(57)【要約】本発明は、（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）またはその塩に関するものである。化合物１を得るための有利な方法、ならびにそれを含有する医薬組成物も記載される。（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）またはその薬学的に許容可能な塩は、その病因におけるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の活性を含む病理の治療におけるＥＰ４受容体アンタゴニストとしての使用について記載されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造：
【化１】
2021524494.tif 000033
を有する、（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）
またはその塩。
【請求項２】
前記塩がナトリウム塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記塩がリチウム塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記塩が塩酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）またはその塩の製造方法であって、以下の工程：
ａ）カップリング剤の存在下で（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−プロリン（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｄ−プロリン）をメチル４−（１−アミノシクロプロピル）と反応させてアミド（中間体Ｐ１）を生成する工程
【化２】
2021524494.tif 000034
ｂ）前記中間体Ｐ１のＢｏｃ基を少なくとも１つの酸で脱保護して、中間体Ｐ２を得る工程
【化３】
2021524494.tif 000035
ｃ）塩基の存在下で前記中間体Ｐ２を４−トリフルオロメチルベンジルブロミドでアルキル化して、メチルエステル誘導体（中間体Ｐ３）を得る工程
【化４】
2021524494.tif 000036
ｄ）強塩基の存在下で前記誘導されたメチルエステル（中間体Ｐ３）を加水分解して、前記化合物１を得る工程
【化５】
2021524494.tif 000037
を含む、方法。
【請求項６】
工程ａ）の前記カップリング剤が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）において、前記少なくとも１つの酸が２，２，２−トリフルオロ酢酸である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）において、前記塩基が炭酸セシウムである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｄ）において、前記強塩基が水酸化ナトリウムである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）またはその塩の製造方法であって、以下の工程：
ａ）溶媒としてアルコールを用いて強塩基の存在下でＤ−プロリンを４−トリフルオロメチルベンジルブロミドでアルキル化して、中間体Ｐ４を得る工程
【化６】
2021524494.tif 000038
ｂ）カップリング剤の存在下で前記中間体Ｐ４を４−（１−アミノシクロプロピル）安息香酸メチルと反応させることによってアミド（中間体Ｐ３）を生成する工程
【化７】
2021524494.tif 000039
および
ｃ）塩基の存在下で前記中間体Ｐ３を加水分解して、前記化合物１を得る工程
【化８】
2021524494.tif 000040
を含む、方法。
【請求項１１】
工程ａ）において、前記塩基が水酸化カリウムであり、前記アルコールが２−プロパノールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｂ）において、前記カップリング剤が好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである、請求項１０〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｃ）において、前記強塩基が水酸化ナトリウムである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
医薬として使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１６】
病因にプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の活性が関与する病理の治療においてＥＰ４受容体アンタゴニストとして使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載の（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１７】
前記病理が、関節リウマチ、脊椎関節炎、乾癬性関節炎および強直性脊椎炎、関節症および炎症による急性および慢性疼痛、変形性関節炎疼痛、免疫学的病因を伴う関節炎疼痛および関節リウマチからなる群より選択される、請求項１６に記載の使用のための（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１８】
前記病理が腫瘍疾患である、請求項１６に記載の使用のための（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１９】
前記病理が、好ましくは未熟児網膜症（ＲＯＰ）、増殖糖尿病網膜症および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群より選択される眼疾患である、請求項１６に記載の使用のための（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２０】
前記病理が子宮内膜症である、請求項１６に記載の使用のための（Ｒ）−４−（１−（１−（４−トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸またはその薬学的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＰ４受容体の強力かつ選択的なアンタゴニストとしてのＤ−プロリンの新しい誘導体、式
【化１】
2021524494.tif 000002
の化合物（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）およびその薬学的に許容される塩、その調製方法、それを含む医薬組成物、ならびに病因プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）がＥＰ４受容体サブタイプとの相互作用を介して根本的な働きをする疾患の治療のための医薬としてのその使用を記載する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＰ４受容体は７−膜貫通型受容体であり、その起動は通常、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の細胞内レベルの増加と関連している。
【０００３】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、サイトカイン増幅系、例えばインターロイキン−６（ＩＬ−６）として、活性化されたＥＰ４受容体を介して作用し、炎症誘発性ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）の分化および増殖を誘導する（非特許文献１）。
