(57)【要約】  高IgM症候群、欠陥のあるCD40シグナル伝達によって特徴付けられる一群の障害の処置を可能にするゲノム編集システム及び関連した方法が本明細書で開示される。本明細書に記載される組成物及び方法は、適切なCD40シグナル伝達及びB細胞クラススイッチ組換えを回復するために、CD40Lエクソンを含むドナー鋳型の使用に依存する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'から3'にかけてA1-N-UTR-pA-A2を含む単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型であって、
A1は、標的CD40L核酸の第1の相同腕と実質的に同一である相同腕であり;
Nは、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴであり;
UTRは、CD40Lの3'非翻訳領域(UTR)であり;
pAは、ポリAテールであり;
A2は、前記標的CD40L核酸の第2の相同腕と実質的に同一である相同腕である、
単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型。
【請求項２】
5'から3'にかけてA1-S1-N-UTR-pA-S2-A2を含み、
S1は第1のスタッファーであり、S2は第2のスタッファーである、
請求項1に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型。
【請求項３】
5'から3'にかけてA1-S1-N-UTR-pA-R-S2-A2を含み、Rはレポーターである、請求項2に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型。
【請求項４】
5'から3'にかけてA1-N-UTR-pA-R-A2を含み、Rはレポーターである、請求項1に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型。
【請求項５】
前記カーゴが、前記CD40L遺伝子のエクソン2;前記CD40L遺伝子のエクソン3;前記CD40L遺伝子のエクソン4;前記CD40L遺伝子のエクソン5;前記CD40L遺伝子のエクソン2〜5;前記CD40L遺伝子のエクソン2〜4;前記CD40L遺伝子のエクソン2及び3;前記CD40L遺伝子のエクソン3〜5;前記CD40L遺伝子のエクソン3及び4;又は
前記CD40L遺伝子のエクソン4及び5
を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型。
【請求項６】
前記CD40L遺伝子が野生型CD40L配列である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型。
【請求項７】
前記標的CD40L核酸が突然変異を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型。
【請求項８】
前記レポーターが緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFB)、DS-Red又はルシフェラーゼである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型。
【請求項９】
一本鎖オリゴヌクレオチドドナー鋳型又は二本鎖オリゴヌクレオチドドナー鋳型である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型、及び任意選択で、薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１１】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型を含むベクター。
【請求項１２】
前記ベクターがAAVベクター、レンチウイルス、裸のDNAベクター又は脂質ナノ粒子である、請求項11に記載のベクター。
【請求項１３】
配列番号18〜25のいずれか1つを含む、単離されたgRNA分子。
【請求項１４】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型を含むゲノム編集システム。
【請求項１５】
RNA誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのgRNA分子をさらに含む、請求項14に記載のゲノム編集システム。
【請求項１６】
請求項13に記載の単離されたgRNA分子をさらに含む、請求項14に記載のゲノム編集システム。
【請求項１７】
細胞を変更する方法であって、前記細胞を請求項14〜16のいずれか一項に記載のゲノム編集システムと接触させ、それによって前記細胞を変更することを含む方法。
【請求項１８】
請求項14〜16のいずれか一項に記載のゲノム編集システムを含むキット。
【請求項１９】
医療で使用するための、請求項1〜9のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型、請求項10に記載の組成物、請求項11〜12のいずれか一項に記載のベクター、請求項13に記載の単離されたgRNA分子、請求項14〜16のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム、請求項17に記載の方法又は請求項18に記載のキット。
【請求項２０】
細胞を変更する方法であって、
前記細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、前記標的CD40L核酸が前記切断部位の5'に第1の相同腕及び前記切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、
外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって前記標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含む、ステップと
を含み、
それによって前記細胞を変更する方法。
【請求項２１】
前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である前記第1のドナー相同腕、第1のスタッファー、前記CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含む前記カーゴ、前記3' CD40L非翻訳領域(UTR)、前記ポリAテール、第2のスタッファー、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である前記第2のドナー相同腕を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である前記第1のドナー相同腕、前記第1のスタッファー、前記CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含む前記カーゴ、前記3' CD40L非翻訳領域(UTR)、前記ポリAテール、レポーター、前記第2のスタッファー、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である前記第2のドナー相同腕を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である前記第1のドナー相同腕、前記CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含む前記カーゴ、前記3' CD40L非翻訳領域(UTR)、前記ポリAテール、レポーター、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である前記第2のドナー相同腕を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
前記カーゴが、前記CD40L遺伝子のエクソン2;前記CD40L遺伝子のエクソン3;前記CD40L遺伝子のエクソン4;前記CD40L遺伝子のエクソン5;前記CD40L遺伝子のエクソン2〜5;前記CD40L遺伝子のエクソン2〜4;前記CD40L遺伝子のエクソン2及び3;前記CD40L遺伝子のエクソン3〜5;前記CD40L遺伝子のエクソン3及び4;又は前記CD40L遺伝子のエクソン4及び5を含む、請求項20〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記CD40L遺伝子が野生型CD40L配列である、請求項20〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的CD40L核酸が突然変異を含む、請求項20〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記レポーターが緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFB)、DS-Red又はルシフェラーゼである、請求項22又は23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも1つの前記一本鎖又は二本鎖切断を形成する前記ステップが、前記細胞をRNA誘導型ヌクレアーゼと接触させることを含む、請求項20〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記RNA誘導型ヌクレアーゼがクラス2のクラスター化規則的散在性反復配列(CRISPR)関連のヌクレアーゼである、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記RNA誘導型ヌクレアーゼが、野生型Cas9、Cas9ニッカーゼ、野生型Cpf1及びCpf1ニッカーゼからなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記RNA誘導型ヌクレアーゼを前記細胞と接触させることが、前記RNA誘導型ヌクレアーゼ及びガイドRNA(gRNA)を含むリボ核タンパク質(RNP)複合体を前記細胞に導入することを含む、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって前記標的CD40L核酸中へと組み換える前記ステップが、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を前記細胞に導入することを含む、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
導入する前記ステップが、前記RNP複合体及び/又は前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の存在下における前記細胞の電気穿孔法を含む、請求項31又は請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
細胞の中の、前記切断部位の5'に第1の相同腕及び前記切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更する方法であって、
前記細胞を、
(a)少なくとも1つのgRNA分子、
(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び
(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型
と接触させるステップであって、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、
前記gRNA分子及び前記RNA誘導型ヌクレアーゼ分子が前記標的CD40L核酸と相互作用し、前記切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、前記切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成するステップを含み、
それによって、前記細胞の中の前記標的CD40L核酸を変更する方法。
【請求項３５】
前記細胞を、
(d)第2のgRNA分子と接触させるステップであって、前記第2のgRNA分子及び前記RNA誘導型ヌクレアーゼ分子が前記標的核酸と相互作用し、前記切断部位又はその近くで第2の切断事象をもたらし、前記第2の切断事象が少なくとも1つの前記DNA修復経路によって修復される、ステップをさらに含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である前記第1のドナー相同腕、第1のスタッファー、前記CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含む前記カーゴ、前記3' CD40L非翻訳領域(UTR)、前記ポリAテール、第2のスタッファー、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である前記第2のドナー相同腕を含む、請求項34又は請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である前記第1のドナー相同腕、前記第1のスタッファー、前記CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含む前記カーゴ、前記3' CD40L非翻訳領域(UTR)、前記ポリAテール、レポーター、前記第2のスタッファー、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である前記第2のドナー相同腕を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である前記第1のドナー相同腕、前記CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含む前記カーゴ、前記3' CD40L非翻訳領域(UTR)、前記ポリAテール、レポーター、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である前記第2のドナー相同腕を含む、請求項34又は請求項35に記載の方法。
【請求項３９】
前記カーゴが、
前記CD40L遺伝子のエクソン2;
前記CD40L遺伝子のエクソン3;
前記CD40L遺伝子のエクソン4;
前記CD40L遺伝子のエクソン5;
前記CD40L遺伝子のエクソン2〜5;
前記CD40L遺伝子のエクソン2〜4;
前記CD40L遺伝子のエクソン2及び3;
前記CD40L遺伝子のエクソン3〜5;
前記CD40L遺伝子のエクソン3及び4;又は
前記CD40L遺伝子のエクソン4及び5
を含む、請求項34〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記CD40L遺伝子が野生型CD40L配列である、請求項34〜39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的CD40L核酸が突然変異を含む、請求項34〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記レポーターが緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFB)、DS-Red又はルシフェラーゼである、請求項37又は38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
変更された前記CD40L核酸が、5'から3'にかけて、前記第1のドナー相同腕、前記カーゴ、前記3' UTR、前記ポリAテール及び前記第2のドナー相同腕を含む、請求項20〜42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
変更された前記CD40L核酸が、5'から3'にかけて、前記第1のドナー相同腕、前記第1のスタッファー、前記カーゴ、前記3' UTR、前記ポリAテール、前記第2のスタッファー、及び前記第2のドナー相同腕を含む、請求項20〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
変更された前記CD40L核酸が、5'から3'にかけて、前記第1のドナー相同腕、前記第1のスタッファー、前記カーゴ、前記3' UTR、前記ポリAテール、前記レポーター、前記第2のスタッファー、及び前記第2のドナー相同腕を含む、請求項20〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
変更された前記CD40L核酸が、5'から3'にかけて、前記第1のドナー相同腕、前記カーゴ、前記3' UTR、前記ポリAテール、前記レポーター、及び前記第2のドナー相同腕を含む、請求項20、34、35又は38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞を少なくとも1つの前記gRNA分子及び前記RNA誘導型ヌクレアーゼ分子と先ず接触させ、続いて前記細胞を前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と接触させる、請求項34〜46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞を少なくとも1つの前記gRNA分子、前記RNA誘導型ヌクレアーゼ分子及び前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と同時に接触させる、請求項34〜46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型がベクターに存在する、請求項34〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記ウイルスベクターがAAVベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記DNA修復経路が前記標的CD40L核酸を修復し、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす、請求項34〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記切断事象、又は前記切断事象と前記第2の切断事象の両方が遺伝子修正によって修復される、請求項34〜52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
変更された前記CD40L核酸が、前記標的CD40L核酸の配列と異なる配列を含む、請求項34〜53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記gRNA分子がgRNA核酸であり、前記RNA誘導型ヌクレアーゼ分子がRNA誘導型ヌクレアーゼタンパク質である、請求項34〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記gRNA分子がgRNA核酸であり、前記RNA誘導型ヌクレアーゼ分子がRNA誘導型ヌクレアーゼ核酸である、請求項34〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞を、前もって形成された複合体としての前記gRNA分子及び前記RNA誘導型ヌクレアーゼ分子と接触させる、請求項34〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記RNA誘導型ヌクレアーゼが、野生型Cas9、Cas9ニッカーゼ、野生型Cpf1及びCpf1ニッカーゼからなる群から選択される、請求項34〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞が真核細胞である、請求項20〜58のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記真核細胞がヒト細胞である、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞がT細胞である、請求項20〜60のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞が造血幹細胞(HSC)である、請求項20〜60のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞が高IgM症候群罹患対象に由来する、請求項20〜62のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞が前記切断部位に少なくとも1つの突然変異を有する対象に由来する、請求項20〜63のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記形成ステップ又は前記接触ステップの前に前記対象から前記細胞を単離するステップをさらに含む、請求項63又は64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記組換えステップの後に、又は前記切断事象が少なくとも1つの前記DNA修復経路によって修復された後に、前記細胞を対象に導入することをさらに含む、請求項20〜65のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記形成ステップ及び前記組換えステップ、又は前記接触ステップがin vitroで実行される、請求項20〜66のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記形成ステップ及び前記組換えステップ、又は前記接触ステップがex vivoで実行される、請求項20〜66のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記形成ステップ及び前記組換えステップ、又は前記接触ステップがin vivoで実行される、請求項20〜66のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象が前記細胞の導入の前に調整される、請求項66に記載の方法。
【請求項７１】
前記対象がシクロホスファミドで調整される、請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
前記対象が前記細胞の導入の前に調整されない、請求項66に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象においてクラススイッチングが回復される、請求項66に記載の方法。
【請求項７４】
対象においてIgMのレベルが低下する、請求項66に記載の方法。
【請求項７５】
対象においてIgGのレベルが増加する、請求項66に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞が細胞集団であり、前記DNA修復経路が前記標的CD40L核酸を修復し、前記細胞集団の細胞の少なくとも約10%において前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす、請求項20〜75のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
請求項20〜76のいずれか一項に記載の方法によって変更された細胞又は細胞集団。
【請求項７８】
前記細胞が造血幹細胞(HSC)であり、前記HSCの集団の細胞の少なくとも約10%が、機能的CD40L対立遺伝子である変更されたCD40L核酸を含む、請求項77に記載の細胞集団。
【請求項７９】
請求項77又は請求項78の細胞又は細胞集団を含む医薬組成物。
【請求項８０】
細胞の中の標的CD40Lを変更することによって高IgM症候群を有する対象を処置する方法であって、
前記細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、前記標的CD40L核酸が前記切断部位の5'に第1の相同腕及び前記切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、
外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって前記標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含む、ステップと
を含み、
それによって、高IgM症候群を有する前記対象を処置する方法。
【請求項８１】
細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更することによって、高IgM症候群を有する対象を処置する方法であって、
前記細胞を、
(a)少なくとも1つのgRNA分子、
(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び
(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型
と接触させるステップであって、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、
前記gRNA分子及び前記RNA誘導型ヌクレアーゼ分子が前記標的CD40L核酸と相互作用し、前記切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、前記切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成するステップを含み、
それによって、高IgM症候群を有する前記対象を処置する方法。
【請求項８２】
細胞の中の標的CD40Lを変更することによって対象においてB細胞クラススイッチングを回復する方法であって、
前記細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、前記標的CD40L核酸が前記切断部位の5'に第1の相同腕及び前記切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、
外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって前記標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含むステップと
を含み、
それによって、前記対象においてB細胞クラススイッチングを回復する方法。
【請求項８３】
細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更することによって、対象においてB細胞クラススイッチングを回復する方法であって、
前記細胞を、
(a)少なくとも1つのgRNA分子、
(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び
(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型
と接触させるステップであって、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、
前記gRNA分子及び前記RNA誘導型ヌクレアーゼ分子が前記標的CD40L核酸と相互作用し、前記切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、前記切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成するステップを含み、
それによって、前記対象においてB細胞クラススイッチングを回復する方法。
【請求項８４】
細胞の中の標的CD40Lを変更することによって対象においてIgMのレベルを低下させる方法であって、
前記細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、前記標的CD40L核酸が前記切断部位の5'に第1の相同腕及び前記切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、
外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって前記標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含むステップと
を含み、
それによって、前記対象においてIgMのレベルを低下させる方法。
【請求項８５】
細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更することによって、対象においてIgMのレベルを低下させる方法であって、
前記細胞を、
(a)少なくとも1つのgRNA分子、
(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び
(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型
と接触させるステップであって、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、
前記gRNA分子及び前記RNA誘導型ヌクレアーゼ分子が前記標的CD40L核酸と相互作用し、前記切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、前記切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成するステップを含み、
それによって、前記対象においてIgMのレベルを低下させる方法。
【請求項８６】
細胞の中の標的CD40Lを変更することによって対象においてIgGのレベルを増加させる方法であって、
前記細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、前記標的CD40L核酸が前記切断部位の5'に第1の相同腕及び前記切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、
外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって前記標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含むステップと
を含み、
それによって、前記対象においてIgGのレベルを増加させる方法。
【請求項８７】
細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更することによって、対象においてIgGのレベルを増加させる方法であって、
前記細胞を、
(a)少なくとも1つのgRNA分子、
(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び
(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型
と接触させるステップであって、前記外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、前記第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び前記第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、
前記gRNA分子及び前記RNA誘導型ヌクレアーゼ分子が前記標的CD40L核酸と相互作用し、前記切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、前記切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成するステップを含み、
それによって、前記対象においてIgGのレベルを増加させる方法。
【請求項８８】
その集団の細胞の少なくとも30%が工学操作CD40L配列の少なくとも1つのコピーを含むことを特徴とする細胞集団。
【請求項８９】
少なくとも1つの前記コピーが内因性CD40L遺伝子のイントロンに挿入される、請求項88に記載の細胞集団。
【請求項９０】
前記細胞集団又は前記細胞集団の後代が、高IgM症候群罹患対象においてクラススイッチングを回復することが可能である、請求項88に記載の細胞集団。
【請求項９１】
単離された細胞集団であって、前記細胞集団の細胞の少なくとも約5%から約100%が機能的CD40L対立遺伝子を発現し、前記細胞集団が、高IgM症候群を有すると以前に診断された対象から単離された、単離された細胞集団。
【請求項９２】
(a)少なくとも1つのgRNA分子、
(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び
(c)オリゴヌクレオチドドナー鋳型
を含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2017年10月24日に出願の米国特許仮出願第62/576,277号、2018年4月30日に出願の米国特許仮出願第62/664,800号、2018年5月17日に出願の米国特許仮出願第62/673,039号、2018年6月26日に出願の米国特許仮出願第62/690,284号及び2018年10月17日に出願の米国特許仮出願第62/746,900号への優先権を主張し、その各々の全内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、高IgM症候群を処置するためのCRISPR/Cas関連の方法及び成分、CD40L標的核酸配列を編集し、CD40L標的核酸配列の発現をモジュレートする方法、並びにその適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
CRISPR(クラスター化規則的散在性の短いパリンドローム反復配列)は、ウイルスの攻撃から防御する適応免疫系として細菌及び古細菌において進化した。ウイルスへの曝露の後、ウイルスDNAの短いセグメントがCRISPR遺伝子座に組み込まれる。ウイルスの配列を含むCRISPR遺伝子座の部分から、RNAが転写される。ウイルスゲノムに相補的である配列を含有するそのRNAは、ウイルスゲノムの中の標的配列へのCas9タンパク質の標的化を媒介する。Cas9タンパク質は、次に、ウイルス標的を切断し、それによってウイルス標的をサイレンシングする。
【０００４】
最近、CRISPR/Casシステムは、真核細胞におけるゲノム編集のために応用された。部位特異的二本鎖切断(DSB)の導入は、内因性DNA修復機構、例えば非相同末端連結(NHEJ)又は相同性誘導修復(HDR)を通して、標的配列の変更を可能にする。
【０００５】
