(57)【要約】【課題】癌の予防又は治療に利用される新規の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント、及びこれを含むキメラ抗原受容体とそれらの用途を提供する。【解決手段】本発明の抗体は、癌細胞（特に、乳癌又は胃癌細胞）で高発現するＨＥＲ２に特異的に結合する抗体であり、既存のトラスツズマブとは異なるエピトープに結合する抗体である。本発明の抗体は、トラスツズマブ抗体に対して非反応性（又は耐性）を有するか或いは感度が減少したＨＥＲ２−未発現癌細胞に対して、優れた殺傷能を示す。また、本発明の抗−ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブと併用投与した場合、トラスツズマブ抗体が作用する癌細胞株に対して相乗的な殺傷能を示す。したがって、本発明の組成物は、癌の治療のためにトラスツズマブ抗体との併用投与用途及びトラスツズマブにより治療されない癌の治療に非常に有用に使用することができる。【選択図】  図３Ｃ
2021509288.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つを含むＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）に対する抗体又はその抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２及び配列番号３のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号４のＣＤＲＬ１、配列番号５のＣＤＲＬ２及び配列番号６のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号７のＣＤＲＨ１、配列番号８のＣＤＲＨ２及び配列番号９、７１、又は７２のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０配列のＣＤＲＬ１、配列番号１１のＣＤＲＬ２及び配列番号１２、７３、又は配列番号７４のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１３のＣＤＲＨ１、配列番号１４のＣＤＲＨ２及び配列番号１５のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６のＣＤＲＬ１、配列番号１７のＣＤＲＬ２及び配列番号１８のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号１９のＣＤＲＨ１、配列番号２０のＣＤＲＨ２及び配列番号２１配列のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２のＣＤＲＬ１、配列番号２３のＣＤＲＬ２及び配列番号２４のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；及び
（ｅ）配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２及び配列番号２７のＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２及び配列番号３０のＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
【請求項２】
前記（ａ）の重鎖可変領域は、配列番号３１、又は７５のアミノ酸配列を含み；
前記（ｂ）の重鎖可変領域は、配列番号３９、８３、８７、９５、又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含み；
前記（ｃ）の重鎖可変領域は、配列番号４７のアミノ酸配列を含み；
前記（ｄ）の重鎖可変領域は、配列番号５５のアミノ酸配列を含み；及び
前記（ｅ）の重鎖可変領域は、配列番号６３又は配列番号７９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記（ａ）の軽鎖可変領域は、配列番号３５、又は配列番号７７のアミノ酸配列を含み；
前記（ｂ）の軽鎖可変領域は、配列番号４３、配列番号８５、配列番号９１、配列番号９９、又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含み；
前記（ｃ）の軽鎖可変領域は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み；
前記（ｄ）の軽鎖可変領域は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み；及び
前記（ｅ）の軽鎖可変領域は、配列番号６７又は８１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記（ａ）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖を含み；
前記（ｂ）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４１、８９、９７、１０５のアミノ酸配列を含む重鎖を含み；
前記（ｃ）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖を含み；
前記（ｄ）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖を含み；及び
前記（ｅ）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記（ａ）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み；
前記（ｂ）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４５、９３、１０１、１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み；
前記（ｃ）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み；
前記（ｄ）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み；及び
前記（ｅ）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質。
【請求項７】
以下を含むキメラ抗原受容体ポリペプチド：
（ａ）ＨＥＲ２結合ドメイン（ＨＥＲ２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）；
（ｂ）膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ，ＴＭ）；
（ｃ）共刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ）；及び
（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ，ＩＣＤ）。
【請求項８】
前記ＨＥＲ２結合ドメインは、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、請求項７に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド。
【請求項９】
前記膜貫通ドメインは、Ｔ−細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項７に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド。
【請求項１０】
前記共刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、イムノグロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球性活性化分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＳＬＡＭ）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ（Ｂ  ａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）、トル様リガンド受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されるタンパク質から得られた機能的シグナル伝達ドメインである、請求項７に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド。
【請求項１１】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組合せを含む、請求項７に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項１３】
請求項７に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
請求項７に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するエフェクター細胞。
【請求項１７】
前記エフェクター細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マクロファージ及びそれらの前駆細胞からなる群から選選される、請求項１６に記載のエフェクター細胞。
【請求項１８】
前記Ｔリンパ球は、炎症性Ｔリンパ球、細胞毒性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球又はヘルパーＴリンパ球からなる群から選択される、請求項１７に記載のエフェクター細胞。
【請求項１９】
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌予防又は治療用の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１６に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するエフェクター細胞を含む、癌の治療用の医薬組成物。
【請求項２１】
前記癌は、乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、頭頸部癌、皮膚癌、甲状腺癌、副甲状腺癌又は尿管癌であることを特徴とする、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記医薬組成物はトラスツズマブ抗体をさらに含む、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含む癌診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大韓民国産業通商資源部の支援下で課題番号１４１５１１８３８５によってなされたものであり、前記課題の研究管理専門機関は韓国産業技術振興院、研究事業名は“国際共同技術開発事業”、研究課題名は“革新エピトープ発掘プラットホーム技術基盤グローバル抗体新薬開発”、主管機関はアブクロン株式会社、研究期間は２０１１年１１月１日から２０１４年１０月３１日である。
【０００２】
本特許出願は、２０１７年１１月１４日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１７−０１５１８４１号に基づく優先権を主張し、該特許出願の開示事項は本明細書に参照として組み込まれる。
【０００３】
本発明は、新規の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント、及びこれを含むキメラ抗原受容体、及びそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）遺伝子は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）のファミリーの一つである、１８５ｋＤａ細胞膜通過糖タンパク質をコードする。Ｈｅｒ２タンパク質は、６２０個のアミノ酸残基からなる細胞外ドメイン、２３個のアミノ酸残基の細胞膜通過ドメイン、及びチロシンキナーゼ活性を有し、４９０個のアミノ酸残基からなる細胞内ドメインで構成されている（非特許文献１）。
【０００５】
一方、様々な特性を有する抗−ＨＥＲ２抗体が開示されている（非特許文献２から非特許文献１６）。
【０００６】
抗−ＨＥＲ２抗体のうち、商業的に最も成功した抗体はトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）として商業化されている。特許文献１）であり、これに関する多くの研究がなされている（非特許文献１７から非特許文献１９）。
【０００７】
トラスツズマブ抗体は商業的に成功したものの、この抗体に対して非反応性（又は耐性）を有する又は感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が低い癌細胞種類が相当あり、トラスツズマブ抗体による治療の限界（制限）が問題となっている。したがって、このような抗体治療学の上の問題点を解決しようとする試みがなされてきた。
【０００８】
例えば、特許文献３は、トラスツズマブ抗体のようなＨＥＲ２アンタゴニスト及びＰＣＤＧＦ（ＰＣ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）アンタゴニストを用いて癌細胞のＨＥＲ２感受性を増加させる方法を開示している。特許文献９は、ＦｏｘＭｌ抑制剤とトラスツズマブ抗体の組合せを用いてトラスツズマブ耐性腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を開示している。
【０００９】
特許文献５は、コフィリン（ｃｏｆｉｌｉｎ）抑制剤、ＰＡＫ１抑制剤、ＬＩＭＫ抑制剤、ＲＨＯ抑制剤、ＲＯＣＫ１抑制剤又はＲＯＣＫ２抑制剤を用いてトラスツズマブ耐性癌を治療する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際特許出願公開ＷＯ１９９４／００１３６
【特許文献２】米国特許第５，７８３，１８６号
【特許文献３】米国特許第５，８２１，３３７号
【特許文献４】米国特許第７，６７４，４６０号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１０／０１８３６０４号
【特許文献６】米国特許第４，５５４，１０１号
【特許文献７】米国特許第８，３１４，２１３号
【特許文献８】米国特許第８，４０４，８１１号
【特許文献９】国際特許出願公開ＷＯ２０１１／１２７２９７
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】アキヤマ（Ａｋｉｙａｍａ  Ｔ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２（４７５８）：１６４４−１６４６（１９８６）
【非特許文献２】タリアブエ（Ｔａｇｌｉａｂｕｅ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：９３３−９３７（１９９１）
【非特許文献３】マッケンジー（ＭｃＫｅｎｚｉｅ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：５４３−５４８（１９８９）
【非特許文献４】メイヤー（Ｍａｉｅｒ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３６１−５３６９（１９９１）
