(57)【要約】  本開示は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示されたペプチドを同定および定量化する方法を提供する。そのような方法は、ＭＨＣによって提示された各ペプチドの型、同一性、および量を決定する能力を含み得る。いくつかの実施形態では、これらの方法を使用して、抗癌療法を開発するか、または患者のＨＬＡを型判別することができる。配列決定のために調製されたＭＨＣからのペプチドを含む組成物もまた、本明細書において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示された１つ以上のペプチドを同定する方法であって、
（Ａ）前記ＭＨＣによって提示されたペプチドを含有する試料を得る工程と、
（Ｂ）前記ＭＨＣによって提示されたペプチド上の第１のアミノ酸残基を第１の標識で標識して、標識ペプチドを得る工程と、
（Ｃ）前記標識ペプチドを配列決定して、前記ＭＨＣによって提示された１つ以上のペプチドの同一性を決定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２】
１００，０００個未満のペプチドが同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＨＣによって提示されたペプチドが、患者から得られたものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＨＣによって提示された２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のペプチドを同定する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、組織生検、細胞培養物、生体液、または生体試料に由来する濃縮細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＨＣによって提示されたペプチドを含有する試料を得る工程が、前記ＭＨＣによって提示されたペプチドを濃縮することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＨＣによって提示されたペプチドを含有する試料を得る工程が、前記ＭＨＣによって提示されたペプチドを抽出することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチド上の第２のアミノ酸残基が、第２の標識で標識される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、第１の標識、第２の標識、および第３の標識で標識される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識が、蛍光標識である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドを固体表面上に固定化する工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、Ｃ末端、Ｎ末端、または内部アミノ酸残基によって固定化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識された第１のアミノ酸残基が、内部アミノ酸残基である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識された第１のアミノ酸残基が、システイン、リジン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
システイン、リジン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸から選択される２つのアミノ酸残基を標識する工程を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
システイン、リジン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸から選択される３つのアミノ酸残基を標識する工程を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが、単一分子レベルで配列決定される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドが、蛍光配列決定法によって配列決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛍光配列決定法が、各ペプチドの蛍光を測定することを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記各ペプチドの蛍光が、前記ペプチドの存在する量と相関する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記蛍光配列決定法が、末端アミノ酸残基を除去することを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記蛍光配列決定法が、
（Ａ）前記ペプチドの蛍光を測定することと、
（Ｂ）前記末端アミノ酸残基を除去することと
を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドの配列決定が、前記ペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の位置の同定をもたらす、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドの配列決定が、前記ペプチド上の１つ以上の翻訳後修飾の同定をもたらす、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドの配列決定が、前記ＭＨＣによって提示されたペプチドの量の決定をもたらす、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドの蛍光のパターンを得る工程と、
前記パターンを、前記ペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の位置と相関させる工程と
をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記蛍光配列決定の間に得られた配列からの参照データセットを最適化する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
患者からのＭＨＣによって提示されたペプチドのデータベースを得る方法であって、
（Ａ）患者からＭＨＣを得る工程と、
（Ｂ）前記ＭＨＣによって提示されたペプチドを分離する工程と、
（Ｃ）前記ＭＨＣによって提示されたペプチド上のアミノ酸残基を、第１の標識で標識する工程と、
（Ｄ）前記ＭＨＣによって提示されたペプチドを配列決定する工程と、
（Ｅ）前記ＭＨＣによって提示されたペプチドの配列をデータベースに記録する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２９】
１００，０００個未満のペプチドが同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭＨＣによって提示されたペプチドを分離する工程が、前記ＭＨＣによって提示されたペプチドを濃縮することを含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭＨＣによって提示されたペプチドを分離する工程が、前記ＭＨＣによって提示されたペプチドを前記ＭＨＣから分離することを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＭＨＣによって提示されたペプチドが、酸性条件下で処理されることによって前記ＭＨＣから分離される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＭＨＣによって提示されたペプチド上の第２のアミノ酸残基を、第２の標識で標識する工程をさらに含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
第１のアミノ酸残基、第２のアミノ酸残基、および第３のアミノ酸残基を標識する工程を含む、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチドを固体表面上に固定化する工程をさらに含む、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドが、Ｃ末端、Ｎ末端、または内部アミノ酸残基によって固定化される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドが、蛍光配列決定法によって配列決定される、請求項８７〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記蛍光配列決定法が、末端アミノ酸残基を除去することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記蛍光配列決定法が、
（Ａ）前記ペプチドの蛍光を測定することと、
（Ｂ）前記末端アミノ酸残基を除去することと
を含む、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ペプチドを配列決定する工程が、前記ペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の位置の同定をもたらす、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ペプチドの蛍光のパターンを得る工程と、
前記パターンを、前記ペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の位置と相関させる工程と
をさらに含む、請求項２８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
１つ以上のペプチドを含む組成物であって、
（Ａ）前記ペプチドが、５〜２０個のアミノ酸を含み、
（Ｂ）前記ペプチドが、少なくとも１つの標識アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基が、第１の標識で標識され、かつ
（Ｃ）前記ペプチドが、ＭＨＣに由来する、
前記組成物。
【請求項４３】
前記ペプチドが、ＭＨＣによって提示されたペプチドである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
対象におけるＨＬＡ型を同定する方法であって、
（Ａ）請求項１〜２７のいずれか一項に記載のＭＨＣと関連するペプチドを配列決定する工程と、
（Ｂ）前記ペプチドを既知のＨＬＡと比較して、対象のＨＬＡ型を同定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項４５】
抗癌療法を調製する方法であって、
（Ａ）請求項１〜２７のいずれか一項に記載のＭＨＣと関連するペプチドを配列決定する工程と、
（Ｂ）前記ペプチドを患者からの既知のペプチドと比較して、患者によって特異的に提示された、癌と関連するペプチドを決定する工程と、
（Ｃ）前記患者によって特異的に提示された癌と関連するペプチドを使用して、抗癌療法を調製する工程と
を含む、前記方法。
【請求項４６】
前記抗癌療法を必要とする患者に前記抗癌療法を投与する工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を分析するための方法であって、
ＭＨＣに由来するペプチドを配列決定して、前記ペプチドの１つ以上のアミノ酸を同定し、それによって前記ペプチドまたは前記ＭＨＣを同定する工程
を含む、前記方法。
【請求項４８】
前記ＭＨＣに由来する追加のペプチドを実質的に同時に配列決定して、前記追加のペプチドの配列を同定する工程をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１種類が、少なくとも１つの検出可能な標識で標識され、それによって標識ペプチドを産生する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記標識ペプチドを産生する前に、前記ペプチドを親和性試薬で処理する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記配列決定の前に、前記ＭＨＣを断片化して、複数のペプチドを産生する工程
をさらに含む方法であって、前記ペプチドが前記複数のペプチドに由来する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記ペプチドまたはＭＨＣを同定する工程が、前記ペプチドの配列または前記ペプチドの部分配列を同定することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記配列決定が、単一分子配列決定である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記ペプチドまたは前記ＭＨＣが、少なくとも１つの細胞から単離される、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年８月１４日に出願された米国特許仮出願第６２／７１８，５６６号に対する優先権の利益を主張し、この出願の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって認可された助成金番号Ｒ３５ＧＭ１２２４８０およびＯＤ００９５７２のもとで、政府の支援によってなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
１．分野
本開示は、概して、タンパク質、ペプチド配列決定、およびペプチド同定の分野に関する。より具体的には、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に結合されるペプチドの同一性、量、および／または配列の決定のためのペプチドの配列決定に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の記載
