(57)【要約】【課題】  本発明は、より効率よい糖尿病処置のための薬剤のスクリーニング方法およびＰＰＡＲに関連する疾患を処置および予防するための新たな化合物を提供すること。【解決手段】  膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を有し、かつ、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）を調節する能力を有する化合物を同定する方法が提供される。この方法はＡ）候補化合物を提供する工程；Ｂ）該候補化合物について、膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を測定する工程；Ｃ）該候補化合物を、ＰＰＡＲの活性を測定するアッセイに供する工程；およびＤ）Ｂ工程およびＣ工程の各々において、活性ありと判断された物質を、リード化合物と同定する工程、を包含する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルホニル尿素剤を含む、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）調節剤。
【請求項２】
前記スルホニル尿素剤は、
【化１】
2008019169.tif 000007
という構造を有し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、夫々独立して、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シアノ、ニトロ、アミノ、置換されたアミノ、カルボキシ、置換されたカルボキシ、カルバモイル、アシル、置換されたアシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィニルからなる群より選択される置換基を有する、請求項１に記載の調節剤。
【請求項３】
前記スルホニル尿素剤は、グリメピリド、グリベンクラミド、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミドおよびグリクラジドからなる群より選択される、請求項１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
【請求項４】
前記スルホニル尿素剤は、グリメピリドまたはグリベンクラミドである、請求項１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
【請求項５】
前記調節は、ＰＰＡＲの活性化である、請求項１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
【請求項６】
さらに、膵臓β細胞のインスリン分泌活性およびインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を有する、請求項１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
【請求項７】
前記ＰＰＡＲ調節活性を、チアゾリジンジオン（チアゾリジンジオン）の少なくとも１０％有することを特徴とする、請求項１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
【請求項８】
前記チアゾリジンジオンは、ピオグリタゾンである、請求項７に記載のＰＰＡＲ調節剤。
【請求項９】
前記ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲγである、請求項１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
【請求項１０】
前記ＰＰＡＲは、配列番号２ (NP_035276)、配列番号４ (NP_619726)、配列番号６ (NP_037256)および配列番号８(AAB87480)からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列またはその１もしくは数個の置換、付加もしくは欠失を含む改変体配列を含む、請求項１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
【請求項１１】
前記ＰＰＡＲ調節剤は、脂肪細胞の分化；糖尿病；高グリシン血症；；低グルコース寛容；インスリン抵抗性；肥満；脂肪障害；異脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）；高脂血症；高トリグリセリド血症；高コレステロール血症；低ＨＤＬレベル；高ＬＤＬレベル；粥状硬化症；血管狭窄；過敏性腸症候群；炎症性腸疾患；クローン病；腸潰瘍；炎症疾患；膵炎；腹部肥満；神経変性病；網膜症；乾癬；代謝性症候群；卵巣高アンドロゲン症からなる群より選択される状態または疾患の処置または予防に使用される、ＰＰＡＲ調節剤。
【請求項１２】
膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を有し、かつ、ＰＰＡＲを調節する能力を有する化合物を同定する方法であって、該方法は：
Ａ）候補化合物を提供する工程；
Ｂ）該候補化合物について、膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を測定する工程；
Ｃ）該候補化合物を、ＰＰＡＲの活性を測定するアッセイに供する工程；および
Ｄ）Ｂ工程およびＣ工程の各々において、活性ありと判断された物質を、リード化合物と同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記候補化合物は、スルホニル尿素剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記候補化合物は、
【化２】
2008019169.tif 000008
という構造を有し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、夫々独立して、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シアノ、ニトロ、アミノ、置換されたアミノ、カルボキシ、置換されたカルボキシ、カルバモイル、アシル、置換されたアシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィニルからなる群より選択される置換基を有する
請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記調節は、ＰＰＡＲの活性化である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物は、前記膵臓β細胞のインスリン分泌活性およびインスリン感受性を促進する活性の両方を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＰＡＲ調節活性がチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）と比較して測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲγである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＰＡＲは、配列番号２ (NP_035276)、配列番号４ (NP_619726)、配列番号６ (NP_037256)および配列番号８(AAB87480)からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列またはその１もしくは数個の置換、付加もしくは欠失を含む改変体配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃ）工程は、前記候補化合物がスルホニル尿素剤またはチアゾリジンジオン剤とともに提供して競合するかどうかを観察する工程、を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＰＡＲ活性を測定するアッセイは、転写活性アッセイである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記膵臓β細胞のインスリン分泌活性は、細胞から分泌されるインスリンを直接測定することにより測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記末梢のインスリン感受性を促進する活性は、インスリン負荷試験（Insulin tolerance test)により測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＰＡＲの活性は、転写因子認識配列と作動可能に連結されるレポーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物と、該選択されたＰＰＡＲとを含む系において、該候補化合物の活性を判定する工程であって、該レポーターの発現が増強される場合、該候補化合物は該ＰＰＡＲのアゴニストと判定し、該レポーターの発現が減少する場合、該候補化合物は該ＰＰＡＲのアンタゴニストと判定する、工程によって測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記レポーターは、ルシフェラーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記系は、細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｃ工程において、Ｃ末活性化機能−２（ＡＦ−２）ドメインを含むタンパク質が標的として使用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的は、アミノ酸配列ＰＬＬＱＥＩＹＫＤＬＹ（配列番号９）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｃ工程において、ＰＰＡＲのコファクターとＰＰＡＲとの相互作用が観察される、請求項１２に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＰＡＲのコファクターは、ＤＲＩＰ  ２０５、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を有し、かつ、ＰＰＡＲを調節する能力を有する化合物を同定するためのシステムであって、該システムは：
Ａ）候補化合物；
Ｂ）該候補化合物について、膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を測定する手段；
Ｃ）該候補化合物を、ＰＰＡＲの活性を測定するアッセイに供する手段；および
Ｄ）Ｂ手段およびＣ手段の各々により、活性ありと判断された物質を、リード化合物と同定する手段、
を備える、システム。
【請求項３２】
ＰＰＡＲに関連する疾患を処置または予防するための方法であって、
Ａ）スルホニル尿素剤を被検体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
前記スルホニル尿素剤は、グリメピリド、グリベンクラミド、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミドおよびグリクラジドからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＰＡＲに関連する疾患を処置または予防するための医薬を製造するにおける、スルホニル尿素剤の使用。
【請求項３５】
前記スルホニル尿素剤は、グリメピリド、グリベンクラミド、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミドおよびグリクラジドからなる群より選択される、請求項３４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病などのＰＰＡＲ遺伝子に関連する疾患もしくは障害の診断、処置または予防に関する。より詳細には、本発明は、ＰＰＡＲ遺伝子に関連する疾患の診断、処置または予防のための薬剤のスクリーニングに関する。本発明はまた、それによって得られた薬剤自体も提供する。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病において見られる高血糖は、膵臓β細胞からのインスリン分泌および末梢組織（例えば、肝臓、筋肉および脂肪）のインスリン感受性の両方の多重欠損によって生じる。スルホニル尿素（ＳＵ）剤が、有効な経口血糖降下剤として２型糖尿病の薬物治療において中心的な役割を果たしてきた。スルホニル尿素剤は、まず、膵臓β細胞の原形質膜上のスルホニル尿素レセプター（ＳＵＲ）に結合することによってインスリン分泌を刺激する（非特許文献１：Gribble, F. M.,and Ashcroft, F. M. (2000) Metabolism 49, 3-6）。
【０００３】
このような膵臓の作用に加え、スルホニル尿素剤（グリメピリドおよびグリベンクラミドを含む）は、脂肪に直接的な影響を与え、そして、スルホニル尿素剤は、３Ｔ３−Ｌ１細胞または単離した脂肪細胞におけるインスリンの作用を増進するかまたはその作用を模倣することが、数報の報告によって指摘されている。しかし、膵臓外での作用をもたらす分子標的は依然として決定されていない。
【０００４】
ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（ＰＰＡＲγ）は、グルコースおよび脂質の代謝ならびに脂質生成を調節する重要な転写因子の１つである（非特許文献２：Wu, Z. et al.(1998) J. Clin. Invest. 101, 22-32；非特許文献３：Tontonoz, P. et al.(1994) Genes Dev. 8, 1224-1234；非特許文献４：Tontonoz, P., Hu, E., and Spiegelman, B. M.(1994) Cell 79, 1147-1156）。チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）は、末梢のインスリン耐性を改善する別の血糖降下剤である。チアゾリジンジオンは、効果的ＰＰＡＲγアゴニストであり、そして、その薬理学的作用の大部分は、脂肪細胞中のＰＰＡＲγの活性化によって媒介されると考えられる（非特許文献５：Lehmann, J. M. et al(1995) J. Biol. Chem. 270, 12953-12956；非特許文献６：Spiegelman, B. M. (1998) Diabetes 47, 507-514）。
【０００５】
糖尿病の治療には、インスリンの作用を増強すること（すなわち、感受性を高めること）およびインスリン分泌を刺激すること（膵臓β細胞を活性化すること）の両方を行うことが好ましい。しかし、その両方の活性を有する化合物は知られていなかった。
【０００６】
Ｍｅｒｃｋは、ＰＰＡＲの新たな調節剤を記載する。しかし、この化合物は、他の糖尿病治療剤（たとえば、スルホニル尿素剤）と併用することが記載されている。しかし、インスリンの作用を増強すること（すなわち、感受性を高めること）およびインスリン分泌を刺激すること（膵臓β細胞を活性化すること）の両方を行う化合物については、何ら記載がない（特許文献１）。
【非特許文献１】Gribble, F. M.,and Ashcroft, F. M. (2000) Metabolism 49, 3-6
【非特許文献２】Wu, Z. et al. (1998) J. Clin. Invest. 101,22-32
【非特許文献３】Tontonoz, P. et al.(1994) Genes Dev. 8, 1224-1234
【非特許文献４】Tontonoz, P.,Hu, E., and Spiegelman, B. M. (1994) Cell 79, 1147-1156
【非特許文献５】Lehmann, J. M. et al (1995) J. Biol. Chem. 270, 12953-12956
【非特許文献６】Spiegelman, B. M. (1998) Diabetes 47, 507-514
【特許文献１】ＷＯ２００４／０６６９６３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明は、より効率よい糖尿病処置のための薬剤のスクリーニング方法およびＰＰＡＲに関連する疾患を処置および予防するための新たな化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題は、本発明者らが、スルホニル尿素剤が予想外に、ＰＰＡＲの調節効果を有することを見出したことによって解決した。
【０００９】
スルホニル尿素剤（グリメピリドおよびグリベンクラミドを含む）は、広範に使用されている経口血糖降下剤であり、これは、主に、膵臓のβ細胞の原形質膜上のスルホニル尿素レセプターに結合することによって、インスリン分泌を刺激する。チアゾリジンジオン（チアゾリジンジオン）（例えば、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾン）は、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（ＰＰＡＲγ）の活性化を介して末梢のインスリン耐性を効率的に改善する血糖降下剤である。本発明において、本発明者らは、グリメピリドが、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるＰＰＡＲγ転写活性を特異的に誘導することを見出した。グリメピリドは、コアクチベータであるＤＲＩＰ２０５（vitamin D receptor-interacting protein 205の略；アクセッション番号AF283812。Dr.David J. Mangelsdorf (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas,TX)から入手可能）の動員およびコリプレッサー（Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴ。それぞれ、nuclear receptor corepressorの略 (N-CoR；アクセッション番号NM_006311)、およびsilencingmediator for retinoid and thyroid hormone receptorsの略 (SMRT；例えば、アクセッション番号AF113003)。Dr.David J. Mangelsdorf (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas,TX)から入手可能）の解離を増進した。さらに、グリメピリドは、ＰＰＡＲγに対する実証済みのリガンドであるロシグリタゾンに対して競合する様式で、ＰＰＡＲγに直接結合した。さらに、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、グリメピリドは、ＰＰＡＲ応答性エレメント（ＰＰＲＥ）を含む遺伝子プロモーターの転写活性を刺激し、そして、ａＰ２、レプチン、およびアディポネクチンを含むＰＰＡＲγ標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの変化を与えた。最後に、グリメピリドが、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞における脂肪細胞分化を誘導した。この３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞は、ＰＰＡＲγアゴニスト依存的様式で分化することが明らかになった。極めて興味深いことに、グリメピリドを用いたときに観察した効果の殆どは、グリベンクラミドによっても再現された。これらのデータによって、グリメピリドおよびグリベンクラミド（これらの両方とも、スルホニル尿素剤に属する）は、ＰＰＡＲγにとってのアゴニストであるが、これらの能力は、ピオグリタゾンによって達される最大値の１２〜２０％であった。グリメピリドおよびグリベンクラミドがスルホニル尿素レセプターだけでなくＰＰＡＲγに対して作用し得たという本発明者らの観察によって、膵臓β細胞のインスリン分泌および末梢部位のインスリン感受性を増進する理想的な抗糖尿病剤の開発の糸口が与えられ得る。
【００１０】
本研究において、本発明者らは、ＰＰＡＲγへのスルホニル尿素剤の直接的な効果を研究した。一つの実施形態において、本発明者らは、グリメピリド（これは、スルホニル尿素剤の１つである）が特異的にＰＰＡＲγ転写活性を誘導することを見出した。さらに、グリメピリドは、ロシグリタゾンに対して競合的な様式でＰＰＡＲγに直接結合することを見出した。さらに、グリメピリドは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中のＰＰＡＲγ標的遺伝子のｍＲＮＡレベルに変化を与え、そして、３Ｔ３−Ｆ４２２Ａ細胞における脂肪細胞分化を誘導した。極めて興味深いことに、グリメピリドを用いて観察された効果の殆どは、グリベンクラミドによっても再現された。これらのデータによって、グリメピリドおよびグリベンクラミドの両方が、ＰＰＡＲγにとってのアゴニストであることが強く示唆される。グリメピリドおよびグリベンクラミドはｍＳＵＲに対してだけでなくＰＰＡＲγに対しても作用し得たという本発明者らの観察によって、膵臓β細胞のインスリン分泌および末梢のインスリン感受性を増進する理想的な抗糖尿病剤の開発の糸口が与えられ得る。
【００１１】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）スルホニル尿素剤を含む、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）調節剤。
（２）上記スルホニル尿素剤は、
【００１２】
【化１１】
2008019169.tif 000002
【００１３】
という構造を有し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、夫々独立して、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シアノ、ニトロ、アミノ、置換されたアミノ、カルボキシ、置換されたカルボキシ、カルバモイル、アシル、置換されたアシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィニルからなる群より選択される置換基を有する、項目１に記載の調節剤。
（３）上記スルホニル尿素剤は、グリメピリド、グリベンクラミド、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミドおよびグリクラジドからなる群より選択される、項目１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
（４）上記スルホニル尿素剤は、グリメピリドまたはグリベンクラミドである、項目１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
（５）上記調節は、ＰＰＡＲの活性化である、項目１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
（６）さらに、膵臓β細胞のインスリン分泌活性およびインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を有する、項目１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
（７）上記ＰＰＡＲ調節活性を、チアゾリジンジオン（チアゾリジンジオン）の少なくとも１０％有することを特徴とする、項目１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
（８）上記チアゾリジンジオンは、ピオグリタゾンである、項目７に記載のＰＰＡＲ調節剤。
（９）上記ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲγである、項目１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
（１０）上記ＰＰＡＲは、配列番号２ (NP_035276)、配列番号４ (NP_619726)、配列番号６ (NP_037256)および配列番号８(AAB87480)からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列またはその１もしくは数個の置換、付加もしくは欠失を含む改変体配列を含む、項目１に記載のＰＰＡＲ調節剤。
（１１）上記ＰＰＡＲ調節剤は、脂肪細胞の分化；糖尿病；高グリシン血症；；低グルコース寛容；インスリン抵抗性；肥満；脂肪障害；異脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）；高脂血症；高トリグリセリド血症；高コレステロール血症；低ＨＤＬレベル；高ＬＤＬレベル；粥状硬化症；血管狭窄；過敏性腸症候群；炎症性腸疾患；クローン病；腸潰瘍；炎症疾患；膵炎；腹部肥満；神経変性病；網膜症；乾癬；代謝性症候群；卵巣高アンドロゲン症からなる群より選択される疾患の処置に使用される、ＰＰＡＲ調節剤。
（１２）膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を有し、かつ、ＰＰＡＲを調節する能力を有する化合物を同定する方法であって、上記方法は：
Ａ）候補化合物を提供する工程；
Ｂ）上記候補化合物について、膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を測定する工程；
Ｃ）上記候補化合物を、ＰＰＡＲの活性を測定するアッセイに供する工程；および
Ｄ）Ｂ工程およびＣ工程の各々において、活性ありと判断された物質を、リード化合物と同定する工程、
を包含する、方法。
（１３）上記候補化合物は、スルホニル尿素剤を含む、項目１２に記載の方法。
（１４）上記候補化合物は、
【００１４】
【化１２】
2008019169.tif 000003
【００１５】
という構造を有し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、夫々独立して、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シアノ、ニトロ、アミノ、置換されたアミノ、カルボキシ、置換されたカルボキシ、カルバモイル、アシル、置換されたアシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィニルからなる群より選択される置換基を有する
項目１２に記載の方法。
（１５）上記調節は、ＰＰＡＲの活性化である、項目１２に記載の方法。
（１６）上記化合物は、上記膵臓β細胞のインスリン分泌活性およびインスリン感受性を促進する活性の両方を有する、項目１２に記載の方法。
（１７）上記ＰＰＡＲ調節活性がチアゾリジンジオン（チアゾリジンジオン）と比較して測定される、項目１２に記載の方法。
（１８）上記ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲγである、項目１２に記載の方法。
（１９）上記ＰＰＡＲは、配列番号２ (NP_035276)、配列番号４ (NP_619726)、配列番号６ (NP_037256)および配列番号８(AAB87480)からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列またはその１もしくは数個の置換、付加もしくは欠失を含む改変体配列を含む、項目１２に記載の方法。
（２０）上記Ｃ）工程は、上記候補化合物がスルホニル尿素剤またはチアゾリジンジオン剤とともに提供して競合するかどうかを観察する工程、を包含する、項目１２に記載の方法。
（２１）上記ＰＰＡＲ活性を測定するアッセイは、転写活性アッセイである、項目１２に記載の方法。
（２２）上記膵臓β細胞のインスリン分泌活性は、細胞から分泌されるインスリンを直接測定すること（J Pharmacol Exp Ther. 2004 Sep;310(3):1273-80.）により測定される、項目１２に記載の方法。
（２３）上記末梢のインスリン感受性を促進する活性は、インスリン負荷試験（Insulin tolerance test)により測定される、項目１２に記載の方法。
（２４）上記ＰＰＡＲの活性は、転写因子認識配列と作動可能に連結されるレポーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物と、上記選択されたＰＰＡＲとを含む系において、上記候補化合物の活性を判定する工程であって、上記レポーターの発現が増強される場合、上記候補化合物は上記ＰＰＡＲのアゴニストと判定し、上記レポーターの発現が減少する場合、上記候補化合物は上記ＰＰＡＲのアンタゴニストと判定する、工程によって測定される、項目１２に記載の方法。
（２５）上記レポーターは、ルシフェラーゼである、項目２４に記載の方法。
（２６）上記系は、細胞である、項目２４に記載の方法。
（２７）上記Ｃ工程において、Ｃ末活性化機能−２（ＡＦ−２）ドメインを含むタンパク質が標的として使用される、項目１２に記載の方法。
（２８）上記標的は、アミノ酸配列ＰＬＬＱＥＩＹＫＤＬＹ（配列番号９）を含む、項目27に記載の方法。
（２９）上記Ｃ工程において、ＰＰＡＲのコファクターとＰＰＡＲとの相互作用が観察される、項目１２に記載の方法。
（３０）上記ＰＰＡＲのコファクターは、ＤＲＩＰ  ２０５（vitamin D receptor-interacting protein 205）、Ｎ−ＣｏＲ（nuclear receptorcorepressor）およびＳＭＲＴ（silencing mediator for retinoid and thyroid hormonereceptors）からなる群より選択される、項目２９に記載の方法。
（３１）膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を有し、かつ、ＰＰＡＲを調節する能力を有する化合物を同定するためのシステムであって、上記システムは：
Ａ）候補化合物；
Ｂ）上記候補化合物について、膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を測定する手段；
Ｃ）上記候補化合物を、ＰＰＡＲの活性を測定するアッセイに供する手段；および
Ｄ）Ｂ手段およびＣ手段の各々により、活性ありと判断された物質を、リード化合物と同定する手段、
を備える、システム。
（３２）  ＰＰＡＲに関連する疾患を処置または予防するための方法であって、
Ａ）スルホニル尿素剤を被検体に投与する工程、
を包含する、方法。
（３３）上記スルホニル尿素剤は、グリメピリド、グリベンクラミド、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミドおよびグリクラジドからなる群より選択される、項目３２に記載の方法。
（３４）  ＰＰＡＲに関連する疾患を処置または予防するための医薬を製造するにおける、スルホニル尿素剤の使用。
（３５）上記スルホニル尿素剤は、グリメピリド、グリベンクラミド、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミドおよびグリクラジドからなる群より選択される、項目３４に記載の使用。
【００１６】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および添付の図面、ならびに当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、以下に記載する本発明の効果の他、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、糖尿病のより効率的な治療または予防のための化合物の探索のための新たなスクリーニング法を提供する。本発明はまた、ＰＰＡＲに関連する薬剤として新たなカテゴリーを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により記載する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１９】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００２０】
（定義）
（疾患）
本明細書において「糖尿病」とは、当該分野において使用されるのと同じ意味で用いられ、持続的な高血糖・糖尿を呈する代謝疾患をいう。インシュリン依存性（I型）とインシュリン非依存性（II型）があり、前者は発症が急で症状が重く、インシュリンの投与が必要。後者は経過緩慢で必ずしもインシュリン投与を必要としない。
【００２１】
