(57)【要約】  本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む組換融合タンパク質であって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の少なくとも１つのパラトープはリンカを介して重鎖または軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結され、組換融合タンパク質はＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１およびＦｃＲに同時に結合できる、組換融合タンパク質を提供する。本発明はまた、組換融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、組換えタンパク質を生産するための」方法と、組換えタンパク質を使用して、ＣＤ４７および／またはＰＤ−Ｌ１の過剰発現によって引き起こされる疾患を治療するための方法とを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む組換融合タンパク質であって、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体の少なくとも１つのパラトープはリンカを介して重鎖または軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結され、前記組換融合タンパク質はＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１およびＦｃＲに同時に結合できる、組換融合タンパク質。
【請求項２】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体の各パラトープは前記重鎖または前記軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結される、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項３】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体の各パラトープは前記重鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結される、請求項２に記載の組換融合タンパク質。
【請求項４】
前記シグナル調節タンパク質はＳＩＲＰαである、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項５】
前記シグナル調節タンパク質の前記細胞外Ｉｇ様ドメインはＳＩＲＰαＤ１である、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカは５〜３０アミノ酸残基の短いペプチドである、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカは‐（Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒ）３‐である、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項８】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列識別番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を各々有する２つの重鎖と、配列識別番号８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を各々有する２つの軽鎖とを備える、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項９】
前記重鎖は配列識別番号６のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の組換融合タンパク質。
【請求項１０】
前記軽鎖は配列識別番号８のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の組換融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを備える発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターを備える宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の組換融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを備える医薬組成物。
【請求項１５】
少なくとも１つの薬学的に許容されるアジュバントを更に含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＣＤ４７および／またはＰＤ−Ｌ１の過剰発現により引き起こされる疾患を治療するための薬剤の調製における、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組換融合タンパク質、または、請求項１４または１５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１７】
前記疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵癌、および腎細胞癌から成る群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記疾患は、クローン病、アレルギー性喘息および関節リウマチから成る群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換融合タンパク質、ならびに、その調製および使用に関し、特に、腫瘍治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞は、宿主の免疫監視を回避するためのいくつかの機構を獲得している。その機構には、１）膜タンパク質ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２（両方ともＴ細胞の表面上のＰＤ−１に結合する）を高発現してＴ細胞のアポトーシスを誘導することによる、Ｔリンパ球による免疫監視の回避、２）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による免疫監視の回避（ＮＫ細胞の表面上のＮＫＧ２Ｄタンパク質は、癌細胞の表面上のＭＩＣＡ／ＭＩＣＢタンパク質に結合すると、癌細胞を破壊するようにＮＫ細胞を活性化できるが、しかしながら、癌細胞は、細胞膜からのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢの脱離を促進する機構を獲得し、脱離したＭＩＣＡ／ＭＩＣＢは、ＮＫＧ２Ｄに結合し、ＮＫ細胞の活性をブロックする）、３）マクロファージ（Ｍφ）による免疫監視の回避（ほぼすべての癌細胞は、表面上で多くのＣＤ４７を発現し、ＣＤ４７はＭφの表面上のシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）に結合し、それにより、Ｍφによる癌細胞の食作用を阻害する阻害シグナルの生産を誘導する）が含まれる。癌細胞は非常に「賢く」、獲得された回避機構に依存して急速に繁殖しているように見える。従って、すべての癌細胞を破壊するための効果的な抗癌薬剤の開発は、これらの機構を標的にする必要がある。
【０００３】
ＳＩＲＰおよびＣＤ４７
【０００４】
シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）は、３つのファミリーメンバー、すなわち、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）、およびＳＩＲＰγ（ＣＤ１７２ｇ）を含む膜貫通糖タンパク質である。３つのタンパク質はすべて、同様の細胞外領域を含むが、細胞内ドメインは異なる。細胞外領域は、３つの免疫グロブリン様ドメイン、１つのＩｇ  Ｖセット、および２つのＩｇ  Ｃセットドメインを含む。ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）の細胞内ドメインは、シグナル伝達および対応する細胞機能を阻害できる２つの阻害シグナリング領域を含む。ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）およびＳＩＲＰγ（ＣＤ１７２ｇ）は、いかなるシグナル伝達ドメインも有しない非常に短い細胞内領域を有する。しかしながら、ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）は、例えばＤＡＰ１２などのアダプタタンパク質を通じてシグナル伝達のために機能し得る。ＳＩＲＰは主に、マクロファージ（Ｍφ）、樹状細胞（ＤＣ）およびニューロンにおいて発現する。