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）は、適応免疫系に必須の細胞表面タンパク質複合体である。ヒトにおいて、これらはＨＬＡまたはヒト白血球抗原とも呼ばれる。ＭＨＣの主な機能は、病原体に由来する抗原ペプチドを提示すること、または適切なＴ細胞による認識のために分解された細胞タンパク質をサンプリングすることによるものである。ＭＨＣ遺伝子ファミリーの３つのクラスのうち、クラスＩおよびＩＩは、広範囲に研究される。ＭＨＣ−Ｉファミリーは、ほとんどの有核細胞中に存在し、細胞プロテオームに由来し、ＣＤ８  Ｔ細胞上の受容体によって認識される抗原ペプチドを提示する。しかしながら、ＭＨＣ−ＩＩファミリーのタンパク質は、典型的に、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞などの抗原提示細胞中で発現される。ＭＨＣ−ＩＩペプチドは、抗原および細菌などの感染の免疫原性処理に由来し、免疫または抗原クリアランスを発達させるために、Ｔヘルパー細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞上の受容体について提示される（Ｎｅｅｆｊｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０００５】
ヒトにおいて、高度に多形かつ共優性的に発現されたＨＬＡ−Ａ、Ｂ、およびＣ遺伝子が存在し、各々が所与の細胞中のＭＨＣ−Ｉタンパク質複合体の６つの異なる多様体を与えるＭＨＣ−Ｉタンパク質複合体をコードすることができる。さらに、各ＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子形態は、ペプチド結合親和性の差を呈し、したがって提示された抗原ペプチド、プロテアソームからの分解されたタンパク質の集団は、高度に配列が異なる。細胞ＭＨＣ−Ｉタンパク質によって提示されるペプチドの同一性は、細胞プロテオームの状態を説明する免疫系のシグナルとして想像され得る。新たなタンパク質がウイルス感染または悪性腫瘍の結果として産生される場合、ＭＨＣ−Ｉタンパク質上の新たな抗原ペプチド、ネオ抗原は、Ｔ細胞性免疫の標的である。悪性細胞中のＭＨＣ−Ｉタンパク質によって提示される全ての個々のペプチド分子の配列を得ることは、ネオ抗原を発見し、癌ワクチンまたは内因性Ｔ細胞療法の標的を発達させるために重要である（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｄｕｄｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２００３）。
【０００６】
以下を取り扱うことにおける現在の技術の限界に起因して、腫瘍生検中のこの情報を得ることにはいくつかの課題がある。（ａ）ペプチドの多様性に富んだランダムなソース：ＭＨＣペプチドのソースは、プロテアソームからの分解されたペプチドであり、これらはＥＲタンパク質によってＭＨＣタンパク質複合体にランダムに選択、処理、および負荷される。１秒あたりプロテアソームによって生成された２００万ペプチドのうち、１５０ＭＨＣペプチドが提示されることが推定された。細胞タンパク質のこの大規模なサブサンプリングに加えて、ペプチドがミスフォールドタンパク質（欠陥のあるリボソーム生成物）から生成され、高ターンオーバータンパク質について濃縮され、ＨＬＡアンカー残基結合選択性が拡充される（Ｇｏｄｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。（ｂ）ＨＬＡ対立遺伝子変異：細胞中のＨＬＡ対立遺伝子多様性およびその共優性発現は、提示されるペプチドの同一性を決定する複数のＨＬＡパターンが存在することを示唆する。（ｃ）ＭＨＣタンパク質の低コピー数：個々の細胞において、１０３〜１０６個のＭＨＣタンパク質分子が存在し、それによって固有のペプチドの数が減少すると推定され、高度に多様なＭＨＣペプチド集団をもたらし、各ペプチドは、細胞あたり極めて低いコピー数で存在する（Ｙｅｗｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０００７】
質量分析による直接同定または基礎的なゲノム情報に基づく間接的予測は、ＭＨＣ−Ｉペプチドを同定するための２つの方法である。しかしながら、これらの方法は、腫瘍細胞中のＭＨＣ−Ｉタンパク質によって提示されるペプチド配列の多様なセットをカタログ化するには不適切である。質量分析計の制限された感受性および動的範囲は、大量の腫瘍試料および大きなデータベース検索スペースを得ることにおける困難と相まって、質量分析に基づく方法が豊富かつ均一に発現されるペプチド配列を高忠実度で同定する能力が限定されることを示唆する（Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。典型的に腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原を含む豊富でない種は、検出されることがあるとしても稀である。一方、ペプチド配列を予測する間接的方法は、エクソーム配列、転写物量、および各ＨＬＡ対立遺伝子の結合効率の既知のインビトロ測定などの基礎的なゲノム情報を使用する。しかし最近、予測されるペプチドが免疫原性応答を有することが見出されたため、得られる配列リストの有効性が疑問視されている（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｚａｎｅｔｔｉ，２０１７）。これらのペプチド分子を直接配列決定し、同定する感受性の高い方法は、関連抗原ペプチドをカタログ化するために重要であり、個別化された癌免疫療法の道を開くであろう（Ｙｅｅ  ａｎｄ  Ｌｉｚｅｅ，２０１７）。したがって、ＭＨＣおよびＭＨＣ上に提示されたペプチドを配列決定する新たな方法を開発する重要な必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００８】
概要
いくつかの態様では、本開示は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示された１つ以上のペプチドを同定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、
（Ａ）ＭＨＣによって提示されたペプチドを含有する試料を得る工程と、
（Ｂ）ＭＨＣによって提示されたペプチド上の第１のアミノ酸残基を第１の標識で標識して、標識ペプチドを得る工程と、
（Ｃ）標識ペプチドを配列決定して、ＭＨＣによって提示された１つ以上のペプチドの同一性を決定する工程と
を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、１００，０００個未満のペプチドが同定される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示された各ペプチドが同定される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示されたペプチドは、患者から得られたものである。いくつかの実施形態では、患者は、哺乳動物、例えば、ヒトである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、方法は、ＭＨＣによって提示された２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のペプチドを同定する工程を含む。いくつかの実施形態では、同定されたＭＨＣによって提示されたペプチドは、抗原ペプチドである。いくつかの実施形態では、試料は、組織生検、細胞培養物、生体液、または生体試料に由来する濃縮細胞である。いくつかの実施形態では、組織生検は、健常な組織の生検である。他の実施形態では、組織生検は、癌組織の生検である。いくつかの実施形態では、生体液は、血液、尿、または脳髄液である。他の実施形態では、血流からの濃縮細胞は、樹状細胞である。他の実施形態では、試料は、細胞培養物である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣは、ＭＨＣクラスＩである。他の実施形態では、ＭＨＣは、ＭＨＣクラスＩＩである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示されたペプチドを含有する試料を得ることは、ＭＨＣによって提示されたペプチドを濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示されたペプチドを含有する試料を得ることは、ＭＨＣによって提示されたペプチドを抽出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示されたペプチドを含有する試料を得ることは、ＭＨＣによって提示されたペプチドを濃縮し、抽出することをさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示されたペプチドは、５〜２０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示されたペプチドは、８〜１２個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド上の第２のアミノ酸残基は、第２の標識で標識される。いくつかの実施形態では、ペプチド上の第３のアミノ酸残基は、第３の標識で標識される。いくつかの実施形態では、ペプチド上の第４のアミノ酸残基は、第４の標識で標識される。いくつかの実施形態では、ペプチド上の第５のアミノ酸残基は、第５の標識で標識される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、第１の標識、第２の標識、および第３の標識で標識される。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光標識である。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、エドマン分解条件下での使用に好適である。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、キサンテン染料、Ａｔｔｏ染料、Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料、もしくはＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ染料、例えば、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５５５（登録商標）、Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４９、Ａｔｔｏ６４７Ｎ（登録商標）、またはローダミン染料から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、方法は、樹脂、ビーズ、またはガラス表面などの固体表面上にペプチドを固定化する工程をさらに含む。いくつかの態様では、ペプチドは、Ｃ末端、Ｎ末端、または内部アミノ酸残基によって固定化される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｃ末端、Ｎ末端、リジン残基、またはシステイン残基によって固定化され、例えばＣ末端によって固定化される。いくつかの実施形態では、標識された第１のアミノ酸残基は、内部アミノ酸残基である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、標識された第１のアミノ酸残基は、システイン、リジン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸から選択される。いくつかの実施形態では、標識された第１のアミノ酸残基は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、方法は、システイン、リジン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸から選択される２つのアミノ酸残基を標識する工程を含む。いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸残基は、リジンおよびグルタミン酸、リジンおよびチロシン、グルタミン酸およびチロシン、リジンおよびアスパラギン酸、アスパラギン酸およびグルタミン酸、アスパラギン酸およびチロシン、トリプトファンおよびアスパラギン酸、トリプトファンおよびグルタミン酸、リジンおよびトリプトファン、ならびにトリプトファンおよびチロシン、システインおよびアスパラギン酸、システインおよびグルタミン酸、リジンおよびシステイン、システインおよびチロシン、ならびにシステインおよびトリプトファンである。いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸残基は、リジンおよびグルタミン酸、リジンおよびチロシン、グルタミン酸およびチロシン、リジンおよびアスパラギン酸、アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびにアスパラギン酸およびチロシンである。
【００１５】
他の実施形態では、方法は、システイン、リジン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸から選択される３つのアミノ酸残基を標識する工程を含む。いくつかの実施形態では、３つのアミノ酸残基は、リジン、グルタミン酸、およびチロシン；リジン、アスパラギン酸、およびチロシン；リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸；アスパラギン酸、グルタミン酸、およびチロシン；リジン、トリプトファン、およびグルタミン酸；リジン、トリプトファン、およびチロシン；リジン、システイン、およびグルタミン酸；トリプトファン、グルタミン酸、およびチロシン；リジン、システイン、およびチロシン、リジン、トリプトファン、およびアスパラギン酸；システイン、グルタミン酸、およびチロシン；トリプトファン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸；リジン、システイン、およびアスパラギン酸；トリプトファン、アスパラギン酸、およびチロシン；システイン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸；システイン、アスパラギン酸、およびチロシン；システイン、トリプトファン、およびアスパラギン酸；システイン、トリプトファン、およびグルタミン酸；リジン、システイン、およびトリプトファン；ならびにシステイン、トリプトファン、およびチロシンである。いくつかの実施形態では、３つのアミノ酸残基は、リジン、グルタミン酸、およびチロシン；リジン、アスパラギン酸、およびチロシン；リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸；アスパラギン酸、グルタミン酸、およびチロシン；リジン、トリプトファン、およびグルタミン酸；リジン、トリプトファン、およびチロシン；リジン、システイン、およびグルタミン酸；ならびにトリプトファン、グルタミン酸、およびチロシンである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、単一分子レベルで配列決定され、例えばペプチドは、蛍光配列決定法によって配列決定される。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、各ペプチドの蛍光を測定することを含む。いくつかの実施形態では、各ペプチドの蛍光は、ペプチドの存在する量と相関する。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、末端アミノ酸残基を除去することを含む。いくつかの実施形態では、末端アミノ酸残基は、Ｎ末端アミノ酸である。他の実施形態では、末端アミノ酸残基は、Ｃ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態では、末端アミノ酸残基は、酵素によって除去される。他の実施形態では、末端アミノ酸残基は、エドマン分解によって除去される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、
