(57)【要約】標的ゲノムを調節するための方法及び組成物が開示される。本開示は、宿主細胞、組織若しくは被験者における１つ若しくは複数の位置のゲノムをインビボ又はインビトロで改変するための新規の組成物、システム及び方法に関する。特に、本発明は、宿主ゲノムへの外性遺伝因子の導入のための組成物、システム及び方法を特徴とする。以下：（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、（ｉ）又は（ｉｉ）の一方若しくは両方が、鳥レトロトランスポザーゼに由来する、ポリペプチド又は核酸；及び（ｂ）（ｉ）前記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは前記鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）を含む、ＤＮＡを改変するためのシステムが開示される。
2021534798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、（ｉ）又は（ｉｉ）の一方若しくは両方が、鳥レトロトランスポザーゼに由来する、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）前記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは前記鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【請求項２】
前記鳥レトロトランスポザーゼが、キンカチョウ（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ  ｇｕｔｔａｔａ）、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ  ｆｏｒｔｉｓ）、ノドジロシトド（Ｚｏｎｏｔｒｉｃｈｉａ  ａｌｂｉｃｏｌｌｉｓ）、又はノドジロシギダチョウ（Ｔｉｎａｍｕｓ  ｇｕｔｔａｔｕｓ）からのレトロトランスポザーゼである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで（ｉ）又は（ｉｉ）の少なくとも１つが異種である、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）前記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは前記鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【請求項４】
以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含むポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）前記ポリペプチドに結合する配列と、（ｉｉ）異種目的配列と、（ｉｉｉ）前記鋳型ＲＮＡの５’末端に、標的ＤＮＡ鎖と１００％同一性の少なくとも１０塩基を有する第１の相同性ドメインと、（ｉｖ）前記鋳型ＲＮＡの５’末端に、標的ＤＮＡ鎖と１００％同一性の少なくとも１０塩基を有する第２の相同性ドメインとを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは前記鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【請求項５】
（ａ）が、ＲＮＡを含み、（ｂ）がＲＮＡを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
（ａ）及び（ｂ）が、同じ核酸の一部である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
（ａ）及び（ｂ）が、個別の核酸である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
ＲＮＡのみを含むか、又は少なくとも１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、若しくは１００：１のＲＮＡ：ＤＮＡ比で、ＤＮＡより多くのＲＮＡを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
前記異種目的配列が、前記鋳型ＲＮＡに５’から３’の方向でオープンリーディングフレームを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記異種目的配列が、前記鋳型ＲＮＡに３’から５’の方向でオープンリーディングフレームを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ポリペプチドに結合する配列が、３’非翻訳配列である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記鋳型ＲＮＡが、５’非翻訳配列をさらに含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記鋳型ＲＮＡが、前記異種目的配列と作動可能に連結したプロモータをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記プロモータが、前記５’非翻訳配列と前記異種目的配列との間に配置される、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記プロモータが、前記ポリペプチドに結合する前記３’非翻訳配列と前記異種目的配列との間に配置される、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１６】
前記５’非翻訳配列が、表３、第６列の配列、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記３’非翻訳配列が、表３、第７列の配列、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記異種目的配列が、酵素、膜タンパク質、血液因子、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、センサータンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、又は貯蔵タンパク質を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記鋳型ＲＮＡが、前記鋳型ＲＮＡの前記５’末端に、標的ＤＮＡ鎖と１００％同一性の少なくとも１０塩基を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２０】
前記鋳型ＲＮＡが、前記鋳型ＲＮＡの前記３’末端に、標的ＤＮＡ鎖と１００％同一性の少なくとも１０塩基を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２１】
細胞内の標的ＤＮＡ鎖を修飾する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のシステムを前記細胞に投与し、これにより、前記標的ＤＮＡ鎖を修飾するステップを含む方法。
【請求項２２】
前記細胞のゲノムへの外性ＤＮＡ配列の少なくとも５塩基対の付加を達成する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞のゲノムへの外性ＤＮＡ配列の少なくとも１００塩基対の付加を達成する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ゲノム当たり少なくとも０．０１、０．０５、又は０．５コピーの平均コピー数で前記標的ＤＮＡへの前記異種目的配列の挿入を達成する、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
非切断型である前記標的ＤＮＡへの前記異種目的配列の約５０〜１００％の組込みを達成する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）の前記核酸が、前記細胞のゲノムに組み込まれない、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記鋳型ＲＮＡが、前記鋳型ＲＮＡの５’末端に、前記標的ＤＮＡ鎖と１００％同一性の少なくとも１０塩基を含む、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記鋳型ＲＮＡが、前記鋳型ＲＮＡの３’末端に、前記標的ＤＮＡ鎖と１００％同一性の少なくとも１０塩基を含む、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年８月２８日に提出された米国特許出願第６２／７２３，８８６号明細書、２０１８年８月３１日に提出された米国特許出願第６２／７２５，７７８号明細書、２０１９年５月２１日に提出された米国特許出願第６２／８５０，８８３号明細書、及び２０１９年６月２１日に提出された米国特許出願第６２／８６４，９２４号明細書に対する優先権を主張し、それらの各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子ファイルにより提出された配列表を含み、これは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年８月２８日に作成され、Ｖ２０６５−７０００ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、４，００４，５４８バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
ゲノムへの目的の核酸の組込みは、挿入事象を促進するための特殊なタンパク質の非存在下において、低頻度で起こり、しかも部位特異性はほとんどない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のようないくつかの存在する手法は、小さな編集により適しており、長い配列の組込みには有効性が低い。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰといった他の既存の手法は、ｌｏｘＰ部位をゲノムに挿入する第１ステップ、次いで目的の配列をｌｏｘＰ部位に挿入する第２ステップを必要とする。当技術分野では、目的の配列をゲノムに挿入するための改善されたタンパク質が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、宿主細胞、組織若しくは被験者における１つ若しくは複数の位置のゲノムをインビボ又はインビトロで改変するための新規の組成物、システム及び方法に関する。特に、本発明は、宿主ゲノムへの外性遺伝因子の導入のための組成物、システム及び方法を特徴とする。
【０００５】
組成物又は方法の特徴は、以下に挙げる実施形態の１つ若しくは複数を含み得る。
【０００６】
１．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）治療ポリペプチドをコードするか、又は哺乳動物（例えば、ヒト）ポリペプチド、又はその断片若しくは変異体をコードする異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【０００７】
２．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステムにおいて、以下：
ｉ．異種目的配列は、タンパク質、例えば、酵素（例えば、リソソーム酵素）又は血液因子（例えば、第Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ若しくはＸＩＩＩ因子）をコードする；
ｉｉ．異種目的配列は、組織特異的プロモータ又はエンハンサーを含む；
ｉｉｉ．異種目的配列は、２５０、３００、４００、５００、若しくは１，０００アミノ酸超、及び任意選択で最大７，５００アミノ酸のポリペプチドをコードする；
ｉｖ．異種目的配列は、哺乳動物遺伝子の断片をコードするが、全哺乳動物遺伝子はコードせず、例えば、１つ若しくは複数のエキソンをコードするが、完全長タンパク質はコードしない；
ｖ．異種目的配列は、１つ若しくは複数イントロンをコードする；
ｖｉ．異種目的配列は、ＧＦＰ以外であり、例えば、蛍光タンパク質以外であるか、又はリポータタンパク質以外である；
ｖｉｉ．異種目的配列は、Ｔ細胞キメラ抗原受容体以外である、
の１つ若しくは複数であるシステム。
【０００８】
３．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【０００９】
４．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）標的ＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【００１０】
５．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、（ｉ）若しくは（ｉｉ）の一方又は両方が、鳥レトロトランスポザーゼに由来し、例えば、表２若しくは３の配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【００１１】
６．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、上記ポリペプチドは、３７℃で、それ以外は同様の条件下での２５℃のその活性の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の活性を有する、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【００１２】
７．上記ポリペプチドが、鳥レトロトランスポザーゼ、例えば、表３の第８列に挙げる鳥レトロトランスポザーゼに由来するか、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列である、実施形態６に記載のシステム。
【００１３】
８．上記鳥レトロトランスポザーゼが、キンカチョウ（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ  ｇｕｔｔａｔａ）、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ  ｆｏｒｔｉｓ）、ノドジロシトド（Ｚｏｎｏｔｒｉｃｈｉａ  ａｌｂｉｃｏｌｌｉｓ）、若しくはノドジロシギダチョウ（Ｔｉｎａｍｕｓ  ｇｕｔｔａｔｕｓ）からのレトロトランスポザーゼ、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列である、実施形態６に記載のシステム。
【００１４】
９．上記ポリペプチドが、表３の第８列に挙げるレトロトランスポザーゼに由来するか、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列である、実施形態６に記載のシステム。
【００１５】
１０．上記鋳型ＲＮＡが、表３の配列（例えば、表３、第６列の５’非翻訳領域及び表３、第７列の３’非翻訳領域の一方若しくは両方）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００１６】
１１．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステムにおいて、以下：
ｉ．上記ポリペプチドをコードする核酸と、鋳型ＲＮＡ若しくは鋳型ＲＮＡをコードする核酸は、別の核酸であり；
ｉｉ．鋳型ＲＮＡは、活性逆転写酵素をコードせず、例えば、不活性化変異型逆転写酵素（例えば、実施例１〜２に記載される通り）を含むか、又は逆転写酵素配列を含まない；或いは
ｉｉｉ．鋳型ＲＮＡは、活性エンドヌクレアーゼをコードせず、例えば、不活性化エンドヌクレアーゼを含むか、又はエンドヌクレアーゼを含まない；或いは
ｉｖ．鋳型ＲＮＡは、１つ若しくは複数の化学改変を含む、
の１つ若しくは複数であるシステム。
【００１７】
１２．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含むポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する５’非翻訳配列と、（ｉｉ）上記ポリペプチドに結合する３’非翻訳配列と、（ｉｉｉ）異種目的配列と、（ｉｖ）上記異種目的配列と作動可能に連結したプロモータとを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステムにおいて、
上記プロモータは、上記ポリペプチドに結合する５’非翻訳配列と、異種配列との間に位置するか、又は
上記プロモータは、上記ポリペプチドに結合する３’非翻訳配列と、異種配列との間に位置するシステム。
【００１８】
１３．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する５’非翻訳配列と、（ｉｉ）上記ポリペプチドに結合する３’非翻訳配列と、（ｉｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステムにおいて、
上記異種目的配列は、上記鋳型ＲＮＡ上に５’から３’方向でオープンリーディングフレーム（若しくはその逆相補鎖）を含むか；又は
上記異種目的配列は、上記鋳型ＲＮＡ上に３’から５’方向でオープンリーディングフレーム（若しくはその逆相補鎖）を含むシステム。
【００１９】
１４．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、（ｉ）若しくは（ｉｉ）の少なくとも１つが異種である、ポリペプチド又は核酸、及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【００２０】
１５．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）標的ＤＮＡ結合ドメインと、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、（ｉ）、（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）の少なくとも１つが異種である、ポリペプチド又は核酸、及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【００２１】
１６．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）型非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一）の配列と、（ｉｉ）ＡＰＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一）の配列とを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【００２２】
１７．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）型非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一）の配列と、（ｉｉ）ＲＬＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一）の配列と、（ｉｉｉ）異種標的ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、異種ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン）を含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【００２３】
１８．上記鋳型ＲＮＡが、（ｉｉｉ）異種目的配列と作動可能に連結されたプロモータを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００２４】
１９．上記ポリペプチドが、さらに（ｉｉｉ）ＤＮＡ結合ドメインを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００２５】
２０．上記ポリペプチドが、配列番号１０１６の配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一）の配列を含む、実施形態１７に記載のシステム。
【００２６】
２１．上記ポリペプチドが、表３、第８列の配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一）の配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００２７】
２２．上記ポリペプチドをコードする核酸と、鋳型ＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡをコードする核酸が、共有結合されており、例えば、融合タンパク質の一部である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００２８】
２３．上記融合核酸がＲＮＡを含む、実施形態２２に記載のシステム。
【００２９】
２４．上記融合核酸がＤＮＡを含む、実施形態２２に記載のシステム。
【００３０】
２５．（ｂ）が鋳型ＲＮＡを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００３１】
２６．上記鋳型ＲＮＡが、さらに核局在化シグナルを含む、実施形態２５に記載のシステム。
【００３２】
２７．（ａ）が、上記ポリペプチドをコードするＲＮＡを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００３３】
２８．（ａ）のＲＮＡと（ｂ）のＲＮＡが、個別のＲＮＡ分子である、実施形態２７に記載のシステム。
【００３４】
２９．（ａ）のＲＮＡと（ｂ）のＲＮＡが、１０：１〜５：１、５：１〜２：１、２：１〜１：１、１：１〜１：２、１：２〜１：５、又は１：５〜１：１０の比で存在する、実施形態２８に記載のシステム。
【００３５】
３０．（ａ）のＲＮＡが、核局在化シグナルを含まない、実施形態２８に記載のシステム。
【００３６】
３１．上記ポリペプチドが、核局在化シグナル及び／又は核小体局在化シグナルをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００３７】
３２．（ａ）が、以下：（ｉ）上記ポリペプチド及び（ｉｉ）核局在化シグナル及び／又は核小体局在化シグナルをコードするＲＮＡを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００３８】
３３．上記ＲＮＡが、例えば、異種目的配列の５’側に、シュードノット配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００３９】
３４．上記ＲＮＡが、シュードノット配列の５’側にステムループ配列又はヘリックスを含む、実施形態３３に記載のシステム。
【００４０】
３５．上記ＲＮＡが、シュードノット配列の３’側、例えば、シュードノット配列の３’側で、且つ異種目的配列の５’側に、１つ若しくは複数（例えば、２、３、若しくはそれ以上）のステムループ配列又はヘリックスを含む、実施形態３３又は３４に記載のシステム。
【００４１】
３６．上記シュードノットを含む鋳型ＲＮＡが、触媒活性、例えば、ＲＮＡ切断活性、例えば、ｃｉｓ−ＲＮＡ切断活性を有する、実施形態３３〜３５のいずれかに記載のシステム。
【００４２】
３７．上記ＲＮＡが、例えば、異種目的配列の３’側に、少なくとも１つのステムループ配列又はヘリックス、例えば、１、２、３、４、５若しくはそれ以上のステムループ配列、ヘアピン又はヘリックス配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００４３】
３８．上記ポリペプチドが、表１に列記されるポリペプチドの配列と少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一性）を有する少なくとも５０アミノ酸（例えば、少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００アミノ酸）の配列、又はその逆転写酵素ドメイン若しくはエンドヌクレアーゼドメインを含む、いずれかの上記番号のシステム。
【００４４】
３９．上記ポリペプチドが、表２〜３のいずれかに列記されるポリペプチドの配列と少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一性）を有する少なくとも５０アミノ酸（例えば、少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００アミノ酸）の配列、又はその逆転写酵素ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、若しくはＤＮＡ結合ドメインを含む、いずれかの上記番号のシステム。
【００４５】
４０．上記ポリペプチドが、表３、第８列のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一性）を有する少なくとも５０アミノ酸（例えば、少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００アミノ酸）の配列、又はその逆転写酵素ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、若しくはＤＮＡ結合ドメインを含む、いずれかの上記番号のシステム。
【００４６】
４１．上記鋳型ＲＮＡが、表３の配列（例えば、表３、第６列の５’非翻訳領域及び表３、第７列の３’非翻訳領域の一方若しくは両方）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列、いずれかの上記番号のシステム。
【００４７】
４２．上記鋳型ＲＮＡが、表３、第７列の３’非翻訳領域から約１００〜１２５ｂｐの配列を含み、例えば、上記配列は、表３、第７列の３’非翻訳領域のヌクレオチド１〜１００、１０１〜２００、若しくは２０１〜３２５、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態４１に記載のシステム。
【００４８】
４３．（ａ）がＲＮＡを含み、（ｂ）がＲＮＡを含む、いずれかの上記番号のシステム。
【００４９】
４４．ＲＮＡのみを含むか、又は少なくとも１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、若しくは１００：１のＲＮＡ：ＤＮＡ比で、ＤＮＡより多くのＲＮＡを含む、いずれかの上記番号のシステム。
【００５０】
４５．ＤＮＡを含まないか、又は質量又はモル量基準で１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％超のＤＮＡを含まない、いずれかの上記番号のシステム。
【００５１】
４６．（ｂ）のＤＮＡ依存性ＲＮＡ重合化を妨害することなく、異種目的配列の挿入によりＤＮＡを改変することができる、いずれかの上記番号のシステム。
【００５２】
４７．ＤＮＡ修復経路の阻害剤（例えば、ＳＣＲ７、ＰＡＲＰ阻害剤）の存在下で、又はＤＮＡ修復経路が欠失した細胞株（例えば、ヌクレオチド除去修復経路又は相同組み換え修復経路が欠失した細胞株）において、異種目的配列の挿入によりＤＮＡを修飾することができる、いずれかの上記番号のシステム。
【００５３】
４８．標的細胞中で検出可能なレベルの二本鎖切断の形成を引き起こさない、いずれかの上記番号のシステム。
【００５４】
４９．逆転写酵素活性を用いて、任意選択で相同組み換え活性の非存在下で、ＤＮＡを修飾することができる、いずれかの上記番号のシステム。
【００５５】
５０．上記鋳型ＲＮＡが、二次構造を低減するように処理されており、例えば、二次構造を低減する温度、例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、若しくは９５℃に例えば、加熱された、いずれかの上記番号のシステム。
【００５６】
５１．上記鋳型ＲＮＡが、続いて、例えば、二次構造を可能にする温度、例えば、３０、２５、若しくは２０℃以下まで冷却された、実施形態５０に記載のシステム。
【００５７】
５２．以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含む、ポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と、（ｉｉ）異種目的配列と、（ｉｉｉ）鋳型ＲＮＡの５’末端に、標的ＤＮＡ鎖に対する１００％同一性の少なくとも１０塩基を有する第１相同性ドメインと、（ｉｖ）鋳型ＲＮＡの５’末端に、標的ＤＮＡ鎖に対する１００％同一性の少なくとも１０塩基を有する第２相同性ドメインとを含む鋳型ＲＮＡ（若しくは鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
を含む、ＤＮＡを改変するためのシステム。
【００５８】
５３．（ａ）及び（ｂ）が、同じ核酸の一部である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００５９】
５４．（ａ）及び（ｂ）が、個別の核酸である、実施形態１〜５２のいずれかに記載のシステム。
【００６０】
５５．上記鋳型ＲＮＡが、鋳型ＲＮＡの５’末端に、標的ＤＮＡ鎖に対する１００％同一性の少なくとも１０塩基を含む（例えば、標的ＤＮＡ鎖は、ヒトＤＮＡ配列である）、いずれかの上記番号のシステム。
【００６１】
５６．上記鋳型ＲＮＡが、鋳型ＲＮＡの３’末端に、標的ＤＮＡ鎖に対する１００％同一性の少なくとも１０塩基を含む（例えば、標的ＤＮＡ鎖は、ヒトＤＮＡ配列である）、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム。
【００６２】
５７．いずれかの先行する番号のシステムを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）。
【００６３】
５８．細胞、組織又は被験者の標的ＤＮＡ鎖を修飾する方法であって、細胞、組織又は被験者に、いずれかの先行する番号のシステムを投与するステップを含み、ここで、上記システムは、鋳型ＲＮＡ配列を標的ＤＮＡ鎖に逆転写し、それによって標的ＤＮＡ鎖を修飾する方法。
【００６４】
５９．上記細胞、組織又は被験者が、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞、組織若しくは被験者である、実施形態５８に記載の方法。
【００６５】
６０．上記細胞が、線維芽細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
【００６６】
６１．上記細胞が、初代細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
【００６７】
６２．上記細胞が、不死化されていない、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
【００６８】
６３．哺乳動物細胞のゲノムを修飾する方法であって、上記細胞を以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインと、任意選択で（ｉｉｉ）ＤＮＡ結合ドメインと、を含むポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と、（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
と接触させるステップを含む方法。
【００６９】
６４．上記ポリペプチドが、標的ＤＮＡ結合ドメインを含まない、実施形態６３に記載の方法。
【００７０】
６５．上記ポリペプチドが、ＡＰＥ型トランスポゾン逆転写酵素に由来する、実施形態６３に記載の方法。
【００７１】
６６．（ｉ）逆転写酵素ドメイン、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が、表１の配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一性を有する配列を有する、実施形態６３に記載の方法。
【００７２】
６７．上記ポリペプチドが、標的ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、実施形態６３に記載の方法。
【００７３】
６８．哺乳動物細胞のゲノムを修飾する方法であって、上記細胞を以下：
（ａ）ポリペプチドをコードするＲＮＡであって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインと、任意選択で（ｉｉｉ）ＤＮＡ結合ドメインと、を含むＲＮＡ；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と、（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ
と接触させるステップを含み、
ここで、上記方法は、哺乳動物細胞をＤＮＡと接触させるステップを含まないか、又は（ａ）及び（ｂ）の組成物は、核酸の質量若しくはモル量基準で、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０２％、若しくは０．０１％超のＤＮＡを含まない方法。
【００７４】
６９．上記哺乳動物細胞のゲノムへの外性ＤＮＡ配列の少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、若しくは５，０００塩基対の付加をもたらす、実施形態６８に記載の方法。
【００７５】
７０．上記哺乳動物細胞のゲノムへのタンパク質コード配列の付加をもたらす、実施形態６８又は６９に記載の方法。
【００７６】
７１．哺乳動物細胞のゲノムにＤＮＡを挿入する方法であって、上記細胞をＲＮＡ組成物と接触させるステップを含み、上記ＲＮＡ組成物が、以下：
（ａ）上記ゲノムへの鋳型ＲＮＡの挿入を指令する第１ＲＮＡ、及び
（ｂ）異種配列を含む鋳型ＲＮＡ
を含み、
ここで、上記方法は、上記哺乳動物細胞をＤＮＡと接触させるステップを含まないか、又は（ａ）及び（ｂ）の組成物は、核酸の質量若しくはモル量基準で、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０２％、若しくは０．０１％超のＤＮＡを含まず、
上記方法は、上記哺乳動物細胞のゲノムへのＤＮＡ（例えば、外性ＤＮＡ）配列の少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、若しくは５，０００塩基対の付加をもたらす方法。
【００７７】
７２．上記第１ＲＮＡが、ポリペプチド（例えば、本明細書の表１、２、若しくは３のいずれかのポリペプチド）をコードし、ここで、上記ポリペプチドが、ゲノムへの鋳型ＲＮＡの挿入を指令する、実施形態７１に記載の方法。
【００７８】
７３．上記鋳型ＲＮＡが、上記ポリペプチドと結合する配列をさらに含む、実施形態７２に記載の方法。
【００７９】
７４．上記細胞にＤＮＡを送達することなく、哺乳動物細胞のゲノムに外性ＤＮＡの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００ｂｐを付加する方法。
【００８０】
７５．哺乳動物細胞のゲノムに外性ＤＮＡの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００ｂｐを付加する方法であって、上記方法は、上記哺乳動物細胞をＤＮＡと接触させるステップを含まないか、又は上記方法は、核酸の質量若しくはモル量基準で、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０２％、若しくは０．０１％未満のＤＮＡを含む組成物と上記哺乳動物細胞を接触させるステップを含む方法。
【００８１】
７６．哺乳動物細胞のゲノムに外性ＤＮＡの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００ｂｐを付加する方法であって、ＲＮＡだけを上記哺乳動物細胞に送達するステップを含む方法。
【００８２】
７７．哺乳動物細胞のゲノムに外性ＤＮＡの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００ｂｐを付加する方法であって、ＲＮＡとタンパク質を上記哺乳動物細胞に送達するステップを含む方法。
【００８３】
７８．上記鋳型ＲＮＡが、上記外性ＤＮＡの挿入のための鋳型として役立つ、実施形態６８〜７７のいずれか１つに記載の方法。
【００８４】
７９．外性ＤＮＡのＤＮＡ依存性ＲＮＡ重合化を含まない、実施形態６８〜７８のいずれか１つに記載の方法。
【００８５】
８０．少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、若しくは５，０００塩基対のＤＮＡの哺乳動物細胞のゲノムへの付加をもたらす、実施形態５８〜７９のいずれか１つに記載の方法。
【００８６】
８１．（ａ）のＲＮＡ及び（ｂ）のＲＮＡが、共有結合している、例えば、同じ転写物の一部である、実施形態６８〜８０のいずれか１つに記載の方法。
【００８７】
８２．（ａ）のＲＮＡ及び（ｂ）のＲＮＡが、個別のＲＮＡである、実施形態６８〜８０のいずれか１つに記載の方法。
【００８８】
８３．上記哺乳動物細胞を鋳型ＤＮＡと接触させるステップを含まない、実施形態５８〜８２のいずれか１つに記載の方法。
【００８９】
８４．ヒト細胞のゲノムを修飾する方法であって、上記細胞を以下：
（ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインと、任意選択で（ｉｉｉ）ＤＮＡ結合ドメインと、を含むポリペプチド又は核酸；及び
（ｂ）（ｉ）上記ポリペプチドに結合する配列と、（ｉｉ）異種目的配列とを含む鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）
と接触させるステップを含み、
ここで、上記方法によって、ヒト細胞ゲノムへの上記異種目的配列の挿入が達成され、
上記ヒト細胞は、いずれのＤＮＡ修復遺伝子及び／又は癌抑制遺伝子の上方制御も示さないか、或いはＤＮＡ修復遺伝子及び／又は癌抑制遺伝子が、１０％、５％、２％、若しくは１％超上方制御されず、例えば、その際、上方制御は、例えば、実施例１４に記載のように、ＲＮＡ配列によって測定される方法。
【００９０】
８５．細胞（例えば、哺乳動物細胞）のゲノムに外性コード領域を付加する方法であって、上記外性コード領域のノンコーディング鎖を含むＲＮＡと上記細胞を接触させるステップを含み、任意選択で、上記ＲＮＡは、上記外性コード領域のコーディング鎖を含まず、任意選択で、送達は、非ウイルス送達を含む方法。
【００９１】
８６．細胞（例えば、哺乳動物細胞）にポリペプチドを発現させる方法であって、上記細胞をＲＮＡと接触させるステップを含み、上記ＲＮＡは、ポリペプチドをコードすることになる配列の逆相補鎖であるノンコーディング鎖を含み、任意選択で、上記ＲＮＡは、上記ポリペプチドをコードするコーディング鎖を含まず、任意選択で、送達は、非ウイルス送達を含む方法。
【００９２】
８７．哺乳動物ゲノムに挿入される配列が、哺乳動物ゲノムに対して外性の配列である、実施形態５８〜８６のいずれかに記載の方法。
【００９３】
８８．ＤＮＡ鋳型とは独立に作動する、実施形態５８〜８７のいずれかに記載の方法。
【００９４】
８９．上記細胞が、組織の一部である、実施形態５８〜８８のいずれかに記載の方法。
【００９５】
９０．上記哺乳動物細胞が、正倍数体であり、不死化されておらず、生物の一部であり、初代細胞であり、非分裂であり、肝細胞であるか、又は遺伝子疾患を有する被験者に由来する、実施形態５８〜８９のいずれかに記載の方法。
