(57)【要約】  ＲＳＶに対するワクチンの改善は、ＣＸ３Ｃ−Ｒとの相互作用を遮断するｍＡｂと複合体形成したＧタンパク質ＣＣＤ部分および血中半減期を延ばすために修飾された形態のｍＡｂ、ならびに吸入可能なワクチンを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質またはペプチド模倣体と、前記組換えＲＳＶ  Ｇタンパク質と宿主受容体ＣＸ３ＣＲ１との相互作用を遮断するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片とによって形成される複合体を含む、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する免疫原であって、前記ＲＳＶ  Ｇタンパク質が中央保存ドメイン（ＣＣＤ）を含む、免疫原。
【請求項２】
前記ＣＣＤが、前記ＲＳＶ  Ｇタンパク質の残基１３１〜２３０または１６７〜１７６を含む、請求項１に記載の免疫原。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体または断片が、約１ｎＭ未満のＫｄに関連する親和性を有する、請求項１に記載の免疫原。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が：
配列番号２および配列番号１６；または
配列番号４および配列番号１８；または
配列番号６および配列番号２０；または
配列番号８および配列番号２２を含む、請求項１に記載の免疫原。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原を含むワクチン。
【請求項６】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染の予防の方法に使用する、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
ＲＳＶ  Ｇタンパク質に対するｍＡｂを含むワクチンであって、前記ｍＡｂが、対象中で実効寿命の延長をもたらすように修飾されているＦｃを含む、ワクチン。
【請求項８】
前記Ｆｃ部分が、ＦｃＲｎまたはムチンに結合する、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記Ｆｃ部分が、ＹＴＥ突然変異を含む、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１０】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染の予防または処置の方法に使用する、請求項７〜９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
吸入用として製剤化されるＲＳＶの予防または処置のためのワクチン。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原または請求項７〜９のいずれか一項に記載の修飾されたｍＡｂを含む、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
対象におけるＲＳＶ感染の予防または処置の方法であって、前記対象の細胞において前記ＲＳＶ  Ｇタンパク質に対して作られたｍＡｂまたはその抗原結合断片の発現をもたらす工程を含む方法。
【請求項１４】
前記ｍＡｂが、対象中で実効寿命の延長をもたらすように修飾されているＦｃを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍＡｂが：
配列番号２および配列番号１６；または
配列番号４および配列番号１８；または
配列番号６および配列番号２０；または
配列番号８および配列番号２２を含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
[1]本出願は、２０１８年８月８日に出願された米国特許仮出願第６２／７１６，１８４号明細書の優先権を主張し、その内容を参照により本明細書に組み込む。
【技術分野】
【０００２】
[2]本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染の予防および処置に対する改善された方法および材料を対象とする。
配列表の参照による組み込み
[3]本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、３８８５１２０１３８４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔという表題のファイルとして提供され、２０１９年８月８日に作成され、サイズ３２キロバイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体を参照により組み込む。
【背景技術】
【０００３】
[4]ＲＳＶは、１１個のタンパク質をコードしている１０個の遺伝子を持つマイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、一部には、感染が強力な免疫をもたらさないので、６０年を超えて効果的な治療技術に抵抗してきた［Ｂｒｏａｄｂｅｎｔ，Ｌ．ら、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（２０１５年）９：１６９〜７８頁］。現在まで、いくつかの実質的な試みにもかかわらず、いかなるワクチンも承認されていない［Ｊｏｒｑｕｅｒａ，Ｐ．Ａ．およびＴｒｉｐｐ，Ｒ．Ａ．、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｍｅｄ（２０１７年）１１（８）：６０９〜６１５頁］。米国において乳児の５０％以上が、最初の１年の間に感染し、ほぼ５％が入院を必要とする［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  Ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（２０１４年）１３４：ｅ６２０〜３８頁］。乳児期における重篤なＲＳＶ疾患は、小児喘息様徴候に対する立証済みの危険因子である［Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｅ．Ｗ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２年）２４（６）：７１３〜９頁］。特に危険性の高い早産児（＜妊娠２９週齢）は、罹患率を減少させるが死亡率は減少させない高額な処置であるヒト化マウスモノクローナル抗体またはｍＡｂ［パリビズマブ、Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ  ＬＬＣによりシナジス（登録商標）として販売されている］による予防に集中してきた［Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ｈ．Ｃ．およびＫｉｍｂｅｒｌｉｎ，Ｄ．Ｗ．、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（２０１３年）１３２：９１５〜８頁］。幼児におけるＲＳＶ感染の世界的な発生率は、米国ほどよく記録されていないが、より高い死亡率で米国の２倍以上と考えられている［Ｎａｉｒ  Ｈ．ら、Ｌａｎｃｅｔ（２０１０年）３７５（９７２５）：１５４５〜１５５５頁］。加えて、高齢者において医学的に通院した急性呼吸器疾患の最大１２％がＲＳＶ感染に起因し、これら症例の６〜８％が致死的である。入院は、３〜６日間続き、かなりの割合で集中治療病棟に入院する［Ｃｏｌｏｓｉａ，Ａ．Ｄ．ら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．（２０１７年）１２（８）：ｅ０１８２３２１］。ＲＳＶ感染症は、免疫不全状態の患者においても一般的であり、死亡率２５％を超える［Ｓｈａｈ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ（２０１４年）１２３（２１）：３２６３〜３２６８頁］。
【０００４】
[5]ＲＳＶの２つのサブタイプ、ＡおよびＢが、優性株としておよそ１〜２年間隔で交互に循環し、世界的に同程度の発生率がある。２つのサブタイプは異なる遺伝子型を含み、感染の間に共循環し得る。したがって、効果的なワクチンまたは処置は、両方のサブタイプの株に対して活性を示す必要がある。