【０００５】
ＣＤ４７は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通糖タンパク質であり、赤血球を含むすべての種類の細胞の表面上で発現する。ＣＤ４７のリガンドはインテグリン、トロンボスポンジン‐１およびＳＩＲＰを含む。ＣＤ４７は、ＳＩＲＰαと相互作用して「私を食べないでください」というシグナルを発することにより、マクロファージによる食作用を阻害でき、これにより、血液細胞などの細胞をマクロファージによる攻撃から保護する。
【０００６】
研究が示すところによれば、多くの腫瘍または癌細胞はＣＤ４７を過剰発現する。ＣＤ４７はマクロファージの細胞表面上のＳＩＲＰαと結合することにより、マクロファージによる癌細胞の食作用を防止する。ＣＤ４７を過剰発現する癌細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵癌、および腎癌の細胞を含む。ＳＩＲＰαに対するＣＤ４７の結合をブロックする、ＣＤ‐４７に特異的な抗体を注射することにより、担癌マウスにおける腫瘍増殖を大幅に阻害できることが報告されている。ヒト白血病細胞を保持するマウスに同一の抗体を注射したとき、腫瘍または癌細胞は完全に除去された（Ｔｈｅｏｃｈａｒｉｄｅｓ  ＡＰＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。
【０００７】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１
【０００８】
ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １またはＣＤ２７４としても知られているＰＤ−Ｌ１は、組織同種移植、自己免疫性疾患および癌の発生など、一部の特定のイベントにおいて免疫系を抑制する上で主な役割を担う膜貫通タンパク質である。癌において、ＳＴＡＴ３およびＮＦ−κＢのような転写因子間のフィードバック抑制の喪失は、局所的なＰＤ−Ｌ１発現が増加を引き起こし得、ＰＤ−Ｌ１を標的にする薬剤を用いる全身治療の効果が制限され得る（Ｖｌａｈｏｐｏｕｌｏｓ  ＳＡ，  ２０１７）。腎細胞癌の患者からの１９６の腫瘍標本の解析から、ＰＤ−Ｌ１の高い腫瘍発現は、腫瘍の進行性の増加、および、死亡リスクの４．５倍の増加に関連することが分かった（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。
【０００９】
ＰＤ−１は約２６８アミノ酸の細胞表面受容体である。ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に結合したとき、免疫系を下方制御し、Ｔ細胞炎症活性を抑制することにより自己寛容を促進する。免疫系に対するＰＤ−１の阻害作用は、自己免疫性疾患を防止するが、免疫系が癌細胞を破壊することも防止する。抗ＰＤ−１抗体ＢＭＳ−９３６５５８は、非小細胞性肺癌、悪性黒色腫、または腎細胞癌の患者うち、約５人中１人から４人中１人において、客観的応答を生じさせた（Ｓｕｚａｎｎｅ  Ｌ．  Ｔｏｐａｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。
【００１０】
ＦｃおよびＦｃＲ
【００１１】
断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）は抗体の尾部領域であり、抗体のエフェクター機能、すなわち、特定の細胞受容体または他の防御タンパク質とどのように係合するかを決定するドメインである。
【００１２】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、Ｂリンパ球、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞を含む特定の細胞の表面上に見られるタンパク質である。これらの細胞は、免疫系の保護機能に寄与している。
【００１３】
Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体、および、免疫系を活性化する相補系の一部のタンパク質と相互作用し得る。
【００１４】
治療用二重特異性または多特異性融合タンパク質／抗体
【００１５】
単一の腫瘍関連抗原を標的にする抗体は、治療効率が限定されることが分かっている。例えば、現在承認されている抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ）の全奏効率はわずか３３％である。 
【００１６】
したがって、２つ以上の標的に対するいくつかの抗癌薬剤が開発された、または開発されているが、Ｔｒｉｏｍａｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＢｉＴＥ、ＤＡＲＴおよびＴａｎｄＡｂを含む、二重特異性または多特異性抗体を伴う現在利用可能な技術の大部分は、凝集の程度が大きい、分子量が大きい（＞２００ｋＤａ）、半減期が短い（＜１２時間、ＢｉＴＥ、ＤＡＲＴおよびＴａｎｄＡｂ）などの欠点を有し、治療効率を低減している。
【００１７】
ＷＯ２０１６／１６９２６１は、ＨＬ細胞を保持するＢａｌｂ／ｃヌードマウスを治療するために使用される、ＣＤ４７およびＦｃＲの両方を標的にする約９０ｋＤａの組換え二機能性融合タンパク質を開示し、抗癌効果が強化されることが観察された。しかしながら、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１およびＦｃＲを同時に正確に標的化し、分子量が小さく、半減期が長い、いかなる単一の分子薬剤もまだ報告されていない。本発明はこの必要性を満たすものである。 
【発明の概要】
【００１８】
本発明、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を備える組換融合タンパク質を開示する。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の少なくとも１つのパラトープがリンカを介して、パラトープを構成する重鎖または軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結される。当該タンパク質はＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１、およびＦｃＲに同時に結合できる。癌細胞上のＣＤ４７への結合により、ＣＤ４７とマクロファージ上のＳＩＲＰとの相互作用をブロックでき、これにより、ＳＩＲＰ媒介阻害シグナルによるマクロファージに対するブレーキを解除する。癌細胞上のＰＤ−Ｌ１に結合すると、ＰＤ−１媒介阻害シグナルによるＴ細胞に対するブレーキを解除するが、同時に、ＮＫ細胞またはマクロファージ上のＦｃＲへの結合は、ＮＫ細胞またはマクロファージによる標的化された癌細胞破壊を促進する。
【００１９】
実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の１つのパラトープは、パラトープを構成する重鎖または軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結する。別の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の各パラトープは、パラトープを構成する重鎖または軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結される。一実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の各パラトープは、パラトープを構成する重鎖のＮ末端で、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結される。一実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の各パラトープは、パラトープを構成する軽鎖のＮ末端で、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結される。さらなる実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の一方のパラトープは、パラトープを構成する重鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結され、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の他方のパラトープは、パラトープを構成する軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結される。いくつかの実施形態において、各パラトープは、パラトープを構成する重鎖および軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の１より多くの細胞外Ｉｇ様ドメインに連結される。
