(57)【要約】  強力なユニークな不可逆的な阻害剤と共に化学プロテオミクスを使用して、本発明者らは、主要な脳チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）がバソヒビン−１（ＶＡＳＨ１）と低分子バソヒビン結合タンパク質（ＳＶＢＰ）との複合体であることを見出した。ＶＡＳＨ１及びそのホモログバソヒビン−２（ＶＡＳＨ２）は、ＳＶＢＰと複合体形成すると、微小管に対するロバストかつ特異的なＴｙｒ／Ｐｈｅカルボキシペプチダーゼ活性を示す。したがって、本発明者らは、バソヒビン及びバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体の酵素活性を最初に同定した。培養ニューロンにおけるバソヒビン又はＳＶＢＰのノックダウンは、チロシン化α−チューブリンレベルの顕著な減少及び重度の分化欠陥の発症をもたらす。更に、バソヒビンのノックダウンは、発達中のマウス新皮質のニューロン移動を破壊する。これらの結果は、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体がＴＣＰ酵素であることを立証している。したがって、本発明は、バソヒビン又はバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体の活性又は発現の阻害剤を用いて、チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患、例えば神経学的障害及び心血管疾患を処置するための方法及び医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被験体におけるチューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患を処置するための方法において使用するための、バソヒビン又はバソヒビン／ＳＶＢＰ（低分子バソヒビン結合タンパク質）複合体活性又は発現の阻害剤。
【請求項２】
前記チューブリンカルボキシペプチダーゼ関連疾患が神経学的障害である、請求項１に記載の使用のための阻害剤。
【請求項３】
前記神経学的障害が、多発性硬化症、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病及びアルツハイマー病からなる群より選択される神経変性障害である、請求項２に記載の使用のための阻害剤。
【請求項４】
前記神経変性障害がアルツハイマー病である、請求項３に記載の使用のための阻害剤。
【請求項５】
前記チューブリンカルボキシペプチダーゼ関連疾患が、心筋梗塞、心筋梗塞誘発性心血管機能障害、心不全、心筋症及びジストロフィン異常症からなるリストより選択される心血管疾患である、請求項１に記載の使用のための阻害剤。
【請求項６】
前記心血管疾患が心筋症である、請求項５に記載の使用のための阻害剤。
【請求項７】
バソヒビン活性の前記阻害剤が有機小分子又は生体分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項８】
バソヒビン活性の前記阻害剤が、バソヒビン−１又はバソヒビン−２の活性の阻害剤からなるリストより選択される、請求項７に記載の使用のための阻害剤。
【請求項９】
バソヒビン発現又はバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体発現の前記阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びリボザイムからなるリストより選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１０】
バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体発現の前記阻害剤が、バソヒビン−１  バソヒビン−２又はＳＶＢＰの発現の阻害剤からなるリストより選択される、請求項９に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１１】
それを必要とする被験体におけるチューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患を処置するための方法において使用するための医薬組成物であって、請求項１〜１０のいずれかに記載のバソヒビン又はバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現の阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
前記チューブリンカルボキシペプチダーゼ関連疾患が、神経学的障害及び心血管疾患からなるリストより選択される、請求項１１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患を処置するために有用な複数の候補化合物をスクリーニングするための方法であって、（ａ）バソヒビン又はバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現を阻害するその能力について、該候補化合物の各々を試験すること、及び（ｂ）及び該バソヒビン又はバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現を阻害することができる候補化合物をポジティブ選択することからなる工程を含む、方法。
【請求項１４】
候補チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）阻害剤をスクリーニングするための方法であって、（ｉ）試験すべき候補化合物を、ＴＣＰ及びビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｙ（配列番号１３）の配列のビオチン化ペプチドと共にインキュベーションする工程；質量分析によって、工程（ｉ）の終了時に得られた混合物中に存在するビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｙ（配列番号１３）のビオチン化ペプチド及び／又はビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅのビオチン化ペプチドを定量する工程；並びに（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた結果を考慮して、前記候補化合物がＴＣＰ阻害剤であるかを決定する工程を含む、方法。
【請求項１５】
工程（ｉｉｉ）で定量するために、工程（ｉ）及び（ｉｉ）の間に、ビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ（配列番号１２）及び／又はビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｙ（配列番号１３）のビオチン化ペプチド（単数又は複数）を単離する精製工程を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、バソヒビン又はバソヒビン／ＳＶＢＰ（低分子バソヒビン結合タンパク質）複合体の活性又は発現の阻害剤を用いて、チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患、例えば神経学的障害及び心血管疾患を処置するための方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
微小管は、細胞分裂、運動性及び形態形成に中心的に関与するα／βチューブリンダイマーの細胞骨格ポリマーである。チューブリンの脱チロシン化／チロシン化サイクルでは、α−チューブリンのＣ末端チロシンは、理解困難なペプチダーゼ（ＴＣＰ）によって除去され、チューブリンチロシンリガーゼ（ＴＴＬ、総説については、((Barra et al. (1988), Mol Neurobiol, 2:133)1)を参照のこと）によって再付加される。チューブリンにユニークであり、脊索動物から哺乳動物への進化の間でほとんど保存されているこのサイクルは、in vivoで重要な役割を有する((Erck et al. (2005), Proc Natl Acad Sci U S A, 102:7853)2)。α−チューブリンのチューブリン脱／チロシン化は、有糸分裂(Badin-Larcon et al. (2004), Proc Natl Acad Sci U S A, 101:5577; Barisic and Maiato (2016), Trends Cell Biol; Barisic et al. (2015), Science, 348:799) (Barisic and Maiato, 2016; Barisic et al., 2015)（３〜５）(Gobrecht et al. (2016),  Journal of Neuroscience 36.14: 3890-3902.; Konishi and Setou (2009), Nat Neurosci, 12:559; Marcos et al. (2009), PloS one, 4:e5405; Peris et al. (2006), J Cell Biol, 174:839-849)、神経生理学（６〜８）及び筋肉メカノトランスダクション(Kerr et al. (2015), Nature communications, 6:8526; Robison et al. (2016), Science, 352:aaf0659)（９、１０）の重要な調節シグナルであるその結果として、異常なチロシン化レベルは、細胞トランスフォーメーション及び腫瘍浸潤性(Lafanechere et al. (1998), J Cell Sci, 111 ( Pt 2):171; Whipple et al. (2007), Exp Cell Res, 313:1326)（１１、１２）、神経崩壊(Erck et al. (2005), Proc Natl Acad Sci U S A, 102:7853; Peris et al. (2006), J Cell Biol, 174:839; Peris et al. (2009), J Cell Biol, 185:1159)(2)並びに心不全及び心筋症(Robison et al. (2016), Science, 352:aaf0659)（１０、１３）に関連する脱チロシン化反応は４０年前に最初に記載されたが（１４）、ＴＣＰの正体は依然として不明であるので、前記サイクルの完全な理解は依然として不足している。
【０００３】
したがって、病的症状におけるその活性をモデュレーションするために、ＴＣＰ酵素の性質を同定する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書では、本発明者らは、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体がＴＣＰ酵素であることを同定し、神経生理学に対するそれらのダウンレギュレーションの影響を研究した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明は、それを必要とする被験体におけるチューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患、例えば心血管障害及び神経学的障害を処置するための方法において使用するための、バソヒビン又はバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現の阻害剤に関する。
【０００６】
本発明はまた、チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患を処置するために有用な複数の候補化合物をスクリーニングするための方法であって、（ａ）バソヒビン又はバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現を阻害するその能力について、前記候補化合物の各々を試験すること、及び（ｂ）及び前記バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現を阻害することができる候補化合物をポジティブ選択することからなる工程を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】マウス脳ＴＣＰの精製及び同定。（Ａ）マウス脳（タンパク質 １μg）からの示されているＴＣＰ濃縮画分（画分Ｉ〜ＩＶ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）。硫酸アンモニウム沈殿工程とそれに続く２回の連続イオン交換カラム段階を実施した。
【図１Ｂ】（Ｂ）阻害剤に対する画分ＩＶの感度。ＴＰＣＫ（トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン）、ＴＬＣＫ（トシル−Ｌ−リシルクロロメチルケトン）：Ｐｈｅ又はＬｙｓ残基のいずれかを含有する市販のセリン／システイン阻害剤。画分ＩＶ活性は、芳香族残基に対する高い親和性と一致して、ＴＬＣＫよりもＴＰＣＫに対して１００倍高い感度を示した。パルテノライドは、エポキシド求電子試薬を含有する細胞脱チロシン化阻害剤である。Ｅ−６４は、エポキシド求電子試薬を含有するクランＣＡシステインプロテアーゼの天然物阻害剤である。ＥｐｏＹ、ｅｐｏＥＹ及びｅｐｏＥＥＹは、それぞれＹ、ＥＹ又はＥＥＹアミノ酸とカップリングしたＥ−６４由来のエポキシドを含有する設計阻害剤である。アルキン−ｅｐｏＹは、ｅｐｏＹのクリック可能バージョンである。結果は、ＤＭＳＯを用いたコントロールにおける酵素活性（放射能アッセイ）の割合として表されている（平均＋／−ＳＤ、ｎ＝３〜６）。
【図１Ｃ】（Ｃ）アルキン−ｅｐｏＹの構造。
【図１Ｄ】（Ｄ）Ｃｕ触媒アジド−アルキン環化付加反応（クリック反応）を使用したＴＣＰ同定の最終工程の概略図。
【図１Ｅ】（Ｅ）アルキン−ｅｐｏＹを使用したＴＡＭＲＡプローブによる画分ＩＶからの推定ＴＣＰの標識（クリック不能ｅｐｏＹをコントロールとして使用）。
【図１Ｆ】（Ｆ）マウスバソヒビン１及びバソヒビン２の概略図（６９％の全体的な配列相同性；コアドメインについては７７％（透明青色の囲み枠））。これらの推定トランスグルタミナーゼ様システインペプチダーゼは、非在来型三残基の触媒残基（Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ）を含有する。
【図２Ａ】ＳＶＢＰと会合したバソヒビンは、強力なチューブリンチロシンカルボキシペプチダーゼである。（Ａ）外因性ＳＶＢＰ共発現の非存在下又は存在下で各ＶＡＳＨ（Ｖ１、Ｖ２）又はそれらの失活バージョンを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の内因性チューブリンのイムノブロット。チロシン化及び脱チロシン化チューブリンに特異的な抗体を使用して、脱チロシン化を評価した。α−チューブリン、Ｈｉｓ及びＦｌａｇに対する抗体はそれぞれ、チューブリン、バソヒビン及びＳＶＢＰの量を明らかにする。非トランスフェクション細胞（−）は、チューブリン改変の内因性レベルを示す。
【図２Ｂ】（Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙ−α１Ｂ−チューブリン、各ＶＡＳＨ及びＳＶＢＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のタンパク質抽出物のイムノブロット。それぞれＥＥＹ又はＥＥＡの末端を有するネイティブ又は突然変異バージョンのα１Ｂ−チューブリンを使用した。（Ａ）のように、脱／チロシン化チューブリンのレベルを測定した。ｍＣｈｅｒｒｙに対する抗体は、同じ量の外因性α−チューブリンを実証する。
【図２Ｃ】（Ｃ）放射性標識微小管を使用して評価した精製ＶＡＳＨ／ＳＶＢＰ複合体の脱チロシン化活性（６〜８μM）、ｎ＝３。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、バソヒビンの活性及び触媒失活バージョンをＳＶＢＰと共発現させ、コバルト樹脂で精製した（図６Ａ）。コントロールとして精製ＧＦＰ−Ｈｉｓ構築物を使用した。理論最大チロシン放出は、１００％の実線によって示されている。
【図２Ｄ】（Ｄ）イムノブロットによって評価した、脳微小管又はチューブリンダイマー（５μM）に対する精製ＶＡＳＨ１／ＳＶＢＰ複合体（２０又は４０nM）の脱チロシン化活性。ＶＡＳＨ２／ＳＶＢＰ複合体を用いた同様の実験（図６Ｂ）。本発明者らは、チューブリンがダイマー又は集合体であり（図６Ｃ）、同じ量の酵素複合体が存在するようにコントロールした（図６Ｄ）。
【図２Ｅ】（Ｅ）脳微小管又はリコンビナントＧＦＰ−ＥＢ１（５μM）に対する精製ＶＡＳＨ／ＳＶＢＰ複合体（６００nM）の脱チロシン化活性。ポジティブコントロールとしてカルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）を使用した。チロシン化及び脱チロシン化ＥＢ１に対する抗体を（１５）で特性評価した。
【図３Ａ】ＶＡＳＨ１及びＶＡＳＨ２のダウンレギュレーションは、神経分化に影響を与える。（Ａ）脳組織及び海馬ニューロンでは、Ｖａｓｈ１、Ｖａｓｈ２及びＳｖｂｐ転写産物が見られる。２５サイクルのみを実施したＧＡＰＤＨを除いて、全ての示されている組織及び細胞について、精製ｍＲＮＡ ５０ngを使用して、４５サイクルのＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。
【図３Ｂ】（Ｂ）ニューロンにおける脱チロシン化チューブリンのレベルに対するＶＡＳＨ１及びＶＡＳＨ２（ｓｈＶ１＋ｓｈＶ２）又はＳＶＢＰ（ｓｈＳＶＢＰ）ダウンレギュレーションの効果のウエスタンブロット分析。プレーティングの直前に、エレクトロポレーションによって、ｔｕｒｂｏＧＦＰ（ｔＧＦＰ）ｃＤＮＡに関連するｓｈＲＮＡをニューロンにトランスフェクションし、２ＤＩＶにおいて分析した（３回の独立したニューロン培養の３回反復イムノブロットからの結果）。
【図３Ｃ】（Ｃ〜Ｅ）神経突起伸長及び軸索分化に対するバソヒビンダウンレギュレーションの効果。Ｂのようにニューロンをトランスフェクションし、２ＤＩＶ及び３ＤＩＶにおいて免疫染色によって分析した。（Ｃ）２ＤＩＶ及び３ＤＩＶの３〜４つの異なる培養物からの免疫蛍光画像において、（軸索を有する）ステージＩＩＩニューロンを手動でカウントした。
【図３Ｄ】（Ｄ）Ｃのように作成した免疫蛍光画像における、AutoNeuriteJマクロ（詳細については、方法を参照のこと）を使用した少なくとも８５個の（２ＤＩＶの）ニューロンの形態学的分析。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１（ｔ又はマンホイットニー検定）。
【図４Ａ】バソヒビンのダウンレギュレーションは、新生皮質ニューロンの放射状移動に影響を与える。（Ａ）６つの等しいビンに分割した皮質にわたるＧＦＰ陽性ニューロンの分布を示す定量分析。１条件当たり５つの脳からのデータ、平均±ＳＥＭ。ｎｓ、非有意、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１（マンホイットニー検定）。
【図４Ｂ】（Ｂ）
【図５Ａ】ＳＶＢＰのダウンレギュレーションは、神経分化を変化させる。（Ａ）ＶＡＳＨ１、ＶＡＳＨ２及びＳＶＢＰ  ｓｈＲＮＡの検証。タンパク質及び対応するｓｈＲＮＡ又はコントロールｓｈＲＮＡの発現を可能にするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした。抗ＧＦＰ及び抗Ｆｌａｇを用いてウエスタンブロットによって粗タンパク質抽出物を分析して、それぞれＶＡＳＨ１／２又はＳＶＢＰの存在を試験し、抗ｔｕｒｂｏＧＦＰを用いてｓｈＲＮＡの存在をアッセイした；
【図５Ｂ】（Ｂ〜Ｃ）神経突起伸長及び軸索分化に対するＳＶＢＰダウンレギュレーションの効果。図３Ｂのようにニューロンをトランスフェクションし、２ＤＩＶ及び３ＤＩＶにおいて免疫染色によって分析した。（．（Ｂ）２ＤＩＶ及び３ＤＩＶの３〜４つの異なる培養物からの免疫蛍光画像において、（軸索を有する）ステージＩＩＩニューロンを手動でカウントした。
【図５Ｃ】（Ｃ）Ｂのように作成した免疫蛍光画像における、AutoNeuriteJマクロ（詳細については、方法を参照のこと）を使用した少なくとも２７個の（２ＤＩＶの）ニューロンの形態学的分析。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．００５；＊＊＊、Ｐ＜０．０００５（ｔ又はマンホイットニー検定）。
【図６Ａ】ＶＡＳＨ／ＳＶＢＰ複合体の精製及び特性。（Ａ）バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体の精製のウエスタンブロット分析（上パネル）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（下パネル）。図２Ａのように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、バソヒビン及びそれらの触媒失活バージョンをＳＶＢＰと共発現させ、次いで、コバルト樹脂で精製した。コントロールとして（Ｈｉｓタグを有する）ＧＦＰのみ構築物を使用した。ＧＦＰ及びバソヒビンを抗Ｈｉｓ抗体でプローブし、ＳＶＢＰを抗Ｆｌａｇ抗体でプローブした。未精製（溶解物）及び精製（溶出液）タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析並びに精製タンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥが示されている。ＳＶＢＰを全てのバソヒビンと共精製したが、ＧＦＰと共精製しなかったことに留意する。
