(57)【要約】本発明は、疾患を有する患者においてT細胞疲弊を予防する、逆転するまたは増加させる方法を供する。本発明はまた、疾患を有する患者において疾患を治療するための方法も供する。本発明はまた、標的とされている高優先度のエピジェネティック経路を含む操作されたT細胞、およびその使用も供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患を治療するのに用いるための改良された細胞治療組成物を作製する方法であって、該方法が、
（ａ）対象からのリンパ球を含む試料を得る段階と、
（ｂ）該リンパ球における疲弊したCD8+Tリンパ球（TEX）の誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現を低減または排除する段階と、
（ｃ）治療に関連する抗原を標的とするように該リンパ球を操作する段階と、
を含み、前記疾患が、癌および感染症から選択される、方法。
【請求項２】
前記対象からのT細胞を含む試料が、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象からのT細胞を含む試料が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍関連リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記リンパ球におけるTEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現が低減される、請求項１、２、または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記リンパ球におけるTEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現が排除される、請求項１、２、または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リンパ球におけるTEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現が、RNA干渉、クラスター化した散在性の短い回文構造の反復（CRISPR）／CRISPR関連タンパク質（Cas）システム、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、アンチセンス、リボザイム、および不活性型（dead）Cas9を含むCRISPR阻害システムからなる群から選択される方法によって低減される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記リンパ球におけるTEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現が、RNA干渉、クラスター化した散在性の短い回文構造の反復（CRISPR）／CRISPR関連タンパク質（Cas）システム、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、アンチセンス、リボザイム、不活性型Cas9を含むCRISPR阻害システムからなる群から選択される方法によって排除される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患がウイルス感染症である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス感染症が急性ウイルス感染症または慢性ウイルス感染症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患が急性ウイルス感染症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記急性ウイルス感染症が、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、アネロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、およびインフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスによる感染症を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスが、A型肝炎ウイルス（HAV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、D型肝炎ウイルス（HDV）、E型肝炎ウイルス（HEV）、GB肝炎ウイルスA（GBV-A）、GB肝炎ウイルスB（GBV-B）、およびGB肝炎ウイルスC（GBV-C）からなる群から選択される肝炎ウイルスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスが、アルファヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス1型（HSV1）、単純ヘルペスウイルス2型（HSV2）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、ベータヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス7、ガンマヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス（EBV）、およびヒトヘルペスウイルス8からなる群から選択されるヘルペスウイルスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスが、BKウイルス（BKV）、JCウイルス（JCV）、KIポリオーマウイルス（KIPyV）、WUウイルス（WUPyV）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（MCPyV）、ヒトポリオーマウイルス6（HPyV6）、ヒトポリオーマウイルス7（HPyV7）、毛髪異形成棘状ウイルス（trichodysplasia spinulosa virus：TSPyV）、ヒトポリオーマウイルス9（HPyV9）、およびMWウイルス（MWPyV）からなる群から選択されるポリオーマウイルスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスが、アデノウイルス血清型A、アデノウイルス血清型B、アデノウイルス血清型C、アデノウイルス血清型D、アデノウイルス血清型E、アデノウイルス血清型F、およびアデノウイルス血清型Gからなる群から選択されるアデノウイルスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスが、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスB、インフルエンザウイルスC、およびインフルエンザウイルスDからなる群から選択されるインフルエンザウイルスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患が慢性ウイルス感染症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記慢性ウイルス感染症がHIV、HCVまたはHBVによる感染症を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記慢性ウイルス感染症がHIVによるものであり、前記対象が抗レトロウイルス療法（ART）で処置中である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記慢性ウイルス感染症が、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、およびスプマウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスによるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記レトロウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記感染症が細菌感染症または寄生体感染症である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が癌である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記TEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子が、転写因子またはDNAのエピジェネティックな改変に関与する遺伝子である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記TEXの誘導および／または維持のために必要とされる１つまたは複数の遺伝子が転写因子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記転写因子が、TOX、NFAT1、NFAT2、BATF、IRF4、T-bet、Eomes、Tcf1、Blimp-1、Bcl6、Foxo1、Stat1、Stat2、Tcf4、およびIkzf2からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記TEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子が、DNAのエピジェネティックな改変に関与する遺伝子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記DNAのエピジェネティックな改変に関与する遺伝子が、
2021501156.tif 000202
からなる群から選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
治療に関連する抗原を標的とするようにリンパ球を操作する段階が、所望の抗原／MHCもしくはネオ抗原／MHCの組み合わせに結合することができる組換えT細胞受容体の導入、または所望の抗原に結合することができるキメラ抗原受容体の導入、を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療に関連する抗原が、CD19、PSMA、CAIX、HER2、CD30zeta、葉酸受容体アルファ、ムチン1（MUC1）、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、HIVエンベロープ糖タンパク質gp120、CMV pp65、GPC3、CEA、メソテリン、GD2、EGFR、PSMA、EpCAM、BCMA、IL-13R、FAPおよびCD20からなる群から選択される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
疲弊したＣＤ８＋エフェクターT細胞（TEX）の数の増加を特徴とする疾患を治療する方法であって、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法によって作製された改良された細胞治療組成物を投与する段階を含む、方法
【請求項３２】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法によって作製された操作されたリンパ球を含む、改良された細胞治療組成物。
【請求項３３】
疲弊したＣＤ８＋エフェクターT細胞（TEX）の数の増加を特徴とする疾患を治療する方法であって、カルシウムシグナル伝達の阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
前記カルシウムシグナル伝達の阻害剤が、FK506／タクロリムス、ピメクロリムス、およびシクロスポリンAからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
自己免疫疾患を治療するための改良された細胞治療組成物を作製する方法であって、
（ｄ）対象からの自己反応性リンパ球を含む試料を得る段階と、
（ｅ）該自己反応性リンパ球における疲弊したＣＤ８＋Ｔリンパ球（TEX）の誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現を増加させる段階と、
（ｆ）治療に関連する抗原を標的とするようにリンパ球を操作する段階と、
を含む、方法。
【請求項３６】
前記対象からのT細胞を含む試料が、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象からのT細胞を含む試料が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍関連リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記自己反応性リンパ球におけるTEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現が増加される、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法によって作製された操作されたリンパ球を含む、改良された細胞治療組成物。
【請求項４０】
疲弊したＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（TEX）の数の減少を特徴とする疾患を治療する方法であって、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法によって作製された改良された細胞治療組成物を投与する段階を含む、方法。
【請求項４１】
T細胞の再活化（reinvigoration）を必要とする対象を同定する方法であって、
（ｇ）対象からのリンパ球を含む試料を得る段階と、
（ｈ）該試料における疲弊したＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（TEX）に特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現を測定する段階と、
（ｉ）TEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現を、リンパ球を含む対照試料におけるTEXに特徴的な同じ1つまたは複数の遺伝子の発現と比較する段階と、
（ｊ）段階（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を1つまたは複数の後続の時点で繰り返す段階と、
（ｋ）リンパ球を含む第２の試料または後の試料におけるTEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現が、リンパ球を含む第１の試料または前の試料におけるその発現と比較して増加している場合に、対象がT細胞の再活化を必要としていると決定し、または
（ｌ）第２の試料または後の試料におけるTEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現が、リンパ球を含む第１の試料または前の試料におけるその発現と比較して同じか減少している場合に、対象がT細胞の再活化を必要としていないと決定する段階と、
を含む、方法。
【請求項４２】
前記TEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子が、TOX、NFAT1、NFAT2、BATF、IRF4、T-bet、Eomes、Tcf1、Blimp-1、Bcl6、Foxo1、Stat1、Stat2、Tcf4、およびIkzf2からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記TEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子が、
2021501156.tif 000203
からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象からのＴ細胞を含む試料が、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象からのＴ細胞を含む試料が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍関連リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象がＴ細胞の再活化を必要としていると決定された場合に、該対象にＴ細胞の再活化のための組成物を投与する段階をさらに含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象がＴ細胞の再活化を必要としていないと決定された場合に、代替処置を対象に施す段階をさらに含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、全体が引用により本明細書に組み込まれる、2017年10月27日に提出された米国仮出願第62/578,234号の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する声明
この発明は、国立衛生研究所（NIH）から授与された助成金番号AI105343、AI082630、AI082292、R37GM053256、および1-F30-AI-129263-01に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
T細胞機能不全の獲得状態であるT細胞疲弊（T cell exhaustion）は、癌および慢性ウイルス感染の特徴である(Wherry et al. (2007) Immunity 27:670-684（非特許文献1）; Zajac et al. (1998) J. Exp. Med. 188:2205-2213（非特許文献2）)。近年、癌におけるT細胞疲弊を逆転させる処置が著しく効果的であることが証明されている(Barber et al. (2006) Nature 439:682-687（非特許文献3）; Topalian et al. (2012) New Engl. J. Med. 366:2443-2454（非特許文献4）)。キメラ抗原受容体（CAR）−T細胞療法も、血液悪性腫瘍に極めて効果的であることが証明されている(Porter et al. (2011) New Engl. J. Med. 365:725-733（非特許文献5）)が、固形腫瘍を治療するための操作されたT細胞における疲弊の発達は、その広範な使用に対する重要な障壁のままである(Long et al. (2015) Nat. Med. 21:581-590（非特許文献6）)。T細胞疲弊を調節するメカニズムを同定することは、免疫チェックポイント遮断および癌免疫療法のための養子T細胞療法の有効性を改善し得る(Barber et al. (2006) Nature 439:682-687; Topalian et al. (2012) New Engl. J. Med. 366:2443-2454; Porter et al. (2011) New Engl. J. Med. 365:725-733（非特許文献3〜5）)。
【０００４】
T細胞疲弊を調節するための現在のストラテジーは、免疫チェックポイントなどのエフェクター遺伝子発現産物の発現を直接調節することに依存しており、そのようなエフェクター遺伝子発現産物の生理的レベルは通常のT細胞機能にしばしば必要とされるため、このような調節は望ましくない副作用を引き起こす。さらに、そのようなストラテジーは薬剤耐性に対して脆弱であり、免疫病理学につながり得る。したがって、T細胞においてエフェクター遺伝子発現産物の発現を調節するとともに、耐久性、ホーミングおよびマイグレーション、（転写因子およびエピジェネティックレギュレーターを含む）転写制御、ならびに代謝制御メカニズムに影響を与える遺伝子を調節するために有用な組成物および方法を同定するための、当技術分野において大きな必要性がある。T細胞の分化状態を疲弊から遠ざけ、エフェクターまたはメモリーの運命に導くための遺伝子発現プログラムを調節するための方法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wherry et al. (2007) Immunity 27:670-684
【非特許文献２】Zajac et al. (1998) J. Exp. Med. 188:2205-2213
【非特許文献３】Barber et al. (2006) Nature 439:682-687
【非特許文献４】Topalian et al. (2012) New Engl. J. Med. 366:2443-2454
【非特許文献５】Porter et al. (2011) New Engl. J. Med. 365:725-733
【非特許文献６】Long et al. (2015) Nat. Med. 21:581-590
【発明の概要】
【０００６】
概要
疾患を治療するのに用いるための改良された細胞治療組成物を作製する方法を供する。その方法は、
（ａ）対象からのリンパ球を含む試料を得る段階と、
（ｂ）該リンパ球における疲弊した（exhausted）CD8+Tリンパ球（TEX）の誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現を低減または排除する段階と、
（ｃ）治療に関連する抗原を標的とするように該リンパ球を操作する段階と、
を含み、ここで、前記疾患は、癌および感染症から選択される。
【０００７】
特定の実施形態において、前記対象からのT細胞を含む試料は、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む。特定の実施形態において、前記対象からのT細胞を含む試料は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍関連リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。さらなる実施形態において、前記リンパ球におけるTEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現は低減される。さらなる実施形態において、前記リンパ球におけるTEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現は排除される。
【０００８】
特定の実施形態において、前記リンパ球におけるTEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現は、RNA干渉、クラスター化した散在性の短い回文構造の反復（CRISPR）／CRISPR関連タンパク質（Cas）システム、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、アンチセンス、リボザイム、および死んだCas9を含むCRISPR阻害システムからなる群から選択される方法によって低減される。
【０００９】
特定の実施形態において、前記リンパ球におけるTEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現は、RNA干渉、クラスター化した散在性の短い回文構造の反復（CRISPR）／CRISPR関連タンパク質（Cas）システム、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、アンチセンス、リボザイム、死んだCas9を含むCRISPR阻害システムからなる群から選択される方法によって排除される。
【００１０】
特定の実施形態において、前記疾患はウイルス感染症である。特定の実施形態において、前記ウイルス感染症は急性ウイルス感染症または慢性ウイルス感染症である。特定の実施形態において、前記疾患は急性ウイルス感染症である。さらなる実施形態において、前記急性ウイルス感染症は、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、アネロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、およびインフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスによる感染症を含む。
【００１１】
特定の実施形態において、前記ウイルスは、A型肝炎ウイルス（HAV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、D型肝炎ウイルス（HDV）、E型肝炎ウイルス（HEV）、GB肝炎ウイルスA（GBV-A）、GB肝炎ウイルスB（GBV-B）、およびGB肝炎ウイルスC（GBV-C）からなる群から選択される。特定の実施形態において、前記ウイルスは、アルファヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス1型（HSV1）、単純ヘルペスウイルス2型（HSV2）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、ベータヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス7、ガンマヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス（EBV）、およびヒトヘルペスウイルス8からなる群から選択されるヘルペスウイルスである。特定の実施形態において、前記ウイルスは、BKウイルス（BKV）、JCウイルス（JCV）、KIポリオーマウイルス（KIPyV）、WUウイルス（WUPyV）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（MCPyV）、ヒトポリオーマウイルス6（HPyV6）、ヒトポリオーマウイルス7（HPyV7）、毛髪異形成棘状ウイルス（trichodysplasia spinulosa virus：TSPyV）、ヒトポリオーマウイルス9（HPyV9）、およびMWウイルス（MWPyV）からなる群から選択されるポリオーマウイルスである。特定の実施形態において、前記ウイルスは、アデノウイルス血清型A、アデノウイルス血清型B、アデノウイルス血清型C、アデノウイルス血清型D、アデノウイルス血清型E、アデノウイルス血清型F、およびアデノウイルス血清型Gからなる群から選択されるアデノウイルスである。特定の実施形態において、前記ウイルスは、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスB、インフルエンザウイルスC、およびインフルエンザウイルスDからなる群から選択されるインフルエンザウイルスである。
【００１２】
特定の実施形態において、前記疾患は慢性ウイルス感染症である。特定の実施形態において、前記慢性ウイルス感染症は、HIV、HCVまたはHBVによる感染症を含む。特定の実施形態において、前記慢性ウイルス感染症はHIVによるものであり、前記対象は抗レトロウイルス療法（ART）で処置されている。特定の実施形態において、前記慢性ウイルス感染症は、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、およびスプマウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスによるものである。特定の実施形態において、前記レトロウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスである。
【００１３】
特定の実施形態において、前記感染症は細菌感染症または寄生体感染症である。
【００１４】
特定の実施形態において、前記疾患は癌である。
【００１５】
特定の実施形態において、前記TEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子は、転写因子またはDNAのエピジェネティックな改変に関与する遺伝子である。さらなる実施形態において、前記TEXの誘導および／または維持のために必要とされる１つまたは複数の遺伝子は転写因子である。特定の実施形態において、前記転写因子は、TOX、NFAT1、NFAT2、BATF、IRF4、T-bet、Eomes、Tcf1、Blimp-1、Bcl6、Foxo1、Stat1、Stat2、Tcf4、およびIkzf2からなる群から選択される。特定の実施形態において、１つまたは複数の転写因子は図１９に示される。
【００１６】
特定の実施形態において、前記TEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子は、DNAのエピジェネティックな改変に関与する遺伝子である。特定の実施形態において、前記DNAのエピジェネティックな改変に関与する遺伝子は、
2021501156.tif 000002
からなる群から選択される。
【００１７】
特定の実施形態において、治療に関連する抗原を標的とするようにリンパ球を操作する段階は、所望の抗原／MHCもしくはネオ抗原／MHCの組み合わせに結合することができる組換えT細胞受容体の導入、または所望の抗原に結合することができるキメラ抗原受容体の導入、を含む。特定の実施形態において、前記治療に関連する抗原は、CD19、PSMA、CAIX、HER2、CD30zeta、葉酸受容体アルファ、ムチン1（MUC1）、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、HIVエンベロープ糖タンパク質gp120、CMV pp65、GPC3、CEA、メソテリン、GD2、EGFR、PSMA、EpCAM、BCMA、IL-13R、FAPおよびCD20からなる群から選択される。
【００１８】
疲弊したＣＤ８＋エフェクターT細胞（TEX）の数の増加を特徴とする疾患を治療する方法であって、先の請求項のいずれか一項に記載の方法によって作製された改良された細胞治療組成物を投与する段階を含む、方法を供する。
【００１９】
先の請求項のいずれか一項に記載の方法によって作製された操作されたリンパ球を含む、改良された細胞治療組成物を供する。
【００２０】
疲弊したＣＤ８＋エフェクターT細胞（TEX）の数の増加を特徴とする疾患を治療する方法であって、カルシウムシグナル伝達の阻害剤を投与することを含む、方法を供する。特定の実施形態において、前記カルシウムシグナル伝達の阻害剤は、FK506／タクロリムス、ピメクロリムス、およびシクロスポリンAからなる群から選択される。
【００２１】
自己免疫疾患を治療するための改良された細胞治療組成物を作製する方法も供する。その方法は、
（ａ）対象からの自己反応性リンパ球を含む試料を得る段階と、
（ｂ）該自己反応性リンパ球における疲弊したＣＤ８＋Ｔリンパ球（TEX）の誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現を増加させる段階と、
（ｃ）治療に関連する抗原を標的とするようにリンパ球を操作する段階と、
を含む。
【００２２】
特定の実施形態において、前記対象からのT細胞を含む試料は、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む。特定の実施形態において、前記対象からのT細胞を含む試料は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍関連リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。特定の実施形態において、前記自己反応性リンパ球におけるTEXの誘導および／または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現は増加される。
【００２３】
先の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製された操作されたリンパ球を含む、改良された細胞治療組成物を供する。
【００２４】
疲弊したＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（TEX）の数の減少を特徴とする疾患を治療する方法であって、先の実施形態のいずれか１つに記載の方法によって作製された改良された細胞治療組成物を投与する段階を含む、方法を供する。
【００２５】
T細胞の再活化（reinvigoration）を必要とする対象を同定する方法を供する。その方法は、
（ａ）対象からのリンパ球を含む試料を得る段階と、
（ｂ）該試料における疲弊したＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（TEX）に特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現を測定する段階と、
（ｃ）TEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現を、リンパ球を含む対照試料におけるTEXに特徴的な同じ1つまたは複数の遺伝子の発現と比較する段階と、
（ｄ）段階（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を1または複数の後続の時点で繰り返す段階と、
（ｅ）リンパ球を含む第２の試料または後の試料におけるTEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現が、リンパ球を含む第１の試料または前の試料における発現と比較して増加している場合に、対象がT細胞の再活化を必要としていると決定し、または
（ｆ）第２の試料または後の試料におけるTEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現が、リンパ球を含む第１の試料または前の試料における発現と比較して同じか減少している場合に、対象がT細胞の再活化を必要としていないと決定する段階と、
を含む。
【００２６】
特定の実施形態において、前記TEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子は、TOX、NFAT1、NFAT2、BATF、IRF4、T-bet、Eomes、Tcf1、Blimp-1、Bcl6、Foxo1、Stat1、Stat2、Tcf4、およびIkzf2からなる群から選択される。特定の実施形態において、TEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子は、図１９に示される。
【００２７】
特定の実施形態において、前記TEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子は、
2021501156.tif 000003
からなる群から選択される。
【００２８】
特定の実施形態において、前記対象からのＴ細胞を含む試料は、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む。
【００２９】
特定の実施形態において、前記対象からのＴ細胞を含む試料は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍関連リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。
【００３０】
前記対象がＴ細胞の再活化を必要とすると決定された場合に、該対象にＴ細胞の再活化のための組成物を投与する段階をさらに含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の方法も供する。
【００３１】
前記対象がＴ細胞の再活化を必要としないと決定された場合に、代替処置を対象に施す段階をさらに含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の方法も供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、よりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的で、現在好ましい実施形態が図面に示されている。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置および手段に限定されないことを理解されたい。
【００３３】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｆは、抗ＰＤ−Ｌ１処置がＴＥＸの転写プロファイルに及ぼす影響を示す一連の画像である。図１Ａは、対照または抗PD-L1抗体による処理の前（15日pi ）または治療後（34日pi ）にマウスから単離されたPBMC上のCD8+細胞にゲートされた代表的なフローサイトメトリープロット（上）またはDbGP276四量体+細胞にゲートされたヒストグラム（下）を示す。図１Ｂは、ＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋細胞のＤｂＧＰ２７６四量体＋細胞（上）およびＤｂＧＰ２７６四量体＋細胞のＫｉ−６７＋（下）の頻度を示す図１Ａの定量化を示す。図１Ｃは、図１Ｂに示されるマウスからの血清処置前（１２日目）および処置後（３８日目）におけるウイルス負荷（プラーク形成単位／ｍｌ）を示す。図１Ｂおよび図１Ｃにおけるドットを結ぶ線は、同じマウスの処置前後のデータを示す。グループ間の対応t検定によって決定された有意性を示すアスタリスクは、**p<0.01および***p<0.001であり。データは、グループあたり少なくとも５匹のマウスでの少なくとも３つの独立した実験の代表である。図１Ｄは、マイクロアレイデータにおける倍率変化に基づいて有意に差次的に発現された上位の遺伝子を示す列正規化ヒートマップを示す。選択された遺伝子が表示される。Pauken et al. Table S1(Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)において利用可能な倍数変化およびp値を伴う遺伝子の完全なリスト。図１Ｅは、ＴＥＸ対ＴＮにおけるメタジーンと比較した、対照−vs抗ＰＤ−Ｌ１処理ＴＥＸにおいて同定されたメタジーンのオーバーラップを示すCircosプロットを示す。TEX対TNの転写データは、Doering et al.から入手した(Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144)。図１Ｆは、Doering et al. (Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144)からのTEFF、TMEM、またはTEXをTNと比較、および図２Ａ〜２Ｊからの抗PD-L1で処理されたTEXを対照処理TEXと比較したメタジーンのP値およびFDR q値を示す。メタジーンのメンバーシップおよびオーバーラップの詳細は、Pauken et al. Table S4 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)に見出すことができる。
【図１−２】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−３】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−４】図１−１の説明を参照のこと。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｊは、処置の停止後に持続されない抗ＰＤ−Ｌ１によって誘導されたＴＥＸ細胞におけるエフェクター様転写プログラムを示す一連の画像である。図２Ａは、対照または抗PD-L1処理TEX上のマイクロアレイからの1-ピアソン相関によるコンセンサス階層的クラスタリングを示す。図２Ｂは、代表的なGene Ontology（GO）タームのGene Set Enrichment Analysis（GSEA）を示す。図２Ｃは、エフェクター遺伝子のGSEAを示す。図２Ｄは、エフェクター関連遺伝子の列正規化ヒートマップを示す。図２Ｅは、TEFF（左）およびTMEM細胞（右）におけるメタジーンと比較した、抗PD-L1処理TEXで同定されたメタジーンにおける重複を示すCircosプロットを示す。Circosプロットの領域を結ぶリボンは、グループ間で共有されている遺伝子を示す。マイクロアレイには、実験ごとに1グループあたり１０〜１２匹のマウスを用いた４つの独立した実験が含まれる。図２Ｆは、ＣＤ８ Ｔ細胞のうちのＰ１４細胞の頻度を示し、図２Ｇは、末梢血中のＫｉ６７＋Ｐ１４細胞を示す。灰色のバーは抗体処理期間を示す。図２Ｈは、ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋Ｐ１４細胞の定量化を示す。図２Ｉは、腎臓におけるウイルス負荷を示す。図２Ｆ〜２Ｇのデータは、１つの代表的な実験である。図２Ｈ〜２Ｉにおいて、+1日の時点は2つの代表的な実験から組み合わされ、+20週の時点は1つの代表的な実験からのものである。図２Ｆ〜２Ｉのデータは、実験ごとにグループごとに少なくとも４匹のマウスを用いた少なくとも２つの独立した実験の代表である。図２Ｊは、ＲＮＡ−ｓｅｑの主成分分析を示し、分散（変数）の％で示される。「方法」において示されるように、RNA-seqは1グループあたり5〜13匹のマウスを用いる2〜4回の独立した実験で行った。各ドットは独立した実験を表す。グループ間の対応のないt検定によって決定された有意性を示すアスタリスクは、*p<0.05、**p<0.01、および***p<0.001である。
【図２−２】図２−１の説明を参照のこと。
【図２−３】図２−１の説明を参照のこと。
【図２−４】図２−１の説明を参照のこと。
【図２−５】図２−１の説明を参照のこと。
【図２−６】図２−１の説明を参照のこと。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｅは、抗ＰＤ−Ｌ１処置の中止後のウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の再疲弊を表す一連の画像である。図３Ａは、抗PD-L1処理の中止後1日または20週の脾臓におけるP14s（Ly5.1+細胞）を示すCD8+T細胞にゲートされた代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図３Ｂは、図３Ａに示されるマウスからの脾臓におけるＰ１４頻度（左）および数（右）の定量化を示す。図３Ｃは、脾臓におけるKi-67（左）およびグランザイムB（右）のフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。図３Ｄは、図３Ｃの定量化を示す。図３Ｅは、ｇｐ３３−４１ペプチドによるエクスビボ刺激後のＰ１４細胞にゲートされた代表的なフローサイトメトリープロットを示し、図２Ｉにおいて定量化されたＩＦＮγおよびＴＮＦα産生を示す。図３Ａ〜図３Ｅに示されるマウスは、図２Ｈおよび２Ｉに示されるマウスに対応する。+1日の時点は2つの代表的な実験からの組み合わせであり、+20週の時点は1つの代表的な実験のものである。データは、実験ごとにグループごとに少なくとも4匹のマウスを用いた少なくとも2つの独立した実験の代表である。グループ間の対応のないt検定によって決定された有意性を示すアスタリスクは、*p<0.05、**p<0.01、および***p<0.001である。
【図３−２】図３−１の説明を参照のこと。
【図３−３】図３−１の説明を参照のこと。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、抗PD-L1処理後の阻害性受容体発現を示す一連の画像である。図４Ａは、処置の中止後2日（左）または20週（右）の脾臓におけるP14細胞上の抑制性受容体の共発現を示す。代表的なヒストグラム（上）および複数のマウスからの相乗平均蛍光強度（MFI）の定量化（下）は、クローン13感染中の抗PD-L1処置後、図４Ｂに示すような、2日、または図４Ｃに示すような、20週、における、PD-1、Lag-3、Tim-3、および2B4を示す。Arm免疫マウスは、P14細胞にゲートされた、30+ 日p.iであった。データは、Arm免疫グループあたり少なくとも3匹のマウス、および、クローン13グループあたり少なくとも5匹のマウスを用いた2つの独立した実験の代表である。統計的有意性は、ノンパラメトリック一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて決定された。グループ間の有意性を示すアスタリスクは、*p<0.05、**p<0.01、および***p<0.001である。青いアスタリスクはANOVA p値を示し、黒いアスタリスクはテスト後のp値を示す。
【図４Ｂ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図４Ｃ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｆは、内因性ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の再活化が、抗原が高いままである場合、時間とともに衰えることを示す一連の画像である。抗PD-L1処理後の2日間（末梢血中）、7週間（脾臓）、または18週間（脾臓）での内因性ウイルス特異的CD8 T細胞応答のモニタリング。図５Ａは、ＤｂＧＰ２７６四量体およびＣＤ４４を示す代表的なプロットを示す。図５Ｂは、全ＣＤ８＋集団のＤｂＧＰ２７６＋（上）およびＤｂＧＰ３３＋（下）の頻度の定量化を示す。図５Ｃは、ＤｂＧＰ２７６＋細胞でゲートされた、ＰＤ−１発現の代表的なヒストグラムを示す。図５Ｄは、ＤｂＧＰ２７６＋細胞（上）またはＤｂＧＰ３３＋細胞（下）でゲートされた、ＰＤ−１のジオメトリックＭＦＩの定量化を示す。図５Ｅは、Ｋｉ−６７発現を示す代表的なヒストグラムを示す。図５Ｆは、Ki-67+DbGP276+（上）またはDbGP33+（下）の頻度の定量化を示す。データは、グループあたり少なくとも4匹のマウスを用いた2つの独立した実験の代表である。グループ間の対応のないt検定によって決定された有意性を示すアスタリスクは、***p<0.001である。
【図５−２】図５−１の説明を参照のこと。
【図５−３】図５−１の説明を参照のこと。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｅは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−ｓｅｑによって生成された対照および抗ＰＤ−Ｌ１処理されたＴＥＸ細胞の転写プロファイルの比較を示す一連の画像である。図６Ａは、2週間の処置期間の1日後に単離された対照または抗PD-L1処置マウスからのTEX間の（1-ピアソン相関による）分散によるRNA-seqからの遺伝子のコンセンサス階層的クラスタリングを示す。図６Ｂは、マイクロアレイにおいて評価された遺伝子の重複、および処置後１日のマウスからのＲＮＡ−ｓｅｑデータセットを示す。図６Ｃは、マイクロアレイおよびＲＮＡ−ｓｅｑデータセットにおける抗ＰＤ−Ｌ１処理後の示差的に発現された遺伝子（ｐ＜０．０５）の対数倍変化（ＬＦＣ）の比較を示す。差次的に発現された遺伝子の完全なリストは、マイクロアレイについてPauken et al. Table S1 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)、およびＲＮＡ−ｓｅｑについてPauken et al. Table S5 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)において入手可能である。図６Ｄは、代表的な有意に富化された（enriched）GOタームのGSEAを示す。Pauken et al. Table S6 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)で利用可能なRNA-seqのGOタームの完全なリスト。図６Ｅは、マイクロアレイ（左）およびRNA-seq（右）における対照TEXと比較した抗PD-L1処理TEXの上位15の有意に富化されたGOタームを示す。マイクロアレイについてPauken et al. Table S2 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)、およびRNA seqについてPauken et al. Table S6 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)において利用可能なGOタームの完全なリスト。
【図６−２】図６−１の説明を参照のこと。
【図６−３】図６−１の説明を参照のこと。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｅは、ＲＮＡ−ｓｅｑを用いる抗ＰＤ−Ｌ１処理を伴うまたは伴わない、ＴＥＸの転写プロファイルの時間的変化を表す一連の画像である。図７Ａは、処置の中止の1日後または18〜29週後の対照または抗PD-L1処置マウスからのTEX間の（1-ピアソン相関による）分散によるRNA-seqからの遺伝子のコンセンサス階層的クラスタリングを示す。左に示す4つのグループすべてのクラスター化、右にボックス化して示される、対照および処置後18〜29週の抗PD-L1処置TEXの対での比較。図７Ｂは、クラスネイバー分析（class neighbor analysis）のヒートマップを示し、対照、または抗PD-L1処理の中止の1日後もしくは18〜29週後の抗PD-L1処理TEXにおいて差次的に発現された上位の遺伝子を示す。遺伝子の完全なリストは、Pauken et al. Table S5 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)において利用可能である。図７Ｃは、示された処置および時点の間の一対比較における有意に変化した遺伝子の数を比較する表を示す。遺伝子の完全なリストは、Pauken et al. Table S5 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)において利用可能である。図７Ｄは、RNA-seqのヒートマップを示し、処置の1日後の抗PD-L1処置後の差次的に発現される上位の遺伝子、および処置の18〜29週後のこれらの遺伝子の対応する発現を示す。図７Ｅは、処置後１日または１８〜２９週の対照ＴＥＸに関連する上位ＧＯタームを示す。短期対長期、抗PD-L1対対照処理TEXの一対比較の完全なリストは、Pauken et al. Table S6 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)において利用可能である。
【図７Ｂ】図７Ａの説明を参照のこと。
【図７Ｃ】図７Ａの説明を参照のこと。
【図７Ｄ】図７Ａの説明を参照のこと。
【図７Ｅ】図７Ａの説明を参照のこと。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｈは、ＩＬ−７ ｉ．ｃでの組み合わせ処置を示す一連の画像であり、抗PD-L1は、インビボでウイルス特異的CD8 T細胞応答を増強する。図８Ａは、図２Ａおよび２Ｂについての実験計画を示す。図８Ｂは、IL-7またはIL-15での30分間のエクスビボ刺激の後39日p.i. で単離された脾臓からのP14細胞にゲートされた代表的なフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。陰の灰色のヒストグラムは未刺激の対照であり、色付きのヒストグラムはサイトカインで刺激されている。図１Ｆに示す複数のマウスの定量。図８Ｃは、抗PD-L1およびIL-7 i.cとの組み合わせ治療の実験計画の概略図を示す。図８Ｄは、DbGP276 +細胞およびP14細胞（Ly5.1+）を示すCD8+T細胞でゲーティングされた代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ゲートの横の数字は、CD8+親母集団の各集団の頻度を示す。図８Ｅは、対照、IL-7 i.c. 抗PD-L1、または抗PD-L1とIL-7 i.c.との両方による処置後の脾臓における生存細胞の総数を示す。データは正常に分布していたため、パラメトリックな一元配置分散分析（one-way ANOVA）およびグループを比較するためのボンフェローニの多重比較検定を用いて有意性を決定した。図８Ｆは、図８Ｅに示されるマウスからのDbGP276+CD8 T細胞の頻度（左）および数（右）を示す。図８Ｇは、図８Ｅのマウスの処置後の腎臓におけるウイルス負荷を示す。図８Ｆおよび図８Ｇでは、ノンパラメトリック一元配置分散分析（Kruskal-Wallis test）およびDunnの多重検定比較を用いて、グループを比較して有意性を決定した。図８Ｅ〜図８Ｇでは、青いアスタリスク（上の列）はANOVAのp値を示し、黒いアスタリスクはテスト後のp値を示す。図８Ｈは、図８Ｅのマウスの処置前および処置後の血清中のウイルス負荷を示す。ラインは、同じマウスからの一連の測定を繋ぐ。有意性は、各処置グループについて対応のあるスチューデントのt検定を用いて決定された。図８Ｄ〜図８Ｈからのデータは、グループあたり少なくとも4匹のマウスで2つの独立した実験から組み合わせたものである。これらのデータは、図９Ｇおよび９Ｈに示すマウスに対応する。有意性を示すアスタリスクは、*p<0.05、**p<0.01、および***p<0.001である。
【図８−２】図８−１の説明を参照のこと。
【図８−３】図８−１の説明を参照のこと。
【図８−４】図８−１の説明を参照のこと。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｈは、ＰＤ−１経路遮断がＴＥＸにおける抗原非依存性の持続性およびＩＬ−７シグナル伝達を適度に改善することを示す一連の画像である。図９Ａは、移行後27日目（1日目と比較）の100万個のPBMCあたりのDbGP33+ドナーCD8 T細胞の数を示し、図９Ｂは、脾臓から回収された数を示す。図９Ｃは、TMEM P14細胞またはバルクCD44loCD62L+TN細胞（LCMV Arm 後167日）と比較したTEX P14細胞（クローン13後35日）でのCD127およびCD122発現のヒストグラムを示す。値は、平均の幾何平均蛍光強度（MFI）および平均の標準誤差（SEM）を示す。図９Ｄは、図９ＣのマウスからのPD-1対CD127の等高線図を示す。図９Ｅは、図９Ｄの定量化を示す。図９Ａ〜図９Ｅのデータは、グループあたり少なくとも4匹のマウスを用いた少なくとも2回の独立した実験の代表である。図９Ｆは、IL-7またはIL-15での30分間のエクスビボ刺激後39日p.i. のP14細胞によるphospho-STAT5誘導の定量化を示す。値は、未刺激の対照に対する変化の倍数を示す。（図９Ｇ）2週間の処置後の脾臓におけるP14細胞の頻度（CD8+、左）および数（右）。図９Ｈは、エクスビボペプチド刺激後の図９ＧからのＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋Ｐ１４細胞のプロット（左）および定量化（右）を示す。図９Ｆ〜図９Ｈは、グループごとに少なくとも4匹のマウスを用いた2つの独立した実験からの組み合わせである。有意性を示すアスタリスクは、*p<0.05、**p<0.01、および***p<0.001であり、実験例の材料および方法に記載されるように決定した。青いアスタリスクはANOVA p値を示し、黒いアスタリスクはテスト後のp値を示す。
【図９−２】図９−１の説明を参照のこと。
【図９−３】図９−１の説明を参照のこと。
【図９−４】図９−１の説明を参照のこと。
【図９−５】図９−１の説明を参照のこと。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｊは、ＰＤ−１経路遮断が記憶様想起能力を回復すること、またはＴＥＸのエピジェネティックな景観をＴＥＦＦまたはＴＭＥＭ細胞に再プログラムすること、ができないことを示す一連の画像である。図１０Ａ〜図１０Ｄは、レシピエントのマウスが移行の３．５週後にリステリアＧＰ３３で再チャレンジされたことを除いて、ここで使用された図８Ａで概説された実験計画を描く。図１０Ａは、リステリアＧＰ３３での再チャレンジ後６日での応答するＴＭＥＭ、ＴＥＸまたは抗ＰＤ−Ｌ１処理ＴＥＸのフローサイトメトリープロットを示す。図１０Ｂは、エクスビボのペプチド刺激の後の図１０ＡのマウスからのＰ１４細胞にゲートされた連結フローサイトメトリープロットを示す。図１０Ｃは、図１０Ａに示される脾臓におけるドナー（Ｌｙ５．２＋）ＤｂＧＰ３３＋ＣＤ８ Ｔ細胞の定量化を示す。図１０Ｄは、図１０Ｂに示されるＩＦＮγ＋Ｐ１４細胞の定量化を示す。図１０Ｅは、図９Ｂに示されるマウスからのドナーＤｂＧＰ３３＋細胞上のＰＤ−１のヒストグラムを示す。値は、平均的な幾何学的MFIおよびSEMを示す。データは、グループあたり少なくとも4匹のマウスを用いた2つの独立した実験の代表である。有意性を示すアスタリスクは、*p<0.05、**p<0.01、および***p<0.001であり、実験例の材料および方法に記載されるように決定した。青いアスタリスクはANOVA p値を示し、黒いアスタリスクはテスト後のp値を示す。図１０Ｆは、TN細胞（LFC≧2）と比較したATAC-seqオープンクロマチン領域（OCR）のVenn図を示す。2つの複製からのデータが結合されている。図１０Ｇは、ＩｆｎｇおよびＰｃｄｃ１遺伝子座で示されるグループごとの１つの独立した複製からの代表的なＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す。図１０Ｈは、ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータセットにおけるＯＣＲの富化を示す分散の共クラスター分析を示す。実線は細胞型を分離し、複製を並べて示している。図１０Ｉは、図１０ＨからのＡＴＡＣ−ｓｅｑ富化を示すボックスおよびウイスカー（whisker）図を示す。ひげ（whisker）は四分位範囲を表す。図１０Ｊは、すべてのOCRの主成分分析を示す。図１０Ｉおよび図１０Ｊでは、各複製が示される。ATAC seqデータは、本明細書の他所に記載されるように、グループあたり2〜15匹のマウスを用いた2つの独立した実験からのデータである。
【図１０−２】図１０−１の説明を参照のこと。
【図１０−３】図１０−１の説明を参照のこと。
【図１０−４】図１０−１の説明を参照のこと。
【図１０−５】図１０−１の説明を参照のこと。
【図１０−６】図１０−１の説明を参照のこと。
【図１０−７】図１０−１の説明を参照のこと。
【図１０−８】図１０−１の説明を参照のこと。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータの品質管理分析を示す一連の画像である。図１１Ａは、ＡＴＡＣ−ｓｅｑについて生成された各生物学的複製について求められた、すべての対のリード、整列された数、整列された％、およびピークの数を示す表を示す。図１１Ｂは、各細胞型についての複製物１と複製物２との間の正規化されたＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク富化の相関を示す。R2は、複製間の相関の程度を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａの説明を参照のこと。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータの領域分布を示す一連の画像である。図１２Ａは、細胞型ごとの遺伝子間、イントロン、エキソン、およびプロモーター／TSS領域におけるATAC-seqピークの分布を示す円グラフである。図１２Ｂは、TNに対するTEFF、TMEM、TEX、または抗PD-L1 TEXの差分（LFC≧2上（赤）もしくは下（青））または一定または非差分（灰色）領域を比較する円グラフを示す。図１２Ｃは、ＴＮ細胞（ＬＦＣ≧２上または下）と比較した非差次的および差次的ＡＴＡＣ−ｓｅｑピークの分布を示す。示されるデータは、各細胞型の合併された複製に関するものである。
【図１２Ｂ】図１２Ａの説明を参照のこと。
【図１２Ｃ】図１２Ａの説明を参照のこと。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｅは、オープンクロマチンの領域の近くの遺伝子の増加した転写が各細胞型に対応することを示す一連の画像である。ATAC-seq分析において同定されたOCRに対応する遺伝子セットのGSEAは、図１３Ａに示すように、TNと比較してTEFFまたはTMEMにおいて富化され（LFC≧2）、または図１３Ｂに示すように、TEFFまたはTMEMに比べてTNにおいて富化され（LFC≧2）、それらは転写開始点（TSS）の20 kb以内にある。図１３Ａおよび図１３Ｂの遺伝子セットの転写を比較するデータは、Doering et al. (Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144)から得られた。図１３Ｃおよび１３Ｄは、TSSから20 kb以内にある、（図１３Ｃ）TNと比較した対照もしくは抗PD-L1処理TEX（LFC≧2）における富化、または（図１３Ｄ）対照もしくは抗PD-L1処理TEXと比較したTN（LFC≧2）における富化、のATAC-seq分析において同定されたピークに対応する遺伝子セットのGSEAを示す。RNA-seqデータを、図１３Ｃおよび図１３Ｄの遺伝子セットの転写を比較するのに用いた。図１３Ｅは、TN、対照TEX、および抗PD-L1処理TEXにおけるCd200r2遺伝子座を示すATAC-seqおよびRNA-seqトラックを示す。1つの代表的な複製からのトラックが示される。
【図１３−２】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−３】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１４】図１４は、すべてのATAC-seqオープンクロマチン領域の階層的クラスタリングを示す。実線は、2つの複製を並べて表示して、細胞型間の分離を示す。入力データのユークリッド距離の90ワードクラスタリングのしきい値を平坦化することによって決定される列／クラスター。
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｇは、共クラスターのピーク富化を示す一連の画像である。図１５Ａは、図１０Ｉに対応する、図１０Ｈに示される共クラスター分析からの、ＴＮ富化、ＴＥＦＦ富化、およびＴＭＥＭ富化グループのオープンクロマチン領域のＡＴＡＣ−ｓｅｑ富化（ｌｏｇ２）を示す。各複製のデータは個別に表示される。図１５Ｂ〜図１５Ｇは、TN、TEFF、またはTMEMにおいて富化された遺伝子座の代表的なトラックを示す。赤いボックスは、指定されたグループおよび後続のグループの間の示差的ピークを示す。1つの代表的な複製からのトラックが表示される。
【図１５−２】図１５−１の説明を参照のこと。
【図１５−３】図１５−１の説明を参照のこと。
【図１５−４】図１５−１の説明を参照のこと。