（Ａ）ペプチドの蛍光を測定することと、
（Ｂ）末端アミノ酸残基を除去することと
を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）ペプチドの蛍光を測定することと、（ｉｉ）末端アミノ酸残基を３〜３０回除去することとを含む。いくつかの実施形態では、繰り返しは、８〜１８回である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ペプチドの配列決定は、ペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の位置の同定をもたらす。いくつかの実施形態では、ペプチド中の１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸残基の位置が同定される。いくつかの実施形態では、ペプチド中の１、２、３、または４種類のアミノ酸残基の位置が同定される。いくつかの実施形態では、ペプチドの配列決定は、配列全体の同定をもたらす。いくつかの実施形態では、ペプチドの配列決定は、ペプチド上の１つ以上の翻訳後修飾の同定をもたらす。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、グリコシル化またはリン酸化である。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、グリコシル化である。他の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ペプチドの配列決定は、ＭＨＣによって提示されたペプチドの量の決定をもたらす。いくつかの実施形態では、ペプチドの配列決定は、ＭＨＣによって提示された各ペプチドの量の決定をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、ペプチドの蛍光のパターンを得る工程と、そのパターンをペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の位置と相関させる工程とをさらに含む。いくつかの実施形態では、パターンは、１つ以上のアルゴリズムを使用して相関される。いくつかの実施形態では、アルゴリズムは、ｎｅｔＭＨＣ、ＭＨＣＦｌｕｒｒｙ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ｎｅｔＣＨＯＰ、およびｎｅｔＭＨＣｐａｎである。いくつかの実施形態では、アルゴリズムは、ｎｅｔＭＨＣである。他の実施形態では、パターンは、参照データセットと相関される。いくつかの実施形態では、参照データセットは、細胞、例えば細胞プロテオームの生物情報学的分析から得られる。他の実施形態では、生物情報学的分析は、細胞エクソーム、トランスクリプトーム、ＨＬＡ型判別、リボソームフットプリント法（Ｒｉｂｏｓｅｑ法）、またはタンパク質存在量、ＭＨＣタンパク質存在量の測定、ペプチド−ＭＨＣ結合親和性の測定に関するものである。他の実施形態では、参照データセットは、エクソームおよび転写配列決定データから得られる。他の実施形態では、参照データセットは、個々の細胞株のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型判別から得られる。他の実施形態では、参照データセットは、健常な組織試料、例えば同じ患者からの健常な組織試料から得られる。他の実施形態では、参照データセットは、配列決定によって健常な組織試料から生成された健常な組織試料から得られる。いくつかの実施形態では、配列決定は、質量分析によって行われる。他の実施形態では、配列決定は、蛍光配列決定によって行われる。他の実施形態では、配列決定は、核酸配列決定によって行われる。いくつかの実施形態では、核酸配列決定は、ＤＮＡを配列決定することを含む。他の実施形態では、核酸配列決定は、ＲＮＡを配列決定することを含む。他の実施形態では、配列決定は、ペプチドの既知のライブラリとの比較によって行われる。いくつかの実施形態では、方法は、蛍光配列決定の間に得られた配列からの参照データセットを最適化する工程をさらに含む。
【００２１】
別の態様では、本開示は、患者からのＭＨＣによって提示されたペプチドのデータベースを得る方法であって、
（Ａ）患者からＭＨＣを得る工程と、
（Ｂ）ＭＨＣによって提示されたペプチドを分離する工程と、
（Ｃ）ＭＨＣによって提示されたペプチド上のアミノ酸残基を第１の標識で標識する工程と、
（Ｄ）ＭＨＣによって提示されたペプチドを配列決定する工程と、
（Ｅ）ＭＨＣによって提示されたペプチドの配列をデータベースに記録する工程と
を含む方法を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、１００，０００個未満のペプチドが同定される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示された各ペプチドが同定される。いくつかの実施形態では、患者は、哺乳動物、例えば、ヒトである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示されたペプチドを分離する工程は、ＭＨＣによって提示されたペプチドを濃縮することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示されたペプチドは、免疫沈降によって濃縮される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示されたペプチドを分離する工程は、ＭＨＣによって提示されたペプチドをＭＨＣから分離することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣによって提示されたペプチドは、酸性条件下で処理されることによってＭＨＣから分離される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、方法は、ＭＨＣによって提示されたペプチド上の第２のアミノ酸残基を第２の標識で標識する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＨＣによって提示されたペプチド上の第３のアミノ酸残基を第３の標識で標識する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＨＣによって提示されたペプチド上の第４のアミノ酸残基を第４の標識で標識する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＨＣによって提示されたペプチド上の第５のアミノ酸残基を第５の標識で標識する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１のアミノ酸残基、第２のアミノ酸残基、および第３のアミノ酸残基を標識する工程を含む。いくつかの実施形態では、第１の標識、第２の標識、第３の標識、第４の標識、または第５の標識は、蛍光染料である。いくつかの実施形態では、第１の標識、第２の標識、第３の標識、第４の標識、および第５の標識は、蛍光染料である。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、エドマン分解条件下での使用に好適である。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、キサンテン染料、Ａｔｔｏ染料、Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料、またはＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ染料から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、方法は、樹脂、ビーズ、またはガラス表面などの固体表面上にペプチドを固定化する工程をさらに含む。いくつかの態様では、ペプチドは、Ｃ末端、Ｎ末端、または内部アミノ酸残基によって固定化される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｃ末端またはＮ末端によって固定化される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、単一分子レベルで配列決定され、例えばペプチドは、蛍光配列決定法によって配列決定される。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、各ペプチドの蛍光を測定することを含む。いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、末端アミノ酸残基を除去することを含む。いくつかの実施形態では、末端アミノ酸残基は、Ｎ末端アミノ酸である。他の実施形態では、末端アミノ酸残基は、Ｃ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態では、末端アミノ酸残基は、酵素によって除去される。他の実施形態では、Ｎ末端アミノ酸残基は、エドマン分解によって除去される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、蛍光配列決定法は、
（Ａ）ペプチドの蛍光を測定することと、
（Ｂ）末端アミノ酸残基を除去することと
を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）ペプチドの蛍光を測定することと、（ｉｉ）末端アミノ酸残基を３〜３０回除去することと、を繰り返すことを含む。いくつかの実施形態では、繰り返しは、８〜１８回である。いくつかの実施形態では、ペプチドを配列決定することは、ペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の位置の同定をもたらす。いくつかの実施形態では、ペプチド中の１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸残基の位置が同定される。いくつかの実施形態では、ペプチドの配列決定は、配列全体の同定をもたらす。いくつかの実施形態では、ペプチドの配列決定は、ペプチド上の１つ以上の翻訳後修飾の同定をもたらす。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、グリコシル化またはリン酸化である。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、グリコシル化である。他の実施形態では、翻訳後修飾は、リン酸化である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、方法は、ペプチドの蛍光のパターンを得る工程と、そのパターンをペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の位置と相関させる工程とをさらに含む。いくつかの実施形態では、データベースは、細胞プロテオームの生物情報学的分析から得られた参照データセットである。他の実施形態では、データベースは、エクソームおよび転写配列決定データから得られた参照データセットである。他の実施形態では、データベースは、個々の細胞株のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型判別から得られた参照データセットである。他の実施形態では、データベースは、健常な組織試料から得られた参照データセットであり、例えば健常な組織試料は、同じ患者に由来する。他の実施形態では、参照データセットは、配列決定によって健常な組織試料から生成された健常な組織試料から得られる。
【００２９】
なおもさらなる別の態様では、本開示は、１つ以上のペプチドを含む組成物を提供し、
（Ａ）ペプチドは、５〜２０個のアミノ酸を含み、
（Ｂ）ペプチドは、少なくとも１つの標識アミノ酸残基を含み（アミノ酸残基は、第１の標識で標識される）、かつ
（Ｃ）ペプチドは、ＭＨＣに由来する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、８〜１２個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、第１の標識は、蛍光標識である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、第２の標識アミノ酸残基を含み、アミノ酸残基は、第２の標識で標識される。いくつかの実施形態では、第２の標識は、蛍光標識である。いくつかの実施形態では、第１の標識および第２の標識は、異なる蛍光シグナルを産生する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣによって提示されたペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＭＨＣから除去されている。
【００３１】
さらに別の態様では、本開示は、対象におけるＨＬＡ型を同定する方法であって、
（Ａ）本明細書に記載されるＭＨＣと関連するペプチドを配列決定する工程と、
（Ｂ）ペプチドを既知のＨＬＡと比較して、対象のＨＬＡの型を同定する工程と
