(57)【要約】  本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ活性の二次マーカーの分野に関し、特に本発明は、神経細胞内でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４によって抑制されるｍＲＮＡとしてのセルピン１の同定、およびｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４調節のためのバイオマーカー、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤のためのバイオマーカーとしてのセルピン１のｍＲＮＡまたはタンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞、例えば神経細胞内でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターの活性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記方法は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターが添加された細胞内でのセルピン１バイオマーカーのレベルを決定するステップを含む、方法。
【請求項２】
神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例として、てんかん性脳症などのてんかん、または脳虚血性傷害）を患っている対象を、アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを含む治療薬の投与から利益を得られる可能性が高い対象として同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記方法は、
ａ）前記対象から得られたサンプル中のセルピン１バイオマーカーのレベルを測定するステップと、
ｂ）前記セルピン１バイオマーカーの少なくとも１つの参照レベルと比較するステップと、
ｃ）前記対象が、アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを含む治療薬の投与から利益を得られる可能性が高いかどうかを同定するステップと
を含む、方法。
【請求項３】
対象におけるアンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターの有効性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記方法は、
ｄ）アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを以前に投与されたことのある対象から得られたサンプル中のセルピン１バイオマーカーのレベルを測定するステップと、
ｅ）セルピン１バイオマーカーの少なくとも１つの参照レベルと比較するステップと、
ｆ）アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターの有効性を同定するステップと
を含む、方法。
【請求項４】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療に適した神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例として、てんかん性脳症などのてんかん、または脳虚血性傷害）を診断するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記方法は、
ａ．対象から得られたサンプル中のセルピン１バイオマーカーのレベルを測定するステップと、
ｂ．前記セルピン１バイオマーカーの少なくとも１つの参照レベルと比較するステップと、
ｃ．前記対象が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療に適した神経障害を患っているか否かを同定するステップと
を含む、方法。
【請求項５】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療を必要とする対象における、神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例として、てんかん性脳症などのてんかん、または脳虚血性傷害）の治療方法であって、前記方法は、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法を含み、続いて、有効量のｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項６】
前記参照レベルが、
ａ．疾患に関連するセルピン１バイオマーカーのレベル、
ｂ．セルピン１バイオマーカーの正常レベル、
ｃ．ａ）およびｂ）の両方
のいずれかである、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４調節を測定するためのセルピン１バイオマーカーアッセイのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用。
【請求項８】
神経障害、例えばてんかんの治療に使用するための、アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーター、例として、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬のコンパニオン診断としての、セルピン１バイオマーカーアッセイのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用。
【請求項９】
神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例として、てんかん性脳症などのてんかん、または脳虚血性傷害）を患っている対象の、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを含む治療薬に対する応答の可能性を決定するためのセルピン１バイオマーカーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用。
【請求項１０】
前記セルピン１バイオマーカーアッセイが、
ａ．セルピン１ｍＲＮＡの測定、
ｂ．セルピン１タンパク質の測定、
ｃ．セルピン１活性の測定、
ｄ．組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）活性の測定、
ｅ．プラスミノーゲンからプラスミンへの変換の測定
からなる群から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１１】
セルピン１バイオマーカーの上昇がｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４のレベルの低下を示し、またはセルピン１バイオマーカーの減少がｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４のレベルの増加を示す、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用の方法。
【請求項１２】
前記対象が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４に関連する疾患もしくは障害、例えば神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例として、てんかん性脳症などのてんかん、または脳虚血性傷害）を患っているか、または前記ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４に関連する疾患もしくは障害、例えば発作、例として、てんかん性脳症などのてんかんを発症する可能性が高い、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１３】
前記対象が、例えば血栓症のために、以前にｔＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベーター）治療を受けたことがある、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１４】
前記セルピン１バイオマーカーが、脳脊髄液サンプル、血液サンプル、または血漿サンプルからなる群から選択される、前記対象から得られたサンプル中でアッセイされる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１５】
前記セルピン１バイオマーカーが、前記対象から得られた脳脊髄液サンプル中でアッセイされる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項１６】
前記ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターが、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤であり、当該阻害剤は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４、例えばｈｓａ−ｍｉＲ−１３４、例えば配列番号１に相補的な、例えば完全に相補的な少なくとも７個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の使用の方法。
【請求項１７】
前記ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターがＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ活性の二次マーカーの分野に関し、特に本発明は、神経細胞内でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４によって抑制されるｍＲＮＡとしてのセルピン１の同定、およびｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４調節のためのバイオマーカー、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤のためのバイオマーカーとしてのセルピン１のｍＲＮＡまたはタンパク質の使用に関する。セルピン１は、セルピンＥ１；ＰＬＡＮＨ１；ＰＡＩ−１としても知られている。
【背景技術】
【０００２】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、転写後の遺伝子発現を制御するノンコーディングＲＮＡのクラスであり、１つのｍｉｃｒｏＲＮＡが数百のｍＲＮＡの発現を調節することもある。
【０００３】
Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９，ｖｏｌ  ３７，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｎ９０４は、ｍｉＲＮＡ阻害研究の解釈に不可欠であるとして、二次エンドポイントの評価の重要性について論じている。
【０００４】
国際公開第２０１３／０４５６５２号に記載されているように、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４は、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）とｍｉＲＮＡ−１３４の発現増加との強い関連性、ならびにｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４を標的とするＬＮＡ抗ｍｉＲにより、齧歯類モデルにおけるてんかんに起因した発作活動および海馬活動が抑制されるという実験結果に基づいて、てんかんの治療の治療標的として示されている（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  ａｎｄ  Ｒｅｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。注目すべきことに、ラットのてんかん重積状態後にｍｉＲ−１３４をサイレンシングすると、後天性てんかんのトキシンフリーモデルである穿通経路刺激モデルでは、その後の自然発作の発生が８６％減少した（Ｒｅｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４は、脳虚血性傷害の治療のための治療薬としての適応がある（Ｋｈｏｓｈｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｒｏｋｅ  ２０１７；１９（２）：１６６−１８７）。
【０００５】
国際公開第２００７／１１２７５４号は、５’−ＴｇＧｔｃＡＡｃｃＡｇＴｃＡＣ−３’などの、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４を標的とするＬＮＡ抗ｍｉＲといったＬＮＡ抗ｍｉＲを開示しており、配列中、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシド、小文字はＤＮＡヌクレオシド、ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４を標的とするＬＮＡ抗ｍｉＲは、実施例においてコレステロールコンジュゲートまたは非コンジュゲート化合物のいずれかで使用されていた。ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４を標的とする短い完全ＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、国際公開第２００９０４３３５３号に開示されている。
【０００６】
したがって、てんかんの治療のためのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４を標的とする治療法の開発に関心が集まっている。このことは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４の阻害により、てんかん状態の重症度が低下する一方で、関与する根本的なメカニズム、特にどのｍＲＮＡがｍｉＲ−１３４によって調節されるのか、またはそのサブセットが疾患調節に関与しているのかについては、ほんと知られていないという大きな問題を提起している。この知識は、有効なｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害剤治療薬の同定および開発、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４活性に及ぼすそれらの影響の観察を可能にする必要なバイオマーカーを提供するために求められる。セルピン１ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲに多数の推定ｍｉｃｒｏＲＮＡターゲット結合部位を有し（例えばＴａｒｇｅｔＳｃａｎＨｕｍａｎを参照されたい）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４の保存度の低い部位アノテーションを示している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｖｅｒｔ＿７２／ｖｉｅｗ＿ｇｅｎｅ．ｃｇｉ？ｒｓ＝ＥＮＳＴ０００００２２３０９５．４＆ｔａｘｉｄ＝９６０６＆ｍｅｍｂｅｒｓ＝＆ｓｕｂｓｅｔ＝１＆ｓｈｏｗｃｎｃ＝１＆ｓｈｏｗｎｃ＝１＆ｓｈｏｗｎｃ＿ｎｃ＝１＆ｓｈｏｗｎｃｆ１＝０＃ｍｉＲ−１３４−５ｐ）。
【０００７】
本発明は、初代ニューロンにおけるｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４のロバストなｍＲＮＡ標的としてのセルピン１（ＰＡＩ−１）の同定、およびｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害のためのバイオマーカーとしてのその使用に基づいている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、神経細胞などの細胞内でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターの活性［効力または有効性、阻害レベル］を決定する方法であって、前記方法は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターが添加された細胞内でセルピン１バイオマーカーのレベルを決定するステップを含む、方法を提供する。
【０００９】
本発明は、神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例として、てんかん性脳症などのてんかん、または脳虚血性傷害）を患っている対象を、アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを含む治療薬の投与から利益を得られる可能性が高い対象として同定する方法を提供し、前記方法は、
ａ）対象から得られたサンプル中のセルピン１バイオマーカーのレベルを測定するステップと、
ｂ）セルピン１バイオマーカーの少なくとも１つの参照レベルと比較するステップと、
ｃ）対象が、アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを含む治療薬の投与から利益を得られる可能性が高いかどうかを同定するステップと
を含む。
【００１０】
本発明は、対象におけるアンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターの有効性を決定する方法を提供し、前記方法は、
ａ）アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを以前に投与されたことのある対象から得られたサンプル中のセルピン１バイオマーカーのレベルを測定するステップと、
ｂ）セルピン１バイオマーカーの少なくとも１つの参照レベルと比較するステップと、
ｃ）アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターの有効性を同定するステップと
を含む。
【００１１】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療に適した神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例として、てんかん性脳症などのてんかん、または脳虚血性傷害）を診断する方法を提供し、前記方法は、
