(57)【要約】  本明細書に提供されるのは、いくつかの態様において、例えば、治療用タンパク質を包含する、異種タンパク質を産生することにおける使用のための、Lactobacillusからの分泌を指向することができる人工分泌ペプチドである。
2021500035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１、および配列番号７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工分泌シグナルペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１、および配列番号７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載の人工分泌シグナルペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１、および配列番号７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する、請求項２に記載の人工分泌シグナルペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１、および配列番号７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の人工分泌シグナルペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の人工分泌シグナルペプチドに融合されたタンパク質。
【請求項６】
人工シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端に融合されている、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
タンパク質は、治療用タンパク質である、請求項５または６に記載のタンパク質。
【請求項８】
タンパク質は、抗体であり、任意に、抗体は、ウイルス抗原または微生物抗原に特異的に結合する、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
治療用タンパク質は、サイトカインであり、任意に、サイトカインは、ＩＬ−１０である、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項１０】
治療用タンパク質は、内分泌ホルモンであり、任意に、内分泌ホルモンは、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）である、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項１１】
治療用タンパク質は、抗微生物ペプチドであり、任意に、抗微生物ペプチドは、ヒトベータデフェンシン１（ｈＢＤ１）である、請求項７に記載のペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の人工分泌シグナルをペプチド、または、請求項５〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１３】
核酸は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される誘導性プロモーターを含む、請求項２２に記載の核酸。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の核酸を含む改変されたLactobacillus細胞。
【請求項１５】
改変されたLactobacillus細胞は、L. gasseri細胞およびL. rhamnosus細胞から選択される、請求項１４に記載の改変されたLactobacillus細胞。
【請求項１６】
核酸によってコードされるタンパク質を産生するために、請求項１４または１５に記載の改変されたLactobacillus細胞を細胞培養培地中で培養することを含む、タンパク質を産生するための方法。
【請求項１７】
改変されたLactobacillus細胞は、Lactobacillus rhamnosus GG (LGG)細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Lactobacillus細胞は、１ｍＬの細胞培養培地あたり少なくとも１０μｇのタンパク質を産生する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞培養培地からタンパク質を回収することをさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
対象に、請求項１４または１５に記載の改変されたLactobacillus細胞を投与することを含む方法。
【請求項２１】
対象は、自己免疫状態を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
自己免疫状態は、炎症性腸疾患、任意に、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象は、微生物感染症を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）菌株特異的配列のライブラリー内のシグナル配列の集団についてのアミノ酸残基位置重量マトリックス（ＰＷＭ）をコンピュータ処理すること；および
（ｂ）シグナル配列の集団についてのＰＷＭに基づいてコンセンサスシグナルペプチド配列を生成すること
を含む方法。
【請求項２５】
（ｃ）菌株の細胞において、コンセンサスシグナルペプチド配列を含むシグナルペプチドに連結された目的の異種タンパク質を発現することをさらに含み、任意に、異種タンパク質は、治療用タンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
炎症性腸疾患を有する対象へ、Lactobacillus rhamnosusに由来する人工シグナルペプチドに融合された抗炎症性サイトカインをコードする核酸を含む改変されたLactobacillus rhamnosusを投与することを含む方法。
【請求項２７】
人工分泌シグナルペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
人工分泌シグナルペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
抗炎症性サイトカインは、ＩＬ１０である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
核酸は、人工分泌シグナルペプチドに融合された抗炎症性サイトカインをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
任意に、改変されたLactobacillus rhamnosus細胞の単回用量に続く、改変されたLactobacillus rhamnosus細胞によって対象において産生される抗炎症性サイトカインの量は、対照条件下で産生される抗炎症性サイトカインの量よりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍多く、任意に、対照状態は、抗炎症性サイトカインを分泌するように改変されたLactobacillus細胞を包含する、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
対象において存在する結腸ＩＬ１０のレベルは、任意に、改変されたLactobacillus rhamnosus細胞の単回用量に続いて、ベースラインと比べて、少なくとも２５％、少なくとも３５％、または少なくとも４５％増大する、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１０月２０日に出願された米国仮出願番号６２／５７５，３５０、２０１７年１１月１０日に出願された米国仮出願番号６２／５８４，３６７、２０１８年５月２４日に出願された米国仮出願番号６２／６７６，２０３、および２０１８年６月２８日に出願された米国仮出願番号６２／６９１，５５３の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下の利益を主張し、これらの各々はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府支援研究
本発明は、エネルギー省によって授与された助成金番号ＤＥ−ＦＧ０２−０２ＥＲ６３４４５下の政府の支援によってなされた。政府は、本発明においてある権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ほとんどの分泌タンパク質は、分泌経路において膜を通過する転移を指向するＮ末シグナルペプチドを有する。これらのペプチドは、大抵１５〜６０アミノ酸長であり、および正に帯電したアミノ酸を典型的に含むＮ末領域、中央の疎水性領域、および短いＣ末領域によって特徴付けられ得る。細菌を含む原核生物では、分泌シグナルペプチドはしばしば、Ｓｅｃ転移酵素を通じて細胞内搬出を指向する。自然では、Ｓｅｃ経路を介して搬出される全てのタンパク質は、その独自のユニークな分泌シグナルに結合されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
概要
本明細書に提供されるのは、様々な異なる治療用タンパク質の効率的なおよび確固たる産生を可能にする、多用途な人工分泌シグナルペプチドである。既存の治療用タンパク質産生技術は、小さいセットの天然に存在する分泌シグナルペプチドの使用に過度に依存している。これらの天然に存在するペプチドの性能は、しかしながら、しばしば予測不能であり、非効率的な／有効でない搬出および／または折り畳まれていない／誤って折り畳まれたタンパク質を生じる。さらに、かかる分泌シグナルペプチドの性能は、必ずしも、異なるタンパク質の中で、移行可能ではない。実例として、１つのタンパク質の分泌を指向するシグナルペプチドは、しばしば、別のタンパク質の分泌を促進することはできない。さらにまた、１つの菌株においてタンパク質を機能的に分泌する、これまでに特徴付けられた天然のシグナルペプチドは、しばしば、他の密接に関わっている菌株において同じタンパク質の分泌を促進するのに失敗する。本開示の人工分泌シグナルペプチドは、様々な異種タンパク質（例として、治療用タンパク質）の分泌を確実に促進する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、少なくとも部分的に、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１、または配列番号７のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列を含む人工分泌シグナルペプチドが、Lactobacilliからの機能的異種タンパク質の分泌を指向することができることを示す、予想外のデータに基づく。
【０００６】
よって、本明細書に提供されるのは、いくつかの側面において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１、または配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む人工分泌シグナルペプチドである。
【０００７】
また本明細書に提供されるのは、人工分泌シグナルペプチドに融合されたタンパク質（例として、治療用タンパク質）である。
さらに本明細書に提供されるのは、人工分泌シグナルペプチドまたは人工分泌シグナルペプチドに融合されたタンパク質をコードする核酸である。
なおさらに、本開示は、本明細書に記載の核酸を含むベクターおよび細胞（例として、Lactobacillus細胞）を提供する。
本開示はまた、タンパク質を産生する方法、タンパク質を含む組成物、組成物およびタンパク質を使用する方法を提供する。
【０００８】
本開示はさらに、（ａ）菌株特異的配列のライブラリー内のシグナル配列の集団について、アミノ酸残基位置重量マトリクス（ＰＷＭ）をコンピュータ処理すること、および（ｂ）シグナル配列の集団について、ＰＷＭに基づくコンセンサスシグナルペプチド配列を生成することを包含する方法を提供する。いくつかの態様において、方法はさらに、（ｃ）コンセンサスシグナルペプチド配列を含むシグナルペプチドに連結された目的の異種タンパク質を菌株の細胞中で発現させることを包含する。菌株は、例えば、Yersinia spp.、Escherichia spp.、Klebsiella spp.、Acinetobactoer spp.、Bordetella spp.、Neisseria spp.、Aeromonas spp.、Franciesella spp.、Corynebacterium spp.、Citrobacter spp.、Chlamydia spp.、Hemophilus spp.、Brucella spp.、Mycobacterium spp.、Legionella spp.、Rhodococcus spp.、Pseudomonas spp.、Helicobacter spp.、Salmonella spp.、Vibrio spp.、Bacillus spp.、Erysipelothrix spp.、Salmonella spp.、Streptomyces spp.、Bacteroides spp.、Prevotella spp.、Clostridium spp.、Bifidobacterium spp.、またはLactobacillus spp.であり得る。いくつかの態様において、細菌細胞は、生菌細胞である。
【０００９】
いくつかの態様において、目的の異種タンパク質は、抗体などの治療用タンパク質である。抗体は、例えば、宿主組織抗原（例として、ＴＮＦα、または上皮または粘膜表面タンパク質）または外来抗原（例として、病原性細菌、ウイルス、および毒素タンパク質）に対して指向され（特異的であり）得る。
いくつかの態様において、コンセンサスシグナルペプチド配列に連結された目的の異種タンパク質をコードする核酸は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。
【００１０】
本開示の他の側面は、炎症性腸疾患を有する対象へ、Lactobacillus rhamnosusに由来する人工分泌シグナルペプチドに融合された抗炎症性サイトカインをコードする核酸を含む改変されたLactobacillus rhamnosusを投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、人工分泌シグナルペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、人工分泌シグナルペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗炎症性サイトカインは、ＩＬ１０である。
【００１１】
いくつかの態様において、任意に、改変されたLactobacillus rhamnosus細胞の単回用量に続く、改変されたLactobacillus rhamnosus細胞によって対象において産生される抗炎症性サイトカインの量は、対照条件下で産生される抗炎症性サイトカインの量より、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍多い。いくつかの態様において、対照条件は、抗炎症性サイトカインを分泌するように改変されたLactobacillus細胞を包含する。いくつかの態様において、任意に、改変されたLactobacillus rhamnosus細胞の単回用量に続く、対象において存在する結腸ＩＬ１０のレベルは、ベースライン（改変されたL. rhamnosus細胞の投与に先立つ３か月以内の平均ＩＬ１０レベル）と比べて、少なくとも２５％、少なくとも３５％、または少なくとも４５％増大する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
図面の簡単な記載
【図１】図１は、Lactobacillusについての分泌シグナルペプチドの各位置における各アミノ酸の蓋然性を指し示す配列ロゴを包含する。配列ロゴは、アミノ酸残基位置重量マトリックス（ＰＷＭ）をコンピュータ処理することによって生成される。パネルＡは、L. rhamnosus（L. rhamnosus SP1）についての分泌シグナルペプチド配列についての配列ロゴを示す。パネルＢは、L. gasseri（L. gasseri SP1）についての分泌シグナルペプチドについての配列ロゴを示す。パネルＣは、L. rhamnosus（L. rhamnosus SP2）についての分泌シグナルペプチドについての配列ロゴを示す。
【００１３】
【図２】図２は、人工分泌シグナルペプチドがLactobacillusから抗ＨＩＶ抗体フラグメント（Ｊ３ＶＨＨ）の分泌を促進できることを指し示す。精製された培養上清を分析した。Ｊ３ＶＨＨの予測されるサイズは、１４．３ＫＤａである。ｈｉｓ精製された培養上清のクーマシー染色（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ）を使用して、これらの画像を生成した。パネルＡは、Ｊ３ＶＨＨに融合された配列番号１として提供される分泌シグナルペプチドをコードするベクターで形質転換されたL. rhamnosusからの精製された培養上清におけるＪ３ＶＨＨの存在を指し示す。分子量タンパク質マーカーは、最後のレーンにおいて指し示される。パネルＢは、Ｊ３ＶＨＨに融合された配列番号３をコードするベクターで形質転換されたL. gasseriからの精製された培養上清におけるＪ３ＶＨＨの存在を指し示す。分子量マーカーは、最初のレーンにおいて差し示される。
