(57)【要約】エンドウ豆タンパク質加水分解物を調製する組成物及び方法は、エンドウ豆タンパク質組成物を取得することと、真菌のプロテアーゼを当該エンドウ豆タンパク質組成物に添加することと、エンドウ豆タンパク質加水分解物を取得するために当該エンドウ豆タンパク質組成物を約４％以上の加水分解度に加水分解することとを含む。一例では、加水分解度は、約５〜約７．５の範囲のｐＨかつ約３０℃〜約６０℃の範囲の温度で約４％〜約２５％の範囲であり得る。得られるエンドウ豆タンパク質加水分解物は、ｐＨ３．４での少なくとも３０％の溶解性、ｐＨ３．４での少なくとも６５ｃＰの粘性、約中性ｐＨでの少なくとも１１５秒の分散性、及びｐＨ３．４での少なくとも１．５ＴＳＩ  Ｇｌｏｂａｌの懸垂性を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドウ豆タンパク質加水分解物を調製する方法であって、
エンドウ豆タンパク質組成物を取得することと、
酵素を、約０．０５：１００〜約５：１００のエンドウ豆タンパク質に対する酵素の重量比で前記エンドウ豆タンパク質組成物に添加することと、
約４％〜約２５％の範囲の加水分解度を有するエンドウ豆タンパク質加水分解物を取得するために、約５〜約７．５の範囲のｐＨかつ約３０℃〜約６０℃の範囲の温度で前記エンドウ豆タンパク質組成物を加水分解することと、を含み、
前記エンドウ豆タンパク質加水分解物が、ｐＨ３．４で少なくとも３０％の溶解性、ｐＨ３．４で少なくとも６５の粘性、約中性ｐＨで少なくとも１１５の分散性、及び／またはｐＨ３．４で少なくとも１．５の懸垂性を有する、前記方法。
【請求項２】
前記エンドウ豆タンパク質組成物が、天然エンドウ豆タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エンドウ豆タンパク質組成物が、修飾されたエンドウ豆タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記比が、約０．５：１００〜約５：１００の酵素対エンドウ豆タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記比が、約１：１００の酵素対エンドウ豆タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記エンドウ豆タンパク質組成物が、少なくとも８０重量％のエンドウ豆タンパク質を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記加水分解度が、約４％〜約２５％の範囲である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記加水分解度が、約６％〜約１０％の範囲である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記加水分解度が、約１６％〜約２５％の範囲である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記エンドウ豆タンパク質加水分解物が、ｐＨ３．４で少なくとも５５％の溶解性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記エンドウ豆タンパク質加水分解物が、ｐＨ３．４で少なくとも６０％の溶解性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記エンドウ豆タンパク質加水分解物が、ｐＨ３．４で少なくとも６５％の溶解性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素がプロテアーゼであり、選択される真菌種がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が、２００アゾカゼイン分解ユニット、５３カゼイン由来Ａ２８０放出ユニット、１７カゼイン由来αアミン放出ユニット、０．５４グリシン−ニトロアニリド加水分解ユニット、１０，４００ロイシン−ニトロアニリド加水分解ユニット、１２８０リジン−ニトロアニリド加水分解ユニット、９１メチオニン−ニトロアニリド加水分解ユニット、２．３ベンゾイル−アルギニン−ニトロアニリド加水分解ユニット、または３６ベンゾイル−チロシン−ニトロアニリド加水分解ユニットで表される活性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
加水分解温度が、約４０℃と約５０℃との間である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
加水分解ｐＨが、約５．５と約６．５との間である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記エンドウ豆タンパク質組成物を加水分解する時間が、約３０分と約７０分との間である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ｐＨ３．４での少なくとも３０％の溶解性、ｐＨ３．４での少なくとも６５の粘性、約中性ｐＨでの少なくとも１１５の分散性、及び／またはｐＨ３．４での少なくとも１．５の懸垂性を含むエンドウ豆タンパク質加水分解物。
【請求項１９】
前記溶解性が、ｐＨ３．４で少なくとも６０％である、請求項１８に記載のエンドウ豆タンパク質加水分解物。
【請求項２０】
前記溶解性が、ｐＨ３．４で約５０％〜約７０％の範囲である、請求項１８に記載のエンドウ豆タンパク質加水分解物。
【請求項２１】
少なくとも８０重量％のタンパク質を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のエンドウ豆タンパク質加水分解物。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のエンドウ豆タンパク質加水分解物の飲料における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、食品に使用するためのエンドウ豆タンパク質の分野に関する。より詳細には、本出願は、高溶解性を有するエンドウ豆タンパク質加水分解物、それを調製する方法、及びそれを含有する飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドウ豆は、デンプン、タンパク質、及び粗繊維の豊富な高品質の栄養食品である。エンドウ豆タンパク質は、リジンが豊富であり、更に人体に必要な種々の必須アミノ酸を含む栄養バランスの取れた植物性タンパク質である。エンドウ豆タンパク質は、健康製品における使用及び食品または飲料における添加剤としての使用に好適である。エンドウ豆タンパク質は、一部の消費者、特にビーガンを含むベジタリアンにとって魅力的なタンパク質源であり得る。
【０００３】
健康製品、食品、及び飲料に使用するためのエンドウ豆タンパク質に対する関心の高まりにもかかわらず、エンドウ豆タンパク質製品は、エンドウ豆タンパク質の溶解性及び風味の点で課題に直面し続けている。このため、特に食品及び飲料におけるエンドウ豆タンパク質の市場での受け入れ度は、比較的低いままである。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の発明者らは、とりわけ、改善された溶解性ならびに好ましい味及び質感を有するエンドウ豆タンパク質加水分解物の様々な飲料適用における使用への可能性を認める。
【０００５】
本出願による例は、エンドウ豆タンパク質加水分解物を調製する方法を含み得る。本方法は、エンドウ豆タンパク質組成物（すなわち出発材料）を取得することと、酵素、好ましい態様では真菌酵素、より好ましい態様ではＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅに由来する真菌酵素を約０．５：１００〜約１．５：１００のエンドウ豆タンパク質に対する真菌酵素の重量比でエンドウ豆タンパク質組成物に添加することと、約５〜約７．５の範囲のｐＨにて、かつ約３０℃〜約６０℃の範囲の温度にて、約４％〜約２５％の範囲の加水分解の程度までエンドウ豆タンパク質組成物を加水分解し、エンドウ豆タンパク質加水分解物を取得することと、を含み得る。得られるエンドウ豆タンパク質加水分解物は、約ｐＨ３．４または７での少なくとも５０％の溶解性を有し得る。エンドウ豆タンパク質組成物（加水分解を受ける出発材料）は、エンドウ豆タンパク質濃縮物または単離物であり得る。
