(57)【要約】  本明細書の開示は、いくつかの態様において、より少ない分化状態を維持するT細胞の培養及び改変に関する方法及び組成物を提供する。T細胞はノッチシグナル伝達を誘導する条件で培養される。得られたT細胞は長期間にわたって低分化状態の維持を示し、疲弊に対する感受性が低下する。また、本方法により生産された細胞、並びに関連する組成物及び養子療法のための使用方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでナイーブT（TN）細胞を培養する方法であって、ナイーブT（TN）細胞を、細胞内にノッチ受容体シグナルを誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストを含む培地に曝す工程を含む、方法。
【請求項２】
インビトロでナイーブT（TN）細胞を培養する方法であって、ナイーブT（TN）細胞の集団を、細胞内にノッチ受容体シグナルを誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストを含む培地に曝す工程を含む、方法。
【請求項３】
前記TN細胞の集団が、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は約100%のTN細胞を含む、請求項2の方法。
【請求項４】
前記TN細胞の集団が、約40%〜約90%、約50%〜約90%、約60%〜約90%、約70%〜約90%、約80%〜約90%、約40%〜約80%、約50%〜約80%、約60%〜約80%、約70%〜約80%、約40%〜約70%、約50%〜約70%、約60%〜約70%、約40%〜約60%、約50%〜約60%、又は約40%〜約50%のTN細胞を含む、請求項2の方法。
【請求項５】
前記T細胞が、CD62L+、CD45RA+、CD45RO-、CD95-、及び/又はCCR7+としてさらに特徴付けられる、請求項1〜4のいずれか1項の方法。
【請求項６】
前記曝す工程が、少なくとも約12時間、少なくとも約1日、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約1週間、少なくとも約8日、少なくとも約9日、少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、少なくとも約15日、少なくとも約16日、少なくとも約17日、少なくとも約18日、少なくとも約19日、少なくとも約20日、少なくとも約21日、少なくとも約22日、少なくとも約23日、少なくとも約24日、少なくとも約25日、少なくとも約26日、少なくとも約27日、少なくとも約28日、少なくとも約29日、少なくとも約30日、又は少なくとも約1ヶ月の期間（「曝露時間」）続く、請求項2〜5のいずれか1項の方法。
【請求項７】
前記曝露時間が1日から15日の間、又は2日から10日の間である、請求項6の方法。
【請求項８】
前記曝す工程後、前記集団中のTN細胞の割合が変化しない、請求項2〜7のいずれか1項の方法。
【請求項９】
前記集団中のTN細胞の割合が、前記曝す工程後に、約1%未満、約2%未満、約5%未満、約10%未満、約15%未満、約20%未満、約25%未満、約30%未満、約35%未満、約40%未満、約45%未満、又は約50%未満で変化する、請求項2〜7のいずれか1項の方法。
【請求項１０】
前記集団中のTN細胞の割合が、(i)曝す工程前に少なくとも約40%及び曝す工程後に少なくとも約40％、(ii)曝す工程前に少なくとも約50%及び曝す工程後に少なくとも約40％、(iii)曝す工程前に少なくとも約50%及び曝す工程後に少なくとも約50％、(iv)曝す工程前に少なくとも約50%及び曝す工程後に少なくとも約60％、(v)曝す工程前に少なくとも約60%及び曝す工程後に少なくとも約50％、(vi)曝す工程前に少なくとも約60%及び曝す工程後に少なくとも約60％、(vii)曝す工程前に少なくとも約60%及び曝す工程後に少なくとも約70％、(viii)曝す工程前に少なくとも約70%及び曝す工程後に少なくとも約60％、(ix)曝す工程前に少なくとも約70%及び曝す工程後に少なくとも約70％、(x)曝す工程前に少なくとも約70%及び曝す工程後に少なくとも約80％、(xi)曝す工程前に少なくとも約80%及び曝す工程後に少なくとも約70％、(xii)曝す工程前に少なくとも約80%及び曝す工程後に少なくとも約80％、(xiii)曝す工程前に少なくとも約80%及び曝す工程後に少なくとも約90％、(xiv)曝す工程前に少なくとも約90%及び曝す工程後に少なくとも約80％、(xv)曝す工程前に少なくとも約90%及び曝す工程後に少なくとも約90％、又は(xvi)曝す工程前に少なくとも約90%及び曝す工程後に少なくとも約100％である、請求項2〜9のいずれか1項の方法。
【請求項１１】
前記TN細胞、前記TN細胞の集団、又はその1つ以上の子孫細胞が、ノッチ受容体アゴニストを受けなかったTN細胞と比較して、インビボで少なくとも1.2倍、少なくとも1.3倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.7倍、少なくとも1.8倍、少なくとも1.9倍、少なくとも2.0倍、少なくとも2.2倍、少なくとも2.3倍、少なくとも2.4倍、少なくとも2.5倍、少なくとも2.6倍、少なくとも2.7倍、少なくとも2.8倍、少なくとも2.9倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4.0倍、少なくとも4.5倍、少なくとも5.0倍、少なくとも5.5倍、少なくとも6.0倍、少なくとも6.5倍、又は少なくとも7.0倍少ない分化状態を維持する、請求項1〜10のいずれか1項の方法。
【請求項１２】
前記ノッチ受容体アゴニストが、哺乳類のノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、又はノッチ4受容体に結合する哺乳類のノッチ受容体リガンドのドメインを含む、請求項1〜11のいずれか1項の方法。
【請求項１３】
前記ノッチ受容体アゴニストが、哺乳類のノッチ受容体に結合するデルタ蛋白質、Jagged蛋白質、抗ノッチ抗体、又はそれらの断片もしくは誘導体、又はそれらの組み合わせである、又は含む、請求項1〜12のいずれか1項の方法。
【請求項１４】
前記ノッチ受容体アゴニストが、ノッチ受容体に結合すると、ノッチ受容体の構造変化を誘発できる、請求項1〜13のいずれか1項の方法。
【請求項１５】
前記ノッチ受容体アゴニストが、ノッチ受容体に結合すると、ノッチ受容体のネガティブ制御領域（NRR）のS2切断部位を露出させることができる、請求項1〜14のいずれか1項の方法。
【請求項１６】
前記ノッチ受容体アゴニストが、デルタ蛋白質又はJagged蛋白質の細胞外ドメインを含む、請求項13〜15のいずれか1項の方法。
【請求項１７】
前記ノッチ受容体アゴニストが、デルタ様リガンド1（DLL1）、デルタ様リガンド3（DLL3）、デルタ様リガンド4（DLL4）、Jagged1、Jagged2、Dlk1、Dlk2、DNER、EGFL 7、F3/コンタクチン、それらの断片、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせである、又は含む、請求項13の方法。
【請求項１８】
前記ノッチ受容体アゴニストが、DLL1、DLL3、及び/又はDLL4である、又は含む、請求項17の方法。
【請求項１９】
前記ノッチ受容体アゴニストが、Jagged1及び/又はJagged2である、又は含む、請求項17の方法。
【請求項２０】
前記ノッチ受容体アゴニストが、抗ノッチ抗体又はその抗原結合断片である、又は含む、請求項13の方法。
【請求項２１】
前記抗ノッチ抗体又はその抗原結合断片が、ノッチ受容体のネガティブ制御領域（NRR）内にはないノッチ細胞外ドメイン（NECD）内のエピトープに結合する、請求項20の方法。
【請求項２２】
前記抗ノッチ抗体がノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、及び/又はノッチ4に結合する、請求項20の方法。
【請求項２３】
前記ノッチ受容体アゴニストが、約0.01μg/ml〜約100μg/mlの濃度で存在する、請求項1〜22のいずれか1項の方法。
【請求項２４】
前記ノッチ受容体アゴニストが、表面又はスキャフォールドに固定化されている、請求項1〜23のいずれか1項の方法。
【請求項２５】
前記TN細胞又はTN細胞の集団が、固定化されたノッチ受容体アゴニストの実質的に全てと接触するのに十分な濃度の培地に曝される、請求項23の方法。
【請求項２６】
前記培地が、TN細胞の分化を調節する1つ以上のサイトカイン、又はその生物学的活性断片をさらに含む、請求項1〜25のいずれか1項の方法。
【請求項２７】
前記1つ以上のサイトカインが、IL-1、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-γ、TNF-α、TGFβ、又はそれらの任意の組み合わせを有効濃度で含む、請求項26の方法。
【請求項２８】
前記TN細胞又はTN細胞の集団が、培地に曝される前に1つ以上のソース対象から得られる、請求項1〜27のいずれか1項の方法。
【請求項２９】
前記曝す工程後に、TN細胞、TN細胞の集団、又はその1つ以上の子孫細胞を培地から単離する工程をさらに含む、請求項1〜28のいずれか1項の方法。
【請求項３０】
前記曝す工程後のTN細胞又はその1つ以上の子孫細胞の集団の少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約99%が、CD62L+及びCD45RO-の特性を有するT細胞である、請求項29の方法。
【請求項３１】
前記TN細胞、前記TN細胞の集団、又はその1つ以上の子孫細胞に、免疫受容体をコードする配列を含む異種核酸分子をトランスダクションする工程をさらに含む、請求項1〜30のいずれか1項の方法。
【請求項３２】
前記免疫受容体が、目的の抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含む抗原受容体であり、前記細胞外ドメインが、細胞外ドメインの目的の抗原への結合時にT細胞を活性化する細胞内ドメインに作動的に連結している、請求項31の方法。
【請求項３３】
前記免疫受容体が、主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合した目的のペプチドに特異的に結合するT細胞受容体（TCR）である、請求項31の方法。
【請求項３４】
前記TN細胞、前記TN細胞の集団、又はその1つ以上の子孫細胞を、それを必要とする対象に投与する工程をさらに含む、請求項29〜33のいずれか1項の方法。
【請求項３５】
異種免疫受容体を発現するTN細胞を生成するインビトロの方法であって、
請求項1〜30のいずれか1項の方法を実行する工程、及び
前記曝す工程の間に、免疫受容体をコードする配列を有する異種核酸分子を前記TN細胞にトランスダクションする工程、
を含む、方法。
【請求項３６】
前記免疫受容体が、目的の抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインが、細胞外ドメインの目的の抗原への結合時にT細胞を活性化する細胞内ドメインに作動的に連結している、請求項35の方法。
【請求項３７】
前記免疫受容体が、主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合した目的のペプチドに特異的に結合するT細胞受容体（TCR）である、請求項35の方法。
【請求項３８】
前記T細胞、又はその1つ以上の子孫T細胞を、それを必要とする対象に投与する工程をさらに含む、請求項35〜37の1項の方法。
【請求項３９】
養子細胞療法の方法であって、請求項1〜30及び32〜37のいずれか1項の方法によって生産された治療上有効な数の細胞を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４０】
前記対象が、がん、感染症、及び自己免疫疾患から選択される状態を有する、請求項39の方法。
【請求項４１】
請求項1〜33及び35〜37のいずれか1つの方法によって生産される、T細胞。
【請求項４２】
請求項41に記載の複数の細胞、及び有効なキャリアを含む、治療用組成物。
【請求項４３】
前記TN細胞又はTN細胞の集団が、キメラ抗原受容体を発現している、請求項1〜40のいずれか1項の方法。
【請求項４４】
キメラ抗原受容体を発現するTN細胞又はキメラ抗原受容体を発現するTN細胞の集団の疲弊を低減又は防止する方法であって、前記TN細胞又はTN細胞の集団を、細胞内にノッチ受容体シグナル伝達を誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストを含む培地に曝す工程を含む、方法。
【請求項４５】
キメラ抗原受容体を発現するTN細胞又はTN細胞の集団を生成する方法であって、ノッチ受容体アゴニストを含む培地で、キメラ抗原受容体を発現するようにTN細胞又はTN細胞の集団を改変する工程を含み、ここで、前記ノッチ受容体アゴニストはTN細胞の疲弊を低減又は防止する、方法。
【請求項４６】
前記ノッチ受容体アゴニストが抗ノッチ抗体である、請求項1〜40及び43〜49のいずれか1項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は2018年8月28日に出願された米国仮出願第62/723936号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関するステイトメント
本願に関連する配列表は紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は70118_Seq_final_20190827.txtである。このテキストファイルは152KBで、2019年8月27日に作成され、明細書の提出とともにEFS-Webで提出されている。
【０００３】
政府のライセンス権に関するステイトメント
本発明は、米国国立衛生研究所が授与したCA136551に基づく政府支援によってなされたものである。政府は本発明について一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００４】
養子T細胞療法とは、T細胞を対象に投与して、特定の標的に対する対象の免疫機能を向上させる手法である。T細胞は任意の個人から採取できるが、多くの手法では、対象から最初の自己細胞を採取し、エクスビボでT細胞の集団をエクスパンドし、エクスパンドした集団を同じ対象に投与する。新たなアプローチは、同種異系細胞を出発ドナー材料として使用することである。これは、対象の細胞が遺伝子工学に適した出発材料ではない、又はその他の点で根本的な欠陥がある適応症にとって非常に重要である。ソースにかかわらず、エクスビボでの培養中にT細胞を操作することで、その有効性をさらに高めることができる。従って、単なる細胞数の増加に加えて、T細胞を特定の所望の特性（例えば、抗原反応性又は多機能性）に合わせて選択又は改変できる。例えば、T細胞は、目的の抗原を特異的に認識する免疫受容体をコードする異種遺伝子を発現するように遺伝的に改変できる。CAR T細胞では、T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）を表面に発現するように遺伝的に改変される。CARは、典型的には、目的の抗原に対する親和性を高めた細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは、抗原結合時にT細胞を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインと結合している。このようなCAR T細胞は、インビボで標的抗原に結合すると、CAR T細胞がさらにエクスパンド及び活性化され、標的に対して直接的な細胞傷害作用を発揮するとともに、サイトカインの生産を通じて内因性免疫機能に影響を与えることができる一種の「生きた薬」となるため、病原体やがん細胞と闘うための強力なツールとなる。
【０００５】
養子T細胞療法は、理論的には汎用性が高く、がん、感染症、及び自己免疫疾患など様々な状態に特異的に適用できるが、この治療法での持続的な臨床反応の達成は、投与後の対象の腫瘍微小環境での増殖、パーシスタンス、及び疲弊への抵抗性をもたらす移植T細胞の質に依存するという認識が高まっている。エクスビボ及びインビボでの安定なT細胞の増殖、その後のインビボでのパーシスタンス、インビボでのT細胞応答の持続、及びインビボでのT細胞の毒性を決定する因子は、エクスビボで増殖されるT細胞の出発集団、及び患者に注入される最終製品の両方において定義することが困難であった。この困難性は、特に、リンパ腫やミエローマのような悪性腫瘍や免疫系の過剰増殖性障害を持つ患者において、ソースから単離されたT細胞の表現型の構成にばらつきがあることが一因となっている。
【０００６】
従って、養子T細胞療法の技術が進歩したにもかかわらず、投与後の対象において治療効果、活性、及びパーシスタンスが向上した安定なT細胞を一貫して提供する方法及び組成物に対するニーズが残っている。本明細書の開示は、このニーズ及び関連するニーズに対応するものである。
【発明の概要】
【０００７】
この概要では、以下の詳細な説明に記載されている概念の一部を簡略化して紹介する。この概要は、請求される主題の主要な特徴を特定することを意図しておらず、また、請求される主題の範囲を決定する際の補助として使用することを意図していない。
【０００８】
一態様では、本明細書はインビトロでT細胞を培養する方法を提供する。方法は、T細胞を、細胞内にノッチ（Notch）受容体シグナル伝達を誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストを含む培地に曝す工程を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、T細胞は、抗原提示細胞（APC）の存在下で培養されない。いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、培地中の細胞上で発現していない。いくつかの実施形態では、T細胞は、ノッチ受容体アゴニストを発現している抗原提示細胞（APC）の存在下で培養されていない。例えば、いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、培地中のAPC上で発現していない。いくつかの実施形態では、T細胞は、デルタ様リガンド4（DLL4）を発現する抗原提示細胞（APC）の存在下で培養されない。
【００１０】
いくつかの実施形態では、T細胞は、ナイーブT細胞（TN）、メモリー幹T細胞（TSCM）、又はセントラルメモリーT細胞（TCM）である。一実施形態では、T細胞は、ナイーブT細胞（TN）である。いくつかの実施形態では、T細胞は、エフェクターメモリーT細胞（TEM）である。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD62L+としてさらに特徴付けられる。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD45RA+としてさらに特徴付けられる。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD45ROとしてさらに特徴付けられる。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD95としてさらに特徴付けられる。いくつかの実施形態では、T細胞は、CCR7+としてさらに特徴付けられる。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD62L+、CD45RA+、及びCD45ROとしてさらに特徴付けられる。
【００１１】
別の態様では、本明細書は、インビトロでT細胞を培養する方法であって、細胞の集団を、細胞内にノッチ受容体シグナル伝達を誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストを含む培地に曝す工程を含む方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、T細胞集団は、抗原提示細胞（APC）の存在下で培養されない。いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、培地中の細胞上で発現していない。いくつかの実施形態では、T細胞集団は、ノッチ受容体アゴニストを発現する抗原提示細胞（APC）の存在下で培養されない。例えば、いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、培地中のAPC上で発現していない。いくつかの実施形態では、T細胞集団は、デルタ様リガンド4（DLL4）を発現する抗原提示細胞（APC）の存在下で培養されない。
【００１３】
一実施形態では、方法は、ナイーブT（TN）細胞をインビトロで培養する方法であって、ナイーブT（TN）細胞の集団を、細胞内にノッチ受容体シグナル伝達を誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストを含む培地に曝す工程を含む。いくつかの実施形態では、TN細胞の集団は、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は約100％のTN細胞を含む。いくつかの実施形態では、集団は、約40%〜約90%、約50%〜約90%、約60%〜約90%、約70%〜約90%、約80%〜約90%、約40%〜約80%、約50%〜約80%、約60%〜約80%、約70%〜約80%、約40%〜約70%、約50%〜約70%、約60%〜約70%、約40%〜約60%、約50%〜約60%、又は約40%〜約50%のTN細胞を含む。いくつかの実施形態では、TN細胞は、CD62L+、CD45RA+、CD45RO-、CD95-、及び/又はCCR7+としてさらに特徴付けられる。いくつかの実施形態では、曝す工程は、少なくとも約12時間、少なくとも約1日、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約1週間、少なくとも約8日、少なくとも約9日、少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、少なくとも約15日、少なくとも約16日、少なくとも約17日、少なくとも約18日、少なくとも約19日、少なくとも約20日、少なくとも約21日、少なくとも約22日、少なくとも約23日、少なくとも約24日、少なくとも約25日、少なくとも約26日、少なくとも約27日、少なくとも約28日、少なくとも約29日、少なくとも約30日、又は少なくとも約1ヶ月の期間（「曝露時間」）続く。いくつかの実施形態では、曝露時間は、1日から15日の間、又は2日から10日の間である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、集団におけるTN細胞の割合は、曝す工程後に変化しない。いくつかの実施形態では、集団中のTN細胞の割合は、曝す工程後に、約1%未満、約2%未満、約5%未満、約10%未満、約15%未満、約20%未満、約25%未満、約30%未満、約35%未満、約40%未満、約45%未満、又は約50%未満で変化する。いくつかの実施形態では、集団中のTN細胞の割合は、(i)曝す工程前に少なくとも約40％、及び曝す工程後に少なくとも約40％、(ii)曝す工程前に少なくとも約50％、及び曝す工程後に少なくとも約40％、(iii)曝す工程前に少なくとも約50％、及び曝す工程後に少なくとも約50％、(iv)曝す工程前に少なくとも約50％、及び曝す工程後に少なくとも約60％、(v)曝す工程前に少なくとも約60％、及び曝す工程後に少なくとも約50％、(vi)曝す工程前に少なくとも約60％、及び曝す工程後に少なくとも約60％、(vii)曝す工程前に少なくとも約60％、及び曝す工程後に少なくとも約70％、(viii)曝す工程前に少なくとも約70％、及び曝す工程後に少なくとも約60％、(ix)曝す工程前に少なくとも約70％、及び曝す工程後に少なくとも約70％、(x)曝す工程前に少なくとも約70％、及び曝す工程後に少なくとも約80％、(xi)曝す工程前に少なくとも約80％、及び曝す工程後に少なくとも約70％、(xii)曝す工程前に少なくとも約80％、曝す工程後に少なくとも約80％、(xiii)曝す工程前に少なくとも約80％、及び曝す工程後に少なくとも約90％、(xiv)曝す工程前に少なくとも約90％、及び曝す工程後に少なくとも約80％、(xv)曝す工程前に少なくとも約90％、及び曝す工程後に少なくとも約90％、又は(xvi)曝す工程前に少なくとも約90％、及び曝す工程後に約100％である。いくつかの実施形態では、TN細胞、TN細胞の集団、又はその1つ以上の子孫細胞が、ノッチ受容体アゴニストを受けなかったTN細胞と比較して、インビボで少なくとも1.2倍、少なくとも1.3倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.7倍、少なくとも1.8倍、少なくとも1.9倍、少なくとも2.0倍、少なくとも2.2倍、少なくとも2.3倍、少なくとも2.4倍、少なくとも2.5倍、少なくとも2.6倍、少なくとも2.7倍、少なくとも2.8倍、少なくとも2.9倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4.0倍、少なくとも4.5倍、少なくとも5.0倍、少なくとも5.5倍、少なくとも6.0倍、少なくとも6.5倍、又は少なくとも7.0倍少ない分化状態を維持する。
【００１５】
上記側面のいくつかの実施形態において、ノッチ受容体アゴニストは、哺乳類のノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、又はノッチ4受容体に結合する哺乳類のノッチ受容体リガンドのドメインを含む。いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、哺乳類のノッチ受容体に結合するデルタ蛋白質、Jagged蛋白質、抗ノッチ抗体、又はそれらの断片もしくは誘導体、又はそれらの組み合わせである、又は含む。いくつかの実施形態では、ノッチ受容体に結合すると、ノッチ受容体のネガティブ制御領域（NRR）のS2切断部位を露出させることができる。いくつかの実施形態では、ノッチ受容体に結合すると、ノッチ受容体のネガティブ制御領域（NRR）のS2切断部位を露出させることができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、デルタ蛋白質又はJagged蛋白質の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、デルタ蛋白質は、デルタ様リガンド1（DLL1）、又はその細胞外ノッチ結合ドメインである、又は含む。いくつかの実施形態では、デルタ蛋白質は、デルタ様リガンド3（DLL3、又はその細胞外ノッチ結合ドメイン）である、又は含む。いくつかの実施形態では、デルタ蛋白質は、デルタ様リガンド4（DLL4）、又はその細胞外ノッチ結合ドメインである、又は含む。いくつかの実施形態では、Jagged蛋白質は、Jagged1、又はその細胞外ノッチ結合ドメインである、又は含む。いくつかの実施形態では、Jagged蛋白質は、Jagged2、又はその細胞外ノッチ結合ドメインである、又は含む。いくつかの実施形態では、ノッチアゴニストは、Dlk1、Dlk2、DNER、EGFL 7、もしくはF3/コンタクチン、又はそれらのノッチ結合誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、ノッチ受容体のネガティブ制御領域（NRR）内にはないノッチ細胞外ドメイン（NECD）内のエピトープに結合する抗ノッチ抗体又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、抗ノッチ抗体（又はその抗原結合断片もしくは誘導体）は、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、及び/又はノッチ4受容体のネガティブ制御領域（NRR）内にはないノッチ細胞外ドメイン（NECD）内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、約0.01μg/ml〜約100μg/mlの濃度で固定化されている。いくつかの実施形態では、複数のT細胞は、固定化されたノッチ受容体アゴニストの実質的に全てと接触するのに十分な濃度で培地に曝される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、培地は、T細胞の分化を調節する1つ以上のサイトカイン、又はその生物学的活性断片をさらに含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のサイトカインは、IL-1、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-γ、TNF-α、TGFβ、又はそれらの任意の組み合わせを、有効濃度で含む。いくつかの実施形態では、T細胞の培地への曝露時間は、約1日〜約15日の間である。いくつかの実施形態では、曝露時間は、約2日〜約10日の間である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、複数のT細胞が培地に曝される。さらなる実施形態では、複数のT細胞は、培地に曝す前に1つ以上のソース対象から得られる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、方法は、曝す工程後のT細胞、又はその1つ以上の子孫T細胞を培地から分離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、T細胞（例えば、TN細胞）の集団が曝露されたとき、曝す工程後のT細胞（例えば、TN細胞）又はその1つ以上の子孫細胞の集団の少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％が、CD62L+及びCD45ROの特性を有するT細胞である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、方法は、T細胞（又はT細胞）、又はその1つ以上の子孫T細胞を、それを必要とする対象に投与する工程をさらに含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、方法は、免疫受容体をコードする配列を含む異種核酸分子で細胞（又はT細胞、例えば、TN細胞）を形質転換する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、目的の抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含む抗原受容体であり、ここで、細胞外ドメインは、細胞外ドメインと目的の抗原との結合時にT細胞を活性化する細胞内ドメインに作動的に連結している。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合した目的のペプチドに特異的に結合するT細胞受容体（TCR）である。
