(57)【要約】  本発明は、ＦＡＰαに特異的に結合する結合ユニット、そのような結合ユニットをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はさらに、前記抗原結合ユニットを生成する方法および本発明のＦＡＰα特異的に結合ユニットを使用して疾患を治療する方法に関する。本発明のＦＡＰαに特異的に結合する結合ユニットは、ＦＡＰαを発現する腫瘍細胞に効果的に結合でき、前記結合ユニットを含む免疫エフェクター細胞はＦＡＰを発現する腫瘍細胞に対して有意な殺傷能力を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖ＣＤＲ領域および重鎖ＣＤＲ領域を含み、重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖ＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の配列は、配列番号：１−３、７および８からなる群から独立して選択され、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列は、配列番号：４−６、９および１０からなる群から独立して選択される、抗原結合ユニット。
【請求項２】
ＨＣＤＲ１は、配列番号：１または７に示される配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号：２または８に示される配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を有する、
請求項１に記載の抗原結合ユニット。
【請求項３】
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の配列は、
Ａ．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３と、
Ｂ．配列番号：７、配列番号：８、配列番号：３との群のいずれか１つから選択される、
請求項２に記載の抗原結合ユニット。
【請求項４】
ＬＣＤＲ１は、配列番号：４または９に示される配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号：５または１０に示される配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を有する、
請求項１に記載の抗原結合ユニット。
【請求項５】
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列は、
Ａ．配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６と、
Ｂ．配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：６との群のいずれか１つから選択される、
請求項４に記載の抗原結合ユニット。
【請求項６】
ＨＣＤＲ１は、配列番号：１または７に示される配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号：２または８に示される配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を有し、ＬＣＤＲ１は、配列番号：４または９に示される配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号：５または１０に示される配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を有する、
請求項１に記載の抗原結合ユニット。
【請求項７】
ＨＣＤＲ１は、配列番号：１に示される配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号：２に示される配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号：４に示される配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号：５に示される配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含む、または
ＨＣＤＲ１は、配列番号：７に示される配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号：８に示される配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号：４に示される配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号：５に示される配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含む、または
ＨＣＤＲ１は、配列番号：１に示される配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号：２に示される配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号：９に示される配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号：１０に示される配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含む、
請求項６に記載の抗原結合ユニット。
【請求項８】
配列番号：１１または１５に示される重鎖可変領域、および配列番号：１３または１７に示される軽鎖可変領域を有する、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原結合ユニット。
【請求項９】
ＦＡＰαへの結合について請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットと競合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットの変異体。
【請求項１０】
変異体の軽鎖可変領域配列が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットのそれと９０ ％、９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の同一性を有し、または、変異体の重鎖可変領域配列が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットのそれと９０ ％、９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の同一性を有し、
好ましくは、変異体の軽鎖ＣＤＲ領域の配列、例えば軽鎖ＣＤＲ１またはＣＤＲ２の配列が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットのそれと、７０ ％以上の同一性を有し、好ましくは、７５ ％以上の同一性を有し、より好ましくは、８０ ％以上の同一性を有し、または、変異体の重鎖ＣＤＲ領域の配列、例えば重鎖ＣＤＲ１またはＣＤＲ２の配列が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットのそれと、７０ ％以上の同一性を有し、好ましくは、７５ ％以上の同一性を有し、より好ましくは、８０ ％以上の同一性を有する、
請求項９に記載の変異体。
【請求項１１】
ＦＡＰαへの結合について請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットと競合する、
請求項９に記載の変異体。
【請求項１２】
軽鎖ＣＤＲ領域および重鎖ＣＤＲ領域を含み、重鎖ＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖ＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１，ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、配列番号：１−３、７、および８のいずれか１配列と少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５ ％、より好ましくは、少なくとも９０ ％、より好ましくは、少なくとも９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の類似性を有する配列から独立して選択され、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、配列番号：４−６、９、および１０のいずれか１配列と少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５ ％、より好ましくは、少なくとも９０ ％、より好ましくは、少なくとも９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の類似性を有する配列から独立して選択される、抗原結合ユニット。
【請求項１３】
ＨＣＤＲ１は、配列番号：１または７に示される配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号：２または８に示される配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を有する、
請求項１２に記載の抗原結合ユニット。
【請求項１４】
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の配列は、
Ａ．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３と、
Ｂ．配列番号：７、配列番号：８、配列番号：３との群のいずれか１つから選択される、
請求項１３に記載の抗原結合ユニット。
【請求項１５】
ＬＣＤＲ１は、配列番号：４または９に示される配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号：５または１０に示される配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を有する、
請求項１２に記載の抗原結合ユニット。
【請求項１６】
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列は、
Ａ．配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６と、
Ｂ．配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：６との群のいずれか１つから選択される、
請求項１５に記載の抗原結合ユニット。
【請求項１７】
ＨＣＤＲ１は、配列番号：１または７に示される配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号：２または８に示される配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を有し、ＬＣＤＲ１は、配列番号：４または９に示される配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号：５または１０に示される配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を有する、
請求項１２に記載の抗原結合ユニット。
【請求項１８】
ＨＣＤＲ１は、配列番号：１に示される配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号：２に示される配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号：４に示される配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号：５に示される配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含む、または
ＨＣＤＲ１は、配列番号：７に示される配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号：８に示される配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号：４に示される配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号：５に示される配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含む、または