【０００５】
[6]ＲＳＶは、２つの主要な表面糖タンパク質、ＦおよびＧを有する。現在のところ、ＲＳＶに対して唯一販売されているｍＡｂは、未熟児における予防的使用に対してのみ承認されているパリビズマブ［商標名シナジス（登録商標）で市販されている］であり、Ｆタンパク質に対して作られている。エスケープ変異が容易に検出されるが、このｍＡｂは、株間でＦタンパク質配列が保存されているため広く有用である［Ｚｈｕ，Ｑ．ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２０１１年）２０３：６７４〜８２頁］。ＲＳＶ  Ｆタンパク質に基づいてワクチンを開発する取り組みについて記載されている［Ｊｏｒｑｕｅｒａ，Ｐ．Ａ．およびＴｒｉｐｐ，Ｒ．Ａ．、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｍｅｄ（２０１７年）１１（８）：６０９〜６１５頁］。免疫した対象において産生されるＦタンパク質に対する抗体価は、細胞培養においてＲＳＶ伝播を阻害するレベルに達しているが、ＲＳＶ疾患は、そのようなワクチンのいずれもＦＤＡ承認を受けるのに十分に防止されなかった。
【０００６】
[7]さらに、未熟児（妊娠３２〜３５週齢で生まれた）のパリビズマブ処置は、年齢６歳における喘息または肺機能に対して大きな効果がなかった［Ｓｃｈｅｌｔｅｍａ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｒｅｓｐｉｒ．Ｍｅｄ．（２０１８年）６：２５７〜２６４頁］。パリビズマブのエスケープ変異はよく記録されており、効力の欠如の一因となっている可能性がある［Ｂａｔｅｓ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０１４年）４５４〜４５５：１３９〜４４頁］。そのうえ、パリビズマブ、モタビズマブのより高親和性の誘導体は、非常に高い用量１００ｍｇ／ｋｇ（ｍＡｂについて）で与えられても、満期出産乳児における急性感染の処置として臨床的有益性を示せなかった［Ｒａｍｉｌｏ  Ｏ．ら、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ．（２０１４年）３３（７）：７０３〜９頁］。
【０００７】
[8]対照的に、Ｇタンパク質は、全体的に株間で極めて多様である。しかしながら、残基１６７〜１７６を含む配列の中央の領域は、非常に高度に保存されており、中央保存ドメイン（ＣＣＤ）と示される。実際のところ、公開されているＲＳＶ配列およそ７０００個のうち＜１％しかＣＣＤ内に何らかの変化を示さず、その大多数が保存的置換である。
【０００８】
[9]ホルマリン不活性化ウイルスを用いるワクチン接種によるＲＳＶに対する予防の初期の試みは、逆効果であり、疾患の増強および肺好酸球増加症を引き起こすことが判明した［Ｋｉｍ，Ｈ．Ｗ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ（１９６９年）８９：４２２〜４３４頁］。この有害な反応は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質とＣＸ３ＣＲ１受容体との相互作用に起因し、炎症細胞の動員および起こりうる活性化を生じると現在思われている。この受容体と相互作用する領域であるＣＸ３Ｃモチーフは、ＣＣＤの直ぐ外側の１８２〜１８６位である。この観察の結果、ホルマリン不活性化ワクチンは、それ以上開発されなかった。さらに、ＲＳＶ  Ｇタンパク質は、インターフェロン応答を低下させることによりＲＳＶ感染を悪化させることが示された［Ｏｓｈａｎｓｋｙ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００９年）２２（３）：１４７〜１６１頁］。ＲＳＶ  Ｇタンパク質のバリアントに基づくが、ＣＸ３ＣＲ１相互作用を欠くワクチンが、提案されてきた。米国特許第８，１７３，１３１号明細書は、ＣＸ３Ｃモチーフが修飾されているワクチン、またはモチーフと受容体との相互作用を防止し、したがって細胞への侵入を防止する抗体もしくは他の部分を含む組成物を開示している。米国特許第８，８４６，０５６号明細書は、ワクチン成分としてＲＳＶ  Ｇタンパク質、特に残基１６４〜１７６または１５５〜２０６を含む免疫原性ペプチドを開示している。米国特許第９，３２１，８３０号明細書は、ＲＳＶ感染症の処置または防止に有用であり、残基１６７〜１７６を含む領域でＲＳＶのＧタンパク質の保存されている直鎖状配列に結合するｍＡｂを開示しており；これらの抗体は天然のヒト免疫レパートリーから得られたので、ヒト対象に投与された場合、免疫原性は最小限であると予想される。
【０００９】
[10]ＲＳＶ  Ｇタンパク質の約１５％は、細胞質ドメインと膜貫通ドメイン領域の一部を除去するコドン４８での選択的翻訳開始部位の使用により、分泌される［Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ，Ｄ．Ａ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（１９８８年）６２：２２２８〜３３頁］。この開始部位の欠失は、毒性をかなり減少させる［Ｓｔｏｂａｒｔ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ（２０１６年）７：１３９１６頁］、［Ａｒｎｏｌｄ，Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００４年）３３０：３８４〜３９７頁］。そのような弱毒化生ウイルスは、ワクチンとして有用であり得るが、ＲＳＶの高い伝播性は、弱毒にもかかわらず、非常に若い人、高齢の人および免疫不全の人を含めた重篤な疾患の危険性がある人々へ移行するかなりの危険性を有する。可溶性因子を中和するには抗原に対する高い親和性が必要なので、分泌されたＧタンパク質は、効果的なワクチンまたは処置のさらなる障壁となる；さもなければｍＡｂは、抗原のための循環貯蔵所を単に提供するだけになり、抗原の血中半減期を延長し、抗原を全身により効率的に分布させる［Ｔａｂｒｉｚｉ，Ｍ．ら、ＡＡＰＳ  Ｊ（２０１０年）１２：３３〜４３頁］。その結果、米国特許第９，３２１，８３０号明細書に開示されるｍＡｂなど、ＲＳＶ  Ｇタンパク質ＣＣＤに対して低ピコモル（ｐＭ）の親和性を持つｍＡｂが、一般に有利である。
【００１０】
[11]Ｃｏｌｌａｒｉｎｉ，Ｅ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００９年）１８３：６３３８〜４５頁は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質ＣＣＤに結合する高親和性で、広く中和するｍＡｂ、および３Ｄ３（１．１ｐＭ）、２Ｂ１１（１０ｐＭ）、３Ｇ１２（５８０ｐＭ）、５Ｄ８（４．４ｎＭ）を含めた様々な親和性を持つ抗体について記載している。ｍＡｂ  ３Ｄ３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏと齧歯動物モデルの両方で広い中和活性を示し；短い直鎖ペプチドのレベルで定義される３Ｄ３に対するエピトープは、ほとんど全ての循環株にわたって高度に保存されている。さらなるｍＡｂである２Ｄ１０は、３Ｄ３（米国特許第８，２７３，３５４号明細書）より効力は低いが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス中和アッセイにおいて活性があるにもかかわらず、いかなる直鎖ペプチドエピトープもそれに対して定義されなかったので、興味深いものである。低ｎＭ〜高ｐＭ範囲の親和性を持つさらなる天然のヒトｍＡｂが、米国特許第１０，０３５，８４２号明細書に開示されている。
【００１１】
[12]米国特許出願公開第２０１９／０１３５８７６号−Ａ１明細書に開示されている通り、ｍＡｂ  ３Ｄ３および２Ｄ１０と複合体形成したＧタンパク質のＣＣＤのペプチドの構造が、Ｘ線結晶構造解析によって高解像度で決定され、それによりエピトープの立体配座の特質が定義された。
【００１２】
