(57)【要約】  本発明は、生物学的標的に機械的支持体および／または薬剤を提供するための組成物、キット、および方法に関する。具体的には、組成物は、血小板溶解物、フィブリノゲン、およびトロンビンを含む。組成物は、創傷／損傷（例えば、角膜）の治療、および組織培養を含む他の用途に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜２０Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む組成物。
【請求項２】
イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つまたは複数をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記イオンが、カルシウムイオンを含み、および／または前記増殖因子が、ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、前記イオンおよびアミノ酸を含む培養培地を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記イオンが、前記組成物に含まれるイオン性塩溶液の構成成分である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、
（ｉ）０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜１５Ｕ／ｍＬのトロンビン、および５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜１０Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１０〜３５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉｉ）０．２〜５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜８Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１５〜３０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｖ）０．２〜３ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜４Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１５〜２５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、
（ｉ）１ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．２ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲン、２〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約３Ｕ／ｍｌ、約５Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ）のトロンビン、および５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０〜３０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物、または
（ｉｉ）１〜４ｍｇ／ｍｌ（例えば、約２ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲン、５〜１５Ｕ／ｍｌ（例えば、約７Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約１２Ｕ／ｍｌ）のトロンビン、および１０〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約１５〜３０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物、または
（ｉｉｉ）３〜８ｍｇ／ｍｌ（例えば、約５ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲン、２〜１５Ｕ／ｍｌ（例えば、約４Ｕ／ｍｌ、約８Ｕ／ｍｌ、約１２Ｕ／ｍｌ）のトロンビン、および１５〜３０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０〜２５％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、
（ｉ）約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌもしくは約１ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および
約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビン、および
約２０％（ｖ／ｖ）、約２５％（ｖ／ｖ）もしくは約３０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約２ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、もしくは約８ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および
約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビン、および
約１０％、約１５％（ｖ／ｖ）、もしくは約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉｉ）約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および
約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビン、および
約５％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）、もしくは約２５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、
（ｉ）少なくとも、約０．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、約２ユニット／ｍＬのトロンビン、および約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）少なくとも、約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および約１０Ｕ／ｍＬのトロンビンを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
キット、パッケージまたはデバイスであって、
−フィブリノゲンを含む第１の区画およびトロンビンを含む第２の区画であって、前記キット、パッケージまたはデバイスが、前記フィブリノゲンおよびトロンビンの前記キット、パッケージまたはデバイスへの装填中および装填後に、前記第１の区画の前記フィブリノゲンおよび前記第２の区画の前記トロンビンを分離できるように構成されている、第１の区画および第２の区画と、
−血小板溶解物と、
−前記第１の区画の前記フィブリノゲンと前記第２の区画の前記トロンビン、および前記血小板溶解物との混合を促進する手段と、を含む、キット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１４】
前記血小板溶解物が、前記キット、パッケージまたはデバイスの第３の区画に位置し、前記キット、パッケージまたはデバイスが、前記フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物の前記キット、パッケージまたはデバイスへの装填中および装填後に、前記第１の区画の前記フィブリノゲンおよび前記第２の区画の前記トロンビンから前記第３の区画の前記血小板溶解物を分離できるように構成されている、請求項１３に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１５】
前記第１の区画が、前記フィブリノゲンおよび前記血小板溶解物を含み、前記第２の区画が前記トロンビンを含む、請求項１３に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１６】
−いずれかの前記区画が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つもしくは複数をさらに含む、または
−前記キット、パッケージまたはデバイスが、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つもしくは複数を含む追加区画を含み、前記キット、パッケージまたはデバイスが、前記キット、パッケージまたはデバイスの装填中および装填後に、他の区画の内容物から前記追加区画の内容物を分離できるように構成されている、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１７】
前記イオンが、カルシウムイオンである、または
前記イオン源が、イオン性塩であり、および／またはカルシウムイオンを含む、請求項１６に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１８】
前記手段が、前記キット、パッケージまたはデバイスの外部での前記フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物の混合を促進するように構成されている、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１９】
前記手段が、前記フィブリノゲンの流れと前記トロンビンの別個の流れを集束点に向けることにより、前記混合を促進するように構成され、
前記流れのうちの少なくとも１つが、前記血小板溶解物を含む、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２０】
前記第１および第２の区画のいずれかもしくは両方、および／または第３の区画が細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）を含む、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２１】
前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２２】
前記血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２３】
（ｉ）前記第１の区画が、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、１〜４０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の区画が、０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、１〜３０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の区画が、０．１〜１２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、１〜２５Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計７〜１４％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｖ）前記第１の区画が、０．５〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、１〜１０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計０．５〜２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２４】
（ｉ）前記第１の区画が、２ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．８ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の区画が、１〜１６ｍｇ／ｍｌ（例えば、約８ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の区画が、５〜１５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ）を含み、前記第２の区画が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２５】
（ｉ）前記第１の区画が、０．８ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の区画が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記デバイスが、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の区画が、約８ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の区画が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記デバイスが、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の区画が、約２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の区画が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記デバイスが、合計約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２６】
前記トロンビン、フィブリノゲンおよび血小板溶解物の前記混合から生じる製剤が、
（ｉ）少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、少なくとも１ユニット／ｍＬのトロンビン、および約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約２ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、および約５Ｕ／ｍｌのトロンビン、を含む、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２７】
前記第１の区画および前記第２の区画が、前記血小板溶解物を含まない、請求項１３〜２６のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２８】
前記第１の区画および前記第２の区画が、等体積、または１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満異なる体積の液体製剤である、請求項１３〜２７のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２９】
組成物を調製する方法であって、
（ｉ）
フィブリノゲンを含む第１の製剤およびトロンビンを含む第２の製剤を提供することであって、前記第１の製剤が、前記第２の製剤と接触していない、提供することと、
（ｉｉ）前記組成物を提供するために前記第１および第２の製剤を血小板溶解物と混合することと、を含む、方法。
【請求項３０】
前記混合の前に、前記血小板溶解物が、フィブリノゲンを含む前記第１の製剤と組み合わされ、トロンビンを含む前記第２の製剤とは組み合わされない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記混合の前に、前記血小板溶解物が、トロンビンを含む前記第２の製剤と組み合わされない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合の前に、前記血小板溶解物が、フィブリノゲンを含む前記第１の製剤またはトロンビンを含む前記第２の製剤と組み合わされない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つまたは複数を、前記第１および第２の製剤ならびに血小板溶解物と混合することをさらに含む、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記イオンが、カルシウムイオンである、または
前記イオン源が、イオン性塩であり、および／またはカルシウムイオンを含む、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）を前記第１および第２の製剤と混合することをさらに含む、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
（ｉ）前記第１の製剤が、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜４０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記第１および／もしくは第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜３０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記第１および／もしくは第２の製剤が、合計５〜２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、０．１〜１２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜２５Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記第１および／もしくは第２の製剤が、合計７〜１４％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｖ）前記第１の製剤が、０．２〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、２〜２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記第１および／もしくは第２の製剤が、合計８〜１２％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
（ｉ）前記第１の製剤が、１ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記第１および／もしくは第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、１〜８ｍｇ／ｍｌ（例えば、約４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記第１および／もしくは第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、５〜１５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ）を含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記第１および／もしくは第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
（ｉ）前記第１の製剤が、約０．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記第１および／または第２の製剤が、合計約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、約４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記第１および／または第２の製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、約１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記第１および／または第２の製剤が、合計約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物が、
（ｉ）少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、少なくとも１ユニット／ｍＬのトロンビン、および約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約２ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、および約５Ｕ／ｍＬのトロンビン、を含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の製剤および前記第２の製剤が、等体積である、または１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満異なる体積である、請求項２９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１および第２の製剤ならびに前記血小板溶解物の前記混合が、
前記フィブリノゲンを含む第１の流れ、前記トロンビンを含む第２の流れ、および任意選択で第３の流れを生成することであって、前記流れが、当初互いに分離している、生成することと、
前記流れをともに組み合わせることと、を含み、
前記第１の流れ、前記第２の流れおよび／または前記第３の流れのうちのいずれか１つもしくは複数が、前記血小板溶解物を含む、請求項２９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項２９〜４３のいずれか１項に記載の方法により得られたまたは得ることができる組成物。
【請求項４５】
フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物を含む製剤を対象の組織に適用するための、請求項１３〜２８のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイスの使用。
【請求項４６】
対象の組織を治療する方法であって、請求項１〜１２または請求項４４のいずれか１項に記載の組成物を前記組織に適用することを含む、方法。
【請求項４７】
対象の組織の治療に使用するための、請求項１〜１２または請求項４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
対象の組織を治療するための薬剤の調製における、フィブリノゲンを含む第１の製剤、およびトロンビンを含む第２の製剤の使用であって、前記薬剤が、血小板溶解物をさらに含む、使用。
【請求項４９】
