(57)【要約】      （修正有）【課題】２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの直接又は間接発現を刺激し得る活性成分の提供。【解決手段】炎症反応、刺激反応又は過敏反応を引き起こすことなく２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの直接又は間接発現を刺激し得る活性成分としては、（ｉ）キノア抽出物、ボルドー抽出物及びキノア抽出物とボルドー抽出物の混合物からなる群から選択されるいずれかの抽出物、（ｉｉ）ジャスモン酸、又は、（ｉｉｉ）それらの混合物から選択され、０．００１％〜２０重量％の濃度範囲で使用され、殺菌性又は抗真菌性効果を発揮する化粧用組成物及び医薬組成物であり、又上記活性成分を選択するためのスクリーニング方法も含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症反応、刺激反応及び過敏反応を引き起こさないで、２型ヒトβ−デフェンシン（ｈＢＤ２）、３型ヒトβ−デフェンシン（ｈＢＤ３）並びに２型及び３型ヒトβ−デフェンシン（ｈＢＤ２及びｈＢＤ３）から選択されるヒトβ−デフェンシンの発現を刺激する組成物であって、その活性成分が（ｉ）キノア抽出物、ボルドー抽出物及びキノア抽出物とボルドー抽出物の混合物からなる群から選択されるいずれかの抽出物、（ｉｉ）ジャスモン酸、又は、（ｉｉｉ）それらの混合物から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記活性成分が、ＭＩＰ３アルファ（マクロファージ炎症タンパク質）、ＩＬ８、ＩＬ１、ヒスタミン、トリプターゼ、サブスタンスＰ、ロイコトリエン、及びプロスタグランジンからなる群から選択される前炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子を刺激しないことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記活性成分は、０．００１％〜２０重量％の濃度範囲で存在することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
化粧用組成物を得るために、前記活性成分が化粧品用として許容できる賦形剤と混合されている請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
医薬組成物を得るために、前記活性成分が医薬的に許容できる賦形剤と混合されている請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、治療した組織で殺菌性又は抗真菌性効果を発揮するための化粧用組成物である請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
微生物的要因に関わる病気の治療のために、更に他の抗微生物剤からなることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ＭＩＰ３アルファ（マクロファージ炎症タンパク質）、ＩＬ８、ＩＬ１、ヒスタミン、トリプターゼ、サブスタンスＰ、ロイコトリエン、及びプロスタグランジンからなる群から選択される前炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子を刺激しないで、２型ヒトβ−デフェンシン（ｈＢＤ２）、３型ヒトβ−デフェンシン（ｈＢＤ３）並びに２型及び３型ヒトβ−デフェンシン（ｈＢＤ２及びｈＢＤ３）から選択されるヒトβ−デフェンシンの発現を刺激する薬剤であって、（ｉ）ジャスモン酸、（ｉｉ）キノア抽出物及びボルドー抽出物からなる群から選択されるいずれかの抽出物、又は、（ｉｉｉ）それらの混合物から選択されることを特徴とする薬剤。
【請求項９】
ＭＩＰ３アルファ（マクロファージ炎症タンパク質）、ＩＬ８、及びＩＬ１−アルファからなる群から選択される前炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子を刺激しないで、３型ヒトβ−デフェンシン（ｈＢＤ３）の発現を刺激する薬剤であって、（ｉ）ジャスモン酸、（ｉｉ）キノア抽出物、ボルドー抽出物、ヨモギ抽出物、ウサギギク抽出物及びアレカ抽出物からなる群から選択されるいずれかの抽出物、又は、（ｉｉｉ）それらの混合物から選択されることを特徴とする薬剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は主に２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの直接又は間接発現を刺激し得る活性成分に関する。
本発明は主に上記活性成分を含む化粧組成物又は医薬組成物にも関する。
本発明は主に上記組成物を用いる治療方法に関する。
本発明は主に上記活性成分を選択する際のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
従来の技術
抗菌性ペプチドは、細胞膜を透過することによって細菌、真菌又はウィルスのような微生物を殺すことができる小さな分子（１０〜５０アミノ酸残基）である。１９８１年に節足類において発見されて以降、このような性質を持つものが高等動物（植物、昆虫、哺乳類及び人類）で約５００分子同定されている。抗菌性ペプチドは、疎水領域とは性質の異なる陽イオン性（正に荷電している）領域にアミノ酸を分配する両親媒性構造を有するという、共通の性質を持つ。細胞膜は負に荷電した陰イオン性リン脂質を多数有しており、これらは抗菌性ペプチドの陽イオン部位に結合するため、抗菌性ペプチドが細菌の細胞質膜に対して作用するという活性及び特異性を持つのはこの両親媒性構造による（Ｚａｌｓｏｆｆ  Ｍ．  多細胞生物の抗菌性ペプチド（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．）  Ｎａｔｕｒｅ  ２００２；４１５：３８９−３９５）。この構造によって、抗菌性ペプチドの活性領域は大変狭くもなるし、大変広くもなる。
【０００３】
抗菌性ペプチドは、動物界においては、毒液（サソリ類、ハチ類、クモ類）、キイロショウジョウバエ又は青色ハエ、ウシ好中球、白血球、ブタ小腸、乳、カエル、チレニアイガイ等の中で主に発見されている。植物界においては、チオニンやデフェンシンが種子や栄養組織を細菌から保護している。
【０００４】
抗菌性ペプチドのほとんどは、動物の上皮組織において発見され、最初の免疫障壁として重要な役割を果たしている。抗菌性ペプチドは、ヒトの胃腸系や呼吸器系及びヒトの皮膚や粘膜、並びに、カエルやマウスの皮膚において発見されている。
【０００５】
デフェンシン類は、抗菌性ペプチドの中で最も研究の進んだ類の一つである。デフェンシン類は、ジスルフィド架橋を３つ有するシステインを多く含む分子からなる。このような分子は、植物、昆虫及び多様な哺乳類において発見されている。人類においては、６つのシステイン残基間の間隔や結合が互いに異なる２つの類のデフェンシンが発見されている。
−α−デフェンシン（６種類）：好中球（ＨＮＰ１〜４、ヒト好中球ペプチド）から単離されたもの、及び、胃腸系のパネス細胞（Ｐａｎｅｔｈ  ｃｅｌｌｓ）に存在するもの（α−デフェンシン５及び６）。
−β−デフェンシン：α−デフェンシンより長くて塩基性が強く、粘膜や上皮細胞（皮膚、気管、舌、扁桃、唾液等）に発現し、３種類の形態で存在している。
・ｈＢＤ１（ヒトβ−デフェンシン１）：構成性で、主として肝臓において発現しているが、膵臓、唾液、肺、胎盤及び皮膚にも発現している。
・ｈＢＤ２及びｈＢＤ３（ヒトβ−デフェンシン２及び３）：２種とも誘導性。
