。
【０００８】
しかしながら、近年、文献の数が増加するにつれて、熱応答性ヒドロゲル薬物送達システムに大きな関心が寄せられている。
【０００９】
これらの文献の多くは、ポロキサマーとキトサン、および／またはシクロデキストリン、および／または化学療法薬との組み合わせを検討している。（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）は、フェキソフェナジンＨＣｌの送達用の、ポロキサマー４０７／ＨＰ−β−ＣＤ／キトサン製剤について説明している。しかしながら、製剤は、最終成分（ゲニピンの不存在）、その全体的な組成、および製造方法において異なる。（Ｆａｔｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）は、血管内塞栓剤として、イメージング剤と組み合わせた感熱性ヒドロゲルを使用する可能性を探究したが、使用された熱応答性ヒドロゲルシステムは、キトサン／βＧＰを基にした。
Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．は、注入可能な腫瘍内送達プラットフォームとして利用可能な、ポロキサマーＰ４０７、キトサン、Ｈβ−ＣＤおよびゲニピンを含む熱応答性ヒドロゲルについて説明している。ゲルの溶解の遅延に必要な、ゲニピンの架橋作用を開始するために、ポリマー溶液を３７℃で２４時間硬化させる必要があった。２４時間硬化した後、ポリマー溶液は、約２５℃でゾル−ゲル転移を示した。２５℃というゾル−ゲル転移温度は、より温暖な環境では、製剤化後、送達前でもゲル化を引き起こす可能性があり、臨床送達中のゲル化が急速で早すぎる傾向があるので、問題であった。さらに、化学療法剤（シスプラチン）を加えると、ヒドロゲルは、臨床的に適切な熱応答性を失った。ヒドロゲルの保存の問題は、凍結乾燥形式でポリマー溶液を提供し、手術で使用する前に再水和することで克服できるが、架橋を活性化するために、使用前に再水和したポリマー溶液を２４時間硬化させなければならないという要件は、臨床的状況では実用的でない。
【００１０】
本発明の目的は、上記の問題の少なくとも１つを克服することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
出願人は、Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．のヒドロゲルが、ゲニピンのレベルを、典型的には０．２％（ｗ／ｗ）未満まで下げることにより、改善されることを発見した。特に、この変更により、ヒドロゲルに臨床的に変換可能なゾル−ゲル転移温度（例えば２８〜３０℃、ヒドロゲルＧＦ１、ＧＦ２およびＧＦ４と比較したヒドロゲルＧＦ３およびＧＦ５表１を参照）がもたらされ、ヒドロゲルが、臨床現場でより適切に保存および注入できるようになり、硬化時間を必要としないが、熱応答性は維持するヒドロゲルが提供される（図２および表１）。これにより、ヒドロゲルは、２４時間の硬化時間の要件なく直ちに使用できるので、ポリマー溶液が凍結乾燥形式で提供され、病院環境で再水和され得る臨床現場にとって、理想的になる。さらに、ｉｎ−ｖｉｖｏ腫瘍内の研究では、驚くべきことに、本発明によるヒドロゲルが注入部位に１４日間保持され（図１４）、腫瘍体積の増加が大幅に減少し（図１５）、マウスにおいて最大１４日間、急性のオフサイト毒性を引き起こさなかった（図１６）。さらに、臨床的に適切な熱応答性を維持しながら、任意で化学療法剤を本発明のヒドロゲルに加えることができる（図１７および１８）。
【００１２】
一実施形態において、ポロキサマーのレベルは、２０％（ｗ／ｗ）未満、例えば１７％に低減される。これにより、貯蔵弾性率Ｇ’が１０，０００  Ｐａを超えて増加し、より頑強なゲルがｉｎ−ｖｉｖｏで提供され、腫瘍内でのゲルの持続性の向上（表１、図１４）、次いで腫瘍体積の減少へとつながる（図１５）。
【００１３】
本発明の第１の態様によれば
熱応答性ベースヒドロゲル（すなわち、ポロキサマーポリマー）、
ヒドロゲル強化剤（すなわちキトサン）、
任意で包接複合体化剤（すなわち、β−シクロデキストリン、例えば２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ））、
ゲニピン、および
水性基剤含むヒドロゲルが提供される。
【００１４】
一実施形態では、ヒドロゲルは
１５〜２５％の熱応答性ベースヒドロゲル（すなわち、ポロキサマーポリマー）、
ヒドロゲル強化剤（すなわち、キトサン）、
任意で包接複合体化剤（すなわち、β−シクロデキストリン、例えば２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ））、
０．０５〜０．２５％のゲニピン、および
水性基剤を含む。
【００１５】
一実施形態では、ヒドロゲルは室温で注入可能であり、
１５〜１８％の熱応答性ベースヒドロゲル（すなわち、ポロキサマーポリマー）、
ヒドロゲル強化剤（すなわち、キトサン）、
包接複合体化剤（すなわち、β−シクロデキストリン、例えば２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ））、
ゲニピン、および
水性基剤を含む。
【００１６】
生理学的温度で、ヒドロゲル強化剤は、ヒドロゲル強化剤がゲニピンと架橋される熱応答性ヒドロゲル内に、相互貫入骨格を形成する。
【００１７】
典型的には、ヒドロゲルは、熱応答性ヒドロゲルである。典型的には、ヒドロゲルは、未硬化である。
【００１８】
一実施形態では、ヒドロゲル強化剤は、メチルセルロース、デキスタン、カラギーナン、キトサン、およびプルロニックＲから選択される。
【００１９】
一実施形態では、ヒドロゲル強化剤は、キトサンである。
【００２０】
一実施形態では、キトサンは、キトサンがゲニピンと架橋されているヒドロゲル内で、相互貫入骨格を形成する。
【００２１】
一実施形態では、ポロキサマーは、任意にポロキサマー１８８などの追加ポロキサマーと組み合わせたポロキサマー４０７である。
【００２２】
一実施形態では、熱応答性ベースヒドロゲルは、ポロキサマーおよび包接複合体化剤、例えばシクロデキストリンを含む。一実施形態では、包接複合体化剤は、β−シクロデキストリン、例えば、２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンである。
【００２３】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、活性剤を含む。一実施形態では、活性剤は、１つ以上の化学療法剤である。一実施形態では、活性剤は、細胞である。一実施形態では、活性剤は、モノクローナル抗体などの抗体、または抗体断片である。一実施形態では、活性剤は、核酸である（任意で、プラスミドなどの核酸ベクターの一部として提供される）。
【００２４】
一実施形態では、化学療法剤は、水溶性である。一実施形態では、化学療法剤は、難水溶性である。
【００２５】
一実施形態では、化学療法剤は、化学療法剤および２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンなどの包接複合体化剤を含む、包接複合体の形態でヒドロゲル内に分散される。
【００２６】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、造影剤を含む。一実施形態では、造影剤は、ヨウ素化造影剤である。
【００２７】
一実施形態では、ヒドロゲルは、室温（すなわち、１８〜２３℃）で液体（すなわち、注入可能）である。
【００２８】
一実施形態では、ヒドロゲルは、体温（２４〜３７℃）で固体または半固体である。
【００２９】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、典型的には１５〜２５％のポロキサマーポリマー（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、１７〜２２％の熱応答性ポリマー（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、最大１９％のポロキサマーポリマー、例えば１５〜１９％、１５〜１８％または１６〜１８％または約１７％のポロキサマーポリマー（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、ポロキサマーポリマーは、水性基剤の中に提供される。より低いレベル、例えば２０％、１９％または１８％未満のポロキサマーの使用は、驚くべきことに、より高い貯蔵弾性率を有するヒドロゲルをもたらし、これにより、ゲルがより長い期間、例えば最大長１４日間、ｉｎ−ｖｉｖｏで持続することが可能になる。
【００３０】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．１〜１．０％のゲル強化剤（すなわち、キトサン）（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．３〜０．５％のゲル強化剤（すなわち、キトサン）（ｗ／ｗ）を含む。
【００３１】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、５〜２０％の包接複合体化剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、８〜１５％の包接複合体化剤（すなわち、２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン）（ｗ／ｗ）を含む。
【００３２】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．０５〜２．０％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．０５〜０．３％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．５〜０．２％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．０５〜０．１５％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、約０．１％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む。