前記薬剤が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つまたは複数をさらに含む、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記薬剤が、細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）をさらに含む、請求項４８または請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
対象の組織を治療する際に併用するための、フィブリノゲンを含む第１の製剤、トロンビンを含む第２の製剤、および任意選択での第３の製剤であって、前記第１の製剤、前記第２の製剤および／または前記任意選択での第３の製剤のうちのいずれか１つまたは複数が、血小板溶解物を含む、第１の製剤、第２の製剤、および任意選択での第３の製剤。
【請求項５２】
前記第１の製剤、前記第２の製剤、および／または前記任意選択での第３の製剤のうちのいずれか１つまたは複数が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項５１に記載の製剤。
【請求項５３】
前記第１の製剤、前記第２の製剤、および／または前記任意選択での第３の製剤のうちのいずれか１つまたは複数が、細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）を含む、請求項５１または請求項５２に記載の製剤。
【請求項５４】
前記イオンが、カルシウムイオンである、または
前記イオン源が、イオン性塩であり、および／またはカルシウムイオンを含む、請求項４９もしくは請求項５０に記載の使用、または請求項５２〜５３に記載の製剤。
【請求項５５】
前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項４８〜５０もしくは請求項５４のいずれか１項に記載の使用、または請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５６】
前記血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、請求項４８〜５０、５４もしくは５５のいずれか１項に記載の使用、または請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５７】
（ｉ）前記第１の製剤が、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜４０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜３０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計５〜１５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、０．１〜１２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜２５Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計７〜１４％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｖ）前記第１の製剤が、０．２〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、２〜２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計８〜１２％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項４８〜５０もしくは５４〜５６のいずれか１項に記載の使用、または請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５８】
（ｉ）前記第１の製剤が、１ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、１〜８ｍｇ／ｍｌ（例えば、約４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、５〜１５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ）を含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、請求項４８〜５０もしくは５４〜５６のいずれか１項に記載の使用、または請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５９】
（ｉ）前記第１の製剤が、約０．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記薬剤もしくは製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、約４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記薬剤もしくは製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、約１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記薬剤もしくは製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項４８〜５０もしくは５４〜５６のいずれか１項に記載の使用、または請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６０】
前記薬剤または製剤が、
（ｉ）少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、少なくとも１ユニット／ｍＬのトロンビン、および約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約２ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、および約５Ｕ／ｍｌのトロンビン、を含む、請求項４８〜５０もしくは５４〜５６のいずれか１項に記載の使用、または請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６１】
前記第１の製剤および前記第２の製剤が、等体積である、または１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満異なる体積である、請求項４８〜５０もしくは５４〜５６のいずれか１項に記載の使用、または請求項４６〜５１のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６２】
前記組織が、眼組織（例えば角膜組織）である、請求項４５、４８〜５０、もしくは５４〜６１のいずれか１項に記載の使用、請求項５１〜６１のいずれか１項に記載の製剤、または請求項４６に記載の方法、または請求項４７に記載の組成物。
【請求項６３】
前記組織が創傷を含む、または前記組織が創傷を含む眼組織（例えば、創傷を含む角膜組織）である、請求項４５、４８〜５０、もしくは５４〜６１のいずれか１項に記載の使用、請求項５１〜６１のいずれか１項に記載の製剤、または請求項４６に記載の方法、または請求項４７に記載の組成物。
【請求項６４】
前記製剤が、三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを使用して前記対象の前記組織に適用される、請求項４５、または５４〜６２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６５】
三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを使用して前記対象の前記組織を治療するための薬剤である、請求項４８〜５０、または５４〜６２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６６】
前記組成物が、三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを使用して前記組織に適用される、請求項４６に記載の方法。
【請求項６７】
前記組織の前記治療が、三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを利用する、請求項４７に記載の組成物。
【請求項６８】
前記組織の前記治療が、三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを利用する、請求項５１〜６２のいずれか１項に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照による組み込み
本出願は、２０１８年８月７日に出願されたオーストラリア仮出願第２０１８９０２８７０号からの優先権を主張し、その全内容は相互参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、生物学および医学の分野に関し、より具体的には、生物学的標的に機械的支持および／または薬剤を提供するための組成物および方法に関する。さらにより具体的には、本発明は、創傷／損傷の治療、および組織培養を含む他の用途に使用することができる組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
角膜は、瞳孔を通して光を屈折させ、感染、紫外線、および機械的外傷に対する物理的バリアとして機能する、前眼部表面の不可欠な構成成分である。さらに、角膜損傷はオーストラリアで最も一般的な眼の緊急症状であり、全症例の約７５％は、角膜の異物または擦過傷の存在によるものである。これらの損傷だけでも、オーストラリア人に、年間１億５５００万ドル余の費用がかかると推定されており、効果的に治療しない場合、感染や瘢痕化につながり、永続的な視覚障害をもたらす可能性がある。さらに、角膜疾患は、ほとんどの発展途上国で２番目に多い失明の原因であり、世界中で３，９００万人の視覚障害者のうち推定１２％が両側性角膜失明に苦しんでおり、さらに２，３００万人が片側性角膜失明に苦しんでいる。
【０００４】
角膜欠損は、外傷および他の疾患プロセスから生じる可能性がある。軽度の場合、角膜は通常の創傷治癒経路を介して再生することができ、角膜の密な神経支配のために、角膜損傷は非常に痛い可能性がある。しかしながら、場合によっては、角膜の通常の創傷治癒メカニズムでは不十分な可能性がある。これは、角膜融解、角膜血管新生、透明性の喪失、感染、瘢痕化、および失明時までの視力低下をもたらす可能性のある非治癒欠損の形成につながる。
【０００５】
角膜の創傷治癒は、擦過傷、感染、または屈折矯正手術の後など、細胞補充と細胞喪失との均衡が崩れた場合に起こる。軽度の場合、角膜は、この不均衡を回復させるために生理学的プロセスを上方制御することができるが、より重症の場合、追加の治療が必要である。創傷治癒が効果的に起こらない場合、視覚障害、さらに角膜失明などの潜在的に有害な結果が生じる可能性がある。
【０００６】
現在の角膜損傷の医学的処置には、抗生物質、眼帯、縫合糸、および外科用接着剤が含まれ、これらは軽傷に役立つ可能性がある。しかしながら、それらは、痛みの軽減、感染、および／または瘢痕組織の発達を含む、より進行した創傷で生じる問題に適切に対処していない。感染症は重大な合併症を示し、入院が必要になる場合がある。これらの問題は、角膜の損傷のみに限定されるものではなく、他の体組織の創傷の場合にも同様に通用する。重度の角膜損傷で一般的な瘢痕化は、視覚リハビリテーションの唯一の選択肢である角膜移植で永久的な視力喪失につながる可能性がある。
【０００７】
角膜損傷を治療するための改良された組成物および方法が必要である。改良された組成物および方法はまた、他の組織の創傷の治療にも応用できる可能性がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、創傷（例えば、角膜創傷）を治療するための現在の組成物および／または方法に関連する問題のうちの少なくとも１つを軽減する。
【０００９】
血小板溶解物の機械的特性は水の特性と類似しているため、構造化形態で組織に適用することは困難である。例えば、（例えば、バイオプリンティングなどの技術に必要な）二次元または三次元の構造を生成するために、生の血小板溶解物を組織に層ごとに適用することは非常に困難であり、ほとんどの場合実行不可能である。本発明者らは、構造化形態での組織への適用を促進する機械的特性および構造的特性を有する血小板溶解物組成物を開発した。特に、本発明の組成物は、二次元または三次元のバイオプリンティング技術を使用して、血小板溶解物を組織（例えば、眼）に適用するために使用され得る。本組成物は、少なくとも血小板溶解物、フィブリノゲン、およびトロンビンを集合的に含む、最初は分離された構成成分から調製することができる。混合すると、分離された構成成分は固化し、血小板溶解物を含むゲル状の材料になる。凝固速度は、さまざまな組成構成成分のタイミングおよび／または量を変えることによって制御することができ、したがって、適用プロセスに柔軟性を提供する。限定されないが、本明細書に記載の組成物および方法は、一般に、生物学的標的（例えば、組織、膜、細胞）への薬剤（例えば、薬物および／または他の物質）の送達に有用であり、例えば、角膜組織の創傷（例えば、非治癒角膜潰瘍または擦過傷）を含む創傷の治療に適用される。
【００１０】
本発明は、少なくとも部分的に下記の実施形態に関する。
実施形態１．０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜２０Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む組成物。
【００１１】
実施形態２．イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つまたは複数をさらに含む、実施形態１に記載の組成物。
【００１２】
実施形態３．イオンが、カルシウムイオンを含み、および／または増殖因子が、ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）を含む、実施形態１または実施形態２に記載の組成物。
【００１３】
実施形態４．組成物が、イオンおよびアミノ酸を含む培養培地を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【００１４】
実施形態５．イオンが、組成物に含まれるイオン性塩溶液の構成成分である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の組成物。
【００１５】
実施形態６．組成物が、細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）をさらに含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【００１６】
実施形態７．血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含むか、またはそれからなる、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
【００１７】
実施形態８．血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の組成物。
【００１８】
実施形態９．組成物が、
（ｉ）０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜１５Ｕ／ｍＬのトロンビン、および５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜１０Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１０〜３５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉｉ）０．２〜５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜８Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１５〜３０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｖ）０．２〜３ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜４Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１５〜２５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
【００１９】
実施形態１０．組成物が、
（ｉ）１ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．２ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲン、２〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約３Ｕ／ｍｌ、約５Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ）のトロンビン、および５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０〜３０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物、または
（ｉｉ）１〜４ｍｇ／ｍｌ（例えば、約２ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲン、５〜１５Ｕ／ｍｌ（例えば、約７Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約１２Ｕ／ｍｌ）のトロンビン、および１０〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約１５〜３０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物、または
（ｉｉｉ）３〜８ｍｇ／ｍｌ（例えば、約５ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲン、２〜１５Ｕ／ｍｌ（例えば、約４Ｕ／ｍｌ、約８Ｕ／ｍｌ、約１２Ｕ／ｍｌ）のトロンビン、および１５〜３０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０〜２５％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
【００２０】
実施形態１１．組成物が、
（ｉ）約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌもしくは約１ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および
約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビン、および
約２０％（ｖ／ｖ）、約２５％（ｖ／ｖ）もしくは約３０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約２ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、もしくは約８ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および
約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビン、および
約１０％、約１５％（ｖ／ｖ）、もしくは約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉｉ）約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および
約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビン、および
約５％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）、もしくは約２５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
【００２１】
実施形態１２．組成物が、
（ｉ）少なくとも、約０．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、約２ユニット／ｍＬのトロンビン、および約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）少なくとも、約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および約１０Ｕ／ｍＬのトロンビンを含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
【００２２】
実施形態１３．キット、パッケージ、またはデバイスであって、
−フィブリノゲンを含む第１の区画およびトロンビンを含む第２の区画であって、キット、パッケージ、またはデバイスが、フィブリノゲンおよびトロンビンをキット、パッケージまたはデバイスに装填中および装填後に、第１の区画のフィブリノゲンおよび第２の区画のトロンビンを分離できるように構成されている、第１の区画および第２の区画と、
−血小板溶解物と、
−第１の区画のフィブリノゲンと、第２の区画のトロンビン、そして血小板溶解物との混合を促進する手段と、を含む、キット、パッケージ、またはデバイス。
【００２３】
実施形態１４．血小板溶解物が、キット、パッケージまたはデバイスの第３の区画に位置し、キット、パッケージまたはデバイスが、フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物をキット、パッケージまたはデバイスに装填中および装填後に、第１の区画のフィブリノゲンおよび第２の区画のトロンビンから第３の区画の血小板溶解物を分離できるように構成されている、実施形態１３に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００２４】
実施形態１５．第１の区画が、フィブリノゲンおよび血小板溶解物を含み、第２の区画がトロンビンを含む、実施形態１３に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００２５】
実施形態１６．
−いずれかの当該区画が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つもしくは複数をさらに含むか、または
−キット、パッケージ、もしくはデバイスが、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つもしくは複数を含む追加区画を含み、キット、パッケージ、もしくはデバイスが、キット、パッケージ、もしくはデバイスの装填中および装填後に、他の区画の内容物から追加区画の内容物を分離できるように構成されている、実施形態１３〜１５のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００２６】
