(57)【要約】疑似インビボ条件での非特異的相互作用の効果を決定する方法を、ここに開示する。この方法は、（ａ）生物学的に適切な分子密集剤と標的分子とを含む溶液をバイオセンサーに接触させる工程であって、当該バイオセンサーの表面は、当該標的分子に特異的に結合する捕捉分子を含む、工程、（ｂ）当該標的分子が当該捕捉分子に結合することを可能にする工程、及び、（ｃ）バイオレイヤー干渉法を使用して、当該捕捉分子に結合した当該標的分子の量を決定する工程を含む。2021534393.tif 000010
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、疑似インビボ条件での非特異的相互作用の効果を決定する方法：
生物学的に適切な分子密集剤と標的分子とを含む溶液をバイオセンサーに接触させる工程であって、前記バイオセンサーの表面は、前記標的分子と特異的に結合する捕捉分子を含む、工程、
前記標的分子が前記捕捉分子に結合することを可能にする工程、及び、
バイオレイヤー干渉法を使用して、前記捕捉分子に結合した前記標的分子の量を決定する工程。
【請求項２】
前記分子密集剤に対して求引性非特異的相互作用を示す標的生体分子と、前記分子密集剤に対して反発性非特異的相互作用を示す標的生体分子とを区別する対照閾値に対して、前記捕捉分子に結合した前記標的生体分子の量を比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記閾値が、理想溶液、希薄溶液、または半希薄溶液に対して正規化された応答である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生物学的に適切な分子密集剤が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＩｇＧ、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、α１−アンチトリプシン、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−１、アポリポタンパク質Ａ−１１、または、血液もしくは血清試料に認められるその他のあらゆるタンパク質成分を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記分子密集剤が、生理学的に適切な濃度で存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分子密集剤が、約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間の濃度で存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的に適切な分子密集剤の２つ以上の濃度での結合量を決定する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的に適切な分子密集剤が、血清および／または血漿を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
２つ以上のｐＨでの結合量を決定して、結合のｐＨ依存性を決定する工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
２つ以上の塩濃度での結合量を決定して、結合の塩依存性を決定する工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的分子が、抗体を含み、かつ、前記捕捉分子が、前記抗体に対して特異的に結合する抗原を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的分子が、抗原を含み、かつ、前記捕捉分子が、前記抗原に対して特異的に結合する抗体を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的分子が、受容体またはそのリガンド結合フラグメントを含み、かつ、前記捕捉分子が、前記受容体またはそのリガンド結合フラグメントに対して特異的に結合するリガンドを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的分子が、リガンドを含み、かつ、前記捕捉分子が、前記リガンドに対して特異的に結合する受容体またはそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記捕捉分子が、リンカーによって前記センサーの表面に連結される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンカーが、ビオチンと、ストレプトアビジンまたはアビジンとを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的分子が、抗体を含み、かつ、前記捕捉分子が、抗ＩｇＧ  Ｆｃを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ＩｇＧ  Ｆｃが、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程を含む、疑似インビボ条件で生体分子を選択する方法：
インビボ条件を模倣する溶液をバイオセンサーと接触させる工程であって、前記バイオセンサーの表面は、関心対象である２つ以上の標的生体分子のセットに由来する標的生体分子と特異的に結合する捕捉分子を含み、前記溶液は、生物学的に適切な分子密集剤と、関心対象である２つ以上の標的生体分子の前記セットから選択された第１の標的生体分子とをさらに含む、工程、
前記第１の標的生体分子が前記捕捉分子に結合することを可能にする工程、及び、
バイオレイヤー干渉法を使用して、前記捕捉分子に結合した前記第１の標的生体分子の量を決定する工程。
【請求項２０】
インビボ条件を模倣する第２の溶液を前記バイオセンサーと接触させる工程であって、前記第２の溶液は、前記生物学的に適切な分子密集剤と、関心対象である２つ以上の生体分子の前記セットから選択された第２の標的生体分子とをさらに含む、工程、
前記第２の標的生体分子が前記捕捉分子に結合することを可能にする工程、
バイオレイヤー干渉法を使用して、前記捕捉分子に結合した前記第２の標的分子の量を決定する工程、及び、
前記捕捉分子に結合した第１の生体分子の量と、前記捕捉分子に結合した第２の生体分子の量を比較して、前記第１の生体分子と前記第２の生体分子のどちらの結合量が多いかを特定する工程
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分子密集剤に対して求引性非特異的相互作用を示す標的生体分子と、前記分子密集剤に対して反発性非特異的相互作用を示す標的生体分子とを区別する対照閾値に対して、前記捕捉分子に結合した第１および／または第２の標的生体分子の量を比較する工程をさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記閾値が、理想溶液、希薄溶液、または半希薄溶液に対して正規化された応答である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的に適切な分子密集剤が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＩｇＧ、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、α１−アンチトリプシン、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−１、アポリポタンパク質Ａ−１１、または、血液もしくは血清試料に認められるその他のあらゆるタンパク質成分を含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記分子密集剤が、生理学的に適切な濃度で存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記分子密集剤が、約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間の濃度で存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物学的に適切な分子密集剤の２つ以上の濃度での結合量を決定する工程をさらに含む、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的に適切な分子密集剤が、血清および／または血漿を含む、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
２つ以上のｐＨでの結合量を決定して、結合のｐＨ依存性を決定する工程をさらに含む、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
２つ以上の塩濃度での結合量を決定して、結合の塩依存性を決定する工程をさらに含む、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的分子が、抗体を含み、かつ、前記捕捉分子が、前記抗体に対して特異的に結合する抗原を含む、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的分子が、抗原を含み、かつ、前記捕捉分子が、前記抗原に対して特異的に結合する抗体を含む、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的分子が、受容体またはそのリガンド結合フラグメントを含み、かつ、前記捕捉分子が、前記受容体またはそのリガンド結合フラグメントに対して特異的に結合するリガンドを含む、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的分子が、リガンドを含み、かつ、前記捕捉分子が、前記リガンドに対して特異的に結合する受容体またはそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記捕捉分子が、リンカーによって前記センサーの表面に連結される、請求項１９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記リンカーが、ビオチンと、ストレプトアビジンまたはアビジンとを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的分子が、抗体を含み、かつ、前記捕捉分子が、抗ＩｇＧ  Ｆｃを含む、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗ＩｇＧ  Ｆｃが、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃである、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の援用
本出願は、参照によって援用をする、２０１９年８月１２日に作成し、かつ、大きさが１４６６バイトである、ファイル１０４７０ＷＯ０１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとして、コンピューターで読み取りが可能な形式で提出した配列表を含む。
【０００２】
発明の分野
本発明は、生物学的製剤に関するものであり、また、生理学的に近似する条件において、抗体などの治療用生体分子の挙動の決定に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
インビトロでの結合平衡の適切な分析は、必然的に、解離定数に近似する濃度、一般的には、マイクロモル以下のオーダーでの実施を余儀なくされる。これらの条件下では、タンパク質は、本質的に理想的な分子として挙動し、また、あらゆる非特異的な相互作用を容易に無視することができる。タンパク質濃度を任意の高濃度にすると、高分子密集を招き、そして、複合体形成は、タンパク質濃度に関して、もはや線形を示さず、また、質量作用の法則から導いた結合方程式は、濃度よりもむしろ、熱力学的活性を端的に表現している（Ｎｅａｌ，Ｂ．Ｌ．，Ｄ．  Ａｓｔｈａｇｉｒｉ  ａｎｄ  Ａ．Ｍ．  Ｌｅｎｈｏｆｆ（１９９８）．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｓｅｃｏｎｄ  ｖｉｒｉａｌ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ７５（５）：２４６９−２４７７（非特許文献１））。活量係数の大きさは、溶液全体の組成に依存しており、非理想性は、タンパク質自体のレベルの上昇のみならず、相互作用しない高分子や共溶質の存在にも起因する。
【０００４】
非理想的な条件下でのタンパク質の間での非特異的相互作用は、インビトロでの特徴決定において一般的に使用するものとは大きく異なり、このことを理解することは、生物学的状況でタンパク質の機能を、さらに完璧に把握する上で不可欠である。したがって、現在のところ、疑似インビボ条件下での生体分子の非特異的相互作用の効果を決定するための方法が待望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎｅａｌ，Ｂ．Ｌ．，Ｄ．  Ａｓｔｈａｇｉｒｉ  ａｎｄ  Ａ．Ｍ．  Ｌｅｎｈｏｆｆ（１９９８）．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｓｅｃｏｎｄ  ｖｉｒｉａｌ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ７５（５）：２４６９−２４７７
【発明の概要】
【０００６】
ある態様では、本発明は、疑似インビボ条件での非特異的相互作用の効果を決定する方法を提供するものであり、この方法は、（ａ）生物学的に適切な分子密集剤と標的分子とを含む溶液をバイオセンサーに接触させる工程であって、バイオセンサーの表面は、標的分子に対して特異的に結合する捕捉分子を含む、工程、（ｂ）標的分子が捕捉分子に結合することを可能にする工程、及び、（ｃ）バイオレイヤー干渉法を使用して、捕捉分子に結合した標的分子の量を決定する工程を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、この方法は、溶液でのその他の分子に対して求引性非特異的相互作用を示す標的生体分子と、溶液でのその他の分子に対して反発性非特異的相互作用を示す標的生体分子とを区別する対照閾値に対して、捕捉分子に結合した標的生体分子の量を比較する工程をさらに含む。
【０００８】
この方法の様々な実施形態では、対照閾値は、理想溶液、希薄溶液、または半希薄溶液での結合の量に対して正規化された結合の量である。
【０００９】
この方法の様々な実施形態では、生物学的に適切な分子密集剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、ヒト血清アルブミンは、生理学的に適切な濃度で存在する。
【００１１】
一部の実施形態では、ヒト血清アルブミンは、約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間の濃度で存在する。
【００１２】
一部の実施形態では、この方法は、生物学的に適切な分子密集剤の２つ以上の濃度での結合量を決定する工程をさらに含む。
【００１３】
この方法の様々な実施形態では、生物学的に適切な分子密集剤は、血清および／または血漿を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、この方法は、例えば、２つ以上のｐＨでの結合量を決定して結合のｐＨ依存性を決定する工程をさらに含む。
【００１５】
一部の実施形態では、この方法は、例えば、２つ以上の塩濃度での結合量を決定して結合の塩依存性を決定する工程をさらに含む。
【００１６】
この方法の様々な実施形態では、標的分子は、モノクローナル抗体を含み、かつ捕捉分子は、モノクローナル抗体に対して特異的に結合する抗原を含む。
【００１７】
この方法の様々な実施形態では、標的分子は、抗原を含み、かつ捕捉分子は、抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。
【００１８】
この方法の様々な実施形態では、標的分子は、受容体またはそのリガンド結合フラグメントを含み、かつ、捕捉分子は、受容体またはそのリガンド結合フラグメントに対して特異的に結合するリガンドを含む。
【００１９】
この方法の様々な実施形態では、標的分子は、リガンドを含み、かつ、捕捉分子は、リガンドに対して特異的に結合する受容体またはそのリガンド結合フラグメントを含む。
【００２０】
この方法の様々な実施形態では、捕捉分子は、リンカーによってセンサーの表面に連結される。
【００２１】
この方法の様々な実施形態では、リンカーは、ビオチンと、ストレプトアビジンまたはアビジンとを含む。
【００２２】
この方法の様々な実施形態では、標的分子は、抗体を含み、かつ、捕捉分子は、抗ＩｇＧ  Ｆｃを含む。
【００２３】
この方法の様々な実施形態では、抗ＩｇＧ  Ｆｃは、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃである。
【００２４】
別の態様では、本発明は、疑似インビボ条件で生体分子を選択する方法を提供するものであって、この方法は、（ａ）インビボ条件を模倣する溶液をバイオセンサーと接触させる工程であって、バイオセンサーの表面は、関心対象である２つ以上の標的生体分子のセットに由来する標的生体分子に対して特異的に結合する捕捉分子を含み、そして、この溶液は、生物学的に適切な分子密集剤と、関心対象である２つ以上の標的生体分子のセットから選択された第１の標的生体分子とをさらに含む、工程、（ｂ）第１の標的生体分子が捕捉分子に結合することを可能にする工程、及び、（ｃ）バイオレイヤー干渉法を使用して、捕捉分子に結合した第１の標的生体分子の量を決定する工程を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、この方法は、（ａ）インビボ条件を模倣する第２の溶液をバイオセンサーと接触させる工程であって、第２の溶液は、生物学的に適切な分子密集剤と、関心対象である２つ以上の生体分子のセットから選択された第２の標的生体分子とを含む、工程、（ｂ）第２の標的生体分子が捕捉分子に結合することを可能にする工程、（ｃ）バイオレイヤー干渉法を使用して、捕捉分子に結合した第２の標的分子の量を決定する工程、及び、（ｄ）捕捉分子に結合した第１の生体分子の量と、捕捉分子に結合した第２の生体分子の量を比較して、第１の生体分子と第２の生体分子のどちらの結合量が多いかを特定する工程をさらに含む。
【００２６】
一部の実施形態では、この方法は、溶液でのその他の分子に対して求引性非特異的相互作用を示す標的生体分子と、溶液でのその他の分子に対して反発性非特異的相互作用を示す標的生体分子とを区別する対照閾値に対して、捕捉分子に結合した第１および／または第２の標的生体分子の量を比較する工程をさらに含む。
【００２７】
この方法の様々な実施形態では、閾値は、理想溶液、希薄溶液、または半希薄溶液での結合の量に対して正規化された結合の量である。
【００２８】
この方法の様々な実施形態では、生物学的に適切な分子密集剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。
【００２９】
この方法の様々な実施形態では、ヒト血清アルブミンは、生理学的に適切な濃度で存在する。
【００３０】
この方法の様々な実施形態では、ヒト血清アルブミンは、約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの濃度で存在する。
【００３１】
一部の実施形態では、この方法は、生物学的に適切な分子密集剤の２つ以上の濃度での結合量を決定する工程をさらに含む。
【００３２】
この方法の様々な実施形態では、生物学的に適切な分子密集剤は、血清および／または血漿を含む。
【００３３】
一部の実施形態では、この方法は、例えば、２つ以上のｐＨでの結合量を決定して、結合のｐＨ依存性を決定する工程をさらに含む。
【００３４】
一部の実施形態では、この方法は、例えば、２つ以上の塩濃度での結合量を決定して、結合の塩依存性を決定する工程をさらに含む。
【００３５】
この方法の様々な実施形態では、標的分子は、モノクローナル抗体を含み、かつ、捕捉分子は、モノクローナル抗体に対して特異的に結合する抗原を含む。
【００３６】
この方法の様々な実施形態では、標的分子は、抗原を含み、かつ、捕捉分子は、抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。
【００３７】
この方法の様々な実施形態では、標的分子は、受容体またはそのリガンド結合フラグメントを含み、かつ、捕捉分子は、受容体またはそのリガンド結合フラグメントに対して特異的に結合するリガンドを含む。
【００３８】
この方法の様々な実施形態では、標的分子は、リガンドを含み、かつ、捕捉分子は、リガンドに対して特異的に結合する受容体またはそのリガンド結合フラグメントを含む。
【００３９】
この方法の様々な実施形態では、捕捉分子は、リンカーによってセンサーの表面に連結される。
【００４０】
この方法の様々な実施形態では、リンカーは、ビオチンと、ストレプトアビジンまたはアビジンとを含む。