【００９６】
９１．上記接触ステップが、プラスミド、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイロゾーム、リポソーム、小胞、エキソソーム、又は脂質ナノ粒子と、上記細胞を接触させることを含む、実施形態５８〜９０のいずれかに記載の方法。
【００９７】
９２．上記接触ステップが、非ウイルス送達を使用することを含む、実施形態５８〜９１のいずれかに記載の方法。
【００９８】
９３．上記鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）と上記細胞を接触させるステップを含み、上記鋳型ＲＮＡは、上記外性コード領域のノンコーディング鎖を含み、任意選択で、上記鋳型ＲＮＡは、上記外性コード領域のコーディング鎖を含まず、任意選択で、送達は、非ウイルス送達を含み、これによって上記外性コード領域を上記細胞のゲノムに付加する、実施形態５８〜９２のいずれかに記載の方法。
【００９９】
９４．上記鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）と上記細胞を接触させるステップを含み、上記鋳型ＲＮＡは、ポリペプチドをコードすることになる配列の逆相補鎖であるノンコーディング鎖を含み、任意選択で、上記鋳型ＲＮＡは、上記ポリペプチドをコードするコーディング鎖を含まず、任意選択で、送達は、非ウイルス送達を含み、これにより、上記細胞において上記ポリペプチドを発現させる、実施形態５８〜９３のいずれかに記載の方法。
【０１００】
９５．上記接触ステップが、（ａ）及び（ｂ）を被験者に、例えば、静脈内投与することを含む、実施形態６３〜９４のいずれかに記載の方法。
【０１０１】
９６．上記接触ステップが、１用量の（ａ）及び（ｂ）を被験者に少なくとも２回投与することを含む、実施形態６３〜９５のいずれかに記載の方法。
【０１０２】
９７．上記ポリペプチドが、上記鋳型ＲＮＡ配列を上記標的ＤＮＡ鎖に逆転写し、これによって上記標的ＤＮＡ鎖を改変する、実施形態６３〜９６のいずれかに記載の方法。
【０１０３】
９８．（ａ）及び（ｂ）が個別に投与される、実施形態６３〜９７のいずれかに記載の方法。
【０１０４】
９９．（ａ）及び（ｂ）が一緒に投与される、実施形態６３〜９７のいずれかに記載の方法。
【０１０５】
１００．（ａ）の核酸が、宿主細胞のゲノムに組み込まれない、実施形態６３〜９９のいずれかに記載の方法。
【０１０６】
１０１．上記ポリペプチドと結合する配列が、以下の特徴：
（ａ）鋳型ＲＮＡの３’末端側にある；
（ｂ）鋳型ＲＮＡの５’末端側にある；
（ｂ）ノンコーディング配列である；
（ｃ）構造ＲＮＡである；又は
（ｄ）少なくとも１つのヘアピンループ構造を形成する
の１つ若しくは複数を有する、いずれかの先行する番号の方法。
【０１０７】
１０２．上記鋳型ＲＮＡが、標的ＤＮＡ鎖と少なくとも８０％同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一性）の少なくとも２０ヌクレオチドを含む配列をさらに含む、いずれかの先行する番号の方法。
【０１０８】
１０３．上記鋳型ＲＮＡが、標的ＤＮＡ鎖と少なくとも８０％同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一性）の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ヌクレオチドを含む配列をさらに含む、いずれかの先行する番号の方法。
【０１０９】
１０４．標的ＤＮＡ鎖と少なくとも８０％同一性の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ヌクレオチド、又は約２〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１０〜１００、若しくは２〜１００ヌクレオチドを含む配列が、上記鋳型ＲＮＡの３’末端側にある、いずれかの先行する番号の方法。
【０１１０】
１０５．上記鋳型ＲＮＡが、標的ＤＮＡ鎖と少なくとも８０％同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一性）の少なくとも１００ヌクレオチドを含む配列を、例えば、上記鋳型ＲＮＡの３’末端側にさらに含む、いずれかの先行する番号の方法。
【０１１１】
１０６．上記配列が少なくとも８０％同一性を含む上記標的ＤＮＡ鎖内の部位は、上記エンドヌクレアーゼを含むポリペプチドにより認識される（例えば、結合及び／又は切断される）上記標的ＤＮＡ鎖上の標的部位に近位（例えば、その約０〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、若しくは５０〜１００ヌクレオチド内）である、実施形態１０４又は１０５に記載の方法。
【０１１２】
１０７．標的ＤＮＡ鎖と少なくとも８０％同一性の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ヌクレオチド、又は約２〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１０〜１００、若しくは２〜１００ヌクレオチドを含む配列が、上記鋳型ＲＮＡの３’末端にあり、
任意選択で、上記配列が少なくとも８０％の同一性を含む上記標的ＤＮＡ鎖内の部位は、上記エンドヌクレアーゼを含むポリペプチドにより認識される（例えば、結合及び／又は切断される）上記標的ＤＮＡ鎖上の標的部位に近位（例えば、その約０〜１０、１０〜２０、若しくは２０〜３０ヌクレオチド内）である、いずれかの先行する番号の方法。
【０１１３】
１０８．上記標的部位が、上記ヌクレオチドを含むポリペプチドのネイティブ標的部位と最大の同一性を有するヒトゲノム内の部位であり、例えば、上記ヒトゲノム内の部位は、上記ネイティブ標的部位と同一の少なくとも約１６、１７、１８、１９、若しくは２０ヌクレオチドを有する、実施形態１０７に記載の方法。
【０１１４】
１０９．上記鋳型ＲＮＡが、上記標的ＤＮＡ鎖と１００％同一性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０塩基を有する、いずれかの先行する番号の方法。
【０１１５】
１１０．上記標的ＤＮＡ鎖と１００％同一性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０塩基が、上記鋳型ＲＮＡの３’末端側にある、いずれかの先行する番号の方法。
【０１１６】
１１１．上記標的ＤＮＡ鎖と１００％同一性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０塩基が、上記鋳型ＲＮＡの５’末端側にある、いずれかの先行する番号の方法。
【０１１７】
１１２．上記鋳型ＲＮＡが、上記鋳型ＲＮＡの５’末端側に、上記標的ＤＮＡ鎖と１００％同一性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０塩基を、また上記鋳型ＲＮＡの３’末端に、上記標的ＤＮＡ鎖と１００％同一性の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０塩基を含む、いずれかの先行する番号の方法。
【０１１８】
１１３．上記異種目的配列が、５０〜５０，０００塩基対（例えば、５０〜４０，０００ｂｐ、５００〜３０，０００ｂｐ、５００〜２０，０００ｂｐ、１００〜１５，０００ｂｐ、５００〜１０，０００ｂｐ、５０〜１０，０００ｂｐ、５０〜５，０００ｂｐ）である、いずれかの先行する番号の方法。
【０１１９】
１１４．上記異種目的配列が、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、又は７００ｂｐである、いずれかの先行する番号の方法。
【０１２０】
１１５．上記異種目的配列が、少なくとも７１５、７５０、８００、９５０、１，０００、２，０００、３，０００、又は４，０００ｂｐである、いずれかの先行する番号の方法。
【０１２１】
１１６．上記異種目的配列が、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、又は４０，０００ｂｐ未満である、いずれかの先行する番号の方法。
【０１２２】
１１７．上記異種目的配列が、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０、又は１００ｂｐ未満である、いずれかの先行する番号の方法。
【０１２３】
１１８．上記異種目的配列が、以下：
（ａ）オープンリーディングフレーム、例えば、ポリペプチド、例えば、酵素（例えば、リソソーム酵素）、膜タンパク質、血液因子、エキソン、細胞内タンパク質（例えば、細胞質タンパク質、核タンパク質、ミトコンドリアタンパク質若しくはリソソームタンパク質などのオルガネラタンパク質）、細胞外タンパク質、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、センサータンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、又は貯蔵タンパク質をコードする配列；
（ｂ）非コード及び／又は調節配列、例えば、転写モジュレーター、例えば、プロモータ、エンハンサー、インシュレーターに結合する配列；
（ｃ）スプライスアクセプター部位；
（ｄ）ポリＡ部位；
（ｅ）エピジェネティック修飾部位；
（ｆ）遺伝子発現単位
を含む、いずれかの先行する番号の方法。
【０１２４】
１１９．上記標的ＤＮＡが、ゲノムのセーフハーバー（ＧＳＨ）部位である、いずれかの先行する番号の方法。
【０１２５】
１２０．上記標的ＤＮＡが、ゲノムのＮａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位である、いずれかの先行する番号の方法。
【０１２６】
１２１．ゲノム当たり少なくとも０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．５、３、４、又は５コピーの平均コピー数で上記ゲノム内の標的部位への上記異種目的配列の挿入を達成する、いずれかの先行する番号の方法。
【０１２７】
１２２．本明細書に記載のアッセイ、例えば、実施例６のアッセイにより測定して、非切断型のゲノム内の標的部位への約２５〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、７５〜９５％、８０〜９０％の組込み体をもたらす、いずれかの先行する番号の方法。
【０１２８】
１２３．上記細胞のゲノム内の１つの標的部位にのみ上記異種目的配列の挿入を達成する、いずれかの先行する番号の方法。
【０１２９】
１２４．細胞内の標的部位への上記異種目的配列の挿入を達成し、ここで、挿入された異種目的配列は、例えば、実施例１２のアッセイにより測定して、挿入前の異種目的配列と比べ、１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．２％、若しくは０．１％未満の突然変異（例えば、ＳＮＰ又は１つ若しくは複数の欠失、例えば、切断若しくは内部欠失）を含む、いずれかの先行する番号の方法。
【０１３０】
１２５．複数の細胞内の標的部位への上記異種目的配列の挿入を達成し、ここで、例えば、実施例１２のアッセイにより測定して、挿入された異種目的配列のコピーの１０％、５％、２％、若しくは１％未満が、突然変異（例えば、ＳＮＰ又は欠失、例えば、切断若しくは内部欠失）を含む、いずれかの先行する番号の方法。
【０１３１】
１２６．標的細胞ゲノムへの上記異種目的配列の挿入を達成し、ここで、標的細胞は、ｐ５３の上方制御を示さないか、又はｐ５３の上方制御を１０％、５％、２％、若しくは１％未満示し、例えば、その際、ｐ５３の上方制御は、例えば、実施例３０に記載の方法に従ってｐ５３タンパク質レベルにより、又はＳｅｒ１５及びＳｅｒ２０でリン酸化されたｐ５３のレベルにより測定される、いずれかの先行する番号の方法。
【０１３２】
１２７．標的細胞ゲノムへの上記異種目的配列の挿入を達成し、ここで、標的細胞は、ＤＮＡ修復遺伝子及び／又は癌抑制遺伝子の上方制御を一切示さないか、又はＤＮＡ修復遺伝子及び／又は癌抑制遺伝子は、１０％、５％、２％、若しくは１％より多く上方制御されず、例えば、その際、上方制御は、例えば、実施例１４に記載の方法に従ってＲＮＡ配列により測定される、いずれかの先行する番号の方法。
【０１３３】
１２８．例えば、実施例１７に記載されるように、例えば、単一細胞ｄｄＰＣＲを用いて測定して、上記システムと接触させた細胞の集団中（例えば、１若しくは複数回の挿入のコピー数で）約１〜８０％の細胞、例えば、約１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、又は７０〜８０％の細胞内の標的部位に上記異種目的配列の挿入を達成する、いずれかの先行する番号の方法。
【０１３４】
１２９．例えば、実施例１８に記載されるように、例えば、コロニー単離及びｄｄＰＣＲを用いて測定して、上記システムと接触させた細胞の集団中、１回挿入のコピー数で、約１〜８０％の細胞、例えば、約１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、又は７０〜８０％の細胞内の標的部位に、上記異種目的配列の挿入を達成する、いずれかの先行する番号の方法。
【０１３５】
１３０．細胞の集団内の非標的部位への挿入（オフターゲット挿入）より高い割合で標的部位への異種目的配列の挿入（オンターゲット挿入）を達成し、その際、例えば、実施例１１のアッセイを用いて、オンターゲット挿入とオフターゲット挿入の比が、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、５００：１、若しくは１，０００：１より大きい、いずれかの先行する番号の方法。
【０１３６】
１３１．ＤＮＡ修復経路の阻害剤（例えば、ＳＣＲ７、ＰＡＲＰ阻害剤）の存在下、又はＤＮＡ修復経路が欠損した細胞株（例えば、ヌクレオチド除去修復経路若しくは相同組み換え修復経路が欠損した細胞株）において、異種目的配列の挿入を達成する、いずれかの先行する番号の方法。
【０１３７】
１３２．医薬組成物として製剤化される、先行する番号のいずれかのシステム。
【０１３８】
１３３．薬学的に許容される担体（例えば、小胞、リポソーム、天然若しくは合成脂質二重層、脂質ナノ粒子、エキソソーム）中に導入される、いずれかの先行する番号のシステム。
【０１３９】
１３４．哺乳動物細胞のゲノムを改変するシステムを作製する方法であって、以下：
ａ）例えば、鋳型ＲＮＡが、（ｉ）逆転写酵素ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを含むポリペプチドに結合する配列、及び（ｉｉ）異種目的配列を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡを提供するステップ；
ｂ）鋳型ＲＮＡを処理して、二次構造を制限するステップ、例えば、鋳型ＲＮＡを例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、若しくは９５℃まで加熱するステップ、並びに
ｃ）続いて、鋳型ＲＮＡを、例えば、二次構造を可能にする温度まで、例えば、３０、２５、若しくは２０℃以下まで冷却するステップ
を含む方法。
【０１４０】
１３５．上記鋳型ＲＮＡを、（ｉ）逆転写酵素ドメイン及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含むポリペプチド、又は上記ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ）と接触させるステップをさらに含む、実施形態１３４に記載の方法。
【０１４１】
１３６．上記鋳型ＲＮＡを細胞と接触させるステップをさらに含む、実施形態１３４又は１３５に記載の方法。
【０１４２】
１３７．上記異種目的配列が、治療ポリペプチドをコードする、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１４３】
１３８．上記異種目的配列が、哺乳動物（例えば、ヒト）ポリペプチド、又はその断片若しくは変異体をコードする、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１４４】
１３９．上記異種目的配列が、タンパク質、例えば、酵素（例えば、リソソーム酵素）、血液因子（例えば、第Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ若しくはＸＩＩＩ因子）、膜タンパク質、エキソン、細胞内タンパク質（例えば、細胞質タンパク質、核タンパク質、ミトコンドリアタンパク質若しくはリソソームタンパク質などのオルガネラタンパク質）、細胞外タンパク質、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、センサータンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、又は貯蔵タンパク質をコードする、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１４５】
１４０．上記異種目的配列が、組織特異的プロモータ又はエンハンサーを含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１４６】
１４１．上記異種目的配列が、２５０、３００、４００、５００、若しくは１，０００超のアミノ酸、任意選択で最大１３００アミノ酸のポリペプチドをコードする、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１４７】
１４２．上記異種目的配列が、哺乳動物遺伝子の断片をコードするが、全哺乳動物遺伝子はコードせず、例えば、１つ若しくは複数のエキソンをコードするが、完全長タンパク質はコードしない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１４８】
１４３．上記異種目的配列が、１つ若しくは複数のイントロンをコードする、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１４９】
１４４．上記異種目的配列が、ＧＦＰ以外であり、例えば、蛍光タンパク質以外であるか、又はリポータタンパク質以外である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１５０】
１４５．上記ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、（ｉ）若しくは（ｉｉ）の一方又は両方が、鳥レトロトランスポザーゼに由来し、例えば、表２若しくは３の配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１５１】
１４６．上記ポリペプチドが、３７℃で、それ以外は同様の条件下での２５℃のその活性の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の活性を有する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１５２】
１４７．上記ポリペプチドをコードする核酸と、上記鋳型ＲＮＡ若しくは鋳型ＲＮＡをコードする核酸が、個別の核酸である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１５３】
１４８．上記鋳型ＲＮＡが、活性逆転写酵素をコードせず、例えば、実施例１若しくは２に記載されるように、不活性化変異型逆転写酵素を含むか、又は逆転写酵素配列を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１５４】
１４９．上記鋳型ＲＮＡが、１つ若しくは複数の化学修飾を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１５５】
１５０．上記異種目的配列が、プロモータと、上記ポリペプチドに結合する配列との間に位置する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１５６】
１５１．上記プロモータが、上記異種目的配列と、上記ポリペプチドに結合する配列との間に位置する、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１５７】
１５２．上記異種目的配列が、上記鋳型ＲＮＡ上に５’から３’方向でオープンリーディングフレーム（若しくはその逆相補鎖）を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１５８】
１５３．上記異種目的配列が、上記鋳型ＲＮＡ上に３’から５’方向でオープンリーディングフレーム（若しくはその逆相補鎖）を含む、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１５９】
１５４．上記ポリペプチドが、（ａ）逆転写酵素ドメインと、（ｂ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、（ａ）又は（ｂ）の少なくとも一方が異種である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１６０】
１５５．上記ポリペプチドが、（ａ）標的ＤＮＡ結合ドメインと、（ｂ）逆転写酵素ドメインと、（ｃ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが異種である、先行する実施形態のいずれかに記載のシステム又は方法。
【０１６１】
１５６．（ａ）逆転写酵素ドメインと、（ｂ）異種エンドヌクレアーゼドメインとを含む、実質的に純粋なポリペプチド。
【０１６２】
１５７．（ａ）標的ＤＮＡ結合ドメインと、（ｂ）逆転写酵素ドメインと、（ｃ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが異種である、実質的に純粋なポリペプチド。
【０１６３】
１５８．（ａ）逆転写酵素ドメインと、（ｂ）エンドヌクレアーゼドメインと、（ｃ）異種標的ＤＮＡ結合ドメインとを含む、実質的に純粋なポリペプチド。
【０１６４】
１５９．ポリペプチド又は上記ポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペプチドが、（ａ）逆転写酵素ドメインと、（ｂ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、（ａ）又は（ｂ）の少なくとも一方が他方に対して異種である、ポリペプチド又は上記ポリペプチドをコードする核酸。
【０１６５】
１６０．上記ポリペプチドが、（ａ）標的ＤＮＡ結合ドメインと、（ｂ）逆転写酵素ドメインと、（ｃ）エンドヌクレアーゼドメインとを含み、ここで、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の少なくとも１つが他方に対して異種である、ポリペプチド又は上記ポリペプチドをコードする核酸。
【０１６６】
１６１．上記逆転写酵素ドメインが、表１〜３のいずれかに列記されるＡＰＥ型又はＲＬＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインと少なくとも８０％同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一性）を有する、実施形態１５６〜１６０に記載のいずれかのポリペプチド。
【０１６７】
１６２．上記エンドヌクレアーゼドメインが、表１〜３のいずれかに列記されるＡＰＥ型又はＲＬＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインと少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一性を有する、実施形態１５６〜１６１に記載のいずれかのポリペプチド。
【０１６８】
１６３．上記ＤＮＡ結合ドメインが、表１、２、若しくは３のいずれかに列記される配列のＤＮＡ結合ドメインと少なくとも８０％同一性、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一性を有する、実施形態１５６〜１６２に記載のいずれかのポリペプチド又はいずれかの先行する番号の方法。
【０１６９】
１６４．いずれかの先行する番号の実施形態に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【０１７０】
１６５．実施形態１６４に記載の核酸を含むベクター。
【０１７１】
１６６．実施形態１６４に記載の核酸を含む宿主細胞。
【０１７２】
１６７．いずれかの先行する番号の実施形態に記載のポリペプチドを含む宿主細胞。
【０１７３】
１６８．実施形態１６５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【０１７４】
１６９．以下：（ｉ）染色体内の標的部位に異種目的配列（例えば、治療ポリペプチドをコードする配列）、並びに（ｉｉ）上記異種目的配列の片側（例えば、上流）の非翻訳領域（例えば、レトロトランスポゾン非翻訳配列、例えば、表３、第６列の配列）、及び上記異種目的配列の反対側（例えば、下流）の非翻訳領域（例えば、レトロトランスポゾン非翻訳配列、例えば、表３、第７列の配列）の１つ又は両方を含む、宿主細胞（例えば、ヒト細胞）。
【０１７５】
１７０．以下：（ｉ）染色体内の標的部位に異種目的配列（例えば、治療ポリペプチドをコードする配列）を含み、ここで、標的遺伝子座が、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位、例えば、本明細書の表４の部位である、宿主細胞（例えば、ヒト細胞）。
【０１７６】
１７１．以下：（ｉｉ）上記異種目的配列の５’側非翻訳領域、及び上記異種目的配列の３’側非翻訳領域の一方又は両方をさらに含む、実施形態１７０に記載の宿主細胞。
【０１７７】
１７２．以下：（ｉｉ）上記異種目的配列の片側（例えば、上流）の非翻訳領域（例えば、レトロトランスポゾン非翻訳配列、例えば、表３、第６列の配列）、及び上記異種目的配列の反対側（例えば、下流）の非翻訳領域（例えば、レトロトランスポゾン非翻訳領域、例えば、表３、第７列の配列）の一方又は両方をさらに含む、実施形態１７０に記載の宿主細胞。
【０１７８】
１７３．上記標的部位だけに異種目的配列を含む、実施形態１６９〜１７３のいずれかに記載の宿主細胞。
【０１７９】
１７４．いずれかの先行する番号のシステム、核酸、ポリペプチド、又はベクター；及び薬学的に許容される賦形剤若しくは担体を含む医薬組成物。
【０１８０】
１７５．上記薬学的に許容される賦形剤若しくは担体が、ベクター（例えば、ウイルス若しくはプラスミドベクター）、小胞（例えば、リポソーム、エキソソーム、天然若しくは合成脂質二重層）、脂質ナノ粒子から選択される、実施形態１７４に記載の医薬組成物。
【０１８１】
１７６．上記ポリペプチドが、核局在化配列をさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載のポリペプチド。
【０１８２】
１７７．細胞、組織又は被験者における標的ＤＮＡ鎖を修飾する方法であって、上記細胞、組織又は被験者に、いずれかの先行する番号のシステムを投与し、それによって標的ＤＮＡ鎖を修飾するステップを含む方法。
【０１８３】
１７８．上記ポリペプチドが、表５に列記されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１０１７〜１０２２のいずれか１つ）、又はその機能性断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０１８４】
１７９．上記逆転写酵素ドメインが、表５に列記されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１０１７〜１０２２のいずれか１つ）、又はその機能性断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０１８５】
１８０．上記レトロトランスポザーゼが、表５に列記されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１０１７〜１０２２のいずれか１つ）、又はその機能性断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０１８６】
１８１．上記ポリペプチドが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０１８７】
１８２．上記逆転写酵素ドメインが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０１８８】
１８３．上記レトロトランスポザーゼが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０１８９】
１８４．上記ポリペプチド、逆転写酵素ドメイン、又はレトロトランスポザーゼが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むリンカーを含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０１９０】
１８５．上記ポリペプチドが、リンカー、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、３００、４００、又は５００アミノ酸を含むリンカーによって上記ポリペプチドの残りと共有結合したＤＮＡ結合ドメインを含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０１９１】
１８６．上記リンカーが、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、又はエンドヌクレアーゼドメイン内の或る位置（例えば、図１７Ａ〜１７Ｆのいずれかに示す通り）で上記ポリペプチドの残りと結合される、実施形態１８５。
【０１９２】
１８７．上記リンカーが、上記ポリペプチドのαヘリックス領域のＮ末端側の或る位置、例えば、実施例２６に記載のようなバージョンｖ１に対応する位置で上記ポリペプチドの残りと結合される、実施形態１８５又は１８６。
【０１９３】
１８８．上記リンカーが、例えば、ＲＮＡ結合モチーフ（例えば、ａ−１ＲＮＡ結合モチーフ）の前に来る、上記ポリペプチドのαヘリックス領域のＣ末端側の或る位置、例えば、実施例２６に記載のようなバージョンｖ２に対応する位置で上記ポリペプチドの残りと結合される、実施形態番号１８５又は１８６。
【０１９４】
１８９．上記リンカーが、上記ポリペプチドのランダムコイル領域のＣ末端側、例えば、ＤＮＡ結合モチーフ（例えば、ｃ−ｍｙｂＤＮＡ結合モチーフ）に対してＮ末端の或る位置、例えば、実施例２６に記載のようなバージョンｖ３に対応する位置で上記ポリペプチドの残りと結合される、実施形態１８５又は１８６。
【０１９５】
１９０．上記リンカーが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）又はＧＧＧＳ（配列番号１０２４）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１８５〜１８９のいずれか１つ。
【０１９６】
１９１．上記鋳型ＲＮＡ配列の５’末端から少なくとも約５００、１０００、２０００、３０００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、又は４０００の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列が、標的細胞ゲノムに組み込まれる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０１９７】
１９２．上記鋳型ＲＮＡ配列の３’末端から少なくとも約５００、１０００、２０００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、又は３０００の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列が、標的細胞ゲノムに組み込まれる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０１９８】
１９３．上記鋳型ＲＮＡの核酸配列、又はその部分（例えば、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、３５００、若しくは４０００ヌクレオチドを含む部分）が、少なくとも約０．２１、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、若しくは１．０組込み体／ゲノムのコピー数で標的細胞の集団の上記ゲノムに組み込まれる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０１９９】
１９４．上記鋳型ＲＮＡの核酸配列、又はその部分（例えば、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、３５００、若しくは４０００ヌクレオチドを含む部分）が、少なくとも約０．０８５、０．０９、０．１、０．１５、若しくは０．２組込み体／ゲノムのコピー数で標的細胞の集団の上記ゲノムに組み込まれる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２００】
１９５．上記鋳型ＲＮＡの核酸配列、又はその部分（例えば、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、３５００、若しくは４０００ヌクレオチドを含む部分）が、少なくとも約０．０３６、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、若しくは０．０８組込み体／ゲノムのコピー数で標的細胞の集団の上記ゲノム中に組み込まれる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２０１】
１９６．上記ポリペプチドが、機能性エンドヌクレアーゼドメインを含む（例えば、上記エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、本明細書に記載されるように、エンドヌクレアーゼ活性を無効化する突然変異を含まない）、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２０２】
１９７．上記ポリペプチドが、ミディアムグランドフィンチ、例えば、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ  ｆｏｒｔｉｓ）由来のＲ２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の通り、例えば、Ｒ２−１＿ＧＦｏ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能性断片を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２０３】
１９８．上記逆転写酵素ドメインが、ミディアムグランドフィンチ、例えば、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ  ｆｏｒｔｉｓ）由来のＲ２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の通り、例えば、Ｒ２−１＿ＧＦｏ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能性断片を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２０４】
１９９．上記レトロトランスポザーゼが、ミディアムグランドフィンチ、例えば、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ  ｆｏｒｔｉｓ）由来のＲ２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の通り、例えば、Ｒ２−１＿ＧＦｏ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能性断片を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２０５】
２００．上記鋳型ＲＮＡの核酸配列、又はその部分（例えば、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、３５００、若しくは４０００ヌクレオチドを含む部分）が、少なくとも約０．２１組込み体／ゲノムのコピー数で標的細胞の集団の上記ゲノムに組み込まれる、実施形態１９７〜１９９のいずれか１つ。
【０２０６】
２０１．上記ポリペプチドが、大型回虫、例えば、カイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）由来のＲ４ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の通り、例えば、Ｒ４＿ＡＬ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能性断片を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２０７】
２０２．上記逆転写酵素ドメインが、大型回虫、例えば、カイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）由来のＲ４ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の通り、例えば、Ｒ４＿ＡＬ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能性断片を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２０８】
２０３．上記レトロトランスポザーゼが、大型回虫、例えば、カイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）由来のＲ４ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の通り、例えば、Ｒ４＿ＡＬ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能性断片を含む、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２０９】
２０４．上記鋳型ＲＮＡの核酸配列、又はその部分（例えば、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、３５００、若しくは４０００ヌクレオチドを含む部分）が、少なくとも約０．０８５組込み体／ゲノムのコピー数で標的細胞の集団の上記ゲノム中に組み込まれる、実施形態２０１〜２０３のいずれか１つ。
【０２１０】
２０５．標的細胞への上記システムの導入によって、ｐ５３及び／又はｐ２１タンパク質レベル、Ｈ２ＡＸリン酸化（例えば、γＨ２ＡＸ）、ＡＴＭリン酸化、ＡＴＲリン酸化、Ｃｈｋ１リン酸化、Ｃｈｋ２リン酸化、及び／又はｐ５３リン酸化の改変（例えば、上方制御）が起こらない、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２１１】
２０６．標的細胞への上記システムの導入によって、前記システムと同じゲノム部位をターゲティングする部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９の導入により誘導されるｐ５３タンパク質レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％未満のレベルまで、上記標的細胞中のｐ５３タンパク質レベルの上方制御が起こる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２１２】