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｉは、代表的なＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す一連の画像である。図１６Ａは、示されるように、対照TEXまたは抗PD-L1処理TEXにおいて富化された、異なる遺伝子座の代表的なトラックを示す。赤いボックスは、指定されたグループ間の示差的ピークを示す。図１６Ｂでは、黒いボックスはTNと比較したTEFF、TMEMおよびTEXで得られた共有ピークを示し、青いボックスはTEFFおよびTMEMと比較したTEXで失われたピークを示す。図１６Ｃでは、黒いボックスはPdcd1遺伝子座(Oestreich et al. J. Immunol. 2008, 181:4832-4839)のBおよびC領域のピークを示し、赤いボックスは以前に同定されていないOCRを示す。図１６Ｂおよび図１６Ｃは、図１０Ｇに描かれているが、ここでは、抗ＰＤ−Ｌ１処理ＴＥＸも含む。1つの代表的な複製からのトラックが表示される。図１６Ｄは、Tbx21 (T-bet)を示す。図１６ＥはCxcr5を示す。図１６Ｆは、Il10を示す。図１６ＧはNlrc3を示す。図１６ＨはCd200rを示す。図１６ＩはAtp8b4を示す。
【図１６−２】図１６−１の説明を参照のこと。
【図１６−３】図１６−１の説明を参照のこと。
【図１６−４】図１６−１の説明を参照のこと。
【図１６−５】図１６−１の説明を参照のこと。
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｇは、対照−および抗−PD-L1処理TEXについてのエピジェネティックおよび転写プロファイルが、Eomeshi PD-1hi TEXサブセットの特徴について富化されていることを示す一連の画像である。図１７Ａは、T-betおよびEomes発現を示すP14細胞にゲートをかけた代表的なフローサイトメトリーのプロットを示す。数字は、親P14集団の各集団の頻度を示す。図１７Ｂは、抗PD-L1処置後の（図１７Ａ）に示されるT-bethiおよびEomeshiサブセットの頻度の定量化を示す。図１７Ｃは、図１７Ｂに示されるマウスにおけるT-betおよびEomesの幾何学的MFIの定量化を示す。データは、グループあたり少なくとも4匹のマウスを用いた3つの独立した実験の代表である。グループ間の対応のないt検定によって決定された有意性を示すアスタリスクは、*p<0.05、**p<0.01、および***p<0.001である。図１７Ｄは、TNと比較したTEXまたはTNに対する抗PD-L1における富化された遺伝子（LFC≧2、p <0.05、上位200）を、PD-1int（T-bethi）またはPD-1hi（Eomeshi）細胞の転写プロファイルと比較したGSEAを示す。図１７Ｅは、TNと比較したTEXまたはTNに対する抗PD-L1において富化されたオープンクロマチン領域の近くの遺伝子（LFC≧4、p<0.05）を、PD-1intまたはPD-1hi細胞の転写プロファイルと比較するGSEAを示す。GSEA（左）は、（図１７Ｆ）抗PD-L1と比較したTEX、または（図１７Ｇ）TEXと比較した抗PD-L1（LFC≧2、p <0.05）を、PD-1int（T-bethi）またはPD-1hi（Eomeshi）細胞の転写プロファイルと比較する。右側に示される個々の遺伝子のヒートマップ。Doering et al. (Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144)から取得したPD-1intおよびPD-1hi細胞についての転写プロファイル。
【図１７−２】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１７−３】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１７−４】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１７−５】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１７−６】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｅは、共クラスターＧＯタームを示す一連の画像である。図１８Ａ〜図１８Ｅは、各細胞型からのピークに関連する選択された有意に富化された（ｐ＜０．０５）ＧＯタームを示す。REVIGOを用いて同定された1つの細胞型のみに関連付けられた用語が示される（実験例の材料および方法を参照）。各細胞型のGOタームの完全なリストは、Pauken et al. Table S8 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)において見出すことができる。GOタームは、併合した複製で同定した。
【図１８−２】図１８−１の説明を参照のこと。
【図１８−３】図１８−１の説明を参照のこと。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｆは、ＰＤ−１経路遮断後の示差的転写因子結合が、ＴＥＸ再活化中に変化した転写ネットワークに寄与することを示す一連の画像である。図１９Ａは、抗ＰＤ−Ｌ１処置後に失われたまたは得られたＯＣＲにおける転写因子（ＴＦ）結合モチーフの富化を示す。図１９Ｂは、各細胞型のペアワイズ比較におけるＴＦ結合のウェリントンブートストラップ分析を示し、すべてのＯＣＲにおいて富化された上位１０個のＴＦ（ボックス）が示される。Pauken et al. Table S10 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)における完全なリスト。図１９Ｃは、TEXにおけるNFATc1および抗PD-L1処理TEXにおけるNFκB-p65についてのTFフットプリントを示す。図１９Ｄは、抗PD-L1後の転写およびエピジェネティック変化の統合ネットワーク分析を示す。線は、変化した活動があると予測されたTFを、対応する調節された遺伝子に接続する。Pauken et al. Table S11 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)における詳細。図１９Ｅは、「パートナーレス」のNFATコンストラクトCA-RIT-NFAT1(Martinez, et al. Immunity 2015, 42:265-278)によって有意に誘導された遺伝子と比較した、抗PD-L1処理によって有意に変化した遺伝子のLFCを示す。図１９Ｆは、ＴＥＦＦ、ＴＥＸ、または両方（オーバーラップ）（左上）において所定のＴＦモチーフを含むＯＣＲの近くの遺伝子を示すVenn図を示す。TFターゲット遺伝子における差異のパーセンテージは、TEXのみ（左下）と比較したオーバーラップにおける抗PD-L1で変化した（p<0.05、LFC≧0.3）。抗PD-L1後のTF標的遺伝子における発現におけるLFCの絶対値の合計（右）。示されているATAC-seqデータは、各条件の複製を組み合わせたものである。
【図１９Ｂ】図１９Ａの説明を参照のこと。
【図１９Ｃ】図１９Ａの説明を参照のこと。
【図１９Ｄ】図１９Ａの説明を参照のこと。
【図１９Ｅ】図１９Ａの説明を参照のこと。
【図１９Ｆ】図１９Ａの説明を参照のこと。
【図２０】図２０は、対照処理TEX細胞における転写因子フットプリントを示す。転写因子フットプリントは、対照で処理されたTEXからのATAC-seqデータを用いて、示される転写因子についてのマージされた複製（実験例の材料および方法を参照）で実行された。示される転写因子は、図１９Ｂのウェリントンブートストラップ分析を用いて同定した。赤い文字は、フットプリンティング分析での結合の証拠がないために、本明細書の実験例の項の材料および方法において説明される選択基準に基づいて、下流のネットワーク分析から除外された転写因子を示す。
【図２１】図２１は、抗PD-L1処理TEX細胞における転写因子フットプリントを示す。転写因子フットプリンティングは、抗PD-L1処理TEXからのATAC-seqデータを用いる、示される転写因子についてのマージされた複製（実験例の材料および方法を参照）で実行した。示される転写因子は、図１９Ｂのウェリントンブートストラップ分析を用いて同定した。赤い文字は、フットプリンティング分析において結合の証拠がないために、本明細書の他の場所に記載される選択基準に基づいて、下流のネットワーク分析から除外された転写因子を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａ〜２２Ｂは、抗ＰＤ−Ｌ１処置後の再活化されたＴＥＸにおける差次的に発現される遺伝子の調節に関与する予測された転写因子を示す一連の画像である。2週間の抗PD-L1処理後のマイクロアレイによる、図２２Ａに示すように上向きに、または図２２Ｂに示すように下向きに、異なって発現される遺伝子（p<0.05、LFC≧0.3）（y軸）およびPSCAN分析を使用用いて同定されたこれらの遺伝子（x軸）のプロモーター領域に結合すると予測される転写因子。図１９Ｂ〜図１９Ｄにおいて特定された転写因子と共有されるこの分析を用いて同定された転写因子が、各ヒートマップの下に列記される。異なる転写因子に対応する遺伝子の完全なリストは、Pauken et al. Table S12 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)において利用可能である。
【図２２Ｂ】図２２Ａの説明を参照のこと。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｂは、分析されたコホートの臨床的特徴、応答データ、および免疫データを示す一連の画像である。図２３Ａは、分析に含まれるPenn pembro Expanded Access Program（左）およびMSKCC Keynote-001試験（右）から得られた試料を示す。図２３Ｂは、２．２よりも大きいかまたは小さいＫｉ６７の倍率変化によって層別化されたPennコホートにおける分析された患者からの免疫および臨床データを示す（青色、応答者；赤色、非応答者）。
【図２３Ｂ】図２３Ａの説明を参照のこと。
【図２４−１】図２４Ａ〜２４Ｆは、抗ＰＤ−１療法に応答するＣＤ８ Ｔ細胞が疲弊した表現型を示すことを示す一連の画像である。図２４Ａは、ＣＲ、臨床応答者（応答、完全応答＋部分応答）を示す。ＮＲ、非応答者（安定した疾患＋進行性の疾患）。図２４Ｂは、示された時間でのＣＤ８ Ｔ細胞におけるＫｉ６７発現を示す（ｎ＝２９）。図２４Ｃは、３週間でのＫｉ６７＋（緑色）およびＫｉ６７−（青色）ＣＤ８ Ｔ細胞における示されたマーカーの発現を示す（ｎ＝２７）。図２４Ｄは、３週間でのＰＤ−１＋（赤）およびＰＤ−１−（青）ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＫｉ６７発現を示す（ｎ＝２７）。図２４Ｅは、示された時間でのＰＤ−１＋（赤）およびＰＤ−１−（青）ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＫｉ６７発現を示す（ｎ＝２９）。図２４Ｆは、免疫応答対前処置のピークでのＫｉ６７発現の倍率変化を示す。点線は、2.21の倍率変化を示し、これは、健康なドナーにおいて平均プラス3 s.d.である（図２４Ｄを参照）。*P<0.05、***P<0.001、****P<0.0001、ウィルコクソン・マッチドペア検定。エラーバー、s.d。すべてのパネルのフローサイトメトリーデータは、示された染色の1〜4つの独立した技術的複製の代表である。
【図２４−２】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−３】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−４】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２５−１】図２５Ａ〜２５Ｆは、黒色腫を有する患者からのＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋およびＣＤ８ Ｔ細胞が、健康なドナーと比較してＫｉ６７発現を増加させたことを示す一連の画像である。図２５Ａは、健康なドナーおよび黒色腫患者におけるFOXP3+CD4 T細胞における頻度およびKi67発現を示す。スチューデントt検定。図２５Ｂは、健康なドナーと黒色腫患者との間のCD8 T細胞におけるKi67発現を示す。Mann-Whitney U検定。図２５Ｃは、健康なドナーおよび黒色腫を有する患者におけるPD-1+およびPD-1-CD8 T細胞におけるKi67発現を示す。健康なドナー対患者、Mann-Whitney U検定；メラノーマを有する患者におけるPD-1+対PD-1- CD8 T細胞、ウィルコクソン・マッチドペア検定。図２５Ｄは、FOXP3-CD4 T細胞およびFOXP3+CD4細胞におけるKi67発現を経時的に示す。ウィルコクソン・マッチドペア検定。（図２５Ｅ）PD1+CD4+FOXP3-T細胞におけるKi67発現対PFSによる腫瘍負荷の散布図。図２５Ｆは、ＰＤ１＋ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋細胞におけるＫｉ６７発現対ＰＦＳによる腫瘍負荷を示す（前処置、ｎ＝２９；処置後、ｎ＝２７（図２５Ｅ〜２５Ｆ））。すべてのパネルについて、**P<0.01、****P<0.0001。エラーバーはs.d.を示す。すべてのパネルのフローサイトメトリーデータは、示された染色の1〜4つの独立した技術的複製の代表である。
【図２５−２】図２５−１の説明を参照のこと。
【図２５−３】図２５−１の説明を参照のこと。
【図２５−４】図２５−１の説明を参照のこと。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｄは、健康なドナーにおける抗ヒトＩｇＧ４および増殖しているＣＤ８ Ｔ細胞を用いる治療の後に検出されたＰＤ−１を示す一連の画像である。図２６Ａは、健康なドナーPBMCを、抗PD-1クローンEH12 BV421および／またはpembroと、単独で、一緒に、または順次、続いて抗ヒトIgG4-フィコエリトリンとともに、インキュベートしたことを示す。図２６Ｂは、代表的な健康なドナーからのKi67+CD8 T細胞におけるEomes、T-bet、CD45RA、およびCD27発現のプロットを示す。（図２６Ｃ）メラノーマの患者および健康なドナーにおける、Eomes対T-bet、およびCD45RA対CD27の表現型の比較（メラノーマ、n=25、健康なドナー、n=10）。**P<0.01、スチューデントのt検定。図２６Ｄは、健康なドナーにおける３週間にわたるＰＤ−１＋ＣＤ８ Ｔ細胞上のＫｉ６７の平均変化倍率を示す（ｎ＝７）。エラーバーはs.d.を示し、中心線は平均を示し、点線は、2.21の倍数変化を示し、これは平均+3 s.d.に等しい。すべてのパネルのフローサイトメトリーデータは、示された染色の1〜2つの独立した技術的複製の代表である。
【図２６Ｂ】図２６Ａの説明を参照のこと。
【図２６Ｃ】図２６Ａの説明を参照のこと。
【図２６Ｄ】図２６Ａの説明を参照のこと。
【図２７−１】図２７Ａ〜２７Ｃは、Ｋｉ６７発現に対する抗ＣＴＬＡ−４療法の効果が処置前の時点に限定されることを示す一連の画像である。図２７Ａは、Ｋｉ６７を発現するＰＤ−１＋ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージと抗ＣＴＬＡ−４の最後の投与からの月数との相関関係を示す（前処置、ｎ＝２６；３週目、ｎ＝２５）。図２７Ｂは、ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４のパーセンテージと、抗ＣＴＬＡ−４の最後の投与からの月数との相関を示す（前処置、ｎ＝２６；３週目、ｎ＝２５）。図２７Ｃは、ＰＦＳ、全生存率（ＯＳ）、腫瘍負荷、およびKi67対腫瘍負荷の比率などの臨床パラメーターと、抗CTLA-4の最後の投与からの月数との相関を示す（前処理、n=23、3週目、n=22）。rおよびP値、ピアソンの相関。
【図２７−２】図２７−１の説明を参照のこと。
【図２８−１】図２８Ａ〜２８Ｃは、疲弊表現型のＣＤ８ Ｔ細胞が抗ＰＤ−１療法によって優先的に再活化されることを示す一連の画像である。図２８Ａは、３週間でのＰＤ−１＋ＣＴＬＡ−４＋ＣＤ８ Ｔ細胞におけるマーカー発現を示す（対応のあるｔ検定；ｎ＝２７）。（図２８Ｂ）代表的なプロット。図２８Ｃは、阻害性受容体を発現するＣＤ８ Ｔ細胞におけるＫｉ６７発現を示す。バーは差を示す（対応のあるt検定およびウィルコクソン・マッチドペア検定; n=27）。Ki67の上位50の正の相関の遺伝子セット富化分析、およびref.19（下）からの抗PD-L1処理対対照TEX細胞シグネチャにおいて富化されたKi67の正（上）または負（下）の相関関係のリーディングエッジ。NES、正規化された富化スコア。***P<0.001、****P<0.0001。エラーバー、s.d.。フローサイトメトリーデータ（図２８Ａ〜２８Ｃ）は、示された染色の1〜4つの独立した技術的複製の代表である。
【図２８−２】図２８−１の説明を参照のこと。
【図２９−１】図２９Ａ〜２９Ｇは、複数の阻害性受容体を有するＣＤ８ Ｔ細胞およびＰＤ−１＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ８ Ｔ細胞が抗ＰＤ−１療法によって再活化されることを示す一連の画像である。図２９Ａは、経時的な複数の阻害性受容体を有するＣＤ８ Ｔ細胞におけるＫｉ６７発現を示す。第0週対第3週（n=27）。ウィルコクソン・マッチドペア検定。図２９Ｂは、pembro処置の間、ＰＤ−１に対して陽性のＣＤ８ Ｔ細胞の割合（％）を示す（ｎ＝２７）。ウィルコクソン・マッチドペア検定。図２９Ｃは、TEMRAおよびナイーブCD8 T細胞集団のCD45RA対TCF-1へのバックゲーティングを示す（右）。図２９Ｄは、３週目の血液中のＰＤ−１＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＴＣＦ−１発現を示す（ｎ＝１１）。対応のあるt検定。図２９Ｅは、ＰＤ−１＋ＣＸＣＲ５＋（左）およびＰＤ−１＋ＣＴＬＡ−４＋（右）サブセットにおけるＥｏｍｅｓ／Ｔ−ｂｅｔ（赤）およびＥｏｍｅｓ／ＴＣＦ−１（緑）発現を示す。図２９Ｆは、PD-1+CTLA-4+およびPD-1+CXCR5+CD8 T細胞におけるKi67発現の経時的変化（左）、ならびに、PD-1+CXCR5+およびPD-1+CTLA-4+サブセットにおけるKi67の倍率変化（右）を示す（n=11）。ウィルコクソンのマッチドペア検定。図２９Ｇは、経時的なＰＤ−１＋ＣＸＣＲ５＋およびＰＤ−１＋ＣＴＬＡ−４＋サブセットによるＩＦＮγ産生を示す。対応のあるt検定。すべてのパネルで、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。エラーバーはs.d.を示す。CXCR5およびTCF-1染色は、1つの技術的複製の代表である。すべての他のフローサイトメトリーデータは、示された染色の1〜4つの独立した技術的複製の代表である。
【図２９−２】図２９−１の説明を参照のこと。
【図２９−３】図２９−１の説明を参照のこと。
【図２９−４】図２９−１の説明を参照のこと。
【図３０−１】図３０Ａ〜３０Ｆは、応答する末梢血ＣＤ８ Ｔ細胞集団における腫瘍浸潤性Ｔ細胞クローンおよび血液Ｋｉ６７＋ＣＤ８ Ｔ細胞応答が腫瘍負荷と相関することを示す一連の画像である。図３０Ａ〜３０Ｃは、ＣＤ８ Ｔ細胞上のＴＣＲ配列決定を示す（実験例の材料および方法、「セルソーティング」を参照）。図３０Ａは、血液中および腫瘍中の上位10個のクローンの間のクローンの頻度を示す（赤）。灰色の血液または腫瘍のみのクローン（P値;フィッシャーの直接検定）。PBMC、末梢血単核細胞。図３０Ｂは、上位１０個の血液クローンの頻度および上位１０個の腫瘍浸潤性Ｔ細胞クローンと共有される頻度を示す（赤い矢印）。すべての共有されるクローンはHLA-DR+CD38+（栗色）である。図３０Ｃは、上位１０個のＴＩＬクローンとの、共有されていないものに対する共有されている、血液中の上位１００個のクローンの中のＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ３８＋クローンの割合を示す。図３０Ｄは、高い（上）または低い（下）腫瘍負荷のＣＴスキャンの例、および血液ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＫｉ６７発現を示す。図３０Ｅは、３週目のランダムフォレスト分析による腫瘍負荷と相関する上位３９の免疫パラメーターを示す（上）。上位５つのパラメーターのヒートマップ（下）。図３０Ｆは、示された細胞における腫瘍負荷の、Ｋｉ６７発現前処理および最大の処理後に対するピアソン相関を示す（ｎ＝２５前処理、２３処理後）。図３０Ａ〜３０ＣのTCRシーケンシングデータは、1つの技術的複製の代表である。rおよびP値、ピアソンの相関。
【図３０−２】図３０−１の説明を参照のこと。
【図３０−３】図３０−１の説明を参照のこと。
【図３０−４】図３０−１の説明を参照のこと。
【図３１Ａ】図３１Ａ〜３１Ｆは、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ３８の発現が、血液中で同定された腫瘍の上位１００個のクローンに見られる応答性Ｋｉ６７＋細胞およびＴＣＲクローンについて富化することを示す一連の画像である。図３１Ａは、腫瘍の上位１００クローンにもある、処置前および処置後に存在するＴＣＲクローンを示す。処置後末梢血中で上位10に入るクローンは赤で強調表示される。患者14〜784には利用可能な前処理試料がなく、含まれていない。図３１Ｂは、経時的なＫｉ６７＋（赤）およびＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ３８＋（青）であるＣＤ８ Ｔ細胞の割合（％）を示す。図３１Ｃは、ＨＬＡ ＤＲ＋ＣＤ３８＋ＣＤ８ Ｔ細胞およびＣＤ３８＋ＨＬＡ−ＤＲ＋でない（すなわち、ＣＤ３８−ＨＬＡ−ＤＲ−、ＣＤ３８＋ＨＬＡ−ＤＲ−およびＣＤ３８−ＨＬＡ−ＤＲ＋）ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＫｉ６７発現の代表的なプロットを示す。図３１Ｄは、Ki67+およびKi67-CD8 T細胞におけるHLA-DRおよびCD38発現の代表的なプロットを示す。図３１Ｅは、HLA-DR+CD38+（「DR+38+」）CD8 T細胞サブセットおよびCD38+HLA-DR+ではない細胞におけるEomes対T-betおよびPD-1対CTLA-4の代表的なプロットを示す。図３１Ｆは、EomeshiT-betlo、PD-1、CTLA-4の割合（％）、およびCD8 T細胞での発現を示す（n=5）。すべてのパネルのTCRシーケンシングおよびフローサイトメトリーデータは、1つの技術的な複製の代表である。
【図３１Ｂ】図３１Ａの説明を参照のこと。
【図３１Ｃ】図３１Ａの説明を参照のこと。
【図３１Ｄ】図３１Ａの説明を参照のこと。
【図３１Ｅ】図３１Ａの説明を参照のこと。
【図３１Ｆ】図３１Ａの説明を参照のこと。
【図３２−１】図３２Ａ〜３２Ｇは、腫瘍負荷の状況でのＣＤ８ Ｔ細胞再活化のトラッキングが抗ＰＤ−１療法に対する応答を予測することを示す一連の画像である。図３２Ａは、Ki67（上）の高い（n=11）および低い（n=14）発現、または高い（n=9）および低い（n=16）腫瘍負荷（下）の患者の全生存率を示す。CART分析によるカットポイント（実験例の資料および方法を参照）。図３２Ｂおよび３２Ｃは、反応および臨床的利益による血漿サイトカインを示す（Mann-Whitney U検定、進行n=8、臨床的利益n=9）。CR、完全な応答；PD、進行性疾患；SD、安定した疾患。（図３２Ｄ）腫瘍負荷に対するKi67の高および低比率の客観的応答比率（左）、LOSによる腫瘍負荷対Ki67（ランドマーク全生存）（中央）、および腫瘍負荷比率に対する処置後のKi67によって層別化されたカプラン・マイヤー全生存（右）。フィッシャーの直接検定による客観的応答（Ki67対腫瘍負荷比率：高、n=13、低、n=10）。カプラン・マイヤーデータ（Ki67対腫瘍負荷比率：高、n=13、低、n=12）。図３２Ｅ〜３２Ｇは、Independent Keynote 001 trialを示す。図３２Ｅ、３２Ｆは、示されたサブセットにおけるＫｉ６７を示す（ｎ＝１８；対応のあるｔ検定（左）、ウィルコクソン・マッチドペア検定（右））。図３２Ｇは、腫瘍負荷比率に対する高および低Ki67の客観的応答比率（左）、LOSによるKi67対腫瘍負荷（中央）（n=18）、および腫瘍負荷に対する高対低の処置後Ki67発現についてのカプラン・マイヤー全生存（右）。フィッシャーの直接検定による客観的応答（Ki67対腫瘍負荷率：高、n=11、低、n=7）。カプラン・マイヤー全生存率（Ki67対腫瘍負荷の比率：高、n=11、低、n=7）。***P<0.001、****P<0.0001。エラーバー、s.d.。図３２Ｂ、３２Ｃのサイトカインデータは2つの技術的複製の代表である。図３２Ｅ〜３２ＧのMSKCCフローデータは2つの技術的複製の代表である。
【図３２−２】図３２−１の説明を参照のこと。
【図３２−３】図３２−１の説明を参照のこと。
【図３２−４】図３２−１の説明を参照のこと。
【図３２−５】図３２−１の説明を参照のこと。
【図３３−１】図３３Ａ〜３３Ｇは、高いKi67対腫瘍負荷比率が、改善された臨床成績と相関すること、および、モデル選択がBRAFおよび乳酸デヒドロゲナーゼがKi67と相関することを同定することを示す一連の画像である。図３３Ａは、処置後のKi67発現の最大倍率変化対PFSによって層別化された腫瘍負荷の散布図を示す（n=23）。図３３Ｂは、最大の処置後のＫｉ６７発現対応答による腫瘍負荷を示す（ｎ＝２３）。図３３Ｃは、Ｋｉ６７発現対ランドマークＰＦＳによって層別化された腫瘍負荷比率を示す（治療に入る６週間から始まるＰＦＳ）（左；ｎ＝２３）。1.94のKi67対腫瘍負荷比率により層別化されたカプラン・マイヤー分析（右; Ki67対腫瘍負荷比：高、n=13、低、n=10）；ログランク検定。図３３Ｄは、Baysean Information Criteria（BIC）を示す。これは、Ki67を最もよく予測する複数の回帰モデルの選択のための基準として用いられる（低いBICスコアはより強いモデルを生成する）。図３３Ｅは、ＢＲＡＦ状態によって層別化されたＣＤ８ Ｔ細胞（左）および腫瘍負荷（右）におけるＫｉ６７発現の割合（％）を示す。すべてのBRAF+患者はBRAF標的化療法で処置されている（n=4、測定不能な腫瘍負荷の患者を除去した後）；Mann-Whitney U検定。（図３３Ｆ）パーセンテージKi67+対乳酸脱水素酵素（LDH）（左）および腫瘍負荷対LDH（右）の相関関係。ピアソンの相関関係。（図３３Ｇ）ランドマーク全生存によって層別されたKi67対LDH比率（治療に入る6週間から開始する全生存期間）（左; n=23）。0.067のKi67対LDH比率によって層別化されたカプラン・マイヤー分析（右; Ki67対LDH比率：高、n=18、低、n=5）。ログランク検定。
【図３３−２】図３３−１の説明を参照のこと。
【図３３−３】図３３−１の説明を参照のこと。
【図３３−４】図３３−１の説明を参照のこと。
【図３３−５】図３３−１の説明を参照のこと。
【図３３−６】図３３−１の説明を参照のこと。
【図３４】図３４は、腫瘍負荷の状況におけるＴ細胞再活化が、耐性（赤）および応答（緑）の抗ＰＤ−１パターンの免疫生物学をより正確に反映し得ることを示す。
【図３５】図３５Ａ〜３５Ｃは、ＴＥＴ２の喪失が慢性感染中にＣＤ８ Ｔ細胞の拡大を促進することを示す。図３５Ａは、実験計画の概略図を示す。野生型またはTET2cKOバックグラウンド上のP14細胞をコンジェニックCD45.1ホストに移入した。ホストにLCMVクローン13を感染させ、脾細胞および肝リンパ球を感染後16日または29日目に分析した。図３５Ｂは、ライブ、シングレット、ＣＤ８＋、ｇｐ３３四量体＋集団の間のドナー細胞（ＣＤ４５．１-）のパーセントを表すグラフを示す。図３５Ｃは、図３５Ｂでゲーティングされたドナー細胞の絶対数を表すグラフを示す。スチューデントのT検定によって決定されたp値。
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｄは、ＴＥＴ２の喪失が慢性感染中にＣＤ８ Ｔ細胞の拡大を促進することを示す。図３６Ａは、脾臓における２９日目のＫｉ６７＋であるホスト（ＣＤ４５．１＋）および野生型ドナー（ＣＤ４５．１−）由来のＰ１４細胞のパーセントを表すグラフを示す。細胞は、ライブ、シングレット、CD8+、gp33四量体+集団でゲートされ、Ki67発現はCD45.1 +またはCD45.2-細胞間で評価された。図３６Ｂは、Ｋｉ６７＋である宿主（ＣＤ４５．１＋）およびＴＥＴ２ｃＫＯドナー（ＣＤ４５．１-）由来のＰ１４細胞のパーセントを表すグラフを示す。図３６Ａのようにゲートされた細胞。図３６Ｃおよび３６Ｄは、図３６Ａおよび３６Ｂに記載される集団のＫｉ６７染色を示す代表的なフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｃは、ＴＣＦ-１発現の増加がＴＥＴ２欠損に関連していることを示す。図３７Ａは、フローサイトメトリープロットにおいて、野生型ドナーP14細胞を受容しているマウスからのCD45.1+（ホスト、左のプロット）およびCD45.1-（ドナー、右のプロット）におけるグランザイムB対TCF-1の発現を示す。細胞は、ライブ、シングレット、CD8+、gp33テトラマー+集団でゲートした。図３７Ｂは、フローサイトメトリープロットにおいて、ＴＥＴ２ｃＫＯドナーＰ１４細胞を受容しているマウスからのＣＤ４５．１＋（ホスト、左のプロット）およびＣＤ４５．１−（ドナー、右のプロット）におけるグランザイムＢ対ＴＣＦ−１の発現を示す。細胞は、ライブ、シングレット、CD8+、gp33テトラマー+集団でゲートした。図３７Ｃは、１つの実験からのＴＣＦ−１＋グランザイムＢ−であったホストまたはドナー細胞の平均および個々のパーセンテージを棒グラフで示す。感染後16日目に分析を行った。スチューデントのT検定によって決定されたp値。
【図３８】図３８Ａ〜３８Ｄは、Ｌｙ６Ｃ発現の増加がＴＥＴ２欠損と関連していることを示す。図３８Ａは、脾臓における２９日目でのＬｙ６Ｃ＋であるホスト（ＣＤ４５．１＋）および野生型ドナー（ＣＤ４５．１−）由来のＰ１４細胞のパーセントを表すグラフを示す。細胞はライブ、シングレット、CD8+、gp33テトラマー+集団でゲートされ、Ly6C発現はCD45.1+またはCD45.2-細胞間で評価した。図３８Ｂは、Ly6C+であるホスト（CD45.1+）およびTET2cKOドナー（CD45.1-）由来のP14細胞のパーセントを表すグラフを示す。図３８Ａのようにゲートされた細胞。図３８Ｃおよび３８Ｄは、３８Ａおよび３８Ｂに記載される集団でのＬｙ６Ｃ染色を示す代表的なフローサイトメトリーのヒストグラムを表す。
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｃは、クロマチンモジュレーターの特有のセットが、疲弊したＴ細胞において上方制御されることを示す。図３９Ａは、急性または慢性LCMV感染の経過中のCD8 T細胞におけるクロマチン調節機能を有する遺伝子の発現を示す行正規化ヒートマップを示す。クラスター１遺伝子はナイーブT細胞において富化されたものを表し、クラスター２遺伝子はメモリーT細胞において富化され、そしてクラスター３遺伝子はエフェクターT細胞の分化中に特異的に発現される。クラスター４の遺伝子は、慢性感染の過程で特異的に発現される。図３９Ｂは、クラスター４の行正規化ヒートマップを示し、Ｔ細胞疲弊に関連するクロマチン調節遺伝子の名前を示す。図３９Ｃは、クラスター４からの３つの例示的な遺伝子のマイクロアレイ強度を示し、急性および慢性感染の経過中の転写の多様性を示す。
【図４０】図４０Ａ〜４０Ｃは、Ｔｏｘ発現が慢性感染に限定されることを示す。図４０Ａは、急性および慢性感染におけるＴｏｘタンパク質の発現を測定するために用いられる実験モデルの視覚的説明を示す。図４０Ｂは、複数の時点での急性および慢性感染におけるＴｏｘ発現のフローサイトメトリー分析からの等高線プロットを描く。図４０Ｃは、急性および慢性感染においてＴｏｘを発現するＰ１４ Ｔ細胞の頻度の定量化を描写する。
【図４１】図４１は、P14同時移入実験モデルを示す。図示されているのは、Tox欠損P14 T細胞の挙動を検査するために利用されるモデルの視覚的描写である。250の野生型P14 T細胞（WT）および250のToxf/f CD4Cre+P14 T細胞（ToxKO）を、LCMV Cl-13による感染前に、同じ動物に同時移入した。次に、脾臓からのT細胞を、示された時点で分析した。
【図４２】図４２Ａ〜４２Bは、Tox欠損T細胞が慢性感染中に持続できないことを示す。図４２Ａは、Cl-13感染の経過中にWTまたはToxKO T細胞によって作製された総脾臓CD8+ T細胞への寄与の定量化を示す。図４２Ｂは、Cl-13による感染の8日後のWTおよびToxKO T細胞におけるKi-67タンパク質レベルのヒストグラムを示す。
【図４３】図４３Ａ〜４３Ｂは、Ｔｏｘ欠損が複数のＩＲの下降制御をもたらすことを示す。図４３Ａは、Ｃｌ−１３による感染の８日後のＷＴおよびＴｏｘＫＯ Ｔ細胞における阻害性受容体タンパク質発現のヒストグラムを示す。図４３Ｂは、感染の８日後の様々な阻害性受容体を発現するＷＴおよびＴｏｘＫＯ Ｔ細胞の頻度の定量化を描写する。
【図４４】図４４Ａ〜４４Ｂは、Ｔｏｘが最終細胞分化を抑制することを示す。図４４Ａは、感染８日目のＷＴ細胞およびＴｏｘＫＯ Ｔ細胞におけるＣＤ４４、ＫＬＲＧ１、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ１２７タンパク質発現のヒストグラムを示す。図４４Ｂは、Ｃｌ−１３による感染の８日後の図４４Ａにおいて言及されたタンパク質を発現するＷＴおよびＴｏｘＫＯ Ｔ細胞の頻度の定量化を示す。
【図４５】図４５Ａ〜４５Ｂは、エフェクターＴ細胞におけるＴｃｆ１の再発現のためにＴｏｘが重要であることを示す。図４５Ａは、Cl-13による感染の8日後のWTおよびToxKO T細胞におけるTcf1タンパク質発現のヒストグラムおよび棒グラフ定量化を示す。図４５Ｂは、ヒストグラムにおいて、非感染マウスの脾臓からのナイーブWTおよびToxKO T細胞におけるTcf1のタンパク質レベルを示す。
【図４６】図４６は、疲弊したＴ細胞の持続性を維持するためにＴｏｘ発現が必要とされることを示すグラフを示す。説明されているのは、LCMV ArmまたはCl-13に感染したマウスにおける脾臓CD8+ T細胞プール全体に対するErt2Cre+P14またはToxf/fErt2Cre+P14 T細胞の頻度の定量化です。
【図４７】図４７は、Ｔｏｘのインビトロの過剰発現の実験モデルを示す。モデルは、特定の実施形態において、インビトロ由来のエフェクターＴ細胞におけるＴｏｘ過剰発現の効果を検査するために用いられる。CD8+ T細胞はナイーブWTマウスの脾臓からネガティブに富化し、全長Toxまたは対照ベクターをコードするレトロウイルスベクターで形質導入し、そして高用量のIL-2でエフェクターT細胞にインビトロで分化した。活性化の6日後、CD3およびCD28を6時間、クロスリンクすることにより細胞を再刺激し、RNA-SeqまたはATAC-Seqにかけた。
【図４８】図４８Ａ〜４８Ｂは、Ｔｏｘの発現が、疲弊富化遺伝子シグニチャを誘発するのに十分であることを示す。図４８Ａは、対照と比較した、Ｔｏｘをコードするベクターで形質導入されたＴ細胞において差次的に発現される上位２００個の遺伝子を示す行正規化ヒートマップを示す。図４８Ｂは、Tox過剰発現T細胞において富化された遺伝子（左、赤）vs対照T細胞において富化された遺伝子（右、青）に対する、インビボの疲弊CD8+T細胞において富化された遺伝子（上パネル）およびインビボの疲弊CD8+T細胞において下降制御された遺伝子（下パネル）の遺伝子セット富化分析プロットを示す。
【図４９】図４９は、Ｔｏｘが疲弊特異的エンハンサーのクロマチンアクセシビリティーを増加させることを示す。図示されているのは、タンパク質PD-1をコードするPdcd1遺伝子座のATAC-Seq IGVトラックである。上の4つのトラックは、急性および慢性感染からのインビボの疲弊（TEx）、メモリー（TMem）、エフェクター（TEff）、またはナイーブ（TN）CD8+ T細胞に由来する。下の2つのトラックは、インビトロで分化した対照（CT）およびTox過剰発現（ToxOE）CD8+ T細胞のアクセシビリティープロファイルを示す。黒のボックスは、疲弊したToxOE T細胞において特有に「オープン」であるPdcd1の-23キロベースのエンハンサーを強調する。
【図５０】図５０Ａ〜５０Ｂは、Ｔｏｘがクロマチンモジュレーターおよび転写レギュレーターに結合することを示す。図５０Ａは、ＥＬ４胸腺腫細胞株に由来する溶解物からのＴｏｘの磁気免疫沈降（ＩＰ）の銀染色を示す。「CT Ab」レーンはIPにアイソタイプ対照IgGを利用し、「Tox Ab」レーンはToxタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いた。図５０Ｂは、免疫沈降および質量分析後のタンパク質強度のヒートマップを示す。
【図５１−１】図５１Ａ〜５１Ｇは、Ｔｏｘを含む複数のエピジェネティックなモジュレーターがＴＥＸにおいて選択的に発現されることを示す。図５１Ａは、示された時点p.iでの急性（Arm）または慢性（Cl-13）LCMVからのLCMV特異的P14 CD8+ T細胞からの転写データの多次元スケーリング分析を示す。オレンジ色はナイーブP14細胞を示し、灰色および青色はそれぞれArmおよびCl-13感染を示す。挿入の表は、指定されたd.p.iでのArmとCl-13との間で示差的に発現される遺伝子（False Discovery Rate、FDR<0.05）を列挙する。図５１Ｂは、ArmまたはＣｌ−１３感染の６日後に差次的に発現された遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を示す。灰色および青色は、それぞれArmおよびCl-13において富化されたGO生物学的プロセスを示す。クロマチン結合に関連するカテゴリーは赤で強調される。図５１Ｃは、ArmまたはCl-13感染中のナイーブP14 T細胞とP14 T細胞との間で差次的に発現された潜在的クロマチン調節遺伝子（表8、方法を参照）のヒートマップを示す。遺伝子は、マンハッタン距離を用いた階層的クラスタリングおよびK平均法（k-means）によって生成されたクラスターによって順序付けられる。図５１Ｄは、ArmとCl-13との間で差次的に発現されるクラスター1におけるクロマチン調節遺伝子を示す。図５１Ｅは、クラスター１における遺伝子の累積発現の差を示す。値は、すべての時点ｐ．ｉ．における各遺伝子の正規化されたアレイ強度を合計し、Cl-13からArmを差し引くことによって計算した。図５１Ｆは、Ｔｏｘ遺伝子座におけるインビボのＴＮ、ＴＥＦＦ、ＴＭＥＭおよびＴＥＸ Ｐ１４細胞のＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す。遺伝子座全体の正規化されたタグ数を合計し、その長さで割ることによって計算された各サンプルのアクセシビリティーインデックス（AI）。図５１Ｇは、TN、TEFF、TMEM、およびTEX P14 T細胞における遺伝子座にわたるATAC-seqシグナルの分布を示す。水平の破線の上の遺伝子座は、推定スーパーエンハンサーを示す。すべての同定された潜在的なスーパーエンハンサー間のTox遺伝子座のランクが示される。
【図５１−２】図５１−１の説明を参照のこと。
【図５１−３】図５１−１の説明を参照のこと。
【図５１−４】図５１−１の説明を参照のこと。
【図５１−５】図５１−１の説明を参照のこと。
【図５２】図５２Ａ〜５２Ｂは、zスコアおよび遺伝子発現データを示す。図５２Ａは、Arm感染後またはCl-13感染後の時間に対してプロットされた、クラスター1〜5における各遺伝子のzスコアを示すドットを示す。灰色および青色の線は、時間全体のzスコアの移動平均を表し、それぞれArmおよびCl-13感染からのP14細胞における95％信頼区間を示す。図５２Ｂは、時間p.iに対する正規化されたアレイ強度としてプロットされたクラスター1内の選択された遺伝子の発現を示す。灰色および青色は、それぞれArmおよびCl-13感染からのP14細胞を表す。
【図５３−１】図５３Ａ〜５３Ｆは、急速かつ持続的なTOX発現が疲弊の主要な特徴に関連していることを示す。図５３Ａは、ＴＯＸタンパク質発現が、Ａｒｍ（灰色）およびＣｌ−１３（青色）感染後の示された日でＰ１４ Ｔ細胞において測定されたことを示す。代表的な試料からの総P14集団に対するTOX+ P14細胞の頻度をプロット（左）および要約（右）に示す。図５３Ｂは、Cl-13感染後のd8でのP14 T細胞（青色）または内因性CD8+ T細胞（灰色）におけるTOX発現に対するTEFFおよびTMEMマーカーのプロットを示す（左）。TOX+（青）およびTOX-（白）P14 T細胞集団内のTMEMおよびTEFFサブセットの頻度（右）。図５３Ｃは、Cl-13でのd8またはd30 p.iでのTOX対転写因子（TF）Tbet、Eomes、およびTcf1のフロープロットを示す（左）。TOX+およびTOX- P14集団内のTF+細胞の定量化（右）。図５３Ｄは、Cl-13感染の30日後のTOX+およびTOX- P14細胞における阻害性受容体（IR）発現の要約データを示す。図５３Ｅ〜５３Ｆは、（図５３Ｅ）CT26 602癌腫マウスモデルおよび（図５３Ｆ）ヒト黒色腫生検試料（左）からの腫瘍浸潤性T細胞（TIL）におけるTOX対PD-1発現のフロープロットを示す。TOXLOWPD-1LOW、TOXLOWPD-1INT、およびTOXHIPD-1HI TIL集団における抑制性受容体発現のヒストグラム（中央）。これら3つの集団におけるIRの要約された表現（右）。すべての等高線およびヒストグラムのプロットは、グループごとに少なくとも4匹のマウスでの少なくとも3つの独立した実験の1つの代表的な実験からのものである。特に明記しない限り、感染した動物の脾臓からP14細胞を分析した。要約された実験はドットごとに1つの動物を示し、エラーは標準偏差（SD）として報告される。（図５３Ｆ）（右）では、5つのヒトTILおよび11のヒト正常ドナー試料を分析した。アスタリスクは、スチューデントのt検定によって決定された統計的有意性（*P<0.01、**P<0.001、***P<0.0001）を示す。
【図５３−２】図５３−１の説明を参照のこと。
【図５３−３】図５３−１の説明を参照のこと。
【図５３−４】図５３−１の説明を参照のこと。
【図５３−５】図５３−１の説明を参照のこと。
【図５４−１】図５４Ａ〜５４Ｅは、ＴＯＸ発現を示す。図５４Ａは、Arm（グレー）またはCl-13（ブルー）でのd208 p.iでの末梢血から単離されたP14 T細胞におけるTOXタンパク質発現を示す。図５４Ｂ〜５４Ｃは、Ｃｌ-１３感染の３０日後（図５４Ｂ）または８日後（図５４Ｃ、上）のＰ１４および内因性ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴＯＸ対ＩＲ発現の代表的なフロープロットを示す。TOX+およびTOX- P14 T細胞集団におけるIR発現の定量化（図５４Ｃ、下）。図５４Ｄは、示された時間での、インフルエンザ、VSV、またはリステリア菌（Listeria monocytogenes）感染後の抗原特異的CD8+ T細胞におけるTOX発現の代表的な等高線およびヒストグラムのプロットを示す（左）。ArmおよびCl-13感染後のP14細胞に対する病原体特異的T細胞におけるTOXの発現の要約（右）。図５４Ｅは、対照組織または腫瘍からの活性化されたＣＤ８＋ ＣＤ４４＋ Ｔ細胞におけるＴＯＸ対ＰＤ−１発現のフロープロットを示す。B16およびCT26マウス腫瘍モデルについての対照T細胞は脾臓から取得したが、ヒトでは、正常ドナーの末梢血のT細胞が黒色腫TILのための対照として機能した。すべての等高線およびヒストグラムのプロットは、グループごとに少なくとも4匹のマウスからなる、少なくとも3つ（図５４Ａ〜５４Ｃ、図５４Ｅ）または2つ（図５４Ｄ）の独立した実験の1つの代表的な実験からのものである。特に明記しない限り、感染した動物の脾臓からP14細胞を分析した。要約された実験はドットごとに1つの動物を示し、エラーは標準偏差（SD）として報告される。（図５４Ｅ、右）では、5つのヒト試料を分析した。アスタリスクは、スチューデントのt検定によって決定された統計的有意性（*P<0.01、**P<0.001、***P<0.0001）を示す。
【図５４−２】図５４−１の説明を参照のこと。
【図５４−３】図５４−１の説明を参照のこと。
【図５４−４】図５４−１の説明を参照のこと。
【図５５−１】図５５Ａ〜５５Ｉは、TEXの開発のためにTOXが必要とされることを示す。類遺伝子性の異なるナイーブWTおよびTOXFlox/Flox CD4Cre（TOX cKO）P14 T細胞を1：1の比率で混合し、第3の遺伝子的（congenic）背景を持つWTマウスに養子移入し、その後、LCMV ArmまたはCl-13に感染させた。脾臓を、分析のために示された時点（図５５Ａ）またはCl-13感染のd8（図５５Ｂ〜５５Ｅ）で採取した。図５５Ａは、Arm（上）またはCl-13（下）感染の経過中の総CD8+ T細胞プールに対するWTまたはTOX cKO T細胞の頻度を示す。図５５Ｂは、WTおよびTOX cKO T細胞におけるKLRG1およびCD127発現の代表的なプロット（左）および定量化（右）を示す。図５５Ｃは、ＩＲ発現の代表的なヒストグラムを示す（左）。TOX cKOとWT P14 T細胞との間の中央値蛍光強度（MFI）の比率として報告されたIR発現の定量化（右）。図５５Ｄは、WTおよびTOX cKO P14細胞におけるサイトカイン発現の代表的なヒストグラムおよび等高線図（左）ならびに定量化（右）を示す。図５５Ｅは、WTおよびTOX cKO P14 T細胞における転写因子発現を示す。図５５Ｆ〜５５Ｉは、CD44LOWナイーブWTおよびTOX-/-P14 T細胞をソートし、1：1の比率で混合し、コンジェニックWTマウスに養子移入し、そしてRNA-seqのためにCl-13感染のd8で脾臓から回収したことを示す。図５５Ｆは、ＷＴおよび６４８のＴＯＸ−／− Ｐ１４細胞において示差的に発現されるすべての遺伝子（ＦＤＲ＜０．０５）のヒートマップを示す。TEFFまたはTMEMに関連する遺伝子はラベルされる。図５５Ｇは、TOX-/-対WT P14細胞において差次的に発現される遺伝子のセットにおける、Arm（左）またはCl-13（右）からのTEFFにおいて富化された転写シグネチャの、遺伝子セット富化分析（GSEA）（Subramanian, A. et al.  遺伝子セット富化分析：ゲノム全体の発現プロファイルを解釈するための知識ベースのアプローチ。Proc Natl Acad Sci USA 102, 15545-15550 (2005)）を示す。図５５Ｈは、終末期の短寿命TEFFに関連する遺伝子の発現を示す(Herndler-Brandstetter, D. et al. KLRG1+ Effector CD8+ T Cells Lose KLRG1, Differentiate into All Memory T Cell Lineages, and Convey Enhanced Protective Immunity. Immunity 48, 716-729.e8 (2018))。図５５Ｉは、ＴＯＸ−／−対ＷＴ Ｐ１４細胞（左）において差次的に発現される遺伝子と比較した、ＴＮ、ＴＥＦＦ、またはＴＭＥＭに関連する転写シグネチャのＧＳＥＡを示す。TOX-/-（緑）またはWT（青）試料との関連付けに基づく正規化された富化スコア（NES）（右）。すべての等高線およびヒストグラムのプロットは、グループあたり少なくとも4匹のマウスからなる少なくとも4つの独立した実験の1つの代表的な実験からのものである。特に明記しない限り、感染した動物の脾臓からP14細胞を分析した。要約された実験はドットごとに1つの動物を示し、エラーはSDとして報告される。（図５５Ｆ〜Ｉ）では、3つの生物学的複製を各条件でシーケンシングし、正規化されたRNA-seqカウントを後続の分析のために平均化した。アスタリスクは、スチューデントのt検定によって決定された統計的有意性（*P<0.01、**P<0.001、***P<0.0001）を示す。
【図５５−２】図５５−１の説明を参照のこと。
【図５５−３】図５５−１の説明を参照のこと。
【図５５−４】図５５−１の説明を参照のこと。
【図５５−５】図５５−１の説明を参照のこと。
【図５５−６】図５５−１の説明を参照のこと。
【図５５−７】図５５−１の説明を参照のこと。
【図５５−８】図５５−１の説明を参照のこと。
【図５６−１】図５６Ａ〜５６Ｋは、WTおよびTOX cKO T細胞を1：1で混合し、コンジェニックWTマウスに養子移入し、その後Arm（図５６Ｃ、５６Ｄ、５６Ｆ〜５６Ｋ）またはCl-13（図５６Ｃ〜Ｅ）に感染させたことを示す。図５６Ａは、同時養子移入および感染実験において用いたゲーティング戦略を示す。WT P14細胞は、コンジェニックマーカーCD45.1およびCD45.2の二重陽性によって同定されたが、KO系統（ToxFlox/Flox CD4Cre P14、NFAT2Flox/Flox CD4Cre P14、およびTox-/-P14）は、CD45.2に対してのみ陽性であった。図５６Ｂは、養子移入前の血液からのナイーブWT、ToxFlox/Flox CD4Cre P14、およびNFAT2Flox/Flox CD4Cre P14細胞における活性化マーカーおよび転写因子の発現を示す。図５６Ｃは、Ａｒｍ（上）またはＣｌ−１３（下）感染中の移入されたＰ１４細胞のペアワイズ分析を示す。図５６Ｄは、Cl-13感染のd8（左）またはArmもしくはCl-13感染のd30（右）でのWTおよびTOX cKO細胞の代表的なプロットを示す。WT（灰色）およびTOX cKO（青色）P14 T細胞におけるTOX発現のヒストグラム。図５６Ｅは、Cl-13感染のd8におけるWTおよびTOX cKO細胞における代表的なヒストグラムおよびKi-67+頻度の定量化を示す。図５６Ｆ〜５６Ｇは、Arm感染後のd8（図５６Ｆ）またはd30（図５６Ｇ）におけるWTおよびTOX cKO P14細胞でのメモリー集団の頻度を示す。図５６Ｈは、Armでのd30 p.iでのWTおよびTOX cKO P14 T細胞におけるTF発現の定量化を示す。図５６Ｉ〜５６Ｋは、Ａｒｍでのｄ８ ｐ．ｉにおける、サイトカインおよびエフェクター分子（図５６Ｉ）、ＩＲ（図５６Ｊ）、およびＴＦ（図５６Ｋ）発現の代表的なヒストグラムおよび定量化を示す。TOX cKOおよびWT P14 T細胞間の蛍光強度中央値（MFI）の比率として報告されるIR発現の定量化（図５６Ｊ、右）。等高線およびヒストグラムのプロットは、グループごとに少なくとも4匹のマウスを用いた少なくとも4回の独立した実験の1つの代表的な実験からのものである。特に明記しない限り、感染した動物の脾臓からP14細胞を分析した。要約された実験はドットごとに1つの動物を示し、エラーはSDとして報告される。アスタリスクは、Holm-Sidak補正（C）またはスチューデントのt検定（D-K）でのペアワイズt検定によって決定される統計的有意性（*P<0.01、**P<0.001、***P<0.0001）を示す。「ns」、有意でない。
【図５６−２】図５６−１の説明を参照のこと。
【図５６−３】図５６−１の説明を参照のこと。
【図５６−４】図５６−１の説明を参照のこと。
【図５６−５】図５６−１の説明を参照のこと。
【図５６−６】図５６−１の説明を参照のこと。
【図５６−７】図５６−１の説明を参照のこと。
【図５６−８】図５６−１の説明を参照のこと。
【図５７−１】図５７Ａ〜５７Ｇは、カルシニューリンシグナル伝達およびNFAT2がTOXを誘発するのに必要かつ十分であるが、持続的な発現はカルシニューリン非依存になることを示す。図５７Ａは、ＰＭＡ、イオノマイシン、またはイオノマイシンを伴うＰＭＡによる２４時間の刺激の後のＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴＯＸ発現の代表的な等高線およびヒストグラムのプロットを示す（左）。刺激を加えた後のTOX MFIの時間経過。水平の694の点線は、TNのTOX MFIを示す（右）。図５７Ｂは、TEFFからのNFAT1（赤）およびNFAT2（オレンジ）ChIP-seqトラックと比較した、TN（灰色）、TEFF（ライトブルー）、およびTEX（ダークブルー）P14細胞におけるTox遺伝子座のATAC-seqトラックを示す(Martinez, G. J. et al. The Transcription Factor NFAT Promotes Exhaustion of Activated CD8+ T Cells. Immunity 42, 265-278 (2015); Martinez, G. J. et al. The Transcription Factor NFAT Promotes Exhaustion of Activated CD8+ T Cells. Immunity 42, 265-278 (2015))。図５７Ｃは、図５８Ｂに示すように、インビトロで活性化されたCD8+ T細胞を、NFAT2（WT-NFAT2）、NFAT2の構成的に活性な変異体（CA-NFAT2）または対照GFP（CT）をコードするRVで形質導入し、フローサイトメトリー分析の前に6日間、IL-2で分化させたことを示す。TOX発現の等高線およびヒストグラムのプロットが示される。図５７Ｄは、コンジェニックWTおよびNFAT2Flox/Flox x CD4Cre（NFAT2 cKO）P14 T細胞を1：1で混合し、LCMV Cl-13による感染の前にコンジェニックWTマウスに養子移入したことを示す。d8 p.i でのTOX+、KLRG1+、PD-1+、およびTcf1+ P14細胞の頻度の代表的なヒストグラム（左）および定量化（右）。図５７Ｅは、Ｐ１４ Ｔ細胞をＷＴマウスに養子移入し、続いてＣｌ−１３による感染を行ったことを示す。マウスは、d3-7 p.iからのFK506またはPBSで処置した（図５８Ｄ）。FK506またはPBS処理の後のTOX発現の代表的な等高線図とヒストグラム（左）。 d8 p.iでのTOX+、KLRG1+、PD-1+、およびTcf1+ P14細胞の頻度の概要（右）。図５７Ｆは、NFAT2 cKO P14細胞を、TOX + GFP（NFAT2 cKO + TOX）をコードするRVまたは対照のみGFP（NFAT2 cKO + CT）のもので形質導入し、WTコンジェニックマウスに養子移入した後、Cl-13に感染させたことを示す（図５８Ｅ）。TEFFメーカー、IR、およびTFは、d7 p.iで評価した。図５７Ｇは、P14細胞をWTコンジェニックマウスに養子移入し、続いてCl-13を感染させたことを示す。感染のd25-29に、マウスをFK506またはPBSで処置した（図５８Ｆ）。タンパク質発現は、d30 p.iで測定した。すべての等高線とヒストグラムのプロットは、グループあたり少なくとも3匹のマウスからなる少なくとも3つの独立した実験の1つの代表的な実験からのものである。特に明記しない限り、感染した動物の脾臓からP14細胞を分析した。要約された実験はドットごとに1つの動物を示し、エラーはSDとして報告される。アスタリスクは、スチューデントのt検定によって決定された統計的有意性（*P<0.01、**P<0.001、***P<0.0001）を示す。
【図５７−２】図５７−１の説明を参照のこと。
【図５７−３】図５７−１の説明を参照のこと。
【図５７−４】図５７−１の説明を参照のこと。
【図５７−５】図５７−１の説明を参照のこと。
【図５８−１】図５８Ａ〜５８Ｆは、マウスにおける発現結果を示す。図５８Ａは、Arm（灰色）またはCl-13（青色）感染後のP14 T細胞における（NFAT2タンパク質をコードする）Nfatc1および（NFAT1タンパク質をコードする）Nfatc2の正規化されたマイクロアレイ発現を示す。図５８Ｂは、CD8+ T細胞がナイーブマウスから富化され、αCD3およびaCD28抗体で24時間活性化された後、CT、WT-NFAT2またはCA-NFAT2をコードするRVで形質導入されたことを示す。T細胞を拡大し、IL-2の存在下でインビトロで6日間、分化させてから分析した。図５８Ｃは、養子移入の前の血液からのナイーブWTおよびNFAT2Flox/Flox CD4Cre P14細胞における活性化マーカーおよび転写因子の発現を示す。図５８Ｄは、P14 T細胞をコンジェニックWTマウスに養子移入し、続いてLCMV Cl-13により感染させたことを示す。感染のd3-7に、マウスをPBSまたはFK506 i.pで処置し、脾細胞をd8 p.i.で採取した。図５８Ｅは、NFAT2 cKO CD8+ T細胞がナイーブマウスから富化され、αCD3およびαCD28で活性化され、TOX+GFPまたはGFPのみの対照をコードするRVで形質導入されたことを示す。形質導入されたT細胞は、細胞選別（GFP+形質導入細胞の選択）およびコンジェニックCl-13感染マウスへの養子移入の前に、24時間、拡大した。タンパク質発現をd7 p.iで分析した。図５８Ｆは、P14 T細胞がWTマウスに移入され、その後Cl-13に感染させたことを示す。d25-29 p.i.にレシピエントマウスをPBSまたはFK506 i.p.で処置し、脾細胞を、d30 p.i.で分析のために採取した。
【図５８−２】図５８−１の説明を参照のこと。
【図５８−３】図５８−１の説明を参照のこと。
【図５９−１】図５９Ａ〜５９Ｊは、TOXがTEX転写プログラムを強いることを示す。図５９Ａは、図５９Ｂ〜５９Ｅにおいて用いられた実験手順を示す。ナイーブCD8+ T細胞を脾臓から単離し、αCD3およびαCD28抗体で24時間、活性化した後、TOV+GPF（TOXOE）または対照GFPのみ（CT）をコードするRVでRV形質導入した。形質導入された細胞をIL-2中で6日間、培養した後、ストレプトアビジンの存在下でビオチン結合αCD3およびαCD28抗体で5時間、再刺激した。図５９Ｂは、再刺激後の形質導入されたインビトロエフェクターT細胞におけるサイトカインおよびPD-1発現を示す。図５９Ｃは、CTと比較したTOXOEにおいて上方制御された（赤）または下方制御された（青）転写物から遺伝子セットが開発されたことを示す。これらの遺伝子セットは、d8、15、および30 p.i.27で、Arm対Cl-13において差次的に発現された遺伝子において富化について分析した。正規化された富化スコア（NES）を時間p.iに対してプロットした(Doering, T. A. et al. Network Analysis Reveals Centrally Connected Genes and Pathways Involved in CD8+ T Cell Exhaustion versus Memory. Immunity 37, 1130-1144 (2012))。正のNESはCl-13の富化を意味し、負の値はArm感染における富化を意味する。図５９Ｄは、ＴＥＸ ６０において特有に上方制御された（赤）または下方制御された（青）遺伝子が、ＧＳＥＡを用いてＴＯＸＯＥまたはＣＴ Ｔ細胞における富化についてアッセイされたことを示す。図５９Ｅは、（図５９Ｄ）からのリーディングエッジ遺伝子のヒートマップを示す。TEXに関連する主要な遺伝子にラベルが付けられている。図５９Ｆは、図５９Ｇ〜５９Ｊにおいて用いられた実験計画を示す。NIH3T3細胞を、TOX+GFP（TOXOE）または対照GFPのみ（CT）をコードするRVで形質導入した。細胞を48時間、培養した後、RNA-seq分析のために収集および処理した。図５９Ｇは、TOXOE対CT線維芽細胞において異なって制御される生物学的プロセスのGO分析を示す。図５９Ｈは、図５９Ｃと同様に、線維芽細胞において上方制御された（赤）または下方制御された（青）遺伝子を、ArmまたはCl-13感染のd6、8、15、および30でCD8+T細胞において差次的に発現された遺伝子における富化についてアッセイしたことを示す(Doering, T. A. et al. Network Analysis Reveals Centrally Connected Genes and Pathways Involved in CD8+ T Cell Exhaustion versus Memory. Immunity 37, 1130-1144 (2012)。図５９Ｉは、図５９Ｄと同様に、TEXにおいて特有に上昇（赤）または下降（青）制御された遺伝子を、TOXOE対CTで形質導入された線維芽細胞における富化について分析した(Bengsch, B. et al. Epigenomic-Guided Mass Cytometry Profiling Reveals Disease-Specific Features of Exhausted CD8 T Cells. Immunity 48, 1029-1045.e5 (2018))。図５９Ｊは、CT形質導入線維芽細胞と比較してTOXOEにおいて差次的に発現された遺伝子の火山（volcano）プロットを示す。FDR値＜0.05の転写産物は青色で強調される。図５９Ｉのリーディングエッジから選択された、重要なTEX関連遺伝子がラベルされる。すべての等高線およびヒストグラムのプロットは、グループあたり少なくとも2匹のマウスからの細胞からなる少なくとも3つ（図５９Ｂ）の独立した実験の少なくとも1つの代表的な実験からのものである。RNA-seqデータセットは、各条件についての少なくとも2つの生物学的複製から生成した。エラーは標準偏差として報告される。アスタリスクは、スチューデントのt検定によって決���された統計的有意性（*P<0.01、**P<0.001、***P<0.0001）を示す。
【図５９−２】図５９−１の説明を参照のこと。
【図５９−３】図５９−１の説明を参照のこと。
【図５９−４】図５９−１の説明を参照のこと。