【非特許文献５】バカス（Ｂａｃｕｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３：３５０−３６２（１９９０）
【非特許文献６】スタンコフスキ（Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ）ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：８６９１−８６９５（１９９１）
【非特許文献７】バカス（Ｂａｃｕｓ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２５８０−２５８９（１９９２）
【非特許文献８】シュウ（Ｘｕ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：４０１−４０８（１９９３）
【非特許文献９】カスプジュイク（Ｋａｓｐｒｚｙｋ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２７７１−２７７６（１９９２）
【非特許文献１０】ハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４５７５−４５８０（１９９１）
【非特許文献１１】ショウバー（Ｓｈａｗｖｅｒ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１３６７−１３７３（１９９４）
【非特許文献１２】アルテアガ（Ａｒｔｅａｇａ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３７５８−３７６５（１９９４）
【非特許文献１３】ハーヴェル（Ｈａｒｗｅｒｔｈ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５１６０−１５１６７（１９９２）
【非特許文献１４】カオ（Ｋａｏ）ら、Ｕ．Ｓ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．２００９／０２８５８３７（２００９）
【非特許文献１５】ロス（Ｒｏｓｓ）ら、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ８：３０７−３２５（２００３）
【非特許文献１６】クラッパー（Ｋｌａｐｐｅｒ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９−２１０９（１９９７）
【非特許文献１７】サピノ（Ｓａｐｉｎｏ，Ａ）ら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００７）１８：１９６３−１９６８
【非特許文献１８】ブッソラティ（Ｂｕｓｓｏｌａｔｉ，Ｇ）ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２００５）９２，１２６１−１２６７
【非特許文献１９】グラジリン（Ｇｌａｚｙｒｉｎ  Ａ）ら、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ＆  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）５５（１）：２５−３３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本願発明者は、癌（特に、乳癌及び胃癌）を予防又は治療でき、トラスツズマブ抗体に対して非反応性（又は耐性）を有するか或いは感受性の低下した癌細胞に対して優れた殺傷能（又は増殖抑制能）を有する抗体、又はトラスツズマブ抗体と併用投与をする場合、トラスツズマブ単独投与が示す抗癌活性よりも改善された効能で癌を予防又は治療できる新規の抗体を作製しようと努力した。その結果、トラスツズマブ抗体が殆ど作用しないＨＥＲ２−高発現癌細胞に対してトラスツズマブに比べて優れた殺傷能を示す、或いはトラスツズマブ抗体と併用投与時に抗癌活性が改善される新規の抗体を作製し、本発明を完成させた。
【００１３】
本発明は、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）に対する抗体（抗−ＨＥＲ２抗体）又はその抗原結合フラグメントを提供することに関する。
【００１４】
本発明はまた、前記抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質を提供することに関する。
【００１５】
本発明はまた、前記抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）及びこれを発現するエフェクター（効果器）細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ）を提供することに関する。
【００１６】
本発明はまた、前記抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント；又は前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を提供することに関する。
【００１７】
本発明はまた、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供することに関する。
【００１８】
本発明はまた、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供することに関する。
【００１９】
本発明はまた、前記抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを有する癌の予防又は治療用の医薬組成物を提供することに関する。
【００２０】
本発明はまた、前記抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを有する癌診断用キットを提供することに関する。
【００２１】
本発明はまた、前記抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを有する組成物を対象体に投与して癌を予防又は治療する方法を提供することに関する。
【００２２】
本発明はまた、前記キメラ抗原受容体を発現するエフェクター細胞を対象に投与することによりＨＥＲ２の過剰発現に関連した疾患（例えば、癌）の治療方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本明細書において、本発明の態様による抗体は、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）に特異的に結合する抗体及び親和性成熟を経たそれらの修飾抗体である。
【００２４】
本発明の第一の態様は、以下を含む、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）に対する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
（ａ）以下の重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域：配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２及び配列番号３のＣＤＲＨ３；及び
（ｂ）以下の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域：
配列番号４のＣＤＲＬ１、配列番号５のＣＤＲＬ２及び配列番号６のＣＤＲＬ３。
【００２５】
本発明の第二の態様は、以下を含む、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）に対する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
（ａ）以下の重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域：
配列番号７のＣＤＲＨ１、配列番号８のＣＤＲＨ２及び配列番号９、７１、又は７２のＣＤＲＨ３；及び
（ｂ）次の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域：
配列番号１０のＣＤＲＬ１、配列番号１１のＣＤＲＬ２及び配列番号１２、７３、又は７４のＣＤＲＬ３。
【００２６】
本発明の第三の態様は、以下を含む、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）に対する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
（ａ）以下の重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域：
配列番号１３のＣＤＲＨ１、配列番号１４のＣＤＲＨ２及び配列番号１５のＣＤＲＨ３；及び
（ｂ）以下の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域：
配列番号１６のＣＤＲＬ１、配列番号１７のＣＤＲＬ２及び配列番号１８のＣＤＲＬ３。
【００２７】
本発明の第四の態様は、以下を含む、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）に対する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
（ａ）次の重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域：
配列番号１９のＣＤＲＨ１、配列番号２０のＣＤＲＨ２及び配列番号２１のＣＤＲＨ３；及び
（ｂ）以下の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域：
配列番号２２のＣＤＲＬ１、配列番号２３のＣＤＲＬ２及び配列番号２４のＣＤＲＬ３。
【００２８】
本発明の第五の態様は、以下を含む、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）に対する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
（ａ）以下の重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域：
配列番号２５のＣＤＲＨ１、配列番号２６のＣＤＲＨ２及び配列番号２７のＣＤＲＨ３；及び
（ｂ）以下の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域：
配列番号２８のＣＤＲＬ１、配列番号２９のＣＤＲＬ２及び配列番号３０のＣＤＲＬ３。
【００２９】
第一の態様の抗体、第二の態様の抗体、第三の態様の抗体、第四の態様の抗体及び第五の態様の抗体をそれぞれ、２Ｇ１０、３９Ｄ２、２４Ｄ３、１Ｇ３及び８Ｇ１１抗体といい、これらはマウス抗体又はキメラ抗体に該当し、これらのうち、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体は、接頭辞ｈｚを付けてｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、及びｈｚ８Ｇ１１抗体などと表現する。
【００３０】
本発明者は、癌（特に、乳癌及び胃癌）を予防又は治療でき、トラスツズマブ抗体に対して非反応性（又は耐性）を有する或いは感受性の低下した癌細胞に対して優れた殺傷能（又は増殖阻害能）を有する抗体、又はトラスツズマブ抗体と併用投与をする場合、トラスツズマブ単独投与が示す抗癌活性よりも改善された効能で癌を予防又は治療できる新規の抗体を作製しようと努力した。その結果、トラスツズマブ抗体がほとんど作用しないＨＥＲ２−過剰発現癌細胞に対してトラスツズマブに比べて優れた殺傷能を示すか、或いはトラスツズマブ抗体と併用投与時に抗癌活性が改善される新規の抗体を作製した。
【００３１】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＥＲ２に対して特異的結合能を有する。特に、本発明の抗体のうち、ｈｚ２Ｇ１０及びｈｚ３９Ｄ２は、ＨＥＲ２のドメイン１〜４のうち、ドメイン１のエピトープに結合し、２４Ｄ３は、ドメイン３のエピトープに結合し、１Ｇ３及びｈｚ８Ｇ１１は、トラスツズマブと同様に、ドメイン４のエピトープに結合するが、トラスツズマブの結合するエピトープと異なる。
【００３２】
本明細書において、用語“トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）”は、特許文献３に開示された抗体を指す。
【００３３】
本発明の抗体は、トラスツズマブ抗体に対して非反応性（又は耐性）を有するか或いは感受性の低下した癌細胞に対して、単独又はトラスツズマブとの併用によって優れた殺傷能又は増殖阻害能を有する。本明細書において、使用される用語“殺傷”、“増殖阻害”又は“成長阻害”はいすれも癌細胞に関しては同じ意味で使われる。
【００３４】
本明細書において、用語“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、ＨＥＲ２に対する特異抗体を意味し、完全な抗体だけでなく、抗体分子の抗原結合フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）も含む。
【００３５】
完全な抗体（抗体全体）は、２本の全長の軽鎖及び２本の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖と重鎖とはジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領域には、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプがあり、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）がある。軽鎖の定常領域には、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプがある。
【００３６】
本明細書において、用語“抗原結合フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）”は、抗原結合機能を保有しているフラグメント（断片）を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体フラグメントのうち、Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）は、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、及び重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’においては、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を形成する。Ｆｖが重鎖可変部位及び軽鎖可変部位だけを有する最小の抗体フラグメントを用いて、Ｆｖフラグメントを生成する組換え技術は当業界に公知である。二重鎖可変フラグメントＦ（ｄｏｕｂｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｎｔ，ｄｃＦｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位及び軽鎖可変部位に連結されており、単鎖可変フラグメントＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）は一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域に共有結合的に連結されるか、或いはＣ−末端に連結され、二重鎖Ｆｖと同様にダイマ−を形成する。このような抗体フラグメントは、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、完全な抗体をパパインで切断すればＦａｂが得られ、ペブシンで切断すればＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。）、或いは遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。
