(57)【要約】  本開示は、アッカーマンシアムシニフィラを含むアッカーマンシア細菌を遺伝子改変およびスクリーニングするための方法およびシステムを提供する。この方法はまた、遺伝子改変された細菌、遺伝子改変された細菌のライブラリ、および疾患の治療のためのそのような細菌の使用を提供する。【選択図】図３
2021524230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッカーマンシア細菌を遺伝子改変する方法であって、前記方法が、
（ａ）配列番号１の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアに導入して、複数の改変されたアッカーマンシア細菌を生成することと、
（ｂ）前記複数の改変されたアッカーマンシアを培養して、前記ベクターの前記トランスポゾンをゲノムに組み込んだ細菌を選択して、複数の遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌を生成することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記外因性トランスポゾンベクターが、前記トランスポゾンベクターを含む大腸菌との前記アッカーマンシア細菌のコンジュゲーションによって導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）が、クロラムフェニコールを含む培地中で前記複数の改変されたアッカーマンシアを培養して、前記トランスポゾン内に含まれる抗生物質耐性遺伝子を含む前記複数の改変されたアッカーマンシアを選択することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）が、アッカーマンシア細菌の増殖を可能にするが、大腸菌を含む他の細菌株の増殖を可能にしない培養条件下で、前記改変されたアッカーマンシアを培養することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が嫌気性条件下で培養され、前記培地が、それらのゲノム内に組み込まれた前記トランスポゾンを有する改変されたアッカーマンシアを選択するためのクロラムフェニコールを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、
（ｃ）形質を選択する条件下で前記複数の遺伝子改変されたアッカーマンシアを培養することと、
（ｄ）前記アッカーマンシアのゲノム内の前記トランスポゾンに隣接する遺伝子のＰＣＲまたは配列決定により、前記形質に関連する遺伝子を同定することと、をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記形質が、前記アッカーマンシアによるムチンの利用であり、工程（ｃ）が、ムチンを含むかまたはムチンを含まない培地中で前記遺伝子改変されたアッカーマンシアを培養することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、
（ｄ）ムチンの存在下で増殖した前記改変されたアッカーマンシアの遺伝子およびムチンの非存在下で増殖した改変されたアッカーマンシアの遺伝子を遺伝子分析して、ムチン利用を調節する遺伝子を決定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
表現型形質が腸の安定したコロニー形成に関連し、前記方法が、
（ｄ）前記複数の遺伝子改変されたアッカーマンシアを対象に導入することと、
（ｅ）前記改変された細菌の遺伝子を遺伝子分析することにより、前記対象の腸にコロニーを形成する増殖の利点を有する前記改変されたアッカーマンシアを検出することと、をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
複数の改変されたアッカーマンシアバリアントの少なくとも一部のＤＮＡ配列によって遺伝子分析が行われる、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって生成される遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌であって、前記遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌のゲノムが前記トランスポゾンを含む、遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌。
【請求項１２】
配列番号１のベクターからのトランスポゾンをアッカーマンシア細菌に組み込むことによって生成される、遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌。
【請求項１３】
前記細菌は表１に列挙された遺伝子のいずれか１つが破壊されている、請求項１２に記載の遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌。
【請求項１４】
前記細菌は表２に列挙された遺伝子のいずれか１つが破壊されている、請求項１２に記載の遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌。
【請求項１５】
前記細菌は表３に列挙された遺伝子のいずれか１つが破壊されている、請求項１２に記載の遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌。
【請求項１６】
改変されたアッカーマンシア細菌のライブラリであって、配列番号１のベクターからのトランスポゾンをアッカーマンシアの集団にランダムに導入することと、クロラムフェニコールを含む培地中、嫌気性条件下で前記細菌を培養することにより改変された前記アッカーマンシア細菌を選択して、前記トランスポゾンがゲノムに挿入されているアッカーマンシアを選択することによって生成される、ライブラリ。
【請求項１７】
前記ライブラリが、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によって生成される、請求項１３に記載のライブラリ。
【請求項１８】
形質の改変された遺伝的調節因子を有する改変されたアッカーマンシア細菌を選択する方法であって、前記方法が、
（ａ）配列番号１の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアの集団に導入して、前記トランスポゾンを前記アッカーマンシアのゲノムにランダムに組み込むことと、
（ｂ）前記集団アッカーマンシアを培養して、前記トランスポゾンがそれらのゲノムに組み込まれているアッカーマンシアを選択して、アッカーマンシアの複数の改変されたバリアントを生成することと、
（ｃ）前記改変された遺伝形質が選択される条件下で前記アッカーマンシアを培養することにより、前記改変された遺伝的調節因子を有するアッカーマンシアを選択することと、を含む、方法。
【請求項１９】
工程（ａ）が、配列番号１の前記トランスポゾンベクターを含む大腸菌との前記アッカーマンシアのコンジュゲーションを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）が、クロラムフェニコールの存在下でアッカーマンシアの前記改変されたバリアントを選択するために嫌気性条件下で前記細菌を継代培養することを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｄ）前記トランスポゾンに隣接するゲノム領域を配列決定またはＰＣＲ増幅することによって、前記改変された遺伝子調節因子を決定することをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