【００３３】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．０１から１０％の化学療法剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．１〜５％の化学療法剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．１〜１．０％の化学療法剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、１．０〜５．０％の化学療法剤（ｗ／ｗ）を含む。
【００３４】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、３７℃で少なくとも８，０００Ｐａの貯蔵弾性率Ｇ’を有する。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、３７℃で少なくとも９，０００Ｐａの貯蔵弾性率Ｇ’を有する。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、３７℃で少なくとも１０，０００Ｐａの貯蔵弾性率Ｇ’を有する。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、３７℃で少なくとも１１，０００Ｐａの貯蔵弾性率Ｇ’を有する。
【００３５】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、造影剤、例えば、約１〜１０％の造影剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、２〜７％の造影剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、造影剤は、ヨウ素化造影剤である。
【００３６】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、
ポロキサマー、
０．０５〜０．１５％のゲニピン（ｗ／ｗ）と架橋したキトサンを含むヒドロゲル内の、相互貫入骨格、
β−シクロデキストリン、
１つ以上の化学療法剤、
任意で造影剤、および
水性基剤を含むか、または本質的にそれらからなる。
【００３７】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、
１５〜２５％のポロキサマー（ｗ／ｗ）、
０．１〜１．０％のキトサン（ｗ／ｗ）、
０．０５〜０．１５％ゲニピン（ｗ／ｗ）、
５〜２０％のβ−シクロデキストリン（すなわち、２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン）（ｗ／ｗ）、
任意で１〜１０％の造影剤（ｗ／ｗ）、
任意で１つ以上の化学療法剤、および
水性基剤を含むか、または本質的にそれらからなる。
【００３８】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、
１５〜１８％の熱応答性ベースヒドロゲル（ｗ／ｗ）、
０．３〜０．７％のキトサン（ｗ／ｗ）、
０．０５〜０．１５％のゲニピン（ｗ／ｗ）、
８〜１５％の２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ｗ／ｗ）、
１〜１０％の造影剤（ｗ／ｗ）、
任意で、１つ以上の化学療法剤、および
水を含むか、または本質的にそれらからなる。
【００３９】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、
約１７％の熱応答性ベースヒドロゲル（ｗ／ｗ）、
約０．５％のキトサン（ｗ／ｗ）、
約０．１％のゲニピン（ｗ／ｗ）、
５〜２０％の２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ｗ／ｗ）、
１〜１０％の造影染料（ｗ／ｗ）、
１つ以上の化学療法剤、および
水性基剤を含むか、または本質的にそれらからなる。
【００４０】
本発明はまた、本発明による熱応答性ヒドロゲルを凍結乾燥形態で提供する。
【００４１】
本発明はまた、本発明による熱応答性ヒドロゲルを含むシリンジを提供する。
【００４２】
本発明はまた、対象の増殖性障害を治療または予防する方法で使用するための、本発明による熱応答性ヒドロゲルを提供する。
【００４３】
本発明はまた、対象の固形腫瘍を治療する方法において使用するための、本発明による熱応答性ヒドロゲルを提供し、ここでヒドロゲルは、対象の腫瘍内に投与されるか、または腫瘍を手術で切除した後の部位に投与される。
【００４４】
本発明はまた、対象の固形腫瘍（または固形腫瘍が切除された辺縁）を化学療法剤の効果に対して感作する方法で使用するための、本発明による熱応答性ヒドロゲルを提供する。
【００４５】
本発明の熱応答性ヒドロゲルは、様々な固形腫瘍癌における腫瘍負荷を軽減するための付随的治療としての、腫瘍内注入可能な薬物送達システムとして、単独で、または他の腫瘍学的治療アプローチ、例えば全身化学療法、手術、放射線治療と組み合わせて使用できる。それはまた、治療の結果を改善するために、切除処置、例えばＲＦＡ、ＭＷＡ、ＩＲＥと組み合わせて使用してもよい。ヒドロゲルの腫瘍内注入は、画像誘導システムおよび標準的な低侵襲処置、例えば、経皮注入、内視鏡超音波（ＥＵＳ）または気管支超音波（ＥＢＵＳ）などを使用して達成できる。それを使用して手術後の切除部位を裏打ちし、腫瘍成長の再発の可能性を減らすこともできる。
【００４６】
本発明はまた、熱応答性ヒドロゲルの製造方法であって、
（例えば、２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンなどのβ−シクロデキストリン）およびゲル強化剤（例えば、キトサン）の水性基剤中の第一溶液を準備する工程、
溶液を１０℃未満（好ましくは６℃未満）に冷却する工程、
熱応答性ベースヒドロゲル（例えば、ポロキサマー）を溶液に加えて、１０℃未満（好ましくは６℃未満）の温度で混合する工程、
溶液を１０℃未満（好ましくは６℃未満）の温度で、少なくとも４時間保存して水和させる工程、および
少なくとも４時間攪拌しながら水和溶液にゲニピンを加えて、熱応答性ヒドロゲルを形成する工程、および
任意で、熱応答性ヒドロゲルを凍結乾燥する工程を含む方法を提供する。
【００４７】
典型的には、方法は、ヒドロゲルを硬化する工程を含まない。
【００４８】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、水溶性化学療法剤を含み、方法は、水溶性化学療法剤を第一溶液に加える工程を含む。一実施形態では、水溶性化学療法剤は、水性基剤に溶解され、第一溶液に加えられる。
【００４９】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、凍結乾燥され、水溶性化学療法剤を含み、方法は、水溶性化学療法剤を水性基剤に溶解して水性化学療法剤溶液を形成する工程、および凍結乾燥された熱応答性ヒドロゲルを水性化学療法剤溶液中で再水和する工程を含む。
【００５０】
一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、難水溶性化学療法剤を含み、方法は、β−シクロデキストリンの一部および難水溶性化学療法剤を含む包接複合体を形成する工程、ならびに包接複合体を残りのβ−シクロデキストリンと共に、第一溶液に加える工程を含む。一実施形態では、包接複合体は、凍結乾燥される。一実施形態では、β−シクロデキストリンの約３分の２を使用して包接複合体を作製し、残りを遊離β−シクロデキストリンとして加える。
【００５１】
一実施形態では、凍結乾燥されたヒドロゲルは、活性剤の水溶液、典型的には可溶性化学療法剤の水溶液で再構成される。
【００５２】
本発明の他の態様および好ましい実施形態は、以下に示される他の請求項で定義および説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】例１  ＧＦ３−５（左）および例４（右）の調製の概要図である。
【図２】ＡＲ−１０００レオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して得られた、２９℃のゾル−ゲル転移温度を示す、ブランク（薬物不搭載）熱応答性ヒドロゲルのレオロジー温度応答曲線（例１０）（例１  ＧＦ５に従って調製）を示す図である。Ｇ’は、貯蔵弾性率を示す。
【図３】ＡＲ−１０００レオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して得られた、シスプラチンおよびパクリタキセルで薬物搭載した熱応答性ヒドロゲルの、２３℃でゾル−ゲル転移を示すレオロジー温度応答曲線（例１０）（例３に従って調製）を示す図である。パクリタキセルは、シクロデキストリン複合体としてシクロデキストリンの総濃度に組み込まれた。Ｇ’は、貯蔵弾性率を示す。
【図４】ＡＲ−１０００レオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して得られた、シスプラチンおよびパクリタキセルで薬物搭載した熱応答性ヒドロゲルの、３１℃でゾル−ゲル転移を示す、レオロジー温度応答曲線（例１０）（例４に従って調製）を示す図である。パクリタキセルは、製剤に加えられたシクロデキストリン総量の３３．３３％のシクロデキストリン複合体として組み込まれた。Ｇ’は、貯蔵弾性率を示す。
【図５】ＡＲ−１０００レオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して得られた、ゲムシタビンおよびパクリタキセルで薬物搭載した熱応答性ヒドロゲルの、３０℃でゾル−ゲル転移を示すレオロジー温度応答曲線（例１０）（例５に従って調製）を示す図である。パクリタキセルは、製剤に加えられたシクロデキストリンの総量の５０％のシクロデキストリン複合体として組み込まれた。Ｇ’は、貯蔵弾性率を示す。
【図６】ＡＲ−１０００レオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して得られた、ヨウ素化造影剤を含む熱応答性ヒドロゲルの、２８℃でゾル−ゲル転移を示すレオロジー温度応答曲線（例１０）を示す図である。Ｇ’は、貯蔵弾性率を示す。