【０００６】
一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物の得られる溶解性は、ｐＨ約３．４または約７での少なくとも５５％であり得る。一例では、得られる溶解性は、ｐＨ約３．４または約７での少なくとも６０％であり得る。一例では、得られる溶解性は、ｐＨ約３．４または約７での少なくとも６５％であり得る。一例では、得られる溶解性は、ｐＨ約３．４または７で約５０％と約７０％との間の範囲であり得る。
【０００７】
一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物の加水分解度は、約４％〜約２５％の範囲であり得る。一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物の加水分解度は、約６％〜約２０％の範囲であり得る。一例では、加水分解度は、約８％〜約１８％の範囲であり得る。一例では、加水分解度は、約４％〜約１０％の範囲であり得る。一例では、加水分解度は、約１６％〜約２５％の範囲であり得る。一例では、加水分解度は、約８％であり得る。一例では、加水分解度は、約１８％であり得る。
【０００８】
一例では、エンドウ豆タンパク質組成物の加水分解は、約４０摂氏度と約５０の摂氏度との間の温度で実行され得る。一例では、エンドウ豆タンパク質組成物の加水分解は、約５．５と約６．５との間の範囲のｐＨで実行され得る。一例では、エンドウ豆タンパク質組成物を加水分解する時間は、約３０分と約７０分との間である。
【０００９】
一例では、酵素のエンドウ豆タンパク質に対する比は、約１：１００である。一例では、酵素はプロテアーゼであり、選択される真菌種はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅである。
【００１０】
一例では、出発材料／エンドウ豆タンパク質組成物は、天然エンドウ豆タンパク質及び修飾されたエンドウ豆タンパク質のうちの少なくとも１つを含み得る。出発材料／エンドウ豆タンパク質組成物は、１００％エンドウ豆タンパク質でなくてもよいことが理解されよう。一例では、エンドウ豆タンパク質組成物は、少なくとも８０重量パーセントのエンドウ豆タンパク質を含み得る。
【００１１】
本出願による例は、ｐＨ約３．４または約７での少なくとも３０％の溶解性を含むエンドウ豆タンパク質加水分解物を含み得る。一例では、溶解性は、ｐＨ約３．４または約７での少なくとも４０％であり得る。一例では、溶解性は、ｐＨ約３．４または約７での少なくとも５０％であり得る。一例では、溶解性は、ｐＨ約３．４または約７での少なくとも６０％であり得る。一例では、溶解性は、ｐＨ約３．４または約７で約５０％と約７０％との間の範囲であり得る。一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物は、少なくとも８０重量パーセントのタンパク質であり得る。
【００１２】
本出願による例は、ｐＨ約３．４または７での少なくとも６５センチポアズの粘性を含むエンドウ豆タンパク質加水分解物を含み得る。本出願による例は、約中性ｐＨでの少なくとも１１５秒の分散性を含むエンドウ豆タンパク質加水分解物を含み得る。本発明による例は、ｐＨ約３．４または７での少なくとも１．５ＴＳＩ  Ｇｌｏｂａｌを含む懸垂性を含むエンドウ豆タンパク質加水分解物を含み得る。
【００１３】
本出願による例は、飲料における上記のエンドウ豆タンパク質加水分解物の使用を含み得る。一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物を含有する飲料は、当該飲料の少なくとも４５重量パーセントが水である水性飲料であり得る。一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物は、上記飲料の少なくとも５重量パーセントを構成し得る。一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物を含有する飲料は、約１５分間の撹拌後に粘性が室温または周囲条件で測定される場合に、約１００センチポアズ〜約１６５センチポアズの範囲の粘性を有し得る。エンドウ豆タンパク質加水分解物を含有する飲料は、かかる粘性測定前に冷蔵庫に貯蔵され得るため、飲料は、約１９０°Ｆに約９０秒間加熱することを含み得る高温短時間処理を粘性測定の前に受け得る。一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物を含有する飲料の粘性は、直上に記載の条件下で測定される場合に約１００センチポアズ〜約２００センチポアズの範囲であり得る。
【００１４】
飲料配合物において使用される場合、本明細書に記載のエンドウ豆タンパク質加水分解物は、好ましい風味、質感、及び総合的な味を有する飲料を依然として提供すると同時に、ベジタリアン（ビーガンを含む）の食事に適合するタンパク質源を提供し得る。飲料は、低粘性を有し得、飲料の典型的な貯蔵寿命にわたって安定であり得る。
【００１５】
この概要は、本特許出願の主題の概要を提供することを意図する。この概要は、本発明の排他的または網羅的な説明を提供することを意図しない。詳細な説明は、本特許出願についての更なる情報を提供するために含まれる。
【００１６】
必ずしも縮尺どおりに描かれているわけではない図面において、同様の参照番号は、異なる図の同様の要素を表現し得る。異なる接尾文字を有する同様の参照番号は、同様の要素の異なる例を表し得る。図面は、一般に本文書で述べられる種々の実施形態を一例として示すが、限定として示すものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】エンドウ豆タンパク質及び乳清タンパク質を含有する飲料配合物の２つの試料についての食品パネリストによる官能結果のプロットであり、エンドウ豆タンパク質は２つの試料間で異なった。
【図２】エンドウ豆タンパク質を含有する飲料配合物の３つの試料についての食品パネリストによる官能結果のプロットであり、エンドウ豆タンパク質は３つの試料の各々で異なった。
【図３】エンドウ豆タンパク質加水分解物を調製するベンチスケールの方法を示す。
【図４】エンドウ豆タンパク質加水分解物を調製するパイロットスケールの方法を示す。
【図５】エンドウ豆タンパク質組成物の出発材料が異なる場合の加水分解物の溶解性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本出願は、約ｐＨ３．４または７での少なくとも５０％の溶解性を有するエンドウ豆タンパク質加水分解物を調製する方法を提供する。本明細書に記載されるエンドウ豆タンパク質加水分解物の増強された溶解性は、食品及び飲料におけるエンドウ豆タンパク質加水分解物の使用を容易にし得る。増強された溶解性に加えて、エンドウ豆タンパク質加水分解物は、他の類似のタンパク質飲料と比較してタンパク質飲料の総合的な味を改善し得るだけでなく、それが含有されるタンパク質飲料に美容的利点を提供し得る。更に、エンドウ豆タンパク質加水分解物は、満足な質感及び口当たりをもたらす粘性を有し得、飲料の貯蔵寿命の間、安定であり得る。下記に示すように、エンドウ豆タンパク質加水分解物は、５重量％以上のエンドウ豆タンパク質含有レベルで好ましい味の飲料を容易にし得る。従って、場合によっては、上記飲料は、タンパク質の良好なまたは優れた供給源を提供するものとして提案され得る。
【００１９】
エンドウ豆タンパク質加水分解物を調製する本方法は、エンドウ豆タンパク質組成物を取得することと、エンドウ豆タンパク質組成物に真菌酵素を添加することと、一定条件下でエンドウ豆タンパク質組成物を加水分解して所望の加水分解度でエンドウ豆タンパク質加水分解物を形成することと、を含み得る。エンドウ豆タンパク質組成物（すなわち加水分解前のエンドウ豆タンパク質の出発形態）は、エンドウ豆タンパク質濃縮物または単離物であり得、エンドウ豆粉でもあり得る。水がエンドウ豆タンパク質組成物／真菌酵素の組合せに添加される際に、真菌酵素は、エンドウ豆タンパク質の結合を切断し得る。真菌酵素は、真菌のプロテアーゼであり得る。用語「酵素」は、活性な酵素製品を有する組成物を意味することに留意されたい。当業者は、かかる酵素活性及び含有レベルが酵素製品内で異なり得ることを理解するであろう。