−ｈＢＤ２は、皮膚、気管、肺に発現しており、その発現は細菌、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子）（Ｈａｒｄｅｒ  Ｊ．ら、ヒト皮膚由来の抗菌性ペプチド（Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ．）  Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３８７：８６１）、ＬＰＳ（リポ多糖類）（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  Ｅ．ら、口粘膜及び唾液腺におけるβ−デフェンシン抗菌性ペプチドの産生（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ａｎｄ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄｓ．）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９９；６７：２７４０−２７４５）、ＩＬ１α及びＩＬ１β（インターロイキン１）（Ｌｉｕ  ＡＹら、ケラチノサイトにおけるヒトβ−デフェンシン−２の産生はインターロイキン−１、細菌及び分化状態によって制御される（Ｈｕｍａｎ  β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１，  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００２；１１８：２７５−２８１）に刺激されて誘導される。これらは全て炎症プロセスに関係するという共通の性質を持っている。ｈＢＤ２の抗菌活性は、大腸菌のようなグラム陰性菌に特に有効である。
−ｈＢＤ３は、皮膚、気管、扁桃及び舌（Ｈａｒｄｅｒ  Ｊ．ら、新規ヒト誘導性抗菌性ペプチドであるヒトβ−デフェンシン−３の単離と特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−３，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ．）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１；２７６：５７０７−５７１３）並びに筋組織や心臓で見出される（Ｃｏｎｅｊｏ  Ｇａｒｃｉａら、特異的抗菌活性を持つ新規多機能性β−デフェンシン（ヒトβ−デフェンシン−３）の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ，  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ（ｈｕｍａｎ  β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−３）  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．）  Ｃｅｌｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１；３０６：２５７−２６４）。ｈＢＤ３は、細菌ＴＮＦα及び特に炎症プロセスに関与する分子に共通の性質も持っているＩＦＮγ（ガンマインターフェロン）に刺激されて誘導される。ｈＢＤ３の活性のスペクトルは、グラム陰性菌及び黄色ブドウ球菌のようなグラム陽性菌を溶解することができるので、ｈＢＤ２のスペクトルよりも広い。
【０００６】
皮膚における上記デフェンシンの誘導は、病原性微生物の増加に直面した際に自分自身を守るという体の防衛機構の第一段階である。更に、ｈＢＤ２は、未分化樹状突起細胞及び記憶細胞であるＴ−リンパ球に対して走化性を持っており（Ｙａｎｇ  Ｄ．ら、β−デフェンシン：樹状突起Ｔ細胞ＣＣＲ６を介して、自然免疫と適応免疫をつないでいるもの（Ｂｅｔａｄｅｆｅｎｓｉｎｓ：ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ＣＣＲ６．）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９；２８６：５２５−５２８）、従って免疫応答、炎症及び治癒を促進するのに重要な役割を果たしているようである。
【０００７】
そのため、ヒト皮膚におけるβ−デフェンシン量の増加は、病原性である可能性のある特定種（黄色ブドウ球菌）が皮膚の微生物の生態系に過度に進入するのを防ぐことによって、皮膚を保護して健全に保つのに寄与している。ヒト皮膚においてβ−デフェンシン量を増加させるためには：
−当業者によって記載された公知の抗菌性ペプチドに類似した配列又は構造を持つ合成ペプチドを局所的に投与する
−又は、天然分泌細胞において抗菌性ペプチドの合成を刺激することができる活性物質を局所的又は経口的に投与することにより、デフェンシンの誘導を刺激する
という２つの方法が想定できる。
【０００８】
前に挙げたサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ１）は例外であるが、動物においてＬ−イソロイシンがウシ腎臓上皮細胞系におけるｈＢＤ３の発現を誘導するのを除いて、β−デフェンシンを誘導することのできる抗菌性ペプチドとして記述されたものはほとんどない（Ｆｅｈｌｂａｕｍ  Ｐ．ら、必須アミノ酸は上皮β−デフェンシンの発現を誘導する（Ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．）  ＰＮＡＳ  ２０００；９７：１２７２３−１２７２８；特許ＷＯ０１６８０８５号  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｍ．ら、デフェンシンの産生を刺激する方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．）  ２０−０９−２００１）。ヒトにおいて、ケラチノサイトの分化がｈＢＤ２の産生を刺激するということが分かっている（Ｌｉｕ  ＡＹ  ら、ケラチノサイトにおけるヒトβ−デフェンシン−２の産生はインターロイキン−１、細菌及び分化状態によって制御される（Ｈｕｍａｎ  β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１，  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００２；１１８：２７５−２８１）。
【０００９】
皮膚におけるｈＢＤ２及びｈＢＤ３デフェンシンの存在に関する研究は、皮膚切片、外植片、培養細胞又は再生皮膚を用いて行われた。デフェンシン量の増加は、いくつかの技術によって視覚化することができるが、これらの技術は、ヒト細胞においてｈＢＤ２及びｈＢＤ３を定量的に刺激できる活性成分のスクリーニングによる探索にはまだ適用されていない。実際、当業者が従来用いている技術を、この問題、すなわちヒトデフェンシンを刺激し得る活性成分の定量的且つ立証済みの方法での探索に適用することはできない（ＥＬＩＳＡ法で用いるタンパク質の定量分析のための抗体が市販されていない。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション型の分子生物学的手法、ノーザン転写及びＲＴ−ＰＣＲは定量的というよりは定性的であり、また、大変複雑な三次元培養におけるヒト細胞のモデルはスクリーニングでは用いることができない）。このような分析は、本発明の範囲内において開発されるであろう。
【００１０】
発明の目的
本発明者の目的は、炎症反応を引き起こすことなく、且つ、例えば通常炎症反応で発現される分子の分泌を過剰に刺激することなく、２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの発現を誘導することのできる活性成分の同定である。
【００１１】
今までのところ、ヒト中でデフェンシンを刺激する能力のあるものとして述べられている分子（ＴＮＦα、ＩＬ１、ＬＰＳ、細菌、ＩＦＮγ等）は全て前炎症性を有している。上記分子はＩＬ１α、ＩＬ８、又は、ＭＩＰ３α等の炎症性サイトカインを刺激する。
【００１２】
それ故、本発明の目的は、炎症反応、刺激反応又は過敏反応を引き起こすことなく２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの直接的又は間接的発現を刺激することのできる活性成分を提供するという新しい技術的問題を解決することである。
【００１３】
本発明の目的は、前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子の直接合成若しくは間接合成を刺激することなく、又は、感知できるほどには刺激することなく２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの直接的又は間接的発現を刺激することのできる活性成分を提供するという新しい技術的問題を解決することである。