【図７Ａ】ブランク熱応答性ヒドロゲル、ならびにパクリタキセルおよびシスプラチンで薬物搭載した熱応答性ヒドロゲル（それぞれ例１および４に従って調製）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ崩壊（例１１）（３７℃にて）を示す図である。
【図７Ｂ】ヨウ素化造影剤を含む、ブランク熱応答性ヒドロゲル、ならびにパクリタキセルおよびシスプラチンで薬物搭載した熱応答性ヒドロゲル（それぞれ例６および例７に従って調製）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ崩壊（例１１）（３７℃にて）を示す図である。
【図８Ａ】パクリタキセルおよびシスプラチンの、薬物搭載熱応答性ヒドロゲル（例４に従って調製）からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロファイル（３７℃にて）（例１２）を示す図である。
【図８Ｂ】パクリタキセルおよびシスプラチンの、ヨウ素化造影剤を含む薬物搭載熱応答性ヒドロゲル（例７に従って調製）からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロファイル（３７℃にて）（例１２）を示す図である。
【図９】ブランク熱応答性ヒドロゲル、薬物搭載熱応答性ヒドロゲルおよびヨウ素化造影剤含有熱応答性ヒドロゲルについて実施した定常流動（例１３）のレオグラムを示す図である。せん断応力が増加すると、すべてのヒドロゲルにおいて粘度が低下し、製剤のずり流動化挙動を示している。
【図１０】ヨウ素化造影剤を含むブランク熱応答性ヒドロゲル（例５に従って調製）の注入可能性の例（例１４）を示す図である。
【図１１】ヨウ素化イメージング剤を含むブランク熱応答性ヒドロゲル（例５に従って調製）の超音波（左）およびＣＴ（右）画像（例１５）を示す図である。
【図１２Ａ】異なる用量のブランク熱応答性ヒドロゲルでの処理後２４時間および４８時間における、ヒト非小細胞肺癌細胞株、Ａ５４９細胞の生存率への影響（例１６）を示す図である。
【図１２Ｂ】異なる用量の薬物搭載熱応答性ヒドロゲルでの処理後２４時間および４８時間における、ヒト非小細胞肺癌細胞株、Ａ５４９細胞の生存率への影響（例１６）を示す図である。示すデータは、平均＋平均の標準誤差（ＳＥＭ）（ｎ＝３）として表示される。（Ａ）＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１（同じ時点でのブランク熱応答性ヒドロゲル０ｕＬとの比較）。（Ｂ）＊＊＊＝ｐ＜０．００１（同じ時点での薬物搭載熱応答性ヒドロゲル０ｕＬとの比較）＃＃＝ｐ＜０．０１（同じ時点での薬物搭載熱応答性ヒドロゲル１０ｕＬとの比較）を示す図である。
【図１３Ａ】異なる用量のブランク熱応答性ヒドロゲルでの処理後２４時間および４８時間における、ヒト膵臓癌細胞株、Ｐａｎｃ−１細胞の生存率への影響を示す図である。
【図１３Ｂ】異なる用量の薬物搭載熱応答性ヒドロゲルでの処理後２４時間および４８時間における、ヒト膵臓癌細胞株、Ｐａｎｃ−１細胞の生存率への影響を示す図である。示すデータは、平均＋平均の標準誤差（ＳＥＭ）（ｎ＝２）として表示される。（Ａ）＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１（同じ時点でのブランク熱応答性ヒドロゲル０ｕＬとの比較）。（Ｂ）＊＊＊＝ｐ＜０．００１（同じ時点での薬物搭載熱応答性ヒドロゲル０ｕＬとの比較）＃＃＝ｐ＜０．０１（同じ時点での薬物搭載熱応答性ヒドロゲル１０ｕＬとの比較）を示す図である。
【図１４】ブランクおよび薬物ヒドロゲル（例１  ＧＦ５（表２）、および例４）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで１４日間、注入部位に保持された（例１７）ことを示す図である。図１４Ａは、蛍光タグ付きヒドロゲルＧＦ６（左）または薬物搭載ヒドロゲル（右）１００μＬの腫瘍内投与後０日目での、生物発光Ａ５４９−ｌｕｃ細胞の代表的オーバーレイ画像である。青色はＡ５４９−ｌｕｃ細胞からの生物発光信号を表し、黄色はブランクまたは薬物ヒドロゲルからの蛍光信号を表す。図１４Ｂは、生理食塩水（左）、ヒドロゲル（中央）、または薬物搭載したヒドロゲル（右）の腫瘍内投与後、０日目（上）および１４日目（下）の代表的蛍光画像である。図１４Ｃは、生理食塩水（上）またはヒドロゲル（下）の腫瘍内投与後１４日目の、切除された腫瘍の代表的写真画像（左）および蛍光画像（右）である。拡大された部分は、肉眼で見えるヒドロゲルを示す。
【図１５】ブランクまたは薬物搭載ヒドロゲル製剤（例１  ＧＦ５、および例４）の腫瘍内投与（例１７）により、腫瘍の体積増加が著しく減少したことを示す図である。図１５Ａは、生理食塩水、ヒドロゲルまたは薬物搭載ヒドロゲルの腫瘍内投与後０日目における、腫瘍体積の倍率変化を示す。示すデータは、平均±ＳＥＭとして表示される（ｎ＝グループあたり６〜７匹のマウス）。有意性は、反復測定の二元配置分散分析を使用して決定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１（同じ時点でのブランクまたは薬物Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ（登録商標）ＣｈｅｍｏＧｅｌの腫瘍体積と比較）。
【図１６】ブランクまたは薬物搭載ヒドロゲル（例１  ＧＦ５、例４および例５）の腫瘍内投与は、最大１４日間、急性オフサイト毒性を引き起こさなかったことを示す図である。生理食塩水、ヒドロゲルまたは薬物搭載ヒドロゲルで処理されたＡ５４９−ｌｕｃ担癌マウスおよびＰａｎｃ−１担癌マウスの体重（図１６Ａ（１）および図１６Ａ（２））、白血球数（図１６Ｂ（１）および図１６Ａ（２））、またはＡ５４９−ｌｕｃ担癌マウスのアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）（左）および尿素（右）の血清中のレベル（図１６Ｃ（１）および図１６Ｃ（２））に著しい変化は見られなかった。示すデータは、平均＋ＳＥＭとして表示される（ｎ＝グループあたり６匹のマウス）。有意性は、（Ｂ）と（Ｃ）に対して一元配置分散分析を使用して決定された。ｎｓ＝ｐ＞０．０５。生理食塩水（上）、ブランクヒドロゲル（中央）または薬物搭載ヒドロゲル（下）の腫瘍内投与１４日後の、切除された肝臓（左）および腎臓（右）組織の代表的なＨ＆Ｅ染色（図１６Ｄ（１）および図１６Ｄ（２））。
【図１７】Ｊｏｒｄａｎゲルへのシスプラチンの添加（ＧＦ１−表１）により、臨床的に適切な温度で熱応答性が失われたことを示す図である。シスプラチンを含むＪｏｒｄａｎゲルの、２０℃〜４０℃の温度スイープのレオグラムは、２０℃でＧ’＞Ｇ’’であることを、グラフの拡大された部分（緑色の円）で示している。示すデータは、標準を表している。Ｇ’は貯蔵弾性率であり、Ｇ’’は損失弾性率である。
【図１８】本発明の製剤へのシスプラチンの添加（ＧＦ５−表１）により、臨床的に適切な範囲で熱応答性を示すヒドロゲルが生成されたことを示す図である。温度スイープのレオグラムは、３１度でＧ’＞Ｇ’’を示し、グラフの拡大された部分に示される。示すデータは、標準を表している。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本明細書で言及されたすべての出版物、特許、特許出願、およびその他の参考文献は、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示され、その内容が完全に列挙されているかのように、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５５】
定義および一般的な設定
本明細書で使用される場合、特に別段の指示がない限り、以下の用語は、当技術分野での用語のより広い（またはより狭い）意味に加えて、以下の意味をもつものとする。
【００５６】
文脈によって他に必要とされない限り、本明細書での単数形の使用は、複数形を含むと解釈されるべきであり、逆もまた同様である。対象物に関連して使用される用語「ａ」または「ａｎ」は、その対象物の１つまたは複数を指すものと解釈される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００５７】
本明細書で使用される用語、「含む」、または「含む」または「含んでいる」などのその変形は、列挙された整数（例えば、ある特徴、要素、特性、性質、方法／プロセス工程または制限）、または整数のグループ（例えば、複数の特徴、要素、特性、性質、方法／プロセス工程または制限）の包含を示すが、他の整数または整数のグループを除外するものではない、と解釈される。したがって、本明細書で使用する場合、「含む」という用語は、包括的または非限定的であり、追加の列挙されていない整数または方法／プロセス工程を除外しない。
【００５８】
本明細書で使用する用語「疾患」は、生理学的機能を損ない、特定の症状に関連する何らかの異常な状態を定義するために使用される。この用語は、病因の性質に関係なく（または実際に疾患の病因論的根拠が確立されているかどうかにかかわらず）、生理学的機能が損なわれている何らかの障害、疾病、異常、病理、病気、症状または症候群を包含するために広く使用される。したがって、感染症、心的外傷、外傷、手術、放射線アブレーション、中毒または栄養不足から生じる状態が含まれる。
【００５９】
本明細書で使用する用語「増殖性障害」は、遠隔または局所部位に広がる可能性を有する、異常な細胞増殖を伴う疾患のグループを指し、特に悪性腫瘍を意味する。典型的には、癌は、食道胃癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫；リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、網膜芽細胞腫、および白血病を含む群から選択される。
【００６０】