ＨＣＤＲ１は、配列番号：１に示される配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号：２に示される配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号：９に示される配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号：１０に示される配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含む、
請求項１７に記載の抗原結合ユニット。
【請求項１９】
配列番号：１１または１５に示される重鎖可変領域の配列と少なくとも８０ ％、好ましくは、少なくとも８５ ％、より好ましくは、少なくとも９０ ％、より好ましくは、少なくとも９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の類似性を有する配列と、配列番号：１３または１７に示される軽鎖可変領域と少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５ ％、より好ましくは、少なくとも９０ ％、より好ましくは、少なくとも９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の類似性を有する配列とを有する、抗原結合ユニット。
【請求項２０】
抗原結合ユニットが、モノクローナル抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットまたは抗原結合ユニットの変異体。
【請求項２１】
ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２またはシングルドメイン抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗原結合ユニット。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットをコードする核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現ベクターを含むか、ゲノム中に請求項２２に記載の核酸が組み込まれた、宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２１に記載のｓｃＦｖ配列を１つまたは複数の重鎖定常領域と融合することによって形成されるヒト免疫グロブリンＦｃ領域を有する抗体である二価タンパク質であって、
好ましくは、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域は、複合体に接続されており、好ましくは、複合体は、蛍光色素、サイトトキシン、放射性同位元素から選択される、二価タンパク質。
【請求項２６】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットと、それと接続された機能分子とを含む多機能性免疫複合体であって、
機能分子は、
（ａ）免疫細胞表面マーカーに結合する抗体またはリガンドを含む腫瘍表面マーカーを標的とする分子であり、好ましくは、免疫細胞表面マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２８を含み、より好ましくは、免疫細胞表面マーカーに結合する抗体は、抗ＣＤ３抗体であり、かつ最も好ましくは、免疫細胞表面マーカーを標的とする分子は、Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体である、腫瘍表面マーカーを標的とする分子と、
（ｂ）抗腫瘍サイトカインまたは抗腫瘍毒素を含む腫瘍抑制分子であり、好ましくは、サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｉ型インターフェロン、ＴＮＦ−ａｌｐｈａを含む、腫瘍抑制分子と、
（ｃ）免疫細胞表面マーカーを標的とする分子または検出可能なマーカーと、
から選択される、多機能性免疫複合体。
【請求項２７】
キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、請求項１−２１のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットを含み、抗原結合ユニットは好ましくは、一本鎖抗体またはシングルドメイン抗体であるを特徴とする、キメラ抗原受容体。
【請求項２８】
キメラ抗原受容体は、
請求項１−２１のいずれか一項に記載の抗原結合ユニット、ＣＤ８およびＣＤ３ζ、
請求項１−２１のいずれか一項に記載の抗原結合ユニット、ＣＤ８、ＣＤ１３７およびＣＤ３ζ、
請求項１−２１のいずれか一項に記載の抗原結合ユニット、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８分子の細胞内シグナル領域およびＣＤ３ζ、または
請求項１−２１のいずれか一項に記載の抗原結合ユニット、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８分子の細胞内シグナル領域、ＣＤ１３７およびＣＤ３ζ、
の順序で接続される、抗体、膜貫通領域、および細胞内シグナル領域を含む、
請求項２７に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２９】
請求項２７または２８に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列。
【請求項３０】
請求項２９に記載のヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項３１】
請求項３０に記載の発現ベクターを含む、ウイルス。
【請求項３２】
請求項２９に記載のヌクレオチド配列、または
請求項３０に記載の発現ベクター、または
請求項３１に記載のウイルス、が形質導入された、または
請求項２７または２８に記載のキメラ抗原受容体を発現する、遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項３３】
キメラ抗原受容体以外の他の配列をさらに発現する遺伝子修飾免疫細胞であって、他の配列が、サイトカイン、別のキメラ抗原受容体、ケモカイン受容体、ＰＤ−１発現を低下させるｓｉＲＮＡまたはＰＤ−Ｌ１をブロックするタンパク質、ＴＣＲ、または安全スイッチを含み、
好ましくは、サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはＩ型インターフェロンを含み、
好ましくは、ケモカイン受容体は、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、またはＣＸＣＲ４を含み、
好ましくは、安全スイッチは、ｉＣａｓｐａｓｅ−９、Ｔｒｕａｎｃａｔｅｄ  ＥＧＦＲまたはＲＱＲ８を含む、
請求項３２に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項３４】
ＦＡＰαの高発現に関連する疾患を治療、予防または診断するための医薬または試薬の調製における、請求項１−２１のいずれか一項に記載の抗原結合ユニット、または請求項２５に記載の二価タンパク質、または請求項２６に記載の免疫複合体、または請求項２７または２８に記載のキメラ抗原受容体、または請求項２９に記載のヌクレオチド配列、または請求項３０に記載の発現ベクター、または請求項３１に記載のウイルス、または請求項３２または３３に記載の免疫細胞の使用。
【請求項３５】
ＦＡＰαの高発現に関連する疾患は、腫瘍である、
請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
腫瘍は、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、皮膚黒色腫、腎臓癌、膀胱癌である、
請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットまたは抗原結合ユニットをコードする核酸、または
請求項２５に記載の二価タンパク質、または
請求項２６に記載の免疫複合体または複合体をコードする核酸、または
請求項２７または２８に記載のキメラ抗原受容体またはキメラ抗原受容体をコードする核酸、または
請求項３２または３３に記載の遺伝子修飾免疫細胞を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的に、本発明は、ＦＡＰαに特異的に結合する結合ユニット、そのような結合ユニットをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はさらに、前記抗原結合ユニットを生成する方法および本発明のＦＡＰα特異的に結合ユニットを使用して疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞活性化タンパク質α（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  α、ＦＡＰα）は、セリンプロテアーゼファミリーに属する腫瘍関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の表面に特異的に発現する抗原分子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１２７８７３６．１）であり、コラゲナーゼおよびジペプチジルペプチダーゼ活性を有し、腫瘍ホストインターフェースマトリックスの分解と再構築に重要な役割を果たし、腫瘍の増殖、浸潤、転移に関与し、ＦＡＰαは、９０ ％以上の悪性上皮腫瘍（乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、皮膚黒色腫、腎臓がん、膀胱がんなど）のマトリックス、胚組織、創傷治癒および生理学的に再建された臓器で選択的に発現するが、通常、正常な成人組織では発現されない。これらの特徴により、ＦＡＰαはさまざまな腫瘍のイメージング、診断および治療の抗原標的になった。
【０００３】
ヒトＦＡＰαは、最初では、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｆ１９（ＷＯ９３／０５８０４、ＡＴＣＣ番号ＨＢ８２６９に記載）を使用して培養した線維芽細胞で同定された。Ｆ１９抗体のヒト化に基づいて、シロリズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚ ｕｍａｂ）／ＢＩＢＨ１を開発し、シロリズマブを使用した第Ｉ相試験では、１３１Ｉ標識抗体の特異的な腫瘍蓄積が実証された（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９，  １６３９−１６４７（２００３））。しかし、転移性結腸直腸癌患者を対象とした非共役シロリムマブの初期の第ＩＩ相試験は、腫瘍の発生を阻害する抗体の効力がないため中止された（Ｈｏｆｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｋｏｌｏｇｉｅ  ２６，  ４４−４８（２００３））。
【０００４】
したがって、当技術分野では、癌を治療するためのＦａＰαを標的とし、改善された効力を有する抗体を含む、治療の強化された治療方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、抗体を含むがこれに限定されない、ＦＡＰαに特異的に結合する結合ユニットを見出すこと、およびＦＡＰαを標的とする免疫エフェクター細胞を開発することである。
【０００６】
第１の態様では、本発明は、抗原結合ユニットであって、
前記抗原結合ユニットは、軽鎖ＣＤＲ領域および重鎖ＣＤＲ領域を含み、前記重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖ＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、
ここで、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の配列は、配列番号：１−３、７および８からなる群から独立して選択され、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列は、配列番号：４−６、９および１０からなる群から独立して選択される、前記抗原結合ユニットを提供する。
【０００７】
