(57)【要約】  本発明は、多様な癌タイプを標的とすることができる、最適化されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびそれを発現する遺伝子修飾された細胞に関する。より具体的には、ＣＡＲは、ＣＡＲを発現するＴ細胞による広範囲の癌細胞型の標的化および溶解を容易にする最適化されたリンカー長を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識する抗原認識ドメイン、膜貫通ドメインおよびリンカードメインを含むキメラ抗原受容体であって、リンカードメインが１２〜２２８個のアミノ酸からなる、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
リンカードメインが３０〜２２８個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
リンカードメインが５０〜２００個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
リンカードメインが７０〜１８０個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
リンカードメインが９０〜１６０個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
リンカードメインが１１０〜１３０個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
リンカードメインが１１５〜１２５個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
リンカードメインが１１７〜１２１個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
リンカードメインが約１１９個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
リンカードメインが、免疫グロブリンヒンジ領域に相同なアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
リンカードメインが、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡの免疫グロブリンヒンジ領域、またはＩｇＭもしくはＩｇＥの定常重鎖（ＣＨ）２領域に相同なアミノ酸配列、あるいは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％、９６％または９９％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
リンカードメインが、ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリン由来のヒンジ領域に相同なアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％もしくは９６％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
リンカードメインが、免疫グロブリンのＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４サブクラスのヒンジ領域に相同なアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９３％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１４】
リンカードメインが、ＣＸＸＣモチーフを含むＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリン由来のヒンジ領域に相同なアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
ＣＸＸＣモチーフが、ＣＰＰＣ、ＣＰＲＣまたはＣＰＳＣの群から選択される、請求項１４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
リンカードメインが、免疫グロブリンの定常重鎖（ＣＨ）領域に相同な１つ以上のアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％もしくは９６％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１７】
リンカードメインが、免疫グロブリンのＣＨ１領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域および／もしくはＣＨ４領域の１つ以上に相同なアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％もしくは９６％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１８】
リンカードメインが、ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域の１つ以上に相同なアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１９】
リンカードメインが、免疫グロブリンの１つ以上の免疫グロブリンヒンジ領域および／または１つ以上のＣＨ領域からなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２０】
リンカードメインが、ＩｇＧヒンジ領域、および免疫グロブリンの１つ以上のＣＨ領域からなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２１】
リンカードメインが、ＩｇＧヒンジ領域、および／または免疫グロブリンのＣＨ２もしくはＣＨ３領域からなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２２】
リンカードメインが、配列番号９〜１７に記載のアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％もしくは９６％の配列同一性を有する機能的変異体を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２３】
リンカードメインが、配列番号９〜１３に記載のアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％もしくは９６％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２４】
キメラ抗原受容体が、実質的にＦｃ受容体に結合するリンカードメイン中のアミノ酸配列を含まない、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２５】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞において発現した場合、３０：１またはそれより高いＣＡＲを発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞：標的細胞の比率で、少なくとも２０％の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞に対してインビトロで細胞傷害性を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２６】
ＣＤ３＋  Ｔ細胞において発現した場合、Ｔ細胞が、少なくとも２個の異なる癌タイプ、少なくとも３個の異なる癌タイプ、少なくとも４個の異なる癌タイプ、少なくとも５個の異なる癌タイプ、少なくとも６個の異なる癌タイプ、少なくとも７個の異なる癌タイプ、少なくとも８個の異なる癌タイプ、少なくとも９個の異なる癌タイプ、少なくとも１０個の異なる癌タイプに対して活性を示す、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２７】
抗原認識ドメインが、Ｐ２Ｘ７受容体のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合部位に結合したエピトープを認識する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２８】
機能不全Ｐ２Ｘ７受容体が、完全に機能的なＰ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合能力と比較して、低下したＡＴＰを結合する能力を有する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２９】
機能不全Ｐ２Ｘ７受容体が、受容体を機能障害にする立体構造変化を有する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３０】
立体構造変化が、トランス−立体構造からシス−立体構造へのアミノ酸の変化である、請求項２９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３１】
トランス−立体構造からシス−立体構造に変化したアミノ酸が、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置２１０におけるプロリンである、請求項３０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３２】
抗原認識ドメインが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置２００のグリシンからアミノ酸位置２１６のシステインにわたる１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープを認識する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３３】
抗原認識ドメインが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置２１０におけるプロリンを含むエピトープを認識する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３４】
抗原認識ドメインが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の抗原結合ドメインのアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含むか、または抗原認識ドメインが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の重鎖および／もしくは軽鎖の相補性決定領域を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３５】
膜貫通ドメインが、ＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部または一部を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項３７】
請求項３６に記載の核酸分子を含む核酸構築物。
【請求項３８】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含む遺伝子修飾された細胞。
【請求項３９】
請求項３６に記載の核酸分子または請求項３７に記載の核酸構築物を含む遺伝子修飾された細胞。
【請求項４０】
細胞が白血球である、請求項３８または３９に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項４１】
細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項４２】
細胞がリンパ球である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項４３】
細胞がＴ細胞である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項４４】
Ｔ細胞がＣＤ４＋  Ｔ細胞である、請求項４３に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項４５】
Ｔ細胞がＣＤ８＋  Ｔ細胞である、請求項４３に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項４６】
Ｔ細胞がガンマデルタＴ細胞である、請求項４３に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項４７】
細胞がナチュラルキラー細胞である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項４８】
細胞がナチュラルキラーＴ細胞である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項４９】
細胞がマクロファージである、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞。
【請求項５０】
癌を治療するための、請求項３８〜４９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞、または請求項１〜３５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞の使用。
【請求項５１】
癌が固形癌である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を死滅させる方法であって、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞に曝露するステップを含むか、または機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、請求項３８〜４９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞に曝露するステップを含む方法。
【請求項５３】
機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞が癌細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
癌細胞が固形癌由来の細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
癌細胞が、乳癌細胞、膠芽腫癌細胞、卵巣癌細胞、または黒色腫癌細胞である、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
キメラ抗原受容体を発現する細胞、または遺伝子修飾された細胞が、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞に対して自家である細胞である、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞が対象の体内にある、請求項５２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
対象の体内にある細胞が転移性癌由来の細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項３８〜４９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された細胞、請求項３６に記載の核酸分子、または請求項３７に記載の核酸構築物、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６０】
癌の予防または治療のための薬剤の調製における、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体の使用。
【請求項６１】
請求項３６に記載の核酸分子または請求項３７に記載の核酸構築物を含むウイルスベクター。
【請求項６２】
癌の予防または治療のための細胞の形質導入における、請求項６１に記載のウイルスベクターの使用。
【請求項６３】
細胞の形質導入、形質転換またはトランスフェクションにおける、請求項３６に記載の核酸分子または請求項３７に記載の核酸構築物の使用。
【請求項６４】
細胞が、癌の予防または治療のための薬剤の調製において使用される、請求項６３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
[0001]本出願は、２０１８年５月２１日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２０１８９０１７８２号に基づく優先権を主張するものであり、その全内容は、この参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
[0002]本発明は、キメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞、ならびに癌の予防および／または治療のためにキメラ抗原受容体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]免疫系は高度に進化し、一連の病態から生物を保護する特異的なメカニズムを有する。これらのメカニズムの中には、細菌感染、ウイルス感染細胞、および重要なことに、悪性新生物（癌）を引き起こし得る突然変異細胞などの望ましくない病原体の検出および除去がある。免疫系が癌の形成および増殖を予防する能力は、「健常な」細胞と「罹患した」（例えば、腫瘍性または前腫瘍性）細胞とを区別する免疫系の細胞の能力に依存する。これは、正常な状態から疾患状態への細胞の移行を示す細胞マーカー（抗原）を認識することによって達成される。
【０００４】
[0004]癌細胞抗原を発現する標的細胞に免疫系を操作するかまたは指向させることにより、癌を治療するための免疫療法アプローチを開発する多くの試みがなされている。免疫療法アプローチは、単離されたかもしくは操作された抗体を利用することによって体液性免疫系を利用すること、またはより最近では免疫系の細胞アーム（cellular arm）を利用することのいずれかに主に集中している。
【０００５】
[0005]癌の治療のために細胞免疫療法を行う１つの手段は、腫瘍から単離されたＴリンパ球を利用することであり、これは患者に再投与する前にエクスビボで拡大される。このアプローチはいくつかの有望性および有効性を提供したが、このアプローチに関連する多数の技術的課題がある。単離された腫瘍由来のＴ細胞の不均一な性質、および細胞をエクスビボで拡大することの課題は、ほんの僅かな数の癌抗原特異的Ｔ細胞のみを含有する、拡大された集団をもたらす可能性がある。結果として、この方法の有効性は、予測不可能であり、変動的である。
【０００６】
[0006]エクスビボで拡大させた腫瘍単離Ｔ細胞の使用に関連する欠点の一部に対処するために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲまたは人工Ｔ細胞受容体）が１９８０年代後半に開発され始めた。キメラ抗原受容体は、所望の抗原に特異的な細胞外領域を細胞内シグナル伝達領域に組み合わせ、その結果、Ｔ細胞機能を誘導し得る抗原特異的受容体を生じさせる。
【０００７】
[0007]単離されたＴ細胞をＣＡＲを用いて形質転換すると、所与の抗原に特異的なＴ細胞集団が生じる。これらの細胞は、抗原結合分子の抗原特異性と、内因性Ｔ細胞の溶解能および自己再生を組み合わせる。結果として、抗原特異的Ｔ細胞の大きな集団が生成され、患者に投与することができる。
【０００８】
[0008]現在までのところ、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の開発および実施は限られている。主に、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｂ細胞リンパ腫などの血液癌を治療するために使用されている。Ｂ細胞マーカーＣＤ１９に指向されるＣＡＲ  Ｔ細胞を用いたこのような状態の治療により、ＩＶ期リンパ腫患者における客観的奏効率は最大８０％、完全奏効率は５０％を超えている。
【０００９】
[0009]しかしながら、血液癌の治療におけるＣＡＲ  Ｔ細胞療法の成功にもかかわらず、他の癌タイプにおけるその使用は限られている。ＣＡＲ  Ｔ細胞が他の癌タイプ、特に固形腫瘍の治療に成功していないことには多くの理由がある。これらの理由には、固形腫瘍へのＴ細胞のアクセス、固形腫瘍内の敵対的であり、免疫抑制的な微小環境、および重要なことに、固形腫瘍特異的抗原を発現する癌細胞を標的とし攻撃するＣＡＲ−Ｔ細胞の開発における困難が含まれる。
【００１０】
[0010]腫瘍特異的抗原が同定された場合でさえも、固形腫瘍細胞を効果的に標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞を生成する能力は、多様な癌タイプを標的とする能力と同様に困難である。
【００１１】
[0011]したがって、癌性細胞によって選択的に発現され、ＣＡＲで形質導入された細胞において応答を誘導する腫瘍関連抗原を標的とするＣＡＲの開発が必要であることは明らかである。
【００１２】
[0012]文書、行為、材料、装置、物品等の検討は、本発明のための文脈を提供する目的のためにのみ、本明細書に含まれる。これらの事項の何れかまたは全てが、先行技術基準の一部を形成していること、または、本発明に関連する分野において、本出願の各クレームの優先日前に存在していた技術常識であることは示唆も説明もされていない。
【発明の概要】
【００１３】
[0013]本発明は、部分的には、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に指向されるＣＡＲのその抗原を認識する能力が、抗原認識ドメインとＣＡＲの膜貫通ドメインとの間のリンカードメインの長さに依存して変化するという認識に基づく。その結果、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞に対するＣＡＲを発現する免疫細胞の有効性は、抗原認識ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカードメインの長さに影響される。
【００１４】
[0014]したがって、本発明は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識する抗原認識ドメイン、膜貫通ドメインおよびリンカードメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、リンカードメインは１２〜２２８個のアミノ酸からなる。
【００１５】
[0015]一部の実施形態では、本発明は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識する抗原認識ドメイン、膜貫通ドメインおよびリンカードメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、リンカードメインは３０〜２２８個のアミノ酸からなる。
【００１６】
[0016]一部の実施形態では、リンカードメインは、５０〜２００個のアミノ酸、または７０〜１８０個のアミノ酸、または９０〜１６０個のアミノ酸、または１１０〜１３０個のアミノ酸、または１１５〜１２５個のアミノ酸、または１１７〜１２１個のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、リンカードメインは、約１１９個のアミノ酸からなる。
【００１７】
[0017]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡの免疫グロブリンヒンジ領域、またはＩｇＭもしくはＩｇＥの定常重鎖（ＣＨ）２領域に相同なアミノ酸配列、あるいは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％、９６％または９９％の配列同一性を有するその機能的変異体を含むリンカードメインを含む。
【００１８】
[0018]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリン由来のヒンジ領域に相同なアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％、９６％もしくは９８％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。好ましくは、リンカードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４サブクラス抗体のヒンジ領域に相同なアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６６％、７３％、７５％、８０％、８３％、８６％、９１％もしくは９３％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。
【００１９】
[0019]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリン由来のヒンジ領域に相同なアミノ酸配列を含み、ＣＸＸＣモチーフを含み、「Ｃ」はシステインであり、「Ｘ」は任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＣＸＸＣモチーフは、ＣＰＰＣ、ＣＰＲＣまたはＣＰＳＣからなる群から選択される。
【００２０】
[0020]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、免疫グロブリンのＣＨ領域に相同な１つ以上のアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。一部の実施形態では、ＣＨ領域に相同なアミノ酸配列は、免疫グロブリンのＣＨ１領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、もしくはＣＨ４領域のうちの１つ以上に相同であるか、または上記ＣＨ領域と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する。
【００２１】
[0021]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンのＣＨ２領域もしくはＣＨ３領域のうちの１つ以上に相同な１つ以上のアミノ酸配列を含むか、または上記ＣＨ２もしくはＣＨ３領域と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する。
【００２２】
[0022]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、１つ以上の免疫グロブリンヒンジ領域、および／または免疫グロブリンの１つ以上のＣＨ領域を含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ領域、好ましくはＣＨ２領域またはＣＨ３領域に相同な配列からなる。一部の実施形態では、ヒンジ領域、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域は、ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリン由来である。一部の実施形態では、ヒンジ領域、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域は、ＩｇＧ４サブクラス由来である。
【００２３】
[0023]一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧヒンジ領域、および免疫グロブリンの１つ以上のＣＨ領域からなる。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧヒンジ領域、および免疫グロブリンのＣＨ２またはＣＨ３領域からなる。
【００２４】
[0024]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、配列番号９〜１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％もしくは９６％の配列同一性を有する機能的変異体を含む。好ましくは、キメラ抗原受容体は、配列番号９〜１３に記載のアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％もしくは９６％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。
【００２５】
[0025]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、実質的にＦｃ受容体と結合するリンカードメインのアミノ酸配列を含まない。
[0026]一部の実施形態では、本発明によるキメラ抗原受容体は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞において発現された場合、３０：１またはそれより高いＴ細胞：標的細胞の比率で、少なくとも２０％の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞に対してインビトロで細胞傷害性を有する。一部の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞は、癌細胞である。
【００２６】
[0027]本発明の一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の抗原認識ドメインは、Ｐ２Ｘ７受容体のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合部位に結合したエピトープを認識する。一部の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体は、完全に機能的なＰ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合能力と比較して、低下したＡＴＰを結合する能力を有する。一部の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体は、受容体を機能不全にする立体構造変化を有する。一部の実施形態では、立体構造変化は、トランス立体構造からシス立体構造へのアミノ酸の変化であり、好ましくは、立体構造変化は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置が２１０であるプロリンである。
【００２７】
[0028]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置が２００のグリシンからアミノ酸位置が２１６のシステインに及ぶ１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープを認識する。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置が２１０のプロリンを含むエピトープを認識する。
