(57)【要約】  組織能力を判定するための定量的組織病理学分析を実行するためのシステムおよび方法が開示される。いくつかの実施形態によれば、組織分類器を訓練する方法が提供される。本方法によれば、組織分類器を訓練することは、コントロールライブラリにおいてスライド画像内の検出される核の特徴フィンガープリントを生成し、それらの対応する特徴フィンガープリントに基づいてスライド画像をクラスタリングすることを含む。いくつかの実施形態によれば、訓練される組織分類器を利用するための方法が提供される。本方法によれば、訓練される組織分類器は、未知のスライド画像内の組織が、組織分類器の訓練中にクラスタリングされるスライド画像に対応するかどうかを判定する。【選択図】図１
2021524039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
定量的組織病理学的評価を実行するための組織分類器を訓練する方法であって、
スライド画像をバイナリスライド画像に変換することであって、前記スライド画像がコントロール画像のライブラリから選択され、前記コントロール画像のライブラリにおける各スライド画像が合格分類または不合格分類に関連付けられる、変換することと、
前記バイナリスライド画像内の１つ以上の核を検出することと、
検出される核ごとに、前記検出される核から特徴を抽出することであって、前記特徴が、前記バイナリスライド画像内の前記検出される核の特性を表し、前記検出される核の面積、前記検出される核の周囲長、前記検出される核の積分密度、または前記検出される核の真円度のうちの少なくとも１つを含む、抽出することと、
検出される核ごとに、前記特徴に基づいて、前記バイナリスライド画像に関連付けられる特徴フィンガープリントを生成することであって、前記特徴フィンガープリントが、前記特徴の処理から計算される数値である、生成することと、
前記バイナリスライド画像をクラスタに組み込むことであって、前記クラスタが、複数の画像を含み、第１の複数の画像の各々が対応する特徴フィンガープリントに関連付けられ、前記組み込むことが、前記特徴フィンガープリントを前記対応する特徴フィンガープリントと比較することに基づく、組み込むことと、
カットオフ高さを前記クラスタに適用して複数のグループを形成することであって、前記カットオフ高さが、前記クラスタの分散分析の多変量解析に基づいて前記複数のグループ内のグループの数を最小化する、形成することと、
前記複数のグループ内の第１のグループを、前記第１のグループが前記合格分類に関連付けられる第１のスライド画像を含む場合、ポジティブコントロールセットとして分類することと、
前記複数のグループ内の第２のグループを、前記第２のグループが前記不合格分類に関連付けられる第２のスライド画像を含む場合、ネガティブコントロールセットとして分類することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記組織分類器が、対象に移植するための組織の能力または品質を判定することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織が胸腺組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組織が、ヒト対象への移植のための同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物のスライスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト対象が、２２ｑ１１．２欠失に関連する完全なディジョージ症候群；コロボーマ、心臓欠損、後鼻孔閉鎖、成長もしくは精神遅滞、生殖器形成不全および耳の異常もしくは難聴症候群（ＣＨＡＲＧＥ）、またはフォークヘッドボックスタンパク質Ｎ１（ＦＯＸＮ１）欠損症に関連する無胸腺症、に罹患している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組織分類器が、コントロールライブラリにおいてスライド画像内の検出される核の特徴フィンガープリントを生成し、それらの対応する特徴フィンガープリントに基づいて前記スライド画像をクラスタリングすることによって、移植するための未知の組織の対象に移植するための組織の能力または品質を判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記未知の組織が胸腺組織である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記胸腺組織が、胸腺細胞の胸腺組織を部分的に除去するために、一定期間胸腺器官培地中での培養プロセスに供されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記期間が最大２１日である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記期間が約１２日〜約２１日である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記期間が約５日〜約９日である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養プロセスが胸腺間質の機能的構造を保存する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記胸腺間質が胸腺上皮細胞および線維芽細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組織が、血管組織、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖器組織、胃腸組織、骨および軟骨を含む骨格組織、脂肪組織、腱および靭帯を含む結合組織、羊膜組織、絨毛組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔面組織、眼組織からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記特徴フィンガープリントが、前記検出される核の面積、前記検出される核の周囲長、前記検出される核の積分密度、および前記検出される核の真円度の数値を含む測定値から生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
組織の未分類スライド画像の定量的組織病理学的評価を実行するための方法であって、
前記未分類スライド画像からヘマトキシリンチャネルを検出することであって、前記ヘマトキシリンチャネルが、組織の前記未分類スライド画像内の細胞核に関連付けられる、検出することと、
前記検出されるヘマトキシリンチャネルから特徴を抽出することであって、前記特徴が、バイナリスライド画像内の核の特性を表し、前記核の面積、前記核の周囲長、前記核の積分密度、または前記核の真円度のうちの少なくとも１つを含む、抽出することと、
前記特徴に基づいて、前記未分類スライド画像に関連付けられる特徴フィンガープリントを生成することであって、前記特徴フィンガープリントが、前記特徴の処理から計算される数値である、生成することと、
前記特徴フィンガープリントを、１つ以上のポジティブコントロールセットに関連付けられるフィンガープリントの第１のセットおよびネガティブコントロールセットに関連付けられるフィンガープリントの第２のセットと共クラスタリングすることであって、前記ポジティブコントロールセットが、合格分類に関連付けられるスライド画像の第１のセットを含み、前記ネガティブコントロールセットが、不合格分類に関連付けられるスライド画像の第２のセットを含む、共クラスタリングすることと、
前記共クラスタリングに基づいて、前記特徴フィンガープリントが前記合格分類または前記不合格分類に関連付けられるかどうかを判定することと、を含む、方法。
【請求項１７】
前記特徴フィンガープリントが、対象に移植するための前記組織の能力または品質を判定することができる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織が胸腺組織である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織が、ヒト対象に移植するための同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物のスライスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒト対象が、２２ｑ１１．２欠失に関連する完全なディジョージ症候群；コロボーマ、心臓欠損、後鼻孔閉鎖、成長もしくは精神遅滞、生殖器形成不全および耳の異常もしくは難聴症候群（ＣＨＡＲＧＥ）、またはフォークヘッドボックスタンパク質Ｎ１（ＦＯＸＮ１）欠損症に関連する無胸腺症、に罹患している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記特徴フィンガープリントが、コントロールライブラリにおいてスライド画像内の検出される核の特徴フィンガープリントを生成し、それらの対応する特徴フィンガープリントに基づいて前記スライド画像をクラスタリングすることによって、未知の組織の対象内に移植するための組織の能力または品質を判定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記未知の組織が胸腺組織である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記胸腺組織が、胸腺細胞の胸腺組織を部分的に除去するために、一定期間胸腺器官培地中での培養プロセスに供されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記期間が最大２１日である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記期間が約１２日〜約２１日である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記期間が約５日〜約９日である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養プロセスが胸腺間質の機能的構造を保存する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記胸腺間質が胸腺上皮細胞および線維芽細胞を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記組織が、血管組織、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖器組織、胃腸組織、骨および軟骨を含む骨格組織、脂肪組織、腱および靭帯を含む結合組織、羊膜組織、絨毛組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔面組織、眼組織からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
前記特徴フィンガープリントが、前記検出される核の面積、前記検出される核の周囲長、前記検出される核の積分密度、および前記検出される核の真円度の数値を含む測定値から生成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
組織のデジタル画像内のオブジェクトを分類するためのシステムであって、
スライド画像をバイナリスライド画像に変換するための手段であって、前記スライド画像がコントロール画像のライブラリから選択され、前記コントロール画像のライブラリにおける各スライド画像が合格分類または不合格分類に関連付けられる、手段と、
前記バイナリスライド画像内の核を検出するための手段と、
前記検出される核から特徴を抽出するための手段であって、前記特徴が、前記バイナリスライド画像内の前記検出される核の特性を表し、前記検出される核の面積、前記検出される核の周囲長、前記検出される核の積分密度、または前記検出される核の真円度のうちの少なくとも１つを含む、手段と、
前記特徴に基づいて、前記バイナリスライド画像に関連付けられる特徴フィンガープリントを生成するための手段であって、前記特徴フィンガープリントが前記特徴の処理から計算される数値である、手段と、
前記バイナリスライド画像をクラスタに組み込むための手段であって、前記クラスタが複数の画像を含み、第１の複数の画像の各々が対応する特徴フィンガープリントに関連付けられ、前記組み込むことが前記特徴フィンガープリントを前記対応する特徴フィンガープリントと比較することに基づく、手段と、
カットオフ高さを前記クラスタに適用して複数のグループを形成するための手段であって、前記カットオフ高さが前記クラスタの分散分析の多変量解析に基づいて前記複数のグループ内のグループの数を最小化する、手段と、
前記複数のグループ内の第１のグループを、前記第１のグループが前記合格分類に関連付けられる第１のスライド画像を含む場合、ポジティブコントロールセットとして分類するための手段と、
前記複数のグループ内の第２のグループを、前記第２のグループが前記不合格分類に関連付けられる第２のスライド画像を含む場合、ネガティブコントロールセットとして分類するための手段と、を含む、システム。
【請求項３２】
前記システムが、対象に移植するための組織の能力または品質を判定することができる、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記組織が胸腺組織である、請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
前記胸腺組織が、ヒト対象に移植するための同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物のスライスである、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記ヒト対象が、２２ｑ１１．２欠失に関連する完全なディジョージ症候群；コロボーマ、心臓欠損、後鼻孔閉鎖、成長もしくは精神遅滞、生殖器形成不全および耳の異常もしくは難聴症候群（ＣＨＡＲＧＥ）、またはフォークヘッドボックスタンパク質Ｎ１（ＦＯＸＮ１）欠損症に関連する無胸腺症、に罹患している、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
前記システムが、コントロールライブラリにおいてスライド画像内の検出される核の特徴フィンガープリントを生成し、それらの対応する特徴フィンガープリントに基づいて前記スライド画像をクラスタリングすることによって、未知の組織の対象に移植するための組織の能力または品質を分類する、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３７】
前記未知の組織が胸腺組織である、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記胸腺組織が、胸腺細胞の前記胸腺組織を部分的に除去するために、一定期間胸腺器官培地中での培養プロセスに供されている、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記期間が最大２１日である、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
前記期間が約１２日〜約２１日である、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４１】
前記期間が約５日〜約９日である、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４２】
前記培養プロセスが胸腺間質の機能的構造を保存する、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４３】
前記胸腺間質が胸腺上皮細胞および線維芽細胞を含む、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記組織が、血管組織、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖器組織、胃腸組織、骨および軟骨を含む骨格組織、脂肪組織、腱および靭帯を含む結合組織、羊膜組織、絨毛組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔面組織、眼組織からなる群から選択される、請求項３１に記載のシステム。
【請求項４５】
前記特徴フィンガープリントが、前記検出される核の面積、前記検出される核の周囲長、前記検出される核の積分密度、および前記検出される核の真円度の数値を含む測定値から生成される、請求項３６に記載のシステム。
【請求項４６】
分類器であって、
未分類スライド画像からヘマトキシリンチャネルを検出するための手段であって、前記ヘマトキシリンチャネルが、組織の前記未分類スライド画像内の細胞核に関連付けられる、手段と、
前記検出されるヘマトキシリンチャネルから特徴を抽出するための手段であって、前記特徴が、バイナリスライド画像内の核の特性を表し、前記核の面積、前記核の周囲長、前記核の積分密度、または前記核の真円度のうちの少なくとも１つを含む、手段と、
前記特徴に基づいて、前記未分類スライド画像に関連付けられる特徴フィンガープリントを生成するための手段であって、前記特徴フィンガープリントが前記特徴の処理から計算される数値である、手段と、
前記特徴フィンガープリントを、ポジティブコントロールセットに関連付けられるフィンガープリントの第１のセットおよびネガティブコントロールセットに関連付けられるフィンガープリントの第２のセットと共クラスタリングするための手段であって、前記ポジティブコントロールセットが、合格分類に関連付けられるスライド画像の第１のセットを含み、前記ネガティブコントロールセットが、不合格分類に関連付けられるスライド画像の第２のセットを含む、手段と、
前記共クラスタリングに基づいて、前記特徴フィンガープリントが、前記合格分類または前記不合格分類に関連付けられるかどうかを判定する手段と、を含む、分類器。
【請求項４７】
前記システムが、対象に移植するための組織の能力または品質を判定することができる、請求項４６に記載の分類器。
【請求項４８】
前記組織が胸腺組織である、請求項４７に記載の分類器。
【請求項４９】
前記胸腺組織が、ヒト対象に移植するための同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物のスライスである、請求項４８に記載の分類器。
【請求項５０】
前記ヒト対象が、２２ｑ１１．２欠失に関連する完全なディジョージ症候群；コロボーマ、心臓欠損、後鼻孔閉鎖、成長もしくは精神遅滞、生殖器形成不全および耳の異常もしくは難聴症候群（ＣＨＡＲＧＥ）、またはフォークヘッドボックスタンパク質Ｎ１（ＦＯＸＮ１）欠損症に関連する無胸腺症、に罹患している、請求項４９に記載の分類器。
【請求項５１】
前記システムが、コントロールライブラリにおいてスライド画像内の検出される核の特徴フィンガープリントを生成し、それらの対応する特徴フィンガープリントに基づいて前記スライド画像をクラスタリングすることによって、未知の組織の能力を分類する、請求項４６に記載の分類器。
