(57)【要約】  特定の抗原結合部分と、１０８及び／又は１１３位でのシステイン置換について操作された、ＣＨ２ドメインを含む抗体Ｆｃ領域とを含む特定の抗原結合メンバー（ＡＢＭ）であって、ナンバリングはＩＭＧＴに従い、抗体Ｆｃ領域は抗原結合ＣＨ３ドメインを含まない、特定の抗原結合メンバー；並びにＡＢＭと、ＣＨ２ドメインの１０８及び１１３位のシステインの一方又は両方に共有結合によりコンジュゲートしている少なくとも１つの異種分子とを含むＡＢＭコンジュゲート（ＡＢＭＣ）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の抗原結合部分と、１０８及び／又は１１３位でのシステイン置換について操作された、ＣＨ２ドメインを含む抗体Ｆｃ領域とを含む、特定の抗原結合メンバー（ＡＢＭ）であって、ナンバリングはＩＭＧＴに従い、抗体Ｆｃ領域は抗原結合ＣＨ３ドメインを含まない、特定の抗原結合メンバー。
【請求項２】
抗原結合部分が前記抗体ＣＨ２ドメインのＮ末端に融合している、請求項１に記載のＡＢＭ。
【請求項３】
ＣＨ２ドメインが、Ｎ１０８Ｃ及び／又はＬ１１３Ｃである１つ又は２つのシステイン置換を含み、ナンバリングがＩＭＧＴに従う、請求項１又は２に記載のＡＢＭ。
【請求項４】
抗原結合部分が、抗体の抗原結合部分、酵素、接着タンパク質、リガンド又は受容体のリガンド結合部分を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＢＭ。
【請求項５】
抗原結合部分が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、及びＣＤＲの少なくとも１つの抗体結合部位を含む１つ又は複数の抗体ドメインからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＢＭ。
【請求項６】
抗原結合部分が、リンカー及び／又はヒンジ領域を介してＣＨ２ドメインのＮ末端に融合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＢＭ。
【請求項７】
ＣＨ２ドメインのＣ末端がＣＨ３ドメインのＮ末端に融合しており、好ましくは、Ｆｃ領域が、抗体重鎖の二量体からなる抗体Ｆｃである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＡＢＭ。
【請求項８】
Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥアイソタイプのもの、好ましくはヒト抗体のものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＡＢＭ。
【請求項９】
モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、及び抗体の抗原結合部分からなる群から選択される抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＡＢＭ。
【請求項１０】
標的細胞の表面上に発現された標的抗原を特異的に認識する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＡＢＭ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡＢＭと、ＣＨ２ドメインの１０８及び１１３位のシステインの一方又は両方に共有結合によりコンジュゲートしている少なくとも１つの異種分子を含むＡＢＭコンジュゲート（ＡＢＭＣ）であって、ナンバリングはＩＭＧＴに従う、ＡＢＭコンジュゲート。
【請求項１２】
異種分子が、好ましくは、医薬品原薬、毒素、放射性核種、免疫調節剤、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、光活性治療剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、ペプチド、脂質、炭水化物、蛍光タグ、可視化ペプチド、ビオチン、血清半減期調節剤、捕捉タグ、キレート剤、及び固体支持体からなる群から選択される、疾患の診断、治癒、緩和、治療、又は予防に適切に使用される物質である、請求項１１に記載のＡＢＭＣ。
【請求項１３】
異種分子が、コンジュゲーションリンカーを介してＣＨ２ドメインの１０８及び１１３位のシステインの一方又は両方にコンジュゲートしており、ナンバリングがＩＭＧＴに従う、請求項１１又は１２に記載のＡＢＭＣ。
【請求項１４】
コンジュゲーションリンカーがマレイミド基を含む、請求項１３に記載のＡＢＭＣ。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡＢＭをコードする１つ又は複数の核酸分子を含む発現系。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現系を含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡＢＭを調製する方法であって、請求項１６に記載の宿主細胞が、前記ＡＢＭを生成する条件下で培養されるか又は維持される、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれかに記載のＡＢＭ、又は請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のＡＢＭＣ、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を非経口製剤中に含む医薬製剤。
【請求項１９】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のＡＢＭＣを生成する方法であって、
ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡＢＭを用意するステップ；及び
ｂ）部位特異的コンジュゲーション法により、ＣＨ２ドメインの１０８及び１１３位のシステインの一方又は両方の少なくとも１つのチオール基を異種分子と反応させるステップ
を含む方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのチオール基が、マレイミド基を含むコンジュゲーションリンカーを使用して、マイケル反応によって前記異種分子と反応する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システイン操作された抗体Ｆｃ領域を含む抗原結合メンバー（ＡＢＭ）、及び１つ又は複数の異種分子がシステインのいずれかにコンジュゲートしているＡＢＭ結合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、治療用抗原結合分子として広く使用されている。基本的な抗体構造について、天然のＩｇＧ１免疫グロブリンを例として用いて、本明細書で説明する。
２本の等しい重鎖（Ｈ）及び２本の等しい軽鎖（Ｌ）が結合して、Ｙ字型の抗体分子を形成する。各重鎖は４つのドメインを有する。アミノ末端可変ドメイン（ＶＨ）は、Ｙ字の先端にある。これらに３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びＹ字の柄の端部に当たるカルボキシ末端側のＣＨ３が続く。短いストレッチであるスイッチ部分が、重鎖可変領域と定常領域を結びつける。ヒンジが、ＣＨ２及びＣＨ３（Ｆｃフラグメント）を残りの抗体（Ｆａｂフラグメント）と結びつける。天然の抗体分子内のヒンジ部分をタンパク質分解切断することにより、１つのＦｃと２つの等しいＦａｂフラグメントが生成され得る。軽鎖は、スイッチにより分けられた２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）から構成される。
【０００３】
ヒンジ領域内のジスルフィド結合は、２本の重鎖を結びつける。軽鎖は、追加のジスルフィド結合により重鎖と連結している。Ａｓｎ結合した炭水化物部分が、免疫グロブリンのクラスに応じて、定常ドメインの異なる位置で結合している。ＩｇＧ１の場合、ヒンジ領域内の２つのジスルフィド結合が、Ｃｙｓ２３５とＣｙｓ２３８の対の間で２本の重鎖を一体化している。軽鎖は、ＣＨ１ドメインにおけるＣｙｓ２２０（ＥＵインデックスのナンバリング）又はＣｙｓ２３３（Ｋａｂａｔによるナンバリング）と、ＣＬドメインにおけるＣｙｓ２１４（ＥＵインデックス及びＫａｂａｔナンバリング）との間の２つの追加のジスルフィド結合によって重鎖にカップリングされる。炭水化物部分が、各ＣＨ２のＡｓｎ３０６に結合して、Ｙ字の柄の部分に特徴的な膨らんだ部分を生成する。
【０００４】
このような特徴は、重要な機能的意義を有する。重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域はいずれも、Ｎ末端領域、すなわちＹ字の「先端部分」にあり、抗原と反応するように配置されている。分子のこの先端部分は、アミノ酸配列のＮ末端が位置する側である。Ｙ字の柄の部分は、エフェクター機能、例えば補体の活性化、及びＦｃ受容体との相互作用、又はＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ等に効果的に関与するように構成される。柄のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクタータンパク質との相互作用を促進するように膨らんでいる。アミノ酸配列のＣ末端は、先端部分とは反対側に位置し、Ｙ字の「根元」と呼ばれる場合もある。
【０００５】
ラムダ（λ）及びカッパ（κ）と呼ばれる２種類の軽鎖が抗体中に見出される。所定の免疫グロブリンは、κ鎖又はλ鎖のいずれか一方を有し、それぞれ１つ有することはない。機能的な差異は、λ又はκの軽鎖を有する抗体の間で見出されない。
【０００６】
抗体分子内の各ドメインは、圧縮された逆平行βバレル内で、相互に緊密にパックされた２つのβシートからなる類似した構造を有する。この保存的構造は、免疫グロブリンフォールドと呼ばれる。定常ドメインの免疫グロブリンフォールドは、４本のストランドからなるシートに対向してパックされた３本のストランドからなるシートを含む。このフォールドは、各シートのβストランド間の水素結合により、内部の対向するシートの残基間の疎水結合により、及びシート間のジスルフィド結合により安定化している。３本のストランドからなるシートは、ストランドＣ、Ｆ、及びＧを含み、また４本のストランドからなるシートは、ストランドＡ、Ｂ、Ｅ、及びＤを有する。文字Ａ〜Ｇは、免疫グロブリンフォールドのアミノ酸配列に沿って、βストランドの連続的な位置を表す。
【０００７】
可変ドメインのフォールドは、４本及び５本のストランドからなる２つのシート内に配置された９本のβストランドを有する。５本のストランドからなるシートは、定常ドメインの３本のストランドからなるシートと構造的に相同であるが、余分なストランドＣ’及びＣ’’を含む。残りのストランド（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）は、定常ドメインの免疫グロブリンフォールド内のカウンターパートと同一のトポロジー及び類似した構造を有する。ジスルフィド結合は、定常ドメインの場合と同様に、対向するシート内のストランドＢとＦとを結びつける。
【０００８】
免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖両方の可変ドメインは、３つの高頻度可変性ループ、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。Ｖドメインの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）は、βバレル構造の一方の端部に密集している。ＣＤＲは、免疫グロブリンフォールドのβストランドＢ−Ｃ、Ｃ’−Ｃ’’、及びＦ−Ｇを結びつけるループである。ＣＤＲ内の残基は、免疫グロブリン分子毎に変化し、各抗体に抗原特異性を付与する。
【０００９】
抗体分子の先端部分に位置するＶＬ及びＶＨドメインは、６個のＣＤＲ（ドメイン毎に３個）が、抗原と特異的結合するための表面（又はキャビティ）を構成する際に協力し合うように、緊密にパックされている。したがって、抗体の天然の抗原結合部位は、軽鎖可変ドメインのストランドＢ−Ｃ、Ｃ’−Ｃ’’、及びＦ−Ｇ、並びに重鎖可変ドメインのストランドＢ−Ｃ、Ｃ’−Ｃ’’、及びＦ−Ｇを結びつけるループから構成される。
【００１０】
天然の免疫グロブリン内のＣＤＲループではない、又はＣＤＲループにより決定される抗原結合ポケットの一部分ではないループ、並びに任意選択的にＣＤＲループ領域内の隣接したループは、抗原結合又はエピトープ結合特異性を有さないが、免疫グロブリン分子及び／又はそのエフェクター全体の正しいフォールディング、又はその他の機能に寄与し、したがって構造的ループと呼ばれる。したがって、本発明によれば「構造ループ」又は「非ＣＤＲループ」は、以下のように理解されるべきである：免疫グロブリンは、いわゆる免疫グロブリンフォールドを有するドメインから作製される。本質的に、逆平行ベータシートはループで接続され、圧縮された逆平行ベータバレルを形成する。可変領域では、ドメインのループの一部が本質的に、抗体の特異性、すなわち抗原への結合に寄与する。これらのループはＣＤＲループと呼ばれる。抗体ドメインの他のすべてのループは、むしろ分子の構造及び／又はエフェクター機能に寄与している。これらのループは、本明細書では構造ループ又は非ＣＤＲループとして定義される。
【００１１】
例えば、抗原に高アフィニティーで特異的に結合する、修飾されたＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、抗原結合Ｆｃフラグメント（Ｆｃａｂ（商標）［ｆ−ｓｔａｒ；抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を有するＦｃフラグメント（Ｗｏｚｎｉａｋ−Ｋｎｏｐｐら、２０１０年）とも呼ばれる］は、例えば、国際公開第２００９／１３２８７６Ａ１号及び国際公開第２００９／０００００６Ａ１号に記載されている。
【００１２】
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供するために、様々な抗体構築物が現在開発中である。
ＡＤＣは、抗体の特異性を薬物の細胞毒性と組み合わせる。したがって、両方の治療効果を向上させる。ＡＤＣは、通常、抗体、リンカー及び細胞毒素からなる。抗体の役割は、薬物の細胞への標的化送達である。特定の場合では、抗原−抗体複合体の効率的な内在化は、ＡＤＣの作用機序に重要である。内在化の後、リンカーの切断が起こり、毒素はその活性型で放出される。その放出前は、毒素は、コンジュゲーションのために不活性であり、したがって、循環中は安定し無害である。
【００１３】
ＡＤＣで現在使用されている細胞毒素は、２つのカテゴリに分類することができる：微小管集合を阻害することにより微小管と相互作用するもの（例えば、メイタンシノイドやオーリスタチン）、及びＤＮＡの副溝に結合し、ＤＮＡ鎖の切断を誘導することにより細胞死を引き起こすもの（例えば、カリケアマイシン）。ミロタグ（Mylotarg）（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ、ゲムツズマブ−オゾガミシン）は、カリケアマイシン誘導体を使用し、急性骨髄性白血病の治療のために米国食品医薬品局によって承認された最初のＡＤＣであった。安全性への懸念及び患者の満足度が不十分なため、２０１０年に市場から撤退した。現在、様々な臨床試験ではいくつかのＡＤＣがある。
【００１４】
典型的には、細胞毒素の初期の放出がそうでなければ非特異的な細胞殺傷をもたらし得るため、循環において安定しているリンカーが使用される。選択されたリンカーは、リソソームで容易に切断可能であり、細胞内に薬物を放出する。現在、リンカーには４つの異なるクラスがある：中性ｐＨ（例えば、血液）で安定であり、酸性環境で加水分解を受ける酸に不安定なヒドラゾンリンカー；グルタチオンの細胞内濃度が高いためにサイトゾルで切断されるジスルフィドベースのリンカー；ペプチド結合により薬物を抗体にコンジュゲートさせ、リソソームプロテアーゼにより放出されるペプチドベースのリンカー；非常に安定しており、細胞内タンパク質分解を通じて薬物を放出することが想定されるチオエーテル含有の非切断性リンカー。
【００１５】
遊離チオール（ＳＨ）基は、鎖間ジスルフィドを部分的に還元することによって、又は部位特異的突然変異誘発を介して新しい表面システインを導入して特定のコンジュゲーション部位を作製することによって導入され得る（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｂｈａｋｔａら、２００８年；Ｖｏｙｎｏｖら、２０１０年）。それにより、反応性チオール基を有する構築物が「ｐｒｅＡＤＣ」として提供される。表面システインの操作は、様々な位置について、国際公開第２０１３／０７０５６５Ａ１号、国際公開第２２０１４／１２４３１６Ａ１号、国際公開第２０１５／１５７５９５Ａ１号及び国際公開第２０１７／１１２６２４Ａ１号に記載されている。
【００１６】
Ｆｃフラグメントの基本的な特性を変えることなく、抗体のシステイン操作を改善する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、薬物コンジュゲーションのために容易に接触可能な反応性チオール基を提供する、改善されたシステイン操作ＡＢＭを提供することである。
本目的は、本発明の主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明によれば、特定の抗原結合部分と、１０８及び／又は１１３位でのシステイン置換について操作された（野生型ＣＨ２ドメインと比較して突然変異又は別の方法で修飾されていると理解される）、ＣＨ２ドメインを含む抗体Ｆｃ領域とを含む特定の抗原結合メンバー（ＡＢＭ）であって、ナンバリングはＩＭＧＴに従う、特定の抗原結合メンバーが提供される。具体的には、ＡＢＭは、特異的抗原結合部分と、ＣＨ２ドメインを含む抗体Ｆｃ領域とを含み、ＣＨ２ドメインは、１０８及び／又は１１３位にシステイン置換を含み、ナンバリングはＩＭＧＴに従う。
【００１９】
具体的には、１つ又は２つのシステインが、天然に存在するアミノ酸をシステインに置換する点突然変異によって、所定の位置でＣＨ２ドメインのＦ−Ｇループに操作される。それにより、１つ又は複数の遊離チオール基がＡＢＭに操作される。
【００２０】
遊離チオール基は、本明細書では、ＡＢＭの他のシステイン残基と対になっていない（架橋されていない）状態であり、キャップされないか、又は細胞培養においてＡＢＭを発現すると細胞培養中に存在し得る、化学物質（ＡＢＭ以外）で、例えばシステイン若しくはグルタチオンによってキャップされ得る、システイン残基のスルフヒドリル（−ＳＨ）官能基として理解される。具体的には、遊離（対になっていない）システイン残基は、部位特異的な標識及び／又は薬物コンジュゲーションのためにＡＢＭに導入される。
【００２１】
指示された位置は、驚くことに、溶媒との相互作用へのアミノ酸残基の曝露を決定する場合に「隠された」又は「埋もれた」にもかかわらず、十分に適切であることが判明した。先行技術では、ある位置の溶媒曝露は、薬物コンジュゲーションのための好ましい接触可能性を示した。
【００２２】
具体的には、抗原結合部分は、抗体の抗原結合部分、又は酵素、接着タンパク質、リガンド若しくは受容体のリガンド結合部分のいずれか１つの結合部位を含み、その結合部位は、結合パートナーの同族の構造に結合することができる。具体的には、抗原結合部分は、天然に存在する受容体の結合部位で構成される。
【００２３】
具体的には、抗原結合部分は、１つ又は複数の抗体可変ドメイン、特にＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらは会合して、３つのＶＨ−ＣＤＲ領域及び３つのＶＬ−ＣＤＲ領域が関与するか又はそれで構成されるＶＨ／ＶＬ結合部位を形成する。
【００２４】
本明細書に記載される特定のＡＢＭは、抗原結合部位を含む抗原結合ＣＨ３ドメインを含み、例えば、少なくとも１つの構造ループ領域の１つ又は複数のアミノ酸配列が修飾され、それにより、抗原のエピトープ、例えば、非修飾ＣＨ３ドメインが有意に結合しない表面抗原に特異的に結合する修飾された構造ループ領域が得られる。構造ループに抗原結合部位を含む抗原結合ＣＨ３ドメインは、抗原結合Ｆｃにおいて、又は抗体の若しくはこのようなＦｃを含む任意の他のＡＢＭの抗原結合Ｆｃ部分において、好ましい特性を有することが示されている。
【００２５】
本明細書に記載される特定のＡＢＭは、抗原結合部位を含む、本明細書に記載される抗原結合Ｆｃからなるか又はそれを含み、例えば、少なくとも１つの構造ループ領域の１つ又は複数のアミノ酸配列が修飾され、それにより、非修飾Ｆｃが有意に結合しないが、抗原、例えば、Ｈｅｒ２等の表面抗原のエピトープに特異的に結合する修飾された構造ループ領域が得られる。構造ループに抗原結合部位を含む抗原結合Ｆｃは、Ｆｃａｂとして、又は抗体若しくはこのようなＦｃを含む任意の他のＡＢＭの抗原結合Ｆｃ部分として好ましい特性を有することが示されている。
【００２６】
本明細書に記載される特定のＡＢＭには、抗原結合ＣＨ３ドメイン又はＦｃを含む抗体、例えば、ＩｇＧ構造を有するもの等の全長抗体が含まれ、これは、１つ又は複数（例えば、２つのみ）の抗原結合ＣＨ３ドメインを含むか、又は野生型ＣＨ３ドメイン（複数可）及びＦｃをそれぞれ置換する抗原結合Ｆｃを含む。例示的な結合メンバーは、ｍＡｂ２（商標）（ｆ−ｓｔａｒ）と呼ばれる完全長の二重特異性抗体である。
【００２７】
好ましい実施形態によれば、抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、抗原結合ＣＨ３、Ｆｃａｂ、及びＣＤＲ又は非ＣＤＲ（又は構造）ループの少なくとも１つの抗体結合部位を含む１つ又は複数の抗体ドメインからなる群から選択される。
【００２８】
具体的には
ａ）抗原結合部分は、上記抗体ＣＨ２ドメインのＮ末端に融合している；及び／又は
ｂ）抗原結合部分は、ＣＨ３ドメイン及び／又はＦｃ領域に含まれる。
【００２９】
具体的には、抗原結合部分は、Ｆｃ領域の構造ループ、特にＦｃ領域に含まれる１つ又は２つのＣＨ３ドメインのＣ末端構造ループに含まれる。
特定の実施形態によれば、抗原結合部分は、抗原結合Ｆｃに含まれるか、又は抗原結合Ｆｃを含む完全長の多価若しくは二重特異性抗体に含まれる。
【００３０】
具体的には、抗原結合部分は、リンカー及び／又はヒンジ領域を介してＣＨ２ドメインのＮ末端に融合している。具体的には、ヒンジ領域は、天然に存在する免疫グロブリンのヒンジ領域である、アミノ酸配列で構成される任意のペプチドヒンジ領域である。具体的には、ヒンジ領域は、例えば、配列番号７として同定されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるヒト免疫グロブリンのものである。
【００３１】
本明細書に記載されるＡＢＭにおいて、抗体ドメインの結合は、特に、組換え融合又は化学結合による。特定の結合は、１つのドメインのＣ末端と別のドメインのＮ末端との結合を介し得るが、この場合、例えば末端領域内の１つ又は複数のアミノ酸残基がドメインサイズを短縮するために除去される、又はドメインの可撓性を高めるために延長される。
【００３２】
具体的には、例えば少なくとも１、２、３、４、又は５、最大６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸を除去するなどして、Ｃ末端及び／又はＮ末端領域において欠損を含む、短縮したドメイン配列を使用することができる。
【００３３】
具体的には、例えば、少なくとも１、２、３、４、又は５個のアミノ酸、最大１０、１５、又は２０個のアミノ酸を含む、アミノ酸配列で構成されるペプチドリンカー等の、免疫グロブリンのリンカー若しくはヒンジ領域、又はヒンジ領域の少なくとも一部である連結配列を使用することができる。連結配列は、本明細書において「接合部」とも呼ばれる。ドメインは、リンカーによって、例えば、ドメイン間の天然の接合部を含むように、ドメインに隣接して天然に位置する抗体ドメインのＮ末端又はＣ末端領域に由来するアミノ酸配列を介して伸長され得る。或いは、リンカーは、ヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含有し得る。しかしながら、リンカーは同様に人工的な配列であり得、例えば、好ましくは５〜２０個のアミノ酸の長さ、好ましくは８〜１５個のアミノ酸の長さを有する、連続したＧｌｙ及び／又はＳｅｒアミノ酸からなり得る。
【００３４】
具体的には、ＣＨ２ドメインのＣ末端は、ＣＨ３ドメインのＮ末端に融合しており、好ましくは、Ｆｃ領域は、抗体重鎖の二量体からなる抗体Ｆｃに含まれる。
具体的には、Ｆｃ領域は、２つのＣＨ２ドメイン及び２つのＣＨ３ドメインで構成される抗体のＦｃ部分（本明細書では「抗体Ｆｃ」又は「Ｆｃ」と呼ばれる）に含まれ、ＣＨ３ドメインに融合しているＣＨ２ドメインの第１の鎖は、ＣＨ３ドメインに融合したＣＨ２ドメインの第２の鎖と二量体を形成している。
【００３５】
Ｆｃ領域は、具体的に、それぞれがＣＨ２−ＣＨ３抗体ドメインの鎖を含むことによって特徴付けられるＦｃ鎖の二量体によって特徴付けられ、その二量体はホモ二量体又はヘテロ二量体であり得、第１のＦｃ鎖は、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの点突然変異において第２のＦｃ鎖と異なる。
【００３６】
具体的には、ＦｃのＣＨ２ドメインの一方又は両方は、１０８及び／又は１１３位でのシステイン置換の一方又は両方を含むように操作されたシステインであり、ナンバリングはＩＭＧＴに従う。具体的には、Ｆｃは、各ＣＨ２ドメインにシステイン置換の一方又は両方を含み、その結果、Ｆｃは、１、２、３、又は４つの遊離チオール基のみを含む。
【００３７】
具体的には、抗原結合部分は、Ｆｃ又はＦｃ領域、特にＣＨ２ドメインのＮ末端、又は抗原結合部分をＣＨ２ドメインに連結するヒンジ領域に融合している。
特定の実施形態によれば、抗原結合部分は、Ｆｃ領域内に、例えば、「構造ループ領域」と理解される、ＣＨ３ドメインのＣ末端ループ領域内に組み込まれる。
【００３８】
特定の例によれば、抗原結合部分は、Ｆｃａｂの抗原結合部位である。具体的には、Ｆｃａｂは、１つ又は２つの抗原結合部分を含む。具体的には、Ｆｃａｂは、２つの抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分は、第１のＣＨ３ドメインのＣ末端構造ループ領域に組み込まれ、第２の抗原結合部分は、第２のＣＨ３ドメインのＣ末端構造ループ領域に組み込まれる。
【００３９】
さらに、Ｆｃａｂは、１つ又は複数の抗原結合部分を含む構築物の一部であり得、例えば、２つの抗原結合部分であって、第１のものは、第１のＣＨ２−ＣＨ３鎖のＮ末端に、例えば、リンカー又はヒンジ領域を介して融合し、第２のものは、第２のＣＨ２−ＣＨ３鎖のＮ末端に、例えば、リンカー又はヒンジ領域を介して融合している抗原結合部分の一部であり得る。
【００４０】
具体的には、ＡＢＭは、抗原結合Ｆｃ（特にＦｃａｂ）、又は抗原結合Ｆｃを含む完全長の多価若しくは二重特異性抗体（特にｍＡｂ２）である。
特定の例によれば、ＡＢＭは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥのいずれか１つの構造を有する完全長免疫グロブリンであり、ＦｃはＦｃａｂに交換されている。それにより、ＡＢＭは、３つ、４つ、又は少なくとも３つ若しくは４つの抗原結合部分、及び任意選択に２つ、３つ又はそれを超える異なる抗原結合特異性を含む。
【００４１】
特定の実施形態では、ＡＢＭは、完全長の多価又は二重特異性抗体であり、
ｉ）各々が１つの抗原結合部位（例えば、各々が抗体のＦａｂアームである）を有する２つの抗原結合部分であって、抗原結合部位の各々がＣＤＲループで構成される抗原結合部位；