【図６０−１】図６０A〜６０Ｌは、TOXがHBO1複合体を動員することによりTEXのエピジェネティックなシグニチャを誘導することを示す。図６０Ａ〜６０Ｄは、ナイーブCD44LOW TOX-/-およびWT P14 T細胞をソートし、1：1で混合し、そしてコンジェニックWTマウスに養子移入した後、LCMV Cl-13に感染させたことを示す。d8 p.i.に、TOX-/-およびWT P14細胞を分類し、ATAC-seqにより分析した。図６０Ａは、差別的にアクセス可能な遺伝子座のヒートマップを示す。TEFF（黒）およびTMEMまたはTN（青）T細胞遺伝子の近位の領域が標識される。線は、遺伝子の近位に変化のある遺伝子座の数を示す。図６０Ｂは、TN、TEFF、TMEMおよびTEXにおいて特異的にアクセス可能なクロマチン領域(Pauken, K. E. et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science 354, 1160-1165 (2016))を、ピークセット富化分析（PSEA）により、TOX-/-対WT P14 T細胞における富化について分析したことを示す。TEFF（図６０Ｃ）またはTMEM（図６０Ｄ）のATAC-seqトラックは、WT（灰色）およびTOX-/-（青色）細胞からの遺伝子座に関連している。WT T細胞に対するTOX-/-における特有のオープンな（図６０Ｃ）またはクローズな（図６０Ｄ）ピークは灰色で強調される。図６０Ｅ、６０Fは、図５９Ａにおける実験の概要に従って、TNをαCD3およびαCD28抗体で活性化し、TOV+GFP（TOXOE）または対照GFPのみ（CT）をコードするRVで形質導入し、その後IL-2で6日間、拡大したことを示す。次に、形質導入された細胞を、αCD3およびαCD28 786で5時間、再刺激した後、ATAC-seqによるエピジェネティックな評価を行った。図６０Ｄは、ＣＴ細胞と比較した、ＴＯＸＯＥにおける差別的にアクセス可能なクロマチン領域のヒートマップを示す。図６０Ｆは、ＴＯＸＯＥ対ＣＴ ＣＤ８＋ Ｔ細胞における差別的にアクセス可能な遺伝子座を用いる、図６０ＢにおけるようなＴＮ、ＴＥＦＦ、ＴＭＥＭまたはＴＥＸ特異的遺伝子座のＰＳＥＡを示す。図６０Ｇは、クロマチン接近性とＲＮＡ転写との間の相関を表すハイブ（hive）プロットを示す。遺伝子はy軸に沿って整列させ、ATAC-seqピークはx軸に沿って整列させ、両方とも、プロットの原点から開始して、ゲノムの場所によって並べた。TOX-/-T細胞において上方制御されている遺伝子は、原点より上に位置するが、下方制御されている遺伝子は下にある。TOX-/-細胞においてアクセシビリティが増加するゲノム遺伝子座は、原点の右側に配置され、アクセシビリティが減少する遺伝子座は左側に配置される。軸間の接続線は、ATAC-seqピークが差次的に発現される遺伝子に関連付けられている場合に作られる。青色の線はRNAとクロマチンアクセシビリティーとの間の調和性の変化を強調表示し、灰色の線は不調和の変化を強調表示する。図６０Ｈおよび６０Ｉは、TOXタンパク質を、EL4胸腺腫細胞から生成された核ライセートから免疫沈降（IP）させ、質量分析（MS）にかけて、結合タンパク質を同定したことを示す。図６０Ｈは、TOX IPおよびMS後に同定されたタンパク質のMiSTベイト−プレイ（bait-prey）関連スコアを示す。青色で強調されているタンパク質は、HBO1複合体の構成要素である。破線は、高信頼性のヒットの限界を示す。図６０Ｉは、MiSTスコア＞0.80のタンパク質のSTRINGタンパク質−タンパク質相互作用ネットワーク分析を示す。後続のネットワークでのGO生��学的プロセス（BP）分析が強調される。図６０Ｊは異化を示す：上：αＴＯＸまたはポリクローナルＩｇＧ対照抗体を用いて、ＥＬ４溶解物からタンパク質を免疫沈降させ、その後、ａＫａｔ７抗体でブロットした。下：リバースIPを、最初にαKat7で免疫沈降し、次にTOXタンパク質についてブロッティングした。図６０Ｋは、EL4細胞におけるTOXまたはKat7によって結合したゲノムの位置が、ChIP-seqによって同定され、複数の転写因子結合遺伝子座（MTL）が、互いの250bp以内のピークをつなぎ合わせることによって生成されたことを示す。5kbのウィンドウ内のTOX MTLを中心とするゲノム位置でのTOX（左）およびKat7（右）のChIP-seqシグナル強度のヒートマップ。図６０Ｌは、EL4ライゼートにおいてαTOXまたは対照IgGを用いたIPと、それに続くTOX、ヒストンH4、またはアセチル化ヒストンH4（H4ac）に対するブロッティングを示す。ATAC-seqおよびChIP-seqデータセットは、各条件について3つの生物学的複製から生成した。
【図６０−２】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−３】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−４】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−５】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６０−６】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６１−１】図６１Ａ〜６１Ｇは、ＡＴＡＣ-ｓｅｑの結果を図示する。図６１Ａは、注釈付きのゲノム位置でのATAC-seqピークの頻度および一覧を示す。上：Cl-13でのd8 p.i.でのTOX-/-対WT P14 T細胞におけるすべての示差的にアクセス可能な遺伝子座のピーク分布の頻度の円グラフ。棒グラフは、TOX-/-T細胞におけるさまざまな注釈部位におけるオープンおよびクローズのゲノム遺伝子座の数を示す。下：CT T細胞と比較した、TOXOEにおける差別的にアクセス可能な遺伝子座の円グラフおよび棒グラフ。右：バックグラウンドレベルを超えるCD8 T細胞におけるすべてのピークのピーク分布の頻度。図６１Ｂは、（PD-1タンパク質をコードする）Pdcd1遺伝子座におけるCTおよびTOXOE T細胞からのトラックと比較した、TN、TEFF、TMEM、およびTEX細胞のATAC-seqトラックを示す(Pauken, K. E. et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science 354, 1160-1165 (2016))。灰色のバーは、インビトロTEXにおいて特にオープンである-23.8kbエンハンサーを強調する。図６１Ｃは、Cl-13で8日p.i.でＷＴ Ｐ１４細胞と比較した、ＴＯＸ−／−におけるＡＴＡＣ−ｓｅｑクロマチン接近性におけるｌｏｇ２倍率変化に対するＲＮＡ発現のＬｏｇ２倍率変化を示す。示差的に発現する遺伝子および関連するATAC-seqピークのみが示される。ドットの色は、異なって発現された遺伝子の-log10（p値）を表す。ドットサイズは、差別的にアクセス可能な遺伝子座の-log10（p値）を意味する。図６１Ｄは、ＥＬ４細胞におけるＩｇＧ対照に対するＴＯＸ免疫沈降の後のＭＳ分析により同定されたタンパク質の存在量、特異性および再現性のプロットを示す。ヒットは、MiSTスコアによって色分けされる（青は>0.75を示す）。図６１Ｅは、ＭｉＳＴスコア＞０．７５で図６１Ｄにおいて同定されたタンパク質のＧＯ生物学的プロセス富化を示す。図６１Ｆは、Kat7にも結合した、TOXに結合した複数の転写因子結合遺伝子座（MTL）の頻度を示す(Chen, X. et al. Integration of External Signaling Pathways with the Core Transcriptional Network in Embryonic Stem Cells. Cell 133, 1106-1117 (2008))。EL4細胞における両方の因子のChIP-seqによって同定。図６１Ｇは、EL4ライゼートにおいてTOXまたは対照IgGを用いたIPと、それに続くヒストンH3メチル化およびアセチル化修飾に対するブロッティングを示す。
【図６１−２】図６１−１の説明を参照のこと。
【図６１−３】図６１−１の説明を参照のこと。
【図６１−４】図６１−１の説明を参照のこと。
【図６２】図６２は、疲弊に向かうかまたは遠ざかるT細胞の運命決定に関与する因子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の試験のための実施に用いることができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載される。本発明の説明および請求において、以下の用語が使用される。
【００３５】
また、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解されたい。
【００３６】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００３７】
本明細書で使用される「約」は、量、時間的な持続時間などの測定可能な値を指す場合、指定された値から、±20％または±10％、場合によっては±5％、場合によっては±1％、場合によっては±0.1％の変動を包含することを意味する。そのような変動は開示される方法を実行するのに適切であるからである。
【００３８】
本明細書で使用される「活性化」は、検出可能な細胞の増殖を誘導するのに十分に刺激されているT細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能とも関連し得る。「活性化されたＴ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を起こしているＴ細胞を指す。
【００３９】
可溶性因子の「活性化剤（アクティベーター）」または「アゴニスト」は、可溶性因子のレベルを活性化または増加させることができる剤の分子を指すために本明細書で使用される。活性剤は、可溶性因子、たとえばアゴニストの活性または発現を増加、促進、誘発、活性化、またはアップレギュレート（上方制御、上昇制御）する化合物である。活性化剤を検出するためのアッセイは、たとえば、本明細書の他の箇所に記載されるように、細胞または細胞膜においてインビトロで可溶性因子を発現し、推定アゴニスト化合物を適用し、そして次に可溶性因子の活性に対する機能的な効果を決定することを含む。
【００４０】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然のソースまたは組換えソースに由来するインタクトな免疫グロブリンであり得、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体はしばしば免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、たとえば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF（ab）2、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む、様々な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。
【００４１】
「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部を指し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F（ab’）2、およびFv断片、線状抗体、scFv抗体、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書で別段の指定がない限り、「抗体」および「（複数の）抗体」という用語は、広く、自然発生形態の抗体（たとえば、IgG、IgA、IgM、IgE）ならびに組換え抗体、たとえば一本鎖抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体ならびに多重特異性抗体、ならびに前述のすべての断片および誘導体を含み、ここで、これらの断片および誘導体は、少なくとも抗原結合部位を有する。抗体の誘導体は、抗体に結合したタンパク質または化学的成分を含み得る。抗体および抗体断片について本明細書に記載される特性は、本明細書に記載されるFc融合タンパク質にも適用される。
【００４３】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）も含む。本明細書で使用される「抗原結合部分」という用語は、抗原（たとえば、ＰＤ−１ポリペプチドまたはそのフラグメント）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行うことができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例には、（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片である、Fab断片、（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価の断片である、F（ab '）2断片、（iii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、（iv）抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、（v）VHドメインからなるdAb断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)、ならびに（vi）単離された相補性決定領域（CDR）、が含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメイン、VLおよびVHは別個の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、VLおよびVH領域の対が一価ポリペプチドを形成している、単一のタンパク質鎖として作成できるように合成リンカーによって結合させることができる（一本鎖Fv（scFv）として知られる；たとえば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; およびOsbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16: 778を参照）。このような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれることを意図する。完全なIgGポリペプチドまたは他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特定のscFvの任意のVHおよびVL配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域のcDNAまたはゲノム配列に連結させることができる。VHおよびVLは、タンパク質化学または組換えDNA技術のいずれかを用いて、免疫グロブリンのFab、Fvまたはその他の断片の生成にも用いることができる。ダイアボディ（diabodies）などの他の形態の単鎖抗体も含まれる。ダイアボディは、VHドメインおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の2つのドメイン間でのペアリングには短すぎるリンカーを用いることにより、そのドメインを別の鎖の相補的なドメインとペアにして2つの抗原結合部位を作り出す、2価の二重特異性抗体である。(たとえば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照)。
【００４４】
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、1つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの抗体または抗体部分の共有結合または非共有結合によって形成される、より大きな免疫接着ポリペプチドの部分であってもよい。そのような免疫接着ポリペプチドの例には、四量体scFvポリペプチドを作成するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)、ならびに、二価のビオチン化scFvポリペプチドを作成するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびC末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)が含まれる。FabおよびF（ab'）2断片などの抗体部分は、抗体全体のそれぞれパパインまたはペプシン消化などの慣用的な技術を用いて、抗体全体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着ポリペプチドは、本明細書に記載されるように、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。
【００４５】
抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、異種、同種、もしくは同系、またはその改変形態（たとえば、ヒト化、キメラなど）であり得る。抗体は完全にヒトのものでもよい。好ましくは、本発明の抗体は、ＰＤ−１ポリペプチドまたはその断片に特異的または実質的に特異的に結合する。それらはまた、そのような抗原を他のB7ファミリーメンバーなどの密接に関連する抗原から区別することができるように、そのような抗原に対して選択的であってもよい。本明細書で使用する「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の1つの種のみを含む抗体ポリペプチドの集団を指すが、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することができる複数の種の抗原結合部位を含む抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の抗原に対して単一の結合親和性を示す。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「遮断（ブロッキング）」剤または「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原の少なくとも１つの生物学的活性を阻害または低減するものである。たとえば、抗PD-1抗体はPD-1に結合し、PD-1が1つまたは複数のリガンド、たとえばPD-L1および／またはPD-L2に結合する能力を阻害する。特定の実施形態では、本明細書に記載の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体もしくはその断片は、抗原の所定の生物活性を実質的または完全に阻害する。特定の実施形態では、用語「逆（インバース）アゴニスト」は、通常とは反対の作用を促進する剤を指すために使用される。たとえば、PD-1逆アゴニストは、免疫応答の共阻害とは対照的に、共刺激を促進することができる。
【００４７】
本明細書に用いる場合、Ｔ細胞疲弊を逆転または防止することができる剤は、これらに限定されないが、現在、臨床または開発中の任意の既存または新規のエピジェネティック薬物であり得る。これらの剤の多くは、免疫細胞を標的にするために使用されていない。 それらは、腫瘍細胞および感染症疾患に対するそれらの効果のために本明細書において用いられる。本明細書に用いる場合、Ｔ細胞疲弊を逆転または防止することができる剤は、これらに限らないが、任意のチェックポイント遮断剤または免疫機能の変化を引き起こす他の剤を含む、任意の免疫療法薬または剤であり得る。
【００４８】
本明細書で使用される「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答には、抗体産生、もしくは特定の免疫学的にコンピテントな細胞の活性化、またはそれら両方が含まれる。当業者は、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として役立ち得ることを理解するであろう。さらに、抗原は組換えまたはゲノムDNAに由来し得る。したがって、当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、その用語が本明細書で使用される「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要がないことを理解するであろう。本発明が、１を超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むがこれに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることは、容易に明らかである。さらに、当業者は、全く、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要がないことを理解するであろう。抗原は、生成され、合成され、または生物学的試料に由来し得ることは容易に明らかである。そのような生物学的試料は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生物学的流体を含み得るが、これらに限定されない。
【００４９】
「自己抗原」という用語は、本発明によれば、免疫系によって外来性であるかのように認識される任意の自己抗原を意味する。自己抗原は、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質、たとえば細胞表面受容体を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
「ATAC-seq」（シーケンシングを用いるトランスポザーゼアクセス可能クロマチンのアッセイ（Assay for Transposase-Accessible Chromatin））という用語は、クロマチンのアクセシビリティ（接近性）を研究するために分子生物学において用いられる手法である。ATAC-seqは、エピゲノム解析のための迅速かつセンシティブな方法として用いることができる。ATAC-seqは、オープンクロマチン部位を捕捉し、オープンクロマチンのゲノム位置、DNA結合タンパク質、個々のヌクレオソーム、およびヌクレオチドの解像度でのクロマチンコンパクションの間の相互作用を明らかにすることができる。クロマチンは細胞周期中に様々な構造的な変化を起こす。ヒストンタンパク質はクロマチンの基本的なパッカーおよびアレンジャーであり、クロマチンパッキングを変更するためにさまざまな翻訳後修飾によって改変することができる（ヒストン修飾）。改変のほとんどはヒストンのテールで発生する。クロマチンのアクセシビリティおよびコンパクションに関する結果は、たとえば、修飾されるアミノ酸および修飾のタイプに依存する。たとえば、ヒストンのアセチル化は、一般に、複製および転写のためのクロマチンの緩み（loosening）およびアクセシビリティの増加をもたらす。
【００５１】
本明細書で使用される「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答から生じる障害として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な応答の結果である。自己免疫疾患の例には、これらに限らないが、とりわけ、アディソン病、大脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（I型）、ジストロフィー性表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑症、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が含まれる。自己免疫疾患の例には、これらに限らないが、後天性免疫不全症候群（AIDS、自己免疫構成物を伴うウイルス性疾患）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アディソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（AIED）、自己免疫リンパ増殖性症候群（ALPS）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、ベーチェット病、心筋症、セリアックプルー皮膚炎-疱疹状皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（CIPD）、瘢痕性類天疱瘡、冷アグルチニン疾患、CREST症候群、クローン病、デゴス病、皮膚筋炎-若年性、円盤状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋炎、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存型糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ疾患、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（PSS）、全身性硬化症（SS）としても知られる）、シェーグレン症候群、スティフ・マン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫が含まれる。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「自家（自己）」という用語は、後にその個体に再導入される、同じ個体に由来する任意の材料を指すことを意味する。
【００５３】
「同種（異系）」は、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。
【００５４】
「異種」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【００５５】
本明細書で使用する場合、疾患を「緩和する」とは、疾患の1つまたは複数の症状の重症度を軽減することを意味する。
【００５６】
「バイオマーカー」または「マーカー」という用語は、T細胞疲弊を示すと決定されている本発明の測定可能な存在物を指す。たとえば、本明細書に記載されるバイオマーカーは、T細胞における少なくとも1つの遺伝子の発現を調節するゲノム調節領域であり得る。別の実施形態では、本明細書に記載のバイオマーカーは、T細胞によって発現され、T細胞活性および／またはT細胞疲弊に関連するエフェクター遺伝子またはその産物（たとえば、疲弊したT細胞における高持続性PD-1発現および／または活性）であり得る。バイオマーカーには、これらに限らないが、細胞型（たとえば、操作されたT細胞）、細胞比率（たとえば、操作されたT細胞対疲弊したT細胞の比率）、核酸（たとえば、ゲノム核酸および／または転写された核酸）、およびタンパク質、特に、Pauken et al. Table S1 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)において提供されるものも含まれる。バイオマーカーは、本明細書にさらに記載されるように、対象となる免疫障害を治療するために、望ましくない免疫反応を下方制御する免疫学的標的または剤をさらに含み得る。バイオマーカー活性の調節（たとえば、増加または減少）は、（たとえば、対照、比率、ベースラインとの比較などを用いることを含む、本明細書に記載の測定に従って）任意の数の方法で測定することができる。たとえば、操作された疲弊したCD8+ T細胞において選択的にクロマチンにアクセス可能なゲノム調節領域は、操作されたゲノム調節領域のない同じ生物からの同じT細胞型における少なくとも1つの遺伝子の転写および／または翻訳と比較して、少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現（たとえば、遺伝子転写および／または翻訳）の低下によって測定されるように、少なくとも1つの遺伝子のエンハンサー活性を低下させ得る。遺伝子発現の調節は、経時的に評価することができる。調節は、少なくとも、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950%、1000%、もしくはそれを超える、またはそれらの間を包括する任意の範囲（たとえば、5％〜100％）の変化を意味し得る。
【００５７】
本明細書に記載されるバイオマーカーは、そのようなバイオマーカーの任意の個々または組み合わせに関して、本明細書に記載される特徴の任意の組み合わせを示すために用いられ得ることに留意されたい。たとえば、生物にわたるオルソログ、配列組成、同一性パーセント、配列長、ドメイン構造、機能的活性、突然変異状態などの任意の組み合わせを、本発明のバイオマーカー分子を記述するために用いることができる。
【００５８】
「遮断（ブロッキング）」抗体または抗体「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原の少なくとも１つの生物学的活性を阻害または低減するものである。特定の実施形態では、本明細書に記載の遮断抗体もしくはアンタゴニスト抗体またはそれらの断片は、抗原の所与の生物活性を実質的または完全に阻害する。
【００５９】
「二重特異性抗体」または「多重特異性抗体」という用語は、１を超えるエピトープを認識する抗体を指す。そのような抗体は、同じ剤を用いて異なるタンパク質を標的とするのに有用である。そのような抗体を作製する方法は、当技術分野でよく知られている（少なくとも米国特許第5,798,229号；米国特許第5,989,830号；およびHolliger et al. (2005) Nat. Biotech. 23:1126-1136を参照）。
【００６０】
「対照（コントロール）」という用語は、試験試料中の調節および／または発現産物との比較を供するのに適した任意の参照標準を指す。効率のために、発現産物が記載されているが、その説明は発現産物を調節する要素に等しく適用される。一実施形態では、対照は、発現産物レベルが検出され、試験試料からの発現産物レベルと比較される「対照試料」を得ることを含む。そのような対照試料は、これらに限定されないが、既知の結果を伴う対照免疫障害患者からの試料（保存された試料または以前の試料測定物であり得る）、正常な患者または免疫障害患者などの対象から単離された正常な組織または細胞、正常な対象または免疫障害患者などの対象から単離された培養された初代細胞／組織、免疫障害患者の同じ臓器または体の場所から得られた隣接する正常な細胞／組織、正常な対象から単離された組織または細胞の試料、または寄託機関から得られた初代細胞／組織、を含む任意の適切な試料を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、これらに限らないが、ハウスキーピング遺伝子、正常組織からの発現産物レベル範囲（または他の以前に分析された対照試料）、患者のグループまたは特定の結果（たとえば、1、2、3、4年の生存など）を有するかまたは特定の治療（たとえば、ケア免疫障害治療の標準）を受けている患者のセットからの試験試料内の以前に決定された発現産物レベル範囲、を含む任意の適切なソースからの参照標準発現産物レベルを含み得る。そのような対照試料および参照標準発現産物レベルは、本発明の方法において対照として組み合わせて用いることができることは、当業者には理解されよう。一実施形態では、対照は、正常または非免疫障害細胞／組織試料を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、免疫障害患者のセットなどの患者のセット、または特定の治療を受けている免疫障害患者のセット、または1つの結果対別の結果を伴う患者のセット、のための発現レベルを含み得る。前者の場合、各患者の特定の発現産物レベルは、発現の百分位のレベルに割り当てるか、または、参照標準発現レベルの平均またはアベレージよりも高いまたは低いとして表現することができる。別の好ましい実施形態では、対照は、正常細胞、併用化学療法で処置された患者からの細胞、および対象の治療に応答した免疫障害を有する患者からの細胞を含み得る。別の実施形態では、対照はまた、測定値、たとえば、同じ集団におけるハウスキーピング遺伝子の発現のレベルと比較した、集団における特定の遺伝子の発現の平均レベルも含み得る。そのような集団は、正常な対象、いかなる処置も受けていない（すなわち、処置ナイーブ）免疫障害患者、標準的なケア療法を受けている免疫障害患者、または関心のある治療に応答した免疫障害を有する患者を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、これらに限らないが、試験試料中の２つの細胞型および／または遺伝子の発現産物レベルの比率の決定ならびにそれとの、参照標準における同じ２つの細胞型および／または遺伝子の任意の適切な比率との比較、試験試料中の２つまたはそれを超える細胞型および／または遺伝子の発現産物レベルの決定ならびに任意の適切な対照における発現産物レベルにおける差異の決定、ならびに���試験試料中の２つまたはそれを超える細胞型および／または遺伝子の発現産物レベルの決定、それらの発現の試験試料中のハウスキーピング細胞型および／または遺伝子の発現への正規化、ならびに任意の適切な対照との比較、を含む発現産物レベルの比率変換を含む。特に好ましい実施形態では、対照は、試験試料と同じ系統および／またはタイプである対照試料を含む。別の実施形態では、対照は、免疫障害を有するすべての患者などの患者試料のセット内またはそれに基づいてパーセンタイルとしてグループ化された発現産物レベルを含み得る。一実施形態では、たとえば特定の百分位数と比較してより高いまたはより低いレベルの発現産物が結果を予測するための基礎として用いられる、対照発現産物レベルが確立される。別の好ましい実施形態では、対照発現産物レベルは、既知の結果を有する免疫障害対照患者からの発現産物レベルを用いて確立され、試験試料からの発現産物レベルは、結果を予測するための基礎として対照発現産物レベルと比較される。以下のデータによって示されるように、本発明の方法は、試験試料中の発現産物のレベルを対照と比較する際の特定のカットポイントの使用に限定されない。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「蠕虫」という用語は、生きている宿主上で生存および摂食する寄生虫を意味する。特定の実施形態では、蠕虫は、条虫、吸虫、または回虫である。条虫（サナダムシ）は、Cestodaクラスの寄生虫である。それは、典型的には、脊椎動物の消化管に生息する。吸虫は、Trematodaクラスの扁形動物である。吸虫はそれらの宿主に病気を引き起こし得る。住血吸虫症は、吸虫によって引き起こされる寄生虫疾患の例である。回虫はNematoda（線虫）門を構成する。一般にヒトに寄生する回虫には、回虫（ascarids）、フィラリア、鉤虫、蟯虫、および鞭虫が含まれる。多くの回虫はそれらの宿主に病気を引き起こす。たとえば、Trichinella spiralis種は、病気の旋毛虫症の原因である。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「原生動物」という用語は、単細胞の真核生物を意味する。特定の実施形態では、原生動物は、アカントアメーバ種（Acanthamoeba spp.）、バラムチア・マンドリラリス（Balamuthia mandrillaris）、ブラストシスチス種（Blastocystis spp.）、クリプトスポリジウム種（Cryptosporidium spp.）、二核アメーバ（Dientamoeba fragilis）、エントアメーバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）、ジアルジア・ランブリア（Giardia lamblia）、リーシュマニア種（Leishmania spp.）、ネグレリア・フォーレリ（Naegleria fowleri）、温帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、二日熱マラリア原虫（Plasmodium knowlesi）、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、トリコモナス・ヴァギナリス（Trichomonas vaginalis）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma bruceii）またはトリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）であり得る。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「免疫チェックポイント」という用語は、CD4+およびCD8+ T細胞の細胞表面上の一群の分子を意味する。これらの分子は、抗腫瘍免疫応答をダウンモジュレートまたは阻害することにより、免疫応答を微調整する。免疫チェックポイントタンパク質は当技術分野でよく知られており、これらに限らないが、CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR ファミリー受容体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPalpha (CD47)、CD48、2B4 (CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、および A2aR (たとえば、WO 2012/177624を参照)が含まれる。本発明の方法において有用な免疫チェックポイント阻害剤として機能し得る免疫療法剤には、当技術分野で周知の特定のクラスの抗体などのエフェクター機能を有するFc融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
「抗免疫チェックポイント療法（治療）」という用語は、免疫チェックポイントの核酸および／またはタンパク質を阻害する剤の使用を指す。１つまたは複数の免疫チェックポイントの阻害は、免疫調節を促進するために阻害シグナル伝達を遮断または中和することができる。免疫チェックポイントを阻害するのに有用な例示的な剤には、免疫チェックポイントタンパク質またはその断片に結合および／またはそれを不活化または阻害することができる、抗体、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、天然リガンド、および天然リガンドの誘導体、ならびに、免疫チェックポイント核酸またはその断片の発現および／または活性をダウンレギュレーションできる、RNA干渉、アンチセンス、核酸アプタマーなどが含まれる。免疫応答を上方制御するための例示的な剤には、タンパク質とその天然受容体との間の相互作用を遮断する1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体、1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質の非活性化形態（たとえば、ドミナントネガティブポリペプチド）;1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質とその天然受容体の間の相互作用を遮断する小分子またはペプチド、その天然受容体に結合する融合タンパク質（たとえば、抗体または免疫グロブリンのFc部分に融合した免疫チェックポイント阻害タンパク質の細胞外部分）、免疫チェックポイント核酸の転写または翻訳を遮断する核酸分子などが含まれる。そのような剤は、１つまたは複数の免疫チェックポイントとその天然受容体との間の相互作用を直接遮断して（たとえば、抗体）、抑制性シグナル伝達を防止し、免疫応答を上方制御することができる。あるいは、剤は、1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質とその天然受容体との間の相互作用を間接的に遮断して、抑制性シグナル伝達を防ぎ、免疫応答を上方制御することができる。たとえば、安定化された細胞外ドメインなどの免疫チェックポイントタンパク質リガンドの可溶性バージョンは、その受容体に結合して、適切なリガンドに結合する受容体の有効濃度を間接的に低下させることができる。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／または抗ＰＤ−Ｌ２抗体は、単独でまたは組み合わせて、免疫チェックポイントを阻害するために用いられる。これらの実施形態は、ＰＤ−１経路（たとえば、抗ＰＤ−１経路療法、別名ＰＤ−１経路阻害剤療法としても知られる）などの特定の免疫チェックポイントに対する特定の療法にも適用可能である。
【００６５】
本明細書で使用される「インフルエンザウイルス」という用語は、オルソミクソウイルス（Orthomyxoviruses）科のメンバーであるRNAウイルスを指す。特定の実施形態では、インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスB、インフルエンザウイルスCおよびインフルエンザウイルスDからなる属から選択される。さらなる実施形態では、インフルエンザAウイルスは、サブタイプH1N1、H1N2、H2N2またはH3N2のものである。さらなる実施形態では、インフルエンザBウイルスは、Ｂ／Yamagata／１６／８８様系統またはＢ／Victoria／２／８７様系統のものである。
【００６６】
本明細書で使用される「ポリオーマウイルス」という用語は、ポリオーマウイルス（Polyomaviridae）科のメンバーであるエンベロープのないDNAウイルスを指す。ポリオーマウイルスは、環状ゲノムを持つDNAウイルスである。そのファミリーの特定のメンバーはオンコウイルスであり、腫瘍を引き起こし得る。特定の実施形態では、ポリオーマウイルスは、BKウイルス（BKV）、JCウイルス（JCV）、KIポリオーマウイルス（KIPyV）、WUウイルス（WUPyV）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（MCPyV）、ヒトポリオーマウイルス6（HPyV6）、ヒトポリオーマウイルス7（HPyV7）、毛髪異形成棘状（trichodysplasia spinulosa）ウイルス（TSPyV）、ヒトポリオーマウイルス9（HPyV9）、またはMWウイルス（MWPyV）である。
【００６７】
「ＰＤ−１」は、既知のリガンドとしてＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有する共阻害受容体として機能する免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーを指す免疫チェックポイント阻害剤である。PD-1は、アポトーシス細胞死に関与するタンパク質を選択するためのサブトラクションクローニングベースのアプローチを用いて以前に特定された。PD-1は、PD-L1に結合する能力に基づく分子のCD28/CTLA-4ファミリーのメンバーである。CTLA-4と同様に、PD-1は抗CD3に応答してT細胞の表面に迅速に誘導される(Agata et al. Int. Immunol. 1996, 8:765)。しかしながら、CTLA-4とは対照的に、PD-1は（抗IgMに応答して）B細胞の表面にも誘導される。PD-1は胸腺細胞および骨髄細胞のサブセットにも発現される(Agata et al. (1996) supra; Nishimura et al. (1996) Int. Immunol. 8:773)。
【００６８】
代表的なヒトPD-1バイオマーカーの核酸およびアミノ酸配列は、NM_005018.2およびNP_005009.2の下でGenBankデータベースから公開されている(Ishida et al. (1992) 20 EMBO J 11:3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23:704; U.S. Patent 5,698,520も参照)。PD-1は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインを含む細胞外領域、膜貫通ドメイン、および免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ITIM）を含む細胞内領域を有する(Ishida et al. EMBO J. 1992, 11:3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23:704; およびU.S. Patent 5,698,520)。これらの特徴は、免疫抑制受容体と呼ばれるポリペプチドのより大きなファミリーも規定し、これには、gp49B、PIR-B、およびキラー阻害受容体（KIR）も含まれる(Vivier and Daeron Immunol. Today 1997, 18:286)。これらの受容体のチロシルリン酸化ITIMモチーフはSH2ドメイン含有ホスファターゼと相互作用し、阻害シグナルをもたらすとしばしば考えられている。これらの免疫抑制受容体のサブセットはMHCポリペプチド、たとえばKIRに結合し、CTLA4はB7-1およびB7-2に結合する。MHCおよびB7遺伝子の間に系統学的関係があることが提唱されている(Henry et al. (1999) Immunol. Today 20(6):285-8)。ヒト以外の生物におけるPD-1オルソログの核酸およびポリペプチド配列は周知であり、たとえば、マウスPD-1（NM_008798.2およびNP_032824.1）、ラットPD-1（NM_001106927.1およびNP_001100397.1）、イヌPD-1（XM_543338.3およびXP_543338.3）、ウシPD-1（NM_001083506.1およびNP_001076975.1）、およびトリPD-1（XM_422723.3およびXP_422723.2）が含まれる。
【００６９】
PD-1ポリペプチドは、阻害シグナルを免疫細胞に伝達してそれにより免疫細胞エフェクター機能を阻害することができる阻害受容体であるか、または、たとえば可溶性の単量体形態で存在する場合、免疫細胞の共刺激を（たとえば、競合阻害により）促進することができる。好ましいＰＤ−１ファミリーメンバーは、ＰＤ−１と配列同一性を共有し、そして、１つまたは複数のＢ７ファミリーメンバー、たとえば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＰＤ−１リガンド、および／または抗原提示細胞上の他のポリペプチドに結合する。
【００７０】
「ＰＤ−１活性」という用語は、たとえば、抗原提示細胞上の天然のＰＤ−１リガンドに結合することにより、活性化された免疫細胞において阻害シグナルを調節するＰＤ−１ポリペプチドの能力を含む。PD-1は、CTLA4と同様の方法で免疫細胞に抑制シグナルを送信する。免疫細胞における阻害シグナルの調節は、免疫細胞の増殖および／または免疫細胞によるサイトカイン分泌の調節をもたらす。したがって、「ＰＤ−１活性」という用語は、ＰＤ−１ポリペプチドがその天然リガンドに結合する能力、免疫細胞の共刺激または阻害シグナルを調節する能力、および免疫応答を調節する能力を含む。PD-1活性を調節する剤は、当技術分野でよく知られている。代表的な例としては、これらに限らないが、抗体、たとえば、MDX-1106、Merck 3475、およびCT-011が含まれる。MDX-1106-04、ONO-4538 またはBMS- 936558としても知られるMDX-1106は、PCT Publ No. WO 2006/121168 および U.S. Pat. No. 8,0088,449.に記載される完全ヒトIgG4抗PD-1モノクローナル抗体である。SCH-900475およびペンブロリズマブとしても知られるMerck 3475は、PCT Publ WO 2009/114335; U.S. Pat. No. 8,354,509; およびHamid et al. (2013) New Engl. J. Med. 369:134-144に記載されるヒト化IgG4抗PD-1モノクローナル抗体である。ピジリズマブ（CT-011; CureTech）は、PD-1に結合するヒト化IgG1モノクローナル抗体である。ピジリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、PCT Publ. No. WO 2009/101611に開示される。同様に、AMP-224（B7-DCIg; Amplimmune）は、PD-1とPD-L1との間の相互作用をブロックするPD-L2 Fc融合可溶性受容体であり、PCT Publ. Nos. WO 2010/027827 および WO 2011/066342に開示される。さらに、多くの他の抗ＰＤ−１ Ｆｃ融合タンパク質は、U.S. Pat. No. 8,609,089; US Pat. Publ. No. 2010/028330; U.S. Pat. Publ. No. 2012-0114649; および PCT Publ. No. WO 2014/089113に記載されているように、当該分野で公知である。
【００７１】
「PD-1リガンド」という用語は、PD-1受容体の結合パートナーを指し、PD-L1 (Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027) およびPD-L2 (Latchman et al. (2001) Nat. Immunol. 2:261)。少なくとも2つのタイプのヒトPD-1リガンドポリペプチドが存在する。PD-1リガンドタンパク質は、シグナル配列、およびIgVドメイン、IgCドメイン、膜貫通ドメイン、および短い細胞質尾部を含む。PD-L1（配列データについてはFreeman et al. （2000）J. Exp. Med. 192：1027を参照）およびPD-L2（配列データについてはLatchman et al. （2001）Nat. Immunol. 2：261を参照）の両方がポリペプチドのB7ファミリーのメンバーである。PD-L1およびPD-L2の両方は、胎盤、脾臓、リンパ節、胸腺、および心臓において発現される。PD-L2のみは膵臓、肺、および肝臓において発現され、PD-L1のみは胎児の肝臓で発現される。PD-L1の発現はより広いが、両方のPD-1リガンドは活性化された単球および樹状細胞で上方制御される。たとえば、PD-L1は構成的に発現し、マウスの造血細胞（T細胞、B細胞、マクロファージ、樹状細胞（DC）、骨髄由来のマスト細胞など）および非造血細胞（内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞など）においてより高いレベルにアップレギュレートされ、PD-L2はDC、マクロファージ、骨髄由来マスト細胞において誘導的に発現されることが知られている（Butte et al. （2007）Immunity 27：111を参照）。
【００７２】
PD-1リガンドは、特定の保存された構造的および機能的特徴を有するポリペプチドのファミリーを含む。「ファミリー」という用語は、タンパク質または核酸分子を指すのに使用される場合、本明細書で定義されるように、共通の構造ドメインまたはモチーフを有し、十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する2つまたはそれを超えるタンパク質または核酸分子を意味することを意図する。そのようなファミリーメンバーは、自然発生または非自然発生であり得、そして同じまたは異なる種のいずれかに由来し得る。たとえば、ファミリーは、ヒト起源の最初のタンパク質、ならびに他のヒト起源の別個のタンパク質を含み得るか、あるいは、非ヒト起源のホモログを含み得る。ファミリーのメンバーはまた、共通の機能的特徴も有し得る。PD-1リガンドは、ポリペプチドのB7ファミリーのメンバーである。本明細書で使用される「Ｂ７ファミリー」または「Ｂ７ポリペプチド」という用語は、Ｂ７ポリペプチドと配列相同性を共有する共刺激ポリペプチド、たとえば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、B7-H3、B7-H4、VISTA、B7-H6、B7h（Swallow et al. （1999）Immunity 11：423）、および／またはPD-1リガンド（たとえば、PD-L1またはPD-L2）を含む。たとえば、ヒトB7-1およびB7-2は、NCBIでBLASTプログラムをデフォルトのパラメーター（ギャップペナルティがexistence 11 および extension 1に設定されたBlosum62 matrix）を用いて比較した場合に約26％のアミノ酸配列同一性を共有する（NCBI Webサイトを参照）。用語B7ファミリーには、免疫細胞機能を調節することができるこれらのポリペプチドの変異体も含まれる。B7ファミリーの分子は、シグナルドメイン、IgVドメイン、およびIgCドメインを含む、いくつかの保存された領域を共有する。IgVドメインおよびIgCドメインは、当技術分野で認められたIgスーパーファミリーメンバードメインである。これらのドメインは、Igフォールドと呼ばれる別個の折りたたみパターンを有する構造単位に対応する。Igフォールドは、2つのBシートのサンドイッチから構成され、それらはそれぞれが5〜10アミノ酸の逆平行Bストランドからなり、IgのすべてではないがほとんどのIgCドメインに2つのシート間の保存されたジスルフィド結合が存在する。TCR、およびMHC分子は、同じタイプの配列パターンを共有し、Igスーパーファミリー内のC1セットと呼ばれる。他のIgCドメインは他のセット内にある。IgVドメインも配列パターンを共有し、Vセットドメインと呼ばれる。IgVドメインはIgCドメインより長く、Bストランドの追加のペアを含む。
【００７３】
「免疫障害」という用語は、望ましくない免疫応答を特徴とする状態を指す。特定の実施形態では、免疫障害は、所望の抗免疫障害応答が免疫応答を抑制するようなものである。免疫応答のダウンレギュレーションが望まれるそのような状態は当技術分野で周知であり、これらに限らないが、本明細書にさらに記載されるように、組織、皮膚および臓器移植の状態、移植片対宿主病（GVHD）、炎症、または自己免疫疾患、たとえば、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、アレルギー、過敏症反応、改良されたワクチン接種効率を必要とする障害、および増加した調節性T細胞産生または機能を必要とする障害が含まれる。他の実施形態では、免疫障害は、所望の応答が増加した免疫応答であるようなものである。免疫応答のアップレギュレーションが望まれるそのような状態は当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、癌、感染症（たとえば、寄生体、細菌、蠕虫、またはウイルス感染症）などと戦うような増加されたCD4+エフェクターT細胞集団または機能を必要とする障害が含まれる。特定の実施形態では、免疫障害は自己免疫障害である。重要なことに、疲弊は自己免疫において起こる(McKinney et al. Nature. 2015, 523:612-616)。
【００７４】
「急性免疫障害」という用語は、標的化抗原およびそのような標的化抗原を含む宿主、たとえば、癌、またはウイルス、細菌、寄生体、マイコプラズマ、真菌などの感染因子を根絶する適切な免疫応答によって解決することができる状態を指す。このような状態は比較的短く、数日から数週間程度続く。
【００７５】
対照的に、「慢性免疫障害」という用語は、ホストの免疫応答の誘導によって効果的に解消または排除されないこれらの状態を指す。慢性免疫障害では、対象が必ずしも症状を発現することなく、長期間（すなわち、数ヶ月から数年、または一生の期間）にわたって標的抗原または標的抗原を含むホスト（たとえば、感染性または癌に罹患したままであるもの）を維持するように、感染因子または癌細胞などの標的化抗原（および／または標的化抗原を含む宿主）、および免疫応答が平衡に達する。慢性免疫障害は、宿主細胞の急速な死滅または過剰な損傷さえも引き起こさずに、サイレントかつ生産的な標的抗原維持の段階を伴い得る。標的化抗原または標的化抗原を含むホストの検出は、当技術分野でよく知られている多くの方法によって行うことができ、たとえば、米国特許第6,368,832号、第6,579,854号、および第6,808,710号、ならびに米国特許出願公開番号20040137577、20030232323、20030166531、20030064380、20030044768、20030039653、20020164600、20020160000、20020110836、20020107363、および 200201067に記載されている。
【００７６】
特定の実施形態において、慢性免疫障害は、これらに限らないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｔ細胞白血病ウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、麻疹、パポーバウイルス、プリオン、肝炎ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルス、プリオンなどを含む、ウイルスによる感染などの感染の結果である。特定の実施形態では、慢性免疫障害は、これらに限らないが、B型肝炎ウイルス、ノロウイルス、および/またはアネロウイルスを含む、ウイルスによる感染などの感染の結果である。特定の実施形態では、慢性免疫障害は、これらに限らないが、マラリア、結核菌（mycobacterium tuberculosis）、トリパナソーマ・クルジ（trypanasoma cruzi）、トキソプラズマ原虫（toxoplasma gondii）、および／または森林型熱帯リーシュマニアを含む、非ウイルス性慢性感染症での感染の結果である。慢性免疫障害には、たとえば、慢性状態および潜伏状態が含まれる。本明細書中で使用される場合、慢性免疫障害は、慢性状態、潜伏状態、またはその両方に限定され得る。
【００７７】
「慢性状態」では、長期間であっても、疾患の徴候および症状の有無にかかわらず、いつでも対象において標的抗原を検出することができる。感染に起因する慢性状態の非限定的な例には、B型肝炎（B型肝炎ウイルス（HBV）が原因）および肝炎（C型肝炎ウイルス（HCV）が原因）アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、単純ヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス2、ヒトヘルペスウイルス6、水痘帯状疱疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスB19、ポリオーマウイルスBK、ポリオーマウイルスJC、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒトT細胞白血病ウイルスI、およびヒトT細胞白血病ウイルスIIが含まれる。寄生性持続感染は、たとえば、リーシュマニア（Leishmania）、トキソプラズマ（Toxoplasma）、トリパノソーマ（Trypanosoma）、プラスモジウム（Plasmodium）、シストソーマ（Schistosoma）、エンセファリトゾーン（Encephalitozoon）、ノロウイルス、アネロウイルス、マイコバクテリウム種、マラリア種、マラリア、結核菌、トリパナソーマ・クルジ、トキソプラズマ原虫、および／またはまたは森林型熱帯リーシュマニアによる感染の結果として起こり得る。
【００７８】
感染症を含む特定のタイプの慢性状態は、感染因子（ウイルスなど）が、対象が常に兆候や症状を示すわけではないように、不活性で休止状態に見える、「潜伏状態」として知られる。潜伏的なウイルス感染では、ウイルスは症状が再び現れる前に長期間、ホストと平衡状態を保つが、実際のウイルスは、典型的には、疾患の再活性化が起こるまで検出することができない。感染潜伏期は、ウイルスなどの病原性感染因子が細胞内で休眠する能力である。たとえば、潜伏的ウイルス感染は、最初の感染後にウイルス産生が停止する、特定のウイルスのライフサイクルにおけるフェーズである。しかしながら、ウイルスゲノムは完全に根絶されていない。この結果、ホストは新しいウイルスに感染することなく、ウイルスが再活性化し、大量のウイルスの子孫の生成を開始することができる（ウイルスのライフサイクルの溶菌部分）。ウイルスは無期限にホスト内に留まり得る。一実施形態では、ウイルス潜伏期は、ウイルスが潜伏期間を経ているが休止状態ではない臨床潜伏期と同一ではない。潜伏感染の非限定的な例には、単純ヘルペスウイルス（HSV）-1（発熱性水疱）、HSV-2（性器ヘルペス）、および水痘帯状疱疹ウイルスVZV（水痘帯状疱疹）による感染が含まれる。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「免疫療法（治療）剤」という用語は、対象において免疫調節を促進するためにホスト免疫系を刺激することができる任意の分子、ペプチド、抗体または他の剤を含み得る。様々な免疫療法剤が、本明細書に記載される組成物および方法において有用である。
【００８０】
「阻害」または「逆転」という用語は、たとえば、特定の作用、機能、または相互作用の減少、制限、または遮断を含む。特定の実施形態では、免疫障害の少なくとも１つの症状が緩和、終了、減速、または防止される場合に、免疫障害は「阻害」または「逆転」される。本明細書で使用される場合、免疫障害の再発または拡大が低減、減速、遅延、または防止される場合に、免疫障害も「阻害」または「逆転」される。
【００８１】
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００８２】
「単離されたタンパク質」とは、細胞から単離された場合もしくは組換えＤＮＡ技術によって生成された場合、他のタンパク質、細胞材料、分離培地、および培養培地、または化学合成された場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないタンパク質を指す。「単離」または「精製」されたタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質が由来する細胞または組織ソースからの細胞物質または他の汚染タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という言葉は、そのタンパク質がそれが単離されるかまたは組換えにより産生される細胞の細胞成分から分離されている、バイオマーカーポリペプチドまたはその断片の調製物を含む。一実施形態では、「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、約３０％（乾燥重量）未満の非バイオマーカータンパク質（本明細書では「汚染タンパク質」とも呼ばれる）、より好ましくは約２０％未満の非バイオマーカータンパク質、さらにより好ましくは約１０％未満の非バイオマーカータンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非バイオマーカータンパク質を有する、バイオマーカータンパク質またはそのフラグメントの調製物を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質またはその断片、たとえば、その生物学的に活性な断片が組換えにより生成される場合、それはまた好ましくは実質的に培養培地を含まない、すなわち培養培地は、タンパク質調製物の体積の約20％未満、より好ましくは約10％未満、そして最も好ましくは約5％未満を示す。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数をいうことが意図される。開示された発明の抗体の結合親和性は、標準的な抗体−抗原アッセイ、たとえば競合アッセイ、飽和アッセイ、またはELISAもしくはRIAなどの標準的なイムノアッセイによって測定または決定することができる。
【００８４】
