(57)【要約】【課題】従来の電極ホルダーへのマイクロピペットの装着は、気密を保つ必要性からネジとＯリングによって行われていた。このような方法は作業が繁雑になり、測定効率を低下させていた。【解決手段】マイクロピペット１０と、第一の開口部８及び第二の開口部９を有するソケット７と、測定電極４と、スリーブ２と、圧力接続ポート５を設けた接続部材３とからなり、マイクロピペット１０の後端を前記ソケット７の第一の開口部８へ挿入し、このソケット７の第二の開口部９にスリーブ２を挿入した構成とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロピペットの内部に第一の液体を封入し、このマイクロピペットの先端を第二の液体の中に浸して前記第一の液体と第二の液体の間に流れる電流または発生する電圧を測定することによって、前記第一または第二の液体の液中に存在する微小な粒子あるいは膜状個片の電気特性を測定するためのマイクロプローブであって、
第一の開口部及びこの第一の開口部より小さな第二の開口部を有するソケットと、
前記第一の液体と電気的に接続する測定電極と、
前記測定電極を内蔵するためのスリーブと、
圧力接続ポートを有した接続部材とからなり、
前記ソケットの第二の開口部の一部は前記マイクロピペットの後端の内径より小さい形状とし、前記スリーブの先端の外径は前記ソケットの第二の開口部の内径より大きい形状とし、前記マイクロピペットの後端を前記ソケットの第一の開口部へ挿入し、このソケットの第二の開口部にスリーブを挿入したマイクロプローブ。
【請求項２】
測定電極の外径とスリーブの内径には空隙を設けた請求項１に記載のマイクロプローブ。
【請求項３】
スリーブとして、金属、ガラスまたはセラミックのいずれか一つを用いるとともに、前記スリーブの硬度をソケットの硬度より高い硬度とした請求項１に記載のマイクロプローブ。
【請求項４】
ソケットの材料を、ポリエチレン（PE）、ポリカーボネート（PC）、ポリスチレン（PS）、環状オレフィンポリマー（COP）、環状オレフィンコポリマー（COC）、のうちいずれか一つの樹脂を用いるとともに、前記ソケットの硬度をスリーブの硬度より低い硬度とした請求項１に記載のマイクロプロ−ブ。
【請求項５】
スリーブの外径断面を円形状とした請求項１に記載のマイクロプローブ。
【請求項６】
スリーブの外壁面及びソケットの第二の開口部の内壁面を平滑面とした請求項１に記載のマイクロプローブ。
【請求項７】
ソケットの第二の開口部の一部をテーパ形状とした請求項１に記載のマイクロプローブ。
【請求項８】
微小な粒子あるいは膜状個片として、細胞、細胞膜、リポソームまたは脂質二重膜のいずれか一つを用いる請求項１に記載のマイクロプローブ。
【請求項９】
マイクロピペットの内部に第一の液体を封入し、このマイクロピペットの先端を第二の液体の中に浸して前記第一の液体と前記第二の液体の間に流れる電流または発生する電圧を測定することによって、前記第一または第二の液体の液中に存在する微小な粒子あるいは膜状個片の電気特性を測定するための電気的測定システムであって、
第一の開口部及びこの第一の開口部より小さな第二の開口部を有するソケットと、
前記第一の液体と電気的に接続する測定電極と、
前記測定電極を内蔵するためのスリーブと、
圧力接続ポートを有した接続部材とから構成し、
前記ソケットの第二の開口部の一部は前記マイクロピペットの後端の内径より小さい形状とし、前記スリーブの先端の外径は前記ソケットの第二の開口部の内径より大きい形状とし、前記マイクロピペットの後端を前記ソケットの第一の開口部へ挿入し、このソケットの第二の開口部にスリーブを挿入したマイクロプローブと、
前記圧力接続ポートに接続した圧力制御器と、
測定器とからなる電気的測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロピペットの内部の領域に測定のための電極を接続し、マイクロピペットの内外の電気的測定を行うためのマイクロプローブおよびこれを用いた電気的測定システムであって、例えば細胞の活動によって発生する物理化学的変化を観測するために用いられるマイクロピペット型細胞電気生理センサ用測定システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するタンパク質の機能の一つであるイオンチャネル機能を測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャネルの様々な機能が解明されてきた。
【０００３】
そして、このイオンチャネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。
【０００４】
このパッチクランプ法における測定技術としては、微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としている。
【０００５】
