(57)【要約】本発明は、グリシン含有トリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、およびアテローム性動脈硬化症を治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類対象における高脂血症、脂肪肝、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、肥満、高血糖、メタボリックシンドローム、心血管疾患、及びアテローム性動脈硬化症のうちの少なくとも１つの治療方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のグリシン、グリシン含有トリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項２】
前記グリシン含有トリペプチド分子が、肝臓トリグリセリドレベルを有意に低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グリシン含有トリペプチド分子が、肝臓総コレステロールレベルを有意に低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記グリシン含有トリペプチド分子が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
グリシン含有トリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、肝臓の脂質の酸化もしくは利用の増強方法、前記対象の血中のトリグリセリドレベルの低下方法、またはそれを必要とする高コレステロール血症の前記対象の血中のコレステロールレベルの低下方法であって、治療の結果として、肝臓の脂質酸化が増加し、前記トリグリセリドレベル、前記高コレステロール血症またはそれらの任意の組み合わせが改善される、前記方法。
【請求項６】
前記グリシン含有トリペプチド分子が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記グリシン含有トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩が、肝脂質酸化の調節因子ＡＭＰＫα１またはＰＰＡＲαの発現を有意に誘導する、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記グリシン含有トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩が、ＣＰＴ１ａ、ＣＡＣＴ、またはＡＣＡＤＩ（ミトコンドリアβ酸化）またはＰＮＰＬＡ２を有意に上方制御することによって肝臓トリグリセリドレベルを低下させる、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記グリシン含有トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩が、ミトコンドリア陰イオン担体ＵＣＰ２を有意に上方制御することによって肝臓トリグリセリドレベルを低下させる、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記グリシン含有トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩が、ＡＢＣＧ５及びＡＢＣＧ８の発現を有意に増加させることによって前記肝臓におけるコレステロール恒常性を調節する、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
血漿脂質特性の治療を必要とする対象に、グリシン含有トリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を投与して、前記対象の血漿トリグリセリド、血漿ＬＤＬレベルを低下させるか、アテローム性動脈硬化症の病変のさらなる進行を予防するか、または前記対象の動脈に存在するアテローム性動脈硬化症の病変を退行させ、ＭＡＣＥの発症を軽減し、一次心血管事象を予防し、遅延させるかもしくはその重症度を軽減する、前記対象の血漿脂質特性の治療方法。
【請求項１２】
前記グリシン含有トリペプチド分子が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはそれらの薬学的に許容される塩が、アテローム性動脈硬化症の病変を低減する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩が、血漿総コレステロール、血漿ＬＤＬコレステロール、非ＨＤＬコレステロール、ＶＬＤＬコレステロールまたはそれらの組み合わせを低下させる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
脂肪組織における炎症の治療方法及び循環中の炎症マーカーレベルの低減方法であって、それを必要とする対象に、グリシン含有トリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、前記グリシン含有トリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩の投与により、前記対象の前記脂肪組織及び前記循環中の炎症マーカーを低減する、前記治療方法及び低減方法。
【請求項１６】
前記循環中の前記炎症マーカーを、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を前記対象に投与することによって血漿ＭＣＰ１レベルを低下させることにより低減する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂肪組織における炎症が、精巣上体脂肪組織（ＥＡＴ）または皮下脂肪組織（ＳＡＴ）に存在し、ＭＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルを低下させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
レプチンの血漿レベルを低下させるための治療を必要とする対象に、グリシン含有トリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、前記グリシン含有トリペプチド分子の投与が、血漿レプチンのレベルを低下させる、前記レプチンの血漿レベルを低下させるための対象の治療方法。
【請求項１９】
前記治療を、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を用いて行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
治療を必要とする対象にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、前記対象の治療方法であって、前記対象が肝疾患を有する、前記治療方法。
【請求項２１】
前記肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）もしくは非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、またはアルコール性脂肪肝である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、前記対象におけるＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）の安定化方法または低下方法。
【請求項２３】
前記方法が、ＮＡＳの脂肪肝成分の進行を遅延させるか、安定化するか、または低減することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、ＮＡＳの小葉の炎症成分の進行遅延、安定化、または低減することを含む、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が、ＮＡＳの肝臓バルーニング成分の進行遅延、安定化、または低減することを含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＮＡＳが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩での６か月の治療後、少なくとも１．５ポイント異なる、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
肝線維症の軽減を必要とする対象における前記肝線維症の軽減方法であって、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を前記対象に投与することを含む、前記軽減方法。
【請求項２８】
アテローム性動脈硬化症の治療方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、治療有効量のグリシン含有トリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項２９】
前記グリシン含有トリペプチド分子が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
心筋梗塞、動脈硬化症、冠動脈疾患、頸動脈疾患、末梢動脈疾患、アテローム血栓性脳卒中、動脈瘤、または慢性腎疾患からなる群から選択されるアテローム性動脈硬化症の合併症を治療するためのグリシン含有トリペプチド分子を、前記合併症を有する対象に投与することによる、前記合併症の治療方法。
【請求項３１】
前記グリシン含有トリペプチド分子が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、コレステロール吸収阻害剤、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、ＡＲＢ、利尿剤、レニン、ＧＬＰ−１またはその合成バリアント、インスリン、またはその合成バリアント、メトホルミン、スルホニル尿素化合物、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、ＳＧＬＴ２阻害剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）阻害剤、エゼチミブ、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、クロフィブラート、ベザフィブラート、ペマフィブラート、ゲムカベン（ＣＩ−１０２７）、ベンポド酸（ＥＴＣ−１００２）、ＡＣＣ阻害剤、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ阻害剤、ＡＣＬ阻害剤、処方魚油、ＣＥＴＰ阻害剤、抗線維化剤、及びそれらの組み合わせを含む、第２の治療薬を、それを必要とする前記対象に投与することをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
選択されたトリペプチド、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを有する対象を治療するためのキット。
【請求項３４】
前記キットが、ＤＴ−１０９（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）及び／またはＤＴ−１１０（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ）、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３５】
前記キットが、場合により、コレステロール吸収阻害剤、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、ＡＲＢ、利尿剤、レニン、ＧＬＰ−１またはその合成バリアント、インスリン、またはその合成バリアント、メトホルミン、スルホニル尿素化合物、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、ＳＧＬＴ２阻害剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）阻害剤、エゼチミブ、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、クロフィブラート、ベザフィブラート、ペマフィブラート、ゲムカベン（ＣＩ−１０２７）、ベンポド酸（ＥＴＣ−１００２）、ＡＣＣ阻害剤、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ阻害剤、ＡＣＬ阻害剤、処方魚油、ＣＥＴＰ阻害剤、抗線維化剤、及びそれらの組み合わせをさらに含む、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３６】
前記キットが、場合によりエゼチミブを含む、請求項３２または請求項３３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年８月１０日に出願された米国特許出願第６２／７１７，５４６号の優先権を主張する。前述の出願の内容全体が、本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
「非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、世界中、特に西欧諸国でますます一般的になっている。米国では、これは慢性肝疾患の最も一般的な形態であり、推定８０００万〜１億人が罹患している。非アルコール性脂肪性肝疾患は、アルコールをほとんどまたはまったく飲まない人々に影響を与える様々な肝疾患の総称である。名前が示すように、非アルコール性脂肪性肝疾患の主な特徴は、肝細胞に多量の脂肪が蓄積されることである。肝臓に脂肪が含まれていることは正常である。しかしながら、肝臓の重量の５％〜１０％超が脂肪である場合、その状態は脂肪肝（脂肪症）と呼ばれる。
【０００３】
ＮＡＦＬＤのより重症な形態は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれる。ＮＡＳＨは、肝臓を腫れさせ、損傷を与える。ＮＡＳＨは、過体重すなわち肥満であるか、または糖尿病、高コレステロールもしくは高トリグリセリドもしくは炎症状態を有する人に発症する傾向がある。この疾患の潜在的に重度な形態であるＮＡＳＨは、肝細胞のバルーニングと肝臓の炎症を特徴とし、これらは瘢痕化と不可逆的な損傷に進行し得る。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の第１の態様は、炎症性疾患、代謝疾患及び／または心血管疾患の治療方法を提供し、方法は、治療有効量のグリシンまたはグリシン含有トリペプチド分子を、１つ以上の炎症性疾患、代謝疾患及び／または心血管疾患を有する対象に投与することを含む。様々な実施形態において、グリシン含有トリペプチド分子は、ＤＴ−１９０（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）及びＤＴ−１１０（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ）のうちの１つ以上を含み得る。様々な実施形態において、代謝疾患とは、代謝のエラー、代謝の不均衡、または最適ではない代謝が生じる、特定された障害の群を指す。本明細書に記載の代謝疾患には、代謝の調節を通じて治療することができる疾患も含まれるが、疾患自体は、特定の代謝欠損によって引き起こされるものであっても、そうでなくてもよい。そのような代謝疾患は、例えば、グルコース及び脂肪酸の酸化経路を含み得る。「代謝障害」または「代謝疾患」とは、代謝機能の変化または妨害を特徴とする病態を指す。「代謝性」及び「代謝」は、当技術分野で周知の用語であり、一般的に、生きている生物内で生じる全範囲の生化学的プロセスを含む。代謝疾患及び心血管疾患として、肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、メタボリックシンドローム、脂質異常症、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、動脈硬化症、アテローム血栓性脳卒中、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、高脂肪酸血症もしくはメタボリックシンドローム、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。脂質異常症は高脂血症であり得る。高脂血症は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、または高コレステロール血症と高トリグリセリド血症の両方であり得る。ＮＡＦＬＤは、脂肪肝または脂肪性肝炎であり得る。糖尿病は、２型糖尿病または脂質異常症を伴う２型糖尿病であり得る。様々な実施形態において、グルコース調節不全及び／または体内、循環内または例えば肝臓などの様々な器官内への脂質の蓄積に関連する代謝疾患、ならびにそれらから生じる病理学的続発症、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、高血糖症、前糖尿病、糖尿病（Ｉ型及びＩＩ型）、肥満、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム及び糖尿病性脂質異常症に適用可能な方法を本明細書に提示する。
【０００５】
代謝性の疾患、障害または病態は、多数の身体的症状を特徴とし得る。代謝性の疾患、障害または病態と関連する当業者に公知の任意の症状は、グリシントリペプチド分子及び本明細書に記載の方法を用いて、予防、治療、改善され得るか、さもなければ調節され得る。特定の実施形態では、症状は、多尿の生成（多尿）、過度の渇き及び流体摂取の増加（多飲）、霧視、原因不明の体重減少及び嗜眠のいずれかで有り得るが、これらに限定されない。
【０００６】
特定の実施形態では、炎症性疾患、障害または病態として、大動脈弁狭窄症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、アルツハイマー病、及び血栓塞栓性疾患、障害または病態が挙げられるが、これらに限定されない。特定の血栓塞栓性疾患、障害または病態として、脳卒中、血栓症、心筋梗塞、及び末梢血管疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００７】
特定の実施形態では、本明細書に記載のグリシンまたはグリシントリペプチド分子の使用は、炎症性疾患、障害または病態の生理学的マーカーまたは表現型を調節する。例えば、化合物を動物に投与することにより、それらの動物における炎症性サイトカインまたは他の炎症性マーカーレベルを、未処理の動物に比べて低下させることができる。特定の実施形態では、生理学的マーカーまたは表現型の調節は、化合物による肝臓ＤＡＧの阻害、グルコース低下、及び血漿ＬＤＬレベルの低下と関連し得る。
【０００８】
特定の実施形態では、炎症性の疾患、障害または病態の生理学的マーカーを定量化することができる。例えば、サイトカインレベルは、当技術分野で公知の標準的な試験によって測定し、定量化することができる。そのようなマーカーについて、特定の実施形態では、マーカーを、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲で減少させることができる。
【０００９】
また、本明細書において、それを必要とする対象における疾患、障害または病態に関連する症状を、予防、治療または改善するための方法を提供する。特定の実施形態では、炎症性の疾患、障害または病態に関連する症状の発症率を低下させるための方法を提供する。特定の実施形態では、炎症性の疾患、障害または病態に関連する症状の重症度を低下させるための方法を提供する。そのような実施形態では、方法は、治療有効量のグリシンもしくはグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【００１０】
特定の実施形態は、それを必要とする対象における代謝性、心血管性及び炎症性の疾患、特にコレステロール異常、トリグリセリド及びグルコース関連の疾患、障害、及び病態を含む障害を、予防、治療、遅延、進行の鈍化及び／または改善するための組成物及び方法を提供する。特定の実施形態は、それを必要とする対象におけるトリグリセリド及び総コレステロール関連の疾患、障害、及び病態を、予防、治療、遅延、進行を鈍化及び／または改善するための組成物及び方法を提供する。特定の実施形態では、そのような疾患、障害、及び病態には、炎症性、心血管性及び／または代謝性の疾患、障害、及び病態が含まれる。特定のそのような心血管性の疾患、障害または病態として、大動脈弁狭窄症、動脈瘤（例えば、腹部大動脈弁狭窄症）、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、冠動脈疾患、冠動脈心疾患、脂質異常症、高コレステロール血症、高脂質血症、高血圧、高トリグリセリド血症、心筋梗塞、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患、末梢動脈閉塞性疾患）、網膜血管閉塞、または脳卒中が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、代謝性の疾患、障害または病態として、高血糖、前糖尿病、糖尿病（Ｉ型及びＩＩ型）、肥満、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム及び糖尿病性脂質異常症が挙げられるが、これらに限定されない。特定のそのような炎症性の疾患、障害または病態として、大動脈弁狭窄症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、アルツハイマー病、及び血栓塞栓性の疾患、障害または病態が挙げられるが、これらに限定されない。特定の血栓塞栓性の疾患、障害または病態として、脳卒中、血栓症（例えば、静脈血栓塞栓症）、心筋梗塞、及び末梢血管疾患が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態は、特に肝疾患に関連する場合、ブドウ糖感受性ならびに全身性の炎症及び線維症を、予防、治療、遅延、進行を鈍化及び／または改善することに加えて、抑制性ミトコンドリア／ペルオキシソーム脂肪酸β酸化（ＦＡＯ）を伴う食事性高脂血症及び脂肪性肝炎を、予防、治療、遅延、進行を鈍化及び／または改善するための組成物及び方法を提供する。
【００１１】
本開示の第１の態様の一実施形態は、グリシンまたはＤＴ−１０９（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）の投与を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を治療するための方法を提供する。本開示の第１の態様の別の実施形態は、グリシンまたはＤＴ−１０９（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）の投与を含む、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するための方法を提供する。本開示の第１の態様の別の実施形態は、ＤＴ−１１０（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ）の投与を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を治療するための方法を提供する。本開示の第１の態様の一実施形態は、グリシンまたはＤＴ−１１０（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ）の投与を含む、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するための方法を提供する。これらのトリペプチドは、場合により、本明細書に記載するような二次治療薬と組み合わせて投与することができる。
【００１２】
本開示の第２の態様は、選択されたトリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、患者の線維症を軽減するための方法を提供する。本開示の第２の態様の一実施形態は、グリシンまたはＤＴ−１０９（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）の投与を含む、患者の線維症を軽減するための方法を提供する。本開示の第２の態様の別の実施形態は、グリシンまたはＤＴ−１１０（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ）の投与を含む、患者の線維症を軽減するための方法を提供する。これらのトリペプチドは、場合により、スタチンと併用して投与することができる。
【００１３】
本開示の第３の態様は、それを必要とする対象に、１つ以上のトリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、脂肪肝を治療する方法を提供する。第３の態様の一実施形態では、方法は、肝脂質中のトリグリセリドレベルを低下させるか、または肝脂質中の総コレステロールレベルを低下させた。
【００１４】
本開示の第４の態様は、選択されたトリペプチド、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを有する対象を治療するためのキットを提供する。キットの一実施形態では、キットは、有効量のグリシンまたはＤＴ−１０９（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む。別の実施形態では、キットは、グリシンまたは（ＤＴ−１１０（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ）、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む。さらに別のキットでは、キットは、グリシンまたはＤＴ−１０９（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）及び／または（ＤＴ−１１０（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ）、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実験計画（図１Ａ）、研究全体の平均食物摂取量（図２Ｂ）、エンドポイント体重（図１Ｃ）、ベースラインからエンドポイントまでの体重の総増加（図１Ｄ）（Ｂ〜Ｄに関してｎ＝８〜１０）、エンドポイントでの腹腔の全体的な形態（図１Ｅ）、血漿グリシン含有トリペプチド分子レベル（図１Ｆ）（ｎ＝６〜８）。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１対ＷＤ＋Ｈ２Ｏ。
【図２】急性ＯＧＴＴ（マウスにグルコースと、治療薬または対照として水を与えた）（図２Ａ）、慢性ＯＧＴＴ（マウスにグルコースのみを与えた）（図２Ｂ）、水または治療薬存在下で、強制経口投与する前（強制経口投与前）及び３０分後（強制経口投与後）に測定した非空腹時血糖値（図２Ｃ）、エンドポイント血糖値（６時間の絶食後）（図２Ｄ）。グルコース取り込み及び糖新生を調節する肝遺伝子発現のｑＰＣＲ分析（図２Ｅ）。（ｎ＝８〜１０）＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ＷＤ＋Ｈ２Ｏ；＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１対  強制経口投与前。
【図３】代表的な肝臓組織のＨ＆Ｅスライド（図３Ａ）であり、小滴性脂肪肝及び大滴性脂肪肝を、それぞれ、赤色及び黄色の矢印でマークする。肝脂質を抽出し、続いて（図３Ｂ）ＴＧ含有量、及び（図３Ｃ）ＴＣ含有量を定量化した、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ＷＤ＋Ｈ２Ｏ。
【図４】脂質酸化の経路を調節する肝遺伝子発現のｑＰＣＲ分析（図４Ａ及び図４Ｂ）、コレステロール恒常性を調節する肝遺伝子発現のｑＰＣＲ分析（図４Ｃ）（ｎ＝７〜１０）。β−アクチンに対して正規化したＡＢＣＧ８存在量のウエスタンブロット分析及び定量化（図４Ｄ及び図４Ｅ）（ｎ＝４〜６）。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ＷＤ＋Ｈ２Ｏ。
【図５】ベースライン（治療薬を含まないＷＤ給餌の１週間）及びエンドポイント（治療薬または水対照を含むＷＤ給餌の１２週間後）での血漿ＴＣレベル（図５Ａ）。（図５Ｂ）ＴＣ、（図５Ｃ）ＬＤＬ、（図５Ｄ）ＨＤＬ、及び（図５Ｅ）ＴＧのエンドポイント血漿レベル。６時間の絶食後に採血を実施した。（図５Ｆ）オイルレッドＯ染色によって視覚化した動脈硬化巣の分析、及び（図５Ｇ）染色された大動脈の代表的な画像。（ｎ＝６〜１０）。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ＷＤ＋Ｈ２Ｏ。
【図６】ＩＬ−６（図６Ａ）、レジスチン（図６Ｂ）、及びＭＣＰ１（図６Ｃ）のエンドポイント血漿レベル。（図６Ｄ）精巣上体脂肪組織（ＥＡＴ）、及び（図６Ｅ）皮下脂肪組織（ＳＡＴ）における炎症性サイトカインのｑＰＣＲ分析。（ｎ＝６〜１０）。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ＷＤ＋Ｈ２Ｏ。
【図７Ａ】肝臓における炎症性サイトカインのｑＰＣＲ分析
【図７Ｂ】肝臓における代表的なＦ４／８０免疫組織化学
【図７Ｃ】定量化。（ｎ＝７〜１０）。＊ｐ＜０．０５対ＷＤ＋Ｈ２Ｏ。
【図８】ＮＡＳＨ食餌を与えたＡＧＸＴ１−／−マウスの血漿変化。ＨｅｐＧ２細胞にｓｉＣＴＬまたはｓｉＡＧＸＴ１を形質移入した：（図８Ｃ）ＧＡＰＤＨと比較したＡＧＸＴ１  ｍＲＮＡ（ｎ＝１２）、（図８Ｄ）ローディング対照としてＧＡＰＤＨを含むＡＧＸＴ１タンパク質（ｎ＝４）、及び（図８Ｅ）ＰＡローディングの存在下または非存在下での細胞ＴＧ（２００μＭ、ｎ＝１２）。（図８Ａ）ＡＧＸＴ１遺伝子のエキソン１上のガイドＲＮＡ標的部位に下線が引かれており、ＰＡＭから３塩基離れた位置のＡ欠失がサンガーシーケンシング法によって確認された。（図８Ｂ）ウエスタンブロットによって確認されたＡＧＸＴ１の欠損（ｎ＝７）。ＡＧＸＴ１＋／＋マウス及びＡＧＸＴ１−／−マウスにＮＡＳＨ食餌を１２週間与えた（ｎ＝１２）：血漿（図８Ｌ）ＴＧ、（図８Ｍ）ＴＣ、（図８Ｎ）ＡＳＴ、（図８Ｏ）ＡＬＴ、及び（図８Ｐ）グリシン／シュウ酸比。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。ＰＡ、パルミチン酸。    ＣＤ給餌下では、ＡＧＸＴ１＋／＋とＡＧＸＴ１−／−は同等である。ＡＧＸＴ１＋／＋マウス及びＡＧＸＴ１−／−マウスに標準ＣＤを１２週間与えた（ｎ＝６）：（図８Ｆ）体重、（図８Ｇ）腹膜腔の肉眼的外観ならびにＨ＆Ｅ及びＯＲＯ染色を使用した組織学（スケールバー：Ｈ＆Ｅについては５０μｍ、ＯＲＯについては１００μｍ）、（図８Ｈ）肝臓重量、（図８Ｉ）体重（ＢＷ）に対する肝臓重量（ＬＷ）の比、（図８Ｊ）血漿ＡＳＴ、及び（図８Ｋ）血漿ＡＬＴ。データは平均±ＳＤであり、全点を示す。
【図９】グリシン系化合物。グリシンに構造的に類似した化合物を選択して、グリシン骨格の構造的、立体配座的、電子的及び立体的等価の修飾を評価した。（図９Ａ）グリシン、（図９Ｂ）Ｎ−メチルグリシン、（図９Ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、（図９Ｄ）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン、（図９Ｅ）グリコール酸、（図９Ｆ）グリシンアミド、（図９Ｇ）２−アミノ−Ｎ−メチルアセトアミド、（図９Ｈ）エタノールアミン、（図９Ｉ）２−オキソピペラジン、（図９Ｊ）モルホリン−２−オン、及び（図９Ｋ）（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メタナミン。
【図１０】ＮＡＦＬＤにおけるグリシン生合成の障害。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＣＤまたはＷＤを１２週間与えた（ｎ＝４〜５）：（図１０Ａ）血漿ＴＣ、（図１０Ｂ）肝臓組織学（スケールバー：Ｈ＆Ｅ  ５０μｍ、ＯＲＯ  １００μｍ）、（図１０Ｃ）肝臓ＴＧ、（図１０Ｄ）肝臓ＴＣ、（図１０Ｅ）ＣＤと比較した血漿ＡＡ、（図１０Ｆ）ＧＡＰＤＨと比較したグリシン生合成遺伝子の肝臓発現。（図１０Ｇ）細胞ＴＧ、及び（図１０Ｈ）２００μＭのＰＡまたはエタノールを２４時間ローディングしたＨｅｐＧ２細胞におけるＡＧＸＴ１発現（ｎ＝３〜４）。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＮＡＳＨ食餌またはＣＤを２４週間与えた（ｎ＝１０）：（図１０Ｉ）肝臓の形態、Ｈ＆Ｅ及びシリウスレッドの組織学（スケールバー：５０μｍ）。（図１０Ｋ）ＣＤまたはＮＡＳＨマウス由来の肝臓のＲＮＡ配列決定によるグリシン生合成遺伝子／経路の有意な下方制御（緑色）（ｎ＝３、ｌｏｇ２ＦＣ、ｌｏｇ２倍率変化）。（図１０Ｌ）食事性ＮＡＳＨを有するマウスにおけるＧＡＰＤＨと比較したＡＧＸＴ１発現（ｎ＝８）。（図１０Ｍ）健康な患者とＮＡＳＨ患者に由来する肝臓マイクロアレイデータのメタ分析によるグリシン代謝遺伝子における有意な下方制御（緑色）または上方制御（赤色）。（図１０Ｎ）移植ドナー由来の肝臓におけるＡＧＸＴ１発現と総肝脂肪との間の相関（ｎ＝２０６）。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。    ＮＡＳＨを有するマウスの肝臓の経路分析。ＣＤまたはＮＡＳＨ食餌を２４週間与えたマウスの肝臓のＲＮＡ配列決定後の経路分析（ｎ＝３）。上方制御された差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）が豊富な経路を赤色でプロットし、一方、下方制御されたＤＥＧが豊富な経路を緑色でプロットする。
【図１１】ＡＧＸＴ１−／−マウスにおける加速された食事性ＮＡＳＨ。ＡＧＸＴ１＋／＋マウス及びＡＧＸＴ１−／−マウスにＮＡＳＨ食餌を１２週間与えた（ｎ＝１２）：（図１１Ａ）腹腔の肉眼的外観、及び肝臓組織学（スケールバー：Ｈ＆Ｅ及びシリウスレッド５０μｍ、ＯＲＯ  １００μｍ）、（図１１Ｂ）肝臓重量／体重（ＬＷ／ＢＷ）比、（図１１Ｅ）肝臓ＴＧ、（図１１Ｆ）肝臓ＴＣ、（図１１Ｇ）ＮＡＳ、及び（図１１Ｈ）線維症スコア。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。（図１１Ｊ）ＡＧＸＴ１＋／＋マウス及びＡＧＸＴ１−／−マウス由来の肝臓のＲＮＡ配列決定後の経路分析（ｎ＝４）。上方制御または下方制御されたＤＥＧが豊富な経路を、それぞれ赤色または緑色でプロットする。（図１１Ｋ）２５個のＮＡＳＨ関連ＤＥＧのヒートマップ。（図１１Ｌ）ｑＰＣＲによって確認されたＦＡＯ関連のＤＥＧ（ｎ＝１０）、及び（図１１Ｍ）ウエスタンブロット（ｎ＝４）。（図１１Ｎ）炎症及び（図１１Ｏ）ｑＰＣＲによって確認された線維症関連ＤＥＧ（ｎ＝１０）。データは平均±ＳＥである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＡＧＸＴ１＋／＋。    ＮＡＳＨ食餌を与えたＡＧＸＴ１−／−マウスのＮＡＦＬＤ関連パラメータ。ＡＧＸＴ１＋／＋マウス及びＡＧＸＴ１−／−マウスにＮＡＳＨ食餌を１２週間与えた（ｎ＝１２）：（図１１Ｃ）体重、（図１１Ｄ）肝臓重量、ならびに（図１１Ｉ）Ｈ＆Ｅベースの脂肪肝、肝細胞バルーニング及び小葉内炎症のスコアリング。データは平均±ＳＤである。
【図１２】グリシン欠乏症は、ＷＤ誘発性肥満を悪化させる。ＡｐｏＥ−／−マウスに、ＣＤ、ＷＤＡＡ＋ＧｌｙまたはＷＤＡＡ−Ｇｌｙを１０週間給餌した（ｎ＝６）：（図１２Ａ）血漿グリシン。ＮＭＲベースの体組成分析：（図１２Ｂ）体重、（図１２Ｃ）体脂肪（％）、及び（図１２Ｄ）除脂肪体重（％）。ＣＬＡＭＳ分析：（図１２Ｅ）食物摂取、（図１２Ｆ）総活性、（図１２Ｇ）呼吸交換率（ＲＥＲ）、及び（図１２Ｈ）エネルギー消費。（図１２Ｉ）血漿グリシントリペプチド分子、及び（図１２Ｊ）精巣上体組織及び皮下脂肪組織のＨ＆Ｅ組織学（ＥＡＴ及びＳＡＴ、スケールバー：１００μｍ）。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。
【図１３】グリシン欠乏症は、ＷＤ誘発性の高脂血症とＨＳを悪化させる。ＡｐｏＥ−／−マウスに、ＣＤ、ＷＤＡＡ＋ＧｌｙまたはＷＤＡＡ−Ｇｌｙを１０週間給餌した（ｎ＝６）：（図１３Ａ）血漿ＴＣ、（図１３Ｂ）血漿ＴＧ、（図１３Ｃ）血漿ＬＤＬ、（図１３Ｄ）血漿ＨＤＬ、（図１３Ｅ）血漿グルコース、（図１３Ｆ）Ｈ＆Ｅ及びＯＲＯ染色を使用した肝臓組織学（スケールバー：Ｈ＆Ｅの場合は５０μｍ、ＯＲＯの場合は１００μｍ）、（図１３Ｇ）肝臓ＴＧ、ならびに（図１３Ｈ）肝臓ＴＣ。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。血漿グリシンと：（図１３Ｉ）血漿ＴＣ、（図１３Ｊ）血漿グルコース、及び（図１３Ｋ）肝臓ＴＧとの間のスピアマン相関分析。
【図１４】耐糖能に対するグリシン系化合物の効果。１２時間の絶食後のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにＯＧＴＴを実施した（ｎ＝６〜８）。マウスに、グルコースのみ（２ｍｇ／ｇ体重）、グルコースと０．５ｍｇ／ｇ体重のグリシンまたは０．５ｍｇ／ｇ体重のグリシン系化合物：（図１４Ａ）Ｎ−メチルグリシン、（図１４Ｂ）Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、（図１４Ｃ）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン、（図１４Ｄ）グリコール酸、（図１４Ｅ）ＤＴ−１１０、及び（図１４Ｆ）ＤＴ−１０９を経口投与した。（図１４Ｇ）マウスに、グルコースのみ（２ｍｇ／ｇ体重）、グルコースとＤＴ−１０９（０．５ｍｇ／ｇ体重）または同等レベルの遊離ロイシンもしくはグリシン（それぞれ０．１７または０．３３ｍｇ／ｇ体重）を経口投与した。データは平均±ＳＥである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対グルコース；＃Ｐ＜０．０５対ロイシン。＾Ｐ＜０．０５対グリシン。
