(57)【要約】ＣＡＲ−Ｔ細胞機能を増強するＣＤ２８の細胞質ドメインの変異型、核内因子κＢ（ＮＦκＢ）のシグナル伝達を増強する４１ＢＢの細胞質ドメインの変異型、またはそれらの組合せを有する共刺激シグナル伝達領域を含む、がんを標的として死滅させるために養子細胞移入とともに使用され得るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドが本明細書において開示される。また、これらのＣＡＲを発現するように設計された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞など）が開示される。さらに、ＣＡＲおよび１以上のＴＲＡＦタンパク質を共発現する免疫エフェクター細胞が開示される。したがって、開示される免疫エフェクター細胞の養子移入を含む、腫瘍関連抗原を発現するがんを有する対象に抗腫瘍免疫を与える方法も開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、および共刺激シグナル伝達領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、ここで共刺激シグナル伝達領域が、核内因子κＢ（ＮＦκＢ）のシグナル伝達を増強する４１ＢＢの細胞質ドメインの変異型、ＣＡＲ−Ｔ細胞融合を増強するＣＤ２８の細胞質ドメインの変異型、またはそれらの組合せを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
【請求項２】
共刺激シグナル伝達領域が、ＹＭＮＭサブドメインを持たないＣＤ２８の細胞質ドメインを含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
共刺激シグナル伝達領域が、ＰＲＲＰサブドメインを持たないＣＤ２８の細胞質ドメインを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
共刺激シグナル伝達領域が、ＰＹＡＰサブドメインを持たないＣＤ２８の細胞質ドメインを含む、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
共刺激シグナル伝達領域が、４１ＢＢの２つの細胞質ドメインを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
共刺激シグナル伝達領域が、ＴＲＡＦ結合領域に少なくとも１つの変異を有する４１ＢＢの２つの細胞質ドメインを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
共刺激シグナル伝達領域が、ＴＲＡＦ結合領域に少なくとも２つの変異を有する４１ＢＢの２つの細胞質ドメインを含む、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
ＣＡＲポリペプチドが以下の式によって規定される、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド：
ＳＰ−ＴＡＡ−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ；または
ＳＰ−ＴＡＡ−ＨＧ−ＴＭ−ＩＳＤ−ＣＳＲ
ここで、「ＳＰ」はシグナルペプチドを表し、
「ＴＡＡ」は腫瘍関連抗原結合領域を表し、
「ＨＧ」は任意のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は二価のリンカーを表す。
【請求項９】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の組換えポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
【請求項１１】
請求項１０記載の単離された核酸配列を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載のベクターを含む細胞。
【請求項１３】
αβＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、制御性Ｔ細胞、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、請求項１２記載の細胞。
【請求項１４】
ＣＡＲの抗原結合ドメインがＴＡＡに結合した場合に抗腫瘍免疫を示す、請求項１３記載の細胞。
【請求項１５】
異種キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドおよび１以上のＴＲＡＦタンパク質を共発現する、免疫エフェクター細胞。
【請求項１６】
ＴＲＡＦタンパク質が、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、またはそれらのあらゆる組合せを含む、請求項１５記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項１７】
ＣＡＲが請求項１〜９のいずれかに記載の組換えポリペプチドを含む、請求項１６または１７に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項１８】
ＴＡＡを発現するがんを有する対象に抗腫瘍免疫を与える方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチドを発現するように遺伝子改変された有効量の免疫エフェクター細胞、または請求項１２〜１７のいずれかに記載の有効量の免疫エフェクター細胞を対象に投与し、それにより哺乳類に抗腫瘍免疫を与えることを含む方法。
【請求項１９】
免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および制御性Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
チェックポイント阻害剤を対象に投与することをさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはそれらの組合せを含む、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年９月２２日に出願された米国仮出願第６２／５６１，８１５号、２０１７年１２月１１日に出願された米国仮出願第６２／５９７，１２８号、２０１８年３月８日に出願された米国仮出願第６２／６４０，１５３号、２０１８年５月３日に出願された米国仮出願第６２／６６６，３８１号、および２０１８年５月３日に出願された米国仮出願第６２／６６６，３８５号の利益を主張し、これらすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本願は、２０１８年８月３１日に作成された「320103-2020 Sequence Listing_ST25」という題名のＡＳＣＩＩ．ｔｘｔファイルとして電子形式で提出された配列表を含む。配列表の内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
手術、放射線療法および化学療法は、がん（白血病、固形腫瘍および転移を含む）の処置のために標準的に受け入れられている手法である。身体の免疫系を直接または間接的に使用してがんを縮小または根絶する免疫療法（生物学的療法、生物療法または生体応答修飾物質を用いた治療法と呼ばれる場合もある）は、従来のがん療法の補助として長年研究されてきた。ヒトの免疫系はがん療法のための未開拓資源であり、免疫系の構成要素を適切に利用することで有効な処置が開発できると考えられている。
【０００４】
抗がんＴ細胞療法の主な進歩は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のシグナル伝達ドメインに融合した抗体に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である（Davila, M.L., et al., Oncoimmunology, 2012. 1(9):1577-1583）。第１世代のＣＡＲの細胞内ドメインはＣＤ３ζのみを含むが、第２世代のＣＡＲは共刺激ドメイン（ＣＤ２８または４１ＢＢなど）も含む。これらの第２世代のＣＡＲドメインは、マウスにおいて非常に有効な殺腫瘍を支持し、患者におけるＣＡＲ Ｔ細胞療法の臨床評価を導いた。ＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞の可能性は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）患者についての９０％の完全寛解率の報告により確認された（Davila, M.L., et al., Sci Transl Med, 2014. 6(224):224ra25; Maude, S.L., et al., N Engl J Med, 2014. 371(16):1507-17）。しかしながら、ＣＡＲ Ｔ細胞の不十分な持続性および過剰なＴ細胞活性化は再発および重度の毒性にそれぞれ寄与しており、ＣＡＲ Ｔ細胞の生物学を理解する重要な必要性を示唆している（Gangadhar, T.C. and R.H. Vonderheide, Nat Rev Clin Oncol, 2014. 11(2):91-9）。さらに、再発および毒性はすべての第２世代のＣＡＲで見られており、これはＣＡＲへの共刺激ドメインの付加が有効性を改善したものの、生物学的合併症を犠牲にしたことを示唆している。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書は、共刺激が増強された養子細胞移入とともに使用され得るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを開示する。開示されるＣＡＲは、ＣＡＲ−Ｔ細胞機能のシグナル伝達を増強するＣＤ２８および／または４１ＢＢの細胞質ドメインにおいて１以上の変異を有する共刺激シグナル伝達領域を含む。
【０００６】
いくつかの実施態様において、変異した共刺激シグナル伝達領域はＣＡＲ−Ｔ細胞の消耗を減少させる。ＣＤ２８ドメインは、ＴＣＲ刺激後にシグナル伝達経路を調節する３つの細胞内サブドメイン（ＹＭＮＭ、ＰＲＲＰおよびＰＹＡＰ）を含む。いくつかの実施態様において、開示されるＣＡＲは、ＣＡＲ−Ｔ細胞機能を増強する（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞の消耗を減少させる）これらのサブドメインのうち１つ以上において変異または欠失を含む。
【０００７】
本明細書に開示されるように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によって支持される核内因子κＢ（ＮＦκＢ）シグナル伝達のレベルは、その機能に相関する。したがって、本明細書は、ＮＦκＢシグナル伝達の増強を伴うキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開示する。本明細書にさらに開示されるように、共刺激タンパク質４１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）を介してＴ細胞におけるＮＦκＢシグナル伝達を活性化する。したがって、開示されるＣＡＲは、ＴＲＡＦタンパク質による４１ＢＢ活性化を増強し得る。いくつかの例において、開示されるＣＡＲは、４１ＢＢの２以上のコピーを含む。また、本明細書に開示されるように、ＴＲＡＦタンパク質は、ＣＡＲの発現、持続性、増殖、サイトカイン産生および細胞毒性を独立して調節し得る。さらに、各ＴＲＡＦはＣＡＲ Ｔ細胞機能に異なる影響を与える。
【０００８】
したがって、本明細書は、特定のＴＲＡＦタンパク質（ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６またはそれらのあらゆる組合せなど）との結合を増強する変異を有する１以上の４１ＢＢドメインを含むＣＡＲを開示する。いくつかの例において、４１ＢＢの変異は、（例えばＮＦ−κＢを介して）Ｔ細胞のＴＲＡＦ１および／またはＴＲＡＦ２依存的な増殖および生存を増強する。いくつかの例において、４１ＢＢの変異は、（例えばＩＲＦ７／ＩＮＦβを介して）ＴＲＡＦ３依存的な抗腫瘍効果を増強する。
【０００９】
また、本明細書に開示されるように、いくつかの例において、ＴＲＡＦタンパク質は、ＮＦκＢおよび４１ＢＢとは独立にＣＡＲ Ｔ細胞機能を増強し得る。例えば、いくつかの例において、ＴＲＡＦタンパク質はＴ細胞のＣＤ２８共刺激を増強し得る。したがって、本明細書はまた、ＣＡＲを１以上のＴＲＡＦタンパク質（ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、またはそれらのあらゆる組合せなど）とともに共発現する免疫エフェクター細胞を開示する。いくつかの例において、ＣＡＲは腫瘍抗原を標的とする任意のＣＡＲである。例えば、第１世代のＣＡＲは通常、ＣＤ３ζ鎖由来の細胞内ドメインを有していたが、第２世代のＣＡＲは、様々な共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）由来の細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲのエンドドメインに付加し、さらなるシグナルをＴ細胞に提供した。いくつかの例において、ＣＡＲは、４１ＢＢ活性化の増強を伴う開示されるＣＡＲである。
【００１０】
いくつかの実施態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲ Ｔ細胞機能を増強するＣＤ３ゼータおよび／または４１ＢＢにおける１以上の欠失または変異をさらに含む。
【００１１】
他のＣＡＲと同様に、開示されるＣＡＲポリペプチドは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現するがん細胞に結合し得る結合物質を外部ドメインに含む。開示されるポリペプチドはまた、膜貫通ドメインおよび免疫エフェクター細胞を活性化できるエンドドメインを含み得る。例えば、エンドドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインおよび任意で１以上の共刺激シグナル伝達領域を含み得る。
【００１２】
いくつかの実施態様において、抗ＴＡＡ結合物質は、ＴＡＡに特異的に結合する抗体フラグメントである。例えば、抗原結合ドメインは、ＴＡＡに特異的に結合する抗体のＦａｂまたは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。いくつかの実施態様において、抗ＴＡＡ結合物質は、ＴＡＡに特異的に結合するアプタマーである。例えば、抗ＴＡＡ結合物質は、ＴＡＡに結合する能力に基づいてランダム配列プールから選択されたペプチドアプタマーであり得る。抗ＴＡＡ結合物質はまた、ＴＡＡの天然リガンド、またはＴＡＡに結合できるそのバリアントおよび／またはフラグメントであり得る。
【００１３】
いくつかの実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインである。いくつかの例において、共刺激シグナル伝達領域は、１以上の細胞内シグナル伝達分子の１、２、３または４つの細胞質ドメインを含む。
【００１４】
開示されるＣＡＲポリペプチドをコードする単離された核酸配列、この単離された核酸を含むベクター、およびこのベクターを含む細胞もまた、開示される。例えば、該細胞は、アルファ−ベータＴ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、および制御性Ｔ細胞からなる群から選択される免疫エフェクター細胞であり得る。
【００１５】
いくつかの実施態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインが腫瘍上のＴＡＡに結合した場合に、該細胞は抗腫瘍免疫を示す
【００１６】
開示されるＴＡＡ特異的なＣＡＲを用いて遺伝子改変された有効量の免疫エフェクター細胞を対象に投与することを含む、ＴＡＡを発現するがんを有する対象に抗腫瘍免疫を与える方法もまた、開示される。
【００１７】
本発明の１以上の実施態様の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１は、種々の細胞内ドメインを有するｍＣＤ１９標的ＣＡＲを含むマウスＴ細胞の比較である。（Ａ）細胞毒性アッセイ。ＣＡＲ Ｔ細胞をＥＬ４−ｍＣＤ１９細胞と図に示されるＥ：Ｔ比で共培養した。細胞毒性を、クロム放出アッセイを用いて評価した。データは３通りの独立した３回の実験の代表である。対応のないｔ検定。
【図１Ｂ】図１は、種々の細胞内ドメインを有するｍＣＤ１９標的ＣＡＲを含むマウスＴ細胞の比較である。（Ｂ）サイトカイン産生。ＣＡＲ Ｔ細胞を３Ｔ３−ｍＣＤ１９細胞と２４時間共培養した。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイのために上清を収集した。データは、３通りの独立した２回の実験の代表である。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意でない。
【図１Ｃ】図１は、種々の細胞内ドメインを有するｍＣＤ１９標的ＣＡＲを含むマウスＴ細胞の比較である。（Ｃ）生存率。Ｅμ−ＡＬＬ細胞の注射の６日後、マウスにシクロホスファミド（ＣＴＸ）を腹腔内注射し、１日後に５×１０６個のＴ細胞を静脈内注射した。生存率のデータを２つの独立した実験からプールした（合計ｎ＝４５）。陰性対照群は、シクロホスファミド単独またはｍ１９ΔｚＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＴＸ±ｍ１９Δｚ）である。ログランク検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意でない。
【図１Ｄ】図１は、種々の細胞内ドメインを有するｍＣＤ１９標的ＣＡＲを含むマウスＴ細胞の比較である。（Ｄ）５×１０６用量でのＣＡＲ Ｔ注射の３週間後におけるインビボ(in vivo)でのＢ細胞の死滅およびＴ細胞の持続性。Ｅμ−ＡＬＬ細胞の注射の６日後、マウスにシクロホスファミド（ＣＴＸ）を腹腔内注射し、１日後に５×１０６個のＴ細胞を静脈内注射した。陰性対照群は、シクロホスファミド単独またはｍ１９ΔｚＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＴＸ±ｍ１９Δｚ）である。各ドットは１匹のマウスを表す。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意でない。
【図１Ｅ】図１は、種々の細胞内ドメインを有するｍＣＤ１９標的ＣＡＲを含むマウスＴ細胞の比較である。（Ｅ）生存率。Ｅμ−ＡＬＬの注射の７日後、マウスにＣＴＸを腹腔内注射し、１日後にＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射した。生存率のデータは１回の実験からのものである（合計ｎ＝３９）。ログランク検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意でない。
【図１Ｆ】図１は、種々の細胞内ドメインを有するｍＣＤ１９標的ＣＡＲを含むマウスＴ細胞の比較である。（Ｆ）３×１０５個のＴ細胞の用量でのＣＡＲ Ｔ注射の４週間後におけるインビボでのＢ細胞の死滅およびＴ細胞の持続性。Ｅμ−ＡＬＬの注射の７日後、マウスにＣＴＸを腹腔内注射し、１日後にＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射した。血液中のＢ（Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋）細胞およびドナーＴ（ＣＤ３＋Ｔｈｙ１．１＋）細胞をＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔカウントビーズを用いて定量化した。各ドットは１匹のマウスを表す。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意でない。
【００１９】
【図２Ａ】図２は、ストレス試験用量において、ヒト４−１ＢＢエンドドメイン（ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ）を含むｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等のインビボにおける機能を示すことを示す。（Ａ）マウス（配列番号２５）およびヒト（配列番号１）の４−１ＢＢエンドドメインのアミノ酸配列アラインメント。同一のアミノ酸をアスタリスクで示す。
【図２Ｂ】図２は、ストレス試験の用量において、ヒト４−１ＢＢエンドドメイン（ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ）を含むｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等のインビボにおける機能を示すことを示す。（Ｂ）ｍＣＤ１９抗原刺激によるＣＡＲ Ｔ細胞における細胞内ＩＦＮγおよびＴＮＦα。１００万個の形質導入されたＴ細胞を、タンパク質輸送阻害剤の存在下で１×１０５個の照射された３Ｔ３−ｍＣＤ１９と４時間共培養した。細胞に対してフローサイトメトリーを行った。データは、３通り行った２回の独立した実験の代表である。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図２Ｃ】図２は、ストレス試験の用量において、ヒト４−１ＢＢエンドドメイン（ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ）を含むｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等のインビボにおける機能を示すことを示す。（Ｃ）細胞毒性アッセイ。ＣＡＲ Ｔ細胞を３Ｔ３−ｍＣＤ１９と１０：１のＥ：Ｔ比で共培養し、標的細胞の死滅をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡシステム上でモニターした。データは３通りの１回の実験からのものである。対応のないｔ検定。
【図２Ｄ】図２は、ストレス試験の用量において、ヒト４−１ＢＢエンドドメイン（ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ）を含むｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等のインビボにおける機能を示すことを示す。（Ｄ）全生存率。マウスをＣＴＸ（２５０〜３００ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内において処理し、ＣＡＲ Ｔ細胞（マウスあたり１．５〜３×１０５個のＣＡＲ Ｔ細胞）で静脈内において処理した。データを４回の独立した実験からプールした。ｎ＝１２７。ログランク検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図２Ｅ】図２は、ストレス試験の用量において、ヒト４−１ＢＢエンドドメイン（ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ）を含むｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等のインビボにおける機能を示すことを示す。（Ｅ）ＣＡＲ Ｔ細胞注射の１週間後における大腿骨のＢ（ＣＤ１９＋Ｂ２２０＋）細胞およびＣＡＲ Ｔ（ＣＤ３＋ＣＡＲ＋）細胞。骨髄細胞を単離し、フローサイトメトリーを行った。データを２回の独立した実験からプールした（合計ｎ＝３３）。各ドットは１匹のマウスを示す。すべての計数を、Ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズを用いて計算した。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【００２０】
【図３Ａ】図３は、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性がインビボでの最適な機能に必要であることを示す。（Ａ）移植の１週間後のＲａｇ１−／−マウスにおけるＣＡＲ Ｔ（ＣＤ３＋ＣＡＲ＋）細胞数およびドナーＴ（ＣＤ３＋Ｔｈｙ１．１＋）細胞数。１００万個のＣＡＲ Ｔ細胞をＲａｇ１−／−マウスに静脈内注射した。１週間後、ＢＭ細胞を単離および染色し、フローサイトメトリーで分析した。各ドットは１匹のマウスを示す。１群あたりｎ＝５。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図３Ｂ】図３は、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性がインビボでの最適な機能に必要であることを示す。１００万個の照射された、または照射されていないＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＴＸ（３００ｍｇ／ｋｇ）で前処理したＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。１週間後、血液およびＢＭを採取および染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）移植の１週間後の血液およびＢＭにおける照射された、および照射されていないＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＡＲ＋）の数。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図３Ｃ】図３は、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性がインビボでの最適な機能に必要であることを示す。１００万個の照射された、または照射されていないＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＴＸ（３００ｍｇ／ｋｇ）で前処理したＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。１週間後、血液およびＢＭを採取および染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ｃ）ＣＡＲ Ｔ移植の１週間後の血液中のＢ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋）の数およびＢＭ中のＢ細胞の割合。データは１回の実験からのものである。各ドットは１匹のマウスを示す。血液試料について１群あたりｎ＝１０；ＢＭ試料について１群あたりｎ＝３。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【００２１】
【図４Ａ】図４は、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い抗アポトーシスタンパク質発現を有することを示す。（Ａ）ｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率。ＣＡＲ Ｔ細胞を作製し、初期の細胞数から４日目の最終的な細胞の収量までの倍率変化によって増殖を評価した。細胞生存率を、自動セルカウンター（BIO-RAD）上でトリパンブルー染色によって測定した。データを１７の独立した産生からプールした。
【図４Ｂ】図４は、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い抗アポトーシスタンパク質発現を有することを示す。（Ｂ）ｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖。ＣＡＲ Ｔ細胞を作製し、初期の細胞数から４日目の最終的な細胞の収量までの倍率変化によって増殖を評価した。細胞生存率を、自動セルカウンター（BIO-RAD）上でトリパンブルー染色によって測定した。データを１９の独立した産生からプールした。
【図４Ｃ】図４は、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い抗アポトーシスタンパク質発現を有することを示す。（Ｃ）フローサイトメトリーによるＣＡＲ Ｔ細胞におけるＢＣＬ２およびＢＣＬ−ＸＬの発現。４日目に、ＣＡＲ Ｔ細胞を抗ＢＣＬ２抗体および抗ＢＣＬ−ＸＬ抗体で細胞内染色し、フローサイトメトリーを行った。細胞を生きているＣＡＲ Ｔ細胞に対してプレゲート(pre-gate)した。データは２回の独立した実験の代表である。
【図４Ｄ】図４は、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い抗アポトーシスタンパク質発現を有することを示す。（Ｄ）抗原刺激後のＢＣＬ２およびＢＣＬ−ＸＬタンパク質発現。４日目の１００万個のＣＡＲ Ｔ細胞を１×１０５個の３Ｔ３−ｍＣＤ１９細胞で４時間刺激した。ＣＡＲ Ｔ細胞からの細胞溶解物を調製し、ＢＣＡを定量化し、総タンパク質について正規化し、ウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロットは２回の独立した実験の代表である。ウエスタンブロットの半定量化を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行った。種々のＣＡＲ Ｔ細胞におけるＢＣＬ２およびＢＣＬ−ＸＬ発現を、βアクチンについて正規化することにより比較した。すべてのデータ、対応のないｔ検定。ｎｓ、有意でない。
【００２２】
【図５Ａ】図５は、ＮＦ−κＢシグナル伝達が４−１ＢＢに基づくＣＡＲ Ｔ細胞の生存率および増殖を調節することを示す。（Ａ）ＮＦ−κＢ／２９３／ＧＦＰ−Ｌｕｃレポーター細胞における形質導入（左）およびＮＦ−κＢの上方調節（右）後のＣＡＲ発現（ｍＣｈｅｒｒｙ）。レポーター細胞にマウスＣＤ１９標的ＣＡＲを形質導入し、ＮＦ−κＢシグナル伝達をフローサイトメトリーによってＧＦＰについて測定した。データは２回の独立した実験の代表である。
【図５Ｂ】図５は、ＮＦ−κＢシグナル伝達が４−１ＢＢに基づくＣＡＲ Ｔ細胞の生存率および増殖を調節することを示す。（Ｂ）ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原刺激後においてｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも大きなＮＦ−κＢシグナル伝達を有する。ＮＦ−κＢ−ＲＥ−ｌｕｃトランスジェニックマウスに由来する３００万個のＣＡＲ Ｔ細胞を、３Ｔ３−ｍＣＤ１９細胞と１０：１の比率で４時間共培養した。細胞溶解物を、ルシフェラーゼアッセイを用いて評価した。データは３通りの３回の独立した実験の代表である。データは平均値±ＳＤを表す。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図５Ｃ】図５は、ＮＦ−κＢシグナル伝達が４−１ＢＢに基づくＣＡＲ Ｔ細胞の生存率および増殖を調節することを示す。（Ｃ）ｈＣＤ１９標的ＣＡＲにおいて評価されたヒト野生型（配列番号１）および変異型（配列番号２〜５）４−１ＢＢエンドドメインのアミノ酸配列。４−１ＢＢエンドドメインのアミノ酸数が示されている。
【図５Ｄ】図５は、ＮＦ−κＢシグナル伝達が４−１ＢＢに基づくＣＡＲ Ｔ細胞の生存率および増殖を調節することを示す。（Ｄ）ｈＣＤ１９ ＣＡＲを形質導入したレポーター細胞のＮＦ−κＢシグナル伝達。ＮＦ−κＢ／２９３／ＧＦＰ−Ｌｕｃレポーター細胞に、ｈＣＤ１９標的ＣＡＲをレトロウイルスによって形質導入した。ＧＦＰ＋細胞の割合をフローサイトメトリーによって測定し、これはＮＦ−κＢシグナル伝達を反映する。データは１回の実験からのものであり、３通り行った。データは平均値±ＳＤを表す。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図５Ｅ】図５は、ＮＦ−κＢシグナル伝達が４−１ＢＢに基づくＣＡＲ Ｔ細胞の生存率および増殖を調節することを示す。（Ｅ）インビトロで培養したｈＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞の１６日目の生存率。ヒトＴ細胞を、０日目に健常なドナーＰＢＭＣから単離した。ＣＡＲ Ｔ細胞を回収し、ビーズを除去し、３Ｔ３−ｈＣＤ１９細胞と５：１の比率で２週間共培養した。細胞数を図に示す時点で測定した。データは３通りの１回の単独の実験からのものである。データは平均値±ＳＤを表す。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図５Ｆ】図５は、ＮＦ−κＢシグナル伝達が４−１ＢＢに基づくＣＡＲ Ｔ細胞の生存率および増殖を調節することを示す。（Ｆ）インビトロで培養したｈＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖。ヒトＴ細胞を、０日目に健常なドナーＰＢＭＣから単離した。ＣＡＲ Ｔ細胞を回収し、ビーズを除去し、３Ｔ３−ｈＣＤ１９細胞と５：１の比率で２週間共培養した。細胞数を図に示す時点で測定した。データは３通りの１回の単独の実験からのものである。データは平均値±ＳＤを表す。細胞増殖曲線、二元配置分散分析。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図５Ｇ】図５は、ＮＦ−κＢシグナル伝達が４−１ＢＢに基づくＣＡＲ Ｔ細胞の生存率および増殖を調節することを示す。（Ｇ）ｈＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞毒性。ＣＡＲ Ｔ細胞を３Ｔ３−ｈＣＤ１９細胞と１０：１の比率で共培養した。標的細胞の死滅をＲＴＣＡによってモニターした。データは３通りの１回の単独の実験からのものである。細胞毒性曲線は平均値のみを示す。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【００２３】