すなわち、１個の細胞にマイクロピペットを挿入する必要があるため、顕微鏡による観測下で一つの細胞に狙いを定めてマイクロマニュピレータ等の手段により、高精度にマイクロピペットの先端を細胞の膜表面に接触させる必要がある。このマイクロピペットの先端を高精度に位置制御するため、マイクロピペットは一般的に電極ホルダーと呼ばれる固定装置にセットされ、この電極ホルダーをマイクロマニュピレータ等で位置制御するマイクロプローブとして用いられている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
次に、従来のマイクロプローブについて図面を用いて詳細に説明する。図１１はマイクロピペットと電極ホルダーからなる従来のマイクロプローブの構成を示す断面図である。図１１に示すように、従来のマイクロプローブはマイクロピペット１６の内部の領域に封入された電気生理液体（通常は細胞内液）と電気的接触を行う電極１７を備え、さらにマイクロピペット１６の内部の領域を減圧もしくは陽圧に制御する圧力制御手段に接続するための圧力接続ポート２０を備えている。また、電極１７は電極引き出し口２１と接続されており、これらによってマイクロピペット１６をピペット押さえ１８の開口部に挿入設置した後、マイクロピペット１６の先端を細胞に接触させれば、細胞膜を流れる電流を計測することができるように構成されている（例えば、非特許文献２参照）。
【非特許文献１】岡田泰伸編「新パッチクランプ実験技術法」吉岡書店、２００３年８月１０日、Ｐ３１２〜３３９
【非特許文献２】Bert Sakman and Erwin Neher「Single-Channel Recording Second Edition」Plenum Publishing Corp.、１９９５年、Ｐ３２９〜３４０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記従来の構成では、マイクロピペットの内部領域を外部との気密を保つためにマイクロピペット１６をピペット押さえ１８のネジにより締め付け、Ｏリング１９によって気密を確保する必要がある。このピペット押さえ１８のネジによる締め付けは作業が繁雑になり、測定の効率を低下させる。また、マイクロピペット１６の先端は極めて清浄に保つ必要があることから、測定によって細胞膜等に一度触れたものは再利用が不可能となり、新しい測定の際にはマイクロピペット１６を交換する必要がある。従って、これらを用いて測定装置の自動化を行おうとするとマイクロピペット１６の交換のためにピペット押さえ１８のネジを取り外し、マイクロピペット１６の挿入・締め付けにはロボット機構が必要となり、このような機構はマイクロピペット１６を高密度に配置することに不利となっている。
【０００８】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、電極ホルダーへマイクロピペットを設置する機構を簡略にし、交換作業を効率化するとともにマイクロピペットの高密度配置を実現することができるマイクロプローブおよびこれを用いた電気的測定システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、マイクロピペットの後端の開口部側に、第一の開口部とこの第一の開口部より小さな第二の開口部を備えたソケットと、さらに前記マイクロピペットの内部に封入された第一の液体と電気的に接続する測定電極と、前記測定電極を内蔵するためのスリーブと、圧力接続ポートを形成した接続部材とからなる電極ホルダーを構成し、前記ソケットの一部の第二の開口部はマイクロピペットの後端の開口部の内径より小さな形状とし、スリーブの先端の外径はソケットの第二の開口部の内径より大きい形状とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のマイクロプローブ及びこれを用いた電気的測定システムは、マイクロピペットの内部の領域に電極を挿入する際に、容易に気密を保ったまま挿入することができ、同時にマイクロピペットの内部領域と圧力接続ポートを接続していることから、電極ホルダーへのマイクロピペットの装着の自動化とマイクロピペットの高密度配置を容易に実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１におけるマイクロプローブ及びこれを用いた電気的測定システムについて、図面を参照しながら説明する。
【００１２】
図１は本発明の実施の形態１におけるマイクロプローブの断面図、図２は図１の要部拡大断面図、図３はマイクロプローブを構成する電極ホルダーの断面図、図４はマイクロピペット及びソケットの断面図、及び図５はマイクロピペットをソケットにはめ込んだときの断面図である。
【００１３】
図１〜図３において、電極ホルダー１はセラミックよりなるスリーブ２、樹脂よりなる接続部材３及び金属よりなる電極引き出し口６から構成している。
【００１４】
また、この接続部材３には圧力を制御する制御器へ接続するための圧力接続ポート５を形成するとともに、スリーブ２を挿入する開口部を形成し、さらに、この接続部材３の後端には電極引き出し口６を形成している。
【００１５】
また、前記スリーブ２の内部には空洞を形成しており、この空洞の内部には銀および塩化銀よりなる電極４を配置している。そして、この電極４の外径はスリーブ２の内径より小さくしておき、電極４の外周部には空隙を設けている。
【００１６】
