(57)【要約】  本発明は、ビタミンＤ３の生物工学的生成に使用されるビタミンＤ３前駆物質７−デヒドロコレステロール（７−ＤＨＣ）のアシル化に対する向上した活性及び／又は特異性を有する修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ酵素に関する。本発明は、前記修飾酵素を発現する宿主株並びにビタミンＤ３又はその誘導体及び／若しくは代謝産物を生成するプロセスにおけるその使用に更に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１によるポリペプチドにおける１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２４、６２６、６２７、６３６及びその組み合わせからなる群から選択される残基に対応する位置での１つ又は複数のアミノ酸置換、好ましくはＥ１１Ｇ、及び／若しくはＬ２８１Ｉ、及び／若しくはＤ３６６Ｖ、及び／若しくはＩ４４２Ｖ、及び／若しくはＨ５５１Ｙ、及び／若しくはＨ５５４Ｑ、及び／若しくはＦ５７２Ｌ、及び／若しくはＦ６２４Ｌ、及び／若しくはＬ６２６Ｆ、及び／若しくはＧ６２７Ｄ、及び／若しくはＣ６３６Ｓ並びに／又はその組み合わせに対応する１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する修飾酵素。
【請求項２】
７−デヒドロコレステロール（７−ＤＨＣ）及びチモステロールを含むステロールのエステル化を触媒し、ステロールエステル中のチモステロールに対する７−ＤＨＣの比は、それぞれの非修飾酵素を用いた触媒におけるチモステロールに対する７−ＤＨＣの比と比較して少なくとも約１．４倍だけ増加される、請求項１に記載の修飾酵素。
【請求項３】
前記アミノ酸置換は、Ｆ６２４Ｌ、Ｇ６２７Ｄ、Ｅ１１Ｇ、Ｈ５５４Ｑ、Ｉ４４２Ｖ及びその組み合わせから選択される、請求項１又は２に記載の修飾酵素。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾酵素を含む宿主細胞、好ましくは酵母、より好ましくはステロール産生酵母、更により好ましくはコレステロール産生酵母。
【請求項５】
配列番号３によるポリペプチドにおける５９２及び／又は５９５から選択される残基に対応する位置での１つ又は複数のアミノ酸置換、好ましくはＦ５９２Ｌ及び／又はＧ５９５Ｄに対応する置換を更に含む、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
７−ＤＨＣ及びチモステロールを含むステロールミックスの生成に使用され、チモステロールに対する７−ＤＨＣの比は、非修飾酵素を発現する宿主細胞と比較して少なくとも約１．４倍だけ増加される、請求項４又は５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
ＥＲＧ５及びＥＲＧ６は、不活化されている、請求項３〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ステロールΔ２４−レダクターゼ活性を有するＥＣ１．３．１．７２から選択される異種酵素を発現し、好ましくは、前記異種酵素は、植物又は脊椎動物に由来し、より好ましくはヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウマ又はゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）に由来する、請求項３〜７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項９】
チモステロール及び７−ＤＨＣを含むステロールミックス中のチモステロールのパーセンテージを低減するプロセスであって、適切な条件下において、請求項４〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、任意選択的に、前記ステロールミックスから前記７−ＤＨＣを単離及び／又は精製することとを含むプロセス。
【請求項１０】
７−ＤＨＣ及びチモステロールを含むステロールミックス中の７−ＤＨＣのパーセンテージを増加させるプロセスであって、適切な条件下において、請求項４〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、任意選択的に、前記ステロールミックスから前記７−ＤＨＣを単離及び／又は精製することとを含むプロセス。
【請求項１１】
請求項４〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞を用いる、チモステロール及び７−ＤＨＣを含むステロールミックスへのアセチル−ＣｏＡの酵素的変換を含む、７−ＤＨＣの生成のプロセスであって、前記ステロールミックス中の７−ＤＨＣのパーセンテージは、少なくとも４０％である、プロセス。
【請求項１２】
前記７−ＤＨＣは、ビタミンＤ３に更に変換される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記７−ＤＨＣは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３に更に変換される、請求項１１又は１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
７−ＤＨＣの生成のプロセスにおける、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾酵素又は請求項４〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用であって、前記７−ＤＨＣは、チモステロール及び７−ＤＨＣを含むステロールミックスから単離され、チモステロールに対する７−ＤＨＣの比は、それぞれの非修飾酵素及び宿主細胞を用いたプロセスとそれぞれ比較して少なくとも約１．４倍だけ増加される、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ビタミンＤ３の生物工学的生成に使用されるビタミンＤ３前駆物質７−デヒドロコレステロール（７−ＤＨＣ）のアシル化に対する向上した活性及び／又は特異性を有する修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ酵素に関する。本発明は、前記修飾酵素を発現する宿主株並びにビタミンＤ３又はその誘導体及び／若しくは代謝産物を生成するプロセスにおけるその使用に更に関する。
【０００２】
ビタミンＤ３（コレカルシフェロール又はカルシオールとしても知られる）は、哺乳動物の皮膚においてプロビタミンＤ３（７−デヒドロコレステロール又は７−ＤＨＣとしても知られる）から合成され得、それは、コレステロール生合成の産物であり、紫外線に曝露されると、７−ＤＨＣは、プロビタミンＤ３に光化学的に変換され、体温において生物活性型ビタミンＤ３に異性化する。肝臓において、ビタミンＤ３は、生物学的に不活性な２５−ヒドロキシビタミンＤ３（カルシジオール、カルシフェジオール、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、２５−ＯＨ−Ｄ３又はＨｙＤとしても知られる）に変換され、それは、ビタミンＤ３の主要な循環形である。更なるヒドロキシル化が腎臓内で生じる。
【０００３】
ビタミンＤ３の工業的製造について、化学合成及び生物工学的合成のいずれも（原則的に）利用可能である。化学合成は、例えば、羊毛脂から単離されたコレステロールから開始され、それは、化学合成及び生物工学的合成のいずれでも重要な中間体である７−ＤＨＣに脱水素される。紫外線による曝露及び更なる精製／抽出工程により、７−ＤＨＣは、ビタミンＤ３に変換される。修飾酵母株を７−ＤＨＣの生合成に使用することができ、多段階酵素的プロセスでアセチル−ＣｏＡが７−ＤＨＣに変換される。前記酵素的変換は、酵母の小胞体内で行われる。細胞膜で必要とされない、７−ＤＨＣ及びその前駆物質などの過剰量のステロールは、酵母に対して毒性であり、したがって細胞小器官内にステリルエステル（いわゆる脂肪滴）として貯蔵され、細胞小器官からそれを更に単離することができる。遊離ステロールと、脂肪滴に貯蔵されるステロール（主にステリルエステルの形態における）との平衡状態は、ステロールアシルトランスフェラーゼの作用など、数種類のタンパク質（酵素）の作用を介して誘発される。酵母、特にサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、ステロールのエステル形成は、主に２種類のステロールアシルトランスフェラーゼＡｒｅ１ｐ及びＡｒｅ２ｐによって行われる。