【図６Ｂ】（Ｂ）図（２Ｄ）のように評価した、精製脳微小管又はチューブリンダイマーに対する精製ＶＡＳＨ２／ＳＶＢＰ複合体の脱チロシン化活性。
【図６Ｃ】（Ｃ）図（２Ｄ）で使用した非集合微小管（チューブリンダイマー、Ｔｕｂ）又は集合微小管（ＭＴ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによるコントロール。ＭＴ及びＴｕｂ抽出物（５００ng）を２５℃及び２００，０００ｇで１５分間遠心分離した。ＳＮ、上清。
【図６Ｄ】（Ｄ）図２Ｄで使用したＶＡＳＨ１、ＶＡＳＨ２及びＳＶＢＰ量のウエスタンブロットによるコントロール。
【図７】脱チロシン化／チロシン化サイクル及び関連酵素：チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）の中心的位置。通常、α−チューブリンは、ほとんどの遺伝子ではＣ末端芳香族残基チロシンを伴って、又はα８遺伝子ではフェニルアラニンを伴って新合成される（３１）。αβ−チューブリンダイマーが微小管を組み込んでＴＣＰ基質になると、α−チューブリンは脱／チロシン化サイクルに入り得る。ＴＣＰは最後の芳香族残基を除去して、脱チロシン化αチューブリン（又はαΔ１−チューブリン）を有する微小管を生成する。脱チロシン化αチューブリンプールはまた、最後の芳香族残基を有しないα−チューブリンをコードするα４遺伝子からの直接的な新合成によって供給され得る。サイクルを完了するために、微小管は解重合し、チューブリンチロシンリガーゼ（ＴＴＬ）によって再チロシン化され得る脱チロシン化ダイマーを遊離させる。ＴＴＬ酵素は単一のタンパク質からなるのに対して、本研究において発見されたＴＣＰ酵素は、触媒ユニット（バソヒビン）及びアクセサリータンパク質（ＳＶＢＰ、低分子バソヒビン結合タンパク質）を含む。祖先バソヒビン遺伝子の重複事象によって、脊椎動物は、２つのＴＣＰ触媒サブユニット、バソヒビン１（ＶＡＳＨ１）及びバソヒビン２（ＶＡＳＨ２）を有する。脱チロシン化α−チューブリンは他の改変の供給源である。最後から２番目及び最後から３番目のグルタミン酸残基は、ＣＣＰファミリー酵素によって連続的にプロセシングされて、それぞれαΔ２及びαΔ３チューブリンが生成される（２８、３２、３３）。
【図８】ＡＤ及びコントロール患者の脳におけるチューブリン脱チロシン化状態の比較。健常年齢適合（コントロール）、並びにＩ〜ＩＩ（初期ＡＤ）、ＩＩＩ〜ＩＶ（中期ＡＤ）及びＶ〜ＶＩ（後期ＡＤ）で分類されるＩ〜ＶＩのＢｒａａｋを有するＡＤ患者由来の内嗅、海馬、側頭及び外側組織由来のタンパク質抽出物を用いて、イムノブロット分析を実施した。３回の独立した実験から定量を実施し、一連の実験全体で「コントロール」脳サンプルを使用して、内部標準化を可能にした。分析サンプルは、コントロールｎ＝１１、Ｂｒａａｋ段階Ｉ〜ＩＩ  ｎ＝５、Ｂｒａａｋ段階ＩＩＩ〜ＩＶ  ｎ＝６及びＢｒａａｋ段階ＩＶ〜Ｖ  ｎ＝７であった。総チューブリンに対して、脱チロシン化及びΔ２チューブリンを標準化した。全てのデータは平均＋ＳＥＭとして示されている。混合モデルを使用した二元配置ＡＮＯＶＡ。変動源はＢｒａａｋ及び脳領域である。領域効果は有意ではなく、Ｔｕｂ  ｄｅｔｙｒ／Ｔｕｂ  ｔｏｔ（＊ｐ＝０．０３１）及びＴｕｂ  Δ２／ｔｕｂ  ｔｏｔ（＊＊ｐ＝０．００５１）では、Ｂｒａａｋ効果は有意である。
【図９】ＶＡＳＨ１の発現低下は、脳におけるチューブリンチロシン化に影響を与える。チロシン化チューブリン、脱チロシン化チューブリン、デルタ２チューブリン、α−チューブリン及びＴＴＬのキャピラリーウエスタンブロット（Ａ）。ＶＡＳＨ１  ＫＯヘテロ接合性（＋／−）、ホモ接合性（−／−）及び野生型マウス（＋／＋）マウス由来の海馬におけるチロシン化（Ｂ）、脱チロシン化（Ｃ）、デルタ２（Ｄ）及び総α−チューブリン（Ｅ）並びにチューブリンチロシンリガーゼ（Ｆ）レベルの相対定量（平均±ＳＥＭ）。ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定とそれに続くダン多重比較検定を使用して、統計比較を実施した。ＷＴマウスと比較して、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１０】ＳＶＢＰの発現低下は、脳におけるチューブリンチロシン化に影響を与える。チロシン化チューブリン、脱チロシン化チューブリン、デルタ２チューブリン、α−チューブリン及びＴＴＬのキャピラリーウエスタンブロット（Ａ）。ＳＶＢＰ  ＫＯヘテロ接合性（＋／−）、ホモ接合性（−／−）及び野生型マウス（＋／＋）マウス由来の海馬におけるチロシン化（Ｂ）、脱チロシン化（Ｃ）、デルタ２（Ｄ）及び総α−チューブリン（Ｅ）並びにチューブリンチロシンリガーゼ（Ｆ）レベルの相対定量（平均±ＳＥＭ）。ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定とそれに続くダン多重比較検定を使用して、統計比較を実施した。ＷＴマウスと比較して、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１１】ＶＡＳＨ２の発現低下は、脳におけるチューブリンチロシン化に影響を与えない。チロシン化チューブリン、脱チロシン化チューブリン、デルタ２チューブリン、α−チューブリン及びＴＴＬのキャピラリーウエスタンブロット（Ａ）。ＶＡＳＨ２  ＫＯヘテロ接合性（＋／−）、ホモ接合性（−／−）及び野生型マウス（＋／＋）マウス由来の海馬におけるチロシン化（Ｂ）、脱チロシン化（Ｃ）、デルタ２（Ｄ）及び総α−チューブリン（Ｅ）並びにチューブリンチロシンリガーゼ（Ｆ）レベルの相対定量（平均±ＳＥＭ）。ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定とそれに続くダン多重比較検定を使用して、統計比較を実施した。
【図１２】ＶＡＳＨ１の発現低下は、心室におけるチューブリンチロシン化に影響を与える。α−チューブリン、チロシン化チューブリン、脱チロシン化チューブリン、デルタ２−チューブリン及びＴＴＬのウエスタンブロット分析（Ａ）。ＶＡＳＨ１  ＫＯホモ接合性（−／−）、ヘテロ接合性（＋／−）及び野生型マウス（＋／＋）マウス由来の心室におけるチロシン化（Ｂ）、脱チロシン化（Ｄ）、デルタ２（Ｆ）及び総（Ｃ）α−チューブリン並びにチューブリンチロシンリガーゼ（Ｅ）レベルの相対定量（平均±ＳＥＭ）。ノンパラメトリック一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計比較を実施した。ＷＴマウスと比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１３】ＳＶＢＰの発現低下は、心室におけるチューブリンチロシン化に影響を与える。α−チューブリン、チロシン化チューブリン、脱チロシン化チューブリン、デルタ２−チューブリン及びＴＴＬのウエスタンブロット分析（Ａ）。ＳＶＢＰ  ＫＯホモ接合性（−／−）、ヘテロ接合性（＋／−）及び野生型マウス（＋／＋）マウス由来の心室におけるチロシン化（Ｂ）、脱チロシン化（Ｄ）、デルタ２（Ｆ）及び総（Ｃ）α−チューブリン並びにチューブリンチロシンリガーゼ（Ｅ）レベルの相対定量（平均±ＳＥＭ）。ノンパラメトリック一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計比較を実施した。ＷＴマウスと比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１４】ＶＡＳＨ２の発現低下は、心室におけるチューブリンチロシン化に影響を与えない。α−チューブリン、チロシン化チューブリン、脱チロシン化チューブリン、デルタ２−チューブリン及びＴＴＬのウエスタンブロット分析（Ａ）。ＶＡＳＨ２  ＫＯホモ接合性（−／−）、ヘテロ接合性（＋／−）及び野生型マウス（＋／＋）マウス由来の心室におけるチロシン化（Ｂ）、脱チロシン化（Ｄ）、デルタ２（Ｆ）及び総（Ｃ）α−チューブリン並びにチューブリンチロシンリガーゼ（Ｅ）レベルの相対定量（平均±ＳＥＭ）。ノンパラメトリック一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計比較を実施した。
【図１５】ＶＡＳＨ１又はＳＶＢＰのダウンレギュレーションは、成熟ニューロンにおけるチューブリンチロシン化状態に影響を与える。１７ＤＩＶ皮質ニューロン由来のタンパク質抽出物に対して、分析を実施した。３つの異なる胚由来の抽出物を用いて、３回の独立したイムノブロットから、定量を実施した。（平均±ＳＥＭ、ｔ検定）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１６】バソヒビン又はＳＶＢＰ欠失は、Ａβ毒性によって誘発される樹状突起スパイン喪失からマウス培養ニューロンを保護する。（Ａ）ＧＦＰを発現し、１００nM Ａβオリゴマーで４８時間処理した又は処理しなかったＷＴ並びにＳＶＢＰ−、ＶＡＳＨ１−及びＶＡＳＨ２−ＫＯ培養ニューロン（１７ＤＩＶ）の樹状突起セグメントの代表例の共焦点画像。スケールバー＝５μm。（Ｂ）１００nM Ａβで処理した又は処理しなかったＷＴ  １７ＤＩＶニューロンの総樹状突起スパイン密度（左）又は成熟マッシュルーム型樹状突起スパイン（右）のグラフ。全てのデータは平均＋ＳＥＭとして示されている。スチューデントｔ検定。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。（Ｃ）ＷＴ及びＳＶＢＰ−、ＶＡＳＨ１−及びＶＡＳＨ２−ＫＯ  １７ＤＩＶ培養ニューロン由来のＡβ処理ニューロンの総樹状突起スパイン密度（左）又は成熟マッシュルーム型樹状突起スパイン（右）のグラフ。結果は、それぞれＷＴ及びＳＶＢＰ−、ＶＡＳＨ１−及びＶＡＳＨ２−ＫＯ由来の未処理（コントロール）ニューロンと比べて、平均＋ＳＥＭとして示されている。シダック多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１７】野生型及びＳＶＢＰ  ＫＯ後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの条件軸索再成長のin vitro分析。（Ａ）いかなる事前のコンディショニングもないか（非挫滅）又は坐骨神経挫滅の３日後（挫滅）のいずれかの解離及び培養した代表的な成人ＤＲＧニューロン。（Ｂ）各ニューロンの神経突起の最長の長さの定量。ｎ＝２回の独立した実験。バーの値は、定量したニューロンの数に対応する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を表す；統計分析：クラスカル・ワリス検定とダン多重比較検定。ｎｓ、統計的非有意差；＊＊Ｐ＜０，０１。ＷＴと比較して、ＳＶＢＰ  ＫＯ  ＤＲＧニューロンは、プレコンディショニングプロトコール後に有意に速く成長する。
【図１８】阻害剤に対するＶＡＳＨ１／ＳＶＢＰ感度。ビオチニル−Ｖ−１５−Ｙのペプチドを用いたＥｌｉｓａベースの方法を使用して、アッセイを実施した。いくつかの阻害剤を試験した。Ｐｈｅ残基を含有する市販のセリン／システイン阻害剤であるＴＰＣＫ（トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン）；Ａｂｌチロシンキナーゼの市販の強力な阻害剤であるポナチニブ；それぞれＹ又はＥＥＹアミノ酸とカップリングしたエポキシド基を含有する設計阻害剤であるＥｐｏＹ及びｅｐｏＥＥＹ(Aillaud et al., 2017)；ｅｐｏＹのクリック可能バージョンであるアルキン−ｅｐｏＹ。結果は、ＤＭＳＯを用いたコントロールにおける酵素活性の割合として表されている（少なくとも２回反復の平均）。
【図１９】検量線：２．７μM及び２０μMの範囲の２つのペプチド（ビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ及びビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｙ）で、検量線を得た。１／ｘ線形曲線フィットを使用した８点検量線に基づいて、濃度を計算した。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明：
α−チューブリンの可逆的脱チロシン化は微小管ダイナミクス及び機能に重要であり、その欠陥は、ガン、脳崩壊及び心筋症に関与している。しかしながら、脱チロシン化を担当するチューブリンチロシンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）の同定は依然として未成功である。本明細書では、強力でユニークな不可逆的な阻害剤と共に化学プロテオミクスを使用して、本発明者らは、主要な脳ＴＣＰがバソヒビン−１（ＶＡＳＨ１）と低分子バソヒビン結合タンパク質（ＳＶＢＰ）との複合体であることを見出した。ＶＡＳＨ１及びそのホモログバソヒビン−２（ＶＡＳＨ２）は、ＳＶＢＰと複合体形成すると、微小管に対するロバストかつ特異的なＴｙｒ／Ｐｈｅカルボキシペプチダーゼ活性を示す。したがって、本発明者らは、バソヒビン及びバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体の酵素活性を最初に実証した。培養ニューロンにおけるバソヒビン又はＳＶＢＰのノックダウンは、チロシン化α−チューブリンレベルの顕著な減少及び重度の分化欠陥の発症をもたらす。更に、バソヒビンのノックダウンは、発達中のマウス新皮質のニューロン移動を破壊する。これらの結果は、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体がＴＣＰ酵素であることを立証している。
【０００９】
したがって、本発明は、それを必要とする被験体におけるチューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患を処置するための方法において使用するための、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現の阻害剤に関する。
【００１０】
本明細書で使用される場合、用語「チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患」は、チューブリンの脱チロシン化／チロシン化サイクルの崩壊に関連する一群の疾患を指す。チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）が関与する病状の例としては、神経学的障害及び心血管疾患が挙げられる。
【００１１】
ＴＴＬ酵素及びコントロールされた量のチロシン化チューブリンは、神経組織化に不可欠である(Erck et al. (2005), Proc Natl Acad Sci U S A, 102:7853)。ヒトの加齢脳(Loerch et al. (2008), PloS one, 3:e3329)及びアルツハイマー病患者の脳（未発表のデータ）では、ＴＴＬ発現が減少している。アルツハイマーの動物モデルにおけるこれらの欠陥は、シナプス可塑性及び認知能力の障害と同時であることが示されている（Andrieux研究室からの未発表の結果）。したがって、ＴＣＰ阻害剤の使用は、脳におけるチロシン化／脱チロシン化チューブリンの生理学的量を再確立し、疾患に関連する認知能力の更なる低下を回復又は予防するはずである（認知能力は、最も単純なものから最も複雑なものまで任意のタスクを行うために必要な技能：学習、記憶、問題解決、意思決定など．．．を指す）。
【００１２】
また、最近の研究は、微小管の脱チロシン化の減少が神経再生を促進し(Gobrecht et al. (2016), The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, 36:3890)、傷害軸索におけるチロシン化アルファ−チューブリンの増加が逆行性傷害シグナリング及び軸索再生に必要である(Song et al, 2015)ことを示している。微小管ダイナミクスのターゲティングは、瘢痕組織によって形成される阻害性環境の組成を改変し、それを軸索の再生により許容的にする。微小管は、軸索再生において二重機能を有する。軸索成長の支援における役割の他に、それらは、核に戻る逆行性シグナルの輸送路を提供する(Blanquie and Bradke, 2018)。
【００１３】
したがって、特定の実施態様では、ＴＣＰ関連疾患は、神経変性疾患などの神経学的障害を含む。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「神経学的障害」は、被験体の神経系の正常な機能又は解剖学的構造に直接的又は間接的に影響を与える疾患、障害又は症状として定義される。
【００１５】
本発明の文脈では、用語「神経変性障害」は、中枢神経系又は末梢神経系の細胞が影響を受けるか又は失われる疾患として定義される。
【００１６】
特に好ましい神経変性障害はアルツハイマー病（ＡＤ）である。微小管は、アルツハイマー病の病理におけるキープレーヤーであることが十分に立証されている(Matsuyama and Jarvik, 1989; Dent, 2016; Brandt and Bakota, 2017)。最近の結果は、アルツハイマー病患者の脳ではＴＴＬ発現が減少しているのに対して（未発表データ）、（以下の実施例で実証されているように）脱チロシン化チューブリンが増加していることを示している。また、バソヒビン１又はＳＶＢＰタンパク質を欠失させたトランスジェニックマウス由来の初代神経細胞培養物では、ベータ−アミロイド誘発性神経毒性が予防される（結果も以下に示されている）。微小管は３つの細胞骨格構成要素の１つであり、軸索の完全性を維持して軸索輸送の経路を形成するために重要である(Eira et al, 2016)。軸索輸送欠陥は、神経変性疾患の直接的な原因である。α−チューブリンの可逆的脱チロシン化は、微小管ダイナミクス及び機能、例えば軸索輸送及び樹状突起スパイン；ＣＮＳにおける興奮性ニューロンのシナプス後コンパートメントに重要である(Dent, 2016)。いくつかの神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及び進行性核上性麻痺のようなタウオパチーでは、微小管ダイナミクスの改変が観察されている(Baird and Benneth, 2013; Dubey et al, 2015; Cartelli and Cappelletti, 2017)。最近の研究はまた、成人脳におけるＭＴダイナミクスが学習及び記憶の重要なプロセスにおいて機能し、変性疾患では損なわれ得ることを示唆している(Dent et al., 2016)。
【００１７】
ハンチントン病患者では、シナプス及び軸索の機能不全並びに神経突起ジストロフィーがニューロン喪失に先行するという証拠もある(Li and Conforti, 2013)。
【００１８】
in vitro又はin vivoのいずれかの虚血（脳卒中）モデルでは、微小管及び／又はチューブリンが崩壊していることも報告されている(Ma et al, 2010; Psilodimitrakopoulos et al, 2013)。多発性硬化症（ＭＳ）及び関連モデル、例えば実験的自己免疫性脳脊髄炎では、神経変性が起こる前に、軸索輸送の変化が存在することが示されている(Van den Berg et al, 2017)。神経炎症に関連する化学的環境はそれ自体が既に、微小管関連軸索輸送を破壊することができる(Van den Berg et al, 2017)。
【００１９】
好ましくは、神経学的障害又は神経変性障害は、多発性硬化症、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病からなる群より選択される。
【００２０】
神経学的障害の他の例はまた、外傷性脳傷害、脊髄傷害、頭蓋内病変又は椎骨内病変であり、限定されないが、挫傷、浸透、剪断、脊髄の圧迫若しくは裂傷病変又はむち打ち揺さぶられっ子症候群が挙げられる。
【００２１】
好ましい実施態様では、神経変性障害はアルツハイマー病である。
【００２２】
別の好ましい実施態様では、神経学的障害は脳卒中である。
【００２３】
本発明はまた、神経保護剤又は向神経剤として使用するための、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現の阻害剤に関する。
【００２４】
微小管におけるチロシン化／脱チロシン化チューブリンのコントロールもまた、心筋細胞における筋節短縮及び伸張に対する粘弾性抵抗に関与するので、心筋収縮に関与する(Kerr et al. (2015) Nature Comm., 6:8526 ; Robison et al. (2016) Science,352:aaf0659 ; Chen et al. (2018) Nature Med., 24 :1225)。臨床データにより、コントロール被験体及び肥大型心筋症患者では、心筋脱チロシン化チューブリンのレベルは左心室駆出率と負に相関することが示された(Robison et al. (2016) Science, 352:aaf0659)。したがって、ＴＣＰ阻害剤はまた、肥大型心筋症、虚血後心筋症、拡張型心筋症(Robison et al. (2016) Science, 352:aaf0659 ; Chen et al. (2018) Nature Med., 24 :1225)、ジストロフィン異常症(Belanto et al. (2016))の処置において使用され得る。
【００２５】
特定の実施態様では、ＴＣＰ阻害剤は、心不全、特に駆出率の減少を伴う心不全（虚血性、非虚血性）及び駆出率の維持を伴う心不全（肥大性心筋症、糖尿病性心筋症）の処置において使用される。
【００２６】
特定の実施態様では、ＴＣＰ関連疾患は、心筋梗塞、心筋梗塞誘発性心血管機能障害、心不全、心筋症及びジストロフィン異常症からなるリストより選択される心血管疾患である。