高IgM症候群(HIGM)は、感染症への感受性をもたらす、正常な又は上昇した血清IgMレベル、及び他の血清免疫グロブリンのレベルの低下又は不在によって特徴付けられる免疫グロブリン欠損である。ほとんどのHIGMの症例はX連鎖であり、活性化ヘルパーT細胞の表面でタンパク質(CD40リガンド、「CD40L」)をコードするX染色体の上の遺伝子における突然変異によって引き起こされる。高IgM症候群を有する対象におけるCD40L遺伝子(「CD40LG」)における突然変異には、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、スプライス部位突然変異、欠失及び挿入が含まれ、当業者に周知である。例えば、Seyama et al.,(1998) Blood, 92(7):2421-2434を参照する。サイトカインの存在下で、正常なCD40リガンドはB細胞と相互作用し、こうして、IgMの生成からIgA、IgG及び/又はIgEの生成に切り換えるようにそれらにシグナルを伝達する。X連鎖高IgM症候群では、T細胞は機能的CD40リガンドを欠いており、B細胞に対して切り換えるようにシグナルを伝達することができない。したがって、HIGM対象のB細胞はIgMだけを生成し、IgMレベルは正常であるか又は上昇することがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
HIGM症候群の処置には、免疫グロブリン補充療法、長期の抗生物質及び抗真菌予防法、並びに好中球減少のためのG-CSF処置が通常含まれる。HLA一致兄弟ドナーが利用可能である場合、造血幹細胞移植も好ましい。しかし、HIGM患者の約80%が30才前に死亡するので、現在の処置は効果的でない。したがって、HIGMを処置する新規治療戦略及び製品の開発への継続した、満たされていない必要性がまだある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
遺伝子修正自家T細胞に基づく養子免疫療法アプローチは、レシピエントHIGM1患者における防御免疫の発生、及びおそらく一部の長期生存記憶B細胞の産生も誘導するのに十分であるかもしれない。しかし、広範な病原体に応答して効率的なT細胞支援を媒介することができる、長期持続性の、広いT細胞レパートリーを再構成するために、編集されたT細胞の複数回の投与が要求されるかもしれない。さらに、CD40LGはCD4 T細胞(Th0、Th1及びTh2)で重要な機能を有するが、この分子はいくつかの他の造血細胞型、例えば活性化B細胞、血小板、NK細胞、単球、好塩基球及び好酸球でも発現される。したがって、本開示は、驚くべきことにT細胞の修正から自家造血幹/前駆体細胞(HSPC)の修正に遺伝子編集戦略を拡張し、それはかなりより広く長期間にわたる治療的恩恵を提供する。
【０００８】
本開示は、CD40リガンド(CD40L)編集細胞が驚くべきことに機能的活性CD40Lタンパク質を生成し、高IgM症候群の処置のためにB細胞クラススイッチングの機能を回復するために使用することができることの発見に少なくとも一部基づく。特に、ゲノム編集システムを使用して、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上が細胞、例えば、T細胞又は造血幹細胞(HSC)において編集される場合、編集された細胞は、高レベルのCD40L遺伝子編集及び高レベルの機能的外因性CD40Lの発現を実証する。具体的には、CD40L編集T細胞は、生成されるIgGのレベルを増加させつつIgMのレベルを低下させることによって、B細胞クラススイッチング能力を回復した。さらに、少なくとも10%のCD40L編集細胞を含む造血幹細胞を受けたマウスは、ワクチン接種の後により高いレベルのIgGを生成し、高IgM症候群の処置で使用するためのCD40L編集造血幹細胞の治療的恩恵を実証した。
【０００９】
本明細書に開示されるゲノム編集システムは、CD40L遺伝子のエクソン1が編集されず、ランダムな組込み事象又は標的外事象の可能性を回避するように設計される。具体的には、エクソン1の編集は、遺伝子座のプロモーター制御の喪失につながることがあり、CD40L遺伝子の発現に影響を及ぼし、特に造血幹細胞移植との関連で、リンパ増殖性障害につながる。
【００１０】
したがって一態様では、5'から3'にかけてA1-N-UTR-pA-A2を含む単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型が本明細書で開示され、ここで、A1は、標的CD40L核酸の第1の相同腕と実質的に同一である相同腕であり;Nは、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴであり;UTRは、CD40Lの3'非翻訳領域(UTR)であり;pAは、ポリAテールであり;A2は、標的CD40L核酸の第2の相同腕と実質的に同一である相同腕である。
【００１１】
一態様では、5'から3'にかけてA1-S1-N-UTR-pA-S2-A2を含む単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型が本明細書で開示され、ここで、A1は、標的CD40L核酸の第1の相同腕と実質的に同一である相同腕であり;S1は第1のスタッファーであり、Nは、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴであり;UTRは、CD40Lの3'非翻訳領域(UTR)であり;pAは、ポリAテールであり;S2は第2のスタッファーであり、A2は、標的CD40L核酸の第2の相同腕と実質的に同一である相同腕である。
【００１２】
一態様では、5'から3'にかけてA1-S1-N-UTR-pA-R-S2-A2を含む単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型が本明細書で開示され、ここで、A1は、標的CD40L核酸の第1の相同腕と実質的に同一である相同腕であり;S1は第1のスタッファーであり、Nは、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴであり;UTRは、CD40Lの3'非翻訳領域(UTR)であり;pAは、ポリAテールであり;Rはレポーターであり;S2は第2のスタッファーであり、A2は、標的CD40L核酸の第2の相同腕と実質的に同一である相同腕である。
【００１３】
一態様では、5'から3'にかけてA1-N-UTR-pA-R-A2を含む単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型が本明細書で開示され、ここで、A1は、標的CD40L核酸の第1の相同腕と実質的に同一である相同腕であり;Nは、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴであり;UTRは、CD40Lの3'非翻訳領域(UTR)であり;pAは、ポリAテールであり;Rはレポーターであり;A2は、標的CD40L核酸の第2の相同腕と実質的に同一である相同腕である。
【００１４】
本明細書に記載されるいずれの態様でも、カーゴはCD40L遺伝子のエクソン2;CD40L遺伝子のエクソン3;CD40L遺伝子のエクソン4;CD40L遺伝子のエクソン5;CD40L遺伝子のエクソン2〜5;CD40L遺伝子のエクソン2〜4;CD40L遺伝子のエクソン2及び3;CD40L遺伝子のエクソン3〜5;CD40L遺伝子のエクソン3及び4;又はCD40L遺伝子のエクソン4及び5を含み得る。一実施形態では、カーゴは、コドン最適化CD40L配列を含む。例えば、カーゴは、CD40Lエクソン2、CD40Lエクソン3、CD40Lエクソン4、CD40Lエクソン5又はその組合せのコドン最適化バージョン、例えば、コドン最適化エクソン2〜5配列、コドン最適化エクソン2〜4配列;コドン最適化エクソン2及び3配列;コドン最適化エクソン3〜5配列;コドン最適化エクソン3及び4配列;又はコドン最適化エクソン4及び5配列を含み得る。CD40Lのエクソン2〜5の例示的なコドン最適化バージョンは、配列番号48で提供される。
【００１５】
一実施形態では、CD40L遺伝子は、野生型CD40L配列である。一実施形態では、標的CD40L核酸は、突然変異を含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドドナー鋳型は、レポーターをコードする配列をさらに含む。一実施形態では、レポーターは、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFB)、DS-Red又はルシフェラーゼである。一実施形態では、レポーターは、当技術分野で標準の方法を使用して生細胞において検出することができるマーカー、例えば、抗体によって検出可能な表面抗原、光学的に検出可能な生成物を生成する化学反応を触媒するかさもなければ促進するペプチド、例えばルシフェラーゼであってよい。一実施形態では、レポーターは選択マーカーである。例示的な実施形態では、選択マーカーは、低親和性の神経成長因子受容体(NGFR)である。他の実施形態では、選択マーカーは、薬剤耐性タンパク質(例えば、ネオマイシン又はピューロマイシン耐性、MGMT遺伝子の突然変異体バージョン)、細胞表面タンパク質(例えばCD19、EGFR)のトランケーションバージョン、編集された細胞のin vivo移植の後に選択的成長及び/又は生着利点を付与する遺伝子(例えばCXCR4、CD47、IL2受容体)、又は、蛍光性レポータータンパク質(例えば、緑色蛍光性タンパク質(GFP)、青色蛍光性タンパク質(BFP)、黄色蛍光性タンパク質(YFP)等、又はその組合せであってよい。一実施形態では、単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型は、一本鎖オリゴヌクレオチドドナー鋳型である。一実施形態では、単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型は、二本鎖オリゴヌクレオチドドナー鋳型である。
【００１６】
一態様では、単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型及び、任意選択で、薬学的に許容される担体を含む組成物が本明細書で開示される。
【００１７】
一態様では、単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型を含むベクターが本明細書で開示される。一実施形態では、ベクターは、AAVベクター、レンチウイルス、裸のDNAベクター又は脂質ナノ粒子である。一実施形態では、AAVベクターは、AAV6ベクターである。
【００１８】
一態様では、配列番号18〜25のいずれか1つを含む単離されたgRNA分子が、本明細書で開示される。一実施形態では、単離されたgRNA分子は、配列番号18を含む。一実施形態では、単離されたgRNA分子は、配列番号19を含む。一実施形態では、単離されたgRNA分子は、配列番号20を含む。一実施形態では、単離されたgRNA分子は、配列番号21を含む。一実施形態では、単離されたgRNA分子は、配列番号22を含む。一実施形態では、単離されたgRNA分子は、配列番号23を含む。一実施形態では、単離されたgRNA分子は、配列番号24を含む。一実施形態では、単離されたgRNA分子は、配列番号25を含む。
【００１９】
一態様では、単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型を含むゲノム編集システムが、本明細書で開示される。一実施形態では、ゲノム編集システムは、RNA誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも1つのgRNA分子をさらに含む。一実施形態では、ゲノム編集システムは、本明細書で開示される単離されたgRNA分子をさらに含む。
【００２０】
一態様では、細胞を本明細書で開示されるゲノム編集システムと接触させ、それによって細胞を変更することを含む、細胞を変更する方法が本明細書で開示される。
【００２１】
一態様では、ゲノム編集システムを含むキットが、本明細書で開示される。
【００２２】
一態様では、医薬品で使用するための、単離されたオリゴヌクレオチドドナー鋳型、組成物、ベクター、単離されたgRNA分子、遺伝子編集システム、方法又はキットが本明細書で開示される。
【００２３】
一態様では、細胞を変更する方法であって、細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、標的CD40L核酸が切断部位の5'に第1の相同腕及び切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含むステップとを含み、それによって細胞を変更する方法が本明細書で開示される。
【００２４】
一態様では、細胞を変更する方法であって、細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、標的CD40L核酸が切断部位の5'に第1の相同腕及び切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、第1のスタッファー、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、第2のスタッファー、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含むステップとを含み、それによって細胞を変更する方法が本明細書で開示される。
【００２５】
一態様では、細胞を変更する方法であって、細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、標的CD40L核酸が切断部位の5'に第1の相同腕及び切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、第1のスタッファー、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、レポーター、第2のスタッファー、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含むステップとを含み、それによって細胞を変更する方法が本明細書で開示される。
【００２６】
一態様では、細胞を変更する方法であって、細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、標的CD40L核酸が切断部位の5'に第1の相同腕及び切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、レポーター、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含むステップとを含み、それによって細胞を変更する方法が本明細書で開示される。
【００２７】
一実施形態では、カーゴは、以下の全部又は一部を含む:CD40L遺伝子のエクソン2;CD40L遺伝子のエクソン3;CD40L遺伝子のエクソン4;CD40L遺伝子のエクソン5;CD40L遺伝子のエクソン2〜5;CD40L遺伝子のエクソン2〜4;CD40L遺伝子のエクソン2及び3;CD40L遺伝子のエクソン3〜5;CD40L遺伝子のエクソン3及び4;又はCD40L遺伝子のエクソン4及び5。
【００２８】
一実施形態では、CD40L遺伝子は、野生型CD40L配列である。一実施形態では、標的CD40L核酸は、突然変異を含む。
【００２９】
一実施形態では、レポーターは、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFB)、DS-Red又はルシフェラーゼである。一実施形態では、レポーターは、当技術分野で標準の方法を使用して生細胞において検出することができるマーカー、例えば、抗体によって検出可能な表面抗原、光学的に検出可能な生成物を生成する化学反応を触媒するかさもなければ促進するペプチド、例えばルシフェラーゼであってよい。別の実施形態では、レポーターは選択マーカーである。例示的な実施形態では、レポーターはNGFRである。
【００３０】
一実施形態では、少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップは、細胞をRNA誘導型ヌクレアーゼと接触させることを含む。一実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼは、クラス2のクラスター化規則的散在性反復配列(CRISPR)関連のヌクレアーゼである。一実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼは、野生型Cas9、Cas9ニッカーゼ、野生型Cpf1及びCpf1ニッカーゼからなる群から選択される。
【００３１】
一実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼを細胞と接触させることは、RNA誘導型ヌクレアーゼ及びガイドRNA(gRNA)を含むリボ核タンパク質(RNP)複合体を細胞に導入することを含む。一実施形態では、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって標的CD40L核酸中へと組み換えるステップは、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を細胞に導入することを含む。一実施形態では、導入するステップは、RNP複合体及び/又は外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の存在下における細胞の電気穿孔法を含む。
【００３２】
一態様では、細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更する方法であって、細胞を、(a)少なくとも1つのgRNA分子、(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と接触させるステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、gRNA分子及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子が標的CD40L核酸と相互作用し、切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成する、ステップを含み、それによって、細胞の中の標的CD40L核酸を変更する方法が本明細書で開示される。
【００３３】
一態様では、細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更する方法であって、細胞を、(a)少なくとも1つのgRNA分子、(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と接触させるステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、第1のスタッファー、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、第2のスタッファー、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、gRNA分子及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子が標的CD40L核酸と相互作用し、切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成する、ステップを含み、それによって、細胞の中の標的CD40L核酸を変更する方法が本明細書で開示される。
【００３４】
一態様では、細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更する方法であって、細胞を、(a)少なくとも1つのgRNA分子、(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と接触させるステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、第1のスタッファー、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、レポーター、第2のスタッファー、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、gRNA分子及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子が標的CD40L核酸と相互作用し、切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成する、ステップを含み、それによって、細胞の中の標的CD40L核酸を変更する方法が本明細書で開示される。
【００３５】
一態様では、細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更する方法であって、細胞を、(a)少なくとも1つのgRNA分子、(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と接触させるステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、レポーター、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、gRNA分子及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子が標的CD40L核酸と相互作用し、切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成する、ステップを含み、それによって、細胞の中の標的CD40L核酸を変更する方法が本明細書で開示される。
【００３６】
一実施形態では、本方法は、細胞を(d)第2のgRNA分子と接触させることをさらに含み、ここで、第2のgRNA分子及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子は標的核酸と相互作用し、切断部位又はその近くで第2の切断事象をもたらし、第2の切断事象は少なくとも1つのDNA修復経路によって修復される。
【００３７】
一実施形態では、カーゴは、以下の全部又は一部を含む:CD40L遺伝子のエクソン2;CD40L遺伝子のエクソン3;CD40L遺伝子のエクソン4;CD40L遺伝子のエクソン5;CD40L遺伝子のエクソン2〜5;CD40L遺伝子のエクソン2〜4;CD40L遺伝子のエクソン2及び3;CD40L遺伝子のエクソン3〜5;CD40L遺伝子のエクソン3及び4;又はCD40L遺伝子のエクソン4及び5。
【００３８】
一実施形態では、CD40L遺伝子は、野生型CD40L配列である。一実施形態では、標的CD40L核酸は、突然変異を含む。
【００３９】
一実施形態では、レポーターは、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFB)、DS-Red又はルシフェラーゼである。一実施形態では、レポーターは、当技術分野で標準の方法を使用して生細胞において検出することができるマーカー、例えば、抗体によって検出可能な表面抗原、光学的に検出可能な生成物を生成する化学反応を触媒するかさもなければ促進するペプチド、例えばルシフェラーゼであってよい。別の実施形態では、レポーターは、選択マーカーである。例示的な実施形態では、レポーターは、NGFRである。
【００４０】
一実施形態では、変更されたCD40L核酸は、5'から3'にかけて、第1のドナー相同腕、カーゴ、3' UTR、ポリAテール及び第2のドナー相同腕を含む。一実施形態では、変更されたCD40L核酸は、5'から3'にかけて、第1のドナー相同腕、第1のスタッファー、カーゴ、3' UTR、ポリAテール、第2のスタッファー、及び第2のドナー相同腕を含む。一実施形態では、変更されたCD40L核酸は、5'から3'にかけて、第1のドナー相同腕、第1のスタッファー、カーゴ、3' UTR、ポリAテール、レポーター、第2のスタッファー、及び第2のドナー相同腕を含む。一実施形態では、変更されたCD40L核酸は、5'から3'にかけて、第1のドナー相同腕、カーゴ、3' UTR、ポリAテール、レポーター、及び第2のドナー相同腕を含む。
【００４１】
一実施形態では、細胞を少なくとも1つのgRNA分子及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子と先ず接触させ、続いて細胞を外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と接触させる。一実施形態では、細胞を、少なくとも1つのgRNA分子、RNA誘導型ヌクレアーゼ分子及び外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と同時に接触させる。
【００４２】
一実施形態では、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型は、一本鎖オリゴヌクレオチドドナー鋳型である。一実施形態では、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型は、二本鎖オリゴヌクレオチドドナー鋳型である。
【００４３】
一実施形態では、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型は、ベクターの中に存在する。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、AAVベクター又はレンチウイルスベクターである。
【００４４】
一実施形態では、DNA修復経路は、標的CD40L核酸を修復して外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす。一実施形態では、切断事象、又は切断事象と第2の切断事象の両方は、遺伝子修正によって修復される。
【００４５】
一実施形態では、変更されたCD40L核酸は、標的CD40L核酸の配列と異なる配列を含む。
【００４６】
一実施形態では、gRNA分子はgRNA核酸であり、RNA誘導型ヌクレアーゼ分子はRNA誘導型ヌクレアーゼタンパク質である。一実施形態では、gRNA分子はgRNA核酸であり、RNA誘導型ヌクレアーゼ分子はRNA誘導型ヌクレアーゼ核酸である。一実施形態では、細胞を、前もって形成された複合体としてのgRNA分子及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子と接触させる。一実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼは、野生型Cas9、Cas9ニッカーゼ、野生型Cpf1及びCpf1ニッカーゼからなる群から選択される。
【００４７】
一実施形態では、細胞は、真核細胞である。一実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、T細胞である。一実施形態では、細胞は、造血幹細胞(HSC)である。
【００４８】
一実施形態では、細胞は、高IgM症候群罹患対象に由来する。一実施形態では、細胞は、切断部位に少なくとも1つの突然変異を有する対象に由来する。一実施形態では、本方法は、形成ステップ又は接触ステップの前に対象から細胞を単離するステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、組換えステップの後に、又は切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復される後に、細胞を対象に導入することをさらに含む。
【００４９】
一実施形態では、形成ステップ及び組換えステップ、又は接触ステップは、in vitroで実行される。一実施形態では、形成ステップ及び組換えステップ、又は接触ステップは、ex vivoで実行される。一実施形態では、形成ステップ及び組換えステップ、又は接触ステップは、in vivoで実行される。
【００５０】
一実施形態では、レシピエント対象は、対象への編集された細胞の投与の前に調整される。調整は、対象のリンパ枯渇を含み得る。例えば、一実施形態では、編集された細胞の受領の前に、対象は、リンパ枯渇を引き起こす化学療法で調整される。一実施形態では、対象のT細胞は、調整によって枯渇させる。対象を調整するのに好適な薬剤には、リンパ枯渇、例えば、T細胞の枯渇を誘導する薬剤が含まれる。一実施形態では、調整剤は、シクロホスファミドである。一部の実施形態では、本方法は、対象に調整剤、例えば、リンパ枯渇を引き起こす調整剤を投与するステップを任意選択で含み得る。一実施形態では、調整剤は、化学療法剤、例えばシクロホスファミド、フルダラビン、ブスルファン、トレオスルファン又はその組合せである。一実施形態では、調整剤は、ポリクローナル若しくはモノクローナル枯渇抗体、例えば、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)、抗CD3、抗CD4、抗CD52、抗CD2、抗TCRαβ、抗IL2Rα又はその組合せである。別の実施形態では、対象は、対象への編集された細胞の投与の前に調整されない。
【００５１】
一実施形態では、細胞は、対象への投与の前に刺激される。一実施形態では、細胞は、サイトカイン、例えば、IL-7、IL-15、IL-2又はその組合せを使用して刺激される。
【００５２】
一実施形態では、対象においてクラススイッチングが回復される。一実施形態では、対象においてIgMのレベルが低下する。一実施形態では、対象においてIgGのレベルが増加する。
【００５３】
一実施形態では、細胞は、細胞集団であり、DNA修復経路は標的CD40L核酸を修復し、細胞集団の細胞の少なくとも約10%において外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす。一実施形態では、細胞は、細胞集団であり、DNA修復経路は、標的CD40L核酸を修復し、細胞集団の細胞の少なくとも約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%又は75%において外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす。一実施形態では、細胞は、細胞集団であり、DNA修復経路は標的CD40L核酸を修復し、細胞集団の細胞の少なくとも約15%において外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす。一実施形態では、細胞は、細胞集団であり、DNA修復経路は標的CD40L核酸を修復し、細胞集団の細胞の少なくとも約20%において外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす。一実施形態では、細胞は、細胞集団であり、DNA修復経路は標的CD40L核酸を修復し、細胞集団の細胞の少なくとも約30%において外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす。一実施形態では、細胞は、細胞集団であり、DNA修復経路は標的CD40L核酸を修復し、細胞集団の細胞の少なくとも約40%において外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす。一実施形態では、細胞は、細胞集団であり、DNA修復経路は標的CD40L核酸を修復し、細胞集団の細胞の少なくとも約50%において外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす。一実施形態では、細胞は、細胞集団であり、DNA修復経路は標的CD40L核酸を修復し、細胞集団の細胞の少なくとも約60%において外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす。一実施形態では、細胞は、細胞集団であり、DNA修復経路は標的CD40L核酸を修復し、細胞集団の細胞の少なくとも約75%において外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型の標的化組込みをもたらす。
【００５４】
一態様では、本明細書で開示される方法によって変更される細胞が、本明細書で開示される。一態様では、本明細書で開示される方法によって変更される細胞集団が、本明細書で開示される。
【００５５】
一実施形態では、細胞は造血幹細胞(HSC)であり、HSCの集団の中の細胞の少なくとも約10%が、機能的CD40L対立遺伝子である変更されたCD40L核酸を含む。一実施形態では、細胞は、T細胞である。
【００５６】
一態様では、細胞又は細胞集団を含む医薬組成物が、本明細書で開示される。
【００５７】
一態様では、細胞の中の標的CD40Lを変更することによって高IgM症候群を有する対象を処置する方法であって、細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、標的CD40L核酸が切断部位の5'に第1の相同腕及び切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含むステップとを含み、それによって、高IgM症候群を有する対象を処置する方法が本明細書で開示される。
【００５８】
一態様では、細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更することによって、高IgM症候群を有する対象を処置する方法であって、細胞を、(a)少なくとも1つのgRNA分子、(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と接触させるステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、gRNA分子及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子が標的CD40L核酸と相互作用し、切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成する、ステップを含み、それによって、高IgM症候群を有する対象を処置する方法が本明細書で開示される。
【００５９】
一態様では、細胞の中の標的CD40Lを変更することによって対象においてB細胞クラススイッチングを回復する方法であって、細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、標的CD40L核酸が切断部位の5'に第1の相同腕及び切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含むステップとを含み、それによって、対象においてB細胞クラススイッチングを回復する方法が本明細書で開示される。
【００６０】