【０００４】
前記ステロールアシルトランスフェラーゼ酵素の非特異的作用のため、脂肪滴内に貯蔵されているステリルエステルのプールは、相対的に多様であり、限定されないが、例えばエルゴステロール、チモステロール、ラノステロール、ラトステロール、コレスタ−５，７，２４（２５）−トリエノール又は７−ＤＨＣのエステルなどが挙げられる。ビタミンＤ３合成には、７−ＤＨＣの前駆物質、コレスタ−５，７，２４（２５）−トリエノールのみを使用することができ、チモステロールを使用することができないため、例えば７−ＤＨＣのエステルなど、脂肪滴内への特異的なエステルの選択的な貯蔵並びに／或いはビタミンＤ３及び／又はその誘導体若しくは代謝産物に更に変換される、かかる酵母株によって生成される７−ＤＨＣの中間体の代謝回転を増加することのいずれかが必要とされる。本発明の焦点でもある特定の代謝産物は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３である。
【０００５】
したがって、７−ＤＨＣに対する高い生産性／特異性を有し、且つ／又は副産物／中間体、例えばチモステロール、ラノステロール若しくはラトステロール、特に脂肪滴内に貯蔵されるかかる中間体のエステルの蓄積が低減された、ステロールを生成することができる酵母などの宿主細胞を生成することが継続的な課題である。
【０００６】
意外なことに、本発明者らは、ここで、宿主細胞におけるステロールアシルトランスフェラーゼ活性の特異性及び／又は活性が、ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１の配列に特定のアミノ酸置換を導入することによってシフトすることができ、それによりビタミンＤ３生成における重要な中間体としての７−ＤＨＣに対する宿主細胞の生産性が高まることを見出した。
【０００７】
したがって、本発明は、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性、すなわち修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ、特にステロールアシルトランスフェラーゼアイソフォームＡｒｅ１ｐ及び／又はＡｒｅ２ｐの活性を有する修飾酵素であって、配列番号１によるポリペプチドにおける１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２４、６２６、６２７、６３６及びその組み合わせからなる群から選択される残基に対応する位置での１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、チモステロールなどの副産物／中間体と比較して、７−ＤＨＣに対する増加した特異性及び／又は７−ＤＨＣのエステルなどのエステル形成に対する増加した活性を有する、修飾酵素に関する。
【０００８】
ＡＲＥ２活性を示す、配列番号１によるポリペプチドであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチドがサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されている。ＡＲＥ１活性を示す、配列番号３によるポリペプチドであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチドがサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されている。
【０００９】
「ステロールアシルトランスフェラーゼ」、「アシルトランスフェラーゼ」、「ＡＲＥ」、「アシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素」又は単なる「酵素」という用語は、本明細書において区別なく使用され、且つ酵素［ＥＣ２．３．１．２６］、すなわち１つの分子から別の分子に脂肪酸アシル基を転移するアシルトランスフェラーゼを意味する。かかる転移又は酵素活性は、当業者に公知の手段で測定することができる。ステロールアシルトランスフェラーゼは、哺乳動物、酵母又は植物などの様々な起源から単離されている。ＡＲＥ１及びＡＲＥ２のいずれも、例えば、チモステロールなどのステロール及び／又は７−ＤＨＣをそれぞれのエステルにアシル化することができる。本明細書で使用される「修飾」酵素、すなわち修飾アシルトランスフェラーゼは、例えば、チモステロールのエステル化と比較して、７−ＤＨＣのエステル化に対して好ましい活性及び／若しくは特異性を有し、且つ／又は例えば７−ＤＨＣ若しくはチモステロールなどのステロールエステル全体の向上した形成を有する。好ましいアシルトランスフェラーゼアイソフォームは、Ａｒｅ２ｐ又はＡｒｅ１ｐである。本明細書で使用される「非修飾」ステロールアシルトランスフェラーゼ、特にＡＲＥ１及びＡＲＥ２は、本明細書で定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を保有しないそれぞれの内因性酵素を意味する。
【００１０】
本明細書で定義される修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を保持する、特に本明細書で定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１を保持する、本明細書で使用される宿主細胞は、「修飾」宿主細胞と呼ばれる。非修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を保持する、すなわち野生型ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１遺伝子をコードするそれぞれの宿主細胞は、「非修飾」宿主細胞と呼ばれる。
【００１１】
本明細書で使用される、ビタミンＤ３中間体を特定化する「チモステロール」、「ラノステロール」、「ラトステロール」、「コレスタ−５，８，２４（２５）−トリエノール」、「コレスタ−５，７，２４（２５）−トリエノール」又は「７−ＤＨＣ」という用語は、前記化合物の遊離型及びエステル型の両方を含む。本明細書で使用されるステロールミックスは、７−ＤＨＣ及び「副産物」又は中間体、限定されないが、チモステロール、ラノステロール、ラトステロール、コレスタ−５，８，２４（２５）−トリエノール若しくはコレスタ−５，７，２４（２５）−トリエノールなどを含有する。
【００１２】
本明細書で使用される「コレステロール産生酵母」は、もはやエルゴステロールを産生することができないが、限定されないが、コレスタ−５，７，２４（２５）−トリエノール、コレスタ−５，８，２４（２５）−トリエノール、コレスタ−７，２４（２５）−ジエノール、７−ＤＨＣ又はチモステロールなどのコレステロール生成物を産生することができる。特に、これは、ｅｒｇ５ｅｒｇ６ダブルノックアウトの導入によって達成され得る。
【００１３】
特に、修飾は、ステロールアシルトランスフェラーゼ２及び／又は１の修飾活性に対応し、すなわちアミノ酸置換を含むＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性に対応し、好ましくは配列番号１によるポリペプチドにおける１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２４、６２６、６２７、６３６及びその組み合わせからなる群から選択される残基に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｅ１１、及び／又はＬ２８１、及び／又はＤ３６６、及び／又はＩ４４２、及び／又はＨ５５１、及び／又はＨ５５４、及び／又はＦ５７２、及び／又はＦ６２４、及び／又はＬ６２６、及び／又はＧ６２７、及び／又はＣ６３６のアミノ酸置換に対応する。より好ましくは、修飾は、修飾ＡＲＥ２活性、更により好ましくは配列番号１による修飾ポリペプチドに対応し、１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２４、６２６、６２７、６３６及びその組み合わせからなる群から選択される位置での少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている。好ましくは、修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性を有する酵素は、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。