【００４１】
この方法の様々な実施形態では、標的分子は、抗体を含み、かつ、捕捉分子は抗ＩｇＧ  Ｆｃを含む。
【００４２】
この方法の様々な実施形態では、抗ＩｇＧ  Ｆｃは、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＣＧ−ＭＡＬＳで測定したｍＡｂ１／ＨＳＡとｍＡｂ２／ＨＳＡとの相互作用のイオン強度依存性を示すグラフである。交差ビリアル係数（Ａ２３）は、リン酸緩衝液でのＮａＣｌ濃度を上げながら、１０ｇ／Ｌ  ＨＳＡと、１０ｇ／Ｌ  ｍＡｂ１（●）またはｍＡｂ２（□）との間の相互作用を、ＣＧ−ＭＡＬＳで決定した。ＣＶＣに関する負の値は、分子間の求引力を示しており、一方で、正のＣＶＣ値は、分子間の反発力を示す。囲いは、ｍＡｂ１とｍＡｂ２のそれぞれに関するＣＶＣ値が、負と正である生理学的イオン強度を示している。
【図２】ｍＡｂとＨＳＡの弱陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出プロファイルを示すグラフである。それぞれのｍＡｂ及びＨＳＡを、２００ｍＭ  ＭＥＳ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で平衡化した弱陽イオン交換カラムでの分析クロマトグラフィーで評価した。勾配は、２０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌを使用しており、そして、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液のパーセンテージとして破線で表している。ＨＳＡ、ｍＡｂ１、及び、ｍＡｂ２の代表的な溶出プロファイルを示している。
【図３】Ａ及びＢは、ＢＬＩで測定した、ＨＳＡの非存在下での１３７ｍＭ  ＮａＣｌでのビオチン標識抗原に対するｍＡｂの結合を示すグラフである。ビオチン標識抗原に対するｍＡｂ１（Ａ）及びｍＡｂ２（Ｂ）の結合を、リン酸緩衝液での生理学的塩濃度にて、バイオレイヤー干渉法を使用して観察した。ナノメートル単位の波長の変化（応答、ｎｍ）を、時間の関数としてプロットして、結合事象に起因するバイオレイヤーの厚さの変化を示す。会合と解離のステップを、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、及び、４０ｎＭ  ｍＡｂに関して示している。破線の記録は、生データを示しており、そして、実線の記録は、近似曲線を示している。データ出力を、ｍＡｂ会合ステップで揃えて、そして、リファレンスデータを、すべての試料の記録から控除した。
【図４】Ａ及びＢは、ＢＬＩで測定した、抗原に対するｍＡｂの結合に関するＨＳＡが、イオン強度依存的である、ことを示すグラフである。ＨＳＡの非存在下及び存在下でのビオチン標識抗原に対する４０ｎＭ  ｍＡｂ１及びｍＡｂ２の結合を、リン酸緩衝液での１０（Ａ）、及び、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｂ）のバイオレイヤー干渉法を使用して観察した。時間の関数としての波長（応答、ｎｍ）の変化は、結合事象を示しており、そして、ｍＡｂの会合と解離のステップだけを示している。上記したようにして、ビオチン標識抗原を、ＳＡチップにロードした。ｍＡｂ１の結合を、１０ｇ／Ｌ  ＨＳＡの非存在下及び存在下で評価し、そして、ｍＡｂ２結合を、１０ｇ／Ｌ  ＨＳＡの非存在下及び存在下で評価した。バイオセンサーチップに対する非特異的結合を防ぐために、０．１ｇ／Ｌの最小限のＨＳＡを使用した。データ出力を、等価濃度のＨＳＡでのベースライン測定に続くｍＡｂ会合ステップで揃えた。１０ｇ／Ｌ  ＨＳＡを含む試料の記録は、溶液の屈折率の変化に起因する会合から解離への移行時のシグナルの変化に関して補正を行った。
【図５】Ａ及びＢは、ＢＬＩで測定した、抗原に対するｍＡｂの結合に関するＨＳＡの効果が、イオン強度依存的であり、かつ、ｍＡｂ特異的である、ことを示すグラフである。濃度が高まっているＨＳＡの存在下でのビオチン標識抗原に対するｍＡｂ１（●）またはｍＡｂ２（□）の結合を、１０（Ａ）、及び、１３７（Ｂ）ｍＭ  ＮａＣｌのバイオレイヤー干渉法を使用して観察した。正規化した（０．１ｇ／Ｌ  ＨＳＡでの結合に対する）応答は、ＨＳＡ濃度の関数として示している。点線は、データポイントと、この点線との関係を示す、１．０の法線を表している。バイオセンサーチップに対する非特異的結合を防ぐために、０．１ｇ／Ｌの最小限のＨＳＡを使用した。実験を３回行い、そして、平均値と標準偏差を示している。一元配置分散分析を、それぞれのＨＳＡ濃度で行い、０．０５未満のｐ値を、アスタリスクで示している。すべてのデータを、表２〜４にまとめてある。
【図６】Ａ〜Ｄは、ＢＬＩで測定した、抗原に対するｍＡｂの結合に関するＦｉｃｏｌｌ  ７０の効果を示す一連のグラフである。濃度を高めているＦｉｃｏｌｌ  ７０の存在下でのビオチン標識抗原に対するｍＡｂ１（●）またはｍＡｂ２（□）の結合を、１０ｍＭ（Ａ）、及び、１３７ｍＭ（Ｂ）ＮａＣｌのバイオレイヤー干渉法を使用して観察した。正規化した（０．１ｇ／Ｌ  Ｆｉｃｏｌｌ  ７０での結合に対する）応答を、Ｆｉｃｏｌｌ  ７０濃度の関数としてプロットしている。図６Ａ及び６Ｂでの点線は、データポイントと、この点線との関係を示す、１．０の法線を表している。実験を３回行い、そして、平均値と標準偏差を示している。一元配置分散分析を、それぞれのＨＳＡ濃度で行い、０．０５未満のｐ値を、アスタリスクで示している。すべてのデータを、表５〜７にまとめてある。結合速度が遅いので、極めて高い濃度のＦｉｃｏｌｌ  ７０（２００ｇ／Ｌ以上、図６Ｃ及び６Ｄ）で、ｍＡｂが抗原に対して会合する時間を延長する必要があった。３００ｇ／Ｌ  Ｆｉｃｏｌｌの存在下でのビオチン標識抗原に対するｍＡｂの結合を、１０ｍＭ（Ｃ）、及び、１３７ｍＭ（図６Ｄ）ＮａＣｌのバイオレイヤー干渉法を使用して観察した。Ｆｉｃｏｌｌ  ７０の非存在下でのｍＡｂ１及びｍＡｂ２のｎｍで揃えた応答は、延長した会合時間（約３時間）の時間に関する関数として示している。３００ｇ／Ｌ  Ｆｉｃｏｌｌ  ７０を、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２に添加すると、結合速度が比較的遅くなる。
【図７】バイオレイヤー干渉測定実験において、バイオセンサーをＨＳＡ溶液に浸すと、シグナルが増大することを示すグラフである。１３７ｍＭ  ＮａＣｌにおける、ビオチン標識抗原をロードしたＳＡチップに結合するｍＡｂ１に関する代表的なセンサーグラム。ベースライン測定（０〜１２０秒）に続いて、ビオチン標識抗原を、０．１ｇ／Ｌ  ＨＳＡの存在下でロードし、そして、平衡化させ（ステップＡ）、センサーを、１０ｇ／Ｌ  ＨＳＡに浸し（ステップＢ）、センサーを、１０ｇ／Ｌ  ＨＳＡ＋４０ｎＭ  ｍＡｂ１に浸し（ステップＣ）、そして、センサーを、ベースライン緩衝液に浸す（ステップＤ）。ステップＢで認められたシグナルの増大の程度は、ビオチンをロードしたＳＡ（抗原なし）を使用した同じ実験セットアップで認められたたシグナルの増大と同様であり、このことは、シグナルが、バイオセンサーチップに対する特異的結合事象ではなく、高濃度のタンパク質のＨＳＡの屈折率に起因するものである、ことを示している（データ示さず）。
【図８】Ａ〜Ｈは、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉チップを使用した親和性測定を示す一連のグラフである。代表的なバイオレイヤー干渉測定センサーグラムは、１０ｍＭ（Ａ）、及び、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｂ）での非標識抗原を含むｍＡｂ１；１０ｍＭ（Ｃ）、及び、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｄ）でのビオチン標識抗原を含むｍＡｂ１；１０ｍＭ（Ｅ）、及び、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｆ）の非標識抗原を含むｍＡｂ２；１０ｍＭ（Ｇ）、及び、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｈ）でのビオチン標識抗原を含むｍＡｂ２に関するものである。バイオセンサーの先端に抗体をロードして、約０．６ｎｍの応答を達成した。抗原会合ステップは、１００〜３００秒であり、そして、解離は、６００〜７５０秒であった。
【図９】ｍＡｂ３が抗原に結合せず、かつ、ＢＬＩシグナルの変化が認められないことを示すグラフである。濃度を高めているＨＳＡの存在下でのビオチン標識抗原に対するｍＡｂ３の結合を、１０（●）及び１３７（□）ｍＭ  ＮａＣｌのバイオレイヤー干渉法を使用して観察した。認められたシグナル（ｎｍ）は、正規化した応答ではなく、ＨＳＡ濃度の関数としてプロットしている。実験を重複して行い、そして、平均値と標準偏差を示している。
【図１０】理想溶液、希薄溶液、及び半希薄溶液の差異を示す一連の概略図である。
【図１１】半希薄溶液が、濃縮溶液と同等でないことを示す一連の概略図である。
【図１２】開示した実施形態による、密集剤、及び、抗原の存在下での抗体相互作用を測定するための一般化したバイオレイヤー干渉測定システムを示す概略図である。
【図１３】開示した実施形態による、密集剤、及び、ＦｃＲｎの存在下での抗体相互作用を測定するための一般化したバイオレイヤー干渉測定システムを示す概略図である。
【図１４】抗体／ＦｃＲｎ結合に関するＨＳＡの効果を示すグラフである。
【図１５】Ａ及びＢは、異なる塩濃度でのＨＳＡの用量反応曲線効果を示すグラフである。
【図１６】２つの異なる抗体＋／−ＦＡに関するＨＳＡの用量反応曲線効果を示すグラフである。
【図１７】野生型、及び、ＹＴＥ変異体の配列アラインメントである。
【図１８】ＦｃＲｎに結合する抗Ｃ５ｍＡｂに関するＨＳＡの用量反応曲線効果を示すグラフである。
【図１９】ＦｃＲｎに結合する抗ジカｍＡｂに関するＨＳＡの用量反応曲線効果を示すグラフである。
【図２０】半減期延長変異体に関するＨＳＡの用量反応曲線効果を示す一連のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明を記載するにあたり、本発明は記載している特定の方法及び実験条件に限定されるものではなく、したがって、方法及び条件は変更し得るものである、と理解すべきである。また、本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のものに過ぎず、限定を意図するものでない、ことを理解すべきである。あらゆる実施形態、または、実施形態の特徴は、互いに組み合わせることができ、そして、そのような組み合わせは、明示的に本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
特に定義が無い限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で使用する用語「約」は、特定の列挙した数値に関して使用する場合、その値が、列挙した値から１％以下でしか変動し得ないことを意味する。例えば、本明細書で使用する「約１００」という表現には、９９及び１０１、ならびに、その間のすべての整数値及び非整数値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００４６】
本明細書に記載しているものと類似または同等のあらゆる方法及び材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を、本明細書で説明する。本明細書に記載しているすべての特許、出願、及び、非特許刊行物は、参照により、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する。
【００４７】
本明細書で使用する略語
ＡＵＣ：分析用超遠心分離
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ＭＡＬＳ：多角度静的光散乱
ＣＧ−ＭＡＬＳ：組成勾配多角度静的光散乱
ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン
ｍＡｂｓ：モノクローナル抗体
ＢＬＩ：バイオレイヤー干渉法
ＳＡ：ストレプトアビジン
ＣＶＣ：交差ビリアル係数
ＭＢＰ：マルトース結合タンパク質
ＦｃＲｎ：新生児Ｆｃ受容体
ＦｅｌＤ１：主要なネコアレルゲン
【００４８】
定義
本明細書で使用する用語「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互に連結した４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖、及び、２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子（すなわち、「完全な抗体分子」）、ならびに、その多量体（例えば、ＩｇＭ）、または、その抗原結合フラグメントを含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）、及び、重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３からなる）を含む。様々な実施形態では、重鎖を、ＩｇＧアイソタイプとし得る。一部の事例では、重鎖を、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、または、ＩｇＧ４から選択する。一部の実施形態では、重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４であり、任意に、アイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２、または、ＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」）、及び、軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称する高度に保存された領域の間に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変領域にさらに細分することができる。それぞれのＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと、４つのＦＲとから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。用語「抗体」は、あらゆるアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化、及び、非グリコシル化免疫グロブリンの双方を利用することを含む。用語「抗体」は、抗体を発現するようにトランスフェクトした宿主細胞から単離した抗体など、組換え手段によって調製、発現、作成、または、単離した抗体分子を含む。抗体構造のレビューについては、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，２７（１）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５−７７；及び、Ｍ．Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１）Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７−４２（１９８３）を参照されたい。
【００４９】
抗体という用語は、「二重特異性抗体」も含み、このものは、複数の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む。単一の重鎖と単一の軽鎖、それに、６つのＣＤＲを含む二重特異性抗体の半分は、１つの抗原またはエピトープに結合し、そして、抗体の残りの半分は、異なる抗原またはエピトープに結合する。一部の事例では、二重特異性抗体は、同じ抗原に結合することができるが、異なるエピトープ、または、重複していないエピトープに結合する。一部の事例では、二重特異性抗体の半抗体の双方が、二重特異性を保持しながら、同一の軽鎖を有している。二重特異性抗体については、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）で概説されている。
【００５０】
抗体の「抗原結合部分」（または、「抗体フラグメント」）という用語は、抗原に対して特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上のフラグメントのことを指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合フラグメントの例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及び、ＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ２４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離したＣＤＲ；及び、（ｖｉｉ）Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬとＶＨからなり、合成リンカーで結合して、ＶＬ領域とＶＨ領域とを対にして、一価分子を形成する単一のタンパク質鎖を形成するｓｃＦｖがある。ダイアボディなどのその他の形態の一本鎖抗体もまた、用語「抗体」に含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  ９０  ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．６４４４−６４４８；及び、Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｔ．（１９９４）２  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １１２１−１１２３を参照されたい）。
【００５１】
さらに、抗体、及び、その抗原結合フラグメントは、当該技術分野で一般に公知である標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して取得することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
【００５２】
「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質の一部または全部を含んでおり、その内の１つは、免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、自然界で共に見出されることはない。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５３５；Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）３４４  Ｎａｔｕｒｅ  ６７７；及び、Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｔ．，（１９９２）“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，１０．１９．１−１０．１９．１１ページで説明されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に結合した受容体の１つ以上の細胞外ドメイン（複数可）を含み、一部の実施形態では、このものは、ヒンジ領域と、それに続く免疫グロブリンのＣＨ２とＣＨ３ドメインとを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上のリガンド（複数可）に結合する２つ以上の別個の受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、ＩＬ−１トラップ（例えば、ｈＩｇＧＩのＦｃに対して融合したＩＬ−１Ｒ１細胞外領域に対して融合したＩＬ−１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含むリロナセプト；米国特許第６，９２７，００４号を参照されたい）、または、ＶＥＧＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに対して融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に対して融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含むアフリベルセプト；米国特許第７，０８７，４１１号（２００６年８月８日発行）、及び、米国特許第７，２７９，１５９号（２００７年１０月９日発行）を参照されたい）などのトラップである。
【００５３】