本明細書で使用される用語「固形腫瘍」は、（血液悪性腫瘍とは対照的に）器官および組織の癌、理想的には上皮癌を指す。固形腫瘍癌の例には、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、乳癌、中皮腫、腎臓癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、黒色腫、神経内分泌癌が含まれる。好適には、本発明の方法による治療および予後に適する固形腫瘍癌は、上記一覧から選択できる。
【００６１】
本明細書で使用される用語「治療」または「治療する」は、疾患の症状を治癒、改善もしくは軽減するか、またはその原因を取り除く（またはその影響を軽減する）（例えば、病理学的レベルのリソソーム酵素の蓄積の削減）介入（例えば、対象への薬剤の投与）を指す。この場合、この用語は、用語「療法」と同義的に使用される。一実施形態では、本発明の療法は、補助的療法である。一実施形態では、本発明の療法は、本発明のヒドロゲルを別の形態の療法と組み合わせて投与することを含む。
【００６２】
さらに、用語「治療」または「治療する」は、疾患の発症もしくは進行を防止もしくは遅延するか、または治療された集団内での発生率を低減（または根絶）する介入（例えば、対象への薬剤の投与）を指す。この場合、治療という用語は、用語「予防」と同義的に使用される。
【００６３】
本明細書で使用する用語「腫瘍内」は、注入による腫瘍内への直接投与、または身体の既存の空洞もしくは固形腫瘍の全部もしくは一部の外科的切除の結果として形成される空洞への送達を指す。腫瘍内投与は一般に、好適なシリンジを使用した注入を伴う。
【００６４】
上記で定義された治療および有効量の文脈において、用語「対象」（文脈が許す場合、「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」を含むと解釈されるべきである）は、任意の対象、特に治療を必要とする哺乳動物対象を定義する。哺乳動物対象には、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、スポーツ動物、ペット動物（イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌牛など）、類人猿、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類、イヌおよびオオカミなどのイヌ科動物、ネコ、ライオン、トラなどのネコ科動物、ウマ、ロバ、シウマなどのウマ科動物、ウシ、ブタおよびヒツジなどの食用動物、シカおよびキリンなどの有蹄類、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどのげっ歯類を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００６５】
本明細書で使用する場合、ヒドロゲルに適用される用語「熱応答性」は、室温で溶液／コロイド分散体を形成し、その後、規定の範囲内の高温で半固体ヒドロゲルに転移する、ポリマーベースの材料を意味する。ヒドロゲルは通常、室温（例えば１８〜２３℃）で十分に流動性があり、通常の注射器を使用してヒドロゲルを体内に注入できるが、体温（例えば２４〜３７℃）で少なくとも部分的に凝固し、体内の部位に保持されやすい固体または半固体を形成する。
【００６６】
本明細書で使用される用語「熱応答性ベースヒドロゲル」は、熱応答性質を示すヒドロゲルを形成できるポリマーを指す。例としては、ポロキサマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）およびトリブロックコポリマーＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ（ＲｅＧｅｌ（登録商標））などが挙げられる。ベースの熱応答性ポリマー溶液は、架橋された相互浸透ネットワークが形成され、ペイロード（使用される場合）が分散される、ヒドロゲルのマトリックスを形成する。ペイロードは一般に、活性剤の何らかの形態、例えば化学療法薬（ＨＰシクロデキストリンなどの包接複合体化剤との包接複合体として提供され得る）であり、活性剤の別の形態、例えばタンパク質、ペプチド、糖、核酸、抗体、抗体断片、細胞、または成長因子であってもよい。細胞は、幹細胞であってもよい。細胞は、遺伝子を改変してもよい。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルはペイロードを含まない。いくつかの実施形態では、本発明のヒドロゲルは、１５〜２５％のベースヒドロゲル（すなわち、ポロキサマー）を含む。一実施形態では、ヒドロゲルは、２０％未満のベースヒドロゲル、例えば、１９または１８％未満のベースヒドロゲルを含む。一実施形態では、本発明のヒドロゲルは、１５〜２０％、１５〜１９％、１６〜１８％、または約１７％のベースヒドロゲルを含む。
【００６７】
本明細書で使用する場合、本発明のヒドロゲルに適用される用語「未硬化」は、硬化工程において、ヒドロゲルを硬化させる熱または他の手段で、ヒドロゲルが処理されていないことを意味する。これは、ヒドロゲルが通常、２０℃で０．７〜０．０５、０．７〜０．１または０．５〜０．０５Ｐａ．ｓ−１の典型的な粘度を有することを意味する。
【００６８】
本明細書で使用する場合、熱応答性ヒドロゲルに適用される用語「注入可能」は、周囲温度でのヒドロゲルが、対象の腫瘍内に注入できるほど十分な流動性を有することを意味する。２０℃で注入可能なヒドロゲルの典型的な粘度は、０．５〜０．０５Ｐａ．ｓであり、応力制御レオメーター（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）での流動レオメトリー（粘度）測定を使用して測定した場合、せん断応力依存性である。
【００６９】
本明細書で使用する用語「ポロキサマー」は、中央の疎水性鎖、およびＡ−Ｂ−Ａトリブロック構造に配置された２つの隣接親水性鎖を有する、非イオン性トリブロックコポリマーを指す。それらは、ＵＳ３７４０４２１に記載されている。ポロキサマー４０７は、中央のポリプロピレングリコールブロックに、２つのポリエチレングリコールブロックが隣接したタイプのポロキサマーである。それは、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ１２７の商品名でＢＡＳＦから、およびＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ  ＰＥ／Ｆ１２７の商品名でＣｒｏｄａから販売されている。ポロキサマー１８８は、ポロキサマー４０７と組み合わせて使用することもできる。
【００７０】
本明細書で使用する用語「ヒドロゲル強化剤」は、ゲニピンと架橋され、熱応答性ヒドロゲル内に相互貫入骨格を形成することができるポリマーを指す。例として、メチルセルロース、デキスタン、カラギーナン、キトサン、およびプルロニックＲなどが挙げられる。
【００７１】
本明細書で使用する用語「キトサン」は、カニおよびエビなどの甲殻類の殻に由来する天然の多糖を指す。キトサンは、塩、例えばキトサンの塩化物塩として提供されてもよい。この用語には、キトサン誘導体、特に水溶性キトサン誘導体も含まれる。一実施形態では、キトサンは、最大９０％の脱アセチル化度を有する。一実施形態では、キトサンは、１５０〜４００ＫＤａの分子量を有する。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．１〜５．０％のゲル強化剤（すなわち、キトサン）（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．１〜１．０％のゲル強化剤（すなわち、キトサン）（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．３〜０．５％のゲル強化剤（すなわち、キトサン）（ｗ／ｗ）を含む。
【００７２】
本明細書で使用する用語「ゲニピン」は、クチナシの果実に存在する、ゲニポシドと呼ばれるイルドイドグリコシドに由来するアグリコンを指す。典型的には、本発明のヒドロゲルは、０．０１〜２．０％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む。典型的には、本発明のヒドロゲルは、０．０５〜１．０％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．１〜０．５％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．０５〜０．２０％、または０．０５〜０．１５％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、約０．１％のゲニピン（ｗ／ｗ）を含む。
【００７３】
本明細書で使用する用語、「包接複合体化剤」は、ゲスト化合物を受け入れることができる空洞を有する化合物を指す。例として、シクロデキストリン、特にベータ−シクロデキストリン（例えば、２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンおよびメチルベータシクロデキストリン）が含まれる。典型的には、本発明のヒドロゲルは、１〜２０％の包接複合体化剤を含む。典型的には、本発明のヒドロゲルは、５〜２０％の包接複合体化剤を含む。典型的には、本発明のヒドロゲルは、８〜１５％の包接複合体化剤を含む。
【００７４】
「２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン」または「ＨＰ−β−ＣＤ」は、効果的な包接複合体化剤として機能する、シクロデキストリンの一形態である。それは、Ｂｏｎａｃｕｃｉｎａ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｏｎａｃｕｃｉｎａ  Ｇ、Ｓｐｉｎａ  Ｍ、Ｍｉｓｉｃｉ−Ｆａｌｚｉ  Ｍ、Ｃｅｓｐｉ  Ｍ、Ｐｕｃｃｉａｒｅｌｌｉ  Ｓ、Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ  Ｍ、ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｂｅｔａ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ４０７．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００７；３２：１１５〜２２）に記載されている。典型的には、本発明のヒドロゲルは、１〜２０％のヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンを含む。典型的には、本発明のヒドロゲルは、５〜２０％のヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンを含む。典型的には、本発明のヒドロゲルは、８〜１５％のヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンを含む。