【００２２】
別の態様では、本明細書は、異種免疫受容体を発現するT細胞を生成するインビトロの方法を提供する。方法は、本明細書に記載の培養方法を実行する工程、及び、曝す工程の間に、免疫受容体をコードする配列を有する異種核酸分子をT細胞にトランスダクションする工程を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、T細胞は、ナイーブT細胞（TN）である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、免疫受容体は、目的の抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含み、ここで、細胞外ドメインは、細胞外ドメインと目的の抗原との結合時にT細胞を活性化する細胞内ドメインと作動的に連結している。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合した目的のペプチドに特異的に結合するT細胞受容体（TCR）である。一部の実施形態では、方法は、T細胞、又はその1つ以上の子孫T細胞を、それを必要とする対象に投与する工程をさらに含む。
【００２５】
別の態様では、本明細書は、養子細胞療法の方法を提供する。方法は、本明細書に記載されたT細胞又はT細胞集団を培養するインビトロの方法によって生産された治療上有効な数の細胞を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される、ナイーブT細胞（TN）、又はその集団を培養するインビトロの方法によって生産される。いくつかの実施形態では、対象は、がん、感染症、及び自己免疫疾患から選択される状態を有する。
【００２６】
本明細書に記載の任意の方法論的側面に関して、いくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞の集団は、キメラ抗原受容体を発現する。いくつかのさらなる実施形態では、T細胞は、ナイーブT細胞（TN）であるか、又はT細胞の集団は、記載されているようにTNを含む。
【００２７】
別の態様では、本明細書は、本明細書に記載された方法のいずれか1つによって生産された細胞の集団細胞を提供する。
【００２８】
別の態様では、本明細書は、本明細書に記載の複数の細胞と、有効なキャリアとを含む治療用組成物を提供する。
【００２９】
別の態様では、本明細書は、キメラ抗原受容体を発現するTN細胞又はキメラ抗原受容体を発現するTN細胞の集団の疲弊を低減又は防止する方法を提供する。この方法は、TN細胞又はTN細胞の集団を、細胞内にノッチ受容体シグナル伝達を誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストを含む培地に曝す工程を含む。
【００３０】
別の態様では、本明細書は、キメラ抗原受容体を発現するTN細胞又はキメラ抗原受容体を発現するTN細胞の集団を生成する方法を提供する。この方法は、ノッチ受容体アゴニストを含む培地で、キメラ抗原受容体を発現するようにTN細胞又はTN細胞の集団を改変する工程を含み、ここで、ノッチ受容体アゴニストは、TN細胞の疲弊を軽減又は防止する。
【００３１】
本明細書に記載の任意の方法に関して、いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、T細胞と共培養される任意の細胞上では発現されない。例えば、いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、APC細胞又は骨髄細胞（例えば、OP9 DL1細胞）上では発現していない。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞の集団は、APCと共培養されない。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞の集団は、骨髄細胞と共培養されない。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞の集団は、OP9-DL1細胞と共培養されない。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、T細胞はTN細胞であり、又はT細胞の集団はTN細胞の集団であり、そのT細胞の集団はOP9-DL1細胞と共培養されない。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、T細胞はTN細胞であり、又はT細胞の集団はTN細胞の集団であり、そのT細胞集団は骨髄細胞と共培養されない。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストはDLL1ではない。
【００３２】
別の態様では、本明細書は、T細胞又はT細胞をインビトロで培養する方法であって、T細胞又はT細胞の集団を、細胞内にノッチ受容体シグナル伝達を誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストを含む培地に曝す工程を含み、ここで、ノッチ受容体アゴニストはペプチドリガンドであり、且つT細胞はOP9-DL1細胞又はデルタ様1（DLL1）を発現する骨髄細胞と共培養しない、方法を提供する。いくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞の集団は、OP9-DL1細胞と共培養したT細胞に比べて、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約110%、少なくとも約120%、少なくとも約130%、少なくとも約140%、少なくとも約150%、少なくとも約160%、少なくとも約170%、少なくとも約180%、少なくとも約190%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、又は少なくとも約300%疲弊が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本発明の上述の側面及び付随する多くの利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することで、よりよく理解できるようになる。
【００３４】
【図１】図1は、固定化DLL1（ノッチアゴニスト）（μg/ml）に曝したナイーブT細胞が、固定化IgG1（コントロールリガンドとして、無関係に結合）に曝した同様の細胞、又はブランク（リガンドなし）の組織培地（「TC」；コントロールとして）でインキュベートした細胞と比較して、ノッチシグナルの相対的な増加（Hes1の発現で測定）を示すグラフである。細胞をDLL1-Ext IgG及びレトロネクチン、IgG1及びレトロネクチンでコーティングしたプレート上、又はTCコントロールプレート上で4時間培養した。Hes1 RNAを単離し、cDNAに転写し、SYBRgreen q-PCRを用いて定量した。この培養法では、Hes1アップレギュレーションが生じており、これはノッチシグナル伝達を示す。
【図２】図2A及び図2Bは、異なる条件下での培養前及び培養後の異なる時点における、ヒトCD4+及びCD8+ T細胞におけるノッチ1及びノッチ2受容体のそれぞれの相対的な発現を示すグラフである。培養物は下部の凡例に示されている（TC＝レトネクチンのみでコーティングされた培養プレート、DLL1＝実験条件のノッチアゴニスト、IgG＝コントロールIgGリガンドでコーティングされた培養プレート、全てのプレートはレトネクチンでコーティングされている）。
【図３Ａ−３Ｄ】図3A〜3Dは、異なる条件下での培養前及び培養後の異なる時点における、ヒトCD4+及びCD8+ T細胞におけるノッチリガンド（ノッチ受容体アゴニスト）DLL1、DLL4、JAG1、及びJAG2の相対的な発現をそれぞれ示すグラフである。培養物は下段の凡例に示されている（TC＝組織培地、DLL1＝実験条件のノッチアゴニスト、IgGはコントロール）。
【図４】図4は、分化したT細胞のサブセットを同定するための例示的なフローサイトメトリーアッセイで使用されるゲーティング戦略及び細胞マーカーを示す。
【図５Ａ−５Ｅ】図5A〜5Eは、異なる濃度のノッチリガンドDLL1、抗ノッチ1抗体（N1）、抗ノッチ2抗体（N2）、又はDLL4とインキュベートした後、フローサイトメトリーによって決定された、ヒトCD4+又はCD8+ T細胞の分化したサブセットの相対的な割合を示すグラフである。分析の前に、ヒトナイーブT細胞を抗CD3/CD28 DYNABEADS(R)（ThermoFisher）で刺激し、示されたノッチアゴニスト、IgG1（無関係なリガンドコントロールとして）、又は単純な組織培地（TC；リガンドコントロールなしとして）とともにIL-2を含む培地中でインキュベートした。CD62LとCD45ROの発現をもとに、フローサイトメトリーで分化状態を判定した。各試験ノッチリガンドとのインキュベーションにおいて、CD4+及びCD8+ T細胞の両方において、低分化T細胞（CD62L+ CD45RO-細胞、即ち、TN/TSCMサブセット）の割合が増加した。具体的には、図5A及び図5Bは、3つの異なる濃度のノッチリガンドDLL1とのインキュベーションが、コントロールと比較して、ナイーブ又は低分化のCD4+ T細胞CD8+ T細胞の割合をそれぞれ高く維持することを示している。図5C及び5Dは、それぞれ3つの異なる濃度のノッチリガンドとのインキュベーションが、コントロールと比較して、ナイーブ又は低分化のCD4+ T細胞CD8+ T細胞の割合をそれぞれ高く維持することを示している。図5Eは、3つの異なる濃度のノッチリガンドDLL4とのインキュベーションが、コントロールと比較して、それぞれナイーブ又は低分化のCD8+ T細胞の割合をそれぞれ高く維持することを示している。
【図６Ａ−６Ｂ】図6A及び図6Bは、異なる濃度のDLL1リガンド、IgG1コントロールリガンドの存在下、及びシンプル組織培地（リガンドなしのコントロール）において、ナイーブT細胞で開始し、抗CD3/CD28 DYNABEADS(R)（ThermoFisher）で刺激した培養物において測定されたT細胞の総数を示すグラフである。細胞数は、CD4+T及びCD8+T細胞について、それぞれ培養開始から7日目（図6A）及び11日目（図6B）に示されている。
【図７】図7は、2.5μgの抗ノッチ1抗体（「N1」、抗ノッチ受容体抗体及びアゴニスト）、IgG1コントロールリガンド、及びシンプル組織培地（リガンドなしのコントロール）でプレコートしたプレートで培養し、抗CD3/CD28ビーズで刺激した細胞について、5日目及び11日目の総T細胞数（CD4+及びCD8+）を示すグラフである。N1抗体は、上述の実験におけるDLL1リガンドと同様の方法で、プラスチック表面に付着させた。
【図８】図8は、Raji腫瘍をマウスに注射した後、生物発光イメージング（BLI）によって測定された腫瘍負荷を示すグラフである。腫瘍の大きさは、コントロールT細胞、組織培地コントロール（TC）CAR T細胞、抗ノッチ1抗体（「N1」）に曝されたCAR T細胞、及びIgG1（無関係なリガンドコントロール）に曝されたCAR T細胞を投与した個体について示されている。各線はマウスを表し、シンボルは個々のデータポイントを示す。
【図９Ａ−９Ｃ】図9A〜9Cは、NSGマウスにRaji腫瘍を注射し、T細胞を注入した後のいくつかの時点での血液中のCAR T細胞のレベルを示すグラフである。マウスはコントロールT細胞、組織培地コントロール（TC）CAR T細胞、抗ノッチ1抗体（「N1」）に曝されたCAR T細胞、及びIgGに曝されたCAR T細胞で処置した。血液を示された時点で採取し、塩化アンモニウムカリウム溶液で溶解した後、CD45、CD4、CD8、及びEGFRの抗体で染色した。データはCanto IIフローサイトメーターで収集した。図9Aは、マウスの全リンパ球集団におけるEGFRt+ CD8+及びCD4+ T細胞の頻度を示す図である。図9Bは、マウスの全リンパ球集団におけるEGFRt+ CD8+ T細胞の頻度を示す図であり、図9Cは、マウスの全リンパ球集団におけるEGFRt+ CD4+ T細胞の頻度を示す図である。
【図１０Ａ】図10Aは、Raji腫瘍をマウスに注射した後、生物発光イメージング（BLI）によって測定された腫瘍負荷を示すグラフである。腫瘍の大きさは、コントロールT細胞、組織培地コントロール（TC）CAR T細胞、抗ノッチ1抗体（「N1」）に曝されたCAR T細胞、及びIgG1 CAR T細胞を投与した個体について示されている。各線はマウスを表し、シンボルは個々のデータポイントを表す。
【図１０Ｂ】図10Bは、Raji腫瘍注射後の経時的な図10Aで特徴づけられるマウスの生存率を示すグラフである。個体には、コントロールT細胞、組織培地（TC）CAR T細胞、抗ノッチ1抗体（「N1」）に曝されたCAR T細胞、及びIgG1に曝されたCAR T細胞を投与した。
【図１１Ａ−１１Ｃ】図11A〜11Cは、CAR T細胞が繰り返し腫瘍細胞を殺傷し排除する能力を評価するための反復刺激アッセイの結果を示すグラフである。CD8+T細胞を、抗ノッチ1抗体（「N1」、ノッチ受容体アゴニスト）、IgG、又は単なる組織培地（TC）で同等の条件で培養し、CD19に特異的なCARを発現するようにトランスダクションした。その後、96ウェルプレートを用いて、K562 CD19（図11A）又はRaji細胞（図11B）のいずれかに、1：1のエフェクター：ターゲット比で曝した。標的細胞には照射せず、培地はIL-2を含まなかった。さらに48時間後と72時間後に追加の標的細胞を追加し、腫瘍抗原の繰り返し及び持続的な暴露を行った。アッセイ中にノーマライズドT細胞数を測定したところ、N1に曝されたT細胞は活性を維持し、抗原に複数回又は持続的に曝されても増殖し続ける（即ち、疲弊が最小限である）ことが示された。培養液のアリコートのフローサイトメトリーにより、N1 CAR T細胞はIgG1に曝されたT細胞よりも効果的に腫瘍細胞を除去したことが示された（図11C）。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図12A及び12Bは、NSG-Rajiマウスにノッチ受容体アゴニストとともに培養した異なる用量のCD4+ CAR T細胞を注入した効果を示すグラフである。具体的には、2.5μgの抗ノッチ抗体（N1）又はIgG1コントロールでコートしたプレート上でCD4+ CAR T細胞を培養した。細胞を11日間の培養後に注入した。図12Aは、異なる用量のCD4+ CAR T細胞を注入した後の経時的なホタルルシフェラーゼの生物発光イメージングによって決定される腫瘍負荷を示すグラフである。図12Bは、CD4+ CAR T細胞を注入した後のいくつかの時点で採取した血液中のリンパ球シングレットのCD4+ CAR T細胞の割合を示すグラフである。各採取した血液を塩化アンモニウムカリウム溶液で溶解した後、CD45、CD4、及びEGFRの抗体で染色した。データはCanto 2-1フローサイトメーターで収集した。
【図１３Ａ−１３Ｂ】図13A及び13Bは、NSG-Rajiマウスにノッチ受容体アゴニストとともに培養した異なる用量のCD8+ CAR T細胞を注入した効果を示すグラフである。具体的には、2.5μgの抗ノッチ抗体（N1）又はIgG1コントロールでコートしたプレート上でCD8+ CAR T細胞を培養した。細胞は11日間の培養後に注入した。図13Aは、CAR T細胞を注入した後の経時的なホタルルシフェラーゼの生物発光イメージングによって決定される腫瘍負荷を示すグラフである。図13Bは、CD8+ CAR T細胞を注入した後のマウスの生存率を示すグラフである。
【図１４Ａ−１４Ｃ】図14A〜14Cは、NSG-Rajiマウスに注入する前の7日又は11日の、ノッチ受容体アゴニスト（抗ノッチ抗体、N1）を用いたCD8+ CAR T細胞の効果を示すグラフである。具体的には、CD8+ CAR T細胞を、N1コートプレート又はIgG1コートプレート上で7日間、又は7日間の後に4日間、ノーマルTCフラスコで培養した（D11グループ）。図14Aは、7日間又は11日間培養したCD8+CAR T細胞を注入した後の経時的なホタルルシフェラーゼの生物発光イメージングによって決定される腫瘍負荷を示すグラフである。図14Bは、7日又は11日間培養したCD8+ CAR T細胞の注入後、いくつかの時点で採取した血液中のリンパ球シングレットのCAR T細胞の割合を示すグラフである。各採取した血液を塩化アンモニウムカリウム溶液で溶解した後、CD45、CD8、及びEGFRの抗体で染色した。図14Cは、CD8+ CAR T細胞を注入した後のマウスの生存率を示すグラフである。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図15A及び15Bは、抗ノッチ抗体（N1アゴニスト）又はコントロール（IgG抗体）と別々にインキュベートしたCD4+ CAR T細胞及びCD8+ CAR T細胞の混合物を注入した後の、インビボでのCD4+ CAR T細胞及びCD8+ CAR T細胞のそれぞれの増殖を示すグラフである。11日目に別々に培養したCD4+ CAR T細胞とCD8+ CAR T細胞を1：1の比率で示された組み合わせで混合し、NSG Rajiマウスに注入した。
【図１６Ａ−１６Ｃ】図16A〜16Cは、ノッチ受容体アゴニスト（抗ノッチ1抗体N1）の存在下で培養されたCD4+細胞の表現型の特徴を示す図である。図16Aは、IgG抗体コントロールとインキュベートした細胞と比較した、ノッチアゴニストとインキュベートしたCD4+細胞のTMRM染色によって決定されたミトコンドリア膜電位をグラフで示す図である。図16Bは、ノッチ活性化によって誘発されるミトコンドリア膜電位の低下が、主にCD45RA高/CD45RO低のCD4+細胞で起こることを示している。図16Cは、ノッチ受容体アゴニスト（抗ノッチ1抗体N1）又はIgGコントロールで培養したCD8+細胞の散布図を示しており、ノッチ刺激がT細胞の異なる分子プロファイルを増加させることを示している。
【図１７】図17は、発生マーカーの発現プロファイルに基づいた、TEM/TEFF、TCM、又はTN/TSCMに分類されたCD4+T細胞の割合を示すグラフである。細胞をN1ノッチアゴニスト又はIgG1コントロールリガンドを伴う培養の5日目、8日目、及び11日目にアッセイした。細胞は培養開始前にはじめにTN細胞が疲弊した。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図18A及び18Bは、発生マーカーの発現プロファイルに基づいた、TEM/TEFF、TCM、又はTN/TSCMに分類されたCD4＋T細胞の割合を示すグラフである。細胞をN1ノッチアゴニスト又はIgG1コントロールリガンドを伴う培養の5日目、8日目、及び11日目にアッセイした。培養開始時の細胞を培養開始時にCD4+ TCM細胞（図18A）又はCD4+ TEM細胞（図18B）に選別した。
【図１９Ａ−１９Ｂ】図19A及び19Bは、発生マーカーの発現プロファイルに基づいた、TEM/TEFF、TCM、又はTN/TSCMに分類されたCD8＋T細胞の割合を示すグラフである。細胞をN1ノッチアゴニスト又はIgG1コントロールリガンドを伴う培養の5日目、8日目、及び11日目にアッセイした。培養開始時の細胞を培養開始時にCD8+ TCM細胞（図19A）又はCD8+ TEM細胞（図19B）に選別した。
【図２０】図20は、発生マーカーの発現プロファイルに基づいた、TEM/TEFF、TCM、又はTN/TSCMに分類されたバルクT細胞の割合を示すグラフである。細胞をN1ノッチアゴニスト又はIgG1コントロールリガンドを伴う培養の5日目、8日目、及び11日目にアッセイした。細胞は培養開始前にはじめにTN細胞が疲弊した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
上述のように、エクスビボでエクスパンド及び操作されたTリンパ球細胞（以下、T細胞）は、がん、感染症、自己免疫疾患などの様々な疾患に対する養子細胞療法に有用である。一時期対象内に投与されたT細胞のパーシスタンス及び機能は、治療の全体的な安定性や耐久性と相関すると考えられている。しかし、エクスビボ及びインビボでの安定なT細胞のエクスパンド、インビボでのパーシスタンス、インビボでのT細胞応答の耐久性、及びインビボでのT細胞の毒性を決定する要因を定義することは困難であった。
【００３６】
養子細胞療法の安定性と耐久性の基礎となるメカニズムを明確に理解する上での障害の一つは、最初のソースから単離されたT細胞の不均一性である。異なるT細胞サブセットは、養子細胞療法に異なる影響を与えるユニークな属性を有するように見える。例えば、非ヒト霊長類では、エフェクターメモリーT細胞（TEM）ではなく、セントラルメモリーT細胞（TCM）由来のウイルス特異的CD8+T細胞の養子移植により、長期的な機能的免疫が得られることが実証されている。CD8+T細胞サブセットの転写及びエピジェネティックプロファイリングは、養子移植後の増殖、パーシスタンス、及びエフェクター機能の階層的ポテンシャルを伴う進行性分化を示唆している。マウスでは、シングルCD8+ TCM細胞を連続的に移植することで、「幹性」（即ち、自己再生、TEM又はエフェクターT細胞（TE）への分化）が見られ、防御免疫が得られる。
【００３７】
このような知見を踏まえて、T細胞分化の進行モデルが提案されているが、他のT細胞分化モデルも提案されておりそれは妥当性がある。進行モデルでは、胸腺で成熟と選択を受けた循環T細胞は、細胞の増殖能と自己再生能が、分化の異なる状態でのT細胞のエフェクター機能能に反比例するような分化の状態を経て進行する。T細胞は、最初は比較的高い増殖能と自己再生能を持ち、比較的低いエフェクター機能を持つが、分化の過程で、増殖能と自己再生能が低下し、エフェクター機能が強化された状態へと徐々に移行していく。この例示的なモデルでは、T細胞の分化状態（即ち、同定可能なT細胞サブセット）は、ナイーブT細胞（TN）からステムセントラルメモリーT細胞（TSCM）へ、さらにセントラルメモリーT細胞（TCM）へ、さらにエフェクターメモリーT細胞（TEM）へ、さらにエフェクターT細胞（TE又はTEFF）へと移行することが示されている。TN細胞は最大の増殖能と自己再生能を有するが、エフェクター機能は最小であり、TE細胞は逆に最小の増殖能と自己再生能を有するが、エフェクター機能は最大である。これらの異なるサブセットは、表面マーカーの発現によって同定できる。例えば、TN細胞は典型的にはCD62L+、CD45RA+、CD45RO-、及びCD95-、TSCMは典型的にはCD62L+、CD45RA+、CD45RO-、及びCD95+、TCMは典型的にはCD62L+、CD45RA-、CD45RO+、及びCD95+、TEMは典型的にはCD62L-、CD45RA-、CD45RO+、及びCD95+、及びTEは、CD62L-、CD45RA+、CD45RO-、及びCD95+が表面マーカーとして見なされる。このような分化サブセットが発現する他のマーカーも知られている。
【００３８】
比較的均一で未分化なT細胞を得るためのアプローチが模索されている。例えば、低分化T細胞サブセット（例えば、TSCM及びTCM）を単離し、抗腫瘍効果を高めるために使用できる。別の研究では、IL-7、IL-15、IL 21の存在下でT細胞を培養すると、初期メモリーT細胞が維持される。さらに、WntシグナルはエフェクターT細胞（TE）分化を阻止し、CD8+メモリー幹細胞（TSCM）を生成することが示されている。最後に、Aktシグナルを阻害すると、養子免疫療法のための優れた腫瘍反応性T細胞の生成が促進されることが示されている。
【００３９】
比較的「若い」又は未分化なT細胞の存在が、養子細胞療法の長期的な有効性を向上させ得る。比較的未分化なT細胞を得るための様々なアプローチが存在するが、養子T細胞療法への実用化には限界がある。例えば、Wntシグナルの増強やAktの阻害など、多くの戦略がT細胞の増殖に悪影響を及ぼすことを考えると、T細胞数を制限することなく初期の未分化な表現型を維持することが一つの課題である。
【００４０】
ここでは、エクスビボでのT細胞（改変T細胞を含む）の増殖及び分化におけるノッチシグナルの役割と、実用的かつ長期的な生体内での治療効果への影響について検討する。
【００４１】
ノッチシグナル伝達経路は、後生動物において細胞間のシグナル伝達を促進する高度に保存された経路である。哺乳類のノッチ受容体（ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4など）は、タイプIの膜貫通型受容体であり、最初は細胞外ドメイン（NECD）、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン（NICD）を持つ前駆体の形で発現する。この前駆体はフーリンコンバーターゼによって切断され、2つのサブユニットを持つ成熟した受容体となる。一方のサブユニットは大部分がNECDからなり、膜貫通ドメインとNICDを含むもう一方のサブユニットと非共有結合している。ノッチ受容体のNECDは、N末端側に一連の上皮成長因子（EGF）様リピートを持ち、これがリガンドとの相互作用に関与している。EGFリピートの後（EGFリピートに比べてサブユニットのC末端側）には、リガンドに依存しないシグナル伝達を防ぐ役割を果たす、3つのシステインリッチLIN12及びノッチ（LNR）リピートと、ヘテロ二量体ドメイン（HD）がある。LNRドメインとHDドメインを持つ領域は、ネガティブ制御領域（NRR）と呼ばれている。
【００４２】