【００１４】
故に、本発明の目的は、上述の少なくとも一つの活性成分を含む組成物を提供するという新しい技術的問題を解決することである。
【００１５】
本発明の目的は、上述の活性成分のスクリーニングを可能にする組織モデル又は細胞モデルを提供するという新しい技術的問題を解決することである。
【００１６】
本発明の目的は、上記の活性成分をスクリーニングする方法を提供するという新しい技術的問題を解決することである。
【００１７】
本発明の目的は、化粧品又は医薬の分野での使用のための、上述の活性成分を含有する組成物を提供するという新しい技術的問題を解決することである。
【００１８】
この使用は、殺菌性及び／又は抗真菌性活性を発揮するために、好ましくは組織、例えば、皮膚、粘膜、髪と爪又は頭皮に局所投与されることによって本質的に行なわれる。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明者らは、本発明の活性成分によって刺激されるデフェンシンについて述べるために下記用語を使用するときには、「活性体（ａｃｔｉｖｅ）」という用語をスクリーニングできる可能性のある活性成分を呼ぶために用い、「デフェンシン類（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）」という用語を２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンを呼ぶために用いる。
【００２０】
第一の態様によれば、本発明は炎症反応、刺激反応又は過敏反応を起こさずに、２型ヒトβ−デフェンシン及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの、直接的又は間接的発現を刺激することのできる活性成分に関する。
【００２１】
本発明者らは、「炎症反応、刺激反応又は過敏反応を起こさずに」という用語を、これらの活性成分を使用することにより、上記活性成分の使用者に対して障害となるようないかなる有害な効果も及ぼさない、ということを意味する為に使用する。「障害となるような」という用語は、発疹、痒み、刺激、敏感性肌などの反応を意味する。
【００２２】
好ましくは、２型ヒトβ−デフェンシン（ｈＢＤ２）及び／又は３型ヒトβ−デフェンシン（ｈＢＤ３）の直接又は間接発現を刺激することのできる上記活性成分は、前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子の合成を直接的若しくは間接的に刺激しない、又は、感知できるほどには刺激しない。
【００２３】
本発明者らは、「前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子の合成を直接的若しくは間接的に刺激しない、又は、感知できるほどには刺激しない」という用語を、上記活性成分は前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子を刺激しない、又は、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）又はガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）によって誘導されるものよりも少ない程度にしか刺激しないことをいうために使用し、好ましくは、同一の温度、接触時間、及び、処理条件でＴＮＦアルファ又はガンマインターフェロンにより誘導された最大刺激の７５％より低い刺激である。
【００２４】
前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子は特にＭＩＰ３アルファ、ＩＬ８若しくはＩＬ１、又は、他のインターロイキン、又は、ヒスタミン、トリプターゼ、サブスタンスＰ、ロイコトリエン類、又は、プロスタグランジン類であることが有利である。
【００２５】
有利には、ヒト上皮細胞の培養物、特に培養中のケラチノサイト及び／又はコルネオサイトにおいて、又は、生存状態が維持されているヒト皮膚生検試料において、又は、細胞マトリックス上若しくは表皮が除去された皮膚上で生成されるか生成されない再生表皮のモデル若しくは再生皮膚のモデルにおいて、上記活性成分は前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子の直接的な又は間接的な産出を感知できるほどには刺激しない。上記上皮細胞は「正常」であることが好ましい。
【００２６】
本発明者らは、「正常」という用語を、未不死化された細胞系由来の上皮細胞ではなく、病的細胞、又は、遺伝子的に変成された細胞由来の細胞であっても良い上皮細胞を意味するものとして使用する。
【００２７】
好ましくは、上記活性成分は、ヨモギの根、ヒメムカシヨモギ、ニワトコの樹皮、コゴメビユ、パイナップル果汁、ペパーミント、アレカ、カカオ、キノア、ウサギギク、ボルドー、サルサパリラ、クルミノキの葉、ハイビスカスの花、カボチャ、ヒマワリ、ボタン、セイヨウオトギリソウ、セイヨウトチノキ、又は、これらの抽出物、ジャスモン酸又はビタミンＡ、それらの誘導体及び前駆体、アルファ−ＭＳＨ又はアルファ−ＭＳＨを構成するペプチドの一つ若しくはそのペプチドに化学構造が類似するもの、イソロイシンエステル、カルシウム又はカルシウムの有機塩若しくは無機塩から選択される。
【００２８】
植物由来の上記活性成分は抽出、好ましくは水性抽出によって得るのが有利であるが、例えば、水／ブチレングリコール混合液（１／９９から９９／１、重量／重量）等の他の抽出方法によっても得られる。ジャスモン酸又はビタミンＡ、その誘導体及び前駆体、アルファ−ＭＳＨ、又は、アルファ−ＭＳＨを構成するペプチドの一つ若しくはそのペプチドに化学構造が類似するもの、イソロイシンエステル及びカルシウム、又は、いずれかの有機若しくは無機のカルシウム塩は、水、又は、エタノール若しくは上述のモデルが可溶な他の溶媒中で希釈される等して用いられる。
【００２９】
第二の態様によれば、本発明は少なくとも一つの上述の活性成分を含んでいる組成物に関する。
【００３０】
上記組成物は、上記活性成分を０．００１％〜２０％、好ましくは０．０１〜１０％の濃度範囲で含んでいるのが有利である。この濃度は、特にこの百分率が重量％であることを明記していなくても重量％で表している。
【００３１】
活性成分が２型及び／又は３型ヒトβデフェンシンの発現を刺激することはできるが、いかなる刺激や炎症を誘導しない、特に、前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子の直接合成若しくは間接合成を刺激しないよう、又は、感知できるほどには刺激しないように、濃度を最適化する。
【００３２】
第三の態様によれば、本発明は化粧用組成物の製造に上述の活性成分の一つを使用することに関する。２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの発現を刺激することはできるが、いかなる刺激や炎症も誘導しない、特に、前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される一以上の分子の直接合成若しくは間接合成を刺激しない、又は、感知できるほどには刺激しないような濃度で上記活性成分を存在させる。上記活性成分は化粧品用として許容される賦形剤と混合しても良い。
【００３３】
第四の態様によれば、本発明は医薬組成物の製造に上述の活性成分の一つを使用することに関する。２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの発現を刺激することはできるが、刺激や炎症を誘導せず、特に、前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子の一以上の直接合成若しくは間接合成を刺激しない、又は、感知できるほどには刺激しないような濃度で上記活性成分を存在させる。上記活性成分は医薬的に許容される賦形剤と混合しても良い。
【００３４】