[13]ＲＳＶ  ＡおよびＢ両サブタイプのＧタンパク質の中央領域（残基１３１〜２３０）を含む組換え融合タンパク質は、マウスにおいて効果的な免疫原であることが示された［Ｌｅｅ，Ｊ．Ｙ．およびＣｈａｎｇ，Ｊ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１７年）１２：ｅ０１７５３８４］。ＤＭＳＯおよびＰＢＳ中で乳化されたＧタンパク質ペプチド、残基１４８〜１９８も、免疫原としてマウスにおいて試験され、感染を中和するのみならずＣＸ３ＣＲ１へのＧタンパク質結合も遮断する抗体を誘導するのに効果的であることが判明した［Ｃｈｏｉ，Ｙ．ら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２年）２５（３）：１９３〜２０３頁］。同様に、Ｇタンパク質残基１６９〜１９８を組み込んだナノ粒子によるワクチン接種は、ＲＳＶで接種したマウスにおいて保護を誘導した［Ｊｏｒｑｕｅｒａ，Ｐ．Ａ．ら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１３年）８：ｅ７４９０５］。この領域からのペプチドの詳細な最適化も試みられ、残基１８２〜１８６におけるＧタンパク質への１つ余分の残基の挿入は、宿主免疫応答に対するＧタンパク質の有害効果を大いに減少させた［Ｂｏｙｏｇｌｕ−Ｂａｒｎｕｍ，Ｓ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２０１７年）９１（１０）ｐｉｉ：ｅ０２０５９〜１６頁］が、天然のＣＣＤにｍＡｂを誘導する能力も減少させた可能性が高い。
【００１３】
[14]これら文書の内容および本明細書に引用される文書の全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
[15]現在までの結果は有望であるが、ＲＳＶ  Ｇタンパク質ワクチンは承認されていない。このウイルスの場合、他の多くのウイルスと異なり、反復性感染が一般的であり、多くの例において重症度の増大を伴う。さらなる改善が有用である免疫原の品質を定義する基準には：応答の継続期間；多様なヒト集団にわたる応答の均一性（力価および親和性）；広域スペクトル（全ての循環株に対して活性がある）；安全性（特に、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体に対して有害な薬理活性がない）；および安定性（特に効果的な冷却供給連鎖がない国における使用に重要である）がある。ワクチン接種によるウイルス疾患の防止は、アジュバントと呼ばれる追加成分と組み合わせた無傷のウイルス粒子、無力化されたウイルス粒子、またはウイルス粒子のいくつかの部分のいずれかの皮下または筋肉内注射を通常含む。アジュバントは、ワクチンの有効性、安定性および保存性を増強させる目的でワクチンに添加される。抗体は、静脈内、筋肉内、または吸入によって投与されてもよい。
【００１４】
[16]ワクチンとしての免疫複合体の使用は、抗原単独によるワクチン接種と比較して一次免疫応答（動力学的および定量的）を増強させ得る［Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＷＥ、ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９７７年）１３５（４）：６００〜１０頁］、［Ｂｒａｄｙ，Ｌ．Ｊ．、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００５年）７３（２）：６７１〜８頁］。これは、抗原プロセッシングおよび提示の効率の増大に起因する［Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｔａｌ．Ｕ．Ｍ．、Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈ．Ｋ、Ｇａｌｉｌｉ．Ｕ．、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００９年）２７（２３）：３０７２〜８２頁］。ワクチンにおける抗抗原抗体複合体の内包が、抗原特異的免疫応答を刺激する免疫複合体の形成を刺激することによってワクチンの有効性を高めることが他の系において判明した［Ｌａｍｂｏｕｒ，Ｊ．ら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ＆  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ（２０１６年）５：ｅ９２；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｅｍｉ．２０１６．９７］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
[17]Ｇタンパク質を標的する能動的および受動的両方のワクチンの鍵となる特徴の改善が、本発明の焦点である。ＲＳＶ免疫化に関する取り組みは、Ｆタンパク質に焦点を合わせてきたが、Ｇタンパク質が、重要な標的であり、ＲＳＶ予防を改善するための免疫原として効果的に採用され得ることが現在理解されている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
[18]一態様において、本発明により、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の保存されているＣＣＤが対象において中和抗体を誘発し、ＣＸ３Ｃモチーフとその受容体との望ましくない相互作用を排除することが可能になる。これは、この相互作用を防止するためにＧタンパク質を突然変異させることによってまたはこの受容体に対してＧタンパク質と競合する抗体もしくは他の部分を提供することによって達成される。本発明によると、抗Ｇ  ｍＡｂを使用して、ワクチン組成物中のＲＳＶ  Ｇタンパク質を結合する。本発明の複合体に利用される抗体は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質と宿主細胞の受容体ＣＸ３ＣＲ１との相互作用を防止し、それによりＧタンパク質またはそのＣＣＤ部分の中和抗体を誘導する能力に干渉することなく、その生物学的活性に関係する有害事象を防止する。そのような組合せは、ＣＸ３ＣＲ１受容体の活性化を遮断することが示されており（実施例４を参照のこと）、そのような複合体は、以下で説明される免疫応答の効率を増大させることができる。
【００１７】
[19]したがって一態様において、本発明は、高親和性でＲＳＶ  Ｇタンパク質に結合し、ＣＸ３ＣＲ１との相互作用を防止するｍＡｂ（またはその断片もしくは誘導体）と複合体形成したＲＳＶ  Ｇタンパク質もしくはＣＣＤを含む断片、もしくはそのホモログもしくは安定化形態またはそのいずれかのペプチド模倣体を含む免疫原およびそれを含有するワクチン組成物に関する。免疫原は、ワクチンアジュバントとともに投与されてもよい。ＣＣＤは、Ｇタンパク質の残基１３１〜２３０または１６７〜１７６のものである。この態様において効果的であるために、ｍＡｂは、１００ｐＭもしくは５０ｐＭもしくは２５ｐＭまたはより低いＫｄに関連するものと同等もしくはより高い親和性など、安定な免疫複合体の形成を支持するのに十分高い親和性を有する必要がある。
【００１８】
[20]別の態様において、本発明は、対象においてＲＳＶ感染に対する予防を提供する方法を含み、その方法は、そのような処置を必要とする対象にこれら免疫原を含む医薬または獣医組成物を投与する工程を含む。
【００１９】
[21]別の態様において、本発明は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のＣＣＤに対するｍＡｂの配列修飾を含み、その修飾は、血中半減期の延長をもたらす。この目的を実現するための技術は、米国特許第８，３１８，９０７号明細書に記載の通り以前より公知である。この様式でＧタンパク質を標的することは、ＲＳＶに対する受動免疫療法／予防に寄与し、標的に対する抗原の選択が重要である。すなわち、Ｆタンパク質に現在適用されている長半減期手法がＧタンパク質に適用されるべきか、または適用され得るかについて事前の示唆なく、ＲＳＶに対するワクチン／抗体の取り組みの圧倒的多数がＦタンパク質に焦点を合わせてきた。半減期を延長するための他の技術は、ムチンへの結合を増強させるためのアルブミン結合ドメインへの融合またはＦｃ領域の修飾を含む。
【００２０】
