(57)【要約】  ノズリスポル酸（ＮＡ）は、強力な殺虫活性が知られる、インドールジテルペン群を含む；しかし、天然の産生者であるヒポキシロン・プリシシドゥム（Ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ  ｐｕｌｉｃｉｃｉｄｕｍ）（ノズリスポリウム属（Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ）種）によるＮＡの生合成は、達成が非常に困難である。ＮＡ産生に関与する遺伝子の同定は、商業適用のため、ＮＡに対するアクセスを提供する生合成経路最適化を可能にしうる。公表された発酵法を用いて、有用な量のＮＡを得ることは困難であるため、遺伝子ノックアウト研究は遺伝子機能を確認する方法として望ましくない。その代わりに、ペニシリウム・パキシリ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐａｘｉｌｌｉ）のようなよりロバストな宿主種における、Ｈ．プリシシドゥム遺伝子の異種遺伝子発現は、ＮＡ生合成において役割を果たす遺伝子の機能を迅速に同定する方法を提供する。本研究において、本発明者らは、ノズリスポル酸Ｆ（ＮＡＦ）の生合成に必要な４つの二次代謝遺伝子の機能を同定し、そしてＰ．パキシリのゲノムにおいて、これらの遺伝子を再構成して、この真菌において、ＮＡＦの異種発現を可能にした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、およびＮｏｄＳ（配列番号５０）あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１、２、４、５、１９、２０、２５、２６、３４、３５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、２２、２３、２８、２９、３１、３２、３７、３８、４８および４９からなる群より選択される核酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは９９％の核酸配列同一性を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３の少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを含む、転写単位（ＴＵ）。
【請求項５】
請求項１の単離ポリペプチドをコードする、ベクター。
【請求項６】
請求項２または請求項３の単離ポリヌクレオチド、あるいは請求項４のＴＵを含む、ベクター。
【請求項７】
請求項１の単離ポリペプチド、請求項２または請求項３の単離ポリヌクレオチド、請求項４のＴＵ、ならびに／あるいは請求項５または請求項６のベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項８】
単離宿主細胞において、少なくとも１つの請求項１の単離ポリペプチド、請求項２または請求項３の単離ポリヌクレオチド、請求項４のＴＵ、ならびに／あるいは請求項５または請求項６のベクターを異種発現する工程を含む、少なくとも１つのノズリスポル酸（ＮＡ）を作製する方法。
【請求項９】
３−ゲラニルゲラニルインドール（ＧＧＩ）２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路における生化学反応を触媒する、ヒポキシロン属（Ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ）種由来の単離ポリペプチドあるいはその機能的断片または変異体。
【請求項１０】
ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路における生化学反応を触媒する、ヒポキシロン属種由来の少なくとも１つのポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
単離宿主細胞において、請求項２または請求項３の単離ポリヌクレオチド、あるいは請求項５または請求項６のベクターを異種発現する工程を含む、少なくとも１つのヒポキシロン属種ポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片を作製する方法。
【請求項１２】
単離宿主細胞において、ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路における生化学反応を触媒する、少なくとも１つのポリペプチドを異種発現する工程を含む、少なくとも１つのＮＡを作製する方法。
【請求項１３】
ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０の形成を導く生合成経路において、基質の転換を触媒する、少なくとも１つの異種ポリペプチドを発現する、単離宿主細胞。
【請求項１４】
ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路に関与する少なくとも１つのポリペプチドを、異種発現によって産生する、単離宿主細胞。
【請求項１５】
基質が少なくとも１つのＮＡに代謝されるように、形質転換前の細胞に比較して、配列番号３、６、２１、２７、３６、９、１２、１５、１８、２４、３０、３３、３９および５０あるいはその機能性変異体または断片からなる群より選択されるポリペプチドの活性レベルの増加を生じる核酸で形質転換された組換え細胞と、基質を含む炭水化物を接触させる工程を含む、少なくとも１つのＮＡを産生する方法。
【請求項１６】
ＮＡＡ  １０を導く生合成経路における酵素をコードする、少なくとも１つの異種核酸配列を含む、ヒポキシロン・プリシシドゥム（Ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ  ｐｕｌｉｃｉｃｉｄｕｍ）の単離株。
【請求項１７】
少なくとも２つの異なるＧＧＰＰＳ酵素を発現する、ヒポキシロン・プリシシドゥムの単離株。
【請求項１８】
ＮＡＡ  １０の生合成増加を導く遺伝子修飾を含む、ヒポキシロン・プリシシドゥムの単離株。
【請求項１９】
ヒポキシロン・プリシシドゥムにおいて、少なくとも１つの異種核酸配列を発現する工程を含む、ＮＡＡ  １０を作製する方法であって、少なくとも１つの異種核酸配列が、ＮＡＡ  １０を導く生合成経路における酵素をコードする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、ノズリスポル酸（ＮＡ）の産生を導く少なくとも１つの生化学反応を触媒する新規ポリペプチド、こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、こうしたポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作製する方法、ならびにこうしたポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、許容宿主における異種発現によって、少なくとも１つのＮＡを産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌は、興味深く、そして有用な化合物の多様なレパートリーを産生する。こうした化合物クラスの１つのメンバーであるインドールジテルペン（ＩＤＴ）は、その広範囲の化学的多様性および付随する生物活性により、特に興味深いものであり、こうした生物活性には、抗ＭＲＳＡ１、抗癌２、３、抗Ｈ１Ｎ１４、殺虫５および発振せん６活性が含まれる。ＮＡ（図１）は、以前はノズリスポリウム属（Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ）種として分類されたヒポキシロン・プリシシドゥム（Ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ  ｐｕｌｉｃｉｃｉｄｕｍ）によって産生される、特に生物活性である準パスパリン様ＩＤＴ群である７。ノズリスポル酸Ａ（ＮＡＡ）１０は、哺乳動物に対して、観察可能な副作用を示さずに、吸血節足動物に対する非常に強力な殺虫活性を示すため、特に重要である５、８。
【０００３】
ＮＡは、天然の生産者、Ｈ．プリシシドゥムから生合成することが特に困難である。報告されるＮＡ生合成法は、非常に栄養素が豊富な培地中、完全な暗所において、２１日間、Ｈ．プリシシドゥムを増殖させることを要する９。Ｈ．プリシシドゥムにおけるＮＡＡ  １０の生合成が困難であるため、公表された発酵法を用いて、ＮＡＡ  １０の有用な量を得るのは困難であり、そして商業的な量のＮＡＡ  １０の産生は、本質的に達成不能である。したがって、ＮＡＡ  １０を化学的に合成する試みがなされてきており、ノズリスポル酸Ｆ（ＮＡＦ）５ａ１０およびノズリスポル酸Ｄ  ７ａ１１の合成機構が生じてきたが、ＮＡＡ  １０の完全な合成は達成されていない１２。その結果、当該技術分野には、有用な量のＮＡＡ  １０を提供するＮＡＡ  １０合成および／または生合成の新規方法に関する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、Ｈ．プリシシドゥムのＮＡＡ  １０生合成経路における少なくとも１つの酵素をコードするポリヌクレオチドを提供し、そして／またはこうしたベクターを用いて、ＮＡである少なくとも１つのインドールジテルペン化合物を産生する方法を提供し、そして／または異種宿主において、ＮＡＡ  １０の前駆体を産生する方法を提供し、そして／または少なくとも有用な選択肢を公共に提供することである。
【０００５】
本明細書において、特許明細書、他の外部文書、または他の情報供給源に言及する場合、これは、一般的に、本発明の特徴を論じるための背景を提供する目的のためである。特に別に明記しない限り、こうした外部文書への言及は、こうした文書、またはこうした情報供給源が、いかなる権限においても、先行技術であるか、または当該技術分野に共通の一般的な知識の一部を形成することの承認とは見なされないものとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの側面において、本発明は、ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドに関する。
【０００７】
別の側面において、本発明は、ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドに関する。
【０００８】
別の側面において、本発明は、ｎｏｄＷ  ｃＤＮＡ（配列番号２）、ｎｏｄＷゲノムＤＮＡ（配列番号１）、ｎｏｄＲ  ｃＤＮＡ（配列番号５）、ｎｏｄＲゲノムＤＮＡ（配列番号４）、ｎｏｄＸ  ｃＤＮＡ（配列番号８）、ｎｏｄＸゲノムＤＮＡ（配列番号７）、ｎｏｄＭ  ｃＤＮＡ（配列番号１１）、ｎｏｄＭゲノムＤＮＡ（配列番号１０）、ｎｏｄＢ  ｃＤＮＡ（配列番号１４）、ｎｏｄＢゲノムＤＮＡ（配列番号１３）、ｎｏｄＯ  ｃＤＮＡ（配列番号１７）、ｎｏｄＯゲノムＤＮＡ（配列番号１６）、ｎｏｄＪ  ｃＤＮＡ（配列番号２０）、ｎｏｄＪゲノムＤＮＡ（配列番号１９）、ｎｏｄＣ  ｃＤＮＡ（配列番号２３）、ｎｏｄＣゲノムＤＮＡ（配列番号２２）、ｎｏｄＹ１  ｃＤＮＡ（配列番号２６）、ｎｏｄＹ１ゲノムＤＮＡ（配列番号２５）、ｎｏｄＤ２  ｃＤＮＡ（配列番号２９）、ｎｏｄＤ２ゲノムＤＮＡ（配列番号２８）、ｎｏｄＤ１  ｃＤＮＡ（配列番号３２）、ｎｏｄＤ１ゲノムＤＮＡ（配列番号３１）、ｎｏｄＹ２  ｃＤＮＡ（配列番号３５）、ｎｏｄＹ２ゲノムＤＮＡ（配列番号３４）、ｎｏｄＺ  ｃＤＮＡ（配列番号３８）、ｎｏｄＺゲノムＤＮＡ（配列番号３７）、ｎｏｄＳ  ｃＤＮＡ（配列番号４９）、ｎｏｄＳゲノムＤＮＡ（配列番号４８）、ｎｏｄＩ  ｃＤＮＡ（配列番号５５）、およびｎｏｄＩゲノムＤＮＡ（配列番号５４）からなる群より選択される核酸配列に対して、少なくとも７０％の核酸配列同一性を含む、単離ポリヌクレオチドに関する。
【０００９】
別の側面において、本発明は、本発明記載の少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを含む転写単位（ＴＵ）に関する。
別の側面において、本発明は、本発明記載の単離ポリペプチドをコードするベクターに関する。
【００１０】
別の側面において、本発明は、本発明記載の単離核酸配列またはＴＵを含むベクターに関する。
別の側面において、本発明は、本発明記載の単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチド、ＴＵおよび／またはベクターを含む、単離宿主細胞に関する。
【００１１】
別の側面において、本発明は、単離宿主細胞において、本発明記載の少なくとも１つのポリペプチド、単離核酸配列、ＴＵまたはベクターを異種発現する工程を含む、少なくとも１つのＮＡを作製する方法に関する。
【００１２】
別の側面において、本発明は、本発明の方法によって作製される少なくとも１つのＮＡに関する。
別の側面において、本発明は、３−ゲラニルゲラニルインドール（ＧＧＩ）２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路における生化学反応を触媒する、ヒポキシロン属種由来の単離ポリペプチドあるいはその機能的断片または変異体に関する。
【００１３】
別の側面において、本発明は、ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路における生化学反応を触媒する、ヒポキシロン属種由来の少なくとも１つのポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片をコードする、単離ポリヌクレオチドに関する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、単離宿主細胞において、本発明記載の単離核酸配列またはベクターを異種発現する工程を含む、少なくとも１つのヒポキシロン属種ポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片を作製する方法に関する。
【００１５】
別の側面において、本発明は、単離宿主細胞において、ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路における生化学反応を触媒する少なくとも１つのポリペプチドを異種発現する工程を含む、少なくとも１つのＮＡを作製する方法に関する。
【００１６】
別の側面において、本発明は、ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０の形成を導く生合成経路において、基質の転換を触媒する、少なくとも１つの異種ポリペプチドを発現する、単離宿主細胞に関する。
【００１７】
別の側面において、本発明は、ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路に関与する少なくとも１つのポリペプチドを、異種発現によって産生する、単離宿主細胞に関する。
【００１８】
別の側面において、本発明は、基質が少なくとも１つのＮＡに代謝されるように、形質転換前の細胞に比較して、ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるポリペプチドの活性レベルの増加を生じる核酸で形質転換された組換え細胞と、基質を含む炭水化物を接触させる工程を含む、少なくとも１つのＮＡを産生する方法に関する。
【００１９】
別の側面において、本発明は、ＮＡＡ  １０を導く生合成経路における酵素をコードする、少なくとも１つの異種核酸配列を含む、ヒポキシロン・プリシシドゥムの単離株に関する。
【００２０】
別の側面において、本発明は、少なくとも２つの異なるＧＧＰＰＳ酵素を発現する、ヒポキシロン・プリシシドゥムの単離株に関する。
別の側面において、本発明は、ＮＡＡ  １０の生合成増加を導く遺伝子修飾を含む、ヒポキシロン・プリシシドゥムの単離株に関する。
【００２１】
別の側面において、本発明は、ヒポキシロン・プリシシドゥムにおいて、少なくとも１つの異種核酸配列を発現する工程を含む、ＮＡＡ  １０を作製する方法であって、少なくとも１つの異種核酸配列が、ＮＡＡ  １０を導く生合成経路における酵素をコードする、前記方法に関する。
【００２２】
上に論じるような本発明の異なる側面の多様な態様はまた、本発明の以下の詳細な説明にも示されるが、本発明はこうした説明には限定されない。
本発明の他の側面は、例としてのみ提供される以下の説明から、そして付随する図を参照して、明らかになりうる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明はここで、付随する図の図像を参照しながら言及される。
【図１】既知のノズリスポル酸（ＮＡ）のコレクション。
【図２】非常に多様なＩＤＴ構造を生じさせる、インドールジテルペン（ＩＤＴ）の生合成経路における分岐点。矢印は、ＩＤＴ生合成における酵素的工程に相当する。