「がん（癌）」または「腫瘍」または「過剰増殖性疾患」という用語は、制御されない増殖、不死、転移の可能性、急速な成長および増殖速度、ならびに特定の特徴的な形態学的特徴など、がんに起因する細胞に典型的な特徴を有する細胞の存在を指す。がん細胞はしばしば腫瘍の形態であるが、そのような細胞は動物内に単独で存在することもできるし、または白血病細胞などの非腫瘍形成性の癌細胞でもあり得る。がん細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を介して体の他の部分に広がり得る。「がん（癌）」という用語は、前悪性および悪性の癌を含む。本明細書に記載される「前悪性病変」という用語は、癌性ではないが癌性になる可能性がある病変を指す。それはまた、「前悪性疾患」または「潜在的に悪性の疾患」という用語も含まれる。特に、これは、悪性形質転換のリスクが通常よりも高い良性の、形態学的、および／または組織学的に変化した組織、ならびに、局所組織の臨床的外観を必ずしも変化させないが、その組織（白板症、紅斑、扁平苔癬（erytroleukoplakia lichen planus）（苔癬反応））および組織検査で細胞の異型または異形成を示した病変または領域における前癌病変または癌発症の通常より高いリスクに関連する、疾患または患者の性質を指す
【００８５】
がんには、これらに限らないが、B細胞癌、たとえば、多発性骨髄腫、ウォルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、たとえば、アルファ鎖疾患、ガンマ鎖疾患、およびミュー鎖疾患、良性単クローン性γグロブリン異常症、および免疫細胞性アミロイドーシス、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜がん、口腔がんまたは咽頭がん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸がんまたは虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがんなどが含まれる。本発明に包含される方法に適用可能な癌のタイプの他の非限定的な例には、ヒト肉腫および癌腫、たとえば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、肝臓癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、骨癌、脳腫瘍、精巣癌、肺癌、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫;白血病、たとえば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球）白血病および慢性リンパ性白血病）、および真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ウォルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖疾患が含まれる。特定の実施形態では、癌は本質的に上皮性であり、これらに限らないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦人科癌、腎癌、喉頭癌、肺癌、口腔癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、または皮膚癌が含まれる。他の実施形態では、癌は、乳癌、前立腺癌、肺癌、または結腸癌である。さらに他の実施形態では、上皮癌は、非小細胞肺癌、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（たとえば、漿液性卵巣癌）、または乳癌である。上皮癌は、これらに限らないが、漿液性、類内膜性、粘液性、明細胞、ブレナー、または未分化を含む、他の様々な方法で特徴付けられてもよい。
【００８６】
「キメラタンパク質」とは、2つのドメインが同じポリペプチドユニット内で自然発生でない、2つの異なるポリペプチドドメインを含む任意の単一のポリペプチドユニットを意味する。典型的には、そのようなキメラタンパク質は、cDNA構築物の発現により作製されるが、当技術分野で既知のタンパク質合成法により作製することができる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「併用療法」とは、第１の剤が別の剤と組み合わせて投与されることを意味する。「併せて」は、別の治療モダリティに加えて、1つの治療モダリティの投与を指す。したがって、「併せて」とは、他の治療モダリティを個体に送達する前、間、または後に、一方の治療モダリティを投与することを指す。このような組み合わせは、単一の治療レジメンまたはレジメンの一部であると見なされる。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「同時投与」という用語は、併用療法における第１の療法の投与と第２の療法の投与が互いに重複することを意味する。
【００８９】
本明細書で使用される「共刺激リガンド」という用語は、T細胞上の同種の共刺激分子に特異的に結合することにより、たとえば、TCR/CD3複合体とペプチドがロードされたMHC分子との結合によって供される一次シグナルに加えて、これに限定されないが、増殖、活性化、分化などを含む、T細胞応答を媒介する、シグナルを供する、抗原提示細胞（たとえば、aAPC、樹状細胞、B細胞など）上の分子を含む。共刺激リガンドには、これらに限らないが、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM）、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンベータ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3と特異的に結合するリガンドが含まれ得る。共刺激リガンドはまた、とりわけ、T細胞上に存在する共刺激分子、たとえば、これらに限定されないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドと特異的に結合する抗体も包含する。
【００９０】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、これに限定されないが、増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激分子には、これらに限らないが、MHCクラスI分子、BTLA、およびTollリガンド受容体が含まれる。
【００９１】
本明細書で使用される「共刺激シグナル」は、TCR/CD3ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、T細胞増殖および／または重要分子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションをもたらすシグナルを指す。
【００９２】
「疾患」は、動物がホメオスタシス（恒常性）を維持することができない動物の健康状態であり、疾患が改善されない場合、動物の健康は悪化し続ける。対照的に、動物の「障害」は、動物が恒常性を維持できる健康の状態であるが、障害がない場合よりも動物の健康状態は好ましくありません。治療しないでおくと、障害によって必ずしも動物の健康状態がさらに悪化するわけではない。
【００９３】
本明細書で使用される「有効量」は、治療的または予防的利益を供する量を意味する。
【００９４】
「コード（コーディング）する」とは、規定されたヌクレオチドの配列（すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA）またはアミノ酸の規定された配列のいずれか、およびそれから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして機能するための、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチド内のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコード（コーディング）鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のためのテンプレートとして用いられる非コード（非コーディング）鎖と、の両方が、そのタンパク質またはその遺伝子もしくはcDNAの産物をコードするとして言及され得る。
【００９５】
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列にはイントロンが含まれ得る。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、「エピジェネティクス」という用語は、DNA配列を変化させることなく発生する、遺伝子活性および発現の遺伝的変化として定義される。これらの非遺伝的な変更は、2つの主要なエピジェネティックな修飾：DNAのシトシン残基への化学的修飾（DNAメチル化）およびDNAに関連するヒストンタンパク質（ヒストン修飾）によって厳密に制御されている。エピジェネティクスとは、単一の遺伝子または遺伝子のセットの変化を指す。
【００９７】
「エピゲノム」という用語は、細胞の全体的なエピジェネティックな状態を反映し、ゲノム全体にわたるエピジェネティックなマーカーのグローバルな分析を指す。エピジェネティック修飾パターンのマッピングまたは所定の細胞におけるエピゲノムのプロファイリングを、臨床予測、診断、および治療開発のためのエピジェネティックバイオマーカーとして使用することができる。
【００９８】
用語「エピジェネティック経路」は、細胞の「エピゲノム」またはエピゲノム状態に寄与する任意の構成要素を含む。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「内因性」とは、生物、細胞、組織、または系からの任意の材料、またはその内部で生産された任意の材料を指す。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、もしくは系に導入された任意の材料、または生物、細胞、組織、もしくは系の外部で生産された任意の材料を指す。
【０１０１】
本明細書で使用される「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
【０１０２】
「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に作用可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用要素を含む。発現のための他の要素は、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において、供給することができる。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（たとえば、裸またはリポソームに含まれるもの）およびウイルス（たとえば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの当技術分野で知られたすべてのものを含む。
【０１０３】
「相同」とは、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。２つの比較される配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで占められている場合、たとえば、２つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンで占められている場合、分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性の割合（パーセント）は、２つの配列で共有される一致または相同な位置の数を、比較される位置の数で割った数X 100の関数である。たとえば、２つの配列間の位置の１０のうちの６がマッチまたは相同なら、それら２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣおよびＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を共有する。一般に、比較は、最大の相同性を供するように２つの配列を整列させて行われる。
【０１０４】
本明細書で使用される「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスとして定義される。B細胞によって発現される抗体は、時々、BCR（B細胞受容体）または抗原受容体と呼ばれる。このクラスのタンパク質に含まれる5つのメンバーは、IgA、IgG、IgM、IgD、およびIgEである。IgAは、唾液、涙、母乳、胃腸分泌物、気道および尿生殖路の粘液分泌物などの体の分泌物中に存在する一次抗体である。IgGは最も一般的な循環抗体である。IgMは、ほとんどの対照において一次免疫応答において産生される主要な免疫グロブリンである。凝集、補体結合、および他の抗体応答において最も効果的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。IgDは、既知の抗体機能を持たない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として機能し得る。IgEは、アレルゲンへの曝露時にマスト細胞および好塩基球からメディエーターの放出を引き起こすことにより、即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
【０１０５】
本明細書で使用される「免疫反応」という用語は、免疫細胞を刺激および／または活性化した検出可能な結果を意味する。
【０１０６】
本明細書で使用される用語「免疫応答」は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、および／または抗原提示細胞のいずれかにおけるエフェクター機能の活性化および／または発動をもたらすプロセスを意味する。したがって、当業者によって理解されるように、免疫応答には、これらに限らないが、ヘルパーT細胞または細胞傷害性T細胞応答の任意の検出可能な抗原特異的または同種異系活性化、抗体の産生、アレルギー反応のT細胞媒介性活性化などが含まれる。本明細書で使用する場合、「免疫応答」という用語は、T細胞媒介および／またはB細胞媒介免疫応答を含む。例示的な免疫応答には、T細胞応答、たとえば、サイトカイン産生および細胞の細胞毒性が含まれる。さらに、免疫応答という用語は、T細胞活性化により間接的に影響を受ける免疫応答、たとえば抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、たとえばマクロファージの活性化を含む。免疫応答に関与する免疫細胞には、リンパ球、たとえば、B細胞およびT細胞（CD4+、CD8+、Th1およびTh2細胞）、抗原提示細胞（たとえば、プロフェッショナル抗原提示細胞、たとえば、樹状細胞、マクロファージ、Bリンパ球、ランゲルハンス細胞、および非プロフェッショナル抗原提示細胞、たとえば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞、たとえば、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および顆粒球が含まれる。
【０１０７】
本明細書で使用される「免疫細胞」は、後天性または先天的な免疫系の生成、制御または効果に関与する任意の細胞を含む。免疫細胞には、CD4+細胞、CD8+細胞、およびさまざまな他のT細胞サブセットなどのT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、および好中球が含まれる。
【０１０８】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の構成要素が、哺乳動物において病的状態を引き起こすか、媒介するか、そうでなければ寄与する、疾患を意味する。免疫応答の刺激または介入が疾患の進行に改善効果をもたらす疾患も含まれる。この用語には、自己免疫疾患、免疫介在性炎症性疾患、非免疫介在性炎症性疾患、感染性疾患、および免疫不全疾患が含まれる。本発明にしたがって処置することができる、そのいくつかは免疫またはT細胞媒介性である、免疫関連および炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋症（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫介在性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢および末梢神経系の脱髄性疾患、たとえば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギランバレー症候群、および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、肝胆道疾患、たとえば、感染性肝炎（肝炎A型、B型、C型、D型、E型およびその他の非肝指向性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性および線維性肺疾患、たとえば、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、グルテン過敏性腸症、およびホイップル病、自己免疫性または免疫介在性皮膚疾患、たとえば、水疱性皮膚疾患、多形紅斑および接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、たとえば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症およびじんま疹、肺の免疫学的疾患、たとえば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎、移植関連疾患、たとえば、移植片拒絶および移植片対宿主病が含まれる。感染症には、AIDS（HIV感染）、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、細菌感染、真菌感染、原虫感染、寄生体感染が含まれる。
【０１０９】
「感染性疾患（感染症）」という用語は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生体などの病原性（微）生物によって引き起こされる障害を指す。本開示の感染性疾患には、これらに限らないが、細菌、ウイルス、原生動物、マイコプラズマ、真菌、酵母、寄生体、またはプリオンが含まれる。たとえば、限定するものではないが、免疫原は、ヒトパピローマウイルス（下記参照）、ヘルペスウイルス、たとえば、単純ヘルペスまたは帯状疱疹、レトロウイルス、たとえば、ヒト免疫不全ウイルス1または2、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、サルモネラ（Salmonella）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）、腸球菌（Enterococcus）、クロストリジウム（Clostridium）、エシェリキア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）、ビブリオ（Vibrio）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属の細菌、アメーバ、パラモリス、マラリア寄生体、およびトリパノソマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）であり得る。
【０１１０】
可溶性因子の「阻害剤」または「アンタゴニスト」は、可溶性因子のレベルを阻害、不活性化、または低下させることができる剤の分子を指すために本明細書で使用される。阻害剤は、たとえば、結合して活性を部分的または完全にブロックし、可溶性因子、たとえば、アンタゴニストの活性または発現を低下、防止、遅延、活性化、不活性化、脱感作、またはダウンレギュレートする化合物である。阻害剤には、ポリペプチド阻害剤、たとえば、抗体、可溶性受容体など、ならびに核酸阻害剤、たとえば、siRNAまたはアンチセンスRNA、可溶性因子の遺伝子改変バージョン、たとえば、変化した活性を有するバージョン、ならびに自然発生および合成の可溶性因子アンタゴニスト、小化学分子などが含まれる。インヒビターを検出するためのアッセイには、たとえば、本明細書の他の場所に記載されるように、細胞または細胞膜においてインビトロで可溶性因子を発現し、推定上のアンタゴニスト化合物を適用し、次いで可溶性因子の活性に対する機能的効果を決定することが含まれる。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「説明材料」には、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために用いることができる、出版物、記録、図表、またはその他の表現の媒体が含まれる。本発明のキットの説明材料は、たとえば、本発明の核酸、ペプチド、および／または組成物を含む容器に添付されてもよく、または核酸、ペプチド、および／または組成物を含む容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、説明材料は、説明材料および化合物が受取人によって協調的に使用されることを意図して、容器とは別に出荷されてもよい。
【０１１２】
「単離」とは、天然の状態から改変または除去されたことを意味する。たとえば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、またはたとえば、宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
【０１１３】
本明細書で使用される「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点でレトロウイルスの中でユニークである。それらは有意な量の遺伝情報を宿主細胞のDNAに送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIV、FIVはすべてレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子移行を達成する手段を提供する。
【０１１４】
本明細書で使用される生物学的試料中の「可溶性因子のレベル」という語句は、典型的には、生物学的試料中に存在する可溶性因子のタンパク質、タンパク質断片またはペプチドレベルの量を指す。「可溶性因子のレベル」は定量化する必要はないが、対照試料からのレベルまたは対照試料に期待されるレベルと比較して、または比較せずに、たとえば、人間による主観的な視覚的検出などで、単に検出することができる。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、免疫応答の「調節」という用語は、処置もしくは化合物がない場合の哺乳動物における免疫応答のレベルと比較して、および／またはそれ以外は同一であるが未処置の哺乳動物における免疫応答のレベルと比較して、哺乳動物において免疫応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、天然のシグナルまたは応答を乱すおよび／または影響を与えることにより、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて有益な治療応答を媒介することを包含する。
【０１１６】
免疫原性組成物の「非経口」投与には、たとえば、皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）、または胸骨内注射、または注入技術が含まれる。
【０１１７】
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書では交換可能に用いられ、本明細書に記載の方法にしたがって、インビトロまたはインサイチュのいずれであっても、任意の動物またはその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、対象または個体はヒトである。
【０１１８】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸およびポリヌクレオチドは交換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、これを加水分解して単量体の「ヌクレオチド」にすることができるという一般的な知識を有する。単量体のヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドは、これらに限定されないが、通常のクローニング技術およびPCR（登録商標）などを用いて、および合成手段により、限定されないが、組換え手段、すなわち、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含む、当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列を含む。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含む必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合された２つまたはそれを超えるアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用する場合、この用語は、たとえば、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも当技術分野で一般に呼ばれる短鎖と、たとえば、多くのタイプが存在する、タンパク質と当技術分野で一般に呼ばれる長鎖と、の両方を指す。「ポリペプチド」は、たとえば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体（アナログ）、融合タンパク質を含む。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１２０】
本明細書で使用される「レトロウイルス」という用語は、レトロウイルス科のメンバーである。レトロウイルスは、一本鎖のプラスセンスRNAウイルスである。特定の実施形態では、レトロウイルスは、アルファ−レトロウイルス、ベータ−レトロウイルス、ガンマ−レトロウイルス、デルタ−レトロウイルス、イプシロン−レトロウイルス、レンチウイルスまたはスプマウイルスである。特定の実施形態では、レトロウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）からなる群から選択されるレンチウイルスである。
【０１２１】
本明細書で使用される「同時投与」という用語は、併用療法における第1の療法および第2の療法が、約15分以下、たとえば、約10分、5分、または1分のいずれか以下などの時間間隔で投与されることを意味する。第1および第2の療法が同時に投与される場合、それら第1および第2の療法は、同じ組成物に（たとえば、第1および第2の療法の両方を含む組成物に）または別々の組成物に（たとえば、第1の療法が1つの組成物に、第2の療法が別の組成物に）含まれ得る。
【０１２２】
抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特定の抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識または結合しない抗体を意味する。たとえば、１つの種からの抗原に特異的に結合する抗体は、１つまたは複数の種からのその抗原にも結合し得る。しかし、そのような異種間反応性は、それ自体が特異的として抗体の分類を変更するものではない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗体はまた、抗原の異なる対立遺伝子形態に結合し得る。しかしながら、そのような交差反応性はそれ自体、特異的として抗体の分類を変えるものではない。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドの、第2の化学種との相互作用への引用において用いることができ、相互作用が化学種に対する特定の構造（たとえば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味し、たとえば、抗体は一般にタンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的であるなら、標識された「A」および抗体を含む反応において、エピトープAを含む分子（または遊離の標識されていないA）の存在は、抗体に結合した標識Aの量を減少させるであろう。
【０１２３】
「刺激」という用語は、刺激分子（たとえば、TCR/CD3複合体）とその同族のリガンドとの結合によって誘導される一次応答を意味し、それによって、シグナル伝達事象、たとえば、これらに限らないが、TCR/CD3複合体を介したシグナル伝達を媒介する。刺激は、特定の分子の変化した発現、たとえば、TGF-βのダウンレギュレーション、および／または細胞骨格構造の再編成などを媒介することができる。
【０１２４】
本明細書で使用される「刺激分子」という用語は、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合するT細胞上の分子を意味する。
【０１２５】
本明細書で使用される「刺激性リガンド」は、抗原提示細胞（たとえば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在する場合、T細胞上の同族の結合パートナー（本明細書において「刺激分子」として引用される）と特異的に結合し、それによって、これらに限らないが、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含む、T細胞による一次応答を媒介することができるリガンドを意味する。刺激性リガンドは当技術分野で周知であり、とりわけ、ペプチドがロードされたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体、およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を包含する。
【０１２６】
「対象」という用語は、免疫応答を誘発することができる生物（たとえば、哺乳動物）を含むことが意図される。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。
【０１２７】
本明細書中で使用される場合、「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。実質的に精製された細胞はまた、それがその自然発生状態において通常関連している他の細胞型から分離されている細胞も指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞の集団を指す。他の例では、この用語は、単に、それらが自然の状態で自然に関連している細胞から分離されている細胞を指す。特定の実施形態では、細胞はインビトロで培養される。他の実施形態では、細胞はインビトロで培養されない。
【０１２８】
Tリンパ球または胸腺細胞としても知られる「T細胞」は、当技術分野で知られている。それは主に胸腺において生産される白血球のタイプである。T細胞は免疫系の一部であり、骨髄における幹細胞から発達する。それらは感染から身体を保護するのに役立ち、癌と戦うのに役立ち得る。T細胞は、細胞表面上のT細胞受容体の存在により、B細胞およびナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球と区別することができる。T細胞にはいくつかのサブセットがあり、それぞれに異なる機能がある。特定の実施形態では、T細胞はCD8+ T細胞である。本明細書では、用語CD8+ T細胞は、用語CD8 T細胞と交換可能に使用される。
【０１２９】
エフェクターT細胞のカテゴリーは、同時刺激などの刺激に対して活発に応答する様々なT細胞を含む広いものである。これには、ヘルパーT細胞、キラーT細胞、制御T細胞、および潜在的な他のT細胞型が含まれる。
【０１３０】
抗原−ナイーブT細胞（ナイーブT細胞、TN）は、プロフェッショナル抗原提示細胞（樹状細胞など）の表面上のMHC分子のコンテキスト内で同種抗原に遭遇した後、メモリーT細胞（TMEM）およびエフェクターT細胞（TEFF）に拡張して分化する。
【０１３１】
メモリーT細胞は、以前にそれらの同族の抗原に遭遇してそれに反応した、感染および潜在的な癌と闘うT細胞（Tリンパ球としても知られる）のサブセットである。したがって、抗原経験T細胞という用語がしばしば適用される。このようなT細胞は、細菌またはウイルスなどの外来の侵入者、ならびにがん細胞を認識することができる。メモリーT細胞は、以前の感染、がんとの遭遇、または以前のワクチン接種の間に、抗原と出会ったことによって「経験」されている。侵入者との2回目の遭遇で、メモリーT細胞は複製して、免疫系が最初に侵入者に応答したときよりも速くかつ強力な免疫応答をマウントすることができる。この挙動は、特定の抗原への暴露を明らかにすることができる、Tリンパ球増殖アッセイにおいて利用される。
【０１３２】
エフェクターT細胞は、共刺激などの刺激に積極的に応答するいくつかのT細胞型を含む、幅広い細胞のグループを表す。これには、CD4+、CD8+、細胞傷害性、ヘルパー、キラー、制御（調節）性、および潜在的な他のT細胞型が含まれる。
【０１３３】
「疲弊した（exhausted）T細胞」（TEX）は、感染、腫瘍、または癌を取り除く代わりに「疲弊」し、感染、腫瘍、または癌を取り除く、緩和する、または減らすことができない、T細胞である。疲弊したT細胞はCD8+ T細胞であり得る。疲弊したT細胞はCD4+ T細胞であり得る。疲弊したT細胞は、T細胞の機能を次第に失う。「疲弊（exhaustion）」または「無応答性」とは、細胞が通常の入力シグナルに応答して通常の機能または活動を実行しない細胞の状態を指し、活性化受容体またはサイトカインによる刺激などの刺激に対する免疫細胞の屈折性（refractivity）を含む。そのような機能または活性には、これらに限らないが、増殖または細胞分裂、細胞周期への進入、サイトカイン産生、細胞毒性、輸送、食作用活性、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。通常の入力シグナルは、これらに限らないが、受容体（たとえば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、共刺激受容体など）を介した刺激を含み得る。
【０１３４】
免疫抑制の一種である「T細胞疲弊」は、エフェクター機能の欠乏、抑制性受容体の持続的発現、および明確な転写状態を特徴とする（Wherry. Nat Immunol. 2011, 12（6）：492-9）。T細胞の疲弊は、エフェクター機能障害の状態、Programmed Death-1（PD-1、またはCD279）を含む高い抑制性受容体発現、転写リプログラミング、および欠陥のある免疫記憶を含む（Pauken et al. Science 2016, 354（6316）：1160 -1165）。
【０１３５】
「対照Ｔ細胞」は、疲弊したＴ細胞ではないＴ細胞を指す。対照Ｔ細胞は、たとえば、ＴＮ、ＴＥＦＦ、および／またはＴＭＥＭであり得る。対照T細胞の集団は、対照T細胞の任意の組み合わせを指す。
【０１３６】
本明細書で使用される「治療（的）」という用語は、治療および／または予防を意味する。治療効果は、病状の抑制、寛解または根絶によって得られる。
【０１３７】
「治療（的）有効量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求める、組織、系、または対象の生物学的または医学的応答を誘発するであろう対象化合物の量を指す。「治療有効量」という用語は、投与されたときに、治療されるべき障害または疾患の兆候または症状の1つまたは複数の発達を防止するか、または特定の程度まで軽減するのに十分である化合物の量を含む。治療有効量は、治療されるべき対象の、化合物、疾患およびその重症度、ならびに年齢、体重などに応じて変化するであろう。
【０１３８】
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入されている細胞である。細胞は、一次対象細胞およびその子孫を含む。
【０１３９】
本明細書で使用される「移植物（片）」は、個体に導入される細胞、組織、または臓器を指す。移植された材料のソースは、培養細胞、別の個体由来の細胞、または同じ個体由来の細胞であり得る（たとえば、細胞がインビトロで培養された後）。例示的な臓器移植物は、腎臓、肝臓、心臓、肺、および膵臓である。
【０１４０】
本明細書で使用される用語として疾患を「治療（処置）する」とは、対象が経験する疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。
【０１４１】
範囲：この開示全体を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で供され得る。範囲形式での記述は、単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記述は、すべての可能な部分範囲とその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。たとえば、1〜6などの範囲の記述は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの具体的に開示されたサブ範囲、およびその範囲内の個々の数値、たとえば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6などを具体的に開示していると見なされるべきである。これは、その範囲の幅に関係なく適用される。
【０１４２】
説明
本開示は、患者において疾患を治療するための方法および組成物を供する。その組成物は、エピジェネティック経路において１つまたは複数の変更を含む操作されたＴ細胞（たとえば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）を含む。特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の変更は、Ｔ細胞の疲弊（exhaustion）を防止、逆転または増加させる。特定の実施形態では、エピジェネティック経路は、高い優先度のエピジェネティック経路である。この方法は、本開示の操作されたＴ細胞を患者に投与する段階を含む。特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の投与は、患者における免疫学的応答を増加させる。特定の実施形態では、患者は、別の処置、たとえば免疫チェックポイント遮断と同時に処置される。特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断は、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤による処置を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤は、抗−PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、B7-H3、BTLA、VISTA、CD40、CEACAM1/CD66a、CD80/B7-1、CD86/B7-2、OX40/CD134、CD40 リガンド、ICOS リガンド/B7-H2、4-1BBL/CD137L、B7-DC/PD-L2/CD273、CD39/CD73、CD200/CD200R、LAG-3、TNFR2、KIRs、IDO、IL-10、IL-27、または TIGIT/CD226/CD112/CD122R/CD94抗体である。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路の標的化が、操作されたT細胞のエピゲノムを変化させる。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路のターゲティングは、Tox、SET、RuvBl1、RuvBl2、DPY30、Tox2、Stat1、Stat2、Ikzf2、Dnmt3a、Kdm4a、Bhlhe41、Nfat2、Eomes、Nr4a2、Tcf1、T-bet、Blimp-1、Id2、Zeb2、Nr4a1、Suv39h2、Csprs、Sfmbt1、Hmgn3、Chd9、Rnf2、Ikzf3、Kmt2e、Satb1、Tet1、Tet2、Tet3、Kdm5b、Sfmbt2、Actr6、および Prmt7のうちの少なくとも１つにおけるエピジェネティックな変化を含む。高優先度エピジェネティック経路をターゲットとすることは、転写因子、またはエピゲノムの形成、変更、もしくは維持に関与するタンパク質をコードする他の遺伝子をノックインまたはノックアウトすることを含む。高優先度エピジェネティック経路のターゲッティングは、T細胞疲弊に関連するOCRドメインの調節配列をノックインまたはノックアウトすることも含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞疲弊に関連するＯＣＲドメインは、表６に列挙されるものである。
【０１４３】
TEXはエピジェネティックにコミットされる。PD-1遮断などの現在の免疫療法は、これらの細胞からのエフェクター機能における一時的な改善を誘発するが、それらのエピジェネティクスを再プログラミングしない。結果として、PD-1遮断の効果は一時的であり、これらの細胞は「疲弊」の「基底状態」に戻る。本発明が解決する主な問題は、疲弊のエピジェネティックな基底状態を確立し、これらの細胞を柔軟性のない分化状態にロックすることに関与するエピジェネティック経路の同定である。本発明はまた、疲弊へのコミットメントの一部としてエピジェネティックに改変されたゲノム位置を同定する問題も解決する。そのような経路および／またはゲノム位置を、単独で、または他の免疫療法と組み合わせて標的とすることは、現在の治療を制限するTEXエピジェネティックなコミットメントを防止または逆転させるであろう。エピジェネティック経路を標的とする薬物は実行可能であり、多くの治療環境に適用することができる。細胞療法では、同定された特定のエピジェネティック経路は、遺伝的に標的とすることができよう。これらの主要な経路の少なくとも1つについての概念の実証が供される。Toxは、クロマチン関連タンパク質の高移動度グループ（High Mobility Group）のメンバーである。本明細書に示されるのは、T細胞疲弊の初期プログラミングおよび継続的維持におけるToxの主要な役割である。Toxは、SET、RuvBl1/2、およびDPY30タンパク質を含む、他の主要なエピジェネティックなモジュレーターと相互作用し、このことは、Toxがエピジェネティックなメカニズムの多様なアレイを調節することを示唆する。TOXに加えて、ここでの分析は、Tox2、Stat1、Stat2、Ikzf2、Dnmt3a、Kdm4a、Bhlhe41、Nfat2、Eomes、Nr4a2、Tcf1、T-bet、Blimp-1、Id2、Zeb2、Nr4a1、Suv39h2、Csprs、Sfmbt1、Hmgn3、Chd9、Rnf2、Ikzf3、Kmt2e、Satb1、Tet1、2、および3、Kdm5b、Sfmbt2、Actr6、Prmt7、抑制性受容体および／またはT細胞転写因子をコードする遺伝子、ならびに他の関連T細胞遺伝子、たとえば、PD-1、CTLA-4、LAG-3、Tim3、CD200/CD200R、Ptger2、Ptger4、T-bet、Eomes、Tox、Blimp1、BATF、AP-1ファミリーメンバー、IRF4、ならびに潜在的な標的としてWherry et al, Doering et al., および／または Crawford et al. (Wherry et al. Immunity 2007, 27:670-684（全体が引用により本明細書に組み込まれる）; Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144（全体が引用により本明細書に組み込まれる）; Crawford et al. Immunity 2014,40(2):289-302（全体が引用により本明細書に組み込まれる）)に記載される他の遺伝子も同定する。他の潜在的な標的には、これらに限らないが、SERTADI、XPA、HINT3、HIST1H1C、ZFP69、NR4A3、TNFAIP3、SAP30L、SPRY2、RYBP、TIPARP、YAf'2、GCHI、GTF2B、PCGF5、SFMBT1、METTL4、THAP6、EOMES、CPEB2、IRF9、PARP9、STAT1、TLR7、APOBEC1、ISG15、PARP12、STAT2、TFDP2、SETBP1、PARP14、IKZF2、TOX、HSPA1A、SP140、SPAG7、MYCBP、TRAPPC2、TCF4、RBL2、ALS2、IKZF3、IRF7、ELL2、MXD1、IRAK2、MXl1、UHRF2、LITAF、NR4A2、NR4A1、ID2、RORA、HIST1H2BC、TBX21、MARVELD2、HIF1A、P2RY14、P2RY13、EPAS1、IRAK3、XDH、ARAP2、EIF4E3、SWAP70、TRAPPC1、GADD45B、IRF4、HMGB2、ACADL、RBBPB、UBD、ZC3H12C、RILPL2、GNPTAB、PRDM1、CARHSP1、N4BP1、ATOH1、TAF9B、APOBEC2、LRRFIP2、NFIL3、および SAP30のうちの少なくとも1つが含まれる。実際に、Tet2に関する追加の研究は、T細胞疲弊におけるDNAメチル化に関与するこの酵素の主要な役割を示し、T細胞疲弊を調節するための、別の、高優先度の、新薬開発につながる（druggable）、エピジェネティック経路を同定する。
【０１４４】
エピジェネティック経路
本明細書に記載されるように、エピジェネティック経路は、細胞の「エピゲノム」またはエピゲノムの状態に寄与する任意の構成要素を含む。
【０１４５】
「エピジェネティック経路」という用語は、安定して遺伝可能なエピジェネティックな状態を一緒に確立および維持するそのような信号を送信する信号または生物学的構成要素の組み合わせを指す。特定の実施形態では、エピジェネティック経路は、エピジェネティック経路の開始をトリガーする環境に由来する信号、この信号を受け取り、特定のエピゲノム状態を確立するための正確なクロマチン位置および／またはDNA環境を決定することができるエピジェネティックイニシエーター、ならびに、最初および後続の世代における特定のエピジェネティックな状態を維持するエピジェネティックメンテナーを含む。
【０１４６】
高優先度エピジェネティック経路
本開示は、患者において疾患を治療する方法を供する。この方法は、操作されたＴ細胞を患者に投与することを含み、ここで、その操作されたＴ細胞は、１つまたは複数の高優先度エピジェネティック経路における１つまたは複数の変更を含む。特定の実施形態では、変更は、ゲノム工学アプローチを介して導入された遺伝子改変、またはエピジェネティックレギュレーターの阻害剤もしくは活性化剤を用いるエピジェネティックな改変を含む。特定の実施形態では、高優先度のエピジェネティック経路は、T細胞の疲弊を逆転させるか、防止するか、または増加させるために標的化されるか、または標的化されている。さらなる実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、T細胞の疲弊を逆転または防止するために標的化されるか、または標的化されている。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、ゲノム工学により、たとえばエピジェネティック経路における遺伝子をノックアウト／ノックインすることによって、またはエピジェネティック経路における遺伝子をコードするタンパク質の機能を変更することによって、標的化されている。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、エピジェネティックレギュレーターの発現を制御する位置における非コーディングゲノムの遺伝子工学によって標的とされる。たとえば、遺伝子の発現パターンを変化させるであろう欠失または改変され得る疲弊のエピジェネティックレギュレーターの遺伝子座においてオープンである疲弊特異的エンハンサーが存在する。高優先度エピジェネティック経路は、次の基準の一つを満たす遺伝子、遺伝子座、またはタンパク質である：ａ）エピジェネティックマークを生成または変化させる既知のまたは潜在的な役割を有する遺伝子／タンパク質、またはｂ）疲弊したT細胞において異なるエピジェネティックな修飾も有する転写プロファイリング研究に基づくT細胞疲弊において既知の役割を有する遺伝子。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、Tox、SET、RuvBl1、RuvBl2、DPY30、Tox2、Stat1、Stat2、Ikzf2、Dnmt3a、Kdm4a、Bhlhe41、Nfat2、Eomes、Nr4a2、Tcf1、T-bet、Blimp-1、Id2、Zeb2、Nr4a1、Suv39h2、Csprs、Sfmbt1、Hmgn3、Chd9、Rnf2、Ikzf3、Kmt2e、Satb1、Tet1、Tet2、Tet3、Kdm5b、Sfmbt2、Actr6、Prmt7、阻害性受容体および／またはT細胞転写因子をコードする遺伝子、ならびに他の関連T細胞遺伝子、たとえば、PD-1、CTLA-4、LAG-3、Tim3、CD200/CD200R、Ptger2、Ptger4、 T-bet、Eomes、Tox、Blimp1、BATF、AP-1ファミリーメンバー、IRF4、ならびに、Wherry et al.、Doering et al.、および／またはCrawford et al. （Wherry et al. Immunity 2007, 27:670-684 （全体が引用により本明細書に組み込まれる）; Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144 （全体が引用により本明細書に組み込まれる）; Crawford et al. Immunity 2014,40(2):289-302 （全体が引用により本明細書に組み込まれる））に記載される他の遺伝子、のうちの少なくとも１つにおけるエピジェネティックな変化を含む。
【０１４７】
エピジェネティックなターゲット
特定の実施形態では、エピジェネティック経路に関連する標的、または本明細書で用いられるような、「エピジェネティック標的」は、細胞内において標的化される。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は、Tet酵素（たとえば、Tet1、Tet2）、HDAC、Tox、Tox2、Csprs、Drud1、Sfmbt1、Chd9、Suv39h2、Sap30L、Hmgn3、BAZ2b、Prmt6、SET、Ruvbl1/2、DPY30、MLLタンパク質、Ezh1/2、PRC複合体、CBP、BET、および／または p300の少なくとも１つである。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は、任意のヒストンアセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、メチラーゼ、もしくはデメチラーゼ、または任意の他のエピジェネティック修飾酵素もしくはクロマチン修飾酵素の少なくとも１つである。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は、エピジェネティックパターンを調節することができる酵素または細胞内タンパク質である。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は転写因子である。特定の実施形態では、エピジェネティックな標的は、下流のエピジェネティックな経路を調節する細胞表面タンパク質である。特定の実施形態では、エピジェネティックな標的は、下流のエピジェネティックな経路を調節する細胞表面タンパク質である。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は、SERTADI、XPA、HINT3、HIST1H1C、ZFP69、NR4A3、TNFAIP3、SAP30L、SPRY2、RYBP、TIPARP、YAf'2、GCHI、GTF2B、PCGF5、SFMBT1、METTL4、THAP6、EOMES、CPEB2、IRF9、PARP9、STAT1、TLR7、APOBEC1、ISG15、PARP12、STAT2、TFDP2、SETBP1、PARP14、IKZF2、TOX、HSPA1A、SP140、SPAG7、MYCBP、TRAPPC2、TCF4、RBL2、ALS2、IKZF3、IRF7、ELL2、MXD1、IRAK2、MXl1、UHRF2、LITAF、NR4A2、NR4A1、ID2、RORA、HIST1H2BC、TBX21、MARVELD2、HIF1A、P2RY14、P2RY13、EPAS1、IRAK3、XDH、ARAP2、EIF4E3、SWAP70、TRAPPC1、GADD45B、IRF4、HMGB2、ACADL、RBBPB、UBD、ZC3H12C、RILPL2、GNPTAB、PRDM1、CARHSP1、N4BP1、ATOH1、TAF9B、APOBEC2、LRRFIP2、NFIL3、および SAP30の少なくとも１つである。特定の実施形態では、細胞はＴ細胞である。特定の実施形態では、細胞は疲弊したＴ細胞である。
【０１４８】
転写標的
エピゲノムは、転写因子が機能するコンテキストを供する。グローバルなエピジェネティックな景観情報は、疲弊したT細胞について、以前には存在しなかったが、（PD1をエンコードする）Pdcd1遺伝子座の研究は有益であった。急性的に解決されたLCMV感染におけるPdcd1プロモーター領域の分析は、これらの領域がエフェクター・フェーズにおいて広く脱メチル化され、後に、感染が解決されてCD8+ T細胞メモリーが形成されるにつれて再メチル化されることを示しました。対照的に、慢性LCMV感染においてPdcd1遺伝子座は完全に脱メチル化され、ウイルスタイターおよび疲弊CD8+ T細胞によるPD1タンパク質発現が減少した場合でも、再メチル化は観察されなかった(Youngblood et al. Immunity. 2011, 35(3):400-12)。十分に制御されたHIV感染を調べた研究でも同様のデータが得られた(Youngblood et al. J Immunol. 2013, 191(2):540-4133)。本開示は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞疲弊における遺伝子発現のエピジェネティック調節が疲弊を防止または逆転できることを教示し、エピゲノムにおける疲弊の耐久性のある痕跡（imprint）の証拠を供する。
【０１４９】
特定の実施形態では、エピジェネティック経路に関連する転写標的、または本明細書で使用される「転写標的」は、細胞内において標的化される。特定の実施形態では、転写標的は、Tox、SET、RuvBl1、RuvBl2、DPY30、Tox2、Stat1、Stat2、Ikzf2、Dnmt3a、Kdm4a、Bhlhe41、Nfat2、Eomes、Nr4a2、Tcf1、T-bet、Blimp-1、Id2、Zeb2、Nr4a1、Suv39h2、Csprs、Sfmbt1、Hmgn3、Chd9、Rnf2、Ikzf3、Kmt2e、Satb1、Tet1、Tet2、Tet3、Kdm5b、Sfmbt2、Actr6、および／またはPrmt7である。特定の実施形態では、転写標的は、SERTADI、XPA、HINT3、HIST1H1C、ZFP69、NR4A3、TNFAIP3、SAP30L、SPRY2、RYBP、TIPARP、YAf'2、GCHI、GTF2B、PCGF5、SFMBT1、METTL4、THAP6、EOMES、CPEB2、IRF9、PARP9、STAT1、TLR7、APOBEC1、ISG15、PARP12、STAT2、TFDP2、SETBP1、PARP14、IKZF2、HSPA1A、SP140、SPAG7、MYCBP、TRAPPC2、TCF4、RBL2、ALS2、IKZF3、IRF7、ELL2、MXD1、IRAK2、MXl1、UHRF2、LITAF、NR4A2、NR4A1、ID2、RORA、HIST1H2BC、TBX21、MARVELD2、HIF1A、P2RY14、P2RY13、EPAS1、IRAK3、XDH、ARAP2、EIF4E3、SWAP70、TRAPPC1、GADD45B、IRF4、HMGB2、ACADL、RBBPB、UBD、ZC3H12C、RILPL2、GNPTAB、PRDM1、CARHSP1、N4BP1、ATOH1、TAF9B、APOBEC2、LRRFIP2、NFIL3、およびSAP30のうちの少なくとも１つである。特定の実施形態では、転写標的は、Pdcd1、Ccr7、Gzmb、Lef1、Itgam、Itgax、Itgad、Cd44、Kcnj8、Lrrc9/Rtn1、Ifng、Tbx21、Cxcr5、Il10、Nlrc3、Cd200r、および/またはAtp8b4のうちの少なくとも１つである。特定の実施形態では、転写標的は、以下：
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である。特定の実施形態において、転写標的は、以下：
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である。特定の実施形態において、細胞はT細胞である。特定の実施形態において、細胞はCD8+ T細胞である。特定の実施形態において、細胞は疲弊したT細胞である。
【０１５０】
操作されたT細胞
特定の実施形態では、本発明は、癌または感染性疾患などの疾患を有する患者において免疫応答の増加に寄与する変化したエピゲノムを有するように操作された細胞（たとえば、Ｔ細胞）を供する。特定の実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、高優先度のエピジェネティック経路における変更を含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、疲弊したＴ細胞（ＴＥＸ）である。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は標的とされる。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路における変更は、ゲノム工学アプローチを介して導入された遺伝子改変、またはエピジェネティックレギュレーターの阻害剤もしくは活性化因子を用いるエピジェネティックな改変を含む。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、ゲノム工学により、たとえば、エピジェネティック経路における転写因子もしくは他の遺伝子をノックアウト／インすることによって、またはエピジェネティック経路におけるタンパク質をコードする遺伝子の機能を変更することによって、標的とされている。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、T細胞疲弊に関連するOCRドメインにおける調節配列をノックイン／ノックアウトすることによって標的とされる。特定の実施形態では、Ｔ細胞疲弊に関連するＯＣＲドメインは、表６に列挙されるものである。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路の標的化は、Ｔ細胞の疲弊を防止、逆転または増加させる。さらなる実施形態では、高優先度エピジェネティック経路のターゲティングは、T細胞の疲弊を防止または逆転する。エピジェネティックな経路のターゲティングは、Tox、SET、RuvBl1、RuvBl2、DPY30、Tox2、Stat1、Stat2、Ikzf2、Dnmt3a、Kdm4a、Bhlhe41、Nfat2、Eomes、Nr4a2、Tcf1、T-bet、Blimp-1、Id2、Zeb2、Nr4a1、Suv39h2、Csprs、Sfmbt1、Hmgn3、Chd9、Rnf2、Ikzf3、Kmt2e、Satb1、Tet1、Tet2、Tet3、Kdm5b、Sfmbt2、Actr6、および Prmt7の少なくとも1つにおける１つまたは複数の変化を引き起こし得る。特定の実施形態では、エピジェネティック経路は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲティングを介して薬物またはゲノム工学を用いてターゲティングされる。
【０１５１】
特定の実施形態では、本開示の操作された哺乳動物T細胞は高優先度エピジェネティック経路を含み、ここで、その高優先度エピジェネティック経路は標的化され、高優先エピジェネティック経路は、少なくとも1つの標的（たとえば、エピジェネティック標的、および／または転写標的）におけるエピジェネティックな変化またはその発現の変化を含み、高優先度エピジェネティック経路の標的化は、Ｔ細胞の疲弊を防止、逆転または増加させる。さらなる実施形態では、高優先度エピジェネティック経路のターゲティングは、T細胞の疲弊を防止または逆転させる。特定の実施形態では、エピジェネティックな変化は、ＤＮＡアクセシビリティ、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、リボシル化、シトルリン化、およびＤＮＡメチル化の少なくとも１つにおける変化を含む。重要な遺伝子座におけるDNAアクセシビリティは、疲弊したT細胞の生物学の変化に重要であることがこの開示を通じて知られる。この効果は、ヒストンのメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、SUMO化、リボシル化、シトルリン化、およびDNAメチル化における変化によって媒介され得る。
【０１５２】
エピゲノムのシグネチャ
疲弊したT細胞は、ナイーブ、エフェクター、および／またはメモリーT細胞と比較して、独特のエピゲノムを有する。この独特のエピゲノムは、本明細書では「エピゲノムのシグネチャ」と呼ぶ。エピゲノムのシグネチャは、TEXにおいてユニークに表現される遺伝子のシグネチャを含む。
【０１５３】
活性化状態の変化および疾患状態との関係を同定して列挙できるだけでなく、調査することもできるアプローチは、免疫療法の患者を監視する上で考慮すべき価値があり、免疫療法アプローチの選択を導き、免疫学的治療反応の追跡を助けるのに用いることができる。
【０１５４】