【００２０】
本明細書で使用する場合、用語「エンドウ豆タンパク質組成物」は、加水分解を受けていないエンドウ豆タンパク質を含む組成物を指す。エンドウ豆タンパク質組成物は、１００％タンパク質以下のタンパク質含有量を有する。一部の態様では、エンドウ豆タンパク質組成物中のエンドウ豆タンパク質含有量は、６０％超、７０％超、及び８０％超のタンパク質含有量の範囲である。エンドウ豆タンパク質組成物は、乾燥粉末形態またはスラリー形態のいずれかであり得る。スラリー形態は、（１）先に記載した乾燥粉末形態が、スラリーの５〜１０重量％を乾燥粉末が構成して水が残りを構成するように水と混合されたもの、または（２）懸濁させた１４〜１８％の乾燥固体を含む、エンドウ豆タンパク質のプロセス中間体スラリーから作製され得る。エンドウ豆タンパク質組成物がスラリー形態である場合、高剪断力での追加の均質化が加工の間に使用され得ることに留意されたい。本明細書で使用する場合、用語「エンドウ豆タンパク質加水分解物」または「加水分解物」は、一定条件下で限定加水分解を受けたエンドウ豆タンパク質組成物を指す。本出願は、エンドウ豆タンパク質組成物の加水分解を実行する方法を記載する。従って、エンドウ豆タンパク質組成物は、本明細書において出発材料と称され得る。
【００２１】
加水分解の間の時間、温度、及びｐＨの条件は、少なくとも部分的に、加水分解度（ＤＨ）に影響を与え得る。一例では、加水分解プロセスは、約３０分〜約７０分続き得る。一例では、加水分解プロセスは、摂氏約３０度〜摂氏約６０度の範囲の温度で進行し得る。一例では、温度は、摂氏約４０度と摂氏約５０度との間の範囲であり得る。一例では、加水分解プロセスは、約５．０〜約７．５の範囲のｐＨで進行し得る。一例では、ｐＨは、約５．５と約６．５との間の範囲であり得る。後述するように、エンドウ豆タンパク質組成物に適した加水分解条件を決定するような実験計画が使用された。
【００２２】
加水分解度（ＤＨ）は、加水分解物中の切断されたペプチド結合の比率として定義される。一例では、本明細書に記載されるエンドウ豆タンパク質加水分解物は、約４％〜約２５％の範囲のＤＨを有し得る。一例では、ＤＨは、約４％〜約１０％の範囲であり得る。一例では、ＤＨは、約８％〜約１２％の範囲であり得る。一例では、ＤＨは、約１６％〜約２５％の範囲であり得る。一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物のＤＨは、約８％であり得、これは食品及び飲料適用において使用されるタンパク質源の一般的なＤＨ値である。一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物のＤＨは、約１８％であり得る。
【００２３】
一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物は、粉末形態で利用可能であり得る。エンドウ豆タンパク質加水分解物の粉末組成物は、１００％未満のエンドウ豆タンパク質を含有し得る。一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物の粉末組成物は、約８０重量％のエンドウ豆タンパク質を含有し得る。
【００２４】
一例では、酵素は、約０．０５：１００〜約５：１００のエンドウ豆タンパク質に対する酵素の（重量）比で添加され得る。一例では、エンドウ豆タンパク質に対する酵素の（重量）比は、約０．５：１００〜約１．５：１００であり得る。一例では、エンドウ豆タンパク質に対する酵素の（重量）比は、約１：１００であり得る。エンドウ豆タンパク質に対する酵素量の増加は、特定の加水分解度を達成するのに必要とされる時間を減少させ得る。
【００２５】
エンドウ豆タンパク質組成物（すなわち加水分解を受ける出発材料）は１００％未満のエンドウ豆タンパク質を含有し得るため、酵素のエンドウ豆タンパク質組成物に対する比はより高い。一例では、１：１００のエンドウ豆タンパク質に対する酵素の比では、エンドウ豆タンパク質組成物が８０％重量のエンドウ豆タンパク質を含有する場合、エンドウ豆タンパク質組成物に対する酵素の比は、１：１２０（重量）である。換言すれば、１：１００のエンドウ豆タンパク質に対する酵素の比では、１グラムの酵素は、１２０グラムのエンドウ豆タンパク質組成物（出発材料）と混合されている。これは、エンドウ豆タンパク質組成物（出発材料）が８０重量％のエンドウ豆タンパク質であるという仮定の下である。一例では、エンドウ豆タンパク質組成物（出発材料）は、粉末形態であり得る。
【００２６】
好ましい態様では、酵素は、真菌酵素である。真菌酵素は、エンドウ豆タンパク質を切断するためのプロテアーゼであり得る。一例では、真菌酵素は、Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｃ．のプロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤであり得る。一例では、真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅであり得る。
【００２７】
エンドウ豆タンパク質組成物には、天然のエンドウ豆タンパク質、修飾されたエンドウ豆タンパク質、またはこれらの組合せが含まれ得る。本明細書における目的に関して、修飾されたエンドウ豆タンパク質は、標的とする機能を得るために（化学的または物理的に）処理されたタンパク質を指す。典型的には、処理としては、抽出及び乾燥の間の熱処理が挙げられる。
【００２８】
エンドウ豆タンパク質加水分解物は、乳製品または非乳製品への適用を含め、種々の飲料中にタンパク質源として含まれ得る。かかる飲料としては、ジュース、タンパク質ドリンク、栄養ドリンクなどが挙げられ得るが、これらに限定されるものではない。一例では、飲料中のエンドウ豆タンパク質加水分解物は、８オンス分当たり５グラムであり得る。一例では、エンドウ豆タンパク質加水分解物は、乳清と組み合わせて使用され得、混ぜ合わされたタンパク質は、８オンス分当たり１０グラムであり得る。
【００２９】
一例では、飲料中のエンドウ豆タンパク質加水分解物は、約５重量％以上であり得る。下記の実施例に記載されているように、飲料配合物に使用される場合、エンドウ豆タンパク質加水分解物は、ＤＨ８及びＤＨ１８で好ましい官能結果を示した。従って、５重量％を超えるレベルでの飲料中のエンドウ豆タンパク質加水分解物の含有が適している。
【００３０】
前述したように、溶解性を増強するために、エンドウ豆タンパク質組成物は加水分解を受け得る。従って、溶解性は、得られるエンドウ豆タンパク質加水分解物の加水分解度（ＤＨ）と相関し得る。ＤＨの増加は、溶解性の増加をもたらし得る。
【００３１】
タンパク質溶解性は、平衡状態での液相及び固相に存在するタンパク質の量に対する液相に存在するタンパク質の濃度として定義され得る。タンパク質溶解性は、百分率として報告され得、多くの場合、特定のタンパク質含有量、ｐＨ、及び塩濃度で調製された溶液に遠心力を印加した後に、遠心分離前の当該溶液中の総タンパク質量に対する上澄み中のタンパク質含有量を測定することによって決定される。
【００３２】
本明細書に記載されるエンドウ豆タンパク質加水分解物は、約ｐＨ３．４で少なくとも５０％の溶解性を有し得る。本明細書に記載されるエンドウ豆タンパク質加水分解物の大部分の溶解性解析が、加水分解物にとって困難なｐＨレベルである３．４に等しいｐＨでなされたことに留意されたい。一例では、ｐＨ３．４でのエンドウ豆タンパク質加水分解物の溶解性は、約３０％と約７０％との間の範囲であり得る。中性ｐＨ（約７）でのエンドウ豆タンパク質加水分解物の溶解性は、ｐＨ３．４でのかかるエンドウ豆タンパク質加水分解物の溶解性と同等かそれより高いことが望ましい。エンドウ豆タンパク質加水分解物の増強された溶解性は、様々な飲料でのエンドウ豆タンパク質のより高い含有レベルを容易にし得る。
【００３３】