【００３７】
本発明において、抗体は、具体的にはモノクローナル（単一クローン）抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド−結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）及び抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、そしてこれらの抗体のエピトープ結合フラグメントなどを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書において、用語“重鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びそのフラグメント（断片）を含有する。また、本明細書において、用語“軽鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びそのフラグメントを含有する。
【００３９】
本明細書において、用語“可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）”又は“可変ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）”は、抗体を抗原に結合させることに関連する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを意味する。自然抗体（ｎａｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般に類似の構造を有し、各ドメインは、４個の保存されたフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ，ＦＲｓ）及び３個の超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ，ＨＶＲｓ）を含む（Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ９１（２００７））。
【００４０】
本明細書において、用語“ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）”は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））。重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）にはそれぞれ３個のＣＤＲが含まれる。ＣＤＲは、抗体が抗原又はエピトープに結合する上で主要な接触残基を提供する。
【００４１】
本明細書において、用語“フレームワーク（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）”又は“ＦＲ”は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ，ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基のことを指す。可変ドメインのＦＲは一般に、４個のＦＲドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨにおいて次の順序で表示される：
ＦＲＨ１（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ  １  ｏｆ  Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）−ＣＤＲＨ１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  １  ｏｆ  Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）−ＦＲＨ２−ＣＤＲＨ２−ＦＲＨ３−ＣＤＲＨ３−ＦＲＨ４。
【００４２】
また、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＬ（又はＶｋ）において次の順序で表示される：
ＦＲＬ１（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ  １  ｏｆ  Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）−ＣＤＲＬ１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  １  ｏｆ  Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）−ＦＲＬ２−ＣＤＲＬ２−ＦＲＬ３−ＣＤＲＬ３−ＦＲＬ４。
【００４３】
本明細書において、用語“特異的結合”は、抗体又はその抗原結合フラグメント、或いはｓｃＦｖのような他の構成物が生理的条件下で比較的安定した抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０−６Ｍ以下の平衡解離定数（例えば、これよりも小さいＫＤは、より堅固な結合を示す。）で特徴化され得る。２個の分子が特異的に結合するか否かを決定する方法は当業界に公知であり、例えば平衡透析、表面プラスモン共鳴などを含む。
【００４４】
本明細書において、用語“親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）”は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）間の非共有相互作用の総和の強度を意味する。特に明示しない限り、“結合親和力（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）”は、結合対（ペア）のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１相互作用を反映する内因性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）結合親和力を意味する。分子ＸとそのパートナーＹの親和度は一般に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和度は本明細書に記載された方法を含め、当業界に公知である通常の方法によって測定され得る。
【００４５】
また、本明細書において、用語“ヒト抗体（ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）”又は“ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、ヒト又はヒト細胞によって生成された抗体、又はヒト抗体レパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ）又は他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト根源から由来した抗体のアミノ酸配列に相応するアミノ酸配列を有する。
【００４６】
本明細書において、用語“キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体”は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源（ｓｏｕｒｃｅ）又は種（ｓｐｅｃｉｅｓ）から由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが他の供給源又は種に由来した抗体を意味する。
【００４７】
本発明の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＥＲ２を特異的に認識できる範囲内で添付の配列表に記載されたアミノ酸配列の変異体を含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他生物学的特性を改善させるために抗体のアミノ酸配列を改変させることができる。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。
【００４８】
このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシン及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは類似の大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似の形状を有することがわかる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そして、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは生物学的に機能的に同等であることがわかる。
【００４９】
変異を導入するに当たり、アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。それぞれのアミノ酸は、疎水性と電荷によって疎水性インデックスが与えられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００５０】
タンパク質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を付与する上で疎水性アミノ酸インデックスは非常に重要である。類似の疎水性インデックスを有するアミノ酸に置換してこそ類似の生物学的活性を保有できることは、よく知られている。疎水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以下、より好ましくは±１以下、さらに好ましくは±０．５以下の疎水性インデックス差を示すアミノ酸間にて置換を行う。
【００５１】
一方、類似の親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸間の置換が、均等な生物学的活性を有するタンパク質をもたらすこともよく知られている。特許文献６に開示されている通り、次の親水性値がそれぞれのアミノ酸残基に与えられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００５２】
親水性値を参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以下、より好ましくは±１以下、特に好ましくは±０．５以下の親水性値差を示すアミノ酸間で置換される。
【００５３】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質でのアミノ酸置換は、当該分野に公知である（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も一般に起きる置換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の置換である。
【００５４】
本発明の例示的な実施形態によれば、ｈｚ２Ｇ１０抗体と２Ｇ１０抗体の重鎖可変領域はそれぞれ、配列番号３１および３２のアミノ酸配列を含む。
【００５５】
本発明の例示的な実施形態によれば、ｈｚ２Ｇ１０抗体と２Ｇ１０抗体の軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号３５および７７のアミノ酸配列を含む。
【００５６】
本発明の例示的な実施形態によれば、ｈｚ３９Ｄ２抗体と３９Ｄ２抗体の重鎖可変領域はそれぞれ、配列番号３９および８３のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
本発明の例示的な実施形態によれば、ｈｚ３９Ｄ２抗体と３９Ｄ２抗体の軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号４３および８５のアミノ酸配列を含む。
【００５８】
本発明の例示的な実施形態によれば、２４Ｄ３抗体の重鎖可変領域は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。
【００５９】
本発明の例示的な実施形態によれば、２４Ｄ３抗体の軽鎖可変領域は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。
【００６０】
本発明の例示的な実施形態によれば、１Ｇ３抗体の重鎖可変領域は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
本発明の例示的な実施形態によれば、１Ｇ３抗体の軽鎖可変領域は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
本発明の例示的な実施形態によれば、ｈｚ８Ｇ１１抗体と８Ｇ１１抗体の重鎖可変領域はそれぞれ、配列番号６３および７９のアミノ酸配列を含む。
【００６３】
本発明の例示的な実施形態によれば、ｈｚ８Ｇ１１抗体と８Ｇ１１抗体の軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号６７および８１のアミノ酸配列を含む。
【００６４】
本発明の抗体は、モノクローナル（単一クローン）抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド−結合Ｆｖ（ｓｄＦＶ）及び抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、およびこれらの抗体のエピトープ−結合フラグメントなどを含むが、これに限定されない。
【００６５】
一方、本発明の抗体は、ＣＤＲ配列が従来の抗−ＨＥＲ２抗体のＣＤＲ配列と比較して相同性（類似性）（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）が非常に低い点で独特である。例えば、本発明の抗体のうちｈｚ２Ｇ１０に対してＢＬＡＳＴ検索をした結果、相同性が最も高いとされた特許文献７及び特許文献８に開示された抗体は、本発明の抗体とＣＤＲ配列相同性が５０％未満であり、しかも特許文献７及び特許文献８に記載された抗体はそれぞれＣＤ２５及びＥＧＦＬ７に結合する抗体であり、本発明の抗体とそのターゲットが異なる。
【００６６】
また、本発明の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記のアミノ酸配列に対してわずかな変化、すなわち、３次構造及び抗体の機能にほとんど影響を与えない修飾を含む抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。したがって、いくつかの例示的な実施形態では、抗体は、上記の配列と少なくとも９０％、９３％、９５％、又は９８％以上の類似性を有するアミノ酸配列を有することができる。
【００６７】