【００１４】
一実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基１１に対応する位置にアミノ酸置換、好ましくはグリシンによるグルタミン酸の置換（Ｅ１１Ｇ）を含む。配列番号１における残基Ｅ１１Ｇに対応する位置での記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号１による且つ本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸残基２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２４、６２６、６２７及び／又は６３６に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。好ましくは、配列番号１における残基Ｅ１１Ｇに対応する位置でのアミノ酸置換は、配列番号１におけるＦ６２４Ｌ、Ｇ６２７Ｄ、Ｄ３６６Ｖ、Ｃ６３６Ｓ及び／又はＩ４４２Ｖに対応する位置のアミノ酸置換など、更なる置換と組み合わされ得、より好ましくは配列番号１における残基Ｅ１１Ｇ−Ｆ６２４Ｌ、Ｅ１１Ｇ−Ｇ６２７Ｄ、Ｅ１１Ｇ−Ｄ３６６Ｖ−Ｃ６３６Ｓ、Ｅ１１Ｇ−Ｄ３６６Ｖ−Ｇ６２７Ｄ−Ｃ６３６Ｓ、Ｅ１１Ｇ−Ｄ３６６Ｖ−Ｆ６２４Ｌ−Ｃ６３６Ｓ、Ｅ１１Ｇ−Ｄ３６６Ｖ−Ｉ４４２Ｖ−Ｆ６２４Ｌ−Ｃ６３６Ｓ又はＥ１１Ｇ−Ｄ３６６Ｖ−Ｉ４４２Ｖ−Ｇ６２７Ｄ−Ｃ６３６Ｓに対応する置換の組み合わせであり、最も好ましい組み合わせは、Ｅ１１Ｇ−Ｄ３６６Ｖ−Ｃ６３６Ｓ、Ｅ１１Ｇ−Ｄ３６６Ｖ−Ｇ６２７Ｄ−Ｃ６３６Ｓ、Ｅ１１Ｇ−Ｄ３６６Ｖ−Ｆ６２４Ｌ−Ｃ６３６Ｓ、Ｅ１１Ｇ−Ｄ３６６Ｖ−Ｉ４４２Ｖ−Ｇ６２７Ｄ−Ｃ６３６Ｓ又はＥ１１Ｇ−Ｄ３６６Ｖ−Ｉ４４２Ｖ−Ｆ６２４Ｌ−Ｃ６３６Ｓから選択される。かかる修飾酵素、特に前記アミノ酸置換の１つを含む配列番号１による酵素を保有するコレステロール産生酵母を使用すると、本明細書に定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて少なくとも約３〜５倍の範囲で酵素特異性を増加させることができた。
【００１５】
一実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基２８１に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはイソロイシンによるロイシンの置換（Ｌ２８１Ｉ）を含む。配列番号１における残基Ｌ２８１Ｉに対応する位置での記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号１によるポリペプチドにおけるアミノ酸残基１１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２４、６２６、６２７及び／又は６３６に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。かかる修飾酵素、特に前記アミノ酸置換の１つを含む配列番号１による酵素を保有するコレステロール産生酵母を使用すると、本明細書で定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて少なくとも約１．５倍の範囲で相対的なエステル形成を増加させることができた。
【００１６】
一実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基３６６に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはバリンによるアスパラギン酸の置換（Ｄ３６６Ｖ）を含む。配列番号１における残基Ｄ３６６Ｖに対応する位置での記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号１による且つ本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸残基１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２４、６２６、６２７及び／又は６３６に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。かかる修飾酵素、特に前記アミノ酸置換の１つを含む配列番号１による酵素を保有するコレステロール産生酵母を使用すると、本明細書で定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて少なくとも約３倍の範囲で酵素特異性を増加させることができた。
【００１７】
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基４４２に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはバリンによるイソロイシンの置換（Ｉ４４２Ｖ）を含む。配列番号１における残基Ｉ４４２Ｖに対応する位置の記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号１による且つ本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸残基１１、２８１、３６６、５５１、５５４、５７２、６２４、６２６、６２７及び／又は６３６に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。好ましくは、配列番号１における残基Ｉ４４２Ｖに対応する位置でのアミノ酸置換は、配列番号１におけるＦ６２４Ｌ、Ｌ６２６Ｆ及び／又はＧ６２７Ｄに対応する位置でのアミノ酸置換などの更なる置換と組み合わされ得、配列番号１における残基Ｉ４４２Ｖ−Ｌ６２６Ｆ、Ｉ４４２Ｖ−Ｇ６２７Ｄ、Ｉ４４２Ｖ−Ｆ６２４Ｌ−Ｌ６２６Ｆ又はＩ４４２Ｖ−Ｌ６２６Ｆ−Ｇ６２７Ｄに対応する置換の組み合わせがより好ましく、最も好ましい組み合わせは、Ｉ４４２Ｖ−Ｇ６２７Ｄ、Ｉ４４２Ｖ−Ｆ６２４Ｌ−Ｌ６２６Ｆ又はＩ４４２Ｖ−Ｌ６２６Ｆ−Ｇ６２７Ｄから選択される。かかる修飾酵素、特に前記アミノ酸置換の１つを含む配列番号１による酵素を保有するコレステロール産生酵母を使用すると、本明細書で定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて少なくとも約２．２〜４．５倍の範囲で酵素特異性を増加させることができた。
【００１８】
更なる実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基５５１に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはチロシンによるヒスチジンの置換（Ｈ５５１Ｙ）を含む。配列番号１における残基Ｈ５５１Ｙに対応する位置での記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号１による且つ本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸残基１１、２８１、３６６、４４２、５５４、５７２、６２４、６２６、６２７及び／又は６３６に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。かかる修飾酵素、特に前記アミノ酸置換の１つを含む配列番号１による酵素を保有するコレステロール産生酵母を使用すると、本明細書で定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて少なくとも約１．７倍の範囲で酵素特異性を増加させることができた。
【００１９】