ｉｉ）１つ又は２つの抗原結合部位を含む１つの抗原結合部分（例えば、１つ又は２つのＣＨ３ドメインに抗原結合部位を含む抗原結合Ｆｃ）であって、抗原結合部位の各々が非ＣＤＲループで構成される抗原結合部分
を含む。
【００４２】
具体的には、ＡＢＭは、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体の抗原結合部分、Ｆｃａｂ分子、及びＦｃａｂ分子を含む抗体からなる群から選択される抗体である。具体的には、ＡＢＭは、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。具体的には、ＡＢＭは、ヒト抗体、特にヒトＩｇＧ抗体であり、これは本明細書に記載されるようにＣＨ２ドメインに点突然変異を導入するために修飾され、任意選択的にさらに修飾して１つ又は複数の追加の抗原結合部位を導入する。
【００４３】
具体的には、ＡＢＭは、二重特異性又は多重特異性であり、２つ以上の異なる抗原を特異的に認識し、特定の抗原は１つ、２つ又はそれを超える抗原結合部分によって認識される。具体的には、ＡＢＭは、二価又は多価であり、抗原はそれぞれ２つ以上の抗原結合部分によって特異的に認識される。
【００４４】
具体的には、ＡＢＭは、２つ以上の抗原が抗原結合部分の１つの交差特異的結合部位によって特異的に認識される交差反応性である。
具体的には、ＡＢＭはモノクローナル抗体である。具体的には、組換え技術によって操作されて、モノクローナル抗体を発現する、宿主細胞の細胞株を培養することにより得られるモノクローナル抗体の調製物が提供される。
【００４５】
特定の実施形態によれば、ＣＨ２ドメインは、Ｎ１０８Ｃ及び／又はＬ１１３Ｃである１つ又は２つのシステイン置換を含み、ナンバリングはＩＭＧＴに従う。
具体的には、ＣＨ２ドメインは、哺乳動物種、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、ラクダ、ラマ、ウシ若しくはウマのものであり、又はトリ種、例えば、ニワトリのものである。
【００４６】
特に、ＣＨ２ドメインは、所定の位置に操作された１つ又は２つのシステインの他に、天然に存在するアミノ酸配列からなる野生型ＣＨ２ドメインであり、それにより人工生成物が得られる。
【００４７】
具体的には、ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥアイソタイプのいずれか１つ、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体のいずれかの免疫グロブリンのものであり、好ましくはヒト抗体のものである。
【００４８】
具体的には、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１のものであり、Ｎ１０８Ｃ及び／又はＬ１１３Ｃである１つ又は２つのシステイン置換を含み、ナンバリングはＩＭＧＴに従う。
【００４９】
具体的には、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１のものであり、Ｎ３２５Ｃ及び／又はＬ３２８Ｃである１つ又は２つのシステイン置換を含み、ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。
【００５０】
具体的には、ＣＨ２ドメインは、配列番号１、２若しくは３のいずれかとして同定されたアミノ酸配列、又は配列番号１、２若しくは３のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００５１】
ＣＨ２ドメインの機能的変異体は、特定の程度の配列同一性によって特に特徴付けられる。例えば、天然に存在する配列に対して、例えば少なくとも９０％又は少なくとも９５％は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＥ構造、特にヒトＩｇＧ１構造におけるそれぞれのドメインの構造に似ている抗体ドメインのベータバレル構造によって特徴付けられる。
【００５２】
具体的には、天然に存在する配列に１つ又は複数の点突然変異、好ましくは最大１０個の点突然変異、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の点突然変異を含む、ＣＨ２ドメインの機能的に活性な改変体を使用することができる。
【００５３】
具体的には、Ｆｃ又はＦｃ領域は、哺乳動物種、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、ラクダ、ラマ、ウシ若しくはウマのものであり、又はトリ種、例えば、ニワトリのものである。
【００５４】
特に、Ｆｃ領域は、所定の位置でＣＨ２に操作された１つ又は２つのシステインの他に、天然に存在するアミノ酸配列からなる野生型ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン配列を含み、それにより人工生成物が得られる。
【００５５】
具体的には、Ｆｃ又はＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥアイソタイプのいずれか、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体のいずれかの免疫グロブリンのものであり、好ましくはヒト抗体のものである。
【００５６】
具体的には、１つのＣＨ２及び１つのＣＨ３ドメインで構成されるＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１のものであり、Ｎ１０８Ｃ及び／又はＬ１１３ＣであるＣＨ２ドメインに１つ又は２つのシステイン置換を含み、ナンバリングはＩＭＧＴに従う。
【００５７】
具体的には、１つのＣＨ２及び１つのＣＨ３ドメインで構成されるＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１のものであり、ＣＨ２ドメインに１つ又は２つのシステイン置換を含み、これは、Ｎ３２５Ｃ及び／又はＬ３２８Ｃであり、ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。
【００５８】
具体的には、Ｆｃ領域は、配列番号４、５若しくは６のいずれかとして同定されるアミノ酸配列、又は配列番号４、５若しくは６のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００５９】
Ｆｃ領域の機能的変異体は、例えば、特定の程度の配列同一性によって特に特徴付けられる。例えば、天然に存在する配列と、例えば少なくとも９０％又は少なくとも９５％は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＥ構造、特にヒトＩｇＧ１構造におけるそれぞれのドメインの構造に類似しているＣＨ２及びＣＨ３抗体ドメインのベータバレル構造によって特に特徴付けられる。
【００６０】
具体的には、Ｆｃ領域に含まれるＣＨ２及びＣＨ３ドメインの一方又は両方の天然に存在する配列に１個以上の点突然変異、好ましくは最大１０個の点突然変異、特に、抗体ドメインＣＨ２及びＣＨ３の一方又は両方に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の点突然変異のいずれかを含む、Ｆｃ領域の機能的に活性な変異体を使用することができる。
【００６１】
特定の実施形態によれば、ＡＢＭは、特に１つ又は複数の抗原結合部分を介して、標的細胞の表面上に発現される標的抗原を特異的に認識する。このような表面抗原は、抗原に結合すると、ＡＢＭ又は上記ＡＢＭに連結された任意の異種部分と反応するように標的化された、哺乳動物細胞のいずれか、特にヒト細胞である標的細胞の表面に特異的にある。
【００６２】
具体的には、標的抗原は、受容体を含む細胞表面抗原から、特にｅｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ（例えば、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ等のＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４）からなる群から選択される。加えて、さらなる抗原、例えば、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの分子、例えば、Ａｐｏ−１受容体、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、神経成長因子受容体ＮＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ受容体、Ｔ細胞表面分子、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞抗原、Ａｐｏ−３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、デコイ受容体、例えば、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ−５、ＮＴＲ−１、ＴＮＦＬ１、ＩＧＦＲ−１、ｃ−Ｍｅｔ（これらの分子に限定されない）、Ｂ細胞表面抗原、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＤＣ−ＳＩＧＮ、固形腫瘍又は血液癌細胞、リンパ腫若しくは白血病の細胞、血小板を含む他の血液細胞の抗原又はマーカー（これらの分子に限定されない）を標的とすることができる。
【００６３】
特定の例によれば、表面抗原は、受容体チロシンキナーゼ（ＥｒｂＢファミリー）からなる群から選択される。
具体的には、ＡＢＭは、標的細胞への結合時に内部化している。特定の例によれば、内在化するＡＢＭは、受容体チロシンキナーゼ（ＥｒｂＢファミリー）からなる群から選択される抗原を特異的に認識する。標的細胞への結合時のＡＢＭの内在化は、例えば、フローサイトメトリー、放射標識抗体研究、画像分析、又は抗体薬物コンジュゲートを使用する細胞毒性アッセイを含む標準的な技術によって決定される。
【００６４】
具体的には、ＡＢＭは、ＶＨ／ＶＬドメイン対で構成される機能的な抗原結合部位を含み、高いアフィニティーと１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍのいずれよりも低いＫＤで標的に結合することができる。具体的には、ＡＢＭは、２つの異なる抗原を標的とする二重特異性抗体又はヘテロ二量体抗体であり、抗原の各々は、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍのいずれかよりも低いＫＤで抗体により認識される。
【００６５】
具体的には、ＡＢＭは、少なくともＥＧＦＲを標的とする単一特異性又は二重特異性抗体である。特定の例によれば、抗体は、セツキシマブ（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）である。
【００６６】
具体的には、ＡＢＭは、二重特異性又は多重特異性抗体であり、第１の標的はＣＤ３、ＣＤ１６又はＨｅｒ２ｎｅｕのいずれかであり、第２の標的はＥＧＦＲである。
具体的な実施形態によれば、ＡＢＭは、２つの異なるＦａｂアームを含み、これにより、それぞれが特異的な結合特性を有する２つの異なるＦｖ構造を提供する。具体的には、ＡＢＭは、２つの異なる抗原又は抗原の２つの異なるエピトープを標的とするヘテロ二量体又は二重特異性抗体である。
【００６７】
具体的には、ＡＢＭは、二重特異性全長免疫グロブリン等の、異なる抗原又はエピトープを認識する第１及び第２のＦａｂアームを含むヘテロ二量体又は二重特異性抗体である。
【００６８】
例えば、本明細書に記載されるＡＢＭにおいて使用される抗原結合部分は、ＶＨ−ＣＨ１ドメイン配列からなる重鎖（ＨＣ）及びＶＬ−ＣＬ（カッパ又はラムダ）ドメイン配列からなる軽鎖（ＬＣ）の二量体であるＦａｂアームであって、ジスルフィドブリッジの有無にかかわらず、ヒンジドメイン及び／又はリンカー配列は抗体ドメインを接続する。Ｆａｂアームは、典型的には、抗体から切断された場合のＦａｂフラグメント（又はＦａｂ部分）として理解される。Ｆａｂアームは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの対形成によって形成された唯一の抗原結合部位によって具体的に特徴付けられ、単一特異的及び一価的にのみ標的に結合することができる。
【００６９】
特定の態様によれば、本明細書に記載されるＡＢＭは、ＨＣがＦｃ領域に二量体化する、各々がＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む２つの異なるＨＣ、及び任意選択的にＣＨ４ドメインを含むヘテロ二量体抗体である。
【００７０】
具体的には、ＡＢＭは、ヘテロ二量体Ｆｃ又はＦｃ領域を含み、第１のＦｃ鎖は、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの点突然変異において第２のＦｃ鎖と相違する。
【００７１】
具体的には、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、
ａ）ヒトＩｇＡ及びＩｇＧ  ＣＨ３配列の交互セグメントから構成される鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体；
ｂ）１つ若しくは複数のノブ若しくはホール突然変異、好ましくはＴ３６６Ｙ／Ｙ４０７’Ｔ、Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４’Ｗ、Ｔ３６６Ｙ：Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４‘Ｗ：Ｙ４０７’Ｔ、Ｔ３６６Ｗ／Ｙ４０７’Ａ及びＳ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９’Ｃ：Ｔ３６６’Ｓ：Ｌ３６８’Ａ：Ｙ４０７’Ｖのいずれか；
ｃ）第２のＣＨ３ドメインのシステイン残基に共有結合し、これによりドメイン間ジスルフィド架橋が導入され、好ましくは両方のＣＨ３ドメインのＣ末端を連結する、第１のＣＨ３ドメインのシステイン残基；
ｄ）反発性の電荷がヘテロ二量体の形成を抑制する１つ若しくは複数の突然変異、好ましくはＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９’Ｋ、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９’Ｒ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９’Ｋ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９’Ｒ、Ｋ４０９Ｄ：Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９’Ｋ：Ｅ３５６’Ｋ又はＫ４０９Ｄ：Ｋ３９２Ｄ：Ｋ３７０Ｄ／Ｄ３９９’Ｋ：Ｅ３５６’Ｋ：Ｅ３５７’Ｋのいずれか；並びに／又は
ｅ）ヘテロ二量体形成及び／若しくは熱安定性のために選択された１つ若しくは複数の突然変異、好ましくはＴ３５０Ｖ：Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ：Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｌ：Ｔ３９４Ｗ、
Ｔ３５０Ｖ：Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ：Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、
Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、
Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、又は
Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｔ３９４Ｗのいずれか、
のうちの１つ又は複数を導入するように操作されている及び／又はこれにより特徴付けられる２つのＣＨ３ドメインを含み、
但し、ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく。
【００７２】
このようなＣＨ３突然変異は、好ましくは互いに対形成する２つの異なるＦｃ鎖及びＨＣ（少なくとも異なるＣＨ３ドメインの配列によって異なる）をそれぞれ産生するように操作されて、これによりＦｃ鎖又はＨＣのヘテロ二量体を得て、ＨＣホモ二量体、すなわち同じ配列の２つのＨＣの二量体を産生する傾向を実質的に低下させる。
【００７３】
本明細書に記載するＣＨ３点突然変異を規定する際には、「スラッシュ」は、各対の一方の鎖又は一方のドメイン上の点突然変異を、他方の鎖又は他方のドメインに由来する点突然変異から区別する；アミノ酸位置のナンバリングにおける「インデント」は、ヘテロ二量体の第２の鎖又は二量体を意味する。「コロン」は、複数ある鎖又はドメインのうちの１つの鎖又はドメイン上の点突然変異の組み合わせを、それぞれ特定する。
【００７４】
上記のように、ヘテロ二量体形成のために選択された突然変異、又はＶｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎら（Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、第５巻、５号、２０１３年、６４６〜６５４頁）の開示による更なる突然変異のいずれも利用可能である。
【００７５】
好ましくは、（ｉ）ノブ突然変異；又は（ｉｉ）ホール突然変異、又は（ｉｉｉ）ノブ及びホール突然変異が１つの鎖又はドメイン上に改変され、またカウンターパートの（ｉ）ホール突然変異、又は（ｉｉ）ノブ突然変異、又は（ｉｉｉ）ホール及びノブ突然変異が、ヘテロ二量体の他方の鎖上で改変される。
【００７６】
具体的には、１つ又は２つの操作されたＣＨ３ドメインを含む１対のＣＨ３ドメインは、１を超える（追加の）ドメイン間のジスルフィド架橋を含み得、例えば、２つ又は３つが２つのＣＨ３ドメイン対を接続する。
【００７７】
具体的には、異なる突然変異（上記ａ）に基づく）が、ＣＨ３ドメインの各対の両ＣＨ３ドメインにおいて、同種の（マッチングする）対を生成するために改変されるが、この場合、一方のドメインは、βシート領域内に接触表面の立体修飾を含むが、そのような接触表面は、相補的な立体修飾を通じて他方のドメインの各接触表面と選好的に結合する。そのような立体修飾は、例えば、「ノブ」又は「ホール」構造を生成するような、異なるアミノ酸残基及び側鎖に主に起因し、「ノブ・イントゥ・ホール」二量体を形成する相補性を有する。
【００７８】
特定の態様によれば、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの各々は、配列番号８（ヒト野生型ＩｇＧ１  ＣＨ３）として同定されるアミノ酸配列を有するＩｇＧ型、又は配列番号８の機能的変異体でのものであって、これは、少なくとも２アミノ酸長の少なくとも１つのベータ鎖ＩｇＡセグメントを組み込むことによって鎖交換を得るように設計され、Ｆｃ領域は、好ましくは、第１のＣＨ３ドメインのＩｇＡセグメントと第２のＣＨ３ドメインのＩｇＡセグメントとの対形成を介してＣＨ３ドメインの同族対を含む。鎖交換されたＣＨ３の特定の例によれば、ＡＧ鎖を含む最初のＣＨ３ドメインは、配列番号９として同定されるアミノ酸配列によって特徴付けられ；ＧＡ鎖を含む合致する第２のＣＨ３ドメインは、配列番号１０として同定されるアミノ酸配列によって特徴付けられる。
【００７９】
そのようなストランド交換ＣＨ３ドメインは、例えばそれぞれ異なる位置に配置し、そして非ＩｇＡセグメント、例えばＩｇＧセグメントにより互いに分離している少なくとも１、２、３、４、又は５個の異なるＩｇＡセグメントを組み込む、ＩｇＡアミノ酸配列及びＩｇＧアミノ酸配列の交互に反復したセグメントを特に含み得る。
【００８０】
具体的な態様によれば、ＡＢＭは、任意選択的にＦｃ領域において、Ｆｃガンマ受容体結合部位及び／又はＣ１ｑ結合部位を含むエフェクター機能コンピテント抗体である。
具体的には、抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性のいずれかにより特徴付けられる。
【００８１】
さらに、特に好ましい態様によれば、ＡＢＭは、Ｆｃガンマ受容体及び／又はＣ１ｑへの結合を欠いているＦｃ領域を含むエフェクター陰性（ＥＮ）抗体である。
具体的には、抗体は、エフェクター欠損性であり（本明細書では、エフェクター陰性とも呼ばれる）、Ｆｃ領域を介したＦｃγ受容体又はＣＤ１６ａとの結合は実質的に低下又は欠損している。
【００８２】
具体的には、エフェクター陰性抗体は、ヒトＩｇＧ２のＣＨ２配列、又は改変されたその変異体により特徴付けられ、例えば「ＶＨ（１）−ＣＨ３＿ＫＮＯＢ（Ｔ３６６Ｙ）−ＣＨ２ＥＮ−ＣＨ３ＡＧ」（配列番号１５）で用いられるような、Ｃ末端側ＣＨ３ドメインのＮ末端に融合した（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく）、米国特許第８５６２９８６号に記載の修飾型ヒトＩｇＧ２のＣＨ２ドメイン（Ｆ２９６Ａ、Ｎ２９７Ｑ）を含む。
【００８３】
具体的には、ＥＮ抗体は、実質的に低下したＡＤＣＣ及び／若しくはＣＤＣを有する、又は一切有さない。
具体的には、ＡＢＭは、もしあれば、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインに位置するｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合部位を含む。具体的には、ＡＢＭは、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとのインタージャンクションのＦｃＲｎ結合部位を含む抗体のＦｃ部分を含む。具体的には、ＦｃＲｎ結合部位は、ｐＨ依存的に１０−４Ｍ未満、又は１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、若しくは１０−８Ｍ未満のＫＤでＦｃＲｎに結合するアフィニティーを有する。
【００８４】
具体的には、ｐＨ依存性にＦｃＲｎと結合する結合アフィニティーは、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）における同結合アフィニティーと比較して、ｐＨ５〜６において、少なくとも１対数、好ましくは少なくとも２対数、又は３対数増加している。
【００８５】
更なる態様によれば、ＡＢＭは、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合を変化させるために改変される。例えば、少なくとも１つのヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインは、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合を低下させるためにＦｃＲｎ結合部位に少なくとも１つの突然変異、具体的にはＨ４３３Ａ若しくはＨ４３５Ａ突然変異の少なくとも１つ、又はＨ４３３ＡとＨ４３５Ａ突然変異の両方を含むように操作され、ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる。ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合の低下は、ｐＨ依存性にＦｃＲｎと結合する結合アフィニティーが、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）における同結合アフィニティーと比較して、ｐＨ５〜６において１対数を超えて低い、好ましくはほぼ同等又はそれ以下であり得る。
【００８６】
具体的な実施形態とは、本明細書に例示するＡＢＭのいずれか、又は実施例セクションに記載する重鎖及び軽鎖のいずれか、若しくは重鎖及び軽鎖の対のいずれかを含む抗体のいずれかを意味する。具体的には、本明細書に記載するＡＢＭは、実施例セクションに記載する重鎖及び軽鎖を含み得る、又はそれから構成され得る。
【００８７】
本発明はさらに、本明細書に記載されるＡＢＭと、ＣＨ２ドメインの１０８及び１１３位のシステインの一方又は両方に共有結合によりコンジュゲートしている少なくとも１つの異種分子を含むＡＢＭコンジュゲート（ＡＢＭＣ）であって、ナンバリングはＩＭＧＴに従う、ＡＢＭコンジュゲートを提供する。具体的には、ＡＢＭＣは、システインが連結したＡＤＣである。
【００８８】
具体的には、ＡＢＭ：異種分子（薬物）の化学量論比は、１：２〜１：４の範囲である。
具体的には、遊離システインとの反応による巨大分子への薬物のバイオコンジュゲーションに一般的に使用されるコンジュゲーション化学法が使用される。システイン残基は、マレイミド誘導体等のα−ハロケトン又はマイケル受容体とシステイン残基を反応させることにより、特異的にアルキル化される。具体的には、ＡＢＭの遊離チオール基のいずれか又は各々が反応して、マイケル付加と呼ばれる反応によって異種分子を共有結合する。具体的には、チオールをマレイミド基と反応させて、チオール−マレイミド付加物（Ｍｉｃｈａｅｌ付加物）を生じさせることができる。
【００８９】
非架橋の高反応性システインアミノ酸との反応を介して抗体を１つ又は複数の薬物部分とコンジュゲートさせる適切な方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第７，５２１，５４１Ｂ２号に記載されている。
【００９０】
具体的には、ＡＢＭの遊離システインは、同じＡＢＭ分子の別のシステインと対形成しないため、ＡＢＭ内で架橋されないか、又はＡＢＭ分子内ジスルフィド架橋の一部ではない。
【００９１】
具体的には、ＡＢＭの遊離システインは、他のチオールを有する分子（同じＡＢＭ分子以外）、例えば、細胞培養におけるＡＢＭの組換え発現後に存在し得る非結合システイン又はグルタチオンに結合する。このようなチオール結合は、チオール反応性試薬との反応を妨げる「チオールキャップ」として理解され、好ましくは、ＴＣＥＰ（トリス−（２−カルボキシエチル）−ホスフィン）等の還元剤で抗体を還元することにより除去される。
【００９２】
本明細書で使用される「還元剤」という用語は、別の化学種に電子を提供する化学種を指す。例示的な還元剤には、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、並びにそれらの関連する塩（例えば、ＴＣＥＰ−塩酸塩）が含まれる。
【００９３】
還元剤による処理は、通常、抗体の鎖間ジスルフィド結合を還元する。したがって、酸化剤（例えば、デヒドロアスコルビン酸）を使用する再酸化ステップは、好ましくは還元ステップに続く。還元ステップと酸化ステップの間に精製ステップを含めることができる。再酸化された抗体は、典型的には、非常に反応性の高いシステインアミノ酸である遊離システイン（複数可）を含む。
【００９４】
本明細書で使用される「酸化剤」という用語は、一対の遊離チオールのジスルフィド結合への変換を引き起こす化合物を指す。酸化剤の例には、例えば、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）、及び硫酸銅（ＣｕＳＯ４）が含まれる。「再酸化ステップ」は、一対の遊離チオールをジスルフィド結合に変換させるために行われる肯定的なステップである。肯定的なステップには、外因性の酸化剤の導入及び／又は自動酸化を可能にするための意図的な保持期間が含まれる。
【００９５】
チオール反応性マレイミドの代替として、ジスルフィド架橋は、システインのチオール基を、スルフヒドリル基を有するリンカーで酸化することによって得ることができる。
α、β−不飽和カルボニル化合物及びα、β−不飽和ニトリルと、エノレートイオン及びエナミン等の共鳴安定化された炭素求核試薬との１，４−付加反応は、マイケル付加として公知である。マイケル付加を受けるα，β−不飽和化合物は、マイケル受容体、求核試薬マイケル供与体、及び生成物マイケル付加物と呼ばれる。