【図３】異なるＨ．プリシシドゥム（Ｎｏｄ）酵素および／またはＰ．パキシリ（Ｐａｘ）酵素（黒の（−））を発現するＰ．パキシリ・ノックアウト（ＫＯ）株（グレーの（−））の抽出物のＨＰＬＣ分析（２７１ｎｍ）。黒いＸは、Ｐ．パキシリＫＯ株において発現されない酵素（単数または複数）を含む（トレースｉ．ａ、ｉｉ．ａ、ｉｉｉ．ａ、ｉｖ．ａ、およびｖ．ａ）。Ｐ．パキシリＫＯ株で新規に発現されている酵素（単数または複数）を、対応するＫＯ株の下に、そしてそのＵＶトレースの隣に示す（ｉ．ｂ、ｉｉ．ｂ、ｉｉｉ．ｂ、ｉｖ．ｂ、およびｖ．ｂ）。特に、エミンドールＳＢ  ４ａと同じ保持時間で溶出する化合物があるが、対応する４０６．３１±０．０１ｍ／ｚ  ＥＩＣ（図５、６、および９）によって確認されるように、エミンドールＳＢ  ４ａは、３つのトレース（ｉｉ．ｂ、ｉｉｉ．ｂ、およびｖ．ｂ）にのみ存在する。トレースは、以下のように真菌抽出物に対応する：ｉ．ａ＝ＰＮ２２９０、ｉ．ｂ＝ｐＫＶ２７：ＰＮ２６９０、ｉｉ．ａ＝ＰＮ２２５７、ｉｉ．ｂ＝ｐＫＶ６３：ＰＮ２２５７、ｉｉｉ．ａ＝ＰＮ２２５０、ｉｉｉ．ｂ＝ｐＳＫ６６：ＰＮ２２５０、ｉｖ．ａ＝ＰＮ２２５０、ｉｖ．ｂ＝ｐＫＶ７４：ＰＮ２２５０、ｖ．ａ＝ＰＮ２２５７、ｖ．ｂ＝ｐＫＶ６４：ＰＮ２２５７。
【図４】パキシリン６ｂのＭＳピーク（５．３分、４３６．２４８±０．０１ｍ／ｚ）を示す、ｐＫＶ２７：ＰＮ２２９０（ｎｏｄＣ：ΔｐａｘＣ）の抽出イオンクロマトグラム。
【図５】エミンドールＳＢ  ４ａのＭＳピーク（１９．３分、４０６．３１±０．０１ｍ／ｚ）を示すが、パスパリン４ｂ（１７．６分、４２２．３０５±０．０１ｍ／ｚ）を示さない、ｐＫＶ６３：ＰＮ２２５７（ｎｏｄＭ：ΔｐａｘＭ）の抽出イオンクロマトグラム。
【図６】エミンドールＳＢ  ４ａのＭＳピーク（１９．３分、４０６．３１±０．０１ｍ／ｚ）を示すが、パスパリン４ｂ（１７．６分、４２２．３０５±０．０１ｍ／ｚ）を示さない、ｐＳＫ６６：ＰＮ２２５０（ｐａｘＧ、ｎоｄＣ、ｎоｄＭ、およびｎоｄＢ：ΔＰＡＸクラスター）の抽出イオンクロマトグラム。
【図７】パスパリン４ｂのＭＳピーク（１７．６分、４２２．３０５±０．０１ｍ／ｚ）を示すが、エミンドールＳＢ  ４ａ（１９．３分、４０６．３１±０．０１ｍ／ｚ）を示さない、ｐＫＶ７４：ＰＮ２２５０（ｐａｘＧ、ｐａｘＣ、ｐａｘＭ、ｎоｄＢ：ΔＰＡＸクラスター）の抽出イオンクロマトグラム。
【図８】Ｈ．プリシシドゥム由来の予測されるＮＡ遺伝子クラスター（Ａ）およびＮＡＦ  ５ａ生合成経路（Ｂ）の図。矢印は個々の遺伝子を表し、そして矢印の装飾は遺伝子機能を表す。図は正確な縮尺ではなく、そしてエクソン／イントロン構造を含まない。特に、遺伝子クラスターは、ＩＤＴ合成における第一の二次代謝工程に関与するＧＧＰＰＳを欠く。
【図９】エミンドールＳＢ  ４ａ（１９．３分、４０６．３１±０．０１ｍ／ｚ）およびＮＡＦ  ５ａ（６．２分、４３６．２８４±０．０１ｍ／ｚ）のＭＳピークを示す、ｐＫＶ６４：ＰＮ２２５７（ｎｏｄＭおよびｎоｄＷ：ΔｐａｘＭ）の抽出イオンクロマトグラム。
【図１０】エミンドールＳＢ  ４ａ（１９．３分、４０６．３１±０．０１ｍ／ｚ）およびＮＡＦ  ５ａ（６．２分、４３６．２８４±０．０１ｍ／ｚ）のＭＳピークを示す、ｐＳＫ６８：ＰＮ２２５０（ｐａｘＧ、ｎоｄＣ、ｎоｄＭ、ｎоｄＢ、およびｎоｄＷ：ΔＰＡＸクラスター）の抽出イオンクロマトグラム。
【図１１】ＭＩＤＡＳレベル１クローニングの概観。
【図１２】ＭＩＤＡＳモジュールアドレス系。
【図１３】ＭＩＤＡＳカセットの概観。
【図１４】ＭＩＤＡＳマルチ遺伝子組み立て（レベル３）の原理。
【図１５】ＭＩＤＡＳ形式の概観。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書および請求項において、「少なくとも部分的にからなる」を意味し；これはすなわち、「含む」を含む、本明細書および請求項における言及を解釈する際、各言及において、この用語が前に置かれた特徴がすべて存在する必要があるが、他の特徴もまた存在してもよいことを意味する。関連する用語、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、類似の方式で解釈されるものとする。
【００２５】
用語「から本質的になる」は、本明細書において、明記される材料または工程、ならびに請求する発明の基本的なおよび新規の特性（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないものを意味する。
【００２６】
用語「からなる」は、本明細書において、請求項に明記されていないいかなる要素、工程、または成分も除いた、請求する発明の明記する材料または工程を意味する。
用語「認識部位」および「制限部位」は、本明細書において交換可能に用いられ、そして同じものを意味する。制限酵素に関連する、本明細書で用いるようなこれらの用語は、所定の制限酵素のポリヌクレオチド上の結合部位を定義する核酸配列またはポリヌクレオチド配列を意味する。
【００２７】
用語「インドールジテルペン（ＩＤＴ）化合物」または「インドールジテルペノイド」は、インドール含有前駆体に由来する任意の化合物、好ましくはインドール−３−グリセロールリン酸１ｂ、およびゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）１ａを指す。
【００２８】
いくつかの態様において、ＩＤＴ化合物は、ＧＧＩ  ２、エミンドールＳＢ  ４ａ、およびＮＡＦ  ５ａからなる群より選択される。
用語「遺伝子構築物」は、通常は二本鎖ＤＮＡであるポリヌクレオチド分子であって、別のポリヌクレオチド分子にコンジュゲート化されている、前記ポリヌクレオチド分子を指す。１つの限定されない例において、遺伝子構築物は、例えば当該技術分野に知られるような制限／連結によって、第二のポリヌクレオチド分子内に第一のポリヌクレオチド分子を挿入することによって、作製される。いくつかの態様において、遺伝子構築物は、単一のポリヌクレオチドモジュール、少なくとも２つのポリヌクレオチドモジュール、または単一の連続ポリヌクレオチド分子に組み立てられた一連の多数のポリヌクレオチドモジュール（本明細書において、また、「マルチ遺伝子構築物」とも称される）を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
用語「遺伝子構築物」は、通常は二本鎖ＤＮＡであるポリヌクレオチド分子であって、別のポリヌクレオチド分子にコンジュゲート化されている、前記ポリヌクレオチド分子を指す。１つの限定されない例において、遺伝子構築物は、例えば当該技術分野に知られるような制限／連結によって、第二のポリヌクレオチド分子内に第一のポリヌクレオチド分子を挿入することによって、作製される。いくつかの態様において、遺伝子構築物は、単一のポリヌクレオチドモジュール、少なくとも２つのポリヌクレオチドモジュール、または単一の連続ポリヌクレオチド分子に組み立てられた一連の多数のポリヌクレオチドモジュール（本明細書において、また、「マルチ遺伝子構築物」とも称される）を含むが、これらに限定されない。
【００３０】
遺伝子構築物は、ポリヌクレオチド分子の転写を可能にする必要な要素、および随意に、転写物をポリペプチドに翻訳するために必要な要素を含有してもよい。遺伝子構築物中に、そして／または遺伝子構築物によって含まれるポリヌクレオチド分子は、宿主細胞由来であってもよいし、あるいは異なる細胞または生物に由来していてもよいし、そして／または組換えポリヌクレオチドであってもよい。ひとたび宿主細胞内に入ったら、遺伝子構築物は、宿主染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。遺伝子構築物は、ベクターに連結されていてもよい。
【００３１】
用語「転写単位」（ＴＵ）は、本明細書において、プロモーター、ＲＮＡコード配列、およびターミネーターを含むがこれらに限定されない、単一のＲＮＡ分子の転写に必要なすべてのヌクレオチド配列を含む、単一のＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。
【００３２】
用語「転写単位モジュール」（ＴＵＭ）は、本明細書において、単一のＲＮＡ分子またはその部分をコードする；あるいはタンパク質コード配列（ＣＤＳ）またはその部分をコードする；あるいはそのＲＮＡ分子の転写を制御する配列要素またはその部分をコードする；あるいはＣＤＳの翻訳を制御する配列要素またはその部分をコードする、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。こうした配列要素には、限定されるわけではないが、プロモーター、非翻訳領域（ＵＴＲ）、ターミネーター、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサーが含まれてもよい。
【００３３】
用語「マルチ遺伝子構築物」は、本明細書において、少なくとも２つのＴＵを含むポリヌクレオチドである遺伝子構築物を意味する。
用語「マーカー」は、本明細書において、選択可能マーカーまたはスコア化可能マーカーをコードする、ポリヌクレオチドにおける核酸配列を意味する。
【００３４】
用語「選択可能マーカー」は、本明細書において、細胞内に導入された際、細胞に少なくとも１つの特質を与えるＴＵであって、その特質の存在または非存在に基づいて、細胞を選択することが可能になる前記ＴＵを指す。１つの態様において、細胞は、少なくとも１つの選択可能マーカーを含まない細胞を殺す条件下での生存に基づいて選択される。
【００３５】
用語「スコア化可能マーカー」は、本明細書において、細胞内に導入された際、細胞に少なくとも１つの特質を与えるＴＵであって、その特質の存在または非存在に基づいて、細胞をスコア付けすることが可能になる前記ＴＵを指す。１つの態様において、ＴＵを含む細胞は、複数の細胞から、細胞を表現型的に同定することによってスコア付けされる。
【００３６】
用語「遺伝子要素」は、本明細書において、ＴＵではなく、またはＴＵの部分を形成しない、いかなるポリヌクレオチド配列も指す。こうしたポリヌクレオチド配列には、限定されるわけではないが、プラスミドおよびウイルスの複製起点、セントロメア、テロメア、反復配列、相同組換えに用いられる配列、部位特異的組換え配列、および生物間のＤＮＡトランスファーを制御する配列が含まれてもよい。
【００３７】
用語「ベクター」は、本明細書において、増幅され、複製され、操作され、部分的に複製され、修飾され、そして／または発現されることが可能であるように、遺伝子材料を操作するために使用可能な任意のタイプのポリヌクレオチド分子を指すが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ベクターを用いて、そのベクター中に含まれるポリヌクレオチドを細胞または生物内に輸送してもよい。
【００３８】
用語「供給源ベクター」は、本明細書において、関心対象のポリヌクレオチド配列をクローニング可能なベクターを指す。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載するようなＴＵおよびＴＵＭである。いくつかの態様において、供給源ベクターは、プラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ファージ人工染色体（ＰＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリオファージ、ファージミド、およびコスミドからなる群より選択される。いくつかの態様において、関心対象のポリヌクレオチド配列を含む供給源ベクターは、エントリークローンと称される。いくつかの態様において、エントリークローンは、さらなるポリヌクレオチド配列を受け入れるためのシャトルまたはデスティネーションベクターとして働いてもよい。
【００３９】
用語「シャトルベクター」は、本明細書において、関心対象のポリヌクレオチド配列がクローニング可能であり、そしてそこからこれらの配列が操作可能であるベクターを指す。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載するようなＴＵおよびＴＵＭである。いくつかの態様において、シャトルベクターは、プラスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、バクテリオファージ、ファージミド、およびコスミドからなる群より選択される。いくつかの態様において、関心対象のポリヌクレオチド配列を含むシャトルベクターは、さらなるポリヌクレオチド配列を受け入れるためのデスティネーションベクターとして働いてもよい。
【００４０】
用語「デスティネーションベクター」は、本明細書において、関心対象のポリヌクレオチド配列をクローニング可能なベクターを指す。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載するようなＴＵおよびＴＵＭである。いくつかの態様において、デスティネーションベクターは、プラスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、バクテリオファージ、ファージミド、およびコスミドからなる群より選択される。いくつかの態様において、関心対象のポリヌクレオチド配列を含むデスティネーションベクターはエントリークローンである。いくつかの態様において、エントリークローンは、さらなるポリヌクレオチド配列を受け入れるためのデスティネーションベクターとして働いてもよい。
【００４１】
用語「ポリヌクレオチド（単数または複数）」は、本明細書において、任意の長さの一本鎖または二本鎖デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、そしてこれには、限定されない例として、遺伝子のコードおよび非コード配列、センスおよびアンチセンス配列、エクソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組換えポリヌクレオチド、単離および精製天然存在ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ配列、核酸プローブ、プライマー、断片、遺伝子構築物、ベクターおよび修飾ポリヌクレオチドが含まれる。核酸、核酸分子、ヌクレオチド配列およびポリヌクレオチド配列に対する言及は、同様に理解されるものとする。
【００４２】
用語「遺伝子」は、本明細書において、遺伝の生物学的単位であり、自己複製性であり、そして特定の染色体上の明確な位置（遺伝子座）に位置する遺伝子を指す。１つの態様において、特定の染色体は真核または細菌染色体である。用語、細菌染色体は、本明細書において、用語、細菌ゲノムと交換可能に用いられる。
【００４３】
用語「遺伝子クラスター」は、本明細書において、その産物が、細胞の一次または二次代謝の特定の側面において、協調的な役割を果たす、同じ染色体上に、ともに近接して位置する遺伝子群を指す。１つの例において、遺伝子クラスターは、その産物が、所定の代謝産物、特に二次代謝産物を産生する生合成経路またはアレイを含む、一連の生化学反応にすべて関与する、ＣＤＣ群を含む。
【００４４】
用語「二次代謝産物」は、本明細書において、一次代謝に関与せず、そしてしたがって、生命の基本的な機構を構成する、タンパク質および核酸などのより広く存在する巨大分子とは異なる化合物を指す。
【００４５】
用語「単数の酵素が活性である条件下」および「複数の酵素が活性である条件下」、およびその文法的変形は、酵素活性に関して用いた際、酵素がその予期される機能を果たす；例えば、制限エンドヌクレアーゼが適切な制限部位で核酸を切断し、そしてＤＮＡリガーゼが２つのポリヌクレオチドをともに共有連結させることを意味する。
【００４６】
用語「内因性」は、本明細書において、細胞、組織または生物に由来するかまたはこれらの中で天然に産生される、細胞、組織または生物の構成要素を指す。「内因性」構成要素は、限定されるわけではないが、ポリヌクレオチド、非リボソームポリペプチドを含むポリペプチド、脂肪酸またはポリケチドを含む任意の構成要素であってもよいが、これらに限定されない。
【００４７】
用語「外因性」は、本明細書において、細胞、組織または生物に由来しないかまたはこれらの中で天然に産生されない、細胞、組織または生物の任意の構成要素を指す。外因性構成要素は、例えば、細胞、組織または生物内に導入されているポリヌクレオチド配列、あるいはそのポリヌクレオチド配列から、細胞、組織または生物において発現されるポリペプチドであってもよい。
【００４８】
「天然存在」は、本明細書において、本発明記載のポリヌクレオチド配列に関して、天然に見られる一次ポリヌクレオチド配列を指す。野生型ポリヌクレオチド配列に同一である合成ポリヌクレオチド配列は、本開示の目的のため、天然存在配列と見なされる。天然存在ポリヌクレオチド配列に関して重要であるのは、該ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド塩基の実際の配列が、天然に見られるかまたは知られることである。
【００４９】
例えば、野生型ポリヌクレオチド配列は天然存在ポリヌクレオチド配列であるが、これに限定されない。天然存在ポリヌクレオチド配列はまた、野生型とは異なる、天然に見られるような変異体ポリヌクレオチド配列も指す。例えば、ハイブリダイゼーションまたは水平遺伝子トランスファーによるアレル変異体および天然存在組換えポリヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