上記組成物は、殺菌剤（ｍｉｃｒｏｂｉｏｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）又は微生物増殖抑制剤（ｍｉｃｒｏｂｉｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）の少なくとも一つを含んでいることが好ましい。本発明者らは、「殺菌剤」という用語を細菌に対して破壊効果を有する薬品の群を述べるのに使用し、また、「微生物増殖抑制剤」という用語を、細菌増殖を制限する効果を有する薬品の群を述べるのに使用している。
【００３５】
第五の態様によれば、本発明は、２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの発現を刺激することはできるが、刺激や炎症を誘導せず、特に、前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される一以上の分子の直接合成若しくは間接合成を刺激し得ない、又は、感知できるほどには刺激し得ない活性成分の少なくとも一つのスクリーニングを可能にする細胞モデル又は組織モデルに関する。
【００３６】
上記細胞モデル又は組織モデルは適切な条件、具体的には、０〜１００ｍＭ、好ましくは１．７ｍＭのカルシウムを含む培養条件下で培養するのに好適な上皮細胞（例えばケラチノサイト及び／又はコルネオサイト）を含んでいることが有利である。
【００３７】
第六の態様によれば、本発明は、２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの直接的又は間接的発現を刺激することはできるが、刺激や炎症を誘導せず、特に前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される一以上の分子の直接合成若しくは間接合成を刺激し得ない、又は、感知できるほどには刺激し得ない活性成分のスクリーニング方法に関し（この活性成分は本発明の中では「スクリーニングできる可能性のある活性成分」と呼ぶ）、以下の工程：
ａ）適当な培養条件下におけるさまざまなスクリーニングできる可能性のある活性成分の存在下での細胞モデル又は組織モデルの培養；少なくとも一つのスクリーニングできる可能性のある活性成分に対しこの方法は適用することができるが、同時に多量の活性成分（又は「活性体」）をテストするのがより好ましい；
ｂ）２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシン発現の刺激の有無の、直接的又は間接的確認
ｃ）この活性成分の非刺激性及び非炎症性の確認、特に、前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子の直接合成又は間接合成の刺激が無いことの確認
からなる。
【００３８】
上記スクリーニング方法は、上記のようにテストされ、且つ、２型及び／又は３型β−デフェンシンの直接的又は間接的発現を刺激し得るが、前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子の直接合成若しくは間接合成を同時には刺激し得ない、又は、感知できる程には刺激し得ない少なくとも一つの活性成分が選択される工程ｄ）をさらに含むのが有利である。
【００３９】
本発明者らが発明を、本発明のスクリーニングの本質を実施するための単なる手段に過ぎない特定の分析方法に限定していないということを、読者らは明らかに認識するであろう。
【００４０】
実際に、将来的には本発明中の発明者らによって使用された分析方法が、ｈＢＤ２又は３を認識する抗体を用いる方法（ＥＬＩＳＡ型法、イムノブロッティング、イムノヒストロジー等）等の他の方法で置き換えられても良い。
【００４１】
上記スクリーニング法は、工程ａ）において、上皮細胞、生存状態が維持されている皮膚生検試料、又は、再生表皮のモデル若しくは再生皮膚のモデルを含有する細胞モデル又は組織モデル、具体的には、０〜１００ｍＭ、好ましくは１．７ｍＭのカルシウムが含まれる培養条件下で培養するのに好適な、例えばケラチノサイト及び／又はコルネオサイト等の上皮細胞が含まれる細胞モデル若しくは組織モデルが包含されることが好ましい。
【００４２】
上記スクリーニング法は、工程ａ）において、スクリーニングできる可能性のあるさまざまな活性成分を、細胞モデル又は組織モデルと共に６から４８時間、好ましくは約１６時間（接触時間）存在させることが有利である。
【００４３】
上記スクリーニング法は、総ＲＮＡを抽出し、上述の２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンをコードするｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を工程ｂ）中で行なうことが好ましい。
【００４４】
上記スクリーニング法は、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３をコードするｍＲＮＡの増加が、アクチンに対してコードするｍＲＮＡに相関するようなアクチン（弱刺激性リポーター遺伝子）のＲＴ−ＰＣＲを工程ｂ）中で行なうのが有利である。
【００４５】
上記スクリーニング法は、ＵＶ下で可視化できる核酸挿入（臭化エチジウム等）を含むアガロースゲルに増幅させたｍＲＮＡをのせることを工程ｂ）中で行なうのが有利である。
【００４６】
上記スクリーニング法は、アガロースゲルでの生成物の電気泳動後に、ＵＶ光下でｈＢＤ２／アクチンバンドとｈＢＤ３／アクチンバンドの強度比の比較を工程ｂ）中で行なうのが有利である。
【００４７】
上記スクリーニング法は、前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子に対するＥＬＩＳＡ型分析を工程ｃ）中で行なうのが有利である。
【００４８】
上記スクリーニング法は、前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子の直接合成又は間接合成を刺激せずに、又は、感知できるほどには刺激せずに、上記２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンをコードするｍＲＮＡの発現を刺激することができる少なくとも一つの活性成分の選択を工程ｄ）中で行なうのが好ましい。
【００４９】
上記スクリーニング法では、上記ヒトβ−デフェンシンの発現を刺激し、一以上の前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される一以上の分子（例えば、ＩＬ１、ＩＬ８、及び、ＭＩＰ３α等）を刺激しない、又は、感知できるほどには刺激しない活性成分の選択を行なうことが有利である。
【００５０】
上記スクリーニング法は、下記の工程を含んでいるのが有利である：
−スクリーニングできる可能性のある活性成分と正常ヒトケラチノサイトを、血清は含まないがカルシウムを多く含む特異的培地中で、例えば未処理対照と二つの陽性対照を同時に（ＴＮＦαに対してｈＢＤ２及びＩＦＮγに対してｈＢＤ３）セットアップすること等により単層中で接触させる工程：
−次に、分光光度計を使って、好ましくは波長が２６０〜２８０ｎｍの範囲で総ＲＮＡを抽出・分析する工程：必要ならばこのＲＮＡは希釈しても良い：
−アクチン、ｈＢＤ２、及び、ｈＢＤ３のＲＴ−ＰＣＲを、総原ＲＮＡを元にして行なう工程
−総ＲＮＡのレトロ転写、次にレトロ転写した産物（ｃＤＮＡ）の増幅を例えばサーモサイクラー中で、アクチン、ｈＢＤ２、及び、ｈＢＤ３に共通の増幅プログラムに従って行なう工程。
−ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及び、アクチンの増幅産物を混合し、次にチャージバッファーと水（２／３）の混合液を加え、最終溶液をあらかじめ成型した臭化エチジウムを含むアガロースゲルにのせた。試料を電気泳動させ、この手法で得られたバンドをＵＶ下で（好ましくは暗室で）視覚化し、デジタル写真化することができる。バンドをこの段階で分析して強度を定量化する。デフェンシンの発現の基底量（未処理対照）は検出できないので、ｈＢＤ２／アクチン及びｈＢＤ３／アクチンのバンドの強度比を、例えば、陽性対照（ｈＢＤ２に対してＴＮＦαで処理したもの、ｈＢＤ３に対してＩＦＮγで処理したもの）に対して得られる強度比と比較することで、問題のβ−デフェンシン発現の刺激があるかどうかが分かる。
【００５１】
このスクリーニング方法は、さらに次の工程を含んでいるのが有利である；