２０７．上記ｐ５３タンパク質レベルが、実施例３０に記載の方法に従って決定される、実施形態２０５又は２０６。
【０２１３】
２０８．標的細胞への上記システムの導入によって、前記システムと同じゲノム部位をターゲティングする部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９の導入により誘導されるｐ５３リン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％未満のレベルまで、上記標的細胞ゲノム中のｐ５３リン酸化レベルの上方制御が起こる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２１４】
２０９．標的細胞への上記システムの導入によって、前記システムと同じゲノム部位をターゲティングする部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９の導入により誘導されるｐ５３タンパク質レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％未満のレベルまで、上記標的細胞ゲノム中のｐ２１タンパク質レベルの上方制御が起こる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２１５】
２１０．上記ｐ２１タンパク質レベルが、実施例３０に記載の方法に従って決定される、実施形態２０５又は２０９。
【０２１６】
２１１．標的細胞への上記システムの導入によって、前記システムと同じゲノム部位をターゲティングする部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９の導入により誘導されるＨ２ＡＸリン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％未満のレベルまで、上記標的細胞ゲノム中のＨ２ＡＸリン酸化レベルの上方制御が起こる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２１７】
２１２．標的細胞への上記システムの導入によって、前記システムと同じゲノム部位をターゲティングする部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９の導入により誘導されるＡＴＭリン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％未満のレベルまで、上記標的細胞ゲノム中のＡＴＭリン酸化レベルの上方制御が起こる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２１８】
２１３．標的細胞への上記システムの導入によって、前記システムと同じゲノム部位をターゲティングする部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９の導入により誘導されるＡＴＲリン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％未満のレベルまで、上記標的細胞ゲノム中のＡＴＲリン酸化レベルの上方制御が起こる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２１９】
２１４．標的細胞への上記システムの導入によって、前記システムと同じゲノム部位をターゲティングする部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９の導入により誘導されるＣｈｋ１リン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％未満のレベルまで、上記標的細胞ゲノム中のＣｈｋ１リン酸化レベルの上方制御が起こる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２２０】
２１５．標的細胞への上記システムの導入によって、前記システムと同じゲノム部位をターゲティングする部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９の導入により誘導されるＣｈｋ２リン酸化レベルの約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％未満のレベルまで、上記標的細胞ゲノム中のＣｈｋ２リン酸化レベルの上方制御が起こる、いずれかの先行する番号の実施形態。
【０２２１】
定義
ドメイン：本明細書で使用される用語「ドメイン」は、生体分子の特定の機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインは、生体分子の連続領域（例えば、連続配列）又は個別の非連続領域（例えば、非連続配列）を含み得る。タンパク質ドメインの例として、限定されないが、エンドヌクレアーゼドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメインが挙げられ；核酸のドメインの一例は、調節ドメイン、例えば、転写因子結合ドメインである。
【０２２２】
外性：本明細書で使用されるように、用語「外性」とは、生体分子（例えば、核酸配列又はポリペプチドなど）に関して用いられる場合、生体分子が、人為的に、宿主ゲノム、細胞若しくは生物に導入されたことを意味する。例えば、組換えＤＮＡ技術又はその他の方法を用いて、既存のゲノム、細胞、組織若しくは被験者に付加される核酸は、既存の核酸配列、細胞、組織若しくは被験者に対して外性である。
【０２２３】
ゲノムセーフハーバー部位（ＧＳＨ部位）：ゲノムセーフハーバー部位は、例えば、挿入された遺伝因子が、宿主細胞若しくは生物にリスクをもたらす宿主ゲノムの有意な改変を引き起こさないように、新たな遺伝物質の組込みを収容することができる宿主ゲノム内の部位である。ＧＳＨ部位は、概して、以下の基準の１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９を満たす：（ｉ）癌関連遺伝子から＞３００ｋｂに位置する；（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ／その他の機能性低分子ＲＮＡから＞３００ｋｂに位置する；（ｉｉｉ）５’遺伝子末端から＞５０ｋｂに位置する；（ｉｖ）複製起点から＞５０ｋｂに位置する；（ｖ）超保存エレメントから＞５０ｋｂ離れている；（ｖｉ）低転写活性を有する（即ち、ｍＲＮＡ＋／−２５ｋｂがない）；（ｖｉｉ）コピー数可変領域内ではない；（ｖｉｉｉ）オープンクロマチン内である；及び／又は（ｉｘ）ヒトゲノム内に１コピーを有し、ユニークである。これらの基準のいくつか又は全部を満たすヒトゲノム内のＧＳＨ部位の例として、以下のものが挙げられる：（ｉ）アデノウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、１９番染色体上のＡＡＶウイルスの天然に存在する組込み部位；（ｉｉ）ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、ＨＩＶ−１共受容体として知られるケモカイン受容体遺伝子；（ｉｉｉ）マウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオーソログ；（ｉｖ）ｒＤＮＡ遺伝子座。さらに別のＧＳＨ部位が知られており、例えば、Ｐｅｌｌｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．ｅｐｕｂ  Ａｕｇｕｓｔ  ２０，２０１８（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／３９６３９０）に記載されている。
【０２２４】
異種：用語「異種」は、第２の要素に関して第１の要素を表すために使用される場合、第１の要素と第２の要素が、記載されるような配置で天然に存在しないことを意味する。例えば、異種ポリペプチド、核酸分子、構築物若しくは配列は、（ａ）それが発現される細胞に対してネイティブではないポリペプチド、核酸分子、又はポリペプチド若しくは核酸分子配列の部分、（ｂ）その天然の状態に対して改変若しくは突然変異したポリペプチド若しくは核酸分子又はポリペプチド若しくは核酸分子の部分、或いは（ｃ）類似の条件下でのネイティブ発現レベルと比較して改変された発現を有するポリペプチド又は核酸分子を指す。例えば、異種調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）を用いて、遺伝子又は核酸分子が天然に通常発現されるものとは異なる様式で、遺伝子又は核酸分子の発現を調節することができる。別の例では、ポリペプチド又は核酸配列の異種ドメイン（例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメイン又はポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸）を他のドメインに対して配置してもよいし、或いはそれが、ポリペプチドの他のドメイン若しくは部分又はそのコード核酸に対して、異なる配列であるか、又は異なる起源由来であってもよい。特定の実施形態では、異種核酸分子は、天然の宿主細胞ゲノム内に存在し得るが、改変された発現レベル若しくは異なる配列を有するか、又はその両方であり得る。他の実施形態では、異種核酸分子は、宿主細胞又は宿主ゲノムに内在性ではなくてもよいが、その代わりに、形質転換（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション）により宿主細胞に導入されていてもよく、ここで、付加される分子は、宿主ゲノムに組み込まれ得るか、又は一過性（例えば、ｍＲＮＡ）若しくは２世代以上にわたって半安定的（例えば、エピソームウイルスベクター、プラスミド若しくは他の自己複製ベクター）のいずれかで染色体外遺伝材料として存在することができる。
【０２２５】
突然変異又は突然変異型：用語「（突然）変異型」は、核酸配列に適用されるとき、核酸配列内のヌクレオチドが、参照（例えば、天然）核酸配列に比して、挿入、欠失若しくは変更されている可能性があることを意味する。単一の改変が１遺伝子座で為される（点変異）、又は単一遺伝子座で複数のヌクレオチドが挿入、欠失若しくは変更される場合もある。加えて、１核酸配列内の任意の数の遺伝子座で、１つ若しくは複数の改変が為される場合もある。核酸配列は、当技術分野で公知の任意の方法によって突然変異させることができる。
【０２２６】
核酸分子：核酸分子は、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の両方を指し、限定しないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡが挙げられ、本明細書に記載される通り、ＲＮＡ鋳型のように、化学的に合成される又は組換えにより生成されるものなどの合成核酸分子も含む。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖、環状若しくは線状であってよい。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖であってよい。別に記載のない限り、また、一般フォーマット「配列番号」として本明細書に記載される全ての配列の例として、「配列番号１」を含む核酸は、少なくともその一部が、（ｉ）配列番号１の配列、又は（ｉｉ）配列番号１と相補的な配列のどちらかを有する核酸を指す。２つのどちらを選択するかは、配列番号１が使用される状況によって決定される。例えば、核酸がプローブとして使用される場合には、２つの間の選択は、プローブが、所望の標的と相補的であるという要件によって決定される。本開示の核酸配列は、当業者には容易に理解されるように、化学的若しくは生化学的に修飾されてもよいし、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有してもよい。こうした修飾として、例えば、標識、メチル化、類似体による１つ若しくは複数の自然発生的なヌクレオチドの置換、無電荷結合（例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、カルバミン酸塩など）、電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などのヌクレオチド間修飾、ペンダント部分、（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾結合（例えば、α−アノマー核酸など）が挙げられる。また、水素結合及びその他の化学的相互作用により指定配列と結合する能力についてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。こうした分子は、当技術分野において公知であり、例えば、分子の骨格中のリン酸結合の代わりにペプチド結合を使用するものがある。他の修飾として、例えば、リボース環が、架橋部分又は「ロックド」核酸に見いだされる修飾などの他の構造を含む類似体を挙げることができる。
【０２２７】
遺伝子発現単位：遺伝子発現単位は、少なくとも１つのエフェクター配列に作動可能に連結された少なくとも１つの調節核酸配列を含む核酸配列である。第１の核酸配列は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的に関連して配置されるとき、第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモータ又はエンハンサーは、プロモータ又はエンハンサーが、コード配列の転写若しくは発現に影響を及ぼす場合、コード配列と作動可能に連結している。作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連続的又は非連続であり得る。２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、作動可能に連結した配列が同じリーディングフレーム内に存在してもよい。
【０２２８】
宿主：宿主ゲノム又は宿主細胞という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質及び／又は遺伝材料が導入された細胞及び／又はそのゲノムを指す。こうした用語は、特定の被験者細胞及び／又はゲノムだけではなく、そのような細胞の子孫及び／又はそのような細胞の子孫のゲノムも指す。特定の修飾は、突然変異又は環境の影響により後の世代に起こり得ることから、こうした子孫は、実際、親細胞と同一ではない場合もあるが、やはり本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲に含まれることを理解されたい。宿主ゲノム又は宿主細胞は、単離された細胞若しくは培養で増殖した細胞株、又はそうした細胞若しくは細胞株から単離されたゲノム物質であってもよいし、或いは生体組織若しくは生物を構成する宿主細胞又は宿主ゲノムであってもよい。いくつかの事例では、宿主細胞は、例えば、本明細書で記載されるように、動物細胞又は植物細胞であってよい。特定の例では、宿主細胞は、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、ニワトリ細胞、又はシチメンチョウ細胞であり得る。特定の例では、宿主細胞は、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、コムギ細胞、又はコメ細胞であり得る。
【０２２９】
シュードノット：「シュードノット配列」は、本明細書で使用される場合、シュードノット構造を形成するのに好適な自己相補性を備えた配列を有する、例えば、第１セグメント、第１セグメントと第３セグメントの間の第２セグメント（第３セグメントは、第１セグメントと相補的である）、及び第４セグメント（第４セグメントは、第２セグメントと相補的である）を有する核酸（例えば、ＲＮＡ）を指す。シュードノットは、任意選択で、さらに別の二次構造、例えば、第２セグメント内に位置するステムループ、第２セグメントと第３セグメントの間に位置するステムループ、第１セグメントの前の配列、又は第４セグメントの後ろの配列を有し得る。シュードノットは、第１及び第２セグメント間、第２及び第３セグメント間、又は第３及び第４セグメント間に別の配列を有し得る。一部の実施形態では、セグメントは、５’から３’に：第１、第２、第３、及び第４と配置される。一部の実施形態では、第１及び第３セグメントは、完全な相補性の５つの塩基対を含む。一部の実施形態では、第２及び第４セグメントは、１０塩基対を含み、任意選択で、１つ若しくは複数（例えば、２つ）のバルジを伴う。一部の実施形態では、第２セグメントは、例えば、ループを形成する１つ若しくは複数の不対ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第３セグメントは、例えば、ループを形成する１つ若しくは複数の不対ヌクレオチドを含む。
【０２３０】
ステムループ配列：本明細書で使用される場合、「ステムループ配列」は、ステムループ、例えば、少なくとも２つ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０）の塩基対を含むステムと、少なくとも３つ（例えば、４つ）の塩基対を含むループとを有する）を形成するのに十分な自己相補性を備える核酸配列（例えば、ＲＮＡ配列）を指す。ステムは、ミスマッチ又はバルジを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集システムの概略図である。
【図２】Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターポリペプチドの構造の概略図である。
【図３】ゲノムの異なる部位をターゲティングするように設計された異種ＤＮＡ結合ドメインを含むＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターポリペプチドの概略図である。
【図４】Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディター鋳型ＲＮＡの構造の概略図である。
【図５】ゲノム内のセーフハーバー部位に遺伝子発現単位を付加するためのＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集システムを示す概略図である。
【図６】ゲノム内の特定のイントロンに新たなエキソンを付加して、下流エキソンを置換するためのＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集を示す概略図である。
【図７】Ｍｉｓｅｑライブラリー構築の概略図を示す。（１）外部フォワードプライマー及びテール付き内部リバースプライマー、続いて（２）テール付き内部フォワードプライマー及びテールリバースプライマーを用いて、Ｒ２Ｔｇ−ｒＤＮＡ接合部にわたりネステッドＰＣＲを実施した。内部リバースプライマーは、１〜４塩基スタッガー、８ヌクレオチドランダム化ＵＭＩ、及びマルチプレックス化バーコードを含有する。ＵＭＩは、個別の増幅事象の計数が、ＰＣＲバイアスを排除することを可能にする。
【図８】Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞へのＤＮＡ媒介Ｒ２Ｔｇ組込みのＭｉｓｅｑ及びＭａｔｌａｂ解析の結果を示す。各グラフは、（図８Ａ）実験Ｒ２Ｔｇ（図８Ｂ）及び１ｂｐ欠失陰性対照の分析を示す。ｙ軸は、Ｍａｔｌａｂを介して見いだされたユニークＵＭＩにより決定されるユニーク配列のアラインメント数を示す。Ｘ軸は、配列カバレッジの配列位置を示す。グラフ左側の縦方向の灰色の直線は、フォワードプライマーの位置を示し、グラフ右側の縦方向の灰色の直線は、予想されるＴｇ−ｒＤＮＡ接合部位を示す。グラフ右端のバーは、切断のない挿入を示し、グラフ左端のバーは、切断を示す。図８Ａは、ほとんどの配列が、予想される組込み産物との高度のアラインメントを示すことを明らかにしている。
【図９】トランスフェクション条件間のヒト細胞中のＲ２Ｔｇ−ｒＤＮＡ接合のコピー数変化のｄｄＰＣＲ評価を示す。フォワードプライマー及びプローブは、Ｒ２Ｔｇの３’ＵＴＲと結合することが予想されたが、リバースプライマーは、ヒトｒＤＮＡにターゲティングされた。得られたｄｄＰＣＲシグナルを参照アッセイＲＰＰ３０のそれに対して正規化して、コピー数を決定した。１−ｂｐ欠失により翻訳を改変した遺伝子対照（フレームシフト変異体対照、右側の一連のバー）と比較して、野生型（ＷＴ、左側の一連のバー）Ｒ２Ｔｇで、有意に高いゲノム当たりの平均コピー数が認められた。
【図１０】実施例７からのネステッドＰＣＲ産物をクローニングするＴＯＰＯの配列アラインメント及びカバレッジを示す。グラフ右端の灰色のバーは、予想されるトランスジーン−ｒＤＮＡ接合を示す。ほとんどの配列は、予想される組込み産物との高度のアラインメントを示す。
【図１１】例示的な鋳型ＲＮＡの概略図である。これは、中心にペイロードドメイン（例えば、異種目的配列、例えば、プロモータ及びタンパク質コーディング配列を含む）を含む。ペイロードドメインは、５’及び３’タンパク質相互作用ドメイン、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドに結合することができる配列、例えば、表３に示す５’及び３’ＵＴＲ配列にフランキングされている。タンパク質相互作用ドメインとフランキングするのは、５’及び３’相同性ドメインであり、これらは、当該ゲノム内の所望の挿入領域との相同性を有する。
【図１２】様々なトランスフェクション条件を用いるｄｄＰＣＲ（デジタルドロップレットＰＣＲ）により測定したレトロ転位効率を示すグラフである。バーＡ〜Ｃは、それぞれ１００ｎｇ、２５０ｎｇ、又は５００ｎｇを含み、０．１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸを用いてトランスフェクトしたサンプルを示す。バーＤ〜Ｆは、それぞれ１００ｎｇ、２５０ｎｇ、又は５００ｎｇを含み、０．３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸを用いてトランスフェクトしたサンプルを示す。バーＧ〜Ｉは、それぞれ１００ｎｇ、２５０ｎｇ、又は５００ｎｇを含み、１μｌのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｍＲＮＡトランスフェクションキットを用いてトランスフェクトしたサンプルを示す。
【図１３】ｔｒａｎｓ−トランスジーン送達機構の概略図である。この概略図は、ｐＣＥＰ４骨格を有するドライバープラスミド（左側）を示し、これは、逆転写酵素Ｒ２Ｔｇをコードし、上流にプロモータ及びＫｏｚａｋ配列を、下流にポリアデニル化シグナルを備える。ドライバープラスミドは、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質の発現を駆動することができる。ｐＣＤＮＡ骨格を有するトランスジーンプラスミド（右側）は、（順に）ＣＭＶプロモータ、ｒＤＮＡ相同性配列、５’ＵＴＲ、アンチセンス配向挿入片、３’ＵＴＲ、第２ｒＤＮＡ相同性配列、第２ポリアデニル化シグナル、及びｍＫａｔｅ２マーカを駆動するＴＫプロモータを含む。アンチセンス−配向挿入片は、ＥＦ１αプロモータ、イントロンを含むＥＧＦＰのコーディング領域、及びポリアデニル化シグナルを含む。トラジーンプラスミド中のＣＭＶプロモータを使用すると、ｒＤＮＡ相同性領域、ＵＴＲ、及びアンチセンス−配向挿入片を含む鋳型ＲＮＡの発現を駆動する。
【図１４】トランスフェクション条件でのヒト細胞中のトランスジーン−ｒＤＮＡ接合のコピー数変化についてのｄｄＰＣＲ評価を示す。フォワードプライマー及びプローブは、Ｒ２Ｔｇの３’ＵＴＲに結合するように設計され、リバースプライマーは、ヒトｒＤＮＡにターゲティングさせた。得られたｄｄＰＣＲシグナルを、参照アッセイＲＰＰ３０のそれに対して正規化して、コピー数を決定した。Ｒ２Ｔｇ配列を伴わない骨格構築物と比較して野生型（ＷＴ）Ｒ２Ｔｇで、有意に高いゲノム当たりの平均コピー数が認められた。条件１は、９：１のドライバープラスミド：トランスジーンプラスミドモル比を示し；条件２は、４：１のモル比を示し、条件３は、１：１のモル比を示し、条件４は、１：４のモル比を示し、条件５は、１：９のモル比を示す。
【図１５】図１５Ａ：Ｒ２Ｔｇのハイブリッドキャプチャーは、ヒトゲノム中のオンターゲット組込みを同定した。Ｒ２リボソーム部位中の予想標的組込みとアラインメントされるリードカバレッジをｙ軸に示す。ｒＤＮＡとＲ２Ｔｇの間の５’接合部を左側の縦線で示し、３’接合部を右側の縦線で示す。次世代シーケンシングが、予想される接合部にわたるリードを同定する。図１５Ｂは、この実験から、組込み配列の５’末端及び３’末端でのオンターゲット組込み又はオフターゲット組込みとして分類されるリードの数を示す。
【図１６】３’接合部ネステッドＰＣＲのサンガーシーケンシング結果を示す。小文字のヌクレオチドは、設計されたＳＮＰを表す。影を付けた大文字のヌクレオチドは、ＷＴ配列を表す。図１６には、配列番号１５３８を開示する。
【図１７】様々な共有結合二量体化ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ立体配置を描く概略図である。描かれるタンパク質は、以下の通りである：図１７Ａ：野生型完全長酵素。図１７Ｂ：リンカーにより連結された２つの完全長酵素（各々、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む）。図１７Ｃ：リンカーにより、完全長酵素に連結されたＤＮＡ結合ドメイン及びＲＮＡ結合ドメイン。図１７Ｄ：リンカーにより、ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインに連結されたＤＮＡ結合ドメイン及びＲＮＡ結合ドメイン。図１７Ｅ：第１リンカーによりＲＮＡ結合ドメインに連結されたＤＮＡ結合ドメインであり、このＲＮＡ結合ドメインは、第２リンカーにより第２ＲＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインに連結されている。図１７Ｆ：第１リンカーによりＲＮＡ結合ドメインに連結されたＤＮＡ結合ドメインであり、このＲＮＡ結合ドメインは、第２リンカーにより複数のＲＮＡ結合ドメイン（この図では、該分子は、３つのＲＮＡ結合ドメインを含む）に連結され、これらは、リンカーにより逆転写酵素ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインに連結されている。一部の実施形態では、各Ｒ２は、鋳型ＲＮＡ中のＵＴＲに結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つの分子は、逆転写酵素ドメインとエンドヌクレアーゼドメインを含む。一部の実施形態では、タンパク質は、複数のＲＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、モジュラーシステムは分割されて、それがＤＮＡに結合するときだけ活性になり、ここで、該システムは、２つの異なるＤＮＡ結合モジュール、例えば、標的プライム逆転写のためのＲＮＡ鋳型を動員するＲＮＡ結合モジュールに融合された第１ＤＮＡ結合モジュールを含む第１タンパク質と、組込み部位に結合し、且つ逆転写及びエンドヌクレアーゼモジュールに融合された第２ＤＮＡ結合モジュールを含む第２タンパク質を使用する。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒをコードする核酸は、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質が、２つの個別の遺伝子から発現され、しかも、翻訳された後にタンパク質スプライシングにより融合されるように、インテインを含む。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、非ＬＴＲタンパク質、例えば、Ｒ２タンパク質に由来する。
【図１８】ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質の異なるモジュラー要素を示す概略図である。描かれるタンパク質は、次の通りである：図１８Ａ：野生型完全長酵素。図１８Ｂ：ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー、Ｃａｓ９、又は転写因子、又はそれらのいずれかの断片若しくは変異体を含み得る。図１８Ｃ：逆転写酵素ドメイン及びＲＮＡ結合ドメインは一緒に、タンパク質の１つ若しくは複数の他のドメインに対して異種である逆転写酵素ドメイン（例えば、Ｒ２タンパク質由来）を含んでよく、また、任意選択で、１つ若しくは複数の追加ＲＮＡ結合ドメイン、又はそれらのいずれかの断片若しくは変異体を含んでもよい。図１８Ｄ：ＲＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｂ−ボックスタンパク質、ＭＳ２コートタンパク質、ｄＣａｓタンパク質、又はＵＴＲ結合タンパク質、又はそれらいずれかの断片若しくは変異体を含み得る。図１８Ｅ：逆転写酵素ドメインは、例えば、Ｒ２タンパク質由来の切断逆転写酵素ドメイン；ウイルス（例えば、ＨＩＶ）由来の逆転写酵素ドメイン、又はＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）由来の逆転写酵素ドメイン、又はそれらのいずれかの断片若しくは変異体を含み得る。図１８Ｆ：エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓオーソログ、ＦｏｋＩ、又は制限酵素、又はそれらのいずれかの断片若しくは変異体を含み得る。一部の実施形態では、個別のＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、該ポリペプチドの既存若しくは以前のＤＮＡ結合ドメインよりも、標的ＤＮＡ配列に対して強い親和性を有するＤＮＡ結合ドメイン、又は該ポリペプチドの既存若しくは以前のＤＮＡ結合ドメインとは異なる標的ＤＮＡ配列に結合するＤＮＡ結合配列）に結合することができる。一部の実施形態では、例えば、標的ＤＮＡ配列に対する親和性が増大したＤＮＡ結合ドメイン変異体を作製することができる。複数の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーを含む。複数の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、本明細書に記載のように、リンカーを介してポリペプチド（例えば、Ｎ末端若しくはＣ末端）に結合する。複数の実施形態では、ジンクフィンガーは、ポリペプチドが、ｒＤＮＡとの競合なしに、標的ＤＮＡ配列（例えば、ジンクフィンガーに指令される通りに）との結合の増大を呈示するように、ＤＮＡ結合ドメイン変異体に結合される（例えば、本明細書に記載されるように）。
【図１９】ゲノム当たりのＲ２Ｔｇ組込みのコピー数を評価するｄｄＰＣＲアッセイにより評価される、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノムへのリンカー変異体組込みを示すグラフである。ｖ１変異体では、挿入は、予測される−１ＲＮＡ結合モチーフに先行するＲ２Ｔｇのαヘリックス領域のＮ末端側に位置し；ｖ２変異体では、挿入は、予測される−１ＲＮＡ結合モチーフに先行するＲ２Ｔｇのαヘリックス領域のＣ末端側に位置し；ｖ３変異体では、挿入は、Ｒ２Ｔｇの予測されるｃ−ｍｙｂＤＮＡ結合モチーフの後に来るランダムコイル領域のＣ末端側に位置する。
【図２０Ａ】Ｒ２Ｔｇ  ｃｉｓ組込みの忠実度を確認するロングリードシーケンシングを示す一連のグラフである。ＵＭＩにより決定される通り、ユニーク配列カバレッジを、予想参照配列を通してグラフ化する。左側の縦線は、ｒＤＮＡ及びＲ２Ｔｇの予想される５’接合部を示し、右側の縦線は、３’接合部を示す。５’接合部から３’接合部にわたる２つの個別のアンプリコンを示す。
【図２０Ｂ】Ｒ２Ｔｇ  ｃｉｓ組込みの忠実度を確認するロングリードシーケンシングを示す一連のグラフである。ＵＭＩにより決定される通り、ユニーク配列カバレッジを、予想参照配列を通してグラフ化する。左側の縦線は、ｒＤＮＡ及びＲ２Ｔｇの予想される５’接合部を示し、右側の縦線は、３’接合部を示す。５’接合部から３’接合部にわたる２つの個別のアンプリコンを示す。
【図２１Ａ】Ｒ２Ｔｇ  ｃｉｓ組込みの忠実度を確認するロングリードシーケンシングを示す一連のグラフである。ＵＭＩにより決定される通り、ユニークな配列欠失（＞３ｂｐ）を、予想参照配列を通してグラフ化する。左側の縦線は、ｒＤＮＡ及びＲ２Ｔｇの予想される５’接合部を示し、右側の縦線は、３’接合部を示す。５’接合部から３’接合部にわたる２つの個別のアンプリコンを示す。
【図２１Ｂ】Ｒ２Ｔｇ  ｃｉｓ組込みの忠実度を確認するロングリードシーケンシングを示す一連のグラフである。ＵＭＩにより決定される通り、ユニークな配列欠失（＞３ｂｐ）を、予想参照配列を通してグラフ化する。左側の縦線は、ｒＤＮＡ及びＲ２Ｔｇの予想される５’接合部を示し、右側の縦線は、３’接合部を示す。５’接合部から３’接合部にわたる２つの個別のアンプリコンを示す。
【図２２】Ｒ２Ｇｆｏのｃｉｓ組込みについての例示的なプラスミドマップＰＬＶ０３３を示す図である。
【図２３】Ｒ２Ｇｆｏ、Ｒ４Ａｌ、及びＲ２ＴｇのＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｃｉｓ組込みを示すグラフである。４つの複製の平均を示す；エラーバーは、標準偏差を示す。
【図２４】Ｒ２Ｔｇがヒト線維芽細胞にｃｉｓで組み込まれることを示すグラフである。Ｒ２Ｔｇ及びｒＤＮＡ標的の３’接合部のｄｄＰＣＲにより測定して、野生型（ＷＴ）及びエンドヌクレアーゼ（ＥＮ）対照Ｒ２Ｔｇの組込み効率を４つの複製実験についてプロットした。
【図２５】ｐ５３、ｐ２１、アクチン、及びビンクリンについてのウエスタンブロット分析を示す図である。Ｕ２ＯＳ細胞を、表示の化合物又はプラスミド：ＧＦＰ、Ｒ２Ｔｇ−ＷＴ（野生型）、又はＲ２Ｔｇ−ＥＮ（エンドヌクレアーゼドメイン変異体）を用いて試験した。プラスミドトランスフェクションは、リポフェクタミン３０００（Ｌｉｐｏ）又はＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｆｕｇ）のいずれかを用いて実施した。処理又はトランスフェクションから２４時間後に分析した。
【発明を実施するための形態】
【０２３２】
本開示は、例えば、インビボ又はインビトロで、細胞、組織若しくは被験者におけるＤＮＡ配列内の１つ若しくは複数の位置で、ＤＮＡ配列をターゲティング、編集、修飾若しくは操作する（例えば、哺乳動物ゲノムの標的部位に異種目的ＤＮＡ配列を挿入する）ための組成物、システム及び方法に関する。目的ＤＮＡ配列は、例えば、コード配列、調節配列、遺伝子発現単位を含み得る。
【０２３３】
より具体的には、本開示は、目的の配列をゲノムに挿入するためのレトロトランスポゾンに基づくシステムを提供する。本開示は、一部には、バイオインフォマティクス解析に基づいて、多種多様な生物からのレトロトランスポザーゼ配列、並びに関連５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを同定する（表３を参照）。理論に縛れることは望まないが、一部の実施形態では、鳥類などの恒温（温血）動物種で同定されるレトロトランスポザーゼは、より低温で進化したいくつかの他の酵素に比べ、向上した耐熱性を有する可能性があり、そのため、耐熱性レトロトランスポザーゼは、ヒト細胞での使用により適していると考えられる。本開示はまた、異なる種、例えば、異なる動物の種及び／又はレトロトランスポゾンの様々な種及びクレード（例えば、Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１９）ＲＮＡ（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、逆転写酵素系統発生論により分類される通り）からの複数のレトロトランスポザーゼを用いて、ヒト細胞内の標的部位へのＤＮＡ挿入を促進することができる（実施例７及び実施例２８を参照）。
【０２３４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、様々な以前のシステムに比べて、いくつかの利点を有し得る。例えば、本開示は、異種核酸の長鎖配列（例えば、３０００ヌクレオチド超）をゲノムに挿入することができるレトロトランスポザーゼを記載する（例えば、図２０Ａを参照）。加えて、本明細書に記載のレトロトランスポザーゼは、ｒＤＮＡ遺伝子座（例えば、実施例７）など、ゲノム内の内在性部位に異種核酸を挿入することができる。これは、外性ｌｏｘＰ部位に目的の配列を挿入する第２ステップの前に、このｌｏｘＰ部位を挿入する第１ステップを必要とするＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムとは対照的である。
【０２３５】
Ｇｅｎｅ−ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノムエディター
非長鎖末端反復配列（Ｎｏｎ−ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）レトロトランスポゾンは、真核生物ゲノムの広範囲に存在する可動遺伝因子の１タイプである。これらは、２つのクラス：脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）型及び制限酵素様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ）型を含む。ＡＰＥクラスレトロトランスポゾンは、２つの機能性ドメイン：エンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメイン、及び逆転写酵素ドメインから構成される。ＲＬＥクラスは、３つの機能性ドメイン：ＤＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインから構成される。非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインは、ＲＮＡ配列鋳型に結合して、これを宿主ゲノムの標的ＤＮＡに逆転写することにより機能する。ＲＮＡ配列鋳型は、トランスポザーゼに特異的に結合される３’非翻訳領域と、一般にトランスポザーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有する可変５’領域とを含む。ＲＮＡ配列鋳型はまた、レトロトランスポザーゼに特異的に結合する５’非翻訳領域も含み得る。
【０２３６】