【０００４】
特許文献１には、ＥＰ４受容体アンタゴニストとしての環状アミノ誘導体が記載されている。特に、実施例７では、４−（１−（６−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）−６−アザスピロ［２．５］オクタン−５−カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸（Ｅ７と称される）が記載されている。ＣＲ６０８６と略称される鏡像異性体ＲであるＥ７は、ヒトＥＰ４受容体（ＫＩ  １６．６ｎＭ）に対して高親和性および選択性を示し、刺激されたｃＡＭＰ  ＰＧＥ２の製造において純粋なアンタゴニストとして機能した。Ｅ７細胞培養の実験モデルにおいて、それは、ＩＬ−６および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のマクロファージにおける発現、樹状細胞におけるＩＬ−２３の放出、Ｔｈ−１７リンパ球におけるＩＬ−１７の放出を減少させるなど、関節リウマチのメディエーターとしての重要なサイトカインの作用を阻害した。さらに、ラットおよびマウスにおけるコラーゲン関節炎（ＣＩＡ）のモデルにおいて、ＣＲ６０８６は、誘起された関節炎の全てのパラメータ：組織病理学、炎症、疼痛を改善することが示されている（非特許文献２）。
【０００５】
しかし、ＣＲ６０８６は、反応式１として以下に示す複雑な化学合成を通して得られる：
【化２】
2021524494.tif 000003
【０００６】
特許文献１および特許文献２に記載されているこの合成を分析すると、合成中間体ＣＲ６０８６、すなわち以下の（Ｒ）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−６−アザスピロ［２．５］オクタン−５−カルボン酸の合成の複雑さが、明確に示される：
【化３】
2021524494.tif 000004
【０００７】
上記のスキーム１に示すように、この合成は、８段階の連続からなる：市販のピペリジン−４−オンから出発した後、アミノ基は、クロロギ酸ベンジルで保護される。Ｗｉｔｔｉｇ反応は、標準条件下で二重結合中のケトンを変換するために起こる。二重結合は、ジエチル亜鉛を用いてシクロプロピルに変換され、アミン上の保護基は、水素化分解により除去される。アミンは、無水炭酸ｔ−ブチルで再保護され、ラセミ体混合物として酸を得るために得られた中間体は、炭酸化される。ラセミ体の分割は、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−１−フェニルエタン−１−アミンを用いた、塩としての単一の鏡像異性体の選択的沈殿によって起こる。最後に、ラセミ体塩溶液をＨＣｌで酸性化することにより、中間体（Ｒ）−６（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−６−アザスピロ［２．５］オクタノ−５−カルボン酸が得られる。
【０００８】
したがって、新たな類似のＥＰ４受容体阻害薬が必要であると考えられるが、その合成はより複雑ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１３／００４２９０号
【特許文献２】国際公開第２０１１／００６９６０号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．２０１３，；６５：１０１０−５２
【非特許文献２】Ｃａｓｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１８）２０：３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の第１の目的は、少なくともＣＲ６０８６と等しいが、同時にはるかに複雑でない合成経路で得ることができる、前述の受容体のアンタゴニストを必要とする疾患の薬理学的治療のためのＥＰ４受容体の新しい選択的アンタゴニスト薬物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上に示した目的は、Ｄ−プロリンの元の誘導体、すなわち、以下の構造を有する（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）：
【化４】
2021524494.tif 000005
またはその塩によって得られた。
【００１３】
したがって、本発明は、ＥＰ４受容体の強力なアンタゴニストである化合物１に関する。
【００１４】
さらに、以下の説明から明らかなように、本発明者らは、ＣＲ６０８６を製造するための先行のプロセスの欠点を克服する２つの合成手順を通して化合物１を調製した。
【００１５】
したがって、さらなる局面において、本発明は、（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）、またはその塩の製造方法であって、以下の工程：
ａ）（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−プロリン（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｄ−プロリン）を４−（１−アミノシクロプロピル）安息香酸メチルと、カップリング剤の存在下で反応させることによりアミド（中間体Ｐ１）を生成する工程
【化５】
2021524494.tif 000006
ｂ）中間体Ｐ２を得るために中間体Ｐ１のＢｏｃ基を少なくとも１つの酸で脱保護する工程
【化６】
2021524494.tif 000007
ｃ）塩基の存在下で中間体Ｐ２を４−トリフルオロメチルベンジルブロミドでアルキル化して、メチルエステル誘導体（中間体Ｐ３）を得る工程
【化７】
2021524494.tif 000008
ならびに
ｄ）化合物１を得るために、強い塩基の存在下で誘導されたメチルエステル（中間体Ｐ３）を加水分解する工程
【化８】
2021524494.tif 000009
を含む方法に関する。
【００１６】
上記に例示された本発明の方法は、その操作ステップの簡便性のためにも、また、商業コストが従来技術の中間体、すなわちＣＲ６０８６の合成に使用される（Ｒ）−６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−６−アザスピロ［２．５］オクタン−５−カルボン酸より少なくとも２０倍低いＮ−Ｂｏｃ−Ｄ−プロリンの工程ａ）における使用のためにも、極めて有利であることがもたらされた。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）またはその塩の調製のための別の方法に関し、この方法は、以下の工程を含む：
ａ）中間体Ｐ４を得るために溶媒としてアルコールを用いる強塩基の存在下で４−トリフルオロメチルベンジルブロミドでＤ−プロリンをアルキル化する工程
【化９】
2021524494.tif 000010
ｂ）カップリング剤の存在下で中間体Ｐ４を４−（１−アミノシクロプロピル）安息香酸メチルと反応させることによってアミド（中間体Ｐ３）を生成する工程
【化１０】
2021524494.tif 000011
；ならびに
ｃ）化合物１を得るために強塩基の存在下で中間体Ｐ３を加水分解する工程。
【化１１】
2021524494.tif 000012
【００１８】
この場合においてＤ−プロリンの４−（トリフルオロメチル）ベンジルブロミドでの直接のアルキル化反応で始まり、それによってＮ−Ｂｏｃ−Ｄ−プロリンの保護およびその後の脱保護の使用を回避する、その合成のステップのさらなる減少を提供する化合物１またはその薬学的に許容可能な塩を調製するこのプロセスは、合成の観点からより有利であることが証明された。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、本発明の化合物１またはその薬学的に許容される塩および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬および医薬組成物として使用するための化合物１またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００２０】