【請求項５２】
前記未知の組織が胸腺組織である、請求項５１に記載の分類器。
【請求項５３】
前記胸腺組織が、胸腺細胞の前記胸腺組織を部分的に除去するために、一定期間胸腺器官培地中での培養プロセスに供されている、請求項５２に記載の分類器。
【請求項５４】
前記期間が最大２１日である、請求項５３に記載の分類器。
【請求項５５】
前記期間が約１２日〜約２１日である、請求項５３に記載の分類器。
【請求項５６】
前記期間が約５日〜約９日である、請求項５３に記載の分類器。
【請求項５７】
前記培養プロセスが胸腺間質の機能的構造を保存する、請求項５３に記載の分類器。
【請求項５８】
前記胸腺間質が胸腺上皮細胞および線維芽細胞を含む、請求項５７に記載の分類器。
【請求項５９】
前記組織が、血管組織、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖器組織、胃腸組織、骨および軟骨を含む骨格組織、脂肪組織、腱および靭帯を含む結合組織、羊膜組織、絨毛組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔面組織、眼組織からなる群から選択される、請求項４６に記載の分類器。
【請求項６０】
前記特徴フィンガープリントが、前記検出される核の面積、前記検出される核の周囲長、前記検出される核の積分密度、および前記検出される核の真円度の数値を含む測定値から生成される、請求項４６に記載の分類器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年７月６日に出願された米国特許仮出願第６２／６９４，８２９号の利益および優先権を主張し、その米国特許仮出願の主題は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
記載される実施形態は、生存可能な移植組織候補を判定するための組織サンプル内の細胞のデジタル画像の定量的組織形態学的分析を実行するための定量的アプローチに関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の調製を参照することによって理解され得るが、本発明のこの開示および請求項は、本発明のそのような実施形態に限定されない。
【０００４】
同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物は、先天性無胸腺症に起因するＴ細胞免疫不全（原発性免疫不全）の治療に、例えば、２２ｑ１１．２欠失に関連する完全なディジョージ異常（ｃＤＧＡ）、ならびにｃｈｄ７（クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質７）遺伝子およびフォークヘッドボックスタンパク質Ｎ１（ＦＯＸＮ１）欠損症の無胸腺症患者における変異に関連するＣＨＡＲＧＥ（コロボーマ、心臓欠損、後鼻孔閉鎖、成長または精神遅滞、生殖器低形成および耳の異常または難聴）症候群の治療に有用であることが示されている。先天性無胸腺症は、まれな致死的状態であり、現在、規制当局が承認した製剤を利用した薬物治療の選択肢を有さない。
【０００５】
胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）を維持する同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の実験的移植は、先天性無胸腺症の小児患者を治療するために成功裏に適用された（Ｍａｒｋｅｒｔ  ＭＬ，Ｄｅｖｌｉｎ  ＢＨ，ＭｃＣａｒｔｈｙ  ＥＡ，２０１０，“Ｔｈｙｍｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，”Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５（２）：２３６−４６；Ｍａｒｋｅｒｔ  ＭＬ，ｅｔ  ａｌ．，２００４，“Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｔｈｙｍｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＤｉＧｅｏｒｇｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，”Ｂｌｏｏｄ  １０４（８）：２５７４−２５８１；Ｍａｒｋｅｒｔ  ＭＬ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，“Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉＧｅｏｒｇｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４１（１６）：１１８０−１１８９  ２７）。
【０００６】
同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物は、Ｔ細胞が枯渇した胸腺組織スライスを部分的に生成するために調製、培養、最大２１日間保存される再生医療産生物であり、コンディショニングプロセスによってネイティブ胸腺と区別される。コンディショニングレジメンは、培養胸腺組織スライスからドナー胸腺細胞を部分的に枯渇させる。インビトロデータ（免疫組織化学）に基づいて、１２〜２１日の培養期間は、サイトケラチン抗体を使用して評価される上皮網を保存する。培養は、好ましくは、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で行われる。
【０００７】
培養プロセスは、以下に概説されるように、同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物のスライスの効果的な治療特性を最適化するために、以下の方法でドナー胸腺組織およびその中に含有される構成細胞の生物学的特性を大幅に修飾する。培養プロセスは、予め必要な生物学的特性を有する培養細胞／組織の定義された組成物が、対象への外科的移植に適した方法で得られ、対象の免疫系の再構築を可能にすることを保証する。培養プロセスは、胸腺細胞の喪失ならびにドナー胸腺組織切片における胸腺上皮細胞および他の間質細胞の相対的濃縮をもたらす。培養プロセスはさらに、胸腺細胞の枯渇およびＴＥＣの維持をもたらして、レシピエントの免疫系の再構築を可能にし、寛容がドナー胸腺におけるＨＬＡ抗原に対してレシピエントにおいて発達することを可能にする。全体として、製造プロセスは、胸腺細胞をドナー胸腺組織から除去し、胸腺間質（胸腺上皮細胞および線維芽細胞）の機能的構造を保存するように設計される。
【０００８】
無胸腺症患者における同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物（例えば、「ＲＶＴ−８０２」）の外科的投与は、機能的免疫系の発達をもたらす一連の事象につながる。レシピエントにおける同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の外科的配置後、Ｔ細胞は、ドナーＴＥＣおよびレシピエント樹状細胞（ＤＣ）によって教育される。レシピエントＤＣと関連したドナーＴＥＣは、移植されたドナー胸腺組織に対する寛容を可能にし、これは、培養胸腺組織片として移植される。これは、正常な胸腺と同じ寛容誘導である。レシピエントＤＣと関連したレシピエントＴＥＣは、自己免疫寛容につながる。
【０００９】
胸腺リンパ球形成については、同種移植片生検および末梢におけるレシピエントナイーブＴ細胞の存在によって文書化されていて（Ｍａｒｋｅｒｔ  ＭＬ，２０１０，；Ｍａｒｋｅｒｔ  ＭＬ，ｅｔ  ａｌ．，２００８，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｙｍｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８０（９）：６３５４−６３６４；Ｍａｒｋｅｒｔ  ＭＬ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，“Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ５４  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉＧｅｏｒｇｅ  ａｎｏｍａｌｙ  ｅｎｒｏｌｌｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｙｍｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ４４  ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ，”Ｂｌｏｏｄ  １０９（１０）：４５３９−４５４７２８）、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００１０】
治験同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物で治療された小児の研究は、混合リンパ球反応によるドナー主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）への寛容を示す（Ｃｈｉｎｎ  ＩＫ，Ｄｅｖｌｉｎ  ＢＨ，Ｌｉ  ＹＪ，＆  Ｍａｒｋｅｒｔ  ＭＬ，２００８，“Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｈｙｍｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤｉＧｅｏｒｇｅ  ａｎｏｍａｌｙ，”Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２６（３）：２７７−２８１）。加えて、同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の移植後、先天性無胸腺症を有する乳児は、エプスタインバールウイルスなどの感染を制御することができる（Ｍａｒｋｅｒｔ  ＭＬ，２０１４，Ｔｈｙｍｕｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｔｉｅｈｍ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ，ｅｄｓ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＫＥ  ＆  Ｓｔｉｅｈｍ  ＥＲ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），１ｓｔ  Ｅｄ，ｐｐ  １０５９−１０６７）。
【００１１】
歴史的に、同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の放出基準は、製造プロセスの中間点でのＨ＆Ｅおよび組織の免疫染色切片の組織病理学的評価を含んでいて、後に培養期間の５〜９日目に精製された。この組織病理学的評価は、能力アッセイとして機能し、委員会認定の病理医による定性分析として実施されている。組織スライスを切片化し、スライドに固定する前に、凍結またはホルマリン固定のいずれかによる評価のためにサンプルを調製した。この方法で調製されたサンプルは長期間にわたって安定していて、再分析を行うことができる。
【００１２】
２０年以上の開発履歴から入手できる過去のサンプルは、陽性の臨床転帰に関連付けることができるため、製品の品質を評価するための定量的組織学的アッセイの開発のために強力なデータセットを提供する。
【００１３】
新しいデジタル組織学的アッセイは、以前の臨床ロットおよび同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の実験ロットからのＨ＆Ｅスライドの走査画像を使用して開発された。これらの画像は、以下に説明するように、定量的放出アッセイへの展開のために分析された。
【発明の概要】
【００１４】
本明細書に完全に開示される実施形態には、スライド画像内に表される組織の全体的な核特性を定量的に評価するための方法が記載されている。
【００１５】
開示された実施形態の１つの用途は、組織分類器の訓練を通じて、患者に移植する前に組織の能力または品質を判定することができるアッセイの開発である。例えば、以下に説明するアプローチは、完全なディジョージ症候群患者の同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物のスライスの能力を判定するために適用され得る。記載される実施形態は、組織学的スライド画像分析に基づいて胸腺組織の能力を評価し、合格組織を合格分類におよび不合格組織を能力の不合格分類に関連付ける、同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物のスライス組織特性付けアッセイとして利用され得る。以下の図１に示すように、分類器は、未分類のスライド画像を入力として受信し、未分類のスライド画像の分析に基づいて、未分類のスライド画像内の組織が移植組織候補であるかどうかを判定する。
【００１６】
以下でさらに詳細に説明するように、説明される実施形態は、スライド画像のライブラリに基づく分類器の訓練を含む訓練フェーズと、分類されていないスライド画像で訓練される分類器を利用して分類されていないスライド画像に表される組織の能力を判定する分類フェーズとを説明する。訓練フェーズでは、組織組成および細胞生存能力に関連する核特性の定量的評価を通じて分類器を訓練する。訓練フェーズには、合格および不合格スライド画像における対応する核特性を認識するように分類器を訓練する合格および不合格スライド画像の両方の分析が含まれる。結果として得られる分類器は、組織移植後の免疫再構築の成功をもたらす履歴データに基づいて、合格および不合格の組成および生存能力特性を認識するアッセイを実施する。
【００１７】
一実施形態では、訓練フェーズは２つの部分を含む。第１の部分は、適切なメタデータ値、バックグラウンド値、および組織エントロピーについての適合性基準を生成するために使用される訓練データセットの検証を含み、定量分析に許容可能とみなされる許容範囲または値を規定してもよい。訓練データセットには、移植についての合格または不合格分類を有すると認識されるスライド画像が含まれる。これらは、例えば、病理医または他の医療専門家によって分析されたスライド画像であってもよい。第２の部分は、画像のポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループへのクラスタリングをもたらす、コントロールライブラリ内の画像に第１の部分で生成される許容範囲または値を適用することが含まれる。以下の明細書および実施例でさらに説明するように、各コントロールグループには、類似の特徴フィンガープリントを有することに基づいてグループリングされるスライド画像が含まれる。ポジティブコントロールグループには、移植の基準に合格になると判定される同様の特徴フィンガープリントを有するスライド画像が含まれ、ネガティブコントロールグループには、移植の基準に不合格になると判定される同様の特徴フィンガープリントを有するスライド画像が含まれる。
【００１８】
一実施形態では、次に、分類フェーズは、ポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループに基づいて新しいスライド画像を分析し、それぞれの特徴フィンガープリントに基づいて新しいスライド画像をクラスタリングする。次に、分類フェーズでは、新しいスライド画像がポジティブコントロールグループとネガティブコントロールグループのどちらでクラスタリングされているかに基づいて、新しいスライド画像の能力を判定する。
【００１９】
一実施形態では、特徴フィンガープリントは、培養胸腺細胞の４つの判定に基づく。これらには、「面積」、「真円度」、「積分密度」、および「周囲長」が含まれる。以下で説明するように、「面積」は核面積を示し、それは胸腺細胞よりも胸腺上皮細胞のほうが大きい。アポトーシスを起こしている細胞もより小さくなる可能性がある。「真円度」は、セルがどの程度真円であるかを示す。真円度は０〜１のスケールで示され、１は真円である。胸腺細胞は、胸腺上皮細胞と比較して真円度が高い。非生存細胞は、生存細胞と比較して真円度が低い。このように、両方の胸腺細胞が減少し、より多くの生存不能な細胞が組織スライスにおいて観察されることが予想されるため、真円度は培養時間の経過とともに減少すると予想され得る。分解されたサンプルはまた、生存不能な細胞が多くなり、それによって分布がより低い真円度にシフトするため、真円度が低下すると予想される。「積分密度」は、核がどの程度濃く染色されているかを表す。積分密度は、胸腺細胞について高く、均一に濃い染色を示した。胸腺上皮細胞は、濃く染色された縁、ほとんどが透明な核質を有し、顕著な濃い核小体がある。最後に、「周囲長」は、検出される核の輪郭を表す。周囲長は細胞の生存能力に関連付けられ、細胞が分解すると、核の輪郭が不規則になり、その周囲長が増加する。培養が進むにつれて全細胞に対するＴＥＣ細胞の割合が増加するにつれて、周囲長も増加する。周囲長の変化は、組織の分解と同様に、培養において時間経過とともに予想される。
【００２０】
記載される実施形態は、能力を判定するためにスライド画像の免疫組織化学（ＩＨＣ）およびヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）組織病理学を介した定性的ヒト駆動分析のみに依存する現在のアプローチに対する改善となる。これらの現在のアプローチは、現在の定性分析の有効性を低下させる多くの制限に悩まされていて、そのような定性分析を半定量的または定量的に行うことができないこと、およびヒトアッセイでは病理医が組織全体を評価できないことを含む。代わりに、病理医は、組織のスライス全体ではなく、組織の一部（個々の視野）のみを調べている。
【００２１】
さらに、記載される実施形態は、胸腺のような複雑な組織を分析するための従来のアプローチよりも特に効果的である。複雑な組織では、サンプル組織の向きによって結果の変動が著しく変化する可能性がある。例えば、形状（皮髄質比）が大きく異なる２つの別々のスライスは、どちらも許容できる能力を有する「良好な」サンプル（すなわち、合格分類）とみなされ得る。説明される実施形態は、この制限を回避し、したがって、すべての組織を分類するのに効果的である。
【００２２】
記載される実施形態は、既知の能力および有効性を有するスライド画像のライブラリを活用することによる定量分析に依存する。ライブラリにおけるスライド画像には、そのような組織を良好または不良の臨床転帰（例えば、生存か否か）に関連付けることによって、その特定の組織の能力についての基準に合格または不合格になったことが認識される組織の画像が含まれる。合格したスライド画像は合格分類に関連付けられ得、不合格になったスライド画像は不合格分類に関連付けられ得る。
【００２３】