一態様では、細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更することによって、対象においてB細胞クラススイッチングを回復する方法であって、細胞を、(a)少なくとも1つのgRNA分子、(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と接触させるステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、gRNA分子及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子が標的CD40L核酸と相互作用し、切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成する、ステップを含み、それによって、対象においてB細胞クラススイッチングを回復する方法が本明細書で開示される。
【００６１】
一態様では、細胞の中の標的CD40Lを変更することによって対象においてIgMのレベルを低下させる方法であって、細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、標的CD40L核酸が切断部位の5'に第1の相同腕及び切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含むステップとを含み、それによって、対象においてIgMのレベルを低下させる方法が本明細書で開示される。
【００６２】
一態様では、細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更することによって、対象においてIgMのレベルを低下させる方法であって、細胞を、(a)少なくとも1つのgRNA分子、(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と接触させるステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、gRNA分子及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子が標的CD40L核酸と相互作用し、切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成する、ステップを含み、それによって、対象においてIgMのレベルを低下させる方法が本明細書で開示される。
【００６３】
一態様では、細胞の中の標的CD40Lを変更することによって対象においてIgGのレベルを増加させる方法であって、細胞の標的CD40L核酸において切断部位で少なくとも1つの一本鎖又は二本鎖切断を形成するステップであって、標的CD40L核酸が切断部位の5'に第1の相同腕及び切断部位の3'に第2の相同腕を含むステップと、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型を相同組換えによって標的CD40L核酸と組み換えて、変更されたCD40L核酸を生成するステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含むステップとを含み、それによって、対象においてIgGのレベルを増加させる方法が本明細書で開示される。
【００６４】
一態様では、細胞の中の、切断部位の5'に第1の相同腕を、及び切断部位の3'に第2の相同腕を含む標的CD40L核酸を変更することによって、対象においてIgGのレベルを増加させる方法であって、細胞を、(a)少なくとも1つのgRNA分子、(b)RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、及び(c)外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型と接触させるステップであって、外因性オリゴヌクレオチドドナー鋳型が、第1の相同腕と実質的に同一である第1のドナー相同腕、CD40L遺伝子のエクソン2〜5の1つ以上を含むカーゴ、3' CD40L非翻訳領域(UTR)、ポリAテール、及び第2の相同腕と実質的に同一である第2のドナー相同腕を含み、gRNA分子及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子が標的CD40L核酸と相互作用し、切断部位又はその近くで切断事象をもたらし、切断事象が少なくとも1つのDNA修復経路によって修復されて、変更されたCD40L核酸を生成する、ステップを含み、それによって、対象においてIgGのレベルを増加させる方法が本明細書で開示される。
【００６５】
一態様では、その集団の細胞の少なくとも10%が工学操作CD40L配列の少なくとも1つのコピーを含むことを特徴とする細胞集団が、本明細書で開示される。一実施形態では、集団の細胞の少なくとも15%が工学操作CD40L配列の少なくとも1つのコピーを含む。一実施形態では、集団の細胞の少なくとも20%が工学操作CD40L配列の少なくとも1つのコピーを含む。一実施形態では、集団の細胞の少なくとも30%が工学操作CD40L配列の少なくとも1つのコピーを含む。一実施形態では、集団の細胞の少なくとも40%が工学操作CD40L配列の少なくとも1つのコピーを含む。一実施形態では、集団の細胞の少なくとも50%が工学操作CD40L配列の少なくとも1つのコピーを含む。一実施形態では、集団の細胞の少なくとも60%が工学操作CD40L配列の少なくとも1つのコピーを含む。
【００６６】
一実施形態では、少なくとも1つのコピーは、内因性CD40L遺伝子のイントロンに挿入される。一実施形態では、細胞集団又は細胞集団の後代は、高IgM症候群罹患対象においてクラススイッチングを回復することが可能である。
【００６７】
一態様では、その細胞集団の細胞の少なくとも約5%から約100%が機能的CD40L対立遺伝子を発現し、その細胞集団が、高IgM症候群を有すると以前に診断された対象から単離された、単離された細胞集団が本明細書で開示される。一実施形態では、細胞集団の細胞の少なくとも約6%は、機能的CD40L対立遺伝子を発現する。一実施形態では、細胞集団の細胞の少なくとも約7%は、機能的CD40L対立遺伝子を発現する。一実施形態では、細胞集団の細胞の少なくとも約8%は、機能的CD40L対立遺伝子を発現する。一実施形態では、細胞集団の細胞の少なくとも約9%は、機能的CD40L対立遺伝子を発現する。一実施形態では、細胞集団の細胞の少なくとも約10%は、機能的CD40L対立遺伝子を発現する。一実施形態では、細胞集団の細胞の少なくとも約15%は、機能的CD40L対立遺伝子を発現する。一実施形態では、細胞集団の細胞の少なくとも約20%は、機能的CD40L対立遺伝子を発現する。一実施形態では、細胞集団の細胞の少なくとも約25%は、機能的CD40L対立遺伝子を発現する。
【００６８】
添付の図面は、本開示のある特定の態様及び実施形態の、包括的であるよりは例示的及び図式的な例を提供するものである。図面はいかなる特定の理論にもモデルにも限定も束縛もするものではなく、必ずしも基準化するわけではない。上述のものを限定することなく、核酸及びポリペプチドは、線状配列として、又は模式的な二次元若しくは三次元構造として表すことができる;これらの描写は、それらの構造に関していかなる特定のモデルにも理論にも限定も束縛もするものでなく、例示するものである。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１Ａ−Ｄ】遺伝子編集のための例示的なCD40Lドナー鋳型の構成を表す図である。図1Aは、相同腕、CD40L cDNA、GFP及びスタッファー配列を含む構築物を表す。図1Bは、相同腕、CD40L cDNA及びGFPを含むが、スタッファー配列を含まない構築物を表す。図1Cは、相同腕、CD40L cDNA及びスタッファー配列を含むが、GFPを含まない構築物を表す。図1Dは、相同腕及びCD40L cDNAを含むが、GFP及びスタッファー配列を含まない構築物を表す。
【図２Ａ】本明細書に記載されるゲノム編集システムが、高レベルのCD40LG遺伝子編集をもたらしたことを表す図である。具体的には、図2Aは、CD40L遺伝子編集のための例示的な構築物の概略図である。図2Bは、一次ヒトT細胞においてCD40LGの切断効力についてスクリーニングされた、8つのS.ピオゲネス(S. pyogenes)及び30個の黄色ブドウ球菌(S. aureus)gRNAの標的にされたCD40LGイントロン1における位置を表す。図2Cは、一次ヒトT細胞にRNP複合体としてヌクレアーゼと送達された図2Bからの例示的なgRNAのための、挿入/欠失率を含む編集百分率を表す。図2Dは、Tリンパ球におけるCD40L遺伝子編集の実験手順を表す。図2Eは、遺伝子編集後のT細胞集団におけるGFP陽性細胞の百分率を表す。T幹記憶細胞(TSCM)はCD62L+CD45RA+として、Tセントラル記憶(TCM)はCD62L+CD45RA-として、Tエフェクター記憶(TEM)はCD62L-CD45RA-として、ターミナルエフェクター(TEMRA)はCD62L-CD45RA+として定義される。図2Fは、FACS分析によってCD45RA及びCD62を発現する、処置の7日後(左パネル)及び20日後(右パネル)のT細胞の代表的プロットを表す。図2Gは、FACS分析によって測定した、処置の7及び19日後(左パネル)並びに20日後(右パネル)のT細胞培養組成を表す。図2Hは、AAV6又はIDLVによって提供されるドナー鋳型を使用したT細胞における遺伝子編集のための概略プロトコールである。図2Iは、様々なT細胞亜集団におけるHDRの結果(GFP+細胞の百分率として評価される)を表す。図2Jは、HD及び患者細胞における遺伝子編集のレベルを表す。
【図２Ｂ】図２Ａの続きである。
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ｂの続きである。
【図２Ｅ−Ｆ】図２Ｃ−Ｄの続きである。
【図２Ｇ】図２Ｅ−Ｆの続きである。
【図２Ｈ−Ｉ】図２Ｇの続きである。
【図２Ｊ】図２Ｈ−Ｉの続きである。
【図３Ａ−Ｃ】3つの例示的なgRNA(gRNA A、D及びG)による編集の後の標的化組込み及びCD40L発現を表す図である。図3Aは、CD40LGイントロン1の中の例示的なgRNAの位置を表す。図3Bは、図3D〜3Eに提示される実験のための実験手順及びタイムラインを表す。図3Cは、示されたRNP複合体及びAAV6ドナー鋳型による処置の後の、標的化組込みの率(GFP+細胞の%)を提供する。図3Dは、FACS分析によって決定した、GFP陽性細胞集団におけるCD40L発現を表す。図3Eは、再刺激の後の、様々な時点でのCD40L+細胞の割合を表す。
【図３Ｄ−Ｅ】図３Ａ−Ｃの続きである。
【図４Ａ−Ｃ】編集されたCD40Lが生理的調節を保存することを表す図である。具体的には、図4A及び4Bは、Tリンパ球におけるCD40L遺伝子編集及び発現のために使用された構築物及び実験手順を表す。図4C及び4Eは、ポリクローナル刺激(PMA/イオノマイシン)によるCD40L表面発現の誘導の後の、編集されたT細胞におけるCD40L発現のカイネティクスを表す。図4Dは、活性化CD4+及びCD8+細胞におけるCD40Lの発現を示す代表的プロットを表す。図4Fは、刺激したCD4+細胞におけるCD40Lの発現を示す代表的プロットを表す。
【図４Ｄ−Ｆ】図４Ａ−Ｃの続きである。
【図５Ａ−Ｂ】編集されたCD40Lが生理的調節を保存することを表す図である。具体的には、図5A及び5Bは、Tリンパ球におけるCD40L遺伝子編集及び発現のために使用された構築物及び実験手順を表す。図5Cは、野生型及び編集されたT細胞におけるCD40L及びCD8の発現を表す。図5Dは、編集されたT細胞におけるCD40L発現のカイネティクスを表す。図5Eは、遺伝子編集効率に及ぼすAAV6の影響を表す。
【図５Ｃ】図５Ａ−Ｂの続きである。
【図５Ｄ−Ｅ】図５Ｃの続きである。
【図６Ａ】遺伝子編集が、異なる導入遺伝子構成(野生型cDNA(再コード化なし)又はコドン最適化(再コード化された)配列;内因性ポリアデニル化シグナル又はウイルスのSV40ポリアデニル化シグナル)を使用して、高レベルのCD40L遺伝子編集(図6A)及び高レベルの外因性CD40L発現(図6B)を生成することを実証する図である。
【図６Ｂ】図６Ａの続きである。
【図７Ａ−Ｂ】CD40LGを標的にする例示的なgRNAの特異性を評価する実験の結果を表す図である。図7Aは、gRNA A及びgRNA DのGuide-Seq分析を提示する。図7B及び7Eは、Amplicon-Seq分析を使用してgRNA Aで観察された標的の及び標的外の編集を検証する。図7C〜7Dは、gRNA A及びgRNA Dのための潜在的な標的外部位を同定するためのDigenome分析の結果を提示する。図7Fは、gRNA A及びDについて同定された標的外切断部位のためのAmplicon-Seq分析の結果の概要を表す。
【図７Ｃ−Ｅ】図７Ａ−Ｂの続きである。
【図７Ｆ】図７Ｃ−Ｅの続きである。
【図８】CD40L編集T細胞が、in vitro共培養アッセイにおいてB細胞クラススイッチング能力を回復したことを表す図である。ヒストグラムは、野生型T細胞(非編集)、編集されたCD40L遺伝子を有するT細胞(GFP+)、遺伝子編集のために処置したが修正導入遺伝子の組込みが陰性であるT細胞(GFP-)、又は内因性CD40L遺伝子がレポーターカセットの組込みによってノックアウトされたT細胞との共培養の5日後のそれらの表面のIgGを発現したB細胞の百分率を示す。B細胞だけと、及びB細胞に加えて可溶性CD40Lタンパク質との培養を、陰性及び陽性対照としてそれぞれ使用した。いかなる刺激無しで(静止)、又は抗CD3-CD28ビーズ(ビーズ)若しくはPMA/イオノマイシンによる刺激の後に、全てのT細胞を試験した。
【図９】編集されたCD40L遺伝子座を有するT細胞と共培養したB細胞の培地における、IgMの低下したレベル及びIgGの増加したレベルを表す図である。
【図１０】以下のカーゴ:スタッファー配列、CD40LG cDNA/3' UTR/ポリA及びGFP発現カセットを含むAAV6ドナー鋳型を使用した、4つのgRNA切断部位における標的化組込みのベースラインレベルを表す図である。予測された切断部位に短い相同腕が隣接した。GFP発現に基づいて、gRNA間の標的化組込みのベースラインレベルにおける差を検出した。
【図１１】様々な相同腕長を有するドナー鋳型を使用して得られた標的化組込みのレベルを比較する図である。カーゴ配列の各側で相同腕を500塩基対に延長して、図10の通りにAAV6ドナー鋳型を調製した。相同腕の長さを増加させることは、試験した両方のgRNA切断部位について標的化組込みのレベルを増加させた。
【図１２Ａ−Ｂ】注射後の異なる時点における移植されたT細胞の表現型を表す図である。図12Aには、循環する野生型T細胞集団の中で測定したCD8及びCD4細胞の百分率を示す。図12Bには、循環する野生型T細胞のCD8及びCD4分画の中で測定された、エフェクター(CD44+CD62L-)、セントラル記憶(TCM、CD44+CD62L+)、ナイーブ(CD44-CD62L+)及び初期エフェクター(CD44-CD62L-)T細胞の百分率を示す。
【図１３】シクロホスファミド事前調整レジメン有り又は無しで移植された、野生型T細胞を使用したCD40L KOマウスにおける養子T細胞療法を表す図である。左のグラフは、事前調整レジメンによる処置有り又は無しのマウスにおける経時的なレシピエント及びドナーT細胞の百分率を表す。右のドットプロットは、キーホールリンペットヘモシアニン(TNP-KLH)抗原にコンジュゲートされたトリニトロフェニールハプテンによる移植マウスの免疫化の14日前か後、及び28日前か後の、移植された動物の血清中における抗原特異的IgGの量を表す。HIGM1マウスは、陰性対照として使用した。野生型造血幹細胞(HSCT)の全用量を移植したマウスは、陽性対照として使用した。
【図１４Ａ−Ｂ】野生型T細胞を移植したHIGM1マウスのワクチン接種への応答を表す図である。図14Aは、異なる用量の調整有り又は無しで移植したHIGM1マウスの血清中の、TNP-KLH抗原による2回の追加免疫の前後の抗原特異的IgG応答の量を示す。図14Bは、TNP/KLH特異的IgGの血清レベルと、循環する野生型CD4 T細胞の量の間の相関グラフを示す(上には百分率、下には絶対数)。
【図１４Ｃ−Ｄ】抗白血球(ALS)又は抗CD4抗体による事前調整レジメン有り又は無しで移植された、野生型T細胞を使用したCD40L KOマウスにおける養子T細胞療法を表す図である。図14C及び14Eは、事前調整レジメンによる処置有り又は無しのマウスにおける経時的なレシピエント及びドナーT細胞の百分率を表す。ワクチン接種への特異的IgG応答のレベルは、投与される調整用量に相関する(図14D)。
【図１４Ｅ】図１４Ｃ−Ｄの続きである。
【図１５Ａ】TNP-KLH免疫化の後の、図14からの養子移植マウスの脾臓切片におけるGC B細胞の免疫組織化学分析を表す図である。図15Aは、脾臓切片におけるGC B細胞の免疫組織化学染色分析を表し、落花生凝集素は褐色、ヘマトキシリン対比染色は青色である。図15Bはヒストグラムを表し、図15Aに示す免疫組織化学分析を数量化する。
【図１５Ｂ】図１５Ａの続きである。
【図１６Ａ】マウスの高IgM症候群モデルにおける、造血幹細胞療法を表す図である。図16Aに示すように、胸腺依存性抗原(TNP-KLH)による免疫化の前に、レシピエントHIGM1マウスにおいて、野生型C57BL/6マウスから採収されたCD40LG野生型造血幹細胞の異なる用量を、HIGM1マウスから採収されたCD40LG陰性HSPCと一緒に異なる比で移植した。ドットプロットは、TNP-KLH抗原による移植マウスの免疫化の14日前か後、及び28日前か後の、移植された動物の血清中におけるTNP-KLH特異的IgGの量を表す。図16Bは、図16Aについて記載した通り、野生型HSPC及びCD40LG陰性HSPCの異なる百分率でCD40Lマウスに移植した第2の実験を表す。マウスをTNP-KLHで免疫化し、その後オボアルブミンで免疫化した。ドットプロットは、免疫化の前後のTNP特異的IgGの量(左パネル)及びOVA特異的IgGの量(右パネル)を表す。図16Cは、移植後の異なる時点で測定した、末梢血におけるドナーT細胞生着を表す。
【図１６Ｂ】図１６Ａの続きである。
【図１６Ｃ】図１６Ｂの続きである。
【図１７Ａ−Ｄ】健康ドナー(HD)及び患者由来のT細胞の両方における、高いポリクローナルCD40L標的化を表す図である。in vitroで刺激し、25ピコモルRNP A(S.p.)及びMOI:5*10^4 vg/細胞のAAV6で処置した、異なる健康ドナー(HD、n=4)、又は、エクソン3に突然変異を引き起こす示したHIGM1を有する患者(患者)から、CD4 T細胞を収集した。図17Aは、処置の17日後に異なるT細胞亜集団において測定したGFP+編集細胞の百分率を示す。図17Bは、細胞蛍光測定分析(GFPマーキング)によって測定した培養組成を示す。図17Cは、ddPCR分子分析(左バー)によって、及び細胞蛍光測定分析(FACSによるGFP、右バー)によって測定した、遺伝子編集効率を比較する。図17Dは、TCR-Bの21ファミリーを識別する5つの異なる多重PCR反応によって評価された、未処置患者細胞(灰色/右パネル)及び編集された患者細胞(黒色/左パネル)におけるTCR多様性を示す。
【図１８Ａ−Ｂ】修正構築物の標的化組込みが、CD40Lの発現及び生理的調節を回復したことを表す図である。図18Aは、図17からのHD及び患者細胞における、PMA/イオノマイシン(P/I)刺激の8時間後のCD40L及びGFP発現を表す代表的なフローサイトメトリードットプロットを示す。図18Bは、P/I活性化の0、3、8、24及び48時間後に測定した、相対蛍光強度(RFI、T0に対する比で計算される)及び百分率としてのCD40L表面発現の時間経過を示す。
【図１９Ａ−Ｂ】共培養アッセイにおいてB細胞増殖を回復するCD40L編集T細胞の能力を表す図である。図19Aは、T及びB細胞共培養アッセイのプロトコールの概略図を示す。図19B及び図19Cは、静止しているビーズ活性化(1:1の比)又はPMA/イオノマイシン刺激T細胞(未処置(UT)又は編集された(GFP+))との共培養における増殖B細胞の百分率を示す、フローサイトメトリープロット及びヒストグラムをそれぞれ表す。陰性対照:B細胞だけ;陽性対照:B細胞+可溶性CD40L。
【図１９Ｃ】図１９Ａ−Ｂの続きである。
【図２０Ａ】共培養アッセイにおいてB細胞クラススイッチングを回復するCD40L編集T細胞の能力を表す図である。図20A及び図20Bは、静止しているビーズ活性化(1:1の比)又はPMA/イオノマイシン刺激T細胞(未処置(UT)又は編集された(GFP+))との共培養におけるIgGスイッチB細胞の百分率を示す、Elispot像及びヒストグラムをそれぞれ表す。陰性対照:B細胞だけ;陽性対照:B細胞+可溶性CD40L。
【図２０Ｂ】図２０Ａの続きである。
【図２１Ａ−Ｄ】本明細書に記載されるゲノム編集システムが、ヒト造血幹細胞/前駆体細胞(HSPC)において高レベルのCD40LG遺伝子編集をもたらしたことを表す図である。図21Aは、CD34+細胞を編集するために使用したドナー構築物の概略図である。図21B、図21C及び図21Eは、ゲノム接合部に対する5'ベクターで実行されたデジタルドロップレットPCR分析によって測定した、バルク処置CD34細胞及び示した選別亜集団における標的化組込みの百分率をそれぞれ示す。図21Dは、処置及び未処置(UT)細胞の培養組成を表す。図21Fは、移植後の異なる時点で測定した、移植体の中のhCD45+細胞の百分率(左パネル)及びHDR細胞の百分率(右パネル)を表す。
【図２１Ｅ−Ｆ】図２１Ａ−Ｄの続きである。
【図２２Ａ−Ｃ】CD40LG編集T細胞を富化するために開発された選択戦略を表す図である。図22Aは、修正CD40LG遺伝子、リボソーム内部進入部位(IRES)配列及び選択遺伝子(例えば、デルタLNGFR)を有するドナーDNA構築物を表す。図22Bは、選択遺伝子の発現が細胞蛍光測定分析によって評価された異なる時点を示す、標的化組込みプロトコールの概略図である。図22Cは、図22Bに記載の通りに処置したCD4及びCD8 T細胞における、示した時点(6日目、13日目及び20日目)でのレポーター遺伝子の発現を表す。図22Dは、遺伝子編集のために処置したT細胞の再刺激の後の、CD40L発現のカイネティクスを表す。図22Eは、未処置のNGFR+及びNGFR- T細胞集団における、CD40L遺伝子(左)の発現レベル(平均蛍光強度、MFI)及びCD40L+細胞の百分率を表す。図22Fは、共培養アッセイにおいてB細胞クラススイッチングを回復するCD40L編集T細胞の能力を表し、静止しているビーズ活性化(1:1の比)又はPMA/イオノマイシン刺激T細胞(未処置(UT)又は編集された(NGFP+))との共培養におけるIgGスイッチB細胞の百分率を示す。陰性対照:B細胞だけ;陽性対照:B細胞+可溶性CD40L。
【図２２Ｄ−Ｅ】図２２Ａ−Ｃの続きである。
【図２２Ｆ】図２２Ｄ−Ｅの続きである。
【図２３Ａ−Ｃ】NGFR選択遺伝子を使用した、CD40LG編集細胞の選択を表す図である。図23Aは、異なるT細胞亜集団の中で測定された、遺伝子編集の後に得られたNGFR+細胞の百分率を表す(左から右にかけて:ターミナルエフェクター(TEMRA)、CD45RA+ CD62L-;エフェクター記憶(TEM)、CD62L- CD45RA-;セントラル記憶(TCM)、CD45RA-CD62L+;及びT幹記憶細胞(TSCM)、CD45RA+CD62L+)。図23Bは、NGFR選択の前後に測定した、T細胞亜集団の割合を表す。図23Cは、分子分析(ddPCR)又はNGFR選択の前後のNGFR発現によって測定した、CD40LG遺伝子編集の百分率を表す。
【図２４Ａ】NSGマウスにおける異種移植の後のCD40LG編集細胞の生着を表す図である。図24Aは、移植後の異なる時点で測定した、ヒト移植体の中のヒト細胞の百分率(hCD45+細胞;上左及び下左及び右パネル)及びNGFR+細胞の百分率(上右パネル)を表す。図24Bは、移植の4、8及び16週後に測定した、生着したT細胞のT細胞亜集団(ターミナルエフェクター(TEMRA)、CD45RA+ CD62L-;エフェクター記憶(TEM)、CD62L- CD45RA-;セントラル記憶(TCM)、CD45RA-CD62L+;及びT幹記憶細胞(TSCM)、CD45RA+CD62L+)の割合を表す。図24Cは、CD40LG発現のレベル及びNSGマウスから回収したCD40LG+細胞の百分率を表す。
【図２４Ｂ】図２４Ａの続きである。
【図２４Ｃ】図２４Ｂの続きである。
【図２５Ａ−Ｃ】HSPC編集がCRISPR/Casプラットホームに移動可能であることを実証する実験を表す図である。図25Aは、臍帯血から得られたCD34+細胞を編集するためのプロトコールを提示する。図25Bは、ZFN又はRNPを使用して遺伝子編集を通して得られた様々な細胞集団における、標的化組込み効率(GFP+細胞の百分率として表される)を表す。図25Cは、未処置の細胞(UT)と比較した、ZFN又はRNPを使用した遺伝子編集の後の培養組成を表す。図25Dは、未処置の細胞(UT)と比較した、RNP、ZFN、Cas9単独又はRNP-modによる処置に続く、インターフェロン(IFN)応答性遺伝子RIG1、IRF7及びOAS1の誘導倍率を表す。
【図２５Ｄ】図２５Ａ−Ｃの続きである。
【図２６Ａ−Ｂ】HSPC編集がCRISPR/Casプラットホームに移動可能であることを実証するさらなる実験を表す図である。図26Aは、臍帯血(CB)、骨髄(BM)又は移動性末梢血(MPB)からのCD34+細胞を編集するためのプロトコールを提示する。図26Bは、示した編集手順を使用して得られた様々な細胞集団における、標的化組込み効率(GFP+細胞の百分率として表される)を表す。図26Cは、編集後の培養組成を表す。図26Dは、編集された細胞におけるIFN応答性遺伝子RIG1、IRF7及びOAS1の発現を表す。
【図２６Ｃ−Ｄ】図２６Ａ−Ｂの続きである。
【図２７Ａ−Ｂ】様々なドナービヒクル及びヌクレアーゼ構成を使用して多様な供給源からのヒトHSPCを効率的に編集することができることを示すデータを表す図である。図27Aは、ZFN又はRNPをIDLV又はAAV6ドナー鋳型と共に使用した、編集された(GFP+)細胞亜集団の百分率を表す。図27Bは、臍帯血、骨髄及び移動性末梢血(mPB)に由来するCD34+細胞を使用した、編集された(GFP+)細胞亜集団の百分率を表す。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
定義及び略記号
特に明記しない限り、以下の用語の各々は、このセクションにおいてそれに関連した意味を有する。
【００７１】
不定冠詞「a」及び「an」は、関連する名詞の少なくとも1つを指し、用語「少なくとも1つの」及び「1つ以上」と互換的に使用される。例えば、「モジュール」は少なくとも1つのモジュール、又は1つ以上のモジュールを意味する。
【００７２】
接続詞「又は」及び「及び/又は」は、非排他的な論理和として互換的に使用される。
【００７３】
「Alt-HDR」、「代替の相同性誘導修復」又は「代替HDR」は、互換的に使用されて、相同核酸(例えば、内因性相同配列、例えば姉妹染色分体、又は外因性核酸、例えば鋳型核酸)を使用してDNA傷害を修復するプロセスを指す。Alt-HDRは、プロセスが正規のHDRと異なる経路を利用するという点で正規のHDRと異なり、正規のHDR媒介物、RAD51及びBRCA2によって阻害することができる。Alt-HDRは、一本鎖又はニック入りの相同核酸鋳型の関与によっても区別されるが、正規のHDRは二本鎖の相同鋳型を一般的に含む。
【００７４】
「正規のHDR」、「正規の相同性誘導修復」又は「cHDR」は、相同核酸(例えば、内因性相同配列、例えば姉妹染色分体、又は外因性核酸、例えば鋳型核酸)を使用してDNA傷害を修復するプロセスを指す。正規のHDRは、二本鎖切断にかなりの切除があり、DNAの少なくとも1つの一本鎖部分を形成する場合に一般的に作用する。正常な細胞では、cHDRは、一連のステップ、例えば切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖DNAの安定化、DNA交差中間体の形成、交差中間体の分解及びライゲーションを一般的に含む。このプロセスはRAD51及びBRCA2を必要とし、相同核酸は一般的に二本鎖である。
【００７５】
特記しない限り、本明細書で使用される用語「HDR」は、正規のHDR及びAlt-HDRの両方を包含する。
【００７６】
本明細書で使用されるように、用語「切断事象」は、核酸分子における切断を指す。切断事象は、一本鎖切断事象又は二本鎖切断事象であってよい。一本鎖切断事象は、5'オーバーハング又は3'オーバーハングをもたらすことができる。二本鎖切断事象は、平滑末端、2つの5'オーバーハング又は2つの3'オーバーハングをもたらすことができる。
【００７７】
標的核酸配列、例えば標的CD40L核酸配列の上の部位に関して本明細書で使用される用語「切断部位」は、標的核酸の2つのヌクレオチド残基の間の二本鎖切断が起こる標的位置を指すか、或いは、標的核酸のいくつかのヌクレオチド残基の範囲内の、RNA誘導型ヌクレアーゼ依存性プロセスによって媒介される、2つの一本鎖切断が起こる標的位置を指す。切断部位は、例えば平滑二本鎖切断のための標的位置であってよい。或いは、切断部位は、例えば、二本鎖切断を形成する、及び、例えば約10塩基対によって分離される2つの一本鎖切断又はニックのための、標的核酸のいくつかのヌクレオチド残基の範囲内の標的部位であってよい。対の中の二本鎖切断又は2つの一本鎖ニックのクローザーは、理想的には標的位置から0〜500bpの範囲内にある(例えば、標的位置から450以下、400、350、300、250、200、150、100、50又は25bp)。二重ニッカーゼが使用される場合、対の中の2つのニックは、互いから25〜55bp(例えば、25〜50、25〜45、25〜40、25〜35、25〜30、50〜55、45〜55、40〜55、35〜55、30〜55、30〜50、35〜50、40〜50、45〜50、35〜45又は40〜45bp)の範囲内にあり、及び互いから100bp以下(例えば、90以下、80、70、60、50、40、30、20又は10bp)離れている。
【００７８】
語句「から事実上なる」は、列挙される種は支配的な種であるが、他の種が微量で、又は対象組成物の構造、機能若しくは挙動に影響しない量で存在することができることを意味する。例えば、特定の種から事実上なる組成物は、90%、95%、96%又はそれより多くのその種を一般的に含む。
【００７９】
「ドメイン」は、タンパク質又は核酸のセグメントを記載するために使用される。別途指示がない限り、ドメインは、いかなる特異的機能的特性も有することを必要とされない。
【００８０】
本明細書で使用されるように、用語「内因性」遺伝子、「内因性」核酸又は「内因性」相同領域は、細胞のゲノムの中のその天然の位置、例えば、染色体又はプラスミドにある、天然の遺伝子、核酸又は遺伝子領域を指す。対照的に、用語「外因性」遺伝子又は「外因性」核酸は、細胞の中で天然でないが、本発明の方法の間に細胞に導入される遺伝子、核酸又は遺伝子領域を指す。外因性遺伝子又は外因性核酸は、内因性遺伝子又は内因性核酸と相同又は同一であってよい。
【００８１】
用語「エクソン」は、タンパク質をコードするために必要とされる情報を含有する遺伝子のコード領域を指す。真核生物では、遺伝子は、非コードイントロンが散在するコードエクソンで構成される。RNAスプライシングでは、イントロンが除去され、エクソンがお互いと共有結合して、タンパク質に翻訳することができる機能性成熟メッセンジャーRNA(mRNA)を形成する。用語エクソンは、遺伝子の中のDNA配列及びRNA転写物における対応配列の両方を指す。
【００８２】
「遺伝子変換」は、内因性相同配列(例えば、遺伝子アレイの中の相同配列)の組込みによるDNA配列の変更を指す。「遺伝子修正」は、外因性相同配列、例えば外因性の一本鎖又は二本鎖ドナー鋳型DNAの組込みによるDNA配列の変更を指す。遺伝子変換及び遺伝子修正は、下記のものなどのHDR経路によるDNA二本鎖切断の修復の産物である。
【００８３】
本明細書において互換的に使用される用語「相同性」又は「同一性」は、2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の間の配列同一性を指し、同一性はより厳密な比較である。語句「同一性又は相同性パーセント」及び「同一性又は相同性%」は、2つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列の比較において見出される配列同一性の百分率を指す。2つ以上の配列の同一性は、0〜100%のいずれか又はその間の任意の値であってよい。同一性は、参照配列との比較のために整列させることができる、各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較される配列における位置が同じヌクレオチド塩基又はアミノ酸によって占有される場合、分子はその位置で同一である。アミノ酸配列の同一性の程度は、アミノ酸配列によって共有される位置での同一のアミノ酸の数の関数である。核酸配列の間の同一性の程度は、核酸配列によって共有される位置での同一であるか一致するヌクレオチドの数の関数である。アミノ酸配列の相同性の程度は、ポリペプチド配列によって共有される位置でのアミノ酸の数の関数である。
【００８４】
2つの配列の間の相同性又は配列同一性(これらの用語は本明細書で互換的に使用される)の計算は、以下の通りに実行される。配列は、最適な比較目的のために整列させる(例えば、最適なアラインメントのために第1及び第2のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる)。最適なアラインメントは、12のギャップペナルティ、4のギャップ伸長ペナルティ及び5のフレームシフトギャップペナルティによるBlossum 62スコアリングマトリックスによる、GCGソフトウェアパッケージの中のGAPプログラムを使用してベストスコアとして決定される。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを、次に比較する。第1の配列の中の位置が第2の配列の中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められる場合は、これらの分子はその位置で同一である。2つの配列の間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数である。
【００８５】
本明細書で使用される用語「相同腕」は、切断する標的配列、例えば切断部位の内部又は近くの(例えば、隣接又は近接する)DNAの領域、例えば標的核酸に相同性である1つ以上の領域を指す。
【００８６】