本明細書において「ＰＰＡＲに関連する疾患」とは、脂肪細胞の分化に関連する任意の疾患；糖尿病；高グリシン血症；低グルコース寛容；インスリン抵抗性；肥満；脂肪障害；異脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）；高脂血症；高トリグリセリド血症；高コレステロール血症；低ＨＤＬレベル；高ＬＤＬレベル；粥状硬化症；血管狭窄；過敏性腸症候群；炎症性腸疾患；クローン病；腸潰瘍；炎症疾患；膵炎；腹部肥満；神経変性病；網膜症；乾癬；代謝性症候群；卵巣高アンドロゲン症などを挙げることができる。
【００２２】
本明細書において「インスリン代謝に関連する」とは、インスリンの分泌またはインスリンによる糖代謝に関連する任意の因子をいう。そのような遺伝子は、代表的に、図５ｃに示される。図５ｃには、脂肪細胞におけるインスリンレセプターのシグナル伝達に関与する遺伝子が示されている。
【００２３】
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患の種類、障害の種類と程度、身体状態などに関連する種々のパラメ−タを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状、薬物反応性予測、病態変化予測または原因を判定することをいう。
【００２４】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。
【００２５】
本明細書において「予防」（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないように処置することをいう。従って、ある疾患または障害について、そのような状態になることを防止、遅延など、および悪化を防ぐことを包含する。本発明の方法は、肺組織を再生することから、予防にも用いられることが理解される。
【００２６】
本明細書において「処置」とは、ある疾患、障害または状態に対して行う任意の医学的行為をいい、診断、治療、予防、予後などに資するために行う行為が包含される。好ましくは、処置は、医師、看護師など何らかの国家免許を所有する医療従事者によって行われるべきである。その行為が結果論敵にある疾患の経過を悪化させ、患者にとって不利益となる場合であっても、その行為そのものは「処置」であることには変わりはないことに留意すべきである。
【００２７】
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法または診断する方法などを医師、被検体など投与を行う人、診断する人（被検体本人であり得る）に対して記載したものである。指示書は、診断薬などがキットとして提供される場合、その使用方法を指示するために添付され得る。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インタ−ネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メ−ル、ＳＭＳ、ＰＤＦ文書など）のような形態でも提供され得る。
【００２８】
（生化学）
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔＥＳａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００２９】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００３０】
本発明において用いられるＰＰＡＲ、アディポネクチンプロモーターならびにそのフラグメントおよび改変体は、トランスジェニック動物作製技術、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
【００３１】
（ＰＰＡＲの説明）
本明細書において使用される用語「ＰＰＡＲ」とは、「ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」の略称であり、核内レセプターの１種を意味する。ＰＰＡＲαは、配列番号１〜８に示す配列（それぞれ、配列番号１−２ (NP_035276)、配列番号３−４(NP_619726)、配列番号５−６ (NP_037256)および配列番号７−８(AAB87480)、それぞれマウス、ヒト、ラット、サルの核酸配列（奇数番号）およびアミノ酸配列（偶数番号））によって定義される。本発明においては、同様の活性を有する限り、上記配列の改変体もまた、この用語の範囲内に入ることが理解される。ＰＰＡＲは、核内レセプターの一種であり、リガンドと結合することによって、核内における生体反応を開始する分子をいう。通常核内レセプターは、核内に存在するが、生体反応を開始する際に核内に移行する性質を持つものも包含される。核内レセプターは、通常、結合すると複合体を形成してDNAに結合して転写因子として働く。ここで、核内レセプターの生体反応は、代表的には転写の調節（例えば、転写の促進、抑制、開始、または終結が挙げられ、代表的には転写の促進であるが、これらに限定されない）である。代表的には、核内レセプターは、天然の状態では、リガンドによる刺激を受けない場合、細胞質に存在し、リガンドと結合した場合に、核内に移行して、その刺激を核内に伝達する分子をいう。あるいは、核内レセプターは、その局在を変えることなく、リガンドとの結合によって、核内における生体反応を開始する。
【００３２】
本明細書中において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいい、例えば、核内レセプターにおいては、Ａドメインに対応するドメインは、転写促進機能を有する領域であり、Ｂドメインに対応するドメインは、同様に転写促進機能を有する領域であり、Ａ／Ｂドメインと称することもある。Ｃドメインに対応するドメインは、ＤＮＡ結合という作用を有する領域であり、通常、ＤＮＡ結合タンパクに見られる特徴的なＺｎフィンガー構造が２個存在する。Ｄドメインに対応するドメインは、ＣドメインとＥ・Ｆドメインとの間に存在する領域であり、Ｅ・Ｆドメインに対応するドメインは、リガンド（ホルモン）に結合する作用を有する領域であり、リガンド結合ドメインともいう。このリガンド結合ドメイン（Ｅ・Ｆドメイン）は、１２のαヘリックスからなる類似の立体構造をとる。Ｆドメインに対応するドメインは、ＥドメインよりＣ末端側に存在する領域である。酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。ＰＰＡＲにおける対応残基は、アラインメントを行うことによって同定することができる。本明細書において、上記に挙げたもの以外の核内レセプターにおけるＡ〜Ｆのドメインは、上記具体例の始まりのアミノ酸と、終わりのアミノ酸に対応するアミノ酸位置の範囲のドメインが対応することが理解される。
【００３３】
本明細書において、Ａ〜Ｆドメインは、当該分野において公知の定義に基づいて決定され得る。例えば、そのような定義は、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｒｅｃｈａｖｉ  Ｍ  ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  ２００３  Ｆｅｂ  １５；１１６（Ｐｔ  ４）：５８５−５８６およびその中で引用される文献などを参酌することができる。
【００３４】
本明細書において、ＰＰＡＲの「生物学的活性」とは、その核内レセプターがそのリガンドと結合した場合に、その核内レセプターによってもたらされる活性であり、例えば、本明細書において直前に記載されるような活性（例えば、ＰＰＡＲγについて、ＰＥＰＣＫの転写促進、糖新生促進など）が挙げられるが、これらに限定されない。核内レセプター（例えば、ＰＰＡＲγ）のアゴニストは、その核内レセプターと結合することによって、その核内レセプターが有する生物学的活性の少なくとも１部または全部を誘導する。
【００３５】
ＰＰＡＲは、代表的にＰＰＡＲγが挙げられ、その配列は配列番号１〜８（奇数は核酸配列、偶数はそれに対応するアミノ酸配列を示す。それぞれ、マウス、ヒト、ラット、サルである）に示される配列あるいはその改変配列を有する。代表的には、ＰＰＡＲは、以下のような分子であり得る：
（ａ）配列番号２、４、６または８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２、４、６または８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１、３、５または７に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２、４、６または８に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；または
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズスルポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
を含む。
【００３６】
本明細書において、ＰＰＡＲタンパク質の生物学的機能の調節は、ＰＰＡＲタンパク質に対する阻害剤を接触させるか、またはＰＰＡＲの機能を低下させるような変異を導入する（例えば、遺伝子治療による）ことによって達成することができる。
【００３７】
ＰＰＡＲタンパク質の生物学的機能は、ＥＬＩＳＡ法、ノーザン・ブロット分析または定量的ＰＣＲ法、細胞増殖もしくは分化を測定することによる生化学的分析方法、および調べられる物質もしくは前記生物学的抽出物の形態形成に対する顕微鏡分析などを行うことによって測定することが可能であるがこれらに限定されない。
【００３８】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーおよびその改変体をいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得るものを包含する。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明の組成物において使用される場合は、「タンパク質」は、その組成物が使用されるべき宿主において適合性のあるタンパク質であることが好ましいが、その宿主において適合するように処置され得る限り、どのようなタンパク質を用いてもよい。あるタンパク質が宿主に適合性があるかどうか、または宿主において適合するように処置され得るかどうかは、そのタンパク質をその宿主に移植して、必要に応じて免疫拒絶反応などの副反応を抑制することによりその宿主に定着するかどうかを観察することによって、判定することができる。代表的には、上述の適合性があるようなタンパク質としては、その宿主に由来するタンパク質を挙げることができるがそれに限定されない。
【００３９】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００４０】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００４１】
本発明において使用される生体分子は、生体から採取され得るほか、当業者に公知の方法によって化学的に合成され得る。例えば、タンパク質であれば、自動固相ペプチド合成機を用いた合成方法は、以下により記載される：Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）．Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  ＣｈｅｍｉｃａＬＣｏ．；Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．（１９９２）．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９９３）．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．（１９９７）．Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．（１９９７）．Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ。その他の分子もまた、当該分野において周知の技術を用いて合成することができる。
【００４２】
本明細書において生体分子（例えば、ＰＰＡＲなどをコードする核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、比較可能な配列を有する場合、２以上の配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの配列の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の配列が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの配列を直接比較する場合、その配列間で配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、生体分子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。本発明では、このように同一性が高いものまたは類似性が高いものもまた、有用であり得る。
【００４３】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST 2.2.9 (2004.5.12 発行)を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００４４】
本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
【００４５】
用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
【００４６】
本明細書において「アミノ酸改変体」とは、天然のアミノ酸ではないが、天然のアミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸改変体としては、例えば、フェニルアラニンのベンジル側鎖（パラ位、メタ位、オルト位など）にアルキル基、ハロ基、ニトロ基などが結合したもの、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。本発明では、アミノ酸改変体は、非天然アミノ酸およびアミノ酸模倣物を包含することがあることが理解される。
【００４７】
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
【００４８】
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるポリヌクレオチドのアンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。本発明のペプチドの場合、ヒトの細胞増殖因子における特定の配列が使用されるが、他の種の動物の細胞増殖因子における特定の配列において、本発明のペプチドに対応する部分が「対応するアミノ酸」に相当することが理解される。
【００４９】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。例えば、マウスＰＰＡＲに対応する遺伝子は、ヒトＰＰＡＲである。
【００５０】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本発明では、生体分子としてポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどが使用される場合、所望の目的（例えば、細胞誘引効果など）が達成される限り、このようなフラグメントもまた、全長のものと同様に使用され得ることが理解される。
【００５１】
本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【００５２】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００５３】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔスルホニル尿素ｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００５４】
本明細書において「ヌクレオチド」は、糖部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいい、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含み、天然のものでも非天然のものでもよい。ここで、ヌクレオシドは、塩基と糖とがＮ−グリコシド結合をした化合物をいう。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含む。
【００５５】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ＰＰＡＲ遺伝子、またはヒトアディポネクチン遺伝子においてプロモーター活性を有する領域に対応する領域は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子、またはプロモーター領域は、本明細書の開示に基づけば、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ヒトアディポネクチンプロモーター）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばマウス、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００５６】
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるポリヌクレオチドのアンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。本発明のプロモーターの場合、プロモーターにおける特定の配列が使用されるが、他の種の動物のプロモーターにおける特定の配列において、本発明のヌクレオチド配列に対応する部分が「対応するヌクレオチド」に相当することが理解される。
【００５７】
本明細書において「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。このような改変体もまた、所望の目的を達成することができる限り、本発明の細胞増殖因子として使用することができる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００５８】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。
【００５９】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【００６０】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、血管新生、細胞再生など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００６１】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａＬＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００６２】
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号  １文字記号  意味
Ａｌａ      Ａ          アラニン
Ｃｙｓ      Ｃ          システイン
Ａｓｐ      Ｄ          アスパラギン酸
Ｇｌｕ      Ｅ          グルタミン酸
Ｐｈｅ      Ｆ          フェニルアラニン
Ｇｌｙ      Ｇ          グリシン
Ｈｉｓ      Ｈ          ヒスチジン
Ｉｌｅ      Ｉ          イソロイシン
Ｌｙｓ      Ｋ          リジン
Ｌｅｕ      Ｌ          ロイシン
Ｍｅｔ      Ｍ          メチオニン
Ａｓｎ      Ｎ          アスパラギン
Ｐｒｏ      Ｐ          プロリン
Ｇｌｎ      Ｑ          グルタミン
Ａｒｇ      Ｒ          アルギニン
Ｓｅｒ      Ｓ          セリン
Ｔｈｒ      Ｔ          トレオニン
Ｖａｌ      Ｖ          バリン
Ｔｒｐ      Ｗ          トリプトファン
Ｔｙｒ      Ｙ          チロシン
Ａｓｘ                  アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘ                  グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ                  不明または他のアミノ酸。
【００６３】
塩基
記号  意味  
ａ    アデニン
ｇ    グアニン
ｃ    シトシン
ｔ    チミン
ｕ    ウラシル
ｒ    グアニンまたはアデニンプリン
ｙ    チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ    アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ    グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ    グアニンまたはシトシン
ｗ    アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ    グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ    アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ    アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ    アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ    アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
【００６４】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能なものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。
【００６５】
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００６６】
本発明において用いられ得る原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
【００６７】
本発明において用いられ得る動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。
【００６８】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【００６９】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。本発明においては、翻訳開始点の約３．６ｋｂ上流の領域をプロモーター領域として同定し、この領域が、脂肪細胞における高度な発現能力および高い特異性をもたらすことを見出した。
【００７０】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【００７１】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００７２】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。  そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【００７３】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【００７４】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【００７５】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示される。
【００７６】
本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙ、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。
【００７７】
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。
【００７８】
本明細書において、レトロウイルスの感染方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  前出（特にＵｎｉｔｓ  ９．９−９．１４）などに記載されるように、当該分野において周知であり、例えば、トリプシナイズして胚性幹細胞を単一細胞懸濁物（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）にした後、ウイルス産生細胞（ｖｉｒｕｓ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）（パッケージング細胞株＝ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）の培養上清と一緒に  １−２  時間共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）することにより、十分量の感染細胞を得ることができる。
【００７９】
本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、Ｃｒｅ酵素の一過的発現、染色体上でのＤＮＡマッピングなどは、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ「ＦＩＳＨ実験プロトコール  ヒト・ゲノム解析から染色体・遺伝子診断まで」松原謙一、吉川  寛  監修  秀潤社（東京）などに記載されるように、当該分野において周知である。
【００８０】
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子およびその集合体をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子およびその集合体を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子およびその集合体であれば生体分子の定義に入る。したがって、医薬品として利用され得る低分子（たとえば、低分子リガンドなど）もまた生体への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子、およびその集合体（例えば、細胞外マトリクス、線維など）などが包含されるがそれらに限定されない。本明細書において、生体分子は、ＰＰＡＲと相互作用する任意の因子を含むことが意図される。
【００８１】
本明細書において「生体内」または「インビボ」（ｉｎ  ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする組織または器官が配置されるべき位置をいう。スクリーニングを行う場合、インビボでのスクリーニングを行うことができる。
【００８２】
本明細書において「インビトロ」（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。スクリーニングを行う場合、インビトロでのスクリーニングを行うことができる。
【００８３】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバントなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８４】
医薬を製造する方法は、当該分野において周知であり、本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａＬＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する細胞組成物とを混合することによって、凍結乾燥された状態で調製され保存され得るが、適切な保存液中に保存されることが好ましい。
【００８５】
本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。本発明において使用され得る薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、支持体およびペプチドまたはその改変体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、移植のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【００８６】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【００８７】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
【００８８】
好ましい実施形態において、本発明の医薬において用いられる薬剤またはその改変体は、処置を目的とする生体に由来することが有利であるが、それに限定されない。このような宿主と同じ起源のペプチドまたはその改変体は、免疫反応等がほとんどないと考えられることから、有利であると考えられる。ただし、ペプチドまたはその改変体は、精製されたものであれば、免疫反応は通常起きないと考えられることから、特に起源を限定する必要はない。
【００８９】
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法または診断する方法などを医師、被検体など投与を行う人、診断する人（被検体本人であり得る）に対して記載したものである。指示書は、診断薬などがキットとして提供される場合、その使用方法を指示するために添付され得る。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インタ−ネットで提供されるホ−ムペ−ジ（ウェブサイト）、電子メ−ル、ＳＭＳ、ＰＤＦ文書など）のような形態でも提供され得る。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明は遺伝子治療と併用することができる。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、コードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【００９１】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、遺伝子治療の方法の一般的な概説書である、ＧｏｌｄｓｐｉｅＬｅｔ  ａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａＬＰｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５  （１９９３）；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５  （１９９１）；  Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６  （１９９３）；  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２  （１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７  （１９９３）；  Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５  （１９９３）に記載されている。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ  （１９９３）；  およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  （１９９０）に記載される。
【００９２】
（転写活性アッセイ）