典型的なシナリオでは、ノッチシグナル伝達はNECDが相手細胞の表面に提示された適切なリガンドと結合することで開始される。カノニカルリガンド（リガンドJagged1（例えば、GenBank Accession No. AAC51731）、Jagged2（例えば、GenBank Accession No. AAD15562）、デルタ様1（DLL1；例えば、GenBank Accession Nos. ABC26875又はNP005609）、デルタ様3（DLL3；GenBank Accession Nos. NP_982353.1又はNP_058637.1）、又はデルタ様4（DLL4；例えば、GenBank Accession No.NP_061947.1））はI型膜貫通蛋白質であり、N-末端領域、システインリッチデルタ-セレイト、及びLag2（DSL）領域を有する細胞外ドメイン、及び様々な数のEGFリピートを有している（各アクセッション番号の配列は参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、Falix F., et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, 1822(6):988-996 (2012)を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。隣接する細胞から提示されたノッチ受容体に適切なリガンドが結合すると、ノッチ受容体のNRRにあるS2切断部位を露出させる構造変化が起こり、蛋白質分解が可能になる。この構造変化は、リガンドを発現している細胞にリガンドがトランスエンドサイトーシスで取り込まれる際に生じるメカニカルな「引っ張り（tug）」によって生じると考えられている。S2部位でノッチ受容体が最初に切断されると、細胞内でさらに蛋白質分解が起こり、NICDと膜貫通ドメインが分離される。その後、活性化されたNICDは核に移動し、転写の活性化と抑制のカスケード経路に関与する。ノッチシグナル伝達及びその制御の議論については、例えば、WO2018/017827を参照（その全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４３】
ノッチは、細胞の増殖、分化、発生、及びホメオスタシスを調節する上で重要な役割を果たすことが示されている。成体の哺乳類では、ノッチシグナルは、神経幹細胞や造血幹細胞の再生と分化、さらには多くの免疫細胞サブセットの発生など、多くのプロセスで重要な役割を果たしている。ノッチシグナルとT細胞シグナル及び刺激との相互作用については、Falix F., et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, 1822(6):988-996 (2012)に記載されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。カノニカルT細胞シグナルは、表面T細胞受容体（TCR）を介して、典型的には、細胞によって提示されたMHC上に表示された適切なペプチドの結合を介して、共刺激シグナルを介したシグナルと組み合わせて媒介される。また、ノッチはT細胞に発現しており、複数の経路でT細胞の分化に影響を与え得る。カノニカル経路では、ノッチシグナルがHes1遺伝子の発現を促進し、次にPTEN阻害物を阻害することでTCRシグナルを促進する。さらに、ノッチ受容体のエンドサイトーシスと消化は、NFκBの生産とPI3K/Akt/mTor経路の促進につながる相互作用を促進し、増殖、生存、及び分化を刺激することができる。
【００４４】
しかし、ノッチシグナルの機能的な結果を予測することは困難である。なぜならば、異なる状況にある異なる細胞が、ノッチシグナルの異なる表現型の効果を示すからである。例えば、最近の研究では、幹細胞におけるノッチシグナルを介した特定の相互作用が、幹細胞の静止に寄与し、その結果、適切な刺激によって活性化されるまで、幹細胞の自己再生と多能性の維持を可能にすることが示唆されている。例えば、Dahlberg, et al., Blood 117:6083-6090 (2011)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）には、ノッチ2シグナルが、多能性前駆細胞（MPP）及び骨髄/単球(M)細胞系統への分化を阻害することにより、造血幹細胞の自己再生に影響を与えることが示唆されている。一方、ノッチ1は、MPPからのT細胞の分化とB細胞(B)への分化を促進すると説明されている。本発明者らは、固定化したデルタ1Ext-IgG（ノッチリガンド）が、分化を抑制しつつ増殖を最大化することにより、臍帯血からのHSCのエクスビボでのエクスパンドを促進することを以前に示した。この効果は、サイトカインによる強い増殖シグナルの存在下でも観察された。最後に、固定化したデルタ1Ext-IgGアゴニストを滴定することにより、細胞集団におけるノッチシグナルは定量的なシグナルに依存することが示された。
【００４５】
しかしながら、ノッチシグナルは、MPPのT細胞への分化を刺激することも示されている。上述のように、ノッチシグナルはPI3K/Akt/mTor経路を促進し、T細胞の増殖、生存、分化を刺激することが示されている。従って、T細胞のさらなる分化におけるノッチシグナルの役割については議論の余地があり、さまざまな転写作用が観察されている。このように、増殖、発生、静止に対するノッチシグナルの影響は、非常に状況に依存していると考えられる。結局のところ、ノッチがT細胞の分化に対して抑制的な効果を持つのか、活性化的な効果を持つのかは不明である。
【００４６】
HSCから成熟TE細胞へと細胞タイプが分化する際のノッチシグナルの矛盾した効果に鑑み、本明細書で開示する研究は、T細胞サブタイプの分化に影響を及ぼす可能性のあるノッチシグナルの役割を明らかにし、養子細胞療法のためにT細胞を培養及びエクスパンドする際のこの役割の実用化可能性を探るために実施された。
【００４７】
以下に詳述するように、本発明者らは、T細胞のエクスビボ培養におけるノッチシグナルの影響、CAR T細胞の発生、及びマウス腫瘍モデルに投与した後のそのような細胞の有効性への影響を研究した。例えば、ナイーブT細胞を様々なノッチアゴニストに曝してエクスパンドさせ、腫瘍標的キメラ抗原受容体を導入する遺伝子改変を行い、ノッチシグナルが初期の（即ち、より低い）分化状態と一致する表現型を持つT細胞を維持し、治療活性を高めるかどうかを調べた。T細胞をエクスパンドさせた後、細胞表面の表現型を分析したところ、ノッチシグナルにさらされたT細胞のうち、CD45RA及びCD62Lの発現が多いことを特徴とする初期の表現型を維持しているフラクションが多いことが示唆された。さらに例示的な試験では、腫瘍特異的なCARを発現するように遺伝子導入し、ノッチ活性化アゴニストとともに培養したT細胞は、ノッチ活性化アゴニストを使用せずに同一の条件で培養したCAR T細胞と比較して、ヒトB細胞腫瘍を移植したNSGマウスに養子移植した後、より大きなエクスパンド、優れた長期パーシスタンス、及びより高い抗腫瘍活性を示した。さらに、ノッチ活性化細胞は、抗原に複数回、あるいは恒常的に曝されても、驚くべきことに活性を維持し、増殖し続けた。これは、疲弊を避ける能力があることを示している。これらのアッセイでは、CD19特異的CAR T細胞と移植ヒトCD19+ B細胞腫瘍を組み合わせたモデルを使用したが、観察された結果は特定の抗原と対応するCARの機能ではなく、従って、任意の抗原/CARの組み合わせを含む養子細胞療法を使用する任意のT細胞に適用されるであろう。さらに、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞を対象としたアッセイでは、誘導されたノッチシグナルがこれらの細胞集団に対して異なる効果を持つことが示され、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞を混合することで、増殖と抗腫瘍効果に関連した相乗効果が得られることがわかった。従って、治療用T細胞を作る際にノッチシグナルを増強することで、より高い有効性とパーシスタンスを有す細胞を得ることができ、治療効果を高めることができる。また、この技術は、ノッチアゴニストを、二重特異的ターゲティング剤を用いて、選択したT細胞サブセットに特異的にターゲティングすることで、分化を抑制し、がん、感染症、自己免疫疾患などの免疫療法に有効な細胞を開発できる可能性がある。例えば、WO 2018/017827を参照（その全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４８】
上記に従い、本明細書は、特に、T細胞におけるノッチシグナルを刺激する工程を含む、T細胞の比較的未分化な状態を促進する方法、得られたT細胞を含む組成物、及び得られたT細胞を使用する治療方法に典型的には向けられている。
【００４９】
一態様では、本明細書は、インビトロでTリンパ球（「T細胞」）を培養する方法を提供する。本方法は、T細胞をノッチ受容体アゴニストに、細胞にけるノッチ受容体シグナル伝達を誘導するのに十分な時間曝す工程を含む。別の態様では、本明細書は、T細胞をインビトロで培養する方法であって、T細胞の集団を、細胞内にノッチ受容体シグナル伝達を誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストを含む培地に曝す工程を含む方法を提供する。これらの方法の様々な要素は、以下でより詳細に説明される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞集団は、抗原提示細胞（APC）の存在下で培養されない。いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、培地中に存在する細胞上で発現していない。いくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞集団は、ノッチ受容体アゴニストを発現する抗原提示細胞（APC）の存在下で共培養されていない。例えば、いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、培地中のAPC上に発現していない。いくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞集団は、デルタ様リガンド4（DLL4）を発現する抗原提示細胞（APC）の存在下で培養されない。
【００５１】
T細胞
次に、T細胞について説明する。説明は、典型的には、本方法における単一のT細胞の文脈であるが、明示的に別のことを述べない限り、説明は、T細胞の集団に統合的に適用することもできることが理解されるであろう。
【００５２】
いくつかの実施形態では、T細胞は、その表面上のCD3及びCD28の発現によって特徴付けられる（CD3陽性（＋）及びCD28陽性（＋））。T細胞は、ナイーブT細胞（TN）、幹セントラルメモリーT細胞（TSCM）、セントラルメモリーT細胞（TCM）、エフェクターメモリーT細胞（TEM）、及びエフェクターT細胞（TE又はTEFF）を含むサブセットから選択されるような、任意の発生状態（即ち、T細胞サブセット）であり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、T細胞は、低分化、即ち、相対的に高い増殖能と低いエフェクター機能能を有することを特徴とする。いくつかの実施形態では、T細胞をノッチ受容体アゴニストに曝す工程を含む、開示された方法の性能は、低分化状態の維持を促進する。例えば、T細胞は、ナイーブT細胞（TN）又はメモリー幹T細胞（TSCM）であり得る。特定の実施形態では、T細胞は、ナイーブT細胞（TN）である。
【００５４】
また、T細胞は、特定の表面マーカーの存在又は非存在によって特徴付けることができる。例えば、T細胞は、以下の表面マーカーの1つ以上に対して陽性であることができる。CCR7、CD62L、CD45RA、CD27、CD28、CD95、及びCD127。一実施形態では、T細胞は、少なくともCD62Lに対して陽性である。一実施形態では、T細胞は、少なくともCD62L及びCD45RAに陽性である。
【００５５】
一実施形態では、T細胞は、以下の表面マーカーの1つ以上に対して陰性である。CD45RO、CD95、PD-1、Lag-3、及びCD25。一実施形態では、T細胞は、少なくともCD45RO及びCD95に対して陰性である。
【００５６】
一実施形態では、T細胞は、CD62L+、CD45RA+、及びCD45RO-である。一実施形態では、T細胞は、CD62L+、CD45RA+、CD45RO-、及びCD95-である。別の実施形態では、T細胞は、CD62L+、CD45RA+、CD45RO-、及びCD95+である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、T細胞は、TN又はTSCMと比較して、相対的に減少した増殖能及び高いエフェクター機能能を有する、即ち、「中間分化」であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、T細胞をノッチ受容体アゴニストに曝す工程を含む開示された方法の性能は、中間分化状態の維持を促進し、いくつかのさらなる実施形態では、低分化状態への復帰を促進する。いくつかの実施形態では、T細胞は、セントラルメモリーT細胞（TCM）又はエフェクターメモリーT細胞（TEM）であり、本方法の実施は、（上記のように）T細胞の低分化状態への復帰を促進する。いくつかの実施形態では、「より分化した」T細胞は、CD95及びCD45ROの発現によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD45ROの発現の欠如によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD62Lの発現の欠如によって特徴付けられる。一実施形態では、「より分化した」T細胞は、CD62L+、CD45RA-、CD45RO+、及びCD95+である。別の実施形態では、「より分化した」T細胞は、CD62L-、CD45RA-、CD45RO+及びCD95+である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本方法は、"バッチ "と呼ばれることができる複数のT細胞に対して実行される。バッチは、単一のドナー個体から最初に調達することができ、又は複数の個体（典型的には同じ種の個体）から最初に調達されたT細胞の組み合わせバッチであることができる。後述の養子細胞療法においては、ソースとなる個体は、T細胞又はその子孫の投与を受ける対象と同じであっても異なっていてもよい。細胞は、典型的には、ソース個体から得られた生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）から除去又は単離される。特定の実施形態では、細胞は、ソース個体のアフェレーシス又はロイカフェレーシスから得られる。生物学的サンプルの他の成分から関連するリンパ球を分離するために、遠心分離、洗浄、及び適切な試薬とのインキュベーションを含む、1つ以上の処理工程を含んでもよい。上述のように、T細胞及び/又は所望のT細胞分化サブタイプに特徴的な適切な表面マーカーの表面発現に基づく選択によって、細胞をさらに単離できる。選択は、例えば、フローセパレーションと組み合わせた免疫染色技術、免疫親和性磁気ビーズ、免疫親和性クロマトグラフィーなどを用いて行うことができる。
【００５９】
T細胞は、約60％、70％、80％、90％、又はすべて（又は約60％〜100％の範囲に含まれる任意の％）が、T細胞の特定のサブセット、系統、特性、及び/又は分化状態を定義する類似のマーカー発現プロファイルを有することを意味する、実質的に均質なものであることができる。
【００６０】
しかし、いくつかの実施形態では、複数のT細胞は、分化サブタイプの任意の単一タイプに対して事前に選択されておらず、むしろバルクであり、即ち、T細胞サブセット又は関連するマーカープロファイルのバリエーション（潜在的に実質的なバリエーション）を有する。これに関連して、バッチは、例えば、上述の分化サブタイプのうちの少なくとも2つ以上を表すことを特徴とするT細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態では、バッチは、主に（即ち、約50％、60％、70％、80％、90％、95％を超える）「低分化」（即ち、TN及び/又はTSCM）である。いくつかの実施形態では、バッチは、主に（即ち、約50％、60％、70％、80％、90％、95％を超えて）「中間分化」（即ち、TCM及び/又はTEM）である。いくつかの実施形態では、バッチは、主に（即ち、約50％、60％、70％、80％、90％、95％を超えて）より分化している（例えば、TE）。あるいは、バッチは、これらの分化したサブタイプの組み合わせを、任意の所望の割合で、任意の許容可能な誤差の範囲内で含んでもよい。
【００６１】
さらに、いくつかの実施形態では、複数のT細胞における個々のT細胞（又は実質的にすべて、例えば、少なくとも約90％以上）は、CD4+、CD8+のいずれかであるか、又はCD4+及びCD8+が任意の相対的な比率で組み合わせて存在できる。例えば、いくつかの実施形態では、複数のT細胞は、CD8+細胞を除くCD4+T細胞を含むか、CD4+を除くCD8+細胞を含むか、又はCD4+T細胞とCD8+T細胞の両方を有するように選択される。以下の実施例4で詳細に説明するように、ノッチ受容体アゴニストへの曝露は、CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の両方にポジティブな効果をもたらすが、その効果のプロファイルは異なることが決定された。CD4+T細胞は、ノッチシグナルによって増殖が誘導されるものの、独立して同じようにノッチシグナルによって誘導されるCD8+T細胞と比較して、抗腫瘍効果が低いことが明らかになった。しかし、ノッチシグナルで誘導されたCD4+T細胞とCD8+T細胞を組み合わせることで、相乗効果が得られ、増殖率、疲弊耐性、抗腫瘍効果が大幅に向上することが明らかになった。さらに、CD4+T細胞をノッチアゴニストに特異的に曝すことが、増殖、疲弊耐性、抗腫瘍効果に最も大きな影響を与えることが明らかになった。従って、いくつかの実施形態では、ノッチ受容体リガンドに曝された複数のT細胞は、CD4+T細胞からなる、又は含む。ノッチ刺激されたCD4+T細胞は、続いて、ノッチ受容体リガンドに曝されていないCD8+T細胞と組み合わせて、又は協調的に投与できる。
【００６２】
ノッチ受容体アゴニストに曝されたT細胞の出発集団の追加の例示的な組み合わせは、約20：1から約1：20のCD4+：CD8+細胞比を有するT細胞を含む。例えば、複数のT細胞は、約20:1から、約19:1から、約18:1から、約17:1から、約16:1から、約15:1から、約14:1から、約13:1から、約12:1から、約11:1から、約10:1から、約9:1から、約8:1から、約7:1から、約6:1から、約5:1から、約4:1から、約3:1から、約2:1から、約1:1から、約1:2から、約1:3から、約1:4から、約1:5から、約1:6から、約1:7から、約1:8から、約1:9から、約1:10から、約1:11から、約1:12から、約1:13から、約1:14から、約1:15から、約1:16から、約1:17から、約1:18から、約1:19から、及び約1:20からのCD4+:CD8+細胞比を有し得る。
【００６３】
表面マーカーに基づく所望の細胞の選択は、例えば、上述のような免疫染色に基づく技術を用いて行うことができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、方法は、ナイーブT（TN）細胞をインビトロで培養する方法であって、ナイーブT（TN）細胞の集団を、細胞内にノッチ受容体シグナル伝達を誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストを含む培地に曝す工程を含む。TN細胞の集団は、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は約100%のTN細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態では、集団は、約40%〜約90%、約50%〜約90%、約60%〜約90%、約70%〜約90%、約80%〜約90%、約40%〜約80%、約50%〜約80%、約60%〜約80%、約70%〜約80%、約40%〜約70%、約50%〜約70%、約60%〜約70%、約40%〜約60%、約50%〜約60%、又は約40%〜約50%のTN細胞を含む。いくつかの実施形態では、TN細胞は、CD62L+、CD45RA+、CD45RO-、CD95-、及び/又はCCR7+としてさらに特徴付けられる。
【００６５】
ノッチ受容体アゴニスト
哺乳類のノッチ受容体はノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、及びノッチ4を含み、これらのホモログはヒト、げっ歯類、及びその他の種について、当業者には知られており、容易に確認できる。例えば、ヒトのノッチ1の代表的なアミノ酸配列は、Genbank Accession No. P46531（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、配列番号7として本明細書に記載されている。他のノッチ受容体はよく知られており、容易に識別できる。ヒトノッチ2の代表例は、Genbank Accession No. NP_077719.2（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、配列番号8として本明細書に記載されている。ヒトノッチ3の代表例は、Genbank Accession No. AAB91371.1（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、配列番号9として本明細書に記載されている。ヒトノッチ4の代表例は、Genbank Accession No. AAC63097.1（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、配列番号10として本明細書に記載されている。上記の各アクセッション番号は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
開示された方法は、1つ以上のT細胞をノッチ受容体アゴニストに曝すことを取り入れている。上述のように、ノッチ受容体は、細胞間のシグナル伝達を促進する高度に保存されたシグナル伝達経路に組み込まれている。以下に詳述するように、本発明者らは、ノッチ細胞シグナルを刺激するノッチ受容体アゴニストにT細胞を曝すと、T細胞が低分化状態を維持し、インビボで投与した場合に生存率とパーシスタンスが向上することを確立した。これにより、抗腫瘍活性の増強とともに、疲弊に対する感受性の低下が生じる。
【００６７】
用語「ノッチ受容体アゴニスト」は、ノッチ受容体が細胞表面に発現している場合に、ノッチシグナル伝達を機能的にもたらす態様でノッチ受容体に特異的に結合する分子のことである。例えば、本明細書に開示のノッチ受容体アゴニストは、哺乳類ノッチ受容体に対する任意のカノニカル又は非カノニカルリガンド（例えば、哺乳類ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、又はノッチ4受容体に結合するリガンド）、又は哺乳類ノッチ受容体に特異的に結合し、ノッチ受容体を発現する細胞においてノッチ受容体シグナル伝達をもたらすアゴニスト機能を有する任意のアフィニティ試薬を含む。また、ノッチ受容体アゴニストは、典型的には「ノッチリガンド」、「ノッチリガンド」、「ノッチアゴニスト」、「ノッチ受容体アゴニストリガンド」などとも呼ばれる。
【００６８】
本明細書では、ノッチ受容体アゴニストと接触したときのノッチ受容体の機能を表す「ノッチシグナル」などの用語は、細胞膜に発現成熟したノッチ受容体の蛋白質切断分解による切断から生じる細胞シグナルカスケードを意味する。上述のように、ノッチシグナルは、NECDのC末端付近にあるS2部位での蛋白質分解による切断によって開始される。シグナルが出ていない状態では、S2切断部位はネガティブ制御領域（NRR）の閉じた状態によって保護されており、切断部位を直接塞ぎ、プロテアーゼのアクセスを防いでいる。例えば、Gordon et al., "Structure of the Notch1-negative regulatory region: implications for normal activation and pathogenic signaling in T-ALL," Blood, 113(18):4381-4390 (2009)を参照（参照によりその全体が組み込まれる）。リガンドを介したシグナル伝達の活性化は、リガンドが細胞外ドメインに結合し、その結果、細胞外ドメインのNRR内のS2切断部位を露出させるような構造変化が生じたときに起こる。この構造変化は、必ずしも自動的に起こるものではなく、リガンドや他の結合分子がノッチ受容体に力やひずみを与え、NRRの閉じた状態が変化したときに起こるものである。従って、ノッチ受容体のアゴニストは、NECDに結合するだけでなく、S2切断部位の露出に必要な構造変化を誘発するのに十分な力、又は「引っ張り」を加える態様で結合する。S2の切断部位が露出すると、蛋白質分解による切断が可能になり、その後、細胞内シグナルが発生する。以下に記載されるような、任意のノッチリガンド又は結合分子における「引っ張り」の機能性は、以下に詳細に記載されるように、ノッチ受容体を発現する細胞にノッチ受容体アゴニストを適切に提示することによって達成され得る。
【００６９】
ノッチシグナル伝達は、Hes1の発現など、ノッチの活性化に起因する下流の遺伝子産物を測定することによってモニターできる。あるいは、CHO-K1ノッチレポーターシステムなど、ノッチシグナル伝達を示すレポーターシステムが利用できる。例えば、Sprinzak, D., et al. "Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states," Nature 465(7294):86-90 (2010)を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７０】
本明細書に包含される、ノッチ受容体アゴニストの非限定的な例を記載する。
【００７１】
ノッチ受容体アゴニストは、ノッチシグナル伝達を誘導することが実証されている、カノニカル哺乳類ノッチ受容体リガンド、又はそのノッチ結合ドメインであるか、又はそれらを含んでもよい。哺乳類におけるカノニカルノッチリガンドには、Jagged蛋白質（例えば、Jagged1及びJagged2）及びデルタ蛋白質（例えば、DLL1、DLL3、DLL4；ここで、DLLは「デルタ様リガンド」の頭文字）が含まれ、これらはそれぞれよく知られており、本明細書によって企図され、包含されるものである。非限定的な例として、代表的なカノニカルノッチリガンド配列は、GenBank Accession No. AAC51731（Jagged1；本明細書で配列番号11として記載）、GenBank Accession No. AAD15562（Jagged2；本明細書で配列番号12として記載）、GenBank Accession No. ABC26875（部分配列）又はNP005609（DLL1；本明細書で配列番号13及び14として記載）、GenBank Accession Nos. NP_982353.1又はNP_058637.1（DLL3；それぞれ配列番号15及び16として本明細書に記載）、及びNP_061947.1（DLL4；配列番号17として本明細書に記載）（各アクセッション番号の配列は参照により本明細書に組み込まれる）に開示される配列、ホモログ、又はそれらの機能的（ノッチ結合）バリアント、フラグメント、もしくは誘導体を含む。これらのカノニカルノッチリガンドは、まとめてDSLリガンドと呼ばれ、典型的には、N-末端領域、DSLドメイン、及び少なくとも2つのEGF様リピートを含み、これらはノッチ受容体のEGFリピート11及び12との相互作用に必要である。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に開示のノッチ受容体アゴニストは、本明細書に記載の椎動物（例えば、哺乳類）又は無脊椎動物のデルタ蛋白質又はJagged蛋白質のようなデルタ蛋白質又はJagged蛋白質の細胞外ドメインを含んでいる。ノッチ1 DLL4の相互作用領域の2.3オングストローム分解能の結晶構造は、結合に重要なリガンド-受容体複合体の構造要素を示している。Luca, V.C., et al., "Structural Basis for Notch1 Engagement of Delta-Like 4," Science 347(6224):847-853 (2015)を参照。Luca, et al (2015)（その全体が本明細書に組み込まれる）は、受容体への結合親和性を高める野生型DLL4の改変をさらに開示しており、ノッチ受容体への結合に必要なカノニカルノッチリガンドの必要かつ重要なドメインをさらに示している。従って、当業者は、既知又は推定のノッチリガンドから最小限のノッチ結合ドメインを容易に同定できる。いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストはDLL1ではない。さらなる実施形態では、T細胞又はT細胞の集団は、DLL1を発現する他の細胞と共培養されない。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本明細書の開示のノッチ受容体アゴニストは、ノッチ受容体に対する親和性の改変（例えば、増強）をもたらす野生型配列の1つ以上の変異を有するポリペプチド配列を含んでもよい。例えば、Luca, V.C., et al., "Structural Basis for Notch1 Engagement of Delta-Like 4," Science 347(6224):847-853 (2015)（その全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているラットDLL4のE12バリアントで実証されているように、G28S、F107L、L206P、N118I、I143F、H194Y、K215Eの変異は、個別に又は任意の組み合わせで、結合の親和性を高めることができる。従って、例示的、非限定的な実施形態では、ノッチ結合ドメインは、配列番号2に記載の配列に対して少なくとも80％（例えば、約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。配列番号2は、全長の前駆体のMNNLからEGF2ドメイン（即ち、アミノ酸位置27〜283）に対応するラットDLL4フラグメントの野生型ポリペプチド配列である。完全長のラットDLL4前駆体は、本明細書において配列番号1として記載されている。いくつかの実施形態では、ノッチ結合ドメインは、以下から選択されるアミノ酸位置で少なくとも1つの置換を含む配列を有するポリペプチドを含む。28、43、52、96、107、118、143、146、183、194、206、215、223、及び257（これらの位置は、配列番号1に記載された参照配列内の位置に関して番号付けされており、他のDLL蛋白質における対応する相同の位置は、アライメントによって容易に確認できる）。特定の実施形態では、少なくとも1つの置換は親和性を高める。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの置換は以下から選択される。G28S、M/V43I、P52S、S96I、F107L、N118I、I143F/T、Q146K、S183N、H194Y、L206P、K215E、L223R、及びN257K、又は相同配列の対応するアミノ酸残基での類似の置換。いくつかの実施態様では、高親和性ノッチ受容体リガンドは、上記に定められた置換のうち少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の置換を含んでいる。上述の置換の任意の組み合わせが企図される。置換の具体的な組み合わせの例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。(i)P52S、F107L、L206P、(ii)F107L、L206P、N257K、(iii)F107L、L223R、N257K、(iv)G28S、M43I、F107L、N118I、(v)G28S、F107L、N118I、Q146K、H194Y、L206P、K215E、(vi)G28S、F107L、N118I、I143F、H194Y、L206P、K215E、(vii)G28S、M43I、S96I、N118I、I143T、S183N、H194Y、L206P、K215E、(viii)G28S、F107L、L206P、及び(ix)G28S、F107L、L206P、N257K（又は、相同配列の対応するアミノ酸残基での同様の置換）。本明細書に包含される例示的なDLL4は、R&D Systems（カタログ番号1506-D4/CF）から入手可能である。