ａ．対象から得られたサンプル中のセルピン１バイオマーカーのレベルを測定するステップと、
ｂ．セルピン１バイオマーカーの少なくとも１つの参照レベルと比較するステップと、
ｃ．対象が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療に適した神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例として、てんかん性脳症などのてんかん）を患っているか否かを同定するステップと
を含む。
【００１２】
上記の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であってもよい。
【００１３】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療を必要とする対象における、神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例として、てんかん性脳症などのてんかん、または脳虚血性傷害）の治療方法であって、前記方法は、本発明の上記方法（または本明細書に開示もしくは特許請求されている方法）のうちの１つを含み、続いて、有効量のｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、神経障害はてんかんである。いくつかの実施形態では、神経障害は脳虚血性傷害である。
【００１４】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療を必要とする対象における神経発作の治療方法であって、前記方法は、本発明の上記方法（または本明細書に開示もしくは特許請求されている方法）のうちの１つを含み、続いて、有効量のｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療を必要とする対象における脳虚血性傷害の治療方法であって、前記方法は、本発明の上記方法（または本明細書に開示もしくは特許請求されている方法）のうちの１つを含み、続いて、有効量のｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１６】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療を必要とする対象における、神経障害、例えば発作を伴う神経障害の予防的治療方法であって、前記方法は、本発明の上記方法（または本明細書に開示もしくは特許請求されている方法）のうちの１つを含み、続いて、予防的治療を必要とする対象に有効量のｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬を投与するステップを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、神経障害はてんかんである。いくつかの実施形態では、神経障害は脳虚血性傷害である。
【００１７】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療を必要とする対象における、神経発作の予防的治療方法であって、前記方法は、本発明の上記方法（または本明細書に開示もしくは特許請求されている方法）のうちの１つを含み、続いて、予防的治療を必要とする対象に有効量のｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１８】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４調節を測定するためのセルピン１バイオマーカーアッセイのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用を提供する。
【００１９】
本発明は、神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例として、てんかん性脳症などのてんかん、または脳虚血性傷害）の治療に使用するための、アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーター、例として、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬のコンパニオン診断としての、セルピン１バイオマーカーアッセイのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用を提供する。
【００２０】
本発明は、神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例として、てんかん性脳症などのてんかん、または脳虚血性傷害）を患っている対象の、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを含む治療薬に対する応答の可能性を決定するためのセルピン１バイオマーカーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用を提供する。
【００２１】
本発明は、神経発作および／または脳虚血性傷害の治療に使用するための、アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーター、例として、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬のコンパニオン診断としての、セルピン１バイオマーカーアッセイのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用を提供する。
【００２２】
本発明は、神経発作、例として、てんかん性脳症などのてんかん、または脳虚血性傷害を伴う発作を患っている対象の、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを含む治療薬に対する応答の可能性を決定するためのセルピン１バイオマーカーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用を提供する。
【００２３】
本発明は、体外から投与されたｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターの細胞内での活性を決定する方法であって、前記方法は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターが添加された細胞内でセルピン１ｍＲＮＡ、セルピン１タンパク質またはセルピン１活性のレベルを決定するステップを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、活性は、細胞から得られた抽出物中で測定されることが理解されよう。
【００２４】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４調節、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害のためのバイオマーカーとして、セルピン１ｍＲＮＡアッセイ、セルピン１タンパク質アッセイ、またはセルピン１活性アッセイの使用を提供する。
【００２５】
本発明は、神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例えばてんかんまたは脳虚血性傷害）の治療に使用するための、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬のコンパニオン診断として、セルピン１ｍＲＮＡ、セルピン１タンパク質またはセルピン１活性の使用を提供する。
【００２６】
本発明は、神経発作の治療に使用するための、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬のコンパニオン診断として、セルピン１ｍＲＮＡ、セルピン１タンパク質またはセルピン１活性の使用を提供する。
【００２７】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターによる治療を受けている対象、またはｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターによる治療の適性を評価されている対象から得られたサンプル中のセルピン１タンパク質レベルを決定するためのセルピン１抗体の使用を提供する。
【００２８】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーター、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストによる治療を受けている対象、またはｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターによる治療の適性を評価されている対象から得られたサンプル中のセルピン１ｍＲＮＡレベルを決定するためのセルピン１ｍＲＮＡ検出プローブの使用を提供する。
【００２９】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターによる治療を受けている対象、またはｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターによる治療の適性を評価されている対象から得られたサンプル中のセルピン１ｍＲＮＡレベルを決定するためのセルピン１ｍＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイの使用を提供する。
【００３０】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーター、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストによる治療を受けている対象、またはｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターによる治療の適性を評価されている対象から得られたサンプル中のセルピン１活性レベルを決定するためのセルピン１活性アッセイの使用を提供する。
【００３１】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターによる治療を受けている対象、またはｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターによる治療の適性を評価されている対象から得られたサンプル中のセルピン１活性レベルを決定するための組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）アッセイの使用を提供する。
【００３２】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを含む治療薬に対する対象の応答の可能性を決定するためのセルピン１バイオマーカーの使用を提供し、ここで、バイオマーカーは、参照サンプル、例えば、健康な対象からのサンプル、罹患した対象からのサンプル、または対象から得られた１つ以上の以前のサンプルから得られたレベルと比較して変化した、対象から得られた生物学的サンプル中のセルピン１ｍＲＮＡ、タンパク質または活性のレベルである。
【００３３】
本発明は、例として、神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例えばてんかんまたは脳虚血性傷害）の治療のために、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストによる治療を受けている対象の患者モニタリングのための、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストの有効性を観察するためのセルピン１バイオマーカーの使用を提供する。
【００３４】
本発明は、神経発作の治療のためにｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストによる治療を受けている対象の患者観察のためのセルピン１バイオマーカーの使用を提供する。
いくつかの実施形態では、神経障害はてんかん性脳症である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＲＮＡシーケンシング解析により、初代マウス皮質ニューロンを０．１μＭのｍｉＲ−１３４抗ｍｉＲで６日間処置した後の、発現レベルが有意に異なる遺伝子を同定した図である。対照Ｍｏｃｋで処置された初代皮質ニューロンと０．１μＭのｍｉＲ−１３４抗ｍｉＲで処置された初代皮質ニューロン（右にアップレギュレートされた遺伝子と左にダウンレギュレートされた遺伝子）との間の遺伝子発現の違いを示すボルケーノプロットプロット。実験およびデータ分析については、例１に記載している。各点は遺伝子に対応している。多重検定でＰ値を＜０．０５に調整した２つの条件間で発現量が異なる遺伝子には、遺伝子名を付けている。
【図２】ＲＮＡシーケンシングにより同定された候補ｍｉＲ−１３４標的の検証を示す図である。標的遺伝子Ｓｙｔ６（図２Ａ）、Ｐｅｇ１０（図２Ｂ）およびセルピン１（図２Ｃ）のｄｄＰＣＲを、ｍｉＲ−１３４阻害剤ＬＮＡ抗ｍｉＲで５日間処置した初代皮質ニューロンから単離したＲＮＡについて行った。Ｇｐｒ３６は検出レベル未満であった（データは示していない）。セルピン１は、ｍｉＲ−１３４のＬＮＡ抗ｍｉＲ阻害剤により用量依存的に有意にアップレギュレートされた。例２に記載した実験。
【図３】セルピン１のマウス３’ＵＴＲの領域へのｍｉＲ−１３４シード配列のハイブリダイゼーションを説明する図である。
【図４】ｐｒｅｍｉＲ−１３４およびＭｏｃｋ（ＰＢＳ）、ＬＮＡ抗ｍｉＲまたはＬＮＡ対照のトランスフェクションの４８時間後のヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ｎ＝３）内でのセルピン１ｍＲＮＡ発現を示す図である。ＬＮＡ抗ｍｉＲ処置は、Ｍｏｃｋ（ＰＢＳ）で処置した細胞（ｐ＜０．０１、スチューデントのＴ検定）とＬＮＡ対照で処置した細胞（ｐ＜０．０５、スチューデントのＴ検定）の両方に対してセルピン１を有意にアップレギュレートした。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
方法Ａ：本発明は、神経細胞などの細胞内でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターの活性、例えば効力または有効性または阻害レベルを決定する方法であって、前記方法は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターが添加された細胞内でのセルピン  １バイオマーカーのレベルを決定するステップを含む、方法を提供する。方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であってもよい。
【００３７】
細胞は、初代細胞、例えば、初代神経細胞であってもよい。
【００３８】
活性は、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４の効力、有効性または阻害のレベルを指すことができ、１つ以上の参照サンプルまたは値と比較され得る。
【００３９】
方法Ｂ：本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストを含む治療薬の投与から利益を得られる可能性が高い神経障害を患っている対象を同定する方法を提供し、前記方法は、
ａ）対象から得られたサンプル中のセルピン１バイオマーカーのレベルを測定するステップと、
セルピン１バイオマーカーの少なくとも１つの参照レベルと比較するステップと、
ｂ）対象が、アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを含む治療薬の投与から利益を得られる可能性が高いかどうかを同定するステップと
を含む。
【００４０】
方法Ｃ：本発明は、対象におけるアンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターの有効性を決定する方法を提供し、前記方法は、
ａ）アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを以前に投与されたことのある対象から得られたサンプル中のセルピン１バイオマーカーのレベルを測定するステップと、
ｂ）セルピン１バイオマーカーの少なくとも１つの参照レベルと比較するステップと、
アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターの有効性を同定するステップと
を含む。
【００４１】
方法Ｄ：本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療に適した神経障害（例えば、神経障害に関連する発作、例えばてんかんまたは脳虚血性傷害）を診断する方法を提供し、
前記方法は、
ａ）対象から得られたサンプル中のセルピン１バイオマーカーのレベルを測定するステップと、
ｂ）セルピン１バイオマーカーの少なくとも１つの参照レベルと比較するステップと、
対象が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療に適した神経障害を患っているか否かを同定するステップと
を含む。
【００４２】
方法Ｅ：本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療を必要とする対象における神経障害、例えばてんかんの治療方法であって、前記方法は、本発明の請求項１から４のいずれか一項に記載の方法を含み、続いて、有効量のｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。治療は予防的、すなわち、神経障害、例えば神経障害に関連する発作（例えばてんかんまたは脳虚血性傷害）を伴う発作を発症するリスクのある対象の予防的治療であってもよい。治療は治療的、すなわち、疾患の症状が（例えば発作、例えばてんかんと）診断された後の治療であってもよい。
【００４３】
神経障害は、リスクを伴う神経障害であってもよいか、またはてんかんもしくは脳虚血性傷害などの発作を特徴とする神経障害である。
【００４４】
参照レベルは、例えば、次のいずれかであり得る：
ａ．疾患に関連するセルピン１バイオマーカーのレベル、