アッカーマンシアの形質の新規な遺伝的調節因子を同定する方法であって、前記方法が、
（ａ）配列番号１の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアの集団に組み込んで、前記トランスポゾンをそれらのゲノムに組み込んだ改変されたアッカーマンシアの集団を作製することと、
（ｂ）クロラムフェニコールを含む培地で前記アッカーマンシアを培養して、前記外因性トランスポゾンを組み込んだアッカーマンシアを選択することと、
（ｃ）前記改変されたアッカーマンシアを２つの異なる条件にさらすことと、
（ｄ）前記形質に関連する遺伝子を同定するために、前記２つの異なる条件下で増殖させた、前記改変されたアッカーマンシアの前記トランスポゾンによって破壊された遺伝子を配列決定またはＰＣＲ増幅することによって分析することと、を含む、方法。
【請求項２３】
前記アッカーマンシアが、アッカーマンシアムニシプリラ（ｍｕｎｉｃｉｐｌｉｌａ）またはアッカーマンシアの臨床株である、請求項１〜１０または１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記アッカーマンシアが、アッカーマンシアムニシプリラ（ｍｕｎｉｃｉｐｌｉｌａ）またはアッカーマンシアの臨床株である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたアッカーマンシア、または請求項１６もしくは１７に記載のライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１５日に出願された米国仮出願第６２／６７１，６１４号の優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
連邦政府が後援する研究に関する声明
本発明は、ＮＩＨによって授与された連邦助成金番号５Ｒ２１ＤＫ１１０４９６−０２の下で政府の支援を受けて行われた。連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の分野は、表現型が改変した腸内微生物の遺伝子修飾および選択、ならびに疾患を治療する際のこれらの微生物の使用に関する。
【０００４】
アッカーマンシア・ムシニフィリア（ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌｉａ）は、ヒトの腸管の粘膜表面に見出される細菌である。この細菌は、単一の栄養源としてムチンを使用する。この細菌は、成人の腸内細菌の１〜４％を占め、大腸に生息する細菌の一種である。この細菌は、腸内細菌叢に有益であると考えられている、グラム陰性、偏性、嫌気性、非運動性、非胞子形成性の楕円形の真正細菌である。しかしながら、アッカーマンシアは分子操作が難しいことがわかっている。アッカーマンシアが腸内細菌叢、粘膜および全身の免疫、ならびにグルコース／脂質代謝に生理学的に影響を与えるメカニズムは十分に理解されていない。
【０００５】
そのため、腸内細菌叢におけるその役割を研究するために、遺伝子改変されたアッカーマンシア株を生成するための方法およびシステムについての必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、部分的に、トランスポゾンベクターを使用してアッカーマンシア細菌を遺伝子改変する方法の発明者の開発に基づいている。遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌および改変されたアッカーマンシア細菌のライブラリも提供される。本開示の他の態様は、本明細書に記載および例証されるすべてにおいて提供される。
【０００７】
一態様では、本開示は、アッカーマンシア細菌を遺伝子改変する方法を提供し、この方法は、（ａ）配列番号１の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアに導入して、複数の改変されたアッカーマンシア細菌を生成すること、および（ｂ）複数の改変されたアッカーマンシアを培養して、ベクターのトランスポゾンをゲノムに組み込んだ細菌を選択して、複数の遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌を生成することを含む。
【０００８】
別の態様では、本開示は、記載された方法によって生成される遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌を提供し、ここで、遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌ゲノムは、トランスポゾンベクター（配列番号１）のトランスポゾン（配列番号４７）を含む。
【０００９】
別の態様では、本開示は、配列番号１のベクターからのトランスポゾンをアッカーマンシア細菌に組み込むことによって生成される、遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌を提供する。一例では、トランスポゾンは、アッカーマンシアゲノムに組み込まれた配列番号４７である。
【００１０】
別の態様では、本開示は、改変されたアッカーマンシア細菌のライブラリを提供し、ライブラリは、配列番号１のベクターからアッカーマンシアの集団にトランスポゾンをランダムに導入することと、クロラムフェニコールを含む培地中、嫌気性条件下で細菌を培養することにより改変されたアッカーマンシア細菌を選択して、トランスポゾンがゲノムに挿入されているアッカーマンシアを選択することとによって生成される。
【００１１】
さらに別の態様では、本開示は、形質の改変された遺伝的調節因子を有する改変されたアッカーマンシア細菌を選択する方法を提供し、この方法は、（ａ）配列番号１の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアの集団に導入して、トランスポゾンをアッカーマンシアゲノムにランダムに組み込むことと、（ｂ）集団アッカーマンシアを培養して、トランスポゾンがそれらのゲノムに組み込まれているアッカーマンシアを選択して、アッカーマンシアの複数の改変されたバリアントを生成することと、（ｃ）改変された遺伝形質が選択される条件下でアッカーマンシアを培養することにより、改変された遺伝的調節因子を有するアッカーマンシアを選択することとを含む。
【００１２】
別の態様では、本開示は、アッカーマンシアにおける形質の新規の遺伝的調節因子を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）配列番号１の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアの集団に組み込んで、トランスポゾンをそれらのゲノムに組み込んだ改変されたアッカーマンシアの集団を生成することと、（ｂ）クロラムフェニコールを含む培地中でアッカーマンシアを培養して、外因性トランスポゾンを組み込んだアッカーマンシアを選択することと、（ｃ）改変されたアッカーマンシアを２つの異なる条件にさらすことと、（ｄ）形質に関連する遺伝子を同定するために、２つの異なる条件下で増殖した改変されたアッカーマンシアにおいてトランスポゾンによって破壊された遺伝子を配列決定またはＰＣＲ増幅によって分析することとを含む。
【００１３】
本発明の前述のおよび他の態様および利点は、以下の説明から明らかになる。説明において、本明細書の一部を形成し、例示として本発明の好ましい実施形態が示されている添付の図面を参照する。しかし、そのような実施形態は、必ずしも本発明の全範囲を表すわけではなく、したがって、本発明の範囲を解釈するためには、特許請求の範囲および本明細書を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アッカーマンシアの適合するトランスポゾンベクターｐＳＡＭ＿Ａｋｋ。