説明される実施形態は、１つ以上のプロセッサ上で実行され得る。１つ以上のプロセッサは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、またはインターネット（例えば、クラウド）などのネットワーク上に共同設置または分散され得る。そのようなプロセッサのうちの１つ以上は、グラフィックスプロセッシングユニット（ＧＰＵ）であり得る。一実施形態では、ＧＰＵは、数学的に処理の多いアプリケーションを処理するように設計された特殊な電子回路であるプロセッサであり得る。ＧＰＵは、コンピュータグラフィックスアプリケーション、画像、映像などに共通の数学的に処理の多いデータなどの大きなデータのブロックの並列処理に効率的な並列構造を有し得る。１つ以上のプロセッサは、１つ以上のレベルのキャッシュを含むメモリに結合され得、制御ロジック（例えば、コンピュータソフトウェア）および／またはデータがそれに記憶され得る。
【００２４】
本開示の第１の態様は、定量的組織病理学的評価を実行するための組織分類器を訓練する方法を提供し、以下を含む：
スライド画像をバイナリスライド画像に変換することであって、スライド画像がコントロール画像のライブラリから選択され、制御画像のライブラリにおける各スライド画像が合格分類または不合格分類に関連付けられる、変換すること；
バイナリスライド画像内の１つ以上の核を検出すること；
各検出される核ごとに、検出される核から特徴を抽出することであって、特徴が、バイナリスライド画像内の検出される核の特性を表し、検出される核の面積、検出される核の周囲長、検出される核の積分密度、または検出される核の真円度統合のうちの少なくとも１つを含む、抽出すること；
各検出される核ごとに、特徴に基づいて、バイナリスライド画像に関連付けられる特徴フィンガープリントを生成することであって、特徴フィンガープリントが特徴の処理から計算される数値である、生成すること；
バイナリスライド画像をクラスタに組み込むことであって、クラスタが複数の画像を含み、第１の複数の画像の各々が対応する特徴フィンガープリントに関連付けられ、組み込むことが特徴リンガープリントを対応する特徴指紋と比較することに基づく、組み込むこと；
カットオフ高さをクラスタに適用して複数のグループを形成することであって、カットオフ高さを前記クラスタに適用して複数のグループを形成することであって、カットオフ高さが、クラスタの分散分析の多変量解析に基づいて複数のグループ内のグループの数を最小化する、形成すること；
複数のグループ内の第１のグループを、第１のグループが合格分類に関連付けられる第１のスライド画像を含む場合、ポジティブコントロールセットとして分類すること；ならびに、複数のグループ内の第２のグループを、第２のグループが不合格分類に関連付けられる第２のスライド画像を含む場合、ネガティブコントロールセットとして分類すること。
【００２５】
本開示の第２の態様は、組織の未分類のスライド画像の定量的組織病理学的評価を実行するための方法であって、以下を含む：
未分類スライド画像からヘマトキシリンチャネルを検出することであって、ヘマトキシリンチャネルが、組織の未分類スライド画像内の細胞核に関連付けられる、検出すること；
検出されるヘマトキシリンチャネルから特徴を抽出することであって、特徴が、バイナリスライド画像内の核の特性を表し、核の面積、核の周囲長、核の積分密度、または核の真円度のうちの少なくとも１つを含む、抽出すること；
特徴に基づいて、未分類スライド画像に関連付けられる特徴フィンガープリントを生成することであって、特徴フィンガープリントが特徴の処理から計算される数値である、生成すること；
特徴フィンガープリントを、１つ以上のポジティブコントロールセットに関連付けられるフィンガープリントの第１のセットおよびネガティブコントロールセットに関連付けられるフィンガープリントの第２のセットと共クラスタリングすることであって、ポジティブコントロールセットが、合格分類に関連付けられるスライド画像の第１のセットを含み、ネガティブコントロールセットが、不合格分類に関連付けられるスライド画像の第２のセットを含む、共クラスタリングすること；ならびに、
共クラスタリングに基づいて、特徴フィンガープリントが合格分類または不合格分類に関連付けられるかどうかを判定すること。
【００２６】
本開示の第３の態様は、組織のデジタル画像内のオブジェクトを分類するためのシステムであって、以下を含む：
スライド画像をバイナリスライド画像に変換するための手段であって、スライド画像がコントロール画像のライブラリから選択され、コントロール画像のライブラリにおける各スライド画像が合格分類または不合格分類に関連付けられる、手段；
バイナリスライド画像内の核を検出するための手段；
検出される核から特徴を抽出するための手段であって、特徴が、バイナリスライド画像内の検出される核の特性を表し、検出される核の面積、検出される核の周囲長、検出される核の積分密度、または検出される核の真円度のうちの少なくとも１つを含む、手段；
特徴に基づいて、未分類のスライド画像に関連付けられる特徴フィンガープリントを生成するための手段であって、特徴フィンガープリントが特徴の処理から計算される数値である、手段；
バイナリスライド画像をクラスタに組み込むための手段であって、クラスタが複数の画像を含み、第１の複数の画像の各々が対応する特徴フィンガープリントに関連付けられ、組み込むことが特徴フィンガープリントを対応する特徴フィンガープリントと比較することに基づく、手段；
カットオフ高さを前記クラスタに適用して複数のグループを形成するための手段であって、カットオフ高さが、クラスタの分散分析の多変量解析に基づいて複数のグループ内のグループの数を最小化する、手段；
複数のグループ内の第１のグループを、第１のグループが合格分類に関連付けられる第１のスライド画像を含む場合、ポジティブコントロールセットとして分類するための手段；ならびに、
複数のグループ内の第２のグループを、第２のグループが不合格分類に関連付けられる第２のスライド画像を含む場合、ネガティブコントロールセットとして分類するための手段。
【００２７】
本開示の第４の態様は分類器であって、以下を含む：
未分類スライド画像からヘマトキシリンチャネルを検出するための手段であって、前記ヘマトキシリンチャネルが、組織の未分類スライド画像内の細胞核に関連付けられる、手段；
検出されるヘマトキシリンチャネルから特徴を抽出する手段であって、特徴が、バイナリスライド画像内の核の特性を表し、核の面積、核の周囲長、核の積分密度、または核の真円度のうちの少なくとも１つを含む、手段；
特徴に基づいて、未分類スライド画像に関連付けられる特徴フィンガープリントを生成する手段であって、特徴フィンガープリントが、特徴の処理から計算される数値である、手段；
特徴フィンガープリントを、ポジティブコントロールセットに関連付けられるフィンガープリントの第１のセットおよびネガティブコントロールセットに関連付けられるフィンガープリントの第２のセットと共クラスタリングするための手段であって、ポジティブコントロールセットが、合格分類に関連付けられるスライド画像の第１のセットを含み、ネガティブコントロールセットが、不合格分類に関連付けられるスライド画像の第２のセットを含む、手段；ならびに、
共クラスタリングに基づいて、特徴フィンガープリントが合格分類または不合格分類に関連付けられているかどうかを判定する手段。
【００２８】
本開示の第１〜第４の態様の特定の実施形態では、方法、システムおよび分類器は、対象、好ましくは、ヒト対象の組織の能力または移植可能性を判定することができる組織分類器または組織分類器の使用を含み得る。
【００２９】
本開示の第１から第４の態様の特定の実施形態では、組織は、胸腺組織であり、好ましくは、ヒト対象に移植するための同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物のスライスである。
【００３０】
本開示の第１〜第４の態様の特定の実施形態では、ヒトは、２２ｑ１１．２欠失に関連する完全なディジョージ症候群；コロボーマ、心臓欠損、後鼻孔閉鎖、成長もしくは精神遅滞、生殖器形成不全および耳の異常もしくは難聴症候群（ＣＨＡＲＧＥ）、またはフォークヘッドボックスタンパク質Ｎ１（ＦＯＸＮ１）欠損症に関連する無胸腺症、に罹患している可能性がある。
【００３１】
本開示の第１〜第４の態様の特定の実施形態では、組織分類器は、コントロールライブラリにおけるスライド画像内の検出される核の特徴フィンガープリントを生成し、それらの対応する特徴指紋に基づいてスライド画像をクラスタリングすることによって、未知の組織、好ましくは、胸腺組織の能力を判定する。
【００３２】
本開示の第１〜第４の態様の特定の実施形態では、胸腺組織は、胸腺細胞の胸腺組織を部分的に除去するために、ある期間、胸腺器官培地中での培養プロセスに供されている。いくつかの実施形態では、期間は最大２１日である。他の実施形態では、期間は、約１２日〜約２１日、または約５日〜約９日である。
【００３３】
本開示の第１〜第４の態様の特定の実施形態では、培養プロセスは、胸腺間質の機能的構造を維持し、好ましくは、胸腺間質は、胸腺上皮細胞および線維芽細胞を含む。
【００３４】
本開示の第１〜第４の態様の特定の実施形態では、組織は、血管組織、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖器組織、胃腸組織、骨および軟骨を含む骨格組織、脂肪組織、腱および靭帯を含む結合組織、羊膜組織、絨毛組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔面組織、眼組織からなる群から選択される。
【００３５】
本開示の第１〜第４の態様の特定の実施形態では、特徴フィンガープリントは、検出される核の面積、検出される核の周囲長、検出される核の積分密度、および検出される核の真円度の数値を含む測定値から生成される。
【００３６】
さらに、明確にするために、本開示の異なる態様のおよび／または別個の実施形態における文脈に記載される、本明細書に記載される特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。本開示の単一の態様のおよび／または単一の実施形態における文脈に記載される様々な特徴はまた、別々にまたは任意の適切な部分組み合わせで提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
本明細書に開示される原理、およびその利点のより完全な理解のために、添付の図面と併せて以下の説明が参照される。
【００３８】
【図１】未分類のスライド画像の入力を受信し、未分類のスライド画像の分析および事前に確立された許容基準との比較に基づいて、未分類のスライド画像における組織が移植組織候補であるかどうかを判定する分類器の動作の概略図である。
【図２】クラスタが異なるグループａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅに区分された例示的なクラスタおよびクラスタ樹状図を示す。
【図３Ａ−３Ｄ】下には、背景ピクセル量が異なるスライド画像を示す。図３Ａは、適切な背景ピクセル量での組織サンプルを示すスライド画像を示す。図３Ｂおよび３Ｃは、背景ピクセルが多過ぎるスライド画像を示す。図３Ｄは、不十分な背景ピクセル数でのスライド画像を示す。
【図４Ａ−４Ｃ】核分裂の程度が異なるスライド画像を示す。図４Ａは、正しく分裂された核を有するスライド画像を示し、図４Ｂおよび４Ｃは、正しく分裂されていない核を有するスライド画像を示す。
【図５】胸腺組織標本のヘマトキシリン画像を分析する画像処理ステップを示す。図５は、ヘマトキシリンで染色された胸腺組織標本を示し、これは、分析対象のフィールドをボックス内の輪郭として識別し、中央の画像において拡大され、スライド画像の赤いチャネルに変換され、抽出されかつ反転されて右の画像においてバイナリ画像が形成される。
【図６Ａ−６Ｄ】組織が胸腺組織であり、抽出された特徴が面積、周囲長、積分密度、および真円度を含む、一実施形態における特徴抽出の例示的な結果を示す。図６Ａは、面積決定値を示す。図６Ｂは、周囲長決定値を示す。図６Ｃは、積分密度決定値を示す。図６Ｄは、真円度決定値を示す。
【図７】スライド画像用に生成されたフィンガープリントの表現を示す。フィンガープリントは、画像内の核の基本的な特徴を定量的に表す。
【図８】デューク大学から受信された胸腺標本を含むクラスタリングステップからの生の出力の表現を示す。
【図９】訓練フェーズ中のグループ化ステップの結果を示す。図９には、胸腺組織の実験サンプルのスライド画像に基づいてクラスタリングされた複数のポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループが示されている。
【図１０】表２の各セグメントグループ内の集団間の差異の統計分析の結果例を示す。図１０は、各グループ内のスライド画像の集団が大幅に変化しなかったことを示し、これは、これらのスライド画像が同様の特徴フィンガープリントを共有していることを示す。
【図１１】スライド画像の例示的な分析のフローチャートである。一実施形態では、フローチャートは、上記の処理ステップを実行する分類器によって実施される。スライド画像を先ず、評価して、画像が分類ステップ中に分析するのに適しているかどうかが判定されてもよい。
【図１２Ａ−１２Ｄ】胸腺組織のスライド画像の特定の抽出された特徴に基づいて例示的な特徴フィンガープリントを示す仮想例である。図１２Ａは、核の面積に対して生成された特徴フィンガープリントのポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループに関連付けられるスライド画像間の違いを示す。図１２Ｂは、核の周囲長に対して生成された特徴フィンガープリントにおけるポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループに関連付けられたスライド画像間の違いを示す。図１２Ｃは、核の積分密度に対して生成された特徴フィンガープリントのポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループに関連付けられたスライド画像間の違いを示す。図１２Ｄは、核の真円度に対して生成された特徴フィンガープリントのポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループに関連付けられたスライド画像の違いを示す。
【図１３Ａ−１３Ｆ】分類器の例示的な適用から、陽性および陰性の対照群を有する皮質胸腺細胞の例示的なスライド画像までの特徴の指紋を示す。図１３Ａは、ポジティブコントロールグループに関連付けられた胸腺組織の例示的なスライド画像である。図１３Ｂは、ネガティブコントロールグループに関連付けられた胸腺組織の例示的なスライド画像である。図１３Ｃは、真円度決定値に関連付けられた特徴フィンガープリントを示す。図１３Ｄは、面積決定値に関連付けられた特徴フィンガープリントを示す。図１３Ｅは、積分密度決定値に関連付けられた特徴フィンガープリントを示す。図１３Ｆは、周囲長決定値に関連付けられた特徴フィンガープリントを示す。
【図１４Ａ−１４Ｄ】臨床的かつ分解された培養胸腺組織の核を示す。図１４Ａ〜１４Ｃは、培養された胸腺臨床組織サンプルの３つのバッチを表す。図１４Ｄは、分解された胸腺組織を表す。
【図１５】組織面積について正規化された１日当たりの細胞数の傾向を示す。
【図１６Ａ−１６Ｂ】培養プロセス０日目の胸腺組織の画像である。図１６Ａは、０日目の培養されるＨ＆Ｅ染色胸腺組織の写真である。図１６Ｂは、４０倍の倍率での培養されたＨ＆Ｅ染色胸腺組織の一部のクローズアップ拡大写真である。
【図１７Ａ−１７Ｂ】培養プロセス５日目の胸腺組織の画像である。図１７Ａは、５日目の培養されたＨ＆Ｅ染色胸腺組織の写真である。図１７Ｂは、４０倍の倍率での培養されたＨ＆Ｅ染色胸腺組織の一部のクローズアップ拡大写真である。
【図１８Ａ−１８Ｂ】培養プロセス９日目の胸腺組織の画像である。図１８Ａは、９日目の培養されたＨ＆Ｅ染色胸腺組織の写真である。図１８Ｂは、４０倍の倍率での培養されたＨ＆Ｅ染色胸腺組織の一部のクローズアップ拡大写真である。
【図１９Ａ−１９Ｂ】培養プロセス１２日目の胸腺組織の画像である。図１９Ａは、１２日目の培養されたＨ＆Ｅ染色胸腺組織の写真である。図１９Ｂは、４０倍の倍率での培養されたＨ＆Ｅ染色胸腺組織の一部のクローズアップ拡大写真である。
【図２０Ａ−２０Ｂ】培養プロセス２１日目の胸腺組織の画像である。図２０Ａは、２１日目の培養されたＨ＆Ｅ染色胸腺組織の写真である。図２０Ｂは、４０倍の倍率での培養されたＨ＆Ｅ染色された胸腺組織の一部の拡大倍率である。
【図２１Ａ−２１Ｅ】０、５、９、１２および２１日目の核の外観の変化を示す、０、５、９、２および２１日目のＨ＆Ｅ染色培養胸腺組織の画像である。図２１Ａは、核の高い割合がより高い積分密度を有し、胸腺細胞の数が多いことを示している。胸腺細胞が組織から洗い流されると、５日目（図２１Ｂ）、９日目（図２１Ｃ）、１２日目（図２１Ｄ）、２１日目（図２１Ｅ）の組織は、積分密度の著しい減少および胸腺上皮細胞のプロファイルにより類似したプロファイルを示す。
【図２２】同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の技術バッチからの積分密度決定値の時間経過を示すグラフである。胸腺細胞が組織から洗い流されると、５日目の組織は、統合密度の著しい減少と、胸腺上皮細胞のプロファイルにより類似したプロファイルを示す。エラーバーは平均から１Ｓ．Ｄ．である。
【図２３】真円度の測定値を示すグラフである。非常に高い真円度を有する細胞の数は、培養プロセス全体を通して時間経過とともに減少する。これは、真円度が低い核をもたらし、かつ真円度の高い胸腺細胞が洗い出されるアポトーシスが原因である可能性がある。真円度が低い０日目のサンプルの場合、それは、単一の核よりも真円度が低い単一のエンティティとして測定される胸腺細胞の凝集が原因であると考えられる。エラーバーは平均から１Ｓ．Ｄ．である。
【図２４】周囲長の測定値を示すグラフである。０日目０日目では、周囲長が長いセルの割合が大きくなり、これは、大きい周囲長の値をもたらす、プログラムで細胞の塊が単一の形状として読み取られることが原因である可能性がある。周囲長の増加は、胸腺細胞の洗い出しと、培養時間の経過とともにアポトーシスを起こしている細胞と、その結果としてのそのイベントによる周囲長の増加の組み合わせである可能性がある。エラーバーは平均から１Ｓ．Ｄ．である。
【図２５】面積の時間経過を示すグラフである。この手法では、ユークリッド距離（サンプルとグランドセントロイドと間の誤差の二乗和の平方根）を使用して、調査した４つの変数すべてを考慮したときの２つのサンプル間の類似性を測定した。参考のために、ユークリッド距離が短いほど、２つのサンプルは互いにより類似している。エラーバーは平均から１Ｓ．Ｄ．である。
【図２６】データの主効果プロットおよび交互作用プロットである。図２６に示すデータによって、培養胸腺組織が時間の経過とともに同様に挙動することが確認される。
【図２７】１日当たりの重心から胸腺までの距離の９５％の信頼区間を示すグラフである。
【図２８Ａ−２８Ｂ】病理医が赤色で輪郭を描いた胸腺上皮細胞の例示的な画像である。
【図２９】病理医が赤色で輪郭を描いた胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）の画像である。胸腺細胞は青色で輪郭が描かれている。
【図３０】Ｈ＆Ｅスライドからの総細胞数に対するＴＥＣの比率のプロットである。