【００７５】
本明細書で使用される用語、「活性剤」は、哺乳動物において治療的に活性である生物学的および非生物学的薬剤、例えば、薬物、細胞（真核生物および原核生物）、ならびにタンパク質、ペプチド、および核酸などの生体分子、ならびに抗体薬物複合体など、薬物と生体分子との複合体などを意味すると理解されるべきである。一実施形態では、生物学的活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｇＲＮＡから選択される核酸である。一実施形態では、生物学的活性剤は、抗血管新生抗体、抗体断片、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、生物医薬品、タンパク質、核酸から選択される治療因子である。一実施形態では、治療的活性剤は、医薬品、例えば化学療法剤である。典型的には、本発明のヒドロゲルは、０．０１〜１０％の活性剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．１〜５％の活性剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．１〜１．０％の活性剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、１．０〜５．０％の活性剤（ｗ／ｗ）を含む。
【００７６】
本明細書で使用される用語「化学療法剤」は、場合により癌性細胞を細胞死するよう誘導することによって、癌細胞を殺す薬剤を指す。好適な化学療法剤は、当業者に知られているであろう。このような化学療法剤には、ＶＥＧＦ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｔ細胞活性化剤、ＰＤ−１阻害剤、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ２）阻害剤、ＶＥＧＦＲ２阻害剤、およびＩＬ−６阻害剤を含むモノクローナル抗体、アルキル化剤、アントラサイクリン、代謝拮抗剤、細胞毒性抗生物質、植物アルカロイド、白金化合物、ポドフィロトキシン誘導体、トポイソメラーゼＩ阻害剤、ビンカアルカロイド、インターロイキン、サリドマイド（および関連類似体）、プロテインキナーゼ阻害剤、メトホルミン、ならびに抗血管新生薬が含まれるが、これらに限定されない。化学療法剤の例を、以下の表１に示す。一実施形態では、化学療法剤は、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、またはこれらの組み合わせ、例えばシスプラチンとパクリタキセルとの組み合わせ、もしくはゲムシタビンとパクリタキセルとの組み合わせから選択される。
【表１−１】
2021501804.tif 000003
【表１−２】
2021501804.tif 000004
【００７７】
本明細書で使用する場合、薬剤の有効量または治療有効量は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症なく対象に投与できるが、望ましい効果、例えば対象の病状の永続的または一時的な改善によって証明される治療または予防をもたらすのに十分な、合理的な利益／リスク比に相応する量を定義する。量は、個体の年齢および全身状態、投与方法および他の要因に応じて、対象ごとに異なる。したがって、正確な有効量を明記することは不可能であるが、当業者は、慣例的な実験および背景の一般知識を使用して、あらゆる個体のケースにおける適切な「有効」量を決定することができるであろう。この文脈での治療結果には、症状の根絶または軽減、痛みまたは不快感の軽減、生存期間の延長、運動性の改善、およびその他の臨床的改善のマーカーが含まれる。腫瘍内投与あたりの薬物の量は、腫瘍サイズを基に、腫瘍の適切な適用範囲を確認するための画像診断と組み合わせて決定される。例えば、エタノールアブレーション療法では、送達のためのエタノール量は腫瘍のサイズに基づく。
Ｄ＝腫瘍の大きさの場合、エタノール量（ｍｌ）＝４／３π［（Ｄ／２＋０．５）］３（Ｋｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）
Υ＝腫瘍の半径の場合、エタノール量（ｍｌ）＝４／３×π（Υ＋１）３（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）
【００７８】
ヒドロゲルは、臨床反応および毒性に応じて、規定された間隔で繰り返し投与することができる。
典型的には、本発明のヒドロゲルは、０．０１〜１０％の化学療法剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．１〜５％の化学療法剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、０．１〜１．０％の化学療法剤（ｗ／ｗ）を含む。一実施形態では、熱応答性ヒドロゲルは、１．０〜５．０％の化学療法剤（ｗ／ｗ）を含む。
【００７９】
本明細書で使用する場合、化学療法剤に適用される用語「難溶性」は、１ｇの薬剤を溶解するのに、少なくとも３０ｍｌの水が必要である薬剤を意味する。
【００８０】
本明細書で使用される用語、「細胞」は、例えば、膵臓細胞、膵島、平滑筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、前駆細胞、間葉系幹細胞、抗体産生細胞、幹細胞、成体幹細胞またはヒトもしくは非ヒト由来細胞、または細菌細胞を含む、何らかのタイプの真核または原核細胞を意味すると理解されるべきである。細胞は、野生型細胞であってもよく、または遺伝子操作された細胞であってもよい。細胞は、治療を受けている患者（自家細胞移植）から得られても、別の人（同種細胞移植）または別の種（異種細胞移植）から得られてもよい。一般に、細胞は生細胞である。細胞は、患者もしくはドナーの組織から、または細胞寄託機関もしくは研究機関から得ることができる。
【００８１】
本明細書で使用される用語、「造影剤」は、例えば、Ｘ線撮影法、蛍光透視法、およびＣＴスキャンなどのＸ線ベースの画像化技術、ならびに超音波を使用して、本発明の熱応答性ヒドロゲルの体内での可視性を高めるために使用される薬剤を指す。それらはまた、放射線造影剤としても知られている。一般に、造影剤は、ヨウ素化造影剤である。例として、ジストリゾアート、メトリゾアート、イオタラマート、イオキサグラート、イオパミドール、イオヘキソール、イオキシラン、イオプロミド、イオジキサノール、イオベルソルが含まれる。通常、本発明のヒドロゲルは、１〜１０％、２〜９％、典型的には２〜７％の造影剤（ｗ／ｗ）を含む。
【００８２】
本明細書で使用される用語、「水性基剤」は、水、典型的には蒸留水、または水性溶媒もしくは緩衝液を意味する。一実施形態では、水性基剤は、５〜７、典型的には約６のｐＨを有する。
【実施例】
【００８３】
次に、特定の例を参照して本発明を説明する。これらは単なる例示であり、例証のみを目的としている。これらは、請求される独占権の範囲、または記載されている発明に限定することを意図したものでは決してない。これらの例は、本発明を実施するために現在考えられている最良の形態を構成する。
【００８４】
材料
ポロキサマー４０７（Ｐ４０７）
キトサン塩化物塩（ＣＳ）
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（２ＨＰβＣＤ）
ゲニピン（ＧＰ）
シスプラチン
パクリタキセル
ゲムシタビン
ヨウ素化造影剤（Ｉｏｄｉｘｏｎａｌ）
【００８５】
例１
ブランク熱応答性ヒドロゲル（薬物非搭載）。本発明のヒドロゲルとＪｏｒｄａｎヒドロゲルとの比較
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）（１０％ｗ／ｗ）をｄＨ２ＯにｐＨ＜６で溶解し、完全に溶解するまで最低３０分間、室温で攪拌した。次に、溶液を４℃になるまで氷上で冷却した。溶液にキトサン塩化物塩（ＣＳ）（０．５％ｗ／ｗ）を攪拌しながら加え、４℃に維持した。次に、ポロキサマー４０７（Ｐ４０７）（１７％〜２０％ｗ／ｗ）をＨＰ−β−ＣＤ／ＣＳ溶液に連続攪拌しながら散布し、すべての成分が完全に溶解するまで最低１時間攪拌した。次に、この溶液を４℃で保存して、ポリマー溶液が完全に水和するのを確認した（通常、保存期間は最低８〜１２時間）。次に、ゲニピン（ＧＰ）（０．１％〜０．３％ｗ／ｗ）を溶液に加え、氷上で最低４時間攪拌して、完全に溶解するのを確認した。溶液を秤量し、ｄＨ２Ｏで最終重量まで調整した。ゲルＧＦ１および２をガラスバイアルに入れ、３７℃で２４時間水浴中で硬化させた。この工程は、図１に示す回路図で概説されている。ゲルＧＦ１は、Ｊｏｒｄａｎのヒドロゲルである。熱応答性および貯蔵弾性率（Ｇ’）は、すべてのヒドロゲルについて、以下表２で提供されている。
【表２】
2021501804.tif 000005
【００８６】
ゾル−ゲル転移温度は、例１０に従って決定される。
【００８７】
例２
パクリタキセルと２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンとの複合体形成
必要量のＨＰβＣＤを、室温で５分間、攪拌プレート上で必要量のｄＨ２Ｏに溶解した。次に、必要量のパクリタキセルを、この攪拌溶液に加えた。溶液を、高速で３０分間攪拌した。速度を下げ、溶液を７２時間攪拌して、完全に溶解するのを確認した。溶液を、−８０℃で凍結させた。凍結した溶液をＬａｂｃｏｎｏ凍結乾燥機および真空ポンプを使用して一晩凍結乾燥し、Ｐａｃ−ＨＰβＣＤ包接複合体からなる凍結乾燥粉末を生成した。
【００８８】
例３
シスプラチンおよびパクリタキセル（ＨＰβＣＤを加えたパクリタキセル複合体として）が搭載された熱応答性ヒドロゲル薬物