【図２】ｐＳＡＭ＿Ａｋｋトランスポゾンはアッカーマンシアゲノムに挿入される。（Ａ）トランスコンジュゲートを継代培養した後のプラスミド骨格上のｂｌａ遺伝子を検出するための定量的ＰＣＲ。これらの継代培養工程は、大腸菌を対抗選択するため、プラスミドを回復させるため、および転位の発生のために必要である。（Ｂ）野生型アッカーマンシアおよびトランスポゾン変異体からのＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロットは、ジオキシゲニン標識トランスポゾン特異的プローブと反応した。（Ｃ）アッカーマンシア特異的１６Ｓ  ｒＤＮＡ（Ａｋｋ）、プラスミド骨格（ｂｌａ）、およびトランスポゾン内の薬剤耐性マーカー（ｃａｔ）を検出するためのＰＣＲ。
【図３】ムチンの利用のために必要とされる遺伝子のアレイ化変異体スクリーニング。（Ａ）ムチンでの増殖に必要とされる遺伝子を同定するために使用されるアプローチ。コンジュゲーション後、Ｔｎ変異体は抗生物質選択を伴うプレートで増殖させ、個々のコロニーをアレイ化して９６ウェルプレートで増殖させた。次に、これらの変異体を使用して、炭素源としてムチンまたは単糖類のいずれかを有する培地を含むプレートに接種した。ムチンではなく合成培地で増殖させたＴｎ変異体を、Ｔｎ挿入位置を同定するための追加の表現型の特性評価およびＰＣＲのために選択した。（Ｂ）野生型アッカーマンシアおよび選択された変異体の増殖曲線。変異体はムチン特異的な増殖欠陥を示す。
【図４】Ｔｎ／ＩＮ−ｓｅｑを使用したインビボでの大規模遺伝子スクリーニング。（Ａ）アッカーマンシアＴｎ変異体をプールし、強制経口投与により無菌マウスにコロニーを形成するために使用した。強制経口投与の７日後、腸管に沿ったさまざまな場所の内容物が収集され、ＤＮＡ単離のために使用された。イルミナシーケンシングを使用して、トランスポゾン挿入に隣接する固有のＤＮＡ配列に基づいて、入力プールおよび出力プール内の変異体の存在量を同定した。プールから枯渇した変異体は、コロニー形成に必要とされる遺伝子を破壊するＴｎ挿入を有する。（Ｂ）７日後に入力強制経口投与および盲腸で同定された遺伝子のプロット。遺伝子の存在量は１００万あたりのカウント数で標準化されており、各点はＴｎ挿入を有する遺伝子を表す。（Ｃ）７日後に入力強制経口投与および盲腸で同定された遺伝子のプロット。灰色の点はＴｎ挿入部位であり、色付きの点はムチンの利用のために必要とされる遺伝子におけるＴｎ挿入を表す。
【図５】ムチンおよびアッカーマンシアについてのマウスの胃腸管の染色の代表的な画像。
【図６】野生型（ｗｔ）アッカーマンシアまたは変異体Ａｍｕｃ−０５４４アッカーマンシアのいずれかでコロニー形成されたマウスの近位および遠位結腸の染色の代表的な画像。下の行に示されているように、遺伝子Ａｍｕｃ−０５４４は遠位結腸のコロニー形成に必要とされる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、１つまたは複数の好ましい実施形態に関して説明されており、明示的に述べられたものを除いて、多くの同等物、代替物、バリエーション、および修飾が可能であり、本発明の範囲内であることが理解されるべきである。本発明が説明される前に、本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【００１６】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似のまたは同等のいかなる方法および材料も本発明の実施またはテストに使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、本発明に関連して使用される可能性のある刊行物で報告される化学物質、細胞株、ベクター、動物、器具、統計分析および方法論を説明および開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明のおかげでそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００１７】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、この冠詞の文法的目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は、少なくとも１つの要素を意味し、複数の要素を含むことができる。
【００１８】
「約」は、所定の値が望ましい結果に影響を与えることなくエンドポイントの「わずかに上」または「わずかに下」になり得ることを提供することにより、数値範囲エンドポイントに柔軟性を提供するために使用される。本明細書で使用される約という用語は、列挙された数値の＋／−１０％の範囲を指す。
【００１９】
本明細書における「含む」、「含有する」、または「有する」という用語、およびそれらのバリエーションの使用は、その後に列挙される要素およびその同等物ならびに追加の要素を包含することを意味する。特定の要素を「含む」、「含有する」、または「有する」と列挙される実施形態はまた、それらの特定の要素「から本質的になる」および「からなる」ことが企図される。
【００２０】
本明細書の値の範囲の列挙は、特に明記しない限り、範囲内にある各別個の値を個別に参照する簡略化された方法として役立つことを単に意図し、各別個の値は、本明細書に個別に記載されているかのように明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％〜５０％と記載されている場合、２％〜４０％、１０％〜３０％、１％〜３％などの値を本明細書中で明示的に列挙することを意図している。これらは、具体的に意図されていることの単なる例であり、列挙された最小値と最大値との間であり、かつこれらの値を含む数値のすべての可能な組み合わせは、本開示において明示的に述べられていると見なされるべきである。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「処置」、「治療」および／または「治療レジメン」は、患者によって明らかにされた、または患者が感受性である可能性のある疾患、障害または生理学的状態に応答して行われる臨床的介入を指す。治療の目的には、症状の緩和もしくは予防、疾患、障害、もしくは状態の進行もしくは悪化の遅延もしくは停止、および／または疾患、障害、もしくは状態の寛解が含まれる。
【００２２】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益なまたは望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすために十分な量を指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。好ましい実施形態では、対象または患者はヒトである。本開示の「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。いくつかの実施形態では、対象は、マウス、または疾患のマウスモデルである。
【００２４】
方法
本開示は、部分的に、腸内微生物、アッカーマンシアムシニフィラおよび関連種（臨床株を含む）の変異および特徴付けのための材料、システムおよび方法、ならびに改変されたアッカーマンシアのそれらの使用を提供する。
【００２５】
本開示は、新たなプロバイオティクスであるアッカーマンシアムシニフィラを遺伝子操作するためのツールおよび方法を提供する。これらのシステムおよび方法は、表現型の形質に関連する因子、例えば、ムチンの分解および微生物相の他のメンバーとの首尾よい競合を媒介する新しい酵素を含む、動物のコロニー形成を媒介する因子を迅速に同定することを可能にする。このシステムは、慢性炎症の免疫調節剤としてより適しており、食事によって誘導される肥満に対する保護剤および癌免疫治療のブースターとしての特性が強化された改変株の生成を可能にする。