【００９６】
したがって、本発明は、ＡＢＭの部位特異的突然変異を介して、部位特異的な化学的コンジュゲーションによって、又はＡＢＭにおける遺伝子操作された部位によって、異種分子の部位特異的コンジュゲーションを提供する。
【００９７】
特定の実施形態によれば、異種分子は、好ましくは、医薬品原薬、毒素、放射性核種、免疫調節剤、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、例えばＬ−アスパラギナーゼ、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、光活性治療剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、ペプチド、脂質、炭水化物、蛍光タグ、可視化ペプチド、ビオチン、血清半減期調節剤、捕捉タグ、キレート剤、及び固体支持体からなる群から選択される、疾患の診断、治癒、緩和、治療、又は予防に適切に使用される物質である。
【００９８】
具体的には、異種分子は、色素、放射性同位元素、又は細胞毒素のいずれかである。特定の例には、蛍光タンパク質、色素のコンジュゲーション、又は機能性分子、例えば、ＰＥＧ、ポルフィリン、ペプチド、ペプチド核酸、及び薬物との連結（tethering）が含まれる。
【００９９】
特定の例は、細胞の、例えば、癌細胞又は腫瘍細胞の生理学的機能を妨害する任意の人工若しくは生物学的な化合物又は分子である異種分子を指す。ＡＢＭに連結され得る薬物には、細胞増殖抑制剤又は細胞毒性剤が含まれ得る。例えば、ＡＢＭへの共有結合によるカップリングに使用され得る細胞増殖抑制剤には、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗生物質、有糸分裂阻害剤、ホルモン、又はホルモンアンタゴニストが含まれる。アルキル化剤は、例えば、ブスルファン（ミレラン（Myleran））、カルボプラチン（パラプラチン（Paraplatin））、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（シトキサン（Cytoxan））、ダカルバジン（DTIC-Dome）、リン酸エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード（Nitrogen Mustard））、メルファラン（フェニルアラニンマスタード）、プロカルバジン、チオテパ（Thiotepa）、ウラシルマスタードが含まれ得る。代謝拮抗薬には、例えば、クラドリビン、シタラビン（シトシンアラビノシド）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ、５−フルオロデオキシウリジン）、フルダラビン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、メトトレキサート（アメトプテリン）、６−チオグアニン、ペントスタチン、ピボブロマン、テガフール、トリメトレキサート、グルクロン酸塩が含まれ得る。抗生物質には、例えば、アクラルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、プリカマイシン（ミトラマイシン）が含まれ得る。又は有糸分裂阻害剤には、例えば、エトポシド（ＶＰ−１６、ＶｅＰｅｓｉｄ）、テニポシド（ＶＭ−２６、Ｖｕｍｏｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ホルモンが含まれ得て、又はホルモンアンタゴニストには、例えば、ブセレリン、コンジュゲートウマエストロゲン（プレマリン（Premarin））、コルチゾン、クロロトリアセン（Ｔａｃｅ）、デキサメタゾン（デカドロン（Decadron））、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、エチニルエストラジオール（エスチニル（Estinyl））、フルオキシメステロン（ハロテスチン（Halotestin））、フルタミド、ゴセレリンアセテート（ゾラデクス（Zoladex））、ヒドロプロゲステロンカプロエート（デラルチン（Delalutin））、ロイプロリド、酢酸メドロキシプロゲステロン（プロベラ（Provera））、メゲストロールアセテート（メガエース（Megace））、プレドニゾン、タモキシフェン（ノルバデクス（Nolvadex））、テストラクトン（Ｔｅｓｌａｃ）、テストステロンが含まれ得る。上記に開示されたもの等の細胞増殖抑制性又は抗腫瘍性化合物は、先行技術において公知であり、例えば、Ｄ．Ｓ．Ｆｉｓｃｈｅｒ及びＴ．Ｍ．Ｋｎｏｂｆ（１９８９年）、Ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ（３版）．Ｃｈｉｃａｇｏ：Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒｓ（Ｓｐｒｉｎｇ、１９９２年）、Ｃｏｍｐｅｎｄｉａ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤに見出すことができる。
【０１００】
具体的には、異種分子は、コンジュゲーションリンカーを介して、ＣＨ２ドメインの１０８及び１１３位のシステインの一方又は両方にコンジュゲートしており、ナンバリングはＩＭＧＴに従う。このようなコンジュゲーションリンカーはまた、異種分子にコンジュゲートしているスペーサーとして理解される。典型的には、リンカーは、ＡＢＭと反応する前に異種分子に共有結合される。
【０１０１】
具体的には、コンジュゲーションリンカーはマレイミド基を含む。
具体的には、コンジュゲーションリンカーは、切断可能な又は切断不可能なリンカーである。具体的には、リンカーは、ＡＢＭを異種分子又は原薬に接続又は連結する、合成又は人工のアミノ酸配列である。
【０１０２】
具体的には、低ｐＨ、高グルタチオン濃度、及び／又はタンパク質分解切断等の生理学的刺激への応答として切断される切断可能なリンカーが使用される。特定の切断可能なリンカーは、プロテアーゼ、酸によって、又はジスルフィド体の還元（例えば、グルタチオン媒介性又はグルタチオン感受性）によって切断される。例えば、切断可能なリンカーは、バリン−シトルリンリンカー、ヒドラゾンリンカー、又はジスルフィドリンカーを含み得る。
【０１０３】
具体的には、切断不可能なリンカーが内在化ＡＢＭと組み合わせて使用される。このような場合、ＡＢＭＣは内在化後のリソソーム内での分解に依存する。特定の切断不可能なリンカーは、ＭＭＡＦ（ｍｃ−ＭＭＡＦ）へのマレイミドカプロイルリンカー、Ｎ−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＭＣＣ）、又はメルカプト−アセトアミドカプロイルリンカーを含む。
【０１０４】
本発明はさらに、本明細書に記載されるＡＢＭをコードする１つ以上の核酸分子、特に単離された核酸分子を含む発現系を提供する。各々がアミノ酸配列で構成される異なる鎖の数に応じて、１つ又は複数の発現ベクターに含まれる１つ又は複数の発現カセットを含む、１つ又は複数のコード核酸分子を発現系で使用することができる。
【０１０５】
具体的には、上記発現カセットは、本明細書に記載される核酸を含むか又は組み込むプラスミドに組み込まれ、発現カセットは、任意選択的に、調節配列等の核酸配列によってコードされるＡＢＭを発現するためのさらなる配列を含む。
【０１０６】
本発明はさらに、本明細書に記載される発現系を含む宿主細胞を提供する。具体的には、宿主細胞は、本明細書に記載されるＡＢＭをコードする１つ又は複数の核酸分子を組み込んだ少なくとも１つの発現カセット又はプラスミドを含む生成宿主細胞である。
【０１０７】
具体的には、宿主細胞は、一過性又は安定してＡＢＭを発現する。特定の例によれば、宿主細胞は、真核宿主細胞、好ましくは酵母又は哺乳動物細胞のいずれかである。
本発明はさらに、本明細書に記載されるＡＢＭを産生する方法であって、本明細書に記載される宿主細胞は、上記ＡＢＭを産生する条件下で培養又は維持される、方法を提供する。
【０１０８】
具体的には、ＡＢＭは、細胞培養上清から単離及び／又は精製され得る。特定の例によれば、ＡＢＭは、２つの異なるＨＣ及び２つの異なるＬＣを含むヘテロ二量体である二重特異性全長抗体であり、ＡＢＭは、それぞれ同族のＨＣ／ＬＣ対、並びに同族のＣＬ及びＣＨ１ドメインの正しい対形成を含み、ＡＢＭは、宿主細胞により生成され、生成された抗体の１０％未満、好ましくは５％未満が、最大ピーク強度を比較する質量分析法（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）によって測定した場合に、誤って対形成される。
【０１０９】
具体的には、本明細書に記載されるＡＢＭ又はＡＢＭＣは、医療、診断、又は分析用に提供される。
具体的には、本明細書に記載されるＡＢＭ又はＡＢＭＣは、疾患に関連する少なくとも１つの抗原を標的とする、癌、自己免疫疾患又はアレルギーの治療における使用のために提供される。したがって、本発明はさらに、本明細書に記載される有効量のＡＢＭ又はＡＢＭＣを投与することによって、癌、自己免疫疾患又はアレルギーに罹患している対象を治療する方法に関し、ＡＢＭ又はＡＢＭＣは、疾患に関連する少なくとも１つの抗原を標的としている。
【０１１０】
具体的には、癌は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）、切除不能な肝転移、頭頸部の扁平上皮癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、及び頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）からなる群から選択される。
【０１１１】
本発明はさらに、本明細書に記載されるＡＢＭ又はＡＢＭＣを、好ましくは非経口又は粘膜製剤で含み、任意選択的に薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬製剤を提供する。
【０１１２】
具体的には、本明細書に記載されるＡＢＭ又はＡＢＭＣは、非経口製剤中に薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬製剤で提供される。
本発明はさらに、本明細書に記載されるＡＢＭＣを生成する方法を提供し、
ａ）本明細書に記載されるＡＢＭを準備するステップ；並びに
ｂ）ＣＨ２ドメインの１０８及び１１３位のシステインの一方又は両方の少なくとも１つのチオール基を、部位特異的コンジュゲーション法、特に化学的コンジュゲーション法により異種分子と反応させるステップ
を含む。
【０１１３】
具体的には、上記少なくとも１つのチオール基は、マレイミド基を含むコンジュゲーションリンカーを使用して、マイケル反応によって上記異種分子と反応している。
具体的には、上記生成方法は、そうでなければ遊離チオール基を、例えば還元条件下で、生成する分子内スルフィド又はジスルフィド結合を切断する手段及び／又は反応ステップを含まない。したがって、非還元条件下でのＡＢＭ及び／又はＡＢＭＣの調製が好ましい。
【０１１４】
しかし、特定の態様によれば、ＡＢＭは、還元のために還元剤で前処理され、酸化剤で再酸化されて、コンジュゲーションの準備のために、ＡＢＭの遊離反応性システイン（複数可）を調製し、コンジュゲーション効率を向上させることができる。
【０１１５】
他に指示がない限り、本明細書において、位置はＩＭＧＴシステムに従ってナンバリングされる（Ｌｅｆｒａｎｃら、１９９９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２７巻：２０９〜２１２頁）。しかし、「実施例」セクションでは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従うナンバリングが使用される。Ｋａｂａｔナンバリングスキームの説明は、Ｋａｂａｔ，ＥＡら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２、第５版（１９９１年））に見出すことができる。表２３は、突然変異タンパク質の名称及び番号の対応を示している。ＫａｂａｔのＥＵインデックス及びＩＭＧＴナンバリングに従って、本明細書において参照される位置に従ってナンバリングが参照される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】Ｈ５６１−４  Ａｓｎ３２５Ｃｙｓの質量分析：システイン修飾剤による処理は、１つの修飾されたシステイン残基に対応する約８２９．５Ｄａの最大ピークのシフトを引き起こした。Ｈ５６１−４  Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓの質量分析：システイン修飾剤による処理は、２つの修飾されたシステイン残基に対応する約１６５９Ｄａの最大ピークのシフトを引き起こした。
【図２】二重システイン置換された突然変異体ＣＸ Ｎ３２５ＣＬ３２８Ｃ−ｍａｌ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥのＨＩＣ分析。
【図３】単一及び二重システイン置換された突然変異体の質量分析。
【図４】Ｂ１０ｖ５ｘ２２５Ｍ  ＳＥＥＤ−ｍａｌ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥコンジュゲートのＨＩＣ分析。
【図５−１】強いＥＧＦＲ陽性Ａ４３１細胞及びＭＢ−ＭＤＡ４６８細胞への、マレイミド−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とカップリングしたＣＸ Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８並びに単一システイン置換された突然変異体ＣＸ Ｎ３２５Ｃ（Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ）及びＣＸ Ｌ３２８Ｃ（Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓ）突然変異体の内在化。
【図５−２】強いＥＧＦＲ陽性Ａ４３１細胞及びＭＢ−ＭＤＡ４６８細胞への、マレイミド−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とカップリングしたＣＸ Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８並びに単一システイン置換された突然変異体ＣＸ Ｎ３２５Ｃ（Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ）及びＣＸ Ｌ３２８Ｃ（Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓ）突然変異体の内在化。
【図５−３】強いＥＧＦＲ陽性Ａ４３１細胞及びＭＢ−ＭＤＡ４６８細胞への、マレイミド−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とカップリングしたＣＸ Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８並びに単一システイン置換された突然変異体ＣＸ Ｎ３２５Ｃ（Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ）及びＣＸ Ｌ３２８Ｃ（Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓ）突然変異体の内在化。
【図６】ｐＨ５．８でのＣＸ及びＣＸ Ａｓｎ３２５ＣｙｓＬｅｕ３２８Ｃｙｓ ＣｙｓＰ６のＦｃＲｎへの結合、並びに解離のために７．４へのｐＨシフトを伴う。
【図７】配列  配列番号１：Ｎ３２５Ｃ置換を含むヒトＣＨ２のアミノ酸配列。ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。  配列番号２：Ｌ３２８Ｃ置換を含むヒトＣＨ２のアミノ酸配列。ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。  配列番号３：Ｎ３２５Ｃ及びＬ３２８Ｃ置換を含むヒトＣＨ２のアミノ酸配列。ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。  配列番号４：Ｎ３２５Ｃ置換を含むヒトＦｃのアミノ酸配列。ナンバリング、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。  配列番号５：Ｌ３２８Ｃ置換を含むヒトＦｃのアミノ酸配列。ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。  配列番号６：Ｎ３２５Ｃ及びＬ３２８Ｃ置換を含むヒトＣＨ２のアミノ酸配列。ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。  配列番号７：ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列。  配列番号８：ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３のアミノ酸配列。  配列番号９：ＡＧ鎖を含むＳＥＥＤ技術に従って操作されたヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列。  配列番号１０：ＧＡ鎖を含むＳＥＥＤ技術に従って操作されたヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列。
【図８】Ｍａｌ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥによるセツキシマブベースのＡＤＣのインビトロ細胞毒性の評価。
【図９】Ｎ３２５及びＬ３２８Ｃの位置にシステイン突然変異を有する非コンジュゲート及び毒素コンジュゲートしいてるＨＥＲ２結合抗体のＨＩＣクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
本明細書を通じて使用される具体的な用語は、以下の意味を有する。
本明細書で使用される用語「抗原結合分子」又はＡＢＭとは、本明細書では「結合ドメイン」とも呼ばれる、特定の結合アフィニティー及び／又はアビディティーで抗原又はそのエピトープを特異的に認識することができる抗原結合部分を含む分子を意味する。ＡＢＭの特定の例によれば、結合ドメインは、ＣＤＲループ又は非ＣＤＲ（若しくは構造）ループに抗原結合部位を含む免疫グロブリン型結合領域又は１つ又は複数（例えば、２つ）の抗体ドメインであり、特に、単一ドメイン抗体、一本鎖可変ドメイン（ＶＨ／ＶＬ）、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、抗原結合ＣＨ３、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、アルマジロリピートポリペプチド、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、テネイシンＩＩＩ型ドメイン、アンキリンリピートモチーフドメイン、リポカリン、クニッツドメイン、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニタンパク質、Ｃ型レクチン様ドメインスキャフォールド、操作された抗体模倣体、及び抗原結合機能性を保持している前述のいずれかの遺伝子操作された対応物のいずれかに含まれる抗原結合部分である。
【０１１８】
ＡＢＭの具体的な実施形態は、抗体又はその抗原結合フラグメントを含むか又はそれからなる。
用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン様分子である抗原結合ポリペプチド、或いは例えば１つ若しくは複数の抗体ドメインから構成され、また免疫グロブリン又は抗体と類似した抗原結合特性を担持する、モジュラー抗体フォーマットを提示するその他のタンパク質、特に、単一、又は二重、又は多重特異性の結合特性、或いは１価、２価、又は多価の結合特性を示し得るタンパク質、例えば、特に細胞関連のタンパク質若しくは血清タンパク質を含む自己抗原等の病原体起源又はヒト構造物の、例えば抗原、エフェクター分子、又は構造物のエピトープに対応する少なくとも２つの特異的結合部位を示し得るタンパク質として定義される。用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書では交換可能に用いられる。
【０１１９】
抗体は、１つ若しくは複数のリンカー配列を有する、又は有さない免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメイン及び／又は可変ドメインとして理解される抗体ドメインから一般的に構成される又はそれを含む。抗体は、可変抗体ドメインの対、例えば１つ若しくは２つのＶＨ／ＶＬの対等を含む、結合配列又はヒンジ領域を有する、又は有さない可変及び／又は定常抗体ドメインの組み合わせから構成される又はそれを含むものと特に理解される。ポリペプチドは、ループ配列により連結した抗体ドメイン構造の少なくとも２つのβストランドからなるβバレル構造を含む場合には、抗体ドメインとして理解される。抗体ドメインは、天然型構造のドメインであり得る、或いは、例えば、抗原結合特性又はその他の任意の特性、例えば安定性又は機能的特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎ及び／又はＦｃγ受容体との結合等を修飾するために、突然変異誘発又は誘導体生成により修飾され得る。
【０１２０】
用語「抗体」には、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン様構造の抗体を含む、完全長抗体が特に含まれる。特に、抗体は、完全長抗体、例えばＩｇＧタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体の完全長抗体であり得る。典型的には、特定のＣＤＲ構造を介して抗原結合部位を有する抗体は、一対のＶＨ／ＶＬドメインのＣＤＲループを介して標的抗原に結合することができる。
【０１２１】
用語「抗体」はさらに、抗体、抗体ドメイン、若しくは抗体フラグメントの誘導体、組み合わせ又は融合のいずれかを含む。
用語「全長抗体」は、具体的に重鎖の二量体を含む、抗体のＦｃ領域又は少なくともＦｃ部分の大部分を含む任意の抗体分子を指すために使用される。完全長抗体は、単一特異性又は多重特異性、例えば、二重特異性ｍＡｂ２等の二重特異性であり得る。この用語「完全長抗体」は、本明細書では、特定の抗体分子が抗体フラグメントではないことを強調するのに用いられる。
【０１２２】
本明細書によれば、抗体は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にコードされる１つ若しくは複数のポリペプチドを含むタンパク質（又はタンパク質複合体）として一般的に理解される。よく知られた免疫グロブリン遺伝子として、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖（ＬＣ）は、カッパ（ＶＬドメイン及びＣカッパドメインを含む）又はラムダ（ＶＬドメイン及びＣラムダドメインを含む）のいずれかとして分類される。重鎖（ＨＣ）は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類されるが、それは次に免疫グロブリンクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥをそれぞれ定義する。
【０１２３】
用語「抗体」には、異なる標的抗原に対する及び／又は立体配置が異なる抗体ドメインを含むその他の抗体を実質的に含まない単離された形態の抗体が特に含まれるものとする。更に、単離された抗体は、単離された抗体と、例えば少なくとも１つのその他の抗体、例えばモノクローナル抗体又は異なる特異性を有する抗体フラグメント等との組み合わせを含有する組み合わせ調製物に含まれ得る。
【０１２４】
用語「抗体」は、ヒト種、例えば哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ラクダ、ラマ、ウシ及びウマ、又はトリ、例えばニワトリなどの動物起源の抗体に適用され、この用語は、特に、動物起源の配列、例えば、ヒト配列に基づく組換え抗体を含む。
【０１２５】
用語「抗体」は、ヒト抗体に特に適用される。
用語「ヒト」には、抗体において用いられる場合、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体が含まれるものと理解される。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ランダム又は部位特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発性により又はｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異により導入された突然変異）を、例えばＣＤＲ内に含み得る。ヒト抗体として、ヒト免疫グロブリンライブラリから、又は１つ若しくは複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子導入された動物から単離された抗体が挙げられる。
【０１２６】
ヒト抗体は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＭからなる群より選択される、又はそれに由来するのが好ましい。
マウス抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃ、ＩｇＧ３、及びＩｇＭからなる群より選択される、又はそれに由来するのが好ましい。
【０１２７】
用語「抗体」は、キメラの抗体、例えば異なる種を起源とする配列、例えばマウス及びヒトを起源とする配列等を有するキメラ抗体に更に適用される。
用語「キメラ」とは、抗体において用いられる場合、重鎖及び軽鎖の各アミノ酸配列の一部分が、特定の種に由来する、又は特定のクラスに属する免疫グロブリン内の対応する配列と相同である一方、鎖の残りのセグメントは別の種又はクラスの対応する配列と相同である分子を意味する。一般的に、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物の１つの種に由来する免疫グロブリンの可変領域を模倣する一方、定常部分は、他方に由来する免疫グロブリンの配列と相同である。例えば、可変領域は、容易に入手可能なＢ細胞又はヒト以外の宿主生物に由来するハイブリドーマを、例えばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて利用する現在知られているソースに由来し得る。
【０１２８】
用語「抗体」は、ヒト化した抗体に更に適用され得る。
用語「ヒト化」とは、抗体において用いられる場合、ヒト以外の種から得られた免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を意味し、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメインと融合した完全な可変ドメイン、又は可変ドメイン内の該当するフレームワーク領域とグラフト結合した相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含み得る。抗原結合部位は、野生型であり得る、又は例えば１つ若しくは複数のアミノ酸置換により修飾され得る、好ましくはヒト免疫グロブリンとより密接に類似するように修飾され得る。ヒト化免疫グロブリンのいくつかの形態は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えば、６つすべてのＣＤＲを含有するマウス抗体由来のヒト化マウス抗体）。その他の形態は、オリジナルの抗体に関して変更が加えられた１つ又は複数のＣＤＲを有する。