−２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの発現に効果を発揮する、スクリーニングできる可能性のある活性成分を選択する工程。活性体に対応する上清をテストして、前炎症過程において通常共発現する分子（例えばこの活性体の効果の下、培養培地中で分泌されるＭＩＰ３α、ＩＬ１、及びＩＬ８等）の量を測定する。次に、例えばお互いの結果を比較するためにその量は定量したＲＮＡの濃度と照合することができる。
【００５２】
有利には、上記のスクリーニング方法によれば、２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの直接的又は間接的発現を刺激することができる活性成分が、前炎症性分子又は通常炎症プロセスで共発現する分子の直接若しくは間接合成を同時には刺激しない、又は、感知できるほどには刺激しないことを検出することが可能になる。この時、上記活性成分は、ヨモギの根、ヒメムカシヨモギ、ニワトコの樹皮、コゴメビユ、パイナップル果汁、ペパーミント、アレカ、カカオ、キノア、ウサギギク、ボルドー、サルサパリラ、クルミノキの葉、ハイビスカスの花、カボチャ、ヒマワリ、ボタン、セイヨウオトギリソウ、セイヨウトチノキ、又は、これらの抽出物、ジャスモン酸又はビタミンＡ、それらの誘導体及び前駆体、アルファ−ＭＳＨ又はアルファ−ＭＳＨを構成するペプチドの一つ若しくはそのペプチドに化学構造が類似するもの、イソロイシンエステル、カルシウム又はカルシウムの有機塩若しくは無機塩から選ばれる。
【００５３】
第七の態様によれば、本発明は治療した組織、特に皮膚、粘膜、髪及び爪、又は、頭皮に対して殺菌性及び／又は抗真菌効果を発揮するために使用される化粧用組成剤の製造のための活性成分の使用に関する。頭皮の場合には、上記化粧用組成剤はふけの予防又は治療に使用することができる。
【００５４】
本発明の好適な実施形態によれば、本発明の課題である活性成分は、老化プロセス、及び／又は、環境及び／又は気候（寒さ、紫外線等）によって引き起こされるストレスへの曝露、及び／又は、皮膚の生態系に対して刺激の強いクレンジング方法によって脆弱になった皮膚の保護を強化する他の化粧活性物質と併用することもできる。本発明から得られる組成物は、化粧品、及び、特に水性溶液（ゲル化されたものでも使用できる可能性がある）、ローションタイプの分散液（二層分散液でも使用できる可能性がある）、水／オイル又はオイル／水の乳液、三層乳液（ｔｒｉｐｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）又は小胞分散液の形態で使用される生薬の形態であってもよい。この組成物の外見は乾燥状態又は多少液体状態であってもよく、又は、白色若しくは着色クリーム、血清又はムースであってもよい。皮膚にはエアゾール又はスティックの形で塗布しても良い。美容製品及び／又は皮膚用のメークアップ製品として、及び／又は、皮膚、粘膜、髪と爪及び頭皮のクレンジング用製品として使用することもできる。本発明から得られる組成物は、さらにゲル化剤、活性体、防腐剤、オイル、溶媒、酸化防止剤、香水、チャージ、顔料、フィルター、脱臭剤及び染料等の化粧品中で有用な全ての添加剤を含んでも良い。  
【００５５】
好適なことに、少なくとも一つの殺菌剤及び／又は微生物増殖抑制剤を含んだ上記の組成物は特に化粧品及び医薬品分野、皮膚のβ−デフェンシンの殺菌性効果とこれらの化合物の効果を結びつけることにより、特に皮膚の叢を制御するのに有用である。
【００５６】
第八の態様によれば、本発明は、特にアクネ及び細菌性又は真菌性皮膚炎の治療及び／又は予防のために、治療した組織における殺菌性及び／又は抗真菌性効果を発揮することを意図している医薬組成物の製造のための活性成分の使用に関する。
【００５７】
少なくとも一つの殺菌剤及び／又は微生物増殖抑制剤を含んだ上記の組成物は、特に医薬分野で有用であり、特に、ふけ、アクネ、白斑、皮膚炎及び微生物が要因となって引き起こされる皮膚、粘膜、頭皮及び爪の疾患等の、微生物に関係する疾患の治療のために、皮膚β−デフェンシンの殺菌性効果とこれらの薬品の効果を組み合わせるのが有利である。
【００５８】
本発明者らは、前炎症性分子又は通常は炎症反応、刺激反応又は過敏反応等が認められ得る炎症プロセスにおいて共発現される分子の直接合成又は間接合成を示す分析方法を使用した。
【００５９】
本発明は、炎症反応、刺激反応又は過敏反応を示すために、例えば処置すべき組織に塗布して感じる痒み、不快感、緊張感を評価すること等、種々の方法によって行なうことができる。
【００６０】
この態様のいずれかに適用可能な本発明の他の好適な性質によれば、２型及び／又は３型ヒトβ−デフェンシンの直接又は間接発現を刺激することはできるが、前炎症性分子又は炎症プロセスで通常共発現される分子の直接合成若しくは間接合成を刺激しない、又は、感知できるほどには刺激しないような活性成分が選択される。例えば、ＩＬ１α、ＩＬ８及びＭＩＰ３α等の炎症プロセス中に通常共発現されるサイトカインである。
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明者らによって開発された本発明の方法は、スクリーニングによって活性成分を選択し、次に表皮細胞中でｈＢＤ２及び／又はｈＢＤ３デフェンシンｍＲＮＡの量を増大させることができる活性成分を同定することができる方法であって、上記活性成分が炎症反応、刺激反応若しくは過敏反応を引き起こさない、又は、感知できるほどには引き起こさないことを特徴とする。
【００６２】
スクリーニングの方法は次の工程から成る。
正常なヒト表皮細胞、好ましくは正常なヒトケラチノサイトは血清の全くない特異的培地中で、カルシウム濃度が０〜１００ｍＭの範囲、好ましくは１．７ｍＭの濃度で、単層として培養される。与えられたコンフルエンスにおいて、好ましくは７５％〜９５％、好ましくは８０％の細胞が、スクリーニングできる可能性のある活性成分と６〜４８時間の範囲で、好ましくは１６時間接触している。少なくとも一つの未処理対照及び少なくとも一つの陽性対照が、（好ましくは同一の培養プレート上で）同時にセットアップされ、スクリーニングを促進する。陽性対照は、ｈＢＤ２に対してＴＮＦα、ｈＢＤ３に対してＩＦＮγであって、スクリーニングされる活性成分を置き換える。その濃度は１〜５００ｎｇ／ｍＬが有利であり、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬである。このようにして接触させた後、上清は回収されて、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した後に例えば−８０℃で乾燥凍結することができる。総ＲＮＡは抽出されて（好ましくは２６０〜２８０ｎｍで）分光測光法で分析され、総ＲＮＡは好ましくは２〜５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈される。定性ＲＴ−ＰＣＲをアクチン、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３で行なう。使用するプライマーは文献より導き（ｈＢＤ２に対しては、Ｈａｒｄａｒ  Ｊ．ら、「ヒト皮膚由来の抗生ペプチド」（“Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ”）、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３８７：８６１、及び、ｈＢＤ２に対しては、「ヒトβ−デフェンシン−３の単離と特徴付け、新規のヒト誘導性抗生ペプチド（“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｒａｃｔｅｒｉｚｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−３，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ”）」  Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１，２７６：５７０７−５７１３）、また、
−アクチン：
センス：５’−ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ−３’（配列番号  Ｎｏ．１）