【図６Ａ】図６は、ＴＲＡＦ１阻害がＮＦ−κＢシグナル伝達およびｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞機能に負の影響を与えることを示す。（Ａ）ＮＦ−κＢ／２９３／ＧＦＰ−Ｌｕｃレポーター細胞におけるｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ誘導性ＮＦ−κＢシグナル伝達に対するＴＲＡＦドミナントネガティブ（ＤＮ）タンパク質の効果。レポーター細胞に、ｃｅｒｕｌｅａｎタグ付きのＴＲＡＦ１ ＤＮ、ＴＲＡＦ２ ＤＮまたはＴＲＡＦ３ ＤＮコンストラクトをレトロウイルスによって形質導入し、その後ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲを形質導入した。細胞に対して、ＧＦＰ＋細胞として示されるＮＦ−κＢシグナル伝達についてフローサイトメトリーを行った。データは２回の独立した実験の代表である。
【図６Ｂ】図６は、ＴＲＡＦ１阻害がＮＦ−κＢシグナル伝達およびｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞機能に負の影響を与えることを示す。（Ｂ）ＣＡＲ免疫沈降前後におけるＮＦ−κＢ／２９３細胞溶解物のウエスタンブロット。ＣＡＲを形質導入したＮＦ−ｋＢ／２９３細胞から細胞溶解物を調製し、プロテインＬ磁気ビーズに連結させ、磁石を用いて濃縮し、電気泳動し、ＴＲＡＦ１についてプローブした。データは単一の実験からのものである。
【図６Ｃ】図６は、ＴＲＡＦ１阻害がＮＦ−κＢシグナル伝達およびｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞機能に負の影響を与えることを示す。（Ｃ）野生型およびＴｒａｆ１−／−ｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率および増殖。ＣＡＲ Ｔ細胞を野生型Ｂ６マウスまたはＴｒａｆ１−／−マウスから作製し、初期の細胞数から４日目の最終的な細胞の収量までの倍率変化によって増殖を評価した。細胞生存率を、自動セルカウンター（BIO-RAD）上でトリパンブルー染色によって測定した。データは３通りの単一の実験からのものである。
【図６Ｄ】図６は、ＴＲＡＦ１阻害がＮＦ−κＢシグナル伝達およびｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞機能に負の影響を与えることを示す。（Ｄ）ＣＡＲ Ｔ移植の２週間後の血液中のインビボにおけるＢ細胞死滅およびＣＡＲ Ｔ持続性。野生型Ｂ６またはＴｒａｆ１−／−マウスから調製したＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＴＸで前処理したＴｈｙ１．１マウスに３×１０５個の用量で養子移入した。フローサイトメトリーのために血液を採取した。カウントビーズを用いて細胞数を定量化した。各ドットは１匹のマウスを示す。１群あたりｎ＝４。すべてのデータ、対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意でない。
【００２４】
【図７Ａ】図７は、ＴＲＡＦ２の過剰発現が４−１ＢＢに基づくヒトＣＡＲ Ｔ機能を調節することを示す。（Ａ）ＮＦ−κＢの増加によるヒトＣＤ１９ ＣＡＲ（ｈ１９ＢＢｚ）を形質導入したＮＦ−κＢ２９３レポーター細胞におけるＮＦ−κＢシグナル伝達。細胞に、ＴＲＡＦを伴って、または伴わずにｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲを形質導入した。ＮＦ−κＢをＧＦＰによって測定した。データは３通りの１回の実験からのものである。データは２回の独立した実験の代表である。データは平均値±ＳＤで示される。Ｕｎｔｒａｎｓ、形質導入されていない；＋ＴＦ１、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ１；＋ＴＦ２、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ２；＋ＴＦ３、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ３。棒グラフ、対応のないｔ検定。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図７Ｂ】図７は、ＴＲＡＦ２の過剰発現が４−１ＢＢに基づくヒトＣＡＲ Ｔ機能を調節することを示す。（Ｂ）抗原刺激によるＴＲＡＦ過剰発現を伴うｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率。ＣＡＲ Ｔ細胞を３Ｔ３−ｈＣＤ１９と１０：１の比率で共培養し、細胞数および生存率を３日間毎日測定した。実験を３通りで行った。データは３つのドナーの代表である。データは平均値±ＳＤで示される。Ｕｎｔｒａｎｓ、形質導入されていない；＋ＴＦ１、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ１；＋ＴＦ２、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ２；＋ＴＦ３、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ３。生存率曲線および細胞増殖曲線、二元配置分散分析。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図７Ｃ】図７は、ＴＲＡＦ２の過剰発現が４−１ＢＢに基づくヒトＣＡＲ Ｔ機能を調節することを示す。（Ｃ）抗原刺激によるＴＲＡＦ過剰発現を伴うｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞増殖。ＣＡＲ Ｔ細胞を３Ｔ３−ｈＣＤ１９と１０：１の比率で共培養し、細胞数および生存率を３日間毎日測定した。実験を３通りで行った。データは３つのドナーの代表である。データは平均値±ＳＤで示される。Ｕｎｔｒａｎｓ、形質導入されていない；＋ＴＦ１、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ１；＋ＴＦ２、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ２；＋ＴＦ３、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ３。生存率曲線および細胞増殖曲線、二元配置分散分析。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図７Ｄ】図７は、ＴＲＡＦ２の過剰発現が４−１ＢＢに基づくヒトＣＡＲ Ｔ機能を調節することを示す。（Ｄ）ＴＲＡＦ過剰発現を伴うｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞毒性。ＣＡＲ Ｔ細胞を３Ｔ３−ｈＣＤ１９と５：１の比率で共培養した。標的細胞の死滅をＲＴＣＡによってモニターした。実験を３通りで行った。データは３つのドナーの代表である。細胞毒性のデータは平均値のみで示される。Ｕｎｔｒａｎｓ、形質導入されていない；＋ＴＦ１、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ１；＋ＴＦ２、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ２；＋ＴＦ３、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ３。細胞毒性曲線、コルモゴルフ−スミルノフ検定。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図７Ｅ】図７は、ＴＲＡＦ２の過剰発現が４−１ＢＢに基づくヒトＣＡＲ Ｔ機能を調節することを示す。（Ｅ）種々のｓｃＦｖを有するヒトＣＤ３３標的ＣＡＲ（ｈ３３ＢＢｚ）Ｔ細胞の細胞毒性。ＣＡＲ Ｔ細胞をＣＨＯ−ｈＣＤ３３と１０：１の比率で共培養した。標的細胞の死滅をＲＴＣＡによってモニターした。実験を３通りで行った。データは２回の独立した実験の代表である。細胞毒性のデータは平均値のみで示される。Ｕｎｔｒａｎｓ、形質導入されていない；＋ＴＦ１、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ１；＋ＴＦ２、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ２；＋ＴＦ３、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ３。細胞毒性曲線、コルモゴルフ−スミルノフ検定。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図７Ｆ】図７は、ＴＲＡＦ２の過剰発現が４−１ＢＢに基づくヒトＣＡＲ Ｔ機能を調節することを示す。（Ｆ）ＴＲＡＦ２の同時形質導入を伴う、または伴わないｈ３３ＢＢｚ Ｔ細胞産生の倍率変化。ＣＡＲ Ｔ細胞を作製し、初期の細胞数から最終的な細胞の収量までの倍率変化によって増殖を評価した。データは単一の実験からのものである。Ｕｎｔｒａｎｓ、形質導入されていない；＋ＴＦ１、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ１；＋ＴＦ２、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ２；＋ＴＦ３、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ３。
【図７Ｇ】図７は、ＴＲＡＦ２の過剰発現が４−１ＢＢに基づくヒトＣＡＲ Ｔ機能を調節することを示す。（Ｇ）抗原刺激によるインビトロでのｈ３３ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞増殖。ＣＡＲ Ｔ細胞を増殖色素で染色し、ＣＨＯ−ｈＣＤ３３と１０：１のＥ：Ｔ比で４日間共培養した。ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞増殖を、フローサイトメトリー（ＣＡＲ Ｔ集団における増殖色素のＭＦＩ）によって評価した。実験を３通りで行った。データは単一の実験からのものである。データは平均値±ＳＤで示される。Ｕｎｔｒａｎｓ、形質導入されていない；＋ＴＦ１、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ１；＋ＴＦ２、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ２；＋ＴＦ３、ＣＡＲプラスＴＲＡＦ３。棒グラフ、対応のないｔ検定。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【００２５】
【図８Ａ】図８は、ｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔの免疫表現型およびインビボでの効力の用量滴定を示す。（Ａ）インビボ試験（図１ＣおよびＤ）において５ｘ１０６個の用量で使用された形質導入されたＴ細胞の免疫表現型。細胞を単一の生細胞に対してプレゲートした。
【図８Ｂ】図８は、ｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔの免疫表現型およびインビボでの効力の用量滴定を示す。（Ｂ）Ｔ細胞用量滴定を伴うインビボでのＢ細胞の死滅およびＴ細胞の持続性。Ｅμ−ＡＬＬ注射後、種々の用量のＴ細胞を３００ｍｇ／ｋｇ ＣＴＸで前処理したマウスに与えた。末梢血中のＢ（Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋）細胞およびＴ（ＣＤ３＋Ｔｈｙ１．１＋）細胞を、ＣＡＲ Ｔ注射の３週間後に定量化した。各ドットは１匹のマウスを示す。データは単一の実験からのものである（合計ｎ＝３４）。
【００２６】
【図９Ａ】図９は、蛍光タンパク質タグ付きＣＡＲ Ｔ細胞の遺伝子発現を示す。（Ａ）ｍＣＤ１９標的ＣＡＲの遺伝的構造の模式図。レトロウイルスコンストラクトの長い末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナルΨ、スプライスドナー（ＳＤ）、スプライスアクセプター（ＳＡ）、ｓｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）のＶＨおよびＶＬ領域、細胞外ヒンジ（ＥＣ）、膜貫通（ＴＭ）および細胞内領域を示す。Ｇ／Ｓ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）３リンカー配列。
【図９Ｂ】図９は、蛍光タンパク質タグ付きＣＡＲ Ｔ細胞の遺伝子発現を示す。（Ｂ）ＣＡＲ発現を評価する方法としての蛍光タンパク質とプロテインＬの比較。ｍＣｈｅｒｒｙタグ付きＣＡＲを形質導入した１００万個のＴ細胞を、１μｇのビオチン−プロテインＬとともにインキュベートし、次いで蛍光色素で標識されたストレプトアビジンとともにインキュベートした。細胞に対してフローサイトメトリーを行った。データは４つの独立した実験の代表である。
【図９Ｃ】図９は、蛍光タンパク質タグ付きＣＡＲ Ｔ細胞の遺伝子発現を示す。（Ｃ）抗原で刺激したｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞の主成分分析（ＰＣＡ）。蛍光タンパク質ＧＦＰで標識されたｍ１９ｚ、ｍ１９２８ｚまたはｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲを含むＣＡＲ Ｔ細胞を、３Ｔ３−ｍＣＤ１９ ＡＡＰＣとともに１０：１のＥ：Ｔ比で一晩インキュベートし、ＦＡＣＳでソートし、溶解してＲＮＡを単離した。各群のＣＡＲ Ｔ細胞を、３通りで独立して形質導入、刺激およびソートした。
【図９Ｄ】図９は、蛍光タンパク質タグ付きＣＡＲ Ｔ細胞の遺伝子発現を示す。（Ｄ）ｍ１９ｚおよびｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の両方と比較して、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞において差次的に発現された遺伝子の数（ｎ＝２０５）を示すベン図。蛍光タンパク質ＧＦＰで標識されたｍ１９ｚ、ｍ１９２８ｚまたはｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲを含むＣＡＲ Ｔ細胞を、３Ｔ３−ｍＣＤ１９ ＡＡＰＣとともに１０：１のＥ：Ｔ比で一晩インキュベートし、ＦＡＣＳでソートし、溶解してＲＮＡを単離した。各群のＣＡＲ Ｔ細胞を、３通りで独立して形質導入、刺激およびソートした。
【図９Ｅ】図９は、蛍光タンパク質タグ付きＣＡＲ Ｔ細胞の遺伝子発現を示す。（Ｅ）２０５種の差次的に発現された遺伝子のヒートマップ。２０５種の遺伝子のリストは補足の表１〜４に含まれている。蛍光タンパク質ＧＦＰで標識されたｍ１９ｚ、ｍ１９２８ｚまたはｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲを含むＣＡＲ Ｔ細胞を、３Ｔ３−ｍＣＤ１９ ＡＡＰＣとともに１０：１のＥ：Ｔ比で一晩インキュベートし、ＦＡＣＳでソートし、溶解してＲＮＡを単離した。各群のＣＡＲ Ｔ細胞を、３通りで独立して形質導入、刺激およびソートした。
【００２７】
【図１０Ａ】図１０は、蛍光タンパク質タグ付きＣＡＲ Ｔ細胞が、タグ付けされていない対応物と同様に機能することを示す。（Ａ）抗原刺激により蛍光タンパク質タグ付きＣＡＲ Ｔ細胞によって放出されたサイトカイン。４日目のＣＡＲ Ｔ細胞を３Ｔ３−ｍＣＤ１９と１０：１の比率で２４時間共培養した。上清に対して、ＩＦＮγおよびＴＮＦαのためのルミネックスアッセイを行った。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図１０Ｂ】図１０は、蛍光タンパク質タグ付きＣＡＲ Ｔ細胞が、タグ付けされていない対応物と同様に機能することを示す。（Ｂ）蛍光タンパク質タグを有するＣＡＲ Ｔ細胞の免疫表現型。４日目のＣＡＲ Ｔ細胞を回収し、ビーズを除去し、フローサイトメトリーを行った。細胞を、単一の生細胞（上段）またはＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞（中段および下段）に対してプレゲートした。
【図１０Ｃ】図１０は、蛍光タンパク質タグ付きＣＡＲ Ｔ細胞が、タグ付けされていない対応物と同様に機能することを示す。（Ｃ）蛍光タンパク質タグを有するＣＡＲ Ｔ細胞によって処理されたマウスの生存率（ｎ＝５０）、インビボにおけるＢ細胞の死滅およびＣＡＲ Ｔ持続性。１Ｘ１０６個のＥμ−ＡＬＬ細胞を静脈内注射した７日後、マウスにＣＴＸを２５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射し、その１日後に１Ｘ１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射した。生存率をモニターした。ＢＭをＣＡＲ Ｔ注射の１１日後に単離し、フローサイトメトリーを行った。Ｂ（Ｂ２２０＋ＣＤ１９＋）細胞およびＣＡＲ Ｔ（ＣＤ３＋−ＣＡＲ＋）細胞を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを用いて計数した。各ドットは１匹のマウスを示す（１群あたりｎ＝３）。データは単一の実験からのものである。生存率曲線、ログランク検定。他のすべてのデータ、対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図１０Ｄ】図１０は、蛍光タンパク質タグ付きＣＡＲ Ｔ細胞が、タグ付けされていない対応物と同様に機能することを示す。（Ｄ）ＣＡＲ Ｔ処理後における血液中の経時的なＢ細胞数およびＣＡＲ Ｔ細胞数。Ｂ６マウスにＣＴＸ（２５０ｍｇ／ｋｇ）およびＣＡＲ Ｔ細胞（３Ｘ１０５）を注射した。血液試料を経時的に採取し、Ｂ細胞数およびＣＡＲ Ｔ細胞数をフローサイトメトリーによって測定した（１群あたりｎ＝１０）。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【００２８】
【図１１】図１１は、生存率試験（図２Ｄ）のｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞の形質導入効率および免疫表現型を示す。データは、図２Ｄの生存率実験のためのＣＡＲ Ｔ細胞を作製するのに使用した４つの独立した産生物の代表である。形質導入効率のために（上段のパネル）、細胞を単一の生細胞に対してプレゲートした。免疫表現型（中段および下段のパネル）のために、細胞を単一の生きたＣＡＲ Ｔ（ＣＤ３＋ＣＡＲ＋）細胞に対してプレゲートした。
【００２９】
【図１２】図１２は、照射されたＣＡＲ Ｔ試験（図３Ｂ〜３Ｃ）において使用されたＣＡＲ Ｔ細胞の形質導入効率および免疫表現型を示す。４日目に形質導入細胞を回収し、ビーズを除去し、抗体で染色し、フローサイトメトリーを行った。形質導入効率のために（上段のパネル）、細胞を単一の生細胞に対してプレゲートした。免疫表現型（中段および下段のパネル）のために、細胞をＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞に対してプレゲートした。
【００３０】
【図１３Ａ】図１３は、ＣＤ４＋ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の差次的な遺伝子発現を示す。ｍ１９ｚ、ｍ１９２８ｚまたはｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲを含むＴ細胞を、３Ｔ３−ｍＣＤ１９ ＡＡＰＣとともに１０：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、ＦＡＣＳでソートし、溶解してＲＮＡを単離した。各群のＣＡＲ Ｔ細胞を、生物学的に３通りで独立して形質導入、刺激およびソートした。（Ａ）抗原で刺激したマウスＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞のＰＣＡ。
【図１３Ｂ】図１３は、ＣＤ４＋ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の差次的な遺伝子発現を示す。ｍ１９ｚ、ｍ１９２８ｚまたはｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲを有するＴ細胞を、３Ｔ３−ｍＣＤ１９ ＡＡＰＣとともに１０：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、ＦＡＣＳでソートし、溶解してＲＮＡを単離した。各群のＣＡＲ Ｔ細胞を、生物学的に３通りで独立して形質導入、刺激およびソートした。（Ｂ）ｍ１９ｚおよびｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞において差次的に発現された遺伝子の数を示すベン図。
【図１３Ｃ】図１３は、ＣＤ４＋ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の差次的な遺伝子発現を示す。ｍ１９ｚ、ｍ１９２８ｚまたはｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲを有するＴ細胞を、３Ｔ３−ｍＣＤ１９ ＡＡＰＣとともに１０：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、ＦＡＣＳでソートし、溶解してＲＮＡを単離した。各群のＣＡＲ Ｔ細胞を、生物学的に３通りで独立して形質導入、刺激およびソートした。（Ｃ）ＧＳＥＡは、ＮＦ−κＢ調節経路に相関する遺伝子のセットが、ｍ１９ｚまたはｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞に対してｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞において差次的に発現していることを示す。
【００３１】
【図１４】図１４は、図５Ｅ〜ＧのヒトＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲ発現およびＣＤ４／ＣＤ８サブセットを示す。ＣＡＲ発現（上段）のために、細胞を単一の生細胞に対してプレゲートした。免疫表現型（下段）のために、細胞をＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞に対してプレゲートした。
【００３２】
【図１５】図１５は、インビボ試験（図６Ｄ）に使用されたｍＣＤ１９標的野生型（ＷＴ）およびＴｒａｆ１−／−ＣＡＲ Ｔ細胞の形質導入効率および免疫表現型を示す。４日目に形質導入細胞を回収し、ビーズを除去し、抗体で染色し、フローサイトメトリーを行った。形質導入効率（上段のパネル）のために、細胞を単一の生細胞に対してプレゲートした。ＣＤ４／ＣＤ８サブセット（中段のパネル）およびメモリーのサブセット（下段のパネル）のために、細胞を単一の生きたＣＡＲ Ｔ（ＣＤ３＋ＣＡＲ＋）細胞に対してプレゲートした。
【００３３】
【図１６Ａ】図１６は、変異させたｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達を増加させ、サイトカイン産生、抗アポトーシスおよびインビボでの機能を改善したことを示す。（Ａ）ｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＮＦ−ｋＢシグナル伝達。ＮＦ−ｋＢ−ＲＥ−ｌｕｃトランスジェニックマウスに由来するＣＡＲ Ｔ細胞を３Ｔ３−ｍＣＤ１９と４時間共培養した。細胞溶解物を調製し、ルシフェラーゼアッセイを行った。生物発光を測定し、生物発光はＮＦ−ｋＢシグナル伝達と相関する。データは３つの独立した実験の代表である。棒グラフを平均値±ＳＤとして示す。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図１６Ｂ】図１６は、変異ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達を増加させ、サイトカイン産生、抗アポトーシスおよびインビボでの機能を改善したことを示す。（Ｂ）３Ｔ３−ｍＣＤ１９で刺激したＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞における細胞内ＩＦＮγ発現。データは、３通りの独立した２回の実験の代表である。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図１６Ｃ】図１６は、変異ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達を増加させ、サイトカイン産生、抗アポトーシスおよびインビボでの機能を改善したことを示す。（Ｃ）３Ｔ３−ｍＣＤ１９で刺激したＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＢＣＬ−ＸＬ発現。データは、３通りの独立した２回の実験の代表である。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図１６Ｄ】図１６は、変異ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達を増加させ、サイトカイン産生、抗アポトーシスおよびインビボでの機能を改善したことを示す。（Ｄ）以下のインビボ試験に使用したＴ細胞におけるＣＡＲ発現。細胞を単一の生細胞に対してプレゲートした。
【図１６Ｅ】図１６は、変異ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達を増加させ、サイトカイン産生、抗アポトーシスおよびインビボでの機能を改善したことを示す。（Ｅ）ＣＡＲ Ｔ細胞注射の１週間後の血液中のＢ細胞（ＣＤ１９＋Ｂ２２０＋）。各ドットは１匹のマウスを示す（１群あたりｎ＝１０）。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図１６Ｆ】図１６は、変異ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達を増加させ、サイトカイン産生、抗アポトーシスおよびインビボでの機能を改善したことを示す。（Ｆ）ＣＡＲ Ｔ細胞注射の１週間後の血液中のＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＧＦＰ＋）。各ドットは１匹のマウスを示す（１群あたりｎ＝１０）。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【図１６Ｇ】図１６は、変異ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達を増加させ、サイトカイン産生、抗アポトーシスおよびインビボでの機能を改善したことを示す。（Ｇ）ＣＡＲ Ｔ細胞注射の１週間後の血液中のドナーＴ細胞（ＣＤ３＋Ｔｈｙ１．１＋）。各ドットは１匹のマウスを示す（１群あたりｎ＝１０）。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【００３４】
【図１７Ａ】図１７は、ヒトＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＲＡＦおよびＣＡＲの共発現を示す。（Ａ）生存率、増殖および細胞毒性アッセイ（図７Ｂ〜Ｄ）のための抗原刺激前のｈＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＡＲおよびＴＲＡＦ発現。細胞を単一の生細胞に対してプレゲートした。データは３つの健常なドナーの代表である。
【図１７Ｂ】図１７は、ヒトＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＲＡＦおよびＣＡＲの共発現を示す。（Ｂ）３Ｔ３−ｈＣＤ１９での刺激の３日後のｈＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＡＲおよびＴＲＡＦ発現。細胞を単一の生細胞に対してプレゲートした。データは３通りの１回の実験からのものである。数字はゲートされた細胞の割合を示す。
【図１７Ｃ】図１７は、ヒトＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＲＡＦおよびＣＡＲの共発現を示す。（Ｃ）サイトカイン産生。ＣＡＲ Ｔ細胞を、３Ｔ３−ｈＣＤ１９により１０：１の比率で活性化した。２４時間後に上清を回収し、サイトカインをＥＬＬＡにより測定した。棒グラフを平均値±ＳＤとして示す。データは、３通りの３つの異なる健常なドナーの代表である。すべてのデータ、対応のないｔ検定。ｎｓ、有意でない。
【００３５】
【図１８Ａ】図１８は、ＴＲＡＦ２を過剰発現するｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、侵攻性白血病モデルにおいてｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞に類似したインビボでの効力を示すことを示す。ＮＳＧマウスに５ｘ１０５個のＮＡＬＭ６−ＧＬ細胞を静脈内注射することにより、白血病を移植した。４日後、マウスに３ｘ１０５〜１ｘ１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射した。血液試料を毎週採取した。生物発光イメージングを用いて白血病の負荷を評価した。生存率をモニターした。（Ａ）ＴＲＡＦ２を同時形質導入し、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製した。合計ｎ＝１５。データは１回の実験からのものである。生存率のデータを２つの独立した実験（ｎ＝２６）からプールした。数値は１回の実験からのものである。生存率曲線、ログランク検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意でない。
【図１８Ｂ】図１８は、ＴＲＡＦ２を過剰発現するｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、侵攻性白血病モデルにおいてｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞に類似したインビボでの効力を示すことを示す。ＮＳＧマウスに５ｘ１０５個のＮＡＬＭ６−ＧＬ細胞を静脈内注射することにより、白血病を移植した。４日後、マウスに３ｘ１０５〜１ｘ１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射した。血液試料を毎週採取した。生物発光イメージングを用いて白血病の負荷を評価した。生存率をモニターした。（Ｂ）ＴＲＡＦ２を同時形質導入し、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製した。合計ｎ＝１５。データは１回の実験からのものである。各ドットはマウスを示す。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意でない。