【００２８】
[0029]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の抗原認識ドメインは、抗体の抗原結合領域のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の可変重鎖もしくは可変軽鎖の少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、または機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に対する配列相同性を含むドメイン領域のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む。
【００２９】
[0030]一部の実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８；好ましくは、ＣＤ８またはＣＤ２８；より好ましくは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部または一部を含む膜貫通ドメインを含む。
【００３０】
[0031]本発明はさらに、癌を治療するために、免疫細胞で発現される場合、上記されるキメラ抗原受容体の使用を提供する。一部の実施形態では、免疫細胞は白血球であり、一部の実施形態では、免疫細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はアルファベータ（αβ）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はウイルス特異的Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ３＋  Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラーＴ細胞である。一部の実施形態では、癌は固形癌である。
【００３１】
[0032]本発明はさらに、上記されるキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子または核酸構築物を提供する。
[0033]本発明はさらに、上記されるキメラ抗原受容体、核酸分子、または核酸構築物を含む遺伝子修飾された細胞を提供する。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は白血球であり、一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はアルファベータ（αβ）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、ウイルス特異的Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はナチュラルキラーＴ細胞である。
【００３２】
[0034]本発明は、さらに、癌を治療するために上記される遺伝子修飾された細胞の使用を提供する。さらに、本発明は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を死滅する方法を提供し、本方法は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、上記されるキメラ抗原受容体、核酸分子または核酸構築物を含む細胞に曝露することを含む。一部の実施形態では、本発明は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を死滅する方法を提供し、本方法は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、上記される遺伝子修飾された細胞に曝露することを含む。一部の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞は、癌細胞である。
【００３３】
[0035]一部の実施形態では、癌細胞は、固形癌細胞である。一部の実施形態では、癌細胞は、脳癌細胞、食道癌細胞、口腔癌細胞、舌癌細胞、甲状腺癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、腎臓癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、子宮頸癌細胞、上皮細胞癌、皮膚癌細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮内膜癌細胞および精巣癌細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、癌細胞は、乳癌細胞、前立腺癌細胞、膠芽腫癌細胞、卵巣癌細胞、または黒色腫癌細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、癌細胞は転移性癌由来である。一部の実施形態では、癌は、ＩＩＩ期癌を有するかもしくはＩＶ期癌である患者由来であるかまたは患者内にある。
【００３４】
[0036]一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞に対して自家である。一部の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞は、対象の体内にある。
【００３５】
[0037]本発明はまた、上記されるキメラ抗原受容体、核酸分子または核酸構築物を含む遺伝子修飾された細胞、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
[0038]少なくとも一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを提供する。
[0039]さらに、本発明は、癌の予防または治療のために、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体、レンチウイルスベクター、遺伝子修飾された細胞または核酸の使用を提供する。少なくとも一部の実施形態では、癌の予防または治療に使用するための薬剤の製造または調製におけるキメラ抗原受容体、レンチウイルスベクター、遺伝子修飾された細胞または核酸の使用が提供される。
【００３７】
[0040]少なくとも一部の実施形態では、薬剤は、固形癌細胞の予防または治療のために使用される。一部の実施形態では、薬剤は、脳癌細胞、食道癌細胞、口腔癌細胞、舌癌細胞、甲状腺癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、腎臓癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、子宮頸癌細胞、上皮細胞癌、皮膚癌細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮内膜癌細胞および精巣癌細胞からなる群から選択される癌細胞の予防または治療のために使用される。一部の実施形態では、薬剤は、乳癌細胞、前立腺癌細胞、膠芽腫癌細胞、卵巣癌細胞、または黒色腫癌細胞からなる群から選択される癌細胞の予防または治療のために使用される。一部の実施形態では、癌細胞は転移性癌由来である。一部の実施形態では、癌は、ＩＩＩ期癌を有するかもしくはＩＶ期癌である患者由来であるかまたは患者内にある。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】[0041]本発明の一実施形態によるＣＡＲ構築物の概略図である。
【図２】[0042]本発明の例示的な実施形態のＩｇＧサブタイプ抗体のヒンジ領域および突然変異ヒンジ領域のアラインメントを示す図である。
【図３】[0043]本発明の例示的な実施形態のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４抗体および突然変異ヒンジ領域のアラインメントを示す図である。
【図４】[0044]本発明の例示的な実施形態のＩｇＧサブタイプ抗体のＣＨ２領域およびＣＨ２領域のアラインメントを示す図である。
【図５】[0045]本発明の例示的な実施形態のＩｇＧサブタイプ抗体のＣＨ３領域およびＣＨ３領域のアラインメントを示す図である。
【図６】[0046]ＣＮＡ１００４  ＣＡＲを含むｅｐＨＩＶ−７．２レンチウイルスベクターを示す図である。
【図７】[0047]ＣＡＲを形質導入したＣＤ４＋細胞上のＥＧＦＲｔおよびＦｃ発現の散布図である。
【図８】[0048]ＣＡＲを形質導入したＣＤ８＋細胞上のＥＧＦＲｔおよびＦｃ発現の散布図である。
【図９】[0049]単離および拡大されたＣＡＲを形質導入したＣＤ４＋細胞上のＥＧＦＲｔおよびＦｃ発現の散布図である。
【図１０】[0050]単離および拡大されたＣＡＲを形質導入したＣＤ８＋細胞上のＥＧＦＲｔおよびＦｃ発現の散布図である。
【図１１】[0051]種々の標的細胞株に対するＣＡＲを形質導入したＣＤ８＋  Ｔ細胞の死滅アッセイを示す図である。
【図１２】[0052]種々の標的細胞株に対するＣＡＲを形質導入したＣＤ８＋  Ｔ細胞の死滅アッセイを示す図である。
【図１３】[0053]プロトコール２によるＣＮＡ１００３  ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞上のＣＤ４およびＣＤ８発現の散布図、ならびにＥＧＦＲ発現のヒストグラムを示す図である。
【図１４】[0054]種々の癌細胞株に対するＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の死滅アッセイを示す図である。
【図１５】[0055]種々の癌細胞株に対するＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の死滅アッセイを示す図である。
【図１６】[0056]種々の癌細胞株に対するＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の死滅アッセイを示す図である。
【図１７】[0057]種々の癌細胞株に対するＣＤ４＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の死滅アッセイを示す図である。
【図１８】[0058]種々の標的細胞株に対するＣＡＲを形質導入したＣＤ４＋  Ｔ細胞のサイトカイン分泌アッセイを示す図である。
【図１９】[0059]種々の標的細胞株に対するＣＡＲを形質導入したＣＤ４＋  Ｔ細胞のサイトカイン分泌アッセイを示す図である。
【図２０】[0060]本発明の追加の実施形態に使用されるＢＬＩＶベクターを示す図である。
【図２１】[0061]短鎖ヒンジおよび長鎖ヒンジＢＬＩＶ−ＣＡＲを発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞のエフェクター機能を評価する死滅アッセイを示す図である。
【図２２】[0062]様々な抗原認識ドメインを有するＣＡＲ構築物の様々な癌細胞株に対する死滅アッセイを示す図である。
【図２３】[0063]前立腺癌におけるインビボ異種移植モデルにおけるＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を示す図である。
【図２４】[0064]ＣＤ３＋細胞を単回および２回投薬した場合の、ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞に浸潤するＣＤ４＋およびＣＤ８＋腫瘍の生存パーセンテージを示す図である。
【図２５】[0065]ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞に浸潤するＣＤ３＋ＣＤ４＋腫瘍のサイトカイン分泌および活性化プロファイルを示す図である。
【図２６】[0066]ＣＮＡ１００３ＣＡＲ  Ｔ細胞に浸潤するＣＤ３＋ＣＤ８＋腫瘍のサイトカイン分泌および活性化プロファイルを示す図である。
【図２７】[0067]前立腺癌のインビボ異種移植モデルにおけるＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を示す図である。
【図２８】[0068]ＣＮＡ１００３ＣＡＲ  Ｔ細胞に浸潤するＣＤ８＋腫瘍のサイトカインプロファイルおよび活性化プロファイルを示す図である。
【図２９】[0069]様々な用量のＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与したマウス異種移植前立腺癌モデルにおける腫瘍の増殖およびサイズを示す図である。
【図３０】[0070]１×１０７または２×１０７個のＣＤ３＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞を単回投薬または２回投薬で投与したマウス由来のＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞に浸潤したＣＤ３＋腫瘍の総数および生存パーセンテージ、ならびに腫瘍浸潤ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型分析を示す図である。
【図３１】[0071]ＣＤ４＋およびＣＤ８＋腫瘍浸潤ＣＡＲ  Ｔ細胞による細胞傷害性エフェクター分子のグランザイムｂおよびパーフォリンの発現を示す図である。
【図３２】[0072]乳癌のインビボ異種移植モデルにおけるＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能、および肺転移結節の定量化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
[0073]本明細書において言及されるヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、配列識別子番号（配列番号）によって表される。配列識別子の概要は、表１に示される。配列表はまた、本明細書の一部として提供される。
【００４０】
【表１−１】
2021524248.tif 000003
【００４１】
【表１−２】
2021524248.tif 000004
【００４２】
【表１−３】
2021524248.tif 000005
【００４３】
[0074]本発明は、部分的には、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識するＣＡＲの能力が、抗原認識ドメインとＣＡＲの膜貫通ドメインとの間のリンカードメインの長さに依存して変化するという発明者による認識に基づく。その結果、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞に対するＣＡＲを発現する免疫細胞の有効性は、抗原認識ドメインを膜貫通ドメインに連結するリンカードメインの長さに影響される。具体的には、ＣＡＲを発現する免疫細胞が、広範囲の癌細胞型を標的とし、死滅させる能力は、リンカーの長さに影響される。
【００４４】
[0075]当該技術分野において公知であるように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞の表面上で発現すると、抗原特異的細胞応答を誘導することができる人工的に構築されたタンパク質である。ＣＡＲは、最低３つのドメインを含み、第１のドメインは、抗原、またはより具体的には抗原のエピトープ部分、もしくは部分を特異的に認識する細胞外抗原認識ドメインであり；第２のドメインは、細胞内シグナル伝達経路を誘導するかまたは誘導に関与することができる細胞内シグナル伝達ドメインであり；第３のドメインは、細胞膜を横断し、細胞外抗原認識ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを橋渡しする膜貫通ドメインである。
【００４５】
[0076]最初の２つのドメインの組合せは、ＣＡＲの抗原特異性および所望の細胞応答を誘導するＣＡＲの能力を決定し、後者はまたＣＡＲの宿主細胞に依存する。例えば、Ｔヘルパー細胞において発現され、ＣＤ３活性化ドメインを含むシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲの活性化は、その同族抗原に遭遇することによって活性化されると、ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を誘導して、一連のサイトカインを分泌させることができる。別の例では、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞において発現された場合、同じＣＡＲが、同族抗原を発現する細胞によって活性化されると、細胞毒素の放出を誘導し、それが最終的には抗原を発現する細胞のアポトーシスの誘導をもたらすことができる。
【００４６】
[0077]第３のドメイン（膜貫通ドメイン）は、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインの一部を含み得、またはそれと結合され得る。膜貫通ドメインは、典型的には、１つ以上の疎水性ヘリックスであり、細胞の脂質二重層を貫通し、細胞膜内にＣＡＲを埋め込む。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞と結合した場合、ＣＡＲの発現パターンにおける１つの決定因子であり得る。例えば、ＣＤ３補助受容体と結合した膜貫通ドメインを使用することにより、ナイーブＴ細胞においてＣＡＲの発現を可能にすることができるが、ＣＤ４補助受容体からの膜貫通ドメインを使用することにより、Ｔヘルパー細胞においてＣＡＲの発現を指向することができる。ＣＤ８補助受容体膜貫通ドメインを使用することにより、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）における発現を指向することができるが、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＣＴＬとＴヘルパー細胞の両方において発現を可能にし、ＣＡＲにおける安定化を支援することができる。
【００４７】
[0078]キメラ抗原受容体のさらなるコンポーネントまたは一部は、リンカードメインであり得る。リンカードメインは、膜貫通ドメインの細胞外側から抗原認識ドメインに渡り、それによって抗原認識ドメインを膜貫通ドメインに連結する。典型的には、当該技術分野において、リンカードメインは、リンカードメインを含まない、いくつかのＣＡＲ機能として、任意のドメインとして考えられる。
【００４８】
[0079]理論に拘束されることを望まないが、Ｔ細胞のエフェクター機能は、Ｔ細胞とその標的細胞との間の適切なサイズのシナプスの形成に依存するという仮説がある。典型的には、Ｔ細胞がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して抗原を認識する場合、抗原のエピトープは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（特に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞ではＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４＋  Ｔ細胞ではＭＨＣクラスＩＩ）によって提示されている。その結果、Ｔ細胞と標的細胞の間の距離（シナプス間隔）は、一定である（これはＴＣＲとＭＨＣ分子の長さによって決定される）。しかしながら、これは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の場合はない。
【００４９】
[0080]所与のＣＡＲ  Ｔ細胞によって認識されるエピトープは、標的分子のサイズおよび構造、標的分子上のエピトープの位置、ならびにキメラ抗原受容体、特に抗原認識ドメインの性質に依存して変化する。さらに、標的分子上のエピトープの位置に依存して、キメラ抗原受容体は、抗原認識ドメインの配向が標的分子と適切に相互作用し、認識することを可能にするために、ある程度の柔軟性を必要とし得る。
【００５０】
[0081]その結果、リンカードメインは、ＣＡＲの抗原認識ドメインに柔軟性を提供して、抗原認識ドメインの必要な配向を可能にし、免疫シナプス距離を調節し得るため、ＣＡＲにリンカードメインを含めることが有益であり得る。
【００５１】
[0082]本発明者らは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に指向されるキメラ抗原受容体の機能は、抗原認識ドメインを膜貫通ドメインに連結する結合ドメインが１２〜２２８個のアミノ酸、好ましくは３０〜２２８個のアミノ酸である場合に最適化されることを認識した。結果として、最適化されたキメラ抗原受容体は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する広範囲の細胞型を標的とすることができる。好ましくは、標的細胞は癌細胞であり、最適化されたキメラ抗原受容体（免疫細胞上で発現される場合）は、広範囲の癌細胞型を標的とすることができる。このことは、機能不全Ｐ２Ｘ７が広範囲の悪性腫瘍によって発現されるため、特に有利であり、したがって、本発明の最適化されたキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞は、多様な癌を標的とすることができる。
【００５２】
[0083]その結果、本発明は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体、膜貫通ドメイン、およびリンカードメインを認識する抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、リンカードメインは１２〜２２８個のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、リンカードメインは、３０〜２２８個のアミノ酸からなる。
【００５３】
抗原認識ドメイン
[0084]機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を標的とするキメラ抗原受容体は、国際出願公開第ＷＯ２０１７／０４１１４３号に記載されており、その全開示は、これを参考することにより組み込まれる。
【００５４】
[0085]Ｐ２Ｘ７受容体（プリン作動性受容体Ｐ２Ｘ、リガンド依存性イオンチャネル、７）は、ヒトを含む多数の種で発現されるＡＴＰ依存性イオンチャネルである。受容体は、遺伝子によってコードされ、その正式な記号はＰ２ＲＸ７（斜体）で表される。遺伝子はまた、Ｐ２Ｘプリン受容体７、ＡＴＰ受容体、Ｐ２Ｚ受容体、Ｐ２Ｘ７受容体、およびプリン作動性受容体Ｐ２Ｘ７変異体Ａとも呼ばれる。本開示の目的のために、遺伝子およびコードされた受容体は、それぞれ、本明細書中ではＰ２Ｘ７（斜体）およびＰ２Ｘ７と呼ばれる。
【００５５】
[0086]ヒトＰ２Ｘ７（斜体）遺伝子のｍＲＮＡ配列、コード配列（ｃＤＮＡ）、およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１〜３に示される。ヒトＰ２Ｘ７（斜体）遺伝子のｍＲＮＡおよびアミノ酸配列はまた、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２５６２．５およびＮＰ＿００２５５３．３によって表される。Ｐ２Ｘ７（斜体）遺伝子は、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ブタ、ニワトリ、ゼブラフィッシュおよびカエルにおいて少なくとも部分的に保存される。ヒトおよび他の種におけるＰ２Ｘ７（斜体）遺伝子のさらなる詳細は、米国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースからアクセスすることができる。例えば、ヒトＰ２Ｘ７（斜体）の遺伝子ＩＤ番号は５０２７、チンパンジーは４５２３１８、サルは６９９４５５、イヌは４４８７７８、ウシは２８６８１４、マウスは１８４３９、ゼブラフィッシュは３８７２９８、およびカエルは３９８２８６である。さらに、少なくとも７３種の生物がヒトＰ２Ｘ７（斜体）遺伝子のオルソログを有する。
【００５６】
[0087]ヒトおよび他の種におけるＰ２Ｘ７（斜体）遺伝子に関するさらなる詳細は、ＮＣＢＩのＵｎｉＧｅｎｅポータル（例えば、ヒトＰ２Ｘ７に関してはＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．７２９１６９を参照されたい−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／ｃｌｕｓｔ．ｃｇｉ？ＵＧＩＤ＝４５４０７７０＆ＴＡＸＩＤ＝９６０６＆ＳＥＡＲＣＨ）で見出すことができる。あるいは、Ｐ２Ｘ７（斜体）遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の詳細は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）からアクセスすることができ、ヒトＰ２Ｘ７（斜体）遺伝子のＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤはＱ９９５７２である。ＧｅｎＢａｎｋおよびＵｎｉＰｒｏｔ記録の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
[0088]Ｐ２Ｘ７受容体は、３つのタンパク質サブユニット（モノマー）から形成され、ヒトにおける天然受容体において、モノマーの少なくとも１つは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。本明細書で言及される「Ｐ２Ｘ７受容体」はまた、スプライス変異体、天然に存在する受容体の切断型形態および対立遺伝子変異体を含む受容体の天然に存在する変形も含むことが理解されるべきである。Ｐ２Ｘ７受容体はまた、修飾されたアミノ酸配列を有するサブユニット、例えば、配列番号３に示されるアミノ酸の切断、アミノ酸欠失または修飾を含むサブユニットを含み得る。
【００５８】
[0089]Ｐ２Ｘ７（斜体）遺伝子またはコードされたタンパク質の「変異体」は、例えば、天然のＰ２Ｘ７受容体と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．９％同一である、それぞれ核酸またはアミノ酸配列を示し得る。
【００５９】
[0090]Ｐ２Ｘ７受容体は、ＡＴＰが受容体のＡＴＰ結合部位に結合することによって活性化される。これは、膜を通過する小さなカチオンの移動を選択的に可能にするチャネルの急速な開口（ミリ秒以内）をもたらす。短時間（数秒以内）後、サイズが９００Ｄａまでの分子が細胞膜を透過することができる大きな孔が細胞の膜に形成される。この孔の形成は、最終的には、細胞の脱分極をもたらし、多くの場合、細胞傷害性および細胞死をもたらす。この役割は、Ｐ２Ｘ７受容体が様々な細胞型のアポトーシスに関与しているという考えを導く。
【００６０】
[0091]Ｐ２Ｘ７受容体の機能の減少または喪失は、誘導されたアポトーシスに対して比較的抵抗性のある細胞をもたらすことができる。多くの場合、このアポトーシスに対する抵抗性は、正常な「健常」細胞が、突然変異した前癌細胞または癌性細胞に移行する際に重要である。その結果、Ｐ２Ｘ７受容体の機能減少または機能喪失を有する細胞を標的とする能力は、癌治療の可能な標的を提供する。
【００６１】
[0092]したがって、本発明のキメラ抗原受容体は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識する。本明細書を通じて使用される場合、用語「機能不全」は、Ｐ２Ｘ７受容体に関して、同等の細胞におけるその比較的正常な機能に関して、受容体機能の減少を含む。一部の実施形態では、Ｐ２Ｘ７受容体の機能は、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％を超えるまで減少させることができる。一部の実施形態では、用語「機能不全」は、機能しないＰ２Ｘ７受容体を含み得る。
【００６２】
[0093]機能不全受容体をもたらすＰ２Ｘ７受容体の野生型または天然型における任意の変化は、本明細書に包含される。例えば、機能不全受容体は、受容体へのＡＴＰ結合に関連する受容体の１つ以上のアミノ酸における突然変異または変化の結果であり得る。実際には、Ｐ２Ｘ７受容体は、ＡＴＰ結合部位にＡＴＰを結合する能力が低下しているか、または結合することができないため、機能不全に陥っている。この場合、キメラ抗原受容体の抗原認識ドメインは、ＡＴＰ結合部位に結合した機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のエピトープを認識する。したがって、本発明の一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の抗原認識ドメインは、Ｐ２Ｘ７受容体のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合部位に結合したエピトープを認識する。一部の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体は、完全に機能的なＰ２Ｘ７受容体のＡＴＰ結合能力と比較して、低下したＡＴＰに結合する能力を有する。一部の実施態様では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体は、ＡＴＰに結合することができない。
【００６３】
[0094]Ｐ２Ｘ７受容体の１つ以上のアミノ酸における変化は、受容体の１つ以上のアミノ酸における立体構造変化を含み得る。したがって、本発明の一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識し、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体は、受容体を機能不全にする立体構造変化を有する。具体的には、この立体構造変化は、Ｐ２Ｘ７受容体の１つ以上のアミノ酸におけるトランス立体構造からシス立体構造への変化であり得る。一部の実施形態では、Ｐ２Ｘ７受容体の２１０位のプロリンは、トランス立体構造からシス立体構造に変化する。この場合、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置２１０におけるプロリンを含むエピトープを認識することができる。本発明の第１の態様の一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置が２００のグリシンからアミノ酸位置が２１６（を含む）のシステインに及ぶ１つ以上のアミノ酸を含むエピトープを認識する。本発明の第１の態様の一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体の２１０位にプロリンを含むエピトープを認識する。本発明の第１の態様の一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体の２１０位のプロリン、および機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置が２００のグリシンからアミノ酸位置が２１６（を含む）のシステインに及ぶアミノ酸残基の１つ以上を含むエピトープを認識する。