【００２７】
好ましい実施態様では、心血管疾患は、駆出率の減少を伴う心不全（虚血性、非虚血性）である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「処置」、「処置する」は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患若しくはその症候の完全若しくは部分的な予防の点で予防的であり得、並びに／又は疾患の部分的若しくは完全な治癒及び／若しくは疾患に起因する有害効果の点で治療的であり得る。本明細書で使用される場合、「処置」は、被験体における疾患の任意の処置をカバーし、（ａ）生存期間の増加；（ｂ）疾患による死亡リスクの減少；（ｃ）疾患の素因を有し得るがそれを有するとまだ診断されていない被験体における疾患の発生の予防；（ｄ）疾患の阻害、すなわち、その発症の阻止（例えば、疾患進行の速度の減少）；及び（ｅ）疾患の緩和、すなわち、疾患の退縮を含む。
【００２９】
本明細書で互換的に使用される用語「被験体」及び「患者」は、チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患、例えば心血管障害及び神経学的障害と以前に診断されたか、又はチューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患、例えば心血管障害及び神経学的障害を有し若しくは発症するリスクがある哺乳動物、特にヒトを指す。典型的には、神経変性疾患などの神経学的障害の診断は、脳生検後に、又は神経画像処理（ＩＲＭ、ＰｅｔＳｃａｎ．．．）を使用することによって、又は疾患に関連する生物学的マーカーを用いて行われ得る。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「又は「バソヒビン」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、バソヒビン−１又はバソヒビン−２タンパク質から構成される。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「又はバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有する。バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体は、バソヒビン−１又はバソヒビン−２、及びＳＶＢＰ（低分子バソヒビン結合タンパク質）から構成される。
【００３２】
バソヒビン１は、ＶＥＧＦなどの血管新生促進刺激成長因子によって、内皮細胞において選択的に誘導される；それは、血管新生のプロセスに関与する活性化内皮細胞の固有かつ高度に特異的なフィードバック阻害剤として機能するようである。バソヒビン１  ｍＲＮＡ及びタンパク質は、ＶＥＧＦによって時間及び濃度依存的に誘導されるのに対して、分泌タンパク質はＶＥＧＦの血管新生効果をアンタゴナイズする。９つのアイソフォームを最終的にコードする１３個のスプライス変異体を生成する別個の遺伝子によってコードされるバソヒビン−２(Shibuya, T. et al. (2006) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26:１０５１, and NCBI RefSeq)は、バソヒビン−１のホモログである。バソヒビン及びバソヒビン−２は両方とも、ヒトとマウスとの間で＞９５％保存されている。（バソヒビンタンパク質及び血管新生レギュレーションの総説については、Sato Y J Biochem. 2013 Jan; 153(1):5-11を参照のこと）。
【００３３】
前述のように、本発明の発明者らは、バソヒビンの酵素活性を最初に同定した。より具体的には、本発明者らは、バソヒビン−１及びそのホモログバソヒビン−２（ＶＡＳＨ２）が非標準的なＣｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ触媒三残基を有し、トランスグルタミナーゼ様システインプロテアーゼファミリーの未発見メンバーであることを実証する。
【００３４】
ＳＶＢＰは低分子バソヒビン結合タンパク質を意味し、６６個のアミノ酸から構成されるタンパク質である。ＳＶＢＰは、２０１０年に東北大学チームによって最初に単離され、バソヒビン１の分泌シャペロンとして作用し、ＶＡＳＨ１の抗血管新生活性に寄与すると記載されている(Suzuki Y, et al J Cell Sci 2010 123: 3094-3101)。別の研究には、ＳＶＢＰがＶＡＳＨ２タンパク質の分泌シャペロンであることが記載されている(Xue X. et al Oncogene. 2013 Mar 28; 32(13):1724-34)。
【００３５】
したがって、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体は、バソヒビン−１又はバソヒビン−２及びＳＶＢＰ（低分子バソヒビン結合タンパク質）から構成される。
【００３６】
●バソヒビン活性の阻害剤
「バソヒビン活性の阻害剤」又は「バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性の阻害剤」は、当技術分野におけるその同じ一般的な意味を有し、バソヒビン（又はその複合体）又はそのメンバーの１つの生物学的活性を減少させ又は抑制する能力を有する化合物（天然又は非天然）を指す。典型的には、前記化合物は、バソヒビン（又はその複合体）によるチューブリンの脱チロシン化を阻害し又は減少させる。例えば、化合物は、基質に代わって触媒部位に入り得るか、又はバソヒビン（又はその複合体）とチューブリン／微小管／微小管関連タンパク質、例えば＋Ｔｉｐ（プラス−エンドトラッキングタンパク質）との相互作用を遮断し得るか、又はバソヒビンがチューブリン／微小管／微小管関連タンパク質、例えば＋Ｔｉｐに結合することができない様式でバソヒビン（又はその複合体）に結合し得るか、又はバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体の形成を阻害し得る。典型的には、前記阻害剤は、有機小分子又は生体分子（例えば、ペプチド、脂質、抗体、アプタマー）である。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「又は＋Ｔｉｐ」は、「プラス−エンドトラッキングタンパク質」を意味する。プラスエンドトラッキングタンパク質は、成長中の微小管の先端に結合し、微小管ダイナミクスのレギュレーションにおいて重要な役割を果たすＭＡＰ（微小管関連タンパク質）タンパク質である。例えば、＋ＴＩＰは、有糸分裂中の微小管と染色体との相互作用に関与することが観察されている。＋ＴＩＰとして同定された最初のＭＡＰはＣＬＩＰ１７０（細胞質リンカータンパク質）であり、微小管脱重合レスキュー事象において役割を果たすことが示されている。＋ＴＩＰの更なる例としては、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、ｐ１５０Ｇｌｕｅｄ、ダイナミチン、Ｌｉｓ１、ＣＬＩＰ１１５、ＣＬＡＳＰ１及びＣＬＡＳＰ２．．．）が挙げられる。
【００３８】
バソヒビン又はバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体の「生物学的活性」（これは同じものである）は、チューブリンの脱チロシン化／チロシン化サイクルに関連するアルファチューブリン（モノマー、ダイマー又は微小管内重合）の脱チロシン化を意味する。
【００３９】
バソヒビン（又はその複合体）活性の阻害剤である化合物の能力を決定するための試験は当業者に周知である。本出願は更に、バソヒビン及び／又はバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体、すなわちＴＣＰの候補阻害剤をスクリーニング及び選択することを有利に可能にする試験を提供する（以下を参照のこと）。好ましい実施態様では、阻害剤は、バソヒビンの生物学的活性を阻害するために十分な様式で、バソヒビン（又はその複合体）に特異的に結合する。バソヒビン（又はその複合体）に対する結合及びバソヒビンの生物学的活性の阻害は、当技術分野で周知の任意の競合アッセイによって決定され得る。例えば、アッセイは、バソヒビン活性阻害剤として試験すべき薬剤のバソヒビン（又はその複合体）結合能力を決定することからなり得る。結合能力は、Ｋｄ測定値によって反映される。本明細書で使用される場合、用語「ＫＤ」は、解離定数（これは、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（M）として表される）を指すことを意図する。結合生体分子のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定され得る。特定の実施態様では、「バソヒビン（又はその複合体）に特異的に結合する」阻害剤は、１μM以下、１００nM以下、１０nM以下又は３nM以下のＫＤで、ヒトバソヒビン（又はその複合体）ポリペプチドに結合する阻害剤を指すことを意図する。次いで、競合アッセイは、バソヒビンの生物学的活性を阻害する薬剤の能力を決定するように設定され得る。細胞内又はin vivoにおけるアルファチューブリンの脱チロシン化を誘導又は阻害する能力を評価するような機能的アッセイが想定され得る（実施例及び図１を参照のこと）。
【００４０】
当業者は、バソヒビン（又はその複合体）活性阻害剤がバソヒビンの生物学的活性を中和し、遮断し、阻害し、抑止し、減少させ又は妨害するかを容易に決定し得る。最初に特性評価されたアルキン−ｅｐｏＹ化合物と同じ方法で、バソヒビン活性阻害剤がバソヒビン（又はその複合体）に結合し、及び／又は細胞におけるアルファチューブリンの脱チロシン化を阻害するかのチェックは、各阻害剤を用いて実施され得る。例えば、アルファチューブリンアッセイの脱チロシン化は、実施例セクション（及びArce et al (1978) J Neurochemistry (31) 205-210、Argarana et al (1980) Journal of Neurochemistry, 34(1) 114-118）に記載されているように、［１４Ｃ］−チロシン化タキソール安定化微小管又は［１４Ｃ］−チロシン化チューブリンを使用した放射能試験によって測定され得る。
【００４１】
特定の実施態様では、本発明の活性阻害剤は、抗体又はその一部である。
【００４２】
この実施態様では、バソヒビン（又はその複合体）の活性阻害剤は、細胞におけるバソヒビン（又はその複合体）に結合してその生物学的活性を遮断し得る抗体（この用語は、抗体フラグメント又は一部を含む）である。
【００４３】
好ましい実施態様では、バソヒビンの活性阻害剤は、抗体がバソヒビン／活性を損なう方法で、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体又はバソヒビンに対する抗体からなり得る（「中和抗体」）。
【００４４】
次いで、本発明では、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体又はバソヒビンの中和抗体は、（ｉ）バソヒビン（又はその複合体）に結合し、及び／又は（ｉｉ）バソヒビン（又はその複合体）によるアルファチューブリンの脱チロシン化を阻害するそれらの能力について、上記のように選択される。
【００４５】
本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はヒト化抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体はキメラ抗体である。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の軽鎖を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の重鎖を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｃ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｖ部分を含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の可変ドメインを含む。本明細書に記載される抗体又はその部分の一実施態様では、抗体の部分は、抗体の１つ以上のＣＤＲドメインを含む。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、天然に存在する抗体及び天然に存在しない抗体の両方を含む。具体的には、「抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びにその一価フラグメント及び二価フラグメントを含む。更に、「抗体」は、キメラ抗体、完全合成抗体、一本鎖抗体及びそれらのフラグメントを含む。抗体は、ヒト抗体又は非ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を減少させるためのリコンビナント方法によってヒト化され得る。
【００４７】
抗体は、従来の方法にしたがって調製される。モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (Nature, 256:495, 1975)の方法を使用して作製され得る。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するために、抗原型バソヒビン（１又は２）又はＳＶＢＰでマウス又は他の適切な宿主動物を適切な間隔で（例えば、週２回、週１回、月２回又は月１回）免疫する。屠殺の１週間以内に、最終「追加免疫」の抗原を動物に投与し得る。免疫中に免疫学的アジュバントを使用することが望ましいことが多い。適切な免疫学的アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、Hunter’s Titermax、サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１若しくはＱｕｉｌＡ、又はＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントは当技術分野で周知である。皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は他の経路によって、動物を免疫し得る。複数の経路によって、複数の形態の抗原で所定の動物を免疫し得る。
【００４８】
簡潔に言えば、リコンビナントバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体（又はそのメンバーの１つ）は、リコンビナント細胞株による（又は細菌、酵母若しくは昆虫細胞を含む様々な他の発現系によって）発現によって提供され得る。リコンビナント型バソヒビン及び／又はＳＶＢＰは、任意の前記方法を使用して提供され得る。免疫レジメンの後、動物の脾臓、リンパ節又は他の臓器からリンパ球を単離し、次いでポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して適切な骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを形成する。融合後、記載されているように(Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996)、標準的な方法を使用して、融合パートナーではなくハイブリドーマが成長可能な培地中に細胞を置く。ハイブリドーマの培養後、所望の特異性の（すなわち、抗原に選択的に結合する）抗体の存在について、細胞上清を分析する。適切な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降及びウエスタンブロッティングが挙げられる。他のスクリーニング技術は当技術分野で周知である。好ましい技術は、コンフォメーションがインタクトな抗原であって、ネイティブにフォールディングされた抗原に対する抗体の結合を確認するもの、例えば非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び免疫沈降である。
【００４９】
重要なことに、当技術分野で周知であるように、抗体分子のごく一部（パラトープ）のみが、そのエピトープに対する抗体の結合に関与する（一般的に、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照のこと）。Ｆｃ’領域及びＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断された抗体、又はｐＦｃ’領域なしで生産された抗体（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと称される）は、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された抗体、又はＦｃ領域なしで生産された抗体（Ｆａｂフラグメントと称される）は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の一方を保持する。更に進めて、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖と、抗体重鎖の一部（Ｆｄと称される）とからなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変化させずに、最大１０個の異なる軽鎖に結合され得る）、Ｆｄフラグメントは、単独でエピトープ結合能を保持する。
【００５０】
当技術分野で周知であるように、抗体の抗原結合部分内には、抗原のエピトープと直接的に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）とが存在する（一般的に、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照のこと）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメント及び軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲＳ）によってそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より具体的には重鎖ＣＤＲＳは、抗体特異性に大きく関与する。
【００５１】
元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域を同種抗体又は異種特異的抗体の類似領域で置換し得ることは、現在では当技術分野で十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲをヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合して機能的抗体を生産する「ヒト化」抗体の開発及び使用において最も明確に具現されている。
【００５２】
バソヒビン（又はその複合体）は細胞内ターゲットであるので、活性阻害剤として作用する本発明の抗体は、Ｆｃフラグメントを含まない抗体フラグメントであり得る。
【００５３】
したがって、当業者には明らかであるように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄフラグメント；Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラ抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体；並びに、ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦｄフラグメント抗体を提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体を含む。
【００５４】
様々な抗体分子及びフラグメントは、限定されないが、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含む一般的に公知の免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられる。
【００５５】
実施態様では、本発明の抗体は、単一ドメイン抗体である。用語「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」は、軽鎖を本来的に欠くラクダ科哺乳動物に見られ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨは、「nanobody（登録商標）」とも称される。本発明によれば、ｓｄＡｂは、特にラマｓｄＡｂであり得る。
【００５６】
中和ヒトバソヒビン（又はその複合体若しくはそのメンバーの１つ）抗体の例は、以下で開示されているか又は入手可能である。
●ＶＡＳＨ１については：Saito M et al. The Journal of Biochemistry, 160(4), Oct. 2016, p.227-232); (Watanabe, K., et al. (2004). J. Clin. Invest. 114, 898907)及び抗バソヒビン１／ＶＡＳＨ１抗体（Ｃ末端） IHC-plus（商標）LS-B9515 (Lifespan Bioscience) 
●ＶＡＳＨ２については：Koyanagi T. et al Cancer Sci. 2017 Mar;108(3):512-519);米国特許第９７０１７４４号及び抗ＶＡＳＨ２治療用抗体(1760) TAB-248CQ (creative biolab)、抗ＶＡＳＨ２(H00079805-H01) Novus bio.
