(57)【要約】  本出願は、アルスロバクター由来の微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いた、フルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法に関する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、アルスロバクター・クリスタロポイエテス（Arthrobacter crystallopoietes）、アルスロバクター・ウレアファシェンス（Arthrobacter ureafaciens,）及びアルスロバクター・アウレッセンス（Arthrobacter aurescens）からなる群から選択される少なくとも１つのアルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いた、フルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法。
【請求項２】
前記方法は、前記アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物において、砂糖とステビオール配糖体を反応させるステップを含む、請求項１に記載のフルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法。
【請求項３】
前記ステビオール配糖体は、ステビオシド、ルブソシド、ズルコシドＡ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ及びレバウジオシドＭからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載のフルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法。
【請求項４】
前記砂糖とステビオール配糖体を反応させるステップは、ｐＨ３〜８及び１０〜６０℃で行われる、請求項２に記載のフルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法。
【請求項５】
前記フルクトース転移ステビオール配糖体は、フルクトースを１〜３個含む、請求項１に記載のフルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法。
【請求項６】
前記フルクトース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体の１９−ＯＨ位置に直接又はそれに結合されたグルコースを介してフルクトースがβ（２，６）結合により連結されて付加されたステビオール配糖体である、請求項１に記載のフルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法で製造されたフルクトース転移ステビオール配糖体。
【請求項８】
前記フルクトース転移ステビオール配糖体は、フルクトース転移ステビオシド、フルクトース転移ルブソシド、フルクトース転移ズルコシドＡ、フルクトース転移レバウジオシドＡ、フルクトース転移レバウジオシドＣ、フルクトース転移レバウジオシドＤ、フルクトース転移レバウジオシドＥ、フルクトース転移レバウジオシドＦ及びフルクトース転移レバウジオシドＭからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項７に記載のフルクトース転移ステビオール配糖体。
【請求項９】
アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、アルスロバクター・クリスタロポイエテス（Arthrobacter crystallopoietes）、アルスロバクター・ウレアファシェンス（Arthrobacter ureafaciens,）及びアルスロバクター・アウレッセンス（Arthrobacter aurescens）からなる群から選択される少なくとも１つのアルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を含むフルクトース転移ステビオール配糖体生産用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、アルスロバクター属微生物を用いた、フルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖摂取による疾病（肥満）の恐れから１日当たりの糖摂取量を低減することを世界保健機関（ＷＨＯ）が勧告しており、先進国を中心に政府主導の下で糖類摂取量を低減するための様々な政策が盛んに論議されている。また、市場においては様々な代替甘味料素材に対するニーズが増加しており、代替甘味料素材の開発、製品化が続けられている。代替甘味料は、合成甘味料（Saccharin、Aspartame、Sucraloseなど）、合成糖アルコール類（Maltitol, Xylitol）、高甘味料（Rebaudioside A, Liquorice）と変化を続けている。しかし、持続的な合成甘味料の安全性についての懸念から天然甘味料に対する消費者のニーズが大きくなってきているものの、天然甘味料特有の異味・異臭を有する味質の限界により、従来の合成甘味料中心の低カロリー・ゼロカロリー製品を本格的に代替することができていない現状である。
【０００３】
近年、多くの注目を集めている天然の高甘味料は、植物であるステビアレバウディアナベルトニー（Stevia rebaudiana Bertoni）の葉から抽出したステビア（Stevia）である。ステビアは、天然素材であり、砂糖の２００〜３００倍の甘味度を有し、ステビオシド（Stevioside）、レバウジオシド（Rebaudioside）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｍ、ズルコシドＡ（Dulcoside A）、ルブソシドなどからなる。また、ステビアは、カロリーがなく、血中グルコース及びインスリンレベルに有益な効果をもたらし、人体に副作用がないことが報告されており、代替甘味料としての潜在力を有しているが、苦味が非常に強いという欠点があるので、使用に制限がある。