実施形態１７．
イオンが、カルシウムイオンであるか、または
イオン源が、イオン性塩であり、および／またはカルシウムイオンを含む、実施形態１６に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００２７】
実施形態１８．手段が、キット、パッケージまたはデバイスの外部でのフィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物の混合を促進するように構成されている、実施形態１３〜１７のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００２８】
実施形態１９．
手段が、フィブリノゲンの流れとトロンビンの別個の流れとを集束点に向けることにより、当該混合を促進するように構成され、
当該流れのうちの少なくとも１つが、血小板溶解物を含む、実施形態１３〜１８のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００２９】
実施形態２０．第１および第２の区画のいずれかもしくは両方、および／または第３の区画が細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）を含む、実施形態１３〜１９のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００３０】
実施形態２１．血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含むか、またはそれからなる、実施形態１３〜２０のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００３１】
実施形態２２．血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、実施形態１３〜２１のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００３２】
実施形態２３．
（ｉ）第１の区画が、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の区画が、１〜４０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）第１の区画が、０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の区画が、１〜３０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）第１の区画が、０．１〜１２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の区画が、１〜２５Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、デバイスが、合計７〜１４％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｖ）第１の区画が、０．５〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の区画が、１〜１０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、デバイスが、合計０．５〜２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、実施形態１３〜２２のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００３３】
実施形態２４．
（ｉ）第１の区画が、２ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．８ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、第２の区画が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含むか、または
（ｉｉ）第１の区画が、１〜１６ｍｇ／ｍｌ（例えば、約８ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、第２の区画が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含むか、または
（ｉｉｉ）第１の区画が、５〜１５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ）を含み、第２の区画が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、実施形態１３〜２２のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００３４】
実施形態２５．
（ｉ）第１の区画が、０．８ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
第２の区画が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
デバイスが、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）第１の区画が、約８ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
第２の区画が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
デバイスが、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）第１の区画が、約２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
第２の区画が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
デバイスが、合計約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、実施形態１３〜２２のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００３５】
実施形態２６．トロンビン、フィブリノゲンおよび血小板溶解物の混合から生じる製剤が、
（ｉ）少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、少なくとも１ユニット／ｍＬのトロンビン、および約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約２ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、および約５Ｕ／ｍｌのトロンビン、を含む、実施形態１３〜２２のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００３６】
実施形態２７．第１の区画および第２の区画が、血小板溶解物を含まない、実施形態１３〜２６のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００３７】
実施形態２８．第１の区画および第２の区画が、等体積、または１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満異なる体積の液体製剤である、実施形態１３〜２７のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【００３８】
実施形態２９．組成物を調製する方法であって、
（ｉ）
フィブリノゲンを含む第１の製剤およびトロンビンを含む第２の製剤を提供することであって、第１の製剤は、第２の製剤と接触していない、提供することと、
（ｉｉ）第１および第２の製剤を血小板溶解物とともに混合することにより組成物を提供することと、を含む、方法。
【００３９】
実施形態３０．当該混合の前に、血小板溶解物が、フィブリノゲンを含む第１の製剤と組み合わされ、トロンビンを含む第２の製剤とは組み合わされない、実施形態２９に記載の方法。
【００４０】
実施形態３１．当該混合の前に、血小板溶解物が、トロンビンを含む第２の製剤と組み合わされない、実施形態２９に記載の方法。
【００４１】
実施形態３２．当該混合の前に、血小板溶解物が、フィブリノゲンを含む第１の製剤またはトロンビンを含む第２の製剤と組み合わされない、実施形態２９に記載の方法。
【００４２】
実施形態３３．方法が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つまたは複数を、当該第１および第２の製剤ならびに血小板溶解物と混合することをさらに含む、実施形態２９〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【００４３】
実施形態３４．
イオンが、カルシウムイオンであるか、または
イオン源が、イオン性塩であり、および／またはカルシウムイオンを含む、実施形態２９〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【００４４】
実施形態３５．細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）を当該第１および第２の製剤と混合することをさらに含む、実施形態２９〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【００４５】
実施形態３６．血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含むか、またはそれからなる、実施形態２９〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【００４６】
実施形態３７．血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、実施形態２９〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【００４７】
実施形態３８．
（ｉ）第１の製剤が、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、１〜４０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、第１および／または第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）第１の製剤が、０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、１〜３０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、第１および／または第２の製剤が、合計５〜２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）第１の製剤が、０．１〜１２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、１〜２５Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、第１および／または第２の製剤が、合計７〜１４％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｖ）第１の製剤が、０．２〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、２〜２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、第１および／または第２の製剤が、合計８〜１２％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、実施形態２９〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【００４８】
実施形態３９．
（ｉ）第１の製剤が、１ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、第１および／または第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）第１の製剤が、１〜８ｍｇ／ｍｌ（例えば、約４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、第１および／または第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）第１の製剤が、５〜１５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ）を含み、第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、第１および／または第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、実施形態２９〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【００４９】
実施形態４０．
（ｉ）第１の製剤が、約０．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
第１および／または第２の製剤が、合計約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）第１の製剤が、約４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
第１および／または第２の製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）第１の製剤が、約１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
第１および／または第２の製剤が、合計約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、実施形態２９〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【００５０】
実施形態４１．組成物が、
（ｉ）少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、少なくとも１ユニット／ｍＬのトロンビン、および約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約２ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、および約５Ｕ／ｍＬのトロンビン、を含む、実施形態２９〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【００５１】
実施形態４２．第１の製剤および第２の製剤が、等体積であるか、または１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満異なる体積である、実施形態２９〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【００５２】
実施形態４３．第１および第２の製剤ならびに血小板溶解物の混合が、
フィブリノゲンを含む第１の流れ、トロンビンを含む第２の流れ、および任意選択で第３の流れを生成することであって、当該流れは当初互いに分離している、生成することと、
流れをともに組み合わせることと、を含み、
第１の流れ、第２の流れおよび／または第３の流れのうちのいずれか１つもしくは複数が、血小板溶解物を含む、実施形態２９〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【００５３】
実施形態４４．実施形態２９〜４３のいずれか１つに記載の方法により得られるまたは得ることができる組成物。
【００５４】
実施形態４５．フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物を含む製剤を対象の組織に適用するための、実施形態１３〜２８のいずれか１つに記載のキット、パッケージまたはデバイスの使用。
【００５５】
実施形態４６．対象の組織を治療する方法であって、実施形態１〜１２または実施形態４４のいずれか１つに記載の組成物を組織に適用することを含む、方法。
【００５６】
実施形態４７．対象の組織の治療に使用するための、実施形態１〜１２または実施形態４４のいずれか１つに記載の組成物。
【００５７】
実施形態４８．対象の組織を治療するための薬剤の調製における、フィブリノゲンを含む第１の製剤、およびトロンビンを含む第２の製剤の使用であって、薬剤が、血小板溶解物をさらに含む、使用。
【００５８】
実施形態４９．薬剤が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つまたは複数をさらに含む、実施形態４８に記載の使用。
【００５９】
実施形態５０．薬剤が、細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）をさらに含む、実施形態４８または実施形態４９に記載の使用。
【００６０】
実施形態５１．対象の組織の治療で同時使用するための、フィブリノゲンを含む第１の製剤、トロンビンを含む第２の製剤、および任意選択での第３の製剤であって、第１の製剤、第２の製剤および／または任意選択での第３の製剤のうちのいずれか１つもしくは複数が、血小板溶解物を含む、第１の製剤、第２の製剤、および任意選択での第３の製剤。
【００６１】
実施形態５２．
第１の製剤、第２の製剤、および／または任意選択での第３の製剤のうちのいずれか１つもしくは複数が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つまたは複数を含む、実施形態５１に記載の製剤。
【００６２】
実施形態５３．
第１の製剤、第２の製剤、および／または任意選択での第３の製剤のうちのいずれか１つもしくは複数が、細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）を含む、実施形態５１または実施形態５２に記載の製剤。
【００６３】
実施形態５４．
イオンが、カルシウムイオンであるか、または
イオン源が、イオン性塩であり、および／またはカルシウムイオンを含む、実施形態４９もしくは実施形態５０に記載の使用、または実施形態５２〜５３に記載の製剤。
【００６４】
実施形態５５．
血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含むか、またはそれからなる、実施形態４８〜５０または実施形態５４のいずれか１つに記載の使用、または実施形態５１〜５４のいずれか１つに記載の製剤。
【００６５】
実施形態５６．
血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、実施形態４８〜５０、５４または５５のいずれか１つに記載の使用、または実施形態５１〜５５のいずれか１つに記載の製剤。
【００６６】
実施形態５７．
（ｉ）第１の製剤が、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、１〜４０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）第１の製剤が、０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、１〜３０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計５〜１５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）第１の製剤が、０．１〜１２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、１〜２５Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計７〜１４％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｖ）第１の製剤が、０．２〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、２〜２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計８〜１２％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、実施形態４８〜５０、または５４〜５６のいずれか１つに記載の使用、または実施形態５１〜５６のいずれか１つに記載の製剤。
【００６７】
実施形態５８．
（ｉ）第１の製剤が、１ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）第１の製剤が、１〜８ｍｇ／ｍｌ（例えば、約４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）第１の製剤が、５〜１５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ）を含み、第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、薬剤もしくは製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、実施形態４８〜５０、または５４〜５６のいずれか１つに記載の使用、または実施形態５１〜５６のいずれか１つに記載の製剤。
【００６８】
実施形態５９．
（ｉ）第１の製剤が、約０．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
薬剤もしくは製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含むか、または
（ｉｉ）第１の製剤が、約４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
薬剤もしくは製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含むか、または
（ｉｉｉ）第１の製剤が、約１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
薬剤もしくは製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、実施形態４８〜５０、または５４〜５６のいずれか１つに記載の使用、または実施形態５１〜５６のいずれか１つに記載の製剤。
【００６９】
実施形態６０．薬剤または製剤が、
（ｉ）少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、少なくとも１ユニット／ｍＬのトロンビン、および約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約２ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、および約５Ｕ／ｍｌのトロンビン、を含む、実施形態４８〜５０、または５４〜５６のいずれか１つに記載の使用、または実施形態５１〜５６のいずれか１つに記載の製剤。