一実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基５５４に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはグルタミンによるヒスチジンの置換（Ｈ５５４Ｑ）を含む。配列番号１における残基Ｈ５５４Ｑに対応する位置での記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号１による且つ本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸残基１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５７２、６２４、６２６、６２７及び／又は６３６に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。好ましくは、配列番号１における残基Ｈ５５４Ｑに対応する位置でのアミノ酸置換は、配列番号１におけるＦ６２４Ｌ、Ｆ５７２Ｌ及び／又はＧ６２７Ｄに対応する位置でのアミノ酸置換などの更なる置換と組み合わされ得、配列番号１における残基Ｈ５５４Ｑ−Ｆ５７２Ｌ−Ｆ６２４Ｌ又はＨ５５４Ｑ−Ｆ５７２Ｌ−Ｇ６２７Ｄに対応する置換の組み合わせがより好ましい。かかる修飾酵素、特に前記アミノ酸置換の１つを含む配列番号１による酵素を保有するコレステロール産生酵母を使用すると、本明細書で定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて少なくとも約１．４倍〜１２倍を超える範囲で酵素特異性を増加させることができた。
【００２０】
他の実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基５７２に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはロイシンによるフェニルアラニンの置換（Ｆ５７２Ｌ）を含む。配列番号１における残基Ｆ５７２Ｌに対応する位置での記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号１による且つ本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸残基１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、６２４、６２６、６２７及び／又は６３６に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。かかる修飾酵素、特に上記で定義される前記アミノ酸置換の１つを含む配列番号１による酵素を保有するコレステロール産生酵母を使用すると、定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて少なくとも約１．７倍の範囲で酵素特異性を増加させることができた。
【００２１】
一実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基６２４に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはロイシンによるフェニルアラニンの置換（Ｆ６２４Ｌ）を含み、配列番号３によるポリペプチドにおけるＦ５９２Ｌの置換に対応する。配列番号１における残基Ｆ６２４Ｌに対応する位置での記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号１による且つ本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸残基１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２６、６２７及び／又は６３６に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。かかる修飾酵素、特に前記アミノ酸置換の１つを含む配列番号１による酵素を保有するコレステロール産生酵母を使用すると、本明細書で定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて少なくとも約３．１倍の範囲で酵素特異性を増加させることができた。
【００２２】
一実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基６２６に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはフェニルアラニンによるロイシンの置換（Ｌ６２６Ｆ）を含む。配列番号１における残基Ｌ６２６Ｆに対応する位置での記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号１による且つ本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸残基１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２４、６２７及び／又は６３６に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。かかる修飾酵素、特に上記で定義される前記アミノ酸置換の１つを含む配列番号１による酵素を保有するコレステロール産生酵母を使用すると、本明細書で定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて少なくとも約２．２倍の範囲で酵素特異性を増加させることができた。
【００２３】
一実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基６２７に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはアスパラギン酸によるグリシンの置換（Ｇ６２７Ｄ）を含み、配列番号３によるポリペプチドにおけるＧ５９５Ｄの置換に対応する。配列番号１における残基Ｇ６２７Ｄに対応する位置での記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号１による且つ本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸残基１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２４、６２６及び／又は６３６に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。かかる修飾酵素、特に上記で定義される前記アミノ酸置換の１つを含む配列番号１による酵素を保有するコレステロール産生酵母を使用すると、本明細書で定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて少なくとも約２．２倍の範囲で酵素特異性を増加させることができた。
【００２４】
一実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基６３６に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはセリンによるシスチンの置換（Ｃ６３６Ｓ）を含む。配列番号１における残基Ｃ６３６Ｓに対応する位置での記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号１による且つ本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸残基１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２４、６２６及び／又は６２７に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。かかる修飾酵素、特に前記アミノ酸置換の１つを含む配列番号１による酵素を保有するコレステロール産生酵母を使用すると、本明細書で定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて少なくとも約３倍の範囲で酵素特異性を増加させることができた。
【００２５】