【００７３】
また、Luca, et al (2015)に開示されているように、Jagged蛋白質に対する変異は、ノッチ受容体上での接触及び結合のためのこのリガンド上の重要な残基を示すDLL4の配列にマッピングすることができた。従って、本明細書の開示のノッチ受容体アゴニストは、配列番号4に記載の配列に対して少なくとも80％（例えば、約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。この配列は、完全な野生型ラットJagged1ポリペプチドのアミノ酸32〜295に対応するアミノ酸配列を示している。完全な野生型ラットJagged1ポリペプチドの配列は、配列番号3に記載されている。追加の実施形態では、本明細書の開示のノッチ受容体アゴニストは、配列番号3の位置を参照して、100及び182から選択されるアミノ酸位置での少なくとも1つの置換を含むことができる（但し、配列全体を必要とするわけではなく、他のDLL蛋白質における相同な位置は、アライメントによって容易に確認できる）。特定の実施形態では、少なくとも1つの置換は以下から選択される。P100H、Q183P、及びそれらの組み合わせ。あるいは、相同配列では、少なくとも1つの置換は、相同配列の対応するアミノ酸残基位置（複数可）にあることができる。
【００７４】
他の実施形態では、本明細書の開示のノッチ受容体アゴニストは、配列番号5又は6に記載の配列に対して少なくとも80％（例えば、約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。この配列は、代表的なヒトJagged2（Genbank Accession No. AAD15562.1）及びヒトデルタ様1（DLL1；Genbank Accession No. NP005609.3）の細胞外ノッチ結合領域のアミノ酸配列をそれぞれ示している。上記の構造研究及び他の利用可能なデータを考慮して、当業者は、ノッチ受容体への機能的な結合を依然としてもたらす参照配列の許容されるバリエーションを容易に確認できる。
【００７５】
カノニカルノッチ受容体リガンド又はそのノッチ受容体結合ドメインに加えて、本明細書の開示のノッチ受容体アゴニストは、それがアゴニスト活性を有する又は保持する限り、任意の非カノニカルなノッチ受容体リガンドのノッチ結合ドメイン（又はそのノッチ結合誘導体もしくはフラグメント）を含んでもよい。例えば、Hu, Q., et al., "F3/contactin acts as a functional ligand for Notch during oligodendrocyte maturation," Cell 115(2):163-175 (2003)、Schmidt, M.H., et al., "Epidermal growth factor-like domain 7 (EGFL7) modulates Notch signalling and affects neural stem cell renewal," Nat Cell Biol 11(7):873-880 (2009)、及びD'Souza, B., et al., "Canonical and non-canonical Notch ligands," Curr Top Dev Biol 92:73-129 (2010)を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。当業者が容易にアッセイできる、標的ノッチ受容体に結合及び活性化する能力を保持する任意の断片又は誘導体は、本明細書の開示に包含される。例えば、本明細書の他の場所に開示されたアッセイを参照。いくつかの実施形態では、誘導体は、カノニカルノッチ受容体リガンドのソースノッチ結合ドメインの配列の少なくとも80％（例えば、約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%）のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００７６】
上記の説明は、ラット又はヒトのノッチリガンドの例を含んでいるが、ノッチ受容体アゴニストとして機能するノッチリガンドの哺乳類ソースは、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、サルなどを含む）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、モルモットなどを含む）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジなどの非限定的な例を含むことができることが理解されるであろう。ドロソフィアセレイト及びデルタのような非哺乳類のノッチリガンドもよく知られており、本明細書の開示に包含される。示されているように、ノッチシグナル伝達系は高度に保存されており、従って、ノッチ受容体及びそれぞれのノッチリガンドの間の相同配列位置は、当業者によって容易に確認される。さらに、ノッチ受容体リガンドのアゴニスト活性は、例えば、細胞のノッチ誘導転写活性（例えば、以下に記載するようなHes遺伝子の転写）を検出するアッセイを行うことによって、容易に確認できる。
【００７７】
上述したようなカノニカル又は非カノニカルのノッチリガンド又はそのノッチ結合ドメインに加えて、本明細書の開示に包含されるノッチ受容体アゴニストは、アゴニスト機能を有するノッチ受容体に結合するように設計された親和性試薬であるか、又は含んでもよい。本明細書で使用される「親和性試薬」は、標的抗原、本件ではノッチ受容体のNECDの関連ドメインを、向上した親和性（即ち、バックグラウンドを超えて検出可能）で結合することができ、それによってノッチシグナル伝達を誘導できる任意の分子を指す。ノッチ受容体に対する結合親和性は、特異的又は選択的であることができるが、必須ではない。本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語又はそのバリエーションは、当技術分野で知られている標準的な条件下で、他の分子又はNRRドメイン（後述）に有意に結合することなく、目的の抗原（例えば、ノッチ受容体）に結合する親和性試薬成分の能力を指す。抗原結合分子は、他のペプチド、ポリペプチド、又は蛋白質に結合できるが、例えば、イムノアッセイ、BIAcore、又は当技術分野で知られている他のアッセイによって決定されるように、より低い親和性である。但し、親和性試薬は、好ましくは、他の抗原又はNRRドメインと実質的に交差反応しない。
【００７８】
親和性試薬の例示的な非限定的カテゴリーには、抗体、抗体様分子（抗体誘導体及びその抗原（即ち、ノッチ）結合フラグメントを含む）、特定の抗原と特異的に相互作用するペプチド（例えば、ペプチボディ）、抗原結合スキャフォールド（例えば、DARPins、HEATリピート蛋白質、ARMリピート蛋白質、テトラトリコペプチドリピート蛋白質、及び天然に存在するリピート蛋白質に基づく他のスキャフォールドなど）［例えば、Boersma and Pluckthun, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849-857, 2011、及びその中で引用されている参考文献を参照。それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。］、 アプタマー、又は機能的なノッチ結合ドメインもしくはそのフラグメントを含む。これらの親和性試薬については、以下の「追加定義」の項で詳しく説明している。アゴニスト親和性試薬は、上述のノッチ受容体のNECDに結合するための既知の技術を適用して生成できる。
【００７９】
アゴニスト親和性試薬は、ネガティブ制御領域（NRR）が構造変化を起こす機能性を阻害することなくNECDに結合するときにノッチに「アゴニスト機能を伴って」結合する。上述のように、NECDにはEGF様反復を含む拡張部分があり、その後にNRRが続く。アゴニスト親和性試薬は、NRR内の任意のエピトープを除く、ノッチ受容体のNECD内のエピトープに結合する。これにより、NRRはアゴニスト親和性試薬の結合時に閉じた状態を変化させ、S2蛋白質分解部位を露出してシグナル伝達を可能にする。シグナル伝達能力を付与するために結合可能なNECDのドメインは、典型的にはN末端からNRRの始まりの直前まで伸びている。例えば、Gordon et al., Blood, 113(18):4381-4390 (2009)の図1を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。結合のためのNECDの標的ドメインには、EGF様リピートモチーフを含む。いくつかの実施形態では、アゴニスト親和性試薬が結合するエピトープを含むドメインは、例えば、配列番号7のアミノ酸位置1〜約アミノ酸位置1446（ノッチ1受容体の場合）、配列番号8のアミノ酸位置1〜約アミノ酸位置1421（ノッチ2受容体の場合）、配列番号9のアミノ酸位置1〜約アミノ酸位置1383（ノッチ3受容体の場合）、配列番号10のアミノ酸位置1〜約アミノ酸位置1170（ノッチ4受容体）に対応する領域にある。NRRを除く他のノッチ相同体のNECDのサブドメインは、上記のアミノ酸位置との比較、及びGordon et al., Blood, 113(18):4381-4390 (2009)に開示されているアライメントに基づいて、容易に決定できる。
【００８０】
示されるように、アゴニスト親和性試薬は、抗体又はノッチ受容体結合フラグメント及びその誘導体を含む。本明細書の開示に包含されるノッチに結合する非限定的で例示的な抗体は、N1抗ノッチ1抗体（HMN1-519, Biolegend カタログ#352104）のほか、例えば、Wu et al., Nature 464:1052-57 (2010); U.S. Patent No. 9,683,039 B2, 10,370,643 B2, 10,208,286 B2, 9,221,902 B2, 6,689,744 B2, 6,090,922 A, 又は6,149,902 A; 又はU.S. Publication No. 2011/0286916 A1, 又は2005/0222074 A1（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のノッチ1アゴニスト抗体を含む。非限定的で例示的なノッチ2アゴニスト抗体は、限定されないが、HMN2-25（「N2」とも呼ばれる。Biolegendカタログ番号348301）、又は例えば、Wu et al., Nature 464:1052-57 (2010); U.S. Patent No. 9,683,039 B2, 10,370,643 B2, 10,208,286 B2, 9,221,902 B2, 6,090,922 A, 又は6,149,902 A; 又はU.S. Publication No. 2005/0222074 A1（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の抗体を含む。非限定的で例示的なノッチ3アゴニスト抗体は、限定されないが、例えば、Machuca-Parra et al., J. Exp. Med. 214(08):2271-82 (2017); Li et al., J. Biol. Chem. 283(12):8046-54 (2008); U.S. Patent No. 9,518,124 B2, 9,089,556 B2, 9,221,902 B2, 8,513,388 B2, 6,090,922 A, 又は6,149,902 A; U.S. Publication No. 2008/0118520 A1, 2008/0131908 A1, 又は2005/0222074 A1; 又はInternational Application No. WO 2010/141249 A2（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の抗体を含む。非限定的で例示的なノッチ4アゴニスト抗体は、限定されないが、例えば、U.S. Patent No. 10,227,567 B2, 9,221,902 B2, 6,090,922 A, 又は6,149,902 A; or U.S. Publication No. 2005/0222074 A1（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の抗体を含む。
【００８１】
上述のように、アゴニストによって誘導されるノッチシグナルは、十分なアゴニスト結合親和性を必要とするだけでなく、その結合は、S2切断部位での蛋白質分解切断を可能にする必要な構造変化を誘導するために、十分なメカニカル力又は「引っ張り」を適用する態様でなければならない。従って、ノッチ受容体アゴニストは、必要な力や引っ張りを適用できるように、ノッチ発現細胞に適切に提示されなければならない。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、T細胞を接触させたときにノッチシグナルを刺激する能力に悪影響を及ぼさない態様で固定化されている。ノッチ受容体アゴニストは、組織培養プレートの表面などの表面、又は培地中で混合可能な粒子やビーズに固定化できる。例えば、プレートやウェルの表面に固定化することで、ノッチを発現しているT細胞が転がっていくことを防ぎ、それによってリガンド-受容体複合体にノッチの状態を変化させるのに十分な張力を与えることができる。同様に、リガンドに粒子又はビーズ、あるいは他のかさ高い担体を付着させると、バルク又は重量が得られ、同様にリガンド-受容体複合体に張力が生じる。他の実施形態では、ノッチアゴニストは、ヒドロゲルなどの可溶性スキャフォールドに付着する。他のサービス又はスキャフォールドと同様に、これはリガンドに安定性を与え、細胞が転がっていくことを防ぎ、それによってリガンド-受容体複合体に張力を生じさせる。スキャフォールドの溶解能力は、シグナル伝達に時間的な制限を加えることができる。スキャフォールドが培地に溶解すると、付着したリガンドが放出され、ノッチシグナル伝達を刺激する能力を失う。さらに別の実施形態では、ノッチアゴニストは多量体形態で存在できる。多量体のリガンドは、複数のノッチ発現細胞に同時に結合できる。結合した複数のノッチ発現細胞のそれぞれによって加えられるバルク及びカウンターウェイトは、蛋白質分解切断及びその後のシグナル伝達を開始するのに必要な構造変化を誘発するのに必要な張力又は「引っ張り」を作り出す。いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、T細胞又はT細胞の集団と共培養された細胞上に発現しないか、さもなければ提示されない。いくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞の集団は、ノッチ受容体アゴニストを発現する抗原提示細胞（APC）の存在下で培養されない。例えば、いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、培地中のAPC上に発現していない。いくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞の集団は、デルタ様リガンド4（DLL4）を発現する抗原提示細胞（APC）の存在下では培養されない。
【００８３】
上述の様々なノッチ受容体アゴニストは、異なるノッチ受容体（例えば、ノッチ1、ノッチ2、ノッチ3、ノッチ4など）に対して異なる親和性を有するが、適切なノッチ受容体アゴニストの選択の間の機能的な違いは、標的細胞における特定のノッチ受容体の有病率に依存する単なる量的なものである。典型的には親和性が低いと、細胞を一括して曝露した際のシグナルの総量が少なくなる。従って、所望の標的細胞に広く存在するノッチ受容体に対する親和性が比較的低いノッチ受容体であっても使用できる。これは、いくつかの実施形態において、より低いレベルのシグナル伝達が望まれる場合に好ましい。あるいは、比較的低い親和性は、例えば、提示されるアゴニストの密度を高めたり、及び/又は共刺激分子及び/又はサイトカインのレベルを高めたりすることによって補償できる。ノッチ受容体アゴニストの選択、ノッチ受容体アゴニストの密度、及び補因子及び/又はサイトカインの選択及び濃度などの要因を調整することで、ノッチシグナル伝達の強度を制御できる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストを培地中の所定の密度又は濃度でT細胞のバッチと接触させて、T細胞のバッチにおけるノッチシグナル伝達の程度を制御することを容易にする。
【００８５】
例えば、ノッチ受容体アゴニストは、約0.01μg/ml〜約10μg/mlの濃度（例えば、約0.025μg/ml、約0.05μg/ml、約0.1μg/ml、約0.25μg/ml、約0.5μg/ml、約0.75μg/ml、約1μg/ml、約2μg/ml、約3μg/ml、約4μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約7μg/ml、約8μg/ml、約9μg/ml、約10μg/ml）で固定化される。他の実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、約100μg/mlまでの濃度（例えば、約10μg/ml、約15μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml、約30μg/ml、約35μg/ml、約40μg/ml、約45μg/ml、約50μg/ml、約55μg/ml、約60μg/ml、約65μg/ml、約70μg/ml、約75μg/ml、約80μg/ml、約85μg/ml、約90μg/ml、約95μg/ml、及び約100μg/ml、又はそれらの任意の範囲）で固定化される。典型的には、標的T細胞が発現するノッチ受容体に対するノッチ受容体アゴニストの親和性が高いほど、同等のノッチシグナル伝達を実現するために必要なノッチ受容体アゴニストの密度又は濃度は低くなる。1つの例示的な実施形態では、抗ノッチ1抗体、N1は、約0.25μg/ml〜約2.5μg/mlの濃度（例えば、0.25μg/ml、約1μg/ml、約2.5μg/ml）で提示することができる。別の例示的な実施形態では、カノニカルノッチリガンドDLL1、又はそのノッチ結合ドメインは、約2.5μg/ml〜約10μg/mlの濃度で提示できる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、上述したような2つ以上のノッチ受容体アゴニストの組み合わせは、構造変化を誘発してシグナル伝達を開始するためのメカニカル力又は「引っ張り」を課すのに十分な態様で、標的T細胞に曝される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、T細胞のバッチは、有意な細胞間ノッチシグナル伝達が誘導される閾値を超えない細胞濃度でノッチ受容体アゴニストに曝される。典型的には、培養条件で固定化された基材に結合できる最大量の細胞を加える。
【００８８】
培地
方法は、典型的には、当業者が容易に判断・適用できるような、細胞の生存率の維持や増殖をサポートする培養条件で行われる。
【００８９】
上述のように、培地は、ノッチ受容体アゴニストを固定化したフラスコやプレートなどの容器に入れることができる。あるいは、容器に含まれる液体培地は、その中に分散されたノッチ受容体アゴニストを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、粒子又はビーズの表面に固定化され、ここで、粒子又はビーズは培地中に分散されている。
【００９０】
いくつかの実施形態では、培地は、T細胞の維持及び/又は刺激を促進する追加の成分又は条件を含み、その結果、上述したように、より高い増殖能力を有する比較的未分化な状態を維持又は復帰するT細胞が得られる。成分及び条件は、より分化した状態への進行を促進することなく、細胞の増殖、エクスパンド、及び活性化を促進できる。このような条件は、遺伝子操作のために細胞をプライムするように設計することもできる。
【００９１】
例示的な培養因子には、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、及び/又は刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合蛋白質、組換え可溶性受容体、及びT細胞の活性化を促進するように設計された他の任意の薬剤を含む。
【００９２】
さらに、酸素及び二酸化炭素レベル、温度、培養時間、光照射などの様々な条件を制御することで、本方法のパフォーマンスを促進又は最適化できる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、T細胞におけるTCR/CD3シグナルカスケードを刺激する因子を培地に含めることができる。例えば、CD3、CD28、及び/又は4-1BBに特異的な抗体又は抗体フラグメントなどの結合（親和性）剤を、T細胞の刺激及び増殖の誘導を助けるために含めることができる。当技術分野で知られている他の例示的なT細胞刺激因子は、本明細書の開示に包含される。そのような因子は、その存在を制御できるように、ビーズなどの固体支持体上に含めることができる。例えば、以下に説明するアッセイは、抗CD3抗体及び抗CD28抗体を提示したビーズ（即ち、DYNABEADS(R)；ThermoFisher）の使用を含む。後述するように、このような試薬は、所望のT細胞の最終的な抽出及び選択にも有用である。代替的又は追加的に、培地は、上述のノッチリガンドを発現する細胞、及び/又は1つ以上のT細胞刺激性又は共刺激分子を含んでもよい。例えば、この目的に有用な例示的な細胞株は、OP9（ATCC(R) CRL-2749TM）があり、これは、T細胞の刺激及び増殖を誘導できるマウス骨髄ストローマ細胞に由来する。他の実施形態では、Fc受容体を発現する細胞を含んでもよい。但し、他の実施形態では、T細胞（例えば、ナイーブT細胞）は、追加の細胞と共培養されない。いくつかの実施形態では、T細胞（例えば、ナイーブT細胞）は、抗原提示細胞と共培養されていない。いくつかの実施形態では、T細胞（例えば、ナイーブT細胞）は、骨髄細胞と共培養されない。いくつかの実施形態では、T細胞（例えば、ナイーブT細胞）は、OP9細胞と共培養されていない。追加の実施形態では、T細胞（例えば、ナイーブT細胞）は、OP9 DL1細胞と共培養されていない。さらに他の実施形態では、T細胞又はT細胞の集団（例えば、ナイーブT細胞）は、ノッチ受容体アゴニストを発現する抗原提示細胞（APC）と共培養されない。いくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞の集団（例えば、ナイーブT細胞）は、DLL4を発現するAPCと共培養されない。
【００９４】
シグナル因子（例えば、サイトカイン又はその生物学的に活性な断片）の様々なカクテルを、培養相の一部又は全部の培養条件に含めて、T細胞の活性化及び増殖を促進できる。いくつかの実施形態では、シグナル因子は、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、タイプI IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、及びTNFR2の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドである。1つ以上のサイトカインの所定の濃度を有する様々なサイトカインカクテルが企図され、IL-1、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-γ、TNF-α、TGF-β、又はその生物学的に活性な断片などの1つ以上の例示的なサイトカインを、任意の組み合わせで、当業者が容易に決定できる適切な濃度で含んでもよい。いくつかの実施形態では、培地は、Th1プロファイルを促進する1つ以上のサイトカイン（例えば、IFN-γ及び/又はIL-12）を含む。他の実施形態では、培地は、Th17プロファイルを促進するサイトカイン（例えば、TGF-β、IL-6、IL-21、及び/又はIL-23）を任意の組み合わせで含む。例えば、一実施形態では、IL-2を少なくとも約10単位/mlの濃度で使用できる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、培養条件は、フィーダー細胞（例えば、非分裂末梢血単核細胞（PBMC））を含めることも含んでもよい。PBMCへはフィーダー細胞の細胞分裂を防ぐために放射線照射できる。フィーダー細胞は、培養物中のフィーダー細胞と初期T細胞の比率が2：1以上（例えば、2：1、3：1、5：1、10：1、20：1、50：1又はそれより大きい）になる量で含まれ得る。
【００９６】
1つ以上のT細胞は、細胞内でノッチシグナルを誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストに曝される。曝露の時間は、ノッチ受容体アゴニスト及び/又は複数のT細胞の密度又は濃度、T細胞サブタイプのアイデンティティ、又はT細胞のソースによって影響を受け得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、曝露期間は、約12時間〜約20日の間（例えば、約1日〜約15日の間、約2日〜約12日の間、約2日〜約10日の間、約2日〜約8日の間、約3日〜約7日の間、約3日〜約6日の間、及び約4日〜約5日）の間であり得る。いくつかの実施形態では、1つ以上のT細胞は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、又はそれより多くの日数、ノッチ受容体アゴニストに曝される。
