(57)【要約】  チモヒドロキノンで強化された組成物であって、ニゲラ・サティバの種子から単離された活性分子をブレンドすることにより製剤化されたチモキノン、ヘデラゲニン（ｈｅｄｅｒａｇｅｎｍ）および／またはα−ヘデリンをさらに含む、組成物を開示する。ニゲラ・サティバの種子から生物活性成分チモヒドロキノン、チモキノンを単離するための新規な方法も開示する。ニゲラ・サティバの使用済み材料からα−ヘデリンおよびヘデラゲニンを単離するための方法も本明細書において開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニゲラ・サティバの種子から単離された、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノンを含む組成物であって、
ａ）ニゲラ・サティバの種子を粉末にし、１．５ｍｍメッシュを使用して粉砕し、磁気分離器を通過させて、粗粉末を得る工程；
ｂ）工程ａ）の粉末を、液体ＣＯ2を使用した超臨界流体抽出（ＳＣＦＥ）に供して、３つの画分：低揮発性化合物−Ｓ１画分、高揮発性化合物−Ｓ２画分、および使用済み残留物を得る工程；
ｃ）全収率がそれぞれＳ１画分で約１０〜４０％であり、Ｓ２画分で約１〜６％である、低揮発性画分および高揮発性画分の化合物を、ガスクロマトグラフィーを使用して、ＳＴＲ＃２で表されるチモキノン、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノン、および遊離脂肪酸と同定する工程；
ｄ）工程ｂ）の使用済み残留物をエタノール５容量で、６０℃〜６５℃で３時間撹拌しながら抽出する工程；
ｅ）工程ｄ）のエタノール抽出物を濾過、濃縮して、茶色がかったペーストを得る工程；
ｆ）工程ｅ）の茶色がかったペーストを水に溶解させ、ヘキサン３容量で３回分配して、水性画分およびヘキサン画分を得る工程；
ｇ）工程ｆ）の水性画分をｎ−ブタノールで３回分配する工程；
ｈ）工程ｇ）のｎ−ブタノール画分を水でクエンチして、総溶解固形分２０〜３０％を維持しながら溶媒を揮散させる工程；
ｉ）噴霧乾燥して、乾燥ベースで収率が０．００１〜５％で、ＨＰＬＣによってＳＴＲ＃３で表されるα−ヘデリン（ＣＡＳ  ｎｏ．２７０１３−９１−８）と同定される薄茶色の粉末を得る工程；
ｊ）工程ｃ）のＳ２画分を工程ｉ）のα−ヘデリンとブレンドして、チモヒドロキノン、チモキノン、α−ヘデリンおよび遊離脂肪酸を含む混合物を得る工程；
ｋ）工程ｊ）の混合物を、６５℃〜７０℃で３０分間反応器中で撹拌しながらエタノールで溶解させて、均質な混合物を得る工程；
ｌ）真空下で工程ｋ）の混合物からエタノールを揮散させ、不溶物を除去するために濾過して、茶色がかった黄色の油性液体を得る工程；
ｍ）工程ｌ）の混合物に安定剤およびバイオアベイラビリティ増強剤を添加する工程；
ｎ）工程ｍ）の混合物を錠剤、カプセル剤、軟質ゲル剤、散剤、丸剤、シロップ剤、ロゼンジ剤、懸濁剤、乳剤に製剤化する工程
を含む方法を使用して調製される組成物。
【化１】
2021508718.tif 000013
【請求項２】
チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗ、バイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗを含有するように標準化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物中の遊離脂肪酸は、Ω３（オメガ３）脂肪酸０．５％ｗ／ｗ未満、Ω６（オメガ６）脂肪酸４０％〜７０％ｗ／ｗ、およびΩ９（オメガ９）脂肪酸１５％〜２５％ｗ／ｗを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
安定剤は、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
安定剤は、ロスマリン酸であることが好ましく、さらに別の関連する実施形態では、バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンの群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリンであることが好ましい、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ニゲラ・サティバの種子から単離された、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノンを含む組成物であって、
ａ）ニゲラ・サティバの種子を粉末にし、１．５ｍｍメッシュを使用して粉砕し、磁気分離器を通過させて、粗粉末を得る工程；
ｂ）工程ａ）の粉末を、液体ＣＯ2を使用した超臨界流体抽出（ＳＣＦＥ）に供して、３つの画分：低揮発性化合物−Ｓ１画分、高揮発性化合物−Ｓ２画分、および使用済み残留物を得る工程；