ｂ．セルピン１バイオマーカーの正常レベル、
ｃ．ａ）およびｂ）の両方。
【００４５】
いくつかの実施形態では、セルピン１ｍＲＮＡ、タンパク質、またはセルピン−１活性などのセルピン−１バイオマーカーのレベルの低下は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４活性の上昇を示すか、または高くなればｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４活性の低下を示す。（セルピン−１の直接的なバイオマーカーの増加は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害およびセルピン−１抑制解除と相関している）。
【００４６】
間接セルピン−１バイオマーカー：セルピン１（ＰＡＩ−１）はｔＰＡ−１の阻害剤であり、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害によるＰＡＩ−１の上昇は、ｔＰＡ活性の低下、およびプラスミノーゲンからプラスミンへの変換（凝固）の低下をもたらす。
【００４７】
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４調節を測定するためのセルピン１バイオマーカーアッセイの使用を提供する。使用は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用であってもよい。
【００４８】
本発明は、神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例えばてんかんまたは脳虚血性傷害）の治療に使用するための、アンタゴニスト治療薬などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーター、例として、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬のコンパニオン診断としての、セルピン１バイオマーカーアッセイの使用を提供する。使用は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用であってもよい。
【００４９】
本発明は、神経障害を患っている対象の、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターを含む治療薬に対する応答の可能性を決定するためのセルピン１バイオマーカーの使用を提供する。使用は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用であってもよい。
【００５０】
セルピン１バイオマーカーアッセイは、以下からなる群から選択され得る。
ａ．セルピン１ｍＲＮＡの測定
ｂ．セルピン１タンパク質の測定
ｃ．セルピン１活性の測定
ｄ．組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）活性の測定
ｅ．プラスミノーゲンからプラスミンへの変換、すなわち血液凝固の測定。
【００５１】
ａ）、ｂ）およびｃ）は、セルピン−１バイオマーカーの直接的なアッセイであり、一方、ｄ．およびｅ．は、間接的なセルピン−１バイオマーカーである。いくつかの実施形態では、セルピン１バイオマーカーアッセイは、直接的なセルピン−１バイオマーカーアッセイである。いくつかの実施形態では、セルピン１バイオマーカーアッセイは、間接的なセルピン−１バイオマーカーアッセイである。
【００５２】
いくつかの実施形態では、対象は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４に関連する疾患または障害、例えば神経障害、特に神経障害に関連する発作（例えばてんかんもしくは脳虚血性傷害）を患っているか、またはｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４に関連する疾患または障害、例えば神経障害、特に神経障害に関連する発作（例えばてんかんもしくは脳虚血性傷害）を発症する可能性が高いかのいずれかである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、対象は、例えば血栓症のために、以前にｔＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベーター）治療を受けたことがある。
【００５４】
いくつかの実施形態では、セルピン１バイオマーカーは、脳脊髄液サンプル、血液サンプル、または血漿サンプルからなる群から選択される、対象から得られたサンプル中でアッセイされる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、セルピン１バイオマーカーは、対象から得られた脳脊髄液サンプル中でアッセイされる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤であり、これは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４、例えばｈｓａ−ｍｉＲ−１３４、例えば配列番号１または２に相補的な、例えば完全に相補的な少なくとも７個の連続ヌクレオチドを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストは、ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＬＮＡホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５８】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４（ｍｉＲ−１３４とも呼ばれる）
ＭｉｃｒｏＲＮＡ−１３４は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．１２：７３５−７３９（２００２）の中で、組織特異的なｍｉｃｒｏＲＮＡとして初めて報告された。マウスｍｉＲ−１３４  ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｍｕ−ｍｉｒ−１３４  ＭＩ００００１６０は、次の配列：
ＡＧＧＧＵＧＵＧＵＧＡＣＵＧＧＵＵＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＧＵＧＣＡＣＵＣＵＧＵＵＣＡＣＣＣＵＧＵＧＧＧＣＣＡＣＣＵＡＧＵＣＡＣＣＡＡＣＣＣＵ
を有する。
【００５９】
マウス成熟ｍｍｕ−ｍｉＲ−１３４−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００１４６は、配列
ＵＧＵＧＡＣＵＧＧＵＵＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧ（配列番号１）
を有する。
【００６０】
ヒトｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４（遺伝子ＩＤ：４０６９２４）は、１４番染色体の位置ＮＣ＿００００１４．９（１０１０５４６８７．．１０１０５４７５９）Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  １０９（Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＧＲＣｈ３８．ｐ１２−ＧＣＦ＿０００００１４０５．３８）にコードされている。
【００６１】
ｈｓａ−ｍｉｒ−１３４  ＭＩ００００４７４  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列（ステムループ）：
ＣＡＧＧＧＵＧＵＧＵＧＡＣＵＧＧＵＵＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＡＵＧＣＡＣＵＧＵＧＵＵＣＡＣＣＣＵＧＵＧＧＧＣＣＡＣＣＵＡＧＵＣＡＣＣＡＡＣＣＣＵＣ（配列番号２）
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４−５ｐ成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列ＭＩＭＡＴ００００４４７：
ＵＧＵＧＡＣＵＧＧＵＵＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧ（配列番号１）
【００６２】
ヒトおよびマウスのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４シード配列は、ＧＵＧＡＣＵまたはＧＵＧＡＣＵＧである。
【００６３】
ｍｉＲ−１３４、特に成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４配列は、マウス、霊長類、ヒトおよび哺乳類全般の間で高度に保存されている。
【００６４】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーター
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターは、細胞内でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４活性のレベルを調節する化合物である。ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害剤などのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターは、有利には、人工化合物、合成的に生成された化合物、単離された化合物または精製された化合物である。いくつかの実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターは、合成的に合成されたオリゴヌクレオチドであるか、またはそれを含む。合成的に合成されたオリゴヌクレオチドは、有利には、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドまたは少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターは、合成ｍｉｃｒｏＲＮＡ、すなわち、細胞に投与されたときにｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４の活性を模倣する合成オリゴヌクレオチドであるか、またはそれを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターは、合成阻害剤またはｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的とするｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４であるか、またはそれを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、セルピン−１バイオマーカーは、ｍｉｃｒｏＲＮＡモジュレーターを同定するために使用することができ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４ミミックは、セルピン−１のｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４抑制を増強し、一方、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストは、セルピン−１の抑制解除をもたらす。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明で使用するためのｍｉＲ−１３４モジュレーターは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＬＮＡ抗ｍｉＲであり、これは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４標的配列、例えば配列番号１または２に完全に相補的な少なくとも７個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。適切には、ｍｉＲ−１３４を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、は薬学的に活性である。本発明の文脈において、薬学的に活性な化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞ベースのアッセイ）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、マウスデータなどの動物データ）などの前臨床データに基づいて、対象に利益を提供する可能性を有し得る化合物を指す。
【００６９】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト
本明細書でｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト／アンタゴズムと呼ばれる調節の１つのタイプは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４の発現を阻害、ダウンレギュレート、減少、抑制、除去、停止、ブロック、防止、低減、回避、または終結させる化合物の能力であり、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４  ＲＮＡの分解により、または細胞内でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４活性の不活性化により、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４  ＲＮＡ標的に結合（例えば、ハイブリダイズ）し、それによって細胞内でのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４  ＲＮＡとｍＲＮＡとの相互作用を防止することにより行われる。ＬＮＡ抗ｍｉＲなどの、ｍｉｃｒｏＲＮＡを標的とする高親和性修飾オリゴヌクレオチドは、それらの標的ｍｉｃｒｏＲＮＡと非常に安定した二重鎖を形成し、それによってｍｉｃｒｏＲＮＡ活性を効果的に滴定すると考えられている。
【００７０】
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者によって一般的に理解されるように定義される。そのような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは一般的に、固相化学合成、続いて精製により、実験室で作製される。  オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００７１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。ＬＮＡ抗ｍｉＲは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでｍｉｃｒｏＲＮＡを阻害するために使用される例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００７２】
本発明で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４標的配列、例えば配列番号１または２に完全に相補的な少なくとも７個の連続ヌクレオチドを含む。有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４シード配列に相補的である。ヒトにおけるｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４シード配列は、ＧＵＧＡＣＵまたはＧＵＧＡＣＵＧである。いくつかの実施形態では、本発明で言及されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉｃｒｏＲＮＡシード配列の相補配列、例えばヌクレオチドの配列、ＡＧＴＣＡＣまたはＡＧＵＣＡＣまたはＣＡＧＴＣＡＣまたはＣＡＧＵＣＡＣを含む。ワトソン・クリック型塩基対の場合、ＴとＵは互換的に使用される場合があることに留意されたい。有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチド内のシード配列の補体は、少なくとも１つの高親和性修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも１つのＬＮＡまたは少なくとも１つの２’Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド内のシード配列の補体は、少なくとも２つの高親和性修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２つのＬＮＡまたは少なくとも２つの２’Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド内のシード配列の補体は、少なくとも３つの高親和性修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも３つのＬＮＡまたは少なくとも３つの２’Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明で言及されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが７〜２６ヌクレオチド、例えば長さが７〜１２ヌクレオチド、例として、長さが８、９、１０、１１、１２ヌクレオチド、または長さが１２〜２６ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えば長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６の連続ヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）または相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。
【００７５】
ＬＮＡ−抗ｍｉＲ