【０１２９】
具体的な実施形態によれば、本明細書に記載されるＡＢＭに含まれる全ての抗体ドメインは、少なくとも６０％の配列同一性、又は少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の配列同一性を有するヒト起源のもの又はそのヒト化若しくは機能的に活性な変異体であり、好ましくは、抗体ドメインの起源は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥ抗体のいずれかである。具体的には、すべての抗体ドメインは、同じ基本的な免疫グロブリンフォールドに由来するが、ｂ−シートの形式は異なる場合があり、特にＶドメインでは、接続ループは確かに変動可能である。
【０１３０】
「抗体」という用語はさらに、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、特に組換え抗体に適用され、この用語は、動物、例えば、ヒトを含む哺乳動物種を起源とする抗体等の、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離されるすべての抗体及び抗体構造を含み、例えば、キメラ、ヒト化抗体、又はハイブリドーマ由来の抗体に由来する遺伝子又は配列を含む。更なる事例として、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、又は組み換え体から単離された抗体、抗体若しくは抗体ドメインのコンビナトリアルライブラリ、又は抗体遺伝子配列をその他のＤＮＡ配列にスプライシングする工程と関係する任意のその他の手段により調製、発現、作製、又は単離された抗体が挙げられる。
【０１３１】
用語「抗体」には、新規の抗体、又は既存の、例えば天然由来の抗体の機能的に活性な変異体が含まれるものと理解される。
ＡＢＭ又は抗体の変異体、特に抗体様分子の変異体、又は抗体変異体という用語は、そのような分子の誘導体もやはり含むべきものと更に理解される。
【０１３２】
誘導体とは、１つ若しくは複数のＡＢＭの任意の組み合わせ、及び／又はＡＢＭの任意のドメイン若しくはミニドメインが、任意の位置で、１つ若しくは複数のその他のタンパク質、例えばその他のＡＢＭ、例えば抗体若しくは抗体フラグメント等のほか、リガンド、酵素、毒素等と融合し得る融合タンパク質である。
【０１３３】
本明細書に記載されるＡＢＭ又はＡＢＭＣは、具体的には、単離されたポリペプチドとして、又は、例えば、組換え、融合又はコンジュゲーション技術を通じて、他のペプチド又はポリペプチドとの組み合わせ分子として、使用することができる。ペプチドは、抗体ドメイン配列と相同であるのが好ましく、また少なくともアミノ酸５個分の長さであるのが好ましく、少なくとも１０個分、又は更に少なくともアミノ酸５０個分若しくは１００個分の長さであるのがより好ましく、また抗体ドメインのループ領域を少なくとも部分的に構成する。
【０１３４】
ＡＢＭ又は抗体の誘導体は、様々な化学的技法、例えば共有結合カップリング、静電相互作用、ジスルフィド結合等により、その他の物質との会合又は結合によっても取得可能である。抗体に結合したその他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機分子及び無機分子、又は任意のこれらの組み合わせであり得る（例えば、ＰＥＧ、プロドラッグ、又は薬物）。誘導体は、同一のアミノ酸配列を有するが、全体的に若しくは部分的に非天然の又は化学的に修飾されたアミノ酸からなるＡＢＭ又は抗体も含む。具体的な実施形態では、ＡＢＭは、生物学的に許容される化合物との特異的相互作用を可能にする追加タグを含む誘導体である。使用可能なタグに関して、抗体がその標的と結合する際に、その結合に対して悪影響を有さない又は悪影響が許容可能である限り、特別な制限は存在しない。適するタグの例として、Ｈｉｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ストレップ−タグ、カルモジュリン−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグ、及びＳ−タグが挙げられる。別の具体的な実施形態では、抗体は、標識を含む誘導体である。本明細書で使用される「標識」という用語は、「標識された」ＡＢＭを生成するように、ＡＢＭに直接又は間接的にコンジュゲートしている検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、そのものが検出可能、例えば放射性同位体標識若しくは蛍光標識であり得る、又は酵素標識の場合は、基質化合物若しくは組成物の検出可能な化学変化を触媒し得る。
【０１３５】
ＡＢＭ又は抗体の誘導体は、例えば、親のＡＢＭ及び抗体配列にそれぞれ由来し、例えば、親の抗原結合（例えばＣＤＲ）又はフレームワーク（ＦＲ）配列、例えば、インシリコ若しくは組換え操作によって、又は他には化学的誘導体化もしく合成によって得られる突然変異体又は変異体が挙げられる。
【０１３６】
用語「変異体」は、本明細書で用いる場合、本明細書に記載するような、任意の「突然変異体」、「同族体」、又は「誘導体」を特に含むものとする。用語「変異体」は、具体的には、特定の機能性によって特徴付けられる機能的に活性な変異体を包含する。
【０１３７】
本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体の機能性は、本明細書にさらに記載されるように、特定の抗原結合特性（特にエピトープ特異性）及びＣＨ２ドメインに操作されたシステインの遊離チオール基によって特に特徴付けられる。
【０１３８】
「変異体」という用語は、特に、抗体、例えば、突然変異抗体又はＡＢＭ若しくは抗体のフラグメントを指し、これらは、例えば、抗体の安定性、エフェクター機能若しくは半減期を操作するための定常ドメインにおいて、又は抗原結合特性を改善するための可変ドメインにおいて、特に、アミノ酸配列を欠失させ、交換し、挿入物を特定の抗体アミノ酸配列又は領域に導入し、或いは化学的に誘導体化するために、突然変異誘発法によって、例えば、当該技術分野において利用可能なアフィニティー成熟技術によって得ることができる。任意の公知の突然変異誘発法が採用され得るが、これには、例えばランダム化技法により取得されるような、所望の位置での点突然変異が含まれる。場合によっては、位置は、例えば任意の可能性のあるアミノ酸を用いて、又は抗体配列をランダム化するのに好ましいアミノ酸を選択することによりランダムに選択される。用語「突然変異誘発」とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を変化させるための、当技術分野でよく知られた任意の技法を意味する。好ましい種類の突然変異誘発として、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、飽和突然変異誘発、又はその他の部位特異的突然変異誘発が挙げられる。
【０１３９】
用語「機能的変異体」は、本明細書では「機能的に活性な変異体」とも呼ばれ、例えば、１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、除去、又は置換、或いはアミノ酸配列内の１つ若しくは複数のアミノ酸残基の化学的誘導体生成、或いはヌクレオチド配列内の、又は例えば、ＣＤＲ若しくはＦＲ配列内の配列の遠位末端部のいずれか若しくは両方におけるヌクレオチドの化学的誘導体生成による親配列の修飾に起因する配列（例えば、親のＡＢＭ又は抗体に由来する）を含み得るが、その修飾は、この配列の活性に影響を及ぼさない、特に損なわない。選択された標的抗原に対して特異性を有する結合部位の場合、抗体の機能的に活性な変異体は、事前に決定された結合特異性をなおも有するが、但し、例えば、特定のエピトープに対する微細特異性、アフィニティー、アビディティー、Ｋｏｎ又はＫｏｆｆレート等を変化させるために変更され得る。例えば、アフィニティー成熟型抗体は、機能的に活性な変異体抗体として特に理解される。したがって、アフィニティー成熟型抗体内の修飾されたＣＤＲ配列は、機能的に活性な変異体として理解される。
【０１４０】
機能的活性は、例えば、標的抗原との結合特異性、及び／又は分子に求められるｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、及び／又はｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合を測定するアッセイ法において、親分子と対比しながら変異体の構造及び機能により決定されるのが好ましく、例えば、抗体の機能性測定による標準アッセイ法において決定される。
【０１４１】
抗原が細胞表面上で発現する場合、ＡＢＭの機能的な活性は、抗原結合に関して、ＥＬＩＳＡアッセイ法、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ法、Ｏｃｔｅｔ  ＢＬＩアッセイ法、又はＦＡＣＳに基づくアッセイ法で一般的に測定される。
【０１４２】
機能的に活性な変異体は、例えば、親ＡＢＭ、例えば、ＩｇＧ１構造等の抗体の特異的天然構造を有するモノクローナル抗体の配列を変化させて、標的抗原の認識において同一の特異性を有するが、親構造とは異なる構造を有する変異体を取得する、例えば、抗体ドメインのいずれかを改変して特異的突然変異を導入する、二重特異性構築物を生成する、又は親分子のフラグメントを生成すること等により取得可能である。
【０１４３】
典型的には、親のＡＢＭ又は配列は、抗原結合部位近傍の配列領域内又は結合部位内に、抗原結合を損なわない突然変異が組み込まれた変異体であって、好ましくは抗原結合能力を含め、親ＡＢＭと類似した生物活性を有する、例えば抗原を標的とする特異的結合アッセイ法又は機能的試験により測定したときに、実質的に同一の生物活性を有する変異体を生成するように改変可能である。
【０１４４】
用語「実質的に同一の生物活性」とは、本明細書で用いる場合、実質的に同一の活性、すなわち同等のＡＢＭ又は親ＡＢＭについて測定したときの活性の少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも１００％、又は少なくとも１２５％、又は少なくとも１５０％、又は少なくとも１７５％、又は例えば、最大２００％として表される活性を意味する。
【０１４５】
本明細書に記載する好ましい変異体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくは個々の抗原と特異的に結合するが、標的抗原ではないその他の抗原と有意に結合しない能力を有するが、例えば、そのときのＫｄ値の差異は、少なくとも２対数、好ましくは少なくとも３対数である。機能的に活性な変異体による抗原結合は、一般的に損なわれず、親のＡＢＭ若しくは配列、又は例えば、Ｋｄ値の差異が２対数未満、好ましくは３対数未満の配列変異体を含むＡＢＭの結合アフィニティーと実質的にほぼ等しい結合アフィニティーに対応するが、但し、アフィニティーが改善しさえする、例えばＫｄ値の差異が少なくとも１対数、好ましくは少なくとも２対数となる可能性も有する。
【０１４６】
好ましい実施形態では、親ＡＢＭの機能的に活性な変異体は、
ａ）ＡＢＭの生物学的に活性なフラグメントであり、該フラグメントは、分子の配列のうちの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％、９８％、又は９９％を含み、
ｂ）少なくとも１つのアミノ酸が置換、付加、及び／又は除去されたＡＢＭに由来し、機能的に活性な変異体は、分子又はその一部分に対して配列相同性を有し、例えば、少なくとも５０％の配列相同性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なおもより好ましくは少なくとも９０％、なおいっそうより好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有する抗体等であり、並びに／或いは
ｃ）ＡＢＭ又はその機能的に活性な変異体、及びポリペプチド又はヌクレオチド配列とは異種の少なくとも１つの更なるアミノ酸又はヌクレオチドから構成される。
【０１４７】
一実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＭの機能的に活性な変異体は、上記される変異体と本質的に同一であるが、異なる種の相同配列に由来するという点で、それぞれ、そのポリペプチド又はコードするヌクレオチド配列と相違する。これらは、天然由来の変異体又は類似体と呼ばれる。
【０１４８】
用語「機能的に活性な変異体」には、天然由来の対立遺伝子変異体、並びに突然変異体、又は任意のその他の非天然由来の変異体も含まれる。当技術分野において公知なように、対立遺伝子変異体は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠損、又は付加を有するものとして特徴付けられる、交互に入れ替わった形態の（ポリ）ペプチドである。
【０１４９】
機能的に活性な変異体は、ポリペプチド又はヌクレオチド配列中、例えば１つ又は複数の点突然変異の配列変更によって得ることができ、本明細書に記載されるように使用される場合、配列変更は、未変更ポリペプチド又はヌクレオチド配列の機能を保持又は改善する。そのような配列変更として、（保存的な）置換、付加、除去、突然変異、及び挿入を挙げることができるが、但しこれらに限定されない。
【０１５０】
特定の機能的に活性な変異体は、ＣＤＲ変異体である。ＣＤＲ変異体には、ＣＤＲ領域内の少なくとも１つのアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列が含まれ、上記修飾は、アミノ酸配列の化学的又は部分的な変更であり得るが、そのように修飾しても、変異体は、修飾前の配列の生物学的特徴を保持することが可能である。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的な変更は、１つから数個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、若しくは５個のアミノ酸の除去又は置換による、又は１つから数個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、若しくは５個のアミノ酸の付加又は挿入による、又は１つから数個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、若しくは５個のアミノ酸の化学的誘導体生成による、又はその組み合わせによる可能性がある。アミノ酸残基内の置換は、保存的な置換、例えば１つの疏水性アミノ酸と代替的疏水性アミノ酸との置換であり得る。
【０１５１】
保存的な置換は、アミノ酸の側鎖及び化学的特性に関連するアミノ酸のファミリー内で生ずる置換である。そのようなファミリーの例として、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小型の側鎖、大型の側鎖を有するアミノ酸等が挙げられる。
【０１５２】
点突然変異とは、異なるアミノ酸に関する１つ又は複数の一重（非連続的）又は二重のアミノ酸の置換若しくは交換、欠失又は挿入において、非改変アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現を引き起こすポリヌクレオチドの改変と特に理解される。
【０１５３】
本明細書にさらに記載されるようにＣＨ２ドメインの１０８及び／又は１１３位に操作されたシステインは、典型的には、部位特異的点突然変異（複数可）によって得られ、システイン残基の天然に存在するアミノ酸残基の置換をもたらす。
【０１５４】
このような点突然変異に加えて、ＡＢＭは、１つ又は複数のさらなるシステイン又はリジン残基を異なる所定の位置に導入するため等の点突然変異をさらに含むことができ、これは、さらなる異種分子のコンジュゲーションに使用することができる。特定の実施形態によれば、本明細書に記載されるＡＢＭは、グリコシル化部位の数及びタイプを変化させないこのような点突然変異のために操作される。
【０１５５】
本明細書に記載されるＡＢＭの変異体は、同じ極性及び／又は電荷のアミノ酸の交換を指す点突然変異を含み得る。これに関して、アミノ酸は、６４個のトリプレットコドンによってコードされている２０個の天然アミノ酸を指す。これらの２０個のアミノ酸は、中性電荷、正電荷、及び負電荷を持つものに分割することができる。
【０１５６】
２０個の天然アミノ酸をそれぞれの３文字表記と１文字表記、及び極性とともに以下の表に示す。
【０１５７】
【表１】
2021500873.tif 000002
【０１５８】
ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列の同一性のパーセント（％）」は、配列相同性の最大パーセントを達成するように、また配列相同性の一部として保存的置換を一切考慮せずに配列の位置合わせを行い、そして必要な場合にはギャップを導入した後に、所定のポリペプチド配列内のアミノ酸残基と一致する候補配列内のアミノ酸残基の百分率（％）として定義される。当業者は、比較の対象となる配列の全長にわたり、一致性が最大となるのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、一致性を測定するしかるべきパラメーターを決定することができる。
【０１５９】
ＡＢＭ変異体には、例えば、糖鎖工学により生成される特定のグリコシル化パターンを有する同族体、類似体、フラグメント、修飾体、又は変異体が含まれるものと特に理解され、抗体変異体は機能的であり、例えば、特定の標的に結合し、機能的特性を有するなど、また機能的同等物として役に立つ可能性がある。ＡＢＭは、グリコシル化されても、またグリコシル化されなくてもよい。例えば、本明細書に記載するような組み換えＡＢＭは、ＡＢＭを発現する宿主細胞により決定される分子の特異的グリコシル化が可能となるように、適する哺乳動物細胞内で発現され得る。
【０１６０】
抗体ドメイン、特にＣＬ又はＣＨ１ドメイン等の定常抗体ドメインの「βシート」又は「βストランド」という用語は、本明細書では以下のように理解される。抗体ドメインは、少なくとも２つ又は３つのバックボーン水素結合により横方向に連結した少なくとも２本のβストランドから一般的に構成され、一般的に捻じられた、ひだ状のシートを形成する。βストランドは、一般的に長さが３〜１０個のアミノ酸からなる単一の連続的なアミノ酸のストレッチであり、そのように延長型の立体構造を採るが、また少なくとももう一方のストランドとのバックボーン水素結合に関与してβシートを形成する。βシート内では、βストランドの大部分は、他方のストランドに隣接して配置し、そして広範な水素結合ネットワークをその近傍のストランドと形成し、その場合、一方のストランドのバックボーン内のＮ−Ｈ基が、隣接したストランドのバックボーン内のＣ＝Ｏ基と水素結合を形成する。
【０１６１】
抗体定常ドメイン、例えばＣＨ２又はＣＨ３ドメイン等の構造は、ループにより連結したβストランドからなる可変ドメインの構造と類似しており、その一部は、短いαヘリックス型ストレッチを含む。様々なＦｃ結晶構造のｂ因子から理解されるように、フレームワークは、おおむね剛性であり、またループは比較的柔軟性である。抗体ＣＨ２又はＣＨ３ドメインは、βシート（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ）を形成する７本のβストランドを一般的に有し、この場合、βストランドは、複数のループ、すなわちドメインのＮ末端側先端部分に位置する３つのループ（Ａ−Ｂ、Ｃ−Ｄ、Ｅ−Ｆ）、及びドメインのＮ末端側先端部分に位置する更なる３つのループ（Ｂ−Ｃ、Ｄ−Ｅ、Ｆ−Ｇ）を介して結合している。ドメインの「ループ領域」は、ベータ鎖の領域間に位置するタンパク質の部分を指す（例えば、ＣＬドメイン又はＣＨ１ドメインの各々は、Ｎ末端からＣ末端に配向した７つのベータシートＡ〜Ｇを含む）。
【０１６２】
抗体のＦｖ部分は、典型的には、各々のドメインのＣ鎖、Ｃ’鎖及びＦ鎖を伴う結合表面（結合界面）を結びつけることによって（ヘテロ）二量体を産生するＶＬドメインとＶＨドメインの対として理解される。ＶＬドメインのベータシート領域とＶＨドメインのベータシート領域のこのような接触により、二量体（ＶＬ／ＶＨと称される）が産生される。
【０１６３】
Ｆａｂアームは、本明細書において、第１及び第２の抗体鎖の対として理解され、第１の鎖は、ＶＬドメインのＣ末端に連結される、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含むか又はそれからなり（軽鎖、ＬＣ）、第２の鎖は、ＶＨドメインのＣ末端に連結される、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含むか又はそれからなり（重鎖、ＨＣ）、ＶＬは、結合界面を介してＶＨに結びつけ（それと対形成し）、ＣＬは、結合界面を介してＣＨ１に結びつけ（それと対形成し）、これによりＬＣ及びＨＣの（ヘテロ）二量体（ＬＣ／ＨＣとも称される）を産生する。
【０１６４】
抗体のＦｃ部分は、本明細書において、各々がＣＨ２ドメイン及び、抗体鎖の対（Ｆｃ鎖）として理解され、ＣＨ２ドメインのＣ末端に連結されているＣＨ３ドメインを含む抗体鎖の対（Ｆｃ鎖）として理解される。各々の抗体鎖のＣＨ２ドメインは、各々のＣＨ２ドメインのＡ、Ｂ及び／又はＥ鎖を伴う結合表面（結合界面）を介して互いに結びつけ、各々の抗体鎖のＣＨ３ドメインは、各々のＣＨ３ドメインのＡ、Ｂ及び／又はＥ鎖を伴う結合表面（結合界面）を介して互いに結びつけ（それと対形成し）、これによりＦｃ鎖の（ホモ）二量体を産生する。本明細書に記載されるＦｃは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ由来であり得る。
【０１６５】
本明細書に記載される一実施形態では、Ｆｃは、構造ループ内に抗原結合部位を含む突然変異したＣＨ３ドメインを含む。このようなＦｃは、抗原結合Ｆｃとして理解され、ＡＢＭそれ自体として使用することができ、又はＡＢＭの一部、例えば、構造ループ内に抗原結合部位を含まないＦｃの代わりに、抗原結合Ｆｃを含む全長抗体の一部であり得る。
【０１６６】
本明細書に記載される一実施形態では、Ｆｃは、突然変異したＣＨ３ドメイン、例えば、１つ又は複数の突然変異、又はノブ若しくはホール突然変異を含むように、異種配列で置換された１つ又は複数のベータ鎖の少なくとも一部を有するものを含む。このような場合、Ｆｃ領域は、２つの異なるＣＨ３ドメインの会合によって特徴付けられるＦｃ鎖のヘテロ二量体を含む。
【０１６７】
特異的ノブ突然変異は、βストランド構造の追加の突起を提供する１つ又は複数のアミノ酸を組み込むことにより２つのドメイン間で接触表面を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えばＴ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａからなる群より選択されるＣＨ３ノブ突然変異のうちの１つ又は複数である。特異的ノブ修飾とは、抗体のＣＨ３ドメイン内の突然変異Ｔ３６６Ｗを指す（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく）。ノブ突然変異は、例えばホール突然変異を組み込むように修飾された別の抗体ドメインに結合するためのマッチング（同族）表面を特に提供する。
【０１６８】
特異的ホール突然変異は、βストランド構造の追加の陥凹部を提供する１つ又は複数のアミノ酸を組み込むことにより、２つのドメイン間で接触表面を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えばＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従うナンバリング）からなる群より選択されるＣＨ３ホール突然変異のうちの１つ又は複数である。特異的ホール修飾とは、抗体のＣＨ３ドメイン内の突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔのいずれかを指す（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく）。ホール突然変異は、例えばノブ突然変異を組み込むように修飾された別の抗体ドメインに結合するためのマッチング（同族）表面を特に提供する。
【０１６９】
マッチングするノブ・イントゥ・ホール突然変異として、例えばＣＨ３ドメインの対の一方のＣＨ３ドメイン上のＴ３６６Ｙと、これにマッチングする第２のＣＨ３ドメイン上のＹ４０７’Ｔが挙げられ、本明細書ではＴ３６６Ｙ／Ｙ４０７’Ｔと呼ばれる。更なるマッチング突然変異として
Ｔ３６６Ｙ／Ｙ４０７’Ｔ、
Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４’Ｗ、
Ｔ３６６Ｙ：Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４‘Ｗ：Ｙ４０７’Ｔ、
Ｔ３６６Ｗ／Ｙ４０７’Ａ、及び／又は
Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９’Ｃ：Ｔ３６６’Ｓ：Ｌ３６８’Ａ：Ｙ４０７’Ｖ
（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）
が挙げられる。
【０１７０】
特異的ＣＨ３突然変異には、例えばＣＨ３βストランド内の１つ又は複数のセグメント又は配列が突然変異しており、オリジナルのＣＨ３ドメインとは異なる抗体ドメイン、例えば異なるタイプ又はサブタイプの抗体ドメインのセグメント又は配列が組み込まれている場合、分子間のβストランドスワップが含まれる。特異的突然変異体は、ストランド交換により取得されるが、この場合、ＩｇＧタイプのＣＨ３ドメインにＩｇＡタイプのＣＨ３ドメインの１つ又は複数のセグメント又は配列が組み込まれる。２つのストランド交換ＣＨ３ドメインが突然変異して同族の対を形成する場合、ＣＨ３ドメインそれぞれのＩｇＡセグメント又は配列は、突然変異したＣＨ３ドメインが、野生型ＣＨ３ドメインよりも選好的に相互に対をなすように、同族のドメイン間接触表面を生成する。セグメントスワップを組み込んだ抗体ドメインのそのような修飾の具体例として、ストランド交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）を挙げることができる。そのような修飾は、非対称性又は二重特異性抗体、特に重鎖のＳＥＥＤ修飾型ＣＨ３ドメインを選好的に対形成させることによって二重特異性抗体を生成するのに利用可能である。これは、保存されたＣＨ３ドメイン内の構造的に関連した配列の交換に基づく。ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメイン内のヒトＩｇＡ及びＩｇＧに由来の交互に反復する配列は、ＡＧ及びＧＡと表される非対称性であるが相補的な２つのドメインを生成する。ＳＥＥＤデザインは、ＡＧ及びＧＡ  ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避しつつ、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成を可能にする。
【０１７１】
抗体ドメイン若しくはＬＣ／ＨＣ、又はＦｃ鎖の結びつけは、ドメイン内又はドメイン間のジスルフィド架橋によってさらに支持され得る。ジスルフィド結合は、２つのシステインのチオール基の酸化により通常形成され、これによりＳ原子が結合して２つのシステイン残基の間でジスルフィド架橋が形成される。
【０１７２】