具体的な実施形態では、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１または７に示される配列を有し、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２または８に示される配列を有し、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を有する。
【０００８】
具体的な実施形態では、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の配列は、
Ａ．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３と、
Ｂ．配列番号：７、配列番号：８、配列番号：３の群のいずれか１つから選択される。
【０００９】
具体的な実施形態では、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：４または９に示される配列を有し、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：５または１０に示される配列を有し、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を有する。
【００１０】
具体的な実施形態では、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列は、
Ａ．配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６と、
Ｂ．配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：６の群のいずれか１つから選択される。
【００１１】
具体的な実施形態では、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１または７に示される配列を有し、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２または８に示される配列を有し、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を有し、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：４または９に示される配列を有し、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：５または１０に示される配列を有し、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を有する。
【００１２】
具体的な実施形態では、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：４に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：５に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含み、または
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：７に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：８に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：４に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：５に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含み、または
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：９に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：１０に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含む。
具体的な実施形態では、前記抗原結合ユニットは、配列番号：１１または１５に示される重鎖可変領域、および配列番号：１３または１７に示される軽鎖可変領域を有する。
【００１３】
好ましい実施形態では、前記抗原結合ユニットは、抗体であり、好ましくは、モノクローナル抗体またはその活性断片である。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、第１の態様に記載の抗原結合ユニットの変異体であって、ＦＡＰαへの結合について第１の態様に記載の抗原結合ユニットと競合する、前記変異体を提供する。
【００１５】
具体的な実施形態では、前記変異体の軽鎖可変領域配列は、第一の態様に記載の抗原結合ユニットのそれと９０ ％、９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の同一性を有し、または、前記変異体の重鎖可変領域配列は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合ユニットのそれと９０ ％、９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の同一性を有し、
好ましくは、前記変異体の軽鎖ＣＤＲ領域の配列、例えば軽鎖ＣＤＲ１またはＣＤＲ２の配列は、第１の態様に記載の抗原結合ユニットのそれと７０ ％以上の同一性を有し、好ましくは、７５ ％以上の同一性を有し、より好ましくは、８０ ％以上の同一性を有し、または、前記変異体の重鎖ＣＤＲ領域の配列、例えば重鎖ＣＤＲ１またはＣＤＲ２の配列は、第１の態様に記載の抗原結合ユニットのそれと７０ ％以上の同一性を有し、好ましくは、７５ ％以上の同一性を有し、より好ましくは、８０ ％以上の同一性を有する。
【００１６】
具体的な実施形態では、ＦＡＰα上の同じ結合エピトープへの結合について前記変異体は第１の態様に記載の抗原結合ユニットと競合する。
【００１７】
第３の態様では、本発明は、抗原結合ユニットであって、前記抗原結合ユニットは、軽鎖ＣＤＲ領域および重鎖ＣＤＲ領域を含み、前記重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖ＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、配列番号：１−３、７、８のいずれか１配列と少なくとも８０ ％、好ましくは、少なくとも８５ ％、より好ましくは、少なくとも９０ ％、より好ましくは、少なくとも９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の類似性を有する配列から独立して選択され、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、配列番号：４−６、９、１０のいずれか１配列と少なくとも８０ ％、好ましくは、少なくとも８５ ％、より好ましくは、少なくとも９０ ％、より好ましくは、少なくとも９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の類似性を有する配列から独立して選択される、前記抗原結合ユニットを提供する。
【００１８】
具体的な実施形態では、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１または７に示される配列を有し、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２または８に示される配列を有し、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を有する。
【００１９】
具体的な実施形態では、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の配列は、
Ａ．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３と、
Ｂ．配列番号：７、配列番号：８、配列番号：３との群のいずれか１つから選択される。
【００２０】
具体的な実施形態では、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：４または９に示される配列を有し、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：５または１０に示される配列を有し、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を有する。
【００２１】
具体的な実施形態では、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の配列は、
Ａ．配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６と、
Ｂ．配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：６との群のいずれか１つから選択される。
【００２２】
具体的な実施形態では、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１または７に示される配列を有し、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２または８に示される配列を有し、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を有し、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：４または９に示される配列を有し、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：５または１０に示される配列を有し、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を有する。
【００２３】
具体的な実施形態では、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：４に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：５に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含み、または
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：７に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：８に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：４に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：５に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含み、または
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号：２に示される配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号：３に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号：９に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号：１０に示される配列を含み、前記ＬＣＤＲ３は、配列番号：６に示される配列を含む。
【００２４】
第４の態様では、本発明は、抗原結合ユニットであって、前記抗原結合ユニットは、配列番号：１１または１５に示される重鎖可変領域の配列と少なくとも８０ ％、好ましくは、少なくとも８５ ％、より好ましくは、少なくとも９０ ％、より好ましくは、少なくとも９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の類似性を有する配列と、配列番号：１３または１７に示される軽鎖可変領域と少なくとも８０ ％、好ましくは、少なくとも８５ ％、より好ましくは、少なくとも９０ ％、より好ましくは、少なくとも９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の類似性を有する配列とを有する、前記抗原結合ユニットを提供する。
【００２５】