本出願による例は、ｐＨ約３．４または７での少なくとも６５センチポアズの粘性を含むエンドウ豆タンパク質加水分解物を含み得る。一例では、粘性は、ｐＨ約３．４または７での少なくとも８０センチポアズであり得る。一例では、粘性は、ｐＨ約３．４または７での少なくとも９０センチポアズであり得る。一例では、粘性は、ｐＨ約３．４での少なくとも１００センチポアズであり得る。一例では、粘性は、ｐＨ約３．４での少なくとも１１０センチポアズであり得る。粘性は、ラピッドビスコアナライザー（ＲＶＡ）を使用して５グラムの粉末（すなわち、加水分解物）、２０グラムの水溶液を２００ｒｐｍで１０分間撹拌することによって測定される。
【００３４】
本出願による例は、約中性ｐＨでの少なくとも１１５秒の分散性を含むエンドウ豆タンパク質加水分解物を含み得る。一例では、分散性は、約中性ｐＨで少なくとも１２５秒であり得る。一例では、分散性は、約中性ｐＨで少なくとも１３５秒であり得る。分散性は、粉末（すなわち加水分解物）が完全に湿り、凝集塊が容易に分散するまでに必要とされる時間を意味する。５％のタンパク質濃度溶液を得るために必要な粉末は、室温にて１００ｍＬの水に添加される。タイマーが直ちに開始され、溶液は１２０ｒｐｍで一方向に撹拌される。
【００３５】
本発明による例は、ｐＨ約３．４または７での少なくとも１．５ＴＳＩ  Ｇｌｏｂａｌを含む懸垂性を含むエンドウ豆タンパク質加水分解物を含み得る。一例では、懸垂性は、ｐＨ約３．４または７で少なくとも５ＴＳＩ  Ｇｌｏｂａｌであり得る。一例では、懸垂性は、ｐＨ約３．４で少なくとも７ＴＳＩ  Ｇｌｏｂａｌであり得る。懸垂性は、Ｔｕｒｂｉｓｃａｎ安定性指数（ＴＳＩ）  Ｇｌｏｂａｌを使用して測定され、５％タンパク質濃度の溶液が調製され、Ｔｕｒｂｉｓｃａｎで４５分間測定され、最後のＴＳＩ  Ｇｌｏｂａｌの読取りが懸垂性測定値として報告される。
【００３６】
加水分解条件を決定するための実験計画
溶解性を最大にし、飲料に適した粘性を提供する加水分解条件を決定するような実験計画を使用した。加水分解物試料を、ｐＨ、温度、及び時間について様々な値で作製した。ｐＨは３〜８の範囲であり、温度は３５〜５５℃の範囲であり、時間は２０〜１００分の範囲であった。
【００３７】
加水分解物試料を、ＤＨ、溶解性（ｐＨ３．４で測定）、熱安定性、及び粘性について試験した。試験の結果をモデルに入力し、このモデルを２つの予測を立てるために使用した。１つの予測について、８％の標的ＤＨを課し、そのＤＨ値での最大溶解性を達成する条件を計算した。もう１つの予測では、標的ＤＨ値を１８％に設定した。各セットで予測された条件を、下記の表１に示す。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
試料１のＤＨは制約した。換言すれば、ＤＨを８％に設定した。なぜならば、先にも述べたようにこれがタンパク質組成物の一般的なＤＨであるためである。試料２のＤＨは制約しなかった。表１に示す値は、モデルによって選択されたＤＨ値である。各試料の加水分解物を、表１の条件下で形成した。モデルによって予測されたＤＨ及び溶解性と比較したＤＨ及び溶解性を決定するために、各試料を三度繰り返して試験した。結果を下記の表２に示す。下記の実測値は、各試料についての３つの値の平均である。これは、加水分解された成分の生成の繰り返しに全般的に再現性があったことを実証する。
【００４０】
【表２】
2021501591.tif 000004
【００４１】
ＤＨは、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）法を使用して各試料について測定され、非加水分解試料のＤＨ値を減算することによって補正された。溶解性を測定するために、５％のタンパク質溶液を作製し、所望のｐＨ（３．４）に調整し、１時間撹拌した。均質なアリコートをサンプリングし、タンパク質含有量について試験した。別の均質なアリコートをサンプリングし、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、上澄みをサンプリングし、タンパク質含有量について試験した。全てのタンパク質含有量試験は、デュマ法を使用して行った。遠心分離後のタンパク質含有量を、遠心分離前のタンパク質含有量で除算し、１００％で乗算して可溶タンパク質のパーセントを計算した。
【００４２】
エンドウ豆タンパク質加水分解物を含有する２つの飲料配合物を作り、下記で述べるように試験し、加水分解を受けなかったエンドウ豆タンパク質組成物と比較した。
【００４３】
本出願は、以下の実施例において更に説明され、これらは特許請求の範囲における本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４４】
下記の実施例１及び２について、少なくとも１つのエンドウ豆タンパク質加水分解物をエンドウ豆タンパク質組成物から作製し、得られた加水分解物を飲料において試験し、加水分解を受けなかったエンドウ豆タンパク質組成物を含有する飲料と比較した。下記の両方の実施例において、エンドウ豆タンパク質（すなわちエンドウ豆タンパク質組成物）の出発材料は、Ｗｏｒｌｄ  Ｆｏｏｄ  ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇのＰＵＲＩＳ  Ｐｅａ（商標）８７０であった。エンドウ豆タンパク質加水分解物を形成するために、Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｃ．のプロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤを使用して、上記に掲示された１：１００の酵素対エンドウ豆タンパク質比で、かつ実験計画で決定され、表１に示された条件でエンドウ豆タンパク質組成物を加水分解した。
【００４５】
実施例１  エンドウ豆タンパク質及び乳清タンパク質を有する飲料配合物
ＤＨ８でのエンドウ豆タンパク質加水分解物を含有する飲料を、Ｐｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８７０を含有する同一の飲料と比較した（加水分解物は、５重量％のＰｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８７０及び水残部のエンドウ豆タンパク質組成物出発材料を使用して調製されたことに留意されたい）。この実施例では、２つのエンドウ豆タンパク質試料（ＤＨ８での加水分解物及びＰｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８７０）を、それぞれ乳清タンパク質単離物と共に使用して、乳清タンパク質と組み合わされたエンドウ豆タンパク質がどのように機能するか評価した。飲料（飲料配合物１と称する）の配合を下記の表３に示す。
【００４６】
【表３】
2021501591.tif 000005
【００４７】
飲料配合物１のもとで上記試料は、８オンス分当たり１０グラムのタンパク質を提供し、このことが、ある場合には「タンパク質の優れた供給源」を主張するラベルを容易にし得ることは注目に値する。
【００４８】
２つの試料を、表３の成分を混ぜ合わせた後に均質化した。均質化は、２５００ｐｓｉで実行した。次いで、試料はＭｉｃｒｏＴｈｅｒｍｉｃｓ  ｕｎｉｔによる処理を受け、これは、高温短時間（ＨＴＳＴ）法（約１９０°Ｆに加熱）及び次に２５００ｐｓｉでの別のインラインホモジナイザーの通過を含んだ。飲料配合物１としての試料の評価は、２６人の食品パネリストを使用した官能検査を含んだ。試料は、個別にかつランダム順にパネリストに与えられた。パネリストは、総合的な好み、風味、質感、及び後味に基づいて試料をスコア化するよう依頼された。官能パネルの結果を図１に示す。エンドウ豆タンパク質加水分解物試料は、４つ全ての特徴についてのパネリストによる好ましいスコア及び４つ全ての特徴についてのＰｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８７０と比較して高いスコアを得た。
【００４９】
飲料配合物１中の試料は、８週間の貯蔵寿命調査も受けた。試料は、冷蔵庫内で透明なプラスチックボトル中に貯蔵した。試料を冷蔵庫から取り出して、試験／観察を実行した。４週目に、エンドウ豆タンパク質加水分解物試料は、外側から可視的な分離を示した。しかし振盪すると、分離は全てなくなり、飲料は滑らかな質感を有した。