[22]さらに別の態様において、本発明はベクター免疫予防法（ＶＩＰ）、遺伝子導入による免疫予防法（ＩＧＴ）とも称されるまたはベクター媒介性抗体遺伝子導入法による対象の細胞内でのｍＡｂの発現を含み、その方法は、対象の細胞にｍＡｂをコードしている遺伝子を導入し、その後ｍＡｂを分泌させる工程を含む［Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｊ．Ｗ．およびＰｏｎｚｉｏ，Ｔ．Ａ．、Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｔｒａｖｅｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１７年）３：３頁］。
【００２１】
[23]別の態様において、本発明は、吸入による送達を可能にするＲＳＶ  Ｇタンパク質のＣＣＤに対するｍＡｂの製剤を含む。この目的を実現するのに適切な技術は、米国特許第９，７１８，８７５号明細書に記載されている。適切なネブライザーの総説は：［Ａｒｉ，Ａ．およびＦｉｎｋ，Ｊ．Ｂ．、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１６年）１７（１４）：１２６８〜１２７７頁］である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
[24]米国特許第８，２７３，３５４号明細書、参照により本明細書に組み込む、に開示されている高親和性で、広く中和するｍＡｂ  ３Ｄ３および２Ｂ１０によって定義されるＲＳＶ  Ｇ  ＣＣＤ上の立体配座エピトープは、らせん、ジスルフィド結合、ならびに非連続的アミノ酸間の極性および疎水的相互作用を含む。類似の結果が、Ｇ  ＣＣＤに対する追加的なｍＡｂを使用して記載されている［Ｊｏｎｅｓ  Ｈ．Ｇ．ら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ（２０１８年）１４（３）：ｅ１００６９３５］。これらの特徴は、なぜ直鎖状ＲＳＶ  Ｇエピトープペプチドが抗原として完全には効果的でなかったかについて説明し得る；例えば、組換えタンパク質ワクチン（ＢＢＧ２Ｎａ）でＧタンパク質のＣＣＤを標的する初期の試みは、健康な若年成人において中和抗体を誘導する中程度の能力しか示さなかった、また組換えＧタンパク質を使用するより最近の取り組みも高齢者において有効性を確立することができなかった［Ｒｅｚａｅｅ，Ｆ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｖｉｒｏｌ（２０１７年）２４：７０〜７８頁］。
【００２３】
[25]米国特許出願公開第２０１９／０１３５８７６号−Ａ１明細書に記載の通り、これらの立体配座的特徴は、化学架橋剤または非天然のアミノ酸の使用によって安定化させ得る［Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ（２０１３年）１９（３）：１２７〜４０頁］。有効なｍＡｂとの接触残基は、ＣＣＤのほとんどを含むが全てではない。したがって、ｍＡｂ結合に関係しない残基における突然変異は、ｍＡｂ結合に影響を及ぼすことなく免疫原とＣＸ３ＣＲ１との相互作用を防止するために突然変異されてもよく、または本発明において利用されるように、ＣＸ３ＣＲ１の結合に関与する部位を、ｍＡｂまたはその断片（上で示されるものなど）に結合させることによって覆い隠して、この受容体との相互作用を防止することができる。これは、そのような複合型免疫原について記載されている複合体の免疫原性の増強を上回る優位性である。
定義
[26]別段の規定がない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。多くの試薬を構築する詳細な方法は、本明細書の以下の実施例１において提供される。
【００２４】
[27]「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、互換的に使用され、それらは、鎖の長さに関係なく組換え方法によって合成され得るようなアミド結合によって結合される天然に存在するアミノ酸の鎖のことを指す。「ホモログ」は、類似の配列を持つが、ホモログが指示対象に対して８０％もしくは８５％もしくは９５％もしくは９９％相同であるような改変を持つペプチドまたはタンパク質である。「ペプチド模倣体」は、類似の相同性を有するが、ＤおよびＬ異性体ならびにアミド結合または他の結合、例えば、エステル、エーテル、等によって連結されるアミノ酸類似体を含めた非天然もしくは合成のアミノ酸を含む。「ペプチド模倣体」は、例えば、アプタマーを含めて、ペプチドに明らかに類似していない有機分子も含む。本明細書に定義されるように、以前の研究に基づいて、Ｇタンパク質のＣＣＤは、残基１６９〜１９８で表されるタンパク質の一部である。
【００２５】
[28]本明細書では、「対象」とは、ヒトまたは齧歯動物などＲＳＶのための研究室モデルを含めたヒト以外の動物、もしくは家畜もしくはペットのことを指す。
[29]本明細書では、「結合部分」は、抗体および下記のような選択的な非免疫グロブリン結合部分を含む。「抗体」は、従来の抗体の免疫反応性断片ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、重鎖および軽鎖の可変領域が定常領域の一部または全部を含まずに直接結合されている一本鎖抗体など免疫特異性をなお保持する抗体の様々な断片化形態を含む。軽鎖は、特異性を破壊することなしにしばしば交換可能なので、抗体の特異性を決定する重鎖可変領域で構成される抗体は、異種の軽鎖可変領域と組み合わせられてもよい。例えば、異なる種から得られる定常および可変領域を持つキメラ抗体も含まれる。分子のＦｃ部分を突然変異させてＦｃ受容体に対する結合を増強または減少させた抗体も含まれる［Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．、ＢｉｏＤｒｕｇｓ（２００９年）２３（２）：９３〜１０９頁］。
【００２６】
[30]ｍＡｂの可変領域について、周知のように、決定的なアミノ酸配列は、フレームワーク上に配置された相補性決定領域（ＣＤＲ）配列であり、そのフレームワークは、特異性に必ずしも影響を及ぼすことなくまたは許容できないレベルに親和性を低下させることなく変化させ得る。これらのＣＤＲ領域の定義は、技術者に公知の方法によって達成される。具体的には、関連するＣＤＲ領域を同定する最も一般的に使用されている方法は、Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７０年）１３２：２１１〜２５０頁および書籍のＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９８３年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、３２３頁に開示のＫａｂａｔの方法である。別の類似のおよび一般に利用される方法は、Ｃｈｏｔｈｉａ［Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７年）１９６：９０１〜９１７頁］および［Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９年）３４２：８７７〜８８３頁］の方法であり、追加的な修飾［Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ、Ｋ．Ｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８年）４５：３８３２〜３８３９頁］を含める。本明細書に記載されるｍＡｂは、これら系のいずれかまたは当業者に公知の他の認識される系によって定義されるＣＤＲ領域を含む。
【００２７】
[31]ｍＡｂの結合の特異性は、述べた通り、ほとんどの場合重鎖のＣＤＲ領域によって定義されるが、同様に軽鎖のＣＤＲ領域によって相補される（軽鎖は多少交換可能である）。したがって、本発明のｍＡｂは、重鎖の３つのＣＤＲ領域、任意選択でそれに合致する軽鎖の３つのＣＤＲ領域を含有し得る。また結合親和性は、ＣＤＲ領域がフレームワーク上に配置される様式によって決定されるので、ｍＡｂは、３つの関連するＣＤＲ領域を含有する重鎖の全可変領域、および任意選択で、問題の重鎖を相補する軽鎖に関連する３つのＣＤＲ領域を含む全軽鎖可変領域を含有してもよい。本発明のｍＡｂに好ましいＣＤＲ領域は、米国特許第８，２７３，３５４号明細書の図５Ａおよび図５Ｂに開示されている。特に、本発明のｍＡｂは、ｍＡｂ  ３Ｇ１２、３Ｄ３、２Ｂ１１または２Ｄ１０の重鎖および軽鎖可変領域、すなわち、それぞれ配列番号２および１６；配列番号４および１８；配列番号６および２０；配列番号８および２２を含み得る。