シスプラチンおよびパクリタキセルを搭載したポリマー溶液を、例１を変更して調製した。シスプラチンを、必要量のｄＨ２Ｏに溶解した。パクリタキセル−ＨＰβＣＤ（最終製剤の１０％ｗ／ｗのＨＰβＣＤを含む）複合体（例２に従って調製）を、ｐＨ＜６でシスプラチン溶液に溶解し、室温で３０分間攪拌した。次に、溶液を４℃まで冷却した。ＣＳ（０．５％ｗ／ｗ）を攪拌しながら溶液に加え、４℃に維持した。次に、Ｐ４０７（１７％ｗ／ｗ）をＨＰ−β−ＣＤ／ＣＳ溶液に継続的に攪拌しながら散布し、すべての成分が完全に溶解するまで、最低１時間攪拌した。次に、この溶液を４℃で保存して、ポリマー溶液が完全に水和するのを確認した（通常、保存期間は最低８〜１２時間）。次に、ＧＰ（０．１％ｗ／ｗ）を溶液に加え、氷上で最低４時間攪拌して、完全に溶解するのを確認した。溶液を秤量し、ｄＨ２Ｏで最終重量まで調整した。
【００８９】
例４
シスプラチンおよびパクリタキセルを含む二重薬物搭載熱応答性ヒドロゲル（最終的なＨＰβＣＤ濃度をパクリタキセル複合体と「遊離」ＨＰβＣＤとに分割）
製剤に含まれるＨＰβＣＤの最終濃度を、パクリタキセル複合体と複合体化されていない２−Ｈβ−ＣＤとの間で、１：２の比率で分割した。シスプラチンを、必要量のｄＨ２Ｏに溶解した。パクリタキセル複合体（例２に従って作成）、およびＨＰβＣＤの最終量を１０％ｗ／ｗにするために必要な量の遊離ＨＰβＣＤ粉末を、シスプラチン溶液にｐＨ＜６で溶解し、室温で３０分間攪拌した。次に、溶液を４℃になるまで氷上で冷却した。ＣＳ（０．５％ｗ／ｗ）を攪拌しながら溶液に加え、４℃に維持した。次に、Ｐ４０７（１７％ｗ／ｗ）をＨＰ−β−ＣＤ／ＣＳ溶液に継続的に攪拌しながら散布し、すべての成分が完全に溶解するまで、最低１時間攪拌した。次に、この溶液を４℃で保存して、ポリマー溶液が完全に水和するのを確認した（通常、保存期間は最低８〜１２時間）。次に、ＧＰ（０．１％ｗ／ｗ）を溶液に加え、氷上で最低４時間攪拌して、完全に溶解するのを確認した。溶液を秤量し、ｄＨ２Ｏで最終重量まで調整した。この工程は、図１に示す回路図で概説されている。
【００９０】
例５
ゲムシタビンおよびパクリタキセルを含む二重薬物搭載熱応答性ヒドロゲル（最終的なＨＰβＣＤ濃度をパクリタキセル複合体と「遊離」ＨＰβＣＤとに分割）
製剤に含まれるＨＰβＣＤの最終濃度を、パクリタキセル複合体と複合体化されていない２−Ｈβ−ＣＤとの間で、１：１の比率で分割した。ゲムシタビンを、必要量のｄＨ２Ｏに溶解した。パクリタキセル複合体（例２に従って作成）、およびＨＰβＣＤの最終量を１０％ｗ／ｗにするために必要な量の遊離ＨＰβＣＤ粉末を、シスプラチン溶液にｐＨ＜６で溶解し、室温で３０分間攪拌した。次に、溶液を４℃になるまで氷上で冷却した。ＣＳ（０．５％ｗ／ｗ）を攪拌しながら溶液に加え、４℃に維持した。次に、Ｐ４０７（１７％ｗ／ｗ）をＨＰ−β−ＣＤ／ＣＳ溶液に継続的に攪拌しながら散布し、すべての成分が完全に溶解するまで、最低１時間攪拌した。次に、この溶液を４℃で保存して、ポリマー溶液が完全に水和するのを確認した（通常、保存期間は最低８〜１２時間）。次に、ＧＰ（０．１％ｗ／ｗ）を溶液に加え、氷上で最低４時間攪拌して、完全に溶解するのを確認した。溶液を秤量し、ｄＨ２Ｏで最終重量まで調整した。
【００９１】
例６
ヨウ素化造影剤を含むブランク熱応答性ヒドロゲル
ＨＰβＣＤ（１０％ｗ／ｗ）を、ヨウ素化イメージング剤（Ｉｏｄｉｘｏｎａｌ  ２〜７％ｗ／ｗ）を含む必要量のｄＨ２Ｏに溶解し、室温で３０分間攪拌した。次に、溶液を４℃になるまで氷上で冷却した。ＣＳ（０．５％ｗ／ｗ）を攪拌しながら溶液に加え、４℃に維持した。次に、Ｐ４０７（１７％ｗ／ｗ）をＨＰ−β−ＣＤ／ＣＳ溶液に継続的に攪拌しながら散布し、すべての成分が完全に溶解するまで、最低１時間攪拌した。次に、この溶液を４℃で保存して、ポリマー溶液が完全に水和するのを確認した（通常、保存期間は最低８〜１２時間）。次に、ＧＰ（０．１％ｗ／ｗ）を溶液に加え、氷上で最低４時間攪拌して、完全に溶解するのを確認した。溶液を秤量し、ｄＨ２Ｏで最終重量まで調整した。
【００９２】
例７
シスプラチンおよびパクリタキセル（最終的なＨＰβＣＤ濃度をパクリタキセル複合体と「遊離」ＨＰβＣＤとに分割）を含む、ヨウ素化造影剤含有二重薬物搭載熱応答性ヒドロゲル
製剤に含まれるＨＰβＣＤの最終濃度を、パクリタキセル複合体と複合体化されていないＨＰβＣＤとの間で、１：２の比率で分割した。シスプラチンを、ヨウ素化造影剤（Ｉｏｄｉｘｏｎａｌ  ２〜７％ｗ／ｗ）を含む必要量のｄＨ２Ｏに溶解した。パクリタキセル複合体（例２に従って作成）、およびＨＰβＣＤの最終量を１０％ｗ／ｗにするために必要な量の遊離ＨＰβＣＤ粉末を、シスプラチン溶液にｐＨ＜６で溶解し、室温で３０分間攪拌した。次に、溶液を４℃になるまで氷上で冷却した。ＣＳ（０．５％ｗ／ｗ）を攪拌しながら溶液に加え、４℃に維持した。次に、Ｐ４０７（１７％ｗ／ｗ）をＨＰ−β−ＣＤ／ＣＳ溶液に継続的に攪拌しながら散布し、すべての成分が完全に溶解するまで、最低１時間攪拌した。次に、この溶液を４℃で保存して、ポリマー溶液が完全に水和するのを確認した（通常、保存期間は最低８〜１２時間）。次に、ＧＰ（０．１％ｗ／ｗ）を溶液に加え、氷上で最低４時間攪拌して、完全に溶解するのを確認した。溶液を秤量し、ｄＨ２Ｏで最終重量まで調整した。
【００９３】
例８
ブランク熱応答性ヒドロゲルの凍結乾燥（ヨウ素化造影剤非含有、または含有）
ヨウ素化造影剤非含有、または含有ブランク熱応答性ヒドロゲルを、それぞれ例１または例６に概説されているように調製した。既知の重量のポリマー溶液を好適なビーカーに移し、液体窒素を使用して急速冷凍した。次に、凍結した溶液を真空下、−５５℃で４８時間凍結乾燥して、凍結乾燥粉末を生成した。次に、粉末を再水和し、ｄＨ２Ｏで元の重量にし、最低６時間攪拌して、４℃で一晩再水和させた。
【００９４】
例９
シスプラチンおよびパクリタキセルを含む二重薬物搭載熱応答性ヒドロゲル（ヨウ素化造影剤含有、または非含有薬物搭載）の凍結乾燥
二重薬物搭載熱応答性ヒドロゲルを、ヨウ素化造影剤非含有または含有に分類して、それぞれ例４または例７に変更を加えて調製した。ヒドロゲルは、シスプラチンを加えずに調製した。パクリタキセルのみを搭載したポリマー溶液を好適なビーカーに移し、液体窒素を使用して急速冷凍した。次に、凍結した溶液を真空下、−５５℃で４８時間凍結乾燥して、凍結乾燥粉末を生成した。次に、粉末を再水和し、最終製剤に必要な量のシスプラチンを含むｄＨ２Ｏで元の重量にし、最低６時間攪拌し、４℃で一晩再水和させた。
【００９５】
例１０
ゾル−ゲル転移温度の決定
種々のヒドロゲル製剤の熱応答性は、温度およびギャップキャリブレーションを内蔵したＡＲ−１０００定応力レオメーター（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で実施された、振動測定を使用して流動学的に評価した。レオメーターは、コーン／プレートジオメトリー（直径４０ｍｍ、コーン角度４°）を装備した。脱気したサンプルを、事前に２０℃に平衡化して、温度制御されたレオメータープレートに分注した。水を含む溶媒トラップを使用してサンプルを覆い、レオロジー試験中のサンプルからの蒸発を防いだ。水浴（ＬＡＵＤＡ−Ｅｃｏｌｉｎｅ）で、試験中ペルチェプレートの温度を制御した。サンプルプレートの温度は、試験中、常に望ましい値の＋／−０．１℃以内に制御された。試験前に、ジオメトリーギャップを校正した。過剰なサンプルの充填の後、ジオメトリーは、この所定のギャップまで下げられた。過剰なヒドロゲルをスパチュラで取り除き、廃棄して正しい充填が行われることを確認した。試験を開始する前に、サンプルを所定の時間平衡化させた。ＴＡ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、データを処理した。すべてのサンプルを三回分析した。
２０℃〜４０℃の温度スイープを、すべてのヒドロゲル製剤で実施した。ゾル−ゲル転移温度は、ゲル化が起こった温度として定義した。ゲル化点は、貯蔵弾性率（Ｇ’）が損失弾性率（Ｇ’’）と等しくなる温度として定義される。したがって、Ｇ’＞Ｇ’’の場合、ゲル化が発生したとみなされた。適切なゾル−ゲル転移温度は、平均室温（２１℃）を超える、理想的には体温（３７℃）に近い温度であると考えられた。温度は、１℃／分の速度で上昇し、振動応力および角周波数は一定を保った。
【００９６】
例１１
Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ崩壊アッセイ
規定量のポリマー溶液（１ｇ）をガラスバイアルに量り入れ、溶液とバイアルとの総重量を記録した。ポリマー溶液を３７℃で３０分間ゲル化させて、完全にゲル化したことを確認した。予熱したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）１ｍｌをヒドロゲルに加えた。所定の時点で、１ｍｌのＰＢＳをガラスバイアルから完全に除去し、ヒドロゲルおよびガラスバイアルの重量を記録した。次に、ヒドロゲルを水浴に戻し、予熱した１ｍｌの新鮮なＰＢＳをファルコンチューブに加えた。この工程を、２８日間、所定の時点で繰り返した。すべての実験を３回行い、３つの個別実験として繰り返した。
【００９７】
例１２
Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ放出プロファイルアッセイ
規定量のポリマー溶液（１ｇ）を、ガラスバイアルに量り入れた。ポリマー溶液を３７℃で３０分間ゲル化させて、完全にゲル化したことを確認した。予熱したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）１ｍｌをヒドロゲルに加えた。所定の時点で、１ｍｌのＰＢＳをガラスバイアルから完全に取り出し、分析まで−２０℃で保存した。次に、ヒドロゲルを水浴に戻し、予熱した１ｍｌの新鮮なＰＢＳをファルコンチューブに加えた。この工程を、２８日間、所定の時点で繰り返した。すべての実験を３回行い、３つの個別実験として繰り返した。