【００６４】
[0095]理論に拘束されることを望まないが、Ｐ２Ｘ７受容体の２１０位でのプロリンの立体構造変化の結果として、受容体の三次元構造が変化し得る。三次元構造のこの変化は、ＣＡＲの抗原認識ドメインが、Ｐ２Ｘ７受容体の天然の三次元構造において以前はアクセスできなかったアミノ酸またはエピトープに結合することを可能にする。したがって、一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３の２１０位でのプロリンのトランス−からシス−立体構造変化の結果として、抗原認識ドメインに曝露されたＰ２Ｘ７受容体の１つ以上のエピトープを認識する。これらのエピトープは、Ｐ２Ｘ７受容体の２００〜２１０位、または２９７〜３０６位（両端を含む）のうちの１つ以上のアミノ酸を含み得る。したがって、本発明の第１の態様の一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、Ｐ２Ｘ７受容体の２００〜２１０位および／または２９７〜３０６位で１つ以上のアミノ酸を含むエピトープを認識する。
【００６５】
[0096]本明細書を通じて使用される場合、用語「認識する」とは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体、その一部、またはそのエピトープと結合する抗原認識ドメインの能力に関する。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体、またはそのエピトープに直接結合し得る。他の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のプロセシングされた形態に結合し得る。この文脈で使用される場合、用語「プロセシングされた形態」とは、典型的には、細胞内プロセシングの結果として切断または消化されたＰ２Ｘ７受容体の形態に関する。その結果、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体の「プロセシングされた形態」の認識は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と関連して提示される結果としてであり得る。
【００６６】
[0097]抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体、またはそのエピトープを認識することができる任意の適切なドメインであり得る。本明細書を通じて使用される場合、用語「抗原認識ドメイン」とは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に対するＣＡＲの特異性を提供するＣＡＲの一部を指す。抗原認識ドメインは、本発明との関連で、ＣＡＲの細胞外領域（またはエクトドメイン）の一部のみを含む。適切な抗原認識ドメインは、限定されないが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の抗原結合部位またはその断片に対する配列相同性を有するポリペプチドを含む。したがって、本発明の第１の態様の一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体またはその一部に対する相同性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗原認識ドメインの一部は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体またはその一部に対する相同性を有するアミノ酸配列を含む。抗原認識ドメインが相同性を有する抗体配列は、Ｐ２Ｘ７受容体に対する親和性を有する抗体の任意の適切な配列であり得る。例えば、配列は、以下の種：ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、フェレット、イヌ、ニワトリ、ネコ、モルモット、ハムスター、ウマ、ウシ、またはブタのうちの１つ以上に由来する抗体と配列相同性を共有することができる。抗原認識ドメインは、ハイブリドーマ細胞株から生成されたモノクローナル抗体の配列と配列相同性を共有し得る。相同な抗体配列の元々の種がヒトでない場合、抗体は、好ましくはヒト化抗体である。相同な抗体配列はまた、軟骨魚などの非哺乳動物種由来であり得る（例えば、サメＩｇＮＡＲ抗体−国際公開第ＷＯ２０１２／０７３０４８号を参照されたい）。あるいは、抗原結合ドメインは、サメＩｇＮＡＲ抗体（国際公開第ＷＯ２００５／１１８６２９号を参照されたい）に基づく結合部分を有するｉ体などの、サメ抗体と類似した機能性を提供する修飾されたタンパク質足場を含み得る。さらに、抗原認識ドメインは、ＣＡＲシグナル伝達ドメインを活性化するのに十分な親和性で、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体と選択的に相互作用することができる任意の他の適切な結合分子またはペプチドから誘導することができ、またはそれと配列相同性を共有することができる。抗原結合タンパク質を同定するための方法、特に、パニングファージディスプレイライブラリー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、共免疫沈降および酵母ツーハイブリッドシステム（Ｓｒｉｎｉｖａｓａ  Ｒａｏ，Ｖ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１４年；記事ＩＤ  １４７６４８を参照されたい）は、当該技術分野において公知である。
【００６７】
[0098]上記の文脈（および本明細書を通じて使用される場合）において、「相同性」および「相同な」という用語は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の医学件名標目表（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔ  Ｈｅａｄｉｎｇｓ）（ＮＣＢＩ  ＭｅＳＨ）により定義される「配列相同性、アミノ酸」の定義に従って解釈されるものとする。したがって、用語「相同性」および「相同な」などは、「アミノ酸の配列間の類似性の程度」として解釈されるべきである。
【００６８】
[0099]一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する単一の抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）に相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、抗体の可変重鎖（ＶＨ）由来の３つのＣＤＲ、または抗体の可変軽鎖（ＶＬ）に相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する多価ｓｄＡｂのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態では、多価ｓｄＡｂは、二価または三価ｓｄＡｂである。
【００６９】
[0100]一部の実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の断片−抗原結合（Ｆａｂ）部分のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む。当該技術分野において理解されるように、抗体のＦａｂ部分は、抗体の重鎖および軽鎖の各々の１つの定常領域および１つの可変領域で構成される。
【００７０】
[0101]本発明の一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を含む。当該技術分野において理解されるように、ｓｃＦｖは、抗体の可変−重鎖（ＶＨ）および可変−軽鎖（ＶＬ）と相同性を共有し得るかまたはそれと同一であり得る２つの部分を含み、２つの部分がリンカーペプチドとともに連結された融合タンパク質である。例えば、ｓｃＦｖは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識する抗体に由来するＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含み得る。
【００７１】
[0102]上述の文脈において、用語「に由来する」は、ポリペプチド自体の供給源への言及ではなく、むしろ、抗原結合領域の一部を構成するアミノ酸配列情報の誘導を指すことが理解される。その結果、用語「に由来する」は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体に対して配列同一性を共有する合成的、人工的または他の方法で作製されたポリペプチドを含む。
【００７２】
[0103]一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する多価ｓｃＦｖのアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多価ｓｃＦｖは、二価または三価ｓｃＦｖである。
【００７３】
[0104]一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、配列番号４、配列番号６、配列番号７もしくは配列番号８に示されるアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、配列番号４に示されるアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。
【００７４】
[0105]一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の１つ以上のＣＤＲ領域に相同なアミノ酸配列を含む結合ペプチドを含む。一部の実施形態では、結合ペプチドは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体のＶＨおよび／またはＶＬ鎖のＣＤＲ１、２および３ドメインと配列相同性を有する１つ以上の領域を含む。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、配列番号４、６、７または８に示される配列の３０〜３５、５０〜６７、または９８〜１０８位に及ぶＣＤＲ領域のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９４％同一である１つ以上の配列を含む。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、配列番号４、６、７または８に示される配列の３０〜３５、５０〜６７、または９８〜１０８位に及ぶ配列の１つ以上を含む。配列番号４、６、７または８に示される抗原結合ペプチドのＣＤＲ領域間の配列は、ＣＤＲ領域の適切な形成および立体構造を可能にする任意の適切な配列であり得る。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、配列番号４、６、７または８に示される配列の１つと５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、９５％または９９％同一の配列を含む。
【００７５】
[0106]適切なアミノ酸配列が由来し得る機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に指向される抗体、およびこのような抗体を生成する方法は、当該技術分野（例えば、国際公開第ＷＯ２００１／０２０１５５号、同第ＷＯ２００３／０２０７６２号、同第ＷＯ２００８／０４３１４５号、同第ＷＯ２００８／０４３１４６号、同第ＷＯ２００９／０３３２３３号、同第ＷＯ２０１１／０２０１５５号および同第ＷＯ２０１１／０７５７８９号）において記載されている。特定のエピトープ（例えば、前述されるもの）に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は、当業者に公知である。要約すると、所望のエピトープ（例えば、２１０位にプロリンを含む機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のセグメント）は、適切な免疫原性担体タンパク質および場合によりアジュバントの存在下で適切な宿主動物に注射される。次に、血清は、免疫化された動物から回収され、抗体は、その抗体クラスまたはその抗原特異性に基づいて単離することができる。精製された抗体の適応性および特異性の評価に続いて、抗体は、さらに処理されて、抗原結合断片を単離するか、または関連するＶＨおよびＶＬドメインを同定するために配列決定することができる。機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に指向される抗体を生成するための適切なエピトープは、当該技術分野において公知である（例として、国際公開第ＷＯ２００８／０４３１４６号、同第ＷＯ２０１０／００００４１号および同第ＷＯ２００９／０３３２３３号を参照されたい）。
【００７６】
リンカードメイン
[0107]リンカードメインは、膜貫通ドメインおよび抗原認識ドメインを接続する。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、リンカードメインを含まずに機能するように形成されており、したがって、この文脈において、リンカードメインは、一般的に、全てのＣＡＲの機能に必須であるとは考えられない。しかしながら、上述したように、および理論に拘束されることを望むことなく、リンカードメインは、ＣＡＲを発現するエフェクター細胞と標的細胞との間の正しい免疫学的シナプス距離を形成しながら、抗原認識ドメインによるエピトープの認識を可能にするために、ＣＡＲのエクトドメイン（細胞外ドメイン）に対して適切な分子長を提供し得る。さらに、リンカードメインは、抗原認識ドメインがそのエピトープを認識するために正しい方法で配向されるのに適した柔軟性を提供し得る。
【００７７】
[0108]適切なリンカードメインの選択は、（ｉ）ＣＡＲ発現細胞の「オフターゲット」活性化を最小限に抑えるＦｃ受容体（例えば、ＦｃγおよびＦｃＲｎ受容体）に対する結合親和性を低下させること、および（ｉｉ）抗原結合領域の柔軟性を増強し、免疫シナプスの形成のための空間的制約を低下させること（例えば、立体障害の低下およびシナプス距離の最適化）によって、ＣＡＲ構築物の有効性を最適化することに基づくことができる。しかしながら、ヒンジが選択される手段は、当該技術分野において予測不可能であると考えられ、ＣＡＲ発現エフェクター細胞によって標的化される、特異的抗原、およびエピトープの位置に依存する。
【００７８】
[0109]実施例に示されるように、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に指向されるＣＡＲを発現する細胞は、リンカードメインの長さが１２個のアミノ酸である場合、大部分の癌細胞株に対してほとんどから全く反応性を示さなかった。さらに、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に指向されるＣＡＲを発現する細胞は、リンカードメインが２２８アミノ酸である場合、癌細胞株の大部分に対してほとんどから全く反応性を示さなかった。しかし、ＣＤ３＋  Ｔ細胞、および精製されたＣＤ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞のサブ集団に形質導入された場合、１１９個のアミノ酸のリンカーのみが、大部分の細胞株に対して広い効力を示した。典型的には、ＣＡＲは、１種の、または選択された数種類の癌に特異的である上方制御された細胞マーカーを標的とする。したがって、広範囲の癌細胞型に対する広範な反応性は、ＣＡＲを設計する場合に典型的には考慮されず、典型的に重要であるとはみなされない。しかしながら、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体は、広範囲の癌タイプによって発現される。その結果、他のＣＡＲとは異なり、機能不全Ｐ２Ｘ７を標的とするＣＡＲは、多様な癌細胞型に最適化する必要がある。
【００７９】
[0110]さらに、一部の例では、３０アミノ酸のリンカードメインを有し、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に指向されるＣＡＲを発現する細胞は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞株とともにインキュベートされた場合、２２８アミノ酸のリンカードメインを有するＣＡＲを発現する細胞と同等の反応性を示した。
【００８０】
[0111]その結果、一部の実施形態では、リンカードメインは、１２〜２２８個のアミノ酸、または３０〜２２８個のアミノ酸、または５０〜２００個のアミノ酸、または７０〜１８０個のアミノ酸、または９０〜１６０個のアミノ酸、または１０７〜１３１個のアミノ酸、または１１０〜１３０個のアミノ酸、または１１５〜１２５個のアミノ酸、または１１７〜１２１個のアミノ酸からなる。その結果、一部の実施形態では、リンカードメインは、１２〜２２８個のアミノ酸、または３０〜２２８個のアミノ酸、または５０〜２００個のアミノ酸、または７０〜１８０個のアミノ酸、または９０〜１６０個のアミノ酸、または１０７〜１３１個のアミノ酸、または１１０〜１３０個のアミノ酸、または１１５〜１２５個のアミノ酸、または１１７〜１２１個のアミノ酸からなる。
【００８１】
[0112]数値範囲に関して本明細書を通じて使用される場合、用語「間」は、境界の数を含まないものと理解されるべきである。例えば、１〜１０の間は、両端を含む２〜９の範囲を意味する。
【００８２】
[0113]一部の実施形態では、リンカードメインは、約１１９個のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、リンカードメインは、１１９個のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、リンカードメインの長さは、１１９個のアミノ酸±５０個のアミノ酸、または±４０個のアミノ酸、または±３０個のアミノ酸、または±２０個のアミノ酸、または±１０個のアミノ酸、または±５個のアミノ酸、または±２個のアミノ酸、または±１個のアミノ酸である。
【００８３】
[0114]一部の実施形態では、リンカードメインは、１２〜２２７個のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、リンカードメインは、１３〜２２７個のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、リンカードメインは、３０〜２２８個のアミノ酸からなる。一部の実施形態では、リンカードメインは、３１〜２２７個のアミノ酸からなる。
【００８４】
[0115]一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンからのヒンジ領域に相同な配列、またはＴ細胞シナプスの形成に関与する膜結合分子からのヒンジもしくは細胞外領域を含む。例えば、リンカードメインは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ７またはＣＤ２８領域からのヒンジ領域に相同なアミノ酸配列を有する領域を含み得る。
【００８５】
[0116]一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンの一部に相同な配列を含む。一部の実施形態では、該一部は、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、ＣＨ４領域またはヒンジ領域のうちの１つ以上である。一部の実施形態では、部分は、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、または免疫グロブリンのヒンジ領域である。一部の実施形態では、部分は、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域、および免疫グロブリンのヒンジ領域である。一部の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧサブタイプから選択される。
【００８６】
[0117]一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧ１のＦｃ領域の一部、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するその機能的変異体に相同である。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧ２のＦｃ領域、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するその機能的変異体に相同である。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧ３のＦｃ領域、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するその機能的変異体に相同である。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧ４のＦｃ領域、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するその機能的変異体に相同である。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域のうちの１を超えるものの一部、例えばＩｇＧ１ヒンジ領域およびＩｇＧ４のＣＨ２またはＣＨ３領域に対する相同性を有する配列を含む。
【００８７】
[0118]一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンヒンジ領域の全部または一部を含む。当該技術分野において理解されるように、免疫グロブリンのヒンジ領域を形成する特定の領域は、異なるアイソタイプに対して変化する。例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンは、ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間にヒンジ領域を有する一方で、ヒンジ領域の機能は、ＩｇＥおよびＩｇＭアイソタイプ免疫グロブリンのＣＨ２領域によって提供される。
【００８８】
[0119]リンカードメインに組み込まれ得る配列の非網羅的リストは、以下の表２に提供される。一部の実施形態では、本発明のリンカードメインは、表２に提供されるコンポーネントのいずれか１つ以上を含み得る。一部の実施形態では、リンカードメインは、表２に提供されるリンカーの１つ以上を含み得る。さらに、リンカードメインは、ポリグリシン配列、またはＧＧＧＧＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）配列の反復（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）などの人工的に合成された配列であり得る。
【００８９】
【表２】
2021524248.tif 000006
【００９０】
[0120]一部の実施形態では、リンカードメインは、配列番号９〜２５および３０〜３７から選択される配列のいずれか１つ以上に相同な配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するその機能的変異体もしくは一部を含む。
【００９１】
[0121]一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、またはＣＨ２とＣＨ３ドメインの両方に相同な配列を含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、免疫グロブリンヒンジ領域に相同な配列、およびＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメインの１つ以上を含む。免疫グロブリン配列は、１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つの置換、欠失、挿入または付加、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）またはＦｃ受容体新生児（ＦｃＲｎ）結合を低下させる置換を含むことができる。
【００９２】
[0122]用語「置換」とは、親ペプチドまたはタンパク質配列中の特定の位置におけるアミノ酸を別のアミノ酸で置換することを指す。置換は、非保存的方法（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸を別のグループに属するアミノ酸に変更すること；例えば、親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸で置換することによる）、または保存的方法（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸を同じグループに属するアミノ酸に変更すること；例えば、親水性アミノ酸を親水性アミノ酸で置換することによる）で、得られるタンパク質のアミノ酸を変更するために行うことができる。このような保存的変更は、一般的に、修飾されたペプチド／タンパク質の立体構造変化および機能的変化の低下をもたらす。アミノ酸の種々のグループ化の例を以下に示す：１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）帯電していない極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）帯電した極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に帯電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。別のグループ化は、フェニル基を有するアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンであり得る。
【００９３】
[0123]当業者は、任意のアミノ酸が、化学的に（機能的に）類似したアミノ酸で置換され、ポリペプチドの機能を保持し得ることを認識する。このような保存的アミノ酸置換は、当該技術分野において周知である。表３の以下の基は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。
【００９４】
【表３】
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【００９５】
[0124]用語「挿入」とは、配列の内部へのアミノ酸の付加を指す。「付加」とは、配列の末端へのアミノ酸の付加を指す。「欠失」とは、配列からアミノ酸を除去することを指す。
【００９６】
[0125]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡの免疫グロブリンヒンジ領域、またはＩｇＭもしくはＩｇＥの定常重鎖２（ＣＨ２）領域に相同なアミノ酸配列を含むリンカードメイン、あるいは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％、９６％または９９％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。
【００９７】
[0126]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリン由来のヒンジ領域に相同なアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９３％、９６％もしくは９８％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４ヒンジ領域に相同なアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６６％、７３％、７５％、８０％、８３％、８６％、９１％、９３％、９６％もしくは９８％の配列同一性を有する機能的変異体を含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ヒンジ領域に相同なアミノ酸配列を含み、未修飾ヒンジドメインに存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換された１つ以上のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４のヒンジ領域に相同なアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６６％、７３％、７５％、８０％、８３％、８６％、９１％または９３％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。
【００９８】
[0127]ＩｇＧサブタイプヒンジ領域およびＩｇＧ４（突然変異）ヒンジ領域（本発明の実施形態で使用される場合、「ＣＡＲ−Ｔヒンジ」）のアラインメントが図２に提供される。さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４ヒンジ領域ならびにＩｇＧ４（突然変異ヒンジ領域）のアラインメントが図３に提供される。見ることができるように、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４ヒンジ領域と、ＩｇＧ３の一部との間に高度の相同性がある。
【００９９】
[0128]一部の実施形態では、ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリン由来のヒンジ領域に相同な配列は、ＣＸＸＣモチーフを含み、「Ｃ」はシステインであり、「Ｘ」は任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＣＸＸＣモチーフは、ＣＰＰＣ、ＣＰＲＣまたはＣＰＳＣからなる群から選択される。好ましい実施形態では、ＣＸＸＣモチーフは、ＣＰＰＣである。一部の実施形態では、ヒンジ領域に相同な配列は、ＣＰＰＣモチーフを含むように修飾される。
【０１００】
[0129]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、免疫グロブリンのＣＨ領域に相同な１つ以上のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＨ領域に相同なアミノ酸配列は、免疫グロブリンのＣＨ１領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、もしくはＣＨ４領域のうちの１つ以上に相同であるか、または上記ＣＨ領域と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する。