【図１５】ＤＴ−１０９の脂質低下作用。（図１５Ａ）ＡｐｏＥ−／−マウスに標準ＷＤを給餌し、ＤＴ−１０９（１ｍｇ／ｇ体重／日）、同等レベルの遊離ロイシンもしくはグリシン（０．３３または０．６７ｍｇ／ｇ体重）またはＨ２Ｏを１２週間経口投与した（ｎ＝８〜１０）。（図１５Ｂ）１０週目に、１２時間の絶食後にＯＧＴＴを実施した。マウスに、経口グルコースのみ（２ｍｇ／ｇ体重）、グルコースと１ｍｇ／ｇ体重のＤＴ−１０９または同等レベルの遊離ロイシン（０．３３ｍｇ／ｇ体重）もしくはグリシン（０．６７ｍｇ／ｇ体重）を経口投与した。データは平均±ＳＥである。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対Ｈ２Ｏ；＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．０１対ロイシン。（図１５Ｃ）非空腹時血糖を、ＤＴ−１０９、ロイシン、グリシンまたはＨ２Ｏを用いた毎日の強制経口投与の３０分前及び３０分後に測定した。（図１５Ｄ）エンドポイント体重。（図１５Ｅ）平均食物摂取量。（図１５Ｆ）ベースライン（実験群への無作為化前）及びエンドポイントでの血漿ＴＣ（データは平均±ＳＥである）。エンドポイント血漿分析（ｎ＝６〜８）：（図１５Ｇ）ＴＣ。（図１５Ｈ）ＬＤＬ。（図１５Ｉ）ＨＤＬ。（図１５Ｊ）ＴＧ、及び（図１５Ｋ）グリシントリペプチド分子。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。（図１５Ｌ）精巣上体組織及び皮下脂肪組織のＨ＆Ｅ組織学（ＥＡＴ及びＳＡＴ、スケールバー：１００μｍ）。
【図１６】グリシンまたはＤＴ−１０９は、ＷＤ誘発性ＨＳを予防する。エンドポイント肝臓分析（ｎ＝８〜１０）：（図１６Ａ）腹腔の肉眼的外観及びＨ＆Ｅ及びＯＲＯを使用した組織学（スケールバー：Ｈ＆Ｅの場合は５０μｍ、ＯＲＯの場合は１００μｍ）、（図１６Ｂ）肝臓ＴＧ、ならびに（図１６Ｃ）肝臓ＴＣ。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。（図１６Ｄ）ＦＡＯ及び炎症を調節する重要な遺伝子の、ＧＡＰＤＨと比較したｑＰＣＲ分析。データは平均±ＳＥである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＷＤ＋Ｈ２Ｏ。
【図１７】実験群への無作為化前のＮＡＳＨの確認。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＣＤ（ｎ＝１１）またはＮＡＳＨ食餌（ｎ＝５０）を１２週間与えた。（図１７Ｂ）血漿グルコース、ＴＣ、ＡＳＴ及びＡＬＴの分析のために顎下静脈から空腹時血液を採取した（データは平均±ＳＤである）。マウスのサブセット（ＣＤ：ｎ＝３、ＮＡＳＨ食餌  ｎ＝５）を殺処分して肝臓の病理を確認した：（図１７Ｃ）肝臓−体重比（ＬＷ／ＢＷ）。（図１７Ｄ）腹腔の肉眼的外観及びＨ＆Ｅ、ＯＲＯ及びシリウスレッドを使用した組織学（スケールバー：Ｈ＆Ｅ及びシリウスレッドの場合は５０μｍ、ＯＲＯの場合は１００μｍ）、（図１７Ｆ）脂肪肝、肝細胞バルーニング及び小葉内炎症スコアの（図１７Ｅ）合計としてのＮＡＳ。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。（図１７Ｇ）１８週目に、１２時間の絶食後にＯＧＴＴを実施した（ｎ＝８〜９）。マウスに、グルコースのみ（２ｍｇ／ｇ体重）、グルコースと０．５ｍｇ／ｇ体重のＤＴ−１０９または同等レベルの遊離ロイシン（０．１７ｍｇ／ｇ体重）、グリシン（０．３３ｍｇ／ｇ体重）またはＨ２Ｏを経口投与した。データは、平均±ＳＥである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１対ＣＤ＋Ｈ２Ｏ；＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＮＡＳＨ＋Ｈ２Ｏ；＾＾Ｐ＜０．０１対ＮＡＳＨ＋ロイシン。（図１７Ｈ）ＤＴ−１０９、ロイシン、グリシン、またはＨ２Ｏによる毎日の強制経口投与の３０分前及び３０分後の非空腹時血糖。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示す。    確立されたＮＡＳＨを有するＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＤＴ−１０９の代謝効果。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＣＤまたはＮＡＳＨ食餌を１２週間給餌した。ＮＡＳＨの確認後、マウスを無作為化して、０．１２５もしくは０．５ｍｇ／ｇ体重／日のＤＴ−１０９または同等レベルのロイシンもしくはグリシン（０．１７または０．３３ｍｇ／ｇ体重／日）またはＨ２Ｏを、ＮＡＳＨ食餌下で強制経口投与によりさらに１２週間与えた。マウスにＣＤを給餌し、Ｈ２Ｏを投与して対照とした（ｎ＝８〜９）。（図１７Ｌ）精巣上体組織及び皮下脂肪組織のＨ＆Ｅ組織学（ＥＡＴ及びＳＡＴ、スケールバー：１００μｍ）。２２〜２３週でのＣＬＡＭＳ分析：（図１７Ｍ）食物摂取、（図１７Ｎ）脂肪の酸化、（図１７Ｏ）グルコースの酸化、（図１７Ｐ）呼吸交換率（ＲＥＲ）、（図１７Ｑ）エネルギー支出、及び（図１７Ｒ）総活性。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。    ＤＴ−１０９は、食事性ＮＡＳＨから保護する。（図１７Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＣＤまたはＮＡＳＨ食餌を１２週間給餌した。ＮＡＳＨの確認後、マウスを無作為化して、０．１２５もしくは０．５ｍｇ／ｇ／日のＤＴ−１０９または同等レベルのロイシン、グリシン（０．１７、０．３３ｍｇ／ｇ／日）またはＨ２Ｏを、ＮＡＳＨ食餌下で強制経口投与によりさらに１２週間与えた。マウスにＣＤを給餌し、Ｈ２Ｏを投与して対照とした（ｎ＝８〜９）。２２〜２３週でのＮＭＲベースの体組成分析：（図１７Ｉ）体重、（図１７Ｊ）体脂肪（％）、及び（図１７Ｋ）除脂肪体重（％）。
【図１８】エンドポイント血漿分析：（図１８Ａ）ＡＳＴ、（図１８Ｂ）ＡＬＴ、（図１８Ｃ）ＡＬＰ、（図１８Ｄ）ＴＧ、及び（図１８Ｅ）ＴＣ。（図１８Ｆ）肉眼形態及びＨ＆Ｅ組織学（スケールバー：５０μｍ）。（図１８Ｇ）ＬＷ／ＢＷ比。（図１８Ｉ）ＮＡＳ。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。    ＤＴ−１０９は、食事性ＮＡＳＨから保護する。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＣＤまたはＮＡＳＨ食餌を１２週間給餌した。ＮＡＳＨの確認後、マウスを無作為化して、０．１２５もしくは０．５ｍｇ／ｇ体重／日のＤＴ−１０９または同等レベルのロイシンもしくはグリシン（０．１７または０．３３ｍｇ／ｇ体重／日）またはＨ２Ｏを、ＮＡＳＨ食餌下で強制経口投与によりさらに１２週間投与した。マウスにＣＤを給餌し、Ｈ２Ｏを投与して対照とした（ｎ＝８〜９）。（図１８Ｈ）肝臓重量、及び（図１８Ｊ）脂肪症、肝細胞バルーニング及び小葉内炎症のＨ＆Ｅベースのスコアリング。データは平均±ＳＤである。ＮＡＳと：（図１８Ｋ）血漿ＡＳＴ、（図１８Ｌ）血漿ＡＬＴ、及び（図１８Ｍ）血漿ＡＬＰとの間のスピアマン相関分析。
【図１９】グリシン系の治療薬は、ＮＡＳＨ食事性ＦＡＯ障害を修正し、ＨＳを低減する。エンドポイントで採取した肝臓のＲＮＡ配列決定（ｎ＝４）：（図１９Ａ）ＰＣＡ、（図１９Ｂ）ＣＤと比較した各群におけるＤＥＧ（緑色：下方制御；赤：上方制御）のボルケーノプロット、（図１９Ｆ）ＮＡＳＨ＋Ｈ２ＯとＮＡＳＨ＋０．５ｍｇ／ｇ／日ＤＴ−１０９を比較する経路分析。上方制御または下方制御されたＤＥＧが豊富な経路を、それぞれ赤色または緑色でプロットし、（図１９Ｇ）全実験群にわたる５０個のＮＡＳＨ関連ＤＥＧのヒートマップ（ｌｏｇ２倍率変化対ＣＤ群）。（図１９Ｈ）ｑＰＣＲを使用したＦＡＯ関連ＤＥＧの検証（ｎ＝８〜９）、データは平均±ＳＥであり、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＣＤ；＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＮＡＳＨ＋Ｈ２Ｏ、及び（図１９Ｉ）ウエスタンブロット（ｎ＝４）。（図１９Ｋ）ＯＲＯ組織学（スケールバー：１００μｍ）、（図１９Ｌ）肝臓ＴＧ。（図１９Ｎ）肝臓ＤＡＧ（ｎ＝８〜９）。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。    ＤＴ−１０９は、ＮＡＳＨ食事性トランスクリプトームの変化を逆転させる。ＣＤ群と比較したｌｏｇ２倍率変化によって決定される、全実験群にわたる上位５０個のＤＥＧのヒートマップに基づく表現。各行は１つの遺伝子を表し、各列はＣＤ群との１つの比較を表す。（ｎ＝４）。    ＣＤを給餌したマウスとＮＡＳＨ食餌を給餌したマウスに由来する肝臓の経路分析。（図１９Ｄ）上方制御されたＤＥＧが濃縮された経路を赤色でプロットし、一方、下方制御されたＤＥＧが濃縮された経路を緑色でプロットしている。（図１９Ｅ）ＣＤまたはＮＡＳＨマウス由来の肝臓のＲＮＡ配列決定によって分析するグリシン生合成遺伝子／経路の変化及び経路分析（ｎ＝４）。有意に下方制御された遺伝子／経路を緑色で強調表示する（ｌｏｇ２ＦＣ、ｌｏｇ２倍率変化）。（図１９Ｊ）ＦＡＯ関連ＤＥＧのｑＰＣＲ検証（ｎ＝８〜９）。データは平均±ＳＥである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＣＤ；＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１対ＮＡＳＨ＋Ｈ２Ｏ。（図１９Ｍ）肝臓ＴＣ（ｎ＝８〜９）。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している。
【図２０】肝線維症スコアと：（図２０Ｈ）血漿ＡＳＴ、（図２０Ｉ）血漿ＡＬＴ、及び（図２０Ｊ）血漿ＡＬＰとの間のスピアマン相関分析。    グリシン系の治療薬は、ＮＡＳＨ食事性の肝炎及び線維症を軽減する。（図２０Ａ）Ｆ４／８０免疫組織化学及びシリウスレッド組織学（スケールバー：５０μｍ）、（図２０Ｂ）Ｆ４／８０陽性面積、（図２０Ｃ）血漿ＭＣＰ−１、及び（図２０Ｄ）レジスチン。データは平均±ＳＤであり、全点とＰ値を示している（ｎ＝６〜９）。（図２０Ｅ）炎症関連ＤＥＧのｑＰＣＲ検証（データは平均±ＳＥである、ｎ＝８〜９）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＣＤ；＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＮＡＳＨ＋Ｈ２Ｏ。（図２０Ｆ）シリウスレッド陽性面積。（図２０Ｇ）線維症スコア。（図２０Ｋ）リン酸化ＳＭＡＤ２のウエスタンブロット（Ｓｅｒ４６５／４６７）及び全ＳＭＡＤ２。（図２０Ｌ）線維症関連ＤＥＧのｑＰＣＲ検証。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書中で使用する場合：「脂肪肝（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）」は、肝臓における脂肪の蓄積である「脂肪肝（ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ）」と同義である。
【００１７】
対象は哺乳類であってもよく、哺乳類は、例えば、実験動物またはヒトであってもよく、そしてヒト対象には、成人、青年及び小児の対象が含まれる。
【００１８】
「脂肪肝（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）」及び「脂肪肝（ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）」は、本明細書中では同じ意味で使用される。
【００１９】
「血漿（ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｓｍａ）」及び「血漿（ｐｌａｓｍａ）」は、本明細書中では同じ意味で使用される。
【００２０】
「血液（ｂｌｏｏｄ）」及び「血漿（ｐｌａｓｍａ）」は、本明細書中では同じ意味で使用される。
【００２１】
本明細書中では、西洋食を「ＷＤ」と略記する。
【００２２】
本明細書中では、顔面静脈を「ＦＶ」と略記する。
【００２３】
「ＴＧ」は、トリグリセリドの略語である。
【００２４】
「ＴＣ」は、総コレステロールの略語である。
【００２５】
「ＯＧＴＴ」は、経口グルコース負荷試験の略語である。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、文脈上明確な断りのない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、複数の指示対象が含まれる。
【００２７】
「または」は、いくつかの場合では「と組み合わせて」を意味し得るため、ＡまたはＢの投与は、Ａの投与、Ｂの投与、またはＡとＢの投与であり得る。
【００２８】
グリシン以外の一般的なアミノ酸はすべて、少なくとも１つのキラル炭素原子を含む。したがって、これらのアミノ酸は、Ｌ−異性体及びＤ−異性体と呼ばれる立体異性体のペアとして存在する。ほとんどの天然タンパク質及びペプチドは、Ｌ−異性型のみからなる。Ｄ−異性型アミノ酸は、ペプチドまたはタンパク質のコンフォメーションに影響を与える可能性があり、安定性の向上または活性の変化を招き得る。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、用語「薬学的に許容される塩」とは、妥当な医学的判断の正常な範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー応答などを起こさずに、ヒト及び下等動物の組織と接触させて使用することに適合するとともに、合理的な利益／リスク比を有する塩を指す。「薬学的に許容される塩」とは、レシピエントへの投与時に、本発明の化合物を直接的または間接的に提供することができる、本発明の化合物の任意の非毒性塩またはエステルの塩を意味する。薬学的に許容される塩は当技術分野で周知である。例えば、Ｂｅｒｇｅらは、薬学的に許容される塩をＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９（１９７７）に詳細に記載している。
【００３０】
本発明のペプチドの送達に適した医薬組成物及びそれらの調製方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。それらを調製するためのそのような組成物及び方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（２０００）に見出し得る。本発明のペプチドを、即放性及び／または放出調節性であるように製剤化してもよい。
【００３１】
用語「治療する」（または「治療」もしくは「治療する」などの他の形態の単語）は、本明細書中では、本発明の組成物の投与が患者の病態を緩和し、及び／または病態に関連する特定の特性または事象を軽減、抑制、または排除することを意味するように用いられる。したがって、用語「治療」は、特に患者が病態を獲得する素因がある場合に患者における病態の発症を予防し；病態を軽減または抑制し；及び／または病態を改善または逆転させることを含む。本発明の方法が病態を予防することを目的とする限り、用語「予防する」は、病態が完全に阻止されることを必要としないことが理解される。むしろ、本明細書中で使用する場合、予防という用語は、病態の発症前に本発明の組成物の投与を行い得るように、病態に感受性のある集団を特定する当業者の能力を指す。この用語は、病態を完全に回避する必要があることを意味するものではない。
【００３２】
本明細書中で使用する「有効量」とは、検出可能な治療効果を示すのに十分な本発明のグリシン含有トリペプチドの量を指す。この効果は、例えば、臨床状態の改善、または合併症の予防、軽減または改善によって検出される。患者に対する正確な有効量は、患者の体重、サイズ、及び健康状態；病態の性質及び程度；ならびに投与のために選択された治療薬または治療薬の組み合わせによって異なる。所与の状況に対する治療有効量は、臨床医の技術と判断の範囲内にある日常的な実験によって決定される。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「代謝性及び／または心血管性及び／または炎症性の疾患」を有する対象を「特定すること」または「選択すること」とは、高コレステロール血症、高血糖症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高血圧、インスリン抵抗性の増加、インスリン感受性の低下、正常体重超過、及び／または正常体脂肪含有量超過またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、代謝疾患、心血管疾患、全身性もしくは限局性炎症性疾患；またはメタボリックシンドロームであると診断されやすいかまたは診断されている対象を特定または選択すること；あるいは、代謝疾患、心血管疾患、またはメタボリックシンドロームの症状を有する対象を特定または選択することを意味する。そのような特定は、血清もしくは循環（血漿）コレステロールの測定、血清もしくは循環（血漿）血糖の測定、血清もしくは循環（血漿）トリグリセリドの測定、炎症性サイトカインもしくはコルチゾールの測定、血圧の測定、体脂肪含有量の測定、体重の測定などの標準的な臨床試験または評価を含むがこれらに限定されない任意の方法によって達成することができる。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、「グルコース」は、エネルギー源及び炎症性中間体として細胞によって使用される単糖である。「血漿グルコース」とは、血漿中に存在するグルコースを指す。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「高密度リポタンパク質Ｃ」または「ＨＤＬ−Ｃ」とは、高密度リポタンパク質粒子に付随するコレステロールを意味する。血清（または血漿）中のＨＤＬ−Ｃの濃度は、通常、ｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌで定量化される。「血清ＨＤＬ−Ｃ」及び「血漿ＨＤＬ−Ｃ」は、それぞれ血清及び血漿中のＨＤＬ−Ｃを意味する。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤」とは、アトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、及びシンバスタチンなどの酵素ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの阻害によって作用する薬剤を意味する。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、「高コレステロール血症」とは、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ（Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．（１９８８）１４８，３６−３９を参照のこと）  のガイドラインによる、コレステロールまたは循環（血漿）コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール及びＶＬＤＬ−コレステロールの上昇によって特徴付けられる病態を意味する。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、「高脂血症」または「高脂質血症」は、血清脂質または循環（血漿）脂質の上昇を特徴とする病態である。この病態は、異常に高い脂肪濃度を示す。循環血液中の脂質画分は、コレステロール、低密度リポタンパク質、超低密度リポタンパク質、カイロミクロン及びトリグリセリドである。高脂血症のフレドリクソン分類は、電気泳動または超遠心分離によって測定されるＴＧ及びコレステロールリッチなリポタンパク質粒子のパターンに基づいており、高トリグリセリド血症などの高脂血症の主な原因を特徴付けるために一般的に使用される（Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９６５，３１：３２１−３２７；Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，１９６７，２７６（１）：３４−４２）。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、「高トリグリセリド血症」とは、トリグリセリドレベルの上昇を特徴とする病態を意味する。その病因として、主要因（すなわち、遺伝的素因）及び二次的要因（他の遠因、例えば、糖尿病、メタボリックシンドローム／インスリン抵抗性、肥満、身体活動不能、喫煙、過剰のアルコール及び炭水化物過剰の食事）または最も多くの場合では、両方の組み合わせが挙げられる（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＭＡＪ，２００７，１７６：１１１３−１１２０）。
【００４０】
本発明の組成物及び方法を記載する前に、記載する特定のプロセス、組成物、または方法論は様々に異なり得るため、本発明はこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書中で使用する専門用語は、特定のバージョンまたは実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。本明細書中で言及するすべての刊行物は、それらが本発明をサポートする範囲で、その全体が参照により援用される。
【００４１】
代謝性、心血管性及び炎症性疾患の治療のためのグリシントリペプチド分子
【００４２】
本開示の発明者は、肥満、糖尿病、脂質異常症、脂肪肝及びインスリン抵抗性症候群を含むがこれらに限定されない代謝性、心血管性及び／または炎症性疾患の予防的または治療的活性を示すグリシントリペプチド分子、またはそれらの薬学的に許容される塩を開発した。特定の実施形態では、代謝性または心血管性疾患として、肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂肪酸血症もしくはメタボリックシンドローム、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。脂質異常症は高脂血症であり得る。高脂血症は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、または高コレステロール血症と高トリグリセリド血症の両方であり得る。ＮＡＦＬＤは、脂肪肝または脂肪性肝炎であり得る。糖尿病は、２型糖尿病または脂質異常症を伴う２型糖尿病であり得る。
【００４３】
様々な実施形態において、ＤＴ−１９０グリシン含有トリペプチド分子のアミノ酸配列は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−配列番号１である。ＤＴ−１１０グリシン含有トリペプチド分子のアミノ酸配列は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ−配列番号２である。本発明のグリシントリペプチド分子はまた、ＤＴ−１０９及びＤＴ−１１０の薬学的に許容される塩を含む。例として、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好ましい例として、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩など；アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好ましい例として、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミンＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミンとの塩などが挙げられる。無機酸との塩の好ましい例として、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸との塩などが挙げられる。有機酸との塩の好ましい例として、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸との塩などが挙げられる。上記の塩のうち、薬学的に許容される塩が好ましい。例えば、化合物が酸性官能基を有する場合、無機塩、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）など、アンモニウム塩など、及び化合物が塩基性官能基を有する場合、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などの無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が好ましい。
【００４４】
様々な実施形態において、グリシントリペプチド分子もまた、元の合成形態のプロドラッグとして合成及び／または投与してもよい。例えば、グリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩は、プロドラッグ形態であってもよい。プロドラッグとは、生体内の生理的条件下で酵素や胃酸などによって反応してグリシン含有トリペプチド分子に変換される化合物、すなわち酵素による酸化、還元、加水分解などにより、グリシン含有トリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩に変換される化合物；胃酸などによる加水分解などにより、グリシン含有トリペプチド分子に変換される化合物を指す。
【００４５】
グリシン含有トリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩のプロドラッグの例として、グリシン含有トリペプチド分子のアミノ基が、アシル化、アルキル化またはリン酸化されている化合物（例えば、グリシン含有トリペプチド分子のアミノが、エイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化またはｔｅｒｔ−ブチル化されている化合物など）；グリシン含有トリペプチド分子のヒドロキシが、アシル化、アルキル化、リン酸化またはホウ化されている化合物（例えば、グリシン含有トリペプチド分子のヒドロキシが、アセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、スクシニル化、フマリル化、アラニル化またはジメチルアミノメチルカルボニル化されている化合物など）；グリシン含有トリペプチド分子のカルボキシが、エステル化またはアミド化されている化合物（例えば、グリシン含有トリペプチド分子のカルボキシが、Ｃ１−６アルキルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルエチルエステル化またはメチルアミド化されている化合物）などが挙げられる。とりわけ、グリシン含有トリペプチド分子のカルボキシが、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどのＣ１−６アルキルでエステル化されている化合物が好ましくは使用される。これらの化合物は、それ自体が公知の方法によって、グリシン含有トリペプチド分子から生成することができる。
【００４６】
グリシン含有トリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩のプロドラッグはまた、例えば、ＩＹＡＫＵＨＩＮ  ｎｏ  ＫＡＩＨＡＴＳＵ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ），Ｖｏｌ．７，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｐ．１６３−１９８，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＨＩＲＯＫＡＷＡ  ＳＨＯＴＥＮ（１９９０）に記載されている、生理的条件下でグリシン含有トリペプチド分子に変換されるプロドラッグであってもよい。
【００４７】
例示的なグリシントリペプチド分子は、本明細書に記載の、及び当業者に公知のペプチド合成法に従って生成することができる３残基のアミノ酸ポリマーである。ペプチド合成法は、現在公知の方法、例えば、固相合成プロセス及び液相合成プロセスを使用してもよい。すなわち、目的のペプチド、例えばグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩は、所望の配列に従って、グリシントリペプチド分子を構成することができる部分ペプチドまたはアミノ酸、すなわち合成しようとするペプチドと残りの部分（２残基以上のアミノ酸によって構成され得る）の縮合の繰り返しによって生成することができる。所望の配列を有する生成物が保護基を有する場合、保護基を除去することにより目的のペプチドを生成することができる。公知の保護基の縮合法及び除去法の例として、以下の（１）〜（５）に記載の方法が挙げられる。
【００４８】
（１）Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６）
【００４９】
（２）Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｅｂｋｅ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５）
【００５０】
（３）Ｎｏｂｕｏ  Ｉｚｕｍｉｙａ，ｅｔ  ａｌ．：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｏｓｅｉ−ｎｏ−Ｋｉｓｏ  ｔｏ  Ｊｉｋｋｅｎ（Ｂａｓｉｃｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍａｒｕｚｅｎ  Ｃｏ．（１９７５）
【００５１】
（４）Ｈａｒｕａｋｉ  Ｙａｊｉｍａ  ａｎｄ  Ｓｈｕｎｐｅｉ  Ｓａｋａｋｉｂａｒａ：Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｊｉｋｋｅｎ  Ｋｏｚａ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）１，Ｔａｎｐａｋｕｓｈｉｔｓｕ  ｎｏ  Ｋａｇａｋｕ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ＩＶ，２０５（１９７７）
【００５２】
（５）Ｈａｒｕａｋｉ  Ｙａｊｉｍａ，ｅｄ．：Ｚｏｋｕ  Ｉｙａｋｕｈｉｎ  ｎｏ  Ｋａｉｈａｔｓｕ（Ａ  ｓｅｑｕｅｌ  ｔｏ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ），Ｖｏｌ．１４，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｈｉｒｏｋａｗａ  Ｓｈｏｔｅｎ．
【００５３】
グリシントリペプチド分子を使用した代謝性、心血管性及び／または全身性炎症性疾患の治療及び予防
【００５４】
本明細書に記載及び例示のグリシン、もしくはトリペプチド分子を保有するグリシン、またはその薬学的に許容される塩を使用して、それを必要としている対象における１つ以上の代謝性、心血管性及び炎症性疾患を、予防及び／または治療することができる。本開示の目的に関して、「代謝疾患」とは、例えば、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、耐糖能障害、高血中コレステロール、高血糖症、脂質異常症及び高脂血症を含む、内分泌系の広範囲の疾患及び障害、ならびに肝疾患、例えば、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨを指す。本明細書に記載の代謝疾患には、代謝の調節を通じて治療することができる疾患も含まれるが、疾患自体は、特定の代謝欠損によって引き起こされるものであっても、そうでなくてもよい。そのような代謝疾患は、例えば、グルコース及び脂肪酸の酸化経路を含み得る。
【００５５】
それを必要とする対象は、代謝疾患、及び／または心血管疾患、及び／または全身性炎症性疾患、またはこれらの疾患に関連する１つ以上の症状を経験している可能性のある哺乳類、好ましくはヒト、または飼育用哺乳類もしくは実験用哺乳類である。
【００５６】
特定の実施形態では、特定の理論に拘泥することを望むものではないが、本発明のグリシンもしくはグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を、代謝疾患、心血管疾患、及び慢性全身性炎症性疾患またはこれらの一般的な病態のいずれかに関するまたは関連する症状を有する対象への投与は、トリグリセリドレベル、コレステロールレベル、インスリン抵抗性、グルコースレベルまたはそれらの組み合わせを含む脂質レベルの低下をもたらすと考えられる。１つ以上のレベルを、独立して、５％、１０％、２０％、３０％、３５％、または４０％以上低下させることができる。本発明のグリシントリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を投与することにより、インスリン感受性または肝臓インスリン感受性を改善することができる。本発明のグリシントリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を投与することにより、動脈硬化巣、肥満、グルコース、脂質、耐糖能、コレステロールの減少、またはインスリン感受性の改善またはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。
【００５７】
特定の実施形態は、代謝疾患または心血管疾患の１つ以上を、治療、改善、遅延または予防するための薬剤の製造において、本明細書に記載するように、グリシンまたはグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００５８】
特定の実施形態は、本明細書に記載の代謝疾患または心血管疾患の１つ以上を、治療、予防、または改善するためのキットを提供し、キットは：ａ）本明細書に記載のグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩；及び場合によりｂ）本明細書に記載のさらなる第２の治療薬または療法を含む。キットはさらに、グリシントリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を使用して、代謝疾患または心血管疾患の１つ以上を、治療、予防、または改善するためにキットを使用するための説明書またはラベルを含み得る。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態では、グリシンまたはグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩は、強力なグルコース／脂質低下効果を有する。確立されたＮＡＳＨ、グリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を有するマウスにおいて、例えば、ＤＴ−１０９は、ＦＡＯ経路を刺激することによって、脂肪性肝炎を軽減し、体組成を改善し、循環脂質を低下させ、肝酵素及び脂肪性肝炎を正常化または修正することができる。グリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩は、抑制性ＮＦ−κＢ及びＴＧＦα／ＳＭＡＤ経路を阻害することにより、小葉／全身性の炎症及び肝線維症を予想外に低下または軽減させることが示されている。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、用語「脂質異常症」とは、異常なリポタンパク質代謝によって引き起こされる高脂血症、ならびに血中脂肪レベルの増加による高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、及び低ＨＤＬコレステロール血症を含む、異常な脂質状態を指す。本明細書中で使用する場合、用語「脂肪肝」とは、脂質代謝の障害のために脂肪が肝細胞に過剰に蓄積する病態を指す。脂肪肝は、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、動脈硬化症、膵炎などの様々な病気を引き起こし得る。本明細書中で使用する場合、用語「糖尿病」とは、インスリンの相対的または絶対的な欠如を特徴とし、耐糖能障害をもたらす慢性疾患を指す。糖尿病という用語には、１型糖尿病、２型糖尿病及び遺伝性糖尿病などのあらゆる種類の糖尿病が含まれる。インスリン依存性糖尿病である１型糖尿病は、主にβ細胞の破壊に起因する。インスリン非依存性糖尿病である２型糖尿病は、食後のインスリン分泌不足またはインスリン抵抗性によって引き起こされる。本明細書中で使用する場合、用語「インスリン抵抗性」とは、インスリンが血糖を低下させる効果が低くなり、グルコースが細胞によって効果的に燃焼されない生理学的状態を指す。インスリン抵抗性が高いと、体がインスリンを過剰に産生し、高血圧または脂質異常症、及び心疾患、糖尿病などを招き得る。特に２型糖尿病では、筋肉及び脂肪組織は、インスリンの増加を認識しない。本明細書中で使用する場合、用語「インスリン抵抗性症候群」とは、インスリンの作用に対する細胞の抵抗性、高インスリン血症、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びトリグリセリドの増加、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の減少、高血圧症などを特徴とするインスリン抵抗性によって引き起こされる障害の組み合わせを指す。それは、心血管疾患及び２型糖尿病のリスク因子として認識されている（Ｒｅａｖｅｎ  Ｇ  Ｍ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３７：１５９５−６０７（１９８８））。また、インスリン抵抗性は、高血圧、糖尿病、喫煙などの他のリスク因子とともに、酸化ストレスを増加させ、細胞内のシグナル伝達システムを変化させ、炎症反応を誘発し、アテローム性動脈硬化症を引き起こすことが知られている（Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｂ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．４７：４１２−２６（１９８２），Ｋａｗａｍｕｒａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：７７１−８（１９９４））。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、用語「代謝疾患」とは、様々な心血管疾患及び２型糖尿病のリスク因子である代謝障害を含む一群の疾患を指す。これには、インスリン抵抗性とそれに関連する複雑で多様な代謝障害が含まれる。１９８８年、Ｒｅａｖｅｎは、これらの障害の根底にある要因としてインスリン抵抗性を提案し、異常群をインスリン抵抗性症候群と名付けた。しかしながら、１９９８年に、世界保健機関（ＷＨＯ）は、症状のすべての態様がインスリン抵抗性によって説明できないことから、メタボリックシンドロームまたは代謝疾患という用語を導入した。
【００６２】
グリシントリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を活性薬剤として含む本開示の組成物は、様々な代謝疾患、及び／またはそれらの症状、例えば、肥満、糖尿病、高脂血症、非アルコール性脂肪肝、全身性炎症、及び／またはインスリン抵抗性症候群を改善する傾向を有する。本開示の組成物は、様々な活性を有する代謝疾患を予防または治療することができる。