【０００４】
これまでに知られているステビアの甘味質改善方法としては、（１）糖質甘味料やアミノ酸又はアミノ酸塩と配合する方法、（２）シクロデキストリンなどの物質で包接する物理的方法、（３）酵素を用いた糖転移方法の３つの方法が挙げられる。酵素を用いた糖転移方法としては、ＣＧＴａｓｅを用いてステビオール配糖体にグルコース（１〜１２個）を転移させる方法が現在広く用いられている（特許文献１）。しかし、ステビオール配糖体に転移したグルコースが腸内微生物により全て分解され、カロリーを上昇させる結果をもたらすという欠点がある。よって、グルコースでない糖により転移させた糖転移ステビオール配糖体を製造する新たな方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国特許出願第１０−１９９１−００２０７６９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、４種のアルスロバクターの微生物に、フルクトースをステビオール配糖体にｂｅｔａ結合で糖転移させる活性があることを確認し、本出願を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願は、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、アルスロバクター・クリスタロポイエテス（Arthrobacter crystallopoietes）、アルスロバクター・ウレアファシェンス（Arthrobacter ureafaciens,）及びアルスロバクター・アウレッセンス（Arthrobacter aurescens）からなる群から選択される少なくとも１つのアルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いた、フルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本出願は、前記製造方法で製造されたフルクトース転移ステビオール配糖体を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本出願は、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、アルスロバクター・クリスタロポイエテス（Arthrobacter crystallopoietes）、アルスロバクター・ウレアファシェンス（Arthrobacter ureafaciens,）及びアルスロバクター・アウレッセンス（Arthrobacter aurescens）からなる群から選択される少なくとも１つのアルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を含むフルクトース転移ステビオール配糖体生産用組成物を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１０】
本出願によるフルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法は、アルスロバクター・グロビフォルミス、アルスロバクター・クリスタロポイエテス、アルスロバクター・ウレアファシェンス及びアルスロバクター・アウレッセンスからなる群から選択される少なくとも１つのアルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて、フルクトース転移ステビオール配糖体を特異的に生産することができる。本出願によるフルクトース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体の苦味が改善された高甘味料素材であり、公知のグルコース転移ステビオール配糖体に比べてカロリーが高くないので、様々な分野に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図１ｂ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２ａ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２ｂ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図３ａ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図３ｂ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図４ａ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図４ｂ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図５ａ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図５ｂ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図６ａ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図６ｂ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図７ａ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図７ｂ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図８ａ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図８ｂ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図９ａ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図９ｂ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図１０ａ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣ／ＭＳの結果を示す図である。