【００２８】
[32]本発明は、ｍＡｂの結合の特徴を模倣する結合部分も含む。適切なｍＡｂ模倣体には、アプタマー［Ｙｕ，Ｙ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ（２０１６年）１７（３）：３５８頁］およびラクダ科動物などの抗体のタンパク質模倣体またはその断片（選択的足場）、アンチカリン、アンキリン反復タンパク質［Ａｚｈａｒ  Ａ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ（２０１７年）１０２：６３０〜６４１頁］がある。
【００２９】
[33]能動的免疫化の代替手段は、予防的または治療的のいずれかの受動的免疫療法としてｍＡｂを与えることである。予防の場合、現在臨床開発中の抗Ｆタンパク質ｍＡｂ（米国特許第７，３２３，１７２号明細書）について記載されているようにｍＡｂのＦｃ領域を修飾して、血中半減期を延長することが有用である。治療的使用の場合、インフルエンザに対するｍＡｂ（米国特許第９，７１８，８７５号明細書）について記載されているように、吸入製剤が有用である。
組換え態様
[34]抗体またはその抗原結合断片を含む本発明のあらゆるタンパク質もしくはペプチドは、公知の技術を使用して組換えにより産生され得る。本発明は、それらをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子、およびこれらのヌクレオチド配列を含むベクターまたは発現系、これらヌクレオチド配列を発現させるための発現系またはベクターを含有する細胞、ならびにこれら細胞を培養することによってペプチドを産生し、産生された結合部分を回収する方法も含む。原核生物、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞および植物細胞を含めて、組換え方法で一般に使用されるあらゆる型の細胞が利用され得る。関連するペプチドをコードする１つまたは複数の組換え分子で形質転換されたヒト細胞（例えば、筋細胞またはリンパ球）も含まれる。
ＣＸ３Ｃケモカインモチーフに基づく活性
[35]可変的な全体のＲＳＶ  Ｇ（２９８残基）は、高度に保存されておりグリコシル化がないおよそ４０アミノ酸の中央保存ドメイン（ＣＣＤ）を含有するが；タンパク質のこの部分は、ウイルス感染とウイルス病原性の両方において鍵となる役割を果たすことが示されてきた。特に、ＲＳＶ  Ｇ  ＣＣＤは、ヒトケモカイン受容体ＣＸ３ＣＲ１への結合を容易にしてヒト気道上皮細胞におけるＲＳＶ感染を促進するＣＸ３Ｃケモカインのモチーフを含有し、ＣＸ３ＣＲ１＋免疫細胞の輸送に影響を及ぼし、その結果気道うっ血をもたらすシグナル伝達をモジュレートする［Ｔｒｉｐｐ，Ｒ．Ａ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２０１８年）９２：ｅ０１３０２〜１７頁］。
【００３０】
[36]ＣＸ３Ｃモチーフおよびその２つのジスルフィド結合の存在を除いて、ＲＳＶ  Ｇと、ＣＸ３ＣＲ１に対する唯一の公知のリガンドであるフラクタルキン／ＣＸ３ＣＬ１との間に構造または配列類似性は全くない。類似の機能にもかかわらずこの構造的な相違は、ウイルス−宿主相互作用を選択的に遮断する療法、ＨＩＶ共受容体ＣＣＲ５のアンタゴニストを導く戦略を開発する機会を提供する［Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ｂｌｕｍ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２００８年）３０：１２２８〜１２５０頁］。
【００３１】
[37]ＲＳＶ  Ｇタンパク質ＣＣＤまたはそのペプチド模倣体の安定化形態およびその空間的に抑制された形態の親和性は、実施例２に記載のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、または当業者に公知の代わりの多くの方法のうちの１つを使用して試験され得る。有効な抗体の誘導に関するアッセイは、本明細書の下の実施例３に述べられるアッセイまたはワクチンの当業者に周知の他の適切な試験を使用して試験され得る。ＣＸ３Ｃ受容体を活性化または阻害する能力は、例えば、本明細書の下の実施例４に述べられる走化性アッセイまたはＣＸ３ＣＲ１に対する内在性リガンド（フラクタルキン）の変異体の研究において走化性と良い相関を示したカルシウム流出アッセイなど他の任意の適切な方法を使用して判定され得る［Ｄｏｒｇｈａｍ，Ｋ．ら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ（２００９年）８６（４）：９０３〜１１頁］。
免疫原
[38]Ｇタンパク質免疫原の最適化には３つの設計目標がある。
【００３２】
[39]第１に、Ｇタンパク質の薬理活性は、ＲＳＶ感染において有害であり、したがって、前述の免疫原構造の修飾または本明細書に開示されるその部位の遮蔽のいずれかによって免疫原におけるその活性を最小化することが好ましい。
【００３３】
[40]第２に、ウイルス感染した細胞によって産生される有害な可溶性Ｇタンパク質を中和するには高親和性抗体が必要であり、したがって、免疫原によって生成される抗体は、これらの特性を好ましくは有する。本発明の方法は、天然の構造に対する改変を最小化することによってこの目標を達成する可能性を最大化する。過剰なｍＡｂは、免疫複合体の形成を妨げ、したがって免疫原としてのｍＡｂ−抗原複合体の有効性を減少させるので、免疫原複合体におけるｍＡｂ対抗原比の最適化も有用である［Ｍａｎｃａ，Ｆ．ら、Ｊ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９１年）１７３（１）：３７〜４８頁］。
【００３４】
[41]第３に、ＲＳＶは、ワクチンの送達のための冷却供給連鎖がない国々を含めた世界的に重要な病原体なので、室温（またはそれ以上）での輸送および貯蔵を可能にする免疫原の安定化も望ましい。他のワクチンにおいて効果的である生ウイルスのホルマリン不活化は、初期のそのようなワクチンが、その後の天然の感染に対して疾患の増悪を引き起こしたので、ＲＳＶには許容できない［Ｋｉｍ，Ｈ．Ｗ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ（１９６９年）８９：４２２〜３４頁］。
【００３５】
[42]この第３の態様に関して、抗体−抗原の高解像度構造データに基づいて選択された突然変異を使用する構造の安定化によって達成された立体配座の安定性は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に示されたように、免疫した対象全体に親ウイルスより高い力価をより均一にもたらし得る［ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３年）３４０（６１３６）：１１１３〜１１１７頁］。天然のＧタンパク質ＣＣＤは、免疫原性が十分でなく、したがって免疫原性を改善する修飾が重要である。Ｇタンパク質ＣＣＤは、合成または組換えによって作ることができるので、当技術分野において周知の方法を使用してこのペプチドを系統的に突然変異させ得る。多数のそのようなバリアントの評価を容易にするには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが必要である。文献において公知の熱安定性アッセイには、タンパク質の展開として露出される疎水性部位に結合した際の色素の蛍光の増大の観察［Ｂｉｇｇａｒ，Ｋ．Ｋ、ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２０１２年）５３：２３１〜２３８頁］および円偏光二色性による二次構造特質の観察［Ｋｅｌｌｙ，Ｓ．Ｍ．およびＰｒｉｃｅ，Ｎ．Ｃ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９９７年）１３３８（２）：１６１〜１８５頁］がある。
【００３６】