【００６３】
本明細書中で使用する場合の用語「高脂血症」とは、トリグリセリド及びコレステロールなどの脂質の代謝が不十分であることに起因する高レベルの血中脂質によって引き起こされる疾患を指す。より具体的には、高脂血症は、高コレステロール血症及び高トリグリセリド血症を含む、血中のトリグリセリド、ＬＤＬコレステロール、リン脂質、及び遊離脂肪酸などの脂質レベルの増加を特徴とする。
【００６４】
好ましい実施形態によれば、本発明によって治療されるインスリン抵抗性症候群には、肥満、高血圧、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高インスリン血症、非アルコール性脂肪肝及び２型糖尿病が含まれる。
【００６５】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、血中脂肪、肝臓脂肪または内臓脂肪のレベルを低下させる。用語「肝臓」または「内臓」は、臓器、組織及び細胞を包含するために用いられる。
【００６６】
本発明によれば、本発明のグリシンもしくはグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を含有する食事を与えられた対象では、肝臓重量が有意に減少し、血中及び肝臓組織内のトリグリセリドの脂質濃度及び総コレステロールが改善され、内臓脂肪の総重量が有意に減少した。
【００６７】
より好ましい実施形態によれば、本発明によって減少する脂肪には、トリグリセリド、コレステロール、及び遊離脂肪酸が含まれる。
【００６８】
より好ましい実施形態によれば、本発明によって減少する内臓脂肪には、精巣上体脂肪、腎周囲脂肪、腸間膜脂肪及び／または後腹膜脂肪が含まれる。
【００６９】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）またはＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の活性を低下させる。肝機能の指標としてのＡＬＴとＡＳＴは、肝臓の損傷時に血中濃度の上昇を示す酵素である。
【００７０】
「非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）」は、世界中、特に西欧諸国でますます一般的になっている。米国では、これは慢性肝疾患の最も一般的な形態であり、推定８０００万〜１億人が罹患している。非アルコール性脂肪性肝疾患は、アルコールをほとんどまたはまったく飲まない人々に影響を与える様々な肝臓の病態の総称である。名前が示すように、非アルコール性脂肪性肝疾患の主な特徴は、肝細胞に多量の脂肪が蓄積されることである。肝臓に脂肪が含まれていることは正常である。しかしながら、肝臓の重量の５％〜１０％超が脂肪である場合、その状態は脂肪肝（脂肪症）と呼ばれる。
【００７１】
ＮＡＦＬＤは、肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、及び脂質異常症を含むメタボリックシンドロームの特徴と強く関連しており；ＮＡＦＬＤはこの症候群の肝症状と考えられている。
【００７２】
小児ＮＡＦＬＤは現在、小児肝疾患の主要な形態である。研究によると、腹部肥満とインスリン抵抗性がＮＡＦＬＤの発症の主な原因であると考えられている。肥満は世界中でますます一般的な問題になりつつあるため、ＮＡＦＬＤの有病率は同時に増加している。小児ＮＡＦＬＤで真に効果的であることが示されている唯一の治療法は、体重減少である。
【００７３】
ＮＡＦＬＤのより重度の形態は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれる。ＮＡＳＨは、肝臓を腫れさせ、損傷を与える。ＮＡＳＨは、過体重すなわち肥満であるか、または糖尿病、高コレステロールもしくは高トリグリセリドもしくは炎症状態を有する人に発症する傾向がある。この疾患の潜在的に重度な形態であるＮＡＳＨは、肝細胞のバルーニングと肝臓の炎症を特徴とし、これらは瘢痕化と不可逆的な損傷に進行し得る。この損傷は、アルコールの大量使用による損傷と類似している。巨視的及び微視的に、ＮＡＳＨは小葉及び／または門脈の炎症、様々な程度の線維症、肝細胞死及び病理学的血管新生を特徴とする。最も重症の場合、ＮＡＳＨは、肝硬変、肝細胞癌、及び肝不全に進行し得る。現在、ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨは、食事療法、インスリン抵抗性の治療、またはビタミンＥもしくはＤなどのビタミン投与によって治療されている。
【００７４】
ＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）は、Ｋｌｅｉｎｅｒの基準に従って計算することができる（Ｋｌｅｉｎｅｒ  ＤＥ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００５；４１：１３１３）。ＮＡＳスコア０〜２はＮＡＳＨと診断されず、ＮＡＳスコア３〜４はＮＡＳＨと診断されないか、境界線上にあるか、または陽性とみなされ、ＮＡＳスコア５〜８は主にＮＡＳＨと診断される。ＮＡＳＨの治療効果には、疾患の退行、安定化、または進行速度の低下が含まれる。ＮＡＳＨを有している可能性のある患者からの連続肝生検を、ＮＡＳスコアの変化を評価するために使用し、病状の変化の指標として使用することができる。スコアの増加は進行を示唆し、スコアが変化しない場合は安定化を示唆し、一方、スコアの減少はＮＡＳＨの回帰を示す。制御された臨床試験では、通常６か月〜２年の期間にわたってプラセボと被験物質治療群との間のＮＡＳスコアの差異を評価し、その差異は、両方の群が進行している場合であっても、治療効果を示すものとなり得る。ＮＡＳＨにおける意味のある変化を示すために、通常、規定の点差が規制当局によって要求される。
【００７５】
本発明はまた、それを必要とする対象に、脂肪肝を治療する１つ以上のトリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、脂肪肝の治療方法を提供する。一実施形態では、トリペプチド分子は、肝脂質中のトリグリセリドレベルを低下させ、ロイシン陰性対照に対しては有意な影響を及ぼさなかった。別の実施形態では、トリペプチド分子は、肝脂質中の総コレステロールレベルを低下させ、ロイシン陰性対照に対しては有意な影響を及ぼさなかった。上記の実施形態のいずれか１つにおいて、トリペプチド分子は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕである。
【００７６】
本発明はまた、それを必要とする対象に、グリシンもしくは１つ以上のグリシントリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を投与し、それが与えるｍＲＮＡレベルへの効果を測定することを含む、肝臓の脂質酸化の増加方法もしくは増強方法、トリグリセリドレベルの低下方法、またはコレステロール蓄積の治療方法を提供し、その場合、肝脂質の酸化、トリグリセリドレベル、コレステロール蓄積、またはそれらの任意の組み合わせが、増強または治療される。
【００７７】
肝脂質の酸化の増強方法、トリグリセリドレベルの低下方法、またはコレステロール蓄積の治療方法であって、それを必要とする対象に、グリシントリペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−ＬｅｕもしくはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕまたはその薬学的に許容される塩を投与し、それが与えるｍＲＮＡレベルへの効果を測定することを含み、その場合、肝脂質の酸化、トリグリセリドレベル、コレステロール蓄積、またはそれらの任意の組み合わせが、増強または処理される、治療方法。グリシン含有トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕが、ロイシン陰性対照からは影響を受けずに、肝脂質酸化の調節因子、ＡＭＰＫα１またはＰＰＡＲαの発現を有意に誘導した方法。トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕが、ＣＰＴ１ａ、ＣＡＣＴ、またはＡＣＡＤＩ（ミトコンドリアのβ酸化）またはＰＮＰＬＡ２を有意に上方制御することにより、トリグリセリドの加水分解を調節した方法。トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕが、ミトコンドリアの陰イオン担体ＵＣＰ２を有意に上方制御することにより、トリグリセリドの加水分解を調節した方法。
【００７８】
トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕが、ＡＢＣＧ５及びＡＢＣＧ８の発現を有意に増加させることにより、肝臓のコレステロール恒常性を調節した方法。
【００７９】
１つ以上のトリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与して、対象の血漿トリグリセリド、血漿ＬＤＬレベル、または動脈硬化巣を低減することを含む、対象の血漿脂質特性の治療方法。
【００８０】
それを必要とする対象に投与して、対象の血漿トリグリセリド、血漿ＬＤＬレベル、または動脈硬化巣を低減することを含む、対象の血漿脂質特性の治療方法であって、トリペプチド分子が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＬｅｕもしくはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕまたはその薬学的に許容される塩である、治療方法。Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕが動脈硬化巣を低減する、方法。トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕが、血漿総コレステロール、血漿ＬＤＬ、またはそれらの組み合わせを低下させる、それを必要とする対象に投与することを含む、対象の血漿脂質特性の治療方法。
【００８１】
本発明の方法の実施形態のいずれかにおいて、対象に、追加の脂質低下剤を投与してもよい。追加の脂質低下剤が、コレステロール吸収阻害剤、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＰＰＡＲ−αアゴニスト、フェノフィブラート、ＡＣＣ阻害剤、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ阻害剤、ＡＣＬ阻害剤、処方魚油、またはＣＥＴＰ阻害剤である、方法。いくつかの実施形態では、方法は、コレステロール吸収阻害剤である追加のコレステロール低下剤の投与を含む。コレステロール低下剤がコレステロール吸収阻害剤であり、コレステロール吸収阻害剤がエゼチミブである、方法。いくつかの実施形態では、コレステロール低下剤は、ＰＣＫＳ９阻害剤である。
【００８２】
アテローム性動脈硬化症は、心臓から体の残りの部分に酸素と栄養素を運ぶ血管（動脈）が厚く硬くなる（動脈の硬化）場合に発症する。時として、これは器官及び組織への血流を制限する。アテローム性動脈硬化症は、心筋梗塞、冠動脈疾患、頸動脈疾患、頸動脈疾患、末梢動脈疾患、動脈瘤、及び慢性腎疾患を含む多くの合併症を引き起こし得る。
【００８３】
心筋梗塞（心臓発作）は、心臓の一部への血流が減少または停止する場合に発症し、心筋に損傷を与える。一般的な症状は、胸部の中央もしくは左側の痛み、息切れ、吐き気、または、心不全、不整脈、心原性ショックもしくは心停止を引き起こし得る。
【００８４】
冠動脈疾患は、アテローム性動脈硬化症が心臓に近い動脈を狭め、胸痛（狭心症）、心臓発作または心不全を引き起こし得る。
【００８５】
頸動脈疾患は、アテローム性動脈硬化症が脳に近い動脈を狭め、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）または脳卒中を引き起こし得る。症状には、腕もしくは脚の突然の痺れもしくは脱力感、片方の目の一時的な視力低下、または顔の筋肉の垂れ下がりなどが含まれる。
【００８６】
末梢動脈疾患は、アテローム性動脈硬化症が腕または脚の動脈を狭める場合であり、これらの循環の問題は末梢動脈疾患と呼ばれる。これにより、暑さ及び寒さに対する感受性が低下し、火傷や凍傷のリスクが高まる。まれに、腕及び脚の血行不良が組織死（壊疽）を引き起こし得る。症状は、歩行時の脚の痛み（跛行）である。
【００８７】
動脈瘤は、アテローム性動脈硬化症が深刻な合併症を引き起こす場合に発症する場合があり、それは体のどこにでも発症し得る。動脈瘤は動脈壁の膨らみであり、それは救急事態で有り得、破裂した場合は生命を脅かし得る。
【００８８】
慢性腎疾患は、アテローム性動脈硬化症が動脈の狭窄を引き起こし、酸素化した血液の到達を腎臓が妨げることによって引き起こされ得る。時間が経つにつれて、これは老廃物を体外へ排出し続ける腎機能に影響を及ぼし得る。症状は、高血圧または腎不全である。
【００８９】
本開示は、それを必要とする対象に、１つ以上のグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を投与することによるアテローム性動脈硬化症の治療方法を提供し、その場合、グリシン含有トリペプチド分子の投与は、アテローム性動脈硬化症を治療する。一実施形態では、方法は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕであるグリシン含有トリペプチド分子を対象に投与することによるアテローム性動脈硬化症の治療方法である。本開示はまた、アテローム性動脈硬化症の合併症を有する対象に、グリシン含有トリペプチド分子を投与して、心筋梗塞、冠動脈疾患、頸動脈疾患、頸動脈疾患、末梢動脈疾患、動脈硬化症、または慢性腎疾患を治療することによる、合併症の治療方法を提供する。一実施形態では、アテローム性動脈硬化症の合併症を有する対象に、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕであるグリシン含有トリペプチド分子を投与して、心筋梗塞、冠動脈疾患、頸動脈疾患、頸動脈疾患、末梢動脈疾患、動脈硬化症、または慢性腎疾患を治療することによる、合併症の治療方法。
【００９０】
１つ以上のグリシントリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、脂肪組織及び循環中の炎症の治療方法であって、トリペプチド分子の投与が、炎症をより少なくする、治療方法。
【００９１】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、または対象にとって薬学的に許容される塩を、それを必要とする対象に投与することを含む、脂肪組織及び循環中の炎症の治療方法であって、循環中の炎症を、血漿ＭＣＰ１レベルを低下させることによって軽減する、治療方法。それを必要とする対象にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕを投与し、ＭＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルを低下させることを含み、脂肪組織の炎症が精巣上体脂肪組織（ＥＡＴ）または皮下脂肪組織（ＳＡＴ）に存在する、炎症の治療方法。
【００９２】
グリシントリペプチド分子の血漿レベルを低下させるための対象の治療方法であって、それを必要とする対象に、１つ以上のトリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、トリペプチド分子の投与が、血漿グリシントリペプチド分子のレベルを低下させる、治療方法。
【００９３】
それを必要とする対象にトリペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕを投与することを含む、グリシントリペプチド分子の血漿レベルを低下させるための対象の治療方法。
【００９４】
それを必要とする対象に１つ以上のトリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、食後グルコースをより低下させるための対象の治療方法。それを必要とする対象にグリシントリペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕを投与することを含む、食後グルコースをより低下させるための対象の治療方法。
【００９５】
それを必要とする対象にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕを投与することを含む、対象の治療方法であって、対象が肝疾患を有する、治療方法。
【００９６】
それを必要とする対象にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕを投与することを含む、対象の治療方法であって、対象が肝疾患を有し、肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）もしくは非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、またはアルコール性脂肪肝である、治療方法。
【００９７】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象におけるＮＡＦＤＬ活動性スコア（ＮＡＳ）の安定化方法または低下方法。
【００９８】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象におけるＮＡＦＤＬ活動性スコア（ＮＡＳ）の安定化方法または低下方法であって、方法が、ＮＡＳの脂肪肝成分の進行遅延、安定化、または低減することを含む、安定化方法または低下方法。ＮＡＳの小葉の炎症成分の進行遅延、安定化、または低減することを含む、方法。ＮＡＳの肝細胞バルーニング成分の進行遅延、安定化、または低減することを含む、方法。
【００９９】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を含む治療有効量の組成物による治療の６か月後にＮＡＳが１．５ポイント以上異なる、ＮＡＦＬＤ活性スコアを安定化または低下させる方法のいずれか１つに記載の方法。
【０１００】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における肝線維症の軽減方法。
【０１０１】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における血漿フィブリノーゲンレベルの低減方法。
【０１０２】
対象に治療有効量のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ及び／またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を含む組成物を投与する前に、対象のフィブリノーゲンレベルが３００ｍｇ／ｄＬ超である、それを必要とする対象における血漿フィブリノーゲンレベルの低減方法。
【０１０３】
本発明の一実施形態は、ＤＴ−１０９、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む、ＮＡＦＬＤを治療するためのキットである。本発明の別の実施形態は、ＤＴ−１０９、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む、ＮＡＳＨを治療するためのキットである。本発明の一実施形態は、ＤＴ−１１０、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む、ＮＡＦＬＤを治療するためのキットである。本発明の別の実施形態は、ＤＴ−１１０、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む、ＮＡＳＨを治療するためのキットである。
【０１０４】
本発明は、ＤＴ−１０９もしくはＤＴ−１１０またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、患者における肝線維症の軽減方法を提供する。一実施形態は、対象にＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０を投与することを含む、それを必要とする対象における肝線維症の軽減方法である。別の実施形態は、対象にＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０を投与することを含む、それを必要とする対象における肝線維症の軽減方法であり、その場合、対象はＮＡＳＨを有する。
【０１０５】
フィブリノーゲン（第Ｉ因子）は、血餅の形成に関与する哺乳類の糖タンパク質である。フィブリノーゲンは、血餅形成中にトロンビンによってフィブリンに変換される。フィブリノーゲンは肝細胞で合成される。したがって、フィブリノーゲンは多くの疾患の予後指標または血液マーカーであり得、病状の発症及び進行に影響を与えることにも役立ち得る。
【０１０６】
様々な実施形態において、哺乳類対象における高脂血症、脂肪肝、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、肥満、高血糖、メタボリックシンドローム、心血管疾患、及びアテローム性動脈硬化症のうちの少なくとも１つを治療するための方法は、それを必要とする対象に、グリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。
【０１０７】
様々な実施形態において、グリシン含有トリペプチド分子は、肝脂質中のトリグリセリドレベルを有意に減少させ、ロイシン陰性対照に対して有意な影響を及ぼさない。
【０１０８】
様々な実施形態において、グリシン含有トリペプチド分子は、肝脂質中の総コレステロールレベルを有意に減少させ、ロイシン陰性対照に対して有意な影響を及ぼさない。
【０１０９】
様々な実施形態において、グリシン含有トリペプチド分子は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩である。
【０１１０】
本開示は、それを必要とする対象における肝脂質の酸化または利用の増強方法、トリグリセリドレベルの低減方法、または高コレステロール血症の治療方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、グリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、治療の結果として、肝脂質酸化、トリグリセリドレベル、高コレステロール血症またはそれらの任意の組み合わせが改善される。これらの実施形態の関連する態様では、グリシン含有トリペプチド分子は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩である。
【０１１１】
これらの実施形態の関連する態様では、グリシン含有トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩は、ロイシン陰性対照からは影響を受けずに、肝脂質酸化の調節因子ＡＭＰＫα１またはＰＰＡＲαの発現を有意に誘導する。
【０１１２】
これらの実施形態の関連する態様では、グリシン含有トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩は、ＣＰＴ１ａ、ＣＡＣＴ、またはＡＣＡＤＩ（ミトコンドリアβ酸化）またはＰＮＰＬＡ２を有意に上方制御することによってトリグリセリド加水分解を調節する。
【０１１３】
これらの実施形態の関連する態様では、グリシン含有トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩は、ミトコンドリア陰イオン担体ＵＣＰ２を有意に上方制御することによってトリグリセリド加水分解を調節する。
【０１１４】
これらの実施形態の関連する態様では、グリシン含有トリペプチド分子Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩は、ＡＢＣＧ５及びＡＢＣＧ８の発現を有意に増加させることによって肝臓におけるコレステロール恒常性を調節する。
【０１１５】
これらの実施形態の関連する態様では、対象の血漿脂質特性は、それを必要とする対象にグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を投与し、対象の血漿トリグリセリド、血漿ＬＤＬレベル、または動脈硬化巣を低減することを含む。これらの実施形態の関連する態様では、グリシン含有トリペプチド分子は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩である。
【０１１６】
これらの実施形態の関連する態様では、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、グリシントリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩は、動脈硬化巣を低減する。
【０１１７】
これらの実施形態の関連する態様では、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩は、血漿総コレステロール、血漿ＬＤＬまたはそれらの組み合わせを低下させる。
【０１１８】
本開示は、そのような治療を必要とする対象の脂肪組織及び循環中の炎症の治療方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、グリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、グリシン含有トリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩の投与により、対象の脂肪組織及び循環中の炎症が軽減する。これらの実施形態の関連する態様では、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することによって血漿ＭＣＰ１レベルを低下させることにより、循環中の炎症は軽減される。これらの実施形態の関連する態様では、脂肪組織内の炎症は、精巣上体脂肪組織（ＥＡＴ）または皮下脂肪組織（ＳＡＴ）に存在し、ＭＣＰ１  ｍＲＮＡのレベルを低下させる。
【０１１９】
本開示は、それを必要とする対象におけるレプチンの血漿レベルを低下させる、対象の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、グリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、グリシン含有トリペプチド分子の投与は、血漿レプチンのレベルを低下させる。これらの実施形態の関連する態様では、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を用いて治療を行う。
【０１２０】
本開示は、それを必要とする対象における食後グルコースを低下させる、対象の治療方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、グリシン含有トリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。
【０１２１】
これらの実施形態の関連する態様では、対象の治療は、治療有効量のグリシントリペプチド分子、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。
【０１２２】
本開示は、肝疾患、例えば、肝臓が、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨもしくはアルコール関連脂肪肝、肝硬変または肝臓炎などの肝疾患を例示する過剰なコレステロール、トリグリセリド、または他の脂質を有することを特徴とする肝疾患に罹患している、または発症する可能性がある対象の治療方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を投与して、肝疾患を治療または予防することを含む。
【０１２３】
これらの実施形態の関連する態様では、肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）もしくは非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、またはアルコール性脂肪肝である。
【０１２４】
これらの実施形態の関連する態様では、本開示は、対象におけるＮＡＦＤＬ活動性スコア（ＮＡＳ）の安定化方法または低減方法を提供し、方法は、対象に、アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕを有する治療有効量のグリシントリペプチド、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。これらの実施形態の関連する態様では、方法は、ＮＡＳの脂肪肝成分の進行を遅延させるか、安定化するか、または低減することを含む。これらの実施形態の関連する態様では、方法は、ＮＡＳの小葉炎症成分の進行を遅延させるか、安定化するか、または低減することを含む。これらの実施形態の関連する態様では、方法は、ＮＡＳの肝細胞バルーニング成分の進行を遅延させるか、安定化するか、または低減することを含む。これらの実施形態の関連する態様では、ＮＡＳは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩での６か月の治療後、少なくとも１．５ポイント異なる。
【０１２５】
本開示は、治療有効量のグリシントリペプチド分子：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における肝線維症の軽減方法を提供する。
【０１２６】
本開示は、アテローム性動脈硬化症の治療方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、治療有効量のグリシン含有トリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。これらの実施形態の関連する態様では、グリシン含有トリペプチド分子は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ、またはその薬学的に許容される塩である。
【０１２７】
本開示は、合併症を有する対象に、心筋梗塞、動脈硬化症、冠動脈疾患、頸動脈疾患、末梢動脈疾患、アテローム血栓性脳卒中、動脈瘤、または慢性腎疾患からなる群から選択される合併症を治療するための治療有効量のグリシン含有トリペプチド分子を投与することによる、アテローム性動脈硬化症の合併症の治療方法を提供する。
【０１２８】
本開示はまた、代謝疾患、心血管疾患及び炎症性疾患を治療するための二次治療薬と組み合わせたグリシン含有トリペプチド分子の投与による、そのような例示された代謝疾患、心血管疾患及び炎症性疾患の治療を包含する。いくつかの実施形態では、上記に開示した方法は：コレステロール吸収阻害剤、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、ＡＲＢ、レニン、ＧＬＰ−１またはその合成バリアント、インスリン、またはその合成バリアント、メトホルミン、スルホニル尿素化合物、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）阻害剤、エゼチミブ、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、クロフィブラート、ベザフィブラート、ペマフィブラート、ゲムカベン（ＣＩ−１０２７）、ベンポド酸（ＥＴＣ−１００２）、ＡＣＣ阻害剤、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ阻害剤、ＡＣＬ阻害剤、処方魚油、ＣＥＴＰ阻害剤、抗線維化剤、及びそれらの組み合わせから選択される、それを必要とする対象に第２の治療薬を投与することをさらに含む。
【０１２９】
特定の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上の代謝疾患及び／または心血管疾患、及び／または炎症性疾患を、治療、予防、または改善するためのキットを提供し、キットは：ａ）本明細書に記載のグリシン含有トリペプチド分子；及び場合によりｂ）本明細書に記載のさらなる薬剤または療法を含む。キットはさらに、キットを使用して１つ以上の代謝疾患及び／または心血管疾患、及び／または炎症性疾患を、治療、予防、または改善するための説明書またはラベルを含み得る。これらの実施形態の関連する態様では、キットは、選択されたトリペプチド、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを有する対象を治療するためのキットである。これらの実施形態の関連する態様では、キットは、ＤＴ−１０９（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）及び／またはＤＴ−１１０（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ）、場合によりスタチン、及び使用説明書を含む。これらの実施形態の関連する態様では、キットは、場合により、コレステロール吸収阻害剤、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、ＡＲＢ、レニン、ＧＬＰ−１またはそれらの合成バリアント、インスリン、またはその合成バリアント、メトホルミン、スルホニル尿素化合物、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）、ＰＣＳＫ９阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、スタチン、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤、（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型）、エゼチミブ、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、クロフィブラート、ベザフィブラート、ペマフィブラート、ゲムカベン、（ＣＩ−１０２７）、ベンポド酸（ＥＴＣ−１００２）、ＡＣＣ阻害剤、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ阻害剤、ＡＣＬ阻害剤、処方魚油、ＣＥＴＰ阻害剤、抗線維化剤、及びそれらの組み合わせをさらに含む。これらの実施形態の関連する態様では、キットは、場合により、エゼチミブを含む。
【０１３０】
製剤
【０１３１】
本明細書中で使用する場合、用語「薬学的に許容される」とは、ヒトなどの動物で使用するために、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されたか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「担体」とは、投与するためにそれを用いて薬剤を製剤化する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、安定剤、またはビヒクルを指す。医薬用担体は、無菌の液体、例えば、水、及び石油性、動物性、植物性または合成由来のものを含む油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。医薬組成物を静脈内投与する場合、水は、一般的な担体である。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、特に注射液のための液体担体として使用することができる。好適な医薬用賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物には、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有させることもできる。医薬組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。組成物はまた、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体を用いて、坐剤として製剤化することもできる。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は、グリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と混合して含む。薬学的に許容される組成物は、例えば、化合物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸着または浸透を、改変、維持または保存するための１つ以上の製剤物質を含有する。適切な製剤物質として、アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリスＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、その他の有機酸など）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、βシクロデキストリンまたはヒドロキシプロピルβシクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤；香料及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなど）；安定性向上剤（スクロースまたはソルビトール）；等張性強化剤（アルカリ金属ハロゲン化物（一態様では、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／または医薬用アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）。
【０１３３】
本発明の一態様では、グリシン含有トリペプチド分子を、１０ｍＭグルタミン酸、２％グリシン、１％スクロース、及び０．０１％ポリソルベート２０、ｐＨ４．２５からなる製剤緩衝剤で調製された凍結乾燥ケーキを含有する、単回使用専用のガラスバイアルとして供給する。ある量の無菌希釈剤、例えば、無菌等張食塩水または水、例えば、０．５ｍＬ〜約１０ｍＬ、例えば、２．２ｍＬの無菌水で再構成すると、ケーキから１ｇ／ｍＬ〜約１００ｇ／ｍＬの濃度のグリシントリペプチド分子が得られる。グリシン含有トリペプチド分子は、管理された条件下で安全な場所に保管する。単回使用バイアルをいったん再構成したら、薬剤を直ちに投与する（再構成後３時間以内）。注射の前に、被験薬を室温（１５〜３０℃）に到達させることができる。
【０１３４】
用量及び投与
【０１３５】