尚さらなる局面において、本発明は、疾患の治療に使用するための化合物１またはその薬学的に許容可能な塩に関するものであり、その病因においてプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）が、ＥＰ４受容体サブタイプとの相互作用を介して根本的な働きをする。
【００２１】
したがって、本発明は、その病因においてプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）が根本的な働きをする疾患の治療のための選択的ＥＰ４アンタゴニスト薬物として使用するための化合物１またはその薬学的に許容可能な塩に関する。
【００２２】
したがって、本発明の化合物１は、ＥＰ４レセプターによって媒介されるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の活性を阻害することができることが証明されている。
【００２３】
したがって、本発明によれば、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、関節リウマチ、脊椎関節炎（例えば、乾癬性関節炎および強直性脊椎炎）、ならびに変形性関節症疼痛などの炎症による急性および慢性関節症および疼痛、または関節リウマチなどの免疫学的病因による関節炎疼痛からなる群から選択される病理の治療のためのＥＰ４受容体の選択的アンタゴニスト薬物である。
【００２４】
別の態様において、本発明は、腫瘍疾患におけるＥＰ４のアンタゴニスト薬物として使用するための化合物１またはその薬学的に許容可能な塩に関する。この場合、本発明者らは、化合物１は、１）癌細胞に対する免疫学的応答の回復、および２）腫瘍組織に栄養を与える血管新生の阻害、という２つの異なる、代替的および付随的な方法で作用することができると仮定している。
【００２５】
さらに別の局面において、本発明は、眼疾患の治療におけるＥＰ４受容体のアンタゴニスト薬物としての化合物１またはその薬学的に許容可能な塩に関する。これらの中で、ＥＰ４受容体の活性化に大きく連動する共通の病理学的基盤として眼血管新生を有し、先進世界で失明の主因となっている未熟児網膜症（ＲＯＰ）、増殖性糖尿病性網膜症、および加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）に言及することは可能である。
【００２６】
さらに別の局面において、本発明は、子宮内膜症の治療におけるＥＰ４受容体のアンタゴニスト薬物としての化合物１またはその薬学的に許容可能な塩に関する。この場合、子宮内膜症は重篤な慢性疾患であり、生殖可能年齢の女性の１０％〜２０％に不妊症および慢性骨盤痛を引き起こすので、この化合物は極めて有利である。
【００２７】
ここで、本発明は、以下の詳細な説明および添付の図に関連して記述される。
【００２８】
本発明の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、例示的および非限定的な例によって提供される実施形態から、ならびに以下の添付した図面によって明らかになるであろう：
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、実施例９のＬＰＳ（処理１時間後の試料採取）によって誘導されたＴＮＦαの放出に対するＰＧＥ２の影響の復帰を表す。
【図２】図２は、実施例１０の浮腫のＣＩＡ評価を示す。
【図３】図３は、実施例１０のＣＩＡ臨床評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
したがって本発明は、以下の構造を有する（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）：
【化１２】
2021524494.tif 000013
またはその塩に関する。
【００３１】
したがって、本発明は、ＥＰ４受容体の強力なアンタゴニストである化合物１に関する。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）またはその塩の製造方法に関し、これは、以下の工程を含む：
ａ）カップリング剤の存在下で（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−プロリン（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｄ−プロリン）をメチル４−（１−アミノシクロプロピル）と反応させることによってアミド（中間体Ｐ１）を生成する工程
【化１３】
2021524494.tif 000014
ｂ）中間体Ｐ２を得るために中間体Ｐ１のＢｏｃ基を少なくとも１つの酸で脱保護する工程
【化１４】
2021524494.tif 000015
ｃ）メチルエステル誘導体（中間体Ｐ３）を得るために塩基の存在下で中間体Ｐ２を４−トリフルオロメチルベンジルブロミドでアルキル化する工程
【化１５】
2021524494.tif 000016
；ならびに
ｄ）化合物１を得るために強塩基の存在下で誘導されたメチルエステル（中間体Ｐ３）を加水分解する工程。
【化１６】
2021524494.tif 000017
【００３３】
好ましくは、工程ａ）において、メチル４−（１−アミノシクロプロピル）ベンゾエートはＷＯ  ２０１３／００４２９０に記載されているように調製され、カップリング剤は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが好ましい。
【００３４】
特に、工程ａ）は、ＨＯＢｔ、ＥＤＣＩおよびＴＥＡの存在下で２４時間、Ｄ−Ｎ−Ｂｏｃプロリンとメチル４−（１−アミノシクロプロピル）ベンゾエートとの間のアミドの形成を提供し、ＮＨ４Ｃｌの１つおよび最後に水で順次有機相を洗浄し；無水化および溶媒の蒸発、形成物のシリカゲルクロマトグラフィーによる精製、シクロヘキサン／酢酸エチル勾配（１００：０；２５／７５）で溶出する。
【００３５】
工程ｂ）において、少なくとも１つの酸は、好ましくは２，２，２−トリフルオロ酢酸である。
【００３６】
特に、工程ｂ）は、トリフルオロアセト酸によるＢｏｃ基の脱保護およびその後のイオン交換樹脂上の塩の放出を提供する。
【００３７】
工程ｃ）において、塩基は炭酸セシウムが好ましい。
【００３８】
特に、工程ｃ）は、４−（トリフルオロメチル）ベンジルブロミドを用いたアルキル化反応をＣｓ２ＣＯ３存在下で２４時間行い、その後、４．５％ＮａＣｌ溶液で洗浄し、溶媒を無水化して蒸発させ、ＤＣＭに溶解した残留物を、共溶媒としてｎ−ヘプタンを用いた沈殿により精製し、その後、ＤＣＭ／酢酸エチル濃度勾配（１００／０〜８５／１５）で溶出するシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより、ろ液を精製する。
【００３９】
ｄ）の工程では、強塩基は水酸化ナトリウムが好ましい。工程ｄ）では、強塩基は水酸化ナトリウムが好ましい。ステップｄ）は、好ましくは、水混和性有機溶媒混合物中で起こり、より好ましくは、水混和性有機溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）である。特に、工程ｄ）は、ＮａＯＨの存在下でメチルエステルを加水分解し、続いて水のみ、次いでメタノールで溶出する逆相クロマトグラフィーによって精製して、ナトリウム塩の形態の化合物１を得ることを提供する。
【００４０】
上記に示したように、本発明のプロセスは、その操作ステップの簡便さだけでなく、確かに低コストである使用試薬にとっても極めて有利であることがもたらされた。
【００４１】