アンチセンス：５’−ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ−３’  （配列番号  Ｎｏ．２）
−ｈＢＤ２：
センス：５’−ＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＧＴ−３’  （配列番号  Ｎｏ．３）
アンチセンス  ５’−ＧＧＡＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＣＡ−３’ （配列番号  Ｎｏ．４）
−ｈＢＤ３：  
センス  ５’−ＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＧＡＴＣ−３’ （配列番号  Ｎｏ．５）  
アンチセンス  ５’−ＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＧＧＣＣＡ−３’（配列番号  Ｎｏ．６）
である。
【００６３】
ＲＴ−ＰＣＲに使用されるプライマーの配列は、検討される遺伝子（アクチン、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３）に特異的である限り、ここに挙げたものと異なっていても良い。
ＲＴ−ＰＣＲは、原ｍＲＮＡの量が１０〜１００ｎｇ、好ましくは５０ｎｇで、サーモサイクラー中で行なうのが好ましいが、一般的なプログラムにて行なってもよい。
この段階で原ｍＲＮＡを増幅させる。
ＲＴ−ＰＣＲの温度及び時間パラメータは、使用するプライマー及び材料の関数として変化させることができる（サーモサイクラー、ＲＴ−ＰＣＲキットサプライアー等）。
【００６４】
増幅後、生成物を混合し、チャージバッファーと水（２／３）の混合緩衝液を加える。最終溶液は、あらかじめ成型した、ＵＶ下で可視化するための核酸挿入（臭化エチジウム等）を含むアガロースゲルの上に、例えば２％でのせる。サンプルを電気泳動し、バンドは暗室内で、ＵＶ下で可視化され、デジタル写真化を行なう。ゲルの写真はバンド強度を定量化する画像処理ソフトにより分析する。デフェンシン発現（未処理対照）の基底量が検出できないので、ｈＢＤ２／アクチンバンド及びｈＢＤ３／アクチンバンドの強度比を、例えば陽性対照(ｈＢＤ２に対してＴＮＦα、ｈＢＤ３に対してＩＦＮγ)から得られる強度比と比べることができる。また、問題のβ−デフェンシン発現のいかなる刺激をも検出することが可能になる。
【００６５】
第一工程の最後として、β−デフェンシンの発現に関して効果を発揮する活性体が選択される。
【００６６】
この活性体に対応する上清は、次にＥＬＩＳＡキットを使用してテストされ、活性体の効果の下で培養培地中へ分泌されるＭＩＰ３α、ＩＬ１及びＩＬ８中の活性成分量が測定される。スクリーニングできる可能性はあるが、ＭＩＰ３α、ＩＬ１及びＩＬ８の過剰刺激（ＴＮＦα又はＩＦＮによる最大刺激の７５％より有為に高い）を誘導する活性成分はスクリーニングから排除される。
【００６７】
ゲルはバンド強度を定量化する画像処理ソフトによって分析される。挿入のタイプと、ＲＴ−ＰＣＲから得られる生成物の量は変わり得るものの光彩度以下のままであるので、バンドの可視化は核酸電気泳動システムによって行なうことができるのが明らかである。
【００６８】
得られる結果の確認は、後述の定量ＲＴ−ＰＣＲを用いた「投与量による効果」の検討に適用する本発明のスクリーニング方法によって実施できるが、当業者が他の方法の方がふさわしいと認めることもあるのでこの方法に特に限定されるわけではない。
【００６９】
このリアルタイムＲＴ−ＰＣＲはｍＲＮＡ発現における差異に関わる定量化可能な結果を与えるので、現在のところ好ましい方法である。
【００７０】
投与量を０．００１％から１０％へ、好ましくは０．０１％から１０％へ投与量を増加させることによって選択された活性体に対して、細胞毒性の検討を行なう。生存性を定めなければならず、その生存性は好ましくは６５％より上、さらに好ましくは７５％より上である。この生存性は細胞無毒性濃度限界を定める。
【００７１】
従って、スクリーニングできる可能性のある活性成分は数種の濃度、好ましくは０．００１％から細胞無毒性濃度限界の範囲で、好ましくは上述の血清を全く含まない特異的培地中で単層として、正常なヒト上皮細胞、好ましくはヒトケラチノサイトをテストした。
【００７２】
次に、上清は回収され、ＰＢＳ中で洗浄した後、−８０℃で乾燥凍結することができる。総ＲＮＡは抽出され、上述の範囲と同一の濃度に希釈する。希釈したＲＮＡはアクチン、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３の定性ＲＴ−ＰＣＲのために使用される。
【００７３】
この方法は好ましくは上述の原ＲＮＡの量と同一の量で、好ましくはＳＹＢＲ（Ｒ）グリーン（Ｇｒｅｅｎ）を含むワンステップキットを使用して行なわれるのが好ましい。しかしＲＴ−ＰＣＲは、スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（Ｒ））、モレキュラービーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ（Ｒ））、タックマン（ＴａｑｍａｎＴＭ）プローブ等のＳＹＢＲ（Ｒ）グリーン以外の他の方法に基づくものでも良い。上述のプライマーと同一のプライマーを使用して、蛍光サーモサイクラー中で行なうのが有利である。それによって増幅プログラムは実行される。上記増幅プログラムは前に述べたプログラムと同一のプログラムで行なうことができる。
【００７４】
融合グラフの検討を行なえば、増幅プログラムの特異性を実証することができる。サイクル数の関数としての蛍光グラフによると、蛍光シグナルを開始させるのに必要なサイクル数に相当するＣ（Ｔ）値を得ることができる。ｍＲＮＡの発現が多いほど、Ｃ（Ｔ）値は低くなる。各ＲＮＡに対するＳｇｅｎｅ＝（１／２）Ｃ（Ｔ）という計算は、増幅においてコピー数が指数関数的に増加することを考慮に入れたものである。（Ｓｇｅｎｅ  ｈＢＤ２／Ｓｇｅｎｅ  アクチン）及び（Ｓｇｅｎｅ  ｈＢＤ３／Ｓｇｅｎｅ  アクチン）の比を、未処理対照の比と比較して、生じた刺激の百分率を求める。
【００７５】
未処理対照は本発明のスクリーニング方法の第一工程のものと同一であっても良い。
【００７６】
デフェンシンを誘導する能力が確立されている、スクリーニングできる可能性のある活性成分の上清は、ＭＩＰ３α、ＩＬ８及びＩＬ１αの量を分析するために、ＥＬＩＳＡキットを使用してテストしても良い。
【００７７】
好ましくはこの分析は上清について行なう。各々の試料の分析されたＲＮＡ濃度で量を比較する。選択された活性体の非炎症性はこのようにして確認され、及び／又は炎症性分子の分泌を誘導しないデフェンシン刺激に対する最適処方量はこのようにして見つけることができる。
【００７８】
発明者の第一の目的は上記の分子の分泌は刺激せずに２型及び／又は３型β−デフェンシンの発現を刺激することができる活性成分を発見することであるので、本発明は、さらにこのスクリーニング法によってテストされる活性成分に関する。
【００７９】
スクリーニング用の光学機械において、正常なヒト上皮細胞、好ましくは正常なケラチノサイトの培養は、培養が９６ウェルプレートで行なわれる場合には好ましい。ｈＢＤ２及びｈＢＤ３デフェンシンの発現は、未分化の基底ケラチノサイトの場合には非常に低く、ドナーの機能及び細胞を抽出する部位によってかなり変化する。具体的には、ｈＢＤ２は顔の皮膚又は包皮試料中では１００％見出せるが、腹部又は胸の手術試料中には５０％しか見出せない（Ａｌｉ  ＲＳら、正常なヒト皮膚における抗菌性ペプチドｈＢＤ１及びｈＢＤ２の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｐｒｉｄｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｈＢＤ１  ａｎｄ  ｈＢＤ２  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ．）  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００１；１１７：１０６−１１１）。
【００８０】