【００７０】
実施形態６１．
第１の製剤および第２の製剤が、等体積であるか、または１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満異なる体積である、実施形態４８〜５０、または５４〜５６のいずれか１つに記載の使用、または実施形態４６〜５１のいずれか１つに記載の製剤。
【００７１】
実施形態６２．組織が、眼組織（例えば角膜組織）である、実施形態４５、４８〜５０、または５４〜６１のいずれか１つに記載の使用、実施形態５１〜６１のいずれか１つに記載の製剤、または実施形態４６に記載の方法、または実施形態４７に記載の組成物。
【００７２】
実施形態６３．組織が創傷を含むか、または創傷を含む眼組織（例えば、創傷を含む角膜組織）である、実施形態４５、４８〜５０、または５４〜６１のいずれか１つに記載の使用、実施形態５１〜６１のいずれか１つに記載の製剤、または実施形態４６に記載の方法、または実施形態４７に記載の組成物。
【００７３】
実施形態６４．製剤が、三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを使用して対象の組織に適用される、実施形態４５、または５４〜６２のいずれか１つに記載の使用。
【００７４】
実施形態６５．三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを使用して対象の組織を治療するための薬剤である、実施形態４８〜５０、または５４〜６２のいずれか１つに記載の使用。
【００７５】
実施形態６６．組成物が、三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを使用して組織に適用される、実施形態４６に記載の方法。
【００７６】
実施形態６７．当該組織の治療が、三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを利用する、実施形態４７に記載の組成物。
【００７７】
実施形態６８．当該組織の治療が、三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを利用する、実施形態５１〜６２のいずれか１つに記載の製剤。
【００７８】
定義
本出願で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の参照が含まれる。例えば、「構成成分」という用語は、複数の構成成分も含む。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の単語の変化形、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は、相応に変化した意味を有する。したがって、例えば、構成成分「Ａ」を「含む」組成物は、構成成分Ａのみからなるか、１つまたは複数の追加構成成分（例えば、構成成分「Ｂ」および／または構成成分「Ｃ」）を含み得る。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類およびげっ歯類の種を含む、経済的、社会的または研究的に重要な任意の動物を含む。したがって、「対象」は、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物などの哺乳動物であり得る。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「組織」という用語は、組織の構成成分（複数可）である細胞および組織から形成された器官（複数可）の両方を包含すると理解される。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。そのような送達システムには、反応試薬（例えば、適切な容器内の標識、参照試料、支持材料など）および／または支持材料（例えば、緩衝材、アッセイを実施するための取扱説明書）をある位置から別の位置に貯蔵、輸送、または送達することを可能にするシステムが含まれる。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含む、箱などの１つまたは複数の収納容器を含み得る。「キット」という用語には、分割キットおよび複合キットの両方が含まれる。「分割キット」とは、それぞれがキット全構成成分のサブ部分を含む２つ以上の別個の容器を含む送達システムを指す。容器は、意図する受容者に一緒にまたは別々に配達され得る。それぞれがキット全構成成分のサブ部分を含む２つ以上の別個の容器を含む任意の送達システムは、「分割キット」という用語の意味に含まれる。「複合キット」とは、反応アッセイの全構成成分を単一容器に含む送達システムを指す（例えば、所望する構成成分のそれぞれを収容する単一の箱）。
【００８３】
本明細書で使用される場合、列挙された数値に関して使用される場合の「約」という用語は、列挙された数値および列挙された値のプラスマイナス１０パーセント以内の数値を含む。
【００８４】
本明細書の先行技術文書のいかなる説明も、またはそれらの文書から導出された、もしくはそれらの文書に基づく本明細書の記述も、文書または導出された記述が関連技術の共通の一般的知識の一部であることを認めるものではない。
【００８５】
説明の目的で、本明細書で参照されるすべての文書は、別段明記しない限り、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
ここで、本発明の好ましい実施形態は、添付の図を参照して、単に例として説明される。
【００８７】
【図１】（Ａ）バイオインク１（Ｂ）バイオインク２（Ｃ）バイオインク３（Ｄ）バイオインク４（Ｅ）バイオインク５（Ｆ）バイオインク６（Ｇ）バイオインク７（Ｈ）バイオインク８（Ｉ）バイオインク９（表３を参照）について、３４℃で１０分間、１Ｈｚの時間−掃引振動にわたる本発明の実施形態による組成物の貯蔵（Ｇ’）および損失（Ｇ”）係数を示す一連のグラフである。
【図２】バイオインク製剤１〜９（表３を参照）について、３４℃の固定温度で、０．１秒-1から１００秒-1のせん断速度ランプにわたってパスカル秒で測定された本発明の実施形態による組成物の粘度を示すグラフを提供する。
【図３】バイオインク製剤１〜９（表３を参照）について、可視スペクトル（４００〜７００ｎｍ）の波長にわたる本発明の実施形態による組成物の平均透過率を示すグラフを示す。
【図４】スライドガラスに接着された本発明バイオインク５（表３参照）の実施形態による組成物の画像である。
【図５】バイオインク１〜９（表３を参照）について、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍにより測定したＨＣＥ−Ｔ細胞の経時的な平均コンフルエンス（各条件ｎ＝６）を示すグラフを提供する。
【図６】バイオインク５（表３）で培養および増殖させた初代ヒト角膜細胞を示す一連の画像を提供する。（Ａ）は、角膜外植片から増殖している角膜上皮細胞を示す。（Ｂ）は、角膜実質細胞の増殖を示す。（Ｃ）は、角膜ニューロンの増殖を示す。（Ｄ）は、角膜内皮細胞の増殖を示す。
【図７】本発明バイオインク５（表３）の実施形態によるバイオインク製剤におけるＳＨＳＹ−５Ｙの順調な増殖を示す画像を提供する。（Ａ）は、インクでの細胞増殖を示す。（Ｂ）は、インクで十分なコンフルエントに達している細胞を示す。
【図８】本発明の一実施形態によるバイオインク製剤で培養された球状凝集体の画像を示す（ＡおよびＢ）。（Ｃ）は、球状凝集体から増殖した角膜実質細胞を示す。
【図９】２〜７日にわたる吸収による本発明バイオインク５（表３）の実施形態による組成物の吸収および分解の画像を提供する。
【図１０】５％ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびＤＭＥＭ単独におけるＨＣＥ−Ｔ細胞（各条件ｎ＝３）のスクラッチアッセイの結果を示す画像（Ａ）およびグラフ（Ｂ）を提供する。創傷閉鎖は、ＤＭＥＭ単独の条件では観察されなかった。（Ａ）は、０、５、および２４時間での創傷閉鎖の再現を示す（上段０時間、中段５時間、下段２４時間、左列５％ｈＰＬ、中列５％ＦＢＳ、右列ＤＭＥＭ単独）。（Ｂ）は、５％ｈＰＬ条件（０．１９±０．０１μｍ／時間）および５％ＦＢＳ条件（０．１８±０．０３）について、スクラッチ治癒が観察された速度±ＳＥＭを示す。５％ＦＢＳと５％ｈＰＬの間で治癒速度に有意差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。
【図１１】以前は移植の使用に拒絶されていたエクスビボの潰瘍化したヒト角膜の再上皮化を示す画像を提供する。バイオインクは、１日目および４日目に適用され、７日目に固定、凍結切片化、Ｈ＆Ｅ染色した。（Ａ）は、初期の潰瘍を示し、潰瘍領域は赤で強調されている。（Ｂ）は、創傷清拭後の上皮のない表面のサイズを示す。（Ｃ）は、角膜の中央部分のＨ＆Ｅ染色を示し、健康なヒト角膜に匹敵する厚さおよび形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）で完全な再上皮化を示す。（Ｄ）は、比較用に上皮除去された角膜の中央部分のＨ＆Ｅ染色を示す。（ｉ）：上皮、（ｉｉ）：間質、（ｉｉｉ）：上皮がない、（ｉｖ）：間質
【図１２】死後のブタ角膜上での穿孔（直径１ｃｍ）の作成および順調な閉塞を示す画像を提供する。（Ａ）は、穿孔の作成を示す。（Ｂ）は、漏出角膜を示す。（Ｃ）は、アプリケーターデバイスを用いたバイオインクの塗布を示す。（Ｄ）は、バイオインク塗布２分後の塞がれた穿孔を示す。
【図１３】本発明バイオインクの層状プリントを示す画像を提供する。
【図１４−１】Ｈｏｅｓｃｈｔ（青）染色またはヨウ化プロピジウム（赤）染色されたＰ１８  ＨＣＥＴ細胞を含む本発明のプリントされたバイオインクの画像を示す。ＡおよびＢ：押出し後２時間。ＣおよびＤ：押出し後７２時間。
【図１４−２】Ｈｏｅｓｃｈｔ（青）染色またはヨウ化プロピジウム（赤）染色されたＰ１８  ＨＣＥＴ細胞を含む本発明のプリントされたバイオインクの画像を示す。ＡおよびＢ：押出し後２時間。ＣおよびＤ：押出し後７２時間。
【図１５】本発明の実施形態によるプリントされたバイオインク組成物の透明度を示す。
【図１６】浸漬試験後のスライドガラス上の本発明によるバイオインクの画像を示す。表５の通り、Ａは組成物１を示し、Ｂは組成物２を示し、Ｃは組成物３を示し、Ｄは組成物４を示し、Ｅは組成物５を示し、Ｆは組成物６を示し、Ｅは組成物７を示す。
【図１７】本発明のバイオインクで処理されたヒト角膜創傷（１．５ｍｍ）が漏出を防ぐことができる力のレベルを示すグラフである。Ａ：１．６３Ｎ、すなわち、１１２ｍｍＨｇ、Ｂ．１．３３Ｎ、すなわち、１０５ｍｍＨＧ、Ｃ：−．７１Ｎ、すなわち、５６ｍｍＨＧ。
【図１８】本発明のバイオインクが、バイオインクで塞がれた直径１．５ｍｍの穿孔で耐えることができる平均破裂圧力（ｍｍＨｇ±ＳＥＭ）を示すグラフである。
【図１９】秒単位で経時的にパスカル秒（パスカル秒）で測定された１秒-1の固定せん断速度で、本発明のバイオインクの粘度±ＳＥＭを示すグラフである（ｎ＝３）。構成成分Ｂは、ｔ＝６０秒で添加した。固化時間は、添加後に粘度がピークに達するまでにかかる時間として定義され、ピンクの点線で示されている。固化時間は、１秒-1の固定せん断速度で２５秒と決定された。
【図２０】（ｉ）本発明のバイオインクを使用して処理された角膜上皮創傷を有するウサギの眼（列Ｂ）、および（ｉｉ）ヒストアクリルで処理された角膜上皮創傷を有する対照ウサギの眼（列Ａ）において、経時的な創傷治癒の画像を提供する。対照ウサギおよび処理ウサギの両創傷治癒は、ｔ＝５２時間で達成された。−（創傷作成前）、数字（創傷作成後の時間数）。
【図２１】創傷治癒が達成されるまでの時間（ｔ＝５２時間）にわたって測定された図２０の対照ウサギの疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。１：ケタミン（臨時追加の鎮痛剤）投与、２：メタドン（臨時追加の鎮痛剤）投与、３：ブプレノルフィン（ＩＭ）投与、４．メロキシカム投与。
【図２２】創傷治癒が達成されるまでの時間（ｔ＝５２時間）にわたって測定された図２０のバイオインクで処理されたウサギの疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。１：ブプレノルフィン（ＩＭ）投与、２：メロキシカム投与。
【図２３】（ｉ）本発明のバイオインクを使用して処理された角膜穿孔をそれぞれ有する２匹のウサギの眼（列ＡおよびＢ）ならびに（ｉｉ）ヒストアクリルで処理された角膜穿孔を有する対照ウサギの眼（列Ｃ）における経時的な創傷治癒の画像を提供する。角膜穿孔創傷の治癒が達成された場合にピンクの境界線で印をつける。二次性潰瘍の形成が治癒した場合に緑の境界線で印をつける。対照ウサギの角膜穿孔創傷治癒は、ｔ＝８０時間で観察され、処理ウサギでは、それぞれｔ＝２８時間およびｔ＝３２時間であった。Ａ：バイオインク処理ウサギ２、Ｂ：バイオインク処理ウサギ２、Ｃ：対照ウサギ。数字（創傷作成後の時間数）。
【図２４】完全な創傷治癒が達成されるまでの時間（ｔ＝８０時間）にわたって測定された、図２３（列Ｃ）の対照ウサギの疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。Ａ：ブプレノルフィン（ＩＭ）投与、Ｂ：メロキシカム投与、Ｃ：ヒストアクリルオフ、Ｄ：二次潰瘍形成。
【図２５】完全な創傷治癒が達成されるまでの時間（ｔ＝５２時間）にわたって測定された図２３（列Ａ）のバイオインク処理ウサギの疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。Ａ：二次潰瘍形成、Ｂ：ブプレノルフィン（ＩＭ）投与、メロキシカム投与。
【図２６】完全な創傷治癒が達成されるまでの時間（ｔ＝４８時間）にわたって測定された、図２３（列Ｂ）のバイオインク処理ウサギの疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。Ａ：二次潰瘍形成、Ｂ：ブプレノルフィン（ＩＭ）投与、メロキシカム投与。
【図２７】（ｉ）本発明のバイオインクを使用して処理された、改変角膜穿孔を有するウサギの眼（列Ａ）および（ｉｉ）ヒストアクリルで処理された改変角膜穿孔を有する対照ウサギの眼（列Ｂ）における経時的な創傷治癒の画像を提供する。改変角膜穿孔創傷の治癒が達成された場合にピンクの境界線で印をつける。二次性潰瘍の形成が治癒した場合に緑の境界線で印をつける。対照ウサギにおける改変角膜穿孔の治癒は、ｔ＝４８時間で観察され、処理ウサギではｔ＝８時間であった。列Ａ：バイオインク処理ウサギ２、列Ｂ：対照ウサギ。数字（創傷作成後の時間数）。
【図２８】（ｉ）完全な創傷治癒が達成されるまでにかかった時間（ｔ＝４８時間）にわたって測定された図２７（列Ｂ）の対照ウサギ（暗線）および（ｉｉ）完全な創傷治癒が達成されるまでにかかった時間（ｔ＝８時間）にわたって測定された図２７（列Ａ）のバイオインク処理ウサギ（明線）、についての疼痛スコアを示すグラフである。追加の鎮痛剤が投与された時点を記録する。バイオインク処理ウサギには、追加の鎮痛剤を投与しなかった。Ａ：ブプレノルフィン（ＩＭ）投与、Ｂ：メタドン（臨時追加の鎮痛剤）投与、Ｃ：メロキシカム投与、Ｄ：ヒストアクリルオフおよび二次性潰瘍形成。
【図２９】（Ａ）摂氏−４０度で凍結乾燥したバイオインク試料、（Ｂ）１チューブあたり５０ｕＬの水で透明な液体に再構成した（Ａ）の凍結乾燥試料、（Ｃ）再構成後に形成された透明な接着性ゲル、についての画像を示す。
【００８８】
図１の凡例：
【００８９】
【表１】
2021534231.tif 000002
【００９０】
図２の凡例：
【００９１】
【表２】
2021534231.tif 000003
【００９２】
図３の凡例：
【００９３】
【表３】
2021534231.tif 000004
【００９４】
図５の凡例：
【００９５】
【表４】
2021534231.tif 000005
【００９６】
図２８の凡例：
【００９７】
【表５】
2021534231.tif 000006
【発明を実施するための形態】
【００９８】
本発明者らは、構造化形態での組織への適用を促進する機械的特性および構造的特性を有する血小板溶解物組成物を開発した。特に、本発明の組成物は、二次元または三次元のバイオプリンティング技術を使用して、血小板溶解物を組織（例えば、眼）に適用するために使用され得る。本組成物は、生物学的標的（例えば、器官、組織、細胞）に薬剤を送達する手段を提供する。角膜損傷の治療への適用に好適であるが、本明細書に記載の組成物は、例えば、構造的支持、生細胞、および創傷治癒のプロセスを促進する他の因子を提供することにより、創傷治癒の分野における多数の治療のためのプラットフォームを提供する。当技術分野では、眼表面の創傷などの創傷に対する効果的な血液由来の治療が必要とされている。本明細書に記載の組成物は、眼の治療の観点から、涙の代用物として作用するように眼の表面を潤滑するだけでなく、創傷治癒を促進する多様な増殖因子およびサイトカインの供給源も提供する血小板溶解物に基づいている。本明細書に記載の組成物は、インビボ組織を模倣し、細胞が増殖するための足場として機能し、および／または条件操作を通じて、細胞自体がそれらの周囲の基質を再生することを促進する、生体材料を利用することができる。眼組織への適用に対する適合性という観点から、本発明者らは、例えば、治療中の組織（例えば、角膜）の構造的完全性を具現化できる基質を作成することの困難に取り組む一方で、透明性を維持し、さらに多孔性で生体適合性があり、角膜細胞および必要な治癒促進増殖因子の浸潤、移動および／または増殖を可能にする。損傷組織（例えば、角膜などの眼組織）の構造的、機械的および物理的な要件を満たしながら、損傷組織の栄養必要量を提供することのバランスは、本発明が生まれたときに存在した問題であった。本発明は、多様な生物学的標的に薬剤を送達するための改善された組成物および方法を提供する。特定の用途に限定されることなく、本組成物は、創傷および他の形態の組織損傷を治療するために使用され得る。
【００９９】
生物剤の送達のための組成物
本発明は、組織および細胞などの生物学的標的への薬剤の送達に好適な組成物を提供する。
【０１００】
本組成物は、生物学的標的（例えば、組織、膜、細胞、器官）への適用時に構造的支持を提供し、生物学的標的への薬剤の送達を促進し、ならびに／または損傷組織、および／または生物学的標的内の細胞の再生を促進するために、基本足場材料を利用する。
【０１０１】
足場を生成するために使用される特定の材料（複数可）に関して、特に制限はない。
【０１０２】
例えば、足場はフィブリン足場であり得る。これらは、例えば、組成物中のフィブリノゲンおよびトロンビンの使用を介して生成され得る。当業者に知られているように、フィブリノゲンからフィブリンへの変換は、一般に３段階で起こる。トロンビンは、限定されたタンパク質分解である第１段階を触媒して、フィブリノゲンからフィブリノペプチド（ＦｐＡおよびＦｐＢ）を放出し、それによってフィブリンモノマーを提供し得る。第２段階では、フィブリンモノマーは非共有相互作用を介して中間ポリマーを形成し得る。第３段階では、中間ポリマーが凝集して三次元フィブリン基質を形成し得る。フィブリン形成および生物学的足場におけるその使用は、例えば、Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｂ  Ｒｅｖ．２００８  Ｊｕｎ；１４（２）：１９９−２１５）に記載されている。
【０１０３】
本発明の組成物は、任意選択で、イオンおよび／またはイオン源をさらに含み得る。好適なイオンの非限定的な例には、カルシウムイオンが含まれる。好適なイオン源の非限定的な例には、カルシウム含有化合物（例えば、塩化カルシウム）が含まれる。
【０１０４】
本発明の組成物は、血小板溶解物を含み得る。血小板溶解物は、例えば、哺乳動物の血小板溶解物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヤギ、マウス、ウサギ、ハムスター、またはイタチの血小板、またはそれらの任意の組み合わせを使用して生成される）であり得る。血小板溶解物を生成するために利用される血小板の供給源は、一般に、組成物が使用される特定の目的に依存するであろう。当業者に知られているように、血小板溶解物は、血小板を単離し、それらを溶解し、細胞残屑を除去することによって生成する。血小板溶解物の構成要素およびその用途は十分に分析されている（例えば、Ｂｕｒｎｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１６  Ｊａｎ；７６：３７１−８７を参照）。
【０１０５】
本発明者らは、本発明の組成物についてフィブリノゲン、トロンビン、および血小板溶解物の最適な相対濃度を特定し、そのいくつかは、本出願の実施例および特許請求の範囲に記載されている。開示されたフィブリン、トロンビンおよび血小板溶解物の相対濃度は例示的なものにすぎないことが理解されよう。
【０１０６】
本発明による組成物は、細胞を含み得る。細胞は、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ヤギ細胞、マウス細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、イタチ細胞、またはこれらの任意の組み合わせ）であり得る。利用される細胞のタイプは、一般に、組成物が使用される特定の目的に依存するであろう。例えば、細胞は、本組成物が投与される組織と同じタイプであり得る（例えば、中枢および／または末梢の角膜上皮、眼球および／または瞼板の結膜上皮、瞼板結膜間質および／または眼瞼縁の細胞を含む眼表面細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、メルケル細胞、およびランゲルハンス細胞を含むがこれらに限定されない皮膚細胞、ならびにニューロンおよびグリア細胞を含むがこれらに限定されない神経組織細胞）。他の例には、上皮細胞、角膜実質細胞、神経細胞、および内皮細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、細胞は、造血幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、筋肉幹細胞、脂肪幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、細胞は神経細胞であり得る。
【０１０７】
組成物の血小板溶解物および／または細胞は、自己由来であり得る（すなわち、組成物を受け取ることを意図した所与の対象に自己由来する、または（すなわち、ドナー由来）。
【０１０８】
本発明の組成物は、必須および／または非必須アミノ酸を含み得る。好適な必須アミノ酸の非限定例には、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、システイン、チロシン、ヒスチジンおよびアルギニンが含まれる。
【０１０９】
本発明の組成物は、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、形質転換増殖因子（ベータを含む）、および結合組織増殖因子）、フィブリン安定化因子（例えば、組織因子ＸＩＩＩ）、基質タンパク質（複数可）（例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリン）およびこれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない追加の構成成分（例えば、薬剤）を含み得る。