具体的な実施形態によれば、抗体ドメインは、追加のドメイン内ジスルフィド架橋によって抗体ドメインを、又は追加のドメイン間ジスルフィド架橋によって一対の抗体ドメインを安定化させるためにジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を組み入れる突然変異を含む。具体的には、システインは、ＣＨ３ドメインのＣ末端領域内又はＣ末端に挿入され得る（アミノ酸付加又はアミノ酸置換による）。追加のシステイン修飾を有する一対のＣＨ３は、ＣＨ３対間のジスルフィド結合形成によって安定化され、これによりＣＨ３／ＣＨ３二量体を産生し得る。一部の実施形態では、ジスルフィド連結された抗体ドメインは、ホモ二量体又はヘテロ二量体、すなわち同一又は異なるドメインの対である。
【０１７３】
抗体鎖又はドメインの正しい対形成を可能にするために、任意のＣＨ３突然変異法が、特に利用可能であり、例えばノブ・イントゥ・ホール技術、ＳＥＥＤ技術、電荷反発技術、ジスルフィド結合、又はクロス−ｍＡｂ技術が、正しく会合しない分子の量を低減するために利用可能である。
【０１７４】
抗体ドメインの「対」は、本明細書において２つの抗体ドメイン一式として理解され、この場合、一方は、その表面上又はキャビティ内に、他方のドメイン上の部位と特異的に結合する、したがって相補的な部位を有する。抗体ドメインは会合（associate）及び会合（assemble）して、ベータシート領域の接触を介して一対の抗体ドメインを形成し得る。そのようなドメインの対は二量体とも呼ばれ、例えば静電相互作用、組み換え融合、又は共有結合により会合するが、例えば固体形態及び液状形態の両方において、２つのドメインを物理的に直接会合させる。本明細書において具体的に記載されているのは、本明細書において同定された位置での特定の点突然変異を介した同族の抗体ドメインの好ましい対となりうるＣＬ／ＣＨ１二量体である。
【０１７５】
一対の抗体ドメインにおいて、抗体ドメインは、本明細書では、「対応する」ドメインと呼ばれる。本明細書に記載される抗体において、以下のドメインは、一対の抗体ドメインを適切に形成する対応物（スラッシュ（／）で分離された対応物）と見なされる：
ＶＬ／ＶＨ；
ＣＬ（Ｃラムダダ又はカッパ）／ＣＨ１；
ＣＨ２／ＣＨ２；
ＣＨ３／ＣＨ３。
【０１７６】
用語「多価」とは、本明細書に記載するＡＢＭに関して、同一の標的抗原に結合する、特にそのような標的抗原の同一の又は異なるエピトープと結合する少なくとも２つの結合部位を有する分子を指すものとする。該用語には、２価の抗体、又は例えば少なくとも２、３、４個、若しくはそれより多くの結合部位を通じて標的抗原と結合する２以上の結合価を有する分子が含まれるものとする。例えば、２価の抗体は、２つの対からなり、その両方とも同一の標的抗原と結合するＶＨ／ＶＬドメインを介した２つの抗原結合部位を有し得る。
【０１７７】
用語「多重特異性」とは、本明細書に記載するＡＢＭに関して、少なくとも２つの異なる標的抗原と特異的に結合する少なくとも２つの結合部位を有する分子を指すものとする。該用語には、二重特異性抗体、又は２つ以上の標的抗原と、例えば少なくとも２、３、４個、若しくはそれより多くの結合部位を通じて結合する２つ以上の特異性を有する分子が含まれるものとする。
【０１７８】
例えば、二重特異性抗体は、ＶＨ／ＶＬドメインの第１の対（第１のＦｖ領域）を通じて１つの標的抗原と結合し、またＶＨ／ＶＬドメインの第２の対（第２のＦｖ領域）により別の標的抗原と結合し得る。二重特異性抗体は、典型的には、４つの異なる抗体鎖、すなわち、２つのＨＣ及び２つのＬＣから構成され、そのため、２つの異なるＣＤＲ結合部位が、第１のＨＣと第１のＬＣとの、及び第２のＨＣと第２のＬＣのヘテロ二量体化（対形成）によって形成される。
【０１７９】
別の例では、二重特異性抗体は、抗体可変ドメインのＣＤＲループ内の１つ又は複数の抗原結合部位によって１つの標的抗原、及び抗体定常ドメインの非ＣＤＲループ（本明細書では「構造ループ」と呼ばれる）内の１つ又は複数の抗原結合部位によって別の標的抗原を結合し得る。
【０１８０】
本明細書で使用される「ＡＢＭコンジュゲート」又は「ＡＢＭＣ」という用語は、ＡＢＭと１つ又は複数の異種分子とのコンジュゲートを指し、コンジュゲーションは、異種分子（複数可）を共有結合してカップリングさせる任意の適切な方法、例えば、化学的又は酵素的結合によるものである。
【０１８１】
ＡＢＭにコンジュゲートしている異種分子に関して本明細書で使用される「異種」という用語は、ＡＢＭとの関連で天然に存在しない任意の物質分子又は分子複合体を指す。異種分子は、特に人工物質、又は非ヒト若しくは非哺乳動物の生物学的物質である。例示的な異種分子は、標的細胞に対して生物活性を有する薬物又は毒素である。
【０１８２】
典型的には、異種分子は、ＡＢＭの１つ又は複数の遊離チオール基と反応することができるコンジュゲーションリンカー及び／又は反応基を含むように誘導体化される。
本明細書で使用される「抗原」又は「標的」という用語は、特に、抗体の結合部位によって認識することができる全ての抗原及び標的分子（パラトープとも呼ばれる）を含む。本明細書に記載される結合分子によって標的化される具体的に好ましい抗原は、免疫学的又は治療的に関連性があることが既に証明されているか又はそうであり得る抗原、とりわけ臨床効果が試験されている抗原である。用語「標的」又は「抗原」は、本明細書で用いる場合、（ヒト又はその他の動物の）、自己抗原である腫瘍関連受容体及び可溶性の腫瘍関連抗原、例えば、腫瘍細胞上に位置する受容体、又はそのような腫瘍と関連して癌患者の循環系内に豊富に存在すサイトカイン若しくは又は増殖因子からなる群より選択される分子を特に含むものとする。更なる抗原は、病原体起源、例えば微生物又はウイルス性の病原体の抗原であり得る。
【０１８３】
標的抗原は、標的分子全体、又はそのような分子のフラグメント、特に下部構造、例えば免疫学的に関連し、すなわち、天然抗体又はモノクローナル抗体によって認識可能でもある、「エピトープ」（例えばＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ）と一般的に呼ばれる標的のポリペプチド又は炭水化物構造として認識される。本明細書で使用される用語「エピトープ」とは、本明細書に記載されるＡＢＭの結合部位に対する、特異的結合パートナーを完全に構成するか又は特異的結合パートナーの一部であり得る分子構造を特に指す。用語「エピトープ」は、ハプテンも意味する。化学的には、エピトープは、炭水化物、ペプチド、脂肪酸、有機物質、生体物質、又は無機物質、又はその誘導体及び任意のその組み合わせから構成され得る。エピトープがポリペプチドの場合、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは８〜５０個のアミノ酸、及びより好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸が、ペプチド内に通常含まれる。ペプチドの長さに重大な上限はなく、タンパク質のほぼ完全長ポリペプチド配列を含む場合もある。エピトープは、直鎖状又は高次構造エピトープであり得る。直鎖状エピトープは、ポリペプチドの一次配列又は炭水化物鎖からなる単一のセグメントから構成される。直鎖状エピトープは、連続性又は重複性であり得る。高次構造エピトープは、アミノ酸又は炭水化物から構成され、ポリペプチドのフォールディングにより一体化して三次構造を形成し、またアミノ酸は、直鎖状配列において必ずしも相互に隣接していない。特に、エピトープは、診断上関連する分子の少なくとも一部分である、すなわちサンプル中のエピトープの有無は、患者の疾患若しくは健康状態、又は製造におけるプロセスの状態、又は環境及び食物の状態と定性的又は定量的に相関する。エピトープは、治療上関連する分子、すなわち疾患の経過に変化をもたらす、特異的結合ドメインの標的対象となり得る分子の少なくとも一部分に相当し得る。
【０１８４】
特定の実施形態は、天然に存在する抗原若しくはエピトープ、又はエピトープの合成（人工）抗原を指す。天然に存在する抗原の誘導体である人工抗原は、抗原性又は安定性が増加するという利点を有する可能性があり、これは、特定のＡＢＭに対する結合パートナーとして認識されることに関連する。
【０１８５】
本明細書で用いる場合、用語「特異性」又は「特異的結合」とは、不均質な分子集団内で目的の同族リガンドを判別する結合反応を意味する。したがって、指定された条件下（例えばイムノアッセイ条件下）で、本明細書に記載されるＡＢＭは、その特定の標的に結合し、試料中に存在する他の分子に有意な量では結合しない。特異的結合とは、結合はターゲットアイデンティティーに関して選択的であることを意味し、選択に応じて結合アフィニティー又はアビディティーは高、中、又は低となる。選択的結合は、結合定数又は結合動力学が少なくとも１０倍異なる場合に通常実現し、好ましくは、差異は少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍である。
【０１８６】
本明細書で使用される「抗原結合部分」という用語は、抗原との結合相互作用能力のある可変構造を有する分子（例えば、抗体ドメイン等の１つのペプチド又はポリペプチド）又は分子の会合（例えば、抗体Ｆｖ等のペプチド又はポリペプチド二量体）を意味する。そのような分子は、そのまま利用可能、又はより大きなタンパク質に組み入れ可能であり、したがって結合機能を備えたそのようなタンパク質の特異的領域を形成する。可変構造は、結合タンパク質の天然のレパートリー、例えば免疫グロブリン又は抗体等に由来し得る。可変構造は、ランダム化技法、特に本明細書に記載する技法によっても生成可能である。これらは、突然変異誘発されたＣＤＲ又は非ＣＤＲ領域（例えば、定常抗体ドメインの構造ループ領域）、抗体可変ドメイン又は定常ドメインのループ領域、特に抗体のＣＤＲループを含む。典型的には、本明細書に記載されているＡＢＭの抗原結合部位は、このような抗原結合部分によって形成される。
【０１８７】
抗体の抗原結合部位は、典型的には、重（「Ｈ」）及び／又は軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域、又はその可変ドメインのアミノ酸残基によって形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様なストレッチは、「高度可変領域」と呼ばれ、フレームワーク領域として知られているより保存されたフランキングストレッチの間に挿入されている。抗原結合部位は、結合したエピトープ又は抗原の三次元表面に相補的な表面を提供するが、また高度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる。ＣＤＲ内に組み込まれた抗原結合部位は、本明細書では「ＣＤＲ結合部位」とも呼ばれる。
【０１８８】
定常抗体ドメインの構造ループ領域に組み込まれた抗原結合部位は、「非ＣＤＲ結合部位」とも呼ばれる。
用語「発現」とは、次のように理解される。発現産物、例えば本明細書に記載するようなＡＢＭ等の所望のコーディング配列、及び制御配列、例えば作動可能な結合内のプロモーター等を含有する核酸分子が、発現を目的として利用可能である。このような配列で形質転換又はトランスフェクトされた宿主は、コードされたタンパク質を生成する能力を有する。形質転換を有効にするために、ベクターに発現系を含めることができる；但し、関連するＤＮＡも宿主染色体に組み込むことができる。特に該用語は、例えば、ベクターに担持され、宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質発現用の、適する条件に置かれた宿主細胞及び適合するベクターを意味する。
【０１８９】
コーディングＤＮＡは、特定のポリペプチド又はタンパク質、例えばＡＢＭ等に対応する特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コーディングＤＮＡの発現を開始、規制、さもなければ媒介、又は制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコーディングＤＮＡは、同一の遺伝子又は異なる遺伝子に由来し得るが、また、同一の又は異なる生物に由来し得る。組み換えクローニングベクターには、多くの場合、クローニング又は発現用の１つ若しくは複数の複製系、宿主内で選択するための１つ若しくは複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、及び１つ若しくは複数の発現カセットが含まれる。
【０１９０】
本明細書で用いられる「ベクター」は、クローン化された組み換えヌクレオチド配列、すなわち組み換え遺伝子の転写、及び適する宿主生物内でのそのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列として定義される。
【０１９１】
「発現カセット」とは、定義された制限部位においてベクターに挿入可能な発現産物をコードするＤＮＡのＤＮＡコーディング配列又はセグメントを意味する。カセット制限部位は、正しいリーディングフレーム内へのカセットの挿入を保証するように設計される。一般的に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つ又は複数の制限部位に挿入され、次にベクターにより伝染性ベクターＤＮＡと共に宿主細胞に搬送される。発現ベクター等の、挿入又は付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメント又は配列は、「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれる場合がある。
【０１９２】
発現ベクターは、発現カセットを含み、また宿主細胞における自律複製のための起点又はゲノム組み込み部位、１つ又は複数の選択マーカー（例えば、抗生物質、例えばゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、カナマイシン、Ｇ４１８、又はハイグロマイシン等に対する耐性を付与するアミノ酸合成遺伝子又は遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適するプロモーター配列、及び転写終結因子を通常更に含むが、これらの成分は作動可能に共に結合している。用語「ベクター」には、本明細書で用いる場合、自律複製ヌクレオチド配列、並びにゲノム組み込み用ヌクレオチド配列が含まれる。一般的な種類のベクターは「プラスミド」であり、それは一般的に、追加（外来）のＤＮＡを容易に受け入れ可能な二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子であるが、また適する宿主細胞に容易に導入可能である。プラスミドベクターは、多くの場合、コーディングＤＮＡ及びプロモーターＤＮＡを含有し、また外来ＤＮＡの挿入に適する１つ又は複数の制限部位を有する。特に、用語「ベクター」又は「プラスミド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入可能であり、その結果宿主を形質転換させ、そして導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進する媒体を意味する。
【０１９３】
用語「宿主細胞」とは、本明細書で用いる場合、特定の組み換えタンパク質、例えば本明細書に記載するようなＡＢＭ等を生成するように形質転換された初代対象細胞、及び子孫を指すものとする。すべての子孫が親細胞とまったく同一とは限らないが（計画的若しくは偶然の突然変異、又は環境の差異に起因して）、但し、該子孫が、当初形質転換された細胞の機能と同一の機能を保持する限り、そのように変化した子孫もその用語に含まれるものと理解すべきである。用語「宿主細胞株」とは、組み換え遺伝子を発現させて、組み換えポリペプチド、例えば組み換えＡＢＭ等を生成するのに用いられるような宿主細胞の細胞株を意味する。用語「細胞株」とは、本明細書で用いる場合、長期間にわたり増殖能力を獲得した特定の細胞型の確立されたクローンを意味する。そのような宿主細胞又は宿主細胞株は、細胞培養内で維持可能、及び／又は組み換えポリペプチドを生成するために培養可能である。
【０１９４】
用語「単離された」又は「単離」とは、核酸、ＡＢＭ、ＡＢＭＣ、又はその他の化合物に関して本明細書で用いる場合、「実質的に純粋な」形態で存在するように、それが本来関連する環境から十分に分離された化合物を指すものとする。「単離された」とは、その他の化合物又は材料との人工的又は合成混合物、或いは基本的な活性を妨害しない、そして例えば、不完全な精製に起因して存在し得る不純物の存在の除外を必ずしも意味しない。特に、本明細書に記載されるＡＢＭをコードする単離された核酸分子はまた、特定の宿主細胞における発現を改善するために天然に存在する核酸配列のコドン最適化変異体、又は化学合成されたものを含むことが意味される。
【０１９５】
核酸を参照しながら、用語「単離された核酸」が時に用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、配列から分離したＤＮＡ分子を意味するが、その場合、該ＤＮＡ分子の起源となる生物の天然由来のゲノム内では、該ＤＮＡ分子は該配列と隣接する。例えば、「単離された核酸」は、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター等に挿入された、或いは原核細胞若しくは真核細胞又は宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。ＲＮＡに適用される場合、用語「単離された核酸」は、上記で定義した単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子を主に意味する。或いは、該用語は、天然の状態（すなわち、細胞又は組織内）ではその他の核酸と関連するＲＮＡ分子であるが、そのような核酸から十分に分離した該ＲＮＡ分子を意味し得る。「単離された核酸」（ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、生物学的手段又は合成手段により直接生成し、そして生成期間中に存在するその他の成分から分離した分子を更に表す場合もある。
【０１９６】
ポリペプチド又はタンパク質、例えば単離されたＡＢＭ又はＡＢＭＣ等を参照する際に、用語「単離された」とは、化合物が本来関連する物質、例えば天然の環境、又は化合物が調製される場合（例えば、細胞培養）であって、そのような調製が組み換えＤＮＡ技術によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで実施される場合、その環境において見出されるその他の化合物等を含まない、若しくは実質的に含まない該化合物を特に指すものとする。単離された化合物は、希釈剤、又はアジュバントと共に処方化され得るが、またなおも実用的な目的で単離され得る−例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、診断又は治療で用いられる場合、薬学的に許容される担体又は賦形剤と混合され得る。
【０１９７】
用語「組み換え」とは、本明細書で用いる場合、「遺伝子工学により調製される、又は遺伝子工学の結果」を意味するものとする。或いは、「操作された」という用語が使用される。例えば、ＡＢＭ、抗体又は抗体ドメインは、それぞれの親配列を操作して、修飾されたＡＢＭ、抗体及びドメインをそれぞれ生成することによって、変異体を生成するように操作され得る。組み換え宿主は、発現ベクター又はクローニングベクターを特に含む、又は組み換え核酸配列を含むように、特に宿主にとって外来のヌクレオチド配列を利用して遺伝子改変されている。組換えタンパク質は、宿主においてそれぞれの組換え核酸を発現させることによって生成される。本明細書で使用される、ＡＢＭ又は抗体に関する「組換え」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離されたＡＢＭ及び抗体をそれぞれ含み、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック若しくはトランスクロモソームである動物（例えば、マウス）、又はそれから調製されるハイブリドーマから単離されたＡＢＭ又は抗体、（ｂ）ＡＢＭ及び抗体をそれぞれ発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離されたＡＢＭ又は抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルのヒトＡＢＭライブラリ及び抗体ライブラリからそれぞれ単離されたＡＢＭ又は抗体、並びに（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列から他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う他の任意の手段によって調製、発現、作製若しくは単離されたＡＢＭ又は抗体が挙げられる。このような組換えＡＢＭ又は抗体は、それぞれＡＢＭ及び抗体を含み、これらは、例えば、抗体成熟中に生じる再編成及び突然変異を含むように操作される。
【０１９８】
所望の構造を有するＡＢＭ又は抗体が同定されると、このようなＡＢＭ及び抗体はそれぞれ、例えば、ハイブリドーマ技術又は組換えＤＮＡ技術を含む、当該技術分野において周知である方法によって生成され得る。
【０１９９】
ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター等のその他の適する宿主動物が、免疫化で用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生する能力を有するリンパ球を誘発するように免疫化される。或いは、リンパ球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化され得る。次に、適する融合剤、例えばポリエチレングリコール等を用いてリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。
【０２００】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析され得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法により、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ法、例えばラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等により測定される。
【０２０１】
組換えＡＢＭ、特にモノクローナル抗体は、例えば、それぞれ、必要なタンパク質及びポリペプチド鎖、例えば、抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、周知の組換え宿主ベクター、例えば本明細書に記載されるＡＢＭをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド又は発現カセット（複数可）を用いて、発現用のコード配列で組換え宿主細胞をトランスフェクトすることにより生成可能である。組み換え宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞、例えば上記の細胞等であり得る。
【０２０２】
特定の態様によれば、ヌクレオチド配列は、ＡＢＭ、特に抗体をヒト化するための遺伝子操作のために、又はそのアフィニティー若しくは他の特徴を改善するために使用され得る。例えば、ＡＢＭがヒトを対象とした臨床トライアル及び治療で用いられる場合には、抗体定常領域は、ヒト定常領域とより密接に類似させて免疫反応を避けるように改変され得る。標的抗原に対するアフィニティーがより高まるようにＡＢＭ配列を遺伝子操作するのが望ましいと考えられる。標的抗原に対する抗体の結合能力をなおも維持しつつ、ＡＢＭに１つ又は複数のポリヌクレオチドの変化を生じさせ得ることは、当業者にとって明白である。
【０２０３】
様々な手段によるＡＢＭ、特に抗体の生成は、一般的によく理解されている。例えば、米国特許第６３３１４１５号（Ｃａｂｉｌｌｙら）は、抗体の組み換え生成の方法について記載するが、この場合、重鎖及び軽鎖は、単一のベクターから又は単一の細胞中の２つの別個のベクターから同時に発現される。Ｗｉｂｂｅｎｍｅｙｅｒら、（１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、第１４３０巻（２）：１９１〜２０２頁）、並びにＬｅｅ及びＫｗａｋ（２００３年、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０１巻：１８９〜１９８頁）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の分離培養物中に発現したプラスミドを用いて個別に生成した重鎖及び軽鎖からのモノクローナル抗体の製造について記載する。ＡＢＭ又は抗体の生成に関連する様々なその他の技法が、例えばＨａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８８年）に提示されている。
【０２０４】
モノクローナル抗体は、培養物中の連続細胞系により抗体分子を生成する任意の方法を用いて生成される。モノクローナル抗体を調製するのに適する方法の例として、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻：４９５〜４９７頁）のハイブリドーマ法、及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１３３巻：３００１頁；及びＢｒｏｄｅｕｒら、１９８７、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、５１〜６３頁）が挙げられる。
【０２０５】
本明細書に記載するＡＢＭ又はＡＢＭＣは、治療を必要としている対象への治療投与において利用可能である。
用語「対象」は、本明細書で用いる場合、温血哺乳動物、特にヒト又はヒト以外の動物を指すものとする。したがって、用語「対象」は、特にイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、及び家禽を含む動物も指す場合がある。特に、本明細書に記載するＡＢＭ又はＡＢＭＣは、疾患状態の予防又は治療を必要とする対象又は患者を治療するために、医学的用途で提供される。用語「患者」には、予防上又は治療上の処置を受けるヒト及びその他の哺乳動物対象が含まれる。用語「処置」は、したがって、予防上の処置と治療上の処置の両方が含まれるように意図される。
【０２０６】
具体的には、本明細書に記載するＡＢＭ又はＡＢＭＣは、実質的に純粋な形態で提供される。用語「実質的に純粋な」又は「精製された」とは、本明細書で用いる場合、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の化合物、例えば核酸分子、ＡＢＭ又はＡＢＭＣ等を含む調製物を指すものとする。純度は、化合物に適する方法により測定される（例えば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ分析法等）。
【０２０７】
用語「治療有効量」は、化合物、例えば、本明細書に記載されるＡＢＭ又はＡＢＭＣの「有効量」又は「十分な量」という用語のいずれかと本明細書において交換可能に使用され、対象に投与された場合に、臨床結果を含む有益な又は所望の結果に十分な量又は活性であり、そのため、有効量又はその同義語は、それが適用されている文脈に依存する。
【０２０８】
有効な量とは、そのような疾患又は障害を治療、予防、又は阻止するのに十分な化合物の量を意味するように意図されている。疾患という文脈において、本明細書に記載するＡＢＭ又はＡＢＭＣの治療上有効な量は、ＡＢＭとその標的抗原の相互作用から利益を得る疾患又は状態を治療、調節、軽減する、逆転させる、又はそれに影響を及ぼすのに特に用いられる。
【０２０９】
そのような有効な量に対応する化合物の量は、様々な要因、例えば投与される薬物又は化合物、医薬製剤、投与経路、疾患又は障害の種類、治療される対象又は宿主の同一性等に応じて変化するものの、当業者によりルーチン的に決定可能である。
【０２１０】