【００５０】
８週間の調査の間、粘性、色、及びｐＨも、試料の各々について毎週測定した。結果を下記の表４〜６に示す。
【００５１】
粘度測定をする前に、試料は、約９０秒間１９０°Ｆに加熱する高温短時間（ＨＴＳＴ）処理を受けた。粘性を、ＲＶＡ（ラピッドビスコアナライザー）を使用して室温にて撹拌しながら約１５分間測定した。測定される粘性が水平になったら、粘性値（センチポアズ）を記録した。
【００５２】
【表４】
2021501591.tif 000006
【００５３】
【表５】
2021501591.tif 000007
【００５４】
【表６】
2021501591.tif 000008
【００５５】
８週間の調査の間、加水分解物試料の粘性は、全般的に安定したままであり、Ｐｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８７０試料より著しく低かった。エンドウ豆タンパク質加水分解物が配合された飲料のより高いｐＨは、飲料配合物中の乳清タンパク質の存在に起因している可能性がある。
【００５６】
試料の比色測定値は、比色計、特にＨｕｎｔｅｒ  Ｌａｂ  Ｌａｂｓｃａｎ  ＸＥ（シリアル番号ＬＸ１７９８３）を使用して取得した。本明細書では表６に緑色／赤色のａ＊値のみを示す。なぜならば、これが飲料に最も関連する次元であるためである。結果は、消費者の観点から許容される経時的な自然分解を示す。
【００５７】
実施例２  エンドウ豆タンパク質を有する飲料配合物
飲料配合物２と称するこの例では、配合から乳清タンパク質単離物を除いて、エンドウ豆タンパク質加水分解物（加水分解物は、５重量％のＰｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８７０及び水残部のエンドウ豆タンパク質組成物出発材料を使用して調製されたことに留意されたい）がタンパク質源として単独でどのように機能するか評価した。飲料配合物２を下記の表７に示す。
【００５８】
【表７】
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【００５９】
乳清タンパク質を飲料配合物２の成分から除外したが、他の成分は飲料配合物１と同様である。飲料配合物２としての以下の３つのエンドウ豆タンパク質試料：ＤＨ８でのエンドウ豆タンパク質加水分解物、ｐＨ１８でのエンドウ豆タンパク質加水分解物、及びＰｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  ８７０を評価した。飲料配合物２は、８オンス分当たり５グラムのタンパク質を提供し、このことは、ある場合には「タンパク質の良好な供給源」を主張するラベルを容易にし得る。
【００６０】
飲料は、実施例１で上記に掲示されたのと同一の条件及び方法を使用して処理した。
【００６１】
３つの試料の官能検査は、２２人の食品パネリストによって実行された。試料は、個別にかつランダム順にパネリストに与えられた。パネルは、総合的な好み、風味、質感、及び後味に基づいて各試料を評価し、スコア化した。官能パネルによる結果を図２に示す。２つのエンドウ豆タンパク質加水分解物試料（ＤＨ８及びＤＨ１８）は、Ｐｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  ８７０試料と比較して良い評価を得た。より具体的には、ＤＨ８でのエンドウ豆タンパク質加水分解物は、各カテゴリにおいてＰｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８７０より高いかまたは同じくらいのスコアを得た。ＤＨ１８でのエンドウ豆タンパク質加水分解物は、全てのカテゴリにおいてＰｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８７０より高いスコアを得た。
【００６２】
図２に示す官能結果に基づいて、ＤＨ１８の加水分解物は、ＤＨ８の加水分解物より良い評価を得た。より高い加水分解度にもかかわらず、ＤＨ１８の加水分解物は、飲料の全体的な苦味をもたらさなかったようである。むしろ、ＤＨ１８の加水分解物は、好ましい口当たりを有する好ましい味の飲料を提供した可溶性エンドウ豆タンパク質粉末を提供した。
【００６３】
飲料配合物２中の試料は、８週間の貯蔵寿命調査を受けた。試料は、冷蔵庫内で透明なプラスチックボトル中に貯蔵され、次いで試験／観察のために取り出された。全ての試料は、４週目で可視的な分離を示した。Ｐｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ８７０試料は、水相に浮遊する粒子を含む同程度の分離を有し、かかる分離はボトルが開けられた場合には、あまり目立たなかった。エンドウ豆タンパク質加水分解物試料は「ねばねばした」質感を有し、ボトルが開けられた場合に泡立って見えた。全ての試料について、振盪すると分離はなくなり、飲料は滑らかな質感を有した。
【００６４】
８週間の調査の間、粘性、色、及びｐＨを、試料の各々について測定した。粘性は、飲料配合物１で上記したプロセスを使用して（センチポアズで）測定した。結果を下記の表８〜１０に示す。
【００６５】
【表８】
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【００６６】
【表９】
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【００６７】
【表１０】
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【００６８】
８週間の調査の間、両方の加水分解物試料の粘性は、全般的に安定したままであり、Ｐｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  ８７０試料より著しく低かった。８週間の調査の間、両方の加水分解物試料のｐＨは、比較的一定のままであったが、Ｐｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  ８７０試料よりごくわずかに高かった。
【００６９】
ここで３つの試料の比色測定値を、実施例１で使用されたのと同じ比色計を使用して取得した。表１０では、緑色／赤色のａ＊値のみを示す。８週間の調査の間、３つ全ての試料は、同程度の色の減少を示し、かかる変化は許容される。
【００７０】
エンドウ豆タンパク質加水分解物試料は、特にＰｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  ８７０試料と比較して良好な溶解性及び低粘性を示した。エンドウ豆タンパク質加水分解物試料、特に１８に等しいＤＨでの試料は、Ｐｕｒｉｓ（商標）Ｐｅａ  ８７０試料と比較して優れた風味及び質感も示した。本発明者らは、本明細書に記載される加水分解プロセスにおいて使用される真菌酵素が、タンパク質の特定の部位を標的とし、これにより苦さとして認知されない親水性ペプチドの放出をもたらし、実際に飲料配合物中のエンドウ豆タンパク質による異風味を最小限にし得ると考えている。貯蔵寿命の調査は、加水分解物が経時的に比較的安定しており、低粘性を維持したことを示した。好ましい試飲結果、粘性、及び安定性を考えれば、本明細書に記載されるエンドウ豆タンパク質加水分解物は、タンパク質飲料と記載されている飲料を含む種々の飲料適用において使用することができる。
【００７１】
上記の詳細な説明は、発明を実施する形態の一部を形成する添付の図面への参照を含む。図面は、例証として、本発明が実施され得る特定の実施形態を示す。これらの実施形態は、本明細書において「例」とも称される。かかる例は、示されたかまたは記載された要素以外の要素を含み得る。ただし、本発明者らは、示されたかまたは記載された要素のみが提供される例も意図する。更に、本発明者らは、本明細書において示されたかまたは記載された、特定の例（またはその１つ以上の態様）に関して、または他の例（または１つ以上の態様）に関して、示されたかまたは記載された要素の任意の組合せまたは入替（またはそれらの１つ以上の態様）を使用する例も意図する。