また、本発明において、前記抗体又はその抗原結合フラグメントに含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、一般式（ＧｎＳｍ）ｐ又は（ＳｍＧｎ）ｐで表示されるアミノ酸配列からなるリンカーによって連結され得る。
【００６８】
ここで、前記ｎ、ｍ及びｐは以下の条件を満たす、
ｎは１〜７の整数であり；
ｍは０〜７の整数であり；
ｎとｍの和は８以下の整数であり；及び
ｐは１〜７の整数である。
【００６９】
本発明のある例示的な実施形態によれば、前記リンカーはｎ＝１〜５であり、ｍ＝０〜５である。より具体的な実施形態の場合、ｎ＝４で、ｍ＝１である。さらにより具体的な実施形態において、前記リンカーは（Ｇ４Ｓ）３又は（Ｓ４Ｇ）３である。
【００７０】
他の例示的な実施形態では、前記リンカーはＶＤＧＳであり、さらに他の例示的な実施形態では、前記リンカーはＡＳＧＳである。
【００７１】
また、本発明に係る抗体又は抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば以下の配向であり得る：
軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域；又は
重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
【００７２】
本発明の他の態様によれば、本発明は、抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質を提供する。
【００７３】
本発明において、前記融合タンパク質は、本発明の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントの生産性精製効率、生物学的活性の向上、融合タンパク質の安定性増加、フォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）の改善及び／又は追加の機能性を持つ機能的モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）との結合のために製造される。前記融合タンパク質は、２以上のポリペプチド鎖が組換え融合タンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）として発現されることにより、共有結合によって連結されるか、或いは化学的コンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって２以上のポリペプチド鎖が連結されたコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の形態であり得る。
【００７４】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、以下を含むキメラ抗原受容体ポリペプチドを提供する：
（ａ）ＨＥＲ２結合ドメイン（ＨＥＲ２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）；
（ｂ）膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ，ＴＭ）；
（ｃ）共刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ）；及び
（ｄ）細胞内シグナル（信号）伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ，ＩＣＤ）。
【００７５】
本明細書において、用語“キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）”は、エフェクター細胞シグナル伝達又はエフェクター細胞活性化ドメイン（例えば、Ｔ−細胞シグナル伝達又はＴ−細胞活性化ドメイン）に連結されたターゲット結合ドメイン（例えば、単一鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））を含む人工的に作製されたハイブリッドタンパク質（融合タンパク質）又はポリペプチドを意味する。キメラ抗原受容体は一般には、モノクローナル抗体の抗原−結合性質を用いて非−ＭＨＣ−制限方式で、選択された標的に対するＴ−細胞特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。非−ＭＨＣ−制限された抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ−細胞に抗原処理に関係なく抗原を認識する能力を提供し、腫瘍逃避の主要メカニズムを回避させる。また、ＣＡＲはＴ−細胞に発現されるとき、有利なことに、内在性Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖と二量体化されない。
【００７６】
本発明の例示的な実施形態によれば、本発明のキメラ抗原受容体は、本発明で上記した抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含むＨＥＲ２結合ドメインを含むので、ＨＥＲ２抗原を認識し、細胞の表面で発現される。
【００７７】
本発明のキメラ抗原受容体は、細胞の表面で発現されるので、膜貫通ドメインを含む。前記膜貫通ドメインは、Ｔ−細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインであり得るが、これに限定されない。
【００７８】
本発明の特定の例示的な実施形態によれば、前記膜貫通ドメインはＣＤ８、又はＣＤ２８の膜貫通ドメインであり得る。
【００７９】
本発明のキメラ抗原受容体の前記共刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、イムノグロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球性活性化分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＳＬＡＭ）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ（Ｂ  ａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）、トル様リガンド受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されるタンパク質から得られた機能的シグナル伝達ドメインであり得るが、これに限定されない。
【００８０】
本発明の特定の例示的な実施形態によれば、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及び／又はＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）からなる群から選ばれるタンパク質から得られた機能的シグナル伝達ドメインであり、より具体的にはＣＤ２８及び／又はＯＸ４０の機能的シグナル伝達ドメインであり得る。
【００８１】
本発明の他の例示的な実施形態によれば、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、又はそれらの組合せである。最も具体的には、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインである。
【００８２】
本発明のキメラ抗原受容体の前記ＨＥＲ２結合ドメインは、ヒンジドメインによって前記膜貫通ドメインに連結される。
【００８３】
本発明の他の具体的な実施形態によれば、前記ヒンジドメインは、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ヒンジ、又はＩｇＤヒンジであり得る。
【００８４】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント、又は上述したキメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードする核酸分子を提供する。
【００８５】
本明細書において、用語“核酸分子“は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味であり、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０））。
【００８６】
本発明の前記抗体又はその抗原結合フラグメント、又は前記キメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列は、前記キメラ抗原受容体分子を構成するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列であればよく、特定のヌクレオチド配列に限定されない。
【００８７】
これは、ヌクレオチド配列の変異が、発現を介してタンパク質配列に変化をもたらさない可能性があるためである。これをコドンの縮退という。したがって、前記ヌクレオチド配列は、機能的に均等なコドン又は同じアミノ酸をコードするコドン（例えば、コドンの縮退によって、アルギニン又はセリンに対するコドンは６個である。）、又は生物学的に等価（均等）なアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
本発明の特定の例示的な実施形態では、前記本発明のＨＥＲ２に対する抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、又は軽鎖をなすポリペプチドをエンコードする核酸のヌクレオチド配列は、本明細書の添付した配列表に記載されている。
【００８９】
抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント、又は前記キメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、前記したヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと理解される。前記の実質的な同一性は、本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当技術分野で通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小で８０％の相同性、より好ましくは最小で９０％の相同性、最も好ましくは最小で９５％の相同性をヌクレオチド配列が示すことを意味する。
【００９０】
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の抗体又は抗原結合フラグメント；又はキメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードする核酸分子は、配列表に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと理解される。前記の実質的な同一性は、本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当技術分野で通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小で６１％の相同性、より具体的には７０％の相同性、より具体的には８０％の相同性、最も具体的は９０％の相同性を配列が示すことを意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当技術分野で公知である。アラインメントに対する様々な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ  ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５−６５（１９９２）ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９９４）に開示されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））はＮＢＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などでアクセス可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用できる。ＢＬＡＳＴはｎｃｂｉウェブサイトのＢＬＡＳＴページを介してアクセス可能である。このプログラムを利用した配列相同性比較方法はｎｃｂｉウェブサイトのＢＬＡＳＴ  ｈｅｌｐページから確認できる。
【００９１】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
【００９２】
本明細書において、用語“ベクター”は、伝達ベクターおよび発現ベクターを含む。
【００９３】
本明細書において、用語“伝達ベクター”は、単離した核酸を含み、単離した核酸を細胞内部に伝達するために使用可能な物質の組成を意味する。線形ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と連結されたポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含むが、これに限定されない。より具体的には、前記伝達ベクターは自己複製性プラスミド又はウイルスを含む。前記用語は、細胞内への核酸の転移を促進させる非−プラスミド及び非−ウイルス性化合物、例えばポリリシン化合物、リポソームなどをさらに含み得るものと解釈される必要がある。ウイルス性伝達ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含むが、これに限定されない。
【００９４】
本明細書において、用語“発現ベクター”は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるために、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用因子（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含み、発現のための他の要素は宿主細胞又は試験管内発現システムによって提供され得る。前記発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを含むプラスミドベクター；コスミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルス、レトロウイルスベクター及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。本発明の特定の例示的な実施形態によれば、本発明のベクターで前記スイッチ分子をコードする核酸分子は、前記ベクターのプロモーターと作動的に結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）されている。本明細書において、用語“作動的に結合”されるとは、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これによって前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は翻訳に影響を与える。
【００９５】
本発明の組換えベクターシステムは当技術分野で公知の様々な方法によって構築可能であり、これに対する具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されている。