「非天然存在」は、本明細書において、本発明記載のポリヌクレオチド配列に関して、天然には見られないポリヌクレオチド配列を指す。非天然存在ポリヌクレオチド配列の例には、例えば点突然変異、挿入、または欠失によって作製された、人工的に産生された突然変異体および変異体ポリヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。非天然存在ポリヌクレオチド配列にはまた、化学的進化配列も含まれる。本発明記載の非天然存在ポリヌクレオチド配列に関して重要なことは、該ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド塩基の実際の配列が、天然には見られずまた知られないことである。
【００５１】
用語「野生型」は、本明細書において、ポリヌクレオチドに関して用いた際、ポリヌクレオチドの天然存在；非突然変異体型を指す。突然変異体ポリヌクレオチドは、当該技術分野に知られるような突然変異、例えば点突然変異、挿入、欠失、置換、増幅または転位置を維持するポリヌクレオチドを意味するが、これらに限定されない。
【００５２】
用語「野生型」は、本明細書において、ポリペプチドに関して用いた際、ポリペプチドの天然存在の非突然変異体型を指す。野生型ポリペプチドは、野生型ポリヌクレオチドから発現されることが可能なポリペプチドである。
【００５３】
用語「コード配列」または「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、適切な制御配列の制御下で、転写産物および／またはポリペプチドを産生することが可能なゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列のセンス鎖を指す。ＣＤＳは、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳停止コドンの存在によって同定される。遺伝子構築物または発現カセット内に挿入された際、「コード配列（ＣＤＳ）」は、プロモーター配列および／または他の制御要素に機能可能であるように連結された際、発現されることが可能である。
【００５４】
「機能可能であるように連結された」は、発現しようとする配列が、制御要素の制御下に置かれていることを意味する。
「制御要素」は、本明細書において、ベクター、遺伝子構築物または発現カセットからのポリヌクレオチド挿入物の発現を制御するかまたはこれに影響を及ぼす、任意の核酸配列要素を指し、そしてこれには、プロモーター、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、組織特異的制御要素、一時的制御要素、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リプレッサーおよびターミネーターが含まれる。制御要素は、本明細書に記載するような遺伝子構築物、発現カセットまたはベクターから発現しようとするポリヌクレオチド挿入物に対して、「同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」であってもまたは「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」であってもよい。本明細書に記載するような遺伝子構築物、発現カセットまたはベクターが細胞中に存在する場合、制御要素は、細胞に関して、「内因性」、「外因性」、「天然存在」および／または「非天然存在」であってもよい。
【００５５】
用語「非コード領域」は、翻訳開始部位の上流および翻訳停止部位の下流の、非翻訳配列を指す。これらの配列はまた、それぞれ、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲとも称される。これらの領域には、転写開始および終結に、そして翻訳効率の制御に必要な要素が含まれる。
【００５６】
ターミネーターは、転写を終結させる配列であり、そして翻訳される配列の下流の遺伝子の３’非翻訳端に見られる。ターミネーターは、ｍＲＮＡ安定性の重要な決定要因であり、そしていくつかの場合、空間的制御機能を有することが見出されてきている。
【００５７】
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の転写を制御する、コード領域の上流の非転写シス制御要素を指す。プロモーターは、転写開始部位および保存されたボックスを特定するシス・イニシエーター要素を含む。１つの限定されない例において、細菌プロモーターは、「プリブノーボックス」（−１０領域としても知られる）、および転写因子が結合し、そして転写を促進する他のモチーフを含んでもよい。プロモーターは、発現しようとするポリヌクレオチド配列に関して同種であってもまたは異種であってもよい。ポリヌクレオチド配列を細胞において発現しようとする際、プロモーターは、内因性または外因性プロモーターであってもよい。プロモーターは、当該技術分野に知られるような、恒常的プロモーター、誘導性プロモーターまたは制御可能プロモーターであってもよい。
【００５８】
「同種」は、本明細書において、ポリヌクレオチド制御要素に関して、生得的でありそして天然存在であるポリヌクレオチド制御要素である、ポリヌクレオチド制御要素を意味する。同種ポリヌクレオチド制御要素は、関心対象のポリヌクレオチドが、本発明記載のＴＵ、遺伝子要素またはベクターから発現可能であるように、関心対象のポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されていてもよい。
【００５９】
「同種」は、本明細書において、宿主生物におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その宿主生物内で、生得的でありそして天然存在であるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであることを意味する。同種ポリヌクレオチドは、同種ポリペプチドが、本明細書に記載するような同種ポリヌクレオチドを含むＴＵ、遺伝子要素またはベクターから発現可能であるように、同種または異種制御要素に機能可能であるように連結されていてもよい。
【００６０】
「導入された同種」は、本明細書において、宿主生物におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、実験技術によって、生物内に導入されているその宿主生物内で、生得的でありそして天然存在であるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであることを意味する。導入された同種ポリヌクレオチドは、同種ポリペプチドが、本明細書に記載するような同種ポリヌクレオチドを含むＴＵ、遺伝子要素またはベクターから発現可能であるように、同種または異種制御要素に機能可能であるように連結されていてもよい。
【００６１】
「異種」は、本明細書において、ポリヌクレオチド制御要素に関して、生得的でありそして天然存在であるポリヌクレオチド制御要素でない、ポリヌクレオチド制御要素を意味する。異種ポリヌクレオチド制御要素は、機能可能であるように連結されたＣＤＳとは、通常は関連しない。異種制御要素は、関心対象のポリヌクレオチドが、本発明記載のベクター、遺伝子構築物または発現カセットから発現可能であるように、関心対象のポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されていてもよい。こうしたプロモーターには、通常は他の遺伝子、ＯＲＦまたはコード領域に関連するプロモーター、ならびに／あるいは任意の他の細菌、ウイルス、真核、または哺乳動物細胞から単離されるプロモーターが含まれてもよい。
【００６２】
「異種」は、本明細書において、宿主生物におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して、その宿主生物において、生得的でありそして天然存在であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドではない、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。異種ポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドが、本明細書に記載するような異種ポリヌクレオチドを含むＴＵ、遺伝子要素またはベクターから発現可能であるように、異種または同種制御要素に機能可能であるように連結されていてもよい。
【００６３】
用語「異種性に発現する」および「異種発現」は、宿主細胞における異種ポリペプチドの発現を意味する。
「ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路における生化学反応」は、基質分子ＧＧＩ  ２から、以下の中間体：モノエポキシ化（ｍｏｎｏ−ｅｘｐｏｘｉｄｉｚｅｄ）ＧＧＩ  ３ａ、エミンドールＳＢ  ４ａ、ＮＡＦ  ５ａ、ＮＡＥ  ６ａ、ＮＡＤ  ７ａ、ＮＡＣ  ８、ＮＡＢ  ９を通じた、ＮＡＡ  １０までの転換に関与する特異的酵素の１つによって触媒される特異的反応の１つを意味し、そしてこれには、類似の機能を有しうるが、上にあげた特定の中間体に作用しない、宿主細胞内の類似の酵素は含まれない。
【００６４】
ポリペプチドの「機能的変異体またはその断片」は、そのポリペプチドの生物学的活性または結合に必要な機能を実行し、そして／または該ポリペプチドの三次元構造を提供する、ポリペプチドの下位配列である。該用語は、ポリペプチド、ポリペプチドの凝集体、例えば二量体または他の多量体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、あるいはポリペプチド活性を実行可能なその機能性ポリペプチド誘導体を指してもよい。
【００６５】
「単離された」は、本明細書において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して、天然細胞環境から除去されている配列を記載する。単離分子は、生化学、組換え、および合成技術を含む、当該技術分野に知られ、そして用いられるような、任意の方法または方法の組み合わせによって得られてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、少なくとも１つの精製工程によって調製されてもよい。
【００６６】
「単離された」は、本明細書において、細胞または宿主細胞に関して用いた際、生物からまたはその天然環境から得られているかまたは取り出されており、そして続いて、当該技術分野に知られるような実験室環境において維持されている、細胞または宿主細胞を記載する。該用語は、単細胞それ自体、ならびに細胞培養中に含まれる細胞または宿主細胞を含み、そしてこれには、単細胞または単一宿主細胞が含まれてもよい。
【００６７】
用語「単離宿主細胞」は、本明細書において、真菌宿主細胞に関して、単細胞真菌の単細胞、ならびに有隔および無隔型を含む糸状菌の菌糸および菌糸体を含む。
用語「組換え」は、天然背景において取り巻かれている配列から取り出され、そして／または天然背景において存在しない配列と組み換えられている、ポリヌクレオチド配列を指す。「組換え」ポリペプチド配列は、「組換え」ポリヌクレオチド配列からの翻訳によって産生される。
【００６８】
本明細書において、用語「変異体」は、特異的に同定される配列とは異なり、１つまたはそれより多いヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されている、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。変異体は、天然存在アレル変異体、または非天然存在変異体であってもよい。変異体は、同じ種由来または他の種由来であってもよく、そして相同体、パラログおよびオルソログを含んでもよい。特定の態様において、本発明で有用なポリペプチドの変異体は、対応する野生型分子；すなわち親ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのものと同じまたは類似の生物学的活性を有する。
【００６９】
特定の態様において、本明細書記載のポリペプチドの変異体は、対応する野生型分子と類似であるかまたは実質的に類似である、生物学的活性を有する。特定の態様において、類似性は、類似の活性および／または結合特異性である。
【００７０】
特定の態様において、本明細書記載のポリペプチドの変異体は、対応する野生型分子とは異なる生物学的活性を有する。特定の態様において、相違は、改変された活性および／または結合特異性である。
【００７１】
用語「変異体」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関して、本明細書に定義するようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドのすべての型を含む。
変異体ポリヌクレオチド配列は、本発明の配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、および好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、本発明の方法にしたがって用いられるかまたは同定されるポリヌクレオチドの少なくとも８ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも２７ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも７０ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも８０ヌクレオチド位、好ましくは全長に渡る比較ウィンドウに渡って見出される。
【００７２】
ポリヌクレオチド変異体はまた、これらの配列の機能的同等性を保持する可能性が高く、そしてランダムな可能性によって起こっているとは合理的に予期されえない、特異的に同定された配列の１つまたはそれより多くに対する類似性を示すものも含む。
【００７３】
ポリヌクレオチド配列同一性および類似性は、当業者によって容易に決定されうる。
変異体ポリヌクレオチドはまた、本明細書に記載するポリヌクレオチド配列とは異なるが、遺伝暗号の縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと類似の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含む。ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない配列改変は、「サイレント変異」である。ＡＴＧ（メチオニン）およびＴＧＧ（トリプトファン）を除き、同じアミノ酸に関する他のコドンを、当該技術分野が認識する技術によって、例えば特定の宿主生物においてコドン発現を最適化させるために変化させてもよい。
【００７４】
その生物学的活性を有意に改変することなく、コードされるポリペプチド配列における１つまたはいくつかのアミノ酸の保存的置換を生じるポリヌクレオチド配列改変もまた、本発明に含まれる。当業者は、表現型的にサイレントであるアミノ酸置換を作製するための方法を知っている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，  １３０６を参照されたい）。
【００７５】
ポリペプチドに関する用語「変異体」はまた、天然存在、組換えおよび合成産生ポリペプチドも含む。変異体ポリペプチド配列は、本発明の配列に対して、好ましくは少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７１％、好ましくは少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７４％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、好ましくは少なくとも７７％、好ましくは少なくとも７８％、好ましくは少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、および好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、本発明の方法にしたがって用いられるかまたは同定されるポリペプチドの少なくとも２アミノ酸位、好ましくは少なくとも３アミノ酸位、好ましくは少なくとも４アミノ酸位、好ましくは少なくとも５アミノ酸位、好ましくは少なくとも７アミノ酸位、好ましくは少なくとも１０アミノ酸位、好ましくは少なくとも１５アミノ酸位、好ましくは少なくとも２０アミノ酸位、好ましくは全長に渡る比較ウィンドウに渡って見出される。
【００７６】
ポリペプチド変異体はまた、これらの配列の機能的同等性を保持する可能性が高く、そしてランダムな可能性によって起こっているとは合理的に予期されえない、特異的に同定された配列の１つまたはそれより多くに対する類似性を示すものも含む。
【００７７】