●ＳＶＢＰについては、抗ＳＶＢＰ抗体(HPA008507 SIGMA)
【００５７】
●バソヒビン（又はその複合体）発現の阻害剤
「バソヒビン発現の阻害剤」又は「バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体発現の阻害剤」は、バソヒビンの少なくとも１つの異なるメンバー（又はその複合体）をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害し又は有意に減少させる生物学的効果を有する天然又は合成化合物を指す。
【００５８】
特定の実施態様では、バソヒビン発現の阻害剤は、バソヒビン１又はバソヒビン２の発現の阻害剤からなる群より選択される。
【００５９】
特定の実施態様では、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体発現の阻害剤は、バソヒビン１、バソヒビン２又はＳＶＢＰの発現の阻害剤からなる群より選択される。
【００６０】
【表１】
2021500371.tif 000002
【００６１】
実施例セクション（図３及び５）に示されているように、in vitro／in vivo研究におけるバソヒビン１又はバソヒビン２又はＳＶＢＰの発現の阻害の使用は、神経突起及びニューロンの分枝の数を明らかに増加させ（図３）、軸索分化の遅延を改変する（図５）。
【００６２】
好ましい実施態様では、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体発現の阻害剤は、バソヒビン１及び／又はバソヒビン２発現の阻害剤である。
【００６３】
本発明において使用するための発現の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物をベースとするものであり得る。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体（又はそのメンバーの少なくとも１つ）ｍＲＮＡに結合してタンパク質翻訳を防止するか、又はｍＲＮＡ分解を増加させることによって、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体（又はそのメンバーの少なくとも１つ）ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断し、それにより、細胞内のバソヒビンのレベル及び活性を低下させるように作用する。例えば、少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体（又はそのメンバーの少なくとも１つ）をコードするｍＲＮＡ転写配列のユニーク領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば通常のホスホジエステル技術によって合成し、例えば静脈内注射又は静脈内注入によって投与し得る。その配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためにアンチセンス技術を使用する方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；米国特許第６，５６６，１３１号；米国特許第６，３６５，３５４号；米国特許第６，４１０，３２３号；米国特許第６，１０７，０９１号；米国特許第６，０４６，３２１号；及び米国特許第５，９８１，７３２号を参照のこと）。
【００６４】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明において使用するための発現阻害剤として機能し得る。バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体遺伝子発現が特異的に阻害されるように、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は低分子二本鎖ＲＮＡの生成を引き起こすベクター若しくは構築物と被験体又は細胞を接触させることによって、バソヒビン（又はその複合体）遺伝子発現を減少させ得る（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。その配列が公知の遺伝子について、適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号及び米国特許第６，５０６，５５９号；並びに国際公開第０１／３６６４６号、国際公開第９９／３２６１９号及び国際公開第０１／６８８３６号を参照のこと）。有利には、本発明のｓｉＲＮＡのホスホジエステル結合の全部又は一部は保護される。この保護は、当技術分野で公知の方法を使用して化学的経路によって一般的に実行される。ホスホジエステル結合は、例えば、チオール若しくはアミン官能基によって、又はフェニル基によって保護され得る。有利には、本発明のｓｉＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端もまた、例えば、ホスホジエステル結合を保護するための上記技術を使用して保護される。有利には、ｓｉＲＮＡ配列は、少なくとも１２個の連続ジヌクレオチド又はそれらの誘導体を含む。
【００６５】
本明細書で使用される場合、本核酸配列に関して用語「ｓｉＲＮＡ誘導体」は、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体（又はそのメンバーの少なくとも１つ）又はそのフラグメントと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、一例として少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性の割合を有する核酸を指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、２つの核酸配列間の「同一性の割合」は、比較すべき２つの配列間の最良のアライメントで得られた、前記配列間における同一の核酸の割合を意味し、この割合は全く統計的であり、これら２つの配列間の差異は、核酸配列にわたってランダムに広がっている。本明細書で使用される場合、「最良のアライメント」又は「最適なアライメント」は、決定された同一性の割合（以下を参照のこと）が最高であるアライメントを意味する。２つの核酸配列間の配列比較は、通常、最良のアライメントに基づいて予めアライメントされているこれらの配列を比較することによって実現される；類似性の局所領域を同定及び比較するために、この比較は、比較セグメントで実現される。比較を実施するための最良の配列アライメントは、手動による以外に、SMITH及びWATERMANによって開発されたグローバル相同性アルゴリズムを使用することによって（Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981）、NEDDLEMAN及びWUNSCHによって開発されたローカル相同性アルゴリズムを使用することによって(J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970)、PEARSON及びLIPMANによって開発された類似性の方法を使用することによって(Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988)、このようなアルゴリズムを使用したコンピュータソフトウェアを使用することによって（Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USAのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）、ＭＵＳＣＬＥ多重アライメントアルゴリズムを使用することによって(Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004)実現され得る。最良のローカルアライメントを得るために、好ましくはＢＬＡＳＴソフトウェアを使用し得る。２つの核酸配列間の同一性の割合は、最適にアライメントされたこれら２つの配列を比較することによって決定され、これら２つの配列間の最適なアライメントを得るために、核酸配列は、参照配列に関して付加又は欠失を含むことができる。同一性の割合は、これら２つの配列間における同一の位置の数を決定し、比較された位置の総数でこの数を割り、得られた結果に１００を乗じて、これら２つの配列間の同一性の割合を求めることによって計算される。
【００６７】
ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）もまた、本発明において使用するための発現阻害剤として機能し得る。
【００６８】
リボザイムもまた、本発明において使用するための発現阻害剤として機能し得る。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ切断を含む。それにより、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体（又はそのメンバーの少なくとも１つ）ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的及び効率的に触媒する人工ヘアピン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。リボザイム切断部位（これらとしては、典型的には、以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣが挙げられる）についてターゲット分子をスキャンすることによって、任意のＲＮＡターゲット候補内の特異的リボザイム切断部位を最初に同定する。同定したら、切断部位を含有するターゲット遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る予測構造的特徴（例えば、二次構造）について評価し得る。
【００６９】
発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは両方とも、公知の方法によって調製され得る。これらとしては、例えば、固相ホスホラミダイト(phosphoramadite)化学合成などによる化学合成技術が挙げられる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitro又はin vivo転写によって作製され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが組み込まれた様々なベクターに組み込まれ得る。細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な改変を導入し得る。可能な改変としては、限定されないが、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を分子の５’及び／若しくは３’末端に付加すること、又はホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート若しくは２’−Ｏ−メチルをオリゴヌクレオチド骨格内で使用することが挙げられる。
【００７０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びリボザイムは、単独で又はベクターに結合してin vivo送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、細胞（好ましくは、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体を発現する細胞）へのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸の運搬を促進することができる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在で起こり得る分解程度と比べて低減した分解で、核酸を細胞に輸送する。一般的に、本発明に有用なベクターとしては、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作されたプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス源又は細菌源に由来する他のビヒクルが挙げられる。ウイルスベクターは好ましい種類のベクターであり、限定されないが、以下のウイルス：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスに由来する核酸配列が挙げられる。命名されていないが当技術分野で公知の他のベクターも容易に用い得る。
【００７１】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスをベースとするものである。非細胞変性ウイルスとしてはレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が挙げられ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、それに続くプロウイルスの宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試験に承認されている。最も有用なのは、複製欠損性（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令することはできるが、感染性粒子を製造することができない）レトロウイルスである。このような遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、in vivoにおける高効率な遺伝子トランスダクションについて全般的な有用性を有する。複製欠損性レトロウイルスを生産するための標準的なプロトコール（外因性遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドでパッケージング細胞株をトランスフェクションする工程、パッケージング細胞株によってリコンビナントレトロウイルスを生産する工程、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程、及びウイルス粒子をターゲット細胞に感染させる工程を含む）は、Kriegler, 1990及びMurry, 1991)に示されている。
【００７２】
特定の用途に好ましいウイルスは、遺伝子治療におけるヒトへの使用が既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルス及びアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスである。実際、１２個の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜１２）が公知であり、それぞれが異なる組織親和性を有する(Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27)。リコンビナントＡＡＶは、依存型パルボウイルスＡＡＶ２に由来する(Choi, VW J Virol 2005; 79:6801-07)。アデノ随伴ウイルスタイプ１〜１２は、複製欠損性となるように操作することができ、広範囲の細胞型及び種に感染することができる(Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27)。それは更に、熱安定性及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高いトランスダクション頻度；並びに、重複感染阻害がないので複数回のトランスダクションが可能であるなどの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスを部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み込むことにより、挿入突然変異誘発の可能性及びレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子の発現の変動性を最小限にし得る。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００継代回以上にわたって組織培養液中で観察されており、これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みは、比較的安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外でも機能し得る。
【００７３】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは当技術分野で広く記載されており、当業者に周知である。例えば、Sambrook et al., 1989を参照のこと。ここ数年間では、プラスミドベクターは、in vivoにおいて抗原をコードする遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全上の懸念がないので、特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現し得る。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは当業者に周知である。加えて、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去及び付加する制限酵素及びライゲーション反応を使用して、プラスミドをカスタム設計し得る。プラスミドは、様々な非経口経路、粘膜経路及び局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路によって注射され得る。それはまた、鼻腔内スプレー又は点鼻液、直腸坐剤によって及び経口的に投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面に投与され得る。プラスミドを水溶液に加えてもよいし、金粒子上に乾燥してもよいし、又は別のＤＮＡ送達システム（限定されないが、リポソーム、デンドリマー、コクリエート及びマイクロカプセル化を含む）と併用してもよい。
【００７４】
好ましい実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸配列は、異種調節領域、例えば異種プロモーターのコントロール下にある。プロモーターは、単球又はマクロファージに特異的であり得る。
【００７５】
ヒト及びマウスバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体（又はそのメンバーの１つ）の発現の阻害剤（ｓｉＲＮＡ）の例は、以下で開示されているか又は入手可能である：
●バソヒビン１については、Kitajima T., et al Anticancer Research October 2014 vol. 34(10) p.5321-5329; Miyashita H, et al (2012). PLoS ONE 7(10): e46459; Watatani H et al, Physiol Rep. 2014 June; 2(6): e12054.Vasohibin-1 Gene Silencers siRNA (h), sc-61776, (SantaCruz Biotechnology); SMARTpool: Accell VASH1 siRNA (Darmacon) ; Invitrogen Stealth mouse siRNA MSS280250、MSS280251及びMSS280252.
●バソヒビン２については：Tu, M., et al (2016). (Cancer Letters; 383(2), 28 Dec. ; p. 272-281) ; Koyanagi T. et al (Cancer Science 104(12) Dec. 2013 p.1705-1710) ; Suenaga K. et al (PLoS One. 2014; 9(9): e104728) ; Invitrogen Stealth mouse siRNA MSS213191、MSS280251及びMSS280252.