本明細書において「転写活性アッセイ」とは、ある領域について転写活性を有するか否かを検定するための任意のアッセイをいう。このアッセイでは、ある化学物質が細胞内でレセプターに結合し、目的遺伝子からタンパク質への転写を活性化させる一連の作用への影響を評価する。例えば、タンパク質としてルシフェラーゼを例示することができるが、それに限定されない。目的遺伝子としてＰＰＡＲγが例示される。レポーター遺伝子をコードするＤＮＡの上流には、転写因子認識配列として、ＧＡＬ４結合領域が例示される。転写調節因子としてＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＤＢＤ）と融合したＰＰＡＲγ結合ドメイン（ＰＰＡＲγＬＢＤ）が例示される。この方法では、まず目的となる核内レセプターをコードするＤＮＡとレポーター遺伝子をコードするＤＮＡを導入した培養細胞を調製する。この培養細胞を含む培地に化学物質を加えて培養し、蛍光強度等を測定する。ここでは、化学物質がレセプターへの結合からタンパク質合成に至るまでの一連の作用をホルモンと同様に作用するかどうかを評価する。この方法では目的のホルモンと化学物質を共存させることにより、化学物質がアゴニストとして作用するかアンタゴニストとして作用するかを評価することが可能となる。さらに、この方法ではロボットシステムであるハイスループット装置を用いて大量のサンプルを迅速に処理することが可能である。
【００９３】
従って、本発明では、候補化合物、核内レセプターのアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかどうかを判定する方法を実施する際に、このような転写活性アッセイを用いることができる。この方法では、候補化合物を提供した後、その候補化合物が、該核内レセプター中のシステインと共有結合するかどうかを判定し、共有結合すると判定された候補化合物を選択し、核内レセプターと相互作用する領域を含む核酸配列と作動可能に連結されるレポーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物と、該選択された核内レセプターとを含む系（例えば、細胞）において、候補化合物を暴露させる。ここで、レポーターの発現が増強される場合、候補化合物は該核内レセプターのアゴニストと判定し、レポーターの発現が減少する場合、候補化合物は該核内レセプターのアンタゴニストと判定する。
【００９４】
本明細書においてレポーターとしては、発現を確認することができる限り、どのような物を利用しても良いが、ルシフェラーゼが代表的に用いられる。化学発光することから、観察が容易であるからである。このほかに、例えば、蛍光タンパク質なども使用され得るがそれに限定されない。
【００９５】
本発明において用いられる転写活性アッセイにおいて利用される系は、細胞であり得るがこれに限定されず、無細胞系もまた使用され得ることが理解される。
【００９６】
また、上記転写因子認識配列としては、例えば、ＧＡＬ４ＤＮＡ（Ｔｙｒｅｅ  ＣＭ，  Ｋｌａｕｓｉｎｇ  Ｋ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２００３；８５：１７５−８３）、ＬｅｘＡ  ＤＢＤ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  １０，ｎｏ．７，ｐｐ．５８４−５８５  （Ｊｕｌｙ，２００３））などを挙げることができるがそれに限定されない。このような転写因子認識配列は、どのような核内レセプターであっても使用され得ることが理解される。他の転写因子認識配列は、本発明のこの系を用いて、アゴニストであると分かっている物質を上記候補化合物の代わりに使用し、転写因子認識配列の候補配列を上記ＧＡＬ４ＤＮＡの代わりに使用したアッセイを実行し、そのアッセイにおいてアゴニストによるポジティブな応答が見られる任意の配列を転写因子認識配列として使用することができることが理解され得る。
【００９７】
（有機化学）
本発明は、スルホニル尿素剤がＰＰＡＲを調節する能力を有することを見出したことによって一部完成された。
【００９８】
本明細書において、「スルホニル尿素剤」とは、
【００９９】
【化１３】
2008019169.tif 000004
【０１００】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、任意の置換基を指す）で示されるスルホニル基と、尿素とが結合した構造を有するものをいう。スルホニル尿素剤は、古くからインスリン分泌刺激作用による血糖降下作用がありインスリンの代用として用いられてきた。スルホニル尿素剤としては、例えば、グリメピリド、グリベンクラミド、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミドおよびグリクラジドなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１０１】
本明細書において「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１１アルキルまたはＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルキルであり得る。ここで、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（ＣＨ３−）、エチル（Ｃ２Ｈ５−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘキシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘプチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−オクチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ノニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−デシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２などが例示される。また、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキルとは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
【０１０２】
本明細書において「置換されていてもよいアルキル」とは、上で定義した「アルキル」または「置換されたアルキル」のいずれであってもよいことを意味する。
【０１０３】
本明細書において「アルキレン」とは、メチレン、エチレン、プロピレンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が二つ失われて生ずる２価の基をいい、一般に−ＣｎＨ２ｎ−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキレンは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキレン」とは、以下に規定する置換基によってアルキレンのＨが置換されたアルキレンをいう。これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルキレン、Ｃ１〜Ｃ３アルキレン、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン、Ｃ１〜Ｃ５アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ１〜Ｃ７アルキレン、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン、Ｃ１〜Ｃ９アルキレン、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ１１アルキレンまたはＣ１〜Ｃ１２アルキレン、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルキレンまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルキレンであり得る。ここで、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキレンとは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキレンを意味し、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−Ｃ２Ｈ４−）、ｎ−プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピレン（−（ＣＨ３）２Ｃ−）、ｎ−ブチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ペンチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘキシレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘプチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−オクチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ノニレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−デシレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−などが例示される。また、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキレンとは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレンであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。本明細書において「アルキレン」は、酸素原子および硫黄原子から選択される原子を１またはそれ以上含んでいてもよい。
【０１０４】
本明細書において「置換されていてもよいアルキレン」とは、上で定義した「アルキレン」または「置換されたアルキレン」のいずれであってもよいことを意味する。
【０１０５】
本明細書において「シクロアルキル」とは、環式構造を有するアルキルをいう。「置換されたシクロアルキル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルキルのＨが置換されたシクロアルキルをいう。具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたシクロアルキルまたはＣ３〜Ｃ１２置換されたシクロアルキルであり得る。例えば、シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロヘキシルなどが例示される。
【０１０６】
本明細書において「置換されていてもよいシクロアルキル」とは、上で定義した「シクロアルキル」または「置換されたシクロアルキル」のいずれであってもよいことを意味する。
【０１０７】
本明細書において「アルケニル」とは、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−１−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってアルケニルのＨが置換されたアルケニルをいう。具体例としては、Ｃ２〜Ｃ３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ９アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１１アルケニルまたはＣ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ４置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ５置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ６置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ７置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ９置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ１１置換されたアルケニルまたはＣ２〜Ｃ１２置換されたアルケニルであり得る。ここで、例えばＣ２〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルケニルを意味し、ビニル（ＣＨ２＝ＣＨ−）、アリル（ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−）、ＣＨ３ＣＨ＝ＣＨ−などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニルとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
【０１０８】
本明細書において「置換されていてもよいアルケニル」とは、上で定義した「アルケニル」または「置換されたアルケニル」のいずれであってもよいことを意味する。
【０１０９】
本明細書において「アルケニレン」とは、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が二つ失われて生ずる２価の基をいい、一般に−ＣｎＨ２ｎ−２−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルケニレン」とは、以下に規定する置換基によってアルケニレンのＨが置換されたアルケニレンをいう。具体例としては、Ｃ２〜Ｃ２５アルケニレンまたはＣ２〜Ｃ２５置換されたアルケニレンが挙げられ、なかでも特にＣ２〜Ｃ３アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ４アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ５アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ７アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ８アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ９アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ１１アルケニレンまたはＣ２〜Ｃ１２アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ３置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ４置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ５置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ７置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ８置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ９置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ１１置換されたアルケニレンまたはＣ２〜Ｃ１２置換されたアルケニレンが好ましい。ここで、例えばＣ２〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルケニレンを意味し、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、−（ＣＨ３）Ｃ＝ＣＨ−などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニレンとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニレンであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。本明細書において「アルケニレン」は、酸素原子および硫黄原子から選択される原子を１またはそれ以上含んでいてもよい。
【０１１０】
本明細書において「置換されていてもよいアルケニレン」とは、上で定義した「アルケニレン」または「置換されたアルケニレン」のいずれであってもよいことを意味する。
【０１１１】
本明細書において「シクロアルケニル」とは、環式構造を有するアルケニルをいう。「置換されたシクロアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルケニルのＨが置換されたシクロアルケニルをいう。具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたシクロアルケニルまたはＣ３〜Ｃ１２置換されたシクロアルケニルであり得る。例えば、好ましいシクロアルケニルとしては、１−シクロペンテニル、２−シクロヘキセニルなどが例示される。
【０１１２】
本明細書において「置換されていてもよいシクロアルケニル」とは、上で定義した「シクロアルケニル」または「置換されたシクロアルケニル」のいずれであってもよいことを意味する。
【０１１３】
本明細書において「アルキニル」とは、アセチレンのような、分子内に三重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−３−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルキニル」とは、以下に規定する置換基によってアルキニルのＨが置換されたアルキニルをいう。具体例としては、Ｃ２〜Ｃ３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ２〜Ｃ７アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ９アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１１アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ２〜Ｃ３置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ４置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ５置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ６置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ７置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ８置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ９置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ１１置換されたアルキニルまたはＣ２〜Ｃ１２置換されたアルキニルであり得る。ここで、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルとは、例えば炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルキニルを意味し、エチニル（ＣＨ≡Ｃ−）、１−プロピニル（ＣＨ３Ｃ≡Ｃ−）などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルキニルとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
【０１１４】
本明細書において「置換されていてもよいアルキニル」とは、上で定義した「アルキニル」または「置換されたアルキニル」のいずれであってもよいことを意味する。
【０１１５】
本明細書において「アルコキシ」とは、アルコール類のヒドロキシ基の水素原子が失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１Ｏ−で表される（ここで、ｎは１以上の整数である）。「置換されたアルコキシ」とは、以下に規定する置換基によってアルコキシのＨが置換されたアルコキシをいう。具体例としては、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ９アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１１アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルコキシまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルコキシであり得る。ここで、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシとは、炭素原子を１〜１０個含む直鎖または分枝状のアルコキシを意味し、メトキシ（ＣＨ３Ｏ−）、エトキシ（Ｃ２Ｈ５Ｏ−）、ｎ−プロポキシ（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）などが例示される。
【０１１６】
本明細書において「置換されていてもよいアルコキシ」とは、上で定義した「アルコキシ」または「置換されたアルコキシ」のいずれであってもよいことを意味する。
【０１１７】
本明細書において「ヘテロ環（基）」とは、炭素およびヘテロ原子をも含む環状構造を有する基をいう。ここで、ヘテロ原子は、Ｏ、ＳおよびＮからなる群より選択され、同一であっても異なっていてもよく、１つ含まれていても２以上含まれていてもよい。ヘテロ環基は、芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。ヘテロ環基は置換されていてもよい。
【０１１８】
本明細書において「置換されていてもよいヘテロ環（基）」とは、上で定義した「ヘテロ環（基）」または「置換されたヘテロ環（基）」のいずれであってもよいことを意味する。
【０１１９】
本明細書において「アルコール」とは、脂肪族炭化水素の１または２以上の水素原子をヒドロキシル基で置換した有機化合物をいう。本明細書においては、ＲＯＨとも表記される。ここで、Ｒは、アルキル基である。好ましくは、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり得る。アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２０】
本明細書において「炭素環基」とは、炭素のみを含む環状構造を含む基であって、前記の「シクロアルキル」、「置換されたシクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「置換されたシクロアルケニル」以外の基をいう。炭素環基は芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換された炭素環基」とは、以下に規定する置換基によって炭素環基のＨが置換された炭素環基をいう。具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１２炭素環基、Ｃ３〜Ｃ４置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１置換された炭素環基またはＣ３〜Ｃ１２置換された炭素環基であり得る。炭素環基はまた、Ｃ４〜Ｃ７炭素環基またはＣ４〜Ｃ７置換された炭素環基であり得る。炭素環基としては、フェニル基から水素原子が１個欠失したものが例示される。ここで、水素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であってもよい。
【０１２１】
本明細書において「置換されていてもよい炭素環基」とは、上で定義した「炭素環基」または「置換された炭素環基」のいずれであってもよいことを意味する。
【０１２２】
本明細書において「ヘテロ環基」とは、炭素およびヘテロ原子をも含む環状構造を有する基をいう。ここで，ヘテロ原子は、Ｏ、ＳおよびＮからなる群より選択され、同一であっても異なっていてもよく、１つ含まれていても２以上含まれていてもよい。ヘテロ環基は、芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換されたヘテロ環基」とは、以下に規定する置換基によってヘテロ環基のＨが置換されたヘテロ環基をいう。具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１２炭素環基、Ｃ３〜Ｃ４置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１置換された炭素環基またはＣ３〜Ｃ１２置換された炭素環基の１つ以上の炭素原子をヘテロ原子で置換したものであり得る。ヘテロ環基はまた、Ｃ４〜Ｃ７炭素環基またはＣ４〜Ｃ７置換された炭素環基の炭素原子を１つ以上へテロ原子で置換したものであり得る。ヘテロ環基としては、チエニル基、ピロリル基、フリル基、イミダゾリル基、ピリジル基などが例示される。水素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であってもよい。
【０１２３】
本明細書において、炭素環基またはヘテロ環基は、下記に定義されるように１価の置換基で置換され得ることに加えて、２価の置換基で置換され得る。そのような二価の置換は、オキソ置換（＝Ｏ）またはチオキソ置換（＝Ｓ）であり得る。
【０１２４】
本明細書において「ハロゲン」とは、周期表７Ｂ族に属するフッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）などの元素の１価の基をいう。
【０１２５】
本明細書において「ヒドロキシ」とは、−ＯＨで表される基をいう。「置換されたヒドロキシ」とは、ヒドロキシのＨが下記で定義される置換基で置換されているものをいう。
【０１２６】
本明細書において「チオール」とは、ヒドロキシ基の酸素原子を硫黄原子で置換した基（メルカプト基）であり、−ＳＨで表される。「置換されたチオール」とは、メルカプトのＨが下記で定義される置換基で置換されている基をいう。
【０１２７】
本明細書において「シアノ」とは、−ＣＮで表される基をいう。「ニトロ」とは、−ＮＯ２で表される基をいう。「アミノ」とは、−ＮＨ２で表される基をいう。「置換されたアミノ」とは、アミノのＨが以下で定義される置換基で置換されたものをいう。
【０１２８】
本明細書において「カルボキシ」とは、−ＣＯＯＨで表される基をいう。「置換されたカルボキシ」とは、カルボキシのＨが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。
【０１２９】
本明細書において「チオカルボキシ」とは、カルボキシ基の酸素原子を硫黄原子で置換した基をいい、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＨまたは−ＣＳＳＨで表され得る。「置換されたチオカルボキシ」とは、チオカルボキシのＨが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。
【０１３０】
本明細書において「アシル」とは、カルボン酸からＯＨを除いてできる１価の基をいう。アシル基の代表例としては、アセチル（ＣＨ３ＣＯ−）、ベンゾイル（Ｃ６Ｈ５ＣＯ−）などが挙げられる。「置換されたアシル」とは、アシルの水素を以下に定義される置換基で置換したものをいう。
【０１３１】
本明細書において「アミド」とは、アンモニアの水素を酸基（アシル基）で置換した基であり、好ましくは、−ＣＯＮＨ２で表される。「置換されたアミド」とは、アミドが置換されたものをいう。
【０１３２】
本明細書において「カルボニル」とは、アルデヒドおよびケトンの特性基である−（Ｃ＝Ｏ）−を含むものを総称したものをいう。「置換されたカルボニル」は、下記において選択される置換基で置換されているカルボニル基を意味する。
【０１３３】
本明細書において「チオカルボニル」とは、カルボニルにおける酸素原子を硫黄原子に置換した基であり、特性基−（Ｃ＝Ｓ）−を含む。チオカルボニルには、チオケトンおよびチオアルデヒドが含まれる。「置換されたチオカルボニル」とは、下記において選択される置換基で置換されたチオカルボニルを意味する。
【０１３４】
本明細書において「スルホニル」とは、特性基である−ＳＯ２−を含むものを総称したものをいう。「置換されたスルホニル」とは、下記において選択される置換基で置換されたスルホニルを意味する。
【０１３５】
本明細書において「スルフィニル」とは、特性基である−ＳＯ−を含むものを総称したものをいう。「置換されたスルフィニル」とは、下記において選択される置換基で置換されているスルフィニルを意味する。
【０１３６】
本明細書において「アリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が１個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、炭素環基に包含される。
【０１３７】
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換することも可能である。
【０１３８】
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換することも可能である。
【０１３９】
本発明における置換基としては、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、アシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルまたは置換されたスルフィニルが挙げられるがそれらに限定されない。このような置換基は、本発明において、アミノ酸の設計のときに、適宜利用することができる。
【０１４０】
好ましくは、置換基は、複数存在する場合それぞれ独立して、水素原子またはアルキルであり得るが、複数の置換基全てが水素原子であることはない。より好ましくは、独立して、置換基は、複数存在する場合それぞれ独立して、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より選択され得る。置換基は、すべてが水素以外の置換基を有していても良いが、好ましくは、少なくとも１つの水素、より好ましくは、２〜ｎ（ここでｎは置換基の個数）の水素を有し得る。置換基のうち水素の数が多いことが好ましくあり得る。大きな置換基または極性のある置換基は本発明の効果（特に、アルデヒド基との相互作用）に障害を有し得るからである。従って、水素以外の置換基としては、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、メチルなどであり得る。ただし、本発明の効果を増強し得ることもあることから、大きな置換基を有することもまた好ましくあり得る。
【０１４１】
本明細書において、Ｃ１、Ｃ２、．．．Ｃｎは、炭素数を表す。従って、Ｃ１は炭素数１個の置換基を表すために使用される。
【０１４２】
本明細書において、「光学異性体」とは、結晶または分子の構造が鏡像関係にあって、重ねあわせることのできない一対の化合物の一方またはその組をいう。立体異性体の一形態であり、他の性質は同じであるにもかかわらず、旋光性のみが異なる。
【０１４３】
本明細書において「保護反応」とは、Ｂｏｃのような保護基を、保護が所望される官能基に付加する反応をいう。保護基により官能基を保護することによって、より反応性の高い官能基の反応を抑制し、より反応性の低い官能基のみを反応させることができる。保護反応は、例えば、脱水反応により行うことができる。
【０１４４】
本明細書において「脱保護反応」とは、Ｂｏｃのような保護基を脱離させる反応をいう。脱保護反応としては、Ｐｄ／Ｃを用いる還元反応のような反応が挙げられる。脱保護反応は、例えば、加水分解により行うことができる。
【０１４５】
本明細書において「保護基」としては、例えば、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、Ｎ-フタルイミジル基、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル基、２-ニトロ-４，５-ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、カルバメート基などが代表的な保護基として挙げられる。
【０１４６】
本発明の各方法において、目的とする生成物は、反応液から夾雑物（未反応減量、副生成物、溶媒など）を、当該分野で慣用される方法（例えば、抽出、蒸留、洗浄、濃縮、沈澱、濾過、乾燥など）によって除去した後に、当該分野で慣用される後処理方法（例えば、吸着、溶離、蒸留、沈澱、析出、クロマトグラフィーなど）を組み合わせて処理して単離し得る。
【０１４７】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物、細胞または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュ−タを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物、診断剤、治療薬などが提供されることも企図される。