用語「ヒト抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導した可変領域、及び、定常領域を有する抗体を含む、ことを意図している。本発明のヒトｍＡｂｓは、例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３でのヒト生殖系列免疫グロブリン配列がコードしないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発、または、インビボでの体細胞突然変異によって導入する突然変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用する用語「ヒト抗体」は、その他の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列から誘導したＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に移植したｍＡｂｓを含む、ことを意図していない。この用語は、非ヒト哺乳動物、または、非ヒト哺乳動物の細胞で組換え的に産生した抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離した、または、ヒト対象において生成した抗体を含む、ことを意図していない。
【００５４】
「バイオレイヤー干渉法」または「ＢＬＩ」は、生体分子相互作用を測定するための無標識技術である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ，２００６，６８−８２、及び、Ｈｉｇｈｅｒ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ，ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｉｃｈ，Ｒ．Ｌ．；Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，３６１，１−６を参照されたい）。ＢＬＩは、２つの表面、例えば、バイオセンサーの先端に固定化した生体分子の層と、内部リファレンス層とから反射した光の干渉パターンを分析する光学分析技術である。バイオセンサーの先端に結合した標的生体分子の数の変化は、リアルタイムで測定することができる干渉パターンのシフトを引き起こす。
【００５５】
バイオセンサー先端表面に固定化した捕捉分子と、溶液での標的生体分子との間の結合は、バイオセンサー先端で厚みが大きくなり、その結果、波長シフトを引き起こす。ＢＬＩの例示的な機器は、例えば、Ｆｒｅｍｏｎｔ  ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＦｏｒｔｅＢｉｏから市販されている。
【００５６】
本明細書で使用する用語「接触する」とは、直接的な物理的関連における配置のことを指す。接触は、インビトロで、例えば、抗体などの標的生体分子を含む生物学的試料などの試料に対して起こり得る。
【００５７】
概要
生物学的環境に関して、血液は、何百もの異なる分子からなる複雑で密集した溶液である。このような非理想的な条件下でのタンパク質の間での非特異的相互作用を理解することは、生物学的状況におけるタンパク質機能のさらに完璧な全体像を達成するために不可欠である。したがって、密集した環境でのタンパク質活性の測定は最も重要であり、そして、分析的超遠心分離（ＡＵＣ）や核磁気共鳴（ＮＭＲ）などの方法は、密集した溶液の分子挙動を調べるために従前より利用されていた（Ｈｅｄｄｉ，Ｂ．＆  Ｐｈａｎ，Ａ．Ｔ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｃｒｏｗｄｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３３，９８２４−９８３３，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊＡ２００７８６ｑ（２０１１），Ｍａｒｔｏｒｅｌｌ，Ｇ．，Ａｄｒｏｖｅｒ，Ｍ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｇ．，Ｔｅｍｕｓｓｉ，Ｐ．Ａ．＆  Ｐａｓｔｏｒｅ，Ａ．  Ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｒｅａｄｉｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ：ＮＭＲ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｈｅｎ  ｅｇｇ  ｗｈｉｔｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７９，１４０８−１４１５，ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏｔ．２２９６７（２０１１），Ｒｉｖａｓ，Ｇ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ａ．＆  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｌｕｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｅｒｔ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｒａｃｅｒ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ：ｔｈｅｏｒｙ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，９３７９−９３８８，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ９９０３５５ｚ（１９９９），Ｒｉｖａｓ，Ｇ．＆  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．  Ｎｏｎ−ｉｄｅａｌ  ｔｒａｃｅｒ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ：ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃＲｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｒｏｗｄｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ＪＭＲ  １７，３６２−３６７，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｍｒ．７０８（２００４），Ｐｉｅｌａｋ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｄｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８，２２６−２３４，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ８０１８９４８（２００９），Ｗｒｉｇｈｔ，Ｒ．Ｔ．，Ｈａｙｅｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｐ．Ｊ．＆  Ｃｏｒｒｅｉａ，Ｊ．Ｊ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ＡＵ−ＦＤＳ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔ��ｏｎ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５０，７２−８３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１８．０４．００２（２０１８））。しかしながら、これらの方法には、幾つかの欠点があり、ＡＵＣは、実験に数日を要する時間のかかる方法であり、また、ＮＭＲは、試料のイオン強度と、材料の消費に関して制限を受ける。
【００５８】
タンパク質の熱力学的、及び、速度論的特性に関する高分子密集の影響は非常に複雑であり、また、予測が困難である（Ｅｌｃｏｃｋ，Ａ．Ｈ．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｓｏｌｅｌｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１２，８８５−８９６，ｄｏｉ：１０．１００６／ｊｍｂｉ．２００１．５００９（２００１），Ｃａｎｄｏｔｔｉ，Ｍ．＆  Ｏｒｏｚｃｏ，Ｍ．  Ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｏｗｄｉｎｇ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １２，ｅ１００５０４０，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００５０４０（２０１６），Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｄｉａ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６，１０５７７−１０５８０，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃＲ１００００５２００（２００１），Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ，ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ２２，２７−６５，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｂ．２２．０６０１９３．０００３３１（１９９３））。主たる回避不可能な結果として、立体排除、別名、排除体積効果があり、これは、一般的に、すべての分子が利用可能な体積を増やすために、高分子会合の余地を広げる。大きさ、形状、表面、及び、固有の電荷特性、及び、溶媒和状態など、タンパク質の様々な物理化学的特性が、正味の非特異的相互作用に寄与する。さらに、静電相互作用、ファンデルワールス力、電荷異方性（局所双極子モーメント）、及び、疎水性相互作用は、おそらく、全く異なる方法で、全体的な効果を調節する。最後に、非特異的相互作用は、溶液条件（例えば、ｐＨやイオン強度；不活性共溶質）に大きく依存しており、そして、特定の事例では、正味の反発性相互作用を、求引性相互作用に変化させ得る（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｗｉｔｈａｍ，Ｓ．＆  Ａｌｅｘｏｖ，Ｅ．  Ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ  ８，０３５００１，ｄｏｉ：１０．１０８８／１４７８−３９７５／８／３／０３５００１（２０１１），Ｅｌｃｏｃｋ，Ａ．Ｈ．＆  ＭｃＣａｍｍｏｎ，Ｊ．Ａ．  Ｃａｌｕｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｅａｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．ｔｈｅ  ｐＨ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ８０，６１３−６２５，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０００��−３４９５（０１）７６０４２−０（２００１），Ｂｌａｎｃｏ，Ｍ．Ａ．，Ｐｅｒｅｖｏｚｃｈｉｋｏｖａ，Ｔ．，Ｍａｒｔｏｒａｎａ，Ｖ．，Ｍａｎｎｏ，Ｍ．＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｃ．Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｉｌｕｔｅ  ｔｏ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：ａｌｐｈａ−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ  ｉｎ  ａｃｉｄｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  Ｂ  １１８，５８１７−５８３１，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｐ４１２３０１ｈ（２０１４））。したがって、その他の点では相互作用しないタンパク質を含む溶液では、高濃度のタンパク質に起因する非理想性は、かなりのレベルのヘテロ会合をもたらし、または、溶質を、さらに分散した分布で維持し得る。
【００５９】
熱力学的非理想性の結果は、多様である。抗体の製造と製剤の観点から、分子の最終的な提示は、大抵の場合、１００ｇ／Ｌを超えており、非理想性が、粘度、溶解度、相分離、及び、自己会合などの様々なタンパク質溶液現象を変化させる、ことが報告されている（Ｓａｌｉｎａｓ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｏｐａｌｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９９，８２−９３，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｐｓ．２１７９７（２０１０），Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．  Ｗｅａｋ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｇｏｖｅｒｎ  ｔｈｅ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  １０３，６９−７８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｊ．２０１２．０４．０４７（２  ０１２），Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍ．Ｄ．，Ａｎｄｙａ，Ｊ．Ｄ．＆  Ｓｈｉｒｅ，Ｓ．Ｊ．  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９４，１９２８−１９４０，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｐｓ．２０３４７（２００５），Ｒａｕｔ，Ａ．Ｓ．＆  Ｋａｌｏｎｉａ，  Ｄ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  Ｏｐａｌｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｌｉｑｕｉｄ−Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  １３，１４３１−１４４４，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｍｏｌｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．５ｂ００９３７（２０１６））。細胞内環境、細胞外マトリックス、及び、循環血液などの生体系の特定の環境に関して、高分子密集は、結合平衡のみならず、反応速度、タンパク質の折り畳みと異性化、タンパク質間の相互作用、それに、全体的な細胞恒常性にも影響を及ぼす（Ｓｐｉｔｚｅｒ，Ｊ．  Ｆｒｏｍ  ｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃｒｏｗｄｅｄ  ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７５，４９１−５０６，目次の第２頁，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＭＭＢＲ．０００１０−１１（２０１１），ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｊ．，Ｂｏｅｒｓｍａ，Ａ．Ｊ．＆  Ｐｏｏｌｍａｎ，Ｂ．  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５，３０９−３１８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ．２０１７．１７（２０１７），Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｘ．，Ｒｉｖａｓ，Ｇ．＆  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅ���ｔ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ，ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３７，３７５−３９７，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｐｈｙｓ．３７．０３２８０７．１２５８１７（２００８）。例えば、細胞内外の浸透圧輸送に影響を与える細胞浸透圧平衡の理論的モデリングでは、密集した細胞環境に起因する非理想的な細胞内熱力学を考慮する必要がある（Ｒｏｓｓ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｌ．Ｕ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｊ．Ａ．＆  ＭｃＧａｎｎ，Ｌ．Ｅ．  Ｎｏｎ−ｉｄｅａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖ  Ｂｉｏｂａｎｋ  １０，４６２−４７１，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｂｉｏ．２０１２．００２７（２０１２））。加えて、高分子密集は、細胞の病理に影響を与えることができ、加速したアミロイド形成は、密集した環境で起こることが実証されている（Ｈａｔｔｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．＆  Ｈｏｗｌｅｔｔ，Ｇ．Ｊ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ａｍｙｌｏｙｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ−ＩＩ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７７，７８２４−７８３０，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１０４２９２００（２００２），Ｌａｓｈｕｅｌ，Ｈ．Ａ．，Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｄ．，Ｐｅｔｒｅ，Ｂ．Ｍ．，Ｗａｌｚ，Ｔ．＆  Ｌａｎｓｂｕｒｙ，Ｐ．Ｔ．，Ｊｒ．    Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｏｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，２９１，ｄｏｉ：１０．１０３８／４１８２９１ａ（２００２），Ｍｕｎｉｓｈｋｉｎａ，Ｌ．Ａ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｅ．Ｍ．，Ｕｖｅｒｓｋｙ，Ｖ．Ｎ．＆Ｆｉｎｋ，Ａ．Ｌ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｉｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ＪＭＲ  １７，４５６−４６４，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｍｒ．６９９（２００４））。生理学的環境の構成は、大抵の場合、ビリアル係数を特徴決定するために通常使用する分析方法を妨げる。したがって、熱力学的非理想性の現象と、それに続く結果は、実用面でも、生物学的にも重要である。
【００６０】
モノクローナル抗体などの生物学的製剤タンパク質は、一般的には、高濃度で血液に投与を行うが、このものは、本質的に複合体であり、かつ、タンパク質をかなり含んだ密集した溶液である。高分子密集の影響と、その結果生じるタンパク質の非理想性は、この生理学的状況において、相当レベルの非特異的ヘテロ会合を引き起こし得る（図１１及び１２を参照されたい）。したがって、このような非理想的で、密集した条件下でのタンパク質の間での非特異的相互作用を理解する方法であって、インビトロでの特徴決定のために一般的に使用されてきた方法から著しくかけ離れた方法を開発することは、生物学的状況でのタンパク質機能のより完璧な全体像を達成する上で重要である。この目的のために、本開示は、生物学的に活性な分子（例えば、抗体、二重特異性抗体、融合タンパク質、Ｆｃ受容体融合タンパク質）と、それらの同族結合パートナーとの相互作用、例えば、抗体−抗原、または、受容体−リガンド相互作用に関する分子密集の影響を研究するためのモデルシステムの開発に関する。本明細書に開示した通り、インビボ環境を模倣する溶液でのこれらの分子の相互作用、例えば、結合を決定することで、これらの分子の挙動に関する情報を、費用を要するインビボ試験で、及び／または、臨床試験の開始前に得ることができる。そのような情報は、最終的な治療薬の手がかりとなる、探索すべき分子または化合物に関して、情報に基づいた決定をするために使用し得る。