【０１１０】
本発明の組成物は、水および／または培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＭＥＭ、ＣｎＴ−ＰＲ）を含む他の好適な成分を含み得る。培養培地は、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アスパラギン−Ｈ2Ｏ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン塩酸塩−Ｈ2Ｏ、Ｌ−シスチン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩二水和物、Ｌ−バリン、ビタミン、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミドピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２、ｉ−イノシトール、無機塩、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）（無水）、硫酸銅（ＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ）、硝酸鉄（Ｆｅ（ＮＯ3）3”９Ｈ2Ｏ）、硫酸鉄（ＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ）、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）無水、一塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ4−、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ4−７Ｈ2Ｏ）、他の構成成分、Ｄ−グルコース（デキストロース）、ヒポキサンチンＮａ、リノール酸、リポ酸、プトレシン２ＨＣｌ、ピルビン酸ナトリウム、チミジン、またはこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上を含み得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本組成物は、抗凝固剤を含まないか、または微量でのみ存在し得る抗凝固剤を実質的に含まない。これらの抗凝固剤の非限定例には、ヘパリン、ビタミンＫ拮抗薬（例えば、ワルファリン、クマリン）、リバーロキサバン、エドキサバン、アピキサバン、ダビガトランなどが含まれる。
【０１１２】
組成物の非限定的な特性には、以下のうちの１つまたは複数が含まれる。
−非ニュートンせん断減粘流体の特性により、せん断速度が増加するにつれ、組成物の粘度が低下し得る。いくつかの実施形態では、組成物の粘度は、室温で０．０１〜１０００パスカル秒の範囲であり得る。
−光の透過率から生じる視力を妨げない、または実質的に妨げない、例えば４００〜７００ｎｍの視覚色範囲で９０％超の光学的透明度。
−プリント後の形状／構造を維持するまたは実質的に維持する能力を備えたプリンティング（例えば、バイオプリンティング／押出しプリンティング）への適合性。
−プリンティングプロセスの間、組成物内の細胞の生存率を維持しながらのプリンティングへの適合性。
−生細胞を含む場合または含まない場合の二次元または三次元の構造で提供される能力。
−細胞の増殖を維持および／または促進する能力（例えば、上皮細胞、角膜実質細胞、神経細胞、および内皮細胞などの初代ヒト細胞の拡大増殖を維持および／または促進する）。
−球状オルガノイドの形成を促進する能力。
−細胞による経時的な（例えば、２〜７日）分解能力。
−経時的（例えば、７日）な創傷治癒能力（例えば、角膜潰瘍）。
−経時的な（例えば、３４℃で７日間）細胞生存率の維持。
−組織、器官、膜（例えば、哺乳動物およびヒトの組織、器官、膜）を含むさまざまな表面に付着する能力。
【０１１３】
創傷治癒組成物の調製
本発明の組成物は、血小板溶解物（例えば、哺乳動物血小板溶解物、ヒト血小板溶解物）を含む。血小板溶解物は、任意の好適な方法によって調製することができる（例えば、凍結／解凍による溶解、例えば、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｂｕｒｎｏｕｆ，ＩＳＢＴ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ  １２，Ｉｓｓｕｅ  １，Ｆｅｂ  ２０１７，ｐａｇｅｓ  １６８−１７５を参照）。
【０１１４】
さらに、本発明者らは、血小板溶解物の調製中（例えば、培養時）の抗凝固剤の使用が、本発明による組成物を形成する血小板溶解物の能力に影響を及ぼし得ることを観察した。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、利用される血小板溶解物は、調製方法の一部またはすべての段階で抗凝固剤（例えば、ヘパリン）なしで調製される。
【０１１５】
一般に、本発明の組成物は、複数の異なる調製物を組み合わせることによって調製することができる。いくつかの実施形態において、トロンビンを含む調製物は、フィブリノゲンを含む調製物とは別に維持され、２つの調製物は、組成物の適用前または適用中に組み合わされる。
【０１１６】
例えば、フィブリノゲンおよび血小板溶解物を含む第１の調製物を、トロンビンを含む第２の調製物と混合して、本発明の組成物を提供することができる。あるいは、フィブリノゲンを含む第１の調製物を、トロンビンおよび血小板溶解物を含む第２の調製物と混合して、本発明の組成物を提供することができる。追加の構成成分（例えば、イオン、イオン源、アミノ酸、細胞、抗生物質、増殖因子、フィブリン安定化因子、麻酔薬など）は、任意の好適な様式で、任意の好適な時間（例えば、混合段階の前）に組成物に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、追加の構成成分（すなわち、フィブリノゲンおよびトロンビンに追加の構成成分）のいくつかまたはすべてを、トロンビンを含む調製物および／またはフィブリノゲンを含む調製物に含めることができる。他の実施形態では、追加の構成成分（すなわち、フィブリノゲンおよびトロンビンに追加の構成成分）のいくつかまたはすべては、トロンビンまたはフィブリノゲンを含むこれらの調製物とは別の１つまたは複数の調製物で提供することができる。さらに他の実施形態では、いくつかの追加の構成成分（すなわち、フィブリノゲンおよびトロンビンに追加の構成成分）は、トロンビンを含む調製物および／またはフィブリノゲンを含む調製物に含めることができ、いくつかの追加の構成成分（すなわち、フィブリノゲンおよびトロンビンに追加の構成成分）は、トロンビンまたはフィブリノゲンを含むこれらの製剤とは別の１つまたは複数の製剤に含めることができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本組成物は、分離された構成成分の個々の流れを確立することによって調製することができる。これらの流れは、好適な期間、継続的な流れの状態で維持され、所与の点で互いに混合するように方向づけられることにより、生物学的標的上に沈着される混合構成成分のさらなる流れを提供する。あるいは、流れは、組成物が適用される生物学的標的の表面または表面上で互いに混合するように方向づけられ得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、使用するまで本発明の組成物を形成するために必要な異なる調製物の分離を容易にするデバイスおよび／またはキットを提供する。一般に、デバイスおよびキットは、少なくとも２つの物理的に分離された区画を含み、第１はトロンビンの調製物を含み、第２はフィブリノゲンの調製物を含む。いくつかの実施形態において、一方または両方の区画は、組成物を生成する際に使用される追加の構成成分（例えば、血小板溶解物、イオン、アミノ酸、細胞、抗生物質、増殖因子、フィブリン安定化因子、麻酔薬など）を含み得る。
【０１１９】
デバイスおよびキットは、例えば、第１および第２の区画を分離するバリア（複数可）の除去によって、ならびに／または一方もしくは両方の区画のシールまたは壁に穴を開けることによってなど、２つの区画化された調製物の混合を促進する手段を提供する構成成分をさらに含み得る。当業者は、この目的のためにさまざまな準備を行うことができることを容易に理解するであろう。
【０１２０】
追加的または代替的に、デバイスおよびキットは、デバイスまたはキットからの調製物の放出中または放出後に、２つの区画化された調製物の混合を確実にする方法で構成され得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、デバイスおよびキットは、組成物を生成する際に使用される追加の構成成分（例えば、血小板溶解物、イオン、アミノ酸、細胞、抗生物質、増殖因子、フィブリン安定化因子、麻酔薬など）を含む追加の区画を含み得る。デバイスまたはキットは、デバイスまたはキットの使用中に、これらの追加の構成成分を、互いにならびに／またはフィブリノゲンおよび／またはトロンビンの調製物（複数可）と混合することを促進するように構成され得る。
【０１２２】
デバイスおよびキットは、デバイスまたはキットからの構成成分の放出の前、最中、または直後に、分離された構成成分の混合を促進し得る。
いくつかの実施形態では、デバイスおよびキットは、分離された構成成分の個々の流れを確立するための手段を提供し得る。これらの流れは、デバイスまたはキットの使用中に継続的な流れの状態で維持され、所与の点で互いに混合するように方向づけられ得る。混合点は、デバイスもしくはキット内、流れがデバイスもしくはキットを出る場所、またはデバイスもしくはキットの外部（例えば、組成物が適用されている生物学的標的の表面または表面の前）であり得る。いくつかの実施形態では、組成物はバイオインクであり、デバイスは三次元（３Ｄ）プリンター（例えば、押出しプリンター）である。
【０１２３】
組成物の適用
本発明者らは、バイオプリンティングに非常に好適な特徴を有する標的の組織および細胞に薬剤を送達するための組成物を開発した。創傷治癒における治療適用でのそれらの使用に加えて、本発明の組成物は、薬剤（例えば、天然増殖因子、薬物、ナノ粒子、および／または細胞）の送達および／または個々の生物学的表面の固定、および／または組織培養法で必要である治療適用で使用され得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本組成物は、創傷シーラントとして、および／または生物学的構造の固定剤として機能し得る。これらは、創傷に構造的および／または栄養的支持を提供し得る。追加的または代替的に、本組成物は、創傷領域に存在する組成物および／または細胞の構成成分として提供され得るものを含む、標的細胞タイプの増殖を促進し得る。
【０１２５】
組成物を適用できる組織のタイプに関して制限はないが、本発明者らは、組成物が眼の創傷の治療において非常に効果的であることを実証した。
【０１２６】
例えば、組成物は、角膜創傷の治療に有効であることが本明細書で実証されている。これらの実施形態において、本組成物は、角膜上皮細胞の増殖および／または移動を促進するために使用され得る。本組成物は、例えば、角膜上皮細胞の多方向増殖および／または層化を支持し、これは、細胞単層が形成されると、組成物を部分的または完全に生分解し得る。
【０１２７】
したがって、本発明は、創傷を治療するための方法、およびそのような治療方法のために製造された薬剤を提供する。創傷は、例えば、中枢および／または末梢の角膜上皮、眼球および／または瞼板の結膜上皮、瞼板結膜間質、および／または眼瞼縁の組織を含む眼組織の中または周囲に位置し得る。
【０１２８】
広く記載されている本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態に開示されているように、本発明に対して多数の変形および／または改変を行えることは、当業者に理解されるであろう。したがって、本実施形態は、すべての点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
【実施例】
【０１２９】
次に、本発明を具体的な実施例を参照して説明するが、これは決して限定的なものとして解釈されるべきではない。
【０１３０】
実施例１：バイオインク組成物の調製および特性評価
−材料および方法
（ｉ）血小板溶解物の調製
医薬品のヒト血小板溶解物は、オーストラリア赤十字血液サービスによって２つの方法で調製される。
１．アフェレーシス
ａ．血小板はアフェレーシスによって得られる。
ｂ．血小板は摂氏４度で５日間保存される。
ｃ．血小板溶解物の濃度はアフェレーシスプロセスのために高いが、含有する。
ｄ．血小板溶解物は、複数の凍結融解サイクルによって調製され、各ラウンドで遠心分離およびｏｐｔｉ−ｐｒｅｓｓによる残屑除去を行い、次いで−８０℃で保存される。
２．プール
ａ．血液バッグを吊し、インラインろ過により赤血球を分離する
ｂ．血漿はバッグ内で回転させ、次に血漿はｏｐｔｉ−ｐｒｅｓｓによって３０％の血漿／血小板濃度に分離される
ｃ．バッグに残った血小板製品は、チューブ溶接機を通って閉鎖系にプールされる。
ｄ．プールされた血小板は、摂氏４度で５日間保存される。
ｅ．プールされた血小板ユニットは、２リットルのバッチにプールされる（５０〜７０の輸血）
ｆ．プールされた血小板ユニットは次いで、遠心分離し、上清を除去し、約２×１０11血小板の濃度を得る。
ｇ．プールされた血小板ユニットは、複数の凍結融解サイクルによって調製され、遠心分離およびｏｐｔｉ−ｐｒｅｓｓによる残屑除去を行い、次いで−８０℃で保存される。
注記：
●調製したすべてのｈＰＬは、−８０℃で最大１２か月間安定であった。
●血漿濃度が３０％未満と低いため、プールされた血小板はフィブリノゲンが減少しなかった。
●病原菌を除去するために、最終遠心分離および滅菌ろ過により閉鎖系で調製した。
●すべての血小板は、貯蔵段階前の収集後にガンマ照射され、病原体不活化技術は使用されなかった。
【０１３１】
赤十字血液銀行（Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ  ｂｌｏｏｄ  ｂａｎｋ）から受け取った溶解物を４℃で一晩解凍し、３７℃の水浴に２時間入れた。その後、すぐに使用する場合は４°Ｃ、必要になるまで−８０°Ｃで保存した。
【０１３２】
（ｉｉ）バイオインクの調製
血小板溶解物、トロンビンおよびフィブリノゲンを含む医薬組成物（「バイオインク組成物」）が製造された。場合によっては、バイオインク組成物は、イオン（例えば、カルシウム）、薬学的に許容される必須アミノ酸（例えば、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、システイン、チロシン、ヒスチジンおよび／またはアルギニン）、フィブロネクチン、ヒト内皮増殖因子、組織因子ＸＩＩＩ、麻酔薬、抗生物質、他の増殖因子（血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、形質転換増殖因子（ベータを含む）および／または結合組織増殖因子）を含むがこれらに限定されない）、および／または他の成分／賦形剤（表１を参照）などの追加成分を含んでいた。
【０１３３】
【表６】
2021534231.tif 000007
【０１３４】
組成物は、バイオインクの適用前に一緒に混合された２つの別々の溶液ＡおよびＢ（表２を参照）を最初に調製することによって製造された。混合は完全である必要はなく、バイオインクを形成するには部分的な混合で十分であった。
【０１３５】
【表７】
2021534231.tif 000008
【０１３６】
−結果および考察
バイオインクは、溶液ＡおよびＢを混合して、透明で無色のゲルを形成することで生成した。バイオインクの以下の特性が認められた。
−バイオインクは非ニュートンせん断減粘流体であり、それにより、せん断速度が増加するにつれ、その粘度が低下する。バイオインクの粘度は、室温で０．０１〜１０００パスカル秒の範囲である。
−バイオインクは光学的に透明であり、４００〜７００ｎｍの視覚色範囲で９０％を超える光の透過率により視覚を妨げない。
−バイオインクは、押出しプリンティングによってプリンティング適性を維持し、レオロジーにより測定されるように、一旦押出されるとその形状を保持できる。
−バイオインクは組織に付着することができる
−バイオインクは、二次的支持媒体なしで組織培養における細胞の増殖を維持および促進することができる。
−バイオインクは、上皮細胞、角膜実質細胞、神経細胞、内皮細胞などの初代ヒト細胞の拡大増殖を維持および促進することができる。
−バイオインクは、球状オルガノイドの形成を促進する。
−細胞は２〜７日の期間にわたってバイオインクを分解し、バイオインク基質を再吸収することができる。
−バイオインクは、７日の間にわたって角膜潰瘍などの創傷を治癒することができる。
−バイオインクは、３４°Ｃで保存した場合、バイオインク内の細胞の生存率を最大７日間維持する。
−バイオインクは、第１の区画で細胞を懸濁することにより、３Ｄ細胞プリンティングを可能にする
−バイオインクは、細胞の増殖および治癒を促進する構造的サポート（足場）および栄養的サポートの両方を同時に提供する。
−バイオインクは複数の細胞型の増殖を促進する
【０１３７】
バイオインクは、角膜内の複数の細胞タイプの増殖を促進することができ、複数の角膜層を通して施される創傷治癒治療として機能し、および／またはヒトの角膜外植片からのニューロンの伸長を促進する。角膜由来ではない神経細胞株であるＳＨＳＹ５Ｙは、バイオインクでの培養に成功し、角膜以外に広がる適用を可能にする。
【０１３８】
バイオインクは、細胞の球状凝集体を作成するために組織培養で使用することができる。凝集体は、既知の方法と比較してより簡単な方法で作成でき、酵素で組織を消化したり、マイクロウェルを使用したりする必要がなく、球状体を生成できる。
【０１３９】
バイオインクは、用途が広くカスタマイズ可能であり、個々の患者のニーズに合わせて調整することができ、より多くの病状およびより多くの組織タイプに拡大し得る幅広い適用を包含する。自己血小板溶解物またはドナーからの溶解物は、患者にとって最も有益なものに応じて、バイオインクに含めることができる。抗生物質および麻酔薬／鎮痛薬の濃度および種類は、特定の感染症／疾患を標的とし、潜在患者のアレルギーに対応するようにカスタマイズできる。バイオインクにコラーゲンおよび他のタンパク質などの構成成分を使用する予備データ、ならびに異なる濃度のさまざまな因子についての予備データにより、さまざまな適用に向けてその機械的および栄養的プロファイルを改変および最適化することができた。
【０１４０】
バイオインクは、眼の異常を高解像度で充填するために使用でき、液体であり、混合すると数分で温度に関係なく創傷部位で固化する。バイオインクは、異常を効率的に充填し、形状を保持して、創傷治癒を潜在的に加速し、および／または診療所で必要な時間を短縮することができる。バイオインクのせん断減粘特性は、押出しおよび液滴に基づくバイオプリンティングと適合性のある範囲で提供され得る。
【０１４１】
バイオインクは実質的に透明で、角膜の創傷治癒および細胞増殖を促進することに加えて、視力を維持するのに有益な特徴である。
【０１４２】
したがって、バイオインクは、例えば角膜細胞に構造的および栄養的サポートの両方を提供することができ、幅広い潜在適用を有し、好ましい物理的特性を有し、初代培養においてニューロンの増殖および球状凝集体を生成することが示されている。
【０１４３】
実施例２：バイオインク製剤および例示的特徴の最適化
−材料および方法
（ｉ）試薬および抗生物質
フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＴｒｙｐＬＥ、ペニシリン／ストレプトマイシンは、Ｇｉｂｃｏから購入した。ヒト血小板溶解物は赤十字血液銀行から入手した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（米国）から購入した。ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、ペニシリン−ストレプトマイシン［（Ｐ−Ｓ）、１０，０００Ｕ／ｍｌ］は、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国）から購入した。フィブリノゲンおよびトロンビンはＭｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。ヘマトキシリン＆エオシンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）から購入した。
【０１４４】
（ｉｉ）試料調達
移植に適さないヒト角膜は、地域保健地区の人体実験倫理委員会（ＨＥＲＣ  １４／２７５）からの同意と倫理承認を得て、ライオンズＮＳＷアイバンクから提供された。すべての手順はヘルシンキ宣言に従った。
【０１４５】
凍結したブタの目は、シドニー眼科病院の視力財団トレーニング研究所から入手した。
【０１４６】
（ｉｉｉ）スクラッチアッセイ
ＳＶ４０不死化ヒト角膜上皮細胞株（ＨＥＣ−Ｔ、Ｒｉｌｋａ、日本）を解凍し、５％ＦＢＳ培地（５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ  ｈＥＧＦ、５％Ｐ−Ｓ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ｇｌｕｔｍａｘ）で８０％コンフルエントになるまで培養した。次に、細胞を２つのＴ−７５フラスコに継代し、８０％コンフルエントになるまで、一方を５％ＦＢＳ培地で培養し、他方を５％ｈＰＬ培地（５％ｈＰＬ、１０ｎｇ／ｍＬ  ｈＥＧＦ、５％Ｐ−Ｓ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）で培養した。次に、５％ＦＢＳからのＨＣＥ−Ｔ細胞を６ウェルの２４ウェルプレート（２０，０００細胞／ウェル）に播種し、完全にコンフルエントになるまで放置した。同様に、５％ｈＰＬのＨＣＥ−Ｔ細胞を、同じ密度で３つのウェルの同じ２４ウェルプレートに播種し、完全にコンフルエントになるまで放置した。培地は２日ごとに交換した。５％ＦＢＳで培養した６つのウェルのうち３つを、スクラッチの１日前にＤＭＥＭと交換した。スクラッチ後、すべてのウェルを監視し、４倍の対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、米国）を使用して２時間ごとに画像を撮った。すべての画像は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ｖ１．５１）によって分析された。創傷閉鎖率は、最初の５時間の５時間にわたる創傷サイズの減少として算出した。これはＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）で算出され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、米国）でグラフ化および統計的に分析された。
【０１４７】
（ｉｖ）バイオインク製剤試験
バイオインクの調製
受け取ったｈＰＬを４℃で一晩解凍した後、３７℃の水浴で２時間インキュベーションした。その後、ｈＰＬはさらに使用するまで４℃で保存した。
【０１４８】