【図３１】選択した組織領域に対して正規化された細胞の総数に対するＴＥＣの比率のプロットである。
【図３２】例としてグループ「Ｃ」と「Ｄ」との間の距離を示すクラスタ樹状図である。強調表示された緑および赤のボックスは、単一のグループ化を示す。これは、０．４３のカットオフｙ軸高さに基づいている。この例では、グループＣとＤは０．６の距離にあるため、２つの別個のグループであるとみなされる。各グループ内のサンプルは統計的に類似しているとみなされ、異なるグループ内のサンプルは統計的に異なるとみなされる。
【図３３】臨床的に良好なサンプルおよび確認された不良なサンプルすべてを有する訓練セットを示すグラフである。ボックスのあるクラスタは、強制的に分解されたサンプルである。
【図３４】最終的なサンプルライブラリを示している。左から右に、グループは、グループ４、グループ３、グループ２、およびグループ１という。グループ１、２および３は合格分類に関連付けられ、グループ４は不合格分類に関連付けられている。
【図３５Ａ−３５Ｄ】最終サンプルライブラリにおける各クラスタグループについての代表的な画像を示す。グループ１（図３５Ａ）、２（図３５Ｂ）、および３（図３５Ｃ）は、肯定的な臨床転帰のサンプルで構成されている。グループ４（図３５Ｄ）は、確認された分解サンプルで構成されている。グループ１のサンプルはＬＯＴ−３４５由来、グループ２のサンプルはＬＯＴ−１６０由来、グループ３のサンプルはＬＯＴ−１９４由来、グループ４のサンプルはＦＤ．ＳＰ１７−４０３４８−Ｃ１．１（分解方法：−２０℃で凍結）由来である。
【図３６Ａ−３６Ｄ】グループごとに分けられた、様々なパラメータのグラフ表示である。図３６Ａは、面積決定値に関するデータのクラスタのグラフ表示である。図３６Ｂは、真円度決定値に関するデータのクラスタのグラフ表示である。図３６Ｃは、積分密度決定値に関するデータのクラスタのグラフ表示である。図３６Ｄは、周囲長決定値に関するデータのクラスタのグラフ表示である。
【図３７】強調表示された、面積１０（赤）、真円度０．９（緑）、周囲長１８（青）、および積分密度１５００（黄色）の特徴を有するグループ１からの画像である。これらのグループは一般に、グループ間で最大の変動を示す。
【図３８】グループ１の細胞の面積測定値を示すヒストグラムである。
【図３９】グループ１の細胞の真円度測定値を示すヒストグラムである。
【図４０】グループ１の細胞の積分密度測定値を示すヒストグラムである。
【図４１】グループ１の細胞の周囲長測定値を示すヒストグラムである。
【図４２】強調表示された、面積１０（赤）、真円度０．９（緑）、周囲長１８（青）、および積分密度１５００（黄色）の特徴を有するグループ２の画像である。これらのグループは一般に、グループ間で最大の変動を示す。
【図４３】グループ２の細胞の面積測定値を示すヒストグラムである。
【図４４】グループ２の細胞の真円度測定値を示すヒストグラムである。
【図４５】グループ２の細胞の積分密度測定値を示すヒストグラムである。
【図４６】グループ２の細胞の周囲長測定値を示すヒストグラムである。
【図４７】強調表示された、面積１０（赤）、真円度０．９（緑）、周囲長１８（青）、および積分密度１５００（黄色）の特徴を有するグループ３からの画像である。これらのグループは一般に、グループ間で最大の変動を示す。
【図４８】グループ３の細胞の面積測定値を示すヒストグラムである。
【図４９】グループ３の細胞の真円度測定値を示すヒストグラムである。
【図５０】グループ３の細胞の積分密度測定値を示すヒストグラムである。
【図５１】グループ３の細胞の周囲長測定値を示すヒストグラムである。
【図５２】強調表示された、面積１０（赤）、真円度０．９（緑）、周囲長１８（青）、および積分密度１５００（黄色）の特徴を有するグループ４からの画像である。これらのグループは一般に、グループ間で最大の変動を示す。
【図５３】グループ４の細胞の面積測定値を示すヒストグラムである。
【図５４】グループ４の細胞の真円度測定値を示すヒストグラムである。
【図５５】グループ４の細胞の積分密度測定値を示すヒストグラムである。
【図５６】グループ４の細胞の周囲長測定値を示すヒストグラムである。
【図５７】ビンごとのグループ間およびグループ内の変動性の分析のプロットである。データは、先ずグループごとに、次にパラメータに対するビンごとにｘ軸上に示される。各パラメータの上のグラフは個々のものであり、下のグラフはそのグループの標準偏差である。両者ともデータの広がりを視覚化するために使用できる。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書で提供されるタイトル、見出し、および小見出しは、本開示の様々な態様を限定するものとして解釈されるべきではない。したがって、以下で定義される用語は、明細書全体への参照によってより完全に定義される。本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。
【００４０】
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本出願では、「または」の使用は、特に明記されない限り、「および／または」を意味する。複数の従属請求項の文脈では、「または」の使用は、代替の場合のみ、複数の先行する独立または従属請求項に戻って参照される。
【００４１】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」、ならびに任意の単語の単数形の使用は、１つの指示対象に明確かつ明白に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書で使用される場合、「含む」という用語およびその文法上の変形は、リスト中の項目の列挙が、列挙された項目に置換または追加することができる他の同様の項目を除外しないように、非限定的であることが意図される。
【００４２】
本発明は、以下の定義を参照して最も明確に理解される：
【００４３】
「約」という用語は、本明細書では、およそ、ほぼ、大体、または前後を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲とともに使用される場合、それは、記載される数値の上下に境界を拡張することによって、その範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、本明細書では、＋／−１０％の分散によって、述べられた値の上下の数値を変更するために使用される。本明細書で使用される場合、約という用語は、明示的に示されるかどうかに関係なく、例えば、整数、分数、およびパーセンテージを含む、数値を指す。約という用語は、一般に、当業者が列挙された値と同等であるとみなす（例えば、同じ関数または結果を有する）数値の範囲（例えば、列挙された範囲の＋／−５〜１０％）を指す。数値または範囲のリストに先立って少なくともおよび約などの用語が使用される場合、用語は、リストにおいて提供される値または範囲のすべてを変更する。いくつかの場合では、約という用語は、最も近い有効数字が四捨五入された数値を含み得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの含むことの任意の形態）、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの有することの任意の形態）、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含むことの任意の形態）、または「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含有することの任意の形態）は、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。加えて、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて使用される用語は、「〜からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「〜から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語と併せて使用することができることも理解される。
【００４５】
本明細書で使用される「組織」という用語は、ヒトまたは動物における任意のタイプの組織を指し、これらに限定されないが、血管組織、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖器組織、胃腸組織、骨および軟骨を含む骨格組織、脂肪組織、腱および靭帯を含む結合組織、羊膜組織、絨毛組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔面組織、眼組織を含む。
【００４６】
本明細書に記載されるように、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲、または整数範囲は、特に示されない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（整数の１／１０および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。範囲は、概算であり、整数よりも変動し得る。
【００４７】
単位、接頭辞、および記号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で承認された形式で示される。数値範囲は、範囲を定義する数値を含める。測定値は、有効数字および測定に関連する誤差を考慮して、概算であると理解される。
【００４８】
さらに、明確にするために、別個の実施形態の文脈において記載される、本明細書に記載される特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈において記載される様々な特徴は、別々にまたは任意の適切な部分組み合わせで提供することもできる。
【００４９】
「面積」はμｍ２で報告される。核面積は、胸腺細胞に対してよりも胸腺上皮細胞に対してのほうが大きい。アポトーシスを起こしている細胞もより小さくなる可能性がある。
【００５０】
「円形度」は、細胞がどの程度の円形であるかの尺度である。真円度は０〜１のスケールで示され、１は真円である。胸腺細胞は、胸腺上皮細胞と比較して真円度が高い。非生存細胞は、生存細胞と比較して真円度が低い。このように、両方の胸腺細胞が減少し、より多くの生存不能な細胞が組織スライスにおいて観察されることが予想されるため、真円度は培養時間の経過とともに減少すると予想され得る。分解されたサンプルはまた、生存不能な細胞が多くなり、それによって分布がより低い真円度にシフトするため、真円度が低下すると予想される。
【００５１】
「積分密度」は、核がどの程度濃く染色されているかを表す。均一に濃い染色を示す胸腺細胞に対する積分密度は高い。胸腺上皮細胞は、濃く染色された縁および顕著に濃い核小体を備えたほとんど透明な核質を有する。
【００５２】
「周囲長」は、検出される核の輪郭を表し、μｍで報告される。周囲長は細胞の生存能力に関連付けられ、細胞が分解すると、核の輪郭が不規則になり、その周囲長が増加する。培養が進むにつれて全細胞に対するＴＥ細胞の割合が増加するにつれて、周囲長も増加する。周囲長の変化は、組織の分解と同様に、培養において時間経過とともに予想される。
【００５３】
定量的組織学的方法の概要
開発された定量的組織学的方法は、同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物と統計的および生物学的に関連性を有すると判定された特性に基づいて画像のようにクラスタリングする画像ベースのアルゴリズムである。被走査Ｈ＆Ｅ組織学的スライドが作成される。スライドは、ＳＣＮ画像またはＴＩＦＦ画像のどちらかとして検証済みの胸腺組織分析ソフトウェアにアップロードされる。アップロードされるファイルがＳＣＮ画像の場合、アルゴリズムは分析のためにそれをＴＩＦＦ画像に変換する。エオシン染色で強調表示された核がここで白い背景で黒い形状になるように、画像の赤いチャネルが抽出され、次いで反転される。
【００５４】
次に、面積、周囲長、積分密度（形状の暗さ）、および真円度が各核について測定される。次に、これらの属性の度数分布は、データベースにおける既知の良好なサンプルおよび不良なサンプルと比較され得る。次に、属性に対して統計的クラスタリング比較が実行されて、新しい入力サンプルが既知のサンプルと統計的に類似しているかどうかが判定され、したがって、以前に識別された基準に従って「合格」または「不合格」として判定され得る。
【００５５】
同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の臨床およびＲ＆Ｄ  Ｈ＆Ｅスライドの選択について、４０倍または２０倍の倍率で走査された。次に、定量的組織学的方法の開発のために画像がアップロードされた。
【００５６】
スライドを定量化するために、先ず画像を分析して、画像から属性データを抽出され得るようにした。これを実現するために、画像はＴＩＦＦ  ＦＧＰ形式に変換され、次いで、ＩｍａｇｅＪを介して画像処理アルゴリズムによって処理され、画像は１μｍ／ｐｉｘｅｌに較正され、赤いチャネルが抽出され、次いで、赤いチャネルが反転され、したがって、より濃い染色された核がより高いピクセル強度をもたらす。この分析の描写については、図５Ａ〜Ｃを参照されたい。
【００５７】
画像分析が画像間で一貫していることを保証するために、閾値が決定され、核の選択のための適切な値に設定された。面積で１０μｍ２を超える、連続したピクセルの領域としてここで定義される画像が粒子（細胞核）について分析される。次に、面積、周囲長、幅などを含む各粒子についてのパラメータが抽出された（評価されたパラメータの全リストについては、表１を参照されたい）。
【００５８】
最初に分析された組織集団における主成分分析によって統計的に有意であると判定された特徴は、面積、周囲長、積分密度、および真円度であった。他の特徴は、サンプルを区別するのに役立たないことが判明し、その後はもはや分析されなくなった。
【００５９】
図１４Ａ〜１４Ｄは、臨床的に培養された胸腺組織サンプル（図１４Ａ〜１４Ｃ）の３つのバッチおよび分解された胸腺組織サンプルを示す。図１４Ａに示されているサンプルの面積、周囲長、積分密度、および真円度の４つの特徴は次のとおりである：面積＝１１．３４、真円度＝０．６９６、周囲長＝１４．３１０および積分密度＝１８８９．２。図１４Ｂに示されているサンプルの面積、周囲長、積分密度、および真円度の４つの特徴は次のとおりである：面積＝１１．４１、真円度＝０．９９３、周囲長＝１１．９８２および積分密度＝１９１２．４。図１４Ｃに示されているサンプルの面積、周囲長、積分密度、および真円度の４つの特徴は次のとおりである：面積＝１０．５３、真円度＝０．８４６、周囲長＝１２．５１０および積分密度＝１７０７．４。図１４Ｄに示されているサンプルの面積、周囲長、積分密度、および真円度の４つの特徴は次のとおりである：面積＝１３．０、真円度＝０．３５２、周囲長＝２１．５５６および積分密度＝１７８６．０。各画像の単一の核は円で識別される。
【００６０】
核ごとに４つのパラメータが記録されると、スライド全体にわたる核の分布を示すために、パラメータごとに度数分布が作成される。一般に、各スライドには１００，０００を超えるデータポイントが存在する。分布内の各パラメータのビン幅およびカットオフは、スライド間でまだ変動性を示している最も少ないビンを選択することによって決定された。各ビン内の核の割合が決定され、それらの値がクラスタリング分析に使用される。
【００６１】
定量分析およびクラスタリングの概要
本明細書で説明する定量分析は、デジタルパソロジーへの偏りのない／創発的なアプローチである。訓練フェーズおよび分類フェーズの両方に、各画像の特徴フィンガープリントを生成するためのコンピューター化された特徴抽出が含まれる。一実施形態では、特徴フィンガープリントは、各画像の基礎となる核特徴を表す。細胞の特徴抽出を利用することによって、各スライド画像に表される組織内の基礎となる細胞集団の定量的特性評価が可能になる。両方のフェーズには、スライド画像内の各セルを表す定量的特徴によって組織学的セクションを分類するための統計的階層的凝集クラスタリング手法も含まれる。クラスタリング分析は、各スライド画像に対して生成されるフィンガープリント間の類似性に基づいて、スライド画像を異なるグループに分類する。一実施形態では、階層的凝集クラスタリングが、未知の組織の能力を判定するために組織分類器を訓練することと訓練された組織分類器を利用することの両方のために、画像分析のコンテキスト内で使用される。本開示のクラスタリングの実施形態の例は、以下の明細書、図および実施例に記載されている。例えば、限定としてではなく、クラスタリング手法について、図２、７〜９、３２以降、ならびに付随するテキストおよび表に対応付けて説明される。
【００６２】
組織分類のコンテキストでの階層的凝集クラスタリングには、基礎となるデータセットの創発的特性を明らかにするために、データから直接クラスタを組み立てることが含まれる。分類フェーズでは、一実施形態によれば、クラスタリング手法は、未知の組織の生成された特徴フィンガープリントの既知の組織の以前にクラスタリングされた特徴フィンガープリントとの類似性に基づいて未知の組織の分類（例えば、スライド画像のライブラリから）を可能にする。クラスタリング手法はまた、クラスタの中心点間の距離を示すクラスタ樹状図の相対的な高さの分析に依存する（図２を参照）。相対的な高さは通常、クラスタの数値的特徴間の違いに比例する（以下でさらに説明する）。
【００６３】
図２は、クラスタが異なるグループａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅに分けられている例示的なクラスタおよびクラスタ樹状図を示す。クラスタおよび／またはクラスタ樹状図の生成後、統計分析手法を適用して、統計的に有意に互いに異なるグループを判定し得る。統計分析手法の一例は、多変量分散分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ、ＭＡＮＯＶＡ）であり、これは、２つ以上（つまり複数）の変数を有するデータセット間の分散を判定するための手順である。
【００６４】
訓練および分類フェーズには、適合性の判定、画像処理、特徴抽出、およびクラスタリングのうちの１つ以上の工程が含まれ得る。
【００６５】
適合性の判定
適合性の判定は、スライド画像の特性を評価して、スライド画像が、開示された実施形態に記載されるようなさらなる定量分析に適しているかどうかを判定することを指す。適合性の判定は、画像の訓練セットおよび新しいスライド画像の両方に対して実行され得る。一実施形態では、スライド画像の適合性判定は、メタデータ分析、背景ピクセル分析（例えば、スライド画像に存在する背景ピクセルの量の検査）、および組織エントロピー（および核セグメンテーション）分析（例えば、スライド画像におけるエントロピー量の検査）を含む。
【００６６】
メタデータ分析