第５の態様では、本発明は、第１の態様〜第４の態様に記載の抗原結合ユニットまたは抗原結合ユニットの変異体であって、前記抗原結合ユニットは、モノクローナル抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体である、前記抗原結合ユニットまたは抗原結合ユニットの変異体を提供する。
【００２６】
具体的な実施形態では、前記抗原結合ユニットは、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２またはシングルドメイン抗体である。
【００２７】
第６の態様では、本発明は、第１の態様〜第５の態様に記載の抗原結合ユニットをコードする核酸を提供する。
【００２８】
第７の態様では、本発明は、発現ベクターであって、第６の態様に記載の核酸を含む、前記発現ベクターを提供する。
【００２９】
第８の態様では、本発明は、宿主細胞であって、第７の態様に記載の発現ベクターを含むか、ゲノム中に第６の態様に記載の核酸が組み込まれた、前記宿主細胞を提供する。
【００３０】
第９の態様では、本発明は、二価タンパク質であって、第５の態様に記載のｓｃＦｖ配列を１つまたは複数の重鎖定常領域と融合することによって形成されるヒト免疫グロブリンＦｃ領域を有する抗体であり、好ましくは、前記ヒト免疫グロブリンＦｃ領域は、複合体に接続されており、好ましくは、前記複合体は、蛍光色素、サイトトキシン、放射性同位元素から選択される、前記二価タンパク質を提供する。
【００３１】
第１０の態様では、本発明は、多機能性免疫複合体を提供する。前記多機能性免疫複合体は、第１の態様〜第５の態様に記載の抗原結合ユニットと、およびそれと接続された機能分子とを含み、
前記機能分子は、
（ａ）免疫細胞表面マーカーに結合する抗体またはリガンドを含む腫瘍表面マーカーを標的とする分子であって、好ましくは、前記免疫細胞表面マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２８を含み、より好ましくは、前記免疫細胞表面マーカーに結合する抗体は、抗ＣＤ３抗体であり、最も好ましくは、前記免疫細胞表面マーカーを標的とする分子は、Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体である、腫瘍表面マーカーを標的とする分子と、
（ｂ）抗腫瘍サイトカインまたは抗腫瘍毒素を含む腫瘍抑制分子であって、好ましくは、前記サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｉ型インターフェロン、ＴＮＦ−ａｌｐｈａを含む、腫瘍抑制分子と、
（ｃ）免疫細胞表面マーカーを標的とする分子または検出可能なマーカーとから選択される。
【００３２】
第１１の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、第１の態様〜第５の態様に記載の抗原結合ユニットを含み、前記抗原結合ユニットは好ましくは、一本鎖抗体またはシングルドメイン抗体である、前記キメラ抗原受容体を提供する。
好ましい実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナルドメインをさらに含み、
前記膜貫通ドメインは、好ましくは、ＴＣＲのα、β、ｚｅｔａ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ１の膜貫通領域から選択され、より好ましくは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、ＣＤ１５４およびＣＤ２８の膜貫通ドメインから選択され、
および／または
前記細胞内シグナルドメインは、１つまたは複数の共刺激シグナルドメインおよび／またはプライマリシグナルドメインを含み、ここで、前記共刺激シグナルドメインは、好ましくは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７０、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７８、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＦｃεＲＩγ、ＭｙＤ８８、および４１ＢＢＬの細胞内シグナル領域から選択され、および／または前記プライマリシグナルドメインは、ＴＣＲξ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」とも称される）およびＣＤ６６ｄ、およびＣＤ３ζから選択され、より好ましくは、ＣＤ１３７，ＣＤ１３４，ＣＤ２８およびＯＸ４０から選択され、および／または前記プライマリシグナルドメインは、ＣＤ３ζから選択される。
【００３３】
好ましい実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８から選択され、前記共刺激シグナルドメインは、ＣＤ１３７またはＣＤ２８の細胞内シグナルドメインから選択され、前記プライマリシグナルドメインは、ＣＤ３ζから選択される。
【００３４】
具体的な実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、
第１の態様〜第５の態様に記載の抗原結合ユニット、ＣＤ８およびＣＤ３ζ、
第１の態様〜第５の態様に記載の抗原結合ユニット、ＣＤ８、ＣＤ１３７およびＣＤ３ζ、
第１の態様〜第５の態様に記載の抗原結合ユニット、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８分子の細胞内シグナル領域およびＣＤ３ζ、または
第１の態様〜第５の態様に記載の抗原結合ユニット、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８分子の細胞内シグナル領域、ＣＤ１３７およびＣＤ３ζ、の順序で接続される、抗体、膜貫通領域および細胞内シグナル領域を含む。
【００３５】
第１２の態様では、本発明は、第１１の態様に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００３６】
第１３の態様では、本発明は、第１２の態様に記載のヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを提供する。
【００３７】
第１４の態様では、本発明は、第１３の態様に記載の発現ベクターを含む、ウイルスを提供する。
【００３８】
第１５の態様では、遺伝子修飾免疫細胞であって、第１２の態様に記載のヌクレオチド配列、または第１３の態様に記載の発現ベクター、または第１４の態様に記載のウイルスが形質導入された、または第１１の態様に記載のキメラ抗原受容体を発現する、前記遺伝子修飾免疫細胞を提供する。
【００３９】
好ましい実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の細胞およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【００４０】
具体的な実施形態では、前記遺伝子修飾免疫細胞は、キメラ抗原受容体以外の他の配列をさらに発現する。他の配列は、サイトカイン、別のキメラ抗原受容体、ケモカイン受容体、ＰＤ−１発現を低下させるｓｉＲＮＡまたはＰＤ−Ｌ１をブロックするタンパク質、ＴＣＲ、または安全スイッチであり、
好ましくは、前記サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはＩ型インターフェロンを含み、
好ましくは、前記ケモカイン受容体は、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、またはＣＸＣＲ４を含み、
好ましくは、前記安全スイッチは、ｉＣａｓｐａｓｅ−９、Ｔｒｕａｎｃａｔｅｄ  ＥＧＦＲまたはＲＱＲ８を含む。
【００４１】
第１６の態様では、本発明は、第１の態様〜第５の態様に記載の抗原結合ユニット、または第９の態様に記載の二価タンパク質、または第１０の態様に記載の免疫複合体、または第１１の態様に記載のキメラ抗原受容体、または第１２の態様に記載のヌクレオチド配列、または第１３の態様に記載の発現ベクター、または第１４の態様に記載のウイルス、または第１５の態様に記載の免疫細胞の使用であって、ＦＡＰαの高発現に関連する疾患を治療、予防または診断するための医薬または試薬の調製における、前記使用を提供する。
【００４２】
具体的な実施形態では、前記ＦＡＰαの高発現に関連する疾患は、腫瘍である。
【００４３】
具体的な実施形態では、前記腫瘍は、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、皮膚黒色腫、腎臓癌、膀胱癌である。
【００４４】
第１７の態様では、本発明は、薬学的組成物であって、
前記薬学的組成物は、
第１の態様〜第５の態様に記載の抗原結合ユニットまたは前記抗原結合ユニットをコードする核酸、または
第９の態様に記載の二価タンパク質、または
第１０の態様に記載の免疫複合体または前記複合体をコードする核酸、または
第１１の態様に記載のキメラ抗原受容体または前記キメラ抗原受容体をコードする核酸、または
第１５の態様に記載の遺伝子修飾免疫細胞、を含む、前記薬学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【００４５】
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される技術的特徴を互いに組み合わせることができ、それにより新しいまたは好ましい技術的解決策を形成できる。スペースの制限のため、ここでは繰り返しない。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ニッケルカラムで精製した組換えヒトＦＡＰα＿Ｈｉｓ（ｈｕＦＡＰ）、マウスＦＡＰ＿Ｈｉｓ（ｍＦＡＰ）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図２】ＥＬＩＳＡアッセイによって測定したファージクローン発現上清液および組換えｈｕＦＡＰａ、ｍＦＡＰ結合を示す。
【図３】ＦＡＣによって検出した部分的に精製されたクローンとＵ−８７ＭＧおよびＡ５４９細胞の結合を示す。
【図４】Ｂｉａｃｏｒｅによって測定したｈｕＦＡＰとｍＦＡＰの結合に対する１Ａ７、８Ｅ３（ｓｃＦｖ）の親和性を示す。
【図５】抗体１Ａ７、８Ｅ３および親抗体１０Ａ４の配列アラインメント（ｓｃＦｖ）を示す。
【図６】ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって精製した抗体１Ａ７、８Ｅ３（ｓｃＦｖ＿Ｆｃ）の分析である。
【図７】３Ｔ３−ｍＦＡＰおよびＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰα安定細胞株のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ検出の結果である。
【図８】３Ｔ３−ｍＦＡＰ（ａ）、およびＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰα（ｂ）安定細胞株のＦＡＣｓ検出の結果である。
【図９】ＦＡＣｓによって測定した抗体１０Ａ４、１Ａ７、８Ｅ３（ｓｃＦｖ＿Ｆｃ）とＵ−８７ＭＧ、３Ｔ３−ｍＦＡＰ、ＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰα細胞の結合を示す。
【図１０】３Ｔ３−ｍＦＡＰ（ａ）、およびＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰ（ｂ）安定細胞株におけるｍＦＡＰαおよびｈｕＦＡＰαの発現を検出するための抗フラグ抗体ＦＡＣｓの検出である。
【図１１】Ｔ細胞におけるｈｕ８Ｅ３−２８Ｚ  ＣＡＲ発現のＦＡＣｓ検出である。
【図１２】３Ｔ３−ｍＦＡＰ（ａ）およびＨ１０８０−ｈｕＦＡＰα（ｂ）細胞に対するｈｕ８Ｅ３−２８Ｚ  ＣＡＲを発現するＴ細胞の細胞毒性検出である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
広範囲にわたる詳細な研究の結果、発明者はＦＡＰに特異的に結合する抗体を予期せず発見し、これに基づいて、ＦＡＰを特異的に標的とする免疫エフェクター細胞を開発した。本発明の抗体は、ＦＡＰを発現する腫瘍細胞に効果的に結合でき、本発明の免疫エフェクター細胞は、ＦＡＰを発現する腫瘍細胞に対して有意な殺傷能力を示し、したがって、多発性骨髄腫などの悪性腫瘍の治療に効果的かつ安全に適用できる。これに基づいて、本発明を完成した。
【００４８】