さらなる態様において、本発明は、（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロジリン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸（化合物１）またはその塩の調製のための別の方法に関し、これらの方法は、以下の工程を含む：
ａ）中間体Ｐ４を得るために溶媒としてアルコールを用いて強塩基の存在下でＤ−プロリンを４−トリフルオロメチルベンジルブロミドでアルキル化する工程
【化１７】
2021524494.tif 000018
ｂ）カップリング剤の存在下で中間体Ｐ４を４−（１−アミノシクロプロピル）安息香酸メチルと反応させることによってアミド（中間体Ｐ３）を生成する工程
【化１８】
2021524494.tif 000019
ならびに
ｃ）化合物１を得るために強塩基の存在下で中間体Ｐ３を加水分解する工程。
【化１９】
2021524494.tif 000020
【００４２】
工程ａ）では、塩基は水酸化カリウムが好ましく、アルコールは２−プロパノールである。
【００４３】
特に、工程ａ）は、溶媒としてアルコール、好ましくは２−プロパノールを使用する強塩基の存在下でのＤ−プロリンの４−トリフルオロメチル−ベンジル−ブロミドでのアルキル化；水性ＨＣｌでの処理による生成物回収、ならびに続いての濾過および共溶媒としてのアセトンおよびｔｅｒｔ−ブチル−エーテルでの処理による精製からなる。
【００４４】
工程ｂ）では、４−（１−アミノシクロプロピル）安息香酸メチルをＷＯ  ２０１３／００４２９０に記載されているように調製することが望ましく、カップリング剤は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドであることが好ましい。
【００４５】
特に、工程ｂ）は、ＤＣＭ溶液中に溶解したヒドロキシベンゾトリアゾール水和物ＴＥＡ、ＥＤＣＩの存在下で、前の工程ａ）に従って調製した４−（トリフルオロメチル）ベンジル）−Ｄ−プロリンと４−（１−アミノシクロプロピル）安息香酸メチルとの間のアミドの生成；ＮａＨＣＯ３の飽和溶液で有機相を洗浄し、最後に溶媒の水洗、無水化および蒸発、このようにメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルでの処理および沈殿により形成されたメチル化合物（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）ベンゾエートの精製および回収を提供する。
【００４６】
工程ｃ）では、強塩基は水酸化ナトリウムが好ましい。工程ｃ）は、好ましくは、水混和性有機溶媒混合物中で起こり、より好ましくは、水混和性有機溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）である。
【００４７】
工程ｃ）では特に、前のポイントｂ）で述べたようにして得られたメチルエステル加水分解、および化合物１の回収は、第１の方法のポイントｄ）で述べたことに従って順次行われる。
【００４８】
上に示したように、この場合、Ｄ−プロリンの４−（トリフルオロメチル）ベンジルブロミドでの直接アルキル化から開始して、その合成のための経過のさらなる減少を提供する化合物のこの調製方法は、それにより、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｄ−プロリンの保護およびその後の脱保護は、合成の観点からより有利であることが証明された。
【００４９】
１つの有利な局面において、化合物１は、塩、好ましくは薬学的に許容される塩、より好ましくは塩酸塩またはリチウム塩またはナトリウム塩の形態である。
【００５０】
さらに有利な局面において、化合物１は、双性イオンの形態である。
【００５１】
別の態様では、本発明は、本発明の化合物１またはその薬学的に許容される塩および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬および医薬組成物として使用するための化合物１またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００５２】
尚さらなる局面において、本発明は、疾患の治療に使用するための化合物１またはその薬理学的に許容可能な塩に関するものであり、その病因プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）が、ＥＰ４受容体サブタイプとの相互作用を通して基本的な働きをする。
【００５３】
したがって、本発明は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の病因が根本的な働きをする疾患の治療のための選択的ＥＰ４アンタゴニスト薬物として使用するための化合物１またはその薬学的に許容可能な塩に関する。
【００５４】
したがって、本発明によれば、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、関節リウマチ、脊椎関節炎（例えば、乾癬性関節炎および強直性脊椎炎）、関節症および疼痛、ならびに変形性関節症疼痛などの炎症による急性および慢性、または関節リウマチなどの免疫学的病因による関節炎疼痛からなる群から選択される病理の治療のためのＥＰ４受容体の選択的アンタゴニスト薬物である。
【００５５】
別の態様において、本発明は、腫瘍疾患におけるＥＰ４のアンタゴニスト薬物として使用するための化合物１またはその薬学的に許容可能な塩に関する。この場合、本発明者らは、化合物１は、１）癌細胞に対する免疫学的応答の回復、２）腫瘍組織に栄養を与える血管新生の阻害、という２つの異なる、代替的および付随的な方法で作用することができると仮定している。
【００５６】
さらに別の局面において、本発明は、眼疾患の治療におけるＥＰ４受容体のアンタゴニスト薬物としての化合物１またはその薬学的に許容可能な塩に関する。これらの中で、ＥＰ４受容体の活性化に大きく連動し、先進世界で失明の主因となっている、共通の病理学的基盤として眼血管新生を有する未熟児網膜症（ＲＯＰ）、増殖糖尿病網膜症、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を挙げることができる。
【００５７】
さらに別の局面において、本発明は、子宮内膜症の治療におけるＥＰ４受容体のアンタゴニスト薬物としての化合物１またはその薬学的に許容可能な塩に関する。この場合、子宮内膜症は重篤な慢性疾患であり、生殖可能年齢の女性の１０％〜２０％に不妊症および慢性骨盤痛を引き起こすので、この化合物は極めて有利である。
【００５８】
本発明の実施形態のさらなる例を、非限定的な例によって以下に挙げる。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例で使用した試薬は、様々な供給業者から購入し、それ以上の精製を行わずに使用した。溶媒は、無水形態で使用した。無水環境での反応は、Ｎ２の正の圧力の下で行った。
【００６０】
陽子核磁気共鳴スペクトル（１ＨｎＭＲ）を、機器Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ４００ＭＨｚ上で記録した。残留溶媒線を内部標準として、化学シフトをｐｐｍ（δ）で報告した。符号の多重性を、ｓ：一重項、ｄ：二重項、ｔ：三重項、ｑ：四重項、ｍ：多重項、ｂｒ：拡大符号とする。
【００６１】
ＵＰＬＣ−Ｍａｓｓａスペクトルは、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ−ＢＥＨ（１．７μＭ、５０×２．１ｍｍ）のＣ１８カラムを用いて機器Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ−ＳＱＤ上で行った。
【００６２】
シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーを、ＳＮＡＰ  ＨＰ  Ｂｉｏｔａｇｅシリカカートリッジを用いて、Ｂｉｏｔａｇｅ自動フラッシュクロマトグラフィーシステム（Ｓｐ１およびＩｓｏｌｅｒａシステム）で実施した。逆相クロマトグラフィーを、ＲｅｄｉＳｅｐ  Ｇｏｌｄ  Ｃ−１８Ａｑカートリッジを用いてＢｉｏｔａｇｅ（Ｉｓｏｌｅｒａ）自動フラッシュクロマトグラフィーシステムで行った。
【００６３】
ＳＰＥ−ＳＣＸカートリッジは、固相抽出用イオン交換カラムである。
【００６４】
旋光パワーは、Ａｕｔｏｐｏｌ  Ｖ旋光計（ＲｕｄｏｌｐＨＳｃｉ．）で測定した。
【００６５】
ここでは以下の略語を用いる：
ＮＨ４Ｃｌ：塩化アンモニウム；ＮａＨＣＯ３：重炭酸ナトリウム；Ｃｓ２ＣＯ３炭酸セシウム；ＮａＯＨ：水酸化ナトリウム；ＫＯＨ：水酸化カリウム；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＮＨ３：アンモニア；ＨＣｌ：塩酸；ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；Ｎａ２ＳＯ４：硫酸ナトリウム；ＤＣＭ：ジクロロメタン；ＥｔＯＨ：エタノール；ＭｅＯＨ：メタノール；ＩｓＯＨ：２−プロパノール；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ｔ．ａ．：室温。
【００６６】
実施例１：
本発明の第１の方法による化合物１の調製
調製１：Ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−２−（（１−（４−（メトキシカルボニル）フェニル）シクロプロピル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボキシレート（中間体Ｐ１）の調製
Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２５．６ｇ、１６７ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（４０．１ｇ、２０９ｍｍｏｌ）を、（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−プロリン（３０ｇ、１３９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５５０ｍｌ）溶液に加え、混合物を、室温で１時間撹拌した。この時間の後、４−（１−アミノシクロプロピル）安息香酸メチル塩酸塩（３３．０ｇ、１４５ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（２６．２ｍｌ、１８８ｍｍｏｌ）を加えた。反応を２４時間撹拌した。反応が完了したら水（３５０ｍＬ）を加え、２相を約１０分間撹拌した。有機相を水相から分離し、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液（３００ｍｌ）、ＮＨ４Ｃｌの１つ（３００ｍｌ）で順次洗浄し、最後に水３００ｍＬで洗浄した。
【００６７】
有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、シクロヘキサン／酢酸エチル勾配（１００：０；２５／７５）でシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製した淡黄色固体を得、所望の化合物（４９．５ｇ；収率８８％）を提供した（中間体Ｐ１）。
ＭＳ：（ＥＳ／＋）ｍ／ｚ：３８９［ＭＨ−］
【化２０】
2021524494.tif 000021
【００６８】
調製２：メチル（Ｒ）−４−（１−（ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）ベンゾエートの調製（中間体Ｐ２）
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−２−（（（１−（４−（メトキシカルボニル）フェニル）シクロプロピル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボキシレート（４９．５ｇ、１２２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４００ｍＬ）に溶解し、２，２，２−トリフルオロ酢酸（８０ｍＬ、１０３８ｍｍｏｌ）を添加する前に混合物を０℃に冷却した。反応は、室温に達するまで放置した後、３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗残留物をＳＰＥ−ＳＣＸカートリッジ（１５０ｇ）に負荷させ、最初にＭｅＯＨのみで、その後ＭｅＯＨ中のＮＨ３  １Ｍで溶出させた。アンモニアを含む画分を蒸発させて、所望の残留固体（３０．９ｇ：収率８８％）を得た（中間体Ｐ２）。
ＭＳ：（ＥＳ／＋）ｍ／ｚ：２８９
【化２１】
2021524494.tif 000022
【００６９】
調製３：メチル（Ｒ）−４−（１−（１−（４−トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピルベンゾエートの調製（中間体Ｐ３）
メチル（Ｒ）−４−（１−（ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）ベンゾエート（２９．６ｇ、１０３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５００ｍｌ）に溶解した。Ｃｓ２ＣＯ３（５７．２ｇ、１７６ｍｍｏｌ）および４−（トリフルオロメチル）ベンジルブロミド（１６．８２ｍｌ、１０９ｍｍｏｌ）を順次加え、混合物を室温で２４時間撹拌した。ＴＨＦを蒸発させ、残留物をＤＣＭ（２５０ｍｌ）と水（２５０ｍｌ）との間で分配し、得られた混合物を約１０分間激しく撹拌した。有機相を水相から分離し、４．５％ＮａＣｌ（２５０ｍｌ）溶液で２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮して、白色固体（４６．５ｇ）を得、これにＤＣＭ（１００ｍＬ）を添加し、完全に溶解するまで約４０℃に加熱した。この時点で、溶液を室温に達するまで放置した後、ｎ−ヘプタン（５００ｍＬ）を添加して、白色沈殿を得、それを次いで濾過し、５０℃で２４時間乾燥して、所望の化合物（５０ｇ；収率：８９％）を得た。（中間体Ｐ３）
ＭＳ：（ＥＳ／＋）ｍ／ｚ：４４７
【化２２】
2021524494.tif 000023
【００７０】
調製４：（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル安息香酸のナトリウム塩の調製（化合物１）
メチル（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）−ベンゾエート（４０．９５ｇ、９２ｍｍｏｌ）（中間体Ｐ３）をＴＨＦ（４５０ｍｌ）および水（２５０ｍｌ）の混合物に溶解した後、ＮａＯＨ（４．４０ｇ、１１０ｍｍｏｌ）を加えた。白色を帯びた懸濁液を、室温で２４時間撹拌した。有機溶媒を蒸発させ、残留物をＲｅｄｉＳｅｐ  Ｇｏｌｄ  Ｃ−１８Ａｑカラムに負荷したところ、まず水（２カラム体積）のみで、最後にＭｅＯＨ（３カラム体積）で溶出した。ＭｅＯＨを含有する画分を濃縮し、得られた残留物固体を真空下、６０℃で乾燥させて、３５．５ｇの化合物１ナトリウム塩（８４％収率）を得た。
Ｃ２３Ｈ２２Ｆ３Ｎ２ＮａＯ３
ＭＳ：（ＥＳ／＋）ｍ／ｚ：４３３［ＭＨ−］
【化２３】
2021524494.tif 000024
比旋光度：（α）Ｄ２０、１％、Ｈ２Ｏ中＝３０．２°
【００７１】
実施例２：
本発明の第２の方法による化合物１の調製
調製１：（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）−Ｄ−プロリン（中間体Ｐ４）の調製