【００２０】
一実施形態において、組換融合タンパク質におけるシグナル調節タンパク質はＳＩＲＰαであり得、シグナル調節タンパク質の細胞外Ｉｇ様ドメインはＳＩＲＰαの第１細胞外Ｉｇ様ドメインであり得る（ＳＩＲＰαＤ１）。ＳＩＲＰαＤ１など、シグナル調節タンパク質の細胞外Ｉｇ様ドメインは、例えば癌／腫瘍細胞の細胞表面上のＣＤ４７に結合でき、これにより、ＣＤ４７とマクロファージの細胞表面上のＳＩＲＰとの相互作用をブロックする。 
【００２１】
一実施形態において、ＳＩＲＰαＤ１は、配列識別番号１および２においてそれぞれ記載される核酸配列およびアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰαＤ１は、配列識別番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＳＩＲＰαＤ１は、例えば癌／腫瘍細胞などの細胞表面上のＣＤ４７に結合して、ＣＤ４７とマクロファージの細胞表面上のＳＩＲＰとの相互作用をブロックできる。
【００２２】
組換融合タンパク質におけるリンカは約５〜３０アミノ酸残基のペプチドであり得る。実施形態において、リンカは１０〜３０アミノ酸残基のペプチドである。別の実施形態において、リンカは１５〜３０アミノ酸残基のペプチドである。いくつかの実施形態において、リンカは、配列識別番号３によってコードされ得る‐（Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒ）３‐（配列識別番号４）である。
【００２３】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブなどの単離モノクローナル抗体、および、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する抗体であり得る。
【００２４】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列識別番号５および７の核酸配列によってそれぞれコードされ得る、配列識別番号６のアミノ酸配列を各々有する２つの重鎖と、配列識別番号８のアミノ酸配列を各々有する２つの軽鎖とを備える単離モノクローナル抗体であり得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の抗原結合（Ｆａｂ）部分（またはパラトープ）は、癌／腫瘍細胞の細胞表面上のＰＤ−Ｌ１に結合して、ＰＤ−Ｌ１と、Ｔ細胞の細胞表面上のＰＤ−１との相互作用をブロックでき、これにより、ＰＤ−１媒介阻害シグナルによるＴ細胞に対するブレーキを解除する。抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＦｃ部はＮＫ細胞またはマクロファージの細胞表面上のＦｃＲに結合して、ＮＫ細胞またはマクロファージによる癌細胞破壊を促進できる。いくつかの実施形態において、重鎖は配列識別番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＰＤ−Ｌ１に結合して、ＰＤ−Ｌ１とＴ細胞の細胞表面上のＰＤ−１との相互作用をブロックでき、また、ＮＫ細胞またはマクロファージの細胞表面上のＦｃＲに結合でき、これにより、癌細胞を破壊するようにＮＫ細胞またはマクロファージを活性化する。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列識別番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＰＤ−Ｌ１に結合して、ＰＤ−Ｌ１と、Ｔ細胞の細胞表面上のＰＤ−１との相互作用をブロックできる。 
【００２５】
ＳＩＲＰαＤ１−リンカ−抗ＰＤ−Ｌ１重鎖は、配列識別番号９のヌクレオチドによってコードされ得る配列識別番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰαＤ１−リンカ−抗ＰＤ−Ｌ１重鎖は、配列識別番号１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＩＲＰαＤ１−リンカ−抗ＰＤ−Ｌ１重鎖は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖と共に、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１およびＦｃＲに結合して、ｉ）癌細胞上のＰＤ−Ｌ１と、Ｔ細胞上のＰＤ−１との相互作用をブロックし、ｉｉ）癌細胞上のＣＤ４７と、マクロファージ上のＳＩＲＰとの相互作用をブロックし、ｉｉｉ）ＮＫ細胞またはマクロファージによる癌細胞破壊を刺激できる。 
【００２６】
本発明の組換融合タンパク質をコードする核酸分子、ならびに、核酸を含む発現ベクター、および、発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。 
【００２７】
発現ベクターを含む宿主細胞を使用して組換融合タンパク質を調製するための方法も提供され、（ｉ）宿主細胞において組換融合タンパク質を発現する段階と、（ｉｉ）宿主細胞から組換融合タンパク質を単離する段階とを含む。
【００２８】
別の点において、本発明は、本発明の組換融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、少なくとも１つのアジュバントを更に含み得る。
【００２９】
別の態様において、本発明は、本発明の医薬組成物の治療的有効量を、必要とする患者または対象に投与する段階を含む、ＣＤ４７および／またはＰＤ−Ｌ１の過剰発現によって引き起こされる疾患を治療するための方法を提供する。
【００３０】
一実施形態において、本発明は、ＣＤ４７および／またはＰＤ−Ｌ１の過剰発現によって引き起こされる疾患の治療のための医薬組成物の製造における組換融合タンパク質の使用を提供する。 
【００３１】
一実施形態において、本発明の方法は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵癌、および腎細胞癌から成る群から選択される疾患を治療するためのものである。一実施形態において、本発明は、クローン病、アレルギー性喘息または関節リウマチを治療するための方法を提供する。 
【００３２】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例から明らかであるが、これは限定として解釈されるべきでない。本出願全体において引用されるすべての内容、ＧｅｎＢａｎｋエントリ、特許および特許出願公開は、参照いよって本明細書に明示的に組み込まれる。 
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の組換融合タンパク質の構造の概略図である。
【００３４】
【図２】本発明の組換融合タンパク質の作用機構を示す概略図である。
【００３５】
【図３】組換融合タンパク質ＩＭＭ２５０５における抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖の核酸配列を示す。
【００３６】
【図４】組換融合タンパク質ＩＭＭ２５０５における抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖のアミノ酸配列を示す。
【００３７】
【図５】組換融合タンパク質ＩＭＭ２５０５における抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖の核酸配列を示す。
【００３８】
【図６】組換融合タンパク質ＩＭＭ２５０５における抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【００３９】
【図７】ＣＨＯ細胞上のＰＤ−Ｌ１に対するＩＭＭ２５０５の結合活性を示す。
【００４０】
【図８】ジャーカット細胞上のＣＤ４７に対するＩＭＭ２５０５の結合活性を示す。
【００４１】
【図９】ＩＭＭ２５０５によるＣＨＯ細胞上のＰＤ−Ｌ１のブロックを示す。
【００４２】
【図１０】ＩＭＭ２５０５によるジャーカット細胞上のＣＤ４７のブロックを示す。