【図１０ｂ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣ／ＭＳの結果を示す図である。
【図１０ｃ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣ／ＭＳの結果を示す図である。
【図１０ｄ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣ／ＭＳの結果を示す図である。
【図１０ｅ】アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣ／ＭＳの結果を示す図である。
【図１１】各温度におけるフルクトース転移ステビオール配糖体（ステビオシド，レバウジオシドＡ）への変換率を示すグラフである。
【図１２】各ｐＨにおけるフルクトース転移ステビオール配糖体（ステビオシド，レバウジオシドＡ）合成の変換率を示すグラフである。
【図１３】各濃度のステビオール配糖体（ステビオシド，レバウジオシドＡ）におけるフルクトース転移ステビオール配糖体合成の変換率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
【００１３】
前記目的を達成するための本出願の一態様は、４種のアルスロバクターの微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物の存在下で、砂糖とステビオール配糖体を反応させてフルクトース転移ステビオール配糖体を製造するステップを含む、フルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法を提供する。
【００１４】
本出願における「ステビオール配糖体」とは、天然甘味料の一つであり、化学式１を有するものである。前記ステビオール配糖体は、砂糖に比べて低カロリーであり、砂糖の約２００〜３００倍の甘味度を有するという利点があるが、独特の渋味や苦味を伴うという欠点があり、甘味質を改善する努力がなされてきた。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
化学式１において、Ｒ１には水素（Ｈ）が結合されてもよく、グルコース（Glucose）がβ結合により１個〜３個結合されてもよく、Ｒ２にはグルコース（Glucose）、キシロース（Xylose）又はラムノース（Rhamnose）がβ結合により１個結合され、そこにグルコース（Glucose）がβ結合により０個〜２個結合されてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
α−／β−グリコシド結合は、アノマー位（Anomeric position）と単糖の１位の炭素から最も遠く離れた立体中心（Stereocenter）の相対的な立体化学（Stereochemistry, Ｒ体又はＳ体）により区分される。一般に、２つの炭素が同じ立体化学を有するとα−グリコシド結合が形成されるのに対して、２つの炭素が異なる立体化学を有するとβ−グリコシド結合が形成される。本発明者らは、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、アルスロバクター・クリスタロポイエテス（Arthrobacter crystallopoietes）、アルスロバクター・ウレアファシェンス（Arthrobacter ureafaciens,）及びアルスロバクター・アウレッセンス（Arthrobacter aurescens）からなる群から選択される少なくとも１つのアルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物が砂糖を基質として砂糖をフルクトースに分解し、ステビオール配糖体に選択的に１個〜３個のフルクトースをβ結合により連結させることを最初に解明し、本出願の４種のアルスロバクター由来の微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物がフルクトース転移ステビオール配糖体への優れた変換率を有し、従来のステビオール配糖体に比べて甘味質が大幅に向上されるという利点があることを最初に解明した。
【００１８】
本出願における「フルクトース転移ステビオール配糖体」は、砂糖とステビオール配糖体を基質とし、アルスロバクター・グロビフォルミス、アルスロバクター・クリスタロポイエテス、アルスロバクター・ウレアファシェンス及びアルスロバクター・アウレッセンスからなる群から選択される少なくとも１つのアルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物により、ステビオール配糖体の１９−ＯＨ位置に直接又はそれに結合されたグルコースにフルクトースがβ結合により１個〜３個付加された形態であってもよく、より具体的には、ステビオール配糖体の１９−ＯＨ位置に直接又はそれに結合されたグルコースにフルクトースがβ（２，６）結合により１個〜３個付加された形態であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
前記フルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法の各ステップについて具体的に説明すると、まず、アルスロバクター・グロビフォルミス、アルスロバクター・クリスタロポイエテス、アルスロバクター・ウレアファシェンス及びアルスロバクター・アウレッセンスからなる群から選択される少なくとも１つのアルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を準備するステップが行われる。