【０１０１】
[0130]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリンのＣＨ２領域もしくはＣＨ３領域の１つ以上に相同な１つ以上のアミノ酸配列を含むか、または上記ＣＨ２もしくはＣＨ３領域と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する。
【０１０２】
[0131]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、１つ以上の免疫グロブリンヒンジ領域、および／または免疫グロブリンの１つ以上のＣＨ領域を含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ領域、好ましくはＣＨ２領域またはＣＨ３領域からなる。一部の実施形態では、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域は、ＩｇＧアイソタイプ免疫グロブリン由来である。一部の実施形態では、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域は、ＩｇＧ抗体のＩｇＧ４サブクラス由来である。
【０１０３】
[0132]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、配列番号９〜１７に記載のアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその機能的変異体もしくは機能性部分を含み、好ましくは、キメラ抗原受容体は、配列番号９〜１３に記載のアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその機能的変異体もしくは機能性部分を含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６６％、７３％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するその機能的変異体を含むか、またはそれからなる。
【０１０４】
[0133]免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域、特にＩｇＧアイソタイプ抗体は、Ｆｃガンマ受容体およびＦｃ新生児受容体などのＦｃ受容体によって結合され得る。キメラ抗原受容体のリンカードメインの結合は、受容体の効力を低下させることができ、オフターゲット死滅をもたらすことができる。したがって、一部の実施形態では、リンカードメインは、それがＦｃ受容体と結合する能力が低下したかまたは全くないように設計される。一部の実施形態では、リンカードメインは、他の免疫グロブリンアイソタイプと比較して、Ｆｃ受容体と結合する能力が低下した免疫グロブリンに相同である。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体のリンカードメインは、実質的にＦｃ受容体と結合するリンカードメイン中のアミノ酸配列を含まない。
【０１０５】
[0134]異なるＦｃ受容体と結合するＩｇＧアイソタイプの能力は、下記の表４に提示される。
【０１０６】
【表４】
2021524248.tif 000008
【０１０７】
[0135]一部の実施形態では、リンカードメインが免疫グロブリンのＦｃ領域に相同な部分を含む場合、その部分は、Ｆｃ受容体への結合を低下させるように修飾され得る。Ｆｃ受容体による結合を低下させるためにＦｃ領域を修飾する方法は、当該技術分野において公知である。Ｆｃガンマ受容体は、主に、免疫グロブリン領域のＣＨ２領域の下流ヒンジ領域およびｎ末端に結合する一方で、新生児Ｆｃ受容体は、主に、ＣＨ２領域のｃ末端およびＣＨ３領域のＮ末端のアミノ酸に結合する。Ｆｃ受容体のＩｇＧ抗体への結合に関するガイドは、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ：Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ａｃｋｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１４年の第７章に見出すことができる。したがって、これらの領域の修飾は、免疫グロブリンのＦｃ部分と相同性を有するリンカードメインへのＦｃ受容体の結合を変化させる可能性がある。Ｆｃ−ガンマ受容体およびＦｃＲｎ結合を低下させることが示されているヒトＩｇＧ１に対する突然変異の非網羅的な例示的リストには、Ｅ１１６Ｐ、Ｌ１１７Ｖ、Ｌ１１８Ａ、Ｇ１１９欠失、Ｐ１２１Ａ、Ｓ１２２Ａ、Ｉ１３６Ａ、Ｓ１３７Ａ、Ｒ１３８Ａ、Ｔ１３９Ａ、Ｅ１４１Ａ、Ｄ１４８Ａ、Ｓ１５０Ａ、Ｓ１５０Ａ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ１５３Ａ、Ｅ１５５Ａ、Ｎ１５９Ａ、Ｄ１６３Ａ、Ｈ１６８Ａ、Ｎ１６９Ａ、Ｋ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｒ１７５Ａ、Ｅ１７６Ａ、Ｑ１７８Ａ、Ｙ１７９Ｆ、Ｎ１８０Ａ、Ｓ１８１Ａ、Ｒ１８４Ａ、Ｖ１８８Ａ、Ｔ１９０Ａ、Ｌ１９２Ａ、Ｑ１９４Ａ、Ｄ１９５Ａ、Ｎ１９８Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｋ２０５Ａ、Ｋ２０９Ａ、Ａ２１０Ｑ、Ａ２１０Ｓ、Ａ２１０Ｇ、Ｐ２１２Ａ、Ｐ２１４Ａ、Ｅ２１６Ａ、Ｋ２１７Ａ、Ｓ２２０Ａ、Ｋ２２１Ａ、Ａ２２２Ｔ、Ｋ２４３Ａ、Ｑ２４５Ａ、Ｈ２５１Ａ、Ｄ２５９Ａ、Ａ２６１Ｑ、Ｅ２６３Ａ、Ｅ２６５Ａ、Ｖ２８６Ａ、Ｓ２８８Ａ、Ｋ２９７Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｅ３１３Ａ、Ｈ３１６Ａ、Ｎ３１７Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｙ３１９Ａ（番号は、Ｕｎｉｐｒｏｔ参照番号Ｐ０１８５７−１および配列番号２６に示される配列に対応する）が含まれる。４つのＩｇＧサブタイプのＣＨ２およびＣＨ３領域、ならびに本明細書に提供される実施例で使用されるＣＨ２およびＣＨ３領域の比較は、図４および５に提供される。
【０１０８】
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン
[0136]ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞外部分（エクトドメイン）を細胞内部分（エンドドメイン）に架橋し、その役割は主として構造的である。したがって、膜貫通ドメインは、細胞の脂質二重層を固定し、貫通することができる任意の配列からなることができる。しかしながら、膜貫通ドメインの性質は、その局在化および発現に影響を与え得る。
【０１０９】
[0137]好ましい実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞シナプス形成、またはＴ細胞シグナル誘導に関与する分子の配列に対する相同性を有する。一部の実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部または一部に相同な配列を含む膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部または一部に相同な配列を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部または一部に相同な配列を含む。
【０１１０】
[0138]抗原認識ドメイン、リンカードメインおよび膜貫通ドメインに加えて、本発明のキメラ抗原受容体は、シグナル伝達部分（シグナル伝達ドメイン）を含む細胞内（エンド）ドメインを含む。
【０１１１】
[0139]キメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原認識ドメインによる抗原の認識の結果として、ＣＡＲの活性化時に、細胞内シグナル伝達カスケードを誘導または誘導に関与することができる、任意の適切なドメインであり得る。ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの活性化後に望ましい細胞転帰に応じて特異的に選択される。多数の可能なシグナル伝達ドメインがあるが、免疫療法および癌治療に用いられる場合、シグナル伝達ドメインは、それらが由来する受容体、すなわち、活性化受容体および共刺激受容体に基づいて、２つの一般的なカテゴリーに分類することができる（以下の詳細をさらに参照されたい）。したがって、一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激受容体に由来する部分を含む。
【０１１２】
[0140]本明細書を通じて使用される場合、用語「部分」とは、活性化受容体または共刺激受容体に関して使用される場合、受容体とその同族抗原またはリガンドとの相互作用に続く細胞内シグナル伝達カスケードの開始／誘導に関わるかまたは関与する配列を含む受容体の任意のセグメントに関する。ＣＤ３を介したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞内シグナル伝達カスケードの開始／誘導の例が、以下に概説される。
【０１１３】
[0141]理論に拘束されることを望まないが、ＴＣＲの細胞外部分は、クローン型ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖（ＴＣＲα／β受容体）またはＴＣＲγおよびＴＣＲδ鎖（ＴＣＲγδ受容体）のいずれかのヘテロ二量体を主に含む。これらのＴＣＲヘテロ二量体は、一般的に、固有のシグナル伝達形質導入能力を欠損しており、したがって、ＣＤ３の複数のシグナル伝達サブユニット（主にＣＤ３−ゼータ、−ガンマ、−デルタ、および−イプシロン）と非共有結合的に結合している。ＣＤ３のガンマ、デルタ、およびイプシロン鎖の各々は、単一の免疫受容体−チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内（細胞質）部分を有し、一方、ＣＤ３−ゼータ鎖は、３つのタンデムＩＴＡＭを含む。ＭＨＣの存在下でＴＣＲが同族抗原と結合し、ＣＤ４またはＣＤ８などの必須の補助受容体と結合すると、シグナル伝達が開始され、その結果、ＣＤ３鎖の細胞内ＩＴＡＭ内の２つのチロシン残基をリン酸化するチロシンキナーゼ（すなわち、Ｌｃｋ）が生じる。続いて、第２のチロシンキナーゼ（ＺＡＰ−７０実体、Ｌｃｋリン酸化によって活性化される）が引き寄せられ、ＩＴＡＭが二リン酸化される。結果として、いくつかの下流標的タンパク質が活性化され、組み合わせた場合に、最終的には転写因子の活性化およびＴ細胞免疫応答の誘導をもたらす細胞内立体構造変化、カルシウム動員、およびアクチン細胞骨格の再配列を結果としてもたらす。
【０１１４】
[0142]本明細書を通じて使用される場合、用語「活性化受容体」とは、抗原性または他の免疫原性刺激の認識の結果として、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体、または免疫細胞の特異的活性化に関与する受容体のコンポーネントを形成するかまたはその形成に関与する受容体、または補助受容体に関する。
【０１１５】
[0143]このような活性化受容体の非限定的な例には、Ｔ細胞受容体−ＣＤ３複合体（ＣＤ３−ゼータ、−ガンマ、−デルタ、および−イプシロン）、ＣＤ４補助受容体、ＣＤ８補助受容体、Ｆｃ受容体またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞関連活性化受容体、例えば、ＬＹ−４９（ＫＬＲＡ１）、天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ、好ましくはＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０もしくはＮＫＧ２、またはＣＤ９４／ＮＫＧ２ヘテロ二量体）のコンポーネントが含まれる。その結果、本発明の第１の態様の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３補助受容体複合体のメンバー（好ましくは、ＣＤ３−ゼータ（ζ）鎖）、ＣＤ４補助受容体、ＣＤ８補助受容体、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（好ましくは、ＦｃεＲＩまたはＦｃγＲＩ）、またはＮＫ関連受容体、例えば、ＬＹ−４９のうちのいずれか１つ以上に由来する部分を含む。
【０１１６】
[0144]ＣＤ３鎖の各々の特異的な細胞内シグナル伝達部分は、当該技術分野において公知である。一例として、ＣＤ３ζ鎖の細胞内の細胞質領域は、配列番号４２に示される配列のアミノ酸５２からアミノ酸１６４に及び、３つのＩＴＡＭ領域は、配列番号４２のアミノ酸６１から８９、１００から１２８、および１３１から１５９に及ぶ。さらに、ＣＤ３ε鎖の細胞内部分は、配列番号４３に示される配列のアミノ酸１５３から２０７に及び、単一のＩＴＡＭ領域は、配列番号４３のアミノ酸１７８から２０５に及ぶ。ＣＤ３γ鎖の細胞内部分は、配列番号４４に示される配列のアミノ酸１３８から１８２に及び、単一のＩＴＡＭ領域は、配列番号４４のアミノ酸１４９から１７７に及ぶ。ＣＤ３δの細胞内部分は、配列番号４５に示される配列のアミノ酸１２７から１７１に及び、単一のＩＴＡＭ領域は、配列番号４５のアミノ酸１３８〜１６６に及ぶ。
【０１１７】
[0145]本発明の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３（好ましくは、ＣＤ３−ζ鎖またはその一部）に由来するかまたはそれに対する配列相同性を有する部分を含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３−ζ）の細胞内ドメインの全部または一部に相同なシグナルを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３−ζ補助受容体複合体の一部は、配列番号４６に示されるアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。
【０１１８】
[0146]代替のシグナル伝達ドメインは、当該技術分野において公知であるＦｃ受容体の細胞内部分を含む。例えば、ＦｃεＲ１の細胞内部分は、配列番号４７に示される配列のアミノ酸１から５９、１１８から１３０、および２０１から２４４に及ぶ。さらに、ＦｃγＲＩの細胞内部分は、配列番号４８に示される配列のアミノ酸３１４から３７４に及ぶ。
【０１１９】
[0147]活性化受容体の部分の種々の組合せは、ＣＡＲの膜貫通（ＴＭ）部分および細胞内（ＩＣ）部分、例えば、ＣＤ３ζＴＭおよびＣＤ３ζＩＣ（Ｌａｎｄｍｅｉｅｒ  Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７年；６７巻：８３３５〜４３頁；Ｇｕｅｓｔ  ＲＤ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５年、２８巻：２０３〜１１頁；Ｈｏｍｂａｃｈ  ＡＡ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７年；１７８巻：４６５０〜７頁）、ＣＤ４ＴＭおよびＣＤ３ζＩＣ（Ｊａｍｅｓ  ＳＥ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年；１８０巻：７０２８〜３８頁）、ＣＤ８ＴＭおよびＣＤ３ζＩＣ（Ｐａｔｅｌ  ＳＤ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９９年；６巻：４１２〜９頁）、ならびにＦｃεＲＩγ  ＴＭおよびＦｃεＲＩγ  ＩＣ（Ｈａｙｎｅｓ  ＮＭら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年；１６６巻：１８２〜７頁；Ａｎｎｅｎｋｏｖ  ＡＥ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８年；１６１巻：６６０４〜１３頁）を形成するために利用することができる。
【０１２０】
[0148]本明細書を通じて使用される場合、用語「共刺激受容体」とは、活性化受容体の抗原特異的誘導に際して免疫細胞の活性化を支援する受容体または補助受容体に関する。理解されるように、共刺激受容体は、抗原の存在を必要とせず、抗原特異的ではないが、典型的には、２つのシグナルのうちの１つであり、他方は、免疫細胞応答の誘導に必要とされる活性化シグナルである。免疫応答との関連で、共刺激受容体は、典型的には、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のその発現されたリガンドの存在によって活性化される。特にＴ細胞に関して、共刺激は、細胞の活性化、増殖、分化および生存に導くために必要であり（これらは全て、一般的に、Ｔ細胞活性化の傘下で言及される）、一方、共刺激の非存在下でのＴ細胞への抗原提示は、アネルギー、クローン除去および／または抗原特異的寛容の発生を導き得る。重要なことに、共刺激分子は、同時に遭遇した抗原にＴ細胞応答について情報を与えることができる。一般的に、「陽性」共刺激分子との関連で遭遇した抗原は、Ｔ細胞の活性化、およびその抗原を発現する細胞を排除することを目的とした細胞性免疫応答をもたらす。「陰性」補助受容体との関連で遭遇した抗原は、同時に遭遇した抗原に誘導された寛容状態をもたらす。
【０１２１】
[0149]Ｔ細胞共刺激受容体の非限定的な例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳが挙げられる。具体的には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびＩＣＯＳは全て、Ｔ細胞応答の活性化を増強する「陽性」共刺激分子を表す。したがって、本発明の第１の態様の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＩＣＯＳのうちのいずれか１つ以上に由来する部分を含む。
【０１２２】
[0150]本発明の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０または４−１ＢＢ共刺激受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの一部を含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢ共刺激受容体の部分は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列、または少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するその機能的変異体もしくは一部を含む。
【０１２３】
[0151]共刺激受容体の部分の種々の組合せは、ＣＡＲの膜貫通（ＴＭ）部分および細胞内（ＩＣ）部分を形成させるために利用することができる。例えば、ＣＤ８  ＴＭおよびＤＡＰ１０  ＩＣまたはＣＤ８  ＴＭおよび４−１ＢＢ  ＩＣ（Ｍａｒｉｎ  Ｖ．ら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００７年；３５巻：１３８８〜９７頁）、ＣＤ２８  ＴＭおよびＣＤ２８  ＩＣ（Ｗｉｌｋｉｅ  Ｓ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年；１８０巻：４９０１〜９頁；Ｍａｈｅｒ  Ｊ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２年；２０巻：７０〜５頁）、ならびにＣＤ８  ＴＭおよびＣＤ２８  ＩＣ（Ｍａｒｉｎ  Ｖ．ら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００７年；３５巻：１３８８〜９７頁）。
【０１２４】
[0152]上記で参照される活性化受容体および共刺激受容体の配列情報は、種々のデータベースにおいて容易にアクセス可能である。例えば、これらの受容体に関するヒトアミノ酸、遺伝子およびｍＲＮＡ配列の実施形態は、表５に示される。
【０１２５】
【表５】
2021524248.tif 000009
【０１２６】
[0153]表５は、ヒトの活性化および共刺激受容体を参照して提供されるが、各受容体の相同な変形およびオルソロガスな変形が、哺乳動物および脊椎動物種の大部分に存在することは、当業者によって理解される。したがって、上記で参照された配列は、本発明の第１の態様のＣＡＲに含まれ得る受容体配列の非限定的な例としてのみ提供され、任意の所望の種由来の相同な配列およびオルソロガスな配列は、所与の種に適しているＣＡＲを生成するために使用され得る。
【０１２７】
[0154]本発明の一部の実施形態では、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインの一部は、同一分子と相同性を共有する。例えば、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含むＣＤ３の一部は利用され得る。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部または一部に相同な配列を含むかまたはそれからなり、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞内ドメインの全部または一部を含むかまたはそれからなる。
【０１２８】
[0155]本発明の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体に由来する部分および共刺激受容体に由来する部分を含む。理論に拘束されることを望まないが、この文脈において、ＣＡＲの抗原認識ドメインによる抗原の認識は、細胞内活性化シグナルと細胞内共刺激シグナルの両方を同時に誘導する。その結果、これは、共刺激リガンドを発現するＡＰＣによる抗原の提示をシミュレートする。あるいは、ＣＡＲは、活性化受容体または共刺激受容体のいずれかに由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有し得る。この代替の形態では、ＣＡＲは、活性化細胞内シグナル伝達カスケードまたは共刺激細胞内シグナル伝達カスケードのいずれかを誘導するだけである。
【０１２９】
[0156]本発明の一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢおよびＣＤ３−ζ鎖の細胞内ドメインの全部または一部を含むかまたはそれらからなる。
[0157]一部の実施形態では、ＣＡＲは、単一の活性化受容体に由来する部分、および複数の共刺激受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、複数の活性化受容体に由来する部分、および単一の共刺激受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、複数の活性化受容体に由来する部分、および複数の共刺激受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、単一の活性化受容体に由来する部分、および２つの共刺激受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、単一の活性化受容体に由来する部分、および３つの共刺激受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、２つの活性化受容体に由来する部分、および１つの共刺激受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、２つの活性化受容体に由来する部分、および２つの共刺激受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する。理解されるように、シグナル伝達ドメインが誘導され得る活性化受容体および共刺激受容体の数のさらなる変形があり、上記の実施例は、本明細書に含まれる可能な組合せを制限するとは予期されない。
【０１３０】
[0158]本発明の一部の実施形態では、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインの一部は、異なる分子と相同性を共有する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインの全部もしくは一部に相同な配列を含むかまたはそれからなり、シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢおよびＣＤ３−ζ鎖の細胞内ドメインの全部もしくは一部を含むかまたはそれからなる。
【０１３１】
キメラ抗原受容体
[0159]本発明の実施形態では、キメラ抗原受容体は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識する抗原認識ドメイン、ＩｇＧ４重鎖のヒンジおよびＣＨ３領域に相同な配列を含むリンカードメイン、ＣＤ２８の膜貫通部分に相同な配列を含む膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ鎖の細胞内部分および４−１ＢＢの細胞質領域を含む活性化ドメイン、または相同な部分のいずれか１つに対して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％の配列同一性を有するそれらの機能的部分もしくは同等物を含む。
【０１３２】
[0160]本発明の一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号５０もしくは配列番号５１に示されるアミノ酸配列、または配列番号５０もしくは配列番号５１の機能的変異体を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、機能的変異体は、配列番号５０または配列番号５１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明との関連で、「機能的変異体」は、上記の配列のいずれか１つの機能を維持するという条件で、任意のアミノ酸配列を含み得る。したがって、機能的変異体は、例えば、配列番号５０もしくは配列番号５１のうちの１つに対する１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換；突然変異体形態または対立遺伝子変異体；オルソログ；ホメオログ；配列番号５０または配列番号５１のうちの１つの類似体などを有し得るが、ただし、機能的変異体が配列番号５０または配列番号５１のいずれか１つの機能を維持することを条件とする。
【０１３３】
[0161]例えば、配列番号５０または配列番号５１に関して、キメラ抗原受容体の好ましい機能は、機能性Ｐ２Ｘ７受容体の有意な認識なしに機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識し、ＣＡＲを発現するＴ細胞の活性化をもたらす細胞内シグナルを誘導することである。当業者に理解されるように、配列番号５０または配列番号５１に示されるキメラ抗原受容体のアミノ酸配列の部分に対する変形は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体の認識および／またはＣＡＲを発現するＴ細胞の活性化の有意な変化なしに行うことができる。このような変形には、限定されないが、キメラ抗原受容体のヒンジ領域における変形、膜貫通ドメインにおける変形、ならびにキメラ抗原受容体の細胞内ドメインを含む活性化受容体および／または共刺激受容体の部分における変形が含まれ得る。
【０１３４】
[0162]一部の実施形態では、機能的変異体は、配列番号５０または配列番号５１のいずれか１つに対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９１％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９２％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９４％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、もしくは９９．９％のアミノ酸配列同一性を含むことができる。
【０１３５】
[0163]アミノ酸配列を比較する場合、配列は、ポリペプチドの長さによって決定される比較ウィンドウ上で比較されるべきである。例えば、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基、少なくとも７５個のアミノ酸残基、少なくとも１００個のアミノ酸残基、少なくとも２００個のアミノ酸残基、少なくとも３００個のアミノ酸残基、少なくとも４００個のアミノ酸残基、少なくとも５００個のアミノ酸残基、少なくとも６００個のアミノ酸残基、または表１に列挙されている配列のいずれか１つの全長にわたる比較ウィンドウが想定される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％、約１８％、約１６％、約１４％、約１２％、約９％、約８％、約６％、約４％もしくは約２％またはそれ以下の付加または欠失を含み得る。比較ウィンドウをアライメントさせるための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７年；２５巻：３３８９〜３４０２頁によって開示されるようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーなどのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって行うことができる。全体的なアラインメントプログラムはまた、ほぼ等しいサイズの類似した配列をアライメントするために使用することができる。グローバルアラインメントプログラムの例としては、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（Ｒｉｃｅ  Ｐら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０００年；１６巻：２７６〜２７７頁）の一部であるＮＥＥＤＬＥ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で入手可能）、およびＦＡＳＴＡパッケージ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＷおよびＬｉｐｍａｎ  Ｄ、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻：２４４４〜２４４８頁）の一部であるＧＧＳＥＡＲＣＨプログラム（ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｃｏｍｐａｒｅ＆ｐｇｍ＝ｇｎｗで入手可能）が含まれる。これらのプログラムはともに、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づいており、それらの全長に沿った２つの配列の最適アラインメント（ギャップを含む）を見つけるために使用される。配列分析の詳細な検討はまた、Ａｕｓｕｂｅｌらのユニット１９．３（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ、１９９４〜１９９８頁、１５章、１９９８年）に見出すことができる。