【００１４】
【図３】図３は、配列番号３において提供される配列を有する分泌シグナルが、LactobacillusからＪＭ４ＶＨＨ（抗ＨＩＶ抗体フラグメント）、ozoralizumab（抗ＴＮＦα抗体フラグメント）およびＶＲＣ０１ｓｃＦＶ（広く中和するＩｇＧ抗体ＶＲＣ０１由来の抗ＨＩＶ抗体フラグメント）の分泌を促進できることを指し示すデータを示す。指し示された抗体フラグメントに融合された配列番号３において提供される分泌シグナルをコードするベクターで形質転換されたL. gasseri由来の精製された培養上清。分子量マーカーは、最初のレーンに指し示される。各抗体フラグメントについて予測されるサイズは、以下の通りである：ＪＭ４ＶＨＨ：１５ｋＤａ、ozoralizumab：１３．３ｋＤａおよびＶＲＣ０１ｓｃＦＶ：２８．８ｋＤａ。ｈｉｓ精製された培養上清のクーマシー染色（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ）を使用して、これらの画像を生成した。
【００１５】
【図４】図４は、配列番号３において提供されるアミノ酸配列を有する分泌シグナルが、L. gasseriから機能的抗体フラグメントを分泌できることを指し示すデータを示す。データは、ｇｐ１２０（ＹＵ２株）について指し示された分泌抗体の結合親和性を測定するために、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して生成された。
【図５】図５は、L. rhamnosus GG(LGG)SP1（配列番号１）およびL. rhamnosus GG SP2（配列番号５）は、Ｊ３ＶＨＨを分泌できることを指し示すデータを示す。Ｊ３ＶＨＨの予測されるサイズは、１４．３ｋＤａである。ｈｉｓ精製された培養上清のクーマシー染色（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ）を使用して、これらの画像を生成した。
【００１６】
【図６】図６は、L. rhamnosus GG SP2（配列番号５）が、L. rhamnosusから、ｇｐ１２０を結合することができる機能的Ｊ３ＶＨＨを分泌することを指し示すデータを示す。ｇｐ１２０への結合を検出するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図７】図７は、L. rhamnosus GG SP1（配列番号１）が、L. rhamnosusから、ｇｐ１２０を結合することができる機能的Ｊ３ＶＨＨを分泌することを指し示すデータを示す。ｇｐ１２０への結合を検出するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【００１７】
【図８】図８は、指し示す天然に存在する分泌シグナルペプチドの、予測される分泌効率  対  測定された分泌効率に関連するデータを示す。各分泌シグナルは、ｍＣｈｅｒｒｙのＮ末に融合され、およびL. gasseri中で試験した。上清におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を、相対的な蛍光ユニット（ＲＦＵ）における倍率変化として測定した。灰色の棒は、予測される分泌効率を指し示し、および、黒色の棒は、L. gasseriにおけるＲＦＵの、相対的な実験的に測定された倍率変化を指し示す。白色の棒は、L. rhamnosus GGにおけるＲＦＵの、相対的な実験的に測定された倍率変化を指し示す。
【００１８】
【図９】図９は、配列番号３において提供されるアミノ酸配列を有する分泌シグナルペプチド(L. gasseri SP1)が、試験された最も高性能の天然に存在するシグナルペプチド（Ｌｐ３１８９）よりも多く分泌を指向できることを指し示すデータを示す。各分泌シグナルは、ｍＣｈｅｒｒｙのＮ末に融合し、および、L. gasseriで試験した。任意の単位（ＡＵ）で測定される場合の上清におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を指し示す。陰性対照についての蛍光もまた示す。
【００１９】
【図１０】図１０は、L. gasseri SP1（配列番号３）によって分泌されるＪ３ＶＨＨが、文献において報告されるように、従来の方法により産生されたＪ３ＶＨＨと同等のＨＩＶ中和活性を示すことを指し示すデータを包含する。パネルＡは、左側の軸においてL. gasseri SPによって分泌されるＪ３ＶＨＨの濃度を測定するＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。パネルＢは、ＨＩＶ中和活性を査定する’ＴＺＭ−ｂｌデータを示す。手短に言うと、これは、抗体を用いる処置によって保護されるヒトＨＩＶ感受性細胞の画分を測定する。L. gasseri SPによって分泌されるＪ３ＶＨＨのＩＣ５０は、測定されたＩＣ５０として指し示される。文献において報告されるように、従来の方法により産生されたＪ３ＶＨＨのＩＣ５０は、公開されたＩＣ５０として指し示される。
【００２０】
【図１１】図１１は、バイオレイヤー干渉法を介して、L. rhamnosus GG SP1（配列番号１）によって分泌されるＡｂｌｙｎｘによって市販される抗ＴＮＦα抗体フラグメントであるOzoralizumabの機能を分析するデータを包含する。２つの複製物についてのＫＤを示す。
【００２１】
【図１２】図１２Ａ−１２Ｂは、改変されたLactobacilli（図１２Ａ）が、大腸菌（図１２Ｂ）よりも大量に生成物を分泌できることを実証する比較可能なデータを示す。図１２Ａは、L. gasseri SP1（配列番号３）が、L. gasseriにおいて１つ、２つ、および３つの抗原結合部位を有する抗志賀毒素（Ｓｔｘ２）抗体フラグメントを分泌できることを指し示すデータを包含する。ウェスタンブロットを使用して、指し示す細菌を使用する、３つの複製物についての各分泌された抗体の相対量を可視化した。抗志賀毒素モノマーは、従来の単一のモノマー（１７ｋＤａ）であり、およびダイマー（３３．５ｋＤａ）およびトリマー（４８ｋＤａ）は、夫々２つおよび３つの融合されたモノマーである。各々は、抗精製染色タグに２０分間暴露された。L. gasseri SP1を含む改変されたL. gasseriを使用する分泌された志賀毒素（Ｓｔｘ２）に対する化学発光暴露を用いる抗ｅＴａｇ検出抗体を使用するウェスタンブロット結果を示す。
【００２２】
【図１３】図１３は、機械学習によるＳＰ機能の予測的なスコア付に関するデータを包含する。パネルＡは、あるサブセットのアミノ酸が、どのように、それらの生理化学的な特性の類似性に起因して、ペプチド配列における相互のアミノ酸置換を許容し得るかの、Ｖｅｎｎダイアグラムを示す。パネルＢは、特異値分解を介する多次元機能的特性データの線形判別分析（ＳＶＤ−ＬＤＡ）に関連するデータを示す。
【００２３】
【図１４】図１４は、精製されたＩＬ−１０の標準曲線と比較した、無細胞L. rhamnosus GG(LGG)上清を用いるＩＬ−１０捕捉ＥＬＩＳＡからのデータを指し示す。希釈シリーズは、無細胞の陰性対照培養培地において再懸濁された、本来の培養物ＣＦＵ／ｍＬ密度；精製されたＩＬ−１０の分数として報告される。
【００２４】
【図１５】図１５は、配列番号５(L. rhamnosus GG SP2)において提供されるアミノ酸配列を有する分泌シグナルペプチドは、Ａｐｆ分泌ペプチドおよびＵｓｐ分泌ペプチドよりも多くの分泌を指向できることを示すデータを包含する。各分泌シグナルは、ｍＣｈｅｒｒｙに融合され、およびL. rhamnosus GGにおいて試験した。任意のユニット（ＡＵ）で測定される場合、上清におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光が、指し示される。陰性対照についての蛍光もまた示される。
【００２５】
【図１６】図１６は、３３アミノ酸長である、L. gasseri (L. gasseri SP2)についての別の分泌シグナルペプチド配列を記載する配列ロゴである。
【図１７】図１７は、配列番号７(L. gasseri SP2)として提供される配列を有する分泌シグナル配列は、配列番号３(L. gasseri SP1)と同様に、L. gasseriからＪ３−ＶＨＨを分泌できることを示すゲル画像である。レーン１は、非結合対照を有する結果を示し、レーン２は、L. gasseri SP1-J3-VHHを用いる結果を示し、および、レーン３は、L. gasseri SP2-J3-VHHを用いる結果を示す。
【００２６】
【図１８】図１８は、L. gasseri SP2（配列番号７）が、L. gasseriから機能的Ｊ３−ＶＨＨを分泌することを指し示すグラフである。グラフは、精製されていない上清において、抗ｇｐ１２０抗体を使用する、ｇｐ１２０への結合を検出するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｂは、L. rhamnosus GG SP1（配列番号１）（図１９Ａ）およびL. rhamnosus GG SP2（配列番号５）（図１９Ｂ）において存在するモチーフの２つの物理化学的なアミノ酸特性（疎水性およびらせん性）を示すグラフである。
【００２７】
【図２０】図２０Ａ−２０Ｂは、L. gasseri SP1（配列番号３）（図２０Ａ）およびL. gasseri SP2（配列番号７）またはL. gasseri SP3（図２０Ｂ）において存在するモチーフの２つの物理化学的なアミノ酸特性（疎水性およびらせん性）を示すグラフである。
【図２１】図２１は、組み換えL. rhamnosus GGによるＩＬ１０のin vivo送達を示すグラフである。
【図２２】図２２は、ベンダーにより精製されたＧＬＰ２標準捕捉ＥＬＩＳＡ濃度曲線適合を示すグラフである。
【図２３】図２３は、組み換えL. rhamnosus GGによるＧＬＰ１のin vitro分泌を示すグラフである。
【図２４】図２４は、L. gasseriによって分泌されるｈＢＤ１による大腸菌ＡＴＣＣ  ２５９２２増殖阻害を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な記載
本開示は、いくつかの側面において、例えば、Lactobacillus細胞による治療用タンパク質産生における使用のための人工分泌シグナルペプチドを提供する。
【００２９】
人工分泌シグナルペプチド
本開示は、様々なタンパク質の分泌を促進する人工分泌シグナルペプチドを提供する。人工分泌シグナルペプチドは、天然に存在しない分泌シグナルペプチドである。人工配列は、例えば、組み換えでまたは合成により産生され得る。分泌シグナルペプチドは、一般に、分泌経路に侵入する、新たに合成されたタンパク質のＮ末端において存在する短いペプチド（例として、１５〜６０アミノ酸）である。本開示の人工分泌シグナルペプチドは、いくつかの態様において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１、および配列番号７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を包含する。
【００３０】
いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列と同一である。
【００３１】
いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号３によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号３によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号３によって同定されるアミノ酸配列と同一である。
【００３２】
いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号５によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号５によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号５によって同定されるアミノ酸配列と同一である。
【００３３】
いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号７によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号７によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号７によって同定されるアミノ酸配列と同一である。
【００３４】
いくつかの態様において、アミノ酸配列は、配列番号１１によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である。
本明細書に提供されるのはまた、人工分泌シグナルペプチドをコードする核酸である。核酸は、少なくとも２つのヌクレオチドが一緒に共有結合的に結合されており、および、いくつかの場合において、ホスホジエステル結合（例として、ホスホジエステル「主鎖」）を含有し得る。本明細書に記載の核酸は、組み換えまたは合成技術によって生成されてもよい。いくつかの態様において、人工シグナルペプチドをコードする核酸は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれか１つによって同定される核酸配列に対して少なくとも９０％同一である。
【００３５】
いくつかの態様において、核酸は、配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９５％同一である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９８％同一である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号２の核酸配列と同一である。
【００３６】
いくつかの態様において、核酸は、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９５％同一である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９８％同一である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号４の核酸配列と同一である。
【００３７】
いくつかの態様において、核酸は、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも９５％同一である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも９８％同一である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号６の核酸配列と同一である。
【００３８】
いくつかの態様において、核酸は、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも９５％同一である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも９８％同一である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号８の核酸配列と同一である。
いくつかの態様において、核酸は、コドン最適化されている。いくつかの態様において、核酸は、コドン最適化されていない。
【００３９】
本開示は、本明細書に記載の人工分泌シグナルペプチド、並びに、参照人工シグナルペプチド（例として、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１、または配列番号７）とある程度の配列同一性を共有する人工分泌シグナルペプチドのいずれか１以上の使用を包含することが理解されるべきである。パーセント同一性は、配列を比較することによって決定される場合、ポリペプチド（例として、タンパク質およびペプチド）またはポリヌクレオチド（核酸）の２つ以上の配列の間での関係を指す。同一性は、具体的な数学的モデルまたはコンピュータプログラム（例として、「アルゴリズム」）によって取り組まれる（もしあれば）ギャップアライメントを用いる２以上の配列のうちでより小さい配列間の同一適合のパーセントを測定する。
【００４０】
関連分子の同一性は、公知の方法によって容易に計算され得る。「パーセント（％）同一性」は、それがアミノ酸または核酸配列に適用される場合、最大のパーセント同一性を達成するために、配列を配列比較しおよび（必要であれば）ギャップを導入した後、第二の配列のアミノ酸配列または核酸配列における残基と同一の候補アミノ酸または核酸配列における残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージとして定義される。同一性は、パーセント同一性の計算に依存するが、計算において導入されるギャップおよびペナルティーに起因して値において異なり得る。具体的な配列のバリアントは、本明細書に記載のおよび当業者に公知の、配列アライメントプログラムおよびパラメーターによって決定される場合、具体的な参照配列に対する具体的な参照配列同一性に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、しかしながら１００％未満の配列同一性を有し得る。