【図１８Ｃ】図１８は、ＴＲＡＦ２を過剰発現するｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、侵攻性白血病モデルにおいてｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞に類似したインビボでの効力を示すことを示す。ＮＳＧマウスに５ｘ１０５個のＮＡＬＭ６−ＧＬ細胞を静脈内注射することにより、白血病を移植した。４日後、マウスに３ｘ１０５〜１ｘ１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射した。血液試料を毎週採取した。生物発光イメージングを用いて白血病の負荷を評価した。生存率をモニターした。（Ｃ）ＴＲＡＦ２を同時形質導入し、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製した。合計ｎ＝１５。データは１回の実験からのものである。各ドットはマウスを示す。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意でない。
【図１８Ｄ】図１８は、ＴＲＡＦ２を過剰発現するｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、侵攻性白血病モデルにおいてｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞に類似したインビボでの効力を示すことを示す。ＮＳＧマウスに５ｘ１０５個のＮＡＬＭ６−ＧＬ細胞を静脈内注射することにより、白血病を移植した。４日後、マウスに３ｘ１０５〜１ｘ１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射した。血液試料を毎週採取した。生物発光イメージングを用いて白血病の負荷を評価した。生存率をモニターした。（Ｄ）ＣＡＲおよびＴＲＡＦ２を発現するバイシストロニックなコンストラクトを形質導入し、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製した。生存率のデータを２つの独立した実験（ｎ＝２６）からプールした。数値は１回の実験からのものである。生存率曲線、ログランク検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意でない。
【図１８Ｅ】図１８は、ＴＲＡＦ２を過剰発現するｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、侵攻性白血病モデルにおいてｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞に類似したインビボでの効力を示すことを示す。ＮＳＧマウスに５ｘ１０５個のＮＡＬＭ６−ＧＬ細胞を静脈内注射することにより、白血病を移植した。４日後、マウスに３ｘ１０５〜１ｘ１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射した。血液試料を毎週採取した。生物発光イメージングを用いて白血病の負荷を評価した。生存率をモニターした。（Ｅ）ＣＡＲおよびＴＲＡＦ２を発現するバイシストロニックなコンストラクトを形質導入し、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製した。各ドットはマウスを示す。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意でない。
【図１８Ｆ】図１８は、ＴＲＡＦ２を過剰発現するｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が、侵攻性白血病モデルにおいてｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞に類似したインビボでの効力を示すことを示す。ＮＳＧマウスに５ｘ１０５個のＮＡＬＭ６−ＧＬ細胞を静脈内注射することにより、白血病を移植した。４日後、マウスに３ｘ１０５〜１ｘ１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射した。血液試料を毎週採取した。生物発光イメージングを用いて白血病の負荷を評価した。生存率をモニターした。（Ｆ）ＣＡＲおよびＴＲＡＦ２を発現するバイシストロニックなコンストラクトを形質導入し、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製した。各ドットはマウスを示す。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意でない。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本明細書は、ＣＡＲ−Ｔ細胞機能のシグナル伝達を増強するＣＤ２８および／または４−１ＢＢの細胞質ドメインにおいて１以上の変異を有する共刺激シグナル伝達領域を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを開示する。また、これらのＣＡＲを発現するように設計された免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞など）を開示する。したがって、開示されるＣＡＲを発現するように設計された開示される免疫エフェクター細胞の養子移入を含む、ＴＡＡを発現するがんを有する対象に抗腫瘍免疫を与える方法も開示する。
【００３７】
いくつかの実施態様において、変異した共刺激シグナル伝達領域はＣＡＲ−Ｔ細胞の消耗を減少させる。ＣＤ２８ドメインは、ＴＣＲ刺激後にシグナル伝達経路を調節する３つの細胞内サブドメイン（ＹＭＮＭ、ＰＲＲＰおよびＰＹＡＰ）を含む。いくつかの実施態様において、開示されるＣＡＲは、ＣＡＲ−Ｔ細胞機能を増強する（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞の消耗を減少させる）これらのサブドメインのうち１つ以上において変異または欠失を含む。いくつかの実施態様において、開示されるＣＡＲは、Ｙ２０６および／またはＹ２１８において改変されたリン酸化を含む。いくつかの実施態様において、開示されるＣＡＲはＹ２０６に弱毒化変異を含み、これはＣＡＲの活性を減少させる。いくつかの実施態様において、開示されるＣＡＲはＹ２１８に弱毒化変異を含み、これはＣＡＲの発現を減少させる。弱毒化を達成するために、該チロシンは任意のアミノ酸残基（アラニンまたはフェニルアラニンなど）に置換され得る。いくつかの実施態様において、Ｙ２０６および／またはＹ２１８のチロシンは、ホスホミメティック残基に置換される。いくつかの実施態様において、開示されるＣＡＲはＹ２０６のホスホミメティック残基への置換を含み、これはＣＡＲの活性を増加させる。いくつかの実施態様において、開示されるＣＡＲはＹ２１８のホスホミメティック残基への置換を含み、これはＣＡＲの発現を増加させる。例えば、ホスホミメティック残基はホスホチロシンであり得る。いくつかの実施態様において、ＣＡＲは、ホスホミメティックアミノ酸と、同一のＣＡＲの異なる残基における非リン酸化性(non-phosphorylatable)アミノ酸による置換との組合せを含み得る。例えば、ＣＡＲは、Ｙ２０９および／またはＹ１９１におけるアラニンまたはフェニルアラニン置換プラスＹ２０６および／またはＹ２１８におけるホスホミメティック置換を含み得る。
【００３８】
本明細書に開示されるように、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によって支持される核内因子κＢ（ＮＦκＢ）シグナル伝達のレベルは、その機能と相関する。したがって、本明細書は、ＮＦκＢシグナル伝達の増強を伴うキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開示する。本明細書にさらに開示されるように、共刺激タンパク質４１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）を介してＴ細胞におけるＮＦκＢシグナル伝達を活性化する。したがって、開示されるＣＡＲは増強されたＴＲＡＦの４１ＢＢ活性化を含み得る。
【００３９】
いくつかの例において、開示されるＣＡＲは、４１ＢＢの２以上のコピーを含む。いくつかの例において、開示されるＣＡＲは、ＴＲＡＦタンパク質（ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３またはそれらのあらゆる組合せなど）との結合を調節する変異を有する１以上の４１ＢＢドメインを含む。ＴＲＡＦタンパク質は、ＮＦＫＢに対して正および／または負の両方の調節作用を有し得る。これらは４１ＢＢに直接結合するか、または４１ＢＢに結合する他のタンパク質に結合する。いくつかの実施態様において、開示される変異はＮＦＫＢを増強するＴＲＡＦの結合を増強し、ＮＦＫＢシグナル伝達を減弱するＴＲＡＦの結合を減少させる。
【００４０】
４１ＢＢの細胞質ドメインは、ＴＲＡＦタンパク質との結合に関与している。したがって、いくつかの実施態様において、開示されるＣＡＲは、４１ＢＢの細胞質ドメインの２以上のコピーを含む。さらに、ＴＲＡＦ活性のより精密な制御を与えるために、４１ＢＢの細胞質ドメインはＴＲＡＦ結合を調節する変異を含み得る。
【００４１】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１）を含む。本明細書に開示されるように、ＴＲＡＦ結合に関与するこのドメインの領域は、配列番号１において下線が引かれている。したがって、開示されるＣＡＲは、ＴＲＡＦ結合を増強し、かつ／またはＮＦκＢシグナル伝達を増強するこれらの下線が引かれた配列において少なくとも１つの変異を有する４１ＢＢの細胞質ドメインを含み得る。
【００４２】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２、Ｍｕｔ０１）を含む。
【００４３】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬ（配列番号３、Ｍｕｔ０２）を含む。
【００４４】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬ（配列番号４、Ｍｕｔ０３）を含む。
【００４５】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号５、Ｍｕｔ０４）を含む。
【００４６】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号６、Ｍｕｔ０５）を含む。
【００４７】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号７、Ｍｕｔ０６）を含む。
【００４８】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号８、Ｍｕｔ０７）を含む。
【００４９】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬ（配列番号９、Ｍｕｔ０８）を含む。
【００５０】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１０、Ｍｕｔ０９）を含む。
【００５１】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１１、Ｍｕｔ１０）を含む。
【００５２】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬ（配列番号１２、Ｍｕｔ１１）を含む。
【００５３】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１３、Ｍｕｔ１２）を含む。
【００５４】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬ（配列番号１４、Ｍｕｔ１３）を含む。
【００５５】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬ（配列番号１５、Ｍｕｔ１４）を含む。
【００５６】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬ（配列番号１６、Ｍｕｔ１５）を含む。
【００５７】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬ（配列番号１７、Ｍｕｔ１６）を含む。
【００５８】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬ（配列番号１８、Ｍｕｔ１７）を含む。
【００５９】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１９、Ｍｕｔ１８）を含む。
【００６０】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＡＡＡＡＧＣＳＣＲＦＰＡＡＡＡＧＧＣＥＬ（配列番号２０、Ｍｕｔ１９）を含む。
【００６１】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１、しかし下線が引かれたアミノ酸において少なくとも１、２、３、４、５、６または７つのアミノ酸置換を有する）を含む。いくつかの例において、アミノ酸置換は保存的置換である。いくつかの実施態様において、アミノ酸は非酸性残基に置換される。
【００６２】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２１、ここでＸ１はＧｌｎではなく、Ｘ２はＧｌｕではなく、Ｘ３はＧｌｕではなく、Ｘ４はＡｓｐではなく、またはそれらのあらゆる組合せである）を含む。
【００６３】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＧＧＣＥＬ（配列番号２２、ここでＸ５はＧｌｕではなく、Ｘ６はＧｌｕではなく、Ｘ７はＧｌｕではなく、Ｘ８はＧｌｕではなく、またはそれらのあらゆる組合せである）を含む。
【００６４】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＣＳＣＲＦＰＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＧＧＣＥＬ（配列番号２３、ここでＸ１はＧｌｎではなく、Ｘ２はＧｌｕではなく、Ｘ３はＧｌｕではなく、Ｘ４はＡｓｐではなく、Ｘ５はＧｌｕではなく、Ｘ６はＧｌｕではなく、Ｘ７はＧｌｕではなく、Ｘ８はＧｌｕではなく、またはそれらのあらゆる組合せである）を含む。
【００６５】
いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＣＳＣＲＦＰＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＧＧＣＥＬＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＧＣＳＣＲＦＰＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＧＧＣＥＬ（配列番号２４、ここでＸ１はＧｌｎではなく、Ｘ２はＧｌｕではなく、Ｘ３はＧｌｕではなく、Ｘ４はＡｓｐではなく、Ｘ５はＧｌｕではなく、Ｘ６はＧｌｕではなく、Ｘ７はＧｌｕではなく、Ｘ８はＧｌｕではなく、Ｘ９はＧｌｎではなく、Ｘ１０はＧｌｕではなく、Ｘ１１はＧｌｕではなく、Ｘ１２はＡｓｐではなく、Ｘ１３はＧｌｕではなく、Ｘ１４はＧｌｕではなく、Ｘ１５はＧｌｕではなく、Ｘ１６はＧｌｕではなく、またはそれらのあらゆる組合せである）を含む。いくつかの例において、４１ＢＢの細胞質ドメインは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸置換（保存的アミノ酸置換など）を有する配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
【００６６】
ＣＡＲは一般に、リンパ球活性化に関与する膜貫通シグナル伝達モチーフとともにモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）由来の抗原認識ドメインを組み込む（Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35-45）。本明細書は、免疫エフェクター細胞において発現され得、がんに対する抗腫瘍活性を増強し得るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開示する。
【００６７】
開示されるＣＡＲは一般に、３つのドメイン（外部ドメイン、膜貫通ドメインおよびエンドドメイン）で構成されている。外部ドメインはＴＡＡ結合領域を含み、抗原認識に関与している。外部ドメインはまた、ＣＡＲをグリコシル化して免疫エフェクター細胞の細胞膜に固定し得るように、任意でシグナルペプチド（ＳＰ）を含む。膜貫通ドメイン（ＴＤ）は、その名称が示すように外部ドメインをエンドドメインと連結しており、細胞に発現される場合、細胞膜内に存在する。エンドドメインは、抗原認識後に活性化シグナルを免疫エフェクター細胞に伝達するＣＡＲの末端部である。例えば、エンドドメインは細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）および共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）を含み得る。開示されるＣＡＲは、ＮＦκＢシグナル伝達を増強する変異型４１ＢＢを含むＣＳＲを有する。
【００６８】
いくつかの実施態様において、開示されるＣＡＲは、以下の式で規定される：
ＳＰ−ＴＡＡ−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ；
ここで、「ＳＰ」は任意のシグナルペプチドを表し、
「ＴＡＡ」はＴＡＡ結合領域を表し、
「ＨＧ」は任意のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、ペプチド結合またはリンカーを表す。
【００６９】
さらなるＣＡＲコンストラクトが、例えば、Fresnak AD, et al. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81に記載されており、これはこれらのＣＡＲモデルの教示のために参照によりその全体が組み込まれる。
【００７０】
例えば、ＣＡＲは、ＴＲＵＣＫ、ユニバーサルＣＡＲ、自己駆動型ＣＡＲ、アーマード(armored)ＣＡＲ、自己破壊型ＣＡＲ、コンディショナルＣＡＲ、標識化(Marked)ＣＡＲ、ＴｅｎＣＡＲ、デュアルＣＡＲ、またはｓＣＡＲであり得る。
【００７１】
ＴＲＵＣＫ（普遍的なサイトカイン死滅のためにリダイレクトされたＴ細胞(T cells redirected for universal cytokine killing)）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および抗腫瘍サイトカインを共発現する。サイトカイン発現は構成的であり得るか、またはＴ細胞活性化により誘導され得る。ＣＡＲの特異性により標的とされると、炎症促進性サイトカインの局所的な産生が内在性免疫細胞を腫瘍部位に補充し、抗腫瘍応答を増強し得る。
【００７２】
ユニバーサル同種ＣＡＲ Ｔ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子を発現しないように設計されているため、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または拒絶反応をそれぞれ防ぐ。
【００７３】
自己駆動型ＣＡＲはＣＡＲおよびケモカイン受容体を共発現し、ケモカイン受容体は腫瘍リガンドに結合するため、腫瘍ホーミングを増強する。
【００７４】
免疫抑制に対して抵抗性であるように設計されたＣＡＲ Ｔ細胞（アーマードＣＡＲ）は、免疫チェックポイントスイッチ受容体とともに様々な免疫チェックポイント分子（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）またはプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１））を発現しないように遺伝子操作され得るか、または免疫チェックポイントシグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体とともに投与され得る。
【００７５】
自己破壊型ＣＡＲは、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＡを用いてＣＡＲをコードするように設計され得る。あるいは、Ｔ細胞の誘導性アポトーシスは、遺伝子改変リンパ球におけるチミジンキナーゼに結合するガンシクロビル、またはより最近に記述された小分子二量体化剤によるヒトカスパーゼ９の活性化の系に基づいて達成され得る。
【００７６】
コンディショナルＣＡＲ Ｔ細胞は、低分子が追加されて回路が完成し、シグナル１とシグナル２の両方の完全な伝達が可能になり、それによりＣＡＲ Ｔ細胞が活性化されるまで、初期状態で非応答性または「オフ」になっている。あるいは、Ｔ細胞は、後に投与される標的抗原に対する二次抗体に親和性を有するアダプター特異的な受容体を発現するように設計され得る。
【００７７】
標識化ＣＡＲ Ｔ細胞はＣＡＲプラス腫瘍エピトープを発現し、これに既存のモノクローナル抗体剤が結合する。耐え難い有害作用の状況において、モノクローナル抗体の投与はＣＡＲ Ｔ細胞を除去し、さらなる腫瘍外効果を伴わずに症状を軽減する。
【００７８】
タンデムＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）Ｔ細胞は、細胞内共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインに融合した異なる親和性を持つ２つの連結した単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）からなる単一のＣＡＲを発現する。ＴａｎＣＡＲ Ｔ細胞の活性化は、標的細胞が両方の標的を共発現する場合にのみ達成される。
【００７９】
デュアルＣＡＲ Ｔ細胞は、異なるリガンド結合標的を有する２つの別々のＣＡＲを発現する：一方のＣＡＲはＣＤ３ζドメインのみを含み、他方のＣＡＲは共刺激ドメインのみを含む。デュアルＣＡＲ Ｔ細胞の活性化は、腫瘍上の両方の標的の共発現を必要とする。
【００８０】
セーフティ(safety)ＣＡＲ（ｓＣＡＲ）は、細胞内抑制性ドメインに融合した細胞外ｓｃＦｖからなる。標準的なＣＡＲを共発現するｓＣＡＲ Ｔ細胞は、標準的なＣＡＲの標的を有するがｓＣＡＲの標的を有さない標的細胞に遭遇した場合にのみ活性化される。
【００８１】
開示されるＣＡＲの抗原認識ドメインは通常ｓｃＦｖである。しかし、多くの代替物が存在する。天然のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファおよびベータ単一鎖由来の抗原認識ドメインが、単純な外部ドメイン（例えば、ＨＩＶ感染細胞を認識するＣＤ４外部ドメイン）およびより外来性の認識成分（連結されたサイトカインなど、これはサイトカイン受容体を持つ細胞の認識を導く）を有するものとして記載されている。実際、所定の標的に高い親和性で結合するほとんどすべてのものが抗原認識領域として使用され得る。
【００８２】
エンドドメインはＣＡＲの末端部であり、抗原認識がシグナルを免疫エフェクター細胞に伝達した後に免疫エフェクター細胞の通常のエフェクター機能の少なくとも１つを活性化する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはヘルパー活性（サイトカインの分泌を含む）であり得る。したがって、エンドドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および任意の共受容体の「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含み得る。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分が使用される場合、そのような切断された部分はエフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用され得る。
【００８３】
刺激性の様式で作用するＴＣＲ複合体の主要な活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達配列の例には、ＣＤ８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３２（ＦｃガンマＲＩＩａ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩγ、ＦｃγＲＩＩＩγ、ＦｃεＲＩβ（ＦＣＥＲＩＢ）、およびＦｃεＲＩγ（ＦＣＥＲＩＧ）に由来するものが含まれる。
【００８４】
特定の実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）（ＴＣＲゼータ、GenBank accno. BAG36664.1）に由来する。Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖はＴ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖またはＣＤ２４７（分化抗原分類２４７）としても知られ、ヒトではＣＤ２４７遺伝子によってコードされるタンパク質である。
【００８５】
第１世代のＣＡＲは通常、内在性ＴＣＲからのシグナルの主要な伝達物質であるＣＤ３ζ鎖由来の細胞内ドメインを有していた。第２世代のＣＡＲは、様々な共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）由来の細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲのエンドドメインに付加して、Ｔ細胞に追加のシグナルを与える。前臨床研究により、第２世代のＣＡＲの設計がＴ細胞の抗腫瘍活性を改善することが示されている。より最近では、第３世代のＣＡＲは、複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせて効力をさらに増強させる。これらのＣＡＲを移植したＴ細胞は、共刺激受容体／リガンド相互作用とは無関係に、増殖、活性化、持続性および腫瘍根絶効率の改善を実証している（Imai C, et al. Leukemia 2004 18:676-84; Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002 20:70-5）。
【００８６】
例えば、ＣＡＲのエンドドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを単独で含むように設計され得、または本発明のＣＡＲの文脈において有用なあらゆる他の所望の細胞質ドメインと組み合わされ得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ならびにＣＤ８３、ＣＤ８、ＣＤ４、ｂ２ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＭｙＤ８８、ＢＴＮＬ３、およびＮＫＧ２Ｄと特異的に結合するリガンドが含まれる。したがって、ＣＡＲは主に、共刺激シグナル伝達要素として変異型４１ＢＢを有すると例示されるが、他の共刺激要素が組合せにおいて使用され得る。
【００８７】
いくつかの実施態様において、ＣＡＲはヒンジ配列を含む。ヒンジ配列は、抗体の柔軟性を促進する短いアミノ酸配列である（例えば、Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004)参照）。ヒンジ配列は、抗原認識部分と膜貫通ドメインとの間に配置され得る。ヒンジ配列は、任意の適切な分子に由来するか、または該分子から得られる任意の適切な配列であり得る。いくつかの実施態様において、例えば、ヒンジ配列は、ＣＤ８ａ分子またはＣＤ２８分子に由来する。
【００８８】
膜貫通ドメインは、天然または合成のいずれかの供給源に由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインはあらゆる膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、もしくはＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲおよびＰＡＧ／Ｃｂｐに由来し得る（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域を含み得る）。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、この場合、膜貫通ドメインは主に疎水性残基（ロイシンおよびバリンなど）を含む。いくつかの例において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの両端に見出される。短いオリゴまたはポリペプチドリンカー（２〜１０アミノ酸長など）は、ＣＡＲの膜貫通ドメインと内質ドメインとの間の結合を形成し得る。
【００８９】
いくつかの実施態様において、ＣＡＲは２以上の膜貫通ドメインを有し、これらは同一の膜貫通ドメインの反復であり得、または異なる膜貫通ドメインであり得る。
【００９０】
いくつかの実施態様において、ＣＡＲは、WO2015/039523に記載される複数鎖のＣＡＲであり、これは参照によってこの教示のために組み込まれる。複数鎖のＣＡＲは、異なる膜貫通ポリペプチドに別個の細胞外リガンド結合およびシグナル伝達ドメインを含み得る。シグナル伝達ドメインは膜近傍の位置に構築されるように設計され得、これは天然の受容体により近い柔軟な構造を形成し、最適なシグナル伝達を与える。例えば、複数鎖のＣＡＲは、ＦＣＥＲＩ鎖が自発的に二量体化してＣＡＲを形成するように、ＦＣＥＲＩアルファ鎖の一部およびＦＣＥＲＩベータ鎖の一部を含み得る。
【００９１】
以下の表１および２は、開示されるＣＡＲにおいて生じ得るＴＡＡ結合領域、共刺激シグナル伝達領域および細胞内シグナル伝達ドメインのいくつかの例の組合せを提供する。
【表１】
2021500859.tif 000003
【００９２】
【表２−１】
2021500859.tif 000004
【表２−２】
2021500859.tif 000005
【表２−３】
2021500859.tif 000006
【表２−４】
2021500859.tif 000007
【表２−５】
2021500859.tif 000008
【表２−６】
2021500859.tif 000009
【表２−７】
2021500859.tif 000010
【表２−８】
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【表２−９】
2021500859.tif 000012
【００９３】
いくつかの実施態様において、抗ＴＡＡ結合物質は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体である。抗ＴＡＡ ｓｃＦｖの親和性／特異性は、重（ＶＨ）鎖および軽（ＶＬ）鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内の特定の配列によって主に生じる。各ＶＨおよびＶＬ配列は３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する。
【００９４】
いくつかの例において、抗ＴＡＡ結合物質は、親和性成熟ｓｃＦｖである。いくつかの例において、抗ＴＡＡは、ＴＡＡに対する５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭまたは１０ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００９５】
いくつかの実施態様において、抗ＴＡＡ結合物質は、天然の抗体（モノクローナル抗体など）に由来する。いくつかの例において、抗体はヒト抗体である。いくつかの例において、抗体は、ヒトに投与された場合により低い免疫原性を与えるように変化を受けている。例えば、変化は、キメラ化、ヒト化、ＣＤＲ移植、脱免疫化(deimmunization)、および最も近いヒト生殖系列配列に対応するためのフレームワークアミノ酸の変異からなる群から選択される１以上の技術を含む。
【００９６】
腫瘍抗原は、免疫応答（特にＴ細胞媒介性免疫応答）を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。追加の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原の抗体または天然リガンドであり得る。追加の抗原結合ドメインの選択は、処置されるがんの特定の種類に依存する。
【００９７】