【０１３６】
核酸構築物および細胞の遺伝子修飾
[0164]本明細書中に記載されるＣＡＲは、当該技術分野において公知である任意の手段によって生成することができるが、組換えＤＮＡ技術を用いて生成することが好ましい。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当該技術分野において公知である分子クローニングの標準的技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）により、都合のよいように調製され、完全なコード配列にアセンブルされ得る。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、適切な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を形質転換するために使用される。
【０１３７】
[0165]このようにして、本発明は、さらに、上記されるキメラ抗原受容体をコードする核酸分子を含む核酸分子または核酸構築物を提供する。一部の実施形態では、核酸分子は、天然に存在しないおよび／または合成の核酸分子である。
【０１３８】
[0166]一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号５０または配列番号５１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、機能的変異体は、配列番号５０または配列番号５１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３９】
[0167]核酸分子は、修飾されていないかもしくは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含み得る。例えば、核酸分子は、一本鎖および／もしくは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、または一本鎖および二本鎖領域の混合物を含み得る。さらに、核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を含み得る。核酸分子はまた、安定性のために、または他の理由のために修飾された１つ以上の修飾された塩基、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して種々の修飾を行うことができ、したがって、用語「核酸分子」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【０１４０】
[0168]本発明の一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号５２または配列番号５３に示されるヌクレオチド配列を含む。
[0169]当業者であれば、配列番号５２もしくは配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体、または配列番号５２もしくは配列番号５３の機能的変異体をコードするいずれかのヌクレオチド配列が、本発明によって企図されることを理解する。例えば、配列番号５２または配列番号５３の変異体は、配列番号５２または配列番号５３に対して１つ以上の異なる核酸を含むが、同一のアミノ酸配列を依然としてコードするものと企図される。遺伝暗号の縮重のために、多数の核酸が任意の所与のタンパク質をコードすることができる。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される配列番号５２または配列番号５３の全ての位置において、コードされたポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンのいずれかにコドンが変更され得る。したがって、配列番号５２もしくは配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体、または配列番号５２もしくは配列番号５３の機能的変異体をコードする、本明細書における全てのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の全ての可能なサイレント変形もまた記載する。当業者は、核酸（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）中の各コドンが修飾されて、機能的に同一の分子を得ることができることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の各サイレント変形は、記載された各配列に暗黙的である。
【０１４１】
[0170]さらに、少なくとも一部の実施形態では、本発明は、細胞の形質転換、トランスフェクションまたは形質導入のためのベクターの調製における核酸の使用を提供する。好ましくは、細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８のうちの１つ以上を発現するＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、癌を予防または治療するための薬剤の調製において使用される。その結果、一部の態様では、本発明は、癌を予防または治療するための薬剤の調製におけるベクターの使用を提供する。
【０１４２】
[0171]本発明による核酸構築物は、１つ以上の宿主についての複製起点；１つ以上の宿主において活性である選択マーカー遺伝子；および／または１つ以上の転写調節配列のうちの１つ以上をさらに含むことができることが理解されるべきである。
【０１４３】
[0172]本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー遺伝子」は、それが発現される細胞上に表現型を付与して、構築物でトランスフェクトまたは形質導入された細胞の同定および／または選択を容易にする任意の遺伝子を含む。
【０１４４】
[0173]「選択マーカー遺伝子」には、構築物で形質導入された細胞により発現された場合、これらの形質導入された細胞の同定および／または選択を容易にする表現型を細胞に付与する任意のヌクレオチド配列が含まれる。適切な選択マーカーをコードする一連のヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｍｏｒｔｅｓｅｎ，  ＲＭ．およびＫｉｎｇｓｔｏｎ  ＲＥ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２００９年；ユニット９．５）。選択マーカーをコードする例示的なヌクレオチド配列としては、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子；シトシンデアミナーゼ（ＣＤＡ）遺伝子；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子；ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）遺伝子；ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）遺伝子；チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子；キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）遺伝子または抗生物質耐性遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子；蛍光レポーター遺伝子、例えば、緑色、赤色、黄色、または青色蛍光タンパク質をコードする遺伝子；ならびに発光ベースのレポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、とりわけ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの技術を使用して細胞の光学的選択を可能にするものなどが挙げられる。
【０１４５】
[0174]本発明の一部の実施形態では、選択マーカーは、修飾された表面発現タンパク質を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、表面発現タンパク質は、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）である。一部の実施形態では、上皮細胞増殖因子受容体は切断される（ＥＧＦＲｔ）。一部の実施形態では、選択マーカーは、配列番号６２に示される配列と相同であるか、または５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．７％の配列同一性を有するその変異体である。
【０１４６】
[0175]さらに、選択マーカー遺伝子は、構築物中の異なるオープンリーディングフレームであり得るかまたは別のポリペプチド（例えば、ＣＡＲ）との融合タンパク質として発現され得ることに留意されたい。
【０１４７】
[0176]上記されるように、核酸構築物はまた、１つ以上の転写調節配列を含み得る。用語「転写調節配列」は、作動可能に連結された核酸の転写に影響する任意の核酸配列を含むものと理解されるべきである。転写調節配列は、例えば、リーダー、ポリアデニル化配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、および転写ターミネーターを含み得る。典型的には、転写調節配列は、少なくともプロモーターを含む。本明細書で使用される用語「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与し、活性化し、または増強する任意の核酸を記載する。
【０１４８】
[0177]一部の実施形態では、少なくとも１つの転写調節配列は、本発明の第２の態様の核酸分子に作動可能に連結される。本明細書の目的のために、転写調節配列が核酸分子の転写を促進、阻害または他には調節することができる場合、転写調節配列は、所与の核酸分子に「作動可能に連結された」ものとみなされる。したがって、一部の実施形態では、核酸分子は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターなどの転写調節配列の制御下にある。
【０１４９】
[0178]「核酸構築物」は、任意の適した形態、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ベクターなどの形態であり得、これらは、適切な制御エレメントと結合した場合に複製することができ、構築物内に含有され、細胞間で遺伝子配列を伝達することができる。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、核酸構築物はベクターである。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【０１５０】
[0179]プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、または臓器に関して、構成的に、または差次的に、作動可能に連結された核酸分子の発現を調節することができる。したがって、プロモーターは、例えば、構成性プロモーター、または誘導性プロモーターを含み得る。「構成的プロモーター」は、ほとんどの環境および生理学的条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性プロモーター」は、特定の環境または生理学的条件下で活性であるプロモーターである。本発明は、目的の細胞において活性である任意のプロモーターの使用を企図する。したがって、広範囲のプロモーターが、当業者によって容易に確認される。
【０１５１】
[0180]哺乳動物構成プロモーターは、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｐ−アクチン、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、伸長因子−１アルファ（ＥＦ１Ａ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧＧ）を含み得る。
【０１５２】
[0181]誘導性プロモーターとしては、限定されないが、化学的な誘導性プロモーターおよび物理的な誘導性プロモーターが含まれ得る。化学的な誘導性プロモーターには、アルコール、抗生物質、ステロイド、金属イオンまたは他の化合物などの化合物によって調節される活性を有するプロモーターが含まれる。化学的な誘導性プロモーターの例としては、特に、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、米国特許第５，８５１，７９６号および米国特許第５，４６４，７５８号を参照されたい）、ステロイド応答性プロモーター、例えば、グルココルチコイド受容体プロモーター（例えば、米国特許第５，５１２，４８３号を参照されたい）、エクジソン受容体プロモーター（例えば、米国特許第６，３７９，９４５号を参照されたい）、および金属応答性プロモーター、例えば、メタロチオネインプロモーター（例えば、米国特許第４，９４０，６６１号、米国特許第４，５７９，８２１号および米国特許第４，６０１，９７８号を参照されたい）が挙げられる。
【０１５３】
[0182]上述したように、制御配列はまた、ターミネーターを含み得る。用語「ターミネーター」とは、転写終結をシグナル伝達する転写単位の末端のＤＮＡ配列を指す。ターミネーターは、一般的に、ポリアデニル化シグナルを含有する３’非翻訳ＤＮＡ配列であり、これは、一次転写物の３’末端へのポリアデニル化配列の付加を容易にする。プロモーター配列と同様に、ターミネーターは、それが使用されることが意図されている細胞、組織または臓器において作動可能である任意のターミネーター配列であり得る。適切なターミネーターは、当業者に公知である。
【０１５４】
[0183]理解されるように、本発明による核酸構築物は、さらなる配列、例えば、増強された発現、細胞質または膜輸送、および局在化シグナルを可能にする配列をさらに含むことができる。特定の非限定的な例としては、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が挙げられる。
【０１５５】
[0184]本発明は、本質的に本明細書に記載されるように、全ての遺伝的構築物に及ぶ。これらの構築物は、真核生物における遺伝的構築物の維持および／もしくは複製、ならびに／または真核細胞のゲノムへの遺伝的構築物もしくはその一部の組み込みのために意図されたヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【０１５６】
[0185]本発明の第３の態様の核酸構築物などの外因性遺伝物質の真核細胞への意図的な導入（トランスフェクション／形質導入）のための方法は、当該技術分野において公知である。理解されるように、核酸構築物を所望の宿主細胞に導入するのに最も適した方法は、核酸構築物のサイズ、宿主細胞のタイプ、トランスフェクション／形質導入の所望の効率、およびトランスフェクション／形質導入された細胞の最終的な所望のまたは必要な生存率などの多くの因子に依存する。このような方法の非限定的な例には、化学物質、例えば、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、またはリポソームおよびデンドリマーなどの構造による化学的トランスフェクション；非化学的方法、例えば、エレクトロポレーション（ＰｏｔｔｅｒおよびＨｅｌｌｅｒ．「Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．」Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、編集、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、２００３年：ユニット９．３）、ソノポレーション（Ｗａｎｇ，Ｍら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐｓ、２０１８年；８巻：３８８５頁）、熱ショックまたは光学的トランスフェクション；粒子ベースの方法、例えば、「遺伝子銃」送達、マグネトフェクション、もしくはインパレフェクション、またはウイルス形質導入が含まれる。
【０１５７】
[0186]哺乳動物細胞のための種々のウイルス形質導入技術が当該技術分野において公知である。一般的なウイルスベクターには、レンチウイルスおよびレトロウイルスが含まれる。例示的プロトコールは、Ｗａｎｇ  Ｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、２０１１年；１０８巻：Ｅ８０３−１２に提供される。代替のウイルスベクターには、ＨＳＶ、アデノウイルスおよびＡＡＶ（Ｈｏｗａｒｔｈ  Ｊら、Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．＆  Ｔｏｘｉｃ．、２０１０年、２６巻、１号、１〜２０頁）が含まれる。
【０１５８】
[0187]一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレンチウイルスを提供する。さらに、本発明は、癌の予防または治療のための細胞または薬剤の調製におけるレンチウイルスの使用を提供する。
【０１５９】
[0188]核酸構築物は、トランスフェクション／形質導入の所望の方法に応じて選択される。一部の実施形態では、核酸構築物はウイルスベクターであり、宿主細胞に核酸構築物を導入する方法はウイルス形質導入である。ＰＢＭＣにおけるＣＡＲの発現を誘発するためにウイルス形質導入を利用する方法（Ｐａｒｋｅｒ，ＬＬ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００年；１１巻：２３７７〜８７頁）、より一般的には、哺乳動物細胞の形質導入のためのレトロウイルス系を利用する方法（Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．およびＰｅａｒ，Ｗ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００１年、ユニット９．９）は、当該技術分野において公知である。一部の実施形態では、核酸構築物は、プラスミド、コスミド、人工染色体などであり、当該技術分野において公知である任意の適切な方法によって細胞内にトランスフェクトすることができる。
【０１６０】
[0189]本発明による核酸構築物は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞の死滅に用いることができる遺伝子修飾された細胞を作製するために用いることができる。遺伝子修飾に適した細胞は、異種または自家であり得る。
【０１６１】
[0190]細胞サブセットの選択／単離のための技術は、当該技術分野において公知である。これらには、蛍光活性化細胞選別（Ｂａｓｕ  Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１０年；４１巻：１５４６頁）、基質上に固定化された抗体を利用する技術、例えば、所望のマーカーを発現する細胞を免疫磁気的に選択する磁気細胞単離（ＭＡＣＳ（登録商標））デバイス（Ｚｏｌａ  Ｈ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００５年；１０６巻（９号）：３１２３〜６頁）、またはマイクロ流体チップの使用が含まれる。一連の細胞マーカーは、（限定されないが）ＢＣＲ、ＣＣＲ１０、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５ｇ、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１０３  ＣＤ１０６、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６５、ＣＤ１６９、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１８３、ＣＤ１８５、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９８、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＣＤ２１２、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８アルファ、ＣＤ２２９、ＣＤ２４４、ＣＤ２６８、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８２、ＣＤ２８４、ＣＤ２８９、ＣＤ２９４、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３１４、ＣＤ３１９、ＣＤ３２４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＸＣＲ３、Ｄｅｃｔｉｎ−１、Ｔｃ  ｅｐｓｉｌｏｒ  Ｒ１アルファ、Ｆｌｔ３、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３ａｐｈａ１、ＩＬ−２１Ｒ、ｉＮＯＳ、ＫＬＲＧ１、ＭＡＲＣＯ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＲＡＧ、ＲＯＲガンマＴ、Ｓｉｎｇｌｅｃ−８、ＳＴ２、ＴＣＲアルファ／ベータ、ＴＣＲガンマ／デルタ、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＶＥＧＦ、ＺＡＰ７０を含む免疫系の細胞を単離するために使用することができる。
【０１６２】
[0191]特に注目すべきは、Ｔ細胞マーカーＣＣＲ１０、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５６、ＣＤ６２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１０３、ＣＤ１２２、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１５２、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６５、ＣＤ１７８、ＣＤ１８３、ＣＤ１８５、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９８、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８アルファ、ＣＤ２２９、ＣＤ２４４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２９４、ＣＤ３０４、ＣＤ３１４、ＣＸＣＲ３、Ｆｌｔ３、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３アルファ１、ＩＬ−２１Ｒ、ＫＬＲＧ１、ＭＨＣクラスＩＩ、ＲＡＧ、ＲＯＲガンマＴ、ＳＴ２、ＴＣＲアルファ／ベータ、ＴＣＲガンマ／デルタ、ＺＡＰ７０である。Ｔ細胞選択のための特に好ましい細胞マーカーは、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８を含む。
【０１６３】
[0192]次に、単離された細胞は培養されて、細胞活性を修飾され、拡大され、または活性化され得る。細胞を拡大し、活性化するための技術は、当該技術分野において公知である（Ｗａｎｇ  Ｘ．およびＲｉｖｉｅｒｅ  Ｉ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ．２０１６年；３巻：１６０１５頁）。これらには、抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ、または他の形態の固定化ＣＤ３／ＣＤ２８活性化抗体の使用が含まれる。次に、活性化／遺伝子修飾された細胞は、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５またはＩＬ−１７など）の存在下、インビトロで拡大され、続いて、凍結保存することができる。ＣＡＲ  Ｔ細胞を拡大する方法の概要は、ＷａｎｇおよびＲｉｖｉｅｒａ（同段落）に記載されている。
【０１６４】
[0193]本発明は、さらに、上記されるキメラ抗原受容体、核酸分子、または核酸構築物を含む遺伝子修飾された細胞を提供する。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は白血球である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は骨髄細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は単球である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はマクロファージである。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はアルファベータ（αβ）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はウイルス特異的Ｔ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はＣＤ３＋  Ｔ細胞（例えば、ナイーブＣＤ３＋  Ｔ細胞または記憶ＣＤ３＋  Ｔ細胞サブセット）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞（例えば、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞または記憶ＣＤ４＋  Ｔ細胞サブセット）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞（例えば、ナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞または記憶ＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセット）である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はナチュラルキラーＴ細胞である。
【０１６５】
キメラ抗原受容体発現細胞の使用
[0194]遺伝子修飾された細胞が使用されて、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を標的化することができ、（細胞型に応じて）機能不全受容体を発現する細胞の死滅を支援するかまたはもたらすことができる。一部の実施形態では、本発明は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を死滅させる方法を提供し、本方法は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、上記されるキメラ抗原受容体を発現する遺伝子修飾された細胞と接触させることを含む。
【０１６６】
[0195]機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞は、癌細胞であり得る。したがって、一部の実施形態では、本発明は、癌を治療するための上記される遺伝子修飾された細胞の使用を提供する。さらに、本発明は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を死滅させる方法を提供し、本方法は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、上記される核酸分子または核酸構築物を含む細胞と接触させることを含む。一部の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞は癌細胞である。
【０１６７】
[0196]一部の実施形態では、本発明は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を死滅させる方法を提供し、本方法は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞を、上記されるようなキメラ抗原受容体を発現する遺伝子修飾された細胞と接触させることを含む。
【０１６８】
[0197]一部の実施形態では、癌細胞は、固形癌細胞である。一部の実施態様では、癌細胞は、脳癌細胞、食道癌細胞、口腔癌細胞、舌癌細胞、甲状腺癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、膵臓癌細胞、腎臓癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、子宮頸癌細胞、上皮細胞癌、皮膚癌細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮内膜癌細胞および精巣癌細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、癌細胞は、乳癌細胞、膠芽腫癌細胞、卵巣癌細胞、または黒色腫癌細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、癌細胞は転移性癌由来である。一部の実施形態では、癌は、ＩＩＩ期癌であるかまたはＩＶ期癌である。
【０１６９】
[0198]一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞に対して自家である。一部の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞は、対象の体内にある。
【０１７０】
[0199]一部の実施形態では、本発明によるキメラ抗原受容体は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）において発現される場合、ＣＡＲを形質導入したＣＴＬ：標的細胞が３０：１またはそれより高い、１０：１またはそれより高い、３：１またはそれより高い、または１：１またはそれより高い比率で、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞に対してインビトロで細胞傷害性を有する。
【０１７１】
[0200]一部の実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体は、ＣＤ３＋  Ｔ細胞において発現される場合、少なくとも２つの異なる癌タイプ、少なくとも３つの異なる癌タイプ、少なくとも４つの異なる癌タイプ、少なくとも５つの異なる癌タイプ、少なくとも６つの異なる癌タイプ、少なくとも７つの異なる癌タイプ、少なくとも８つの異なる癌タイプ、少なくとも９つの異なる癌タイプ、少なくとも１０の異なる癌タイプに対して活性を示す。