【００９６】
本発明のベクターは、遺伝子クローニングのためのベクター、タンパク質の発現のためのベクター、又は遺伝子の伝達のためのベクターとして構築され得る。また、本発明のベクターは原核細胞又は真核細胞を宿主にして用いて構築され得る。
【００９７】
例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例：メタルロチオニンプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用可能であり、これらは一般に転写終結配列としてポリアデニル化配列を有する。
【００９８】
本発明の例示的な実施形態では、前記ベクターが伝達ベクターである場合、“レトロウイルスベクター”であり得る。レトロウイルスは遺伝子伝達システムのための便利なプラットホームを提供する。
遺伝子伝達のために選択された遺伝子はレトロウイルスベクター内に挿入され、レトロウイルス粒子内にパッケージングされ得る。次いで、組み換えられたレトロウイルスは、インビボ、又はインビトロでターゲットとする宿主細胞に伝達され得る。多くのレトロウイルスベクターが当技術分野において知られており、本発明の特定の例示的な実施形態において前記レトロウイルスベクターは、ＭＬＶ−ベースのレトロウイルスベクターであるｐＭＴレトロウイルスベクターであるが、これに限定されない。
【００９９】
本発明の他の実施形態によれば、前記ベクターはレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターである。
【０１００】
本発明のベクターはそれから発現するポリペプチド又はタンパク質の精製を容易にするために、他の配列と融合され得る。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ  Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。一方、本発明の発現ベクターは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、及びこれを含むＣＡＲポリペプチドの発現を評価するための選択標識として選択可能マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子を含むことができる。選択可能マーカー遺伝子としては、当技術分野で通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。レポーター遺伝子にはルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を含む。
【０１０１】
本発明の組換えベクターを細胞内に導入して発現させる方法は関連技術分野によく知られている。ベクターは当技術分野で公知の方法によって宿主細胞、例えば哺乳動物、バクテリア、酵母、又は昆虫細胞内に容易に導入され得る。例えば、ベクターは物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞内に伝達され得る。前記物理的手段は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、微細注入、電気穿孔などを含む。前記化学的手段は、コロイド分散液システム、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油エマルジョン、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースのシステムを含む。また、前記生物学的手段は、上記のレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどの、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターの使用を含む。
【０１０２】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１０３】
本発明のベクターを安定的且つ連続的にクローニング及び発現できる宿主細胞は、当該分野に公知の任意の宿主細胞を利用可能であり、例えば、前記ベクターの適切な真核細胞宿主細胞は、サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ細胞、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ−２９３細胞を含むが、これに限定されない。
【０１０４】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを発現するエフェクター（効果）細胞を提供する。
【０１０５】
本発明の例示的な実施形態では、前記エフェクター細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びそれらの前駆細胞からなる群から選ばれるが、これに限定されない。ここで、前記Ｔリンパ球は炎症性Ｔリンパ球、細胞毒性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球又はヘルパーＴリンパ球からなる群から選択される。
【０１０６】
本発明において、前記エフェクター細胞は、自己細胞又は同種異型細胞の集団を含む。すなわち、前記エフェクター胞は、本ＨＥＲ２特異的ＣＡＲポリペプチドを発現する自己細胞又は同種異型細胞の群を含む。
【０１０７】
また、本発明の他の例示的な実施形態によれば、前記エフェクター細胞は、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターでトランスフェクション又は形質導入された細胞の群を含む。前記トランスフェクション又は形質導入は、当技術分野で知られた様々な手段によって制限なく達成され得る。
【０１０８】
したがって、本発明の特定の例示的な実施形態によれば、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲをコードする核酸分子は、エフェクター細胞、例えばＴリンパ球、又はナチュラルキラー細胞に伝達され、ｍＲＮＡに転写され、前記ｍＲＮＡからＨＥＲ２特異的ＣＡＲポリペプチドが翻訳されてエフェクター細胞の表面に発現される。
【０１０９】
本発明の他の態様は、（ａ）上記の本発明の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌予防又は治療用の医薬組成物を提供する。
【０１１０】
本発明のさらに他の態様は、上記のキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するエフェクター細胞を含む、癌又は炎症性疾患の治療用医薬組成物を提供する。
【０１１１】
前記医薬組成物は、前記した抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント；又はキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するエフェクター細胞を含む免疫治療用の医薬組成物である。
【０１１２】
本明細書において、“免疫治療（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）”とは、兔疫体系を活性化させる癌の治療方法を指す。免疫治療は能動的免疫治療と受動的免疫治療に区別される。能動的免疫治療は、ｉ）癌細胞又は癌細胞によって生成された物質を人体に注入して兔疫体系を活性化させる癌ワクチン治療（ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）、ｉｉ）サイトカイン（インターフェロン、インターロイキンなど）、成長因子などの免疫調節剤（ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）を投与して特定白血球を活性化させる免疫調節治療を含む。受動的免疫治療は、抗体治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ）と免疫細胞治療（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ）を含む。免疫細胞治療は具体的に、樹状細胞ワクチン治療（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）とＣＡＲ−Ｔ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ）治療、ＮＫ細胞治療（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ）、ＣＴＬ治療（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）、養子細胞転移（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）などを含むが、これに限定されない。本発明において、免疫治療は、主にＨＥＲ２抗体を含む治療的抗体とＨＥＲ２特異的ＣＡＲを活用した免疫細胞治療を意味する。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメント；キメラ抗原受容体ポリペプチド；又はキメラ抗原受容体を発現するエフェクター細胞を有効成分として利用する。したがって、これらに共通する内容は、重複を避けるために、その詳細な説明を省略する。
【０１１４】
下記の実施例から立証されるように、本発明の抗−ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ抗体がほとんど作用しないＭＣＦ−７細胞株に対してトラスツズマブに比べて優れた殺傷能を示す。また、本発明の抗−ＨＥＲ２抗体をトラスツズマブと併用投与した場合、ＳＫＢＲ−３乳癌細胞株の殺傷能の改善を示す。したがって、本発明の組成物は、癌の治療のためにトラスツズマブ抗体との併用投与用途及びトラスツズマブで治療されない癌の治療に非常に有効である。
【０１１５】
本発明の組成物によって予防又は治療可能な癌は、当技術分野に公知の様々な癌が含まれる。例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆道癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵癌、膀胱癌、腎臓癌、大腸癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、頭頸部癌、皮膚癌、甲状腺癌、副甲状腺癌又は尿管癌が含まれる。
【０１１６】
具体的には、本発明の組成物によって予防又は治療可能な癌はＨＥＲ２−発現癌であり、より具体的には、ＨＥＲ２−発現乳癌又は胃癌である。
【０１１７】
本発明の医薬組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、調整時に通常利用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。本発明の医薬組成物は、これらの成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。薬剤学的に許容される適切な担体及び調整物はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【０１１８】
本発明の医薬組成物は、経口及び非経口で投与でき、例えば、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与、硬膜内投与、眼球投与、皮膚投与及び経皮投与などで投与できる。
【０１１９】
本発明の薬剤学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病理状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様であり、通常の訓練を受けた医師は、効果的な治療又は予防のための投与量を容易に決定及び処方を行うことができる。本発明の特定の実施形態によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書において、用語“薬剤学的有効量”は、癌の予防又は治療に十分な量を意味する。
【０１２０】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位剤形又は複数剤形に製剤化され得る。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末制、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定剤をさらに含むことができる。
【０１２１】
本発明の例示的な実施形態によれば、本発明の医薬組成物はトラスツズマブ抗体をさらに含むことができる。
【０１２２】
本発明の医薬組成物はまた、上記由来の有効成分に加えて、他の薬剤学的活性薬剤又は薬物、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタクセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの化学治療剤、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、オラパリブ（ｏｌａｐａｒｉｂ）などの標的治療剤、又はニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）のような免疫チェックポイント抑制剤を含むか、或いはこれらと併用投与できる。
【０１２３】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、上述した抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物；又は前記のＨＥＲ２特異的キメラ抗原受容体を発現するエフェクター細胞を含む組成物を、治療が必要な対象体に投与する段階を含む癌の治療方法を提供する。
【０１２４】
本発明の治療方法の対象疾病である癌は、前記医薬組成物の治療対象疾病と関連して定義したものと同じである。
【０１２５】
本発明の例示的な実施形態では、前記対象体は哺乳動物又はヒトである。
【０１２６】
本発明の癌又は炎症性疾患の治療方法は、有効成分として上述した抗体又は抗原結合フラグメント；又はキメラ抗原受容体を発現するエフェクター細胞を共通に使用する方法であるので、重複を避けるために上述した詳細説明は省く。
【０１２７】
本発明の上記の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントは、診断、例えば癌を診断するのに利用され得る。
【０１２８】
したがって、本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、上記の本発明の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含む癌診断用キットを提供する。
【０１２９】
本発明の診断キットは、上述した本発明の抗−ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、本発明の薬剤学的組成物と同じ疾患を診断するので、この両者に共通する内容は、反復記載による本明細書の複雑性を避けるために、その記載を省く。
【０１３０】