「インデル」は、核酸配列における挿入及び/又は欠失である。インデルは、本開示のゲノム編集システムによって形成される二本鎖切断などの、DNA二本鎖切断の修復の産物であってよい。インデルは、下記のNHEJ経路などの「誤りがちな」修復経路によって切断が修復される場合に最も一般的に形成される。
【００８７】
インデル、遺伝子変換、遺伝子修正及び他のゲノム編集結果は、シークエンシング(最も一般的には「次世代」又は「合成によるシークエンシング」方法によるが、サンガーシークエンシングを使用することもできる)によって一般的に評価され、全てのシークエンシング読み取りデータの中で目的の部位における数値的変化(例えば、±1、±2又はそれより多い塩基)の相対頻度によって定量化される。シークエンシングのためのDNA試料は、当技術分野で公知の様々な方法によって調製することができ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、Tsai et al.(参照により本明細書に組み込まれる、Nat. Biotechnol. 34(5): 483 (2016))に記載されるGUIDEseqプロセスにおけるように二本鎖切断によって生成されるDNA末端の捕捉、又は当技術分野で周知である他の手段による目的の部位の増幅を含み得る。ゲノム編集結果は、in situハイブリダイゼーション方法、例えば、Genomic Vision(Bagneux、France)によって商品化されたFiberComb(商標)システムによって、及び当技術分野で公知の任意の他の好適な方法によって評価することもできる。
【００８８】
用語「イントロン」は、遺伝子のエクソン(又は、コード領域)の間で見出される長いひと続きの非コードDNAを指す。イントロンは、特異的な一連のヌクレオチドで通常開始、終了し、RNA分子がタンパク質に翻訳される前にスプライスアウトされる。これらの配列は、イントロンとエクソンの間の境界の働きをし、スプライス部位として知られる。コードDNAと非コードDNAの間の境界の認識は、機能的遺伝子の形成のために重要である。
【００８９】
用語「単離遺伝子」又は「単離核酸」は、その起源又は誘導源のためにその天然状態においてそれに付随する天然に関連している成分と関連していない;同じ種からの他のタンパク質を実質的に含まない;異なる種の細胞によって発現される;又は天然に存在しない遺伝子又は核酸である。したがって、化学合成されるか又はそれが天然に由来する細胞と異なる細胞システムにおいて合成される核酸は、その天然に関連する成分から「単離されている」。核酸は、当技術分野で周知であるタンパク質精製技術を使用して、単離によって天然に関連する成分を実質的に含まないようにすることもできる。
【００９０】
本明細書に提示されるヌクレオチド配列では、下の表1に示すような従来のIUPAC表記が使用される(参照により本明細書に組み込まれる、Cornish-Bowden A, Nucleic Acids Res. 1985 May 10; 13(9):3021-30も参照)。しかし、例えばgRNA標的化ドメインにおいて配列をDNA又はRNAによってコードすることができる場合、「T」は「チミン又はウラシル」を表す点に留意するべきである。
【００９１】
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【００９２】
「キット」は、特異的目的のために用いることができる機能的単位を一緒に構成する、2つ以上の成分の任意の集合を指す。例示(限定でなく)として、この開示による1つのキットは、RNA誘導型ヌクレアーゼとの複合型であるか又は複合体を形成することができるガイドRNAを、薬学的に許容される担体と一緒に(例えば、その中に懸濁されて、又は懸濁可能である)含み得る。キットは、そのような細胞又は対象において所望のゲノム変更を引き起こす目的で、例えば細胞又は対象の中に複合体を導入するために使用することができる。キットの成分は一緒にパッケージすることができるか、又は、それらを別々にパッケージすることができる。この開示によるキットは、例えばこの開示の方法によるキットの使用を記載する、使用説明書(DFU)も任意選択で含む。DFUはキットと一緒に物理的にパッケージすることができるか、又は、例えば電子手段によってそれをキットのユーザーに利用可能にすることができる。
【００９３】
「非相同末端連結」又は「NHEJ」は、正規のNHEJ(cNHEJ)及び代替NHEJ(altNHEJ)を含む、ライゲーション媒介修復及び/又は非鋳型媒介修復を指し、代替NHEJは、微相同性媒介末端連結(MMEJ)、一本鎖アニーリング(SSA)及び合成依存性微相同性媒介末端連結(SD-MMEJ)を次に含む。
【００９４】
用語「ポリ(A)」、「ポリ(A)テール」、及び「ポリアデニル化」は、メッセンジャーRNAへのポリ(A)テールの付加を指す。ポリAテールは、分子の安定性を増加させるためにRNAプロセシングの間にメッセンジャーRNA(mRNA)分子に加えられるアデニンヌクレオチドの長鎖である。真核細胞の中の遺伝子が転写される直後に、新しいRNA分子はRNAプロセシングとして知られるいくつかの修飾を受ける。これらの修飾は、一次RNA転写物の両末端を変更して、成熟mRNA分子を生成する。3'末端のプロセシングは、ポリAテールをRNA分子に加える。
【００９５】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」及び「オリゴヌクレオチド」は、DNA及びRNAの中の一連のヌクレオチド塩基(「ヌクレオチド」とも呼ばれる)を指し、2つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、核酸等は、一本鎖又は二本鎖のキメラ混合物又はその誘導体若しくは改変版であってよい。それらは、分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメータ等を向上させるために、例えば塩基部分、糖部分又はリン酸主鎖において改変することができる。ヌクレオチド配列は、タンパク質及び酵素を作製するために細胞機構によって使用される情報を限定されずに含む遺伝情報を一般的に有する。これらの用語には、二本鎖又は一本鎖のゲノムDNA、RNA、任意の合成及び遺伝子操作ポリヌクレオチド、並びにセンス及びアンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。これらの用語には、改変された塩基を含有する核酸も含まれる。本明細書で使用される「CD40L」核酸は、CD40Lタンパク質をコードする一連のヌクレオチド塩基を指す。
【００９６】
「予防する」、「予防すること」及び「予防」は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患の予防を指し、(a)疾患を回避若しくは排除すること;(b)疾患の素因に影響を及ぼすこと;又は(c)疾患の少なくとも1つの症状の開始を阻止するか遅らせることを含む。
【００９７】
用語「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は互換的に使用されて、ペプチド結合を通して一緒に連結されるアミノ酸の連続した鎖を指す。これらの用語には、個々のタンパク質、一緒に結合したタンパク質の群又は複合体、並びにそのようなタンパク質の断片又は部分、変異体、誘導体及び類似体が含まれる。ペプチド配列は、本明細書において、左のアミノ又はN末端で始まり、右のカルボキシル又はC末端に進行する、従来の表記を使用して提示される。標準の一文字又は三文字略記号を使用することができる。
【００９８】
分子(例えば、核酸又はタンパク質)の改変に関して使用される場合、「置換」又は「置換された」は、プロセス制限を必要とせず、置換実体が存在することを単に示すだけである。
【００９９】
本明細書で使用される用語「スタッファー配列」は、標的部位へのドナー鋳型の標的化組込み、及びスタッファー配列を含むアンプリコンの以降の増幅を促進するように選択された、非相同的又はランダムな核酸配列を指す。スタッファー配列の存在は、別の部位へのドナー鋳型の組込みの推進も阻止する。スタッファー配列は、本明細書においてより詳細に記載される。
【０１００】
「対象」は、ヒト又は非ヒト動物を意味する。ヒト対象は任意の年齢(例えば、小児、子供、若年成人又は成人)であってよく、疾患を患ってもよく、又は遺伝子の変更を必要としてもよい。或いは、対象は動物であってよく、この用語には、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類及びより詳細には、非ヒト霊長類、齧歯動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター等)、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコなどが限定されずに含まれる。この開示のある特定の実施形態では、対象は畜産動物、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ又はヤギである。ある特定の実施形態では、対象は家禽である。
【０１０１】
本明細書で使用されるように、用語「実質的に」は、目的の特徴又は特性の全体又はほぼ全体の範囲又は程度を示す定性的状態を指す。生物分野の当業者は、生物的及び化学的現象が完結すること、及び/又は完結まで進行すること、又は絶対的な結果を達成若しくは回避することは、あるとしても稀であることを理解する。したがって、用語「実質的に」は、本明細書で、多くの生物的及び化学的現象に内在する完全性の潜在的欠如を捉えるために使用される。
【０１０２】
2つの核酸配列に関して本明細書で使用される用語「実質的に同一である」は、一部の実施形態では、2つの核酸配列の各々の少なくとも20個のヌクレオチドの連続したひと続きの間の少なくとも95%の配列同一性を指す。例えば、第1の核酸配列が、第2の核酸配列の少なくとも20個のヌクレオチドの連続したひと続きにわたって、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の同一性を有する場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と実質的に同一である。一部の実施形態では、第1の核酸配列が第2の核酸配列の全長にわたって少なくとも95%の同一性を有する場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と実質的に同一である。一部の実施形態では、用語「実質的に同一である」は、プライミング部位との関連で使用され、増幅反応の間に同じPCRプライマーによるプライミングを支持するプライミング部位の能力を指す。一部の実施形態では、用語「実質的に同一である」は、ドナー鋳型の相同腕と標的核酸の相同腕の間の関係を記載するために使用され、例えば、組み換えられた遺伝子座におけるPAM又はプロトスペーサー配列を排除するために、多少の程度の多型を寛容して標的核酸においてドナー鋳型の効率的な組換えを可能にする、相同腕の間の核酸同一性を指す。
【０１０３】
本明細書で使用されるように、「標的CD40L核酸」は、例えば染色体に存在する、本明細書に開示されるゲノム編集システムを使用したRNA誘導型ヌクレアーゼ依存性プロセスによる改変の標的であるCD40L核酸を指す。標的CD40L核酸は、例えば突然変異を含み得る。一部の実施形態では、突然変異は、欠陥のあるCD40シグナル伝達のためにB細胞クラススイッチングの喪失につながる。
【０１０４】
本明細書で使用されるように、「標的位置」は、RNA誘導型ヌクレアーゼ依存性プロセスによって改変される、標的核酸(例えば、染色体)の上の部位を指す。一実施形態では、標的位置は、標的核酸の上の2つのヌクレオチド、例えば隣接したヌクレオチドの間の部位であってよい。標的位置は、鋳型核酸によって変更される、例えば修正される、1つ以上のヌクレオチドを含み得る。一実施形態では、標的位置は、「標的配列」(例えば、gRNAが結合する配列)の中にある。一実施形態では、標的位置は、標的配列(例えば、gRNAが結合する配列)の上流又は下流にある。
【０１０５】
「処置する」、「処置すること」及び「処置」は、疾患を抑制すること、すなわち、その発達又は進行を阻むこと又は阻止すること;疾患を軽減すること、すなわち、疾患状態の退行を引き起こすこと;疾患の1つ以上の症状を軽減すること;及び、疾患を治療することの1つ以上を含む、対象(例えば、ヒト対象)における疾患の処置を意味する。
【０１０６】
用語「非翻訳領域」又は「UTR」は、mRNAの2つの非タンパクコードセクションのいずれか1つを指す。リーダー配列又はリーダーRNAとしても知られる5'非翻訳領域(5' UTR)は、開始コドンの直ぐ上流にあるmRNAの領域である。3'非翻訳領域(3' UTR)は、翻訳終結コドン直後のmRNAのセクションを指す。
【０１０７】
用語「変異体」は、参照実体とかなりの構造的同一性を示すが、参照実体と比較して1つ以上の化学部分の存在又はレベルにおいて参照実体と構造的に異なる実体、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド又は小分子を指す。多くの実施形態では、変異体は、その参照実体と機能的にも異なる。一般に、特定の実体が参照実体の「変異体」であると適切に考えられるかどうかは、参照実体との構造的同一性のその程度に基づく。
【０１０８】
概要
高IgM症候群、欠陥のあるCD40シグナル伝達によって特徴付けられる一群の障害の処置を可能にするゲノム編集システム、ドナー鋳型、gRNA分子及び関連した方法が本明細書で提供される。本明細書に記載される組成物及び方法は、適切なCD40シグナル伝達及びクラススイッチ組換えを機能的に復元するために、CD40Lのエクソン2〜5の1つ以上を含むドナー鋳型の使用に依存する。
【０１０９】
ゲノム編集システム
用語「ゲノム編集システム」は、RNA誘導型DNA編集活性を有する任意のシステムを指す。本開示のゲノム編集システムは、天然に存在するCRISPRシステムから応用した少なくとも2つの成分を含む:ガイドRNA(gRNA)及びRNA誘導型ヌクレアーゼ。これらの2つの成分は、特異的核酸配列と結合し、例えば、一本鎖切断(SSB又はニック)、二本鎖切断(DSB)及び/又は点突然変異の1つ以上を形成することによって、その核酸配列又はその周囲のDNAを編集することが可能である複合体を形成する。
【０１１０】
天然に存在するCRISPRシステムは、進化的に2つのクラス及び5つのタイプに組織化され(参照により本明細書に組み込まれる、Makarova et al. Nat Rev Microbiol. 2011 Jun; 9(6): 467-477 (Makarova))、本開示のゲノム編集システムは、天然に存在するCRISPRシステムの任意のタイプ又はクラスの成分を応用することができるが、本明細書で提示される実施形態は、クラス2及びタイプII又はVのCRISPRシステムから一般的に応用される。タイプII及びVを包含するクラス2システムは、crRNAの標的化(又は、スペーサー)配列に相補的な特異的遺伝子座に結合し(すなわち、標的にし)、切断する、リボ核タンパク質(RNP)複合体を形成する、比較的大きな多ドメインRNA誘導型ヌクレアーゼタンパク質(例えば、Cas9又はCpf1)及び1つ以上のガイドRNA(例えば、crRNA及び、任意選択で、tracrRNA)によって特徴付けられる。本開示によるゲノム編集システムは細胞DNA配列を同様に標的にし、編集するが、天然に存在するCRISPRシステムとかなり異なる。例えば、本明細書に記載される単分子ガイドRNAは天然に存在せず、この開示によるガイドRNAとRNA誘導型ヌクレアーゼの両方は、いかなる数の天然に存在しない改変も組み込むことができる。
【０１１１】
ゲノム編集システムは様々な方法で実行する(例えば、細胞又は対象に投与又は送達する)ことができ、異なる適用のために異なる実行が好適であってもよい。例えば、ある特定の実施形態では、ゲノム編集システムはタンパク質/RNA複合体(リボ核タンパク質又はRNP)として実行され、それは、薬学的に許容される担体及び/又は封入剤、例えば、脂質若しくはポリマーの微粒子若しくはナノ粒子、ミセル、リポソーム等を任意選択で含む、医薬組成物の中に含まれてもよい。ある特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、上記のRNA誘導型ヌクレアーゼ及びガイドRNA成分を(任意選択で1つ以上のさらなる成分と一緒に)コードする1つ以上の核酸として実行され;ある特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、そのような核酸を含む1つ以上のベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスのベクターとして実行され;ある特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、上述のいずれかの組合せとして実行される。本明細書に示される原理によって作動するさらなる又は改変される実行は当業者にとって明らかになり、この開示の範囲内である。
【０１１２】
本開示のゲノム編集システムは、単一の特異的ヌクレオチド配列を標的にすることができること、又は、2つ以上のガイドRNAの使用を通して2つ以上の特異的ヌクレオチド配列を標的にすることができること、及び並行して編集することが可能であることに注意すべきである。この開示全体において、複数のgRNAの使用は「多重化」と呼ばれ、目的の複数の無関係な標的配列を標的にするために、又は、単一の標的ドメインの中で複数のSSB若しくはDSBを形成するために、及び一部の場合には、そのような標的ドメインの中で特異的編集を生成するために用いることができる。例えば、本明細書に参照により組み込まれる、Maederら(Maeder)による国際特許出願公開第2015/138510号は、遺伝子の機能を次に低減又は消去する隠れたスプライス部位の形成をもたらす、ヒトCEP290遺伝子における点突然変異(C.2991+1655AからGへ)を修正するためのゲノム編集システムを記載する。Maederのゲノム編集システムは、点突然変異のいずれかの側の(すなわち、隣接する)配列を標的にする2つのガイドRNAを利用し、突然変異に隣接するDSBを形成する。これは、次に、突然変異を含む介在配列の欠失を促進し、それによって隠れたスプライス部位を消去し、正常な遺伝子機能を回復する。
【０１１３】
別の例として、参照により本明細書に組み込まれる、Cotta-Ramusinoら(「Cotta-Ramusino」)によるWO 2016/073990は、Cas9ニッカーゼ(S.ピオゲネスD10Aなどの一本鎖ニックを形成するCas9)と組み合わせて2つのgRNAを利用するゲノム編集システムを記載し、この構成は、「二重ニッカーゼシステム」と呼ばれる。Cotta-Ramusinoの二重ニッカーゼシステムは、1つ以上のヌクレオチドによってオフセットされる目的の配列の反対側の鎖の上で2つのニックを形成するように構成され、ニックは連合して、オーバーハング(Cotta-Ramusinoの場合5'であるが、3'オーバーハングも可能である)を有する二本鎖切断を形成する。オーバーハングは、次に、一部の場合には相同性誘導修復事象を促進することができる。さらに別の例として、Palestrantら(「Palestrant」、参照により本明細書に組み込まれる)によるWO 2015/070083は、Cas9をコードするヌクレオチド配列を標的にするgRNA(「支配RNA」と呼ばれる)を記載し、それは、さもなければ例えば一部のウイルスで形質導入された細胞において構成的に発現される可能性があるCas9の一時的発現を可能にするために、1つ以上のさらなるgRNAを含むゲノム編集システムに含まれてもよい。これらの多重化適用は限定するのが目的ではなく、例示を目的とし、当業者は、多重化の他の適用がここで記載されるゲノム編集システムに一般的に適合することを理解する。
【０１１４】
ゲノム編集システムは、一部の場合には、NHEJ又はHDRなどの細胞DNA二本鎖切断機構によって修復される二本鎖切断を形成することができる。これらの機構は、例えば、Davis & Maizels, PNAS, 111(10):E924-932, March 11, 2014 (Davis)(Alt-HDRを記載する);Frit et al. DNA Repair 17(2014) 81-97 (Frit)(Alt-NHEJを記載する);及びIyama and Wilson III, DNA Repair (Amst.) 2013-Aug; 12(8): 620-636 (Iyama)(正規のHDR及びNHEJ経路を一般的に記載する)による文献全体で記載される。
【０１１５】
ゲノム編集システムがDSBを形成することによって作動する場合、そのようなシステムは、二本鎖の切断修復の特定の様式又は特定の修復結果を促進又は助長する1つ以上の成分を任意選択で含む。例えば、Cotta-Ramusinoは、一本鎖のオリゴヌクレオチド「ドナー鋳型」が加えられるゲノム編集システムも記載する;ドナー鋳型は、ゲノム編集システムによって切断される細胞DNAの標的領域に組み込まれ、標的配列に変化をもたらすことができる。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、一本鎖又は二本鎖切断を引き起こすことなく、標的配列を改変するか、又は標的配列若しくはその近くの遺伝子の発現を改変する。例えば、ゲノム編集システムは、DNAに作用し、それによって標的配列又はその発現を改変する機能的ドメインに融合した、RNA誘導型ヌクレアーゼを含み得る。一例として、RNA誘導型ヌクレアーゼはシチジンデアミナーゼ機能的ドメインに接続する(例えば、融合させる)ことができ、標的化されたCからAへの置換を生成することによって作動することができる。例示的なヌクレアーゼ/デアミナーゼ融合は、参照により組み込まれる、Komor et al. Nature 533, 420-424 (19 May 2016) ("Komor")に記載される。或いは、ゲノム編集システムは、切断不活性化(すなわち、「作動しない」)ヌクレアーゼ、例えば、作動しないCas9(dCas9)を利用することができ、細胞DNAの1つ以上の標的化領域で安定複合体を形成し、それによって、mRNA転写、クロマチン再構築等を限定されずに含む、標的化領域が関与する機能に干渉することによって作動することができる。
【０１１７】
ガイドRNA(gRNA)分子
用語「ガイドRNA」及び「gRNA」は、Cas9又はCpf1などのRNA誘導型ヌクレアーゼの、細胞内の標的配列、例えばCD40L配列への特異的結合(又は、「標的化」)を促進する任意の核酸を指す。gRNAは、単分子(単一のRNA分子を含み、代わりにキメラとも呼ばれる)、又はモジュール式(1つを超える、及び一般的に2つの、別個のRNA分子、例えばcrRNA及びtracrRNAを含み、それらは例えば二重化によって通常お互いと結合している)であってもよい。gRNA及びそれらの構成部品は、文献全体で、例えば、Briner et al.(参照により組み込まれる、Molecular Cell 56(2), 333-339, October 23, 2014 (Briner))、及びCotta-Ramusinoに記載される。
【０１１８】
細菌及び古細菌では、タイプII CRISPRシステムは、RNA誘導型ヌクレアーゼタンパク質、例えば、Cas9、外来配列に相補的な5'領域を含むCRISPR RNA(crRNA))、及び、crRNAの3'領域に相補的でそれと二重鎖を形成する5'領域を含むトランス活性化crRNA(tracrRNA)を一般的に含む。いかなる理論によっても束縛されるものではないが、この二重鎖はCas9/gRNA複合体の形成を促進し、その活性に必要であると考えられる。タイプII CRISPRシステムは遺伝子編集での使用に適合しているので、1つの非限定的な例では、crRNA(その3'末端で)及びtracrRNA(その5'末端で)の相補領域を架橋する4つのヌクレオチド(例えば、GAAA)、「テトラループ」又は「リンカー」配列によって、crRNA及びtracrRNAは単一の単分子又はキメラのガイドRNAの中で連結することができることが発見された。(Mali et al. Science. 2013 Feb 15; 339(6121): 823-826 ("Mali"); Jiang et al. Nat Biotechnol. 2013 Mar; 31(3): 233-239 ("Jiang");及びJinek et al., 2012 Science Aug. 17; 337(6096): 816-821 ("Jinek")、その全ては参照により本明細書に組み込まれる)。
【０１１９】
単分子であれモジュール式であれ、ガイドRNAは、編集が所望される細胞のゲノムの中の標的配列、例えばCD40L配列の中の標的ドメインに完全又は部分的に相補的である「標的化ドメイン」を含む。標的化ドメインは、文献において様々な名称で呼ばれ、例えば、限定されずに、「ガイド配列」(参照により本明細書に組み込まれる、Hsu et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep; 31(9): 827-832, ("Hsu"))、「相補性領域」(Cotta-Ramusino)、「スペーサー」(Briner)及び総称的に「crRNA」(Jiang)が含まれる。それらに与えられる名称にかかわりなく、標的化ドメインは、長さが一般的に10〜30ヌクレオチドであり、ある特定の実施形態では、長さが16〜24ヌクレオチド(例えば、長さが16、17、18、19、20、21、22、23又は24ヌクレオチド)であり、Cas9 gRNAの場合は5'末端又はその近くにあり、Cpf1 gRNAの場合には3'末端又はその近くにある。
【０１２０】
標的化ドメインに加えて、gRNAは、gRNA/Cas9複合体の形成又は活性に影響することができる複数のドメインを一般的に(しかし、下で議論するように、そうとは限らない)含む。例えば、上で指摘した通り、gRNAの第1及び第2の相補性ドメインによって形成される二重構造(反復配列:抗反復配列二重構造とも呼ばれる)は、Cas9の認識(REC)ローブと相互作用し、Cas9/gRNA複合体の形成を媒介することができる。(Nishimasu et al., Cell 156, 935-949, February 27, 2014 (Nishimasu 2014)及びNishimasu et al., Cell 162, 1113-1126, August 27, 2015 (Nishimasu 2015)、両方とも参照により本明細書に組み込まれる)。第1及び/又は第2の相補性ドメインは、1つ以上のポリAトラクトを含有することがあり、それはRNAポリメラーゼが終止シグナルとして認識することができることに注意すべきである。したがって、第1及び第2の相補性ドメインの配列は、例えばBrinerに記載の通りにA-G交換の使用を通して、又はA-U交換の使用を通して、これらのトラクトを排除し、gRNAの完全なin vitro転写を促進するように、任意選択で改変される。第1及び第2の相補性ドメインへのこれら及び他の類似の改変は、本開示の範囲内である。
【０１２１】
第1及び第2の相補性ドメインとともに、Cas9 gRNAは、in vivoでヌクレアーゼ活性に関与しているがin vitroではそうとは限らない2つ以上のさらなる二重領域を一般的に含む。(Nishimasu 2015)。第2の相補性ドメインの3'部分の近くの第1のステムループワンは、「近位ドメイン」、(Cotta-Ramusino)「ステムループ1」(Nishimasu 2014及び2015)及び「ネクサス」(Briner)と様々に呼ばれる。1つ以上のさらなるステムループ構造は、一般的にgRNAの3'末端の近くに存在し、その数は種によって異なる:S.ピオゲネスgRNAは2つの3'ステムループを一般的に含み(反復配列:抗反復配列二重構造を含む合計4つのステムループ)、黄色ブドウ球菌及び他の種はただ1つ(合計3つのステムループ構造)を有する。種によって組織化される保存されたステムループ構造(及び、より一般的にはgRNA構造)の記載は、Brinerにおいて提供される。
【０１２２】
前述の記載はCas9との使用のためのgRNAに重点を置いているが、この点で記載されるものからいくつかの点で異なるgRNAを利用する、他のRNA誘導型ヌクレアーゼが発見又は発明されている(又は、将来発見又は発明される)ことを理解すべきである。例えば、Cpf1(「Prevotella及びFranciscella 1からのCRISPR」)は、機能するためにtracrRNAを必要としない、最近発見されたRNA誘導型ヌクレアーゼである。(Zetsche et al., 2015, Cell 163, 759-771 October 22, 2015 (Zetsche I)、参照により本明細書に組み込まれる)。Cpf1ゲノム編集システムで使用するためのgRNAは、標的化ドメイン及び相補性ドメイン(或いは、「ハンドル」とも呼ばれる)を一般的に含む。Cpf1で使用するためのgRNAでは、標的化ドメインは、Cas9 gRNAに関連して上に記載される通り5'末端ではなく3'末端又はその近くに通常存在することにも注意すべきである(ハンドルはCpf1 gRNAの5'末端又はその近くにある)。
【０１２３】
異なる原核生物の種からのgRNAの間に、又はCpf1とCas9 gRNAの間に構造的な差が存在する可能性があるが、gRNAが作動する原理は一般的に一貫していることを当業者は理解する。作動のこの一貫性のため、gRNAはそれらの標的化ドメイン配列によって大まかに定義することができ、当業者は、単分子若しくはキメラのgRNAを含む任意の好適なgRNAに、又は1つ以上の化学的改変及び/若しくは連続した改変(置換、付加ヌクレオチド、トランケーション等)を含むgRNAに、所与の標的化ドメイン配列を組み込むことができることを理解する。したがって、この開示における提示の効率的使用のために、gRNAはそれらの標的化ドメイン配列に関してだけ記載される。
【０１２４】
より一般的には、本開示の一部の態様は、複数のRNA誘導型ヌクレアーゼを使用して実行することができるシステム、方法及び組成物に関することを当業者は理解する。この理由から、特に明記しない限り、用語gRNAは、Cas9又はCpf1の特定の種に適合するgRNAだけでなく、任意のRNA誘導型ヌクレアーゼで使用することができる任意の好適なgRNAを包含すると理解するべきである。例として、用語gRNAは、ある特定の実施形態では、クラス2 CRISPRシステム、例えばタイプII若しくはタイプV若しくはCRISPRシステムに存在する任意のRNA誘導型ヌクレアーゼ、又はそこから誘導若しくは応用されるRNA誘導型ヌクレアーゼで使用するためのgRNAを含み得る。
【０１２５】
gRNA設計
標的配列の選択及び検証並びに標的外分析のための方法が、例えば、Mali; Hsu; Fu et al., 2014 Nat Biotechnol. 32(3): 279-84, Heigwer et al., 2014 Nat methods 11(2):122-3; Bae et al. (2014) Bioinformatics 30(10): 1473-5;及びXiao A et al. (2014) Bioinformatics 30(8): 1180-1182において以前に記載されている。これらの参考文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。非限定例として、gRNA設計は、例えばゲノム全体の全標的外活性を最小にするために、ユーザーの標的配列に対応する潜在的標的配列の選択を最適化するためのソフトウェアツールの使用を含み得る。標的外活性は切断に限定されないが、各標的外配列における切断効率は、例えば、実験により導かれる計量スキームを使用して予測することができる。これら及び他のガイド選択方法は、Maeder及びCotta-Ramusinoに詳細に記載される。
【０１２６】
gRNA改変
gRNAの活性、安定性又は他の特徴は、ある特定の改変の組込みを通して変更することができる。一例として、一時的に発現又は送達される核酸は、例えば細胞性ヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。したがって、本明細書に記載されるgRNAは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する1つ以上の改変されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含有することができる。理論に束縛されることを望むことなく、細胞に導入されるとき、本明細書に記載されるある特定の改変されたgRNAは、先天性免疫応答の低減を示すことができると考えられてもいる。当業者は、外因性核酸、特にウイルス又は細菌起源のものに応答して、細胞、例えば哺乳動物細胞において一般的に観察される、ある特定の細胞性応答を知っているだろう。サイトカインの発現及び放出並びに細胞死の誘導を含み得るそのような応答は、本明細書に提示される改変によって低減することができるか、又は完全に排除することができる。
【０１２７】
このセクションで議論されるある特定の例示的な改変は、5'末端若しくはその近く(例えば、5'末端から1〜10、1〜5又は1〜2ヌクレオチド以内)、及び/又は3'末端若しくはその近く(例えば、3'末端から1〜10、1〜5又は1〜2ヌクレオチド以内)を限定されずに含む、gRNA配列の中の任意の位置に含まれてもよい。一部の場合には、改変は機能的モチーフ、例えばCas9 gRNAの反復配列-抗反復配列二重構造、Cas9又はCpf1 gRNAのステムループ構造及び/又はgRNAの標的化ドメインの中に配置される。
【０１２８】
一例として、gRNAの5'末端は、以下に示すように真核生物のmRNAキャップ構造又はキャップ類似体(例えば、G(5')ppp(5')Gキャップ類似体、m7G(5')ppp(5')Gキャップ類似体又は3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G抗リバースキャップ類似体(ARCA))を含み得る:
【０１２９】
【化１】
2021500080.tif 000003
キャップ又はキャップ類似体は、gRNAの化学的合成又はin vitro転写のいずれかの間に含まれてもよい。
【０１３０】
類似の系に沿って、gRNAの5'末端は、5'三リン酸基を欠いてもよい。例えば、in vitro転写gRNAは、5'三リン酸基を除去するために、ホスファターゼ処理することができる(例えば、子ウシ腸管アルカリ性ホスファターゼを使用して)。
【０１３１】
別の一般的な改変は、gRNAの3'末端における、ポリAトラクトと呼ばれる複数(例えば、1〜10、10〜20又は25〜200個)のアデニン(A)残基の付加を含む。ポリAトラクトは、ポリアデノシンポリメラーゼ(例えば、大腸菌(E. coli)ポリ(A)ポリメラーゼ)を使用してin vitro転写の後に化学的合成の間に、又はMaederに記載の通りに、ポリアデニル化配列によりin vivoでgRNAに加えることができる。