ＬＮＡ−抗ｍｉＲは、標的ｍｉｃｒｏＲＮＡ、例えばｈｓａ−ｍｉＲ−１３４に相補的な連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、これは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。ＬＮＡ−抗ｍｉＲは、国際公開第２００７／１１２７５４号および国際公開第２００９０４３３５３号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）およびトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）化合物も参照されたい。
【００７６】
他のＬＮＡ−抗ｍｉＲ設計は、国際公開第２００７／０２７７７５号、国際公開第０７０２７８９４号、国際公開第２０１５／０６１５３６号、国際公開第２０１７０３５３１９号、国際公開第２０１８／１０６５６６号、欧州特許出願公開第２８４１５７９号明細書、および国際公開第１８１０６５６８号に開示されている。
【００７７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストは、配列５’−ａｇｔｃａｃ−３’または５’−ｃａｇｔｃａｃ−３’を含み、これらの配列は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４シード領域の補体であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で言及されるアンチセンスオリゴヌクレオチドｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニストは、配列５’−ａｇｔｃａｃ−３’を含み、ここで、５’−ａｇｔｃａｃ−３’中のヌクレオシドの少なくとも１、例えば、２、３、４、５または６がＬＮＡヌクレオシドである。
【００７８】
１つの例示的なＬＮＡ−ａｎｔｉｍｉＲは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、５’−ＴｇＧｔｃＡＡｃｃＡｇＴｃＡＣ−３’（配列番号８）であり、配列中、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシド、小文字はＤＮＡヌクレオシド、ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【００７９】
有利な実施形態では、モジュレーターは、アンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む。１つの特別に好ましい実施形態では、モジュレーターは、７〜２５ヌクレオチド長であって少なくとも１つのＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡモジュレーターは、７〜２５ヌクレオチド長であって少なくとも１つのＬＮＡを含みかつ親和性を高める少なくとも１つの他のヌクレオチドアナログをさらに含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、抗ｍｉＲ−１３４オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ抗ｍｉＲである（例えば、国際公開第２００７／１１２７５４号を参照されたい）。ＬＮＡ抗ｍｉＲは、ＬＮＡヌクレオシドを含む成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含んでいてもよい。ＬＮＡ抗ｍｉＲは、ＤＮＡおよび／または２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）ヌクレオシドなどの他のヌクレオチドをさらに含んでいてもよい（例えば、欧州特許出願公開第１９３１７８０号明細書を参照されたい）。成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡを標的とするために、抗ｍｉＲ−１３４オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ１をリクルーティングしないことが有利であり、したがって、ＬＮＡ抗ｍｉＲなどの抗ｍｉＲ−１３４オリゴヌクレオチドが４個以上の連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を含まないことが有利である。
【００８１】
抗ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ＬＮＡホスホロチオエートは、Ｑｉａｇｅｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｄｋ／ｓｈｏｐ／ｐｃｒ／ｐｒｉｍｅｒ−ｓｅｔｓ／ｍｉｒｃｕｒｙ−ｌｎａ−ｍｉｒｎａ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ／＃ｏｒｄｅｒｉｎｇｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から注文することができる。本明細書に記載の実験で使用される化合物Ｃ（Ｅｘｉｑｏｎ社、アンタゴｍｉｒ）は、この供給元から入手することができる。
【００８２】
有利には、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４標的核酸を標的とする抗ｍｉＲ−１３４オリゴヌクレオチドは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４シード領域（ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４の５’末端からのヌクレオチド２〜７）の補体を含む。いくつかの実施形態では、抗ｍｉＲ１３４オリゴヌクレオチドは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４シード領域に相補的な位置にある少なくとも１、例えば少なくとも２または少なくとも３のＬＮＡヌクレオチドを含む（例えば、抗ｍｉＲ−１３４オリゴヌクレオチドは、配列ＣＡＧＴＣＡＣまたはＡＧＴＣＡＣを含む）。
【００８３】
ＬＮＡ抗ｍｉＲは、完全にホスホロチオエートであってもよいし、部分ホスホロチオエートであってもよい。全身投与の場合は、完全ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの割合が高いと好ましくあり得るが、ＣＮＳへの局所投与の場合は、部分ホスホロチオエートを使用することが望ましくあり得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、抗ｍｉＲ−１３４オリゴヌクレオチドは、長さが７〜１０個の連続ＬＮＡヌクレオチドであり（Ｔｉｎｙ  ＬＮＡとも呼ばれる、Ｏｂａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１  Ｍａｒ  ２０；４３（４）：３７１−８および国際公開第２００９０４３３５３号を参照されたい）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４シード領域の補体を含む。ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４のＴＩＮＹ  ＬＮＡ阻害剤の例としては、ＡＣＣＡＧＴＣＡＣ、ＣＣＡＧＴＣＡＣおよびＣＡＧＴＣＡＣが挙げられ、ここで、各ヌクレオチドはβ−Ｄ−オキシＬＮＡなどのＬＮＡヌクレオシドであり、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートである。部分ホスホロチオエートの使用も使用することができ、例えば、末端ヌクレオチド間のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートであり得、残りのヌクレオシド間結合はホスホジエステルであり得る。
【００８５】
一実施形態では、医薬組成物は、以下の配列を有する抗ｍｉＲ−１３４オリゴマーを含む：本明細書では化合物Ａとも呼ばれる５’−ＴｇＧｔｃＡＡｃｃＡｇＴｃＡＣ−３’（配列番号８）であって、配列中、大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡを示し、小文字のＤＮＡおよびＬＮＡ  Ｃは５メチルＣであり、そのような化合物は完全ホスホロチオエート骨格を有する。このオリゴマーは、国際公開第２００７／１１２７５４号に記載されているように調製することができる。国際公開第２００７／１１２７５４号の他のオリゴマーを本発明に従って使用することができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害剤は、表１に記載の配列のいずれか１つを含むか、またはそれからなるＬＮＡアンチセンスオリゴマーである。
【００８７】
表１．本発明の方法において使用することができる以下の特定の配列または化合物は、例えば、疾患の治療に、例えば、ｍｉＲ−１３４の発現／過剰発現が示される疾患、例えば表１に示される疾患に使用することができる。化合物は、好ましくは完全ホスホロチオエートであり、各ヌクレオチドは、β−Ｄ−オキシＬＮＡなどのＬＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡシトシンは、５−メチルシトシンであってもよい。同等の抗ｍｉＲを、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの−２〜−８／−９または−１０の位置（７、８、または９ｍｅｒの場合）（ｍｉｃｒｏＲＮＡの末端５’ヌクレオチドから数えて（すなわち、−１の位置））をマッチさせることにより設計することができる。
【００８８】
【表１】
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＊大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡを示し、小文字のＤＮＡおよびＬＮＡ  Ｃは５メチルＣであり、そのような化合物は完全ホスホロチオエート骨格を有する。
【００８９】
抗ｍｉｃｒｏＲＮＡオリゴヌクレオチドの他の数多くの化学的性質および設計が当該技術分野で知られている。
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害のために、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的を標的とする、非ＲＮａｓｅＨをリクルートするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、数多くの化学的性質および設計が当該技術分野で使用されてきた。例えば、以下のものが挙げられる：
【００９０】
国際公開第２００５０１３９０１号、Ｅｓａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．２００６  Ｆｅｂ；３（２）：８７−９８およびＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００６  Ｍａｙ  １１；３４（８）：２２９４−３０４に報告されている完全２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエート。
【００９１】
２’−Ｏ−メトキシエチル／２’フルオロミックスマーホスホロチオエート−Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００９  Ｊａｎ；３７（１）：７０−７を参照のこと。
【００９２】
２’−Ｏ−メチルアンタゴｍｉＲ−成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの完全に２’−Ｏ−メチルで修飾された完全補体であって、５’および３’領域は、コレステロールコンジュゲートを組み込んだホスホジエステルの内部領域を有するホスホロチオエートである（Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００５  Ｄｅｃ  １；４３８（７０６８）：６８５−９）。
【００９３】
ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的を標的とするために、ＲＮａｓｅＨリクルート設計が機能的であると報告されており、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ標的配列を標的とする２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマーを開示している国際公開第２００５０１３９０１号を参照のこと。
【００９４】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４関連の疾患または障害、例えば発作を伴う神経障害（例えばてんかんもしくは脳虚血性傷害）の予防のために、または治療のために、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４を阻害することを目的として、発見、開発された、または販売承認を取得しているか、もしくは販売されているｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害剤である。
【００９５】
セルピン１バイオマーカー
セルピン１バイオマーカーは、細胞内またはサンプル中でのセルピン１の発現または活性の直接的または間接的なバイオマーカーである。
【００９６】
セルピン１発現の直接的なバイオマーカーとしては、以下のものが含まれる：
セルピン１ｍＲＮＡの測定、例えば、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ（例えば、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、プローブハイブリダイゼーション、マイクロアレイ分析、ＲＮＡ保護アッセイ、ＲＮＡシーケンシング）を使用した測定。
【００９７】
セルピン１ｐｒｅ−ｍＲＮＡが、７番ヒト染色体にコードされている：１０１，１２７，０８９−１０１，１３９，２６６  ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｔｒａｎｄ（ＧＲＣｈ３８：ＣＭ０００６６９．２）、本明細書に配列番号３（セルピン１〜２０１）として例示的に提供されている。
【００９８】
セルピン１タンパク質レベルの測定、例えば、セルピン１特異的抗体を使用した測定。数多くのセルピン１特異的抗体が市販されている。セルピン−１抗体アッセイを、例えば、Ｅｌｉｓａアッセイを使用してセルピン１タンパク質を測定するために使用してもよく、これも市販されており、例えば、ａｂｃａｍ社からＨｕｍａｎ  ＰＡＩ１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（セルピン１）（ａｂ１８４８６３）として入手可能である。ヒトセルピン１タンパク質配列の例は、配列番号７として提供される。
【００９９】
セルピン１は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のレギュレーターである。ｔＰＡは、プラスミノーゲンをプラスミンに変換するセリンプロテアーゼであり、血栓の分解を司る主要な酵素である。
【０１００】
セルピン１発現の間接的なバイオマーカーには、ｔＰＡ活性のアッセイが含まれ、これは、例えば、ＡｎａＳｐｅｃ社からＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）ＡＭＣ  ｔＰＡ活性アッセイキット＊蛍光分析＊として入手可能である。ｔＰＡのＥｌｉｓａアッセイも市販されている。さらに、セルピン−１はｔＰＡを阻害し、ｔＰＡはプラスミノーゲンをプラスミンに変換することから、凝固アッセイなどのプラスミノーゲンからプラスミンへの変換もセルピン−１バイオマーカーとして使用することができる。
【０１０１】
参照レベル
本発明の使用方法では、セルピン−１バイオマーカーのレベルは、少なくとも１つの参照レベルと比較され得る。参照レベルは、例えば、疾患に関連するセルピン１バイオマーカーのレベル、および／またはセルピン１バイオマーカーの正常レベルであり得る。セルピン−１バイオマーカーのレベルは、例えば、対象の集団、例えば、疾患と診断された対象の集団、および／または疾患を有していないと考えられる対象の集団から決定され得る。
【０１０２】
追加的に、または代替的に、セルピン−１参照は、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬を投与された患者／対象の観察に使用するために、対象からの過去のセルピン−１バイオマーカーレベルであってもよい。したがって、本発明は、効果的なｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４阻害のために患者を観察し、それによって個々の対象／患者の投与計画を最適化するために使用することができる。
【０１０３】
対象
対象は、ラットまたはマウスといった齧歯類などの哺乳類であってもよいし、サルなどの霊長類（例えば、カニクイザル）であってもよい。
【０１０４】
対象は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４関連疾患の非ヒト動物モデルであってもよい。いくつかの実施形態では、動物モデルは、化学物質（カイニン酸）誘発性発作に基づくマウスモデルである。
【０１０５】
対象は、ヒト、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療を必要としているヒト、またはｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４アンタゴニスト治療薬による治療を受けているヒトであってもよい。
【０１０６】
対象は、発作に関連する（例えば、発作を特徴とする、または発作のリスクがある）神経障害を患っているヒトであってもよい。
【０１０７】
対象は、脳虚血性傷害を患っているヒトであってもよい。
【０１０８】
対象は、てんかんなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４関連の疾患または障害を有すると診断されたヒトであってもよいし、てんかんなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４関連の疾患または障害を発症するリスクがあると診断されたヒトであってもよい。
【０１０９】