ポリペプチド配列同一性および類似性は、当業者によって容易に決定されうる。
変異体ポリペプチドには、アミノ酸配列が、１つまたはそれより多くの保存的アミノ酸、あるいはペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさない非保存的置換、欠失、付加または挿入によって、本明細書のポリペプチドと異なる、ポリペプチドが含まれる。
【００７８】
保存的置換には、典型的には、１つのアミノ酸の、類似の特性を持つ別のアミノ酸に関する置換、例えば以下の群：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換が含まれる。
【００７９】
進化生物学的配列の分析は、少なくとも部分的に、生物学的レベルでの保存的対非保存的置換の相違を反映して、すべての配列変化が同等にありうるわけではないことを示している。例えば、特定のアミノ酸置換がしばしば起こりうる一方、他のものは非常に稀である。アミノ酸残基における進化的変化または置換は、置換マトリックスとも称されるスコアリングマトリックスによってモデリング可能である。こうしたマトリックスは、配列間の関係を同定するためにバイオインフォマティクス分析において用いられており、そして当業者に知られる。
【００８０】
他の変異体には、ペプチド安定性に影響を及ぼす修飾を含むペプチドが含まれる。こうした類似体は、例えばペプチド配列における、１つまたはそれより多い非ペプチド結合（ペプチド結合を置換するもの）を含有してもよい。やはり含まれるのは、天然存在Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または非天然存在合成アミノ酸、例えばベータまたはガンマアミノ酸および環状類似体を含む類似体である。
【００８１】
置換、欠失、付加または挿入は、当該技術分野に知られる突然変異誘発法によって作製されてもよい。当業者は、表現型的にサイレントであるアミノ酸置換を作製するための方法を知っている。例えばＢｏｗｉｅら，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，  １３０６を参照されたい。
【００８２】
本明細書で用いるようなポリペプチドはまた、合成中または合成後に、例えばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、リン酸化、アミド化、ブロッキング基／保護基を用いた誘導体化等によって修飾されているポリペプチドも指す可能性もある。こうした修飾は、ポリペプチドの安定性または活性を増加させうる。
【００８３】
用語、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「発現を調節する」、「調節された発現」および「発現調節」は、本発明にしたがって発現しようとするポリヌクレオチドに対応するゲノムｃＤＮＡが修飾され、したがって、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの調節された発現を導く状況を含むよう意図される。ゲノムＤＮＡの修飾は、遺伝子形質転換または突然変異を誘導するための当該技術分野に知られる他の方法を通じるものであってもよい。「調節された発現」は、産生されるメッセンジャーＲＮＡおよび／またはポリペプチドの量の増加または減少に関連してもよいし、そしてまた、産生されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列の改変による、ポリペプチドの活性の増加または減少を生じてもよい。
【００８４】
用語、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「活性を調節する」、「調節された活性」および「活性調節」は、本発明にしたがって発現しようとするポリヌクレオチドに対応するゲノムｃＤＮＡが修飾され、したがって、本発明のポリヌクレオチドの調節された発現、あるいはポリペプチドの調節された発現または活性を導く状況を含むよう意図される。ゲノムＤＮＡの修飾は、遺伝子形質転換または突然変異を誘導するための当該技術分野に知られる他の方法を介するものであってもよい。「調節された活性」は、産生されるメッセンジャーＲＮＡおよび／またはポリペプチドの量の増加または減少に関連してもよいし、そしてまた、産生されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列の改変による、ポリペプチドの活性の増加または減少を生じてもよい。
【００８５】
本明細書に開示する数の範囲（例えば１〜１０）に対する言及はまた、その範囲内のすべての関連する数（例えば１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９および１０）およびまたその範囲内の有理数の任意の範囲（例えば２〜８、１．５〜５．５および３．１〜４．７）に関する言及も取り込み、そしてしたがって本明細書に明確に開示するすべての範囲のすべての下位範囲は、明確に開示される。これらは単に特に意図される例であり、そして列挙する最低値および最高値の間の数値のすべてのありうる組み合わせが、類似の方式で、本明細書に明確に言及されると見なされるものとする。
【００８６】
詳細な説明
ペニシリウム・パキシリにおけるＩＤＴパキシリン６ｂに関する生合成の同定６、１３−１６以来、７つの他のＩＤＴ生合成経路における遺伝子機能性が解明されてきている１７−２２。これらのＩＤＴ経路は、ＩＤＴ生合成における最初の３つの工程のための酵素をコードする、相同遺伝子を共有する（図２）：（Ｉ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）は、ファルネシルピロリン酸およびイソペンチルピロリン酸をＧＧＰＰ  １ａに変換し、（ＩＩ）ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）は、ＧＧＰＰ  １ａおよびインドール−３−グリセロールリン酸１ｂのインドール縮重を触媒して、ＧＧＩ  ２を作製し、そして（ＩＩＩ）位置選択的フラビン・アデニン二ヌクレオチド（ＦＡＤ）依存性エポキシダーゼは、単一および／または二重エポキシ化ＧＧＩ産物３ａ／３ｂを生成する。ＩＤＴ環化を伴う第四の酵素工程で、経路は４つの重要な分岐に分かれ、エミンドールＳＢ  ４ａおよびパスパリン４ｂのようなモノ／ジ酸素化アンチマルコフニコフ由来環状コア、あるいはアフラビニン４ｃおよびエミンドールＤＢ  ４ｄのようなモノ／ジ酸素化マルコフニコフ由来環状コアを生じさせる。これらの環状コアは、しばしば、装飾性酵素でさらに修飾されて、ＩＤＴに渡って見られる生物活性多様性を生成する。
【００８７】
ＮＡは、ヒポキシロン・プリシシドゥムによって産生される生物活性ＩＤＴであり、ＮＡＡ  １０は、吸血節足動物に対する殺虫活性が強力であり、そして哺乳動物毒性を欠くため、特に重要である５、８。しかし、本明細書に記載するように、直接合成によるＮＡＡ  １０の産生は達成されてきておらず、そして小規模商業レベルであっても有用である量でのこの化合物の生合成産生は、まったくではないとしても達成が困難であろう。
【００８８】
したがって、本発明は、一般的に、真菌、Ｈ．プリシシドゥム由来の一連の単離遺伝子であって、組み合わされて、ＮＡの産生を仲介する遺伝子クラスターを形成する前記単離遺伝子、および単離宿主細胞において、好ましくは単離真菌細胞において、ＮＡの異種発現を導くためのこうした遺伝子クラスターの使用に関する。最近開発された、モジュラー冪等ＤＮＡ組み立て系（ＭＩＤＡＳ）と称される、遺伝子配列を操作するための技術を用いて、本発明者らは、Ｈ．プリシシドゥム由来のＮＡＦ  ５ａのための、代替真菌宿主、ペニシリウム・パキシリにおける生合成経路を再構成した。ＭＩＤＡＳプラットホームおよびＭＩＤＡＳプラットホームを用いた方法は、本明細書、およびその全体が本明細書に援用される関連特許出願ＡＵ２０１７９０３９５５に記載される。
【００８９】
本発明者らは、Ｈ．プリシシドゥムのゲノム配列を分析し、そしてＮＡＡ  １０の生合成に必要な酵素をコードすると予測される、１５の予測されるコード配列（ＣＤＳ）：ｎｏｄＷ  ｃＤＮＡ（配列番号２）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１）、ｎｏｄＲ  ｃＤＮＡ（配列番号５）およびゲノムＤＮＡ（配列番号４）、ｎｏｄＸ  ｃＤＮＡ（配列番号８）およびゲノムＤＮＡ（配列番号７）、ｎｏｄＭ  ｃＤＮＡ（配列番号１１）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１０）、ｎｏｄＢ  ｃＤＮＡ（配列番号１４）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１３）、ｎｏｄＯ  ｃＤＮＡ（配列番号１７）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１６）、ｎｏｄＪ  ｃＤＮＡ（配列番号２０）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１９）、ｎｏｄＣ  ｃＤＮＡ（配列番号２３）およびゲノムＤＮＡ（配列番号２２）、ｎｏｄＹ１  ｃＤＮＡ（配列番号２６）およびゲノムＤＮＡ（配列番号２５）、ｎｏｄＤ２  ｃＤＮＡ（配列番号２９）およびゲノムＤＮＡ（配列番号２８）、ｎｏｄＤ１  ｃＤＮＡ（配列番号３２）およびゲノムＤＮＡ（配列番号３１）、ｎｏｄＹ２  ｃＤＮＡ（配列番号３５）およびゲノムＤＮＡ（配列番号３４）、ｎｏｄＺ  ｃＤＮＡ（配列番号３８）およびゲノムＤＮＡ（配列番号３７）、ｎｏｄＳ  ｃＤＮＡ（配列番号４９）およびゲノムＤＮＡ（配列番号４８）、ｎｏｄＩ  ｃＤＮＡ（配列番号５５）およびゲノムＤＮＡ（配列番号５４）を含むクラスターを同定した。
【００９０】
このクラスターの境界は、ノズリスポル酸を産生しない別のヒポキシロン属株における同等のゲノム遺伝子座と比較して、高い類似性および合成機構を有する隣接遺伝子を同定することによって決定された。クラスターにおけるこれらの予測される遺伝子の詳細およびその提唱される機能を表１に示す。クラスター遺伝子のうち７つは、他のＩＤＴ生合成遺伝子クラスターで見られるものと相同である（表２〜６）。他の真菌由来のＩＤＴ生合成遺伝子に相同な７つの予測される遺伝子のタンパク質産物は、Ｐ．パキシリのＰＡＸクラスター、Ｐ．ジャンチネルム（Ｐ．  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）のＪＡＮクラスター、および／またはＰ．クルストスム（Ｐ．  ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）のＰＥＮクラスターにおけるその相同体に対して、少なくとも３５％のアミノ酸同一性を有し、そしてこれには、ＧＧＴ（ＮｏｄＣ（配列番号２４））、２つのＦＡＤ依存性オキシダーゼ（ＮｏｄＭ（配列番号１２））およびＮｏｄＯ（配列番号１８））、ＩＤＴシクラーゼ（ＮｏｄＢ（配列番号１５））、２つのプレニルトランスフェラーゼ（ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、およびＮｏｄＤ１（配列番号３３））、ならびに１つのチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ（ＮｏｄＲ（配列番号６））が含まれる。他の７つの推定上のＯＲＦは、４つのチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ（ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、およびＮｏｄＺ（配列番号３９））、パラログ性ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ対（ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、およびＮｏｄＹ２（配列番号３６））、および未知の機能のＮＡ生合成に関与しうる２つの遺伝子産物（ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６））をコードすると予測された。テルペンドール生合成に関与するチャウノピクニス・アルバ（Ｃｈａｕｎｏｐｙｃｎｉｓ  ａｌｂａ）（トリポクラジウム・アルブム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ａｌｂｕｍ））由来のＴＥＲ遺伝子クラスター１７と同様、ＮＯＤクラスターは、二次代謝産物特異的ＧＧＰＰＳ遺伝子を含有しないようである。特に、本発明者らは、Ｈ．プリシシドゥムのゲノムにおいて、１つのＧＧＰＰＳコード遺伝子しか同定せず、そしてその予測されるタンパク質産物のアミノ酸配列、そのエクソン／イントロン構造、および同定されるクラスター外の位置は、該遺伝子が、Ｐ．パキシリにおけるｇｇｓ１と類似の一次代謝機能に関与することを強く示唆する２３。
【００９１】
遺伝子産物の機能を確認し、そしてＮＡＡ  １０生合成におけるそれぞれの役割を直接確立するため、本発明者らは、これらの遺伝子を多様な組み合わせで宿する一連のプラスミドを構築し、これを次いで、ＮＡＡ  １０前駆体の異種産生のため、適切なＰ．パキシリ宿主（表７）に形質転換した。したがって、関心対象のＨ．プリシシドゥム遺伝子のＣＤＳを増幅し（プライマーに関しては表８を参照されたい）、そしてＭＩＤＡＳレベル１デスティネーションベクター、ｐＭＬ１（表９）にクローニングした。ＭＩＤＡＳレベル２で、クローニングされたＣＤＳを、異種プロモーター（ＰｒｏＵＴＲ）および転写ターミネーター（ＵＴＲｔｅｒｍ）モジュールの制御下に配置して、全長ＴＵ（表１０）を生成し、次いでこれを用いて、マルチ遺伝子プラスミド（表１１）を生成した。本発明者らは、Ｐ．パキシリ・ノックアウト株のレパートリー（表７）を用いて、機能補償および経路再構築を実行して、ＮＯＤクラスターにおける遺伝子の機能を決定した。マルチ遺伝子プラスミドでのＰ．パキシリ宿主の形質転換後、本発明者らは、まず、真菌抽出物の順相薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ、結果は未提示）によって、そして続いて逆相液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析によって、形質転換体の化学的表現型を決定した。本発明者らは、高解像度質量分析（ＨＲＭＳ）によって、セミ分取逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって決定されるように、新規に発現された代謝産物を精製し、そして最終同定のため、化合物を核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析（１Ｈ、１３Ｃ、およびＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＣＯＳＹ）に供した。
【００９２】
この方法論を用いて、本発明者らは、ｎｏｄＣ（ｃＤＮＡ（配列番号２３）およびゲノムＤＮＡ（配列番号２２））は、ｐａｘＣ（ｃＤＮＡ（配列番号４３）およびゲノムＤＮＡ（配列番号４２））の機能的オルソログであり、そしてＮｏｄＣ（配列番号２４）は、Ｈ．プリシシドゥムにおけるＩＤＴ生合成の第二の工程であるＧＧＩ  ２の産生を仲介することを同定した（図３、トレースｉ．ｂ、図４）。ＮｏｄＣ（配列番号２４）は、Ｐ．パキシリ由来のＰａｘＣ（配列番号４４）と５２．３％のアミノ酸配列同一性を共有する（表２）。本発明者らはまた、ｎｏｄＭ（ｃＤＮＡ（配列番号１１）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１０））が、ｐａｘＭ（ｃＤＮＡ（配列番号４６）およびゲノムＤＮＡ（配列番号４５））の相同体であり、そしてＮｏｄＭ（配列番号１２）が、モノエポキシ化ＧＧＩ  ３ａの産生を触媒するＧＧＩ  ２モノエポキシダーゼであることも同定した（図３、トレースｉｉ．ｂ、図５）。ＮｏｄＭ（配列番号１２）は、Ｐ．パキシリ由来のＰａｘＭ（配列番号４７）と４８．６％の配列同一性を共有する（表３）。特に、本発明者らは、ＮｏｄＭ（配列番号１２）が、モノまたはジエポキシダーゼであるＰａｘＭ（配列番号４７）とは異なり、特にモノエポキシダーゼであることを示した。本発明者らはさらに、Ｈ．プリシシドゥム由来のＮｏｄＢ（配列番号１５）が、モノエポキシ化ＧＧＩ産物３ａを環化するＩＤＴシクラーゼとして働いて、エミンドールＳＢ  ４ａを形成し（図３、トレースｉｉｉ．ｂ、図６）、そしてｎоｄＢ（ｃＤＮＡ（配列番号１４）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１３））はＰ．パキシリ由来のｐａｘＢ（ｃＤＮＡ（配列番号５２）およびゲノムＤＮＡ（配列番号５１））の機能的オルソログであることをさらに確認した（図３、トレースｉｖ．ｂ、図７）。Ｈ．プリシシドゥム由来のＮｏｄＢ（配列番号１５）は、Ｐ．パキシリ由来のＰａｘＢ（配列番号５３）と、６３％の同一性を共有する（表４）。
【００９３】