を含む方法を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ペプチドの配列決定は、第２のアミノ酸残基の同一性を同定する。いくつかの実施形態では、ペプチドの配列決定は、第９のアミノ酸残基の同一性を同定する。いくつかの実施形態では、ペプチドの配列決定は、第２および第９のアミノ酸残基の同一性を同定する。
【００３３】
なおもさらなる別の態様では、本開示は、抗癌療法を調製する方法であって、
（Ａ）本明細書に記載されるＭＨＣと関連するペプチドを配列決定する工程と、
（Ｂ）ペプチドを患者からの既知のペプチドと比較して、患者によって特異的に提示された、癌と関連するペプチドを決定する工程と、
（Ｃ）該患者によって特異的に提示された癌と関連するペプチドを使用して、抗癌療法を調製する工程と
を含む方法を提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、方法は、抗癌療法を必要とする患者にそれを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗癌療法は、免疫療法である。いくつかの実施形態では、患者は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、患者は、霊長類、例えば、ヒトである。いくつかの実施形態では、既知のペプチドは、同じ患者に由来する。いくつかの実施形態では、既知のペプチドは、非腫瘍組織試料と関連する。
【００３５】
別の態様では、本開示は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を分析するための方法であって、該ＭＨＣに由来するペプチドを配列決定して、該ペプチドの１つ以上のアミノ酸を同定し、それによって該ペプチドまたは該ＭＨＣを同定することを含む、方法を提供する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、方法は、該ＭＨＣに由来する追加のペプチドを実質的に同時に配列決定して、該追加のペプチドの配列を同定することを含む。いくつかの実施形態では、該ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１種類は、少なくとも１つの検出可能な標識で標識され、それによって標識ペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つの検出可能な標識は、蛍光標識である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、該ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも２種類は、少なくとも２つの検出可能な標識で標識され、それによって標識ペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、該ペプチドのアミノ酸のほとんどの種類は、検出可能な標識で標識され、それによって標識ペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、該検出可能な標識は、蛍光標識である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、該標識ペプチドを産生する前に、該ペプチドを抗体などの親和性試薬で処理する。いくつかの実施形態では、方法は、該配列決定の前に、該ＭＨＣを断片化して、複数のペプチドを産生することをさらに含み、このペプチドは、該複数のペプチドに由来する。いくつかの実施形態では、該ペプチドまたはＭＨＣを同定する工程は、該ペプチドの配列または該ペプチドの部分配列を同定することを含む。いくつかの実施形態では、該配列決定は、単一分子配列決定である。いくつかの実施形態では、該ペプチドまたは該ＭＨＣは、少なくとも１つの細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該ペプチドＭＨＣまたは該ＭＨＣは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、ネオ抗原ペプチド、またはそれらの組み合わせであるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、方法は、該ＨＬＡ、該ネオ抗原ペプチド、または該それらの組み合わせを単離すること、検証すること、またはそれらの組み合わせをさらに含む。
【００３９】
別の態様では、本開示は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を分析するための方法であって、該ＭＨＣに由来するペプチドを配列決定して、該ペプチドの１つ以上のアミノ酸を同定し（該ペプチドの同定は、単一分子レベルで生じる）、それによって該ペプチドまたは該ＭＨＣを同定することを含む、方法を提供する。
【００４０】
さらに別の態様では、本開示は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を分析するための方法であって、該ＭＨＣに由来するペプチドを配列決定して、該ペプチドの１つ以上のアミノ酸を同定し、それによって該ペプチドまたは該ＭＨＣを同定することを含む、方法を提供し、同定は、該ＭＨＣによって提示されたペプチドの数を定量化することができる。
【００４１】
別の態様では、本開示は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を分析するための方法であって、該ＭＨＣに由来するペプチドを配列決定して、該ペプチドの１つ以上のアミノ酸を同定し、それによって該ペプチドまたは該ＭＨＣを同定することを含む、方法を提供し、方法は、該ペプチドが、該ペプチドの１００，０００未満のコピーの濃度で存在する場合、該ペプチドを同定することができる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、具体的な構成成分の観点における「本質的に含まない」は、具体的な構成成分が、組成物に意図的に配合されていない、および／または混入物質として、もしくは痕跡量で存在することを意味するために、本明細書で使用される。組成物の任意の意図しない汚染によりもたらされる、具体的な構成成分の総量は、０．１％未満であるのが好ましい。最も好ましいのは、具体的な構成成分の量が標準的な分析方法を用いて分析できない組成物である。
【００４３】
本明細書で使用する場合、明細書および特許請求の範囲において、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味することができる。本明細書で使用する場合、明細書および特許請求の範囲において、単語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用する場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つ、または２つ以上を意味し得る。本明細書で使用する場合、明細書および特許請求の範囲において、「別の」または「さらなる」とは、少なくとも「第２の、またはそれ以上」を意味することができる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、明細書および特許請求の範囲において、用語「約」は、ある値が、その値、または研究対象間で存在する差を測定するのに用いたデバイス、方法に関しての、固有の誤差変動を含むことを意味するように用いられる。上記の値に基づいて別途特定されない限り、用語「約」は、列挙される値の±５％を意味する。
【００４５】
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。詳細な説明および具体例は、本開示のある特定の実施形態を示しているが、単なる具体例として与えられ、これは本開示の趣旨および範囲内の種々の変更および修正が、この詳細な説明から明らかになるからである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに示すために含まれている。本開示は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによって、よりよく理解され得る。
【図１】単一分子ペプチド同定のための蛍光配列決定技術の実験的説明エドマン溶媒の交換を伴うＴＩＲＦ顕微鏡上の固定化ペプチドの実験準備を示す（左パネル）。モデルペプチドの強度の段階的低下は、示唆される配列または蛍光配列を得る根拠を強調する。
【図２】ＭＨＣペプチド同定パイプライン腫瘍および正常細胞試料のエクソームおよびトランスクリプトーム配列決定は、抗原予測のための生物情報学的ツールを伴って、突然変異ペプチドおよび非突然変異ペプチドの予測されるセットを生成する。腫瘍試料によって単離された抗原からの蛍光配列決定の結果は、突然変異抗原セットに存在するペプチド配列の確認を提供するか、またはその予測を改善する。これらの抗原ペプチドのうちのいくつかに関するそのような直交確認は、下流試験および治療モダリティにおいてより低いリスクを示す。
【図３】ＭＨＣペプチド同定スケールを概念化するスケールは、異なるアプローチによってアクセス可能なＭＨＣペプチド配列の情報コンテンツを示す。全てのペプチドのデノボ配列決定が行われ得る場合、完全な同定が可能である。代替として、いずれのアミノ酸も配列決定され得ない場合、ＭＨＣペプチドレパートリーに関する情報は存在しない。しかしながら、標識され得るアミノ酸の数および用いられる戦略に応じて、ＭＨＣペプチド同定は、このスケールのデノボ配列決定の終わりに近い。
【図４】多数のＨＬＡエピトープは単純なアミノ酸標識スキームで可視化され得るＩＥＤＢデータレポジトリにおけるＨＬＡ−Ａ２エピトープの８０％超が、これらのペプチドを可視化するのを助け得るアスパラギン酸塩／グルタミン酸塩およびチロシンなどのアミノ酸を有する。この分析は、これらのエピトープの大部分が、蛍光配列決定のために標識され得るアミノ酸を有することを示す。
【図５】異なる標識選択によるＭＨＣペプチド同定全ての「黒色腫」でフィルタリングされたペプチドのデータセット（ＩＥＤＢ．ｏｒｇ）の分析は、蛍光配列決定技術を使用してＭＨＣペプチド同定を得る可能性を強調する。図５Ａに示されるように、２つのアミノ酸（Ｋ、Ｅ）を標識することは、ペプチド配列の約２５％を固有に同定することができ、観察された蛍光配列の最大６０％は、最大５つのペプチドまで絞り込むことができる。同様に、ＭＨＣペプチド上のアミノ酸Ｋ、Ｅ、およびＹを標識することによって（図５Ｂ）、観察された蛍光配列の最大８０％は、５つの潜在的なペプチド配列まで絞り込むことができる。
【図６】Ｂ細胞培養物からのＭＨＣペプチドの単離Ｂ細胞の溶解を行い、（全ＭＨＣ抗体）で感応化された磁気ビーズを使用してＭＨＣ複合体を単離した。タンデム質量分析を使用して分析する前に、結合したＨＬＡペプチドを溶出し、精製した。
【図７】ＨＬＡ単離方法の検証単離されたペプチドを、確認のために質量分析によって分析した。棒グラフ（図７Ａ）は、２つの細胞株からの予測アルゴリズムｎｅｔＭＨＣに基づいて、３つのカテゴリーにビニングされたペプチドのカウントを示す。予測されるペプチドの５０％超は、強力なバインダーであった。ペプチドに関するモチーフ分析を、ロゴによって描く（図７Ｂ）。ＨＬＡ−Ａ２６０３細胞株上の（位置１における）酸性残基および（位置９における）アルギニンの濃縮、ならびにＨＬＡ−Ｂ０７０２細胞株中の（位置２における）プロリンの濃縮が、対立遺伝子選好に関する以前の報告と一致することを明らかに示す。
【図８】３つの方法−質量分析、比較ＲＮＡ配列分析、および予測ソフトウェアによって同定されたペプチドを示すベン図
【図９】ペプチドを標識し、蛍光配列決定する（細胞株間の比較）２つの単一対立遺伝子細胞株からのペプチドの比較は、酸性残基の濃縮の頻度を観察することによって行った。質量分析データおよび蛍光配列パターンを、棒グラフに提示し、２つの方法間の相関に対する証拠を提供する。
【図１０】蛍光配列決定技術を使用して標的ＨＬＡ抗原の検出限界を得る標的ペプチドを、漸減濃度でＨＬＡバックグラウンドに添加し、蛍光配列決定を使用して測定する。標的ペプチド蛍光配列パターンのカウントは、入力濃度の関数としてプロットされる（ｘ軸に提示される）。蛍光配列決定検出限界は、およそ１分子／１０細胞である。
【図１１】ＨＬＡペプチドを配列決定することからの蛍光配列決定の適用ＨＬＡペプチドは、固体腫瘍、液体生検、および他の細胞源から単離され得る。ＨＬＡペプチドを分析することは、ネオ抗原もしくは腫瘍関連抗原の発見を予測するもしくは助けるなどの発見、または患者の選択もしくはモニタリングのための確認方法のいずれかであり得る。
【図１２】ＭＨＣペプチド処理および提示のための細胞経路を描く簡略図細胞の基礎ゲノムにおいて腫瘍関連または特異的に起こる突然変異は、異常タンパク質に転写され、翻訳される。これらの腫瘍タンパク質は、修飾され、プロテアソームによって消化され、分泌経路において処理され、ＨＬＡ複合体上に提示される。これらの提示されたペプチドは、Ｔ細胞による認識、ならびに下流細胞溶解活性および免疫活性をもたらす能力の基礎である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
例示的態様の記載
いくつかの態様では、本開示は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示されたペプチドを型判別、同定、定量化、または位置特定する方法を提供する。いくつかの態様では、本明細書に提供される方法は、ＭＨＣによって提示されたペプチド中の特定のアミノ酸残基の同一性を同定するための蛍光配列決定法の使用を含む。これらの同定されたアミノ酸残基を使用し、アルゴリズムおよび／もしくは他の計算方法を使用してペプチドを同定することができるか、または配列全体をデノボで得ることができる。追加として、本方法を使用して、ＭＨＣによって提示された特定のペプチドを定量化することができる。
【００４８】
蛍光配列決定法は、ＭＨＣによって提示された抗原ペプチドの同定を助けるのに適している。蛍光配列決定法は、ペプチド中の少数のアミノ酸の種類の位置情報（例えば、ｘＣｘｘＣ、ｘ＝任意のアミノ酸、Ｃ＝システイン）が、ペプチドの同一性を十分に反映して、既知のタンパク質配列データベースにおけるその同定を可能にすることができるという原理に基づく。実験的実装を可能にするために、ペプチドは、１つ以上のアミノ酸を蛍光団で選択的に標識し、エドマン化学によってスライド上の固定化ペプチドを連続的に分解し、サイクルあたり１つのアミノ酸を失うため、各ペプチドの蛍光強度の変化を並行してモニタリングした。図１は、システイン分子上の第２および第５の位置において蛍光団で標識された個々のペプチド分子の単一分子配列決定データを示す（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃｅｐｔｅｄ  ２０１８）。この方法は、光退色および逸失したエドマンサイクルに起因するある程度の誤差を有する二色標識に基づいて、制御された混合物中の個々のペプチド分子を同定するために使用されている。この方法について得られた検出閾値は、ペプチド質量分析よりも既に６桁近く改善している。