●ＳＶＢＰについては、Suzuki Y, et al (J Cell Sci 2010 123: 3094-3101).
【００７６】
実施例セクションにおいて使用されているマウスバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体（又はそのメンバーの１つ）の発現の阻害剤（ｓｈＲＮＡ）の例は、以下のものである。
●バソヒビン−１：ＣＣＧＡＧＡＣＡＴＧＣＧＧＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＧＣＡＡＧＧ（配列番号１）
●バソヒビン−２：ＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＡ（配列番号２）
●ＳＶＢＰ：ＡＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＣ（配列番号３）
【００７７】
●医薬組成物
バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現の阻害剤を、薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、治療用組成物を形成し得る。
【００７８】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物では、活性成分は単独で、又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与形態で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与され得る。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口用懸濁剤又は溶液などの経口経路剤形、舌下及び口内投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内及び鼻腔内投与形態並びに直腸投与形態を含む。
【００７９】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤にとって薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に等張滅菌食塩水（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水の添加により注射液の構成を可能にする乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。
【００８０】
注射用途に適切な医薬剤形としては、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。全ての場合において、剤形は滅菌でなければならず、注射容易性が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【００８１】
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水で調製され得る。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物で、並びに油で調製され得る。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。
【００８２】
本発明のバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現の阻害剤は、中性又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）酸付加塩であって、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。
【００８３】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合では、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収遅延剤、例えば組成物におけるモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【００８４】
滅菌注射液は、上記に列挙されている他の成分のいくつかを含む適切な溶媒に必要な量の活性ポリペプチドを組み込み、必要に応じて続いて濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、基本分散媒と、上記に列挙されているものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の更なる所望の成分との散剤をその予め濾過滅菌された溶液から得る真空乾燥技術及び凍結乾燥技術である。
【００８５】
製剤化されると、溶液は、投与製剤に適合する方法で、治療有効量で投与されるであろう。製剤は、上記種類の注射液などの様々な投与剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いられ得る。
【００８６】
水溶液による非経口投与では、例えば、必要な場合には溶液は適切に緩衝化されるべきであり、最初に、液体希釈剤は十分な食塩水又はグルコースで等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に適切である。これに関して、用いられ得る滅菌水性媒体は、本開示を考慮して当業者に公知であろう。例えば、１投与量を等張ＮａＣｌ溶液 １mlに溶解させ、皮下点滴液 １０００mlに添加し得るか、又は提案された注入部位に注射し得る。処置されている被験体の症状に応じて、投与量のいくらかの変動が必然的に生じるであろう。いずれにせよ、投与責任者は、個々の被験体のための適切な用量を決定するであろう。
【００８７】
本発明のバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現の阻害剤は、１用量当たり約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０又は更には約１０ミリグラムなどを含むように治療用混合物内で製剤化され得る。複数回用量も投与され得る。
【００８８】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、錠剤又は経口投与のための他の固形物；リポソーム製剤；持続放出カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
【００８９】
●スクリーニング方法
本発明は更に、候補バソヒビン／ＳＶＢＰ複合阻害剤（「ＴＣＰ阻害剤」とも称される）をスクリーニングするための方法に関する。本発明の方法は、
（ｉ）候補化合物を、バソヒビン／ＳＶＢＰ（ＴＣＰ）及びビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｙ（配列番号１３）の配列のビオチン化ペプチドと共にインキュベーションする工程；
（ｉｉ）質量分析により、工程（ｉ）の終了時に得られた混合物中に存在するビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｙ（配列番号１３）のビオチン化ペプチド及び／又はビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅのビオチン化ペプチドを定量する工程；並びに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた結果を考慮して、前記候補化合物がＴＣＰ阻害剤であるかを決定する工程
を含む。
【００９０】
配列番号１３のペプチドはＴＣＰの基質であり、ＴＴＬとの反応生成物である。したがって、候補化合物がＴＣＰ阻害剤である場合、工程（ｉｉ）で定量されるこのペプチドの量は、工程（ｉ）で最初にインキュベーションされたペプチドの量と実質的に同じである。
【００９１】
配列番号１２のペプチドはＴＴＬの基質であり、ＴＣＰとの反応の生成物である。したがって、候補化合物がＴＣＰ阻害剤ではない場合、工程（ｉ）の間にこのペプチドの量は増加する。
【００９２】
本方法は、ＴＣＰ阻害剤の迅速かつ正確な検出を可能にする（以下の実施例７に示されている結果を参照のこと）。特許請求の範囲に記載されている方法は、試験化合物の阻害性特徴を決定することを可能にする；典型的には、本方法は、阻害剤の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を決定することを可能にする。
【００９３】
上記スクリーニング方法は、配列番号１３のペプチドと接触させる前に、ＴＣＰ及び試験化合物をプレインキュベーションするプレインキュベーション工程を更に含み得る。
【００９４】
インキュベーション工程は、ＴＣＰ活性を可能にする条件下で行われる。典型的には、インキュベーション工程は、１５℃〜２５℃の温度で実施される。典型的には、インキュベーション工程は、室温で実施される。
【００９５】
インキュベーション工程は、ＴＣＰ活性を可能にするために十分な期間にわたって実施される。典型的には、前記期間は、５〜６０分間、より具体的には１０〜３０分間である。
【００９６】
定量工程は、質量分析（ＭＳ）を使用することによって実施される。典型的には、質量分析計はRapidFire（登録商標）質量分析計である。更なる実施態様では、質量分析計は、エレクトロスプレー負イオンモードで操作される。
【００９７】
更なる実施態様では、スクリーニング方法は、工程（ｉｉｉ）で定量するために、工程（ｉ）と（ｉｉ）との間に、配列番号１２又は１３のビオチン化ペプチドを単離する精製工程を含む。
【００９８】
この精製は、ビオチン化ペプチドを単離するための当業者に公知の任意の方法によって実施され得る。特に、精製工程は、ビオチンの特異的結合を可能にする任意の手段を使用することによって実施され得る。例えば、ストレプトアビジン又はアビジンを含む任意のデバイスが使用され得る。典型的には、前記精製工程は、エレクトロスプレー負イオンモードで操作される質量分析計と共にタイプＣカートリッジを使用することによって実施され得る。
【００９９】
本発明はまた、チューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）関連疾患を処置するために有用な複数の候補化合物をスクリーニングするための方法であって、（ａ）バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体又はバソヒビン活性又は発現を阻害するその能力について、前記候補化合物の各々を試験すること、及び（ｂ）及び前記バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体又はバソヒビン活性又は発現を阻害することができる候補化合物をポジティブ選択することからなる工程を含む方法に関する。
【０１００】
典型的には、候補化合物は、有機小分子、ペプチド、ポリペプチド又はオリゴヌクレオチドからなる群より選択される。他の潜在的な候補化合物としては、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ又はリボザイムが挙げられる。
【０１０１】
候補化合物がバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体活性又は発現を阻害し得るかの試験は、当技術分野で公知のレポーターアッセイを使用するか又はそれを慣用的に改変して決定され得る。
【０１０２】
例えば、前記方法は、バソヒビン（又はその複合体）を発現する細胞を候補化合物と接触させること、及びバソヒビン（又はその複合体）媒介性転写（例えば、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体（又はそのメンバーの少なくとも１つ）結合部位を含有するプロモーターの活性化）を測定すること、及び細胞応答を標準細胞応答と比較することを伴い得る。典型的には、標準細胞応答は、候補化合物の非存在下で測定される。標準に対する細胞応答の減少は、候補化合物がバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体発現の阻害剤（又はそのメンバーの少なくとも１つ）であることを示す。
【０１０３】
別の実施態様では、本発明は、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体（又はそのメンバーの１つ）に特異的に結合するリガンドを同定するための方法を提供する。例えば、膜又はその調製物などの細胞区画は、バソヒビン（又はその複合体）に結合する分子を発現する細胞から調製され得る。調製物を標識バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体又は標識バソヒビンと共にインキュベーションし、バソヒビン（又はその複合体）に結合したリガンドの複合体を単離し、当技術分野で公知の慣用の方法にしたがって特性評価する。あるいは、細胞から可溶化された結合分子がカラムに結合され、次いで、慣用の方法にしたがって溶出及び特性評価されるように、バソヒビン（又はその複合体）相互作用ポリペプチドを固体支持体に結合させ得る。別の実施態様では、膜又はその調製物などの細胞区画は、バソヒビン（又はその複合体）に結合する分子、例えばバソヒビン（又はその複合体）によってモデュレーションされるシグナリング又は調節経路、例えばチューブリンの脱チロシン化の分子を発現する細胞から調製され得る。調製物は、候補化合物の非存在下又は存在下で、標識バソヒビン（又はその複合体）と共にインキュベーションされる。結合分子に結合する候補化合物の能力は、標識リガンドの結合の減少を反映する。不必要に、すなわち、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体又はバソヒビン結合分子の結合に対するバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体又はバソヒビンの効果を誘導せずに結合する分子は、バソヒビン／ＳＶＢＰ複合体又はバソヒビン活性の優れた阻害剤である可能性が最も高い。
【０１０４】
別の方法は、例えば、バソヒビン（又はその複合体）を発現する細胞におけるバソヒビン／（又はその複合体）結合部位を含有するプロモーターからの転写の量を決定することによって、バソヒビン活性を阻害する化合物をスクリーニングすることを伴う。このような方法は、細胞がバソヒビン（又はその複合体）を発現するように、バソヒビン（又はその複合体）をコードするＤＮＡを真核細胞にトランスフェクションすること、前記細胞を候補化合物と接触させること、及びバソヒビン（又はその複合体）結合部位を含有するプロモーターからの転写の量を決定することを伴い得る。このような方法では、バソヒビン（又はその複合体）結合部位を含有するプロモーターに連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）が使用され得、この場合、レポーター遺伝子からの転写の量は、レポーター遺伝子産物のレベル、又はレポーター遺伝子が酵素である場合にはレポーター遺伝子産物の活性のレベルをアッセイすることによって測定され得る。バソヒビン（又はその複合体）を発現しない細胞と比較した、バソヒビン（又はその複合体を発現する細胞におけるバソヒビン（又はその複合体）結合部位を含有するプロモーターからの転写の量の減少は、候補化合物がバソヒビン活性の阻害剤であることを示す。
【０１０５】
別の方法は、例えば、上記及び実施例セクション（ＴＣＰ活性アッセイ）に記載されているように、［１４Ｃ］−チロシン化タキソール安定化微小管酵素活性を使用した放射能試験を用いて、アルファチューブリンの脱チロシン化のレベルを決定することによって、バソヒビン生物学的活性を阻害する化合物をスクリーニングすることを伴う。
【０１０６】
したがって、ＴＣＰ活性アッセイによるアルファチューブリンの脱チロシン化の阻害に対するその特性を更にアッセイすることを考慮して、結合試験でポジティブ選択された候補化合物は更なる選択工程に供され得る。
【０１０７】
また、アルツハイマー病などの神経変性疾患を患っている被験体から単離されたニューロン、又は神経毒ベータ−アミロイドペプチドに曝露されたニューロン細胞株に対するその特性を更にアッセイすることを考慮して、ポジティブ選択された候補化合物は更なる選択工程に供され得る。例えば、上記スクリーニング方法を用いてポジティブ選択された候補化合物は、アルツハイマー病を有する患者のニューロン又は神経毒ベータ−アミロイドペプチドに曝露されたニューロン細胞株由来の樹状突起スパインの減少を阻害する能力について更に選択され得る。典型的には、スクリーニング方法は、ｉ）アルツハイマー病を有する患者由来のニューロン又は神経毒ベータ−アミロイドペプチドに曝露されたニューロン細胞株を、ポジティブ選択された候補化合物と接触させる工程、ｉｉ）前記ニューロンの樹状突起スパインの密度を決定する工程、及びｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定された密度を、ポジティブ選択された候補化合物の非存在下で工程ｉ）を実施した場合に決定された密度と比較する工程を更に含み得る。上記工程ｉ）は、一定量の試験すべき候補化合物をニューロンの培養培地に追加することによって実施され得る。通常、複数の培養サンプルを調製して、漸増量の試験すべき候補化合物を異なる培養サンプルに追加する。一般的に、更なる比較のためにネガティブコントロールとして、候補化合物を含まない少なくとも１つの培養サンプルも調製される。
【０１０８】
最後にアルツハイマー病の動物モデルに対するその特性を更にアッセイすることを考慮して、ポジティブに選択された候補化合物は更なる選択工程に供され得る（アルツハイマーの動物モデルの総説については、Sasaguri H. et al (2017) EMBO J.;36(17):2473-2487; or Gotz J et al (2008) Nature Reviews Neuroscience 9, 532-544; ort Laurijssens B. et al (2013) Drug Discovery Today: Technologies Volume 10, Issue 3,, Pages e319-e327を参照のこと）。典型的には、ポジティブ選択された候補化合物を動物モデルに投与し得、アルツハイマー病の進行を決定し、候補化合物を投与しなかった動物モデルにおけるアルツハイマー病の進行と比較する。
【０１０９】
本発明は、以下の図及び実施例によって更に例証される。しかしながら、これらの実施例及び図は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：強力なチューブリンチロシンカルボキシペプチダーゼとしてのバソヒビン／ＳＶＢＰ複合体の同定
材料及び方法：
動物。雄又は雌マウスを２〜４カ月齢で使用した。Institut des Neurosciences of Grenoble (GIN)のポリシー及びフランスの法律にしたがって、１９８６年１１月２４日の欧州共同体理事会指令（８６／６０９／ＥＥＣ）に準拠して実験を行った。動物に関わる調査は、Direction Departementale de la protection des populations-Prefecture de l’Isere-Franceによって、及びフランス調査省が認定したＧＩＮ番号００４の倫理委員会によって承認された。
【０１１１】
チロシン化チューブリン及び微小管並びにＥＢ１の調製。ｐＨ６．７の４０mM Ｐｉｐｅｓ、６０mM ＫＣｌ、２．５mM ＡＴＰ、１mM ＤＴＴ、１２．５mM ＭｇＣｌ２中で精製ニワトリＴＴＬ（１mg/mL、Steinmetzグループから寄贈）及び０．１mM Ｌ−チロシン又は［１４Ｃ］−Ｌ−チロシン（０．１２５μCi／ナノモル）と共に３０℃で４５分間インキュベーションすることによって、ウシ脳チューブリン（１２mg/mL、（３４）のように調製））をチロシン化した。ｐＨ６．７の１００mM ＰＩＰＥＳ、１mM ＥＧＴＡ、１mM ＭｇＣｌ２、３０％グリセロール、１mM ＧＴＰで１／３希釈し、３２℃で４５分間インキュベーションし、続いて、５０μM パクリタキセル(Calbiochem)と共に更に４５分間インキュベーションすることによって、微小管重合を可能にした。６０％グリセロールクッション上、１００，０００ｇ及び３０℃で２５分間遠心分離することによって、微小管を沈降させた。ＴＴＬ含有上清を廃棄し、チロシン化微小管をｐＨ６．７の１００mM ＰＩＰＥＳ、１mM ＥＧＴＡ、１mM ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、８０μM パクリタキセルに再懸濁し、−２０℃で保存した。非重合チロシン化チューブリンを得るために、手順全体を通じてパクリタキセルを省略した。（３４）のように、ＥＢ１を調製した。