本発明によると、広範なスクリーニングできる可能性のある活性成分をテストすることができ、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３のｍＲＮＡの発現を検出することのできる再生可能なモデルを提案することができる。
【００８１】
本発明は、カルシウム特異的培地中でのケラチノサイトの培養のためのシステムに関する。この培養条件で誘導される分化によって、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３デフェンシンのｍＲＮＡの基底発現量を増加させることができ、これにより刺激の検出を容易にする。
【００８２】
９６ウェル中での培養細胞は、所望の効果をスクリーニングすることができ、定性分析及び定量分析を９６ウェルフォーマットに対して適用することができるモデルである。
【００８３】
定性ＲＴ−ＰＣＲによって広範な活性体を選択することができ、定量ＲＴ−ＰＣＲによるこれらの実証は、結果の確認を行なう上で不可欠なステップである。刺激に対する陽性対照（ｈＢＤ２に対してＴＮＦα、ｈＢＤ３に対してＩＦＮγ）は、参照として働き、定量ＲＴ−ＰＣＲ法を検証するデフェンシン及び炎症性分子に対する誘導価を与える。
【００８４】
上清中の、炎症に対する標識分子の分泌量の分析によって、非炎症性活性体の選択が行なえる。
【００８５】
上述の所望の活性はスクリーニング法によって以下の活性成分中で見出された：  ヨモギの根、ヒメムカシヨモギ、ニワトコの樹皮、コゴメビユ、パイナップル果汁、ペパーミント、アレカ、カカオ、キノア、ウサギギク、ボルドー、サルサパリラ、クルミノキの葉、ハイビスカスの花、カボチャ、ヒマワリ、ボタン、セイヨウオトギリソウ、セイヨウトチノキ、又は、これらの抽出物、ジャスモン酸又はビタミンＡ、それらの誘導体及び前駆体、アルファ−ＭＳＨ又はアルファ−ＭＳＨを構成するペプチドの一つ若しくはそのペプチドに化学構造が類似するもの、イソロイシンエステル、カルシウム又はカルシウムの有機塩若しくは無機塩。
【００８６】
実施例では、従来技術と対比して新規と思われるいかなる特徴も本発明と一体化をなす部分であり、機能と一般的態様の点から保護は適用される。
【００８７】
さらに、請求項の記載によると、特に記載の無い限り、全ての％は重量％であり、温度は摂氏で表す。
【００８８】
実施例１
スクリーニング法における第一工程
９６ウェル培養プレート上の単層の正常ヒトケラチノサイトに、カルシウムを多量に含み血清を含まない特定の培地中で、１％の濃度の活性体をテストする（最終濃度１．７ｍＭ）。
８０％コンフルエンスになったところで、上記細胞を活性体と１６時間接触させる（１ウェルにつき１活性体）。
活性成分は、同じ培養プレートに、未処理対照１種及び陽性対照２種（ｈＢＤ２に対してＴＮＦα  １００ｎｇ／ｍＬ、ｈＢＤ３に対してＩＦＮγ  １００ｎｇ／ｍＬ）を同時にセットアップする。
１６時間後培養上清を回収し、細胞はＰＢＳ中で洗浄した後−８０℃にて凍結乾燥させる。
シリカカラムで９６ウェル抽出キットを用いて総ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ量を、９６ウェル用分光光度計を用いて２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにて定量する。ＲＮＡは５ｎｇ／ｍＬに希釈する。
【００８９】
９６ウェル培養プレートにおいて、５０ｎｇの原ＲＮＡを元にアクチン、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３について、定性ワンステップＲＴ−ＰＣＲを行なう。
プライマーは、０．５μＭの濃度で用い、先行文献から導く：−ｈＢＤ２  センス  ５’−ＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＧＴ−３’；ｈＢＤ２  アンチセンス  ５’−ＧＧＡＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＣＡ−３’ （Ｈａｒｄｅｒ  Ｊ．ら、ヒト皮膚由来の抗菌性ペプチド（Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ．）  Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３８７：８６１）；ｈＢＤ３  センス  ５’−ＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＣＴＡ−ＴＧＡＧＧＡＴＣ−３’；ｈＢＤ３  アンチセンス  ５’−ＣＴＴＣＧＧＣＡＧ−ＣＡＴＴＴＴＣＧＧＣＣＡ−３’；アクチン  センス  ５’−ＧＴＧＧＧＧＣＧ−ＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ−３’；アクチン  アンチセンス  ５’−ＣＴＣＣＴ−ＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＴＴＴＣ−３’（Ｈａｒｄｅｒ  Ｊ．ら、新規ヒト誘導性抗菌性ペプチドであるヒトβ−デフェンシン−３の単離と特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−３，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ．）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１；２７６：５７０７−５７１３）。
【００９０】
試料をサーモサイクラーに設置し、一般的な下記の増幅プログラムに従う。
増幅プログラムを次に示す。：５０℃、３０分；９４℃、２分；（９４℃、３０秒；６０℃、３０秒；６８℃、３０秒）をデフェンシンについて３２サイクル、アクチンについて３０サイクル；７２℃、１０分；１４℃、無限。
【００９１】
増幅後、上記増幅産物を、アクチン増幅産物３μＬ＋ｈＢＤ２増幅産物６μＬ＋ｈＢＤ３増幅産物６μＬの割合で混合する。これに、チャージバッファーと水の混合物（チャージバッファー／水＝２／３）５μＬを加えた計２０μＬを、あらかじめ成形した２％アガロースゲルにのせる。試料は３０分間で電気泳動させ、そのバンドを暗室でＵＶを照射して視覚化し、デジタル写真化する。
【００９２】
ゲルの写真を、バンドの強度を定量化する画像処理ソフトによって分析する。デフェンシンの発現の基底量（未処理の対照）は検出できないので、ｈＢＤ２／アクチン及びｈＢＤ３／アクチンのバンドの強度比を、例えば、陽性対照（ｈＢＤ２に対してＴＮＦαで処理したもの、ｈＢＤ３に対してＩＦＮγで処理したもの）／アクチンのバンドの強度比と比較することで、問題のβ−デフェンシン発現の刺激があるかどうかが分かる。
【００９３】
上記第一工程の最後にβ−デフェンシンの発現に効果のあった活性体を選択し、これらの活性体の効果の下、培地中に分泌されたＭＩＰ３α、ＩＬ１及びＩＬ８の量を測定するために、これらの活性成分に対応する培養上清を、ＥＬＩＳＡキットを用いて試験する。発現量は、定量した各ウェルのＲＮＡ濃度で表し、測定結果を互いに比較する。
【００９４】
第一工程の結果についての表
通常デフェンシンの発現の基底量は検出できないため、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３の刺激は陽性対照（ｈＢＤ２に対してＴＮＦα、ｈＢＤ３に対してＩＦＮγ）に対する百分率で表される。ＩＬ８及びＭＩＰ３αの発現量は、ｐｇ／ｍＬ／ＲＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ中）として示す。
【００９５】
【表１】
2008019264.tif 000002
【００９６】
【表２】
2008019264.tif 000003
【００９７】
上記活性体のうち、本発明の第一工程の基準を満たすもの、すなわち、サイトカインであるＭＩＰ３α及びＩＬ８の発現を誘導することなくｈＢＤ２及び／又はｈＢＤ３を刺激するものは：ヨモギの根、ヒメムカシヨモギ、ニワトコの樹皮、コゴメビユ、パイナップル果汁、ペパーミント、アレカ、カカオ、キノア、ウサギギク、ボルドー、サルサパリラ、クルミノキの葉、ハイビスカスの花、カボチャ、ヒマワリ、ボタン、セイヨウオトギリソウ、セイヨウトチノキ、又は、これらの抽出物の１つ、ジャスモン酸並びにその誘導体及び前駆体、イソロイシンエステルである。