【００４９】
Ｉ．ペプチド配列決定法
蛍光配列決定、質量分析を含むペプチドの配列を同定する、核酸配列からペプチド配列を同定する、およびエドマン分解の多くの方法が存在する。蛍光配列決定は、対象となるタンパク質の配列決定のための単一分子分解能を提供することが見出された（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，２０１０、米国特許第９，６２５，４６９号、米国特許出願第１５／４６１，０３４号、米国特許出願第１５／５１０，９６２号）。蛍光配列決定の特徴のうちの１つは、ペプチド配列の特定のアミノ酸残基への蛍光団または他の標識の導入である。これは、固有の標識部分を有する１つ以上のアミノ酸残基の導入を伴い得る。いくつかの実施形態では、１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上の異なるアミノ酸残基は、標識部分で標識される。使用され得る標識部分は、蛍光団、発色団、またはクエンチャーを含み得る。これらのアミノ酸残基の各々は、システイン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、セリン、トレオニン、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン、およびグルタミンを含み得る。これらのアミノ酸残基の各々は、異なる標識部分で標識され得る。いくつかの実施形態では、複数のアミノ酸残基は、アスパラギン酸およびグルタミン酸またはアスパラギンおよびグルタミンなどの同じ標識部分で標識され得る。この技法は、上記のものなどの標識部分とともに使用され得るが、蛍光配列決定のような方法において他の標識部分が使用され得ることも企図され、例えば合成オリゴヌクレオチドまたはペプチド−核酸が使用され得る。具体的に、本出願で使用される標識部分は、アミノ酸残基のうちの１つ以上を除去する条件に耐えるために好適であり得る。本方法で使用され得る潜在的な標識部分のいくつかの非限定例としては、赤〜赤外スペクトルの蛍光シグナルを発するもの、例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料、Ａｔｔｏ染料、Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、ローダミン染料、または他の同様の染料が挙げられる。アミノ酸残基を除去する条件に耐えることができるこれらの染料の各々の例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、ローダミンＢ、テトラメチルローダミン、Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４９、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｔｔｏ６４７Ｎ、および（５）６−ナフトフルオレセインが挙げられる。他の態様では、標識部分は、蛍光ペプチドもしくはタンパク質、または量子ドットであり得る。
【００５０】
代替として、合成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体を、ペプチドの標識部分として使用することができる。例えば、チオール化オリゴヌクレオチドは市販されており、既知の方法を使用してペプチドに連結され得る。一般に入手可能なチオール修飾は、５′チオール修飾、３′チオール修飾、およびジチオール修飾であり、これらの修飾の各々を使用してペプチドを修飾することができる。上記のようにオリゴヌクレオチドがペプチドに連結した後、ペプチドは、エドマン分解に供され得（Ｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９５０）およびオリゴヌクレオチドを使用して、残りのペプチド配列中の特定のアミノ酸残基の存在を決定することができる。他の実施形態では、標識部分は、ペプチド−核酸であり得る。ペプチド−核酸は、特定のアミノ酸残基上のペプチド配列に結合され得る。
【００５１】
蛍光配列決定の１つの要素は、特定のアミノ酸が切断されたことを示す蛍光の低減を検出するための、エドマン分解およびその後の可視化などの技法による標識ペプチドの除去である。各アミノ酸残基の除去は、エドマン分解およびタンパク質分解的切断を含む様々な異なる技法によって実行される。いくつかの実施形態では、これらの技法は、エドマン分解を使用して、末端アミノ酸残基を除去することを含む。他の実施形態では、これらの技法は、酵素を使用して、末端アミノ酸残基を除去することを伴う。これらの末端アミノ酸残基は、ペプチド鎖のＣ末端またはＮ末端のいずれかから除去され得る。エドマン分解が使用される状況では、ペプチド鎖のＮ末端におけるアミノ酸残基が除去される。
【００５２】
いくつかの態様では、ペプチド配列を配列決定または撮像する方法は、表面上のペプチドを固定化する工程を含み得る。ペプチドは、システイン残基、Ｎ末端、またはＣ末端などの内部アミノ酸残基を使用して固定化され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、システイン残基を表面と反応させることによって固定化される。いくつかの実施形態では、本開示は、可視スペクトルおよび／または赤外スペクトルにわたって光学的に透明な表面などの表面上にペプチドを固定化することが、１．３〜１．６の屈折率を有し、１０〜５０ｎｍの厚さであり、および／または有機溶媒ならびにトリフルオロ酢酸などの強酸に化学的に耐えることを企図する。広範囲の基質（フルオロポリマーなど（Ｔｅｆｌｏｎ−ＡＦ（Ｄｕｐｏｎｔ）、Ｃｙｔｏｐ（登録商標）（Ａｓａｈｉ  Ｇｌａｓｓ，Ｊａｐａｎ））、芳香族ポリマー（ポリキシレン（Ｐａｒｙｌｅｎｅ，Ｋｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ポリスチレン、ポリメトメチルアクリテート）、および金属表面（金コーティング））、コーティングスキーム（スピンコーティング、浸漬コーティング、金属の電子ビーム蒸着、熱蒸着、およびプラズマ増強化学蒸着）、ならびに感応化方法論（ポリアリルアミン移植、ＰＥＣＶＤにおけるアンモニアガスの使用、長鎖末端感応化フルオラスアルカンのドーピング等）は、本明細書に記載される方法において有用な表面として使用され得る。Ｃｙｔｏｐ（登録商標）で作製された厚さ２０ｎｍの光学的に透明な表面を、本明細書に記載される方法において使用することができる。本明細書で使用される表面は、配列決定のためのペプチドおよび選択のための修飾標的を隔離する様々なフルオロアルカンでさらに誘導体化され得る。代替として、アミノシラン修飾表面を、本明細書に記載される方法において使用することができる。他の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ビーズ、樹脂、ゲル、石英粒子、ガラスビーズ、またはそれらの組み合わせの表面上にペプチドを固定化する工程を含み得る。いくつかの非限定例では、方法は、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）ビーズ、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）樹脂、または他の同様のビーズもしくは樹脂の表面上に固定化されたペプチドを使用することを企図する。本明細書で使用される表面は、ポリエチレングリコールなどのポリマーでコーティングされ得る。他の実施形態では、表面は、アミン感応化される。他の実施形態では、表面は、チオール感応化される。
【００５３】
最後に、これらの配列決定技法の各々は、ペプチド配列を撮像して、ペプチド配列上の１つ以上の標識部分の存在を決定することを伴う。いくつかの実施形態では、これらの画像を、アミノ酸残基の各除去の後に撮影し、それを使用して、ペプチド配列中の特定のアミノ酸の位置を決定する。いくつかの実施形態では、これらの方法は、ペプチド配列中の特定のアミノ酸の位置の解明をもたらし得る。これらの方法を使用して、ペプチド配列中の特定のアミノ酸残基の位置を決定することができるか、またはこれらの結果を使用して、ペプチド配列中のアミノ酸残基の全体リストを決定することができる。これらの方法は、ペプチド配列中の１つ以上のアミノ酸残基の位置を決定することと、これらの位置を既知のペプチド配列と比較して、ペプチド配列中のアミノ酸残基の全体リストを決定することと、を含み得る。
【００５４】
いくつかの態様では、これらの方法は、ペプチドがＭＨＣから分離された後に、１つ以上のアミノ酸残基を標識する工程を含み得る。ペプチド上の２つ以上の位置が標識される場合、アミノ酸が、システイン、リジン、Ｎ末端、Ｃ末端、および／またはアミノ酸の順序で、側鎖上のカルボン酸基および／またはトリプトファンで標識され得ることが企図される。これらの特定のアミノ酸のうちの１つ以上が標識され得るか、またはこれらのアミノ酸残基の全てが異なる標識で標識され得ることが企図される。
【００５５】
いくつかの態様では、配列決定技法において使用される撮像方法は、蛍光定量および蛍光顕微鏡などの様々な異なる方法を伴い得る。蛍光方法は、蛍光偏光、フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、または時間分解蛍光などのような蛍光技法を用いることができる。いくつかの実施形態では、蛍光顕微鏡を使用して、単一分子量中の１つ以上の蛍光団の存在を決定することができる。そのような撮像方法を使用して、特定のペプチド配列上の標識の有無を決定することができる。アミノ酸残基を除去し、ペプチド配列を撮像するサイクルを繰り返した後、ペプチド中の標識アミノ酸残基の位置を決定することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭＨＣの他の構成成分からペプチドを分離する方法を提供する。Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４およびＭｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどのいくつかの方法が、文献において知られている。試料中のＭＨＣは、抗体などの特定の結合要素を使用して、ＭＨＣをビーズ上に捕捉することによって濃縮され得る。この目的のためのビーズは、当該技術分野において周知であり、抗体が結合され得る任意の固体支持体を含む。例えば、ＭＨＣ対立遺伝子に特異的な抗体、または全ての異なるＭＨＣ対立遺伝子を標的とするＷ６／３２抗体などの全特異的抗体。ビーズに結合し、他の構成成分を溶出することによってＭＨＣが濃縮されると、ペプチドは、弱酸性溶液を使用して除去され得る。そのような溶液は、０．１％〜約２．５％の弱酸を含有する水溶液を含み得る。いくつかの実施形態では、溶液は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２．０％、もしくは２．５％、またはその中で想到される任意の範囲を含有し得る。ペプチドを除去する方法で使用され得る酸のいくつかの非限定例としては、ギ酸、酢酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、または硫酸が挙げられる。ＭＨＣから分離されると、これらのペプチドは、上記の配列決定法で使用され得る。
【００５７】
本明細書に記載される方法は、単一分子レベルに感受性である。本明細書に記載される方法の感受性は、ＭＨＣに由来する実質的に全てのペプチドの同一性を明らかにすることができる。本明細書に記載される方法の感受性は、ＭＨＣに由来する各ペプチドの同一性を明らかにすることができる。本明細書に記載される方法は、最大１００，０００ペプチド、９０，０００ペプチド、８０，０００ペプチド、７０，０００ペプチド、６０，０００ペプチド、５０，０００ペプチド、４０，０００ペプチド、３０，０００ペプチド、２０，０００ペプチド、１０，０００ペプチド、５，０００ペプチド、４，０００ペプチド、３，０００ペプチド、２，０００ペプチド、１，０００ペプチド、５００ペプチド、１００ペプチド、５０ペプチド、１０ペプチド、５ペプチド、２ペプチド、または１ペプチドの同一性を明らかにすることができる。本明細書に記載される方法は、少なくとも１ペプチド、２ペプチド、５ペプチド、１０ペプチド、５０ペプチド、１００ペプチド、５００ペプチド、１，０００ペプチド、２，０００ペプチド、３，０００ペプチド、４，０００ペプチド、５，０００ペプチド、１０，０００ペプチド、２０，０００ペプチド、３０，０００ペプチド、４０，０００ペプチド、５０，０００ペプチド、６０，０００ペプチド、７０，０００ペプチド、８０，０００ペプチド、９０，０００ペプチド、１００，０００ペプチド、またはそれ以上のペプチドの同一性を明らかにすることができる。本明細書に記載される方法は、１００，０００ペプチド〜１ペプチド、５０，０００ペプチド〜１ペプチド、１０，０００ペプチド〜１ペプチド、５，０００ペプチド〜１ペプチド、１，０００ペプチド〜１ペプチド、５００ペプチド〜１ペプチド、１００ペプチド〜１ペプチド、１０ペプチド〜１ペプチド、または５ペプチド〜１ペプチドの同一性を明らかにすることができる。
【００５８】
ＩＩ．主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）は、外来分子を認識するために身体によって使用される一連の細胞表面タンパク質であり、獲得免疫系における必須因子である。これらのタンパク質は、抗原に結合し、次いで抗原をそれらの表面上に提示して、抗原がＴ細胞によって認識されるようにする。３つの主要なクラスＩ  ＭＨＣハプロタイプ（Ａ、Ｂ、およびＣ）ならびに３つの主要なＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ（ＤＲ、ＤＰ、およびＤＱ）が存在する。ヒトにおけるＭＨＣはまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体として知られる。クラスＩ  ＭＨＣタンパク質は、他の要素、例えばＴＡＰおよびタパシンなどの抗原提示を助ける分子をさらに含み得る。
【００５９】