また、電極４はスリーブ２の一端に引き出されて電極引き出し口６に接続している。
【００１７】
また、このスリーブ２の一端はソケット７の第二の開口部９に形成したテーパ形状とマッチングするようにテーパ形状をしており、これによってスリーブ２とソケット７との挿入性と気密性を確実にしている。
【００１８】
一方、電極４とスリーブ２の内部にある空隙は圧力接続ポート５へ接続されており、この圧力接続ポート５に圧力制御器を接続することができる。
【００１９】
また、図４及び図５に示すように、樹脂よりなるソケット７は第一の開口部８と第二の開口部９を有しており、第一の開口部８に対向した第二の開口部９ａの開口形状をマイクロピペット１０の後端の開口部１１の内径より小さくしている。これによって、電極４とスリーブ２のソケット７への挿入性と気密性を容易に保持することができる。
【００２０】
そして、第一の開口部８側にはガラスよりなるマイクロピペット１０を挿入している。
【００２１】
次に、図６は前記電極ホルダー１を前記マイクロピペット１０が挿入されたソケット７へ装着するときのマイクロプローブの断面構造を示しており、図７はその要部拡大断面図である。図６及び図７に示すように、スリーブ２の先端部における外径はソケット７の第二の開口部９ａより少し大きくするとともに、マイクロピペット１０の開口部１１の内径より小さい形状とすることが好ましい。これによって、スリーブ２の挿入性と気密性を容易に保持できることと、セルフアライメント性に優れたマイクロプローブとすることができる。
【００２２】
さらに、ソケット７の材料は樹脂とすることが生産性、均質性の観点から好ましい。また、電極ホルダー１のスリーブ２はセラミックであるので、スリーブ２の硬度が十分に高くなっている。このように、スリーブ２の硬度をソケット７の硬度よりも高くすることによって、マイクロプローブ及びソケット７を取り替える際の安定した装着性を実現するとともに、連続して使用するスリーブ２の寸法形状を高精度に維持することができ、スリーブ２を消耗することなく高い気密性を維持することができる。
【００２３】
このように、ソケット７の第二の開口部９ａの内径をスリーブ２の先端の外径より少し小さくしておくことによって、スリーブ２の先端をソケット７の第二の開口部９側から挿入すると、スリーブ２は第二の開口部９ａを押し広げながらマイクロピペット１０の内部に進入していく。このとき、スリーブ２の一部の外壁面がソケット７の第二の開口部９ａの内壁面に密着することによって外部との気密は保たれる。同時に、ソケット７の第二の開口部９ａをマイクロピペットの開口部１１の内径より小さい形状としておくことによって、電極４はマイクロピペット１０の内部の領域に確実に挿入、到達させることができ、容易にマイクロピペット１０の内部に充填された測定のための溶液内へ電気的接続ができるようになる。
【００２４】
このように、本発明の電極ホルダー１はマイクロピペット１０を装着したソケット７へ挿入するだけで良いことから、マイクロピペット１０を従来のねじ込み式電極ホルダーにセットする手間が省けることができる。さらに、電極ホルダー１にネジ機構などを必要としないことから、コンパクトな構造を実現でき、マイクロピペット１０の高密度配置が可能となる。
【００２５】
なお、スリーブ２の材料はセラミックの他に、ガラス、金属などを用いることができる。ただし、金属の場合はスリーブ２の内部の溶液と電気的導通を起こすことから、表面に絶縁処理などを施しておくことが必要となり、外部からのノイズの進入、外部への電気リークには注意が必要である。
【００２６】
さらに、ソケット７の材料は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、環状ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデン等の適度に柔軟性を持つ樹脂を用いることが好ましい。
【００２７】
また、マイクロピペット１０は従来の細胞電気生理測定方法であるパッチクランプ法において用いるガラス製マイクロピペットと製法、形状においてほぼ同様であり、詳細な説明は省略する。
【００２８】
なお、ガラス以外にも樹脂などのマイクロピペットなども使用目的によっては用いることができる。
【００２９】
また、ソケット７の第二の開口部９は図４及び図５に示すようにテーパ形状をしていることが好ましい。これによって、スリーブ２がより確実にマイクロピペット１０の内部へ進入できるようになっている。
【００３０】
そして、スリーブ２の外壁面とソケット７の第二の開口部９の内壁面は平滑な面としておくことが好ましい。これによって、マイクロピペット１０への進入が容易となり、第二の開口部９を押し広げて進入する際にソケット７との密着性・気密性をより確実にすることができる。
【００３１】
次に、本実施の形態１におけるマイクロプローブを用いて、電気的測定を行う測定システムについて図面を参照しながら説明する。この電気的測定システムは、例えば細胞の電気生理現象を測定する方法に用いることができる。
【００３２】
ここで、図８〜図１０は本実施の形態１におけるマイクロプローブを用いて細胞の電気生理現象を測定する測定方法を説明するための断面図である。