【００４３】
【図１１】ＩＭＭ２５０５のＡＤＣＣ分析の結果を示す。
【００４４】
【図１２】ＩＭＭ２５０５によるジャーカットＣＰＲのアポトーシス阻害を示す。
【００４５】
【図１３】ＩＭＭ２５０５のＡＤＰＣ分析の結果を示す。
【００４６】
【図１４】Ｒａｊｉ  ＰＤ−Ｌ１異種移植モデルにおけるＩＭＭ２５０５のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
腫瘍増殖の標的とする２つ以上の薬理に対して、主に３つの異なるアプローチがある。もっとも一般的には、患者は２つ以上の異なる薬剤のカクテルを与えられ得る。この選択肢では、可能な薬剤の組み合わせ、および異なる投与量に関して最大限の柔軟性を可能にするが、（ａ）錠剤の負担が増加すること、および、個々の薬剤ごとに投与スケジュールが異なることから、治療に対する患者のアドヒアランスが低下する可能性があり、（ｂ）薬剤間の相互作用による不適合の可能性があり、（ｃ）薬剤の副作用のリスクが増加する、という問題がある。これらの課題により、治療の効果が低減し、特に癌など慢性疾患の管理において、治療目標の達成の妨げになり得る。 
【００４８】
第２のアプローチは、単回投与形態の薬剤の多剤混合薬を使用することに依存する。このアプローチは、錠剤の負担を低減させるので、患者コンプライアンスの改善をもたらす。多剤混合薬の短所は主に、有効成分間の可能な用量比の選択肢が限定されることである。これにより、最小の副作用で最大の効力を得るように個々の患者について適切に調整することがより難しくなる。加えて、組み合わせにおける成分の薬物動態特性が異なることにより、個々の標的における薬力学作用の複雑な時間的ミスマッチが生じ得、それにより、全体的な効力が損なわれる。 
【００４９】
第３のアプローチは、単一の化合物において２つ以上の薬理を組み合わせる多機能性薬剤を使用することである。そのような多機能分子の設計および妥当性確認は、より複雑であり、分子における標的活性の最適比について、多くの調査を必要とするが、統一された薬物動態は、分子標的における整合された薬力学活性をもたらし得る。多機能分子はまた、他の薬剤との多剤混合薬にもなり得、これにより、単一の錠剤において、３つ、または更には４つの薬理を組み合わせて効力の更なる増加をもたらす。
【００５０】
本発明者は入念な実験を通じて、３つの作用機構（１つはＰＤ−１媒介阻害シグナルによるＴ細胞に対するブレーキまたは阻害を解除すること、１つはＳＩＲＰ媒介阻害シグナルによるマクロファージに対するブレーキを解除すること、１つはＮＫ細胞および／またはマクロファージによる癌細胞破壊を刺激すること）を介して腫瘍を攻撃できる新規の組換え多機能性融合タンパク質を発明した。
【００５１】
本発明の組換融合タンパク質は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含み、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の少なくとも１つのパラトープが、パラトープを構成する重鎖または軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結される。組換えタンパク質は、ＣＤ４７、ＨＥＲ２およびＦｃＲに同時に結合でき、ｉ）癌細胞上のＰＤ−Ｌ１とＴ細胞上のＰＤ−１との相互作用をブロックし、これにより、ＰＤ−１媒介阻害シグナルによるＴ細胞に対するブレーキを解除し、ｉｉ）癌細胞上のＣＤ４７と、マクロファージ上のＳＩＲＰとの相互作用をブロックし、これにより、ＳＩＲＰ媒介阻害シグナルによるマクロファージに対するブレーキを解除し、（ｉｉｉ）ＮＫ細胞またはマクロファージ上のＦｃＲに対して抗体のＦｃ部を結合させて、ＮＫ細胞またはマクロファージによる癌細胞破壊を刺激する。実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の１つのパラトープは、パラトープを構成する重鎖または軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結する。別の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の各パラトープは、パラトープを構成する重鎖または軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結される。一実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の各パラトープは、パラトープを構成する重鎖のＮ末端で、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結される。一実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の各パラトープは、パラトープを構成する軽鎖のＮ末端で、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結される。さらなる実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の一方のパラトープは、パラトープを構成する重鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結され、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の他方のパラトープは、パラトープを構成する軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインにリンカを介して連結される。いくつかの実施形態において、各パラトープは、パラトープを構成する重鎖および軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の１より多くの（例えば２つ）細胞外Ｉｇ様ドメインに連結される。本発明の組換融合タンパク質は、サイズが小さく（１５０〜１８０ｋＤａ）、５〜１０日の長い半減期を有する。
【００５２】
本発明の融合タンパク質に含まれる３つの主成分は、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメイン、リンカ、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。当業者であれば、上の３成分を選択するための設計の選択肢が多くあることを認識するであろう。非ヒト動物のタンパク質またはペプチドの免疫原性はアレルギーおよびその他の副作用を引き起こし得るので、好ましくは、ヒト由来配列がヒトの癌療法において使用される。しかしながら、異なる応用の目的に基づき、他の動物タンパク質またはペプチドも、必要に応じてヒト化されて本発明において使用され得る。
【００５３】
ＣＤ４７と結合可能な任意のＳＩＰＲ（ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβ、ＳＩＲＰγ）の任意の細胞外Ｉｇ様ドメインが融合タンパク質の構築のために選択され得る。一実施形態において、組換融合タンパク質におけるシグナル調節タンパク質はＳＩＲＰαであり、シグナル調節タンパク質の細胞外Ｉｇ様ドメインはＳＩＲＰαの第１細胞外Ｉｇ様ドメインである（ＳＩＲＰαＤ１）。
【００５４】
一実施形態において、組換融合タンパク質は、配列識別番号１および２においてそれぞれ記載される核酸配列およびアミノ酸配列を有するＳＩＲＰαＤ１を含む。別の実施形態において、ＳＩＲＰαＤ１は、配列識別番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＳＩＲＰαＤ１は、癌／腫瘍細胞などの細胞表面上のＣＤ４７に結合して、ＣＤ４７とマクロファージの細胞表面上のＳＩＲＰとの相互作用をブロックできる。
【００５５】
リンカは主に、ＳＩＲＰの細胞外Ｉｇ様ドメインと、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖のＮ末端との間のスペーサとして機能する。リンカは、ペプチド結合によって連結された、好ましくは５〜３０アミノ酸のペプチド結合によって共に連結されるアミノ酸から作られ得る。ここで、アミノ酸は、天然に発生する２０アミノ酸から選択される。当業者であれば理解できるように、これらのアミノ酸のうち１または複数は、グリコシル化され得る。一実施形態において、５〜３０アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、セリン、リシンから選択され得る。一実施形態において、リンカの大部分は、グリシンおよびアラニンなど、立体障害のないアミノ酸から作られる。例示的なリンカは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙｓ、（Ｇｌｙ）８、ｐｏｌｙ（Ｇｌｙ−Ａｌａ））およびポリアラニンである。下の例に示される好適なリンカの一例は、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、例えば‐（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３‐である。