【００９７】
他の実施形態（例えば、T細胞（例えば、TN細胞）の集団を培養する実施形態）では、曝す工程は、少なくとも約12時間、少なくとも約1日、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約1週間、少なくとも約8日、少なくとも約9日、少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、少なくとも約15日、少なくとも約16日、少なくとも約17日、少なくとも約18日、少なくとも約19日、少なくとも約20日、少なくとも約21日、少なくとも約22日、少なくとも約23日、少なくとも約24日、少なくとも約25日、少なくとも約26日、少なくとも約27日、少なくとも約28日、少なくとも約29日、少なくとも約30日、又は少なくとも約1ヶ月の期間（「曝露時間」）続く。いくつかの実施形態では、曝露時間は、1日から15日の間、又は2日から10日の間である。TN細胞の集団を培養する実施形態では、集団中のTN細胞の割合は、曝す工程後に変化しない。いくつかの実施形態では、集団中のTN細胞の割合は、曝す工程後に、約1％未満、約2％未満、約5％未満、約10％未満、約15％未満、約20％未満、約25％未満、約30％未満、約35％未満、約40％未満、約45％未満、又は約50％未満で変化する。いくつかの実施形態では、集団中のTN細胞の割合は、(i)曝す工程前に少なくとも約40%及び曝す工程後に少なくとも約40％、(ii)曝す工程前に少なくとも約50%及び曝す工程後に少なくとも約40％、(iii)曝す工程前に少なくとも約50%及び曝す工程後に少なくとも約50％、(iv)曝す工程前に少なくとも約50%及び曝す工程後に少なくとも約60％、(v)曝す工程前に少なくとも約60%及び曝す工程後に少なくとも約50％、(vi)曝す工程前に少なくとも約60%及び曝す工程後に少なくとも約60％、(vii)曝す工程前に少なくとも約60%及び曝す工程後に少なくとも約70％、(viii)曝す工程前に少なくとも約70%及び曝す工程後に少なくとも約60％、(ix)曝す工程前に少なくとも約70%及び曝す工程後に少なくとも約70％、(x)曝す工程前に少なくとも約70%及び曝す工程後に少なくとも約80％、(xi)曝す工程前に少なくとも約80%及び曝す工程後に少なくとも約70％、(xii)曝す工程前に少なくとも約80%及び曝す工程後に少なくとも約80％、(xiii)曝す工程前に少なくとも約80%及び曝す工程後に少なくとも約90％、(xiv)曝す工程前に少なくとも約90%及び曝す工程後に少なくとも約80％、(xv)曝す工程前に少なくとも約90%及び曝す工程後に少なくとも約90％、又は(xvi)曝す工程前に少なくとも約90%及び曝す工程後に少なくとも約100％である。いくつかの実施形態では、TN細胞、TN細胞の集団、又はその1つ以上の子孫細胞が、ノッチ受容体アゴニストを受けなかったTN細胞と比較して、インビボで少なくとも1.2倍、少なくとも1.3倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.7倍、少なくとも1.8倍、少なくとも1.9倍、少なくとも2.0倍、少なくとも2.2倍、少なくとも2.3倍、少なくとも2.4倍、少なくとも2.5倍、少なくとも2.6倍、少なくとも2.7倍、少なくとも2.8倍、少なくとも2.9倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4.0倍、少なくとも4.5倍、少なくとも5.0倍、少なくとも5.5倍、少なくとも6.0倍、少なくとも6.5倍、又は少なくとも7.0倍少ない分化状態を維持する。
【００９８】
特定の実施形態では、本明細書に開示のいくつかの方法は、T細胞又はT細胞の集団を、細胞内にノッチ受容体シグナル伝達を誘導するのに十分な時間、ノッチ受容体アゴニストを含む培地に曝す工程を含み、ここで、ノッチ受容体アゴニストはペプチドリガンドであり、T細胞はOP9-DL1細胞又はDLL1を発現する骨髄細胞と共培養されない。いくつかの実施形態では、T細胞又はT細胞の集団は、OP9-DL1細胞と共培養したT細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約110%、少なくとも約120%、少なくとも約130%、少なくとも約140%、少なくとも約150%、少なくとも約160%、少なくとも約170%、少なくとも約180%、少なくとも約190%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、又は少なくとも約300%疲弊が少ない。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、T細胞及び/又はその子孫を、ノッチ受容体アゴニストから、場合によっては初期培地から単離する工程をさらに含む。細胞は、以下に詳述するように、フローサイトメトリーを用いて細胞表面の発現をプロファイリングすることなどによって、表現型を評価できる。細胞は、以下に詳述するように、対象に投与するために適切に製剤化することもできる。また、対象に投与するために、細胞をさらに追加の細胞と組み合わせることもできる。例えば、ノッチ受容体アゴニストに曝された細胞は、主に又は大部分CD4+細胞であることができる。ノッチ受容体アゴニストとのインキュベーション後、CD4+ T細胞は、ノッチ受容体アゴニストに別々に暴露されていてもいなくてもよいCD8+T細胞と組み合わせて、又は協調的に投与できる。
【０１００】
細胞の改変
本明細書の開示は、T細胞が、細胞の表現型及び/又は性能を変化させる遺伝子改変を含む態様及び実施形態も包含する。例えば、一態様では、本明細書の開示による異種ポリヌクレオチド又は発現ベクターを含むT細胞が提供され、またその生産方法も提供される。いくつかの実施形態では、T細胞は異種ポリヌクレオチドによってコードされる抗原結合蛋白質をその細胞表面に発現する。このようなT細胞は特異的に調整された養子細胞治療技術に有用である。いくつかの実施形態では、明細書の開示の方法は、T細胞を異種核酸でトランスダクションして、トランスジェニック又は遺伝的に改変されたT細胞を生産することを含む。遺伝子改変は、本明細書に記載の培養方法の前、間、又は後に実施できる。T細胞は、本明細書に記載の任意のT細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、T細胞のノッチ受容体アゴニストへの最初の曝露後の期間、例えば、トランスダクション工程の前に約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又はそれより多い日に渡って培養される。いくつかの実施形態では、トランスダクション工程の前に、細胞を約1日、2日、又は3日培養する。
【０１０１】
これらの工程により、組換えT細胞が得られる。本明細書では、「組換え」という用語は、ヒトの介入によって遺伝子操作された、即ち異種核酸分子の導入によって改変された細胞、微生物、核酸分子、又はベクターを指し、又は内因性の核酸分子又は遺伝子の発現がコントロールされ、脱制御され、欠失し、減衰し、又は構成的になるように改変された細胞又は微生物を指す。ヒト由来の遺伝子改変には、例えば、1つ以上の蛋白質や酵素をコードする核酸分子（プロモーターなどの発現制御要素を含んでいてもよい）を導入する改変や、核酸分子の付加、欠失、置換などの機能的な破壊や細胞の遺伝物質への付加などの変異を含む。例示的な改変には、参照分子又は親分子からの異種又は相同のポリペプチドのコード領域又はその機能的断片におけるものを含む。
【０１０２】
本明細書では、「変異」は、参照分子又は野生型の核酸分子又はポリペプチド分子と比較して、それぞれ核酸分子又はポリペプチド分子の配列が変化することを指す。変異は、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む、いくつかの異なるタイプの配列の変化をもたらすことができる。特定の実施形態では、変異は、1つ又は3つのコドン又はアミノ酸の置換、1〜約5つのコドン又はアミノ酸の欠失、又はそれらの組み合わせである。
【０１０３】
本明細書では、「トランスダクション（transduce、transduction）」という用語は、異種核酸をT細胞に導入して、T細胞の遺伝子改変をもたらすことを指す。遺伝子操作された構成要素、例えば、（新規又は改変された）サイトカイン及び免疫受容体（例えば、CARs及びTCRs）をコードする遺伝子コンストラクトを導入するための様々な方法は、よく理解されており、開示された方法及び組成物と共に使用できる。
【０１０４】
そのような例示的な方法には、ウイルス、例えば、レトロウイルス又はレンチウイルス、トランスダクション、トランスポゾン、及びエレクトロポレーションを介したものを含む、受容体をコードする核酸の移転のための方法を含む。いくつかの実施形態では、トランスダクションの結果、T細胞が異種核酸によってコードされる異種蛋白質を発現する能力を有する。いくつかの実施形態では、異種核酸（例えば、DNA、RNA、又はcDNA）は、細胞の核内での異種核酸の発現を促進するベクター（例えば、ウイルス発現ベクター）に含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは細胞のゲノムにおける異種核酸の統合を促進する。
【０１０５】
さらに例示すると、「コンストラクト」という用語は、組換え核酸分子を含む任意のポリヌクレオチドを指す。上に示したように、コンストラクトは、ベクター（例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター）中に存在してもよいし、ゲノムに組み込まれてもよい。「ベクター」は、別の核酸分子を輸送できる核酸分子のことである。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半合成又は合成核酸分子を含む得る直鎖状又は環状DNA又はRNA分子であってもよい。例示的なベクターは、自律的な複製（エピソームベクター）又は連結された核酸分子の発現（発現ベクター）が可能なものである。
【０１０６】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病、水胞性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹、センダイ）などのネガティブ鎖RNAウイルス、ピコルナウイルス及びアルファウイルスなどのポジティブ鎖RNAウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型及び2型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、ファウルポックス、及びカナライポックス）などの二鎖DNAウイルスを含む。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスなどを含む。レトロウイルスの例としては、例えば、鳥類白血病サルコーマ、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスを含む（Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。「レンチウイルスベクター」は、本明細書で使用される場合、遺伝子送達のためのHIVベースのレンチウイルスベクターを意味し、これは統合的又は非統合的であることができ、比較的大きなパッケージング容量を有し、様々な異なる細胞型にトランスダクションできる。レンチウイルスベクターは、典型的には、3つ（パッケージング、エンベロープ、トランスファー）以上のプラスミドを生産細胞に一過性にトランスフェクションして生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターはウイルス表面の糖蛋白質が細胞表面の受容体と相互作用することで標的細胞に侵入する。侵入したウイルスRNAは、ウイルスの逆転写酵素複合体によって逆転写される。逆転写の産物は二本鎖直鎖ウイルスDNAであり、これは感染細胞のDNAにウイルスを組み込むための基質となる。
【０１０７】
遺伝子改変体は、標的T細胞における新規又は改変されたトランスジェニック配列の発現を促進するように構成されたプロモーターなどの、機能性を付与する核酸配列に作動可能に連結できる。このように、「作動可能に連結」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響を受けるように、単一の核酸断片上に2つ以上の核酸分子が集合していることを意味する。例えば、プロモーターは、そのコーディング配列の発現に影響を与えることができる場合（即ち、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コーディング配列と作動可能に連結される。「非連結」は、集合する遺伝要素が互いに密接に集合しておらず、一方の機能が他方に影響を与えないことを意味する。
【０１０８】
本明細書で使用する「発現ベクター」は、好適な宿主において核酸分子の発現を生じさせることができる好適な制御配列に作動可能に連結している核酸分子を含有するDNAコンストラクトを指す。そのような制御配列には、転写を生じさせるプロモーター、そのような転写を制御するための必要に応じたオペレーター配列、好適なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、ウイルス、又は単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。好適な宿主細胞に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムから独立して複製及び機能することができ、又は一部の場合には、自体を宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。本明細書では、「プラスミド」、「発現プラスミド」、「ウイルス」及び「ベクター」は、しばしば同義で使用される。
【０１０９】
本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子などの核酸分子のコード化配列に基づいてポリペプチドが生産されるプロセスを意味する。このプロセスには、転写、転写後の制御、転写後の修飾、翻訳、翻訳後の制御、翻訳後の修飾、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１１０】
核酸分子を細胞に挿入する文脈での用語「導入した（introduced）」は、「トランスフェクション」、「形質転換」又は「トランスダクション」を意味し、核酸分子を細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド又はミトコンドリアDNA）に組み込むことができる、自律レプリコンに変換できる、又は（例えば、トランスフェクトされたmRNAを）一過性に発現できる、真核又は原核細胞への核酸分子の組込みへの言及を含む。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「異種」核酸分子、コンストラクト又は配列とは、宿主細胞にとってネイティブでないが、宿主細胞由来の核酸分子又は核酸分子の部分に対して相同であり得る、核酸分子又は核酸分子の部分を指す。異種核酸分子、コンストラクト又は配列のソースは、異なる属又は種からであり得る。特定の実施形態では、異種核酸分子は、例えば、コンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによって、宿主細胞又は宿主ゲノムに添加され（即ち、内因性でもネイティブでもない）、ここで、添加された分子は、宿主ゲノム中に組み込まれ得、又は染色体外遺伝物質として（例えば、プラスミド又は他の形態の自己複製性ベクターとして）存在し得、複数コピーで存在し得る。さらに、「異種」は、その宿主細胞が相同な蛋白質又は活性をコードする場合であっても、宿主細胞中に導入された異種ポリヌクレオチドによってコードされる非ネイティブの酵素、蛋白質又は他の活性を指す。
【０１１２】
本明細書に記載するように、1超の異種核酸分子が、別々の核酸分子として、複数の個々に制御される遺伝子として、ポリシストロニック核酸分子として、融合蛋白質をコードする単一の核酸分子として、又はそれらの任意の組み合わせとして、宿主細胞中に導入され得る。例えば、本明細書で開示されているように、標的抗原ペプチドに特異的な所望の結合蛋白質（例えば、TCR分子及び/又は抗体）をコードする2つ以上の異種核酸分子を発現するように、宿主細胞を改変できる。2つ以上の異種核酸分子が宿主細胞中に導入される場合、これら2つ以上の異種核酸分子は、単一の核酸分子として（例えば、単一のベクター上に）、別々のベクター上に、単一の部位もしくは複数の部位において宿主染色体中に組み込まれて、又はそれらの任意の組み合わせで導入され得ることが理解される。言及された異種核酸分子又は蛋白質活性の数は、コード核酸分子の数又は蛋白質活性の数を指すが、宿主細胞中に導入された別々の核酸分子の数を指すわけではない。
【０１１３】
他の実施形態では、宿主T細胞のゲノムを遺伝子編集技術で改変して、抗原特異的分子の活性を高めたり、発現を変化させたりした改変宿主細胞又は人工宿主細胞を提供できる。
【０１１４】
例示すると、いくつかの実施形態では、染色体遺伝子ノックアウト又は遺伝子ノックインは、宿主T細胞の染色体編集によってなされ得る。染色体編集は、例えば、エンドヌクレアーゼを使用して、行うことができる。本明細書で使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合の切断を触媒できる酵素を指す。特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、標的遺伝子を切断することによって標的遺伝子を不活性化又は「ノックアウト」できる。エンドヌクレアーゼは、天然に存在するエンドヌクレアーゼ、組換えエンドヌクレアーゼ、遺伝子修飾エンドヌクレアーゼ又は融合エンドヌクレアーゼであってもよい。エンドヌクレアーゼにより引き起こされる核酸鎖切断は、一般に、相同組換え又は非相同末端結合（NHEJ）の明確に異なる機序によって修復される。相同組換え中に、ドナー核酸分子は、ドナー遺伝子「ノックイン」に、標的遺伝子「ノックアウト」に、及び必要に応じて、ドナー遺伝子ノックイン又は標的遺伝子ノックアウト事象によって標的遺伝子を不活性化するために、使用され得る。NHEJは、DNA配列の切断部位での変化、例えば、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失又は付加をもたらすことが多い、エラープローン修復プロセスである。NHEJは、標的遺伝子を「ノックアウトする」ために使用されることもある。エンドヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、CRISPR-Casヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びメガTALを含む。
【０１１５】
本明細書で使用する「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（ZFN）は、Foklエンドヌクレアーゼなどの、非特異的DNA切断ドメインに融合されたジンクフィンガーDNA結合ドメインを含む融合蛋白質を指す。約30アミノ酸の各ジンクフィンガーモチーフがDNAの約3塩基対と結合し、ある特定の残基におけるアミノ酸を変化させてトリプレット配列特異性を変更できる（例えば、Desjarlais et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:2256-2260, 1993; Wolfe et al., J. Mol. Biol. 285:1917-1934, 1999を参照）。複数のジンクフィンガーモチーフをタンデムに連結させて、所望のDNA配列、例えば、約9〜約18塩基対の範囲の長さを有する領域、に対する結合特異性を生じさせることができる。背景として、ZFNは、ゲノム内での部位特異的DNA二本鎖切断（DSB）の形成を触媒することによりゲノム編集を媒介し、DSBの部位にゲノムに相同な隣接配列を含むトランスジーンの標的組込みが相同組換え修復により容易になる。あるいは、ZFNにより生じたDSBは、切断部位のヌクレオチドの挿入又は欠失を生じさせる結果となるエラープローン細胞修復経路である非相同末端結合（NHEJ）による修復を介して、標的遺伝子のノックアウトをもたらし得る。特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、ZFN分子を使用してなされる挿入、欠失、変異又はそれらの組合せを含む。
【０１１６】
本明細書で使用する「転写活性化因子様エフェクター（TALE）ヌクレアーゼ」（TALEN）は、FokIエンドヌクレアーゼなどの、TALE DNA結合ドメインとDNA切断ドメインとを含む融合蛋白質を指す。「TALE DNA結合ドメイン」又は「TALE」は、12番目及び13番目のアミノ酸が異なる高度に保存された33〜35アミノ酸配列を各々が一般に有する、1つ以上のTALE反復ドメイン/ユニットで構成されている。TALE反復ドメインは、TALEの標的DNA配列への結合に関与する。反復可変二残基（RVD）と呼ばれる、異なるアミノ酸残基は、特異的ヌクレオチド認識と相関する。これらのTALEのDNA認識についての天然（標準）コードは、TALEの12及び13位のHD（ヒスチジン-アスパラギン酸）配列が、シトシン(C)へのTALE結合をもたらし、NG（アスパラギン-グリシン）がTヌクレオチドと、NI（アスパラギン-イソロイシン）がAと結合し、NN（アスパラギン-アスパラギン）がG又はAヌクレオチドと結合し、NG（アスパラギン-グリシン）がTヌクレオチドと結合するように、決定された。非カノニカル（非定型）RVDもまた公知である（例えば、U.S. Patent Publication No. US 2011/0301073を参照。この非定型RVDはそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。TALENを使用して、T細胞のゲノム内での部位特異的二本鎖切断（DSB）を指示できる。非相同末端結合（NHEJ）は、アニーリングのための配列重複がほとんど又は全くない、二本鎖切断の両側からのDNAをライゲーションし、それによって、遺伝子発現をノックアウトする誤りを導入する。あるいは、相同組換え修復は、相同隣接配列がトランスジーンに存在することを条件に、そのトランスジーンをDSBの部位に導入できる。特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、TALEN分子を使用してなされる挿入、欠失、変異、又はそれらの組合せを含む。
【０１１７】
本明細書で使用する「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート/Cas」（CRISPR/Cas）ヌクレアーゼシステムは、塩基対合相補性によってゲノム内の標的部位（プロトスペーサーとして公知）を認識するために、そしてその後、短い保存プロトスペーサー関連モチーフ（PAM）が相補標的配列の3'の直後に続く場合にはDNAを切断するために、CRISPR RNA（crRNA）誘導型Casヌクレアーゼを利用するシステムを指す。CRISPR/Casシステムは、Casヌクレアーゼの配列及び構造に基づいて3つの型（即ち、I型、II型及びIII型）に分類される。I型及びIII型のcrRNA誘導型監視複合体は、複数のCasサブユニットを必要とする。最もよく研究されているII型システムは、少なくとも次の3つの成分を含む：RNA誘導型Cas9ヌクレアーゼ、crRNA、及びトランス作用性crRNA（tracrRNA）。tracrRNAは、二重鎖形成領域を含む。crRNA及びtracrRNAは、Cas9ヌクレアーゼと相互作用すること及びcrRNA上のスペーサーとPAMから上流の標的DNA上のプロトスペーサーとの間のワトソン・クリック塩基対合によって標的DNA上の特定の部位にCas9/crRNA：tracrRNA複合体を誘導できる、二重鎖を形成する。Cas9ヌクレアーゼは、crRNAスペーサーにより規定される領域内で二本鎖切断を行う。NHEJによる修復は、標的遺伝子座の発現を破壊する挿入及び/又は欠失をもたらす。あるいは、相同隣接配列を伴うトランスジーンを相同組換え修復によってDSBの部位に導入できる。crRNA及びtracrRNAを操作して一本鎖ガイドRNA（sgRNA又はgRNA）にできる（例えば、Jinek et al., Science 337:816-21, 2012を参照）。さらに、標的部位に相補的なガイドRNAの領域を、所望の配列を標的とするように変更又はプログラムできる（Xie et al., PLOS One 9:e100448, 2014、U.S. Pat. Appl. Pub. No. US 2014/0068797、U.S. Pat. Appl. Pub. No. US 2014/0186843、U.S. Pat. No. 8,697,359、及びPCT Publication No. WO 2015/071474。これらの各々は、参照により組み込まれる）。特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは挿入、欠失、変異、又はそれらの組合せを含み、それは、CRISPR/Casヌクレアーゼシステムを使用してなされる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、そうでなければ人工T細胞の機能に阻害的又は有害な影響を及ぼす可能性のある自己由来の遺伝子及び蛋白質の発現又は活性を低減することが有利である場合がある。即ち、染色体遺伝子ノックアウトを実施できる。用語「染色体遺伝子ノックアウト」は、機能的に活性な内因性ポリペプチド産物の宿主細胞による生産を妨げる宿主細胞の遺伝子改変を指す。染色体遺伝子ノックアウトの得られる変化には、例えば、導入されたナンセンス変異（早発停止コドンの形成を含む）、ミスセンス変異、遺伝子欠失、及び鎖切断、並びに宿主細胞における内因性遺伝子発現を阻害する阻害性核酸分子の異種発現が含まれ得る。例示的なgRNA配列、及びそれらを使用して、免疫細胞蛋白質をコードする内在性遺伝子をノックアウトする方法は、Ren et al., Clin. Cancer Res. 23(9):2255-2266 (2017)に記載されるものを含み、この文献のgRNA、CAS9 DNA、ベクター及び遺伝子ノックアウト技法は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
本明細書で使用する「ホーミングエンドヌクレアーゼ」とも呼ばれる「メガヌクレアーゼ」は、大きい認識部位（約12〜約40塩基対の二本鎖DNA配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼは、配列及び構造モチーフに基づいて次の5つのファミリーに分類できる：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cysボックス、及びPD-(D/E)XK。例示的なメガヌクレアーゼとしては、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII、及びI-TevIIIを含み、これらの認識配列は公知である（例えば、U.S. Patent Nos. 5,420,032及び6,833,252; Belfort et al., Nucleic Acids Res. 25:3379-3388, 1997; Dujon et al., Gene 82:115-118, 1989; Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127, 1994; Jasin, Trends Genet. 12:224-228, 1996; Gimble et al., J. Mol. Biol. 263:163-180, 1996; Argast et al., J. Mol. Biol. 280:345-353, 1998を参照）。
【０１２０】