【０１１２】
ＴＣＰ活性アッセイ。［１４Ｃ］−チロシン化タキソール安定化微小管を使用した放射能試験では、（凡例に示されているように）図２Ｄ及びＳ２Ｄを除いて、ｐＨ６．７の１００mM ＭＥＳ、１mM ＥＧＴＡ及び１mM ＭｇＣｌ２中、２μM 放射性標識チューブリンを使用して、酵素活性を測定した。反応を３７℃で４５分間実施し（阻害剤との事前のインキュベーションの有無にかかわらず。凡例を参照のこと）、２０μg/mlウシ血清アルブミン及び１０％過塩素酸の添加並びに遠心分離によって、氷上で停止させた。上清中の放射能を測定することによって、微小管から切断されたチロシンを推定した（ゼロ時間のコントロールを差し引いた）。図Ｓ１Ａの表を構成するために、等量の様々な画分からの脱チロシン化活性を測定した。阻害剤を用いた試験では、阻害剤と共に２０分間プレインキュベーションした後に脱チロシン化活性を試験し（凡例に示されているように、様々な時間のインキュベーションを使用した図Ｓ２Ｃ及びＳ２Ｄを除く）、阻害剤を用いた結果は、対応する溶媒を用いたコントロールの活性の割合として表した。ウエスタンブロットを使用した試験では、図に示されている時間で、ｐＨ６．７の１００mM ＭＥＳ、１mM ＥＧＴＡ及び１mM ＭｇＣｌ２中、５μM 基質（タキソール安定化微小管、チューブリン又はＥＢ１）を用いて、酵素活性をアッセイした。カルボキシペプチダーゼＡ（２ng/mL）を用いて、ポジティブコントロールを行った。Laemmliバッファーの添加によって、反応を停止させた。芳香族及び脂肪族Ｃ末端残基を効率的に切断するカルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）との反応をポジティブコントロールとして使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からコバルト樹脂で精製したＶＡＳＨ／ＳＶＢＰ複合体を使用した試験では、ウシ血清アルブミンの標準と一緒に精製ＶＡＳＨ１及びＶＡＳＨ２のゲル内クーマシーブルー染色から、酵素濃度を概算した。
【０１１３】
酵素濃縮。本発明者らは、以前の取り組み（２３、３５）から着想した脳溶解物からの３段階精製手順を設計した。全ての工程を４℃で行った。プロテアーゼ阻害剤カクテル(cOmplete EDTA-free, Roche)を含むｐＨ６．７の５０mMリン酸バッファー、１mM ＥＧＴＡ、１mM ＭｇＣｌ２、１μg/ml ＤＮＡｓｅ中で、成体マウス脳をホモジナイズし、１００，０００ｇで１時間遠心分離した。上清を収集した（画分Ｉ）。工程１（硫酸アンモニウム分画）では、画分Ｉを徐々に４５％硫酸アンモニウムにし、１５分間インキュベーションし、１５，０００ｇで２０分間遠心分離した。得られた上清は、６５％硫酸アンモニウムで同じ手順を受けた。ペレットを、５０mM ＭＥＳ  ｐＨ６．７、１mM ＥＧＴＡ、１mM ＭｇＣｌ２を含む初期容量の１／８に再懸濁し、同じバッファー（画分ＩＩ）で平衡化したBio-Gel P30 (Bio-Rad)を使用して脱塩した。工程２（強力な陰イオンカラム）では、画分ＩＩを、BioLogic DuoFlowクロマトグラフィーシステム(Biorad)に接続した5 mL Hitrap Q XLカラム(GE Healthcare)にロードし、未結合タンパク質を収集した（画分ＩＩＩ）。工程３（強力な陽イオンカラム）では、ｐＨ６．２及び０．１２M ＮａＣｌに調整した画分ＩＩＩを5mL Hitrap SP XLカラム(GE Heathcare)にロードした。０．１２M〜１M ＮａＣｌ勾配でタンパク質を溶出させた。（BioGelP-30で脱塩することによって）ｐＨ６．７の５０mM ＭＥＳ、１mM ＥＧＴＡ、１mM ＭｇＣｌ２でタンパク質画分を平衡化した。これらの画分に対してＴＣＰ活性アッセイを実施し、活性含有画分をプールした（画分ＩＶ）。典型的な実験の精製データは、図１Ａに示されている。迅速な酵素濃縮のために、脳ホモジネートを工程３に直接進め、次いで脱塩した。
【０１１４】
クリックケミストリー（Ｃｕ触媒アジド−アルキン環状付加、ＣｕＣＡＡＣ反応）。ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液で画分ＩＶを平衡化し、２mg/mlに濃縮した。１０μMのアルキン−ｅｐｏＹ又は１０μMのｅｐｏＹ（それぞれクリック可能阻害剤及びコントロール不可逆的阻害剤、図１Ｃ、Ｓ２Ｂの構造を参照のこと）と共に３７℃で１時間のインキュベーションした後、次いで、２当量のアジド−アガロースビーズ(Jena Biosciences)を添加し、１mM ＣｕＳＯ４、１００μM ＴＢＴＡ及び１mM ＴＣＥＰの添加によってクリック反応を開始させた。反応は、室温で３時間で完了した。蛍光標識については、アジドアガロースビーズに代えて、１００μM ５／６−ＴＡＭＲＡ−ＰＥＧ３−アジド(Jena Bioscience)を使用した。
【０１１５】
質量分析サンプルの調製。クリックケミストリーキャプチャーキットプロトコール(Jena Bioscience)にしたがって、非特異的結合タンパク質の除去及び分析すべきペプチドの調製を達成した。迅速に、アガロース結合タンパク質を還元し、アルキル化した。ビーズを１％ＳＤＳ及び８M尿素で洗浄した。オンビーズトリプシンタンパク質分解（シーケンシンググレード改変トリプシン、Promegaを使用）を実施し、放出されたペプチドをＣ１８カートリッジ(ウルトラマイクロスピンカラム、Harvard Apparatus)で精製した。
【０１１６】
質量分析ベースのプロテオミクス分析。（３６）に記載されている１２０分勾配を使用して、タンデム質量分析に接続したナノ液体クロマトグラフィー(LTQ-Orbitrap Velos Proに接続したUltimate 3000, Thermo Scientific)によって、ペプチドを分析した。Mascot（バージョン２．５．１）を使用したUniprot（２０１７年３月バージョン、Mus musculus分類法）、古典的汚染物質（自作）及び対応する逆データベースに対する同時検索によって、ペプチド及びタンパク質を同定した。Prolineソフトウェア(http://proline.profiproteomics.fr)を使用して、結果をフィルタリングしてから（ランク１ペプチドの保存、逆データベース戦略を用いることによるペプチドスコアの計算で＜１％のペプチド同定ＦＤＲ、及び同定されたタンパク質群当たり最低１個の特定のペプチド）コントロール及び陽性サンプルからのタンパク質群のコンパイル、グループ化及び比較を実施した。汚染物質データベースからのタンパク質及び更なるケラチンを、同定されたタンパク質の最終リストから破棄した。陽性サンプルの３つの複製において最低３つの特定のスペクトルカウントで同定されたタンパク質であって、コントロールサンプルに存在しないタンパク質のみを更に検討した。
【０１１７】
発現構築物。マウスバソヒビン−１（ＶＡＳＨ１）及びバソヒビン−２（ＶＡＳＨ２）ｃＤＮＡ（それぞれアクセッションナンバーＮＭ＿１７７３５４及びＮＭ＿１４４８７９）をＰＣＲ増幅し、自作のＣＡＧプロモーター含有ベクターに挿入した（これは、Ｎ末端にＦｌａｇタグを有し、Ｃ末端にスーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ（３７））及び６Ｈｉｓタグを有するタンパク質（Ｆｌａｇ−バソヒビン−ｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ）を生成する）。対応するコントロールプラスミドは、Ｆｌａｇ−ｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質をコードする。Ｃ末端Ｍｙｃタグを有するマウスＳＶＢＰ（アクセッションナンバーＮＭ＿０２４４６２）をコードするｃＤＮＡの前に脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ配列を含有するカセットをＦｌａｇ−バソヒビン−ｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ  ｃＤＮＡの下流に導入することによって、バソヒビン及びＳＶＢＰの両方の共役発現を可能にする二シストロン性プラスミドを得た（Ｆｌａｇ−バソヒビン−ｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ／ＳＶＢＰ−Ｍｙｃ）。ＰＣＲによって点突然変異を導入して、酵素失活バージョンのバソヒビンを生成した：それぞれアクセッションナンバーＮＰ＿７９６３２８及びＮＰ＿６５９１２８のナンバリングしたがって、ＶＡＳＨ１についてはＣ１７９Ａ及びＶＡＳＨ２についてはＣ１５８Ａ。Ｃ末端Ｍｙｃ及びＦｌａｇタグを有するマウスＳＶＢＰをコードするプラスミド（ＳＶＢＰ−Ｍｙｃ−Ｆｌａｇ）は、OriGeneから入手した。ＥＢ１−ＥＧＦＰを生成するために、マウスＥｂ１  ｃＤＮＡ（アクセッションナンバーＮＭ＿００７８９６）をＥＧＦＰタグ付きベクターに挿入した。E. coliにおけるタンパク質産生のためのＨｉｓ−ＥＢ１をコードするプラスミドは、（１５）に記載されていた。ヒトチューブリンα１Ｂ及びマウスチューブリンα８（それぞれアクセッションナンバーＮＭ＿００６０８２及びＮＭ＿０１７３７９）をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、Ｎ末端ｍＣｈｅｒｒｙタグを有するベクターに挿入した。ＰＣＲによって点突然変異をαチューブリンｃＤＮＡに導入して、最後の芳香族残基をアラニンで置換した：それぞれアクセッションナンバーＮＰ＿００６０７３及びＮＰ＿０５９０７５のナンバリングにしたがって、α１Ｂ−チューブリンについてはＹ４５１Ａ及びα８−チューブリンについてはＦ４４９Ａ。マウス特異的ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドは、OriGene製であった：Ｖａｓｈ１についてはＴＬ５１１８００Ｂ、Ｖａｓｈ２についてはＴＬ５０６７５１Ｃ、ＳｖｂｐについてはＴＬ５１７６０１Ｂ及びコントロールについてはＴＲ３００２１。ＤＮＡシーケンシングによって、全ての構築物を検証した。
【０１１８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのＨｉｓタグ付きバソヒビンの精製。ＧＦＰ又は活性／不活性型バソヒビン及びＳＶＢＰの発現を可能にするプラスミド（Ｆｌａｇ−ｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ又はＦｌａｇ−（失活）ＶＡＳＨ１／２−ｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ及びＳＶＢＰ−Ｍｙｃ−Ｆｌａｇ）をコトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(cOmplete EDTA-free, Roche)の存在下、ｐＨ８．０のトリスバッファー、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１mM ＭｇＣｌ２、２００mM ＮａＣｌ、５mMイミダゾールで溶解させた。遠心分離（１６．０００ｇ及び４℃で１０分間）後、上清を収集し、コバルト樹脂(Sigma)２０μLに添加し、４℃で３時間インキュベーションした。溶解バッファーで３回洗浄した後、２００mMイミダゾール、ｐＨ８．０のトリスバッファー、１mM ＭｇＣｌ２、２００mM ＮａＣｌを使用して、タンパク質を溶出させた。１００mM Ｐｉｐｅｓ、１mM ＥＧＴＡ及び１mM ＭｇＣｌ２中、４℃の透析によって精製タンパク質を平衡化し、放射能アッセイにおいて直接使用した。
【０１１９】
細胞培養及びトランスフェクション。以前に記載されているように（２）、海馬ニューロン及びＭＥＦを調製した。標準的な条件下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を維持した。JetPRIMEトランスフェクション試薬(Polyplus-Transfection)を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。Amaxa Nucleofectorキット(Lonza)を使用して、ＭＥＦ及びニューロンをトランスフェクションした。（ＶＡＳＨ１／２についてはＳＶＢＰとの、又はｍＣｈｅｒｒｙ−チューブリンについては、ＶＡＳＨ１／２及びＳＶＢＰの共役発現を可能にする二シストロン性プラスミドとの）ｃＤＮＡコトランスフェクションでは、１：１の比を一般的に使用した。
【０１２０】
ウエスタンブロッティング及び免疫蛍光。チロシン化チューブリン（ＹＬ１／２、Ｔｙｒ−ｔｕｂ）又はネイティブＥＢ１（Ｔｙｒ  ＥＢ１）及びＣ末端脱チロシン化チューブリン（ｄｅＴｙｒ−ｔｕｂ）又はＥＢ１（ｄｅＴｙｒ−ＥＢ１）に特異的な抗体を使用して、脱チロシン化活性を検出した。両種を認識する抗体を用いて、総チューブリン又はＥＢ１のコントロールを推定した（BD Transduction lab製の総α−ｔｕｂ又はα３Ａ１、総ＥＢ１）。これらの抗体は全て、（１５）において記載及び特性評価されている。他の一次抗体、抗Ｈｉｓ、抗Ｆｌａｇ、抗ＧＦＰ、抗ｔｕｒｂｏＧＦＰ、抗ｍＣｈｅｒｒｙ、抗タウ及び抗アンキリンは、それぞれQiagen、Molecular Probes、Chromotek、Invitrogen、Sigma、Millipore及びSanta-Cruz製であった。ウエスタンブロッティングでは、トランスフェクションの２４時間後に、細胞を収集した。３７℃のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）培地で洗浄した後、細胞をLaemmliバッファーで直接溶解させた。タンパク質抽出物を１０％アクリルアミドゲル(Mini-PROTEAN（登録商標）TGX Stain-Free（商標）, Invitrogen)にロードし、Trans-Blot（登録商標）Turbo (Bio Rad)で転写した。膜を、ＨＲＰとコンジュゲートされた一次及び二次抗体と共にインキュベーションし、最後に、Chemidocカメラ(Biorad)を用いて明らかにした。イムノブロットの分析及びグラフ表示（図４Ａ）のために、ImageJソフトウェア(National Institutes of Health, Bethesda, MD)を使用して、３回の異なる実験の３回反復のブロットからタンパク質バンドを定量した。無染色画像から推定したサンプルの総タンパク質含有量に対して、脱チロシン化α−チューブリンシグナルを正規化した。免疫蛍光では、一般的に、４％パラホルムアルデヒド、４．２％スクロース、リン酸緩衝生理食塩水培地（ＰＢＳ）で細胞を３７℃で固定し（２０℃におけるメタノール固定を使用したアンキリン染色を除く）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＢＳを使用して透過処理した。次いで、細胞を一次抗体と共にインキュベーションし、続いて、ａｌｅｘａ−４８８、シアニン−３又はシアニン−５フルオロフォアとコンジュゲートされた二次抗体（１：１０００）（以下を参照のこと）と共にインキュベーションした。Ｈｏｅｓｃｈｔ３３２５８（１μg/ml）を使用して、核を染色した。
【０１２１】
ＲＴ−ＰＣＲ増幅。Dynabeads精製キット(Invitrogen)を用いて、細胞及び組織由来のメッセンジャーＲＮＡを調製した。ＲＮＡ ５０ngを含む１２．５μLでSuperscript One step RT-PCRシステム(Invitrogen)を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。以下のプライマー：Ｖａｓｈ１については５’−ＴＡＣＡＡＡＣＣＧＣＣＣＧＣＣＴＴＣＣ（フォワード）及び５’−ＡＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＡ（リバース）（配列番号４及び５）、Ｖａｓｈ２については５’−ＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＴ（フォワード）及び５’−ＣＡＧＴＣＡＡＣＣＣＡＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣ（リバース）（配列番号６及び７）、Ｓｖｂｐについては５’−ＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＡ（フォワード）及び５’−ＧＣＡＣＣＡＧＴＴＣＣＴＣＴＧＣＣＧＧＧ（リバース）（配列番号８及び９）．を使用して、マウスのＶａｓｈ１、Ｖａｓｈ２及びＳｖｂｐからのそれぞれ６９７、７４８及び１５４ｂｐの産物を５８℃で４５サイクル増幅した。５’−ＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡ（フォワード）及び５’−ＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＣ（リバース）プライマー（配列番号１０及び１１）を用いて、ＧＡＰＤＨを６４℃で２５サイクル増幅した。
【０１２２】
形態学的ニューロン分析。固定して抗チューブリン抗体で染色した２ＤＩＶニューロンのモザイク画像を、電動式スタンドを備えるDMI6000Leica顕微鏡で２０倍Ｎ．Ａ０．５対物レンズを用いて取得した。ＤｏＧフィルタによる処理後、画像をセグメント化した。単一ニューロンの細胞体を手動で選択し、自作のAutoNeuriteJマクロによるニューロンの個別処理に使用した。簡潔に言えば、ニューロン画像をスケルトン処理し、“Analyze Skeleton 2D/3D ImageJプラグイン”（３８）を使用して解像した。“BinaryConnectivity” imageJプラグイン(G. Landiniによる開発、http://www.mecourse.com/landinig/software/software.html)を使用して、神経突起の末端をマーキングした。各神経突起の末端から細胞体までの画像を作成した。経路重複の神経突起の中で、最長のものを一次神経突起として定義した。重複神経突起の画像から一次神経突起の画像を差し引いて、二次神経突起及び分枝数を定義した。神経突起の長さを測定した。スケルトン処理のアーチファクトを回避するために、１２μm未満の長さを有する神経突起は検討しなかった。単一ニューロンの一次神経突起のうち、その長さが少なくとも４８μmであり、任意の他の一次神経突起よりも１．３倍長い場合には、軸索を定義した。このマクロを使用して、本発明者らは、各条件について最低２７個のニューロンを選択し、平均軸索長、平均一次神経突起数及び分枝頻度を比較した。
【０１２３】
子宮内エレクトロポレーション、組織処理、免疫組織化学及び分析。完全な説明は（３９）で入手可能である。簡潔に言えば、Ｅ１４．５において、麻酔した時限妊娠マウス由来の胚に、ｓｈＲＮＡの発現を可能にするプラスミドをエレクトロポレーションした（上記を参照のこと）。４日後（Ｅ１８．５）、胚脳を解剖し、固定し、凍結切片化し、分析のためのスライド上に置いた。抗ｔＧＦＰ一次抗体（１：３００）を４℃で一晩インキュベーションした。ＤＡＰＩ(Roche)で核を対比染色した。電動式スタンドを備えるDMI6000Leica顕微鏡で２０倍Ｎ．Ａ０．５対物レンズを用いて画像を取得し、Image Jを用いて分析した。トランスフェクション細胞が検出された皮質領域を等面積の６つのビンに分割し、ＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）ニューロンをカウントした（１条件当たり胚 ５つ、胚 １つ当たりスライド ３つ）。胚 １つ当たりＧＦＰ＋ニューロン 少なくとも２６０個をカウントした。