TEXにおいてユニークに発現される遺伝子のシグネチャは本明細書において同定される。特定の実施形態において、TEXにおいてユニークに発現される遺伝子のシグネチャは、SERTADI、XPA、HINT3、HIST1H1C、ZFP69、NR4A3、TNFAIP3、SAP30L、SPRY2、RYBP、TIPARP、YAf'2、GCHI、GTF2B、PCGF5、SFMBT1、METTL4、THAP6、EOMES、CPEB2、IRF9、PARP9、STAT1、TLR7、APOBEC1、ISG15、PARP12、STAT2、TFDP2、SETBP1、PARP14、IKZF2、TOX、HSPA1A、SP140、SPAG7、MYCBP、TRAPPC2、TCF4、RBL2、ALS2、IKZF3、IRF7、ELL2、MXD1、IRAK2、MXl1、UHRF2、LITAF、NR4A2、NR4A1、ID2、RORA、HIST1H2BC、TBX21、MARVELD2、HIF1A、P2RY14、P2RY13、EPAS1、IRAK3、XDH、ARAP2、EIF4E3、SWAP70、TRAPPC1、GADD45B、IRF4、HMGB2、ACADL、RBBPB、UBD、ZC3H12C、RILPL2、GNPTAB、PRDM1、CARHSP1、N4BP1、ATOH1、TAF9B、APOBEC2、LRRFIP2、NFIL3、および／またはSAP30を含む。特定の実施形態において、TEXにおいてユニークに発現される遺伝子のシグネチャは、以下：
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を含む。TEXに特異的な転写およびエピジェネティックな変化の異種間同定を組み合わせた新規のアプローチを用いた。マウスのリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）モデルにおいて、正規T細胞集団（ナイーブ、エフェクター、メモリーT細胞）と比較してTEXにおいて特異的に上方制御される遺伝子を同定した。この遺伝子のセットの中で、オープンクロマチン領域内でユニークなTEX特異的エピジェネティック変化を有するサブセットを、ATAC-seq分析に基づいてさらに選択した（Pauken et al Science 2016, 354(6316):1160-1165）。エピジェネティックに選択された遺伝子は、シグネチャ富化のリーディングエッジで典型的に蓄積する他のデータセットで富化を駆動するため、このシグネチャは、以前の疲弊シグネチャよりも優れる。
【０１５５】
疾患
T細胞の疲弊は、通常、エフェクター機能の進行的および階層的喪失、複数の抑制性受容体の持続的なアップレギュレーションおよび同時発現、主要な転写因子の発現およびと使用の変化、代謝攪乱、ならびに静止状態への移行の失敗など、いくつかの特徴的な機能を伴って顕在化し、抗原非依存性のメモリーT細胞恒常性応答を獲得する。T細胞の疲弊は、マウスにおける慢性ウイルス感染において最初に記述されたが、それは、HIVおよびC型肝炎ウイルス（HCV）などの感染中のヒトにおいて、ならびに癌においても観察されている。重要なことに、T細胞の疲弊は感染症および腫瘍の最適な制御を妨げるが、たとえばプログラムされた細胞死タンパク質1（PD1）および細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）を標的とすることにより、疲弊において過剰発現される経路を調節することにより、この機能不全の状態を逆転させ、免疫応答を再活化（reinvigorate）することできることである。しかしながら、これらの免疫応答は患者においてまれにしか耐久性がない。特定の実施形態では、患者は疾患を有し、本開示の操作されたＴ細胞で処置される。特定の実施形態では、疾患は癌である。特定の実施形態では、疾患は感染性疾患である。
【０１５６】
特定の実施形態において、疾患は、癌、ウイルス感染症、細菌感染症、および寄生体感染症からなる群から選択される。さらなる実施形態において、ウイルス感染症は、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、アネロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、およびインフルエンザウイルスからなる群から選択される。特定の実施形態において、疾患は、結核菌（ＭＴＢ）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、大腸菌（Escherichia coli）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、サルモネラ・ボンゴリ（Salmonella bongori）、およびコレラ菌（Vibrio cholera）からなる群から選択される細菌感染症である。特定の実施形態において、癌は、免疫チェックポイント阻害剤での処置に対して応答性である。さらなる実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤での処置に対して応答性である癌は、切除不能な黒色腫、転移性黒色腫、ステージIII黒色腫、転移性非小細胞肺癌（NSCLC）、NSCLC、頭頸部の再発性扁平上皮がん（SCCHN）、転移性腎細胞がん（RCC）、尿路上皮がん、肝細胞がん（HCC）、膀胱がん、結腸直腸がん、卵巣がん、および内皮がんからなる群から選択される。特定の実施形態において、疲弊のゲノムシグネチャが検出される任意の疾患を処置することができる。  
【０１５７】
処置（治療）
特定の実施形態では、患者は、本開示の操作されたＴ細胞を投与される。ここで、そのＴ細胞は、Ｔ細胞の疲弊を防止、逆転または増加させるように操作されている。さらなる実施形態において、患者は、Ｔ細胞の疲弊を防止または逆行するように操作されている、本開示の操作されたＴ細胞を投与される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞における高優先度エピジェネティック経路を標的とすることによって操作されている。特定の実施形態では、操作されたＴ細胞の投与は、患者における免疫学的応答を増加させる。特定の実施形態では、疾患を有する患者は、操作されたＴ細胞が投与される前に、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤で疾患について治療される。特定の実施形態では、操作されたT細胞を投与する前に、患者は、1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤で処置される。特定の実施形態では、操作されたＴ細胞は、免疫チェックポイント阻害剤と同時にまたは同時発生的に投与される。
【０１５８】
ヒト化抗体
特定の実施形態では、非ヒト抗体はヒト化することができる。ここで、抗体の特定の配列または領域は、ヒトにおいて自然に産生される抗体との類似性を高めるように改変される。たとえば、本発明において、抗体またはその断片は、非ヒト哺乳動物scFvを含み得る。一実施形態では、抗原結合ドメイン部分はヒト化されている。
【０１５９】
ヒト化抗体は、これらに限らないが、以下を含む、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる：ＣＤＲ移植（たとえば、それぞれ全体が引用により本明細書に組み込まれる、欧州特許第239,400号、国際公開第WO 91/09967号、ならびに米国特許第5,225,539、5,530,101、および 5,585,089号を参照）、ベニアリング（veneering）またはリサーフェシング（たとえば、それぞれ内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる、欧州特許第EP 592,106およびEP 519,596号、Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805- 814; およびRoguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973を参照）、チェーンシャッフリング（たとえば、全体が引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,565,332号を参照）、ならびに、たとえば、それぞれ内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第US2005/0042664号、米国特許出願公開第US2005/0048617号、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、国際公開第WO 9317105号、Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002)、Caldas et al., Protein Eng., 13 (5): 353-60 (2000)、Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000)、Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997)、Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996)、Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995)、Couto et al., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995)、Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)、およびPedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)に開示される技術。しばしば、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基で置換され、抗原結合を変更、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により、たとえば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに、特定の位置での普通でないフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（たとえば、それぞれ内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる、Queen et al., 米国特許第5,585,089号、およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323を参照）。
【０１６０】
ヒト化抗体は、非ヒトであるソースからそれに導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基としばしば呼ばれ、それは、典型的には、「インポート」可変ドメインから取得される。したがって、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子由来の1つまたは複数のCDRおよびヒト由来のフレームワーク領域を含む。抗体のヒト化は当技術分野で周知であり、ヒト抗体の対応する配列の代わりにげっ歯類のCDRまたはCDR配列を置換することにより、すなわちCDR移植（それぞれ内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる、欧州特許第239,400号、国際公開第WO 91/09967号、および米国特許第 4,816,567; 6,331,415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 6,548,640号）により、Winter および共同研究者（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法にしたがって、本質的に行うことができる。そのようなヒト化キメラ抗体では、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基およびおそらくいくつかのフレームワーク（FR）残基がげっ歯類抗体における類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。抗体のヒト化は、ベニアリングまたはリサーフェシング（欧州特許第592,106号；欧州特許第519,596号; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); および Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994))またはチェーンシャッフリング（米国特許第5,565,332号）によっても達成することができる。これらそれぞれ内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
ヒト化抗体を作製する際に用いられるヒト可変ドメイン、軽鎖および重鎖の両方の選択は、抗原性を低下させることである。いわゆる「ベストフィット」法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全体のライブラリーに対してスクリーニングされる。げっ歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（FR）として受け入れられる（それぞれ内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる、Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に用いることができる（内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる、Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)）。
【０１６２】
抗体は、標的抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しながらヒト化することができる。本発明の一態様によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および様々な概念的ヒト化産物を分析するプロセスによって調製される。
【０１６３】
三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元立体構造を例示および表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性ある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンが標的抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能になる。このようにして、FR残基を選択し、レシピエント配列およびインポート配列から組み合わせて、標的抗原に対する親和性の増大などの所望の抗体特性を達成することができる。一般に、CDR残基は、抗原結合への影響に直接かつ最も実質的に関与する。
【０１６４】
ヒト化抗体は、オリジナルの抗体と同様の抗原特異性を保持する。しかしながら、ヒト化の特定の方法を用いて、標的抗原への抗体の結合の親和性および／または特異性は、内容の全体が引用により本明細書に組み込まれる、Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151 (1999)に記載されるように、「定向進化（directed evolution）」の方法を用いて増加させることができる。
【０１６５】
T細胞
急性感染またはワクチン接種の間に、ナイーブT細胞は活性化され、1〜2週間にわたってエフェクターT細胞に分化する。この分化は、強力な増殖、転写、エピジェネティックおよび代謝的再プログラミング、ならびにエフェクター機能、変化した組織ホーミング、および劇的な数値的拡大などのエフェクターT細胞の基本的な特徴の獲得を伴う。エフェクターの拡大のピーク、炎症の解消、および抗原のクリアランスに続いて、ほとんどの活性化T細胞は死ぬが、サブセットは存続し、メモリーT細胞プールに移行する。これらのメモリーT細胞は、エフェクターT細胞の活性化プログラムの多くをダウンレギュレートするが、それらは、再刺激時にエフェクター機能を迅速に再活性化する能力を維持する。さらに、メモリーT細胞は、抗原非依存性の自己再生の重要なメモリー特性を発達させる。これは、インターロイキン-7（IL-7）とIL-15によって駆動される幹細胞のような遅い分裂の一種である。急性感染またはワクチン接種後のメモリーT細胞サブセットおよび分化には、かなりの多様性および複雑性がある（たとえば、エフェクターメモリーT細胞と中央メモリーT細胞）。しかしながら、機能的で持続的なメモリーT細胞の発達の重要な側面は、エフェクターフェーズの後、メモリー発達が、進行中の抗原刺激および高レベルの持続的な炎症がない状態で発生することである(Wherry and Kurachi. Nat Rev Immunol. 2015, 15(8):486-499)。
【０１６６】
対照的に、慢性的な感染症や癌−持続的な抗原曝露および／または炎症を伴う−の間に、このメモリーT細胞分化のプログラムは著しく変化する。T細胞の疲弊と呼ばれる変化した分化状態は、通常、エフェクター機能の進行性および階層的喪失、複数の抑制性受容体の持続的なアップレギュレーションおよび共発現、主要な転写因子の変化した発現および使用、代謝攪乱、ならびに静止状態への移行および抗原非依存性メモリーT細胞恒常性応答の獲得の失敗など、いくつかの特徴的な特徴を示す。T細胞の疲弊は、マウスにおいて慢性ウイルス感染において最初に記述されたが、HIVやC型肝炎ウイルス（HCV）などの感染中のヒト、および癌においても観察されている。重要なことに、T細胞疲弊は感染症および腫瘍の最適な制御を妨げるが、たとえばプログラムされた細胞死タンパク質1（PD1）および細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）を標的とすることにより、疲弊において過剰発現された経路を調節することは、この機能不全の状態を逆転させ、免疫反応を再活化することができる。しかしながら、TEXを完全には再活化できないため、耐久性のある臨床応答はしばしば発生しない。
【０１６７】
疲弊T細胞
疲弊したT細胞は不活性ではない。それらは、進行中の病原体の複製または腫瘍の進行を制限する、最適ではないが重要な機能を保持する。疲弊したT細胞によって媒介されるこの宿主−病原体の膠着状態にもかかわらず、これらの細胞は病原体または腫瘍を根絶するのに効果的ではなく、疲弊を回避または逆転することに大きな関心が寄せられている。T細胞の疲弊が終末期または不可逆的な運命ではなく（少なくとも集団レベルで）可逆的であることの実証は、免疫療法を用いて免疫を改善する実質的な臨床機会を供する。これらのヒト治療の免疫学的効果は完全に規定されていないが、新たな結果は、ヒトにおけるT細胞疲弊の逆転が、PD1経路を遮断する剤を受容している多くの患者に見られる顕著な抗腫瘍効果の原因となるメカニズムであるという考えを支持する。
【０１６８】
疲弊した免疫細胞は、同じタイプの対応する対照免疫細胞と比較して、細胞毒性活性、サイトカイン産生、増殖、輸送、食作用活性、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％またはそれを超える減少を有し得る。一実施形態では、疲弊した細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（たとえば、抗原特異的であるエフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞）である。CD8細胞は、通常、T細胞受容体および／または共刺激受容体刺激に応答して、ならびにIL-2などのサイトカインに応答して、増殖（たとえば、クローン的に拡大）する。したがって、疲弊したCD8 T細胞は、正常な入力シグナルに応答して増殖および／またはサイトカインを産生しないものである。エフェクター機能の疲弊は、いくつかの段階に従って描写され、結局は、終末的または完全な疲弊、そして最終的には削除につながることが知られている（Yi et al. (2010) Immunol. 129:474-481; Wherry and Ahmed (2004) J. Virol. 78:5535-5545）。最初の段階で、機能的なT細胞は、IL-2産生の喪失、TNFα産生の減少、増殖および／またはエクスビボ溶解の能力の低下を含む、エフェクター機能のサブセットの喪失を特徴とする「部分的疲弊Ｉ」期に入る。第２段階では、IL-2とTNFαとの両方の産生が抗原刺激後に停止し、IFNγ産生が低下すると、部分的に疲弊したT細胞が「部分的疲弊ＩＩ」期に入る。「完全疲弊」または「終末疲弊」は、CD8+ T細胞が、IL-2、TNFα、およびIFNγの産生の欠如、ならびに抗原刺激後のエクスビボ溶解能および増殖能の喪失を含む、すべてのエフェクター機能を失うときに発生する。完全に疲弊したCD8+ T細胞は、正常な入力シグナルに対する応答において、増殖せず、標的細胞を溶解せず（細胞毒性）、および／またはIL-2、TNFα、IFNγなどの適切なサイトカインを産生しないものである。このようなエフェクター機能の欠如は、抗原の負荷が高い場合、および／またはCD4の助けが低い場合に発生し得る。この階層的な機能の喪失は、PD-1、TIM-3、LAG-3などの共阻害剤免疫受容体の発現にも関連している(Day et al. (2006) Nature 443:350-4; Trautmann et al. (2006) Nat. Med. 12:1198-202; および Urbani et al. (2006) J. Virol. 80:1398-1403)。他の分子マーカーは、終末的に疲弊したT細胞のマーカーとしての高エオメソデルミン（eomesodermin）（EOMES）および低TBET発現など、免疫細胞疲弊の階層的な段階を区別する(Paley et al. (2012) Science 338:1220-1225)。Bcl-bの減少およびBLIMP-1（Pdrm1）の生産の増加など、疲弊T細胞の追加マーカー。
【０１６９】
適応免疫システムの保護能力は、細胞の運命の間の効率的かつ協調的な移行に依存する。特定の抗原による最初の活性化に続いて、ナイーブCD8+ T細胞は広範囲に増殖し、分子の再配線およびエフェクターCD8+ T細胞（TEFF）への分化の高度に編成されたプログラムを経て、細胞毒性および炎症性サイトカインの産生を介して保護を媒介することができる(Kaech, S. M. & Wherry, E. J. Heterogeneity and cell-fate decisions in effector and memory CD8+ T cell differentiation during viral infection. Immunity 27, 393-405 (2007); Chang, J. T., Wherry, E. J. & Goldrath, A. W. Molecular regulation of effector and memory T cell differentiation. Nat Immunol 15, 1104-1115 (2014); Kaech, S. M. & Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. 12, 749-761 (2012); Cui, W. & Kaech, S. M. Generation of effector CD8+ T cells and their conversion to memory T cells. Immunol Rev 236, 151-166 (2010))。感染または抗原がクリアされると、このTEFFプールのほとんどは死ぬが、サブセットは持続し、さらなる分化を経て、迅速なリコール応答をマウントすることができる長寿命の自己再生メモリーT細胞（TMEM）のプールを形成する。対照的に、慢性感染症またはがんの期間中、T細胞刺激が持続すると、この機能的T細胞分化のプログラムが迂回され、T細胞は強力なエフェクター機能を維持できず、代わりに疲弊になる（Wherry, E. J. & Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nature Publishing Group 15, 486-499 (2015); Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat Immunol 12, 492-499 (2011)）。疲弊したCD8+ T細胞（TEX）は、損傷する免疫病理を抑制しながら、限られた病原体または腫瘍制御のバランスをとり得るが、抑制された機能性の結果は、疾患の持続および進行の可能性である（Barber, D. L. et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic 1155 viral infection. Nature 439, 682-687 (2005); Frebel, H. et al. Programmed death 1 protects from fatal circulatory failure during systemic virus infection of mice. J Exp Med 209, 2485-2499 (2012)）。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）に感染したマウスにおいて最初に記述されたが、T細胞疲弊が多くの慢性感染症ならびにマウスおよびヒトの両方におけるさまざまな癌の共通の特徴であることは今や明らかである（Zajac, A. J. et al. Viral Immune Evasion Due to Persistence of Activated T Cells Without Effector Function. J Exp Med 188, 2205-2213 (1998); Gallimore, A. et al. Induction and Exhaustion of Lymphocytic Choriomeningitis Virus-specific Cytotoxic T Lymphocytes Visualized Using Soluble Tetrameric Major Histocompatibility Complex Class I-Peptide Complexes. J Exp Med 187, 1383-1393 (1998); Lechner, F. et al. Analysis of Successful Immune Responses in Persons Infected with Hepatitis C Virus. J Exp Med 191, 1499-1512 (2000) 1166 12. Shankar, P. et al. Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection. Blood 96, 3094-3101 (2000)）。実際、これらの細胞は、ヒト癌患者におけるチェックポイント遮断が媒介する免疫再活化の主要な標的であるため、TEXは高度に治療に関連する（Pauken, K. E. & Wherry, E. J. Overcoming T cell exhaustion in infection and cancer. Trends in Immunology 36, 265-276 (2015); Page, D. B., Postow, M. A., Callahan, M. K., Allison, J. P. & Wolchok, J. D.; Immune Modulation in Cancer with Antibodies. Annu. Rev. Med. 65, 185-202 (2014); Hamid, O. et al. Safety and Tumor Responses with Lambrolizumab (Anti-PD-1) in Melanoma. N Engl J Med 369, 134-144 (2013); Hirano, F. et al. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005); Barber, D. L. et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature 439, 682-687 (2005)）。
【０１７０】
T細胞疲弊は、炎症性サイトカイン産生(IL-2、TNFα、IFNγ)の階層的喪失を含む、エフェクター機能の進行性の低下を特徴とする（Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., van der Most, R. & Ahmed, R. Viral Persistence Alters CD8 T-Cell Immunodominance and Tissue Distribution and Results in Distinct Stages of Functional Impairment. J Virol 77, 4911-4927 (2003); Fuller, M. J. & Zajac, A. J. Ablation of CD8 and CD4 T Cell Responses by High Viral Loads. J Immunol 170, 477-486 (2003)）。TEXは、複数の抑制性受容体(PD-1、LAG3、TIGIT、CD160、TIM-3、2B4）の高い共発現も維持する（Blackburn, S. D. et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat 1186 Immunol 10, 29-37 (2008)）、解糖系および酸化系リン酸化能力を低下させ（Bengsch, B. et al. Bioenergetic Insufficiencies Due to Metabolic Alterations Regulated by the Inhibitory Receptor PD-1 Are an Early Driver of CD8+ T Cell Exhaustion. Immunity 45, 358-373 (2016); Staron, M. M. et al. The Transcription Factor FoxO1 Sustains Expression of the Inhibitory Receptor PD-1 and Survival of Antiviral CD8+ T Cells during Chronic Infection. Immunity 41, 802-814 (2014)）、そして、増殖および生存を損なわせる（Wherry, E. J., Blattman, J. N. & Ahmed, R. Low CD8 T-Cell Proliferative Potential and High Viral Load Limit the Effectiveness of Therapeutic Vaccination. J Virol 79, 8960-8968 (2005); Wherry, E. J., Barber, D. L., Kaech, S. M., Blattman, J. N. & Ahmed, R. Antigen independent memory CD8 T cells do not develop during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci USA 101, 16004-16009 (2004); Shin, H., Blackburn, S. D., Blattman, J. N. & Wherry, E. J. Viral antigen and extensive division maintain virus-specific CD8 T cells during chronic infection. J 1201 Exp Med 204, 941-949 (2007)）。TEFFおよびTMEMと比較したTEXにおけるこれらの主要な違いの根底にあるのは、主要な転写因子の使用の変更および転写回路の変更によって強調される異なる転写プログラムである（Wherry, E. J. et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity 27, 670-684 (2007); Doering, T. A. et al. Network Analysis Reveals Centrally Connected Genes and Pathways Involved in CD8+ T Cell Exhaustion versus Memory. Immunity 37, 1130-1144 (2012); Crawford, A. et al. Molecular and Transcriptional Basis of CD4+ T Cell Dysfunction during Chronic Infection. Immunity 40, 289-302 (2014)）。実際に、転写因子（TF）のユニークなネットワークは、疲弊の異なる機能的モジュールを調節する。NFATタンパク質、BATF、およびIRF4を含む、T細胞受容体シグナル伝達インテグレーターは、疲弊の誘発に関与することが示されている（Grusdat, M. et al. IRF4 and BATF are critical for CD8&plus; T-cell function following infection with LCMV. Cell Death and Differentiation 21, 1050-1060 (2014); Man, K. et al. Transcription Factor IRF4 Promotes CD8+ T Cell Exhaustion and Limits the Development of Memory-like T Cells during Chronic Infection. Immunity 47, 1129-1141.e5 (2017); Martinez, G. J. et al. The Transcription Factor NFAT Promotes Exhaustion of Activated CD8+ T Cells. Immunity 42, 265-278 (2015)）が、T-bet、Eomesodermin (Eomes)、およびTcf1は、いったん確立されたTEX集団を維持するための増殖的階層の協調に関与する（Im, S. J. et al. Defining CD8+ T cells that provide the proliferative burst after PD-1 therapy. Nature 537, 417-421 (2016); Wu, T. et al. The TCF1-Bcl6 axis counteracts type I interferon to repress exhaustion and maintain T cell stemness. Sci Immunol 1, eaai8593-eaai8593 (2016); Utzschneider, D. T. et al. T Cell Factor 1-Expressing Memory-like CD8+ T Cells Sustain the Immune Response to Chronic Viral Infections. Immunity 45, 415-427 (2016); Paley, M. A. et al. Progenitor and Terminal Subsets of CD8+ T Cells Cooperate to Contain Chronic Viral Infection. Science 338, 1220-1225 (2012)）。さらに、Blimp-1、Bcl6、およびFoxo1は、TEX細胞の運動および代謝能力、ならびに機能不全の全体的な重症度を調節する。場合によっては、これらのTFはTEFFまたはTMEMによっても用いられるが、異なる機能および変更された転写接続により、同じTFが多様な活性を実行できるようにするエピジェネティックな環境を意味する。この研究にもかかわらず、TEXは単純に調節不全のTEFFか、停止したTMEMか、またはTEXが明確な細胞運命であるのか、は不明であった。しかしながら、最近のエピジェネティック分析は、TEXは、他の主要な造血系統間の差に類似して、TEFFおよびTMEMと〜6000のオープンクロマチン領域において異なることを明らかにし、これは、TEXは単純なTEFFまたはTMEMの活性化の状態ではなく、むしろ、異なる免疫系統であることを示唆する（Im, S. J. et al. Defining CD8+ T cells that provide the proliferative burst after PD-1 therapy. Nature 537, 417-421 (2016); Wu, T. et al. The TCF1-Bcl6 axis counteracts type I interferon to repress exhaustion and maintain T cell stemness. Sci Immunol 1, eaai8593-eaai8593 (2016); Utzschneider, D. T. et al. T Cell Factor 1-Expressing Memory-like CD8+ T Cells Sustain the Immune Response to Chronic Viral Infections. Immunity 45, 415-427 (2016); Paley, M. A. et al. Progenitor and Terminal Subsets of CD8+ T Cells Cooperate to Contain Chronic Viral Infection. Science 338, 1220-1225 (2012)）。このTEX運命のコミットメントならびにエピジェネティックおよび転写プログラミングを開始するメカニズムは、これまで十分に理解されておらず、疲弊特異的TFまたは転写プログラミング活性は理解しにくいままであった。
【０１７１】
ここでは、TEX系統への運命のコミットメントを推進する初期のエピジェネティックなイベントのプログラミングにおけるHMGボックスTF TOXの必要な役割が規定される。理論に結びつける意図はないが、TOXは初期の持続的なNFAT2活性を後続のNFATに依存しないTOX駆動の分子およびエピジェネティックTEXプログラムに統合する。TOXは、抑制性受容体発現、機能の低下、およびTEX集団の維持に必要な下流のTF発現のパターンを含む、TEXの主要な細胞の特徴を誘導するのに必要かつ十分である。TOXは多くの急性感染症の間に一過性かつ低く発現され、TEFFおよびTMEMはTOXなしで形成され得る。対照的に、TOX発現はTEXにおいて強力で維持され、TEXの発達はこのTFに完全に依存する。TOXは主要なヒストン修飾酵素複合体と相互作用し、TEX系統イニシエーターとして機能するように主要なTEX特異的エピジェネティックな変化を開始することができる。したがって、これらのデータはTOXを重要なTEX系統プログラミング転写およびエピジェネティックコーディネーターとして同定する。これらの結果は、TEXの個体発生に関係し、TOXおよびTOX調節エピジェネティックイベントのターゲティングに基づく潜在的な治療法を示唆する。
【０１７２】
抑制性受容体および免疫チェックポイント遮断による処置
抑制性受容体は、自己反応性および免疫病理学を制御する重要な負の調節経路である。抑制性受容体は、活性化中に機能的エフェクターT細胞において一時的に発現されるが、抑制性受容体のより高く持続的な発現は、疲弊T細胞の特徴である。PD1リガンド1（PDL1）および／またはPDL2の結合に応答してPD1によって媒介される抑制性シグナル伝達経路は、例示的な例を提供する。抑制性受容体PD1がT細胞疲弊を制御する分子メカニズムについての我々の理解は不完全であり、理論に縛られることを望まないが、PD1などの抑制性受容体がT細胞機能を調節するメカニズムはいくつかある：最初に、外部ドメイン競合によるもの。これは、標的受容体またはリガンドを隔離する、および／またはマイクロクラスターおよび脂質ラフト（たとえば、CTLA4）の最適な形成を防止する阻害性受容体を指す；第２に、細胞内メディエーターの調節を介するもの。これは、TCRおよび共刺激受容体などの活性化受容体からの陽性シグナルの局所的および一過性の細胞内減衰を引き起こし得る；ならびに、第３に、抑制遺伝子の誘導を介するもの。
【０１７３】
PD1について特定の知見はあるが、PD1を含む、抑制性受容体の作用の細胞内メカニズムの理解は不完全である。PD1の細胞内ドメインは、免疫受容体チロシンベースの抑制性モチーフ（ITIM）および免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ITSM）を含む。インビトロの研究は、チロシンタンパク質ホスファターゼSHP1（別名PTPN6）および／またはSHP2（別名PTPN11）のリクルーティングにおけるITSMの役割を示唆する。PD1機能におけるITIMの役割はほとんど理解されていない。他の証拠は、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）、AKTおよびRAS経路の調節におけるPD1シグナル伝達の役割を示唆し、PD1を細胞周期制御に関連付ける。特に、PD1がT細胞シグナル伝達を制御する方法に関する我々の情報の多くは、急性的に活性化されたT細胞のインビトロの研究に由来する。急性T細胞の活性化および拡大の間のPD1の役割のインビボでの研究は、状況に応じて、移動性停滞の増加または遊走停止の減少のいずれかにおけるPD1シグナル伝達についての可能性ある役割を示唆する。最後に、PD1の下流のシグナル伝達は、アクティベータープロテイン1（AP-1）ファミリーメンバーベイシックロイシンジッパー転写因子ATF様をコードするBATFなどのエフェクター遺伝子の発現を負に調節し得る遺伝子の発現を実際に誘導し得る。このエレガントな研究にもかかわらず、これらの観察がインビボで慢性感染症に曝された疲弊したT細胞にいかに関連するかは不明である。
【０１７４】
PD1の発現は、T細胞活性化により急速にアップレギュレートされ、健康なヒトでは中程度のレベルで持続し得る。これは、PD1の発現だけでは疲弊T細胞のユニークな特徴ではないことを示している。しかしながら、慢性感染中、PD1の発現は、機能性エフェクターまたはメモリーCD8+ T細胞で観察されるよりも実質的に高くなり得る。慢性感染の間、PD1の持続的なアップレギュレーションは、通常、継続するエピトープ認識に依存する。ただし、持続する抗原シグナル伝達を取り除いた後でさえ、PD1の残存発現の例が存在する。
【０１７５】
PD1に加えて、疲弊したT細胞は他のさまざまな細胞表面抑制分子を発現する。疲弊したT細胞は、リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG3）、2B4（別名CD244）、CD160、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン含有タンパク質3（TIM3、別名HAVCR2）、CTLA4および多くの他の抑制性受容体と共にPD1を共発現することができる。典型的には、疲弊T細胞によって共発現される阻害性受容体の数が多いほど、疲弊はより深刻になる。実際、PD1または他の抑制性受容体の個々の発現は疲弊を示すものではないが、複数の抑制性受容体の同時発現は重要な特徴である。複数の抑制性受容体を同時に遮断すると、T細胞疲弊が相乗的に逆転するため、これらの共発現パターンは機構的に関連している。この概念は、慢性LCMV感染におけるPD1およびLAG3について、ならびに、HIV感染、その他の感染症および癌におけるPD1およびCTLA4について実証された。PD1およびTIM3などの抑制性受容体の他の多くの組み合わせも、疲弊T細胞を同時調節できる。黒色腫の患者におけるPD1およびCTLA4の遮断は、印象的な腫瘍制御を示し、阻害性受容体を遮断する他の剤の組み合わせの臨床試験が進行中である（たとえば、PD1経路に関わる120を超える他の試験の中の、ClinicalTrials.gov識別名NCT01968109、NCT02210117、およびNCT02408861）。全体として、T細胞疲弊の共調節における抑制性受容体の役割に関するこれらのデータは、これらの経路が非冗長であることを示唆する。これらの分子は、多様な構造ファミリーに由来し、異なる発現パターンでリガンドに結合し、異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有する。したがって、疲弊したT細胞の再活化のタイプおよび大きさを適合させる（tailor）または調整（tune）する可能性がある。
【０１７６】
抑制性受容体に加えて、共刺激受容体がT細胞疲弊に関与していることが明らかになっている。たとえば、アダプター分子の喪失を介した共刺激経路シグナル伝達の脱感作は、慢性感染中のT細胞機能不全のメカニズムとして機能し得る。シグナリングアダプター腫瘍壊死因子受容体（TNFR）関連因子1（TRAF1）は、HIV進行因子の機能不全T細胞において、および慢性LCMV感染において、ダウンレギュレートされる。TRAF1を発現するCD8+ T細胞の養子移入は、TRAF1欠損CD8+ T細胞の移入と比較して、慢性LCMV感染の制御を増強し、このことは、この設定におけるTRAF1依存性共刺激経路のための重要な役割を示している。正の共刺激経路に対するアゴニスト抗体を阻害経路の遮断と組み合わせることにより疲弊を逆転するための共刺激の潜在的な有益な役割を活用することも可能になった。4-1BB（CD137およびTNFRSF9としても知られている）は、TNFRファミリーメンバーであり、活性化T細胞で発現される正の共刺激分子である。PD1遮断と4-1BBに対するアゴニスト抗体での処置とを組み合わせることにより、疲弊したT細胞機能およびウイルス制御は劇的に改善された。T細胞疲弊の間の正対負の共刺激の単純なモデルは、おそらくメカニズムの妥当性を有するが、経路の多様性および実験データの多くは、特定の定性的なシグナルが異なる共刺激経路および共抑制経路によって与えられ得ることを示唆する（Wherry and Kurachi. Nat Rev Immunol. 2015, 15（8）：486-499）。
【０１７７】
特定の実施形態では、阻害性受容体が患者において標的とされる。特定の実施形態では、阻害性受容体は、免疫チェックポイント阻害剤で標的化される。免疫チェックポイント阻害剤は、これらに限らないが、PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、B7-H3、BTLA、VISTA、CD40、CEACAM1/CD66a、CD80/B7-1、CD86/B7-2、OX40/CD134、CD40 リガンド、ICOS リガンド/B7-H2、4-1BBL/CD137L、または B7-DC/PD-L2/CD273であり得る。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗免疫チェックポイント阻害剤抗体で標的化される。特定の実施形態では、患者は、本開示の抗免疫チェックポイント阻害剤および操作されたＴ細胞で同時にまたは同時発生的に治療される。特定の実施形態では、患者は、たとえば、免疫チェックポイント阻害剤による処置後、1分、5分、30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、または7日に、患者が抗免疫チェックポイント阻害剤で処置されている後に本開示の操作されたT細胞で処置される。
【実施例】
【０１７８】
実験例
以下の実験例を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。これらの例は、説明のみを目的として提供されており、特に指定のない限り、制限することを意図したものでない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意のすべての変形を包含すると解釈されるべきである。
【０１７９】
さらに説明することなく、当業者は、先の説明および以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作成および利用し、請求される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を具体的に指摘しており、本開示の残りの部分を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１８０】
実施例1〜10で用いられた材料および方法を次に説明する。
【０１８１】
マウス、感染症、および抗体処置
5〜6週齢のメスのC57BL/6およびB6-Ly5.2CR（Ly5.1を発現するB6マウス）は、Charles River（NCI strains）から購入した。C57BL/6 P14マウスをB6-Ly5.2CRマウスと交配して、記載されるようにP14 Ly5.1+マウスを生成した（Odorizzi et al. J. Exp. Med. 2015, 212：1125-1137）。LCMV株（Armstrong（Arm）およびクローン13）を増殖させ、記載されるとおりに力価を測定した（Odorizzi et al. J. Exp. Med. 2015, 212：1125-1137）。特定の実施形態では、C57BL/6 P14、Toxf/f CD4Cre+ P14、およびToxf/f Ert2Cre+ P14マウスを自家交配し、移植後の急性拒絶反応を予防するためにNCI C57BL/6マウスと戻し交配した。LCMV株（Armstrong（Arm）およびクローン13）を増殖させ、前述の通り力価を測定した。B6マウスに腹腔内（i.p.）に2x105 PFU LCMV Armを、または静脈内（i.v.）に4x106 PFU LCMVクローン13を感染させ、それぞれ急性感染または持続感染を確立した。特定の実施形態では、感染後25〜30日目の間、50:50 Kolliphor/エタノールに溶解させた2mgのタモキシフェン（Sigma）を毎日マウスにIP注射した。すべてのクローン13感染について、CD4 T細胞を、LCMVクローン13で、-1および+1 日p.i.に、200μgの抗CD4（クローンGK1.5、Bio X Cell）をi.p.注入することにより枯渇させた。抗PD-L1（クローン10F.9G2、Bio X Cell）またはアイソタイプ対照抗体（Rat IgG2b、Bio X Cell）を、記載されるように、22〜25 日p.i.の間に開始し、3日ごとに5回の注射の200μg/注射を5回の合計処置で、i.p.投与した（Barber et al. Nature 2006, 439, 682-687）。いくつかの実験では、対照としてビヒクル（PBS）を注射した。IL-7をインビボで投与した実験では、サイトカインは抗IL-7と複合体化させて安定性を高めた。これらの実験のために、IL-7/抗IL-7免疫複合体（i.c.）を記載されるように調製した（Boyman et al. J. Immunol. 2008, 180：7265-7275）。簡単に言うと、注射あたりマウス1匹あたり1.5μgの組換えヒトIL-7（NCI Preclinical RepositoryまたはBiolegend）および7.5μgの抗ヒト／抗マウスIL-7（Charlie Surh提供のクローンm25）を混合し、30分間、複合体化させ、その後、注射用PBSで希釈した。複合体は抗PD-L1と同時にi.p.投与した（5回の注射で3日ごと）。すべてのマウスはUniversity of Pennsylvaniaで特定の無菌条件下で維持し、すべてのプロトコルはInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。
【０１８２】
リンパ球単離および養子移入
P14細胞を監視する実験では、P14トランスジェニックマウスの末梢血からヒストパク1083グラジエント（histopaque 1083 gradients、Invitrogen)を用いてP14細胞を単離し、P14細胞（クローン13実験では500、Arm実験では500〜2000）を感染の少なくとも1日前に5〜6週齢のレシピエントB6マウスにi.v.で養子移入した。P14細胞を内因性DbGP33+およびDbGP276+細胞と比較した場合に同様の結果が得られ（図５）、以前の報告では、クローン13実験のために移入されたP14細胞の数（500）がウイルスロードに影響を与えなかったことを示している（Odorizzi et al. J. Exp. Med. 2015, 212:1125-1137; Blattman et al. J. Virol. 2009, 83:4386-4394）。TMEM、TEX、または抗PD-L1処理TEXを養子移入した実験では、CD8 T細胞は、抗体処理期間の1日後に脾臓から単離し、製造元の指示にしたがってCD8 T細胞EasySep陰性選択キット（Stem Cell Technologies）を用いて富化した。番号は、抗原のないレシピエントマウスへのi.v.養子移入前のDbGP33テトラマー染色に基づいてグループ間で正規化した。LCMV免疫マウス（30+日p.i.）を抗原のないレシピエントとして用いたため、内因性LCMV特異的メモリーは、記載されるように任意の移入されたウイルスを排除することができた（Angelosanto et al. J. Virol. 2012, 86：8161-8170）。抗原非依存的持続性をテストする実験では、レシピエントマウスはLCMV Armに免疫性であった（30+日pi）。再チャレンジ実験では、レシピエントマウスは、記載されるようにGP33エピトープを欠如するLCMVクローン13 V35Aによる低用量（200 PFU）感染を以前に解消していた（Shin、et al. J. Exp. Med. 2007, 204：941-949）。V35A免疫マウスは、内因性DbGP33特異的メモリーCD8 T細胞との直接の競合を防ぐためにリコール実験に用いた。
【０１８３】
フローサイトメトリー
MHCクラスIペプチド四量体（DbGP276およびDbGP33）は、前述の通り作成するか、またはNIH四量体コアから取得した。抗体は、eBioscience、BD、Biolegend、Life Technologies、R&D Systems および AbD Serotecから購入し、CD8、CD4、B220、CD45.1、CD45.2、CD44、CD122、CD127、PD-1、2B4、Tim-3、Lag-3、Ki-67、granzyme B、IFNγ、TNFα、および phospho-STAT5が含まれる。単一細胞懸濁液は、製造元の指示に従ってLive/Dead Aqua（Life Technologies）で染色した後、表面抗原について染色した。Ki-67およびグランザイムBについての細胞内染色は、製造元の指示（eBioscience）にしたがってeBioscience Foxp3固定化／透過化キットを用いて行った。ブレフェルジンAおよびモネンシン（BD）の存在下で0.2μg/mlのgp33-41ペプチド（KAVYNFATM、GenScript）を用いて5時間のインビトロでの再刺激を行った後、製造元の指示（BD）にしたがって、BDサイトフィックス／サイトパームキットを用いて、IFNγおよびTNFαの細胞内染色を行った。phosho-STAT5検出では、刺激の前に脾細胞を37℃で1〜2時間、休ませた。細胞を10 ng/mlの組換えマウスIL-7またはIL-15（Peprotech）で30分間刺激した。次に、細胞を37℃で15分間、パラホルムアルデヒドで固定し、1回洗浄し、直ちにPhospho Perm Buffer III（BD）に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、製造元の指示に従って染色した。細胞をLSR IIフローサイトメーター（BD）で収集し、FlowJoソフトウェア（Tree Star）を用いてデータを分析した。ソーティングはFACS Aria（BD）で行い、ソートのクオリティーを決定するために、ソート後の純度を得た。
【０１８４】
マイクロアレイおよびRNA-seqによる遺伝子発現
マイクロアレイによる転写プロファイリングのために、最終的な処置の1〜2日後の脾臓からのCD8 T細胞（上記のように合計5回の処置を受けた後）を、磁気ビーズ（CD8陰性選択キット、Stem Cell Technologies）を用いて富化し、DbGP276+ CD8 T細胞をFACSAria（BD）でソートした。実験ごとにグループごとにプールした10〜12匹のマウスで、各処置グループに対して4つの独立した実験を行った。RNAは、製造元の指示に従ってTRIzol（Life Technologies）で単離した。RNAをプロセッシングし、増幅し、ラベルを付け、University of Pennsylvania Microarray FacilityのAffymetrix GeneChip MoGene 2.0 STマイクロアレイにハイブリダイズさせた。マイクロアレイデータは、以前に記載されるように処理および分析した（Doering et al. Immunity 2012, 37：1130-1144）。Gene Patternのヒートマップモジュールを、異なって発現された遺伝子を同定して表示するために用いた。遺伝子セット富化分析およびリーディングエッジのメタ遺伝子分析は、記載されるように行った（Godec et al. Immunity 2016, 44：194-206）。抗PD-L1のためのメタジーンを、抗PD-L1を対照TEXと比較するマイクロアレイデータセットを用いて同定した。TEFF（LCMV Arm感染後8日目）、TMEM（LCMV Arm感染後30日目）、およびTEX（LCMVクローン13感染後30日目）細胞のメタジーンは、以前に公開された転写プロファイルを用いてナイーブT細胞と比較することによって生成した（Doering et al. Immunity 2012, 37：1130-1144）。メタ遺伝子の組成と比較の詳細は、Pauken et al. Table S4 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)に見出される。図２Ｃに示すエフェクター遺伝子リストを作成するために、我々は、（Doering et al. Immunity 2012, 37：1130-1144）におけるナイーブと比較した6日後Armで上方制御されたトップ300の遺伝子で開始した。次に、6つの主要な細胞周期ターム（細胞周期、有糸分裂、紡錘体、DNA複製、有糸分裂細胞周期、および細胞周期）でGOメンバーシップを有する遺伝子が削除した。このリストは、Pauken et al. Table S3 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)に示される。
【０１８５】
RNA-seqによる転写プロファイリングのため、脾臓からのCD8 T細胞を磁気ビーズ（CD8ネガティブセレクションキット、Stem Cell Technologies）を用いて富化し、P14細胞をFACSAria（BD）でソートした。P14細胞を、最終処理の1日後（上記のように5用量の抗PD-L1または対照を使用；対照について3つの独立した実験（それぞれ5〜7マウスをプール）、抗PD-L1について4つの独立した実験（それぞれプールされた5〜6匹のマウス））、または最終処理後の長期（2つの独立した実験、18（プールされた対照処理マウス5匹および抗PD-L1処理マウス7匹）および29週間（プールされた対照処理マウス13匹および抗PD-L1処理マウス12匹））でソートした。ナイーブCD8+ T細胞を、2つの独立した実験からの2〜3匹の非感染C57BL/6マウスからのプールされた脾臓からソートした。細胞を溶解し、1％の2-メルカプトエタノール（Sigma）を含む緩衝液RLT plus（RNeasy Plus Lysis Buffer、Qiagen）中で凍結した。ソートされた細胞からのトータルのRNAは、Applied Biosystems Arcturus PicoPure RNA単離キットを用いて抽出した。Clontech SMRT-seq v4法を用いて二本鎖cDNAを生成し、マイクロチューブ中にCovaris S220を用いて断片化した。インデックス付きのイルミナ互換（Indexed Illumina-compatible）シーケンシングライブラリーを、NEBNext Ultra II法を用いて断片化されたcDNAから生成した。ライブラリーは、Illumina用のKapa Library QCキットを用いて定量化し、プールし、Illumina NextSeq 500で75サイクル（シングルエンド）シーケンスした。配列決定されたライブラリーをSTARを用いてmm10リファレンスゲノムにアラインし、RefSeq遺伝子からの遺伝子発現をCufflinksを用いて定量化し、FPKM値として報告した。
【０１８６】
ATAC-seqによるエピジェネティックプロファイリング
CD8 T細胞は、磁気ビーズ（CD8ネガティブ選択キット、Stem Cell Technologies）を用いて富化し、P14 CD8 T細胞（8日 pi Arm（プールした実験あたり5の脾臓）、33日 pi Arm（プールした実験あたり12〜13の脾臓）、35日 piクローン13（コントロール処理プールの実験で15の脾臓、抗PD-L1処理プールの実験で7匹のマウス））またはナイーブCD8 T細胞（プールした2〜3の脾臓から）をFACSAria（BD）でソーターした。対照および抗PD-L1処理TEX細胞を、上記のように、最終処理（合計5処理、3日ごと）の1日後にソートした。条件ごとに2つの独立した実験を行った。ATAC-seqは、記載されるように行った（Buenrostro et al. Nat. Methods 2013, 10:1213-1218）。簡単に言えば、核を、10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、および0.1％IGEPAL CA-630の溶液を用いて、複製ごとに50,000〜150,000のソートされた細胞から単離した。核単離の直後に、転移反応を、Tn5トランスポザーゼおよびTDバッファー（Illumina）を用いて37℃で45分間、行った。転移されたDNA断片は、Qiagen MinElute Kitを用いて精製し、デュアルインデックスでバーコード化し（Illumina Nextera）、そしてNEBNext High Fidelity 2x PCRマスターミックス（New England Labs）を用いてPCR増幅した。シーケンシングライブラリのサイズ分布およびモル濃度は、Agilent BioanalyzerおよびKAPA定量RT-PCR（KAPA Biosystems）を用いることにより決定した。シーケンシングは、NextSeq 500（Illumina）でV2 chemistryを備えた高出力150サイクルキットを用いて行った。ペアエンドリードは、Bowtie2を用いてmm10リファレンスゲノムにマッピングした。一致してマッピングされたペアのみを、さらなる分析のために保持した。MACS v1.4を用いてピークコーリングを行い、シーケンスタグ富化の領域を同定した。BedToolsを用いて、同定されたピーク間の共通の交差点を見出し（1bp最小オーバーラップ）、マージされたピークリストを作成した。ATAC-seqタグ濃縮、マージされたピークリスト全体のDNAモチーフ分析、およびGOターム評価を、HOMER（homer.salk.edu）を用いて計算した。主成分分析、スペクトル共クラスタリング、および階層的クラスタリングを、scipy、matplotlab、およびscikit-learnを用いて行った。REVIGOは、異なる細胞型にまたがるユニークなGOタームを同定するために用いた。ピークのリストをいくつかのダウンストリーム分析用にフィルタリングして、全部で5つの細胞型にわたって富化が低いピークを削除した（第3四分位）。