【０１３２】
本明細書に記載される改変は任意の好適な様式で組み合わせることができ、例えば、DNAベクターからin vivo転写されたgRNAであれin vitro転写gRNAであれ、5'キャップ構造又はキャップ類似体の一方又は両方及び3'ポリAトラクトを含み得ることに注意すべきである。
【０１３３】
ガイドRNAは、3'末端Uリボースで改変することができる。例えば、以下に示すように、Uリボースの2つの末端ヒドロキシル基はアルデヒド基に酸化することができ、リボース環の同時開口は改変されたヌクレオシドを与える:
【０１３４】
【化２】
2021500080.tif 000004
ここで、「U」は未改変又は改変されたウリジンであってよい。
【０１３５】
3'末端Uリボースは、以下に示すように2'3'環状リン酸で改変することができる:
【０１３６】
【化３】
2021500080.tif 000005
ここで、「U」は未改変又は改変されたウリジンであってよい。
【０１３７】
ガイドRNAは、例えば、本明細書に記載される改変ヌクレオチドの1つ以上を組み込むことによって、分解に対して安定化させることができる3'ヌクレオチドを含有することができる。ある特定の実施形態では、ウリジンは、改変されたウリジン、例えば、5-(2-アミノ)プロピルウリジン及び5-ブロモウリジン、又は本明細書に記載される改変されたウリジンのいずれかで置き換えることができる;アデノシン及びグアノシンは、例えば8位の改変を有する改変されたアデノシン及びグアノシン、例えば8-ブロモグアノシンで、又は本明細書に記載される改変されたアデノシン又はグアノシンのいずれかで置き換えることができる。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、糖改変リボヌクレオチドをgRNAに組み込むことができ、例えば、ここで、2'-OH基は、H、-OR、-R(ここで、Rは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であってよい)、ハロ、-SH、-SR(ここで、Rは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であってよい)、アミノ(ここで、アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ又はアミノ酸であってよい);又はシアノ(-CN)から選択される基で置き換えられる。ある特定の実施形態では、リン酸主鎖は本明細書に記載される通りに、例えばホスホチオエート(PhTx)基で改変することができる。ある特定の実施形態では、gRNAのヌクレオチドの1つ以上は、各々独立して、2'-糖改変、例えば、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチル、又は2'-フルオロ改変、例えば、2'-F又は2'-O-メチル、アデノシン(A)、2'-F又は2'-O-メチル、シチジン(C)、2'-F又は2'-O-メチル、ウリジン(U)、2'-F又は2'-O-メチル、チミジン(T)、2'-F又は2'-O-メチル、グアノシン(G)、2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン(Teo)、2'-O-メトキシエチルアデノシン(Aeo)、2'-O-メトキシエチル-5-メチルシチジン(m5Ceo)、及びその任意の組合せを限定されずに含む、改変されたか未改変のヌクレオチドであってよい。
【０１３９】
ガイドRNAは、2'-OH基を、例えばC1-6アルキレン又はC1-6ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の4'炭素に接続することができる、「ロック」核酸(LNA)を含むこともできる。そのような架橋を提供するために任意の好適な部分を使用することができ、例えばメチレン、プロピレン、エーテル又はアミノ架橋;O-アミノ(ここで、アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノであってよい)及び、アミノアルコキシ又はO(CH2)n-アミノ(ここで、アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノであってよい)が限定されずに含まれる。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、gRNAは、多環式である改変されたヌクレオチド(例えばトリシクロ;及び「アンロックド」形態、例えばグリコール核酸(GNA)(例えば、R-GNA又はS-GNA、ここで、リボースはホスホジエステル結合に結合したグリコール単位と置き換えられる)、又はトレオース核酸(TNA、ここで、リボースはα-L-トレオフラノシル-(3'→2')で置き換えられる)を含み得る。
【０１４１】
一般的に、gRNAは糖基リボースを含み、それは酸素を有する5員環である。例示的な改変されたgRNAは、限定されずに、リボース中の酸素の置換(例えば、硫黄(S)、セレニウム(Se)又はアルキレン、例えば、メチレン若しくはエチレンによる);二重結合の付加(例えば、シクロペンテニル又はシクロヘキセニルによってリボースを置き換えるために);リボースの環縮小(例えば、シクロブタン又はオキセタンの4員環を形成するために);リボースの環拡張(例えば、ホスホロアミデート主鎖も有する、さらなる炭素又はヘテロ原子を有する6-又は7員環、例えばアンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル及びモルホリノを形成するために)を含み得る。大半の糖類似体変更は2'位に局在化されるが、4'位を含む他の部位が改変に適合する。ある特定の実施形態では、gRNAは、4'-S、4'-Se又は4'-C-アミノメチル-2'-O-Me改変を含む。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、デアザヌクレオチド、例えば、7-デアザアデノシンをgRNAに組み込むことができる。ある特定の実施形態では、O-及びN-アルキル化ヌクレオチド、例えば、N6-メチルアデノシンをgRNAに組み込むことができる。ある特定の実施形態では、gRNAの中のヌクレオチドの1つ以上又は全ては、デオキシヌクレオチドである。
【０１４３】
CD40Lドナー鋳型
この開示によるドナー鋳型、例えばオリゴヌクレオチドドナー鋳型は、一本鎖若しくは二本鎖DNA、線状若しくは環状、裸の若しくはベクターの中に含まれる、及び/又はガイドRNAと共有結合若しくは非共有結合で結合した(例えば、直接ハイブリダイゼーション又はスプリントハイブリダイゼーションによる)を限定されずに含む、任意の好適な方法で実行することができる。一部の好ましいドナー鋳型設計は、図1に図式的に表される。
【０１４４】
一部の実施形態では、ドナー鋳型は、ssODNである。線状のssODNが使用される場合、それは、(i)標的核酸のニック入りの鎖にアニールする、(ii)標的核酸のインタクトな鎖にアニールする、(iii)標的核酸のプラス鎖にアニールする、及び/又は(iv)標的核酸のマイナス鎖にアニールするように構成することができる。ssODNは、任意の好適な長さ、例えば、約150〜200ヌクレオチド(例えば、150、160、170、180、190又は200ヌクレオチド)又はそれ以下を有することができる。他の実施形態では、ssODNは約100〜3000ヌクレオチド、例えば、約100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900又は3000ヌクレオチドの長さを有する。他の実施形態では、ssODNは、少なくとも100〜3000ヌクレオチド、例えば、少なくとも100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900又は3000ヌクレオチドの長さを有する。他の実施形態では、ssODNは、100以下〜3000ヌクレオチド、例えば、100以下、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900又は3000ヌクレオチドの長さを有する。
【０１４５】
他の実施形態では、ドナー鋳型は、dsODNである。一実施形態では、ドナー鋳型は、第1の鎖を含む。別の実施形態では、ドナー鋳型は、第1の鎖及び第2の鎖を含む。dsODNは、任意の好適な長さ、例えば、約150〜200塩基対(例えば、150、160、170、180、190又は200塩基対)又はそれ以下を有することができる。他の実施形態では、dsODNは、約100〜3000塩基対、例えば、約100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900又は3000塩基対の長さを有する。他の実施形態では、dsODNは、少なくとも100〜3000塩基対、例えば、少なくとも100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900又は3000塩基対の長さを有する。他の実施形態では、dsODNは、100以下〜3000塩基対、例えば、100以下、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900又は3000塩基対の長さを有する。
【０１４６】
一部の実施形態では、ドナー鋳型は、外因性オリゴヌクレオチド、例えば、細胞に天然に存在しないオリゴヌクレオチドである。
【０１４７】
ドナー鋳型は、核酸ベクター、例えば、ウイルスゲノム又は環状二本鎖DNA、例えばプラスミドの中に含まれてもよいことに注意すべきである。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、犬の骨形のDNAであってよい(例えば、米国特許第9,499,847号を参照)。ドナー鋳型を含む核酸ベクターは、他のコード又は非コードエレメントを含み得る。例えば、ドナー鋳型核酸は、ある特定のゲノム主鎖エレメント(例えば、AAVゲノムの場合、逆方向末端反復配列)を含み、gRNA及び/又はRNA誘導型ヌクレアーゼをコードするさらなる配列を任意選択で含む、ウイルスゲノム(例えば、AAV又はレンチウイルスゲノム)の一部として送達することができる。ある特定の実施形態では、ドナー鋳型は、同じgRNAを使用して、細胞DNAの中に形成される対応するSSB又はDSBの修復に参加することができるドナー鋳型の片方又は両方の末端での遊離DSBの形成を促進するために、1つ以上のgRNAによって認識される標的部位に近接又は隣接することができる。ドナー鋳型として使用するのに好適な例示的な核酸ベクターは、Cotta-Ramusinoに記載される。一実施形態では、ドナー鋳型は、AAV6ベクターの中に存在する。別の実施形態では、ドナー鋳型は、IDLVベクターの中に存在する。
【０１４８】
A.相同腕
一本鎖であれ二本鎖であれ、ドナー鋳型は、切断する標的配列、例えば切断部位の内部又は近くの(例えば、隣接又は近接する)DNAの領域、例えば標的核酸、CD40L配列に相同性である1つ以上の領域を一般的に含む。これらの相同性の領域は「相同腕」とここで呼ばれ、図1に図式的に例示される。
【０１４９】
本明細書に記載されるドナー鋳型の相同腕は、任意の好適な長さであってよいが、ただし、そのような長さは、ドナー鋳型を必要とするDNA修復プロセスによる、標的化核酸の上の切断部位の効率的な分解能を可能にするのに十分である。一部の実施形態では、例えばPCRによる相同腕の増幅が所望される場合、相同腕は、増幅を実行することができるような長さである。一部の実施形態では、相同腕のシークエンシングが所望される場合、相同腕は、シークエンシングを実行することができるような長さである。一部の実施形態では、アンプリコンの定量的評価が所望される場合、相同腕は、例えば、類似のG/C含有量、増幅温度等を有することによって各アンプリコンの類似の回数の増幅が達成されるような長さである。一部の実施形態では、相同腕は、二本鎖である。一部の実施形態では、二本鎖相同腕は一本鎖である。
【０１５０】
一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが150〜250ヌクレオチドの間にある。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが700ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが650ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが600ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが550ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが500ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが400ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが300ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが250ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが200ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが150ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが100ヌクレオチド未満である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが50ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21又は20ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが40ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが250ヌクレオチド以下である。他の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも50ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも100ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも150ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも200ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも250ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも300ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも350ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも40
0ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも450ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも500ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも550ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも600ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも650ヌクレオチドである。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも700ヌクレオチドである。一実施形態では、5'相同腕は、長さが200〜700ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが200〜300ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが200〜400ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが200〜500ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが400〜700ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが500〜700ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが約500ヌクレオチドである。
【０１５１】
一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが150〜250ヌクレオチドの間にある。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが700ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが650ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが600ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが550ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが500ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが400ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが300ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが200ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが150ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが100ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが50ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21又は20ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが40ヌクレオチドである。他の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも50ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも100ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも150ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも200ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも250ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも300ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも350ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも400ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも450ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少
なくとも500ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも550ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも600ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも650ヌクレオチドである。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも700ヌクレオチドである。一実施形態では、3'相同腕は、長さが200〜700ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが200〜300ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが200〜400ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが200〜500ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが400〜700ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが500〜700ヌクレオチドの間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが約500ヌクレオチドである。
【０１５２】
一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが150塩基対から250塩基対の間にある。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが700塩基対以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが650塩基対以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが600塩基対以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが550塩基対以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが500塩基対以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが400塩基対以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが300塩基対以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが250塩基対以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが200塩基対以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが150塩基対以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが100塩基対未満である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが50塩基対以下である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21又は20塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが40塩基対である。他の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも50塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも100塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも150塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも200塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも250塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも300塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも350塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも400塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも450塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも500塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さ
が少なくとも550塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも600塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも650塩基対である。一部の実施形態では、5'相同腕は、長さが少なくとも700塩基対である。一実施形態では、5'相同腕は、長さが200〜700塩基対の間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが200〜300塩基対の間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが200〜400塩基対の間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが200〜500塩基対の間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが400〜700塩基対の間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが500〜700塩基対の間にある。一実施形態では、5'相同腕は、長さが約500塩基対である。
【０１５３】
一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが150塩基対から250塩基対の間にある。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが700塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが650塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが600塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが550塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが500塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが400塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが300塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが250塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが200塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが150塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが100塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが50塩基対以下である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21又は20塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが40塩基対である。他の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも50塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも100塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも150塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも200塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも250塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも300塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも350塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも400塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも450塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも500塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さ
が少なくとも550塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも600塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも650塩基対である。一部の実施形態では、3'相同腕は、長さが少なくとも700塩基対である。一実施形態では、3'相同腕は、長さが200〜700塩基対の間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが200〜300塩基対の間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが200〜400塩基対の間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが200〜500塩基対の間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが400〜700塩基対の間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが500〜700塩基対の間にある。一実施形態では、3'相同腕は、長さが約500塩基対である。
【０１５４】
5'及び3'相同腕は、同じ長さであってよいか、又は長さが異なってもよい。一部の実施形態では、標的核酸、例えばCD40Lにおける遺伝子編集事象、例えば標的化組込みの定量的な評価を可能にするために、5'及び3'相同腕は増幅される。一部の実施形態では、遺伝子編集事象の定量的な評価は、単一の増幅反応において単一のPCRプライマー対を使用して相同腕の全体又は一部を増幅することによる、標的化組込み部位の5'接合部と3'接合部の両方の増幅に頼ることができる。したがって、5'及び3'相同腕の長さは異なってもよいが、所望により、各相同腕の長さは増幅が可能であるべきである(例えば、PCRを使用して)。さらに、単一のPCR反応において5'及び5'と3'相同腕の長さの差の両方の増幅が所望される場合、5'と3'相同腕の間の長さの差は、単一のPCRプライマー対を使用したPCR増幅を可能にするべきである。
【０１５５】
一部の実施形態では、5'及び3'相同腕の長さは、75ヌクレオチドを超えて異ならない。したがって、一部の実施形態では、5'及び3'相同腕の長さが異なる場合、相同腕の間の長さの差は、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1ヌクレオチド又は塩基対未満である。一部の実施形態では、5'及び3'相同腕は、長さが少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74又は75ヌクレオチド異なる。一部の実施形態では、5'及び3'相同腕の間の長さの差は、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1塩基対未満である。一部の実施形態では、5'及び3'相同腕は、長さが少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74又は75塩基対異なる。
【０１５６】
どのフォーマットを使用しようが、ドナー鋳型は、望ましくない配列を回避するように設計することができる。ある特定の実施形態では、ある特定の配列反復エレメント、例えば、Alu反復配列、LINEエレメント等との重複を回避するために、片方又は両方の相同腕を短縮することができる。
【０１５７】
B.カーゴ  -  CD40Lエクソン
本明細書に記載される遺伝子編集システムのドナー鋳型は、カーゴ(例えば、CD40L遺伝子修正カーゴ)を含む。本明細書に開示されるカーゴは、CD40L核酸のエクソン2〜5の1つ以上を含み得る。カーゴは、所望の結果を達成するために必要な任意の長さであってよい。例えば、カーゴ配列は、長さが2500塩基対未満又は2500ヌクレオチド未満であってよい。ドナー鋳型がサイズ限界を有する送達ビヒクル(例えば、ウイルスの送達ビヒクル、例えばアデノ随伴ウイルス(AAV)又は単純ヘルペスウイルス(HSV)送達ビヒクル)を使用して送達される場合、カーゴを含むドナー鋳型のサイズは、送達システムのサイズ限界を超えるべきでないことを当業者は容易に確認する。
【０１５８】
一部の実施形態では、カーゴは、置換配列を含む。一実施形態では、置換配列は、野生型CD40L配列である。一実施形態では、置換配列はコドン最適化CD40L配列であり、それはCD40Lタンパク質の翻訳を増加させるだろう。一実施形態では、野生型CD40L配列は、CD40Lを非機能的にするかその発現及び/又はスプライシングに影響を及ぼすだろう突然変異を含まない。
【０１５９】