本発明者らは、驚くことに、標的ＤＮＡ配列をターゲティング、編集、修飾若しくは操作する、例えば、標的ゲノム、例えば、哺乳動物ゲノムに、逆転写によって、目的（例えば、異種）核酸配列を挿入するために、こうした非ＬＴＲレトロトランスポゾンの要素を機能的にモジュール化して、且つ／又は修飾することができることを見出した。このようなモジュール化及び修飾核酸、ポリペプチド組成物及びシステムが本明細書に記載され、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターと呼ばれる。Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターは、以下：（Ａ）ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸（ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素ドメインと、（ｘ）ＤＮＡ結合機能性を含むエンドヌクレアーゼドメイン又は（ｙ）エンドヌクレアーゼドメイン及び個別のＤＮＡ結合ドメインのいずれかを含む）；並びに（Ｂ）（ｉ）ポリペプチドに結合する配列と（ｉｉ）異種挿入配列を含む鋳型ＲＮＡを含む。例えば、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディタータンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含み得る。他の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディタータンパク質は、逆転写酵素ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインを含み得る。特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターポリペプチドは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、ＡＰＥ型若しくはＲＬＥ型レトロトランスポゾン又はそれらの部分若しくはドメインの配列から得ることができる。一部の実施形態では、ＲＬＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンは、Ｒ２、ＮｅＳＬ、ＨＥＲＯ、Ｒ４、又はＣＲＥクレード由来である。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターは、ヒトゲノムに存在するＲ４エレメントＸ４＿Ｌｉｎｅから得られる。一部の実施形態では、ＡＰＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンは、Ｒ１、又はＴｘ１クレード由来である。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターは、ヒトゲノムに存在するＴｘ１エレメントＭａｒｅ６から得られる。Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノムエディターシステムのＲＮＡ鋳型エレメントは、典型的に、ポリペプチドエレメントに対して典型的に異種であり、宿主ゲノムに挿入（逆転写）される目的配列を提供する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディタータンパク質は、ターゲットプライム逆転写を達成することができる。
【０２３７】
一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターは、第２のポリペプチドと結合される。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＰＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンから得られる。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ジンクナックル様モチーフを有する。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｇａｇタンパク質の相同体である。
【０２３８】
Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターシステムのポリペプチド成分
ＲＴドメイン：
本発明の特定の形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムの逆転写酵素ドメインは、ＡＰＥ型又はＲＬＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインに基づく。Ｇｅｎｅ  ＷｒｉｔｅｒシステムにおいてＡＰＥ型又はＲＬＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンの野生型逆転写酵素ドメインを使用するか、又は修飾（例えば、１つ若しくは複数の残基の挿入、欠失、又は置換により）して、標的ＤＮＡ配列に対する逆転写酵素活性を改変することができる。一部の実施形態では、逆転写酵素をその天然配列から改変して、改変されたコドン使用頻度、例えば、ヒト細胞のために改善されたコドン使用頻度を取得する。一部の実施形態では、逆転写酵素は、異なるレトロウイルス、ＬＴＲ−レトロトランスポゾン、又は非ＬＴＲレトロトランスポゾン由来の異種逆転写酵素である。特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムは、Ｒ２、ＮｅＳＬ、ＨＥＲＯ、Ｒ４、若しくはＣＲＥクレード由来のＲＬＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメイン、又はＲ１、若しくはＴｘ１クレード由来のＡＰＥ型非ＬＴＲレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインを含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムは、表１、表２、又は表３に列記されるレトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインを含むポリペプチドを含む。複数の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムの逆転写酵素ドメインのアミノ酸配列は、レトロトランスポゾンの逆転写酵素ドメインのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であり、そのＤＮＡ配列は、表１、表２、又は表３に参照として掲載される。当業者は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のような常用のツールを用いて、他の既知逆転写酵素ドメインとの相同性に基づき逆転写酵素ドメインを同定することができる。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、部位特異的突然変異により修飾される。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインを操作して、異種鋳型ＲＮＡと結合させる。
【０２３９】
エンドヌクレアーゼドメイン：
特定の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムで、ＡＰＥ型レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメイン又はＲＬＥ型レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインを使用するか、又は修飾する（例えば、１つ若しくは複数の残基の挿入、欠失、又は置換により）ことができる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメインをその天然配列から改変して、改変されたコドン使用頻度、例えば、ヒト細胞のために改善されたコドン使用頻度を取得する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼエレメントは、異種エンドヌクレアーゼエレメント、例えば、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼ、ＩＩ型制限様エンドヌクレアーゼ（ＲＬＥ型ヌクレアーゼ）、又は別のＲＬＥ型エンドヌクレアーゼ（ＲＥＬとしても知られる）である。一部の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼ活性は、ニッカーゼ活性を有し、二本鎖切断を形成しない。本明細書に記載のＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムのエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列は、レトロトランスポゾンのエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であり、そのＤＮＡ配列は、表１、表２、又は表３に参照として掲載される。当業者は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のようなツールを用いて、他の既知エンドヌクレアーゼドメインとの相同性に基づきエンドヌクレアーゼドメインを同定することができる。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、Ｆｏｋ１又はその機能性断片である。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、ホリデイ（Ｈｏｌｌｉｄａｙ）ジャンクションリゾルバーゼ又はその相同体、例えば、スルフォロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）−Ｓｓｏｌ  Ｈｊｅ由来のホリデイジャンクション解離酵素である（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４：７，２０１６）。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、スプライソソームタンパク質の大きな断片のエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｐｒｐ８である（Ｍａｈｂｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  ８：１６，２０１７）。例えば、本明細書に記載のＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、ＡＰＥ型又はＲＬＥ型レトロトランスポゾン由来の逆転写酵素ドメインと、Ｆｏｋ１又はその機能性断片を含むエンドヌクレアーゼドメインを含み得る。また別の実施形態では、例えば、部位特異的突然変異により相同性エンドヌクレアーゼドメインを修飾して、ＤＮＡ結合ドメインエンドヌクレアーゼ活性を改変する。さらに別の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインを修飾して、任意の潜在的ＤＮＡ配列特異性を除去する。
【０２４０】
ＤＮＡ結合ドメイン：
特定の態様では、所望の宿主ＤＮＡ標的配列と結合させるために、本明細書に記載のＧｅｎｅ  ＷｒｉｔｅｒポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインを選択、設計、又は構築する。特定の実施形態では、操作ＲＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、天然のレトロトランスポゾン配列に比べ、異種ＤＮＡ結合タンパク質又はドメインである。一部の実施形態では、異種ＤＮＡ結合エレメントは、ジンクフィンガーエレメント又はＴＡＬエフェクターエレメント、例えば、ジンクフィンガー若しくはＴＡＬポリペプチド又はその機能性断片である。一部の実施形態では、異種ＤＮＡ結合エレメントは、シーケンスガイドＤＮＡ結合エレメント、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、又はエンドヌクレアーゼ活性を一切持たないように改変された他のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質などである。一部の実施形態では、異種ＤＮＡ結合エレメントは、エンドヌクレアーゼ活性を保持する。一部の実施形態では、異種ＤＮＡ結合エレメントを、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼエレメントの代わりに使用する。具体的な実施形態では、異種ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９、ＴＡＬドメイン、ＺＦドメイン、Ｍｙｂドメイン、それらの組合せ、又はそれらの集団のいずれか１つ若しくは複数であってよい。特定の実施形態では、異種ＤＮＡ結合ドメインは、表１、表２、又は表３に記載されるレトロトランスポゾンのＤＮＡ結合ドメインである。当業者は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）としてのツールを用いて、他の既知ＤＮＡ結合ドメインとの相同性に基づき、ＤＮＡ結合ドメインを同定することができる。また別の実施形態では、例えば、部位特異的突然変異、ＤＮＡ結合ドメインエレメント（例えば、ジンクフィンガーの数及び／又は特異性）の増大若しくは低減により修飾して、ＤＮＡ結合特異性及び親和性を改変する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、その天然の配列から改変して、改変されたコドン使用頻度、例えば、ヒト細胞のために改善されたコドン使用頻度を取得する。
【０２４１】
本発明の特定の態様では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムにより組み込まれた宿主ＤＮＡ結合部位は、遺伝子内、イントロン内、エキソン内、ＯＲＦ内、任意の遺伝子のコード領域外部、遺伝子の調節領域内、又は遺伝子の調節領域外部であり得る。他の態様では、操作ＲＬＥは、１つ又は複数のＤＮＡ配列に結合し得る。
【０２４２】
特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムＲＮＡは、細胞内局在化配列、例えば、核局在化配列をさらに含む。核局在化配列は、核へのＲＮＡの移入を促進するＲＮＡ配列であり得る。特定の実施形態では、核局在化シグナルは、鋳型ＲＮＡ上に位置する。特定の実施形態では、レトロトランスポザーゼポリペプチドは、第１のＲＮＡ上でコードされ、鋳型ＲＮＡは、第２の個別のＲＮＡであり、核局在化シグナルは、鋳型ＲＮＡに配置されるが、レトロトランスポザーゼポリペプチドをコードするＲＮＡには配置されない。理論に縛られることは望まないが、一部の実施形態では、レトロトランスポザーゼをコードするＲＮＡは、主として細胞質にターゲティングされて、その翻訳を促進するのに対し、鋳型ＲＮＡは、主として核にターゲティングされて、ゲノムへのそのレトロ転位を促進する。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、３’末端、５’末端、又は鋳型ＲＮＡの内部領域内である。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、異種配列の３’側である（例えば、異種配列の３’側に隣接する）か、又は異種配列の５’側である（例えば、異種配列の５’側に隣接する）。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、鋳型ＲＮＡの５’ＵＴＲの外部又は３’ＵＴＲの外部である。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの間に位置し、この場合、任意選択で、核局在化シグナルは、トランスジーンで転写される（例えば、核局在化シグナルは、アンチセンス配向であるか、又は転写終結シグナル若しくはポリアデニル化シグナルの下流である）。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、イントロンの内部に位置する。一部の実施形態では、複数の同じ又は異なる核局在化シグナルがＲＮＡ内、例えば、鋳型ＲＮＡ内にある。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ｂｐ未満の長さである。様々なＲＮＡ核局在化配列を用いることができる。例えば、Ｌｕｂｅｌｓｋｙ  ａｎｄ  Ｕｌｉｔｓｋｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ５５５（１０７−１１１），２０１８は、核へのＲＮＡ局在化を駆動するＲＮＡ配列を記載している。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、ＳＩＮＥ由来の核ＲＮＡ局在化（ＳＩＲＬＯＩＮ）シグナルである。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、核濃縮タンパク質に結合する。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、ＨＮＲＮＰＫタンパク質に結合する。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、ピリミジンが豊富であり、例えば、Ｃ／Ｔリッチ、Ｃ／Ｕリッチ、Ｃリッチ、Ｔリッチ、又はＣリッチ領域である。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、長鎖ノンコーディングＲＮＡに由来する。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、ＭＡＬＡＴ１長鎖ノンコーディングＲＮＡに由来するか、又はＭＡＬＡＴ１の６００ヌクレオチドＭ領域（Ｍｉｙａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  １８，（７３８−７５１），２０１２に記載）である。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、ＢＯＲＧ長鎖ノンコーディングＲＮＡに由来するか、又は���ＧＣＣＣモチーフ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４，２３１８−２３２９（２０１４）に記載）である。一部の実施形態では、核局在化配列は、Ｓｈｕｋｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｅ９８４５２（２０１８）に記載されている。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、ＬＴＲレトロトランスポゾン、レトロウイルス、又は内在性レトロウイルスに由来する。
【０２４３】
特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムポリペプチドは、細胞内局在化配列、例えば、核局在化配列及び／又は核小体局在化配列をさらに含む。核局在化配列及び／又は核小体局在化配列は、核及び／又は核小体へのタンパク質の移入を促進するアミノ酸配列であってよく、その際、この配列は、ゲノムへの異種配列の組込みを促進することができる。特定の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ遺伝子エディターシステムポリペプチド（例えば、レトロトランスポザーゼ、例えば、本明細書に記載の表１、２、又は３のいずれかに従うポリペプチド）は、核小体局在化配列をさらに含む。特定の実施形態では、レトロトランスポザーゼは、第１ＲＮＡ上にコードされ、鋳型ＲＮＡは、第２の、個別のＲＮＡであり、核小体局在化シグナルは、レトロトランスポザーゼポリペプチドをコードするＲＮＡ上にコードされるが、鋳型ＲＮＡにはコードされない。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端に、又は内部領域内に位置する。一部の実施形態では、複数の同じ又は異なる核小体局在化シグナルが使用される。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、５、１０、２５、５０、７５、又は１００アミノ酸長未満である。様々なポリペプチド核小体局在化シグナルが使用される。例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２，３３（２０１５）は、核小体局在化シグナルとしても機能する核局在化シグナルを記載している。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、核局在化シグナルであってもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、核局在化シグナルと重複してもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、１区間の塩基残基を含み得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、アルギニン及びリシン残基が豊富であり得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、核小体が濃縮されたタンパク質に由来するものであってもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、リボソームＲＮＡ遺伝子座で濃縮されたタンパク質に由来するものであってもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、ｒＲＮＡに結合するタンパク質に由来するものであってもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、ＭＳＰ５８に由来するものであってもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）モチーフであってもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）モチーフであってもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、複数の単節型及び双節型モチーフから構成されてもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、単節型及び双節型モチーフの混合から構成されてもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、二重双節型モチーフであってもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、ＫＲＡＳＳＱＡＬＧＴＩＰＫＲＲＳＳＳＲＦＩＫＲＫＫ（配列番号１５３０）であってもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、核因子−κＢ誘導キナーゼに由来するものであってもよい。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、ＲＫＫＲＫＫＫモチーフ（配列番号１５３１）（Ｂｉｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１７（３６１５−３６２４），２００４）であってもよい。
【０２４４】
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸（例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡ、又はそのＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を用いて、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムの標的細胞特異性を増大させる。例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位は、非標的細胞型に存在するが、標的細胞型には存在しない（又は非標的細胞と比べ、低いレベルで存在する）ｍｉＲＮＡにより認識される基準に基づいて選択することができる。従って、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡが非標的細胞中に存在するとき、これは、ｍｉＲＮＡに結合されており、また、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡが標的細胞中に存在するとき、これは、ｍｉＲＮＡに結合されていない（又は、非標的細胞と比べ、低いレベルでしか結合されていない）であろう。理論に縛られることは望まないが、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＲＮＡに対するｍｉＲＮＡの結合は、例えば、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを分解することにより、又は翻訳を妨害することにより、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドの生成を低減し得る。従って、異種目的配列は、非標的細胞のゲノムよりも効率的に、標的細胞のゲノムに挿入されることになる。また、本明細書において「Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムの鋳型ＲＮＡ成分」と題するセクションに説明されるように、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする（又はＲＮＡをコードするＤＮＡにコードされる）ＲＮＡ中のｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を有するシステムを、第２のｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位によって調節される鋳型ＲＮＡと組み合わせて使用してもよい。
【０２４５】
【表１】
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【０２４６】
【表２】
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【０２４７】
【表３】
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【０２４８】
【表４】
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【０２４９】
【表５】
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【０２５０】
【表６】
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【０２５１】
【表７】
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【０２５２】
【表８】
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【０２５３】
【表９】
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【０２５４】
【表１０】
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【０２５５】
【表１１】
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【０２５６】
【表１２】
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【０２５７】
【表１３】
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【０２５８】
【表１４】
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【０２５９】
【表１５】
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【０２６０】
【表１６】
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【０２６１】
【表１７】
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【０２６２】
【表１８】
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【０２６３】
【表１９】
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【０２６４】
【表２０】
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【０２６５】
【表２１】
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【０２６６】
【表２２】
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【０２６７】
【表２３】
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【０２６８】
【表２４】
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【０２６９】
【表２５】
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【０２７０】
【表２６】
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【０２７１】
【表２７】
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【０２７２】
【表２８】
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【０２７３】
【表２９】
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【０２７４】
【表３０】
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【０２７５】
【表３１】
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【０２７６】
【表３２】
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【０２７７】
【表３３】
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【０２７８】
【表３４】
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【０２７９】
【表３５】
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【０２８０】
【表３６】
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【０２８１】
【表３７】
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【０２８２】
【表３８】
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【０２８３】
【表３９】
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【０２８４】
【表４０】
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【０２８５】
【表４１】
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【０２８６】
【表４２】
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【０２８７】
【表４３】
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【０２８８】
【表４４】
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【０２８９】
【表４５】
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【０２９０】
【表４６】
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【０２９１】
【表４７】
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【０２９２】
【表４８】
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【０２９３】
【表４９】
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【０２９４】
【表５０】
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【０２９５】
【表５１】
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【０２９６】
【表５２】
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【０２９７】
【表５３】
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【０２９８】
【表５４】
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【０２９９】
【表５５】
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【０３００】
【表５６】
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【０３０１】
【表５７】
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【０３０２】
【表５８】
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【０３０３】
【表５９】
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【０３０４】
【表６０】
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【０３０５】
【表６１】
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【０３０６】
【表６２】
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【０３０７】
【表６３】
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【０３０８】
【表６４】
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【０３０９】
【表６５】
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【０３１０】
【表６６】
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【０３１１】
【表６７】
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【０３１２】
【表６８】
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【０３１３】
【表６９】
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【０３１４】
【表７０】
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【０３１５】
【表７１】
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【０３１６】
【表７２】
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【０３１７】
【表７３】
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【０３１８】
【表７４】
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【０３１９】
【表７５】
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【０３２０】
【表７６】
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【０３２１】
【表７７】
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【０３２２】
【表７８】
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【０３２３】
【表７９】
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【０３２４】
当業者は、例えば、保存ドメイン解析のためのＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）又はＣＤ−Ｓｅａｒｃｈのような常用の配列解析ツールを用いることにより、表１〜３に記載されるアクセッション番号に基づいて、各レトロトランスポゾンの核酸及び対応するポリペプチド配列並びにそれらのドメインを決定することができる。他の配列解析ツールは周知であり、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ−ｔｏｏｌｓ．ｃａ、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ−ｔｏｏｌｓ．ｃａ／Ｍｏｔｉｆｓ．ｈｔｍに見出すことができる。配列番号１〜１１２は、表１の各行とアラインメントし、配列番号１１３〜１０１５は、表２の最初の９０３行とアラインメントする。
【０３２５】
本明細書に記載の表１〜３は、レトロトランスポザーゼのアミノ酸配列を含め、例示的なトランスポゾンの配列、レトロトランスポザーゼを鋳型ＲＮＡに結合させることができる５’及び３’非翻訳領域の配列、並びに全トランスポゾン核酸配列を掲載する。一部の実施形態では、表１〜３のいずれかの５’ＵＴＲは、レトロトランスポザーゼと鋳型ＲＮＡとの結合を可能にする。一部の実施形態では、表１〜３のいずれかの３’ＵＴＲは、レトロトランスポザーゼと鋳型ＲＮＡとの結合を可能にする。従って、一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムのいずれかで使用するためのポリペプチドは、本明細書の表１〜３のいずれかのポリペプチド、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列であり得る。一部の実施形態では、システムは、例えば、同じ表の同じ行に表示されるように、前文で述べたポリペプチドと同じトランスポゾンに由来する、本明細書の表１〜３のいずれかの５’又は３’非翻訳領域（又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列）の一方若しくは両方をさらに含む。一部の実施形態では、システムは、本明細書の表１〜３のいずれかの５’又は３’非翻訳領域の一方若しくは両方、例えば、レトロトランスポザーゼに結合することができるＲＮＡをコードする全トランスポゾン配列のセグメント、及び／又は予測５’ＵＴＲ若しくは予測３’ＵＴＲと題する列に記載される部分配列を含む。