クラスＩ  ＭＨＣタンパク質は、概して、α１、α２、およびα３と標識される３つのドメインを含む。α１ドメインは、ＭＨＣをβ−ミクログロブリンに結合するように機能し、α３機能は、タンパク質を細胞膜に係留する膜貫通ドメインであり、α１とα２との間の溝は、ペプチド提示ドメインとしての機能を果たす。一方、クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質は、２つのドメインを有し、各々が２つのクラスのタンパク質サブユニットαおよびβを有する。第１のドメインは、α１およびα２サブユニットを含み、一方で第２のドメインは、β１およびβ２サブユニットを含む。α２およびβ２は、ＭＨＣを細胞膜に係留するタンパク質の膜貫通ドメインを形成し、α１およびβ１サブユニットは、ペプチド結合溝を形成する。
【００６０】
ＨＬＡ遺伝子座は、高度に多形であり、染色体６上の４Ｍｂにわたって分布している。領域内のＨＬＡ遺伝子をハプロタイプする能力は、この領域が自己免疫および感染性疾患と関連し、ドナーとレシピエントとの間のＨＬＡハプロタイプの適合性が移植の臨床転帰に影響し得るため、臨床的に重要である。ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは、細胞の内側からペプチドを提示し、ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡは、細胞の外側からＴリンパ球までの抗原を提示する。移植片と宿主との間のＭＨＣハプロタイプの不適合性は、移植片に対する免疫応答を誘起し、その拒絶反応につながる。したがって、患者は、拒絶反応を防止するために免疫抑制剤で治療され得る。ＨＬＡ適合幹細胞株は、免疫拒絶反応のリスクを克服することができる。
【００６１】
移植におけるＨＬＡの重要性のために、現在、ＭＨＣ（またはＨＬＡ）を同定するいくつかの型が存在する。伝統的に、ＨＬＡ遺伝子座は、通常、好ましいドナー−レシピエント対を同定するために、血清学およびＰＣＲによって型判別される。ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ抗原の血清学的検出は、精製されたＴまたはＢリンパ球を用いた補体媒介性リンパ球障害作用試験を使用して達成され得る。この手順は、主にＨＬＡ−Ａおよび−Ｂ遺伝子座を一致させるために使用される。分子ベースの組織型判別は、多くの場合、血清学的検査よりも適切であり得る。ＰＣＲ生成物が一連のオリゴヌクレオチドプローブに対して試験されるＳＳＯＰ（配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ）法などの低分解能分子法を使用して、ＨＬＡ抗原を同定することができ、現在これらの方法は、クラスＩＩ−ＨＬＡ型判別に使用される最も一般的な方法である。ＰＣＲ増幅のために対立遺伝子特異的プライマーを利用するＳＳＰ（配列特異的プライマー）法などの高分解能技法は、特定のＭＨＣ対立遺伝子を同定することができる。
【００６２】
ＩＩＩ．主要組織適合遺伝子複合体からのペプチドおよびＭＨＣから得られたペプチドの治療的使用
ＭＨＣから得られたペプチドは、患者から得られ得る。患者は、哺乳動物、例えば、ヒトであり得る。これらのペプチドは、組織生検、細胞培養物、または生体試料に由来する濃縮細胞などの試料から得ることができる。生体試料は、血流から、または血液、唾液、尿、もしくはリンパ液などの体液から得ることができる。実施形態では、濃縮細胞は、樹状細胞であり得る。組織生検は、健常組織の生検または癌性組織の生検から生じ得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、方法は、ＭＨＣによって提示された２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのペプチド配列の配列を同定する工程を含む。ペプチドはさらに、ＭＨＣから濃縮され、ＭＨＣから抽出され得る。ＭＨＣから得られたペプチドは、約５〜約２０アミノ酸残基の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、同定されたＭＨＣペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９〜約２０アミノ酸残基、またはその中で想到されるアミノ酸残基の任意の範囲内のアミノ酸残基を有する。これらのペプチドは、グリコシル化またはリン酸化などの１つ以上の翻訳後修飾をさらに含み得る。これらの方法を使用して、ＭＨＣによって提示された１つ以上のペプチドを定量化することができる。
【００６４】
Ａ．免疫療法の有望性および苦労
急性リンパ芽球性白血病に対する免疫療法を受けている４人の患者のうち３人が１８ヶ月後に完全寛解を示す場合、それは癌との闘いにおけるワクワクする希望に満ちた期間を定義する（Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。２０１１年のイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））の承認以来、癌免疫療法は、患者の全生存の劇的な改善、約１４００件の進行中の臨床試験で（ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、２０１８年１１月１７日現在、検索用語「免疫療法」）、様々な種類の癌の治癒をもたらし、２０２１年の世界市場で１２００億ドルが推定される（ＢＣＣ  Ｌｉｂｒａｒｙ−Ｒｅｐｏｒｔ  Ｖｉｅｗ−ＰＨＭ０５３Ａ）。免疫療法は、患者自身の免疫系を操作および／または活用して、特定の細胞表面腫瘍抗原を標的とし、腫瘍クリアランスに対する免疫応答を誘導することにおける努力を基に広く構築されている（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。しかしながら、開発された療法は、必ずしも有効であるとは限らず、理由は無応答から致命的なサイトカイン放出症候群にまで及ぶ。例えば、急性リンパ芽球性白血病の治療薬ＪＣＡＲ０１５または多発性骨髄腫のためのＭｅｒｃｋのペムブロリズマブについての臨床試験における死亡は、患者および製薬会社に同様に大きな不安を与えた（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。しかしながら、免疫療法に対する癌の再発率は、腫瘍細胞を完全に排除するか、または不完全に作用して有害な副作用を伴う可能性があるかの二峰性であると思われる（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。この発見は、慎重な患者の選択を支持する。したがって、患者の選択を助けるより予測的なバイオマーカーを使用する努力が重要であり、増大する未だ満たされていない市場ニーズである。
【００６５】
免疫療法のほとんどのクラス−Ｔ細胞療法（ＣＡＲおよびＴＣＲ）、癌ワクチン、およびチェックポイント阻害剤は、体内のＴ細胞を設計または操作するため（Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）、患者を階層化するための厳しい基準は、Ｔ細胞と相互作用する生体分子を直接プロファイリングすることによるものであり得る。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、細胞の表面上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体によって提示された短い８〜１２アミノ酸長のペプチドを認識する。図１２は、これらのペプチドの生成および提示のための簡略化した細胞経路を描く。ウイルス感染または腫瘍関連突然変異によって引き起こされる機能障害プロテオームは、提示されたＨＬＡ−Ｉペプチドのセットに反映される。したがって、これらのペプチドは、Ｔ細胞係合、活性化、免疫応答、およびクリアランスについての細胞シグナルとして機能する（Ｎｅｅｆｊｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。腫瘍関連ペプチドおよび腫瘍特異的ペプチド（ネオ抗原）の両方が、Ｔ細胞ベースの両方および癌ワクチンによって標的とされ（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０１５）、したがってこれらのペプチドの存在は、免疫療法の有効性の最良の相関を提供し得る。生検から直接同定されたＨＬＡ−Ｉペプチドは、患者を既存の免疫療法と結びつけるための新たな高度に相補的な診断を与え得る。
【００６６】
Ｂ．腫瘍生検から直接ＨＬＡペプチドを得るために必要な方法
現在、患者の腫瘍試料から直接ＨＬＡ−Ｉ結合ペプチドを配列決定および同定することには、技術的「盲点」が存在する（Ｂｒｅｎｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。課題は、（ａ）Ｔ細胞認識を誘起するために細胞あたりわずか１０コピーの各ペプチドが提示される、極めて低い存在量、（ｂ）試料あたり最大１０，０００個の異なるＴＡＡペプチドの高度に異種の集団、および（ｃ）突然変異したペプチドを処理し、提示するための個別化された腫瘍関連経路に関する不完全な理解に起因する（Ｙｅｗｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。質量分析は、ペプチドを同定することができるが、感受性が非常に限定されており、検出可能なシグナルを産生するために約１００万コピー（分子）の単一ペプチドを必要とする。これは、より制限されたサイズの典型的な腫瘍生検から直接ではなく、拡張可能な細胞株からのペプチドをカタログ化するためのその使用を制限する（Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。代替として、ペプチド予測アルゴリズムは、例えば、腫瘍生検から得られたエクソームおよびトランスクリプトーム配列を、ＨＬＡ結合モチーフ、結合親和性、およびプロテアソーム切断パターンのコンピューターモデルと統合することによって、抗原ペプチドを予測することができる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。現在、そのようなアルゴリズムは、互いにほとんど一致せず、それらが腫瘍特異的ペプチドおよび腫瘍関連ペプチドを同定する能力は、盲検試験において正しいことはほとんどない（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｚａｎｅｔｔｉ，２０１７）。
【００６７】
Ｃ．臨床相関の確立
ＨＬＡ−Ｉペプチド配列決定によって患者の選択および転帰を改善する
今日、患者のスクリーニングは、発現された遺伝子または突然変異を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲまたは全エクソーム配列決定などの代理ツールに依存している。例えば、多発性骨髄腫ＴＣＲ療法の場合、２０人の患者が、全長の発現されたＮＹ−ＥＳＯ−１  ｍＲＮＡについて最初にスクリーニングされたが、療法が開発された実際に提示されたＨＬＡ−Ｉペプチドについてはスクリーニングされなかった（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。腫瘍上の標的抗原を直接確認することなく操作されたＴ細胞を患者に導入することは、潜在的な有効性に関する知識なしに、患者を自己免疫反応またはサイトカイン症候群のリスクにさらす（Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。現在、多くの治療ペプチド標的が、拡大し続けている公的データベース（ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）および私的データベース（企業）において同定され、カタログ化されている（Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。これらの確認されたペプチド抗原を腫瘍生検から直接同定するための高速アッセイは、患者を事前に設計されたＴ細胞またはワクチンに割り当てるのを助けるために必要とされる。
【００６８】
多くの免疫療法治療は、そのようなアッセイから潜在的に利益を享受するＨＬＡ−Ｉ結合ペプチド抗原を標的とすることに基づく（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。抗原焦点式免疫療法と呼ぶこれらのタイプの免疫療法には、以下が含まれる：（ａ）腫瘍抗原特異的Ｔ細胞が、患者の末梢血から単離され、インビトロで拡張され、再度患者に注入される、内因性Ｔ細胞療法（ＥＴＣ）、（ｂ）患者Ｔ細胞が、腫瘍抗原特異的ＴＣＲを発現するように操作される、ＴＣＲ  Ｔ細胞療法、および（ｃ）抗腫瘍Ｔ細胞応答を活性化するために、ペプチドネオ抗原のカクテルを使用して患者に免疫付与する、癌ワクチン（Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。
【００６９】
ＩＶ．定義
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、一般に、イオン化形態で存在し得る少なくとも１つのアミノ基、−ＮＨ２、−ＮＨ３＋、およびイオン化形態−ＣＯＯ−で存在し得る１つのカルボキシル基、−ＣＯＯＨを含有する有機化合物を指し、カルボン酸は、中性ｐＨで脱プロトン化され、塩基式ＮＨ２ＣＨＲＣＯＯＨを有する。アミノ酸およびしたがってペプチドは、Ｎ（アミノ）末端残基領域およびＣ（カルボキシ）末端残基領域を有する。アミノ酸の種類は、哺乳動物における生物学的タンパク質の大部分を含むため「天然」とみなされる少なくとも２０を含み、リジン、システイン、チロシン、トレオニン等のアミノ酸を含む。アミノ酸はまた、カルボン酸基を（中性ｐＨで）有するものなどのそれらの側鎖に基づいてグループ分けされ得、アスパラギン酸またはアスパラギン酸塩（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸またはグルタミン酸塩（Ｇｌｕ、Ｅ）、ならびにリジン（Ｌｙｓ、Ｌ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｎ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）を含む塩基性アミノ酸を（中性ｐＨで）含む。
【００７０】