【００２６】
本発明者らは、トランスポゾン変異誘発（ベクターからアッカーマンシアゲノムへのトランスポゾンの挿入）、表現型分析およびＰＣＲまたは配列に基づく変異マッピングを組み込んで、腸内のヒト微生物叢に見出されるアッカーマンシアの新規遺伝子調節因子を同定する、アッカーマンシアムシニフィラを遺伝子改変する方法を開発した。
【００２７】
アッカーマンシアムシニフィラは、腸内細菌叢に見られるグラム陰性、厳密に嫌気性、非運動性、非胞子形成性、楕円形の細菌である。本開示以前は、Ａ．ムシニフィラが分子遺伝学的操作に適していることは知られていなかった。それらは、胃腸管の管腔保護において重要なグリコシル化タンパク質であるムチンを処理することが知られている。
【００２８】
胃腸管内の炭水化物の利用可能性は、微生物叢の構造−機能を形作り、どの微生物が腸管で増殖してコロニーを形成できるかを決定する際に役割を果たす。健康増進における微生物の利用は、健康な植物相を維持するために腸内で有用な細菌にコロニーを形成させる能力に依存している。腸内細菌によるムチン分解の構造的要件、およびムチンおよびムチングリカンを分解および利用できる株と相関する酵素の限られた機能的特徴については、まだほとんど知られていない。ムチンは大きく、高度にグリコシル化されたタンパク質である。本開示は、アッカーマンシアの改変されたバリアント、改変されたアッカーマンシアの集団を作製する方法、および改変されたアッカーマンシアを使用して結腸にコロニーを形成し、対象の健康を促進する方法を提供する。
【００２９】
一態様では、本開示は、アッカーマンシア細菌を遺伝子改変する方法を提供し、この方法は、（ａ）配列番号１の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアに導入して、改変されたアッカーマンシア細菌を生成すること、および（ｂ）上記改変されたアッカーマンシアを培養して、トランスポゾンがゲノムに組み込んだアッカーマンシアを選択することを含む。別の態様では、本開示は、アッカーマンシア細菌を遺伝子改変する方法を提供し、この方法は、以下を含む。（ａ）配列番号１の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアに導入して、トランスポゾンを含む複数の改変されたアッカーマンシア細菌を生成すること、および（ｂ）上記複数の改変されたアッカーマンシアを培養して、トランスポゾンをゲノムに組み込んだ細菌を選択して、複数の遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌を生成することを含む。
【００３０】
配列番号１の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアに導入して、複数の改変されたアッカーマンシア細菌を生成する方法は、当技術分野で知られている。これらの方法は、一般にトランスポゾン変異誘発または転位変異誘発と呼ばれ、遺伝子を宿主生物の染色体に移し、染色体上の現存する遺伝子の機能を中断または改変し、変異を引き起こすことを可能にする。これにより、ゲノム内でシングルヒット変異を誘発する能力、およびトランスポゾンに隣接する配列を同定できることによって変異誘発された遺伝子を同定する能力が可能になる。配列番号１のトランスポゾンベクターは、実施例１に記載されているように、アッカーマンシアで使用するために特別に設計されている。配列番号１のベクターは、クロラムフェニコール耐性カセット（ｃａｔ）および転位を触媒するために必要とされるトランスポザーゼ酵素を備えた修飾マリナートランスポゾン、ｈｉｍａｒ１Ｃ９を含む。このベクターは、ｌａｍｂａ  ｐｉｒ依存性の複製起点をさらに含み、ｐｉｒ遺伝子を欠くアッカーマンシアなどの株では複製できない。
【００３１】
トランスポゾンベクター（配列番号１）は、トランスポゾン（配列番号１（例えば、配列番号４７）の核酸１０７８〜１１４５）およびトランスポザーゼ酵素を含む。トランスポザーゼ酵素は、トランスポゾンを抽出してアッカーマンシアゲノムに挿入するために必要である。一旦転位が起こると、トランスポゾン（配列番号４７（配列番号１の核酸１０７８−１１４５））が、改変されたアッカーマンシア株のゲノムに挿入される。したがって、改変されたアッカーマンシア株／バリアントは、配列番号１のトランスポゾンを含む。言い換えれば、改変されたアッカーマンシア株／バリアントは、そのゲノム内に配列番号４７を含むが、残りのトランスポゾンベクター骨格を含まない。
【００３２】
トランスポゾンベクターは、抗生物質の選択としてエリスロマイシンを使用した以前のベクターがアッケルマンシアでは機能せず、自発的耐性をもたらしたため、トランスポゾン内にクロラムフェニコール（ｃａｔ）の抗生物質耐性遺伝子を含有する。
【００３３】
トランスポゾンベクターをアッカーマンシアに導入する１つの方法は、コンジュゲーションによるものである。コンジュゲーションの方法は当技術分野で知られており、例えば、限定されないが、実施例２に記載の方法である。細菌のコンジュゲーションは、直接的な細胞間による細菌細胞間の遺伝物質（例えば、配列番号１の外因性トランスポゾンベクター）の移動である。好ましい実施形態では、トランスポゾンベクターは、大腸菌株からアッカーマンシアにコンジュゲートされる。コンジュゲートの方法は、トランスポゾンベクター（例えば、配列番号１）を保有する大腸菌株を、好気性条件下、３７℃で約７〜１４時間、アッカーマンシアと共培養することを含む。
【００３４】
コンジュゲーション後、大腸菌に対して対抗選択し、転位が起こることを可能にするために、トランスコンジュゲーション体を継代培養した。継代培養の適切な方法は当技術分野で知られている。例えば、実施例２に記載されているように、トランスコンジュゲートは、嫌気性条件下で、複数回、例えば３回継代培養される。これにより、トランスポゾン（例えば、配列番号１の核酸１０７８−１１４５に対応する配列番号４７）を培養中の他の細菌株からそれらのゲノムに組み込んだアッカーマンシアの改変されたもの（バリアント株）の選択が可能になった。この継代培養条件は嫌気性条件であり、トランスポゾン配列に含まれる抗生物質耐性遺伝子であるクロラムフェニコールを含む培地での継代培養工程が含まれる。
【００３５】
一旦継代培養されると、ゲノムにトランスポゾン（抗生物質耐性遺伝子を含む）を含む改変されたアッカーマンシアの集団が生成される。改変されたアッカーマンシアのこの集団は、増殖され、スクリーニングおよび治療の目的で改変されたアッカーマンシアのライブラリとして使用され得る。改変されたアッカーマンシア（変異バリアント）のライブラリは、表現型の形質をスクリーニングするために使用できる。例えば、一実施形態では、ライブラリは、表現型形質に関連する条件下で増殖させ、表現型形質に関連する遺伝子を同定するためにスクリーニングすることができる。
【００３６】
改変されたアッカーマンシア株のライブラリを使用して、ゲノムに挿入されたトランスポゾンに隣接するゲノム配列のＤＮＡ配列決定またはＰＣＲ分析によって、改変された各アッカーマンシア株を特徴付けることもできる。これにより、トランスポゾンの挿入によってどの遺伝子が改変されたかを特定できる。
【００３７】
一実施形態では、この方法は、形質を選択するための条件下で、複数の遺伝子改変されたアッカーマンシアを培養すること、およびアッカーマンシアゲノム内のトランスポゾンに隣接する遺伝子のＰＣＲまたは配列決定により、形質に関連する遺伝子を特定することをさらに含む。
【００３８】