【００７２】
本文書と参照により組み込まれるあらゆる文献との間で矛盾した用法がある場合は、本文書における用法が有効となる。本文書において、用語「ａ」または「ａｎ」は、特許文献において一般的であるように、「少なくとも１つの」または「１つ以上の」という任意の他の例または使用法とは関係なく、１つまたは２つ以上を含めるために使用される。本文書において、用語「または」は、特に明記しない限り、非排他的であること、または、「ＡまたはＢ」が「ＢではなくＡ）」、「ＡではなくＢ）」及び「Ａ及びＢ」を含むことを、指すために使用される。本文書において、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「における（ｉｎ  ｗｈｉｃｈ）」は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「における（ｗｈｅｒｅｉｎ）」それぞれのわかりやすい英語の均等表現として使用される。また、以下の請求項において、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、オープンエンドであって、すなわち、請求項において当該用語の後に列挙されたものに加えて、更に要素を含むシステム、装置、物品、組成物、製剤もしくはプロセスが、当該請求項の範囲内に収まると依然として見なされる。更に、以下の請求項において、用語「第１の」、「第２の」及び「第３の」等は、単なるラベルとして使用されるにすぎず、それらの対象物に数値的要件を課すことを意図するものではない。
【００７３】
本明細書に記載される方法の例は、少なくとも部分的に、機械またはコンピュータにより実行され得る。一部の例は、上記例に記載したような方法を実行する電子装置を構成するように操作可能な命令によってコード化されるコンピュータ可読媒体または機械可読媒体を含み得る。かかる方法の実装は、マイクロコード、アセンブリ言語コード、高水準言語コードなどのコードを含み得る。かかるコードは、種々の方法を実行するコンピュータ可読命令を含み得る。コードは、コンピュータプログラム製品の一部を形成し得る。更に一例では、コードは、実行時または他の時点などにおいて、１つ以上の揮発性で非一時的なまたは不揮発性で有形のコンピュータ可読媒体に実体的に格納され得る。これら有形のコンピュータ可読媒体の例としては、ハードディスク、リムーバブル磁気ディスク、リムーバブル光ディスク（例えば、コンパクトディスク及びデジタルビデオディスク）、磁気カセット、メモリカードまたはメモリスティック、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
上記の説明は例示であり、限定するものではないことを意図する。例えば、上記の例（またはその１つ以上の態様）は、互いに組み合わせて使用されてもよい。他の実施形態が、例えば上記の説明を検討する際に当業者によって使用され得る。要約書は、読み手が技術的開示内容の本質を直ちに確認できるように、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．７２（ｂ）に準拠して掲示されている。要約書は、特許請求の範囲の範囲または意味を解釈するかまたは限定するのに使用されないという理解の下で提出されている。また、上記の発明を実施するための形態において、種々の特徴はともにグループ化され、開示内容を簡素化し得る。これは、特許請求の範囲に記載されていない開示された特徴が、いずれの請求項においても不可欠であることを意図するように解釈されるべきではない。正確には、発明の主題は、特定の開示された実施形態の全ての特徴よりも少ないところにあってよい。従って、以下の特許請求の範囲は、例または実施形態として発明を実施するための形態に組み込まれると共に、各請求項は、別個の実施形態として単独で有効であり、かかる実施形態は、種々の組合せまたは入替により互いに組み合わされ得ることが意図される。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲に権利が付与される等価物の全範囲と共に、かかる特許請求の範囲を参照して決定される。
【００７５】
実施例３  エンドウ豆タンパク質加水分解物の特性
この実施例では、エンドウ豆タンパク質（すなわちエンドウ豆タンパク質組成物）の出発材料は、スラリー形態で噴霧乾燥される前のＷｏｒｌｄ  Ｆｏｏｄ  ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇのＰＵＲＩＳ  Ｐｅａ（商標）８７０の変形形態であり、他の出発材料は、無殺菌の天然エンドウ豆タンパク質スラリー（アルカリ可溶化及び酸沈殿を使用してエンドウ豆粉（ＰＵＲＩＳＷｈｏｌｅ（商標））から抽出された）であった。エンドウ豆タンパク質加水分解物を形成するために、Ａｍａｎｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｃ．のプロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤを使用して、１：１００の酵素対エンドウ豆タンパク質比で、かつ図３及び図４に示す条件でＤＨ８まで３つのエンドウ豆タンパク質組成物を加水分解した。表１１、表１２、表１３、及び表１４は、それぞれ、得られたエンドウ豆タンパク質加水分解物についての溶解性、粘性、分散性、及び懸垂性データを提供する。
【００７６】
【表１１】
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【００７７】
【表１２】
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【００７８】
【表１３】
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【００７９】
【表１４】
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【００８０】
実施例４  酵素的特徴の解析
この実施例では、酵素的特徴を評価して、修飾の結果に対するそれらの効果を決定する。市販のプロテアーゼは、一般に、多重特異性の個々の酵素に由来する触媒能力の混合物であり、異なる特異性の酵素の混合物である。機能の存在及び欠如の両方が、酵素修飾の結果に影響を与える。タンパク質の酵素修飾の効果を理解するために、酵素製品の特異的加水分解活性の混合及び強度に関する何かを理解することは有益である。酵素製品を特徴付ける潜在的に多数の方法が存在する。そのため、限られた活性のセットが、実行するのに時間がかかりすぎることなく実用的な説明を提供する。以下の方法が、活性を評価するために本発明で使用された。この実施例で使用される場合、「酵素」へのいかなる言及も、追加の非酵素成分を含む「酵素製品」への言及である。
【００８１】
ｐＨ７でのアゾカゼインの一般的な加水分解
アゾカゼイン（Ｓｉｇｍａ  Ａ２７６５）を、非特異的プロテアーゼ活性を検出するための基質として使用した。アゾカゼインの２重量％溶液を、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨで調製した。２ｍＬの遠心チューブに０．５ｍＬの同じ緩衝液を添加することによって反応混合物を構成した。チューブは、０、１０、２０、及び３０分時点用に用意した。ゼロ時点のチューブを、５０μＬの水中１００重量％トリクロロ酢酸を添加直後に氷上に配置した。希釈した酵素の５０μＬのアリコートを各チューブに添加し、チューブを５０℃のウォーターバスで暖めた。時間間隔をあけて、０．４ｍＬのアゾカゼイン溶液を添加し、タイマーを開始した。ブランクを調製したが、酵素を５０μＬの緩衝液で置換した。指定された時点で、反応を停止させるための５０μＬの１００重量％ＴＣＡを添加し、停止された反応物をアイスバスに直ちに移した。
【００８２】
酵素は、上記の反応緩衝液で希釈した（または溶解及び希釈した）。様々な希釈物を試験して、アッセイの酵素濃度との直線性を実証した。色素放出の速度が直線であった希釈物のみを、その後の解析に含めた。
【００８３】
全ての試料が停止されたら、試料を１６，０００ｘｇで７．５分間遠心分離して、未反応のタンパク質を沈殿させた。