【０１４８】
本明細書において「候補化合物」とは、スクリーニングにおいて用いられる場合、そのスクリーニングが対象とする目的に関して候補となる化合物をいう。そのような化合物は、どのような因子であってもよい。候補化合物としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリーで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子を上げることができるがそれらに限定されない。候補化合物は、その候補が薬物である場合、候補薬物とも言う。このような候補化合物の集合をライブラリーとも言う。
【０１４９】
本明細書において「化合物種」とは、ある化合物の集合において、特定の目的とする活性を有するなど、所望の性質を有する１種の化合物についていう。例えば、活性を調節する化合物の集合において、化合物が特定される場合、そのような化合物は、化合物種と称され得る。本明細書では、単に化合物とも称される。
【０１５０】
従って、本明細書において「ライブラリー」とは、スクリーニングをするための化合物などの一定の集合をいう。ライブラリーは、同様の性質を有する化合物の集合であっても、ランダムな化合物の集合であってもよい。好ましくは、同様の性質を有すると予測される化合物の集合が使用されるが、それに限定されない。本発明で使用する化合物ライブラリーは、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術、醗酵方法、植物および細胞抽出手順などが挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの手段により、作製することができるかまたは入手することができる。コンビナトリアルライブラリーを作成する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｅ．Ｒ．Ｆｅｌｄｅｒ，Ｃｈｉｍｉａ  １９９４，４８，５１２−５４１；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，１２３３−１２５１；Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９３，９，２３５−２３９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５４，８４−８６；Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５４，８２−８４；Ｃａｒｅｌｌら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９５，３，１７１−１８３；Ｍａｄｄｅｎら、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ２，２６９−２８２；Ｃｗｉｒｌａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９０，８７，６３７８−６３８２；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９２，８９，５３８１−５３８３；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，１３８５−１４０１；Ｌｅｂｌら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  １９９５，３７  １７７−１９８；およびそれらで引用された参考文献を参照のこと。これらの参考文献は、その全体を、本明細書中で参考として援用する。
【０１５１】
本明細書において「調節」とは、ＰＰＡＲについて言及するとき、その生物学的活性が変更されることをいう。
【０１５２】
本明細書において「阻害」とは、ＰＰＡＲについて言及するとき、その生物学的活性が低減または消失することをいう。
【０１５３】
本明細書において「促進」とは、ＰＰＡＲについて言及するとき、その生物学的活性が増加または無い状態から有る状態が生じることをいう。
【０１５４】
本明細書において「生物学的試験」とは、実際の生体反応を用いてある化合物がある活性を有するかどうかを判定することをいう。生物学的試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの試験を包含する。したがって、生物学的試験は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏとは対立する概念である。
【０１５５】
本明細書において「評価」とは、スクリーニングにおいて用いられるとき、ある指標（例えば、医薬としての活性）に関して、候補化合物がそのような指標の要件を満たすかどうか決定することをいう。そのような評価は、当該分野において公知の方法を用いて行うことができ、インシリコ（コンピュータを用いる）かまたはウェット（実際の生物学的アッセイを行う）によって行うことができる。
【０１５６】
本発明のスクリーニング技術において、スクリーニングのヒットは、遺伝子技術を用いたアッセイなどによって確認することができる。
【０１５７】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子（通常は、ＤＮＡ形態）などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。別の実施形態では、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシング（例えば、リーダー配列切除）を受けたものであり得る。
【０１５８】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、生物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（例えば、罹患部位などの特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。そのような特異的発現は、抗原提示細胞の特性を利用して実現することができる。従って、本発明における医薬のスクリーニングは、特定の指標の特異的発現を確認することによっても行うことができる。
【０１５９】
本明細書においてある細胞において「のみ」発現するとは、その細胞においてのみある遺伝子が発現し、他の種の細胞においては実質的に発現しないことをいう。従って、ある細胞においてのみ発現することは、その細胞において特異的に発現することを包含する。この場合、脂肪細胞において活性であり、かつ他の細胞における非特異的発現がほとんどない。
【０１６０】
本明細書において「活性」とは、核酸、タンパク質などの遺伝子または遺伝子産物について言及されるとき、その遺伝子または遺伝子産物が本来発揮しようとする機能についての活性をいう。そのような活性としては、例えば、ＰＰＡＲについていえば、脂肪細胞分化、糖代謝の調節、脂質代謝の調節などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１６１】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、必要に応じてマイクロタイタープレートを用いる、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１６２】
本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノ−ザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【０１６３】
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。
【０１６４】
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。
【０１６５】
本明細書において「塩基対の」および「Ｗａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対の」という表現は、本明細書では同義に用いられ、二重らせん状のＤＮＡにおいて見られるものと同様に、アデニン残基が２つの水素結合によってチミン残基またはウラシル残基と結合し、３つの水素結合によってシトシン残基とグアニン残基とが結合するという配列の正体に基づいて互いに水素結合可能なヌクレオチドを示す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照）。
【０１６６】
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
【０１６７】
（インスリン感受性増強）
以下に、アッセイ例を挙げて本発明のインスリン抵抗性改善薬またはインスリン感受性増強薬としての有用性を支持する効果について説明する。一例としてグルコースクランプ法は末梢組織のインスリン感受性を評価する方法の１つである。このグルコースクランプ法は、現在のところ最も正確に感受性を評価できるとされている。本法では血中インスリン値を一定レベルに保つようにインスリンの持続的注入下に、血糖値をモニターしながらグルコース液を注入し、血糖値を空腹時血糖に保持するもので、この際に必要なグルコース注入速度をグルコース代謝速度としてインスリン感受性の指標とする。
試験の結果は平均値±標準誤差で示すことができる。有意差検定はｔ−検定で行い、例えば、ｐ値が０.０５より小さいときに有意であると判断することができる。
試験計画例１：２型糖尿病患者２０名を１０名ずつ２群に無作為に割り付ける。試験群とプラセボ群との間には、年齢、性別、肥満指数、経口血糖降下剤の服用、空腹時の血糖およびヘモグロビンＡ１ｃのような背景因子には差が認められないように調整する。また、全ての患者はインスリン投与を受けさせない。これらの患者は、例えば、試験の少なくとも２週間前に入院し、１日当たり少なくとも２００ｇの炭水化物を含む体重維持食を摂取させる。
試験群の患者には候補化合物を試験量１日３回１週間にわたり連日経口投与する。プラセボ群の患者には同様のプラセボ錠１個ずつを１日３回１週間にわたり連日経口投与する。治療前と最終治療日には、空腹時に患者の血管カテーテルから血液をＥＤＴＡ１．２ｍｇとアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｒ、バイエル社製、ドイツ）４００ＫＩＵを含む管に採取する。遠心分離により集めた血漿は分析するまで−４０℃で保存した。血中のグルコース、フルクトサミンおよびヘモグロビンＡ１ｃは、例えば、それぞれグルコースオキシダーゼ法、ＮＢＴ（ＮｉｔｒｏＢｌｕｅＴｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）法およびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）法により測定する。血漿中のインスリン量および尿中のＣペプチド量は、それぞれ市販のキットであるインスリン−ＩＩＩ（ベーリンガー−マンハイム社製、ドイツ）およびＣペプチドキット（第一化学、日本）を用いて測定した。なお、尿中のＣペプチド量は、２日間の平均値として計算する。
試験群およびプラセボ群ともに全患者について、治療前と最終治療日に、体重１ｋｇ当たり０．２ｇのグルコースを静脈内投与し、経時的に血糖およびインスリン分泌を測定するグルコース負荷試験を実施する。
また、両群ともに一部の患者（例えば、５名）について、治療前と最終治療日に、高インスリン−正常血糖状態固定法（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉｃ−ｎｏｒｍｏｇｌｙｃｅｍｉｃ−ｃｌａｍｐ；以下「グルコースクランプ法」という）試験を実施するとともに、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）により赤血球３００μｌ当たりののインスリンレセプターの全量およびチロシン自己リン酸化量を測定し、インスリン感受性を評価する。ＥＬＩＳＡによるインスリンレセプターの測定は、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４３，２７４−２８０（１９９４）に記載の方法に準じて行う。
【０１６８】
グルコースクランプ法試験では、肝のグルコース産生を抑制するために、インスリンを０．８ｍＵ／ｋｇ／分の割合で４時間注入し、血漿中インスリン濃度は１００μＵ／ｍｌ（６００ｐｍｏｌ／Ｌ）に維持した。血糖値は９５ｍｇ／ｄｌ（５．３２ｍｍｏｌ／Ｌ）に保持するようにグルコース液を注入する。インスリン注入開始後２〜４時間のグルコース注入速度を測定し、グルコース代謝速度とする。
次に、本発明の化合物が有する作用の一つである「インスリン感受性増強作用」について説明する。
すなわち、インスリン感受性増強作用の強さは、ＫＫＡｙマウスに薬物を投与した時の血糖降下率により評価することができる。ＫＫＡｙマウスはインスリン抵抗性を示す糖尿病モデル動物であり（日本臨床６０巻、増刊号８、３８−４４、（２００２））、インスリン分泌促進作用に基づく２型糖尿病治療剤であるスルホニル尿素系血糖降下剤は有効ではないことが知られている（ＭｅｄｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．３，１３１−１３６、（１９９０））。ＫＫＡｙマウスを用いた経口投与の血糖降下試験においては、ＫＫＡｙマウスの血糖値を約４５％抑制すると正常マウスの血糖値とほぼ同じになることから、血糖降下率が４０〜５０％であることが好ましい。
ＫＫＡｙマウスを用いた経口投与の血糖降下試験による血糖降下率の測定は公知の方法により行うことができるが、好ましい方法を以下に示す。
【０１６９】
例えば、１１週齢の雄性マウス（ＫＫＡｙ／Ｔａ）の６匹を１群として試験に用いる。そして、コントロールとして処置前の血糖値を測定するため、尾部から採血しておく。採血後に、ビグアナイド誘導体を適切な濃度で０．５％ＣＭＣ−Ｎａ（ＳｏｄｉｕｍＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌＣｅｌｌｕｌｏｓｅ）液に溶解し、１０ｍＬ／ｋｇの用量で経口投与する。また、対照として溶媒のみを投与したマウスを準備する。薬物投与の１時間、２時間、４時間、６時間後に、血糖値を測定するため尾部から採血する。血糖値はグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬株式会社製）を用いて測定する。
また、血糖降下率は次式により求める。
【０１７０】
血糖降下率（％）＝［（対照群の血糖値のＡＵＣ−化合物投与群の血糖値のＡＵＣ）／対照群の血糖値のＡＵＣ］×１００
ここで、血糖値のＡＵＣとは、薬物投与後の血糖値変化を時間に対してプロットしたグラフにおいて、グルコース値０をベースラインとして薬物投与６時間後までの面積を表す。具体的には、Ａ＝薬物投与前の血糖値、Ｂ＝薬物投与１時間後の血糖値、Ｃ＝薬物投与２時間後の血糖値、Ｄ＝薬物投与４時間後の血糖値、Ｅ＝薬物投与６時間後の血糖値としたとき、血糖値のＡＵＣは以下の式：
血糖値のＡＵＣ＝１×（（Ａ＋Ｂ）／２）＋１×（（Ｂ＋Ｃ）／２）＋２×（（Ｃ＋Ｄ）／２）＋２×（（Ｄ＋Ｅ）／２）
から求めることができる。
【０１７１】
この血糖降下率が約４５％である場合、正常マウスの血糖値とほぼ同じレベルに血糖値が低下する。
【０１７２】
また、インスリン感受性増強作用の強さは、インスリン抵抗性を示す糖尿病モデル動物であるｄｂ／ｄｂマウス（日本臨床６０巻、増刊号８、３８−４４、（２００２））に薬物を投与した時の血糖降下率によって評価することもできる。ｄｂ／ｄｂマウスを用いた経口投与の糖負荷試験においては、ｄｂ／ｄｂマウスの血糖値を約５０％抑制すると正常マウスの血糖上昇とほぼ同じになることから、血糖降下率が４０％以上であることが好ましく、さらに５０％以上であることがより好ましい。
【０１７３】
ｄｂ／ｄｂマウスを用いた経口投与の糖負荷試験による血糖降下率の測定は公知の方法により行うことができるが、好ましい方法を以下に示す。すなわち、先ず、１１〜１７週齢の雌性マウス（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ＜ｄｂ＞（ｄｂ／ｄｂ））を１８〜２４時間絶食させる。このとき、５〜６匹を１群として試験に用いる。コントロールとして処置前の血糖値を測定するため、尾部から採血しておく。採血後に、ビグアニド誘導体を適切な濃度でリン酸バッファー生理食塩液に溶解し、５ｍｌ／ｋｇの用量で皮下投与する。また、対照として溶媒のみを投与したマウスを準備する。更に、化合物あるいは溶媒投与の３０分後に、グルコースを３ｇ／６ｍｌ／ｋｇの用量で経口投与し、経口糖負荷試験を実施する。グルコース投与の３０分、１時間、２時間後に、血糖値を測定するため、尾部より採血する。血糖値は新ブラッド・シュガーテスト（ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）、またはグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いて測定する。
【０１７４】
そして、血糖降下率は以下の式より求める。
【０１７５】
血糖降下率（％）＝［（溶媒投与群の血糖上昇値のＡＵＣ−化合物投与群の血糖上昇値のＡＵＣ）／溶媒投与群の血糖上昇値のＡＵＣ］×１００
ここで、血糖上昇値のＡＵＣとは、グルコース投与後の血糖値変化を時間に対してプロットしたグラフにおいて、グルコース投与前の血糖値をベースラインとしてグルコース投与２時間後までの増加部分の面積を表す。具体的には、Ａ＝グルコース投与前の血糖値、Ｂ＝グルコース投与３０分後の血糖値、Ｃ＝グルコース投与１時間後の血糖値、Ｄ＝グルコース投与２時間後の血糖値としたとき、血糖上昇値のＡＵＣは、以下の式：
血糖上昇値のＡＵＣ＝０．５×（（Ａ＋Ｂ）／２−Ａ）＋０．５×（（Ｂ＋Ｃ）／２−Ａ）＋１×（（Ｃ＋Ｄ）／２−Ａ）
から求めることができる。
【０１７６】
なお、経口糖負荷試験による血糖降下率および血中乳酸値の測定は公知の方法により行うことができ、前者の測定は前述の方法により行うことができる。また、後者の測定は以下の方法により好適に行うことができる。すなわち、まず、１１〜１７週齢の雌性マウス（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒ＜ｄｂ＞（ｄｂ／ｄｂ））を１８〜２４時間絶食させる。このとき、５〜６匹を１群として試験に用いる。コントロールとして処置前の血中乳酸値を測定するため、尾部から採血しておく。採血後に、ビグアニド誘導体を適切な濃度でリン酸バッファー生理食塩液に溶解し、５ｍｌ／ｋｇの用量で皮下投与する。また、対照として溶媒のみを投与したマウスを準備する。更に、化合物あるいは溶媒投与の３０分後に、グルコースを３ｇ／６ｍｌ／ｋｇの用量で経口投与し、経口糖負荷試験を実施する。グルコース投与の３０分、１時間、２時間後に、血中乳酸値を測定するため、尾部より採血する。血中乳酸値は、「アスカ・シグマ」（シグマ・ダイアグノスティクス株式会社製）を用いて測定することができる。
【０１７７】
そして、血中乳酸値上昇率は、以下の式：
血中乳酸値上昇率（％）＝［（化合物投与群の血中乳酸値のＡＵＣ−溶媒投与群の血中乳酸値のＡＵＣ）／溶媒投与群の血中乳酸値のＡＵＣ］×１００
から求められる。
【０１７８】
ここで、血中乳酸値のＡＵＣとは、グルコース投与後の血中乳酸値変化を時間に対してプロットしたグラフにおいて、グルコース投与２時間後までの面積を表す。具体的には、Ｅ＝グルコース投与前の血中乳酸値、Ｆ＝グルコース投与３０分後の血中乳酸値、Ｇ＝グルコース投与１時間後の血中乳酸値、Ｈ＝グルコース投与２時間後の血中乳酸値としたとき、血中乳酸値のＡＵＣは、以下の式：
血中乳酸値のＡＵＣ＝０．５×（Ｅ＋Ｆ）／２＋０．５×（Ｆ＋Ｇ）／２＋１×（Ｇ＋Ｈ）／２
から求めることができる。
【０１７９】
（改変体設計）
本明細書において、改変体分子の設計は、変異前のタンパク質またはポリペプチド分子（例えば、野生型分子（例えば、ＰＰＡＲ））のアミノ酸配列および立体構造を解析することによって、各アミノ酸がどのような特性（例えば、触媒活性、他の分子との相互作用など）を担うかを予測し、所望の特性の改変（例えば、触媒活性の向上、タンパク質の安定性の向上など）をもたらすために適切なアミノ酸変異を算出することにより行われる。設計の方法は、好ましくはコンピューターを用いて行われる。このような設計方法で用いられるコンピューターのプログラムの例としては、本明細書において言及されるように、以下が挙げられる：構造を解析するプログラムとして、Ｘ線回折データの処理プログラムであるＤＥＮＺＯ（マックサイエンス）；位相を決定するための処理プログラムとして、ＰＨＡＳＥＳ（Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）；初期位相の改良のためのプログラムとして、プログラムＤＭ（ＣＣＰ４パッケージ、ＳＥＲＣ）；３次元グラフィックスを得るためのプログラムとしてプログラムＯ（Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）；立体構造精密化プログラムとして、ＸＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＣＴ、ＵＳＡ）；そして、変異導入モデリングのためのプログラムとして、Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒ。
【０１８０】
本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物（例えば、インヒビター、活性化剤など）が提供されることも企図される。
【０１８１】
本発明では、コンピュータモデリングを行うためのコンピュータープログラムもまた、フラグメントまたは化学物質を選択するプロセスにおいて使用され得る。このようなプログラムとしては、以下が挙げられる。
【０１８２】
１．ＧＲＩＤ（Ｐ．Ｊ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，「Ａ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｆａｖｏｒａｂｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８，８４９−８５７頁（１９８５））。ＧＲＩＤは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能である。
【０１８３】
２．ＭＣＳＳ（Ａ．Ｍｉｒａｎｋｅｒら，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｍａｐｓ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ：Ａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｐｙ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄ」  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，２９−３４頁（１９９１））。ＭＣＳＳは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。
【０１８４】
３．ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｄ．Ｓ．Ｇｏｏｄｓｅｌｌら，「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｏｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８，１９５−２０２頁（１９９０））。ＡＵＴＯＤＯＣＫは、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能である。
【０１８５】
４．ＤＯＣＫ（Ｉ．Ｄ．Ｋｕｎｔｚら，「Ａ  Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１，２６９−２８８頁（１９８２））。ＤＯＣＫは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡから入手可能である。
【０１８６】
一旦、適切な候補化合物（化合物種）が選択されると、それらは、単一化合物またはＰＰＡＲとの複合体にアセンブリすることができる。構築に先だって、ＰＰＡＲまたはその調節薬剤の構造座標に関連してコンピューター画面上に表示される３次元イメージ上で、互いのフラグメントの関連性の視覚的検査が行われ得る。これに続き、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌ［Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］のようなソフトウェアを用いるマニュアルでのモデル構築が行われる。
【０１８７】
個々の化学物質を連結させる際に使用され得る有用なプログラムは、以下を含む。
【０１８８】
１．ＣＡＶＥＡＴ（Ｐ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔら、「ＣＡＶＥＡＴ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ．，Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，１８２−１９６頁（１９８９））；Ｇ，ＬａｕｒｉおよびＰ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ，「ＣＡＶＥＡＴ：ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，８，５１−６６頁（１９９４））。ＣＡＶＥＡＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡから入手可能である。
【０１８９】
２．ＩＳＩＳ（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）のような３Ｄデータベースシステム。この分野は、Ｙ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ，「３Ｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５，２１４５−２１５４頁（１９９２）において概説される。
【０１９０】
３．ＨＯＯＫ（Ｍ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎら，「ＨＯＯＫ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ  ｔｈａｔ  Ｓａｔｉｓｆｙ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｃ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ．，１９，１９９−２２１頁（１９９４））。ＨＯＯＫは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。
【０１９１】
上記のように一度に１つの化学物質を段階的様式でＰＰＡＲのインヒビターなどとして構築することを進める代わりに、阻害性または他のＰＰＡＲの結合化合物は、空の結合部位を使用し、または必要に応じていくつかの既知のインヒビターの部分を含めるなどにより、グローバルでまたはデノボで設計され得る。多くの新規リガンド設計方法としては、例えば、以下を挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１９２】
１．ＬＵＤＩ（Ｈ．−Ｊ．Ｂｏｈｍ，「Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ＬＵＤＩ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６  ６１−７８頁（１９９２））。ＬＵＤＩは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。
【０１９３】
２．ＬＥＧＥＮＤ（Ｙ．Ｎｉｓｈｉｂａｔａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７，８９８５頁（１９９１））。ＬＥＧＥＮＤは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。
【０１９４】
３．ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能である）。
【０１９５】
４．ＳＰＲＯＵＴ（Ｖ．Ｇｉｌｌｅｔら，「ＳＰＲＯＵＴ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ，７，１２７−１５３頁（１９９３））。ＳＰＲＯＵＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｅｅｄｓ，ＵＫから入手可能である。
【０１９６】
他の分子モデリング技術もまた、本発明に従って使用され得る［例えば、Ｎ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，８８３−８９４頁（１９９０）を参照のこと；Ｍ．Ａ．ＮａｖｉａおよびＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ，「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，２０２−２１０頁（１９９２）もまた参照のこと；Ｌ．Ｍ．Ｂａｌｂｅｓら，「Ａ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」，（Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．５，Ｋ．Ｂ．ＬｉｐｋｏｗｉｔｚおよびＤ．Ｂ．Ｂｏｙｄ編，ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３３７−３８０頁（１９９４））；Ｗ．Ｃ．Ｇｕｉｄａ，「Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌｏｇｙ．，４，７７７−７８１頁（１９９４）］。
【０１９７】
一旦上記の方法により化合物が設計されるかまたは選択されると、その物質がＰＰＡＲに結合し得る効率が、計算による評価により試験され、そして最適化され得る。例えば、有効なＰＰＡＲインヒビターは、好ましくは、その結合状態と遊離状態との間に相対的に小さなエネルギー差（すなわち、結合の小さな変形エネルギー）を示さなければならない。ＰＰＡＲインヒビターは、全結合エネルギーにおいて類似する２つ以上のコンフォメーションで結合ポケットと相互作用し得る。これらの場合、結合の変形エネルギーは、遊離物質のエネルギーとインヒビターがタンパク質に結合するとき観察されるこれらのコンフォメーションの平均エネルギーとの間の差であると考えられる。
【０１９８】
ＰＰＡＲに結合するとして設計または選択される物質は、その結合状態において、好ましくは、標的酵素および周囲の水分子との静電的斥力相互作用がないように、計算によりさらに最適化され得る。このような非相補的静電的相互作用は、電荷−電荷斥力相互作用、双極子−双極子斥力相互作用および電荷−双極子斥力相互作用を含む。
【０１９９】
特定のコンピューターソフトウェアは、化合物変形エネルギーおよび静電的相互作用を評価する分野において入手可能である。このような使用のために設計されたプログラムの例として、以下が挙げられる：Ｇａｕｓｓｉａｎ  ９４，ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｃ（Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ  １９９５）；ＡＭＢＥＲ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１（Ｐ．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９５）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  １９９５）；Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  １９９５）；ＤｅｌＰｈｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  １９９５）；およびＡＭＳＯＬ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ，Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション（例えば、「ＩＭＰＡＣＴ」グラフィクスを備えるＩｎｄｉｇｏ２）を用いて実行され得る。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージもまた、当業者に公知である。