【００２０】
前記フルクトース転移ステビオール配糖体の製造方法の次のステップは、アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物の存在下で、砂糖とステビオール配糖体を反応させるステップである。
【００２１】
前記ステビオール配糖体は、ステビオシド、ルブソシド、ズルコシドＡ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ及びレバウジオシドＭからなる群から選択される少なくとも１つであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
前記砂糖とステビオール配糖体を反応させるステップは、ｐＨ１〜１０及び１〜８０℃で行われてもよく、より具体的にはｐＨ２〜９及び５〜７０℃で行われてもよく、さらに具体的にはｐＨ３〜８及び１０〜６０℃で行われてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
前記目的を達成するための本出願の他の態様は、前記製造方法で製造されたフルクトース転移ステビオール配糖体を提供する。前記フルクトース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体の１９−ＯＨ位置に直接又はそれに結合されたグルコースを介してフルクトースがβ結合により１個〜３個付加された形態であってもよく、より具体的には、ステビオール配糖体の１９−ＯＨ位置に直接又はそれに結合されたグルコースを介してフルクトースがβ（２，６）結合により１個〜３個付加された形態であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
前記アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物は、ステビオール配糖体からフルクトース転移ステビオール配糖体への変換率が３０〜７０％であってもよいが、これに限定されるものではない。具体的には、本出願のフルクトース転移ステビオシドへの変換率は、公知の他の微生物由来の酵素に比べて高いことを特徴とする。より具体的には、前記フルクトース転移ステビオシドへの変換率は１０〜８０％であってもよく、さらに具体的には、前記変換率は１０〜８０％、２０〜７５％、３０〜７０％であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
さらに、前記アルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物は、反応液中で０．０１〜１６％（ｗ／ｗ）であってもよく、より具体的には０．０５〜８％（ｗ／ｗ）、０．１〜６％（ｗ／ｗ）、０．２〜４％（ｗ／ｗ）、０．４〜３％（ｗ／ｗ）、０．６〜２％（ｗ／ｗ）、０．８〜１．５％（ｗ／ｗ）又は１％（ｗ／ｗ）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
より具体的には、前記方法で製造されたフルクトース転移ステビオール配糖体は、フルクトース転移ステビオシド、フルクトース転移ルブソシド、フルクトース転移ズルコシドＡ、フルクトース転移レバウジオシドＡ、フルクトース転移レバウジオシドＣ、フルクトース転移レバウジオシドＤ、フルクトース転移レバウジオシドＥ、フルクトース転移レバウジオシドＦ及びフルクトース転移レバウジオシドＭからなる群から選択される少なくとも１つであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本出願のさらに他の態様は、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）、アルスロバクター・クリスタロポイエテス（Arthrobacter crystallopoietes）、アルスロバクター・ウレアファシェンス（Arthrobacter ureafaciens,）及びアルスロバクター・アウレッセンス（Arthrobacter aurescens）からなる群から選択される少なくとも１つのアルスロバクター属微生物、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び菌株の破砕物を含むフルクトース転移ステビオール配糖体生産用組成物を提供する。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１
アルスロバクター属の粗酵素液の製造方法
砂糖を炭素源とし、イースト抽出物及びトウモロコシ浸漬液を窒素源とする栄養培地において、１０種のアルスロバクター属（A. atorocyaneus KCCM 41106, A. crystallopoietes KCCM 41107, A. sulfureus KCCM 12457, A. oxydans KCCM 11369, A. globiformis KCCM 40830, A. globiformis KCCM 40829, A. globiformis KCCM 40800, A. ureafaciens KCCM 40801, A. ureafaciens KCCM 40828, A. aurescens KCCM 41109）の微生物を３０℃で２４〜４８時間培養した。培養物を遠心分離して菌体と上清を分離し、その後上清のみを回収して酵素溶液を準備した。前述した１０種のアルスロバクター属の砂糖加水分解活性をＤＮＳ法で確認した。
【００３０】
実施例２
ステビオール配糖体からフルクトース転移ステビオール配糖体への変換の評価
ステビオール配糖体、砂糖を０．０５Ｍ酢酸緩衝液に溶解し、その後実施例１で準備した９種のアルスロバクター属の粗酵素液を添加して４０℃で２４時間反応させた。反応後に１００℃で失活させ、その後フルクトース転移ステビオール配糖体を生産するか否かをＨＰＬＣで確認した。