トランスポゾンによって破壊された遺伝子を同定するためのＤＮＡ配列決定の方法は、当技術分野で知られている。例えば、一実施形態では、使用されるＤＮＡ配列決定方法は、Ｇｏｏｄｍａｎら（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．：６（１２）：１９６９−１９８０（２０１２），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ２０１１．４１７）に記載されているように、ＩＮＳｅｑ／ＴｎＳｅｑであり得、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。簡単に言えば、挿入配列決定（ＩＮＳｅｑ）は、挿入部位および、末端にＭｍｅＩ部位を含む修飾マリナートランスポゾンを使用して、混合集団におけるトランスポゾン変異体の存在量を決定する方法であり、挿入されたトランスポゾンから１６〜１７ｂｐの染色体部位での切断を可能にする。Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．要約を参照のこと。トランスポゾンに隣接するゲノム領域は、リニアＰＣＲによって増幅され、Ｇｏｏｄｍａｎにおいて説明されているように、ハイスループット機器を使用して配列決定される。
【００３９】
本開示は、遺伝子改変されたアッカーマンシアのライブラリ、具体的には、遺伝子改変されたアッカーマンシアムシニフィラのライブラリを企図している。さらに、遺伝子改変されたアッカーマンシアのライブラリは、アッカーマンシアの臨床株（例えば、肥満患者、慢性炎症を有する患者などであるがこれらに限定されない患者から単離された株）から作製される。このライブラリは、表現型の形質において役割を果たす、改変されたアッカーマンシアのスクリーニングおよび培養に使用できる。
【００４０】
別の実施形態では、本開示は、配列番号１のベクターからのトランスポゾンをアッカーマンシアの集団にランダムに導入すること、および嫌気性条件下で細菌をクロラムフェニコール含有培地中で培養することにより、改変されたアッカーマンシア細菌を選択して、トランスポゾンがゲノムに挿入されているアッカーマンシアを選択することによって生成される、改変されたアッカーマンシア細菌のライブラリを提供する。「ライブラリ」という用語は、複数の改変されたアッカーマンシア細菌を参照して使用され、それらと交換可能に使用される。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「改変されたアッカーマンシア」、「改変されたアッカーマンシア株」、「遺伝子修飾されたアッカーマンシア」、「アッカーマンシアのバリアント」、「Ｔｎ変異アッカーマンシア」、「Ｔｎ変異体」、および「変異アッカーマンシア」という用語は、配列番号１のトランスポゾンベクターのトランスポゾンをゲノムに組み込んだ遺伝子改変されたアッカーマンシアを指すために交換可能に使用される。Ｔｎ変異体は、当技術分野で記載されているように、トランスポゾン（Ｔｎ）の挿入によって作製された変異株を指す。アッカーマンシアは、例えば、アッカーマンシアムシニフィラまたは患者から単離された臨床種を含むがこれらに限定されない、属に含まれる任意の既知のアッカーマンシア種であり得る。
【００４２】
例えば、改変されたアッカーマンシア株のライブラリは、ムチンの利用のために必要とされる遺伝子をスクリーニングする方法に使用することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたアッカーマンシアのライブラリは、ムチンを含むまたは含まない培地で培養される。ムチンなしで増殖したライブラリは、ムチンを含む培地で増殖したライブラリと遺伝的に比較することができる。ムチンの存在下で増殖した改変されたアッカーマンシアの遺伝子およびムチンの非存在下で増殖した改変されたアッカーマンシアの遺伝子を遺伝子分析する方法は、本明細書に詳述するように、配列またはＰＣＲ分析によって決定でき、２つの集団からの遺伝子が比較されて、ムチンの利用を調節する遺伝子を同定する。これは、本明細書の実施例３に示されている。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ムチンの存在下で有利な増殖特性を有する改変されたアッカーマンシア株を同定することができる。有利な増殖特性を有するこれらの改変されたアッカーマンシアは、改変されたアッカーマンシアを対象に投与することにより、対象の結腸にコロニーを形成するために使用することができる。
【００４４】
改変されたアッカーマンシア株を対象に投与する適切な方法は当技術分野で知られており、改変されたアッカーマンシアを経口、直腸、または細菌の生存能力を維持する他の経路で投与することが含まれる。いくつかの実施形態では、改変された菌株は、例えば、限定されないが、菌株の腸管への送達を可能にする錠剤、カプセル、液体などの中で経口投与することができる。適切には、改変された菌株は、腸管に送達されている間、菌株が生存能力を維持することを可能にする組成物に製剤化され得る。
【００４５】
別の実施形態では、改変されたアッカーマンシアのライブラリは、腸の安定したコロニー形成に関連する表現型の形質についてスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態では、この方法は、複数の遺伝子改変されたアッカーマンシアを対象に導入すること、および、対象の結腸内で増殖する改変された細菌の遺伝子を遺伝子分析することにより、対象の腸にコロニーを形成する増殖の利点を有する改変されたアッカーマンシアを検出することを含む。いくつかの実施形態では、対象の腸にコロニーを形成している細菌は、対象の結腸からのサンプル中で得られ、改変されたアッカーマンシアの増殖に適した条件下（トランスポゾンを用いてアッカーマンシアを選択するための、クロラムフェニコールの存在下での嫌気性条件下）でサンプルを培養し、そして増殖したアッカーマンシア株の配列決定またはＰＣＲ分析によって、増殖の利点に関連する遺伝子を同定する。適切には、関連する遺伝子を決定するために使用されるＤＮＡ配列決定またはＰＣＲ法は、トランスポゾンに特異的であり（例えば、外因性トランスポゾンに特異的なプライマーを使用）、したがって、腸内で増殖している可能性のあるいかなる野生型細菌とも対照的に、トランスポゾンを有する遺伝子改変されたアッカーマンシア株の同定を可能にする。いくつかの実施形態では、対象はマウスである。いくつかの実施形態では、対象は、疾患のマウスモデル（例えば、肥満マウスモデルなど）である。
【００４６】
本明細書に記載の方法は、他の表現型の形質についてスクリーニングする方法で使用することができる。例えば、Ｔｎ／ＩＮ−ｓｅｑは、さまざまな食事／疾患の条件下でコロニー形成が強化されたバリアントをスクリーニングする。これは、対象に特定の食事を与えること、および特定の食事条件下または免疫状態の改変の下で、改変された細菌が結腸にコロニーを形成する能力をスクリーニングすることによって行うことができる。これにより、食事の成分を特異的に分解して利用する遺伝子を有する改変された細菌を特定できる。
【００４７】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、コロニー形成および宿主との相互作用、例えば、バイオフィルム形成、凝集、カプセル生成、ＩｇＡ結合、および抗菌ペプチドまたは胆汁酸塩に対する耐性に影響を及ぼし得る表現型に関与する遺伝子をスクリーニングすることができる。いくつかの例において、表現型形質は、例えば、これらに限定されないが、アミノ酸生合成、炭水化物代謝、栄養素取り込み、レドックス耐性、付着、侵入、増殖、生殖などであり得る。形質には、宿主の腸にコロニーを形成する能力など、その細菌の全体的な増殖および生存のために重要な遺伝的に決定された特性を含めることができる。例えば、実施例に示されているように、アッカーマンシア増殖のいくつかの遺伝的調節因子には、ムチンの利用に必要とされる遺伝子、例えば表１に見られる遺伝子が含まれている。対象の遠位結腸を含む結腸でのアッカーマンシアの増殖およびコロニー形成に必要な他の遺伝子は表３に示される。本開示は、これらの遺伝子が本明細書に記載の方法によって同定され得るものの例示であるため、これらの遺伝子に限定されない。