スライド画像のメタデータ分析は、スライド画像が定量分析に適切なメタデータプロパティを有するかどうかを判定する。考慮される可能性のあるメタデータの例としては、ファイル名（例えば、ファイル名が一意であるかどうか）、最終変更日（ファイルが最後に変更された日付）、ファイルサイズ（例えば、バイト単位での、ファイルのサイズ）、フォーマット（例えば、ＴＩＦなどのファイル種類）、画像の幅（例えば、ピクセル単位での、スライド画像の幅を含む値）、画像の高さ（例えば、ピクセル単位での、スライド画像の高さを含む値）、ビット深さ（スライド画像のカラーチャネルについての合計ビット数）、色の種類（画像の色の種類、例えば、ＲＧＢ）、ｘ解像度（例えば、Ｘ方向のスライド画像の解像度を表す値）、ｙ解像度（例えば、Ｙ方向のスライド画像の解像度を表す値）、解像度の単位（例えば、ｘ解像度およびｙ解像度の特性の単位を含む文字列）、画像の背景比率（総ピクセル数に対する背景ピクセルの量の比率）、背景ラベル（画像の背景ピクセルの量を表すラベル）、組織エントロピー（セグメント化された問題ピクセルのみを表すエントロピー）、および核セグメンテーションラベル（核セグメンテーション分析の成功を表すラベル）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
一実施形態では、スライド画像は、上記の１つ以上のメタデータプロパティの分析に基づく定量分析に適しているとみなされ得る。例えば、一実施形態では、上記のすべてのフィールドがスライド画像のヘッダ内に存在し、読み取り可能であり、スライド画像が０．８μｍ〜１．２μｍのｘ解像度および０．８μｍ〜１．２μｍのｙ解像度を有する場合、スライド画像は定量分析に適している。別の実施形態では、いずれかのフィールドが欠落しているか破損している場合、スライド画像は定量分析から除外され得る。
【００６８】
背景分析
背景ピクセルの分析は、組織の画像が、背景に関して分析される組織のビューを必要とするさらなる分析に適していることを保証するためのステップである。一実施形態では、定量分析は、スライド画像内の標準化された量の背景ピクセルを利用して、組織セグメンテーションおよび核セグメンテーション中に正確なセグメンテーションが行われることを保証する。背景ピクセルが多過ぎる画像（空の画像）または背景ピクセルが十分でない画像（トリミングされた画像）は、セグメンテーション分析（以下で説明）中にパフォーマンスが低下するため、背景ピクセルの範囲は、この範囲外の画像が開示される実施形態の定量分析を続行する前にスクリーニングされるように決定される必要がある。
【００６９】
背景分析の結果は、背景ラベル（例えば、合格または不合格）をスライド画像に関連付ける結果となり得る。例えば、図３Ａ〜３Ｄは、様々な量の背景ピクセルを有するスライド画像を示す。図３Ａは、適切な量の背景ピクセルでの組織サンプルを示すスライド画像を示す。一実施形態では、適切な量のピクセルを有するスライド画像は、さらなる分析に適しているとみなされる。この種類の画像は、第１の背景クラスとみなされ得る。
【００７０】
図３Ｂおよび３Ｃは、背景ピクセルが多過ぎるスライド画像を示す。一実施形態では、背景ピクセルが多過ぎるスライド画像は、さらなる分析には適さないとみなされる。この種類の画像は、第２の背景クラスとみなされ得る。
【００７１】
図３Ｄは、不十分な数の背景ピクセルを有するスライド画像を示す。一実施形態では、そのようなスライド画像は、さらなる分析には適さないとみなされる。この種類の画像は、第３の背景クラスとみなされ得る。
【００７２】
ここで、背景分析の例示的なステップについて説明する。スライド画像についての背景画像は、総ピクセル数に対する背景ピクセル数の比率に基づく分類間隔を使用して分類される。例えば、空の画像（例えば、図３Ｂ、３Ｃ）は、かなり高い画像背景比率（例えば、９５％）を示し、トリミングされた画像は、かなり低い画像背景比率（例えば、５％）を示し（例えば、図３Ｄ）、通常の量の背景ピクセルおよび組織を有する画像は、中程度の画像背景比率（例えば、２０％〜８０％）を示す（例えば、図３Ａ）。これらの値は、単なる例示であり、訓練セット内の画像の分析に基づいて動的に決定され得る。
【００７３】
背景分析は、訓練セット内の画像に対して（例えば、定量分析に適しているとみなされる値の適切な範囲を生成するために）、コントロールセットにおける画像に対して（例えば、コントロールセットにおける画像の背景値が生成される適切な範囲内にあるかどうかを判定するために）、および新しい不特定の画像のために、実行される。一実施形態では、スライド画像についての画像背景比率分類を判定することは、以下のステップを含むが、これらに限定されない。
【００７４】
一実施形態では、訓練セットのスライド画像の画像背景比分類を判定することは、以下のステップを含むが、これらに限定されない。
１．訓練セットにおけるすべての画像についての画像背景比を計算する。
ａ．正規化された画像ヒストグラムカウントを計算する。
ｂ．赤色チャネルからのすべての画像ピクセルで反転関数を使用して、背景ピクセルから組織ピクセルをセグメント化する（例えば、アプリケーションＩｍａｇｅＪのｏｔｓｕ＿ｄａｒｋ関数）。
ｃ．Ｎ＝２スライド画像のビット深度であるＮ個のビンを有するすべての画像ピクセルからヒストグラムカウントを生成する。
ｄ．すべてのヒストグラムカウントを画像における総ピクセル数で除算して、データを正規化する。
ｅ．閾値より大きいピクセルの割合を計算する。この割合は、画像背景比率を表す。
２．適切な数の背景ピクセル（例えば、合格）を有するとみなされる画像についての画像背景比率の分類間隔を計算する。
ａ．第１、第２、および第３の背景クラスの各々について、平均画像背景比率および標準偏差を計算する。
ｂ．分類範囲の上限を計算する。
ｉ．第１および第２の背景クラスについての平均画像背景比率間の中間点を計算する。この値は、受け入れられる分類間隔の上限として割り当てられ得る。
ｃ．分類範囲の下限を計算する。
ｉｉ．第１、第２および第３の背景クラスについての平均画像背景比率間の中間点を計算する。この値は、受け入れられる分類間隔の下限として割り当てられる。
【００７５】
一実施形態では、スライド画像の訓練クラスにおいて実行される前述のステップの結果によって、許容可能な背景範囲が生成される。この許容可能な背景範囲内の背景値を有するスライド画像は、さらなる定量分析に適しているとみなされ得る。次に、許容可能な背景範囲を適用して、コントロールライブラリ内の画像などの、訓練クラス外の新しい画像を分類し得る。例えば、第１の背景クラス（例えば、図３Ａ）を有する画像について計算される背景範囲内の背景比率を有すると判定される新しいスライド画像は、適切な量の背景ピクセルを有するとして分類され、分析の次のステップに受け入れられる。逆に、第１の背景クラスを有する画像について計算される背景範囲外の新しいスライド画像（例えば、図３Ｂ〜Ｄ）は拒否され、さらなる分析には進むことはない。
【００７６】
組織エントロピー分析
核セグメンテーション分析は、核ピクセルがスライド画像内の他のピクセルから適切に分離されていることを確認する。スライド画像の特徴フィンガープリントは、部分的に核の特徴に基づいているため、実施形態における定量分析には、正しくセグメント化された核ピクセルが必要である。核セグメンテーション分析の結果は、核セグメンテーションラベル（例えば、合格または不合格）をスライド画像に関連付ける結果をもたらし得る。
【００７７】
核セグメンテーション分析には、組織ピクセルのエントロピーを評価して、正確な核セグメンテーションが行われるように十分なエントロピーが存在することを確認することが含まれる。画像エントロピーは、熱力学的エントロピーと同様に、システム内の状態の数に対応する。多くの異なるピクセル値が画像間で均等に分布している画像は、状態の数が多いため、エントロピーが高くなる。ピクセル値が画像間で不均一に分布している画像は、状態の数が少ないため、エントロピーが低くなる。スライド画像における組織ピクセルのエントロピーを評価することによって、画像に適切なコントラストおよび鮮鋭性が存在することが保証され、スライド画像の定量分析に役立つ。組織のコントラストが低い画像は、通常の組織のコントラストの量を有する画像と比較してエントロピーが低くなる。核ごとのピクセルの数と配置は、それらの「特徴」に対応し、組織サンプルをクラスタリングするために使用される特徴フィンガープリントの生成に対応する。これらの特徴は、スライド画像の核ごとに異なる。一実施形態では、前の２つのステップ（メタデータ分析、画像背景）を通過した画像は、この組織エントロピー分析に進む。
【００７８】
訓練セットに適用すると、組織エントロピー分析により、画像内で受け入れられる組織エントロピーの範囲が作成される。一実施形態では、組織エントロピー分析は、以下のステップを含み得るが、これらに限定されない：
１．背景ピクセルからすべての組織ピクセルをセグメント化する。
ｉ．赤色チャネルのすべての画像ピクセルで反転関数を使用して、背景ピクセルから組織ピクセルをセグメント化する（例えば、アプリケーションＩｍａｇｅＪのｏｔｓｕ＿ｄａｒｋ関数）。
ｉｉ．エントロピー方程式を使用してすべての組織ピクセルのエントロピーを計算し、対応する値を保存する。エントロピー方程式の例を以下に示し、ここで、ＥＴはすべての組織ピクセルの組織エントロピーであり、ｐはビンｉにおける組織ピクセルの正規化されたヒストグラムカウントであり、Ｎはヒストグラムで使用されるヒストグラムビンの数である。
【数１】
2021524039.tif 000003
ｉｉｉ．スライド画像内のすべてのセグメント化された核のバイナリマスクを作成する（例えば、すべての組織ピクセルに関数ｏｔｓｕ＿ｄａｒｋを適用する）。バイナリマスクは特定の画像に対応し、使用されるピクセルを指す。バイナリマスクは通常、セグメンテーションが実行されるときに作成される。例えば、Ｈ＆Ｅ画像に対応するバイナリ核マスクは、元の画像と同じ次元の行列であり、核マスクは１ビットのみであり、所定の値（例えば、０または１）のみが含まれる。元の画像内の核の位置と一致するピクセル位置は、所定の値（例えば、１）を有し、非核ピクセルは、所定の値（例えば、０）を有する。
２．すべての画像について核セグメンテーションラベルを作成する。このラベルは、組織エントロピー分析に関して上記の画像処理ルーチンで実行された核セグメンテーションの成功を表す。核セグメンテーションは、元のスライド（例えば、Ｈ＆Ｅ）画像内の他のすべてのピクセルから核のピクセルを分離することである。核セグメンテーションが実行されるため、オブジェクト分析は画像内の細胞核に対してのみ実行される。
ｉ．核セグメンテーションの精度を決定する。例えば、このステップは、アプリケーションを使用して、正確なおよび不正確なセグメンテーションの例を提供する画像キーと比較して実行され得る。
１．特定の不透明度の値を使用して、バイナリ核マスクを赤いチャンネル画像にオーバーレイする（下の図４Ａ〜Ｃ）。
２．マスクが核の上に適切にオーバーレイされていると定義されている正しいセグメンテーションについて、所定の数の核（例えば、５０個）を調べる。
ａ．所定の数の核のうちの特定の数（例えば、４５個）以上の核が正しくセグメント化される場合、画像には、第１の核セグメンテーションラベル（例えば、「０」）が与えられ得る（図４Ａ）。
ｂ．特定の数より少ない核が正しくセグメント化されている場合、画像には、第２の核セグメンテーションラベル（例えば、「１」）が与えられ得離（図４Ｂ、Ｃ）。
３．第１の核セグメンテーションラベルが付いた画像の組織エントロピーの分類間隔を計算する。
ｉ．第１および第２の核セグメンテーションラベルを有する画像の各々についての平均組織エントロピーおよび標準偏差を計算する。
ｉｉ．分類範囲の下限を計算する。
１．第１および第２の核セグメンテーションラベルについての平均組織エントロピーの中間点を計算する。この値が、組織エントロピー範囲の下限として割り当てられる。
２．組織エントロピーの許容範囲は、ステップ３．ｉｉ．１で計算された範囲の下限から無限大まで及ぶ可能性がある。
【００７９】
一実施形態では、スライド画像の訓練クラスに対して実行された前述のステップの結果が、スライド画像における組織エントロピーについての許容可能な分類範囲を生成する。次に、許容可能な分類範囲を適用して、新しいスライド画像を分類することができる。組織エントロピー値が分類範囲の下限よりも大きいスライド画像（ステップ３．ｉｉ．１を参照）は、適切な量の組織エントロピーを有するとして分類され、この方法を使用した分析に受け入れられる。分類範囲の下限よりも小さい組織エントロピー値を有するスライド画像は拒否され、さらなる定量分析に進むことはない。
【００８０】
図４Ａ〜４Ｃは、核セグメンテーションの程度が異なるスライド画像を示す。図４Ａは、正しくセグメント化された核を有するスライド画像を示し、図４Ｂおよび４Ｃは、誤ってセグメント化された核を有するスライド画像を示す。
【００８１】
画像処理
スライド画像のヘマトキシリンチャネルは各細胞の核の特徴を表すため、このチャネルの分析に関して、画像処理機能について以下でさらに説明する。一実施形態では、ヘマトキシリン画像はエオシン画像から分離される。一実施形態では、画像処理ステップはまた、以下の図５Ａ〜Ｃに示されるように、分析のためにスライド画像をバイナリ画像に変換することを含み得る。一実施形態では、スライド画像（図５Ａ）は、同じ解像度およびスケールを使用して分析される。次に、核および対応する核の特徴を検出するために、ピクセルの連続領域がバイナリ画像から抽出される（図５Ｂを参照）。一実施形態では、スライド画像の赤いチャネルが抽出され、反転されて、図５Ｃに示されるようなバイナリ画像が形成される。一部のシステムでは、画像の赤いチャネルがスライド画像内の核の最良の画像を提供する。
【００８２】
特徴抽出
一実施形態では、特徴抽出ステップは、スライド画像において検出された各核の特徴を抽出し、抽出された特徴の各々について指紋を生成することを含む。一実施形態では、特徴は、数値の特徴値として表される。以下の表１は、例えば、検出可能であり、したがって各核について抽出できる特徴を示しているが、これに限定されない。核ごとに１つ以上の特徴が抽出され得る。例えば、特定の特徴が、様々な能力の適用の目的により関連している場合がある。すなわち、特定の機能が、合格になる組織と不合格になる組織との間で大幅に異なると判定される場合がある。
【００８３】
一実施形態では、分類される組織が胸腺組織（アッセイの一部である場合もあれば、その一部である場合もある）である場合、関連する抽出される特徴は、各検出される核の面積、各検出される核の周囲長、各検出される核の積分密度、および各核の真円度である。面積に関しては、胸腺細胞よりも胸腺上皮細胞のほうが核面積が大きい。周囲長は細胞の生存能力に関連付けられ、細胞が分解すると、核の輪郭が不規則になり、その周囲長が増加する。積分密度は胸腺細胞で高く、均一に濃い染色を示す。胸腺上皮細胞は、濃く染色された縁、ほとんどが透明な核質を有し、顕著な濃い核小体がある。胸腺細胞は、胸腺上皮細胞と比較して真円度が高い。非生存細胞は、生存細胞と比較して真円度が低い。
【００８４】
一実施形態では、積分密度は、検出される核のサイズおよび検出される核に関連付けられる暗さの値により表される。円形は、検出される核の円形形状の評価を表し、一実施形態では、範囲（例えば、０．０〜１．０、ここで、１．０は完全な円を表す）によって表され得る。
【表１】
2021524039.tif 000004
【００８５】
ここで、一実施形態によるスライド画像についての特徴フィンガープリントの判定について説明する。最初に、抽出される特徴ごとに数値フィンガープリントが作成される。例えば、上記の実施形態では、特徴フィンガープリントは、スライド画像内の核の面積、周囲長、積分密度、および真円度ごとに生成される。一実施形態では、ヒストグラムは、抽出される特徴（例えば、面積、周囲長、積分密度および真円度）の各々について生成される。各ヒストグラムは、特徴の特定の範囲（ビン）での結果の頻度を示す。特徴フィンガープリントは、各スライド画像について組み合わされたヒストグラムから生成される。クラスタリング（下記および以下に示す例で論じられる）は、抽出される特徴の統計分析に基づいている。ヒストグラムを図６Ａ〜６Ｄに示す。図６Ａ〜Ｄは、組織が胸腺組織であり、抽出される特徴が面積、周囲長、積分密度、および真円度を含む一実施形態における特徴抽出の例示的な結果を示す。図６Ａは、面積決定値を示す。図６Ｂは、周囲長決定値を示す。図６Ｃは、積分密度決定値を示す。図６Ｄは、真円度決定値を示す。
【００８６】
クラスタリング
一実施形態では、クラスタリングは、スライド画像の特徴フィンガープリントに基づいてクラスタを組み立てることを含み得る。一実施形態では、生成された特徴フィンガープリントについてのユークリッド距離行列が表にされている。次に、距離行列は、スライド画像のグループ内分散が最小化されるようにスライド画像の最適な配置を探すことによって、階層的凝集クラスタリングに使用され得る。
【００８７】
一実施形態では、特徴フィンガープリントは、上記のように抽出される特徴の組み合わされたヒストグラムから生成される各スライド画像についての数値によって表され得る。訓練フェーズでは、階層的凝集クラスタリングが、デューク（Ｍａｒｋｅｒｔ  Ｌａｂ）、強制分解（ＣＴ２）、製造（ＣＴ２）標本スライドなどの既知のデータセットを有するコントロール画像のライブラリからのスライド画像の特徴フィンガープリントに適用される。一実施形態では、クラスタリングはまた、統計分析を実行して、クラスタをグループに分離して、各グループ内のスライド画像間の統計的有意性を保証するカットオフ高さを判定することを含む。分類フェーズでは、未知のサンプルは、ライブラリからのスライド画像との共クラスタリングによって分類される。次に、未知のサンプルは、未知のサンプルが共同クラスタリングされるクラスタ内のグループに基づいて分類される。
【００８８】
以下の図７は、スライド画像用に生成された例示的な指紋の表現を示す。上記のように、フィンガープリントは、画像内の核の基礎となる特徴の定量的表現である。
【００８９】
以下の図８は、デューク大学から提供された組織サンプルからのデータを含むクラスタリングステップからの生の出力の例示的な表現を示す。
【００９０】
一実施形態では、クラスタリングステップは、クラスタのグループへの分離を含み得る。統計的に有意な方法で分離を実行するためのカットオフ高さを計算する必要がある。一実施形態では、カットオフ高さは、グループ間およびグループ間の対応する多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）を用いてカットオフ高さの体系的な増加を通じて計算され、選択されるカットオフ高さは、グループの数を最小化する一方で、グループ集団間の特徴フィンガープリントにおける差異の統計的有意性を最大化する。組織が胸腺組織であり、抽出される特徴に面積、周囲長、積分密度、および真円度が含まれる例示的な実験試験において、カットオフ高さ（例えば、０．４）が、クラスタを特定の数のグループ（例えば、９つ）に分離することをもたらすクラスタのセグメンテーションについて判定された。
【００９１】