いくつかの実施態様において、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＴＡＧ−７２、ＣＤ９９、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＴＩＭ３、ＣＤ８３、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３、ＣＤ３３、およびそれらのあらゆる組合せの群から選択される。
【００９８】
腫瘍抗原の限定されない例には以下が含まれる：分化抗原（チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２など）および腫瘍特異的多系列抗原（ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐｉ５など）；過剰発現させた胚性抗原（ＣＥＡなど）；過剰発現させたがん遺伝子および変異させた腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕなど）；染色体転座に起因する特有の腫瘍抗原（ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲなど）；ならびに、ウイルス抗原（エプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７など）。他の大型のタンパク質に基づく抗原には、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトプロテイン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳｌ、ＳＤＣＣＡＧ１ ６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリン(cyclophilm)Ｃ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＧＰＣ３、ＭＵＣ１６、ＬＭＰ１、ＥＢＭＡ−１、ＢＡＲＦ−１、ＣＳ１、ＣＤ３１９、ＨＥＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｌ１ＣＡＭ、ＩＬ６、およびＭＥＴが含まれる。例えば、腫瘍抗原には、神経膠腫関連抗原、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ−ｌｌＲａ、ＩＬ−１３Ｒａ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、Ｂ７Ｈ３、Ｋｉｔ、ＣＡ ＬＸ、ＣＳ−１、ＭＵＣ１、ＢＣＭＡ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＨＥＲ２、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＬＫ、ＣＤ１９、サイクリンＢｌ、レクチン反応性ＡＦＰ、Ｆｏｓ関連抗原１、ＡＤＲＢ３、サイログロブリン、ＥｐｈＡ２、ＲＡＧＥ−１、ＲＵｌ、ＲＵ２、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＬＣＫ、ＯＹ−ＴＥＳｌ、ＰＡＸ５、ＳＡＲＴ３、ＣＬＬ−１、フコシルＧＭ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＮ−ＣＡ ＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＥＶＴ６−ＡＭＬ、ＴＧＳ５、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ポリシアル酸(plysialic acid)、ＰＬＡＣ１、ＲＵｌ、ＲＵ２（ＡＳ）、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｌｅｗｉｓＹ、ｓＬｅ、ＬＹ６Ｋ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、ｐｒｏｓｔａｓｅ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＸ３、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＬＭＰ２、ＮＣＡＭ、ｐ５３、ｐ５３変異体、Ｒａｓ変異体、ｇｐｌＯＯ、ｐｒｏｓｔｅｉｎ、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＡＮＸ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＡＶＣＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ−��ータ、サバイビンおよびテロメラーゼ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、精子タンパク質１７、ＳＳＥＡ−４、チロシナーゼ、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、前立腺がん腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＬ−ＩＡＰ、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ １、ＸＡＧＥ１、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、好中球エラスターゼ、肉腫転座ブレークポイント(sarcoma translocation breakpoint)、ＮＹ−ＢＲ−１、ｅｐｈｎｎＢ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、アンドロゲン受容体、ＦＡＰ、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＧＤ２、ｏ−アセチル−ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＰＲ２０、ＣＸＯＲＦ６１、葉酸受容体（ＦＲａ）、葉酸受容体ベータ、ＲＯＲ１、Ｆｌｔ３、ＴＡＧ７２、ＴＮ Ａｇ、Ｔｉｅ２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＵＰＫ２、メソテリン、ならびにこれらのあらゆる組合せが含まれる。
【００９９】
核酸およびベクター
開示される免疫エフェクター細胞においてＣＡＲの発現を可能にする、開示されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドベクターもまた開示される。
【０１００】
開示されるＣＡＲをコードする核酸配列およびその領域は、当分野で公知の組換え法を用いて（例えば、標準的な技術を用いて、遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによって、遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を得ることによって、または遺伝子を含む細胞および組織から直接単離することによって）取得され得る。あるいは、目的の遺伝子は、クローニングされるのではなく合成的に作製され得る。
【０１０１】
通常、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、コンストラクトを発現ベクターに組み込むことによって達成される。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含む。
【０１０２】
開示される核酸は、多くの種類のベクターにクローニングされ得る。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングされ得る。特に興味深いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシークエンシングベクターが含まれる。
【０１０３】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に与えられ得る。ウイルスベクター技術は当分野で周知であり、例えばSambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)ならびに他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１以上の選択可能なマーカーを含む。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドベクターはレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである。
【０１０４】
哺乳類細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスに基づく系が開発されている。例えば、レトロウイルスは遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当分野で公知の技術を用いてベクターに挿入され得、レトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次に、組換えウイルスが単離され得、インビボまたはエクスビボ(ex vivo)のいずれかにおいて対象の細胞に送達され得る。
【０１０５】
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列（限定されないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルス）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、およびヒト遺伝子プロモーター（限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターなど）を含む）もまた使用され得る。あるいは、プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターの例には、限定されないが、メタロチオネイン(metallothionine)プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが含まれる。
【０１０６】
追加のプロモーター要素（例えばエンハンサー）は、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近、多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の間隔は、要素が互いに反転または移動した場合にプロモーター機能が保存されるように柔軟であることが多い。
【０１０７】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含み得、ウイルスベクターにより遺伝子導入または感染させることを試みた細胞集団からの発現細胞の同定および選択を促進し得る。他の態様において、選択可能なマーカーはＤＮＡの別個の部分において保有され得、同時形質導入の手法において使用され得る。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子はともに、宿主細胞における発現を可能にするために適切な調節配列に隣接し得る。有用な選択可能なマーカーには、例えば抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【０１０８】
レポーター遺伝子は、遺伝子導入された可能性がある細胞を同定し、調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織に存在しないか、または該生物または組織において発現しない遺伝子であり、発現がいくつかの容易に検出可能な特性（例えば酵素活性）によって明示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時期にアッセイされる。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る。適切な発現系は周知であり、公知の技術を用いて調製してもよく、または商業的に入手してもよい。一般に、レポーター遺伝子の最も高いレベルの発現を示す最小の５’隣接領域を有するコンストラクトは、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結され得、プロモーターにより駆動される転写を調節する能力について物質を評価するために使用され得る。
【０１０９】
細胞に遺伝子を導入および発現させる方法は当分野で公知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは当分野の任意の方法により宿主細胞（例えば、哺乳類、細菌、酵母または昆虫細胞）に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞に導入され得る。
【０１１０】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションなどが含まれる。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を作製する方法は当分野で周知である。例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)参照。
【０１１１】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法には、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター（特にレトロウイルスベクター）は、哺乳類（例えばヒト細胞）に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。
【０１１２】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散系（高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなど）および脂質ベースの系（水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む）が含まれる。インビトロおよびインビボにおいて送達担体として使用される例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。
【０１１３】
非ウイルス送達系が使用される場合、例示的な送達担体はリポソームである。別の態様において、核酸は脂質と結合し得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性の内部に封入され得、リポソームの脂質二重層内に散在し得、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方に結合する連結分子を介してリポソームに結合し得、リポソームに封入され得、リポソームと複合体を形成し得、脂質を含む溶液に分散され得、脂質と混合され得、脂質と組み合わされ得、脂質において懸濁液として含まれ得、ミセルに含まれ得、もしくはミセルと複合体を形成し得、または脂質と結合し得る。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターに関連する組成物は、溶液中において任意の特定の構造に限定されない。例えば、該組成物はミセルとして二重層構造で存在し得、または「崩壊した」構造を伴って存在し得る。また、該組成物は単に溶液中に散在し得、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成し得る。脂質は脂肪性物質であり、天然に存在する脂質または合成脂質であり得る。例えば、脂質には、細胞質中に天然に存在する脂肪滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体（脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドなど）を含む化合物の分類が含まれる。使用に適した脂質は商業的供給源から入手できる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はSigma, St. Louis, Mo.から入手できる；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）はK & K Laboratories (Plainview, N.Y.)から入手できる；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はCalbiochem-Behringから入手できる；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質はAvanti Polar Lipids, Inc, (Birmingham, Ala.)から入手され得る。
【０１１４】
免疫エフェクター細胞
開示されるＣＡＲを発現するように設計された免疫エフェクター細胞（本明細書では「ＣＡＲ−Ｔ細胞」とも呼ばれる）も開示される。この細胞は、好ましくは処置される対象から取得される（すなわち自家性である）。しかしながら、いくつかの実施態様において、免疫エフェクター細胞株またはドナーエフェクター細胞（同種）が使用される。免疫エフェクター細胞は、多数の供給源（末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、ならびに感染、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍の部位由来の組織を含む）から取得され得る。免疫エフェクター細胞は、当業者に公知の多くの技術（ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離など）を用いて対象から採取された血液から取得され得る。例えば、個体の循環血由来の細胞はアフェレーシスによって取得され得る。いくつかの実施態様において、免疫エフェクター細胞は、（例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって、または向流遠心溶出法によって）赤血球を溶解して単球を枯渇させることにより末梢血リンパ球から単離される。免疫エフェクター細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択の技術によってさらに単離され得る。例えば、免疫エフェクター細胞は、陽性選択される細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組合せを用いて（例えば、所望の免疫エフェクター細胞の陽性選択に十分な時間、抗体を結合したビーズとともにインキュベートすることによって）単離され得る。あるいは、免疫エフェクター細胞集団の濃縮は、陰性選択される細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組合せを用いた陰性選択によって達成され得る。
【０１１５】
いくつかの実施態様において、免疫エフェクター細胞は、感染症および異物から身体を防御することに関与する任意の白血球を含む。例えば、免疫エフェクター細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球またはそれらのあらゆる組合せを含み得る。例えば、免疫エフェクター細胞はＴリンパ球を含み得る。
【０１１６】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球（Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など）から区別され得る。これらは胸腺で成熟する（扁桃腺で成熟するものもある）ためＴ細胞と呼ばれる。Ｔ細胞にはいくつかのサブセットがあり、各サブセットは異なる機能を有する。
【０１１７】
Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、免疫学的プロセス（Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む）において他の白血球を補助する。この細胞は表面上にＣＤ４糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られている。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化する。ヘルパーＴ細胞は活性化すると急速に分裂し、能動的な免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。ヘルパーＴ細胞はいくつかのサブタイプ（ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９またはＴＦＨを含む）のいずれかに分化し得、これらは異なるサイトカインを分泌して異なる種類の免疫応答を促進する。
【０１１８】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）はウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与している。細胞傷害性Ｔ細胞はその表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られている。細胞傷害性Ｔ細胞は、あらゆる有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩ分子に関連する抗原に結合することにより、その標的を認識する。ＩＬ−１０、アデノシンおよび制御性Ｔ細胞によって分泌される他の分子により、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活性化され得、これは自己免疫疾患を防ぐ。
【０１１９】
メモリーＴ細胞は、感染から回復した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞はその同種抗原への再曝露により多数のエフェクターＴ細胞に急速に増殖するため、過去の感染に対する「記憶」を免疫系に提供する。メモリー細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は通常、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０１２０】
以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に重要である。その主要な役割は、免疫反応の終わりに向かってＴ細胞媒介性免疫を停止させること、および胸腺において陰性選択のプロセスを回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラスが記載されている（天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応型Ｔｒｅｇ細胞）。
【０１２１】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と混同してはならない）は、適応免疫系と自然免疫系との橋渡しをする。主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞はＣＤ１ｄと呼ばれる分子によって提示される糖脂質抗原を認識する。
【０１２２】
いくつかの実施態様において、Ｔ細胞はＣＤ４＋細胞の混合物を含む。他の実施態様において、Ｔ細胞は、細胞表面の発現に基づいて１以上のサブセットについて濃縮される。例えば、いくつかの例において、Ｔは細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球を含む。いくつかの実施態様において、Ｔ細胞はγδＴ細胞を含み、これはαおよびβ鎖の代わりに１つのγ鎖および１つのδ鎖を有する別個のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。
【０１２３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞はウイルス感染細胞および形質転換細胞を死滅させ得るＣＤ５６＋ＣＤ３−大型顆粒リンパ球であり、自然免疫系の重要な細胞サブセットを構成する（Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676）。細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は事前の感作を必要とせずに腫瘍細胞に対して細胞傷害性を開始し、ＭＨＣ−Ｉ陰性細胞を根絶し得る（Narni-Mancinelli E, et al. Int Immunol 2011 23:427-431）。ＮＫ細胞はサイトカインストーム（Morgan RA, et al. Mol Ther 2010 18:843-851）、腫瘍崩壊症候群（Porter DL, et al. N Engl J Med 2011 365:725-733）およびオンターゲット効果、腫瘍外効果の致死的となり得る合併症を回避し得るため、より安全なエフェクター細胞である。ＮＫ細胞はがん細胞のキラーとして周知の役割を有しており、ＮＫ細胞の機能障害はＭＭの進行に重要であると広く実証されているが（Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676; Fauriat C, et al. Leukemia 2006 20:732-733）、ＮＫ細胞を介した抗ＭＭ活性を増強し得る手段は、開示されるＣＡＲより以前にはほとんど明らかになっていなかった。
【０１２４】
治療方法
開示されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、ＴＡＡ発現がん細胞に対する抗腫瘍免疫応答を誘発し得る。開示されるＣＡＲで修飾された免疫エフェクター細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的免疫応答であり得る。さらに、ＣＡＲ媒介性免疫応答は、ＣＡＲで修飾された免疫エフェクター細胞がＴＡＡに特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法の手法の一部であり得る。
【０１２５】
キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞の養子移入は、有望な抗がん治療である。患者の免疫エフェクター細胞を収集した後、細胞を開示されるＣＡＲを発現するように遺伝子操作し、患者に注入して戻してもよい。
【０１２６】
開示されるＣＡＲで修飾された免疫エフェクター細胞は、単独で、または希釈剤および／または他の成分（ＩＬ−２、ＩＬ−１５もしくは他のサイトカインまたは細胞集団など）と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。簡潔に述べると、医薬組成物は、１以上の薬学的または生理的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせた本明細書に記載される標的細胞集団を含み得る。このような組成物は、緩衝液（中性緩衝生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水など）；炭水化物（グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなど）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（グリシンなど）；抗酸化剤；キレート剤（ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。いくつかの実施態様において、開示される方法における使用のための組成物は、静脈内投与用に処方されている。医薬組成物は、ＭＭを処置するのに適切な任意の様式で投与され得る。投与の量および頻度は患者の状態および患者の疾患の重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量が臨床試験によって決定され得る。
【０１２７】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」または「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態における個体差を考慮して医師によって決定され得る。本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重（１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重など）の投与量（これらの範囲内のすべての整数値を含む）で投与され得ることが一般的に記述され得る。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術を用いて投与され得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照）。特定の患者のための最適な投与量および処置計画は、患者を疾患の兆候についてモニターし、それに応じて処置を調整することにより、医学における当業者によって容易に決定され得る。
【０１２８】
ある実施態様において、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、その後、血液を再採取（またはアフェレーシスを実施）し、開示された方法に従ってそこからＴ細胞を活性化し、この活性化および増殖させたＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間毎に複数回実行され得る。ある実施態様において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。ある実施態様において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃまたは１００ｃｃの採血から活性化される。この複数の採血／複数の再注入のプロトコルの使用は、Ｔ細胞の特定の集団を選択するのに役立ち得る。
【０１２９】
開示される組成物の投与は、任意の都合の良い様式（注射、輸血または注入を含む）で実施され得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、節内(intranodally)、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、または腹腔内において患者に投与され得る。いくつかの実施態様において、開示される組成物は皮内または皮下注射によって患者に投与される。いくつかの実施態様において、開示される組成物は静脈内注射によって投与される。組成物はまた、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射され得る。
【０１３０】
ある実施態様において、開示されるＣＡＲで修飾された免疫エフェクター細胞は、任意の数の関連する処置様式（限定されないが、サリドマイド、デキサメタゾン、ボルテゾミブおよびレナリドミドを含む）と組み合わせて（例えば、前、同時または後に）患者に投与される。さらなる実施態様において、ＣＡＲで修飾された免疫エフェクター細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制物質（シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびＦＫ５０６など）、抗体、または他の免疫除去(immunoablative)物質（ＣＡＭ ＰＡＴＨなど）、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、ｃｙｔｏｘｉｎ、フルダリビン(fludaribine)、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインおよび照射と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施態様において、ＣＡＲで修飾された免疫エフェクター細胞は、骨髄移植、いずれかの化学療法物質（フルダラビン、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドまたは抗体（ＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨなど）など）を用いたＴ細胞除去療法と組み合わせて（例えば、前、同時または後に）患者に投与される。別の実施態様において、本発明の細胞組成物は、Ｂ細胞除去療法（ＣＤ２０と反応する物質（例えばリツキサン）など）の後に投与される。例えば、いくつかの実施態様において、対象は、高用量化学療法による標準処置を受け得、その後末梢血幹細胞移植を受け得る。ある実施態様において、移植後、対象は本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施態様において、増殖した細胞は手術の前または後に投与される。