フィブリノゲンを３７°Ｃの滅菌水に溶解し、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で１ｍＬエッペンドルフチューブに分注した。これらは−２０°Ｃで保存し、使用直前に３７°Ｃで解凍した。
【０１４９】
トロンビンをＤＭＥＭ／Ｆ１２に溶解し、２０Ｕ／ｍＬの濃度で１ｍＬエッペンドルフチューブに分注した。これらは−２０°Ｃで保存し、使用直前に３７°Ｃで解凍した。
【０１５０】
バイオインクは、２つの別々の構成成分を均等に混合することによって構成され、構成成分１はＤＭＥＭ／Ｆ１２にｈＰＬおよびフィブリノゲンを含み、構成成分２はＤＭＥＭ／Ｆ１２にトロンビンを含む。さまざまな濃度のフィブリノゲン（０．２、２、および５ｍｇ／ｍＬ）およびトロンビン（１、５、１０ユニット／ｍＬ）を試験した。すべてのバイオインクには、２０％ｈＰＬの初期濃度が含まれていた（表１）。
【０１５１】
【表８】
2021534231.tif 000009
【０１５２】
レオロジー
調製インクのレオロジー特性をＡＲ−Ｇ２血流計（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）で調べた。すべての試験で２°／４０ｍｍのコーンプレート形状を使用した。時間掃引試験を実施して、１ＨＺの一定周波数および１％のひずみでインクの粘稠度を決定した。角膜表面の温度を模倣するために、温度も３４℃で一定に保った。各バイオインク（バイオインクあたりｎ＝３）の貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ”）を、１０分超の時間の関数として測定した。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、米国）を使用して、データを作表し、グラフ化し、分析した。
【０１５３】
せん断減粘は、押出しに基づくバイオプリンティングにとって理想的な特性であり、その結果、加えられたせん断応力に応じたインクの粘度も血流計で測定された。各バイオインク（バイオインクあたりｎ＝３）について、３４°Ｃの固定温度で０．１秒-1〜１００秒-1のせん断速度ランプにわたる粘度を測定した。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、米国）を使用して、データを作表し、グラフ化し、分析した。
【０１５４】
透明性
光の平均透過率は、可視スペクトル（４００〜７００ｎｍ）にわたって測定された。スライドガラス用に機械をゼロの設定にし、続いて試料をスライド上に配置し（試料あたりｎ＝３）、平均透過率を測定した。スライドガラス上にインクで「角膜」と書くことにより、インクの透明度の視覚的表現を作成し、光の中で保持した。
【０１５５】
細胞の適合性
上記のように調製されたバイオインクは、細胞適合性試験にも使用された。ＨＣＥ−Ｔ細胞（継代数２３）を９６ウェルプレートに播種し（６０００細胞／ウェル、各条件ｎ＝６）、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（商標）（ＺＯＯＭ、Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ）を使用して７日間にわたって２時間ごとにコンフルエンスを測定した。
【０１５６】
その後のすべての実験は、バイオインク５の１つの製剤を使用して実施した（表３、予混合濃度：２０％ｈＰＬ、４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、１０Ｕ／ｍＬのトロンビン、ＤＥＭＥ／Ｆ１２）。
【０１５７】
角膜外植片の培養
角膜外植片は、ライオンズＮＳＷアイバンクから入手した。角膜縁および中央領域は、８ｍｍトレフィンを使用して分離された。次に、角膜縁領域を８つの等しいサイズの小片に切断し、可能な限り多くの強膜を除去し、６ウェルプレートの１つのウェルに配置し、中央領域を８つの等しいサイズの小片に切断して、６ウェルプレートの別のウェルに配置した。次に、外植片を２ｍＬのバイオインク５で被覆した（表３）。
【０１５８】
（ｖ）エクスビボ創傷治癒試験
潰瘍化角膜の上皮（ライオンズＮＳＷアイバンクから受け取った）を外科用スペードで除去し、ＰＢＳですすいだ。バイオインク５（表３）をすぐに創傷表面に塗布した。次に、角膜を器官培養培地の広口瓶で懸濁した。インクを４日目に再塗布した。７日目に、角膜を４％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、ＰＢＳで２回すすぎ、３０％スクロースに一晩置いた。次に、角膜を半分に切断し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、米国）に浸し、液体窒素で急速凍結し、切片作成まで−８０℃で保存した。凍結角膜を、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０  Ｓ  ｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）を使用して、−２０°Ｃで１２μｍの厚さの薄片にし、ポリリジンでコーティングしたスライド上に移し、乾燥し、−２０°Ｃで保存した。Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンおよびエオシン染色では、スライドを９５％エタノールに１５秒間浸し、次に４％パラホルムアルデヒドに１０回浸漬して浸した。次に、スライドを蒸留水で１０回浸漬してすすぎ、ヘマトキシリンで３０秒間懸濁した。次に、スライドをそれぞれ蒸留水で２回交換して１０回浸漬した後、９５％エタノールにさらに１０回浸漬した。次に、スライドをエオシンで１５秒間対比染色した後、９５％エタノールで２回交換し、１００％エタノールで２回交換して、それぞれ１０回の浸漬で脱水した。次に、スライドをキシレンで２回交換してそれぞれ１０回浸漬し、ＤＰＸ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で標本にした。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０光学顕微鏡で切片を調べた。ヒトの提供角膜を陰性対照として使用し、その上皮を除去し、すぐに固定し、切片にし、同じプロトコルを使用して染色した。
【０１５９】
（ｖｉ）エクスビボ穿孔試験
冷凍したブタ眼（ｎ＝３）の角膜を切除した後、Ｂａｒｒｏｎの人工前眼房に固定した。人工前眼房に接続された注射器を通して水を注入することにより、角膜を膨張させた。金属串（直径１ｃｍ）を使用して各角膜に穿孔を作成し、漏水を観察して、全層穿孔が作成したことを確認した。次に、バイオインク５（表３）を穿孔部位に適用し、２分間放置した。次に、角膜を再膨張させ、その後の漏水を観察した。
【０１６０】
（ｖｉｉ）非角膜起源の細胞株の培養
ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を解凍し、Ｔ−２５フラスコ内のバイオインク５（表３）で培養した。細胞の形態およびコンフルエンスは、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０によって観察された。細胞が８０％のコンフルエンスに達したときに継代し、継代数を記録した。
【０１６１】
カルシウムイオン溶液およびＭＥＭでバイオインクを作成し、バイオインクのＤＭＥＭ／Ｆ１２構成成分と置き換える
塩化カルシウム溶液（２００ｍｇ／ｍＬの濃度）およびＭＥＭを使用して、バイオインクのＤＭＥＭ／Ｆ１２構成成分と置き換え、最終産物のゲル化を観察した。
【０１６２】
（ｖｉｉｉ）統計分析
すべての統計分析はＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、米国）で実施した。Ｔ検定を使用して、２つの個別の条件を比較した。３つ以上の製剤を使用した場合、１つ−
【０１６３】
−結果および考察
（ｉ）スクラッチアッセイ
５％ｈＰＬおよび５％ＦＢＳで処理されたウェルは、それぞれ何割および何割で、２４時間で完全に治癒した（図１）。有意差は観察されなかった（ｐ＞０．０５）。創傷閉鎖は、２４時間後にＤＭＥＭ単独の条件では観察されなかった。
【０１６４】
（ｉｉ）レオロジー
時間掃引実験は、貯蔵弾性率が損失弾性率よりも大きかったため（図２）、バイオインク製剤２〜９（表３）はゲル化できること、両弾性率が経時的に安定していたため、インクが一貫していたことを示した（図２）。経時的な粘度測定により、すべてのバイオインク製剤１〜９（表３）は、せん断速度が増加するにつれ、すべてのバイオインクの粘度が低下するため、非ニュートン流体およびせん断減粘挙動を示すことが実証された（図３）。
【０１６５】
（ｉｉｉ）透明性
インクの全バリエーション（表３）は、可視スペクトル（図４）の波長で８５％を超える透明度を示した。インクの透明度を直接評価することにより、インクを押出し、形状を保持できるようにインクのプリンティング適性が強化され、インクを通して建物が容易に見えるように透明度が強化された（図５）。
【０１６６】
細胞の適合性
バイオインク製剤６および９（表３）を除いて、細胞のコンフルエンスは経時的に増加し、バイオインク製剤１−５および７−８が細胞増殖をサポートすることを示唆している（図６）。２０Ｕ／ｍｌのトロンビン濃度を４および１０ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンと事前に混合したインクで培養した細胞は、平均コンフルエンスの増加を示さなかった。さらに、平均コンフルエンス率もフィブリノゲン濃度が増加するにつれて低下した。角膜上皮細胞、角膜実質細胞、内皮細胞および神経細胞がバイオインクで増殖していることが観察された（図７）。細胞が外植片から移動し始めると、バイオインクの分解も観察された（図７ａ）。
【０１６７】
（ｖ）エクスビボ創傷治癒
脱上皮化角膜と比較して、バイオインクで処理された潰瘍性角膜では、複数の細胞層が観察された（図８）。これにより、バイオインクがエクスビボで潰瘍化したヒト角膜の完全な再上皮化を促進することができることが実証された。
【０１６８】
（ｖｉ）穿孔試験
３つの穿孔角膜はすべて、２分の固化時間でインクを塗布することで完全な創傷閉塞を実証した（図９）。
【０１６９】
（ｖｉｉ）他の細胞タイプとの適合性
ＳＨ−ＳＹ細胞はコンフルエントに達することができ、表３のバイオインクで試験した８継代（図１０）にわたって正常に培養された。
【０１７０】
−考察
透明で、プリンティング可能で、生体適合性があり、生分解性の血小板溶解物に基づくインクが、眼表面の創傷治癒のために開発された。５％ｈＰＬは、標準的な組織培養プロトコルで現在使用されているウシ胎児血清（ＦＢＳ）と同等の速度で、角膜上皮細胞株の引っかき傷の治癒を促進した。血小板溶解物にフィブリノゲンおよびトロンビンを添加することにより、３Ｄフィブリン基質形成を誘導し、生体適合性、強度、プリンティング適性などの特性を操作することができた。
【０１７１】
本発明者の知る限り、ヒト血小板溶解物は、独立したバイオプリンティング材料として使用されていない。これは、血小板溶解物単独では、それ自体でプリンティングするのに十分な強度の基質ではないためである。血小板溶解物がゲルを形成する能力は、その調製方法に依存する。組織培養では、血餅の形成を防ぐために、一般的にヘパリンが血小板溶解物に添加される。使用する血液生成物の凝固時間、遠心分離、および希釈は研究によって異なるが、これらのパラメーターは一般に血液生成物の有効性および特性に影響を及ぼすことが示されている。
【０１７２】
２つの別々のチャンバー（第１は２０％ｈＰＬ、４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む、の開発を通して、２つのチャンバーからの２つの成分を混合することにより、直接創傷部位で３Ｄ基質として固化する透明で粘着性のあるバイオプリント可能なインクを生成することができ、達成された。時間掃引レオロジー実験（図２）は、プリンティング可能なインクの最小要件がフィブリノゲン≧０．２ｍｇ／ｍｌ、トロンビン＞１ユニット／ｍＬ、およびｈＰＬ  １０％（すべての濃度は予混合段階を参照する）からなることを実証した。ｈＰＬは、その生物活性を保持するために方法のセクションで説明されているように調製する必要があり、ヘパリンはフィブリンメッシュの形成を防ぐためにｈＰＬの調製では避ける必要がある。すべてのインク組成物は、可視スペクトルの波長にわたって高い透明性を示したため、この製品は眼科適用に理想的である（図４および５）。細胞適合性試験は、効果的な細胞コンフルエントを実現するために、インクが１０Ｕ／ｍＬ以上（図６）のトロンビンを含めないことを実証した。
【０１７３】
細胞適合性およびレオロジーデータの組み合わせにより、インク中のフィブリノゲンおよびトロンビンの有益な予混合濃度は、それぞれ４ｍｇ／ｍＬと１０Ｕ／ｍＬであることが観察された（表３のバイオインク５）。これらの濃度は、その後のエクスビボ研究で使用され、バイオインクが、潰瘍化ヒト角膜の完全な再上皮化を促進し（図８）、直径１ｃｍの完全な穿孔を閉塞する能力を有することを実証した（図１２）。さらに、４つの細胞タイプすべてがバイオインクで増殖できることが示され（図７）、この製品は全層の眼内用途として機能し得る。これらすべての結果は、バイオインクが３Ｄプリント方式で角膜創傷治癒を治療するための特徴を有することを示す。
【０１７４】
角膜で３Ｄプリンティングを使用するという概念は、主に全体または一部の構造を外部からバイオプリンティングすることに関連しているが、インビボでプリンティングできることは、さまざまなサイズで迅速な注意が必要な角膜創傷の治療に有益である。創傷を閉塞するために商業的に使用されるフィブリン接着剤は不透明であり、創傷を閉塞するようにのみ作用することが示されており、角膜細胞の移動を阻害するため、角膜細胞の増殖を促進しない。これは、自然な創傷治癒反応を妨げ、したがって全体的な創傷治癒を妨げる。生成されたバイオインクは、フィブリン接着剤が細胞の移動および増殖を可能にするという追加の利点を提供できる構造的サポートを組み込んでおり、角膜再生を強化するサプリメントを含めることもできる。
【０１７５】
そのプリンティング適性に加えて、バイオインクは細胞の増殖および治癒を促進する構造的および栄養的サポートの両方を同時に提供する。さらに、バイオインク製品の性質は用途が広くカスタマイズ可能であり、個々の患者のニーズに合わせて調整することができ、より多くの病状およびより多くの組織タイプに拡大する幅広い適用を網羅できる可能性がある。自己血小板溶解物またはドナーからの溶解物は、患者にとって最も有益なものに応じて、バイオインクに含めることができる。抗生物質および麻酔薬／鎮痛薬の濃度および種類は、特定の感染症／疾患を標的とし、潜在患者のアレルギーに対応するようにカスタマイズできる。バイオインクは、半減期を延長し、創傷部位に直接薬物を正確に送達するための薬物送達ツールとしても使用できる。また、ナノ粒子などの他の物質を標的部位に送達するためにも使用できる。
【０１７６】
球状細胞の形成は、３Ｄ培養の指標である（図１１）。過去１０年間で、角膜適用の三次元細胞凝集体の開発に関心が高まっている。三次元の細胞凝集体は、二次元の単層細胞培養よりも速い速度で組織の自己組織化を促進することが示されている。この細胞培養法は、単細胞初代培養と比較して特に有益であり、この構成がより多くの細胞間接着を促進するだけでなく、細胞をより若い子孫に戻すことができるため、これらの細胞はより強い前駆細胞の潜在性を有し、初代培養の同等物よりも速い速度で移動および増殖し、テロメラーゼ活性およびテロメア長が高くなっている。この細胞培養法は、角膜創傷治癒の適用に非常に有望である。バイオインクは、３Ｄ培養の代替基質に使用でき、球状細胞を得るためのより簡単な手段を示す。
【０１７７】
最後に、組織培養の結果は、バイオインクがＳＨＳＹ−５Ｙ（非角膜由来の神経細胞株）をサポートする能力を有することを実証し（図１０）、角膜よりも広く拡大されるこのインクの潜在的な将来の適用範囲を示している。
【０１７８】
結論として、本発明者らは、バイオプリント可能な、生分解性で、透明な、創傷治癒を促進する特性を有するバイオインクを開発した。バイオインクはまた、球状細胞を生成するための３Ｄ培養用のツール、他の組織の創傷を治癒する能力、および疾患治療に対する効果的な薬物／物質担体として作用する能力などの追加の機能を有することも予想されている。
【０１７９】
実施例３：層状のバイオインク製剤の三次元プリンティング
−方法
Ｐ１８  ＨＣＥＴ細胞をトリプシン処理し、１×１０6細胞／ｍＬの最終濃度でバイオインクに懸濁させた。次に、バイオインクをペトリ皿に押出し、２分間放置した。次に、インクの別の層を頂部に直交して押出し、放置して固化させた。２本の線を光学顕微鏡で観察して、それらが依然区別できるか否かを決定した。
【０１８０】
−結果
図１３に示すように、バイオインクは個別の層でプリンティング可能である。
【０１８１】
実施例４：プリントされたバイオインクにおける細胞の生存
−方法
Ｐ１８  ＨＣＥＴ細胞をトリプシン処理し、１×１０6細胞／ｍＬの最終濃度でバイオインクに懸濁させた。次に、バイオインクをペトリ皿に押出し、２分間放置した。Ｈｏｅｓｃｈｔおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）生死染色は、押出し後２時間および７２時間で実施され、細胞生存率はｉｍａｇｅ  Ｊを用いて算出した。ヘキスト染色（青）は全細胞核を染色する一方、ＰＩ染色（赤）は死細胞のみを染色する。
【０１８２】
−結果
図１４Ａおよび１４Ｂは、押出し後２時間の同じ領域でのＨｏｅｓｃｈｔおよびヨウ化プロピジウム染色を示す。図１４Ｃおよび１４Ｄは、押出し後７２時間の同じ領域でのＨｏｅｓｃｈｔおよびヨウ化プロピジウム染色を示す。
【０１８３】
Ｉｍａｇｅ  Ｊ分析では、どちらの場合も細胞生存率が９０％を超えると決定され、この製品が３Ｄプリント細胞の細胞担体として使用できることを意味する。
【０１８４】
実施例５：バイオインクの形成におけるカルシウムイオンの役割
−方法
表３に示すように条件を試験した（各条件ｎ＝３）
【０１８５】
【表９】
2021534231.tif 000010
【０１８６】
−結果
カルシウムイオンとは無関係に、ｈＰＬを含むすべての溶液で透明なゲルが得られた。不透明なゲルは、ｈＰＬを使用せず、カルシウムイオンが存在する条件で得られた。ｈＰＬもカルシウムイオンも存在しないと、透明な液体の上にフィブリン片が浮遊し、ゲルが形成されなかった。
【０１８７】
ｈＰＬは、インクのゲル化および透明性に不可欠である（図１５）。バイオインクはカルシウムイオンとは無関係に形成することができた。
【０１８８】
実施例６：バイオインクへの構成成分の追加。
−方法
種々の構成成分をさまざまな濃度でバイオインクに添加し（表５）（製剤あたりｎ＝３）、スライドガラス上に３滴として押出した。最初の液滴を１分間、２番目の液滴を２分間、３番目の液滴を５分間固化させた。これらの時点で、それらは「浸漬試験」にかけられることによって、水に浸漬し、次いで０．９％ＮａＣｌですすいだ。最小固化時間は、ゲル化した液滴が「浸漬試験」後スライド上に残った最短の時点によって決定された。
【０１８９】
【表１０】
2021534231.tif 000011
【０１９０】
−結果
すべての組成物は、混合後５分以下で固化することができた（表６）。図１６は、浸漬試験後のスライドガラス上のバイオインクの画像を示す。表５の通り、Ａは組成物１を示し、Ｂは組成物２を示し、Ｃは組成物３を示し、Ｄは組成物４を示し、Ｅは組成物５を示し、Ｆは組成物６を示し、Ｅは組成物７を示す。
【０１９１】
【表１１】
2021534231.tif 000012
【０１９２】
実施例７：眼表面シーラントとしてのバイオインクの使用
−方法
この実施例の実験は、バイオインク５の１つの製剤（表３）、予混合濃度：２０％ｈＰＬ、４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、１０Ｕ／ｍＬのトロンビン、ＤＥＭＥ／Ｆ１２を使用して実施された。直径約１．５ｍｍの創傷は、Ｌｉｏｎｓ  ＮＳＷ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋから入手したヒト角膜の中心に作成した。次に、角膜をハンナ人工前眼房（ＡＡＣ）に入れた。バイオインク（ｎ＝３）を創傷に投与し、圧力を上げた。シーラントのない穿孔角膜が安定な漏出を示す圧力を測定し、システムに固有の基準圧として採用した。シーラントの不具合は、創傷の漏出が観察された場合であると決定され、破裂圧力は次のように算出し、
【数１】
2021534231.tif 000013
ｍｍＨｇで記録した。
【０１９３】
−結果
結果（図１７および１８を参照）は、バイオインクが小さな角膜穿孔のシーラントとして、およびシアノアクリレート接着剤などの市販のシーラントの生体適合性代替品として使用できることを実証している。直径約１．５ｍｍの穿孔では、バイオインクは９１±２７ｍｍＨｇの平均圧力に耐えることができた。これは平均眼圧（１０〜２２ｍｍＨｇ）をはるかに上回っている。
【０１９４】
実施例８：固化時間対固定せん断速度
−方法
この実施例の実験は、バイオインク５の１つの製剤（表３）、予混合濃度：２０％ｈＰＬ、４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、１０Ｕ／ｍＬのトロンビン、ＤＥＭＥ／Ｆ１２）を使用して実施した。バイオインクの固化時間は、１秒-1の固定せん断速度で定量的に測定した。ＡＲ−Ｇ２血流計（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）でも、クエットカップおよびボブの粘度計の形状を使用して、バイオインクの１秒-1の固定せん断速度での粘度を測定した（ｎ＝３）。１５ｍＬの構成成分Ａ（２０％ｈＰＬ、４ｍｇ／ｍＬ  ｈＰＬ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）をこの形状に注ぎ、構成成分Ａ単独の粘度を６０秒間測定した。次に、ボブは５秒間回転を一時停止し、その間に１５ｍＬの構成成分Ｂ（１０Ｕ／ｍＬのトロンビン、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を添加した。その後、ボブは回転を再開し、粘度をさらに１８０秒間測定した。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、米国）を使用して、データを作表し、グラフ化し、分析した。固化時間は、構成成分Ｂの添加後に安定した粘度に達するのにかかる時間であると確立され、決定された。
【０１９５】
−結果
１秒-1の固定せん断速度で混合した場合、バイオインクは２５秒で固化した（図１９）。構成成分ＡおよびＢがベンチトップで受動的に混合される場合、２〜５分で固化することが以前に測定されていた。これらの結果は、せん断速度が固化時間に影響を及ぼすことを実証しており、３Ｄプリンティングデバイスでバイオインクが押出される解像度が、バイオインクの固化速度に影響を及ぼすことを意味している。
【０１９６】
実施例９：インビボ動物試験
−方法
この実施例の実験は、バイオインク５の１つの製剤（表３）、予混合濃度：２０％ｈＰＬ、４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、１０Ｕ／ｍＬのトロンビン、ＤＥＭＥ／Ｆ１２を使用して実施された。
【０１９７】
バイオインクがインビボ角膜上皮創傷モデルおよびインビボ角膜穿孔モデルにおいて創傷治癒を促進する／妨害しないか否かを決定し、それが創傷治癒プロセスに伴って経験する疼痛を軽減するか否かを確認するために実験を実施した。