２−プロパノール５００ｍｌに溶解した水酸化カリウム７３ｇ（１．３モル）の溶液に、Ｄ−プロリン５０ｇ（０．４３モル）を加え、続いて２−プロパノール３００ｍｌに溶解した４−（トリフルオロメチル）ベンジルブロミド７４ｍｌ（０．４７７モル）を分割して加え、５０℃で１２時間撹拌しながら溶液を反応させた。溶液を、その後０℃に冷却し、３２％ＨＣｌ水溶液でｐＨを約４±１に調整した。形成された沈殿した固体を濾過し、少量の２−プロパノールで洗浄し、アセトンに溶解し、熱間濾過し、メチル−ｔｅｒブチルエーテルを加えることによって再沈殿させて、濾過および乾燥後、所望の化合物（９９ｇ；収率８３％）を得た。（中間体Ｐ４）
ＭＳ：（ＥＳ／＋）ｍ／ｚ：２７４
【化２４】
2021524494.tif 000025
【００７２】
調製２：メチル（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）ベンゾエート（中間体Ｐ３）の調製
４−（トリフルオロメチル）ベンジル）−Ｄ−プロリン２６ｇ（９５．４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１７．６ｇ、１１４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ６００ｍｌに溶解した溶液に、ＴＥＡ（５７０ｍｍｏｌ）８０ｍｌおよびＥＤＣＩ２０ｇ（１０５ｍｍｏｌ）を窒素流下で添加した。反応混合物を約６時間撹拌下に放置した後、メチル−４−（１−アミノシクロプロピル）ベンゾエート塩酸塩２４ｇ（１０５ｍｍｏｌ）を加え、室温でさらに２４時間撹拌しながら常時反応させた。反応が完了したとき、水（５００ｍＬ）を加え、２相を約１０分間撹拌した。有機相を水相から分離し、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液（４００ｍｌ）で順次洗浄し、最後に水４００ｍＬで洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、固形クリーム色を得た。この固体を１リットルのメチル−テルブチル−エーテルに懸濁し、沸騰するまで加熱し、濾過し、このようにして得られた透明な溶液を真空下で濃縮乾固して白色固体を得、それを次いで５０℃で２４時間乾燥して、所望の化合物（３２．５ｇ；収率：７５％）を得た。（中間体Ｐ３）
ＭＳ：（ＥＳ／＋）ｍ／ｚ：４４７
【化２５】
2021524494.tif 000026
【００７３】
調製３：（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の調製（化合物１）
メチル（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）−ベンゾエート（４０．９５ｇ、９２ｍｍｏｌ）（中間体Ｐ３）をＴＨＦ（４５０ｍｌ）および水（２５０ｍｌ）の混合物に溶解した後、ＮａＯＨ（４．４０ｇ、１１０ｍｍｏｌ）を加えた。白色を帯びた懸濁液を、室温で２４時間撹拌した。有機溶媒を蒸発させ、残留物をＲｅｄｉＳｅｐ  Ｇｏｌｄ  Ｃ−１８Ａｑカラムに負荷したところ、まず水（２カラム体積）のみで、最後にＭｅＯＨ（３カラム体積）で溶出した。ＭｅＯＨを含む画分を濃縮し、得られた残留物固体を真空下６０℃で乾燥して、化合物１ナトリウム塩３５．５ｇ（収率８４％）を得た。
Ｃ２３Ｈ２２Ｆ３Ｎ２ＮａＯ３
ＭＳ：（ＥＳ／＋）ｍ／ｚ：４３３［ＭＨ−］
【化２６】
2021524494.tif 000027
比旋光度：（α）Ｄ２０、１％、Ｈ２Ｏ中＝３０．２°
【００７４】
実施例３
（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸（化合物１両性イオン）の調製
酢酸１．７ｍｌ（２９．４ｍｍｏｌ）を、Ｈ２Ｏ８０ｍｌに溶解した（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩６．１ｇ（１３．４ｍｍｏｌ）の溶液に加え、この溶液をＤＣＭ８０ｍｌで２回抽出した。結合した有機相をＨ２Ｏで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮して、非晶質外観の薄いクリーム色の固体（５．７ｇ；収率９６％）を得た。
Ｃ２３Ｈ２３Ｆ３Ｎ２Ｏ３
ＭＳ：（ＥＳ／＋）ｍ／ｚ：４３３
【化２７】
2021524494.tif 000028
比旋光度：（α）Ｄ２０、メタノール中１％＝２８．９°。
【００７５】
実施例４
（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸（化合物１ＨＣｌ）の調製
ＨＣｌ１Ｎ（３０ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を、ブタン−２−オン３００ｍｌに溶解した（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸（化合物１「双性イオン」）７ｇ（１６．２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物を１２時間撹拌し、懸濁液中に形成された白色沈殿を濾過し、真空下、６０℃で乾燥して、化合物１塩酸塩５．８ｇを得た（収率８５％）
Ｃ２３Ｈ２３Ｆ３Ｎ２Ｏ３＊ＨＣｌ．
ＭＳ：（ＥＳ／＋）ｍ／ｚ：４３３
【化２８】
2021524494.tif 000029
比旋光度：（α）Ｄ２０、Ｈ２Ｏ＝１８．３°で１％
【００７６】
実施例５
（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のリチウム塩の調製
水酸化リチウム一水和物１．４ｇ（３３．１ｍｍｏｌ）を、５０％Ｈ２Ｏ−ジオキサンの混合物に溶解したメチル（Ｒ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）ベンゾエート８ｇ（１８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。この溶液を６時間撹拌下に放置した後、ジオキサンを真空下で蒸発させた。残留物をＢｉｏｔａｇｅ  Ｃ−１８カラムに負荷させ、まず水のみで溶出し（２カラム体積）、最後にＭｅＯＨで溶出した（３カラム体積）。ＭｅＯＨを含有する画分を濃縮し、得られた固体を真空下６０℃で乾燥して、６．９ｇの化合物１リチウム塩を得た（収率８８％）。
Ｃ２３Ｈ２２Ｆ３Ｎ２ＬｉＯ３
ＭＳ：（ＥＳ／＋）ｍ／ｚ：４３３
【化２９】
2021524494.tif 000030
【００７７】
実施例６  参照化合物、すなわち（Ｓ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸のナトリウム塩の調製（化合物２）
化合物２は、本発明の第１の方法に従って調製されたため、実施例１に記載された全プロセスに従って量および試薬を含むが、（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−プロリンの代わりに（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−プロリンから始める。
Ｃ２３Ｈ２２Ｆ３Ｎ２ＮａＯ３．
ＭＳ：（ＥＳ／＋）ｍ／ｚ：４３３
【化３０】
2021524494.tif 000031
比旋光度：（α）Ｄ２０、Ｈ２Ｏ中１％＝−２８．５°。
【００７８】
薬理学的評価
実施例７
ヒトＥＰ４受容体に対する結合の研究
実験は、Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ；１４８３，２８５−２９３，２０００）によって記載されている手順に従って実施した。
【００７９】
組織標本：