特定の実施形態では、PD-1、LAG3、TIM3、CTLA4、TIGIT、anHLA-コード遺伝子、又はTCRコンポーネントコード遺伝子から選択される標的の部位特異的ゲノム改変を促進するために、天然に存在するメガヌクレアーゼを使用できる。他の実施形態では、標的遺伝子に対する新規の結合特異性を有する人工メガヌクレアーゼを、部位特異的なゲノム改変のために使用する（例えば、Porteus et al., Nat. Biotechnol. 23:967-73, 2005; Sussman et al., J. Mol. Biol. 342:31-41, 2004; Epinat et al., Nucleic Acids Res. 31:2952-62, 2003; Chevalier et al., Molec. Cell 10:895-905, 2002; Ashworth et al., Nature 441:656-659, 2006; Paques et al., Curr. Gene Ther. 7:49-66, 2007; U.S. Patent Publication Nos. US 2007/0117128; US 2006/0206949; US 2006/0153826; US 2006/0078552; 及びUS 2004/0002092を参照）。さらなる実施形態では、TALENのモジュラーDNA結合ドメインで改変されたホーミングエンドヌクレアーゼを使用して染色体遺伝子ノックアウトを生成し、megaTALとして知られる融合蛋白質を作る。MegaTALは、1つ以上の標的遺伝子をノックアウトするだけでなく、TCRα鎖、TCRβ鎖又はその両方、キメラ抗原受容体、抗体又は抗体成分、修飾サイトカインなどの目的のポリペプチドをコードする外因性ドナーテンプレートと組み合わせて使用するときに、異種又は外因性のポリヌクレオチドを導入（ノックイン）するために利用できる。
【０１２１】
特定の実施形態では、染色体遺伝子ノックアウトは、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原特異的受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞（例えば、T細胞）に導入される阻害性核酸分子を含み、ここで、阻害性核酸分子は標的特異的阻害剤をコードし、コードされた標的特異的阻害剤は宿主細胞における内因性遺伝子発現（即ち、PD-1、TIM3、LAG3、CTLA4、TIGIT、HLA構成要素、又はTCR構成要素、又はそれらの任意の組み合わせ）を阻害する。
【０１２２】
染色体遺伝子ノックアウトは、ノックアウト手順又は薬剤の使用後に、宿主免疫細胞のDNA配列決定によって直接確認できる。また、染色体遺伝子ノックアウトは、ノックアウト後に遺伝子が発現しないこと（例えば、その遺伝子によってコードされるmRNAやポリペプチド産物がないこと）から推測することもできる。
【０１２３】
上に示したように、いくつかの実施形態では、異種核酸は、例えば、シグナル伝達因子又は免疫受容体をコードする少なくとも1つの配列を含む。また、異種核酸は、選択マーカー、安全性を確保するための蛋白質（例えば、ネガティブセレクションに感受性）をコードする配列を含んでもよい。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、異種核酸は、炎症性サイトカインなどのシグナル伝達因子をコードする少なくとも1つの配列を含む。例示的な非限定的リストには、IL-2、IL-12、IL-7、IL-15、及びIL-21を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、異種核酸は、免疫受容体をコードする少なくとも1つの配列を含む。免疫受容体は、細胞の表面に発現したときに、目的の抗原に結合できる細胞外ドメインを含んでもよい。例えば、キメラ抗原受容体（CAR）は、本明細書の開示の態様に包含される。いくつかの実施形態では、CARの細胞外ドメインは、目的の抗原に対して特異的な結合親和性を有する抗体フラグメント（例えば、scFv）を含む。目的の抗原は、典型的には、細胞表面又は細胞外環境に発現するマーカーである。がんへの応用では、マーカーは理想的には標的のがん細胞に固有であるか、又は健康な組織と比較して少なくとも多数ががん細胞で発現する。がんや感染性物質のマーカーは既知であり、この点においてCARドメインが標的となりうる。細胞外ドメインは、膜貫通ドメイン及び任意のスペーサードメインを介して、適切なリガンドとの結合時にCARを発現するT細胞を活性化する少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。膜貫通ドメインは、天然に存在する膜貫通蛋白質（例えば、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、ゼータ鎖、CD2S、CD3イプシロン、CD45、CD4、CDS、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CDSO、CDS6、CD134、CD137、CD154など）に由来するか、又は主に疎水性残基を有する合成されたものであってもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3 ξ鎖、及び/又はFc受容体λなどの他の分子を含んでもよい。抗原結合によって開始された活性化シグナルは、最終的に細胞の増殖とエフェクター（即ち細胞傷害性）機能の開始をもたらする。
【０１２６】
T細胞へのCARの設計及び導入には、例えば、W0200014257; U.S. Pat. No. 6,451,995; US2002131960; U.S. Pat. No. 7,446,190; U.S. Pat. No. 8,252,592; EP2537416; US2013287748; and W02013126726,; 及び/又はSadelain et al., Cancer Discov. 3(4):388-398 (2013); Davila et al., PLoS ONE 8(4):e61338 (2013); Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 24(5):633-39 (2012); 及びWu et al., Cancer, 18(2):160-75 (2012)に記載されているアプローチが含まれ、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
あるいは、免疫受容体は、ペプチド抗原が主要組織適合性複合体（MHC）蛋白質と適切に複合化した場合に、目的のペプチド抗原に対して特異的な結合特性とシグナル伝達活性を有するT細胞受容体（TCR）である。表面抗原に限定されるCARとは異なり、TCRはMHC上に提示されたあらゆるペプチド抗原を検出し、反応できる。さらに、TCRはMHCクラス1又はMHCクラス2に限定できるため、より正確で適切な反応を促し、偽の活性や無関係な活性を低減できる。従って、非自己抗原又は異常ながん抗原に対する細胞応答の刺激に関連するこのアプローチに利用可能な潜在的な標的抗原がより広く利用可能である。
【０１２８】
TCRは改変T細胞の投与を受ける可能性がある特定の対象に適合したMHC（又はHLA）であり得る。TCRは自然に存在するT細胞から、又は代替的に、合成設計によってクローン化することができる。ファージディスプレイなどの技術を利用して、目的のペプチド抗原を認識するTCRを開発できる。トランスジェニックTCRの実装は、例えば、Baum et al., Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063 (2006); Frecha et al., Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757 (2010); 及びHackett et al., Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683 (2010)（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ウイルス（例えば、レトロウイルス又はレンチウイルス）ベクターを用いて達成することができる。
【０１２９】
細胞
別の態様では、本明細書は、本明細書に記載の方法によって生産される細胞又は細胞組成物も提供する。組成物は、本明細書に記載されているように、CD4+及び/又はCD8+細胞又はその定義された分化サブセットに富む。細胞は、養子細胞療法における投与に適切な治療用組成物に組み込むことができる。組成物は、細胞又は細胞集団と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む。いくつかの実施形態における医薬組成物は、他の薬学的に活性な薬剤又は医薬、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどをさらに含む。いくつかの実施形態では、薬剤は塩の携帯で存在する。
【０１３０】
適切なキャリアの決定は、細胞及び/又は細胞によって発現され得る特定のCARもしくはTCR、並びに意図される投与経路に基づいて行うことができる。組成物は、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、及び塩化ベンザルコニウムなどから選択される、1つ以上の保存剤をさらに含んでもよい。また、治療用組成物は緩衝剤を含んでもよい。例示的で非限定的な緩衝剤は、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、及び様々な他の酸及び塩を含む。
【０１３１】
治療用組成物は、意図した投与形態のために適切かつ有効な十分な量の細胞を含んでおり、当業者であれば決定できる。
【０１３２】
治療方法
別の態様では、本明細書は、上記の方法によって生産された細胞又は上記の方法によって生産された細胞を含む治療用組成物の投与を組み込んだ治療方法を提供する。細胞又は治療用組成物は、それを必要とする対象、例えば、養子細胞療法によって治療可能な疾患又は状態に罹患している対象に投与される。例示的な疾患又は状態は、がん、感染性物質（例えば、寄生生物、ウイルス、又は細菌）による感染、又はアレルギー性疾患もしくは免疫不全性疾患を含む。
【０１３３】
用語「対象」及び「治療」は、以下の「追加の定義」でより詳細に定義されている。
【０１３４】
養子細胞療法における細胞の投与のための典型的で例示的な方法及び技術は、本明細書の開示の態様に適用することができ、より詳細には、例えば、U.S. Pub. No. 2003/0170238; U.S. 4,690,915; Rosenberg, Nat Rev Clin Oneal. 8(10):577-85 (2011). See, e.g., Themeli et al., Nat Biotechnol. 31(10):928-933 (2013); Tsukahara et al., Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9 (2013); Davila et al., PLoS ONE 8(4):e61338 (2013)（これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、養子細胞療法は自己由来であり、これは、本明細書に開示されている方法によって生産された細胞の投与を受ける対象が、培養方法が行われた最初の細胞のソースの個体と同じであることを意味する。他の実施形態では、養子細胞療法はアロジェニックのものであり、これは、本明細書に開示されている方法によって生産された細胞の投与を受ける対象が、培養方法が行われた最初の細胞のソースとは異なる個体であることを意味する。
【０１３６】
本発明の方法は、がん又は新生物の状態を有する個体に適用できる。CAR T細胞の投与を含む、がんや感染性物質に対する対象の反応を高める養子細胞療法は、近年大きく進歩しているが、大きな技術的ハードルが残っている。現在の多くの方法では、改変細胞は、疾患のマーカーや抗原に最初に曝された後、非常に強力な活性化を示すが、その後に疲弊を示す。疲弊は増殖やエフェクター機能が著しく低下することで特徴付けられる。従って、治療はしばしば短命に終わり、形質転換された細胞集団（例えば、腫瘍）が復活してしまう。ノッチシグナルを誘導するための本明細書に開示の方法から生産された細胞は、低分化サブタイプの状態を延長させている。このことは、より大きな増殖能力を持って、体内での長期化した寿命とパーシスタンスをもたらし、最終的には腫瘍負荷に大きな影響を与えることが示される。
【０１３７】
さらに、典型的なCAR T細胞を投与するような養子細胞療法は、固形がんに効果的に対処するための特別な課題に直面している。腫瘍は、特に免疫細胞のエフェクター及び増殖能力を阻害する免疫抑制シグナルの産生を含む、免疫細胞にとってしばしば敵対的な環境である。さらに、単一の場所での抗原の集中は、T細胞の疲弊にすぐにつながる可能性があり、エフェクター及び増殖機能の喪失を強化する。現在、チェックポイント阻害剤の投与など、投与された細胞をさらに操作するための研究が多く行われているが、固形腫瘍は従来の養子細胞療法では依然として治療が困難である。
【０１３８】
後述するように、本明細書に開示の方法で生産された細胞、即ち上述のようにノッチシグナルが誘導された細胞は、増殖能力を阻害することなく、長期間にわたって低分化状態を維持することが実証されている。この結果、高い増殖能力を維持したまま、インビボで延長したパーシスタンスがもたらされる。さらに、ノッチ誘導T細胞は、反復又は長期の抗原曝露の状況で、疲弊に対する感受性が著しく低いことが示された。最後に、ノッチ誘導を伴うCAR T細胞で治療した場合、ノッチ誘導を伴わないCAR T細胞と比較して、腫瘍負荷が著しく減少し、罹患者の生存期間が著しく延長されることが実証された。
【０１３９】
従って、本投与及び治療方法は、液性腫瘍（例えば、リンパ腫（例えば、B細胞悪性腫瘍）、白血病、ミエローマなどの血液がん）及び固体腫瘍を含む、全てのタイプのがんの治療を包含する。固形腫瘍は、任意の組織を起源にできる。この方法に包含される固形腫瘍の例示的で非限定的な例としては、グリオブラストーマ、グリオーマ、ニューロブラストーマ、頭頸部がん、乳がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、肺扁平上皮がん）、肝臓がん、膵臓がん、中皮腫、メラノーマ、前立腺がん、精巣がん、骨がん、コロレクタルカルシノーマ、腎細胞がん、及び卵巣がんを含む。本願に包含される固形腫瘍ターゲットを含む追加のがんターゲットは、ターゲティングに適切な代表的な抗原を含めて、例えば、D'Aloia, M.M., et al., Cell Death and Disease, 9:282 (2018); Yeku, O., et al., Am Soc Clin Oncol Educ Book, 37:193-204 (2017); 及びGarber K, Nature Biotechnology, 36(3):215-219 (2018)（これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
【０１４０】
当業者であれば理解できるように、細胞は、適切ながん抗原に対する免疫受容体を設計することにより、選択した特定のがんに対処するために適切に設計及び最適化できる。この方法に包含される養子T細胞療法のための細胞（例えば、CAR T細胞及びTCR発現細胞）は、がんのいずれかを区別する細胞表面マーカーに結合するように改変できる。理想的には、このマーカーは標的がんに固有のものであるが、必須ではない。本方法に包含されるTCRは、CAR Tアプローチによって認識されない可能性がある細胞内抗原を含む、がんに特徴的な特定のペプチドのより大きなアレイに設計できる。
【０１４１】
細胞の投与は、典型的には、投与量及び投与方法に応じて適切に配合された担体、賦形剤、任意の緩衝剤などを含む治療用組成物の形態で行われる。養子細胞療法の細胞は、全身に、例えば、静脈注射で投与することもできるし、感染部位や腫瘍部位に局所的に投与することもできる。
【０１４２】
上述のように、投与される細胞は、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、又はCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を任意の比率で含んでもよい。いくつかの実施形態では、CD4+ T細胞は、ノッチ受容体アゴニストに曝されており、その後、ノッチ受容体アゴニストに別々に曝されていてもいなくてもよいCD8+T細胞と混合されるか、又は協調して投与されている。
【０１４３】
追加の定義
本明細書で使用する用語「核酸」は、複数のヌクレオチドサブユニットを含む任意のポリマー分子（即ち、ポリヌクレオチド）を指す。本明細書の開示に包含される核酸は、デオキシリボヌクレオチドポリマー（DNA）、リボヌクレオチドポリマー（RNA）、cDNA、又は当技術分野で既知の合成核酸を含んでもよい。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ノッチ受容体アゴニストは、ノッチに対して特異的な結合親和性を有し、結合すると、細胞でのノッチシグナル伝達を誘導する親和性試薬である。いくつかの実施形態では、親和性試薬は抗体である。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、任意の抗体生産哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、及びヒトを含む霊長類）に由来する、目的の抗原（例えば、ノッチ）に特異的に結合する抗体及びその抗原結合抗体断片を包含する。例示的な抗体には、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス-ヒト、マウス-霊長類、霊長類-ヒトのモノクローナル抗体、及び抗イディオタイプ抗体を含む。抗原結合分子は、任意のインタクトな抗体分子又はその断片（例えば、機能的な抗原結合ドメインを有する）であり得る。
【０１４５】
抗体断片は、完全長の抗体に由来する、又は関連する部分であり、好ましくは相補性決定領域（CDR）、抗原結合領域、又はその可変領域を含む。本明細書で有用な抗体断片及び誘導体の例としては、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、及びFv断片、ナノボディ（例えば、VHH断片及びVNAR断片）、線形抗体、一本鎖抗体分子、抗体断片から形成された多重特異性抗体などを含む。一本鎖抗体は、一本鎖可変フラグメント（scFv）及び一本鎖Fabフラグメント（scFab）を含む。「一本鎖Fv」又は「scFv」抗体断片は、例えば、抗体のVHドメイン及びVLドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができ、これにより、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成できる。一本鎖抗体には、ダイアボディ、トリアボディなども含まれる。抗体断片は、組換え的に、又は酵素消化によって生産できる。
【０１４６】
上記の親和性試薬は、天然に存在する又は天然由来のものである必要はなく、必要に応じて、例えば、ドメインのサイズを小さくしたり、ノッチ受容体に対する親和性を変更したりするなど、さらに改変できる。例えば、相補性決定領域（CDR）をあるソース生物から得て、ヒトなどの他の成分と組み合わせることで、対象の免疫反応を刺激しないキメラ分子を作ることができる。
【０１４７】
抗体又は抗体様分子の生産は、当技術分野で一般的に知られている任意の技術を用いて行うことができる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせを含む、当技術分野で知られている様々な技術を用いて調製できる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で知られており、例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に教示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて作製できる。用語「モノクローナル抗体」は、真核生物、原核生物、又はファージのクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を指し、それが生産される方法を指さない。ハイブリドーマ技術を用いて特異的な抗体を生産し、スクリーニングする方法はルーチンであり、当技術分野ではよく知られている。モノクローナル抗体が二重特異性分子に含まれることが確認されると、関連する結合ドメインをコードする遺伝子を、二重特異性分子の残りの構造をコードする核酸も含む発現ベクターにクローニングできる。
【０１４８】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、当業者に知られている任意の技術によって生成できる。例えば、本発明のFab及びF(ab')2フラグメントは、パパイン（Fabフラグメントを生成する）又はペプシン（F(ab')2フラグメントを生成する）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子を蛋白質分解的に切断することによって生成できる。F(ab')2フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のCHIドメインを含む。さらに、本発明の抗体は、当技術分野で知られている様々なファージディスプレイ法を用いて生成することもできる。
【０１４９】
本明細書で使用する用語「アプタマー」は、対象の特定の抗原に結合できるオリゴヌクレオチド又はペプチド分子を指す。核酸アプタマーは、通常、特異的な結合特性を示すオリゴヌクレオチドのショートストランドである。この核酸アプタマーは、典型的には、インビトロでの数回の選択、又は指数関数的濃縮プロトコルによる系統的進化を経て、アビディティや選択性などの最良の結合特性を選択して生産される。有用な核酸アプタマーの一種であるチオアプタマーは、ホホジエステル結合の非架橋酸素原子の一部又は全部が硫黄原子に置換されており、蛋白質との結合エネルギーを増加させ、ヌクレアーゼ酵素による分解を遅らせることができる。いくつかの実施形態では、核酸アプタマーは、アプタマー/ノッチ結合を促進できる変化した側鎖を有する修飾塩基を含むものもある。
【０１５０】
ペプチドアプタマーは、しばしば、プロタマーゼインスキャフォールドに両末端で取り付けられたペプチドループを含む蛋白質分子である。ループは典型的には10〜20アミノ酸の長さを有し、スキャフォールドは典型的には可溶性でコンパクトな任意の蛋白質である。蛋白質スキャフォールドの一例は、チオレドキシン-Aであり、ここで、ループ構造は、還元活性部位内に挿入できる。ペプチドアプタマーは、ファージディスプレイ、mRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、バクテリアディスプレイ、酵母ディスプレイライブラリなど、様々な種類のライブラリから生成/選択できる。
【０１５１】
本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者にとってそれらが意味するのと同じ意味を有する。当業者は、技術の定義及び用語について、Sambrook J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2001); Ausubel, F.M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (2010); 及びColigan, J.E., et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York (2010)を特に参照できる。
【０１５２】
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを参照するように明示されているか、代替物が相互に排他的である場合を除き、「及び/又は」を意味するように使用されているが、本明細書は代替物及び「及び/又は」のみを参照する定義をサポートするものである。長年の特許法に従い、特許請求の範囲や明細書で「含む」という言葉と一緒に使われる「a」や「an」という言葉は、特に断りのない限り、1つ以上を意味する。
【０１５３】
文脈上明らかに別の意味に解釈される場合を除き、本明細書及び特許請求の範囲において、「含む（comprise、comprising）」などの語は、排他的又は網羅的な意味ではなく、包括的な意味で解釈されるものとする。つまり、「〜を含むが、限定されない」という意味である。また、単数又は複数の数を用いた言葉は、それぞれ複数及び単数の数を含む。さらに、「本明細書」、「上記」、「下記」という言葉、及び同様の意味を持つ言葉を本願で使用する場合、本願の特定の部分ではなく、本願全体を指すものとする。「約」という言葉は、記載された参照番号の上又は下のわずかな変動の範囲内の番号を示す。例えば、「約」は、示された参照番号の上又は下の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、又は1％の範囲内の数値を指すことができる。
【０１５４】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書では言い換え可能なものとして使用され、治療のために評価されている及び/又は治療されている哺乳類を指す。特定の実施形態では、哺乳類はヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、限定されないが、がんを有する個体を包含する。対象はヒトであってもよいが、この用語は、他の哺乳類、特に、ヒトの疾患の実験モデルとして有用な哺乳類、例えば、マウス、ラット、イヌ、非ヒト霊長類なども包含される。
【０１５５】
用語「治療する」及びその文法上の変形は、疾患又は状態（例えば、がん、感染症、自己免疫疾患）の治療又は改善又は予防における成功のあらゆる指標を指すことができ、例えば、症状の軽減、寛解、軽減又は患者がより耐えられる状態にすること、変性又は衰退の速度を遅くすること、又は変性の最終点をより衰弱させないことなどの客観的又は主観的なパラメータを含む。
【０１５６】
症状の治療や改善は、医師による検査結果を含む、客観的又は主観的なパラメータに基づいて行われる。従って、「治療する」という用語は、本明細書に開示の化合物又は薬剤を投与して、疾患又は状態（例えば、がん、感染症、又は自己免疫疾患）に関連する症状又は状態の発生を予防又は遅延させる、緩和する、又は停止又は抑制することを含む。用語「治療効果」は、対象における疾患又は状態、疾患又は状態の症状、又は疾患又は状態の副作用の軽減、除去、又は予防を指す。
【０１５７】
本明細書では、細胞又は細胞集団が特定のマーカーに対して「陽性」（又は「＋」）であるという特徴は、細胞又は細胞集団がマーカーの検出可能な存在を有することを意味する。しばしば、マーカーは細胞の表面に存在又は発現している。マーカーは、任意の従来の技術を用いて検出できる。表面発現を検出するために、例えば、マーカーは、免疫染色に基づく技術を用いて検出できる。例えば、マーカーに特異的な抗体を細胞又は細胞の集団に曝し、抗体の結合をフローサイトメトリーによって画像化又は検出できる。逆に、「陰性」（又は「-」）という用語の使用は、細胞内又は細胞表面に実質的な存在がないことを意味する。
【０１５８】
本明細書に開示の方法及び組成物のために使用できる、それとともに組み合わせて使用できる、それのための準備に使用できる、又はそれの製品である材料、組成物、及び成分が開示される。この材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、これらの化合物の1つ1つの組み合わせ及び順列への具体的な言及が明示的に開示されていなくても、様々な個別及び集合的な組み合わせのそれぞれが具体的に企図されていることが理解される。この概念は、記載された方法の工程を含む（但し、これに限定されない）本明細書の開示の全ての側面に適用される。従って、任意の上述の実施形態の特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせたり、置換したりできる。例えば、実行可能な様々な追加工程がある場合、追加工程の各々は、開示された方法の任意の特定の方法の工程又は方法の工程の組み合わせで実行可能であり、そのような組み合わせ又は組み合わせのサブセットの各々は、具体的に企図されており、開示されているとみなされるべきであることが理解される。さらに、本明細書に記載されている実施形態は、本明細書の他の箇所に記載されているものや、当技術分野で知られているものなど、任意の適切な材料を用いて実施できることが理解される。
【０１５９】
本明細書で引用されている出版物及び引用されている主題は、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
【実施例】
【０１６０】
以下の実施例は、当業者に本発明の生産方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために記載されており、本発明者らが本発明とみなす範囲を限定することを意図しておらず、また、以下の実験が実施された全ての実験又は唯一の実験であることを表すことを意図していない。