シスプラチンの検出のため、ＩＣＰ−ＭＳを実行した。検量線は、ＰＢＳで適切な１００万分の１（ｐｐｍ）まで希釈した、白金（Ｐｔ）標準液（塩酸中１０００ｍｇ／ＬのＰｔ）を使用して作成した。サンプルをＩＣＰ−ＭＳに手動で導入した。分析に使用されたパラメーターは、電力１．２ｋＷ、プラズマ流量１５Ｌ／分、補助流量１．５Ｌ／分、ネブライザ圧力２００ｋＰａであった。検体検出波長を、Ｐｔ用に２１４．４２３ｎｍに設定した。すべてのサンプルを三回分析した。
ＨＰＬＣは、ＵＶ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｌ．Ｃで実施した。パクリタキセルＨＰＬＣは、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）によって公開された方法に基づき、展開した。ＨＰＬＣは、Ｓｙｎｅｒｇｉ  ４ｕ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  ８０Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｏｌｕｍｎ（１５０ｘ４．６ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で実施した。カラム温度は、制御しなかった。移動相は、アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（５５：４５）で構成した。流速は１ｍｌ／分で、総実行時間は１０分であった。パクリタキセルのＵＶ検出を、２２７ｎｍで実施した。すべてのサンプルは、最低２回分析した。
【００９８】
例１３
流動レオロジー（粘度）測定
種々のヒドロゲル製剤の粘度試験は、温度およびギャップキャリブレーションを内蔵したＡＲ−１０００定応力レオメーター（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で実施され、流動レオロジーを使用して評価した。レオメーターは、コーン／プレートジオメトリー（直径４０ｍｍ、コーン角度４°）を装備した。脱気したサンプルを、事前に２０℃に平衡化して、温度制御されたレオメータープレートに分注した。水を含む溶媒トラップを使用してサンプルを覆い、レオロジー試験中のサンプルからの蒸発を防いだ。水浴（ＬＡＵＤＡ−Ｅｃｏｌｉｎｅ）で、試験中ペルチェプレートの温度を制御した。サンプルプレートの温度は、試験中、常に望ましい値の＋／−０．１℃以内に制御された。試験前に、ジオメトリーギャップを校正した。過剰なサンプルの充填の後、ジオメトリーは、この所定のギャップまで下げられた。過剰なヒドロゲルをスパチュラで取り除き、廃棄して正しい充填が行われることを確認した。試験を開始する前に、サンプルを所定の時間平衡化させた。ＴＡ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、データを処理した。すべてのサンプルを三回分析した。
定常流動実験を２０℃で実施して、ヒドロゲルが、せん断応力の上昇下でどのように挙動するかを確認した。サンプルの粘度は、１Ｐａ〜１００Ｐａの範囲にわたるせん断応力で判定した。
【００９９】
例１４
注入可能性アッセイ
一軸引張試験を実施して、表３に明記される針またはカテーテルを備えたシリンジからゲルを排出するのに必要な力を、５ｋＮのロードセルを備えた機械的試験機（Ｚ０５０、Ｚｗｉｃｋ／Ｒｏｅｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して判定した。ヒドロゲルサンプルを２ｍｌのルアーロックシリンジ（ＢＤ、Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ）に充填し、サンプルが確実に液体状態を維持するように、引張試験の前に氷上で冷やし続けた。適切な医療機器をルアーロックを介してシリンジに取り付け、規定された体積のヒドロゲルを排出するのに必要な、最大の力を判定した。
すべての試験で固定グリップを引張試験機に取り付け、シリンジをロードセルが取り付けられた位置に固定した。１Ｎの事前荷重（予備荷重）が印加され、ゲル０．５ｍｌに相当する距離である、最大伸長（８．５ｍｍ）を確認して、試験を終了した（Ｖｅｒｎｉｅｒのカリパスを使用して測定）。注入速度は、２ｍｌ／分または１ｍｌ／分と規定した。次に、ヒドロゲルサンプルに破壊まで荷重をかけ、カテーテルから排出されたヒドロゲルをバイアルに収集した。
【表３】
2021501804.tif 000006
【０１００】
例１５
超音波およびコンピューター断層撮影（ＣＴ）画像化
ヨウ素化造影剤に分類されたポリマー溶液５ｍｌを、ｅｘ  ｖｉｖｏの動物組織（子ウシの肝臓）モデルに注入して、注入されたＣｈｅｍｏＧｅｌの、組織内での分布を評価した。注入前に、子ウシの肝臓を水浴中で３７℃まで加熱した。内部組織温度は、肉温度計を使用して記録した。ポリマー溶液は、長さ５ｃｍの１８Ｇ針（Ｃｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，Ｉｎｄ）を使用して、一定の速度で注入した。Ｅｘ  ｖｉｖｏ分布は、コンピューター断層撮影（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｃｏｒｅ  １２８、Ｐｈｉｌｉｐｓ）を使用して画像化した。画像は、０．８ｍｍスライス厚、０．４ｍｍ再構成間隔、１６８ｍＡｓおよび１００ｋＶを使用して取得した。各ウェル内の関心領域（直径１００ｍｍ）を選択し、平均密度を計算した（最小、最大および標準偏差も記録した）。
超音波画像（Ｘａｒｉｏ、東芝）は、グレースケールＢモードで１２ＭＨｚ線形プローブを使用して取得した。
【０１０１】
例１６
Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ
すべての細胞は、使用前および使用後に７０％エタノールで洗浄した、クラスＩＩ層エアフローキャビネット内で培養した。エアフローキャビネットに入れるすべてのアイテムも、７０％エタノールで拭き上げた。相互汚染を回避するため、異なる細胞株を使用する前に、ＵＶ滅菌を少なくとも１５分間使用した。細胞株は、使用前に液体窒素中の保存から復活させた。細胞株を入れたバイアルを３７℃の水浴中で素早く解凍し、頻繁に回転させて、温度勾配を最小限に抑えた。解凍した細胞に細胞培地を滴下し、室温で５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離した。上清をペレットから吸引して、凍結培地からすべてのＤＭＳＯを除去し、細胞を補充の細胞培養培液に再懸濁し、Ｔ１７５ｃｍ２フラスコ（Ｓｔａｒｓｔｅｄｔ、Ｉｒｅｌａｎｄ）に移した。
補充の培養液を３日ごとに交換し、細胞が８０〜９０％の集密度に達したときに継代した（Ａ５４９細胞およびＰａｎｃ−１細胞）。細胞の継代は、フラスコからすべての培地を除去することによって実施した。５ｍｌのトリプシンをフラスコに加え、５％ＣＯ２、湿度９０％の環境で５分間、３７℃で培養することにより、細胞をフラスコから剥離した。次にフラスコを物理的に攪拌して、完全に剥離したことを確認した。次に１０ｍｌの補充培地をフラスコに加えて、トリプシン処理を停止し、細胞死を防いだ。この混合物をフラスコから取り出し、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに加えた。混合物を室温で５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離した。トリプシンと培地の混合物を慎重に廃棄し、形成された細胞のペレットを新鮮な培地に再懸濁した。
細胞毒性を評価するために、製造者の指示に従い、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）比色アッセイを使用して細胞生存率を判定した。ＣＣＫ−８アッセイは、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）、ＷＳＴ−８を使用して、細胞生存率を定量化する。所定の時点で、適切な処理をウェルから取り除き、ウェルをＰＢＳで１回洗浄した。２００ｕＬの新鮮な補充培地を各ウェルに加えた。２０ｕＬのＣＣＫ−８試薬を各ウェルに加え、プレートをＡ５４９細胞またはＰａｎｃ−１細胞つき、それぞれ９０分または３時間、インキュベーターに戻した。次に、ＣＣＫ−８を培養した１００ｕＬの培地を９６ウェルプレートに移し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈプレートリーダーで、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。培地で処理された細胞を１００％の生存率とみなし、各処理グループの生存率を、このパーセンテージとして表した。
生細胞／死細胞染色は、製造者の修正版プロトコルを使用して実施した（Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２００４）。生細胞をカルセインＡＭを使用して緑色に染色し、死細胞をエチジウムホモダイマー−１を使用して赤色に染色した。２．５μＬのカルセインＡＭおよび１０μＬのエチジウムホモダイマー−１を、５ｍｌのＰＢＳに加えた。所定の時点で適切な処理をウェルから取り除き、ウェルをＰＢＳで１回洗浄した。このカルセインＡＭ／エチジウムホモダイマー−１溶液３００μＬを各処理ウェルに加え、３０分間発色させた。その後、染料を取り除き、３００μＬのＰＢＳをウェルに加えた。生細胞と死細胞を、それぞれＬｅｉｃａ  ＤＭＩＬ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で青色（ＦＩＴＣ／ＧＦＰ）および緑色（ＲＦＰ）フィルターを使用して、個別に視覚化した。Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用して、細胞生存率の合成画像を編集した。
細胞毒性プロトコルは、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）によって公開された方法を基にした。細胞は、５００ｕＬの補充培地を含む２４ウェルプレートに、ウェルあたり２０，０００細胞の密度で播種した。細胞を、５％ＣＯ２、湿度９０％の環境において、３７℃で２４時間接着させた。２４時間後、培地をウェルから取り除き、新鮮な補充培地と交換した。ブランクまたは薬物を搭載したポリマー溶液の適切な容量（０、１０、２０、または３０ｕＬ）を新鮮な補充培地に加えて、各ウェルの最終容量を５００ｕＬにした。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％の環境のインキュベーターに、２４時間または４８時間戻した。所定の培養期間の後、プレートをインキュベーターから取り出し、上清を廃棄した。ウェルをＰＢＳで１回洗浄し、上記で概説した適切な生存率アッセイを実施した。