【０１７２】
[0201]一部の実施形態では、本発明によるキメラ抗原受容体は、ＣＤ４＋  Ｔ−ヘルパー細胞において発現される場合、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞と共培養された場合にＩＬ−２、ＴＮＦアルファおよび／またはＩＦＮガンマ生成を増加させる。一部の実施形態では、増加は、統計的に有意な増加である。一部の実施形態では、統計的に有意な増加は、Ｐ値が０．０５、０．０１または０．００１までである。
【０１７３】
[0202]一部の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する細胞は、癌細胞である。
[0203]本発明は、さらに、癌を治療するために、免疫細胞において発現される場合、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体の使用を提供する。一部の実施形態では、免疫細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、免疫細胞は骨髄細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は単球である。一部の実施形態では、免疫細胞はマクロファージである。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラーＴ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞はウイルス特異的Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ３＋  Ｔ細胞（例えば、ナイーブＣＤ３＋  Ｔ細胞または記憶ＣＤ３＋  Ｔ細胞サブセット）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞（例えば、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞または記憶ＣＤ４＋  Ｔ細胞サブセット）である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（例えば、ナイーブＣＤ８＋  Ｔ細胞または記憶ＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセット）である。
【０１７４】
[0204]本発明はまた、上記されるキメラ抗原受容体、核酸分子または核酸構築物を含む遺伝子修飾された細胞を含む医薬組成物を提供する。
[0205]本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現するように修飾されたＴ細胞または他の免疫細胞は、対象への送達のための「担体」または「賦形剤」とともに医薬組成物中に製剤化され得る。本明細書で使用される場合、「担体」または「賦形剤」は、任意の溶媒、分散媒体、ビヒクル、被覆剤、希釈剤、抗菌剤、および／または抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、懸濁剤、コロイドなどを含む。医薬活性物質のためのこのような媒体および／または薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。いずれもの従来の媒体または薬剤が遺伝子修飾された細胞と不適合である場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性成分はまた、組成物中に組み込むことができる。「薬学的に許容される」とは、生物学的に望ましくない、または望ましくない反応性もしくは毒性ではない物質を意味し、物質が、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される医薬組成物の他のコンポーネント（特に遺伝子修飾された細胞）のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子修飾された細胞とともに個体に投与され得る。
【０１７５】
[0206]医薬組成物は、好ましい投与経路に適合した種々の形態で製剤化することができる。したがって、組成物は、例えば、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内など）を含む公知の経路を介して投与することができる。組成物はまた、持続放出または遅延放出を介して投与することができる。
【０１７６】
[0207]製剤は、簡便には単位投薬形態で提示することができ、薬学の分野において周知である方法によって調製することができる。薬学的に許容される担体を用いて組成物を調製する方法は、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子修飾された細胞を、１つ以上の補助成分を構成する担体と結合させる工程を含む。キメラ抗原受容体を発現する遺伝子修飾された細胞を含む医薬組成物は、限定されないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、スプレー、エーロゾル、または任意の形態の混合物を含む、任意の適切な形態で提供され得る。
【０１７７】
[0208]組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤、担体、アジュバントまたはビヒクルとともに製剤中で送達することができる。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子修飾された細胞が、例えば、単回投薬から週に複数回の投薬まで投与することができる医薬組成物。一部の実施形態では、本方法は、医薬組成物をこの範囲外の頻度で投与することによって行うことができる。
【０１７８】
[0209]一部の実施形態では、医薬組成物は、週に約１〜約５回投与することができる。一部の実施形態では、医薬組成物は１回投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は２回投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は３回投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は４回投与される。
【０１７９】
[0210]一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０８細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも３×１０８細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０８細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０８細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０７細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０７細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０７細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０６細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０６細胞を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０６細胞を含む。
【０１８０】
[0211]一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０８細胞を提供するように投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも３×１０８細胞を提供するように投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０８細胞を提供するように投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０８細胞を提供するように投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０７細胞を提供するように投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０７細胞を提供するように投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０７細胞を提供するように投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５×１０６細胞を提供するように投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２．５×１０６細胞を提供するように投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０６細胞を提供するように投与される。
【０１８１】
[0212]一般的に、医薬組成物は、癌などの状態の症状または臨床徴候を任意の程度まで低下させ、その進行を制限し、改善し、または消散させるのに有効な量および投与レジメンで対象に投与される。本明細書で使用される場合、「改善」とは、癌に特徴的な症状または臨床徴候の程度、重症度、頻度、および／または可能性のいずれかの低下を指す。「症状」とは、疾患または患者の状態に関する任意の主観的証拠を指す。「徴候」または「臨床徴候」とは、患者以外の１人によって見出され得る特定の状態に関する客観的な身体所見を指す。癌との関連で、組成物は、１つ以上の腫瘍の増殖を制限し、１つ以上の腫瘍のサイズ、体積もしくは重量を低下させ、癌の転移率もしくは転移数を低下させ、癌細胞の増殖を低下させ、または対象の寿命を延ばすのに有効な量および投与レジメンで対象に投与される。
【０１８２】
[0213]本明細書を通じて、文脈が他に要求しない限り、言葉「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる」などの変形は、記述された要素もしくは成分、または要素もしくは成分のグループを包含することを意味するが、他の要素もしくは成分、または要素もしくは成分のグループを除外することを意味しないものと理解される。
【０１８３】
[0214]最後に、本発明に包含される基本的技術を行うための方法を含有する分子生物学の標準的教科書を参照する。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＭＲおよびＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０１２年を参照されたい。
【０１８４】
[0215]本発明は、明確性および理解の目的である程度詳細に説明されているが、本明細書に開示された発明概念の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された実施形態および方法に対する種々の修飾および変更を行うことができることは、当業者に明らかである。
【０１８５】
[0216]本発明は、以下の実施例においてさらに例証される。実施例は、特定の実施形態のみを説明することが目的であり、上記の説明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１８６】
実施例１
抗機能不全（非機能性）Ｐ２Ｘ７キメラ抗原受容体の調製および発現
抗機能不全Ｐ２Ｘ７  ＣＡＲ構築物
[0217]本発明の実施形態による、抗機能不全Ｐ２Ｘ７受容体キメラ抗原受容体を設計および発現するプロセスを詳細に説明する例示的なプロトコールは、以下のように詳細に説明される。
【０１８７】
[0218]ＣＡＲ構築物（総称してＣＮＡ  ＣＡＲファミリー構築物と称する）は、図７に示されるように調製され、これは、（ｉ）ＣＳＦ２ＲＡ（ヒトコロニー刺激因子２受容体アルファ）リーダー配列２、アミノ酸位置２１０におけるプロリンであるトランス−立体構造からシス−立体構造への変化を有する機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に指向される抗原結合ドメイン３（抗体のＶＨ部分に対する配列相同性を有する）を含むエクトドメイン１、（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン４、ならびに（ｉｉｉ）４１ＢＢの細胞内部分６、ＣＤ３−ゼータ鎖の細胞内部分７、Ｔ２Ａ自己切断部位８、および細胞内シグナル伝達ドメインを欠損している切断型ＥＧＦＲ受容体（ＥＧＦＲｔ）９を含むエンドドメイン５（ＥＧＦＲｔの表面発現は、形質導入効率を測定するための代理として用いることができる）を含む。
【０１８８】
[0219]エクトドメイン１および膜貫通ドメイン４は、以下の３つの連結ドメインのうちの１つによって連結された：
ａ．突然変異型ＩｇＧ４ヒンジ領域（図２、ならびに配列番号１３および３８を参照されたい）を含み、ＣＮＡ１００２と呼ばれるＣＡＲを生じさせる、１２個のアミノ酸のリンカー領域１０。このキメラ抗原受容体のためのアミノ酸配列および核酸配列は、それぞれ配列番号５４および５５により提供される；
ｂ．突然変異型ＩｇＧ４ヒンジ領域およびＩｇＧ４  ＣＨ２領域（配列番号３９を参照されたい）を含み、ＣＮＡ１００３と呼ばれるＣＡＲを生じさせる、１１９個のアミノ酸のリンカー領域１１。このキメラ抗原受容体のためのアミノ酸配列および核酸配列は、それぞれ配列番号５１および５３により提供される；ならびに
ｃ．突然変異型ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＩｇＧ４  ＣＨ２領域、およびＩｇＧ４  ＣＨ３領域（配列番号４０を参照されたい）を含み、ＣＮＡ１００４と呼ばれるＣＡＲを生じさせる、２２８個のアミノ酸のリンカー領域１２。このキメラ抗原受容体のためのアミノ酸配列および核酸配列は、それぞれ配列番号５６および５７により提供される。
【０１８９】
[0220]次に、これらの核酸分子をレンチウイルス骨格（ｅｐＨＩＶ−７．２−図６）にクローニングして、核酸構築物を形成した。
[0221]ＣＤ８ａシグナル伝達ペプチド１３、上記されるＣＮＡファミリーにおいて使用された結合ペプチドとは異なる抗機能不全Ｐ２Ｘ７結合ペプチド１４（ＰＥＰ２−２−３と呼ばれる）、エンドドメイン５の一部も提供するＣＤ２８の一部を含む膜貫通領域１５、ならびにＯＸ４０の細胞内部分１６およびＣＤ３ゼータ鎖の細胞内部分１７を含む細胞内部分、ならびにＴ２Ａ自己切断部位９を含む、ＣＡＲの更なるファミリー（配列番号６０および配列番号６１）が構築され、調製された。結合ペプチドおよび膜貫通領域は、３０個のアミノ酸（配列番号４１）１８または２２８個のアミノ酸１９（配列番号６３）の連結ドメインによって連結された。３０個のアミノ酸のリンカードメインは、リンカー（Ｇ４Ｓ）３（１５ａ．ａ．）、続いてアミノ酸配列「ＤＰＫ」（ＢＬＩＶ  ＣＡＲ短鎖ヒンジリンカーと呼ばれる−配列番号４１を参照されたい）によって進行するＩｇＧ４ヒンジ領域（１２ａ．ａ．）の突然変異型を含んだ。
【０１９０】
ＣＮＡファミリーウイルストランスフェクションおよびレンチウイルス生成
[0222]２３９Ｔ細胞は、ＣＡＲのＣＮＡファミリーを含有するベクターで一時的にトランスフェクトされ、以下のプロトコールに従ってレンチウイルスを生成した。
【０１９１】
[0223]１日目−２９３Ｔ細胞は、１０ｃｍ細胞培養プレート中の１０％血清を補充した１０ｍｌのＤＭＥＭ培地中に播種された。実質的なコンフルエンスが２４時間までに達成された。各々のウイルスをパッケージングするために４枚のプレートが調製された。プレートは、５％ＣＯ２で一晩、３７℃にてインキュベートされ、細胞をプレートに接着させた。
【０１９２】
[0224]２日目−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、４枚のプレートの一時的なトランスフェクションのために使用される試薬およびプラスミドＤＮＡ量は、以下に列挙される（表６）。ＣＮＡ１００２、ＣＮＡ１００３およびＣＮＡ１００４の３種類のＣＡＮ  ＣＡＲ構成体についてウイルスが作製された。
【０１９３】
[0225]各々のウイルスについて２本のチューブが調製された。チューブ１では、ＬＶ−ＣＡＲをコードするプラスミドが、３つのウイルスパッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２、ｐＣＨＧＰ−２、およびｐＣＭＶ−Ｇ）と組み合わせられ、ＯｐｔｉＭＥＭ培地で希釈された。チューブ２では、適切な体積のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈された。
【０１９４】
[0226]２本のチューブの内容物が合わせられ、穏やかに撹拌した後、２０分間、室温でインキュベートされた。次に、混合物（１ｍｌ／プレート）は、１日目に調製された２９３Ｔ細胞に添加され、３７℃にて５％ＣＯ２で一晩、インキュベートされた。
【０１９５】
【表６】
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【０１９６】
[0227]３日目−培地が除去され、１０％血清および酪酸ナトリウム（最終濃度６ｍＭ）を補充した新鮮なＤＭＥＭ培地で置換され、続いて、さらに４８時間、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートされた。
【０１９７】
[0228]５日目−４枚のプレートから上清が回収され、円錐管に移された後、９１４  ＲＣＦで１０分間スピンされ、細胞残屑を除去した。次に、上清が濾過（０．４５μＭ）され、ウイルスは遠心分離によって、濾過された上清から濃縮された。
【０１９８】
[0229]遠心分離後、上清は捨てられ、チューブを反転させることによって、残った培地は全て排出された。残存ウイルスペレットは、２００μｌの血清不含ＤＭＥＭ中に再懸濁され、次に、濃縮されたウイルス懸濁液は新しいチューブに移された。ウイルスは、高速遠心分離によってさらに濃縮され、その後、−８０℃に保存された。
【０１９９】
ウイルス力価アッセイ
[0230]調製されたウイルスの形質導入能を決定するために、既知体積の濃縮されたウイルス（１：１００００、１：５０００、１：２０００、１：１０００、１：５００、１：１６６および１：１００）は、硫酸プロタミン（０．１ｍｇ／ｍｌ）の存在下、４８時間、３７℃にて５％ＣＯ２でＨ９細胞（５００μｌの培地中、１×１０５）とともにインキュベートされた。各々のウイルスの力価は、形質導入されたＨ９細胞を抗ＥＧＦＲ（Ｅｒｂｉｔｕｘ−ビオチン）で染色され、フローサイトメトリーにより表面発現を算出することによって決定された。
【０２００】
遺伝子修飾されたＣＡＲを発現する細胞の調製
[0231]形質導入されたＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞は、以下のプロトコールのうちの１つによって調製された：
プロトコール１
[0232]ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、血小板アフェレーシスキット（Ｂｌｏｏｄｗｏｒｋｓ  ＮＷ）から排出された白血球除去チャンバー（ＬＲＳチャンバー）から単離された。Ｔ細胞は、ＡｕｔｏＭＡＣ  Ｐｒｏ（登録商標）分離器またはＬＳカラムのいずれかを用いて単離された。
【０２０１】
[0233]ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、３つのＣＮＡ  ＣＡＲウイルス（ＣＮＡ１００２、ＣＮＡ１００３およびＣＮＡ１００４）の各々で別々に形質導入された。形質導入されないモック（mock）ウェルは、対照として各々の細胞型に含められた。
【０２０２】
[0234]細胞は、単離後の１〜３日間、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（１：１）で刺激された。刺激された細胞はカウントされ、５００μｌの培地中、２４ウェルプレート（ウェルあたり２×１０６細胞）にプレーティングされた。硫酸プロタミンは、４０μｇ／ｍｌの最終濃度で各ウェルに添加された。
【０２０３】
[0235]形質導入に必要とされるウイルス量は、上記される方法から得られたウイルス力価の結果に基づいて算出された。３の多重感染（ＭＯＩ）が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を形質導入するために使用された。解凍したウイルス懸濁液を添加した後、プレートは旋回して混合され、３０分間、３２℃でスピノキュレート（８００  ＲＣＦ）された。次に、プレートは、４時間、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートされた。インキュベーション後、ＣＤ４＋細胞については５ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−７および０．５ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ１５、ならびにＣＤ８については５０ｕ／ｍｌのｒｈＩｌ−２および０．５ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１５を補充した温完全培地（ウェルあたり１．５ｍｌ）が各ウェルに添加された。
【０２０４】
[0236]形質導入された細胞は、２〜３日ごとにサイトカイン含有培地の半分を補充することによって維持された。細胞が視覚的に混み合った場合、培養体積が拡大された。刺激から９日後にダイナビードは除去された。
【０２０５】
プロトコール２
[0237]ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅｓｅｐのヒトＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ３  Ｔ細胞濃縮カクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を用いて、製造プロトコールに従って全血から単離された。
【０２０６】
[0238]ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、３つのＣＮＡ  ＣＡＲウイルス（ＣＮＡ１００２、ＣＮＡ１００３およびＣＮＡ１００４）の各々で別々に形質導入された。加えて、形質導入されないモックウェルは、対照として各々の細胞型に含められた。
【０２０７】
[0239]ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ３細胞は、以下のサイトカインを補充した完全なエクスビボ培地で培養された（表７）。
【０２０８】
【表７】
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【０２０９】
[0240]細胞は、単離後１時間、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（３：１の細胞対ビーズ比）で刺激された。刺激された細胞は、最終濃度８μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて２０の多重感染（ＭＯＩ）で形質導入された。次に、プレートは、一晩、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートされた。
【０２１０】
[0241]２日目に、培地の半分が除去され、ポリブレンの濃度を希釈するために置換された。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）は、２４時間刺激後、ＣＤ８細胞から除去された。ＣＤ３＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞において、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）は、１０日間放置された。形質導入された細胞は、２〜３日ごとに、培地の半分を除去し、適切なサイトカインを補充した新鮮な培地を添加することによって供給された。細胞が視覚的に混み合った場合、培養体積は拡大した。
【０２１１】
形質導入効率の決定
[0242]刺激形質導入の１０日後の効率は、次のプロトコールに従って、形質導入されたＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞をＥＧＦＲおよび／またはＦｃ発現のために染色することによって決定された。
【０２１２】
−形質導入された細胞の試料を５ｍｌのポリスチレンチューブに移し、１２００ｒｐｍで３分間、室温でスピンしてペレットを形成した。上清は除去され、細胞ペレットは２ｍｌのＦＡＣＳ染色溶液で洗浄された；
−形質導入された各細胞株の（ｉ）非染色対照チューブ、（ｉｉ）抗ＥＧＦＲ染色細胞、および（ｉｉｉ）抗Ｆｃ染色細胞について３つの試料が調製された；
−細胞（非染色対照細胞を除く）は、ビオチン化された一次抗体（抗ＥＧＦＲまたは抗Ｆｃ）の１：１００希釈物とともに、室温にて暗所で２０分間インキュベートされ、続いて、上記のように遠心分離することにより細胞を洗浄し、得られたペレットを２ｍｌのＦＡＣＳ染色溶液（×２）で洗浄された；
−洗浄された細胞は、ＰＥをコンジュゲートしたストレプトアビジン二次抗体とともに、２０分間、室温にて暗所でインキュベートされ、続いて、上記で概説したように洗浄された；
−次に、洗浄された細胞は遠心分離され、２００μｌのＦＡＣＳ固定液に再懸濁され、フローサイトメトリーによる分析まで４℃で保存された。
【０２１３】
[0243]ＣＤ４＋細胞の結果は図７に提供される。ＣＮＡ１００２  ＣＡＲで形質導入されたＣＤ４＋細胞の２７．５％は、切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）発現に対して陽性であり、ＣＮＡ１００２  ＣＡＲでの形質導入を示した。ＣＮＡ１００３で形質導入されたＣＤ４＋細胞の１６．０９％は、ＥＧＦＲｔ発現に対して陽性であり、ＣＮＡ１００４で形質導入されたＣＤ４＋細胞の１１．６５％は、ＥＧＦＲｔに対して陽性であった。
【０２１４】
[0244]ＣＤ８＋細胞の結果は図８に示される。ＣＮＡ１００２  ＣＡＲで形質導入されたＣＤ８＋細胞の９．８４％は、切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）発現に対して陽性であり、ＣＮＡ１００２  ＣＡＲでの形質導入を示した。ＣＮＡ１００３で形質導入されたＣＤ８＋細胞の１２．３０％はＥＧＦＲｔ発現に対して陽性であり、ＣＮＡ１００４で形質導入されたＣＤ８＋細胞の９．２０％は、ＥＧＦＲｔに対して陽性であった。
【０２１５】
細胞選別および拡大
[0245]形質導入細胞の純度を高めるために、ＥＧＦＲｔ発現細胞は、正の選択および磁気ビーズを用いて単離された。形質導入されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞は、ビオチン化された抗ＥＧＦＲ抗体（１：１００）で２０分間、４℃で染色され、次に、上記されるように洗浄され、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標））で１５分間、４℃でインキュベートされた。細胞は、ＭｉｄｉＭＡＣＳ磁石およびＬＳカラムを用いて、製造業者のプロトコールに従って選別された。
【０２１６】
[0246]あるいは、形質導入された細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって精製され、続いて、当該技術分野において公知であるプロトコールを用いて、標識された抗ＥＧＦＲ抗体で染色された。
【０２１７】
[0247]その後、精製された、形質導入された細胞は、照射されたフィーダー細胞（ＰＢＭＣおよび形質導入されたＢ細胞）および可溶性ＯＫＴ３抗体を用いて細胞を刺激することによって１２日間拡大された。Ｔ２５フラスコにおいて、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、１：５０または１：２５（Ｔ細胞：ＰＢＭＣ）の比率で凍結ＰＢＭＣとともにインキュベートされた。形質導入されたＢ細胞株（１×１０６）および／または可溶性ＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体（３０ｎｇ／ｍｌ）は、２５ｍｌの完全ＲＰＭＩ中に添加された。さらに、ｒｈＩＬ−７およびｒｈＩＬ−１５はＣＤ４＋細胞に添加され、ｒｈＩＬ−２およびｒｈＩｌ−１５はＣＤ８＋を形質導入された細胞に添加され、培地の半分を２〜３日ごとに補充することによって維持された。細胞が視覚的に混み合った場合、培養体積は拡大した。
【０２１８】
[0248]拡大の１２日後、形質導入されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞は、上記されるように抗ＥＧＦＲおよび抗ヒトＦｃ抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＥＧＦＲｔおよびＣＡＲＴ表面発現について分析された（図９および１０）。
【０２１９】
[0249]ＣＤ４＋細胞の結果は図９に提供される。ＣＮＡ１００２  ＣＡＲで形質導入されたＣＤ４＋細胞の９９．５％は、切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）発現に対して陽性であり、ＣＮＡ１００２  ＣＡＲでの形質導入を示した。ＣＮＡ１００３で形質導入されたＣＤ４＋細胞の９９％は、ＥＧＦＲｔ発現に対して陽性であり、ＣＮＡ１００４で形質導入されたＣＤ４＋細胞の８２．９％は、ＥＧＦＲｔに対して陽性であった。ＣＡＮ１００２で形質導入されたＣＤ４＋細胞の２１．２％は、Ｆｃに対して陽性であり、ＣＮＡ１００３で形質導入されたＣＤ４＋細胞の８３．６％は、Ｆｃに対して陽性であり、ＣＮＡ１００４で形質導入されたＣＤ４＋細胞の８２．６％は、Ｆｃに対して陽性であった。
【０２２０】
[0250]ＣＤ８＋細胞についての結果は図１０に提供される。ＣＮＡ１００２  ＣＡＲで形質導入されたＣＤ８＋細胞の９４％は、切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）発現に対して陽性であり、ＣＮＡ１００２  ＣＡＲでの形質導入を示した。ＣＮＡ１００３で形質導入されたＣＤ８＋細胞の９４．４％は、ＥＧＦＲｔ発現に対して陽性であり、ＣＮＡ１００４で形質導入されたＣＤ８＋細胞の７７％は、ＥＧＦＲｔに対して陽性であった。ＣＮＡ１００２で形質導入されたＣＤ８＋細胞の５．３９％は、Ｆｃに対して陽性であり、ＣＮＡ１００３で形質導入されたＣＤ８＋細胞の３７．３％は、Ｆｃに対して陽性であり、ＣＮＡ１００４で形質導入されたＣＤ８＋細胞の７４．２％は、Ｆｃに対して陽性であった。
【０２２１】
実施例２