【００６１】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、ヒト循環器系で最も豊富なタンパク質の１つであり、血漿中のタンパク質含量の約半分を占めている。ＨＳＡの相対的な豊富度、それに、複数の生物学的プロセスにおけるその役割は、生物学的製剤との潜在的な相互作用、そして、さらに重要なことに、これらの相互作用が、対象でのこれらの生物学的製剤の生物学的活性に、どのくらい影響を及ぼし得るかを調べることを加速させた。加えて、アルブミンは、生理学的ｐＨでは負に帯電しているので、ＨＳＡと、正味の正電荷を有する生物学的製剤薬、または、大きな溶媒に曝された正の表面との間の非特異的な静電相互作用の可能性が高まる。
【００６２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と、２つの組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）との間の非特異的相互作用、及び、ｍＡｂ：抗原結合に関するこれらの相互作用の影響を本明細書で説明する。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、生理学的ＨＳＡ濃度でのｍＡｂによる抗原結合に関するＨＳＡの影響を評価して、これらの非特異的相互作用が、ｍＡｂ：抗原相互作用に機能的な影響を与えることを示した。重要なことに、ＨＳＡの代わりにＦｉｃｏｌｌ  ７０（数多くの分子密集実験で使用する作用物質）を使用しても、同様の結果は得られず、ＨＳＡが、静電相互作用などによって、分子密集を超える効果を有することを実証した。ここで開示しているインビトロのデータは、血清中の高濃度のＨＳＡが、インビボでｍＡｂと非特異的相互作用を引き起こし、また、抗原、ならびに、Ｆｃ受容体などのその他の機能的に関連するタンパク質との親和性に影響を与え得ることを実証している。まとめると、これらの結果は、本明細書に開示したＢＬＩをベースとした方法を使用して、特定の生物学的に適切な相互作用に関する非特異的タンパク質−タンパク質相互作用の影響を決定し、密集した状態での結合事象を評価する直接的方法を提供できる、ことを実証している。
【００６３】
本開示の態様は、インビボ条件を模倣する条件下で、抗原、及び／または、そのエピトープに対する抗体の特異的結合など、生体分子の挙動に関する非特異的相互作用の効果を決定する方法に関する。例えば、本明細書に開示する方法を使用して、モノクローナル抗体などの潜在的な治療用生体分子が、潜在的な治療用生体分子の有効濃度、故に、効果を抑制するなどして、その機能を阻害し得るインビボでの非特異的相互作用に供し得るか否かを予測することができる。したがって、本明細書で開示しているのは、疑似インビボ条件での非特異的相互作用の効果を評価する方法である（例示的なシステムに関しては、図１２を参照されたい）。実施形態では、この方法は、生物学的に適切な分子密集剤と標的生体分子とを含む溶液をバイオセンサーに接触させる工程を含む。バイオセンサーの表面は、標的分子に対して特異的に結合する捕捉分子を含み、その結果、標的生体分子のバイオセンサーに対する（捕捉分子を介して媒介した）結合を、評価、及び／または、決定することができる。様々な実施形態では、バイオセンサーは、例えば、平衡に達したときに、標的生体分子が捕捉分子に対して結合するのに十分な時間、溶液で、インキュベートすることができる。次に、捕捉分子に対して結合した標的生体分子の量を、例えば、バイオレイヤー干渉法を使用して決定する（例えば、図４Ａ及び４Ｂを参照されたい）。実施形態では、捕捉分子に対して結合した標的生体分子の量は、溶液でのその他の分子に求引性非特異的相互作用を示す標的生体分子と、溶液でのその他の分子に反発性非特異的相互作用を示す標的生体分子とを区別する閾値などの対照と比較する。非特異的求引性を有する閾値に満たない標的生体分子は、そのような非特異的相互作用を示さずに（または、あまり示さずに）閾値を超える生体分子よりも、望ましいものとは言えない。したがって、この方法を使用して、同定した標的生体分子を投与した対象で認め得るインビボ条件により適した標的生体分子を同定することができる。一部の実施形態では、閾値は、正規化した応答であり、例えば、分子密集剤、及び／または、理想溶液、希薄溶液、もしくは半希薄溶液を含まず、または、ほとんど含まない溶液に対して正規化する。一部の実施形態では、生物学的に適切な分子密集剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含み、そして、結合の量は、約０．０００１ｇ／ＬのＨＳＡと０．１ｇ／ＬのＨＳＡとの間などの低濃度のＨＳＡで、例えば、理想溶液、希薄溶液、もしくは半希薄溶液に近い条件、または、それらを模倣する条件で認められる結合に対して正規化する。この例では、閾値を、１に設定しており、正味の求引力または反発力が無いことを意味する。正規化した応答が１未満の分子は、ＨＳＡなどの生物学的に適切な分子密集剤に対して非特異的な相互作用を示すものと見なすことができ、そして、治療の可能性を評価するためのさらなる研究を再検討し得る。逆に、正規化した応答が１を超えている分子は、ＨＳＡなどの生物学的に適切な分子密集剤に対して有意な非特異的相互作用を示さないと見なすことができ、そして、治療可能性が大きいと見なし得るものであり、さらなる評価を必要とする。実施形態では、ＨＳＡは、生理学的に適切な濃度で、溶液に存在する。その他の実施形態（ＨＳＡに関連して、上記した、または、本明細書で論じたものなどでは、分子密集剤は、ＩｇＧ、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、α１−アンチトリプシン、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−１、アポリポタンパク質Ａ−１１、血漿、血清、または、血液もしくは血清試料に認められるその他のタンパク質成分から選択する。
【００６４】
特定の実施形態では、ＨＳＡは、約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間の濃度、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または、１００ｇ／Ｌ  ＨＳＡなど、例えば、約３５〜５０、２５〜４０、または、１０〜８０ｇ／Ｌ  ＨＳＡなどで存在する。一部の実施形態では、この方法を、様々な濃度の生物学的に適切な分子密集剤、例えば、約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／ＬのＨＳＡで実施し、例えば、ＨＳＡの濃度の高まりに対する標的分子の応答を決定する（例えば、図５Ａ及び５Ｂを参照されたい）。実施形態では、この方法は、分子密集剤の２つ以上の濃度で結合量を決定して、例えば、用量反応曲線を作成することを含む。
【００６５】
実施形態では、ＨＳＡには、例えば、ＦＡの効果を決定するために、脂肪酸（ＦＡ）を担持させている。一部の実施形態では、溶液は、生理学的成分（または、さらなる生理学的成分）、例えば、ＩｇＧ、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、α１−アンチトリプシン、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−１、アポリポタンパク質Ａ−１１、または、血液もしくは血清試料に認められるその他のタンパク質成分などを含む。実施形態では、生物学的に適切な分子密集剤は、血清および／または血漿を含む。
【００６６】
実施形態では、溶液は、生理学的ｐＨ、例えば、中性ｐＨ付近の単一の生理学的ｐＨのものである。しかしながら、この方法は、様々なｐＨで実施できることを想定している。特定の実施形態では、この方法は、２つ以上のｐＨでの結合量を決定して結合のｐＨ依存性を決定する工程をさらに含む。
【００６７】
実施形態では、溶液は、生理学的塩濃度である。特定の実施形態では、この方法は、２つ以上の塩濃度での結合量を決定して結合の塩依存性を決定する工程をさらに含む。
【００６８】
開示した方法は、インビボ環境の非特異的相互作用を模倣する条件下で、生物学的に適切な分子の対の結合を決定するために使用することができる。実施形態では、標的分子は、モノクローナル抗体を含み、かつ、捕捉分子は、例えば、高親和性でモノクローナル抗体に対して特異的に結合する抗原を含む。実施形態では、標的分子は、タンパク質をベースとしたの免疫原などの抗原を含み、かつ、捕捉分子は、抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。特定の実施形態では、生物学的標的分子は、変異体半減期延長モノクローナル抗体のセットである。特定の実施形態では、標的分子は、受容体、または、そのリガンド結合フラグメントを含み、かつ、捕捉分子は、受容体、または、そのリガンド結合フラグメントに対して特異的に結合するリガンドを含む。特定の実施形態では、標的分子は、リガンドを含み、かつ、捕捉分子は、リガンドに対して特異的に結合する受容体またはそのリガンド結合フラグメントを含む。
【００６９】
本開示の態様は、さらに、疑似インビボ条件下で生体分子を選択する方法に関する。開示した方法は、例えば、前臨床または臨床試験でのさらなる研究のために、潜在的な候補治療用モノクローナル抗体のセットなどの生体分子のセットをスクリーニングするために使用することができる。実施形態では、この方法は、生物学的に適切な分子密集剤と標的生体分子（第１の標的生体分子など）とを含む溶液をバイオセンサーに接触させる工程を含む。バイオセンサーの表面は、標的分子に対して特異的に結合する捕捉分子を含み、その結果、バイオセンサーに対する標的生体分子の（捕捉分子を介して媒介した）結合を、評価、及び／または、決定することができる。実施形態では、第１の標的生体分子は、関心対象である２つ以上の標的生体分子のセットから選択する。バイオセンサーは、例えば、平衡に達したときに、標的生体分子が捕捉分子に対して結合するのに十分な時間、溶液で、インキュベートすることができる。次に、捕捉分子に対して結合した標的生体分子の量を、バイオレイヤー干渉法を使用して決定する。
【００７０】
実施形態では、この方法は、インビボ条件を模倣する第２の溶液などの溶液をバイオセンサーと接触させる工程をさらに含み、第２の溶液は、関心対象である２つ以上の生体分子のセットから選択する第２の標的生体分子を含む。バイオセンサーは、例えば、平衡に達したときに、第２の標的生体分子が捕捉分子に対して結合するのに十分な時間、溶液で、インキュベートすることができる。次に、捕捉分子に対して結合した第２の標的生体分子の量を、バイオレイヤー干渉法を使用して決定する。実施形態では、捕捉分子に対して結合した第２の生体分子の量を、捕捉分子に対して結合した第１の生体分子の量と比較して、第１の生体分子、及び、第２の生体分子での結合量が大きい方を特定する、例えば、生物学的に適切な密集剤での捕捉分子に対するそれぞれの結合に関する生体分子（例えば、抗体、二重特異性抗体、または、融合タンパク質）の等級付けを行う。このプロセスは、関心対象であるモノクローナル抗体のセットなど、関心対象である生体分子のセットでのあらゆる数の生体分子に対して反復できる、と考えられる。等級付けを使用して、さらなる分析のために、セット内からモノクローナル抗体を選択することができる。特定の実施形態では、生体分子は、インビボ適合性に基づいて選択する。実施形態では、第２の溶液、または第３、第４などは、個々の標的生体分子（複数可）が存在すること以外は、第１の溶液と同一である。したがって、本明細書に開示した方法を使用して、捕捉分子に特異的なモノクローナル抗体のセットから選択する２つ以上のモノクローナル抗体など、２つ以上の標的生体分子の結合を比較することができる。実施形態では、捕捉分子に対して結合した第１および／または第２の標的生体分子の量を、上記したようにして、対照と比較し得る。
【００７１】
特定の実施形態では、生物学的に適切な密集剤（例えば、ＨＳＡ）は、約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの間の濃度、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または、１００ｇ／Ｌなど、例えば、約３５〜５０、２５〜４０、または、１０〜８０ｇ／Ｌなどで存在する。一部の実施形態では、この方法を、様々な濃度の生物学的に適切な分子密集剤、例えば、約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌで実施し、例えば、密集剤の濃度の高まりに対する標的分子の応答を決定する。実施形態では、この方法は、分子密集剤の２つ以上の濃度での結合量を決定して、例えば、用量反応曲線を作成することを含む。
【００７２】
実施形態では、密集剤は、ＨＳＡであり、または、ＨＳＡには、例えば、ＦＡの効果を決定するために、脂肪酸（ＦＡ）を担持させている。一部の実施形態では、溶液は、生理学的成分、または、さらなる生理学的成分、例えば、ＩｇＧ、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ＩｇＡ、α２−マクログロブリン、ＩｇＭ、α１−アンチトリプシン、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−１、アポリポタンパク質Ａ−１１、または、血液もしくは血清試料に認められるその他のタンパク質成分などを含む。実施形態では、生物学的に適切な分子密集剤は、血清および／または血漿を含む。
【００７３】
実施形態では、溶液は、生理学的ｐＨ、例えば、中性ｐＨ付近の単一の生理学的ｐＨのものである。しかしながら、この方法は、様々なｐＨで実施できることを想定している。特定の実施形態では、この方法は、２つ以上のｐＨでの結合量を決定して結合のｐＨ依存性を決定する工程をさらに含む。
【００７４】
実施形態では、溶液は、生理学的塩濃度である。特定の実施形態では、この方法は、２つ以上の塩濃度での結合量を決定して結合の塩依存性を決定する工程をさらに含む。
【００７５】
捕捉分子は、共有結合および／または化学的架橋を含むあらゆる数の手段を介してバイオセンサーに付着し得る。次に、標的生体分子は、捕捉プローブに対する特異的結合を介してバイオセンサーに付着し得る。バイオセンサー、試薬、及び、反応容器の操作は、ロボットで行い得る。バイオセンサーによる標的生体分子の捕捉は、例えば、抗原に関する特異的抗体親和性を含む、標的分子の特異的認識に依存している。選択した捕捉分子を、当業者が利用可能なあらゆる方法によって、適切な基板上に固定化する。例えば、捕捉分子は、基板上の選択した官能基に直接に結合させることができる。あるいは、捕捉分子は、リンカーまたはスペーサーを介して基質に対して間接的に連結することができる。図１２に例示したように、ストレプトアビジンは、バイオセンサーの表面に結合しており、そして、捕捉分子は、ストレプトアビジンがビオチン（図１２に示す例では、ビオチン標識抗原）に結合することで、バイオセンサーに動員される。一部の事例では、選択した捕捉分子を、ストレプトアビジン（または、ビオチン）に対する結合を介して固定化し、次いで、基質に共有結合しているビオチン（または、ストレプトアビジン）部分を介して、基質に付着させることができる。特定の実施形態では、捕捉分子は、リンカーによってセンサーの表面に連結される。特定の実施形態では、リンカーは、ビオチンと、ストレプトアビジンまたはアビジンとを含む。ある例では、標的分子は、ヒト化抗体などの抗体であり、そして、捕捉分子は、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃなどの抗ＩｇＧ  Ｆｃである。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、当業者に対して、本発明の方法を再現及び使用する手順の完全な開示と説明を提供するために用意したものであり、そして、本発明者らが本発明と見なす範囲の制限は意図していない。使用する数値（例えば、量、温度など）に関して正確を期するための努力を尽くしてきたが、幾らかの実験誤差と偏差は考慮すべきである。特に断りの無い限り、部は、重量部、分子量は、平均分子量、温度は、摂氏度、室温は、約２５℃、そして、圧力は、大気圧またはその近似圧である。
【００７７】
実施例１：バイオレイヤー干渉法によるタンパク質機能に関する高分子密集の効果の測定
分子レベルでは非常に複雑であるが、適度に高レベルのタンパク質濃度（１０ｇ／Ｌのオーダー）で認められる理想性からの逸脱は、第２の浸透ビリアル係数で簡便に表現し得る（Ｎｅａｌ，Ｂ．Ｌ．，Ａｓｔｈａｇｉｒｉ，Ｄ．＆  Ｌｅｎｈｏｆｆ，Ａ．Ｍ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｓｅｃｏｎｄ  ｖｉｒｉａｌ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ７５，２４６９−２４７７，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０００６−３４９５（９８）７７６９１−Ｘ（１９９８））。自己（Ｂ２２）及び交差（Ｂ２３）ビリアル係数は、それぞれ、単一及び複数のタンパク質種を含む溶液での弱い非特異的なタンパク質−タンパク質の間の相互作用を特徴決定する。多角度静的光散乱（ＭＡＬＳ）は、理想的な限度で、タンパク質などの様々な高分子のモル質量を測定できる第１の原理分析法である。したがって、静的光散乱法は、モル質量の濃度依存性から、正味の相互作用（タンパク質−タンパク質、及び、タンパク質−溶質）を反映し、かつ、溶液でのすべての種の体積効果を除外する、第２のビリアル係数を決定するために、一般的に使用されている（Ａｌｆｏｒｄ，Ｊ．Ｒ．，Ｋｅｎｄｒｉｃｋ，Ｂ．Ｓ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．＆  Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｔ．Ｗ．  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｖｉｒｉａｌ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｍｅｒ−ｄｉｍｅｒ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７７，１２８−１３３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２００８．０３．０３２（２００８））。組成勾配多角度光散乱（ＣＧ−ＭＡＬＳ）では、光散乱検出器を、必要に応じて、それぞれが異なる分子を含む最大で３つの異なる溶液を同時に注入できる自動シリンジポンプシステムの下流に配置する（Ｓｏｍｅ，Ｄ．，Ｋｅｎｒｉｃｋ，Ｓ．ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（ｅｄ  Ｊｉａｎｆｅｎｇ  Ｃａｉ）（ＩｎＴｅｃｈ，２０１２））。このバッチモードでは、溶液でのすべての溶質の重量平均モル質量が決定され、そして、限られた事前知識で結合相互作用の定量分析を提供できる。ＣＧ−ＭＡＬＳの幾つかの実装が、タンパク質と、その他の高分子との間の特異的及び非特異的な相互作用を特徴決定するために開発されている。非特異的なタンパク質−タンパク質の間の相互作用の場合、ＣＧ−ＭＡＬＳシステムには、単一の実験から自己ビリアル係数と交差ビリアル項の両方を抽出できるという利点がある。使用する十分に確立された分析アルゴリズムに加えて、この手法の堅牢性により、広範な濃度範囲で、タンパク質溶液での相互作用の効率的かつ比較的簡便な特徴決定が可能になる（Ｓｏｍｅ，Ｄ．，Ｐｏｌｌａｓｔｒｉｎｉ，Ｊ．＆  Ｃａｏ，Ｓ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ｖｉａ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓ��ｉ  １０５，２３１０−２３１８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｘｐｈｓ．２０１６．０５．０１８（２０１６））。
【００７８】