以下の詳細な説明は、本明細書に開示される実施形態を詳細に示す。本明細書は、ここに開示される具体的な実施形態に限定されることを意図するものではなく、変更され得ることを理解されたい。当業者は、本明細書に開示された内容が多くの変更または変形を有する可能性があり、すべてが開示された範囲および原理によってカバーされることを理解するであろう。特に明記しない限り、各実施形態は任意の他の実施形態と任意に組み合わせることができる。
【００４９】
本明細書に開示される特定の実施形態は数値範囲を含み、本発明の特定の態様は範囲に関して説明することができる。特に明記しない限り、数値範囲または範囲の説明は、簡潔さおよび便宜のためだけであり、本発明の範囲に対する厳密な制限と見なされるべきではないことを理解されたい。したがって、これらのサブ範囲と数値ポイントが本明細書で明示的に記述されているように、範囲方法の説明は、可能な範囲すべてと範囲内のすべての可能な具体的な数値ポイントを具体的に開示していると見なされる。
【００５０】
量、一時的な期間などの測定可能な値を指す場合、用語「約」は、指定された値の±２０ ％、場合によっては±１０ ％、場合によっては±５ ％、または場合によっては±１ ％、場合によっては±０.１ ％を含む変化を指す。
【００５１】
用語の定義
本明細書で使用される用語は、当業者によって従来理解されているものと同様の意味を有する。明確にするために、これらの用語の一部を以下に定義する。
【００５２】
本明細書で使用される用語「ＦＡＰα」は、線維芽細胞活性化タンパク質αを指す。ヒト線維芽細胞活性化タンパク質αは、７６０個のアミノ酸残基から構成される膜貫通タンパク質である（ＮＣＢＩ参照配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）：ＮＰ＿００１２７８７３６．１）。特に明記しない限り、本明細書でのＦＡＰαはヒト線維芽細胞活性化タンパク質αを指す。マウス線維芽細胞活性化タンパク質は、７６１個のアミノ酸残基で構成された（７６０個のアミノ酸残基で構成される膜貫通タンパク質、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０３２０１２．１）。
【００５３】
本明細書で使用される用語「結合ユニット」、「抗原結合ユニット」または「抗原結合タンパク質」は同じ意味を有し、本明細書で互換的に使用されることができ、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の任意の形態の免疫学的活性部分を指し、すなわち、抗原に特異的に結合するか、または抗原と免疫反応性である抗原結合部位を含む分子を指す。構造的に、最も単純な天然抗体（例えば、ＩｇＧ）は、４本のポリペプチド鎖を有し、２本の重（Ｈ）鎖、２本の軽（Ｌ）鎖がジスルフィド結合によって互いに接続される。免疫グロブリンは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなどのいくつかの分子タイプを含む分子の大きなファミリーを表す。抗原結合ユニットは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＦｖ、ｄＡｂ、２鎖抗体、３鎖抗体、４鎖抗体、ドメインＡｂ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、二重特異性抗体、および多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書で使用される用語「競合的結合」は、２つまたは複数の物質が結合標的の同じ位置、例えば、ある抗原の同じ結合エピトープに結合することを意味し、言い換えれば、同じ結合標的の異なる位置に結合する異なる物質は存在しない本明細書に記載の「競合的結合」の関係である。
【００５５】
本明細書で使用される用語「抗原結合ユニット」は、無脊椎動物および脊椎動物を含む様々な種の免疫グロブリン分子も含む。抗原結合ユニットに適用される用語「ヒト」は、ヒト遺伝子またはその断片によって発現される免疫グロブリン分子を指す。非ヒト（例えば、げっ歯類または霊長類）抗体に適用される用語「ヒト化」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片である。ほとんどの場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基は、必要な特異性、親和性、および容量を持つ非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、または霊長類）に由来するＣＤＲ（ドナー抗体）残基で置換される。場合によっては、非ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応するヒトの残基で置換される。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含む可能性がある。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練および最適化し、人体に導入したときに免疫原性を最小限にするために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここですべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域は  非ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。
【００５６】
本明細書で使用される用語「抗体」は、当技術分野で知られている用語と同様に、免疫系の抗原結合タンパク質を指す。本明細書で言及される用語「抗体」は、抗原結合領域を有する完全長抗体およびその「抗原結合部分」または「抗原結合領域」によって保持されるその任意の断片、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などのその一本鎖を含む。自然抗体とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖、またはその抗原結合断片を含む糖タンパク質を指す。用語「抗体」はまた、原核細胞で発現される抗体、非グリコシル化抗体、および抗原に結合する抗体断片と以下に記載される誘導体などの抗体（特に本明細書に記載の抗体）のすべての組換え型を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および重鎖定常領域で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）および軽鎖定常領域で構成される。ＶＨとＶＬはさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分されることができる。各ＶＨとＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ基端からカルボキシル基端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の最初の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介することができる。
【００５７】
本明細書で使用される用語「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを含む。Ｆａｂは、単離されたこの領域、または完全長の抗体または抗体断片の状況にあるこの領域を指すことができる。
【００５８】
本明細書における用語「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、第１の定常領域の免疫グロブリンドメイン以外の抗体定常領域を含むポリペプチドを含む。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインと、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、およびこれらのドメインのＮ末端の柔軟なヒンジを指す。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃはＪチェーンを含むことができる。ＩｇＧの場合、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２とＣγ３、およびＣγ１とＣγ２間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変更できるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は一般に、そのカルボキシル基端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。ヒトＩｇＧ１の場合、Ｆｃは、残基Ｐ２３２からカルボキシル基端までを含むものとして本明細書で定義され、番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。Ｆｃは、単離されたこの領域、または抗体などのＦｃポリペプチドの環境に位置するこの領域を指すことができる。
【００５９】
本明細書で使用される用語「親抗体」または「親免疫グロブリン」は、修飾されていない抗体を含み、前記抗体は次いで修飾されて変異体を生成する。親抗体は、天然に存在する抗体、または天然に存在する抗体の変異体または操作されたバージョンであることができる。親抗体は、抗体自体、親抗体を含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指すことができる。本明細書で使用される用語「親抗体」または「親免疫グロブリン」は、その後修飾されてヒト化抗体を産生するマウスまたはキメラ抗体を含む。
【００６０】
本明細書で使用される用語「変異体抗体」または「抗体変異体」または「変異体」は、親と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親抗体配列とは異なる抗体配列を含む。抗体変異体は、抗体自体または親抗体を含む組成物を指すことができる。具体的な実施形態では、本明細書に記載の変異体抗体の軽鎖可変領域配列は、親抗体の軽鎖可変領域の配列と９０ ％、９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の同一性を有し、本明細書に記載の変異体抗体の重鎖可変領域配列は、親抗体の重鎖可変領域と９０ ％、９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％または９９ ％の同一性を有する。好ましい実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１またはＣＤＲ２配列などの本明細書に記載の変異体抗体の軽鎖ＣＤＲ領域は、軽鎖ＣＤＲ１またはＣＤＲ２配列などの親抗体の軽鎖ＣＤＲ領域と７０ ％以上同一性を有し、好ましくは、７５ ％以上の同一性を有し、より好ましくは、８０ ％以上の同一性を有し、重鎖ＣＤＲ１またはＣＤＲ２の配列などの本明細書に記載の変異体抗体の重鎖ＣＤＲ領域は、重鎖ＣＤＲ１またはＣＤＲ２配列などの親抗体の重鎖ＣＤＲ領域と６０ ％以上同一性を有し、好ましくは、７０ ％以上の同一性を有し、より好ましくは、８０ ％以上の同一性を有する。
【００６１】
用語「アミノ酸修飾」は、アミノ酸の置換、付加、および／または欠失を含み、「アミノ酸置換」は、親ポリペプチド配列の特定の位置にあるアミノ酸を別のアミノ酸で置換されることを意味する。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、９４位のアルギニンがリジンで置換されることを意味し、本明細書で使用される「アミノ酸挿入」は、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸を付加することを意味する。本明細書で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。
【００６２】
本明細書で使用される用語「保存的修飾」または「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意な影響または変化をもたらさないアミノ酸修飾を意味する。このような保存的修飾は、アミノ酸の置換、挿入、および欠失を含む。当技術分野で公知の標準的技術によって修飾を、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換である。当技術分野では、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーをすでに定義している。これらのファミリーは、塩基性側鎖を含むアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域またはフレームワーク領域の１つまたは複数のアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換することができ、修飾された抗体（変異体抗体）の保持された機能を試験することができる。