例えば、ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１など、本発明による修飾ステロールアシルトランスフェラーゼは、好ましくは、配列番号１によるポリペプチドにおけるＦ６２４Ｌに対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、約４の酵素特異性が得られる。これは、１つ又は複数の更なるアミノ酸置換、例えばＦ５７２Ｌ及び／又はＨ５５４Ｑに対応する位置でのアミノ酸置換を導入することによって増加させることができ、本明細書で定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて１２倍を超える範囲で酵素特異性が増加する。
【００２６】
本発明の他の実施形態による修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ、例えばＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１などは、好ましくは、配列番号１によるポリペプチドにおけるＧ６２７Ｄに対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、４を超える酵素特異性が得られる。これは、１つ又は複数の更なるアミノ酸置換、例えばＦ５７２Ｌ及び／又はＨ５５４Ｑに対応する位置でのアミノ酸置換を導入することによって増加させることができ、本明細書で定義される非修飾酵母を使用した場合と比べて酵素特異性が約５倍だけ増加する。
【００２７】
本明細書で使用されるＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１の活性は、修飾される。これは、例えば、ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１をコードする内因性遺伝子に変異、すなわち本明細書に記載の１つ又は複数の位置でのアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。酵母細胞をどのように遺伝子操作して、ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性が修飾されるかは、当業者に公知である。これらの遺伝子操作としては、限定されないが、例えば遺伝子置換、遺伝子増幅、遺伝子破壊、トランスフェクション、プラスミド、ウイルス又は他のベクターを用いた形質転換が挙げられる。
【００２８】
核酸又はアミノ酸内への変異の生成、すなわち変異誘発は、様々な方法において、例えばランダム若しくは部位特異的突然変異誘発、例えば放射線、化学的治療などの薬剤又は遺伝因子の挿入によって起こる物理的ダメージなどによって行われ得る。
【００２９】
本発明は、特に、７−ＤＨＣ、ビタミンＤ３の中間体を生成するプロセスにおける、本明細書で定義されるかかる修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１酵素の使用に関する。好ましくは、本発明の修飾酵素は、酵母、好ましくはステロール産生酵母、特にコレステロール産生酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、クルイベロミセス属（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．）又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、好ましくはＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される酵母など、適切な宿主細胞に導入され、且つ／又は発現される。修飾宿主は、ビタミンＤ３及び／又は２５−ヒドロキシビタミンＤ３に更に変換され得る７−ＤＨＣを生成するために使用される。
【００３０】
適切な宿主細胞を更に修飾して、ビタミンＤ３の生合成に対する重要な中間体、７−ＤＨＣの生成が更に増加され、且つ／又は副産物の蓄積が低減され得る。
【００３１】
したがって、一実施形態において、本発明は、修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性を有する酵母株に関し、更に、ＥＲＧ５及びＥＲＧ６は、不活化されている。酵母細胞は、前記酵母細胞内で発現することができる限り、コレスタ−７，２４−ジエノール、チモステロール又はトリエノール（例えば、コレスタ−５，７，２５−トリエノール）上で活性である異種Ｃ２４−レダクターゼ、好ましくは植物若しくは脊椎動物ステロールΔ２４−レダクターゼ、より好ましくは脊椎動物由来のレダクターゼ、更により好ましくはヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウマ、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）又は既知のいずれかの源由来のレダクターゼなど、ＥＣ１．３．１．７２から特に選択される、Ｃ２４−レダクターゼ活性を有する異種酵素の発現によって更に修飾され得る。最も好ましくは、ステロールΔ２４−レダクターゼは、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、ラット又はヒトから選択される。前記ステロールΔ２４−レダクターゼ酵素を発現する配列は、公的に入手可能であり、限定されないが、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ参照番号Ｑ１５３９２、Ｑ６０ＨＣ５、Ｑ８ＶＣＨ６、Ｑ５ＢＱＥ６、Ｑ３９０８５又はＰ９３４７２（例えば、国際公開第２００３０６４６５０号パンフレットを参照されたい）が挙げられる。
【００３２】
他の実施形態において、本発明による宿主細胞は、例えば、Ｃ５−ステロールデサチュラーゼ（ＥＲＧ３）及び／又はＣ８−ステロールイソメラーゼ（ＥＲＧ２）など、７−ＤＨＣの生合成に関与する内因性酵素のホモログの導入によって更に修飾され得、７−ＤＨＣの特異性及び／又は生産性が増加すると共に、限定されないが、チモステロール、ラノステロール及び／又はラトステロールなどの副産物又はビタミンＤ３中間体の蓄積が低減される。
【００３３】
特定の実施形態において、本発明は、７−ＤＨＣの生成に関して宿主細胞を向上させるプロセスであって、その細胞は、本明細書で定義される修飾宿主細胞、すなわち本明細書において定義されるステロールアシルトランスフェラーゼＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１における１つ又は複数のアミノ酸置換の導入によって修飾された修飾宿主細胞、特にコレステロール産生酵母細胞であり、好ましくはＥＲＧ５及びＥＲＧ６が不活化されており、任意選択的に、本明細書で定義されるＣ−２４−レダクターゼ活性を有する異種酵素が発現され、且つ／又は任意選択的に、内因性ＥＲＧ２及び／又はＥＲＧ３のホモログが発現される、酵母細胞であり、宿主細胞は、前記宿主細胞によって産生されるステロールの総量中の７−ＤＨＣのパーセンテージが、本明細書で定義される非修飾宿主細胞と比較して増加し、且つ／又はステロールの産生に対する宿主細胞の活性が増加するように改善される、プロセスに関する。
【００３４】
一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される少なくとも１つ又は複数のアミノ酸置換を含む修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１に関し、酵素の特異性は、非修飾酵素の特異性と比べて増加し、かかる修飾ステロールアシルトランスフェラーゼを保有する適切な宿主細胞によって産生されたステロールミックス中の例えばチモステロールなどの副産物に対する７−ＤＨＣの比が高くなる。その比は、例えば、それぞれのＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１配列におけるＨ５５４Ｑに対応するアミノ酸置換の導入などにより、少なくとも約１．４倍だけ増加され得、例えばそれぞれのＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１配列におけるＥ１１Ｇ−Ｆ６２４Ｌ、Ｉ４４２Ｖ−Ｇ６２７Ｄ又はＩ４４２Ｖ−Ｆ６２４Ｌ−Ｌ６２６Ｆに対応するアミノ酸置換の導入などにより、少なくとも３倍だけ増加され、例えばそれぞれのＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１配列におけるＦ６２４Ｌ又はＧ６２７Ｄに対応するアミノ酸置換の導入などにより、少なくとも４倍だけ増加され、例えばそれぞれのＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１配列におけるＨ５５４Ｑ−Ｆ５７２Ｌ−Ｇ６２７Ｄ又はＥ１１Ｇ−Ｄ３６６Ｖ−Ｉ４４２Ｖ−Ｇ６２７Ｄ−Ｃ６３６Ｓに対応するアミノ酸置換の導入などにより、少なくとも５、１０又は１２倍以上だけ増加され得る。