ＨＥＫ２９３細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  ２９３）により安定的に発現されるヒトＥＰ４受容体を有する細胞膜を、以下に記載するように調製した。培地（ＤＭＥＭ、Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉを添加し、１０％のウシ胎児血清およびブラスチシジン１０μｇ／ｍｌを含む）を除去した後、低張溶解緩衝液（ＴＲＩＳ−Ｃｌ５ｍＭ＋ＥＤＴＡ５ｍＭ−ｐＨ７．４）１０ｍｌで細胞単層の洗浄を行った。３７℃、５％ＣＯ２で上記媒体で付着性に成長した細胞を、増殖容器（１５０ｃｍ２フラスコ）から剥離し、機械的作用により溶解し、新鮮溶解緩衝液２０ｍｌを加えた。溶解物を３０秒間撹拌し、４００００×ｇで４℃で２２分間遠心分離した。最終ペレットは、使用まで−８０℃で保存した。結合実験の時点で、膜を解凍し、分析緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有）に再懸濁して、１ｍｇのタンパク質／ｍｌの濃度を得た。ウシ血清アルブミンを標準として使用して、膜懸濁液のタンパク質含量を測定した。
【００８０】
結合試験：
実験では、膜の１０μｌアリコートを、試験すべき化合物の種々の濃度の非存在下または存在下で、１ｎＭの濃度で放射性リガンド［３Ｈ］−プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）と共にインキュベートした。非特異性結合は、ＰＧＥ２１μＭの存在下で決定された。インキュベーションは、最終容量０．１ｍｌで、９６の深いマイクロプレートで行い、２５℃で９０分間進行した。受容体に結合した遊離の放射性リガンドの分離は、Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ  ＧＦＢガラス繊維フィルターマイクロプレートを用いて、減圧下での急速ろ過により起こり、分析緩衝液に溶解したポリエチレンイミン０．３％であらかじめ湿らせた後、低温緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ  ５００ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１％、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次にろ過ディスクを３０℃で乾燥し、これにＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０シンチレーション液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）０．０５ｍｌをそれぞれに加え、最後に存在する放射能を安定化の少なくとも１時間後に測定した。
【００８１】
化合物／放射性リガンド競合曲線は、「非線形曲線適合」プログラム（Ｗｉｎｄｏｗｓ向けＧｒａｐＨＰａｄ、バージョン７）を用いて解析し、これにより、評価した各々の化合物についてＩＣ５０値（試験中の放射性リガンドの受容体への結合の５０％を阻害できる濃度）を算出することが可能になった。
【００８２】
結果：このようにして得られた結果をＩＣ５０で表し、以下の表１に示す。
【００８３】
【表１】
2021524494.tif 000032
【００８４】
表に示したデータから、化合物１およびＣＲ６０８６の両方が、ＥＰ４受容体への結合を阻害する強力な活性をいかにして示したかがわかる。化合物１は、比較化合物ＣＲ６０８６で得られたものと実質的に同一のＰＧＥ２リガンドの結合に対して阻害活性を示した。本発明者らは、化合物１の参照「Ｓ型」鏡像異性体である化合物２、すなわち（Ｓ）−４−（１−（１−（４−（トリフルオロメチル）ベンジル）ピロリジン−２−カルボキサミド）シクロプロピル）安息香酸が、ヒトＥＰ４受容体へのＰＧＥ２リガンドの結合の阻害において約５０倍低い活性を有することから、化合物１のＥＰ４アンタゴニスト活性が立体特異的であることに注目し、興味深いと考えた。
【００８５】
実施例８：
ヒトＥＰ４受容体をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰの判定（機能試験）
方法：ヒトＥＰ４受容体をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において発現したヒトＥＰ４受容体における化合物１のアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を、内因性アゴニストＰＧＥ２の非存在下および存在下でｃＡＭＰ産生に及ぼす影響を測定することにより評価する。
【００８６】
ＣＨＯ細胞を、ＨＥＰＥＳ２０ｍＭ（ｐＨ７．４）およびＩＢＭＸ５００ｍＭを添加したＨＢＳＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁した後、マイクロプレートにウェルあたり２００００細胞の密度で分配し、試験中の化合物の非存在下（対照）または存在下で室温で１０分間インキュベートした。アゴニスト活性の基準対照として、１μＭのＰＧＥ２を、独立した投与量ウェルに加えた。アンタゴニスト作用の評価の場合、代わりに基準アゴニストのＰＧＥ２を、３０ｎＭの最終濃度に加えた。室温で１０分間インキュベートした後、細胞を溶解し、蛍光受容体（ｃＡＭＰ標識Ｄ２）および蛍光供与体（ユーロピウムクリプタートで標識した抗ｃＡＭＰ抗体）を添加した。室温で６０分後、マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて励起波長３３７ｎｍ、発光量６２０ｎｍ、６６５ｎｍで蛍光移動量を測定した。ｃＡＭＰ濃度は、６６５ｎｍでの測定信号を６２０ｎｍでの測定信号（比）で除して求めた。アゴニスト効果の評価の場合において、ＰＧＥ２１μＭにおける対照応答のパーセンテージとして、一方アンタゴニスト効果の評価の場合において、３０ｎＭ  ＰＧＥ２における対照アゴニストの応答の阻害のパーセンテージとして、結果を表した。アンタゴニスト活性を決定するために、修正Ｃｈｅｎｇ  Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式（Ｋｂ＝ＩＣ５０／（１＋Ａ／ＥＣ５０Ａ））を適用することにより、見かけ上の解離定数（Ｋｂ）を計算した。式中、Ａ＝基準アゴニストＰＧＥ２の濃度、およびＥＣ５０Ａ＝基準アゴニストのＥＣ５０値である。
【００８７】
結果：
機能的ｃＡＭＰ試験は、化合物１がアゴニスト型活性を持たないヒトＥＰ４受容体の純粋なアンタゴニストであることを示した（Ｋｂ値：１５ｎＭ化合物１対７．８ｎＭ  ＣＲ６０８６）。
化合物１
アゴニスト効果：１０−６Ｍまで不活性
アンタゴニスト効果：ＩＣ５０＝１．６×１０−７Ｍ；Ｋｂ＝１．５×１０−８Ｍ
ＣＲ６０８６
アゴニスト効果：１０−６Ｍまで不活性
アンタゴニスト効果：ＩＣ５０＝８．２×１０−８Ｍ；Ｋｂ＝７．８×１０−９Ｍ
【００８８】
実施例９：
ｅｘ−ｖｉｖｏ機能性試験：ＣＲ６０８６（３０ｍｇ／ｋｇ）法と比較した、化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ）によるＥＰ４受容体占有のラット７における評価
方法：エンドトキシンリポ多糖（大腸菌由来）によって誘導され、ＰＧＥ２の濃度の増加によって調節されるサイトカインＴＮＦαの放出を、ラットの全血に存在し、ＥＰ４受容体を発現する細胞によって評価した。文献から知られているように、ＰＧＥ２は、これを阻害することによりこの放出を調節し、試験した化合物は、それらの取り込み後に血中に存在する場合、ＥＰ４受容体に選択的であり、受容体に結合し、ＰＧＥ２がサイトカイン放出を阻害することを妨げる。このＴＮＦα放出調節の反転作用は、ＥＰ４受容体に対する拮抗作用のバイオマーカーと考えることができる。
【００８９】
体重２５０〜２７５ｇの雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、イタリア）を用い、ビヒクルまたは化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ）またはＣＲ６０８６（３０ｍｇ／ｋｇ）で経口投与した。各投与群は６匹の動物からなった。