【００６３】
抗体断片は、（ｉ）Ｆａｂ’およびＦａｂ’−ＳＨを含むＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１構造ドメインで構成されるＦａｂ断片と、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１構造ドメインで構成されるＦｄ断片と、（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬおよびＶＨ構造メインで構成されるＦｖ断片と、（ｉｖ）単一の可変領域で構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）と、（ｖ）Ｆ（ａｂ’２断片、２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価フラグメントと、および（ｖｉ）一本鎖Ｆｖ分子抗原結合部位（Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ８５：５８７９−５８８３）と、（ｖｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）と、（ｖｉｉｉ）「二量体」または「トリソミー」、遺伝子融合によって構築された多価または多重特異的断片（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３２６：４６１−４７９；  ＷＯ９４／１３８０４；  Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９０：６４４４−６４４８）と、および（ｉｘ）同じか異なる抗体遺伝子融合ｓｃＦｖ（Ｃｏｌｏｍａ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５、１５９−１６３）とを含むが、これらに限定されない。
定常領域の遺伝子決定に従って、抗体を分類し、アイソタイプとも呼ばれる。ヒト定常軽鎖は、К（ＣК）とλ（Ｃλ）の軽鎖に分けられる。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεに分けられ、それぞれ抗体アイソタイプＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを定義する。ＩｇＧクラスは、治療目的で最も一般的に使用される。人間では、このカテゴリはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。マウスでは、このカテゴリはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３を含む。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むが、これらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むが、これらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。したがって、本明細書で使用される「アイソタイプ」は、定常領域の化学的および抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンの任意のクラスまたはサブクラスを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤおよびＩｇＥである。
【００６４】
抗ＦＡＰαの抗体
本開示では、抗体を含む、ｓｃＦｖベースの抗原結合領域を有する抗原結合タンパク質を説明する。ここで、組換えＦＡＰαを使用して、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーからｓｃＦｖを選択した。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ｓｃＦｖ配列を有する抗体を含み、前記ｓｃＦｖ配列は、１つまたは複数の重鎖定常領域に融合されてヒト免疫グロブリンＦｃ領域を有する抗体を形成して二価タンパク質を産生し、それにより抗体の全体的な親和性と安定性を増加させる。さらに、Ｆｃ部分により、他の分子（蛍光染料、サイトトキシン、放射性同位元素などを含むが、これらに限定されない）を、親和性測定、治療薬の標的送達、免疫エフェクター細胞を使用したＦｃを介した細胞毒性、他のアプリケーションなど、多くの抗体を固定化するために、抗原定量化研究で使用される抗体に他の分子を直接結合させることができる。
本明細書で提供される結果は、ＦＡＰαを標的とする場合の本発明の抗体の特異性、感度、および有用性を強調している。
【００６６】
本発明の分子は、ファージディスプレイを用いた一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の同定および選択に基づいており、前記一本鎖可変断片のアミノ酸配列は、分子特異性をＦａＰαに与え、本発明のすべての抗原結合タンパク質の基礎を形成する。したがって、前記ｓｃＦｖを使用して、例えば、完全長抗体、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２などのその断片、融合タンパク質（ｓｃＦｖ＿Ｆｃを含む）、多価抗体、つまり、同じ抗原または異なる抗原の複数の特異的抗体、例えば、二重特異性Ｔ細胞結合抗体（ＢｉＴＥ）、トリアボディなどターゲティングを含む、一連の異なる「抗体」分子を設計できる（Ｃｕｅｓｔａら、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｗｈｅｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｓｕｒｐａｓｓｅｓ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：３５５−３６２、２０１０を参照）。
【００６７】
抗原結合タンパク質が完全長抗体である一実施形態では、本発明の抗体の重鎖および軽鎖は完全長であり得る（例えば、抗体は少なくとも１つ、好ましくは２つの完全重鎖、および少なくとも１つおよび好ましくは２つの完全な軽鎖を含むことができる）または抗原結合部分（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖ）を含むことができる。他の実施形態では、抗体重鎖定常領域は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択される。抗体タイプの選択は、設計された抗体の免疫エフェクター機能に依存する。組換え免疫グロブリンの構築において、様々な免疫グロブリンアイソタイプの定常領域に適したアミノ酸配列および多種多様な抗体を作製する方法は当業者に知られている。
【００６８】
別の態様では、本発明は、配列番号：１１、１５から選択される重鎖可変領域配列を含む、ＦａＰαに結合する抗原結合ユニットを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号：１３、１７から選択される軽鎖可変領域配列を含む、ＦａＰαに結合する抗原結合ユニットを提供する。
これらの重鎖および軽鎖可変領域配列のそれぞれがＦＡＰαに結合できることを考慮して、重鎖および軽鎖可変領域配列を「混合および適合」して、本発明の抗ＦＡＰα結合分子を生成することができる。
【００６９】
別の態様では、本発明は、ＦａＰαに結合する抗体またはその断片の変異体を提供する。したがって、本発明は、本発明の抗体の重鎖または軽鎖の可変領域配列と少なくとも８０ ％同一である重鎖および／または軽鎖可変領域を有する抗体またはその断片を提供する。好ましくは、重鎖および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列同一性は、少なくとも８５ ％、より好ましくは少なくとも９０ ％、最も好ましくは少なくとも９５ ％、特に９６ ％、より特に９７ ％、さらにより特に９８ ％、最も特に９９ ％であり、例えば、８０ ％、８１ ％、８２ ％、８３ ％、８４ ％、８５ ％、８６ ％、８７ ％、８８ ％、８９ ％、９０ ％、９１ ％、９２ ％、９３ ％、９４ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％、９９ ％および１００ ％を含む。
【００７０】
抗ＦＡＰα抗体の特性
抗ＦＡＰ抗体などの抗体の結合能力を評価する標準的なアッセイは当技術分野で知られており、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、ウエスタンブロット、およびフローサイトメトリー分析を含む。適切なアッセイは、実施例に詳細に記載されている。
【００７１】
核酸、ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、ＦＡＰαに結合し、コードする抗体およびその断片を分離する核酸、ベクターおよび前記核酸またはベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物、または部分的に精製された、または実質的に精製された形態で存在することができる。
【００７２】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができ、例えば、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術を用いて、抗体をコードする軽鎖および重鎖、またはＶＨおよびＶＬセグメントをコードするｃＤＮＡを得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体の場合（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）、抗体をコードする１つまたは複数の核酸をライブラリーから回収することができる。外因性核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野で一般に知られており、使用する宿主細胞によって異なり得る。
タンパク質を発現させるために、本発明の抗体をコードする核酸を発現ベクターに組み込むことができる。タンパク質発現には様々な発現ベクターを使用できる。発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれたベクターを含み得る。本発明で使用される発現ベクターは、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母、およびインビトロ系でのタンパク質発現を可能にするものを含むが、これらに限定されない。当技術分野で知られているように、様々な発現ベクターは市販されるか、他の方法で入手可能である。本発明では、抗体を発現させるために使用することができる。
【００７３】
本発明の利点：
１．本発明は、ＦＡＰαに特異的に結合する抗体を提供し、
２．本発明は、ＦＡＰαを特異的に標的とする免疫エフェクター細胞を提供し、および
３．本発明の抗体は、ＦＡＰαを発現する腫瘍細胞に効果的に結合することができ、本発明の免疫エフェクター細胞は、ＦＡＰαを発現する腫瘍細胞に対して有意な殺傷能力を示す。
【００７４】
本発明は、具体的な実施形態に結び付けて以下でさらに説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためだけに使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例で具体的な条件のない実験方法は、通常、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年に記載されている条件に基づいているか、製造元による推奨条件に従う。
【００７５】
実施例１．ＦＡＰα組換えタンパク質の調製
ヒトＦＡＰαの細胞外セグメントのＬｅｕ２６−Ａｓｐ７６０遺伝子をインビトロで合成し、Ｈｉｓタグを前記遺伝子のＣ端に挿入し、「ＧＳ」を中央に接続して融合発現タンパク質ヒトＦＡＰα＿Ｈｉｓ（配列番号：１９）を形成し、対応する遺伝子配列は配列番号：２０で示されたとおりである。
【００７６】
マウスＦＡＰ細胞外セグメント遺伝子（Ｌｅｕ２６−Ａｓｐ７６１）をインビトロで合成し、ＨｉｓタグをＣ端に挿入し、「ＧＳ」を中央に接続して融合発現タンパク質マウスＦＡＰα＿Ｈｉｓ（配列番号：２１）を形成し、対応する遺伝子配列は配列番号：２２で示されたとおりである。