【００４１】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。同一性を決定するための技法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて成分化される。２つの配列間の相同性を決定するための例示のコンピュータソフトウェアは、これらに限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J. et al. Nucleic Acids Researh, 12(1): 387, 1984)、BLAST suite (Altschul, S. F. et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389, 1997)、およびFASTA (Altschul, S. F. et al. J. Molec. Biol. 215: 403, 1990)を包含する。他の技法は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム(Smith, T.F. et al. J. Mol. Biol. 147: 195, 1981；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム(Needleman, S.B. et al. J. Mol. Biol. 48: 443, 1970；およびFast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm(FOGSAA)(Chakraborty, A. et al. Sci Rep.3: 1746, 2013)を包含する。
【００４２】
いくつかの態様において、本明細書に記載の人工分泌シグナルペプチドは、本明細書に開示の参照配列（例として、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１、または配列番号７）と比べて保存的なアミノ酸置換を含有し得る。保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸置換が行われるタンパク質またはペプチドの相対的な電荷またはサイズ特徴を変更しないアミノ酸置換である。アミノ酸の保存的な置換は、以下の群内のアミノ酸内で行われる置換を包含する：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。いくつかの態様において、人工分泌シグナルペプチドは、参照配列と比較してモチーフの疎水性および／またはらせん性プロファイル（例として、親水性ヘッドモチーフ、疎水性コアモチーフ、または、Ｉ型シグナルペプチダーゼ切断部位）が保存されるように、本明細書に開示の参照配列（例として、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１、または配列番号７）と比べて、１つの保存的なアミノ酸置換を含む。例えば、以下の例７を参照のこと。いくつかの態様において、疎水性は、ΔｔＲ（Ｇｌｙ）を算出することによって測定される。例として、Kovacs et al., Biopolymers. 2006;84(3):283-97を参照のこと。いくつかの態様において、らせん性は、Ｐαを算出することによって測定される。例として、Deber et al., Prptein Sci. 2001 Jan;10(1):212-9を参照のこと。
【００４３】
バリアントは、当業者に公知のポリペプチド配列を変更するための方法（かかる方法を編集する参考文献において見出されるようなものなどの）に従って調製することができる（例として、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al., New York: John Wiley & Sons, 2006；Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Green, M.R.およびSambrook J., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012；Gibson, D.G., et al., Nature Methods 6(5):343-345 (2009)、ポリペプチド調製および改変に関連するこれらの教示は、本明細書に参照により援用される）。
【００４４】
異種タンパク質
本開示の人工分泌シグナルペプチドは、Lactobacillus細胞からの異種タンパク質の分泌を促進する。よって、本明細書に提供されるのは、人工分泌シグナルペプチドに融合された異種タンパク質をコードする核酸である。また本明細書に提供されるのは、完全長の、核酸によってコードされる機能的タンパク質である。異種タンパク質は、具体的な細胞を参照する場合、その細胞によって天然に（通常）産生されないタンパク質である。異種タンパク質は、本明細書に提供されるとおり、Lactobacillus細胞によって天然に産生されない、いずれかのタンパク質であり得る。本来は、ユニークな分泌シグナルペプチドは、Ｓｅｃ経路を介して搬出される各タンパク質に結合される。よって、天然に存在するLactobacillus細胞内には無数の異なる分泌シグナルペプチドが存在し得る、および、分泌シグナルペプチドは、しばしば交換可能ではない（例として、異なるタンパク質の分泌を駆動できない）。驚くべきことに、本明細書に開示の人工分泌シグナルペプチドは、多用途であり、および、様々な異種タンパク質（異種タンパク質を包含する）を分泌するために使用され得る。
【００４５】
非限定例として、本開示の異種タンパク質は、１〜１０，０００アミノ酸長であり得る。いくつかの態様において、異種タンパク質は、１〜１００アミノ酸長、１〜２５アミノ酸長、１〜５０アミノ酸長、１０〜５０アミノ酸長、５０〜１００アミノ酸長、１００〜２００アミノ酸長、２００〜３００アミノ酸長、３００〜４００アミノ酸長、４００〜５００アミノ酸長、５００〜１，０００アミノ酸長、１，０００〜５，０００アミノ酸長、または５，０００〜１０，０００アミノ酸長である。いくつかの態様において、異種タンパク質は、１ｋＤａ〜１０ｋＤａ、１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１ｋＤａ〜１，０００ｋＤａまたは１ｋＤａ〜５，０００ｋＤａである。いくつかの態様において、異種タンパク質は、２ｋＤａ〜５ｋＤａのサイズである。
【００４６】
異種タンパク質は、治療用タンパク質（予防用タンパク質および／または診断用タンパク質を包含する）であり得る。治療用タンパク質の非限定例は、抗体、酵素、ホルモン（例として、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１））、成長因子（例として、ＴＧＦβ、サイトカイン（例として、ＩＬ１０）、血漿タンパク質、融合タンパク質、膜溶解性タンパク質、凝固因子、および抗微生物ペプチドを包含する。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、炎症剤である。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、抗炎症剤である。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、免疫調節剤である。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、抗がん剤である。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、代謝剤である。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、抗ウイルス／殺ウイルス剤である。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、抗細菌／殺細菌剤（例として、デフェンシン（例として、ヒトベータデフェンシン１（ｈＢＤ１）またはベータデフェンシン２（ｈＢＤ２））、ＬＬ−３７、デルマセプチン、ＨＣＶ  Ｃ５アルファペプチド、マガイニン、または細菌起源のいずれかの抗微生物性ペプチドなどの抗細菌性ペプチド）。
【００４７】
本明細書に記載の改変されたLactobacillus細胞のいずれかによって産生される異種タンパク質または改変されたLactobacillus細胞培養物からの上清の抗微生物／殺細菌活性は、当該分野で公知のいずれかの方法によって測定され得る。非限定例として、異種タンパク質または異種タンパク質を含む上清の、微生物の増殖を阻害する能力は、例１０において記載されるように試験され得る。本明細書に記載の改変されたLactobacillus細胞のいずれかによって産生される異種タンパク質または改変されたLactobacillus細胞培養物からの上清は、微生物（例として、病原性細菌）の増殖を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害し得る。
【００４８】
いくつかの態様において、治療用タンパク質は、抗体である。用語「抗体」は、全抗体（２つの重鎖および２つの軽鎖を有する免疫グロブリン）、および抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントは、これらに限定されないが、ラクダ科動物抗体、重鎖フラグメント（ＶＨＨ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ナノボディー（単一ドメイン抗体）、および二特異性抗体（二重特異性／二価の二量体抗体フラグメント）を包含する。いくつかの態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、単一のＢ細胞系譜によって分泌される抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、異なるＢ細胞系譜によって分泌される抗体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、ある種（例として、マウス）からの抗原結合領域（重鎖および軽鎖の可変ドメイン、ＶＨおよびＶＬ）を、別の種（例として、ヒト）からの定常ドメインと融合させることによって作成された抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、そのタンパク質配列がヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントに対するそれらの類似性を増加させるように改変された非ヒト種からの抗体である。いくつかの態様において、抗体は、融合抗体（例として、ＶＨＨまたは他の抗体フラグメントの他のタンパク質タイプへの融合）である。いくつかの態様において、抗体は、その上にＣＤＲ移植が実施され得るヒト化ナノボディー（登録商標）である。
【００４９】
本明細書に提供される方法によって産生されるモノクローナル抗体の非限定例は、アブシキシマブ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））、アダリムマム（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、アレファセプト（ＡＭＥＶＩＶＥ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））、ベリムマブ（ＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標））、ベズロトクスマブ（ＺＩＮＰＬＡＶＡ（登録商標））、カナキヌマブ（ＩＬＡＲＩＳ（登録商標））、セルトリズマブペゴル（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（登録商標））、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ、ＺＩＮＢＲＹＴＡ（登録商標））、デノスマブ  （ＰＲＯＬＩＡ、ＸＧＥＶＡ（登録商標））、エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標））、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））、インフレクトラ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、イキセキズマブ（ＴＡＬＴＺ（登録商標））、ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標））、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、オララツマブ（ＬＡＲＴＲＵＶＯ（登録商標））、オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））、オゾラリズマブ、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、セクキヌマブ（ＣＯＳＥＮＴＹＸ（登録商標））、およびウステキヌマブ（ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標））を包含する。
【００５０】
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法によって産生される抗体は、外来抗原（例として、病原性の細菌、ウイルス、および毒素タンパク質）に結合するかまたは宿主組織上に存在する抗原（例として、上皮または粘膜組織上に存在する表面タンパク質またはＴＮＦα）に結合する。
【００５１】
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法によって産生される抗体は、ウイルス抗原に特異的に結合する。ウイルスの抗原の非制限例は、ボレリア、シャーガス、チクングニア、クラミジア、サイトメガロ、デング熱、エボラ、ＥＢＶ、脳炎、ネコ白血病ウイルス、ハンタウイルス、ＨＢｓＡｇ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヘルペス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、インフルエンザ、ラッサ熱、マラリア、麻疹、ムンプス、マイコプラズマ、ノロウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、風疹、ＳＡＲＳ、志賀様毒素、トキソプラズマ、トレポネーマ、S. Typhi、水痘、西ナイル、およびジカ抗原を包含する。いくつかの態様において、抗体は、ＪＭ４ＶＨＨおよびＶＲＣ０１ｓｃＦＶから選択される抗ＨＩＶ抗体である。
【００５２】
いくつかの態様において、産生される抗体は、微生物抗原に特異的に結合する。微生物抗原の非限定例は、Yersinia spp.、Escherichia spp.、Klebsiella spp.、Acinetobacter spp.、Bordetella spp.、Neisseria spp.、Aeromonas spp.、Franciesella spp.、Corynebacterium spp.、Citrobacter spp.、Chlamydia spp.、Hemophilus spp.、Brucella spp.、Mycobacterium spp.、Legionella spp.、Rhodococcus spp.、Pseudomonas spp.、Helicobacter spp.、Salmonella spp.、Vibrio spp.、Bacillus spp.、Erysipelothrix spp.、Salmonella spp.、Streptomyces spp.、Bacteroides spp.、Prevotella spp.、Clostridium spp.、Bifidobacterium spp.、およびLactobacillus spp.抗原を包含する。いくつかの態様において、抗体は、志賀毒素、アルファ毒素、炭疽菌毒素、シアノ毒素、ジフテリア毒素、外毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、またはボツリヌス神経毒素などの細菌毒素に特異的に結合する。
【００５３】
いくつかの態様において、抗体は、サイトカインなどの炎症性分子に特異的に結合する。サイトカインの非限定例は、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーを包含する。特定の態様において、抗体は、ＴＮＦ−アルファに結合する。
【００５４】
いくつかの態様において、治療用タンパク質は、サイトカインである。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、抗炎症性サイトカインである。抗炎症性サイトカインの非制限例は、インターロイキン（ＩＬ）−１受容体アンタゴニスト、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、およびＩＬ−１３を包含する。いくつかの態様において、治療用タンパク質は、ＩＬ−１０である。
【００５５】
いくつかの態様において、治療用タンパク質は、免疫治療用の腫瘍抑制サイトカインである。免疫治療用サイトカインの非限定例は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＴＧＦβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、およびＧ−ＣＳＦを包含する。
【００５６】