【００４８】
さらなる実施形態では、変異体は、宿主シグナル伝達経路、例えば、腸の健康および肥満の予防に関連しているＴＬＲ２シグナル伝達経路の活性化に関与する遺伝子についてスクリーニングすることができる。例えば、一実施形態では、この方法は、免疫細胞による異なるレベルのＴＬＲ２媒介性認識を有する改変されたアッカーマンシア株のスクリーニングを含み、または別の実施形態では、改変されたアッカーマンシアを正常対象および肥満対象（例えば、正常および肥満のマウスモデル）に投与することを含み、両方とも同じ食餌（例えば、正常または高脂肪）を与えられ、非肥満の対象と比較した肥満の対象内の細菌に関連する遺伝子のスクリーニングを含む。
【００４９】
別の態様では、本開示は、形質の改変された遺伝的調節因子を有する改変されたアッカーマンシア細菌を選択する方法を提供し、この方法は、（ａ）配列番号１の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアの集団に導入して、トランスポゾンをアッカーマンシアゲノムにランダムに組み込むこと、（ｂ）集団アッカーマンシアを培養して、トランスポゾンがゲノムに組み込まれているアッカーマンシアを選択し、アッカーマンシアの複数の改変されたバリアントを生成すること、および（ｃ）改変された遺伝形質が選択される条件下でアッカーマンシアを培養することにより、改変された遺伝的調節因子を有するアッカーマンシアを選択することを含む。いくつかの態様では、工程（ａ）は、配列番号１のトランスポゾンベクターを含む大腸菌とのアッカーマンシアのコンジュゲーションを含む。さらなる態様では、工程（ｂ）の方法は、嫌気性条件下で細菌を継代培養して、クロラムフェニコールの存在下でアッカーマンシアの改変されたバリアントを選択することを含む。変更された遺伝子調節因子を決定する方法は、トランスポゾンエレメントに隣接しているゲノムの配列決定（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１に記載されているＩＮＳｅｑ／ＴｎＳｅｑ）、またはＰＣＲ分析を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている方法によって行うことができる。
【００５０】
別の実施形態では、本開示は、アッカーマンシアにおける形質の新規の遺伝的調節因子を同定する方法を提供し、この方法（ａ）配列番号１の外因性トランスポゾンベクターをアッカーマンシアの集団に組み込んで、トランスポゾンをゲノムに組み込んだ改変されたアッカーマンシアの集団を生成すること、（ｂ）クロラムフェニコールを含む培地中でアッカーマンシアを培養して、外因性トランスポゾンを組み込んだアッカーマンシアを選択すること、（ｃ）改変されたアッカーマンシアを２つの異なる条件にさらすこと、および（ｄ）形質に関連する遺伝子を同定するために、２つの異なる条件下で増殖した改変されたアッカーマンシアにおいてトランスポゾンによって破壊された遺伝子を配列決定またはＰＣＲ増幅によって分析することを含む。
【００５１】
本開示の別の態様は、対象の慢性炎症の治療のためのプロバイオティクス、アッカーマンシアムシニフィラを含む、アッカーマンシア細菌を遺伝的に操作するためのトランスポゾンベクターを使用するディスカバリープラットフォームを含むシステムを提供する。
【００５２】
いくつかの態様では、対象における食事誘発性肥満の治療のためにプロバイオティクス、アッカーマンシアムシニフィラは遺伝的に操作される。
【００５３】
別の態様では、遺伝子改変されたアッカーマンシアは、癌免疫治療における免疫チェックポイント阻害剤を増強するために使用され得る。これは、チェックポイント阻害剤の抗癌特性を増強するためにチェックポイント阻害剤治療を受けている対象に有効量の改変されたアッカーマンシア（例えば、改変アッカーマンシアムシニフィラ）を投与することによって行うことができる（例えば、Ｒｏｕｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５９，９１−９７（２０１８）を参照））。
【００５４】
チェックポイント阻害剤治療を強化する方法が企図される。これらの方法は、チェックポイント阻害剤の抗癌特性を増強するために、チェックポイント阻害剤治療を受けている対象に有効量の改変されたアッカーマンシア（例えば、改変されたアッカーマンシアムシニフィラ）を投与することを含。例えば、一実施形態では、改変されたアッケルマンシア（例えば、改変されたアッカーマンシアムシニフィラ）を使用して、ＰＤ−１ベースの免疫治療（例えば、ＰＤ−１抗体（すなわち、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブなど、これらは、市販されており、例えば、ペンブロリズマブおよび抗ＰＤ−１抗体は、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏから入手可能であり、米国特許第８９５２１３６号、同第８３５４５５０９号、同第８９００５８７号およびＥＰ２１７０９５９に記載されており、抗ＰＤ−１抗体であるニボルマブはＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．から入手可能であり、米国特許第７５９５０４８号、同第８７２８４７４号、同第９０７３９９４号、同第９０６７９９９号、同第８００８４４９号および同第８７７９１０５号に記載されている。
【００５５】
一実施形態では、食事誘発性肥満を治療する方法が企図される。この方法は、食事によって誘発された肥満を治療するために、有効量の改変されたアッカーマンシア株を対象に投与することを含む。一実施形態では、改変されたアッカーマンシア株は、表３から選択される改変された遺伝子を有する。
【００５６】
別の態様では、本開示は、炎症性障害を治療する方法を提供し、この方法は、炎症性障害を治療するために有効量の改変されたアッカーマンシア株を投与することを含む。
【００５７】
本開示の他の態様は、新たなプロバイオティクスであるアッカーマンシアムシニフィラを遺伝子操作して、慢性炎症の免疫調節剤としてより適しており、食事誘発性肥満に対する保護剤としての特性が強化された株を生成するための本明細書に記載のシステムおよび方法を使用することを提供する。
【００５８】
本開示はまた、配列番号１からのトランスポゾンを含む遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌を企図する。
【００５９】
別の態様では、本開示は、表１に列挙された遺伝子のいずれか１つが破壊されている、遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌を企図している。これらの遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌は、ムチンを利用する能力が改変された遺伝子を有する。
【００６０】