例示的な実験試験では、グループが形成された後、グループ内のサンプルの集団が、能力基準に合格したと以前に判定されたサンプル（すなわち、合格分類とされる「良好な」サンプル）からのスライド画像からなる場合、グループはポジティブコントロールグループとして割り当てられた。これらのグループの例には、デュークおよび製造データセットが含まれる。グループ内のサンプルの集団が、能力基準に合格しなかったと以前に判定されたスライド（すなわち、分類に失敗した「不良」サンプル）からなる場合、グループはネガティブコントロールグループとして割り当てられた。これらのグループの例には、強制分解データセットが含まれていた。
【００９２】
以下の図９は、訓練フェーズ中のグループ化ステップの例示としての結果を示す。
【００９３】
図９は、胸腺組織のスライド画像に基づいてクラスタリングされた複数のポジティブおよびネガティブコントロールグループを示す。そのような実施形態では、能力についての単一の合格／不合格基準は存在し得ない。むしろ、複数の特徴が、サンプルを区別し、能力について考慮される場合がある。切片が採取される領域および組織のサイズなどのスライド画像における変動に基づいて、ポジティブコントロールグループ間でより多くの変動が存在する可能性がある。例えば、胸腺などのより複雑な組織の様々な領域から採取される切片は、様々な皮質髄質比（例えば、胸腺細胞、上皮網状細胞、およびハッサル体の数の分布）を有するが、尚も能力の合格基準を満たし得る。
【００９４】
一実施形態では、図９のコントロールグループについて以下の説明は、単に例示的なものであり、それぞれのコントロールグループの形成をもたらすスライド画像の可能な共通の特徴を説明することを意図している。コントロールグループは、それらに含まれるスライド画像内の他の特徴または特徴の組み合わせに基づいて形成され得る。図９の例では、図９の第１のネガティブコントロールグループ（「ネガティブコントロール１」）は、ハッサル体の存在、不十分に定義された髄質および皮質領域、および広範な壊死および線維症に基づいてグループ化された。図９における第２のネガティブコントロールグループ（「ネガティブコントロール２」）は、ハッサル体の存在が最小限またはまったくないこと、線維症および壊死、ならびに不十分に定義された延髄および皮質領域に基づいてグループ化された。図９における第３のネガティブコントロールグループ（「ネガティブコントロール３」）は、ハッサル体の存在が最小限またはまったくないこと、線維症および壊死、ならびに不十分に定義された髄質および皮質領域に基づいてグループ化された。
【００９５】
図９に示すポジティブコントロールグループに関して、この例では、図９の第１のコントロールグループ（「ポジティブコントロール１」）は、定義された皮質または髄質領域の欠如、ハッサル体の存在、およびリンパ球の量が少ないまたは正常に基づいてグループ化された。図９の第２のコントロールグループ（「ポジティブコントロール２」）は、正常な上皮細胞、正常な皮質および髄質領域、ハッサル体の存在、および正常な成熟Ｔ細胞の変化を伴うリンパ球の存在に基づいてグループ化された。図９の第３のコントロールグループ（「ポジティブコントロール３」）は、正常な上皮細胞、正常な皮質および髄質領域の存在、ハッサル体の存在、および正常な成熟Ｔ細胞の変化を伴うリンパ球に基づいてグループ化された。図９の第４のコントロールグループ（「ポジティブコントロール４」）は、リンパ球の量が少ないこと、髄質および皮質領域の程度が異なること、一部の組織では髄質から皮質に広がる壊死の存在、および無しから存在までの上皮細胞の変化に基づいてグループ化された。図９の第５のコントロールグループ（「ポジティブコントロール５」）は、正常な皮質および髄質領域、ハッサル体の存在、正常な胸腺細胞の分布、および正常な成熟Ｔ細胞の変化を伴うリンパ球に基づいてグループ化された。図９の第６のコントロールグループ（「ポジティブコントロール６」）は、ハッサル体の存在が最小限またはまったくないこと、皮質および髄質領域についての識別の欠如、および高度の線維組織に基づいてグループ化された。本開示の代替のクラスタリング技術は、本明細書の実施例に見出すことができる。
【００９６】
以下の表２および３は、共クラスタリング分析を実行した後にグループを形成する統計分析の例示的な結果を示す。一実施形態では、ＭＡＮＯＶＡ分析が実行される。表２は、共クラスタリング分析に基づくグループが、互いに大幅に異なるクラスタリングされたグループ間の集団をもたらしたことを示す。
【表２】
2021524039.tif 000005
【表３】
2021524039.tif 000006
【００９７】
図１０は、表２の各セグメント化グループ内の集団間の差異の統計分析の例示的な結果をさらに示す。図１０は、各グループ内のスライド画像の集団が大幅に変化しなかったことを示し、これは、それらのスライド画像が同様の特徴フィンガープリントを共有していることを示している。
【００９８】
表３は、ランダムに生成されたグループのうちのグループ（すなわち、共クラスタリングを実行しない場合の）が、各グループの集団間で統計的有意性をもたらさなかったことを示している。
【００９９】
一実施形態では、訓練段階の後、分類器は、ライブラリからのスライド画像のセグメント化されたグループ化を確立した。グループ化は、ポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループに分けられ、ポジティブコントロールグループには、移植の候補である（すなわち、合格分類）と以前に判定されたスライド画像が含まれ、ネガティブコントロールグループには、移植の候補ではない（すなわち、不合格分類）と以前に判定されたスライド画像が含まれる。
【０１００】
分類フェーズでは、分類されるサンプルスライド画像が分析されて、スライド画像内の組織の能力が評価される。スライド画像は、分析の準備として処理される。一実施形態では、これは、画像のバイナリ画像への変換を含む。次に、特徴検出が実行される。一実施形態では、ヘマトキシリンチャネル（すなわち、核）がスライド画像から抽出される。抽出されたチャネルについての特徴が判定される。特徴フィンガープリントは、抽出されるチャネルの特徴に基づいて生成される。一実施形態では、特徴フィンガープリントは、上記の図８に示されるようなヒストグラムによって表され得る。別の実施形態では、特徴フィンガープリントは、抽出されるチャネルの面積、周囲長、積分密度、および真円度の特徴から生成される。
【０１０１】
次に、生成される特徴フィンガープリントは、訓練フェーズ中に生成されたポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループの特徴フィンガープリントと比較され得る。一実施形態では、比較ステップは、生成される特徴フィンガープリントを、ポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループの特徴フィンガープリントと共クラスタリングすることを含む。
【０１０２】
共クラスタリング後、統計分析（例えば、ＭＡＮＯＶＡ）を実行して、生成される特徴フィンガープリントクラスタが統計的に有意な方法でポジティブコントロールグループまたはネガティブコントロールグループのいずれかと相関するかどうかを判定するために、形成されるクラスタを評価する。統計分析の結果が、統計的に有意なクラスタリングの欠如を、またはネガティブコントロールグループで特徴フィンガープリントクラスタが生成されたことを示す場合、スライド画像は、能力基準を満たしていないものとみなされ、不合格類に関連付けられ得るか、または分解について定性的に評価され得る。統計分析の結果がポジティブコントロールグループでのクラスタリングを示す場合、スライド画像は、能力基準に合格したとみなされ、合格分類に関連付けられ得る。
【０１０３】
以下の図１１は、スライド画像の例示的な分析のフローチャートを表している。一実施形態では、フローチャートは、上記のステップを実行する分類器によって実施される。スライド画像を先ず評価して、画像が分類ステップ中に分析されるのに適しているかどうかを判定し得る。そうでない場合、スライド画像は除外され、分析の適合性要件を満たしていないものと判定される。スライド画像が必要な適合性要件を満たしている場合、スライド画像は除外されずに分析される。分析には、上記の画像処理ステップ、特徴抽出ステップおよびクラスタリングステップの少なくとも１つが含まれる。試験結果の結果により、スライド画像の特徴フィンガープリントがポジティブコントロールグループまたはネガティブコントロールグループでクラスタリングされるかどうかの判定がもたらされ得る。下の図１１に示すように、ポジティブコントロールグループでクラスタリングされる場合、スライド画像は、能力基準を満たしているとみなされるため、合格分類に関連付けられ得る。ネガティブコントロールグループでクラスタリングされている場合、スライド画像は、能力基準を満たさないとみなされるため、不合格分類に関連付けられ得る。
【０１０４】
以下の表４は、分類フェーズが胸腺組織のスライド画像のライブラリに適用されたときの実験実施形態におけるネガティブコントロールグループおよびポジティブコントロールグループのスライド画像からの組織の対応する定性的特徴を表している。
【表４】
2021524039.tif 000007
【０１０５】
表５は、ネガティブコントロールグループ（ネガティブ１〜５とラベル付け）とポジティブコントロールグループ（ポジティブ１〜６とラベル付け）とに対応する特性を示す。
【表５】
2021524039.tif 000008
【０１０６】
一実施形態では、クラスタリングは、スライド画像内のすべての細胞の核の組成および特徴に基づく。胸腺細胞の場合、胸腺細胞は集団核の大部分を構成するため、分析に寄与する要因となる可能性がある。延髄および皮質胸腺細胞は、フィンガープリントに使用される特徴に基づいて、特徴フィンガープリントに異なるように寄与する。細胞集団における量的な違いは、クラスタリングにおける違いにつながる特徴フィンガープリントの量的な違いにつながる。胸腺細胞の組成は、組成の有意な変動が壊死、線維症、および一般的な分解を示すため、組織の健康状態を表す。クラスタリングは、同様のフィンガープリントパターンを共有するサンプルをグループ化し、したがって、それらの細胞集団の同様の特徴を共有する。フィンガープリントが統計的に大幅に異なるサンプル画像は、異なるグループにあるものである。
【０１０７】
特徴フィンガープリンティングはスライド画像内のすべての検出可能な核を評価するため、開示される定量分析および特徴フィンガープリント生成のための実施形態は、分類器が細胞集団のシフトを検出することを可能にする。培養中、胸腺細胞の総数は組織内で減少するはずである。ただし、皮質の髄質胸腺細胞に対する相対的な比率は一定に保たれるはずである。この比率の大幅な変更は、不均一な組織の分解または能力の低下を示している可能性がある。細胞集団における有意な変化は、定量的特徴フィンガープリントにおけるシフトとして検出される。皮質髄質胸腺細胞の比率の有意な変化（増加または減少）は、特徴フィンガープリントをネガティブコントロールグループにシフトさせるため、サンプルはネガティブコントロールサンプルでクラスタリングする。
【０１０８】
図１２Ａ〜１２Ｄは、胸腺組織のスライド画像の特定の抽出される特徴に基づく例示的な特徴フィンガープリントを示し得る仮想例である。図１２Ａは、核の領域について生成される特徴フィンガープリントにおけるポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループに関連付けられるスライド画像間の差異を示す。図１２Ｂは、核の周囲長について生成される特徴フィンガープリントにおけるポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループに関連付けられるスライド画像間の差異を示す。図１２Ｃは、核の積分密度について生成される特徴フィンガープリントにおけるポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループに関連付けられるスライド画像間の差異を示す。図１２Ｄは、核の真円度について生成される特徴フィンガープリントにおけるポジティブコントロールグループおよびネガティブコントロールグループに関連付けられるスライド画像間の差異を示す。
【０１０９】
図１３は、分類器の例示的な適用からの、ネガティブコントロールグループに関連付けられる胸腺組織の例示的なスライド画像およびポジティブコントロールグループに関連付けられる胸腺組織の例示的なスライド画像への特徴フィンガープリントを示す。面積特徴および積分密度特徴についてのフィンガープリントを含む特徴フィンガープリントは、ネガティブコントロールグループのスライド画像とポジティブコントロールグループのスライド画像との間の皮質胸腺細胞における違いを示す。
【０１１０】
本発明の好ましい実施形態では、組織の分類されていないスライド画像の定量的組織病理学的評価を実行する方法および定量的組織病理学的評価を実行するように組織分類器を訓練する方法が、以下の例示的な方法で実行され得る。
【０１１１】
検査される組織に対する培養期間は、所望の再生医療産生物の移植後の陽性の臨床転帰を構成する結果に基づいて選択される。同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産物に関して、培養期間は、組織から胸腺細胞を洗い流すことによって、および／またはアポトーシスによって、組織が胸腺細胞を除去することを可能にする。培養された胸腺組織のＴＥＣは、培養時間を通して実質的に維持される。
【０１１２】
アッセイでは、培養の５〜９日目に採取したサンプルを検査して、培養胸腺組織の放出および移植性に対する適合性を評価する。産生物をよりよく理解し、アッセイの識別能力をよりよく評価するために、データを評価して明確な傾向を判定し得るサンプルを１日目〜２１日目およびそれ以降に採取する。
【０１１３】
例えば、臨床的に培養される胸腺組織サンプルおよび分解される胸腺組織サンプルのバッチは、面積、周囲長、積分密度、および真円度などの組織病理学的特徴について検査され得る。検出される核の数の全体的な傾向が検査され、これは、胸腺細胞が組織から洗い流されるか、アポトーシスを起こすにつれて、時間の経過とともに減少すると予想される。次に、これらのデータは、複数のロットからの異なるスライスが異なる日に検査される場合に、組織面積に対して正規化される。組織切片のサイズはスライス間で異なり、データセットにおいてばらつきを生じさせる可能性があるが、培養日数が増えると一般的な負の傾向が見られ、１０日目あたりのデータに視覚的なステップ変化が見られる。以前のデータは、細胞の総数の減少と比較した場合、胸腺細胞の大部分が培養期間の早い段階で枯渇することを示している。次に、培養組織サンプルを経時的研究で分析して、例えば、組織間の変動性を評価し得る。例示を目的として、胸腺間組織の変動性を評価するためのプロセスについて説明する。これには、胸腺上皮細胞および胸腺細胞の評価が含まれる。胸腺間変動ステップで得られるデータが、階層的クラスタ分析に供される。データの訓練セットが確立され、次いで、培養される胸腺組織のグループごとの分析が判定される。これらのデータは、組織の強制分解試験で、および／またはグループごとの判定を、臨床転帰が陰性の不合格の標本に関連付けられるデータのセットと比較することによって得られるデータと比較される。
【０１１４】
組織の一般的な外観、およびその結果としての組織学的スライドは、選択される培養期間の過程にわたって、例えば、培養胸腺組織の場合は０、５、９、１２および２１日で変化する。重ねて、培養胸腺組織の例示においては、胸腺細胞が培養胸腺組織から洗い流されるためである。５、９、１２および２１日目の組織は、積分密度における著しい減少と、胸腺上皮細胞についてのプロファイルにより類似したプロファイルとを示す。非常に高い真円度を有する細胞の数は、培養プロセス全体を通して時間経過とともに減少する。これは、低い真円度をもたらし、核が円形ではなくなり、非常に高い真円度の胸腺細胞を洗い流すアポトーシスが原因である可能性がある。真円度が低い０日目のサンプルの場合、単一の核よりも真円度が低い単一のエンティティとして測定される胸腺細胞の凝集が原因である可能性がある。０日目には、周囲長の高い細胞の割合が高くなり、これは、大きい周囲長の値をもたらす単一の形状としてプログラムにおいて読み取られるセルの塊が原因である可能性がある。周囲長の増加は、胸腺細胞の洗い流しと、培養時間の経過とともにアポトーシスを起こす細胞と、その結果としてのそのイベントによる周囲長の増加との組み合わせである可能性がある。全体として、培養時間の経過にわたる核の特徴は、傾向に対する理論的予測と一致している。データにおける明らかな変化のほとんどが、ロットの意図されたリリース日より前である。これは、変化の多くが培養の最初の数日間に発生し、その後、環境を最大２１日間維持できることを示唆している。これは、細胞集団の真の傾向およびそれらが時間経過とともにどのように変化するかを検出するためのアッセイをサポートする。
【０１１５】
サンプルが胸腺間で類似しているかどうかをよりよく理解するために、胸腺間の変動が検査される。胸腺間変動は、検査されるサンプルが１日目からのものである胸腺内変動と同様の方法で評価し得るが、単一の胸腺に限定されるのではなく、評価にはロット全体のサンプルが含まれる。各サンプルのユークリッド距離は、分離されたデータセット内のすべてのサンプルの中心点まで計算され得る。次に、ＡＮＯＶＡが、胸腺によって中心までの距離で実行される。このような分析は、５日目および９日目のサンプルで実行される。サンプルが胸腺間で類似しているかどうかをよりよく理解するために、胸腺間変動が調査され得る。胸腺ごとに、毎日９５％の信頼区間が生成される。同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物を特徴付けるのを助けるために、胸腺上皮細胞のみのより具体的な分析が行われる。胸腺上皮細胞は、同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の作用機序に重要であると仮定されている。病理医は、胸腺上皮細胞として同定された細胞の核を選択する。胸腺上皮細胞の核は、組織集団における他の細胞とは異なる。ＴＥＣは一般に大きく、核小体が存在し、核小体は、明るい紫色の外側の核の中心に暗い紫色の点として現れる。次に、既知のマークされた細胞がソフトウェアから個別のデータポイントとして抽出される。このデータを使用して、次の手順を順番に実行できるようにするフィルタが考案され得る。２つのサイズフィルタは、結合された細胞の分割前および分割後の両方で、サイズ範囲ウィンドウ外の細胞を除去する。以下のフィルタリングステップが実行された。
【０１１６】
最も濃いピクセルの下に含める閾値を定義することにより、最も暗い細胞がデータセットから削除される。次に、面積が５０μｍ２以下の細胞を除去する。穴が埋められ、結合された細胞を分割するためにウォーターシェッドが適用される。次に、３０〜２５０μｍ２の範囲外および真円度０．７５未満の細胞を、データセットから除外する。前述のフィルタは、ＴＥＣ細胞を特徴付けるために生成および制限されたデータセットを用いる画像の分析を可能にする。培養期間の過程にわたって組織内の細胞の総割合を調査すると、ＴＥＣにおいて一般的に増加する。ＴＥＣにおける増加は、胸腺細胞が組織から洗い流されるにつれて、残りの細胞の多くがＴＥＣであるためである。ＴＥＣの前述の分析はまた、培養期間を通して組織から洗い流される胸腺細胞の傾向のより良い見方を提供する。同様の分析は、ＴＥＣの比率が増加するにつれて、培養の過程で胸腺細胞の数が減少するというデータから推測され得る。前述のデータは、グループに分けられたサンプルを示すために使用され得る。グループは、階層クラスタ分析によって生成される。この分析は、類似した特性のデータの有意味のクラスタ（「グループ」と呼ばれる）をもたらす類似性に基づいてデータを繰り返してグループ化することにより、類似した特性を有するサンプルを体系的かつ統計的に識別する。細胞をグループ化するプロセスには、次のステップが必要であった。