【００５６】
リンカは非ペプチドリンカでもよい。例えば、‐ＮＨ‐、‐（ＣＨ２）ｓ‐Ｃ（Ｏ）‐などのアルキルリンカ（ｓ＝２〜２０）を使用できる。これらのアルキルリンカは更に、低級アルキル（例えばＣ１‐４）、低級アシル、ハロゲン（例えばＣＩ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなど、任意の非立体障害基によって置換され得る。
【００５７】
任意の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本発明の融合タンパク質の形成において使用され得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブから成る群から選択される単離モノクローナル抗体であり得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列識別番号５および７の核酸配列によってそれぞれコードされ得る、配列識別番号６のアミノ酸配列を各々有する２つの重鎖と、配列識別番号８のアミノ酸配列を各々有する２つの軽鎖とを備える単離モノクローナル抗体である。抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＦａｂ部分（またはパラトープ）は、癌／腫瘍細胞の細胞表面上のＰＤ−Ｌ１に結合して、ＰＤ−Ｌ１と、Ｔ細胞の細胞表面上のＰＤ−１との相互作用をブロックでき、これにより、ＰＤ−１媒介阻害シグナルによるＴ細胞に対するブレーキを解除する。抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＦｃ部はＮＫ細胞またはマクロファージの細胞表面上のＦｃＲに結合して、ＮＫ細胞またはマクロファージによる癌細胞破壊を促進できる。いくつかの実施形態において、重鎖は配列識別番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＰＤ−Ｌ１に結合して、ＰＤ−Ｌ１とＴ細胞の細胞表面上のＰＤ−１との相互作用をブロックでき、また、ＮＫ細胞またはマクロファージの細胞表面上のＦｃＲに結合でき、これにより、癌細胞を破壊するようにＮＫ細胞またはマクロファージを活性化する。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列識別番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＰＤ−Ｌ１に結合して、ＰＤ−Ｌ１と、Ｔ細胞の細胞表面上のＰＤ−１との相互作用をブロックできる。
【００５９】
また、本発明は、組換融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、および、組換え二機能性融合タンパク質を発現する発現ベクターを提供する。ベクターの例には、これらに限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、形質転換可能人工染色体（ＴＡＣ）、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）、およびヒト人工エピソーム染色体（ＨＡＥＣ）が含まれる。
【００６０】
本発明は、上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされ得る。好適な宿主細胞として、大腸菌、酵母および他の真核生物が挙げられる。好ましくは、大腸菌、酵母または哺乳類の細胞株（ＣＯＳまたはＣＨＯなど）が使用される。
【００６１】
別の態様において、本開示は、薬学的に許容されるアジュバントと共に製剤化された本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。組成物は任意で、別の抗体または薬剤など、１または複数の追加の薬学的有効成分を含み得る。本発明の医薬組成物はまた、例えば、別の免疫刺激剤、抗癌剤、抗ウイルス剤、またはワクチンなどとの併用療法において投与できる。
【００６２】
医薬組成物は任意の数の賦形剤を含むことができる。使用できる賦形剤として、担体、表面活性剤、増粘剤、乳化剤、固体結合剤、分散助剤、懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、着香剤、コーティング、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存料、等張剤、およびそれらの組み合わせが挙げられる。好適な賦形剤の選択および使用は、参照によってその開示が本明細書に組み込まれるＧｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２０ｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００３）において教示されている。
【００６３】
医薬組成物における主要なビヒクルまたは担体は、本質的に水性でも非水性でもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、場合によっては注射において一般的な他の物質が添加されている、注射、生理食塩水、または人工脳脊髄液のための水であり得る。例えば、ビヒクルまたは担体は、中性緩衝生理食塩水、または、血清アルブミンと混合された生理食塩水であり得る。他の例示的な医薬組成物は、ソルビトールまたはその好適な置換を更に含み得るＴｒｉｓ緩衝液、または、酢酸塩緩衝液を含む。本発明の一実施形態において、組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、所望の純度を有する選択された組成物を任意の製剤化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｓｕｐｒａ）と混合することによって、保管のために調製され得る。更に、治療用組成物は、スクロースなど適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化され得る。
【００６４】
医薬組成物は、好ましくは（例えば注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に好適である。投与の経路に応じて、活性分子は、それを不活性化し得る酸および他の天然条件の作用から保護するための物質にコーティングされ得る。本明細書において使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。代替的に、本発明の抗体は、例えば、鼻腔内、口腔内、経膣、直腸、舌下、局所など、局所、表皮、または粘膜の投与経路などの非経口経路を介して投与できる。
【００６５】
医薬組成物は、無菌水溶液または分散系の形態であり得る。また、それらはマイクロエマルション、リポソーム、または、高い薬剤濃度に好適な他の規則構造で製剤化され得る。
【００６６】
単回投与形態を生成するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される対象、および、特定の投与方法に応じて変動し、一般的に、治療効果を生じさせる組成物の量である。一般的に、１００パーセント中、有効成分の量は組成物の約０．０１％〜約９９％、好ましくは、約０．１％〜約７０％、もっとも好ましくは、薬学的に許容される担体と組み合わされる組成物の約１％〜約３０％の範囲である。
【００６７】
最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように投与計画が調整される。例えば、いくつかの分割された用量を経時的に投与できる、または、治療状況の緊急事態による指示に応じて用量を比例的に減少または増加させることができる。投与を容易にするために、および、投与量を統一するために、単位用量形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において使用される単位用量形態とは、治療される対象のための単位用量として好適な物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬担体と組み合わせて所望の治療効果を生じさせるために算出された活性化合物の予め定められた量を含む。融合タンパク質は代替的に、徐放性製剤として投与できる。この場合、必要な投与頻度が少ない。