【０３２６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムのいずれかで使用されるポリペプチドは、複数のレトロトランスポゾンのアラインメントされたポリペプチド配列に基づく分子再構築物又は祖先配列再構築物であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムのいずれかで使用される５’又は３’非翻訳領域は、複数のレトロトランスポゾンのアラインメントされた５’又は３’非翻訳領域に基づく分子再構築物であり得る。当業者は、例えば、保存ドメイン解析のためのＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）又はＣＤ−Ｓｅａｒｃｈのような常用の配列解析ツールを用いることにより、本明細書に記載のアクセッション番号に基づいて、ポリペプチド又は核酸配列をアラインメントすることができる。分子再構築物は、例えば、Ｉｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９９７，５０１−５１０；Ｗａｇｓｔａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ２０１３，８８−９９に記載のアプローチを用いて、配列コンセンサスに基づき作製することができる。一部の実施形態では、５’若しくは３’非翻訳領域又はポリペプチドが由来するレトロトランスポゾンは、Ｂｏｉｓｓｉｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ２０００，９１５−９２８に記載されたものなどの生物発生学的方法により評価されるように、若いか、又は新しく活性となった可動因子である。
【０３２７】
表３（以下）は、データマイニングを用いて同定された様々なレトロトランスポザーゼ由来の例示的なＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒタンパク質及び関連配列を示す。第１列は、レトロトランスポゾンが帰属するファミリーを示す。第２列は、成分名を列記する。第３列は、存在する場合に、アクセッション番号を示す。第４列は、レトロトランスポザーゼが見出される生物を列記する。第５列は、レトロトランスポゾンのＤＮＡ配列を列記する。第６列は、予測５’非翻訳領域を列記し、第７列は、予測３’非翻訳領域を列記し；いずれも、鋳型ＲＮＡを第８列のレトロトランスポザーゼに結合させることができると予測される第５列の配列のセグメントである。（第５〜７列が、ＤＮＡ配列であること、第５〜７列のいずれかに従うＲＮＡ配列が、チミジンではなく、典型的にウラシルであることは理解される）。第８列は、第５列のレトロトランスポゾンにコードされる予測レトロトランスポザーゼ配列を列記する。
【０３２８】
【表８０】
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【０３２９】
【表８１】
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【０３３０】
【表８２】
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【０３３１】
【表８３】
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【０３３２】
【表８４】
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【０３３３】
【表８５】
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【０３３４】
【表８６】
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【０３３５】
【表８７】
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【０３３６】
【表８８】
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【０３３７】
【表８９】
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【０３３８】
【表９０】
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【０３３９】
【表９１】
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【０３４０】
【表９２】
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【０３４１】
【表９３】
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【０３４２】
【表９４】
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【０３４３】
【表９５】
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【０３４４】
【表９６】
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【０３４５】
【表９７】
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【０３４６】
【表９８】
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【０３４７】
【表９９】
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【０３４８】
【表１００】
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【０３４９】
【表１０１】
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【０３５０】
【表１０２】
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【０３５１】
【表１０３】
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【０３５２】
【表１０４】
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【表４１０】
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【表４１１】
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【０６６８】
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【表４２５】
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【表４２８】
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【表４２９】
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【０６７７】
【表４３０】
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【表４３１】
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【表４３２】
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【表４３３】
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【０６８１】
【表４３４】
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【０６８２】
【表４３５】
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【表４３７】
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【０６８８】
【表４４１】
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【表４４２】
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【０６９０】
【表４４３】
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【０６９１】
【表４４４】
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【表４４８】
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【０６９６】
【表４４９】
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【表４５０】
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【表４５１】
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【表４５２】
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【０７００】
【表４５３】
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【表４５４】
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【表４５５】
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【表４５６】
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【表４５７】
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【０７０５】
【表４５８】
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【０７０６】
【表４５９】
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【０７０７】
【表４６０】
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【表４６１】
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【表４６２】
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【表４６３】
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【表４６７】
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【０７１５】
【表４６８】
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【０７１６】
【表４６９】
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【０７１７】
Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ、例えば、耐熱性Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ
理論に縛られることは望まないが、一部の実施形態において、低温環境で進化したレトロトランスポザーゼは、ヒトの体温で良好に機能しない可能性がある。本出願は、鳥レトロトランスポザーゼ由来のタンパク質を含め、いくつかの耐熱性Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒを提供する。表３に示す例示的なトリトランスポザーゼ配列は、キンカチョウ（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ  ｇｕｔｔａｔａ）（ゼブラフィンチ；トランスポゾン名Ｒ２−１＿ＴＧ）、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ  ｆｏｒｔｉｓ）（ミディアムグランドフィンチ；トランスポゾン名Ｒ２−１＿Ｇｆｏ）、ノドジロシトド（Ｚｏｎｏｔｒｉｃｈｉａ  ａｌｂｉｃｏｌｌｉｓ）（ノドジロシトド；トランスポゾン名Ｒ２−１＿ＺＡ）、及びノドジロシギダチョウ（Ｔｉｎａｍｕｓ  ｇｕｔｔａｔｕｓ）（ノドジロシギダチョウトランスポゾン名Ｒ２−１＿ＴＧｕｔ）のものを含む。
【０７１８】
熱安定性は、例えば、Ｇｅｎｅ  ＷｒｉｔｅｒがＤＮＡを高温（例えば、３７℃）及び低温（例えば、２５℃）にて、インビトロで重合する能力を検定することによって測定することができる。ＤＮＡ重合活性（例えば、処理能力）をインビトロで検定するための好適な条件は、例えば、Ｂｉｂｉｌｌｏ  ａｎｄ  Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，“Ｈｉｇｈ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｎｏｎ−ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ”（２００２）ＪＢＣ  ２７７，３４８３６−３４８４５に記載されている。一部の実施形態では、耐熱性Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、３７℃で、それ以外は類似の条件下で２５℃のその活性の７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満の活性、例えば、ＤＮＡ重合活性を有する。
【０７１９】
一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチド（例えば、表１、２、若しくは３の配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列）は、哺乳動物（例えば、ヒト）又は鳥から選択される被験者において、安定している。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドは、３７℃で機能性である。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドは、３７℃で、それより低い温度、例えば、３０℃、２５℃、若しくは２０℃での活性より高い活性を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドは、ゼブラフィッシュ細胞よりもヒト細胞において、高い活性を有する。
【０７２０】
一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドは、本明細書に記載の実施例６又は実施例７のアッセイを用いて、３７℃で培養したヒト細胞において活性である。
【０７２１】
一部の実施形態では、アッセイは、以下：（１）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０，０００細胞／ウェルで直径６．４ｍｍの１つ又は複数のウェルに導入するステップ、（２）細胞を３７℃で２４ｈｒインキュベートするステップ、（３）０．５μｌのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬及び８０ｎｇＤＮＡ（ＤＮＡは、順に（ａ）ＣＭＶプロモータ、（ｂ）標的部位上流の１００ｂｐと相同性の１００ｂｐの配列、（ｃ）ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質に結合する５’非翻訳領域をコードする配列、（ｄ）ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質をコードする配列、（ｅ）ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質に結合する３’非翻訳領域をコードする配列、（ｆ）標的部位の下流１００ｂｐと相同性の１００ｂｐの配列、及び（ｇ）ＢＧＨポリアデニル化配列を含むプラスミドである）並びに１０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを含有するトランスフェクション混合物を用意し、室温で１５分インキュベートするステップ、（４）トランスフェクション混合物を細胞に添加するステップ、（５）細胞を３日間インキュベートするステップ、並びに（６）細胞ゲノム中の標的遺伝子座（例えば、ｒＤＮＡ）への外性配列の組込みを検定するステップを含み、例えば、先行ステップの１つ又は複数は、本明細書の実施例６に記載される通りに実施される。
【０７２２】
一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドは、ゲノム当たり少なくとも０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．５、３、４、又は５コピーの平均コピー数で標的部遺伝子座（例えば、ｒＤＮＡ）への異種目的配列（例えば、ＧＦＰ遺伝子）の組込みを達成する。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞（例えば、標的挿入部位で異種配列を含む細胞）は、ゲノム当たり少なくとも０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．５、３、４、又は５コピーの平均コピー数で異種目的配列を含む。
【０７２３】
一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒは、末端で比較的少ない切断事象を伴って、標的ＲＮＡへの配列の組込みをもたらす。例えば、一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒタンパク質（例えば、配列番号１０１６）は、本明細書に記載のアッセイ、例えば、実施例６及び図８のアッセイにより測定して、非切断型である標的部位への約２５〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、７５〜９５％、８０〜９０％、又は８６．１７％の組込み体を達成する。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒタンパク質（例えば、配列番号１０１６）は、本明細書に記載のアッセイにより測定して、非切断型である標的部位への少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の組込み体を達成する。一部の実施形態では、組込み体は、エレメント（例えば、キンカチョウ（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ  ｇｕｔｔａｔａ）の野生型トランスポゾン配列）の末端から５６５ｂｐに位置するフォワードプライマー及び標的挿入部位のゲノムＤＮＡ、例えば、ｒＤＮＡに位置するリバースプライマーによる増幅を含むアッセイを用いて、切断型及び非切断型として分類される。一部の実施形態では、標的挿入部位における完全長組込み体の数は、標的挿入部位内の３００〜５６５ヌクレオチドだけ切断型組込み体の数より大きく、例えば、完全長組込み体の数は、切断型組込み体の数の少なくとも１．１×、１．２×、１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、若しくは１０×であるか、又は完全長組込み体の数は、切断型組込み体の数の少なくとも１．１×〜１０×、２×〜１０×、３×〜１０×、又は５×〜１０×である。
【０７２４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、標的細胞のゲノム中の標的部位だけに異種目的配列の挿入を達成する。挿入は、例えば、実施例８に記載されるように、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％を超える閾値を用いて、測定することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、異種目的配列の挿入を達成し、その際、例えば、本明細書に記載されるアッセイ、例えば、実施例８のアッセイを用いて、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％の挿入が標的部位以外に存在する。
【０７２５】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、異種目的配列の「スカーレス（ｓｃａｒｌｅｓｓ）」挿入を達成し、一部の実施形態では、標的部位は、異種配列の挿入の結果として内在性ＤＮＡの欠失又は複製を示し得る。異なるレトロトランスポゾンの作用機構により、宿主ゲノムに様々なパターンの重複又は欠失が生じるが、これらは標的部位でのレトロ転位中に起こる。一部の実施形態では、本システムは、周囲のゲノムＤＮＡに重複又は欠失を招くことなく、スカーレス挿入を達成する。一部の実施形態では、本システムによって、挿入上流のゲノムＤＮＡの１、２、３、４、５、１０、５０、又は１００ｂｐ未満の欠失が起こる。一部の実施形態では、本システムによって、挿入下流のゲノムＤＮＡの１、２、３、４、５、１０、５０、又は１００ｂｐ未満の欠失が起こる。一部の実施形態では、本システムによって、挿入上流のゲノムＤＮＡの１、２、３、４、５、１０、５０、又は１００ｂｐ未満の重複が起こる。一部の実施形態では、本システムによって、挿入下流のゲノムＤＮＡの１、２、３、４、５、１０、５０、又は１００ｂｐ未満の重複が起こる。
【０７２６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ、又はそのＤＮＡ結合ドメインは、実施例２１のアッセイを用いて測定して、その標的部位に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ又はそのＤＮＡ結合ドメインは、ヒトゲノム内のいずれか他の結合部位よりも強力にその標的部位に結合する。例えば、一部の実施形態では、実施例２１のアッセイにおいて、標的部位は、ヒトゲノムＤＮＡに対するＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ又はそのＤＮＡ結合ドメインの結合事象の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは９５％超を呈示する。
【０７２７】
遺伝子操作された、例えば、二量体化（された）ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒ
一部の非ＬＴレトロトランスポゾンは、２つのサブユニットを使用して、レトロ転位を完了する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ  ２００６）。一部の実施形態では、本明細書に記載のレトロトランスポザーゼは、単一のポリペプチドとして２つの結合されたサブユニットを含む。例えば、２つの野生型レトロトランスポザーゼは、リンカーと結合して、共有結合により「二量体化」したタンパク質を形成することができた（図１７を参照）。一部の実施形態では、レトロトランスポザーゼをコードする核酸は、２つのトランスポザーゼサブユニットをコードして、単一のポリペプチドとして発現させる。一部の実施形態では、サブユニットは、本明細書で「リンカー」と題するセクションにおいて、また、例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ２０１３に記載されているように、ペプチドリンカーにより連結される。一部の実施形態では、ポリペプチド中の２つのサブユニットは、剛直なリンカーにより連結される。一部の実施形態では、剛直なリンカーは、モチーフ（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号１５３４）から構成される。他の実施形態では、ポリペプチドの２つのサブユニットは、柔軟なリンカーにより連結される。一部の実施形態では、柔軟なリンカーは、モチーフ（Ｇｌｙ）ｎから構成される。一部の実施形態では、柔軟なリンカーは、モチーフ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１５３５）から構成される。一部の実施形態では、剛直又は柔軟リンカーは、レトロ転位を可能にするために、１、２、３、４、５、１０、１５若しくはそれを超えるアミノ酸長から成る。一部の実施形態では、リンカーは、剛直又は柔軟リンカーモチーフの組合せから構成される。
【０７２８】
作用機構に応じて、両レトロトランスポザーゼサブユニットから全ての機能が要求されるわけではない。一部の実施形態では、融合タンパク質は、完全に機能性のサブユニットと、１つ又は複数の機能性ドメインが欠如した第２サブユニットとから構成されていてもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、逆転写酵素機能性が欠如していてもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、逆転写酵素ドメインが欠如していてもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、エンドヌクレアーゼ活性のみを有し得る。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、エンドヌクレアーゼドメインのみを有し得る。一部の実施形態では、単一のポリペプチドを含む２つのサブユニットは、相補的機能性を提供し得る。
【０７２９】
一部の実施形態では、一方のサブユニットは、エンドヌクレアーゼ機能性が欠如していてもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、エンドヌクレアーゼドメインが欠如していてもよい。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、逆転写酵素活性のみを有し得る。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、逆転写酵素ドメインのみを有し得る。一部の実施形態では、一方のサブユニットは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成機能性のみを有し得る。
【０７３０】
リンカー
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及びシステムのドメイン（例えば、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ及び逆転写酵素ドメイン又はポリペプチドのＤＮＡ結合ドメイン及び逆転写酵素ドメイン）は、リンカーにより連結され得る。リンカーエレメントを含む本明細書に記載の組成物は、一般的形態Ｓ１−Ｌ−Ｓ２を有し、ここで、Ｓ１及びＳ２は、同じでも異なってもよく、リンカーで互いに結合された２つの部分（例えば、各々、ポリペプチド又は核酸ドメイン）を呈示する。一部の実施形態では、リンカーは、２つのポリペプチドを連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、２つの核酸分子を連結し得る。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドと核酸分子を連結し得る。リンカーは、化学結合、例えば、１つ若しくは複数の共有結合又は非共有結合であってよい。リンカーは、柔軟、剛直、及び／又は切断可能であってよい。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。概して、ペプチドリンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれを超えるアミノ酸長、例えば、２〜５０アミノ酸長、２〜３０アミノ酸長である。
【０７３１】
最も一般的に使用される柔軟リンカーは、主としてＧｌｙ及びＳｅｒ残基の区間から成る配列を有する（「ＧＳ」リンカー）。柔軟リンカーは、ある程度の移動又は相互作用を必要とするドメインの連結に有用であると考えられ、小さい無極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ若しくはＴｈｒ）アミノ酸を含み得る。Ｓｅｒ又はＴｈｒの組込みはまた、水分子を用いて水素結合を形成することにより、水溶液中のリンカーの安定性を維持することができるため、リンカーと他の部分との好ましくない相互作用を低減することができる。こうしたリンカーの例としては、構造［ＧＧＳ］≧１又は［ＧＧＧＳ］≧１（配列番号１５３６）を有するものが挙げられる。剛直リンカーは、ドメイン間の定距離を保持すると共に、それらの独立の機能を維持するのに有用である。剛直リンカーはまた、薬剤中の１つ若しくは複数の成分の安定性又は生物活性を保存するためにドメインの空間的分離が不可欠である場合にも有用となり得る。剛直リンカーは、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列、（ＸＰ）ｎを有し得る（Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、若しくはＧｌｕを指す）。切断可能なリンカーは、遊離機能性ドメインをインビボで放出し得る。一部の実施形態では、リンカーは、特定の条件下、例えば、還元剤又はプロテアーゼの存在下で切断され得る。インビボで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合の可逆性を利用する場合がある。一例として、２つのＣｙｓ残基の間のトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）がある。ＣＰＲＳＣ（配列番号１５３７）のインビトロトロンビン処理によって、トロンビン感受性配列の切断が起こるのに対し、可逆性ジスルフィド結合はインタクトなままである。こうしたリンカーは、周知であり、例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９に記載されている。本明細書に記載の組成物中のリンカーのインビボ切断は、特定の細胞若しくは組織において、病状（例えば、癌若しくは炎症）下、インビボで発現されるか、又は特定の細胞コンパートメント内に拘束されたプロテアーゼによっても実施され得る。様々なプロテアーゼの特異性によって、拘束されたコンパートメント内のリンカーの緩徐な切断が可能になる。
【０７３２】
一部の実施形態では、アミノ酸リンカーは、天然のポリペプチド内のこうしたドメインの間に存在する内在性アミノ酸（又はそれらと相同性）である。一部の実施形態では、そのようなドメインの間に存在する内在性アミノ酸は、置換されているが、長さは天然の長さから不変である。一部の実施形態では、ドメイン間に天然に存在するアミノ酸残基に、追加のアミノ酸残基が付加される。
【０７３３】
一部の実施形態では、アミノ酸リンカーは、タンパク質機能を最大化するように、コンピューターにより設計されるか、又はスクリーニングされる（Ａｎａｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８７：１９，２０１３）。
【０７３４】
Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムの鋳型ＲＮＡ成分
本明細書に記載のＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムは、ターゲット−プライム逆転写により、宿主標的ＤＮＡ部位にＲＮＡ配列鋳型を転写することができる。宿主ゲノムへのＲＮＡ配列鋳型の直接の逆転写を介してＤＮＡ配列を編集することにより、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムは、外性ＤＮＡ配列を宿主細胞に導入する必要（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムとは異なり）、さらには外性ＤＮＡ挿入ステップを排除する必要もなく、目的配列を標的ゲノムに挿入することができる。従って、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムは、目的配列、例えば、異種遺伝子コーディング及び／又は機能情報を含む配列を含むカスタマイズされたＲＮＡ配列鋳型の使用のためのプラットフォームを提供する。
【０７３５】
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、異種目的配列と共にＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒタンパク質をｃｉｓでコードする。様々なｃｉｓ構築物が、例えば、Ｋｕｒｏｋｉ−Ｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１９）Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  １０：２３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、本明細書に記載の実施形態のいずれかと組み合わせて使用することができる。例えば、一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、異種目的配列、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒタンパク質（例えば、本明細書に記載されるように、例えば、（ｉ）逆転写酵素ドメインと（ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメインを含むタンパク質）をコードする配列、５’非翻訳領域、及び３’非翻訳領域を含む。これらの成分は、様々な順序で含有され得る。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒタンパク質と異種目的配列は、例えば、Ｋｕｒｏｋｉ−Ｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ（同上）の図３Ａに示される配置を用いて、異なる方向（センス対アンチセンス）にコードされる。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒタンパク質と異種目的配列は、同じ方向にコードされる。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸と、鋳型ＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡをコードする核酸は、共有結合され、例えば、融合核酸の一部であり、且つ／又は同じ転写物の一部である。一部の実施形態では、融合核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む。
【０７３６】
Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする核酸は、いくつかの例において、異種目的配列の５’側であってよい。例えば、一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、５’から３’の方向に、５’非翻訳領域、センスコード化Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、センスコード化異種目的配列、及び３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、５’から３’の方向に、５’非翻訳領域、センスコード化Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒポリペプチド、アンチセンスコード化異種目的配列、及び３’非翻訳領域を含む。
【０７３７】
一部の実施形態では、ＲＮＡは、さらに、ＤＮＡ標的部位に対する相同性を含む。
【０７３８】
鋳型ＲＮＡが、オープンリーディングフレーム又はその逆相補鎖を含むものとして記載される場合、一部の実施形態では、オープンリーディングフレームが転写及び翻訳される前に、鋳型ＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換（例えば、逆転写により）しなければならないことが理解される。
【０７３９】
特定の実施形態では、カスタマイズされたＲＮＡ配列鋳型は、例えば、異種コード領域をゲノムに導入する；エキソン構造／選択的スプライシングに影響を与える、又はそれを引き起こす；外性遺伝子の破壊を引き起こす；外性遺伝子の転写活性化を引き起こす；外性ＤＮＡのエピジェネティック制御を引き起こす；作動可能に連結した遺伝子の上方若しくは下方制御を引き起こす、等によって、宿主ゲノム機能を改変又は指定する配列を含むように、同定、設計、操作及び構築することができる。特定の実施形態では、カスタマイズされたＲＮＡ配列鋳型は、エキソン及び／又はトランスジーンをコードする配列を含有し、転写因子アクチベータ、抑制因子、エンハンサーなど、並びにこれらの組合せを結合部位に提供するように操作することができる。他の実施形態では、コーディング配列は、スプライスアクセプター部位、ポリＡテールを用いてさらにカスタマイズすることもできる。特定の実施形態では、ＲＮＡ配列は、ＲＬＥトランスポザーゼと相同性のＲＮＡ配列鋳型をコードする配列を含有するか、異種コーディング配列を含有するように操作されるか、又はそれらの組合せであってよい。
【０７４０】
鋳型ＲＮＡは、標的ＤＮＡに対してある程度の相同性を有し得る。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端の標的ＤＮＡに対して厳密な相同性の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００又はそれを超える塩基を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、例えば、鋳型ＲＮＡの５’末端側で、標的ＤＮＡに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％相同性の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７５、１８０、２００又はそれを超える塩基を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、本明細書に記載の非ＬＴＲレトロトランスポゾンに由来する３’非翻訳領域を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、本明細書に記載の非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、表１、２、若しくは３の非ＬＴＲレトロトランスポゾンの３’配列に対して少なくとも５０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％相同性の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００又はそれを超える塩基の３’領域を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、本明細書に記載の非ＬＴＲレトロトランスポゾンに由来する５’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、本明細書に記載の非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、表２若しくは３の非ＬＴＲレトロトランスポゾンの５’配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくはそれを超える相同性の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、若しくは２００又はそれを超える塩基の５’領域を有する。