いくつかの態様において、人工分泌ペプチドは、１より多くの異種タンパク質（例として、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００の異種タンパク質）、またはフラグメント（例として、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、またはＦｃフラグメントなどの抗体フラグメント）に融合されている。例えば、人工分泌ペプチドは、１より多くの治療用タンパク質（例として、治療用タンパク質は同じであってもよいし異なっていてもよい）に融合されてもよい。いくつかの態様において、人工分泌ペプチドは、リンカー（例としてグリシン−セリンリンカー）を通じてお互いに連結される、２以上の異種タンパク質に融合されている。いくつかの態様において、人工分泌ペプチドは、抗体（または他の抗体抱合体）に連結されているサイトカインに融合されている。いくつかの態様において、人工分泌ペプチドは、ＩＬ１０−ＩｇＦｃ融合物に融合されている。いくつかの態様において、人工分泌ペプチドは、２つのサイトカイン（例としてセリン−グリシンリンカーなどの、リンカーによって分離される２つのＩＬ−１０サイトカイン）に融合されている。
【００５７】
有利には、本発明の人工分泌シグナルペプチドは、異なる分子量の抗体の産生が可能であり、および、また、多価抗体の生成が可能である。本明細書に記載の本発明のLactobacillus系は、抗体のサイズによって制限されない。例えば、本発明の人工分泌シグナルペプチドは、１つの抗体ドメイン（例として軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン）を含む抗体の分泌を指向することができる。いくつかの例において、抗体は、２つの抗体ドメイン（例として２つの重鎖可変ドメイン、２つの軽鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン）を含む。いくつかの例において、抗体は、３つの抗体ドメインを含む。いくつかの態様において、本開示の抗体は、１つの抗原結合部位を有する。いくつかの態様において、本開示の抗体は、例えば、グリシン−セリンリンカー（グリシンおよびセリンを含むリンカー）などのリンカーによって結合される２つの抗原結合部位を包含する。いくつかの態様において、本開示の抗体は、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つの抗原結合部位を含む多価  抗体である。いくつかの態様において、本開示の抗体は、例えば、２つのリンカー（例としてグリシン−セリンリンカー）によって連結される３つの抗原結合部位を包含する。
【００５８】
本明細書で産生される異種タンパク質は、Lactobacillus細胞内で発現される場合、人工分泌シグナルペプチド、典型的にはそのタンパク質のＮ末端に最初に融合される。しかしながら、シグナルペプチドは、成熟したタンパク質が細胞から分泌される前に切断されることを理解すべきである。よって、本明細書に提供される方法によって産生および分泌される機能的タンパク質は、人工分泌シグナルペプチドを包含しないはずである。
【００５９】
例に示されるとおり、本明細書に提供されるような、産生される異種タンパク質は、機能的である。Ｓｅｃ転移酵素経路を介して搬出されるタンパク質は、合成および分泌の間、折り畳まれていない状態で維持され、および、折り畳みが始まるのは、タンパク質が細胞外環境への拡散のために細胞壁へ放出されるときである。よって、たとえタンパク質が分泌されることが示されているとしても、それは、正確に折り畳まれて、および機能的であるという徴候を帯びるものではない。本開示の異種タンパク質は、適切に折り畳まれ、および機能的であった。抗体などのタンパク質の機能を査定するための方法は、公知であり、これらのいずれかが、本明細書で提供されるとおりに使用され得る。例えば、抗体機能は、例１に示されるとおり、適切な抗原への抗体の結合親和性を測定することによって査定され得る。いくつかの態様において、本明細書に提供される方法によって（例として、Lactobacilli中の人工分泌シグナルペプチドを使用して）産生される抗体の結合親和性は、天然に存在する分泌シグナルペプチドを使用して産生される抗体と同じタイプの抗体の結合親和性に匹敵するかまたはそれよりも大きい。
【００６０】
結合親和性は、見かけの会合定数またはＫＡである。ＫＡは、解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書に記載の方法によって産生された抗体は、標的抗原または抗原性エピトープについて、少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍ、またはこれより低い結合親和性（ＫＤ）を有し得る。増大した結合親和性は、減少したＫＤに対応する。第二の抗原と比べて高い、第一の抗原についての抗体の親和性結合は、第二の抗原を結合するためのＫＡ（または数値ＫＤ）よりも、第一の抗原を結合するためのＫＡが高いこと（または数値ＫＤが小さいこと）によって指し示され得る。かかるケースにおいて、抗体は、第二の抗原（例として、第二の立体配座の同じ第一のタンパク質またはその模倣物；または第二のタンパク質）と比べて、第一の抗原（例として、第一の立体配座の第一のタンパク質またはまたはその模倣物）について特異性を有する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体は、天然に存在する分泌シグナルペプチドを使用して産生された抗体と同じタイプの抗体の結合親和性と比較する場合、適切な抗原に対して、より高い結合親和性（より高いＫＡまたはより小さいＫＤ）を有する。結合親和性における差異（例として、特異性または他の比較について）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００または１０５倍であり得る。いくつかの態様において、本明細書に提供されるとおりの産生された抗体のいずれかは、標的抗原またはその抗原性エピトープへの抗体の結合親和性を増大させるために、さらに親和性を成熟させ得る。
【００６１】
結合親和性（または結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例として、蛍光アッセイを使用する）を包含する、様々な方法によって決定され得る。結合親和性を評価するための例示の条件は、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）中である。これらの技法は、標的タンパク質濃度の関数として、結合された結合タンパク質の濃度を測定するために使用され得る。結合された結合タンパク質の濃度（［Ｂｏｕｎｄ］）は、一般に以下の等式によって、遊離の標的タンパク質の濃度（［Ｆｒｅｅ］）に関連する：
［Ｂｏｕｎｄ］＝［Ｆｒｅｅ］／（Ｋｄ＋［Ｆｒｅｅ］）
【００６２】
しかしながら、ＫＡの正確な測定を行うことは必ずしも必要ではない。なぜなら、ときには、例として、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析または磁性免疫沈降などの方法を使用して測定された、親和性の定量的測定値（これはＫＡに比例する）を得ることは充分であるからであり、およびよって、より高い（例として２倍より高い）親和性によって親和性の定量的測定値を得られるかどうか、または、例として、機能的アッセイ中の活性、例として、in vitroまたはin vivoアッセイによって親和性の推論を得ることができるかどうかを決定するなどの比較のために使用できる。
【００６３】
核酸
本明細書に提供されるのは、いくつかの態様において、人工分泌シグナルペプチドに融合された異種タンパク質をコードする核酸である。本明細書の他に記載されるように、人工分泌シグナルペプチドをコードする核酸は、いくつかの態様において、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のいずれか１つによって同定される核酸配列に対して少なくとも９０％同一である。
【００６４】
いくつかの態様において、核酸は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの、調節タンパク質および分子が結合し得るサブ領域を含有し得る。プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現または転写を駆動する。プロモーターは、その配列の転写開始および／または発現を制御（「駆動」）するヌクレオチド配列に関係して、それが正確な機能的場所および配向である場合、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結され」ているとみなされる。プロモーターは、構成的であってもよいし誘導性であってもよい。誘導性プロモーターは、具体的な因子の存在または不在によって調節される（例として、活性化されるかまたは不活性化される）プロモーターである。
【００６５】
本開示に従って使用するための誘導性プロモーターは、Lactobacillusにおいて機能するものを包含する。本明細書において使用するための例示の誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーターである。
【００６６】
本明細書に提供されるのは、いくつかの態様において、Lactobacillusにおいて異種タンパク質を発現させるための発現ベクターである。本明細書に記載の発現ベクターは、本開示の核酸のいずれかを含んでいてもよい。発現ベクターの例は、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミドおよび細菌性人工染色体（ＢＡＣ）を包含する。本開示の発現ベクターは、標準的な分子クローニング方法を使用して生成され得る（例として、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al., New York: John Wiley & Sons, 2006;Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Green, M.R. and Sambrook J., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012; Gibson, D.G., et al, Nature Methods 6(5):343-345 (2009)を参照のこと、分子クローニングに関連するこれらの教示は、本明細書に参照により援用される）。
【００６７】
改変されたLactobacillus細胞における異種タンパク質産生の方法
本開示のいくつかの側面は、タンパク質（例として、治療用タンパク質などの異種タンパク質）を産生するための方法を提供し、タンパク質を産生するために、本明細書に記載の改変されたLactobacillus細胞を細胞培養培地において培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、細胞培養培地からタンパク質を回収すること（例として、単離することおよび／または精製すること）をさらに含む。
【００６８】
本明細書に提供されるLactobacillus細胞は、人工分泌シグナルペプチドに融合された異種タンパク質をコードする核酸を包含するように改変されている。よって、本開示は、人工分泌シグナルペプチドに融合された異種タンパク質をコードする核酸を含むLactobacillus細胞を提供し、およびまた、異種タンパク質を含むLactobacillus細胞を提供する。改変されたLactobacillus細胞は、少なくとも１つの改変された核酸を含むか、または、その他に、野生型対応物とは構造的または機能的に別個である。よって、人工分泌シグナルペプチドを含むLactobacillus細胞は、改変された細胞であると考えられる。いくつかの態様において、改変されたLactobacillus細胞は、本開示の発現ベクターを含む。本開示の核酸のいずれかは、細菌形質転換を包含するがこれに限定されない、組み換え技術を使用してLactobacillus細胞に導入される。
【００６９】
本開示のLactobacillus細胞は、当該技術分野において周知である条件（例として温度、培養培地およびインキュベーション時間）下で増殖され得る。Lactobacillus細胞が誘導性プロモーターに作動可能に連結される核酸を含むいくつかの態様において、Lactobacillus細胞は、誘導性プロモーターからの発現を誘導するために、有効量の誘導剤の存在下で培養される。いくつかの態様において、異種タンパク質をコードする核酸の発現を駆動する誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーターであり、よって、Lactobacillus細胞は、テトラサイクリン誘導性プロモーターからの発現を誘導するために、有効量のテトラサイクリン中で培養される。
【００７０】
抗体精製方法は、これらに限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、アンモニウムスルファート沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属キレートクロマトグラフィー、チオ親和性(thiophilic)吸着、ｍｅｌｏｎゲルクロマトグラフィーおよび抗体リガンドクロマトグラフィーを包含し、これらのいずれかが、Lactobacillus細胞からの分泌後にタンパク質を回収するために、本明細書に提供されるとおり使用され得る。
【００７１】
驚くべきことに、本開示の人工分泌シグナルペプチドの使用は、天然に存在する分泌シグナルペプチドを使用して産生される異種タンパク質よりも、少なくとも二桁大きい規模の収量で、異種タンパク質の産生（例として、抗体の産生）を生じる。いくつかの態様において、本明細書に提供される産生された異種タンパク質の収量は、天然に存在する分泌シグナルペプチドを使用して産生される異種タンパク質よりも、少なくとも２〜１０桁大きい規模である。例えば、提供される産生された異種タンパク質の収量は、天然に存在する分泌シグナルペプチドを使用して産生される異種タンパク質よりも、２、３、４、５、６、７、８、９または１０桁大きい規模であり得る。
【００７２】
いくつかの態様において、本明細書に提供される産生された異種タンパク質の収量は、細胞培養培地（または他の培地または緩衝液）の少なくとも１ｎｇ／ｍＬである。いくつかの態様において、産生される異種タンパク質の収量は、少なくとも１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも７００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも８００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも９００ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも１μｇ／ｍＬである。
【００７３】
いくつかの態様において、本明細書に提供される産生された異種タンパク質の収量は、細胞培養培地（または他の培地または緩衝液）の少なくとも１０μｇ／ｍＬである。いくつかの態様において、産生される異種タンパク質の収量は、細胞培養培地の少なくとも２０μｇ／ｍＬである。いくつかの態様において、産生される異種タンパク質の収量は、細胞培養培地の少なくとも３０μｇ／ｍＬである。いくつかの態様において、産生される異種タンパク質の収量は、細胞培養培地の少なくとも４０μｇ／ｍＬである。いくつかの態様において、産生される異種タンパク質の収量は、細胞培養培地の少なくとも５０μｇ／ｍＬである。いくつかの態様において、産生される異種タンパク質の収量は、１０μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬである。
【００７４】
また驚くべきことは、本明細書に提供されるデータであり、これは、本明細書に提供されるLactobacillus系の細胞は、Escherichia細胞よりも大量に異種タンパク質を分泌することを示す（例３を参照のこと）。よって、いくつかの態様において、本明細書に提供される方法は、Lactobacillus細胞を使用して、Escherichia細胞を使用する場合に達成される収率よりも、少なくとも２〜１０倍大きい収率での異種タンパク質産生を生じる。例えば、本明細書に提供される方法は、Lactobacillus細胞を使用して、Escherichia細胞を使用する場合に達成される収率よりも、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍大きい収率での異種タンパク質産生を生じ得る。
【００７５】
いくつかの態様において、本開示のLactobacillus細胞は、生菌細胞である。生菌細胞は、適正な量で投与される場合、これらが投与される宿主に対して健康上の利益を付与する。例えば、生菌細胞は、宿主の粘膜（例として腸および膣の粘膜）において健康上の利益を付与し得る。例示のLactobacillusの生菌種は、これらに限定されないが、L. gasseri、L. rhamnosus、L. plantarum、L. casei、L. salivariusおよびL. helveticusを包含する。本明細書に提供されるような使用のための例示のLactobacillus株は、L. rhamnosus GG、L. gasseri ATCC 33323およびL. gasseri OLL2716を包含する。
【００７６】