対象は、例えば血栓症のために、以前にｔＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベーター）治療を受けていてもよい（そのような対象は、てんかんを発症するリスクがあり得る）。そのような場合、本発明の方法または使用は、診断的に、すなわち、発作（てんかんなど）を発症するリスクが高い対象を同定するために、かつ／または治療的に、すなわち、発作（例えばてんかん）を予防もしくは治療するために使用され得る。発作は、脳虚血性傷害などの神経障害に関連している可能性がある。
【０１１０】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４関連の疾患または障害
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４は、ニューロンの微細構造に関与する脳特異的なｍｉＲＮＡであり、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４の過剰発現は、脊髄体積の減少、樹状突起長の減少および長期増強の抑制と関連している。したがって、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４は、さまざまな神経障害の治療のための興味深い標的である。最近のエビデンスは、ｍｉＲＮＡがてんかんのいくつかの形態で重要な役割を果たしている可能性を示唆している。アイルランド王立外科医学院（ＲＣＳＩ）のＤａｖｉｄ  Ｈｅｎｓｈａｌｌ教授が率いる研究は、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）と、樹状突起の伸長を促進し、脊椎の成熟をネガティブに制御することに重要な役割を果たすことが知られているｍｉＲＮＡ、ｍｉｒ−１３４の発現増加との間に強い関連性があることを突き止めた。さらに、彼らは、ロックド核酸（ＬＮＡ）抗ｍｉＲ−１３４オリゴヌクレオチド、例えばアンタゴｍｉｒ（抗１３４）を使用して、てんかん重積状態の成体マウスモデルにおいてｍｉｒ−１３４をサイレンシングすることにより、てんかん重積状態に起因する発作活動および海馬損傷を強力に抑制することができることを示している。具体的には、彼らは、扁桃体内カイニン酸（ＫＡ）誘発性てんかん重積状態の２４時間前にＩＣＶ注射によるｍｉｒ−１３４に対するアンタゴｍｉｒを使った治療を行うことで、脳波で記録されたてんかん重積状態の重症度だけでなく、海馬損傷の組織学的測定を有利に減少させることが可能であることを実証した（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。抗ｍｉＲ−１３４のＩＣＶ注射によるマウスの前処理も、化学けいれん薬のピロカルピン（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）およびＰＴＺ（Ｒｅｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）によって誘発される発作を強力に抑制した。さらに、アンタゴミル（ＩＣＶ）治療を扁桃体内ＫＡ注射の１時間後に行ったところ、急性てんかん活動は減少しなかったが、脳波遠隔測定により２週間以上にわたって観察された自発性発作の発症を有意に遅らせ、総数を減少させた（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。注目すべきことに、ラットのてんかん重積状態後にｍｉＲ−１３４をサイレンシングすると、後天性てんかんのトキシンフリーモデルである穿通経路刺激モデルでは、その後の自然発作の発生が８６％減少した（Ｒｅｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【０１１１】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４に関連する疾患または障害は、神経障害、例えば発作を伴う神経障害（例えばてんかんまたは脳虚血性傷害）であり得る。
【０１１２】
アンタゴニストなどのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターによる治療にとって興味深い可能性がある他の神経障害としては、脳卒中、ＣＮＳ感染関連発作、脳腫瘍、外傷性脳損傷、神経変性障害、発作を引き起こす代謝障害（低血糖、グリコーゲン蓄積症、ピルビン酸脱水素酵素複合体欠損症、後天性副甲状腺機能低下症、アデニルコハク酸リアーゼ（ＡＤＳＬ）欠損症を含むがこれらに限定されない）および発作を引き起こす自己免疫障害（多発性硬化症、真性糖尿病および全身性紅斑性狼瘡）が挙げられる。「てんかんもしくは発作を突然引き起こす可能性が高い、または脳損傷を引き起こす、または引き起こした可能性が高い脳傷害」という用語は、脳卒中、外傷、または他の種類の急性神経傷害を意味すると理解されるべきである。ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４モジュレーターは、神経障害に関連する発作を治療または予防するために使用することができる。
【０１１３】
連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語および「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列、を含み、任意に更なるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでいてもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。有利には、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸（ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４  ＲＮＡ、例えば配列番号１または２）に１００％相補的である。
【０１１４】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。本来、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドに存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、互換的に「単位」または「モノマー」と呼ばれ得る。
【０１１５】
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」という用語は、等価なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、「ヌクレオシドアナログ」または修飾「単位」または修飾「モノマー」と本明細書では互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対合が可能であれば、依然として一般的にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。
【０１１６】
修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに領域ＦおよびＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。
【０１１７】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合が、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性であるように、天然のホスホジエステルから修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いることにより決定することができ、これらの両方は当該技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾され、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを、例えばコンジュゲートなどの非ヌクレオチド官能基に結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。
【０１１８】
好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。
【０１１９】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、および製造の容易さのため特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部は、ホスホロチオエートである。
【０１２０】
核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニンおよびグアニン）ならびにピリミジン（例えば、ウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語はまた、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチン、ならびに天然に存在しないバリアントの両方を指す。そのようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ  ４５  ｐａｇｅ  ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．３７  １．４．１．に記載されている。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを、修飾プリンまたはピリミジンに、例えば置換プリンまたは置換ピリミジンに、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チアゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
【０１２２】
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示され得、ここで、各文字は、等価な機能の修飾核酸塩基を任意に含み得る。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５−メチルシトシンから選択される。任意に、ＬＮＡギャップマーには、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【０１２３】
サンプル
セルピン−１バイオマーカーの測定は、細胞抽出物中で、例えば、本発明のｉｎ  ｖｔｉｒｏ法で行ってもよいし、対象から得られた生物学的抽出物中で行ってもよい。
【０１２４】
生物学的抽出物としては、例えば、脳脊髄液サンプル、血液サンプル、または血漿サンプルが挙げられる。有利には、サンプルは、対象から得られた脳脊髄液のサンプルであってもよい。
【０１２５】
セルピン−１バイオマーカーをアッセイする前に、細胞抽出物またはサンプルを処理してもよく、例えば、バイオマーカー分子を精製してもよく、例えば、セルピン１ｍＲＮＡアッセイの場合、抽出物またはサンプルからＲＮＡを抽出してもよいことが理解されよう。
【０１２６】
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖−修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述する。「キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。
【０１２７】
相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対合の能力を説明する。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば５−メチルシトシンは、シトシンの代わりに使用されることが多く、したがって、相補性という用語は、非修飾塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ  ４５  ｐａｇｅ  ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．３７  １．４．１を参照されたい）。
【０１２８】
本明細書で使用される「％相補性」という用語は、個別の核酸分子（例えば、標的核酸または標的配列）の所与の位置における、ヌクレオチドの連続配列に相補性である（すなわち、ワトソン・クリック塩基対を形成する）、所与の位置における、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列の割合における、ヌクレオチドの数を意味する。百分率は、２つの配列間で対を形成する（標的配列５’−３’とオリゴヌクレオチド配列３’−５’を整列させたとき）、整列された塩基の数を数え、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割って１００を掛けることにより計算される。そのような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。好ましくは、挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。
【０１２９】
「完全に相補的な」という用語は、１００％相補性を指す。
【０１３０】
同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）に同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性の百分率は、２つの配列（例えば、本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列における）の間で同一の（マッチする）整列された塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割って１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性のパーセンテージ＝（マッチ×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さである。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されよう（例えば、５−メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【０１３１】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって記述されることが多い。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ  ａｎｄ  Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １３：５１５−５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発反応であり、自発反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６−３８およびＨｏｌｄｇａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙに記載されているように、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°はまた、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９５：１４６０−１４６５に記載されているように、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１２１１−１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：５３８８−５４０５に記載されている適切に導出された熱力学パラメーターを使用して、最近傍モデルを使用して数値的に推定することができる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの場合、−１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば−１５ｋｃａｌ未満、例えば−２０ｋｃａｌ未満、および例えば−２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、−１０〜−６０ｋｃａｌ、例えば−１２〜−４０、例えば−１５〜−３０ｋｃａｌまたは−１６〜−２７ｋｃａｌ、例えば−１８〜−２５ｋｃａｌの推定ΔＧ゜値で標的核酸にハイブリダイズする。ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４活性にハイブリダイズし、阻害（アンタゴナイズ）することができる。
【０１３２】
標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳類またはヒトのｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４  ＲＮＡ、例えば配列番号１または２である。
【０１３３】
標的配列
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指し、これは本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な標的核酸上の領域からなる。
【０１３４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的な、またはその核酸にハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列、例えば標的核酸のサブ配列、例えば本明細書で記載される標的配列を含む。
【０１３５】
オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に存在する標的配列に相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。連続ヌクレオチド配列（ひいては、標的配列）は、少なくとも７の連続ヌクレオチド、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の連続ヌクレオチド、例えば８〜２２、例えば１１〜１８の連続ヌクレオチドを含む。
【０１３６】