[43]冷凍を必要とする不都合に加えて、免疫原として柔軟なペプチドを使用することは、折り畳まれたタンパク質において立体配座エピトープに弱く結合する（≧マイクロモルＫｄ）抗体をしばしば誘発する。その理由のため、立体配座的に制限されている合成エピトープ模倣体が、免疫原設計において特定の目的となるものであり、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、その他を解決する取り組みを含めた例がある［Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ（２０１３年）１９（３）：１２７〜４０頁］。
【００３７】
[44]非天然のモチーフを組み込んだペプチドは、タンパク質分解性分解にしばしば非常に抵抗性であり、そのことは、模倣自体とは関係なく有利な特徴である。小分子（「ハプテン」）の不都合は、それ自体しばしば免疫原性でないことであり；しかしながら、ウイルス様粒子に埋め込まれた免疫系に存在する場合、ハプテンは効果的な免疫原になり得る［Ｂｕｏｎａｇｕｒｏ，Ｌ．ら、Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１１年）１０：１５６９〜１５８３頁］。
【００３８】
[45]特に、ＲＳＶのＦタンパク質が、そのような模倣に供されてきた。この例において、２つの「要素」（架橋）が、効果的な模倣体を創出するために必要とされ、その模倣体はｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨｅｐ−２細胞におけるＲＳＶ感染の競合阻害に対してナノモルの効力を示した［Ｇａｉｌｌａｒｄ，Ｖ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２０１７年）６１（４）ｐｉｉ：ｅ０２２４１〜１６頁］。
ｍＡｂ投薬の延長
[46]なお、本発明の別の態様は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質に対して作られた抗体を修飾して対象内での効果的な存続期間の期間の延長を実現する、または存続期間がアルブミンへのコンジュゲーションによって延長される、または抗体もしくは抗原結合部分が対象の細胞内で発現される受動的ワクチンを提供することである。
【００３９】
[47]ＲＳＶは季節性ウイルスであり、典型的な季節は、米国において１０月から４月まで続く。その期間にわたって５歳未満の子供の間で２，１００，０００人の外来患者が来診し、５７，５２７人が入院する［Ｈａｌｌ，Ｃ．Ｂ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．（２００９年）３６０（６）：５８８〜９８頁］。６５歳以上の成人の場合、１７７，０００人が入院し、１４，０００人が死亡する［Ｆａｌｓｅｙ，Ａ．Ｒ．ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．（２００５年）３５２（１７）：１７４９〜５９頁］。季節を通じて保護を提供するために半減期を延長したＲＳＶに対する抗体の優位性は、したがって本分野においてよく認識されている。
【００４０】
[48]一実施形態において、ｍＡｂのＦｃ領域を修飾して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのＩｇＧ１のＦｃ領域の結合を増強させる。ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対するＦｃ修飾ｍＡｂ（ＭＥＤＩ８８９７）は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）と共同でＳａｎｏｆｉによって臨床開発中である（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２２９０３４０）。このｍＡｂは、ＲＳＶを標的する唯一承認されているｍＡｂ（パリビズマブ）と比較してｉｎ  ｖｉｔｒｏで１００倍より高い効力を有する。ｍＡｂは、Ｆｃ領域内の３つのアミノ酸（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ［ＹＴＥ］）置換によって操作されている［Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｍ．Ｐ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２０１７年）６１（３）：ｅ０１７１４〜１６頁］。ＹＴＥ置換は、リソソームの酸性条件下（ｐＨ６．０）でＦｃＲｎに対するＩｇＧ１の結合を増強させる。これは、分解を防止し、細胞の表面への再循環を増大させ、それにより抗体の血中半減期を延ばす。より高い効力とより長い半減期の組合せにより、単回用量が３〜４ヵ月間中和活性を発揮することが可能になる。先の例が、半減期が延長されたｍＡｂの実用性の予想を支持する一方で、乳児におけるＲＳＶの天然の履歴は、感染約２週間後にウイルス量の反跳を含み（２〜３ｌｏｇ）、これは乳児の約１／３に起こる［Ｂｒｉｎｔ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ（２０１７年）８２（５）：８７２〜８８０頁］。この結果は、ウイルスに対する初期の天然の抗体応答からのエスケープを反映していると考えられる。したがって、半減期を延長したｍＡｂを最大限効果的にするには、ウイルス構造上の機能的に決定的な部位を標的することが必要である。ＲＳＶ  Ｇタンパク質、特にＧタンパク質のＣＣＤを標的する抗体は、Ｆタンパク質を標的する抗体よりはるかによくこの基準を満たす。したがって、３Ｇ１２、３Ｄ３、２Ｂ１１および２Ｄ１０など、ＹＴＥ置換を本発明のｍＡｂに適用してウイルスのより効果的な中和を提供する。
【００４１】
[49]別の実施形態において、ｍＡｂのＦｃ領域を修飾して、粘液成分に結合させる。これは、吸入製剤に対して特定の実用性のあるものである［Ｗｅｓｓｌｅｒ，Ｔ．ら、ＡＣＳ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０１６年）２（１）：８２〜９２頁］。ｍＡｂまたはその断片の半減期を延長させる別の選択肢は、アルブミン結合ドメインに配列を融合またはコンジュゲートすることである［Ｍａｌｍ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．（２０１４年）９（９）：１２１５〜２２頁］。
【００４２】
[50]さらに別の選択肢において、ｍＡｂまたは抗原結合部分は、事前に特徴付けられた中和抗体をコードしている遺伝子が対象の細胞内へベクター化され、その遺伝子によってコードされるモノクローナル抗体を次いで分泌させる過程であるベクター免疫予防法によって対象の細胞内で発現される。本技術は動物において効果的であることが証明されており、ヒトにおいてＨＩＶに対する保護を延長するかについて審議中である［Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｊ．Ｗ．およびＰｏｎｚｉｏ，Ｔ．Ａ．、Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｔｒａｖｅｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１７年）３：３頁］。
【００４３】
[51]一実施において、血清型８（抗体応答の発生率が低い）の自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）を含むベクターは、腓腹筋の１回の注射による投与後に、ＣＭＶプロモーターから駆動される全長ヒト抗体の長命の発現を支持した。１週間以内に、抗体遺伝子の発現は検出可能になり、１２〜１６週間後に最大レベルを達成し、その後安定化前に１／２〜１／３に減少し、６４週間の研究の継続期間中＞５０μｇ／ｍＬ  ｍＡｂであった。この系を使用して広く中和するＨＩＶ抗体を発現させた場合、マウスは、ＩＶと腟内曝露経路両方によって反復性ＨＩＶ感染から少なくとも１５週間保護された［Ｂａｌａｚｓ，Ａ．Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１２年）４８１（７３７９）：８１〜８４頁；Ｂａｌａｚｓ，Ａ．Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１４年）２０（３）：２９６〜３００頁］。
【００４４】