一部の実施形態では、カーゴは、遺伝子配列CD40Lのエクソンの全部又は一部、例えばCD40Lのエクソン2、3、4及び5の1つ以上の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン2の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン3の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン4の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン5の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン2〜5の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン2及び3の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン2〜4の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン3及び4の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン3〜5の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン3及び5の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン4及び5の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、カーゴは、CD40Lのエクソン1を含まない。好ましい実施形態では、カーゴは、CD40Lの前にスプライスアクセプター(SA)シグナルを含む。
【０１６０】
CD40L遺伝子の配列並びにエクソン及びイントロン境界は、当業者に周知である。一実施形態では、CD40L mRNA配列は、少なくともNM_000074に記載され、その全内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。一実施形態では、X染色体のCD40L RefSeq遺伝子配列は、少なくともNG_007280.1に記載され、その全内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本明細書に記載されるように、一部の実施形態では、CD40Lの1つ以上のエクソンのコドン最適化バージョンをドナー鋳型で使用することができる。CD40Lのエクソン2〜5の例示的なコドン最適化バージョンは、配列番号48で提供される。
【０１６１】
2021500080.tif 000006
2021500080.tif 000007
2021500080.tif 000008
2021500080.tif 000009
【０１６２】
一部の実施形態では、カーゴは、遺伝子配列のイントロンを含む。一部の実施形態では、カーゴは、cDNA配列を含む。一部の実施形態では、カーゴは、転写調節エレメントを含む。一部の実施形態では、カーゴは、置換配列の逆相補体、遺伝子配列のエクソン、遺伝子配列のイントロン、cDNA配列又は転写調節エレメントを含む。一部の実施形態では、カーゴは、置換配列の一部、遺伝子配列のエクソン、遺伝子配列のイントロン、cDNA配列又は転写調節エレメントを含む。
【０１６３】
ドナー鋳型の中の置換配列は、Cotta-Ramusinoらを含む他の文献に記載されている。置換配列は、任意の好適な長さ(所望の修復結果が欠失である、0ヌクレオチドを含む)であってよく、編集が所望される細胞の中の天然に存在する配列と比較して、1、2、3又はそれより多くの配列改変を一般的に含む。1つの一般的な配列改変は、処置が所望される疾患又は状態に関連している突然変異を修復するための、天然に存在する配列の変更を含む。別の一般的な配列改変は、置換配列が標的部位に組み込まれた後に標的部位の反復切断を低減又は排除するための、RNA誘導型ヌクレアーゼのPAM配列又はSSB若しくはDSBを生成するために使用されるgRNAの標的化ドメインに相補的であるかそれをコードする1つ以上の配列の変更を含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドドナー鋳型は、レポーターをコードする配列をさらに含み得る。一実施形態では、レポーターは、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFB)、DS-Red又はルシフェラーゼである。一実施形態では、レポーターは、当技術分野で標準の方法を使用して生細胞において検出することができるマーカー、例えば、抗体によって検出可能な表面抗原、光学的に検出可能な生成物を生成する化学反応を触媒するかさもなければ促進するペプチド、例えばルシフェラーゼであってよい。一実施形態では、レポーターは、選択マーカーである。例示的な実施形態では、選択マーカーは、低親和性の神経成長因子受容体(NGFR)である。他の実施形態では、選択マーカーは、薬剤耐性タンパク質(例えば、ネオマイシン又はピューロマイシン耐性、MGMT遺伝子の突然変異体バージョン)、細胞表面タンパク質(例えばCD19、EGFR)のトランケーションバージョン、編集された細胞のin vivo移植の後に選択的成長及び/又は生着利点を付与する遺伝子(例えばCXCR4、CD47、IL2受容体)、又は蛍光性レポータータンパク質(例えば、緑色蛍光性タンパク質(GFP)、青色蛍光性タンパク質(BFP)、黄色蛍光性タンパク質(YFP)等、又はその組合せであってよい。
【０１６５】
C.スタッファー
一部の実施形態では、ドナー鋳型は、1つ以上のスタッファー配列を任意選択で含み得る。一般的に、スタッファー配列は、(a)標的部位への本開示のドナー鋳型の標的化組込み、及びこの開示のある特定の方法によるスタッファー配列を含むアンプリコンの以降の増幅を促進する(又は、阻害しない)ように、しかし、(b)別の部位へのドナー鋳型の組込みの推進を回避するように選択された、非相同的又はランダムな核酸配列である。スタッファー配列は、例えば、ドナー鋳型配列が標的部位に組み込まれるときに生成されるアンプリコンのサイズを調整するために、相同腕とCD40Lエクソン配列の間に配置することができる。そのようなサイズ調整は、一例として、組み込まれた及び組み込まれていない標的部位によって生成されるアンプリコンのサイズのバランスをとり、その結果として、各アンプリコンが単一のPCR反応において生成される効率のバランスをとるために用いることができ;これは、反応混合物における2つのアンプリコンの相対的存在度に基づいて、標的化組込みの率の定量的評価を促進することができる。
【０１６６】
標的化組込み及び増幅を促進するために、スタッファー配列は、DNA修復機構による(例えば、相同組換えを通した)切断部位の分解能に干渉することがあるか、又は増幅に干渉することがある、二次構造の形成を最小にするように選択することができる。
【０１６７】
一実施形態では、第1のスタッファーは、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも105、少なくとも110、少なくとも115、少なくとも120、少なくとも125、少なくとも130、少なくとも135、少なくとも140、少なくとも145、少なくとも150、少なくとも155、少なくとも160、少なくとも165、少なくとも170、少なくとも175、少なくとも180、少なくとも185、少なくとも190、少なくとも195、少なくとも200、少なくとも205、少なくとも210、少なくとも215、少なくとも220、少なくとも225、少なくとも230、少なくとも235、少なくとも240、少なくとも245、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも325、少なくとも350、少なくとも375、少なくとも400、少なくとも425、少なくとも450、少なくとも475又は少なくとも500ヌクレオチドを含む配列を有する。別の実施形態では、第2のスタッファーは、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも105、少なくとも110、少なくとも115、少なくとも120、少なくとも125、少なくとも130、少なくとも135、少なくとも140、少なくとも145、少なくとも150、少なくとも155、少なくとも160、少なくとも165、少なくとも170、少なくとも175、少なくとも180、少なくとも185、少なくとも190、少なくとも195、少なくとも200、少なくとも205、少なくとも210、少なくとも215、少なくとも220、少なくとも225、少なくとも230、少なくとも235、少なくとも240、少なくとも245、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも325、少なくとも350、少なくとも375、少なくとも400、少なくとも425、少なくとも450、少なくとも475又は少なくとも500ヌクレオチドを含む配列を有する。
【０１６８】
スタッファー配列は、標的核酸の切断部位の分解能に干渉しないことが好ましい。したがって、スタッファー配列は、標的核酸の切断部位の核酸配列に最小限の配列同一性を有するべきである。一部の実施形態では、スタッファー配列は、標的核酸の切断部位から500、450、400、350、300、250、200、150、100、50ヌクレオチドの範囲内の任意の核酸配列と80%未満、70%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%又は10%同一である。一部の実施形態では、スタッファー配列は、標的核酸の切断部位から500、450、400、350、300、250、200、150、100、50塩基対の範囲内の任意の核酸配列と80%未満、70%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%又は10%同一である。
【０１６９】
標的外分子組換え事象を避けるために、スタッファー配列は標的細胞のゲノムの中の核酸配列と最小限の相同性を有することが好ましい。一部の実施形態では、スタッファー配列は、標的細胞のゲノムの中の核酸と最小限の配列同一性を有する。一部の実施形態では、スタッファー配列は、標的細胞のゲノムの中の同じ長さの任意の核酸配列と80%未満、70%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%又は10%同一である(塩基対又はヌクレオチドで測定したとき)。一部の実施形態では、スタッファー配列の20塩基対のひと続きは、標的細胞ゲノムの任意の少なくとも20塩基対のひと続きの核酸と80%未満、70%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%又は10%同一である。一部の実施形態では、スタッファー配列の20ヌクレオチドのひと続きは、標的細胞ゲノムの任意の少なくとも20ヌクレオチドのひと続きの核酸と60%未満、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%又は10%同一である。
【０１７０】
一部の実施形態では、スタッファー配列は、ドナー鋳型の中の核酸配列(例えば、カーゴの核酸配列又はドナー鋳型に存在するプライミング部位の核酸配列)と最小限の配列同一性を有する。一部の実施形態では、スタッファー配列は、ドナー鋳型の中の同じ長さの任意の核酸配列と80%未満、70%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%又は10%同一である(塩基対又はヌクレオチドで測定したとき)。一部の実施形態では、スタッファー配列の20塩基対のひと続きは、ドナー鋳型の任意の20塩基対のひと続きの核酸と80%未満、70%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%又は10%同一である。一部の実施形態では、スタッファー配列の20ヌクレオチドのひと続きは、ドナー鋳型の任意の20ヌクレオチドのひと続きの核酸と80%未満、70%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%又は10%同一である。
【０１７１】
スタッファー配列は、その全内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる、2017年7月14日に出願の米国仮出願第62/532,509号にさらに詳細に記載される。
【０１７２】
RNA誘導型ヌクレアーゼ
本開示によるRNA誘導型ヌクレアーゼには、限定されずに、天然に存在するクラス2 CRISPRヌクレアーゼ、例えばCas9、及びCpf1、並びにそれから導かれるか得られる他のヌクレアーゼが含まれる。機能の点から、RNA誘導型ヌクレアーゼは、(a)gRNAと相互作用する(例えば、複合体を形成する);及び(b)gRNAと一緒に、(i)gRNAの標的化ドメインに相補的な配列、及び任意選択で、(ii)下でさらに詳しく記載される、「プロトスペーサー隣接モチーフ」又は「PAM」と呼ばれるさらなる配列を含むDNAの標的領域と結合し、任意選択でそれを切断又は改変するヌクレアーゼと定義される。下の例が例示するように、RNA誘導型ヌクレアーゼは、それらのPAM特異性及び切断活性によって広い観点から定義することができるが、同じPAM特異性又は切断活性を共有する個々のRNA誘導型ヌクレアーゼの間に変動が存在することができる。本開示の一部の態様は、ある特定のPAM特異性及び/又は切断活性を有する任意の好適なRNA誘導型ヌクレアーゼを使用して実行することができるシステム、方法及び組成物に関することを、当業者は理解する。この理由から、特に明記しない限り、用語RNA誘導型ヌクレアーゼは総称であって、RNA誘導型ヌクレアーゼのいかなる特定のタイプ(例えば、Cas9対Cpf1)、種(例えば、S.ピオゲネス対S.アウレウス)又は変異形(例えば、完全長対トランケーション型又はスプリット型;天然に存在するPAM特異性対工学操作PAM特異性等)にも限定されないと理解するべきである。
【０１７３】
PAM配列は、gRNA標的化ドメイン(又は、「スペーサー」)に相補的な「プロトスペーサー」配列との連続的な関係からその名称をとる。プロトスペーサー配列と一緒に、PAM配列は、特異的RNA誘導型ヌクレアーゼ/gRNA組合せのために、標的領域又は配列を規定する。
【０１７４】
様々なRNA誘導型ヌクレアーゼは、PAMとプロトスペーサーの間で異なる連続的な関係を必要とするかもしれない。一般に、Cas9sは、ボトム又は非相補的鎖の上で可視化される通り、プロトスペーサーの3'側にあるPAM配列を認識する:
2021500080.tif 000010
【０１７５】
他方、Cpf1は、ボトム又は非相補的鎖の上で可視化される通り、プロトスペーサーの5'側にあるPAM配列を一般的に認識する:
2021500080.tif 000011
【０１７６】
PAM及びプロトスペーサーの特異的な連続的配向を認識することに加えて、RNA誘導型ヌクレアーゼは、特異的PAM配列を認識することもできる。S.アウレウスCas9は、例えば、NNGRRT又はNNGRRVのPAM配列を認識し、ここで、N残基は、gRNA標的化ドメインによって認識される領域の直ぐ3'側にある。S.ピオゲネスCas9は、NGGのPAM配列を認識する。F.ノビシダ(F. novicida)のCpf1は、TTNのPAM配列を認識する。様々なRNA誘導型ヌクレアーゼに関してPAM配列が同定されており、新規PAM配列を同定するための戦略が、Shmakov et al., 2015, Molecular Cell 60, 385-397, November 5, 2015に記載されている。工学操作RNA誘導型ヌクレアーゼが、参照分子のPAM特異性と異なるPAM特異性を有することができることにも注意すべきである(例えば、工学操作RNA誘導型ヌクレアーゼの場合、参照分子は、RNA誘導型ヌクレアーゼが由来する、天然に存在する変異体、又は工学操作RNA誘導型ヌクレアーゼに最大のアミノ酸配列相同性を有する、天然に存在する変異体であってもよい)。
【０１７７】
それらのPAM特異性に加えて、RNA誘導型ヌクレアーゼは、それらのDNA切断活性によって特徴付けることができる:天然に存在するRNA誘導型ヌクレアーゼは標的核酸においてDSBを一般的に形成するが、SSBだけを生成する(上で議論される)(Ran & Hsu, et al., Cell 154(6), 1380-1389, September 12, 2013 (Ran)、参照により本明細書に組み込まれる)か又は全く切断しない工学操作変異体が生成されている。
【０１７８】
Cas9
S.ピオゲネスCas9(Jinek 2014)及びS.アウレウスCas9のための、単分子ガイドRNA及び標的DNAと複合体を形成した結晶構造が決定されている(Nishimasu 2014; Anders 2014;及びNishimasu 2015)。
【０１７９】
天然に存在するCas9タンパク質は、2つのローブを含む:認識(REC)ローブ及びヌクレアーゼ(NUC)ローブ;各々は特定の構造的及び/又は機能的ドメインを含む。RECローブは、冨アルギニン架橋ヘリックス(BH)ドメイン及び少なくとも1つのRECドメイン(例えば、REC1ドメイン及び、任意選択で、REC2ドメイン)を含む。RECローブは他の公知のタンパク質と構造類似性を共有せず、それが特異な機能的ドメインであることを示す。いかなる理論によっても束縛されることを望まないが、突然変異分析は、BH及びRECドメインのための特異的な機能的役割を示唆する:BHドメインはgRNA:DNA認識において役割をするようであり、RECドメインは、gRNAの反復配列:抗反復二重鎖と相互作用し、Cas9/gRNA複合体の形成を媒介すると考えられる。
【０１８０】
NUCローブは、RuvCドメイン、HNHドメイン及びPAMと相互作用する(PI)ドメインを含む。RuvCドメインはレトロウイルスのインテグラーゼスーパーファミリーメンバーと構造類似性を共有し、標的核酸の非相補(すなわち、ボトム)鎖を切断する。それは、2つ以上のスプリットRuvCモチーフ(例えば、s.ピオゲネス及びs.アウレウスのRuvCI、RuvCII及びRuvCIII)から形成することができる。一方、HNHドメインは、HNNエンドヌクレアーゼモチーフと構造的に類似し、標的核酸の相補(すなわち、トップ)鎖を切断する。その名称が示唆する通り、PIドメインはPAM特異性に寄与する。
【０１８１】
Cas9のある特定の機能は上に示す特異的ドメインに関連している(しかし、必ずしもそれによって完全に決定されるわけではない)が、これら及び他の機能は、他のCas9ドメインが、又はいずれかのローブの上の複数のドメインが媒介又は影響することができる。例えば、Nishimasu 2014に記載の通りに、S.ピオゲネスCas9では、gRNAの反復配列:抗反復二重鎖は、RECとNUCローブの間の溝に入り、二重鎖の中のヌクレオチドは、BH、PI及びRECドメインのアミノ酸と相互作用する。第2及び第3のステムループ(RuvC及びPIドメイン)の一部のヌクレオチドがそうするように、第1のステムループ構造の中の一部のヌクレオチドは、複数のドメイン(PI、BH及びREC1)のアミノ酸とも相互作用する。
【０１８２】
Cpf1
crRNA及びTTTN PAM配列を含む二本鎖(ds)DNA標的と複合体を形成したアシドアミノコッカス属(Acidaminococcus)の種のCpf1の結晶構造が、Yamanoら(Yamano et al. (Cell. 2016 May 5; 165(4): 949-962 (Yamano)、参照により本明細書に組み込まれる)によって解決されている。Cas9と同様に、Cpf1は、2つのローブを有する:REC(認識)ローブ及びNUC(ヌクレアーゼ)ローブ。RECローブはREC1及びREC2ドメインを含み、それらはいかなる公知のタンパク質構造との類似性も欠いている。一方、NUCローブは、3つのRuvCドメイン(RuvC-I、-II及び-III)及びBHドメインを含む。しかし、Cas9と対照的に、Cpf1 RECローブはHNHドメインを欠いており、公知のタンパク質構造との類似性を同じく欠いている他のドメインを含む:構造的に特異なPIドメイン、3つのWedge(WED)ドメイン(WED-I、-II及び-III)及びヌクレアーゼ(Nuc)ドメイン。
【０１８３】
Cas9及びCpf1は構造及び機能において類似性を共有するが、ある特定のCpf1活性はいかなるCas9ドメインにも類似していない構造ドメインによって媒介されることを認識するべきである。例えば、標的DNAの相補鎖の切断はNucドメインによって媒介されるようであり、そのことは、Cas9のHNHドメインと順序的及び空間的に異なる。さらに、Cpf1 gRNAの非標的化部分(ハンドル)は、Cas9 gRNAにおいて反復配列:抗反復二重鎖によって形成されるステムループ構造ではなく偽ノット構造を採択する。
【０１８４】
RNA誘導型ヌクレアーゼの改変
上記のRNA誘導型ヌクレアーゼは、様々な適用において役立つことができる活性及び特性を有するが、RNA誘導型ヌクレアーゼは、ある特定の場合には、切断活性、PAM特異性又は他の構造的若しくは機能的フィーチャーを変更するために改変することもできることを当業者は理解する。
【０１８５】
切断活性を変更する改変に先ず目を向けるとして、NUCローブの中のドメインの活性を低減又は排除する突然変異が上に記載された。RuvCドメイン、Cas9 HNHドメイン又はCpf1 Nucドメインにおいて作製することができる例示的な突然変異は、Ran及びYamano、並びにCotta-Ramusinoに記載される。一般に、2つのヌクレアーゼドメインの1つにおいて活性を低減又は排除する突然変異は、ニッカーゼ活性を有するRNA誘導型ヌクレアーゼをもたらすが、ニッカーゼ活性のタイプは、どのドメインが不活性化されるかによって異なることに注意すべきである。一例として、Cas9のRuvCドメインの不活性化は、相補又はトップ鎖を切断するニッカーゼをもたらす。他方、Cas9 HNHドメインの不活性化は、ボトム又は非相補鎖を切断するニッカーゼをもたらす。
【０１８６】
天然に存在するCas9参照分子と比較したPAM特異性の改変は、KleinstiverらによってS.ピオゲネス(Kleinstiver et al., Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5 (Kleinstiver I))及びS.アウレウス(Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec; 33(12): 1293-1298 (Klienstiver II))の両方について記載されている。Kleinstiverらは、Cas9の標的化忠実度を向上させる改変も記載している(Nature, 2016 January 28; 529, 490-495 (Kleinstiver III))。これらの参考文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８７】
Zetscheら(Nat Biotechnol. 2015 Feb; 33(2):139-42 (Zetsche II)、参照により組み込まれる)及びFineら(Sci. Rep. 2015 Jul 1;5:10777 (Fine)、参照により組み込まれる)によって記載されるように、RNA誘導型ヌクレアーゼは2つ以上の部分に分割されている。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼは、例えば、gRNA結合、標的及びPAM認識並びに切断活性をなお保持しつつ、ヌクレアーゼのサイズを低減する1つ以上の欠失を通して、サイズを最適化するかトランケーションすることができる。ある特定の実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼは、任意選択でリンカーによって、別のポリペプチド、ヌクレオチド又は他の構造に、共有結合又は非共有結合的に結合される。例示的な結合したヌクレアーゼ及びリンカーは、Guilingerら、Nature Biotechnology 32, 577-582 (2014)によって記載され、それは全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８９】
RNA誘導型ヌクレアーゼは、タグ、例えば、限定されずに、RNA誘導型ヌクレアーゼタンパク質の核内への移動を促進するための核局在化シグナルも任意選択で含む。ある特定の実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼは、C末端及び/又はN末端核局在化シグナルを組み込むことができる。核局在化配列は当技術分野で公知であり、Maederに及び他の文献に記載される。
【０１９０】
改変の上述のリストは、元来例示するものであり、当業者は、本開示に照らして、ある特定の適用において他の改変が可能であるか望ましいかもしれないことを理解する。簡潔さのために、したがって、本開示の例示的なシステム、方法及び組成物が、特定のRNA誘導型ヌクレアーゼに関して提示されるが、使用されるRNA誘導型ヌクレアーゼは、それらの作動原理を変更しない方法で改変することができることを理解すべきである。そのような改変は、本開示の範囲内にある。
【０１９１】
RNA誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸
RNA誘導型ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1又はその機能的断片をコードする核酸が、本明細書で提供される。RNA誘導型ヌクレアーゼをコードする例示的な核酸は、以前に記載されている(例えば、Cong 2013;Wang 2013;Mali 2013;Jinek 2012を参照)。
【０１９２】
一部の場合には、RNA誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、合成核酸配列であってよい。例えば、合成核酸分子は、化学修飾されてもよい。ある特定の実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼをコードするmRNAは、以下の特性の1つ以上(例えば、全て)を有する:キャップすること;ポリアデニル化すること;並びに5-メチルシチジン及び/又はプソイドウリジンで置換することができる。
【０１９３】
合成核酸配列はコドン最適化することもでき、例えば、少なくとも1つの一般的でないコドン又はより一般的でないコドンが一般的なコドンで置き換えられている。例えば、合成核酸は、最適化された、例えば、例えば本明細書に記載される哺乳動物の発現システムにおける発現のために最適化された、メッセンジャーmRNAの合成を誘導することができる。コドン最適化Cas9コード配列の例は、Cotta-Ramusinoに提示されている。
【０１９４】
さらに、又は或いは、RNA誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、核局在化配列(NLS)を含み得る。核局在化配列は、当技術分野で公知である。
【０１９５】
候補分子の機能分析
候補RNA誘導型ヌクレアーゼ、gRNA及びその複合体は、当技術分野で公知である標準の方法によって評価することができる。例えば、Cotta-Ramusinoを参照する。RNP複合体の安定性は、下記の通り、示差走査蛍光分析によって評価することができる。
【０１９６】
示差走査蛍光分析(DSF)
gRNA及びRNA誘導型ヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質(RNP)複合体の耐熱性は、DSFを通して測定することができる。DSF技術はタンパク質の耐熱性を測定し、それは、結合性RNA分子、例えばgRNAの付加などの良好な条件下で増加することができる。
【０１９７】
DSFアッセイは任意の好適なプロトコールによって実行することができ、(a)RNP形成のための最適な条件を同定するために異なる条件(例えば、gRNA:RNA誘導型ヌクレアーゼタンパク質の異なる化学量論比、異なる緩衝液等)を試験すること;及び、(b)RNPの形成又は安定性を向上させる改変を同定するために、RNA誘導型ヌクレアーゼ及び/又はgRNAの改変(例えば、化学修飾、配列の変更等)を試験することを限定されずに含む、任意の好適な状況で用いることができる。DSFアッセイの1つの読み出しは、RNP複合体の融点におけるシフトである;比較的高いシフトは、RNP複合体が、より低いシフトによって特徴付けられる参照RNP複合体と比較してより安定している(したがって、より大きな活性又はより良好な形成カイネティクス、分解カイネティクス又は別の機能的特徴を有することができる)ことを示唆する。DSFアッセイがスクリーニングツールとして配置される場合、出力が閾値以上の融点シフトを有する1つ以上のRNPであるように、閾値融点シフトを指定することができる。例えば、閾値は5〜10℃(例えば、5°、6°、7°、8°、9°、10°)又はそれより高くてもよく、出力は、閾値以上の融点シフトによって特徴付けられる1つ以上のRNPであってよい。
【０１９８】
DSFアッセイ条件の2つの非限定的な例を、下に示す:
【０１９９】
RNP複合体を形成するのに最良の溶液を決定するために、水+10×SYPRO Orange(登録商標)(Life Technologies cat#S-6650)の中のCas9の固定濃度(例えば、2μM)を、384ウェルプレートに分注する。様々なpH及び塩を有する溶液に希釈した等モル量のgRNAを次に加える。室温で10分間のインキュベーション及びいかなる気泡も除去するための短時間の遠心分離の後に、20℃から90℃まで、温度を10秒ごとに1℃上昇させて勾配を流すために、Bio-Rad CFXマネージャソフトウェアと一緒にBio-Rad CFX384(商標)リアルタイムシステムC1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用する。
【０２００】
第2のアッセイは、gRNAの様々な濃度を上のアッセイ1からの最適な緩衝液中の固定濃度(例えば、2μM)のCas9と混合すること、及び384ウェルプレートの中でインキュベートする(例えば、室温で10分間)ことからなる。等量の最適な緩衝液+10×SYPRO Orange(登録商標)(Life Technologies cat#S-6650)を加え、プレートをMicroseal(登録商標)B接着剤(MSB-1001)で密封する。いかなる気泡も除去するための短時間の遠心分離に続いて、20℃から90℃まで、温度を10秒ごとに1℃上昇させて勾配を流すために、Bio-Rad CFXマネージャソフトウェアと一緒にBio-Rad CFX384(商標)リアルタイムシステムC1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用する。
【０２０１】
ゲノム編集戦略
本開示の様々な実施形態では、細胞の中の又はそこから得たDNAの標的化領域の中で編集を生成する(すなわち、変更する)ために、上記のゲノム編集システムを使用する。特定の編集を生成するために、本明細書において様々な戦略が記載され、これらの戦略は、所望の修復結果、個々の編集(例えば、SSB又はDSB)の数及び配置、並びにそのような編集の標的部位に関して一般的に記載される。
【０２０２】
SSB又はDSBの形成を含むゲノム編集戦略は、以下を含む修復結果によって特徴付けられる:(a)標的化領域の全部若しくは一部の欠失;(b)標的化領域の全部若しくは一部への挿入若しくはそれの置換;又は(c)標的化領域の全部若しくは一部の中断。このグループ分けはいかなる特定の理論又はモデルに限定するものでも束縛するものではなく、単に提示の効率的使用のために提供される。当業者は、掲載される結果は互いに排他的でなく、一部の修復が他の結果をもたらすことがあることを理解する。特定の編集戦略又は方法の記載は、特に明記しない限り特定の修復結果を要求していると理解するべきでない。
【０２０３】
標的化領域の置換は、例えば、HDR経路によって媒介される2つの修復結果である遺伝子修正又は遺伝子変換を通した、標的化領域の中の既存の配列の全部又は一部の相同配列による置換を一般的に含む。下でより詳細に記載される通り、HDRは、一本鎖又は二本鎖であってよいドナー鋳型を使用して促進される。一本鎖又は二本鎖の鋳型は外因性であってよく、その場合にはそれらは遺伝子修正を促進し、又はそれらは内因性であってよく(例えば、細胞ゲノムの中の相同配列)、遺伝子変換を促進する。例えばRichardsonら(Nature Biotechnology 34, 339-344 (2016), (Richardson)、参照により組み込まれる)によって記載される通り、外因性鋳型は非対称のオーバーハングを有することができる(すなわち、DSBの部位に相補的である鋳型の部分は、ドナー鋳型の中の中心に置かれるよりも3'又は5'方向にオフセットすることができる)。鋳型が一本鎖である場合、それは標的化領域の相補(トップ)又は非相補(ボトム)鎖に対応することができる。
【０２０４】
Ran及びCotta-Ramusinoに記載の通りに、遺伝子変換及び遺伝子修正は、一部の場合には、標的化領域又はその周囲における1つ以上のニックの形成によって促進される。一部の場合には、代わってオーバーハング(例えば、5'オーバーハング)を有する単一のDSBを形成する2つのオフセットSSBを形成するために、二重ニッカーゼ戦略が使用される。
【０２０５】
標的化配列の全部又は一部の中断及び/又は欠失は、様々な修復結果によって達成することができる。一例として、標的化領域に隣接する2つ以上のDSBを同時に生成することによって、配列を欠失させることができ、標的化領域は、LCA10突然変異のためにMaederにおいて記載されている通り、DSBが修復されるときに次に切除される。別の例として、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖切断の形成と、続く修復前のオーバーハングのエクソヌクレアーゼ分解性プロセシングによって生成される欠失によって、配列を中断することができる。
【０２０６】
標的配列中断の1つの特異的サブセットは、標的化配列の中のインデルの形成によって媒介され、ここで、修復結果はNHEJ経路(Alt-NHEJを含む)によって一般的に媒介される。NHEJは、インデル突然変異とのその関連のために、「誤りがちな」修復経路と呼ばれる。しかし、一部の場合には、DSBはその周囲の配列の変更無しでNHEJによって修復される(いわゆる「完全な」又は「瘢痕無しの」修復);これは、DSBの2つの末端が完全にライゲーションされることを一般的に必要とする。一方、インデルは、一方又は両方の遊離末端の一方又は両方の鎖からヌクレオチドを加える及び/又は除去する、それらがライゲーションされる前の遊離DNA末端の酵素的プロセシングから生じると考えられる。
【０２０７】