上記のキットは抗体を含むので、様々な免疫分析（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）又は免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）の用途に適するように作製され得る。前記免疫分析又は免疫染色は、放射能免疫分析、放射能免疫沈殿、免疫沈殿、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、キャプチャー−ＥＬＩＳＡ、抑制又は競合分析、サンドウィッチアッセイ、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色及び免疫親和性精製を含むが、これに限定されない。前記免疫分析又は免疫染色の方法は、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅ．Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８０；Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．，Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，１９８４；及びＥｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されており、前記文献は本明細書に参照として組み込まれる。
【０１３１】
例えば、本発明の方法がラジオイムノアッセイ法（放射能免疫分析法）によって実施される場合、ラジオアイソトープ（放射能同位元素）（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）でラベリングされた抗体を、ＨＥＲ２タンパク質を検出するために用いることができる。本発明がＥＬＩＳＡ法で実施される場合、本発明の方法は、（ｉ）分析されるサンプルを固体基質の表面にコーティングする工程；（ｉｉ）一次抗体としての本発明の抗−ＨＥＲ２抗体とサンプルを反応させる工程；（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の結果物を酵素が結合された二次抗体と反応させる工程；及び（ｉｖ）前記酵素の活性を測定する工程を含む。
【０１３２】
前記固体基質として好適なものは、炭化水素ポリマー（例えば、ポリスチレン及びポリプロピレン）、ガラス、金属又はゲルであり、最も具体的にはマイクロタイタープレートである。
【０１３３】
前記二次抗体に結合された酵素は、これらに限定されないが、発色反応、蛍光反応、発光反応又は赤外線反応を触媒する酵素を含む。例えば、アルカリンホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ及びサイトクロムＰ４５０を含む。前記二次抗体に結合する酵素としてアルカリンホスファターゼが用いられる場合には、基質としてブロモクロロインドイルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェ−ト（ｎａｐｈｔｈｏｌ−ＡＳ−Ｂ１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＥＣＦ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のような発色反応基質が用いられ得る。ホースラディッシュペルオキシダーゼが用いられる場合には、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムニトレート）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アンプレックスレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ  ａｎｄ  ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２−Ａｚｉｎｅ−ｄｉ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）及びナフトール／パイロニン、グルコースオキシダーゼとｔ−ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）及びｍ−ＰＭＳ（ｐｈｅｎｚａｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）のような基質が用いられ得る。
【０１３４】
本発明がキャプチャー−ＥＬＩＳＡ方式で実施される場合、本発明の方法は、（ｉ）捕獲（捕捉）抗体（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）としてＨＥＲ２抗体を固体基質の表面にコーティングする工程；（ｉｉ）捕獲抗体とサンプルを反応させる段階；（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の結果物を、シグナルを発生させるラベルが結合されているＨＥＲ２検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）と反応させる工程；及び（ｉｖ）前記ラベルから発生するシグナルを測定する工程を含む。
【０１３５】
本発明の抗−ＨＥＲ２抗体は、前記検出抗体によって検出可能なシグナルを発生させるラベルを有する。前記ラベルは、化学物質（例えば、ビオチン）、酵素（アルカリンホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びサイトクロムＰ４５０）、放射能物質（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）、蛍光物質（例えば、フルオレシン）、発光物質、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）及びＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含むが、これに限定されない。様々なラベル及びラベリング方法は、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。
【０１３６】
前記ＥＬＩＳＡ方法及びキャプチャー−ＥＬＩＳＡ方法において、酵素の活性測定又はシグナルの測定は、当該技術分野で公知の様々な方法によって実施され得る。ラベルとしてビオチンが用いられる場合にはストレプトアビジンで、ルシフェラーゼが用いられる場合にはルシフェリンでシグナルを容易に検出することができる。
【０１３７】
本発明のキットに適用可能な試料は、細胞、組織又は組織−由来抽出物、破砕物（ｌｙｓａｔｅ）、精製物、血液、血漿、血清、リンパ又は腹水を含むが、これに限定されない。
【０１３８】
本発明の抗体はインビボ又はインビトロイメージングに利用され得る。本発明の他の態様によれば、本発明の抗体及び前記抗体に結合された検出可能な信号を発生させるラベルが結合された結合体を含むイメージ用組成物を提供する。
【０１３９】
前記検出可能な信号を発生させるラベルは、Ｔ１造影物質（例えば、Ｇｄキレート化合物）、Ｔ２造影物質（例えば、超常磁性物質（例：マグネタイト、Ｆｅ３Ｏ４、γ−Ｆｅ２Ｏ３、マンガンフェライト、コバルトフェライト及びニッケルフェライト））、放射性同位元素（例えば、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、Ｐ３２、Ｓ３５、４４Ｓｃ、４５Ｔｉ、１１８Ｉ、１３６Ｌａ、１９８Ｔｌ、２００Ｔｌ、２０５Ｂｉ及び２０６Ｂｉ）、蛍光物質（フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ローダミン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、Ｃｙ３及びＣｙ５）、化学発光物質、磁気粒子、マス標識又は電子密集粒子を含むが、これに限定されない。
【発明の効果】
【０１４０】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下の通りに要約される。
【０１４１】
（ａ）本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、癌細胞（特に、乳癌又は胃癌細胞）で高発現するＨＥＲ２に特異的に結合する抗体であり、トラスツズマブとは異なるエピトープに結合する抗体又は抗原結合フラグメントである。本発明は、前記抗体又は抗原結合フラグメント、これを含むキメラ抗原受容体、及びそれらの用途を提供する。
【０１４２】
（ｂ）本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは従来のＨＥＲ２ターゲット抗体のＣＤＲ配列と比較して相同性が非常に低いという点が独特である。
【０１４３】
（ｃ）トラスツズマブと比較して、本発明の抗体は、トラスツズマブ抗体に対して非反応性（又は耐性）を有する、或いは敏感度が減少したＨＥＲ２−未発現癌細胞に対してより優れた殺傷能を示す。また、本発明の抗−ＨＥＲ２抗体をトラスツズマブと併用投与する場合、トラスツズマブ抗体が作用する癌細胞株に対して相乗的な殺傷能力を示す。したがって、本発明の組成物は、癌の治療のためにトラスツズマブ抗体との併用投与用途及びトラスツズマブで治療されない癌の治療に非常に有用に使用することができる。特に、本発明の抗−ＨＥＲ２抗体又は、抗原結合フラグメントを含むキメラ抗原受容体をＴリンパ球などエフェクター細胞に発現させる場合、ＨＥＲ２に関連した様々な癌の免疫細胞治療法として有用に使用することができる。
【０１４４】
（ｄ）理論に束縛されないが、本発明の抗体が上記の効果を示す理由は、トラスツズマブとは異なるＨＥＲ２上のエピトープに結合し、トラスツズマブとは異なる方式でＨＥＲ２を抑制するためであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３、１Ｇ３、及びｈｚ８Ｇ１１クローンのＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ抗原に対する親和性をＥＬＩＳＡで分析した結果を示す。
【図２】ｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３、１Ｇ３、及びｈｚ８Ｇ１１クローンが結合するＨＥＲ２の細胞外部ドメインを調べた結果を示す。
【図３Ａ】ＨＥＲ２過発現乳癌細胞株（ＳＫＢＲ−３）とＨＥＲ２未発現乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）に対する本発明の５種の抗体（ｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３、１Ｇ３、及びｈｚ８Ｇ１１）の単独処理時に細胞成長抑制効能を分析した結果を示す。
【図３Ｂ】ＨＥＲ２過発現乳癌細胞株（ＳＫＢＲ−３）とＨＥＲ２未発現乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）に対する本発明の５種の抗体（ｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３、１Ｇ３、及びｈｚ８Ｇ１１）の単独処理時に細胞成長抑制効能を分析した結果を示す。
【図３Ｃ】ＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞株（ＳＫＢＲ−３）とＨＥＲ２非発現乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）に対する本発明の５種の抗体（ｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３、１Ｇ３、及びｈｚ８Ｇ１１）及びトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，ＴＲＡ）抗体の併用処理時に細胞成長阻害効果を分析した結果を示す。
【図３Ｄ】ＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞株（ＳＫＢＲ−３）とＨＥＲ２非発現乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）に対する本発明の５種の抗体（ｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３、１Ｇ３、及びｈｚ８Ｇ１１）及びトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，ＴＲＡ）抗体の併用処理時に細胞成長阻害効果を分析した結果を示す。
【図４】ＥｒｂＢファミリーを発現し、作製した抗体の特異性を調べた結果を示す。セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ，ＣＥＴ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，ＴＲＡ）及びパトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ，ＡＭＧ８８８，ＡＭＧ）はそれぞれＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３に結合する対照群として使用された。
【図５Ａ】作製した抗体のトラスツズマブとのエピトープを比較した結果を示す。トラスツズマブとのエピトープ比較のために、センサーチップにトラスツズマブとＨＥＲ２−Ｈｉｓを固定化した後、本発明の５種の抗体との結合を分析した結果を示す。
【図５Ｂ】作製した抗体のトラスツズマブとのエピトープを比較した結果を示す。トラスツズマブとのエピトープ比較のために、センサーチップにトラスツズマブとＨＥＲ２−Ｈｉｓを固定化した後、本発明の５種の抗体との結合を分析した結果を示す。
【図５Ｃ】作製した抗体のトラスツズマブとのエピトープを比較した結果を示す。トラスツズマブとのエピトープ比較のために、センサーチップにトラスツズマブとＨＥＲ２−Ｈｉｓを固定化した後、本発明の５種の抗体との結合を分析した結果を示す。
【図５Ｄ】作製した抗体のトラスツズマブとのエピトープを比較した結果を示す。トラスツズマブとのエピトープ比較のために、センサーチップにトラスツズマブとＨＥＲ２−Ｈｉｓを固定化した後、本発明の５種の抗体との結合を分析した結果を示す。
【図５Ｅ】作製した抗体のトラスツズマブとのエピトープを比較した結果を示す。トラスツズマブとのエピトープ比較のために、センサーチップにトラスツズマブとＨＥＲ２−Ｈｉｓを固定化した後、本発明の５種の抗体との結合を分析した結果を示す。
【図６Ａ】ｈｚ３９Ｄ２及びこれから親和度を向上させたクローン（ｈｚ３９Ｄ２．１４、ｈｚ３９Ｄ２．２２、及びｈｚ３９Ｄ２．２３）のＨＥＲ２過剰発現胃癌及び乳癌細胞に対する単独処理またはトラスツズマブ抗体との併用処理時の細胞成長阻害効果を分析した結果を示する。
【図６Ｂ】ｈｚ３９Ｄ２及びこれから親和度を向上させたクローン（ｈｚ３９Ｄ２．１４、ｈｚ３９Ｄ２．２２、及びｈｚ３９Ｄ２．２３）のＨＥＲ２過剰発現胃癌及び乳癌細胞に対する単独処理またはトラスツズマブ抗体との併用処理時の細胞成長阻害効果を分析した結果を示する。
【図６Ｃ】ｈｚ３９Ｄ２及びこれから親和度を向上させたクローン（ｈｚ３９Ｄ２．１４、ｈｚ３９Ｄ２．２２、及びｈｚ３９Ｄ２．２３）のＨＥＲ２過剰発現胃癌及び乳癌細胞に対する単独処理またはトラスツズマブ抗体との併用処理時の細胞成長阻害効果を分析した結果を示する。
【発明を実施するための形態】
【０１４６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないことは、当技術分野における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【０１４７】