【０１９８】
対象：メスのニュージーランドアルビノ白ウサギ
上皮創傷（ウサギ１および２）
１．ＳＯＰであるＡｎａｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ａｎａｌｇｅｓｉａ  Ｒａｂｂｉｔｓ（Ｈｙｂｒｉｄ  Ｔｈｅａｔｒｅ）Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（ＳＯＰ−ＡＮＡ＿０４＿ＬＡＳ  ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  ａｎａｌｇｅｓｉａ＿ｒａｂｂｉｔｓ＿２０１７１１３０）およびＬＡＳ  ＳＯＰ＃３８  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｒａｉｎｔ  ｏｆ  Ｒａｂｂｉｔｓを使用して、手術（ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）用にウサギ対象を準備する。
２．手術前にウサギの背中にブプレノルフィンパッチを配置する。
３．眼周囲領域から毛皮を除去することにより眼瞼辺縁を準備する。獣医助手が獣医クリッパー（＃４０ブレード）を使用して完了する。
４．眼表面および眼周囲の皮膚表面領域を１０％のポビドンヨード洗浄液を用いて準備する。
５．滅菌外科用ドレープをウサギの上に配置し、眼周囲領域を露出させる。
６．手術中のアクセスを維持するために小児用開瞼器を眼に配置する。
７．次に、角膜を滅菌生理食塩水で洗い流して、１０％ポビドンヨード洗浄液を除去する。
８．角膜に外科用スピアを軽く当てて表面を乾かす。
９．５ｍｍの滅菌角膜遮光体（スポンジ）を３滴（約１５０マイクロリットル）の３０％エタノールを使用して準備する。次に、スポンジを角膜中央表面に２０秒間配置して、下部の角膜層からの上皮細胞の弛緩を促進する。スポンジから残留液が漏出する可能性がないか、スポンジを観察するよう留意する。これは、余分な液体を吸収するために外科用スピアを使用することで改善できる（必要な場合）。
１０．次に、外科用鉗子を使用して角膜遮光体／スポンジを取り外し、それを廃棄する。次に、外科用スピアを使用して、角膜上の残留エタノール液を吸収する。
１１．中央５ｍｍの領域にわたって外科用スピアを動かすことによって弛緩した上皮を除去する。外科用スピアの使用で上皮を除去できない場合、本研究者らは滅菌ホッケーの刃を使用して残りの細胞を丁寧に除去するであろう。
１２．ウサギが研究ウサギとみなされる場合、中央５ｍｍの異常部の上にバイオインクを配置する。露出した角膜表面への適切な接着を確実にするために、タイマーを１２０秒間開始する。
１３．抗生物質の点眼薬を手術眼に入れ、開瞼器を取り外す。ウサギにメロキシカム０．５ｍｇ／ｋｇを投与する。獣医の麻酔科医がメロキシカムを投与する。
１４．本研究者らは、創傷およびその周辺領域を外部から検査して、術中合併症がないことを確認する。
１５．手術が完了すると、ウサギを監視するために術後室に移す。個々の飼育室に戻す前に、Ｃｅｌｌｕｖｉｓｃ人工涙滴を両眼に滴下する。抗生物質の点眼前および創傷が閉じるまで最長２覚醒時間ごとに、Ｃｅｌｌｕｖｉｓｃを手術眼に入れる。その日の最終検査時にリフレッシュ防腐剤を含まないゲル潤滑剤を手術眼に入れ、一晩適用範囲を拡大する。これは、創傷が閉じるまで、または本研究者らの意見で、ウサギ対象がスリットランプ検査下で表面炎症を示している（例えば、結膜浮腫、乾燥または不規則な角膜表面）場合まで継続する。
１６．ＨＴ複合疼痛スコアウサギの文書に従って、活動時間を通して２時間ごとに疼痛を採点する。
１７．スリットランプ生体顕微鏡検査（最長７日）で示されるように創傷が治癒するまで、一般検査を１日４回行い、その後、創傷閉鎖後７日間は１日１回、安楽死まで平日１回行う。
【０１９９】
角膜穿孔（ウサギ３、４および５）
１．ＳＯＰであるＡｎａｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ａｎａｌｇｅｓｉａ  Ｒａｂｂｉｔｓ（Ｈｙｂｒｉｄ  Ｔｈｅａｔｒｅ）Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（ＳＯＰ−ＡＮＡ＿０４＿ＬＡＳ  ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  ａｎａｌｇｅｓｉａ＿ｒａｂｂｉｔｓ＿２０１７１１３０）およびＬＡＳ  ＳＯＰ＃３８  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｒａｉｎｔ  ｏｆ  Ｒａｂｂｉｔｓを使用して、手術用にウサギ対象を準備する。
２．手術前にウサギの背中にブプレノルフィンパッチを配置する。
３．眼周囲領域から毛皮を除去することにより眼瞼辺縁を準備する。獣医助手が獣医クリッパー（＃４０ブレード）を使用して完了する。
４．眼表面および眼周囲の皮膚表面領域を１０％のポビドンヨード洗浄液を用いて準備する。
５．滅菌外科用ドレープをウサギの上に配置し、眼周囲領域を露出させる。
６．手術中のアクセスを維持するために小児用開瞼器を眼に配置する。
７．次に、角膜を滅菌生理食塩水で洗い流して、１０％ポビドンヨード洗浄液を除去する。
８．角膜に外科用スピアを軽く当てて表面を乾かす。
９．ブレードを使用して、角膜の周辺領域に長さ約２ｍｍの完全な穿孔を作成する。
１０．ウサギが研究用ウサギとみなされる場合、バイオインクを穿孔上に配置する。露出した角膜表面への適切な接着を確実にするために、タイマーを１２０秒間開始する。
１１．ウサギが対照ウサギとみなされる場合、市販のｈｉｓｔｏａｃｒｙｌを穿孔上に配置する。
１２．抗生物質の点眼薬を手術眼に入れ、開瞼器を取り外す。ウサギにメロキシカム０．５ｍｇ／ｋｇを投与する。獣医の麻酔科医がメロキシカムを投与する。
１３．本研究者らは、創傷およびその周辺領域を外部から検査して、術中合併症がないことを確認する。
１４．手術が完了すると、ウサギを監視するために術後室に移す。個々の飼育室に戻す前に、Ｃｅｌｌｕｖｉｓｃ人工涙滴を両眼に滴下する。抗生物質の点眼前および創傷が閉じるまで最長２覚醒時間ごとに、Ｃｅｌｌｕｖｉｓｃを手術眼に入れる。その日の最終検査時にリフレッシュ防腐剤を含まないゲル潤滑剤を手術眼に入れ、一晩適用範囲を拡大する。これは、創傷が閉じるまで、または本研究者らの意見で、ウサギ対象がスリットランプ検査下で表面炎症を示している（例えば、結膜浮腫、乾燥または不規則な角膜表面）場合まで継続する。
１５．ＨＴ複合疼痛スコアウサギの文書に従って、活動時間を通して２時間ごとに疼痛を採点する。
１６．スリットランプ生体顕微鏡検査（最長７日）で示されるように創傷が治癒するまで、一般検査を１日４回行い、その後、創傷閉鎖後７日間は１日１回、安楽死まで平日１回行う。
【０２００】
改変角膜穿孔（ウサギ６および７）
１．ＳＯＰであるＡｎａｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ａｎａｌｇｅｓｉａ  Ｒａｂｂｉｔｓ（Ｈｙｂｒｉｄ  Ｔｈｅａｔｒｅ）Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（ＳＯＰ−ＡＮＡ＿０４＿ＬＡＳ  ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  ａｎａｌｇｅｓｉａ＿ｒａｂｂｉｔｓ＿２０１７１１３０）およびＬＡＳ  ＳＯＰ＃３８  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｒａｉｎｔ  ｏｆ  Ｒａｂｂｉｔｓを使用して、手術用にウサギ対象を準備する。
２．手術前にウサギの背中にブプレノルフィンパッチを配置する。
３．眼周囲領域から毛皮を除去することにより眼瞼辺縁を準備する。獣医助手が獣医クリッパー（＃４０ブレード）を使用して完了する。
４．眼表面および眼周囲の皮膚表面領域を０．２％のポビドンヨード洗浄液を用いて準備する。
５．滅菌外科用ドレープをウサギの上に配置し、眼周囲領域を露出させる。
６．手術中のアクセスを維持するために小児用開瞼器を眼に配置する。
７．次に、角膜を滅菌生理食塩水で洗い流して、０．２％ポビドンヨード洗浄液を除去する。
８．角膜に外科用スピアを軽く当てて表面を乾かす。
９．ブレードを使用して、角膜の周辺領域に長さ約２ｍｍの完全な穿孔を作成する。
１０．ウサギが研究用ウサギとみなされる場合、バイオインクを穿孔上に配置する。露出した角膜表面への適切な接着を確実にするために、タイマーを１２０秒間開始する。
１１．ウサギが対照ウサギとみなされる場合、市販のｈｉｓｔｏａｃｒｙｌを穿孔上に配置する。
１２．抗生物質の点眼薬を手術眼に入れ、開瞼器を取り外す。ウサギにメロキシカム０．５ｍｇ／ｋｇを投与する。獣医の麻酔科医がメロキシカムを投与する。
１３．本研究者らは、創傷およびその周辺領域を外部から検査して、術中合併症がないことを確認する。
１４．手術が完了すると、ウサギを監視するために術後室に移す。個々の飼育室に戻す前に、Ｃｅｌｌｕｖｉｓｃ人工涙滴を両眼に滴下する。抗生物質の点眼前および創傷が閉じるまで最長２覚醒時間ごとに、Ｃｅｌｌｕｖｉｓｃを手術眼に入れる。その日の最終検査時にリフレッシュ防腐剤を含まないゲル潤滑剤を手術眼に入れ、一晩適用範囲を拡大する。これは、創傷が閉じるまで、または本研究者らの意見で、ウサギ対象がスリットランプ検査下で表面炎症を示している（例えば、結膜浮腫、乾燥または不規則な角膜表面）場合まで継続する。
１５．ＨＴ複合疼痛スコアウサギの文書に従って、活動時間を通して２時間ごとに疼痛を採点する。
１６．スリットランプ生体顕微鏡検査（最長７日）で示されるように創傷が治癒するまで、一般検査を１日４回行い、その後、創傷閉鎖後７日間は１日１回、安楽死まで平日１回行う。
【０２０１】
−結果
各ウサギの概要
手術１日目、２０１８年８月２０日
ウサギ１−ＩＤ＃：２３３６６５が２０１８年７月１１日に到着した（群１−２の１）。
３０％エタノールによる創面切除術
Ｔｘ．−バイオインク
結果−中等度の結膜炎症、４８時間後に創傷が治癒した。
ウサギ２−ＩＤ＃：２３３６６６が２０１８年７月１１日に到着した（群１−２の２）。
アルコールによる創面切除術
Ｔｘ．−対照（抗生物質の点眼剤単独）
結果−重度の結膜炎症および結膜浮腫、病変のサイズが２倍になり、最初は疼痛を管理するのが困難であったが、２日目には大幅に改善された。創傷は４８時間後に治癒した。
手術２日目、２０１８年９月３日
ウサギ３−ＩＤ＃：２３９６８６が２０１８年８月１日に到着した（群２−５の１）。
穿孔手術
Ｔｘ．−バイオインク
結果−中等度の結膜炎症および二次性潰瘍形成、３２時間で穿孔が治癒し、５２時間で二次性潰瘍が治癒した。
ウサギ４−ＩＤ＃：２３９６８５が２０１８年８月１日に到着した（群２−５の２）。
穿孔手術
Ｔｘ．−バイオインク
結果−中等度の結膜炎症および二次性潰瘍形成、２８時間で穿孔が治癒し、４８時間で二次性潰瘍が治癒した。
ウサギ５−ＩＤ＃：２３９６８４が２０１８年８月１日に到着した（群２−５の３）。
穿孔手術
Ｔｘ．−対照（シアノアクリレート接着剤）
結果−中等度の結膜炎症および結膜浮腫。ウサギは非常に落ち着かなかったが、適切な疼痛管理戦略が採用されているため、今はそれほど不快ではない。二次性潰瘍の形成は５６時間で観察されたが、７２時間で現在治癒している。穿孔創傷は８０時間で治癒した。
手術３日目、２０１８年９月４日−５％から０．２％へのポビドンヨード濃度の減少および潤滑点眼剤の添加を行った。
ウサギ６−ＩＤ＃：２３９６８７が２０１８年８月１日に到着した（群２−５の４）。
穿孔手術
Ｔｘ．−バイオインク
結果−８時間で治癒し、合併症はない。最初のブプレノルフィンパッチから追加の鎮痛は必要なかった。
ウサギ７−ＩＤ＃：２３９６８８が２０１８年８月１日に到着した（群２−５の５）。
穿孔手術
Ｔｘ．−対照（シアノアクリレート接着剤）
結果−ウサギは当初、中等度の結膜炎およびシアノアクリレート接着剤の位置に関連しているように見える重症の結膜浮腫を伴う激しい痛みがあった。安楽死を検討したが、投与されたメタドンに反応したようであり、その夜摂食し始めた。今朝（２日目）の検査で、ウサギはうまく疼痛管理されたことでより穏やかに見えた−依然落ち着きはないが苦痛を感じてはいない。創傷は４８時間で治癒し、今は穏やかである。
【０２０２】
上皮欠損創傷モデル（ウサギ１および２）では、対照ウサギおよび処理ウサギが同時点で創傷治癒を達成した（図２０）。処理ウサギは有意に少ない術後鎮痛剤を投与され、全体的な疼痛スコアは対照ウサギが経験したものよりも低かった（図２１および２２）。疼痛スコアは、過度のまばたき、眼瞼けいれん、眼を擦る、眼瞼けいれん、ならびに眼の流涙および擦りを含む指標の評価に基づいた。
【０２０３】
角膜穿孔モデル（ウサギ３、４、および５）では、対照ウサギ（ｔ＝８０時間）と比較して、処理ウサギ（ｔ＝２８およびｔ＝３２時間）で創傷治癒が有意に速く起こった（図２３）。全体として、処理ウサギは、対照ウサギ（図２４）と比較して、術後鎮痛剤の投与も少なかった（図２５および２６）。
【０２０４】
改変角膜穿孔モデル（ウサギ６および７）では、創傷治癒は、対照（ｔ＝４８時間）と比較して、処理ウサギ（ｔ＝８時間）で有意に速く起こった（図２７）。術後鎮痛剤は処理ウサギに投与されず、記録された疼痛スコアは、対照と比較して処理ウサギで有意に低かった（図２８）。
【０２０５】
バイオインクは生体適合性があり、角膜創傷の治癒を妨げない。これらの結果は、バイオインクが角膜損傷に伴う疼痛を軽減し、従来の治療選択肢と比較して、角膜穿孔の創傷治癒も加速する可能性があることを示唆している。
【０２０６】
実施例１０：バイオインクの凍結乾燥および再構成
−方法
●５０ｕＬのバイオインク構成成分ＡおよびＢを準備した。
構成成分Ａには、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に２０％ｈＰＬ、４ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンが含まれ、構成成分ＢにはＤＭＥＭ／Ｆ１２に１０Ｕ／ｍＬのトロンビンが含まれていた。両構成成分の最終体積は５０ｕＬであった。混合すると、バイオインク５と同じ製剤が得られた（表３、予混合濃度：２０％ｈＰＬ、４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、１０Ｕ／ｍＬのトロンビン、ＤＥＭＥ／Ｆ１２）。
●試料を−４０度で凍結乾燥した（図２９Ａ）
●それぞれのチューブにつき５０ｕＬの水で数秒以内に再構成した（図２９Ｂ）
●混合し、接着性の透明なゲルが形成された（図２９Ｃ）
【０２０７】
−結果
視覚的評価は、バイオインクが再構成後２分以内にまだ固化できることを示した。接着性（図２９Ｃの先端に付着している）および透明であることが観察された。（図２９Ｃ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2021534231.tif 000026
【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2021534231.tif 000031
【図１８】
2021534231.tif 000032
【図１９】
2021534231.tif 000033
【図２０】
2021534231.tif 000034
【図２１】
2021534231.tif 000035
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2021534231.tif 000039
【図２６】
2021534231.tif 000040
【図２７】
2021534231.tif 000041
【図２８】
2021534231.tif 000042
【図２９】
2021534231.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月11日(2020.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜２０Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む組成物。
【請求項２】
イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つまたは複数をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記イオンが、カルシウムイオンを含み、および／または前記増殖因子が、ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、前記イオンおよびアミノ酸を含む培養培地を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記イオンが、前記組成物に含まれるイオン性塩溶液の構成成分である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、
（ｉ）０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜１５Ｕ／ｍＬのトロンビン、および５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜１０Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１０〜３５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉｉ）０．２〜５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜８Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１５〜３０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｖ）０．２〜３ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、２〜４Ｕ／ｍＬのトロンビン、および１５〜２５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、
（ｉ）１ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．２ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲン、２〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約３Ｕ／ｍｌ、約５Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ）のトロンビン、および５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０〜３０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物、または
（ｉｉ）１〜４ｍｇ／ｍｌ（例えば、約２ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲン、５〜１５Ｕ／ｍｌ（例えば、約７Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約１２Ｕ／ｍｌ）のトロンビン、および１０〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約１５〜３０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物、または
（ｉｉｉ）３〜８ｍｇ／ｍｌ（例えば、約５ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲン、２〜１５Ｕ／ｍｌ（例えば、約４Ｕ／ｍｌ、約８Ｕ／ｍｌ、約１２Ｕ／ｍｌ）のトロンビン、および１５〜３０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０〜２５％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、
（ｉ）約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌもしくは約１ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビン、および、約２０％（ｖ／ｖ）、約２５％（ｖ／ｖ）もしくは約３０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約２ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、もしくは約８ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビン、および、約１０％、約１５％（ｖ／ｖ）、もしくは約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉｉ）約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビン、および、約５％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）、もしくは約２５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、
（ｉ）少なくとも、約０．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、約２ユニット／ｍＬのトロンビン、および約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）少なくとも、約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、および約１０Ｕ／ｍＬのトロンビンを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
キット、パッケージまたはデバイスであって、
−フィブリノゲンを含む第１の区画およびトロンビンを含む第２の区画であって、前記キット、パッケージまたはデバイスが、前記フィブリノゲンおよびトロンビンを前記キット、パッケージまたはデバイスへの装填中および装填後に、前記第１の区画の前記フィブリノゲンおよび前記第２の区画の前記トロンビンを分離できるように構成されている、第１の区画および第２の区画と、
−血小板溶解物と、
−前記第１の区画の前記フィブリノゲンと前記第２の区画の前記トロンビン、および前記血小板溶解物との混合を促進する手段と、を含む、キット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１４】
前記血小板溶解物が、前記キット、パッケージまたはデバイスの第３の区画に位置し、前記キット、パッケージまたはデバイスが、前記フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物の前記キット、パッケージまたはデバイスへの装填中および装填後に、前記第１の区画の前記フィブリノゲンおよび前記第２の区画の前記トロンビンから前記第３の区画の前記血小板溶解物を分離できるように構成されている、請求項１３に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１５】