特化した（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）ＮＡＡ  １０コアは、エミンドールＳＢ  ４ａの末端メチル炭素、Ｃ５”の酸化によって生成されるＮＡＦ  ５ａである（図８Ｂ）。したがって、本発明者らは、ＮＡＦ  ５ａの産生を生じる、ｐａｘＭ（ｃＤＮＡ（配列番号４６）およびゲノムＤＮＡ（配列番号４５））欠失バックグラウンド（ＰＮ２２５７）内での、ｎоｄＭ（ｃＤＮＡ（配列番号１１）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１０））とｎоｄＷ（ｃＤＮＡ（配列番号２）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１））の同時発現によって、Ｈ．プリシシドゥムｎоｄＷ（ｃＤＮＡ（配列番号２）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１））によってコードされるＰ４５０オキシゲナーゼとしてこのオキシダーゼの同一性を確認した（図３、トレースｖ．ｂ、図９）。
【００９４】
わずか５つの遺伝子がＰ．パキシリにおけるＮＡＦ  ５ａの産生に必須であることを確認し、そしてｐａｘＭ  ＫＯ株（ＰＮ２２５７）においてＰＡＸクラスター由来のいかなる他のＰ．パキシリＩＤＴ遺伝子もＮＡＦ  ５ａ産生に寄与しないことを確立するため、本発明者らは、Ｐ．パキシリ由来のｐａｘＧ（ゲノムＤＮＡ（配列番号４０））、ならびにＨ．プリシシドゥム由来のｎоｄＣ（ゲノムＤＮＡ（配列番号２２））、ｎоｄＭ（ゲノムＤＮＡ（配列番号１０））、ｎоｄＢ（ゲノムＤＮＡ（配列番号１３））、およびｎоｄＷ（ゲノムＤＮＡ（配列番号１））を含むマルチ遺伝子構築物を組み立てた。このマルチ遺伝子構築物を、Ｐ．パキシリＰＡＸ遺伝子クラスター・ノックアウト株（ＰＮ２２５０）に形質転換した。予期されるように、５つの遺伝子の発現は、ＮＡＦ  ５ａが産生されることを示し（図１０）、そしてこれらの５つの遺伝子が実際に、ＮＦＡ  ５ａの生合成に必要であることを示した。
【００９５】
本明細書に記載する研究に基づいて、本発明者らは、ＮＡＡ  １０コア化合物、ＮＡＦ  ５ａを産生する最初の５つの工程を同定するための、異種発現の使用を開示する。特に、本発明者らは、Ｈ．プリシシドゥム由来の以前は知られていなかった４つの遺伝子：ｎоｄＣ（ｃＤＮＡ（配列番号２３）およびゲノムＤＮＡ（配列番号２２））、ｎоｄＭ（ｃＤＮＡ（配列番号１１）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１０））、ｎｏｄＢ（ｃＤＮＡ（配列番号１４）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１３））、およびｎоｄＷ（ｃＤＮＡ（配列番号２）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１））の機能を確認し、そして二次代謝ＧＧＰＰＳ遺伝子を持たないようであるがなおＩＤＴを産生可能である、第二の糸状菌種Ｈ．プリシシドゥムを発見した。理論によって束縛されることは望ましくないが、本発明者らは、Ｈ．プリシシドゥムは、ＩＤＴ合成のためのＧＧＰＰを提供するため、その一次代謝ＧＧＰＰＳに頼ると考える。二次代謝ＧＧＰＰＳの欠如は、Ｈ．プリシシドゥムがこれほど少量のＮＡしか産生しないのはなぜかを説明しうる。Ｈ．プリシシドゥムによって産生されるＮＡが少量であることは、生合成の詳細を解明するためにも、そして化合物またはその誘導体の使用のためにも、どちらに関しても困難である。ＭＩＤＡＳの効率的な遺伝子再組み立ておよびＰ．パキシリにおける異種発現を用いて、本発明者らは、これらの問題の両方を克服した。さらに、本発明者らは、Ｐ．パキシリが、はるかに好ましい増殖条件を持ち、異種発現研究に適した宿主であり、本発明者らが、Ｈ．プリシシドゥムの生合成機構に頼った場合に可能であろうよりも、遺伝子の機能をより迅速に、そして容易に確認することを可能にすることを立証した。
【００９６】
Ｐ．パキシリにおけるＮＡＦ  ５ａの異種産生のための生合成経路の解明は、完全に機能化されたＮＡＡ  １０の産生を導く「装飾」工程に関与する、Ｈ．プリシシドゥム由来の遺伝子産物を完全に同定可能にする際の成功の合理的な期待を提供する。この合理的な期待は、本発明者らが、ノズリスポル酸Ｅ  ６ａを形成するプレニル化のために、そしてノズリスポル酸Ｄ  ７ａを形成する酸化のために必要な酵素をコードすると予期される核酸ＣＤＳを同定したことに由来する。これらの核酸配列の各々は、本明細書に記載するＨ．プリシシドゥム生合成遺伝子クラスターから推定して同定された。総合すると、本明細書に記載する本発明者らの研究は、異種宿主におけるＩＤＴ遺伝子の異種発現が、他の方法では得ることが困難であり、そして多くの産業に渡って有用でありうる天然産物を産生するために使用可能な、実行可能な方法であることを確認する。
【００９７】
ポリペプチド
したがって、１つの側面において、本発明は、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドに関する。
【００９８】
好ましくは、機能的変異体またはその断片は、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）からなる群より選択されるアミノ酸配列に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を含む。
【００９９】
好ましくは、ＮｏｄＷ（配列番号３）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ活性を有する。
【０１００】
好ましくは、ＮｏｄＲ（配列番号６）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ活性を有する。
【０１０１】
好ましくは、ＮｏｄＸ（配列番号９）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ活性を有する。
【０１０２】
好ましくは、ＮｏｄＭ（配列番号１２）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ活性を有する。
【０１０３】
好ましくは、ＮｏｄＢ（配列番号１５）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、シクラーゼ活性、好ましくはＩＤＴシクラーゼ活性を有する。
好ましくは、ＮｏｄＯ（配列番号１８）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ活性を有する。
【０１０４】
好ましくは、ＮｏｄＪ（配列番号２１）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ活性を有する。
【０１０５】
好ましくは、ＮｏｄＣ（配列番号２４）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、トランスフェラーゼ活性、好ましくはＧＧＴ活性を有する。
好ましくは、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ活性を有する。
【０１０６】
好ましくは、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、トランスフェラーゼ活性、好ましくはプレニルトランスフェラーゼ活性を有する。
【０１０７】
好ましくは、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、トランスフェラーゼ活性、好ましくはプレニルトランスフェラーゼ活性を有する。
【０１０８】
好ましくは、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ活性を有する。
【０１０９】
好ましくは、ＮｏｄＺ（配列番号３９）あるいはその機能的変異体または断片を含む単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ活性を有する。
【０１１０】
１つの態様において、単離ポリペプチドは、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片を含む。
【０１１１】
１つの態様において、単離ポリペプチドは、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片から本質的になる。
【０１１２】
１つの態様において、単離ポリペプチドは、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片からなる。
【０１１３】
ポリヌクレオチド
別の側面において、本発明は、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドに関する。
【０１１４】
好ましくは、その機能的変異体または断片は、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるアミノ酸配列に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を含む。
【０１１５】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ活性を有する、ＮｏｄＷ（配列番号３）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１１６】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ活性を有する、ＮｏｄＲ（配列番号６）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１１７】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ活性を有する、ＮｏｄＸ（配列番号９）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１１８】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ活性を有する、ＮｏｄＭ（配列番号１２）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１１９】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、シクラーゼ活性、好ましくはＩＤＴシクラーゼ活性を有する、ＮｏｄＢ（配列番号１５）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１２０】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ活性を有する、ＮｏｄＯ（配列番号１８）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１２１】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ活性を有する、ＮｏｄＪ（配列番号２１）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１２２】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、トランスフェラーゼ活性、好ましくはＧＧＴ活性を有する、ＮｏｄＣ（配列番号２４）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１２３】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ活性を有する、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１２４】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、トランスフェラーゼ活性、好ましくはプレニルトランスフェラーゼ活性を有する、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１２５】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、トランスフェラーゼ活性、好ましくはプレニルトランスフェラーゼ活性を有する、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１２６】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ活性を有する、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１２７】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、オキシゲナーゼ活性、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼ活性を有する、ＮｏｄＺ（配列番号３９）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１２８】
１つの態様において、単離ポリヌクレオチドは、ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片を含むポリペプチドをコードする。
【０１２９】
１つの態様において、単離ポリヌクレオチドは、ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片から本質的になるポリペプチドをコードする。
【０１３０】
１つの態様において、単離ポリヌクレオチドは、ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片からなるポリペプチドをコードする。
【０１３１】
別の側面において、本発明は、ｎｏｄＷ  ｃＤＮＡ（配列番号２）、ｎｏｄＷゲノムＤＮＡ（配列番号１）、ｎｏｄＲ  ｃＤＮＡ（配列番号５）、ｎｏｄＲゲノムＤＮＡ（配列番号４）、ｎｏｄＸ  ｃＤＮＡ（配列番号８）、ｎｏｄＸゲノムＤＮＡ（配列番号７）、ｎｏｄＭ  ｃＤＮＡ（配列番号１１）、ｎｏｄＭゲノムＤＮＡ（配列番号１０）、ｎｏｄＢ  ｃＤＮＡ（配列番号１４）、ｎｏｄＢゲノムＤＮＡ（配列番号１３）、ｎｏｄＯ  ｃＤＮＡ（配列番号１７）、ｎｏｄＯゲノムＤＮＡ（配列番号１６）、ｎｏｄＪ  ｃＤＮＡ（配列番号２０）、ｎｏｄＪゲノムＤＮＡ（配列番号１９）、ｎｏｄＣ  ｃＤＮＡ（配列番号２３）、ｎｏｄＣゲノムＤＮＡ（配列番号２２）、ｎｏｄＹ１  ｃＤＮＡ（配列番号２６）、ｎｏｄＹ１ゲノムＤＮＡ（配列番号２５）、ｎｏｄＤ２  ｃＤＮＡ（配列番号２９）、ｎｏｄＤ２ゲノムＤＮＡ（配列番号２８）、ｎｏｄＤ１  ｃＤＮＡ（配列番号３２）、ｎｏｄＤ１ゲノムＤＮＡ（配列番号３１）、ｎｏｄＹ２  ｃＤＮＡ（配列番号３５）、ｎｏｄＹ２ゲノムＤＮＡ（配列番号３４）、ｎｏｄＺ  ｃＤＮＡ（配列番号３８）、ｎｏｄＺゲノムＤＮＡ（配列番号３７）、ｎｏｄＳ  ｃＤＮＡ（配列番号４９）、ｎｏｄＳゲノムＤＮＡ（配列番号４８）、ｎｏｄＩ  ｃＤＮＡ（配列番号５５）、およびｎｏｄＩゲノムＤＮＡ（配列番号５４）からなる群より選択される核酸配列に、少なくとも７０％の核酸配列同一性を含む、単離ポリヌクレオチドに関する。
【０１３２】
好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、配列番号：ｎｏｄＷ  ｃＤＮＡ（配列番号２）、ｎｏｄＷゲノムＤＮＡ（配列番号１）、ｎｏｄＲ  ｃＤＮＡ（配列番号５）、ｎｏｄＲゲノムＤＮＡ（配列番号４）、ｎｏｄＸ  ｃＤＮＡ（配列番号８）、ｎｏｄＸゲノムＤＮＡ（配列番号７）、ｎｏｄＭ  ｃＤＮＡ（配列番号１１）、ｎｏｄＭゲノムＤＮＡ（配列番号１０）、ｎｏｄＢ  ｃＤＮＡ（配列番号１４）、ｎｏｄＢゲノムＤＮＡ（配列番号１３）、ｎｏｄＯ  ｃＤＮＡ（配列番号１７）、ｎｏｄＯゲノムＤＮＡ（配列番号１６）、ｎｏｄＪ  ｃＤＮＡ（配列番号２０）、ｎｏｄＪゲノムＤＮＡ（配列番号１９）、ｎｏｄＣ  ｃＤＮＡ（配列番号２３）、ｎｏｄＣゲノムＤＮＡ（配列番号２２）、ｎｏｄＹ１  ｃＤＮＡ（配列番号２６）、ｎｏｄＹ１ゲノムＤＮＡ（配列番号２５）、ｎｏｄＤ２  ｃＤＮＡ（配列番号２９）、ｎｏｄＤ２ゲノムＤＮＡ（配列番号２８）、ｎｏｄＤ１  ｃＤＮＡ（配列番号３２）、ｎｏｄＤ１ゲノムＤＮＡ（配列番号３１）、ｎｏｄＹ２  ｃＤＮＡ（配列番号３５）、ｎｏｄＹ２ゲノムＤＮＡ（配列番号３４）、ｎｏｄＺ  ｃＤＮＡ（配列番号３８）、ｎｏｄＺゲノムＤＮＡ（配列番号３７）、ｎｏｄＳ  ｃＤＮＡ（配列番号４９）、ｎｏｄＳゲノムＤＮＡ（配列番号４８）、ｎｏｄＩ  ｃＤＮＡ（配列番号５５）、およびｎｏｄＩゲノムＤＮＡ（配列番号５４）からなる群より選択される核酸配列に、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の核酸配列同一性を含む。
【０１３３】