【０１３１】
開示される方法のがんは、無秩序な増殖、浸潤または転移を受けている対象における任意のＴＡＡ発現細胞であり得る。いくつかの態様において、がんは、放射線療法が現在使用されている任意の新生物または腫瘍であり得る。あるいは、がんは、標準的な方法を用いた放射線療法に対して十分な感受性がない新生物または腫瘍であり得る。したがって、がんは、肉腫、リンパ腫、白血病、がん腫、芽細胞腫または胚細胞腫瘍であり得る。開示される組成物が処置するのに使用され得るがんの代表的であるが非限定的なリストには、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん、腎がん、肺がん（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんなど）、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、肝がん、黒色腫、口、喉、喉頭および肺の扁平上皮がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、子宮頸がん、乳がん、上皮がん、腎臓がん、泌尿生殖器がん、肺がん、食道がん、頭頸部がん、大腸がん、造血器がん；精巣がん；結腸直腸がん、前立腺がん、および膵がんが含まれる。
【０１３２】
開示されるＣＡＲは、細胞毒性効果または細胞増殖抑制効果を有する任意の化合物、部分または基と組み合わせて使用され得る。薬物部分は、マイクロチューブリン阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤またはＤＮＡインターカレーターとして機能し得る化学療法物質（特にがん療法に使用される化学療法物質）を含む。
【０１３３】
開示されるＣＡＲは、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用され得る。２つの公知の抑制性チェックポイント経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム死１（ＰＤ−１）受容体を介したシグナル伝達を含む。これらのタンパク質は、Ｔ細胞機能のすべての段階にわたって重要な役割を果たす共シグナル伝達分子のＣＤ２８−Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ−１受容体（ＣＤ２７９としても知られている）は、活性化Ｔ細胞の表面上に発現する。そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１；ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ；ＣＤ２７３）は、ＡＰＣ（樹状細胞またはマクロファージなど）の表面上に発現する。ＰＤ−Ｌ１が主要なリガンドであり、ＰＤ−Ｌ２はより制限された発現パターンを有する。リガンドがＰＤ−１に結合すると抑制シグナルがＴ細胞に伝達され、これはサイトカイン産生を減少させ、Ｔ細胞増殖を抑制する。チェックポイント阻害剤には、限定されないが、ＰＤ−１（ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６）、ＣＴ−０１１、ＭＫ−３４７５）、ＰＤ−Ｌ１（ＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＰＤ−Ｌ２（ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７）、ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０）、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６））、ＩＤＯ、Ｂ７−Ｈ３（ＭＧＡ２７１）、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ−３（ＢＭＳ−９８６０１６）をブロックする抗体が含まれる。
【０１３４】
プログラム死１（ＰＤ−１）に対するヒトモノクローナル抗体、および抗ＰＤ−１抗体を単独で、または他の免疫療法と組み合わせて用いるがんを処置する方法が、米国特許第８，００８，４４９号に記載されており、これはこれらの抗体について参照によって組み込まれる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその使用が、米国特許第８，５５２，１５４号に記載されており、これはこれらの抗体について参照によって組み込まれる。抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗がん物質が、米国特許第８，６１７，５４６号に記載されており、これはこれらの抗体について参照によって組み込まれる。
【０１３５】
いくつかの実施態様において、ＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤＬ１に特異的に結合する抗体（ＢＭＳ−９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）またはＭＰＤＬ３２８０Ａ（Roche）など）を含む。いくつかの実施態様において、ＰＤ１阻害剤は、ＰＤ１に特異的に結合する抗体（ランブロリズマブ（Merck）、ニボルマブ（Bristol-Myers Squibb）またはＭＥＤＩ４７３６（AstraZeneca）など）を含む。ＰＤ−１に対するヒトモノクローナル抗体、および抗ＰＤ−１抗体を単独で、または他の免疫療法と組み合わせて用いるがんを処置する方法が、米国特許第８，００８，４４９号に記載されており、これはこれらの抗体について参照によって組み込まれる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその使用が、米国特許第８，５５２，１５４号に記載されており、これはこれらの抗体について参照によって組み込まれる。抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗がん物質が、米国特許第８，６１７，５４６号に記載されており、これはこれらの抗体について参照によって組み込まれる。
【０１３６】
開示されるＣＡＲは、他のがん免疫療法と組み合わせて使用され得る。２つの異なる種類の免疫療法がある：受動免疫療法は、免疫系の成分を用いてがん細胞に対する標的細胞毒性活性を誘導するが、必ずしも患者の免疫応答は開始しない；能動免疫療法は、内在性免疫応答を能動的に引き起こす。受動的な戦略には、特定の抗原に応答してＢ細胞により産生されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用が含まれる。１９７０年代のハイブリドーマ技術の発展および腫瘍特異的抗原の同定により、免疫系による破壊のために腫瘍細胞を特異的に標的とし得るｍＡｂの医薬品開発が可能となった。これまでのところ、ｍＡｂは免疫療法の最大の成功例である；２０１２年に最も良く売れた上位３つの抗がん剤は、ｍＡｂであった。その中には、Ｂ細胞性悪性腫瘍（非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）など）の表面上に高度に発現するＣＤ２０タンパク質に結合するリツキシマブ（Rituxan, Genentech）がある。リツキシマブは、化学療法と組み合わせたＮＨＬおよび慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の処置についてＦＤＡによって承認されている。別の重要なｍＡｂは、ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）の発現を標的とすることによってＨＥＲ２陽性乳がんの処置に革命をもたらしたトラスツズマブ（Herceptin; Genentech）である。
【０１３７】
最適な「キラー」ＣＤ８ Ｔ細胞応答の生成にはＴ細胞受容体の活性化プラス共刺激が必要であり、これは腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバー（ＯＸ４０（ＣＤ１３４）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む）の連結を介して提供され得る。活性化（アゴニスト）抗ＯＸ４０ ｍＡｂによる処置はＴ細胞分化および細胞溶解機能を増強し、様々な腫瘍に対する抗腫瘍免疫の増強をもたらすため、ＯＸ４０は特に興味深い。
【０１３８】
いくつかの実施態様において、そのような追加の治療物質は、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン(decarbazine)、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビンまたはクラドリビンなどの代謝拮抗物質から選択され得る。
【０１３９】
いくつかの実施態様において、そのような追加の治療物質は、メクロレタミン、チオテパ(thioepa)、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、および他の白金誘導体（カルボプラチンなど）などのアルキル化剤から選択され得る。
【０１４０】
いくつかの実施態様において、そのような追加の治療物質は、タキサン（例えばドセタキセルおよびパクリタキセル）およびビンカアルカロイド（例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビノレルビン）などの抗有糸分裂物質から選択され得る。
【０１４１】
いくつかの実施態様において、そのような追加の治療物質は、トポイソメラーゼ阻害剤（トポテカンまたはイリノテカンなど）または細胞増殖抑制物質（エトポシドおよびテニポシドなど）から選択され得る。
【０１４２】
いくつかの実施態様において、そのような追加の治療物質は、ＥｒｂＢｌ（ＥＧＦＲ）の阻害剤（ＥＧＦＲ抗体（例えば、ザルツムマブ、セツキシマブ、パニツムマブまたはニモツズマブ）または他のＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブまたはエルロチニブなど）など）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）の別の阻害剤（ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＤＭｌまたはペルツズマブ）など）、またはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の両方の阻害剤（ラパチニブなど）などの増殖因子阻害剤から選択され得る。
【０１４３】
いくつかの実施態様において、そのような追加の治療物質は、イマチニブ（Glivec, Gleevec STI571）またはラパチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤から選択され得る。
【０１４４】
したがって、いくつかの実施態様において、開示される抗体は、オファツムマブ、ザノリムマブ、ダラツムマブ、ラニビズマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、ｈｕ８０６、ダクリズマブ（ゼナパックス）、バシリキシマブ（シムレクト）、インフリキシマブ（レミケード）、アダリムマブ（ヒュミラ）、ナタリズマブ（タイサブリ）、オマリズマブ（ゾレア）、エファリズマブ（ラプティバ）、および／またはリツキシマブと組み合わせて使用される。
【０１４５】
いくつかの実施態様において、上述の障害を処置するためにＣＡＲと組み合わせて使用される治療物質は、抗がんサイトカイン、ケモカインまたはそれらの組合せであり得る。適切なサイトカインおよび増殖因子の例には、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８ａ、ＩＬ−２８ｂ、ＩＬ−２９、ＫＧＦ、ＩＦＮａ（例えばＩＮＦａ２ｂ）、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、アンセスチム、およびＴＮＦａが含まれる。適切なケモカインには、ヒトＣＸＣおよびＣ−Ｃケモカインファミリー由来のＩＰ−１０、ＭＣＰ−３、ＭＩＧおよびＳＤＦ−ｌａなどのＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＥＬＲ）陰性ケモカインが含まれ得る。適切なサイトカインには、サイトカイン誘導体、サイトカインバリアント、サイトカインフラグメントおよびサイトカイン融合タンパク質が含まれる。
【０１４６】
いくつかの実施態様において、上述の障害を処置するためにＣＡＲと組み合わせて使用される治療物質は、細胞周期制御／アポトーシス調節因子（または「調節物質」）であり得る。細胞周期制御／アポトーシス調節因子には、（ｉ）ｃｄｃ−２５（ＮＳＣ ６６３２８４など）、（ｉｉ）細胞周期を過剰に刺激するサイクリン依存性キナーゼ（フラボピリドール（L868275, HMR1275）、７−ヒドロキシスタウロスポリン（UCN-01, KW-2401）およびロスコビチン（R-roscovitine, CYC202）など）、および（ｉｉｉ）テロメラーゼ修飾因子（ＢＩＢＲ１５３２、ＳＯＴ−０９５、ＧＲＮ１６３、ならびに例えばＵＳ６，４４０，７３５およびＵＳ６，７１３，０５５に記載されている組成物など）などの細胞周期制御／アポトーシス調節因子を標的とし、調節する分子が含まれ得る。アポトーシス経路を妨害する分子の限定されない例には、ＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）／アポトーシス２リガンド（Ａｐｏ−２Ｌ）、ＴＲＡＩＬ受容体を活性化する抗体、ＩＦＮおよびアンチセンスＢｃｌ−２が含まれる。
【０１４７】
いくつかの実施態様において、上述の障害を処置するためにＣＡＲと組み合わせて使用される治療物質は、ホルモン調節物質（抗アンドロゲンおよび抗エストロゲン療法に有用な物質など）であり得る。そのようなホルモン調節物質の例には、タモキシフェン、イドキシフェン、フルベストラント、ドロロキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール／エスチニル(estinyl)、抗アンドロゲン（フルタミンド(flutaminde)／ｅｕｌｅｘｉｎなど）、プロゲスチン（ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステル、メドロキシプロゲステロン／プロベラ、酢酸メゲストロール／ｍｅｇａｃｅなど）、副腎皮質ステロイド（ヒドロコルチゾン、プレドニゾンなど）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（およびその類似体、および他のＬＨＲＨアゴニスト（ブセレリンおよびゴセレリンなど））、アロマターゼ阻害剤（アナストラゾール(anastrazole)／アリミデックス、アミノグルテチミド／ｃｙｔｒａｄｅｎ、エキセメスタンなど）、またはホルモン阻害剤（オクトレオチド／サンドスタチンなど）がある。
【０１４８】
いくつかの実施態様において、上述の障害を処置するためにＣＡＲと組み合わせて使用される治療物質は、抗がん核酸または抗がん抑制性ＲＮＡ分子であり得る。
【０１４９】
上述の併用投与は、同時、個別または連続的であり得る。同時投与のために、物質は必要に応じて１つの組成物または別々の組成物として投与され得る。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、開示されるＣＡＲは、放射線療法と組み合わせて投与される。放射線療法は放射線を含み得、または患者への放射性医薬品の関連する投与が提供される。放射線源は、処置される患者の外部または内部のいずれかであり得る（放射線処置は、例えば外照射療法（ＥＢＲＴ）または近接照射療法（ＢＴ）の形式であり得る）。そのような方法を実施するのに使用され得る放射性元素には、例えば、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、およびインジウム−１１１が含まれる。
【０１５１】
いくつかの実施態様において、開示されるＣＡＲは、手術と組み合わせて投与される。
【０１５２】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍細胞毒性および特異性を増強し、腫瘍の免疫抑制を回避し、宿主の拒絶反応を回避し、治療的半減期を延長するいくつかの方法で設計され得る。例えば、ＴＲＵＣＫ（普遍的なサイトカイン死滅のためにリダイレクトされたＴ細胞）Ｔ細胞はＣＡＲを有しており、腫瘍の死滅を促進するサイトカイン（ＩＬ−１２など）を放出するように設計されている。これらの細胞はＣＡＲの活性化により分子ペイロードを放出するように設計されているため、腫瘍環境に局在化すると、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞は「アーマードＣＡＲ」とも呼ばれる場合がある。がん療法としてのいくつかのサイトカインが前臨床および臨床の両方において研究されており、ＴＲＵＣＫ型のＣＡＲ−Ｔ療法に同様に組み込まれた場合にも有用であることが証明され得る。これらの中には、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ、ＦＬＴ３リガンド、リンホタクチン、およびＴＧＦ−β（Dranoff 2004）が含まれる。「自己駆動型」または「ホーミング」ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲに加えてケモカイン受容体を発現するように設計されている。特定のケモカインが腫瘍中で上方制御され得るため、ケモカイン受容体の取り込みは養子Ｔ細胞への腫瘍の輸送および養子Ｔ細胞による浸潤を助け、それによりＣＡＲ−Ｔの特異性および機能性の両方を増強する（Moon 2011）。ユニバーサルＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＡＲを有しているが、内在性ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）またはＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）タンパク質を発現しないように設計されている。養子Ｔ細胞療法のシグナル伝達レパートリーからのこれら２つのタンパク質の除去は、移植片対宿主病および拒絶反応をそれぞれ防ぐ。さらに、アーマードＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍の免疫抑制および腫瘍誘発性のＣＡＲ−Ｔ機能低下を回避する能力のためにそのように呼ばれている。これらの特定のＣＡＲ−ＴはＣＡＲを有しており、チェックポイント阻害剤を発現しないように設計されてい得る。あるいは、これらのＣＡＲ−Ｔは、チェックポイントシグナル伝達をブロックするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と同時投与され得る。抗ＰＤＬ１抗体の投与は、ＣＡＲ ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）の死滅能力を著しく回復させた。ＰＤ１−ＰＤＬ１およびＣＴＬＡ−４−ＣＤ８０／ＣＤ８６シグナル伝達経路が研究されているが、アーマードＣＡＲ−Ｔの設計において他の免疫チェックポイントシグナル伝達分子（ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、ＩＤＯ−１、２Ｂ４およびＫＩＲを含む）を標的とすることが可能である。ＴＩＬの他の細胞内阻害剤には、ホスファターゼ（ＳＨＰ１）、ユビキチン−リガーゼ（すなわち、ｃｂｌ−ｂ）およびキナーゼ（すなわち、ジアシルグリセロールキナーゼ）が含まれる。アーマードＣＡＲ−Ｔは、腫瘍により分泌されるサイトカインの作用に対してアーマードＣＡＲ−Ｔを保護するか、または耐性にするタンパク質または受容体を発現するように設計され得る。例えば、二重陰性型のＴＧＦ−β受容体を形質導入したＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）は、リンパ腫によって分泌されるＴＧＦ���βによる免疫抑制に耐性がある。これらの形質導入細胞は、それらの対照の対応物と比較してインビボにおいて顕著に増加した抗腫瘍活性を示した。
【０１５３】
タンデムおよびデュアルＣＡＲ−Ｔ細胞は、２つの異なる抗原結合ドメインを有する点で特有である。タンデムＣＡＲは、細胞内の共刺激および刺激ドメインに連結した細胞外環境に面した２つの連続する抗原結合ドメインを含む。デュアルＣＡＲは、１つの細胞外抗原結合ドメインが細胞内共刺激ドメインに連結し、第２の別個の細胞外抗原結合ドメインが細胞内刺激ドメインに連結するように設計される。刺激ドメインおよび共刺激ドメインは２つの別々の抗原結合ドメインに分けられるため、デュアルＣＡＲは「スプリットＣＡＲ」とも呼ばれる。タンデムおよびデュアルＣＡＲの両方の設計において、両方の抗原結合ドメインの結合がＴ細胞のＣＡＲ回路のシグナル伝達を可能にするために必要である。これらの２つのＣＡＲの設計は異なる別個の抗原に対する結合親和性を有するため、これらは「二重特異性」ＣＡＲとも呼ばれる。
【０１５４】
「生きている治療物質」の形態としてのＣＡＲ−Ｔ細胞の１つの主要な懸念は、インビボでの操作性および潜在的な免疫刺激性の副作用である。ＣＡＲ−Ｔ療法をより上手く制御し、望ましくない副作用を防ぐために、様々な特徴（オフスイッチ、安全性の機構、および条件的な制御機構を含む）が設計されている。自己破壊型および標識化／タグ化ＣＡＲ−Ｔ細胞は、例えばＣＡＲを発現するＴ細胞の排除を促進する「オフスイッチ」を有するように設計される。自己破壊型ＣＡＲ−ＴはＣＡＲを含むが、外来性分子の投与により誘導されるアポトーシス促進性の自殺遺伝子または「除去遺伝子」を発現するように設計されている。様々な自殺遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、Ｆａｓ、ｉＣａｓｐ９（誘導性カスパーゼ９）、ＣＤ２０、ＭＹＣタグ、および切断型ＥＧＦＲ（内皮増殖因子受容体）を含む）がこの目的に使用され得る。例えば、ＨＳＫは、プロドラッグのガンシクロビル（ＧＣＶ）を複製ＤＮＡに自身を組み込むＧＣＶ三リン酸に変換し、最終的に細胞死を引き起こす。ｉＣａｓｐ９は、小分子ＡＰ１９０３に結合するＦＫ５０６結合タンパク質の成分を含むキメラタンパク質であり、カスパーゼ９の二量体化およびアポトーシスを引き起こす。しかしながら、標識化／タグ化ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＡＲを有し、選択マーカーを発現するように設計されている。この選択マーカーに対するｍＡｂの投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の排除を促進する。切断型ＥＧＦＲは抗ＥＧＦＲ ｍＡｂによるそのような標的可能な抗原の１つであり、セツキシマブの投与はＣＡＲ−Ｔ細胞の除去を促進するように機能する。これらの機能を有するように作製されたＣＡＲは、「切替え可能なＣＡＲ」としてｓＣＡＲ、および「調節可能なＣＡＲ」としてＲＣＡＲとも呼ばれる。「セーフティＣＡＲ」は「抑制性ＣＡＲ」（ｉＣＡＲ）としても知られており、２つの抗原結合ドメインを発現するように設計される。これらの細胞外ドメインの１つは腫瘍関連抗原に対するものであり、細胞内共刺激および刺激ドメインに結合している。しかし、第２の細胞外抗原結合ドメインは正常組織に特異的であり、細胞内チェックポイントドメイン（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１またはＣＤ４５など）に結合している。複数の細胞内抑制性ドメインをｉＣＡＲに組み込むことも可能である。これらの抑制性ドメインを提供し得るいくつかの抑制性分子には、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、ＰＩＨ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１およびＴＧＦβ−Ｒが含まれる。正常組織の存在下において、この第２の抗原結合ドメインの刺激はＣＡＲを阻害するように機能する。この二重の抗原特異性のため、ｉＣＡＲは二重特異性ＣＡＲ−Ｔ細胞の一種でもあることに留意すべきである。セーフティＣＡＲ−Ｔの設計は腫瘍組織に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の特異性を増強し、標準的なＣＡＲではオフターゲット効果をもたらす特定の正常組織が非常に低いレベルで腫瘍関連抗原を発現し得る状況において有利である（Morgan 2010）。コンディショナルＣＡＲ−Ｔ細胞は、細胞内共刺激ドメインおよび別個の細胞内共刺激因子���連結した細胞外抗原結合ドメインを発現する。共刺激および刺激ドメイン配列は、外来性分子の投与によって得られたタンパク質が細胞内に集合してＣＡＲ回路を完成させるように設計される。このようにして、ＣＡＲ−Ｔの活性化が調節され得、特定の患者に合わせて「微調整」または個別化され得る。デュアルＣＡＲの設計と同様に、コンディショナルＣＡＲにおいて不活性な場合、刺激ドメインおよび共刺激ドメインは物理的に分離されている；このため、これらも「スプリットＣＡＲ」と呼ばれる。
【０１５５】
いくつかの実施態様において、増強された多機能性ＣＡＲ−Ｔを作製するために、これらの設計された特徴のうち２つ以上が組み合わされ得る。例えば、ＴＲＵＣＫのようにサイトカインを放出するデュアルＣＡＲまたはコンディショナルＣＡＲの設計によりＣＡＲ−Ｔ細胞を作製できる。いくつかの実施態様において、２つの異なるがん抗原に対する２つの別個の抗原結合ドメイン（各ドメインはそれぞれの共刺激ドメインに結合している）を有する２つのＣＡＲを発現するように、デュアルコンディショナルＣＡＲ−Ｔ細胞が作製され得る。共刺激ドメインは、活性化分子が投与された後にのみ刺激ドメインとともに機能的となる。このＣＡＲ−Ｔ細胞が有効となるためには、がんが両方のがん抗原を発現していなければならず、活性化分子が患者に投与されなければならない；したがって、この設計はデュアルＣＡＲ−Ｔ細胞およびコンディショナルＣＡＲ−Ｔ細胞の両方の機能を組み込んでいる。
【０１５６】
通常、ＣＡＲ−Ｔ細胞はα−β Ｔ細胞を用いて作製されるが、γ−δ Ｔ細胞も使用され得る。いくつかの実施態様において、ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するのに使用される記載されたＣＡＲコンストラクト、ドメインおよび設計された特徴は、他の種類のＣＡＲ発現免疫細胞（ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、骨髄由来の食細胞、およびＮＫＴ細胞を含む）の作製に同様に使用され得る。あるいは、ＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方の特性を有するように作製され得る。さらなる実施態様において、ＣＡＲの形質導入は自家または同種であり得る。
【０１５７】
ＣＡＲの発現のためにいくつかの異なる方法（レトロウイルスの形質導入（γ−レトロウイルスを含む）、レンチウイルスの形質導入、トランスポゾン／トランスポザーゼ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙおよびＰｉｇｇｙＢａｃシステム）およびメッセンジャーＲＮＡの移植を介した遺伝子発現を含む）が使用され得る。遺伝子編集（遺伝子挿入または遺伝子欠失／破壊）は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を設計する可能性に関してもますます重要となっている。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）およびＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）システムは、ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成し得る３つの潜在的な方法である。
【０１５８】
定義
用語「アミノ酸配列」は、アミノ酸残基を表す略称、文字、または単語のリストを指す。本明細書で使用されるアミノ酸の略称は従来のアミノ酸の一文字コードであり、以下のように表される：Ａ、アラニン；Ｂ、アスパラギンまたはアスパラギン酸；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタメート、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン；Ｚ、グルタミンまたはグルタミン酸。
【０１５９】
用語「抗体」は、免疫グロブリン、特異的な結合能を維持するその誘導体、および免疫グロブリン結合ドメインと相同または大部分が相同である結合ドメインを有するタンパク質を指す。これらのタンパク質は天然の供給源に由来していてもよく、部分的または全体的に合成により作製されていてもよい。抗体はモノクローナルであってもよく、ポリクローナルであってもよい。抗体は、任意の種由来の任意の免疫グロブリンクラス（ヒトのクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのいずれかを含む）のメンバーであり得る。例示的な実施態様において、本明細書に記載の方法および組成物とともに使用される抗体は、ＩｇＧクラスの誘導体である。未変化の免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」にはそれらの免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、および標的抗原に選択的に結合する免疫グロブリン分子のヒトまたはヒト化型も含まれる。
【０１６０】
用語「アプタマー」は、特定の標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子を指す。これらの分子は通常、ランダム配列のプールから選択される。選択されたアプタマーは、特有の三次構造に適応して標的分子を高い親和性および特異性で認識できる。「核酸アプタマー」は、その立体構造を介して標的分子に結合し、それによりそのような分子の機能を阻害または抑制するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴ核酸である。核酸アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組合せによって構成され得る。「ペプチドアプタマー」は、一定の足場タンパク質内に挿入された可変ペプチド配列を有するコンビナトリアルタンパク質分子である。ペプチドアプタマーの同定は通常、ストリンジェントな酵母ジハイブリッド条件下で行われ、これは選択されたペプチドアプタマーが細胞内で安定に発現し、正しく折り畳まれる可能性を高める。
【０１６１】
用語「担体」は、化合物または組成物と組み合わせた場合に、その意図された使用または目的のために化合物または組成物の調製、保存、投与、送達、有効性、選択性または他の任意の特徴を補助または促進する化合物、組成物、物質または構造を意味する。例えば、担体は、活性成分の任意の分解を最小限にし、対象における任意の有害な副作用を最小限にするように選択され得る。
【０１６２】
用語「キメラ分子」は、天然の状態で別々に存在する２以上の分子を連結することによって作製された単一の分子を指す。単一のキメラ分子は、そのすべての構成分子の所望の機能性を有する。融合タンパク質はキメラ分子の一種である。
【０１６３】
用語「融合タンパク質」は、１つのポリペプチドのアミノ末端と別のポリペプチドのカルボキシ末端との間に形成されるペプチド結合により２以上のポリペプチドを連結することによって形成されたポリペプチドを指す。融合タンパク質は構成ポリペプチドの化学共役によって形成され得、または単一の連続する融合タンパク質をコードする核酸配列から単一のポリペプチドとして発現され得る。一本鎖融合タンパク質は、単一の連続するポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、分子生物学の従来の技術を用いて２つの遺伝子をインフレームで単一の核酸に連結し、次いで融合タンパク質が生成される条件下で適切な宿主細胞に核酸を発現させることによって調製され得る。