【００３３】
まず、図５に示したようにマイクロピペット１０とソケット７を接続し、その後図８に示したようにマイクロピペット１０の内部に細胞の電気生理現象を測定するために用いる溶液の一種である細胞内液１２を投入する。ここで、細胞内液１２とは図１０に示した被検体細胞１４の内部を満たす溶液とほぼ同じ成分に調整された溶液であり、例えば哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ+イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ+イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞の種類によって成分は変更されることがある。
【００３４】
なお、ここで、ソケット７の第二の開口部９ａの内径がマイクロピペット１０の内径より小さいため、容易にマイクロピペット１０の内部に細胞内液１２を投入するためのディスペンサなどを挿入することが簡単になるという利点も有している。
【００３５】
次に、図９に示したようにソケット７の第二の開口部９側に電極ホルダー１を挿入する。このときスリーブ２の先端はソケット７の第二の開口部９ａを押し広げながら密着していくことから、電極ホルダー１の内部領域は気密性を保持した状態で電極４をマイクロピペット１０の中に配置させることができ、圧力接続ポート５から吸引を確実に行うことができるようになる。
【００３６】
なお、スリーブ２の先端をソケット７に挿入する際には、圧力接続ポート５は大気解放しておくことが好ましい。これによって、スリーブ２の挿入によってマイクロピペット１０の内部が不要に圧力上昇することを防止することができる。
【００３７】
その後、図１０に示したように細胞外液１３側に存在する被検体細胞１４に対してマイクロピペット１０の先端を細胞外液１３の内部に浸すことで、電極４と細胞外液１３との間に発生する電位差あるいは電流を測定器によって測定することができるようになる。
【００３８】
ここで、細胞外液１３とはＫ+イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ+イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液であるが、細胞内液１２と同様に、必要に応じて成分調整することができる。
【００３９】
そして、マイクロピペット１０の先端を被検体細胞１４に接触させる、あるいは圧力制御器で吸引するなどの処理を行うことによって被検体細胞１４をマイクロピペット１０の先端に密着性よく接着させることで、この被検体細胞１４の細胞膜を通過する電流などを測定することができる。
【００４０】
なお、本実施の形態１では細胞などの微小な粒子の電気的測定を対象として説明してきたが、この他には、リン脂質から構成される二重層膜構造のカプセルからなるリポソームなどの人工粒子に加えて、リポソームが膜状になった脂質二重膜等の人工細胞膜状個片であっても同様の測定が可能である。これらは、どちらも水溶液中で人工的に作れるものであり、これらの中に特定のタンパク質を結合させることができる。このタンパク質が結合されたリポソームや脂質二重膜をマイクロピペットの先端に密着させることで、タンパク質の電気的性質を測定することができる。例えば、人工脂質二重膜に臭覚、味覚、視覚などの感覚器官を構成するタンパク質（イオンチャネル）を内在させ、これを測定することで、これらタンパク質がどのような刺激により電気的活動を生み出すかを研究している分野にも用いることができる。これは、特定の感覚の高精度センサ（例えば、犬の嗅覚を人工センサ化）などにも応用されることが期待されている。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
以上のように、本発明にかかるマイクロプローブ及びこれを用いた電気的測定システムは、例えば細胞の電気生理現象の効率的な測定を実現できることから、高速で薬理判定を行う、薬品スクリーニング等の測定システムなどに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の実施の形態１におけるマイクロプローブの断面図
【図２】同要部拡大断面図
【図３】同電極ホルダーの断面図
【図４】同マイクロピペットとソケットの断面図
【図５】同断面図
【図６】同接続の構成を説明するための断面図
【図７】同要部拡大断面図
【図８】同測定方法を説明するための断面図
【図９】同断面図
【図１０】同断面図
【図１１】従来のマイクロプローブの断面図
【符号の説明】
【００４３】
１  電極ホルダー
２  スリーブ
３  接続部材
４  電極
５  圧力接続ポート
６  電極引き出し口
７  ソケット
８  第一の開口部
９  第二の開口部
１０  マイクロピペット
１１  マイクロピペットの開口部
１２  細胞内液
１３  細胞外液
１４  被験体細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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