【０２００】
本発明により可能な別のアプローチは、ＰＰＡＲに全体または部分的に結合し得る化学物質または化合物についての低分子データベースの計算的なスクリーニングである。このスクリーニングにおいて、結合部位へのこのような物質の適合の質は、形状的相補性または見積もられた相互作用エネルギーのいずれかにより判定され得る［Ｅ．Ｃ．Ｍｅｎｇら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，１６，５０５−５２４頁（１９９２）］。
【０２０１】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用されるＰＰＡＲには、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
【０２０２】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  （ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
【０２０３】
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
【０２０４】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
【０２０５】
本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、実質的に同一の機能（本発明においてはプロモーター活性）を有する核酸分子でもよい。
【０２０６】
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。
【０２０７】
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２０８】
本発明で用いられる細胞としては、脂肪細胞を有する生物である限りどの生物（例えば、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）など）由来の細胞を用いることができる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。また、そのような細胞は、脂肪細胞を含む付着細胞、浮遊細胞、組織形成細胞およびそれらの混合物などであり得る。
【０２０９】
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。本発明では特に、脂肪組織がその対象として使用される。
【０２１０】
本発明において、臓器が対象とされる場合、そのような臓器はどのような臓器でもよく、また本発明が対象とする組織または細胞は、生物のどの臓器または器官に由来するものでもよい。本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、脂肪組織に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする臓器は、脂肪組織を有する内臓（例えば、腹部、肝臓など）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１１】
本明細書において「生物体」は、生命体として存在し得る1個の個体として存在し得る生物の一形態をいう。
【０２１２】
本明細書中で使用する「脂肪細胞」とは、脂肪組織を構成する主要成分である細胞をいう。この細胞の特徴は、組織間に散在、または疎性結合組織の一つとして毛細血管の走行に沿う集団として脂肪組織を形成する多量の脂肪を含むことなどが挙げられる。細胞内の脂肪ははじめいくつかの微小滴として現われ、しだいに大きくなり、一つに融合してついには細胞体の大部を占める。細胞内の脂肪はスダンＩＩＩまたは四酸化オスミウムにより容易に検出される。脂肪細胞には、白色脂肪細胞および褐色脂肪細胞がある。脂肪細胞を識別するための方法は、当該分野において公知であり、例えば、上記脂肪の検出、脂肪細胞分化マーカーの発現、脂肪細胞特異的サイトカインの発現などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０２１３】
本明細書において「脂肪組織」とは、結合組織の一種で、脂質を貯蔵する点で特徴的であり、この他にも種々の重要な機能を有する組織である。脂肪組織には、脂肪が蓄積される。脂肪組織中の脂肪細胞は、格子繊維によって囲まれ、細胞間に毛細血管が密に分布する。他の組織から独立してほぼ一定した塊状もしくは房状の脂肪組織を形成している場合、脂肪体という。脂肪組織は、例えば、腹部、骨格筋、臀部、胸部、内臓などにおいて発達する。
【０２１４】
本発明において、脂肪特異的に発現または抑制するように遺伝子が導入される場合に使用される脂肪細胞は、種々の生物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ウシなど）から単離された培養細胞であってもよいし、生体内に存在する細胞であってもよい。
【０２１５】
本明細書において「脂肪」とは、脂肪酸のグリセリンエステルで常温で固体のものをいい、本明細書ではときに、脂肪組織または脂肪細胞と同義で用いられ得る。
【０２１６】
ある組織、細胞などに対して、「特異的に送達」するための手段は、当該分野において公知のＤＤＳ技術を利用して実現することができる。そのような脂肪への特異的な送達方法としては、例えば、脂肪に特異的に発現する表面マーカーに対して特異的な抗体を本発明の阻害剤に結合させる方法、脂肪細胞特異的なプロモーターを用いた発現制御などを挙げることができるがそれらに限定されない。そのような技術は、例えば、新・ドラッグデリバリーシステム、監修：永井恒司シーエムシー、２０００などに記載されている。
【０２１７】
本明細書において「診断、予防、処置または予後上有効な量」とは、それぞれ、診断、予防、処置（または治療）または予後において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができる。
【０２１８】
本発明のペプチドが医薬として使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
【０２１９】
本明細書において使用されるキャリアは、薬学的に受容可能であることが好ましく、そのようなキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、本発明のペプチド、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【０２２０】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２１】
さらなる例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【０２２２】
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。
【０２２３】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドなどは、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、座剤等の固形製剤、またはシロップ剤、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、溶解補助剤、安定化剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、経鼻、直腸、膣および経皮等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２４】
固形製剤における賦形剤としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。
【０２２５】
固形製剤における滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ホウ酸末、コロイド状ケイ酸、タルクおよびポリエチレングリコール等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２６】
固形製剤における結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、白糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デンプン溶液、ゼラチン溶液、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、およびシェラック等が挙げられる。
【０２２７】
固形製剤における崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カンテン末、ラミナラン末、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、ステアリン酸モノグリセリド、ラクトースおよび繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２８】
固形製剤における崩壊阻害剤の好ましい例としては、水素添加油、白糖、ステアリン、カカオ脂および硬化油等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２９】
固形製剤における吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３０】
固形製剤における吸着剤としては、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイトおよびコロイド状ケイ酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３１】
固形製剤における保湿剤としては、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３２】
固形製剤における溶解補助剤としては、例えば、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３３】
固形製剤における安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３４】
固形製剤として錠剤、丸剤等を調製する際には、必要により胃溶性または腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）のフィルムで被覆していてもよい。錠剤には、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーテイング錠あるいは二重錠、多層錠が含まれる。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。座剤の形態に成形する際には、上記に列挙した添加物以外に、例えば、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセライド等を添加することができるがそれらに限定されない。
【０２３５】
液状製剤における溶剤の好ましい例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
【０２３６】
液状製剤における溶解補助剤の好ましい例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３７】
液状製剤における懸濁化剤の好ましい例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３８】
液状製剤における等張化剤の好ましい例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３９】
液状製剤における緩衝剤の好ましい例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２４０】
液状製剤における無痛化剤の好ましい例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２４１】
液状製剤における防腐剤の好ましい例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２４２】
液状製剤における抗酸化剤の好ましい例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２４３】
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましい。通常、これらは、細菌保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
【０２４４】
さらに、必要ならば、医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
【０２４５】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版、その追補またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
【０２４６】
本発明の組成物の投与すべき量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０２４７】
本明細書において「患者」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「被検体」または「被験体」ともいわれる。患者は好ましくは、ヒトであり得る。
【０２４８】
本発明は、患者への有効量の本発明の組成物の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、本発明の組成物は実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。
【０２４９】
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中に封入された状態で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０２５０】
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された徐放系中で送達され得る。
【０２５１】
本明細書中、「投与する」とは、本発明の医薬などまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて処置が意図される宿主に与えることを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の粘膜を通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０２５２】
本発明における医薬の投与は、どのような手法を用いて行ってもよいが、好ましくは、針無し注射を用いることが有利である。患者に過度の負担を与えることなく投与を行えるからである。
【０２５３】
ここで本発明における針無注射器とは、注射針を用いずに、ガス圧または弾性部材の弾力によりピストンを移動させて薬液を皮膚に噴射し、薬剤成分を皮下、より好ましくは皮下の細胞内に投与する医療機器を意味する。
【０２５４】
具体的には例えば、シマジェットＴＭ  （島津製作所製）、メディ・ジェクター  ビジョン（Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔｏｒ  Ｖｉｓｉｏｎ）ＴＭ、（Ｅｌｉｔｅ  ｍｅｄｉｃａｌ社製）、ペンジェット（ＰｅｎＪｅｔ）ＴＭ（ＰｅｎＪｅｔ社製）などが市販されている。
【０２５５】
（脂肪組織特異的な遺伝子導入／欠損）
脂肪組織で特異的に遺伝子を導入または欠損させるために、ａＰ２プロモーター作動性のＣｒｅトランスジェニックマウスが広範に使用されている（Ｉｍａｉ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８，２２４〜２２８（２００１）、Ｂｌｕｈｅｒ，Ｍ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ３，２５〜３８（２００２）およびＢａｒｌｏｗ，Ｃ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５，２５４３〜２５４５（１９９７））。しかし、ａＰ２プロモーターは、マクロファージおよび脂肪細胞において活性化される（Ｆｕ，Ｙ．ら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １６５，２５９〜２６９（２００２））。それゆえ、ａＰ２−Ｃｒｅマウスにおいて、いくらかの量のＣｒｅ導入遺伝子の発現が、マクロファージを含む他の組織（例えば、脾臓、肺およびリンパ節）において生じる（Ｂｏｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｆａｚｉｏ，Ｓ．およびＬｉｎｔｏｎ，Ｍ．Ｆ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１３，１４１〜７（２００２））。さらに、最近の研究は、蓄積脂肪中のマクロファージが肥満関連代謝疾患の発症に重要な役割を果たすことが明らかになった（Ｂｏｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｆａｚｉｏ，Ｓ．およびＬｉｎｔｏｎ，Ｍ．Ｆ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１３，１４１〜７（２００２））。これらの背景に基づいて、脂肪細胞特異的な様式でＣｒｅ遺伝子を発現するＣｒｅトランスジェニックマウスが切望されている。
【０２５６】
アディポネクチン／ＡＣＲＰ３０は、ヒトｃＤＮＡプロジェクトにおける脂肪特異的な遺伝子のスクリーニングによって本発明者らが同定した、脂肪由来のホルモンである（Ｍａｅｄａ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２１，２８６〜２８９（１９９６））。アディポネクチンは、脂肪細胞において非常に高発現である、ａｄｉｐｏｓｅ  ｍｏｓｔ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ｇｅｎｅ  １（ａｐＭ１）として最初に発見された。アディポネクチンｍＲＮＡは、ヒト、サルおよびマウスの分化した脂肪細胞および脂肪組織において独占的に発現する（Ｍａｅｄａ，Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．８，７３１〜７３７（２００２））。マクロファージを含む他の型の細胞において、アディポネクチンｍＲＮＡの発現は検出されない。それゆえ、本発明者らは、完全に脂肪細胞特異的なトランスジェニックマウスを得るためには、アディポネクチンプロモーターが理想的であると考えた。
【０２５７】
本発明者らは、アディポネクチンプロモーター作動性のＣｒｅトランスジェニックマウスを作製し、ＰＰＡＲｆｏｌｘ／ｆｌｏｘマウスと交配した。アディポネクチン−Ｃｒｅ／ＰＰＡＲｆｏｌｘ／ｆｌｏｘは、ＰＰＡＲ発現を細胞組織特異的に欠き、そして脂肪組織におけるＡｋｔ情報伝達の刺激作用を示し、結果としてインスリン感受性を増加した。非常に興味深いことに、脂肪ＰＰＡＲ欠損は、蓄積脂肪におけるミトコンドリア生合成を著しく誘導し、エネルギー支出を増加し、そして、これらの変化は、摂食亢進にも関わらず、体重および脂肪重量の有意な減少を伴った。本発明者らの生理学的実験はまた、ＰＰＡＲがインスリン媒介性の情報伝達を負に調節するだけでなく、脂肪細胞におけるミトコンドリア関連遺伝子をダウンレギュレートすることによって熱産生を抑制することもまた示唆した。本発明者らのデータは、脂肪細胞におけるＰＰＡＲの抑制が、エネルギー支出およびインスリン感受性を増強することによって、肥満および２型糖尿病を処置するための治療ストラテジーとなる。
【０２５８】
（脂肪特異的なプロモーター）
本発明者らは、これまでに、アディポネクチンのプロモーター領域について検討した結果、プロモーター領域開始点から約２ｋｂ上流までの領域から、脂肪細胞において特異的に発現し、かつ他の細胞における非特異的発現がほとんどない脂肪組織特異的プロモーター（アディポネクチン２ｋｂプロモーター）を取得することに成功している。（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：１６５５−１６６３（２００３））。さらに今回、アディポネクチンのプロモーター領域について、ヒトとマウスとの間で相同性が非常に高い、プロモーター領域開始点から３６００塩基のＤＮＡ配列をクローニングし解析した結果、この領域を含む配列が、上述のアディポネクチン２ｋｂプロモーターを凌ぐ活性および脂肪細胞特異性を有するプロモーター活性を有することを発見した。この本発明のアディポネクチン３．６ｋｂプロモーターはまた、その特異性だけでなく、その活性においても、ＡＰ−２プロモーターを凌駕している。本発明は、このような脂肪特異的（好ましくは、脂肪にのみ）に発現を誘導するプロモーターが単離されている。
【０２５９】
従って、本発明は、
（ａ）配列番号１０に示す配列を含むポリヌクレオチド、または配列番号１０の１位〜１６９１位までの配列のいずれかの少なくとも一部を含有しかつ脂肪細胞特異的プロモーター活性を有するそのフラグメントもしくは改変体；
（ｂ）（ａ）と８０％以上の相同性を有し、かつ脂肪細胞特異的プロモーター活性を有するポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪細胞特異的プロモーター活性を有する、ポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、ポリヌクレオチドを使用することができる。
【０２６０】
１つの実施形態において、本発明において使用されるポリヌクレオチドは、配列番号１０に示す配列からなる。
【０２６１】
本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。１つの実施形態において、本発明のベクターには、脂肪細胞において発現させたい遺伝子が作動可能に連結されている。ここで、本発明のベクターには、該遺伝子の３’側にポリＡ配列をさらに含んでいてもよい。
【０２６２】
本発明はさらに、上記ポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含む、脂肪細胞特異的Ｃｒｅ発現ベクターを提供する。１つの実施形態において、本発明のベクターは、ウイルス由来ベクター（例えば、アデノウイルス由来ベクターまたはレトロウイルス由来ベクター）である。好ましくは、このベクターは、ポリＡ配列をさらに含む。
【０２６３】
本発明は、上記ベクターが導入された脂肪細胞；この脂肪細胞を含む脂肪組織；この脂肪細胞を含む非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびモルモットなど）を提供する。
【０２６４】
別の局面において、本発明は、有用な遺伝子を特異的に高発現する脂肪細胞を生産する方法であって、本発明において使用されるベクターを脂肪細胞に導入する工程、および該遺伝子を発現させる工程、を包含する、方法に関する。別の局面において、本発明は、脂肪細胞において、目的の遺伝子を特異的に産生する方法であって、本発明において使用されるベクターを脂肪細胞に導入する工程、および該遺伝子を発現させる工程、を包含する、方法に関する。ここで、１つの実施形態において、上記遺伝子の発現は、脂肪細胞以外の細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、およびモルモット細胞、好ましくはヒト細胞）においては抑制される。
【０２６５】
別の局面において、本発明は、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびモルモットなど、好ましくはマウスの作製方法であって、上記の脂肪細胞特異的Ｃｒｅ発現ベクターを導入する工程を包含する、方法、およびこの方法によって作製されるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明はまた、脂肪細胞における遺伝子の高発現を必要とするが、繊維芽細胞、表皮細胞、間質系細胞、またはマクロファージでの該遺伝子の発現が望まれない疾患を処置するための、上記ポリヌクレオチドの使用に関する。
【０２６６】
本明細書において「アディポネクチン」（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）とは、脂肪細胞で作られる分泌タンパク質として同定されたタンパク質またはそれをコードする遺伝子をいう。アディポネクチンは、Ａｃｒｐ３０（脂肪細胞補体関連３０ｋＤａタンパク質＝ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ３０ｋＤａ）、ゼラチン結合タンパク質（Ｇｅｌａｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ａｄｉｐｏｓｅ  ｍｏｓｔ  ａｂｕｎｄｕｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  １（ａｐＭ−１）等の別名を有し、遺伝子名はＡＰＭ１、ＡＣＲＰ３０、ＧＢＰ２８として知られている。そのｍＲＮＡは脂肪細胞分化の過程で１００倍以上誘導される。アディポネクチンはまた、豊富に存在する血清タンパク質で、結果としてエネルギー・恒常性、肥満に影響を与える。現在までに、インスリンの効果を高めて血糖値を下げる働きがあることが知られている。アディポネクチンは、ＴＮＦαと構造的に非常に似ており、ヒト、マウスなどの動物の様々な肥満形態において調節不能になることから、エネルギー・恒常性に影響を与える重要な分子として研究が進められている。
【０２６７】
アディポネクチンは、１９９６年、前田らによりヒト脂肪組織から新たに分離された動物脂肪組織特異的タンパク質であり、そのアミノ酸配列も明らかにされている。（Ｍａｅｄａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２１：２８６（１９９６））。これとほぼ同時期に他の研究グループにより、マウス３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞からクローニングされたＡＣＲＰ３０と呼ばれる物質（Ｓｃｈｅｒｅｒ  ＰＥ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２６７４６〜２６７４９（１９９５））はアディポネクチンと同一物質と考えられている。このアディポネクチンは、脂肪組織のみならず、血中にも多量存在しており、正常ヒト血中には５〜１０μｇ／ｍｌという高濃度で存在している（Ａｒｉｔａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５７：７９〜８３（１９９９））。また、このアディポネクチンは肥満が進むにつれてパラドキシカルに血中濃度が低下する。
【０２６８】
このアディポネクチンの作用については、これまでにいくつかの研究グループにより血管平滑筋の増殖ならびに細胞遊走の抑制、抗動脈硬化作用、単球、マクロファージの活性化抑制、抗炎症作用、肝星細胞の活性化の抑制、細胞外マトリックス産生の抑制、肝星細胞増殖の抑制、肝細胞増殖促進などが判明しているが、その作用の全容については未だ明らかではない。
【０２６９】
アディポネクチンは、ヒト脂肪組織特異的なコラーゲン様因子としても知られている。その遺伝子は、２４４のアミノ酸より構成されるタンパク質であることが知られている。ヒトアディポネクチンタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列は、配列番号１１および１２に示されている。ヒトアディポネクチンの生理作用を検討する中で本発明者らは、すでに、ヒトアディポネクチンが単球系の細胞およびＢ細胞系の細胞の増殖を抑制する現象を見出し、それら血球系細胞の増殖抑制剤として有効である事を示した。上述したように、炎症時には単球、マクロファージ、好中球等の白血球系細胞が増殖し、かつ集積する現象が見られる。アディポネクチンにより増殖が抑制される単球は、そのような細胞性の生体防御反応において重要な役割を担っている細胞であり、成熟すると貪食を担うマクロファージとなり、一方ではインターロイキンー１、腫瘍壊死因子αなどの炎症性サイトカインを産生する。炎症反応の過程おいて、単球はそのように重要性な働きをしており、アディポネクチンは単球の増殖を抑制して集積を防ぐ事により、抗炎症剤として用いる事ができる。
【０２７０】
アディポネクチンはヒトを含む動物の脂肪組織で産生され、血中にも多量存在するタンパク質である。ヒトアディポネクチンについては、これをコードするｃＤＮＡから遺伝子組換え法により高純度に精製されたものが得られている（Ａｒｉｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５７，７９〜８３（１９９９））。マウス由来のＡＣＲＰ３０も、前述のとおり組み換え遺伝子の手技により高純度のものが得られており、市場で入手可能である。
【０２７１】
本明細書において「アディポネクチンの生物学的活性」は、アディポネクチンが有する少なくとも１つの機能を包含し、例えば、血管内皮機能改善作用、血管平滑筋増殖抑制作用、マクロファージ泡沫化抑制作用、炎症性サイトカイン分泌抑制作用、筋肉細胞取り込み促進作用が挙げられるがそれらに限定されない。そのような生物学的活性は、血管平滑筋細胞への［３Ｈ］チミジン取り込み、マクロファージ培養上清ＴＮＦα分泌、筋肉細胞［３Ｈ］デオキシグルコース取り込みなどによって測定することができる。
【０２７２】
本発明のプロモーターは、脂肪細胞の機能をインビボで研究する上でも非常に有用である。例えば、本発明のプロモーターを、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系と組み合わせて使用することで、脂肪細胞の機能をより正確に解析することが可能である。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系は、Ｃｒｅリコンビナーゼとその認識配列であるｌｏｘＰ配列を利用した発現制御系である。ＣｒｅリコンビナーゼはｌｏｘＰ配列を認識し、ｌｏｘＰ配列に挟まれた遺伝子を切り出す。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系については、例えば、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７５：５５９４−５５９８（１９７８）；Ｍａｃｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０：４４５１−４４５５（１９９２）；Ｈｏｅｓｓら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１６：８７３−８８２（１９９０）；Ｄｙｍｅｃｋｉら，Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  −  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  ２ｎｄ  Ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．３７−９９（２０００）；およびＴｏｒｒｅｓら，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９７）に記載されている。上述のように、本発明のプロモーターは、脂肪細胞において高い活性を有し、かつ脂肪細胞以外の細胞における非特異性が実質的にないので、脂肪細胞のみを標的としたＣｒｅ−ｌｏｘＰ系を構築することができる。これによって、インビトロでは困難であった脂肪細胞の機能解析をインビボで実施することを可能とし、脂肪細胞の機能解析の一層の前進に寄与するものと考えられる。従って、１つの局面において、本発明は、脂肪組織特異的Ｃｒｅ発現ベクターを提供する。１つの実施形態において、ベクターはウイルス由来のベクターである。ウイルス由来ベクターは、例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルス由来のベクターである。本発明のベクターはまた、Ｃｒｅ遺伝子の３’側にポリＡ配列を含み得る。
【０２７３】
本発明はまた、本発明のプロモーターを用いて、トランスジェニック動物を作製する方法、およびこの方法によって作製されたトランスジェニック動物を提供する。
【０２７４】