【０１６１】
実施例1
タイトル：エクスビボでのT細胞発生へのノッチシグナルの影響
イントロダクション：上記でより詳細に説明したように、HSCから成熟TE細胞への細胞型の分化におけるノッチシグナル伝達の役割は不明である。本研究では、T細胞サブタイプの分化に影響を及ぼす可能性のあるノッチシグナルの役割を明らかにするとともに、養子細胞療法のためのT細胞の培養及びエクスパンドにおける実用化の可能性を検討することを目的としている。
【０１６２】
結果と考察
Delaney, et al., Blood, 106(8): 2693-2699 (2005)（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に適合した初期アッセイを行い、細胞のエクスビボにおけるノッチシグナルの効果を決定した。簡単に説明すると、ナイーブT細胞を、レトロネクチン及び異なる濃度の固定化DLL1-Ext IgG（ノッチアゴニスト）又はIgG1（コントロールとして）をコートしたプレート上で4時間培養するか、又は固定化アゴニストや他の部分を含まない単純な組織培地（TC）で培養した。RNAを単離した後、cDNAに転写した。Hes1の発現をSYBRgreen q-PCRで測定した。この培養法では、Hes1の発現量が増加し、ノッチシグナル伝達が実証された。このアッセイデザインでは、細胞-細胞の相互作用及びノッチ受容体とリガンドの相互作用で適用される物理的な「引っ張り」や張力がシグナル伝達に重要であると考えられる。そこで、リガンドをプレート上にレクトロンクチンとともにコートし、リガンドをプレート表面に効果的に固定する。図1に示すように、固定化DLL1に曝したT細胞では、用量依存的なHes1のアップレギュレーションが起こり、ノッチシグナル伝達が示された。同じ効果は、IgGやTCのコントロールでは観察されなかった。なお、細胞密度が低いことは、コートされたリガンドの存在や密度とは独立して、反応に影響を与える可能性のある細胞間のシグナル伝達を制限するため、アッセイの精度に重要であることが観察された。
【０１６３】
ノッチ受容体及びリガンドの発現を含むT細胞の表現型及び分化状態に対するノッチシグナルの影響を確認するために、上記のアッセイを拡張した。具体的には、1日目において、組織培地プレートを、レクトロネクチン及び選択したリガンド（即ち、固定化DLL1又はIgG1コントロール）で一晩コートした。0日目において、2x105個のナイーブT細胞を、成長と増殖を刺激するために抗CD3/CD28 DYNABEADS(R)（ThermoFisher）を添加して（例えば、3：1の比率で）プレーティングした。間隔を置いて（例えば、24時間ごと）細胞を取り出し、RNAを単離して塩基配列を決定し、Hes及びその他の遺伝子発現レベルを定量化した。ほとんどのアッセイでは、Taqman遺伝子発現アッセイを用いたQ-PCRで遺伝子発現を定量した。これらの例示的な方法のより詳細な説明は、以下の実施例5に記載されている。
【０１６４】
このアッセイデザインに従って培養されたナイーブT細胞について、ノッチ受容体、ノッチリガンド、及び他の細胞表面マーカーの相対的な発現を評価した。図2A及び図2Bは、異なる条件での培養の前及び後の異なる時点における、ヒトCD4+及びCD8+ T細胞におけるノッチ1及びノッチ2受容体の相対的な発現を、それぞれグラフで示している。培養は下段の凡例で示した（TC=組織培地のみ、DLL1=固定化DLL1ノッチアゴニスト（実験条件）、IgG=固定化IgG（コントロールリガンド））。示されているように、ノッチ1及び2受容体は、異なるエクスビボ培養条件の間で発現に差はない。ノッチ1の発現は、CD4+及びCD8+ T細胞の両方において、培養中に全体的に減少するが、CD8+細胞では11日目に増加している。ノッチ2は、CD4+ T細胞では変わらないが、CD8+ T細胞では11日目に増加する。図3A〜3Dは、異なる条件でエクスビボ培養したCD4+ T及びCD8+ T細胞におけるノッチリガンドDLL1、DLL4、JAG1、及びJAG2の相対的な発現をそれぞれグラフで示している。培養した細胞は下段の凡例に示した（TC=組織培地コントロール、DLL1=実験条件のノッチアゴニスト、IgG=コントロールリガンド）。示したように、JAG1とJAG2のアゴニストは、条件間で発現がある程度変化した。JAG1は、全ての培養条件において、CD4+とCD8+細胞の両方で最初に発現が増加し、その後、5日目以降に減少した。JAG2は培養後、最初に発現量が減少し、その後、11日目までに全体的に増加した。DLL1及びDLL4リガンドは、実験的な培養条件に曝された後、ほとんどの時点で低レベルでしか検出されなかった。
【０１６５】
遺伝子組み換え免疫細胞、例えば、CAR T細胞の発生と有効性に対するノッチの効果を評価するために、上述のようにノッチ1アゴニスト、又はコントロールリガンド、又はTCコントロールの存在下で培養したヒトナイーブT細胞を、1日目にCD19特異的CARでトランスダクションすることによってさらに改変し、エクスビボでヒトCD19 CAR T細胞を作成した。細胞を分割し、2〜3日ごとに培地を交換した。5日目に改変CAR T細胞を取り出し、カウントして表現型を評価した。最終的に全ての細胞を組織培地のみのプレートに移し、11日目に表現型と機能性を評価した。TN/TSCM、TCM、及びTEM/TE細胞を区別するために、抗CD62L抗体、抗CD45RO抗体、及び抗CDRA抗体と、図4に示されるようなゲーティング戦略を用いたフローサイトメトリーを用いて表現型を評価した。
【０１６６】
図5A〜5Eは、上述のように、異なるノッチアゴニスト対コントロールリガンド及びTCコントロールに曝されたT細胞の分化表現型を決定するためのフローベースアッセイの結果を示す。分析に先立ち、ヒトナイーブT細胞を抗CD3/CD28 DYNABEADS(R)（ThermoFisher）で刺激し、IL-2を含む培地中で、ノッチリガンド、IgG1（無関係なリガンドコントロールとして）、又は単純な組織培地（TC；リガンドなしのコントロールとして）とインキュベートした。
【０１６７】
図5A及び5Bは、異なる用量のDLL1アゴニスト（及びコントロール条件）とともに培養した後のT細胞サブタイプの割合をグラフで示している。図に示されるように、DLL1プレート上でTNを培養及びCD19-CARを含むように改変した場合、コントロールと比較して、CD4+細胞（図5A）及びCD8+細胞（図5B）の両方について、CD62L+CD45RO- CAR T細胞（即ち、TN/TSCMサブセット）の割合が増加する。この効果は用量依存的である。また、CD27、CD28、CD95、PD1、LAG3、CD69といった細胞表面マーカーの発現についても、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞の両方を対象に、抗CD3/CD28 DYNABEADS(R)（ThermoFisher）で5日間刺激した後に評価した。これは、CAR TN細胞をノッチアゴニストDLL1に曝した培養物が、活性化マーカーPD-1、LAG3、及びCD69の発現が低い細胞をもたらすことを示す。CD4+ T細胞では、DLL1を用いた培養により、CD27とCD28の発現が増加したが、CD95の発現は低下した。CD8+ T細胞では、CD28の発現が増加している。他のノッチ受容体アゴニストも同様に、CD62L+CD45RO- CAR T細胞（即ち、TN/TSCMサブセット）の割合が、コントロールと比較して、CD4+細胞及びCD8+細胞の両方で増加した。図5C及び5Dは、コントロールと比較した、抗ノッチ1抗体（即ち、N1抗体）又は抗ノッチ2抗体（即ち、N2抗体）とともに培養した後の、CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞についてのCD62L+CD45RO- CAR T細胞（即ち、TN/TSCMサブセット）の割合の上昇をグラフで示している。図5Eは、ノッチアゴニストDLL4とともに培養した後、CD8+ T細胞に対するCD62L+CD45RO- CAR T細胞（即ち、TN/TSCMサブセット）の割合が、コントロールと比較してそれぞれ上昇したことをグラフで示している。従って、CD4+細胞とCD8+ T細胞の両方において、ノッチシグナルが初期発生表現型をより長く維持することが示された。
【０１６８】
また、ノッチシグナルがCD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の増殖に影響を与えるかどうかを確認するために、総細胞数を定量した。図6A及び図6Bは、異なる濃度の固定化DLL1、IgG1コントロール、又はTCコントロールを用いて培養し、7日目及び11日目に測定したCD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の総数をグラフで示している。培地には、それぞれ抗CD3/CD28 DYNABEADS(R)（ThermoFisher）も含まれていた。図に示されるように、ノッチシグナルはCD4+ T細胞やCD8+ T細胞の増殖を阻害していない。さらに、ノッチリガンドへの曝露は、高濃度ではCD4+ T細胞の増殖を増加させる可能性さえあることが示された。
【０１６９】
結論：これらの結果は、ノッチアゴニストの存在下でT細胞を培養すると、ノッチ経路を介した定量的シグナル伝達が可能になることを示している。さらに、CD45RO、CD62L、共刺激分子（即ち、CD27及びCD28）、及び活性化マーカー（即ち、PD-1、LAG-3、CD69）の観察結果より、ナイーブT細胞の培養中にノッチを介したシグナル伝達を行うと、低分化表現型が生じることがわかった。低分化表現型の促進は、ノッチリガンドや抗ノッチ抗体を含む、さまざまな異なるノッチアゴニストを用いて実証された。しかし、ノッチシグナルを誘導しても、増殖や機能性が阻害されることはなく、むしろ増殖が促進される可能性すらあった。
【０１７０】
実施例2
タイトル：インビボでの養子細胞療法におけるノッチ誘導CAR T細胞の性能
イントロダクション：実施例1には、「若い」又は比較的未分化なT細胞をノッチアゴニストとともにエクスビボで培養することで、定量的ノッチシグナル伝達が可能になることが示されている。これにより、低分化表現型が得られたが、異種CARを発現するようにさらに改変された細胞を含めて、細胞の増殖や機能性が阻害されることはなかった（向上する可能性すらある）。次に、実施例1で説明した初期TN細胞のエクスビボ培養から生成したCAR T細胞について、Rajiマウスモデルにおける養子細胞療法における性能を評価した。
【０１７１】
結果と考察：典型的にはSommermeyer et al., Leukemia volume 30, pages 492-500 (2016)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている免疫不全のNod/Scid/ガンマ鎖-/-(NSG)マウスにおけるRajiリンパ腫モデルを用いて、対象マウスに投与する前に上述のノッチ受容体アゴニストの存在下又は非存在下で培養したヒトCAR T細胞のパーシスタンス及び抗腫瘍効果をアッセイした。
【０１７２】
簡単に説明すると、ヒトCAR T細胞を上述の典型的なプロトコルと同様に生産した。1日目に、2.5μgのN1抗体（抗ノッチ受容体アゴニスト；LEAF Biolegend抗体）又はIgG1コントロールリガンドをコートして、培養プレートを調製した。0日目に、ナイーブT細胞を24ウェルに1ウェルあたり2x105 CD8+で、抗CD3/CD28 DYNABEADS(R)（ThermoFisher）とともに3：1の比率でプレーティングした。1日目に、CD19-CARのトランスダクションを行った。4日目に、7-8週齢のNSG雄マウスに5x105個のRaji細胞（GFP/fflucで標識）を注射した。5日目に、CAR T細胞を培地から取り出し（DYNABEADS(R)による除去）、細胞をカウントし、フローサイトメトリーで表現型を評価した。7日目に、細胞をTCプレート/フラスコに移した。培養期間中、2〜3日ごとに培地を交換した。最後に、11日目に細胞をカウントし、表現型と機能性を評価した。事前にRaji細胞を注射したNSGマウスに、3つの条件（即ち、N1抗体、IgG1、又はTCコントロールを用いた条件）のいずれかで培養した7x105 EGFRt+細胞（2x105 CD4+及び5x105 CD8+）CAR T細胞を注射した。マウスのT細胞集団を定期的にブリードしてモニターした。バイオレイヤー干渉法（BLI）により腫瘍量を評価し、最終的にマウスの生存を確認した。エクスビボ培養のための例示的方法と材料の詳細は、以下の実施例3に記載されている。
【０１７３】
全てのグループが同等の有効量のCAR T細胞を受けたことを確認するために、トランスダクション効率を注入前に確認した。CARを発現しているT細胞の頻度を特定するために、EGFR-ビオチンに続くストレプトアビジン-PEで染色した後、注入前T細胞のフローサイトメトリー分析を行った。投与量は、リンパ球上のCD4、CD8、EGFRの発現をプロファイリングした注入前フローアッセイデータの分析により最適化され（図示せず）、総T細胞数3x106個、そのうち〜6x105個がEGFR+で約80%がCD8+ T細胞と決定された。
【０１７４】
示すように、培養したヒトCAR発現CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の表現型を、フローサイトメトリーを用いて5日目及び11日目に評価し、細胞上の表面マーカーのパネルの発現を特徴づけた。5日目、N1に曝されたCD4+ T細胞は、CCR7、CD28、CD27、及びCD62Lの発現量が多く、CD95、PD-1、Lag-3、CD25、及びCD69の発現量が少なかったことから、低分化/活性化表現型が示唆された。同様に、N1に曝されたCD8+ T細胞は、CCR7、CD28、CD27、及びCD62Lの発現量が多く、CD95、PD-1、Lag-3、CD25、CD69、及びTim-3の発現量が少ないことから、こちらも低分化/活性化表現型が示唆された。
【０１７５】
注入前の培養11日目に、2.5μgのN1抗体（「N1曝露」）で培養したCD8+ T細胞、IgG又はTCコントロール細胞、非トランスダクション細胞（mock）について、CD45RO、CD45RA、及びCD62Lの発現を測定し、PBMCサンプルの染色と比較した。N1に曝されたT細胞は、CD62L+細胞の高い割合、CD45RAの高い発現、且つCD45ROの低い発現を示し、低分化表現型を示す。さらに、2.5μgのN1抗体で培養したCD8+及びCD4+ T細胞、IgG又はTCコントロール細胞、及び非トランスダクション細胞（mock）について、CD95、CCR7、CD28、CD27、及びCD62Lの発現を測定し、PBMCサンプルの染色と比較した。11日目に、ほとんどのマーカーは全ての条件で類似していたが、CD8+とCD4+のCCR7はIgG条件で低くなっている。2.5μgのN1抗体で培養したCD8+及びCD4+ T細胞、IgG又はTCコントロール細胞、及び非トランスダクション細胞（mock）について、注入前11日目におけるPD-1、LAG-3、CD25、CD69、及びTim-3の発現を測定し、PBMCサンプルの染色と比較した。ほとんどのマーカーは全ての条件で類似していたが、CD25はN1に曝されたT細胞で低くなっていた。この違いは、CD8+T細胞ではわずかであったが、CD4+T細胞ではより大きかった。
【０１７６】
2.5μgのN1抗ノッチ受容体アゴニスト抗体の培養条件を用いたノッチシグナル伝達がT細胞の増殖に影響を与えるかどうかを評価するために、培養物からの総細胞数を注入前の時間に定量化した。図7は、N1抗体を用いて培養した細胞の5日目及び11日目の総T細胞数（CD4+及びCD8+）を、ネガティブコントロールとしてのIgG1又は組織培養（TC）のみの場合と比較してグラフ化したものである。このことから、低分化表現型は、このシステムでは増殖を制限しないことがわかる。また、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）増殖アッセイを行い、関連するCARターゲットを持つマウスに注入した後のN1に曝されたCAR T細胞の増殖を評価した。CFSEアッセイでは、CD19+腫瘍細胞（K562/CD19又はRaji）とともに培養した、又は培地のみで培養したCAR T細胞の増殖を測定した。細胞の増殖はCFSEの希釈によって測定する。このアッセイでは、CD4+とCD8+の両方のT細胞について、N1に曝されたT細胞がCD19陽性のターゲット（K562-CD19及びRaji）に対して増殖することが示された（図示せず）。
【０１７７】
腫瘍ターゲットに対するN1に曝されたCAR T細胞の機能的性能を評価するために、マウス（ホタルルシフェラーゼを発現するRaji細胞をあらかじめ移植したもの）にN1に曝されたCAR T細胞を投与後、あるいはTC又はIgG1コントロール培養を伴うCAR T細胞の投与後、長期間にわたって生物発光イメージングを行い、腫瘍負荷をモニターした。腫瘍負荷を示すマウスの写真を作成し、ヒートマップを重ねて表示した。29日目に、コントロールT細胞群（CAR発現なし）の2匹のマウスは、腫瘍負荷のためにすでに安楽死していた。N1に曝されたCAR T細胞で処置した5匹のマウスのうち4匹は84日目までに腫瘍がなくなったが、IgGグループでは残った2匹とも腫瘍があり、TCグループでは全てのマウスが安楽死した。図8は、コントロールT細胞、組織培養（TC）CAR T細胞、ノッチ-1刺激CAR T細胞、及びIgG1 CAR T細胞を投与した個体の腫瘍負荷を、生物発光イメージング（BLI）によって示したグラフである。全ての時点は，Raji腫瘍細胞をマウスに注射した後である。各線はマウスを表し、記号は個々のデータポイントを示す。図に示すように、N1に曝したCAR T細胞を投与したマウスの腫瘍負荷は大幅に減少し、投与後100日間にわたって減少し続けた。このデータは、N1に曝したCAR T細胞がインビボの腫瘍に対して効果的な反応を誘導できることを示している。さらに、この効果は長期間にわたって維持されており、ノッチシグナルを誘導する条件で培養されたCAR T細胞の長期間のパーシスタンスを示している。
【０１７８】
Raji移植マウスの血中に出現したT細胞を、注入及びRaji腫瘍注射後のいくつかの時点で評価した。上述のように、Raji移植マウスを、コントロールT細胞、TC CAR T細胞、N1に曝したCAR T細胞（CAR T細胞の生成中にノッチ1アゴニスト抗体に曝露した）、及びIgG1に曝したCAR T細胞で処置した。血液を塩化アンモニウムカリウム溶液で溶解した後、CD45、CD4、CD8、及びEGFRの抗体で染色した。データはCanto IIフローサイトメーターで収集した。図9A〜9Cは、複数の時点における血液中のT細胞のレベルをグラフ化したものであり、図9AはCD8+及びCD4+ T細胞のレベルを示し、図9BはCD8+ T細胞のレベルを示し、図9CはCD4+ T細胞のレベルを示している。図に示されているように、N1に曝されたT細胞で処置されたRajiマウスは、35日目以降、EGFR+ CD4+及びCD8+ T細胞の頻度がコントロール群よりもはるかに高かった。また、35日目の時点ですでに腫瘍負荷が減少していることから、N1に暴露されたT細胞が生存及びパーシスタンスが長期化し、その結果、長期間にわたって抗腫瘍活性が促進されることが示された。
【０１７９】
注入後のいくつかの時点で、Raji移植マウスから採取したT細胞について、サイトメトリック分析を行った。56日目と91日目に、CD45+細胞をゲートして分析を行い、CD4+及びCD8+対EGFRの染色を行った（図示せず）。この結果から、N1に曝露したCAR T細胞で処置したマウスは、血液中のEGFR+細胞及びEGFR-細胞の頻度が高く、ノッチ1シグナルにより、細胞がインビボで抗原に曝されるのとは独立して、高い増殖能力とパーシスタンスを有すT細胞が得られることが示された。
【０１８０】
上記で観察された効果が、マウスに注入されたCAR T細胞によるものなのか、それとも（EGFR-である）非トランスダクションT細胞が共注入されたことによるGvHDによるものなのかを判断するために、マウスに注射する前にEGFR選別を追加して、アッセイを繰り返した。上述のアッセイと同様に、ナイーブヒトT細胞を、ノッチ1アゴニスト抗体、コントロール（IgG1）、又はIgG1を含まないコントロール条件（TC）でインキュベートし、CD19 CARをトランスダクションし、最終的にRajiリンパ腫細胞をすでに移植したマウスに注入する。但し、T細胞を養子移植する前に、以前に観察されたノッチ1効果がCAR T細胞によるものなのか、それともEGFR-細胞によるアロ反応によるものなのかを調べるために、EGFR+細胞を選別した。具体的には、EGFR-ビオチンで細胞を染色し、続いてストレプトアビジン-PEでEGFR+細胞を選別した。CARのトランスダクション効率は、異なるグループで同様であった（図示せず）。また、トランスダクションしたT培養細胞の表現型を確認するために、フローサイトメトリーで表面マーカーの発現を評価した。5日目（注入前）では、N1に曝したCD4+ T細胞とN1に曝したCD8+ T細胞の両方とも、CD62L+細胞の割合が高く、CD45RAの発現が高く、CD45ROの発現が低いことが示された。これらのデータは低分化表現型を示している。
【０１８１】
同様のアッセイで、CD4+及びCD8+ CAR T細胞の5日目（注入前）に追加の表面マーカーを評価した。具体的には、CD95、CCR7、CD28、CD27、CD62Lに加え、PD-1、Lag-3、CD25、CD69、及びTim-3の発現を測定した。CD4+ CAR T細胞とCD8+ CAR T細胞の両方において、表現型は培養条件によって違いがあり、N1に曝されたT細胞はIgG1に曝されたT細胞やTCコントロール細胞と比較して、CCR7、CD28、CD27、及びCD62Lを高レベルで発現し、Lag-3とCD69を低レベルで発現しており、最終的には低分化/活性化表現型であることが示唆された。
【０１８２】
さらに後の時点に対応するため、トランスダクションしたT培養細胞の表現型を確認するために、トランスダクションしたT細胞の11日目（注入前）にフローサイトメトリーで表面マーカーの発現を再度評価した。N1に曝されたCD4+ T細胞及びN1に曝されたCD8+ T細胞は、IgG1コントロール又はTCでインキュベートしたT細胞と比較して、引き続き高い割合のCD62L+細胞、高いCD45RAの発現、及び低いCD45ROの発現を示した。これは、N1抗ノッチ受容体アゴニスト抗体によるノッチシグナル伝達後、エクスビボでの培養中に低分化表現型が継続的かつ長期的に維持されることを示している。
【０１８３】
このN1に曝されたCAR T細胞（EGFR+で選別）の腫瘍標的に対する機能的性能を評価するために、Raji移植マウスにおいて、上述のように生物発光イメージング（BLI）によって腫瘍負荷をモニターした。Raji細胞はイメージングのためにホタルルシフェラーゼを発現させた。比較のために、あらかじめN1抗ノッチ受容体アゴニスト、IgG1コントロール、又はTC（IgG1コントロールなし）に曝したCAR T細胞をマウスに投与した。マウスの画像はヒートマップのオーバーレイで示された腫瘍負荷で展開された。21日目までに、コントロールと比較して、CD19 CAR N1グループで抗腫瘍活性の明らかな増加が観察された。図10Aは、Raji細胞を用いてマウスを生着させた後、生物発光輝度で示される腫瘍サイズをグラフ化したもので、各線はマウスを表し、記号は個々のデータポイントを表す。図示されているように、N1に曝されたCAR T細胞を受けたマウスの腫瘍サイズは、コントロールCAR T細胞と比較して大きく減少した。図10BはRaji移植マウスの生存曲線を示す。図に示されるように、N1に曝されたCAR T細胞を注入された個体は、生存期間が大幅に延長され、試験終了時には半数以上の対象が生存していた。一方、同等量のコントロールT細胞（CAR発現なし、又はN1曝露なし）又はコントロールのN1に曝したT細胞（CAR発現なし）を投与されたRaji移植マウスは、移植後20日目までにすべて死亡した。TCコントロールCAR T細胞（N1曝露なし）又はIgG1に曝したCAR T細胞を投与されたRaji移植マウスは、生存期間が延長されたが、最終的に移植後50日目から60日目の間に全てのマウスが死亡した。これは、インビボの腫瘍に対して効果的な反応を引き起こすための、N1に曝されたCAR T細胞の長期間にわたる顕著な有効性を示す。さらに、このデータは、上述した養子細胞療法の効果が、EGFR-細胞のアロ反応ではなく、ノッチ刺激を受けた（例えば、N1曝露）CAR T細胞自体によるものであることを裏付けている。
【０１８４】
結論：これらの結果は、ノッチアゴニストの存在下で培養したCAR T細胞が、比較的未分化な状態を長期間維持することを明確に示している。腫瘍を持つ対象に投与すると、投与されたCAR T細胞は、関連する標的に曝されると増殖し、さらに対象内で長期間生存及びパーシスタンスし、疲弊に対する長期の耐性が示された。実際に、長期間にわたって腫瘍の大きさが著しく減少した。最後に、これらの効果は、ノッチリガンドの存在下で培養されたCAR T細胞の結果であり、トランスダクションされていないT細胞のアロ反応によるものではないことが決定された。
【０１８５】
実施例3
タイトル：抗原に長時間曝されたノッチ誘導CAR T細胞のパーシスタンス
イントロダクション：CAR T細胞を抗ウイルスや抗がん剤の治療に応用する際の大きな障害は、標的抗原に長期間又は慢性的に曝されている間に、CAR T細胞が疲弊してしまうこと、即ち、一時的なエフェクター効果が限られてしまうことである。疲弊したCAR T細胞は、典型的には、増殖能力が低く、サイトカインの生産が少なく、表面の阻害性受容体を多く発現し、アポトーシスの割合が高いことが分かっている。このような疲弊した特徴は、養子CAR T治療法の有効性を大きく制限する。最近の研究では、CARの構造、特にCARのエクトドメインの構造が、CARを発現しているT細胞の機能性と疲弊に決定的な影響を与えることが示されている。例えば、Long, A. H., et al., Nat. Med., 21(6):581-590 (2015)を参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８６】
ノッチアゴニストの存在下で生成されたCAR T細胞は、増殖及び機能性を阻害することなく、低分化し表現型をもたらすことが上記で実証されている。さらに、ノッチアゴニストの存在下で生成されたCAR T細胞を投与すると、ノッチアゴニストに曝されていないコントロールCAR T細胞と比較して、インビボでの有効性及びパーシスタンスが向上することが上記で示されている。移植Rajiリンパ腫のNSGマウスにおいて、ノッチシグナルが誘導されたCAR T細胞の養子移植により、コントロールT細胞やノッチアゴニストに曝されていないコントロールCAR T細胞の養子移植と比較して、腫瘍負荷が有意に減少し、長期間にわたって生存率が向上することが示された。
【０１８７】
また、パーシスタンスの特徴と疲弊に対する感受性を具体的に評価するために、ノッチアゴニストに曝したCAR T細胞を抗原に長時間曝した。
【０１８８】
結果と考察：上記で詳しく説明したように、ナイーブT細胞をノッチアゴニストとともに又はコントロール条件（IgG1抗原又は抗原なしのTCコントロール）で培養した。また、培地には抗CD3/CD28 DYNABEADS(R)（ThermoFisher）を3：1の割合で含ませた。1日目に、T細胞をCD19特異的CARを発現するようにトランスダクションした。培養グループ間のトランスダクション効率と一貫性を確認した。上述の実施例1のアッセイ形式とは異なり，慢性的な抗原曝露を再現するために，アッセイの過程でCAR T細胞の培養物に標的抗原を複数回添加した。具体的には、2つの異なる試験において、K562-CD19細胞又はRajiリンパ腫細胞を、96ウェルプレートフォーマットで、エフェクター：標的の比率が1：1となるように、2日目、4日目、及び7日目にCAR T細胞培養物に添加した。標的細胞には放射線を照射せず、培地にはIL-2を含ませなかった。培養物をフローサイトメトリーで評価し、アッセイの経過中にノーマライズドT細胞数を決定した。
【０１８９】