遊離DSB末端の酵素的プロセシングは本来確率的である可能性があるので、インデル突然変異は分布に沿って変動する傾向があり、特異的標的部位、使用する細胞型、使用するゲノム編集戦略等を含む様々な因子によって影響される可能性がある。たとえそうでも、インデル形成について限定された一般化を引き出すことが可能である:単一のDSBの修復によって形成される欠失は、最も一般的には1〜50bpの範囲内にあるが、100〜200bpを超過することがある。単一のDSBの修復によって形成される挿入はより短い傾向があり、切断部位の直ぐ周りの配列の短い複製をしばしば含む。しかし、大きな挿入を得ることが可能であり、これらの場合、挿入された配列はゲノムの他の領域に、又は細胞に存在するプラスミドDNAにしばしば由来していた。
【０２０８】
インデル突然変異、及びインデルを生成するように構成されたゲノム編集システムは、例えば、特異的最終配列の生成が要求されない場合、及び/又はフレームシフト突然変異が許容される場合、標的配列を中断するために有益である。それらは、所与の部位において所望のある特定の配列がSSB又はDSBの修復から優先的に生じる傾向がある限り、特定の配列が好ましい場面で役立つこともできる。インデル突然変異は、特定のゲノム編集システム及びそれらの成分の活性を評価又はスクリーニングするための有益なツールでもある。これら及び他の場面では、インデルは、(a)ゲノム編集システムと接触させた細胞のゲノムにおけるそれらの相対的及び絶対的頻度、並びに(b)未編集の配列と比較した数値的差、例えば、±1、±2、±3等の分布によって特徴付けることができる。一例として、リード物質発見場面では、制御された条件下でインデル読み出しに基づいて標的部位で切断を最も効率的に促進するgRNAを同定するために、複数のgRNAをスクリーニングすることができる。閾値頻度以上でインデルを生成するか、又はインデルの特定の分布を生成するガイドを、さらなる研究及び開発のために選択することができる。インデルの頻度及び分布は、例えばgRNAを一定に保ち、ある特定の他の反応条件又は送達方法を変えることによって、異なるゲノム編集システム実行又は製剤化及び送達方法を評価するための読み出しとして有益である可能性もある。
【０２０９】
多重戦略
上記の例示的な戦略は単一のDSBによって媒介される修復結果に重点を置いているが、この開示によるゲノム編集システムは、同じ遺伝子座又は異なる遺伝子座における、2つ以上のDSBを生成するために用いることもできる。複数のDSB又はSSBの形成を含む編集のための戦略は、例えば、Cotta-Ramusinoに記載される。
【０２１０】
ドナー鋳型設計
ドナー鋳型設計は、文献に、例えばCotta-Ramusinoに詳細に記載される。一本鎖(ssODN)又は二本鎖(dsODN)であってよいDNAオリゴマードナー鋳型(オリゴデオキシヌクレオチド又はODN)は、DSBのHDRベースの修復を促進するために使用することができ、標的DNA配列に変更を導入するために、新しい配列を標的配列に挿入するために、又は標的配列を完全に置換するために特に有益である。
【０２１１】
一本鎖であれ二本鎖であれ、ドナー鋳型は、切断する標的配列の内部又は近くの(例えば、隣接又は近接する)DNAの領域に相同性である領域を一般的に含む。これらの相同性の領域は「相同腕」とここで呼ばれ、下に図式的に例示される:
[5'相同腕]-[置換配列]-[3'相同腕]。
【０２１２】
相同腕は任意の好適な長さ(ただ1つの相同腕を使用する場合、0ヌクレオチドを含む)を有することができ、3'及び5'相同腕は同じ長さを有することができるか又は長さが異なってもよい。適当な相同腕の長さの選択には、様々な因子、例えば、Alu反復配列又は他の非常に一般的なエレメントなどのある特定の配列との相同性又は微相同性を回避したいという願望が影響することができる。例えば、配列反復エレメントを回避するために、5'相同腕を短縮することができる。他の実施形態では、配列反復エレメントを回避するために、3'相同腕を短縮することができる。一部の実施形態では、ある特定の配列反復エレメントの含有を回避するために、5'及び3'の両相同腕を短縮することができる。さらに、一部の相同腕の設計は編集効率を向上させることができるか、又は所望の修復結果の頻度を増加させることができる。例えば、参照により組み込まれる、Richardson et al. Nature Biotechnology 34, 339-344 (2016) (Richardson)は、一本鎖ドナー鋳型の3'及び5'相同腕の相対的な非対称が、修復の率及び/又は結果に影響することを見出した。
【０２１３】
ドナー鋳型における置換配列は、Cotta-Ramusinoらを含む、他の文献に記載されている。置換配列は、任意の好適な長さ(所望の修復結果が欠失である場合の、0ヌクレオチドを含む)であってよく、編集が所望される細胞の中の天然に存在する配列と比較して、1、2、3又はそれより多くの配列改変を一般的に含む。1つの一般的な配列改変は、処置が所望される疾患又は状態に関連している突然変異を修復するための、天然に存在する配列の変更を含む。別の一般的な配列改変は、置換配列が標的部位に組み込まれた後に、標的部位の反復切断を低減又は排除するための、RNA誘導型ヌクレアーゼのPAM配列又はSSB若しくはDSBを生成するために使用されるgRNAの標的化ドメインに相補的であるかそれをコードする1つ以上の配列の変更を含む。
【０２１４】
線状のssODNが使用される場合、それは、(i)標的核酸のニック入り鎖にアニールするように、(ii)標的核酸のインタクトな鎖にアニールするように、(iii)標的核酸のプラス鎖にアニールするように、及び/又は(iv)標的核酸のマイナス鎖にアニールするように構成することができる。ssODNは、任意の好適な長さ、例えば、約、又は少なくとも150〜200ヌクレオチド(例えば、150、160、170、180、190又は200ヌクレオチド)又はそれ以下を有することができる。
【０２１５】
鋳型核酸は、核酸ベクター、例えば、ウイルスゲノム又は環状二本鎖DNA、例えばプラスミドであってもよいことに注意すべきである。ドナー鋳型を含む核酸ベクターは、他のコード又は非コードエレメントを含み得る。例えば、鋳型核酸は、ある特定のゲノム主鎖エレメント(例えば、AAVゲノムの場合、逆方向末端反復配列)を含み、gRNA及び/又はRNA誘導型ヌクレアーゼをコードするさらなる配列を任意選択で含む、ウイルスゲノム(例えば、AAV又はレンチウイルスゲノム)の一部として送達することができる。ある特定の実施形態では、ドナー鋳型は、同じgRNAを使用して、細胞DNAの中に形成される対応するSSB又はDSBの修復に参加することができるドナー鋳型の片方又は両方の末端での遊離DSBの形成を促進するために、1つ以上のgRNAによって認識される標的部位に近接又は隣接することができる。ドナー鋳型として使用するのに好適な例示的な核酸ベクターは、Cotta-Ramusinoに記載される。
【０２１６】
どのフォーマットを使用しようが、鋳型核酸は、望ましくない配列を回避するように設計することができる。ある特定の実施形態では、ある特定の配列反復エレメント、例えば、Alu反復配列、LINEエレメント等との重複を回避するために、片方又は両方の相同腕を短縮することができる。
【０２１７】
相同腕に加えて、ドナー鋳型はさらなるエレメント、例えばスタッファー配列及び/又はレポーター配列、例えば、GFPレポーター(図1を参照する)又はNGFR配列(図22を参照する)を含み得る。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、第1の相同腕、第1のスタッファー配列、カーゴ配列、例えば、CD40Lのエクソン2〜5の1つ以上、3' UTR配列、ポリA配列、レポーター配列、例えばGFPレポーター配列又はNGFR配列、第2のスタッファー配列、及び第2の相同腕を含む。別の実施形態では、ドナー鋳型は、第1の相同腕、カーゴ配列、例えば、CD40Lのエクソン2〜5の1つ以上、3' UTR配列、ポリA配列、レポーター配列、例えばGFPレポーター配列又はNGFR配列、及び第2の相同腕を含む。別の実施形態では、ドナー鋳型は、第1の相同腕、第1のスタッファー配列、カーゴ配列、例えば、CD40Lのエクソン2〜5の1つ以上、3' UTR配列、ポリA配列、第2のスタッファー配列、及び第2の相同腕を含む。別の実施形態では、ドナー鋳型は、第1の相同腕、カーゴ配列、例えば、CD40Lのエクソン2〜5の1つ以上、3' UTR配列、ポリA配列及び第2の相同腕を含む。
【０２１８】
標的細胞
この開示によるゲノム編集システムは、例えば標的核酸を編集又は変更するために、細胞を人為操作又は変更するために使用することができる。様々な実施形態では、人為操作はin vivo又はex vivoで起こすことができる。
【０２１９】
この開示の実施形態により様々な細胞型を人為操作又は変更することができ、in vivo適用などの一部の場合には、例えばこの開示によるゲノム編集システムを複数の細胞型に送達することによって、複数の細胞型が変更又は人為操作される。しかし、他の場合には、人為操作又は変更を特定の細胞型に制限することが望ましいかもしれない。例えば、一部の場合には、限られた分化能力を有する細胞又は最終分化細胞、例えばMaederの場合視細胞を編集することが望ましいかもしれず、ここでは、遺伝子型の改変は細胞表現型の変化をもたらすことが予想される。しかし、他の場合には、より分化していない、多分化能性又は多能性の幹細胞又は前駆体細胞を編集することが望ましいかもしれない。例として、細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)、造血幹細胞/前駆体細胞(HSPC)又は所与の適用若しくは適応症に関連した細胞型に分化する他の幹細胞若しくは前駆体細胞型であってもよい。
【０２２０】
高IgM症候群の処置のために、標的細胞は造血幹細胞(HSC)又はHSCの集団であってもよい。或いは、標的細胞はT細胞、又はT細胞の集団であってもよい。
【０２２１】
当然の結果として、変更又は人為操作される細胞は、標的にされる細胞型及び/又は所望の編集結果によって分裂細胞又は非分裂細胞と様々である。
【０２２２】
細胞がex vivoで人為操作若しくは変更される場合、細胞は直ちに使用することができる(例えば、対象に投与される)か、又は、それらは後の使用のために維持若しくは保存することができる。当業者は、当技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して細胞を培養で維持するか保存する(例えば、液体窒素の中で冷凍する)ことができることを理解する。
【０２２３】
処置の方法
この開示によるゲノム編集システムは、高IgM症候群(HIGM)及び関連する障害を処置するために使用することができる。HIGMは、細菌感染症への感受性をもたらす、正常な又は上昇した血清IgMレベル、及び他の血清免疫グロブリンのレベルの低下又は不在によって特徴付けられる免疫グロブリン欠損症である。HIGM症候群患者は、IgMタイプの抗体の生成からIgG、IgA及び/又はIgEタイプの抗体に切り換える能力がない。その結果、この疾患を有する対象は、血液中にIgG及びIgAの低下したレベルを有するが、IgMの正常であるか又は高いレベルを有する。これらの異なるタイプの抗体は異なる機能を果たし、感染症との闘いで全て重要である。通常、Bリンパ球はそれ自体でIgM抗体を生成することができるが、IgMからIgG、IgA又はIgEへ切り換えるために、それらはTリンパ球からの双方向性の支援を必要とする。HIGMは、Tリンパ球とBリンパ球の間のこの相互作用に影響を及ぼす様々な遺伝子欠損からもたらされる。
【０２２４】
HIGM症候群の最も一般的な形態は、活性化Tリンパ球の表面で見出されるタンパク質の欠陥又は欠損からもたらされる。影響を受けるタンパク質は、CD40と呼ばれるBリンパ球の上のタンパク質に結合又はライゲーションするので、CD40リガンド(CD40L)と呼ばれる。CD40リガンドは、X染色体の上の遺伝子によって作られる。したがって、この原発性免疫不全疾患は、X連鎖劣性形質として遺伝する。
【０２２５】
CD40リガンドの欠損の結果として、X連鎖高IgM(XHIGM)患者におけるTリンパ球は、IgMからIgG、IgA及び/又はIgEに免疫グロブリンの生成を切り換えるようにBリンパ球に指示することができない。CD40リガンドはTリンパ球によって実行される他の機能にとっても重要であるので、X連鎖高IgM症候群(XHIM)患者は欠陥のある細胞性免疫を有し、多種類の感染症、特に日和見感染、及び一部のタイプのがんにも感受性である。この形態を有する患者は、重度の好中球減少も有することがあり、幼年期にニューモシスティス・ジロベシイ(Pneumocystis jirovecii)肺炎を呈することがしばしばある。欠損したCD40リガンドシグナル伝達はB細胞を活性化しないので、リンパ系組織は非常に小さい。
【０２２６】
高IgM症候群の診断は、臨床判定基準に基づいて推測される。血清Igレベルが測定される;正常な又は上昇した血清IgMレベル、及び他の免疫グロブリンのレベルの低下又は不在は診断を支持する。T細胞表面のCD40リガンド発現のフローサイトメトリー試験を実行するべきである。可能な場合、診断は遺伝子試験によって確認される。妊娠を考えている女性がCD40リガンド欠損の家族歴を有する場合、出生前の遺伝子試験を彼女らに提供することができる。他の親類の遺伝子試験は、日常的に実行されない。他の検査所見には、記憶B細胞(CD27)の数の低減及びクラススイッチ記憶B細胞(IgD-CD27)の不在が含まれる。
【０２２７】
高IgM症候群と関連した再発性の感染症の予防を助けることが示された処置には、抗生物質薬の予防的投与及び/又は血漿から得た抗体(免疫グロブリン)による注入が含まれる。さらに、ステロイド治療は好中球減少症の処置においてしばしば有効であるが、ステロイド薬の使用は既に弱い免疫系をしばしば抑制するので、高IgM症候群を有する児童における自己免疫性障害は、困難な処置ジレンマを提示することがある。一部の場合には、コルチコステロイドの使用を回避して自己免疫様症状を制御するのに、非ステロイド性抗炎症薬が役立つことがある。
【０２２８】
本明細書に提示されるデータは、本明細書に記載されるゲノム編集システムを使用してCD40Lの発現及び機能を修正するためにT細胞及び造血幹細胞を編集する場合、編集T細胞がB細胞クラススイッチングの能力を回復した証拠を提供する。同様に、10%のCD40L編集細胞を含む造血幹細胞を受けたマウスは、かなりより高いレベルのIgGを有し、少なくとも10%のCD40L編集を有する造血幹細胞が、高IgM症候群の処置の大きな治療的潜在能力を実証することを示唆する。したがって、本明細書に記載されるゲノム編集システムは、高IgM症候群を有する対象に重要な新しい処置を提供する。
【０２２９】
一実施形態では、細胞集団の中の少なくとも5%の編集細胞は、クラス細胞スイッチングを機能的に回復するのに十分である。別の実施形態では、細胞集団の中の少なくとも6%の編集細胞は、クラス細胞スイッチングを機能的に回復するのに十分である。別の実施形態では、細胞集団の中の少なくとも7%の編集細胞は、クラス細胞スイッチングを機能的に回復するのに十分である。別の実施形態では、細胞集団の中の少なくとも8%の編集細胞は、クラス細胞スイッチングを機能的に回復するのに十分である。別の実施形態では、細胞集団の中の少なくとも9%の編集細胞は、クラス細胞スイッチングを機能的に回復するのに十分である。別の実施形態では、細胞集団の中の少なくとも10%の編集細胞は、クラス細胞スイッチングを機能的に回復するのに十分である。別の実施形態では、細胞集団の中の少なくとも15%の編集細胞は、クラス細胞スイッチングを機能的に回復するのに十分である。別の実施形態では、細胞集団の中の少なくとも20%の編集細胞は、クラス細胞スイッチングを機能的に回復するのに十分である。
【０２３０】
一部の実施形態では、高IgM症候群を有する対象は、編集された細胞の投与の前にリンパ枯渇させることが望ましいかもしれない。したがって、一実施形態では、対象は、編集された細胞の投与の前に調整される。調整は、対象のリンパ枯渇を含み得る。例えば、一実施形態では、編集された細胞の受領の前に、対象は、リンパ枯渇を引き起こす化学療法で調整される。一実施形態では、対象のT細胞は、調整によって枯渇させる。対象を調整するのに好適な薬剤には、リンパ枯渇、例えば、T細胞の枯渇を誘導する薬剤が含まれる。リンパ枯渇を誘導する薬剤、すなわち調整剤は、当技術分野で公知である。一実施形態では、調整剤は化学療法剤である。一実施形態では、調整剤はシクロホスファミドである。一部の実施形態では、本方法は、対象に調整剤、例えば、リンパ枯渇を引き起こす調整剤を投与するステップを任意選択で含み得る。一実施形態では、調整剤は化学療法剤である。一実施形態では、調整剤はシクロホスファミドである。
【０２３１】
別の実施形態では、編集された細胞は、リンパ枯渇無しで対象に投与される。この実施形態では、対象は、編集された細胞の投与の前に調整されない。
【０２３２】
一実施形態では、細胞は、対象への投与の前に刺激される。一実施形態では、細胞は、サイトカイン、例えば刺激性サイトカインを使用して刺激される。例えば、細胞は、IL-7、IL-15、IL-2又はその組合せで刺激することができる。
【０２３３】
ゲノム編集システムの実行例:送達、製剤化及び投与経路
上記のように、この開示のゲノム編集システムは、任意の好適な様式で実行することができ、これは、RNA誘導型ヌクレアーゼ、gRNA及び任意選択のドナー鋳型核酸を限定されずに含む、そのようなシステムの成分を、ゲノム編集システムの形質導入、発現若しくは導入をもたらし及び/又は細胞、組織若しくは対象において所望の修復結果を引き起こす任意の好適な形態又は形態の組合せで送達、製剤化又は投与することができることを意味する。表5及び6は、ゲノム編集システム実行例のいくつかの非限定的な例を示す。しかし、当業者は、これらのリストは包括的でないこと、及び他の実行例が可能であることを理解する。特に表5に関し、この表は、単一のgRNA及び任意選択のドナー鋳型を含むゲノム編集システムのいくつかの例示的な実行例を掲載する。しかし、この開示によるゲノム編集システムは、複数のgRNA、複数のRNA誘導型ヌクレアーゼ、及びタンパク質などの他の成分を組み込むことができ、表に例示される原理に基づいて様々な実行例が当業者に明白になる。表では、[N/A]は、ゲノム編集システムが示された成分を含まないことを示す。
【０２３４】
2021500080.tif 000012
【０２３５】
表6は、本明細書に記載されるゲノム編集システムの成分のための様々な送達方法を要約する。再び、リストは限定するものではなく例示するものである。
【０２３６】
2021500080.tif 000013
【０２３７】
ゲノム編集システムの核酸ベースの送達
本開示によるゲノム編集システムの様々なエレメントをコードする核酸は、当技術分野で公知の方法によって、又は本明細書に記載される通りに、対象に投与することができるか又は細胞に送達することができる。例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼをコードする、及び/又はgRNAをコードするDNA、並びにドナー鋳型核酸は、例えばベクター(例えば、ウイルス又は非ウイルス性のベクター)、非ベクターベースの方法(例えば、裸のDNA又はDNA複合体を使用して)又はその組合せによって送達することができる。
【０２３８】
ゲノム編集システム又はその成分をコードする核酸は、例えばトランスフェクション若しくは電気穿孔法によって裸のDNA若しくはRNAとして細胞に直接的に送達することができるか、又は、標的細胞(例えば、赤血球、HSC)による取り込みを促進する分子(例えば、N-アセチルガラクトサミン)にコンジュゲートすることができる。核酸ベクター、例えば表6に要約されるベクターを使用することもできる。
【０２３９】
核酸ベクターは、ゲノム編集システム成分、例えばRNA誘導型ヌクレアーゼ、gRNA及び/又はドナー鋳型をコードする1つ以上の配列を含み得る。ベクターは、タンパク質をコードする配列と関連する(例えば、それに挿入又は融合された)シグナルペプチド(例えば、核局在化、核小体局在化又はミトコンドリア局在化のための)をコードする配列を含むこともできる。一例として、核酸ベクターは、1つ以上の核局在化配列(例えば、SV40からの核局在化配列)を含むCas9コード配列を含み得る。
【０２４０】
核酸ベクターは、任意の好適な数の調節/制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列又はリボソーム内部進入部位(IRES)を含むこともできる。これらのエレメントは当技術分野で周知であり、Cotta-Ramusinoに記載される。
【０２４１】
この開示による核酸ベクターは、組換えウイルスベクターを含む。例示的なウイルスベクターは表6に示され、さらなる好適なウイルスベクター並びにそれらの使用及び生成は、Cotta-Ramusinoに記載される。当技術分野で公知の他のウイルスベクターを、使用することもできる。さらに、核酸及び/又はペプチドの形態でゲノム編集システム成分を送達するために、ウイルス粒子を使用することができる。例えば、任意の好適なカーゴを含有するように、「空の」ウイルス粒子をアセンブルすることができる。標的組織特異性を変更するために標的化リガンドを組み込むように、ウイルスベクター及びウイルス粒子を工学的に操作することもできる。
【０２４２】
本開示によるゲノム編集システムをコードする核酸を送達するために、ウイルスベクターに加えて非ウイルス性のベクターを使用することができる。非ウイルス性の核酸ベクターの1つの重要なカテゴリーはナノ粒子であり、それは有機であっても無機であってもよい。ナノ粒子は当技術分野で周知であり、Cotta-Ramusinoに要約される。そのような成分をコードするゲノム編集システム成分又は核酸を送達するために、任意の好適なナノ粒子設計を使用することができる。例えば、この開示のある特定の実施形態では、有機の(例えば、脂質及び/又はポリマー)ナノ粒子が送達ビヒクルとして使用するのに好適であるかもしれない。ナノ粒子製剤及び/又は遺伝子移入で使用するための例示的な脂質は表7に示し、表8は、遺伝子移入及び/又はナノ粒子製剤で使用するための例示的なポリマーを掲載する。
【０２４３】
2021500080.tif 000014
2021500080.tif 000015
【０２４４】
2021500080.tif 000016
【０２４５】
非ウイルス性のベクターは、取り込みを向上させるため、及び/又はある特定の細胞型を選択的に標的にするために、標的化改変を任意選択で含む。これらの標的化改変は、例えば、細胞特異抗原、モノクローナル抗体、単鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖(例えば、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc))及び細胞透過性ペプチドを含み得る。そのようなベクターは、さらに任意選択で、例えば細胞コンパートメントへの放出のために、融合誘導性及びエンドソーム不安定化ペプチド/ポリマーを使用し、酸誘発立体配置変化(例えば、カーゴのエンドソーム脱出を加速するために)を経、及び/又は、刺激切断性ポリマーを組み込む。例えば、還元性細胞環境において切断されるジスルフィドベースのカチオンポリマーを、使用することができる。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、ゲノム編集システムの成分、例えば、本明細書に記載されるRNA誘導型ヌクレアーゼ成分及び/又はgRNA成分以外の1つ以上の核酸分子(例えば、DNA分子)が送達される。ある特定の実施形態では、ゲノム編集システムの成分の1つ以上同時に、この核酸分子は送達される。ある特定の実施形態では、この核酸分子は、ゲノム編集システムの成分の1つ以上が送達される(例えば、約30分未満、1時間、2時間、3時間、6時間、9時間、12時間、1日、2日、3日、1週、2週又は4週)前又は後に送達される。ある特定の実施形態では、この核酸分子は、ゲノム編集システムの成分、例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼ成分及び/又はgRNA成分の1つ以上が送達されるのと異なる手段で送達される。この核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかで送達することができる。例えば、この核酸分子はウイルスベクター、例えば組込み欠損レンチウイルスによって送達することができ、RNA誘導型ヌクレアーゼ分子成分及び/又はgRNA成分は、例えば、核酸(例えば、DNA)によって引き起こされる毒性を低減することができるように、電気穿孔法によって送達することができる。ある特定の実施形態では、この核酸分子は、治療的タンパク質、例えば、本明細書に記載されるタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、この核酸分子は、RNA分子、例えば、本明細書に記載されるRNA分子をコードする。
【０２４７】
ゲノム編集システム成分をコードするRNP及び/又はRNAの送達
RNP(gRNA及びRNA誘導型ヌクレアーゼの複合体)並びに/又はRNA誘導型ヌクレアーゼ及び/若しくはgRNAをコードするRNAは、当技術分野で公知の方法によって細胞に送達するか又は対象に投与することができ、そのいくつかはCotta-Ramusinoに記載される。in vitroでは、RNA誘導型ヌクレアーゼをコードする及び/又はgRNAをコードするRNAは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔法、一時的な細胞圧縮又は搾出によって送達することができる(例えば、Lee 2012を参照)。脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、GalNAc又は他のコンジュゲート媒介送達及びその組合せを、in vitro及びin vivoでの送達のために使用することもできる。
【０２４８】
in vitroでは、電気穿孔法を通した送達は、ドナー鋳型核酸分子の有無にかかわらず、カートリッジ、チャンバー又はキュベットの中で細胞をRNA誘導型ヌクレアーゼ及び/又はgRNAをコードするRNAと混合すること、並びに規定の期間及び振幅の1つ以上の電気インパルスを加えることを含む。電気穿孔法のためのシステム及びプロトコールは当技術分野で公知であり、任意の好適な電気穿孔法ツール及び/又はプロトコールをこの開示の様々な実施形態に関連して使用することができる。
【０２４９】
投与経路
ゲノム編集システム又はこれらのシステムを使用して改変若しくは操作される細胞は、局所的か全身的かを問わず任意の適切な様式若しくは経路により対象に投与され得る。投与の全身的様式には、経口及び非経口経路がある。非経口経路には、例として、静脈内、髄内、動脈内、筋肉内、真皮内、皮下、鼻腔内及び腹膜内経路がある。全身的に投与される成分は、例えば、HSC、造血幹細胞/前駆体細胞又は赤血球前駆体若しくは先駆細胞を標的するように修飾又は製剤化することができる。
【０２５０】
投与の局所的様式には、例として、骨小柱への髄内注射又は髄空間への大腿骨内注射、及び門脈への注入がある。ある特定の実施形態では、全身的に投与される(例えば、静脈内)場合と比較して局所的(例えば、骨髄へ直接)に投与される場合、(全身的アプローチと比較して)有意に少ない量の成分が、効果を発揮し得る。投与の局所的様式は、治療有効量の成分が全身的に投与される際に起こり得る潜在的な毒性副作用の発生を低減又は排除することができる。
【０２５１】
投与は、定期的なボーラス投与(例えば、静脈内)として、又は内部リザーバー若しくは外部リザーバー(例えば、静脈袋又は埋め込み式ポンプから)から持続注入として提供され得る。成分は、例えば、徐放性薬物送達装置からの連続的放出により局所的に投与され得る。
【０２５２】
加えて、成分を製剤化して、長期間にわたる放出を可能にすることができる。放出システムには、生分解性材料又は拡散により組み込まれている成分を放出する材料の基材があり得る。成分は、放出システム内で均質に又は異質に分布し得る。様々な放出システムが有用であり得るが、適当なシステムの選択は、特定の用途に必要とされる放出の速度によって決まることになる。非分解性及び分解性放出システムが、使用され得る。適切な放出システムには、ポリマー並びにポリマー基材、非ポリマー基材、又は無機及び有機賦形剤及び希釈剤、例えばそれだけには限らないが、炭酸カルシウム及び糖(例えば、トレハロース)がある。放出システムは、天然でも合成的でもよい。しかしながら、合成放出システムは、一般により信頼性が高く、より再現性があり、より規定された放出プロファイルを生成するので、好ましい。放出システム材料は、材料の拡散又は分解によって異なる分子量を有する成分が放出されるように選択され得る。
【０２５３】
代表的な合成、生分解性ポリマーには、例えば:ポリアミド、例えばポリ(アミノ酸)及びポリ(ペプチド);ポリエステル、例えばポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸-グリコール酸コポリマー)、及びポリ(カプロラクトン);ポリ(無水物);ポリオルトエステル;ポリカーボネート;及びそれらの化学誘導体(置換、化学基、 例えばアルキル、アルキレンの付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業技術者によって日常的に行われる他の修飾)、コポリマー並びにそれらの混合物がある。代表的な合成、非分解性ポリマーには、例えば:ポリエーテル、例えばポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレングリコール)及びポリ(テトラメチレンオキシド);ビニルポリマー-ポリアクリレート及びポリメタクリレート、例えばメチル、エチル、他のアルキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル及びメタクリル酸、並びに他のビニルポリマー、例えばポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)及びポリ(酢酸ビニル);ポリ(ウレタン);セルロース及びその誘導体、例えばアルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロース、及び様々な酢酸セルロース;ポリシロキサン;及びその任意の化学誘導体(置換、化学基、例えば、アルキル、アルキレンの付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業技術者によって日常的に行われる他の修飾)、コポリマー並びにそれらの混合物がある。
【０２５４】
ポリ(ラクチド-グリコリドコポリマー)微小球も、使用され得る。一般に、微小球は、乳酸及びグリコール酸のポリマーで構成され、構築されて中空の球体を形成する。球体は、直径およそ15〜30ミクロンであり得、本明細書に記載される成分でロードされ得る。
【０２５５】
成分の集学的又は差異的送達
本開示から、当業者は、本開示に照らして、本明細書に開示されるゲノム編集システムの異なる成分が、一緒に若しくは別々に及び同時に又は別個に送達され得ることを認識することになる。ゲノム編集システム成分の別々の及び/又は同時でない送達は、ゲノム編集システムの機能に対する時間的又は空間的制御を提供し、その活性により引き起こされるある特定の効果を限定することが特に望ましくなり得る。
【０２５６】
本明細書では異なる又は差異的な様式とは、対象成分分子、例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼ分子、gRNA、鋳型核酸又はペイロードに異なる薬力学的若しくは薬物カイネティクス学的特性をもたらす送達の様式のことを指す。例えば、送達の様式は、異なる組織分布、異なる半減期、又は例えば、選択された区画、組織若しくは器官において異なる時間的分布をもたらし得る。
【０２５７】
例えば、送達の一部の様式、例えば、自己複製又は細胞核酸への挿入によって細胞若しくは細胞の後代中で持続する核酸ベクターによる送達は、成分のより持続的な発現及び存在をもたらす。例には、ウイルス性、例えば、AAV又はレンチウイルス送達がある。
【０２５８】
例として、ゲノム編集システムの成分、例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼ及びgRNAは、身体又は特定の区画、組織若しくは器官において得られる半減期若しくは送達される成分の持続性に関して異なる様式によって送達され得る。ある特定の実施形態では、gRNAが、そのような様式によって送達され得る。RNA誘導型ヌクレアーゼ分子成分は、低い持続性又は身体若しくは特定の区画若しくは組織若しくは器官に少ない曝露をもたらす様式によって送達され得る。
【０２５９】
より一般には、ある特定の実施形態では、送達の第1の様式を使用して第1の成分を送達し、送達の第2の様式を使用して第2の成分を送達する。送達の第1の様式は、第1の薬力学的又は薬物カイネティクス学的特性を与える。第1の薬力学的特性は、身体、区画、組織又は器官における例えば、成分、若しくは成分をコードする核酸の分布、持続性、若しくは曝露であり得る。送達の第2の様式は、第2の薬力学的又は薬物カイネティクス学的特性を与える。第2の薬力学的特性は、身体、区画、組織又は器官における例えば、成分、若しくは成分をコードする核酸の分布、持続性若しくは曝露であり得る。
【０２６０】
ある特定の実施形態では、第1の薬力学的又は薬物カイネティクス学的特性、例えば、分布、持続性若しくは曝露は、第2の薬力学的又は薬物カイネティクス学的特性より限定される。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、送達の第1の様式は、薬力学的又は薬物カイネティクス学的特性、例えば、分布、持続性若しくは曝露を最適化、例えば最小化するように選択される。
【０２６２】
ある特定の実施形態では、送達の第2の様式は、薬力学的又は薬物カイネティクス学的特性、例えば、分布、持続性若しくは曝露を最適化、例えば最大化するように選択される。
【０２６３】
ある特定の実施形態では、送達の第1の様式は、比較的持続的なエレメント、例えば核酸、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、AAV又はレンチウイルスの使用を含む。そのようなベクターは、比較的持続的なので、それから転写される産物は、比較的持続的である。
【０２６４】