抗機能不全Ｐ２Ｘ７キメラ抗原受容体エフェクター機能
[0251]ＣＮＡ１００２、ＣＮＡ１００３およびＣＮＡ１００４で形質導入されたＴ細胞の機能性を評価するために、インビトロ死滅アッセイ（ＣＤ８＋細胞）およびサイトカイン放出アッセイ（ＣＤ４＋細胞）が下記のように行われた。
ＣＤ８＋  ＣＡＲＴエフェクター機能
[0252]３つのＣＮＡファミリーＣＡＲ（ＣＮＡ１００２、ＣＮＡ１００３、ＣＮＡ１００４）を発現するＣＤ８＋を形質導入されたＴ細胞は、クロム放出アッセイを用いて細胞傷害活性について評価された。
【０２２２】
[0253]第１の機能アッセイ（図１１）は、一連の標的細胞（接着細胞と非接着細胞の両方）および陽性対照細胞株（ＯＫＴ３を発現するＫ５６２細胞）および非癌性対照細胞株（Ｋ５６２細胞株）に対して行われた。３つの癌細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、Ｕ８７（神経膠腫）およびＳＫＮＤＺ（神経芽腫）細胞株は、標的細胞として使用された。
【０２２３】
[0254]工程１−１日目−接着性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌細胞株）標的細胞（５×１０６）は、午前中に７ｍｌの完全培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中のＴ７５フラスコに播種され、３７℃にて５％ＣＯ２で６時間、インキュベートされて、フラスコへの接着を可能にした。接着後、５１Ｃｒ（７５μｌの５ｍＣｉ／ｍｌ）を各々のフラスコに添加され、混合され、３７℃（５％ＣＯ２）で一晩インキュベートされた。
【０２２４】
[0255]非接着性標的細胞株（Ｋ５６２、ＯＫＴ３を発現するＫ５６２、２９３Ｔ、Ｕ８７およびＳＫＮＤＺ）は、４ｍｌの完全培地中の１２ウェルプレートに播種された（ウェルあたり５×１０６）。７５μｌの５ｍＣｉ／ｍｌの５１Ｃｒは各ウェルに添加され、混合され、３７℃（５％ＣＯ２）で一晩インキュベートされた。
【０２２５】
[0256]工程２−２日目−ＣＮＡファミリーＣＡＲを発現するＣＤ８＋を形質導入された細胞はカウントされ、４つの異なる希釈（３０：１、１０：１、３．３：１、１．１：１）に必要とされる細胞体積が算出された。
【０２２６】
[0257]工程３−５１Ｃｒ標識された標的細胞（接着細胞はトリプシン処理によって回収された）は、ＰＢＳ（１０ｍｌ）溶液で２回洗浄した後、カウントされた。細胞濃度は５×１０４／ｍｌに調節され、完全ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳを含む）中の５０００標的細胞は、所望のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を提供するために、エフェクター細胞を含有する各ウェルに添加された。
【０２２７】
[0258]さらなる対照ウェルは、各標的細胞株についてプレーティングされた。最大の細胞溶解ウェルについては、１００μｌの２％ＳＤＳ溶液は標的細胞のみに添加されて、完全な細胞溶解を引き起こした。最小限の細胞溶解、またはバックグラウンド照射については、完全培地が添加された。エフェクターおよび標的を合わせた後、プレートを３７℃にて５％ＣＯ２で４時間インキュベートされた。
【０２２８】
[0259]４時間のインキュベーションの終了時に、アッセイプレートは、室温に１０４ＲＣＦでスピンされ、ブレーキされた。次に、５０μｌの上清が回収され、白いＬＵＭＡプレートに移された。ＬＵＭＡプレートは、ベンチで一晩乾燥された。
【０２２９】
[0260]工程４−３日目−各ＬＵＭＡプレートは、ＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、細胞死滅を示す５１Ｃｒ（１分間あたりのカウント−ＣＰＭ）について評価され、細胞溶解のパーセンテージが、以下に示すように算出された。
【０２３０】
[0261]細胞溶解パーセンテージ＝（ＣＰＭ試料−ＣＰＭ最小）／（ＣＰＭ最大−ＣＰＭ最小）×１００
[0262]上記の標的細胞およびＭ２１−黒色腫細胞およびＯＶＣＡＲ３−卵巣癌細胞を含む第２の機能アッセイ（図１２）が上記されるように行われた。
【０２３１】
[0263]図１１に見ることができるように、最初の機能アッセイは、ＣＮＡ１００３を発現するＣＤ８＋  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、２つの癌細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１（４６％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）およびＵ８７（１４％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）に対して特異的な細胞溶解を示すことを実証した。その程度の細胞溶解は、滴定依存的な方法で観察され、Ｅ：Ｔ比が減少するにつれて細胞溶解パーセンテージ値が減少した。界面活性剤による最大溶解に基づいて、細胞溶解パーセンテージ値が算出された。Ｋ５６２細胞（陰性対照）に対する細胞溶解は認められず、Ｋ５６２−ＯＫＴ３（陽性対照）に対して高い細胞溶解が全てのＣＤ８細胞により認められたことから、全てのＣＤ８集団が有効な細胞溶解応答に対応し得ることが示された。
【０２３２】
[0264]ＣＮＡ１００２およびＣＮＡ１００４を発現するＣＤ８＋  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、モック形質導入されたＣＤ８＋細胞と同様の挙動を示し、癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＵ８７に対して有意な細胞溶解を示さなかったことから、リンカー長が、抗機能不全Ｐ２Ｘ７  ＣＡＲ−Ｔ死滅において中心的な役割を果たし、最適化された場合、広範囲の癌タイプの標的化を可能にすることが示された。
【０２３３】
[0265]図１２に見ることができるように、第２の機能アッセイは、初期結果を確認し、さらに、ＣＮＡ１００３を発現するＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、癌細胞株Ｍ２１（約２５％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、ＯＶＡＣＡＲ−３（約５０％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（約４０％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）およびＵ８７（約２８％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）に対して特異的な溶解を示すことを実証した。さらに、ＣＮＡ１００２を発現するＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＯＶＣＡＲ−３（５０％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）細胞株を溶解する能力を実証した。
【０２３４】
[0266]重要なことに、これらの結果は、ＣＮＡ１００３  ＣＡＲが最大数の癌細胞株に対して最も広範な活性を示したことを示す。したがって、３０〜２２８個のアミノ酸（具体的には１１９個のアミノ酸を含む）の抗機能不全Ｐ２Ｘ７  ＣＡＲリンカーは、１２個のアミノ酸（ＣＮＡ１００２）または２２８個のアミノ酸（ＣＮＡ１００４）のリンカードメインを有するＣＡＲと比較して、最大数の癌タイプに対して有効性を提供し、ＣＮＡ１００２は、１つの癌細胞株に対して活性を有し、ＣＮＡ１００４は、いずれの癌細胞株に対しても活性を有さないと結論付けることができる。
【０２３５】
ＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲＴエフェクター機能
ＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼ細胞溶解アッセイ
[0267]ルシフェラーゼを安定的に発現する癌細胞株は、ＣｅｌｌＢａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａから購入した。標的細胞（１×１０４）は、試験された各条件について３重にして、丸底９６ウェルプレートに播種された（５０μｌ）。さらなる対照ウェルが、各標的細胞株についてプレーティングされた。ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞はカウントされ、連続希釈が行われた。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、以下のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（３０：１、１０：１、３．３：１、１．１：１）で標的細胞に添加された。９６ウェルプレートは、１６時間、３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートされた。続いて、等体積のＢｒｉｇｈｔＧｌｏアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）が各ウェルに添加され、十分に混合され、４分間、室温でインキュベートされ、次に、混合物の一部は不透明プレートに移された。発光は、ルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ  Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて読み取られた。残った標的細胞から測定された発光は、標的細胞のみからの発光と比較されて、ＣＡＲ−Ｔ細胞およびモック形質導入されたＴ細胞の細胞傷害性パーセンテージを算出した。
【０２３６】
[0268]ＣＮＡ１００３  ＣＡＲを発現するＣＤ３＋  Ｔ細胞は、上記のように生成され、拡大された。ＣＤ３＋  Ｔ細胞集団は、約３０％のＣＤ８＋  Ｔ細胞および７０％のＣＤ４＋  Ｔ細胞からなっていた（図１３）。ＥＧＦＲｔの表面発現は、形質導入効率を測定するための代理として使用され、ＣＤ３＋  Ｔ細胞の約８０％が首尾よく形質導入された。
【０２３７】
[0269]形質導入されたＣＤ３＋細胞の細胞傷害機能は、上記されたＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼアッセイシステムを用いて評価された。
[0270]ＣＡＲ  Ｔ細胞は、３０：１、１０：１、３．３：１および１．１：１のＥ：Ｔ比で１６時間、以下の癌細胞株；ＰＣ３（前立腺癌）、Ｃ３２（黒色腫）、ＳｋＭｅｌ５（黒色腫）、ＳｋＭｅｌ２８（黒色腫）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、Ｂｅ（２）Ｍ１７（神経芽腫）、Ｒａｊｉ（リンパ腫）およびＲＤ（横紋筋肉腫）およびＡＳＰＣ−１（膵臓癌）とともに、標的癌細胞株と共培養された。ＣＤ３＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞はエフェクター細胞として使用され、形質導入されていないＣＤ３＋  Ｔ細胞は陰性対照として使用された。
【０２３８】
[0271]図１４および図１５に示されるように、特異的な細胞溶解は、試験された全ての癌細胞株；ＰＣ３（１００％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、Ｃ３２（１００％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、ＳｋＭｅｌ５（８２％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、ＳｋＭｅｌ２８（９８％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（９０％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、Ｂｅ（２）Ｍ１７（９５％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、Ｒａｊｉ（４８％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、ＲＤ（９９％  Ｅ：Ｔ：  ３０：１）およびＡＳＰｃ（５９％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）に対してＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ−Ｔ細胞により観察された。滴定に依存した効果は、一部の癌において観察され、Ｅ：Ｔ比が減少するにつれて細胞溶解パーセンテージ値が減少した。データは、示された各時点におけるＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ３＋  ＵＴとを比較する、対応のないスチューデントｔ検定で分析された。データは、２つの独立した実験を表す。
【０２３９】
ＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲＴエフェクター機能
[0272]ＣＮＡ１００３  ＣＡＲを発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞が生成され、上記されるように拡大された。癌細胞株（標的細胞）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、Ｃ３２（黒色腫）、ＰＣ３（前立腺癌）およびＳＫＯＶ３（卵巣癌）上のＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害機能は、上記されるＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼアッセイシステムを用いて評価された。Ｔ細胞は、３０：１、１０：１、３．３：１および１．１：１のＥ：Ｔ比で標的癌細胞株と１６時間共培養された。ＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３ＣＡＲ細胞は、エフェクター細胞として使用された。モックＣＤ８細胞（形質導入されていない）は、非特異的死滅の対照として使用された。
【０２４０】
[0273]図１６に見ることができるように、特異的細胞溶解は、試験された４つ全ての癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（８２％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、Ｃ３２（１００％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、ＰＣ３（９８％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）およびＳＫＯＶ３（３３％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）に対して観察された。滴定に依存した効果が、一部の癌細胞株において観察され、Ｅ：Ｔ比が減少するにつれて細胞溶解パーセンテージ値が減少した。
【０２４１】
ＣＤ４＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲＴエフェクター機能
[0274]ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、主要な細胞傷害性Ｔ細胞集団である。しかしながら、ＣＤ４＋  Ｔ細胞が強力な抗腫瘍活性を媒介することが現在公知である。
【０２４２】
[0275]ＣＮＡ１００３  ＣＡＲを発現するＣＤ４＋  Ｔ細胞が生成され、上記されるように拡大された。癌細胞株（標的細胞）ＢＴ５４９（乳癌）、ＯＶＣＡＲ３（卵巣癌）、Ｃ３２（黒色腫）およびＰＣ３（前立腺癌）上のＣＤ４＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ細胞の細胞傷害機能は、上記されるＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼアッセイシステムを用いて評価された。ＳＫＮＤＺ（神経芽細胞腫）細胞は、ＣＮＡ１００３を発現するＴ細胞による死滅に対する抵抗性を示す以前のデータに基づいて、陰性対照として使用された。
【０２４３】
[0276]ＣＤ４＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、３０：１、１０：１、３．３：１および１．１：１のＥ：Ｔ比で標的癌細胞株と１６時間共培養された。モック形質導入された（形質導入されていない−ＵＴ）ＣＤ４＋細胞は、非特異的死滅の対照として使用された。
【０２４４】
[0277]５つの癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（６７％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、ＢＴ５４９（１００％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、ＯＶＣＡＲ３（９５％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）、Ｃ３２（１００％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）およびＰＣ３（７７％  Ｅ：Ｔ  ３０：１）に対する特異的な細胞溶解が観察された（図１７）。全ての実験において、滴定に依存した効果が観察され、Ｅ：Ｔ比が減少するにつれて細胞溶解パーセンテージ値が減少した。ＣＡＲ  Ｔ細胞はいずれも神経芽細胞腫細胞株ＳＫＮＤＺ（陰性対照）に対して細胞溶解を示さなかった。データは、示された時点でのＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ４＋  ＵＴとを比較する、対応のないスチューデントｔ検定で分析された。データは、２つの独立した実験を表す。
【０２４５】
[0278]上記は、機能不全（特異的に非機能性）Ｐ２Ｘ７を認識するＣＤ４＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、広範な癌タイプを表す多数の癌細胞株に対して有意な細胞傷害性を有することを示す。
【０２４６】
ＣＤ４＋  ＣＡＲＴ  Ｔヘルパー機能
[0279]ＣＮＡファミリーのＣＡＲを発現するＣＤ４＋細胞の活性化は、工程１および２（上記）に従って設定されたサイトカイン放出アッセイにおいて、サイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αについてアッセイすることによって測定された。サイトカイン放出アッセイでは、標的細胞株は、ＣＤ４＋モック細胞、またはＣＮ１００２、ＣＮＡ１００３もしくはＣＮＡ１００４ＣＡＲのいずれかを発現するＣＤ４＋細胞と２４時間（５％ＣＯ２）、３７℃で共培養された。その後、上清中のサイトカイン；ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの濃度は、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）検証キットを用いてアッセイされた。
【０２４７】
[0280]第１のサイトカイン放出アッセイ（図１８）は、陰性対照としてＫ５６２および２９３Ｔ細胞株、ならびに陽性対照としてＯＫＴ３を発現するＫ５６２を用いて行われた。３つの癌細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、Ｕ８７（神経膠腫）およびＳＫＮＤＺ（神経芽腫）細胞株は標的細胞として使用された。ＣＮＡ１００２、ＣＮＡ１００３またはＣＮＡ１００４  ＣＡＲを発現するＣＤ４＋細胞は、エフェクター細胞として使用された。モックＣＤ４＋細胞（形質導入されていない）は、エフェクター細胞の陰性対照として使用された。
【０２４８】
[0281]図１８に示されるように、ＣＮＡ１００３を発現するエフェクター細胞を含有する細胞培養物は、ＭＢ−２３１（乳癌細胞）標的細胞およびＵ８７（神経膠腫）標的細胞に対してインキュベートした場合、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの有意な分泌を示した。一方、ＣＮＡ１００２およびＣＮＡ１００４を発現するＣＤ４＋細胞は、いずれかの標的細胞と共インキュベートした場合、サイトカイン分泌をほとんどまたは全く示さなかった。
【０２４９】
[0282]第２のサイトカイン放出アッセイ（図１９）は、上記されるように行われ、これは、上記の標的細胞（Ｕ８７細胞を除く）を含み、またＯＶＣＡＲ３−卵巣癌細胞をインキュベートした。
【０２５０】
[0283]図１９に見ることができるように、ＩＬ−２の分泌増加、ＣＮＡ１００３を発現するＣＤ４＋細胞が癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１と共培養された上清中にＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが存在し、最初のサイトカイン放出アッセイにおける結果を確実にした。
【０２５１】
実施例３
追加のキメラ抗原受容体のためのプロトコール
[0284]本発明の実施形態による、抗機能不全（具体的には非機能性［ｎｆ］）Ｐ２Ｘ７受容体ＣＡＲを設計および発現するプロセスを詳述する例示的なプロトコールは、以下のように詳細に説明される。
【０２５２】
ＰＥＰ２−２−３（抗ｎｆ−Ｐ２ｘ７）キメラ抗原受容体の設計
[0285]抗ｎｆ−Ｐ２ｘ７キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、３０個のアミノ酸（ＢＬＩＶ  ＣＡＲ短鎖ヒンジリンカー；配列番号４１）または２２８個のアミノ酸（ＢＬＩＶ  ＣＡＲ長鎖ヒンジ；配列番号６３）のいずれかのヒンジ領域を有する、図１（上記されるように）による概略図に従って設計された。
レンチウイルスベクターの設計およびアセンブリ
[0286]設計されたＣＡＲは、蛍光および生物発光レポーティングタンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および蛍ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を含む、図２０に示されるＢＬＩＶレンチウイルスプラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）に組み込まれた。さらに、ＢＬＩＶプラスミドは、ＦＬｕｃおよびＧＦＰタンパク質の翻訳後分離を可能にするＧＦＰおよびＦＬｕｃレポータータンパク質コード配列間にＴ２Ａコード配列を含む。
【０２５３】
[0287]ＢＬＩＶベクターのＮｈｅＩ制限部位の上流および下流の配列に対する相同性を有する配列は、設計されたＣＡＲの５’および３’末端に付加されて、配列番号５８（ＣＡＲ−短鎖ヒンジ）および配列番号５９（ＣＡＲ−長鎖ヒンジ）に示される最終ヌクレオチド配列をもたらした。５’および３’配列を含めることにより、Ｇｉｂｓｏｎクローニングを用いて、抗ｎｆ  Ｐ２Ｘ７ＣＡＲをＢＬＩＶベクターに組み込むことが可能となった。
【０２５４】
[0288]ＢＬＩＶプラスミドは、ＮｈｅＩクローニング部位に制限され、抗ｎｆ  Ｐ２Ｘ７ＣＡＲコード配列は、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて組み込まれた。
ＢＬＩＶ−ＣＡＲベクターのクローニングおよび評価
[0289]Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ５−アルファコンピーテント大腸菌細胞（Ｇｉｂｓｏｎアセンブリクローニングキットに提供される）は、製造業者の指示書に従って生成されたＢＬＩＶ−ＣＡＲベクターで形質導入された。
【０２５５】
[0290]形質導入された（大腸菌）細胞のインキュベーション後、ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短鎖ヒンジプラスミドで形質導入された細菌の１０コロニー、およびＢＬＩＶ−ＣＡＲ−長鎖ヒンジプラスミドで形質導入された細菌の１０コロニーが単離され、プラスミドＤＮＡが精製され、ＢａｍＨＩ制限酵素で制限された。制限されたＤＮＡは、適切なサイズにされた制限断片について、ゲル電気泳動により分析された。
【０２５６】
レンチウイルスベクターの構築および検証
[0291]２９３Ｔ細胞が使用されて、以下の方法に従って、３つのプラスミドプロトコールからレンチウイルスをパッケージングした。
【０２５７】
１日目：２９３Ｔ細胞は、Ｔ−２２５フラスコ中の１０％血清を含む３５ｍｌ  ＤＭＥＭ培地に播種され、細胞が翌日に実質的にコンフルエントになるようにした。
２日目：生成されたＢＬＩＶ−ＣＡＲプラスミド（または未修飾ＢＬＩＶプラスミド）の１つの３０μｇ、ｇａｇ−ｐｏｌプラスミドデルタ８．２の３０μｇ、およびＶＳＶ−Ｇプラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ）の１５μｇは、ＯｐｔｉＭＥＭ培地に添加され、最終容量を７５０μｌにし、混合された。３００μｌのＰＥＩ溶液が添加され、室温で少なくとも２０分間インキュベートされた。次に、３７℃でインキュベーションする前に、混合物はコンフルエントな２９３Ｔ細胞に添加された。
【０２５８】
３日目：上清が、プラスミド混合物の添加から２４時間後に２９３Ｔ細胞から廃棄され、４℃で保存された。廃棄された混合物は、３５ｍｌの新鮮な培地に置換され、その後、３７℃でさらにインキュベートされた。
【０２５９】
４日目：プラスミド混合物の添加から４８時間後、培地が除去され、２４時間の回収からの上清と合わせられた。合わせられた上清は、１５分間、１５００ｇでスピンされて、いずれもの残存する細胞残屑を除去した。上清は、０．４５μｍフィルターで濾過され、次に、１７，０００ｒｐｍで１時間、スピンされた。遠心分離後、上清は、手動で廃棄され、５０〜２００μｌがチューブに残った。遠心管は、汚染および蒸発を防止するために、５０ｍｌのスクリュートップチューブに入れられ、ウイルスは４℃で一晩、再懸濁された。
【０２６０】
５日目：ウイルスは、遠心管の底部から再懸濁され、新しい１．５ｍｌチューブに移された。再懸濁されたウイルスは、マイクロ遠心管中で５０００ｒｐｍで５分間スピンされ、いずれもの残存する残屑を除去した。
【０２６１】
[0292]２９３Ｔ細胞のＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短鎖ヒンジおよびＢＬＩＶ−ＣＡＲ−長鎖ヒンジベクターによるトランスフェクションは、ＧＦＰ蛍光の存在により２４時間のインキュベーション後に評価された。短鎖−および長鎖−ヒンジＢＬＩＶ−ＣＡＲレンチウイルスベクターを含有する、５日目（上記されるように）に回収された上清は、新鮮な２９３Ｔ細胞とともにインキュベートされ、ＧＦＰ蛍光について可視化して、形質導入能を試験した。
【０２６２】
ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能
[0293]１０８個のＣＤ８＋  Ｔ細胞は、製造業者の指示書に従って、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、５０ｍｌのヒト血液から単離された。純度の分析は、精製された細胞の７６．６％がＣＤ８＋であることを実証した。
【０２６３】
[0294]ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ダイナルＴ細胞エキスパンダー（ＣＤ３／ＣＤ２８）ビーズの１：１の比率でウェルあたり１０５細胞でインキュベートされた。次に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、未修飾ＢＬＩＶプラスミド、ＢＬＩＶ−ＣＡＲ−短鎖ヒンジプラスミドまたはＢＬＩＶ−ＣＡＲ−長鎖ヒンジプラスミドのいずれかを含有する、５以上の多重感染（ＭＯＩ）で、レンチウイルス調製物と一緒に一晩、インキュベートされた。インキュベーション後、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は洗浄され、その後、標的細胞と共培養された。
【０２６４】
[0295]非機能性Ｐ２Ｘ７受容体を発現する標的細胞は、乳癌細胞株ＢＴ５４９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２２）によって提供された。これらの細胞は、製造業者の説明書に従って、蛍光膜挿入型色素ｅＦｌｕｏｒ（商標）６７０（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて色素標識された。
【０２６５】
[0296]色素標識後、標的細胞は、１０：１、５：１、１：１および０：１（Ｃａｒを発現するＴ細胞：標的）の比率で、調製されたＣＤ８＋  Ｔ細胞と共培養された。
[0297]２４時間の共培養後、細胞は回収され、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて分析された。共培養されたＴ細胞が標的細胞死または細胞増殖の停止を引き起こしたかどうかを評価するために、膜挿入型色素を含有する標的細胞の数が定量された。
【０２６６】
[0298]図２１は、３０個のアミノ酸のＢＬＩＶ  ＣＡＲ短鎖ヒンジを発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞が、形質導入されていないかまたは対照の形質導入された（未修飾ＢＬＩＶベクター）ＣＤ８＋  Ｔ細胞との標的細胞の共培養と比較して、４８時間後に標的細胞溶解の増加を実証したことを示す。３０個のアミノ酸のＢＬＩＶ  ＣＡＲ短鎖ヒンジの有効性は、ＢＬＩＶ−ＣＡＲ短鎖ヒンジよりもわずかに高い溶解を示した２２８個のアミノ酸のＢＬＩＶ  ＣＡＲ長鎖ヒンジ（配列番号６３）のそれよりもわずかに低かった。
【０２６７】
実施例４
抗原認識ドメインの変化
[0299]機能不全（具体的には、非機能性（ｎｆ））Ｐ２Ｘ７受容体に結合する異なる抗原認識ドメインを含む６つの異なるＣＡＲ構築物は、有効性について比較された。３つのＣＡＲ構築物は、ペプチド結合剤（ＣＮＡ１００３、ＣＮＡ１１０３、ＣＮＡ１２０３）からなる抗原認識ドメイン（単一ドメイン抗体またはｓｄＡｂ）を含み、２つは、ｎｆＰ２Ｘ７を認識するモノクローナル抗体からの単一可変鎖（ｓｃｆｖ）からなる２つの抗原認識ドメイン（ＣＮＡ１３０３およびＣＮＡ１４０３）を含み、および１つは、ジペプチド（ＣＮＡ１５０３）であった。
【０２６８】
[0300]ＣＮＡ１００３、ＣＮＡ１１０３およびＣＮＡ１２０３は、ｎｆＰ２Ｘ７に特異的な抗体の可変重鎖由来の３つのＣＤＲから形成された。ＣＮＡ１３０３およびＣＮＡ１４０３は、配列番号６９に示される配列を有するアミノ酸を介して、異なる抗ｎｆＰ２Ｘ７抗体の可変軽鎖にカップリングされた、ｎｆＰ２Ｘ７に特異的な抗体由来の可変重鎖から形成された。ＣＮＡ１５０３は、配列番号６９に示される配列を有するアミノ酸によってカップリングされた２つのｄＡｂ領域から形成された。