【０１６４】
用語「同一性」は、２つの核酸分子またはポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較のためにアラインされ得る各配列中の位置を比較することによって決定され得る。比較される配列のある位置が同じ塩基で占められている場合、分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、核酸配列によって共有される位置における同一または一致するヌクレオチドの数の関数である。様々なアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラム（ＧＣＧ配列分析パッケージ（University of Wisconsin, Madison, Wis.）の一部として利用できるＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含む）が２つの配列間の同一性を計算するために使用され得、例えば初期設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載の特定のポリペプチドと少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、好ましくは実質的に同一の機能を示すポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが想定される。他の指示がない限り、類似性スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰを使用する場合、類似性の割合はＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性の割合はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一である高スコアの配列ペアにおける残基全体の数および割合を示す；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、アラインメントスコアが正の値を有し、互いに類似している残基の数および割合を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列とこれらの同一性または類似性の程度または任意の中間の同一性または類似性の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって想定および包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は遺伝暗号を用いて推定され、従来の手段によって（特に、遺伝暗号を用いてそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって）取得され得る。
【０１６５】
用語「核酸」は、単一のヌクレオチド、またはあるヌクレオチドの３’位のリン酸基によって別のヌクレオチドの５’末端に連結されている２つ以上のヌクレオチドを含む天然または合成の分子を指す。核酸の長さは限定されず、したがって核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。
【０１６６】
用語「作動可能に連結された」は、核酸と別の核酸配列との機能的関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳終結部位、ならびに他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結された核酸配列の例である。例えば、ＤＮＡの転写調節エレメントへの作動可能な連結は、そのようなＤＮＡの転写がＤＮＡを特異的に認識、結合および転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始されるようなＤＮＡとプロモーターとの間の物理的および機能的関係を指す。
【０１６７】
用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は互換的に使用され、あるアミノ酸のカルボキシ基によって別のアミノ酸のアルファアミノ基に連結されている２つ以上のアミノ酸を含む天然または合成の分子を指す。
【０１６８】
用語「薬学的に許容され得る」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または合理的な利益／リスク比に見合った他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物、物質、組成物および／または剤形を指す。
【０１６９】
用語「タンパク質ドメイン」は、タンパク質の一部または構造的完全性を示すタンパク質全体を指す；この決定は、タンパク質の一部またはタンパク質全体のアミノ酸組成に基づき得る。
【０１７０】
本明細書における「スペーサー」は、融合タンパク質を含むタンパク質を連結するペプチドを指す。スペーサーは通常、タンパク質を結合すること、またはタンパク質間のいくらかの最小距離もしくは他の空間的関係を保持すること以外に、特定の生物活性を有さない。しかしながら、スペーサーの構成アミノ酸は、分子のいくつかの特性（分子のフォールディング、正味の電荷または疎水性など）に影響を与えるように選択され得る。
【０１７１】
本明細書における用語「特異的に結合する」は、ポリペプチド（抗体を含む）または受容体を指す場合、タンパク質および他の生物製剤の不均一集団においてタンパク質もしくはポリペプチドまたは受容体の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定された条件下（例えば、抗体の場合におけるイムノアッセイ条件）において、特定のリガンドまたは抗体が試料中に存在する他のタンパク質、またはリガンドもしくは抗体が生体内で接触し得る他のタンパク質にわずかな量でしか結合しない場合、特定のリガンドまたは抗体は特定の「標的」に「特異的に結合する」（例えば、抗体は内皮抗原に特異的に結合する）。一般に、第２の分子に「特異的に結合する」第１の分子は、第２の分子に対して約１０５Ｍ−１より大きな（例えば、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、および１０１２Ｍ−１またはそれ以上の）親和性定数（Ｋａ）を有する。
【０１７２】
本明細書における用語「特異的に送達する」は、特定の標的分子またはマーカーを有する細胞または組織と分子とが優先的に結合し、標的分子を持たない細胞または組織とは優先的に結合しないことを指す。当然のことだが、分子と非標的細胞または組織との間にある程度の非特異的相互作用が生じ得ることが認識される。それにもかかわらず、特異的な送達は、標的分子の特異的な認識を介するものとして区別され得る。通常、特異的な送達は、送達される分子と標的分子を持たない細胞との間よりも、送達される分子と標的分子を有する細胞との間においてはるかに強い結合をもたらす。
【０１７３】
用語「対象」は、投与または処置の標的である任意の個体を指す。対象は脊椎動物（例えば哺乳類）であり得る。したがって、対象はヒトまたは獣医学における患者であり得る。用語「患者」は、臨床医（例えば医師）の処置を受けている対象を指す。 
【０１７４】
用語「治療上有効」は、使用される組成物の量が疾患または障害の１以上の原因または症状を改善するのに十分な量であることを指す。そのような改善は減少または変化のみを必要とし、必ずしも除去を必要としない。
【０１７５】
用語「形質転換」および「遺伝子導入」は、核酸（例えば発現ベクター）のレシピエント細胞への導入（核酸の前記細胞の染色体ＤＮＡへの導入を含む）を意味する。
【０１７６】
用語「処置」は、疾患、病状または障害を治癒、改善、安定化または予防することを意図した患者の医学的管理を指す。この用語は、疾患、病状または障害の改善を特異的に対象とする処置である積極的処置を含み、関連する疾患、病状または障害の原因の除去を対象とする処置である原因処置を含む。さらに、この用語は、疾患、病状または障害の治癒ではなく症状の軽減のために設計された処置である緩和的処置；関連する疾患、病状または障害の発生を最小化するか、または部分的もしくは完全に阻害することを対象とする処置である予防的処置；および、関連する疾患、病状または障害の改善を対象とする別の特定の治療を補足するために利用される処置である補助的処置を含む。
【０１７７】
用語「バリアント」は、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換（すなわち、縮重バリアント）、アミノ酸をコードする各コドン（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）のゆらぎ位置における置換、ペプチドのＣ末端に付加されたアミノ酸、または参照配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するペプチドを有するアミノ酸またはペプチド配列を指す。
【０１７８】
用語「ベクター」は、ベクター配列に連結している別の核酸を細胞内に輸送できる核酸配列を指す。用語「発現ベクター」には、細胞による発現に適した形態の（例えば、転写調節エレメントに連結した）遺伝子コンストラクトを含む任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミドまたはファージ染色体）が含まれる。
【０１７９】
本発明の多くの実施態様が記載されている。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な改変がなされ得ることが理解される。したがって、他の実施態様は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【実施例】
【０１８０】
実施例１：ＣＡＲ Ｔ機能の４−１ＢＢによる増強はＮＦ−κＢおよびＴＲＡＦを必要とする
方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６、Ｔｈｙ１．１（Ｂ６．ＰＬ−Ｔｈｙ１ａ／ＣｙＪ）、およびＲａｇ１−／−（Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ／Ｊ）マウスをJackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から購入し、ＮＦ−κＢ−ＲＥ−ｌｕｃ（ＢＡＬＢ／ｃ−Ｔｇ（Ｒｅｌａ−ｌｕｃ）３１Ｘｅｎ）トランスジェニックマウスをTaconic (Hudson, NY)から購入した。Ｔｒａｆ１−／−マウスはトロント大学のTania Watts博士から頂戴し、Ｍｏｆｆｉｔｔの動物施設で維持および飼育した。ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）をJackson Laboratoryから購入し、Ｍｏｆｆｉｔｔの動物施設で飼育した。８〜１２週齢の雌性および／または雄性マウスを研究に使用した。生存研究のために、マウスにＥμ−ＡＬＬ（１×１０６細胞／マウス、０日目）を静脈内注射し、その後シクロホスファミド（２５０〜３００ｍｇ／ｋｇ、６〜７日目）およびｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞（０．１５〜５×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞／マウス、７〜１０日目）を腹腔内注射した。マウスを病気についてモニターし、白血病の進行が認められた場合（活動の低下、猫背の姿勢および毛の乱れ(ruffled coat)など）に屠殺した。特定の時点で、血液および／または骨髄を分析のために収集した。Ｒａｇ１−／−マウスの研究のために、マウスに１×１０６個のｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射した。フローサイトメトリーのために血液およびＢＭを採取した。
【０１８１】
細胞
Ｅμ−ＡＬＬ細胞株が記載されている（Davila ML, et al. PLoS One. 2013 8(4):e61338）。細胞を、フィーダーとしての（３０Ｇｙで）照射されたＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞とともに培養した。培地は、等量の１）２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５５μＭ β−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを添加したＩＭＤＭ、ならびに２）２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ血清を添加したＤＭＥＭからなる。ＥＬ４−ｍＣＤ１９細胞を標的細胞として用いた。ＥＬ４−ｍＣＤ１９細胞が記載されている（Davila ML, et al. PLoS One. 2013 8(4):e61338）。３Ｔ３−ｍＣＤ１９および３Ｔ３−ｈＣＤ１９細胞は、マウスまたはヒトＣＤ１９をレトロウイルスにより形質導入したＮＩＨ／３Ｔ３細胞であり、標的細胞として用いた。ＣＨＯ−ｈＣＤ３３細胞は、ヒトＣＤ３３をレトロウイルスにより形質導入したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、ヒトＣＤ３３標的ＣＡＲ Ｔ細胞の標的細胞として用いた。ＮＩＨ／３Ｔ３およびＣＨＯ細胞をATCC (Manassas, VA)から購入した。マウスＴ細胞完全培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５５μＭ β−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンからなる。健常なドナー由来のヒトＰＢＭＣをReachBio (Seattle, WA)から購入した。ヒトＴ細胞完全培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンからなる。すべての培地および添加物は、ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)からのものであった。ＮＦ−κＢ／２９３／ＧＦＰ−ＬｕｃＴＭ転写レポーター細胞をSystem Biosciences (Palo Alto, CA)から購入し、製造者の説明書に従って維持および使用した。ＦＦＬｕｃ−ＧＦＰ ＮＡＬＭ６（ＮＡＬＭ６−ＧＬ）細胞が記載されている（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28）。
【０１８２】
遺伝子コンストラクトおよびＣＡＲ Ｔ細胞の作製
ＳＦＧレトロウイルスコンストラクトをすべてのコンストラクトに用いた。ｍ１９Δｚ、ｍ１９ｚ、ｍ１９２８ｚ、およびｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲが記載されている（Davila ML, et al. PLoS One. 2013 8(4):e61338; Ghosh A, et al. Nat Med. 2017 23(2):242-9）。マウス４−１ＢＢエンドドメインをヒト４−１ＢＢエンドドメインまたは変異型マウス４−１ＢＢドメインに置換するように、これらのコンストラクトを改変した（図２Ａおよび９Ａ）。ヒトＣＤ１９標的ＣＡＲは、図９Ａに記載のヒト対応物とマウス４−１ＢＢエンドドメインを組み合わせたＦＭＣ６３ ｓｃＦｖを含むようにGenewiz (South Plainfield, NJ)によって合成された。ＴＲＡＦおよびＴＲＡＦ ＤＮ（ドミナントネガティブ）コンストラクトは、コード配列、グリシンセリンリンカー、ｃｅｒｕｌｅａｎ、および終止コドンを含み、これらは合成され、ＳＦＧレトロウイルスベクターにサブクローニングされた。ＴＲＡＦ ＤＮコード配列が記載されている（Duckett CS, et al. Mol Cell Biol. 1997 17(3):1535-42）。ＴＲＡＦ１ ＤＮ（１８４〜４１７ａａ）はＴＲＡＦドメインのみからなり、ＴＲＡＦ２ ＤＮ（８７〜５０１ａａ）はリングフィンガードメインを持たず、ＴＲＡＦ３ ＤＮ（３８２〜５６８ａａ）もリングフィンガードメインを持たない。すべてのＳＦＧコンストラクトをＨ２９細胞にリン酸カルシウム法で遺伝子導入した。遺伝子導入されたＨ２９細胞のレトロウイルス上清を採取し、マウスＴ細胞の形質導入のためにＰｈｏｅｎｉｘ Ｅ細胞またはヒトＴ細胞の形質導入のためにＲＤ１１４細胞を形質導入するのに用いた。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＥまたはＲＤ１１４生成細胞のレトロウイルス上清を回収し、０．４５μＭでろ過し、記載されているようにマウスまたはヒトＴ細胞を形質導入するのに用いた（Davila ML, et al. PLoS One. 2013 8(4):e61338; Li G, et al. Methods Mol Biol. 2017 1514:111-8）。ＴＲＡＦ過剰発現ＣＡＲ Ｔ細胞のために、１日目および２日目においてＴ細胞にＣＡＲまたはＴＲＡＦを含むレトロウイルスを同時形質導入した。３日目または４日目にＣＡＲ Ｔ細胞を収集し、ビーズを除去し、下流の実験的使用の前に計数および生存率評価を行った。生存率を、細胞をトリパンブルーで染色することによって測定し、自動セルカウンター（Bio-Rad, Hercules, CA）上で数えた。形質導入効率を、フローサイトメトリーによって検出したＧＦＰ＋またはＣｈｅｒｒｙ＋生細胞の割合として推定した。一部の実験では、ＣＡＲの発現を、記載されるように、Ｔ細胞を１μｇのビオチン−プロテインＬ（GenScript, Piscataway, NJ）およびその後の蛍光色素標識ストレプトアビジン（eBioscience）で染色し、フローサイトメトリーによって評価した（Zheng Z, et al. Journal of translational medicine. 2012 10:29）。下流の実験のために、ＣＡＲ Ｔ細胞の用量をＣＡＲ遺伝子導入に基づいて正規化したが、ＣＡＲ陰性Ｔ細胞を排除するようにソートしなかったため、Ｔ細胞全体の用量は様々であった。照射研究のために、ＣＡＲ Ｔ細胞を１０Ｇｙで照射した。ＣＤ３３標的ＣＡＲの開発は補足方法に記載されている。
【０１８３】
フローサイトメトリー
記載されているクローンを含むこれらの抗マウスまたは抗ヒト抗体を、eBioscience (San Diego, CA)から入手した：抗ｍＣＤ１６／ＣＤ３２（９３）、抗ｍＢ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、抗ｍＣＤ１９（ｅＢｉｏ１Ｄ３）、抗ｍＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、抗ｍＣＤ４（ＧＫ１．５）、抗ｍＣＤ８（５３−６．７）、抗ｍＴｈｙ１．１（ＨＩＳ５１）、抗ｍＣＤ４４（１Ｍ７）、抗ｍＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、抗ｍＴＥＲ１１９（ＴＥＲ−１１９）、抗ｍＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、抗ｍＧｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）、抗ｍＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、抗ｍＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）、抗ｍＴＮＦα（ＭＰ６−ＸＴ２２）、抗ｍＢｃｌ２（１０Ｃ４）。これらはBiolegend (San Diego, CA)からのものであった：抗ｍＣＤ３（１７Ａ２）、抗ｍＣＤ４（ＲＭ４−５）、抗ｍＣＤ８（５３−６．７）。これらはBD Bioscience (San Jose, CA)からのものであった：抗ｈＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、抗ｈＣＤ４（ＳＫ３）、抗ｈＣＤ８（ＲＡＰ−Ｔ８）。抗ＢＣＬ−ＸＬ（５４Ｈ６）は、Cell Signaling Technology (Danvers, MA)からのものであった。
【０１８４】
細胞を最初にＰＢＳで２回洗浄し、固定可能な生存率測定用色素（eBioscience）で染色した。表面染色を、０．５％ＢＳＡ（Miltenyi Biotec, San Diego, CA）を含むＭＡＣＳ緩衝液中でＦｃ ｂｌｏｃｋ（eBioscience）および抗体混合物を用いて４℃で行った。細胞内染色のために、１００万個のＣＡＲ Ｔ細胞を、タンパク質輸送阻害剤（eBioscience）の存在下で１×１０５個の照射された３Ｔ３−ｍＣＤ１９と４時間共培養した。Ｔ細胞を、細胞内固定および透過処理緩衝液セット（eBioscience）を用いて回収、固定および透過処理した後、抗体染色を行った。製造者の説明書に従った。末梢血試料を抗体で染色し、その後ＢＤ ＦＡＣＳ溶解液を用いて溶解した（Davila ML, et al. PLoS One. 2013 8(4):e61338）。一部の実験では、Ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を細胞の定量化に用いた。すべての試料を５レーザーＢＤ ＬＳＲＩＩ（BD Biosciences）で分析し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star, Ashland, OR）を用いて分析した。
【０１８５】
サイトカインイムノアッセイ
１００万個のマウスＣＡＲ Ｔ細胞を１×１０５個の３Ｔ３−ｍＣＤ１９細胞と２４時間共培養した。上清を回収し、マウスｌｕｍｉｎｅｘキット（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて分析した。データをＬｕｍｉｎｅｘ１００システム（Luminex, Austin, TX）で収集した。製造者の説明書に従った。ヒトＣＡＲ Ｔ細胞研究のために、ＣＡＲ Ｔ細胞を３Ｔ３−ｈＣＤ１９細胞と１０：１で２４時間共培養した。上清を回収し、Ｅｌｌａ ｍａｃｈｉｎｅ（ProteinSimple, San Jose, CA）上でＳｉｍｐｌｅ Ｐｌｅｘアッセイキット（R&D systems）を用いて分析した。製造者の説明書に従った。
【０１８６】
細胞毒性アッセイ
ＥＬ４−ｍＣＤ１９を標的細胞とし、マウスＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞をエフェクターとして、４時間のクロム放出アッセイを行った。本発明者らの方法が記載されている（Davila ML, et al. PLoS One. 2013 8(4):e61338）。細胞毒性アッセイを、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ（リアルタイム細胞分析）装置（ACEA Biosciences, San Diego, CA）上で製造者の説明書に従って実行した。簡潔に述べると、３Ｔ３−ｍＣＤ１９または３Ｔ３−ｈＣＤ１９細胞をＥ−Ｐｌａｔｅ９６に１ウェルあたり１０，０００細胞で播種した。翌日、マウスまたはヒトＣＡＲ Ｔ細胞をＩＬ２を含まない新鮮な完全培地に再懸濁し、標的細胞上に種々のＥ：Ｔ比で添加し、細胞増殖をモニターした。
【０１８７】
ウエスタンブロットおよび免疫沈降
ＣＡＲ Ｔ細胞を３Ｔ３−ｍＣＤ１９で１０：１の比率で４時間刺激した。細胞溶解物を、６ｘ１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞について２４０μｌの細胞溶解緩衝液（Cell Signaling Technology, Danvers, MA）を用いて調製した。３０μｌの還元および変性させた細胞溶解物を１０％ Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｐｒｅｃａｓｔゲル（Bio-Rad, Hercules, California）により電気泳動し、ニトロセルロースブロット膜に移行してブロックし、膜を分子量に基づいて切断して種々のタンパク質をプローブした。膜を一次抗体と１：１０００で一晩４度でインキュベートした。ブロットを洗浄し、ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ（Cell Signaling Technology）と１：１０，０００で室温で１時間インキュベートした。ブロットを再度洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ ｆｅｍｔｏ ｍａｘｉｍｕｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ThermoFisher, Waltham, MA）とともにインキュベートした。Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｆｃイメージングシステム（LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE）上で画像を取得した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてタンパク質の半定量化を行った。抗ＢＣＬＸＬ（５４Ｈ６）、抗ＢＣＬ２（Ｄ１７Ｃ４）および抗βアクチンウサギｍＡｂ（１３Ｅ５）は、Cell Signaling Technologyからのものであった。
【０１８８】
免疫沈降（ＩＰ）実験のために、３０×１０６個のＣＡＲ発現ＮＦ−κＢ／２９３／ＧＦＰ−Ｌｕｃレポーター細胞を、製造者の推奨に従ってｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma-Aldrich）を添加したＲＩＰＡ緩衝液（Cell Biolabs, Inc）を用いて溶解した。タンパク質抽出物を、プロテインＬ磁気ビーズ（ThermoScientificTM PierceTM）とともに４℃で一晩インキュベートした。免疫複合体を、ＤｙｎａＭａｇＴＭ−２磁石（LifeTechnologies）を用いて回収し、ＳＤＳＰＡＧＥのために調製した。
【０１８９】
ＮＦ−κＢアッセイ
ＮＦ−κＢ／２９３／ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞（System Biosciences, Palo Alto, CA）に、ＴＲＡＦまたはＴＲＡＦ−ＤＮコンストラクトおよびＣＤ１９標的ＣＡＲをレトロウイルスにより形質導入した。ＮＦ−κＢシグナル伝達を、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより測定することによって評価した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＮＦ−κＢ−ＲＥ−ｌｕｃトランスジェニック脾細胞から作製した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、（３０Ｇｙで）照射された３Ｔ３−ｍＣＤ１９細胞と６ウェルプレート中で４時間共培養した。各群について、１ウェルあたり３×１０６個のｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞に正規化したＴ細胞を、１ウェルあたり３×１０５個の３Ｔ３−ｍＣＤ１９細胞とともにインキュベートした。刺激後、細胞溶解物をＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Promega, Madison, WI）を用いて調製した。ルシフェラーゼアッセイを、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を用いて製造者の説明書に従って行った。細胞溶解物を９６ウェルホワイトプレート（Corning, Corning, NY）に１ウェルあたり２０μｌ添加し、その後１ウェルあたり１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、生物発光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌマイクロプレートルミノメーター（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）上で直ちに測定した。各試料を３通りで行った。
【０１９０】
ヒトＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでの増殖
正規化した数（１または２×１０６）のヒトＣＡＲ Ｔ細胞を、組織培養処理されていない６ウェルプレート中で１ウェルあたり２×１０５個の３Ｔ３−ｈＣＤ１９ ＡＡＰＣと３通りで共培養した。細胞を６０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ２を添加したヒトＴ細胞完全培地中で増殖させ、２〜３日ごとまたは培地が黄色に変化するたびに分割した。各ウェルにおける細胞生存率および総細胞数を、トリパンブルー染色を用いてセルカウンター（Bio-Rad）上で（Ｔ単離を０日目として）毎日または２〜４日ごとに測定した。インビトロでの増殖のフローサイトメトリー分析のために、ＣＡＲ Ｔ細胞をｅＦｌｕｏｒ６７０増殖色素（eBioscience）で染色し、その後標的細胞と５：１の比率で４日間共培養した。
【０１９１】
統計
平均値を対応のないパラメトリックな両側ｔ検定を用いて比較した。細胞毒性曲線をコルモゴルフ−スミルノフ検定を用いて比較した。インビトロでのヒトＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を二元配置分散分析を用いて比較した。生存率をログランク検定を用いて比較した。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア７（Graphpad, La Jolla, CA）およびＲソフトウェアパッケージを用いて行った。＊Ｐ＜０．０５を有意であると見なした。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意でない。
【０１９２】
遺伝子発現
マイクロアレイ。ｍ１９ｚ、ｍ１９２８ｚおよびｍ１９−ｍｕｓＢＢｚの比較のために、３００万個のＣＡＲ Ｔ細胞を３×１０５個の３Ｔ３−ｍＣＤ１９細胞と一晩インキュベートした。翌日、生きているＣＡＲ Ｔ細胞をＴｒｉｚｏｌ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）中にソートした。ＲＮＡを製造者の説明書に従って単離し、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ ＦａｃｉｌｉｔｙにおいてＭＯＥ ４３０Ａ ２．０ ａｒｒａｙ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（Affymetrix, Santa Clara, CA）上に流した。遺伝子発現解析およびグラフ表現を、Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅソフトウェアを用いて行った。ＲＭＡの正規化を行い、すべての試料の各プローブセットについて値を生成した。差次的に発現した遺伝子を分散分析によって検出し、統計的有意性を有するプローブセットを倍率変化＞２およびＦＤＲ £０．０５によって規定した。
【０１９３】