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、これは、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５〜＋１２ｏＣ、より好ましくは＋１．５〜＋１０ｏＣ、最も好ましくは＋３〜＋８ｏＣの融解温度の上昇をもたらす。数多くの高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野において知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３を参照されたい）。
【０１３７】
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較して、糖部分が修飾された１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
【０１３８】
リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の性質を改善することを主な目的として作製されてきた。
【０１３９】
そのような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）もしくは二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間にビラジカル架橋を有する）、または典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ））で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）または三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合には、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシド、またはモルホリノ核酸が含まれる。
【０１４０】
糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を水素以外の基、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドに天然に存在する２’−ＯＨ基に変更することによる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、または５’位で導入され得る。
【０１４１】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは−ＯＨ以外の置換基を有し（２’置換ヌクレオシド）、または２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’−４’ビラジカル架橋）である。
【０１４２】
実際、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれることで有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾ヌクレオシドは、向上された結合親和性および／または増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３，およびＤｅｌｅａｖｅｙ  ａｎｄ  Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２，１９，９３７を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明図である。
【化１】
2021534759.tif 000003
【０１４３】
本発明に関連して、２’置換は、ＬＮＡのような２’架橋分子を含まない。
【０１４４】
ロックド核酸（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’を結合するビラジカル（「２’−４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドはまた、文献にて架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補二重鎖の融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。
【０１４５】
非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３−７６、Ｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ  ７５（５）ｐｐ．１５６９−８１、およびＭｉｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９，３７（４），１２２５−１２３８、およびＷａｎ  ａｎｄ  Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１６，５９，９６４５−９６６７に開示されている。
【０１４６】
更なる非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、スキーム１に開示されている。
スキーム１：
【化２】
2021534759.tif 000004
【０１４７】
特定のＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）およびＥＮＡである。
【０１４８】
特定の有利なＬＮＡは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【０１４９】
非ＲＮａｓｅＨをリクルートするアンチセンスオリゴヌクレオチド
国際公開第２００５／０１３９０１号は、ｍｉｃｒｏＲＮＡを阻害するための、ＲＮａｓｅＨをリクルートする２’−Ｏ−ＭＯＥギャップマー、および完全２−Ｏ−ＭＯＥ修飾オリゴヌクレオチドを開示していた。一般に、ＲＮＡｓｅＨをリクルートするギャップマーオリゴヌクレオチドは、ｍｉｃｒｏＲＮＡの阻害に関して、非ＲＮａｓｅＨをリクルートするｓｔｅｒｉｃ  ｂｌｏｃｋ型アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも劣ると考えられている（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４−２２９４−３０４を参照されたい）。Ｋｒｕｅｔｚｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｎａｔｕｒｅ  ４３８  ６８５−９には、完全２’Ｏ−メチル修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドコレステロールコンジュゲートを開示しており、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２２を阻害するのに有効なＲＮａｓｅＨをリクルートすることができない。
【０１５０】
ｍｉｃｒｏＲＮＡの阻害について国際公開第２００７／１１２７５４号に開示されているように、非ＲＮａｓｅＨをリクルートする高親和性アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＬＮＡ抗ｍｉＲを使用することが有利である。
【０１５１】
欧州特許出願公開第１２２２３０９号明細書は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ法を提供し、これはＲＮａｓｅＨをリクルートする能力を決定するために使用され得る。オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的を提供されたときに、欧州特許出願公開第１２２２３０９号明細書の実施例９１〜９５によって提供される方法を用いて、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する、２’置換を伴わない、同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドの少なくとも１％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％未満のｐｍｏｌ／ｌ／ｍｉｎで測定した初期速度を有する場合に、ＲＮａｓｅＨをリクルートすることができると見なされる。
【０１５２】
一実施形態では、いくつかの実施形態では、オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的、ＲＮａｓｅＨを提供されたときに、ｐｍｏｌ／ｌ／ｍｉｎで測定したＲＮａｓｅＨ初期速度が、欧州特許出願公開第１２２２３０９号明細書の実施例９１〜９５によって提供される方法を用いて、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する、２’置換を伴わない、同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて決定された初期速度の１％未満、例えば５％未満、例えば１０％未満または２０％未満である場合に、ＲＮａｓｅＨをリクルートすることが本質的にできないと見なされる。
【０１５３】
トータルマー（Ｔｏｔａｌｍｅｒｓ）
いくつかの実施形態では、オリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、ヌクレオシドアナログ、例えば親和性増強ヌクレオシドアナログ連続配列からなり、本明細書では「トータルマー」と呼ばれる。
【０１５４】
トータルマーは、一本鎖オリゴマー、またはその連続ヌクレオチド配列であり、これはＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドを含まず、したがって、ヌクレオシドアナログヌクレオシドのみを含む。オリゴマー、またはその連続ヌクレオチド配列は、トータルマーの可能性があり、実際、様々なトータルマーの設計が、特にｍｉｃｒｏＲＮＡ（抗ｍｉＲ）またはスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）を標的とする場合、治療用オリゴマーとして非常に効果的である。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、トータルマーは、反復配列ＸＹＸもしくはＹＸＹなどの少なくとも１つのＸＹＸもしくはＹＸＹ配列モチーフを含むか、またはそれからなり、ＸはＬＮＡであり、Ｙは２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ単位および２’−フルオロＤＮＡ単位などの代替（すなわち、非ＬＮＡ）ヌクレオチドアナログである。上記の配列モチーフは、いくつかの実施形態では、例えば、ＸＸＹ、ＸＹＸ、ＹＸＹまたはＹＹＸであり得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、トータルマーは、８〜１６ヌクレオチド、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５ヌクレオチド、例えば８〜１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなっていてもよい。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、トータルマーの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば９５％、例えば１００％のＬＮＡ単位を含む。残りの単位は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位、および２’−ＭＯＥ  ＲＮＡ単位からなる群、または２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ単位および２’−フルオロＤＮＡ単位の群から選択されるものなど、本明細書で言及される非ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択されてもよい。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、トータルマーは、ＬＮＡ単位のみからなる連続ヌクレオチド配列からなるか、またはそれを含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、トータルマーは、米国仮出願第６０／９７９２１７号および同第６１／０２８０６２号、ならびにＰＣＴ／ＤＫ２００８／０００３４４で言及されているように、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（すなわち、抗ｍｉＲ）を標的とし得、これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
ミックスマー（Ｍｉｘｍｅｒｓ）
「ミックスマー」という用語は、ＤＮＡヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログヌクレオシドを含むオリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列を指し、ここで、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒｓ）、テイルマー（ｔａｉｌｍｅｒｓ）、ヘッドマー（ｈｅａｄｍｅｒｓ）およびブロックマー（ｂｌｏｃｋｍｅｒｓ）とは対照的に、天然に存在するＤＮＡヌクレオシド（すなわち、ＲＮａｓｅＨリクルートメント活性を可能にするのに十分な領域ｏｄ  ＤＮＡ）の４超または５超の連続配列が存在しない。
【０１６１】
オリゴマー、またはその連続ヌクレオチド配列は、ミックスマーの可能性があり、実際、様々なミックスマー設計が、特にｍｉｃｒｏＲＮＡ（抗ｍｉＲ）、ｍＲＮＡ上のｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位（Ｂｌｏｃｋｍｉｒ）、またはスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）を標的とする場合、治療用オリゴマーとして非常に効果的である。
【０１６２】
オリゴマー、またはその連続ヌクレオチド配列は、いくつかの実施形態では、ミックスマーの可能性もあり、実際、ミックスマーがそれらの標的に効果的かつ特異的に結合する能力のために、治療用オリゴマーとしてのミックスマーの使用は、標的ＲＮＡの減少に特に有効であると考えられている。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、ヌクレオチドアナログと天然に存在するヌクレオチドとの繰り返しパターンの連続ヌクレオチド配列、または１種のヌクレオチドアナログと第２のタイプのヌクレオチドアナログを含むか、またはそれらからなる。繰り返しパターンは、例えば、次のようになり得る：１つ置きもしくは２つ置きのヌクレオチドは、ＬＮＡなどのヌクレオチドアナログであり、残りのヌクレオチドは、ＤＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドであるか、または本明細書で言及される２’フルオロアナログの２’ＭＯＥなどの２’置換ヌクレオチドアナログ、またはいくつかの実施形態では、本明細書で言及されるヌクレオチドアナログの群から選択されたものである。ＬＮＡ単位などのヌクレオチドアナログの繰り返しパターンは、固定位置、例えば５’末端または３’末端でヌクレオチドアナログと組み合わせられ得ることが認識されている。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーまたはミックスマーの第１のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドアナログである。
【０１６５】
同じであってもよいし異なっていてもよい、いくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーまたはミックスマーの第２のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドアナログである。
【０１６６】
同じであってもよいし異なっていてもよい、いくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーまたはミックスマーの第７および／または第８のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドアナログである。
【０１６７】
同じであってもよいし異なっていてもよい、いくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーまたはミックスマーの第９および／または第１０のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドアナログである。
【０１６８】
同じであっても異なっていてもよい、いくつかの実施形態では、オリゴマーまたはミックスマーの５’末端は、ＬＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドアナログである。
【０１６９】
上記の設計上の特徴は、いくつかの実施形態では、抗ｍｉＲミックスマーなどのミックスマー設計に組み込まれてもよい。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、４超の連続ＤＮＡヌクレオチド単位または３つの連続ＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、ミックスマーは、２つを超える連続ＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、少なくとも２つの連続ヌクレオチドアナログ単位、例えば少なくとも２つの連続ＬＮＡ単位からなる領域を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、少なくとも３つの連続ヌクレオチドアナログ単位、例えば少なくとも３つの連続ＬＮＡ単位からなる領域を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本発明のミックスマーは、ＬＮＡ単位などの７つを超える連続ヌクレオチドアナログ単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のミックスマーは、ＬＮＡ単位などの６つを超える連続ヌクレオチドアナログ単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のミックスマーは、ＬＮＡ単位などの５つを超える連続ヌクレオチドアナログ単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のミックスマーは、ＬＮＡ単位などの４つを超える連続ヌクレオチドアナログ単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のミックスマーは、ＬＮＡ単位などの３つを超える連続ヌクレオチドアナログ単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のミックスマーは、ＬＮＡ単位などの２つを超える連続ヌクレオチドアナログ単位の領域を含まない。