【０１８７】
転写因子フットプリントおよびネットワーク分析
TEXのユニークなエピジェネティックな景観に基づく統合された転写ネットワークを構築するために（図１９Ｄ）、ウェリントンブートストラップ（Piper et al. BMC Genomics 2015, 16：1000）を最初に用いて、5つの細胞型（TN、TEFF、TMEM、TEX、抗PD-L1処理TEX）のすべての順序付けられたペアについて20セットの差分フットプリントを計算することにより精査された他の細胞型と比較したすべてのOCRにおける対照または抗PD-L1処理TEX のいずれかにおいて富化された転写因子（TF）結合モチーフを同定した。差分フットプリントにおけるモチーフ頻度を分析するために、HOMERからのannotatePeaks.plスクリプトを用いてこれらのフットプリント座標内でモチーフ検索を行い（Heinz et al. Mol. Cell 2010、38：576-589）、Piper et al. に記載されるように相対モチーフ頻度を計算した（BMC Genomics 2015, 16：1000）。マトリックスを生成し、GenePatternのClassNeighborsモジュール（Reich et al. Nat. Genet. 2006, 38：500-501）を用いてモチーフスコアをヒートマップ（図１９Ｂ）として表示して、細胞型特異的TFを示した。
【０１８８】
有意に富化されたTF結合モチーフは、下流ネットワークに含まれることが後に確認された。RNA-seqにおいて転写的に検出できなかったTFおよび／またはTFフットプリント分析でのコンセンサス配列への結合の証拠が最小限であったTFは除外した。TFフットプリント検証では、異なるTFモチーフの周りの200 bpウィンドウ内のTn5カットの平均プロファイルを推定し、Wellington dnase_average_footprinting.py（Piper et al. Nucleic Acids Res. 2013, 41, e201）を用いてプロットした。次に、これらの検証済みのTF、およびマイクロアレイデータセットからの抗PD-L1処理後のTEX細胞において特異的に発現された遺伝子でネットワークを構築した。LFC≧0.3を有する遺伝子が含まれた。TFとターゲット遺伝子を接続するラインは、その領域でそのTFのコンセンサス結合モチーフを有する遺伝子に基づいた。TFおよび標的遺伝子の完全なリストは、Pauken et al. Table S11 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)で利用可能である。
【０１８９】
エピジェネティックな景観および転写の変化を関連付けるこの統合ネットワーク分析において同定されたTFを検証するために、抗PD-L1処理後にマイクロアレイから示差的に発現された遺伝子を用いて第２のネットワークを構築し（LFC≧0.3アップまたはダウン、p <0.05）、PSCANを用いてて、これらの遺伝子のプロモーター領域においてコンセンサス結合モチーフを含むと予測されるTFを同定した（Pauken et al. Table S12を参照（Pauken et al. Science 2016, 354（6316）：1160-1165））。示差的に発現された遺伝子について各TFについての富化をヒートマップとしてプロットした（図２２）。抗PD-L1がTEXにおいてエフェクター様回路の再関与を引き起こすという予測をテストするために、統合ネットワーク分析で同定されたTFにおけるコンセンサス結合モチーフを含むTEFFまたはTEX細胞におけるすべてのOCRの近くの遺伝子を決定し（図１９Ｄ）、T-bet、Eomes、Prdm1（Blimp1）、およびRunx1-3を含む関心のある追加のTFを選択した。マイクロアレイに転写データがなかったOCRの近くの遺伝子は除外した。次に、TEFFとTEXまたはTEXのみの間のオーバーラップのリストにメンバーシップを含む抗PD-L1後に変化した遺伝子のパーセンテージを計算し、TEXのみと比較したオーバーラップのパーセント差をプロットした。
【０１９０】
統計分析
フローサイトメトリーおよびウイルス負荷データの統計は、GraphPad Prismソフトウェアを用いて分析した。2つの条件のみを比較した場合の2つの独立した条件間の比較では、対応のないスチューデントのt検定を用いて有意性が決定された。図面の凡例に示されるように、同じマウス由来の試料を2つの異なる時点で比較した場合、対応のあるスチューデントのt検定を用いた。２つを超えるグループを比較する場合、一元配置分散分析（One way ANOVA）テストを用いた。最初に、ダゴスティーノとピアソンの正規性検定（D’Agostino and Pearson normality test）を用いて正規性をテストした。すべてのグループが正規分布であると判断された場合は、パラメトリック一元配置分散分析を行い、ボンフェローニの多重比較テスト（Bonferroni’s multiple comparison test）を用いて、関心のあるグループのテスト後の分析を行った。すべてのグループが正規分布であると判断されなかった場合は、ノンパラメトリックANOVA（クラスカル−ウォリス検定（Kruskal-Wallis test)）を行い、ダンの複数のテスト比較（Dunn’s multiple test comparisons）を用いて、対象グループのテスト後の分析を行った。ANOVAのP値は各図のY軸の横に青色で示され、示されたペア間のポスト・テストのp値は黒色で示される。0.05未満の場合、P値は有意であると見なした。有意性を示すのに用いたアスタリスクは、p <0.05 *、p <0.01 **、p <0.001 ***に対応する。
【０１９１】
患者および検体収集
IV期の黒色腫の患者を、ペンの拡張アクセスプログラム（Expanded Access Program at Penn）(www.clinicaltrials.gov identifier NCT02083484) に基づいて、または、メモリアルスローンケタリングがんセンター（Memorial Sloan Kettering Cancer Center）(‘MSKCC’)のNCT01295827に基づいて、ペンブロリズマブ（pembrolizumab）での処置（３週ごとの注入により2 mg kg−1）について登録した。患者は、ペンシルベニア大学アブラムソンがんセンター（University of Pennsylvania Abramson Cancer Center’s）（「ペン」）の黒色腫研究プログラム組織採取プロトコルUPCC 08607に基づき、および、MSKCCのプロトコル00-144に基づいて、両機関のInstitutional Review Boardsに従って、採血について同意した。末梢血は、処置前、および各ペンブロ注入前に、3週間ごとに、12週間、ヘパリンナトリウムチューブで採取した。末梢血単核細胞（PBMC）は、フィコール勾配を用いて単離し、標準的なプロトコルを用いて保存した。
【０１９２】
応答および腫瘍負荷の評価
腫瘍負荷：総測定可能腫瘍負荷は、治療前画像レポートで報告されたすべての測定可能な病変の長軸の合計として定義した。測定不可能な病変または活動的な脳転移のみを有する患者は、臨床応答および腫瘍負荷に関する分析から除外した。臨床応答および腫瘍負荷の評価は、盲検的に独立して行った。
【０１９３】
臨床応答、ペンコホート：Pennコホートのための抗PD-1療法に対する臨床反応は、一次元測定を用いた免疫関連RECIST（irRECIST）に基づく最良の反応として決定した（Nishino et al. Clin. Cancer Res. 2013, 19：3936-3943）。さらに、次の変更を用いた。（1）PETスキャンでの標準取り込み値（SUV）が5を超え、短軸が10〜15 mmでのリンパ節病変を測定可能な病変として含めた。（2）生検によって黒色腫と確認された5 mmを超える病変を測定可能な病変として含めた。
【０１９４】
臨床応答、MSKCCコホート：MSKCCコホートのための臨床反応は、免疫関連応答基準（Wolchok et al. Clin. Cancer Res. 2009, 15：7412-7420）に基づいて、12週の時点での2次元測定を用いて評価した。
【０１９５】
フローサイトメトリー
ペンコホート：前処理からの凍結保存PBMC試料、サイクル1〜4（3〜12週）を解凍し、CD4 (Biolegend、OKT4)、CD8 (ebioscience、RPA-T8)、2B4 (Beckman Coulter、IM2658)、CD45RA (Biolegend、HI100)、TIM-3 (F38-2E2)、LAG-3 (Enzo、ALX-804-806B-C100)、CXCR5-BV421 (BD、RF8B2) および CD27 (BD、L128) を含む表面染色、ならびにFOXP3 (BD、259D/C7)、CTLA-4 (BD、BNI3)、Eomes (ebioscience、WD1928)、T-bet (Biolegend、4B10)、GzmB (Life Tech、GB11)、TCF-1-AlexaFluor647 (Biolegend、7F11A10) および Ki67 (BD、B56)のための細胞内染色、のための抗体のマスターミックスで染色した。透過処理は、FOXP3 Fixation / Permeabilization Concentrate and Diluent kit（eBioscience）を用いて行った。ペンブロ後の検体のPD-1は、抗ヒトIgG4 PE（Southern Biotec）を用いて検出した。前処理試料を、25μg ml-1ペンブロでインビトロで37℃で30分間、前処理し、2回洗浄して、標準的な抗体ミックスで染色した。細胞を1％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、BD Biosciences LSR IIサイトメーターで取得し、FlowJo（Tree Star）を用いて分析した。
【０１９６】
MSKCCコホート：ペンブロリズマブ処置前および後の示されている訪問時のPBMC試料を解凍し、固定可能なAqua生存率色素（Invitrogen）および次の表面マーカーに対する抗体のカクテルで染色した：CD8-Qdot605 (Invitrogen、3B5)、CD4-Qdot655 (Invitrogen、S3.5)、PD-1-PE (BD、MIH4)、LAG-3-FITC (Enzo、17B4)、ICOS-PE-Cy7 (eBioscience、ISA-3)、TIM-3-APC (R&D Systems、344823)。次に、細胞を固定し、FOXP3/Ki67 Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent (eBioscience)で透過処理した後、CD3-BV570 (Biolegend、UCHT1)、Ki67-AlexaFluor700 (BD)、FOXP3-eFluor450 (eBioscience)、および CTLA-4-PerCP-eFluor710 (eBioscience)で細胞内で染色した。染色された細胞をBD Biosciences LSRFortessaで取得し、FlowJoソフトウェア（FlowJo、LLC）を用いて分析した。
【０１９７】
細胞選別（ソーティング）
フローサイトメトリープロトコル（上記）のとおり、凍結保存したPBMC試料を解凍して染色した。RNAシーケンス実験では、ダンプ／デッドCD3+ CD8+ゲーティングストラテジーを用いて、全CD8 T細胞を分類した。TCRシーケンス実験では、CD8 T細胞は上記のようにゲーティングし、CD38+ HLA-DR+およびCD38+ HLA-DR+でない細胞（すなわち、CD38-HLA-DR-、CD38+ HLA-DR-、およびCD38- HLA-DR+）をソートした。セルソーティングはBD Aria Sorterで行った。
【０１９８】
サイトカイン分析
Luminexテクノロジー（EMD Millipore）を用いて、循環血漿サイトカインの濃度を分析した。
【０１９９】
PMAおよびイオノマイシンでの刺激
解凍した細胞を、0.25μg ml-1でホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）（Sigma）で、および2.5μg ml-1でイオノマイシン（Sigma）で、2〜5時間、37°Cで刺激し、染色した。サイトカイン産生は、IFNγ（Biolegend、B27）およびTNF-α（Biolegend、Mab11）に対する抗体を用いた細胞内染色で分析した。
【０２００】
分類および回帰のためのランダムフォレスト
ランダムフォレスト回帰および分類（RF-RC）は、多変数のノンパラメトリックアンサンブルパーティショニングツリー法であり、応答変数の予測因子としての遺伝子およびタンパク質間のすべての相互作用の効果をモデル化するために用いることができる31。各モデルは、ランダムに選択されたサンプルの約3分の2を用いて構築され、モデル構築プロセスから除外されたサンプル（「out-of-bag」サンプル）の3分の1で交差検証される。多くの反復の後、すべてのモデルの結果が平均化されて、予測値、エラーレート、および変数の重要度の測定値の不偏の推定が提供される。RF-RCモデルのパフォーマンスは、回帰の平均二乗誤差により、および分類の誤分類エラーレートにより、測定される。フローサイトメトリーのサブセットは、臨床反応変数の可能な予測因子として用いた。各予測因子について、変数のエラー率への寄与を測定する重要度スコアが決定される（スコアが高いほど予測性が高くなる）。‘randomForest’ R package version 4.6-12 implementationおよび次のパラメーター：5,000 trees, node size of 1, mtry value（すなわち、各ノードでの分割に利用できる変数の数）（モデル内の変数の数値の平方根に等しい）、ならびに重要度スコアを決定するためのブライマン・カトラー（Breiman-Cutler）順列法、を用いた。精度の平均低下は、重要度スコアの指標として用いる。
【０２０１】
T細胞受容体シーケンシング
必要に応じてメスならびにガイドとしてヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色したスライドを用いて、FFPEスライドで手動のマクロ切開を行った。組織の脱パラフィンおよびDNA抽出は、標準的な方法を用いて行った。DNAは、Qubit dsDNA BR Assay（Invitrogen）を用いて定量した。末梢血CD8 T細胞を精製し、BD Aria Sorterを用いてPBMCから単離した。DNA抽出、増幅、ライブラリー調製、シーケンシング、および予備的バイオインフォマティクス分析は、Adaptive Biotechnologiesによって行った。TCRB CDR3の増幅およびシーケンシングは、immunoSEQ Platform（Adaptive Biotechnologies）を用いて調査レベルの解像度で行った。
【０２０２】
PD-L1およびCD8の免疫組織化学、ならびに分析
ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍を外科的切除時または生検から採取した。抗PD-L1染色のため、熱誘導抗原修復（Bond ER2、20分）の後、腫瘍スライドを1:50希釈の抗PD-L1抗体（E1L3N、Cell Signaling）で染色した。特異性を確認するために、抗PD-L1抗体はホジキンリンパ腫細胞および胎盤を染色することによって検証した。抗CD8染色のために、熱誘導抗原回復（Bond ER1、20分）の後、腫瘍スライドを1:40希釈の抗CD8抗体（M7103、Dako）で染色した。腫瘍浸潤CD8陽性T細胞は、盲検の専門家黒色腫病理学者によって、非存在、最小、軽度、中程度、および活発であるとスコアリングされた。腫瘍浸潤CD8 T細胞は、ImageJ2を用いる画像認識分析によっても分析した。デジタルスライドはライカ顕微鏡により取得した。CD8染色のRGBスタック画像をグレースケールに変換し、粒子（陽性染色）を100のしきい値を用いて10〜625μm2のサイズでカウントした。腫瘍の総面積は、腫瘍マスクを用いて計算した。
【０２０３】
RNAシーケンシングおよび分析
ソーティング後、細胞を再懸濁し、RLTバッファー（Qiagen）で凍結した。RNAは、製造元のプロトコルに従って、Qiagen RNeasyマイクロキット（74034）を用いて単離した。RNA-seqライブラリーは、製造元のプロトコル（635007）に従って、ClonetechからSMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit for Pico Input Mammalianを用いて調製した。ライブラリーは、900万〜2060万のペアのマップされた読み取りの読み取り深度で、300サイクルの高出力フローセル（15057929）を用いてIllumina NextSeqマシン上でシーケンシングした。Fastqファイルは、STAR 2.5.2aおよびhg19を用いて調整した。アラインされたファイルは、PORT遺伝子ベースの正規化（www.github.com/itmat/Normalization）を用いて処理した。差次的遺伝子発現はLimmaを用いて行った。Limma-voomを用いて、P値<0.05を用いてグループ間で有意に異なる転写物を同定した。サイクル1にKi67ピークがある患者（3人の患者）について、MKI67と高い相関がある上位40の遺伝子で、MKI67相関遺伝子と相関する上位5遺伝子を含む相関ネットワークを作成した。最終的なネットワークには、MKI67と相関の高い（相関係数の絶対値> 0.7（abs（corr）> 0.7））値を持つノードがあった。Cytoscape 3.4.0は相関ネットワークの作成のために用い、metascape.orgはGO生物学的プロセスのための遺伝子を富化するために用いた。この出版物において議論されるデータはNCBI Gene Expression Omnibusに寄託されており、その全体が引用により本明細書に組み込まれる、GEOシリーズアクセッション番号GSE96578（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/ acc.cgi?acc=GSE96578）を介してアクセスできる。
【０２０４】
全エキソームシーケンシング、変異負荷分析、およびネオエピトープ予測
必要に応じてメスおよびガイドとしてH＆E染色されたスライドを用いて、FFPEスライドで手動のマクロ解剖を行った。組織の脱パラフィンおよびDNA抽出は、標準的な方法を用いて行った。DNAは、Qubit dsDNA BR Assay（Invitrogen）を用いて定量した。DNAライブラリーは、NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England BioLabs)を用いて作成し、標的はSureSelect Human All Exon V6+ COSMIC（Agilent）でキャプチャした。OptiTypeおよびネオエピトープ（neoepitope）予測を伴うHLAは、Ccons 1.1 Serverを用いて作成した。
【０２０５】
統計的手法ならびに分類および回帰ツリー（CART）分析
グループ比較および相関分析のために、PRISM 6.0を用いてテストを行った。D'Agostino-Pearson omnibus正規性検定を用いて分布の正規性を評価し、F検定を用いてデータのグループ間の分散を評価した。正規分布データについて、平均差の有意性は、両側の（two-sided）対応のある、または対応のないスチューデントのt検定を用いて決定し、分散が異なるグループについては、ウェルチの修正（Welch’s correction）を伴う対応のないt検定を用いた。非正規データについて、非パラメトリックマンホイットニーU検定（Mann-Whitney U-tests）またはウィルコクソン一致対符号付き順位検定（Wilcoxon matched-pairs signed rank tests）を、非対分析と対分析とにそれぞれ用いた。記述統計には、連続変数についての平均、中央値、標準偏差、および範囲、ならびに、カテゴリー変数についての頻度および比率が含まれる。連続変数間の相関関係はピアソンのr係数によって決定し、順序スケーリングされたカテゴリー変数間の相関関係はスピアマンのr係数（Spearman’s r coefficient）によって決定した。全生存期間は、処置の開始から死亡の日または患者との最後の接触までの生存期間として規定し、カプラン・マイヤー法によって推定した。ランドマークの全生存およびPFS分析は、治療後6週間からの全生存およびPFSとして規定した。Ki67（最大6週目）、ベースラインの腫瘍負荷および臨床結果の関係を視覚的に検査するために、ベースラインの腫瘍負荷によってKi67の簡単な散布図を作成し、全生存、PFS、臨床応答などの臨床結果に色分けされた記号を採用した。一般に、平均は臨床結果の二分法（dichotomization）のために用いた。これには、PennデータセットにおけるPFSおよびランドマークPFS（図２７、図３３）、ならびにMSKCCデータセットについてランドマークの全生存率（図３２Ｇ）が含まれる。Pennデータセットでは、ランドマークの全生存期間は、9.5か月のカットオフを用いて二分した。これは、最長の完全生存期間を表しているためである（すなわち、LOSが9.5か月未満の患者は生存しておらず、生存が検閲されない）（図３２Ｄ、図３３）。対数順位検定（log rank test）を用いて、患者のサブグループ間の全生存を比較した。腫瘍負荷に対するKi67の比率は全生存率と関連しており、CART分析によってさらに調査した。CARTは、この連続変数を全生存期間に従って2つの均一なサブグループに分割するための最適なカットポイントを同定した。この方法により、すべての可能なカットポイントから最適なカットポイントが選択される。生存およびCART統計分析は、IBM SPSS v23またはSTATA v14のいずれかを用いて行った。ランドマークPFSについて同様の分析を行った。
【０２０６】
モデル選択、主成分分析、およびフィッシャーの正確な計算
モデル選択は、一連の候補モデルの中からモデルを選択する方法である。Rパッケージ「leaps」バージョン2.9、パラメーター「nvmax = 3」、および「nbest = 10」を用いて、CD8およびKi67発現を予測するための線形回帰に基づいて10の最良のモデルを選択した。
【０２０７】
臨床パラメーターを予測変数として用い、Ki67を従属変数として用いた。この方法は、1変数、2変数、および3変数のすべてのモデルを評価し、変数の数によってペナルティが課されたベイズ情報量基準（Bayesian information criterion ：BIC）を用いて最適なモデルをランク付けする。BICスコアが低いほど、より良いモデルを示す。
【０２０８】
主成分分析は、3つの変数を視覚化するために用いた：腫瘍負荷、Ki67、および2次元空間での変異負荷。RパッケージfactoMinerは、主成分および各PCA変数に含まれる変数によって説明される分散のパーセンテージを計算および抽出するために用いた。
【０２０９】
フィッシャーの直接確率検定（Fisher’s exact test）を用いて、すべてのユニークなシーケンスされた末梢血クローン間で共有されたTCR CDR3クロノタイプ（上位10の腫瘍浸潤T細胞クローンと末梢血の間、図３０Ａ）が見つかる確率が、107の可能な末梢血クロノタイプの理論的な推定値で、偶然による腫瘍におけるクローンの発見の確率と異なるという仮説をテストした。P値は、R関数「fisher.test（）」を用いて計算した。
【０２１０】
TET2cKO細胞の養子移入：
マウス。
B6; 129S-Tet2tm1.1Iaai/J（TET2fl/fl）マウス、C57BL/6J、B6.SJL-Ptprca（CD45.1+）およびCD4Cre+マウスは、Jackson Laboratoriesから入手し、University of Pennsylvaniaで繁殖させた。TET2fl/fl CD4Cre+（TET2cKO）は、C57BL/6Jマウス10世代に、次にP14マウスに交配させまた。
【０２１１】
養子移入。
TET2cKOまたは野生型P14マウスの末梢血からの同数（500）のP14 CD8+ T細胞を、コンジェニック（CD45.1+）ホストに養子移入した。翌日、宿主に4x106 PFU LCMVクローン13を静脈内で感染させた。脾臓および肝臓を感染後16または29日にマウスから採取した。単一細胞懸濁液を作製し、Percoll（TM）（GE Healthcare）勾配での密度遠心分離を用いて、肝リンパ球をさらに単離した。
【０２１２】
フローサイトメトリーおよび分析。
細胞を単離し、洗浄し、示された抗体で染色した。抗体は、Biolegend、InvitorgenまたはeBiosciencesから購入し、CD8α-BV650 またはAlexaFluor e780; CD62L PE-TexasRed、KLRG1 PE-Cy7 または FITC、CD127 PE-Cy7、PD-1 PE-Cy7、2B4 FITC、CD45.1 AF700、CD44 BV785、Ly6C BV711、Granzyme B BV421、ヒトKi67-BV711、Eomes AF647、TCF-1 FITC、TbetBV605を含む。LCMVのH2-Db制限gp33-41に特異的なバイオチノライト化（Biotinolyted）モノマーは、NIH Tetramer Core Facility から入手し、公開されているプロトコルを用いてテトラマー化した。製造元の指示に従い、FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer kit (eBiosciences)いずれかを用いて細胞内染色を行った。生細胞集団の識別は、製造元の指示に従って、Live/Dead Aqua染色（Invitrogen）を用いて行った。フローサイトメトリーは、BD LSRIIで実行し、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。Prismソフトウェアを用いてデータをグラフ化した。
【０２１３】
インビトロのエフェクターT細胞分化
ナイーブマウスCD8 T細胞を単離するために、5〜6週齢のC57/Bl6雌マウスから脾臓を採取し、シリンジで70umフィルターで分離しました。細胞をPBSで3回洗浄とともにフィルターを通して洗浄し、1億個の細胞あたり1mlの磁気分離バッファー（MSB、10％FCSおよび4mM EDTAを含むPBS）に再懸濁した。MSB 1 mlあたり50 ulの正常ラット血清を添加して、非特異的な抗体相互作用をブロックした。続いて、次のビオチン化抗体を1：200希釈で加えた：抗CD4、抗NK1.1、抗CD19、抗B220、抗CD11c、抗CD11a、抗CD11b、および抗Ter119。MSB 1mlあたりストレプトアビジン磁気ビーズ125ulを添加する前に、抗体−細胞混合物を室温で15分間インキュベートした。混合物を室温でさらに15分間インキュベートし、その後、MSBで総容量を3 mlにした。次にサンプルを穏やかに混合し、磁気分離器（StemCell）に室温で10分間置いた。非結合画分を15mlのコニカルチューブにデカントした。サンプルを10mlのPBSで2回洗浄し、次のステップまで氷上に置いた。
【０２１４】
インビトロで分化したエフェクター細胞を生成するために、上記のステップからの精製されたナイーブCD8 T細胞をカウントし、10％FCS、50uMβ-メルカプトエタノール、20mM HEPES、非必須アミノ酸（1：100、Invitrogen）、ピルビン酸ナトリウム（1：100、Invitrogen）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充した1mlのRPMI培地あたり1x10^6細胞で再懸濁した。3mlの細胞混合物を12ウェルクラスターディッシュのウェルに入れた。細胞は、抗マウスCD3e（1：1000、BioLegend）、抗マウスCD28（1：2000、BioLegend）、および100U/ml組換えヒトIL-2（rhIL-2、Peprotech）で24時間、活性化した。次に、細胞を各ウェルから収集し、カウントし、温かいPBSで1回洗浄した。活性化されたCD8 T細胞をエフェクター細胞に分化させるために、それらを、補充したRPMI 1mlあたり1x10^6で再懸濁し、rhIL-2を100U/mlとし、6ウェルクラスターディッシュのウェルあたり3mlの細胞をプレーティングした。これを、活性化後合計6日になるまで、さらに4日、繰り返した。
【０２１５】
マイクロアレイによる遺伝子発現およびRNA-Seq 
マイクロアレイによる転写プロファイリングのために、TRIzol（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いて、ソートされたCD8+ T細胞からトータルRNAを単離した。RNAは、University of Pennsylvania Microarray facilityによって、処理され、増幅され、ラベルが付けられ、Affymetrix GeneChip MoGene 1.0 stマイクロアレイ（(Santa Clara, CA）にハイブリダイズさせた。Affymetrix Power Toolsを用いて処理し、変位値をRobust Multichip Averagingを用いて蛍光ハイブリダイゼーション信号を標準化した。
【０２１６】
RNA-seqによる転写プロファイリングのために、CD8 T細胞をFACSAria（BD）でソートした。細胞を溶解し、1％ 2-メルカプトエタノール（Sigma）を含むバッファーRLT plus（RNeasy Plus Lysis Buffer、Qiagen）中で凍結した。ソートされた細胞からのトータルRNAは、Applied Biosystems Arcturus PicoPure RNA分離キットを用いて抽出した。Clontech SMRT-seq v4法を用いて二本鎖cDNAを生成し、マイクロチューブでCovaris S220を用いて断片化した。インデックス付きのイルミナ互換シーケンシングライブラリは、NEBNext Ultra II方法論を用いて断片化されたcDNAから生成した。ライブラリーは、Kapa Library QC kit for Illuminaを用いて定量化し、プールし、Illumina NextSeq 500で75サイクル（ペアエンド）シーケンシングした。シーケンスされたライブラリーをSTARを用いてmm10参照ゲノムにアラインし、RefSeq遺伝子からの遺伝子発現をCufflinksを用いて定量化し、FPKM値として報告した。
【０２１７】
ATAC-Seqによるエピジェネティックプロファイリング
ATAC-seqは前述のように実行した。簡単に言えば、核を、10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、および0.1％IGEPAL CA-630の溶液を用いて、複製ごとに50,000〜150,000のソートされた細胞から単離した。核単離の直後に、転位反応をTn5トランスポザーゼおよびTDバッファー（イルミナ）を用いて37°Cで45分、行った。転位したDNA断片を、Qiagen MinElute Kitを用いて精製し、デュアルインデックス（Illumina Nextera）でバーコード化し、NEBNext High Fidelity 2x PCRマスターミックス（New England Labs）を用いてPCR増幅した。シーケンシングライブラリのサイズ分布およびモル濃度は、Agilent BioanalyzerおよびKAPA定量RT-PCR（KAPA Biosystems）を用いて決定した。シーケンシングは、NextSeq 500（Illumina）でV2ケミストリーを備えた高出力150サイクルキットを用いて行った。ペアエンドリードは、Bowtie2を用いてmm10リファレンスゲノムにマッピングした。一致してマッピングされたペアのみを、さらなる分析のために保持した。MACS v1.4を用いてピークコーリングを行い、シーケンスタグ富化の領域を同定した。BedToolsを用いて、同定されたピーク間の共通する交差点（最小オーバーラップ1bp）を見つけ、マージされたピークリストを作成した。ATAC-seqタグ富化、マージされたピークリスト全体のDNAモチーフ分析、およびGOターム評価は、HOMER（homer.salk.edu）を用いて計算した。主成分分析、スペクトル共クラスタリング、および階層的クラスタリングは、scipy、matplotlab、およびscikit-learnを用いて行った。REVIGOは、さまざまな細胞型にまたがるユニークなGOタームを同定するために用いた。8つのピークのリストをいくつかのダウンストリーム分析用にフィルタリングして、全部で5つの細胞型で富化が低いピークを除去した（第3四分位）。
【０２１８】
サンプル調製および質量分析
サンプル調製
EL4胸腺腫細胞（ATCC）を、10％胎児ウシ血清を含むDMEM培地（Invitrogen）で増殖させた。遠心分離後、細胞を収集し、温めたPBSで2回洗浄した。細胞を、10x106細胞あたり1 mlのバッファーA（10 mM TrisHCl pH7.5、1.5 mM MgCl2、10 mM KCl、25 mM NaF、1 mM Na3VO4、1 mM DTT、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）に再懸濁した。細胞をバッファーA中で氷上で3分間インキュベートし、遠心分離し、5 mlのバッファーA中のDounceホモジナイザーに移した。細胞を5ストロークのDounceホモジナイザーで均質化した。核を遠心分離によって収集し、10x106細胞あたり1 mlのバッファーAで洗浄し、10x106細胞あたり1 mlのバッファーB（50 mM Tris-Cl、pH 7.4、1.5 mM MgCl2、20％グリセロール、420 mM NaCl、25 mM NaF、1 mM Na3VO4、1 mM DTT、400ユニット/ml DNase I、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）に再懸濁した。溶液をローテーター内で4度で30分間インキュベートし、10分ごとにボルテックスした。次に、サンプルを4度、3300RPMで5分間遠心分離した。核抽出物を含む上清をバッファーD（50 mM Tris-Cl、pH 7.4（RT）、1.5 mM MgCl2、25 mM NaF、1 mM Na3VO4、0.6％NP40、1 mM DTT、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）で1：3に希釈した。サンプルを再度遠心分離し、アリコート500ulを液体窒素で瞬間凍結した後、-80度で保存した。
【０２１９】
LC-MS/MS分析
サンプルの調製、同重体質量タグ（isobaric mass tags）での標識、ペプチド分画、および質量分析は、本質的に前述のように行った。1回の多重ランでの用量−応答阻害剤データの取得のため、6点データの取得が可能なためTMTTM（Thermo-Fisher Scientific）タグを用いた。イムノアフィニティ精製のため、最大4つのサンプルを比較し、経済性とカバレッジの理由からiTRAQTM試薬（Applied Biosystems）を用いた。
【０２２０】
ペプチドおよびタンパク質の同定および定量
MascotTM 2.0（Matrix Science）は、ペプチド前駆体に対して10 ppmマス・トレランス質量許容度、およびフラグメントイオンに対して0.8 Da（CID）トレランスを用いてタンパク質同定のために用いた。システイン残基のカルバミドメチル化およびリジン残基のiTRAQ/TMT修飾を固定修飾として設定し、S、T、Yリン酸化、メチオニン酸化、タンパク質のN末端アセチル化、およびペプチドN末端のiTRAQ/TMT修飾を可変修飾として設定した。検索データベースは、Matrix Scienceが提供するスクリプトを用いて作成されたこのデータベースのデコイバージョンを組み合わせた、カスタマイズされたバージョンのIPIタンパク質配列データベースからなる。特に明記しない限り、我々は次のようにタンパク質同定を許容した：i）単一スペクトル対シークエンスアサインメントについて、我々は、この割り当てが最適な一致、ならびに31の最小Mascotスコア、および次の最適な割り当てに対してこの割り当ての10x差になることを要求した。これらの基準に基づいて、デコイの検索結果は1％未満の偽発見率（false discovery rate: FDR）を示した。ii）複数スペクトル対シークエンスアサインメントについて、同じパラメーターを用いて、デコイ検索結果は、0.1％未満の偽発見率を示す。タンパク質の定量のために、ユニークなペプチドに一致する最小の2つの配列アサインメントが必要であった。定量化されたタンパク質のFDRは<< 0.1％であった。同定されたタンパク質にユニークなペプチドのみを相対的タンパク質定量化に用い、補足データセットではユニークなペプチドアサインメント（UPA）と呼ばれる。さらに、定量化のために、UPAに一致するスペクトルを次の基準に従ってフィルタリングした：Mascotイオンスコア> 15、前駆体イオンのシグナル対バックグラウンド比> 4、シグナル対干渉> 0.5。レポーターイオン強度にイオン蓄積時間を掛けて、質量分析計に存在するレポーターイオンの数に比例するエリア値を算出した。化合物の競合結合実験のため、ビヒクル対照と比較したレポーターイオンエリアに基づいて倍率変化が報告され、合計ベースのブートストラップアルゴリズムを用いて計算された。倍率変化は、記載されているように同位体の純度に対して補正され、シグナル対干渉測定によって推定されるほぼ等圧のピークの共溶出によって引き起こされる干渉について調整された5。タンパク質の絶対存在量apaは、問題のタンパク質について3つの最も豊富なペプチドのMS1存在量の平均をとることによって計算された6。ベイトタンパク質Bに対する免疫沈降実験で見出されたタンパク質Pの富化Eは、E = log（apa（P）/ apa（B））として計算された。化合物プロファイリングデータは、免疫沈降データを前述の信頼できるインタラクターのセットに制限するのに用いた。ヒートマップおよびt検定は、RパッケージおよびTableauを用いて行った。Cytoscapeソフトウェアは、相互作用ネットワーク視覚化のため用いた。
【０２２１】
データの利用性
調査結果をサポートするRNAシーケンシングデータはNCBI Gene Expression Omnibusに登録されており、GEOシリーズのアクセッション番号GSE96578（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE96578）を介してアクセスできる。フローサイトメトリー、TCRシーケンシング、および臨床データは、引用により全体として本明細書に組み込まれる、Huang et al. (Huang et al. Nature 2017, 4;545(7652):60-65, doi:10.1038/nature22079) およびそのExtended Data and Supplementary Informationに含まれる。
【０２２２】
次に、実験の結果を記載する。
【０２２３】
実施例１：抗PD-L1は、処置の停止後に持続しないTEX細胞におけるエフェクター様転写プログラムを誘導する。
PD-1経路遮断に関連する細胞性、転写性、およびエピジェネティックな変化は、慢性リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）感染のマウスモデルを用いて調べた（図１Ａ〜図１Ｃ）(Barber et al. Nature 2006, 439, 682-687; Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165 - Supplemental Information on Science online)。抗PD-L1処置の後、1080個の遺伝子が上方制御され、1686個の遺伝子が下方制御された(p<0.05, LFC≧0.2) (図２Ａ、図１D、および Pauken et al. Table S1 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。以前の研究は、PD-1経路遮断後の代謝経路における転写（Gubin et al. 2014, Nature. 515, 577-581）または細胞性（Bengsch et al. 2016, Immunity 45、358-373; Staron et al. 2014, Immunity 41、802-814）の変化を同定した。実際、いくつかの代謝遺伝子はPD-L1遮断後に変更した（Pauken et al. Table S1（Pauken et al. Science 2016, 354（6316）：1160-1165））。しかしながら、遺伝子セット富化分析（GSEA）は、細胞分裂経路におけるより顕著な変化を同定した（図２Ｂ、Pauken et al. Table S2 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)） (Barber et al. Nature 2006, 439, 682-687; Patsoukis et al. 2012, Sci. Signal. 5, ra46)。さらに、多くのエフェクター関連遺伝子は抗PD-L1グループに偏っていた（図２Ｃ〜２Ｄ、Pauken et al. Table S3 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)）。関心のある他の遺伝子には、Cxcl9、Il1r2およびIl7r（上）、ならびに、Klra9、Tnfrsf9、およびCd200r2（下）が含まれる（図１ＤおよびPauken et al. Table S1（Pauken et al. Science 2016, 354（6316）：1160-1165））。Leading Edge Metagene（LEM）分析（Godec 2016, Immunity. 44, 194-206）を用いて、対照TEXと比較して、抗PD-L1処理TEXにおいて2つのメタ遺伝子が同定された：1つは白血球の活性化に対応し、もう1つは細胞周期に対応する（図２Ｅ、図１Ｅ、および１Ｆ、およびPauken et al. Table S4 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)）。抗PD-L1処理TEXメタ遺伝子は、主に細胞周期経路によって駆動されるTEFFとの一部の重複を示したが、TMEMとの重複は最小限であった（図２ＥおよびPauken et al. Table S4（Pauken et al. Science 2016, 354（6316）：1160-1165））。このことは、TEX再活化時のメモリーポテンシャルの限られた獲得を示唆する。
【０２２４】
PD-1経路遮断はTEXにおいて機能を再活性化することができるが、再活化が持続する否かは不明である。ここでは、予想どおりTEXが強力に再活化され（図２Ｆおよび２Ｇ、ならびに図１Ａ、１Ｂ、および３）（Barber et al. Nature 2006, 439, 682-687）、拡張は遮断の開始後約3週間でピークに達した。しかしながら、処置後8〜11週までに、この再活化は失われ、抗PD-L1処置マウスにおけるLCMV特異的CD8 T細胞の量、増殖、エフェクター機能、および抑制性受容体発現は、対照処理マウスに匹敵した（図２Ｆ〜２Ｈ、および図３〜５）。さらに、抗PD-L1処置は処置直後のウイルス負荷を減少させたが、4か月後のウイルス負荷は対照処理マウスと同様であった（図２Ｉ）。最後に、遮断の停止後18〜29週で、対照および抗PD-L1処理グループの転写プロファイルは類似した（図２Ｊ、図６および７、ならびにPauken et al. Tables S5 およびS6 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)）。まとめると、これらのデータは、抗原が高いままである場合、PD-1経路遮断によって再活化されたTEXは「再疲弊」されることを示す。
【０２２５】
実施例２：ＰＤ−１経路遮断は、ＴＥＸにおける抗原非依存性持続およびＩＬ−７シグナル伝達を中程度に改善する。
PD-L1遮断の効果が持続しなかった1つの考えられる理由は、感染が持続したことである。感染が治癒した場合に抗PD-L1がTMEMへの分化を誘導し得るという考えをテストするために、同数の対照TEX、抗PD-L1処理TEX、またはTMEMを無抗原マウスに移入し、持続性を監視した（図８Ａ）。以前の研究と一致して（Shin, et al. J. Exp. Med. 2007, 204: 941-949; Wherry, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:16004-16009）、TEXは機能的なTMEMと比較して無抗原レシピエントにおいて低い生存であった（図９Ａ〜９Ｂ）。抗PD-L1で処理されたTEXは、TMEMに比べると不十分であったが、中程度に持続する傾向があった（図９Ａ〜９Ｂ）。次に、この傾向の潜在的なメカニズムを調査した。 PD-1経路遮断後、インターロイキン（IL）-7受容体転写物（Il7r; CD127）は有意に増加した（図１ＤおよびPauken et al. Table S1（Pauken et al. Science 2016, 354（6316）：1160-1165））。抗PD-L1後のTEXのサブセットでCD127タンパク質の適度な増加もあった（図９Ｃ〜９Ｅ）。IL-7で刺激すると、抗PD-L1で処理されたTEXは、対照で処理されたTEXと比較して、より多くのphospho-STAT5も示した（図９Ｆおよび図８Ｂ）。対照的に、IL-15受容体サブユニットCD122の発現およびインビトロでのIL-15に対する応答性は実質的に変化しなかった（図９Ｃおよび９Ｆ、および図８Ｂ）。これらのデータは、抗PD-L1処置がメモリーバイアスIL-7R経路の活性を増強し得ることを示唆する。
【０２２６】
エフェクター段階から始まるIL-7での処置は、疲弊の発達を防ぐことができる（Pellegrini、et al. Cell 2011, 144：601-613; Nanjappa, et al. Blood 2011, 117：5123-5132）。しかしながら、慢性感染の後期では、TEXはIL-7にほとんど反応しない（Shin, et al. J. Exp. Med. 2007, 204：941-949; Wherry, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101 ：16004-16009）。抗PD-L1はIL-7Rシグナル伝達を改善したため、併用処置に追加の利点があるか否かをテストした（図８Ｃ）。実際、反応の他の側面への影響は少ないものの、IL-7単独ではない、IL-7と抗PD-L1による処置は、より多くの抗原特異的CD8 T細胞をもたらし、IFNγとTNFαの同時生産を改善した（図９Ｇ〜９Ｈ、および図８Ｄ〜８Ｈ）。したがって、チェックポイント遮断を改善するために、IL-7Rを含むPD-L1遮断によってアップレギュレートされた経路を活用することが可能であり得る。
【０２２７】
実施例３：PD-1経路遮断は、メモリー様想起能力を回復せず、またはTEXのエピジェネティックな景観をTEFFまたはTMEM細胞に再プログラミングしない。
次に、PD-1経路の遮断がTMEMの定義的特性である再感染時の強力なリコールの可能性を復元できるか否かをテストした。等しい数のDbGP33+ CD8 TEX、抗PD-L1処理TEX、またはTMEMを無抗原マウスに移入し、休ませ、そしてGP33-41を発現するリステリア菌（Listeria monocytogenes）で再チャレンジした。TMEMは強力に拡大し、効率的にIFNγを産生した（図１０Ａ〜１０Ｄ）。対照的に、対照および抗PD-L1処理TEXは両方ともリステリアGP33チャレンジに対する応答が乏しく、再活化されたTEXはこれらの重要な特性において対照TEXと同様に不完全であった（図１０Ａ〜１０Ｄ）。
【０２２８】
抗原除去後、TEXおよび抗PD-L1処理TEXはPD-1のダウンレギュレーションに失敗し（図１０Ｅ）、Pdcd1遺伝子座のDNAメチル化およびPD-1の長期発現と一致した（Youngblood et al. Immunity 2011, 35:400-412; Utzschneider et al. Nat. Immunol. 2013, 14:603-610; Angelosanto et al. J. Virol. 2012, 86:8161-8170）。TEXはまた、全体的なジアセチル化ヒストンH3が低い（Zhang et al. Mol. Ther. 2014, 22：1698-1706）が、これが分化といかに関連するかは不明である。TEXのゲノム全体のエピジェネティックな景観がPD-1経路遮断後の永続的な改善の欠如に寄与し得るか否かをテストするために、グローバルクロマチンランドスケープマッピングをATAC-seqを用いて行った（Buenrostro, et al. Nat. Methods 2013, 10：1213 -1218）（図１１）。同定されたオープンクロマチン領域（OCR）の大部分は、予想どおり（Winter et al. J. Immunol. 2008,181：4832）、遺伝子間領域（33.3〜43.3％）またはイントロン（43.4〜48.5％）に存在した（図１２Ａ）。TEFF、TMEM、およびTEXは、TNと比較して実質的なクロマチンリモデリングを示し（図３Ｆならびに図１２Ｂおよび１２Ｃ）、20 kbのOCR内に転写開始部位（TSS）を持つ遺伝子は、より高度に発現される傾向があった（図１３）。特定の遺伝子のOCRは、TEFF、TMEM、TEXの異なるパターンを示した。たとえば、TEXには、TEFFおよびTMEMのIfng遺伝子座に存在するいくつかのOCRがなかった（図３Ｇ、青いボックス）。同様に、Pdcd1の場合、TEX特異的OCRは、「B」および「C」領域で（図３Ｇ、黒ボックス）（Staron et al. 2014, Immunity 41:802-814; Oestreich, et al. J. Immunol. 2008, 181:4832-4839; Kao et al. Nat. Immunol. 2011, 12:663-671）、以前は未同定のTSSからOCR約23 kbで（図３Ｇ、赤いボックス）同定された。グローバル階層クラスタリングおよび共クラスタ分析は、TEFFおよびTMEMがTEXよりも互いに類似していること、ならびに、TEXが明確なグローバルなエピジェネティックなランドスケープを有していることを示した（図３、Ｈ〜Ｊ、および図１４〜１６）。これらのデータは、TEXがCD8 T細胞の異なる系統を示し得ることを示唆する。
【０２２９】
Eomes、T-betおよびPD-1の発現に基づいて、TEXの2つのサブセットが規定されており（Paley et al. Science 2012, 338:1220-1225; Blackburn, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008, 105:15016-15021）、追加的な異質性が最近記載されている（He, et al. Nature 2016, 537:412-428; Im, et al. Nature 2016, 537:417-421; Utzschneider, et al. Immunity 2016, 45:415-427）。T-bethiEomeslo PD-1intサブセットはPD-1経路遮断によって再活化できるが、EomeshiPD-1hiサブセットはより末期的であり、PD-1の遮断に対する乏しく応答であった（Paley et al. Science 2012, 338:1220-1225; Blackburn, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008, 105:15016-15021）。ここで、TEXは約80％のEomeshiおよび約20％のT-bethiであり、この分布は抗PD-L1処理で最小限に変化した（図１７Ａ〜１７Ｃ）。TEXおよび抗PD-L1処理TEXの転写およびエピジェネティックプロファイルは、Eomeshiサブセットからの遺伝子について有意に富化された（図１７Ｄおよび１７Ｅ）（Doering, et al. Immunity 2012, 37：1130-1144）。しかしながら、抗PD-L1処理グループにおけるPD-1intTbethi TEXサブセットからの遺伝子の富化への傾向もあり（図１７Ｆおよび１７Ｇ）、おそらくTbethi細胞のEomeshi細胞への最近の変換または追加の不均一性を反映している。
【０２３０】
次に、PD-1経路遮断がTEXのエピジェネティックな景観を再プログラムする能力を調べた。階層的クラスタリング、共クラスタリング、および主成分分析は、対照と抗PD-L1処理TEXとの間にかなりの類似性を示した（図１０Ｈ〜１０Ｊ、および図１４）。TEXおよび抗PD-L1処理TEXの両方で優先的に見られるOCRは、Pdcd1、Il10、Ctla4、Cxcr5などの近くに位置し、PD-L1遮断後に実質的に変化しなかった状態特異的な調節を示唆する（図１６）。全体的にエピジェネティックな変化は穏やかであったが、共クラスター分析は、TEX（555ピーク）または抗PD-L1処理TEX（98ピーク）においてユニークに富化されたOCRの小さなサブセットを同定した（図１０Ｈ〜１０Ｉ、図１６;およびPauken et al. Table S7 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)）。これらの遺伝子のいくつかは、エピジェネティックおよび転写的に同じ傾向を示し（たとえば、CD200r；図１３Ｅ）、特定の生物学的経路は、変化したOCRの近くの遺伝子のセットにおいて富化された（図１８）。
【０２３１】
実施例４：PD-1経路遮断後の示差的転写因子結合は、TEXの再活化中に転写ネットワークの変化に寄与する。
TEXは、TEFFおよびTMEMと比較して約6000のユニークなOCR変化を示した（図１０Ｆ〜１０Ｉ）。したがって、PD-L1遮断によって誘導された約650のOCR変化は、比較すると控えめであった。これらの変化が特定の転写回路に影響を与えるか否かを判断するために、得られた（たとえば、NFκB、Jun：AP1、およびCTCF）または失われたピークにおいて富化された転写因子（TF）モチーフを同定した（たとえば、NFATc1、NFAT：AP1、Nur77、EomesおよびEgr2）（図１９Ａ）。再活性化が既存のTEXエピジェネティックランドスケープ内の再配線された転写制御に起因するか否かをテストするために、ウェリントンブートストラップ分析を実行して、TF結合活性を予測した（図１９ＢおよびPauken et al. Table S10 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)。TEXおよび抗PD-L1処理TEXは、TN、TEFFまたはTMEMよりも互いに類似していた。しかしながら、TEXまたは抗PD-L1処理TEXに偏ったTFモチーフが同定された（図１９ＢおよびPauken et al. Table S10 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)）。次に、結合の可能性が高い証拠でTFを同定するために、TFフットプリンティングを行った（図１９Ｃならびに図２０および２１）。次に、予測されたTF活性に基づいて、転写回路用のために統合ネットワークを構築した（図１９ＤおよびPauken et al. Table S11 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165）。このネットワークは、NFκB、IRF、およびbZip因子（AP-1ファミリー）の増加した活動、ならびに、PD-L1遮断時のNFAT、Egr2、およびNur77の減少した活動を同定した。この転写ネットワークの主な機能は、追加のTFファミリーが同定された2番目のネットワークアプローチを用いて要約された（たとえば、Runx、Nr2f6、Prdm1、Rarb、Pparg.Rxra、およびホメオボックスTF；図２２およびPauken et al. Table S12 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)）。これらの変更が特定のTFにどのように影響するかをさらに調査するため、NFATを調査した。AP-1を使用するNFATは、多くのエフェクターフェーズ遺伝子をトランス活性化する。対照的に、AP-1に結合できない「パートナーレス」のNFATは、TEX遺伝子のサブセットを誘導する（Martinez、et al. Immunity 2015, 42：265-278）。ここでは、抗PD-L1処置時に、再活化されたTEXにおいてパートナーレスNFATのターゲットの発現が有意に減少し（図１９Ｅ）、遮断後のこの転写回路の再配線を示唆する。
【０２３２】
これらのデータをまとめると、PD-1経路遮断はTEXをTMEMまたはTEFFに完全に再プログラムしなかったものの、これらの細胞はTEFF生物学の特定の特徴を（再）獲得し得ることを示唆した。1つの仮説は、PD-L1遮断時に、再配線された転写ネットワークにより、TEXがTEFFと重複するエピゲノムプログラムの特徴を優先的に再利用できるようになるというものである。このアイデアをテストするために、TFターゲット遺伝子を次のOCRを含むものに分離した：ａ）TEFFにユニークなもの；ｂ）TEXにユニークなもの；またはｃ）TEFFとTEXとの間で共有されるもの（図１９Ｆ）。次に、PD-L1遮断後の各カテゴリーにおいて発現された遺伝子の変化を調べた。T-betおよびEomesを含むいくつかのTFでは、標的遺伝子発現のパターンの再分布はなかった（図１９Ｆ）。しかしながら、NFκB、IRF1、IRF2、Nur77、およびBlimp-1（Prdm1によってコードされる）などのエフェクター生物学において重要な役割を有する上記で同定された多くのTFでは、PD-L1遮断時のTEXのみのグループと比較して、TEFFおよびTEXオーバーラップグループにおいて発現された標的遺伝子の数が増加した（図１９Ｆ）。さらに、共有されたTEFFおよびTEXエピジェネティックモジュールにおける遺伝子は、TEXのみのグループにおける遺伝子よりも実質的に大きな発現の変化を示した（図１９Ｆ）。これらのデータは、PD-1経路の遮断が再配線された転写活性を誘導し、TEXがTEXのエピジェネティックな景観に含まれるエフェクター遺伝子のモジュールをより効果的に再結合できるようにすることを示す。NFκBなどの変更された特定のTF回路は、PD-1およびTNFRファミリーの経路を同時標的化するための関係を有し得（Wherry et al. Nat. Rev. Immunol. 2015, 15:486-499; Sharma et al. Science 2015, 348:56-61; Ward-Kavanagh, et al. Immunity 2016, 44:1005-1019）、将来の治療法の設計に関連し得る。
【０２３３】
上記のデータは、重度のT細胞疲弊の状況で、特に腫瘍またはウイルス抗原が持続する場合、耐久性のある免疫記憶の再取得がチェレンジングであり得ることを示す。しかしながら、データは、PD-1経路遮断が、T細胞の品質またはエフェクター活性（たとえば、NFκB、IL-7R）をさらに増強する機会を明らかにし得ることも示す。新しいT細胞応答のプライミング（Sharma et al. Science 2015, 348：56-61）、疲弊の少ないサブセットの選択的拡大（Blackburn et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105：15016- 15021）、または複数の免疫調節経路もしくは恒常性経路（たとえば、IL-7、IL-2）の同時のターゲティング（Wherry et al. Nat. Rev. Immunol. 2015, 15：486-499; Sharma et al. Science 2015, 348： 56-61）などの追加的なストラテジーはまた、耐久性のある免疫性の獲得を増強し得る。これらの研究は、エピジェネティックなランドスケープマッピングをヒトTEXに拡張するための推進力、エピジェネティックな修飾因子と組み合わせたチェックポイント遮断の将来的評価、またはT細胞のためのエピゲノムエンジニアリングを提供する。したがって、TEXの統合された細胞の、転写的、およびエピジェネティックなプロファイリングは、PD-1経路遮断を介した再活化への機械的な洞察を明らかにするだけでなく、これらの効果の長期的な耐久性を改善する重要な機会も示す。
【０２３４】
実施例５：抗ＰＤ−１療法に応答するＣＤ８ Ｔ細胞は、疲弊表現型を示す。
健康なドナー対黒色腫患者を比較した。抗PD-1抗体ペンブロリズマブ（pembro）で処置されたステージIV黒色腫の29人の患者を、本明細書に記載される臨床試験に登録した。すべての患者は以前に抗CTLA-4療法を受けていた（図２３）。患者をpembroで処置し、治療前、および治療中は3週間ごとに合計12週間、血液を採取した。患者の62％は、公表されている試験と一致する、免疫RECIST（固形腫瘍における応答評価基準）基準に基づいて決定された客観的な臨床応答を有さなかった（Robert et al. N. Engl. J. Med. 2015, 372:2521-2532; Ribas et al. Lancet Oncol. 2015, 16:908-918）（図２４Ａ、図２３）。