【００６８】
融合タンパク質の投与については、投与量は、宿主の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、体重あたり０．３ｍｇ／ｋｇ、体重あたり１ｍｇ／ｋｇ、体重あたり３ｍｇ／ｋｇ、体重あたり５ｍｇ／ｋｇ、または体重あたり１０ｍｇ／ｋｇ、または、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例示的な治療は、１週間あたり２回、１週間あたり１回、２週間あたり１回、３週間あたり１回、４週間あたり１回、１か月あたり１回、３か月あたり１回、または、３〜６か月あたり１回の投与を伴う。本発明の融合タンパク質の好ましい投与計画は、腹腔内投与を介して体重あたり３ｍｇ／ｋｇ、または、体重あたり６ｍｇ／ｋｇを含み、抗体は、以下の投与スケジュール、すなわち、（ｉ）６回の投与は４週間ごと、その後３か月ごと、（ｉｉ）３週間ごと、（ｉｉｉ）体重あたり３ｍｇ／ｋｇを１回、その後、体重あたり１ｍｇ／ｋｇを３週間ごと、（ｖｉ）体重あたり６ｍｇ／ｋｇを１週間あたり１回投与のうち１つを使用して提供される。いくつかの方法において、約１〜１０００μｇ／ｍｌ（いくつかの方法において、約２５〜３００μｇ／ｍｌ）の血漿抗体濃度を達成するように、投与量が調整される。
【００６９】
本発明の融合タンパク質の「治療有効投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、無疾患症状期間の頻度および期間の増加、または、疾患の苦痛に起因する機能障害または能力障害の予防を引き起こす。例えば、担癌の対象を治療する場合、「治療有効投与量」は好ましくは、未治療の対象と比較して、少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、なおさらに好ましくは少なくとも約９９％だけ腫瘍増殖を阻害する。本発明の融合タンパク質の治療有効量は、腫瘍サイズを低減でき、または、そうでなければ、典型的にはヒトである、または別の哺乳類であり得る対象における症状を改善する。
【００７０】
医薬組成物、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤であり得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など、生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７８を参照されたい。
【００７１】
治療用組成物は、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３；  ５，３８３，８５１；  ５，３１２，３３５；  ５，０６４，４１３；  ４，９４１，８８０；  ４，７９０，８２４；および４，５９６，５５６号）、（２）マイクロ注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮装置（米国特許第４，４８６，１９４号）、（４）注入機器（米国特許第４，４４７，２３３および４，４４７，２２４号）、（５）浸透圧装置（米国特許第４，４３９，１９６および４，４７５，１９６号）などの医療装置を介して投与され得る。これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７２】
特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで適切に分布することを確実にするために製剤化され得る。例えば、本発明の治療用融合タンパク質が血液脳関門を超えることを確実にするために、それらは、特定の細胞または臓器への選択的輸送を強化する標的化部分を追加的に含み得るリポソームにおいて製剤化され得る。例えば、米国特許第４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；５，４１６，０１６；および５，３９９，３３１を参照されたい。
【００７３】
本発明の組換融合タンパク質またはその誘導体をコードする核酸分子が対象に直接導入されるｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法も考えられる。例えば、本発明の組換融合タンパク質をコードする核酸配列が、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適切な送達ベクターを用いて、または用いず、核酸コンストラクトの局所注射を介して標的細胞に導入される。代替的なウイルスベクターは、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、乳頭腫ウイルスベクターを含む。ウイルスベクターの物理的移入は、所望の核酸コンストラクト、または、所望の核酸配列を含む他の適切な送達ベクターの局所注射、リポソーム媒介移入、直接注射（ネイキッドＤＮＡ）、または微粒子ボンバードメント（遺伝子ガン）によってｉｎ  ｖｉｖｏで達成され得る。
【００７４】
本開示の組成物は、単独で、または、治療効果を強化するために、もしくは、潜在的な副作用を低減するために、他の治療剤と組み合わせて使用され得る。
【００７５】
本発明の別の目的は、上の組換融合タンパク質、および、それを含む医薬組成物を調製するための方法を提供することである。一実施形態において、方法は、（１）ポリヌクレオチド分子をコードするタンパク質を提供すること、（２）（１）のポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを構築すること、（３）（２）の発現ベクターで好適な宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換して、タンパク質を発現させるために宿主細胞を培養すること、（４）タンパク質を精製することを含む。調製は、当業者によって、既知の技術を用いて実行され得る。
【００７６】
本発明の別の目的は、上記医薬組成物の有効量を、それを必要とする患者または対象に投与することを含む、本発明の医薬組成物を使用して癌を治療する方法を提供することである。一実施形態において、医薬組成物は、これらに限定されないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵癌、腎癌を含む、ＣＤ４７および／またはＰＤ−Ｌ１過剰発現腫瘍または癌を治療するために使用される。 
【００７７】
一実施形態において、ＣＤ４７および／またはＰＤ−Ｌ１の過剰発現に関連する疾患は、これらに限定されないが、クローン病、アレルギー性喘息、関節リウマチを含む。
【００７８】
以下では非限定的な例を用いて、本発明を更に説明する。
【００７９】
［例］
【００８０】
下の例において、ＩＭＭ２５は、ＰＤ−Ｌ１を標的化するモノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。この抗体は、配列識別番号６のアミノ酸配列を各々有する２つの重鎖と、配列識別番号８のアミノ酸配列を各々有する２つの軽鎖とを有し、これら２つはそれぞれ、配列識別番号５および７の核酸配列によってコードされ得る。
【００８１】
ＩＭＭ０１は、ＷＯ２０１６１６９２６１に記載された、Ｆｃ断片に連結するＳＩＲＰαＤ１から成る、ＣＤ４７に結合できる融合タンパク質である。この融合タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列はそれぞれ、配列識別番号１１および配列識別番号１２において記載される。
【００８２】
ＩＭＭ２５０５は、各重鎖のＮ末端においてＧＳ−リンカを介してＩＭＭ２５に各々連結される２つのＳＩＲＰαＤ１を含む組換融合タンパク質である。ここで、ＳＩＲＰαＤ１は、それぞれ配列識別番号１および配列識別番号２である核酸配列およびアミノ酸配列を含み、配列識別番号４のアミノ酸配列を有するリンカは、配列識別番号３の核酸配列によってコードされ得る。
【００８３】
［例１］
［ＩＭＭ２５０５を発現するベクターの構築］
【００８４】