【００３５】
一実施形態において、本発明は、本明細書で定義される少なくとも１つ又は複数のアミノ酸置換を含む修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ、特に修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１に関し、酵素の活性が非修飾酵素の活性と比べて増加し、ステロール及び／又はステリルエステルの全体的産生が高くなり、修飾ステロールアシルトランスフェラーゼを保有する適切な宿主細胞によって産生される７−ＤＨＣの量が高くなる。したがって、相対的なエステル形成、すなわち遊離７−ＤＨＣに対するすべてのエステルの比は、例えば、それぞれのＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１配列におけるＨ５５Ｑ又はＨ５５４Ｑ−Ｆ５７２Ｌに対応するアミノ酸置換の導入などによって少なくとも１．２倍だけ増加され得、例えばそれぞれのＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１配列におけるＩ４４２Ｖ−Ｇ６２７Ｄ又はＩ４４２Ｖ−Ｌ６２６Ｆ−Ｇ６２７Ｄに対応するアミノ酸置換の導入などによって少なくとも２倍又は３倍だけ増加され得る。７−ＤＨＣ総生産は、本明細書に記載の１つ又は複数のアミノ酸置換の導入によって少なくとも約１．２〜１．４倍だけ増加され得る。
【００３６】
修飾宿主細胞、例えばステロール産生酵母などの酵母、特に本明細書に記載のコレステロール産生酵母を使用した場合、ステロールミックス中の７−ＤＨＣのパーセンテージを、ステロールの総量に対して少なくとも４０％、例えば５０、６０、７０、８０、９０％の７−ＤＨＣに増加させることができた。
【００３７】
本発明の一態様において、本明細書で定義される修飾ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１活性を含む宿主細胞がビタミンＤ３前駆物質７−ＤＨＣを産生するプロセスで使用される。それぞれのコレステロール産生宿主細胞に関して、好気性又は無気的条件下において且つ当業者に公知のように、適切な栄養で補われた水性媒体中で修飾宿主細胞が培養され得る。任意選択的に、かかる培養は、当技術分野で公知のように、タンパク質及び／又は電子の移行に関与する補因子の存在下にある。宿主細胞の培養／増殖は、バッチ、フェドバッチ、半連続又は連続式で行われ得る。宿主細胞に応じて、好ましくは、ビタミンＤ３及び７−ＤＨＣなどのその前駆物質の生成は、当業者に公知であるように様々であり得る。ビタミンＤ３の生成における７−ＤＨＣ及び他の中間体の培養及び単離は、例えば、国際公開第２０１１０６７１４４号パンフレット又は国際公開第２０１７１０８７９９号パンフレットに記載されている。７−ＤＨＣは、ステロールミックスから単離され、且つ／又は任意選択的に更に精製され得、当技術分野で公知の方法を用いてビタミンＤ３及び／又は２５−ヒドロキシビタミンＤ３に更に変換され得る。
【００３８】
「ＡＲＥ１」及び「Ａｒｅ１ｐ」、「ＡＲＥ２」及び「Ａｒｅ２ｐ」、「ＥＲＧ５」及び「Ｅｒｇ５ｐ」、「ＥＲＧ６」及び「Ｅｒｇ６ｐ」という用語は、本明細書において区別なく使用され、それぞれの遺伝子ａｒｅ１、ａｒｅ２、ｅｒｇ５及びｅｒｇ６によってコードされるポリペプチドを意味する。本発明の目的のために、コレステロール産生酵母細胞は、ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１の修飾活性を示す例えば内因性ＡＲＥ２、ＡＲＥ１又はその両方の修飾を保持し、ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１の修飾特異性が得られるように修飾され、前記修飾は、本明細書で定義される１つ又は複数のアミノ酸置換の導入を含む。
【００３９】
ＥＲＧ５、ＥＲＧ６、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２、ＥＲＧ２、ＥＲＧ３又はステロールΔ２４−レダクターゼ（ＥＲＧ４）をコードする遺伝子、本明細書において使用される酵母細胞の培養及び遺伝子操作は、公知であり、例えば米国特許第７６０８４２１号明細書に記載されている。
【００４０】
本明細書で使用される「Ｃ−２４−レダクターゼ」又は「Δ２４−レダクターゼ」という用語は、本明細書において区別なく使用される。酵母において、この酵素は、ｅｒｇ４によってコードされ、位置２４の炭素原子のメチル基に対して活性である。したがって、前記位置でかかるメチル基を示さないトリエノールは、酵母ＥＲＧ４に対して許容可能な基質ではない。
【００４１】
「Ｃ−８ステロールイソメラーゼ」、「Δ８，７−イソメラーゼ」又は「Ｃ−８ステロールイソメラーゼを有する酵素」という用語は、本明細書において区別なく使用され、コレスタ−８−エノールのコレスタ−７−エノールへの変換及び／又はチモステロールのコレスタ−７，２４−ジエノールへの変換を触媒することができる酵素を意味する。酵母において、この酵素は、ｅｒｇ２によってコードされる。本発明による修飾宿主細胞において使用される好ましいＥＲＧ２ホモログは、配列番号５と少なくとも４１％、例えば少なくとも４４、４５、４８、４９、５３、５６、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までの同一性を有するポリペプチドであり、Ｃ−８ステロールイソメラーゼ活性を示し、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓから入手可能なかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。特に、前記ＥＲＧ２ホモログの少なくとも１、２、３、５つなど、１つ又は複数のコピーは、本明細書で定義される修飾宿主細胞において発現される。
【００４２】
「Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ」、「Ｃ−５ステロールデサチュラーゼを有する酵素」、「デサチュラーゼ」又は「ＥＲＧ３−ホモログ」という用語は、本明細書において区別なく使用され、コレスタ−８−エノールのコレスタ−７，２４−ジエノールへの変換並びに／又はコレスタ−７−エノールのコレスタ−５，７，２４−トリエノール及び／若しくは７−ＤＨＣへの変換を触媒することができる酵素を意味する。酵母において、この酵素は、ｅｒｇ３によってコードされる。本発明による修飾宿主細胞において使用される好ましいＥＲＧ３ホモログは、配列番号７と少なくとも４５％、例えば少なくとも５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までの同一性を有するポリペプチドであり、Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ活性を示し、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）から入手可能なかかるポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む。特に、前記ＥＲＧ３ホモログの少なくとも１、２、３、５つなど、１つ又は複数のコピーは、本明細書で定義される修飾宿主細胞において発現される。
【００４３】