ｃ）全収率がそれぞれＳ１画分で約１０〜４０％であり、Ｓ２画分で約１〜６％である、Ｓ１画分およびＳ２画分の化合物を、ガスクロマトグラフィーを使用して、ＳＴＲ＃２で表されるチモキノン、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノン、および遊離脂肪酸と同定する工程；
ｄ）工程ｂ）の使用済み残留物をエタノール５容量で、６０℃〜６５℃で３時間撹拌しながら抽出する工程；
ｅ）工程ｄ）のエタノール抽出物を濾過、濃縮して、茶色がかったペーストを得る工程；
ｆ）工程ｅ）の茶色がかったペーストを水に溶解させ、ヘキサン３容量で３回分配して、水性画分およびヘキサン画分を得る工程；
ｇ）工程ｆ）の水性画分をｎ−ブタノールで３回分配する工程；
ｈ）工程ｇ）のｎ−ブタノール画分を水でクエンチして、総溶解固形分２０〜３０％を維持しながら溶媒を揮散させる工程；
ｉ）噴霧乾燥して、乾燥ベースで収率が０．００１〜５％で、ＨＰＬＣによってＳＴＲ＃３で表されるα−ヘデリンと同定される薄茶色の粉末を得る工程；
ｊ）工程ｉ）の粉末を、エタノール２容量、２Ｎ  ＨＣｌ１．４容量に溶解させ、混合物を５０℃〜６０℃で撹拌しながら５〜６時間加熱することにより、温和な加水分解に供する工程；
ｋ）反応産物からエタノール画分を揮散させて、酢酸エチル画分を得る工程；
ｌ）酢酸エチル画分を２％Ｎａ2ＣＯ3溶液で洗浄してｐＨを中和する工程；
ｍ）酢酸エチル画分を分液し、濃縮して、ＨＰＬＣによってＳＴＲ＃４で表されるヘデラゲニンと同定される薄茶色の粉末を含有率４０〜７０％で得る工程；
ｎ）工程ｃ）のＳ２画分を工程ｍ）のヘデラゲニンとブレンドして、チモヒドロキノン、チモキノン、ヘデラゲニンおよび遊離脂肪酸を含む混合物を得る工程；
ｏ）工程ｎ）の混合物を、６５℃〜７０℃で３０分間反応器中で撹拌しながらエタノールで溶解させて、均質な混合物を得る工程；
ｐ）真空下で工程ｏ）の混合物からエタノールを揮散させ、不溶物を除去するために濾過して、茶色がかった黄色の油性液体を得る工程；
ｑ）工程ｐ）の混合物に安定剤およびバイオアベイラビリティ増強剤を添加する工程；
ｒ）工程ｑ）の混合物を錠剤、カプセル剤、軟質ゲル剤、散剤、丸剤、シロップ剤、ロゼンジ剤、懸濁剤、乳剤に製剤化する工程、
を含む方法を使用して調製される組成物。
【化２】
2021508718.tif 000014
【請求項８】
チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、ヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗを含有するように標準化されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
組成物中の遊離脂肪酸は、Ω３（オメガ３）脂肪酸０．５％ｗ／ｗ未満、Ω６（オメガ６）脂肪酸４０％〜７０％ｗ／ｗ、およびΩ９（オメガ９）脂肪酸１５％〜２５％ｗ／ｗを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
安定剤は、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
安定剤は、ロスマリン酸であることが好ましく、さらに別の関連する実施形態では、バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンの群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリンであることが好ましい、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
ニゲラ・サティバの種子から単離された、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノンを含む組成物であって、
ａ）ニゲラ・サティバの種子を粉末にし、１．５ｍｍメッシュを使用して粉砕し、磁気分離器を通過させて、粗粉末を得る工程；
ｂ）工程ａ）の粉末を、液体ＣＯ2を使用した超臨界流体抽出（ＳＣＦＥ）に供して、３つの画分：低揮発性化合物−Ｓ１画分、高揮発性化合物−Ｓ２画分、および使用済み残留物を得る工程；
ｃ）全収率がそれぞれＳ１画分で約１０〜４０％であり、Ｓ２画分で約１〜６％である、低揮発画分および高揮発画分の化合物を、ガスクロマトグラフィーを使用して、ＳＴＲ＃２で表されるチモキノン、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノン、および遊離脂肪酸と同定する工程；
ｄ）工程ａ）の粉末をエタノールで抽出して、エタノール抽出物および使用済み材料を得る工程；
ｅ）工程ｄ）の使用済み材料を６０℃〜７０℃で乾燥させ、４０＃メッシュで粉砕およびシフトして、ニゲラ・サティバの脱脂粉末を得る工程；