本明細書中で使用する「用量」は、一般的に、１日１回投与し得るか、または１日数回投与し得る活性成分の用量に等しい（例えば、単位用量は、所望の日用量の一部である）。様々な実施形態において、様々な用量及び投与レジメンを、本明細書に開示するグリシンまたはグリシン含有トリペプチド分子に適用する。例えば、本発明において有用な用量は、対象の体重に基づく計算で、５ｍｇ／Ｋｇ〜２，０００ｍｇ／Ｋｇ、または３０ｍｇ／Ｋｇ〜１，５００ｍｇ／Ｋｇ、または４０ｍｇ／Ｋｇ〜１，２５０ｍｇ／Ｋｇ、または５０ｍｇ／Ｋｇ〜１，０００ｍｇ／Ｋｇ、または６０ｍｇ／Ｋｇ〜５，０００ｍｇ／Ｋｇである。本明細書中で使用する用語「単位用量」とは、所定量の活性化合物を含む離散量の治療用組成物を示すために使用され得る。活性成分の量は、一般的に、１日１回投与し得るか、または１日数回投与し得る活性成分の用量に等しい（例えば、単位用量は、所望の日用量の一部である）。単位用量はまた、１日総用量を示すと捉えてもよく、それは、１日１回投与し得るか、またはそのような用量の便利な分数として投与し得る（例えば、単位用量は、例えば、投与量の半分または３分の１などの分数のきざみ幅で与えられ得る１日総用量である）。
【０１３６】
本明細書中で使用する場合、用語「開始日用量」とは、以前にグリシントリペプチド分子の滴定レジメンを受けたことがなく、グリシン含有トリペプチド分子治療を開始する患者に投与または処方する１日あたりのグリシン含有トリペプチド分子の量を指す。この量は、複数の単位用量または単一の単位用量で、日中の単一の時間で、または日中の複数回で投与することができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ／日、約１，０００ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日、または約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約３ｍｇ／ｋｇ／日〜約７０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約７ｍｇ／ｋｇ／日〜約４０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約３ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、用量は、１０００ｍｇ／日〜１００ｇ／日、より好ましくは１０００ｍｇ／日〜７５ｇ／日であり得る。組成物中のグリシン含有トリペプチド分子の量は、好ましくは、約５０ｍｇ〜約１００ｇ、約１００ｍｇ〜約９０ｇ、約５００ｍｇ〜約７５ｇ、約６００ｍｇ〜約８０ｇ、約７００ｍｇ〜約７５ｇであり得る。いくつかの実施形態では、組成物中のグリシン含有トリペプチド分子の量は、約１００ｍｇ〜約１，０００ｇ、約２００ｍｇ〜約５００ｇ、約３００ｍｇ〜約１００ｇ、約４００ｍｇ〜約７５ｇ、約５００ｍｇ〜約５０ｇ、約７５０ｍｇ〜約２５ｇ、約１，０００ｍｇ〜約５０ｇ、または１０００ｍｇ〜約２５ｇであり得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、投与するグリシン含有トリペプチド分子の治療有効量は、約１００ｍｇ〜約２００ｇである。この用量は、１日１回の用量として投与してもよく、または１日を通して投与するいくつかの用量、例えば、１日あたり１〜５回の用量、好ましくは２回または３回の用量に分割してもよい。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約２５０ｍｇ〜約１００ｇである。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約５００ｍｇ〜約９０ｇである。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約７５０ｍｇ〜約７５ｇである。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約１０００ｍｇ〜約５０ｇである。いくつかの実施形態では、組成物は、経口投与に好適である。いくつかの実施形態では、組成物は、固体の経口剤形である。
【０１４０】
組成物は、グリシン含有トリペプチド分子について、少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．６％、好ましくは少なくとも９９．７％、好ましくは少なくとも９９．８％、好ましくは少なくとも９９．９％、好ましくは少なくとも９９．９５％、またはより好ましくは少なくとも９９．９９％のキラル純度を有し得る。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子について、キラル純度は１００％である。いくつかの実施形態では、組成物は、グリシン含有トリペプチド分子について、９９．９％以上のキラル純度を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、グリシン含有トリペプチド分子について、９９．９５％以上のキラル純度を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、グリシン含有トリペプチド分子について、９９．９９％以上のキラル純度を有する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、組成物は、経口投与に好適である。いくつかの実施形態では、組成物は、固体の経口剤形である。いくつかの実施形態では、組成物はカプセルである。いくつかの実施形態では、組成物は錠剤である。いくつかの実施形態では、組成物を、経口溶液または非経口溶液として製剤化する。
【０１４２】
簡潔にするために本明細書中で別々に記載する、組成物中のグリシン含有トリペプチド分子の量、キラル純度、及び剤形の実施形態は、任意の適切な組み合わせで結合することができる。
【０１４３】
別の態様では、本発明は、グリシントリペプチド分子に対してキラル的に純粋であるグリシン含有トリペプチド分子を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、対象の体重に基づく計算で、約５ｍｇ／Ｋｇ／日〜５０００ｍｇ／Ｋｇ／日、または５ｍｇ／Ｋｇ／日〜約２，０００ｍｇ／Ｋｇ／日、または３０ｍｇ／Ｋｇ／日〜１５００ｍｇ／Ｋｇ／日、または４０ｍｇ／Ｋｇ／日〜１２５０ｍｇ／Ｋｇ／日、または５０ｍｇ／Ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／Ｋｇ／日、または６０ｍｇ／Ｋｇ／日〜５００ｍｇ／Ｋｇ／日であり得る。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約７ｍｇ／ｋｇ／日〜約９００ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約８００ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。いくつかの実施形態では、用量は、１０ｍｇ／日〜５，０００ｍｇ／日、より好ましくは１００ｍｇ／日〜２０００ｍｇ／日であり得る。いくつかの実施形態では、組成物を、約５００ｍｇ〜約１００ｇ、約１，０００ｍｇ〜約７５ｇ、約１５００ｍｇ〜約５０ｇ、または約２０００ｍｇ〜約２５ｇのグリシントリペプチド分子の用量で投与する。いくつかの実施形態では、組成物を、約２５０ｍｇ〜約５００ｇ、約５００ｍｇ〜約２５０ｇ、約７５０ｍｇ〜約２００ｇ、約１，０００ｍｇ〜約１００ｇ、約１，２５０ｍｇ〜約７５ｇ、約１，５００ｍｇ〜約５０ｇ、約２，０００ｍｇ〜約２５ｇ、または２，５００ｍｇ〜約２０ｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、代謝疾患及び／または心血管疾患、及び／または炎症性疾患を予防または治療するために、それを必要とする対象に投与するグリシン含有トリペプチド分子の有効量は、約５００ｍｇ〜約２００ｇの範囲であってもよい。この用量は、１日１回の用量として投与してもよく、または１日を通して投与するいくつかの用量、例えば、１日あたり１〜５用量、好ましくは１日あたり２〜３用量に分割してもよい。グリシン含有トリペプチド分子のこれらの用量は、好ましくは、９７％以上の化学的純度及び９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、好ましくは９９．９５％以上、より好ましくは９９．９９％以上の化学的純度を有する。好ましい実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を含む組成物は、グリシン含有トリペプチド分子に対して１００％のキラル純度を有していてもよい。組成物には、さらに担体５を含ませてもよい。本発明の組成物は、経口的に、好ましくは固体経口用量として、より好ましくはカプセルまたは錠剤であり得る固体経口用量として投与してもよい。好ましい実施形態では、本発明の組成物を、経口投与用の錠剤として製剤化してもよい。
【０１４４】
別の態様では、本発明はさらに、治療有効量のグリシントリペプチド分子を含む組成物を提供する。組成物には、さらに薬学的に許容される担体を含ませてもよい。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の治療有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約５，０００ｍｇ／ｋｇ／日、約２０ｍｇ／ｋｇ／日〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ／日、約３０ｍｇ／ｋｇ／日〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ／日、約５０ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日、または約１００ｍｇ／ｋｇ／日〜約５，０００ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の治療有効量は、約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約５，０００ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の治療有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約４，０００ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の治療有効量は、約２５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２，０００ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。いくつかの実施形態では、用量は、１０ｍｇ／日〜１，０００ｇ／日、より好ましくは５００ｍｇ／日〜１００ｇ／日であり得る。組成物中のグリシン含有トリペプチド分子の治療有効量は、好ましくは、約２５０ｍｇ〜約５００ｇ、約５００ｍｇ〜約４００ｇ、約７５０ｍｇ〜約２００ｇ、約１，０００ｍｇ〜約１００ｇであり得る。いくつかの実施形態では、組成物中のグリシン含有トリペプチド分子の治療有効量は、約３００ｍｇ〜約１，０００ｇ、約５００ｍｇ〜約５００ｇ、約６００ｍｇ〜約４００ｇ、約７００ｍｇ〜約３００ｇ、約８００ｍｇ〜約２００ｇ、約９００ｍｇ〜約１５０ｇ、または約１，０００ｍｇ〜約１００ｇであり得る。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の量は、約６００ｍｇ〜約３００ｇである。この用量は、１日１回の用量として投与してもよく、または１日を通して投与するいくつかの用量、例えば、１日あたり１〜５用量、好ましくは１日あたり２〜３用量に分割してもよい。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の治療有効量は、約５００ｍｇ〜約３５０ｇである。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の治療有効量は、約７５０ｍｇ〜約２５０ｇである。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の治療有効量は、約１，０００ｍｇ〜約１５０ｇである。いくつかの実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子の治療有効量は、約１，５００ｍｇ〜約１００ｇである。いくつかの実施形態では、組成物は、経口投与に好適である。いくつかの実施形態では、組成物は、固体の経口剤形である。いくつかの実施形態では、組成物は、液体の経口剤形である。いくつかの実施形態では、組成物は、液体の非経口剤形である。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、組成物は、経口投与に好適である。いくつかの実施形態では、組成物は、固体の経口剤形である。いくつかの実施形態では、組成物はカプセルである。いくつかの実施形態では、組成物は錠剤である。
【０１４８】
別の態様では、対象の肝機能に対するグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩の有益な効果は、一態様では、肝脂質酸化、ＡＭＰＫα１、グルコキナーゼ、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ、ＰＰＡＲγコアクチベーター１、ピルビン酸キナーゼ、ステロール調節エレメント結合タンパク質１ｃ、長鎖及び超長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたはステアロイル−ＣｏＡ脱飽和酵素のメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質発現の好ましい変化に認められる。さらなる態様では、対象の肝機能に対するグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩の有益な効果は、ホスホエノイルピルビン酸キナーゼ、ミクロソーム転移タンパク質、アリールアセトアミンデアセチラーゼ、アポリポタンパク質Ｃ２、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＩ、またはホスホリパーゼＤ１のメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質発現の改善に認められる。
【０１４９】
本発明のグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩は、任意の適切な経路によって投与してもよい。例えば、本発明の組成物は、経口、眼、皮内、腹腔内、鼻腔内、皮下、筋肉内または静脈内経路によって投与することができる。
【０１５０】
経口投与に適した製剤として、例えば、固体、半固体、及び液体系、例えば、錠剤；マルチ粒子もしくはナノ粒子、液体、または散剤を含有するソフトまたはハードカプセル；トローチ（液体で満たされたものを含む）；ガム；ゲル；高速分散剤形；フィルム；腔坐剤；スプレーが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドを、ミクロスフェア、リポソーム、腸溶コーティングされた乾燥エマルジョンまたはナノ粒子を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の送達ビヒクルを使用して経口投与用に製剤化する。
【０１５１】
経口投与用の液体剤形として、薬学的に許容される乳濁剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤が挙げられるが、これらに限定されない。活性ペプチドに加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒などの当技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及び脂肪酸エステルソルビタン、ならびにそれらの混合物を含有し得る。不活性希釈剤以外に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、香味剤、及び芳香剤などのアジュバントを含み得る。
【０１５２】
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、及び顆粒剤が含まれる。そのような固体剤形において、活性ペプチドを、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体、及び／またはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸などの充填剤または増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの湿潤剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、ｈ）カオリン及びベントナイト粘土などの吸収剤、ならびにｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤、ならびにそれらの混合物と混合する。カプセル、錠剤及びピルの場合、剤形には緩衝剤も含ませてよい。活性化合物はまた、上述の１つ以上の賦形剤を含むマイクロカプセル化形態であり得る。類似した型の固形組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコール、ポロキサマーなどの賦形剤を使用して、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、及び顆粒の固形剤形は、コーティング及びシェル、例えば、腸溶コーティング及び医薬製剤分野で周知の他のコーティングを用いて調製することができる。注射可能な製剤、例えば、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を使用して、公知の技術に従って製剤化し得る。無菌の注射可能な製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液、懸濁剤または乳濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であり得る。利用し得る許容されるビヒクル及び溶媒として、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、無菌の固定油が、溶媒または懸濁培地として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意のブランドの固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注射剤の調製において使用する。注射可能製剤を、例えば、細菌を保持するフィルターに通して濾過することにより、または使用前に無菌水または他の無菌注射可能培地に溶解または分散し得る無菌の固形組成物の形態で無菌剤を組み込むことによって、無菌化することができる。
【０１５３】
当業者であれば、治療的使用のために投与するグリシン含有トリペプチド分子ポリペプチドの量が様々に異なることを理解するであろう。一態様では、グリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を含有する組成物は、汚染因子を実質的に含まず、汚染レベルは０．０２％（ｗ／ｗ）未満である。患者への注射に適したグリシン含有トリペプチド分子組成物は、例えば、精製されたグリシン含有トリペプチド分子及び安定化塩を含む凍結乾燥試料の薬理学的に許容される希釈剤で再構成することによって調製される。グリシン含有トリペプチド分子組成物の投与は、本明細書で以下に詳細に論じるように、代替的に全身性または局所的であり、治療有効量のグリシン含有トリペプチド分子タンパク質組成物の投与を含む。
【０１５４】
併用治療及び組成物
【０１５５】
グリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を含有する組成物の送達のみに基づく治療に加えて、併用療法が特に企図されている。本発明に関して、グリシン含有トリペプチド分子療法は、代謝疾患、例えば脂肪肝疾患の治療に一般的に使用される他の薬剤と同様に併用することが企図される。
【０１５６】
様々な実施形態において、第２の治療薬（複数可）を、特に活性の相乗的増強のために、グリシントリペプチド分子と併用することができる。活性成分の併用投与は、患者への活性成分の別々の投与によって、または複数の活性成分を１つの医薬製剤中に存在させる組み合わせ製品の形態のいずれかによって行うことができる。二次治療薬は、単剤として使用する場合、承認された用量で投与することができ、または二次治療薬とグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩とを併用して投与する場合、その併用が、治療しようとする患者において治療効果のある結果を提供するように、最初に二次治療薬を治療有効濃度または治療有効濃度以下で投与してもよいと考えられる。
【０１５７】
本発明の方法及び組成物を使用して適切な治療結果を達成するために、グリシン含有トリペプチド分子及び少なくとも１つの他の治療薬（第２の治療薬（複数可））を含む組成物を提供してもよい。本発明において、第２の治療薬は、プラムリニチド、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、エキセナチド、またはチアゾリジンジオンもしくはメトホルミン、またはグリメピリド、及びこれらの化合物のいずれかの類似体を含むがこれらに限定されないインスリン感作物質から選択され得ることが企図される。アテローム性動脈硬化症に関連する脂質異常症、糖尿病及び心血管疾患の制御に使用する他の二次治療薬は、当技術分野で周知であり、本発明のグリシン含有トリペプチド分子と併用してもよい。
【０１５８】
併用療法組成物は、代謝疾患、例えば：グルコース代謝異常、脂質異常症、例えば、コレステロールの増加（純粋または単独高コレステロール血症）、及び／またはトリグリセリド（ＴＧ）のみの増加（純粋または単独高トリグリセリド血症）、及び／またはコレステロールとＴＧの両方の増加（混合または複合高脂血症）、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂肪肝、肝炎症、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、全身性炎症、及びプラーク関連血栓症に関連する虚血性脳卒中を含む脂肪肝疾患のうちの１つ以上に関連する代謝疾患の治療において所望の治療結果を生じるのに有効な組み合わせ量で提供される。このプロセスは、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明の第１の治療薬（すなわち、治療有効量のグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を含む組成物）、及び場合により、第２の治療薬（複数可）または因子（複数可）を同時に投与することを含む。これは、両方の治療薬を含む単一の組成物または薬理学的製剤を投与することによって、または２つの別個の組成物または製剤を同時に投与することによって達成され、その場合、一方の組成物が、グリシン含有トリペプチド分子治療組成物を含み、他方が第２の治療薬を含む。
【０１５９】
グリシン含有トリペプチド分子と併用する二次治療薬として有用な抗糖尿病薬として、インスリン及びインスリン誘導体、例えば、Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）もしくはＨＭＲ１９６４もしくはＬｅｖｅｍｉｒ（登録商標）（インスリンデテミル）またはＷＯ２００５００５４７７に記載されている薬剤（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、速効型インスリン（米国特許第６，２２１，６３３号を参照のこと）、吸入型インスリン、例えば、Ｅｘｕｂｅｒａ（登録商標）または経口インスリン、例えば、ＩＮ−１０５（Ｎｏｂｅｘ）もしくはＯｒａｌ−ｌｙｎ（商標）（Ｇｅｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＧＬＰ−１誘導体及びＧＬＰ−１アゴニスト、例えば、エキセナチド、リラグルチドまたはＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／ＳのＷＯ９８／０８８７１、ＷＯ２００５０２７９７８、ＷＯ２００６０３７８１１もしくはＷＯ２００６０３７８１０、ＺｅａｌａｎｄのＷＯ０１／０４１５６、Ｂｅａｕｆｏｕｒ−ＩｐｓｅｎのＷＯ００／３４３３１に開示されている薬剤、プラムリンチド酢酸塩（Ｓｙｍｌｉｎ；Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＩＭ−５１０７７、ＰＣ−ＤＡＣ−ｅｘｅｎｄｉｎ−４（組換えヒトアルブミンに共有結合したエキセンディン−４類似体）、例えば、Ｄ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４（２００７）９４３に記載されているアゴニスト、ＷＯ２００６１２４５２９に記載されている薬剤、ならびに経口的に有効な血糖降下作用のある活性成分が挙げられる。
【０１６０】
抗糖尿病薬には、例えば、ＷＯ２００６１２１８６０に記載されているグルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド（ＧＩＰ）受容体のアゴニスト、ならびに血糖を制御し、ＩＩ型糖尿病を含む糖尿病を治療するために使用するＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２ならびにそれらの合成バリアント及び変異体も含まれる。
【０１６１】
本明細書に開示するグリシン含有トリペプチド分子と併用するのに有用な例示的な二次治療薬として、経口的に有効な血糖降下活性成分、好ましくはスルホニル尿素、ビグアニジン、メグリチニド、オキサジアゾリジンジオン、チアゾリジンジオン、グルコシダーゼ阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト、グルコキナーゼ活性化因子、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ阻害剤、グルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）調節因子、グルタミン−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）阻害剤、ＧＬＰ−１アゴニスト、カリウムチャネルオープナー、例えば、ピナシジル、クロマカリム、ジアゾキシド、またはＲ．Ｄ．Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２，２００３，２５１３．２５１８，Ｊ．Ｂ．Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１，２００４，１５９５−１６１５，Ｔ．Ｍ．Ｔａｇｍｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７，２００４，３２０２−３２１１もしくはＭ．Ｊ．Ｃｏｇｈｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４４，２００１，１６２７−１６５３に記載されているもの、またはＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／ＳのＷＯ９７／２６２６５及びＷＯ９９／０３８６１で開示されているもの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤、インスリン感作物質、糖新生及び／またはグリコーゲン分解の刺激に関与する肝酵素の阻害剤、グルコース取り込み、グルコース輸送及びグルコース再吸収の調節因子、１１β−ＨＳＤ１阻害剤、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）阻害剤、ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１または２（ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２）調節因子、抗高脂血症活性成分及び抗脂質血症活性成分などの脂質代謝を変化させる化合物、食物摂取を減少させる化合物、熱発生を増加させる化合物、ＰＰＡＲ及びＲＸＲ調節因子ならびにβ細胞のＡＴＰ依存性カリウムチャネルに作用する活性成分が挙げられ得る。
【０１６２】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、シンバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチンまたはＬ−６５９６９９などのＨＭＧＣｏＡレダクターゼ阻害剤と併用して投与する。
【０１６３】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、エゼチミブ、チケシド、パマケシド、ＦＭ−ＶＰ４（シトスタノール／カンプエステロールリン酸アスコルビル；Ｆｏｒｂｅｓ  Ｍｅｄｉ−Ｔｅｃｈ、ＷＯ２００５０４２６９２、ＷＯ２００５００５４５３）、ＭＤ−０７２７（Ｍｉｃｒｏｂｉａ  Ｉｎｃ．，ＷＯ２００５０２１４９７、ＷＯ２００５０２１４９５）などのコレステロール吸収阻害剤、またはＷＯ２００２０６６４６４、ＷＯ２００５０００３５３（Ｋｏｔｏｂｕｋｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、もしくはＷＯ２００５０４４２５６もしくはＷＯ２００５０６２８２４（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）もしくはＷＯ２００５０６１４５１及びＷＯ２００５０６１４５２（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  ＡＢ）、及びＷＯ２００６０１７２５７（Ｐｈｅｎｏｍｉｘ）もしくはＷＯ２００５０３３１００（Ｌｉｐｉｄｅｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ）に記載されているか、またはＷＯ２００４０９７６５５、ＷＯ２００４０００８０５、ＷＯ２００４０００８０４、ＷＯ２００４０００８０３、ＷＯ２００２０５００６８、ＷＯ２００２０５００６０、ＷＯ２００５０４７２４８、ＷＯ２００６０８６５６２、ＷＯ２００６１０２６７４、ＷＯ２００６１１６４９９、ＷＯ２００６１２１８６１、ＷＯ２００６１２２１８６、ＷＯ２００６１２２２１６、ＷＯ２００６１２７８９３、ＷＯ２００６１３７７９４、ＷＯ２００６１３７７９６、ＷＯ２００６１３７７８２、ＷＯ２００６１３７７９３、ＷＯ２００６１３７７９７、ＷＯ２００６１３７７９５、ＷＯ２００６１３７７９２、ＷＯ２００６１３８１６３に記載されている化合物と併用して投与する。
【０１６４】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、エゼチミブとシンバスタチンの固定された組み合わせであるビトリン（商標）と併用して投与する。
【０１６５】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、エゼチミブとアトルバスタチンの固定された組み合わせと併用して投与する。
【０１６６】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、エゼチミブとフェノフィブラートの固定された組み合わせと併用して投与する。
【０１６７】
本発明のさらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、フェノフィブラートとロスバスタチンの固定された組み合わせと併用して投与する。
【０１６８】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、フェノフィブラートとメトホルミンの固定された組み合わせであるＳｙｎｏｒｄｉａ（登録商標）と併用して投与する。
【０１６９】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、アポリポタンパク質Ｂ遺伝子を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ−３０１０１２と併用して投与する。
【０１７０】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、ＪＴＴ−５０１、ＧＩ２６２５７０、Ｒ−４８３、ＣＳ−０１１（リボグリタゾン）などのＰＰＡＲγアゴニストと併用して投与する。
【０１７１】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、塩酸ピオグリタゾンと塩酸メトホルミンの固定された組み合わせであるＣｏｍｐｅｔａｃｔ（商標）と併用して投与する。
【０１７２】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ピオグリタゾンとグリメピリドの固定された組み合わせであるＴａｎｄｅｍａｃｔ（商標）と併用して投与する。
【０１７３】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、塩酸ピオグリタゾンと、例えば、ＴＡＫ−５３６などのアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストとの固定された組み合わせと併用して投与する。
【０１７４】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＰＰＡＲαアゴニスト、例えば、ＧＷ９５７８、ＧＷ−５９０７３５、Ｋ−１１１、ＬＹ−６７４、ＫＲＰ−１０１、ＤＲＦ−１０９４５、ＬＹ−５１８６７４またはＷＯ２００１０４０２０７、ＷＯ２００２０９６８９４、ＷＯ２００５０９７０７６に記載されているものと併用して投与する。
【０１７５】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、混合ＰＰＡＲα／γアゴニスト、例えば、ｎａｖｅｇｌｉｔａｚａｒ、ＬＹ−５１０９２９、ＯＮＯ−５１２９、Ｅ−３０３０、ＡＶＥ８０４２、ＡＶＥ８１３４、ＡＶＥ０８４７、ＣＫＤ−５０１（硫酸ロベグリタゾン）、またはＷＯ００／６４８８８、ＷＯ００／６４８７６、ＷＯ０３／０２０２６９またはＪ．Ｐ．Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２８（５），２４４−２５１，２００５に記載されているものと併用して投与する。
【０１７６】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＰＰＡＲδアゴニスト、例えば、ＧＷ−５０１５１６、またはＷＯ２００６０５９７４４、ＷＯ２００６０８４１７６、ＷＯ２００６０２９６９９、ＷＯ２００７０３９１７２〜ＷＯ２００７０３９１７８に記載されているものと併用して投与する。
【０１７７】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、メタグリダセンまたはＭＢＸ−２０４４もしくは他の部分的ＰＰＡＲγアゴニスト／アンタゴニストと併用して投与する。
【０１７８】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、フェノフィブラート、クロフィブラートまたはベザフィブラートなどのフィブラート系薬剤と併用して投与する。
【０１７９】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＭＴＰ阻害剤、例えば、インプリタピド、ＢＭＳ−２０１０３８、Ｒ−１０３７５７、ＡＳ−１５５２１３３またはＷＯ２００５０８５２２６、ＷＯ２００５１２１０９１、ＷＯ２００６０１０４２３に記載されているものと併用して投与する。
【０１８０】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＣＥＴＰ阻害剤、例えば、トルセトラピブもしくはＪＴＴ−７０５、またはＷＯ２００６００２３４２、ＷＯ２００６０１０４２２、ＷＯ２００６０１２０９３、ＷＯ２００６０７３９７３、ＷＯ２００６０７２３６２、ＷＯ２００６０９７１６９、ＷＯ２００７０４１４９４に記載されているものと併用して投与する。
【０１８１】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、胆汁酸吸収阻害剤（例えば、米国特許第６，２４５，７４４号、米国特許第６，２２１，８９７号、またはＷＯ００／６１５６８を参照のこと）、例えば、ＨＭＲ１７４１、またはＤＥ１０２００５０３３０９９．１及びＤＥ１０２００５０３３１００．９、ＷＯ２００７００９６５５−５６に記載されているものと併用して投与する。
【０１８２】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、コレスチラミンまたはコレセベラムなどの高分子胆汁酸吸着剤と併用して投与する。
【０１８３】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＬＤＬ受容体誘導物質（米国特許第６，３４２，５１２号を参照のこと）、例えば、ＨＭＲ１１７１、ＨＭＲ１５８６、またはＷＯ２００５０９７７３８に記載されているものと併用して投与する。
【０１８４】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、ＷＯ２００６０７２３９３に記載のＡＢＣＡ１発現エンハンサーと併用して投与する。
【０１８５】
本発明のさらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＰＣＳＫ９（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型）阻害剤、例えば、エボロクマブ、インクリシラン、またはＰＣＳＫ９に対するＲＮＡｉ治療薬と併用して投与する。本発明のさらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＰＣＳＫ９に対する抗体、例えば、アリロクマブ（Ｐｒａｌｕｅｎｔ）（２週間ごとに７５〜１５０ｍｇを投与してもよい）；及びエボロクマブ（Ｒｅｐａｔｈａ）（２週間ごとに１４０ｍｇ、または毎月４２０ｍｇ投与する）と併用して投与する。
【０１８６】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、Ｏｍａｃｏｒ（登録商標）（ω−３脂肪酸；エイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸の高濃度エチルエステル）と併用して投与する。
【０１８７】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、アバシミベまたはＳＭＰ−７９７などのＡＣＡＴ阻害剤と併用して投与する。
【０１８８】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、抗酸化剤、例えば、ＯＰＣ−１４１１７、プロブコール、トコフェロール、アスコルビン酸、β−カロテンまたはセレンと併用して投与する。