【０７４１】
本明細書に記載のＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集システムの鋳型ＲＮＡ成分は、典型的に、システムのＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することができる。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することができる３’領域を有する。結合領域、例えば、３’領域は、例えば、少なくとも１、２若しくは３つのヘアピンループを有し、システムのＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することができる構造ＲＮＡ領域であり得る。
【０７４２】
本明細書に記載のＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集システムの鋳型ＲＮＡ成分は、典型的に、システムのＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することができる。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することができる５’領域を有する。結合領域、例えば、５’領域は、例えば、少なくとも１、２若しくは３つのヘアピンループを有し、システムのＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することができる構造ＲＮＡ領域であり得る。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、シュードノット、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノム編集タンパク質に結合することができるシュードノットを含む。
【０７４３】
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ（例えば、ヘアピンＲＮＡの非翻訳領域、例えば、５’非翻訳領域）は、ステム−ループ配列を含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ（例えば、ヘアピンＲＮＡの非翻訳領域、例えば、５’非翻訳領域）は、ヘアピンを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ（例えば、ヘアピンＲＮＡの非翻訳領域、例えば、５’非翻訳領域）は、ヘリックスを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ（例えば、ヘアピンＲＮＡの非翻訳領域、例えば、５’非翻訳領域）は、シュードノットを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、リボザイムを含む。一部の実施形態では、リボザイムは、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムと類似しており、例えば、ＨＤＶリボザイムのそれと同様の二次構造を有し、且つ／又はＨＤＶリボザイムの１つ若しくは複数の活性、例えば、自己切断活性を有する。例えば、Ｅｉｃｋｂｕｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，３１４２−３１５０を参照されたい。
【０７４４】
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ（例えば、ヘアピンＲＮＡの非翻訳領域、例えば、３’非翻訳領域）は、１つ若しくは複数のステム−ループ配列又はヘリックスを含む。Ｒ２  ３’ＵＴＲの例示的な構造は、例えば、Ｒｕｓｃｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｒ２  ＲＮＡｓ”  ＲＮＡ．２００４  Ｊｕｎ；１０（６）：９７８−９８７、例えば、その中の図３、並びにＥｉｋｂｕｓｈ  ａｎｄ  Ｅｉｋｂｕｓｈ，“Ｒ２  ａｎｄ  Ｒ２／Ｒ１  ｈｙｂｒｉｄ  ｎｏｎ−ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ”  Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ（２０１２）３：１０；例えば、その中の図３に示されており、これらの論文は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０７４５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の鋳型ＲＮＡは、本明細書に記載のＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質と結合することができる配列を含む。例えば、一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質中のＭＳ２コートタンパク質配列と結合することができるＭＳ２  ＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、Ｂ−ボックス配列と結合することができるＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質中のｄＣａｓ配列と結合することができるＲＮＡ配列（例えば、ｃｒＲＮＡ配列及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含む。一部の実施形態では、ＵＴＲに加えて、又はその代わりに、鋳型ＲＮＡは、非ＲＮＡ  ＵＴＲ、例えば、タンパク質若しくは小分子に連結（例えば、共有結合により）している。
【０７４６】
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、３’末端にポリＡ（ｐｏｌｙ−Ａ）テールを有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、３’末端にポリＡテールを含まない。
【０７４７】
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、非ＬＴＲレトロトランスポゾン、例えば、本明細書に記載の非ＬＴＲレトロトランスポゾンの５’配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくはそれを超える相同性の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００又はそれを超える塩基の５’領域を有する。
【０７４８】
本システムの鋳型ＲＮＡは、典型的に、標的ＤＮＡへの挿入のための目的配列を含む。目的配列は、コーディング又はノンコーディングであってよい。
【０７４９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、単一の鋳型ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、複数の鋳型ＲＮＡを含む。
【０７５０】
一部の実施形態では、目的配列は、オープンリーディングフレームを含んでもよい。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、Ｋｏｚａｋ配列を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、Ｔ２Ａ又はＰ２Ａ部位などの自己切断ペプチドを有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、開始コドンを有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、スプライスアクセプター部位を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、スプライスドナー部位を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、停止コドンの下流にｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、オープンリーディングフレームの停止コドンの下流にポリＡテールを有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、１つ若しくは複数のエキソンを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、１つ若しくは複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、真核生物転写終結因子を含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、増強された翻訳エレメント又は翻訳増強エレメントを含む。一部の実施形態では、このＲＮＡは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）Ｒ領域を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、核輸出を増大する翻訳後調節エレメント、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）又はウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の翻訳後調節エレメントなどを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡにおいて、異種目的配列は、ポリペプチドをコードし、５’及び３’ＵＴＲに対してアンチセンス方向にコードされる。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡにおいて、異種目的配列は、ポリペプチドをコードし、５’及び３’ＵＴＲに対してセンス方向にコードされる。
【０７５１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を用いて、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムの標的細胞特異性を増大する。例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位は、非標的細胞型に存在するｍｉＲＮＡにより認識されるが、標的細胞型に存在しない（又は標的細胞に比べて低いレベルで存在する）という基準に基づいて選択することができる。従って、鋳型ＲＮＡが非標的細胞中に存在する場合、それは、ｍｉＲＮＡに結合されることになり、鋳型ＲＮＡが標的細胞中に存在すれば、それは、ｍｉＲＮＡに結合されない（又は標的細胞に比べて低いレベルでしか結合されない）。理論に縛られることは望まないが、鋳型ＲＮＡとｍｉＲＮＡの結合は、ゲノムへの異種目的配列の挿入を妨害し得る。従って、異種目的配列は、非標的細胞のゲノムよりも効率的に、標的細胞のゲノムに挿入され得る。また、鋳型ＲＮＡ（又はそれをコードするＤＮＡ）内のｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を有するシステムは、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて使用することもでき、その際、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドの発現は、例えば、本明細書において、例えば、「Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ遺伝子エディターシステムのポリペプチド成分」と題するセクションに記載されるように、第２のｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位により調節される。
【０７５２】
一部の実施形態では、目的配列は、ノンコーディング配列を含み得る。例えば、鋳型ＲＮＡは、プロモータ又はエンハンサー配列を含み得る。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、組織特異的プロモータ又はエンハンサーを含み、その各々は、一方向又は二方向であってよい。一部の実施形態では、プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである。一部の実施形態では、プロモータは、ＴＡＴＡエレメントである。一部の実施形態では、プロモータは、Ｂ認識エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータは、転写因子のための１つ又は複数の結合部位を有する。一部の実施形態では、ノンコーディング配列は、５’及び３’ＵＴＲに対してアンチセンス方向に転写される。一部の実施形態では、ノンコーディング配列は、５’及び３’ＵＴＲに対してセンス方向に転写される。
【０７５３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、プロモータ配列、例えば、組織特異的プロモータ配列を含む。一部の実施形態では、組織特異的プロモータを用いて、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムの標的細胞特異性を高める。例えば、プロモータは、標的細胞型で活性であるが、非標的細胞型では活性ではない（又は低いレベルで活性である）という基準に基づいて選択することができる。従って、プロモータが、非標的細胞のゲノムに組み込まれたとしても、組み込まれた遺伝子の発現を駆動しない（又は低レベルの発現しか駆動しない）。また、鋳型ＲＮＡ内に組織特異的プロモータ配列を有するシステムは、本明細書に記載されるように、例えば、鋳型ＲＮＡ又はＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質をコードする核酸内で、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位と組み合わせて使用してもよい。さらに、鋳型ＲＮＡ内に組織特異的プロモータ配列を有するシステムは、非標的細胞よりも標的細胞において高レベルのＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質を達成するために、組織特異的プロモータにより駆動されるＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒポリペプチドをコードするＤＮＡと組み合わせて使用してもよい。
【０７５４】
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列、ｓｉＲＮＡ配列、ガイドＲＮＡ配列、ｐｉｗｉＲＮＡ配列を含む。
【０７５５】
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、エピジェネティック修飾を調整する部位を含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、エピジェネティックサイレンシングを阻害、例えば、阻止するエレメントを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、クロマチンインスレータを含む。例えば、鋳型ＲＮＡは、ＣＴＣＦ部位又はＤＮＡメチル化のためにターゲティングされる部位を含む。
【０７５６】
より高レベル又はより安定した遺伝子発現を促進するために、鋳型ＲＮＡは、遺伝子サイレンシングを阻止又は阻害する特徴を含み得る。一部の実施形態では、これらの特徴は、ＤＮＡメチル化を阻止又は阻害する。一部の実施形態では、これらの特徴は、ＤＮＡ脱メチル化を促進する。一部の実施形態では、これらの特徴は、ヒストン脱アセチル化を阻止又は阻害する。一部の実施形態では、これらの特徴は、ヒストンメチル化を阻止又は阻害する。一部の実施形態では、これらの特徴は、ヒストンアセチル化を促進する。一部の実施形態では、これらの特徴は、ヒストン脱メチル化を促進する。一部の実施形態では、これらの修飾の１つ又は複数を促進するために、複数の特徴を鋳型ＲＮＡに組み込むことができる。ＣｐＧジヌクレオチドは、宿主メチルトランスフェラーゼによるメチル化を被る。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、ＣｐＧジヌクレオチドが枯渇しており、例えば、ＣｐＧヌクレオチドを含まないか、又は対応する非改変配列と比較して少数のＣｐＧジヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組み込まれたＤＮＡからのトランスジーン発現を駆動するプロモータは、ＣｐＧジヌクレオチドが枯渇している。
【０７５７】
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、エフェクター配列に作動可能に連結した少なくとも１つの調節領域から成る遺伝子発現単位を含む。エフェクター配列は、ＲＮＡに転写される配列（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡをコードする配列などのコーディング配列又はノンコーディング配列）であってもよい。
【０７５８】
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、内在性イントロン内の標的ゲノムに挿入される。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、標的ゲノムに挿入され、これにより新たなエキソンとして作用する。一部の実施形態では、標的ゲノムへの目的配列の挿入によって、天然エキソンの置換又は天然エキソンのスキッピングが起こる。
【０７５９】
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、又はＲＯＳＡ２６などのゲノムセーフハーバー部位で標的ゲノムに挿入される。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、遺伝子間又は遺伝子内領域中のゲノムに付加される。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、内在性活性遺伝子から０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ内のゲノム５’又は３’に付加される。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、内在性プロモータ又はエンハンサーから０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ内のゲノム５’又は３’に付加される。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの目的配列は、例えば、５０〜５０，０００塩基対（例えば、５０〜４０，０００ｂｐ、５００〜３０，０００ｂｐ、５００〜２０，０００ｂｐ、１００〜１５，０００ｂｐ、５００〜１０，０００ｂｐ、５０〜１０，０００ｂｐ、５０〜５０，０００ｂｐであり得る。一部の実施形態では、異種目的配列は、１，０００、１，３００、１５００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、又は７，５００ヌクレオチド長未満である。
【０７６０】
一部の実施形態では、ゲノムセーフハーバー部位は、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、５ＳｒＤＮＡ、１８ＳｒＤＮＡ、５．８ＳｒＤＮＡ、又は２８ＳｒＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、５ＳｒＤＮＡ内のＭｕｔｓｕ部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、２８ＳｒＤＮＡ内のＲ２部位、Ｒ５部位、Ｒ６部位、Ｒ４部位、Ｒ１部位、Ｒ９部位、又はＲＴ部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、１８ＳｒＤＮＡ内のＲ８部位又はＲ７部位である。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、ｔＲＮＡ−Ａｓ又はｔＲＮＡ−ＧｌｕをコードするＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、スプライソソームＲＮＡをコードするＤＮＡである。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、Ｕ２ｓｎＲＮＡなどの低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）をコードするＤＮＡである。
【０７６１】
従って、いくつかの態様では、本開示は、異種目的配列をＮａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位に挿入する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載のＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムを使用するステップ、例えば、表１〜３のいずれかのポリペプチド、又はそれに対して類似性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％同一性を有するポリペプチドを使用するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、酵素、例えば、レトロトランスポザーゼを用いて、異種目的配列をＮａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位に挿入するステップを含む。いくつかの態様では、本開示は、細胞のゲノム内のＮａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位に位置する異種目的配列（例えば、治療ポリペプチドをコードする配列）を含む宿主ヒト細胞を提供する。一部の実施形態では、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈａｒｂｏｒ（商標）部位は、以下の表４に記載する部位である。一部の実施形態では、異種目的配列は、表４に示す配列の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、若しくは１０００塩基対内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表４に示す配列の０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表４に示す配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する部位に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表４に示す配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する部位の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、若しくは１０００塩基対内、又は０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ内に挿入される。一部の実施形態では、異種目的配列は、表４の第５列に示す遺伝子内、又はその遺伝子の２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、若しくは１０００塩基対内、又は０．１ｋｂ、０．２５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、５０、７５ｋｂ、若しくは１００ｋｂ内に挿入される。
【０７６２】
【表４７０】
2021534798.tif 000472
【０７６３】
【表４７１】
2021534798.tif 000473
【０７６４】
【表４７２】
2021534798.tif 000474
【０７６５】
【表４７３】
2021534798.tif 000475
【０７６６】
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステム又は方法は、ヒトゲノム内の標的部位への異種配列の挿入を達成する。一部の実施形態では、ヒトゲノム内の標的部位は、それが天然に由来する生物のゲノム内の対応する野生型レトロトランスポザーゼ（例えば、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒが由来するレトロトランスポザーゼ）の対応する標的部位に対して配列類似性を有する。例えば、一部の実施形態では、挿入部位の中心に位置するヒトゲノム配列の４０ヌクレオチドと、挿入部位の中心に位置するネイティブ生物ゲノムの４０ヌクレオチドとの間の同一性は、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、又は５０％未満、又は５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、若しくは９０〜１００％の範囲である。一部の実施形態では、挿入部位の中心に位置するヒトゲノム配列の１００ヌクレオチドと、挿入部位の中心に位置するネイティブ生物ゲノム配列の１００ヌクレオチドとの間の同一性は、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、又は５０％未満、又は５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、若しくは９０〜１００％の範囲である。一部の実施形態では、挿入部位の中心に位置するヒトゲノム配列の５００ヌクレオチドと、挿入部位の中心に位置するネイティブ生物ゲノムの５００ヌクレオチドとの間の同一性は、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、又は５０％未満、又は５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、若しくは９０〜１００％の範囲である。
【０７６７】
組成物及びシステムの作製
当業者には理解されるように、核酸構築物及びタンパク質又はポリペプチド（例えば、本明細書に記載のシステム、構築物及びポリペプチド）を設計及び構築する方法は、当技術分野において常用的である。一般に、組換え法が使用され得る。概略については、Ｓｍａｌｅｓ  ＆  Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ  ＆  Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。核酸組成物を設計、調製、評価、精製及び操作する方法は、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
【０７６８】
本明細書に記載の医薬用タンパク質又はポリペプチドを生産する例示的な方法は、哺乳動物細胞での発現を含むが、適切なプロモータの制御下の昆虫細胞、酵母、細菌、又は他の細胞を用いて、組換えタンパク質を生産することもできる。哺乳動物発現ベクターは、非転写因子、例えば、複製起点、好適なプロモータ、並びに他の５’若しくは３’フランキング非転写配列、及び５’若しくは３’非転写配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、並びに終結配列を含み得る。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０オリジン、アーリープロモータ、スプライス、及びポリアデニル化部位を使用して、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝因子を提供することができる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主での使用に適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
【０７６９】
様々な哺乳動物細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現させ、製造することができる。哺乳動物発現系の例として、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬＡ、及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬生産のための宿主培養方法は、Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ（Ｅｄｓ．），Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１４）に記載されている。本明細書に記載の組成物は、組換えタンパク質をコードするベクター、例えば、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを含み得る。一部の実施形態では、ベクター、例えば、ウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含み得る。
【０７７０】
タンパク質治療薬の精製については、Ｆｒａｎｋｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。
【０７７１】
適用
コーディング遺伝子をＲＮＡ配列鋳型に組み込むことにより、例えば、機能喪失型変異を有する個体において治療トランスジーンの発現を提供することにより、機能獲得型変異を正常なトランスジーンで置換することにより、機能獲得型変異発現を排除するために調節配列を賦与することにより、及び／又は作動可能に連結した遺伝子、トランスジーン及びそのシステムの発現を制御することによって、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムは、治療ニーズに対処することができる。特定の実施形態では、ＲＮＡ配列鋳型は、宿主細胞の治療ニーズに特異的なプロモータ領域、例えば、組織特異的プロモータ又はエンハンサーをコードする。また別の実施形態では、プロモータは、コーディング配列と作動可能に連結させることができる。
【０７７２】
複数の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）遺伝子エディターシステムは、例えば、代用血液因子又は代用酵素、例えば、リソソーム酵素を発現する治療トランスジーンを提供することができる。例えば、本明細書に記載の組成物、システム及び方法は、標的ヒトゲノムにおいて、ファブリー病治療のためのアガルシダーゼアルファ又はベータ；ゴーシェ病のためのイミグルセラーゼ、タリグルセラーゼアルファ、ベラグルセラーゼアルファ、又はアルグルセラーゼ；リソソーム酸性リパーゼ欠損症（ウォルマン病／ＣＥＳＤ）のためのセベリパーゼアルファ；ムコ多糖症のためのラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ、又はガルスルファーゼ；ポンペ病のためのアルグルコシダーゼを発現するのに有用である。例えば、本明細書に記載の組成物、システム及び方法は、標的ヒトゲノムにおいて、血液因子欠損症のための因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ又はＸＩＩＩを発現するのに有用である。
【０７７３】
一部の実施形態では、異種目的配列は、細胞内タンパク質（例えば、細胞質タンパク質、核タンパク質、ミトコンドリアタンパク質若しくはリソソームタンパク質などのオルガネラタンパク質、又は膜タンパク質）をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、膜タンパク質、例えば、ＣＡＲ以外の膜タンパク質、及び／又は内在性ヒト膜タンパク質をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、細胞外タンパク質をコードする。一部の実施形態では、異種目的配列は、酵素、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、センサータンパク質、モータータンパク質、防御タンパク質、又は貯蔵タンパク質をコードする。
【０７７４】
投与
本明細書に記載の組成物及びシステムは、インビトロ又はインビボで使用され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、例えば、インビトロ又はインビボで細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞）に送達される。一部の実施形態では、細胞は、真核生物細胞、例えば、多細胞生物、例えば、動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウシ）、鳥（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、若しくはアヒルなどの家禽）、又は魚類の細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト以外の動物細胞（例えば、実験動物、家畜、又はペット）である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞（例えば、造血幹細胞）、線維芽細胞、又はＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非分裂細胞、例えば、非分裂線維芽細胞又は非分裂Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＨＳＣであり、ｐ５３は、上方制御されていないか、又は例えば、実施例３０に記載の方法に従い測定して、１０％、５％、２％、若しくは１％未満上方制御されている。当業者であれば、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムの成分が、ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及びそれらの組合せの形態で送達され得ることは理解されよう。
【０７７５】
例えば、送達には、レトロトランスポザーゼ（例えば、レトロトランスポザーゼタンパク質をコードするＤＮＡとして、レトロトランスポザーゼタンパク質をコードするＲＮＡとして、又はタンパク質自体として）及び鋳型ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡをコードするＤＮＡとして、又はＲＮＡとして）を送達するための以下の任意の組合せを使用することができる：
１．レトロトランスポザーゼＤＮＡ＋鋳型ＤＮＡ
２．レトロトランスポザーゼＲＮＡ＋鋳型ＤＮＡ
３．レトロトランスポザーゼＤＮＡ＋鋳型ＲＮＡ
４．レトロトランスポザーゼＲＮＡ＋鋳型ＲＮＡ
５．レトロトランスポザーゼタンパク質＋鋳型ＤＮＡ
６．レトロトランスポザーゼタンパク質＋鋳型ＲＮＡ
７．レトロトランスポザーゼウイルス＋鋳型ウイルス
８．レトロトランスポザーゼウイルス＋鋳型ＤＮＡ
９．レトロトランスポザーゼウイルス＋鋳型ＲＮＡ
１０．レトロトランスポザーゼＤＮＡ＋鋳型ウイルス
１１．レトロトランスポザーゼＲＮＡ＋鋳型ウイルス
１２．レトロトランスポザーゼタンパク質＋鋳型ウイルス
【０７７６】
上述したように、一部の実施形態では、レトロトランスポザーゼタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡは、ウイルスを用いて送達され、一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、ウイルスを用いて送達される。
【０７７７】
一部の実施形態では、システム及び／又はシステムの成分は、核酸として送達される。例えば、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒポリペプチドは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの形態で送達してもよく、鋳型ＲＮＡは、ＲＮＡ又はＲＮＡに転写しようとするその相補的ＤＮＡの形態で送達してもよい。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、１、２、３、４、又はそれ以上の個別の核酸分子上で送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＤＮＡ及びＲＮＡの組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＤＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＲＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＲＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターポリペプチドはタンパク質として送達される。
【０７７８】
一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ベクターを用いて、細胞、例えば、哺乳動物細胞又はヒト細胞に送達される。ベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスであってもよい。一部の実施形態では、送達は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、又はインサイチュである。一部の実施形態では、ウイルスは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルスである。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ウイルス様粒子又はビロソームを用いて細胞に送達される。一部の実施形態では、送達には、ウイルス、ウイルス様粒子又はビロソームを使用する。
【０７７９】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物及びシステムは、リポソーム又は他の類似の小胞体中に製剤化することができる。リポソームは、内部水性コンパートメントを取り囲む単層又は多重層脂質二重膜と、比較的不透過性の外側親油性リン脂質二重膜から構成される球状の小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってよい。リポソームは、生体適合性、非中毒性であり、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達し、それらのカーゴをプラズマ酵素による分解から保護すると共に、それらのロードを生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を介して輸送することができる（例えば、論評については、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