【０２３５】
メラノーマ患者からの末梢血T細胞を、最初に、高次元フローサイトメトリーを用いて、年齢が一致した健康なドナーからのものと比較した。抑制性受容体（PD-1、CTLA-4、2B4、およびTIM-3）のCD4およびCD8 T細胞、メモリーT細胞サブセット、ならびにCD4およびCD8 T細胞共発現の頻度は類似していた（データは示さない）。しかしながら、黒色腫の患者は、より高頻度のCD4+ FOXP3+ T細胞、およびFOXP3+細胞によるKi67発現を有した（図２５Ａ）。メラノーマの患者からのCD8 T細胞（P <0.0001、図２５Ｂ）においても、主にPD-1+ CD8 T細胞サブセット（P <0.0001、図２５Ｃ）において、Ki67発現が増加し、このことは既存の免疫反応を示唆する。
【０２３６】
抗PD-1に対する薬力学的免疫応答が観察された。Ki67は、チェックポイント遮断時のマウスモデル（Blackburn et al. Nat. Immunol. 2009, 10：29-37）、ならびに、抗CTLA-4治療および放射線療法を受けているヒト（Twyman-Saint Victor et al. Nature 2015, 520：373-377）における細胞増殖およびT細胞再活化のマーカーである。したがって、Ki67発現の変化をより詳細に調べた。実際、Ki67+ CD8 T細胞の頻度は、pembro処置後3週で増加し、その後ほとんどの患者で減少した（図２４Ｂ）。応答するKi67+ CD8 T細胞集団は主にCD45RAloCD27hiであり、CTLA-4、2B4、およびPD-1の発現が高い細胞が含まれた（図２４Ｃ）（抗IgG4検出アプローチを使用（Brahmer et al. J. Clin. Oncol. 2010, 28：3167-3175；方法の項、ならびに図２６Ａを参照）。さらに、応答するKi67+細胞はEomeshiおよびT-betloであり（P <0.0001、図２４Ｃ）、TEX細胞の表現型と一致した（Blackburn et al. Nat. Immunol. 2009, 10：29-37; Paley, et al. Science 2012, 338：1220-1225）。対照的に、健康なドナーにおけるKi67+集団は主にEomeshiT-bethiおよびCD27loであり、エフェクターの表現型と一致した（図２６Ｂ、２６Ｃ）。CD8T細胞に加えて、Ki67は主に各集団のPD-1+サブセットにおいて、pembro処置後のFOXP3- CD4 T細胞およびFOXP3+ CD4 T細胞において増加した（図２５Ｄ）。FOXP3-およびFOXP3+ CD4 T細胞応答のいずれも臨床結果と相関しなかった（図２５Ｅ、２５Ｆ）。
【０２３７】
Ki67発現の増加は、PD-1+対PD-1- CD8 T細胞で最も顕著であった（P <0.0001；図２４Ｄ）。さらに、PD-1+サブセットにおけるこのKi67応答は、PD-1-サブセットと比較して、処置後3週間でピークに達した（P <0.0001、図２４Ｅ）。抗CTLA-4療法の最後の投与からの時間は、その後のpembro後のKi67レベルまたは処置応答と相関せず（図２７Ａ〜２７Ｃ）、このことは、この例で観察された免疫学的応答は主に抗PD-1療法によるものであることを示唆する。健康なドナーでは、PD-1+ CD8 T細胞によるKi67発現は3週間でほとんど変化せず、1.1倍±0.37の変化であった（図２６Ｄ）。対照的に、黒色腫の患者の大多数（27人中20人）は、処置後にPD-1+ CD8 T細胞におけるKi67の生物学的に意味のある増加を有した（図２４Ｆ、図２３）。この74％の免疫学的応答率にもかかわらず、臨床的応答を達成したのはわずか38％であり、pembroに対する免疫学的応答を示すすべての患者に臨床的利益があるわけではないことを示す。
【０２３８】
実施例６：疲弊表現型ＣＤ８ Ｔ細胞は、抗ＰＤ−１療法によって優先的に再活化される。
末梢血において再活化されたTEX細胞が検出された。次に、PD-1および他の抑制性受容体を共発現するCD8 T細胞がPD-1遮断の薬力学的効果を追跡する上でより高い精度を供するか否かを評価した。PD-1+ CTLA-4+ CD8 T細胞の循環集団は、主に、EomeshiT-betloおよびCD45RAloCD27hiであった（図２８Ａ）。さらに、PD-1+ CTLA-4+細胞の約50％が処理前にKi67を発現し、マウスにおけるTEX細胞に関するデータと一致し（Paley et al. Science 2012, 338：1220-1225）、これは処置後に約75％に増加した（図２８Ｂ、２８Ｃ）。PD-1+ CTLA-4- T細胞では、実質的により低いKi67発現があった（図２８Ｃ）。第３の抑制性受容体（たとえば、2B4）の追加、または最近の記載に焦点を当ててPD-1+ CXCR5+ TCF-1+サブセット（Im et al. Nature 2016, 537：417-421; He et al. Nature 2016, 537：412-416）は、抗PD-1療法に応答する細胞についてさらに富化された（図２８Ｃ、図２９）。  
【０２３９】
実施例７：応答性末梢血CD8 T細胞集団における腫瘍浸潤性T細胞クローンおよび血液Ki67+ CD8 T細胞応答は、腫瘍負荷と相関する。
血液からの応答性T細胞クローンが腫瘍において見つかった。ネオ抗原−および共有抗原−特異的T細胞の両方が、循環しているPD-1+ CD8 T細胞集団において同定されている（Gros et al. Nat. Med. 2016, 22：433-438）。さらに、血液中のこれらの細胞と腫瘍浸潤性T細胞との間にクローンの重複がある（Gros et al. Nat. Med. 2016, 22：433-438）。抗PD-1療法後のこれらの関係を調査するために、3人のレスポンダーと3人の非レスポンダーからの処置後のKi67発現のピークで、血液からのCD8 T細胞を分類し、T細胞受容体（TCR）レパートリーを、前処理腫瘍浸潤T細胞と比較した。上位10の腫瘍浸潤性T細胞クローンの多くは、臨床応答に関係なく、すべてのケースにおいて頻度による２つの最も豊富なクローンを含め、血液中および処置後に容易に同定可能であった（図３１Ａ、３１Ｂ、図３１Ａ、表２）。
【０２４０】
次に、これらの共有クローンが抗PD-1療法に応答する集団に存在するか否かを決定した。透過性を回避するため、Ki67ではなくHLA-DRおよびCD38（Miller et al. Immunity 2008, 28：710-722）の発現を用いて応答細胞をソートした。HLA-DR+ CD38+ CD8 T細胞の約80％（平均、80.1％）がKi67を発現し、これらのHLA-DR+ CD38+細胞はKi67+ CD8 T細胞と同様の反応速度で応答した（図３１Ｂ〜３１Ｄ）。RNA-seqは、Ki67の上位50の相関関係の中でHLA-DRB1およびCD38を同定し（表１）、これらのHLA-DR+ CD38+細胞はTEX細胞のマーカーについて富化された（図３１Ｅ、３１Ｆ）。6人の患者にわたって、腫瘍および血液の両方で上位10クローンの中に14のクローンが存在した（図３０Ｂ）。これらのすべて（14のうち14）は、血液中のHLA-DR+ CD38+であった（図３０Ｂ）。上位100のクローンに拡張すると、血液および腫瘍の間で共有されている19クローンのうち18クローンがHLA-DR+ CD38+であったが、腫瘍ではなく血液でのみ見られるクローンでは、活性化表現型と休止表現型の混合が見つかった（図３０Ｃ）。これらの観察結果は、血液中のKi67+（HLA-DR+ CD38+）TEX細胞が抗PD-1療法によって活化され、腫瘍にも存在するT細胞クローンを含むという概念を支持する。
【０２４１】
T細胞の再活化は腫瘍負荷と相関することが示された。抗原負荷は、前臨床モデルにおけるPD-1療法によるTEX細胞の疲弊および再活化の重症度の重要な決定要因である（Blackburn et al. Nat. Immunol. 2009, 10：29-37; Wherry et al. J. Virol. 2003, 77：4911-4927）。メラノーマの患者でこのアイデアをテストするために、処置前のイメージングスキャンですべての測定可能な腫瘍病変を用いて抗原負荷を推定する実用的なアプローチを開発した（腫瘍負荷、方法の項を参照）。実際、より高い腫瘍負荷は、治療前と治療後の両方で、より多くのKi67+ CD8 T細胞と関連していた（図３０Ｄ）。3週間での39の免疫パラメーターのランダムフォレストモデリングは、Ki67+ CD8 T細胞が腫瘍負荷の最も強い相関であることを示した（図３０Ｅ、表３）。この相関は処置前にも検出可能であったが、処置後には強くなり（図３０Ｆ）、このことは、抗PD-1療法によって増強された腫瘍負荷に関連する既存のCD8 T細胞応答を示唆する。
【０２４２】
実施例８：腫瘍負荷に関連するCD8 T細胞再活化の追跡は、抗PD-1療法に対する応答を予測する。
本明細書では、再活化／腫瘍比が臨床成績に影響を与えることが示される。より大きなベースライン免疫応答が臨床応答と相関する可能性があった。しかしながら、PD-1+ CD8 T細胞におけるより高い前処理Ki67レベルは、実際には予後不良の指標であった（図３２Ａ、上）。処置前のより大きな免疫応答は、それ自体が悪い予後指標である、より高い腫瘍負荷を反映し得る（図３２Ａ、下）。実際、抗PD-1療法で進行した患者は、ベースラインで全身性炎症の証拠があった（図３２Ｂ、３２Ｃ）。ランダムフォレスト分析では、Ki67単独は臨床結果と相関しないことを示した（データは示していない）。したがって、重要なのは再活化の絶対的な大きさではなく、腫瘍負荷に対するTEX細胞再活化の比率が臨床応答をよりよく予測し得るという仮説を立てた。これをテストするために、ベースラインの腫瘍負荷を調整した抗PD-1療法後のPD-1+ Ki67+ CD8 T細胞の倍率変化に関する臨床応答を調べた。無増悪生存期間（PFS）がより長い患者は、一般的に、腫瘍負荷が低く、PD-1+ Ki67+ CD8 T細胞対腫瘍負荷回帰線の倍率変化の上でクラスター化しており、このことは、腫瘍負荷に対するTEX細胞再活化の比率が臨床成績に関連し得ることを示唆する（図３３Ａ）。さらに、処置前後の両方の測定を必要とする倍率変化の代わりに、処置後のピークT細胞応答時点での腫瘍負荷に対するKi67+ CD8 T細胞のより高い比率は、より良い臨床成績と関連していた。レスポンダーはPD-1+ Ki67+細胞対腫瘍負担回帰線の上でクラスター化したが、非レスポンダーは大きく下回っていました（図３３Ｂ）。分類および回帰ツリー（CART）分析は、治療に入る6週間の早期に、臨床結果によって患者を分離する、1.94のKi67対腫瘍負荷比を同定した。6週間での1.94より大きいKi67対腫瘍負荷比は、客観的奏効率、PFS、および全生存率により良好な結果と関連していた（図３２Ｄ、図３３Ｃ）。
【０２４３】
他の変数は、多変量回帰モデリング（図３３Ｄ）によって検査され、BRAF阻害時の腫瘍浸潤リンパ球に関連し得るBRAF状態の追加の役割（Wilmott et al. Clin。Cancer Res. 2012、18：1386-1394; Knight et al. J. Clin. Invest. 2013, 123：1371-1381）および乳酸デヒドロゲナーゼ、腫瘍負荷のための潜在的な循環プロキシ（図３３Ｅ〜３３Ｇ）、およびステージIV黒色腫における既知の陰性予後指標（Balch et al. J. Clin. Oncol. 2009, 27：6199-6206）を示唆している。さらに、患者のサブセットからのデータは、公開された観察結果と一致する、腫瘍および変異負荷におけるPD-L1発現の役割も示唆している（Herbst et al. Nature 2014, 515：563-567; Tumeh et al. Nature 2014, 515 ：568-571; Rizvi et al. Science 2015, 348：124-128）。したがって、このモデリングを拡張して他の変数を含めることは、将来的に重要になるであろう。
【０２４４】
本明細書に示されるのは、進行性黒色腫の患者におけるPD-1遮断に対する応答の理解に関連するいくつかの発見である。第一に、ほとんどの患者はCD8 T細胞に対するPD-1遮断の的確な免疫学的効果を有しており、この効果は末梢血において検出し、長期的に監視し、そして機構的に検査することができる。第二に、TEX細胞は黒色腫のほとんどの患者においてPD-1遮断の主要な標的として同定され、循環TEX細胞の変化を腫瘍負荷に関連付けることによって再活化スコアを開発することができた。第三に、継続的な処置にもかかわらず、ほとんどの患者はPD-1遮断によって誘発される免疫の再活化の単一のピークを有する。第四に、血液中のこれらの応答するTEX細胞には、腫瘍浸潤性T細胞と共有されるTCRクロノタイプが含まれる。最後に、腫瘍負荷に対するTEX細胞再活化の比率は、臨床成績を区別し、応答を予測することができることが同定された。TEX細胞再活化と腫瘍負荷との間の関係は、抗原負荷に対する免疫応答のキャリブレーションを示唆し、腫瘍負荷が高い場合に抗PD-1療法による強力な再活化でさえ臨床的に効果がない可能性を高める。これらの観察に基づいて、予測された治療上の失敗のクラスを描くことが可能であり得る（図３４）。腫瘍負荷単独は、抗PD-1療法に対する応答の完全な予測因子ではなく、処置中の予測マーカーを規定することはチャレンジングである。処置中のバイオマーカーは、臨床反応をできるだけ早く規定する助けになる価値があるだけでなく、免疫学的不全のタイプを通知し、その後の治療を調整するのにも価値がある。転移の解剖学的位置、PD-L1発現および変異表現型などの他のパラメーターが、T細胞再活化と腫瘍負荷との間のこの関係にさらなる分解能を付加する可能性がある。腫瘍負荷に基づいて、特定の患者におけるPD-1遮断によって誘発される再活化の量が不十分であり得ることを認識すると、たとえば追加の免疫療法または標的療法による早期臨床介入が可能になる（Sharma et al. Cell 2015, 161：205-214; Smyth et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2016, 13：143-158）。ここで報告されたアプローチが他の、特に免疫原性の低い腫瘍タイプに拡張できるか否かをテストすることが重要であろう。しかしながら、現在の研究は、PD-1遮断のオンターゲット薬力学的免疫効果および血液ベースの免疫モニタリングの有用性を示すだけでなく、全体的な腫瘍負荷とPD-1遮断による免疫再活化の大きさとの間の関係を明らかにすることにより、潜在的な新規予測バイオマーカーおよび将来的な機構的な精査のフレームワークも同定する
【０２４５】
実施例９：TET2cKO細胞の養子移入
慢性ウイルス感染症におけるCD8+ T細胞におけるTET2損失の結果を評価するために、養子移入アプローチに目を向けた。同数の野生型またはTET2cKO P14 CD8+ T細胞をコンジェニック（CD45.1+）ホストに養子移入し、その後LCMVクローン13を感染させた（図３５Ａ）。感染後16日目にマウスを分析した。感染したマウスの脾臓からのCD8+ DbGP276テトラマー+ T細胞を同定し、この集団内のドナー細胞の頻度を決定した（図３５Ｂ）。この時点で宿主マウスの脾臓における野生型ドナー細胞と比較してTET2cKOドナー細胞の頻度が有意に高かった（図３５Ｃ）。これらの細胞の絶対数の差は、脾臓において高くなる傾向があった。野生型対TET2欠損細胞の拡大における絶対的な変化を決定するために他の臓器を評価することが重要であろう。これらのデータは、慢性感染中にTET2を欠如するT細胞のために増殖または生存の利点が存在し得ることを示唆する。前者を支持して、野生型ドナー細胞と比較してドナーTET2cKO P14細胞の有意に高いパーセンテージがKi67+であることを見出した（図３６Ａ〜３６Ｄ）。これらの集団の表現型分析は、野生型の対応物と比較して、TET2cKOドナー細胞の間のTCF-1+グランザイム-CD8+ DbGP276テトラマー+ T細胞の有意に増加した頻度を明らかにした（図３７Ａ〜３７Ｃ）。転写因子TCF-1はCD8+メモリー細胞において高度に発現し、慢性感染の設定でのその発現は、疲弊したT細胞集団を維持し、PD-1遮断後の拡大に応答する細胞をマークするようである（Utzschneider et al. （2016）Immunity 45：415-27; Im et al. （2016）Nature 573：417-431）。興味深いことに、これらの細胞は高レベルのLy6Cも発現し、これはメモリー細胞で発現され、TEX細胞でダウンレギュレートされることが示されている（図３８Ａ〜３８Ｄ）（Wherry et al. （2007）Immunity 27：670-684）。これらのデータは、慢性感染時のCD8+ T細胞におけるTET2の喪失が、免疫チェックポイント遮断の設定に有利であり得る、よりメモリー様のプールの分化に有利であり得ることを示唆す。
【０２４６】
実施例１０：T細胞疲弊の確立および維持ならびにそれに関連する因子
エピジェネティックな機能を持つ遺伝子がT細胞の疲弊に重要な役割を果たし得るか否かを判断するために、6、8、15、および30日間、LCMVの急性または慢性変異体に曝露されたP14 LCMV特異的CD8+ T細胞から生成された転写データを利用した。すべてのサンプルにわたって少なくとも1つの統計的に有意なペアワイズ比較（FDR <0.05）でのもののために、遺伝子を最初にフィルタリングした。これらの差次的に発現された遺伝子は、遺伝子オントロジー関連（GO Molecular Function：「クロマチン結合」、「核酸結合」、「ヌクレオチド結合」；PantherDB Protein Classes：「DNA結合タンパク質」、「クロマチン結合タンパク質」）および精選された遺伝子リスト（Zuber et al. Nature Biotechnology. 2011, 29：79-83）によって決定されたクロマチン調節または結合機能を持つもののためにフィルタリングした。最後に、遺伝子は最小発現（少なくとも1つのサンプルで>6のアレイ強度）および倍数変化（1つのサンプルは他のすべてのサンプルと比較して少なくとも2倍のアレイ強度の増加がある）でフィルター処理した。これにより、435の差次的に発現されるクロマチン調節遺伝子の最終的なリストが得られた。次に、遺伝子発現の行正規化ヒートマップを生成した（図３９Ａ）。クラスター化は、Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean on a Manhattan distance matrixを用いて実行した。クラスター4遺伝子は疲弊したT細胞において特異的に発現され、Tox、Ikzf2、Setbp1が含まれる（図３９Ｂ〜３９Ｃ）。この分析を通じて、Toxが最も差次的に発現されるクロマチン調節遺伝子であることが見出された。マイクロアレイの発現結果を確認するために、P14養子移入アプローチを利用して、急性および慢性感染の過程でToxタンパク質の発現を測定した。500のP14 T細胞をナイーブ宿主に移し、それをLCMV ArmまたはCl-13のいずれかに感染させた（図４０Ａ）。感染後8、15、35、および208日でのフローサイトメトリー分析は、CD8 T細胞におけるTox発現が慢性感染に限定されることを示唆する（図４０Ｂ〜４０Ｃ）。実際、Toxタンパク質は、急性感染症に暴露されたT細胞では決して容易に検出できなかった。
【０２４７】
慢性感染症におけるToxの役割を検査するために、LCMV Cl-13に感染させる前に、等しい数のWTおよびToxf/f CD4Cre + P14 T細胞を同じホストに移した。次に、感染した動物の脾臓からのT細胞をさまざまな時点で採取し、フローサイトメトリーで分析した（図４１）。感染後8日に、Tox欠損T細胞は慢性感染症に応答して増殖および蓄積したが、WT T細胞と同じ程度にはならなかった（図４２Ａ）。さらに、Tox欠損T細胞は、感染から15日以内にCl-13感染動物から劇的に枯渇した（図４２Ａ）。興味深いことに、最近の細胞分裂のマーカーであるKi-67の発現は、WTおよびTox欠損T細胞において同等であり、このことは、Toxが慢性感染に曝されたT細胞の生存を調節し得ることを示唆する（図４２Ｂ）。感染中の抑制性受容体の発現は、T細胞のエフェクター機能を抑制し、長期の応答を維持するために重要であり、次にWTおよびToxKO T細胞におけるPD-1、Tigit、Lag3、CD160、Tim3、および2B4の発現を検査した。感染後8日に、ToxKO細胞はPD-1、Tigit、Lag3、およびCD160を発現できなかった。興味深いことに、Tim3および2B4を含む他の阻害性受容体の発現は、ToxKO T細胞において増加した（図４３Ａ〜４３Ｂ）。Tim3および2B4は終末エフェクター分化と関連するので、次に表面記憶とエフェクターマーカーの発現を検査した。実際、ToxKO T細胞は、WT T細胞と比較して、KLRG1+の最終分化集団について富化された。さらに、ToxKO細胞は、メモリーT細胞に関連するタンパク質であるCD62LまたはCD127も発現できなかった（図４４Ａ〜４４Ｂ）。Tcf1などの転写因子は、最終分化の抑制および慢性感染に対する長期T細胞応答の維持に重要な役割を果たすため、次にToxKO T細胞がそのような経路を調節するか否かを検査した。WTとToxKOナイーブT細胞との間のTcf1発現の違いは検出できなかったが、Tox欠損T細胞は感染後8日にTcf1を再発現できないことがわかった（図４５Ａ〜４５Ｂ）。
【０２４８】
Toxの発現が疲弊したT細胞の維持にも必要とされるか否かを解明するために、WTおよびToxf/f Ert2Cre+ P14 T細胞を用いた養子共移入（adoptive co-transfer）アプローチを利用した。P14 T細胞を等量で宿主に移入し、その後、LCMV ArmまたはCl-13に感染させた。感染後25〜30日から、宿主を毎日2mgのタモキシフェンで処置した。感染後35日に、WTおよびTox疲弊T細胞の頻度をフローサイトメトリーにより検査した。疲弊T細胞におけるTox発現の喪失は、タモキシフェン処理された宿主からのウイルス特異的P14細胞の有意な枯渇をもたらした（図４６）。要約すると、これらの結果は、Toxが、T細胞疲弊を誘発し、ウイルス特異的応答を長期間維持することにより、慢性感染に対するT細胞応答を調節することを示唆する。
【０２４９】
Toxの異所性発現がT細胞の疲弊を駆動するのに十分であるか否かをテストするために、Toxをコードするレトロウイルスベクターで形質導入されたナイーブT細胞の転写プロファイルを分析した（図４７）。Toxの過剰発現は、対照ベクターで形質導入されたT細胞と比較して2300を超える遺伝子の差次的発現をもたらした。さらに、Toxを過剰発現するT細胞は、インビボで疲弊した細胞において上方制御された遺伝子において有意に富化された。同時に、Toxの発現は、疲弊したT細胞においてもダウンレギュレートされる遺伝子を強くダウンレギュレートした（図４８Ａ）。
【０２５０】
ToxがT細胞疲弊をいかに調節するかを検査するために、Toxを過剰発現するT細胞においてATAC-Seqを実行した。Toxの強制された発現は、400を超えるゲノム遺伝子座の示差的アクセシビリティを生じた。これらのうち、Pdcd1の-23kbエンハンサーは、対照と比較してToxで形質導入されたT細胞において「オープン」であることがわかった（図４９）。このエンハンサーは、疲弊T細胞でのみユニークに「オープン」であり、ナイーブ、エフェクター、およびメモリーT細胞では「クローズ」のままであるため、特に注目されている。これらの発見は、Toxが疲弊の重要な遺伝子座のクロマチンアクセシビリティを物理的に変更することによってT細胞疲弊を規定する転写シグネチャを調節し得ることを示唆する。
【０２５１】
最後に、Toxがクロマチン調節機能をいかに達成し得るかを判断するために、質量分析によって結合パートナーを分析した。このアプローチを利用して、Toxがタンパク質のホストに結合することを発見した（図５０Ａ）。これらのうち、Hmbg2、Set、Ruvbl1、Dpy30、およびHmgb1は、これらのタンパク質の局所的なクロマチン構造を変化させる能力のため、特に興味深いものである（図５０Ｂ）。
【０２５２】
要約すると、これらの結果は、ToxがT細胞疲弊の確立および維持の両方の中心であること、ならびに、それが長期的な抗原曝露の間のT細胞応答の抑制に重要な役割を果たす遺伝子の発現を調節する遺伝子座にクロマチン調節タンパク質および転写因子をリクルートすることによって作用することを示唆する。
【０２５３】
表
（表１）
2021501156.tif 000032
【０２５４】
（表２）
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【０２５５】
（表３）
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【０２５６】
実施例１１〜１６に用いた材料および方法をここに記載する。
【０２５７】
マウス
マウスはUniversity of Pennsylvania (UPenn)の特定の病原菌を含まない施設で維持した。実験および手順は、UPennのInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)に従って実施した。次の遺伝子型のマウスはC57BL/6Jバックグラウンド上にあり、UPennで飼育されたか、またはJackson Laboratoryから購入した：WT P14、TOXFlox/Flox x CD4Cre P14、TOX-/- P14、およびNFAT2Flox/Flox x CD4Cre P14。CT26腫瘍での実験のため、BALB/cマウスを用い、Charles Riverから注文した。すべての実験について、マウスは年齢と性別が一致しており、生後6〜8週の間のオスとメスのマウスをランダムに実験グループに割り当てた。
【０２５８】
ナイーブリンパ球の単離および養子T細胞移植
T細胞受容体トランスジェニックGP特異的CD8+ T細胞（P14）は、Histopaque-1083（Sigma Aldrich）での勾配遠心を用いてドナーマウスの末梢血から単離した。LCMV感染を用いる実験のため、WT P14細胞を要求される遺伝子型（TOXFlox/Flox CD4Cre P14、TOX-/-P14、またはNFAT2Flox/Flox CD4Cre P14）の類遺伝子的に異なるP14細胞と1：1で混合し、合計500個のナイーブ細胞を感染前1〜5日に6〜8週齢のレシピエントマウスに尾静脈注射により養子移入した。レシピエントは、ホストT細胞から両方のドナー集団を区別できるようにするために、第３のコンジェニックバックグラウンドのものである。WT P14応答のみを監視する実験では、500個の細胞を移した。以前の報告では、LCMV Cl-13またはArm感染前の500 P14 T細胞の養子移入はウイルス負荷または病因に影響を与えないことが示されている（Frebel, H. et al. Programmed death 1 protects from fatal circulatory failure during systemic virus infection of mice. J Exp Med 209, 2485-2499 (2012); Odorizzi, P. M., Pauken, K. E., Paley, M. A., Sharpe, A. & Wherry, E. J. Genetic absence of PD-1 promotes accumulation of terminally differentiated exhausted CD8+ T cells. J Exp Med 212, 1125-1137 (2015); Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G. & Ahmed, R. Impact of Epitope Escape on PD-1 Expression and CD8 T-Cell Exhaustion during Chronic Infection. J Virol 83, 4386-4394 (2009)）。インフルエンザ、リステリア菌（Listeria monocytogenes：LM）、または水疱性口内炎ウイルス（VSV）感染での実験では、5,000 P14（インフルエンザ、LM）またはOT-I（VSV）CD8+ T細胞を感染前に養子移入した。
【０２５９】
感染症、異所性腫瘍モデル、および治療
LCMV株Armstrong（Arm）およびclone-13（Cl-13）を増殖させ、以前に記載されるとおりにタイターを決定した（Odorizzi, P. M., Pauken, K. E., Paley, M. A., Sharpe, A. & Wherry, E. J. Genetic absence of PD-1 promotes accumulation of terminally differentiated exhausted CD8+ T cells. J Exp Med 212, 1125-1137 (2015)）。C57BL/6Jマウスに、腹腔内（i.p.）に2 x 105プラーク形成単位（PFU）のLCMV Arm、または静脈内（i.v.）に4x106 PFU LMCV Cl-13を感染させた。他の実験では、マウスに2x106 PFU VSV-OVA（i.v.）または1x104コロニー形成単位（CFU）LM-GP33（i.p.）を感染させた。インフルエンザ感染については、30ulのPBS中の50 TCID50 PR8-GP33（H1N1株）を鼻腔内投与する前に、イソフルランおよびケタミンでマウスを麻酔した。B16-F10黒色腫およびCT26結腸癌細胞株はATCCから購入し、10％FBS、100U/mlペニシリン、100U/mlストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを補充したRPMI 1640培地で37℃で培養した。2x105の腫瘍細胞をマウスの右および左側腹部に皮下（s.c.）注射した。FK506（Prograf, Astellas Pharma US）は、PBS中で1.5 mg/mlに希釈することによって注射用に調製した。LCMV Cl-13感染のd3-7またはd25-29から10mg/kgの用量で希釈FK506を皮下投与した（Araki, K. et al. Pathogenic virus-specific T cells cause disease during treatment with the calcineurin inhibitor FK506: implications for transplantation. J Exp Med 207, 2355-2367 (2010)）。対照処置のために、PBSをs.c.投与した。
【０２６０】
レトロウイルスの形質導入、インビトロ分化、および細胞転移
レトロウイルス（RV）形質導入のために、EasySep磁気ネガティブセレクションキット（Stem Cell Technologies）を用いてドナーマウスの882の脾臓からCD8+ T細胞を富化し、以前に記載されるように形質導入した（Kurachi, M. et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc 12, 1980-1998 (2017)）。手短に言えば、細胞を106/mlで「完全RPMI（cRPMI）」に再懸濁した：10％FBS、50μM β-メルカプトエタノール、100U/mlペニシリン、100U/mlストレプトマイシン、非必須アミノ酸（Invitrogen）、ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）、およびHEPESバッファー（Invitrogen）を補充したRPMI 1640。3x106 T細胞を12ウェルクラスターディッシュのウェルにプレーティングし、100U/mlの組換えヒトIL-2（Peprotech）の存在下で1ug/ml抗CD3ε（145-2C11、BioLegend）および0.5ug/ml抗CD28（37.51、BioLegend）で18〜24時間活性化した。活性化後、細胞を3x106/mlでcRPMIに再懸濁し、6ウェルプレートのウェルにプレーティングし、ポリブレン（4μg/ ml）の存在下でスピン感染（2000 xgで75分間、32℃）によりMigR1ベースのRVウイルスで形質導入した。RV上清は、HEK293T細胞をRV発現プラスミドおよびpCL-EcoパッケージングプラスミドでLipofectamine3000（Invitrogen）を用いて同時トランスフェクションすることにより生成した。
【０２６１】
インビトロ実験のために、形質導入されたT細胞を拡大し、IL-2（100U/ml）の存在下でcRPMI中でさらに5日間培養することによりエフェクターT細胞に分化させた（Martinez, G. J. et al. The Transcription Factor NFAT Promotes Exhaustion of Activated CD8+ T Cells. Immunity 42, 265-278 (2015); Pipkin, M. E. et al. Interleukin-2 and Inflammation Induce Distinct Transcriptional Programs that Promote the Differentiation of Effector Cytolytic T Cells. Immunity 32, 79-90 (2010)）。25μg/mlのストレプトアビジン（Invitrogen）の存在下でビオチン化抗CD3ε（1μg/ml、145-2C11、BioLegend）および抗CD28（0.5μg/ml、37.51、BioLegend）を添加することにより、再刺激を行った。
【０２６２】
形質導入されたP14 T細胞の動物への移入に関する実験のために、形質導入と同じ日にマウスをLCMV Cl-13に感染させた。形質導入後24時間に、GFP+細胞を> 98％の純度にソートし、感染した宿主にi.v.で移した。
【０２６３】
細胞懸濁液の調製および再刺激
感染または腫瘍チャレンジの後、サンプルを小片に切断し、70μmのセルストレーナーに対してホモジナイズすることにより、脾臓および流入領域リンパ節からCD8+ T細胞を単離した。細胞をセルストレーナーに通し、赤血球をACK溶解バッファー（Thermo Fisher Scientific）で5分間溶解した。次に、細胞懸濁液をPBSで洗浄し、70μm細胞濾過器にさらに通した。肺および腫瘍を小片に切断し、5％FBS、100U/ml DNaseI（Sigma-Aldrich）および0.2mg/mlコラゲナーゼIV（Sigma-Aldrich）を補充したRPMI 1640培地中で37℃で1時間消化した。続いてサンプルを70μmフィルターに対して機械的に破壊し、PBSで洗浄した。赤血球をACK溶解バッファーで5分間溶解し、サンプルを70μmストレーナーで再度ろ過した。サイトカインおよびエフェクター分子産生を評価するために、サンプルを平底96ウェルディッシュのウェルにcRPMI中2x106/mlでプレーティングし、37℃で5時間、タンパク質輸送阻害剤（GolgiStopおよびGolgiPlug、BD Biosciences）の存在下でGP33-41ペプチドとインキュベートした。
【０２６４】
ヒトサンプルの収集と染色
正常なドナー末梢血サンプル（n=10、18〜39歳の男性および女性のドナー）はCellular Technology, Incから入手した。University of Pennsylvania Abramson Cancer Centerの黒色腫研究プログラム組織収集プロトコルUPCC 08607の下で、Institutional Review Boardにしたがって、ステージIIIおよびステージIVの黒色腫患者からヒトメラノーマ腫瘍およびPBMCサンプルを収集した。腫瘍サンプルは手術室から調達され、同じ日に手作業で解離して単一細胞懸濁液に処理した。次に、腫瘍サンプルを標準的な凍結培地を用いて直ちに凍結し、液体窒素中に保存した。すべてのヒトのサンプルは、以前に記載されるように処理および染色した（Huang, A. C. et al. T-cell invigoration to tumour burden ratio associated with anti-PD-1 response. Nature 545, 60-65 (2017)）。
【０２６５】
フローサイトメトリーおよび細胞ソーティング
抗体はBioLegendから入手した：CD44 (IM7)、CD62L (MEL-14)、CD127 937 (A7R34)、Tbet (4B10)、PD-1 (RMP1-30)、CD160 (7H1)、TIM3 (RMT3-23)、CD3ε (17A2)、TNFα (MP6-XT22)、CD8α (53-6.7)、CD4 (RM4-5)、CD45.1 (A29)、CD45.2 (104); Miltenyi Biotec: TOX (REA473); Southern Biotech: KLRG1 (2F1); eBioscience: Eomes (Dan11mag)、2B4 (eBio244F4)、IFNγ (XMG1.2)、Granzyme B (GB11)、B220 (RA3-6B2); or from BD Biosciences: TIGIT (1G9)、LAG33 (C9B7W)、Tcf-1 (S33-966)、2B4 (2B4)、Ki-67 (B56)。Zombie NIR色素（BioLegend）で染色することにより生細胞を識別した。サイトカイン、エフェクター分子、および転写因子の細胞内および核染色は、FoxP3/転写因子染色バッファーセット（eBioscience）を用いて、製造元のプロトコルに従って行った。フローサイトメトリーのデータはBD LSR II装置で取得し、細胞ソーティングは層流フード内に封入されたBD FACSAriaで実行した。FlowJoソフトウェア（TreeStar）を用いてデータを分析した。
【０２６６】
マイクロアレイ分析
マイクロアレイデータ（GSE41867）（Doering, T. A. et al. Network Analysis Reveals Centrally Connected Genes and Pathways Involved in CD8+ T Cell Exhaustion versus Memory. Immunity 37, 1130-1144 (2012)）を、先に記載されるとおりに処理した（Doering, T. A. et al. Network Analysis Reveals Centrally Connected Genes and Pathways Involved in CD8+ T Cell Exhaustion versus Memory. Immunity 37, 1130-1144 2012; Pauken, K. E. et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science 354, 1160-1165 (2016)）。クロマチン調節機能を持つ遺伝子は、遺伝子オントロジー関連（GO分子機能：クロマチン結合、核酸結合、ヌクレオチド結合、およびPANTHERタンパク質クラス：DNA結合タンパク質、クロマチン結合タンパク質）、EpiFactorsデータベース（Medvedeva, Y. A. et al. EpiFactors: a comprehensive database of human epigenetic factors and complexes. Database 2015, bav067-10 (2015)）、および先に同定されたクロマチンモジュレーター（Shi, J. et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol 33, 661-667 (2015)）から検索された遺伝子リストをコンパイルすることによって同定した。
【０２６７】
RNAおよびATAC-seqサンプル調製およびシーケンシング
T細胞におけるTOX削除の転写およびエピジェネティックな影響を評価するために、250 WTおよび250 TOX-/-ナイーブCD44LOWCD62LHI P14細胞をドナーの末梢血から選別し、混合し、WTマウスに同時導入した。その後、レシピエントにLCMV Cl-13を感染させ、感染後8日に脾細胞を採取した。処理、CD8+ T細胞富化（EasySep CD8+ T細胞陰性選択キット、Stem Cell Technologiesを使用）、および単一細胞懸濁液の染色の前に、3つの複製ごとに10個の脾臓をプールした。100,000 WTおよびTOX-/-P14細胞を、各複製について98％を超える純度までソートした。異所性および強制的発現実験において、TOX+GFPまたは対照GFPのみ（それぞれ3つの生物学的複製）で形質導入されたインビトロ分化CD8+ T細胞を、最初の活性化後6日にGFP発現で純度> 98％にソートした。NIH3T3細胞にTOX+GFPまたは対照GFPのみのRVウイルスを形質導入し、細胞選別の前に48時間培養した。RNAを抽出するために、50,000個の細胞をβ-メルカプトエタノールを補充した緩衝液RLTに再懸濁し、製造元の指示に従ってRNeasy Micro Kit（Qiagen）で処理した。
【０２６８】
全体のRNAライブラリーは、Pico Input SMARTer Stranded Total RNA-Seq KitTM（Takara）を用いて調製した。抽出されたRNAおよびライブラリーは、TapeStation 2200装置（Agilent）で品質について評価した。ATACライブラリーは、小さな変更を伴い記載されるように生成した（Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y. & Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. 10, 1213-1218 (2013)）。簡単に言えば、50,000細胞からの核は、10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、および0.1％IGEPAL CA-630から構成される溶解溶液を用いて単離した。細胞溶解の直後に、核をローバインド1.5mlチューブ（Eppendorf）でペレット化し、Tn5トランスポザーゼ（Illumina）を含むTDバッファーに再懸濁した。転位反応は37℃で45分間行った。DNAフラグメントは、MinElute Enzyme Reaction Cleanup Kit（Qiagen）を用いて酵素溶液から精製した。ライブラリーをバーコード化し（Nextera Index Kit, Illumina）、NEBNext High Fidelity PCR Mix（New England Biolabs）で増幅した。ライブラリーの品質はTapeStation装置を用いて評価した。RNAおよびATACライブラリーは、KAPAライブラリー定量キットを用いて定量化し、高出力フローセル上のIllumina NextSeq 550装置（150bp、ペアエンド）でシーケンシングした。
【０２６９】
RNA-seqデータ処理および分析
FASTQファイルは、mm10マウス参照ゲノムに対してSTAR 2.5.2aを用いてアラインした。整列されたファイルは、PORT遺伝子ベースの正規化（github.com/itmat/Normalization）を用いて処理した。Limmaを用いて示差的遺伝子発現を行った。Limma-voomは、p値<0.05を用いて、実験グループ間で有意に異なって発現された転写産物を同定するのに用いた。
【０２７０】
ATAC-seqデータ処理および分析
未加工のATAC-seq FASTQデータを処理するために使用されるスクリプトは、次のGitHubリポジトリで入手可能である：github.com/wherrylab/jogiles_ATAC。
【０２７１】
手短に言えば、サンプルはBowtie2を用いてmm10参照ゲノムにアラインメントした。マッピングされていない、ペアになっていない、ミトコンドリアの読み取りは、samtoolsを用いて削除した。ENCODE Blacklist 領域を削除した（sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists）。PCRの重複はPicardを用いて削除した。FDR q-value = 0.01でMACS2でピークコーリングを行った。各実験の結合ピークリストは、すべてのサンプルのすべてのピークを組み合わせることによって作成し；重複するピークは、bedtools mergeを用いてマージした。各ピークの読み取りの数は、ベッドツールカバレッジで決定した。
【０２７２】
ピークセットエンリッチメントのスクリプトは、次の場所で利用可能である：github.com/wherrylab/jogiles_ATAC。手短に言えば、bedtools intersectを用いて、実験と対象のピークセットとの間で重なり合うピークを検出した。実験と対象のピークセットとの間のピーク名は、カスタムRスクリプトを用いて統合した。GSEA82は、エンリッチメントスコアの計算に用いた。
【０２７３】
クロマチン免疫沈降（ChIP）およびChIP-seq分析
細胞は、PBSで希釈した1％パラホルムアルデヒド（PFA）で、回転プラットフォーム上で15分間、架橋した。サンプルをグリシンでクエンチし、細胞ペレットを、回転プラットフォーム上で4°Cで10分間、プロテアーゼ阻害剤（ThermoFisher）を補足した50mM HEPES-KOH、pH 7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、10％グリセロール、0.5％NP-40、0.25％Triton X-100を含むバッファー中で溶解した。細胞をペレット化し、回転プラットフォーム上室温（RT）で10分間、プロテアーゼインヒビター（ThermoFisher）を補足した10 mM Tris-HCl pH 8.0、200 mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTAを含む第２の溶解バッファーに再懸濁した。核をペレット化し、10 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、0.1％Na-デオキシコール酸、0.5％N-ラウロイルサルコシンおよびプロテアーゼ阻害剤を含む最終溶解バッファーに再懸濁した。クロマチンをCovarisソニケーターで剪断した。続いてライセートを抗TOX（ab155768、Abcam）または抗Kat7（ab70183、Abcam）結合Dynabeads（Invitrogen）と一緒に4℃で回転プラットフォーム上で一晩インキュベートした。ビーズを磁石により収集し、RIPA洗浄バッファー（50 mM HEPES-KOH pH 7.5、500 mM LiCl、1 mM EDTA、1％NP-40、0.7％Na-デオキシコール酸）で5回洗浄した。50mM Tris-HCl pH 8.0、10mM EDTA、および1％SDSを含むバッファーでビーズからサンプルを溶出した。65℃で12〜18時間インキュベートすることにより、サンプルおよび入力コントロールにおいて架橋を逆転させた。DNAは、サンプルをRNase A（Tris-EDTA中0.2mg/ml、37°Cで2時間）およびProteinase K（0.2mg/ml、55°Cで2時間）と順次インキュベートし、続いてフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールと混合し、Phase Lockチューブ（Qiagen）での遠心分離による相分離によって精製した。水相を新しいチューブに移し、サンプルを冷エタノール中で-80℃で一晩インキュベートすることによりDNAを沈殿させた。ここで説明する実験では、ChIP反応ごとに25x106 EL4細胞を複製ごとに用いた。
【０２７４】
ライブラリは、NEBNext Ultra IIキットとNEBNext Multiplex Oligos for Illumina Sequencers (New England Biolabs)を用いて作成した。ライブラリーの品質およびサイズの分布は、BioAnalyzer 2100装置（Agilent）で分析した。TOX（n = 3の生物学的複製）、Kat7（n = 2の生物学的複製）、および入力コントロールライブラリは、Qubit蛍光光度計によって定量化し、高出力フローセル（150 bp、ペアエンド）でのNextSeq550装置（Illumina）でシーケンシングした。FASTQファイルは、STAR 2.5.2aを用いてmm10マウス参照ゲノムにアラインメントし、samtoolsビューでbamファイルに変換し、bamtoBedを用いてbedファイルフォーマットに変換した。MACS2は、FDR q-value = 0.01でピークコーリングを実行するために用いた。TOXおよびKat7のゲノム全体の同時富化は、記載されるように両方のタンパク質の複数の転写因子結合遺伝子座（MTL）を最初にコンパイルすることにより計算した（Chen, X. et al. Integration of External Signaling Pathways with the Core Transcriptional Network in Embryonic Stem Cells. Cell 133, 1106-1117 (2008)）。簡単に言えば、互いの250bp以内のKat7のピークを繰り返しクラスター化して、MTL遺伝子座を規定した。次に、結果として得られた3315 MTLを、3315コントロールMTL遺伝子座（TSSの100kb内の配列からランダムに割り当てられたもの）と比較してTOX結合についてテストした。Kat7 MTLにおけるTOXエンリッチメントの統計分析は、1000回の繰り返しの測定でエンリッチメントの確率を計算することによって実行した。
【０２７５】
免疫沈降およびイムノブロッティング
以前に記載されているように免疫沈降（IP）を行った（Dou, Z. et al. Autophagy mediates degradation of nuclear lamina. Nature 527, 105-109 (2015)）。簡単に言えば、5x106 EL4細胞を、1：100 HALTプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Thermo Scientific）ならびに12.5 U/mlのベンゾナーゼ（Novagen）を補足した免疫沈降バッファー（20 mM Tris、pH 7.5、137 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2、1％NP-40、10％グリセロール）中で溶解した。溶解物を4℃で60分間回転させた。続いて、抗体結合Dynabeads（Invitrogen）を加え、サンプルを回転プラットフォーム上で4℃で一晩インキュベートした。ビーズを磁石で収集し、サンプルを免疫沈降バッファーで5回洗浄した。次に、サンプルをNuPAGEローディング色素（ThermoFisher）に再懸濁し、95℃で5分間インキュベートし、そしてウエスタンブロッティングで分析した。次の抗体を用いた：IPについてはTOX (ab155768, Abcam) およびKat7 (ab70183, Abcam) ならびに、ウエスタンブロットについてはTOX (TXRX10, eBioscience)、Kat7 (ab70183, Abcam)、H3K4me1 (ab8895, Abcam)、H3K27me3 (ab6002, Abcam)、H3K9ac (39918, Active Motif)、H3K27ac (ab4729, Abcam)、H4 (07-108, Millipore)、およびH4ac (06- 866, Millipore)。
【０２７６】
免疫沈降、LC-MS/MS、および分析
EL4細胞核抽出物を、記載されるとおりに調製した（Dawson, M. A. et al. Inhibition of BET recruitment to chromatin as an effective treatment for MLL-fusion leukaemia. Nature 478, 529-533 (2011)）。簡単に言えば、細胞を低張バッファー（10mM Tris-Cl、pH 7.4、1.5mM MgCl2、10mM KCl、25mM NaF、1mM Na3VO4、1mM DTT、およびRocheプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で3分間インキュベートした。続いて細胞ペレットを遠心分離し、低張バッファーに再懸濁し、5ストロークのDounceホモジナイザーでホモジナイズした。核を遠心分離により収集し、抽出バッファー（50 mM Tris-Cl、pH 7.4、1.5 mM MgCl2、20％グリセロール、420 mM NaCl、25 mM NaF、1 mM Na3VO4、1 mM DTT、400 U/ml DNase I、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁した。回転プラットフォーム上でサンプルを4℃で30分間インキュベートした。50mM Tris-Cl、pH 7.4、1.5mM MgCl2、25mM NaF、1mM Na3VO4、0.6％NP-40、1mM DTT、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むバッファー中で抽出物を3：1に希釈した。製造元の指示に従って、40μgの抗TOX（Abcam、ab155768）または対照IgG抗体を含む磁気co-IPキット（ThermoFisher）を用いて、核抽出物の1 mgに対して免疫精製を行った。
【０２７７】
液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）の分析は、Nano-ACQUITY UPLCシステム（Waters）と一緒にQ Exactive Plus質量分析計（ThermoFisher）を用いてProteomics and Metabolomics Facility at the Wistar Instituteで行った。サンプルをトリプシンでゲル内で消化し、UPLC Symmetryトラップカラム（180μm i.d. x 2 cmに5μm C18樹脂を重点、Waters）に注入した。トリプシンペプチドは、BEH C18ナノキャピラリー分析カラム（75μm i.d. x 25 cm、1.7μm粒子サイズ; Waters）での逆相HPLCにより、溶媒A（水中の0.1％ギ酸）および溶媒B（アセトニトリル中の0.1％ギ酸）によって形成された95分の勾配を用いて分離した。キャリーオーバーを最小限に抑えるために、サンプル注入の間に30分のブランク勾配を実行した。溶出されたペプチドは、正イオンモードでm/zを400から2000まで繰り返しスキャンするように設定された質量分析計で分析した。フルMSスキャンは70,000の解像度で収集され、続いて最小しきい値20,000を超える20種類の最も豊富なイオンに対する17,5000の解像度でのデータ依存MS/MSスキャンを行った。ペプチドマッチを優先として設定し、同位体オプションを除外し、電荷状態スクリーニングを有効にして、単一のおよび割り当てられていない荷電イオンを拒否した。ペプチド配列は、MaxQuant 1.5.2.895を用いて同定した。MS/MSスペクトルは、最大2つの損なった切断、Cysの静的なカルボキサミドメチル化、ならびにMetの可変性の酸化およびタンパク質N末端アセチル化による完全なトリプシン特異性を用いて、UniProtヒトタンパク質データベースに対して検索した。コンセンサス同定リストは、タンパク質およびペプチドレベルで1％の誤った発見率で生成された。統計的に有意なヒットのリストを生成するために、MaxQuant出力からの結果のiBAQタンパク質値を、MiSTスコアリングシステム96を用いて分析した。これは、タンパク質の存在量、特異性、および３つの生物学的複製での再現性を説明する。
【０２７８】
統計分析
フローサイトメトリーデータについての統計テストは、GraphPad Prismソフトウェアを用いて行った。<0.05のp値は、これらの分析で有意であると見なした。スチューデントのt検定（両側）を用いて、2つの独立した条件間の比較を行った。比較されるサンプルが同じ動物に由来する場合、対応のあるスチューデントのt検定を用いた。
【０２７９】
実施例１１：TEXの発達におけるTox選択性の転写アップレギュレーション。
T細胞疲弊の潜在的な分子ドライバーを特定するに、最初に、急性（Armstrong; Arm）または慢性（クローン13; Cl-13）LCMV感染における、ウイルス特異的CD8+ T細胞（LCMV特異的TCRトランスジェニックP14細胞を使用）の縦方向の転写データを分析した。遺伝子発現データの多次元スケーリング（MDS）分析は、TEFFおよびTMEM対TEXの発達に関連する転写シグネチャの動的変化を強調する（図５１Ａ）。急性および慢性感染への応答は早期に著しく異なり、6日以内に遺伝子発現にかなりの相違を伴った（図５１Ａ）。T細胞疲弊は、TN、TEFFまたはTMEMのそれとは異なるユニークなクロマチンのランドスケープに関連付けられる（Pauken, K. E. et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science 354, 1160-1165 (2016); Sen, D. R. et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science 354, 1165-1169 (2016); Philip, M. et al. Chromatin states define tumour-specific T cell dysfunction and reprogramming. Nature 545, 452-456 (2017); Scott-Browne, J. P. et al. Dynamic Changes in Chromatin Accessibility Occur in CD8+ T Cells Responding to Viral Infection. Immunity 45, 1327-1340 (2016)）。エピジェネティックなランドスケープは細胞のアイデンティティの主要なドライバーであるので、クロマチン調節能力を有する遺伝子が初期の発達の違いを引き起こし、TMEMおよびTEXの発達においてユニークな転写の軌道を導き得ると仮定した。実際、感染後日数（d.p.i.）６日の発現データの遺伝子オントロジー分析は、クロマチン結合および転写因子活性を有する遺伝子ファミリーの差次的発現を同定した（図５１Ｂ）。さらに、これらのファミリー内の遺伝子はT細胞分化中に異なって関与しており、このことは、ユニークなセットのクロマチンモジュレーターが異なるT細胞運命の初期の特定において異なる役割を有し得ることを示唆する（図５１Ｃ、図５２Ａおよび表４）。クラスター1（C1）の遺伝子は、慢性感染に応答するCD8+ T細胞に高度に偏っており、このクラスターには、T細胞疲弊の維持に重要な役割を果たすことが知られているいくつかの転写因子（Stat1、Stat2、Tcf4、Ikzf2）およびクロマチンモジュレーター（Tet2、Dnmt3a）（Carty, S. A. et al. The Loss of TET2 Promotes CD8+ T Cell Memory Differentiation. J Immunol 200, 82-91 (2018); Ghoneim, H. E. et al. De Novo Epigenetic Programs Inhibit PD-1 Blockade-Mediated T Cell Rejuvenation. Cell 170, 142-157.e19 (2017)）、ならびに、Setbp1、Kdm4a、およびToxを含む末梢CD8+ T細胞において以前にキャラクタライズされていない機能を有するいくつかの遺伝子が含まれていた（図５１Ｄおよび図５２Ａ〜B）。これらの中で、Toxは、急性感染症からのTEFFおよびTMEMに対するTEXの発達において、最も差異的に発現されたTFまたは潜在的なクロマチンモジュレーターであった（図５１Ｅ）。
【０２８０】
TOXは、DNA結合タンパク質の高移動度グループ（HMG）ファミリーに属し、ナチュラルキラー、生来のリンパ様、およびCD4+ T細胞を含む、免疫細胞型の発達に関与する（Ghoneim, H. E. et al. De Novo Epigenetic Programs Inhibit PD-1 Blockade-Mediated T Cell Rejuvenation. Cell 170, 142-157.e19 (2017); Aliahmad, P., Seksenyan, A. & Kaye, J. The many roles of TOX in the immunesystem. Current Opinion in Immunology 24, 173-177 (2012)）。末梢CD8+ T細胞分化におけるTOXの役割はほとんど理解されていない。共発現ネットワーク分析を用いて、我々は、TOXがTMEMとTEXとの間で最も差次的に関連したTFであることを以前に見出しており、このことは、TEXにおけるユニークな役割を示唆している（Doering, T. A. et al. Network Analysis Reveals Centrally Connected Genes and Pathways Involved in CD8+ T Cell Exhaustion versus Memory. Immunity 37, 1130-1144 (2012)）。他のHMG転写因子、たとえば、Soxタンパク質（Bergsland, M. et al. Sequentially acting Sox transcription factors in neural lineage development. Genes & Development 25, 2453-2464 (2011)）、およびTcf1（Johnson, J. L. et al. Lineage-Determining Transcription Factor TCF-1 Initiates the Epigenetic Identity of T Cells. Immunity 48, 243-257.e10 (2018)）は、細胞系統の（再）プログラミングに関与するので、我々は、TOXをさらに詳しく検査した。慢性LCMV感染時の初期のTox転写における実質的な増加と一致して、Tox遺伝子座のクロマチンアクセシビリティも、TEFFと比較してTEX細胞において顕著に増加しており、このことは、Tox遺伝子座がTEXにおいてエピジェネティックに再プログラミングされることを示唆する（図５１Ｆ）。さらに、我々は、Tox遺伝子座が、他の設定において高密度のH3K27acヒストンマークを含む、「ストレッチ」または「スーパー」エンハンサー（SE）に関連している特徴であるオープンクロマチン領域の密集したクラスターを有することを見出した（Whyte, W. A. et al. Master Transcription Factors and Mediator Establish Super- Enhancers at Key Cell Identity Genes. Cell 153, 307-319 (2013); Hnisz, D. et al. Super-Enhancers in the Control of Cell Identity and Disease. Cell 155, 934-947 (2013); Vahedi, G. et al. Super-enhancers delineate disease-associated regulatory nodes 1257 in T cells. Nature 520, 1-15 (2015)）。オープンクロマチンの大きなストレッチを持つ遺伝子座の中で、Toxは、TNおよびTMEMにおける上位100（ランク= 91または64）のみのランキングと比較して、TEX（ランク= 35）においてはるかに高くランク付けされた（図５１Ｇ）。オープンクロマチンおよびSEのそのような大きな領域が細胞の運命決定に関与する遺伝子または遺伝子座の境界をしばしば定めるので、観察は興味深いものであり得る（Hnisz, D. et al. Super-Enhancers in the Control of Cell Identity and Disease. Cell 155, 934-947 (2013)）。一緒に、これらのデータは、TOXがTEXの分化経路における中心ノードとして機能し得るという仮説を誘発する。