【０１１７】
グループ間の距離が計算される。距離は、グループ間の類似性の尺度である。２つのグループを結合させるコストが計算される。ここでのコストは、グループを結合させることによって追加されるエラーの量である。マージコストが最も少ないグループが結合される。このプロセスは、すべてのデータが１つのグループに結合されるまで繰り返される。結果として得られるデータセットは、本質的に、サンプルが互いにどの程度「関連」または類似しているかのファミリーツリーを示す。ブランチ間の高さは、２つのグループが互いにどの程度関連しているかを示す。水平ｘ軸上の距離は、グラフ化されたときにいずれかの密接な関係を示すものではない。各グループ内のサンプルは統計的に類似しているとみなされ、異なるグループ内のサンプルは統計的に異なるとみなされる。
【０１１８】
カット高さが異なるグループ間のどこにあるかを判定するために、スクリープロットを使用して、グループ間の距離が最も重要な場所を調査し得る。これにより、サンプル間の最小限の差異がアルゴリズムに過度の影響を与えないことが保証される。差異が小さ過ぎると、サンプルが同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物について現実的であるというよりも類似し過ぎてクラスタリングする必要がないため、将来のサンプルは独立したグループに分かれる可能性が高くなる。あるいは、サンプル間で確実に区別できるように、グループは適切なカットオフを有する必要がある。同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の場合、組織の性質およびそれ自体が現れる可能性のあるロット間のばらつきのために、不均一性の可能性が高い。以前に陽性の臨床転帰（ここでは生存によって定義される）を示したサンプルを検査し、分解された組織と比較することによって、適切な分化レベルを判定し得る。
【０１１９】
臨床転帰に関連するほとんどの情報を含む訓練セットが選択され得る。最初は、サンプルは、様々な代表的なＲ＆Ｄ研究、ならびに複数の強制分解条件および臨床サンプルから組み込まれる。これらのデータは、良好グループおよび不良グループにクラスタリングされ得る。訓練セットは、ロットリリースについて検査される将来のインプロセスサンプルを表す既知の「良好」サンプルおよび既知の「不良」サンプルに限定されている場合、最も有益であるとみなされ得る。このステップでは、次の方法でサンプルを制限する。
【０１２０】
サンプルは、培養期間の中間点または５〜９日目からのものでない場合、除去され得る。同種異系の培養された胸腺組織由来の組織の例では、これは、定量的組織学に基づくロット放出のためのインプロセスサンプルが採取され得る場合である。サンプルは、代表的であると考えられているが、調査すべき関連付けられる臨床転帰がないＲ＆Ｄロットからのものである場合にも、削除され得る。さらに、サンプルは、不良な臨床転帰と関連付けられる場合、削除され得る。サンプルはまた、直交法で分解を確認できなかった場合、強制分解アームから除去され得る。
【０１２１】
基礎となるデータをグループ化して、基礎となる特徴が様々なクラスタにもたらすものをよりよく理解することができる。グループは、良好な臨床転帰、ならびに不良な臨床転帰に関連する強制的に分解されるサンプルおよび／または組織に関連付けられ得る。異なるパラメータは、強制的に分解されるサンプルおよび／または不良な臨床転帰からの良好な臨床転帰（例えば、中間サイズの面積、高い真円度、および高い周囲長）を有するグループの区別化を促進し得る。
【０１２２】
例えば、グループは、周囲長が長く、積分密度が高く、面積が大きく、真円度が低い核の割合が大きいことによって特徴付けられ得る。これは、ソフトウェアで独立した細胞として読み取ることができない核の塊の存在が原因である可能性がある。これは、培養期間の初期にまだ多数の胸腺細胞が存在する組織で発生する可能性が高くなる。
【０１２３】
良好な臨床転帰を有する追加のグループが定義され得る。例えば、グループは、他のグループおよび／またはミッドレンジの積分密度と比較した場合に、高い真円度値および／またはより大きい面積を有する多数の細胞を有することによって指定され得る。これらの値は、培養期間のミッドレンジの健康な生存組織に対して予測される。面積、真円度、積分密度、および周囲長の測定値のヒストグラムは、データから作成され得る。
【０１２４】
比較のために、５日目および９日目にサンプルが除去される前に、サンプルを胸腺器官培地（ＴＯＭ）に戻す強制分解試験を実施し得る。これは、同種異系培養された出生後の胸腺組織由来の産生物が、プロセス条件の変化に対してどれほど頑健であるかを示している。すべての培養条件が、使用される手段のいずれかによって検出可能な分解を引き起こす可能性があるわけではない。これらの条件は、組織が機能しなくなったり、生存できなくなったりする時点まで組織に恒久的な損傷を与えることはないと考えられる。分解されるサンプルで予測されるように、真円度が低く、面積が小さく、周囲長が高いセルの割合が高くなっている。これは、生存能力をもはや維持できなくなったために形状が変化し、エッジが縮んで収縮する細胞を示している。グループ内の類似性を示すために、各グループについての変動性の分析により長さされて、「良好」および「不良」（合格対不合格）の分類が判定され得る。前述のステップを使用して、合格および不合格の特性に関連付けられる組織標本の分析が評価され得る。
【実施例】
【０１２５】
同種異系の培養された出生後胸腺組織由来の産生物（例えば、「ＲＶＴ−８０２」）は、通常、レシピエントへの移植の１２〜２１日前に培養される。この培養期間は、歴史的に、再生医療産生物の移植後に良好な臨床転帰をもたらすことが実証されている。理論に束縛されることを意図していないが、この培養期間は、組織から胸腺細胞を洗い流すか、またはアポトーシスのどちらかによって、組織が胸腺細胞を除去することを可能にすると考えられている。胸腺上皮細胞は培養期間を通して維持される。
【０１２６】
検証済みのアッセイでは、培養の５〜９日目に採取されるサンプルを検査して、培養胸腺組織の放出の適合性を評価する。産生物をよりよく理解し、アッセイの識別能力をよりよく評価するために、１〜２１日目およびそれ以降に採取されるサンプルがソフトウェアプログラムによって実行され、得られたデータを相互に比較して、どの傾向が明らかかを評価した。
【０１２７】
図１４Ａ〜１４Ｄは、臨床的に培養された胸腺組織サンプル（図１４Ａ〜１４Ｃ）の３つのバッチおよび分解された胸腺組織サンプルを示す。図１４Ａに示されているサンプルの面積、周囲長、積分密度、および真円度の４つの特徴は次のとおりである：面積＝１１．３４、真円度＝０．６９６、周囲長＝１４．３１０および積分密度＝１８８９．２。図１４Ｂに示されているサンプルの面積、周囲長、積分密度、および真円度の４つの特徴は次のとおりである：面積＝１１．４１、真円度＝０．９９３、周囲長＝１１．９８２および積分密度＝１９１２．４。図１４Ｃに示されているサンプルの面積、周囲長、積分密度、および真円度の４つの特徴は次のとおりである：面積＝１０．５３、真円度＝０．８４６、周囲長＝１２．５１０および積分密度＝１７０７．４。図１４Ｄに示されているサンプルの面積、周囲長、積分密度、および真円度の４つの特徴は次のとおりである：面積＝１３．０、真円度＝０．３５２、周囲長＝２１．５５６および積分密度＝１７８６．０。各画像における単一の核は円で識別される。
【０１２８】
検出された核の数の全体的な傾向も調べられ、これは、胸腺細胞が組織から洗い流されるか、アポトーシスを起こすにつれて、時間の経過とともに減少すると予想され、これについては図１５で観察できる。これらのデータは、複数のロットからの異なるスライスが異なる日に検査されたため、組織面積に対して正規化され、組織切片のサイズはスライス間で異なり、データセットにばらつきが生じる可能性があるが、培養日数が増えると一般的な負の傾向が見られ、１０日目あたりのデータに視覚的なステップ変化が見られた。以前のデータは、胸腺細胞の枯渇の大部分が、以下に示す細胞の総数の減少と比較した場合、培養期間の早い段階であることを示している。
【０１２９】
実施例１．培養胸腺組織の経時的研究
組織の一般的な外観、およびその結果としての組織学的スライドは、培養期間の過程をとおして変化する。図１６ＡおよびＢ、１７ＡおよびＢ、１８ＡおよびＢ、１９ＡおよびＢ、ならびに２０ＡおよびＢに示されている画像は、様々な時間間隔、すなわち、０、５、９、１２および２１日でのＨ＆Ｅ染色スライドにおける培養胸腺組織の外観の違いを示している。画像は４０倍の倍率で表示されている。これらの画像およびさらなる分析のために選択された日は、製造プロセスの観点から重要であるとして指定された日からのものである。０日目は受け入れた組織を表す。０日目の組織学は、アイデンティティの目的で採取される。０日目および５〜９日目の組織学的サンプルの両方をホルマリン固定し、パラフィン包埋と切片化のために病理学研究所に持ち込まれた。切片は、ボード認定の病理医によって染色および評価された。
【０１３０】
図２１Ａ〜２１Ｅは、０、５、９、２および２１日目のＨ＆Ｅ染色された培養胸腺組織の画像であり、０、５、９、１２および２１日目の核の外観の変化を示している。図２１Ａは、胸腺細胞の数が多いことを示す高い積分密度を有する核の高い比率を示している。胸腺細胞が組織から洗い流されると、５日目（図２１Ｂ）、９日目（図２１Ｃ）、１２日目（図２１Ｄ）、２１日目（図２１Ｅ）の組織は、積分密度の著しい減少および胸腺上皮細胞のプロファイルにより類似しているプロファイルを示す。
【０１３１】
図２２は、同種異系の培養された出生後胸腺組織由来の産生物の技術的バッチからの積分密度決定値の時間経過を示している。胸腺細胞が組織から洗い流されると、５日目の組織は、統合密度の著しい減少および胸腺上皮細胞のプロファイルにより類似したプロファイルを示す。エラーバーは平均から１Ｓ．Ｄ．である。
【０１３２】
図２３に真円度の測定値を示す。非常に高い真円度を有する細胞の数は、培養プロセス全体を通して時間経過とともに減少する。これは、真円度が低い核、および非常に高い真円度の胸腺細胞の洗い流しをもたらすアポトーシスが原因である可能性がある。真円度が低い０日目のサンプルの場合、単一の核よりも真円度が低い単一のエンティティとして測定される胸腺細胞の凝集が原因である可能性がある。エラーバーは平均から１Ｓ．Ｄ．である。
【０１３３】
図２４に周囲長の測定値を示す。０日目には、周囲長の長い細胞の割合が高くなり、これは、大きい周囲長値をもたらす単一の形状としてのプログラムで読み取られる細胞の塊が原因である可能性がある。周囲長の増加は、胸腺細胞の洗い流しと、培養時間の経過とともにアポトーシスを起こす細胞と、その結果としてのそのイベントによる周囲長の増加との組み合わせである可能性がある。エラーバーは平均から１Ｓ．Ｄ．である。
【０１３４】
図２５は、調べた４つの変数すべてを考慮した場合に、２つのサンプル間の類似性を測定するためのユークリッド距離（サンプルとグランドセントロイドとの間の誤差の二乗和の平方根）を示している。参考までに、ユークリッド距離が短いほど、２つのサンプルは互いに類似している。エラーバーは平均から１Ｓ．Ｄ．である。
【０１３５】
図２６は、データの主効果プロットおよび交互作用プロットである。図２６に示すデータによって、培養胸腺組織が時間の経過とともに同様に挙動することが確認される。
【０１３６】
全体として、培養時間の経過にわたる核の特徴は、傾向に対する理論的予測と一致している。データにおける明らかな変化のほとんどが、ロットの意図されたリリース日より前である。これは、変化の多くが培養の最初の数日間に発生し、その後、環境を最大２１日間維持できることを示唆している。これは、細胞集団の真の傾向およびそれらが時間経過とともにどのように変化するかを検出するためのアッセイをサポートする。
【０１３７】
実施例２：胸腺間変動性試験
サンプルが胸腺間で類似しているかどうかをよりよく理解するために、胸腺間の変動が検査された。胸腺間変動は、検査されるサンプルが１日目からのものである胸腺内変動と同様の方法で評価されたが、単一の胸腺に限定されるのではなく、評価にはロット全体のサンプルが含まれる。各サンプルのユークリッド距離は、分離されたデータセット内のすべてのサンプルの中心点まで計算された。次に、ＡＮＯＶＡが、胸腺によって中心までの距離で実行された。この分析は、５日目および９日目のサンプルで実行された。
【０１３８】
サンプルが胸腺間で類似しているかどうかをよりよく理解するために、胸腺間の変動が検査された。胸腺間変動は、検査されるサンプルが１日目からのものである胸腺内変動と同様の方法で評価されたが、単一の胸腺に限定されるのではなく、ロット全体のサンプルが含まれる。各サンプルのユークリッド距離は、分離されたデータセット内のすべてのサンプルの中心点まで計算された。次に、ＡＮＯＶＡが、胸腺によって中心までの距離で実行された。この分析は、５日目および９日目のサンプルで実行された。
【０１３９】
以下の表６からは、９日目のロット間に検出可能な差異はない。５日目の胸腺間にはわずかな統計的差異がある。これらが産生物の品質に差異をもたらす実際的な差異をもたらすかどうかを判定することは困難である。これを異なる方法で評価するために、胸腺ごとに毎日９５％の信頼区間が生成された。図２７に示されているように、バッチＭＦＧ−０５８は、５日目では他の組織の信頼区間と重なり合っていないが、９日目までに重なり合う。このロットは他のロットに対する代表的な方法で製造されており、いずれの日も肉眼的組織学的検査で差異は観察されなかった。このように、これは組織間の核分布のわずかな差異に対する方法の感度のアーティファクトである可能性がある。
【表６】
2021524039.tif 000009
【０１４０】
実施例３：胸腺上皮細胞の分析
同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物を特徴付けるのを助けるために、胸腺上皮細胞のみのより具体的な分析が行われた。胸腺上皮細胞は、同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の作用機序に重要であると仮定される。画像が病理医に送信された。病理医は、胸腺上皮細胞として同定された細胞の核を選択した（図２８ＡおよびＢを参照）。胸腺上皮細胞の核は、組織集団の他の細胞とは異なる。ＴＥＣＳは一般に大きく、核小体が存在し、これは、図２８ＡおよびＢにおいて薄い紫色の外側の核の中心内に濃い紫色の点として現れる。
【０１４１】
既知のマークされたセルが、ソフトウェアから個々のデータポイントとして抽出された。このデータを使用して、次のステップを順番に実行できるようにするフィルタが考案された。２つのサイズフィルタは、結合された細胞の分割前および分割後の両方で、サイズ範囲ウィンドウ外の細胞を除去する。以下のフィルタリングステップが実行された。
【０１４２】
最も暗いピクセル（染色強度に応じて１００〜１３０〜１５０〜１８０ピクセル強度の含まれるピクセル）の下に含める閾値を定義することにより、最も暗い細胞がデータセットから削除された。
【０１４３】
面積が５０μｍ２以下の細胞を除去した。
【０１４４】
穴が埋められ、結合された細胞を分割するためにウォーターシェッドが適用された。
【０１４５】
３０〜２５０μｍ２の範囲外および真円度＜０．７５の細胞を、データセットから除外した。
【０１４６】
前述のフィルタは、ＴＥＣ細胞を特徴付けるために生成および制限されたデータセットを用いる画像の分析を可能にした。培養期間の過程にわたって組織内の細胞の総割合を調査すると、ＴＥＣにおいて一般的に増加する。ＴＥＣにおける増加は、胸腺細胞が組織から洗い流されるにつれて、残りの細胞の多くがＴＥＣであるためである。この変化は、図３０において、Ｈ＆Ｅスライドの総細胞数に対するＴＥＣの比率で視覚化できる。これらの判定はまた、ＴＥＣが産生物の有効性に必要とされる培養期間を通して維持されることを示している。図３１に示すように、組織面積に対して正規化される場合に、同じ傾向が見られる。分析セットからＴＥＣを分類および抽出するためのデータは、１日当たり１つのサンプルで行われ、サンプル間のばらつきがある。
【０１４７】
実施例４：胸腺細胞分析
実施例３のＴＥＣ分析はまた、培養期間を通して組織から洗い流される胸腺細胞の傾向のより良い見方を与える。胸腺細胞についても同様の分析は行われていないが、上記のデータから、ＴＥＣの比率が増加するにつれて、培養の過程で胸腺細胞の数が減少することが推測され得る。この変化はまた、複数の倍率でのＨ＆Ｅ染色スライドの画像でも視覚化され得る（例えば、図１６〜２１を参照）。これらの画像の胸腺細胞は、小さい暗い紫色の核である。図１６Ａおよび１６Ｂの０日目の画像には、それらは多数あり、図１７Ａおよび１７Ｂに示すように、５日目までに著しい減少がある。これは、胸腺細胞マーカーであるＬ−セレクチン（ＲＥＰ−０１６）のサイトカインおよびケモカイン分析だけでなく、多くの病理学の報告でも指摘されてきた。全体的なデータの傾向も、前述の定量分析を使用したこの分析と一致している。
【０１４８】
実施例５：階層クラスタ分析
例１〜４に提示されるデータは、図３２に示すように４つのグループに分けられたサンプルを示している。図３２に示されているグループは、階層クラスタ分析によって生成された。この分析は、類似した特性のデータの有意味のクラスタ（「グループ」と呼ばれる）をもたらす類似性に基づいてデータを繰り返してグループ化することにより、類似した特性を有するサンプルを体系的かつ統計的に識別する。細胞をグループ化するプロセスには、次のステップが必要であった。
【０１４９】
グループ間の距離が計算される。距離は、グループ間の類似性の尺度である。
【０１５０】
２つのグループを結合させるコストが計算される。ここでのコストは、グループに結合させることによって追加されるエラーの量である。
【０１５１】
マージコストが最も少ないグループが結合される。
【０１５２】
このプロセスは、すべてのデータが１つのグループに結合されるまで繰り返される。
【０１５３】
結果として得られるデータセットは、基本的に、サンプルが互いにどの程度「関連」または類似しているかのファミリーツリーを示す。ブランチ間の高さは、２つのグループが互いにどの程度関連しているかを示す。水平ｘ軸上の距離は、いずれかの密接な関係を示すものではない。これの例示については、図３２を参照されたい。図３２は、例としてグループ「Ｃ」と「Ｄ」との間の距離を示すクラスタ樹状図である。強調表示された緑および赤のボックスは、単一のグループ化を示す。これは、０．４３のカットオフｙ軸の高さに基づいている。この例では、グループＣとＤは０．６の距離にあるため、２つの別個のグループであるみされる。各グループ内のサンプルは統計的に類似しているとみなされ、異なるグループ内のサンプルは統計的に異なるとみなされる。