１つの態様において、単離ポリヌクレオチドは、ｎｏｄＷ  ｃＤＮＡ（配列番号２）、ｎｏｄＷゲノムＤＮＡ（配列番号１）、ｎｏｄＲ  ｃＤＮＡ（配列番号５）、ｎｏｄＲゲノムＤＮＡ（配列番号４）、ｎｏｄＸ  ｃＤＮＡ（配列番号８）、ｎｏｄＸゲノムＤＮＡ（配列番号７）、ｎｏｄＭ  ｃＤＮＡ（配列番号１１）、ｎｏｄＭゲノムＤＮＡ（配列番号１０）、ｎｏｄＢ  ｃＤＮＡ（配列番号１４）、ｎｏｄＢゲノムＤＮＡ（配列番号１３）、ｎｏｄＯ  ｃＤＮＡ（配列番号１７）、ｎｏｄＯゲノムＤＮＡ（配列番号１６）、ｎｏｄＪ  ｃＤＮＡ（配列番号２０）、ｎｏｄＪゲノムＤＮＡ（配列番号１９）、ｎｏｄＣ  ｃＤＮＡ（配列番号２３）、ｎｏｄＣゲノムＤＮＡ（配列番号２２）、ｎｏｄＹ１  ｃＤＮＡ（配列番号２６）、ｎｏｄＹ１ゲノムＤＮＡ（配列番号２５）、ｎｏｄＤ２  ｃＤＮＡ（配列番号２９）、ｎｏｄＤ２ゲノムＤＮＡ（配列番号２８）、ｎｏｄＤ１  ｃＤＮＡ（配列番号３２）、ｎｏｄＤ１ゲノムＤＮＡ（配列番号３１）、ｎｏｄＹ２  ｃＤＮＡ（配列番号３５）、ｎｏｄＹ２ゲノムＤＮＡ（配列番号３４）、ｎｏｄＺ  ｃＤＮＡ（配列番号３８）、ｎｏｄＺゲノムＤＮＡ（配列番号３７）、ｎｏｄＳ  ｃＤＮＡ（配列番号４９）、ｎｏｄＳゲノムＤＮＡ（配列番号４８）、ｎｏｄＩ  ｃＤＮＡ（配列番号５５）、およびｎｏｄＩゲノムＤＮＡ（配列番号５４）からなる群より選択される核酸配列を含む。
【０１３４】
１つの態様において、単離ポリヌクレオチドは、ｎｏｄＷ  ｃＤＮＡ（配列番号２）、ｎｏｄＷゲノムＤＮＡ（配列番号１）、ｎｏｄＲ  ｃＤＮＡ（配列番号５）、ｎｏｄＲゲノムＤＮＡ（配列番号４）、ｎｏｄＸ  ｃＤＮＡ（配列番号８）、ｎｏｄＸゲノムＤＮＡ（配列番号７）、ｎｏｄＭ  ｃＤＮＡ（配列番号１１）、ｎｏｄＭゲノムＤＮＡ（配列番号１０）、ｎｏｄＢ  ｃＤＮＡ（配列番号１４）、ｎｏｄＢゲノムＤＮＡ（配列番号１３）、ｎｏｄＯ  ｃＤＮＡ（配列番号１７）、ｎｏｄＯゲノムＤＮＡ（配列番号１６）、ｎｏｄＪ  ｃＤＮＡ（配列番号２０）、ｎｏｄＪゲノムＤＮＡ（配列番号１９）、ｎｏｄＣ  ｃＤＮＡ（配列番号２３）、ｎｏｄＣゲノムＤＮＡ（配列番号２２）、ｎｏｄＹ１  ｃＤＮＡ（配列番号２６）、ｎｏｄＹ１ゲノムＤＮＡ（配列番号２５）、ｎｏｄＤ２  ｃＤＮＡ（配列番号２９）、ｎｏｄＤ２ゲノムＤＮＡ（配列番号２８）、ｎｏｄＤ１  ｃＤＮＡ（配列番号３２）、ｎｏｄＤ１ゲノムＤＮＡ（配列番号３１）、ｎｏｄＹ２  ｃＤＮＡ（配列番号３５）、ｎｏｄＹ２ゲノムＤＮＡ（配列番号３４）、ｎｏｄＺ  ｃＤＮＡ（配列番号３８）、ｎｏｄＺゲノムＤＮＡ（配列番号３７）、ｎｏｄＳ  ｃＤＮＡ（配列番号４９）、ｎｏｄＳゲノムＤＮＡ（配列番号４８）、ｎｏｄＩ  ｃＤＮＡ（配列番号５５）、およびｎｏｄＩゲノムＤＮＡ（配列番号５４）からなる群より選択される核酸配列から本質的になる。
【０１３５】
１つの態様において、単離ポリヌクレオチドは、ｎｏｄＷ  ｃＤＮＡ（配列番号２）、ｎｏｄＷゲノムＤＮＡ（配列番号１）、ｎｏｄＲ  ｃＤＮＡ（配列番号５）、ｎｏｄＲゲノムＤＮＡ（配列番号４）、ｎｏｄＸ  ｃＤＮＡ（配列番号８）、ｎｏｄＸゲノムＤＮＡ（配列番号７）、ｎｏｄＭ  ｃＤＮＡ（配列番号１１）、ｎｏｄＭゲノムＤＮＡ（配列番号１０）、ｎｏｄＢ  ｃＤＮＡ（配列番号１４）、ｎｏｄＢゲノムＤＮＡ（配列番号１３）、ｎｏｄＯ  ｃＤＮＡ（配列番号１７）、ｎｏｄＯゲノムＤＮＡ（配列番号１６）、ｎｏｄＪ  ｃＤＮＡ（配列番号２０）、ｎｏｄＪゲノムＤＮＡ（配列番号１９）、ｎｏｄＣ  ｃＤＮＡ（配列番号２３）、ｎｏｄＣゲノムＤＮＡ（配列番号２２）、ｎｏｄＹ１  ｃＤＮＡ（配列番号２６）、ｎｏｄＹ１ゲノムＤＮＡ（配列番号２５）、ｎｏｄＤ２  ｃＤＮＡ（配列番号２９）、ｎｏｄＤ２ゲノムＤＮＡ（配列番号２８）、ｎｏｄＤ１  ｃＤＮＡ（配列番号３２）、ｎｏｄＤ１ゲノムＤＮＡ（配列番号３１）、ｎｏｄＹ２  ｃＤＮＡ（配列番号３５）、ｎｏｄＹ２ゲノムＤＮＡ（配列番号３４）、ｎｏｄＺ  ｃＤＮＡ（配列番号３８）、ｎｏｄＺゲノムＤＮＡ（配列番号３７）、ｎｏｄＳ  ｃＤＮＡ（配列番号４９）、ｎｏｄＳゲノムＤＮＡ（配列番号４８）、ｎｏｄＩ  ｃＤＮＡ（配列番号５５）、およびｎｏｄＩゲノムＤＮＡ（配列番号５４）からなる群より選択される核酸配列からなる。
【０１３６】
本発明のまたはそうでなければ本明細書に記載される核酸分子は、好ましくは単離されている。これらは、一般の当業者に知られる多様な技術を用いて、生物学的試料から単離されていてもよい。例えば、こうしたポリヌクレオチドは、当該技術分野に知られるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を通じて単離されていてもよい。本発明のポリヌクレオチド配列に由来する、本明細書に定義するようなプライマーを用いて、本発明の核酸分子を増幅してもよい。
【０１３７】
ポリヌクレオチドを単離するためのさらなる方法には、ハイブリダイゼーションプローブとしての、本発明のポリヌクレオチドのすべてまたは一部の使用が含まれる。ニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜などの固体支持体上に固定されたポリヌクレオチドに標識ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる技術を用いて、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよい。同様に、プローブをビーズにカップリングして、そしてターゲット配列にハイブリダイズさせてもよい。磁気分離などの当該技術分野に知られるプロトコルを用いて、単離を達成してもよい。適切にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の選択は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。
【０１３８】
制限エンドヌクレアーゼ消化およびオリゴヌクレオチド合成などの当該技術分野に周知の技術によって、ポリヌクレオチド断片を産生してもよい。
試料において、対応する全長ポリヌクレオチド配列を同定するため、当該技術分野に周知の方法において、部分的なポリヌクレオチド配列をプローブとして用いてもよい。こうした方法には、当該技術分野に知られるようなＰＣＲに基づく方法、５’ＲＡＣＥおよびハイブリダイゼーションに基づく方法、コンピュータ／データベースに基づく方法が含まれる。検出可能標識、例えば放射性同位体、蛍光、化学発光および生物発光標識を用いて、検出を容易にしてもよい。逆ＰＣＲはまた、当該技術分野において知られ、そして用いられるように、既知の領域に基づくプライマーから出発して、本明細書に開示するポリヌクレオチド配列に隣接する未知の配列の獲得を可能にする。該方法は、いくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域における適切な断片を生成する。次いで、分子内連結によって、断片を環状化して、そしてＰＣＲテンプレートとして用いる。既知の領域から、発散性（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）プライマーを設計する。全長クローンを物理的に組み立てるため、当該技術分野に知られるような標準的な分子生物学アプローチを利用してもよい。本発明のポリヌクレオチドの増幅を可能にするプライマーおよびプライマー対もまた、本発明のさらなる側面を形成する。
【０１３９】
記載する方法によって、変異体（オルソログを含む）を同定してもよい。当該技術分野に知られるようなＰＣＲに基づく方法を用いて、変異体ポリヌクレオチドを同定してもよい。典型的には、ＰＣＲによってポリヌクレオチド分子の変異体を増幅するために有用なプライマーのポリヌクレオチド配列は、対応するアミノ酸配列の保存された領域をコードする配列に基づいてもよい。
【０１４０】
変異体ポリヌクレオチドを同定するためのさらなる方法には、上述のようなゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとしての明記するポリヌクレオチドのすべてまたは部分の使用が含まれる。典型的には、対応するアミノ酸配列の保存される領域をコードする配列に基づくプローブを用いてもよい。ハイブリダイゼーション条件はまた、プローブと同一の配列に関してスクリーニングする際に用いるものよりも、よりストリンジェントでなくてもよい。
【０１４１】
別の側面において、本発明は、本明細書に記載するような少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを含むＴＵに関する。１つの態様において、ＴＵは、ベクター、好ましくは発現ベクター中に含まれる。１つの態様において、ベクターは、プラスミド、ＢＡＣ、（ＰＡＣ）、ＹＡＣ、バクテリオファージ、ファージミド、およびコスミドからなる群より選択される。好ましくは、ベクターはプラスミドである。
【０１４２】
別の側面において、本発明は、本発明記載の単離ポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片をコードするベクターに関する。
別の側面において、本発明は、本発明記載の単離核酸配列を含むベクターに関する。
【０１４３】
１つの態様において、単離核酸配列は、ＴＵ中に含まれる。
１つの態様において、ベクターは、プラスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、バクテリオファージ、ファージミド、およびコスミドからなる群より選択される。好ましくは、ベクターはプラスミドである。１つの態様において、ベクターは発現ベクターである。
【０１４４】
本発明のポリヌクレオチドを含むＴＵを、そのポリヌクレオチド、または適用可能な場合には、本発明のコードされるポリペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または宿主細胞において、発現可能な任意の適切なベクター内に取り込んでもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。適切な発現ベクターの例には、限定されるわけではないが、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスベクター）が含まれる。いくつかの態様において、プラスミドおよび／またはファージベクターを、以下のｐＵＣ１８、ｐＵ１９、Ｍｐ１８、Ｍｐ１９、ＣｏｌＥ１、ＰＣＲ１およびｐＫＲＣ；ラムダｇｔ１０およびＭ１３プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＴ１２７、ＲＰ４、ｐ１Ｊ１０１、ＳＶ４０およびＢＰＶを含むベクターまたはその変異体から選択してもよい。やはり含まれるのは、限定されるわけではないが、例えばコスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣシャトルベクター、例えばｐＳＡ３、ＰＡＴ２８トランスポゾン（例えばＵＳ  ５，７９２，２９４に記載されるようなもの）等のベクターである。
【０１４５】
適切なウイルスベクターには、限定されるわけではないが、アデノウイルス（ＡＶ）：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えばレンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、ネズミ白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等に由来するベクターが含まれる。本明細書で使用するウイルスベクターを、当該技術分野に知られ、そして用いられるように、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質または他の表面抗原でシュードタイプ化することによって、あるいは異なるウイルスカプシドタンパク質で置換することによって、適切に修飾してもよい。
【０１４６】
１つの態様において、発現ベクターは、本明細書に記載するような、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つ、好ましくは少なくとも８つ、好ましくは少なくとも９つ、好ましくは少なくとも１０の単離ポリヌクレオチドを含む。
【０１４７】
１つの態様において、発現ベクターは、本明細書に記載するような、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つ、好ましくは少なくとも８つ、好ましくは少なくとも９つ、好ましくは少なくとも１０のＴＵを含む。
【０１４８】
１つの態様において、ベクターはクローニング系の構成要素である。１つの態様において、クローニング系は、少なくとも１つのＴＵを含む遺伝子構築物を作製するために有用である。
【０１４９】
１つの態様において、ベクターはベクターセット中に含まれ、ベクターセットはクローニング系の一部である。１つの態様において、クローニング系は、少なくとも１つのＴＵを含む遺伝子構築物を作製するために有用である。
【０１５０】
１つの態様において、クローニング系は、少なくとも１つのＴＵを含む遺伝子構築物を作製するために有用である。
１つの態様において、遺伝子構築物は、少なくとも２つのＴＵを含むマルチ遺伝子構築物である。１つの態様において、マルチ遺伝子構築物は、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つ、好ましくは少なくとも８つ、好ましくは少なくとも９つ、好ましくは少なくとも１０のＴＵを含む。
【０１５１】
本明細書に記載するＴＵは、本発明の開示するポリヌクレオチド配列および／または本発明の開示するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つまたはそれより多くを含んでもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで、ＮＡＡ  １０の生合成に関与する少なくとも１つのポリペプチドの発現を駆動するように、ＴＵを構築してもよい。１つの態様において、ＴＵは、５’または３’非翻訳制御配列に機能可能であるように連結された本発明のポリヌクレオチドを含む。特定のＴＵの設計は、機能可能であるように連結されたポリヌクレオチドを発現しようとする宿主細胞、およびポリヌクレオチド発現の望ましいレベルを含む、多様な要因に依存するであろう。
【０１５２】
同様に、ＴＵに関する多様なプロモーター、エンハンサーおよび／または他の遺伝子要素の選択は、上に論じる、宿主細胞および発現レベルを含む、多様な要因に依存するであろう。１つの態様において、ＴＵは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能であるように連結された同種プロモーターを含む。別の態様において、発現カセットは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能であるように連結された異種プロモーターを含む。１つの態様において、同種または異種プロモーターは、誘導性、抑制性または制御可能プロモーターである。本発明のポリヌクレオチドの高レベル発現を導くために適した条件下で、適切なプロモーターを選択し、そして用いてもよい。多くのこうした要素が文献に記載され、そして商業的供給者を通じて入手可能である。
【０１５３】
例としてのみであるが、発現カセットにおいて有用なプロモーターは、任意の適切な真核または原核プロモーターであってもよい。１つの態様において、真核プロモーターは、真核ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐоｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐоｌ  ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐоｌ  ＩＩＩ）であってもよい。特定の細胞タイプにおいて、機能可能であるように連結されたポリヌクレオチドの発現レベルは、特定の遺伝子制御配列（例えばエンハンサー、サイレンサー等）の近傍の存在（または非存在）によって決定されるであろう。任意の適切なプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（真核プロモーターデータベースＥＰＤＢを参照されたい）を用いて、本発明のポリヌクレオチドの発現を駆動してもよい。
【０１５４】
発現カセットにおいて有用なさらなるプロモーターには、すべて当該技術分野に周知である、β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、トリプトファン、およびｔａｃプロモーター系が含まれる。酵母プロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、エノラーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グルコキナーゼ、およびグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