【０１８９】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ビタミン、例えば、ビタミンＢ６またはビタミンＢ１２と併用して投与する。
【０１９０】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、リポタンパク質リパーゼ調節因子、例えば、イブロリピム（ＮＯ−１８８６）と併用して投与する。
【０１９１】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＡＴＰクエン酸リアーゼ阻害剤、例えば、ＳＢ−２０４９９０と併用して投与する。
【０１９２】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、スクアレンシンテターゼ阻害剤、例えば、ＢＭＳ−１８８４９４、ＴＡＫ−４７５、またはＷＯ２００５０７７９０７、ＪＰ２００７０２２９４３に記載されているものと併用して投与する。
【０１９３】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、リポタンパク質（ａ）アンタゴニスト、例えば、ゲムカベン（ＣＩ−１０２７）と併用して投与する。
【０１９４】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＧＰＲ１０９Ａのアゴニスト（ＨＭ７４Ａ受容体アゴニスト；ＮＡＲアゴニスト（ニコチン酸受容体アゴニスト）、例えば、ニコチン酸またはＭＫ−０５２４Ａと組み合わせた徐放性ナイアシンまたはＷＯ２００６０４５５６５、ＷＯ２００６０４５５６４、ＷＯ２００６０６９２４２、ＷＯ２００６１２４４９０、ＷＯ２００６１１３１５０、ＷＯ２００７０１７２６１、ＷＯ２００７０１７２６２、ＷＯ２００７０１７２６５、ＷＯ２００７０１５７４４、ＷＯ２００７０２７５３２に記載されている化合物と併用して投与する。
【０１９５】
本発明の別の実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、ＷＯ２００６０６７５３１、ＷＯ２００６０６７５３２に記載のＧＰＲ１１６のアゴニストと併用して投与する。
【０１９６】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、リパーゼ阻害剤、例えば、オルリスタットまたはセチリスタット（ＡＴＬ−９６２）と併用して投与する。
【０１９７】
本発明の一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、インスリンと併用して投与する。
【０１９８】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、トルブタミド、グリベンクラミド、グリピジド、グリクラジドまたはグリメピリドなどのスルホニル尿素と併用して投与する。
【０１９９】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、インスリン分泌を増強する物質、例えば、ＫＣＰ−２６５（ＷＯ２００３０９７０６４）またはＷＯ２００７０２６７６１に記載されているものと併用して投与する。
【０２００】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、グルコース依存性インスリン分泌性受容体（ＧＤＩＲ）のアゴニスト、例えば、ＡＰＤ−６６８と併用して投与する。
【０２０１】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ビグアニド、例えば、メトホルミンと併用して投与する。
【０２０２】
さらに別の実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、メグリチニド、例えば、レパグリニド、ナテグリニドまたはミチグリニドと併用して投与する。
【０２０３】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ミチグリニドと、グリタゾン、例えば、塩酸ピオグリタゾン、もしくはマレイン酸ロシグリタゾンとの組み合わせ、またはグリタゾンとグリメピリドの組み合わせ、またはメトホルミン、またはそれらの組み合わせとともに投与する。
【０２０４】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ミチグリニドとα−グルコシダーゼ阻害剤との組み合わせと共に投与する。
【０２０５】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、チアゾリジンジオン、例えば、トログリタゾン、シグリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、またはＤｒ．Ｒｅｄｄｙ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎのＷＯ９７／４１０９７に開示されている化合物、特に、５−［［４−［（３，４−ジヒドロ−３−メチル−４−オキソ−２−キナゾリニルメトキシ］−フェニル］メチル］−２，４−チアゾリジンジオンと併用して投与する。
【０２０６】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、α−グルコシダーゼ阻害剤、例えば、ミグリトールまたはアカルボースと併用して投与する。
【０２０７】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、β細胞のＡＴＰ依存性カリウムチャネルに作用する活性成分、例えば、トルブタミド、グリベンクラミド、グリピジド、グリメピリドまたはレパグリニドと併用して投与する。
【０２０８】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、前述の化合物の２つ以上と併用して、例えば、スルホニル尿素とメトホルミン、スルホニル尿素とアカルボース、レパグリニドとメトホルミン、インスリンとスルホニル尿素、インスリンとメトホルミン、インスリンとトログリタゾン、インスリンとロバスタチンなどと併用して投与する。
【０２０９】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、例えば、ＰＳＮ−３５７もしくはＦＲ−２５８９００、またはＷＯ２００３０８４９２２、ＷＯ２００４００７４５５、ＷＯ２００５０７３２２９−３１もしくはＷＯ２００５０６７９３２に記載されているものと併用して投与する。
【０２１０】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、グルカゴン受容体アンタゴニスト、例えば、Ａ−７７００７７、ＮＮＣ−２５−２５０４、またはＷＯ２００４１００８７５もしくはＷＯ２００５０６５６８０に記載されているものと併用して投与する。
【０２１１】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、グルコキナーゼの活性化因子、例えば、ＬＹ−２１２１２６０（ＷＯ２００４０６３１７９）、ＰＳＮ−１０５、ＰＳＮ−１１０、ＧＫＡ−５０、または、例えば、ＷＯ２００４０７２０３１、ＷＯ２００４０７２０６６、ＷＯ２００５０８０３６０、ＷＯ２００５０４４８０１、ＷＯ２００６０１６１９４、ＷＯ２００６０５８９２３、ＷＯ２００６１１２５４９、ＷＯ２００６１２５９７２、ＷＯ２００７０１７５４９、ＷＯ２００７０１７６４９、ＷＯ２００７００７９１０、ＷＯ２００７００７０４０〜４２、ＷＯ２００７００６７６０〜６１、ＷＯ２００７００６８１４、ＷＯ２００７００７８８６、ＷＯ２００７０２８１３５、ＷＯ２００７０３１７３９、ＷＯ２００７０４１３６５、ＷＯ２００７０４１３６６、ＷＯ２００７０３７５３４、ＷＯ２００７０４３６３８、ＷＯ２００７０５３３４５、ＷＯ２００７０５１８４６、ＷＯ２００７０５１８４５、ＷＯ２００７０５３７６５、ＷＯ２００７０５１８４７に記載されているものと併用して投与する。
【０２１２】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、糖新生阻害剤、例えば、ＦＲ−２２５６５４と併用して投与する。
【０２１３】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）阻害剤、例えば、ＣＳ−９１７（ＭＢ−０６３２２）もしくはＭＢ−０７８０３またはＷＯ２００６０２３５１５、ＷＯ２００６１０４０３０、ＷＯ２００７０１４６１９に記載されているものと併用して投与する。
【０２１４】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、グルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）調節因子、例えば、ＫＳＴ−４８（Ｄ．−Ｏ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．５４（１２），８３５（２００４））と併用して投与する。
【０２１５】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、ＷＯ２００４１０１５２８に記載されているように、グルタミン−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）阻害剤と併用して投与する。
【０２１６】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤、例えば、ビルダグリプチン（ＬＡＦ−２３７）、シタグリプチン（ＭＫ−０４３１）、リン酸シタグリプチン、サクサグリプチン（（ＢＭＳ−４７７１１８）、ＧＳＫ−８２３０９３、ＰＳＮ−９３０１、ＳＹＲ−３２２、ＳＹＲ−６１９、ＴＡ−６６６６、ＴＳ−０２１、ＧＲＣ−８２００、ＧＷ−８２５９６４Ｘ、ＫＲＰ−１０４、ＤＰ−８９３、ＡＢＴ−３４１、ＡＢＴ−２７９もしくはその別の塩、またはＷＯ２００３０７４５００、ＷＯ２００３１０６４５６、ＷＯ２００４０３７１６９、ＷＯ２００４５０６５８、ＷＯ２００５０５８９０１、ＷＯ２００５０１２３１２、ＷＯ２００５／０１２３０８、ＷＯ２００６０３９３２５、ＷＯ２００６０５８０６４、ＷＯ２００６０１５６９１、ＷＯ２００６０１５７０１、ＷＯ２００６０１５６９９、ＷＯ２００６０１５７００、ＷＯ２００６０１８１１７、ＷＯ２００６０９９９４３、ＷＯ２００６０９９９４１、ＪＰ２００６１６０７３３、ＷＯ２００６０７１７５２、ＷＯ２００６０６５８２６、ＷＯ２００６０７８６７６、ＷＯ２００６０７３１６７、ＷＯ２００６０６８１６３、ＷＯ２００６０９０９１５、ＷＯ２００６１０４３５６、ＷＯ２００６１２７５３０、ＷＯ２００６１１１２６１、ＷＯ２００７０１５７６７、ＷＯ２００７０２４９９３、ＷＯ２００７０２９０８６に記載されている化合物と併用して投与する。
【０２１７】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、シタグリプチンリン酸塩とメトホルミン塩酸塩の固定された組み合わせであるＪａｎｕｍｅｔ（商標）と併用して投与する。
【０２１８】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、１１−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１（１１β−ＨＳＤ１）阻害剤、例えば、ＢＶＴ−２７３３、ＪＮＪ−２５９１８６４６、ＩＮＣＢ−１３７３９または、例えば、ＷＯ２００１９００９０〜９４、ＷＯ２００３４３９９９、ＷＯ２００４１１２７８２、ＷＯ２００３４４０００、ＷＯ２００３４４００９、ＷＯ２００４１１２７７９、ＷＯ２００４１１３３１０、ＷＯ２００４１０３９８０、ＷＯ２００４１１２７８４、ＷＯ２００３０６５９８３、ＷＯ２００３１０４２０７、ＷＯ２００３１０４２０８、ＷＯ２００４１０６２９４、ＷＯ２００４０１１４１０、ＷＯ２００４０３３４２７、ＷＯ２００４０４１２６４、ＷＯ２００４０３７２５１、ＷＯ２００４０５６７４４、ＷＯ２００４０５８７３０、ＷＯ２００４０６５３５１、ＷＯ２００４０８９３６７、ＷＯ２００４０８９３８０、ＷＯ２００４０８９４７０〜７１、ＷＯ２００４０８９８９６、ＷＯ２００５０１６８７７、ＷＯ２００５０９７７５９、ＷＯ２００６０１０５４６、ＷＯ２００６０１２２２７、ＷＯ２００６０１２１７３、ＷＯ２００６０１７５４２、ＷＯ２００６０３４８０４、ＷＯ２００６０４０３２９、ＷＯ２００６０５１６６２、ＷＯ２００６０４８７５０、ＷＯ２００６０４９９５２、ＷＯ２００６０４８３３１、ＷＯ２００６０５０９０８、ＷＯ２００６０２４６２７、ＷＯ２００６０４０３２９、ＷＯ２００６０６６１０９、ＷＯ２００６０７４２４４、ＷＯ２００６０７８００６、ＷＯ２００６１０６４２３、ＷＯ２００６１３２４３６、ＷＯ２００６１３４４８１、ＷＯ２００６１３４４６７、ＷＯ２００６１３５７９５、ＷＯ２００６１３６５０２、ＷＯ２００６１３８６９５、ＷＯ２００６１３３９２６、ＷＯ２００７００３５２１、ＷＯ２００７００７６８８、ＵＳ２００７０６６５８４、ＷＯ２００７０４７６２５、ＷＯ２００７０５１８１１、ＷＯ２００７０５１８１０に記載されているものと併用して投与する。
【０２１９】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、ＷＯ２００１１９８３０〜３１、ＷＯ２００１１７５１６、ＷＯ２００４５０６４４６、ＷＯ２００５０１２２９５、ＷＯ２００５１１６００３、ＷＯ２００５１１６００３、ＷＯ２００６００７９５９、ＤＥ１０２００４０６０５４２．４、ＷＯ２００７００９９１１、ＷＯ２００７０２８１４５、ＷＯ２００７０８１７５５に記載されているように、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）阻害剤と併用して投与する。
【０２２０】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ナトリウム依存性グルコース輸送体１または２（ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２）調節因子、例えば、ＫＧＡ−２７２７、Ｔ−１０９５、ＳＧＬ−００１０、ＡＶＥ２２６８、ＳＡＲ７２２６及びセルグリフロジン、または、例えば、ＷＯ２００４００７５１７、ＷＯ２００４５２９０３、ＷＯ２００４５２９０２、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００５９５９、ＷＯ２００５０８５２３７、ＪＰ２００４３５９６３０、ＷＯ２００５１２１１６１、ＷＯ２００６０１８１５０、ＷＯ２００６０３５７９６、ＷＯ２００６０６２２２４、ＷＯ２００６０５８５９７、ＷＯ２００６０７３１９７、ＷＯ２００６０８０５７７、ＷＯ２００６０８７９９７、ＷＯ２００６１０８８４２、ＷＯ２００７０００４４５、ＷＯ２００７０１４８９５、ＷＯ２００７０８０１７０もしくはＡ．Ｌ．Ｈａｎｄｌｏｎ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ（２００５）１５（１１），１５３１−１５４０に記載されているものと併用して投与する。
【０２２１】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＧＰＲ４０の調節因子、例えば、ＷＯ２００７０１３６８９、ＷＯ２００７０３３００２に記載されているものと併用して投与する。
【０２２２】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＧＰＲ１１９ｂの調節因子、例えば、ＷＯ２００４０４１２７４に記載されているものと併用して投与する。
【０２２３】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＧＰＲ１１９の調節因子、例えば、ＷＯ２００５０６１４８９（ＰＳＮ−６３２４０８）、ＷＯ２００４０６５３８０、ＷＯ２００７００３９６０〜６２及びＷＯ２００７００３９６４に記載されているものと併用して投与する。
【０２２４】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＧＰＲ１２０の調節因子と併用して投与する。
【０２２５】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、ＷＯ２００５０７３１９９、ＷＯ２００６０７４９５７、ＷＯ２００６０８７３０９、ＷＯ２００６１１１３２１、ＷＯ２００７０４２１７８に記載されているように、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）阻害剤及び／またはホスホリパーゼと併用して投与する。
【０２２６】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）阻害剤、例えば、ＷＯ１９９９４６２６２、ＷＯ２００３７２１９７、ＷＯ２００３０７２１９７、ＷＯ２００５０４４８１４、ＷＯ２００５１０８３７０、ＪＰ２００６１３１５５９、ＷＯ２００７０１１８０９、ＷＯ２００７０１１８１１、ＷＯ２００７０１３６９１に記載されるものと併用して投与する。
【０２２７】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、キサンチンオキシドレダクターゼ（ＸＯＲ）の調節因子と併用して投与する。
【０２２８】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）阻害剤、例えば、ＷＯ２００４０７４２８８に記載されているものと併用して投与する。
【０２２９】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、ＵＳ２００５２２２２２０、ＷＯ２００５０８５２３０、ＷＯ２００５１１１０１８、ＷＯ２００３０７８４０３、ＷＯ２００４０２２５４４、ＷＯ２００３１０６４１０、ＷＯ２００５０５８９０８、ＵＳ２００５０３８０２３、ＷＯ２００５００９９９７、ＵＳ２００５０２６９８４、ＷＯ２００５０００８３６、ＷＯ２００４１０６３４３、ＥＰ１４６００７５、ＷＯ２００４０１４９１０、ＷＯ２００３０７６４４２、ＷＯ２００５０８７７２７またはＷＯ２００４０４６１１７に記載されているように、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）阻害剤と併用して投与する。
【０２３０】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、ＷＯ２００６０７２３５４に記載されているように、血清／グルココルチコイド調節キナーゼ（ＳＧＫ）阻害剤と併用して投与する。
【０２３１】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えばＷＯ２００７０３５３５５に記載されているように、ＲＵＰ３受容体のアゴニストと併用して投与する。
【０２３２】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤、例えば、ルボキシスタウリンと併用して投与する。
【０２３３】
別の実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、血管拡張性失調症変異（ＡＴＭ）タンパク質キナーゼをコードする遺伝子の活性化因子、例えば、クロロキンと併用して投与する。
【０２３４】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、エンドセリンＡ受容体アンタゴニスト、例えば、アボセンタン（ＳＰＰ−３０１）と併用して投与する。
【０２３５】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、ＷＯ２００１０００６１０、ＷＯ２００１０３０７７４、ＷＯ２００４０２２５５３またはＷＯ２００５０９７１２９に記載されているように、「Ｉ−κＢキナーゼ」阻害剤（ＩＫＫ阻害剤）と併用して投与する。
【０２３６】
一実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、例えば、ＷＯ２００５０９０３３６、ＷＯ２００６０７１６０９、ＷＯ２００６１３５８２６に記載されているように、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）の調節因子と併用して投与する。
【０２３７】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＣＡＲＴ調節因子と併用して投与する（“Ｃｏｃａｉｎｅ−ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ａｎｘｉｅｔｙ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｍｐｔｙｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”  Ａｓａｋａｗａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１），３３（９），５５４−５５８を参照のこと）；
【０２３８】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＮＰＹアンタゴニスト、例えば、ナフタレン−１−スルホン酸｛４−［（４−アミノキナゾリン−２−イルアミノ）メチル］シクロヘキシルメチル｝アミド塩酸塩（ＣＧＰ７１６８３Ａ）；Ｌ−１５２８０４などのＮＰＹ−５受容体アンタゴニスト、または、例えば、ＷＯ２００６００１３１８に記載されているもの；例えば、ＷＯ２００７０３８９４２に記載されているようなＮＰＹ−４受容体アンタゴニスト；例えば、ＷＯ２００７０３８９４３に記載されているようなＮＰＹ−２受容体アンタゴニスト；ペプチドＹＹ３−３６（ＰＹＹ３−３６）または類似の化合物、例えば、ＣＪＣ−１６８２（Ｃｙｓ３４を介してヒト血清アルブミンと結合したＰＹＹ３−３６）、ＣＪＣ−１６４３（ｉｎ  ｖｉｖｏで血清アルブミンに複合体化するＰＹＹ３−３６誘導体）またはＷＯ２００５０８０４２４、ＷＯ２００６０９５１６６に記載されているもの；ＷＯ２００６０９６８４７に記載されているペプチドオベスタチン誘導体；ＣＢ１Ｒ（カンナビノイド受容体１）アンタゴニスト（例えば、リモナバン、ＳＲ１４７７７８、ＳＬＶ−３１９、ＡＶＥ−１６２５、ＭＫ−０３６４またはその塩）または、例えば、ＥＰ０６５６３５４、ＷＯ００／１５６０９、ＷＯ２００１／６４６３２〜６４６３４、ＷＯ０２／０７６９４９、ＷＯ２００５０８０３４５、ＷＯ２００５０８０３２８、ＷＯ２００５０８０３４３、ＷＯ２００５０７５４５０、ＷＯ２００５０８０３５７、ＷＯ２００１７０７００、ＷＯ２００３０２６６４７〜４８、ＷＯ２００３０２７７６、ＷＯ２００３０４０１０７、ＷＯ２００３００７８８７、ＷＯ２００３０２７０６９、米国特許第６，５０９，３６７号、ＷＯ２００１３２６６３、ＷＯ２００３０８６２８８、ＷＯ２００３０８７０３７、ＷＯ２００４０４８３１７、ＷＯ２００４０５８１４５、ＷＯ２００３０８４９３０、ＷＯ２００３０８４９４３、ＷＯ２００４０５８７４４、ＷＯ２００４０１３１２０、ＷＯ２００４０２９２０４、ＷＯ２００４０３５５６６、ＷＯ２００４０５８２４９、ＷＯ２００４０５８２５５、ＷＯ２００４０５８７２７、ＷＯ２００４０６９８３８、ＵＳ２００４０２１４８３７、ＵＳ２００４０２１４８５５、ＵＳ２００４０２１４８５６、ＷＯ２００４０９６２０９、ＷＯ２００４０９６７６３、ＷＯ２００４０９６７９４、ＷＯ２００５０００８０９、ＷＯ２００４０９９１５７、ＵＳ２００４０２６６８４５、ＷＯ２００４１１０４５３、ＷＯ２００４１０８７２８、ＷＯ２００４０００８１７、ＷＯ２００５０００８２０、ＵＳ２００５０００９８７０、ＷＯ２００５００９７４、ＷＯ２００４１１１０３３−３４、ＷＯ２００４１１０３８〜３９、ＷＯ２００５０１６２８６、ＷＯ２００５００７１１１、ＷＯ２００５００７６２８、ＵＳ２００５００５４６７９、ＷＯ２００５０２７８３７、ＷＯ２００５０２８４５６、ＷＯ２００５０６３７６１〜６２、ＷＯ２００５０６１５０９、ＷＯ２００５０７７８９７、ＷＯ２００６０４７５１６、ＷＯ２００６０６０４６１、ＷＯ２００６０６７４２８、ＷＯ２００６０６７４４３、ＷＯ２００６０８７４８０、ＷＯ２００６０８７４７６、ＷＯ���００６１００２０８、ＷＯ２００６１０６０５４、ＷＯ２００６１１１８４９、ＷＯ２００６１１３７０４、ＷＯ２００７００９７０５、ＷＯ２００７０１７１２４、ＷＯ２００７０１７１２６、ＷＯ２００７０１８４５９、ＷＯ２００７０１６４６０、ＷＯ２００７０２０５０２、ＷＯ２００７０２６２１５、ＷＯ２００７０２８８４９、ＷＯ２００７０３１７２０、ＷＯ２００７０３１７２１、ＷＯ２００７０３６９４５、ＷＯ２００７０３８０４５、ＷＯ２００７０３９７４０、ＵＳ２００７００１５８１０、ＷＯ２００７０４６５４８、ＷＯ２００７０４７７３７、ＷＯ２００７０８４３１９、ＷＯ２００７０８４４５０に記載されている化合物）；例えば、ＷＯ２００７００１９３９、ＷＯ２００７０４４２１５、ＷＯ２００７０４７７３７に記載されているような、カンナビノイド受容体１／カンナビノイド受容体２（ＣＢ１／ＣＢ２）調節化合物；ＭＣ４アゴニスト（例えば、１−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸［２−（３ａ−ベンジル−２−メチル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−１−（４−クロロフェニル）−２−オキソエチル］アミド；（ＷＯ０１／９１７５２））またはＬＢ５３２８０、ＬＢ５３２７９、ＬＢ５３２７８またはＴＨＩＱ、ＭＢ２４３、ＲＹ７６４、ＣＨＩＲ−７８５、ＰＴ−１４１またはＷＯ２００５０６０９８５、ＷＯ２００５００９９５０、ＷＯ２００４０８７１５９、ＷＯ２００４０７８７１７、ＷＯ２００４０７８７１６、ＷＯ２００４０２４７２０、ＵＳ２００５０１２４６５２、ＷＯ２００５０５１３９１、ＷＯ２００４１１２７９３、ＷＯＵＳ２００５０２２２０１４、ＵＳ２００５０１７６７２８、ＵＳ２００５０１６４９１４、ＵＳ２００５０１２４６３６、ＵＳ２００５０１３０９８８、ＵＳ２００４０１６７２０１、ＷＯ２００４００５３２４、ＷＯ２００４０３７７９７、ＷＯ２００５０４２５１６、ＷＯ２００５０４０１０９、ＷＯ２００５０３０７９７、ＵＳ２００４０２２４９０１、ＷＯ２００５０１９２１、ＷＯ２００５０９１８４、ＷＯ２００５０００３３９、ＥＰ１４６００６９、ＷＯ２００５０４７２５３、ＷＯ２００５０４７２５１、ＷＯ２００５１１８５７３、ＥＰ１５３８１５９、ＷＯ２００４０７２０７６、ＷＯ２００４０７２０７７、ＷＯ２００６０２１６５５〜５７、ＷＯ２００７００９８９４、ＷＯ２００７０１５１６２、ＷＯ２００７０４１０６１、ＷＯ２００７０４１０５２に記載されているもの；オレキシン受容体アンタゴニスト（例えば、１−（２−メチルベンゾオキサゾール−６−イル）−３−［１，５］ナフチリジン−４−イル尿素塩酸塩（ＳＢ−３３４８６７−Ａ）または、例えば、ＷＯ２００１９６３０２、ＷＯ２００１８５６９３、ＷＯ２００４０８５４０３、ＷＯ２００５０７５４５８もしくはＷＯ２００６０６７２２４に記載されているもの）；ヒスタミンＨ３受容体アゴニスト（例えば、３−シクロヘキシル−１−（４，４−ジメチル−１，４，６，７−テトラヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−イル−）プロパン−１−オンシュウ酸塩（ＷＯ００／６３２０８）またはＷＯ２０００���４８８４、ＷＯ２００５０８２８９３、ＷＯ２００６１０７６６１、ＷＯ２００７００３８０４、ＷＯ２００７０１６４９６、ＷＯ２００７０２０２１３に記載されているもの）；ヒスタミンＨ１／ヒスタミンＨ３調節因子、例えばベタヒスチン及びその二塩酸塩；ＣＲＦアンタゴニスト（例えば、［２−メチル−９−（２，４，６−トリメチルフェニル）−９Ｈ−１，３，９−トリアザフルオレン−４−イル］ジプロピラミン（ＷＯ００／６６５８５））；ＣＲＦ  ＢＰアンタゴニスト（例えば、ウロコルチン）；ウロコルチンアゴニスト；β−３アドレナリン受容体のアゴニスト、例えば、１−（４−クロロ−３−メタンスルホニルメチルフェニル）−２−［２−（２，３−ジメチル−１Ｈ−インドール−６−イルオキシ）エチルアミノ］エタノール塩酸塩（ＷＯ０１／８３４５１）；またはＳｏｌａｂｅｇｒｏｎ（ＧＷ−４２７３５３）もしくはＮ−５９８４（ＫＲＰ−２０４）もしくはＪＰ２００６１１１５５３、ＷＯ２００２０３８５４３、ＷＯ２００７０４８８４０〜８４３に記載されているもの；ＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）アゴニスト；ＭＣＨ（メラニン凝集ホルモン）受容体アンタゴニスト（例えば、ＮＢＩ−８４５、Ａ−７６１、Ａ−６６５７９８、Ａ−７９８、ＡＴＣ−０１７５、Ｔ−２２６２９６、Ｔ−７１、ＧＷ−８０３４３０またはＷＯ２００５０８５２００、ＷＯ２００５０１９２４０、ＷＯ２００４０１１４３８、ＷＯ２００４０１２６４８、ＷＯ２００３０１５７６９、ＷＯ２００４０７２０２５、ＷＯ２００５０７０８９８、ＷＯ２００５０７０９２５、ＷＯ２００４０３９７８０、ＷＯ２００４０９２１８１、ＷＯ２００３０３３４７６、ＷＯ２００２００６２４５、ＷＯ２００２０８９７２９、ＷＯ２００２００２７４４、ＷＯ２００３００４０２７、ＦＲ２８６８７８０、ＷＯ２００６０１０４４６、ＷＯ２００６０３８６８０、ＷＯ２００６０４４２９３、ＷＯ２００６０４４１７４、ＪＰ２００６１７６４４３、ＷＯ２００６０１８２８０、ＷＯ２００６０１８２７９、ＷＯ２００６１１８３２０、ＷＯ２００６１３００７５、ＷＯ２００７０１８２４８、ＷＯ２００７０１２６６１、ＷＯ２００７０２９８４７、ＷＯ２００７０２４００４、ＷＯ２００７０３９４６２、ＷＯ２００７０４２６６０、ＷＯ２００７０４２６６８、ＷＯ２００７０４２６６９、ＵＳ２００７０９３５０８、ＵＳ２００７０９３５０９、ＷＯ２００７０４８８０２、ＪＰ２００７０９１６４９に記載されているような化合物）；ＣＣＫ−Ａアゴニスト（例えば、｛２−［４−（４−クロロ−２，５−ジメトキシフェニル）−５−（２−シクロヘキシルエチル）チアゾール−２−イルカルバモイル］−５，７−ジメチルインドール−１−イル｝酢酸トリフルオロ酢酸塩（ＷＯ９９／１５５２５）、ＳＲ−１４６１３１（ＷＯ０２４４１５０）もしくはＳＳＲ−１２５１８０またはＷＯ２００５１１６０３４に記載されているもの）；セルトニン作動性化合物とノルアドレナリン作動性化合物の混合物（例えば、ＷＯ００／７１５４９）；５−ＨＴ受容体アゴニスト、例えば、１−（３−エチルベンゾフラン−７−イル）ピペラジンシュウ酸塩（ＷＯ０１／０９１１１）；混合ドーパミン／ノルエピネフリン／アセチルコリン再取り込み阻害剤（例えば、テソフェンシン）；５−ＨＴ２Ｃ受容体アゴニスト（例えば、塩酸ロルカセリン（ＡＰＤ−３５６）、ＢＶＴ−９３３またはＷＯ２０００７７０１０、ＷＯ２００７７００１〜０２、ＷＯ２００５０１９１８０、ＷＯ２００３０６４４２３、ＷＯ２００２４２３０４、ＷＯ２００５０３５５３３、ＷＯ２００５０８２８５９、ＷＯ２００６０７７０２５、ＷＯ２００６１０３５１１に記載されているもの）；５−ＨＴ６受容体アンタゴニスト、例えば、Ｅ−６８３７もしくはＢＶＴ−７４３１６または、例えば、ＷＯ２００５０５８８５８、ＷＯ２００７０５４２５７に記載されているもの；ボンベシン受容体アゴニスト（ＢＲＳ−３アゴニスト）；ガラニン受容体アンタゴニスト；成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモンまたはＡＯＤ−９６０４）；成長ホルモン放出化合物（第三級ブチル６−ベンジルオキシ−１−（２−ジイソプロピル−アミノエチルカルバモイル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２−カルボキシレート（ＷＯ０１／８５６９５））；成長ホルモン分泌促進物質受容体アンタゴニスト（グレリンアンタゴニスト）、例えば、Ａ−７７８１９３またはＷＯ２００５０３０７３４に記載されているもの；ＴＲＨアゴニスト（例えば、ＥＰ０４６２８８４を参照のこと）；脱共役タンパク質２または３調節因子；レプチンアゴニスト（例えば、Ｌｅｅ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｗ．；Ｌｅｉｎｕｎｇ，Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｃ．；Ｒｏｚｈａｙｓｋａｙａ−Ａｒｅｎａ，Ｍａｒｉｎａ；Ｇｒａｓｓｏ，Ｐａｔｒｉｃｉａ．  Ｌｅｐｔｉｎ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ．  Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２００１），２６（９），８７３−８８１を参照のこと）；ＤＡアゴニスト（ブロモクリプチンまたはドプレキシン）；リパーゼ／アミラーゼ阻害剤（例えば、ＷＯ００／４０５６９）；ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、例えば、ＢＡＹ−７４−４１１３、または例えば、ＵＳ２００４／０２２４９９７、ＷＯ２００４０９４６１８、ＷＯ２０００５８４９１、ＷＯ２００５０４４２５０、ＷＯ２００５０７２７４０、ＪＰ２００５２０６４９２、ＷＯ２００５０１３９０７、ＷＯ２００６００４２００、ＷＯ２００６０１９０２０、ＷＯ２
００６０６４１８９、ＷＯ２００６０８２９５２、ＷＯ２００６１２０１２５、ＷＯ２００６１１３９１９、ＷＯ２００６１３４３１７、ＷＯ２００７０１６５３８に記載されているもの；脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）阻害剤、例えば、Ｃ７５またはＷＯ２００４００５２７７に記載されているもの；例えば、ＷＯ２００７００９２３６、ＷＯ２００７０４４０８５、ＷＯ２００７０４６８６７、ＷＯ２００７０４６８６８、ＷＯ２００７０５０１１２４に記載されているステアロイル−ＣｏＡδ９脱飽和酵素（ＳＣＤ１）阻害剤；オキシントモジュリン；オレオイルエストロンもしくは甲状腺ホルモン受容体アゴニストまたは部分アゴニスト、例えば：ＫＢ−２１１５またはＷＯ２００５８２７９、ＷＯ２００１７２６９２、ＷＯ２００１９４２９３、ＷＯ２００３０８４９１５、ＷＯ２００４０１８４２１、ＷＯ２００５０９２３１６、ＷＯ２００７００３４１９、ＷＯ２００７００９９１３、ＷＯ２００７０３９１２５に記載されているものと併用して投与する。
【０２３９】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、α４−β２ニコチン性アセチルコリン受容体の部分アゴニストである酒石酸バレニクリンと併用して投与する。
【０２４０】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、トロダスクエミンと併用して投与する。
【０２４１】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、ＳＩＲＴ１酵素の調節因子と併用して投与する。
【０２４２】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、デキサンフェタミンまたはアンフェタミンと併用して投与する。
【０２４３】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、フェンフルラミンまたはデクスフェンフルラミンと併用して投与する。
【０２４４】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、シブトラミンと併用して投与する。
【０２４５】
さらなる実施形態では、グリシン含有トリペプチド分子を、マジンドールまたはフェンテルミンと併用して投与する。
【０２４６】
あるいは、数分〜数週間の範囲の間隔で、グリシン含有トリペプチド分子のポリペプチド治療の前または後に、二次薬剤治療を行う。第２の治療薬及びグリシン含有トリペプチド分子を別々に投与する実施形態では、通常、各送達の時間の間に有意な期限切れが生じないようにすると考えられ、その結果、第２の薬剤とグリシン含有トリペプチド分子は、それでも組み合わせの効果を有利に発揮することができるであろう。そのような場合、互いに約１２〜２４時間以内に、そして一態様では、互いに約６〜１２時間以内に両方のモダリティを投与し、わずか約１２時間の遅延時間が最も好ましいと考えられる。いくつかの状況では、治療のための期間を有意に延長させ、しかしながら、それぞれの投与の間に数日間（２、３、４、５、６または７日間）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）を経過させることが望ましい。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、代謝疾患、例えば脂肪肝疾患の治療方法は、グリシン含有トリペプチド分子と第２の治療薬、例えば、ＡＣＣ阻害剤、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ阻害剤、ＡＣＬ阻害剤、処方魚油、またはＣＥＴＰ阻害剤を投与することを含み得る。
【０２４８】
グリシン含有トリペプチド分子発現構築物またはペプチドの患者への全身性送達は、治療上有効な組成物を送達して疾患の即時の臨床症状を打ち消すための非常に効率的な方法である。あるいは、グリシン含有トリペプチド分子及び／または第２の治療薬の局所送達は特定の状況において適切である。
【０２４９】
本発明はさらに、本発明の組成物を哺乳類に投与する方法を提供する。一態様では、哺乳類はヒトである。治療的に使用する組成物の有効量は、例えば、治療の状況及び目的に依存するであろう。したがって、当業者であれば、治療のための適切な用量レベルが、送達する分子、組成物を使用している適応症、投与経路、及びサイズ（体重、体表面または臓器のサイズ）ならびに患者の状態（年齢及び全般的な健康状態）に部分的に依存して様々に異なることを理解するであろう。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、用量を滴定し、投与経路を変更してもよい。
【０２５０】
一態様では、グリシン含有トリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩を含む組成物を哺乳類に送達するためのレジメンは、日用量で、またはより長いまたはより短い間隔、例えば、隔日、週２回、週１回、月１回、半年に１回、または１日２回または３回での同等の用量で与えられる、５ｍｇ／Ｋｇ〜２０００ｍｇ／Ｋｇ、または３０ｍｇ／Ｋｇ〜１５００ｍｇ／Ｋｇ、または４０ｍｇ／Ｋｇ〜１２５０ｍｇ／Ｋｇ、または５０ｍｇ／Ｋｇ〜１０００ｍｇ／Ｋｇ、または６０ｍｇ／Ｋｇ〜５０００ｍｇ／Ｋｇの投与を含むであろう。投与は、経口、静脈内、皮下、鼻腔内、吸入、経皮、経粘膜、または本明細書で論じる他の任意の経路によるものであってもよい。
【０２５１】
さらなる態様では、グリシン含有トリペプチド分子を、本明細書中で指定する用量で皮下注射によって投与する。しかしながら、グリシン含有トリペプチド分子は、本明細書で論じられ、当技術分野で公知の方法のいずれかによって投与してもよい。さらなる態様では、単一部位での注射は、２．０ｍｌの最大許容量を有する。より高濃度のグリシン含有トリペプチド分子が必要な場合、グリシン含有トリペプチド分子を複数の部位に注射するか、またはより多くの用量で注射してもよいと考えられる。別の態様では、グリシン含有トリペプチド分子を、毎日ほぼ同じ時間に投与する。しかしながら、送達のための代替の時間は、本発明に含まれる。