本明細書で定義される「相対的なエステル形成」とは、（すべてのエステル／遊離７−ＤＨＣ）ｍｕｔａｎｔ／（すべてのエステル／遊離７−ＤＨＣ）ｗｔの比である。本明細書で定義される酵素「特異性」とは、（７−ＤＨＣエステル／チモステロールエステル）ｍｕｔａｎｔ／（７−ＤＨＣエステル／チモステロールエステル）ｗｔの比である。本明細書で定義される「７−ＤＨＣ総生産」は、（総７−ＤＨＣ）ｍｕｔａｎｔ／（７−ＤＨＣ）ｗｔの比である。
【００４４】
本明細書で使用される、酵素に関する「特異的活性」又は「活性」という用語は、その触媒活性、すなわち所定の基質からの産物の形成を触媒するその能力を意味する。所定の時間内及び定義された温度において、タンパク質の定義された量当たりで消費される基質及び／又は生成される産物の量が特異的活性によって定義される。通常、特異的活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１分当たりで消費される基質又は形成される産物μｍｏｌで表される。通常、μｍｏｌ／分は、Ｕ（＝単位）によって省略される。したがって、μｍｏｌ／分／（タンパク質ｍｇ）又はＵ／（タンパク質ｍｇ）の特異的活性の単位定義は、本明細書全体を通して区別なく使用される。酵素がその触媒活性を生体内、すなわち本明細書で定義される宿主細胞内又は適切な基質の存在下において適切な（無細胞）システム内で発揮する場合、酵素は、活性である。当業者であれば、例えばＨＰＬＣなどによる測定など、どのように酵素活性を測定するかを知っている。
【００４５】
本発明に関して、例えば、微生物、菌類、藻類又は植物などの生物は、原核生物の命名法の国際コード又は菌類、藻類及び植物の命名法の国際コード（メルボルンコード）によって定義される、同じ生物学的特性を有するかかる種の異名又はバソニムも包含する。
【００４６】
特に、本発明は、本発明の以下の実施形態を特徴とする：
（１）配列番号１によるポリペプチドにおける１１、２８１、３６６、４４２、５５１、５５４、５７２、６２４、６２６、６２７、６３６及びその組み合わせからなる群から選択される残基に対応する位置での１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する、本明細書で定義される修飾酵素。
（２）７−デヒドロコレステロール及びチモステロールを含むステロールのエステル化を触媒し、ステロールエステルにおけるチモステロールに対する７−ＤＨＣの比は、それぞれの非修飾酵素を用いた触媒におけるチモステロールに対する７−ＤＨＣの比と比較して少なくとも約１．４倍だけ増加される、本明細書で定義され且つ実施形態（１）の修飾酵素。
（３）アミノ酸置換は、Ｆ６２４Ｌ、Ｇ６２７Ｄ、Ｅ１１Ｇ、Ｈ５５４Ｑ、Ｉ４４２Ｖ及びその組み合わせから選択される、本明細書で定義され且つ実施形態（１）又は（２）の修飾酵素。
（４）本明細書で定義され且つ実施形態（１）、（２）、（３）のいずれかによる修飾酵素を含む宿主細胞、好ましくは酵母、より好ましくはステロール産生酵母、更により好ましくはコレステロール産生酵母であって、前記宿主細胞は、任意選択的に、配列番号３によるポリペプチドにおける５９２及び／又は５９５から選択される残基に対応する位置での１つ又は複数のアミノ酸置換、好ましくはＦ５９２Ｌ及び／又はＧ５９５Ｄに対応する置換を更に含む、宿主細胞、好ましくは酵母、より好ましくはステロール産生酵母、更により好ましくはコレステロール産生酵母。
（５）７−ＤＨＣ及びチモステロールを含むステロールミックスの生成に使用され、チモステロールに対する７−ＤＨＣの比は、非修飾酵素を発現する宿主細胞と比較して少なくとも約１．４倍だけ増加される、本明細書で定義され且つ実施形態（４）の宿主細胞。
（６）任意選択的に、
−  ＥＲＧ５及びＥＲＧ６の不活化、及び／又は
−  ステロールΔ２４−レダクターゼ活性を有するＥＣ１．３．１．７２から選択される異種酵素の発現であって、好ましくは、異種酵素は、植物又は脊椎動物に由来し、より好ましくはヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウマ又はゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）に由来する、発現
を更に含む、本明細書で定義され且つ実施形態（４）又は（５）の宿主細胞。
（７）チモステロール及び７−ＤＨＣを含むステロールミックス中のチモステロールのパーセンテージを低減するプロセスであって、適切な条件下において、本明細書で定義され且つ実施形態（４）、（５）若しくは（６）の１つの宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に、ステロールミックスから７−ＤＨＣを単離及び／若しくは精製する工程とを含むプロセス又は７−ＤＨＣ及びチモステロールを含むステロールミックス中の７−ＤＨＣのパーセンテージを増加するプロセスであって、適切な条件下において、本明細書で定義され且つ実施形態（４）、（５）若しくは（６）の１つの宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に、ステロールミックスから７−ＤＨＣを単離及び／若しくは精製する工程とを含むプロセス。
（８）本明細書で定義され且つ実施形態（４）、（５）又は（６）の１つの宿主を用いる、チモステロール及び７−ＤＨＣを含むステロールミックスへのアセチル−ＣｏＡの酵素的変換を含む、７−ＤＨＣの生成のプロセスであって、ステロールミックス中の７−ＤＨＣのパーセンテージは、少なくとも４０％であり、任意選択的に、７−ＤＨＣは、ビタミンＤ３及び／又は２５−ヒドロキシビタミンＤ３に更に変換される、プロセス。
（９）７−ＤＨＣの生成のプロセスにおける、本明細書で定義され且つ実施形態（１）、（２）、（３）のいずれかの修飾酵素又は本明細書で定義され且つ実施形態（４）、（５）若しくは（６）の１つの宿主細胞の使用であって、７−ＤＨＣは、チモステロール及び７−ＤＨＣを含むステロールミックスから単離され、チモステロールに対する７−ＤＨＣの比は、それぞれの非修飾酵素及び宿主細胞を用いたプロセスと比較してそれぞれ少なくとも約１．４倍だけ増加される、使用。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＡＲＥ２野生型株（「ＷＴ」）並びにＡｒｅ２バリアント＃２及び＃１の脂質抽出物のＨＰＬＣ分析（表１を参照されたい）。７−ＤＨＣのエステル（「７−ＤＨＣエステル」）及びチモステロールのエステル（「Ｚｙｍエステル」）に関して、それぞれのカラムに濃い灰色と薄い灰色によって示されるように、２つのエステル形が検出された。遊離７−ＤＨＣは、黒色で示される。（Ａ）エステル形成に対する７−ＤＨＣの比、（Ｂ）総チモステロールエステル対する総７−ＤＨＣ（遊離及びエステル形を含む）の比、（Ｃ）異なるカラムによって示される遊離７−ＤＨＣ、７−ＤＨＣエステル及びチモステロールエステルの形成。バッフルなしでフラスコ内に２つのグルコースを流加して株を２日間培養した。データは、それぞれ１回培養された３つの独立した形質転換株の平均値である。
【図２】ＡＲＥ２野生型株（「ＷＴ」）並びにＡｒｅ２バリアント＃２及び＃１の脂質抽出物のＨＰＬＣ分析（表１を参照されたい）。更なる詳細については、図１の説明文を参照されたい。バッフルなしでフラスコ内に１つのグルコースを流加して株を４日間培養した。データは、それぞれ１回培養された２つの独立した形質転換株の平均値である。
【図３】ＡＲＥ２野生型株（「ＷＴ」）並びにＡｒｅ２バリアント＃９及び＃１の脂質抽出物のＨＰＬＣ分析（表１を参照されたい）。更なる詳細については、図１の説明文を参照されたい。ＨＰＬＣ分析は、標準手順に従う。更なる詳細については、本文を参照されたい。
【図４】ＡＲＥ２野生型株（「ＷＴ」）並びにＡｒｅ２バリアント＃２４及び＃２０の脂質抽出物のＨＰＬＣ分析（表１を参照されたい）。更なる詳細については、図１の説明文を参照されたい。ＨＰＬＣ分析は、標準手順に従う。更なる詳細については、本文を参照されたい。
【図５】ＡＲＥ２野生型株（「ＷＴ」）並びにＡｒｅ２バリアント＃２２及び＃２７の脂質抽出物のＨＰＬＣ分析（表１を参照されたい）。更なる詳細については、図１の説明文を参照されたい。ＨＰＬＣ分析は、標準手順に従う。更なる詳細については、本文を参照されたい。
【図６】ＡＲＥ２野生型株（「ＷＴ」）並びにＡｒｅ２バリアント＃２０、＃２２、＃２７及び＃２２の脂質抽出物のＨＰＬＣ分析（表１を参照されたい）。更なる詳細については、図１の説明文を参照されたい。ＨＰＬＣ分析は、標準手順に従う。更なる詳細については、本文を参照されたい。