ＣＧ−ＭＡＬＳ法は、２つの種の間での非特異的相互作用の程度と性質を決定する上で非常に便利であるが、しかしながら、濃度が１０ｇ／Ｌを超えるような系では、データ分析が、さらに煩雑になってしまい、そして、精度が低下する。これにより、濃度範囲を生理学的に適切な範囲にまで広げた代替方法、ならびに、特異的な機能的結合事象に関する非特異的相互作用の影響にかかる研究を展開する代替方法の探求に至った。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）は、反応速度と結合親和性の決定など、特定の高分子相互作用を測定するための無標識光学技術である（Ａｂｄｉｃｈｅ，Ｙ．，Ｍａｌａｓｈｏｃｋ，Ｄ．，Ｐｉｎｋｅｒｔｏｎ，Ａ．＆  Ｐｏｎｓ，Ｊ．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，  ｔｈｅ  Ｏｃｔｅｔ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７７，２０９−２１７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２００８．０３．０３５（２００８），Ｆａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｇ．＆  Ｆｅｒｒｉｅ，Ａ．Ｍ．  Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ａｓｓａｙｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ５５，３１４−３２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｓｃｎ．２００６．１１．００１（２００７），Ｒｉｃｈ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２００６  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ＪＭＲ  ２０，３００−３６６，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｍｒ．８６２（２００７））。ＢＬＩは、内部リファレンス層、及び、バイオセンサーチップ上の固定化タンパク質の層（すなわち、バイオレイヤー）から反射した白色光の干渉パターンを分析する。結合事象は、バイオレイヤー上の分子の数を増やし、リアルタイムでモニタリングできる干渉パターンのシフトを生成する。この方法は、タンパク質−タンパク質の間の相互作用（Ｓｈａｈ，Ｎ．Ｂ．＆  Ｄｕｎｃａｎ，Ｔ．Ｍ．  Ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ，ｅ５１３８３，ｄｏｉ：１０．３７９１／５１３８３（２０１４））、タンパク質−リガンドの間の相互作用（Ｆｒｅｎｚｅｌ，Ｄ．＆  Ｗｉｌｌｂｏｌｄ，Ｄ．  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｓｅｒｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ９，ｅ１０６８８２，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０��８８２（２０１４））、タンパク質−核酸の間の相互作用（Ｐａｒｋ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｇｎａｙｔｅ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６，４１５４−４１６８，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．７ｂ００４８４（２０１７），Ｓｕｌｔａｎａ，Ａ．＆  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｅ．  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ７９，１９  ２５  １１−２６，ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４０８６４．ｐｓ１９２５ｓ７９（２０１５））、及び、小分子とペプチドスクリーニング（Ｗａｒｔｃｈｏｗ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｓｃＲｅｅｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２５，６６９−６７６，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０８２２−０１１−９４３９−８（２０１１））などの評価のために使用している。
【００７９】
本明細書では、簡略化した系において、これらの原理を実証するために、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を使用して、密集した溶液でのｍＡｂ：抗原相互作用に関する非特異的相互作用の影響を測定する方法を開示している。アルブミンは、３５〜５０ｇ／Ｌの生理学的濃度範囲で、血清中の体積分率の大部分を占めており、かつ、生理学的ｐＨでは負に帯電するので、正味の正（または負）の電荷、または、溶媒に曝した表面を担持する生物学的製剤との静電的会合（または反発）を招き得る。この目的のために、ＨＳＡと、同じ抗原に結合する２つの組換え完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ１、及び、ｍＡｂ２）との間の非特異的相互作用を、まず、ＣＧ−ＭＡＬＳを使用して、二成分（ＨＳＡ、及び、ｍＡｂ）系で、次に、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、三成分（ＨＳＡ、ｍＡｂ、抗原）系で研究した。これらのｍＡｂは、抗原上の異なるエピトープを標的とする相補性決定領域（ＣＤＲ）を除けば、配列が非常に類似している。二成分系は、十分に確立された光散乱方法論を使用して、生理学的タンパク質濃度に満たない濃度でのＨＳＡとｍＡｂとの間の非特異的相互作用が、イオン強度依存性と、ｍＡｂ特異性の両方であることを実証した。ｍＡｂの機能特性に関するこれらの相互作用の効果をさらに解明するために、ＢＬＩを、非標準的な方法で利用して、低濃度から生理学的ＨＳＡ濃度に至る濃度でのｍＡｂによる抗原結合を評価した。ＢＬＩの結果は、ＣＧ−ＭＡＬＳデータと相関しており、高濃度ＨＳＡの存在下でのＢＬＩのこの新規の使用は、抗体：抗原結合などの非常に特異的な機能的相互作用に関する密集に起因する非特異的相互作用の影響を直接に評価できることを実証している。本明細書に提示した結果は、血清での高濃度のＨＳＡが、ｍＡｂとの非特異的相互作用をもたらし、抗体機能に潜在的な影響を与えることを実証している。この効果は、イオン強度が低ければ特に顕著であるが、この特定のｍＡｂセットに関する生理学的イオン強度では軽減されるが、しかしながら、この傾向は、必ずしも、その他のすべてのｍＡｂ：抗原系にまで及ぶわけではない。生物学的製剤の開発の初期段階でこの手法を利用することで、非特異的相互作用の効果を容易に検出することができる；逆に、このタイプの研究は、インビボでの予期しない結果に関する懸念事項を払拭することもできる。制御された単純な系に適応分析を備えたＢＬＩプラットフォームを使用して、本発明者らは、非特異的相互作用の機能的影響を決定できること、結果の広がり具合を詳しく研究する段階を設定して、高分子密集、及び、タンパク質の非理想性が、より複雑な溶液で認め得ることを実証した。
【００８０】
材料と試薬調製：この研究で使用したすべてのモノクローナル抗体は、リサーチグレードであり、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．のＰｒｅＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）で製造したものである。すべての抗体は、完全なヒトＩｇＧ４分子であり、また、ＩｇＧ１ヒンジ配列を再現して、ＩｇＧ４二量体形成を安定化するために、ヒンジ領域に変異Ｓ１０８Ｐを含んでおり、そして、これらは、チャイニーズハムスター卵巣細胞からクローニングしたＲｅｇｅｎｅｒｏｎ独自の細胞株で産生した。凍結乾燥ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ  ７０、及び、溶液成分は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、または、ＶＷＲ（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）から入手しており、そして、それらは、入手可能な最高グレードのものであった。
【００８１】
モノマーＨＳＡは、凍結乾燥したＨＳＡを、１０ｍＭ  ＮａＣｌを補充したリン酸緩衝剤（１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、そして、同じ緩衝剤で平衡化した、ＨｉＬｏａｄ  ２６／１００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）で精製して調製した。精製した後に、１０ｋＤａカットオフの遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、ＨＳＡを、約１００〜１３０ｇ／Ｌに濃縮した。抗体は、ＣＧ−ＭＡＬＳ実験と同様の方法で調製した。ＨＳＡ濃度は、３５，７００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ＵＶλ＝２８０ｎｍで、ＳｏｌｏＶＰＥ分光光度計で決定した。ＢＬＩ測定に関しては、高濃度ｍＡｂ製剤（＞５０ｇ／Ｌ）を、１０ｍＭ  ＮａＣｌを補充したリン酸緩衝剤で希釈して、ｍＡｂの原液（１ｇ／Ｌ）を調製し、そして、平衡実験において、４０ｎＭの最終濃度で使用した。タンパク質濃度は、ｍＡｂ１に関しては、１０３，５５５Ｍ−１ｃｍ−１、ｍＡｂ２に関しては、１００，７００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ＵＶλ＝２８０ｎｍで決定した。凍結乾燥したＦｉｃｏｌｌ  ７０を、１０ｍＭ  ＮａＣｌを補充したリン酸緩衝剤に溶解し、そして、一晩、穏やかに回転させて可溶化を促して、Ｆｉｃｏｌｌ  ７０の原液（６００ｍＭ）を調製した。抗原を、製造業者の標識化プロトコルに従って、ビオチン−ヒドラジド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でビオチン標識した。
【００８２】
糖タンパク質抗原を、製造業者の標識化プロトコルに従って、ビオチン−ヒドラジド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、単一グリカンにてビオチン標識した。簡単に説明すると、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７を使用して、８ｇ／Ｌメタ過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液を作成し、そして、抗原と混合し、ホイル内で、室温で、１５分間回転させた後に、１％（ｖ／ｖ）グリセロールで反応停止した。酸化した抗原を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０を入れたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）で溶出した。抗原を含む画分をプールして濃縮し、１０倍モル過剰のビオチン−ヒドラジドと共に、室温で、２時間、インキュベートした。標識した抗原は、１０ｍＭ  ＮａＣｌを補充したｐＨ７．４のリン酸緩衝剤で平衡化した同じカラムから溶出した。
【００８３】
弱陽イオン交換クロマトグラフィー：弱陽イオン交換クロマトグラフィーを、２００ｍＭ  ＭＥＳ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で平衡化したＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０（４ｍｍ×２５０ｍｍ）液体クロマトグラフィーカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で実施した。タンパク質をしっかりと注入し、それぞれの試料の１０μｇを、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）のカラムに、０．５ｍＬ／分の流速で適用した。タンパク質の溶出には、２０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの範囲の勾配を使用した。
【００８４】
組成勾配多角度光散乱（ＣＧ−ＭＡＬＳ）：すべてのタンパク質を、適切な緩衝剤に対して、一晩、透析を行った；すべての緩衝剤を、０．０２μｍのフィルターに通し、そして、すべてのタンパク質試料を、０．１μｍ  Ａｎｏｔｏｐ  ２５  Ｐｌｕｓシリンジフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，ＵＫ）に通し、次いで、使用前に、約２５トールで、１０分間、真空脱気した。第１のタンパク質原液は、ろ過前に、手作業で、約１０ｇ／Ｌに希釈した。ｍｉｎｉＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ  ＭＡＬＳ光度計と、Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸインライン示差屈折計（Ｃａｌｙｐｓｏシステム、及び、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡの両方の検出器）とを組み合わせたＣａｌｙｐｓｏ組成勾配システムを利用して、クロスオーバー勾配スキームを用いて、ＨＳＡ、ｍＡｂ、及び、それらの混合物の静的光散乱測定値を収集した。簡単に説明すると、Ｃａｌｙｐｓｏポンプシステムは、ＨＳＡを、１ｇ／Ｌ刻みで、１〜１０ｇ／Ｌの濃度に自動的に希釈して注入するようにプログラムしていた（１０回の注入、または、ステップ）。希釈していない（１０ｇ／Ｌ）ＨＳＡを注入すると、一連の１０回の注入で、ｍＡｂの濃度が１０％増加したため（クロスオーバー期間）、ＨＳＡの濃度を１０％減少させた。希釈していないｍＡｂ（１０ｇ／Ｌ）を注入した後、その濃度は、一連の９回の注入によって、１ｇ／Ｌの増分で減少した。この濃度は、生理学的条件を反映していないが、交差ビリアル係数の決定に関して推奨された最大最適濃度である。各ステップで、適切に希釈／混合した試料の２ｍＬボーラスを注入して、検出器フローセルを完全に飽和させ、次の濃縮／混合ステップを作成して注入する前に、静止条件下で、９０秒間、データを得た。ベースライン測定値は、勾配プログラムの直前と直後に取得した。角度に依存する有意な光散乱が無いことを確認した後に、９０°光散乱検出器からのデータだけを分析に使用した。機器制御、データ収集、及び、データ分析（Ｓｏｍｅ，Ｄ．，Ｋｅｎｒｉｃｋ，Ｓ．ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（ｅｄ  Ｊｉａｎｆｅｎｇ  Ｃａｉ）（ＩｎＴｅｃｈ，２０１２），Ｓｏｍｅ，Ｄ．  Ｌｉｇｈｔ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｖ  ５，１４７−１５８，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２５５１−０１３−０１０７−１（２０１３））はすべて、Ｃａｌｙｐｓｏソフトウェア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、実行した。
【００８５】
バイオレイヤー干渉法：バイオレイヤー干渉法試験は、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＳＡ、カタログ番号１８−５０１９）を備えたＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６、または、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ、カタログ番号１８−５０６４）でコーティングしたバイオセンサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して行った。９６ウェルプレートに、２００μＬの溶液（緩衝剤、抗原、ＨＳＡ、または、ｍＡｂ）を充填し、そして、１，０００ｒｐｍで攪拌を行い、そして、すべての実験を、２５℃で温度制御した。溶液が蒸発したので、高温になることは避けられた。すべての試験に関して、低塩濃度（１０ｍＭ  ＮａＣｌ）、または、生理学的塩濃度（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）にて、室温で、２０分間、補充したリン酸緩衝剤、ｐＨ７．４で、ＳＡ、または、抗ヒトＦｃチップを水和した。記載したすべての緩衝剤と試料溶液は、特に断りが無い限り、０．１ｇ／Ｌ  ＨＳＡを含んでいた。分析物の非存在下で、チップを緩衝剤に浸して、ベースライン控除を行った。
【００８６】
抗体をロードしたチップに対する抗原の結合を測定する標準的な実験は、ＡＨＣチップを使用して行った。０．１ｇ／Ｌ  ＨＳＡを補充した低塩濃度、または、生理学的塩濃度のリン酸緩衝剤に入れたＡＨＣチップを、２分間、ベースライン測定した後に、２．５μｇ／ｍＬ抗体と共にチップをインキュベートして、約０．６ｎｍの応答を達成した。次に、抗体をロードしたチップを緩衝剤に浸して、過剰なｍＡｂを２分間かけて除去した後に、様々な濃度の未標識抗原、一般的には、２．５〜５０ｎＭのものと、１００〜３００秒間の会合ステップを行った。解離ステップのために、チップを、７５０秒間、緩衝剤に浸した。両方のｍＡｂに関して、１０ｍＭ及び１３７ｍＭ  ＮａＣｌで、ビオチン標識抗原について同じ手順を行った。
【００８７】
ＳＡチップを使用して、抗原をロードしたチップに対する抗体の結合を測定する標準的な結合試験を実施した。０．１ｇ／Ｌ  ＨＳＡを含む低塩分、または、生理学的塩分リン酸緩衝液にて、ＳＡチップを、２分間、ベースラインで測定した後に、これらのチップを、５μｇ／ｍＬビオチン標識抗原と共にインキュベートして、約０．６ｎｍの応答を達成した。次に、抗原をロードしたチップを緩衝剤に浸して、過剰な抗原を２分間かけて除去した後に、様々な濃度、一般的には、２．５〜５０ｎＭの未標識抗原を用いて、９００秒間の会合ステップを行った。解離ステップのために、これらのチップを、１８００〜３６００秒間、緩衝剤に浸した。両方のｍＡｂに関しては、１０ｍＭ、及び、１３７ｍＭ  ＮａＣｌについて、同じ手順を実行した。
【００８８】
最大で５０ｇ／ＬのＨＳＡの存在下での抗原に対するｍＡｂ結合の定常状態分析には、ＨＳＡでのさらなるインキュベーションステップが必要であった。抗原をロードした後に、センサーを、０．１〜５０ｇ／Ｌ  ＨＳＡを含むウェルに浸し、約１５分間かけて平衡化した後に、同じ組成の新たな溶液で２分間インキュベートをして、ＨＳＡインキュベーションの際のシグナルのわずかな増加に起因する新たなベースラインを確立した（図７、ステップＢを参照されたい）。次に、第２の会合ステップとして、４０ｎＭ  ｍＡｂと、０．１〜５０ｇ／Ｌ  ＨＳＡとを含むウェルに、センサーを２０分間浸した。すべての平衡実験で、抗原会合ステップに対するｍＡｂ結合の完了時のシグナル応答（ｎｍ）を  測定基準として使用した。ＨＳＡ＞０．１ｇ／Ｌの存在下で、ｍＡｂ：抗原結合を測定するあらゆる実験では、速度論的分析は行わなかった。それぞれのＨＳＡ濃度で得た生応答（ｎｍ）を、０．１ｇ／Ｌ  ＨＳＡでのｍＡｂ：抗原結合の生応答で割って、データを１．０に正規化した。すべての実験は、３回行った。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して、それぞれの条件で実行して、ｍＡｂ１とｍＡｂ２との差異が、ｐ値の決定を通じて統計的に有意であるか否かを評価した。
【００８９】
Ｆｉｃｏｌｌ  ７０を含む実験は、ＨＳＡを、Ｆｉｃｏｌｌ  ７０に置き換えて、同様の方法で実行した。２００ｇ／Ｌ以上のＦｉｃｏｌｌ  ７０を含む実験では、粘度が上昇するので、平衡を達成するためには、抗原に対して結合するｍＡｂの会合時間を長くする必要があった（約１．７〜３時間）。
【００９０】