【００３１】
次の表１は１０種のアルスロバクター属由来の粗酵素液の砂糖加水分解活性及びフルクトース転移ステビオール配糖体生産活性を示す表であり、図１ａ及び図１ｂはアルスロバクター属微生物由来の粗酵素液を用いて製造されたフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
表１に基づいて、ステビオール配糖体へのフルクトース転移活性を有する４種のアルスロバクター（A. crystallopoietes, A. globiformis, A. ureafaciens, A. aurescens）を選択した。図１〜図９は１０種のアルスロバクターの粗酵素液とステビオール配糖体を反応させた反応液をＨＰＬＣで分析し、フルクトース転移ステビオール配糖体の生成を確認した図である。ここで、ステビオール配糖体はステビオシド、ルブソシド、ズルコシドＡ、レバウジオシドＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｍであり、フルクトース転移ステビオシド、フルクトース転移ルブソシド、ズルコシドＡ、レバウジオシドＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｍを生成するか否かをＨＰＬＣで確認した。
【００３４】
その結果、１０種のアルスロバクターのうち７種においてのみフルクトース転移ステビオール配糖体が生成された。これは、アルスロバクター属に属する微生物のうち、一部の微生物種のみ特異的に、フルクトースをステビオール配糖体に転移させる活性を有する微生物であることを意味するものである。フルクトース転移ステビオール配糖体のフルクトース重合度を確認するために、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析を行ってフルクトース転移ステビオール配糖体の分子量を確認した。
【００３５】
図１０ａ〜図１０ｅはアルスロバクター・グロビフォルミス由来の微生物を用いて製造したフルクトース転移ステビオール配糖体のＨＰＬＣ／ＭＳの結果を示す図である。
【００３６】
その結果、アルスロバクター・グロビフォルミス由来の酵素を用いて製造されたフルクトース転移ステビオール配糖体は、１〜３個のフルクトースがランダムにステビオール配糖体に転移していることが確認された。
【００３７】
実施例３
フルクトース転移ステビオール配糖体合成における温度の影響
アルスロバクター・グロビフォルミス由来の粗酵素液によるフルクトース転移ステビオール配糖体の生産における温度の影響を評価した。砂糖とステビオール配糖体を酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、その後前記粗酵素液を添加して１０〜６０℃で２４時間反応させた。反応終了後、溶液中のフルクトース転移ステビオール配糖体の生成をＨＰＬＣで分析した。
【００３８】
図１１は各温度におけるフルクトース転移ステビオール配糖体（ステビオシド，レバウジオシドＡ）への変換率を示すグラフである。
【００３９】
その結果、アルスロバクター・グロビフォルミスの粗酵素液によるフルクトース転移ステビオール配糖体への変換率は、２０〜４０℃で５０〜７０％の高いレベルであることが確認された。
【００４０】
実施例４
フルクトース転移ステビオール配糖体合成におけるｐＨの影響
アルスロバクター・グロビフォルミスの粗酵素液によるフルクトース転移ステビオール配糖体の生産におけるｐＨの影響を評価した。砂糖とステビオール配糖体を酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜５．０）、リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）、トリス緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）に溶解し、その後粗酵素液を添加してｐＨ３〜ｐＨ８の範囲で２４時間反応させた。反応終了後、フルクトース転移ステビオール配糖体の生成をＨＰＬＣで分析した。
【００４１】
図１２は各ｐＨにおけるフルクトース転移ステビオール配糖体（ステビオシド，レバウジオシドＡ）合成の変換率を示すグラフである。
【００４２】
その結果、アルスロバクター・グロビフォルミスの粗酵素液によるフルクトース転移ステビオール配糖体への変換率は、ｐＨ４〜７で高いレベルであり、特にｐＨ５．０で最も高いことが確認された。
【００４３】
実施例５
各濃度のステビオール配糖体におけるフルクトース転移ステビオール配糖体の分析
各濃度のステビオール配糖体におけるアルスロバクター・グロビフォルミスの粗酵素液によるフルクトース転移ステビオール配糖体の生産を評価した。砂糖とステビオール配糖体（ステビオシド，レバウジオシドＡ）を酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、４０℃で２４時間反応させた。砂糖の濃度は０．７５Ｍにし、酵素の最終濃度は５０Ｕ／ｍｌにした。反応終了後、フルクトース転移ステビオール配糖体の生成をＨＰＬＣで分析した。
【００４４】
図１３は各濃度のステビオシドにおけるフルクトース転移ステビオール配糖体合成の変換率を示すグラフである。
【００４５】
その結果、アルスロバクター・グロビフォルミスの粗酵素液によるフルクトース転移ステビオール配糖体への変換率は、０．４％（ｗ／ｗ）〜４％（ｗ／ｗ）で高いレベルであり、特に１％（ｗ／ｗ）で最も高いことが確認された。
【００４６】
図１３は各濃度のレバウジオシドＡにおけるフルクトース転移レバウジオシドＡ合成の変換率を示すグラフである。
【００４７】
その結果、アルスロバクター・グロビフォルミスの粗酵素液によるフルクトース転移レバウジオシドＡへの変換率は、０．５％（ｗ／ｗ）〜２％（ｗ／ｗ）で高いレベルであり、特に１％（ｗ／ｗ）で最も高いことが確認された。