【０１７４】
３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの修飾を参照するミックスマーの実施形態では、ＬＮＡ単位は、本明細書で言及されるものなどの他のヌクレオチドアナログで置き換えられてもよい。したがって、「Ｘ」は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位からなる群から選択され得る。「ｘ」は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ、最も好ましくはＤＮＡである。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、抗ｍｉＲミックスマーなどのミックスマーは、３〜８位で修飾されており、すなわち、３’末端から数えて３〜８番目の位置に少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む。このシーケンスの設計は、存在する非ＬＮＡ単位の数または存在するＬＮＡ単位の数によって定義されてもよい。前者のいくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、例えば１つは、非ＬＮＡ単位である。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドのうちの少なくとも２つ、例えば２つは、非ＬＮＡ単位である。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドのうちの少なくとも３つ、例えば３つは、非ＬＮＡ単位である。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドのうちの少なくとも４つ、例えば４つは、非ＬＮＡ単位である。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドのうちの少なくとも５つ、例えば５つは、非ＬＮＡ単位である。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置の６つのヌクレオチドすべてが非ＬＮＡ単位である。
【０１７６】
あるいは、いくつかの実施形態では、本発明による抗ｍｉＲミックスマーなどのミックスマーは、３’末端から数えて３〜８番目の位置に少なくとも１つのＬＮＡ単位を含む。いくつかの実施形態では、抗ｍｉＲミックスマーなどのミックスマーは、３’末端から数えて３〜８番目の位置に１つのＬＮＡ単位を含む。３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンは、Ｘｘｘｘｘｘ、ｘＸｘｘｘｘ、ｘｘＸｘｘｘ、ｘｘｘＸｘｘ、ｘｘｘｘＸｘおよびｘｘｘｘｘＸからなる群から選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、抗ｍｉＲミックスマーなどのミックスマーは、３’末端から数えて３〜８番目の位置に少なくとも２つのＬＮＡ単位を含む。そのいくつかの実施形態では、ミックスマーは、３’末端から数えて３〜８番目の位置に２つのＬＮＡ単位を含む。３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンは、ＸＸｘｘｘｘ、ＸｘＸｘｘｘ、ＸｘｘＸｘｘ、ＸｘｘｘＸｘ、ＸｘｘｘｘＸ、ｘＸＸｘｘｘ、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘ、ｘＸｘｘｘＸ、ｘｘＸＸｘｘ、ｘｘＸｘＸｘ、ｘｘＸｘｘＸ、ｘｘｘＸＸｘ、ｘｘｘＸｘＸおよびｘｘｘｘＸＸからなる群から選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。一実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンは、ＸｘＸｘｘｘ、ＸｘｘＸｘｘ、ＸｘｘｘＸｘ、ＸｘｘｘｘＸ、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘ、ｘＸｘｘｘＸ、ｘｘＸｘＸｘ、ｘｘＸｘｘＸおよびｘｘｘＸｘＸからなる群から選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンは、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘ、ｘＸｘｘｘＸ、ｘｘＸｘＸｘ、ｘｘＸｘｘＸおよびｘｘｘＸｘＸからなる群から選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンは、ｘＸｘＸｘｘ、ｘＸｘｘＸｘおよびｘｘＸｘＸｘからなる群から選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンはｘＸｘＸｘｘであり、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、抗ｍｉＲミックスマーなどのミックスマーは、３’末端から数えて３〜８番目の位置に少なくとも３つのＬＮＡ単位を含む。その実施形態では、ミックスマーは、３’末端から数えて３〜８番目の位置に３つのＬＮＡ単位を含む。３’末端から数えて３〜８位のヌクレオチドの置換パターンは、ＸＸＸｘｘｘ、ｘＸＸＸｘｘ、ｘｘＸＸＸｘ、ｘｘｘＸＸＸ、ＸＸｘＸｘｘ、ＸＸｘｘＸｘ、ＸＸｘｘｘＸ、ｘＸＸｘＸｘ、ｘＸＸｘｘＸ、ｘｘＸＸｘＸ、ＸｘＸＸｘｘ、ＸｘｘＸＸｘ、ＸｘｘｘＸＸ、ｘＸｘＸＸｘ、ｘＸｘｘＸＸ、ｘｘＸｘＸＸ、ｘＸｘＸｘＸおよびＸｘＸｘＸｘから選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンは、ＸＸｘＸｘｘ、ＸＸｘｘＸｘ、ＸＸｘｘｘＸ、ｘＸＸｘＸｘ、ｘＸＸｘｘＸ、ｘｘＸＸｘＸ、ＸｘＸＸｘｘ、ＸｘｘＸＸｘ、ＸｘｘｘＸＸ、ｘＸｘＸＸｘ、ｘＸｘｘＸＸ、ｘｘＸｘＸＸ、ｘＸｘＸｘＸおよびＸｘＸｘＸｘから選択され、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンは、ｘＸＸｘＸｘ、ｘＸＸｘｘＸ、ｘｘＸＸｘＸ、ｘＸｘＸＸｘ、ｘＸｘｘＸＸ、ｘｘＸｘＸＸおよびｘＸｘＸｘＸからなる群から選択され、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンは、ｘＸｘＸｘＸまたはＸｘＸｘＸｘであり、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンはｘＸｘＸｘＸであり、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、３’末端から数えて３〜８番目の位置に少なくとも４つのＬＮＡ単位を含む。そのいくつかの実施形態では、ミックスマーは、３’末端から数えて３〜８番目の位置に４つのＬＮＡ単位を含む。３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンは、ｘｘＸＸＸＸ、ｘＸｘＸＸＸ、ｘＸＸｘＸＸ、ｘＸＸＸｘＸ、ｘＸＸＸＸｘ、ＸｘｘＸＸＸ、ＸｘＸｘＸＸ、ＸｘＸＸｘＸ、ＸｘＸＸＸｘ、ＸＸｘｘＸＸ、ＸＸｘＸｘＸ、ＸＸｘＸＸｘ、ＸＸＸｘｘＸ、ＸＸＸｘＸｘおよびＸＸＸＸｘｘから選択され得、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本発明によるミックスマーは、３’末端から数えて３〜８番目の位置に少なくとも５つのＬＮＡ単位を含む。そのいくつかの実施形態では、ミックスマーは、３’末端から数えて３〜８番目の位置に５つのＬＮＡ単位を含む。３’末端から数えて３〜８番目の位置のヌクレオチドの置換パターンは、ｘＸＸＸＸＸ、ＸｘＸＸＸＸ、ＸＸｘＸＸＸ、ＸＸＸｘＸＸ、ＸＸＸＸｘＸおよびＸＸＸＸＸｘからなる群から選択され得、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、前記非ＬＮＡ単位は、別のヌクレオチドアナログ単位である。
【０１８２】
いくつかのミックスマーの実施形態にでは、３’末端から数えて１１番目の位置から５’末端までのヌクレオチドの置換パターンは、ヌクレオチドアナログ単位（例えばＬＮＡ）を含んでいてもよいし、または含んでいなくてもよい。いくつかの実施形態では、ミックスマーは、３’末端から数えて１１番目の位置から５’末端まで少なくとも１つのヌクレオチドアナログ単位（例えばＬＮＡ）、例えば１つのヌクレオチドアナログ単位を含む。いくつかの実施形態では、ミックスマーは、３’末端から数えて１１番目の位置から５’末端まで少なくとも２つのヌクレオチドアナログ単位、例えばＬＮＡ単位、例えば２つのヌクレオチドアナログ単位を含む。
【０１８３】
オリゴマーの１１番目の位置から５’末端までのヌクレオチドのヌクレオチド修飾に言及するいくつかの実施形態では、ＬＮＡ単位は、本明細書で言及されるものなどの他のヌクレオチドアナログで置き換えられてもよい。したがって、「Ｘ」は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位からなる群から選択され得る。「ｘ」は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ、最も好ましくはＤＮＡである。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、３’末端から数えて１１番目のヌクレオチドから５’末端まで繰り返される以下の置換パターンを有する：ｘＸｘＸまたはＸｘＸｘ、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。別の実施形態では、ミックスマーは、３’末端から数えて１１番目のヌクレオチドから５’末端まで繰り返される以下の置換パターンを有する：ＸＸｘＸｘｘ、ＸＸｘｘＸｘまたはＸｘＸｘｘＸ、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。さらに別の実施形態では、ミックスマーは、３’末端から数えて１１番目のヌクレオチドから５’末端まで繰り返される以下の置換パターンを有する：ＸＸＸｘＸＸＸｘ、ＸＸｘＸｘＸｘＸ、ＸＸＸｘｘｘＸＸまたはＸＸｘＸｘｘＸＸ、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。
【０１８５】
３’末端から数えて１１番目の位置から５’末端までのヌクレオチドの特定の置換パターンは、ミックスマー中のヌクレオチドの数に依存する。好ましい実施形態では、ミックスマーは１２ヌクレオチドを含み、３’末端から数えて１１〜１２番目の位置の置換パターンは、ｘＸおよびＸｘからなる群から選択され、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて１１〜１２番目の位置の置換パターンはｘＸであり、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。あるいは、３’末端から数えて１１〜１２番目の位置にＬＮＡ単位が存在せず、すなわち、置換パターンはｘｘである。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは１２ヌクレオチドを含み、３’末端から数えて１０〜１２番目の置換パターンは、Ｘｘｘ、ｘＸｘ、ｘｘＸ、ＸＸｘ、ＸｘＸ、ｘＸＸおよびＸＸＸからなる群から選択され、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。そのいくつかの実施形態では、３’末端から数えて１０〜１２番目の位置の置換パターンは、ｘＸｘ、ｘｘＸおよびｘＸＸからなる群から選択され、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。いくつかの実施形態では、３’末端から数えて１０〜１２番目の位置の置換パターンはｘｘＸであり、ここで、「Ｘ」は、ＬＮＡ単位を示し、「ｘ」は、非ＬＮＡ単位を示す。あるいは、３’末端から数えて１０〜１２番目の位置にＬＮＡ単位が存在せず、すなわち、置換パターンはｘｘｘである。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ミックスマーは、５’末端にＬＮＡ単位を含む。いくつかの実施形態では、ミックスマーは、５’末端から数えて最初の２番目の位置にＬＮＡ単位を含む。ミックスマーはまた、本明細書の抗ｍｉＲの文脈で規定される１つ以上の構造的特徴を含んでいてもよく−ミックスマーが類似のパターンおよびヌクレオチド／ヌクレオチドアナログの数（例えば、ＸおよびｘまたはＸおよびＹ）を含む文脈のいずれかである。
【０１８８】
コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）。
【０１８９】
１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込み、または安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、浸透性、および／または細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節または向上させる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低下させるのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織または器官内のオフ標的活性または活性）。
【０１９０】
一実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１９１】
リンカー
結合またはリンカーは、１つ以上の共有結合を介して目的の１つの化学基またはセグメントを目的の別の化学基またはセグメントに結合する、２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えばオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列またはギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。
【０１９２】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、必要に応じて、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）の間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）と、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）とを含み得る。
【０１９３】
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇するまたは遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、またはそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化もしくは還元条件または薬剤などの化学条件、および哺乳動物の細胞で見られるまたは遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。ＤＮＡホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている−本明細書の領域Ｄ’またはＤ’’も参照されたい。
【０１９４】
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造またはオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−ＣまたはＡ−Ｙ−Ｃから構築され得る。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６〜Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２〜Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
【０１９５】
治療
本明細書で使用される「治療」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患もしくは障害）の治療、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。
【実施例】
【０１９６】
概要
ｍｉＲ−１３４はてんかんにおいて重要な調節的役割を果たしているが（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、てんかんにおけるｍｉＲ−１３４の作用機序はまだ明らかになっていない。ｍｉＲ−１３４の潜在的な標的を同定するために、初代皮質ニューロンをｍｉＲ−１３４のＬＮＡ−抗ｍｉＲ阻害剤で処理し、６日間インキュベートした。インキュベーション期間後、細胞からＲＮＡを単離し、グローバルＲＮＡシーケンス解析を行って、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４の阻害により発現が調節されたｍＲＮＡを同定した。同定された抑制解除されたｍＲＮＡから、３’ＵＴＲ内の潜在的なｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４シード配列の存在に基づいて、有意に抑制解除されかつ推定ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４結合部位も含む遺伝子を同定した。これらの候補バイオマーカー転写物は、様々な濃度のＬＮＡ−抗ｍｉＲ−１３４で処理された初代皮質ニューロンを用いた追加の実験で実験的に検証した。試験した候補転写物のうち、１つのセルピン１の有効性が確認され、用量依存的に抑制解除され、制御されていた。セルピン１は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）に結合して阻害するタンパク質プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）をコードする。てんかんにおけるｔＰＡの因果的役割は、ｔＰＡノックアウトマウスが化学的に誘導されたてんかんの発症を抑制することから明らかになっている（Ｔｓｉｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。このことは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４がてんかんを調節し得る潜在的なメカニズムを示しており、ｍｉＲ−１３４を阻害することでセルピン１／ＰＡＩ−１の抑制が解除され、ｔＰＡが阻害されることになる。セルピン１／ＰＡＩ−１または活性ｔＰＡは、ｍＲＮＡレベルだけでなく、脳脊髄液などの体液中のタンパク質レベルおよび活性レベルでも、ｍｉＲ−１３４を阻害するためのバイオマーカーである。