ｍＡｂ１／ＨＳＡ及びｍＡｂ２／ＨＳＡの非特異的相互作用のイオン強度依存性：異なるイオン強度でのＨＳＡとそれぞれのｍＡｂとの間の非特異的相互作用を、交差ビリアル係数（ＣＶＣ）を決定するための確立した手法である、組成勾配多角度光散乱（ＣＧ−ＭＡＬＳ）を使用して調べた。この手法は、ＢＬＩによる分析の前に、ＨＳＡとｍＡｂとの間の非特異的相互作用の程度と性質の両方を決定して、データを入念に解釈するために適用した。幾名かの研究者は、厳密な熱力学的原理に基づいて、静的光散乱から決定したビリアル係数は、純粋な自己または交差相互作用パラメーターではなく、タンパク質：共溶質（すなわち、緩衝剤、または、電解質）相互作用と関係している、と指摘している（Ａｌｆｏｒｄ，Ｊ．Ｒ．，Ｋｅｎｄｒｉｃｋ，Ｂ．Ｓ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．＆  Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｔ．Ｗ．  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｖｉｒｉａｌ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｍｏｎｏｍｅｒ−ｄｉｍｅｒ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７７，１２８−１３３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２００８．０３．０３２（２００８），Ｄｅｓｚｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｓ．Ｅ．＆  Ｗｉｎｚｏｒ，Ｄ．Ｊ．  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃＲｙｓｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｆｕｔｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｏｓｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ａｓ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｖｉｒｉａｌ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  １２０，１０６−１１３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｃ．２００５．１０．００３（２００６），Ｗｉｎｚｏｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｅｓｚｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｓ．Ｅ．＆Ｗｉｌｌｓ，Ｐ．Ｒ．  Ｎｏｎｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄ  ｖｉｒｉａｌ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ａｎｄ  ｓｔａｔｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  １２８，４６−５５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｃ．２００７．０３．００１（２００７））。したがって、好ましい従来技術は、光散乱分析から得たビリアル係数をＡ２と称して、モル条件（Ｂ２２）とそれとを区別している。タンパク質が高度に帯電しておらず、かつ、共溶質が単純な緩衝液と電解質である場合、Ａ２（本明細書で使用した）とＢ２２との間の数値的な差異は最小である。同様に、光散乱測定で得たＣＶＣ、または、Ａ２３は、２つの種の間の非特異的相互作用の性質と程度の指標であり、そして、それらを、１０〜７５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液でのｍＡｂ１／ＨＳＡ、及び、ｍＡｂ２／ＨＳＡ相互作用に関して測定をした（図１）。Ａ２３が負の値であれば、２つの種の間の求���力を示し、逆に、正の値であれば、反発力を示す。１０ｍＭ  ＮａＣｌの濃度では、ｍＡｂ１／ＨＳＡとｍＡｂ２／ＨＳＡの両方が、求引力を示しており、ｍＡｂ２／ＨＳＡと比較して、ｍＡｂ１／ＨＳＡとの間でより強い力が認められた。この現象は、イオン強度が強くなるにしたがって軽減した。生理学的イオン強度（約１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）では、ｍＡｂ１とＨＳＡとの間の非特異的相互作用は、わずかに求引的であったが、ｍＡｂ２とＨＳＡとの間の相互作用は、わずかに反発的であった。このことは、ＨＳＡとの非特異的相互作用のイオン強度依存性と、ｍＡｂ依存性の両方を示す。これらの相互作用における静電気の役割を決定するために、分子を、イオン交換クロマトグラフィーで評価した。
【００９１】
クロマトグラフィー法は、ｍＡｂ１とｍＡｂ２は、異なる表面特性を有していることを示す：ｍＡｂ１とｍＡｂ２の表面特性を調べて、ＨＳＡとの非特異的相互作用の程度の違いが、分子間の広範囲電荷−電荷相互作用に起因するものか否かを判断した。続いて、弱陽イオン交換クロマトグラフィーを実行して、２つのｍＡｂの表面特性を、より具体的に評価した。これらの実験は、ｍＡｂ１の保持時間（約１３分）が、ｍＡｂ２の保持時間（約６分）よりも大幅に長いことを示しており、荷電カラム樹脂との相互作用が強いことを示す（図２）。同様に、ＨＳＡに関するクロマトグラフィープロファイルを評価しており、そこでは、２つのｍＡｂと比較して非常に短い保持時間（約２分）で溶出して、より酸性の表面電荷を示した。疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いたｍＡｂの評価では、溶出量の差異は最小であり（データ示さず）、このことは、ｍＡｂとＨＳＡとの間の非特異的相互作用の差異が、疎水性相互作用に起因するものではなく、本質的に静電的である可能性が高いことを示すものであった。総合すると、これらのデータは、それぞれのｍＡｂの表面特性が、ＨＳＡとの非特異的相互作用の程度と性質に重要な役割を果たす可能性があることを実証している。これらの相互作用、ならびに、ｍＡｂの機能特性に関するそれらの影響をさらに評価するために、バイオレイヤー干渉法を使用して、ＨＳＡの非存在下及び存在下での、抗原に対するｍＡｂの結合親和性を調べた。
【００９２】
２つのｍＡｂは、バイオレイヤー干渉法では、同様の結合親和性で、ビオチン標識抗原に対して結合する：これらの２つのｍＡｂの結合特性に関する生理学的に適切なレベルのＨＳＡの効果を評価するために、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、それらに共通する抗原に対するｍＡｂの会合をモニタリングした。系と試薬を試験するために、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーチップを使用して、標準的な親和性測定実験を行い、ｍＡｂ１またはｍＡｂ２をチップにロードし、そして、低塩濃度、及び、生理学的塩濃度条件において、未修飾抗原、または、ビオチン標識抗原のいずれかとの抗原結合を測定した（図８Ａ〜８Ｈ）。これらの実験のデータを、表１にまとめており、そして、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及び、ＫＤに関して、先に生成したＢｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）データ（データ示さず）と強い類似性を示している。
【００９３】
（表１）抗ヒトＦｃ捕捉バイオセンサーチップを用いたＢＬＩで実行した反応速度アッセイで得た結合反応速度パラメーター
2021534393.tif 000003
【００９４】
標準的な親和性測定実験を、抗原をロードしたバイオセンサーチップを使用して実行して、抗体結合を検出した。このことを行うために、抗原を、部位特異的にビオチン標識し、そして、ストレプトアビジンでコーティングしたバイオセンサーチップにロードした。ｍＡｂではなく、小さな抗原を固定化することで、抗体の結合に起因する応答の変化（ｎｍ）が、より顕著なシグナルを与えて、ノイズに対するシグナルを増やした。図３は、理想溶液条件下で、それぞれのｍＡｂに関する結合親和性を決定するために実行した標準ＢＬＩ試験の結果を示す。緩慢な解離反応速度は、見かけのＫＤの正確な推定を可能にするものではないが、緊密な結合は、ナノモルに満たない機能的結合親和性を示しており、このことは、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲデータと一致している（図示せず）。
【００９５】
理想溶液及び実験条件下で実施した反応速度結合試験は、以前に実施したＢｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲ研究（データ示さず）と一貫した結果を示しており、そして、調製した試薬が、完全に活性であることを確立した後に、ビオチン標識抗原に対するｍＡｂ結合を、高濃度で、生理学的に適切な濃度のＨＳＡの存在下で調べた。シグナルの増減のモニタリングを可能にし、そして、おおよその生理学的投与濃度である約５５０ｎＭをはるかに下回っている４０ｎＭ  ｍＡｂの濃度での抗原に対する結合の応答レベルであったので、この濃度を、その後のすべての結合実験で選択した。
【００９６】
抗原に対するｍＡｂ結合に関するＨＳＡの全体的な効果は、イオン強度に依存しており、かつ、ｍＡｂ特異的である：ｍＡｂ−抗原結合に関するＨＳＡの効果を調べるために、非理想溶液条件下でＢＬＩ試験を使用して、定常状態、終点データを分析した。それぞれのｍＡｂを用いた長い（２０分）会合ステップの後の定常状態応答（ｎｍ）レベルをモニタリングして、平衡状態、または、ほぼ平衡状態のＨＳＡの存在下で達成した抗原に対する結合レベルを決定した。親和性フォーマットと、ＨＳＡの濃度の増大に伴って高まった複雑さが故に、反応速度的（オン、及び、オフレート）分析は実施しなかった。ＨＳＡが抗原と相互作用しないことを実証するために、抗体の非存在下で、ＨＳＡだけを用いて対照も実施した（データ示さず）。図４は、１０ｍＭまたは１３７ｍＭ  ＮａＣｌのいずれかで、１０ｇ／Ｌ  ＨＳＡが存在及び非存在である場合のｍＡｂ１及びｍＡｂ２のセンサーグラムを示す。これらのデータは、ＨＳＡの効果が、２つのｍＡｂに関する２つのイオン強度条件を有するという差異を定性的に示しており、イオン強度依存性と、ＨＳＡとのｍＡｂ相互作用との両方についての差異を実証している。低塩分では、ＨＳＡの効果は、ｍＡｂ２よりもｍＡｂ１で大きく、ＨＳＡの添加時の違った応答に反映される。生理学的塩分では、１０ｇ／Ｌ  ＨＳＡの影響は、抗原と、いずれかのｍＡｂとの相互作用に関しても最小限である。これらの結果は、上記したＣＧ−ＭＡＬＳデータと相関しており、そして、ｍＡｂの機能特性に関する潜在的な効果を明らかにしている。
【００９７】
ＨＳＡ濃度の高まりの効果を、低塩分条件と、生理学的塩分条件とでさらに例示しており（図５）、様々なＨＳＡ濃度の平衡状態での応答レベルを、０．１ｇ／Ｌ  ＨＳＡレベルに正規化した。１０ｍＭ  ＮａＣｌでは、ｍＡｂ２は、ＨＳＡ濃度の高まり（約２０％）に伴って、応答がわずかに減少した（すなわち、抗原結合が減少した）が、ｍＡｂ１は、より劇的な減少を示した（約４０％；図５Ａ、表２）。１３７ｍＭ  ＮａＣｌでは、両方のｍＡｂが、２０ｇ／Ｌ未満のＨＳＡ濃度で、抗原結合の適度な増加を示した；ＨＳＡ濃度が高くなると、抗原結合に関するＨＳＡの効果は、ｍＡｂ２と比較して、ｍＡｂ１の方が大きい（図５Ｂ、表３）。ＨＳＡの非存在下でのｍＡｂ結合の応答（図５Ｂの点線で示した）と比較して、ｍＡｂ１のシグナルは約１０％減少しており、一方で、ｍＡｂ２に関するシグナルは、生理学的ＨＳＡ範囲で約６％高まった（３５〜５０ｇ／Ｌ、表４）。このように認められた結合事象は、抗原結合に対して特異的であった；この抗原に結合しない対照ｍＡｂ（ｍＡｂ３）は、０．１〜５０ｇ／Ｌ  ＨＳＡの存在下で、シグナル、または、結合の増加を示さなかった（図９）。
【００９８】
（表２）１０ｍＭ  ＮａＣｌでのＨＳＡの存在下での結合応答に関する正規化した値
2021534393.tif 000004
【００９９】
（表３）１３７ｍＭ  ＮａＣｌでのＨＳＡの存在下での結合応答に関する正規化した値
2021534393.tif 000005
【０１００】
（表４）ＨＳＡでのｍＡｂ１及びｍＡｂ２のＡＮＯＶＡの結果のまとめ
2021534393.tif 000006
＊は、ｐ値＜０．０５を示す
【０１０１】
密集剤Ｆｉｃｏｌｌ  ７０は、抗原に対するｍＡｂ結合に関して同じ効果をもたらさない：ｍＡｂ／抗原結合に関してＨＳＡで認められた効果が、ｍＡｂとＨＳＡとの間の非特異的相互作用、または、ごく一般的な高分子密集効果のいずれに起因しているのかを決定するために、抗原に対するｍＡｂ結合を、密集剤として頻繁に使用されている高溶解性多糖類であるＦｉｃｏｌｌ  ７０を等濃度で存在させて評価した（Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｘ．，Ｒｉｖａｓ，Ｇ．＆  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ，ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３７，３７５−３９７，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｐｈｙｓ．３７．０３２８０７．１２５８１７（２００８）。Ｆｉｃｏｌｌ  ７０は、タンパク質と特異的な相互作用をしない無色の約７０ｋＤａのポリマーである。ＨＳＡ実験で使用した濃度と同等のＦｉｃｏｌｌ  ７０の濃度で、１０及び１３７ｍＭ  ＮａＣｌで、抗原に対して結合するｍＡｂ１及びｍＡｂ２の正規化した応答での変化は、殆ど、または、全く認められなかった（０〜５０ｇ／Ｌ、図６）。密集研究で使用した濃度と忠実に同等であったＦｉｃｏｌｌ  ７０の濃度でも結合を評価した（１００〜３００ｇ／Ｌ、図６）。予想した通り、これらの濃度のＦｉｃｏｌｌ  ７０において、特に、ｍＡｂ１に関して、抗原に対するｍＡｂ結合の緩慢な反応速度では、平衡応答レベルをほぼ達成するためには、会合相の延長が必要であった（ウェル溶液の蒸発を防ぐために、全体の時間を、約３時間に制限した；図６Ｃ及び６Ｄ）。低塩濃度と生理学的塩濃度の両方について、すべてのＦｉｃｏｌｌ濃度で、抗原結合に関する最小限で、かつ、非常に類似した効果が認められた。これらのデータは、ＨＳＡで認められた抗原結合に関する効果が、排除体積効果というごく一般的な現象ではなく、むしろ、ＨＳＡとｍＡｂとの間の静電相互作用による可能性が高いことを示唆している。
【０１０２】
（表５）１０ｍＭ  ＮａＣｌでのＦｉｃｏｌｌ  ７０の存在下での結合応答に関する正規化した値
2021534393.tif 000007
【０１０３】
（表６）１３７ｍＭ  ＮａＣｌでのＦｉｃｏｌｌ  ７０の存在下での結合応答に関する正規化した値
2021534393.tif 000008
【０１０４】
（表７）ＦｉｃｏｌｌでのｍＡｂ１及びｍＡｂ２のＡＮＯＶＡの結果のまとめ
2021534393.tif 000009
＊は、ｐ値＜０．０５を示す
【０１０５】
高分子密集は、生物学では遍在している。密集した溶液でのタンパク質の間に結果として生じる非理想的な相互作用は、タンパク質の挙動と機能に大きく影響すると予測されている（Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｄｉａ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６，１０５７７−１０５８０，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃＲ１００００５２００（２００１），Ｈｕ，Ｚ．，Ｊｉａｎｇ，Ｊ．＆  Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｒ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｏｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９３，１４６４−１４７３，ｄｏｉ：１０．１５２９／ｂｉｏｐｈｙｓｊ．１０７．１０４６４６（２００７），Ｗｅｉ，Ｊ．，Ｄｏｂｎｉｋａｒ，Ｊ．，Ｃｕｒｋ，Ｔ．＆  Ｓｏｎｇ，Ｆ．  Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｏｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  １１，ｅ０１５１１５９，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５１１５９（２０１６））。これらの高度に非線形な効果の特定の性質は、幾つかの報告で異なる結論が導かれていることから明らかなように、大抵の場合、予測が難しい（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ，Ｉ．Ｍ．，Ｔｕｒｏｖｅｒｏｖ，Ｋ．Ｋ．＆  Ｕｖｅｒｓｋｙ，Ｖ．Ｎ．  Ｗｈａｔ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｃａｎ  ｄｏ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ  １５，２３０９０−２３１４０，ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１５１２２３０９０（２０１４），Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １０，３４−３９（２０００））。様々な高分子密集剤を使用した限られた件数の研究では、平衡定数と反応速度に対して相当の影響を及ぼしており、大抵の場合、数ログのオーダーであるとされている（Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｄｉａ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６，１０５７７−１０５８０，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃＲ１００００５２００（２００１），Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ，Ｉ．Ｍ．，Ｔｕｒｏｖｅｒｏｖ，Ｋ．Ｋ．＆  Ｕｖｅｒｓｋｙ，Ｖ．Ｎ．  Ｗｈａｔ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｃａｎ  ｄｏ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ  １５，２３０９０−２３１４０，ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１５１���２３０９０（２０１４），Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｕｏｎ  ｏｆ  ｉｎｅｒｔ  ｃｏｓｏｌｕｔｅｓ  ｏｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ  ａｎｄ  ｒａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｅｒｍｓ  ｏｆ  ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２９５，１２７−１４９（１９９８），Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．＆  Ｙｅｔｈｉｒａｊ，Ａ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｒａｔｅ：ａ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９６，１３３３−１３４０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｊ．２００８．１１．０３０（２００９），Ｊｉａｏ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｈ．Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．＆Ｌｉａｎｇ，Ｙ．  Ａｔｒａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ａｌｔｅｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９９，９１４−９２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｊ．２０１０．０５．０１３（２０１０））。併せて、このことは、生理学的環境を厳密に複製する条件での非理想性の効果に関する情報の容易な提供を可能にする技術の必要性を浮き彫りにしている。本明細書では、ＣＧ−ＭＡＬＳとＢＬＩの２つの補完的な技術を使用して、アルブミンの生理学的濃度が、モノクローナル抗体の機能に及ぼす影響を調べた。２つの種の間の交差ビリアル係数の測定を可能にする、信頼性が大きく、かつ、すでに確立されたツールであるＣＧ−ＭＡＬＳを使用して、システム内の非特異的相互作用の初期理解を得た。次に、非理想溶液条件に適合した定常状態分析を伴うＢＬＩ法を利用して、まず、ＣＧ−ＭＡＬＳの結果を複製し、そして、生理学的濃度のＨＳＡの下で、抗原結合の平衡測定を行って、これらの観察の範囲を広げた。蛍光検出を備えたＡＵＣなどの直交法では、非理想的な条件での特定の相互作用を測定できる（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｒ．Ｔ．，Ｈａｙｅｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｐ．Ｊ．＆  Ｃｏｒｒｅｉａ，Ｊ．Ｊ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ＡＵ−ＦＤＳ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５０，７２−８３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１８．０４．００２（２０１８），Ｗｒｉｇｈｔ，Ｒ．Ｔ．，Ｈａｙｅｓ，Ｄ．，Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｐ．Ｊ．，Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｗ．Ｆ．＆  Ｃｏｒｒｅｉａ，Ｊ．Ｊ．  ＡＵＣ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏ���ｅｉｎｓ．Ｅｕｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２４９−０１８−１３１９−ｘ（２０１８））。ＢＬＩは、結合相互作用を固有の柔軟性で評価するものであり、高濃度の密集剤で多くの異なる条件を試験する上で便利かつハイスループットな方法として有利であるので、一連の小さな実験での様々な環境での結合に関する情報を提供することができる。この手法は、探索研究の早い段階で、スクリーニングプロセスの間に、ｍＡｂ、または、その他の分子を、考慮から除外するための簡単で効率的な方法である。