【０１０２】
例１７
Ｉｎ−ｖｉｖｏ研究
例１のヒドロゲル（ＧＦ５ヒドロゲル）は、肺癌（Ａ５４９細胞）および膵臓癌（Ｐａｎｃ−１細胞）の２つのｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植モデルで評価した。さらに、例４のヒドロゲルを肺癌（Ａ５４９細胞）異種移植モデルで評価し、例５のヒドロゲルを膵臓癌（Ｐａｎｃ−１細胞）異種移植モデルで評価した。
腫瘍は、注入後３〜６週間で実験に必要な体積に達し、両方の異種移植モデルの確立に成功した。
すべての動物実験は、アイルランドのＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｒｏｙａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ（ＲＥＣ  ｎｏ．１３８９）、および国の実験動物規制当局であるＨｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（ＨＰＲＡ）（プロジェクト認可：ＡＥ１９１２７／Ｐ０４０）により承認され、動物の権利に関するＥＵ規則（指令２０１０／６３／ＥＵ）に従って実施された。
【０１０３】
腫瘍異種移植の確立
生物発光Ａ５４９−ルシフェラーゼ細胞株および非生物発光Ｐａｎｃ−１細胞株を使用して、雌Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス（体重２０〜２５  ｇ）で、肺および膵臓の異種移植モデルをそれぞれ確立した。Ｆｒｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）による方法に基づき、Ａ５４９−ｌｕｃまたはＰａｎｃ−１細胞を８０〜９０％の集密度でトリプシン処理し、ＰＢＳ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合液（１：１）に１  ｘ  １０７細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、使用まで氷上で維持した。誘導チャンバーで４％ｖ／ｖイソフルランおよび酸素を使用した吸入により麻酔が導入されたら、２％ｖ／ｖイソフルランを維持麻酔として、誘導チャンバーまたはノーズコーンで使用した。２９Ｇインスリンシリンジ（Ｒｏｍｅｄ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、１００μＬの細胞懸濁液（１ｘ１０６細胞）を、マウスの右下腹部の脇腹に皮下注入した。注入後３０秒間、針を所定の位置に残し、回転させ、ゆっくりと取り外して、注入部位からの細胞懸濁液の漏出を防止した。次に、動物を発熱ランプに隣接する清潔な回復用ケージに入れ、麻酔から完全に回復させてから、ホームケージに戻した。
【０１０４】
腫瘍内注入
腫瘍体積が、Ａ５４９−ｌｕｃ異種移植では２５０ｍｍ３±５０ｍｍ３、Ｐａｎｃ−１異種移植では１７０ｍｍ３±５０ｍｍ３に達してから、滅菌ブランクヒドロゲル（例１、ＧＦ５）または薬物搭載ヒドロゲル（例５または例７）製剤または生理食塩水の腫瘍内（ＩＴ）投与を実施した。注入用のヒドロゲル製剤または生理食塩水の所定の体積（腫瘍体積に基づいて計算）を、２２Ｇ針を備えた１ｍｌルアーロックシリンジに充填し、投与前は氷上に維持した。プロトコルに従って、吸入麻酔を導入した。鉗子を使用して腫瘍を安定化し、下から固定して、針が腫瘍を貫通するリスクを最小限に抑えた。針を腫瘍内に挿入し、必要な製剤の全量をゆっくりと排出した。注入の完了後、針を所定の位置に３０秒間維持して、ヒドロゲル製剤のゲル化を起こさせ、針を回転させ、ゆっくりと取り外して、注入された材料の逆流を防止した。次に、動物を発熱ランプに隣接する清潔な回復用ケージに入れ、麻酔から完全に回復させてから、ホームケージに戻した。
【０１０５】
異種移植モニタリング
腫瘍が触知できたら、デジタルカリパスを使用して外部から腫瘍の寸法を測定し、長さ（ｌ）および幅（ｗ）を測定した。
腫瘍体積は、方程式１（Ｔｏｍａｙｋｏ  ｅｔ  ａｌ、１９８９）を使用して導出した。
【数１】
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Ａ５４９−ｌｕｃ腫瘍の体積が２５０ｍｍ３±５０ｍｍ３に達した時点で、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光の画像化を実施した。動物に、新たに調製したＤ−ルシフェリンのＰＢＳ溶液をＩＰ注入し（１５０ｍｇ／ｋｇ）、プロトコルに従って吸入により麻酔した。ＩＴ投与されたヒドロゲル製剤の蛍光画像化もまた、製剤への蛍光タグの組み込み後に行われた。Ｅｘ  ｖｉｖｏ画像化もまた、切除された腫瘍組織で実施した。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、Ａ５４９−ｌｕｃ細胞およびヒドロゲル製剤から放出されるそれぞれの生物発光および蛍光の可視化を、表１のパラメーターを使用して実施した。
【０１０６】
生物発光および蛍光信号の疑似カラー画像を生成し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアによって、動物全体または切除された組織のグレースケール画像に重ね合わせた。画像は、ヒドロゲルの局在および保持の質的な確認に使用した。
【０１０７】
オフサイト毒性評価
研究全体を通じて体重を監視することにより、一般的な動物福祉を評価した。
深い全身麻酔（ケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を、２５Ｇの針および１ｍｌのルアーロックシリンジを使用してＩＰ投与した）の下で、１ｍｌのルアースリップシリンジ（Ｂ  Ｂｒａｕｎ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および２１Ｇ針を使用して、終末心臓穿刺を実施した。動物を仰向けにしっかりと置き、針を４５°の角度で心臓に挿入した。プランジャーをゆっくりと引き抜いて循環血液を収集し、必要に応じて針の位置を変え、処置中の針またはシリンジ内での血液の凝固を防止するために十分な注意を払って、血液収集を完了した。次に、採取した血液の３００μＬをＫ３ＥＤＴＡ抗凝固チューブ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ  ５００  Ｋ３Ｅ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に排出し、残りを２ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に排出した。Ｋ３ＥＤＴＡチューブ内の抗凝固処理された血液サンプルは、シスメックスＫＸ−２１Ｎ血液学分析装置（シスメックスコーポレーション、神戸、日本）を使用して、直ちに白血球数について分析した。残りの血液サンプルを、約３０分間放置して凝固させた。次に、サンプルをＭｉｎｉｓｐｉｎ（登録商標）遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、４，７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、血清を分離した。遠心チューブから血清を慎重に取り出し、ＣｒｙｏＰｕｒｅチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し、分析まで−８０℃で凍結した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）および尿素アッセイキットを使用して、製造者の指示に従い血清を分析した。Ｖｉｃｔｏｒ２１４２０プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、４５０ｎｍおよび５７０ｎｍでの吸光度をそれぞれ読み取った。
【０１０８】
終末心臓穿刺後、頸椎脱臼を使用して動物の死を確認した。肝臓および腎臓を特定し、鋭利なハサミを使用して切除した。次に、腫瘍を側腹部の右下腹部から切除した。剖検時に収集されたすべての組織を、１０％中性緩衝ホルマリン固定液に２４時間入れ、その後７０％エタノールに移した。ホルマリン固定組織をトリミングし、処理して、パラフィンブロックに埋め込んた。パラフィン包埋腫瘍、腎臓および肝臓サンプル各々から典型的な５ｕｍ厚切片を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０１０９】
肺癌および膵臓癌のマウスモデルに投与された本発明のヒドロゲル製剤の保持率、有効性および最小限のオフサイト毒性を裏付ける証拠が確定した。固形腫瘍の治療における局所領域薬物送達プラットフォームとして、本発明のヒドロゲルの使用を支持する結果は、ヒドロゲルの腫瘍内投与によって、
・投与部位での局所的なゲル化を促進され（図１４Ａ）、少なくとも１４日間保持されること（図１４Ｂおよび図１４Ｃ）、
・２つの異なるタイプの固形腫瘍において、１４〜２８日間にわたり、腫瘍体積の増加を大幅に低減する効果が実証されること（図１５）、
・急性オフサイト毒性が誘発されない（図１６）、
ことを確立した。
【０１１０】
同等物
前述の説明は、本発明の現時点の好ましい実施形態を詳述している。これらの説明を考慮すれば、その実践における多数の修正および変更が当業者には思い浮かぶと予想される。これらの修正および変更は、本明細書に添付された特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【０１１１】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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