【０２５２】
医薬組成物はまた、非経口送達のために選択することができる。あるいは、組成物は、吸入のために、または経口などの消化管を介した送達のために選択してもよい。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の技術の範囲内である。
【０２５３】
一実施形態では、医薬組成物を、吸入用に製剤化してもよい。例えば、グリシン含有トリペプチド分子組成物を、吸入用の乾燥粉末として製剤化してもよい。医薬組成物吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴射剤と共に製剤化してもよい。さらに別の実施形態では、溶液を噴霧してもよい。肺投与については、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載されており、これは、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達について記載している。
【０２５４】
特定の製剤を経口投与してもよいこともまた、企図される。本発明の一実施形態では、この方法で投与するグリシン含有トリペプチド分子組成物は、錠剤及びカプセルなどの固体剤形の配合に通常使用する担体の有無にかかわらず、製剤化することができる。例えば、カプセルを、胃腸管内でアベイラビリティが最大化され、事前の全身性分解が最小化される時点において製剤の活性部分を放出するように設計してもよい。組成物の吸収を促進するために、追加の薬剤を含ませることができる。希釈剤、香料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤も使用してもよい。
【０２５５】
別のグリシン含有トリペプチド分子組成物は、錠剤の製造に適した非毒性の賦形剤との混合物中に有効量のグリシン含有トリペプチド分子を含み得る。錠剤を無菌水または他の適切なビヒクルに溶解することにより、溶液を単位剤形で調製することができる。適切な賦形剤として、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム；または結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、もしくはアカシア；または潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５６】
持続または制御送達製剤中の組成物を含む製剤を含む、追加的なグリシン含有トリペプチド分子組成物は、当業者には明らかであろう。リポソームまたはミセル担体、生体侵食性微粒子または多孔質ビーズ及びデポー注射などの他の様々な持続または制御送達手段を製剤化するための技術もまた、当業者に公知である。
【０２５７】
投与の頻度は、使用する製剤中のグリシン含有トリペプチド分子組成物の薬物動態パラメータに依存するであろう。通常、臨床医は、所望の効果を達成する用量に達するまで、組成物を投与する。したがって、組成物は、単回投与として、または期間にわたって２回以上の投与（同量の所望の分子を含む場合も含まない場合もある）として、または移植デバイスまたはカテーテルを介した連続注入として投与してもよい。適切な用量のさらなる改良は、当業者によって日常的に行われ、当業者によって日常的に実行されるタスクの範囲内にある。適切な用量反応データを使用することにより、適切な用量を確認してもよい。
【０２５８】
本明細書に開示する投与経路に加えて、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病変内経路、関節内、腫瘍内、脳脊髄、直腸内及び結腸、局所、結膜下、膀胱内、膣内、硬膜外、肋内、皮膚内、吸入、経皮、経漿液、頬内、経口、鼻腔内、口腔または他の体腔内溶解、気道への点滴注入、気道からのガス注入、血管、腫瘍、器官などへの注射、及び哺乳類の体内の空洞への注射または沈着などであるがこれらに限定されない任意の様式で、哺乳類に本発明の組成物を治療のために導入することができる。
【０２５９】
あるいは、またはさらに、所望の分子を吸収させるか、またはカプセル化した膜、スポンジ、または別の適切な物質の移植を介して、組成物を局所的に投与してもよい。移植デバイスを使用する場合、デバイスを任意の適切な組織または器官に移植してもよく、そして所望の分子の送達を、拡散、徐放ボーラス、または連続投与を介して行ってもよい。
【０２６０】
いくつかの場合では、ｅｘ  ｖｉｖｏ方式で組成物を使用することが望ましい場合がある。そのような場合、患者から取り出した細胞、組織、または器官を、組成物に曝露し、その後、細胞、組織及び／または器官を患者に移植して戻す。
【０２６１】
本発明の組成物の投与は、例えば、連続注入、ボーラス注射、間欠注入、吸入、またはこれらの方法の組み合わせを含むいくつかの標準的な方法のいずれかを使用して実施することができる。例えば、使用することができる投与の一様式には、継続的な静脈内注入が含まれる。そのようなアプローチでは、本発明の組成物の注入用量は、例えば、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重／時間、より好ましくは０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ／時間、最も好ましくは０．０３〜０．１ｍｇ／ｋｇ／時間、例えば、１〜１００、１０〜１００、または約１２、２４、４８、７２、８４もしくは９６時間の間に薬剤を注入する。本発明の組成物の注入は、必要に応じて、ボーラス注射を先行させることができる。そのようなボーラス注射は、約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与する。本発明の組成物の用量及び注入期間には変動が生じ得るが、これも本発明に含まれる。
【０２６２】
単回ボーラス注射は、例えば、中枢アクセスラインまたは末梢静脈ラインを介した静脈内注入によって、またはシリンジを使用した直接注射によって投与してもよい。そのような投与は、患者のエンドトキシン曝露リスクが短期的なものに過ぎず、したがって薬物の長期持続を必要としない場合に望ましい場合がある。例えば、この投与様式は、適切な場合、外科患者、例えば、心臓手術、例えば、冠動脈バイパス移植手術及び／または弁置換手術を受けている患者において望ましい場合がある。これらの患者では、薬物の単回ボーラス注射は、手術前の４時間及び／または手術中にわたって投与することができる。（投与する薬物の量は、患者の体重及び状態に基づいており、熟練した医師によって決定されることに注意されたい。）当業者によって適切であると判断される、より短いまたはより長い投与期間を用いることができる。
【０２６３】
本発明のグリシントリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩を、より長期間送達することが望ましい場合、間欠投与を実施することができる。これらの方法では、負荷用量を投与し、その後、（ｉ）第２の負荷用量及び維持用量（もしくは複数回の用量）、または（ｉｉ）第２の負荷用量を伴わない、当業者によって適切であると判断される維持用量もしくは複数回の用量のいずれかを投与する。
【０２６４】
患者へのグリシントリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩のさらなる送達を達成するために、化合物の維持用量（または複数の用量）を投与して、それにより患者の血中で化合物のレベルを維持することができる。維持用量は、負荷用量（複数可）よりも少ないレベルで、例えば、負荷用量の約１／６のレベルで投与することができる。維持用量で投与する特定の量は、化合物レベルが少なくとも維持されることを目的として、医療専門家によって決定され得る。維持用量は、例えば、１２時間ごとに約２時間、２４時間目から始めて、例えば、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、及び１２０時間目において継続して投与することができる。当然のことながら、維持用量は、この時間枠内の、医療専門家によって適切であると判断される任意の時点で停止することができる。
【０２６５】
上記の注入方法は、当技術分野で広く利用可能なカテーテル（例えば、末梢静脈、中枢静脈、または肺動脈カテーテル）及び関連製品（例えば、注入ポンプ及び注入チューブ）を使用して実施することができる。これらの方法で使用するカテーテル及び／またはチューブを選択する際に考慮すべき重要な１つの基準は、これらの製品の材料（またはこれらの製品のコーティング）が薬物のサイズに与える影響である。
【０２６６】
本発明の方法で使用することができる追加的なカテーテル関連製品は、薬物投与で使用するものと合致する条件下で、製品の材料が化合物のサイズを変えるかどうかを判定することによって特定することができる。さらに、最適な薬物サイズを維持しないカテーテルを患者が所定の位置にすでに有している場合、不適合なカテーテルの表面に薬液が接触しないように、適合性のある材料（例えば、ポリアミドポリマー）製であるか、適合性のあるコーティングを有するカテーテルインサートを使用することができる。化合物の溶液の流れに適応するのに十分な大きさの内径を維持しながら、既存のカテーテルに容易に挿入できるように十分に小さい外径を有するそのようなインサートを、既存のカテーテル内に配置し、チューブまたはシリンジに接続し、それを通して薬物を送達する。
【０２６７】
適切な投与頻度は、当業者によって決定することができ、１日あたり１回〜数回投与することができる。本発明の組成物はまた、１日１回または１日おきに１回投与してもよい。急性投与の場合、通常、数時間または数日の期間で治療を実施し、一方、慢性治療は、数週間、数か月間、または数年間も実施することができる。
【０２６８】
慢性投与及び急性投与のいずれにおいても、本明細書の他の場所に記載する製剤から作製することができる標準的な肝門脈投与製剤を使用することができる。この経路による投与は、いくつかの利点、例えば、グリシントリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩をより高い局所濃度で所望の作用部位に投与することにより、作用の迅速な開始を提供する。治療部分がその所望の効果を発揮するためには、治療部分が、肝細胞に存在する受容体などのその生理学的標的と物理的に接触している必要がある。部位特異的な薬物送達は、そのような相互作用が肝臓の所望の解剖学的位置でのみ起こることを保証し；したがって、以下の基準を満たす必要がある：（ｉ）胃及び腸などの解剖学的障壁を越えることができる必要があり、（ｉｉ）アシアロ糖タンパク質などの肝細胞に存在する受容体によって選択的に認識されるべきであり、（ｉｉｉ）標的化のために外来的に送達したリガンドが、内在的に産生されたリガンドと競合すべきであり、（ｉｖ）作成された送達系は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかにおいて、肝細胞内で非毒性、生体適合性、生分解性、及び物理化学的に安定している必要があり、（ｖ）均一な洞様毛細血管分布を有しているべきであり、（ｖｉ）治療量のグリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩のみが肝細胞に放出されるように、制御可能かつ予測可能な薬物放出速度を有しているべきであり、（ｖｉｉ）薬物放出が薬物分布に影響を与えるべきでなく、（ｖｉｉｉ）胃、腸、及び体の他の部分を通過する際に最小限の薬物漏出を示すべきであり、（ｉｘ）グリシントリペプチド分子をカプセル化するために使用する担体が、毒性の徴候を与えることなく体から排除されなければならず、担体が病状の調節を誘発するべきでなく、（ｘ）最後に、グリシントリペプチド分子またはその薬学的に許容される塩の送達系の調製は、容易であり、適度にシンプルで、再現性があり、費用対効果が高くあるべきである。
【０２６９】
グリシントリペプチド分子、またはその薬学的に許容される塩は、肝臓組織送達を目的とした薬物送達系の一部として投与することができる。グリシン含有トリペプチド分子を肝臓特異的標的化部分に結合するための異なる方法には：（ａ）予め形成されたナノキャリア上の標的化部分の結合、（ｂ）ポストインサーション法による標的化部分の結合、（ｃ）アビジン／ビオチン複合体による標的化部分の結合、（ｄ）ナノキャリア配合前の標的化部分の結合が含まれ得る。特定の肝細胞への本発明の組成物の送達において有用な、例示的な標的化部分及び担体は、Ｎｉｄｈｉ  Ｍｉｓｈｒａ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）  “Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ”，ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１３に記載されており、その開示はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０２７０】
本明細書に記載の特定のグリシントリペプチド分子及びその薬学的に許容される塩、組成物、及び方法を、特定の実施形態に従って具体的に記載してきたが、以下の実施例は、本明細書に記載の化合物を説明する役割のみを果たし、これを限定することを意図するものではない。本出願に記載の参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０２７１】
方法
【０２７２】
動物実験手順
【０２７３】
動物実験の全手順は、ミシガン大学の動物実験委員会によって承認され（ＰＲＯ００００８２３９）、同会のガイドラインに従って実施した。８週齢の雄のアポリポタンパク質Ｅ欠損（ａｐｏＥ−／−）マウス（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、在庫番号：００２０５２）をジャクソン研究所から入手した。マウスには西洋食（ＷＤ、脂肪由来カロリー４２％、重量で０．２％コレステロール、Ｅｎｖｉｇｏ  ＴＤ．８８１３７）を与えた。ＷＤ給餌の１週間後、顔面静脈から血液を注意深く採取して、総コレステロール（ＴＣ）のベースライン血漿レベルを測定した。次いで、マウスをＷＤ給餌で維持し、無作為に５つの実験群に分け、以下の治療薬を、強制経口投与によって週６回、１２週間投与した：１）ＷＤ＋Ｈ２Ｏ（ビヒクル対照として水を与えた）；２）ＷＤ＋Ｇｌｙ（０．６７ｍｇ／ｇグリシン）；３）ＷＤ＋Ｌｅｕ（０．３３ｍｇ／ｇロイシン）；４）ＷＤ＋ＤＴ−１０９（１ｍｇ／ｇ  ＤＴ−１０９＝Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）；５）ＷＤ＋ＤＴ−１１０（１ｍｇ／ｇ  ＤＴ−１１０＝Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｄＬｅｕ）。すべてのマウスを１２時間の明／暗サイクルで維持し、食物と水を自由に摂取させた。体重と食物摂取量を、それぞれ、１週間ごとに、及び３週間ごとに測定した。
【０２７４】
ＯＧＴＴ及び非空腹時血糖
【０２７５】
１０週目に、一晩絶食させた後に、２ｍｇ／ｇのグルコースを強制経口投与で投与することにより、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施した。治療の急性効果を評価するために、グリシン（０．６７ｍｇ／ｇ）、ロイシン（０．３３ｍｇ／ｇ）、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０（１ｍｇ／ｇ）をグルコース溶液に添加し、強制経口投与により投与した。治療の慢性的効果を評価するために、マウスにグルコースのみを投与した。ベースラインの血糖値を、血糖値計とテストストリップ（ＮＤＣ：０１９３−７３０８−５０，Ｃｏｎｔｏｕｒ  Ｎｅｘｔ）を使用して、尾の先端から採血した後に測定した。次いで、マウスに、治療薬を含む（急性）か、または含まない（慢性）グルコースを投与し、血糖値を３０分ごとに最大１２０分間測定した。非空腹時血糖値に対する治療の効果を評価するために、治療薬の強制経口投与による定期投与の前（強制経口投与前）に、及び３０分後（強制経口投与後）に、尾の先端から血液を採取した。血糖値を、血糖値計とテストストリップ（ＮＤＣ：０１９３−７３０８−５０，Ｃｏｎｔｏｕｒ  Ｎｅｘｔ）を使用して測定した。
【０２７６】
血漿脂質、アディポカイン及びサイトカイン
【０２７７】
ＴＣ、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）、及び高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）の血漿レベルを、ミシガン糖尿病研究センターの化学研究所（ＭＤＲＣ）のＣｏｂａｓ  Ｍｉｒａ化学分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により、製造元が提供するアッセイ試薬とプロトコールを使用して測定した。グリシントリペプチド分子、レジスチン、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１）の血漿レベルを、ＭＤＲＣの化学研究所で、Ｌｕｍｉｎｅｘ２００化学分析装置（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、製造元が提供するアッセイ試薬とプロトコール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ，ＭＭＨＭＡＧ−４４Ｋ）を使用して測定した。
【０２７８】
組織学的分析
【０２７９】
組織学的処理を、ミシガン大学獣医学実験施設（ＵＬＡＭ）内のＩｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｒｅ（ＩＶＡＣ）組織学研究所で実施した。ホルマリン固定組織を段階的アルコールで処理し、キシレンで除去した後、自動ＶＩＰ５またはＶＩＰ６組織プロセッサー（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ，Ｓａｋｕｒａ−Ａｍｅｒｉｃａｓ）を使用して溶融パラフィンを浸透させた。Ｈｉｓｔｏｓｔａｒ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してパラフィン包埋した後、組織をＭ３５５Ｓ回転式ミクロトーム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４μｍの厚さに切片化し、スライドガラスにマウントした。脱パラフィンならびにキシレン及び段階的アルコールによる水和に続いて、ハリスヘマトキシリン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８４２）を使用して、スライドをヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）について染色し、Ｃｌａｒｉｆｉｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７４０１）で分化させ、ブルーイング試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７３０１）、エオシンＹ、アルコール性（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８３２）で染色し、次いで脱水して段階的アルコール及びキシレンで除去し、Ｌｅｉｃａ  ＣＶ５０３０自動カバースリッパーを使用し、マイクロマウント（Ｌｅｉｃａ  カタログ番号３８０１７３１）を用いてカバーガラスで覆った。免疫組織化学染色を、ＩｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ  ＦＬＸ自動免疫組織化学染色装置（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、カタログ番号ＩＰＳ０００１ＵＳ）上で実施したが、それには、内在性ペルオキシダーゼ及び非特異的結合のブロッキング、西洋ワサビペルオキシダーゼビオチンフリーポリマーに基づく市販検出系を用いた検出、ジアミノベンジジン色素原を用いた開示、ならびにヘマトキシリンによる核の対比染色が含まれていた。Ｆ４／８０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、カタログ番号ＭＣＡ４９７）に特異的なラットモノクローナル一次抗体（クローンＣＩ：Ａ３−１）を、ＤａＶｉｎｃｉ希釈剤（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、カタログ番号ＰＤ９００）中で１：４００に希釈し、６０分間インキュベートした後、それぞれ１０分間及び３０分間の、Ｒａｔ−ｏｎ−Ｍｏｕｓｅ  ＨＲＰポリマー（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、カタログ番号ＲＴ５１７）２段階プローブ−ポリマーインキュベーションを使用して検出した。
【０２８０】
ＲＮＡ単離、逆転写及び定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
【０２８１】
ＱＩＡＧＥＮのＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、肝臓または脂肪組織試料から全ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩとランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。特定の転写レベルを、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と正規化ΔΔＣｔ閾値サイクル法を使用したリアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって評価した。遺伝子発現レベルを、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。ｑＰＣＲに使用するプライマーペアはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手し、以下に列挙する：
【表１】
2021534243.tif 000002
【０２８２】
肝脂質の抽出
【０２８３】
安楽死させたマウスから肝臓を迅速に取り出し、−８０℃に維持した。凍結肝臓試料（およそ１００ｍｇ）をＰＢＳでホモジナイズし、遠心分離（１４，０００ＲＰＭ、２０分）した。上清を回収し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによってタンパク質含有量を分析した。肝脂質の組成を評価するために、ヘキサン（≧９９％、３２２９３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とイソプロパノール（≧９９．５％、Ａ４２６−４、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３：２の比率（ｖ：ｖ）で使用して上清から脂質を抽出し、ヘキサン相を４８時間蒸発させた。肝臓のＴＧまたはＴＣの量は、市販のキット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して分光光度法で測定した。データをタンパク質レベルに対して正規化し、μｇＴＧまたはＴＣ／ｍｇタンパク質として表した。
【０２８４】
肝タンパク質抽出及びウエスタンブロッティング
【０２８５】
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した放射性免疫沈降アッセイ溶解緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して組織抽出物を調製した。タンパク質を１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。メンブレンを、５％無脂肪乳を含有するトリス緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中、室温で１時間ブロッキングし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した：ウサギポリクローナル抗ＡＢＣＧ８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−３０１１１、作業希釈１：１０００）及びウサギポリクローナル抗βアクチン（細胞シグナル伝達、４９６７Ｓ、作業希釈１：３０００）。ＴＢＳＴ洗浄後、メンブレンを二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ロバ抗ウサギＩＲＤｙｅ  ９２６−３２２１３、９２６−６８０７３、作業希釈１：１００００）とともに室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴ洗浄後、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、バージョン２．１）を使用して、バンドを視覚化し、定量化した。
【０２８６】
動脈硬化病変の分析
【０２８７】
採血後、マウスを心臓から２０ｍＬの生理食塩水で、続いて２０ｍＬの３７％ホルマリンで灌流した。マウスをホルマリンで固定し、大動脈樹全体を手術顕微鏡下で解剖した。次に、大動脈樹をオイルレッドＯ溶液（３．５：１のメタノール：１Ｎ  ＮａＯＨ中の０．２％オイルレッドＯ（ｗ／ｖ））で５０分間染色し、続いて７０％エタノール中に３０分間置いた。その後、大動脈樹をＤＤＷ中に維持した。次いで、大動脈樹から付着している脂肪及び結合組織を取り除き、ベンネスはさみで縦方向に開いて動脈硬化病変を露出させた。大動脈樹全体の画像をデジタルカメラを使用して取得し、総管腔表面積に対するオイルレッドＯで染色された硬化巣の面積の割合を、ＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェアで定量化した（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）。
【０２８８】
統計解析
【０２８９】
データ解析には、ＳＰＳＳ２４．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．ＩＢＭ）を使用した。データは、箱ひげ図または平均±ＳＥＭとして示す。各研究に使用する動物の数は、各図面の凡例に指定する。データ解析には、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くＴｕｋｅｙ事後検定を使用した。差異はｐ＜０．０５で統計的に有意であるとみなした。
【０２９０】
結果
【０２９１】
実験１  体重と脂肪症への影響
【０２９２】
実験計画を図１Ａに示す。ａｐｏＥ−／−マウスに西洋食（ＷＤ）を１週間給餌した後、顔面静脈（ＦＶ）から血液を採取して、ＴＣのベースライン血漿レベルを測定した。次いで、マウスをＷＤ給餌で維持し、無作為に５つの実験群に分けて強制経口投与により以下の治療薬を週６回、１２週間投与した：１）ＷＤ＋Ｈ２Ｏ；２）ＷＤ＋Ｇｌｙ（０．６７ｍｇ／ｇグリシン）；３）ＷＤ＋Ｌｅｕ（０．３３ｍｇ／ｇロイシン）；４）ＷＤ＋ＤＴ−１０９（１ｍｇ／ｇ  ＤＴ−１０９）；５）ＷＤ＋ＤＴ−１１０（１ｍｇ／ｇ  ＤＴ−１１０）。研究全体を通して、食物摂取量に有意差は認められなかった（図１Ｂ）。エンドポイント測定により、グリシンを投与したマウスの体重が有意に減少したことが明らかになり（１２％、ｐ＜０．０５、図１Ｃ）、一方、ベースラインからエンドポイントまでの体重の総増加は、グリシンまたはＤＴ−１０９で治療したマウスにおいて有意に低かった（それぞれ、５１％，ｐ＜０．０１または２８％，ｐ＜０．０５、図１Ｄ）。エンドポイントでの腹腔の肉眼的外観からは、対照マウス及びロイシン投与マウスにおいて肝臓の黄色がかった着色と内臓脂肪パッドの拡大が明らかとなり、これらは、グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０での治療によって減弱した（図１Ｅ）。したがって、グリシン含有トリペプチド分子の血漿レベルは、グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０を投与したマウスで有意に低かった（５３％、６２％または５６％、ｐ＜０．０５、図１Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＷＤ誘発性脂肪症に対するグリシン、ＤＴ−１０９、及び程度は低いがＤＴ−１１０の保護効果を示している。
【０２９３】
実験２  グルコース恒常性への影響
【０２９４】
ＷＤ給餌の１０週目に、一晩絶食した後、ＯＧＴＴを実施した。血糖値に対する治療の急性効果を決定するために、グリシン（０．６７ｍｇ／ｇ）、ロイシン（０．３３ｍｇ／ｇ）、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０（１ｍｇ／ｇ）をグルコース溶液（２ｍｇ／ｇ）に添加し、強制経口投与により投与した。図２Ａに示すように、ベースラインにおいて、群間で血糖値に有意差は認められなかった。治療薬の有無にかかわらずグルコースの投与から３０分後、すべての治療薬によって血糖値が著しく減少し、グリシンまたはＤＴ−１０９について、最も有意な効果があった。後の時点（６０〜１２０分）で、血糖値は、グリシン、ＤＴ−１０９及びＤＴ−１１０で処置したマウスで有意に減少したが、ロイシンでは減少しなかった。治療薬の慢性的影響を評価するために、ＷＤ給餌の１１週目にＯＧＴＴを繰り返したが、この時はグルコース溶液に治療薬を加えなかった。治療薬を加えないグルコース負荷後の群間に有意差は認められなかった（図２Ｂ）。非空腹時血糖値に対する治療薬の効果を評価するために、強制経口投与による治療薬の定期投与前（強制経口投与前）及び３０分後（強制経口投与後）に血液を採取した。対照マウスと比較して、強制経口投与前の血糖値は全群で有意に低かった。しかしながら、水またはロイシンによる強制経口投与が血糖値の上昇傾向をもたらした一方で、グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０による強制経口投与は血糖値を有意に低下させた（それぞれ、１０％，ｐ＜０．０５、２１％，ｐ＜０．０１または１３％，ｐ＜０．０５、図２Ｃ）。最後に、エンドポイントのグルコースレベル（６時間の絶食後）は、グリシンまたはＤＴ−１０９で処置したマウスで有意に低かった（それぞれ、４１％，ｐ＜０．０１または３０％，ｐ＜０．０５、図２Ｄ）。肝臓の遺伝子発現の解析により、グルコース取り込みを調節する遺伝子（ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２及びＧＬＵＴ４）は、糖新生を調節する遺伝子（Ｇ６ｐｃ、ＰＣＫ１及びＦＢＰ１）の発現に有意な変化を生じさせずに、グリシン処置によって上方制御されることが明らかになった。ＧＬＵＴ１発現はまた、ＤＴ−１１０で処置したマウス由来の肝臓において著しく誘導された（図２Ｅ）。まとめると、これらの結果は、グリシン、ＤＴ−１０９及びＴ−１１０の顕著な食後血糖降下特性を示している。
【０２９５】
実験３  肝脂質代謝への影響
【０２９６】
肝臓試料のＨ＆Ｅ染色により、対照マウス及びロイシン投与マウスにおいて顕著な小滴性及び大滴性脂肪肝が明らかとなった。重要なことに、グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０による処置は、ＷＤ誘発性脂肪肝を無効化した（図３Ａ）。したがって、肝脂質の抽出とそれに続くＴＧ及びＴＣ含有量の定量化により、グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０による処置が、肝ＴＧ（それぞれ、７４％、７３％または６８％、ｐ＜０．０１、図３Ｂ）及び肝ＴＣ（それぞれ、７６％、７１％、ｐ＜０．０１、または６３％、ｐ＜０．０１、図３Ｃ）を有意に低下させ、ロイシン投与については有意な影響がないことが明らかになった。
【０２９７】
実験４  次に、肝臓でのＴＧ、脂肪酸及びコレステロールの蓄積を調節する遺伝子の発現を評価し、脂肪肝に対する観察された効果を説明した。興味深いことに、グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０での処置は、肝脂質酸化の主要制御因子であるＡＭＰＫα１及びＰＰＡＲαの発現を有意に誘導したが、ロイシンでは誘導されなかった（図４Ａ）。したがって、ＴＧ加水分解（ＰＮＰＬＡ２）、ミトコンドリアβ酸化（ＣＰＴ１ａ、ＣＡＣＴ、ＡＣＡＤＩ）、及びミトコンドリア陰イオン担体ＵＣＰ２を調節する主要な標的遺伝子は、グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０で処置したマウスの肝臓において有意に上方制御された（図４Ａ、図４Ｂ）。肝臓のコレステロール恒常性を調節する遺伝子に関しては、グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０による処置により、コレステロールの胆汁への排泄の主要な調節因子であるＡＢＣＧ５及びＡＢＣＧ８の発現が有意に増加した。ＤＴ−１１０で処置したマウスの肝臓においてＬＤＬＲの有意な上方制御が認められ、グリシン及びＤＴ−１０９処置についても同様の傾向が認められた（図４Ｃ）。グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０で処置したマウスの肝臓におけるＡＢＣＧ８の過剰発現が、ウエスタンブロットによって確認された（図４Ｄ及び図４Ｅ）。全体として、これらの結果は、脂質酸化及びコレステロールの胆汁への抽出を調節する遺伝子の過剰発現に関連して、ＷＤ誘発性脂肪肝に対するグリシン、ＤＴ−１０９及びＤＴ−１１０の強力な保護効果を強く示している。
【０２９８】
実験５  血漿脂質特性及びアテローム性動脈硬化症への影響
【０２９９】
実験群に無作為化する前に、ＷＤ給餌の１週間後にマウスから血液を採取して、ベースラインの血漿ＴＣレベルを測定した。治療薬または水対照を含むＷＤ給餌の１２週間後に、エンドポイントで血漿ＴＣを再度測定した。図５Ａに示すように、血漿ＴＣの時間依存的な増加は、グリシンまたはＤＴ−１０９での処置によって有意に減弱され、ＤＴ−１１０処置についても同様の傾向であったが、ロイシン処置についてはそうではなかった。したがって、ＴＣ及びＬＤＬのエンドポイント血漿レベルは、グリシンまたはＤＴ−１０９で処置したマウスにおいて有意に低下し（それぞれ、ＴＣ：１９％、ｐ＜０．０５または２５％、ｐ＜０．０１；ＬＤＬ：３０％、それぞれ、ｐ＜０．０１または３６％、ｐ＜０．０１）、ＤＴ−１１０処置についても同様の傾向であった（図５Ｂ、図５Ｃ）。興味深いことに、血漿ＨＤＬレベルは、グリシンで処置したマウスにおいて有意に低かった（３５％、ｐ＜０．０５）が、ＤＴ−１０９処置では保持された（図５Ｄ）。血漿ＴＧレベルの有意な変化は認められなかった（図５Ｅ）。最後に、オイルレッドＯ染色によるｅｎ  ｆａｃｅ大動脈病変の解析により、グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０で処置したマウスの全動脈硬化巣の有意な減少が明らかになった（それぞれ、４８％、ｐ＜０．０１、６２％、ｐ＜０．００１または４９％、ｐ＜０．０１、図５Ｆ、図５Ｇ）が、ロイシンで処置したマウスではそうではなかった。
【０３００】
実験６  全身性、肝臓、脂肪組織の炎症への影響
【０３０１】
炎症はＮＡＦＬＤとアテローム性動脈硬化症の両方の病因に重要な役割を果たしているため、次に炎症性サイトカインとアディポカインの血漿レベルを評価した。ＩＬ−６とレジスチンの血漿レベルについて群間で有意な変化は認められなかったが（図６Ａ、図６Ｂ）、ＭＣＰ１レベルは、グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０で処置したマウスにおいて有意に低下した（図６Ｃ）。精巣上体脂肪組織（ＥＡＴ）及び皮下脂肪組織（ＳＡＴ）における遺伝子発現の解析により、すべての処置でＥＡＴにおいてＴＮＦαが有意に下方制御され、ＤＴ−１１０で最も有意な効果が得られたことが明らかになった（図６Ｄ）。より低いＭＣＰ１血漿レベルに従って、ＥＡＲ及びＳＡＴの両方におけるＭＣＰ１発現は、グリシン、ＤＴ−１０９またはＤＴ−１１０での処置によって有意に抑制されたが、ロイシンでは抑制されなかった（図６Ｄ、図６Ｅ）。最後に、グリシンは肝臓でのＭＣＰ１発現を抑制したが（ＤＴ−１０９でも同様の傾向、図７Ａ）、免疫組織化学による判定で、組織Ｆ４／８０に有意な変化は認められなかった（図７Ｂ、図７Ｃ）。全体として、これらの結果は、主に脂肪組織及び循環におけるＭＣＰ１の抑制に関連するグリシン、ＤＴ−１０９及びＤＴ−１１０に対するいくつかの抗炎症効果を示唆している。
【０３０２】
実施例ｘ  ＮＡＦＬＤに対するグリシン系の治療薬
【０３０３】
Ａ． 序文
【０３０４】
最も一般的な慢性肝疾患であるＮＡＦＬＤは、世界中の人口の２５％に影響を及ぼす。ＮＡＦＬＤは、脂肪肝（ＨＳ）、線維症の進行に伴う肝細胞の損傷と小葉の炎症を特徴とするＮＡＳＨ、及び肝不全または肝細胞癌を招き得る硬変症に至るまで、様々な肝病変を包含する。ＮＡＦＬＤ患者では、肥満、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）及び脂質異常症を含む心血管代謝の併存症が一般的である。肝臓特有の死亡率とは別に、心血管疾患は、特にＮＡＳＨに罹患しているＮＡＦＬＤ患者の主要な死因である。ＮＡＦＬＤの世界的な負担と医薬品開発における多大な努力にもかかわらず、これまでのところ承認された治療法は存在しない。
【０３０５】
特にメタボロミクスと腸内細菌叢における最近の進歩により、ＮＡＦＬＤの病因についての理解が深まり、新規治療標的が示唆されている。脂質と炭水化物の異常な代謝がＮＡＦＬＤに関係していることが知られている一方で、最近のメタボロミクスに基づく研究からは、特定のアミノ酸（ＡＡ）の代謝の調節不全がＮＡＦＬＤの病因に役割を果たしていることが示されている。特に、ほとんどの循環ＡＡがＮＡＦＬＤ患者において増加する一方で、グリシンレベルは低下する。循環グリシンレベルは、ＨＳ、肝細胞バルーニング、及び小葉炎症のレベルと負の相関がある。血漿グリシンは、既知のバイオマーカー（例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びＰＮＰＬＡ３遺伝子型）とともに、ＮＡＳＨの予測モデルに最近含められた。血漿グリシンが低いと、肥満、２型糖尿病、ＭｅｔＳ、冠動脈性心疾患及び心筋梗塞の有病率が高くなり、血漿グリシンが高いと、脂質特性が良好になる（表Ｓ１に要約）。
【０３０６】
【表２】
2021534243.tif 000003
【０３０７】