ｆ）工程ｂ）から得られたＳ２画分２％〜５％を、工程ｄ）のエタノール抽出物３０％〜４０％および工程ｅ）からの脱脂粉末５０％〜７０％とブレンドして、チモヒドロキノン、チモキノンおよび遊離脂肪酸を含む組成物を得る工程；
ｇ）工程ｆ）の組成物を、請求項２の工程ｍ）から得られたＳＴＲ＃４で表されるヘデラゲニン０．００１％〜１％および／または請求項２の工程ｉ）から得られたＳＴＲ＃３で表されるα−ヘデリン０．００１％〜１％と混合して、チモヒドロキノン、チモキノン、遊離脂肪酸、α−ヘデリンおよび／またはヘデラゲニンを含む組成物を得る工程；
ｈ）工程ｇ）の組成物に安定剤およびバイオアベイラビリティ増強剤を添加する工程；
ｉ）工程ｈ）の混合物を錠剤、カプセル剤、軟質ゲル剤、散剤、丸剤、シロップ剤、ロゼンジ剤、懸濁剤、乳剤に製剤化する工程、
を含む方法を使用して調製される組成物。
【化３】
2021508718.tif 000015
【請求項１４】
チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンおよび／またはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗ、を含有するように標準化されている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
組成物中の遊離脂肪酸は、Ω３（オメガ３）脂肪酸０．５％ｗ／ｗ未満、Ω６（オメガ６）脂肪酸４０％〜７０％ｗ／ｗ、およびΩ９（オメガ９）脂肪酸１５％〜２５％ｗ／ｗを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
安定剤は、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールからなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
安定剤は、ロスマリン酸であることが好ましい、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンの群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリンであることが好ましい、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２６１０５６５号の優先権を主張する通常の特許出願である。
本発明は、全体として、チモヒドロキノンを含有する組成物に関する。より詳細には、本発明は、ニゲラ・サティバ（Ｎｉｇｅｌｌａ  ｓａｔｉｖａ）からチモヒドロキノンおよびその他の活性物質を単離するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニゲラ・サティバは、医薬に関するアーユルヴェーダ、ウナニおよびシッダの各システムで広く使用されている良く知られた薬用植物である。この植物は治療特性を呈すると報告されている多くの有効成分を含有する。有効成分の一部として、チモキノン、チモヒドロキノン、ジチモキノン、ｐ−シメン、カルバクロール、４−テルピネオール、ｔ−アネトール、セスキテルペンロンギフォレン、α−ピネン、チモール、αヘデリンおよびヘデラゲニンが挙げられる（Ahmad et al., A review on therapeutic potential of Nigella sativa: A miracle herb, Asian Pac J Trop Biomed. 2013; 3(5): 337-352）。
ニゲラ・サティバから生物活性物質を単離するために報告された様々な方法が存在する：
１．Salea et al., Supercritical fluid carbon dioxide extraction of Nigella sativa (black cumin) seeds using taguchi method and full factorial design, Biochemical Compounds 2013, doi: 10.7243/2052-9341-1-1.
２．Venkatachallam et al., Chemical composition of Nigella sativa L. seed extracts obtained by supercritical carbon dioxide, J Food Sci Technol, 2010; 47(6):598-605.
３．Baharetha et al., Use of Nigella sativa Linn. Supercritical Carbon Dioxide Extract for Targeting the Angiogenesis Cascade, Med Aromat Plants 2016, 5(3) 1-12.