【０１０６】
様々なタンパク質が提示する溶媒にアクセス可能な表面積の物理化学的複雑さは、非特異的な高分子相互作用の多様性において基本的な役割を果たす。排除体積効果があまり優勢でない中程度のタンパク質濃度（≦１０ｇ／Ｌ）では、静電気が主要な分子間力である（Ｅｌｃｏｃｋ，Ａ．Ｈ．＆  ＭｃＣａｍｍｏｎ，Ｊ．Ａ．  Ｃａｌｕｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｅａｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．ｔｈｅ  ｐＨ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ８０，６１３−６２５，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０００６−３４９５（０１）７６０４２−０（２００１））。この考え方と符合するように、実験的に認められた異なる基本等電点（約０．６５のｐＨ単位だけ相違する）を有するｍＡｂ１とｍＡｂ２の両方が、ＣＧ−ＭＡＬＳを使用して、酸性等電点を持つＨＳＡと相互作用することを示した。これらは特異的な相互作用ではなく、ＨＳＡとそれぞれの抗体との間の非特異的な相互作用である。両方の抗体に関して、ＨＳＡとの相互作用の大きさは、イオン強度の高まりに伴って軽減することが示されており、静電相互作用は、イオン強度の高まりに伴って効果的にスクリーニングできるので、分子間の主要な作用力が静電的である、ことをさらに示唆している（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  １２，１７９−１９３，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ５００５３３ｃ（２０１５）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  １１，２４７５−２４８９，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ５００２３３４（２０１４））。興味深いことに、生理学的イオン強度の近傍では、ｍＡｂ１は、ＨＳＡとの求引性相互作用を示し続けたが、ｍＡｂ２は、ＨＳＡとは、僅かな反発性相互作用を示すに過ぎなかった。ＣＧ−ＭＡＬＳで使用する２成分系システムは、生理学的条件の複雑さを完全には反映しておらず、また、技術的な理由で、生理学的濃度を下回っているが、この分析は、タンパク質の間での非特異的相互作用の程度と性質が、生物学的機能に影響を与え得る、ことを示唆している。これらの抗体は、ＣＤＲだけが異なるので、ＨＳＡとの弱い相互作用の違いが、この領域で発生する可能性がある。さらに、これらの非特異的相互作用は、タンパク質依存性であり、生理学的環境における機能的及び構造的挙動の広大なスペクトルの可能性を示しており、そして、インビトロの結果と、薬物動態及び臨床の結果との間に時折認められる差異を説明できる可能性がある。合成、及び、タンパク質密集の分子動力学シミュレーションは、生物学的ネットワーク内のタンパク質の構造、動力学、及び、相互作用に関する密集の効果が、機能に影響を与えることができる一時的な相互作用を促し得ることを示している（���ａｎｄｏｔｔｉ，Ｍ．＆  Ｏｒｏｚｃｏ，Ｍ．  Ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｏｗｄｉｎｇ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １２，ｅ１００５０４０，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００５０４０（２０１６））。実際のところ、進化的圧力が、非特異的なタンパク質−タンパク質の間の相互作用を最小限に抑えて、複雑さと、タンパク質の乱雑度とを抑制する、という仮説が立てられている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．＆  Ｈｕｍｍｅｒ，Ｇ．  Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｉｍｉｔｓ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｓｈａｐｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８，６０３−６０８，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１０９５４１０８（２０１１），Ｄｅｅｄｓ，Ｅ．Ｊ．，Ａｓｈｅｎｂｅｒｇ，Ｏ．，Ｇｅｒａｒｄｉｎ，Ｊ．＆  Ｓｈａｋｈｎｏｖｉｃｈ，Ｅ．Ｉ．  Ｒｏｂｕｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｒｏｗｄｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，１４９５２−１４９５７，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７０２７６６１０４（２００７））。加えて、幾つかの関連性が認められない研究では、静電気が、非特異的相互作用の主たる牽引役である、ことを示唆している（Ｅｌｃｏｃｋ，Ａ．Ｈ．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｓｏｌｅｌｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１２，８８５−８９６，ｄｏｉ：１０．１００６／ｊｍｂｉ．２００１．５００９（２００１），Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｗｉｔｈａｍ，Ｓ．＆  Ａｌｅｘｏｖ，Ｅ．  Ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ  ８，０３５００１，ｄｏｉ：１０．１０８８／１４７８−３９７５／８／３／０３５００１（２０１１），Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＩｇＧ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８５，１９６３７−１９６４６，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ。Ｍ１１０．１１７３８２（２０１０），Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．Ａ．，Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｂ．＆  Ｌｕｎｄ，Ｍ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ：ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ  ｆｏｒｃｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  Ｂ，１０４５９−１０４６４，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｐ９０４５４１ｇ（２００９），Ｗｌｏｄｅｋ，Ｓ．Ｔ．，Ｓｈｅｎ，Ｔ．＆  ＭｃＣａｍｍｏｎ，Ｊ．Ａ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｔｏ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｉｅｌｄ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ．  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５３，２６５−２７１，ｄｏｉ：１０．１００２／（ＳＩＣＩ）１０９７−０２８２（２００００３）５３：３＜２６５：：ＡＩＤ−ＢＩＰ６＞３．０。ＣＯ；２−Ｎ（２０００））。本明細書に示したＣＧ−ＭＡＬＳとクロマトグラフィーのデータは、これらの研究の幅をさらに広げ、そして、タンパク質の表面電荷特性と、それらの電荷から生じる静電相互作用の潜在的な効果を理解することの重要性を明らかにしており、本明細書では、非特異的相互作用が、抗体：抗原結合事象などの機能的相互作用に影響を及ぼすことができる、ことを実証している。
【０１０７】
マイクロ流体よりはむしろ、ディップ・アンド・リード・デザインを利用することで、バイオレイヤー干渉法は、抗体：抗原結合などの非常に特異的な機能的相互作用に対する、高溶質濃度で誘発する非特異的相互作用の影響を研究する上で役立つ。抗原を固定化し、そして、ＨＳＡの濃度を高めたｍＡｂ溶液を使用することで、本発明者らは、ＣＧ−ＭＡＬＳに使用する条件を緩和して、高濃度の両方のＨＳＡを調べること、そして、親和性をベースとした形式ではあるが、この方法を使用して、３成分相互作用系を確立することができた。重要なことに、抗原結合に関する生理学的ＨＳＡ濃度の影響は、低イオン強度では、ｍＡｂ２よりもｍＡｂ１の方が大きかったが、生理学的塩レベルでは、ＨＳＡの影響は大幅に減少した。生理学的イオン強度でのｍＡｂの間での差異の大きさは、１０ｍＭ塩で認められたものよりも非常に小さいが、複製内の精度を考慮に入れると、２０ｇ／Ｌ以上で、統計的に有意である。溶液蒸発に関する現在の技術的問題は、開発過程にある生理学的温度ではなく、周囲温度でのＢＬＩ試験を必要としているが、このことは、本明細書で説明するＢＬＩ手法が、技術的な問題が故に、周囲温度で行われる光散乱法から得たデータを複製及び展開できることを明確に示唆している。さらに、低イオン強度でＣＧ−ＭＡＬＳで認められた非特異的相互作用は、実際のところ、抗体：抗原相互作用に関して機能的な影響を及ぼしており、そして、この効果は、中程度のＨＳＡ濃度では安定状態に見える；例えば、５０ｇ／Ｌ  ＨＳＡは、３５ｇ／Ｌよりも、結合に関して、さほど大きな影響を与えない。このことが、ほとんどの治療用ｍＡｂ、または、その他の生物学的製剤に関する一般的な傾向であるか否かについては不明なままであり、継続的な研究が必要である。血清に含まれる天然のその未精製抗原と会合するｍＡｂを試験したバイオセンサープラットフォームＫｉｎＥｘＡを使用して行った研究（Ｂｅｅ，Ｃ．，Ａｂｄｉｃｈｅ，Ｙ．Ｎ，Ｐｏｎｓ，Ｊ．＆  Ｒａｊｐａｌ，Ａ．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅｉｒ  ｎａｔｉｖｅ  ｕｎｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８，ｅ８０５０１，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８０５０１（２０１３））は、一部のｍＡｂが、緩衝剤または血清で同じ見かけの親和性を示す一方で、その他のｍＡｂでは、見かけの親和性に差異があったことを実証した。これらの結果は、タンパク質共溶質が媒介する高分子密集の理解をさらに深める。リゾチーム、リボヌクレアーゼＡ、アルブミン、及び、再構成したＥ．ｃｏｌｉサイトゾルなどの幾つかのタンパク質が、高分子密集剤として使用されており、対照的な結果になることが多い。例えば、アポミオグロビンの自己会合は、密集したリボヌクレアーゼＡ溶液では強くなるが、密集したＨＳＡ溶液では強くならないことが認められた（Ｚｏｒｒｉｌｌａ，Ｓ．，Ｒｉｖａｓ，Ｇ．，Ａｃｕｎａ，Ａ．Ｕ．＆  Ｌｉｌｌｏ，Ｍ．Ｐ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｒｏｗｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：ａ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １３，２９６０−２９６９，ｄｏｉ：１０．１１１０／ｐｓ．０４８０９４０４（２００４））。逆に、ＧＢ１のＡ３４Ｆ変異体の二量体化は、１００ｇ／Ｌ  ＢＳＡで強まり、そして、５０ｇ／Ｌ  リゾチームで弱まった（Ｋｙｎｅ，Ｃ．＆  Ｃ．Ｒｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｂ．  Ｓｈｏｒｔ  Ａｒｇｉｎｉｎｅ  Ｍｏｔｉｆｓ  Ｄｒｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｉｃｋｉｎｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６，５０２６−５０３２，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．７ｂ００７３１（２０１７））。執筆者らは、解離定数で認められた差異の主な要因として、Ａ３４Ｆの電荷状態と比較した電荷状態の差異を指摘している。さらに、濃縮したＢＳＡ／ＳＨ３ドメイン溶液での弱いヘテロ相互作用は、溶液の粘度に関して予測したものをはるかに超えて  両方のタンパク質の移動拡散を遅延させた（Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｐｐａｒｅｎｔ  ｖｉｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｒｏｗｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  １８，１８００６−１８０１４，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ６ｃｐ０１０５６ｃ（２０１６））。このことは、移動拡散と同等、または、それよりも速い時間スケールに関する一時的な結合事象に起因している可能性がある。本明細書に記載した結果をも考え合わせると、一過性の相互作用が、抗体：抗原結合事象などの高親和性（ｎＭ−ｐＭ）相互作用に関する効果を奏することができる、ことは明らかである。
【０１０８】
ＰＥＧ、デキストラン、または、Ｆｉｃｏｌｌなどの合成ポリマーは、密集剤として頻繁に使用されているが、しかしながら、研究の目的は、一般的には、タンパク質の折り畳み、または、安定性である（Ｃａｎｄｏｔｔｉ，Ｍ．＆  Ｏｒｏｚｃｏ，Ｍ．  Ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｏｗｄｉｎｇ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １２，ｅ１００５０４０，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００５０４０（２０１６），ＭｃＧｕｆｆｅｅ，Ｓ．Ｒ．＆  Ｅｌｃｏｃｋ，Ａ．Ｈ．  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ，ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ＆  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ６，ｅ１０００６９４，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ。ｐｃｂｉ．１０００６９４（２０１０），Ｍｉｔｔａｌ，Ｓ．＆  Ｓｉｎｇｈ，Ｌ．Ｒ．  Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓｔａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ：  ａ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８，ｅ７８９３６，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７８９３６（２０１３），Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｘ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｒｏｗｄｅｒｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｗｄｅｒｓ  ａｃｔ  ｓｉｍｉｌａｒｌｙ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８７，３９４−３９７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｅｂｓｌｅｔ．２０１３．０１．０３０（２０１３），Ｂａｔｒａ，Ｊ．，Ｘｕ，Ｋ．，Ｑｉｎ，Ｓ．＆  Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｘ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ：  ｍｏｄｅｓｔ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９７，９０６−９１１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｊ．２００９．０５．０３２（２００９），Ｓｅｎｓｋｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｎｔｈａｌｐｙ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｅｎｔｒｏｐｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３６，９０３６−９０４１，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ５０３２０５ｙ（２０１４），Ｈｏｎｇ，Ｊ．＆  Ｇｉｅｒａｓｃｈ，Ｌ．Ｍ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｒｅｍｏｄｅｌｓ  ｔｈｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ａ  ｍｏｒｅ  ｃｏｍｐａｃｔ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｓｔａｔｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３２，１０４４５−１０４５２，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊＡ１０３１６６ｙ（２０１０））。ポリマーが、不均一なタンパク質−タンパク質の間の相互作用に及ぼす効果に関しては、件��は比較的少ないものの、研究報告はされている（Ｃａｎｄｏｔｔｉ，Ｍ．＆  Ｏｒｏｚｃｏ，Ｍ．  Ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｏｗｄｉｎｇ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １２，ｅ１００５０４０，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００５０４０（２０１６）、Ｊｉａｏ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｈ．Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．＆Ｌｉａｎｇ，Ｙ．  Ａｔｒａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ａｌｔｅｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９９，９１４−９２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｊ．２０１０．０５．０１３（２０１０）、Ｐｈｉｌｌｉｐ，Ｙ．＆  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｃｒｏｗｄｅｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  −  ｆｒｏｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｏ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８７，１０４６−１０５２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｅｂｓｌｅｔ．２０１３．０１．００７（２０１３），Ｋｏｚｅｒ，Ｎ．，Ｋｕｔｔｎｅｒ，Ｙ．Ｙ．，Ｈａｒａｎ，Ｇ．＆  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：ｆｒｏｍ  ｄｉｌｕｔｅ  ｔｏ  ｓｅｍｉｄｉｌｕｔｅ  ｔｏ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９２，２１３９−２１４９，ｄｏｉ：１０．１５２９／ｂｉｏｐｈｙｓｊ．１０６．０９７７１７（２００７））。本明細書では、合成ポリマーの真の効果に関する明確なコンセンサスは存在せず、そして、基本的成果は、関心対象であるシステムに固有である、と改めて思料している。Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒと仲間達は、バルナーゼとバースターとの間、または、β−ラクタマーゼとそのタンパク質阻害剤との間の相互作用に関するＰＥＧとデキストランの最小限の効果を示しており、一方で、Ｌｉａｎｇと同僚達は、カタラーゼとスーパーオキシドジスムターゼとの会合に関するポリマー密集の顕著な効果を示した（Ｊｉａｏ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｈ．Ｔ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．＆Ｌｉａｎｇ，Ｙ．  Ａｔｒａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ａｌｔｅｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９９，９１４−９２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｊ．２０１０．０５．０１３（２０１０）、Ｐｈｉｌｌｉｐ，Ｙ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｅ．，Ｈａｒａｎ，Ｇ．＆  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．  Ｃｏｍｍｏｎ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｈａｖｅ  ｏｎｌｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９７，８７５−８８５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｊ．２０��９．０５．０２６（２００９））。抗体：抗原結合に関する高濃度ＨＳＡの影響は、単に排除体積効果に起因するものであるが、ＨＳＡよりはむしろ、多糖Ｆｉｃｏｌｌ  ７０の存在下で行った同等の実験では異なる結果が得られており、高濃度でも、結合に関する影響は、殆ど、または、全く無かった。この差異は、低イオン強度で特に明白であり、ＨＳＡの存在下で、結合活性の有意なｍＡｂ特異的抑制を示した。Ｆｉｃｏｌｌが密集した溶液では、効果は最小限でしかなく、また、２つのｍＡｂで同様である。このことは、ＨＳＡの効果が、排除体積に関する効果だけでは説明できないことを示唆している；生物学的システムの複雑さ（すなわち、タンパク質の表面特性）が、生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。関心対象であるさらなるシステムを使用した研究は、タンパク質高分子密集のモデルの改善に役立つと思われる。
【０１０９】
当然のことながら、高濃度のＦｉｃｏｌｌ（１００ｇ／Ｌ以上）は、定常状態を達成するために必要な時間で評価すると、両方の抗体の見かけの結合を遅延させたが、しかしながら、効果は、ｍＡｂ２よりもｍＡｂ１でより顕著であった。これは、高粘度の溶液に加えて、一般的な密集研究に使用するものと同様のＦｉｃｏｌｌ濃度での系の結合特性に関するさらなるタンパク質特異的効果を示唆している。２つのｍＡｂに対する高濃度のＦｉｃｏｌｌの異なる効果の具体的な理由は不明であるが、結合または排除のいずれかの優先的相互作用の差異に起因するものと考えられる（Ａｒａｋａｗａ，Ｔ．＆  Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ，Ｓ．Ｎ．  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２２４，１６９−１７７（１９８３），Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ，Ｓ．Ｎ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｏｌｖｅｎｔ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９，９７２１−９７２６，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２２２２５３９９（２００２））。特に，それぞれのｍＡｂに関するＦｉｃｏｌｌの効果は、低イオン強度と、高イオン強度との間で、ほぼ一貫していた。従前の研究は、Ｆｉｃｏｌｌが、分子の熱安定性と構造動力学に様々な影響を与えることができる、と示唆しており（Ｑｕ，Ｙ．＆  Ｂｏｌｅｎ，Ｄ．Ｗ．  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｉｎ  ｆｏｒｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｆｏｌｄ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  １０１−１０２，１５５−１６５（２００２），Ｓａｓａｈａｒａ，Ｋ．，ＭｃＰｈｉｅ，Ｐ．＆  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｔｏ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２６，１２２７−１２３７（２００３），Ｓｔａｇｇ，Ｌ，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｑ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｍ．Ｓ．＆  Ｗｉｔｔｕｎｇ−Ｓｔａｆｓｈｅｄｅ，Ｐ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｎａｔｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，１８９７６−１８９８１，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７０５１２７１０４（２００７），Ｔｏｋｕｒｉｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １３，１２５−１３３，ｄｏｉ：１０．１１１０／ｐｓ．０３２８８１０４（２００４））、そして、２つのｍＡｂの間のＣＤＲの差異は、結合に関する随伴���果と共に、構造または動力学に関する様々なＦｉｃｏｌｌ誘発効果に寄与すると考えられる。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を使用した研究では、Ｆｉｃｏｌｌが、タンパク質に結合して、天然リガンドであるマルトースの結合と競合できることを示した（Ｍｉｋｌｏｓ，Ａ．Ｃ．，Ｓｕｍｐｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｘ．  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８，ｅ７４９６９，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７４９６９（２０１３））。このことは、タンパク質−リガンド相互作用に関する密集剤の直接的な効果と、その他の高分子との競合の潜在的な結果を実証するものである。しかしながら、Ｆｉｃｏｌｌで認められた効果は、平衡応答それ自体に関するものではなく、むしろ平衡に達するまでに必要な時間に基づいており、このことは、ポリマー（Ｆｉｃｏｌｌ）とタンパク質（ＨＳＡ）密集剤が、必ずしも同じ結果を招くものではない、ことを実証している。これらの潜在的な差異は、研究を進めている分子に関連する固有の物理化学的特性に依存しているようである。この複雑な現象をよりよく理解するためには、さらなる研究が必要であり、さらに、タンパク質の水和、または、優先的な排除／相互作用の研究は、この不一致の背後にある機序を明らかにし得る。ポリマー密集剤は、リガンド結合に関する効果を絶えず奏するわけではない。この系のポリマーを、タンパク質密集剤に置き換えると、静電相互作用や、その他の非理想的な挙動がさらに複雑になるので、熱力学に関する大きな異なる効果を与え得る。
【０１１０】
生体液の複雑さと体積占有率は、構成分子に関する理想挙動から大きく逸脱している。このような条件下でのタンパク質の非理想挙動と非特異的な相互作用を理解することは、タンパク質の機能を、より完全かつ正確に把握する上で不可欠である。本明細書で、本発明者らは、バイオレイヤー干渉法を使用して、非特異的タンパク質−タンパク質の間の相互作用の機能的影響を特徴決定するハイスループット手法を実証しており、これにより、最小限の材料を使用して、比較的短時間で、多数の試験品をスクリーニングすることができる。具体的には、本発明者らは、生理学的濃度のアルブミンが、抗体−抗原結合に及ぼす影響を研究した。同じ抗原に結合する２つの異なる抗体は、アルブミンの存在によって異なる影響を受けており、このことは、生物学的製剤が、定義した系において、アルブミンとの様々な非特異的相互作用を示し得ることを示唆している。ＨＳＡの存在下で、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのその他の生物学的に適切な分子に対して結合するｍＡｂの評価が、最も重要である。酸性エンドソームから血流へのＩｇＧとＨＳＡの両方の再循環を、ｐＨ依存的にＦｃＲｎが促しており（Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｅ．＆  Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６，６３−７３（１９９８））、そして、このプロセスはよく理解されているが、ＩｇＧとＨＳＡとの間で認められた潜在的な相互作用は、さらに複雑なプロセスを示唆している（Ｗａｎｇ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  Ｆｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃａｎ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ＦｃＲｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｗｉｔｈ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ３９，１４６９−１４７７，ｄｏｉ：１０．１１２４／ｄｍｄ．１１１．０３９４５３（２０１１））。最後に、生物学的製剤の開発の大部分を未知の領域として、適応症、及び、投与経路に関連する非特異的相互作用を特徴決定することは、有力候補分子のプールの中での重要な識別因子として役立つ。様々な生物学的問題及び創薬問題に対するバイオレイヤー干渉法技術の応用が進んでいる（Ｖｅｒｚｉｊｌ，Ｄ．，Ｒｉｅｄｌ，Ｔ．，Ｐａｒｒｅｎ，Ｐ．＆  Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ，Ａ．Ｆ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ．Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ８７，３８８−３９５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ。ｂｉｏｓ．２０１６．０８．０９５（２０１７），Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ｔ．，Ｇｕｎｎａｒｓｓｏｎ，Ａ．＆  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄｎｅｒ，Ｓ．  Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ＡＣＳ  Ｓｅｎｓ  ２，１０−１５，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｓｅｎｓｏｒｓ．６ｂ００７３５（２０１７），Ｙａｎｇ，Ｄ．，Ｓｉｎｇｈ，Ａ．，Ｗｕ，Ｈ．＆  Ｋｒｏｅ−Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｒ．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｏｕｒ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ，ｄｏｉ：１０．３７９３／５５６５９（２０１７））。早期発見研究スクリーニングツールとして、ＢＬＩは、パイプラインから候補をより迅速に排除するために使用することができ、そして、探索研究で使用するアッセイのタイプを多様化する上で役立つ。本明細書で説明した手法は、ＮＭＲやＡＵＣなどのその他の生物物理学的手法と組み合わせて使用して、密集溶液現象のより適切な研究を行う上で重要なツールである。
【０１１１】
実施例２：ＦｃＲｎを介した再循環経路からの抗体の選択
ＦｃＲｎは、内皮細胞のリソソーム分解を抑制することで、ＩｇＧと血清アルブミンの半減期を延長する。ＩｇＧ、血清アルブミン、及び、その他の血清タンパク質は、飲作用によって継続的に内在化される。一般的に、血清タンパク質は、エンドソームからリソソームへと輸送され、そこで、分解される。ＩｇＧと血清アルブミンは、わずかに酸性のｐＨ（＜６．５）で、ＦｃＲｎに結合し、そして、中性ｐＨ（＞７．０）の血液で放出されて細胞表面で再利用に供される。このようにして、ＩｇＧと血清アルブミンは、リソソーム分解を回避する。このメカニズムは、ＩｇＧと血清アルブミンの血清循環半減期が長くなる、ことを説明している。したがって、疑似インビボ条件下でＦｃＲｎの結合が増えた抗体は、より長い半減期を有するとものと考えられ、したがって、これは、優れた治療薬のことを意味し得る。抗体ＦｃＲｎ結合に関するＨＳＡの効果を決定するための試験システムを、図１３に示している。図１４は、ＨＳＡとｍＡｂ／ＨＳＡとの会合ステップが、ｐＨ６．０で、特異的なＦｃＲｎ結合応答を生成したことを示しており、この応答は、ｐＨ７．４では、完全に可逆的である。図１５Ａ及び１５Ｂは、ＦｃＲｎに対するｍＡｂ１及びｍＡｂ２の結合が、ＨＳＡによって同様に影響を受けることを示している。この効果は、低イオン強度、及び、生理学的イオン強度でも同じである。ＨＳＡは、低ＨＳＡ濃度、及び、生理学的ＨＳＡ濃度で、ＦｃＲｎに対するｍＡｂの結合を抑制する。以下に説明する試験は、一般的に、実施例１に記載したようにして行う。
【０１１２】
ＦｃＲｎ抗体結合に関するＦＡをロードしたＨＳＡの効果：Ｃ１８：１が、ｈＦｃＲｎ結合を消失させ、そして、Ｃ１６：０が、ｈＦｃＲｎ結合を大幅に抑制したのに対して、Ｃ１２：０の影響が些細であった、ことが以前に報告されており、これらのことは、ＦＡ結合ＨＳＡの再利用効率が、リガンドを持たないＨＳＡよりも低いであろう、ことを示している。本実施例では、実験が、ＦＡ：ＨＳＡの存在下でのＦｃＲｎに対する２つの異なるｍＡｂ（ｍＡｂ１、及び、ｍＡｂ２）の結合が、純粋なＨＳＡとの結合と比較して強いことを示している（図１６を参照されたい）。この結果は、純粋なＨＳＡが、「汚れたＨＳＡ」よりも大きな親和性でＦｃＲｎに結合し、ｍＡｂとＦｃＲｎとの相互作用を妨げることを示唆している。ＦＡをロードしたＨＳＡは、循環を継続する必要があるかもしれず、一方で、リガンドを含まないＨＳＡは、細胞質での再利用を必要とする。ＦＡ結合ＨＳＡの電荷状態の変化により、ＦｃＲｎ親和性は低下し得る。
【０１１３】
ＦｃＲｎに結合する抗Ｃ５  ｍＡｂに関するＨＳＡの異なる効果：ｍＡｂ３は、抗Ｃ５ｍＡｂである。このｍＡｂ（ｍＡｂ４）で半減期が長い抗体として、ＹＴＥ変異体（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）（図１７を参照されたい）がある。ｍＡｂ５とｍＡｂ６には、それぞれ、ＨＬＥ変異体ＫＦＦ（Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｆ、Ｙ４３６Ｆ）と、ＬＳ（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ）がある。ｍＡｂ１及びｍＡｂ２で認められたものとは対照的に、ＨＳＡは、ＦｃＲｎに対して結合する様々な抗Ｃ５分子に異なる影響を及ぼした（図１８を参照されたい）。すべての分子は、ＨＳＡの存在下で、ＦｃＲｎに対する結合を抑制するが、ＨＬＥ変異体（ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、及び、ｍＡｂ６）は、さほど影響を受けなかった。ｍＡｂ５は、その他のＨＬＥ変異体と比較して、ＦｃＲｎ結合に関するＨＳＡの影響が最小であった。
【０１１４】
ＦｃＲｎに結合する抗ジカｍＡｂに関する異なるＨＳＡ効果：ｍＡｂ７は、Ｆｃγ受容体結合活性を抑制した抗ジカｍＡｂである。ｍＡｂ８＝ｍＡｂ７＋ＹＴＥ変異体。ｍＡｂ９は、Ｆｃγ受容体結合活性を抑制した抗ジカウイルス抗体である。ＹＴＥ変異体だけが、ＦｃＲｎとの相互作用に影響を及ぼす。図１９に示したように、ＦｃＲｎに対するｍＡｂ９の結合は、ＨＳＡの生理学的レベルを抑制する；しかしながら、ｍＡｂ９は、ＨＳＡの存在下で、ｍＡｂ７及びｍＡｂ８と比較して、ＦｃＲｎとの高度の相互作用を維持した。２０ｍｇ／ｍｌ以上のＨＳＡの濃度では、ＦｃＲｎに対するｍＡｂ７及びｍＡｂ９の結合は、ＨＳＡシグナルによって、わずかに不明瞭になった（負の値）。
【０１１５】
半減期延長変異体は、ＨＳＡの存在下では、ＦｃＲｎに対して、親ｍＡｂよりも高い結合応答を実証する：ＨＬＥ変異体は、ＦｃＲｎに対して高い結合親和性を示すようにデザインされており、そして、ＨＳＡの存在下では、図２０に示したように、この序列を保っている。ＫＦＦ変異体は、生理学的濃度に近いＨＳＡ下で、最高の結合応答を示す。
【０１１６】
ＦｃＲｎ結合実験は、生理学的設定において、ｍＡｂ機能を評価するツールとして、このプラットフォームを使用する可能性を実証する：標準的なＢＬＩ結合実験は、ｍＡｂ１とｍＡｂ２が、両方の塩濃度で、ＦｃＲｎに対して同様の結合親和性を有することを示した。ＨＳＡは、１０及び１３７ｍＭ    ＮａＣｌにて、ＦｃＲＮに対するｍＡｂ１及びｍＡｂ２の結合に、同様の影響を及ぼす。ＨＳＡの存在は、ＦｃＲｎに対するｍＡｂの結合を抑制した。抗Ｃ５及び抗ジカ抗体由来のＹＴＥ変異体は、「野生型」と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性を高め、そして、ＨＳＡの影響を抑制する、ことを実証した。この方法論は、ほぼ生理学的な設定でのｍＡｂ機能を理解するためのプラットフォームを提供しており、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ＡｓｓｅｓｍｅｎｔｓとＰＫ研究との間の間隙を解消することができる。
【０１１７】
本発明を、本明細書に記載した特定の実施形態に基づいて、範囲を限定すべきではない。実際のところ、本明細書に記載した変更の他に、本発明の様々な変更は、当業者であれば、上記した説明、及び、添付図面から明らかであろう。このような変更は、添付した特許請求の範囲に含まれる、ことを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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