本明細書に記載されるＡＢＭ又はＡＢＭＣは、具体的には、医薬組成物に使用され得る。したがって、本明細書に記載されるＡＢＭ又はＡＢＭＣ、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤、例えば、体液中の免疫グロブリンとともに天然には存在しないか、又は免疫グロブリンとともに天然に存在する人工担体又は賦形剤を含む医薬組成物が提供され、さらに、異なる量若しくは比率で担体又は賦形剤を含有する調製物中に提供される。
【０２１１】
本明細書に記載される医薬組成物は、ボーラス注射若しくは注入として、又は持続注入によって投与することができる。そのような投与手段を円滑にするのに適する医薬担体は、当技術分野において周知されている。
【０２１２】
薬学的に許容される担体として、本明細書に記載するＡＢＭ又はＡＢＭＣと生理学的に適合するあらゆるすべての適する固体又は液体の物質、溶媒、分散媒、コーティング物、等張性吸収遅延剤等が一般的に挙げられる。薬学的に許容される担体の更なる例として、無菌の水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにその任意の組み合わせが挙げられる。
【０２１３】
１つのそのような態様では、ＡＢＭ又はＡＢＭＣは、所望の投与経路に適する１つ又は複数の担体と併用可能であり、ＡＢＭ又はＡＢＭＣは、例えば、ラクトース、スクロース、スターチ、アルカノン酸、ステアリン酸のセルロースエステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidine）、ポリビニルアルコールのいずれかと混合され得るが、また任意選択的に、従来方式での投与用として更に錠剤化又はカプセル化される。或いは、ＡＢＭ又はＡＢＭＣは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースのコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカントガム、及び／又は様々なバッファーに溶解し得る。その他の担体、アジュバント、及び投与様式は、医薬品技術分野で周知されている。担体は、制御放出型材料又は時間遅延材料、例えばグリセリルモノステアレート若しくはグリセリルジステアレート等を単独で、又はワックス若しくは当技術分野において周知のその他の材料と共に含み得る。
【０２１４】
追加の薬学的に許容される担体は、当技術分野において公知であり、また例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳに記載されている。液状製剤は、液剤、乳剤又は懸濁剤であり得、また賦形剤、例えば懸濁剤、可溶化剤、界面活性剤、防腐剤、及びキレート剤等を含み得る。
【０２１５】
本明細書に記載されるＡＢＭ又はＡＢＭＣ、及び１つ又は複数の治療上活性な薬剤が処方化される場合、医薬組成物が検討される。所望の純度を有する上記ＡＢＭ又はＡＢＭＣを任意選択的な薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤と混合することにより、安定な製剤が、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態で保存用に調製される。Ｉｎ  ｖｉｖｏ投与用として用いられる製剤は、特に無菌状態であり、好ましくは無菌の水溶液の形態である。これは、滅菌濾過メンブレンを通過する濾過又はその他の方法により容易に実現される。本明細書に開示のＡＢＭ又はＡＢＭＣ及びその他の治療上活性な薬剤は、イムノリポソームとしても処方化され得る、及び／又はマイクロカプセル中に捕捉され得る。
【０２１６】
本明細書に記載されるＡＢＭ又はＡＢＭＣを含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内（intraotically）、経皮、粘膜、局所的、例えばゲル、軟膏、ローション、クリーム等、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、非経口、直腸、又は眼内を含む様々な方法において実施可能である。
【０２１７】
非経口投与で用いられる代表的な製剤として、皮下、筋肉内、又は静脈内注射に適する製剤、例えば無菌の液体、乳剤又は懸濁剤等が挙げられる。
本発明は、本明細書で提示する実施例に詳記するような代表的なＡＢＭ又はＡＢＭＣを特に提供する。さらなるＡＢＭ又はＡＢＭＣ変異体が実施可能である。例えば、例示されたＡＢＭ又はＡＢＭＣの機能的変異体を含む。例えば、Ｆｃは、分子の構造及び機能を改善するためにさらに操作されていて、又は異なるＣＤＲ結合部位若しくは非ＣＤＲ結合部位を含む抗体、例えば、異なる特異性を有する抗体が生成される。
【０２１８】
特定の例によれば、ＦｏｌｄＸと組み合わせたＦｃ結晶構造の目視検査を使用して、Ｆｃ分子における突然変異の可能な影響を予測した（Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚら、２００５年）。システインは、ＩｇＧ１抗体の野生型Ｆｃフラグメントに導入された。結果として生じる突然変異体Ｆｃフラグメントは、サイズ排除クロマトグラフィー、円偏光二色性分光法、及び示差走査熱量測定によって、生化学的及び生物物理学的特性について特徴付けられた。表面プラズモン共鳴測定は、プロテインＡ、ＦｃＲｎ、ＣＤ１６ａ、及びＣＤ６４への結合を特徴付けるために採用された。エルマンアッセイを使用して、分子上の遊離チオールを滴定した。タンパク質は、市販のマレイミドカップリングキットで特異的にビオチン化された。続いて、ビオチン化は、バイオレイヤー干渉法を使用したストレプトアビジン結合アッセイを用いてアッセイされた。次に、野生型様ＳＥＣ、ＤＳＣ、ＣＤプロファイル及び特定のビオチン化を有するＦｃフラグメントを生じさせる突然変異は、ＥＧＦＲ結合Ｆｃａｂに導入された。タンパク質の同じ基本的な特徴付けが行われ、さらに、ＥＧＦＲ結合Ｆｃａｂがフルオロフォアに特異的にカップリングする内在化アッセイが行われ、このｐｒｅＡＤＣ構築物がすべての期待される必要な特性を有することが証明された。
【０２１９】
先行技術のシステイン置換と比較して、Ｇｅｔａｒｅａ（ｈｔｔｐ：／／ｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ．ｈｔｍｌ；参考文献Ｆｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚ，Ｒ．及びＢｒａｕｎ，Ｗ．（１９９８年）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．、１９巻、３１９〜３３３頁）によって分析した場合、１０８及び１１３位のシステイン（ＩＭＧＴに従うナンバリング）はともに埋もれていることが判明し、一方、他のすべての先行技術の残基は溶媒曝露されることが判明した。これらの先行技術による置換は、このような位置での薬物コンジュゲーションがより良い結果をもたらすと仮定して、このような曝露のために行われた。しかしながら、本明細書に記載されるように、ＣＨ２ドメインのＦ−Ｇループにおける埋もれた位置の選択は、組換え抗体の生成中の操作されたシステインの酸化的翻訳後修飾の程度が驚くほど少ないため、さらに良好であったことは驚くべきことであった。
【０２２０】
このような酸化的翻訳後修飾は、細胞培養プロセス中に形成されたジスルフィド結合を介して、操作され及び対になっていないシステインでのシステイン化及び／又はグルタチオン化の形で発生することが周知であり（Ｃｈｅｎ  ＸＮら、ＭＡｂｓ．２００９年；１巻（６号）：５６３〜７１頁）。
【０２２１】
驚くべきことに、産生プロセス中に溶媒曝露されていないシステインに対する抗体の位置を突然変異させることにより、酸化的翻訳後修飾の量が減少することが見出され、操作されたシステインのＳＨ基を異種分子へのコンジュゲーションに利用できるようにした。
【０２２２】
上記説明は、下記の実施例を参照しながらより十分に理解される。但し、そのような実施例は、本発明の１つ又は複数の実施形態を実践する方法を代表するに過ぎず、発明の範囲を制限するものと読み取るべきでない。
【実施例】
【０２２３】
実施例１：Ｎ末端ループスクリーニングによって決定されたＣＨ２ドメインの構造的許容範囲
ＩｇＧのＣＨ２ドメインの３つのＮ末端ループのいずれかが、毒素分子のカップリングのためのシステイン突然変異をさらに操作するために採用し得るかを決定するために、以下の実験を行った。認識配列ＥＬＤＫＷＡ（配列番号１１）は、プライマーｅｌｂｃ１、ｅｌｂｃ２、ｅｌｄｅ１、ｅｌｄｅ２、ｅｌｆｇ１、及びｅｌｆｇ２の対で部位特異的突然変異誘発を使用して、ＢＣループ、ＤＥループ、及びＦＧループの残基を交換することによって、ＦｃフラグメントのＮ末端ループにグラフト結合された。ピキア・パストリス（Pichia pastoris）発現ベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａＡにクローニングされたヒトＩｇＧ１  Ｆｃの配列（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、配列番号９のＦｃアミノ酸配列）に、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して突然変異を誘発し、構築物Ｆｃ ＥＬＤＫＷＡ ＢＣ（配列番号１３）、Ｆｃ ＥＬＤＫＷＡ ＤＥ（配列番号１４）及びＦｃ ＥＬＤＫＷＡ ＦＧ（配列番号１５）を作製した。突然変異体をコードするベクターを線状化し、標準的な方法を使用してピキア・パストリスＸ３３に形質転換した。選択はゼオシン含有ＹＰＤ培地で行った。形質転換体をＹＰＧ培地で培養し、１％メタノールを添加してタンパク質発現を誘導し、３日間継続した。次に、上清を清澄化し、ペプチドがグラフト結合したＦｃフラグメントをプロテインＡクロマトグラフィーで精製した。簡単に言えば、上清を０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に緩衝化し、同じ緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに充填した。洗浄後、タンパク質は０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．５で溶出された。溶出液を含有する画分を２Ｍ  Ｔｒｉｓを添加して中和し、ＰＢＳに対して透析した。グラフト結合した突然変異体は、天然の状態でのＳＥＣプロファイル及びそれらの抗原認識能力を監視することにより、それらの完全性について試験された。ＢＣループに修飾を有するＦｃ突然変異体は、幅広い溶出プロファイルを生成したが、一方、ＤＥ及びＦＧがグラフト結合した変異体は野生型のようであった。ＥＬＩＳＡアッセイでは、ＥＬＩＳＡ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを５μｇ／ｍｌの２Ｆ５抗体で被覆した。４％ＢＳＡ−ＰＢＳで遮断した後、１０μｇ／ｍｌから開始する３倍希釈系列のＦｃ変異体を抗原と反応させた。結合をプロテインＡ−ＨＲＰコンジュゲートで検出し、反応物をＴＭＢで発色させ、３０％のＨ２ＳＯ４で停止した。吸光度を４０５ｎｍで読み取り、６２０ｎｍでのバックグラウンドを差し引いた。ＤＥ及びＦＧループがグラフト結合したタンパク質は、ＢＣループがグラフト結合した変異体と比較して、抗原に対してより強いアフィニティーを示している。ＤＥループ指向されたグラフトは、ヒトＩｇＧ１（ＥＵナンバリングではＡｓｎ２９７残基であり、ＩＭＧＴナンバリングでは８４．４残基である）の天然に存在するＮ結合型グリコシル化部位を取り除き、システインコンジュゲートしている毒素分子へのＮ結合型グリコシル化の直接的な近接は望ましくないため、ＦＧループにおいて交換されたアミノ酸残基は、システイン残基への突然変異誘発による置換及びさらなる操作に最も適しているように見えた。
【０２２４】
配列番号１２：Ｆｃ野生型配列
ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１３：Ｆｃ ＥＬＤＫＷＡ ＢＣ
ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＥＬＤＫＷＡＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１４：Ｆｃ ＥＬＤＫＷＡ ＤＥ
ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＬＤＫＷＡＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１５：Ｆｃ ＥＬＤＫＷＡ ＦＧ
ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＥＬＤＫＷＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２２５】
【表２】
2021500873.tif 000003
【０２２６】
【表３】
2021500873.tif 000004
【０２２７】
実施例２：システイン残基への交換の許容性についてのＣＨ２ドメインにおけるＦＧループの残基のスクリーニング
ｐＰＩＣＺａｌｐｈａＡベクターにクローニングされたＦｃフラグメントの突然変異体は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キットを使用して構築された。残基Ｓｅｒ３２４、Ａｓｎ３２５、Ｌｙｓ３２６、Ａｌａ３２７、Ｌｅｕ３２８、Ｐｒｏ３２９及びＡｌａ３３０は、システイン残基と別々に交換された。
【０２２８】
【表４】
2021500873.tif 000005
【０２２９】
突然変異体をコードするベクターを線状化し、ピキア・パストリスＸ３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。選択は、ゼオシン含有ＹＰＤ培地で行った。形質転換体をＹＰＧ培地で培養し、１％のメタノールを添加してタンパク質発現を誘導し、３日間継続した。次に、上清を清澄化し、突然変異ＦｃフラグメントをプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。簡単に言えば、上清を０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に緩衝化し、同じ緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに充填した。洗浄後、タンパク質は０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．５で溶出された。溶出液を含有する画分を２Ｍ  Ｔｒｉｓを添加して中和し、ＰＢＳに対して透析した。突然変異体は、天然の条件でＳＥＣプロファイルを監視することによって完全性について分析され、野生型Ｆｃの典型的な時間に溶出することが判明した。突然変異体Ｌｙｓ３２６Ｃｙｓは５〜１０％の凝集体を含み、Ａｌａ３２７Ｃｙｓは５％の凝集体を含み、他のすべての調製物には凝集体がなかった。
【０２３０】
突然変異体の熱安定性プロファイルは、示差走査熱量測定を使用して決定された。５μＭのタンパク質溶液は、自動化ＶＰ−ＤＳＣ装置で２５℃から１００℃に１℃／分の加熱速度で加熱され、その場で冷却されて、ベースラインとして機能する２回目の温度スキャンのために加熱された。評価のために、ベースラインは温度プロファイルから差し引かれ、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＯｒｉｇｉｎ  ７．０を使用して非２状態遷移メカニズムを想定してデコンボリューションされた。ＣＨ３ドメインの熱転移は、未修飾Ｆｃとほぼ同じであった。対照的に、ＣＨ２ドメインの展開に対応する遷移は、ほとんどの突然変異体において低温で生じた。最も重大に不安定化されたＣＨ２ドメインは、突然変異体Ｌｙｓ３２６Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓにおいて観察され、Ｔｍの負のシフトは４．５℃であった。Ｓｅｒ３２４Ｃｙｓは約３．５℃で不安定化した。突然変異体Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＡｌａ３２７Ｃｙｓの融解曲線全体は、野生型Ｆｃの融解曲線と有意に相違しなかった。
【０２３１】
タンパク質は、試薬ＥＺ−Ｌｉｎｋマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、マレイミド−ビオチンとのそれらの反応性を試験された。カップリング後、タンパク質をＰＢＳに対して透析し、その後、バイオレイヤー干渉法を使用してＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔにおけるストレプトアビジンの先端への結合をプローブした。タンパク質を６００秒間結合させ、解離相は６００秒間であった。Ｆｃ Ａｓｎ３２５Ｃｙｓによって示される強い正のシグナルがあり、Ｆｃ Ｓｅｒ３２４Ｃｙｓ及びＦｃ Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓによって示される弱い正のシグナルがあった。野生型Ｆｃを含む他のすべての突然変異体は、このアッセイにおいて陰性であった。
【０２３２】
遊離チオール基は、エルマンアッセイを使用して決定された。アッセイは、Ｒｉｅｎｅｒら（Ｒｉｅｎｅｒ  ＣＫ、Ｋａｄａ  Ｇ、Ｇｒｕｂｅｒ  ＨＪ．、Ｑｕｉｃｋ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｌｌｍａｎ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  ｗｉｔｈ  ４，４’−ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｙｒｉｄｉｎｅ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００２年；３７３巻（４〜５号）：２６６〜２７６頁）に従って、エルマン試薬（５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸））を用いて行われた。簡単に言えば、タンパク質試料を解凍し、希釈せずに適用した。１００ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（＋０．２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する２つのチューブを準備し、ｐＨをそれぞれ７．０及び８．０に設定した。アッセイの直前に、１０ｍＭのＤＴＮＢ（２５ｍＬのリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ７中に７７．１  ｍｇのＤＴＮＢ）を準備した。２００μＭのＢＳＡ溶液を陽性対照として使用した。８３３μＬの緩衝液ｐＨ８＋１６７μＬタンパク質＋１６．７μＬエルマン試薬を混合し、３００ｒｐｍで振とうしながら３０分間、２０℃でインキュベートした。インキュベーション後、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｕ２９１０分光光度計で４１２ｎｍの吸収を測定し、チオールの濃度を以下の式を使用して取得した：
【０２３３】
【数１】
2021500873.tif 000006
【０２３４】
式中：［ＳＨ］Ｍ−試料中のチオールのモル濃度；
【０２３５】
【数２】
2021500873.tif 000007
【０２３６】
−試料の４１２ｎｍでの吸光度；
【０２３７】
【数３】
2021500873.tif 000008
【０２３８】
−試料なしの４１２ｎｍでの吸光度；
【０２３９】
【数４】
2021500873.tif 000009
【０２４０】
−タンパク質なしのブランクの４１２ｎｍでの吸光度；
【０２４１】
【数５】
2021500873.tif 000010
【０２４２】
−４１２ｎｍでのモル吸光係数（１４，１５０Ｍ−１ｃｍ−１）；ｄ−キュベットの経路長；６は希釈係数である。
チオールのモル濃度が０．６を示す対照としてＢＳＡを使用すると、突然変異体Ｆｃ Ａｓｎ３２５Ｃｙｓは、カップリングに利用することができるモルあたり２つ近くの遊離チオール基を示している。突然変異体Ｆｃ Ｓｅｒ３２４Ｃｙｓ及びＦｃ Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓは、カップリングに利用することができる１モルあたり１つ未満の遊離チオール基を示している。他のタンパク質は、遊離チオール基の存在を示していない。ＥＺ−Ｌｉｎｋマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応することができるタンパク質は、遊離チオール基の利用可能性の減少を示している。
【０２４３】
【表５】
2021500873.tif 000011
【０２４４】
ＣＤ１６ａ結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ測定で決定された。Ｆｃ突然変異体Ｓｅｒ３２４Ｃｙｓ及びＬｙｓ３２６Ｃｙｓは、野生型ＦｃのようにＣＤ１６ａと同様の結合を示した。他のすべてのクローンは、この受容体に対して劇的に減少したアフィニティーを示した。Ｐｒｏ３２９Ｃｙｓ及びビオチン化されたＡｓｎ３２５Ｃｙｓの場合、結合は観察することができなかった。
【０２４５】
ＦｃＲｎ結合はＢＩＡｃｏｒｅ測定で決定された。ＦｃＲｎへの会合と解離の両方が、野生型Ｆｃ及びすべてのシステイン突然変異体で類似していた。ビオチン化は、ＦｃＲｎ結合に影響を与えなかった。
【０２４６】
実施例３：ＥＧＦＲ結合ＦｃａｂクローンにおけるＳｅｒ３２４Ｃｙｓ、Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓ突然変異体
ｗｔ  ＦｃにおけるＣＨ２ドメインのＦＧループ内の７つの突然変異体のうち、３つの単一システイン交換された突然変異体は、ＥＧＦＲ結合ＦｃａｂクローンＥＡＭ１５１−５（国際公開第ＷＯ２０１１／００３８１１Ａ１号）に移動された：Ｓｅｒ３２４Ｃｙｓ、Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓ。突然変異体は、以下の表に記列挙されているように、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ突然変異誘発キット及びプライマーを使用して構築された。
【０２４７】
【表６】
2021500873.tif 000012
【０２４８】
突然変異体ＥＡＭ１５１−５  Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及び野生型ＥＡＭ１５１−５クローンは、試薬ＥＺ−Ｌｉｎｋヨードアセチル−ＰＥＧ２−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してヨードアセチル−ビオチンで標識された。使用直前に、ヨードアセチルビオチン試薬の４ｍＭ溶液を調製した。計算された量の試薬溶液をタンパク質溶液に添加し、暗所で室温にて９０分間インキュベートした。未反応のビオチン試薬は、ＰＢＳに対して４℃で透析して除去された。突然変異体ＥＡＭ１５１−５  Ａｓｎ３２５Ｃｙｓは、バイオレイヤー干渉法でＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔのストレプトアビジンの先端に有意な結合を示したが、一方、ビオチン化された野生型ＥＡＭ１５１−５、ビオチン化された野生型Ｆｃ及びビオチン化されていないタンパク質ＥＡＭ１５１−５  Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ、ＥＡＭ１５１−５及び野生型Ｆｃは、ストレプトアビジンの先端への結合を示さなかった。
【０２４９】
遊離チオール基をエルマン試薬で滴定した。ＢＳＡを対照として使用し、分子あたり０．６４個の遊離チオール基を示している。単一システイン置換分子は、分子あたり異なる数の接触可能なチオール基を示している。ＥＡＭ１５１−５Ａｓｎ３２５Ｃｙｓは、１分子あたり１．６２個、ＥＡＭ１５１−５  Ｓｅｒ３２４Ｃｙｓは０．８３個、及びＥＡＭ１５１−５  Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓは１．２個の遊離チオールグループを示している。未修飾のＥＡＭ１５１−５は陰性結果（分子あたり０．１６個の遊離チオール）を与え、野生型Ｆｃ（分子あたり０．１個の遊離チオール）もそうであった。
【０２５０】
Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のＦｃａｂ  ＥＡＭ１５１−５の熱展開プロファイルのデコンボリューションは、３つの非２状態遷移を使用して解決することができる。１番目は６３．５５℃、２番目は６６．２９℃、及び３番目は６７．９９℃で発生する。最も不安定な突然変異Ｆｃａｂは、５８．５９℃、６２．２２℃、及び６５．８２℃の転移温度を有するＥＡＭ  Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓであった。ＥＡＭ  Ｓｅｒ３２４ＣｙｓはまたＤＳＣにおいて不安定なプロファイルを示した（５８．９４℃、６２．８９℃、及び６５．６０℃）。対照的に、ＥＡＭ  Ａｓｎ３２５Ｃｙｓは、ＥＡＭ１５１−５に近い熱安定性プロファイルを示し、ＣＨ２ドメインは６１．８７℃で融解し、そのＣＨ３ドメインはその熱安定性を保持した（Ｔｍは６５．７１℃及び６８．３７℃である）。
【０２５１】
ＣＤ１６ａ及びＣＤ６４への結合は、表面プラズモン共鳴を使用して決定された。野生型Ｆｃのスキャフォールドにおける突然変異体Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓは、野生型Ｆｃと比較して、ＣＤ１６ａとのアフィニティーの著しい減少を示している。ＥＡＭ１５１−５は、野生型Ｆｃと同様にＣＤ１６ａへの結合反応速度を示した。ＥＡＭ  Ｓｅｒ３２４Ｃｙｓは、ビオチン化とは無関係にＥＡＭ１５１−５と同様の結合反応速度を示した。対照的に、ＥＡＭ  Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓは、未処理の場合、大幅に減少した程度でＣＤ１６ａに結合したが、一方、ビオチン化した場合、結合はほぼ完全に失われた。ＥＡＭ１５１−５  Ａｓｎ３２５Ｃｙｓは、ＥＡＭ１５１−５  Ｌ３２８Ｃよりもさらに弱い結合を示し、ビオチン化した場合は反応性を示さなかった。さらに、野生型Ｆｃのスキャフォールドにおける突然変異体Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓは、野生型Ｆｃと比較してＣＤ６４に対するアフィニティーの減少を示している。ＥＡＭ１５１−５のＣＤ６４への結合は、野生型Ｆｃと比較して減少した。突然変異体ＥＡＭ１５１−５  Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＥＡＭ１５１−５  Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓは、クローンＥＡＭ１５１−５よりもＣＤ６４への結合が少ないことが示されている。
【０２５２】
【表７】
2021500873.tif 000013
【０２５３】
ＦｃＲｎへの結合の反応速度論は、ＥＡＭ１５１−５突然変異体のすべてについて同様であった。ビオチン化タンパク質では、ＦｃＲｎへの結合に相違を観察することはできなかった。
【０２５４】
ＥＧＦＲへの結合を決定するＥＬＩＳＡにおいて、ＥＡＭ１５１−５及び単一システイン置換された突然変異体は、ＥＧＦＲへのほぼ同一の結合を示したが、一方、野生型Ｆｃは陰性対照として機能した。ビオチン化後の操作されたＦｃフラグメントは、非常に類似した結合挙動を示した。
【０２５５】