いくつかの場合において、分泌されたタンパク質（例として、抗体）の相対的な量は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびウェスタンブロット（例として、以下の例１および２を参照のこと）を使用して決定され得る。分泌されたタンパク質の機能は、当該分野で公知の方法を使用して試験され得る。例えば、抗ＨＩＶ抗体は、それらのｇｐ１２０を結合する能力について試験され得る（例として、以下の例１を参照のこと）。抗ＨＩＶ抗体はまた、ＴＺＭ−ｂｌアッセイを用いてそれらのＨＩＶを中和する能力について試験され得る（例として、以下の例２を参照のこと）。
【００７７】
治療的／予防的適用および医薬組成物
以下に議論されるとおり、本開示の抗体分泌Lactobacillus細胞は、様々な治療的および予防的適用において、生菌薬物送達ベクターとして使用され得る。改変された細胞はしばしば、対象において外来物質として認識される危険を冒しており、および有害な免疫応答を潜在的に誘発し得る。例えば、あるタイプの細菌は、病原性である（例として大腸菌およびStaphylococcus aureusのある株）。したがって、たとえ大腸菌は遺伝子操作を受け入れられるとしても、これらは、対象（例としてヒト）における好ましい薬物送達ベクターではない。有利には、Lactobacillusの様々な株は、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）として分類されており、およびよって、薬物送達のための好ましい薬剤である。さらにまた、ＣＲＩＳＰＲなどのゲノム編集技術は、意図されない突然変異を永続的に導入するオフターゲット効果を有し得るが、本開示のLactobacillus系は、粘膜器官への局所薬物送達、微生物のコロニー形成による連続的な産生を介する持続的な半減期、および低産生費用を可能にする。
【００７８】
本開示はまた、いくつかの側面において、対象へ、本開示の改変されたLactobacillus細胞（例として、生菌細胞）または治療用タンパク質（例として、炎症剤、抗炎症剤、免疫調節剤、抗がん剤、代謝剤、抗ウイルス／殺ウイルス剤、または抗細菌／殺細菌剤）を投与することを包含する方法を提供する。
【００７９】
本開示の改変されたLactobacillus細胞（例として、生菌細胞）または治療用タンパク質のいずれかの投与は、対象における具体的なタンパク質の量を、対象におけるタンパク質のレベルのベースラインレベルと比較して、少なくとも５％（例として、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、または少なくとも１，０００％）増大させ得る。いくつかの態様において、本開示の改変されたLactobacillus細胞（例として、生菌細胞）のいずれかの投与は、対照条件下で産生されたタンパク質の量よりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍多い、対照における異種タンパク質の産生を生じる。
【００８０】
対象におけるタンパク質（例として、治療用タンパク質を包含する異種タンパク質）の量は、いずれかの好適な方法（例として、ウェスタンブロット、目的のタンパク質を認識する抗体を用いる免疫蛍光、またはＥＬＩＳＡ）を使用して、いずれかの組織または器官（例として、血液、結腸、肺、心臓、粘膜、汗、精液、唾液等々）において測定され得る。タンパク質の量は、本開示の改変されたLactobacillus細胞（例として、生菌細胞）または治療用タンパク質のいずれかの少なくとも１用量（例として、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、または１００用量）に続いて測定され得、および、タンパク質のベースラインまたは対照レベルと比較される。
【００８１】
タンパク質のベースラインレベルまたは対照レベルは、本開示の改変されたLactobacillus細胞（例として、生菌細胞）または治療用タンパク質のいずれかの投与に先立つ、内在性タンパク質の量を指す。非限定例として、対照またはタンパク質のベースラインレベルは、本開示の改変されたLactobacillus細胞（例として、生菌細胞）または治療用タンパクの投与に先立つ、１月、２月、３月、４月、５月、１０月、または１２月以内に決定され得る。
【００８２】
典型的には、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、自己免疫状態を有する。自己免疫状態の非限定例は、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫血管性浮腫、自己免疫自律神経失調症、自己免疫脳脊髄炎、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫心筋炎、自己免疫膵炎、自己免疫網膜症、自己免疫じんましん、神経細胞軸索型ニューロパチー(Axonal & neuronal neuropathy:AMAN)、Ｂａｌｏ病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ヘルペス状皮膚炎、皮膚筋炎、Ｄｅｖｉｃ病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、必須の混合型クリオブロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠ヘルペスまたは妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、腫瘍随伴性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿（ＰＮＨ）、Ｐａｒｒｙ  Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ブドウ膜炎）、パーソネイジ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性症候群Ｉ型、ＩＩ、ＩＩＩ、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、自己免疫性精子形成障害(Sperm & testicular autoimmunity)、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、Ｓｕｓａｃ症候群、交��性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症（または多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ））を包含する。
【００８３】
本開示は、いくつかの態様において、腸の炎症を有する対象へ、改変されたLactobacillus細胞または分泌された治療用タンパク質を投与する方法を提供する。腸の炎症の例は、これらに限定されないが、クローン病、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）および潰瘍性大腸炎を包含する。潰瘍性大腸炎は、例えば、大腸（結腸）および直腸の最内裏層(innermost lining)における長期にわたる炎症およびひりひりする痛み(sore)（潰瘍）を引き起こす。クローン病は、別の例として、消化管の裏層の炎症によって特徴づけられ、これはしばしば、罹患組織深くに広がる。
【００８４】
いくつかの態様において、本開示の抗炎症性サイトカイン（例として抗ＴＮＦα）を分泌する改変されたLactobacillus細胞は、腸の炎症を有する対象に投与される。いくつかの態様において、腸の炎症は、クローン病である。いくつかの態様において、腸の炎症は、過敏性腸疾患である。いくつかの態様において、腸の炎症は、過敏性腸症候群である。いくつかの態様において、腸の炎症は、潰瘍性大腸炎である。いくつかの態様において、改変されたLactobacillusの投与は、対象の炎症を、少なくとも１０％（例として１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、７０％、８０％または９０％）を低減させ得る。炎症は、当該技術分野において周知である方法を使用してモニタリングされ得る。例えば、炎症性サイトカインのレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して検出してもよい。
【００８５】
いくつかの態様において、対象は、ウイルスの感染症または微生物の感染症を有する。ウイルス感染症または微生物の感染症は、腸、皮膚、肺、上咽頭、または女性器を包含する、いずれかの組織または器官に発症し得る。ウイルス感染症の例は、これらに限定されないが、ボレリア、シャーガス、チクングニア、クラミジア、サイトメガロ、デング熱、エボラ、ＥＢＶ、脳炎、ネコ白血病ウイルス、ハンタウイルス、ＨＢｓＡｇ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヘルペス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、インフルエンザ、ラッサ熱、マラリア、麻疹、ムンプス、マイコプラズマ、ノロウイルス、ロトウイルス（Ｒｏｔｏｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス、パルボウイルス、風疹、ＳＡＲＳ、志賀様毒素、トキソプラズマ、トレポネーマ、S. Typhi、水痘、西ナイル、およびジカ抗原を包含する。微生物の感染症の例は、これらに限定されないが、Yersinia spp.、Escherichia spp.、Klebsiella spp.、Acinetobacter spp.、Bordetella spp.、Neisseria spp.、Aeromonas spp.、Franciesella spp.、Corynebacterium spp.、Citrobacter spp.、Chlamydia spp.、Hemophilus spp.、Brucella spp.、Mycobacterium spp.、Legionella spp.、Rhodococcus spp.、Pseudomonas spp.、Helicobacter spp.、Salmonella spp.、Vibrio spp.、Bacillus spp.、Erysipelothrix spp.、Salmonella spp.、Streptomyces spp.、Bacteroides spp.、Prevotella spp.、Clostridium spp.、Bifidobacterium spp.、およびLactobacillus spp.感染症を包含する。
【００８６】
いくつかの態様において、Lactobacillus細胞組成物は、予防処置として、対象に、例えば、微生物感染症またはＨＩＶ感染症などのウイルス感染症を予防するために、投与される。よって、いくつかの態様において、Lactobacillus細胞は、抗微生物抗体または抗ＨＩＶ抗体などの抗ウイルス抗体をコードする核酸をコードするように改変されている。
【００８７】
いくつかの態様において、１以上の異種タンパク質を産生する、本開示の改変されたLactobacillus細胞（例として、L. gasseri、L. rhamnosus、L. plantarum、L. casei、L. salivarius、L. acidophilus、L. delbreuckii、L. bulgaricus、L. jensenii、L. crispatus、L. paracasei、L. johnsonii、L. reuteri、L. fermentum、L. brevis、およびL. helveticus）のいずれかは、疾患（例として、胃腸管、呼吸器、女性器、またはそれらのいずれかの組み合わせに発症する疾患）を有する対象に投与される。改変されたLactobacillus細胞は、宿主組織を調節し得る（例として、ＩＬ１０を介する免疫調節効果またはＧＬＰ１を介するホルモン効果）か、または、病原体または毒素（例としてウイルスまたは細菌）を中和し得る。非限定例として、ｈＢＤ１、Ｊ３、抗志賀毒素ナノボディー、またはそれらの組み合わせを分泌するように改変されたLactobacillus細胞は、これを必要とする対象に、病原体、毒素、またはそれらの組み合わせを中和するために投与され得る。
【００８８】
Lactobacillus細胞および／または分泌されたタンパク質は、いくつかの態様において、医薬組成物において製剤化される。医薬組成物は、医薬担体（例としてリポソームまたはナノ担体）を含んでいてもよい。医薬組成物はまた、薬学的に許容し得る賦形剤を包含してもよいし、代替的に包含してもよい。薬学的に許容し得る賦形剤の非制限例は、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを包含する。薬学的に許容し得る賦形剤は、リン酸緩衝化生理食塩水、炭酸水素溶液、防腐剤、安定化剤、乳化剤（例としてホスホ脂質乳化剤）、可溶化剤（例として、界面活性剤）、または結合剤を含み得る。賦形剤は、投与の様式およびルート、および標準的な医薬習慣に基づいて選択され得る。
【００８９】
本開示の医薬組成物の製剤化および／または製造における一般的な考慮は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005（その全体が参照により本明細書に援用される）において見出され得る。
【００９０】
有効量または治療的に有効な量は、単独で、または、少なくとも１の他の活性剤と組み合わせて、対象に治療効果を付与するために必要な活性剤の量である。有効量は、当業者によって認識されるとおり、投与のルート、賦形剤の用法、および他の活性剤の同時用法に依存して、変化し得る。投与される分量は、例えば、個々の免疫系の強度または遺伝的素因を包含する、処置される対象に依存する。好適な投薬量の範囲は、当業者によって容易に決定され、および、本開示のポリペプチドのマイクログラムのオーダーに基づき得る。本明細書に開示の組成物の投薬量は、投与のルートに依存し得、および、対象のサイズに従って変化し得る。
【００９１】
いくつかの場合において、改変されたLactobacillus細胞（例として、生菌細胞）または治療用タンパク質のいずれかの少なくとも１の用量（例として、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、または１００用量）は、対象に投与される。例としては、改変されたLactobacillus細胞の用量は、１０３〜１０５０（例として、１０６〜１０２０）のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）を含み得る。
【００９２】
当業者によって理解されるように、投薬スケジュールは、様々な因子（例として、投与される細菌のタイプまたは株、投与されるタンパク質のタイプ等々を包含する、投与される組成物のタイプ）に依存して変化し得る。投薬スケジュールの非制限例は、１日に少なくとも１用量、１日おきに少なくとも１用量、１日に少なくとも２用量、１日に少なくとも３用量、２日毎に少なくとも１用量、３日毎に少なくとも１用量、４日毎に少なくとも１用量、５日毎に少なくとも１用量、６日毎に少なくとも１用量、毎週少なくとも１用量、または毎月少なくとも１用量の投与を包含する。いくつかの態様において、改変されたLactobacillus細胞のいずれかの少なくとも１用量（例として、１用量または３用量）は、対象に、１日１回、１日おきに１回、または週１回投与される。本明細書に記載の改変されたLactobacillus細胞またはタンパク質のいずれかの用量は、食事と共に、または、食事を伴わずに投与され得る。
【００９３】
投与の好適なルートは、注射または埋め込みによる、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、髄腔内に、腹腔内に、皮膚内(intracuteanously)、大槽内(intrasternally)、関節内に、頭蓋内に、病変内に(intralesionally)、直腸内に(intrarectually)、直腸内に(intrarectally)、膣内に、鼻腔内に、胃内に(intragastically)、気管内に、または肺内に(intrapulmonarily)を包含する。代替的に、坐薬、経口製剤、腸内、経鼻、局所のまたは経粘膜投与を包含する、他の投与様式は、所望され得る。坐薬については、バインダーおよび担体は、例えば、ポリアルカレン(polyalkalene)グリコールまたはトリグリセリドを包含し得る。経口製剤は、例えば、医薬グレードのサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等のような、通常使用される添加物(incipient)を包含し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤または粉末の形態をとり得る。非限定例として、Lactobacillus細胞は、腸溶性カプセル、錠剤、スラリーで製剤化されてもよいし、または乳製品ベースの食品(dairy based food product)で製剤化されてもよい。
【００９４】
当業者によって、投与の好適なルートは、投与される組成物のタイプに依存し得ることが理解されるべきである。例えば、投与のあるルート（例として、非経口、静脈内、または皮下投与）は、対象への細菌細胞の投与に好適でないかもしれない。なぜなら、具体的な理論に拘束されることなく、血流への細菌の直接投与は、敗血症を引き起こし得るからである。対照的に、非経口、静脈内、または皮下投与は、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される組み換えペプチドの投与に好適であり得る。