トランスジェニック動物の作製については、当該分野で種々の方法が知られている。例えば、トランスジェニックマウスの作製の場合、一般的な作製技術は、国際公開ＷＯ０ｌ／１３１５０（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）に記載されている。米国特許第４，８７３，１９ｌ号（Ｗａｇｎｅｒら）は、哺乳動物接合体へのＤＮＡのマイクロインジェクションによって得られた、外因性ＤＮＡを有する哺乳動物を教示している。さらに転位性遺伝因子（トランスポゾン）を内因性ＤＮＡに挿入あるいはさらに転位させることで、該ＤＮＡの構造変化を起こしてこれを不活性化させ、動植物等の変異体を効率的に作出する方法が研究されてきている。トランスポゾンを利用した、染色体への特定遺伝子の導入・付加等が可能となってきている。
【０２７５】
この他では、トランスジェニック動物を作り出すための様々な方法として、例えば、Ｍ．Ｍａｒｋｋｕｌａら，Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１，９７−１０６（１９９６）；Ｒ．Ｔ．Ｗａｌｌら，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，８０，２２１３−２２２４（１９９７）；Ｊ．Ｃ．Ｄａｌｔｏｎら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４１１，４１９−４２８（１９９７）；およびＨ．Ｌｕｂｏｎら，Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．，１０，１３１−１４３（１９９６）に記載される方法などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２７６】
さらに近年、胚性幹（ＥＳ）細胞の相同組換えを介したトランスジェニック（ノックアウト、ノックインを含む）動物の作製が可能となってきている。高等生物では、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いる陽性選択およびＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子またはジフテリア毒素遺伝子を用いる陰性選択により組換え体の効率的な選別が行われる。ＰＣＲまたはサザンブロット法によっても相同組換え体の選択が行われる。すなわち、標的遺伝子の一部を陽性選択用のネオマイシン耐性遺伝子等で置換し、その末端に陰性選択用のＨＳＶＴＫ遺伝子等を連結したターゲティングベクターを作成し、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８およびガンシクロビルの存在下で選択して、生じたコロニーを単離し、さらにＰＣＲまたはサザンブロットにより相同組換え体を選択する。
【０２７７】
このようにして内在する標的遺伝子を置換または破壊して、機能が喪失したかまたは変更された変異を有するトランスジェニック（標的遺伝子組換え）マウスを作製する方法は、標的とした遺伝子だけに変異が導入されるので、その遺伝子機能の解析に有用である。
【０２７８】
所望の相同組換え体を選択した後、得られた組換えＥＳ細胞を胚盤注入法または集合キメラ法により正常な胚と混合してＥＳ細胞と宿主胚とのキメラマウスを作製する。胚盤注入法では、ＥＳ細胞を胚盤胞にガラスピペットで注入する。集合キメラ法では、ＥＳ細胞の塊と透明帯を除去した８細胞期の胚とを接着させる。ＥＳ細胞を導入した胚盤胞を偽妊娠させた代理母の子宮に移植してキメラマウスを得る。ＥＳ細胞は、全能性を有するので、生体内では、生殖細胞を含め、あらゆる種類の細胞に分化することができる。ＥＳ細胞由来の生殖細胞を有するキメラマウスと正常マウスを交配させるとＥＳ細胞の染色体をヘテロに有するマウスが得られ、このマウス同士を交配するとＥＳ細胞の改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスが得られる。得られたキメラマウスから改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスを得るには、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させ、生まれた雄性および雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代のホモ接合体マウスを選択する。Ｆ１およびＦ２の各世代において所望の遺伝子変異が導入されているか否かは、組換えＥＳ細胞のアッセイと同様に、サザンブロッティング、ＰＣＲ、塩基配列の解読など当該分野において慣用される方法を用いて分析され得る。
【０２７９】
さらに近年、多様な遺伝子機能を選択的に解析する目的で、上記のようなＣｒｅ−ｌｏｘＰの部位特異的組み換えを併用する技術が注目されている。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いるトランスジェニックマウスは、標的遺伝子の発現を阻害しない位置にネオマイシン耐性遺伝子を導入し、エキソンをはさむようにしてｌｏｘＰ配列を挿入したターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、その後相同組換え体を単離する。この単離したクローンからキメラマウスを得、遺伝子改変マウスが作製される。次に、大腸菌のＰ１ファージ由来の部位特異的組換え酵素Ｃｒｅを組織特異的に発現するトランスジェニックマウスとこのマウスを交配させると、Ｃｒｅを発現する組織中でのみ遺伝子が破壊される（ここでは、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ配列（３４ｂｐ）を特異的に認識して、２つのｌｏｘＰ配列にはさまれた配列で組換えを起こさせ、これが破壊される）。組織特異的なプロモーターに連結したＣｒｅ遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交配させるか、またはＣｒｅ遺伝子を有するウイルスベクターを使用して、成体でＣｒｅを発現させることができる。上記のように、本発明のプロモーターは、脂肪細胞特異的に遺伝子を高発現するので、本発明のプロモーターを用いれば、Ｃｒｅを脂肪細胞特異的に発現させることが可能となる。従って、他の組織に影響を与えることなく、脂肪細胞においてのみ標的遺伝子を破壊または変異することが可能となる。これによって、近年その重要性がますます注目されている脂肪細胞の機能解析に大きく寄与するものと考えられる。他の生物であっても、同様のメカニズムを用いてトランスジェニック生物を作製することができる。
【０２８０】
上述のように、本発明は、アディポネクチン由来の新規の脂肪細胞特異的プロモーターを提供する。本発明のプロモーターにおいて使用される、配列番号１０（ヒト）または配列番号１３（マウス）に示すポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、配列番号１０または配列番号１３に示すポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪細胞特異的プロモーター活性を有するポリヌクレオチドも包含する。ストリンジェントな条件は、定義の節で既に説明している。本明細書中には、配列番号１０（ヒト）、配列番号１３（マウス）などのアディポネクチンプロモーター配列を提供しているが、これらの配列の一部をプロモーターとして用いて、当該分野で周知の技術を用いて取得することのできる他の種由来の配列もまた、本発明における使用に含まれることが意図される。従って、本発明において使用されるポリヌクレオチドは、その起源となった種に依存しない。
【０２８１】
本発明はまた、脂肪細胞特異的プロモーター活性を有する、配列番号１０、配列番号１３などに示すポリヌクレオチドのフラグメントまたは改変体を利用することができる。本発明のフラグメントまたは改変体の例としては、例えば、末端が短縮されたもの、またはそのポリヌクレオチド配列中に１つ以上の塩基の付加または欠失を有するものが挙げられる。本発明のフラグメントまたは改変体が、配列番号１０、配列番号１３などに示すプロモーター配列と同等（またはそれ以上）の活性を有するか否かは、当業者に公知の種々の方法によって決定できる。プロモーター活性を測定する方法としては、例えば、レポーター遺伝子を用いる方法が挙げられるがこれに限定されない）。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子が挙げられるがこれに限定されない。ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして使用する場合、本発明のフラグメントまたは改変体およびルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターを作製し、このベクターで細胞をトランスフェクトし、発現したルシフェラーゼを細胞の溶解によって遊離させ、この細胞溶解液にルシフェラーゼの基質を添加し、生じた発光をルミノメーターで測定することによって、プロモーター活性を測定することができる。そのフラグメントまたは改変体が脂肪細胞特異的活性を有するか否かは、脂肪細胞とそれ以外の細胞を用いて同様の実験をし、プロモーター活性を比較すればよい。これらの技術を用いれば、当業者は、脂肪細胞特異的プロモーター活性を有する本発明のプロモーターフラグメントまたはプロモーター改変体を、過度の実験をせずに選択することができる。従って、このようなフラグメントまたは改変体もまた、本発明の範囲に含まれることが理解される。
【０２８２】
本明細書において、「脂肪細胞特異的プロモーター活性」とは、上述のような、任意の方法で活性を測定した場合に、脂肪細胞以外の細胞においては、プロモーターを含まないベクターのみを用いた場合（すなわち、コントロール）の活性とほぼ同じであるかまたはそれ以下の活性しか示さないが、脂肪細胞においては、検出可能に高い活性を示すことを意味する。
【０２８３】
以下の実施例で実証されるように、本発明のプロモーターは、脂肪細胞において特異的に高発現するだけでなく、脂肪細胞以外の細胞においては、遺伝子の発現を抑制するという驚くべき活性を有する。このような活性は、従来から使用されているＡＰ−２プロモーターでは見出されなかったものである。
【０２８４】
従って、１つの局面において、本発明は、目的の遺伝子を脂肪細胞において特異的に高発現させる方法に関する。この方法は、本発明のベクターを脂肪細胞に導入する工程、および該遺伝子を発現させる工程を包含する。この特異性の意味には、脂肪細胞以外の細胞において発現が抑制されることも含まれる。本発明はまた、有用な遺伝子を特異的に高発現する脂肪細胞を生産する方法に関する。この方法は、この方法は、本発明のベクターを脂肪細胞に導入する工程、および該遺伝子を発現させる工程を包含する。
【０２８５】
本発明はまた、本発明のプロモーターを含むベクターを提供する。１つの実施形態において、本発明のベクターは、本発明のプロモーター、およびこのプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む。この遺伝子は、脂肪細胞において特異的に発現させたい遺伝子である。好ましい実施形態において、脂肪細胞において特異的に発現させたい遺伝子とは、アディポサイトカイン遺伝子（特に、アディポネクチン遺伝子）である。本発明のベクターはまた、目的の遺伝子の３’側にポリＡ配列を含み得る。
【０２８６】
本発明はさらに、本発明のプロモーターを含む脂肪細胞を提供する。本明細書中で使用する場合、用語「脂肪細胞」は、脂肪組織を構成する主要成分をいう。脂肪組織とは、結合組織の一種で、脂質を貯蔵する点で特徴的であるが、発明の背景の節で述べたように、その他にも種々の重要な機能を有する組織である。本発明のベクターが導入される脂肪細胞は、種々の生物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ウシなど）から単離された培養細胞であってもよいし、生体内に存在する細胞であってもよい。１つの実施形態において、本発明のプロモーターは、ベクター形態で脂肪細胞に導入される。あるいは、このような細胞は、細胞を含むサンプル中で、本発明のプロモーターの一部をプローブとして用い、当該分野で周知のスクリーニング技術を使用して同定することができる。
【０２８７】
例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７））、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０））またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
【０２８８】
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０２８９】
本発明は、本発明のプロモーターを含む脂肪組織に関する。本発明のプロモーターには、特定の遺伝子（例えば、アディポネクチン）に作動可能に連結されることが好ましい。
【０２９０】
本発明はまた、本発明のプロモーターを含む非ヒト動物に関する。本発明のプロモーターには、特定の遺伝子（例えば、アディポネクチン）に作動可能に連結されることが好ましい。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２９１】
本発明のプロモーターは、脂肪細胞に対する特異性が非常に高いことから、目的の遺伝子を脂肪細胞特異的に発現させたい場合に非常に有用である。例えば、発明の背景の節で述べた通り、アディポネクチンレベルの低下は、肥満関連の代謝障害（例えば、インスリン抵抗性糖尿病およびアテローム硬化症）に関連している。従って、これらの障害を処置するためにアディポネクチン遺伝子脂肪細胞に導入して脂肪細胞内で高発現させる上で、本発明のプロモーターは非常に有用である。従って、本発明は、脂肪細胞において、目的の遺伝子を特異的に発現させる方法に関する。本発明の方法は、本発明のプロモーターおよび目的の遺伝子を含むベクターを脂肪細胞に導入する工程を包含する。本発明はさらに、脂肪細胞における遺伝子発現のダウンレギュレーションに起因する疾患または障害を処置または予防する方法に関する。この方法は、本発明のプロモーターおよびダウンレギュレートされている遺伝子を含むベクターを脂肪細胞に導入する工程を包含する。例えば、この遺伝子は、アディポネクチンであり、処置または予防される疾患は、上記のような肥満関連の疾患（例えば、インスリン抵抗性糖尿病およびアテローム硬化症）である。本発明はまた、上記のような疾患を処置するための医薬の製造における、本発明のプロモーターまたはベクターの使用に関する。特に、上記疾患は、脂肪細胞における遺伝子の高発現が望まれるが、脂肪細胞以外の細胞における該遺伝子の発現は望ましくない疾患である。このような疾患としては、癌などが挙げられるがそれらに限定されない。このような疾患は、癌を抑制する因子を脂肪細胞において特異的に発現させることで処置され得る。なお、転写因子SREBP-1aは肝臓で高発現すると著明な脂質蓄積による脂肪肝を引き起こすが、脂肪で高発現させても脂質の過剰な蓄積は起こらない。(Shimomura et al. J Biol Chem. 274(42):30028-32, 1999., Shimomura et al. J. Biol. Chem.273; 35299-306, 1998., Horton JD, Shimomura I, et al. J Biol Chem. 278:36652-60)。
【０２９２】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０２９３】
（新規ＰＰＡＲ調節剤）
１つの局面において、本発明は、スルホニル尿素剤を含む、ＰＰＡＲ調節剤を提供する。ここで、スルホニル尿素剤は、代表的に、
【０２９４】
【化１４】
2008019169.tif 000005
【０２９５】
という構造を有し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、夫々独立して、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シアノ、ニトロ、アミノ、置換されたアミノ、カルボキシ、置換されたカルボキシ、カルバモイル、アシル、置換されたアシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィニルからなる群より選択される置換基を有する。
【０２９６】
本発明において、代表的なスルホニル尿素剤としては、グリメピリド、グリベンクラミド、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミドおよびグリクラジドを挙げることができるがそれに限定されない。
【０２９７】
好ましい実施形態では、スルホニル尿素剤は、グリメピリドまたはグリベンクラミドを使用することが有利であり得る。これらのスルホニル尿素剤は、より有効なＰＰＡＲ調節活性を有するからである。
【０２９８】
本発明のＰＰＡＲ調節剤は、活性化剤であってもよく、阻害剤であってもよい。好ましくは、活性化剤であり得る。
【０２９９】
１つの実施形態において、本発明のＰＰＡＲ調節剤は、膵臓β細胞のインスリン分泌活性およびインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性をさらに有していてもよい。
【０３００】
本発明において、ＰＰＡＲ調節活性は、チアゾリジンジオン剤（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾンなど；好ましくはピオグリタゾン）と比較して求めることができる。本発明のＰＰＡＲ調節剤は、通常、チアゾリンジオン剤の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１５％の活性を有し得る。
【０３０１】
本発明のＰＰＡＲ調節剤が対象とするレセプターは、どのサブタイプでもよいが、好ましくは、ＰＰＡＲγを対象とすることが有利である。
【０３０２】
ここで、本発明が対象とするＰＰＡＲは、配列番号２、４、６および８からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列またはその改変体（例えば、１または数個の置換、付加または欠失を含む）を含む。
【０３０３】
好ましい実施形態では、本発明が対象とするＰＰＡＲは、少なくともＣ末活性化機能−２（ＡＦ−２）ドメインを含むことが好ましい。１つの実施形態では、本発明が対象とするＰＰＡＲは、アミノ酸配列ＰＬＬＱＥＩＹＫＤＬＹ（配列番号９）を含むことが好ましい。この配列を削除すると、結合活性が消失したことが確認されたからである。
【０３０４】
１つの実施形態において、本発明が対象とするＰＰＡＲと候補化合物との結合を観察するに置いて、ＰＰＡＲのコファクターとＰＰＡＲとの相互作用を観察することができる。スルホニル尿素剤は、ＰＰＡＲのコファクターとＰＰＡＲとの相互作用に影響を与えることが明らかになったからである。
【０３０５】
特定の実施形態において、本発明のＰＰＡＲ調節剤は、糖尿病（特に、２型）；高グリシン血症；低グルコース寛容；インスリン抵抗性；肥満；脂肪障害；異脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）；高脂血症；高トリグリセリド血症；高コレステロール血症；低ＨＤＬレベル；高ＬＤＬレベル；粥状硬化症；血管狭窄；過敏性腸症候群；炎症性腸疾患；クローン病；腸潰瘍；炎症疾患；膵炎；腹部肥満；神経変性病；網膜症；乾癬；代謝性症候群；卵巣高アンドロゲン症からなる群より選択される疾患の処置または予防に使用され得る。
【０３０６】
（ＰＰＡＲスクリーニング法）
別の局面において、本発明は、膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を有し、かつ、ＰＰＡＲを調節する能力を有する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、Ａ）候補化合物を提供する工程；Ｂ）該候補化合物について、膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を測定する工程；Ｃ）該候補化合物を、ＰＰＡＲの活性を測定するアッセイに供する工程；およびＤ）Ｂ工程およびＣ工程の各々において、活性ありと判断された物質を、リード化合物と同定する工程、を包含する。
【０３０７】
１つの実施形態において、本発明が対象とする候補化合物は、スルホニル尿素剤を含む。スルホニル尿素剤は、本明細書において上述したような任意のものを使用することができる。
【０３０８】
１つの実施形態において、本発明のスクリーニング方法が対象とするのは、ＰＰＡＲの活性化作用または阻害作用を有する化合物であり得、好ましくは、活性化作用を有する化合物であり得る。
【０３０９】
１つの実施形態において、本発明のスクリーニング方法が対象とする化合物は、膵臓β細胞のインスリン分泌活性およびインスリン感受性を促進する活性の両方を有することが好ましい。このような活性測定は、本明細書において上述したように任意の方法を用いることによって行うことができる。
【０３１０】
１つの実施形態において、本発明のスクリーニング方法では、ＰＰＡＲ調節活性は、チアゾリジンジオンと比較して測定される。この場合、競合的に比較してもよく、別々の実験結果を比較してもよい。
【０３１１】
１つの実施形態において、本発明のスクリーニング方法が対象とするＰＰＡＲは、ＰＰＡＲγであり得るがそれに限定されない。このようなＰＰＡＲは、ＰＰＡＲは、配列番号２、４、６および８からなる群より選択される配列番号に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を含み得る。
【０３１２】
１つの実施形態において、本発明では、ＰＰＡＲ活性は、候補化合物がスルホニル尿素剤またはチアゾリジンジオン剤とともに提供して競合するかどうかを観察する工程を包含し得る。
【０３１３】
１つの実施形態において、ＰＰＡＲ活性を測定するアッセイは、転写活性アッセイを利用することができる。このような転写活性アッセイは、本明細書において説明されており、実施例において例証される。
【０３１４】
１つの実施形態において、膵臓β細胞のインスリン分泌活性は、細胞から分泌されるインスリンを直接測定すること（J Pharmacol Exp Ther. 2004 Sep;310(3):1273-80.）により測定され得る。
【０３１５】
１つの実施形態において、末梢のインスリン感受性を促進する活性は、グルコースクランプ法、インスリン負荷試験（Insulin tolerance test)により測定され得る。
【０３１６】
好ましい実施形態では、ＰＰＡＲの活性は、転写因子認識配列と作動可能に連結されるレポーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物と、該選択されたＰＰＡＲとを含む系において、該候補化合物の活性を判定する工程であって、該レポーターの発現が増強される場合、該候補化合物は該ＰＰＡＲのアゴニストと判定し、該レポーターの発現が減少する場合、該候補化合物は該ＰＰＡＲのアンタゴニストと判定する、工程によって測定される。このような方法は、当該分野において公知であり、本明細書において例示されている。ここで使用され得るレポーターとしては、ルシフェラーゼを挙げることができる。また、系としては、例えば、無細胞系または細胞を用いることができる。
【０３１７】
１つの実施形態では、対象となるＰＰＡＲとしては、Ｃ末活性化機能−２（ＡＦ−２）ドメインを含むタンパク質を使用することができ、好ましくはこの標的は、アミノ酸配列ＰＬＬＱＥＩＹＫＤＬＹ（配列番号９）を含み得る。
【０３１８】
好ましい実施形態では、このＰＰＡＲのアッセイでは、ＰＰＡＲのコファクターとＰＰＡＲとの相互作用が観察される。
【０３１９】
ここで、このＰＰＡＲのコファクターは、ＤＲＩＰ  ２０５（vitamin D receptor-interacting protein 205）、Ｎ−ＣｏＲ（nuclear receptorcorepressor）およびＳＭＲＴ（silencing mediator for retinoid and thyroid hormonereceptors）からなる群より選択される因子であり得る。
【０３２０】
別の実施形態において、本発明は、膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を有し、かつ、ＰＰＡＲを調節する能力を有する化合物を同定するためのシステムを提供する。このシステムは：Ａ）必要に応じて候補化合物；Ｂ）該候補化合物について、膵臓β細胞のインスリン分泌活性および末梢のインスリン感受性を促進する活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を測定する手段；Ｃ）該候補化合物を、ＰＰＡＲの活性を測定するアッセイに供する手段；およびＤ）Ｂ手段およびＣ手段の各々により、活性ありと判断された物質を、リード化合物と同定する手段を備える、システムを提供する。このシステムでは、上記スクリーニング方法において採り得る任意の形態を採り得ることが理解され得る。
【０３２１】
（処置・予防方法）
別の局面において、本発明は、ＰＰＡＲに関連する疾患を処置または予防するための方法であって、Ａ）スルホニル尿素剤を被検体に投与する工程を包含する、方法を提供する。ここで、ＰＰＡＲに関連する疾患としては、例えば、糖尿病（特に、２型）；高グリシン血症；低グルコース寛容；インスリン抵抗性；肥満；脂肪障害；異脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）；高脂血症；高トリグリセリド血症；高コレステロール血症；低ＨＤＬレベル；高ＬＤＬレベル；粥状硬化症；血管狭窄；過敏性腸症候群；炎症性腸疾患；クローン病；腸潰瘍；炎症疾患；膵炎；腹部肥満；神経変性病；網膜症；乾癬；代謝性症候群；卵巣高アンドロゲン症を挙げることができるがそれらに限定されない。処置または予防方法は、当該分野において公知の方法を用いることができ、本明細書において例示されている。
【０３２２】
１つの実施形態では、上記スルホニル尿素剤としては、グリメピリド、グリベンクラミド、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミドおよびグリクラジドからなる群より選択されるものを使用することができる。
【０３２３】
（使用）
別の局面において、本発明は、ＰＰＡＲに関連する疾患を処置または予防するための医薬を製造するにおける、スルホニル尿素剤の使用を提供する。糖尿病（特に、２型）；高グリシン血症；低グルコース寛容；インスリン抵抗性；肥満；脂肪障害；異脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）；高脂血症；高トリグリセリド血症；高コレステロール血症；低ＨＤＬレベル；高ＬＤＬレベル；粥状硬化症；血管狭窄；過敏性腸症候群；炎症性腸疾患；クローン病；腸潰瘍；炎症疾患；膵炎；腹部肥満；神経変性病；網膜症；乾癬；代謝性症候群；卵巣高アンドロゲン症を挙げることができる。医薬の調製方法は、当該分野において公知の方法を用いることができ、本明細書において例示されている。
【０３２４】
１つの実施形態では、上記スルホニル尿素剤としては、グリメピリド、グリベンクラミド、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミドおよびグリクラジドからなる群より選択されるものを使用することができる。その他の具体的な形態は、本明細書の他の箇所において示されている任意の具体的な形態を採ることができることが理解される。
【０３２５】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０３２６】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０３２７】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）、などから市販されるものを用いた。動物の取り扱いは、大阪大学医学部において規定される規準を遵守して行った。本発明で用いる発現ベクターの作製方法を具体例を挙げて説明する。なお、このような例で用いられる出発プラスミド、プロモーター等の構成要素を同等のもので置き換えて実施することは当業者にとって容易である。
【０３２８】
まず、本欄では、実施例に使用した実験手法および材料を記載する。
【０３２９】
（実験手法）
（材料）
[３Ｈ]ロシグリタゾン（ＡＲＴ１２３１；比活性は、５０Ｃｉ／ｍｍｏｌであった）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ピオグリタゾンは、武田薬品工業株式会社（大阪）のご厚意によるものである。グリメピリドは、アベンティスファーマ（東京）のご厚意によるものである。グリベンクラミド、トルブタミド、クロルプロパミド、およびグリクラジドは、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社（東京）から購入した。
【０３３０】
（プラスミド）
ＧＡＬ４（配列番号１４−１５）をコードする発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４）、ＧＡＬ４−マウスＰＰＡＲαキメラタンパク質（配列番号１６−１７）をコードする発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４−ｍＰＰＡＲα）、ＧＡＬ４−マウスＰＰＡＲδキメラタンパク質（配列番号１８−１９）をコードする発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４−ｍＰＰＡＲδ）、ＧＡＬ４−マウスＰＰＡＲγキメラタンパク質（配列番号２０−２１）をコードする発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４−ｍＰＰＡＲγ）、全長マウスＰＰＡＲγ（配列番号１−２のうち、アイソフォーム１にあたるアミノ酸３１からあとの配列（MVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDIKPFTTVDFSSISAPHYEDIPFTRADPMVADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYNRPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKSRNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYDSYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKNIPGFINLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKNLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKVLQKMTDLRQIVTEHVQLLHVIKKTETDMSLHPLLQEIYKDLY）をコードする発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲγ）、ＶＰ１６（配列番号２２−２３）をコードする発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ＶＰ１６）、ＶＰ１６−マウスＰＰＡＲγキメラタンパク質（配列番号２４−２５）をコードする発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ＶＰ１６−ｍＰＰＡＲγ）、およびβ−ガラクトシダーゼ（配列番号２６−２７）をコードする発現プラスミド（ｐＣＭＸ−β−ｇａｌ）は、Ｄｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ（Ｕｎｉｖｅｒｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）のご厚意によるものである（Willy, P. J., and Mangelsdorf, D. J. (1997) Genes Dev. 11, 289-298などを参照）。Ｃ末活性化機能−２（ＡＦ−２）ドメインの１１アミノ酸（ＰＬＬＱＥＩＹＫＤＬＹ（配列番号９））を欠失しているマウスΔＰＰＡＲγ変異体構築物（ｐＣＭＸ−ΔｍＰＰＡＲγ；ΔＰＰＡＲγ変異体は上述のＰＰＡＲγアイソフォーム１のアミノ酸配列より、最後の１１アミノ酸（ＰＬＬＱＥＩＹＫＤＬＹ）欠失している。）（配列番号２８−２９）については、削除されるべき配列を削除した形態で作製した。ＧＡＬ４−ビタミンＤレセプター結合タンパク質（ＤＲＩＰ）２０５（配列番号３０−３１）をコードする発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４−ＤＲＩＰ２０５）およびＧＡＬ４−核レセプターコリプレッサー（Ｎ−ＣｏＲ）（配列番号３２−３３）をコードする発現プラスミド（ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４−Ｎ−ＣｏＲ）は、文献に記載されている（ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４−ＤＲＩＰ２０５についてKaneko,E. et al (2003) J. Biol. Chem. 278, 36091-36098、およびｐＣＭＸ−ＧＡＬ４−Ｎ−ＣｏＲについてAdachi,R., et al (2004) Mol. Endocrinol. 18, 43-52）。ＤＲＩＰ２０５の核レセプター相互作用ドメイン（アミノ酸５７８〜７２８）（配列番号３４−３５）およびＮ−ＣｏＲの核レセプター相互作用ドメイン（アミノ酸１９９０〜２４１６）（配列番号３６−３７）はＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号３８−３９）に融合されている。ＧＡＬ４応答性ＭＨ１００（ＵＡＳ）×４−ｔｋ−ＬＵＣレポーター（配列番号４０−４１）およびＰＰＡＲ応答性ＰＰＲＥ×３−ｔｋ−ＬＵＣレポーター（配列番号４２−���３）を用いて、ＧＡＬ４−キメラレセプターおよびＰＰＡＲの活性をそれぞれ評価した（Willy,P. J., and Mangelsdorf, D. J. (1997) Genes Dev. 11, 289-298（ＧＡＬ４−キメラレセプター）Kliewer, S. A., et al(1994) Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 91,7355-7359（ＰＰＡＲ））。ヒト脂肪細胞プロモーターの野生型ルシフェラーゼレポータープラスミド［ｐ（−９０８）／ＬＵＣ  ｗｔ］（配列番号４４）およびＰＰＲＥ変異体ルシフェラーゼレポータープラスミド［ｐ（−９０８）／ＬＵＣ  ＰＰＲＥ  ｍｕｔ］（配列番号４５）は文献に記載されている（Iwaki, M., et al(2003) Diabetes 52, 1655-1663）。