実施例
【０１４８】
実施例１：ＨＥＲ２に対する抗体作製
抗体作製のために、ＨＥＲ２タンパク質の細胞外部ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ，ＥＣＤ）を動物細胞を用いて作製した。ＥＣＤのＣ−末端にヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃ部位（ＣＨ２−ＣＨ３）が結合されたＤＮＡを、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ０４４−５０）にＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ制限酵素を用いてクローニングした。次いで、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７９０−０７）細胞にポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．２３９６６）を用いて前記クローニングされたベクターを一時形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆレジン（ＰＡＬＬ，Ｃａｔ  Ｎｏ．２００７８−０２８）を用いて細胞培養液から精製した。精製されたタンパク質を、タンパク質アッセイ色素（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｄｙｅ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５００−０００６）を用いて定量し、その濃度及び純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシーブルー染色によって確認した。精製された１００μｇのタンパク質抗原をフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｆ５５０６）と混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（（株）大韓バイオ）の腹腔に注射した。２週後、抗原１００μｇをＰＢＳに希釈して追加注射し、３日後にマウスの脾臓を摘出してリンパ球を分離した。分離したリンパ球をミエローマ細胞株であるＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８１）と５：１の比率で混合し、ＰＥＧ−１５００（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７８３６４１）を用いて融合（ｆｕｓｉｏｎ）させた。融合された細胞（ハイブリドーマ、ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を選択的に選別してＨＡＴ補助剤（ＨＡＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ０２６２）を含む培地に培養した。
【０１４９】
得られたハイブリドーマ細胞を、ＥＬＩＳＡ方法を用いて検査し、抗原と結合する抗体を作製する細胞か否かを確認した。ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ或いはＣｈｒｏｍＰｕｒｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（ｈＩｇＧ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．００９−０００−００３）を１μｇ／ｍＬの濃度でＣｏｓｔａｒ  ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５９０）に常温で１時間固定した。ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で３回洗浄後、３００μｌのＴＢＳ−Ｔ／ＳＭ（２％スキムミルク）で常温で３０分間ブロッキングした。ブロッキングされたプレートを３回洗浄後にハイブリドーマ培養液を加え、３７℃で１時間抗体を結合させた。３回洗浄後、２次抗体として抗−ｍＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３１４３９）をＴＢＳ−Ｔ／ＳＭに１：５，０００に希釈して加え、３７℃で１時間抗体を結合させた。３回洗浄後、ＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＴＭＢＣ−１０００−０１）を加えて常温で５分間発色させ、１Ｎ硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ  ａｃｉｄ，ＤｕｋＳａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２５４）を追加して発色を停止させた。４５０ｎｍで吸光度をＶｉｃｔｏｒ  Ｘ３（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２０３０−００３０）を用いて測定し、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに特異的に結合する抗体を選択した。
【０１５０】
ＨＥＲ２は細胞表面に発現するタンパク質であるので、作製した抗体がＨＥＲ２を過発現する細胞に結合するかどうかを細胞−基盤ＥＬＩＳＡで確認した。ＨＥＲ２を過発現する卵巣癌細胞株であるＳＫＯＶ−３（韓国細胞株銀行、Ｃａｔ．Ｎｏ．３００７７）をＣｏｓｔａｒ  ９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５９５）に１０，０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで分注した後、２４時間培養した。翌日、細胞培養液上清を除去し、ＰＢＳで３回洗浄後、ハイブリドーマ細胞培養液を添加して３７℃で２時間さらに培養した。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、２次抗体としてヤギ抗−ｍＩｇＧ−ＨＲＰをＰＢＳ／ＦＢＳ（３％  ＦＢＳ）に１：５，０００で希釈して添加し、常温で１時間培養した。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＴＭＢを用いて発色させた。陰性対照群であるＳＰ２／０細胞培養液を用いたものの吸光度よりも高い吸光度を示す６１個のクローンを選択した。
【０１５１】
ＨＥＲ２に特異的に結合するモノクローナル抗体のうち、最終的に選択された５種の抗体（ｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３、１Ｇ３、ｈｚ８Ｇ１１）をキメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）又はヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｈｚ）に改変して検証した。各キメラ抗体又はヒト化抗体のアミノ酸配列は、添付の配列表に記載した。
【０１５２】
図１及び表１に、最終的に選択した５種の抗体（ｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３、１Ｇ３、ｈｚ８Ｇ１１）の吸光度を示す。
【０１５３】
【表１】
2021509288.tif 000003
【０１５４】
実施例２：作製した抗体のＨＥＲ２タンパク質に対する結合部位確認
選択された５種の抗体（ｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３、１Ｇ３、ｈｚ８Ｇ１１）のＨＥＲ２タンパク質の細胞外部ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ，ＥＣＤ）に対する結合部位をＥＬＩＳＡ法で確認した。ＥＬＩＳＡ法の場合、ＥＲＢＢファミリータンパク質の細胞外部ドメイン（ＥＣＤ）部位を動物細胞を用いて作製し、抗原として使用した。具体的には、ＥＣＤのＣ−末端にヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃ部位（ＣＨ２−ＣＨ３）が結合した形態のＤＮＡを、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ０４４−５０）にＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ制限酵素を用いてクローニングした。次いで、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＴＭ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７９０−０７）細胞にポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．２３９６６）を用いて前記クローニングされたベクターを一時形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、細胞培養液からＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＩ  Ｆｃ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＩＩ  Ｆｃ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＩＩＩ  Ｆｃ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＩＶ  Ｆｃ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ  Ｆｃ融合タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆレジン（ＰＡＬＬ，Ｃａｔ  Ｎｏ．２００７８−０２８）を用いて精製した。精製されたタンパク質をタンパク質アッセイ色素（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｄｙｅ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５００−０００６）を用いて定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシーブルー染色を用いて濃度及び純度を確認した。
【０１５５】
ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＩ  Ｆｃ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＩＩ  Ｆｃ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＩＩＩ  Ｆｃ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＩＶ  Ｆｃ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ  Ｆｃ融合タンパク質を１μｇ／ｍＬの濃度でＣｏｓｔａｒ  ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３６９０）に４℃で一晩固定させた。得られたものをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で３回洗浄後、１００μｌのＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ（５％  ＢＳＡ）で常温で１時間ブロッキングした。ブロッキングプレートを３回洗浄後に抗−ＨＥＲ２抗体を入れ、常温で１時間抗体を結合させた。３回洗浄後、２次抗体として抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰをＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡで１：３，０００に希釈して、常温で１時間抗体を結合させた。３回洗浄後、ＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＴＭＢＣ−１０００−０１）を入れて常温で５分間発色させ、１Ｎ硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃ  ａｃｉｄ，ＤｕｋＳａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２５４）を追加して発色を停止させた。４５０ｎｍで吸光度をＶｉｃｔｏｒ  Ｘ３（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２０３０−００３０）を用いて測定した。
【０１５６】
結果は、図２に示す。
【０１５７】
図２に示すように、本明細書の記載にて作製された抗体のうち、ｈｚ２Ｇ１０とｈｚ３９Ｄ２はＨＥＲ２タンパク質の細胞外部ドメインのうちドメイン１に結合し、２４Ｄ３はドメイン３に結合し、１Ｇ３とｈｚ８Ｇ１１はドメイン４に結合した。
【０１５８】
この結果から、本明細書に記載の５種の抗体は、トラスツズマブ（ＴＲＡ）が結合するＨＥＲ２タンパク質の外部ドメイン４と異なるＨＥＲドメインに結合してＨＥＲ２過剰発現癌細胞の成長を抑制させることができる（ｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３）、或いは、トラスツズマブと併用時、単独使用する場合に比べて著しく優れた細胞成長抑制効果を示すので、ＨＥＲ２タンパク質の発現と関連した癌の予防又は治療のための単独製剤、又はトラスツズマブとの併用製剤として有用に使用することができる。
【０１５９】
実施例３：作製された抗体の乳癌細胞成長抑制効能比較
細胞生存率を、ＨＥＲ２が過発現される代表的な乳癌細胞株であるＳＫＢＲ−３及びＨＥＲ２未発現乳癌細胞株であるＭＣＦ−７を対象に単独又はトラスツズマブと併用処理して分析した。併用処理の場合、作製された抗体とトラスツズマブを１：１比率（重量比）で混合して使用した。９６ウェルプレートにＳＫＢＲ３（韓国細胞株銀行、Ｃａｔ．Ｎｏ．３００３０、５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴＢ  ２２、５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）細胞を分注し、２４時間培養した。精製された抗体を最終的に２０μｇ／ｍＬとなるように処理し、４日間追加培養した。細胞の生存率を測定するために、ＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＫ−０４−１３）を最終濃度が１０％となるように添加し、３７℃で３時間処理した後、吸光度を測定した。抗体を非処理したウェルの吸光度を生存率１００％にして相対的生存率を計算した。
【０１６０】
結果は、図３Ａ〜図３Ｄ及び表２に示す。
【０１６１】
【表２】
2021509288.tif 000004
【０１６２】
表２において、ｈＩｇＧはヒトＩｇＧを表す。図３Ａ、図３Ｂ及び表２に示したように、本明細書に記載の５種の抗体は、単独処理においていずれもＳＫＢＲ−３乳癌細胞株の増殖を抑制する効能を示し、異なる濃度範囲において、陽性対照のトラスツズマブに比べて高い又は対等の細胞成長阻害効果を示した（図３Ａ）。しかし、本明細書に記載の５種の抗体はいずれも、ＨＥＲ２−陰性細胞であるＭＣＦ−７細胞株に対して、陽性対照群であるトラスツズマブと同様に、有意な細胞増殖阻害効果は示さなかった（図３Ｂ）。