【００７７】
２９３Ｆ細胞を用いて、ヒトＦＡＰα＿ＨｉｓとマウスＦＡＰα＿Ｈｉｓをそれぞれ一過性にトランスフェクションし、トランスフェクションの方法については、２９３Ｆ細胞の取扱説明書を参照する。トランスフェクション後、ニッケルカラムでアフィニティ精製した。
精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動し、結果を図１に示し、Ｅ２は、より高純度の標的タンパク質を取得した。
【００７８】
０.２２ ｕｍメンブレンでろ過した後、流速１０ＫＤのミリポア（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）限外ろ過チューブを使用して濃縮し、１ｍｌ未満の容量に濃縮し、ＰＤ−Ｍｉｄｉ脱塩カラムを使用して脱塩して、ヒトおよびマウスＦＡＰα組換えタンパク質を収集した。
【００７９】
実施例２．完全にヒトのファージディスプレイライブラリーを使用した、ＦＡＰに特異的ｓｃＦｖのスクリーニング
本発明で使用されるファージディスプレイライブラリーは、出願人により構築された完全ヒト天然ｓｃＦｖファージライブラリーであり、保存容量は１Ｅ ＋ １１である。当業者に既知のスクリーニング方法を使用して、１０ ｕｇ／ｍｌの抗原ヒトＦＡＰαを免疫チューブでコーティングし、ファージライブラリーをヒトＦＡＰαコーティング免疫チューブに添加して１.５時間結合し、ＦＡＰαへの特異的結合するＳｃＦｖファージクローンをスクリーニングおよび濃縮する。
【００８０】
ＦＡＰαの標準的なＥＬＩＳＡ法によって陽性クローンを同定し、合計１３４４個のクローンをスクリーニングし、その中で、ＥＬＩＳＡ結合シグナルが最も高い９６個のクローンを選択し（図２）、シーケンシング後、１６個の単一配列を得、この１６個のクローンを発現および精製し、Ｂｉａｃｏｒｅによって親和性を測定した。結果は表１に示し他とおりである。
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【００８１】
内因的にＦＡＰαを発現するＵ−８７ＭＧ細胞（中国科学院から購入）との結合をＦＡＣｓで検出し、ＦＡＰαを発現しないＡ５４９細胞（中国科学院から購入）を陰性対照細胞として使用した。Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅＴＭ  ＨＴシステム機器を使用し、結果は図３に示したとおりであり、抗体１０Ａ４はＵ−８７ＭＧ細胞に特異的に結合する。
シーケンシング分析後、１０Ａ４の重鎖可変領域は、配列番号：１１に示される配列であり、重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号：１、２、および３に示されたとおりである。１０Ａ４の軽鎖可変領域は、配列番号：１３に示される配列であり、軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の配列は、それぞれ、配列番号：４、５、および６に示されたとおりである。
【００８２】
実施例４．抗体１０Ａ４の親和性成熟ライブラリーの構築および親和性成熟ライブラリーのスクリーニング
抗体１０Ａ４に基づく親和性成熟ライブラリの構築は、軽鎖および重鎖のＣＤＲ３領域を保持し、２つの縮重プライマーを使用して、軽鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ２または重鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ２をそれぞれランダム化して、２つの親和性成熟ライブラリを構築した。具体的な構築方法を以下に簡単に説明する。
【００８３】
まず、抗体１０Ａ４のｓｃＦｖ（アミノ酸配列配列番号：２３、ヌクレオチド配列アミノ酸配列２４）に基づいてテンプレートプラスミドを構築した。軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２にランダム化されたファージライブラリの場合、プライマーＬＭＦ（配列番号：４１）およびＦ１０Ｌ１Ｒ（配列番号：４５）を使用して、断片１をＰＣＲ増幅し、プライマーＦ１０Ｌ２Ｆ（配列番号：４６）およびＦｄＲ（配列番号：４４）を使用して断片２をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲをブリッジして断片１と断片２を接続することでランダム化された配列を含む完全長ｓｃＦｖを取得し、次に全長断片をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで酵素分解し、Ｔ４リガーゼにより同じく酵素分解されたテンプレートプラスミドに連結した。そして、１.５Ｅ ＋ ９の保存容量であるＴＧ１コンピテントセルに変換した。重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２のランダム化されたファージライブラリの場合、プライマーＬＭＦ（配列番号：４１）およびＦ１０Ｈ１Ｒ（配列番号：４２）を使用して、断片３をＰＣＲ増幅し、プライマーＦ１０Ｈ２Ｆ（配列番号：４３）およびＦｄＲ（配列番号：４４）を使用して、断片４をＰＣＲ増幅し、次に、フラグメント化されたシーケンスを含む完全長のｓｃＦｖを取得するために、ＰＣＲをブリッジして断片３と断片４を接続することでランダム化された配列を含む完全長ｓｃＦｖを取得し、次に全長断片をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで酵素分解し、Ｔ４リガーゼにより同じく酵素分解されたテンプレートプラスミドに連結した。そして、６.６Ｅ ＋ ８の保存容量であるＴＧ１コンピテントセルに変換した。
【００８４】
親和性成熟ライブラリーのスクリーニングは、基本的に実施例２の説明と一致している。５ ｕｇ／ｍｌまたは１ ｕｇ／ｍｌ抗原のヒトＦＡＰαを免疫チューブにコーティングし、ファージライブラリをヒトＦＡＰαコーティングされた免疫チューブに追加して１.５時間結合し、スクリーニングと濃縮後、ヒトＦＡＰαに特異的に結合するｓｃＦｖファージクローンを得た。
【００８５】
標準的なＥＬＩＳＡ法で陽性クローンを決定し、発現と精製のためにＥＬＩＳＡシグナルの高いクローンを選択し、Ｂｉａｃｏｒｅ（図４を参照）測定後、親抗体１０Ａ４よりもパフォーマンスの高い２つのクローン（１Ａ７、８Ｅ３）を得、親抗体１０Ａ４のヒトＦＡＰαに対する親和性は１９７ ｎＭであり、図４に示したように、抗体１Ａ７のヒトＦＡＰαに対する親和性は１３.５ ｎＭであり、１０Ａ４の親和性より１４倍向上され、抗体８Ｅ３のヒトＦＡＰαに対する親和性は８１.６ ｎＭであり、１０Ａ４の親和性より２.４倍向上された。２つの抗体はすべてマウスＦＡＰに結合し、親和性はそれぞれ１１２ ｎＭおよび２６７ ｎＭである。
【００８６】
１Ａ７と８Ｅ３をシーケンスし、シーケンス結果は、親抗体１０Ａ４と比較して、抗体１Ａ７に合計７つの点変異があり、そのうち２つが重鎖のＣＤＲ１にあり、第３の位置がＳｅｒからＰｒｏに変化し、第３３の位置がＡｌａがＴｈｒに変化し、５つが重鎖のＣＤＲ２にあり、第５２の位置がＩｌｅからＶａｌに変化し、第５４の位置がＩｌｅからＡｓｎに変化し、第５５の位置がＰｈｅからＶａｌに変化し、第５７の位置がＴｈｒからＶａｌに変化し、第５９の位置がＡｓｎからＴｈｒに変化した。抗体８Ｅ３には合計６つの点変異があり、そのうち４つが軽鎖のＣＤＲ１にあり、第３２の位置がＳｅｒからＰｒｏに変化し、第３５の位置がＴｙｒからＰｈｅに変化し、第３７の位置がＴｙｒからＨｉｓに変化し、第３９の位置がＡｓｐからＴｙｒに変化し、２つが軽鎖のＣＤＲ２にあり、第５５の位置がＬｅｕからＶａｌに変化し、第５７の位置がＳｅｒからＧｌｙに変化した。
【００８７】
配列アラインメントの結果は図５に示したとおりであり、抗体の同一性を比較すると、１Ａ７および１０Ａ４と比較して、重鎖のＣＤＲ１の配列は６０ ％の類似性を有し、重鎖のＣＤＲ２の配列は７０.５ ％の類似性を有し、重鎖のＣＤＲ３は１００ ％の類似性を有し、重鎖可変領域は９３.９ ％の類似性（合計１１６アミノ酸、７種類）を有することが分かった。８Ｅ３および１０Ａ４と比較して、軽鎖ＣＤＲ１の配列は７５ ％の類似性（合計１６アミノ酸、４つが異なる）を有し、軽鎖ＣＤＲ２は７１.４ ％の類似性（合計７アミノ酸、２つが異なる）を有し、軽鎖のＣＤＲ３は１００ ％の類似性を有し、軽鎖可変領域は９４.６ ％の類似性を有する（合計１１３アミノ酸、６つが異なる）。
【００８８】
実施例５．ｓｃＦｖ＿Ｆｃ融合抗体の構築および真核細胞におけるその一過性発現精製
１０Ａ４、１Ａ７、および８Ｅ３のＶＨおよびＶＬ片断のプライマーをそれぞれ設計し、１５の柔軟なアミノ酸（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）からなるリンカーを導入してｓｃＦｖ（１０Ａ４、配列番号：２３、１Ａ７、配列番号：２５、８Ｅ３、配列番号：２７）を形成し、ＶＨの上流にＮｈｅ  Ｉ酵素分解部位と保護塩基を導入し、ＶＬの下流にＢａｍＨＩ酵素分解部位と保護塩基を導入した。ＰＣＲ産物を１ ％アガロースゲル電気泳動で分析し、精製、回収した。酵素分解後、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＦｃセグメントＡｓｐ１０４−Ｌｙｓ３３０を含むＶ１５２（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｒｕｉｊｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）真核生物発現ベクター連結した。２９３ｆｅｃｔｉｎTMトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７−０１９）またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４０８７２７）で対数増殖期の２９３Ｆ細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの５〜７日後、培養上清を回収し、プロテインＡによってアフィニティ精製した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析で産物を精製し、図６に示したように、還元条件下で、バンドサイズは予想どおり５０ｋＤであった。
【００８９】
実施例６．ＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰα、３Ｔ３−ｍＦＡＰ安定トランスフェクト細胞株の構築
１．レンチウイルスパッケージングプラスミドｐＷＰＴ−ｈｕＦＡＰα＿Ｆｌａｇ、ｐＷＰＴ−ｍＦＡＰ＿Ｆｌａｇの構築
ｈｕＦＡＰａの完全長配列をインビトロで合成し、Ｃ端にＦｌａｇタグ（配列番号：２９）を挿入し、ＭｌｕＩ／ＳａｌＩ二重酵素分解で、同じ二重酵素分解レンチウイルスパッケージングプラスミドｐＷＰＴに挿入した。ｍＦＡＰａの完全長配列をインビトロで合成し、Ｃ端にＦｌａｇタグ（配列番号：３０）を挿入し、ＭｌｕＩ／ＳａｌＩ二重酵素分解で、同じ二重酵素分解レンチウイルスパッケージングプラスミドｐＷＰＴに挿入した。
【００９０】
２．ｍＦＡＰウイルス液およびｈｕＦＡＰαウイルス液の調製
６×１０６個の細胞をペトリ皿に接種し、細胞のコンフルエンスが７０ ％〜８０ ％である時にトランスフェクションし、トランスフェクションの１時間前に２９３Ｔ培地を完全培地に交換した。ＥＰチューブに８００ｕｌのＤＭＥＭを添加し、５ ｕｇのｐＷＰＴ−ｍＦＡＰ−Ｆｌａｇプラスミド、７.５ ｕｇのｐｓＰＡＸ．２プラスミド、２.５ ｕｇのｐＭＤ２．Ｇプラスミドおよびボルテックスを添加して８秒間混合してから、別のＥＰチューブに８００ｕｌのＤＭＥＭを添加し、４５ ｕＬの１ ｕｇ／ｕｌ  ＰＥＩを室温で５分間放置した。プラスミド混合物をＰＥＩインキュベーション溶液に滴下し、混合し、室温で２０分間放置した。次に、調製したプラスミド／ＰＥＩ混合液を細胞に滴下した。トランスフェクションの６時間後、培地を新しい完全培地に交換した。トランスフェクションの７２時間後、細胞培養上清を回収し、４ ℃で、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を０.４５ ｕｍフィルターで濾過してｍＦＡＰウイルス溶液を得た。
ｈｕＦＡＰウイルス液の調製方法は、ｍＦＡＰウイルス液と同じである。
【００９１】
３．ウイルス感染細胞
初日、６ｃｍのペトリ皿に１ × １０５  ３Ｔ３細胞を接種した。翌日、上清を捨て、１ ｍｌの新鮮な完全培地を加え、続いて４ ｍｌのｍＦＡＰウイルス液と最終濃度６ ｕｇ／ｍｌとポリブレンを加えて、３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ混合クローン細胞を得た。