【０３３１】
（ＨＥＫ２９３細胞における同時トランスフェクションアッセイ）
ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞（ATCC (American Type Culture Collection)〜入手可能）を、５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。文献に記載されたようなリン酸カルシウム共沈殿アッセイ（Lu,T. T. et al (2000) Mol. Cell 6, 507-515））によってトランスフェクションを行った。トランスフェクションの８時間後にリガンド化合物を添加した。ルシフェラーゼアッセイおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイを行うために、１６〜２０時間後に細胞を回収した。代表的には、ＤＮＡ同時トランスフェクション実験は、９６ウェルプレートの１ウェルあたりに、５０ｎｇのレポータープラスミド、２０ｎｇのｐＣＭ−β−ｇａｌ（Dr.David J. Mangelsdorf (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas,TX)のご厚意による。）、１５ｎｇのレポーター発現プラスミドおよび／または補因子発現プラスミドの各々を含み、加えて合計１５０ｎｇのＤＮＡとするためのｐＧＥＭキャリアＤＮＡ（Nishizawa,H. et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 1586-1592）を含ませた。ルシフェラーゼデータは、内因性βガラクトシダーゼコントロールに対して規格化した（Nishizawa,H. et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 1586-1592）。
【０３３２】
（リガンド結合アッセイ）
２μｇのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−全長ヒトＰＰＡＲγ２（(Y13467；別名p53 regulatory protein、RB18Aprotein）および４０ｎＭの［３Ｈ］ロシグリタゾンを、１００μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および４％グリセロ−ル中、４℃で２４時間インキュベートした。競合結合アッセイに関して、ピオグリタゾン、グリメピリドまたはグリベンクラミドを反応物に添加した。Ｍｉｃｒｏ  Ｓｐｉｎ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で遠心分離することによって、結合リガンドを遊離リガンドから分離した。放射能をＷａｌｌａｃ  １４０９液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で計測した。各アッセイを二連で行った。
【０３３３】
（ＧＳＴプルダウンアッセイ）
ＤＲＩＰ２０５の核レセプター相互作用ドメイン（配列番号３５のアミノ酸５７８〜７２８）をＧＳＴ融合ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングした。ＧＳＴ−ＤＲＩＰ２０５融合タンパク質をＢＬ２１  ＤＥ３細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）に発現させた。ＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｌａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３５Ｓ−標識全長マウスＰＰＡＲγを作製した。約２μｇのＧＳＴ−ＤＲＩＰ２０５をグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合させ、そして、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１８０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５ｍＭ  フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ  ＤＴＴおよび３．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む結合バッファー中で平衡化させた。次いで、結合したＧＳＴタンパク質を、標識したｍＰＰＡＲγおよびリガンドとともに４℃で１．５時間インキュベートした。結合させた後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１８０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび３．５％  ＢＳＡを含む洗浄バッファーで５回洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）サンプルバッファー中に再懸濁し、１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動の後、結合したタンパク質をオートラジオグラフィーで画像化し、ＢＡＳ  ２５００システム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して定量化した。
【０３３４】
（３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるトランスフェクション研究）
マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪前駆細胞（ＡＴＣＣから入手可能）を培養し、文献に記載されたように分化を誘導した（Iwaki, M. et al (2003)Diabetes 52, 1655-1663）。分化の誘導後４日目に、３Ｔ３−Ｌ１細胞の培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に交換し、文献に記載されたように（Iwaki, M. et al (2003)Diabetes 52, 1655-1663）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞をＰＰＲＥ×３−ｔｋ−ＬＵＣレポーターまたはヒトアディポネクチンプロモーターを含むレポータープラスミドでトランスフェクトした。薬剤処理の２０時間後に、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ルシフェラーゼの値を内部のβ−ガラクトシダーゼコントロールで規格化し、相対的ルシフェラーゼ活性として表した。
【０３３５】
（定量的逆転写−ＰＣＲ）ｓｕｐｅｒ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて総ＲＮＡを抽出した。Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴｄＴプライマーを用いて総ＲＮＡから第１のｃＤＮＡ鎖を合成した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、東京）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）でリアルタイム定量的ＰＣＲ増幅を行った。プライマーセットは、以下の通りであった：
マウスａＰ２、５’−ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＧＡ−３’（配列番号４６）および５’−ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＣＣＣ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＣＴ−３’（配列番号４７）；
マウスレプチン、５’−ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＡＧ−３’（配列番号４８）および５’−ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＣＧ−３’（配列番号４９）；
マウスアディポネクチン、５’−ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＣＣ−３’（配列番号５０）および５’−ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＡＴ−３’（配列番号５１）；
マウスサイクロフィリン、５’−ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  Ｔ−３’（配列番号５２）および５’−ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＴＧＣ  ＡＡ−３’（配列番号５３）。
【０３３６】
ｍＲＮＡレベルをサイクロフィリンのｍＲＮＡ量に対して規格化し、任意の単位で表した。
【０３３７】
（３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるアディポネクチン分泌の分析）
分化誘導後７日目に、ピオグリタゾン、グリメピリドまたはグリベンクラミドを４８時間培地に添加した。この培養培地中に分泌されたアディポネクチンの量を、マウス／ラットアディポネクチン酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｏｔｓｕｋａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ）で測定した。
【０３３８】
（脂肪細胞分化アッセイ）
マウス３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ脂肪前駆細胞（阪上浩博士（神戸大学）のご厚意による）を、１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で維持した。分化のために、細胞（コンフルエントに達してから３日後）を、１μｇ／ｍＬのインスリンを含む、１０％  ＦＢＳを動員したＤＭＥＭにて、化合物の有無のもと、インキュベートした。分化した脂肪細胞を、固定し、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（ナカライテスク（京都））で染色して、その脂質を可視化した。
【０３３９】
（統計解析）
データを平均±ＳＥとして表す。ダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）検定によって差を解析した。ダネット検定は、対照群として指定した１群と他の群を比較する方法で、多群間の分散分析で有意差が認められていなくても使用できる。各群のデータ数、分散や正規分布であるかどうかに制限を加えず検定できる。本実施例では、Ｐ＜０．０５をもって、統計的に有意であるとみなした。
【０３４０】
（実施例１：スルホニル尿素剤のＰＰＡＲγに対する作用）
本実施例では、本発明者らは、スルホニル尿素剤としてグリメピリドおよびグリベンクラミドを用い、ＰＰＡＲγ転写活性に対する効果を明らかにした。本実施例では、上述の実験手法に従って、ＧＡＬ４−ＰＰＡＲγおよびＧＡＬ４応答性ルシフェラーゼレポーターを用いて、非脂肪細胞であるＨＥＫ２９３細胞においてレポーターアッセイを行った。
【０３４１】
ＰＰＡＲγのリガンド結合作用ドメインを、酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合した。本実施例において使用したレポーターは、外因性のＧＡＬ４−キメラレポーターによってのみ活性化されるので、内因性レポーターの効果は排除される。興味深いことに、本発明者らは、グリメピリドおよびグリベンクラミドが、１０μＭの投与量にてＧＡＬ４−ＰＰＡＲγ転写活性を誘導したことを見出した。ところが、本発明者らは、１０μＭでは、他のスルホニル尿素剤（トルブタミド、クロルプロパミド、およびグリクラジド）は、グリメピリドおよびグリベンクラミドほどはＰＰＡＲγ活性化を検出しなかった（図１Ａ）。そのため、これらの他のスルホニル尿素剤については、さらに濃度を上げて活性を検出したところ、１００μＭでは、ＰＰＡＲγの転写活性が誘導されることを見出した。従って、スルホニル尿素剤は、一般にＰＰＡＲγの転写活性を誘導することが明らかになった（図１Ａ）。ただし、その活性は、スルホニル尿素剤の種類によって異なるようである。従って、新規なスルホニル尿素剤を開発することによってＰＰＡＲγ活性を向上させる可能性があることが判明した。
【０３４２】
次に、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞中のグリメピリドおよびグリベンクラミドによるＧＡＬ４−ＰＰＡＲγの濃度依存的活性化を調べた。図１Ｂに示されるように、グリメピリドまたはグリベンクラミドに用いた処理によって、ＧＡＬ４−ＰＰＡＲγの濃度依存的活性化を生じた。グリメピリドおよびグリベンクラミドは、それぞれ、ピオグリタゾンによって活性化された最大レベルの１２％および２０％までＧＡＬ４−ＰＰＡＲγを活性化した。
【０３４３】
従って、スルホニル尿素剤は、ＰＰＡＲの部分的なアゴニストであることが明らかになった。
【０３４４】
（実施例２：スルホニル尿素剤のＰＰＡＲサブタイプ特異性）
本実施例では、グリメピリドのＰＰＡＲサブタイプ選択性を調べるために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＬ−ＰＰＡＲを使用してレポーターアッセイを実施した。Ｗｙ１４６４３、ＧＷ５０１５１６、およびピオグリタゾン（これらは、各々のＰＰＡＲサブタイプに対する特異的なリガンドとして知られている（Hsu, M. H. et al(2001) J. Biol. Chem. 276, 27950-27958；Oliver, W. R.et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 5306-5311；Spiegelman,B. M. (1998) Diabetes 47, 507-514）は、それぞれ、ＧＡＬ−ＰＰＡＲα、ＧＡＬ−ＰＰＡＲδおよびＰＰＡＲγを活性化した（図１Ｃ）。興味深いことに、グリメピリドは、ＧＡＬ４−ＰＰＡＲγを活性化するが、ＧＡＬ４−キメラレポーターである、ＲＸＲα、ＬＸＲα、ＬＸＲβ、およびＦＸＲの転写活性に対するグリメピリドの効果を調べた。グリメピリドは、これらのレポーターに対してなんら効果を与えなかった。
【０３４５】
従って、グリメピリドは、ＰＰＡＲに特異的であることが明らかになった。
【０３４６】
（実施例３：スルホニル尿素剤とＰＰＡＲとの結合様式）
次に、本実施例では、グリメピリドおよびピオグリタゾンが、ＰＰＡＲγに直接的に結合するか否かを明確にするために、本発明者らは、ＧＳＴ−全長ＰＰＡＲγおよび[３Ｈ]ロシグリタゾンを用いて競合的結合アッセイを実施した。
【０３４７】
競合的結合アッセイを上記実験手法に従って行ったところ、[３Ｈ]ロシグリタゾンのピオグリタゾンによる置き換えが観察された。そのＩＣ５０値は、２．０μＭであった（図１Ｄ）。グリメピリドおよびピオグリタゾンによる置換はまた、濃度依存的であり、そして、ＩＣ５０値は、それぞれ、２４μＭおよび９６μＭであった（図１Ｄ）。
【０３４８】
これらのデータから、グリメピリドおよびピオグリタゾンが、直接結合によってＰＰＡＲγを活性化することが示され、そして、ＰＰＡＲγに対する部分アゴニストであることが示されたことになる。
【０３４９】
（実施例４：スルホニル尿素剤のコファクターとＰＰＡＲとの相互作用に対する効果）
次に、本実施例では、スルホニル尿素剤であるグリメピリドがコファクターとＰＰＡＲγの相互作用を増大させるかどうかを調べた。
【０３５０】
この相互作用の実験は、上記実験手法に従って行った。核レセプターは、リガンドに結合すると、コンフォメーション変化を受け、そして、この変化によって、コリプレッサーのＡＦ−２ドメイン依存的な解離およびコアクチベータの動員を生じる（Glass, C. K., and Rosenfeld, M. G. (2000) Genes Dev. 14,121-141）。本発明者らは、全長ＰＰＡＲγまたは変異ＰＰＡＲγ（ΔＡＦ−２）と、ＰＰＲＥ×３−ｔｋ−ＬＵＣレポーターの同時トランスフェクションによってＰＰＡＲγ  ＡＦ−２欠失変異体に対するグリメピリドの効果を調べた。グリメピリドならびにピオグリタゾンは、全長ＰＰＡＲγを活性化した。しかし、ＰＰＡＲγのグリメピリド依存的活性化は、ＡＦ−２ドメインの切断によって完全に消失した（図２Ａ）。
【０３５１】
次に、本発明者らは、ＰＰＡＲγと、コアクチベータＤＲＩＰ２０５（これはまた、ＰＰＡＲ結合タンパク質（ＰＢＰ）として知られる。Zhu, Y. et al (1997) J. Biol. Chem. 272, 25500-25506；Yang, W.,Rachez, C., and Freedman, L. P. (2000) Mol. Cell. Biol. 20,8008-8017）、またはコリプレッサーＮ−ＣｏＲとの相互作用に対するグリメピリドの効果を、上記実験手法に従ってＨＥＫ２９３細胞における哺乳動物ツーハイブリッドアッセイによって、調べた。これらのアッセイは、リガンド依存的な、コファクターの動員または解離の検出のために、ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質のトランス活性化ドメインに融合した全長ＰＰＡＲγ、およびＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合した、ＤＲＩＰ２０５またはＮ−ＣｏＲの核レセプター相互作用ドメインを使用して実施した（Makishima,M. et al (1999) Science 284, 1362-1365）。簡単に説明すると、ツーハイブリッドシステムはルシフェラーゼで定量を行う哺乳動物細胞系のシステムです。転写因子にみられるモジュールドメインを利用してinvivoでタンパク質とタンパク質との相互作用を検出できる有効な方法である。目的のタンパク質Ｘとタンパク質Ｙが相互作用を起こすと転写活性化ドメイン(VP16)とDNA結合ドメイン(GAL4)が会合し、レポーター遺伝子の転写活性が促進される。
【０３５２】
その結果、ピオグリタゾンおよびグリメピリドの両方とも、ＶＰ１６−ＰＰＡＲγ、ＧＡＬ４−ＤＲＩＰ２０５およびＧＡＬ４応答性ＬＵＣレポーターの同時トランスフェクションによる転写活性を顕著に増加させた（図２Ｂ）。これらの結果は、グリメピリドおよびピオグリタゾンの両方がＤＲＩＰ２０５とのＰＰＡＲγの会合を誘導することを示す。他方、ＶＰ１６−ＰＰＡＲγとＧＡＬ４−Ｎ−ＣｏＲとの同時トランスフェクションは、リガンドの不在下でレポーターの活性化を生じた。ピオグリタゾンまたはグリメピリドの存在下において、レポーター活性は顕著に抑制された（図２Ｃ）。同様のピオグリタゾンまたはグリメピリドについては、ＰＰＡＲγとコリプレッサーＳＭＲＴとの相互作用に対する阻害効果も見られた。
【０３５３】
これらの結果は、グリメピリドのようなスルホニル尿素剤が、ＰＰＡＲγのコリプレッサーであるＮ−ＣｏＲまたはＳＭＲＴとの解離を誘導することを示す。
【０３５４】
さらに、本発明者らは、ＧＳＴプルダウンアッセイを用いて、全長ＰＰＡＲγのＤＲＩＰ２０５との相互作用へのグリメピリドの直接的な作用を評価した。図２Ｄに示すように、３５Ｓで標識したＰＰＡＲγは、ＧＳＴ−ＤＲＩＰ２０５に結合し、この結合は、ピオグリタゾンによって増強された（レーン８）。同様に、グリメピリドは標識したＰＰＡＲγのＧＳＴ−ＤＲＩＰ２０５との相互作用を用量依存性の様式で誘導した（図３Ｄ、レーン９〜１１）。ＧＳＴ単独と標識したＰＰＡＲγとの間の結合は、リガンドの存在または非存在下のいずれにおいても観察されなかった（図２Ｄ、レーン２〜６）。これらのデータによって、ＰＰＡＲγに対するグリメピリドの直接的な結合が、ＰＰＡＲγのコアクチベーターであるＤＲＩＰ２０５との会合を誘導することが強く示唆される。
【０３５５】
従って、スルホニル尿素剤であるグリメピリドがコファクターとＰＰＡＲγとの相互作用に直接効果を有することが明らかになった。
【０３５６】
（実施例５：スルホニル尿素剤のＰＰＡＲ依存性の転写活性に対する効果）
次に、本実施例において、スルホニル尿素剤が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞などの細胞中でＰＰＡＲ依存性の転写活性に寄与するかどうかを調べた。
【０３５７】
本実施例では、スルホニル尿素剤として、グリメピリドおよびグリベンクラミドを使用した。
【０３５８】
脂肪細胞でのＰＰＡＲ依存性のトランス活性化に対するグリメピリドおよびグリベンクラミドの効果を研究するために、本発明者らは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中でＰＰＲＥ×３−ｔｋ−ＬＵＣを使用してルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。グリメピリドは、用量依存的な様式で脂肪細胞中のＰＰＥＥレポーターの活性を有意に誘導した（図３Ａ）。グリベンクラミドはまた、グリメピリドくらい効果的に、用量依存的に脂肪細胞中でＰＰＲＥレポーターを活性化させた（図３Ａ）。これらの結果によって、グリメピリドおよびグリベンクラミドの両方が、脂肪細胞中の内因性ＰＰＡＲγを活性化させることを示唆する。次いで、本発明者らは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中のレポーターアッセイによってアディポネクチン遺伝子の転写に対するグリメピリドの直接的な効果を調べた。本発明者らにより、アディポネクチン遺伝子の発現がＰＰＡＲγ活性化によってアップレギュレートされることがこれまでに実証されている（Iwaki, M. et al (2003)Diabetes 52, 1655-1663）。図３Ｂにおいて示されるように、グリメピリドならびにピオグリタゾンは、脂肪細胞中で野生型アディポネクチンプロモーターの転写活性を増大させた。これまでにも報告されているように（Iwaki, M. et al (2003)Diabetes 52, 1655-1663）、ＰＰＲＥ変異アディポネクチンプロモーターのトランスフェクションによって、基底状態（basal condition）における転写活性の顕著な低減を引き起し、そして、ピオグリタゾンを用いた処理によるさらなる誘導は、観察されなかった。興味深いことに、アディポネクチンプロモーターのグリメピリド依存的な活性化はまた、ＰＰＲＥの変異によって完全に消滅した（図３Ｂ）。これらのデータによって、グリメピリドが脂肪細胞中のＰＰＲＥ依存的機構を介してアディポネクチンプロモーターを活性化させることを示唆する。
【０３５９】
従って、スルホニル尿素剤は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中のＰＰＡＲ依存性転写活性を誘導することが明らかになった。
【０３６０】
（実施例６：スルホニル尿素剤の脂肪細胞中でアディポネクチン産生に対する効果）
次に、本実施例では、スルホニル尿素剤のＰＰＡＲ下流の効果として、アディポネクチンおよびレプチンの産生に対する効果があるかどうかを観察した。
【０３６１】
本発明者らは、分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における、既知のＰＰＡＲγ標的遺伝子である、ａＰ２およびレプチンのｍＲＮＡ発現に対するグリメピリドの効果を調べた。文献において報告されたように（Perrey, S. et al(2001) Metabolism 50, 36-40；Kallen, C. B., and Lazar, M. A. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 93, 5793-5796）、ピオグリタゾンは、脂肪細胞において、ａＰ２  ｍＲＮＡレベルを有意に増大させ、そして、レプチン  ｍＲＮＡレベルを低減した（図４Ａおよび図４Ｂ）。同様に、グリメピリドは、ａＰ２およびレプチンの両方のｍＲＮＡレベルを有意に変更した（図４Ａおよび図４Ｂ）。次に、本発明者らは、分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中におけるアディポネクチンのｍＲＮＡの発現および分泌に対するグリメピリドの効果を調べた。公知文献に報告されたように（Maeda,N. et al (2001) Diabetes 50, 2094-2099）、ピオグリタゾンは、アディポネクチンのｍＲＮＡ発現および分泌の両方を増大させた（図４Ｃおよび図４Ｄ）。興味深いことに、グリメピリドでの処理によって、脂肪細胞中のアディポネクチンのｍＲＮＡレベルを有意に増大させた（図４Ｃ）。さらに、グリメピリドは、培地へのアディポネクチン分泌を用量依存的に刺激した（図４Ｄ）。さらに、本発明者らは、グリベンクラミド処理した脂肪細胞中のアディポネクチンの分泌を調べた。グリベンクラミドは、グリメピリドと同様にアディポネクチン分泌を増大した（図４Ｄ）。これらの結果は、グリメピリドおよびグリベンクラミドの両方が、脂肪細胞中でのＰＰＡＲγ活性化を介して、インスリン感受性増加（sensitizing）ホルモンであるアディポネクチン産生を増大することを示唆する。
【０３６２】
その結果、グリメピリドおよびグリベンクラミドは、脂肪細胞中でアディポネクチン産生を増大させることが明らかになった。グリメピリドは脂肪細胞におけるレプチンの遺伝子発現を減少した。肥満に伴う高レプチン血症などに有効である。
【０３６３】
（実施例７：スルホニル尿素剤の脂肪細胞分化に対する効果）
次に、スルホニル尿素剤の細胞分化に対する効果を調べた。
【０３６４】
従来のＰＰＡＲγアゴニストは、成熟脂肪細胞への脂肪前駆細胞の変換を促進することが知られている（Tontonoz, P., Hu, E., and Spiegelman, B. M. (1994) Cell 79,1147-1156）。本実施例では、グリメピリドおよびグリベンクラミドのようなスルホニル尿素剤が、そのようなＰＰＡＲアゴニスト活性があるかどうかを調べた。本発明者らは、３Ｔ３−Ｆ４２２Ａ脂肪前駆細胞（阪上浩博士(神戸大学) のご厚意による）における脂肪細胞分化に対するグリメピリドおよびグリベンクラミドの効果を調べた。３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ前駆脂肪細胞は、ＰＰＡＲγアゴニスト依存的脂肪細胞分化を示すことが知られている（Wright,H. M. et al (2000) J. Biol. Chem. 275, 1873-1877）。Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏでの脂肪の染色によって示されるように、ピオグリタゾンと同様にグリメピリドとのインキュベーションは、脂肪細胞分化を顕著に刺激した（図５Ａ）。グリベンクラミドによる脂肪沈着が、観察され、グリメピリドにおいても脂肪沈着が観察された。さらに、本発明者らは、脂肪細胞分化マーカー遺伝子である、ａＰ２およびアディポネクチンの誘導におけるグリメピリドおよびグリベンクラミドの効果を調べた。グリメピリドおよびグリベンクラミドの両方は、ピオグリタゾンと同様に、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞（図５Ｂおよび図５Ｃ）におけるこれらの遺伝子のｍＲＮＡ発現を有意に誘導した。これらの結果は、グリメピリドおよびグリベンクラミドの両方がＰＰＡＲγ活性化を介して脂肪細胞分化を刺激することを示唆する。
【０３６５】
（まとめ）
本発明において、本発明者らは、少なくとも以下の１）〜５）を見出した：
１）グリメピリドは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＰＰＡＲγの転写活性を誘導した；
２）グリメピリドは、コアクチベータＤＲＩＰ２０５の動員およびコリプレッサー（例えば、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴ）の解離を増大させた；
３）グリメピリドは、ロシグリタゾンに競合する様式でＰＰＡＲγに直接結合した；
４）グリメピリドは、ＰＰＥＲを含む遺伝子プロモーターの転写活性を刺激し、そして、３Ｔ３脂肪細胞におけるＰＰＡＲγ標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを変更した；そして、
５）グリメピリドは、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞における脂肪細胞分化を誘導した。
【０３６６】
興味深いことに、グリメピリドを用いて観察された効果の殆どは、ピオグリタゾンによっても再現された。これらのデータによって、グリメピリドおよびグリペンクラミド（これらの両方は、スルホニル尿素抗糖尿病薬に属する）は、ＰＰＡＲγに対するアゴニストとして作用するが、これらの能力は、ピオグリタゾンの１２〜２０％であった。本発明者らの結果によって、ＰＰＡＲγアゴニストであるというスルホニル尿素剤の新規局面が提供される。
【０３６７】
数個の化合物が、ＰＰＡＲγに対する部分アゴニストとして報告されてきた（(1) Oberfield, J. L. et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 96,6102-6106；(2) Kurosaki, E. et al (2003) Biochem.Pharmacol. 65, 795-805；(3) Schupp, M. et al(2004) Circulation 109, 2054-2057；(4) Benson, S. C. et al (2004) Hypertension 43, 993-1002）。例えば、ＧＷ００７２
【０３６８】
【化１】
2008019169.tif 000006
【０３６９】
は、それらの部分アゴニストのうちの１つであり、コリプレッサーＮ−ＣｏＲの解離において完全アゴニストと同等の能力を有する。しかし、コアクチベータ（例えば、ＣＢＰおよびＳＲＣ−１）の動員は、チアゾリジンジオンと比較して限定されている（Oberfield, J. L. et al(1999) Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 96,6102-6106）。本発明者らは、グリメピリドが、ピオグリタゾンと同等に、ＤＲＩＰ２０５の動員と、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴの解離の両方とを誘導することを観察した。従って、グリメピリドおよびグリベンクラミドによるＰＰＡＲγトランス活性化の最大レベルの抑制は、ＤＲＩＰ２０５以外の他のコアクチベータの動員の機能障害に起因し得る。
【０３７０】