【００８４】
上澄みの１００μＬのアリコートを、９６プレースマイクロプレートリーダーのウェルに配置した。各ウェルに１００μＬの緩衝液及び１００μＬの１Ｍ  ＮａＯＨを添加した。プレートを、Ｇｅｎ  ５．１．１１ソフトウェアを使用したＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴを用いて４４０ｎｍで読み取った。酵素なしのブランクを使用して、平均ブランク値を作成し、全ての「アクティブ」セルから減算した。０時点でのいかなる負の値もゼロにセットした。吸光度の変化の傾きを計算した。
【００８５】
１ユニットの活性を、ΔＡ４４０／分での１ユニットの変化として定義した。市販の酵素製品のユニット／ｇを導くために、各希釈物の活性をアッセイにおける酵素の質量に対してプロットし、活性対酵素の回帰直線を算定した。傾きは活性／ｍｇ酵素製品を表し、これはΔＡ４４０／分／ｇ酵素製品に変換された。個々の酵素アッセイ直線性を、解析に含める前に確認した。
【００８６】
ｐＨ７でのウシ血清アルブミンの一般的な加水分解
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａ２１５３−５０Ｇ）を、非特異的プロテアーゼ活性を測定するための基質として使用した。２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液を、ｐＨ７で調製した。酵素は、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液での系列希釈によってｐＨ７で調製した。微量遠心チューブは、酵素濃度及び時点（０、１０、２０、及び３０分）ごとにラベル付けし、配置した。自動ピペットを使用して、９５０μＬのＢＳＡ溶液を各チューブに添加した。ゼロ時点のチューブを直ちにアイスバスに配置し、全ての他のチューブを５０℃に設定したウォーターバスに配置して平衡化した。酵素活性を阻害し、タンパク質を沈殿させるために、５０μＬの水中１００％ｗｔトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）をゼロ時点のチューブに添加した。５０μＬの適切な酵素溶液を各ゼロ時点のチューブに添加した。１０、２０、及び３０分時点のチューブが平衡化したら、５０μＬの適切な酵素溶液を時間間隔をあけて対応するチューブに添加した。タイマーを最初の酵素添加時に開始した。ブランクは、５０μＬ緩衝液を酵素溶液と置き換えて調製した。適切な時点で、５０μＬの１００％ｗｔのＴＣＡを添加して反応を停止させ、チューブをウォーターバスから取り出し、振盪し、アイスバスに少なくとも３０分間配置した。次いで、試料を９１００ｘｇで１０分間遠心分離した。
【００８７】
２８０ｎｍでの正確な測定値を取得するために、上澄みのｐＨを約９．０へと調整した。水酸化ナトリウム（１２０μＬ、０．５Ｍ）を、ＵＶ透過９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに添加した。１９０μＬの上澄みをウェルに添加し、プレートを穏やかに揺り動かして混合した。プレートを、Ｇｅｎ５ソフトウェアを備えたマイクロプレートリーダーを使用して２８０ｎｍで読み取った。
【００８８】
ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）を使用して上澄みを遊離アミノ酸についても解析した。解析前に超純水中０．５％のＴＮＢＳ溶液を調製し、使用まで冷蔵庫で貯蔵した。マイクロピペットを使用して、５０μＬの各標準溶液（０．０１ＮのＨＣｌ中０〜６ｍＭのロイシン）を二連で９６ディープウェルプレートに加えた。４０μＬアリコートの各試料（上澄み）を１０μＬの２．５％ホウ酸塩試薬（ｐＨ９．５）と共にディープウェルプレートに移した。マルチチャンネルピペットを使用して、１ｍＬの２．５％ホウ酸塩試薬を各標準物質及び試料のウェルに添加した。反応を開始するために２０μＬの０．５％ＴＮＢＳを各ウェルに添加し、シリコンカバーをプレート上に配置して個々のウェルを密閉した。プレートを振盪して混合し、室温にて暗所に配置し顕色させた。３０分後、カバーを取り外し、５００μＬの新たに調製した１Ｍの一塩基性リン酸ナトリウムを各ウェルに添加して反応を停止させた。プレートをシリコンカバーと共に再び振盪し、各標準物質及び試料溶液の３００μＬのアリコートを９６ウェルマイクロプレートに移した。４２０ｎｍでの吸光度を測定し、ロイシン当量濃度を平均した検量線を使用して計算した。１ユニットの活性を、１μｍｏｌのロイシン当量／分の放出として定義した。市販の酵素製品のユニット／ｇを導くために、各希釈物の活性をアッセイにおける酵素の質量に対してプロットし、活性対酵素の回帰直線を算定した。傾きは、活性／ｇ酵素製品を表す。
【００８９】
グリシン特異的加水分解
グリシンでの切断に特異的な酵素活性を、合成発色基質を使用して試験した。１ｍＭのグリシン４−ニトロアニリド−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ４２５４）溶液を、５ｍｇを０．２５ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、次いで２５ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７５）で２５ｍＬまで希釈することによって調製した。酵素は、氷冷した２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に系列希釈することによって調製した。酵素の１００μＬのアリコートを、９６プレースマイクロタイタープレートのウェルに添加した。１００μＬの基質溶液の添加によって反応を開始した。プレートを、Ｇｅｎ  ５．１．１１ソフトウェアを実行している（予熱した）５０℃のＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ装置に配置した。４０５ｎｍでの吸光度を、振盪の０、１０、及び２０分後に測定した。
【００９０】
１ユニットの活性を、ΔＡ４０５／分での１ユニットの変化として定義した。市販の酵素製品のユニット／ｇを導くために、各希釈物の活性をアッセイにおける酵素の質量に対してプロットし、活性対酵素の回帰直線を算定した。傾きは活性／ｍｇ酵素製品を表し、これはΔＡ４０５／分／ｇ酵素製品に変換された。個々の酵素アッセイ直線性を、解析に含める前に確認した。
【００９１】
ロイシン特異的加水分解
ロイシンでの切断に特異的な酵素活性を、合成発色基質を使用して試験した。１ｍＭのＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ  Ｌ２１５８）溶液を、６．３ｍｇを０．２５ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、次いで２５ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７５）で２５ｇまで希釈することによって調製した。酵素は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に系列希釈することによって調製した。酵素の１００μＬのアリコートを、９６プレースマイクロタイタープレートのウェルに添加した。１００μＬの基質溶液の添加によって反応を開始した。プレートを、Ｇｅｎ  ５．１．１１ソフトウェアを実行している（予熱した）５０℃のＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ装置に配置した。４０５ｎｍでの吸光度を、振盪後の０〜３０分の間隔で測定した。
【００９２】
１ユニットの活性を、ΔＡ４０５／分での１ユニットの変化として定義した。市販の酵素製品のユニット／ｇを導くために、各希釈物の活性をアッセイにおける酵素の質量に対してプロットし、活性対酵素の回帰直線を算定した。傾きは活性／ｍｇ酵素製品を表し、これはΔＡ４０５／分／ｇ酵素製品に変換された。個々の酵素アッセイ直線性を、解析に含める前に確認した。
【００９３】
リジン特異的加水分解