【００９５】
上に言及されるとおり、必要とされる投薬量は、投与のルートの選択；製剤の性質；対象の病気の性質；対象の種、サイズ、重量、表面積、年齢、および性別；他の投与される薬物；および実践者の判断に依存する。好適な投薬量は、０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要な投薬量の広範なバリエーションが、入手可能な組成物の種類および投与の様々なルートの異なる効率を考慮して、予測されるべきである。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも、高い投与量を必要とすることが予測される。これらの投薬量レベルにおけるバリエーションは、当該技術分野において十分に理解されるような最適化のための標準的な経験上のルーチンを使用して調整され得る。好適な送達ビヒクル（例として、ポリマーマイクロ粒子または移植可能なデバイス）中の組成物のカプセル化は、送達、具体的には経口送達の効率を増大させ得る。
【００９６】
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法は、アミノ酸残基位置重量マトリックス（例として、以下の例１を参照のこと）を使用して、Lactobacillus株特異的シグナルペプチド配列をコンピュータ処理することを包含する。位置重量マトリックスをコンピュータ処理するために使用され得る例示のコンピュータプログラムは、ＧＬＡＭである。いくつかの態様において、方法は、位置重量マトリックスをコンピュータ処理すること、および、潜在的に機能的でないバリアントをin silicoで選別するために、ＳＰ機能の予測的スコア付を可能にするアルゴリズムをさらに使用することを包含する（例として、以下の例４を参照のこと）。
【００９７】
追加の態様
本開示はまた、番号をつけた段落によって包含される以下の追加の態様を提供する。
１．  配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１、および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む人工分泌シグナルペプチド。
２．  アミノ酸配列は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である、段落１に記載の人工分泌シグナルペプチド。
３．  アミノ酸配列は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である、段落２に記載の人工分泌シグナルペプチド。
４．  アミノ酸配列は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列と同一である、段落３に記載の人工分泌シグナルペプチド。
５．  アミノ酸配列は、配列番号３によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である、段落１に記載の人工分泌シグナルペプチド。
６．  アミノ酸配列は、配列番号３によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である、段落５に記載の人工分泌シグナルペプチド。
７．  アミノ酸配列は、配列番号３によって同定されるアミノ酸配列と同一である、段落６に記載の人工分泌シグナルペプチド。
８．  アミノ酸配列は、配列番号５によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である、段落１に記載の人工分泌シグナルペプチド。
９．  アミノ酸配列は、配列番号５によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である、段落８に記載の人工分泌シグナルペプチド。
１０．  アミノ酸配列は、配列番号５によって同定されるアミノ酸配列と同一である、段落９に記載の人工分泌シグナルペプチド。
１１．  アミノ酸配列は、配列番号１１または配列番号７によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である、段落１に記載の人工分泌シグナルペプチド。
１２．  アミノ酸配列は、配列番号１１または配列番号７によって同定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一である、段落１１に記載の人工分泌シグナルペプチド。
１３．  アミノ酸配列は、配列番号１１または配列番号７によって同定されるアミノ酸配列と同一である、段落１２に記載の人工分泌シグナルペプチド。
１４．  段落１〜１３のいずれか１つに記載の人工分泌シグナルペプチドに融合されたタンパク質。
１５．  人工分泌シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端に融合されている、段落１４に記載のタンパク質。
１６．  タンパク質は、治療用タンパク質である、段落１４または１５に記載のタンパク質。
１７．  タンパク質は、抗体である、段落１６に記載のタンパク質。
１８．  抗体は、ウイルス抗原または微生物抗原に特異的に結合する、段落１７に記載のタンパク質。
１９．  抗体は、単一ドメイン抗体（ナノボディー（登録商標））である、段落１７または１８に記載のタンパク質。
２０．  治療用タンパク質は、サイトカインである、段落１６に記載のタンパク質。
２１．  サイトカインは、ＩＬ−１０である、段落２０に記載のタンパク質。
【００９８】
２２．  段落１〜１５のいずれか１つに記載の人工分泌シグナルペプチドまたは段落１４〜２１のいずれか１つに記載のタンパク質タンパク質をコードする核酸。
２３．  核酸は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、段落２２に記載の核酸。
２４．  プロモーターは、誘導性プロモーターである、段落２３に記載の核酸。
２５．  核酸は、コドン最適化されている、段落２２〜２４のいずれか１つに記載の核酸。
２６．  段落２２〜２５のいずれか１つに記載の核酸を含むベクター。
２７．  ベクターは、発現ベクターである、段落２６に記載のベクター。
２８．  段落２２〜２５のいずれか１つに記載の核酸または段落２６または２７に記載のベクターを含む、改変されたLactobacillus細胞。
２９．  改変されたLactobacillus細胞は、L. gasseriおよびL. rhamnosus細胞から選択される、段落２８に記載の改変されたLactobacillus細胞。
【００９９】
３０．  核酸によってコードされるタンパク質を産生するために、段落２８または２９に記載の改変されたLactobacillus細胞を、細胞培養培地中で培養することを含む、タンパク質を産生する方法。
３１．  改変されたLactobacillus細胞は、Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) 細胞である、段落３０に記載の方法。
３２．  Lactobacillus細胞は、細胞培養培地の１ｍＬあたり、少なくとも１０μｇのタンパク質を産生する、段落３０または３１に記載の方法。
３３．  Lactobacillus細胞は、細胞培養培地の１ｍＬあたり、少なくとも３０μｇのタンパク質を産生する、段落３２に記載の方法。
３４．  細胞培養培地からタンパク質を回収することをさらに含む、段落３３に記載の方法。
３５．  段落３３または３４に記載の方法によって産生されたタンパク質。
３６．  段落２８または２９に記載の改変されたLactobacillus細胞または段落３５に記載のタンパク質を対象に投与することを含む方法。
３７．  対象は、自己免疫状態を有する、段落３６に記載の方法。
３８．  自己免疫疾患は、炎症性腸疾患またはクローン病である、段落３７に記載の方法。
３９．  対象は、ウイルス感染症または微生物発明を有する、段落３６に記載の方法。
【０１００】
４０．  （ａ）菌株特異的配列のライブラリー内のシグナル配列の集団についてアミノ酸残基位置重量マトリックス（ＰＷＭ）をコンピュータ処理すること；および
（ｂ）シグナル配列の集団について、ＰＷＭに基づいてコンセンサスシグナルペプチド配列を生成すること、を含む方法。
４１．  （ｃ）コンセンサスシグナルペプチド配列を含むシグナルペプチドに連結された目的の異種タンパク質を、菌株の細胞において発現させることをさらに含む、段落４０に記載の方法。
４２．  菌株は、Yersinia spp.、Escherichia spp.、Klebsiella spp.、Acinetobacter spp.、Bordetella spp.、Neisseria spp.、Aeromonas spp.、Franciesella spp.、Corynebacterium spp.、Citrobacter spp.、Chlamydia spp.、Hemophilus spp.、Brucella spp.、Mycobacterium spp.、Legionella spp.、Rhodococcus spp.、Pseudomonas spp.、Helicobacter spp.、Salmonella spp.、Vibrio spp.、Bacillus spp.、Erysipelothrix spp.、Salmonella spp.、Streptomyces spp.、Bacteroides spp.、Prevotella spp.、Clostridium spp.、Bifidobacterium spp.、またはLactobacillus spp.から選択される、段落４０または４１に記載の方法。
４３．  細菌細胞は、生菌細胞である、段落４２に記載の方法。
４４．  目的の異種タンパク質は、治療用タンパク質である、段落４０〜４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．  治療用タンパク質は、抗体である、段落４４に記載の方法。
４６．  コンセンサスシグナルペプチド配列に連結された目的の異種タンパク質をコードする核酸は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、段落４１〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【実施例】
【０１０１】
例１：Lactobacillusから抗体フラグメントを分泌することができる人工分泌シグナルの同定。
様々な抗体フラグメントを信頼しておよび再生可能にスクリーニングすることができるシグナルペプチド配列を同定するために、配列決定されたゲノムを有する全てのLactobacillusの計算分析からアセンブリされた分泌シグナルの汎ゲノムライブラリーのハイスループットスクリーニングを行った。これは、分泌を改善するために遺伝子ダイアルが調整され得る範囲を拡大する、今日までで最も大規模な候補分泌シグナルペプチドプールを構成するが、並列アプローチの基礎もまた提供する。それらの天然のタンパク質パートナーとともにおそらく共同進化した既存の分泌シグナルに依存するのではなく、ライブラリーは、株対株ベースの潜在的に一般化可能な人工シグナルの設計のための鋳型配列に圧縮され得る。公に入手可能なモチーフ発見アルゴリズムを使用して、ライブラリーの株特異的サブセクションを分析し、アミノ酸残基位置重量マトリックス（ＰＷＭ）をコンピュータ処理し、および、最も蓋然性の高いペプチドを生成する。
【０１０２】
L. rhamnosus GGおよびL. gasseriは、ヒトマイクロバイオームにおける（例として、腸および膣粘膜における）注目すべき腸内有益菌であり、および、ヒトマイクロバイオームにおけるエンドポイント適用において使用され得、ペプチド配列の分析を、L. rhamnosus GG（図１、パネルＡ）およびL. gasseri（図１、パネルＢ）に対して実施した。各株のＰＷＭによって生じる最も蓋然性の高い配列を最初に選択し（L. rhamnosus GGについて配列番号１およびL. gasseriについて配列番号３）、対応する株特異的およびコドン最適化されたヌクレオチド配列（L. rhamnosus GGについて配列番号２およびL. gasseriについて配列番号４）を、種ゲノムから作成したコドン使用表を使用して生成した。次いで、抗ＨＩＶ抗体フラグメント１（Ｊ３ＶＨＨ）のＮ末に融合されたときの、各分泌シグナルペプチドの分泌を指向する能力を試験した。顕著なことに、両方の人工シグナルペプチドは、Ｊ３ＶＨＨ（図２、パネルＡおよびＢ）の分泌を指向した。
【０１０３】
今日まで、L. gasseriにおいてナノボディーを分泌することができる天然に存在する分泌シグナルは見出されていなかった。L. rhamnosusについては、開示された分泌シグナルペプチドは、最も高い収量の天然に存在する配列よりも２桁の規模優れている。分泌を、L. rhamnosusおよびL. gasseriについて、夫々２２．０５％および５９．８４％タンパク質カバー度で、質量分析によってさらに確認した（カバー度における相違は、図２に見られるような相対的な分泌収率に相関する）。加えて、分泌シグナルペプチドは、配列がコンピュータ処理された株と一致しない場合、分泌は観察されず、このストラテジーにおける株特異性を指し示す。これらの配列が構成的プロモーターによって発現される場合、シグナルペプチドは、それらの機能を破壊するやり方で迅速に変異する。しかしながら、テトラサイクリン誘導系によって制御される場合、これらは遺伝子学的に安定したままである。
【０１０４】
開示された分泌シグナルペプチドはまた、第二の公開された抗ＨＩＶナノボディー（登録商標）２（ＪＭ４ＶＨＨ）、Ａｂｌｙｎｘによって市販される抗ＴＮＦαナノボディー（登録商標）（ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、および幅広く中和するＩｇＧ抗体ＶＲＣ０１（ＶＲＣ０１ｓｃＦｖ）に由来する公開された抗ＨＩＶ単一鎖フラグメント３を包含する、他の抗体フラグメントとともに機能した。配列番号３として提供される分泌シグナルペプチドに融合される場合、L. gasseriによる上清への分泌を、ＪＭ４ＶＨＨおよびｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂの場合、Ｊ３ＶＨＨに等しいレベルで、および、ＶＲＣ０１ｓｃＦｖについてのレベルの半分のレベルで検出した（図３）。後者のタンパク質についての減少した収量は、それが試験された他の抗体フラグメントのサイズの２倍であるという事実に起因し得る。
【０１０５】
開示された分泌シグナルペプチドを使用するLactobacillusから分泌された抗体フラグメントを、抗体フラグメントが機能的であるかどうかを決定するために試験した。Sec転換酵素経路を介して搬出されるタンパク質は、合成および分泌の間、折り畳まれていない状態で維持され、および、折り畳みが始まるのは、細胞外環境への拡散のために細胞壁に放出されるときである。よって、たとえタンパク質が分泌されることが示されるとしても、それは正確に折り畳まれており、機能的であるという徴候を帯びるものではない。そのため、適切な抗原への結合親和性を測定するアッセイを使用して、分泌された抗体フラグメントが機能的であるかどうかを決定した。
【０１０６】
そのため、抗体フラグメントを、適切な抗原に対する結合親和性を測定するアッセイを使用して、機能について直接試験されることによって、適切に折り畳まれていることを証明した。試験された抗ＨＩＶ抗体の全ては、Ｔ細胞ＣＤ４受容体への結合に協調するウイルスコートタンパク質であるｇｐ１２０を結合することを実証した。結果的に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施して、配列番号３に提供されるアミノ酸配列を有する分泌シグナルのＮ末に融合された抗体フラグメントを含むL. gasseriにおいてｇｐ１２０についての抗体結合親和性を測定した（図４）。全ての抗ＨＩＶ抗体バリアントについて測定された結合曲線は、各々について、これまでに公開された結果に匹敵する１−３。機能は、リアルタイムで結合動態を測定するためのＯｃｔｅｔ機器を使用して、バイオレイヤー干渉法(biolayer interferometry)によって二次的に証明した。これらの実験は、ＶＲＣ０１ｓｃＦＶ、Ｊ３ＶＨＨ、およびＪＭ４ＶＨＨについて夫々、１０．２２ｎＭ、７５．５５ｎＭ、および１１０．９ｎＭのＨＩＶ−ＲＳＣ３についてのＫＤ値を報告し、抗ＨＩＶ抗体について試験されたＥＬＩＳＡデータを実証した。Ｊ３ＶＨＨおよびＪＭ４ＶＨＨは、ＶＲＣ０１などの他の抗体バリアントと比較して、ＲＳＣ３抗原への結合が相対的に弱いことが実証されていることは注目に値する。並行して、ＴＮＦαに対するL. gasseri分泌ozoralizumab結合を測定し、０．６９ｎＭ±．２６ｎＭ（ｎ＝３）のＫＤを有していた。両方の場合において、結合活性が予測されていない抗体を陰性対照（すなわち、ＴＮＦα実験についてＪ３ＶＨＨ、ＨＩＶ  実験についてｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）として使用した。陰性対照は、全ての有効な実験にわたり、測定可能な結合活性を登録しなかった。同様に、L. rhamnosus GG SP1（配列番号１）を含む人工分泌シグナルは、上に記載されるｇｐ１２０  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される場合、機能的なＪ３ＶＨＨを分泌した（図７）。Ａｂｌｙｎｘによって市販される抗ＴＮＦα抗体フラグメント、L. rhamnosus GG SP1によって分泌されるozoralizumabの機能を、バイオレイヤー干渉法を介して測定した。この方法は、分泌された抗体フラグメントが、Ａｂｌｙｎｘによって報告されるozoralizumab活性と同等のナノモル濃度の親和性（ＫＤ＝６．２ｎＭ、２複製物）で、その標的タンパク質に結合することを示した（図１１）。