【０１９７】
Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４サイレンシングは、神経保護効果と長期の発作抑制効果をもたらす（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１２  Ｊｕｌ；１８（７）：１０８７−９４）。
【０１９８】
Ｔｓｉｒｋａ  ＳＥらは、エキサイトトキシンによって誘発される神経変性と発作が組織プラスミノーゲンアクチベーターによって媒介されることを示した（Ｎａｔｕｒｅ．１９９５  Ｓｅｐ  ２８；３７７（６５４７）：３４０−４）。
【０１９９】
実施例１：マウス初代皮質ニューロンをｍｉＲ−１３４阻害剤抗ｍｉＲで６日間処理した後に単離したＲＮＡのＲＮＡシークエンス解析により、潜在的なｍｉＲ−１３４標的が同定される。
【０２００】
この例では、Ｅｘｉｑｏｎ社から供給されたコレステロールコンジュゲートＬＮＡ抗ｍｉＲを使用した。
【０２０１】
マウス神経細胞培養物の初代培養物をＰ１仔マウスから調製し、記載されているように６個のマルチウェルプレートにプレーティングした（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。６日間のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養日数（ＤＩＶ）後、マウス初代神経細胞培養物をさらに６日間、Ｍｏｃｋ（ｎ＝６）または０．１μＭ（ｎ＝３）のｍｉＲ−１３４阻害剤抗ｍｉＲ（Ｅｘｉｑｏｎ社、ＬＮＡ修飾および３’コレステロール修飾オリゴヌクレオチド）のいずれかで処理した。神経細胞は、ＰＢＳにオリゴヌクレオチドを添加した基礎増殖培地で培養した。６ウェルセットアップからのＲＮＡを、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、ＩＤ：０５４６９５３５００１）によって、５０μＬの溶出量で製造元の指示に従って精製した。リボソーム枯渇後のＲＮＡシーケンシング（１億ペアエンドリード）はＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社が行った。
【０２０２】
イルミナシーケンシング実験から得られたペアエンドＦａｓｔｑファイルを、「−−ｒｎａ−ｓｔｒａｎｄｎｅｓｓ  ＲＦ」を除くデフォルト設定でｈｉｓａｔ２バージョン２．１．０  （Ｋｉｍ，Ｌａｎｇｍｅａｄ，ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ  ２０１５）を使用して、マウスゲノム配列（ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＩＤ：ｍｍ１０）にアラインメントした。マップされたリードは、少なくとも１０であることが要求されるマッピング品質（ＳＡＭファイルの５列目）と、属性「ｒｅａｄ  ｍａｐｐｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｐｅｒ  ｐａｉｒ（適切なペアとしてマップされたリード）」がｔｒｕｅでなければならないＳＡＭフラグ（ＳＡＭファイルの２列目）に基づいてフィルタリングした。マップされたリードは、マウスＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子アノテーションバージョン９２（「ｈａｖａｎａ」および「ｅｎｓｅｍｂｌｅまたはｈａｖａｎａ」遺伝子のみを使用；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／）を使用して、Ｒｓｕｂｒｅａｄ  Ｒパッケージバージョン１．２８．１の関数ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓを使用して（Ｌｉａｏ，Ｓｍｙｔｈ，ａｎｄ  Ｓｈｉ  ２０１３）、「ｉｓＰａｉｒｅｄＥｎｄ＝ＴＲＵＥ，ｒｅｑｕｉｒｅＢｏｔｈＥｎｄｓＭａｐｐｅｄ＝ＴＲＵＥ，ｓｔｒａｎｄＳｐｅｃｉｆｉｃ＝２，ｊｕｎｃＣｏｕｎｔｓ＝ＴＲＵＥ，ａｌｌｏｗＭｕｌｔｉＯｖｅｒｌａｐ＝ＦＡＬＳＥ」の設定でｓａｍｍａｒｉｚｅされた。遺伝子発現の差異は、ｌｉｍｍａ  Ｒパッケージのユーザーガイド（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ／ｖｉｇｎｅｔｔｅｓ／ｌｉｍｍａ／ｉｎｓｔ／ｄｏｃ／ｕｓｅｒｓｇｕｉｄｅ．ｐｄｆ初版：２００２年１２月２日、最終改訂日：２０１８年４月１５日）に記載されているように、ｌｉｍｍａ  Ｒパッケージ、バージョン３．３４．９のｖｏｏｍ法（Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）を用いて行った。
【０２０３】
ｍｉｃｒｏＲＮＡシード配列は、ｍｉｃｒｏＲＮＡの６〜８ヌクレオチド長の領域であり、これはｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の標的配列と完全にハイブリダイズする必要がある（Ｅｌｌｗａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。所定の遺伝子がｍｉＲ−１３４シード配列と一致するかどうかを同定するために、ｍｉＲＮＡ−１３４の２位から始まる７−ｍｅｒとして定義されたｍｉＲ−１３４のシード配列と完全に一致する７−ｍｅｒ配列  「ＣＡＧＴＣＡＣ」が、所定の遺伝子の３’ＵＴＲに何回出現しているかをカウントした（アノテーションされた３’ＵＴＲが複数存在する遺伝子については、最大カウント数を示す）。
【０２０４】
結果：ＲＮＡシーケンス解析により、初代マウス皮質ニューロンを０．１μＭのｍｉＲ−１３４抗ｍｉＲで６日間処理した後、有意に制御された遺伝子が同定された。コントロールＭｏｃｋで処理した初代皮質ニューロンと０．１μＭのｍｉＲ−１３４抗ｍｉＲで処理した初代皮質ニューロンとの間の遺伝子発現の違いを示すボルケーノプロットプロット（図１）（上段、右にアップレギュレートされた遺伝子、左にダウンレギュレートされた遺伝子）。各点は遺伝子に対応している。多重検定でＰ値を＜０．０５に調整した２つの条件間で発現量が異なる遺伝子には、遺伝子名を付けている。
７−オリゴヌクレオチドｍｉＲ−１３４シード配列を有する有意にアップレギュレートされた遺伝子には、セルピン１、Ｇｐｒ３５、Ｓｙｔ６、Ｐｅｇ１０、Ｏｌｆｒ４６０が含まれる。表１を参照されたい。
【０２０５】
【表２】
2021534759.tif 000005
【０２０６】
実施例２
本実施例で使用した化合物は、以下の配列の非共役ＬＮＡ抗ｍｉＲであった：５’−ＴｇＧｔｃＡＡｃｃＡｇＴｃＡＣ−３’（配列番号８）、配列中、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシド、小文字はＤＮＡヌクレオシド、ＬＮＡシトシンは５−メチルシトシンであり、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０２０７】
初代マウス皮質ニューロンをｍｉＲ−１３４ＬＮＡ阻害剤である抗ｍｉＲで処理すると、セルピン１ｍＲＮＡの発現を誘導し、Ｓｙｔ６、Ｇｐｒ３５、またはＰｅｇ１０  ｍＲＮＡの発現は誘導しない。マウス神経細胞培養物の初代培養物をＰ１仔マウスから調製し、記載されているように２４個のマルチウェルプレートにプレーティングした（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。６日間のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養日数（ＤＩＶ）後、マウス神経細胞培養物をさらに５日間、Ｍｏｃｋ（ｎ＝４）または０．０４μＭ、０．１１μＭ、０．３３μＭ、１μＭ、もしくは３μＭ（ｎ＝４）のｍｉＲ−１３４阻害剤ＬＮＡ−抗ｍｉＲで処理した。ＲＮＡは、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、ＩＤ：０５４６９５３５００１）によって、５０μＬの溶出量で製造元の指示に従って精製した。ｃＤＮＡは、ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、ＩＤ：１７２５０３８）を使用して、製造元の指示に従って合成した。ｃＤＮＡ合成の阻害を防ぐために、ｃＤＮＡ合成の前にＲＮＡを９０℃で１分間変性させた。ｄｄＰＣＲは、ｄｄＰＣＲＴＭ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｎｏ  ｄＵＴＰ）（ＢＩＯＲＡＤ社、ＩＤ：１８６−３０２４）を用いて行った。ＦＡＭ標識プローブおよびプライマーは、ＩＤＴ（セルピン１  Ｍｍ．ＰＴ．５８．６４１３５２５；Ｓｙｔ６  Ｍｍ．ＰＴ．５８．５４１２２０２、Ｐｅｇ１０  Ｍｍ．ＰＴ．５８．１２８８７４４９、Ｇｐｒ２５  Ｍｍ．ＰＴ．５８．６７１３３４８）由来のものであり、一方、ＨＥＸ標識Ｔｂｐプローブおよびプライマーは、ＢＩＯ−ＲＡＤ社（カタログ番号１００３１２５６）由来のものであった。サイクリング条件は次のとおりであった：９５℃で１０分間、９４℃で３０秒間の変性、アッセイに応じたアニーリング温度で１分間、変性とアニーリングのステップを４２回繰り返す。４２回のサイクル後、酵素を９８℃で１０分間失活させた。サンプルを直接使用しない場合は、４℃で保存した。蛍光分析のために液滴を液滴リーダーＱＸ２００ＴＭ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）に流し、ＦＡＭ色のセルピン１液滴およびＨＥＸ色のＴｂｐ液滴の数をカウントした。
【０２０８】
実施例３
セルピン１の潜在的なｍｉＲ−１３４標的部位を、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎＨｕｍａｎ  ７．１を使用して同定し、ｍｉＲ−１３４シード配列と３’ＵＴＲセルピン１ｍＲＮＡとの潜在的なハイブリダイゼーションが、マウスの転写産物では３４５〜３５２位、およびヒトの転写産物では４１７〜４２４位のセルピン３’ＵＴＲで同定された（図３を参照されたい）。ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１３４と３’ＵＴＲフラグメントとの間の相互作用を、ＲＮＡＳｔｒｕｃｔｕｒｅ「Ｐｒｅｄｉｃｔ  ａ  Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ」バージョン６．０．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／Ｓｅｒｖｅｒｓ／ＰｒｅｄｉｃｔＢｉ／ＰｒｅｄｉｃｔＢｉ．ｈｔｍｌ）（Ｒｅｕｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｗｓ  ２０１０）を用いて予測した。
【０２０９】
実施例４
ｐｒｅｍｉＲ−１３４およびＬＮＡ抗ｍｉＲまたはＬＮＡ対照で処理した後のヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるセルピン１ｍＲＮＡの発現解析。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を２４ウェルプレートにプレーティングし、その翌日、４０ｎＭのｐｒｅｍｉＲ−１３４（Ａｍｂｉｏｎ  Ｐｒｅ−ｍｉＲ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｈｓａ−ｍｉｒ−１３４−５ｐ，ＡＭ１７１００）または／および１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲもしくは１００ｎＭの対照ＬＮＡを、製造元の指示に従って  ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、２４ウェルセットアップからのＲＮＡを、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社、ＩＤ：０５４６９５３５００１）によって、５０μＬの溶出量で製造元の指示に従って精製した。ワンステップｄｄＰＣＲを、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｄｄＰＣＲ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（ＢＩＯＲＡＤ社、ＩＤ：１８６４０２１）を用いて行った。ＦＡＭ標識プローブおよびプライマーはＩＤＴ（セルピン１  Ｈｓ．ＰＴ．５８．３９３８４８８．ｇ）由来のものであり、一方で、ＨＥＸ標識ＨＰＲＴ１プローブおよびプライマーは、ＩＤＴ（Ｈｓ．ＰＴ．５８ｖ．４５６２１５７２）由来ものであった。サイクリング条件は次のとおりであった：９５℃で１０分間、９４℃で３０秒間の変性、アッセイに応じたアニーリング温度で１分間、変性とアニーリングのステップを４２回繰り返す。４２回のサイクル後、酵素を９８℃で１０分間失活させた。サンプルを直接使用しない場合は、４℃で保存した。蛍光分析のために液滴を液滴リーダーＱＸ２００ＴＭ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に流し、ＦＡＭ色のセルピン１液滴およびＨＥＸ色のＨＰＲＴ１液滴の数をカウントした。結果を図４に示す。
【０２１０】
その他の参考資料：
Ｃｈｅｎ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２００７；２（５）：１０４４−５１．
Ｅｌｌｗａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１．“Ｔｈｅ  Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｓｅｔ  ｏｆ  ＭｉＲＮＡ  Ｓｅｅｄ  Ｔｙｐｅｓ．”  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）２７（１０）：１３４６−５０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ１４９．
Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５．“ＨＩＳＡＴ：Ａ  Ｆａｓｔ  Ｓｐｌｉｃｅｄ  Ａｌｉｇｎｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｌｏｗ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ．”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２（４）：３５７−６０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３３１７．
Ｌａｗ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４．“Ｖｏｏｍ：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔｓ  Ｕｎｌｏｃｋ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｒｅａｄ  Ｃｏｕｎｔｓ．”  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５（２）：Ｒ２９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｇｂ−２０１４−１５−２−ｒ２９．
Ｌｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３．“Ｔｈｅ  Ｓｕｂｒｅａｄ  Ａｌｉｇｎｅｒ：Ｆａｓｔ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｎｄ  Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｒｅａｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｅｅｄ−ａｎｄ−Ｖｏｔｅ．”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１（１０）：ｅ１０８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ２１４．
Ｒｅｕｔｅｒ，Ｊｅｓｓｉｃａ  Ｓ．，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ．２０１０．“ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．”  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １１（Ｍａｒｃｈ）：１２９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／１４７１−２１０５−１１−１２９．
【図１】
2021534759.tif 000006
【図２Ａ】
2021534759.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
2021534759.tif 000011
【配列表】
2021534759000001.app
【国際調査報告】
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2021534759.tif 000013
2021534759.tif 000014