[52]別の実施において、抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子をコードしているプラスミドが、ヒアルロニダーゼで前処理して細胞へのプラスミドの接近を改善したマウスの筋肉内にエレクトロポレーションによって導入された［Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１８年）６（３）：３５頁］。プラスミドベクターは、ＡＡＶより安全であると考えられ、調製が容易であり、貯蔵の間、安定である。さらに、プラスミドＤＮＡは、それ自体に対する免疫応答を誘導しない。マウスにおいてこの手段によって誘導された、インフルエンザＨＡタンパク質に対する抗体は、抗体遺伝子導入後少なくとも７０日間、血清中で＞１０μｇ／ｍＬの抗体を産生し、ワクチン接種から誘導されたＨＡ特異的ＩｇＧ抗体のレベル（１〜３μｇ／ｍＬ）より有意に高かった。
吸入製剤
[53]ＲＳＶ用として唯一承認されている抗ウイルス薬、リバビリンは、その毒性および弱い有効性のためまれにしか使用されない［Ｓｉｍｏｅｓ，Ｅ．Ａ．Ｆ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｔｈｅｒ．（２０１８年）７（１）：８７〜１２０頁］。したがって、乳児および高齢者の両方において機械的人工換気を特に含む緩和ケアが、重篤なＲＳＶ疾患を管理するのに一般的な技術である。抗ウイルス抗体を吸入送達による処置に組み込むことは、したがって標準的な医療と適合する。市販されているメッシュ式ネブライザーは、肺全体の分布に適当なサイズ範囲（直径低マイクロメーター）で抗体を含有する液滴を生成するのに適している［Ｒｅｓｐａｕｄ，Ｒ．ら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１６年）２３４：２１〜３２頁］。乳児と比較して成人には＞１０倍高い全身用量が必要とされるため、全身に送達される抗体と比較して同程度の有効性のための用量が減少することは、高齢者を処置するのに特に有利である。
【００４５】
[54]ＣＸ３ＣＲ１に対するＲＳＶ  Ｇタンパク質ＣＣＤの結合は、ヒト気道上皮細胞における感染の有力な経路として確立されてきた［Ｊｅｏｎｇ，Ｋ．Ｉ．ら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１５年）１０：ｅ０１３０５１７；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．ら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ（２０１５年）１１：ｅ１００５３１］。したがって、気道へのｍＡｂの送達は、感染した細胞の頂端面から気道内に排出されたウイルスの直接中和を提供することになる［Ｖｉｌｌｅｎａｖｅ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２０１２年）１０９：５０４０〜５０４５頁；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐ．Ｆ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２００５年）７９：８６５１〜８６５４頁；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２００２年）７６：５６５４〜５６６６頁］。それに対し、全身に送達される抗体は、細胞の基底側を攻撃し、したがってウイルスの中和にあまり効果的でない。ＲＳＶ  Ｆタンパク質を標的する吸入抗体模倣体（ラクダ科動物抗体から得られる「ナノボディ」）が、臨床的に試験されている［Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｊ．ら、Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２０１６年）３５：２１３〜２２１頁］。完全なＩｇＧのより長い半減期は、この先例と比較して有利である。
【００４６】
[55]Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｉｄａｌ  Ｂｒｅａｔｈｉｎｇに関するＵＳ／ＥＵ  Ｐｈａｒｍ第１６０１章は、送達される用量を適格にするための規制手引きを提供する［ＵＳＰ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ３６（２）：５３４頁］。販売されているネブライザー、Ａｅｒｏｇｅｎ，Ｌｔｄ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）製ＡｅｒｏＮｅｂ−Ｓｏｌｏ（登録商標）デバイスは、高効率振動メッシュを使用してエアロゾルを生成する。１５０ＭＨｚで振動素子に印加された圧電エネルギーは、メッシュ内の１０００個の微小な漏斗形開口部それぞれの振動を生じさせてマイクロポンプとして働き、穴を通して液体を吸い込み、肺への標的化薬物送達に最適化された低速エアロゾルを生成する。低速は、タンパク質を変性させる可能性がある剪断力を最小化し、この系を抗体治療法の送達に特に有用にする。本デバイスは、加圧定量吸入器（喘息処置用として典型的である）などの標準的な小容量ネブライザーより９倍多いエアロゾル用量を一般に送達する。エアロゾル粒子サイズは、カスケードインパクター（Ｉｎ−Ｔｏｘ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＬＬＣ、Ｍｏｒｉａｒｉｔｙ、ＮＭ）を使用して測定される。この系を使用して、空気動力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）  ２．１７μｍおよび幾何標準偏差（ＧＳＤ）  ２．２４μｍを持つ抗体のエアロゾルを作製した。
【００４７】
[56]第２世代のＡｅｒｏｇｅｎ製品は、人工呼吸器を必要とする患者を処置するために特別に設計されている。このＰｈｏｔｏ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ａｐｅｒｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（ＰＤＡＰ）デバイスは、使いやすさおよび平均粒子サイズのより厳密な制御を達成することにより第１世代製品に勝るさらなる用量減少の有意な改善を提供する。あまり大きいエアロゾル液滴は、肺に深く入りこまないが、液滴があまりに小さいと、液滴は定着せずに単純に排気されるので、これは重要なことである。ＰＤＡＰデバイスにより、ネブライザーを患者の呼吸と同期させることも可能になる。呼吸周期の吸気相の間にのみエアロゾルを生成することにより、肺に沈着される薬物の割合が実質的に改善される。
適用
[57]本発明は、活性成分として本発明の結合部分、変異体または他のペプチドもしくはペプチド模倣体を含む医薬および獣医学組成物も対象とする。組成物は、緩衝剤および他の単純な賦形剤など適切な生理的に適合する賦形剤を含有する。組成物は、追加的な活性成分、特に免疫原の場合、ワクチンアジュバントとして免疫系刺激剤も含み得る。医薬または獣医学組成物は、米国特許第９，７１８，８７５号明細書に記載のｍＡｂの鼻腔内または吸入送達のための製剤を含めて、他の製剤賦形剤も含有し得る。
【００４８】
[58]免疫原は、妊婦、乳児、高齢者または免疫不全の対象などのヒト対象を含めた対象に免疫原を含有する製剤を投与する工程を含むＲＳＶに対する免疫応答を生成する方法に利用される。他の動物種におけるＲＳＶに関連する感染も、本発明の免疫原または結合部分によって予防的に処置され得る。
【００４９】
実施例１
タンパク質の産生
Ａ．Ｆａｂ  ３Ｄ３およびｓｃＦｖ  ２Ｄ１０の産生
[59]組換えｍＡｂ  ３Ｄ３および２Ｄ１０を、ＣＨＯ細胞における一過性トランスフェクションおよび固定化したプロテインＡによる精製によって産生した。
【００５０】
[60]３Ｄ３のＦａｂ断片を、固定化したパパインとのインキュベーションによって、組換えにより作製した３Ｄ３から生成し、続いて固定化したプロテインＡによりＦｃ断片を除去した。Ｆａｂ  ３Ｄ３を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって次いで精製した。
【００５１】