【０１０７】
L. rhamnosus GGにおいて再現可能な機能性を有する別の分泌シグナルペプチドを、異なる長さの別のアミノ酸（L. rhamnosus GG SP2について３０アミノ酸  対  L. rhamnosus GG SP1について２５アミノ酸）に基づいて、配列番号５において提供されるアミノ酸配列(L. rhamnosus GG SP2)を有すると同定した。配列番号５をコードする核酸は、配列番号６として提供される。L. rhamnosus GG SP1およびL. rhamnosus GG SP2の両方は、L. rhamnosusからＪ３ＶＨＨを分泌した（図５）。ＥＬＩＳＡを実施して、L. rhamnosus GG SP2によって分泌されたＪ３ＶＨＨが機能的であるかどうかを測定した。Ｊ３ＶＨＨに融合されたL. rhamnosus GG SP2を含む改変されたL. rhamnosus GGからの上清および精製された上清を分析して、分泌されたＪ３ＶＨＨのｇｐ１２０への結合親和性を決定した。ｇｐ１２０への結合は、陰性対照と比較して、Ｊ３ＶＨＨに融合したL. rhamnosus GG SP2を含む改変されたL. rhamnosus GGからの上清および精製された上清において有意に高く、分泌されたＪ３ＶＨＨが機能的であることが示唆された（図６）。
【０１０８】
文献において報告された８つの基準のペプチド配列の予測される分泌  対  測定される分泌のプロットを生成した（図８）。各天然に存在するシグナルペプチドを、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙのＮ末に融合した。これらの構築物を、L. gasseriにおいて試験し、各天然に存在するシグナルペプチドの分泌を指向する能力を決定した。分泌のレベルは、精製された上清におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の量を用いて測定した。図８は、既存の技法によって予測される分泌効率と、L. rhamnosus GGにおいて実際に測定された分泌との間の相関の欠如を示した。同様の結果がL. gasseriについて観察されたが、１つを除く全ての天然に存在する分泌シグナルペプチドは、測定可能な分泌を示さなかった（図８）。分泌は、Ｌｐ３１８９についての分泌シグナルペプチドについてのみ検出された。注目すべきことには、配列番号３において提供されるアミノ酸配列(L. gasseri SP1)を含む人工分泌シグナルは、Ｌｐ３１８９についての分泌シグナルペプチドより優れていた（図９）。図８におけるように、図９に記載の各  分泌シグナルペプチドは、ｍＣｈｅｒｒｙのＮ末に融合され、分泌のレベルを、精製された上清中のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の量を用いて測定した。L. gasseri SP1（配列番号３）は、Ｌｐ３１８９についての分泌シグナルペプチドと比較して、３倍を超えるレベルのｍＣｈｅｒｒｙを分泌した。よって、配列番号３は、L. gasseriにおいて試験された最も高性能の天然に存在するシグナルペプチドよりも多くの分泌を指向することができる。
【０１０９】
同様に、配列番号５に提供されるアミノ酸配列（L. rhamnosus GG SP2またはLGG SP2）を含む人工分泌シグナルは、図８に示されるＬＧＧにおけるトップ２の性能の分泌シグナルペプチドより優れていた（Ａｐｆ、Ｕｓｐ）。ＬＧＧ  ＳＰ２は、ｍＣｈｅｒｒｙに融合される場合、ＵｓｐおよびＡｐｆについてのシグナルペプチドよりも、精製された上清において、１．５倍〜２．７５倍高い分泌レベルを示した（図１５）。着目すべきことは、図９についてのデータを生じる実験は、５０ｍＬの細菌培養液の精製を介して実施されたが、図１５のデータは、５ｍＬの細菌培養液を用いて生成された。したがって、図９および図１５において使用されるペプチド間の絶対的な収率は、比較することはできないが、使用される培養液の体積に基づいて、１０倍の相違が予測されるだろう。
【０１１０】
例２：L. gasseri SP1（配列番号３）の治療的適用
ＴＺＭ−ｂｌアッセイを使用して、L. gasseri SP1（配列番号３）によって分泌される抗ＨＩＶ抗体フラグメント（Ｊ３ＶＨＨ）が、ＨＩＶ感受性細胞をＨＩＶ感染から保護できるかどうかを決定した。Ｊ３ＶＨＨの結合を測定した（図１０、パネルＡ）。ＴＺＭ−ｂｌアッセイを使用して、ヒトの画分、抗体を用いる処置によって保護されるＨＩＶ感受性細胞を測定した（図１０、パネルＢ）。注目すべきことには、L. gasseri SP1によって分泌されるＪ３ＶＨＨは、文献において報告されるとおり１、従来の方法により産生されたＪ３ＶＨＨと同等の活性（ＩＣ５０、線で囲まれている）を示す。このことは、証明された治療用タンパク質が、本質的に等価の機能性を有して産生され得ることを実証する。
【０１１１】
例３：抗志賀毒素抗体フラグメントの分泌に対する人工シグナルペプチドの影響
抗志賀毒素（Ｓｔｘ２）抗体フラグメントの分泌に対する人工シグナルペプチドの影響を決定するために、L. gasseri SP1（配列番号３）を、３つの異なる抗志賀毒素抗体フラグメントの各々のＮ末に融合し、および、L. gasseriにおいて試験した。精製されていない上清を回収し、および、精製されていない上清中の各抗体フラグメントの分泌を、３つの複製物を用いるウェスタンブロットによって検出した。抗志賀毒素（Ｓｔｘ２）モノマーは、従来の単一ドメイン抗体フラグメント（１７ｋＤａ）であり、およびダイマー（３３．５ｋＤａ）およびトリマー（４８ｋＤａ）は、夫々２つおよび３つの融合されたモノマーである。モノマーは、ダイマーおよびトリマーを産生するために、可撓性のグリシン−セリンリンカーによって融合した。各々は、抗精製染色タグに２０分間暴露した。図１２に示されるとおり、L. gasseri SP1は、Ｓｔｘ２モノマー、Ｓｔｘ２ダイマーおよびＳｔｘ２トリマーを分泌した（図１２）。
【０１１２】
例４：機械学習によるＳＰ機能の予測的スコア付
以下に提供されるのは、その構成成分であるアミノ酸の分析を介してシグナルペプチド機能を予測するための、L. plantarumにおける異種（ＮｕｃＡ）分泌ライブラリーからの公開されたデータ４に基づいて訓練された、データ分析方法である。あるサブセットのアミノ酸は、それらの物理化学的特性の類似性に起因して、ペプチド配列における相互の置換を許容し得る（図１３、パネルＡ）。機能特性は、コンピュータ処理された分泌シグナルに対するＣ末切断モチーフ配列類似性、Ｎ末配列モチーフの長さ、Ｎ末配列モチーフの疎水性、コア配列の長さ、コア配列の疎水性、コア配列の膜貫通ヘリックスの長さ、コア配列膜貫通らせん性、および以下の比率：コア配列膜貫通ヘリックスの長さ／疎水性配列の長さを包含する。これを、分泌シグナルペプチドについて生成された位置重量マトリックスによって付与される配列蓋然性と対にすることによって、スクリーニングにおけるバリアントの数は、in silicoでの弱い実施者を同定することによって低減され得る。さらにまた、機械学習技法として、それが強力であると予測する配列の分泌スクリーニングによって生じる、いずれかの測定されたデータを、このモデルにフィードバックすることができ、よって、これに続くスクリーニングのためのその予測の正確性を改善することができる。特異値分析を介する多次元機能的特性データの線形判別分析の例は、図１３、パネルＢに提供される。機械学習によるＳＰ機能の予測的スコア付のためのパイプラインは、以下のステップを含む：
１．  ＳｉｇｎａｌＰを使用して、所与の株の天然分泌ペプチド（ＳＰ）ライブラリーを生成する
２．  ＧＬＡＭを使用して、所与の天然ＳＰライブラリーについてのコンセンサス配列を生成する
３．  コンセンサス位置幅マトリックスを考慮して、人工ＳＰライブラリーを生成する
４．  ＳＶＤ−ＬＤＡを用いて人工ＳＰライブラリーメンバー機能を予測する
５．  機能的な可能性が低いＳＰをふるい分ける
６．  機能的スクリーニングを実施する；および
７．  ヒットしなければ、測定されたデータをステップ４にフィードバックし、およびアルゴリズムを再教育し、予測を繰り返す
【０１１３】
例５：ＬＧＧによるＩＬ−１０分泌
L. rhamnosus GG(LGG)は、本開示の合成分泌シグナルがナノボディー（登録商標）以外の治療用ペイロードとともに機能することを部分的に実証するために、ＩＬ−１０を分泌するように改変した。これまでにＯｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ、Ｖｏｂａｒｉｌｕｚｕｍａｂ、抗ＨＩＶナノボディー（登録商標）、および蛍光レポータータンパク質とともに首尾よく使用された、同じシグナルペプチド（配列番号１）をＩＬ１−１０に融合した。ＬＧＧは、同じシグナルペプチドとともにＩＬ−１０を強力に分泌することができ、１ｍＬの培養上清あたり、少なくとも３０μｇのサイトカインを生じた（図１４）。本明細書に報告される分泌レベルは、これまでに報告された(Steidler, L., et al. 2000. Science 289 (5483): 1352-55)、３μｇ／ｍＬ分泌レベルの少なくとも１０倍である。L. lactisとは異なり、ＬＧＧは、胆汁塩によって殺傷されず、これを治療用タンパク質の理想的な経口送達ビヒクルとしている（例として、完全長タンパク質、融合タンパク質、ペプチド等々）。
【０１１４】
例６：L. gasseri（L. gasseri SP2、配列番号７）についての第二の機能的ＳＰ配列
ＧＬＡＭ２を全ての天然のL. gasseriシグナルペプチドの平均長さ：３３ａａにプリセットした、別の合成ＳＰを、L. gasseri (SP2)についての第二のコンセンサス配列に基づいて試験した（図１６）。
L. gasseri SP2を、L. gasseri SP2に融合したＪ３−ＶＨＨを発現する組み換えL. gasseriから精製された上清のタンパク質ゲル分析を介して実証し、L. gasseri SP1（配列番号３、長さ＝３０ａａ）と比較した。L. gasseri SP2は、L. gasseri SP1（予測サイズ１４．３ｋＤ）と比較して、（わずかに少ないが）同等の量のタンパク質を分泌した（図１７）。ゲル結果はまた、検出可能な量の未切断のタンパク質が存在しないことを指し示し、両方の合成ＳＰがシグナルペプチダーゼＩによって効率的にプロセシングされることを指し示す。
分泌された産物は、未精製の上清を用いる抗ｇｐ１２０  ＥＬＩＳＡによって示されるように、機能的であることが証明された（図１８）。このアッセイによって指し示されるＣＦＵあたりの結合強度はまた、L. gasseri SP2と比較して、L. gasssesri SP1についてのゲルによって可視化されるタンパク質の量が少ないことと一貫しており、より短い長さの合成ＳＰが一般に所望され得ることが指し示された。
【０１１５】
例７：所与のコンセンサスについて許容されるアミノ酸置換の関連する物理化学的特徴の分析
少なくとも２つの合成シグナルペプチド配列は、L. rhamnosus GGおよびL. gasseriにおいて異種タンパク質を機能的に分泌することが、本明細書で示されている。各例において、全く異なるシグナルペプチドを、別個のコンセンサス配列に基づいて生成した。１つは所与の種（ＳＰ２）について平均的なシグナルペプチド長に基づき、およびもう１つは、ＧＬＡＭ２コンセンサスソフトウェアを異なる長さをランダムにサンプルし、および、それ自体（ＳＰ１）についての最適な長さ予測するように設定した。これらの２つの配列を比較するために、２つの物理化学的アミノ酸特性（疎水性およびらせん性）を各ＳＰモチーフ（Ｎ末親水性ヘッド配列、疎水性コア配列、およびＣ末Ｉ型シグナルペプチダーゼ切断部位）に対してプロットした。図１９Ａは、L. rhamnosus GG SP1（配列番号１）についての疎水性およびらせん性曲線を示し、および図１９Ｂは、L. rhamnosus GG SP2（配列番号５）についての疎水性およびらせん性曲線を示す。図２０Ａは、L. gasseri SP1（配列番号３）についての疎水性およびらせん性曲線を示し、および図２０Ｂは、L. gasseri SP2（配列番号７）についての疎水性およびらせん性曲線を示す。
【０１１６】
親水性Ｎ末ヘッド配列およびＩ型シグナルペプチダーゼ切断部位についてのコンセンサスは、各株について、ＳＰ１とＳＰ２との間で本質的に同じであったが、２つの例外：（１）L. rhamnosus GGについては、Ｎ末配列は、１つのＫが、ＳＰ２に対してＳＰ１において短く、これは、全体の長さと比例する相違であろう；（２）L. gasseriについては、切断部位の最後のアミノ酸は、ＳＰ１においてＳおよびＳＰ２においてＴであったが、これらのアミノ酸は、密接な同族であり（上に記載の保存的なアミノ酸置換基ｅに対応する）、および最終的な位置は、このモチーフ（すなわち、ＡＸＡ−ＡＸ）においてより可変であることが理解されるべきである。
【０１１７】
それらは、それらの疎水性コアの含量において異なるが、Ｉ、Ｌ、＆Ｖ（上に記載の保存的アミノ酸置換基ａに対応する）、およびＡ＆Ｇ（上に記載の保存的アミノ酸  置換基ｄに対応する）内の近縁アミノ酸置換によってのみ異なり、興味深いことには、全体の長さの低減にも関わらず、切断モチーフから５〜６アミノ酸先だって始まる、以前に特徴付けられた配列疎水性およびらせん性における減少に対して、長さにおける低減が保存されているにも関わらず、同様の疎水性およびらせん性プロファイル曲線を生じる。これは、今日までの公開された文献において考察されていない、シグナルペプチドプロセシングについてのこの特徴に対する、推定される重要性を指し示す。これらの疎水性およびらせん性曲線を保存するアミノ酸置換は、よって、機能的ＳＰバリアントを生じるようである。
【０１１８】
例８：L. rhamnosus GGによるＩＬ１０のin vivoでの分泌
実験概念の証明を実施して、合成シグナルペプチドを用いて改変されたLactobacillusが、in vitroにおけるのと同等の機能をin vivoで示すことを実証した。この場合において、健常マウス（ｂａｌｂ／ｃ株）を、ＩＬ１０を分泌するように改変された（ＬＧＧ  ＳＰ２、配列番号５を使用して）１０１０ＣＦＵの組み換えL. rhamnosus GGを、強制経口投与を介して、１日１回、５日連続接種した。この期間の間、１群のマウスは、アンヒドロテトラサイクリンに感受性のスイッチ可能なプロモーターによって制御されるＳＰ２−ＩＬ１０の発現を誘導する、０．１ｍｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリンを包含する飲用水を与えた。別の群は、いずれの誘導因子も与えず、陰性対照として使用した。５日目に、マウスをサクリファイスし、および全結腸組織を収集し、均質化し、および培養上清を用いてこれまでに行ったとおり（精製されたＩＬ１０の標準曲線を用いるＩＬ１０捕捉ＥＬＩＳＡ）ＩＬ１０分泌収率を正確に測定した。ＩＬ１０は、健常結腸組織に天然に発現されるので、誘導因子が提供されない陰性対照において背景シグナルは存在しない。しかしながら、誘導は、結腸ＩＬ１０のレベルを４５％増大させ、誘導された組み換え体による全結腸への３．９ｎｇのＩＬ１０の送達を生じた（図２１）。
【０１１９】
先の研究は、１日に１７回マウスに提供された組み換えＩＬ１０を分泌するL. lactisによる全結腸へ送達された０．２８ｎｇのＩＬ１０は、ＤＳＳ大腸炎モデルにおける大腸炎兆候の３０％の低減を付与したことを示した［５］。驚くべきことに、本明細書で使用された組み換えL. rhamnosus GGは、１日１回のみマウスに提供され、３．９ｎｇのＩＬ１０を送達し、よって、約１４倍多いＩＬ１０が時間の分数で送達され、先の方法と比べて、遙かに少ない用量の細菌を必要とした。
【０１２０】
例９：L. rhamnosus GGによるＧＬＰ１のin vitroでの分泌
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）は、結腸Ｌ細胞によって天然に産生される内分泌ホルモンであり、これは、インスリン産生を刺激し、およびよって耐糖能を改善する。それはまた、摂食の際の心的飽和の感覚に貢献し、および、脂質代謝に影響し、内皮障害を逆転させ、および心房血圧を低減させることが観察されている。そのため、それは、糖尿病、肥満、および心血管疾患のための治療候補として提案されている  ［６］。しかしながら、ＧＬＰ１は、血流において、迅速に不活性形態に分解され、および、経口投与される場合に消化される。よって、改変された微生物は、天然のＧＬＰ１発現（これは、結腸で生じる）に類似する様式で、ＧＬＰ１送達についてユニークな機会を提供する。ここで実証されるように、本開示の合成シグナルペプチドは、ＧＬＰ１の分泌を容易にし、よって、小さいペプチド（２〜５ｋＤａ）から構成されるホルモンは、本明細書に提供される方法による分泌にアクセス可能な追加のペイロードクラスである。腸共生生物L. rhamnosus GG（配列番号５）は、ＳＰ２を使用する誘導下でＧＬＰ１を分泌するように改変された。分泌されたＧＬＰ１を、精製されたＧＬＰ１標準を用いるＧＬＰ１捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを使用する、アンヒドロテトラサイクリンによるin vitroでの４時間の誘導後、無細胞上清において測定した。驚くべきことに、この組み換え株は、５．３ｎｇ／ｍＬまでのＧＬＰ１を分泌および送達することができる（図２２および２３を参照のこと）。