ｈｕＦＡＰαウイルスを使用してＨＴ１０８０細胞を感染させ、ｍＦＡＰウイルス液で３Ｔ３細胞を感染させる方法と同じである。
【００９２】
４．３Ｔ３−ｍＦＡＰ、ＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰα混合クローンのウエスタンブロット同定
３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ混合クローン細胞またはＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰα混合クローン細胞をタンパク質溶解物で溶解し、遠心分離後、上清をＢＣＡ濃度測定用に採取し、３Ｔ３を陰性対照として使用した。一次抗体：抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ（Ｍ２）、１：４００希釈用。結果は図７に示したとおりである。
【００９３】
５．フロー検出
ＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰαと３Ｔ３−ｍＦＡＰの混合クローン細胞をそれぞれ消化してカウントし、限界希釈法によってモノクローナルプレーティングを行って、ＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰαと３Ｔ３−ｍＦＡＰの安定したトランスフェクト細胞株を得た。４×１０５セルを使用してフロー検出し、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅＴＭ  ＨＴシステム機器を使用して検出した。結果は図８に示したように、２つの安定した細胞株でＦＡＰ発現を検出した。
【００９４】
Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ抗体フローサイトメトリーを使用して３Ｔ３−ｍＦＡＰ、ＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰα細胞株を検出し、１×１０６細胞を取ってフローサイトメトリー検出し、結果は図１０に示したように、ＦＡＰに携帯されたＦｌａｇタグを検出することにより、２つの安定した細胞株でＦＡＰ発現を検出した。
【００９５】
実施例７．ＦＡＣｓで抗体１０Ａ４、１Ａ７、８Ｅ３のｓｃＦｖ＿ＦｃとＵ−８７ＭＧ、３Ｔ３−ｍＦＡＰ、ＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰα細胞の結合を測定
３Ｔ３細胞およびＨＴ１０８０細胞を陰性対照細胞として使用した。具体的な手順は次のとおりである。細胞を回収し、細胞を増殖培地で１回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、細胞濃度を４Ｅ ＋ ５ 細胞／ｍｌに調整した。２００ ｎＭ抗体を細胞と共に氷上で３０分間インキュベートした。その後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体とインキュベートした。２回洗浄した後、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅＴＭ  ＨＴシステム機器を使用して検出した。
【００９６】
結果は図９に示したように、抗体１０Ａ４は、ｈｕＦＡＰαを安定してトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞株、ｍＦＡＰを安定してトランスフェクトされた３Ｔ３細胞株、内因的にｈｕＦＡＰαを発現するＵ−８７ＭＧ細胞に結合するが、ｈｕＦＡＰαを発現しないＨＴ１０８０細胞には結合せず、３Ｔ３細胞株へ非特異的結合する。抗体８Ｅ３は陰性細胞株３Ｔ３およびＨＴ１０８０に結合しないが、ＦＡＰ発現が陽性の細胞株ＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰα、３Ｔ３−ｍＦＡＰおよびＵ−８７ＭＧには結合する。抗体１Ａ７は陰性細胞株３Ｔ３およびＨＴ１０８０に結合しないが、ＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰαおよび３Ｔ３−ｍＦＡＰには結合し、Ｕ−８７ＭＧ細胞には結合しない。
【００９７】
実施例８．ＦＡＰαを標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞の調製
１．レンチウイルスパッケージングプラスミドｐＲＲＬ−ｈｕ８Ｅ３−２８Ｚの構築
ＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１αをベクターとして、ＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−１０Ａ４−２８Ｚ、ＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−１Ａ７−２８ＺおよびＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−８Ｅ３−２８Ｚを含む、抗体１０Ａ４、１Ａ７、および８Ｅ３の第２世代キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスプラスミドを構築した。１０Ａ４−２８Ｚ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：３２）、１０Ａ４  ｓｃＦｖ（配列番号：２４）、ＣＤ８  ｈｉｎｇｅ（配列番号：３４）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号：３６）と細胞内シグナル伝達構造ドメイン（配列番号：３８）およびＣＤ３の細胞内セグメントＣＤ３ξ（配列番号：４０）で構成され、１Ａ７−２８Ｚ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：３２）、１Ａ７  ｓｃＦｖ（配列番号：２６）、ＣＤ８  ｈｉｎｇｅ（配列番号：３４）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号：３６）と細胞内シグナル伝達構造ドメイン（配列番号：３８）およびＣＤ３の細胞内セグメントＣＤ３ξ（配列番号：４０）で構成され、８Ｅ３−２８ＢＢ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：３２）、８Ｅ３−ｓｃＦｖ（配列番号：２８）、ＣＤ８  ｈｉｎｇｅ（配列番号：３４）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号：３６）と細胞内シグナル伝達構造ドメイン（配列番号：３８）およびＣＤ３的細胞内セグメントＣＤ３ξ（配列番号：４０）で構成される。
【００９８】
２．プラスミドトランスフェクション２９３Ｔパッケージングｈｕ８Ｅ３−２８Ｚレンチウイルス
ａ）２９３Ｔ細胞を消化した後、１.２５ × １０７で１５ｃｍディッシュに広げ、３７ ℃で細胞コンフルエンスが７０ ％−８０ ％になるまで培養し、上清を１０ ｍＬの新鮮な１０ ％ＦＢＳ培地と交換した。
ｂ）プラスミド／ＰＥＩ混合液の調製
ｐＲＲＬ−ｈｕ８Ｅ３−２８Ｚ  １３.７ ｕｇ、ｐＶＳＶ．Ｇ  ６.３ ｕｇ、ＲＲＥ  １６.４ ｕｇ、ＲＥＶ  １６.４ ｕｇを取り、２２００ｕＬのＤＭＥＭを添加してインキュベートした。ＰＥＩに対応する量は１６５ｕｌ（１ ｕｇ／ｕｌ）であり、２２００ｕＬ  ＤＭＥＭに添加し、５分間インキュベートした。プラスミド混合液をＰＥＩインキュベーション溶液に加え、よく混合し、室温で２０分間インキュベートして、プラスミド／ＰＥＩ混合液を取得した。
ｃ）ｂ）で調製したプラスミド／ＰＥＩ混合液をａ）の細胞に滴下し、よく混合し、５時間後に液体を交換し、７２時間後にウイルス上清を収集し、０.４５ ｕｍフィルターでろ過し、ＰＥＧ８０００を添加し、４ ℃で一晩精製し、４０００ ｒｐｍ、４ ℃で遠心分離し、ウイルスペレットを収集してｈｕ８Ｅ３−２８Ｚレンチウイルスを取得した。
【００９９】
３．組換えヒトレンチウイルスのＴ細胞の感染
ａ）ＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培養基（Ｇｉｂｃｏ、＃０８７０１１２）＋ ２ ％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、＃１００−５１２）で培養し、組換えヒトＩＬ−２（５００ Ｕ／ｍｌ）（上海華新バイオテック株式会社）を添加し、ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２１０１３）を１：１（細胞：磁気ビーズ）の比率で加え、Ｔ細胞を活性化し、４８時間後に感染させた。
ｂ）Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ、＃Ｔ１００Ａ）を５μｇ／ｍｌの濃度で４ ℃で一晩コーティングした。活性化したＴ細胞を１×１０６細胞／ｍｌの密度でＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ被覆プレートに加え、ステップ２で収集した高純度ウイルス（ＭＯＩ≒１０）を加えた後、１８００ ｒｐｍで３２ ℃で４０分間遠心し、４８時間インキュベーターに入れ、培地（ＡＩＭ−Ｖ培地 ＋ ２ ％ヒトＡＢ血清、ＩＬ−２  ５００Ｕ／ｍｌ）を交換し、磁気ビーズを除去して、細胞を５×１０５細胞／ｍｌの密度で６〜１０日培養して、ｈｕ８Ｅ３−２８Ｚウイルスに感染したＴ細胞を得、すなわち８Ｅ３−２８Ｚ（配列番号：４８）を発現するＴ細胞を得た。
５×１０５の８Ｅ３−２８Ｚ  Ｔ細胞およびウイルスフリーＴ細胞を取って、Ｔ細胞をフローサイトメトリー検出し、Ｔ細胞おける８Ｅ３−２８Ｚ  ＣＡＲの発現を検出し、検出機器はＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーターである。結果は図１１に示したように、ｈｕ８Ｅ３−２８Ｚウイルスに感染したＴ細胞でｈｕ８Ｅ３−２８Ｚ  ＣＡＲ発現を検出できることを示す。
【０１００】
実施例９．８Ｅ３−２８ＺのＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞毒性検出
実施例８で調製したｈｕ８Ｅ３−２８Ｚ  Ｔ細胞を取って、３Ｔ３−ｍＦＡＰおよびＨ１０８０−ｈｕＦＡＰα細胞の殺傷を検出し、その方法は以下のとおりである。
【０１０１】
３Ｔ３−ｍＦＡＰモノクローナル細胞を消化してカウントし、８Ｅ３−２８Ｚ  ＣＡＲを発現するＴ細胞を遠心分離してカウントした。３Ｔ３−ｍＦＡＰ細胞を標的細胞として使用し、エフェクター細胞は８Ｅ３−２８Ｚ  ＣＡＲを発現するＴ細胞であり、エフェクター細胞と標的細胞の比率は３：１、１：１、１：３であり、標的細胞の数は１００００／ウェルであり、異なるエフェクター細胞と標的細胞の比率従って異なる数のエフェクター細胞（すなわち、３００００／ウェル、１００００／ウェル、３３３３／ウェル）を設定した。各グループに５つの複数ウェルを設置した。合計１８時間のインキュベーション後、上清中のＬＤＨの含有量をＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ１７８０）で検出し、その殺傷活性を計算した。具体的には、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性キット取扱説明書を参照した。３Ｔ３、Ｈ１０８０、およびＨ１０８０−ｈｕＦＡＰα細胞への８Ｅ３−２８Ｚ  ＣＡＲを発現するＴ細胞の殺傷毒性試験は、３Ｔ３−ｍＦＡＰ細胞と同じである。
【０１０２】
図１２に示したように、８Ｅ３−２８Ｚ  ＣＡＲを発現するＴ細胞は、マウスＦＡＰαを発現する３Ｔ３−ｍＦＡＰ細胞およびヒトＦＡＰαを発現するＨ１０８０−ｈｕＦＡＰα細胞を特異的に殺傷することができる。
【０１０３】
本発明で言及されるすべての文書は、あたかも各文書が個々に参照により組み込まれたかのように、本出願に参照により組み込まれている。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本願に添付された特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。
【図１】
2021509820.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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