４．Baharetha et al., Proapoptotic and Antimetastatic Properties of Supercritical CO2 Extract of Nigella sativa Linn. Against Breast Cancer Cells, J Med Food, 2013;16(12): 20131121-1130.
【０００３】
しかし、その方法は、費用および時間を要するか、生物活性物質の収率が低く、産業的に実行不能であるかのいずれかである。したがって、単離された生物活性物質の収率が高く、経済的であるとともに産業的に実行可能でもある新規な方法の技術的必要性が存在する。本発明は、ニゲラ・サティバから生物活性物質を単離するための新規な高収率方法を開示することにより、上記の問題を解決する。
本発明の主要な目的は、ニゲラ・サティバから生物活性物質を単離するための非自明で産業上利用可能な方法を開示することである。
本発明の別の目的は、ニゲラ・サティバの種子から単離されたチモヒドロキノンを含む組成物を開示することである。
本発明は、前述の目的を満たし、関連する利点をさらに提供する
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、チモヒドロキノンで強化された組成物であって、ニゲラ・サティバの種子から単離された活性分子をブレンドすることにより製剤化されたチモキノン、α−ヘデリンおよび／またはヘデラゲニンをさらに含む、組成物を開示する。本発明はまた、超臨界流体抽出（ＳＣＦＥ）を使用して、ニゲラ・サティバから生物活性成分チモヒドロキノンおよびチモキノンを単離するための新規な方法も開示する。ニゲラ・サティバの使用済み材料からα−ヘデリンおよびヘデラゲニンを単離するための方法も本明細書において開示する。
【０００５】
本発明のその他の特徴および利点は、例として本発明の原理を例示する、以下のより詳細な説明から明らかとなろう。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
最も好ましい実施形態では、本発明は、ニゲラ・サティバの種子から単離された、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノンを含む組成物であって、
ａ）ニゲラ・サティバの種子を粉末にし、１．５ｍｍメッシュを使用して粉砕し、磁気分離器を通過させて、粗粉末を得る工程；
ｂ）工程ａ）の粉末を、液体ＣＯ2を使用した超臨界流体抽出（ＳＣＦＥ）に供して、３つの画分：低揮発性化合物−Ｓ１画分、高揮発性化合物−Ｓ２画分、および使用済み残留物を得る工程；
ｃ）全収率がそれぞれＳ１画分で約１０〜４０％であり、Ｓ２画分で約１〜６％である、低揮発性画分および高揮発性画分の化合物を、ガスクロマトグラフィーを使用して、ＳＴＲ＃２で表されるチモキノン、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノン、および遊離脂肪酸と同定する工程；
ｄ）工程ｂ）の使用済み残留物をエタノール５容量で、６０℃〜６５℃で３時間撹拌しながら抽出する工程；
ｅ）工程ｄ）のエタノール抽出物を濾過、濃縮して、茶色がかったペーストを得る工程；
ｆ）工程ｅ）の茶色がかったペーストを水に溶解させ、ヘキサン３容量で３回分配して、水性画分およびヘキサン画分を得る工程；
ｇ）工程ｆ）の水性画分をｎ−ブタノールで３回分配する工程；
ｈ）工程ｇ）のｎ−ブタノール画分を水でクエンチして、総溶解固形分２０〜３０％を維持しながら溶媒を揮散させる工程；
ｉ）噴霧乾燥して、乾燥ベースで収率が０．００１〜５％で、ＨＰＬＣによってＳＴＲ＃３で表されるα−ヘデリン（ＣＡＳ  ｎｏ．２７０１３−９１−８）と同定される薄茶色の粉末を得る工程；
ｊ）工程ｃ）のＳ２画分を工程ｉ）のα−ヘデリンとブレンドして、チモヒドロキノン、チモキノン、α−ヘデリンおよび遊離脂肪酸を含む混合物を得る工程；
ｋ）工程ｊ）の混合物を、６５℃〜７０℃で３０分間反応器中で撹拌しながらエタノールで溶解させて、均質な混合物を得る工程；
ｌ）真空下で工程ｋ）の混合物からエタノールを揮散させ、不溶物を除去するために濾過して、茶色がかった黄色の油性液体を得る工程；
ｍ）工程ｌ）の混合物に安定剤およびバイオアベイラビリティ増強剤を添加する工程；
ｎ）工程ｍ）の混合物を錠剤、カプセル剤、軟質ゲル剤、散剤、丸剤、シロップ剤、ロゼンジ剤、懸濁剤、乳剤に製剤化する工程、
を含む方法を使用して調製される上記組成物を開示する。
【０００７】
【化１】