本明細書で使用する場合、用語「末端」は、単数の末端および複数の末端と称される。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「側鎖」または「Ｒ」は、各種類のアミノ酸に固有性を与えるα炭素に結合された固有の構造（アミノ酸のアミン基およびカルボン酸基を結合する）を指す。Ｒ基は、様々な形状、サイズ、電荷、および反応性、例えば正または負に荷電した荷電極性側鎖、例えばリジン（＋）、アルギニン（＋）、ヒスチジン（＋）、アスパラギン酸塩（−）、およびグルタミン酸塩（−）を有し、アミノ酸はまた、塩基性（リジンなど）または酸性（グルタミン酸など）であり得る。非荷電極性側鎖は、ヒドロキシル、アミド、またはチオール基、例えば化学的反応性側鎖を有するシステイン、すなわち、異なるサイズのヒドロキシルＲ側鎖を有する別のシステイン、セリン（Ｓｅｒ）、およびトレオニン（Ｔｈｒ）；アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）との結合を形成し得るチオール基を有する。非極性疎水性アミノ酸側鎖は、アミノ酸グリシン；アラニンのメチル基からロイシンおよびイソロイシンの異性体ブチル基までのサイズの範囲の脂肪族炭化水素側鎖を有するアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。メチオニン（Ｍｅｔ）は、チオールエーテル側鎖を有し、プロリン（Ｐｒｏ）は、環式ピロリジン側基を有する。フェニルアラニン（そのフェニル部分とともに）（Ｐｈｅ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）（そのインドール基とともに）は、バルクならびに非極性を特徴とする芳香族側を含有する。
【００７２】
アミノ酸はまた、名称または３文字コードもしくは１文字コードによって、例えばそれぞれシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）と称され得る。
【００７３】
アミノ酸は、栄養的に必須または非必須と分類され得るが、非必須と必須は生物間で異なり得るか、または異なる発達段階中で異なり得ることに注意されたい。特定の生物に対する非必須または条件付きアミノ酸は、典型的に、いくつかの遺伝子によってコードされる酵素をタンパク質合成の基質として使用する経路において、体内で適切に合成されるものである。必須アミノ酸は、生物が、デノボ経路を介して産生不可能でないか、または十分に天然に産生することができないアミノ酸、例えばヒトにおけるリジンである。ヒトは、合成サプリメント、肉、植物、および他の生物を含む食事によって必須アミノ酸を得る。
【００７４】
「非天然」アミノ酸は、天然にコードされないか、もしくは遺伝コードに見出されないもの、または哺乳動物および植物におけるデノボ経路を介して産生されないものである。それらは、自然界のアミノ酸に通常は見出されない、またはめったに見出されない側鎖を付加することによって合成され得る。
【００７５】
本明細書で使用する場合、２０標準生物学的アミノ酸と同様に、α炭素ではなくβ炭素に結合したアミノ基を有するβアミノ酸は、非天然アミノ酸である。一般的な天然に存在するβアミノ酸は、β−アラニンである。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語用語「アミノ酸配列」、「ペプチド」、「ペプチド配列」、「ポリペプチド」、および「ポリペプチド配列」は、ペプチド（アミド）結合によって共有結合される少なくとも２つのアミノ酸もしくはアミノ酸類似体、またはペプチド結合の類似体を指すように、本明細書において互換的に使用される。用語「ペプチド」は、アミノ酸またはアミノ酸類似体のオリゴマーおよびポリマーを含む。用語「ペプチド」はまた、一般にペプチドと称される分子を含み、一般に約２〜約２０個のアミノ酸を含有する。用語「ペプチド」はまた、一般にポリペプチドと称される分子を含み、一般に約２０〜約５０個のアミノ酸を含有する。用語「ペプチド」はまた、一般にタンパク質と称される分子を含み、一般に約５０〜約３０００個のアミノ酸を含有する。ペプチドのアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸であり得る。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、合成、組み換えであり得るか、または天然に存在し得る。合成ペプチドは、インビトロで人工的に産生されたペプチドである。
【００７７】
本明細書で使用する場合、用語「サブセット」は、個々のペプチド分子のＮ−末端アミノ酸残基を指す。Ｎ−末端リジン残基を有する個々のペプチドの「サブセット」は、リジンでないＮ−末端アミノ酸残基を有する個々のペプチド分子の「サブセット」とは区別される。
【００７８】
本明細書で使用する場合、用語「蛍光」は、異なる波長の光を吸収した物質による可視光の発光を指す。いくつかの実施形態では、蛍光は、特定の波長での蛍光発光に基づいて生体分子を追跡および／または分析する非破壊的方法を提供する。タンパク質（抗体を含む）、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド（単一標準プライマーおよび二重標準プライマーを含む）は、蛍光団と称される様々な外因性蛍光分子で「標識」され得る。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「単一分子レベルでの」ペプチドの配列決定は、多様なペプチド分子の混合物中の個々の（すなわち、単一の）ペプチド分子から得られたアミノ酸配列情報を指す。本開示は、個々のペプチド分子から得られたアミノ酸配列情報が、個々のペプチド分子の完全なまたは連続したアミノ酸配列である方法に限定されなくてもよい。いくつかの実施形態では、部分アミノ酸配列情報が得られ、ペプチドまたはタンパク質の同定を可能にすることが十分である。例えば、個々のペプチド分子内の特定のアミノ酸残基（すなわち、リジン）のパターンを含む、部分的アミノ酸配列情報は、個々のペプチド分子を固有に同定するのに十分であり得る。例えば、個々のペプチド分子内のリジン分子の分布を示すＸ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｌｙｓなどのアミノ酸のパターンは、個々のペプチド分子を同定するために、所与の生物の既知のプロテオームに対して検索され得る。単一分子レベルでのペプチドの配列決定が、個々のペプチド分子中のリジン残基のパターンを同定することに限定されることは意図されない。任意のアミノ酸残基（複数のアミノ酸残基を含む）の配列情報を使用して、多様なペプチド分子の混合物中の個々のペプチド分子を同定することができる。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「単一分子分解能」は、多様なペプチド分子の混合物中の個々のペプチド分子からデータ（例えば、アミノ酸配列情報を含む）を取得する能力を指す。１つの非限定例では、多様なペプチド分子の混合物は、固体表面（例えば、ガラススライド、または表面が化学的に修飾されたガラススライドを含む）上に固定化され得る。一実施形態では、これは、ガラス表面にわたって分布した複数の個々の（すなわち、単一の）ペプチド分子の蛍光強度を同時に記録する能力を含み得る。このように適用され得る光学デバイスは市販されている。例えば、全内部反射照明および強化電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器を備えた従来の顕微鏡が入手可能である（Ｂｒａｓｌａｙｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３を参照）。高感度ＣＣＤカメラを用いた撮像は、器具が、表面にわたって分布した複数の個々の（すなわち、単一の）ペプチド分子の蛍光強度を同時に記録することを可能にする。一実施形態では、２つの帯域フィルター（各蛍光分子に好適なもの）を通して光を配向する画像スプリッターを使用して画像収集を行い、ＣＣＤ表面上に並んだ２つの画像として記録することができる。自動焦点制御を有する電動顕微鏡ステージを使用して、フローセル中の複数のステージ位置を撮像することは、数百万の個々の単一ペプチド（またはそれ以上）が１回の実験で配列決定されるのを可能にすることができる。
【００８１】
本明細書で使用される用語「標識」は、なんらかの形態の測定可能なシグナルを生成する分子への化学基の導入である。そのようなシグナルは、限定されないが、蛍光、可視光、質量、放射線、または核酸配列を含み得る。
【００８２】
帰属確率質量関数−所与の蛍光配列の場合、そのソースタンパク質の事後確率質量関数、すなわち、観察された蛍光配列をｆｉとした各ソースタンパク質ｐｉの確率のセットＰ（ｐｉ／ｆｉ）。
【実施例】
【００８３】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を示すために含まれる。後に続く実施例で開示される技法は、発明者により発見された技法が、本開示の実施に際して十分機能することを示し、それ故、その実施のための好ましい方式を構成すると考えることができる。しかしながら、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、同じまたは同様の結果が依然として得られる多くの変更をなし得る。
【００８４】
実施例１−ＭＨＣに結合したペプチドを配列決定によって同一性および量によりプロファイリングする
ＭＨＣペプチドをプロファイリングするために使用される方法は、図２に要約される。おおまかに、プロセスは４つの部分に細分される：（ａ）生体試料からＭＨＣ結合ペプチドを抽出し、濃縮するための手順、（ｂ）アミノ酸を蛍光団で標識し、蛍光配列決定データを実施すること、（ｃ）生体試料のゲノムおよびトランスクリプトーム配列決定を実施すること、ならびに（ｄ）蛍光配列決定およびゲノムデータを生物情報学的分析と統合して潜在的なＭＨＣペプチド配列のリストを得ること。これらの実施形態の各々は、以下でより詳細に述べられる。
【００８５】
Ａ．ＭＨＣ結合ペプチドを抽出する
ＭＨＣ結合ペプチドを濃縮し、抽出するためのいくつかの方法は、文献で十分に説明されている（Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。細胞および組織を最初に溶解し、ＭＨＣタンパク質を免疫沈降法によって濃縮する。簡潔に言うと、ＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子特異的（または実験に依存する全対立遺伝子的）抗体をビーズに固定し、ＭＨＣ−Ｉタンパク質を濃縮する。このタンパク質混合物を弱酸（例えば０．２〜１％ギ酸）でやさしく処理することによって、ＭＨＣ−Ｉ複合体に結合したペプチドが放出される。これらのペプチドを収集し、下流用途のために凍結乾燥する。生体試料のソースは、腫瘍生検、健常な組織生検、細胞培養物、血流からの濃縮細胞（樹状細胞など）、または他の好適なソースであり得る。同じ患者から腫瘍および適合した対照試料が入手可能であるという事態が生じた場合、これは、個別化されたＭＨＣペプチドの抽出および同定につながり得、これは「個別化」療法と呼ばれる療法の性質である。適合した試料のソースまたは特定の存在にかかわらず、抽出方法（複数可）の最終生成物は、ペプチドのプールである。
【００８６】
Ｂ．ＭＨＣ結合ペプチドの蛍光配列決定
Ａにおいて得られた抽出ＭＨＣペプチドを、蛍光配列決定で使用される標識手順に供する。
【００８７】
（ｉ）ペプチドの標識
異なるアミノ酸、すなわちステイン、リジン、トリプトファン、およびアスパラギン／グルタミン酸を標識するための戦略は、以前に記載されている（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。チロシン、メチオニン、ヒスチジン、および翻訳後修飾されたアミノ酸残基（リン酸化およびグリコシル化）の標識は、同様に実施され得ると考えられる（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｐｈａｔｎａｍｉ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｌｅａｆ，２００６、Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。実験的に、ペプチド試料は、ランダムサブサンプリングによって、またはペプチドを塩もしくはｐＨ勾配カラムによって異なるアリコートに分離することなどの断片化法を介して部分に分けられる。これらのアリコートの各々は、アミノ酸選択的蛍光団のサブセットで蛍光標識される。考えられる実装では、アリコートの各々をさらに細分し、アミノ酸選択的蛍光団の異なるサブセットで標識する。ＭＨＣペプチド試料の濃度に応じて、直接蛍光標識を行うことができる。
【００８８】
（ｉｉ）標識ペプチドの蛍光配列決定
蛍光標識されたペプチドの集団は、記載されているように配列決定される（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，２０１０、米国特許第９，６２５，４６９号、米国特許出願第１５／４６１，０３４号、米国特許出願第１５／５１０，９６２号）。ＭＨＣペプチドは、典型的に９〜１１アミノ酸長であるため、約１０〜１５サイクルの実験サイクルを実施する（１サイクルは、１回のエドマン分解化学および複数の蛍光チャネルにわたって全てのペプチドの画像を得るためにスライド表面を走査するラウンドラスターを含む）。エドマンサイクルによる各ペプチド分子の強度痕跡を分析し、蛍光配列を得る。実験における異なる生理化学的プロセスの効率（光退色速度およびエドマン効率など）に関する情報を複合した後、蛍光配列のリストを、それらのカウントおよび信頼性スコアとともに生成する。
【００８９】
Ｃ．蛍光配列を一致させるためにエピトープの参照データベースを構築する
Ｂから得られた蛍光配列のリストを参照データセットと一致させて、その正確なペプチド配列を決定することができる。参照データベース（例えば、全てのＭＨＣペプチド配列の潜在的なセット）の構築は、基礎となる細胞プロテオームの生物情報学的分析を必要とする。しかし、細胞プロテオーム中に存在する全てのタンパク質およびペプチドをカタログ化することにおける困難を考慮して、研究者は、多くの場合、エクソームおよびトランスクリプトーム配列決定データを使用して、ＭＨＣペプチドドリストを推測する。ゲノム情報からＭＨＣペプチドを予測するために、２つの該当する情報源が必要である−（ａ）発現されたタンパク質の集団（エクソームまたはトランスクリプトームデータから得ることができる）および（ｂ）個々の細胞株のＨＬＡ型判別（６つの異なるＨＬＡ対立遺伝子のセット）。したがって、蛍光配列決定によるＭＨＣペプチド配列決定のパイプラインでは、（ａ）細胞もしくは組織生検のゲノム（もしくはエクソーム）およびトランスクリプトーム配列決定が実施されるか、または（ｂ）上記２つの情報をもたらし得る特定の生体試料の公的に入手可能なデータセットが使用される。
【００９０】