ＥＡＭ１５１−５突然変異体の内在化は、蛍光顕微鏡を使用した細胞アッセイにおいてインビトロで観察された（表７）。強力なＥＧＦＲ陽性ＭＢ−ＭＤＡ４６８細胞を、以前にＤｙｌｉｇｈｔ４８８マレイミドと４℃及び３７℃でコンジュゲートさせた、操作された遊離システインを５μｇ／ｍＬのＦｃフラグメント又はＥＡＭ１５１−５クローンとともにインキュベートして、活性な内在化を分析した。陰性対照として、操作された遊離システインを含むＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識されたＦｃフラグメント（Ｆｃ  Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ）を使用した。ＭＢ−ＭＤＡ４６８細胞による取り込みの特異性を確認するために、細胞株ＥＧＦＲ陰性ＭＣＦ−７細胞株を使用した。野生型ＥＡＭ１５１−５を陰性対照として使用した。すべての修飾されたＥＡＭ１５１−５突然変異体は、細胞によって内在化された。細胞を蛍光標識されたＦｃ誘導体とともに４℃でインキュベートした場合、Ｆｃ突然変異体は主に細胞表面に位置され、細胞の蛍光は陽性シグナルとして解釈された。蛍光標識されたＦｃ突然変異体との細胞のインキュベーションが３７℃で行われた場合、点状の外観は、蛍光標識されたＦｃフラグメント誘導体の内在化を示し、これは陽性シグナルとして解釈された。ＭＣＦ−７細胞は、Ｄｙ−Ｌｉｇｈｔ４８８コンジュゲートしているＥＡＭ  Ａｓｎ３２５Ｃｙｓによるいずれもの染色を示していない。未修飾のＥＡＭ１５１−５は、ＭＢ−ＭＤＡ４６８細胞への内在化時に弱い陽性シグナルを示している。これは、おそらくＤｙ−Ｌｉｇｈｔ４８８による非特異的な標識が原因である。
【０２５６】
【表８】
2021500873.tif 000014
【０２５７】
実施例４：Ｈｅｒ２結合ＦｃａｂクローンのＡｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓ突然変異体
突然変異Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓを導入するための骨格として、ｐＴＴ５ベクター（ＣＮＲＣ）にクローニングされたＨｅｒ２特異的ＦｃａｂクローンＨ５６１−４（Ｌｅｕｎｇら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１５年；２３巻（１１号）：１７２２〜１７３３頁）を使用した。突然変異は、実施例２及び３に記載されているＨｉＳｐｅｅｄ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットを使用して導入された。タンパク質をＣＨＯ細胞で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。
【０２５８】
配列番号４２。Ｈ５６１−４  Ａｓｎ３２５Ｃｙｓクローンタンパク質配列
ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＣＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＦＦＴＹＷＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＲＲＲＷＴＡＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４３。Ｈ５６１−４  Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓクローンタンパク質配列
ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＣＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＦＦＴＹＷＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＲＲＲＷＴＡＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＳＰＤＢリンカーを含むチューブリシンコンジュゲートを次のプロトコールに従ってＦｃａｂ  Ｈ−５６１−４にカップリングさせた。毒素をＤＭＳＯで希釈し、１：４のモル比でタンパク質調製物に添加した。インキュベーションは、室温で１．５時間であった。ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０カラムに混合物を充填し、タンパク質を１ｍｌの画分に収集した。タンパク質含有画分は、Ａ２８０を測定することによって同定され、ＰＢＳに対して一晩透析した。
【０２５９】
カップリングした突然変異体を質量分析に供した。３μｇの所望のタンパク質をＬＣ−ＭＳシステムに直接注入した（ＬＣ：ＤｉｏｎｅｘｂＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００ＬＣ、ＭＳ：Ｂｒｕｋｅｒ、Ｍａｘｉｓ  ４Ｇ、標準ＥＳＩソースを装備する）。１５％から７０％までのアセトニトリル（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｂｉｏ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  Ｃ５カラム、５０×０．３２ｍｍ、３μｍパッキング）の直線勾配を発生させることにより、タンパク質を溶出した。データはＤａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４．０（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して処理され、スペクトルはＭａｘＥｎｔによってデコンボリューションされた。
【０２６０】
変異体Ｈ５６１−４  Ａｓｎ３２５Ｃｙｓについて、無傷なタンパク質の測定は不均一なスペクトルを示し、３つの異なる主要な変異体が検出され、９４８Ｄａの質量増分を示した。それにもかかわらず、完全長タンパク質（末端リジンを欠く）は、最高強度を示した。システイン修飾剤による処理は、１つの修飾されたシステイン残基によって引き起こされる最大ピークの約８２９．５Ｄａのシフトを引き起こした。変異体Ｈ５６１−４  Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓについて、無傷なタンパク質の測定は不均一なスペクトルを示し、３つの異なる主要な変異体が検出され、９４８Ｄａの質量増分を示した。それにもかかわらず、完全長タンパク質（末端リジンを欠く）は、最高強度を示した。システイン修飾剤による処理は、２つの修飾されたシステイン残基によって引き起こされる最大ピークの約１６５９Ｄａのシフトを引き起こした。図１を参照されたい。
【０２６１】
実施例５：セツキシマブフレームワークのＡｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓ突然変異体
セツキシマブ（ＣＸ）の重鎖の配列をｐＴＴ５哺乳動物細胞発現ベクターにクローニングした。単一アミノ酸置換Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓは、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットを使用してＣＸ配列（以下の配列）に導入された。野生型に対して９℃でＣＨ２ドメインを安定化させるデノボジスルフィド結合（ＣｙｓＰ６）をもたらす突然変異Ｔｈｒ２５０Ｖａｌ、並びに突然変異Ｐｒｏ２７１Ｃｙｓ及びＡｒｇ２９２Ｃｙｓ（ＣｙｓＰ６又はＣＰ６）の組み合わせは、ＣＸＡｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＣＸＬｅｕ３２８Ｃｙｓ突然変異体の配列に導入された。重鎖構築物を１：１の質量比でＣＸ軽鎖構築物と混合し、標準プロトコールに従ってＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした。３０ｍｌのＣＨＯ−Ｓ細胞に１×１０６／ｍｌの密度で３７．５μｇのＤＮＡ、３７．５μｌのＭＡＸ試薬をそれぞれ６００μｌのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ培地で希釈した混合物をトランスフェクションした。３７℃で７日間、５％ＣＯ２下、加湿雰囲気において培養後、上清を回収し、プロテインＡ精製を使用してタンパク質を単離した。簡単に言えば、プロテインＡ  Ｈｉ−Ｔｒａｐカラムに結合させるために上清を０．１ＭのＮａ−リン酸で緩衝化し、０．１ＭグリシンでｐＨを３．５にシフトさせて溶出し、２ＭのＴｒｉｓで直ちに中和した。ＰＢＳで大規模な透析を行った後、タンパク質を−８０℃で保存した。
【０２６２】
配列番号４４。ＣＸ重鎖アミノ酸配列（最初の１９アミノ酸、下線付きのリーダーペプチド）
ＭＡＶＬＧＬＬＦＣＬＶＴＦＰＳＣＶＬＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４５。ＣＸ重鎖ヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＡＧＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＡＴＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＡＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＴＴＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＧＴＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号４６。ＣＸ軽鎖アミノ酸配列（最初の２０アミノ酸、下線付きのリーダーペプチド）ＭＶＳＴＰＱＦＬＶＦＬＬＦＷＩＰＡＳＲＧＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号４７。ＣＸ軽鎖ヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＡＡＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＣＴＴＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
【０２６３】
【表９】
2021500873.tif 000015
【０２６４】
マレイミド−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とのインキュベーションにより突然変異体を標識し、ＰＢＳに対して広範囲に透析して未反応の試薬を除去した。強力なＥＧＦＲ陽性細胞ＭＢ−ＭＤＡ４６８及びＡ４３１へのそれらの結合レベルは、ＦＡＣＳ実験を使用したＮＨＳカップリング化学を用いて、リジン残基全体でＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とカップリングさせたセツキシマブと比較して推定された。細胞を回収し、２％ＢＳＡ−ＰＢＳに１×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。染色は、１０００００細胞／ウェルで９６ウェルプレートにおいて行われた。細胞を氷上で３０分間遮断し、次に、氷上で３０分間、１０ｎＭから開始する２％ＢＳＡ−ＰＢＳで３倍希釈系列でＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とカップリングさせた一次抗体とともにインキュベートした。分析前に、細胞を７−ＡＡＤを１：１００に希釈した２００μｌのＰＢＤに再懸濁し、氷上に置いた。生細胞集団の平均蛍光強度を決定した。高い蛍光シグナルは、マレイミド誘導体化されたフルオロフォアとシステイン残基のカップリングが成功したことを示した。
【０２６５】
さらに、構築物の内在化は、異なる期間、抗体の飽和濃度に細胞を曝露させることによって推定された。次に、細胞を回収し、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで遮断し、５０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ４８８クエンチング抗体とともにインキュベートした。内在化された抗体のパーセンテージは、公開されたプロトコールに従って決定された。内在化の時間経過を監視し、リジン残基を介してＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とカップリングさせたセツキシマブの内在化と同様であることが推定された。
【０２６６】
より大規模での生成のために、構築物をＥｘｐｉＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ＭａｘＴｉｔｅｒプロトコールを使用してタンパク質生成を行った。プロテインＡ及びＳＥＣ精製を使用してタンパク質を単離した。毒素ｍａｌ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ（ベドチン）とのカップリングは、ＡＤＣｓ＆Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＮＢＥ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｍｅｒｃｋ）の研究室で行われた。薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、質量分析を用いて、ＣＸ Ａｓｎ３２５Ｃｙｓについて１：１．２６、ＣＸ Ａｓｎ３２５Ｃｙｓについて１：１．６４、ＣＸ Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓについて１：１．６４、及びＣＸ Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓ ＣｙｓＰ６について１：５２と決定された。
【０２６７】
【表１０】
2021500873.tif 000016
【０２６８】
【表１１】
2021500873.tif 000017
【０２６９】
【表１２】
2021500873.tif 000018
【０２７０】
【表１３】
2021500873.tif 000019
【０２７１】
システイン置換された突然変異体の安定化は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット、並びにプライマーｐ３７８ｖｆｏｒ及びｐ３７８ｖｒｅｖを使用して、安定化突然変異Ａｌａ３７８Ｖａｌを導入することにより行われた。タンパク質生成、マレイミド−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とのカップリング、及び細胞結合アッセイを上記のように行った。
【０２７２】
【表１４】
2021500873.tif 000020
【０２７３】
【表１５】
2021500873.tif 000021
【０２７４】
実施例６：二重システイン突然変異体ＣＸ  Ａｓｎ３２５ＣｙｓＬｅｕ３２８Ｃｙｓ
システイン残基は、ＣＸ Ｎ３２５Ｃ構築物を鋳型として使用し、プライマーＤＤＳ３２８及びＤＤＳ３２８Ａを使用して突然変異体ＣＸ Ｎ３２５ＣＬ３２８Ｃを構築することにより、１つの分子の両方の標的化位置に導入された。ＣｙｓＰ６安定化された変異体は、プライマーＣＸＰ２７１Ｃ１及びＣＸＰ２７１Ｃ２、並びにＣＸＲ２９２Ｃ１及びＣＸＲ２９２Ｃ２を使用して構築された。
【０２７５】
細胞結合抗原の結合は、親抗体と同等であった。ＣＨ２ドメインのいくつかの修飾のため、突然変異体ＣＸ Ａｓｎ３２５ＣｙｓＬｅｕ３２８Ｃｙｓ ＣｙｓＰ６は、バイオレイヤー干渉法を使用してＦｃＲｎへの結合について調べられた。その結合定数は、解離がｐＨ５．８で行われた場合に野生型セツキシマブと同等であることが判明し（５．２×１０−８対７．２×１０−８ｎＭ）、そのｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合が保持された。
【０２７６】
【表１６】
2021500873.tif 000022
【０２７７】
重鎖構築物を１：１の質量比でＣＸ軽鎖構築物と混合し、標準プロトコールに従ってＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした。３０ｍｌのＣＨＯ−Ｓ細胞に１×１０６／ｍｌの密度で３７．５μｇのＤＮＡ、３７．５μｌのＭＡＸ試薬をそれぞれ６００μｌのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ培地で希釈した混合物をトランスフェクトした。３７℃で７日間、５％ＣＯ２下、加湿雰囲気において培養後、上清を回収し、プロテインＡ精製を使用してタンパク質を単離した。簡単に言えば、プロテインＡ  Ｈｉ−Ｔｒａｐカラムに結合させるために上清を０．１ＭのＮａ−リン酸で緩衝化し、０．１ＭグリシンでｐＨを３．５にシフトさせて溶出し、２ＭのＴｒｉｓで直ちに中和した。ＰＢＳで大規模な透析を行った後、タンパク質を−８０℃で保存した。
【０２７８】
マレイミド−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とのインキュベーションにより突然変異体を標識し、ＰＢＳに対して広範囲に透析して未反応の試薬を除去した。強力なＥＧＦＲ陽性細胞ＭＢ−ＭＤＡ４６８及びＡ４３１へのそれらの結合レベルは、ＦＡＣＳ実験を使用したＮＨＳカップリング化学を用いて、リジン残基全体でＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とカップリングさせたセツキシマブと比較して推定された。細胞を回収し、２％ＢＳＡ−ＰＢＳに１×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。染色は、１０００００細胞／ウェルで９６ウェルプレートにおいて行われた。細胞を氷上で３０分間遮断し、次に、氷上で３０分間、１０ｎＭから開始する２％ＢＳＡ−ＰＢＳで３倍希釈系列でＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とカップリングさせた一次抗体とともにインキュベートした。分析前に、細胞を７−ＡＡＤを１：１００に希釈した２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、氷上に置いた。生細胞集団の平均蛍光強度を決定した。高い蛍光シグナルは、マレイミド誘導体化されたフルオロフォアとシステイン残基のカップリングが成功したことを示した。
【０２７９】
【表１７】
2021500873.tif 000023
【０２８０】
すべてのシステイン安定化された突然変異体、並びにＣＸ Ａｓｎ３２５ＣｙｓＬｅｕ３２８Ｃｙｓ及びＣＸ Ａｓｎ３２５ＣｙｓＬｅｕ３２８Ｃｙｓ ＣｙｓＰ６は、毒素カップリングの適応性について試験された。ＭＡＬ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥを１ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解し、１抗体分子あたり８つの毒素のモル比で突然変異体とともにインキュベートした。大規模な透析後、天然の条件でＳＥＣにおけるタンパク質調製物のプロファイルを分析した。ＳＥＣは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇで、移動相としてＰＢＳ／０．２Ｍ  ＮａＣｌを使用して行われ、タンパク質サイズの指標としてＢｉｏ−Ｒａｄ分子量標準を使用した。分析された突然変異体には凝集体がないことが判明した。
【０２８１】
置換された突然変異体の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムの移動パターンを調べた。クロマトグラフィーは、２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ  ７．５緩衝液中の１．５〜０Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４の勾配を使用して、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ  Ｅｔｈｙｌ−ＮＰ５  ４．６×１００ｍｍ  Ｓｅｐａｘカラムで行われた。突然変異体ＣＸ Ａｓｎ３２５ＣｙｓＬｅｕ３２８Ｃｙｓは、カップリングしていないタンパク質よりも大幅に遅く溶出した。これは、カップリングしたタンパク質とカラムマトリックスとの相互作用の増加を示している。質量分析は、０、１、又は２つの毒素分子のいずれかとカップリングしたタンパク質種の混合を示している。図２及び３を参照されたい。
【０２８２】
さらに、ＣｙｓＰ６安定化された、単一置換された突然変異体、並びに二重突然変異体ＣＸ Ａｓｎ３２５ＣｙｓＬｅｕ３２８Ｃｙｓ及びＣＸ Ａｓｎ３２５ＣｙｓＬｅｕ３２８Ｃｙｓ ＣｙｓＰ６は、ＷＳＴ−１増殖アッセイにおいて、ＭＢ−ＭＤＡ４６８及びＡ４３１細胞株、並びに陰性細胞株としてのＨＥＫ２９３−６Ｅに対する細胞毒性について試験された。細胞は、１０％ＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含む１００μｌのＤＭＥＭ中で１００００細胞／ウェルにて９６ウェルプレートに播種され、５％ＣＯ２下、加湿雰囲気で一晩付着させた。毒素コンジュゲート及び非コンジュゲートタンパク質は、１０μｇ／ｍＬから開始して５倍希釈系列で添加され、５日間インキュベートされた。すべての突然変異体は、標的細胞に対してある程度の特定の細胞毒性を示したが、ＣＸ Ａｓｎ３２５ＣｙｓＬｅｕ３２８Ｃｙｓは最も強力であり、未処理の対照と比較して、ＥＧＦＲ陽性細胞株ＭＢ−ＭＤＡ４６８の増殖を１７．５％、及びＡ４３１の増殖を２４．５％に減少させることができた。カップリングした毒素を含まないタンパク質調製物は細胞増殖に影響を及ぼさず、コンジュゲートしている化合物は、ＥＧＦＲ発現が低い対照細胞株ＨＥＫ２９３−６Ｅに影響を及ぼさなかった。
【０２８３】
【表１８】
2021500873.tif 000024
【０２８４】
【表１９】
2021500873.tif 000025
【０２８５】
【表２０】
2021500873.tif 000026
【０２８６】
実施例７：ＩｇＧ１／２  ＮＱ突然変異体
単一突然変異Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓは、エフェクター機能ＣＸ−ＩｇＧ１／２ＮＱ（配列番号５８、配列番号５９）のサイレンシングに最適化された抗体フォーマットの機能化のために、選択された安定化突然変異と組み合わせてプローブされた。さらに、変異体ｈｕ２２５Ｍ−ＩｇＧ１／２ＮＱ（以下の配列）を使用した。
【０２８７】
配列番号６２：ＣＸ  ＩｇＧ１／２ＮＱ重鎖のアミノ酸配列（最初の１９アミノ酸、下線付きのリーダーペプチド）
ＭＡＶＬＧＬＬＦＣＬＶＴＦＰＳＣＶＬＳＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＡＱＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＡＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号６３：ＣＸ  ＩｇＧ１／２ＮＱ重鎖のヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＡＧＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＡＴＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＡＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴ
配列番号６４：ｈｕ２２５Ｍ−ＩｇＧ１／２ＮＱ重鎖のアミノ酸配列（最初の１９アミノ酸、下線付きのリーダーペプチド）
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＭＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＶＴＩＴＳＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号６５：ｈｕ２２５Ｍ−ＩｇＧ１／２ＮＱ重鎖のヌクレオチド配列
ＧＡＧＧＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＴＧＡＴＡＴＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＡＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴ
配列番号６６：ｈｕ２２５Ｍ軽鎖のアミノ酸配列（最初の１９アミノ酸、下線付きのリーダーペプチド）
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＮＹＮＷＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号６７：ｈｕ２２５Ｍ軽鎖のヌクレオチド配列
ＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＧＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＴＣＴＴＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＣＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
突然変異Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓは、以下の表に列挙されたプライマーを用いてｈｕ２２５Ｍ−ＩｇＧ１／２ＮＱに導入された。二重突然変異体ｈｕ２２５Ｍ−ＩｇＧ１／２ＮＱは、プライマーＮＱＮ３２５３ＣＬ２８Ｃ及びＮＱＮ３２５ＣＬ３２８ＣＡを用いて、Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ突然変異を含む構築物を変異誘発することによって構築された。
【０２８８】
【表２１】
2021500873.tif 000027
【０２８９】
各変異体は、１回はプライマーＮＱＰ１Ｃ及びＮＱＰ１ＣＡ、並びにＮＱＲ２Ｃ及びＮＱＲ２ＣＡを使用して導入されたＰｒｏ２７１Ｃｙｓ／Ａｒｇ２９２Ｃｙｓ（ＣｙｓＰ６）突然変異の組み合わせ、並びに１回はプライマーＮＱＡ３７８Ｖ及びＮＱＡ３７８ＶＡを使用して導入されたＡｌａ３７８Ｖａｌ突然変異で安定化された突然変異体として発現された。この特定の安定化の動機は、構造的にＣＨ３ドメインのＮ末端ループに位置しており、ＦｏｌｄＸアルゴリズムから推測され、ＣＨ２ドメインのＴｍが３℃改善することが確認された。突然変異体は、ＭａｘＴｉｔｅｒプロトコールに従ってＥｘｐｉＣＨＯ細胞において発現された。プロテインＡ精製後、ｈｕ２２５Ｍ変異体の収量は１８．４〜５７．７ｍｇ／Ｌであった。Ａｌａ３７８Ｖａｌモチーフで安定化された突然変異体についてのみ、負の条件でのＳＥＣのホモ二量体の量が９０％を超えた。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８−マレイミドのラベリングは、単一システイン置換された突然変異体への効率的なカップリングをもたらし、ＥＧＦＲ陽性細胞株ＭＢ−ＭＤＡ４６８への結合が観察され得た。
【０２９０】
【表２２】
2021500873.tif 000028
【０２９１】
実施例８：ＳＥＥＤ突然変異体