【０７８０】
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から製造することができるが；薬物担体としてリポソームを作製するためにはリン脂質が最も一般的に使用される。多重層小胞脂質の調製方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照；多重層小胞脂質の調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。脂質膜を水溶液と混合すれば、小胞形成は自然に起こり得るが、ホモジナイザー、超音波発生装置、又は押出機を用いて振盪の形態で力を加えることにより、それを促進することもできる（例えば、論評については、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押出脂質は、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７−６５２，１９９７（押出脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、サイズ漸減フィルターを介した押出により調製することができる。
【０７８１】
脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の医薬組成物のための生体適合性及び生分解性送達系を提供する担体のもう１つの例である。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特徴を保持し、薬物安定性及び負荷容量を向上させると共に、薬物漏出を防ぐ、修飾固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬物送達の重要な成分である。これらのナノ粒子は、特定の標的に対して薬物送達を効果的に指向し、薬物安定性及び薬物放出制御を改善する。また、脂質−ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）、即ち、リポソーム及びポリマーを組み合わせた新しいタイプの担体を使用してもよい。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの相補的利点を有する。ＰＬＮは、コア−シェル構造から構成され；ポリマーコアは、安定した構造を提供し、リン脂質シェルは良好な生体適合性を賦与する。このように、２つの成分は、薬物封入効率を高め、表面修飾を促進すると共に、水溶性薬物の漏出を防ぐ。例えば、論評については、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。
【０７８２】
また、本明細書に記載の組成物及びシステム用の薬物送達ビヒクルとしてエキソソームを使用することもできる。例えば、論評については、Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｕｌｙ  ２０１６．Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ  ６，Ｉｓｓｕｅ  ４，Ｐａｇｅｓ  ２８７−２９６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。
【０７８３】
ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒシステムを細胞、組織及び多細胞生物に導入することができる。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、機械的手段又は物理的手段を用いて、細胞に送達される。
【０７８４】
タンパク質治療薬の製剤化は、Ｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｓｅｒｉｅｓ（２０１２）に記載されている。
【０７８５】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、特許、並びに他の出版物及び参照文献（例えば、配列データベース参照番号）は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書に、例えば本明細書の任意の表に参照として掲載されるＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、及びＥｎｔｒｅｚは全て、参照により本明細書に組み込まれる。別に明示されない限り、本明細書の全ての表を含め、本明細書に記載される配列アクセッション番号は、２０１８年８月２７日現在で最新のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子又はタンパク質に複数の配列アクセッション番号が付いている場合、これら配列変異体の全てが包含される。
【実施例】
【０７８６】
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。これらの実施例は、説明の目的で提供されるものであり、本発明の範囲又は内容を限定するものとして解釈すべきではない。
【０７８７】
実施例１：哺乳動物細胞へのＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの送達
この実施例では、哺乳動物細胞ゲノムへの外因性ＤＮＡの部位特異的挿入のために哺乳動物細胞に送達されるＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを説明する。
【０７８８】
この実施例では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムのポリペプチド成分は、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のＲ２Ｂｍタンパク質であり、鋳型ＲＮＡ成分は、逆転写酵素ドメインに、レトロトランスポザーゼを不活性にする突然変異を含むカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のＲ２ＢｍレトロトランスポザーゼのＲＮＡである。
【０７８９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする：
１．スクランブルＲＮＡ対照
２．前述のポリペプチドをコードするＲＮＡ
３．前述の鋳型ＲＮＡ
４．２と３の組合せ
【０７９０】
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を少なくとも４日間培養し、部位特異的ゲノム編集について検定する。ゲノムＤＮＡを各群のＨＥＫ２９３細胞から単離する。２８ｓｒＲＮＡ遺伝子中のＲ２Ｂｍ組込み部位と隣接するプライマーを用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させて、増幅したＤＮＡの長さを測定する。
【０７９１】
変異Ｒ２Ｂｍレトロトランスポザーゼの配列を標的ゲノムに挿入するＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）ゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのＰＣＲ産物は、上の群４の完全Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムでトランスフェクトした細胞だけに観察される。
【０７９２】
実施例２：昆虫細胞へのＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの部位特異的送達
この実施例では、ゲノムの特異的標的部位で、昆虫細胞に送達されるＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノム編集システムを説明する。
【０７９３】
この実施例では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムのポリペプチド成分は、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＲ２Ｂｍ由来であり、これは、ポリペプチドのアミノ末端におけるそのＤＮＡ結合ドメインを異種ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインで置換することによって修飾されている。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、カイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）細胞のＢｍＢＬＯＳ２遺伝子座中のＤＮＡと結合することがわかっている（Ｔａｋａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０（１０）：７５９−７６５，２０１０）。鋳型ＲＮＡは、逆転写酵素ドメインに、レトロトランスポザーゼを不活性にする突然変異を含むカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のＲ２ＢｍレトロトランスポザーゼのＲＮＡである。さらに、鋳型ＲＮＡは、標的ＤＮＡ部位と相同性の１８０塩基を有するように、５’末端で修飾されている。
【０７９４】
カイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）昆虫細胞株は、以下の試験物質でトランスフェクトする：
１．スクランブルＲＮＡ対照
２．前述のポリペプチド成分をコードするＲＮＡ
３．前述の鋳型ＲＮＡ
４．２と３の組合せ
【０７９５】
トランスフェクション後、細胞を少なくとも４日間培養し、部位特異的Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）ゲノム編集について検定する。ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、ゲノム中の標的組込み部位と隣接するプライマーを用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させて、ＤＮＡの長さを測定する。変異Ｒ２Ｂｍレトロトランスポザーゼの配列を標的昆虫細胞ゲノムに挿入するＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）ゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのＰＣＲ産物は、上の群４の完全Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムでトランスフェクトした細胞だけに観察される。
【０７９６】
実施例３：哺乳動物細胞へのＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムの部位特異的送達
この実施例では、哺乳動物ゲノムの特異的部位に異種配列を挿入するために使用されるＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）ゲノムエディターシステムを説明する。
【０７９７】
この実施例では、システムのポリペプチドは、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のＲ２Ｂｍタンパク質であり、鋳型ＲＮＡ成分は、ＧＦＰタンパク質をコードするＲＮＡであり、これは、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のＲ２Ｂｍレトロトランスポザーゼの５’ＵＴＲが５’末端に、３’ＵＴＲが３’末端にフランキングしている。ＧＦＰ遺伝子は、その開始コドンの上流にリボソーム進入部位を、また停止コドンの下流にポリＡテールを有する。
【０７９８】
ＨＥＫ２９３細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする：
１．スクランブルＲＮＡ対照
２．前述のポリペプチドをコードするＲＮＡ
３．前述のＧＦＰをコードする鋳型ＲＮＡ
４．２と３の組合せ
【０７９９】
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３細胞を少なくとも４日間培養し、部位特異的Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）ゲノム編集事象について検定する。ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞から単離し、２８ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子中のＲ２Ｂｍ組込み部位とフランキングするプライマーを用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させて、ＤＮＡの長さを測定する。Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）ゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのＰＣＲ産物は、群４の試験物質（完全Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム）でトランスフェクトした細胞に検出される。この結果は、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集システムが、新しいトランスジーンを哺乳動物細胞ゲノムに挿入することができることを立証するものである。
【０８００】
トランスフェクトした細胞をさらに１０日間培養し、複数の細胞培養継代後に、ＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーにより検定する。各細胞集団からＧＦＰ陽性の細胞のパーセントを算出する。ＧＦＰ陽性細胞は、群４の試験物質（完全Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム）でトランスフェクトした細胞に検出される。この結果は、哺乳動物細胞ゲノムに書き込まれた新しいトランスジーンが発現されることを立証するものである。
【０８０１】
実施例４：Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いた哺乳動物細胞への遺伝子発現単位の標的送達
この実施例では、哺乳動物ゲノムに異種遺伝子発現単位を挿入するためのＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターの作製及び使用を説明する。
【０８０２】
この実施例では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステムのポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ末端におけるそのＤＮＡ結合ドメインを異種ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインで置換することにより修飾されたカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＲ２Ｂｍポリペプチドから得られる。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、ヒト細胞のＡＡＶＳ１遺伝子座内のＤＮＡと結合することがわかっている（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（９）：８５１−８５７，２００９）。鋳型ＲＮＡは、遺伝子発現単位を含む。遺伝子発現単位は、少なくとも１つのコーディング配列と作動可能に連結した少なくとも１つの調節配列を含む。この実施例では、調節配列は、ＣＭＶプロモータ及びエンハンサー、増強された翻訳エレメント、及びＷＰＲＥを含む。コーディング配列は、ＧＦＰオープンリーディングフレームである。遺伝子発現単位は、５’末端で標的ＤＮＡ部位と相同性の１８０塩基と、また３’末端でカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のＲ２Ｂｍレトロトランスポザーゼの３’ＵＴＲと隣接している。
【０８０３】
ＨＥＫ２９３細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする：
１．スクランブルＲＮＡ対照
２．前述のポリペプチド成分をコードするＲＮＡ
３．遺伝子発現単位を含む鋳型ＲＮＡ（前述の通り）
４．（２）と（３）の両方を含む完全Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステム
【０８０４】
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３細胞を少なくとも４日間培養し、部位特異的Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集について検定する。ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞から単離し、ゲノム中の標的組込み部位とフランキングするプライマーを用いて、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させて、ＤＮＡの長さを測定する。Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇ（商標）ゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのＰＣＲ産物は、群４の試験物質（完全Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システム）でトランスフェクトした細胞に検出される。
【０８０５】
トランスフェクトした細胞をさらに１０日間培養し、複数の細胞培養継代後に、ＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーにより検定する。各細胞集団からＧＦＰ陽性の細胞のパーセントを算出する。ＧＦＰ陽性細胞は、群４の試験物質でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の集団に検出され、これは、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集により哺乳動物細胞ゲノムに付加された遺伝子発現単位が発現されることを立証するものである。
【０８０６】
実施例５：Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒ（商標）システムを用いた哺乳動物細胞のイントロン領域への遺伝子発現単位の標的送達
この実施例では、上流エキソンのスプライスアクセプターとして作用させる目的で、異種配列をイントロン領域に付加するためのＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集システムの作製及び使用を説明する。
【０８０７】
標的組込み部位は、アルブミン遺伝子座の第１イントロンである。第１イントロンへの、５’末端にスプライスアクセプター部位を、また３’末端にポリＡテールを含む新しいエキソンのスプライシングによって、新たなエキソンにスプライシングされたアルブミン遺伝子座の第１天然エキソンを含有する成熟ｍＲＮＡが得られる。タンパク質プロセシングの際にアルブミンの第１エキソンが除去されるため、新しく形成された遺伝子単位を発現する細胞は、新しいエキソンだけを含む成熟タンパク質を分泌することになる。
【０８０８】
この実施例では、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ末端のＤＮＡ結合ドメインを異種ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインで置換することにより修飾されたカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＲ２Ｂｍ  Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒゲノムエディターから得られる。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、Ｓａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２６，１５：１７７７−１７８４，２０１５に記載されているように、第１イントロン内のアルブミン遺伝子座と密接に結合することがわかっている。鋳型ＲＮＡは、成熟ＥＰＯ（開始コドン及びシグナルペプチドが除去されている）の第１アミノ酸に５’側で隣接するスプライスアクセプター部位と、停止コドンの下流に３’ポリＡテールとを含むＥＰＯをコードするＲＮＡである。ＥＰＯ  ＲＮＡは、５’末端で標的ＤＮＡ部位と相同性の１８０塩基と、また３’末端でカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のＲ２Ｂｍレトロトランスポザーゼの３’ＵＴＲとフランキングしている。
【０８０９】
ＨＥＫ２９３細胞は、以下の試験物質でトランスフェクトする：
１．スクランブルＲＮＡ対照
２．前述のポリペプチドをコードするＲＮＡ
３．前述のＥＰＯスプライスアクセプターを含む鋳型ＲＮＡ
４．（２）と（３）の両方を含む完全Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒシステム
【０８１０】
トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３細胞を少なくとも４日間培養し、部位特異的Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集及び適切なｍＲＮＡプロセシングについて検定する。ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞から単離する。逆転写−ＰＣＲを実施して、アルブミン遺伝子座の第１天然エキソンと、新しいエキソンとを含む成熟ｍＲＮＡを測定する。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、アルブミン遺伝子座の第１天然エキソンに結合するフォワードプライマー、及びＥＰＯに結合するリバースプライマーを用いて実施する。ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させて、ＤＮＡの長さを測定する。Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集事象の成功を示す、予想長さのＰＣＲ産物は、群４の試験物質でトランスフェクトした細胞に検出される。この結果は、Ｇｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集システムが、上流エキソンのスプライスアクセプターとして作用させる目的で、或る遺伝子をコードする異種配列をイントロン領域に付加することができることを立証するものである。
【０８１１】
トランスフェクトした細胞をさらに１０日間培養し、複数の細胞培養継代後に、細胞上清中のＥＰＯ分泌について検定する。上清中のＥＰＯの量は、ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキットにより測定する。ＥＰＯは、群４の試験物質でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に検出され、これは、上流エキソンのスプライスアクセプターとして作用させる目的で、異種配列をＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｉｎｇゲノム編集によりイントロン領域に付加することができ、この配列が活性に発現されることを立証するものである。
【０８１２】
実施例６：哺乳動物細胞へのＲ２Ｔｇレトロトランスポゾンの標的送達
この実施例では、ＤＮＡ又はＲＮＡ送達による哺乳動物細胞へのＲ２Ｔｇレトロトランスポゾンエレメント（本明細書の表３の第１行を参照）の標的組込みを説明する。
【０８１３】
Ｒ２Ｔｇは、ゼブラフィンチ（キンカチョウ（Ｔａｅｎｏｐｙｇｉａ  ｇｕｔｔａｔａ））由来の内在性レトロトランスポゾンである。非ＬＴＲ  Ｒ２エレメントはヒトゲノム中に存在せず、しかも高度に部位特異的であると考えられるため、Ｒ２Ｔｇが自身をヒトゲノムに正確且つ効率的に組み込む能力は、ゲノム標的組込みを実施し、おそらくヒトの遺伝子療法を可能にする能力を立証し得る。
【０８１４】
ＤＮＡ送達方法では、Ｒ２Ｔｇを保有するプラスミド（ＰＬＶ０１４）は、Ｒ２Ｔｇエレメントがコドン最適化され、且つ、そのネイティブ非翻訳領域（ＵＴＲ）とフランキングするように設計及び合成され、ｒＤＮＡ標的遺伝子座に対する１００ｂｐ相同性とのさらなるフランキングを伴う、又は伴わない。Ｒ２Ｔｇエレメント発現は、哺乳動物ＣＭＶプロモータにより駆動した。さらに、レトロトランスポザーゼのコーディング配列内にフレームシフトを有する１ｂｐ欠失変異体（６７８＊）を不活性化対照として構築した（「フレームシフト変異体」）。ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬により各プラスミドをＨＥＫ３９３Ｔ細胞に導入した。トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで接種した。トランスフェクションの日に、０．５μｌのトランスフェクション試薬と８０ｎｇのＤＮＡを１０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で混合し、室温で１５分間インキュベートした。次に、トランスフェクション混合物を接種細胞の培地に添加した。トランスフェクションから３日後、ゲノムＤＮＡをレトロ転位アッセイのために抽出した。
【０８１５】
次に、ヒトゲノムへのＲ２Ｔｇトランスポザーゼの組込みを評価した。フィンチゲノムに対する相同性に基づき、ヒトｒＤＮＡ中の推定組込み部位を試験した。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｓｅｑ及びｄｄＰＣＲアッセイを使用して、組込みを評価した。
【０８１６】
最初のＰＣＲにランダムユニーク分子指数（ＵＭＩ）を導入することにより、Ｍｉｓｅｑライブラリー構築中のバイアスを排除した（図７）。初めに、Ｒ２ＴｇとｒＤＮＡ遺伝子座の予想３’接合部を３０サイクル増幅することにより、ネステッドＰＣＲを実施した。この段階で、１つのＭｉｓｅｑアダプター、マルチプレックス化バーコード、及び８ｂｐ  ＵＭＩを導入した。２回目のＰＣＲを使用して、予想産物をさらに濃縮し、第２のＭｉｓｅｑアダプターを付加した。サンプルをＭｉｓｅｑで３００サイクルシーケンシングした。デマルチプレックス化の後、サンプルをＭａｔｌａｂにより解析した。初めに、隣接配列を検索することにより、各配列上のＵＭＩを位置決定した。ＵＭＩのデータベースを作成し、次に一意性により崩壊させた。各々ユニークなリードについて、予想ｒＤＮＡ組込み部位の配列、並びにアラインメントされたヒトゲノムＤＮＡと外性ＤＮＡの単離された配列の検索を実施した。次に、外性ＤＮＡを予想組込み配列とアラインメントした。Ｍｉｓｅｑ解析パイプラインの結果を図８Ａ〜８Ｂに示す。標的ｒＤＮＡに対する１００ｂｐ相同性とフランキングする野生型Ｒ２Ｔｇ構築物で処理した細胞に、予測される組込み部位への多量のユニークな組込みが見出されたが、フレームシフト変異体対照で処理したものはそうではなかった。ほとんどの組込み事象は、予想配列と完全にアラインメントするリードをシーケンシングすることにより証明される通り、組込み部位の５６５ｂｐ最近位に組み込まれる完全な鋳型ＲＮＡ配列を有する。実験Ｒ２Ｔｇを含む組込み事象のサブセットは、標的部位に隣接するギャップ後に予想配列とアラインメントするリードのシーケンシングに基づいて、約３００ｂｐ又は約４５０切断のいずれかを有する（図８Ａ）。より具体的には、観察される組込み体の８６．１７％は、組込み部位の５６５ｂｐ最近位で非切断型であった。対照的に、図８Ｂは、組込み事象の検出を全く示さない。フランキングするｒＤＮＡ相同性のない構築物は、ノイズ付近に重要ではない組込みシグナルを示した。
【０８１７】
次に、ｄｄＰＣＲを実施して、組込みを確認し、組込み効率を評価する。ＴａｑｍａｎプローブをＲ２Ｔｇエレメントの３’ＵＴＲ部分に設計した。フォワードプライマーは、プローブの上流に直接結合するように合成し、リバースプライマーは、ｒＤＮＡに結合するように合成した。従って、組込み接合部にわたる予想産物の増幅によって、プローブが分解し、蛍光シグナルが生成される。前述のプラスミドのいくつかの複製実験でｄｄＰＣＲを実施して、Ｒ２Ｔｇ組込み事象の平均コピー数を決定した。ｄｄＰＣＲコピー数分析の結果（参照遺伝子ＲＰＰ３０と比較して）を図９に示す。いくつかのプラスミドトランスフェクション条件の間で、相同性と共に送達された場合、標的部位のゲノム当たり平均５以上のＲ２Ｔｇのコピーの組込みが、対照構築物よりも有意な増加を伴って認められた。対照的に、フレームシフト変異体ネガティブ対照におけるゲノム当たりの平均コピー数は、典型的に１未満であった。相同性のない構築物を細胞に送達した場合、重要ではないシグナルが観察された。これらの実験は、標的部位のヒト細胞へのＲ２Ｔｇレトロトランスポゾンの効率的な組込みを示唆するものである。
【０８１８】
ＲＮＡ送達方法では、Ｒ２Ｔｇ  ＲＮＡ（ＲＮＡ  Ｖ０１９）は、Ｒ２Ｔｇエレメントが、コドン最適化され、そのネイティブ非翻訳領域（ＵＴＲ）にフランキングされるように設計した。より具体的には、構築物は、順に以下：Ｔ７プロモータ、５’２８Ｓ標的相同性領域１００ヌクレオチド長、Ｒ２Ｔｇ野生型５’ＵＴＲ、Ｒ２Ｔｇコドン最適化コード配列、Ｒ２Ｔｇ野生型３’ＵＴＲ、及び３’２８Ｓ標的相同性領域１００ヌクレオチド長を含む。組込みを増強するために、１００ｂｐの２８Ｓ相同性配列をＵＴＲの外部に付加した。Ｒ２Ｔｇ  ＲＮＡを合成し、キャップ及びポリＡテールを付加した。Ｒ２Ｔｇエレメント転写をＴ７プロモータにより駆動した。一連のＲＮＡ用量と共に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ又はＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｍＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて、ＲＮＡをＨＥＫ３９３Ｔ細胞に導入した。トランスフェクションの２４ｈｒ前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに接種した。トランスフェクションの日に、トランスフェクション試薬とＲＮＡを１０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で混合し、トランスフェクション混合物を接種細胞の培地に添加した。トランスフェクションから３日後、ＤＮＡ送達と同じ設計のｄｄＰＣＲを用いて、ゲノムＤＮＡを抽出し、レトロ転位効率を測定した。
【０８１９】
ｄｄＰＣＲコピー数分析の結果（参照遺伝子ＲＰＰ３０に対して正規化）を図１２に示す。いくつかのトランスフェクション条件について、平均組込みは、測定によってゲノム当たり０．０１のＲ２Ｔｇコピーであることが判明し、検出限界を有意に超えた。これらの結果は、ＲＮＡ送達方法を用いたヒト細胞へのＲ２Ｔｇレトロトランスポゾンの組込みの成功を示すものである。
【０８２０】
実施例７：Ｒ２Ｔｇレトロトランスポゾンを用いた哺乳動物細胞への異種目的配列の標的送達
この実施例では、複数の送達機構を備えたＲ２Ｔｇレトロトランスポゾンシステムの使用による、ヒト細胞へのトランスジーンの送達を説明するが、これは、Ｒ２Ｔｇレトロトランスポゾンシステムの使用による、ヒト細胞への異種目的配列のＲＮＡ媒介送達を含む。
【０８２１】
Ｒ２タンパク質は、各エレメントの非翻訳領域（ＵＴＲ）内でそれらの鋳型ＲＮＡ構造を認識して、リボ核タンパク質粒子を形成し、これは、宿主ゲノムへの下流組込みの中間体として役立つ。従って、Ｒ２Ｔｇ機構を用いて所望の核酸にゲノムを送達するように、そのネイティブ環境からのＵＴＲのデカップリング及び別の外性配列へのＵＴＲの組込みを操作した。
【０８２２】
１）Ｒ２Ｔｇコード配列と、２）Ｒ２Ｔｇ  ＵＴＲ配列及び２８Ｓ  ｒＤＮＡに対する１００ｂｐ相同性によりフランキングされるトランスジーンカセットを、それぞれ個別のドライバー及びトランスジーンプラスミド中に構築物することにより、ｔｒａｎｓ−トランスジーン組込みを試験した。図１３は、二重プラスミドシステムを示す。二重プラスミドは、複数のドライバー：トランスジーンモル比で、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。ＷＴ  Ｒ２Ｔｇドライバー以外に、バックボーンプラスミドを対照として使用した。トランスフェクションの２４ｈｒ前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種した。トランスフェクションの日に、トランスフェクション試薬とプラスミドを１０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で混合し、室温で１５分インキュベートした後、接種細胞の培地に添加した。トランスフェクションから３日後、ゲノムＤＮＡをｄｄＰＣＲアッセイのために抽出し、ｔｒａｎｓ−レトロ転位効率を調査した。図１４は、ドライバーに対して過剰量のトランスジーンを有する条件についてのｄｄＰＣＲ結果を示す。
【０８２３】
プラスミドによるｔｒａｎｓ−トランスジーン送達と同様に、Ｔ７プロモータ配列が前に位置するＲ２Ｔｇのコーディング配列のアンプリコンを構築することにより、ＲＮＡ送達を実施した。構築したアンプリコンは、実験Ｒ２Ｔｇエレメント並びに１ｂｐ欠失フレームシフト変異体対照を含有した。独立に、ＧＦＰをコードする外性配列と、Ｒ２Ｔｇによるゲノムへの組込みを駆動するのに十分な隣接領域であるＥＧＦ１−αリポータを含有するアンプリコンを構築した。より具体的には、構築物は、ＲＮＡの転写を駆動するＴ７プロモータを含み、このＲＮＡは、５’から３’に向かって以下を含んだ：（ａ）１０ｎｔ長の５’２８Ｓ相同性領域、（ｂ）５’非翻訳領域、（ｃ）アンチセンスＴＫｐＡポリＡ配列、（ｄ）ＧＦＰをコードするアンチセンス異種目的配列、（ｅ）アンチセンスＫｏｚａｋ配列、（ｆ）アンチセンスＥＦ１αプロモータ、（ｇ）ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質に結合する３’非翻訳領域、及び（ｈ）１０ｎｔ長の３’２８Ｓ相同性領域。各ＲＮＡは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＨｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７  ＡＲＣＡキットを用いて転写し、ＺｙｍｏＲＮＡ  ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いて精製した。
【０８２４】
得られた異種目的ＲＮＡ及びＲ２ＴｇＲＮＡ（実験Ｒ２Ｔｇエレメント又はフレームシフト変異体のいずれか）を１：１モル比でヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｍＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより導入した。トランスフェクションの２４ｈｒ前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種した。トランスフェクションの日に、１μｌのトランスフェクション試薬と５００ｎｇの全ＲＮＡを１０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で混合し、室温で５分インキュベートした。次に、トランスフェクション混合物を接種細胞の培地に添加した。トランスフェクションから３日後、ゲノムＤＮＡをＰＣＲアッセイのために抽出した。
【０８２５】
予想トランスジーン−ｒＤＮＡ接合部の３’末端にわたる最初の３０ラウンドのＰＣＲ、続いて内部プライマーセットを用いた２０追加ラウンドのＰＣＲ増幅により、ネステッドＰＣＲを実施した。野生型トランスポザーゼ反応で処理した細胞から抽出されたゲノムＤＮＡに対して実施したネステッドＰＣＲの３つの複製のうち１つが、予想サイズ（約５９６ｂｐ）のＰＣＲ産物を生成した。対照的に、フレームシフト−不活性化Ｒ２Ｔｇ変異体対照、又は非トランスフェクション対照で処理した細胞から抽出したゲノムＤＮＡには、ＰＣＲ産物は認められなかった。Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、ＰＣＲ産物をゲル精製し、得られたコロニーをサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングに付した。次に、個々のＰＣＲ産物配列を各々、予想組込み配列にアラインメントした。予想組込み異種目的配列とアラインメントするＰＣＲ産物配列の画分を図１０に示す。ＰＣＲ産物の大部分は、アラインメント図の右側の予想組込み部位と隣接するシーケンシングアラインメントによって示される通り、予想組込み体を有した。これは、Ｒ２Ｔｇ機構によるヒト細胞への外性配列のＲＮＡ媒介組込みを立証するものである。
【０８２６】
実施例８：哺乳動物細胞へのＲ２Ｔｇレトロトランスポゾンの標的送達
この実施例では、ＤＮＡ送達による哺乳動物細胞へのＲ２Ｔｇレトロトランスポゾンエレメントの標的組込みを説明する。
【０８２７】
実施例６で既述したように、Ｒ２Ｔｇ（ＰＬＶ０１４）及び対照プラスミドを保有するプラスミドを設計及び合成した。各プラスミドをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬によりＨＥＫ３９３Ｔ細胞に導入した。トランスフェクションの２４ｈｒ前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種した。トランスフェクションの日に、０．５μｌのトランスフェクション試薬と８０ｎｇのＤＮＡを１０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で混合し、室温で１５分間インキュベートした。次に、トランスフェクション混合物を接種細胞の培地に添加した。トランスフェクションから３日後、ゲノムＤＮＡをレトロ転位アッセイのために抽出するか、又は凍結させて、標的遺伝子座修飾に付した。
【０８２８】
標的遺伝子座増幅をｈｇ３８参照ヒトゲノム及びｒＤＮＡ遺伝子座配列ｈｓｕ１３３６９（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１３３６９．１）に対して実施した。２つの独立したプライマーセットを使用して、標的遺伝子座増幅を実施した。両方のプライマーセットを用いた解析から、２８ＳｒＤＮＡ遺伝子座配列は、１％閾値を超えて検出された唯一の組込み部位であることが明らかにされた。従って、哺乳動物細胞におけるＲ２Ｔｇトランスポゾンの組込みは、この標的部位に対して特異的である。
【０８２９】
実施例９：ＲＮＡリフォールディング又はドライバー：鋳型ＲＮＡの比による哺乳動物細胞へのトランスＲＮＡ鋳型挿入
ＲＮＡ鋳型は、前実施例と同様に設計する。ドライバー及びトランスジーンペイロードから構成される２つのＲＮＡを哺乳動物細胞に送達する。フォールディングをよりよくするために、９５℃での加熱及び室温での冷却によるペイロードＲＮＡの変性を実施して、適正な二次構造形成を促進する。一部の実施形態では、室温でのＲＮＡの冷却によって組換え効率が上昇し得る。