【０２６９】
[0301]これらのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物は、末端自己切断ペプチドＴ２Ａとともに、上記抗原認識ドメイン（配列番号４−ＣＮＡ１００３；配列番号６４−ＣＮＡ１１０３；配列番号６５−ＣＮＡ１２０３；配列番号６６−ＣＮＡ１３０３；配列番号６７−ＣＮＡ１４０３；および配列番号６８−ＣＮＡ１５０３）の１つであるヒトコロニー刺激因子２受容体アルファ（ＣＳＦ２ＲＡ）リーダー配列、リンカードメイン（ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ３−長さ１１９個のアミノ酸）、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４１ＢＢ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータドメインからなる。細胞内シグナル伝達ドメインを欠損する切断型ＥＧＦＲ受容体（ＥＧＦＲｔ）は、自己切断ペプチドＴ２Ａを介して同じ転写物から共発現された。ＥＧＦＲｔの表面発現は、形質導入されたＴ細胞（上記されるように）の形質導入効率および純度を測定するための代理として使用された。
【０２７０】
[0302]ＣＡＲ構築物は、レンチウイルス骨格にクローニングされ、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は形質導入されて、ＣＮＡ１００３、ＣＮＡ１１０３、ＣＮＡ１２０３、ＣＮＡ１３０３、ＣＮＡ１４０３およびＣＮＡ１５０３を発現させ、次に、上記されるように拡大した。
【０２７１】
[0303]ＣＤ８＋  ＣＡＲを発現するＴ細胞は、上記されるプロトコールに従って、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ細胞溶解アッセイにおいて使用された。簡単に説明すると、ＣＡＲを発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞は、３０：１、１０：１、３．３：１および１．１：１のＥ：Ｔ比で１６時間、標的癌細胞株と共培養された。ＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼベースのアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、４つの異なる癌細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、Ｃ３２（黒色腫）、ＰＣ３（前立腺癌）およびＳＫＯＶ３（卵巣癌）に対する６つのＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞株の細胞溶解能を測定するために使用された。モックＣＤ８細胞（形質導入されていない−ＵＴ）は、非特異的な死滅の対照として使用された。
【０２７２】
[0304]図２２に見ることができるように、ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、４つ全ての癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｃ３２、ＰＣ３およびＯＶＣＡＲ３に対して特異的な細胞溶解を示した。これは、本発明者らの以前の観察結果と一致した。ＣＮＡ１２０３およびＣＮＡ１５０３はまた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｃ３２、ＰＣ３およびＯＶＣＡＲ３細胞株に対して特異的な細胞溶解を示した。しかしながら、これは、ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ−Ｔと同等であるかまたはわずかに低かった。ＣＮＡ１４０３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株に対して特異的な細胞溶解を示したが、試験された他の３つの細胞株に対して非常に低い活性を示した。ＣＮＡ１１０３は、Ｃ３２およびＯＶＣＡＲ３細胞株に対して特異的な細胞溶解を示した。いくつかの場合には、滴定に依存した効果が観察され、Ｅ：Ｔ比が減少するにつれて細胞溶解パーセンテージ値が減少した。
【０２７３】
[0305]これらの結果は、抗原認識ドメインがＣＡＲ  Ｔ細胞の機能性に影響し得る一方で、長さが１１９個のアミノ酸であるリンカーを有する抗ｎｆ−Ｐ２Ｘ７  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、特定の細胞型に対して抗癌機能を維持することを実証する。さらに、本明細書に記載された実験は、当業者が、種々の癌タイプに対して、ｎｆ−Ｐ２Ｘ７に指向されるＣＡＲの抗癌機能をスクリーニングすることを可能にする。
【０２７４】
実施例５
ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞はインビボで前立腺癌細胞の腫瘍増殖を阻害する
[0306]ＣＮＡ１００３ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を組み合わせたもの）およびＣＤ８＋  Ｔ細胞のみがインビボで腫瘍増殖を阻害する能力を試験するために、腫瘍細胞株およびＣＡＲ  Ｔ細胞を移植した免疫不全異種移植マウスモデルが、以下のプロトコールに従って使用された。
【０２７５】
[0307]５〜８週齢の雄免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＩ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスは、動物資源センター（Ｐｅｒｔｈ、ＷＡ）から購入した。マウスは、１２時間の明／暗周期で病原体を含まない状態で飼育された。マウスは、分析前にＣＯ２窒息により人道的に安楽死された。
【０２７６】
異種移植マウスモデル
[0308]ルシフェラーゼを発現するように操作された前立腺腺癌ＰＣ３細胞株は、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）および１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２栄養混合物（Ｇｉｂｃｏ）中に維持され、３７℃にて５％ＣＯ２で培養された。細胞は、滅菌ＰＢＳでフラスコをすすぎ、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中のトリプシン／ＥＤＴＡで細胞を約４分間、３７℃で解離することによって、２〜３日ごとに継代された。細胞は、定期的にマイコプラズマについて試験され、マイコプラズマがないことが確認された。
【０２７７】
[0309]６〜８週齢の雄ＮＳＧマウスは、滅菌ＰＢＳに再懸濁された１×１０６個のＰＣ３ヒト前立腺癌細胞を右側腹部に皮下注射された。注射後の３日目に、１×１０７個のヒトＣＡＲ  Ｔ細胞が投与された。投与されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、以下の群：（ｉ）ＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４＋とＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方を含む）；（ｉｉ）精製されたＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞；（ｉｉｉ）フローサイトメトリーによりＥＧＦＲｔ発現について選別されたＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（「選別ＣＡＲ」−ＣＡＲ発現のために富化された）；フローサイトメトリーによりＥＧＦＲｔについて選別されたＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（「選別ＣＡＲ」）、または形質導入されていないＣＤ３＋  Ｔ細胞（図２３Ａ−ＣＤ３＋および図２７−ＣＤ８＋）もしくは１６日目に第２の用量による２回の投薬（図２３Ｂ−ＣＤ３＋）のうちの１つから選択された。
【０２７８】
[0310]細胞は、蛍光ベースの細胞選別（ＦＡＣＳ）により富化され（「選別ＣＡＲ」と称する）、続いて、当該技術分野において公知であるプロトコールを用いて、上記されるように、蛍光コンジュゲート標識された抗ＥＧＦＲ抗体（ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ｍｅ１Ｂ３）、ｅＦｌｕｏｒ  ６６０）で染色された。
【０２７９】
[0311]腫瘍は、長さとしての最長距離および幅としての垂直距離を測定することにより、デジタルキャリパを用いて５日目から開始して２日ごとに測定された。腫瘍面積は、長さ×幅として計算された。マウスの健康状態は、毎日モニターされ、腫瘍の長さが１５ｍｍ以上であった場合、またはマウスが以下：反毛、ハンチ姿勢、移動もしくは努力呼吸への抵抗、初期体重の１０％以上の体重減少、および／または行動もしくは歩行の変化のいずれかの組合せを含む疾患症状を示した場合にマウスを安楽死させた。
【０２８０】
組織分析
[0312]腫瘍内のＣＡＲ  Ｔ細胞の浸潤およびサイトカイン産生を分析するために、腫瘍は、マウスから切除され、小片に手動でミンチにされ、温かい消化培地中で１．５時間、３７℃で１５〜２０分ごとに混合しながらインキュベートされた。消化培地は、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に５％熱不活化ＦＣＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３０Ｕ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充することにより調製された。腫瘍ホモジネートは、７０μｍフィルター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通過され、マウス赤血球溶解緩衝液中で５分間、３７℃でインキュベートされた。
【０２８１】
[0313]腫瘍浸潤細胞は、フローサイトメトリーにより分析された。サイトカイン発現を染色するために、精製対照またはＣＡＲ  Ｔ細胞の単一細胞懸濁液は、１０％  ＦＣＳ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５４ｐＭ  Ｂ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｎＭイオノマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（１：１５００希釈；  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で捕捉された温かいＩＭＤＭとともに４時間、３７℃でインキュベートされた。単一細胞懸濁液は、近赤外固定可能色素および１０％ヒト血清で１５分間染色された。次に、細胞は、α−ｈｕ  ＣＤ８  ＢＵＶ３９５（ＲＰＡ−Ｔ８）およびＣＤ４  ＢＵＶ４９６（ＳＫ３）抗体で３０分間染色された。細胞内染色のために、細胞は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで２０分間、インキュベートされ、Ｐｅｒｍｗａｓｈ緩衝液で洗浄され、ＩＦＮγ  ＰＥ（Ｂ２７）、ＴＮＦα  ＡＰＣ（ＭＡｂ１１）、ＣＤ１０７ａ  ＰＥＣｙ７（Ｈ４Ａ３）およびグランザイムＢ（Ｇｚｍｂ）ＢＶ４２１（ＧＢ１１）およびパーフォリン（Ｂ−Ｄ４８）Ｔ細胞（Ｐｒｆ＋）を含む、細胞内で直接コンジュゲートされた抗体で２０分間染色された。抗体および染色試薬は全て、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。１％パラホルムアルデヒド中での固定後、細胞は、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０フローサイトメーター上で獲得された。ＦｌｏｗＪｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ．１０（ツリースター）を用いてデータ分析が行われた。
【０２８２】
結果
[0314]図２３Ａおよび図２７は、選別されていないＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（図２３Ａ）およびＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（図２７）の単回投薬が、形質導入されていないＴ細胞またはＰＢＳで処理されたマウスと比較して、前立腺癌異種移植マウスモデルにおける腫瘍サイズおよび重量の低下に有効であったことを実証する。図２３Ｂは、選別されたＣＤ３＋  Ｔ細胞の２回投薬が、選別されていないＣＤ３＋  Ｔ細胞の単回投薬よりも有効である一方で、選別されていないＣＤ３＋細胞の２回投薬は、１回目後の１３日目で２回目の投薬がなされ（図２３Ｂ）、単回投薬（図２３Ａ）に匹敵したことを実証する。
【０２８３】
[0315]腫瘍へのＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の浸潤は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージと一緒に評価された（図２４）。さらに、サイトカインの分泌：ＩＦＮγおよびＴＮＦα；活性化のマーカー：グランザイムＢ（Ｇｚｍｂ＋）およびＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）；および中枢記憶Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７のマーカーは、フローサイトメトリーにより評価された。
【０２８４】
[0316]図２４は、選別されたＣＡＲ  Ｔ細胞と選別されていないＣＡＲ  Ｔ細胞の両方が腫瘍に浸潤し、ＣＤ８＋細胞のレベルが低いＣＤ４＋  Ｔ細胞が大部分であったことを示す。
【０２８５】
[0317]図２５および図２６は、ＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方を発現する）が腫瘍に浸潤し、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを生成し、Ｇｚｍｂ＋、Ｐｒｆ＋およびＣＤ１０７ａ＋について陽性であることを示し、これは、浸潤ＣＡＲ  Ｔ細胞が腫瘍において活性化されることを示す。期待されるように、ＣＤ４＋（ヘルパーＴ細胞）は、より高レベルのＩＦＮγおよびＴＮＦαを生成し、一方、ＣＤ８＋細胞は、より高レベルのＧｚｍｂ＋およびＰｒｆ＋を示す。
【０２８６】
[0318]図２７は、精製されたＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与（実質的なＣＤ４＋  Ｔ細胞集団が存在しない場合）が、形質導入されていないＣＤ８＋  Ｔ細胞またはＰＢＳで処理されたマウスと比較して、癌の治療および腫瘍増殖の低下に有効であることを示す。さらに、図２８は、かなりの数のＣＤ８＋  Ｔ細胞が腫瘍に浸潤し、ＩＦＮγの分泌およびＧｚｍｂの発現によって証明されるように、生存し、活性であることを示す。さらに、ＣＤ８＋浸潤のかなりの部分は、記憶表現型（ＣＤ４５ＲＡ−）を有し、リンパ節ホーミングケモカイン受容体ＣＣＲ７（約５０％）を発現する。
【０２８７】
[0319]以上のことから、ＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の送達は、ＮＳＧマウスにおけるＰＣ３ヒト前立腺癌の癌を治療し、腫瘍増殖を阻害することができることは明らかである。これは、ＣＤ３＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、単回投薬においてバルクの選別されていない集団として、または選別されたもしくは選別されていない集団として、２回の投薬で送達される場合に明白である。さらに、ＣＮＡ１００３＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、細胞の単回投薬を受けたマウスでは２５日目と２回投薬を受けたマウスでは２７日目の両方において、腫瘍内に存在することが示されている。これは、いずれのエンドポイントにおいても検出されなかった、形質導入されていないＣＤ３＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞とは対照的である。さらに、ある割合のＣＡＲ  Ｔ  ＣＤ４＋は、サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαを発現し、ならびにかなりの割合のＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球の死滅活性の重要なメディエーターであることが全て公知であるグランザイムＢおよびＣＤ１０７ａである。さらに、腫瘍に見出されるＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ−Ｔ細胞の大部分は、中枢記憶表現型（ＣＣＲ７＋およびＣＤ４５ＲＡ−）を有し、約４５％はエフェクターＴ細胞表現型（ＣＣＲ７−およびＣＤ４５ＲＡ−）を有することから、腫瘍内のＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、エフェクター細胞として腫瘍細胞を直接死滅させ、さらに中枢記憶細胞として二次リンパ器官を通じて再循環する能力を備えることが示唆される。これにより、初回投薬後も長期的な防護を維持するための自己複製プールとしての役割を果たすことができる。
【０２８８】
実施例６
インビボにおけるＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量反応性
[0320]前立腺異種移植片癌細胞モデルは、１×１０７個のＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞または２×１０７個のＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞を腫瘍注射後の３日目（ｄ３）に投与されたマウスを除いて、上記実施例５に示されるように使用された。２回目の投与を受けたマウスにおいて、さらなる１×１０７個のＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍注射後の１６日目に投与された。形質導入されていない（ＵＴ）ＣＤ３＋  Ｔ細胞は、上記と同一の用量および投与レジメンで対照として使用された。
【０２８９】
[0321]マウスおよび腫瘍の発生は、実施例５において上記で示されるようにモニターされた。
組織分析およびフローサイトメトリー
[0322]腫瘍が切除され、上記の実施例５において示されるように単一の細胞懸濁液が得られた。次に、フローサイトメトリー分析のために、細胞は、以下の蛍光標識抗体：α−ｈｕ  ＣＤ８  ＢＵＶ３９５（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ４  ＢＵＶ４９６（ＳＫ３）、ＣＤ４５ＲＡ  ＡＰＣ（ＨＩ１００）およびＣＣＲ７  ＰＥ（１５０５０３）で３０分間染色された。細胞内染色のために、細胞は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍとともに２０分間インキュベートされ、Ｐｅｒｍｗａｓｈ緩衝液で洗浄され、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ（Ｂ−Ｄ４８）およびＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ＢＶ４２１（ＧＢ１１）を含む、細胞内で直接コンジュゲートする抗体で２０分間染色した。抗体および染色試薬は全て、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。１％パラホルムアルデヒドで固定した後、細胞は、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０フローサイトメーターで分析された。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ．１０（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて行なわれた。
【０２９０】
結果
[0323]図２９Ａおよび２９Ｂは、１×１０７個のＣＤ３＋  ＣＡＲ−Ｔの単回投薬（図２９Ａ）または２回投薬（図２９Ｂ）が、形質導入されていない（ＵＴ）Ｔ細胞またはＰＢＳで処置されたマウスと比較して、前立腺癌異種移植マウスモデルにおける腫瘍サイズを低下させるのに効果的であったことを示す。さらに、図２９Ｃは、２×１０７個のＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回投薬が、１×１０７個の細胞の投薬と比較して、腫瘍サイズのさらなる減少をもたらしたことを示す。個々のマウスの分析（図２９Ｃの右側パネル）は、ＰＢＳ処置されたマウスまたは形質導入されていない（ＵＴ）ＣＤ３＋  Ｔ細胞を投与されたマウスと比較して、処置されたマウス７匹中６匹において腫瘍増殖の顕著な減少を示した。注目すべきことに、７匹のマウス中４匹に腫瘍がほぼ完全に消失していた。
【０２９１】
[0324]図２９Ｄおよび２９Ｅは、１×１０７個のＣＤ３＋ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ  ＣＤ３＋（１））の単回投薬、１３日間の間隔をあけて１×１０７個のＣＤ３＋ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の２回投薬（ＣＡＲ−Ｔ  ＣＤ３＋（２））、または２×１０７個のＣＤ３＋ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回投薬（ＣＡＲ−Ｔ  ＣＤ３＋（２×１０７））を受けたマウスにおける腫瘍増殖を示す。図２９Ｄに見ることができるように、マウスは、３日目に２×１０７個のＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回投薬の投与により、ＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けた他の全ての群と比較して、腫瘍サイズが低かった。さらに、全てのＣＡＲ処置群は、ＰＢＳまたは形質導入されていないＣＤ３＋  Ｔ細胞で処置されたマウスと比較して、腫瘍サイズの減少を示した。これらの結果は、腫瘍重量が、未形質導入群（文字「Ａ」で示される）またはＰＢＳ処置群（図２９Ｅ）と比較して、腫瘍重量が低い各ＣＡＲ処置群（文字「Ｂ」で示す）で分析された場合に反映された。
【０２９２】
[0325]腫瘍浸潤Ｔ細胞の表現型が分析され、その結果は図３０Ａおよび３０Ｂに示される。図３０Ａは、組織１ｍｇあたりの生存しているＣＤ３＋細胞のパーセンテージを示す。見ることができるように、２×１０７個のＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ  ２ｘ）の単回投薬で投与されたマウスの腫瘍は、生存ＣＤ３＋  Ｔ細胞の最大パーセンテージを占め、全ての投与群（ＣＡＲ−Ｔ（１）−１用量の１×１０７個のＣＡＲ細胞；ＣＡＲＴ（２）−２用量の１×１０７個のＣＡＲ細胞；およびＣＡＲ−Ｔ（２ｘ）−１用量の２×１０７個のＣＡＲ細胞）は、腫瘍浸潤ＣＤ３＋  Ｔ細胞を有したが、一方、形質導入されていない（ＵＴ）対照は、Ｔ細胞の腫瘍浸潤はごくわずかであった。
【０２９３】
[0326]腫瘍浸潤細胞集団の組成分析は、図３０Ｂに提示される。見ることができるように、ＣＤ３＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与されたマウス由来の腫瘍に存在するＣＤ４＋  およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の大部分は、エフェクター表現型（ＴＥＭ−ＣＤＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−）を有した。中枢記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ−ＣＤＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ−）および最終分化したエフェクター記憶細胞（ＴＥＭＲＡ−ＣＤＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）もまたかなりの割合で認められ、これらの細胞集団はいずれもリンパ節に移動することができる抗原を経験した細胞であった。ナイーブＴ細胞（ＴＮ−ＣＤＲ７−ＣＤ４５ＲＡ＋）の少数の集団もまた存在する。
【０２９４】
[0327]図３１は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞のグランザイムｂ（Ｇｚｍｂ＋）およびパーフォリン発現を示す。グランザイムｂとパーフォリンはともに、腫瘍浸潤ＣＡＲ  Ｔ細胞が細胞傷害性であることを示す細胞傷害性Ｔリンパ球の主要な死滅機構を構成する。
【０２９５】
実施例７
ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞はインビボで乳癌細胞の腫瘍増殖を阻害する
[0328]６週齢の雌免疫不全ＮＳＧマウスは、動物資源センター（Ｐｅｒｔｈ、ＷＡ）から購入した。マウスは、１２時間の明／暗周期で病原体を含まない状態で飼育された。マウスは、ＣＯ２窒息により人道的に安楽死された。
【０２９６】
異種移植マウスモデル
[0329]一次腫瘍モデルについて、１２〜１３週の雌ＮＳＧマウスは、最終タンパク質濃度が４〜６ｍｇ／ｍｌとなるように、滅菌ＰＢＳ：マトリゲルに再懸濁された２×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を第４左乳房脂肪パッド（Ｌ４）に皮下注射された。
【０２９７】
[0330]注射後の３日目に、１×１０７個のＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ−Ｔ細胞または対照ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ヒト血液から精製され、レンチウイルスで形質導入された）は、静脈内注射された。腫瘍は、デジタルキャリパを用いて５日目から開始して２日ごとに測定され、長さとしての最長距離および幅としての垂直距離を測定した。腫瘍面積は、長さ×幅として計算された。マウスの健康状態は、毎日モニターされ、腫瘍の長さが１５ｍｍ以上であった場合、またはマウスが反毛、ハンチ姿勢、移動への抵抗もしくは呼吸困難、初期体重の１０％以上の体重減少、および／または行動もしくは歩行の変化を示した場合に安楽死された。
【０２９８】
肺転移結節の視覚化
[0331]マウスは、ＣＯ２窒息により安楽死させ、肋骨は外され、気管が露出された。水に再懸濁された１５％ブラックインク（Ｐａｒｋｅｒ）は、肺が完全に満たされるまで２６ゲージ針を用いて口腔内に注入された。肺が取り出され、５５％ＥｔＯＨ、６％ホルムアルデヒド、８％氷酢酸中で直ちに脱色され、水（Ｆｅｋｅｔｅ溶液）に再懸濁された。肺は５葉に分別され、白色結節がカウントされた。
【０２９９】
結果
[0332]図３２は、精製されたＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ（「ＣＡＲ−Ｔ」）細胞の投与が、（ｉ）形質導入されていないＣＤ８＋  Ｔ細胞（「ＣＤ８＋  Ｔ」）またはＰＢＳで処置されたマウスと比較して、乳癌異種移植マウスモデルにおいて、癌を処置し、腫瘍増殖（サイズおよび重量）を低下させ、（ｉｉ）肺などの二次部位における転移形成を減少させるのに有効であることを示す。
【０３００】
[0333]上記を考慮すると、ＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与は、対照ＣＤ８＋  ヒトＴ細胞またはＰＢＳを投与されたマウスと比較して、ＮＳＧマウスにおいてヒト乳癌の腫瘍増殖を阻害し得ることが明らかである。これは、ＣＤ８＋  ＣＮＡ１００３  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けたマウスにおいて、高転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の自然転移から生じる肺上の結節がより少ないことに関連付けられる。
【０３０１】
[0334]本明細書に記載された全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提供される任意のおよび全ての例または例示的な言語（例えば、「例えば」、「すなわち」）の使用は、単に例示的な実施形態をより良く説明することだけを意図しており、他に請求されない限り、請求項に係る発明の範囲を限定するものではない。明細書中のいかなる言語も、いずれの請求されていない要素が必須であることを示すものとして解釈されるべきではない。
【０３０２】
[0335]本明細書で提供される説明は、共通の特性および特徴を共有し得るいくつかの実施形態に関するものである。１つの実施形態の１つ以上の特徴は、他の実施形態の１つ以上の特徴と組み合わせることができることが理解されるべきである。さらに、実施形態の単一の特徴または特徴の組合せは、追加の実施形態を構成することができる。
【０３０３】
[0336]本明細書で使用される主題の見出しは、読者の参照を容易にするためにのみ含まれており、開示または特許請求の範囲を通じて見出される主題を限定するために使用されるべきではない。主題の見出しは、特許請求の範囲のまたは請求項の限定を解釈する際に使用するべきではない。
【０３０４】
[0337]当業者は、本明細書に記載される本発明が、具体的に記載されたもの以外の変形および修飾を受け入れることを理解する。本発明は、全てのこのような変形および修飾を含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において個別にまたは集合的に言及または示される全ての工程、特徴、組成物および化合物、ならびに任意の２つ以上の工程または特徴の任意および全ての組合せを含む。
【０３０５】
[0338]また、本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が既に別のことを指示しない限り、複数の態様を含むことに留意されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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