リジンでの切断に特異的な酵素活性を、合成発色基質を使用して試験した。１ｍＭのＬ−リジン  ｐ−ニトロアニリド二臭化水素酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ｌ７００２）溶液を、１１ｍｇを０．２５ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、次いで２５ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７５）で２５ｇまで希釈することによって調製した。酵素は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に系列希釈することによって調製した。酵素の１００μＬのアリコートを、９６プレースマイクロタイタープレートのウェルに添加した。１００μＬの基質溶液の添加によって反応を開始した。プレートを、Ｇｅｎ  ５．１．１１ソフトウェアを実行している（予熱した）５０℃のＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ装置に配置した。４０５ｎｍでの吸光度を、振盪後の０〜３０分の間隔で測定した。
【００９４】
１ユニットの活性を、ΔＡ４０５／分での１ユニットの変化として定義した。市販の酵素製品のユニット／ｇを導くために、各希釈物の活性をアッセイにおける酵素の質量に対してプロットし、活性対酵素の回帰直線を算定した。傾きは活性／ｍｇ酵素製品を表し、これはΔＡ４０５／分／ｇ酵素製品に変換された。個々の酵素アッセイ直線性を、解析に含める前に確認した。
【００９５】
メチオニン特異的加水分解
メチオニンでの切断に特異的な酵素活性を、合成発色基質を使用して試験した。１０ｍＭのＬ−メチオニン  ｐ−ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ  Ｍ３５２９）溶液を、４．８ｍｇを１．７８ｍＬのアセトン中に溶解することによって調製した。酵素を、氷冷した２５ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に系列希釈することによって調製した。５０μＬの酵素のアリコートを、室温にて１３０μＬの緩衝液と共に９６プレースマイクロタイタープレートのウェルに添加した。２０μＬの基質溶液の添加によって反応を開始した。プレートを、Ｇｅｎ  ５．１．１１ソフトウェアを実行している（予熱した）５０℃のＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ装置に配置した。４０５ｎｍでの吸光度を、断続的振盪後の０〜４５分の間隔で測定した。
【００９６】
１ユニットの活性を、ΔＡ４０５／分での１ユニットの変化として定義した。市販の酵素製品のユニット／ｇを導くために、各希釈物の活性をアッセイにおける酵素の質量に対してプロットし、活性対酵素の回帰直線を算定した。傾きは活性／ｍｇ酵素製品を表し、これはΔＡ４０５／分／ｇ酵素製品に変換された。個々の酵素アッセイ直線性を、解析に含める前に確認した。
【００９７】
アルギニン特異的加水分解
アルギニンでの切断に特異的な酵素活性を、合成発色基質を使用して試験した。１０ｍＭのＮα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン  ４−ニトロアニリド塩酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ｂ４８７５）溶液を、０．２５ｍＬのＤＭＳＯに約１０ｍｇの基質を溶解し、次いで２５ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．７５）で２５ｇまで希釈することによって調製した。酵素を、氷冷した２５ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．７５）に系列希釈することによって調製した。酵素の１００μＬのアリコートを、９６プレースマイクロタイタープレートのウェルに添加した。１００μＬの基質溶液の添加によって反応を開始した。プレートを、Ｇｅｎ  ５．１．１１ソフトウェアを実行している（予熱した）５０℃のＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ装置に配置した。４０５ｎｍでの吸光度を、断続的振盪後の０〜１５分の間隔で測定した。
【００９８】
１ユニットの活性を、ΔＡ４０５／分での１ユニットの変化として定義した。市販の酵素製品のユニット／ｇを導くために、各希釈物の活性をアッセイにおける酵素の質量に対してプロットし、活性対酵素の回帰直線を算定した。傾きは活性／ｍｇ酵素製品を表し、これはΔＡ４０５／分／ｇ酵素製品に変換された。個々の酵素アッセイ直線性を、解析に含める前に確認した。
【００９９】
チロシン特異的加水分解
チロシンでの切断に特異的な酵素活性を、合成発色基質を使用して試験した。１０ｍＭのＮα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン  ４−ニトロアニリド塩酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ｂ４８７５）溶液を、２．３２ｍＬのアセトンに１１．６ｍｇの基質を溶解することによって調製した。酵素を、氷冷した２５ｍＭのＭＯＰＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に系列希釈することによって調製した。室温の緩衝液の３５０μＬアリコートに加えて１００μＬの希釈した酵素を、マイクロチューブに添加した。５０μＬの基質を添加することによって反応を開始した。チューブを混合し、５０℃のウォーターバスへ移した。反応を、５０μＬの１００％ｗ／ｗのＴＣＡを添加することによって１、３．５、及び２３時間時点で停止させ、全ての試料を収集するまでチューブを冷却した。ゼロ時点については、ＴＣＡを基質の添加の前に添加した。終了したら、試料を１６，０００ｇで７．５分間遠心分離して沈殿したタンパク質及び未反応の基質を沈降させた。試料（２００μＬ）を、９６ウェルマイクロタイタープレートにロードし、Ｇｅｎ  ５．１．１１ソフトウェアを実行しているＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ装置で読み取った。４０５ｎｍでの吸光度を記録した。この反応は非常に遅かったため、更なる解析に使用した唯一のデータポイントは、２３時間でのものであった。確認として、パンクレアチンも同一の緩衝系で基質に対して試験され、最初の１時間以内で０．６３を超えるΔＡ４０５を示した。
【０１００】
１ユニットの活性を、ΔＡ４０５／２３時間での１ユニットの変化として定義した。市販の酵素製品のユニット／ｇを導くために、各希釈物の活性をアッセイにおける酵素の質量に対してプロットし、活性対酵素の回帰直線を算定した。傾きは活性／ｍｇ酵素製品を表し、これはΔＡ４０５／２３時間／ｇ酵素製品に変換された。
【０１０１】
このセットのアッセイにおけるプロテアーゼＭの活性を表１５に示す。
【０１０２】
【表１５】
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【０１０３】
１ｇのプロテアーゼＭが１００ｇのタンパク質基質に適用される例において、適用されている活性は、約２００アゾカゼイン分解ユニット、５３カゼイン由来Ａ２８０放出ユニット、１７カゼイン由来αアミン放出ユニット、０．５４グリシン−ニトロアニリド加水分解ユニット、１０，４００ロイシン−ニトロアニリド加水分解ユニット、１２８０リジン−ニトロアニリド加水分解ユニット、９１メチオニン−ニトロアニリド加水分解ユニット、２．３ベンゾイル−アルギニン−ニトロアニリド加水分解ユニット、及び３６ベンゾイル−チロシン−ニトロアニリド加水分解ユニットであるとも記載され得る。当業者は、酵素の総合的及び特異的活性の他の尺度が、本発明の結果を達成するために適用されている酵素活性的特徴を更に指定するために使用され得ることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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