【０８３０】
また、トランスジーン：ドライバーのモル比を変動させて、成分の好適な化学量論を評価する。組込みをｄｄＰＣＲ及びシーケンシングによって解析する。一部の実施形態では、より高い比のドライバー：トランスジーンを使用する。一部の実施形態では、より高い比のトランスジーン：ドライバーを使用する。
【０８３１】
ｃｉｓトランスジーン組込みを含む前実施例も、ドライバー：ペイロードの化学量論について同様に検定する。組込みは、ｄｄＰＣＲ及び配列決定により解析する。一部の実施形態では、より高い比のドライバー転写又は翻訳：トランスジーン転写によって、より高い組込み効率が得られる。一部の実施形態では、より高い比のトランスジーン転写：ドライバー転写及び翻訳によって、より高い組込み効率が得られる。
【０８３２】
実施例１０：ハイブリッドキャプチャーアッセイ
標的部位へのレトロトランスポゾン組込みの特異性についてバイアスのない検証を行うために、ハイブリッドキャプチャー実験を実施した。前実施例と同様に、そのネイティブＵＴＲと、予想Ｒ２ｒＤＮＡ標的の片側に対する１００ｂｐ相同性にフランキングされたＲ２Ｔｇを導入することにより、レトロトランスポゾン実験を実施した。ｒＤＮＡ標的部位は、対応するネイティブ標的部位に対する１００ヌクレオチド同一性の２つのフランキングセットを有した。レトロトランスポゾンは、プラスミド又はｍＲＮＡを介して、ヒト２９３Ｔ細胞に送達した。７２時間後、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出後、各ゲノムＤＮＡサンプルを、カスタムプローブセットを含むプロトコル（Ｔｗｉｓｔ）に従ってハイブリッドキャプチャーに付した。ビオチン化プローブは、約１２０ｂｐプローブが、Ｒ２Ｔｇコーディング配列及びＵＴＲの両鎖にわたるように設計された。初めに、Ｔｗｉｓｔ（ワールドワイドウェブ：ｔｗｉｓｔｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｎｇｓ＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿ｃｕｓｔｏｍｐａｎｅｌ＿ｈｙｂｒｉｄｃａｐで入手可能）からのプロトコルに従って、ゲノムＤＮＡの断片化及びシーケンシングアダプターの連結により次世代ライブラリーを作製した。次に、プローブをゲノムＤＮＡライブラリーにハイブリダイズして、濃縮サンプルを増幅した。３００ｂｐペアーエンドのリードを用いるＭｉｓｅｑで、最終ライブラリーをシーケンシングした。カスタムＭａｔｌａｂスクリプトを用いて、リードを解析した。得られた解析結果は、ＲＮＡ送達について図１５Ａ及び１５Ｂに示す。ハイブリッドキャプチャーは、予想遺伝子座へのＲ２Ｔｇのオンターゲット組込みを示した。ＲＮＡ送達では、予想遺伝子座で１００を超えるリードと比較して、１つのリードを含む１つの考えられるオフターゲットが、データ中の非予想３’接合部で同定されたが、これは、１００：１を超える特異性を示している。５’接合部では、５０リードは全て、予想遺伝子座にあったが、これは、５０：１を超える特異性を示している。この実験は、高い組込み特異性を示している。
【０８３３】
実施例１１：ロングリードＰａｃＢｉｏ解析
ヒトゲノムの標的部位への所望する完全長配列の組込みを測定するために、また、突然変異が、挿入の最中に導入されるか否かを測定するために、ロングレンジＰＣＲ増幅を実施することができる。前実施例に記載のように、レトロトランスポゾン組込み実験を実施する。一実施例では、ＰＣＲ増幅を使用して、ゲノム組込み部位をターゲティングする１つのプライマーと、組込み体配列をターゲティングする１つのプライマーとを設計することにより、アンプリコンを作製する。この実施例では、これらのプライマーは、組込み体配列と融合した増幅ゲノム遺伝子座の長さを最大化するように設計される。組込み体の両端にわたるアンプリコンをプールし、ロングリード次世代シーケンシングを実施することにより、各組込みの忠実度を評価する。
【０８３４】
別の実施例では、ハイブリッドキャプチャーを前実施例に記載のように実施するが、これは、最初のライブラリー作製中に、より大きな標的ライブラリー長を有する。次に、得られたライブラリーをロングリード次世代シーケンシングに付す。
【０８３５】
一部の実施形態において、ロングリード次世代シーケンシングは、サンプル全体で組み込まれたＤＮＡ中に１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満のＳＮＰがあることを示すであろう。一部の実施形態において、ロングリード次世代シーケンシングは、組み込まれたＤＮＡの１０％、５％、２％、又は１％未満が、ＳＮＰを有することを示すであろう。一部の実施形態では、ロングリード次世代シーケンシングは、組み込まれたＤＮＡの１０％、５％、２％、又は１％未満が、内部欠失を有することを示すであろう。一部の実施形態では、ロングリード次世代シーケンシングは、集団全体での総組込みＤＮＡの１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満が欠失していることを示すであろう。一部の実施形態では、ロングリード次世代シーケンシングは、組み込まれたＤＮＡの１０％、５％、２％、又は１％未満が、切断されていることを示すであろう。
【０８３６】
実施例１２：様々な相同性長さ及び相同性の点変異を用いた実験
この実施例では、標的部位への効率的なレトロトランスポゾン組込みのための相同性の好適な長さ及び開始位置を特性決定するように、実験を設計する。また、相同性を使用して、逆転写駆動される組込みの機構を支持する。
【０８３７】
プラスミドＰＬＶ０１４を修飾することにより、Ｒ２Ｔｇプラスミドの相同性の下流１００ｂｐ以内に一連のＳＮＰを導入した。ＳＮＰの設計を図１６に示す。トランスフェクションの後、ネステッドＰＣＲを適用して、３’組込み接合部位を回復し、約７３８ｂｐの予想アンプリコンサイズを有するＰＣＲ産物を生成した後、ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングに付すことにより、いずれかのＳＮＰが取り込まれたか否かを確認した。この実験では、接合配列に取り込まれたＳＮＰ遺伝マーカが存在しなければ、組込みが逆転写により駆動されたことを示す。ＳＮＰ設計及びシーケンシング結果を図１６に示す。ＳＮＰ導入は、設計された１８の遺伝マーカに観察され、これは、逆転写により指向するＲ２Ｔｇの組込みと一致する。
【０８３８】
この実施例ではまた、ゲノムへの効率的な組込みを促進する、より短い領域を同定するために、標的部位に対する様々な相同性領域の評価も説明する。この実施例では、２つの手法を説明する。第１に、標的部位に対する相同性の１００ｂｐの様々なウィンドウを検定するが、これは、標的部位の３’側ｂｐ１〜１００から開始し、次に、標的部位の３’側２〜１０１、標的部位の３’側３〜１０３に続けて、標的部位の３’側ｂｐ３０〜１３１まで検定する。第２に、ＤＮＡ組込みに十分な標的部位に対するより短い長さの相同性を検定するが、これは、標的部位の３’側ｂｐ０〜１００から開始して、次に、標的部位の３’側０〜９５、標的部位の３’側０〜９０に続けて、標的部位の３’側ｂｐ０〜１０まで検定する。２９３Ｔ細胞への各プラスミドのトランスフェクション後に、ｄｄＰＣＲを使用して、レトロ転位効率を測定する。
【０８３９】
この実施例では、様々な長さの異なるＵＴＲ領域を評価して、ゲノムへの効率的な組込みのためのより短い配列を同定する。３’ＵＴＲは、この３２５ｂｐ配列を３つの領域、即ち、１〜１００ｂｐ、１０１〜２００ｂｐ、及び２０１〜３２５ｂｐに分割することにより検定する。各々、切断された３’ＵＴＲを含むＲ２Ｔｇの構築物を作製して、それぞれ組込み効率を検定した。
【０８４０】
実施例１３：ｐ５３又は他の修復経路が上方制御されているか否かの評価
この実施例では、遺伝子発現、特に癌抑制因子及びＤＮＡ修復遺伝子に対する外性Ｒ２Ｔｇレトロ転位の作用の評価について説明する。プラスミドを発現するＲ２Ｔｇを複数の癌細胞株（２９３Ｔ、ＭＣＦ−７、及びＴ４７Ｄを含む）に送達する。各細胞株への組込みを確認した後、ＲＮＡ−ｓｅｑを実施して、遺伝子発現プロフィールに対する作用を評価する。次に、遺伝子セット濃縮分析を適用して、いずれかのＤＮＡ修復経路がレトロ転位後に上方制御されているか否かを評価する。ＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄは、それぞれ野生型及び変異型ｐ５３を含む乳癌細胞株であり、これらを用いて、ｐ５３とレトロ転位との関係を詳しく評価する。一部の実施形態では、レトロトランスポゾンＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒがゲノムに組み込まれると、ｐ５３は上方制御されない。一部の実施形態では、レトロトランスポゾンＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒがゲノムに組み込まれると、ＤＮＡ修復遺伝子は一切上方制御されない。一部の実施形態では、レトロトランスポゾンＧｅｎｅ  Ｗｒｉｔｅｒがゲノムに組み込まれると、癌抑制遺伝子は一切上方制御されない。
【０８４１】
実施例１４：ＤＮＡ修復阻害因子の存在下でのレトロ転位
この実施例では、実験で、ＤＮＡ修復経路阻害因子又はＤＮＡ修復経路欠損細胞株の適用によるＲ２Ｔｇレトロ転位への様々なＤＮＡ修復経路の作用を検定する。ＤＮＡ修復経路阻害因子を適用する場合、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生存能アッセイをまず実施して、阻害因子の毒性、並びに続くアッセイに何らかの正規化を適用すべきか否かを決定する。ＳＣＲ７は、ＮＨＥＪの阻害因子であり、これをＲ２Ｔｇ送達中に、一連の希釈度で適用する。ＰＡＲＰタンパク質は、一本鎖及び二本鎖切断の両方にホモ二量体として結合する核酵素である。従って、その阻害因子を関連ＤＮＡ修復経路（相同組換え修復経路及び塩基除去修復経路など）の検定に使用する。実験手順は、ＳＣＲ７の手順と同じである。ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路の欠損コアタンパク質を含む細胞株を用いて、Ｒ２Ｔｇレトロ転位に対するＮＥＲの作用を検定する。細胞へのＲ２Ｔｇエレメントの送達後、ｄｄＰＣＲを使用して、ＤＮＡ修復経路の阻害に関連してレトロ転位を評価する。また、シーケンシング解析を実施して、特定のＤＮＡ修復経路が、組込み接合の改変に役割を果たすか否かを評価する。一部の実施形態では、ゲノムへのＲ２Ｔｇ組込みは、いずれのＤＮＡ修復経路のノックダウンによっても低減されることはなく、これは、Ｒ２Ｔｇが、ＤＮＡ組込みのために宿主細胞経路に依存しないことを示唆している。
【０８４２】
実施例１５：線維芽細胞及びＴ細胞におけるレトロ転位
この実施例では、以前実施した２９３Ｔ細胞のＲ２Ｔｇレトロ転位解析を、非分裂細胞（線維芽細胞及びＴ細胞を含む）において再度実施する。２９３Ｔ細胞と比較して、非分裂細胞は、脂質試薬でトランスフェクトするのが難しい場合がある。従って、Ｒ２Ｔｇエレメントの送達のためにヌクレオフェクションを使用する。組換え効率及びシーケンシング解析を目的とする次のレトロ転位アッセイは、２９３Ｔ細胞について本明細書に記載した通りに実施する。一部の実施形態では、Ｒ２Ｔｇは、線維芽細胞及びＴ細胞のゲノムに組み込まれる。
【０８４３】
実施例１６：単一細胞ｄｄＰＣＲ
この実施例では、単一細胞レベルでの標的ゲノム組込みの頻度を決定するために、定量的アッセイを使用し、その情報をゲノムＤＮＡから定量したゲノム当たりの標的ゲノム組込みのコピー数と比較することができる。
【０８４４】
約５０００個のトランスフェクトした細胞を収集し、ｄｄＰＣＲ反応混合物と混合した後、約２０，０００の液滴中に配分するが、その際、各液滴が１個の細胞を含有するか、又は細胞を全く含まないようにする。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲアッセイを含むｄｄＰＣＲアッセイを前述のように実施して、単一細胞レベルでのＲ２又はトランスジーン組込みの頻度を決定する。同時に、同数の細胞から採取したゲノムＤＮＡを用いて、対照実験を実施して、ゲノム当たりの標的ゲノム組込み効率を決定する。一部の実施形態において、単一細胞レベルでの標的ゲノム組込みの頻度は、１〜８０％、例えば、２５％と算出され、その際、表示されるパーセンテージの細胞が、所望の遺伝子座に組み込まれたトランスジーンの１つ若しくは複数のコピーを有する。
【０８４５】
実施例１７：コロニー単離による単一細胞解析
この実施例では、定量的アッセイを使用して、単一細胞に由来する細胞コロニー中のゲノム組込みコピー番号を決定する。
【０８４６】
コロニーの採取又は限界希釈により単一細胞コロニーを単離してから、９６ウェルフォーマット中で培養する。細胞が＞８０％密集度に達したら、細胞の半分を予備のために凍結し、残り半分の細胞からのゲノムＤＮＡをｄｄＰＣＲのために採取する。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲアッセイを含む最適化ｄｄＰＣＲアッセイを前述のように実施して、Ｒ２又はトランスジーン組込みの頻度を決定する。少なくとも９６コロニーを、適切な対照と共に各Ｒ２エレメントについてスクリーニングする。スクリーニングしようとするコロニーの総数は、適用可能であれば単一細胞ｄｄＰＣＲデータにより、又は第１セットの単一細胞コロニースクリーンデータによって決定する。一部の実施形態では、単一細胞レベルでの標的ゲノム組込みの頻度は、１〜８０％、例えば、２５％と算出され、その際、表示されるパーセンテージの細胞が、所望の遺伝子座に組み込まれたトランスジーンの単一コピーを有する。また、このアッセイを使用して、所望の遺伝子座に組み込まれたトランスジーンの２つ以上のコピーを有するコロニーのパーセンテージを決定することもできる。
【０８４７】
実施例１８：ＤＮＡ結合親和性及び／又は再ターゲティング
野生型Ｒ２のＤＮＡターゲティングモジュールは、システイン−ヒスチジンジンクフィンガー及びｃ−Ｍｙｂ転写因子結合モチーフから構成される。このＮ末端モジュールは、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）、ジンクフィンガー（例えば、天然若しくは設計モチーフ）、及び／又は核酸誘導型、触媒不活性エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９−ＲＮＰを形成するためにガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と結合したＣａｓ９）など、様々なＤＮＡ結合モジュールで置換することができる。このＤＮＡ結合モジュールは天然に存在するモジュールと交換され、いくつかの事例では、それをＲＮＡ結合／ＲＴモジュールと結合させる柔軟なリンカーと一緒に配置される。加えて、いくつかの構成では、この新規ＤＮＡ結合モジュールは、同じ及び／又は異なるＤＮＡ結合モジュールとタンデムで配置される。さらに、いくつかの構成では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒタンパク質を分割し得るが、この場合、１つのタンパク質分子は、ＲＮＡ結合モジュールを含み、他のタンパク質は、ＲＴ及びエンドヌクレアーゼモジュールを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡモジュールの交換によって、或るゲノム位置に対する特異性及び／又は親和性が増大し、いくつかの事例では、新たなゲノム位置の特異的ターゲティングを可能にする。
【０８４８】
実施例１９：ＤＮＡ結合親和性を測定するアッセイ
本明細書に記載のＧｅｎｅＷｒｉｔｅｒｓのＤＮＡ結合活性（及び同様にＤＮＡ結合ドメイン）は、例えば、この実施例に記載するように試験することができる。ＤＮＡ結合モジュールは、細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））においてそれらを組換えによって発現させることにより精製するか、又は転写及び翻訳の無細胞反応（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ＋コムギ胚芽抽出物）で発現させる。結合アッセイ（例えば、ＥＭＳＡ、蛍光異方性、二重フィルター結合、ＦＲＥＴ、ＳＰＲ、又は熱泳動（温度に関する強度変化）でＫｄを測定することにより、精製ＤＮＡ結合モジュールを結合親和性について試験する。タンパク質（ＤＮＡ結合モジュール）を標識する、及び／又はＤＮＡモジュールを、前述した結合アッセイと適合性の分子（例えば、色素、放射性同位体（例えば、タンパク質：３５Ｓ−メチオニン、マレイミド色素、ＤＮＡ：３２Ｐ末端若しくは内部標識、ＮＨＳ−エステル色素と反応した結合アミンを含むＤＮＡ）で標識する。これらの分子は、その濃度を変化させ、結合親和性を計算する結合曲線に当てはめることによって測定される。いくつかのアッセイでは、核酸配列特異性は、タンパク質−核酸複合体（例えば、Ｃａｓ９−ＲＮＰ  ＤＮＡ結合モジュール）に対するアミノ酸変更若しくは改変によるＤＮＡ結合モジュールに対するＤＮＡ配列若しくは突然変異の突然変異解析によって検定する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合モジュールのＫｄが増加すると、オフターゲット挿入が低減し、いくつかの事例では、特定のゲノム位置におけるＲ２−ＲＮＡ複合体の滞留時間を増加することにより、オンターゲット部位の活性が増大する。
【０８４９】
実施例２０：全体的特異性を新たに（ｄｅ  ｎｏｖｏ）決定するアッセイ
ＤＮＡ結合モジュールは、完全長レトロトランスポゾンＲ２、又はレトロトランスポザーゼのない対照に関して、ＤＮＡ結合モジュール単独として細胞（例えば、動物細胞、例えば、ヒト細胞）に発現させる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質を送達する従来の方法を用いて、モジュール又はレトロトランスポゾンの発現を細胞に送達する。複合体を架橋するか（例えば、化学薬品若しくは紫外線を用いて）、又は架橋しない。細胞を溶解させてから、結合ＤＮＡだけが分解から保護されるように、ＤＮａｓｅＩで処理する。ＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ断片のＮＧＳライブラリーを調製した後、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ又はＤＩＧ−ｓｅｑと同様に、新たな結合部位を同定する。一部の実施形態では、潜在的オフターゲット部位を同定し、これを追跡して偽陽性を除去することができる。他の実施形態では、このアッセイにより、ＤＮＡ結合モジュールがその意図される部位に結合し、他の部位には結合しない特異性に関するインビトロアッセイを確認する。
【０８５０】
ハイスループットでＤＮＡ結合部位を同定するための直交型アッセイでは、Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ２０１７により記載される方法を使用し、ここで、ＤＮＡ結合ドメインを無細胞セッティングで試験して、新たなＤＮＡ結合モジュールに関する配列変異体の系統的解析と共に、特異性を決定する。
【０８５１】
実施例２１：ＲＮＡモジュールのモジュール性
ＲＮＡモジュールは、逆転写酵素モジュール（サブモジュール「ＲＮＡ結合」と呼ばれる）中に見いだされる相互作用を介してＲ２タンパク質に結合する。タンパク質は、５’及び／又は３’ＵＴＲ内の特定の構造を認識して、ＲＮＡと相互作用する。一部の実施形態では、ＵＴＲモジュールの交換によって、タンパク質相互作用が増大し、ＵＴＲに結合するタンパク質特異性が変化し、ヌクレアーゼに対して安定化し、且つ／又は細胞耐性が向上する（例えば、自然免疫応答の低下を招く）。他の実施形態では、Ｒ２タンパク質のＲＮＡ結合モジュールの添加及び／又は交換は、トランスジーン及び／又はＲＮＡとのエレメントモジュールに連結する様々な配列又はリガンドの使用と適合性である。一部の実施形態では、ＵＴＲの代わりの新しいリガンドの組合せは、Ｒ２のＲＮＡ結合ドメインとの優れた親和性を有するため、優れた挿入効率をもたらすことになる。一部の実施形態では、ＵＴＲの配列に対する変化又はＵＴＲの塩基修飾に対する変化は二次構造の安定性を増加させ、これは、ＲＮＡ結合モジュールとの優れた相互作用につながる。
【０８５２】
実施例２２：新しい配列に対するＲＮＡ結合親和性を測定するアッセイ
新しいＵＴＲモジュールを結合アッセイで試験する。新しいＲＮＡの場合、これらは、合成ＤＮＡ鋳型を用いた無細胞インビトロ転写、又は完全長中のＲＮＡの化学合成若しくは一緒に連結されて単一のＲＮＡモジュールを形成する断片の化学合成のいずれかによって合成される。精製ＵＴＲの結合親和性を結合アッセイ（例えば、ＥＭＳＡ、蛍光異方性、二重フィルター結合、ＦＲＥＴ、ＳＰＲ、又は熱泳動（温度に関する強度変化））で測定する。ＲＮＡの標識について前述した標識を用いて、又は用いずに、ＵＴＲモジュール及び／又はＲＮＡ結合モジュール／ＲＴモジュールを検出する。様々な濃度の分子の測定を実施して、結合親和性を決定する。一部の実施形態では、５’及び／若しくは３’ＵＴＲ結合モジュールに対する改変、その交換並びに／又はＲＮＡ結合／ＲＴモジュールに対する変化によって、野生型Ｒ２タンパク質又はＵＴＲより優れた相互作用が達成されるであろう。一部の実施形態では、増大した相互作用によって、レトロ転位の効率が向上し、またいくつかの事例では、ＲＮＡと相互作用するＲ２タンパク質の特異性が増大する。
【０８５３】
実施例２３：代替的ＵＴＲ
理論に縛られることは望まないが、一部の実施形態では、ＵＴＲは、Ｒ２タンパク質のハンドルとして働いて、ＲＮＡと相互作用し、ＵＴＲは、このＲＮＡをそれと共同でＲＴの鋳型として利用して、ゲノム位置に結合し、そのエンドヌクレアーゼモジュールでＤＮＡを切断した後、結合したＲＮＡを、ＤＮＡ中の切断部位でのＲＴ挿入のための鋳型として使用する。ＵＴＲがＲＴモジュールに近接した鋳型を保持するために、ＵＴＲモジュールを異なるリガンドで置換することができ、これらのリガンドは、Ｒ２タンパク質に操作された特異的ＲＮＡ結合部位に結合する。従って、一部の実施形態では、代替の非ＲＮＡ  ＵＴＲは、タンパク質、小分子、又は他の化学物質のいずれかであり、これは、タンパク質−タンパク質相互作用、小分子−タンパク質相互作用、又はハイブリダイゼーションを介して共有結合される。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合モジュールは、レトロ転位の効率、安定性、及び／又は速度を高めるトランスジーンモジュールＲＮＡに結合されるＲＮＡではないリガンドに特異的に結合する。
【０８５４】
実施例２４：ＵＴＲ構築物の活性を測定するためのアッセイ
操作ＵＴＲとＲ２タンパク質の親和性を測定する結合アッセイを前述のように、例えば、タンパク質−核酸相互作用について実施する。タンパク質−タンパク質又はタンパク質−小分子相互作用の場合、このアッセイは、ＵＴＲモジュールが結合されるＲＮＡトランスジーンモジュールに標識を使用する。
【０８５５】
実施例２５：標的ゲノム組込み
この実施例では、ＧｅｎｅＷｒｉｔｉｎｇ技術を標的細胞及び非標的細胞に送達し、非標的細胞中より高い頻度で、標的細胞中のゲノムに新しいＤＮＡを組み込む。以下にさらに詳しく説明するように、この手法は、標的細胞にはない（又は低いレベルで有する）内在性ｍｉＲＮＡを有する非標的細胞を利用する。内在性ｍｉＲＮＡを使用して、非標的細胞へのＤＮＡ組込みを低減する。
【０８５６】
使用するポリペプチドは、Ｒ２Ｔｇタンパク質であり、鋳型ＲＮＡ成分は、ＧＦＰタンパク質をコードするＲＮＡであり、５’末端でＲ２Ｔｇレトロトランスポザーゼの５’ＵＴＲと、３’末端でその３’ＵＴＲとフランキングする。５’ＵＴＲは、Ｒ２Ｔｇ  ２８ｓ  ｒＤＮＡ標的部位の５’側と相同性の１００ｂｐとフランキングし、３’ＵＴＲは、Ｒ２Ｔｇ  ２８ｓ  ｒＤＮＡ標的部位の３’側と相同性の１００ｂｐとフランキングする。ＧＦＰ遺伝子は、５’及び３’ＵＴＲに関してアンチセンス方向で向き合い、それ自身のプロモータ及びポリアデニル化シグナルを有する。
【０８５７】
鋳型ＲＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ認識配列をさらに含む。このｍｉｃｒｏＲＮＡ認識配列は、非標的細胞中のｍｉｃｒｏＲＮＡに結合されて、ゲノム組込み前の鋳型ＲＮＡの阻害（例えば、分解）を引き起こす。
【０８５８】
この実施例では、標的細胞は、肝細胞であり、非標的細胞は、造血系からのマクロファージである。標的細胞及び非標的細胞は、別々に培養する。鋳型ＲＮＡ及びレトロトランスポザーゼタンパク質は、本明細書に記載の通り、例えば、ＲＮＡとして、又はウイルスベクター（例えば、アデノ関連ウイルスベクター）を用いて、細胞に送達することができ、鋳型ＲＮＡは、ウイルスベクターＤＮＡから転写される。
【０８５９】
細胞の処理から３日後、ＧＦＰ発現及びゲノム組込みを検定する。
【０８６０】
フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現を検定する。一部の実施形態では、ＧＦＰ発現は、マクロファージ集団よりも肝細胞集団の方が高いであろう。
【０８６１】
ゲノム組込み（参照遺伝子に対して正規化した細胞当たりのコピー数に関して）は、本明細書に記載の方法を用いるドロップレットデジタルＰＣＲで検定する。一部の実施形態では、ゲノム組込みは、マクロファージ集団よりも肝細胞集団の方が高いであろう。
【０８６２】
実施例２６：ＤＮＡ結合ドメインのモジュール性の検定
この実施例では、様々な変異型レトロトランスポザーゼの活性を検定すると共に、これらのタンパク質に関する構造的知識を取得するために、一連の実験を実施した。この実験では、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）がモジュラーであるか否かを決定する目的で、様々な位置及び長さの柔軟リンカーを検定した。これらの実験は、残りのＲ２ＴｇからＤＢＤを分離することができるための、且つ任意のＤＮＡターゲティングタンパク質配列でそれを置換するための立証も提供する。従って、この実施例は、本明細書に記載のトランスポザーゼが、機能を維持しながら、構造モデリングにより同定された複数の位置（例えば、以下に説明するように、予測−１ＲＮＡ結合モチーフ、αヘリックス、及び予測ｃ−ｍｙｂＤＮＡ結合モチーフ）で試験レベルの配列分散に耐え得るという理解を支持するものである。
【０８６３】
手短には、２つのリンカー（リンカーＡ：ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２３）、及びリンカーＢ：ＧＧＧＳ（配列番号１０２４）を３つの位置に挿入し、本明細書ではバージョンｖ１、ｖ２及びｖ３として示す。ｖ１は、予測−１ＲＮＡ結合モチーフに先行するＲ２Ｔｇのαヘリックス領域のＮ末端側に位置し、ｖ２は、予測−１ＲＮＡ結合モチーフに先行するＲ２Ｔｇのαヘリックス領域のＣ末端側に位置し、ｖ３は、Ｒ２Ｔｇの予測ｃ−ｍｙｂＤＮＡ結合モチーフの後に来るランダムコイル領域に対してＣ末端側に位置した。ｖ１、ｖ２及びｖ３の各々について、リンカーＡ又はＢの一方が、ＰＣＲにより、Ｒ２Ｔｇを発現したＤＮＡプラスミドに付加され、これによって、以下の表５に示すように、配列ｖ１Ａ（ｖ１＋リンカーＡ）、ｖ１Ｂ（ｖ１＋リンカーＢ）、ｖ１Ｃ（ｖ１＋リンカーＣ）、ｖ２Ａ（ｖ２＋リンカーＡ）、ｖ２Ｂ（ｖ２＋リンカーＢ）、及びｖ２Ｃ（ｖ２＋リンカーＣ）が得られた。リンカーの挿入をサンガーシーケンシングにより確認し、ＤＮＡプラスミドをトランスフェクションのために精製した。
【０８６４】
【表４７４】
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【０８６５】
【表４７５】
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【０８６６】
【表４７６】
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【０８６７】
【表４７７】
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【０８６８】
【表４７８】
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【０８６９】
【表４７９】
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【０８７０】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートで平板培養し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩増殖させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｒ２Ｔｇ（野生型）、Ｒ２エンドヌクレアーゼ変異体、及びリンカー変異体でトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造者の推奨事項に従い、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤトランスフェクション試薬を用いて実施したが、その際、各ウェルは、８０ｎｇのプラスミドＤＮＡと０．５μＬのトランスフェクション試薬を受け入れた。トランスフェクションは全て、２回反復で実施し、ゲノムＤＮＡ抽出の前に７２時間インキュベートした。
【０８７１】
変異体の活性をｄｄＰＣＲアッセイにより測定し、これによって、ゲノム当たりのＲ２Ｔｇ組込みのコピー数を定量した。５’及び３’接合部は、各末端に２つの異なるアンプリコンを作製することによって定量した。
【０８７２】
ｖ３（ＤＢＤ中のｃ−ｍｙｂ結合モチーフ付近）は、リンカーＡ又はＢのいずれかとの相互作用活性を低減した。ｖ１（−１ＲＮＡ結合モチーフに先行するαヘリックスのＮ末端側）は、リンカーＡ（１６ＡＡ）と、それより短いリンカーＢ（４ＡＡ）を用いた場合、野生型に対して同等の活性を有した。これは、アミノ酸選択、長さ、又は３次元構造に関連し得る。ｖ２（−１ＲＮＡ結合モチーフに先行するαヘリックスのＣ末端側）は、リンカーＡを許容しなかったが；リンカーＢは、野生型と同等及びそれよりやや優れた活性を有した。従って、ｖ１及びｖ２は、Ｒ２ＴｇのＤＮＡ結合ドメインと残りのタンパク質を隔てることができるリンカーを付加する上で好ましい位置と考えることができる。
【０８７３】
実施例２７：組込み忠実度を決定するためのロングリードシーケンシング
レトロトランスポゾン組込み実験を上記実施例に記載したように実施した。一例では、ＰＣＲ増幅を用いて、ゲノム組込み部位をターゲティングする１つのプライマーと、組込み体配列をターゲティングする１つのプライマーを設計することにより、アンプリコンを作製した。この実施例では、これらのプライマーは、組込み体配列と融合した増幅ゲノム遺伝子座の長さを最大化するように設計した。組込み体の両端にわたるアンプリコンをプールし、ロングリード次世代シーケンシングを実施することにより、各組込みの忠実度を評価した。
【０８７４】
本明細書に記載のプラスミドトランスフェクションを介してＲ２Ｔｇのシス構築物を２９３Ｔ細胞に組み込んだ。組換えの各末端にわたるアンプリコンを、ＰＣＲバイアスを制御するための隣接するランダム化ＵＭＩを用いて作製した。これらのアンプリコンをＰａｃＢｉｏ次世代シーケンシングによりシーケンシングした。得られた配列を崩壊させて、同一のＵＭＩのリードを除去した。ユニークなリードをアラインメントすることにより、図２０Ａ〜２０Ｂに示すように、カバレッジプロットを作成した。シーケンスカバレッジは主に、アンプリコン全体で均一なカバレッジを示し、組込みの有意な忠実度を示している。関連する逆転写酵素欠損変異体対照は、シグナルを生成しなかった。図２１Ａ〜２１Ｂでは内部欠失も分析した。内部欠失は、概して、合計一意リード数に対して低く、ｒＤＮＡ−Ｒ２Ｔｇの５’接合部にある程度のクラスター形成を有した。
【０８７５】
別の例では、ハイブリッドキャプチャーを、初期ライブラリー作製中の標的ライブラリー長が長くなる以外は前実施例に記載のように実施してもよい。続いて、得られたライブラリーをロングリード次世代シーケンシングに付すことができる。
【０８７６】
実施例２８：哺乳動物細胞へのＲ２Ｇｆｏ及びＲ４Ａｌレトロトランスポゾンの標的送達
この実施例では、ＤＮＡ送達によるＲ２Ｇｆｏ及びＲ４Ａｌレトロトランスポゾンエレメントの標的組込み部を説明する。
【０８７７】
１実施例では、本発明者らは、ミディアムグランドフィンチ、例えば、ガラパゴスフィンチ（Ｇｅｏｓｐｉｚａ  ｆｏｒｔｉｓ）由来の全Ｒ２エレメントＲ２−１＿ＧＦｏ（Ｒｅｐｂａｓｅ；Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １１，ｅ０１６３４９６（２０１５））（「Ｒ２ＧＦｏ」）を検定した。別の例では、本発明者らは、カイチュウ（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）由来の全Ｒ４エレメントＲ４＿ＡＬ（Ｒｅｐｂａｓｅ；Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，４６２８−３４（１９９５））（「Ｒ４Ａｌ」）を検定した。非ＬＴＲ  Ｒ２及びＲ４エレメントはヒトゲノム中に存在せず、それが高度に部位特異的であると思われるため、レトロトランスポゾンが正確且つ効率的にそれ自身をヒトゲノムに組み込む能力は、ゲノム標的組込みを実施する能力を示すことになる。
【０８７８】
Ｒ２Ｇｆｏ又はＲ４Ａｌエレメントのシス組込みのために、前実施例に記載のように、Ｒ２Ｇｆｏ（ＰＬＶ０３３）又はＲ４Ａｌ（ＰＬＶ４６２）を保有するプラスミドを合成した。プラスミドは、野生型エレメントがそのネイティブ非翻訳領域（ＵＴＲ）、及びそのｒＤＮＡ標的に相同性の１００ｂｐとフランキングするように合成した（図２２）。エレメント発現は、哺乳動物ＣＭＶプロモータにより駆動した。本発明者らは、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬を用いて、各プラスミドをＨＥＫ３９３Ｔ細胞に導入した。トランスフェクションの２４時間前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種した。トランスフェクションの日に、０．５μｌのトランスフェクション試薬と８０ｎｇのＤＮＡを１０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で混合し、室温で１５分インキュベートした。次に、トランスフェクション混合物を接種細胞の培地に添加した。トランスフェクションから３日後、ゲノムＤＮＡをレトロ転位アッセイのために抽出した。並行して、比較として使用するために、Ｒ２Ｔｇも同じフォーマットで送達した。
【０８７９】
組込みを確認し、組込み効率を評価するために、ｄｄＰＣＲを実施した。各エレメントの３’ＵＴＲ部分に対するＴａｑｍａｎプローブを設計した。フォワードプライマーを合成して、プローブの上流に直接結合させ、リバースプライマーを合成してｒＤＮＡに結合させた。このようにして、組込み接合部にわたる予想産物の増幅により、プローブを分解し、蛍光シグナルを生成する。ｄｄＰＣＲコピー数分析の結果（参照遺伝子ＲＰＰ３０と比較して）を図２３に示す。Ｒ２Ｇｆｏ組込みによって、この実験では、０．２１組換え体の平均コピー数／ゲノムが達成された。Ｒ４Ａｌは、０．０８５組換え体／ゲノムの平均コピー数を達成した。
【０８８０】
実施例２９：ヒト線維芽細胞へのレトロトランスポゾンの組込み
この実施例では、ヒト線維芽細胞へのＲ２Ｔｇのｃｉｓ組込みを説明する。手短には、Ｒ２Ｔｇをｃｉｓで組み込むように設計されたプラスミドを、前実施例に記載の通り、Ｒ２ＴｇがそのネイティブＵＴＲ及びそのｒＤＮＡ標的との相同性配列とフランキングするように合成した。０．５μｇのＰＬＶ０１４（野生型）及びＰＬＶ０７２（ＥＮ突然変異体）プラスミドを、新生児包皮（ＨＤＦｎ，Ｃ００４５Ｃ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から単離した１００，０００のヒト真皮線維芽細胞に、それぞれＮｅｏｎトランスフェクションシステムを用いてトランスフェクトした。２つのプログラムを各々２回反復して実施した。プログラム１の設定は、１７００Ｖパルス電圧、２０ｍｓパルス幅、及び１パルス数であった。プログラム２の設定は、１４００Ｖパルス電圧、２０ｍｓパルス幅、及び２パルス数であった。いずれのプログラムも、ＥＧＦＰをコードするプラスミドを用いて測定して、９５％トランスフェクション効率を達成した。トランスフェクションから３日後、ゲノムＤＮＡをｄｄＰＣＲアッセイのために抽出した。ｄｄＰＣＲを実施して、組込みを確認し、組込み効率を評価した。Ｒ２Ｔｇエレメントの３’ＵＴＲ部分に対するＴａｑｍａｎプローブを設計した。フォワードプライマーを合成して、プローブの上流に直接結合させ、リバースプライマーを合成してｒＤＮＡに結合させた。このようにして、組込み接合部にわたる予想産物の増幅によって、プローブを分解し、蛍光シグナルを生成する。ｄｄＰＣＲコピー数分析の結果（参照遺伝子ＲＰＰ３０と比較して）を図２４に示す。野生型（ＷＴ）Ｒ２Ｔｇ組込みによって、この実験では、０．０３６組換え体／ゲノムの平均コピー数が達成され、これは、エンドヌクレアーゼ活性（ＥＮ）を無効化する点変異を含む対照Ｒ２Ｔｇプラスミドより有意に高かった。
【０８８１】
実施例３０：レトロトランスポゾントランスフェクション時のＤＮＡ損傷応答の評価
ＤＮＡ損傷（例えば、ＤＳＢ形成又は複製フォーク崩壊によって生じる）は、ｐ５３の活性化を招き、これが、他の多くの転写応答の中でも、ｐ２１の上方制御を引き起こし、細胞周期停止又はアポトーシスに到る。ＣＲＩＳＲＰ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集は、ｐ５３及びｐ２１を活性化することが示されており、これは、ＣＲＩＳＰＲ／ベースの治療薬に関する潜在的な安全性及び効果の問題である。細胞へのＲ２Ｔｇ送達がｐ５３及びｐ２１の活性化を招くか否かを証明するために、Ｕ２ＯＳ細胞を４×１０４細胞／ウェルの密度で接種し、２４時間後、５００ｎｇのＲ２Ｔｇ−ＷＴプラスミド又は５００ｎｇのＲ２Ｔｇ−ＥＮ（エンドヌクレアーゼ（ＥＮ）ドメインに、Ｒ２Ｔｇを不活性にする変異を含むＲ２Ｔｇの変異体）のいずれかと一緒にＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ及びリポフェクタミン試薬を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション効率を制御するために、Ｕ２ＯＳ細胞を、ＧＦＰを発現するプラスミドでもトランスフェクトした。最後に、ｐ５３及びｐ２１の陽性対照として、Ｕ２ＯＳ細胞をＤＮＡ損傷誘導剤エトポシド（２０μＭ）又はブレオマイシン（１０μｇ／ｍｌ）の１つで処理した。トランスフェクション／処理から２４時間後にＵ２ＯＳ細胞を回収した。タンパク質溶解物をＲＩＰＡバッファー中で調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に泳動させた後、ニトロセルロースに移してから、ｐ５３及びｐ２１に対する抗体、並びにアクチン及びビンクリンでプロービングした。図２５に示すように、ＧＦＰプラスミド対照を超えるＲ２Ｔｇ誘導によるｐ５３又はｐ２１の上方制御は、いずれのトランスフェクション条件においても検出されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021534798.tif 000510
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