【０１５４】
カット高さが異なるグループ間のどこにあるかを判定するために、スクリープロットを使用して、グループ間の距離が最も重要な場所を調査し得る。これにより、サンプル間の最小限の差異がアルゴリズムに過度の影響を与えないことが保証される。差異が小さ過ぎると、サンプルが同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物について現実的であるというよりも類似し過ぎてクラスタリングする必要がないため、将来のサンプルは独立したグループに分かれる可能性が高くなる。あるいは、サンプル間で確実に区別できるように、グループは適切なカットオフを有する必要がある。同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物の場合、組織の性質およびそれ自体が現れる可能性のあるロット間のばらつきのために、不均一性の可能性が高い。以前に陽性の臨床転帰（ここでは生存によって定義される）を示したサンプルを検査し、分解された組織と比較することによって、適切な分化レベルを判定し得る。
【０１５５】
実施例６：訓練セット判定
好ましい実施形態では、臨床転帰に関連するほとんどの情報を含む訓練セットが選択された。最初は、サンプルは、様々な代表的なＲ＆Ｄ研究、ならびに複数の強制分解条件および臨床サンプルから組み込まれた。これにより、多くの良好なグループおよび不良グループを含むクラスタリング分析がもたらされた（図３３を参照）。アッセイのさらなる開発の後、ロットリリースについて検査される将来のインプロセスサンプルを表す既知の「良好」サンプルおよび既知の「不良」サンプルに限定した場合、訓練セットが最も有益であると判定された。これは、次のようにサンプルを制限する。
【０１５６】
サンプルは、培養期間の中間点または５〜９日目からのものでない場合、除去された。これは、定量的組織学に基づくロットリリースのためのインプロセスサンプルが採取される場合である。
【０１５７】
サンプルは、代表的であると考えられているが、調査すべき関連する臨床転帰がないＲ＆Ｄロットからのものである場合、除去された。
【０１５８】
サンプルは、不良な臨床転帰と関連している場合、除去された。これらのサンプルは、使用中の定性的組織学的分析に基づいて施設から放出されたため、「不良」とは考えられず、ロット自体が臨床転帰の原因であると考えられるケースはなかった。これらのケースは、機能したという明確な証拠がないため、除去された。
【０１５９】
サンプルは、直交法で分解を確認できなかった場合、強制分解アームから除去された。これらのサンプルは病理医によって検査され、使用済み培地サンプルはサイトカインとケモカインについて検査され、別の方法で「不良」であることが確認されなかったサンプルは、最終訓練セットから除外された。同種異系の培養された出生後の胸腺組織由来の産生物は、様々な条件に対して耐性があることが示されているため、「良好な」組織が得られる可能性が依然としてあるケースを検出するために分析を歪曲してはならない。分析セットに残された条件は、−２０℃で凍結したサンプル、または培地を１０ＸＰＢＳと交換したサンプルからのものであった。分解条件および結果の完全なリストについては、表７を参照されたい。
【表７】
2021524039.tif 000010
【０１６０】
最終訓練セットで使用された残りのサンプルは、１年で生存が示された臨床症例からのものか、Ｒ＆Ｄ組織の分解が確認された症例からのものである。得られたクラスタを図３３に示す。
【０１６１】
これにより、最初は５つのクラスタ、臨床的に良好なサンプルを有する４つのクラスタ、および確認された不良サンプルを有する１つのクラスタがもたらされた。良好なクラスタのうちの１つには、２つのサンプルのみが含まれ、それ自体には大きな変動性がなかったため、モデルを活用してシフトを引き起こした。したがって、新しいサンプル検査されるとき、これら２つのサンプルにより、他のクラスタが移動して、これらのサンプルを適切にグループ化できる可能性が高くなる。これを試験するために、各サンプルの体系的な除去とその後の再クラスタリングを検査した。これらのサンプルのいずれかが、分離された場合、結果として得られるサンプルをシフトさせることがわかった。そのため、これらのサンプルは除去された。これにより、独立してクラスタリングするこれら２つの組織に類似した追加のサンプルがもたらされ得るが、全体的な結果は、比較するためのより堅牢なアルゴリズムおよび訓練セットになると判断された。これらのサンプルを将来のサンプルと組み合わせて使用して、後日、データセットを拡張できるときにバケットを再評価し得る。ソフトウェアで検証された最終的な訓練ライブラリを図３４に示す。
【０１６２】
実施例７：グループごとの分析
図３４に示されている４つのグループの基礎となるデータを調べて、基礎となる特徴が様々なクラスタにどのような結果をもたらすかをよりよく理解しようとした。グループは、グループ１、２、３および４と呼ばれる。上記の図３２の樹状図は、どのグループ名が各クラスタに属するかをマッピングしているが、追加の参考のために、グループ１、２、および３は良好な臨床転帰を有するサンプルからのものであり、グループ４は強制分解サンプルで構成されている。各グループの組織からの代表的な画像を図３５Ａ〜３５Ｄに示す。図３５Ａ〜３５Ｄは、最終サンプルライブラリの各クラスタグループについての代表的な画像を示す。グループ１（図３５Ａ）、２（図３５Ｂ）、および３（図３５Ｃ）は、臨床転帰が良好なサンプルで構成されている。グループ４（図３５Ｄ）は、確認された分解サンプルで構成されている。グループ１のサンプルはＬＯＴ−３４５からのものであり、グループ２のサンプルはＬＯＴ−１６０からのものであり、グループ３のサンプルはＬＯＴ−１９４からのものであり、グループ４のサンプルはＦＤ．ＳＰ１７−４０３４８−Ｃ１，１からのものである（分解方法：−２０℃で凍結）。
【０１６３】
互いに隣り合うすべてのクラスタのグラフ表示を図３６Ａ〜３６Ｄに示す。図３６Ａは、面積決定値に関するデータのクラスタのグラフ表示である。図３６Ｂは、真円度決定値に関するデータのクラスタのグラフ表示である。図３６Ｃは、積分密度決定値に関するデータのクラスタのグラフ表示である。図３６Ｄは、周囲長決定値に関するデータのクラスタのグラフ表示である。
【０１６４】
図３６Ａ〜３６Ｄは、最終サンプルライブラリにおける各クラスタグループの代表的な画像を示す。グループ１、２、および３は、臨床転帰が良好なサンプルで構成されている。グループ４は、確認された分解サンプルで構成されている。グループ１のサンプルはＬＯＴ−３４５由来、グループ２のサンプルはＬＯＴ−１６０由来、グループ３のサンプルはＬＯＴ−１９４由来、グループ４のサンプルはＦＤ．ＳＰ１７−４０３４８−Ｃ１．１（分解方法：−２０℃で凍結）由来である。
【０１６５】
図３６Ａ〜３６Ｄにプロットされたデータからわかるように、様々なパラメータが、良好な臨床転帰（例えば、中程度のサイズの面積、高い真円度、および高い周囲長）を有するグループの分化を促進する。強制的に分解されるサンプルはまた、グラフに赤いバーで示されているように、他のグループとは多くの点で著しく異なる。このデータは、良好な臨床転帰をもたらす複数のデータセットがあることを示している。データセットに現在捕捉されていないために、いずれのグループにもクラスタリングされないサンプルが良好または不良に見える可能性がある他の方法があり得る。
【０１６６】
グループ１．グループ１は最大のクラスタである。それは、良好な臨床転帰を有する１９個の異なる組織で構成されている。グループ１は、周囲長が大きく、積分密度が高く、面積が大きく、真円度が低い核の割合が大きいことを特徴としている。これは、ソフトウェアで独立したセルとして読み取ることができない核の塊の存在が原因である可能性がある。これは、培養期間の初期にまだ多数の胸腺細胞が存在する組織で発生する可能性が高くなる。盲検試験が実施されたとき、０日目の組織からのサンプルがグループ１にクラスタリングされ、それによって上記の理論が支持される。このアッセイが存在する多数の胸腺細胞を有する組織を拒絶するようには見えないが、グループ１のサンプルは、培養期間の終わりに移植されたときに良好な臨床転帰を有した。
【０１６７】
図３７は、強調表示された、面積１０（赤）、真円度０．９（緑）、周囲長１８（青）、および積分密度１５００（黄色）の特徴を有するグループ１からの画像である。これらのグループは一般に、グループ間で最大の変動を示す。
【０１６８】
図３８は、グループ１の細胞の面積測定値を示すヒストグラムである。
【０１６９】
図３９は、グループ１の細胞の真円度測定値を示すヒストグラムである。
【０１７０】
図４０は、グループ１の細胞の積分密度測定値を示すヒストグラムである。
【０１７１】
図４１は、グループ１の細胞の周囲長測定値を示すヒストグラムである。
【０１７２】
グループ２．
グループ２には、良好な臨床転帰を有する１０個のロットの組織が含まれている。グループ２および３両者は、真円度の値が高い細胞の割合が大きい。グループ２はまた、グループ３および４と比較した場合、面積が大きく、中程度の積分密度の細胞を有するように見える。これらの値は、グループ２を形成するサンプルによって示されるように、中程度の培養期間で健康な生体組織に相当する。面積、真円度、積分密度、周囲長の測定値のヒストグラムを図４３〜４６に示す。
【０１７３】
図４２は、強調表示された、面積１０（赤）、真円度０．９（緑）、周囲長１８（青）、および積分密度１５００（黄色）の特徴を有するグループ２の画像である。これらのグループは一般に、グループ間で最大の変動を示す。
【０１７４】
図４３は、グループ２の細胞の面積測定値を示すヒストグラムである。
【０１７５】
図４４は、グループ２の細胞の真円度測定値を示すヒストグラムである。
【０１７６】
図４５は、グループ２の細胞の積分密度測定値を示すヒストグラムである。
【０１７７】
図４６は、グループ２の細胞の周囲長測定値を示すヒストグラムである。
【０１７８】
グループ３．
グループ３は、良好な臨床転帰を示した６個のロットで構成されている。グループ２と同様に、グループ３は真円度の高い細胞の割合が大きく、胸腺細胞および全体的な細胞の生存率の両方を示している。グループ３は、最小面積のセルの割合が最も高く、積分密度の範囲も低くなっている（第２および第３のビン）。
【０１７９】
図４７は、強調表示された、面積１０（赤）、真円度０．９（緑）、周囲長１８（青）、および積分密度１５００（黄色）の特徴を有するグループ３からの画像である。これらのグループは一般に、グループ間で最大の変動を示す。
【０１８０】
面積、真円度、積分密度、周囲長の測定値のヒストグラムを図４８〜５１に示す。
【０１８１】
図４８は、グループ３の細胞の面積測定値を示すヒストグラムである。
【０１８２】
図４９は、グループ３の細胞の真円度測定値を示すヒストグラムである。
【０１８３】
図５０は、グループ３の細胞の積分密度測定値を示すヒストグラムである。
【０１８４】
図５１は、グループ３の細胞の周囲長測定値を示すヒストグラムである。
【０１８５】
グループ４．
グループ４は、４つの強制分解サンプルで構成されている。ここに示す分解条件は、−２０℃で４時間凍結したサンプルと、培地を１０Ｘ  ＰＢＳと２４時間置き換えたサンプルに対するものである。これらの条件の両者とも、定性的組織学による著しい分解と、ＴＥＣの健全性のバイオマーカーであるＣＣＬ２１を検査するときに著しい変化を示した。すべての強制分解条件および各方法についての結果の表を以下に示す。
【０１８６】
図５２は、強調表示された、面積１０（赤）、真円度０．９（緑）、周囲長１８（青）、および積分密度１５００（黄色）の特徴を有するグループ４からの画像である。これらのグループは一般に、グループ間で最大の変動を示す。
【０１８７】
面積、真円度、積分密度、周囲長の測定値のヒストグラムを図５３〜５６に示す。
【０１８８】
図５３は、グループ４の細胞の面積測定値を示すヒストグラムである。
【０１８９】
図５４は、グループ４の細胞の真円度測定値を示すヒストグラムである。
【０１９０】
図５５は、グループ４の細胞の積分密度測定値を示すヒストグラムである。
【０１９１】
図５６は、グループ４の細胞の周囲長測定値を示すヒストグラムである。
【０１９２】
実施例８：強制分解試験。
強制分解試験を実施し、５日目および９日目にサンプルを除去する前に、サンプルを胸腺器官培地（ＴＯＭ）に戻した。これは、同種異系培養された出生後の胸腺組織由来の産生物が、プロセス条件の変化に対してどれほど頑健であるかを示している。サンプルが５５℃に加熱されることが、従来の組織学の現在の方法では検出できなかったことに注目するのは興味深いことである。これは、組織が加熱されることにより、組織病理学的観点から組織が本質的に固定されたためと考えられる。ただし、ＣＣＬ２１分析では分解が明らかであった。試験された条件の多くは、使用された手段のいずれかで検出可能な分解を引き起こさなかった。これらの条件は、組織が機能しなくなったり、生存できなくなったりする時点まで組織に恒久的な損傷を与えることはなかったと考えられる。産生物が上記の条件のいずれにもさらされないようにするためのプロセス制御がある。分解されるサンプルで予測されるように、真円度が低く、面積が小さく、周囲長が高いセルの割合が高くなっている。これは、生存能力をもはや維持できなくなったために形状が変化し、エッジが縮んで収縮する細胞を示している試験の強制分解条件を表７に示す。
【０１９３】
グループ内の類似性を示すために、各ビンについての変動性の分析により検査した。グループ４は、ビン内のサンプル全体でビン内で最も高い標準偏差を定期的に示した。これはおそらく、そのグループ内のサンプルが少ないためであるが、組織が分解して一貫性が低下するため、組織にとっても予測されないことではない（図５７を参照）。
【０１９４】
図５７は、ビンごとのグループ間およびグループ内の変動性の分析のプロットである。データは、先ずグループごとに、次にパラメータについてのビンごとにｘ軸上に示される。各パラメータについての上のグラフは個々についてのものであり、下のグラフはそのグループの標準偏差である。両者ともデータの広がりを視覚化するために使用できる。
【０１９５】
略語
ＡＥ１／ＡＥ３：すべてのサイトケラチンと反応して上皮細胞を同定する２つの抗体のカクテル。
【０１９６】
ＣＤ３：胸腺細胞を含むＴ細胞と反応する抗体。ＣＫ１４：再増殖の可能性があると仮定された上皮細胞のサブセットにおける細胞骨格の成分であるサイトケラチン１４のみを検出する抗体。
【０１９７】
ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片。
【０１９８】
Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリンおよびエオシン、哺乳類の組織切片の光学顕微鏡検査に最も一般的に使用される組織学的染色。
【０１９９】
Ｋｉ−６７：Ｋｉ−６７抗体は、細胞増殖に関連するタンパク質であるＫｉ−６７抗原を認識する。
【０２００】
ＴＥＣ：胸腺上皮細胞。
【０２０１】
本出願で議論される参考文献は、それらの意図された目的のために、参照によってその全体が組み込まれ、その文脈に基づいて明らかである。
【０２０２】
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。これらの刊行物の開示は、その全体が参照によって本出願に組み込まれる。
【０２０３】
本明細書に引用されるありとあらゆる特許、特許出願、刊行物、およびアクセッション番号の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２０４】
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されてきたが、前述の説明は、例示することが意図され、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定しないことを理解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内である。
【０２０５】
前述の実施形態および利点は、単なる例示であり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本教示は、他のタイプの装置、実験、および外科的手順に容易に適用することができる。また、本発明の実施形態の記載は、例示的であることが意図され、特許請求の範囲を限定しないことが意図される。多くの代替、変更、および変形が、当業者には明らかであろう。
【０２０６】
本開示は、様々な実施形態を参照して開示されてきたが、他の実施形態およびこれらの変形が、本開示の真の趣旨および範囲から逸脱することなく当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような実施形態および同等の変形を含むと解釈されることが意図される。
【０２０７】
前述の明細書は、当業者が実施形態を実施することを可能にするために十分であると考えられる。前述の説明および実施例は、特定の実施形態を詳述し、発明者によって企図される最良の形態を説明する。しかしながら、前述がいかに詳細に本文中に出現しても、実施形態は、多くの方法で実施され得、添付の特許請求の範囲およびその同等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
【０２０８】
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Ｍａｒｋｅｒｔ  ＭＬ，２０１４，Ｔｈｙｍｕｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｔｉｅｈｍ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｅｓ，ｅｄｓ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＫＥ＆Ｓｔｉｅｈｍ  ＥＲ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），１ｓｔ  Ｅｄ，ｐｐ  １０５９−１０６７．
【図１】
2021524039.tif 000011
【図２】
2021524039.tif 000012
【図３Ａ】
2021524039.tif 000013
【図３Ｂ】
2021524039.tif 000014
【図３Ｃ】
2021524039.tif 000015
【図３Ｄ】
2021524039.tif 000016
【図４Ａ】
2021524039.tif 000017
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ−３５Ｄ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５７−３】
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【図５７−４】
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【国際調査報告】
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