発現カセットにおいて有用な原核プロモーターには、当該技術分野に知られるような恒常的プロモーター（例えばバクテリオファージ・ラムダのｉｎｔプロモーターおよびｐＢＲのベータ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター）および制御可能プロモーター（例えばｌａｃＺ、ｒｅｃＡおよびｇａｌ）が含まれる。ＣＤＳ上流のリボソーム結合部位もまた、発現に必要でありうる。
【０１５６】
ＴＵにおいて有用なエンハンサーには、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、グロビン、アルブミン、インスリン等が含まれる。
１つの態様において、ＴＵは、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系によって駆動されてもよい。
【０１５７】
タンパク質発現のための特定のプロモーター／エンハンサー／細胞タイプの組み合わせの選択は、分子生物学の当業者の一般的な技術範囲内である（例えば、本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい）。
【０１５８】
別の側面において、本発明は、本発明記載の単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチド、ＴＵおよび／または単離ベクターを含む、単離宿主細胞に関する。
１つの態様において、単離宿主細胞は、原核または真核細胞である。宿主細胞として最も一般的に使用される原核生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の株である。他の原核宿主には、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５９】
１つの態様において、真核細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞または原生動物細胞である。１つの態様において、動物細胞は昆虫細胞または哺乳動物細胞である。１つの態様において、真菌細胞は単細胞真菌宿主株の単細胞である。１つの態様において、真菌細胞は、真菌菌糸または真菌宿主株の菌糸体を含む。
【０１６０】
１つの態様において、真菌細胞、真菌宿主細胞株の菌糸または菌糸体は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、モルティエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、エレモセシウム属（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ）、トリコプルシア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）、アシュビア属（Ａｓｈｂｙａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、モナスクス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリプトネクトリア属（Ｃｒｙｐｔｏｎｅｃｔｒｉａ）、エンドシア属（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）、ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）、フラムリナ属（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、アウリクラリア属（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）、ガノデルマ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）、（リゾ）ムコル属（（Ｒｈｉｚｏ）ｍｕｃｏｒ）、リオプス属（Ｒｉｏｐｕｓ）、またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来であり、好ましくはペニシリウム属、アスペルギルス属、サッカロミセス属、ピキア属、トリコプルシア属、およびスポンドプテラ属（Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ）由来である。好ましくは、真菌細胞はサッカロミセス属由来である。好ましくは、真菌菌糸または菌糸体は、ペニシリウム属、好ましくはＰ．パキシリ由来である。
【０１６１】
別の側面において、本発明は、単離宿主細胞において、本発明記載の少なくとも１つのポリペプチド、単離核酸配列、ＴＵまたはベクターを異種発現する工程を含む、少なくとも１つのＮＡを作製する方法に関する。
【０１６２】
１つの態様において、ＮＡは、図１に示すＮＡの群より選択される。好ましくは、ＮＡはＮＡＦ  ５ａまたはＮＡＡ  １０、好ましくはＮＡＡ  １０である。
１つの態様において、ポリペプチドは、本発明記載のポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片である。
【０１６３】
本発明のこの側面内の態様として特に意図されるのは、異種発現（適切な制御配列の選択を含む）、発現カセット、遺伝子要素、ＴＵ、マルチ遺伝子構築物、宿主細胞、およびベクターに関連する本発明の任意の他の側面に関して、本明細書に示す多様な態様である。
【０１６４】
特定の態様において、ポリペプチドの異種発現は、本発明記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、または本発明の少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのＴＵの、本明細書に記載するような単離真菌宿主細胞または単離真菌株の菌糸体における、本明細書に記載するような少なくとも１つのベクターからの発現を含む。１つの態様において、ポリペプチドは、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、またはＮｏｄＺ（配列番号３９）であり、好ましくは、ポリペプチドは、ＮＡＢ  ９のＮＡＡ  １０への生物学的転換を触媒する酵素である。１つの態様において、真菌細胞または株は、ペニシリウム属、好ましくはＰ．パキシリの細胞または株である。
【０１６５】
１つの態様において、ＴＵは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、および／または少なくとも１０の本発明記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むマルチ遺伝子構築物中に含まれる。
【０１６６】
別の側面において、本発明は、本発明の方法によって作製された少なくとも１つのＮＡに関する。１つの態様において、ＮＡは、図１に示すＮＡの群より選択される。好ましくは、ＮＡは、ＮＡＦ  ５ａまたはＮＡＡ  １０であり、好ましくはＮＡＡ  １０である。
【０１６７】
別の側面において、本発明は、ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路における生化学反応を触媒する、ヒポキシロン属種由来の単離ポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片に関する。
【０１６８】
別の側面において、本発明は、ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路における生化学反応を触媒する、ヒポキシロン属種由来の少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
【０１６９】
１つの態様において、単離ポリペプチドは、オキシゲナーゼ、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼまたはＦＡＤ依存性オキシゲナーゼである。好ましくは、チトクロームＰ４５０オキシゲナーゼは、ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、またはＮｏｄＺ（配列番号３９）である。好ましくは、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼは、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、またはＮｏｄＹ２（配列番号３６）である。１つの態様において、単離ポリペプチドは、トランスフェラーゼ、好ましくはＧＧＴ、またはプレニルトランスフェラーゼである。好ましくは、ＧＧＴはＮｏｄＣ（配列番号２４）である。好ましくは、プレニルトランスフェラーゼはＮｏｄＤ１（配列番号３３）、またはＮｏｄＤ２（配列番号３０）である。１つの態様において、単離ポリペプチドはＩＤＴシクラーゼである。好ましくは、ＩＤＴシクラーゼはＮｏｄＢ（配列番号１５）である。１つの態様において、単離ポリペプチドはＮｏｄＳ（配列番号５０）である。１つの態様において、単離ポリペプチドはＮｏｄＩ（配列番号５６）である。
【０１７０】
１つの態様において、単離ポリペプチドは、ＧＧＩ  ２からＮＡＦ  ５ａを導く生合成経路における生化学反応を触媒する。好ましくは、単離ポリペプチドは、ＧＧＴ、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ、ＩＤＴシクラーゼ、またはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼである。好ましくは、ＧＧＴはＮｏｄＣ（配列番号２４）である。好ましくは、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼはＮｏｄＭ（配列番号１２）である。好ましくは、ＩＤＴシクラーゼはＮｏｄＢ（配列番号１５）である。好ましくは、チトクロームＰ４５０オキシゲナーゼはＮｏｄＷ（配列番号３）である。
【０１７１】
１つの態様において、単離ポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片は、本発明記載の核酸によってコードされる。
別の側面において、本発明は、単離宿主細胞において、本発明記載の単離核酸配列、ＴＵまたはベクターを異種発現する工程を含む、少なくとも１つのヒポキシロン属種ポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片を作製する方法に関する。
【０１７２】
１つの態様において、少なくとも１つのヒポキシロン属種ポリペプチドは、本発明の任意の他の側面に関して本明細書に意図するような、本発明記載のポリペプチドである。
１つの態様において、少なくとも１つのヒポキシロン属種ポリペプチドは、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）あるいはその機能的変異体または断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）から本質的になるかまたは該配列からなる。１つの態様において、単離宿主細胞は、ペニシリウム属、好ましくはＰ．パキシリの真菌菌糸体を含む。
【０１７３】
本発明のこの側面に関して特に意図されるのは、異種発現（適切な制御配列の選択を含む）、遺伝子要素、ＴＵ、マルチ遺伝子構築物、宿主細胞、およびベクターに関連する、本発明の任意の他の側面に関して示す多様な態様である。
【０１７４】
別の側面において、本発明は、ＧＧＩ  ２からＮＡＡ  １０を導く生合成経路における生化学反応を触媒する少なくとも１つのポリペプチドを、単離宿主細胞において異種発現する工程を含む、少なくとも１つのＮＡを作製する方法に関する。
【０１７５】
１つの態様において、少なくとも１つのポリペプチドは、オキシゲナーゼ、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼまたはＦＡＤ依存性オキシゲナーゼである。好ましくは、チトクロームＰ４５０オキシゲナーゼは、ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、またはＮｏｄＺ（配列番号３９）である。好ましくは、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼは、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、またはＮｏｄＹ２（配列番号３６）である。１つの態様において、単離ポリペプチドは、トランスフェラーゼ、好ましくはＧＧＴ、またはプレニルトランスフェラーゼである。好ましくは、ＧＧＴはＮｏｄＣ（配列番号２４）である。好ましくは、プレニルトランスフェラーゼはＮｏｄＤ１（配列番号３３）、またはＮｏｄＤ２（配列番号３０）である。１つの態様において、単離ポリペプチドはＩＤＴシクラーゼである。好ましくは、ＩＤＴシクラーゼはＮｏｄＢ（配列番号１５）である。１つの態様において、単離ポリペプチドはＮｏｄＳ（配列番号５０）である。１つの態様において、単離ポリペプチドはＮｏｄＩ（配列番号５６）である。
【０１７６】
１つの態様において、少なくとも１つのポリペプチドは、ＧＧＩ  ２からＮＡＦ  ５ａを導く生合成経路における生化学反応を触媒する。好ましくは、少なくとも１つのポリペプチドは、ＧＧＴ、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ、ＩＤＴシクラーゼ、またはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼである。好ましくは、ＧＧＴはＮｏｄＣ（配列番号２４）である。好ましくは、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼはＮｏｄＭ（配列番号１２）である。好ましくは、ＩＤＴシクラーゼはＮｏｄＢ（配列番号１５）である。好ましくは、チトクロームＰ４５０オキシゲナーゼはＮｏｄＷ（配列番号３）である。
【０１７７】
１つの態様において、少なくとも１つのポリペプチドは、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）あるいはその機能的変異体または断片のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）から本質的になるかまたは該配列からなる。１つの態様において、単離宿主細胞は、ペニシリウム属、好ましくはＰ．パキシリの真菌菌糸体を含む。
【０１７８】
本発明のこの側面に関して特に意図されるのは、異種発現（適切な制御配列の選択を含む）、遺伝子要素、ＴＵ、マルチ遺伝子構築物、宿主細胞、およびベクターに関連する、本発明の任意の他の側面に関して示す多様な態様である。
【０１７９】
別の側面において、本発明は、ＮＡＡ  １０の形成を導く生合成経路における基質の転換を触媒する少なくとも１つの異種ポリペプチドを発現する単離宿主細胞に関する。
１つの態様において、少なくとも１つの異種ポリペプチドは、ＮＡＦ  ５ａの形成を導く生合成経路において、基質の転換を触媒する。
【０１８０】
１つの態様において、基質は、ＧＧＰＰ  １ａ、インドール−３−グリセロールリン酸１ｂ、ＧＧＩ  ２、モノエポキシ化ＧＧＩ  ３ａ、エミンドールＳＢ  ４ａ、ＮＡＦ  ５ａ、ＮＡＥ  ６ａ、ＮＡＤ  ７ａ、ＮＡＣ  ８、およびＮＡＢ  ９からなる群より選択される。
【０１８１】
１つの態様において、転換は、縮合、酸化、または環化からなる群より選択される。
１つの態様において、転換される基質はＧＧＰＰ  １ａおよびインドール−３−グリセロールリン酸１ｂであり、そして転換は縮合である。
【０１８２】
１つの態様において、転換される基質はＧＧＩ  ２であり、そして転換は酸化である。
１つの態様において、転換される基質はモノエポキシ化ＧＧＩ  ３ａであり、そして転換は環化である。
【０１８３】
１つの態様において、転換される基質はエミンドールＳＢ  ４ａであり、そして転換は酸化である。
１つの態様において、転換される基質はＮＡＦ  ５ａであり、そして転換は縮合である。
【０１８４】
１つの態様において、転換される基質はＮＡＥ  ６ａであり、そして転換は酸化である。
１つの態様において、転換される基質はＮＡＤ  ７ａであり、そして転換は酸化および縮合である。
【０１８５】
１つの態様において、転換される基質はＮＡＣ  ８であり、そして転換は酸化である。
１つの態様において、転換される基質はＮＡＢ  ９であり、そして転換は酸化である。
別の側面において、本発明は、異種発現によって、ＮＡＡ  １０を導く生合成経路に関与する少なくとも１つのポリペプチドを産生する、単離宿主細胞に関する。
【０１８６】
１つの態様において、少なくとも１つのポリペプチドは、ＧＧＩ  ２からＮＡＦ  ５ａを導く生合成経路における生化学反応を触媒する。好ましくは、少なくとも１つのポリペプチドは、ＧＧＴ、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ、ＩＤＴシクラーゼ、またはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼである。好ましくは、ＧＧＴはＮｏｄＣ（配列番号２４）である。好ましくは、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼはＮｏｄＭ（配列番号１２）である。好ましくは、ＩＤＴシクラーゼはＮｏｄＢ（配列番号１５）である。好ましくは、チトクロームＰ４５０オキシゲナーゼはＮｏｄＷ（配列番号３）である。