図11A及び図11Bは、反復抗原曝露アッセイの結果をグラフ化したものである。図11Aに示すように、N1抗ノッチ受容体抗体（ノッチアゴニスト）を用いて培養したCD8+ CAR T細胞は、標的K562-CD19細胞を2回目及び3回目に投与した後、コントロール細胞の培養物よりも有意に高いノーマライズド細胞数を維持した。Raji細胞の投与に関しては、図11Bに示されるように、N1抗体とともに培養したCD8+ CAR T細胞は、IgG1コントロール培養と比較して、1回目の投与後にコントロール細胞培養よりも高いノーマライズド細胞数を示した。さらに、N1抗体とともに培養したCD8+ CAR T細胞は、標的Raji細胞の2回目及び3回目の投与後に、両方のコントロール細胞培養に比べて有意に高い数値を示した。図11Cは、N1抗ノッチ受容体抗体とともに培養したCD8+ CAR T細胞が、コントロールのIgG1を用いて培養したものよりも、反復刺激アッセイにおいてCD19+腫瘍細胞をより効率的に排除することをグラフで示したものである。
【０１９０】
結論：これらの結果は、CAR T細胞にノッチシグナルを誘導すると、標的抗原に継続的かつ慢性的に曝される環境において、パーシスタンスが高まり、より具体的には疲弊しないことを示している。ノッチアゴニストに曝されたCAR T細胞は、ノッチアゴニストに曝されなかった同様のCAR T細胞と比較して、標的抗原を発現する細胞が常に存在する中で高い増殖活性を維持した。評価した全てのCAR T細胞が同じCD19特異的CARを発現していたことを考慮すると、疲弊への感受性が減少したことは、T細胞内にノッチシグナルが誘導されたためであると考えられる。従って、ノッチシグナルの誘導は他のCARを発現しているT細胞にも適用され、疲弊への感受性が減少し、治療への応用において細胞の増殖力やパーシスタンスを高めることが示された。
【０１９１】
実施例4
タイトル：CD4+ CAR T細胞対CD8+ CAR T細胞のノッチシグナル誘導の効果
イントロダクション：上記の例では、ノッチシグナルが誘導された培養T細胞は、低分化度表現型となるが、それでも細胞の増殖や機能性を許容し、さらには促進することが示されている。また、ノッチシグナルを誘導したCAR T細胞は、マウスの腫瘍モデルにおいて、インビボでの抗腫瘍効果とパーシスタンスが向上することが実証された。さらに、インビトロアッセイでは、ノッチシグナルを誘導したCAR T細胞では、抗原への繰り返しかつ長時間の曝露を受けたときに、パーシスタンスと疲弊への抵抗力が高まることが示された。
【０１９２】
本実施例では、誘導されたノッチシグナルがCD4+T細胞とCD8+T細胞にそれぞれ独立した効果を持ち、誘導されたノッチシグナルを持つCD4+T細胞とCD8+T細胞の集団を混合することで、抗腫瘍反応の相乗効果が得られることを示すアッセイについて説明する。
【０１９３】
結果と考察：まず、CD4+T細胞における誘導されたノッチシグナルの影響を調べた。上述のようにCD4+ CAR T細胞を、2.5μgの抗ノッチ抗体（N1）又はIgG1をコートしたプレート上で培養した。培養11日後、N1に曝したCD4+ CAR T細胞を、上述のようにNSG-Rajiマウスに異なる用量で注入した。腫瘍負荷をホタルルシフェラーゼを用いた生物発光イメージングによって評価した。図12Aにグラフで示されているように、N1に曝されたCD4+ CAR T細胞のみを注入することによる抗腫瘍効果には検出可能な差はない。CAR T細胞のレベルを注入後のいくつかの時点で評価した。具体的には、N1に曝されたCD4+ CAR T細胞の注入後、様々なクレームポイントで血液を採取した。この血液を塩化アンモニウムカリウム溶液で溶解した後、CD45、CD4、及びEGFRの抗体で染色した。データをCanto 2-1フローサイトメーターで収集した。これらのアッセイにより、N1に曝したCD4+ CAR T細胞で処置したマウスは、15日目の時点でコントロール群に比べてEGFR+ CD4+ T細胞の頻度が非常に高く、22日目までに縮小することが明らかになった。従って、CD4+ CAR T細胞はノッチシグナル誘導の結果、強い増殖能を示す。しかし、これだけでは抗腫瘍効果の有意な増強にはつながらない。
【０１９４】
同様のアッセイをCD8+ CAR T細胞についても行った。上述のようにCD8+ CAR T細胞を、2.5μgの抗ノッチ抗体（N1）又はコントロールとしてのIgG1をコートしたプレート上で培養した。培養11日後、N1に曝したCD8+ CAR T細胞を、上述のようにNSG-Rajiマウスに異なる用量で注入した。腫瘍負荷をホタルルシフェラーゼを用いた生物発光イメージングによって評価した。図13Aにグラフで示されているように、N1に曝したCD8+ CAR T細胞のみを注入した後に抗腫瘍効果の増強が観察されたが、この効果の差は時間の経過とともに減少した。CD8+ CAR T細胞のレベルを上述のように注入後のいくつかの時点で評価した。興味深いことに、N1抗体とのインキュベーションによるCD8+ CAR T細胞の明確なピーク拡大は見られなかった。ピーク時のCD8+ CAR T細胞のレベルは、リンパ球シングレットの約2%未満であり、注入後14日目に約30〜45%のピークを達成したCD4+ CAR T細胞とは対照的であった。N1に曝されたCD8+ CAR T細胞を注入したNSG-Rajiマウスの生存率を評価した。図13Bに示されるように、N1に曝されたCD8+ CAR T細胞を注入したNSG-Rajiマウスの生存期間は、IgGコントロールに曝したCD8+ CAR T細胞を注入したNSG-Rajiマウスと比較して小さな延長が見られた。
【０１９５】
さらに評価するために、2種類のCD8+ CAR T細胞の培養を調べた。CD8+ CAR T細胞は、N1抗体アゴニスト又はIgG1を添加したプレートで7日間、又は7日間の後にさらに4日間、通常の組織培養フラスコで培養した（D11グループ）。このCD8+ CAR T細胞を上述のようにNSG-Rajiマウスに注入した。腫瘍負荷に対する異なる注入の効果を、ホタルルシフェラーゼの生物発光イメージングによって時間とともに試験した。図14Aに示すように、N1アゴニストに曝されたCD8+ CAR T細胞を7日間注入した結果、腫瘍負荷の減少が促進された。さらに、図14Bに示すように、N1アゴニストを7日間曝したCD8+ CAR T細胞は、インビボでの増殖が増加し、注入後14日目頃にピークを迎えた。但し、図14Cに示すように、このようなCD8+ CAR T細胞の機能性の向上は、IgGコントロールに曝したCD8+ CAR T細胞と比較して、生存率の増加にはつながらなかった。
【０１９６】
これらの結果から、誘導されたノッチシグナルは、CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞に対して独立した、あるいは異なる効果を持つことが示された。CD4+ T細胞を対象としたアッセイでは、培地をノッチアゴニストに曝した結果、CD4+ T細胞の増殖能力が高くなり、注入後10日目から14日目の間にCAR T細胞シングレットの40％を超えるピークの拡張が見られたのに対し、IgGコントロールに曝されたCAR T細胞は10％未満であった。但し、インビボでは比較的高いレベルの拡大が見られたものの、これは測定可能な抗腫瘍効果の向上にはつながらなかった。一方、CD8+T細胞を対象としたアッセイでは、培地をノッチアゴニストに曝した結果、注入後に比較的小さなT細胞の拡張ピークが得られた。興味深いことに、ノッチ誘導CD8+T細胞は、コントロールのCD8+T細胞を注入した場合と同等の範囲まで腫瘍が成長したが、注入後に優れた腫瘍コントロールを示した。このような独立した効果を考慮して、ノッチシグナル誘導を伴うCD4+T細胞とCD8+T細胞の協調を検討した。CAR T細胞の培養は4つに分けて行った。ノッチアゴニストN1抗体に曝したCD4+ CAR T細胞、コントロールIgG1抗体に曝したCD4+ CAR T細胞、ノッチアゴニストN1抗体に曝したCD8+ CAR T細胞、コントロールIgG1抗体に曝したCD8+ CAR T細胞である。CD4+及びCD8+培地の組み合わせを11日目に1：1の比率で混合し、NSG-Rajiマウスに注入した。NSG-RajiマウスにおけるCD19-CAR T細胞の適用については、例えば、Hudecek, M., et al., The Nonsignaling Extracellular Spacer Domain of Chimeric Antigen Receptors Is Decisive for In Vivo Antitumor Activity, Cancer Immunology Research, 125-135 (2015)（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。CD4+ CAR T細胞及びCD8+ CAR T細胞の増殖を、各組み合わせについて時間とともに決定した。図15A及び15Bに示されるように、CD4+ CAR T細胞が前にノッチアゴニストに曝されたときの注入は、CD8+ CAR T細胞が前にノッチアゴニストに曝さされたかどうかにかかわらず、CD4+ CAR T細胞及びCD8+ CAR T細胞の両方の最大の増殖をもたらした。このことは、培養中にCD4+ T細胞内に誘導されたノッチシグナルが、CD4+ CAR T細胞及びCD8+ CAR T細胞の両方の増殖及び長期パーシスタンスを増加させ、上述の実施例で観察された顕著な抗腫瘍効果を示すことを示している。
【０１９７】
N1アゴニスト抗体とインキュベートしたCD4+ CAR T細胞の表現型をさらに特徴づけるために、テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）染色を用いて、ノッチシグナルが誘導されたCD4+ CAR T細胞内のミトコンドリアを標識するさらなるアッセイを行った。ナイーブCD4+T細胞を2.5μgの固定化N1抗ノッチ抗体を有するプレート上で11日間培養した。図16Aに示すように、N1抗体とインキュベートしたCD4+ CAR T細胞は、ミトコンドリア膜電位が低く、代謝適性が高まっていることが示された。さらにフローサイトメトリー解析を行ったところ、ノッチシグナルによって誘発されたこのようなミトコンドリア膜電位の低下は、主にCD45RA高/CD45RO低CD4細胞に見られることが示された。図16B参照。最終的に、培養でノッチシグナルを誘導するとCD8+T細胞の表面に異なる分子プロファイルが生じる。例えば、図16Cを参照。
【０１９８】
結論：これらの結果は、T細胞におけるノッチシグナルの誘導が、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞に異なる影響を与えることを示している。単独では、CD4+T細胞はノッチシグナルによって誘導されて増殖が大きくなるが、抗腫瘍効果も少なくなる。一方、CD8+T細胞はノッチシグナルによって初期の抗腫瘍効果が大きくなるが、顕著な増殖は見られない。しかし、あらかじめノッチアゴニストに曝露したCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を培養下で組み合わせると、高い増殖性、長期パーシスタンス、及び特定の効果の増強を示した。結果は、特にCD4+T細胞で誘導されたノッチシグナル伝達がこの効果につながり得ることを示す。
【０１９９】
実施例5
タイトル：培養T細胞におけるノッチシグナルの影響に関する出発T細胞集団の分化状態の比較
イントロダクション：以上のことから、T細胞にノッチシグナルを誘導することで、初期、即ち比較的未分化な状態を維持しつつ、増殖能や抗腫瘍能が促進されることが明らかになった。その結果、インビボの寿命や疲弊への抵抗が有意に向上する。また、ノッチシグナルはCD4+ T細胞とCD8+ T細胞に異なる影響を与え、ノッチ刺激を受けたT細胞から観察される顕著な性質の一部は、ノッチに曝されたCD4+ T細胞とCD8+ T細胞の相乗的な協調に起因することが示されている。
【０２００】
上記の実施例で得られた結果は、単離されたナイーブ（即ちTN）T細胞を用いたアッセイに基づいていた。本実施例では、誘導されたノッチシグナルの効果を異なる初期T細胞サブセットについて調べた。
【０２０１】
結果と考察：
最初のアッセイでは、末梢血単核細胞（PBMC）を選別して、ナイーブ（即ち、TN）T細胞が枯渇したCD4+T細胞の集団を得た。CD45RO+ CD4T細胞は、他のマーカー（即ち、CD8及びCD45RA）に対する抗体を細胞に接触させ、結合細胞を磁気活性化セルソーティングを枯渇させる方法で単離した。保持された細胞は、CD45RO+、CD62L+、CD62L¬-、及びCD4+であった。得られた細胞集団を、抗ノッチ1抗体、即ちN1アゴニスト抗体、IgG1コントロール、又はリガンドを含まない組織培養コントロールでコートしたプレート上でインキュベートした。培養を開始してから5日目、8日目、11日目に、CD4+ナイーブ枯渇細胞から出発した細胞集団を、CD28、CD27、CD62Lの発現を評価して、細胞の発生状態を確認した。5日目には、N1アゴニストに曝された細胞は、IgGコントロールに曝された細胞と比較して、CD28及びCD62Lの発現が高かった。8日目には、N1アゴニストに曝された細胞は、IgGコントロールに曝された細胞と比較して、CD35の発現が低く、CD27の発現が高かった。図17は、培養5日目、8日目、及び11日目のCD4+T細胞のうち、発生マーカーの発現プロファイルに基づいてTEM/TEFF、TCM、又はTN/TSCMに分類される割合をグラフ化したものである。図示したように、ノッチシグナルが誘導されると、IgGコントロールと比較して、既に分化を開始したCD4+T細胞（即ち、最初に未分化CD4+T細胞（TN）を枯渇させたCD4+T細胞）において、低分化な状態が維持される。
【０２０２】
次に、初期PBMC集団を、CD4+ TCM細胞、CD8+ TCM細胞、CD4+ TEM細胞、及びCD8+ TEM細胞について選別した。簡単に説明すると、CD4+及びCD8+T細胞を、磁気活性化セルソーティングを用いてPBMCから分離した。その後、CD4+及びCD8+T細胞をCD45RO及びCD62Lの抗体で標識し、フローサイトメトリーでこれらのマーカーの発現に基づいてTN/TSCM（CD45RO-CD62L+）、TCM（CD45RO+/CD62L+）及びTEM（CD45RO+CD62L-）に選別した。異なるソートされた細胞集団を、抗ノッチ1抗体、即ちN1アゴニスト抗体、IgG1コントロール、又はリガンドを含まない組織培養コントロールをコートしたプレート上で別々にインキュベートした。培養を開始してから5日目、8日目、11日目に、細胞集団をCD27、CD28、CD62L、PD1、及びCD25マーカーの発現について評価し、インキュベーション後の細胞の発生及び活性化状態を確認した。図18Aに示すように、ノッチ受容体アゴニストとともにインキュベートしたCD4+ TCM細胞は、より発達したTEM/TEFF細胞の割合が高かった、IgG1コントロールとともにインキュベートしたCD4+ TCM細胞と比較して、5日目にTCM細胞の割合が有意に高く維持された。11日目には、ノッチ誘導培養ではTN細胞の割合が高かった。図18Bに示されるように、ノッチ受容体アゴニストとともにインキュベートしたCD4+TEM細胞は、IgG1コントロールとともにインキュベートしたCD4+TCM細胞と比較して、5日目にTCM細胞の割合が有意に高くなった。図19Aに示されるように、ノッチ受容体アゴニストとともにインキュベートしたCD8+ TCM細胞は、より発達したTEM/TEFF細胞の割合が高かった、IgG1コントロールとともにインキュベートしたCD8+ TCM細胞と比較して、5日目に有意に高い割合のTCM細胞、さらに発達した検出可能なTN細胞を維持した。11日目には、ノッチ誘導培養では、IgG1コントロール群と比較して、TN細胞の割合が高かった。図19Bに示されるように、ノッチ受容体アゴニストとともにインキュベートしたCD8+TEM細胞は、IgG1コントロールとともにインキュベートしたCD8+TCM細胞と比較して、5日目にTCM細胞の割合が有意に高くなった。
【０２０３】
異なるソートされたT細胞サブセットに対する誘導されたノッチシグナルの効果が類似していることを考慮して、全ての培養物に対する効果を試験した。バルクCD8+T細胞を選別し、抗ノッチ1アゴニスト抗体であるN1、又はIgG1抗体コントロールで培養した。培養開始後5日目、7日目、11日目に、細胞を、発生細胞マーカーCD28、CD27、CD62L、PD-1、LAG3、及びCD25の発現について試験した。図20に示すように、培養5日後、N1抗体とともに培養したバルク細胞は、TEM/TEFF細胞の割合が高かったIgGコントロール群と比較して、TCM細胞の割合が有意に高く、検出可能なTN細胞もあった。時間の経過とともに、N1抗体とともに培養したバルク細胞は、IgG1コントロール群と比較して高い割合のTN細胞を発生させた。
【０２０４】
結論：これらのデータは、ノッチ1アゴニストを用いてT細胞を培養すると、T細胞の発生状態に関わらず同じ効果が得られることを示している。より具体的には、ナイーブT細胞、ナイーブ枯渇T細胞、ソートされたT細胞サブセット（CD4+及びCD8+ T細胞を含む）、及びバルクT細胞において、同じ効果が観察された。グループ分けに関係なく、ノッチ受容体アゴニストの曝露は、CD28及びCD27の発現量の増加、及びPD-1、LAG-3、CD25の発現量の減少に示されるように、細胞集団の低分化状態の維持又は発生をもたらした。従って、上記のようなノッチシグナルの効果は、特定のT細胞の発生状態に限定されるものではない。
【０２０５】
実施例6
タイトル：ノッチシグナルが誘導されたCAR T細胞において、インビボで慢性的に抗原にさらされている状況下でパーシスタンス及び疲弊がないことを示す例示的なアッセイ
イントロダクション：上述のように、CAR T細胞を抗ウイルス及び抗がんの治療に応用する際の大きな障害は、標的抗原に長期間又は慢性的に曝されている間に、CAR T細胞が疲弊してしまうこと、即ち、一時的なエフェクター効果が限られ、そのため、養子CAR T治療法の効果が限定されてしまうことである。
【０２０６】
ノッチアゴニストの存在下で作製されたCAR T細胞は、長期間にわたって低分化表現型を示すが、増殖や機能性が阻害されることはないことが上記で示されている。このノッチ誘導CAR T細胞は、コントロールT細胞やノッチアゴニストに曝されていないコントロールCAR T細胞の養子移植と比較して、Rajiリンパ腫を移植したNSGマウスにおいて、インビボでの有効性とパーシスタンスが向上し、その結果、腫瘍負荷が有意に減少し、長期間にわたって生存率が向上することが示された。最終的に、インビトロの研究においてノッチ誘導CAR T細胞は、標的抗原に繰り返し持続的に曝される環境下でも、疲弊への感受性が低いことが示された。培養ノッチ誘導CAR T細胞は、ノッチアゴニストに曝されていない同様のCAR T細胞と比較して、標的抗原を発現する細胞が常に存在する環境下で、より高い増殖活性を維持した。
【０２０７】
本実施例では、インビボにおけるノッチ誘導CAR T細胞の疲弊への感受性の低減を確認するための例示的なアッセイについて説明する。
【０２０８】
実験デザイン：  実験及びコントロールT細胞は、上記で詳細に記載されているように生成することができ、即ち、ノッチリガンド、IgG1コントロールリガンド、又は組織培養のみのプレート上での培養工程を含む。培養物はまた、活性化のために抗CD3/CD28 DYNABEADS(R)（ThermoFisher）を3：1の比率で含み得る。その後、CAR（例えば、抗CD19又はROR1）又はTCR発現のために改変するためのトランスダクションを培養に組み込むことができる。
【０２０９】
1つの例示的なアッセイでは、ノッチ誘導CAR T細胞の感受性の低下は、Hudecek, M., et al., Cancer Immunol Res., 2015, 3(2):125-135（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に典型的に詳述されているように、Raji-fflucモデルで対処できる。簡単に説明すると、Raji細胞をffluc/eGFP融合遺伝子をコードするレンチウイルスでトランスダクションして細胞の標識を可能にし、次いでeGFPの発現についてソートしてRaji-ffluc細胞を得る。上述のように、〜5x105個のRaji ffluc細胞をNOD/SCID/γ鎖-/-（NSG）マウスに移植して、マウスリンパ腫モデルを作成できる。指定された期間、例えば、7日後に、マウスにノッチ誘導CD19 CAR T細胞、IgG1インキュベートされたCAR T細胞（無関係な抗原コントロール）、又は組織培養コントロールCAR T細胞を投与する。CAR T細胞の投与後、NSGマウスは、投与されたCAR T細胞の同種抗原への継続的な曝露を保証するために、Raji-ffluc細胞の1回以上の追加投与を受ける。
【０２１０】
別の例示的なアッセイでは、ノッチ誘導CAR T細胞の感受性の低下は、Hudecek, M., et al., Clin Cancer Res., 2013, 19(12):3153-3164（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に典型的に詳述されているように、ROR1+マウスモデルで対処できる。簡単に説明すると、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）は、CAR改変T細胞を用いて取り組まれてきた免疫療法の候補である。ROR1は、細胞外に免疫グロブリン(Ig)様、フリズルド、及びクリングルドメインを持つ120kDaの糖蛋白質である。ROR1は、胚発生期に発現するが、一部の未成熟なB細胞前駆体のサブセットと脂肪細胞の低レベル発現を除き、正常な成人組織には存在しない。ROR1は、はじめにB細胞性慢性リンパ性白血病（B-CLL）で発現していることが転写プロファイリングにより明らかになり、その後、マントル細胞リンパ腫（MCL）、t(1;19)染色体転座を伴う急性リンパ性白血病（ALL）、及び肺、乳、大腸、膵、腎、卵巣がんのサブセット（14-21）を含む多くのがんの表面で同定された。肺腺がんとt(1;19)ALLでは、ROR1が発がんシグナルに協調しており、siRNAでROR1をノックダウンすることで、この分子が腫瘍細胞の生存維持に重要な役割を果たしていることが明らかになった。
【０２１１】
例示的なアッセイのために、K562/ROR1及びRaji/ROR1細胞を、完全長のROR1遺伝子で細胞をレンチウイルストランスダクションすることによって生成する。抗CD19及び抗ROR1 CAR発現T細胞は、上記で詳述したように生成し、これはノッチ-1リガンド又は適切なコントロールへの曝露を含む、NSGマウスにK562/ROR1細胞及びRaj/ROR1細胞（例えば、〜0.5×106個）を最初に投与する。一定期間（例えば、7日間）経過後、マウスにノッチ誘導CAR T細胞、又は適切なコントロールと代替的にインキュベートしたコントロールCAR T細胞を投与する。CAR T細胞を投与した後、NSGマウスにK562/ROR1細胞又はRaj/ROR1細胞を1回又は複数回追加投与して、投与したCAR T細胞が同種抗原に継続的に曝されるようにできる。
【０２１２】
いずれのアッセイデザインにおいても、T細胞は、マウスから経時的にサンプリングでき、上記に詳述されているように、増殖状態、細胞傷害性、及びサイトカイン生産についてアッセイ/モニタリングできる。さらに、マウスは、例えば、生物発光分析を用いて腫瘍負荷をモニターすることができ、上記に詳述されているように、Raji-ffluc細胞を繰り返し投与した場合の生存率をモニターできる。
【０２１３】
期待される結果
対象内での長期にわたる生存、パーシスタンス、及び活性化、並びに抗原への継続的又は反復的な曝露の環境下での疲弊に対する感受性の低下を示す上記の結果を考慮すると、本発明のアッセイは、投与されたノッチ誘導CAR T細胞が、培養中にノッチシグナルを受けなかったCAR T細胞と比較して、インビボでの長期にわたる低分化状態を維持することを示すことが期待される。この長期にわたるパーシスタンスは、インビボでの長期及び/又は反復した抗原曝露の際の疲弊率の低下に現れ、腫瘍負荷の縮小及び/又は除去が促進され、対象の生存率向上が期待される。
【０２１４】
実施例7
タイトル：T細胞を採取、培養、改変、特徴付けするための例示的な方法と材料
細胞
EASYSEPTMヒトナイーブCD4+及びCD8+ T細胞単離キット（Stem Cell Technologies, それぞれカタログ#19555/19258）又は EASYSEP TMヒトメモリーCD4+T細胞エンリッチメントキット（Stem Cell Technologies, カタログ#19157）を用いてナイーブT細胞を単離できる。
【０２１５】
ノッチ1抗体によるプレートのコート
コート用の抗体の希釈にPBSを使用する。ノッチ1ウェルに2.5μg/mlのLEAF-精製ノッチ1抗体（Biolegendカタログ#352104）、DLL1、DLL4、又はN2抗体（Biolegendカタログ#348301）をコートする。IgGウェルに2.5 μg/mlのヒトIgGをコートする。レトロネクチン（Takara）を5μg/mlでコートされたウェルに使用する。コート量は、24ウェルフォーマットの場合はウェルあたり0.5mL、12ウェルフォーマットの場合はウェルあたり1mL、6ウェルフォーマットの場合はウェルあたり2mLを使用する。
【０２１６】
ウイルスの調製
パッケージング及びエンベロープベクターであるPCHGP-2、pCMV-Rev2、及びpCMV-Gを用いて、リン酸カルシウムトランスフェクションプロトコルにより、濃縮fmc63（抗CD19-41BB CAR）レンチウイルスを作製する。3日後、PEGと超遠心機を用いてウイルスを濃縮し、DMEMに再懸濁した。使用前にウイルスの力価を測定した。
【０２１７】
トランスダクション
トランスダクションの前日に、ノッチ1/レトロネクチン-、ヒトIgG/レトロネクチン-、又はTC-処理プレートに、2e5細胞/ウェルの密度で細胞をプレーティングする。細胞は、トランスダクションの24時間前に、抗CD3/CD28 DYNABEADS(R)（ThermoFisher）の3：1比率と50 u/mLのIL2とともに培養する。その後、過剰な刺激を避けるためにDYNABEADS(R)を除去する。濃縮fmc63ウイルス、ポリブレン（0.43μg/ml）、及び50 IU/ml IL2を用いて、800xgで90分間、32℃で遠心分離することにより細胞をトランスダクションする。トランスダクションの6時間後に培地の半分を交換する。
【０２１８】
培養
T細胞刺激から72時間後（トランスダクションから48時間後）に、細胞をコート又はTC処理された12ウェルプレートに移し、半分の培地交換と500uLの培地追加を行う。T細胞刺激の5日後、磁性体DYNABEADS(R)を除去し、細胞をコート又はTC処理された6ウェルプレートに移す。T細胞刺激の7日後、細胞を通常の組織培養用T25又はT75フラスコに移す（1ウェルを1つのT25フラスコに、又は3ウェルを1つのT75フラスコに）。
【０２１９】
インビトロアッセイ
増殖（Receptor Affinity and Extracellular Domain Modifications Affect Tumor Recognition by ROR1-Specific Chimeric Antigen Receptor T Cells by Michael Hudecek, Maria-Teresa Lupo-Stanghellini, Paula L. Kosasih, Daniel Sommermeyer, Michael C. Jensen, Christoph Rader and Stanley R. Riddell DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-13-0330 Published June 2013を参照）。
【０２２０】
T細胞を0.2μmol/Lカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE；インビトロジェン）で標識し、洗浄し、外因性サイトカインを含まない培地で刺激細胞と3連でプレーティングした。72時間培養後、細胞を抗CD4又はCD8 mAb、抗EGFR mAb及びヨウ化プロピジウムで標識し、フローサイトメトリーで分析して、生CD4/ CD8+ T細胞の細胞分裂を評価した。
【０２２１】
インビトロでの表現型と活性化の解析、及びマウスのブリード解析のために、細胞をモノクローナル抗体で20分間染色し、その後、フローバッファーで洗浄し、Canto IIフローサイトメーターでデータを取得した。データをFlowjo（Treestar）で解析した。
【０２２２】
例示的な実施形態を図示及び説明してきたが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、そこに様々な変更を加えることができることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｃ２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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