【０１２４】
結果：
ＴＣＰを濃縮するために、基質としてタキソール安定化放射性標識チロシン化微小管を使用して活性を追跡する３段階精製手順を設計した。典型的な手順では、ほぼ４００倍の最終精製係数が得られた（図１Ａ）。最後の画分（ＩＶ）は、微小管に組み込まれたチューブリンからＣ末端チロシンを切断することができたが、ＥＢ１からは切断することができなかった。ＥＢ１は、α−チューブリンと類似のＣ末端配列（−ＧＥＥＹに代えてＱＥＥＹ）を共有するタンパク質であり、一般的に、生理学的状況ではＴＣＰの基質ではない（１５）。
【０１２５】
ＴＣＰ活性に関与するタンパク質を画分ＩＶから単離するために、他の化学プロテオミクス研究（１６）のように不可逆的阻害剤を使用し得ると推論した。最初に、様々な市販のプロテアーゼ阻害剤に対する脳ＴＣＰの感度を試験した。活性は、いくつかのセリン／システインプロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、Ｅ−６４、パルテノライド）によって、及びチオール反応性化合物Ｎ−エチルマレイミドによって阻害された（図１Ｂ）。これらの結果は、過去の研究（１７）と一致して、推定ＴＣＰの触媒活性が触媒システインに依存することを強く示唆していた。
【０１２６】
Ｅ−６４は中程度の阻害活性のみを示したが（約３００μMのＩＣ５０、図１Ｂ）、その反応性エポキシド求電子試薬は、ネイティブプロテインＣ末端を模倣するペプチド又はアミノ酸をディスプレイし得るので、この天然産物は阻害剤設計の理想的な出発点である。更に、細胞における脱チロシン化レベルをダウンレギュレーションするために広く使用されている化合物であるパルテノライド（４、６、９、１０）は、その細胞効果に必須であることが示されたエポキシド機能を含有する（１７）。α−チューブリンＣ末端からの１つ、２つ又は３つのアミノ酸にカップリングされたエポキシドを含有する３つの阻害剤ｅｐｏＹ、ｅｐｏＥＹ及びｅｐｏＥＥＹをこのようにして合成した。ＥｐｏＹは、ＴＣＰ活性の最も強力な阻害剤であることが見出された（約５００nMのＩＣ５０、図１Ｂ）。したがって、アフィニティタグに対するクリックケミストリーを使用した標識ターゲットの精製に使用され得るｅｐｏＹの類似体（アルキン−ｅｐｏＹ）を合成した。アルキン−ｅｐｏＹは強力な阻害効力を保持し（図１Ｂ）、強化された酵素活性を不可逆的に阻害した。アルキン−ｅｐｏＹ（又はコントロールｅｐｏＹ）による画分ＩＶのプローブ標識と、それに続くクリック反応によるアジドＴＡＭＲＡ赤色蛍光色素の付着を実施した（図１Ｄ）。標識により、約５０kDaの少数のタンパク質の特異的改変が示された（図１Ｅ）。これらの阻害剤ターゲットを同定するために、アルキン−ｅｐｏＹ又はｅｐｏＹ（コントロールとして）のいずれかで画分ＩＶを前処理し、標識タンパク質を単離し、タンパク質をビーズに共有結合させ、質量分析によって分析した（図１Ｄ）。３回の独立した実験からの結果により、最も可能性の高いＴＣＰ候補としてタンパク質バソヒビン−１（ＶＡＳＨ１）が同定された（表２）。アルキン−ｅｐｏＹ処理サンプルにおいてのみ、ほとんど完全なＶＡＳＨ１配列をカバーするペプチドが検出された。最近のバイオインフォマティクスデータは、バソヒビン−１及びそのホモログバソヒビン−２（ＶＡＳＨ２）が非標準Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ触媒三残基を有し、トランスグルタミナーゼ様システインプロテアーゼファミリーのこれまでに未発見のメンバーであることを示している（１８）（図１Ｆ）。
【表２】
2021500371.tif 000003
【０１２７】
バソヒビンタンパク質（４１〜４２kDa）は、血管新生レギュレーターとして広く特性評価されているが、分子レベルではまだ十分に理解されていない（１９）。最近の研究では、シャペロン様機能を有するバソヒビンの高親和性結合パートナーとしてＳＶＢＰ（Ｃｃｄｃ２３）が同定された（２０）。その結果として、ＳＶＢＰの非存在下又は存在下で細胞におけるα−チューブリンを脱チロシン化するＶＡＳＨタンパク質の能力を調べた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるバソヒビンのみの発現は、脱チロシン化チューブリンのわずかな増加をもたらしたのに対して、ＳＶＢＰとのいずれかのタンパク質の発現は、内因性チロシン化チューブリンのほぼ完全な喪失に対応する脱チロシン化チューブリンの大幅な増加をもたらした。重要なことに、バソヒビン上の推定触媒システインの突然変異（ＶＡＳＨ１についてはＣ１７９Ａ及びＶＡＳＨ２についてはＣ１５８Ａ（１８））は、脱チロシン化チューブリンを生成するそれらの能力を無効化した。同様に、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）では、ＳＶＢＰとのバソヒビンの発現は、内因性α−チューブリンの完全な脱チロシン化をもたらした（図２Ａ）。
【０１２８】
一般的に、アルファ−チューブリンは、２つのグルタミン酸が前にあるＣ末端チロシンを伴ってコードされる。しかしながら、アルファ４−チューブリンはＣ末端チロシンを欠き、α８−チューブリンはＣ末端フェニルアラニン残基を含有する。また、チューブリンでは、チロシンに代えてフェニルアラニンが組み込まれ得、神経機能障害の原因である可能性があり得る（２１）。したがって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＶＡＳＨ１又はＶＡＳＨ２及びＳＶＢＰと一緒にα１Ｂ−及びα８−チューブリンを過剰発現させることによるバソヒビンの基質特異性を試験した。ＳＶＢＰと共に発現させた場合、両チューブリンアイソタイプは、活性バソヒビンによって切断された（図２Ｂ、２Ｂ）。しかしながら、チロシンをアラニンに突然変異させた場合、バソヒビンはＣ末端残基を切断することができず（図２Ｂ、２Ｂ）、これは、Ｃ末端チロシン及びフェニルアラニン残基に対するＶＡＳＨタンパク質の特異性を裏付けている。
【０１２９】
バソヒビンの触媒機能及びＳＶＢＰとのそれらの相互作用の性質を更に確認するために、ＳＶＢＰの非存在下又は存在下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてそれらを過剰発現させ、コバルト樹脂を使用して、得られた複合体を精製した。以前のアフィニティ測定から予想されるように、ＳＶＢＰは両バソヒビンと共精製され（３０〜９０nMのＫＤ（２０））、複合体形成は触媒活性に非依存的であった（図６Ａ）。重要なことに、２つのタンパク質複合体はチューブリン脱チロシン化を効率的に触媒したが、触媒失活バージョンのバソヒビンを含有する複合体はチューブリンを脱チロシン化することができなかった（図２Ｃ）。脳ＴＣＰの報告されている特異性（１、２２、２３）と一致して、両複合体は、チューブリンダイマーと比較して迅速に微小管を切断した（図２Ｄ、６Ｂ）。精製ＶＡＳＨ１／ＳＶＢＰ複合体はＥＢ１からＣ末端チロシンを切断することができなかったが、これは、その明確なチューブリン選好性を示しているのに対して、興味深いことに、ＶＡＳＨ２／ＳＶＢＰ複合体は、同じ条件でＥＢ１を部分的に脱チロシン化することができた（図２Ｅ）。ニューロン由来を含むほとんどの細胞型では、Ｃ末端チロシン切断はチューブリンに限定されることが示された（１、１５）。しかしながら、特定の内皮細胞及び腫瘍細胞では、ＥＢ１は脱チロシン化され得（２４）、これは、それらのＶＡＳＨ２含有量又は調節機構の欠陥に関連し得る。
【０１３０】
バソヒビンの機能的意義及びαチューブリン脱チロシン化におけるそれらの役割を確認するために、本発明者らは、脱／チロシン化サイクルが成長円錐経路探索及び軸索分化（すなわち、ニューロン分極）に非常に重要である（２、７、８）分化ニューロンにおいてこれらのタンパク質の発現をノックダウンすることの表現型効果を評価した。市販の抗体を使用してウエスタンブロットによって、マウスニューロンにおいてバソヒビン及びＳＶＢＰを検出することは不可能であったが、培養海馬ニューロン並びに成体及び胚性マウス脳組織のＲＮＡ調製物からそれらの転写産物を増幅した（図３Ａ）。バソヒビン又はＳＶＢＰのいずれかをターゲティングするショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）並びにコントロールｓｈＲＮＡを発現するプラスミドを海馬ニューロンにトランスフェクションした（図５Ａ）。ウエスタンブロット分析により、２つのバソヒビン又はＳＶＰＢのいずれかをダウンレギュレーションすると、脱チロシン化α−チューブリンのレベルがほぼ５０％減少したことが示されたが、これは、神経微小管の脱チロシン化におけるそれらの重大な役割を実証している（図３Ｂ）。ノックダウンにおける脱チロシン化α−チューブリンの残存プールは、α４−チューブリン（これは、Ｃ末端チロシンを遺伝的に欠き、脳において依然として脱チロシン化形態である）の存在に起因する可能性がある（２５）。in vitroで２日間培養（２ＤＩＶ）したニューロンの共焦点画像により、バソヒビンの発現が減少すると、ネイティブ脱チロシン化α−チューブリンのレベルが減少することが確認された。残存脱チロシン化プールは軸索に特異的に集中するが、神経突起におけるα−チューブリンは高度にチロシン化されているように思われる。形態学的分析では、２ＤＩＶ及び３ＤＩＶの両方における（軸索を有する）ステージＩＩＩ細胞の割合の減少によって示されているように、バソヒビンダウンレギュレーションは、軸索分化の明らかな遅延につながることが示された（図３Ｃ）。軸索を有するニューロンのタウ及びアンキリン染色により、正規分布が確認され、３ＤＩＶの軸索シャフトではタウが高発現され、１０ＤＩＶの軸索初期セグメントではアンキリンが高発現されていた。興味深いことに、バソヒビンをノックダウンした２ＤＩＶニューロンは、軸索の長さが全体的に減少した多数の神経突起及び分枝を発達させる（図３Ｄ）。ＳＶＢＰをダウンレギュレーションすると、軸索分化の遅延及び同様の形態異常が観察された（図５Ｂ〜Ｃ）。したがって、逆酵素ＴＴＬの非存在下で観察された未成熟軸索分化（２）とは逆に、バソヒビン又はＳＶＢＰをダウンレギュレーションすると、軸索分化の明確な遅延が観察された。
【０１３１】
次に、脱／チロシン化サイクルが新皮質層組織に重要である大脳皮質に焦点を当てることによって、in vivoにおけるマウス脳のバソヒビンの機能的重要性を試験した（２）。皮質形成の間、ニューロン移動は、本発明者らがバソヒビン及びＳＶＢＰに強く依存することを示したニューロン分極に部分的に依拠する（図３Ｃ）。バソヒビンをターゲティングするｓｈＲＮＡ及びコントロールｓｈＲＮＡを発現するプラスミドをＥ１４．５胚にエレクトロポレーションし、４日後、放射状ニューロン移動を分析した。培養ニューロンにおける脱チロシン化α−チューブリンプールの約５０％を抑制した検証済みｓｈＲＮＡを使用した。Ｅ１８．５では、コントロール脳由来のほとんどのニューロンは上層（ビン１）に到達したのに対して、バソヒビンの非存在下では、かなりの割合のニューロンが到達することができなかった（図４Ａ〜Ｂ）。したがって、これらの酵素は、大脳皮質発達中のニューロン移動において重要な役割を有する。
【０１３２】
全体的に、これらの結果は、ニューロン及び脳におけるバソヒビン及びそれらの関連パートナーＳＶＢＰの重要な役割を示しており、それらがチューブリンカルボキシペプチダーゼであることを更に裏付けている。
【０１３３】
ＴＣＰは、４０年間にわたってα−チューブリン脱／チロシン化サイクルの重要な不明要素であり続けた。バソヒビンは、ＴＣＰ機能を実行する酵素タンパク質として同定され（図７）、それらの相互作用パートナーＳＢＶＰはそれらの活性に必須である。本発明者らは、神経分化及び大脳皮質発達におけるバソヒビン及びＳＶＢＰの重要な関与を明らかにし、バソヒビンの更なる機能研究に使用し得るこの酵素ファミリーをターゲティングする新たな阻害剤を説明する。ＴＣＰを同定するための過去の試みの失敗はほとんどがおそらく、標準的な精製アッセイ中に失われる可能性があり得る安定性及び活性に関するバソヒビンとＳＶＢＰとの本質的な関連に起因していた。ＴＣＰ機能と一致して、バソヒビンは真核生物において広く分布し、幅広い組織発現を有し、バソヒビン−１（一般的に、これはバソヒビン−２よりも多く発現される）は、脳、心臓及び腎臓において豊富である（１８、２６、２７）（https://www.gtexportal.org/home/のGTEx Portalも参照のこと）。理解困難なＴＣＰ活性の同定は、分子レベルで、α−チューブリン脱チロシン化と細胞微小管安定性との間の関係の理解を提供するはずである（２８、２９）。
【０１３４】
興味深いことに、脱チロシンを通じて微小管安定性をレギュレーションする酵素について予想されるように、バソヒビンは細胞及び組織完全性に重要であることが示され、これらのタンパク質の欠損はガンに関連していた（３０）。全体的に、ＴＣＰの発見は、脱／チロシン化のサイクルの機能、並びに健康及び疾患に対するその影響を解明するための有益な情報を提供する。
【０１３５】
実施例２：健常患者及びＡＤ患者由来のヒト脳における脱チロシン化状態
１  論理的根拠。
アルツハイマー病患者及びコントロール患者の脳のイムノブロッティングによって、チロシン化、脱チロシン化及びΔ２−チューブリン（別の形態の脱チロシン化チューブリン）の量を分析した。病理学の異なるＢｒａａｋ段階でそれらを分析し、健常脳の対応するコントロールサンプルと比較した。各サンプルについて、脳領域 ４つ（内嗅皮質、海馬、側頭及び前頭皮質）を分析した。
【０１３６】
２  材料及び方法
組織。ヒト組織サンプルは、５２〜９３歳の男性及び女性患者 ２９人のパネルからの脳領域 ４つ（内嗅皮質、海馬、側頭皮質、外側前頭前皮質）からなる。コントロール １１個、Ｂｒａａｋ段階Ｉ〜ＩＩ ５個、Ｂｒａａｋ段階ＩＩＩ〜ＩＶ ６個及びＢｒａａｋ段階ＩＶ〜Ｖ ７個（詳細については、添付１を参照のこと）。
【０１３７】
抽出物の調製。Minilys装置で即時使用Precellys溶解キット(Bertin Technologies)を使用して、完全阻害剤カクテル(Roche)を含有する（１０ｖｏｌ／ｗ）１０mMトリス、０．３２Mスクロース、ｐＨ＝７．４中、ヒト脳サンプルを室温で２×３０秒間ホモジナイズした。溶解後、ホモジネートを収集し、液体窒素で凍結し、次いで、使用まで−８０℃で保存した（ホモジネート脳ストックと称される）。必要な場合には、凍結アリコートをＲＩＰＡバッファー（５０mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ＝８）でv/v希釈し、４℃で３０分間撹拌し、次いで、１２０００rpm、４℃で１０分間遠心分離した。上清を液体窒素で凍結し、使用まで−８０℃で保存した。
【０１３８】
抗体。ポリクローナル抗脱チロシン化（抗ｄｅＴｙｒ）及び抗Δ２チューブリン抗体は自作のものであった(Bosson et al., 2012; Paturle-Lafanechere et al., 1994)。
【０１３９】
イムノブロット。
患者 ２９人の領域 ４つのサンプルは、分析すべきサンプル １１６個になる。各サンプルを３回反復で分析した。ＲＩＰＡ上清（凍結サンプルの１／４希釈物 １０μl）を無染色４％−１５％ゲル(Bio Rad)の電気泳動に供し、次いで、Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio Rad)を使用してニトロセルロース膜に迅速に転写した。脱チロシン化及びΔ２チューブリンに対する特異的抗体を１／２００００で使用して、ブロットを明らかにした。ポリクローナルα３Ａ１抗体を１／１００００希釈で使用して、総α−チューブリンを検出した。適切なペルオキシダーゼ標識二次抗体を１／２００００で使用した。Pierce ECLウエスタンブロッティング基質(Thermo scientific)を使用してブロットを明らかにし、定量のためにImage Labソフトウェアを使用してChemiDoc（商標）MPイメージングシステム(Bio Rad)を用いて分析した。
【０１４０】
３  結果
結果は図８に示されている。
【０１４１】
これらの結果は、コントロール脳と比較して、アルツハイマー脳の全ての領域における脱チロシン化及びΔ２チューブリン形態の進行性蓄積を明らかに示している（脳領域の効果なし）。
【０１４２】
実施例３：微小管の脱チロシン化に対するＶＡＳＨ１、ＶＡＳＨ２及びＳＶＢＰのin vivo機能
材料及び方法：
生化学分析のための脳組織の調製：
Precellys装置ホモジナイザー（２×２０秒間、５０００rpm）を使用して、１５０mg/mLのプロテアーゼ(P8340, Sigma)及びホスファターゼ阻害剤カクテル(P5726 and P0044, Sigma)を補充した溶解バッファー（ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、14190-094 Life Technologies）中で、海馬をホモジナイズした。次いで、溶解物を２１，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。得られた上清を収集し、ビシンコニン酸アッセイ(Pierce/Thermo Fisher Scientific)を使用してタンパク質濃度を決定した。サンプルを分析まで−８０℃で保存した。
【０１４３】
Wes（商標）及びPeggy Sue（商標）Simple Westernによる脳サンプルのキャピラリーウエスタンブロッティング
ＳＶＢＰ、ＶＡＳＨ１及びＶＡＳＨ２  ＫＯ野生型、ヘテロ接合性及びホモ接合性マウス由来の海馬の溶解物において、自動Simple Western system (Protein Simple)を使用して、チロシン化、脱チロシン化、デルタ２チューブリン、総α−チューブリン及びチューブリンチロシンリガーゼレベルを評価した。ユーザーマニュアルにしたがって、表１に記載されている一次抗体以外は製造業者の試薬を用いて、全ての手順を実施した。サンプルをタンパク質濃度 ０．１２５μg/μLでロードし、一次抗体と共に６０分間インキュベーションし、二次抗マウス又は抗ウサギＩｇＧと共に３０分間インキュベーションした。Compassソフトウェア(Protein Simple)を用いて、データを分析した。ＧＡＰＤＨレベルに対して、タンパク質レベルを正規化した。
【表３】
2021500371.tif 000004
【０１４４】
心室からのタンパク質抽出及びウエスタンブロット：
プロテアーゼ(Roche; 04906837001)及びホスファターゼ阻害剤(Roche; 11836153001)の存在下で、タンパク質抽出バッファー（Cellsignaling; 9803S)中、ウエスタンブロット用FastPrepホモジナイザーを用いて、Precellysチューブ(KT03961-1-007.2)中で、心室由来のタンパク質（約５０mg）をホモジナイズした。１２％ビストリスＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Bio-Rad; 3450119)で等量のタンパク質（３０μg）を分離し、TransBlotシステム(Bio-Rad;170-4159)を用いてニトロセルロース膜に転写した。ＧＡＰＤＨ（１／１００００、Millipore; MAB374）、α−チューブリン（１／５０００、Sigma; T6199-200μgL）、チロシン化チューブリン（１／１０００、Abcam; ab6160）、脱チロシン化チューブリン（１／１０００、Abcam; ab48389）、デルタ２−チューブリン（１／１０００、Abcam; ab106658）に対する一次抗体、続いて、赤外線色素コンジュゲート二次抗体（１／１０００〜１／１００００、Li-Cor）を用いて、タンパク質を検出した。Odysseyスキャナーを使用してデンシトメトリー分析によってタンパク質の定量を達成し、Ｇａｐｄｈレベルに対して正規化した。
【０１４５】