前記第１の区画が、前記フィブリノゲンおよび前記血小板溶解物を含み、前記第２の区画が前記トロンビンを含む、請求項１３に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１６】
−いずれかの前記区画が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つもしくは複数をさらに含む、または
−前記キット、パッケージまたはデバイスが、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つもしくは複数を含む追加区画を含み、前記キット、パッケージまたはデバイスが、前記キット、パッケージまたはデバイスの装填中および装填後に、他の区画の内容物から前記追加区画の内容物を分離できるように構成されている、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１７】
前記イオンが、カルシウムイオンである、または
前記イオン源が、イオン性塩であり、および／またはカルシウムイオンを含む、請求項１６に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１８】
前記手段が、前記キット、パッケージまたはデバイスの外部での前記フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物の混合を促進するように構成されている、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項１９】
前記手段が、前記フィブリノゲンの流れと前記トロンビンの別個の流れを集束点に向けることにより、前記混合を促進するように構成され、
前記流れのうちの少なくとも１つが、前記血小板溶解物を含む、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２０】
前記第１および第２の区画のいずれかもしくは両方、および／または第３の区画が細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）を含む、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２１】
前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２２】
前記血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２３】
（ｉ）前記第１の区画が、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、１〜４０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の区画が、０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、１〜３０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の区画が、０．１〜１２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、１〜２５Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計７〜１４％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｖ）前記第１の区画が、０．５〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、１〜１０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記デバイスが、合計０．５〜２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２４】
（ｉ）前記第１の区画が、２ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．８ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の区画が、１〜１６ｍｇ／ｍｌ（例えば、約８ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の区画が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の区画が、５〜１５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ）を含み、前記第２の区画が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記デバイスが、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２５】
（ｉ）前記第１の区画が、０．８ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の区画が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記デバイスが、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の区画が、約８ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の区画が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記デバイスが、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の区画が、約２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、
前記第２の区画が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、
前記デバイスが、合計約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２６】
前記トロンビン、フィブリノゲンおよび血小板溶解物の前記混合から生じる製剤が、
（ｉ）少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、少なくとも１ユニット／ｍＬのトロンビン、および約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約２ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、および約５Ｕ／ｍｌのトロンビン、を含む、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２７】
前記第１の区画および前記第２の区画が、前記血小板溶解物を含まない、請求項１３〜２６のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２８】
前記第１の区画および前記第２の区画が、等体積、または１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満異なる体積の液体製剤である、請求項１３〜２７のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイス。
【請求項２９】
組成物を調製する方法であって、
（ｉ）
フィブリノゲンを含む第１の製剤およびトロンビンを含む第２の製剤を提供することであって、前記第１の製剤が、前記第２の製剤と接触していない、提供することと、
（ｉｉ）前記組成物を提供するために前記第１および第２の製剤を血小板溶解物と混合することであって、
前記第１の製剤が、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜４０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、混合後、前記第１および／または第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、提供することと、を含む、方法。
【請求項３０】
前記混合の前に、前記血小板溶解物が、フィブリノゲンを含む前記第１の製剤と組み合わされ、トロンビンを含む前記第２の製剤とは組み合わされない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記混合の前に、前記血小板溶解物が、トロンビンを含む前記第２の製剤と組み合わされない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合の前に、前記血小板溶解物が、フィブリノゲンを含む前記第１の製剤またはトロンビンを含む前記第２の製剤と組み合わされない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つまたは複数を、前記第１および第２の製剤ならびに血小板溶解物と混合することをさらに含む、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記イオンが、カルシウムイオンである、または
前記イオン源が、イオン性塩であり、および／またはカルシウムイオンを含む、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）を前記第１および第２の製剤と混合することをさらに含む、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
（ｉ）前記第１の製剤が、０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜３０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記第１および／または第２の製剤が、合計５〜２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、０．１〜１２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜２５Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記第１および／または第２の製剤が、合計７〜１４％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、０．２〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、２〜２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記第１および／または第２の製剤が、合計８〜１２％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
（ｉ）前記第１の製剤が、１ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記第１および／または第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、１〜８ｍｇ／ｍｌ（例えば、約４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記第１および／または第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、５〜１５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ）を含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記第１および／または第２の製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
（ｉ）前記第１の製剤が、約０．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記第１および／または第２の製剤が、合計約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、約４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記第１および／または第２の製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、約１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記第１および／または第２の製剤が、合計約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物が、
（ｉ）少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、少なくとも１ユニット／ｍＬのトロンビン、および約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約２ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、および約５Ｕ／ｍＬのトロンビン、を含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の製剤および前記第２の製剤が、等体積である、または１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満異なる体積である、請求項２９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１および第２の製剤ならびに前記血小板溶解物の前記混合が、
前記フィブリノゲンを含む第１の流れ、前記トロンビンを含む第２の流れ、および任意選択で第３の流れを生成することであって、前記流れが、当初互いに分離している、生成することと、
前記流れをともに組み合わせることと、を含み、
前記第１の流れ、前記第２の流れおよび／または前記第３の流れのうちのいずれか１つもしくは複数が、前記血小板溶解物を含む、請求項２９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
フィブリノゲン、トロンビンおよび血小板溶解物を含む製剤を対象の組織に適用するための、請求項１３〜２８のいずれか１項に記載のキット、パッケージまたはデバイスの使用。
【請求項４５】
対象の組織を治療する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物を前記組織に適用することを含む、方法。
【請求項４６】
対象の組織の治療に使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
対象の組織を治療するための薬剤の調製における、フィブリノゲンを含む第１の製剤、およびトロンビンを含む第２の製剤の使用であって、前記薬剤が血小板溶解物をさらに含み、前記第１の製剤が、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜４０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記薬剤または製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、使用。
【請求項４８】
前記薬剤が、イオン、イオン源、アミノ酸、フィブロネクチン、麻酔薬、抗生物質、増殖因子（例えば、ｈＥＧＦ）、組織因子ＸＩＩＩ、基質タンパク質（例えば、コラーゲン）のうちのいずれか１つまたは複数をさらに含む、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記薬剤が、細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）をさらに含む、請求項４７または請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記イオンが、カルシウムイオンである、または
前記イオン源が、イオン性塩であり、および／またはカルシウムイオンを含む、請求項４８または請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記血小板溶解物が、ヒト血小板溶解物を含む、またはヒト血小板溶解物からなる、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５２】
前記血小板溶解物が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含まない、もしくは実質的に含まない、または１０％（ｖ／ｖ）未満、９％（ｖ／ｖ）未満、８％（ｖ／ｖ）未満、７％（ｖ／ｖ）未満、６％（ｖ／ｖ）未満、５％（ｖ／ｖ）未満、４％（ｖ／ｖ）未満、３％（ｖ／ｖ）未満、２％（ｖ／ｖ）未満、１％（ｖ／ｖ）未満、０．５％（ｖ／ｖ）未満の抗凝固剤（例えば、ヘパリン）を含む、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５３】
（ｉ）前記第１の製剤が、０．１〜１５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜３０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計５〜１５％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、０．１〜１２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、１〜２５Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計７〜１４％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、０．２〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、２〜２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計８〜１２％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５４】
（ｉ）前記第１の製剤が、１ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、約０．４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、１〜８ｍｇ／ｍｌ（例えば、約４ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、５〜１５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ）を含み、前記第２の製剤が、０．５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば、約１Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ）のトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計５〜４０％（ｖ／ｖ）（例えば、約２０％（ｖ／ｖ））の血小板溶解物を含む、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５５】
（ｉ）前記第１の製剤が、約０．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉ）前記第１の製剤が、約４ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、または
（ｉｉｉ）前記第１の製剤が、約１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを含み、前記第２の製剤が、約２Ｕ／ｍｌ、約１０Ｕ／ｍｌもしくは約２０Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、前記薬剤もしくは製剤が、合計約２０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物を含む、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５６】
前記薬剤または製剤が、
（ｉ）少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、少なくとも１ユニット／ｍＬのトロンビン、および約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、または
（ｉｉ）約１０％（ｖ／ｖ）の血小板溶解物、約２ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン、および約５Ｕ／ｍｌのトロンビン、を含む、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５７】
前記第１の製剤および前記第２の製剤が、等体積である、または１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満異なる体積である、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５８】
前記組織が、眼組織（例えば角膜組織）である、請求項４４、もしくは４７〜５７のいずれか１項に記載の使用、または請求項４５に記載の方法、または請求項４６に記載の組成物。
【請求項５９】
前記組織が創傷を含む、または前記組織が創傷を含む眼組織（例えば、創傷を含む角膜組織）である、請求項４４、４７〜５７のいずれか１項に記載の使用、または請求項４５に記載の方法、または請求項４６に記載の組成物。
【請求項６０】
前記製剤が、三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを使用して前記対象の前記組織に適用される、請求項４４、または４７〜５８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６１】
三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを使用して前記対象の前記組織を治療するための薬剤である、請求項４７〜５８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６２】
前記組成物が、三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを使用して前記組織に適用される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
前記組織の前記治療が、三次元（３Ｄ）バイオプリンティングを利用する、請求項４６に記載の組成物。
【国際調査報告】
2021534231.tif 000044
2021534231.tif 000045
2021534231.tif 000046
2021534231.tif 000047