【００４８】
実施例６
フルクトース転移ステビオール配糖体のＮｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＮＭＲ）分析
砂糖とステビオール配糖体を酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、その後前記粗酵素液を添加して４０℃で２４時間反応させた。反応溶液を１００℃で失活させ、その後０．４５μｍフィルタを用いて不純物を除去した。ＨＰ２０樹脂を用いて、１つのフルクトースが転移したステビオール配糖体（ステビオシド，レバウジオシドＡ）をそれぞれ純粋分離した。分離したフルクトース転移ステビオシドとフルクトース転移レバウジオシドＡの結合構造を分析するために、１Ｈ／１３Ｃ ＮＭＲ、Ｈｏｍｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＣＯＳＹ）、Ｔｏｔａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＴＯＣＳＹ）、Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ−ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ（ＨＳＱＣ）及びｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｂｏｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ（ＨＭＢＣ）で確認した。その結果（１Ｈ／１３Ｃ ＮＭＲ、ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣ）を表２及び表３並びに表４及び表５に示す。
【００４９】
また、フルクトース転移ステビオシドとフルクトース転移レバウジオシドＡの構造を確認した結果、フルクトース転移ステビオシドは１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｏｘｙ］ｋａｕｒ−１６−ｅｎ−１８−ｏｉｃ ａｃｉｄ ６−Ｏ−β−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｅｓｔｅｒの新規化合物であり、フルクトース転移レバウジオシドＡは１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−３−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｏｘｙ］ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−ｅｎ−１９−ｏｉｃ ａｃｉｄ ６−Ｏ−β−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｅｓｔｅｒの新規化合物であることが確認された。
【００５０】
＜フルクトース転移ステビオシドの模式図＞
【００５１】
【化２】
2021500045.tif 000005
【００５２】
＜フルクトース転移レバウジオシドＡの模式図＞
【００５３】
【化３】
2021500045.tif 000006
【００５４】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【００５５】
【表２】
2021500045.tif 000007
【００５６】
【表３】
2021500045.tif 000008
【００５７】
【表４】
2021500045.tif 000009
【００５８】
【表５】
2021500045.tif 000010
【図１ａ】
2021500045.tif 000011
【図１ｂ】
2021500045.tif 000012
【図２ａ】
2021500045.tif 000013
【図２ｂ】
2021500045.tif 000014
【図３ａ】
2021500045.tif 000015
【図３ｂ】
2021500045.tif 000016
【図４ａ】
2021500045.tif 000017
【図４ｂ】
2021500045.tif 000018
【図５ａ】
2021500045.tif 000019
【図５ｂ】
2021500045.tif 000020
【図６ａ】
2021500045.tif 000021
【図６ｂ】
2021500045.tif 000022
【図７ａ】
2021500045.tif 000023
【図７ｂ】
2021500045.tif 000024
【図８ａ】
2021500045.tif 000025
【図８ｂ】
2021500045.tif 000026
【図９ａ】
2021500045.tif 000027
【図９ｂ】
2021500045.tif 000028
【図１０ａ】
2021500045.tif 000029
【図１０ｂ】
2021500045.tif 000030
【図１０ｃ】
2021500045.tif 000031
【図１０ｄ】
2021500045.tif 000032
【図１０ｅ】
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【図１１】
2021500045.tif 000034
【図１２】
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【図１３】
2021500045.tif 000036
【配列表】
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【国際調査報告】
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2021500045.tif 000038
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