非必須ＡＡとして、グリシンは主に肝臓でいくつかの前駆体から合成される。これらの反応は、セリンから（セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ＳＨＭＴ）、スレオニンから（スレオニンデヒドロゲナーゼ、ＴＤＨ）、コリンからサルコシンを介して（コリンデヒドロゲナーゼ、ＣＨＤＨ；サルコシンデヒドロゲナーゼ、ＳＡＲＤＨ）のグリシン形成、及びアラニンからグリオキシレート（ＡＧＸＴ）へのグリシン形成を促進する重要な酵素によって触媒される。グリシンは、核酸、ヘム、グルタチオンなどの必須分子を生成するために複数の経路で利用される。ＮＡＦＬＤまたはＴ２Ｄでは、グリシンの利用可能性が限られているため、グルタチオン合成が減少し、これは栄養素補充後に回復する。この抗酸化作用を超えて、グリシンは脂質代謝とグルコース代謝において二重の利点を有する。グリシンの摂取は、膵臓のβ細胞からのインスリン分泌の刺激によって部分的に、血糖値を低下させる。遺伝的肥満／糖尿病ＫＫ−Ａｙマウスにおいて、食餌性グリシンは耐糖能を改善し、循環ＴＧとアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を低下させ、その一方でＨＳと炎症性浸潤を減弱させた。スクロースを給餌したラットでは、グリシンは、腹腔内脂肪、血漿ＴＧを低下させ、肝ミトコンドリアのＦＡＯマーカーを増加させた。それにもかかわらず、ヒトの疾患と正確な投与を完全に模倣するモデルを適用した、ＮＡＦＬＤにおけるグリシンの役割の包括的な調査は追求されていない。
【０３０８】
ＮＡＦＬＤの負担、利用可能な治療法の欠如、及び循環グリシンの低下をＮＡＦＬＤの重症度に関連付ける一貫した報告を考慮すると、ＮＡＦＬＤにおけるグリシン代謝をよりよく理解するための強力な理論的根拠が存在し、それは新規治療法につながり得る。本明細書において、ヒト及びマウスのＮＡＦＬＤにおいて、グリシン生合成遺伝子、主にＡＧＸＴ１の抑制を特定した。グリシンの利用可能性を制限するための遺伝的アプローチ（ＡＧＸＴ１−／−）及び食事療法的アプローチを適用することにより、高脂血症及び脂肪性肝炎の悪化が認められた。脂質／グルコース二重低下特性を有するグリシン系化合物を探索し、肝ＦＡＯを調節することによって食事性ＮＡＳＨからマウスを強力に保護するＤＴ−１０９を同定した。
【０３０９】
Ｂ． 略号：
【０３１０】
ＡＡ、アミノ酸；ＡＣＡＡ、アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；ＡＣＡＤ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；ＡＣＯＴ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ；ＡＣＯＸ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ；ＡＣＳＬ、アシルＣｏＡシンテターゼ長鎖；ＡＣＳＭ、アシルＣｏＡシンテターゼ中鎖；ＡＧＸＴ、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ；ＡＬＰ、アルカリホスファターゼ；ＡＬＴ、アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＡｐｏＥ、アポリポタンパク質Ｅ；ＡＳＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＣＡＣＴ、カルニチン／アシルカルニチントランスロカーゼ；Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９；ＣＣＬ、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド；ＣＣＲ、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体；ＣＤ、固形飼料；ＣＨＤ、冠動脈心疾患；ＣＬＡＭＳ、包括的実験動物モニタリングシステム；ＣＰＴ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ；ＣＲＩＳＰＲ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート；ＤＡＧ、ジアシルグリセロール；ＤＡＯ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ；ＤＥＧ、差次的発現遺伝子；ＥＣＩ、エノイル−ＣｏＡδイソメラーゼ；ＦＡ、脂肪酸；ＦＡＯ、脂肪酸β酸化；ＨＡＤＨ、ヒドロキシアシル−コエンザイムＡデヒドロゲナーゼ；ＨＳ、脂肪肝；ＬＤＡ、線形判別分析；ＬＥｆＳｅ、線形判別分析の効果量；ＭＣＰ−１、単球走化性タンパク質１；ＭｅｔＳ、メタボリックシンドローム；ＮＡＦＬＤ、非アルコール性脂肪性肝疾患；ＮＡＳＨ、非アルコール性脂肪性肝炎；ＮＦ−κＢ、活性化Ｂ細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー；ＮＭＲ、核磁気共鳴；ＯＧＴＴ、経口グルコース負荷試験；ＯＲＯ、オイルレッドＯ；ＰＧＣ１α、ＰＰＡＲＧコアクチベーター１α（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ）；ＰＮＰＬＡ、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質；ＰＰＡＲ、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体；ＲＥＲ、呼吸交換率；ＳＡＲＤＨ、サルコシンデヒドロゲナーゼ；ＳＥＲＰＩＮＥ、セリンペプチダーゼ阻害剤クレードＥ；ＳＨＭＴ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ；Ｔ２Ｄ、２型糖尿病；ＴＣ、総コレステロール；ＴＤＨ、スレオニンデヒドロゲナーゼ；ＴＧ、トリグリセリド；ＴＧＦＢＲ、形質転換増殖因子β受容体；ＴＧＦβ、トランスフォーミング増殖因子β；ＴＩＭＰ、メタロプロテアーゼの組織阻害剤；ＴＬＲ、ｔｏｌｌ様受容体；ＴＮＦ、腫瘍壊死因子；ＴＮＦＲＳＦ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー；ＷＤ、西洋食。
【０３１１】
Ｃ． 転写産物特性：
【０３１２】
ＲＮＡ配列決定データは、ＮＣＢＩのＳＲＡまたはＧＥＯ（登録番号：ＰＲＪＮＡ５５６５３７またはＧＳＥ１２６２０４）に登録されている。メタゲノミクス配列決定データは、ＮＣＢＩのＳＲＡ（登録番号：ＰＲＪＮＡ５４４７２８）に登録されている。
【０３１３】
Ｄ． 背景及び目的
【０３１４】
脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の有病率は、世界中で増加しているが、承認された薬物療法は存在しない。循環グリシンの低下がＮＡＦＬＤ患者において一貫して報告されているが、原因となるグリシンの役割とその治療可能性は不明なままである。ＮＡＦＬＤにおけるグリシン代謝を研究するために遺伝的及び食事療法的戦略を適用し、グリシン系の治療法を評価した。
【０３１５】
Ｅ． 方法：
【０３１６】
ＮＡＦＬＤを用いてヒトとマウスの肝臓でトランスクリプトミクスを行い、グリシン生合成遺伝子、主にアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ１（ＡＧＸＴ１）の抑制を明らかにした。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＡＧＸＴ１−／−マウスを生成し、グリシン改質型食餌を開発した。グルコース／脂質低下特性を有するグリシン系化合物を探索し、高脂血症／ＮＡＦＬＤのマウスモデルにおいて治療的使用を試験した。血漿脂質、肝酵素及びサイトカインを分析した。組織学、脂質定量化、ＲＮＡ配列決定、ｑＰＣＲ及びイムノブロッティングを使用して肝臓を研究した。ＮＭＲベースの体組成とエネルギー代謝を、間接熱量測定法を使用して評価した。腸内細菌叢を、１６Ｓメタゲノム配列決定を使用して研究した。
【０３１７】
Ｆ． 結果：
【０３１８】
グリシンの利用可能性を制限するための遺伝的アプローチ（ＡＧＸＴ１−／−）及び食事療法的アプローチは、食事性高脂血症及び脂肪性肝炎を悪化させ、基礎経路として、ミトコンドリア／ペルオキシソーム脂肪酸β酸化（ＦＡＯ）を抑制し、炎症を増強した。強力なグルコース／脂質低減効果を有するグリシン系のトリペプチドを同定した（ｇｌｙ−ｇｌｙ−Ｌ−ｌｅｕ／ＤＴ−１０９）。ＮＡＳＨが確立されたマウスでは、ＤＴ−１０９は、ＦＡＯ経路を刺激することにより、体組成を改善し、循環脂質、肝酵素、及び脂肪性肝炎を減少させた。ＤＴ−１０９は、ＮＦ−κＢ及びＴＧＦβ／ＳＭＡＤ経路を抑制することにより、小葉／全身性の炎症及び線維症を軽減した。細菌属Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏは、ＮＡＦＬＤの重症度と正の相関があり、ＤＴ−１０９によって減少したが、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓは逆相関を示し、ＤＴ−１０９によって増加した。
【０３１９】
Ｇ． 方法
【０３２０】
（ｉ） 動物実験手順
【０３２１】
動物実験の手順は、ミシガン大学（Ｕ−Ｍ）の動物実験委員会によって承認され（ＰＲＯ００００８２３９）、同会のガイドラインに従って実施した。７週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスまたはａｐｏＥ−／−マウス（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、ストック：００２０５２）は、ジャクソン研究所から入手した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有するＡＧＸＴ１−／−マウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用し、ＡＧＸＴ１のエキソン１を標的とするガイドＲＮＡ：５’−ＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣ−３’を使用して生成した。８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ、ａｐｏＥ−／−またはＡＧＸＴ１−／−マウスを、全体を通して使用し、自由に食餌を与えた：標準的な固形飼料（ＣＤ、ＬａｂＤｉｅｔ  ５Ｌ０Ｄ、脂肪由来のカロリー１３％）；高脂肪、高コレステロールの西洋食（ＷＤ、Ｅｎｖｉｇｏ  ＴＤ．８８１３７、４２％脂肪分）；グリシンを含むかまたは含まないＡＡ規定のＷＤ（Ｅｎｖｉｇｏ−Ｔｅｋｌａｄ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｄｉｅｔｓで開発、表Ｓ２）：ＷＤＡＡ＋Ｇｌｙ（ＴＤ．１７０５２５）またはＷＤＡＡ−Ｇｌｙ（ＴＤ．１７０５２６）；高脂肪、高コレステロール、高フルクトースのＮＡＳＨ食餌（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｄ１７０１０１０３、４０％脂肪分）、マウスでＮＡＳＨが強力に誘導されることを確認した。必要に応じて、マウスにグリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｇ５４１７）、ロイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌ８９１２）、もしくはＤＴ−１０９（ＣＳＢｉｏ）を０．１２５〜１ｍｇ／ｇ体重／日で、または対照としてＨ２Ｏを強制経口投与した。
【０３２２】
【表３】
2021534243.tif 000004
【０３２３】
（ｉｉ） ヒトのデータ
【０３２４】
グリシン生合成を駆動する差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を、２つの公開された肝臓マイクロアレイデータセットを使用して解析した：１）１０４人のＮＡＳＨ患者と４４人の健常者対照に由来するＧＳＥ８３４５２、２）２４人のＮＡＳＨ患者と２４人の健常者肥満対照に由来するＧＳＥ６１２６０。共変量として年齢、性別、及びＢＭＩを使用した線形回帰モデルを使用し、ＮＡＳＨに関連する重要なグリシン生合成遺伝子を特定した。統計的検出力を高めるために、等効果モデルを使用して２つの研究のメタ解析をさらに実施した。以前に公開したマイクロアレイデータ（ＧＳＥ２６１０６、ｎ＝２０６  肝移植ドナー）を使用して、遺伝子発現レベルと肝脂肪含有量との相関関係を試験した。
【０３２５】
（ｉｉｉ） 組織学及び免疫組織化学
【０３２６】
すべての組織学的手順を、組織学研究所のＵ−Ｍ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｒｅによって実施した。技術者を、実験群に対して盲検化した。Ｈ＆Ｅ染色またはシリウスレッド染色を使用して、ＮＡＦＬＤ活動性（ＮＡＳ）または線維症をスコアリングした。
【０３２７】
（ｉｖ） グリシン系化合物の同定
【０３２８】
グリシンに構造的に類似した化合物を選択して、グリシン骨格の構造的、立体配座的、電子的及び立体的等価の修飾を評価した。ＳｃｉＦｉｎｄｅｒ（Ｃ）により検索を実施し、商用利用可能かどうかを判断した。経口ＬＤ５０＞１ｍｇ／ｇを有する水溶性化合物を、マウスへの経口投与に適していると定義した。
【０３２９】
（ｖ） ＲＮＡ配列決定
【０３３０】
ライブラリの調製と配列決定は、ＮｏｖａＳｅｑ６０００シーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上でＵ−Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅによって実施した。記載のように、ＲＮＡ配列決定及び経路分析を行った。
【０３３１】
（ｖｉ） 包括的実験動物モニタリングシステム（ＣＬＡＭＳ）
【０３３２】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）ベースの分析装置（Ｍｉｎｉｓｐｅｃ  ＬＦ９０ＩＩ；Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ）を使用して、Ｕ−Ｍ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｃｏｒｅで体組成を評価した。酸素消費量（ＶＯ２）、二酸化炭素産生量（ＶＣＯ２）、及び運動能を、ＣＬＡＭＳ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。呼吸交換率（ＲＥＲ）は、ＶＣＯ２／ＶＯ２である。
【０３３３】
（ｖｉｉ） 糞便マイクロバイオーム分析
【０３３４】
糞便ＤＮＡ抽出、１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ４領域に特異的なプライマーを使用した増幅、線形判別分析（ＬＤＡ）効果量（ＬＥｆＳｅ）法を使用した腸内細菌叢の特性評価、及び疾患パラメータとの相関解析を、前述のように実施した。
【０３３５】
（ｖｉｉｉ） 統計解析
【０３３６】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７．０を用いて、統計解析を行った。特に明記しない限り、値は全点を示す平均±ＳＤとして表す。全データを、正規性及び等分散について試験した。合格した場合、２つの群を比較するためにスチューデントｔ検定を、または２つより多くの群間で比較するために一元配置ＡＮＯＶＡと、それに続いてボンフェローニ事後検定を使用した。さもなければ、ノンパラメトリック検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ＵまたはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）を使用した。Ｐ値＜０．０５を、統計上有意であるとみなした。
【０３３７】
（ｉｘ） ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用したＡＧＸＴ１−／−マウスの生成
【０３３８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６ＪバックグラウンドのＡＧＸＴ１−／−マウスを生成した。ＡＧＸＴ１遺伝子のエキソン１のガイドＲＮＡ標的部位は５’−ＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣ−３’であった。以下のプライマーを使用してジェノタイピングを実施した：フォワード：５’−ＡＣＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣＣ−３’、リバース：５’−ＧＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＡＣＣ−３’。以下のプライマーを使用するサンガーシーケンシング：５’−ＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＣＴＧＧＧＡＡＡＴＧ−３’により、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ、図８Ａ）から３塩基離れた位置でのＡ欠失を確認した。ＯＲＦのＡＡ５３の後のフレームシフト変異により、中途での終止コドンが導入され、ウエスタンブロットによってＡＧＸＴ１が存在しないことが確認された（図８Ｂ）。ＣＲＩＳＰＯＲを使用して評価したところ、ＣＲＩＳＰＲオフターゲット効果は検出されなかった。
【０３３９】
（ｘ） ヒトのデータ
【０３４０】
ＮＡＳＨ患者において差次的に発現するグリシン生合成遺伝子を、２つの公開データセットを使用して解析した。第１の研究は、１０４人のＮＡＳＨ患者と４４人の正常対照（ＧＳＥ８３４５２）から得られた肝臓マイクロアレイデータからなる。線形回帰を使用して、遺伝子発現レベルとＮＡＳＨとの相関性を試験した。年齢と性別を共変量として調整した。第２のデータセットには、２４人のＮＡＳＨ患者と２４人の健常者肥満対照（ＧＳＥ６１２６０）から収集した肝臓マイクロアレイデータが含まれている。同様に、年齢、性別、ＢＭＩを共変量として線形回帰モデルを使用して、ＮＡＳＨに関連する有意なグリシン生合成遺伝子を同定した。統計的検出力を高め、結果を比較するために、ｍｅｔａｆｏｒ  Ｒパッケージを使用して、等効果モデルを使用して２つの研究のメタ解析をさらに実施した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ調整したｐ値＜０．０５及びＣｏｃｈｒａｎのＱ不均一性検定のｐ値＞０．０５を有する遺伝子を有意であるとみなした。
【０３４１】
肝移植ドナー（ｎ＝２０６）から収集した、以前に公開したマイクロアレイデータ（ＧＳＥ２６１０６）を使用して、遺伝子発現レベルと肝脂肪含有量の相関関係を試験した。組織解剖、サンプル除外、及びマイクロアレイデータの生成を、前述のように実施した。ドナー肝臓の肝脂肪含有量を、以前に記載したように、有機溶媒（ヘキサン／イソプロパノール  ３：２）を使用して定量化した。抽出した総脂肪含有量を、総タンパク質濃度に対して正規化し、その後の解析のためにｌｏｇ１０スケールに変換した。ピアソン相関を使用して、グリシン生合成遺伝子の発現と相関する肝脂肪の有意性を決定した。
【０３４２】
（ｘｉ） ＮＡＦＬＤ活動性及び線維症の組織学、免疫組織化学及びスコアリング
【０３４３】
組織学的手順は、ミシガン大学のＩｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｒｅ（ＩＶＡＣ）組織学研究所で、実験群に対して盲検化した技術者によって実施した。ホルマリン固定組織を段階的アルコールで処理し、キシレンで除去した後、自動ＶＩＰ５またはＶＩＰ６組織プロセッサー（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ，Ｓａｋｕｒａ−Ａｍｅｒｉｃａｓ）を使用して溶融パラフィンを浸透させた。Ｈｉｓｔｏｓｔａｒ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、組織をＭ３５５Ｓ回転式ミクロトーム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４μｍの厚さに切片化し、スライドガラスにマウントした。スライドを、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）について染色した。シリウスレッド染色では、スライドを０．２リンモリブデン酸で３分間処理し、ピクリン酸で飽和させた０．１％シリウスレッド（Ｒｏｗｌｅｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）に９０分間移した後、０．０１Ｎ塩酸に３分間移した。
【０３４４】
Ｈ＆Ｅ染色を使用してＮＡＦＬＤ活動性をスコアリングした。脂肪肝を、０〜３でスコアリングした（０：＜５％脂肪肝；１：５〜３３％；２：３４〜６６％；３：＞６７％）。肝細胞バルーニングは、０〜２でスコアリングした（０：正常肝細胞、１：  正常サイズだが細胞質が薄い、２：薄く肥大化した肝細胞、少なくとも２倍）。小葉の炎症は、２０×でカウントした炎症の病巣に基づいて０〜２でスコアリングした（０：なし、１：病巣が２つ未満；２：病巣が２つ以上）。ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）は、脂肪肝、肝細胞バルーニング、及び小葉炎症スコアの合計として計算した。シリウスレッド染色を使用して、肝線維症を０〜４でスコアリングした（０：線維症なし；１：類洞周囲または門脈線維症；２：類洞周囲及び門脈線維症；３：架橋形成線維症；４：肝硬変）。
【０３４５】
オイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色には、凍結切片処理を使用した。ホルマリン固定肝臓試料を２０％スクロース中、４℃で一晩凍結保護し、ブロッティングした後、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、カタログ番号４５８３）中で液体窒素による急速凍結を行い、凍結切片化の準備ができるまで−８０℃で保存した。切片化の前に、凍結ブロックを約−２０℃まで上昇させ、次いでＣｒｙｏｔｏｍｅ  ＳＭＥ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｈａｎｄｏｎ、カタログ番号７７２００２２７）上で、５μｍで切片化した。染色時まで、スライドを−８０℃で保存した。染色する前に、肝臓のスライドを３０分間解凍して室温に戻した。スライドを１０％中性緩衝ホルマリンで２０分間後固定し、ＤＤＷでリンスし、６０％イソプロパノールでリンスした後、ＯＲＯ−イソプロパノール染色液（Ｒｏｗｌｅｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｈ−５０３−１Ｂ）中に５分間静置した。次いで、スライドを６０％イソプロパノールでリンスし、続いてＤＤＷを３回交換した。次いで、スライドに対し、ハリスヘマトキシリンで核の対比染色を行い、Ａｑｕａ−Ｍｏｕｎｔ（Ｌｅｒｎｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１３８００）水性封入剤に封入した。
【０３４６】
免疫組織化学染色を、ＩｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ  ＦＬＸ自動免疫組織化学染色装置（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）上で実施し、内在性ペルオキシダーゼ及び非特異的結合のブロッキング、その後に西洋ワサビペルオキシダーゼビオチンフリーポリマーに基づく市販検出系を用いた検出、ジアミノベンジジン色素原を用いた開示、ならびにヘマトキシリンによる核の対比染色を行った。Ｆ４／８０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、カタログ番号ＭＣＡ４９７）に特異的なラットモノクローナル一次抗体（クローンＣＩ：Ａ３−１）を、ＤａＶｉｎｃｉ希釈剤（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、カタログ番号ＰＤ９００）中で１：４００に希釈し、６０分間インキュベートした後、それぞれ１０分間及び３０分間の、Ｒａｔ−ｏｎ−Ｍｏｕｓｅ  ＨＲＰポリマー（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、カタログ番号ＲＴ５１７）２段階プローブ−ポリマーインキュベーションを使用して検出した。
【０３４７】
（ｘｉｉ） 血漿分析
【０３４８】
ミシガン糖尿病研究センター（ＭＤＲＣ）の化学研究所または当社の研究所で、Ｃｏｂａｓ  Ｍｉｒａ化学分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、市販のキット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ９９９−０２６０１及び９９４−０２８９１）を使用して、製造元が提供する試薬とプロトコールを用いて完全な血漿脂質特性（ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ、及びＨＤＬ）を測定した。ＭＤＲＣのＬｕｍｉｎｅｘ２００プラットフォーム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）でＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ（ＭＭＨＭＡＧ−４４Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、血漿グリシン含有トリペプチド分子及びレジスチンを測定した。マウスＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ−１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて血漿ＭＣＰ−１を測定した。ＡＬＴ、ＡＳＴ、及びＡＬＰの臨床化学アッセイを、ミシガン大学ＩＶＡＣにより、Ｌｉａｓｙｓ３３０化学分析装置（ＡＭＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で、製造元が提供する試薬とプロトコールを使用して実施した。シュウ酸塩アッセイキット（Ａｂｃａｍ、ａｂ１９６９９０）を使用して血漿シュウ酸塩を測定した。血糖値計とテストストリップ（ＮＤＣ：０１９３−７３０８−５０、Ｃｏｎｔｏｕｒ  Ｎｅｘｔ）を使用して血漿グルコースを測定した。血漿ＡＡ分析を、ミシガン大学Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅによって実施した。ＥＺ  Ｆａａｓｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓキット（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）の指示に従って、２０μＬの血漿を誘導体化し、ＧＣ−ＭＳ分析用に調製した。簡潔に述べると、試料をカラムクリーンアップにかけ、ＧＣオートサンプラーバイアルに移した。次いで、試料を誘導体化し、穏やかな窒素流下、室温で乾燥させ、以下のパラメータを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ６９８９０Ｎ  ＧＣ−５９７５  ＭＳ検出器でＧＣ分析のために再懸濁した：ＺＢ−ＡＡＡ  １０ｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で流速１．１ｍＬ／分のＨｅガスとともに１：１５のスプリット比で１μＬの試料を注入した。ＧＣオーブンの初期温度は１１０℃であり、毎分３０℃ずつ上昇させて３２０℃とした。注入口温度は２５０℃であり、ＭＳソース温度とＭＳ  ｑｕａｄ温度はそれぞれ２３０℃と１５０℃であった。ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定量分析バージョンＢ．０７．００を使用してデータを処理した。代謝産物を、最も近い同位体で標識した内部標準に正規化し、５つの標準の２回の繰り返し注入を使用して定量化し、各標準について８０％超の精度を有する線形検量線を作成した。ピーク面積は、群間の差異分析に使用した。
【０３４９】
（ｘｉｉｉ） 定量的リアルタイムＰＣＲ分析
【０３５０】
ＱＩＡＧＥＮのＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、マウス肝臓試料から全ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩとランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。特定の転写レベルを、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と正規化ΔΔＣｔ閾値サイクル法を使用したリアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって評価した。遺伝子発現レベルを、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。ｑＰＣＲに使用するプライマーペアはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手し、表Ｓ３に列挙する。
【０３５１】
【表４−１】
2021534243.tif 000005
【表４−２】
2021534243.tif 000006
【表４−３】
2021534243.tif 000007
【表４−４】
2021534243.tif 000008
【０３５２】
（ｘｉｖ） ＲＮＡ配列決定及びデータ解析
【０３５３】
上記のように、マウス肝臓試料から全ＲＮＡを抽出した。ライブラリの調製と配列決定を、ミシガン大学のＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅによって実施した。ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用してＲＮＡの品質を評価した。全試料のＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）は＞８．５であった。Ｐｏｌｙ（Ａ）  ｍＲＮＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎモジュール（ＮＥＢ、Ｅ７４９０Ｌ）を備えたＩｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐキット（ＮＥＢ、Ｅ７７６０Ｌ）及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｕｎｉｑｕｅ  ｄｕａｌ用ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏ（ＮＥＢ、Ｅ６４４０Ｌ）を使用して試料を調製し、１０ｎｇ〜１μｇの全ＲＮＡをｍＲＮＡポリＡ精製に供した。次いで、ｍＲＮＡを断片化し、逆転写酵素とｄＵＴＰミックスを使用して第１鎖ｃＤＮＡにコピーした。試料を末端修復し、ｄＡ−テーリング工程を経て、ＮＥＢＮｅｘｔアダプターをライゲーションした。産物を精製し、ＰＣＲで濃縮して、最終的なｃＤＮＡライブラリを作成した。最終的なライブラリは、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、及びＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォーム用のＫａｐａライブラリ定量化キット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＫＫ４８３５）を使用したｑＰＣＲによって品質と量をチェックした。ＮｏｖａＳｅｑ６０００配列決定システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でライブラリをペアエンドシーケンシングした。
【０３５４】
生のＦａｓｔｑファイルの品質を、ＦａｓｔＱＣ  ｖ０．１１．８でチェックした（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ  ｖ．０．３５を使用して、パラメータ：ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：４：２０  ＭＩＮＬＥＮ：２５を使用して低品質の読み取り結果をトリミングした。１２  結果として得られた高品質の読み取り結果を、ＨＩＳＡＴ２  ｖ．２．１．０を使用してマウス参照ゲノム（ＧＲＣｍ３８．９０）にマッピングした。１３  ＧＲＣｍ３８．９０ゲノムアノテーションに基づくＨＴＳｅｑ−ｃｏｕｎｔｓ  ｖ０．６．０を使用して、遺伝子レベルの定量化を実施した。１４  次いで、ＲパッケージＤＥＳｅｑ２を使用して、有意な差次的発現遺伝子を同定した。１５  調整後のＰ値が０．０５未満であり、絶対倍率変化が２より大きい遺伝子を、有意な差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）とみなした。次いで、上方制御されたＤＥＧと下方制御されたＤＥＧを、ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒパッケージを使用して有意に濃縮されたＫＥＧＧ経路についてそれぞれ分析した。１６  濃縮の有意性は、右側フィッシャー直接検定とそれに続くＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ多重検定調整によって判定した。
【０３５５】
（ｘｖ） 肝脂質分析
【０３５６】
安楽死させたマウスから肝臓を迅速に取り出し、液体窒素で急速凍結し、−８０℃に維持した。凍結肝臓試料（１００ｍｇ）をＰＢＳでホモジナイズし、遠心分離（１４，０００ＲＰＭ、２０分）した。上清を回収し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いてタンパク質含有量を分析した。肝脂質の組成を評価するために、ヘキサン（≧９９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ３２２９３）とイソプロパノール（≧９９．５％、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａ４２６−４）を３：２の比率（ｖ：ｖ）で使用して上清から脂質を抽出し、ヘキサン相を４８時間蒸発させた。肝臓のＴＧまたはＴＣの量は、市販のキット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ９９９−０２６０１及び９９４−０２８９１）を使用して分光光度法で測定した。ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＯＫＥＨ０２６０７）を使用し、製造元の指示に従って肝臓ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を測定した。肝臓のＴＧ、ＴＣ、及びＤＡＧデータを、タンパク質レベルに対して正規化した。
【０３５７】
（ｘｖｉ） ウエスタンブロット分析
【０３５８】
肝臓試料を、プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した放射性免疫沈降アッセイ溶解緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に溶解した。タンパク質を１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。メンブレンを、５％無脂肪乳を含有するトリス緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中、室温で１時間ブロッキングし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した：ＡＧＸＴ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｃ−５１７３８８、１：５００）、ＨＡＤＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  １０７５８−１−ＡＰ、１：１０００）、ＡＣＡＡ２（ＡＢｃｌｏｎａｌ  Ａ１５７７８、１：５００）、ホスホ−ＳＭＡＤ２（Ｓｅｒ４６５／４６７、細胞シグナル伝達、＃３１０８Ｓ；１：１０００）、ＳＭＡＤ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃５３３９Ｓ；１：１０００）、ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｃ−３６５０６２；１：２０００）、またはβアクチン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃３７００）。メンブレンをＴＢＳＴで洗浄した後、ＩＲＤｙｅ標識二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：１００００）とともに室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴ洗浄後、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、バージョン２．１）を使用して、バンドを視覚化し、定量化した。
【０３５９】
（ｘｖｉｉ） グリシン系化合物の同定
【０３６０】
グリシンに構造的に類似した化合物を、グリシン骨格への構造的、立体配座的、電子的及び立体的等価の修飾を評価する目的で選択した（図９Ａ）。ＳｃｉＦｉｎｄｅｒ（Ｃ）により検索を実施し、商用利用可能かどうかを判断した。Ｎ−メチルグリシン（図９Ｂ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（図９Ｃ）、及びＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（図９Ｄ）により、グリシンのアミン部分の様々なメチル化の程度を調べ、グリコール酸（図９Ｅ）により、アミンからアルコールへの置換を評価した。酸性領域Ｗｘの改変
【０３６１】
グリシンアミド（図９Ｆ）、２−アミノ−Ｎ−メチルアセトアミド（図９Ｇ）、及びエタノールアミン（図９Ｈ）で調べる前に、２−オキソピペラジン（図９Ｉ）及びモルホリン−２−オン（図９Ｊ）により、立体配座が制限された類似体を調べた。（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メタンアミン（図９Ｋ）により、酸の等価体置換を調べた。
【０３６２】
（ｘｖｉｉｉ） 経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）
【０３６３】
１２時間の絶食後にＯＧＴＴを実施した。指定の用量（０．１７〜１ｍｇ／ｇ体重）のロイシン、グリシン、ＤＴ−１０９または他のグリシン系化合物を含有するグルコース（２ｍｇ／ｇ体重）の強制経口投与の０、１５、３０、６０、及び１２０分後に尾の先端から血液試料を採取した。血糖値計とテストストリップ（Ｃｏｎｔｏｕｒ  Ｎｅｘｔ）を使用して血糖値を測定した。