マウス。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって、マウスにおいてＳＶＢＰ、ＶＡＳＨ１及びＶＡＳＨ２ノックアウトを生成した（ＶＡＳＨ１  ＫＯの生成については、Teixera et al 2018を参照のこと）。ＳＶＢＰについてはエクソン２中の配列をターゲティングし、ＶＡＳＨ１についてはエクソン１中の配列をターゲティングし、ＶＡＳＨ２についてはエクソン２中の配列をターゲティングした。マイクロインジェクション胚の再移植後に誕生したＦ０モザイク動物を、ＰＣＲ／サンガーシーケンシングによって遺伝子型決定し、次いで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配して、少なくともＦ４／Ｆ５マウスを得た。
【０１４６】
結果：
微小管の脱チロシン化に対するバソヒビン１、バソヒビン２及びＳＶＢＰの機能をin vivoで確認するために、本発明者らは、バソヒビン１、バソヒビン２又はＳＶＢＰタンパク質のいずれかに関するノックダウントランスジェニックマウス（野生型、ヘテロ接合性及びホモ接合性）におけるチロシン化チューブリン、脱チロシン化チューブリン、デルタ２チューブリン、総α−チューブリン及びチューブリンチロシンリガーゼレベルを測定したGrenoble Institute for Neuroscienceにおいてで作成されたマウス由来の脳（海馬）及び心臓（心室）に対して、この研究を実施した。
【０１４７】
ＶＡＳＨ１  ＫＯホモ接合性マウス由来の脳サンプルでは、脱チロシン化チューブリン及びデルタ２チューブリンのレベルは減少したのに対して（図９Ｃ、Ｄ）チロシン化チューブリンのものは増加した（図９Ｂ）。ＳＶＢＰ  ＫＯホモ接合性マウスでは、より強力である以外は同じ効果が観察された（図１０Ｂ、Ｃ、Ｄ）。反対に、ＶＡＳＨ２  ＫＯホモ接合性マウスでは、効果は観察されなかった（図１１Ｂ、Ｃ、Ｄ）。
【０１４８】
心室サンプルでは、ＶＡＳＨ１  ＫＯホモ接合性マウス（図１２Ｃ、Ｄ）及びＳＶＢＰ  ＫＯホモ接合性マウス（図１３Ｃ、Ｄ）については、脱チロシン化チューブリン及びデルタ２チューブリンのレベルが減少したのに対して、ＶＡＳＨ１  ＫＯホモ接合性マウスについては、チロシン化チューブリンのものが増加した（図１２Ｂ）。脳サンプルに関しては、ＶＡＳＨ２  ＫＯホモ接合性マウス由来の心室サンプルでは、効果が見られなかった（図１４Ｂ、Ｃ、Ｄ）。
【０１４９】
予想通り、ＶＡＳＨ１及びＳＶＢＰ  ＫＯホモ接合性マウスでは、脱チロシン化チューブリンレベルは減少したのに対して、脳サンプル又は心室のいずれかでは、チロシン化チューブリンレベルは増加した。ＶＡＳＨ１  ＫＯホモ接合性マウスでは、脱チロシン化チューブリンの減少はＶＡＳＨ１の欠如によるものであるのに対して、ＳＶＢＰ  ＫＯホモ接合性マウスでは、ＶＡＳＨ１及びＶＡＳＨ２のシャペロンの役割を果たしてこれら２つのタンパク質を安定化するＳＶＢＰの欠如により、ＶＡＳＨ１はもはや活性ではない。ＶＡＳＨ２  ＫＯホモ接合性マウスでは、脳におけるＶＡＳＨ２の発現レベルがＶＡＳＨ１のものよりも低いという事実におそらく起因して、統計的差異はなかった。出生以来落ち着いていた代償効果及び／又は脱チロシン化を行うために十分な残存タンパク質の活性レベルにおそらく起因して、ＫＯヘテロ接合性マウスでは、タンパク質にかかわらず、統計的差異は観察されなかった。
【０１５０】
脱チロシン化チューブリンレベルの減少は、ＶＡＳＨ１及びＳＶＢＰの生理学的機能を裏付けているが、より重要なことに、微小管ダイナミクス及び機能に重要なチロシン化チューブリンの同時増加は、微小管機能が変化する神経変性疾患を処置するためのＴＣＰ阻害剤に有利である。
【０１５１】
実施例４：ＡＤの細胞モデルにおけるチロシン化チューブリンのレベルと樹状突起スパイン密度（認知マーカー）との間の関係
１  論理的根拠。
本発明者らの仮説は、脱チロシン化微小管の蓄積がシナプス可塑性に有害であり、ＡＤの初期段階に特徴的な樹状突起スパイン及びシナプス喪失に寄与し得る微小管ダイナミクスの喪失につながり得るというものである。
【０１５２】
脊椎の形状（スタビィ型、シン型、マッシュルーム型）及び数は、シナプス有効性及び認知能力と強く相関する。Ａβオリゴマーへの海馬ニューロンの曝露（慢性曝露）は、樹状突起スパイン密度の強力な減少を誘導することが公知である(Hsieh et al., 2006)。
【０１５３】
本発明者らの仮説を試験するために、本発明者らは、Ａβオリゴマーの存在下又は非存在下で、ＷＴ、ＶＡＳＨ１、ＶＡＳＨ２及びＳＶＢＰノックアウト成熟海馬ニューロンにおける樹状突起スパインの密度及び形態を分析した。
【０１５４】
野生型（ＷＴ）、ＶＡＳＨ１及びＳＶＢＰ欠損マウス（ヘテロ接合体及びＫＯ動物）由来の成熟ニューロンにおいて、様々な形態のチューブリン（チロシン化、脱チロシン化、Δ２−チューブリン）の量を分析した。
【０１５５】
２  実験戦略。
マウス。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって、マウスにおいてＳＶＢＰ、ＶＡＳＨ１及びＶＡＳＨ２ノックアウトを生成した（ＶＡＳＨ１  ＫＯの生成については、Teixera et al 2018を参照のこと）。ＳＶＢＰについてはエクソン２中の配列をターゲティングし、Ｖａｓｈ１についてはエクソン１中の配列をターゲティングし、Ｖａｓｈ２についてはエクソン２中の配列をターゲティングした。マイクロインジェクション胚の再移植後に誕生したＦ０モザイク動物を、ＰＣＲ／サンガーシーケンシングによって遺伝子型決定し、次いで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配して、少なくともＦ４／Ｆ５マウスを得た。
【０１５６】
ニューロン。ＷＴ、ＳＶＢＰ−、ＶＡＳＨ１−及びＶＡＳＨ２−ＫＯ  Ｅ１７胚から海馬又は皮質ニューロンを解剖し、以前に記載されているように培養した(Erck et al 2005)。
【０１５７】
樹状突起スパインの分析。ＧＦＰレンチウイルス（ＭＯＩ  １００）を少数の海馬ニューロン（１％）に感染させ、非感染細胞と混合し、ポリリジンコーティングディッシュ上に高密度（細胞 ５０．０００個/cm2）でプレーティングした。次いで、Ｂ２７を含有するＭＡＣｓ培地中で、ニューロンを３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。in vitroで１５日後（１５ＤＩＶ）、ニューロンを（(Frandemiche et al.)に記載されているように調製した）１００nM Ａβオリゴマーと共に、又はＤＭＳＯ（コントロール）と共にインキュベーションした。１７ＤＩＶにおいて、ニューロンを固定し、抗ＧＦＰ抗体で染色した。樹状突起スパインはＧＦＰ標識樹状突起であると同定された。２００nmのＺ間隔で共焦点顕微鏡によって連続画像を取得し、NeuronStudioを使用して樹状突起スパインの密度及び形態の分析を実施した。
【０１５８】
神経タンパク質抽出物。１７ＤＩＶにおいて、皮質ニューロン由来の抽出物を収集した。３７℃のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）培地で洗浄した後、細胞をLaemmliバッファーで直接溶解させた。サンプルを分析まで−２０℃で保存した。
【０１５９】
イムノブロット。各ニューロン抽出物を３回反復で分析した。ＰＶＤＦ膜を用い、以下のように抗体を使用したことを除いて、ヒトサンプルのようにニューロン抽出物（ｎ＝胚 ３つ）を分析した：ＧＡＰＤＨ抗体（Sigma、１／５０００）、ＹＬ１／２（１／１００００）、抗ｄｅＴｙｒ（１／１００００）、抗Δ２（１／１００００）及びペルオキシダーゼ標識二次抗体（１／１００００）。
【０１６０】
結果。
結果は図１５及び１６に示されている。
【０１６１】
データは、ＳＶＢＰ及びＶＡＳＨ１ノックアウト細胞の両方において、チロシン化チューブリンの増加並びに脱チロシン化及びΔ２−チューブリンの減少を明らかに示している。ヘテロ接合体由来のニューロンは、野生型ニューロンと有意差がなかった。
【０１６２】
毒性Ａβへの野生型ニューロンの曝露は、スパイン密度、特に成熟型（マッシュルーム型）の大幅な減少（３０％）を誘導する。ＳＶＢＰ又はＶＡＳＨ１又はＶＡＳＨ２を欠失させた場合、ニューロンのスパイン密度及びマッシュルーム型含有量はＡβ曝露に対して感受性ではないが、これは、脱チロシン化の減少（チロシン化チューブリンレベルの増加）がＡβ毒性から保護されることを実証している。
【０１６３】
実施例５：再生プロセスにおけるＶＡＳＨ／ＳＶＢＰ複合体の関与
１−論理的根拠：
後根神経節（ＤＲＧ）に位置する細胞体を有するニューロンは偽単極性であり、２つの軸索（傷害時に再生することができる末梢軸索、及び中枢神経系に入る中枢軸索であって、傷害後に再生することができない中枢軸索）に分枝する単一の軸索を有する。末梢軸索の傷害は、中枢枝における再生プロセス（分子、細胞）にもつながることが示されているが、これは、対応する末梢軸索も傷害される場合には、これらのＤＲＧニューロンの中枢軸索が再生することができることを意味する(Richardson and Verge, 1987)。この効果は、コンディショニング病変効果又はプレコンディショニングと称される。病変のコンディショニングは、ニューロンにおける固有の再生能力の増強を誘導し、神経突起成長の増強につながる(Smith and Skene, 1997)。
【０１６４】
本発明者らは、プレコンディショニングプロトコール後に、ＷＴ又はＳＶＢＰ  ＫＯのいずれかのＤＲＧニューロンの成長能力をアッセイした。
【０１６５】
２−材料及び方法
左坐骨神経を３０秒間鉗子破砕することによって、成体（２月齢）ＷＴ及びＳＶＢＰ  ＫＯ成体マウスを外科的にコンディショニングした（プレコンディショニング条件）。３日後、次いで、坐骨神経を形成するものに対応するＤＲＧのニューロンを培養し、対側ＤＲＧニューロン（コントロール条件）と比較した。
【０１６６】
培養手順は、血液を除去するために、Dolethal（登録商標）過剰投与下における各遺伝子型のマウスの４℃ＰＢＳ心内灌流からなる。Ｌ４−Ｌ５−Ｌ６  ＤＲＧを解剖し、次いで、化学的（コラゲナーゼＡ及びトリプシン）及び機械的に分離してから、（Ｌ−グルタミン、Ｂ２７及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充した）Neurobasal-A培養培地と共にポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコーティングカバースリップ上に置いた。１６時間の培養後、ニューロンを固定した。全体的なニューロン形態を視覚化するために、総α−チューブリンの免疫標識を実施する。自作の自動ImageJマクロ(Aillaud et al., 2017)によって、神経突起サイズの定量を行った。
【０１６７】
３−結果
結果は図１７に示されている。
【０１６８】
本発明者らのデータは、ＳＶＢＰ欠失による脱チロシン化の減少（及びチロシン化チューブリンレベルの増加）がＤＲＧニューロンの再生能力を促進することを示している。
【０１６９】
実施例６：α−チューブリンＣ末端ペプチドを用いたＥＬＩＳＡ法を使用したＴＣＰ阻害剤の分析
１  論理的根拠。
ＴＣＰ又はＶＡＳＨ／ＳＶＢＰ複合体は、微小管上のαチューブリンのＣ末端チロシン又はチューブリンの遊離ダイマーを切断する酵素である(Aillaud et al., 2017)。本発明者らは、αチューブリンのＣ末端配列に対応するペプチドを脱チロシン化するそれらの能力、及びこの活性に対するいくつかの潜在的な阻害剤の効果を試験した。このようなアッセイは、大規模な薬物セットのスクリーニングに適合させ得る。
【０１７０】
２  材料及び方法。
ＶＡＳＨ／ＳＶＢＰ複合体の脱チロシン化活性を検出及び定量するために、プレートベースのアッセイ技術を設計した。簡潔に言えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中５０μg/mlのニュートラアビジンでコーティングした９６ウェルImmulon 4HBXプレート上で、アッセイを実施した。ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎでリンスした後、ビオチニル−Ｖ−１５−Ｙペプチド（ビオチニル−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）をＰＢＳ中１０−８Mでプレート上にコーティングし、続いて、ＰＢＳ中Ｔｗｅｅｎ０．０５％でリンスした。次いで、様々な濃度のＤＭＳＯ又は阻害剤と共に０℃で２時間プレインキュベーションしたＶＡＳＨ１／ＳＶＢＰ酵素（０．２μM）を３０分間の反応でペプチドに添加した。ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回リンスすることによって、反応を停止させた。次いで、一次抗体として抗チロシン化チューブリン（ＹＬ１／２、１／２０００）、二次抗体として抗ラットＨＲＰ（１／５０００）を使用し、ＥＬＩＳＡ用ＨＲＰ基質としてＴＭＢ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて、PHERAstarシステム(BMG Labtech)によって、免疫検出を実施した。
【０１７１】
Ni‐NTAカラム(HiTrap 5ml)
【０１７２】
E Coliにおいて、Ｃ末端に６ヒスチジンタグを有するＳＶＢＰと共にＶＡＳＨ１を共発現させた。Ni‐NTAカラムで複合体を精製し、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。
【０１７３】
３  結果
結果は図１８に示されている。
【０１７４】
データは、ビオチニル−Ｖ−１５−ＹペプチドがＶＡＳＨ／ＳＶＢＰ酵素複合体の基質であるので、活性阻害剤のスクリーニングに使用可能であることを明らかに示している。
【０１７５】
実施例７：ＴＣＰ阻害剤の活性を研究するための無細胞アッセイ
RapidFire（登録商標）／質量分析（ＭＳ）によるチューブリンカルボキシペプチダーゼ（ＴＣＰ）又はチューブリンチロシンリガーゼ（ＴＴＬ）の研究は、他の既存のアッセイフォーマットに対して多数の利点を提供する。第１に、システムは、放射性基質を使用する場合に必要とされるコスト及び特別な取扱手順を回避する。第２に、RapidFire（登録商標）／ＭＳベースのアッセイは、データの解釈を複雑化し得る二次反応又は共役反応を伴わない。第３に、ＭＳによってペプチド種を直接測定するので、データのアーチファクトを引き起こし得る蛍光タグが必要ない。
【０１７６】
２つのペプチドを使用して、酵素活性をモニタリングした。第１のものは、ＴＴＬ酵素の基質又はＴＣＰの反応の生成物に相当する：ビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ。第２のペプチドは、ＴＴＬとの反応の生成物又はＴＣＰの基質に相当する。ビオチニル−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｙ（チロシン（Ｙ）はビオチン化ペプチドの末端に位置する）。
【０１７７】
ＴＣＰ又はＴＴＬのいずれかの酵素を化合物と共に室温で１５分間プレインキュベーションする。次いで、ペプチド基質を添加する。反応容量 ５０μl（５％ＤＭＳＯ中ＭＥＳ ５０mM；ＫＣｌ １００mM；ＭｇＣｌ２ ２５mM；ＤＴＴ ０．００１M；ＡＴＰ ０．０００３M及びＬ−チロシン ０．００１M）で、最終濃度 ５５nMのＴＣＰ又はＴＴＬに対して、ペプチドを様々な濃度（１０〜１００μM）、室温で３０分間インキュベーションした。３０分後、ＴＦＡを最終濃度 １％まで添加することによって、反応を停止させた。最終容量は約１００μlであった。
【０１７８】
上記条件を使用して、RapidFire（登録商標）／ＭＳによって、反応生成物を分析した
RapidFire（登録商標）365(Agilent Technology)ハイスループットシステム（ＲＦ）を、エレクトロスプレー負イオンモードで操作されるＧ−６４６０トリプル四重極質量分析計(Agilent)に接続した。タイプＣカートリッジをサンプルの捕捉及び溶出に使用した。RapidFire（登録商標）法は、ＭＳ検出に直接結合した固相抽出（ＳＰＥ）サンプルクリーンアップ工程を用いる。
【０１７９】
サンプルを６００ミリ秒間吸引し、続いて、４０００ミリ秒間ロードし、流速 １．５mL/分で９８％ｄｄＨ２Ｏ＋２％ＡＣＮ＋ＴＦＡ０．０１％の移動相Ａで洗浄した。４０μLサンプルの固定ループをカートリッジにロードした。次いで、流速 １．２５mL/分で８０％ＣＡＮ＋２０％ｄｄＨ２Ｏ＋ＴＦＡ  ０．０１％の移動相Ｂで５０００ミリ秒間溶出させ、続いて、０．７mL/分で移動相Ａでカートリッジを５００ミリ秒間再平衡化した。
【０１８０】
ＭＳパラメータ：ガス温度：２００；乾燥ガス：９；ネブライザー：４０；シースガス温度：４００；シースガスフロー：１２；ＶＣａｐ：３５００；ノズル電圧：３００；デルタＥＭＶ：４００
【０１８１】
チューブリンペプチド基質及び反応生成物のＭＲＭ遷移は、それぞれｍ／ｚ８５８．３→６６９．５、ｍ／ｚ９３９．８→７１９．８であった。各遷移の滞留時間は４ミリ秒であった。ピーク面積を積分し、基質及び反応生成物検量線を使用して、曲線下面積を残存基質及び形成された生成物の量に変換する（図１９を参照のこと）。
【０１８２】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術水準を説明する。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に援用される。
【表４】
2021500371.tif 000005
2021500371.tif 000006
2021500371.tif 000007
2021500371.tif 000008
【図１Ａ】
2021500371.tif 000009
【図１Ｂ】
2021500371.tif 000010
【図１Ｃ】
2021500371.tif 000011
【図１Ｄ】
2021500371.tif 000012
【図１Ｅ】
2021500371.tif 000013
【図１Ｆ】
2021500371.tif 000014
【図２Ａ】
2021500371.tif 000015
【図２Ｂ】
2021500371.tif 000016
【図２Ｃ】
2021500371.tif 000017
【図２Ｄ】
2021500371.tif 000018
【図２Ｅ】
2021500371.tif 000019
【図３Ａ】
2021500371.tif 000020
【図３Ｂ】
2021500371.tif 000021
【図３Ｃ】
2021500371.tif 000022
【図３Ｄ】
2021500371.tif 000023
【図４Ａ】
2021500371.tif 000024
【図４Ｂ】
2021500371.tif 000025
【図５Ａ】
2021500371.tif 000026
【図５Ｂ】
2021500371.tif 000027
【図５Ｃ】
2021500371.tif 000028
【図６Ａ】
2021500371.tif 000029
【図６Ｂ】
2021500371.tif 000030
【図６Ｃ】
2021500371.tif 000031
【図６Ｄ】
2021500371.tif 000032
【図７】
2021500371.tif 000033
【図８】
2021500371.tif 000034
【図９】
2021500371.tif 000035
【図１０】
2021500371.tif 000036
【図１１】
2021500371.tif 000037
【図１２】
2021500371.tif 000038
【図１３】
2021500371.tif 000039
【図１４】
2021500371.tif 000040
【図１５】
2021500371.tif 000041
【図１６】
2021500371.tif 000042
【図１７】
2021500371.tif 000043
【図１８】
2021500371.tif 000044
【図１９】
2021500371.tif 000045
【配列表】
2021500371000001.app
【国際調査報告】
2021500371.tif 000046
2021500371.tif 000047
2021500371.tif 000048
2021500371.tif 000049
2021500371.tif 000050
2021500371.tif 000051