【０２８１】
実施例１２：高いおよび持続的なTOXは、慢性感染症および癌においてTEXおよび主要な疲弊の特徴に関連する。
上記の転写解析を拡張するために、TOXタンパク質の発現をTEFF、TMEM、および急性または慢性LCMV感染の経過中に発達するTEXにおいて測定した。遺伝子発現データと一致して、TOXタンパク質レベルは、慢性LCMV感染から4日以内に有意に増加し、ここで、応答性のCD8+ T細胞の〜80％がd5 p.iまでに高レベルのTOXを発現した（図５３Ａ）。さらに、高いTOX発現は、d15 p.i以降からTEX集団の＞95％において持続され、＞200日p.i. でさえ高度に発現が維持された（図５３Ａおよび図５４Ａ）。対照的に、LCMV Arm感染の急激な解消に応答するTEFFにおいてTOXは誘発されたが、発現は5〜6日p.i.でピークに達し、集団の〜25％またはそれ未満に制限された。さらに、細胞あたりのTOXタンパク質の量はCl-13感染よりもかなり低く、発現は一過性であり、d8-15 p.iの間でほぼベースラインに戻った（図５３Ａ）。したがって、TOXは急性および慢性の両方のウイルス感染時に早期に誘導されたが、高いおよび持続性のTOX発現は慢性感染時にのみに観察された。特に、CD8+ T細胞におけるTOXレベルの違いは、ウイルス学的結果が分岐した時点（これは〜8日p.i.で発生する）の前に現れた（Wherry et al., Viral Persistence Alters CD8 T-Cell Immunodominance and Tissue Distribution and Results in Distinct Stages of Functional Impairment. J Virol 77:4911-4927; Odorizzi et al., Genetic absence of PD-1 promotes accumulation of terminally differentiated exhausted CD8+ T cells. J Exp Med 212:1125-1137 (2015)）。このことは、ウイルス負荷だけでは差次的発現の主要な推進力ではないことを示唆する。
【０２８２】
これらの観察に照らして、我々は慢性感染中のTOX発現はTEX細胞およびTEX前駆体において富化されたと仮定した。早期の時点でTOX-およびTOX+ウイルス特異的CD8+ T細胞集団を検査すると、TMEMおよびTEXの両方の前駆体であるCD127+ KLRG1-細胞の小さな集団がTOX-細胞およびTOX+細胞の両方を含んでいたのに対し、TOX-細胞はCD127-KLRG1+エフェクタープールにおいて富化されることを示し、このことはTOXおよびKLRG1+ターミナルエフェクター細胞の間の負の関係を示唆する（Chang, J. T., Wherry, E. J. & Goldrath, A. W. Molecular regulation of effector and memory T cell differentiation. Nat Immunol 15, 1104-1115 (2014); Joshi, N. S. et al. Inflammation directs memory precursor and short-lived effector CD8(+) T cell fates via the graded expression of T-bet transcription factor. Immunity 27, 281-295 (2007); Herndler-Brandstetter, D. et al. KLRG1+ Effector CD8+ T Cells Lose KLRG1, Differentiate into All Memory T Cell Lineages, and Convey Enhanced Protective Immunity. Immunity 48, 716-729.e8 (2018)）（図５３Ｂ）。このKLRG1+ターミナルエフェクター集団は高度に機能的であり、急性感染時の病原体制御のためにおそらく重要である。それでも、これらの細胞はTEXを生成することができず、これはおそらくTEX細胞の形成および長期維持に重要である、Tcf1およびEomesなどの転写因子の発現を欠如するためである（Utzschneider, D. T. et al. T Cell Factor 1-Expressing Memory-like CD8+ T Cells Sustain the Immune Response to Chronic Viral Infections. Immunity 45, 415-427 (2016); Paley, M. A. et al. Progenitor and Terminal Subsets of CD8+ T Cells Cooperate to Contain Chronic Viral Infection. Science 338, 1220-1225 (2012); Angelosanto, J. M., Blackburn, S. D., Crawford, A. & Wherry, E. J. Progressive loss of memory T cell potential and commitment to exhaustion during chronic viral infection. J Virol 86, 8161-8170 (2012)）。実際、Tcf1およびEomesの発現は主に、d8 p.i.でTOX+細胞に限定されていた（図５３Ｃ、上）。TOXおよびTcf1の間の関係は、後の慢性感染では維持されなかったが、TOXおよびEomesの間の相関はより強くなり、このことは、疲弊が確立されると、TOXは最終分化した（すなわち、EomesHi）TEX細胞とより関連し得ることを示唆する（図５３Ｃ、下）。TEXの決定的な特徴は、複数の阻害剤受容体20の共発現である。TOX+細胞は、PD-1、TIGIT、LAG3およびCD160を慢性感染症全体で高発現していた（図５３Ｄおよび図５４Ｂ〜５４Ｃ）。したがって、TOXは、急速に解消されるLCMV感染の間のCD8+ T細胞の活性化時に一過的に誘導されたが、高レベルでのみ発現され、慢性感染において持続した。さらに、TOX発現は、KLRG1+ターミナルTEFFの発達と反相関し、抑制性受容体および主要なTEX TFの高い共発現とかなり関連していた。
【０２８３】
次に、TOXの発現を、他の急性的に解消された感染症および癌で検査した。最初の誘導であるが、TOXの一時的のみの発現が、インフルエンザウイルス（Flu）、水疱性口内炎ウイルス（VSV）、およびリステリア菌（LM）のマウスにおける急性感染時に観察された。急性LCMV Arm感染で観察されたように、Flu、VSV、およびLMの設定でのTOX発現は、エフェクターフェーズのピークに限定され、時間の経過とともに急速に減少した（図５４Ｄ）。これらの設定では、PD-1発現に関連してTOXが高くなるという適度な傾向があった（図５４Ｄ）。慢性抗原刺激の他の設定をテストするために、B16およびCT26マウス腫瘍モデルも用いた。両方のモデルの腫瘍浸潤性T細胞（TIL）の大部分は、TOXのレベルが高かった。さらに、ヒト黒色腫患者からの高頻度のTILもTOXタンパク質を発現し、このことは、TOX発現と持続的な抗原曝露との間の関連が種に渡って広がっていることを示唆する（図５４Ｅ）。最後に、マウスおよびヒトの両方において、高いTOX発現とPD-1を含む複数の抑制性受容体の高い共発現との間に強い関連があった（図５３Ｅ〜５３Ｆ）。したがって、TOXは、急速に解消される感染の間に抗原特異的CD8+ T細胞に一過性に誘発されたが、大多数の細胞では持続しなかった。対照的に、慢性LCMV感染および癌の間、TOXはより高発現され、抑制性受容体の高発現と正の相関があった抗原特異的CD8+ T細胞の大多数において強く維持された。さらに、TOXはマウスとヒトとの両方における癌に対するT細胞応答において類似する役割を有し得るようである。
【０２８４】
実施例１３：TEXの生成におけるTOXの重要な役割。
TEXにおけるTOXの役割をさらに調査するために、TOXFlox/Flox x CD4Cre P14マウス（cKO）を用いて、TOX欠損CD8+ T細胞を作製した。ナイーブP14 TOX cKO T細胞を、類遺伝子的に異なる対照（WT）P14細胞と1：1で混合し、第３のコンジェニックバックグラウンドを持つ宿主に養子移入した（図５６Ａ）。特に、WT P14と比較して、ナイーブTOX cKO P14細胞は、同様のベースライン活性化および抑制性受容体の発現を有した（図５６Ｂ）。次に、これらのレシピエントマウスをLCMV Cl-13に感染させた。この養子移入アプローチは、ウイルス負荷および炎症環境における潜在的な差異の制御を可能にする。
【０２８５】
慢性感染に対する応答において、TOX cKO P14細胞は初期応答をマウントしたが、その後急速に数が減少し、同時移入されたWT P14細胞とは対照的に、d15 p.i.を超えて持続しなかった（図５５Ａおよび図５６Ｃ）。Toxを完全に削除できなかったTOX+逃避体が容易に検出され、慢性感染の経過を通じて持続し得るため、この低下は拒絶によるものではなかった（図５６Ｄ）。TOX cKOおよびWT P14細胞の両方が同様のレベルのKi-67を発現したため、これは複製能力の差によるものでもなかった（図５６Ｅ）。さらに、急性的に解消されたLCMV Armに応答するTOX cKO P14細胞は、感染後少なくとも30日間は容易に検出可能な堅牢なTEFFおよびTMEM細胞を生成した（図５５Ａ）。したがって、TOX cKO CD8+ T細胞は、TMEMを含む急性感染後に持続し得るCD8+ T細胞を本質的に形成することができなかったが、むしろTEXを生成する能力に特定の障害を有した。
【０２８６】
理論に拘束されるつもりはないが、急性感染の間の初期のTOX-画分におけるKLRG1+細胞の富化に基づいて（図５３Ｂ）、TOX欠損T細胞はこれらの末端TEFF細胞について富化されるであろうと考えられた。実際に、TOX cKO P14細胞の分化は、急性および慢性感染の両方においてKLRG1+ CD127- TEFFの生成に偏っていた（図５５Ｂおよび図５６Ｆ、５６Ｉ〜５６Ｋ）。それでも、急性的に解消されたArm感染では、TOX cKOは典型的なTMEM集団を効果的に生成した（図５６Ｇ）。しかしながら、慢性感染では、WT P14細胞とは対照的に、TOX cKO細胞はより低いPD-1、CD160、LAG3、およびTIGITを発現したが、阻害性受容体2B4およびTIM3はこの初期の時点でTOXなしで増加した（図５５Ｃ）。TOX欠乏は、TOX発現が機能的疲弊を駆動するという概念と一致して、機能の改善ももたらした（図５５Ｄ）。TEXの確立および長期維持は、TF Tcf1、T betおよびEomesによって部分的に媒介される増殖的階層に依存する（Wu, T. et al. The TCF1-Bcl6 axis counteracts type I interferon to repress exhaustion and maintain T cell stemness. Sci Immunol 1, eaai8593-eaai8593 (2016); Utzschneider, D. T. et al. T Cell Factor 1-Expressing Memory-like CD8+ T Cells Sustain the Immune Response to Chronic Viral Infections. Immunity 45, 415-427 (2016); Paley, M. A. et al. Progenitor and Terminal Subsets of CD8+ T Cells Cooperate to Contain Chronic Viral Infection. Science 338, 1220-1225 (2012)）。したがって、TOXの欠如下でのこれらの重要なTFの発現を、TEXにおいて検査した。TOXの欠如下でEomesは減少したが、関連するTF T-betは影響を受けなかった（図５５Ｅ）。TEXのTcf1+サブセットがほとんど存在しない慢性感染症の間、Tcf1の発現はTOX cKO CD8+ T細胞においてほとんど消失した（図５５Ｅ）。特に、ナイーブTOX cKO細胞によるTcf1発現には欠陥がなく、急性感染後に生成されたTOX cKO TMEMはWT TMEM細胞と比較して同等レベルのTcf1およびEomesを発現した（図５６Ｂおよび図５６Ｈ）。理論に縛られることを望まないが、これらのデータは、TOX cKO TEX細胞における主な欠陥が、活性化および初期TEX前駆体発達の後にTcf1および／またはEomesの転写制御を再配線できないことであることを示唆する。
【０２８７】
TEXにおけるTOXの下流の転写メカニズムをよりよく理解するために、Cl-13感染のd8で単離されたWTおよびTOX-/-P14 T細胞に対してRNA-seqを実行した。この時点で、WTおよびTOX-/-CD8+ T細胞の間で3,100を超える遺伝子が異なってした。これらのデータの主な特徴は、Klrg1、Gzma、Gzmb、Cx3cr1、Zeb2、およびPrf1を含むTOXの非存在下での多くのTEFF様遺伝子のアップレギュレーションであった（図５５Ｆ）。対照的に、ダウンレギュレートされた遺伝子にはPdcd1およびCd160が含まれたが、Myb、Il7r、Lef1、およびTcf7を含む耐久性またはT細胞の持続に関連するいくつかの遺伝子も含まれていた（図５５Ｆ）。実際、Cl-13感染においてTOXが存在しない場合、LCMV Arm感染中に生成されたTEFFからのシグネチャについて高度な富化が存在したが、TEX前駆体（すなわち、Cl-13からのTEFF）のシグネチャは強く減少した（図５５Ｇ）。さらに、TEXを生じさせることができないKLRG1+短命ターミナルエフェクターに関連する遺伝子発現のパターンは、Cl-13感染からのTOX欠損P14細胞においても観察された（図５５Ｈ〜５５Ｉ）（Herndler-Brandstetter, D. et al. KLRG1+ Effector CD8+ T Cells Lose KLRG1, 1265 Differentiate into All Memory T Cell Lineages, and Convey Enhanced Protective 1266 Immunity. Immunity 48, 716-729.e8 (2018); Joshi, N. S. et al. Inflammation directs memory precursor and short-lived effector CD8(+) T cell fates via the graded expression of T-bet transcription factor. Immunity 27, 281-295 (2007)）。理論に束縛されることを望まないが、これらの結果はまとめて、TOXがKLRG1+ TEFF系統の発達を抑制する一方で、疲弊のいくつかの重要な発達的ハロマークを助長することによってTEXの生成を促進することを示唆する。
【０２８８】
実施例１４：カルシウムシグナル伝達およびＮＦＡＴ２は、ＴＥＸにおけるＴＯＸ発現を誘導するが維持しないために必要とされる。
TEXの発達におけるTOXの発現を支配するメカニズムを次に評価した。CD4+ CD8+（DP）胸腺細胞およびニューロンでは、TOXの発現はカルシウムおよびカルシニューリンのシグナル伝達に依存する（Aliahmad, P. et al. TOX Provides a Link Between Calcineurin Activation and CD8 Lineage Commitment. J Exp Med 199, 1089-1099 (2004); Artegiani, B. et al. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J 34, 896-910 (2015)）。ジアシルグリセロールアナログホルボールミリスチン酸アセテート（PMA）およびカルシウムイオノフォアイオノマイシン（Iono）またはIono単独でのDP胸腺細胞の処理は、TOX56を誘導できることが示されている。ここでは、Ionoのみは末梢ナイーブCD8+ T細胞においてTOX発現を誘導したのに対し、PMAのみまたはPMAのIonoへの添加はTOXを誘導できなかったことが発見された（図５９Ａ）。理論に拘束されるつもりはないが、これらの結果は、成熟CD8+ T細胞におけるTOX発現が主にカルシニューリン媒介シグナル伝達によって調節されることを示唆する。カルシニューリンシグナル伝達は、主にNFATタンパク質の転写および核局在化を介して転写の変化を導く（Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nat Rev Immunol 1278 5, 472-484 (2005)）。NFAT活性化の調節不全、特にパートナーとして正規のAP-1なしで機能するNFAT（Martinez, G. J. et al. The Transcription Factor NFAT Promotes Exhaustion of Activated CD8+ T Cells. Immunity 42, 265-278 (2015)）は、抑制性受容体（Pdcd1およびCtla4を含む）および転写因子（Irf4、Batf、Tcf7、およびTbx21など）を含むTEX遺伝子のサブセットの転写調節において重要な役割を果たす。TEFFからのNFAT1およびNFAT2 DNA結合データの分析は、両方のNFATがTox遺伝子座に結合することができること、およびこれらのNFAT結合部位の多くがTEXにおけるアクセシビリティにおいて変更されていることを示す（図５９Ｂ）。Nfatc1（NFAT2）はTEX対TEFFおよびTMEMにおいて異なって発現されるため（図６０Ａ）、TOX発現に対するこのNFATの役割は、ここで説明する実験の焦点となった（Man, K. et al. Transcription Factor IRF4 Promotes CD8+ T Cell Exhaustion and Limits the Development of Memory-like T Cells during Chronic Infection. Immunity 47, 1129-1141.e5 (2017)）。構成的に活性で核が制限されたCA-NFAT2変異体のレトロウイルス（RV）発現は、インビトロ活性化CD8+ T細胞においてTOXの発現を誘導したが、WT NFAT2はそうでなかった（図５７Ｃおよび図５８Ｂ）（Monticelli, S. & Rao, A. NFAT1 and NFAT2 are positive regulators of IL-4 gene transcription. Eur. J. Immunol. 32, 2971-2978 (2002)）。さらに、NFAT2（NFAT2Flox/Flox xCD4Cre P14; NFAT2 cKO）を欠くP14 T細胞は、LCMV Cl-13感染中にインビボでTOXを発現できなかった（図５７Ｄおよび図５８Ｃ）。上記のTOX cKOデータと一致して、NFAT2欠損P14 T細胞はTEX前駆体の生成に失敗し、代わりに、KLRG1の増加ならびにPD-1およびTcf1の低下を伴い、豊富なTEFFを生成した（図５７Ｄ）。しかしながら、NFAT2 cKOの1つの潜在的な警告点は、変更された初期T細胞の活性化である。このアプローチを補完するために、P14を含むマウスをLCMV Cl-13に感染させ、最初のT細胞活性化が発生した後の時点である、d3 p.i.で開始するカルシニューリン阻害剤FK506で処理した。d3-7 p.i.の間の処置は、CD44発現により測定すると、全体的なT細胞活性化への影響は最小限であったが、TOX発現は有意に減少した（図５７Ｅおよび図５８Ｄ）。さらに、FK506で処理されたマ���スからのP14細胞は、高KLRG1および低Eomes発現、ならびにTcf1発現の失敗に基づき、TOX欠損T細胞を表現型模写した（図５７Ｅ）。NFAT2は多くの転写効果を有し得るため、NFAT2の非存在下における強制されたTOX発現が疲弊の主要な特徴を誘発するのに十分であるか否かが次に疑われた。したがって、ＮＦＡＴ２ ｃＫＯ Ｐ１４ Ｔ細胞を、ＴＯＸを発現するレトロウイルスで形質導入し、その後、ＬＣＭＶ Ｃｌ−１３に感染したマウスに移入した（図５８Ｅ）。NFAT2欠損T細胞におけるTOXの発現はPD-1および他の抑制性受容体の発現を回復させ、EomesおよびTcf-1発現を増加させ、そしてKLRG1を有意に減少させた（図５７Ｆ）。したがって、カルシニューリンおよびNFAT2はTOXを誘導するために必要とされる。さらに、NFAT2-cKO細胞における異所性TOX発現は、初期のTEX分化を回復することができ、このことは、TOXが初期T細胞活性化中に主要なNFAT2依存性TEXイベントであることを示す。
【０２８９】
TOX遺伝子座はTEFFと比較してTEXにおいてエピジェネティックに再構築されたので、疲弊が確立された後のTOXの持続的な発現のために、継続的なカルシウムおよびNFATを介したシグナル伝達が必要とされるか否かを次にテストした。したがって、カルシニューリンシグナル伝達を、慢性感染のd25および29の間にインビボで遮断した（図５８Ｆ）。この期間中のFK506による処置は、TEXの定常状態の増殖的階層を駆動するためにTCRシグナル伝達が必要とされるために、予想されるように、TEXにおけるKi-67を減少させた（図５７Ｇ）（Paley, M. A. et al. Progenitor and Terminal Subsets of CD8+ T Cells Cooperate to Contain Chronic Viral Infection. Science 338, 1220-1225 (2012)）。確立されたTEXのインビボでの処理は、前駆体TEXサブセット（KLRG1LowTcf1Hi）についてわずかに富化されたが、TOX発現にはほとんど影響がなく、本質的にすべてのウイルス特異的TEXは高度にTOX+のままであった（図５７Ｇ）。さらに、PD-1およびEomesの発現は本質的に変化しなかった（図５７Ｇ）。これらのデータは、初期のTOX誘導はNFAT2に依存しているが、TCR駆動の増殖シグナルはなおNFATを必要とし得るにもかかわらず、TOX発現およびTOX依存のTEXプログラムは、一度確立されるとカルシニューリンシグナル伝達から独立することを示す。したがって、疲弊の確立の後、TOX発現は誘導性シグナルから独立し、PD-1発現を駆動して分化のKLRG1+経路を抑制するのに十分である。
【０２９０】
実施例１５：TOXによって誘発される疲弊のプログラム
TOXの発現のみで疲弊を駆動するのに十分か否かをテストするために、インビトロのアプローチを用いて、インビトロで分化したCD8+ T細胞においてTOXの発現を強制した（図５９Ａ）。TOXのRV発現はサイトカイン産生および多機能性を低下させながらPD-1を増加させ、このことは、TOXがTEXのこれら2つの標準的な特徴を駆動できることを示す（図５９Ｂ）（Wherry, E. J. & Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nature Publishing Group 15, 486-499 (2015); Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., van der Most, R. & Ahmed, R. Viral Persistence Alters CD8 T-Cell Immunodominance and Tissue Distribution and Results in Distinct Stages of Functional Impairment. J Virol 77, 4911-4927 (2003)）。インビトロでのTOXの過剰発現により誘発される遺伝子の転写解析は、インビボでのCl-13感染に応答するT細胞の転写シグネチャについて富化された（図５９C）（Doering, T. A. et al. Network Analysis Reveals Centrally Connected Genes and Pathways Involved in CD8+ T Cell Exhaustion versus Memory. Immunity 37, 1130-1144 (2012)）。さらに、TOX発現によりダウンレギュレートされた遺伝子は、急性的に解消された感染からのTMEMシグネチャにおいて富化された（図５９Ｃ）。さらに、TOXを過剰発現するCD8 T細胞は、TEXにおいて特異的にダウンレギュレートされた転写産物の発現が低下した一方で、TEXにおいてユニークにアップレギュレートされた遺伝子のセットについて有意に富化された（図５９Ｄ）（Bengsch, B. et al. Epigenomic-Guided Mass Cytometry Profiling Reveals Disease-Specific Features of Exhausted CD8 T Cells. Immunity 48, 1029-1045.e5 (2018)）。実際、抑制性受容体（Pdcd1、Lag3、Ctla4）および転写因子（Nr4a2、Ikzf3、Tox2、Bhlhe41）などの多くの重要な個々の疲弊遺伝子は、インビトロでの強制的なTOX発現によって誘発されたが、記憶関連遺伝子（Ccr7、Il7r、Sell）は減少した（図５９Ｅ）。
【０２９１】
インビトロで活性化されたCD8+ T細胞におけるこれらの転写結果は、TOXが疲弊の転写プログラムを駆動することができることを示唆する。次に、TOXによる遺伝子発現がT細胞の調節環境の影響を受けるか、または転写協調の広範な可能性を示すかを研究した。この問題に対処するために、TOXをマウスNIH3T3線維芽細胞において異所的に発現させ、次にそれを48時間培養し、TOX誘導性の転写変化について分析した（図５９Ｆ）。線維芽細胞のように異なる細胞型でさえ、TOX発現は、炎症性サイトカイン産生（Irf1、Irf7、Irf9、Stat1）、T細胞活性化および増殖（Cd80、Ptpn22、Lyn）、ならびにカルシニューリンおよびNFATシグナル伝達（Nfatc1、Nfat5、Adgrb2）に関連するものを含む、複数の免疫経路の転写を誘導した（図５９Ｇ、５９J）。さらに、CD8+ T細胞の場合と同様に、線維芽細胞においてTOXによって誘導される転写シグネチャはインビボのTEXのシグネチャについて富化され、線維芽細胞においてTOXによって誘導される多くの個々の遺伝子はT細胞疲弊において潜在的な役割を有する（図５９Ｈ〜５９Ｊ）。これらのデータは、T細胞発達中にクロマチンアーキテクチャに「パイオニア」様効果を有することが最近示されている、関連するHMG TF Tcf1を連想させる（Johnson et al., Lineage-Determining Transcription Factor TCF-1 Initiates the Epigenetic Identity of T Cells. Immunity 48: 243-257.e10 (2018)）。したがって、TOXはTEXの転写プログラムを誘導することができ、少なくとも部分的には無関係な細胞型でそれを行うことさえできた。これらのデータは、TOXがTEXに関連する遺伝子発現を可能にするエピジェネティックな変化を誘発できる場合のTOX依存のTEX転写プログラム誘発のための潜在的なメカニズムを示唆する。
【０２９２】
実施例１６：TOXによるTEXのエピジェネティックプログラミング
近年、TEXはユニークなエピジェネティックなランドスケープを有し、TN、TEFF、およびTMEMと比較して安定かつ明確な細胞系統を示すことが実証された（Pauken, K. E. et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science 354, 1160-1165 (2016); Sen, D. R. et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science 354, 1165-1169 (2016). Philip, M. et al. Chromatin states define tumour-specific T cell dysfunction and reprogramming. Nature 545, 452-456 (2017). Scott-Browne, J. P. et al. Dynamic Changes in Chromatin Accessibility Occur in CD8+ T Cells Responding to Viral Infection. Immunity 45, 1327-1340 (2016)）。したがって、TOXがTEX運命へのこのエピジェネティックなコミットメントを制御するか否かを次に決定した。TOX-/-およびWT P14細胞を、コンジェニックレシピエントマウスに養子移入し、次にLCMV Cl-13感染させた。TOX依存性であるエピジェネティックなランドスケープの変化を規定するため、８日p.i.でWTおよびTOX-/-P14細胞をATAC-seqで分析した。TOXの欠如下において、クロマチンアクセシビリティにおいて変化した〜4,000の領域が存在した。これらの変化の70％超はエンハンサー要素と一致するイントロンまたは遺伝子間領域にあったが、20％はプロモーターまたは転写開始部位（TSS）にあった（図６０Ａ）。TOXの不在下でのこれらの変化の中には、Klrg1、Gzma、Gzmb、Gzmm、Zeb2、およびNr4a1を含む、最終TEFF分化に関連する多くの遺伝子でクロマチンアクセシビリティの増加があった（図６０Ａ）。対照的に、クロマチンアクセシビリティが低下した遺伝子座には、Tcf7（Tcf1をエンコード）の近位にある遺伝子座、ならびに、Ccr7、Slamf6、Bach2、およびIkzf2などのTMEMおよびTEX前駆体に関連する他の遺伝子が含まれた（図６０Ａ）。ピークセットエンリッチメントアプローチを用いて、慢性感染のd8におけるTOX欠損P14細胞のエピジェネティックシグネチャは、急性感染からのTEFFシグネチャについて強く富化され、TEXエピジェネティックランドスケープシグネチャが枯渇していることが見出された（図６０Ｂ）。さらに、TOXの非存在下でよりアクセスしやすくなったKlrg1、Zeb2、およびClnk遺伝子座を含む、TOX依存様式で変化する多くの主要な遺伝子において特定のピークを同定することができ、Tcf7、Bach2、およびIkzf2におけるピークは強く減少または完全に失われた（図６０Ｃ、６０Ｄ）。
【０２９３】
TOXの損失は、TOXがTEXエピジェネティックなランドスケープの重大な割合を確立するために必要であることを示唆したが、TOX発現がTEXに関連するクロマチン変化を誘発するのに十分であるか否かを次に研究した。このアイデアをテストするために、RVを用いてインビトロで活性化されたCD8+ T細胞においてTOX発現を強制し、その後のエピジェネティックな変化を6日後に検査した（図５９Ａ）。TOX発現は、この短期間のインビトロアッセイで378の部位でクロマチン接近性の変化を誘発した（図６３Ａ）。これらのTOX誘発クロマチン変化の大部分（91％）は、イントロンまたは遺伝子間領域でのアクセシビリティの増加であった（図６０Ｅおよび図６１Ａ）。TOX発現によって誘発されるエピジェネティックな変化は、インビボTEXで観察された景観について強く富化されたが、インビボT細胞分化と比較してこの短期インビトロアッセイの側面を反映し得るか、または我々が以前に同定したTEXおよびTEFFの間に共有される共通のエピジェネティックモジュールを強調し得る、TEFFとの重複も示した（Pauken, K. E. et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science 354, 1160-1165 (2016);Sen, D. R. et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science 354, 1165-1169 (2016)）。しかしながら、強制されたTOX発現によって開かれた領域の少なくとも1つはPdcd1 TSSの23.8kb上流のTEX特異的エンハンサーであり（図６１Ｂ）、このことは、少なくともいくつかの疲弊特異的なエピジェネティックな変化がTOXによってインビトロで誘発され得ることを示す（Pauken, K. E. et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science 354, 1160-1165 (2016); Sen, D. R. et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science 354, 1165-1169 (2016)）。
【０２９４】
HMGファミリーのいくつかのメンバーは本質的にクロマチン構造を変更することができる。ただし、多くの転写およびヒストン修飾の変化は、追加のタンパク質複合体６１の動員によって可能になる。特に、TOXによって引き起こされるエピジェネティックな変化は、クロマチンのオープニングと遺伝子発現の増加とに強い関連性が存在し、その逆も同じなので、機能的に関連するイベントに対応していた（図６０Ｇおよび図６１Ｃ）。TOXによって誘発されるTEX関連のエピジェネティックな変化のメカニズムを調査するために、免疫沈降とそれに続く質量分析（MS）を用いて、TOXに結合したタンパク質を同定した（図６１Ｄ）。インビボTEXは多数、生成することは難しいので、高レベルのTOXを発現するEL4胸腺腫細胞をここでは用い、それはTEXのいくつかの特徴をモデル化するために以前に使用されている（Sen, D. R. et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science 354, 1165-1169 (2016); Kao, C. et al. Transcription factor T-bet represses expression of the inhibitory receptor PD-1 and sustains virus-specific CD8. Nat Immunol 12, 663-671 (2011)）。MS分析は、クロマチンの組織化およびリモデリング、RNAプロセッシングおよび翻訳、ならびにDNA複製に関与するタンパク質を、主要なTOX結合パートナーとして同定した（図６０Ｈ、図６１Ｅ）。STRINGタンパク質−タンパク質ネットワーク分析は、ヒストンH4およびH3アセチル化に関与するHBO1複合体を、タンパク質の主要なTOX結合セットとして同定した（図６０Ｉ）。実際、ヒストンH4をターゲットとするHBO1複合体（Kat7、Ing4、mEaf6、Jade2）の4つすべてのメンバーがTOXに強く結合していることが見出された（図６０Ｈ、６０Ｉ）（Lalonde, M. E. et al. Exchange of associated factors directs a switch in HBO1 acetyltransferase histone tail specificity. Genes & Development 27, 2009-2024 (2013); Miotto, B. & Struhl, K. HBO1 Histone Acetylase Activity Is Essential for DNA Replication Licensing and Inhibited by Geminin. Molecular Cell 37, 57-66 (2010)）。さらに、共免疫沈降実験に基づいて、TOXは、HBO1複合体のアセチルトランスフェラーゼ成分であるKat7と直接、相互作用した（図６０Ｊ）。ゲノムレベルでは、Kat7は、Tox、Tcf7、Foxo1、およびIzkf1の近位の領域を含むTOX結合遺伝子座の高い比率で有意に富化されていることが見出された（図６０Ｋおよび図６１Ｆ）。さらに、TOXはまた、ヒストンH3修飾ではなくトータルおよびアセチル化ヒストンH4と共免疫沈降し（図６０Ｌおよび図６１Ｇ）、このことは、HBO1のTOXへの動員が、ヒストン修飾およびクロマチンの変化を引き起こすことを示唆する。したがって、TOXは、慢性感染症および癌の間のTEX系統の運命決定に関連するエピジェネティックな遺伝子座に、ヒストン修飾複合体を直接、リクルートすることができる。
【０２９５】
討論
TEXが、機能的に乏しいTEFFまたはTMEMの１つの型であるか否か、それとも別個の異なる系統なのかは、長年の疑問である。この明確な細胞運命へのコミットメントの原因となる主要なイベントは、わかりにくいままである。TOXの主要な役割は、TEX特異的エピジェネティックプログラムの疲弊およびイニシエーターの標準的な特徴の主要なインデューサーとしてここに示された。これらの発見はいくつかの潜在的な意味を有する。最初に、TOX発現およびTOXによって制御される分子イベントは、TEXをより正確に検出、定量化、および評価するのに役立ち得る。なぜなら、TEXを特異的に規定および監視するのを不十分にする他のTEXマーカー（PD-1など）も他の活性化されたT細胞によっても発現されるからである。特に、ヒトCD8+ T細胞の最近のCyTOFの研究では、HIVおよび肺癌におけるTEXの大多数においてTOX発現が見出された（Bengsch, B. et al. Epigenomic-Guided Mass Cytometry Profiling Reveals Disease-Specific Features of Exhausted CD8 T Cells. Immunity 48, 1029-1045.e5 (2018)）。したがって、疲弊において原因となる役割を持つ高度にTEXに偏ったTFとしてTOXを同定すると、人間の疾患のTEX設定をより良く同定および評価することを許容し得る。
【０２９６】
TOX発現はTEXだけに限定されないことに注意すべきである。TEXプログラムを誘発するのに十分な長さまたは十分な濃度でこのTOX発現は存在しないかもしれないが、TOXの一過性の発現は、急性的に解決された感染中に明らかに観察された。あるいは、TOXは、急性的に解消された感染症において異なる役割を有し得る。たとえば、確立されたTRMはTOX-68であるが、いくつかのTOX遺伝子発現は、特に、TEFF集団のKLRG1LOWサブセットからも生じる（Milner, J. J. et al. Runx3 programs CD8+ T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature 1-24 (2017). doi:10.1038/nature24993; Mackay, L. K. et al. The developmental pathway for CD103+CD8+ tissue-resident memory T cells of skin. Nat Immunol 14, 1294-1301 (2013)）、組織常駐メモリー細胞（TRM）（Chang, J. T., Wherry, E. J. & Goldrath, A. W. Molecular regulation of effector and memory T cell differentiation. Nat Immunol 15, 1104-1115 (2014); Beura, L. K. et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph- Node-Resident Memory T Cells. Immunity 48, 327-338.e5 (2018)）の早期の確立において明らかである。さらに、TOXはCD4+ T、ナチュラルキラー、および生来のリンパ様細胞の発達に必要である。理論に拘束されるつもりはないが、自己免疫疾患におけるCD8+ T細胞におけるTOXの可能性ある役割が存在し得る。TOXはTEX以外の役割を有し得るが、ここに示す新しいデータは、TEXの明確な機能として、以前には高く評価されていない高度かつ安定したTOX発現の役割を強調する。
【０２９７】
第２の意味は、これらの研究が、可逆性および再活化（re-invigoration）の理解に関連する疲弊の主要な分子基盤を指摘することである。理論に拘束されるつもりはないが、PD-1または他の阻害性受容体の遮断に続くTEXの再活化は、癌治療のためのチェックポイント遮断中にヒトにおいて発生し得る。しかしながら、そのような再活化は、CD8+ T細胞の状態を変化させ、それらを一時的により機能的にするが、それらの運命は変えない。実際、PD-1経路の遮断は、エピジェネティックなランドスケープの変調にほとんど影響を与えず、ヒトにおけるチェックポイント遮断効果の耐久性について潜在的な関連性を伴う観察である、元の疲弊状態に戻ったTEXを再活化した。エピジェネティックランドスケーププログラミングを含むTOXまたはTOXに依存するイベントは、PD-1遮断後でさえTEXのこの発達の柔軟性がない主な理由であり得る。したがって、TOXは新しい治療標的を示し得る。しかしながら、TOXの欠如は、終末KLRG1HI細胞の生成を促進し、これは、高い機能性を伴う運命であるが、特に慢性刺激の設定においては耐久性が乏しい。したがって、より耐久性のあるTMEM系統へ向かう系統運命再分化も促進するストラテジーでTOX治療ターゲティングを補完することが必要であり得る。たとえば、少なくともいくつかのKLRG1HIエフェクターCD8+ T細胞はTMEM発生経路に戻ることができるかもしれないが、Id2の喪失などの追加の転写操作も必要とされ得る。それにもかかわらず、ここで明らかにされたTEXにおけるTOXの役割は、疲弊の分子的、転写的、およびエピジェネティックな基礎の理解に役立つだけでなく、新しい治療の機会にもつながり得る。
【０２９８】
初期のTOX誘導のためのNFATおよびカルシニューリンへのリンクは、TCRシグナル伝達（またはカルシウムシグナル伝達）だけがNFAT依存性の反応不応状態を誘発するインビトロアネルギーに関する以前の研究を思い起こさせる。より最近の研究では、これらのイベントはAP-131なしで機能する「パートナーレス」のNFATによって転写的に模倣され得ることが示されている。パートナーレスのNFAT転写プログラムは主要なTEX遺伝子のサブセットを含まなかったが、インビトロのアネルギーとインビボの疲弊との間の関係はほとんど理解されていないままである。これらの新しいTOXデータは、両方の設定の早期に必要とされるコアNFAT回路を介するアネルギーおよび疲弊の観察を調和させ得る。しかしながら、TEXとアネルギーまたはトレラント細胞と間の１つの違いは、TEXが、アネルギー細胞と異なり、少なくとも最初は獲得したエフェクター機能を有する細胞から生じることである。したがって、アネルギーまたはトレラント細胞は、ナイーブなエピジェネティックなランドスケープの状況でTOX発現を経験し得るが、TEXの発達は、初期のTEFF状態から開始するTOXエピジェネティックリモデリングを開始する。この共有される初期のカルシウム−NFAT−TOX回路は、インビボTEXの場合、後の時点で持続的なカルシウムシグナル伝達およびNFATをもはや必要としない、疲弊を駆動する自己強化型TOX回路を最終的に誘導し得る。
【０２９９】
疲弊に関する初期の研究のいくつかは、機能の喪失の時間的に進行するパターンを示した。その後の研究は、初期の時点で、疲弊への運命のコミットメントは可逆的であり、機能的なTMEMが形成され得る一方、2〜4週間の慢性感染の後、TEXの運命は永続的に確立され、柔軟性がなくなる。ここに記載されるNFATで開始されたTOX依存性のフィードフォワード回路は、この疲弊への進行的なコミットメントと一致しており、進行的な運命の非柔軟性に関する説明を提供する。これらのデータは、TEXの発達における多段階プロセスの可能性も示唆する。理論に縛られることを望まないが、本明細書に提示されるデータは、最初のステップがTOXおよび／またはおそらくTOX依存性Tcf1発現によるKLRG1HI細胞運命の抑制であり得ることを示唆する。慢性感染の最初の週の間にTEX前駆細胞集団が維持されると、TEXへの完全な運命のコミットメントを確実にするために、次の1〜3週にわたって追加のエピジェネティックなイベントが必要とされる可能性がある。これらのイベントの少なくとも1つは、NFATに依存しない転写環境を形成し、長期のTOX発現を確実にする、Tox遺伝子座でのTOXを介した自己強化型の変更のセットに関連し得る。さらに、TOXは、PD-1およびその他の抑制性受容体、Tcf1、Eomesおよび他のTFを含む、耐久性のあるTEX増殖階層およびTEX運命を確立するために必要な主要遺伝子の多くの発現をエピジェネティック的および発達的に制御する。
【０３００】
多くのHMGファミリーメンバーは、我々の独自の分析と一致したTOXについて報告される高度にGCが豊富な結合部位と一致する比較的雑多なDNA結合特性を有する。したがって、TEX発達プログラムを通じてリクルートおよび使用されるTOXパートナーをさらに理解することが将来的に重要になるであろう。しかしながら、TOXに依存する疲弊のプログレッシブモデルは、TEXの発達上の柔軟性、および疲弊を防止または逆転させることを意図した治療法のタイミングに影響を与える。
【０３０１】
理論に縛られることを望まないが、本明細書に提示される観察は、TOXが免疫細胞における他の発達的プログラマーと類似したTEXのマスターレギュレーターであるモデルと一致する。まとめると、これらのデータは、TOXがTEXの発達に必要かつ十分であることを示す。TEXのエピジェネティックなプログラミング経路の同定は、この疾患関連細胞型のメカニズムの理解および治療標的の新たな機会を開く。TEXをさまざまな設定でより正確に規定すること、ならびに、TOX、HBO1、および／またはKat7活性の調節およびTEXにおけるTOX依存性エピジェネティック変化のターゲティングに基づく治療法を想定すること、が今や可能である。
【０３０２】
実施例１７：T細胞疲弊を低減または排除するためのクラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復（CRISPR）システムの使用
CRISPRシステムとは、これらに限らないが、遺伝子の切除、遺伝子の変異（たとえば、点変異、フレームシフト変異、および目的の遺伝子の発現を変化させるその他の変異の導入）、外来遺伝子要素の組み込み（たとえば、親和性タグ、蛍光タグ、および他の外来マーカーなどの外来コーディング領域の導入）、相同性指向性修復（HDR）およびDNAメチル化による編集、を含む、さまざまなタイプのゲノム編集に役立つシステムを指す。CRISPRシステムは、一般に、ゲノム内で標的特異的様式でヌクレアーゼ活性（すなわち、DNAの切断）を駆動するために、CRISPRファミリー酵素（たとえば、Cas9）およびガイドRNA（gRNA）を用いる。CRISPRシステムにおいて有用なポリヌクレオチドは当業者に知られており、これらに限らないが、ガイドRNA（gRNA）、CRISPR RNA（crRNA）、トランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）、シングルガイドcrRNAおよびtracrRNA融合（sgRNA）、CRISPRファミリー酵素をコードするポリヌクレオチド、CRISPRシステム発現ベクター（たとえば、CRISPRファミリー酵素、gRNA、crRNA、tracrRNA、sgRNA、またはそれらの組み合わせをコードするベクター）、またはそれらの組み合わせ、を含む。CRISPRシステムは文献でより詳細に説明されている。たとえば、両方とも全体が引用により本明細書に組み込まれる、M. Adli (“The CRISPR tool kit for genome editing and beyond”; Nature Communications; volume 9 (2018), Article number: 1911) および Y. Lei (“Targeted DNA methylation in vivo using an engineered dCas9-MQ1 fusion protein”; Nature Communications; volume 8 (2017), Article number: 16026)を参照のこと。
【０３０３】
上記のシステムの１つまたは複数は、疲弊に関連する１つまたは複数の遺伝子または調節領域、たとえばエピジェネティック経路の１つまたは複数の遺伝子の定方向突然変異または修飾を作り出すのに用いられる。そのシステムは、オープンクロマチン領域（ＯＣＲ）を編集（たとえば、削除または変更）するために用いることができる。システムは、表６に列記されるオープンクロマチン領域（OCR）を編集（たとえば、削除または変更）するために用いることができる。システムは、インビボ（すなわち、対象内）またはインビトロ（すなわち、対象の外）で用いることができる。
【０３０４】
上記のシステムの１つまたは複数は、Ｔ細胞においてＴｏｘまたはＴｅｔ２の定方向突然変異または修飾を作り出すために用いられる。このシステムは、インビトロ（すなわち、対象の外部）および／またはインビボ（すなわち、対象内）のＴ細胞におけるＴｏｘまたはＴｅｔ２を変異または改変するために用いることができる。より具体的には、ToxまたはTet2の定方向突然変異または修飾は、T細胞疲弊が防止または低減または逆転されるように選択されるであろう。同様に、ToxまたはTet2の発現を調節する原因となる配列を改変または変異するために同じシステムを用いることができる。定方向突然変異および改変を行うために必要とされる操作されたタンパク質および核酸システム（たとえば、ToxまたはTet2に相同なガイドRNAを備えたCRISPR/Cas9システム、およびそのシステムを細胞に送達するための組成物）に加えて、改変T細胞はToxおよび／またはTet2の発現の変化、またはToxおよび／またはTet2遺伝子の改変バージョンの発現を伴って生産されよう。場合によっては、Tox遺伝子とTet2遺伝子との両方、およびそれらの結果として生じるタンパク質配列が変異または修飾されよう。たとえば、ToxおよびTet2をコードする核酸配列の場合、コードする核酸を変異させるか、またはそのメチル化パターンを変化させることができる。変異した配列は、野生型配列と比較して変更された転写または翻訳効率を有するか、またはコードされたタンパク質配列が変更されるか、または所望の結果に応じて両方であろう。コードされたタンパク質配列の変化は、T細胞疲弊を減少または排除する様式で活性を変化させることにより、ToxまたはTet2遺伝子産物（または両方の産物）の活性に影響を与えよう。コードされたタンパク質配列の変化は、代わりに、ToxまたはTet2遺伝子産物の一方または両方の正常な活性を低下させるか、または正常な活性を排除することができる（たとえば、ノックアウト変異）。同様に、ToxまたはTet2遺伝子産物の転写を調節する配列（プロモーター配列など）に関して、上記のCRISPR/Cas9システム（または遺伝子の変異／修飾を指示できる他のシステム）を用いて、ToxまたはTet2遺伝子の転写レベル、または両方の遺伝子の転写レベルがT細胞疲弊が減少または排除されるように変更されているT細胞を生産することができる。
【０３０５】
（表４）遺伝子−クラスターの関係
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【０３０６】
（表５）Tox KOデータ：疲弊特異的な様式でToxによりエピジェネティックに変更された非コーディングゲノム位置
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【０３０７】
（表６）Tox vs 対照GFP RVインビトロで形質導入されインビトロ活性化されたCD8+ T細胞のATAC-Seq
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【０３０８】
（表７）EL4細胞におけるTox免疫沈降および質量分析の後のMiST分析
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【０３０９】
（表８）エピジェネティック調節遺伝子
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【０３１０】
他の実施形態
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの列挙は、任意の単一の要素またはリストされた要素の組み合わせ（またはサブコンビネーション）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態またはその一部と組み合わせて、その実施形態を含む。
【０３１１】
本明細書に引用されるそれぞれおよびすべての特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。本発明は特定の実施形態を引用して開示されているが、本発明の他の実施形態および変形が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような実施形態および同等の変形を含むと解釈されることを意図する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図２９−４】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３０−４】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３２−４】
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【図３２−５】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３３−４】
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【図３３−５】
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【図３３−６】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５１−３】
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【図５１−４】
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【図５１−５】
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【図５２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５３−３】
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【図５３−４】
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【図５３−５】
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【図５４−１】
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【図５４−２】
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【図５４−３】
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【図５４−４】
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【図５５−１】
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【図５５−２】
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【図５５−３】
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【図５５−４】
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【図５５−５】
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【図５５−６】
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【図５５−７】
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【図５５−８】
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【図５６−１】
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【図５６−２】
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【図５６−３】
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【図５６−４】
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【図５６−５】
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【図５６−６】
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【図５６−７】
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【図５６−８】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５７−３】
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【図５７−４】
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【図５７−５】
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【図５８−１】
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【図５８−２】
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【図５８−３】
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【図５９−１】
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【図５９−２】
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【図５９−３】
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【図５９−４】
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【図６０−１】
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【図６０−２】
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【図６０−３】
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【図６０−４】
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【図６０−５】
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【図６０−６】
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【図６１−１】
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【図６１−２】
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【図６１−３】
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【図６１−４】
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【図６２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021501156.tif 000399
2021501156.tif 000400
2021501156.tif 000401