【図７】ＡＲＥ２野生型株（「ＷＴ」）並びにＡｒｅ２バリアント＃３４、＃３２、＃４３、＃２４、＃２０、＃２２及び＃２７の脂質抽出物のＨＰＬＣ分析（表１を参照されたい）。更なる詳細については、図１の説明文を参照されたい。ＨＰＬＣ分析は、標準手順に従う。更なる詳細については、本文を参照されたい。
【図８】ＡＲＥ２野生型株（「ＷＴ」）並びにＡｒｅ２バリアント＃９、＃３５、＃３６、＃３９及び＃４０の脂質抽出物のＨＰＬＣ分析（表１を参照されたい）。更なる詳細については、図１の説明文を参照されたい。ＨＰＬＣ分析は、標準手順に従う。更なる詳細については、本文を参照されたい。
【図９】ＡＲＥ２野生型株（「ＷＴ」）並びにＡｒｅ２バリアント＃２７、＃３３、＃３４、＃３７及び＃３８の脂質抽出物のＨＰＬＣ分析（表１を参照されたい）。更なる詳細については、図１の説明文を参照されたい。ＨＰＬＣ分析は、標準手順に従う。更なる詳細については、本文を参照されたい。
【図１０】ＡＲＥ２野生型株（「ＷＴ」）並びにＡｒｅ２バリアント＃４１、＃４２、＃４３、＃２４及び＃２０の脂質抽出物のＨＰＬＣ分析（表１を参照されたい）。更なる詳細については、図１の説明文を参照されたい。ＨＰＬＣ分析は、標準手順に従う。更なる詳細については、本文を参照されたい。
【００４８】
以下の実施例は、単に例証となるものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４９】
［実施例］
［実施例１：ＡＲＥ２変異体の生成及びスクリーニング］
ステロールエステル画分中の７−ＤＨＣ含有量の向上に関して、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アシルトランスフェラーゼ２（ＳｃＡｒｅ２）のバリアントを発現する１０，０００酵母クローンのエラープローン（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ）ライブラリを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってスクリーニングした（ＡＲＥ１及びＡＲＥ２の野生型配列に対して（配列表を参照されたい）。スクリーニング方法は、わずかに細胞壁が消化された細胞からステロールを同時に抽出及び分離することを含む。処理されたバイオマスをＴＬＣプレートに直接適用し、溶媒に浸漬し、１つの工程でステロール含有画分が抽出及び分離された。ステロールエステル画分中の、共役二重結合を有するステロール（例えば、７−ＤＨＣとしての）の比は、共役二重結合を有する化合物の様々な分光光度的特性（例えば、蛍光、紫外線検出を消光する能力）を利用することにより、共役二重結合を有さないステロールに対して設定された。
【００５０】
最良のバリアントを５回反復で再スクリーニングし、配列決定し、振とうフラスコ中で培養し、ＨＰＬＣ−ＵＶによって生物学的３回反復で分析して、ステロール及びステロールエステル組成を決定した。
【００５１】
最良のバリアントを含有するプラスミドを単離し、コレスタ−５，７，２４−トリエノール産生サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株１０Ａに再び形質転換した（ａｒｅ１  ａｒｅ２  ｅｒｇ５  ｅｒｇ６：：２４Ｒ；構成については、国際公開第２０１７１０８７９９号パンフレットの実施例１を参照されたい）。部位特異的突然変異誘発により、それぞれの変異をＡＲＥ２に導入することにより、複数のアミノ酸の交換を有するバリアントの変異が分離され（サイレント変異は考慮に入れなかった）、いずれの変異が所望の効果を生じたかを調べた。株を培養し、ＨＰＬＣによって分析した。
【００５２】
［実施例２：ＨＰＬＣ−ＵＶ分析の標準手順］
ジェネテシン（１００μｇ／ｍＬ）を含む前培養物  −  １０ｍｌ  −  ＹＰＤに本発明者らの対象の株を接種し（３つの形質転換株／Ａｒｅ２バリアント）、３０℃で適切な密度に増殖させた（２４〜４８時間）。より良好に比較するために、野生型ＡＲＥ２プラスミドを有する３つの異なる形質転換株も接種し、それをバリアントと同時に形質転換した。バッフルなしで２５０ｍＬ振とうフラスコ内でジェネテシンを含む５０ｍＬ  ＹＰＤの本培養物を０．１ＯＤ６００に接種し、２００ｒｐｍ及び３０℃、湿度８０％において、３回グルコースを流加して３日間培養した（およそ３０、４５及び６０時間後にグルコースを最終濃度２％まで添加した）。バイオマス２００ＯＤ単位を１５ｍＬ  Ｇｒｅｉｎｅｒチューブに収集し（１６００×ｇで５分間遠心し、上澄を除去した）、分析まで−２０℃で保管した。
【００５３】
抽出のために、２００ＯＤの細胞ペレットを解凍し、１ｍＬザイモリエイス（ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）溶液（５０ｍＭ  ＫＰｉ中の５ｍｇ／ｍＬザイモリエイス２０Ｔ、ｐＨ７、１Ｍ  Ｄ−ソルビトールを含む）に再懸濁し、３７℃で１５分間インキュベートした（サーモミキサー上で７５０ｒｐｍ）。遠心分離（２５００×ｇ、５分）した後、ザイモリエイス溶液を除去し、無水ＥｔＯＨ  ３．７３ｍＬをペレットに添加した（慎重に上下にピペット操作して１ｍＬで再懸濁し、次いで更に２．７３ｍＬを添加した）。内標準２６７μＬ（酢酸コレステリル、ＥｔＯＨ中に１ｍｇ／ｍＬ）を添加し、細胞浮遊液をボルテックスし、混合しながら７０℃に１時間加熱した（サーモミキサー上で７５０ｒｐｍ）。チューブを数分間放置して室温に冷却した後、壊死組織片をペレット化し（２５００×ｇ、室温で１０分間）、上澄３ｍＬをパイレックス（Ｐｙｒｅｘ）チューブに移し、それをＮ２下で乾燥させた。酢酸エチル２００μＬ中に脂質を取り込んだ（サーモミキサー上で７５０ｒｐｍにおいて４０℃で１５分間ボルテックスし、混合した）。溶液をもう一度遠心分離し（２５００×ｇ、５分）、その後のＨＰＬＣ−ＵＶ分析のためにインレーを有するガラスバイアルに移した。
【００５４】
２つの波長（２１０ｎｍ及び２８０ｎｍ）での紫外線検出を用いたＨＰＬＣにより、脂質抽出物を分析した。チモステロール化合物を２１０ｎｍで検出し、７−ＤＨＣ化合物を２８０ｎｍで定量化した。
溶媒：８０％ＥｔＯＨ  ２０％ＭｅＯＨ  ０．１％ＴＦＡ
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８  ＲＳ
方法：注入体積：１０μＬ
注入器サーモスタット：４０℃
流量：０．６ｍＬ／分
カラムサーモスタット：２０℃
紫外線検出：２１０ｎｍ、２８０ｎｍ（共役二重結合を有するステロール）
【００５５】
３通りの濃度の７−ＤＨＣ、チモステロール、酢酸コレステリル及びスクアレンの標準混合物（それぞれの物質０．５、１．０及び２．０ｍｇ／ｍＬ）を同様に分析し、標準曲線をそれぞれの物質に対して作成して、抽出物中のステロールμｇ／μＬ又はμｇ／ＯＤ６００の濃度を計算した。
【００５６】
［実施例３：活性及び／又は特異性に関するＡＲＥ２バリアントの評価］
直接、比較をするために、野生型ＡＲＥ２プラスミドを、Ａｒｅ２バリアントを発現するプラスミド（実施例１を参照されたい）と共に株１０Ａに再形質転換し、得られた株を同じ試験で分析した（実施例２を参照されたい）。ＨＰＬＣ分析の結果を表１及び図１〜１０にまとめる。表の値は、野生型と比較して変異体／バリアントを発現する株間の倍変化を示す。最初の値は、エステル画分と遊離７−ＤＨＣ画分との比に関する改善を示し、第２の値は、エステル画分中の７−ＤＨＣとチモステロールとの比に関する改善を示す。第３の値は、変異体及び野生型のバイオマス中の７−ＤＨＣ総含有量の比較である。記載のバリアントの一部は、特にエステルレベルの向上を示すのに対して、他は、エステル画分中の７−ＤＨＣ／チモステロール比の向上を示した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
【表２】
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【００５９】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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