別の実施形態では、本開示は、遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌が、表２に列挙された遺伝子のいずれか１つを破壊することを企図する。これらの遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌は、ムチンの利用に必要とされる遺伝子を有する。別の実施形態では、本開示は、遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌が、表３に列挙された遺伝子のいずれか１つを破壊することを企図する。これらの遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌は、対象の結腸にコロニーを形成する際に増殖の利点を提供する遺伝子を有する。表に列挙された遺伝子の１つまたは複数が破壊されている、企図される遺伝子改変されたアッカーマンシア細菌のいずれかを使用する方法は、対象への投与に使用するために企図される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を実行するためのキットが提供される。提供されるキットには、上記の方法の１つまたは複数を実行するために必要なコンポーネントが含まれている場合がある。
【００６２】
一実施形態では、キットは、配列番号１のベクターおよび細菌内での転位のための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、アッカーマンシアムシニフィラまたは臨床株を含むがこれらに限定されない関連種を含む、アッカーマンシアの株を単離および改変する方法に関する説明書を含む。
【００６３】
別の実施形態では、キットは、配列番号１のトランスポゾンを含む改変されたアッカーマンシアムシニフィラ株を含む。
【００６４】
本発明は、１つまたは複数の好ましい実施形態に関して説明されており、明示的に述べられたものを除いて、多くの同等物、代替物、バリエーション、および修飾が可能であり、本発明の範囲内であることが理解されるべきである。
【００６５】
本発明の概念から逸脱することなく、すでに説明したもの以外の多くの追加の修正が可能であることは当業者には明らかであるはずである。この開示を解釈する際に、すべての用語は、文脈と一致する可能な限り広い方法で解釈されるべきである。「含む」という用語のバリエーションは、非排他的な方法で要素、コンポーネント、または工程を指すものとして解釈されるべきであるため、言及される要素、コンポーネント、または工程は、明示的にではなく言及される他の要素、コンポーネント、または工程と組み合わせることができる。特定の要素を「含む」と呼ばれる実施形態はまた、それらの要素「から本質的になる」および「からなる」ことが企図される。「から本質的になる」および「からなる」という用語は、ＭＰＥＰおよび関連する連邦巡回控訴裁判所の解釈に沿って解釈されるべきである。「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲を、特許請求された発明を、特定の材料または工程の範囲に、および「基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさない」範囲に限定する。「からなる」とは、特許請求の範囲で指定されていない要素、工程、または成分を除外するクローズドタームである。例えば、「からなる」配列に関しては、配列番号に列挙された配列を指し、その一部としてその配列番号を含み得るより大きな配列を指す。
【００６６】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾が発生した場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
【００６７】
本明細書で提供されるシステムおよび方法は、ヒト、家畜および産業環境に関連する微生物群集からの多くの商業的に重要な生物学的物質を有する。
【００６８】
本発明は、以下の非限定的な実施例を検討することにより、より完全に理解される。
【実施例】
【００６９】
実施例１：アッカーマンシアにおける使用のための修飾Ｔｎ変異誘発ベクター：ｐＳＡＭ＿Ａｋｋ
遺伝子および改変された表現型を有する改変された細菌の遺伝子スクリーニングを行うことを可能にするには、細菌を変異させるためのツールが必要であった。アッカーマンシアにおいて使用するために、前述のベクターの修飾バージョンが生成された。元のベクター、ｐＳＡＭ＿Ｂｔ1は、バクテロイデス属テタイオタオミクロンにおける使用のために設計された。このベクターは、エリスロマイシン耐性遺伝子を有する修飾マリナートランスポゾンｈｉｍａｒ１Ｃ９と、転位を触媒するために必要とされるトランスポザーゼ酵素の両方をコードしている。このプラスミドは、ｌａｍｂａ  ｐｉｒに依存する複製起点を使用しており、ｐｉｒ遺伝子を欠くアッカーマンシアなどの株では複製できない。
【００７０】
ｐＳＡＭ＿Ｂｔをアッカーマンシアでの使用に適合させるために、トランスポゾン（ｅｒｍＧ）上の元のエリスロマイシン耐性マーカーをクロラムフェニコール耐性カセット（ｃａｔ）に置き換えた。アッカーマンシアでエリスロマイシンを選択マーカーとして使用する最初の試みは成功せず、エリスロマイシンによる増殖は繰り返し自発的耐性をもたらした。次に、トランスポザーゼ酵素は、アッカーマンシアでの発現のためにコドン最適化された。一連のハウスキーピング遺伝子を連結して、コドン分析の入力として使用するための２２  ６２８ｂｐの配列を作成することにより、アッカーマンシアのコドン表を生成した。ｈｉｍａｒ１Ｃ９配列のまれなコドンは、アッカーマンシアで優先的に使用されるコドンに置き換えられた。得られたプラスミドをｐＳＡＭ＿Ａｋｋと名付けた（図１、配列番号１）。ベクターへのこれらの変更は、アッカーマンシアにおける変異誘発に不可欠であり、耐性マーカーまたはトランスポザーゼの変更だけでは、転位が起こるには不十分であることを本発明者らは見出した。同様に、本発明者らは、アッカーマンシアプロモーターを使用してｈｉｍａｒ１Ｃ９の発現を促進することは成功していない。そのため、ｐＳＡＭ−Ａｋｋベクターは、アッカーマンシアムシニフィラの変異誘発を可能にするために特別に作成された。
【００７１】
実施例２：変異誘発およびトランスポゾン（Ｔｎ）ライブラリ構築の方法
トランスポゾンベクター（配列番号１）は、大腸菌ドナー株とのコンジュゲーションによってアッカーマンシアに導入された。アッカーマンシアスターター培養は、３０ｍｌの合成培地2に１：５で継代培養し、ＯＤ６００＝０．６−１．０まで増殖させた。次に、細胞を、１．５ｍｌチューブ内で１００００ｘｇ、５分、４℃で遠心分離することにより回収した。並行して、大腸菌Ｓ１７  ｐＳＡＭ＿Ａｋｋ培養物を、ＬＢ  ＋  １００ｕｇ／ｍｌアンピシリン、３５  ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコール中で、３７°Ｃ  ２００ｒｐｍで光学密度（ＯＤ）ＯＤ６００＝０．４−０．７まで好気的に増殖させた。コンジュゲーション線毛の剪断を避けるために、大腸菌を２０００ｘｇで３分間遠心分離し、滅菌ＰＢＳで１回洗浄した。大腸菌およびアッカーマンシアのペレットを合成培地で総量０．５ｍｌに混合し、懸濁液を使用して、事前に還元した合成培地プレート上に１００μｌの水たまりを作成した。プレートは、アッカーマンシア株に応じて、３７℃で７〜１４時間好気的にインキュベートされた。好気性インキュベーションは、コンジュゲーションを成功させるために重要である。
【００７２】