【０１２１】
例１０：L. gasseriによるｈＢＤ１の分泌
合成シグナルペプチドによる分泌のための別のタンパク質ペイロードクラスは、抗微生物性ペプチドおよびデフェンシンを包含する、１０〜５０アミノ酸長の範囲の小さいペプチドエフェクターである。このクラスのペプチドの１つの例示の場合は、ヒトベータデフェンシン１（ｈＢＤ１）である。このペプチドは、この適用についての理想的なペイロードである。なぜなら、それは、直接的な殺微生物活性および走化因子駆動エフェクター免疫細胞動員を介して、抗細菌活性を有するが［８］、Lactobacilliに対して非毒性であるからである［７］。ヒト微生物叢によって分泌されるｈＢＤ１についての適用は、かかる細菌が送達され得るいずれかの粘膜部位におけるいずれかのグラム陽性感染症の処置のために適用され得る。この実験は、ＳＰ１を使用してｈＢＤ１を分泌するように改変された組み換えL. gasseriから誘導された上清が、病原性株大腸菌ＡＴＣＣ  ２５９２２の増殖を阻害し得るかどうかを試験した。ｈＢＤ１は、５〜１０μｇ／ｍＬのこの株の最小阻害濃度を示すことが知られている［８］。６時間誘導されたL. gasseri培養物からの無細胞上清は、初期対数増殖期（ＯＤ値が０．２５〜０．３５で変化する）まであらかじめ増殖された大腸菌培養物とともに、５０：５０の比率で混合した。改変されていないL. gasseri、ｈＢＤ１を分泌するL. gasseriによって許可される大腸菌の増殖、およびLactobacillus増殖培地（ＭＲＳ）は、３７℃で２０時間後、三連で測定し、背景光学密度シグナル（大腸菌がないＭＲＳ中）に対して比較した。驚くべきことに、ＷＴ  L. gasseriは、おそらく天然に分泌されたバクテリオシンを介して、増殖を静菌的におよそ３２％阻害したが、ｈＢＤ１を分泌するL. gasseriは、大腸菌の増殖を９８％抑制した（図２４）。
【０１２２】
材料および方法
増殖条件
Lactobacilliを、形質転換された培養物を増殖する際、エリスロマイシン選択下、３７℃または室温で、ＭＲＳ培地を用いて培養した。無水テトラサイクリンを、タンパク質を産生する目的で細胞を増殖する際、５００ｎｇ／ｍＬまでのどこかの濃度で添加した。典型的には、細胞は、従来どおり対数中期（光学密度＝０．４〜０．６）まで増殖させ、および次いで無水テトラサイクリンを、静止期（ＯＤ＝１〜１．２）に達するまで添加した。増殖の第二期は、３７℃で数時間または室温で終夜行い得る。L. gasseriは、振盪通気インキュベーター中で増殖させた。L. rhamnosus GGは、嫌気性条件下で増殖させた。
【０１２３】
試薬
１．  ＭＲＳ培地：以下のカクテル５５ｇを１Ｌ蒸留水と混合し、１５分オートクレーブする  
Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ寒天
１リットルあたりの適切な式＊
プロテオースペプトンＮｏ．３  １０．０ｇ
牛肉エキス  １０．０ｇ
酵母エキス  ５．０ｇ
デキストロース  ２０．０ｇ
ポリソルベート８０  １．０ｇ
クエン酸アンモニウム  ２．０ｇ
酢酸ナトリウム  ５．０ｇ
硫酸マグネシウム  ０．１ｇ
硫酸マンガン  ０．０５ｇ
リン酸二カリウム  ２．０ｇ
瓶の底の茶色のシロップについてチェックすることにより、培地がカラメル化(caramelized)していないことを確かめる。
２．  ＭＲＳ寒天：ＭＲＳ培地製剤＋１．５％ｗ／ｖ  ＢａｃｔｏＡｇａｒ、１５分オートクレーブする
３．  グリシンストック溶液：２０ｇのグリシンを１００ｍＬ滅菌水と混合し、０．２２μＭ膜で滅菌濾過する
４．  エレクトロポレーションコンディショナー１：滅菌水中、０．５Ｍスクロース、７ｍＭリン酸カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム溶液；０．２２μＭ膜で滅菌濾過する
５．  エレクトロポレーションコンディショナー２：滅菌水中、９２５ｍＭスクロース、３．５ｍＭ塩化マグネシウム溶液；０．２２μＭ膜で滅菌濾過する
６．  培地回収１：ＭＲＳ培地のアリコートを２０ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウムで補充する；０．２２μＭ膜で滅菌濾過する
７．  培地回収２：ＭＲＳ培地のアリコートを０．５Ｍスクロース、０．１Ｍ塩化マグネシウムで補充する；０．２２μＭ膜で滅菌濾過する
８．  ＳＴＥ培地：６．７％ショ糖、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２２μＭ膜で滅菌濾過する
【０１２４】
Lactobacilliに構築物を導入する方法
１．  必要とされる形質転換あたり１ｍＬのＭＲＳ培地中にLactobasillusのプレ培養物を接種する
２．  終夜または株の要求に従う密度（１．０以上の光学密度）まで増殖する、例えば：
ａ．  L. rhamnosus GG：嫌気性培養について評価されたＢＤ  ＧＡＳＰＡＫ（商標）（Ｒｅｆ＃２６０６８３）を補充した２．５ｇパラジウム触媒を有する嫌気性ジャー中３７℃
ｂ．  L. gasseri：３７度、好気性条件
３．  ０．２５〜２．５％の最終濃度まで（株対株ベースで最適化された）グリシンストック溶液を補充したＭＲＳ培地中で１／１０希釈したプレ培養物を継代培養する
ａ．  L. rhamnosus GG：２％グリシン
ｂ．  L. gasseri：０．５％グリシン
４．  ０．２５の光学密度までインキュベートする
５．  インキュベーションを中断し、０〜２０μｇのアンピシリンを培地に補充する
ａ．  L. rhamnosus GG：１０μｇ
ｂ．  L. gasseri：０μｇ
６．  ０．５の光学密度までインキュベートする
７．  ４〜２１度の環境温度で、２０００〜６０００Ｇで１５分間の遠心分離によって細胞をペレット化する
ａ．  L. rhamnosus GG：５０００Ｇ、２１度
ｂ．  L. gasseri：４度
８．  ０．５体積のエレクトロポレーションコンディショナーを用いて細胞を機械的に再懸濁し、および、簡潔に混合する（株対株ベースで最適化されるようなコンディショナーの選択）
ａ．  L. rhamnosus GG：エレクトロポレーションコンディショナー１
ｂ．  L. gasseri：エレクトロポレーションコンディショナー２
９．  ステップ７に従って細胞をペレット化する
１０．  ステップ８に従って洗浄を繰り返す
１１．  ステップ７に従って細胞をペレット化する
１２．  元のＲＭＳ＋グリシン培養液の１０ｍＬの容量あたり、１００μＬのエレクトロポレーションコンディショナーを用いて細胞を機械的に再懸濁する
１３．  １００μＬの再懸濁された細胞を、予め氷上で冷却された０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに分割する
１４．  １〜５μＬのプラスミドＤＮＡをＴＥ緩衝液中に溶解された５０〜５００ｎｇのＤＮＡと混合する（株対株ベースで最適化されるインプットＤＮＡ量）
１５．  使用されるエレクトロポレーションコンディショナーに依存して、以下の条件を用いて電気穿孔する
ａ．  エレクトロポレーションコンディショナー１  −  ピーク電圧：１．７ｋＶ、キャパシタンス：２５μＦ、並列抵抗：２００ｏｈｍ
ｂ．  エレクトロポレーションコンディショナー２  −  ピーク電圧：１．５ｋＶ、キャパシタンス：２５μＦ、並列抵抗：８００ｏｈｍ
１６．  使用されるエレクトロポレーションコンディショナーに依存して、以下の条件で電気穿孔された細胞を再懸濁する
ａ．  エレクトロポレーションコンディショナー１  −  ３ｍＬ回収培地１
ｂ．  エレクトロポレーションコンディショナー２  −  １ｍＬ回収培地２
１７．  細胞増殖条件に従うインキュベーションを介して、細胞を２〜４時間回収する
ａ．  L. rhamnosus GG：３時間
ｂ．  L. gasseri：２時間
１８．  例として以下の、プラスミドの選択マーカーについての適切な抗生物質濃度を補充したＭＲＳ寒天上に、１００μＬの回収した細胞（またはその濃縮物／希釈物）を播種する：
ａ．  L. rhamnosus GG：１０μｇ／ｍＬエリスロマイシン
ｂ．  L. gasseri：４μｇ／ｍＬエリスロマイシン
１９．  選択された株についての液体培養物について使用されるのと同じ増殖条件で４８〜７２時間インキュベートする
ａ．  L. rhamnosus GG：嫌気性培養について評価されたＢＤ  ＧＡＳＰＡＫ（商標）（Ｒｅｆ＃２６０６８３）を補充した２．５ｇパラジウム触媒を有する嫌気性ジャー中３７度、４８時間
ｂ．  L. gasseri：３７度、好気性条件で７２時間
２０．  形質転換後のＤＮＡ診断について
ａ．  L. rhamnosus GG：１μＬのコロニーバイオマスを取り上げ、および、１６μＬ  ＳＴＥ緩衝液（ｐＨ  ８）＋１．６μＬ  リゾチーム＋２μＬ  プロテアーゼＫ＋０．４μＬ  ムタノリシン中での溶解のために再懸濁した。３０分間３７度でインキュベートする。０．５〜１μＬの溶解材料をＰＣＲ反応の鋳型として使用するか、または、必要な場合、ＲＣＡベースのＳａｎｇｅｒ配列決定のために全容量を使用する。
ｂ．  L. gasseri：コロニーバイオマス全体を取り上げ、および選択的抗生物質を補充した３ｍＬ  ＭＲＳ培地に再懸濁し、および、光学的密度１．０まで２４〜４８時間増殖する。０．５〜１μＬの培養物をＰＣＲ反応中の鋳型として直接使用するか、または、標準的な技法（例として  Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）に従って、液体から全プラスミドＤＮＡを抽出する
【０１２５】
人工分泌配列をコンピュータ処理するための方法
１）  ＳｉｇｎａｌＰを使用して、我々が分泌を改変したい所与の株のプロテオーム（すなわちL. rhamnosus SP 1およびL. rhamnosus SP 2についてのL. rhamnosusプロテオーム、L. gasseri SPについてのL. gasseriプロテオーム）（ＮＣＢＩプロテオームデータベースから供給された）からの全ての実行可能な天然のＳＰ配列を計算的に採掘した。
２）  天然ＳＰ配列のアミノ酸ｆａｓｔａファイルを生成し、および所望される長さのコンセンサス配列で（L. rhamnosus SP 1について２５の長さ、L. rhamnosus SP2について３０の長さ、L. gasseri SP1について３０の長さを使用した）ＧＬＡＭに入れた。大抵、ステップ１で生成された天然ＳＰプールの平均長さを使用した。
３）  ＦＡＳＴＡファイルおよび所望される長さを考慮して（最も可能性のあるのはコンセンサス配列）、ＧＬＡＭは、実行可能なコンセンサス配列についての位置重量マトリックスを生成する。各所与の配列位置についての最も蓋然性の高いアミノ酸を採用し、および、図１における配列ロゴ画像における上部最大文字によって示される、人工ＳＰ配列として使用した。
【０１２６】
配列
L. rhamnosus GG SP1
MKKKLLALALLALLLAGCGQVSAAT (配列番号1)
L. rhamnosus GG SP1 核酸
atgaagaagaaattgttggcattggcattgttggcattgttgttggcaggctgcggccaagtttcagcagcaacc (配列番号2)
L. gasseri SP1
MKKKLLSLGAALALLGLSLTACSNTAKAAS (配列番号3)
L. gasseri SP1 核酸 
atgaaaaaaaaattattatcattaggtgctgctttagctttattaggtttatcattaactgcttgttcaaatactgctaaagctgcttca (配列番号4)
L. rhamnosus GG SP2
MKKLLLLLVVLLGLAALLLSGCGTSVSAAT (配列番号5)
L. rhamnosus GG SP2 核酸 
atgaaaaaattgttgttgttgttggttgttttgttgggcttggcagcattgttgttgtcaggctgcggcacctcagtttcagcagcaacc (配列番号6)
L. gasseri SP2
MKKKLIVLLAALALLFGLGLALTCSSNTAKAAS (配列番号7)
L. gasseri SP2 核酸 
ATGAAAAAAAAATTGATTGTTTTGTTGGCAGCATTGGCATTGTTGTTTGGCTTGGGCTTGGCATTGACCTGCTCATCAAATACCGCAAAAGCAGCAACC (配列番号8)
GLP1:
HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (配列番号9)
hBD1:
GNFLTGLGHRSDHYNCISSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK (配列番号10)
L. gasseri SP3
MKKKLIVLLAALALLFGLGLALTCSSNTAKAAT (配列番号11)
【０１２７】
参考文献
1. McCoy, L. E. et al. J. Exp. Med. 209, 1091-1103 (2012).
2. Matz, J. et al. J. Virol. 87, 1137-1149 (2013).
3. Mata-Fink, J. et al. J. Mol. Biol. 425, 444-456 (2013).
4. Mathiesen, G. et al. BMC Genomics 10, 425 (2009).
5. Steidler et al. Science 2000
6. Ryan et al. Nature Scientific Reports 2017
7. Lebeer, S. et al. Microbiology Biotecnology 4(3) (2010)
8. Wu Z. et al. PNAS 100(15), 8880-8885 (2003)
【０１２８】
本明細書に開示の全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して参照により援用され、これらは、いくつかのケースにおいて、文献の全体を包含し得る。
本明細書に使用されるときおよび請求項において、明確に反対に指し示されない限り、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
明確に反対に指し示されない限り、本明細書で特許請求される、１より多くのステップまたは行為を包含するいずれかの方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも、方法のステップまたは行為が記載される順序に限定されないこともまた理解されるべきである。
【０１２９】
請求項において、ならびに上の本明細書において、「含む(comprising)」、「包含する(including)」、「保有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「包含する(involving)」、「保有する(holding)」、「〜から構成される(composed of)」等のような全ての移行句は、オープンエンド、すなわち、これらに限定されないが包含することを意味することが理解されるべきである。移行句「のみからなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」のみが、米国特許庁審査基準セクション２１１１．０３に記載されるとおり、それぞれクローズドまたは半クローズドの移行句であるべきである。
数値に先行する用語「およそ(about)」および「実質的に」は、記載された数値の  ±１０％を意味する。
広範な値が提供される場合、その範囲の上限および下限の間の各値は、具体的に企図され、および本明細書に記載される。
【図１】
2021500035.tif 000003
【図２】
2021500035.tif 000004
【図３】
2021500035.tif 000005
【図４】
2021500035.tif 000006
【図５】
2021500035.tif 000007
【図６】
2021500035.tif 000008
【図７】
2021500035.tif 000009
【図８】
2021500035.tif 000010
【図９】
2021500035.tif 000011
【図１０】
2021500035.tif 000012
【図１１】
2021500035.tif 000013
【図１２】
2021500035.tif 000014
【図１３】
2021500035.tif 000015
【図１４】
2021500035.tif 000016
【図１５】
2021500035.tif 000017
【図１６】
2021500035.tif 000018
【図１７】
2021500035.tif 000019
【図１８】
2021500035.tif 000020
【図１９】
2021500035.tif 000021
【図２０】
2021500035.tif 000022
【図２１】
2021500035.tif 000023
【図２２】
2021500035.tif 000024
【図２３】
2021500035.tif 000025
【図２４】
2021500035.tif 000026
【配列表】
2021500035000001.app
【国際調査報告】
2021500035.tif 000027
2021500035.tif 000028
2021500035.tif 000029