2021508718.tif 000002
【０００８】
関連する実施形態では、組成物は、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗ、バイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗ、を含有するように標準化されている。別の関連する実施形態では、組成物中の遊離脂肪酸は、Ω３（オメガ３）脂肪酸０．５％ｗ／ｗ未満、Ω６（オメガ６）脂肪酸４０％〜７０％ｗ／ｗ、およびΩ９（オメガ９）脂肪酸１５％〜２５％ｗ／ｗを含む。別の関連する実施形態では、安定剤は、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールからなる群から選択される。関連する実施形態では、安定剤は、ロスマリン酸であることが好ましい。さらに別の関連する実施形態では、バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンの群から選択される。関連する実施形態では、バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリンであることが好ましい。
【０００９】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ニゲラ・サティバの種子から単離された、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノンを含む組成物であって、
ａ）ニゲラ・サティバの種子を粉末にし、１．５ｍｍメッシュを使用して粉砕し、磁気分離器を通過させて、粗粉末を得る工程；
ｂ）工程ａ）の粉末を、液体ＣＯ2を使用した超臨界流体抽出（ＳＣＦＥ）に供して、３つの画分：低揮発性化合物−Ｓ１画分、高揮発性化合物−Ｓ２画分、および使用済み残留物を得る工程；
ｃ）全収率がそれぞれＳ１画分で約１０〜４０％であり、Ｓ２画分で約１〜６％である、Ｓ１画分およびＳ２画分の化合物を、ガスクロマトグラフィーを使用して、ＳＴＲ＃２で表されるチモキノン、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノン、および遊離脂肪酸と同定する工程；
ｄ）工程ｂ）の使用済み残留物をエタノール５容量で、６０℃〜６５℃で３時間撹拌しながら抽出する工程；
ｅ）工程ｄ）のエタノール抽出物を濾過、濃縮して、茶色がかったペーストを得る工程；
ｆ）工程ｅ）の茶色がかったペーストを水に溶解させ、ヘキサン３容量で３回分配して、水性画分およびヘキサン画分を得る工程；
ｇ）工程ｆ）の水性画分をｎ−ブタノールで３回分配する工程；
ｈ）工程ｇ）のｎ−ブタノール画分を水でクエンチして、総溶解固形分２０〜３０％を維持しながら溶媒を揮散させる工程；
ｉ）噴霧乾燥して、乾燥ベースで収率が０．００１〜５％で、ＨＰＬＣによってＳＴＲ＃３で表されるα−ヘデリンと同定される薄茶色の粉末を得る工程；
ｊ）工程ｉ）の粉末を、エタノール２容量、２Ｎ  ＨＣｌ１．４容量に溶解させ、混合物を５０℃〜６０℃で撹拌しながら５〜６時間加熱することにより、温和な加水分解に供する工程；
ｋ）反応産物からエタノール画分を揮散させて、酢酸エチル画分を得る工程；
ｌ）酢酸エチル画分を２％Ｎａ2ＣＯ3溶液で洗浄してｐＨを中和する工程；
ｍ）酢酸エチル画分を分液し、濃縮して、ＨＰＬＣによってＳＴＲ＃４で表されるヘデラゲニンと同定される薄茶色の粉末を含有率４０〜７０％で得る工程；
ｎ）工程ｃ）のＳ２画分を工程ｍ）のヘデラゲニンとブレンドして、チモヒドロキノン、チモキノン、ヘデラゲニンおよび遊離脂肪酸を含む混合物を得る工程；
ｏ）工程ｎ）の混合物を、６５℃〜７０℃で３０分間反応器中で撹拌しながらエタノールで溶解させて、均質な混合物を得る工程；
ｐ）真空下で工程ｏ）の混合物からエタノールを揮散させ、不溶物を除去するために濾過して、茶色がかった黄色の油性液体を得る工程；
ｑ）工程ｐ）の混合物に安定剤およびバイオアベイラビリティ増強剤を添加する工程；
ｒ）工程ｑ）の混合物を錠剤、カプセル剤、軟質ゲル剤、散剤、丸剤、シロップ剤、ロゼンジ剤、懸濁剤、乳剤に製剤化する工程、
を含む方法を使用して調製される上記組成物を開示する。
【００１０】