組換融合タンパク質ＩＭＭ２５０５のコード配列の全長は人工的に設計された。具体的には、重鎖については、ＳＩＲＰα（ＳＩＲＰαＤ１）の第１細胞外ドメインのコード配列（配列識別番号１）は、ＧＳ−リンカ（配列識別番号３）を通じて、ＩＭＭ２５の重鎖可変領域コード配列（配列識別番号５）のＮ末端に連結された。マウスＩｇＧ１重鎖のシグナルペプチドをコードする５７ヌクレオチド（配列識別番号１３）は、ＳＩＲＰαＤ１コード配列の５'末端に追加され、コザック配列（配列識別番号１４）は、シグナルペプチド配列の５'末端に追加された。最後に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限酵素認識部位がそれぞれ、結果として生じる配列の５'および３'末端に追加された。軽鎖については、同一のシグナル配列、および、コザック配列が使用されたが、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素認識部位がそれぞれ、結果として生じる配列の５'および３'末端に追加された。２つの結果として生じる配列は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＩＤ＃：  Ｌ３１８３４（重鎖）；Ｍ６０５７３（軽鎖））によって合成され、それぞれｐＭａｃ−ＨおよびｐＭａｃ−Ｌベクターにサブクローニングされた。
【００８５】
［例２］
［タンパク質発現および精製］
【００８６】
組換えタンパク質ＩＭＭ２５０５を製造するために、ネオマイシンの圧力選択を複数回受けたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ，  Ｃａｔ＃  ＣＣＬ−６１）へ発現ベクターが電気穿孔で導入された。選択された安定した細胞は、血清を含まないＢａｌａｎ  ＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃９４１２０）に適合された。タンパク質発現については、細胞は３リットルバイオリアクタに播種され、フェドバッチプロセスにおいて培養された。細胞の生存率が約８０％に低下したとき、バイオリアクタにおける反応が終了され、細胞培養液の上清が採取され、親和性クロマトグラフィーによるタンパク質精製にかけられた。組換えタンパク質の純度は９５％より高く、エンドチキシンの含有量は０．５Ｕ／ｇより低かった。
【００８７】
［例３  ＰＤ−Ｌ１またはＣＤ４７に結合されるＩＭＭ２５０５］
【００８８】
ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞（ＰＤ−Ｌ１を過剰発現）またはジャーカット細胞（ＣＤ４７を高発現）が４℃で１時間にわたって、連続希釈されたＩＭＭ２５０５または対照薬剤と共にインキュベートされた。細胞は冷たいＰＢＳで２回洗浄され、次に、ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ，  Ｃａｔ＃Ｆ９５１２）に対するＦＩＴＣ結合二次抗体と共に４５分間インキュベートされた。細胞は２回洗浄され、２００ｍｌのＰＢＳにおいて再懸濁された。次に、フローサイトメトリー（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｇｕａｖａ（登録商標）  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ５ＨＴ）を使用して、細胞がＦＡＣＳ分析にかけられた。
【００８９】
ＩＭＭ２５０５は、ＣＨＯ細胞上のＰＤ−Ｌ１に結合し（図７）（ＥＣ５０値は０．０１ｎＭの）、ジャーカット細胞上のＣＤ４７に結合し（図８）（ＥＣ５０値は０．０４ｎＭの）、従来の単一抗原標的化抗体に比べて少し劣っている。
【００９０】
［例４］
［ＩＭＭ２５０５によってブロックされるＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用］
【００９１】
ビオチンＰＤ１−Ｆｃが連続希釈ＩＭＭ２５０５、ＩＭＭ２５、アテゾリズマブ、またはハーセプチン（登録商標）と混合され、次に混合物が、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞を含む９６ウェルプレートに添加された。細胞が４℃で４５分間インキュベートされ、ＰＢＳで洗浄され、次に、４℃で更に４５分間、ＰＥ結合マウス抗ヒトＣＤ２７９（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，  Ｃａｔ＃５５７９４６）と共にインキュベートした。細胞が２００ｍｌのＰＢＳで洗浄および再懸濁され、次に、ＰＤ１−Ｆｃと膜結合ＰＤ−Ｌ１との結合親和性についてＦＡＣＳ分析にかけた。
【００９２】
図９に示されるように、ＩＭＭ２５０５は、ＰＤ１−ＦｃとＰＤ−Ｌ１＋細胞との相互作用をブロックした（ＩＣ５０値は０．３６ｎＭ）。
【００９３】
［例５］
［ＩＭＭ２５０５によってブロックされるＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用］
【００９４】
ＦＩＴＣ結合ＳＩＲＰα−Ｆｃが連続希釈ＩＭＭ２５０５、ＩＭＭ０１、ＳＩＲＰα−Ｆｃまたはハーセプチン（登録商標）と混合され、混合物が、ジャーカット細胞を含む９６ウェルプレートに添加され、４℃で４５分間インキュベートされた。細胞がＰＢＳで洗浄され、次に、ＳＩＲＰα−Ｆｃと膜結合ＣＤ４７との結合親和性についてＦＡＣＳ分析にかけられた。
【００９５】
図１０に示されるように、ＩＭＭ２５０５は、８３．８ｎＭのＩＣ５０値で、ＳＩＲＰα−Ｆｃと、ＣＤ４７＋細胞との相互作用をブロックした。
【００９６】
［例６］
ＩＭＭ２５０５は高い抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示した。
【００９７】
ＣＦＳＥ標識Ｒａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１細胞（標的細胞として使用される）が、ＦｃγＲＩＩＩａを安定的に発現するＮＫ９２ＭＩ細胞（エフェクター細胞）と、１：２の比で混合され、混合細胞は、連続希釈ＩＭＭ２５０５またはＩＭＭ２５の存在下で、５％のＣＯ２と共に３７℃で４時間培養された。次に、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ，  Ｃａｔ＃Ｐ４１７０）が、５μｇ／ｍｌの濃度で細胞培養液に添加され、細胞培養液が、ＰＩシグナルについてＦＡＣＳ分析にかけられた。ＡＤＣＣによって引き起こされた細胞溶解の割合は、以下の式に基づいて算出された。
【００９８】
溶解率（％）＝（ＩＭＭ２５０５またはＩＭＭ２５を有するＰＩ陽性細胞の割合（％）−ネガティブコントロールタンパク質を有するＰＩ陽性細胞の割合（％））／（１００−ネガティブコントロールタンパク質を有するＰＩ陽性細胞の割合（％））×１００
【００９９】
図１１に示されるように、ＩＭＭ２５０５は高いＡＤＣＣ活性を有し、ＩＭＭ２５の約５倍であった。
【０１００】
［例７］
ＩＭＭ２５０５はジャーカット‐ＣＲＰのアポトーシスを阻害した。
【０１０１】
Ｅ１．キメラＰＤ−１受容体（ＣＰＲ）を発現する細胞株の開発
【０１０２】
キメラＰＤ−１受容体（ＣＰＲ）は、ヒトＰＤ−１の細胞外ドメイン、ヒトＣＤ８ａヒンジ領域、ヒトＣＤ２８の膜貫通領域および細胞内領域、およびヒトＣＤ３ζから成る。ＣＰＲコード配列（配列識別番号１５）は、順にヒトＣＤ２８の膜貫通領域および細胞内領域、ならびにＣＤ３ζ配列が続くヒトＣＤ８ａヒンジ領域のコード配列にヒトＰＤ−１の細胞外ドメインコード配列を連結することによって設計された。結果として生じる配列は、Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＩＤ＃：  Ｔ１５０９０９０６６１  −Ｔ３９７０）によって合成され、ｐＭａｃ−Ｆｃベクターにサブクローニングされた。
【０１０３】
ＣＰＲ発現細胞株を開発するために、発現ベクターをジャーカット細胞に電気穿孔で導入し、細胞をネオマイシンによる複数回の圧力選択にかけた。選択された安定した細胞は、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ２７９（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，  Ｃａｔ＃５５７９４６）を使用して、ＦＡＣＳ分析によってＣＰＲを安定的に発現することが確認された。
【０１０４】
Ｅ２．ＣＰＲを発現する細胞のアポトーシスの誘導
【０１０５】
９６ウェルプレートのジャーカットＣＰＲ−細胞は、１０：１の比でＲａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１細胞と混合され、混合細胞は５％のＣＯ２の下で、３７℃で２４時間培養された。次に、２０μｌのＣＣＫ８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，  Ｃａｔ＃ＣＫ０４）が細胞溶液に添加され、４５０ｎｍの波長で光学密度（ＯＤ）を測定する前に細胞培養インキュベータで２時間インキュベートされた。
【０１０６】
Ｅ３．ＰＤ−Ｌ１誘導細胞アポトーシスの阻害
【０１０７】