ＲＮＡ−ＳＥＱ。ｍ１９ｚ、ｍ１９２８ｚおよびｍ１９−ｈｕｍＢＢｚの比較のために、３００万個のＣＡＲ Ｔ細胞を１×１０６個の３Ｔ３−ｍＣＤ１９細胞と４８時間インキュベートした。生きているＣＤ４＋ ＣＡＲ Ｔ細胞をＴｒｉｚｏｌ中にソートした。ＲＮＡを製造者の説明書に従って単離し、品質について評価した。Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｏｒｅにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｔｒｕ−ｓｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ試料調製キットを用いてｍＲＮＡの濃縮およびｃＤＮＡライブラリーの調製を行った。最終的なＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーをサイズおよび品質についてＡｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ上で確認した後、Ｋａｐａライブラリー定量化キットを用いて定量ＰＣＲに基づく定量化を行った。試料ごとに約４０００万対の読み取りデータを生成するために、ライブラリーを２つのＮｅｘｔＳｅｑ高出力２ｘ７５ペアエンドシークエンシングの実行によりシークエンシングした。配列読み取りデータを、Ｔｏｐｈａｔ２（Trapnell C, et al. Bioinformatics. 2009 25(9):1105-11）を用いてスプライシングを認識する様式でヒト参照ゲノムとアラインし、イントロンを含む配列の正確なアラインメントを可能とした。アラインされた読み取りデータを、ＨＴｓｅｑ（Anders S, et al. Bioinformatics. 2015 31(2):166-9）を用いて遺伝子レベルで定量化した。正規化、発現モデリングおよび差異の試験を、ＤＥＳｅｑ（Anders S, et al. Genome Biol. 2010 11(10):R106）を用いて行った。品質管理の測定には、読み取りデータの数の計測、アラインメントの割合、染色体のアラインメントの数、発現分布の測定、ならびに主成分分析および階層的クラスタリングを調べるためのカスタムスクリプトおよびＲＳｅｑＣ（Wang L, et al. Bioinformatics. 2012 28(16):2184-5）が含まれていた。
【０１９４】
差次的に発現した遺伝子を分散分析によって検出し、統計的有意性を有するプローブセットを倍率変化＞４およびＦＤＲ £０．０１によって規定した。遺伝子セットの濃縮分析を（遺伝子発現の値に対して）行い、ＧＳＥＡソフトウェアを用いて遺伝子セットの濃縮を分析した。専門家が精選したジーンオントロジー（ＧＯ）遺伝子セットを含む、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ＤａｔａｂａｓｅのＣ５コレクションバージョンｖ６．０（ＭＳｉｇＤＢ ｖ６．０ Ｃ５）を分析に用いた。脊椎動物のホモロジーリソースを用いて、ヒトとマウスとの間のホモログ遺伝子の変換を行った。すべての比較について、データを遺伝子記号に分解した。遺伝子セットに基づいて１０００回の配列を行った。遺伝子セットを、偽発見率（ＦＤＲ）ｑ値に従って順位付けした。０．２５のＧＳＥＡにおける初期設定のＦＤＲ ｑ値のカットオフにおいて、ｍ１９ｚで上方制御されている３つの遺伝子セットおよびｍ１９２８ｚで上方制御されている６８の遺伝子セットを同定した。
【０１９５】
マイクロアレイおよびＲＮＡ−ＳＥＱデータを、アクセッション番号ＧＳＥ１１２５６７でＧＥＯ（Gene Expression Omnibus）に提出した。
【０１９６】
ＣＤ３３標的ＣＡＲ
抗ＣＤ３３抗体は、標準的な方法を用いてVanderbilt Antibody and Protein Resourceにおいて開発された（Markham NO, et al. Hybridoma (Larchmt). 2012 31(4):246-54）。簡潔に述べると、一連の免疫化を完了した後、免疫化マウスの脾細胞を単離し、Ｉｇ非分泌型骨髄腫細胞株と融合させ、半固体プレート中で増殖させた。抗体を分泌するクラスターを半固体プレートにおいて同定し、９６ウェルプレートにおけるクローン増殖のために選択した。増殖中に上清を収集し、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによってＣＤ３３結合についてアッセイした。このスクリーニングに基づいて、ＲＮＡの増殖および単離のためにハイブリドーマを選択し、これを用いてＩｇＨおよびＩｇＬの再構成を増幅した。ＩｇＨおよびＩｇＬの再構成に基づいてｓｃＦｖを設計し、ＳＦＧレトロウイルスカセット内の本発明者らのヒトＣＤ１９標的ＣＡＲのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングした。これは、抗ヒトＣＤ１９ ｓｃＦｖを抗ヒトＣＤ３３ ｓｃＦｖに置換することを可能とした。次に、これらのコンストラクトを用いて、方法に記載されるようにガンマレトロウイルス上清を生成した。
【０１９７】
ＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボにおけるＮＡＬＭ６動物モデル
ＮＡＬＭ６白血病マウスモデルが記載されている（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28）。簡潔に述べると、ＮＡＬＭ６−ＧＬ細胞をＮＳＧマウスに５ｘ１０５個の用量で静脈内注射した。４日後にマウスを３ｘ１０５〜１ｘ１０６個のヒトＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞で処理した。過剰なＴＲＡＦ２を含むヒトＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲおよびマウスＴＲＡＦ２の同時形質導入、またはＣＡＲおよびヒトＴＲＡＦ２を組み合わせたバイシストロニックなコンストラクトによる形質導入によって作製した。血液試料をフローサイトメトリーのために毎週収集した。白血病の負荷を、ＩＶＩＳシステム上で生物発光イメージングを用いて毎週評価した。生存率をモニターした。進行性白血病の兆候を示した場合にマウスを屠殺した。
【０１９８】
結果
ストレス用量のレベルにおいて、マウス４−１ＢＢエンドドメインを有するＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞（ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ）は、ＣＤ２８エンドドメインを含むＣＡＲを有するＴ細胞（ｍ１９２８ｚ）ほど効果的に白血病を根絶しない。
【０１９９】
４つのｍＣＤ１９標的ＣＡＲ（これらはすべてマウス由来であり、マウスＣＤ８ａヒンジおよび膜貫通ドメインと対となる同一のラット起源細胞外抗ｍＣＤ１９ ｓｃＦｖを有する）を評価した。これらは、ドメインなし（ｍ１９Δｚ）、ＣＤ３ζ単独（ｍ１９ｚ）、またはＣＤ２８（ｍ１９２８ｚ）もしくは４−１ＢＢ共刺激ドメイン（ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ）と対となったＣＤ３ｚを含むことにより、細胞内活性化および共刺激ドメインのみが異なっている。免疫適格マウスモデル（Davila ML, et al. PLoS One. 2013 8(4):e61338）においてマウスＣＤ１９（ｍＣＤ１９）標的ＣＡＲ Ｔ細胞の比較を行い、これは共刺激によって媒介される養子移入ＣＡＲ Ｔ細胞における生物学的差異を同定することを可能にする根拠を伴い、これらの差異を引き起こすシグナル伝達機構を同定するためにさらに調査され得る。これらのマウスＣＡＲ Ｔ細胞の抗原特異的細胞毒性を４時間のクロム放出アッセイで評価した。これは、ｍ１９２８ｚまたはｍ１９ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞がＣＤ１９＋標的細胞を同様のレベルで溶解し、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞がより効果が低かったことを示した（図１Ａ）。３Ｔ３−ｍＣＤ１９人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）で一晩刺激した後、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞はｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも多くのＩＦＮｇおよびＴＮＦαを放出した（図１Ｂ）。
【０２００】
次に、本発明者らのＢ−ＡＬＬマウスモデル（Davila ML, et al. PLoS One. 2013 8(4):e61338）を用いてｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボでの機能を比較した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥμ−ＡＬＬ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、１週間後にマウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）においてシクロホスファミドで処理した後、ｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞で処理した。より効果の低いインビトロでの機能にかかわらず、５ｘ１０６細胞（図１Ｃおよび８Ａ）の用量において、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞はｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と類似した生存率を支持した。ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞およびｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞はともにＢ細胞無形成を維持し、注入の３週間後の末梢血において同等の持続性を有していた（図１Ｄ）。ＣＡＲ間の有効性の小さな差異を検出する能力を向上させるために、記載されるように（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28）「ストレス試験」を行い、Ｂ細胞無形成およびＣＡＲ Ｔ細胞の持続を維持することが困難なレベルまでＴ細胞の用量を滴定した（図８Ｂ）。３×１０５用量において、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で処理した４匹のマウスのうち１匹のみが注射の３週間後にＢ細胞無形成を維持していた（図８Ｂ）。したがって、インビボでのＣＡＲ Ｔ細胞機能を比較するために、この用量以下の用量を選択した。このより低い「ストレス試験」用量では、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚまたはｍ１９ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して白血病に対するより優れた保護を与えた（図１Ｅ）。また、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚと比較してインビボでのＢ細胞無形成およびドナーＴ細胞の持続性が増強していた（図１Ｆ）。
【０２０１】
マウスＣＡＲ Ｔ細胞において遺伝子発現およびシグナル伝達経路が共刺激によってどのように影響を受けるのかを決定するために、３Ｔ３−ｍＣＤ１９ ＡＡＰＣで刺激した後、ソートしたｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞のマイクロアレイによって遺伝子発現を評価した。ＣＡＲ Ｔ細胞は連結後にＣＡＲを下方制御し得るため（Walker AJ, et al. Mol Ther. 2017 25(9):2189-201）、ＣＡＲと直接結合していないレポーターの代わりにＣＤ３ｚの後にグリシン−セリンリンカーを用いて蛍光タンパク質と直接共役するようにＣＡＲを改変し、ＣＡＲ陰性Ｔ細胞のソーティングおよび分析を排除した（図９Ａ）。蛍光タンパク質タグを含むマウスＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞は、再現性のあるＣＡＲ発現のパターンを示した（図９Ｂ）。ｍ１９ｚおよびｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較してｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞によって差次的に発現された２０５のプローブセットのコレクションがある（図９Ｃ〜９Ｅ）。これには、ｍ１９ｚおよびｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるエフェクター遺伝子（Ｇｚｍｆ、Ｉｆｎｇ、Ｐｒｆ１）、ならびに消耗(exhaustion)遺伝子または転写因子（Ｈａｖｃｒ２、ＣＤ２４４、Ｋｌｒｇ１、Ｅｏｍｅｓ）の上方制御が含まれる（表１〜４）。対照的に、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＮＦ−κＢの調節、Ｔ細胞の静止および記憶に重要な遺伝子（Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、Ｔｃｆ７、ＮＦ−κＢｉａ、Ｋｌｆ２／４）を上方制御する。また、サイトカイン産生、免疫表現型、ならびにインビボでの白血病の根絶、Ｂ細胞の死滅、および持続性は、蛍光レポーターによってあまり影響されなかったことが観察された（図１０Ａ〜１０Ｃ）。蛍光タグ付きＣＡＲを用いてＣＡＲ Ｔ細胞の持続性を評価するために、血液中のＣＡＲ ＴおよびＢ細胞の数の時間的動態を追跡した。養子移入の１週間後までに、血液中のＣＡＲ Ｔ細胞およびＢ細胞の数にはすでに差異があった（図１０Ｄ）。これは養子移入の４週間後まで続き、Ｂ細胞数は未だ異なっていたが、ＣＡＲ Ｔ細胞数は類似し始めた。したがって、養子移入後１〜４週間の間の時点における血液中のＣＡＲ Ｔ細胞の持続性の分析に注目することを選択した。
【０２０２】
ｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞におけるヒト４−１ＢＢエンドドメインの包含はインビボでの機能を増強させる
臨床結果（Davila ML, et al. Sci Transl Med. 2014 6(224):224ra25; Maude SL, et al. N Engl J Med. 2014 371(16):1507-17; Lee DW, et al. Lancet. 2015 385(9967):517-28; Turtle CJ, et al. J Clin Invest. 2016 126(6):2123-38; Park JH, et al. N Engl J Med. 2018 378(5):449-59; Maude SL, et al. N Engl J Med. 2018 378(5):439-48）は、ＣＤ２８または４−１ＢＢエンドドメインを含む第２世代のヒトＣＡＲ Ｔ細胞で処置した場合、Ｂ−ＡＬＬ患者について類似した有効なＣＲ率を示している。しかしながら、本発明者らのマウスモデルにおいてストレス試験用量を用いると、４−１ＢＢ共刺激の根拠があったにもかかわらず、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚはｍ１９２８ｚよりもやや効果が低いようであった（図９Ｃ〜９Ｅ）。ヒトとマウスとの間の４−１ＢＢエンドドメインの配列の差異（これらは５４％同一である（図２Ａ））が、第２世代のＣＡＲ Ｔ細胞の臨床観察と一致しないやや低下した有効性に寄与していることが推測された。以前の研究では、マウスおよびヒト４−１ＢＢエンドドメインはともにＴＲＡＦに結合し、これはＴＮＦ受容体ファミリータンパク質（４−１ＢＢなど）の下流のシグナル伝達を増強することが示されている（Jang IK, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1998 242(3):613-20; Arch RH, et al. Mol Cell Biol. 1998 18(1):558-65; McPherson AJ, et al. J Biol Chem. 2012 287(27):23010-9; Saoulli K, et al. J Exp Med. 1998 187(11):1849-62; Ye H, et al. Mol Cell. 1999 4(3):321-30）。しかしながら、インビトロアッセイ（Jang IK, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1998 242(3):613-20; Arch RH, et al. Mol Cell Biol. 1998 18(1):558-65）では、ヒト４−１ＢＢはＴＲＡＦ１−３に結合するが、マウス４−１ＢＢはＴＲＡＦ１−２のみに結合することが示唆されており、これはｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞におけるヒト４−１ＢＢの置換がＴＲＡＦ３結合およびＣＡＲ Ｔ細胞機能を増強し得るという仮説をもたらす（Vallabhapurapu S, et al. Nat Immunol. 2008 9(12):1364-70）。さらに、異なるＴＲＡＦ結合能を有する４−１ＢＢエンドドメインの比較は、４−１ＢＢ共刺激に依存するＣＡＲ Ｔ細胞によるインビボでの機能の増強を支持するシグナル伝達経路を同定することを可能にし得る。したがって、他の抗マウスＣＤ１９ ＣＡＲに含まれるマウスｓｃＦｖ、ＣＤ８およびＣＤ３ｚドメインと対になるヒト４−１ＢＢエンドドメインを含むバリアントＣＡＲ（ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ）を作製した（図９Ａ）。
【０２０３】
ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでの機能を他のＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞と比較した。３Ｔ３−ｍＣＤ１９ ＡＡＰＣで４時間刺激した後、細胞内フローサイトメトリーにより、ｍ１９２８ｚ ＣＤ８＋ ＣＡＲ Ｔ細胞がＩＦＮγに対して８．４％陽性であり、これはｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ（１．４％）またはｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＤ８＋ ＣＡＲ Ｔ細胞（平均０．３％）よりも著しく高いことが示された（図２Ｂ）。さらに、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は最も多くの量のＴＮＦαを産生した。ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲと比較して、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲで改変されたＴ細胞によりＴＮＦα産生が（約２倍）増強された（図２Ｂ）。１０：１のＥ：Ｔ比での細胞毒性アッセイでは、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲで改変されたＴ細胞は、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚと比較して死滅が増強されておらず、すべての標的細胞を迅速に死滅させるｍ１９ｚおよびｍ１９２８ｚ ＣＡＲよりも効果が低かったことが示された（図２Ｃ）。
【０２０４】
また、ストレス試験の細胞用量を用いて本発明者らのＥμ−ＡＬＬモデルにおいてｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボでの機能を他のｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞と比較した。すべての群におけるＣＡＲ Ｔ細胞は、バランスのとれた類似したＣＤ４：ＣＤ８比および主にセントラルメモリー（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞で構成された免疫表現型を有していた（図１１）。想定されるように、ｍ１９Ｄｚおよびｍ１９ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞群における全生存率（ＯＳ）は、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞によって与えられたＯＳ（１５０日目に５７％であった）と比較して不十分であった（図２Ｄ）。しかし、そのインビトロでの不十分な機能にもかかわらず、「ストレス試験」条件下においてｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は１５０日目に７０％のＯＳを媒介し、これはｍ１９Ｄｚおよびｍ１９ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して著しく増強されており、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞に類似していた（図２Ｄ）。ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚおよびｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞によって媒介される改善された生存率は、処理されたマウスの大腿骨のＢ細胞およびＣＡＲ Ｔ細胞によって反映されていた。処理の１週間後、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚおよびｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞はともに、ＢＭにおいて類似した持続性を有し、ｍ１９ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも著しく高いＢ細胞無形成を誘導する（図２Ｅ）。
【０２０５】
ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞はインビボでの機能を増強するために持続性に依存している
ヒトＣＡＲ Ｔ細胞における４−１ＢＢ共刺激が、免疫不全マウスにおいて持続性の増強を支持したことが最近報告された（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28.）。したがって、インビトロでの異なる機能にもかかわらず、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚおよびｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞による同等のインビボでの抗白血病の死滅は、４−１ＢＢ共刺激に伴う増強されたｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性によるものであったと仮定した。この仮説を評価するための本発明者らの理論的根拠は、増強された持続性に寄与するシグナル伝達経路の同定がこの特性の増強を可能にしているということであった。しかしながら、本発明者らのモデルにおいて第２世代のＣＡＲ Ｔ細胞の持続性の差異は同定されなかった（図２Ｅ）。したがって、持続性の増強を示した以前の報告（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28.）が免疫不全マウスにおいて実施されていたため、ｍＣＤ１９抗原を持たないＲａｇ１−／−マウスにおいてｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボでの増殖を評価した。Ｒａｇ１−／−マウスに１×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射し、骨髄（ＢＭ）を１週間後に単離した。ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも１．５倍高い最も大きなインビボでの持続性を有していた（図３Ａ）。
【０２０６】
ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞がインビボにおいて最適な機能のために持続性を必要とするか否かを決定するために、注射の前にＣＡＲ Ｔ細胞を（１０Ｇｙで）照射した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにシクロホスファミドを腹腔内注射した後、１日後にＣＡＲ Ｔ細胞（図１２）を注射した。末梢血およびＢＭにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の持続性およびＢ細胞の死滅を、ＣＡＲ Ｔ細胞移入の１週間後に評価した。血液およびＢＭの両方において、照射はｍ１９−ｈｕｍＢＢｚの持続性を著しく減少させたが、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性は減少しなかった（図３Ｂ）。同様に、血液中では、未照射のｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ群の１０匹中９匹のマウスがＢ細胞無形成を維持していたことと比較して、照射されたｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ群のすべてのマウスにおいて初期のＢ細胞の回復が認められた（図３Ｃ）。対照的に、照射は血中またはＢＭ中のｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＢ細胞死滅にあまり影響を与えなかった（図３Ｃ）。
【０２０７】
増強されたインビボでの持続性、ならびに４−１ＢＢの共刺激がＴ細胞の生存率および抗アポトーシスに重要であることを示す以前の研究（Lee HW, et al. J Immunol. 2002 169(9):4882-8）の証拠を伴って、ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率および増殖を評価した。複数の独立した作製から、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞はｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりもわずかに増加していたが、有意に高くはない生存率および増殖を示した（図４Ａおよび４Ｂ）。また、フローサイトメトリーによって抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ２およびＢＣＬ−ＸＬの発現を評価した。抗原刺激がない場合、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも１．６倍高いＢＣＬ２（ＭＦＩ １１０７対６６８）および１．９倍高いＢＣＬ−ＸＬ（ＭＦＩ ６１８５対３３０５）を有している（図４Ｃ）。また、抗原刺激後のウエスタンブロッティングによって抗アポトーシスタンパク質の発現を評価した。ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、βアクチンに対して正規化した後、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高いＢＣＬ２（３．６対１．８）およびＢＣＬ−ＸＬ（５．７対０．０１）発現を有している（図４Ｄ）。
【０２０８】
４−１１ＢＢ共刺激は、マウスＣＡＲ Ｔ細胞においてＣＤ２８共刺激よりも多くのＮＦ−κＢを誘導する
ＣＡＲ Ｔ細胞の減少は患者に再発をもたらす（Maude SL, et al. N Engl J Med. 2014 371(16):1507-17）ため、ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボでの持続性を調節するシグナル伝達経路を同定し、これらの経路を最適化し、持続性をさらに増強することを試みた。したがって、抗原刺激の後にｍ１９ｚ、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚおよびｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞をソートし、ＲＮＡ−ＳＥＱを実施し、これにより各ＣＡＲ群が固有の転写プロファイルを有することを確認した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、４−１ＢＢ対ＣＤ２８を共刺激するか、または共刺激を欠いたＣＡＲ Ｔ細胞を比較した場合に、ＮＦ−κＢを調節する経路の濃縮を明らかにした（図１３Ｃ）。ＮＦ−κＢはＴ細胞の生存（Watts TH. Annu Rev Immunol. 2005 23:23-68）および抗腫瘍制御（Barnes SE, et al. J Immunother Cancer. 2015 3(1):1）に重要な制御因子であるため、種々のレベルのＮＦ−κＢがインビボでのＣＡＲ Ｔ細胞の持続性および／またはｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能の増強の原因となるか否かを評価した。４−１ＢＢ共刺激の機構の研究（Arch RH, et al. Mol Cell Biol. 1998 18(1):558-65）が、野生型４−１ＢＢを形質導入した２９３細胞を用いて実施されている。本発明者らは、ＮＦ−κＢシグナル伝達の指標としてＧＦＰ蛍光の測定を可能とする類似のレポーター細胞株であるＮＦ−κＢ／２９３／ＧＦＰ−Ｌｕｃを用いた。マウスＣＤ１９標的ＣＡＲをＮＦ−κＢ／２９３／ＧＦＰ−Ｌｕｃレポーター細胞にレトロウイルスにより形質導入し、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ形質導入のみがＮＦ−κＢを誘導した（図５Ａ）。抗原で刺激した初代ｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞においてこの観察を検証した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＮＦ−κＢ応答配列によって調節されるホタルルシフェラーゼ導入遺伝子を有するＮＦ−κＢ−ＲＥ−ｌｕｃトランスジェニックマウスから作製した（Carlsen H, et al. J Immunol. 2002 168(3):1441-6）。３Ｔ３−ｍＣＤ１９ ＡＡＰＣで４時間刺激した後、ＣＡＲ Ｔ細胞溶解物を調製し、生物発光を評価した。ｍ１９Δｚと比較して、ＮＦ−κＢシグナル伝達はｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞において２９倍増加し、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞において約５倍増加した（図５Ｂ）。
【０２０９】
４−１ＢＢ共刺激ドメインの変異は、ＮＦ−κＢおよびヒトＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでの機能を調節する
本発明者らは、４−１ＢＢドメインを含むＣＡＲを有するｍＣＤ１９標的Ｔ細胞が増殖およびＮＦ−κＢシグナル伝達を増強したことを示した。本発明者らは初代ヒトＴ細胞においてこれらの観察を検証し、ＮＦ−κＢシグナル伝達がＣＡＲ Ｔ細胞の生存率および増殖と相関しているか否かを直接評価することによってそれらを拡張することを試みた。野生型（ｈ１９ＢＢｚ）または変異型（ｍｕｔ０１〜ｍｕｔ０４）４−１ＢＢエンドドメインを含むヒトＣＤ１９（ｈＣＤ１９）標的ＣＡＲ（図５Ｃ）を開発し、ＮＦ−κＢシグナル伝達を調節した。４１ＢＢエンドドメイン変異体は以前に同定された（Jang IK, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1998 242(3):613-20; Arch RH, et al. Mol Cell Biol. 1998 18(1):558-65;Saoulli K, et al. J Exp Med. 1998 187(11):1849-62; Ye H, et al. Mol Cell. 1999 4(3):321-30）ＴＲＡＦ１−３結合ドメイン内に位置していた。ｈＣＤ１９標的ＣＡＲがレポーター細胞においてＮＦ−κＢを誘導する能力を測定した。ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲおよび二重４−１ＢＢエンドドメインを有するＣＡＲ（ｍｕｔ０４）は、それぞれ高いレベル（２６％）および中程度のレベル（１２％）のＮＦ−κＢ上方制御を有していた（図５Ｄ）。しかしながら、変異したＴＲＡＦ結合ドメインを有する３つのＣＡＲ（ｍｕｔ０１〜０３）はすべて、形質導入後に最小限のＮＦ−κＢ誘導を示した（図５Ｄ）。次に、これらの異なるレベルのＮＦ−κＢシグナル伝達がヒトＴ細胞のインビトロでの機能にどのように影響を与えるかを評価した。健常なドナーのヒトＴ細胞にｈ１９ＢＢｚまたは変異したＣＡＲをレトロウイルスにより形質導入し、これらは類似の遺伝子導入およびＣＤ４／ＣＤ８比を示した（図１４）。３Ｔ３−ｈＣＤ１９ ＡＡＰＣで刺激した後、細胞増殖をモニターした。より高いレベルのＮＦ−κＢシグナル伝達を有するヒトＣＡＲ Ｔ細胞（ｈ１９ＢＢｚおよびｍｕｔ０４）はまた、ＴＲＡＦ結合ドメインに変異を有するＣＡＲ Ｔ細胞（ｍｕｔ０１〜ｍｕｔ０３、５５．３〜６５．６％）と比較して最も高い生存率（７０〜７４．３％）を有していた（図５Ｅ）。同様に、ｈ１９ＢＢｚおよびｍｕｔ０４ ｈＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞はともに、ｍｕｔ０１〜ｍｕｔ０３ ｈＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞（約５倍、図５Ｆ）よりも著しく多く増殖した（それぞれ１８．６倍および１２．２倍）。しかしながら、１０：１のＥ：Ｔ比では、ＮＦ−κＢシグナル伝達の差異にもかかわらず、すべての群のＣＡＲ Ｔ細胞が３Ｔ３−ｈＣＤ１９細胞を同様に死滅させた（図５Ｇ）。