関連する実施形態では、組成物は、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、ヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗ、を含有するように標準化されている。別の関連する実施形態では、組成物中の遊離脂肪酸は、Ω３（オメガ３）脂肪酸０．５％ｗ／ｗ未満、Ω６（オメガ６）脂肪酸４０％〜７０％ｗ／ｗ、およびΩ９（オメガ９）脂肪酸１５％〜２５％ｗ／ｗを含む。別の関連する実施形態では、安定剤は、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールからなる群から選択される。関連する実施形態では、安定剤は、ロスマリン酸であることが好ましい。さらに別の関連する実施形態では、バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンの群から選択される。関連する実施形態では、バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリンであることが好ましい。
【００１１】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ニゲラ・サティバの種子から単離された、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノンを含む組成物であって、
ａ）ニゲラ・サティバの種子を粉末にし、１．５ｍｍメッシュを使用して粉砕し、磁気分離器を通過させて、粗粉末を得る工程；
ｂ）工程ａ）の粉末を、液体ＣＯ2を使用した超臨界流体抽出（ＳＣＦＥ）に供して、３つの画分：低揮発性化合物−Ｓ１画分、高揮発性化合物−Ｓ２画分、および使用済み残留物を得る工程；
ｃ）全収率がそれぞれＳ１画分で約１０〜４０％であり、Ｓ２画分で約１〜６％である、低揮発画分および高揮発画分の化合物を、ガスクロマトグラフィーを使用して、ＳＴＲ＃２で表されるチモキノン、ＳＴＲ＃１で表されるチモヒドロキノン、および遊離脂肪酸と同定する工程；
ｄ）工程ａ）の粉末をエタノールで抽出して、エタノール抽出物および使用済み材料を得る工程；
ｅ）工程ｄ）の使用済み材料を６０℃〜７０℃で乾燥させ、４０＃メッシュで粉砕およびシフトして、ニゲラ・サティバの脱脂粉末を得る工程；
ｆ）工程ｂ）から得られたＳ２画分２％〜５％を、工程ｄ）のエタノール抽出物３０％〜４０％および工程ｅ）からの脱脂粉末５０％〜７０％とブレンドして、チモヒドロキノン、チモキノンおよび遊離脂肪酸を含む組成物を得る工程；
ｇ）工程ｆ）の組成物を、第２の実施形態で記述の方法の、工程ｍ）から得られたＳＴＲ＃４で表されるヘデラゲニン０．００１％〜１％および／または工程ｉ）から得られたＳＴＲ＃３で表されるα−ヘデリン０．００１％〜１％と混合して、チモヒドロキノン、チモキノン、遊離脂肪酸、α−ヘデリンおよび／またはヘデラゲニンを含む組成物を得る工程；
ｈ）工程ｇ）の組成物に安定剤およびバイオアベイラビリティ増強剤を添加する工程；
ｉ）工程ｈ）の混合物を錠剤、カプセル剤、軟質ゲル剤、散剤、丸剤、シロップ剤、ロゼンジ剤、懸濁剤、乳剤に製剤化する工程、
を含む方法を使用して調製される上記組成物を開示する。
【００１２】
関連する実施形態では、組成物は、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンおよび／またはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗ、を含有するように標準化されている。別の関連する実施形態では、組成物中の遊離脂肪酸は、Ω３（オメガ３）脂肪酸０．５％ｗ／ｗ未満、Ω６（オメガ６）脂肪酸４０％〜７０％ｗ／ｗ、およびΩ９（オメガ９）脂肪酸１５％〜２５％ｗ／ｗを含む。別の関連する実施形態では、安定剤は、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールからなる群から選択される。関連する実施形態では、安定剤は、ロスマリン酸であることが好ましい。さらに別の関連する実施形態では、バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンの群から選択される。関連する実施形態では、バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリンであることが好ましい。
【００１３】
本発明の技術的特徴および技術的効果を具体化する前述の最も好ましい実施形態を、下の本明細書で例示的な実施例を通して説明する。
【実施例】
【００１４】
（実施例１）：ＳＣＦＥ抽出によりニゲラ・サティバから活性分子を単離し、製剤を調製するための方法