従来の臨床研究によって、２型糖尿病における血漿アディポネクチンレベルが増大することが示された（Tsunekawa, T. et al(2003) Diabetes Care 26, 285-289）。本発明者らは、これまで、ＰＰＡＲγアゴニストがヒトにおける血漿アディポネクチンレベルを上昇させることを報告した（Maeda, N. et al (2001)Diabetes 50, 2094-2099）。従って、ヒト被験体における血漿アディポネクチンに対するグリメピリドの効果を上昇することは、ＰＰＡＲγアゴニスト活性によって部分的に説明され得る。
【０３７１】
２型糖尿病における高血糖は、膵臓のβ細胞からのインスリンの分泌および末梢組織におけるインスリン感受性の両方における多重欠損の結果である。従って、２型糖尿病に対する薬理学的アプローチを開発するために、血漿インスリンレベルを上昇するだけでなく、インスリン感受性を改善することが重要であると考えられてきた。スルホニル尿素剤は、これまで広く使用されてきたが、これは、膵臓のインスリン分泌を刺激することによって、スルホニル尿素剤が効率的に血糖を低下させるからであると考えられていたからである。対照的に、チアゾリジンジオン、ＰＰＡＲγアゴニストは、末梢のインスリン耐性を改善することによって、強力な低血糖効果を示す。
【０３７２】
本発明者らの実験において使用されたグリメピリドおよびピオグリタゾンの投与量は、ＰＰＡＲγアゴニスト活性を発揮するのに従来使用されていたランゲルハンス島からのインスリン分泌を誘導するのに必要とされる投与量よりも高かった。しかし、グリメピリドおよびグリベンクラミドの両方がスルホニル尿素レセプター（ＳＵＲ）のみではなくＰＰＡＲγに対しても作用し得るという本発明者の知見は、理想的な抗糖尿病剤、すなわち、膵臓β細胞からのインスリン分泌およびインスリン感受性の両方を増強し得る抗糖尿病を開発する重要な糸口を提供するものである。
【０３７３】
（実施例８：スクリーニング）
本実施例では、ＰＰＡＲの活性を亢進する可能性のある物質を、レポータージーンアッセイを用いてスクリーニングする。
【０３７４】
（レポータージーンアッセイ）
（方法）
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；１０  ｍＭ  リン酸塩；１５０  ｍＭ  塩化ナトリウム，  ｐＨ  ７．２  ｔｏ  ７．３．）
ルシフェラーゼレポーターアッセイキット：
溶解溶液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（７．５）、２ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ），１０％グリセロール、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；ルシフェリンミックス：２０ｍＭトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）／１．０７ｍＭ（ＭｇＣＯ３）４Ｍｇ（ＯＨ）２−５Ｈ２Ｏ／２．６７ｍＭＭｇＳＯ４／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ／３３．３ｍＭ  ＤＴＴ／２７０μＭ  コエンザイム（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ）Ａ／４７０μＭルシフェリン／５３０μＭＡＴＰ（ニッポンジーンのピッカジーン（Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＰＧＫ−Ｌ１００）を使用することができる）。
【０３７５】
（使用する脂肪細胞）
白色脂肪細胞  ：３Ｔ３−Ｌ１，  ３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ，  Ｏｂ１７７１
褐色脂肪細胞  ：ＨＩＢ１Ｂ
白色および褐色の脂肪細胞の初代培養細胞
その他             ：Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２（多分化能細胞なので、脂肪細胞になることもある）
（培地）
これらの細胞は、適宜Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地に１０％ウシ胎仔血清などを用いて培養する。
【０３７６】
（ルシフェラーゼ）
ルシフェラーゼは、蛍光（約５６０ｎｍ）作る酵素である。細胞内に、ＰＰＡＲをコードした核酸配列（配列番号１）を含むプラスミドとレポータープラスミド（ルシフェラーゼレポーター）を同時に細胞に強制発現し、レポーター活性を測定する。ルシフェラーゼ遺伝子産物の発現による蛍光を測定することにより、遺伝子発現を測定することができる。ここで、トランスフェクションなどは、本明細書上記（３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるトランスフェクション研究）に記載されている手法に従って行うことができる。
【０３７７】
（方法）
（１）  上記プラスミドを用いて上記各々の細胞のトランスフェクションを行う。
（２）  ４８〜７２時間、上記細胞を培養する。
（３）  培養上清を除去する。
（４）  培養に使用されているウェルまたはディッシュを洗浄する。
（５）  細胞の溶解（２４穴プレートの場合、溶解溶液２００μｌ／ウェル）。
（６）  ライゼートをＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブへうつす。
（７）  脱核（遠心分離１５Ｋｒｐｍ、３分，４℃）する。
（８）  上清を別のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブへうつす
（９）  液体シンチレーションカウンターにサンプルを挿入する。
（１０）  ルシフェリンミックスにサンプル上清を０．５μｌ加える。
（１１）  蛍光に起因するカウントを測定する。
【０３７８】
このようにして得られた蛍光から、候補化合物が、ＰＰＡＲの機能の抑制または亢進を測定することができる。
【０３７９】
（実施例９：自動化）
実施例８で実施するスクリーニングは、ロボットを用いて自動化することができる。この場合、例えば、ベックマンコールターのＢｉｏｍｅｋシリーズを用いて、マイクロプレートを用いたシステムを構築するか、またはＺｙｍａｒｋのＳｔａｃｃａｔｏ  Ｍｉｎｉ−Ｓｙｓｔｅｍシリーズを用いてシステムを構築することができる。
【０３８０】
このようにして得られたリード化合物は、動物実験に用いることができる。あるいは、このようなリード化合物をもとに、他の化合物を設計することができる。
【０３８１】
（実施例１０：動物実験）
実施例８、９などで、ＰＰＡＲを活性化する可能性があることが判明した化合物について、マウス、ラットまたはサルなどの動物に投与して脂肪組織特異的にＰＰＡＲ  ｍＲＮＡ発現量またはタンパク質量を低下させる化合物をスクリーニングする。
【０３８２】
このようなスクリーニングにより、動物において実際に脂肪細胞の分化；糖尿病；高グリシン血症；低グルコース寛容；インスリン抵抗性；肥満；脂肪障害；異脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）；高脂血症；高トリグリセリド血症；高コレステロール血症；低ＨＤＬレベル；高ＬＤＬレベル；粥状硬化症；血管狭窄；過敏性腸症候群；炎症性腸疾患；クローン病；腸潰瘍；炎症疾患；膵炎；腹部肥満；神経変性病；網膜症；乾癬；代謝性症候群；卵巣高アンドロゲン症などの疾患に作用する物質をスクリーニングすることができる。
【０３８３】
（実施例１１：ヒト被検体における臨床試験）
実施例１０で実際に試験効果があった物質のうち、毒性が見られなかったものについて、ヒト被検体に投与して肥満に対する効果を観察する。ここでは、エネルギー代謝、体重、脂肪量、体脂肪率などを指標として臨床試験を行う。これにより、実施例１０でリード化合物として同定された化合物が、実際に上記疾患に効果があるかどうかを判定することができる。
【０３８４】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３８５】
本発明は、ＰＰＡＲ関連疾患の診断、処置および予防において有用な標的およびそれによるスクリーニング法、ならびにその方法によって同定される医薬を用いて、ＰＰＡＲ関連疾患を処置することができるという有用性を有する。また、本発明は、スルホニル尿素剤が、このようなＰＰＡＲ関連疾患に有効であることを示した。これらから、本発明は、有効な糖尿病治療のための薬剤を開発するにおいても有用である。
【図面の簡単な説明】
【０３８６】
【図１】図１は、グリメピリドおよびグリベンクラミドがＰＰＡＲγについての部分アゴニストであることを示す。Ａ：ＰＰＡＲγの転写活性に対するスルホニル尿素剤の効果。ＨＥＫ２９３細胞を、ＧＡＬ４−マウスＰＰＡＲγ（ｍＰＰＡＲγ）およびＭＨ１００（ＵＡＳ）×４−ｔｋ−ＬＵＣレポーターでトランスフェクトし、そして、ビヒクルコントロール（ｃｏｎｔ）で処理するか、またはスルホニル尿素剤で処理した。このスルホニル尿素剤の各々はとしては、１０μＭで、グリメピリド（ｇｍｐ）、グリベンクラミド（ｇｂｃ）、トルブタミド（ｔｂ）、クロルプロパミド（ｃｐ）、およびグリクラジド（ｇｃ）であった。ルシフェラーゼ値は、内因性βガラクトシダーゼコントロールによって規格化し、そして、相対ルシフェラーゼ活性として表現した。値は、平均±ＳＥ（ｎ＝３）である。Ｂ：ピオグリタゾンによるＰＰＡＲγの濃度依存的活性化。ＨＥＫ２９３細胞を、ＧＡＬ−ｍＰＰＡＲγおよびＭＨ１００（ＵＡＳ）×４−ｔｋ−ＬＵＣレポーターと同時トランスフェクトし、そして、ピオグリタゾン（ｐｉｏ）、グリメピリド、グリベンクラミドを用いて示した投与量で処理した。ルシフェラーゼ活性値は、β−ガラクトシダーゼ活性によって規格化し、そして、そのビヒクルコントロールと比較してその倍数表示として表現した。値は、平均値±ＳＥ（ｎ＝３）である。Ｃ：グリメピリドのＰＰＡＲサブタイプ選択性。ＨＥＫ２９３細胞を、ＭＨ１００（ＵＡＳ）×４−ｔｋ−ＬＵＣレポーターを併用して、ＧＡＬ４、ＧＡＬ４マウスＰＰＡＲγ、ＧＡＬ４−マウスＰＰＡＲδ、またはＧＡＬ４−ｍＰＰＡＲγでトランスフェクトし、そして、ビヒクルコントロール、各々のＰＰＡＲサブタイプに対するリガンド（ＰＰＡＲαリガンド、１０μＭ  Ｗｙ  １４６４３；ＰＰＡＲδリガンド、１０μＭ  ＧＷ  ５０１５１６；ＰＰＡＲγリガンド、１μＭ  ピオグリタゾン）、あるいは１０μＭのグリメピリドに対するリガンドで処理した。ルシフェラーゼを、β−ガラクトシダーゼ活性よって規格化し、そして、相対ルシフェラーゼ活性として表現した。値は、平均値±ＳＥ（ｎ＝３）である。Ｄ：ＰＰＡＲγに対して結合する[３Ｈ]ロシグリタゾンの、ピオグリタゾンによる置換の用量応答曲線。競合結合アッセイは、実験手法に記載されているように実施した。データは、二連の点の平均値を示す。
【図１Ａ】図１Ａは、スルホニル尿素剤について、図１において示された濃度よりさらに高い濃度で効果があるかどうかを示すグラフである。実験条件は、使用した濃度を除き、すべて、図１および実験手法に記載されるとおりである。
【図２】図２は、グリメピリドは、コファクターとのＰＰＡＲγの相互作用に影響を与えることを示す。Ａ：グリメピリドによるＰＰＡＲγのＡＦ−２依存性活性化。ＨＥＫ２９３細胞を、ＣＭＸコントロールベクター（ｃｏｎｔ）、ＣＭＸ−ｍＰＰＡＲγまたはＣＭＸ−ΔｍＰＰＡＲγと、ＰＰＲＥ×３−ｔｋ−ＬＵＣとで同時トランスフェクトし、そして、１μＭピオグリタゾン（ｐｉｏ）または１０μＭグリメピリド（ｇｍｐ）で処理した。ルシフェラーゼ値は、内因性βガラクトシダーゼコントロールによって規格化し、そして、相対ルシフェラーゼ活性として表現した。値は、平均±ＳＥ（ｎ＝３）である。ＢおよびＣ：細胞ベースの系におけるＰＰＡＲγとコファクターとの間の相互作用に対するグリメピリドの効果。哺乳動物のツーハイブリッド解析を、ＨＥＫ  ２９３細胞において、ＶＰ１６またはＶＰ１６−ｍＰＰＡＲγならびにＭＨ１００（ＵＡＳ）×４−ｔｋ−ＬＵＣを併用して、ＧＡＬ４−ＤＲＩＰ２０５またはＧＡＬ４−Ｎ−ＣｏＲを使用することによって実施した。次いで、細胞を、１μＭ  ピオグリタゾンまたは１０μＭ  グリメピリドで処理した。ルシフェラーゼ値を、β−ガラクトシダーゼで規格化し、そして、相対的ルシフェラーゼ活性として表現した。値は、平均値±ＳＥ（ｎ＝３）である。Ｄ：無細胞系におけるＰＰＡＲγとＤＲＩＰ２０５との間の相互作用に対するグリメピリドの直接的な効果。ＧＳＴプルダウンアッセイを、「実験手法」に記載するように実施した。ピオグリタゾンまたはグリメピリドの存在下において、インビトロ翻訳３５Ｓ−マウスＰＰＡＲγを、ＧＳＴ−ＤＲＩＰ２０５との相互作用の結果として検出した。
【図３】図３は、グリメピリドおよびグリベンクラミドは、３Ｔ３脂肪細胞中のＰＰＡＲ依存性トランス活性化を誘導することを示す。Ａ：３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中のＰＰＡＲγ依存性転写活性に対する、グリメピリドおよびグリベンクラミドの効果。分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞を、「実験手法」に記載されるように、ＰＰＲＥ×３−ｔｋ−ＬＵＣレポータープラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後に、細胞を、ビヒクルコントロール（ｃｏｎｔ）、１μＭピオグリタゾン（ｐｉｏ）で２０時間に亘り処理するか、または、グリメピリド（ｇｍｐ）またはグリベンクラミド（ｇｂｃ）で表示した濃度にて処理した。ルシフェラーゼ値を、β−ガラクトシダーゼで規格化し、そして、相対的ルシフェラーゼ活性として表現した。値は、平均値±ＳＥ（ｎ＝４）である。＊コントロール群と比較してＰ＜０．０５である。Ｂ：アディポネクチンのプロモーター活性に対するグリメピリドの効果。「実験手法」に記載されるように、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞を、ヒトアディポネクチンプロモーター−ルシフェラーゼレポータープラスミド、野生型［ｐ（−９０８）／ＬＵＣ  ｗｔ］またはＰＰＲＥ変異レポーター［ｐ（−９０８）／ＬＵＣ  ＰＰＲＥ  ｍｕｔ］でトランスフェクトした。トランスフェクションの後に、細胞を、コントロールビヒクル（ｃｏｎｔ）、１μＭピオグリタゾンまたは１０μＭのグリメピリドで２０時間に亘り処理した。ルシフェラーゼ値は、β−ガラクトシダーゼによって規格化され、そして、相対的なルシフェラーゼ活性値として表現した。ルシフェラーゼ値を、β−ガラクトシダーゼで規格化し、そして、相対的ルシフェラーゼ活性として表現した。値は、平均値±ＳＥ（ｎ＝３）である。＊Ｐ＜０．０５は、コントロール群と比較したものである。
【図４】図４は、グリメピリドおよびグリベンクラミドは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてアディポネクチン産生を増強することを示す。Ａ、Ｂ、およびＣは、ＰＰＡＲγ標的遺伝子のｍＲＮＡ発現に対するグリメピリドの効果である。分化の誘導の７日後に、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、ビヒクルコントロール（ｃｏｎｔ）、１０μＭピオグリタゾン（ｐｉｏ）また２０μＭのグリメピリド（ｇｍｐ）で、２４時間に亘り処理した。総ＲＮＡを、これらの遺伝子のｍＲＮＡ発現についてのリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。ａＰ２、レプチン、およびアディポネクチンのｍＲＮＡレベルを、サイクロフィリンｍＲＮＡの量に対して規格化した。値は、平均値±ＳＥ（ｎ＝３）である。＊コントロール群と比較してＰ＜０．０５である。Ｄ：アディポネクチンの分泌に対するグリメピリドおよびグリベンクラミドの効果。分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞を、ビヒクルコントロール、１０μＭのピオグリタゾン、示した濃度のグリメピリド、または２５μＭのグリベンクラミド（ｇｂｃ）で、４８時間に亘り処理した。この培地のアリコートを、ＥＬＩＳＡに供し、分泌されたアディポネクチンの量を測定した。値は、平均値±ＳＥ（ｎ＝３）である。＊Ｐ＜０．０５は、コントロール群と比較する。
【図５】図５は、グリメピリドおよびグリベンクラミドが、脂肪細胞の分化を刺激することを示す。Ａ：３Ｔ３−Ｆ４２２Ａ脂肪前駆細胞における脂肪細胞分化に対するグリメピリドの効果。ビヒクルコントロール（ｃｏｎｔ）、１μＭのピオグリタゾン（ｐｉｏ）または１０μＭグリメピリド（ｇｂｃ)で９日間にわたりインキュベートした後に、細胞をＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏで染色した。ＢおよびＣ：３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ脂肪前駆細胞において、脂肪細胞分化マーカー遺伝子の誘導に対するグリメピリドおよびグリベンクラミドの効果。３Ｔ３−Ｆ４２２Ａ脂肪前駆細胞を、ビヒクルコントロール、１μＭのピオグリタゾン、１０μＭのグリメピリドまたは１０μＭのグリベンクラミド（ｇｂｃ）とともに、２日間に亘ってインキュベートした。総ＲＮＡを、抽出し、そして、ａＰ２遺伝子およびアディポネクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現のためにリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。そのｍＲＮＡレベルを、サイクロフィリンｍＲＮＡの量と比較して規格化した。値は、平均値±ＳＥ（ｎ＝３）である。＊コントロール群と比較してＰ＜０．０５。
【配列表フリーテキスト】
【０３８７】
（配列表の説明）
配列番号１は、マウスＰＰＡＲγの核酸配列である。(NM_011146、ＰＰＡＲγのアイソフォーム2を示している。)
配列番号２は、マウスＰＰＡＲγのアミノ酸配列である。(NP_035276、ＰＰＡＲγのアイソフォーム2を示している。)
配列番号３は、ヒトＰＰＡＲγの核酸配列である。(NM_138712)
配列番号４は、ヒトＰＰＡＲγのアミノ酸配列である。(NP_619726)
配列番号５は、ラットＰＰＡＲγの核酸配列である。(NM_013124)
配列番号６は、ラットＰＰＡＲγのアミノ酸配列である。NP_037256)
配列番号７は、サルＰＰＡＲγの核酸配列である。(AF033103)
配列番号８は、サルＰＰＡＲγのアミノ酸配列である。(AAB87480)
配列番号９は、ＰＰＡＲ中の結合必須配列の一つであるアミノ酸配列ＰＬＬＱＥＩＹＫＤＬＹを示す。
配列番号１０は、ヒトアディポネクチン３．６ｋｂプロモーターの核酸配列である。(AF304467)
配列番号１１は、ヒトアディポネクチンタンパク質の核酸配列である。(NM_004797)
配列番号１２は、ヒトアディポネクチンタンパク質のアミノ酸配列である。(NP_004788)
配列番号１３は、マウスアディポネクチンプロモーターの核酸配列である（Das, K. et al (2001) Biochem Biophys Res Commun. 280, 1120-1129、Seo JB et al (2004) J.Biol. Chem. 279, 22108-22117等を参照）。
配列番号１４は、ＧＡＬ４の核酸配列である。（X85976；アミノ酸１−１４７に対応：atgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcg）
配列番号１５は、ＧＡＬ４のアミノ酸配列である。（X85976）（アミノ酸１-１４７；MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVS）
配列番号１６は、ＧＡＬ４−マウスＰＰＡＲαキメラタンパク質の核酸配列である。(マウスＰＰＡＲα、NM_011144)
配列番号１７は、ＧＡＬ４−マウスＰＰＡＲαキメラタンパク質のアミノ酸配列である。(マウスＰＰＡＲα、NP_035274)
配列番号１８は、ＧＡＬ４−マウスＰＰＡＲδキメラタンパク質の核酸配列である。(マウスＰＰＡＲδ、NM_011145)
配列番号１９は、ＧＡＬ４−マウスＰＰＡＲδキメラタンパク質のアミノ酸配列である。(マウスＰＰＡＲδ、NP_035275)
配列番号２０は、ＧＡＬ４−マウスＰＰＡＲγキメラタンパク質の核酸配列である。(マウスＰＰＡＲγ、NM_011146) 
配列番号２１は、ＧＡＬ４−マウスＰＰＡＲγキメラタンパク質のアミノ酸配列である。（マウスＰＰＡＲγ、NP_035276）
（配列番号１６−２１は上述のGAL4 配列と各マウスPPARリガンド結合領域との融合体。Kliewer, S. A., et al(1994) Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 91,7355-7359、Umesono, K et al (1991) Cell 65, 1255-1266等を参照）
配列番号２２は、ＶＰ１６の核酸配列である。（78アミノ酸からなる）
（gcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtggg）
配列番号２３は、ＶＰ１６のアミノ酸配列である。（78アミノ酸）
(APPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPGFTPHDSAPYGALDMADFEFEQMFTDALGIDEYGG)
配列番号２４は、ＶＰ１６−マウスＰＰＡＲγキメラタンパク質の核酸配列である。
配列番号２５は、ＶＰ１６−マウスＰＰＡＲγキメラタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２６は、β−ガラクトシダーゼの核酸配列である。
配列番号２７は、β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列である。
(配列番号２４−２７は、Willy,P. J., and Mangelsdorf, D. J. （1997） Genes Dev. 11, 289−298を参照)
配列番号２８は、マウスΔＰＰＡＲγ変異体構築物の核酸配列である。（atggttgacacagagatgccattctggcccaccaacttcggaatcagctctgtggacctctccgtgatggaagaccactcgcattcctttgacatcaagccctttaccacagttgatttctccagcatttctgctccacactatgaagacattccattcacaagagctgacccaatggttgctgattacaaatatgacctgaagctccaagaataccaaagtgcgatcaaagtagaacctgcatctccaccttattattctgaaaagacccagctctacaacaggcctcatgaagaaccttctaactccctcatggccattgagtgccgagtctgtggggataaagcatcaggcttccactatggagttcatgcttgtgaaggatgcaagggttttttccgaagaaccatccgattgaagcttatttatgataggtgtgatcttaactgccggatccacaaaaaaagtagaaataaatgtcagtactgtcggtttcagaagtgccttgctgtggggatgtctcacaatgccatcaggtttgggcggatgccacaggccgagaaggagaagctgttggcggagatctccagtgatatcgaccagctgaacccagagtctgctgatctgcgagccctggcaaagcatttgtatgactcatacataaagtccttcccgctgaccaaagccaaggcgagggcgatcttgacaggaaagacaacggacaaatcaccatttgtcatctacgacatgaattccttaatgatgggagaagataaaatcaagttcaaacatatcacccccctgcaggagcagagcaaagaggtggccatccgaatttttcaagggtgccagtttcgatccgtagaagccgtgcaagagatcacagagtatgccaaaaatatccctggtttcattaaccttgatttgaatgaccaagtgactctgctcaagtatggtgtccatgagatcatctacacgatgctggcctccctgatgaataaagatggagtcctcatctcagagggccaaggattcatgaccagggagttcctcaaaaacctgcggaagccctttggtgactttatggagcctaagtttgagtttgctgtgaagttcaatgcactggaattagatgacagtgacttggctatatttatagctgtcattattctcagtggagaccgcccaggcttgctgaacgtgaagcccatcgaggacatccaagacaacctgctgcaggccctggaactgcagctcaagctgaatcacccagagtcctctcagctgttcgccaaggtgctccagaagatgacagacctcaggcagatcgtcacagagcacgtgcagctactgcatgtgatcaagaagacagagacagacatgagccttcactag）
配列番号２９は、マウスΔＰＰＡＲγ変異体構築物のアミノ酸配列である。（MVDTEMPFWPTNFGISSVDLSVMEDHSHSFDIKPFTTVDFSSISAPHYEDIPFTRADPMVADYKYDLKLQEYQSAIKVEPASPPYYSEKTQLYNRPHEEPSNSLMAIECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLIYDRCDLNCRIHKKSRNKCQYCRFQKCLAVGMSHNAIRFGRMPQAEKEKLLAEISSDIDQLNPESADLRALAKHLYDSYIKSFPLTKAKARAILTGKTTDKSPFVIYDMNSLMMGEDKIKFKHITPLQEQSKEVAIRIFQGCQFRSVEAVQEITEYAKNIPGFINLDLNDQVTLLKYGVHEIIYTMLASLMNKDGVLISEGQGFMTREFLKNLRKPFGDFMEPKFEFAVKFNALELDDSDLAIFIAVIILSGDRPGLLNVKPIEDIQDNLLQALELQLKLNHPESSQLFAKVLQKMTDLRQIVTEHVQLLHVIKKTETDMSLH）
配列番号３０は、ＧＡＬ４−ビタミンＤレセプター結合タンパク質（ＤＲＩＰ）２０５の核酸配列である。上述のGAL4 配列と後述のＤＲＩＰ２０５の核内レセプター相互作用ドメイン（アミノ酸５７８〜７２８）との融合体である。
配列番号３１は、ＧＡＬ４−ビタミンＤレセプター結合タンパク質（ＤＲＩＰ）２０５のアミノ酸配列である。上述のGAL4 配列と後述のＤＲＩＰ２０５の核内レセプター相互作用ドメイン（アミノ酸５７８〜７２８）との融合体である。
配列番号３２は、ＧＡＬ４−核レセプターコリプレッサー（Ｎ−ＣｏＲ）の核酸配列である。上述のGAL4 配列と後述のＮ−ＣｏＲの核内レセプター相互作用ドメイン（アミノ酸１９９０〜２４１６）との融合体である。
配列番号３３は、ＧＡＬ４−核レセプターコリプレッサー（Ｎ−ＣｏＲ）のアミノ酸配列である。上述のGAL4 配列と後述のＮ−ＣｏＲの核内レセプター相互作用ドメイン（アミノ酸１９９０〜２４１６）との融合体である。
配列番号３４は、ＤＲＩＰ２０５の核レセプター相互作用ドメイン（アミノ酸５７８〜７２８）の核酸配列である。(Y13467) (別名p53 regulatory protein、RB18Aprotein)。
配列番号３５は、ＤＲＩＰ２０５の核レセプター相互作用ドメイン（アミノ酸５７８〜７２８）のアミノ酸配列である。(Y13467) (別名p53 regulatory protein、RB18Aprotein)。
配列番号３６は、Ｎ−ＣｏＲの核レセプター相互作用ドメイン（アミノ酸１９９０〜２４１６）の核酸配列である。(U35312)
配列番号３７は、Ｎ−ＣｏＲの核レセプター相互作用ドメイン（アミノ酸１９９０〜２４１６）のアミノ酸配列である。(U35312)
配列番号３８は、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインの核酸配列である。（Willy, P. J., and Mangelsdorf, D. J. (1997) Genes Dev. 11,289-298を参照）。
配列番号３９は、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列である。（Willy, P. J., and Mangelsdorf, D. J. (1997) Genes Dev. 11,289-298を参照）。
配列番号４０は、ＧＡＬ４応答性ＭＨ１００（ＵＡＳ）×４−ｔｋ−ＬＵＣレポーターの核酸配列である。（Willy, P. J., and Mangelsdorf, D. J. (1997) Genes Dev. 11,289-298を参照）。
配列番号４１は、ＧＡＬ４応答性ＭＨ１００（ＵＡＳ）×４−ｔｋ−ＬＵＣレポーターのアミノ酸配列である。（Willy, P. J., and Mangelsdorf, D. J. (1997) Genes Dev. 11,289-298を参照）。
配列番号４２は、ＰＰＡＲ応答性ＰＰＲＥ×３−ｔｋ−ＬＵＣレポーターの核酸配列である。（Kliewer, S. A., et al(1994) Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 91,7355-7359、Kliewer, S. A., et al (1992) Nature (London) 358, 771-774などを参照）。
配列番号４３は、ＰＰＡＲ応答性ＰＰＲＥ×３−ｔｋ−ＬＵＣレポーターのアミノ酸配列である。（Kliewer, S. A., et al(1994) Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 91,7355-7359、Kliewer, S. A., et al (1992) Nature (London) 358, 771-774などを参照）。
配列番号４４は、ヒト脂肪細胞プロモーターの野生型ルシフェラーゼレポータープラスミドの核酸配列である。Iwaki, M., et al (2003) Diabetes 52, 1655-1663などを参照。
配列番号４５は、ＰＰＲＥ変異体ルシフェラーゼレポータープラスミド［ｐ（−９０８）／ＬＵＣ  ＰＰＲＥ  ｍｕｔ］の核酸配列である。Iwaki, M., et al (2003) Diabetes 52, 1655-1663などを参照。
配列番号４６は、マウスａＰ２のプライマー順方向の核酸配列（マウスａＰ２、５’−ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＧＡ−３’）である。
配列番号４７は、マウスａＰ２のプライマー逆方向の核酸配列（５’−ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＣＣＣ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＣＴ−３’）である。
配列番号４８は、マウスレプチンのプライマー順方向の核酸配列（５’−ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＡＧ−３’）である。
配列番号４９は、マウスレプチンのプライマー逆方向の核酸配列（５’−ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＣＧ−３’）である。
配列番号５０は、マウスアディポネクチンのプライマー順方向の核酸配列（５’−ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＣＣ−３’）である。
配列番号５１は、マウスアディポネクチンのプライマー逆方向の核酸配列（５’−ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＡＴ−３’）である。
配列番号５２は、マウスサイクロフィリンプライマー順方向の核酸配列（５’−ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  Ｔ−３’）である。
配列番号５３は、マウスサイクロフィリンのプライマー逆方向の核酸配列（５’−ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＴＧＣ  ＡＡ−３’）である。
【図１】
2008019169.tif 000009
【図１Ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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