【０２１０】
ＴＲＡＦ１／ＮＦ−κＢは、インビボでの最適なｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞機能に必要である
研究により、Ｔ細胞におけるＮＦ−κＢシグナル伝達が、少なくとも部分的にＴＲＡＦ１−３と４−１ＢＢの細胞内ドメインとの結合により媒介されていることが示されている（Jang IK, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1998 242(3):613-20; Arch RH, et al. Mol Cell Biol. 1998 18(1):558-65; McPherson AJ, et al. J Biol Chem. 2012 287(27):23010-9; Saoulli K, et al. J Exp Med. 1998 187(11):1849-62; Ye H, et al. Mol Cell. 1999 4(3):321-30）。ＴＲＡＦ２はＣＡＲ Ｔ細胞において４−１ＢＢ共刺激によって媒介される機能の増強に重要であることが推測されるが、直接的な証拠は存在しない（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28; Gomes-Silva D, et al. Cell Rep. 2017 21(1):17-26）。さらに、変異型４−１ＢＢを含むＣＡＲで改変されたヒトＴ細胞の機能の本発明者らの分析（図５Ｄ）は、ＮＦ−κＢシグナル伝達がｈＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖および生存率と相関していることを示しているが、標的ドメインはＴＲＡＦ１、２または３に結合し得るため、どのＴＲＡＦがＮＦ−κＢを調節しているかを区別することはできない。したがって、本発明者らのモデルを適用して、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２またはＴＲＡＦ３がＮＦ−κＢシグナル伝達およびＣＡＲ Ｔ細胞機能を調節しているか否かを決定した。
【０２１１】
ＴＲＡＦドミナントネガティブ（ＤＮ）タンパク質をＮＦ−κＢ／２９３／ＧＦＰ−Ｌｕｃレポーター細胞に導入した後、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲの形質導入を行った。ＣＡＲおよびＴＲＡＦ ＤＮタンパク質の遺伝子導入をフローサイトメトリーによって確認した（図６Ａ）。ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚのみを形質導入した細胞と比較して、ＴＲＡＦ１ ＤＮによるＮＦ−κＢシグナル伝達は減少した（図６Ａ、ＧＦＰ％：４５．５％対１３．４％；ＧＦＰ ＭＦＩ：１０９２９対１６８８）。ＴＲＡＦ３ ＤＮ群もまた、ＮＦ−κＢの減少を示した（図６Ａ、ＧＦＰ％：４５．５％対３０．８％；ＧＦＰ ＭＦＩ：１０９２９対６０５６）が、ＴＲＡＦ１ ＤＮ群と同程度ではなかった。対照的に、ＴＲＡＦ２ ＤＮ群におけるＮＦ−κＢシグナル伝達は、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ対照よりも大きかった（図６Ａ、ＧＦＰ＋％：６３．５％対４５．５％；ＧＦＰ ＭＦＩ：１４３０９対１０９２９）。また、ＴＲＡＦ１がＣＡＲへの結合により同定できるか否かを評価した。ＮＦ−κＢ／２９３／ＧＦＰ−Ｌｕｃレポーター細胞にｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲを形質導入した後、プロテインＬ結合によりＣＡＲを単離し、ＴＲＡＦ１の保持をアッセイした。全タンパク質溶解物および免疫沈降物の両方においてＴＲＡＦ１が検出され、これによりＴＲＡＦ１がｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲに結合することが確認された（図６Ｂ）。
【０２１２】
免疫適格マウスへの養子移入後の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴｒａｆ１−／−（Tsitsikov EN, et al. Immunity. 2001 15(4):647-57）マウスに由来するＣＡＲ Ｔ細胞を評価することによって、ＴＲＡＦ１がｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞機能の４−１ＢＢ共刺激性増強に必要であることを検証することを目的とした。免疫表現型について、ｍ１９２８ｚおよびｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ Ｔｒａｆ１−／−ＣＡＲ Ｔ細胞はともに、より高いＣＤ４／ＣＤ８比およびより高い頻度のセントラルメモリー細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋）を有する（図１５）。また、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ Ｔｒａｆ１−／−ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ野生型ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に低い生存率および増殖を有していたが、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率または増殖はＴＲＡＦ１の欠如によって有意な影響を受けなかった（図６Ｃ）。インビボにおいて、Ｂ細胞はｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ Ｔｒａｆ１−／−ＣＡＲ Ｔ細胞での処理の２週間後に回復したが、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ野生型ＣＡＲ Ｔ細胞はＢ細胞無形成を維持した（図６Ｄ）。同様に、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ Ｔｒａｆ１−／−群におけるＣＡＲ Ｔ細胞の持続性は、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ野生型ＣＡＲ Ｔ細胞群と比較して有意に低下していた（図６Ｄ）。しかしながら、ドナーＴ細胞がＴＲＡＦ１欠損であった場合、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性またはＢ細胞の死滅は有意に低下しなかった（図６Ｄ）。
【０２１３】
ＮＦ−ｋＢシグナル伝達の増加はＣＡＲ Ｔ細胞機能を増強する
ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性の低下はＮＦ−κＢシグナル伝達が最適化されていないためであり、ＮＦ−κＢシグナル伝達を増強する変異によって最適化され得ると仮定した。したがって、マウス４−１ＢＢの最初の５つのＮ末端アミノ酸ミスマッチ（図２Ａにおいて下線が引かれている）をヒト４−１ＢＢアミノ酸に置換したｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ｍｕｔ０１ ＣＡＲを作製した。ヒト４−１ＢＢのこの領域はそのマウスの対応物よりもＴＲＡＦ３に結合することが以前に確認されており（Arch RH, et al. Mol Cell Biol. 1998 18(1):558-65）、本発明者らは最適なＮＦ−κＢに必要であると特徴付けた（図６Ａ）。Ｔ細胞のドナーとしてＮＦ−κＢ−ＲＥ−ｌｕｃトランスジェニックマウスを用いて、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ｍｕｔ０１ ＣＡＲ Ｔ細胞がｍ１９−ｍｕｓＢＢｚと比較して約２倍のＮＦ−κＢシグナル伝達を有することを示し、これはサイトカイン産生および抗アポトーシスタンパク質産生の増加と相関していた（図１６Ａ〜１６Ｃ）。ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ｍｕｔ０１のインビボでの評価により、Ｂ細胞の死滅およびＣＡＲ Ｔ細胞の持続性がｍ１９−ｈｕｍＢＢｚに類似しており、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚよりも有意に高かったことが示された（図１６Ｄ〜１６Ｇ）。
【０２１４】
４−１ＢＢ共刺激ドメインを変異させてＴＲＡＦ結合およびＮＦ−κＢシグナル伝達を増加させることはＣＡＲ Ｔ細胞機能を増強させるための戦略の１つであり、本発明者らは別の戦略が４−１ＢＢ共刺激を利用するＣＡＲ Ｔ細胞において過剰なＴＲＡＦタンパク質を与えることであることを示すことを目的とした。ＮＦ−κＢ／２９３／ＧＦＰ−Ｌｕｃレポーター細胞にｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲおよびＴＲＡＦを同時形質導入した。ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲのみを形質導入したレポーター細胞と比較して、ＴＲＡＦ２はＮＦ−κＢの劇的な増加を支持したが、過剰なＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ３の効果はごくわずかであった（図７Ａ）。また、初代ヒトＴ細胞にｈ１９ＢＢｚおよびＴＲＡＦを同時形質導入し、ＣＡＲ Ｔ細胞機能に対する影響を評価した。ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３の形質導入はともに、ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率、増殖および標的の死滅を有意に増加させた（図７Ｂ〜７Ｄ）。しかしながら、ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞へのＴＲＡＦ１の同時形質導入は、ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率、増殖および標的の死滅の低下をもたらし、これはＣＡＲ発現の低下によるものであり得る（図１７Ａ〜１７Ｂ）。ＴＲＡＦ発現の増加はまた、抗原刺激後のサイトカイン産生を調節する（図１７Ｃ）。また、ＮＡＬＭ６白血病細胞株で処理した後、過剰なＴＲＡＦ２を有するか、または有さないｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入を行ったＮＳＧマウスのインビボでの活性を比較した（図１８）。両方のｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞群は、形質導入していないＴ細胞と比較して白血病の死滅および生存率を増強させたが、どちらの群も互いに優れているようではなかった。これはＮＡＬＭ６／ＮＳＧマウスモデルの攻撃性の性質によるものであり得（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28）、白血病を急速に死滅させる必要があるため、第２世代のＣＡＲ Ｔ細胞でさえ死を防ぐことができない。
【０２１５】
本発明者らはヒトおよびマウスの両方のＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞機能の調節におけるＮＦ−κＢおよびＴＲＡＦの役割を実証したが、ＣＤ１９抗原がこれらの結果に寄与し得ることを排除できていない。したがって、ＣＤ３３標的ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖が、ＮＦ−κＢを大幅に増加させるＴＲＡＦ２の過剰発現によってどのように影響を受けるかを評価した（図７Ａ）。ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲと同じ設計であるが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖが抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖに置換されており、その後にＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメインならびにＣＤ３ｚが続く５つの新規のＣＤ３３標的ＣＡＲを作製した。インビトロにおけるＣＤ３３陽性標的の細胞毒性を示すことによって、本発明者らのＣＤ３３標的ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の機能を検証した（図７Ｅ）。ＴＲＡＦ２の過剰発現は、アッセイした５つのＣＤ３３標的ＣＡＲ Ｔ細胞のうち４つにおいて産生したＣＡＲ Ｔ細胞の数を増強し、抗原シミュレーション後のそれらの増殖を増強した（図７Ｆ〜７Ｇ）。
【０２１６】
考察
本発明者らの免疫適格動物モデルにおいて、高用量のｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞はｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等の抗白血病効果を有していたが、ストレス試験用量（３ｘ１０５）では効果が低下した（図１Ｃ〜１Ｆ）。本発明者らは、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲは最適ではなく、配列の改変がｍ１９２８ｚ ＣＡＲと同等になるようにその有効性を増加させ得ると仮定した。したがって、マウス４−１ＢＢエンドドメインをヒト４−１ＢＢエンドドメインに置換した（ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ）（図２）。ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボでの機能（図２Ｄ）はストレス試験用量レベルにおいてｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等であり、これはｈ１９ＢＢｚまたはｈ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置した患者において同等のＣＲ率を示す臨床結果と一致していた（Lee DW, et al. Lancet. 2015 385(9967):517-28; Neelapu SS, et al. N Engl J Med. 2017 377(26):2531-44, Maude SL, et al. N Engl J Med. 2018 378(5):439-48; Value in Using CAR T Cells for DLBCL. Cancer Discov. 2018 8(2):131-2）。しかしながら、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでの機能は、サイトカイン産生および細胞毒性によって測定されるように、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して劣っていた（図２Ｂおよび２Ｃ）。これらの結果は、ヒトＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ２８共刺激により分泌されるサイトカイン（ＩＬ２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαなど）を４−１ＢＢ共刺激ドメインを持つＣＡＲよりも高いレベルで与えたことを実証した以前の研究と一致している（Imai C, et al. Leukemia. 2004 18(4):676-84; Milone MC, et al. Mol Ther. 2009 17(8):1453-64; Brentjens RJ, et al. Clin Cancer Res. 2007 13(18 Pt 1):5426-35; Zhong XS, et al. Mol Ther. 2010 18(2):413-20）。
【０２１７】
インビトロでの機能が劣っているにもかかわらず有効なインビボでの白血病の根絶は、最適な細胞傷害性ＣＡＲ Ｔ細胞と整合しないようであったため、補償し得る可能性のある機構を評価した。他の研究（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28）により、ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性の増加が免疫不全マウスにおける悪性Ｂ細胞の死滅の増強を支持したことが観察されているが、腫瘍の死滅はｈ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等ではなく、この研究におけるすべてのマウスは評価されるＣＡＲに関係なく、白血病の進行により急速に死亡した。ＣＡＲ Ｔ細胞の消耗がＴＣＲトランスジェニック免疫適格マウスモデルにおいて抗原の会合により誘導され得ることを示した最近の研究（Yang Y, et al. Sci Transl Med. 2017 9(417)）を考慮すると、抗原が以前の研究と本発明者らの研究との間の交絡変数であり得ると考えられる（図１および２）。したがって、Ｒａｇ１−／−マウスにおける持続性を比較し、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含むＣＡＲで改変されたマウスＴ細胞が最も高い持続性を支持したことを確認した（図３Ａ）。さらに、免疫適格マウスに注入する前にｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞を照射した場合、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞のみが有意に低下した持続性およびＢ細胞の死滅を有し、ｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性およびＢ細胞の死滅は有意な影響を受けなかった。これは、持続性が４−１ＢＢ共刺激によって媒介されるインビボでのＣＡＲ Ｔ細胞機能の増強に重要であることを示している（図３）。
【０２１８】
４−１ＢＢ共刺激によるＣＡＲ Ｔ細胞の持続性の増強のさらなる支持は、新規な観察であるｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞における抗アポトーシスタンパク質の増加である（図４）。ｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞群の遺伝子発現を比較し、４−１ＢＢ共刺激によって与えられる抗アポトーシスおよび／または持続性の増強に寄与し得る経路を同定した。ＧＳＥＡにより、ｍ１９ｚまたはｍ１９２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較した場合、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚはＮＦ−κＢ調節経路の発現において異なっていたことが示され、これはｍ１９−ｍｕｓＢＢｚにおけるＮＦ−κＢ調節遺伝子の濃縮と類似していた（表１〜４および図１３）。２９３レポーター細胞株を用いて、ｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲのみを伴うＮＦ−κＢシグナル伝達を同定し、ＮＦ−κＢシグナル伝達がｍ１９２８ｚマウスＣＡＲ Ｔ細胞と比較してｍ１９−ｈｕｍＢＢｚマウスＣＡＲ Ｔ細胞において増強されることを検証した（図５Ａおよび５Ｂ）。ＮＦ−κＢはＴ細胞機能に重要であることが知られているが（Watts TH. Annu Rev Immunol. 2005 23:23-68; Barnes SE, et al. J Immunother Cancer. 2015 3(1):1）、本発明者らは、４−１ＢＢ共刺激ドメインを持つＣＡＲのＮＦ−κＢシグナル伝達のレベルがＣＤ２８共刺激ドメインを持つＣＡＲよりもはるかに高いことを決定し、これはＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボでの機能の差異に寄与している可能性がある。また、初代ヒトＣＡＲ Ｔ細胞において本発明者らの観察を検証した。抗ヒトＣＤ１９ ＣＡＲにおける４−１ＢＢの変異はＮＦ−κＢを様々に減少させ、これは生存率および／または増殖の減弱と相関していた（図５Ｃ〜５Ｆ）。最近の研究により、ＣＤ２８共刺激がヒトＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクターメモリーへの分化を導き、４−１ＢＢ共刺激がセントラルメモリー細胞への分化を促進することが示唆されている（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28; Kawalekar OU, et al. Immunity. 2016 44(2):380-90; Long AH, et al. Nat Med. 2015 21(6):581-90）。さらに、これらの研究はＣＤ２８または４−１ＢＢエンドドメインに関連する別個の代謝および遺伝子発現経路を同定しており、４−１ＢＢ共刺激がＣＡＲ Ｔ細胞の持続性を促進し、ＣＡＲ Ｔ細胞の消耗から保護することを示唆している（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28; Kawalekar OU, et al. Immunity. 2016 44(2):380-90; Long AH, et al. Nat Med. 2015 21(6):581-90）。したがって、共刺激後にこれらの別個の代謝または遺伝子発現パターンがＣＡＲ Ｔ細胞におけるＮＦ−κＢシグナル伝達の役割を決定することを排除できない。しかしながら、ＮＦ−κＢシグナル伝達がＣＡＲ Ｔ細胞において種々の代謝またはシグナル伝達経路を駆動する可能性もあり、これが本発明者らが評価している仮説である。実際、以前の研究により、ＮＦ−κＢシグナル伝達がメモリーＴ細胞を維持するために必要であり、ミトコンドリア呼吸を増加させ得ることが確立されている（Knudson KM, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 114(9):E1659-E67; Mauro C, et al. Nat Cell Biol. 2011 13(10):1272-9）。
【０２１９】
ＣＡＲ Ｔ細胞機能の４−１ＢＢ共刺激性増強におけるＮＦ−κＢの重要な役割は、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲの効力低下の機構を示唆している。抗原刺激後においてｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞のＮＦ−κＢシグナル伝達は、ｍ１９−ｍｕｓＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも４．７倍大きい（図１６Ａ）。マウスとヒトの４−１ＢＢエンドドメインの間には合計１９ａａの差異があり、それらのうち１つのみが共刺激に重要であると同定されたＱＥＥドメインに位置し、Ｑ−＞Ｅ置換は４−１ＢＢ共刺激に影響を与えないことが報告されている（Jang IK, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1998 242(3):613-20; Arch RH, et al. Mol Cell Biol. 1998 18(1):558-65）。マウス４−１ＢＢエンドドメインのＮ末端部分の５ａａを変異させることにより、ｍＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞のＮＦ−κＢシグナル伝達が改善され、これはサイトカイン産生および抗アポトーシスタンパク質発現ならびにインビボでのＢ細胞死滅およびＣＡＲ Ｔ持続性の増強をもたらした（図１６Ｅ〜１６Ｇ）。ＡｒｃｈおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ（Arch RH, et al. Mol Cell Biol. 1998 18(1):558-65）はマウス４−１ＢＢの同一のドメインを変異させ、ＴＲＡＦ３の補充が増強されたことを報告した。これは、共刺激ドメインに対するＴＲＡＦ補充の最適化がＣＡＲ Ｔ細胞機能を増強し得ることを示唆している。ＴＲＡＦタンパク質は、細胞外活性化受容体（４−１ＢＢを含む）と細胞内シグナル伝達経路を連結することによってＴ細胞機能を調節し、それによりＴ細胞の分化、増殖、生存およびサイトカイン産生に影響を与える（Watts TH. Annu Rev Immunol. 2005 23:23-68; So T, et al. Tohoku J Exp Med. 2015 236(2):139-54）。ＴＲＡＦタンパク質はＣＡＲにおける４−１ＢＢ共刺激の伝達において複数の役割を有していると推測されているが、現在までそれらの具体的な役割は確認または定義できていない（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28; Gomes-Silva D, et al. Cell Rep. 2017 21(1):17-26）。２９３レポーターを用いて、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ３が４−１ＢＢ共刺激による最適なＮＦ−κＢ活性化に必要であることを決定し、これにより初代マウスＣＡＲ Ｔ細胞においてＴＲＡＦ１が確認された（図６）。ＴＲＡＦ２−ＤＮ阻害剤はｍ１９−ｈｕｍＢＢｚ ＣＡＲのＮＦ−κＢシグナル伝達を増加させ、これは代替のＮＦ−κＢシグナル伝達経路の負の調節因子として機能するため、ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）の分解におけるその役割によるものであり得る（Zarnegar BJ, et al. Nat Immunol. 2008 9(12):1371-8）。ＴＲＡＦの枯渇はＣＡＲ Ｔ細胞機能に負の影響を与えたが、初代ヒトｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞において過剰発現されたＴＲＡＦ２またはＴＲＡＦ３は、生存率、増殖および細胞毒性を増強した（図７Ａ〜７Ｄ）。ｈ１９ＢＢｚおよび過剰なＴＲＡＦ２を含むＴ細胞は、ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較してＮＦ−κＢを劇的に（７．７倍）増加させ、これによりＮＦ−κＢの増加がＣＡＲ Ｔ細胞機能を増強させることがさらに確認された（図７Ａ）。しかしながら、ＮＦ−κＢに依存しない一部の群においてもＣＡＲ Ｔ細胞機能の増強が観察された。機能が増強されているにもかかわらず、ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲおよび過剰なＴＲＡＦ３を含むヒトＴ細胞におけるＮＦ−κＢの変化はごくわずかであり、これはＴＲＡＦ３が別のシグナル伝達経路を介してその増強効果を媒介し得ることを示唆している。ＴＲＡＦ３はＴＣＲ／ＣＤ２８シグナル伝達に必要であるため（Xie P, et al. J Immunol. 2011 186(1):143-55）、これは内在性ＣＤ２８共刺激の増強によるものであり得ると考えられる。また、本発明者らの観察を、ＣＤ３３標的ＣＡＲ Ｔ細胞を用いたＣＡＲ Ｔ細胞増殖の増強における過剰なＴＲＡＦ２の役割について検証した（図７Ｅ〜７Ｇ）。
【０２２０】
ＴＲＡＦおよびＣＡＲのＴ細胞への形質導入は、４−１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激の両方の増強を可能にし得る。ＴＲＡＦおよびＣＡＲの両方を組み合わせることは、ＣＤ２８および４−１ＢＢエンドドメインをともに含む第３世代のＣＡＲ設計の代わりになり得、これは細胞毒性および持続性の両方を増強することを目的として想定されていた（Zhong XS, et al. Mol Ther. 2010 18(2):413-20; Till BG, et al. Blood. 2012 119(17):3940-50）。しかしながら、共刺激ドメインの解離は第３世代のＣＡＲ Ｔ細胞機能の増強を伴ってある程度の成功を収めているが、これらの設計はともに相互に排他的な表現型を統合することを試みることによって妨げられ得る（Zhao Z, et al. Cancer Cell. 2015 28(4):415-28）。さらに、４−１ＢＢ共刺激およびＮＦ−κＢシグナル伝達の継続的なＴＲＡＦ増強は、持続性シグナル伝達およびＣＡＲ Ｔ細胞死（Gomes-Silva D, et al. Cell Rep. 2017 21(1):17-26）または発がん（Park MH, et al. Cells. 2016 5(2)）をもたらし得、これは最適なＴＲＡＦ＋ＣＡＲ設計がＴＲＡＦ発現を調節する分子スイッチを必要とし得ることを示唆している。
【０２２１】
患者におけるｈＣＤ１９標的ＣＡＲ Ｔ細胞の臨床評価は有望な結果をもたらしており、これはＢ細胞悪性腫瘍に対する３つのＣＡＲ療法の最近の承認によって表されている。この特有の細胞免疫療法の生物学を理解することは、有効性を改善し、毒性を減少させるために重要である。本発明者らの研究は、４−１ＢＢによるＣＡＲ Ｔ機能の増強が、ＮＦ−κＢを最適に活性化するためにＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ３を必要とすることを示している。さらに、４−１ＢＢに基づくＣＡＲおよびＴＲＡＦタンパク質を共発現するという本発明者らの戦略は、ＣＡＲ Ｔ細胞の生存率、増殖および細胞毒性を増強した。いくつかのＴＲＡＦはＣＤ２８と相互作用するため、ＴＲＡＦタンパク質の過剰発現はＣＤ２８に基づくＣＡＲ Ｔ細胞にも利益をもたらし得る（Xie P, et al. J Immunol. 2011 186(1):143-55）。ＮＦ−κＢ経路におけるＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２の両方の拮抗的な役割ならびに４−１ＢＢおよびＣＤ２８の両方の共刺激におけるＴＲＡＦ３の役割を考慮すると、種々の共刺激ドメインを含むＣＡＲにおける個々のＴＲＡＦの影響を評価し、それらがどのように最適なＣＡＲ Ｔ細胞シグナル伝達および機能を調節しているかを同定する必要がある。
【０２２２】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【０２２３】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、開示される発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で引用される刊行物およびそれらが引用されている資料は、参照により具体的に組み込まれる。
【０２２４】
当業者は、本明細書に記載される発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確認できる。そのような均等物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
2021500859.tif 000023
【図１Ｂ】
2021500859.tif 000024
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【配列表】
2021500859000001.app
【国際調査報告】
2021500859.tif 000093
2021500859.tif 000094
2021500859.tif 000095
2021500859.tif 000096
2021500859.tif 000097