突然変異Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓは、二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ｃ−ＭＥＴ抗体のＣＨ２ドメインに導入され、ＳＥＥＤ技術を用いてヘテロ二量体化が達成される。この分子では、ＥＧＦＲ特異的抗体ｈｕ２２５ＭがＧＡ鎖上の単一鎖フラグメントとして発現され、未修飾のｃ−ＭＥＴ特異的Ｆａｂフラグメントがヘテロ二量体ＦｃのＡＧ鎖と融合する。突然変異を導入するためにＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異誘発キットで使用されるプライマーＡｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓを以下の表に列挙する。ＭａｘＴｉｔｅｒプロトコールに従い、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞においてタンパク質を発現させた。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞における発現収量は、プロテインＡ精製後の野生型では１２０ｍｇ／Ｌに達し、凝集した材料は、分取用ＳＥＣ濾過の単一ステップで除去することができた。単一置換された突然変異体は、ｍａｌ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥとカップリングされた。ＨＩＣ分析により、Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ  ＳＥＥＤ突然変異体への毒素の効率的なカップリングが明らかになった。図４を参照されたい。
【０２９２】
配列番号８０。２２５Ｍ  ｓｃＦｖ ＧＡ鎖のタンパク質配列（最初の１９アミノ酸、下線付きのリーダーペプチド）
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＭＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＶＴＩＴＳＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＮＹＮＷＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＳＳＧＰＧＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＤＲＳＰＧＫ
配列番号８１。２２５  ｓｃＦｖ ＧＡ重鎖のヌクレオチド配列
ＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＧＣＧＡＧＧＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＴＧＡＴＡＴＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＡＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＴＣＴＴＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＣＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＣＣＧＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＧＴＡＴＡＣＴＧＣＧＣＧＴＧＧＣＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＧＡＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号８２．Ｂ１０ｖ５ ＡＧ重鎖のタンパク質配列（最初の２０アミノ酸、下線付きのリーダーペプチド）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＲＩＴＨＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＡＲＧＦＹＰＫＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＴＩＳＬＳＰＧＫ
配列番号８３．Ｂ１０ｖ５ ＡＧ重鎖のヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＧＧＴＣＧＡＣＣＧＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＡＴＣＧＧＣＧＴＡＴＴＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＧＣＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＧＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号８４．Ｂ１０ｖ５軽鎖のタンパク質配列（最初の２０アミノ酸、下線付きのリーダーペプチド）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＴＩＰＣＧＧＤＳＬＧＳＫＩＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＡＰＬＬＶＶＹＤＤＡＡＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＴＴＡＴＬＴＩＳＳＶＥＡＧＤＥＡＤＹＦＣＱＶＹＤＹＨＳＤＶＥＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
【０２９３】
【表２３】
2021500873.tif 000029
【０２９４】
【表２４】
2021500873.tif 000030
【０２９５】
実施例９：ＩｇＧ形式の単一システイン置換された突然変異体（セツキシマブフレームワーク）
発現及び安定化戦略
ＣＨ２ドメインのＦＧループのアミノ酸残基をスクリーニングすることにより、２つの位置Ａｓｎ３２５及びＬｅｕ３２８が発見され、これは、Ｆｃフラグメントでは、マレイミド誘導体化された毒素又は代理レポーター分子にカップリングされ得るシステイン残基に変異誘発を可能にする。この方法で修飾されたＦｃフラグメントは、依然として十分に発現され、負の条件でＳＥＣに単量体プロファイルを示した。セツキシマブ（ＣＸ）抗体の類似した突然変異体を構築した。ＣＨ２ドメインの不安定化を説明するために、安定化突然変異Ｔｈｒ２５０Ｖａｌ及び二重突然変異Ｐｒｏ２７１Ｃｙｓ／Ａｒｇ２９２Ｃｙｓが導入された。これは、本明細書ではＣｙｓＰ６と呼ばれるデノボシステイン結合の形成をもたらす。Ｔｈｒ２５０Ｖａｌは、ＦｏｌｄＸアルゴリズム（Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚ  Ｊ、Ｂｏｒｇ  Ｊ、Ｓｔｒｉｃｈｅｒ  Ｆ、Ｎｙｓ  Ｒ、Ｒｏｕｓｓｅａｕ  Ｆ、Ｓｅｒｒａｎｏ  Ｌ．ＦｏｌｄＸＷｅｂサーバー：オンラインのフォースフィールド．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００５年；３３巻（Ｗｅｂサーバー特集号）：Ｗ３８２〜３８８）に由来し、Ｔｍを９℃シフトすることによりＦｃフラグメントのＣＨ２ドメインを安定させることが示されている。一方、ＣｙｓＰ６は、ＤＳＤｂａｓｅアルゴリズム（Ｖｉｎａｙａｇａｍ  Ａ、Ｐｕｇａｌｅｎｔｈｉ  Ｇ、Ｒａｊｅｓｈ  Ｒ、Ｓｏｗｄｈａｍｉｎｉ  Ｒ．ＤＳＤＢＡＳＥ：タンパク質中の天然及びモデル化されたジスルフィド結合のコンソーシアム．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４年；３２巻（データベース特集号）：Ｄ２００〜２０２）に由来し、ＣＨ２ドメインを９℃で安定させることが証明されている。単一システイン突然変異体と組み合わせた場合、突然変異Ｔｈｒ２５０Ｖａｌは、Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓの場合では、さらなる特徴付けを妨げる程度まで、発現レベルに有害であることが証明された。他のすべての突然変異体は、ＨＥＫ２９３−６Ｅ系において高レベルで発現され及び精製され得たが、しかしながら、システイン連結したカップリング、特に突然変異体Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓに対するそれらの適応性は低かった。次に、ＣＨＯ細胞によって発現された突然変異体を評価した。すべてのＬｅｕ３２８Ｃｙｓ置換された変異体について、マレイミド−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲート（下の段落で説明される）とのモデルカップリングは、ＣＨＯで発現させたタンパク質でより効率的であった。より深い特徴付けのために、プロテインＡ精製及びゲル濾過後に、約３００ｍｇ／Ｌのタンパク質を送達するＥｘｐｉＣＨＯ系で突然変異体を発現させた。
【０２９６】
Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８とのモデルカップリング、細胞結合及び内在化アッセイ
最初に、セツキシマブの単一システイン置換された突然変異体をマレイミド誘導体化されたＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とカップリングさせた。次に、Ｈｅｒ１陽性細胞株ＭＢ−ＭＤＡ４６８及びＡ４３１の表面へのそれらの結合は、蛍光標識した抗体の連続希釈液に細胞を曝露することによって調べられた。カップリングの相対レベルは、標識された細胞集団の蛍光強度に従って評価され、標的の抗原結合は、最大蛍光強度への蛍光読み取り値の正規化後に推定された。内在化実験は、細胞表面に結合したフルオロフォアの蛍光を抗Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８クエンチング抗体（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でクエンチし、非クエンチ試料をクエンチ試料と比較することによって行われた（Ａｕｓｔｉｎ  ＣＤ、Ｄｅ  Ｍａｚｉｅｒｅ  ＡＭ、Ｐｉｓａｃａｎｅ  ＰＩ、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ＳＭ、Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ  Ｃ、Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸら、Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ＥｒｂＢ２  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ａｎｄ  ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００４年；１５巻（１２号）：５２６８〜５２８２頁）。内在化の時間経過を監視し、リジン残基を介してＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とカップリングさせたセツキシマブの内在化と同様であることが推定された（図５）。興味深いことに、内在化は、ＭＢ−ＭＤＡ４６８細胞よりもＡ４３１において低い程度に進行した。
【０２９７】
システイン置換された突然変異体への毒素カップリング、質量分析及び細胞アッセイ
Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８を用いた最初の試験後、抗体をＭａｌ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ（ベドチン）にコンジュゲートさせ、代表的なＡＤＣペイロードとのコンジュゲーション効率を評価した。コンジュゲーションに最適化されていないプロトコールを用いて、ＣＸ Ａｓｎ３２５Ｃｙｓでは１：０．７４、ＣＸ Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ ＣｙｓＰ６では１：１．５、ＣＸ Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓでは１：１．５６、ＣＸ Ｌｅｕ３２８Ｃｙｓ ＣｙｓＰ６では１：５の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を決定した。これらのＡＤＣは、インビトロ細胞アッセイを使用して、標的化細胞毒性について評価された。Ｈｅｒ１陽性細胞株Ａ４３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を複数のウェルプレートに播種し、ＡＤＣ及び対照分子の連続希釈液で処理した。３日間のインキュベーション後、相対的な細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することにより評価された（図８）。すべてのＣＸ−ＭＭＡＥコンジュゲートは、対照抗体（非コンジュゲートＣＸ抗体；ＭＭＡＥコンジュゲート、ＨＥＲ１非結合アイソタイプ対照抗体ＤｉｇｘＭＭＡＥ）と比較して低いタンパク質濃度での低い細胞生存率によって示される有意に増加した細胞毒性を示した。細胞毒性小分子ＭＭＡＥ（スペーサーなし）、タキソール及びドキソルビシンが追加の対照として機能した。
【０２９８】
システイン残基は、１つの分子の両方の標的位置に導入され、ＣｙｓＰ６安定化された変異体もまた構築された。細胞結合抗原の結合は、親抗体と同等であった。ＣＨ２ドメインのいくつかの修飾のため、突然変異体ＣＸ Ａｓｎ３２５ＣｙｓＬｅｕ３２８Ｃｙｓ ＣｙｓＰ６は、バイオレイヤー干渉法を使用してＦｃＲｎへの結合について調べられた。その結合定数は、解離がｐＨ５．８（５．２×１０−８対７．２×１０−８ｎＭ）で行われ、そのｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合が保持された場合、野生型セツキシマブに匹敵することが判明した（図６）。
【０２９９】
実施例１０：システインに突然変異した位置でのアミノ酸側鎖の表面露出の決定
ＧＥＴＡＲＥＡプログラム（Ｆｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚら、１９９８年、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．、１９巻、３１９〜３３３頁；ｈｔｔｐ：／／ｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ．ｈｔｍｌからオンラインでアクセス可能）により、タンパク質の溶媒接触可能表面積又は溶媒和エネルギーを迅速に計算することができる。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント１ＯＱＯ．ｐｄｂの原子座標が、インプットとしてプログラムに供給された。１．４オングストロームのプローブ半径が適用された。プログラムのアウトプットを表２４に示す。
【０３００】
主鎖及び側鎖原子からの寄与は、それぞれ４列目及び５列目に列挙されている。次のカラムは、残基あたりの「ランダムコイル」値に対する側鎖表面積の比を列挙する。残基Ｘの「ランダムコイル」値は、３０個のランダム立体配座の集合におけるトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−ＧｌｙにおけるＸの平均溶媒接近可能表面積である。比率の値が５０％を超える場合、残留物は溶媒に曝露されていると見なされ、比率が２０％未満の場合は、最後の列でそれぞれ「ｏ」と「ｉ」とマークされて埋め込まれる。標準の遺伝暗号によってコードされた２０個のアミノ酸の「ランダムコイル」値を表２５に列挙する。
【０３０１】
表２４に示される結果から、２つの残基Ａｓｎ３２５及びＬｅｕ３２８が埋め込まれている（「イン」）ことが見てとれる。
驚くべきことに、ＣＨ２ドメインのＦＧループ内に埋め込まれているこのような残基がシステイン操作に適していることが判明した。先行技術では、薬物コンジュゲーションのためのＦｃ部位指向性システイン操作に適した部位は、主に表面接触可能性に基づいて選択された。例えば、「残基接触可能性」に言及している国際公開第２０１７／１１２６２４Ａ１号、及びシステイン残基への置換のために選択する部位を決定するために表面接触可能性についてすべてのＦｃ位置を評価している国際公開第２０１４／１２４３１６Ａ２号を参照されたい。注目すべきことに、国際公開第２０１４／１２４３１６Ａ２号によれば、３２５及び３２８位（ＥＵナンバリング）は、表面接触可能性が不十分であることが判明したため、したがって、システイン操作から除外された。
【０３０２】
【表２５】
2021500873.tif 000031
【０３０３】
【表２６】
2021500873.tif 000032
【０３０４】
実施例１１：ＩｇＧ形式の単一システイン置換された突然変異体（抗ＨＥＲ２フレームワーク）
単一アミノ酸置換Ａｓｎ３２５Ｃｙｓ及びＬｅｕ３２８Ｃｙｓは、トラスツズマブに由来するＨＥＲ２結合抗体の配列（以下の配列）に導入された。ＤＮＡ鎖をデノボ合成し、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）によって哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５にクローニングした。重鎖構築物を軽鎖構築物と混合し、標準的なプロトコールに従ってＥｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にトランスフェクトした。培養及び発現後、抗体をプロテインＡクロマトグラフィーで精製し、緩衝液をＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に交換した。
【０３０５】
導入されたシステイン残基とともにジスルフィド結合を形成し、それにより効率的なコンジュゲーションを妨げる可能性があるチオール含有分子を除去するために、還元及び再酸化手順を適用した。したがって、抗体あたり４０モル当量のＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン）とともに３７℃で２時間インキュベートすることにより、抗体は完全に還元した。その後、緩衝液をＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に交換し、還元された抗体を２５℃で１．５時間、２０モル当量のＤＨＡＡ（デヒドロアスコルビン酸）を適用して再酸化した。２５℃で２〜１６時間、６モル当量のｍａｌ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥとともにインキュベーションすることによりコンジュゲーションを行い、その後、２５モル当量のＮ−アセチルシステインでクエンチした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより反応混合物を精製した。ＤＡＲ値は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及びＥＳＩ−ＭＳによって決定された。ＨＩＣについて、緩衝液を０．５Ｍ硫酸アンモニウムに調整し、標準のＨＰＬＣシステムを使用して、４０μｇの処理済み抗体を事前に平衡化したＭＡｂＰａｃ  ＨＩＣ−Ｂｕｔｙｌカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に適用した。７５％緩衝液Ａ（２Ｍ硫酸アンモニウム、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）／２５％緩衝液Ｂ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）から０％Ａ／８０％Ｂ／２０％イソプロパノールまでの直線勾配を使用して、２０分かけて試料を溶出し、ｍＡｂ／ＡＤＣシグナルを２８０ｎｍのＵＶ吸収を使用して監視した。
【０３０６】
ＨＩＣクロマトグラム（図９）は、後の溶出時間での抗体ピークの明確なピークへの完全なシフトによって示される効率的であり、特異的なコンジュゲーションを示す。ＨＩＣによれば、ＤＡＲ値は２．０であるか又はわずかに高く、これは質量分析により確認された。
【０３０７】
記載されたシステイン位置を他の公知の位置と比較するために、軽鎖又は重鎖にシステイン突然変異がある７つのさらなるＨＥＲ２結合抗体、すなわち重鎖位置Ｄ２６５Ｃ、Ｓ２３９Ｃ、Ｓ４００Ｃ、Ｋ２９０Ｃ、Ｓ４４２Ｃ及び軽鎖位置Ｖ２０５Ｃ、Ｋ１８３Ｃ（位置すべてＥＵナンバリングに従う）は、同じＨＥＲ２結合するトラスツズマブ様抗体に導入された。先の抗ＨＥＲ２抗体について記載したように抗体をコンジュゲートし、ＨＩＣにより分析した。その後、ＤＡＲ  ２種のＨＩＣ保持時間（ＨＩＣ  ＲＲＴ）をそれぞれの非コンジュゲート抗体の保持時間で割ることによって、ＡＤＣの相対ＨＩＣ保持時間を決定した（表２６）。ＨＩＣ  ＲＲＴはＡＤＣの疎水性の指標であり、毒素の付着に使用される位置に大きく依存する。低ＲＲＴは、良好なインビトロ特性の指標となり得る。位置Ｎ３２５Ｃ及びＬ３２８ＣにコンジュゲートしているＡＤＣは、他の評価された変異体と比較して、より低い範囲のＲＲＴを示す。
【０３０８】
配列番号８９：ａＨＥＲ２軽鎖のタンパク質配列（最初の２０アミノ酸、下線付きのリーダーペプチド）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号９０：ａＨＥＲ２重鎖 Ｎ３２５Ｃのタンパク質配列（最初の１９アミノ酸、下線付きのリーダーペプチド）
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＣＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９１：ａＨＥＲ２重鎖 Ｌ３２８Ｃのタンパク質配列（最初の１９アミノ酸、下線付きのリーダーペプチド）
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＣＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０３０９】
【表２７】
2021500873.tif 000033
【０３１０】
本明細書に記載される一部の実施形態は、以下に関する：
１．特定の抗原結合部分と、１０８及び／又は１１３位でのシステイン置換について操作された、ＣＨ２ドメインを含む抗体Ｆｃ領域とを含む、特定の抗原結合メンバー（ＡＢＭ）であって、ナンバリングはＩＭＧＴに従う、特定の抗原結合メンバー。
【０３１１】
２．ａ）抗原結合部分が上記抗体ＣＨ２ドメインのＮ末端に融合しており；及び／又は
ｂ）抗原結合部分が、ＣＨ３ドメインに及び／又はＦｃ領域に含まれる、
実施形態１に記載のＡＢＭ。
【０３１２】
３．ＣＨ２ドメインが、Ｎ１０８Ｃ及び／又はＬ１１３Ｃである１つ又は２つのシステイン置換を含み、ナンバリングがＩＭＧＴに従う、実施形態１又は２に記載のＡＢＭ。
４．抗原結合部分が、抗体の抗原結合部分、Ｆｃａｂ、酵素、接着タンパク質、リガンド又は受容体のリガンド結合部分を含む、実施形態１〜３のいずれか一つに記載のＡＢＭ。
【０３１３】
５．抗原結合部分が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、抗原結合ＣＨ３、Ｆｃａｂ、及びＣＤＲ又は非ＣＤＲ（若しくは構造的）ループの少なくとも１つの抗体結合部位を含む１つ又は複数の抗体ドメインからなる群から選択される、実施形態１〜４のいずれか一つに記載のＡＢＭ。
【０３１４】
６．抗原結合部分が、リンカー及び／又はヒンジ領域を介してＣＨ２ドメインのＮ末端に融合している、実施形態１〜５のいずれか一つに記載のＡＢＭ。
７．ＣＨ２ドメインのＣ末端がＣＨ３ドメインのＮ末端に融合しており、好ましくは、Ｆｃ領域が、抗体重鎖の二量体からなる抗体Ｆｃである、実施形態１〜６のいずれか一つに記載のＡＢＭ。
【０３１５】
８．Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥアイソタイプのもの、好ましくはヒト抗体のものである、実施形態１〜７のいずれか一つに記載のＡＢＭ。
９．モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体の抗原結合部分、Ｆｃａｂ分子、及びＦｃａｂを含む抗体からなる群から選択される抗体である、実施形態１〜８のいずれか一つに記載のＡＢＭ。
【０３１６】
１０．標的細胞の表面上に発現された標的抗原を特異的に認識する、実施形態１〜９のいずれか一つに記載のＡＢＭ。
１１．実施形態１〜１０のいずれか一つに記載のＡＢＭと、ＣＨ２ドメインの１０８及び１１３位のシステインの一方又は両方に共有結合によりコンジュゲートしている少なくとも１つの異種分子を含み、ナンバリングがＩＭＧＴに従う、ＡＢＭコンジュゲート（ＡＢＭＣ）。
【０３１７】
１２．異種分子が、好ましくは、医薬品原薬、毒素、放射性核種、免疫調節剤、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、光活性治療剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、ペプチド、脂質、炭水化物、蛍光タグ、可視化ペプチド、ビオチン、血清半減期調節剤、捕捉タグ、キレート剤、及び固体支持体からなる群から選択される、疾患の診断、治癒、緩和、治療、又は予防に適切に使用される物質である、実施形態１１に記載のＡＢＭＣ。
【０３１８】
１３．異種分子が、コンジュゲーションリンカーを介してＣＨ２ドメインの１０８及び１１３位のシステインの一方又は両方にコンジュゲートしており、ナンバリングがＩＭＧＴに従う、実施形態１１又は１２に記載のＡＢＭＣ。
【０３１９】
１４．コンジュゲーションリンカーがマレイミド基を含む、実施形態１３に記載のＡＢＭＣ。
１５．実施形態１〜１０のいずれか一つに記載のＡＢＭをコードする１つ又は複数の核酸分子を含む発現系。
【０３２０】
１６．実施形態１５に記載の発現系を含む宿主細胞。
１７．実施形態１〜１０のいずれか一つに記載のＡＢＭを調製する方法であって、実施形態１６に記載の宿主細胞が、上記ＡＢＭを生成する条件下で培養されるか又は維持される、方法。
【０３２１】
１８．非経口製剤中に実施形態１〜１０のいずれかに記載のＡＢＭ、又は実施形態１１〜１４のいずれか一つに記載のＡＢＭＣ、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬製剤。
【０３２２】
１９．実施形態１１〜１４のいずれか一つに記載のＡＢＭＣを生成する方法であって、
ａ）実施形態１〜１０のいずれか一つに記載のＡＢＭを用意するステップ；及び
ｂ）部位特異的コンジュゲーション法により、ＣＨ２ドメインの１０８及び１１３位のシステインの一方又は両方の少なくとも１つのチオール基を異種分子と反応させるステップ
を含む方法。
【０３２３】
２０．上記少なくとも１つのチオール基が、マレイミド基を含むコンジュゲーションリンカーを使用して、マイケル反応によって上記異種分子と反応する、実施形態１９に記載の方法。
【図１】
2021500873.tif 000034
【図２】
2021500873.tif 000035
【図３】
2021500873.tif 000036
【図４】
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【図５−１】
2021500873.tif 000038
【図５−２】
2021500873.tif 000039
【図５−３】
2021500873.tif 000040
【図６】
2021500873.tif 000041
【図７】
2021500873.tif 000042
【図８】
2021500873.tif 000043
【図９】
2021500873.tif 000044
【配列表】
2021500873000001.app
【国際調査報告】
2021500873.tif 000045
2021500873.tif 000046
2021500873.tif 000047