【００９０】
ラットの全血におけるｅｘ−ｖｉｖｏ効果の測定：
試験中の化合物による受容体占有の影響を、それらの投与の１時間後に評価し、ビヒクル単独の存在下で測定したものと比較した。イソフルオランによるガス麻酔の後、腹部大動脈から血液を採取し、ヘパリン（０．１〜０．２Ｕ／ｍｌ）を含むチューブに移した。次に、０．４ｍｌの血液アリコートを採り、３７℃で１０分間あらかじめ加熱した一連の試験管に分注した。ＬＰＳ（最終濃度０．１μｇ／ｍｌ）を試料に加え、これは、試験対照、またはＬＰＳ混合（最終濃度０．１μｇ／ｍｌ）＋ＰＧＥ２を様々な濃度で表した。サイトカインの基礎放出を表すサンプルでは、ＬＰＳを、滅菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）によって置き換えた。試料を３７℃で４時間インキュベートした後、１０ｍＭのＥＤＴＡ４０μｌを加え、試料を氷中に移した。次いで、試料を、１５００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、このようにして得られた血漿を取り出し、投与時まで−８０℃で保存した。血漿中のＴＮＦα含有量は、特定の市販キットによって測定した。
【００９１】
ＴＮＦαの最終濃度は、ＬＰＳのみを含む試料と比較して、処理動物ごとおよび実験条件ごとに算出し、そこからＰＧＥ２の濃度上昇による阻害の割合を求めた。サイトカイン放出のベースライン値は、製造業者によって示されるＥＬＩＳＡ法の感度限界を下回る結果となった。したがって、この阻害曲線からＩＣ５０数値を算出した。各処理群について、図１に示すように、ＰＧＥ２阻害曲線（阻害対ＰＧＥ２濃度の平均値±標準偏差）を作成した。さまざまな処理群における、ＬＰＳのみの存在下でのサンプルの平均ＴＮＦα値を分析して、検査中の化合物の可能な固有の効果を検証した。こうして得られた結果を、図１に図示した。
【００９２】
図１に見られるように、予想されたように、ＰＧＥ２濃度（１０〜１０００ｎＭの範囲）を上昇させると、濃度依存的にＴＮＦαの放出が阻害された。ＣＲ６０８６または化合物１による処理後、選択的受容体アンタゴニストの存在により、ＰＧＥ２の作用の統計的に有意な復帰が観察された（＊＊  ｐ＜０．０１対ビヒクル群；二元配置分散分析）。化合物による処理群ごとに計算したＰＧＥ２のＩＣ５０値は、ビヒクルによる処理後に計算した値よりも有意に高く、アンタゴニストの存在による同じＰＧＥ２パワーシフトが示唆される。２つの化合物による影響の間に差は観察されず、いずれもＴＮＦαの放出に対する有意な影響自体を示さない（ＰＧＥ２非存在下）。
【００９３】
実施例１０：
マウスのコラーゲン関節炎（ＣＩＡ）：マウスの関節リウマチのモデルにおけるＣＲ６０８６と比較した化合物１の効果
方法：フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中に乳化した異種コラーゲンの皮内注射により、マウスにおいて関節炎を誘発した。発症した関節炎は、免疫複合体の沈着、滑膜炎および関節周囲の炎症を伴う関節軟骨の著しい破壊を特徴とした。コラーゲンは抗原として作用し、抗コラーゲン抗体の産生とともに、ＴおよびＢリンパ球の両方を含む免疫応答を誘導した。この実験モデルを用いてマウスで行われた研究により、ヒト関節リウマチの病因に関与するサイトカインおよびケモカインの多くを同定することが可能になった。イソフルラン／Ｏ２による気体状麻酔の後、成熟雄ＤＢＡ／１マウスを、ＣＦＡ中のタイプＩＩウシコラーゲン２００μｇを含むエマルジョン１００μｌで尾の基部の皮内注射により免疫した。ＣＦＡは、次に、パラフィン油およびモノオレエートマンニドの混合物に懸濁したＭｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３ｍｇ／ｍｌから構成された。非免疫動物群を、健常対照群とした。マウスは、後肢および前肢の浮腫および発赤など、病理学の最初の臨床症状の発症時に試験に登録した。病理の誘発とは異なる時期に、以下の規模に従って臨床スコアを割り当てることによって病理の程度を評価した：０＝通常、１＝足首のわずかな発赤および腫脹、２＝顕著な浮腫、３＝重度の浮腫および強直；次いで、各足に割り当てられた臨床スコア値を追加した。４つの足の体積も測定し、マイクロゲージを用いて合計した。試験終了時に動物を屠殺し、４本の足を採取し、１０％ホルマリンで固定し、組織学的分析のために処理した。標本を光学顕微鏡で分析して、軟骨および骨の分解、炎症性細胞浸潤および滑膜炎症を評価した。この目的のために、評価した個々のパラメータの重症度を定量化するためにスコアを割り当てた。被験薬は、浮腫、臨床スコアおよび関節の組織損傷を減少させることにより、疾患の進行を打ち消すことができれば、有効であると考えられた。蒸留水に溶解した化合物１（４５〜９０ｍｇ／ｋｇ）およびＣＲ６０８６（３０ｍｇ／ｋｇ）を、病状の進行中に１６日間経口投与した。
【００９４】
統計解析。値は群平均±標準誤差で表し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン６．０で分析した。統計解析は、最終処理後１６日目、２４時間目に種々の測定値を用いて実施した。ＡＮＯＶＡ一元配置分散分析を実施した後、浮腫値の多重比較についてＤｕｎｎｅｔｔ検定を実施した。臨床スコア値および病理組織学的スコア値の分析のために、４足のスコアの合計を、ＡＮＯＶＡ−Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック試験で分析し、続いて多重比較のためにＤｕｎｎ試験を行った。実施した統計解析では、Ｐ＝０．０５より低い値を有意とみなした。
【００９５】
結果：
化合物１の治療効果を、マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎の進行に対して、４５および９０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与し、評価した。化合物１は、用量依存的に、薬物治療の１６日間にわたって病理学の進展を有意に低下させた。このようにして得られた結果を、浮腫のＣＩＡ評価を示す図２およびＣＩＡの臨床評価を報告する図３にグラフでまとめた。
【００９６】
この影響は、解析したすべてのパラメータ、すなわち浮腫（＊＊＊Ｐ＜０．００１対ビヒクル；Ｄｕｎｎｅｔｔ試験）、臨床および組織病理学的スコア（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１対ビヒクル；Ｄｕｎｎｅｔｔ試験）に認められた。
【００９７】
浮腫（図２）および臨床スコア（図３）に関連する結果を、同様の研究において３０ｍｇ／ｋｇの用量で選択的ＥＰ４アンタゴニストＣＲ６０８６について得られた結果と比較すると、４５ｍｇ／ｋｇの用量で化合物１による臨床症状（足の腫脹）の回復に対してより大きな影響が認められた。この結果から、２つの化合物は、同じ用量で、マウスの関節炎の進行に対して同じ強力な治療活性を発現し得ると結論できる。
【００９８】
例１１
薬物動態
Ｗｉｓｔａｒラットに投与した化合物１は、優れた経口バイオアベイラビリティを示した。実際、５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した場合、化合物１は、４２７０ｎｇ／ｍｌのＣＭＡＸおよび５４６０ｎｇｘｈ／ｍｌのＡＵＣ（０〜２４時間）を示した。ＣＭＡＸ濃度４２７０ｎｇ／ｍｌは、血漿中濃度約９０００ｎＭに相当し、表１から得られるＩＣ５０値の約２００倍であった。この結果は、図２に示したＣＩＡモデルにおける炎症（足の腫脹）の阻害における化合物１の活性を完全に正当化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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