結合後、プレートを嫌気性チャンバーに移し、細胞をＰＢＳと５０％グリセロールの１：１混合物５ｍｌにこすり落とした（グリセロールはオプションであるが、−８０℃で培養物を保存するために必要である）。大腸菌に対する対抗選択および転位の発生を可能にするために、トランスコンジュゲートを３回継代培養した。細胞懸濁液の２００μｌアリコートを使用して、３ｍｌの合成培地に１２μｇ／  ｍｌのカナマイシンおよび１０μｇ／  ｍｌのゲンタマイシンを接種し、３７℃で、嫌気的に、４８時間インキュベートした。次に、培養物を、上記のように２４時間間隔でさらに２回継代培養した。これらの継代培養工程は、プラスミドを回復させ、トランスポゾン変異体を取得するために必要である（図２Ａ）。３回目の継代培養後、１００〜２００μｌの培養液を１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１２μｇ／ｍｌカナマイシン、および７μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加した合成培地寒天プレートに広げ、３７℃で嫌気的に６日間培養した。この培地は、残留大腸菌の増殖を抑制するために必要である。一旦、トランスコンジュゲートが増殖すると、ピペットチップで単一コロニーを選び、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１２μｇ／ｍｌカナマイシン、および７μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む１ウェルあたり２００μｌの合成培地を含む９６ウェルプレートに配列し、３７°Ｃで３日間、嫌気的にインキュベートした。
【００７３】
トランスポゾンがゲノムに挿入されたことを確認するために、β−ラクタマーゼ遺伝子のＰＣＲを使用して、プラスミド骨格の非存在（ｂｌａ）およびトランスポゾンの存在（ｃａｔ）についてテストした。最後に、変異体のサブセットに対してサザンブロットを実行し、Ｔｎ挿入が単一の挿入として、ゲノム内の複数の場所で発生したことを確認した（図２Ｂおよび２Ｃ）。
【００７４】
実施例３：トランスポゾン変異体のスクリーニング−ムチンの利用に必要とされる遺伝子のトランスポゾン変異体のスクリーニング
ムチンの利用に必要とされる遺伝子をスクリーニングするために、アレイ化されたＴｎ変異体を使用して、ムチン培地3または合成培地のいずれかを含む複製９６ウェルプレートに接種した。プレートを３７℃で３日間嫌気的にインキュベートした。増殖後、プレートリーダーを使用してＯＤ６００を測定した。ムチンではなく合成培地で増殖した変異体を、追加の特性評価のために選択した。最初のスクリーニングを確認するために、プレートリーダーで増殖曲線アッセイを実行し、６０分ごとに７２時間測定することにより、目的の変異体のムチン増殖欠損をテストした（図３）。任意のＰＣＲを使用して、トランスポゾン挿入部位を位置決めし、ムチンでの増殖に必要とされる遺伝子を同定した。このスクリーニングにより、単糖ではなくムチンでの増殖のために特に必要とされる遺伝子が同定された（表１）。
【００７５】
【表１】
2021524230.tif 000003
【００７６】
実施例４：腸のコロニー形成に必要とされる遺伝子のトランスポゾン変異体のスクリーニング
Ｔｎ変異体をスクリーニングするために使用される２番目のアプローチは、トランスポゾン挿入配列（Ｔｎ／ＩＮ−ｓｅｑ）1で使用するための大きなプールライブラリを作成することであった。この方法は、変異体の大きなプールをさまざまな条件で通過させ、続いて次世代シーケンシングを使用して入力プールと出力プールの各変異体の存在量をテストすることにより、条件付きで必須の遺伝子を特定する。特定の条件での生存に必要とされる遺伝子は、入力プールから枯渇する。Ｔｎ／ＩＮ−ｓｅｑを使用して、マウス腸管のコロニー形成に必要とされる遺伝子を特定した。
【００７７】
プールされたライブラリを作製するために、等量のアレイ化されたＴｎ変異体を単一の懸濁液にプールした。細胞懸濁液を合成培地で１：１０に希釈し、３７°Ｃで３６時間嫌気的に培養した（この増殖工程はオプションである）。次に、培養物を滅菌ＰＢＳで１回洗浄し、１０倍に濃縮して、最終濃度を約１０10ＣＦＵ／ｍｌにした。細胞懸濁液は、約１０8ＣＦＵで胃管栄養生殖フリーＣ５７ＢＬ／６マウスに使用した。コロニー形成の１週間後、マウスを安楽死させ、盲腸内容物をＤＮＡ単離のために収集した。次に、ＤＮＡを使用して、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉｓｅｑ  ４０００プラットフォームでのシーケンスを可能にするように修飾されたプライマーセットを使用して、Ｇｏｏｄｍａｎらによって記述されたプロトコルに従ってシーケンスライブラリを調製した。
【００７８】
Ｔｎ／ＩＮ−ｓｅｑデータの分析により、腸管の安定したコロニー形成に必要とされる遺伝子が特定された（図４）。コロニー形成に必要とされる遺伝子には、とりわけ、ＩＩ型分泌系の推定成分、ＩＶ型線毛タンパク質、およびグリコシル加水分解酵素が含まれていた（表２）。逆に、特定の遺伝子の不活性化は存在量の増加につながり、ライブラリが過剰コロニー形成バリアントをスクリーニングできる可能性があることを示唆している（表３）。さらに、ムチン上で増殖できない変異体は集団から劇的に枯渇し、ムチン上での増殖がインビボで起こっていること、およびそれがアッカーマンシアのコロニー形成にとって重要であることを確認した。
【表２】
2021524230.tif 000004
2021524230.tif 000005
【表３】
2021524230.tif 000006
【００７９】
表にあるＮＣＢＩタンパク質および遺伝子アクセッション番号に関連するすべての配列は、参照によりその全体が組み込まれており、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／［ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ］で見つけることができる。アッカーマンシアのゲノム配列は、アクセッション番号ＮＣ＿０１０６５５．１で見つけることができ、その内容は参照によりその全体が組み込まれている。
【００８０】
参考文献
１．Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．６（１２）：１９６９−１９８０
２．Ｐｌｏｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２３：１０７−１１３
３．Ｄｅｒｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：１４６９−１４７６
これらの参考文献は、実施例に記載されている方法に関連する詳細について、その全体が組み込まれている。
【００８１】
実施例５：アッカーマンシアは胃腸管のムチン層と相互作用する
実施例４に記載のマウスからの腸サンプルを採取し、切片化し、ムチンおよびアッカーマンシアに対する抗体で染色した。図５に示すように、アッカーマンシアは腸管内のムチン層と非常に密接に関連している。
【００８２】
さらに、野生型アッカーマンシアまたは変異体Ａｍｕｃ＿０５４４の能力もマウスで調べた。近位および遠位結腸の切片を採取し、切片化し、ムチンまたはアッカーマンシアについて染色した。図６に示すように、ｗｔと変異アッカーマンシアの両方が近位結腸にコロニーを形成することができたが、マウスの遠位結腸のコロニー形成には遺伝子Ａｍｕｃ−０５４４が必要であった。
【００８３】
配列表
テキスト形式の配列表は、本願と同時に提出され、出願時に本願の一部として完全に組み込まれる。
【図１】
2021524230.tif 000007
【図２】
2021524230.tif 000008
【図３】
2021524230.tif 000009
【図４】
2021524230.tif 000010
【図５】
2021524230.tif 000011
【図６】
2021524230.tif 000012
【配列表】
2021524230000001.app
【国際調査報告】
2021524230.tif 000013
2021524230.tif 000014