本発明は、ニゲラ・サティバの種子から単離されたチモヒドロキノンおよびその他の生物活性物質を含む組成物に関する。フローチャートＮｏ．１では、ニゲラ・サティバの種子からチモキノン（ＴＱ）およびチモヒドロキノンを単離するための方法を提供する：
【表１】
2021508718.tif 000003
上記方法によって、ＴＱ、ＴＨＱ、および遊離脂肪酸を含有する２つの画分が得られ、それぞれ３０％および３〜４％の高い全収率である。ＴＱ、ＴＨＱの含有量は、Ｓ２画分において比例的に高くなる。
上記方法からの使用済み材料を処理して、ヘデラゲニンおよびα−ヘデリンなどの成分をさらに得た。フローチャートＮｏ．２では、ヘデラゲニンおよびα−ヘデリンを単離するための方法を提供する。
【表２−１】
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【表２−２】
2021508718.tif 000005
下のフローチャート（フローチャートＮｏ．３）では、チモキノン、チモヒドロキノン、α−ヘデリンまたはヘデラゲニンを含有する製剤をブレンドするための方法について記載する。
【表３】
2021508718.tif 000006
【００１５】
（実施例２）：エタノール抽出によってニゲラ・サティバから活性分子を単離し、製剤を調製するための方法
代替の方法では、ニゲラ・サティバの種子をエタノール抽出に供し、ＳＣＦＥ抽出およびエタノール抽出の両方から単離した生物活性物質を用いて組成物を製剤化した。フローチャートＮｏ．４では、ニゲラ・サティバから生物活性物質を単離するための方法について記載する。
【表４】
2021508718.tif 000007
チモキノン、チモヒドロキノン、α−ヘデリンまたはヘデラゲニンおよび遊離脂肪酸を含有する組成物を、表１に記載のように、上の方法より単離された活性物質からブレンドした。
【００１６】
【表５】
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【００１７】
（実施例３）：チモヒドロキノンを含有する組成物
上に本明細書に記載の方法から、チモキノン、チモヒドロキノン、ヘデラゲニンまたはα−ヘデリンおよび遊離脂肪酸を含有する以下の組成物を製剤化した。表２に、それぞれの活性物質に関する様々な組成物および濃度について記載する。組成物はさらに、安定剤（ロスマリン酸）およびバイオアベイラビリティ増強剤（ピペリン）を含有する。
【００１８】
【表６】
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組成物中の全脂肪酸を、ガスクロマトグラフィーを使用してさらに特徴付け、Ω３、６、９に富んでいることを観察した。結果を表３に表示する。
【００１９】
【表７】
2021508718.tif 000010
【００２０】
チモキノンおよびチモヒドロキノンがブラックシード精油の２つの主要成分であることは科学技術分野でよく知られている。チモヒドロキノンはチモキノンの還元型であるが、両分子の化学的および生物学的能力は互いに異なる。活性物質の抗酸化および抗炎症の能力に関する研究によって、チモヒドロキノンがチモキノンよりも強力な抗酸化分子および抗炎症分子であることが示された。ブラックシードから生物活性物質を単離するのに用いられている方法のほとんどは、チモキノンのみで強化されている。本発明では、チモヒドロキノン含有量が増加している組成物をもたらす新規な方法について報告する。
加速安定性試験によって、チモキノンの含有量の減少と共に、チモヒドロキノン量が徐々に増加することが示された。
【００２１】
【表８】
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加速安定性試験によって、チモキノンの含有量の減少と共に、チモヒドロキノン量が徐々に増加することがわかる。
【００２２】
【表９】
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したがって、チモヒドロキノンで強化された組成物は、改善された治療能力を提示することができ、多くの疾患および障害の管理向けに投与することができる。
本発明の他の修正および変更は、前述の開示および教示から当業者にとって明らかであろう。したがって、本明細書で本発明のある特定の実施形態のみについて具体的に説明したが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明に多数の修正をなし得ることは明らかであろう。
【国際調査報告】
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