エクソームおよびトランスクリプトームデータを使用してＭＨＣペプチド配列を推測する、いくつかの公的に入手可能な予測アルゴリズムが入手可能である（Ｂａｃｋｅｒｔ＆Ｋｏｈｌｂａｃｈｅｒ，２０１５）。潜在的に翻訳されたタンパク質を起源とする９〜１１アミノ酸長のペプチドを、それらの二次構造、ＭＨＣ結合強度、転写レベル存在量、プロテアソーム切断効率等について計算的に分析して、それがＭＨＣ結合ペプチドとして提示される可能性を決定する（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０１５）。このペプチドの順位序列リストは、観察された蛍光配列と一致するパターンの参照データセットである。腫瘍生検および一致した対照試料（エクソームまたはゲノムデータ単独）から得られたリスト上で比較を行う場合、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原を決定することができる。蛍光配列がこれらのＭＨＣペプチド配列を同定するか、またはそれに一致する場合、ネオ抗原を発見し、確認するために蛍光配列決定技術を使用することができる。このデータセットの代替ソースは、質量分析で同定されたペプチドであり得る。高い偽発見スコアを伴い、ペプチドリストはより多くの偽陽性データを有するが、予測アルゴリズムと組み合わせると、単なる予測アルゴリズム出力よりも豊富なデータセットを包含することができる。
【００９１】
Ｄ．蛍光配列決定データを参照データセットに一致させる
Ｂの結果は、観察されたカウントおよびその観察の信頼性スコアを含む蛍光配列のリストである。Ｃからの結果は、ペプチド配列のデータセットであり、予測アルゴリズムからの順位序列または好適に入手可能なソースからのエピトープのデータセットのいずれかである。（ａ）選択的に標識され得る少数のアミノ酸基および（ｂ）より小さいペプチド長（９〜１１アミノ酸長）を考慮して、予測されるデータセットにおけるペプチドへの蛍光配列の固有の一致は低い可能性が高い。しかしながら、蛍光配列の直接観察を考慮し、順位序列ペプチドリストを、直交情報で再重み付けすることができ、新たな順位序列ペプチドリストが生成され得る。観察された蛍光配列を、参照リストにおいてより高い順位のペプチドに一致させ、それを確認することができる可能性もある。スコアリングシステムを開発して、蛍光配列を参照データセットに一致させることができ、より高い重みは、データセットの他のペプチドの中でより低い一致頻度を有し、より高い順位のペプチドを確認する蛍光配列に起因する。
【００９２】
実施例２−ＭＨＣペプチドプロファイリングへのその適用を検証するための蛍光配列決定の数値シミュレーション
同定のためのＭＨＣペプチドの蛍光配列決定は、図３の単純な概略図に示されるように、２つの極値間の配列の情報コンテンツを提供する。スケールの一端では、いずれのアミノ酸も標識されない場合、ＭＨＣペプチドの情報は存在しない。スケールの他端では、全てのアミノ酸の同一性が明らかである場合、ＭＨＣペプチドは、完全に同定され得る。蛍光配列決定による部分アミノ酸標識スキームは、この情報スケールの真中に存在する。スケール上の蛍光配列決定に由来する情報の位置を決定するために、異なる標識方法をシミュレートして、情報コンテンツを最大化する標識戦略を決定し、ＭＨＣペプチドプロファイリングツールとしてのその適用を検証した。
【００９３】
以下の２つのシミュレーション研究は、公的に入手可能なＭＨＣペプチド中の情報コンテンツにアクセスするための蛍光配列決定の実行可能性を強調する。
【００９４】
（ｉ）標識され得るアミノ酸の存在
２０個の天然に存在するアミノ酸のうちの６つが、蛍光配列決定のために標識され得るとすると、どの表示がＭＨＣペプチド配列にあるかは不明である。蛍光配列決定のために視認できる推定上のＭＨＣペプチドのパーセンテージを決定するために、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子によって提示されたエピトープを、ＩＥＤＢデータレポジトリから選択した（ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）（結合アッセイでの確認によりフィルタリングされる）。図４は、１２，１６０ＭＨＣペプチドのうちの７５％超が、たった２つのアミノ酸で標識することによって蛍光配列決定法により検出され得る。アミノ酸を標識するための異なるオプションの中で、グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩残基の標識は、被覆度を著しく増大させた。３つ以上のアミノ酸を標識することにより、蛍光配列決定によって検出され得るペプチドの数をさらに増加させると考えられる。この分析は、エピトープの固有の同定を示さないが、ＭＨＣ結合ペプチドを観察するための蛍光配列決定の実行可能性を単に協調する。
【００９５】
（ｉｉ）蛍光配列決定によるＭＨＣエピトープの固有の同定および確認
癌種の中で、黒色腫細胞株は、最高の突然変異荷重を担持することが観察された。蛍光配列決定に使用可能な標識スキームが、既知のＭＨＣエピトープを固有に同定または確認することができるかどうかを見出すために、黒色腫細胞株において発生したことが観察された検証済みエピトープリストをＩＥＤＢデータレポジトリから選択した。既知の１３３エピトープは、検証されたエピトープ観察において「黒色腫」という用語についてＩＥＤＢデータセットをフィルタリングすることによってコンパイルされ、ＭＨＣペプチドを固有に同定するための蛍光配列決定の限界を検証するためのベンチマークとして機能し得る。図５Ａに見られるように、リスト内のエピトープの４分の１超は、単純な２標識戦略を使用して固有に同定され得る。しかしながら、Ｋ、Ｙ、およびＥなどの３つの標識の単純なスキームを使用して（図５Ｂ）、エピトープの７５％超が、最大５つのペプチドを含有する蛍光配列に割り当てられ得る。
【００９６】
これらの結果は、技術としての蛍光配列決定が、ＭＨＣペプチドの同定可能な情報を提供することを示す。参照データベースおよび複数の標識戦略と組み合わされると、蛍光配列決定技術は、確率の高い予測ペプチドを同定し、確認することができる。さらに、予測ネオ抗原ペプチドに一致する蛍光配列の証拠がある場合、この技術はまた、ネオ抗原発見に使用することもできる。これらの以前に同定されたネオ抗原（公的ネオ抗原とも称される）は、限定された組織生検から蛍光配列決定によって直接同定され得る。このタイプの試験は、患者選択プロセスに対して想定される。選ばれたネオ抗原に基づく療法は、蛍光配列決定によって同定され得る提示されたネオ抗原を発現している患者と組み合わされ得る。
【００９７】
実施例３−ＨＬＡペプチドを配列決定する
（ｉ）単一対立遺伝子Ｂ細胞からのＨＬＡペプチド
パイロット実験を設定して、ＨＬＡペプチドを得て検証し、単一対立遺伝子Ｂ細胞株上のネオ抗原ペプチドを予測した。単離されたペプチドを蛍光配列決定によって配列決定し、混合物中に添加されたペプチドを標的として、検出限界を決定した。
【００９８】
（ｉｉ）ＨＬＡペプチドを単離して検証する
２つの単一対立遺伝子Ｂ細胞株（ＨＬＡ−Ａ２６０３およびＨＬＡ  Ｂ０７０２）は、刊行物に詳述されるように、国際組織適合性学会から購入した（Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。３×１０８細胞を培養し、ＨＬＡペプチド精製を記載のとおり実施した（Ａｂｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。プロセスの概略を図６に示す。
【００９９】
単離されたＨＬＡペプチドを、ヒトプロテオーム（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）の参照データセットを使用し、ＨＬＡペプチドを分析するための文献に記載される設定を用いて、ＬＣ結合されたタンデム質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｕｍｏｓ）によって同定した（Ａｂｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７、Ｂａｓｓａｎｉ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＨＬＡ単離手順の有効性は、単離されたペプチドに関してモチーフ分析および結合親和性分析を実施することによって確認した（図７に示す）。ＨＬＡ対立遺伝子について高比率の強い親和性結合ペプチドと以前に記載されたモチーフとを観察することは、単離されたペプチドの純度に関する直交確認を提供する。
【０１００】
（ｉｉｉ）ゲノム情報からＨＬＡペプチドを予測する
Ｂ細胞株（ＨＬＡ−Ａ２６０３対立遺伝子を発現する）のゲノムおよびＲＮＡ配列決定データを、公的に入手可能なデータセットから得た。生配列リードを分析し、ｍｈｃｆｌｕｒｒｙを含むソフトウェアのリストを使用して標準参照ヒトゲノムと比較して、単一ヌクレオチド変異およびインデル（ネオ抗原）を含有するペプチドのリストを生成した。プロセスの次のステップは、ｎｅｔＭＨＣソフトウェアによるペプチド配列の分析であり、これはＭＨＣ複合体へのペプチドの結合親和性を予測し、細胞上のその提示のプロキシとして機能する。この分析を実施することにより、転写物由来のペプチドのセットを３６，０００に絞り込んだ。
【０１０１】
図８のベン図は、ゲノム情報および計算分析を使用して予測されるＨＬＡペプチドのリスト、ならびに質量分析を使用した直接ペプチド同定との重複を列挙する。分析から、４つのネオ抗原ペプチドは、質量分析で直接観察され、（ｂ）ｎｅｔＭＨＣを使用して強力なバインダーであることが予測され、（ｃ）Ｂ細胞細胞株に特異的な突然変異を含有した。
【０１０２】
（ｉｖ）ＨＬＡペプチドの蛍光配列決定
ＨＬＡペプチドに関する単一分子蛍光配列決定法を検証するために、Ａ２６０３およびＢ０７０２細胞株からのＨＬＡペプチドを、最初に前述のように単離した。次いで、Ｃ末端カルボン酸を、前述のオキサゾロン化学を使用して、酸エステル化Ｆｍｏｃ  ＰＥＧリンカー（Ｆｍｏｃ−ＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２）で選択的にキャップした（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。内部アスパラギン酸およびグルタミン酸残基を、標準カルボジイミド化学（Ｔｏｔａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、続いてＦｍｏｃ基の脱保護を使用してＡｔｔｏ６４７Ｎ−アミンで標識した。標準Ｃ−１８チップクリーンアップによって遊離染料を除去し、次いで蛍光配列決定に供した。これは、遊離カルボン酸末端を有する蛍光標識されたペプチドのセットを産生した。図９は、２つの細胞株間の標識酸性残基を観察するオッズ比および質量分析で同定されたペプチドとの相関を比較する。質量分析に基づく方法は、十分にイオン化され得るペプチドおよび多量の分子に向かって偏向され、それ故に、試料中に存在する全てのペプチドを示すことができない。蛍光配列決定を用いて相関構造を観察することは、ＨＬＡペプチドを配列決定する方法の検証を提供する。
【０１０３】
蛍光配列決定技術の感受性をさらに検証し、その検出限界を得るために、既知の標的抗原ペプチドの添加回収アッセイを、ＨＬＡペプチドバックグラウンドで実施した。以前に同定された（配列ＥＬＹＡＥＫＶＡＴＲの）ネオ抗原を選択し、内部酸性残基をＡｔｔｏ６４７Ｎ蛍光団で標識し、標識ＨＬＡペプチド混合物バックグラウンドへの５桁希釈にわたってペプチドを添加した。このペプチド混合物上の蛍光配列決定を実施し、実験あたり約５０，０００個の個々の分子から測定を行った。観察された蛍光配列パターン「ＥｘｘｘＥ」を有する分子の数を定量化し、図１０に示す。細胞あたり約１０００個のＨＬＡペプチドのカウントを仮定すると、蛍光配列決定法は、１０細胞あたり単一のペプチド分子を検出するために感受性である。
【０１０４】
（ｖ）単一分子ペプチド配列決定法を使用するＨＬＡペプチド配列決定の適用
蛍光配列決定によって例示される単一分子ペプチド配列決定法は、腫瘍治療およびモニタリングに適用可能である。高感受性プロテオーム法である利点は、少量の試料を必要とし、同定のためのハイダイナミックレンジを有することを示唆する。２つの特定の適用を図１１に示す。
１．ネオ抗原または腫瘍関連抗原の治療的発見：腫瘍から直接同定されたＨＬＡペプチドを、ネオ抗原ペプチドの証拠を改善するために核酸配列決定からの予測アルゴリズムと組み合わされる。
２．患者スクリーニング：蛍光配列決定プラットフォームを使用して、既知の（公的な）ネオ抗原群の存在について患者の腫瘍生検を速やかにスクリーニングすることができる。
【０１０５】
本明細書に開示され、特許請求される全ての方法は、本開示の観点で過度な実験を行うことなく、なされ、実行されてもよい。本開示の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点で記載されてきたが、本開示の概念、趣旨および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の方法、工程、または方法の工程の順序に変化が加えられてもよいことは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的に関連する特定の作用物質を、同じ結果または同様の結果が達成されつつ、本明細書に記載される作用物質に交換されてもよいことは明らかであろう。全てのそのような同様の代替物および修正は、添付の特許請求の範囲に定義されるような本開示の趣旨、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【０１０６】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示されるものに対して補助的な手順の例または他の詳細を与える程度まで、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
2021534394.tif 000002
2021534394.tif 000003
【図１】
2021534394.tif 000004
【図２】
2021534394.tif 000005
【図３】
2021534394.tif 000006
【図４】
2021534394.tif 000007
【図５】
2021534394.tif 000008
【図６】
2021534394.tif 000009
【図７】
2021534394.tif 000010
【図８】
2021534394.tif 000011
【図９】
2021534394.tif 000012
【図１０】
2021534394.tif 000013
【図１１】
2021534394.tif 000014
【図１２】
2021534394.tif 000015
【国際調査報告】
2021534394.tif 000016
2021534394.tif 000017
2021534394.tif 000018