【００９８】
スピルリナはｈＢＤ２を強く刺激するが、ＩＬ８又はＭＩＰ３αの分泌を誘導するので選ばなかった。その他の活性体はデフェンシンの発現を刺激しなかった。
Ｌ−イソロイシン及び複数の誘導体について定性ＲＴ−ＰＣＲによって調べたところ、ヒトデフェンシン２又は３に対する顕著な刺激は見られなかった。
【００９９】
実施例２
スクリーニング法における第二工程
上記第一工程の基準を最もよく満たした活性成分について、投与量による効果を調べた。
【０１００】
選択した活性体の細胞毒性を、投与量を０．０１％〜１０％で増加させて検討した。生存度７５％の場合を、細胞毒性がない濃度の上限として設定した（最大生存度％）。
【０１０１】
９６ウェル培養プレート上の単層の正常ヒトケラチノサイトに、カルシウムを多量に含み血清を含まない特定の培地中で、上記活性体を５種類の濃度（０．００１％〜最大生存度）でテストする（ＣａＣｌ２  １．７ｍＭ）（実施例１と同じ条件）。これと同じものを合わせて４通り調製する。
１６時間後培養上清を回収し、細胞はＰＢＳ中で洗浄した後−８０℃にて凍結乾燥させる。
シリカカラムで９６ウェル抽出キットを用いて総ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ量を、９６ウェル用分光光度計を用いて２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにて定量する。ＲＮＡは５ｎｇ／μＬに希釈する。
【０１０２】
Ｓｙｂｒｇｒｅｅｎを含むワンステップキットを用い、９６ウェル培養プレートにおいて蛍光サーモサイクラー中で上記と同じプライマー（０．５μＭ）を用いて、ＲＮＡ５０ｎｇを基にしてアクチン、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３の定量ＲＴ−ＰＣＲを最初に行なう。増幅プログラムを次に示す：５０℃、３０分；９４℃、１５分；（９４℃、１５秒；６０℃、３０秒；７２℃、３０秒）を５０サイクル；９０℃、１分；３０℃、１分；５０℃〜９５℃（各℃において１０秒ずつ）；１４℃、無限。
【０１０３】
融合グラフを検討することにより、増幅産物の特異性を実証できる。蛍光グラフは、サイクル数の関数であり、蛍光シグナルを開始させるのに必要なサイクル数に相当するＣ（Ｔ）値を示す。ｍＲＮＡの発現が多いほど、Ｃ（Ｔ）値は低くなる。各ＲＮＡに対するＳｇｅｎｅ＝（１／２）Ｃ（Ｔ）という計算は、増幅においてコピー数が指数関数的に増加することを考慮に入れたものである。（Ｓｇｅｎｅ  ｈＢＤ２／Ｓｇｅｎｅ  アクチン）及び（Ｓｇｅｎｅ  ｈＢＤ３／Ｓｇｅｎｅ  アクチン）の比を、未処理の対照の比と比較して、産生された刺激の百分率を求める。
【０１０４】
デフェンシンを誘導する能力が確認された活性体に対応する培養上清は、ＭＩＰ３α、ＩＬ８及びＩＬ１αの発現量を定量するためにＥＬＩＳＡキットを用いてテストする。上記分析は、同じ培養上清（２００μＬ）について行い、培養上清は一連の希釈（ＭＩＰ３α及びＩＬ８を分析するのに１．５倍、ＩＬ１αを分析するのに更に２倍）を行なう。その後、発現量は、定量した各ウェルのＲＮＡ濃度で表し、測定結果を互いに比較する。
【０１０５】
本発明者らは、上記のように、選択した活性体に炎症性がないことを確認することができ、及び／又は、炎症性サイトカインの分泌を誘導することなくデフェンシンを刺激するこれらの活性成分の最適な投与量を見いだすことができる。
【０１０６】
第二工程の結果についての表
定量ＲＴ−ＰＣＲ法により、未処理の対照におけるデフェンシンの発現の基底値が分かる。その結果、試験結果は対照に対する百分率で表される。サイトカインであるＩＬ８、ＩＬ１α及びＭＩＰ３αの発現量は、ｐｇ／ｍＬ／ＲＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ中）として示す。
【０１０７】
【表３】
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【０１０８】
上記定量ＲＴ−ＰＣＲの方法により、上記のように、ボルドー、ウサギギク及びアレカが、前炎症性サイトカインを誘導することなくｈＢＤ３に刺激を与えるという効果を確認することができる。１０％のヨモギは、前炎症性サイトカインの分泌を顕著に刺激することなくｈＢＤ３を刺激し、キノア種子の粉末は、活性濃度が１％の段階からｈＢＤ２を刺激する。５％においては、キノア種子の粉末はｈＢＤ２及びｈＢＤ３を刺激する。
Ｌ−イソロイシンについて、ウシデフェンシン−３を刺激することができると記載されている４つの濃度（３．１２５、６．２５、１２．５及び２５μｇ／ｍＬ）（Ｆｅｈｌｂａｕｍ  Ｐ．ら、必須アミノ酸は上皮β−デフェンシンの発現を誘導する（Ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  β−ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．）  ＰＮＡＳ  ２０００；９７：１２７２３−１２７２８）においてテストを行った。その結果、Ｌ−イソロイシンは、正常ヒトケラチノサイトにおいてｈＢＤ２及びｈＢＤ３を誘導しないことが分かった。
また１００μｇ／ｍＬのジャスモン酸及びα−ＭＳＨは、デフェンシン２及び／又は３を誘導することができる。
【０１０９】
上記活性体のうち、本発明の基準を満たすもの、すなわち、サイトカインであるＭＩＰ３α、ＩＬ８又はＩＬ１の発現を誘導することなくｈＢＤ２及び／又はｈＢＤ３を刺激するものは：ボルドー、ウサギギク、キノア、ヨモギ、又は、これらの抽出物のいずれか、ジャスモン酸並びにその誘導体及びその前駆体、αＭＳＨ又はα−ＭＳＨを形成するペプチドの１つ若しくは化学構造が類似のペプチドのうちの一つである。
【０１１０】
実施例３
実施例２と同様に、レチノイン酸及びレチノールのｈＢＤ２及び／又はｈＢＤ３を刺激する能力を調べた。
結果は次の通りである：
【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
レチノイン酸は０．００５％においてｈＢＤ３の合成を弱く刺激し、レチノール（又はビタミンＡ）はｈＢＤ２を弱く刺激し、ｈＢＤ３を強く刺激することが分かる。
レチノイン酸とレチノールのどちらが刺激反応や過敏反応を誘導するのかを明らかにするため、実施例４により、次のように処方を変えて化粧用処方を３通り調製した。
・プラセボクリームＡ：処方に何も添加しない：この実施例における「本発明の生成物」を処方に添加しない。
・クリームＢ：この実施例における「本発明の生成物」はレチノイン酸で、処方における濃度は０．００５％である。
・クリームＣ：この実施例における「本発明の生成物」はレチノールで、処方における濃度は０．０１％である。
上記３通りの処方は２種類の異なる方法にて試験した：
１）調剤の一次皮膚刺激の指標を決めるため、動物に繰り返し投与する。
２）処方の潜在刺激性及び潜在感作性を決めるため、ボランティアの人に繰り返しパッチ投与を行なう。
【０１１３】
上記３通りの処方とも、上記２種類の試験において刺激やアレルギーは見られなかったため、上記濃度においてレチノイン酸及びレチノール（前躯体及び誘導体も同様）は炎症反応、刺激反応及び過敏反応を誘導しないとみなすことができる。
【０１１４】
実施例４：抗シワクリーム
【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
実施例５：抗シミ美容液
【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
実施例６：ファンデーション
【０１１９】
【表７】
2008019264.tif 000008
【０１２０】
実施例７：抗ＵＶＡ／ＵＶＢ美白クリーム
【０１２１】
【表８】
2008019264.tif 000009
【０１２２】
実施例８：痩身ジェル
【０１２３】
【表９】
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【０１２４】
実施例９：保湿クリーム
【０１２５】
【表１０】
2008019264.tif 000011
【０１２６】
実施例１０：シャンプー
【０１２７】
【表１１】
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