[61]組換えｓｃＦｖ  ２Ｄ１０の場合、キイロショウジョウバエ用としてコドンを最適化した２Ｄ１０重鎖可変領域、（ＧＧＧＧＳ）３ＧＧＧリンカー、および２Ｄ１０軽鎖可変領域をコードしている合成遺伝子を、Ｎ末端ＢｉＰシグナル配列およびＣ末端トロンビン切断部位、それに続くＴｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ精製タグと共にインフレームでｐＭＴ−ｐｕｒｏにクローニングした。得られたｓｃＦｖ  ２Ｄ１０発現プラスミドを使用して、安定にトランスフェクトされたシュナイダー２（Ｓ２）昆虫細胞を得た。分泌されたｓｃＦｖ  ２Ｄ１０を、ＳｔｒｅｐＴｒａｐカラムで親和性精製し、トロンビンプロテアーゼで消化して精製タグを除去し、次いで１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
Ｂ．エピトープの産生
[62]ＲＳＶ  Ｇ細胞外ドメイン（Ｇ［ｅｃｔｏ］Ｐ０３４２３）をコードしている合成遺伝子を、Ｎ末端ＴＰＡシグナル配列およびＣ末端直列６−ヒスチジンならびにＴｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ精製タグと共にインフレームでｐＣＦにクローニングした。Ｇ［ｅｃｔｏ］を、ＣＨＯ細胞における一過性トランスフェクションによって作製し、分泌されたＧ［ｅｃｔｏ］を、ＳｔｒｅｐＴｒａｐカラムで親和性精製した。
【００５２】
[63]Ｃ末端６−ヒスチジン精製タグを持つＲＳＶ  Ｇ残基１６１〜１９７（Ｇ［１６１〜１９７］）をコードしている大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）用にコドン最適化した合成遺伝子をｐＥＴ５２ｂにクローニングした。ペプチドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で、１８℃で終夜発現させた。細胞を、２μＭ  ＭｇＣｌ２、ベンゾナーゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２５ｍＭイミダゾール（緩衝液Ａ）中で超音波処理によって次いで溶解させた。ＲＳＶ  Ｇ［１６１〜１９７］を、ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ親和性クロマトグラフィーによって可溶性溶解物から精製し、緩衝液Ｂ（５００ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液Ａ）中に勾配で溶出した。類似の方法を使用して、関連ペプチド（Ｇ［１６２〜１７２］およびＧ［１６９〜１９８］）を作製した。
【００５３】
実施例２
ＥＬＩＳＡアッセイ
[64]５μｇ／ｍＬ（総量１５０μＬ）の濃度で精製したｍＡｂを、９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート中で、室温で終夜インキュベートする。次いでプレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄する。ウェルにＰＢＳ中の５％  ＢＳＡ  １５０μＬを添加し、室温で１時間インキュベートすることによってブロッキングし、続いてＰＢＳＴで３回洗浄する。ＰＢＳ中の１％  ＢＳＡ中の５μｇ／ｍＬ組換えＲＳＶ  Ｇ［ｅｃｔｏ］または２０μｇ／ｍＬ  ＲＳＶ  Ｇ［１６１〜１９７］を、ＰＢＳ中の１％  ＢＳＡを用いて１：３に段階希釈する。ウェルを、ＲＳＶ  Ｇタンパク質１５０μＬと室温で１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでＰＢＳ中の１％  ＢＳＡに１：５０００希釈したＨＲＰ−コンジュゲート−ＨｉｓＰｒｏｂｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）  １５０μＬと室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、０．０５Ｍリン酸−クエン酸緩衝液ｐＨ５．０および１．５％過酸化水素中のペルオキシダーゼ基質ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）を添加することにより室温で１０分間現像する。反応を２Ｎ硫酸と室温で１０分間インキュベーションすることによって停止させ、吸光度を４９０ｎｍで測定する。ＥＬＩＳＡ実験を、生物学的に３回複製して実行する。
【００５４】
実施例３
免疫原の有効性の試験
[65]有効性は、ＲＳＶ  Ｇまたはその断片、Ｇタンパク質とＣＸ３ＣＲ１の相互作用を遮断する抗Ｇ  ｍＡｂ、および標準的なワクチンアジュバントを含むワクチンでマウスを注射することによって評価され得；別法として、投与は、鼻腔内経路によることもできる［Ｋｒｕｉｊｓｅｎ，Ｄ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２０１３年）８７（１３）：７５５０〜５７頁］。免疫化の適切な時間後に、マウスにＲＳＶの毒性株を接種し、罹病率および死亡率について観察する。本発明の組成物は、対象マウスの保護をもたらす。本発明の免疫原を、以下の基準を使用してマウスモデルにおいて評価する。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
実施例４
走化性アッセイ
[66]ＣＸ３ＣＲ１のＲＳＶ  Ｇモジュレーションのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞の受容体媒介性走化性を測定する［Ｔｒｉｐｐ，Ｒ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１年）２：７３２〜７３８頁］。このアッセイにおいて、組換えＲＳＶ  Ｇ［１６１〜１９７］は、ＲＳＶ  Ｇ細胞外ドメイン全体と同等のレベルで走化性を誘導し、活性は、抗ＣＸ３ＣＲ１ポリクローナル血清によって得られたそれと同程度のレベルで３Ｄ３または２Ｄ１０とのプレインキュベーションによって遮断された。表２はこの分析の結果を提供し、Ｇ  ＣＣＤペプチドに結合する高親和性ｍＡｂによる生物学的活性の阻害を示している。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
[67]より詳細には、アッセイは、８μｍの細孔径を持つトランスウエルインサートプレートを使用して実行された。２回洗浄し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した対数期のＴＨＰ−１細胞（ヒト白血病単球細胞株）およそ２，０００，０００個を、インサートプレートの上部チャンバーに添加した。陰性対照は、２５ｎＭ  ｍＡｂを含有する無血清培地を下のチャンバーに添加した無血清培地単独であった。陽性対照として、１０％  ＦＢＳを含有する培地を、下のチャンバーに添加した。ＲＳＶ  Ｇ［ｅｃｔｏ］またはＲＳＶ  Ｇ［１６１〜１９７］試料を、無血清培地中に終濃度５ｎＭで下のチャンバーに添加した。ＲＳＶ  Ｇ［１６１〜１９７］およびｍＡｂを含む試料の場合、ＲＳＶ  Ｇ［１６１〜１９７］を、５倍過剰のｍＡｂ（モル基準による）と室温で２０分間プレインキュベートし、次いで終濃度５ｎＭ  ＲＳＶ  Ｇ［１６１〜１９７］および２５ｎＭ  ｍＡｂになるように下のチャンバーの無血清培地に添加した。抗ＣＸ３ＣＲ１抗体を含む試料の場合、１ｍｇ／ｍＬ抗ＣＸ３ＣＲ１ウサギポリクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．  カタログ番号ＰＡ５−１９９１０）２μＬを、ウェル内に置く前に上部チャンバーにおいてＴＨＰ−１細胞と３０分間インキュベートした。組み立てたプレートを、ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で５時間インキュベートした。下のチャンバーに遊走した細胞を計数し、走化性指数を、無血清培地単独の方への細胞遊走に対する化学誘引物質の方への細胞遊走の倍数増大を比較することによって決定した。実験は、少なくとも４つの生物学的複製で実行された。
【配列表】
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【国際調査報告】
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