９６ウェルプレートのＲａｊｉ−ＰＤ−Ｌ１細胞は、連続希釈ＩＭＭ２５０５、ＩＭＭ２５、アテゾリズマブ、またはハーセプチン（登録商標）と共に、５％ＣＯ２の下で、３７℃で４５分間インキュベートされ、次に、ジャーカットＣＰＲ−細胞がプレートに追加され（ジャーカットＣＰＲ−細胞とＲａｊｉ−ＰＤＬ１細胞の比は１０：１）、２４時間インキュベートされた。ＣＣＫ８がプレートに添加され、４５０ｎｍの波長でＯＤを測定する前に、プレートは更に２時間インキュベートされた。
【０１０８】
ＩＭＭ２５０５が０．０２７ｎＭのＩＣ５０値でジャーカット‐ＣＲＰのアポトーシスを阻害したことが図１２から分かる。
【０１０９】
［例８］
［ＨＬ−６０のＩＭＭ２５０５活性化食作用］
【０１１０】
マウスマクロファージ細胞株Ａｎａ−１が９６ウェル細胞培養プレートに播種され（ウェルあたり１×１０５個の細胞）、５％ＣＯ２の下で３７℃で１６〜１８時間にわたって培養した。標的細胞（ＨＬ−６０）はＣＦＳＥで標識され、次に、連続希釈ＩＭＭ２５０５、ＩＭＭ０１、またはハーセプチン（登録商標）と共に４５分間インキュベートされた。標的化された細胞溶液は、Ａｎａ−１細胞を含むプレートに移された（Ａｎａ−１細胞とＨＬ−６０細胞との比は１：１）。混合物は細胞培養インキュベータで２時間培養され、次に、Ａｎａ−１細胞におけるＣＦＳＥの密度について、ＦＡＣＳによる分析にかけられた。
【０１１１】
図１３は、ＩＭＭ２５０５が高いレベルの腫瘍細胞の食作用を活性化できることを示した。
【０１１２】
［例９］
ＩＭＭ２５０５は良好な抗癌効果を有した。
【０１１３】
４８匹の４〜６週齢ＳＣＩＤマウスが右脇腹にＲａｊｉ細胞を皮下注射された（マウスあたり６×１０６個の細胞）。腫瘍体積が１００〜１５０ｍｍ３に到達したとき、マウスは６群にランダムで割りつけられた（各群あたり８匹のマウス）。マウスはそれぞれ、４週間にわたって週１回、ＰＢＳ、リツキシマブ‐ＡＤＣＣ＋（ＡＤＣＣ増強リツキシマブ、２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ２５０５（６ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ２５（５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ０１（０．５ｍｇ／ｋｇ）およびＩＭＭ０１＋ＩＭＭ２５（０．５ｍｇ／ｋｇ＋５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を受けた。腫瘍体積および体重は３〜４日ごとに測定された。ＰＢＳ群における平均腫瘍体積が１５００ｍｍ３に到達したとき、投与が停止され、実験が終了された。
【０１１４】
腫瘍体積（Ｖ）が（長さ×幅２）／２として算出された。腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）は、腫瘍増殖阻害率＝（投与群における１つの腫瘍体積の変化／対照群における腫瘍体積の変化）×１００％の式によって算出された。
［表１］
【表１】
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ＩＭＭ２５０５および他の薬剤の抗癌効果
【０１１５】
群５は１００．０６％の腫瘍増殖阻害率を示し、上の表１および図１４に示される他の群より遥かに高く、単一抗原標的化薬剤と比較して、ＩＭＭ２５０５の効力が優れていることが示唆された。
【０１１６】
本発明は、１または複数の実施形態と関連して上で説明されたが、本発明はこれらの実施形態に限定されず、本説明は、すべての代替形態、変更形態、等価形態を包含することが意図され、添付の請求項の思想および範囲内に含まれ得ることが理解されるべきである。本明細書において参照される引用はすべて、参照によって全体的に更に組み込まれる。
【０１１７】
［参考文献］
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【０１１８】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月17日(2020.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む組換融合タンパク質であって、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体の少なくとも１つのパラトープはリンカを介して重鎖または軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結され、前記組換融合タンパク質はＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１およびＦｃＲに同時に結合できる、組換融合タンパク質。
【請求項２】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体の各パラトープは前記重鎖または前記軽鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結される、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項３】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体の各パラトープは前記重鎖のＮ末端でシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外Ｉｇ様ドメインに連結される、請求項２に記載の組換融合タンパク質。
【請求項４】
前記シグナル調節タンパク質はＳＩＲＰαである、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項５】
前記シグナル調節タンパク質の前記細胞外Ｉｇ様ドメインはＳＩＲＰαの第１細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＳＩＲＰαＤ１）である、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカは５〜３０アミノ酸残基の短いペプチドである、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカは‐（Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｓｅｒ）３‐である、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項８】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列識別番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を各々有する２つの重鎖と、配列識別番号８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を各々有する２つの軽鎖とを備える、請求項１に記載の組換融合タンパク質。
【請求項９】
前記重鎖は配列識別番号６のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の組換融合タンパク質。
【請求項１０】
前記軽鎖は配列識別番号８のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の組換融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを備える発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターを備える宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを備える医薬組成物。
【請求項１５】
少なくとも１つの薬学的に許容されるアジュバントを更に含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＣＤ４７および／またはＰＤ−Ｌ１の過剰発現により引き起こされる疾患を治療するための薬剤の調製に使用される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換融合タンパク質、または、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵癌、および腎細胞癌から成る群から選択される、請求項１６に記載の組換融合タンパク質または医薬組成物。
【請求項１８】
前記疾患は、クローン病、アレルギー性喘息および関節リウマチから成る群から選択される、請求項１６に記載の組換融合タンパク質または医薬組成物。
【国際調査報告】
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