【０１６３】
【表３】
2021509288.tif 000005
【０１６４】
表３において、ｈＩｇＧは、ヒトＩｇＧを処理した試験群を示し、ＴＲＡ＋は、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）と本明細書に記載の抗体を併用処理した試験群を示す。図３Ｃ、図３Ｄ及び表３に示すように、本明細書に記載の５種の抗体（ｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３、１Ｇ３、ｈｚ８Ｇ１１）はいずれも、トラスツズマブと併用処理した場合、ＳＫＢＲ−３乳癌細胞株においてトラスツズマブ単独処理時に比べて高い又は同等の細胞成長阻害効果を示した（図３Ｃ）。
【０１６５】
理論に束縛されないが、本発明の抗体が上記の効果を示す理由は、トラスツズマブとは異なるＨＥＲ２上のエピトープに結合し、トラスツズマブとは異なる方式でＨＥＲ２を抑制したためであると考えられる。
【０１６６】
実施例４：抗体配列分析
抗体配列を分析するために、各ハイブリドーマのＲＮＡを用いてファージＦａｂ抗体ライブラリーを作製し、これからＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃと結合するファージを得るために、３次にわたる選別過程（ｐａｎｎｉｎｇ）を行った（Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａ，Ｃａｒｌｏｓ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。ハイブリドーマ培養後、ＲＮＡをＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｚ３１００）を用いて分離し、ｃＤＮＡを合成した。公知のプライマーセット（参照：Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃａｒｌｏｓ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて抗体の可変領域を増幅し、ヒトＣｋ（Ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ）とＣＨ１を連結してｐＣｏｍｂ３Ｘベクター（Ｂａｒｂａｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）にＳｆｉ−Ｉ制限酵素を用いてクローニングし、ＥＲ２５３７バクテリア（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．８０１−Ｎ）に形質転換した。形質転換されたバクテリアにＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２５１）を感染させてファージを得て、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに固定されたイムノチューブを用いてＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃに結合するクローンを得た。
【０１６７】
各抗体のコロニーから、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃと結合する抗体をＥＬＩＳＡ方法で確認した。形質転換されたバクテリアコロニーを６００ｎｍで吸光度が０．５となるように３７℃で培養した後、ＩＰＴＧで最終濃度が１ｍＭとなるように処理し、３０℃で一晩培養しながらＦａｂ形態の抗体を発現させた。５ｍＬ培養後、遠心分離によって細胞を収集し、０．４ｍＬの１Ｘ  ＴＥＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％（ｖ／ｖ）スクロース、ｐＨ８．０）に細胞を懸濁した後、４℃で１０分間処理した。ここに０．６ｍＬの０．２Ｘ  ＴＥＳを添加し、さらに４℃で３０分間処理した後、遠心分離して上清を取った。ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃが１μｇ／ｍＬ濃度にコーティングされたＣｏｓｔａｒ  ９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．３６９０）をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＴＢＳ−Ｔ／ＳＭ（３％無脂肪スキムミルク、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で常温で１時間ブロッキングした。各コロニーの培養液（Ｂｒｏｔｈ）或いはペリプラズム抽出物（Ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）をＴＢＳ−Ｔ／ＳＭを用いて１：３比率で希釈して処理後、常温で１時間結合させた。３回洗浄後、２次抗体として抗−ＨＡ−ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１２０−１３８−１９０−０１）を１：５０００に希釈して常温で１時間結合し、３回洗浄後にＴＭＢを用いて発色させた。
【０１６８】
大部分のコロニーが細胞培養液或いはペリプラズム抽出物で吸光度０．２以上を示し、それらのクローンを対象に抗体の塩基配列を解析した結果、単一ハイブリドーマに由来したコロニーは同一配列であることを確認した。
【０１６９】
各クローンで生産された抗体のＣＤＲ配列は、以下の表４及び表５にまとめた。
【０１７０】
【表４】
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【０１７１】
【表５】
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【０１７２】
表４及び表５はそれぞれ、作製された抗体の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）及び軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）のアミノ酸配列を示す。
【０１７３】
実施例５：作製された抗体のＨＥＲ２に対する特異性
作製された本明細書に記載の５種の抗体が、ＨＥＲ２の属したＥｒｂＢファミリータンパク質のうちＨＥＲ２に特異的に結合するかどうかをＥＬＩＳＡ法で確認した。作製された抗体がＥｒｂＢファミリータンパク質のうちＨＥＲ２に特異的に結合するかを確認するために、ＥｒｂＢファミリーに属するＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４の細胞外部ドメインを対象にＥＬＩＳＡ法で確認した。ＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃ）は、上記の実施例２のＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃと同じ方法で生産され、ＨＥＲ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃３４８−ＲＢ−０５０）とＨＥＲ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃１１３１−ＥＲ−０５０）タンパク質は購入した。セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ，ＣＥＴ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，ＴＲＡ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ，ＡＭＧ８８８，ＡＭＧ）をそれぞれＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３に結合する対照群抗体とした。
【０１７４】
結果は、図４に示す。
【０１７５】
図４に示すように、本明細書に記載の５種の抗体は、ヒトＥｒｂＢファミリータンパク質のうちＨＥＲ２に特異的に結合することが確認できた。
【０１７６】
実施例６：作製した抗体のトラスツズマブとのエピトープ比較
ＨＥＲ２に対する抗体トラスツズマブは、ＨＥＲ２  ＥＣＤの４個のドメインのうちドメイン−４に結合することが知られている。作製された抗体がトラスツズマブのＨＥＲ２に対するエピトープと重複するかどうかを確認するために、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）機器を用いてエピトープビニング（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎｎｉｎｇ）を行った。ＡＲ２Ｇセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−５０９２（ｔｒａｙ）、１８−５０９３（ｐａｃｋ）、１８−５０９４（ｃａｓｅ））にトラスツズマブを１０μｇ／ｍＬの濃度で、ＥＣＤ／ＮＨＳを用いたアミンカップリング方法で固定させた。トラスツズマブが固定されたセンサーチップにＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を１０μｇ／ｍＬの濃度で１０分間結合させ、５分間トラスツズマブとＨＥＲ２−ＥＣＤ間の結合を安定化させた。その後、本明細書に記載の抗体５種を１０μｇ／ｍＬの濃度で１０分間結合させ、１０分間抗原と抗体間の結合を安定化させた。トラスツズマブを固定した後、全ての抗体抗原は動態緩衝液（ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，ｃａｔ  Ｎｏ．１８−１０９２）を用いて希釈したが、安定化させる段階でも同緩衝液を使用した。仮に、追加された抗体がトラスツズマブと結合されたＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質に結合する場合、これはトラスツズマブとエピトープを共有しない抗体と解釈できる。
【０１７７】
結果は、図５Ａ〜図５Ｅに示す。
【０１７８】
図５Ａ〜図５Ｅに示すように、作製された抗体であるｈｚ２Ｇ１０、ｈｚ３９Ｄ２、２４Ｄ３、及びｈｚ８Ｇ１１は、トラスツズマブＥ結合されたＨＥＲ２−ＥＣＤに追加結合したので、トラスツズマブと異なるエピトープを有することを確認した。これに対し、１Ｇ３は、トラスツズマブに結合されたＨＥＲ２−ＥＣＤと比べると、トラスツズマブとエピトープを共有していると考えられる。
【０１７９】
実施例７：親和度が増進したｈｚ３９Ｄ２抗体作製
本発明者は、ヒト化３９Ｄ２抗体（ｈｚ３９Ｄ２）に基づいて親和度が改善された抗体を作製するために、軽鎖又は重鎖のＣＤＲ３を無作為化（ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）したファージ抗体ライブラリーを作製した（Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃａｒｌｏｓ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。重鎖のＣＤＲ３のうち、Ｋａｂａｔナンバリングよるアミノ酸番号であるＤ１０１、Ｙ１０２に該当するＤとＹ、及び軽鎖のＣＤＲのうち、Ｐ９５、Ｗ９６、Ｔ９７に該当するＰ、Ｗ、Ｔは、ヒト抗体の各位置で頻繁に発見されるアミノ酸であるので、無作為化から除外した。このとき、使用されたプライマーは、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３に該当する部位に対するものであり、無作為化しようとするアミノ酸に該当するコドンの一番目と二番目には、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン（Ｔ）を同一比率で混合して無作為に入るようにし、三番目の位置はグアニン（Ｇ）やシトシン（Ｃ）が同一比率で入るように合成して使用した。作製されたライブラリーから親和度の向上したクローンを、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を用いたバイオパンニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）によって選択した。最終的に選択された３つの抗体ｈｚ３９Ｄ２．１４、ｈｚ３９Ｄ２．２２、及びｈｚ３９Ｄ２．２３のＣＤＲ配列情報は、表６及び表７にまとめるた。親和度を増進させるために変更されたアミノ酸残基は、太字及び下線で表示した。
【０１８０】
【表６】
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【０１８１】
【表７】
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【０１８２】
ＩｇＧ抗体は、選別された３種の抗体（ｈｚ３９Ｄ２．１４、ｈｚ３９Ｄ２．２２、及びｈｚ３９Ｄ２．２３）の親和性の増加を検証するために作製された。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃Ｈ１０５００）を２０００ＲＵでＥＣＤ／ＮＨＳ方法でＣＭ５センサーチップに固定させた。その後、抗体を５０μｌ／ｍｉｎの速度で５分間結合させ、５分間バッファーを流して安定化させた。抗体を安定化させた後、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を５０μｌ／ｍｉｎの速度で４分間結合させ、１５分間バッファーを流して分離させた。各濃度の分析後には１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を用いてリサイクルさせ、次のアッセイにかけた。抗体の親和度はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析した。分析結果は、表８に整理した。表８に示すように、選別された３種の抗体（ｈｚ３９Ｄ２．１４、ｈｚ３９Ｄ２．２２、及びｈｚ３９Ｄ２．２３）はいずれもｈｚ３９Ｄ２に比べて親和性が向上したことが確認できた。
【０１８３】
【表８】
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【０１８４】
親和性の向上した前記３種の抗体（ｈｚ３９Ｄ２．１４、ｈｚ３９Ｄ２．２２、及びｈｚ３９Ｄ２．２３）の抗癌効果を、ＨＥＲ２過剰発現胃癌細胞のＮＣＩ−Ｎ８７およびＯＥ−１９と乳癌細胞のＢＴ−４７４細胞を用いて分析した。細胞に各抗体を５μｇ／ｍｌの濃度で単独で、又はトラスツズマブと併用して処理した時の癌細胞生存率を分析した。これは図６Ａ〜図６Ｃに示されている。図６Ａ〜図６Ｃから確認できるように、親和度の向上したｈｚ３９Ｄ２．１４、ｈｚ３９Ｄ２．２２、及びｈｚ３９Ｄ２．２３抗体はｈｚ３９Ｄ２に比べて、単独処理時された場合、癌細胞増殖阻害効果の向上を示すことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2021509288.tif 000019
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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