ある特定の実施形態では、送達の第2の様式は、比較的一過性のエレメント、例えば、RNA又はタンパク質を含む。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、第1の成分はgRNAを含み、送達様式は比較的持続的であり、例えば、gRNAは、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、AAV又はレンチウイルスから転写される。遺伝子はタンパク質産物をコードせず、gRNAは単独では作用できないので、これらの遺伝子の転写は、生理的影響がほとんどない。第2の成分、RNA誘導型ヌクレアーゼ分子は、一過性方式で、例えばmRNA又はタンパク質として送達され、完全なRNA誘導型ヌクレアーゼ分子/gRNA複合体が、短い期間だけ存在し、活性があることを確実にする。
【０２６６】
さらに、成分は、異なる分子形態又は互いに相補して安全性及び組織特異性を増強させる異なる送達ベクターで送達され得る。
【０２６７】
差異的送達様式の使用は、成績、安全性及び/又は有効性を増強することができ、例えば、最終的な標的外修飾の可能性が低減され得る。細菌的に得られたCas酵素由来ペプチドは、MHC分子により細胞の表面に提示されるので、免疫原性成分、例えば、Cas9分子の送達は、あまり持続的でない様式によって免疫原性を低減させ得る。2成分送達システムは、これらの欠点を軽減することができる。
【０２６８】
差異的送達様式を使用して、異なっているが、重なり合っている標的領域に成分を送達することができる。形成活性がある複合体は、標的領域の重なりの外側で最小化される。したがってある特定の実施形態では、第1の成分、例えば、gRNAは、第1の空間的、例えば、組織分布をもたらす第1の送達様式によって送達される。第2の成分、例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼ分子は、第2の空間的、例えば、組織分布をもたらす第2の送達様式によって送達される。ある特定の実施形態では、第1の様式は、リポソーム、ナノ粒子、例えば、ポリマーナノ粒子、及び核酸、例えば、ウイルスベクターから選択される第1のエレメントを含む。第2の様式は、群から選択される第2のエレメントを含む。ある特定の実施形態では、送達の第1の様式は、第1の標的化エレメント、例えば、細胞特異的受容体又は抗体を含み、送達の第2の様式はそのエレメントを含まない。ある特定の実施形態では、送達の第2の様式は、第2の標的化エレメント、例えば、第2の細胞特異的受容体又は二次抗体を含む。
【０２６９】
RNA誘導型ヌクレアーゼ分子がウイルス送達ベクター、リポソーム又はポリマーナノ粒子中に送達される場合、単一の組織を単に標的することが望ましい可能性がある場合でも、複数の組織へ送達される潜在性及び複数の組織における治療活性が存在する。2成分送出システムは、この課題を解決し、組織特異性を増強させることができる。gRNA及びRNA誘導型ヌクレアーゼ分子が、固有であるが、重なり合う組織親和性を持つ別々の送達ビヒクル内に詰められる場合、完全に機能的な複合体は、両方のベクターによって標的されている組織においてのみ形成される。
【０２７０】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、その例は、いかなる形であれ限定することを意図しない。本出願の全体を通じて引用されている全ての参照、特許及び公開されている特許出願の全体の内容、並びに図を、参照により本明細書に組み込む。
【実施例】
【０２７１】
以下の実施例は、単なる例示であり、いかなる形であれ本発明の範囲又は内容を限定することを意図しない。
【０２７２】
[実施例1]
Tリンパ球上のCD40Lの遺伝子編集
標的化組込み実験を、CD40L遺伝子座に標的化した野生型S.ピオゲネスCas9リボ核タンパク質(RNP)を用いてT細胞において行った。gRNA配列を、表9に示す。CD40Lドナー配列を、表10に示す。図2Aは、標的化組込み後のCD40L遺伝子座の略図を示す。CD40LGエクソン1を標的化した8個のS.ピオゲネス及び30個のS.アウレウスgRNAを、ヒト初代T細胞においてS.ピオゲネス又はS.アウレウス野生型Cas9と組み合わせて編集効率についてスクリーニングした。CD40LGエクソン1中のgRNAの位置を、図2Bに図示する。S.ピオゲネス及びS.アウレウスにおいて、CD40LG突然変異のおよそ90%〜95%が修正されて、遺伝子の発現及び機能両方が復元された。図2Cは、T細胞において測定した各gRNAの挿入/欠失率を示す。CD40LGイントロン1中に同定された複数のgRNA部位における編集のレベル及び編集の型を決定するために、リボ核タンパク質(RNP)を、ヒト男性初代CD4+ T細胞に導入した。T細胞を解凍し、抗CD3/CD28磁気ビーズを用いて2日間活性化した。その後、ビーズを取り出し、ヌクレオフェクションを実行する前に、細胞をX-Vivo 15培地中で2日間拡大させた。培地は、全てのステップの間ヒトサイトカイン(IL-2、IL-7及びIL-15)を含有した。T細胞に、Lonzaヌクレオフェクションシステムを使用してgRNA:Cas9比2:1で、2.27μM RNPをヌクレオフェクトした。次いで、ゲノムDNAを単離する前に細胞をT細胞培地中で4日間拡大させた。次いで、ゲノムDNA(gDNA)を、目的の切断部位を囲むプライマーを使用してPCR増幅し、配列決定し、切断部位における挿入及び欠失について分析した。70%を超える全体の編集を、図2Cに提示した各gRNAで達成したが、欠失に対する挿入の比は異なった。図2Cに図示した結果は、少なくとも2つの独立した試料を表す。各RNPで達成した編集の百分率も、表9に提示する。
【０２７３】
高い編集効率を呈したgRNAを、図2Aに図示したCD40LGドナー鋳型を含有するAAV6ベクターと組み合わせて標的化組込み実験に使用した。図2Dに示すように、3日目にRNPの電気穿孔後にAAV6を添加し、実験の20日後にGFP蛍光をFACSによって測定した。遺伝子編集後のT細胞集団中のGFP陽性細胞の百分率を、図2Eに示す。T幹記憶細胞(TSCM)は、CD62L+CD45RA+として、Tセントラル記憶(TCM)は、CD62L+ CD45RA-として、Tエフェクター記憶(TEM)は、CD62L- CD45RA-として、及びターミナルエフェクター(TEMRA)は、CD62LCD45RA+として定義される。CRISPR/Cas9とAAV6との組合せにより、複数のT細胞集団において高レベルのCD40L遺伝子編集が可能になった。処置後7日目(左パネル)及び20日目(右パネル)にCD45RA及びCD62Lを発現しているT細胞の代表的なプロットを、図2Fに示す。処置後7及び19日目(左パネル)並びに20日目(右パネル)のT細胞培養組成物を、図2Gに示す。このデータは、未編集の(「細胞のみ」)対照と比較して、CD40L遺伝子座における遺伝子編集後にT細胞亜集団のスキューイング(skewing)がないことを示す。図2Hに示すように、標的化組込み実験も、CD40LGドナー鋳型を含有するIDLVベクターと組み合わせて実行した。様々なT細胞系統内のHDRのレベル(GFP+細胞の百分率を決定することによって評価された)を図2Iに示す。図2Jは、類似の及び高いレベルの遺伝子編集が、HD及び患者細胞の両方で観察されることを図示する。
【０２７４】
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【０２７５】
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【０２７６】
標的化組込み及び典型的なgRNA(gRNA A、D及びG)を含有する3つのRNP複合体による編集後のCD40L発現を、決定した。これらのgRNAによって標的されたCD40LG、イントロン1の位置を、図3Aに図示する。実験手順を、図3Bに概説する。RNP複合体及びAAV6ドナー鋳型による処置後の標的化組込みの率(GFP+細胞の百分率として示した)を、図3Cに提示する。gRNA Aで得られた標的化組込みのレベルは、gRNA Dで得られた標的化組込みのレベルと同等であり、gRNA Gで得たレベルより高かった。図3Dは、FACS分析によって決定したGFP陽性細胞集団におけるCD40L発現を図示する。図3Eは、再刺激後の様々な時点におけるCD40L+細胞の割合を図示する。gRNA A又はgRNA Dを使用するイントロン1の中央における修正修復鋳型の組込みと比較して、gRNA Gを使用するイントロン1の3'末端における修正修復鋳型の組込みは、CD40L発現を変化させなかった。
【０２７７】
CD40Lの遺伝子編集が生理的調節を保存するかどうか試験するために、CD40L発現のカイネティクスを決定した。図4Bに示すように、RNP電気穿孔及びドナーDNA添加の後、CD40L発現のカイネティクスを、PMA/イオノマイシンによるCD40L発現の誘導後に15日目に開始する48時間の時系列で監視した。図4C及び図4Eは、PMA/イオノマイシン処置後の編集されたCD4+T細胞におけるCD40L発現のカイネティクスを図示する。活性化CD4+及びCD8+細胞におけるCD40Lの発現を、図4D及び4Fに示す。このデータは、正常なCD40L発現が遺伝子編集により回復されたことを示す。
【０２７８】
これらの結果を確認するために、別の実験を行った。ヒトT細胞を、RNPと共に電気穿孔し、15分後に修正ドナーを保有するAAV6ベクターで形質導入した。FACS分析を、RNP電気穿孔の6日後に実行し、CD40L発現のカイネティクスを15日目に決定した(図5B)。図5C及び5Dに示すように、CD40LGの編集は、CD40Lタンパク質の正常な発現を可能にし、CD40Lの生理的調節を保存する。図5C及び図5Dは、PMA/イオノマイシン処置後の、野生型又はコドン最適化したCD40LG(「co」)ドナーで編集されたCD4+T細胞におけるCD40L発現のカイネティクスを図示する。活性化CD4+及びCD8+細胞におけるCD40L発現を、図5Cに示す。データは、コドン最適化したCD40LG cDNAが、CD40L発現のより優れた回復を可能にすることを示す。加えて、より高濃度のAAV6ドナーを細胞に添加した場合、遺伝子編集効率は改善された(図5E)。修正CD40L発現は、内因性CD40Lより低いレベルでピークに達するが、それらは両方ともおよそ6時間後に発現の急激な低下を呈する(データ不掲載)。同様に、遺伝子編集効率は、RNP及びAAV6の用量を最適化することによって改善された。図6A及び6Bは、本明細書に記載される方法が、高レベルのCD40L遺伝子編集(図6A)及び高レベルの外因性CD40L発現(図6B)を生成することを実証する。AAVが、そのMOIに応じて電気穿孔後のT細胞拡大を阻害することが観察された(データ不掲載)。
【０２７９】
gRNA A及びgRNA Dの特異性を、Guide-Seq及びAmplicon-Seq(Amp-Seq)分析を使用して評価した。Guide-Seq分析を実行して、gRNA A又はgRNA Dを含有するRNPによる編集後に起こった標的及び標的外編集事象の数を評価し、結果を、図7Aに示す。Guide-Seqを、細胞の活性化及び拡大後に男性T細胞において実行した。細胞に、gRNA A又はDを含有するRNP及び短い二本鎖オリゴをヌクレオフェクトした(Nat. Biotech. 2015、33: 187〜197ページ)。gDNAを単離し、剪断し、PCR増幅用のアダプタをPCR増幅前に添加した。Guide-Seqオリゴに隣接する配列をゲノムに整列させて、二本鎖オリゴ挿入の位置を見出した。Guide-Seq分析の結果を、表11に要約する。
【０２８０】
2021500080.tif 000036
【０２８１】
図7Bに示すように、Amp-Seq分析を実行して、gRNA Aで観察される標的外編集事象を検証した。Amp-Seqを、Guide-Seq分析から見出された標的外切断部位周辺をPCR増幅し、次いで高スループット配列決定及びコンピュータ整列化を使用して実行し、切断部位に編集事象があったかどうか決定した。1つの標的外切断部位が、Guide-SeqによってgRNA Aについて同定された。この切断部位は、第8染色体上にあり、別の遺伝子からおよそ300kbにあった。図7Bに示すように、標的外切断を、より高い忠実度のCas9(eCas9)を使用してバックグラウンドレベルに低減させた。gRNA Aの標的編集事象を、図7B及び図7Eに図示する。検出可能な標的外切断部位は、gRNA Dで観察されなかった。Digenome分析により、gRNA D(10個)と比較して、gRNA Aの有意により多数の潜在的in vitro切断部位(205個)が明らかになった(図7C〜7D)。上で示した通り、gRNA A及びgRNA Dは、高レベルの特異性と合わせて高効率の編集及び標的化組込みを表した。組み込まれたカーゴからのCD40L発現は、CD40Lの内因性レベルと同等であった。図7Fは、gRNA A及びDについて同定された標的外切断部位に対するAmplicon-Seq分析の結果の概要を図示する。
【０２８２】
[実施例2]
編集されたCD40L細胞は機能的に活性があり、B細胞クラススイッチ組換えを回復する
CD40L編集細胞において機能が回復するかどうか決定するために、B細胞と編集されたT細胞を共培養し、B細胞上のIgGの表面発現を決定した。T細胞におけるCD40Lの遺伝子編集を、上に記載の通り実行した。B細胞を、野生型T細胞(非編集)、編集され、修正CD40L遺伝子の標的化組込みに対して選択されたT細胞(GFP+)、遺伝子編集のために処置されたが、修正CD40L遺伝子の組込みが陰性であるT細胞(GFP-)、及び内因性CD40L遺伝子がレポーターカセットの組込みによってノックアウトされたT細胞(CD40L KO)と共培養した。(i)B細胞だけ、及び(ii) B細胞に加えて可溶性CD40Lタンパク質(sCD40L)を含有する培養を、陰性及び陽性対照としてそれぞれ使用した。刺激なし(静止)、抗CD3/CD28ビーズによる刺激後(ビーズ)、又はPMA/イオノマイシンによる刺激後(PMA/Iono)に、T細胞を試験した。共培養5日後に、FACS分析を実行した。図8に示すように、編集されたT細胞は、共培養アッセイにおいてB細胞クラススイッチングを誘導することができた。さらに、遺伝子編集後にT細胞と共培養したB細胞の培地中でIgMレベルは有意に減少し、IgGレベルは有意に増加した(図9)。まとめると、図8及び図9において報告されたデータは、編集されたT細胞が機能的なCD40Lを発現し、その細胞が、in vitroでクラススイッチングを誘導したB細胞へ接触依存的シグナルを提供する能力があることを実証する。
【０２８３】
[実施例3]
CD40L遺伝子座における標的化組込み
実施例1からの4つのgRNA切断部位における標的化組込みのベースラインレベルを決定した: gRNA A(S.ピオゲネス)、gRNA C(S.ピオゲネス)、gRNA D(S.アウレウス)及びgRNA G(S.アウレウス)。全てのドナーが、予測される切断部位に隣接するように設計された短い相同腕内に同じカーゴ(スタッファー配列、CD40LG cDNA/3' UTR/ポリA及びGFP発現カセット)を含有するように、AAV6ドナー鋳型を図1Aの描写にしたがって設計した。各構築物中の相同腕長を、表12に提供する。
【０２８４】
2021500080.tif 000037
【０２８５】
ヒト男性初代CD4+T細胞を成長させ、上に記載した通り表示したgRNAをヌクレオフェクトした。細胞を、新たな培養培地へ移し、AAV6粒子を、感染多重度(MOI)5e4又は1e5のいずれかで15分後に培養に添加した。細胞を7日間拡大し、フローサイトメトリー分析を使用してGFP発現に基づいて標的化組込みについて次いで評価した。ヌクレオフェクション後のこの時点で、組込まれていないAAVドナーから検出可能なGFPの発現は非常にわずかであり(データ不掲載)、このことは、高レベルのGFP発現がある細胞は、標的化組込みを受けたことを示す。図10に示すように、GFP発現に基づいて、gRNA間の差異が、標的化組込みのベースラインレベルに見出された(gRNA Aおよそ35%、gRNA Cおよそ15%、gRNA Dおよそ28%、及びgRNA Gおよそ17%)。標的化組込みの用量依存的低減は、細胞に与えられるAAV6ドナーの量を低減させることによって観察されなかった。結果は、少なくとも2つの独立した試料を表している。
【０２８６】
標的化組込みのベースラインレベルを増加させるために、相同腕を長くする効果を検討した。長い相同腕(カーゴの各側に500bp)を有するAAV6ドナー鋳型を、図10において決定した標的化組込みに基づいてトップgRNA部位用に設計した(gRNA A及びgRNA D)。標的化組込み実験を、上で記載したヒト男性初代CD4+T細胞で行った。細胞に、短いHA(図10に使用したAAV6ドナーと同じ)又は長いHAいずれかを持つAAV6ドナー鋳型を与えた。GFP発現を、ヌクレオフェクション7日後にフローサイトメトリーによって決定し、図11にプロットする。長いHAは、両方のgRNA切断部位について標的化組込みのレベルを改善した。gRNA A部位における標的化組込みは、約35%〜約44%増加し、gRNA D部位における標的化組込みは、約28%〜約42%増加した。
【０２８７】
[実施例4]
マウスモデルにおける養子T細胞療法
マウスを、0日目にシクロホスファミドで事前処置又は調整してレシピエント細胞を枯渇し、リンパ球ニッチに空きを生じさせ、移植細胞のより良好な生着を可能にした。野生型T細胞を2日目に注射し、その生着を経時的に長軸方向に測定した。CD8/CD4比は、無調整群において安定なままであったが、調整されたマウスにおいて有意に増加した(図12Aを参照のこと)。その時間の間、大多数の循環するドナーCD8及びCD4 T細胞は、それぞれTセントラル記憶及びエフェクター記憶表現型を表した(図12B)。TNP/KLHワクチン接種を、21日目に導入し、続いて35及び50日目に血清学的アッセイを行った。図13に示すように、シクロホスファミドによる調整は、マウスにおいて一層高レベルのTNP/KLH特異的IgGをもたらした。ワクチン接種に対する特異的IgG応答のレベルは、投与される調整用量(図14A)及び循環する野生型CD4 T細胞の量(百分率及び絶対数、図14B)と相関する。しかしながら、調整していないマウスもワクチン接種に応じてIgGレベルの増加を示したので、調整ステップは、絶対に必要というわけではない(図13及び図14A)。第2の実験において、マウスを、0日目に抗白血球(ALS)又は抗CD4抗体で事前処置又は調整した。図14C及び14Eは、事前調整レジメンによる処置有り又は無しのマウスにおける経時的なレシピエント及びドナーT細胞の百分率を図示する。ワクチン接種に対する特異的IgG応答のレベルは、投与される調整用量と相関する(図14D)。このデータは、リンパ枯渇調整が、免疫生物学的戦略によっても実行され得たという証拠を提供する。養子T細胞移植は、移植したマウスの脾臓における胚中心の存在も回復させた(図15A及び図15B)。
【０２８８】
[実施例5]
マウスモデルにおける造血幹細胞療法
CD40L陰性マウスを、6〜8週齢野生型C57B/6マウスから採収したCD40L野生型HSPCで処置し、HIGM1マウスから採収したCD40LG陰性細胞と、異なる百分率(100%、10%、1%、及び0%)で混合した。次いでレシピエントマウスを、TNP-KLHで免疫し、TNP-KLH特異的IgGのレベルを測定した。図16Aに示すように、CD40L野生型細胞を10%及び100%含む造血幹細胞を受けたマウスは、非常に高いレベルのIgGを有し、このことは、CD40L編集された細胞を少なくとも10%含む造血幹細胞が、疾患、例えば高IgM症候群を処置する治療効果を示すことを示唆している。
【０２８９】
第2の実験において、図16Bに示すように、マウスを2つの抗原、TNP-KLH及びオバルブミン(OVA)で抗原投与した。0日目にCD40LG陰性マウスに野生型HSPCを異なる百分率で移植した。マウスを、移植後12及び15週目にTNP-KLHで免疫し、移植後20及び23週目にOVAで続いて免疫した。TNP特異的IgG応答を、(i) TNP-KLHによる免疫化前(抗原投与前)、(ii) TNP-KLHによる初期免疫化14日後(14日目)、及び(iii) TNP-KLHによる初期免疫化28日後(追加免疫後、28日目)に評価した。OVA特異的IgG応答を、(i) OVAによる免疫化前(抗原投与前)、(ii) OVAによる初期免疫化14日後(14日目)、及び(iii) OVAによる初期免疫化28日後(追加免疫後、28日目)に評価した。結果は、CD40LG陽性HSPCの少なくとも10%の回復が、異なるT細胞依存的ワクチン接種に対する免疫応答の部分的な回復を可能にすることを示す。図16Cは、末梢血におけるドナーT細胞生着を図示する。
【０２９０】
[実施例6]
HIGM1患者から得られるT細胞に対するCD40LG修正の概念実証
修正ドナー鋳型の標的化組込みによってHIGM1の原因となる突然変異の修正を確認するために、遺伝子編集を、CD40L遺伝子のエクソン3上に遺伝子型判定された不活性化突然変異(c.334 G >T)を持つ男性対象から採収したT細胞に対して実行した。患者から及び対照として健康ドナー(HD)(n=4)から得たCD4+T細胞を、成長させ、RNP(gRNA A)をヌクレオフェクトし、15分後に図2Aに図示した修正ドナー鋳型を保有するAAV6ベクターで、MOI 5e4で形質導入した。標的化組込みを、以下のCD4 T細胞亜集団: T幹細胞記憶(TSCM、CD45RA+ CD62L+)、セントラル記憶(CM、CD45RA-CD62L+)、エフェクター記憶(EM、CD45RA-CD62L-)及びエフェクター記憶RA(TEMRA、CD45RA+CD62L-;図17A、17B)内のGFP+細胞の百分率を記録する細胞蛍光測定分析によって測定した。標的した挿入を、5'ベクターとゲノムの接合部を定量化するデジタルドロップレットPCR分析によって検証し、それによりGFP発現によって測定される量と同様に類似の量の相同性指示修復を確認した(図17C)。ポリクローナルT細胞標的化を、TCR-ベータスペクトラタイピングによるT細胞受容体多様性の定量化によって確認した(図17D)。修正構築物の組込みは、PMA/イオノマイシン刺激後に編集された患者T細胞におけるCD40Lの発現及び生理的調節を回復させた(図18)。編集された細胞の機能性を評価するために、選別したGFP+細胞を、T-B細胞共培養アッセイ(図19A)において試験し、B細胞の増殖(図19B、C)及びクラススイッチしたIgGの産生を誘導するB細胞に対するT細胞依存的シグナルの回復を確認した(図20)。
【０２９１】
[実施例7]
移植前のCD40LG編集された細胞の選択
上で記載した方法に加えて、CD40LG突然変異の修繕に使用される修正構築物を選択遺伝子に備えさせて、移植前に、編集された細胞を富化することができる。修正CD40LG cDNAを内部リボソーム進入部位(IRES)配列の後の選択遺伝子(例えば神経成長因子受容体[NGFR])とカップリングさせる(図22A)ことによって、標的化組込みが起こり、CD40LG遺伝子を付随して発現する細胞においてのみ選択遺伝子を発現させることが可能になる。CD40LGは、Tリンパ球の表面上に曝露されるのに強い刺激を必要とするが、CD40LGプロモーターからの発現の基礎レベルは、編集された細胞においてNGFR選択遺伝子を表面発現させるのに十分であり、遺伝子編集の6日後に始めて、その後13日目に抗体選択する(図22B及び図22C)。処置細胞のPMA/イオノマイシン刺激後、CD40LGプロモーターは、CD40L及びNGFRタンパク質両方の発現を急増させた(図22D)。しかしながら、CD40L表面発現のカイネティクスは、模擬(無編集、UT) T細胞において測定されるそれと同等である(図22E)。NGFR発現カセットを使用して、発現のレベル及びCD40L+細胞の百分率の両方の点から、編集された細胞におけるCD40LG遺伝子の生理的発現を得た(図22E)。図22Fは、共培養アッセイにおいてB細胞クラススイッチングを復元するCD40L編集されたT細胞の能力を図示し、静止、ビーズ活性化(比1:1)又はPMA/イオノマイシン刺激T細胞(未処置[UT]、又は編集された[NGFR+])との共培養におけるIgGスイッチしたB細胞の百分率を示す。選択カセットを含む修正ドナーの標的化組込み効率(図23A)は、元の修正ドナー鋳型で測定された効率と類似していた(図6A)。CD40LGを発現する標的された細胞は、T細胞培養組成物にいかなるスキューもなしにNGFR選択によって富化することができ(図23B)、分子分析は、NGFR+細胞において標的された組込みの存在を確認した(図23C)。NSGマウスを、NGFR発現について選別した又は選別しなかった編集されたCD4+ T細胞で移植した。生着のレベルは、未編集のT細胞を移植したマウスにおいて観察されるレベルと同等であり、編集された細胞の割合は、経時的に安定したままであった(図24A)
。これらのデータは、CD40LG編集手順及びNGFR選択が、処置T細胞の再増殖能力を損なわず、そのT細胞が、長期にわたって移植され、移植後にエフェクター細胞へと生理的に分化することが一般に可能であることを実証する(図24B)。図24Cは、編集されたCD40LGが、NSGマウスから回収された編集されたT細胞によって発現されることを示す。
【０２９２】
本明細書に記載される選択戦略を活用して、in vitro培養したいかなる治療効果ももたらさない無修正のT細胞の数を最小限にしながらHIGM患者において養子移植され得る治療的に関連する修正されたT細胞の割合及び絶対数を増加させ得る。
【０２９３】
[実施例8]
ヒト造血幹前駆体細胞におけるCD40Lの遺伝子編集
遺伝子修正自家T細胞に基づく養子免疫療法アプローチは、レシピエントHIGM1患者における防御免疫の発生及びおそらく一部の長寿命記憶B細胞の産生も誘導するのに十分であり得る。しかしながら、広範な病原体に応答して効率的なT細胞支援を媒介し得る長期持続性の、広いT細胞レパートリーを再構成するのに、編集されたT細胞の複数回の投与が必要な場合がある。さらに、CD40LGは、CD4 T細胞(Th0、Th1及びTh2)に対する重大な機能を有するが、この分子は、他のいくつかの造血細胞型、例えば活性化B細胞、血小板、NK細胞、単球、好塩基球及び好酸球においても発現される。したがって、遺伝子編集戦略を、T細胞の修正から自家造血幹細胞/前駆体細胞(HSPC)の修正に拡張することが有用になり、このことは、さらに広く長期間にわたる治療的恩恵を提供し得る。
【０２９４】
ヒトHSPCについて記載されている遺伝子修正戦略の移植性を実証するために、本発明者らは、CRISPR/Cas9システムへ以前に報告されているZFNに基づく遺伝子編集プロトコールを最初に適合させた。簡潔には、図25Aに示すように、CD34+細胞を、臍帯血から単離し、SR1+dmPGE2を使用して2日間事前刺激した。細胞を、2日目にIDLVドナーで感染させ、3日目に、in vitro転写されたgRNA又は修飾されたバージョンのin vitro転写されたgRNA(gRNAmod: HPLC精製、ARCAキャップ形成、5'ホスファターゼ)と組み立てられたCas9タンパク質によって構成されるリボ核タンパク質(RNP)複合体と共に電気穿孔した。次いで7日目に細胞を、GFP及び細胞表面マーカーの発現について、FACS分析した。指定された細胞集団において異なる2つのRNP及び参照ZFNによって達成された標的化組込み効率を、図25Bに示す。ZFN及びRNPによる編集後の培養組成物を、未処置細胞と比較して図25Cに示す。編集された細胞におけるインターフェロン(IFN)応答性遺伝子RIG1、IRF7及びOAS1の誘導倍を、図25Dに示す。これらの結果は、修飾されたRNPの送達が、有害なIFN応答を誘導することなく、処置細胞の表現型に影響を及ぼすことなしに、本発明らの歴史的な、最も信頼できる基準であるZFNプロトコールと同等の、ヒトHSPCにおける相同性媒介編集のレベルを可能にすることを示す。
【０２９５】
追加の実験を、臍帯血(CB)、骨髄(BM)及び動員末梢血(MPB)から入手したCD34+細胞を使用して実行した。簡潔には、図26Aに示すように、細胞を、SR1、dmPGE2及びUM171で3日間事前刺激し、その時に細胞を、単一又は2成分合成gRNAと組み立てられたCas9タンパク質によって構成されるRNP複合体と共に電気穿孔し、AAV6ドナーで感染させた。次いで6日目に、細胞を、GFP及び細胞表面マーカーの発現についてFACS選別した。標的化組込み効率(GFP+細胞の百分率として表される)を、図26Bに示す。編集後の細胞培養組成物を、図26Cに示す。IFN応答性遺伝子の発現を、図26Dに示す。これらの結果から、ヒトHSPCにおける相同性媒介編集が、有害なIFN応答を誘導せずに、処置細胞の表現型に影響を及ぼすことなく、またドナーDNAの送達ビヒクルとしてAAV6を使用して又は合成gRNAと組み立てられたRNPを用いて達成され得ることを確認された。
【０２９６】
図27に示すように、様々なドナービヒクル及びヌクレアーゼ構成を使用して多様な供給源からのヒトHSPCを効率的に編集することができる。表示した細胞型を、IDLV又はAAV6ドナー鋳型を用いてZFN又はRNPいずれかを使用して編集した。各亜集団における編集された(GFP+)細胞の百分率を、図27Aに示す。臍帯血、骨髄及び動員末梢血(mPB)から得た編集された(GFP+)細胞集団の百分率を、図27Bに示す。
【０２９７】
CD40L遺伝子修正戦略が、ヒトHSPCにおいて実現可能であることを確認するために、修正ドナーの標的化組込みを、健康な男性ドナーから採収した臍帯血CD34+細胞で実行した。HSPCを成長させ、異なるRNP(gRNA A)用量をヌクレオフェクトし、15分後に、異なる用量の、修正ドナーを保有するAAV6ベクター(MOI: 1e4、5e4及び1e5 vg/細胞)で形質導入した(図21A)。標的化組込みを、5'ベクターとゲノムの接合部を定量化する分析デジタルドロップレットPCRによって測定した。異なるHSPC細胞亜集団全てにおける編集を確認するために、処置細胞を、より原始的(CD34+CD133+CD90+)、初期(CD34+CD133+CD90-)及び委任(CD34+CD133-)前駆体、並びに分化した細胞(CD34-)を予め同定する表面マーカーを利用して選別した。高レベルの標的化組込みを、全体の培養組成物を改変することなく(図21D)、バルク及び異なる選別された集団の両方(図21B、C及びE)において測定した。生着のレベルは、未編集のT細胞を移植したマウスにおいて観察されるレベルと同等であり、編集された細胞の割合は、経時的に安定したままであった(図21F)。
【０２９８】
参照文献による組み込み
あたかも各個別の刊行物、特許又は特許出願が、参照により組み込まれるべく特別に及び個別に示されるかのように、本明細書において言及される刊行物、特許及び特許出願の全ては、その全体を参照により本明細書に組み込む。矛盾する場合、本出願が、本明細書におけるあらゆる定義を含めて、優先することとする。
【０２９９】
均等物
当業技術者は、日常の実験だけを使用して本明細書に記載される特定の実施形態に対する多くの均等物を認識する、又は確認できることになる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１Ａ−Ｄ】
2021500080.tif 000038
【図２Ａ】
2021500080.tif 000039
【図２Ｂ】
2021500080.tif 000040
【図２Ｃ−Ｄ】
2021500080.tif 000041
【図２Ｅ−Ｆ】
2021500080.tif 000042
【図２Ｇ】
2021500080.tif 000043
【図２Ｈ−Ｉ】
2021500080.tif 000044
【図２Ｊ】
2021500080.tif 000045
【図３Ａ−Ｃ】
2021500080.tif 000046
【図３Ｄ−Ｅ】
2021500080.tif 000047
【図４Ａ−Ｃ】
2021500080.tif 000048
【図４Ｄ−Ｆ】
2021500080.tif 000049
【図５Ａ−Ｂ】
2021500080.tif 000050
【図５Ｃ】
2021500080.tif 000051
【図５Ｄ−Ｅ】
2021500080.tif 000052
【図６Ａ】
2021500080.tif 000053
【図６Ｂ】
2021500080.tif 000054
【図７Ａ−Ｂ】
2021500080.tif 000055
【図７Ｃ−Ｅ】
2021500080.tif 000056
【図７Ｆ】
2021500080.tif 000057
【図８】
2021500080.tif 000058
【図９】
2021500080.tif 000059
【図１０】
2021500080.tif 000060
【図１１】
2021500080.tif 000061
【図１２Ａ−Ｂ】
2021500080.tif 000062
【図１３】
2021500080.tif 000063
【図１４Ａ−Ｂ】
2021500080.tif 000064
【図１４Ｃ−Ｄ】
2021500080.tif 000065
【図１４Ｅ】
2021500080.tif 000066
【図１５Ａ】
2021500080.tif 000067
【図１５Ｂ】
2021500080.tif 000068
【図１６Ａ】
2021500080.tif 000069
【図１６Ｂ】
2021500080.tif 000070
【図１６Ｃ】
2021500080.tif 000071
【図１７Ａ−Ｄ】
2021500080.tif 000072
【図１８Ａ−Ｂ】
2021500080.tif 000073
【図１９Ａ−Ｂ】
2021500080.tif 000074
【図１９Ｃ】
2021500080.tif 000075
【図２０Ａ】
2021500080.tif 000076
【図２０Ｂ】
2021500080.tif 000077
【図２１Ａ−Ｄ】
2021500080.tif 000078
【図２１Ｅ−Ｆ】
2021500080.tif 000079
【図２２Ａ−Ｃ】
2021500080.tif 000080
【図２２Ｄ−Ｅ】
2021500080.tif 000081
【図２２Ｆ】
2021500080.tif 000082
【図２３Ａ−Ｃ】
2021500080.tif 000083
【図２４Ａ】
2021500080.tif 000084
【図２４Ｂ】
2021500080.tif 000085
【図２４Ｃ】
2021500080.tif 000086
【図２５Ａ−Ｃ】
2021500080.tif 000087
【図２５Ｄ】
2021500080.tif 000088
【図２６Ａ−Ｂ】
2021500080.tif 000089
【図２６Ｃ−Ｄ】
2021500080.tif 000090
【図２７Ａ−Ｂ】
2021500080.tif 000091
【配列表】
2021500080000001.app
【国際調査報告】
2021500080.tif 000092
2021500080.tif 000093
2021500080.tif 000094
2021500080.tif 000095
2021500080.tif 000096