【０３６４】
（ｘｉｘ） 体組成及び包括的実験動物モニタリングシステム（ＣＬＡＭＳ）
【０３６５】
すべての測定は、ミシガン大学のＡｎｉｍａｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｃｏｒｅによって実施した。体脂肪、除脂肪体重、及び遊離体液を、核磁気共鳴（ＮＭＲ）ベースの分析装置（Ｍｉｎｉｓｐｅｃ  ＬＦ９０ＩＩ；Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ）を使用して測定した。分析装置を、製造元が推奨する参照試料を使用して毎日チェックする。最小限の拘束でマウスを個別に測定管に入れた。酸素消費量（ＶＯ２）、二酸化炭素産生量（ＶＣＯ２）、及び運動能を、光学ビーム活性モニタリング装置を備えた集積開放型回路熱量計であるＣＬＡＭＳ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。測定前にマウスの体重を測定し、密閉チャンバー（７．９”×４”×５”）に個別に入れ、食物と水を自由に摂取させた。研究は、２０〜２３℃、１２時間−１２時間の明暗サイクル（６：００ＰＭ〜６：００ＡＭ）に設定した実験室で実施した。測定は４８時間継続して実施した。この間、動物にはチャンバー内にある給餌装置と飲用装置を介して食物と水を供給した。各チャンバーのＶＯ２とＶＣＯ２は、１０分間隔で５秒間連続してサンプリングし、運動能は、Ｘ及びＺ次元で毎秒記録した。チャンバーを通る空気の流速は、静止状態で酸素差が０．３％前後に維持されるように調整した。呼吸交換率（ＲＥＲ）は、ＶＣＯ２／ＶＯ２として計算した。総エネルギー消費量、グルコース酸化及び脂肪酸化は、ＶＯ２、ＶＣＯ２、及びタンパク質分解の値に基づいて計算した。
【０３６６】
（ｘｘ） 糞便マイクロバイオーム分析
【０３６７】
腸内細菌叢の全ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉキット（５１５４０、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造元の指示に従って糞便試料から抽出した。ＤＮＡを、前述のように群集解析用に調製した。１７  簡潔に述べると、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域に特異的なバーコード付きデュアルインデックスプライマーを使用してＤＮＡを増幅した。１８  ＰＣＲ反応は５μＬの４μＭ等モルプライマーセット、０．１５μＬのＡｃｃｕＰｒｉｍｅＴａｑ  ＤＮＡ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ポリメラーゼ、２μＬの１０×ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １２３４６０９４）、１１．８５μＬのＰＣＲグレードの水、及び１μＬのＤＮＡテンプレートからなる。ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間、続いて９５℃で２０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で５分間を３０サイクル、続いて７２℃で１０分間であった。各ＰＣＲ反応は、ＳｅｑｕａｌＰｒｅｐ  Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａ１０５１００１）を使用して正規化した。正規化した反応物をプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用のＫａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｑＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＲＯＸ  Ｌｏｗ）Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＫＫ４８７３）を使用して定量した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用し、高感度ＤＮＡ分析キット（５０６７−４６２６）を使用してアンプリコンライブラリのサイズを確認した（約３９９ｂｐ）。次いで、プールしたアンプリコンライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ＮＡＮＯプラットフォーム（ミシガン大学微生物システム分子生物学研究所）上で標準プロトコールに従って配列決定した。
【０３６８】
ＤＮＡ配列決定データをＳＯＰに従ってＭｏｔｈｕｒを使用して処理し、主にα及びβ多様性ベースの分析に焦点を合わせた。配列をトリミングしてプライマーとバーコードを削除し、品質をフィルタリングし、前述のようにキメラをチェックした。各サンプルの合計３５６５の配列を、さらなる統計解析に使用した。トリミングしたＤＮＡ配列を、平均隣接アプローチを使用してクラスター化し、９７％の配列類似性カットオフ（３％の配列相違）で操作的分類単位（ＯＴＵ）を形成した。Ｃｌｅａｒｃｕｔプログラムを使用して系統樹を構築した。β多様性の測定には、ＯＴＵベースのアプローチを使用した。上位１０７個のＯＴＵの相対存在量（＞１％）の値のｌｏｇ２スケーリングを使用して、全サンプルにわたる各ＯＴＵの相対存在量のヒートマップを生成した。分子ＡＭＯＶＡ統計解析を実施して、サンプリング群全体のコミュニティ間の構造的類似性の有意性を判定した。ＵｎｉＦｒａｃ分析を使用して、加重（ＷＵｎＦ）及び非加重（ＵＷＵｎＦ）ＵｎｉＦｒａｃメトリックを推定した。制約付き順序ＲＤＡ（冗長性分析）を計算し、環境変数の有意性をフォワードセレクション分析によってチェックした。腸内細菌叢を区別する微生物の特徴の特性評価を、統計的有意性と生物学的関連性の両方を強調するバイオマーカー発見のための線形判別分析（ＬＤＡ）効果量（ＬＥｆＳｅ）法（ｈｔｔｐ：／／ｈｕｔｔｅｎｈｏｗｅｒ．ｓｐｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｌｅｆｓｅ／）を使用して実行した。それに応じて、ＲのＰｈｙｌｏｓｅｑパッケージを使用して主成分分析（ＰＣＡ）をプロットした。変化した細菌属の変化と肝臓または血漿のＮＡＦＬＤ関連パラメータとの相関を、ノンパラメトリックスピアマン検定を使用して計算した。
【０３６９】
（ｘｘｉ） ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
【０３７０】
アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）からＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞株を入手し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、Ｇｉｂｃｏ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。いくつかの実験では、ＦＢＳを含まないが０．１％ＢＳＡを添加したＤＭＥＭ中に、細胞をパルミチン酸（ＰＡ、２００μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ０５００）とともにロードした。ＡＧＸＴ１を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＧＸＴ１：ＧＣＡＡＧＧＡＵＡＵＧＵＡＣＣＡＧＡＵｔｔ、ｓｉＲＮＡ  ＩＤ  ｓ１１９０）及び非標的ｓｉＲＮＡ対照（ｓｉＣＴＬ、ｓｉＲＮＡ  ＩＤ  ＡＭ４６１１）はＡｍｂｉｏｎから入手した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、製造元のプロトコールに従って、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ還元血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中、ＨｅｐＧ２細胞に２０ｎＭのｓｉＡＧＸＴ１またはｓｉＣＴＬを形質移入した。ＲＮＡの単離、タンパク質または脂質の抽出は、形質移入の４８時間後に実施した。ＱＩＡＧＥＮのＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ＨｅｐＧ２細胞から全ＲＮＡを精製した。表Ｓ３に列挙されているヒトプライマーペアを使用してｑＰＣＲ分析を上記のように実行した。プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を添加したＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、細胞を溶解した。上記のようにウエスタンブロットを使用して、ＡＧＸＴ１タンパク質の存在量を評価した。ヘキサン：イソプロパノールを３：２の比率で用いて、細胞からの細胞脂質の抽出を行い、ヘキサン相を４８時間蒸発させた。プレート内の残りの細胞を０．１Ｍ  ＮａＯＨで２４時間破砕し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して細胞タンパク質を測定するためにアリコートを採取した。細胞のＴＧまたはＴＣの含有量を、市販のキット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して分光光度法で測定した。細胞のＴＧ及びＴＣデータをタンパク質レベルに対して正規化し、μｇＴＧまたはＴＣ／ｍｇタンパク質として表した。
【０３７１】
Ｈ． 結果
【０３７２】
（ｉ） マウス及びヒトＮＡＦＬＤにおけるグリシン生合成障害
【０３７３】
グリシン代謝の変化がＮＡＦＬＤの発症に寄与するかどうかを試験するために、最初に、ＷＤによって誘発されたＨＳを有するＣ５７ＢＬ／６Ｊを研究した。ＷＤ給餌の１２週間後、高コレステロール血症（図１０Ａ）ならびにＨ＆Ｅ染色及びオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色によって確認されるＨＳ、ならびに肝ＴＧ及び総コレステロール（ＴＣ）の定量化を明らかにした（図１０Ｂ〜Ｄ）。標的化メタボロミクスにより、すべてのＡＡの中で、血漿グリシンが最も有意に低下し、その前駆体であるセリン、スレオニン、及びアラニンが著しく増加したことが明らかになり（図１０Ｅ）、このことからグリシン生合成の障害が示された。したがって、次に、グリシン形成を駆動する遺伝子の発現を研究した。ＨＳを有するマウスにおいて、主要なグリシン生合成遺伝子が下方制御され、その中でも、ＡＧＸＴ１が最も有意に抑制されたことを見出した（図１０Ｆ）。さらに、ＡＧＸＴ１は、パルミチン酸（ＰＡ）によって誘導されるＴＧ蓄積によりＨｅｐＧ２細胞において著しく下方制御された（図１０Ｇ、Ｈ）。
【０３７４】
同様のパターンがより重症のＮＡＦＬＤで明らかであるかどうかを試験するために、２４週間のＮＡＳＨ食餌の給餌によって誘発した進行性ＮＡＳＨ及び線維症を有するマウスに由来する肝臓のＲＮＡ配列決定を実施した（図１０Ｉ）。経路分析により、ケモカイン、ＮＦ−κＢ、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及びトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達の上方制御、ならびにＦＡ分解及びペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）シグナル伝達の下方制御を含む、ＮＡＳＨに関与する既知の経路の変化が明らかになった（図１０Ｊ）。興味深いことに、グリシン、セリン、スレオニン及びグリオキシル酸の代謝を含む、ＡＡ生合成を調節する経路は、ＡＧＸＴ１抑制を含め、ＮＡＳＨにおいて有意に下方制御された（Ｐ＝０．０００９、図１０Ｋ）。食事性ＮＡＳＨを有するマウスの独立したコホートを使用して、ＡＧＸＴ１抑制をｑＰＣＲによって確認した（図１０Ｌ）。
【０３７５】
グリシン生合成遺伝子がヒトＮＡＦＬＤで同様に抑制されるかどうかを試験するために、ＮＡＳＨ患者の肝臓のトランスクリプトミクスに基づいてメタ解析を実施した。ＮＡＳＨにおいて、ＡＧＸＴ１（β＝−０．１４１、Ｐ＝０．００４１）及びＡＧＸＴ２（β＝−０．１３４、Ｐ＝０．０１３５）が有意に下方制御されていたが、一方、グリシンからグリオキシル酸への分解を触媒するＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ）は著しく上方制御されていた（β＝０．２１６、Ｐ＝０．００２５、図１０Ｍ）ことを見出した。肝移植ドナーから得られた２０６サンプルの中で、ＡＧＸＴ１の発現が肝脂肪含有量と逆相関していることを見出した（ｒ＝−０．１９９、Ｐ＝０．００４４、図１０Ｎ）。興味深いことに、ＰＰＡＲα（肝ＦＡＯの主要制御因子）の発現と肝脂肪含有量（ｒ＝−０．１５４、Ｐ＝０．０２７５）の間に同様の逆相関が認められたが、一方、脂肪性肝炎及び線維症の主要なプレーヤーであるＣ−Ｃモチーフケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）とＴＧＦβの発現は、肝脂肪と正の相関があった（それぞれ、ｒ＝０．１８５、Ｐ＝０．００７８及びｒ＝０．２８４、Ｐ＜０．０００１、図示せず）。これらの結果は、グリシン生合成遺伝子の抑制に関連して、ＮＡＦＬＤにおける循環グリシンの低下に関する最近の報告と一致しており、ＮＡＦＬＤにおけるＡＧＸＴ１の役割を示唆している。
【０３７６】
（ｉｉ） ＡＧＸＴ１の喪失は、食事性高脂血症及びＮＡＳＨを悪化させる
【０３７７】
肝細胞のペルオキシソームまたはミトコンドリアに局在する肝臓特異的遺伝子であるＡＧＸＴ１の細胞脂質蓄積における潜在的な役割を研究するために、ＨｅｐＧ２細胞においてＡＧＸＴ１をノックダウンし、これによりＰＡ誘導型ＴＧ蓄積が増強された（図８Ｃ〜Ｅ）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＧＸＴ１の喪失の影響を研究するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＡＧＸＴ１−／−マウスを生成した（図８Ａ、Ｂ）。ＣＤ給餌下では、以前に示したように、ＡＧＸＴ１−／−肝臓の組織学はＡＧＸＴ１＋／＋のそれと同等であったが、さらに、血漿肝酵素もまた同等であることがわかった（図８Ｆ〜Ｋ）。しかしながら、ＮＡＳＨ食餌での１２週間後、ＡＧＸＴ１−／−マウスでは、血漿ＴＧ、ＴＣ、ＡＳＴ及びＡＬＴが増加していた（図８Ｌ〜Ｏ）が、グリシンとシュウ酸塩の比率は有意に低下していた（図８Ｐ）。腹腔の肉眼的外観からは、ＡＧＸＴ１−／−マウスにおける、より肥大化し、黄色がかった着色が増強された肝臓が明らかになった（図１１Ａ）。体重に有意差は認められなかったが、肝臓重量は有意に増加していた（図１１Ｂ、図１１Ｃ、Ｄ）。肝脂質の定量化と組み合わせたＨ＆Ｅ及びＯＲＯ染色により、ＡＧＸＴ１−／−マウスにおけるＨＳの増加が明らかとなり（図１１Ａ、Ｅ、Ｆ）、シリウスレッド染色により、線維症の増加が明らかとなった（図１１Ａ）。さらなる組織学的分析により、ＡＧＸＴ１−／−マウスにおいてＮＡＳ及び線維症スコアが高いことが確認された（図１１Ｇ、Ｈ、図１１Ｉ）。
【０３７８】
ＡＧＸＴ１−／−マウスにおける食事性ＮＡＳＨの加速の根本的なメカニズムを理解するために、ＡＧＸＴ１＋／＋及びＡＧＸＴ１−／−マウスに由来する肝臓のＲＮＡ配列決定とそれに続くｑＰＣＲ検証を実施した。経路分析により、ＡＧＸＴ１−／−マウスにおけるエネルギー代謝とＦＡＯ経路の抑制が明らかとなったが、一方、炎症誘発性経路は上方制御されていた（図１１Ｊ）。ペルオキシソームを調節する遺伝子（アシルＣｏＡチオエステラーゼ３、ＡＣＯＴ３、アシルＣｏＡシンテターゼ中鎖５、ＡＣＳＭ５、アシルＣｏＡシンテターゼ長鎖１、ＡＣＳＬ１）及びミトコンドリアＦＡＯ（ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼα、ＨＡＤＨＡ、及びアセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ２、ＡＣＡＡ２）はＡＧＸＴ１−／−マウスにおいて有意に下方制御された（図１１Ｋ〜Ｍ、ＰＰＡＲαについてはわずかではあるが、Ｐ＝０．０５５７）が、一方、炎症誘発性シグナル伝達の調節因子をコードする遺伝子（ＮＦＫＢ１／２、ＲＥＬＢ、ＣＣＲ２／５、及びＴＬＲ２／４）、サイトカイン（ＴＮＦα及びＣＣＬ２）、線維形成（ＴＧＦＢ１／２及びＴＧＦＢＲ２）及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリング（ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ４Ａ２及びＴＩＭＰ１）は有意に上方制御された（図１１Ｎ、Ｏ）。したがって、肝臓特異的なグリシン生合成遺伝子であるＡＧＸＴ１は、ＮＡＦＬＤにおいて抑制され、その欠損は食事性ＮＡＳＨを加速する。
【０３７９】
（ｉｉｉ） グリシン欠乏症は、食事性高脂血症及びＨＳを悪化させる
【０３８０】
血漿グリシンレベルの低下はＮＡＦＬＤ及び心血管代謝疾患に関連し、より高いレベルは好ましい脂質特性に関連する。脂質異常症における食餌性グリシンの役割を調べるために、グリシンを含むかまたは含まないＡＡ改質型ＷＤ（ＷＤＡＡ＋ＧｌｙまたはＷＤＡＡ−Ｇｌｙ、表Ｓ２）を開発し、高脂血症アポＥ−／−マウスＣＤ、ＷＤＡＡ＋ＧｌｙまたはＷＤＡＡ−Ｇｌｙに、１０週間給餌した。ＷＤＡＡ−Ｇｌｙを給餌したマウスにおいて、血漿グリシンの有意な低下が認められた（図１２Ａ）。ＮＭＲベースの体組成とＣＬＡＭＳ分析により、ＷＤＡＡ−Ｇｌｙを給餌したマウスにおいて、体重及び脂肪の増加が示されたが、ＷＤＡＡ＋Ｇｌｙを給餌したマウスでは示されず（図１２Ｂ〜Ｄ）、食物摂取、活動性またはエネルギー代謝には有意な変化がなかった（図１２Ｅ〜Ｈ）。したがって、血漿グリシン含有トリペプチド分子は、ＷＤＡＡＡ−Ｇｌｙを給餌したマウスにおいて増加し（図１２Ｉ）、脂肪細胞肥大の増加が、精巣上体脂肪組織及び皮下脂肪組織において認められた（ＥＡＴ及びＳＡＴ、図１２Ｊ）。ＷＤＡＡ＋Ｇｌｙに比べて、ＷＤＡＡ−Ｇｌｙを給餌したマウスでは、血漿ＴＣ及びＴＧが増加していた（図１３Ａ〜Ｄ）。ＷＤＡＡ−Ｇｌｙを給餌したマウスにおいて血漿グルコースの増加が認められたが、ＷＤＡＡ＋Ｇｌｙを給餌したマウスでは認められなかった（図１３Ｅ）。組織学及び脂質の定量化により、ＷＤＡＡ−Ｇｌｙ給餌後のＨＳの増加が明らかになった（図１３Ｆ〜Ｈ）。線形回帰分析により、血漿グリシンと血漿ＴＣ、グルコースまたは肝臓ＴＧの個々のレベルの間に有意な逆相関が示された（図１３Ｉ〜Ｋ）。したがって、食事性グリシン欠乏症は、高脂血症マウスにおいて、高脂血症、高血糖症及びＨＳを悪化させる。
【０３８１】
（ｉｖ） ＤＴ−１０９：グルコース／脂質二重低下特性を有するグリシン系トリペプチド
【０３８２】
上記の発見を考慮して、グリシン系化合物が、グルコース／脂質二重低下効果を介した治療可能性を有し得ると推論した。したがって、アミン基やカルボキシル基に様々な化学修飾を適用して、グリシンと構造的に類似した化合物を探索した。１０の潜在的な化合物が同定され（図９Ａ〜Ｋ）、そのうちの４つは経口投与に適していた。慢性的なグリシンの補給（１ｍｇ／ｇ／日）は、ａｐｏＥ−／−マウスにおいて循環ＴＧを低下させ、肥満型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて耐糖能を回復させ、脂肪減少を加速することを示した。ヒトでは、グルコースと一緒にグリシンを摂取すると、血漿グルコースの増加が＞５０％減弱した。グルコース低下効果を試験するために、グリシンまたはグリシン系化合物（０．５ｍｇ／ｇ）を投与したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を実施した。試験した化合物のいずれも、グリシンよりも効率的に血糖の増加を減弱させることはなかった（図１４Ａ〜Ｄ）。ヒトとマウスのグルコースを低下させると報告されている別のＡＡは、ロイシンである。発明者らの研究室の以前の研究では、ロイシンと組み合わせたグリシンのトリペプチド（ｇｌｙ−ｇｌｙ−Ｌ−ｌｅｕ）であるＤＴ−１０９の深刻なグルコース低下効果が明らかになった。ＯＧＴＴを使用して、ＤＴ−１０９またはそのＤ−異性体（ｇｌｙ−ｇｌｙ−Ｄ−ｌｅｕ、ＤＴ−１１０）を試験した。ＤＴ−１１０のグルコース低下効果はグリシンと同様であったが、ＤＴ−１０９は、特にその個々のＡＡの同等レベル（図１４Ｇ）と比較した場合に、グリシンよりも効率的にグルコースを低下させた唯一の化合物であった（図１４Ｅ、Ｆ）。
【０３８３】
脂質低下効果を試験するために、高脂血症のａｐｏＥ−／−マウスに、ＷＤを給餌するとともに、ＤＴ−１０９（１ｍｇ／ｇ／日）、同等レベルのロイシン、グリシン、またはＨ２Ｏを経口投与した（図１５Ａ）。１０週間後、ＤＴ−１０９は、ＯＧＴＴと非空腹時グルコースの両方で最も強力なグルコース低下効果を示した（図１５Ｂ、Ｃ）。食物摂取量または体重に有意差は観察されなかった（図１５Ｄ、Ｅ）。脂質特性分析により、ＤＴ−１０９で処置したマウスが、グリシン処置マウスで認められたＨＤＬの低下を伴わずに、最も低いＴＣ及びＬＤＬを有していたこと（図１５Ｆ〜Ｉ）、ならびに血漿ＴＧにおいて有意差を有していたこと（図１５Ｊ）が示された。グリシンまたはＤＴ−１０９は、ＥＡＴ及びＳＡＴにおいてグリシン含有トリペプチド分子及び脂肪細胞肥大を減少させた（図１５Ｋ、Ｌ）。組織学及び脂質の定量化により、グリシンまたはＤＴ−１０９で処置したがロイシンでは処置しなかったマウスの肝臓において、ＨＳの低下が明らかになった（図１６Ａ〜Ｃ）。ｑＰＣＲ分析により、グリシンまたはＤＴ−１０９で処置したマウスの肝臓においてＦＡＯを調節する重要な遺伝子（ＰＰＡＲα、ＰＮＰＬＡ２、カルニチン／アシルカルニチントランスロカーゼ、ＣＡＣＴ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１ａ、ＣＰＴ１ａ、及びアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ長鎖、ＡＣＡＤＬ）の上方制御ならびにＴＮＦαの有意な変化を伴わないＣＣＬ２の下方制御が明らかになった（図１６Ｄ）。したがって、ＤＴ−１０９は、グルコース／脂質二重低下特性を有し、高脂血症マウスにおけるＷＤ誘発性ＨＳを予防する。
【０３８４】
（ｖ） ＤＴ−１０９は、体組成を改善し、食事性ＮＡＳＨから保護する
【０３８５】
ＮＡＳＨに対するＤＴ−１０９の治療可能性をさらに調べるために、進行性ＮＡＦＬＤをモデル化するための実験的アプローチを考案した（図１７Ａ）。ＮＡＳＨ食餌を１２週間給餌したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＣＤを給餌した場合と比較して、血漿グルコース、ＴＣ、ＡＳＴ、及びＡＬＴが増加していた（図１７Ｂ）。マウスのサブセットを殺処分し、ＮＡＳＨ食餌を給餌した後の肝臓重量の増加を確認した（図１７Ｃ）。Ｈ＆Ｅ及びＯＲＯ組織学により、ＨＳ、肝細胞バルーニング及び炎症細胞の浸潤が明らかになったが、一方、シリウスレッド染色により、初期の線維症が確認された（図１７Ｄ）。ＮＡＳＨを確認した後（図１７Ｄ〜Ｆ）、残りのマウスを無作為化し、ＮＡＳＨ食餌下でさらに１２週間、強制経口投与を介して、０．１２５ｍｇ／ｇ／日もしくは０．５ｍｇ／ｇ／日のＤＴ−１０９、同等レベルのロイシン、グリシンまたはＨ２Ｏを投与した。マウスには、ＣＤを給餌し、対照としてＨ２Ｏを投与した。
【０３８６】
１８週目に、ＯＧＴＴ及び非空腹時グルコース測定により、０．５ｍｇ／ｇ／日のＤＴ−１０９で最も強力なグルコース低下効果が確認された（図１７Ｇ、Ｈ）。体組成分析により、ＮＡＳＨ食餌を給餌したすべてのマウスにおいて体重の増加が明らかになった（図１７Ｉ）が、０．５ｍｇ／ｇ／日のＤＴ−１０９で処置したマウスは、Ｈ２Ｏ対照と比較して、体脂肪が減少するとともに除脂肪体重が維持され（図１７Ｊ、Ｋ）、さらにＥＡＴ及びＳＡＴにおいて脂肪細胞肥大が減少（図１７Ｌ）し、食物摂取量には有意差がなかった（図１７Ｍ）ことが示された。食事性肥満に対する代謝応答は、ＲＥＲの低下を反映して、高脂肪対低炭水化物利用へのシフトを伴う。ＣＬＡＭＳ分析では、ＮＡＳＨ食餌を給餌したすべての群でＲＥＲが低下したが、０．５ｍｇ／ｇ／日のＤＴ−１０９で処置したマウスでは有意差が認められなかったことが明らかとなった（図１７Ｎ〜Ｐ）。エネルギー消費または活動に有意差は認められなかった（図１７Ｑ、Ｒ）。
【０３８７】
エンドポイントにおいて、ＮＡＳＨ食餌を給餌したマウスで観察された血漿ＡＳＴ、ＡＬＴ及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の増加は、グリシンまたはＤＴ−１０９処置によって減弱された（図１８Ａ〜Ｃ）。血漿ＴＧは、グリシンまたはＤＴ−１０９で処置したマウスで減少し（図１８Ｄ）、ＴＣは、０．５ｍｇ／ｇ／日のＤＴ−１０９で減少した（図１８Ｅ）。したがって、ＮＡＳＨ食餌誘発性肝腫大及び黄色がかった着色は、グリシンまたはＤＴ−１０９での処置によって著しく減弱されたが、ロイシンでは減弱されず（図１８Ｆ、Ｇ、図１８Ｈ）、ＮＡＳは０．５ｍｇ／ｇ／日のＤＴ−１０９で有意に減少した（図１８Ｉ、図１８Ｊ）。線形回帰分析により、ＡＳＴ、ＡＬＴまたはＡＬＰの個々のレベルとＮＡＳとの間に非常に有意な正の相関が示された（図１８Ｋ〜Ｍ）。
【０３８８】
（ｖｉ） ＤＴ−１０９はＮＡＳＨ食誘発性トランスクリプトーム変化を逆転させる：ＦＡＯの重要な役割
【０３８９】
グリシン系治療薬によって食事性ＮＡＳＨから保護されるメカニズムを調べるために、エンドポイントで回収した肝臓のＲＮＡ配列決定を実施した。主成分分析（ＰＣＡ）により、ロイシンで処置したＮＡＳＨ食餌のマウス由来の遺伝子発現特性は、Ｈ２Ｏ対照とともにクラスター化し、グリシン及び０．１２５ｍｇ／ｇ／日については中間的なパターンとなり、一方、０．５ｍｇ／ｇ／日のＤＴ−１０９はＣＤマウスの近くにクラスター化したことが明らかとなった（図１９Ａ）。ボルケーノプロット分析により、ＮＡＳＨ食餌を給餌し、Ｈ２Ｏまたはロイシンで処置したマウスにおける、ＣＤと比較した主要なＤＥＧ変化（それぞれ３６０６または３１４５ＤＥＧ）が確認され、この変化は、０．１２５ｍｇ／ｇ／日または０．５ｍｇ／ｇ／日のグリシンまたはＤＴ−１０９で処置することによって著しく減少した（それぞれ、１３００、１０９３または６４２ＤＥＧ、図１９Ｂ）。上位５０ＤＥＧの分析は、ＤＴ−１０９（０．５ｍｇ／ｇ／日）とＣＤ群の類似性をさらに強く示している（図１９Ｃ）。ＮＡＳＨ食餌Ｈ２Ｏ対照とＣＤとを比較するパスウェイ解析により、グリシン生合成及びグリオキシル酸代謝を調節する経路の抑制、ならびにエネルギー代謝経路及びＦＡＯ経路とともに、ＡＧＸＴ１、ＳＨＭＴ１及びＳＡＲＤＨの下方制御が確認された。対照的に、既知のＮＡＳＨ関連炎症促進性／線維症経路は上方制御された（図１９Ｄ、Ｅ）。ＮＡＳＨ食餌Ｈ２Ｏ対照と０．５ｍｇ／ｇ／日のＤＴ−１０９との比較パスウェイ解析では、ＣＤと同様のパターンが示され、ＤＴ−１０９が、根底にある経路におけるＮＡＳＨ食餌誘発性の変化を逆転させたことを示している（図１９Ｆ）。ＮＡＳＨ病因の主要な態様に関与する５０個の遺伝子の分析（図１９Ｇ）では、ＦＡＯを調節する重要な遺伝子（ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲＧコアクチベーター１α）（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ／ＰＧＣ１α）、アシルＣｏＡオキシダーゼ１（ＡＣＯＸ１）、ＣＰＴ２、ＡＣＡＤＳ／Ｍ／Ｌ、ＨＡＤＨＡ／Ｂ、及びＡＣＯＴ３／４）が、ＣＤマウスにおいて過剰に出現し、Ｈ２Ｏまたはロイシンで処置したＮＡＳＨマウスにおいては抑制されたことが明らかとなった。ｑＰＣＲ及びウエスタンブロット分析によって確認されたように、これは、グリシンまたはＤＴ−１０９、特に０．５ｍｇ／ｇ／日での処置によって逆転した（図１９Ｈ、Ｉ、図１９Ｊ）。したがって、ＯＲＯ及び脂質の定量化により、Ｈ２Ｏまたはロイシンで処置したＮＡＳＨマウスの肝臓に顕著なＨＳが確認され、これはグリシンまたはＤＴ−１０９によって有意に減弱された（図１９Ｋ〜Ｌ、図１９Ｍ）。特に、肝障害及びＮＡＳＨを促進することが知られているジアシルグリセロール（ＤＡＧ）は、０．５ｍｇ／ｇ／日のＤＴ−１０９によって有意に減少した（図１９Ｎ）。したがって、グリシン系の治療薬は、ＦＡＯの障害を修正し、ＮＡＳＨ食事性ＨＳ及び脂肪毒性脂質を低減する。
【０３９０】
（ｖｉｉ） ＤＴ−１０９は、ＮＡＳＨ食事性の肝臓の炎症及び線維症を軽減する
【０３９１】
ＲＮＡ配列分析により、グリシン系の治療薬による重要な炎症性経路／遺伝子の抑制が明らかとなり（図１９Ｆ、Ｇ）、抗炎症の役割が示唆された。確かに、肝マクロファージの十分に確立されたマーカーであるＦ４／８０についての免疫染色は、ＮＡＳＨ食餌下でＨ２Ｏまたはロイシンで処置したマウス由来の肝臓で有意に増加したが、グリシンまたはＤＴ−１０９によって減弱された（図２０Ａ、Ｂ）。血漿中では、ＮＡＳＨ患者の既知の炎症マーカーである単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２）とレジスチンは、グリシンまたはＤＴ−１０９で処置したマウスでは低かった（図２０Ｃ、Ｄ）。したがって、ＲＮＡ配列決定により、炎症誘発性シグナル伝達調節因子をコードする遺伝子（ＮＦＫＢ１／２、ＲＥＬＢ、ＣＣＲ１／２／５、ＴＬＲ１／２／４、及びＴＮＦＲＳＦ１Ａ／９／１２）及びサイトカイン（ＴＮＦα及びＣＣＬ２／５）は、ＮＡＳＨ食餌を給餌し、Ｈ２Ｏまたはロイシンで処置したマウスでは上方制御され、グリシンまたはＤＴ−１０９では減弱された（図１９Ｇ）。これは、ｑＰＣＲ分析によって確認され、ＮＦＫＢ２、ＲＥＬＢ及びＴＮＦαは、グリシンまたはＤＴ−１０９のいずれかによって有意に下方制御され、一方、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２及びＣＣＲ５は、０．５ｍｇ／ｇ／日のＤＴ−１０９によってのみ下方制御された（図２０Ｅ）。
【０３９２】
ＲＮＡ配列決定はまた、ＴＧＦβシグナル伝達に関連する経路／遺伝子（ＴＧＦＢ１／２及びＴＧＦＢＲ１／２）及びＥＣＭリモデリング（ＣＯＬ１Ａ１／１Ａ２／３Ａ１／４Ａ１／４Ａ２、ＴＩＭＰ１／２及びＳＥＲＰＩＮＥ１）が、ＮＡＳＨ食餌によって上方制御され、グリシンまたはＤＴ−１０９によって減弱されたことを示した（図１９Ｆ、Ｇ）。実際、シリウスレッド及び線維症スコアリングに基づく組織学的分析では、ＮＡＳＨ食事性肝線維症に対して、グリシンまたはＤＴ−１０９が保護効果を有していたが、ロイシンは有していなかったことが明らかとなった（図２０Ａ、Ｆ、Ｇ）。線形回帰分析では、ＡＳＴ、ＡＬＴまたはＡＬＰの個々のレベルと線維症スコアとの間に非常に有意な正の相関が示され、グリシンまたはＤＴ−１０９がＮＡＳＨ食事性肝障害を軽減することが示された（図２０Ｈ、Ｉ、Ｊ）。グリシン系の治療薬がＴＧＦβを介した肝線維症を軽減するかどうかを試験するために、次にＳＭＡＤシグナル伝達を分析し、主にＤＴ−１０９によるＳＭＡＤ２のＳｅｒ４６５／４６７のリン酸化の減少を発見した（図２０Ｋ）。ｑＰＣＲ分析により、Ｈ２Ｏまたはロイシンを投与したＮＡＳＨマウス由来の肝臓において、ＴＧＦβ関連遺伝子が著しく上方制御され、それがＤＴ−１０９によって減弱されたことが確認された（図２０Ｌ）。したがって、ＨＳ及び脂肪毒性の低下と一致して、２つのグリシン系の治療薬は、ＮＡＳＨ食事性脂肪性肝炎及び線維症を軽減する。
【０３９３】
Ｉ． 考察
【０３９４】
脂質及びグルコースの代謝異常はＮＡＦＬＤの既知の特徴であるが、ＡＡ代謝の乱れはＮＡＳＨに関係していることが示唆された。特に、循環グリシンの低下はＮＡＦＬＤ患者で一貫して報告されているが、グリシン低下の原因とその治療の可能性は不明なままである。本明細書では、グリシンの可用性を制限するための遺伝的アプローチ及び食事療法的アプローチを使用して、ＮＡＦＬＤの発症においてグリシンが原因となる役割を担っているエビデンスを提供する。ＮＡＦＬＤの潜在的なグリシン系治療薬の探索において、ＤＴ−１０９は、グルコース／脂質二重低下効果を有し、マウスを食事性ＮＡＳＨから強力に保護するものとして同定された。
【０３９５】
本明細書に提示する結果は、ＮＡＦＬＤ患者に認められるグリシンレベルの低下が、肝臓のグリシン生合成遺伝子の抑制に関連していることを示している。特に、マウスとヒトの両方のＮＡＳＨで、発明者らは、グリオキシル酸からグリシンへの変換を触媒するＡＧＸＴ１の有意な抑制を見出し、ＡＧＸＴ１の発現がヒトの肝脂肪含有量と逆相関することを示した。ＮＡＳＨ患者またはマウスモデルにおいてＡＧＸＴ１が抑制されていることは報告されていたが、発明者らは、ＮＡＦＬＤにおいてＡＧＸＴ１が原因となる役割を担っていることを初めて報告する。ＡＧＸＴ１の変異は、グリオキシル酸からグリシンへの変換障害、及び腎不全につながる過剰な肝臓シュウ酸塩産生によって引き起こされる原発性高シュウ酸尿症１型の原因である。興味深いことに、ＡＧＸＴ１−／−マウス由来の肝臓のプロテオミクスにより、グルコースと脂質の代謝経路に有意な変化が示されたが、ＮＡＳＨにおけるＡＧＸＴ１の役割はこれまで評価されてこなかった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＡＧＸＴ１−／−マウスを生成したが、このマウスは、ＮＡＳＨ食餌での１２週間後には、悪化した高脂血症とＮＡＳＨをすでに示していた。ＡＧＸＴ１−／−マウスにおいて、ＦＡＯ経路の抑制が特定され、この抑制が、今度は脂肪性肝炎及び線維症を促進する。
【０３９６】
さらに、食事療法を適用してグリシンの利用可能性を制限し、グリシンを含むかまたは含まないＷＤを給餌した高脂血症マウスの脂質特性とＨＳを比較した。グリシン欠乏ＷＤを給餌したマウスで観察された脂肪症、高脂血症及びＨＳの増強は、様々なげっ歯類モデルで食餌性グリシンが脂肪減少を加速し、耐糖能を改善し、血漿脂質またはＨＳを減少させた以前の報告と一致している。興味深いことに、サンプルサイズが小さく、治療期間が短いにもかかわらず、グリシン前駆体であるセリンを補給した後、ＮＡＦＬＤ患者においてＨＳ及び血漿肝酵素の低下が認められた。脂肪性肝炎と線維症の共存を特徴とする進行性のＮＡＦＬＤモデルを使用した徹底的な調査で、マウスにおいて０．３３ｍｇ／ｇ／日の比較的低用量でグリシンを処置することによる保護効果を初めて報告する。
【０３９７】
グリシン系の化合物の探索中に、同定した化合物のいずれも、グリシンよりも効率的に血漿グルコースを低下させることはなかった。したがって、グリシンと、ヒトにおいてグルコースを低下させ、マウスにおいてＨＳを軽減することが報告されている別のＡＡであるロイシンとの組み合わせを試験した。特に、様々なＴ２Ｄモデルを適用して、発明者らの研究室は、遊離グリシン、ロイシンまたはそのジペプチドの組み合わせの効果を超える、トリペプチドｇｌｙ−ｇｌｙ−Ｌ−ｌｅｕの強力なグルコース低下効果を明らかにした。発明者らは、ＤＴ−１０９が、遺伝モデルと食事モデルを使用して、脂質特性、ＨＳ、及びＮＡＳＨも改善することを初めて示した。同等レベルのロイシンで処置したマウスでは有意な効果は観察されなかったが、グリシン処置後に代謝の利点が明らかになった。それにもかかわらず、ロバストなグルコース低下、高脂血症マウスにおけるＨＤＬレベルの維持、ＮＡＳＨ食餌による体組成の変化の予防、肝臓ＤＡＧの低減、及びＮＡＳの有意な減少を含むいくつかの結果は、高用量のＤＴ−１０９でのみ実証された。０．１２５ｍｇ／ｇ／日の低用量のＤＴ−１０９でも大きな利点が認められたことに留意すべきである。
【０３９８】
脂質過負荷はＮＡＳＨの病因の中心である。遊離脂肪酸が、肝臓に過剰に供給される場合及び／またはＦＡＯを介したそれらの排泄が損なわれている場合、それらは酸化ストレス及び脂肪性肝炎と線維症を促進する炎症促進性／線維形成性の経路を誘発する脂肪毒性種の基質として使用される。偏りのないトランスクリプトミクスを適用して、ＮＡＳＨマウス由来の肝臓において抑制された主要なＦＡＯ経路を同定し、これはＤＴ−１０９によって逆転され、その後ＨＳと脂肪毒性ＤＡＧが低減した。これは、グリシン系の治療薬が肝ＦＡＯ障害を正常化し、ＨＳと脂肪毒性を低下させ、それがＮＡＳＨの進行を減弱させ得ることを示している。実際、脂肪性肝炎と線維症を特徴とするモデルを使用して、組織学的、トランスクリプトミクス及び血漿分析によって明らかなように、グリシンまたはＤＴ−１０９が、ＮＡＳＨ食事性の肝臓／全身性の炎症及び線維症を減弱することが見出された。また、以前の研究では、内毒素血症のマウスにおけるグリシンの抗炎症効果及び肝保護効果が報告された。Ｔ２Ｄ患者では、３か月間のグリシン処置（５ｇ／日）が、ヘモグロビンＡ１ｃと血漿ＴＮＦＲ１を低下させた。
【０３９９】
まとめると、ＮＡＦＬＤにおけるグリシン代謝障害を特定した結果、グリシン系の治療薬が同定され、これは、肝臓のＦＡＯを調節することによって実験的ＮＡＦＬＤにおいて有効であることが証明された。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１１−１０】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１７−８】
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【図１７−９】
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【図１７−１０】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１８−７】
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【図１８−８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
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【図１９−７】
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【図１９−８】
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【図１９−９】
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【図１９−１０】
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【図１９−１１】
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【図１９−１２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２０−６】
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【図２０−７】
2021534243.tif 000120
【図２０−８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021534243.tif 000122
2021534243.tif 000123
2021534243.tif 000124
2021534243.tif 000125