【０１８７】
本発明のこの側面に関して特に意図されるいくつかの態様において、少なくとも１つのポリペプチドは、本発明の任意の他の側面に関して、本明細書に定義するような、ＮＡＡ  １０を導く生合成経路において関与するポリペプチドである。
【０１８８】
１つの態様において、少なくとも１つのポリペプチドは、本発明のポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片である。１つの態様において、ポリペプチドあるいはその機能的変異体または断片は、本発明の核酸配列によってコードされる。
【０１８９】
１つの態様において、少なくとも１つのポリペプチドは、ＮＡＦ  ５ａを導く生合成経路に関与する。１つの態様において、少なくとも１つのポリペプチドは、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）あるいはその機能的変異体または断片のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）から本質的になるかまたは該配列からなる。１つの態様において、単離宿主細胞は、ペニシリウム属、好ましくはＰ．パキシリの真菌菌糸体を含む。
【０１９０】
本発明のこの側面に関して特に意図されるのは、異種発現（適切な制御配列の選択を含む）、遺伝子要素、ＴＵ、マルチ遺伝子構築物、宿主細胞、およびベクターに関連する本発明の任意の他の側面に関して示す多様な態様である。
【０１９１】
別の側面において、本発明は、基質が少なくとも１つのＮＡに代謝されるように、形質転換前の細胞と比較して、ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるポリペプチドのレベルまたは活性の増加を生じる核酸で形質転換された組換え細胞と、基質を含む炭水化物を接触させる工程を含む、少なくとも１つのＮＡを産生する方法に関する。
【０１９２】
１つの態様において、核酸は、ＧＧＩ  ２からＮＡＦ  ５ａを導く生合成経路における生化学反応を触媒する、好ましくは、エミンドールＳＢ  ４ａからＮＡＦ  ５ａを導く生化学反応を触媒する、少なくとも１つのポリペプチドをコードする。
【０１９３】
１つの態様において、組換え宿主細胞は、本明細書に記載するような本発明の単離宿主細胞である。
１つの態様において、炭水化物は培地中に含まれる。１つの態様において、培地はＣＤＹＥまたは組換え細胞の増殖を支持するその変形である。
【０１９４】
１つの態様において、核酸は、オキシゲナーゼ、好ましくはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼまたはＦＡＤ依存性オキシゲナーゼである、少なくとも１つのポリペプチドをコードする。好ましくは、チトクロームＰ４５０オキシゲナーゼは、ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、またはＮｏｄＺ（配列番号３９）である。好ましくは、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼは、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、またはＮｏｄＹ２（配列番号３６）である。１つの態様において、単離ポリペプチドは、トランスフェラーゼ、好ましくはＧＧＴ、またはプレニルトランスフェラーゼである。好ましくは、ＧＧＴはＮｏｄＣ（配列番号２４）である。好ましくは、プレニルトランスフェラーゼはＮｏｄＤ１（配列番号３３）、またはＮｏｄＤ２（配列番号３０）である。１つの態様において、単離ポリペプチドはＩＤＴシクラーゼである。好ましくは、ＩＤＴシクラーゼはＮｏｄＢ（配列番号１５）である。１つの態様において、単離ポリペプチドはＮｏｄＳ（配列番号５０）である。１つの態様において、単離ポリペプチドはＮｏｄＩ（配列番号５６）である。
【０１９５】
１つの態様において、核酸は、少なくとも１つのＧＧＴ、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ、ＩＤＴシクラーゼ、またはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼをコードする。１つの態様において、核酸は、ＧＧＴ、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼ、ＩＤＴシクラーゼ、またはチトクロームＰ４５０オキシゲナーゼの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは４つすべてをコードする。好ましくは、ＧＧＴはＮｏｄＣ（配列番号２４）である。好ましくは、ＦＡＤ依存性オキシゲナーゼはＮｏｄＭ（配列番号１２）である。好ましくは、ＩＤＴシクラーゼはＮｏｄＢ（配列番号１５）である。好ましくは、チトクロームＰ４５０オキシゲナーゼはＮｏｄＷ（配列番号３）である。
【０１９６】
１つの態様において、ＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片からなる群より選択されるポリペプチドは、本発明のＮｏｄＷ（配列番号３）、ＮｏｄＲ（配列番号６）、ＮｏｄＸ（配列番号９）、ＮｏｄＭ（配列番号１２）、ＮｏｄＢ（配列番号１５）、ＮｏｄＯ（配列番号１８）、ＮｏｄＪ（配列番号２１）、ＮｏｄＣ（配列番号２４）、ＮｏｄＹ１（配列番号２７）、ＮｏｄＤ２（配列番号３０）、ＮｏｄＤ１（配列番号３３）、ＮｏｄＹ２（配列番号３６）、ＮｏｄＺ（配列番号３９）、ＮｏｄＳ（配列番号５０）、およびＮｏｄＩ（配列番号５６）あるいはその機能的変異体または断片のアミノ酸配列を含む。
【０１９７】
１つの態様において、ポリペプチドは、ＮｏｄＷ（配列番号３）あるいはその機能的変異体または断片のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：ＮｏｄＷ（配列番号３）から本質的になるかまたは該配列からなる。１つの態様において、単離宿主細胞は、ペニシリウム属、好ましくはＰ．パキシリの真菌菌糸体を含む。
【０１９８】
本発明のこの側面に関して特に意図されるのは、異種発現（適切な制御配列の選択を含む）、遺伝子要素、ＴＵ、マルチ遺伝子構築物、宿主細胞、およびベクターに関連する本発明の任意の他の側面に関して示す多様な態様である。
【０１９９】
１つの態様において、少なくとも１つの異種または導入された同種核酸配列は、本明細書に記載するようなｎｏｄＷ、ｎｏｄＲ、ｎｏｄＸ、ｎｏｄＭ、ｎｏｄＢ、ｎｏｄＯ、ｎｏｄＪ、ｎｏｄＹ１、ｎｏｄＤ２、ｎｏｄＤ１、ｎｏｄＹ２、ｎｏｄＺ、ｎｏｄＳ、およびｎｏｄＩからなる群より選択される少なくとも１つのＮＡＡ  １０生合成遺伝子である。
【０２００】
１つの態様において、２つの異なるＧＧＰＰＳ酵素の１つは、異種発現によって、Ｈ．プリシシドゥムにおいて産生される。
１つの態様において、２つの異なるＧＧＰＰＳ酵素の１つは、ＧＧＰＰＳ酵素をコードする天然Ｈ．プリシシドゥムの第二のコピーによってコードされる。
【０２０１】
別の側面において、本発明は、ＮＡＡ  １０の生合成増加を導く遺伝子修飾を含む、ヒポキシロン・プリシシドゥムの単離株に関する。
１つの態様において、単離株は、Ｈ．プリシシドゥムの対照株、好ましくはＨ．プリシシドゥムＡＴＣＣ  ７４２４５に比較した際、少なくとも１つのＧＧＰＰＳ酵素の発現増加を含む。
【０２０２】
１つの態様において、発現増加は、遺伝子制御要素の修飾を通じた、Ｈ．プリシシドゥムの天然一次ＧＧＰＰＳ遺伝子の発現増加である。
１つの態様において、遺伝子制御要素の修飾は、天然一次ＧＧＰＰＳ遺伝子の別のまたは修飾されたプロモーターへの機能可能であるような連結を含む。
【０２０３】
１つの態様において、遺伝子制御要素の修飾は、天然一次ＧＧＰＰＳ遺伝子のよりロバストな天然プロモーターへの機能可能であるような連結を含む。１つの態様において、天然一次ＧＧＰＰＳ遺伝子は導入された同種遺伝子である。
【０２０４】
１つの態様において、発現増加は、ＮＡＡ  １０生合成に寄与する生合成遺伝子の異種発現の結果である。
１つの態様において、発現増加は、本明細書に記載するようなＮｏｄクラスター中に同定される遺伝子と同等の生化学機能を有する、Ｈ．プリシシドゥムにおける異種遺伝子の発現による。
【０２０５】
１つの態様において、発現増加は、ＮＡＡ  １０生合成に必要な基質化合物または生合成中間体の供給における制限を修正する、Ｈ．プリシシドゥムにおける異種遺伝子の発現による。
【０２０６】
１つの態様において、発現増加は、ＧＧＰＰ  １ａおよびインドール−３−グリセロールリン酸１ｂの縮合を触媒して、３−ゲラニルゲラニルインドール２を産生する、ＧＧＴをコードする任意の遺伝子の、Ｈ．プリシシドゥムにおける異種発現による。
【０２０７】
１つの態様において、発現増加は、ＧＧＰＰＳをコードする任意の遺伝子のＨ．プリシシドゥムにおける異種発現による。
１つの態様において、発現増加は、単一エポキシ化ＧＧＩ産物３ａを生成するＦＡＤ依存性オキシダーゼをコードする任意の遺伝子のＨ．プリシシドゥムにおける異種発現による。
【０２０８】
１つの態様において、発現増加は、単一エポキシ化ＧＧＩ  ３ａを環化してエミンドールＳＢ  ４ａを産生する酵素をコードする任意の遺伝子のＨ．プリシシドゥムにおける異種発現による。
【０２０９】
１つの態様において、発現増加は、エミンドールＳＢ  ４ａを酸化してノズリスポル酸を産生するオキシダーゼをコードする任意の遺伝子のＨ．プリシシドゥムにおける異種発現による。
【０２１０】
１つの態様において、発現増加は、本明細書に記載するようなｎｏｄＷ、ｎｏｄＲ、ｎｏｄＸ、ｎｏｄＭ、ｎｏｄＢ、ｎｏｄＯ、ｎｏｄＪ、ｎｏｄＹ１、ｎｏｄＤ２、ｎｏｄＤ１、ｎｏｄＹ２、ｎｏｄＺ、ｎｏｄＳ、およびｎｏｄＩからなる群より選択されるＮＡ生合成遺伝子の発現増加を導く、少なくとも１つの遺伝子修飾による。
【０２１１】
別の側面において、本発明は、ヒポキシロン・プリシシドゥムにおける少なくとも１つの異種核酸配列を発現する工程を含む、ＮＡＡ  １０を作製する方法であって、少なくとも１つの異種核酸配列が、ＮＡＡ  １０を導く生合成経路における酵素をコードする、前記方法に関する。
【０２１２】
本発明のこの側面に関して特に意図されるのは、ＮＡＡ  １０の発現増加に関連するとして含まれる、そしてまた、本明細書に記載するような異種発現（適切な制御配列の選択を含む）、遺伝子要素、ＴＵ、マルチ遺伝子構築物、宿主細胞、およびベクターに関して示されるすべての態様もまた含まれる、本明細書に記載するようなヒポキシロン・プリシシドゥムの単離株に関する、本発明の任意の他の側面に関して示される多様な態様である。
【０２１３】
本明細書において、特許明細書、他の外部文書、または他の情報供給源に言及する場合、これは、一般的に、本発明の特徴を論じるための背景を提供する目的のためである。特に別に言及しない限り、こうした外部文書に対する言及は、こうした文書；またはこうした情報供給源が、いかなる権限においても、先行技術であるか、または当該技術分野に共通の一般的な知識の一部を形成することの承認とはみなされないものとする。
【０２１４】
本発明はここで、以下の実施例によって限定されない方式で例示されるであろう。
【実施例】
【０２１５】
材料および方法
ゲノム配列決定およびＴＵＭ増幅のためのｇＤＮＡ単離
ゲノム配列決定およびＰＣＲによるＴＵＭ増幅のためのゲノムＤＮＡを、修飾を伴い、Ｂｙｒｄら２６にしたがって、ペニシリウム・パキシリ株ＡＴＣＣ（登録商標）２６６０１ＴＭ（ＰＮ２０１３）２４およびヒポキシロン・プリシシドゥム株ＡＴＣＣ（登録商標）７４２４５ＴＭ、２５から単離した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水中、無菌２．４％（ｗ／ｖ）ＤｉｆｃｏＴＭジャガイモ・デキストロース・ブロス（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国メリーランド州）を、１２５ｍＬ三角フラスコ中の２５ｍＬアリコットで調製し、そして５ｘ１０６胞子または〜１ｃｍ２の新鮮にすりつぶした菌糸体（非胞子形成株に関して）を接種した。培養を振盪しながら（２００ｒｐｍ）、２２℃で２〜４日間インキュベーションした。発酵ブロスを無菌の毛羽立ったライナー（ｎａｐｐｙ  ｌｉｎｅｒ）で濾過し、そして菌糸体を無菌水で３回リンスした。菌糸体を無菌１５ｍＬ遠心管に移し、そして２４〜４８時間、凍結乾燥のため、液体窒素中でフラッシュ凍結した。１５〜２０ｍｇのフリーズドライ菌糸体を液体窒素とともに乳鉢に入れ、そしてすりつぶして粉末にした。すりつぶした菌糸体を２ｍＬチューブに移し、そして１ｍＬ抽出緩衝液（１５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、および１％（ｗ／ｖ）ラウロイルザルコシンナトリウム）に再懸濁した。１．６ｍｇプロテイナーゼＫをチューブに添加し、そして内容物を３７℃で３０分間インキュベーションした。チューブを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして上清を新鮮な２ｍＬチューブに移した。５００μＬフェノールおよび５００μＬクロロホルムをチューブに添加し、そして内容物をボルテックスによって混合した後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。水性相を新鮮な２ｍＬチューブに移し、そして先に記載するように、５００μＬフェノールおよび５００μＬクロロホルムでさらに２回洗浄した。次いで、水性相を新鮮な２ｍＬチューブに移し、そして１ｍＬクロロホルムで洗浄した（ボルテックスおよび１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離）。水性相を新鮮な２ｍＬチューブに移し、そして１ｍＬの冷却イソプロパノールと混合した。ＤＮＡを−２０℃で一晩沈殿させ、そして１３，０００ｒｐｍで１０分間、ペレットにした。上清を廃棄し、そしてＤＮＡを１ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌに再懸濁した。チューブを室温で１０分間インキュベーションし、そして次いで、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、多糖をペレットにした。上清を新鮮なチューブに移し、そして１ｍＬイソプロパノールと混合した。チューブを室温で１０分間インキュベーションし、そしてＤＮＡを１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってペレットにした。上清を廃棄し、そして１ｍＬの冷却７０％エタノールを、再懸濁なしにペレットに添加した。チューブを１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、そして上清を廃棄した。チューブを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、そして残った７０％エタノールをピペットで吸い取った。ペレットを室温で風乾し、５０μＬ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水に再懸濁し、そして−２０℃で保存した。
【０２１６】
ＭＩＤＡＳ設計概説
ＭＩＤＡＳツールキットは、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ組み立て技術に基づき２７、ＩＩＳ型制限酵素が、単一の反応において、多数のＤＮＡ断片をともにシームレスに連結する能力を利用する。ＭＩＤＡＳは、３つのＩＩＳ型制限酵素、ＡａｒＩ、ＢｓａＩおよびＢｓｍＢＩを利用し、切断に際して、使用者が定義する４ｂｐオーバーハングを生じる。これらの使用者が定義するオーバーハングの適切な選択を通じて、そして各ＤＮＡ断片に隣接するＩＩＳ型部位の適切な配向を通じて、ワンポット制限連結反応を用いて、多数の断片を、順序だった（方向性のある）方式で、レシピエントプラスミド（デスティネーションベクターとも称される）に組み立ててもよい。レシピエントプラスミドは、ＩＩＳ型酵素の２つの発散性に配向する認識部位が隣接するマーカー遺伝子（典型的には、青色／白色スクリーニングのためのｌａｃＺα遺伝子）を含有し；集合的に「Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングカセット」と称されるこれらの要素は、組み立て反応中に、挿入物によって置換される。
【０２１７】
他の最近記載されたＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅに基づくモジュラー組み立て技術２８−３２と同様に、ＭＩＤＡＳを用いた遺伝子およびマルチ遺伝子構築物の組み立ては、階層的なプロセスである。第一のレベル（ＭＩＤＡＳレベル１）で、機能モジュール（プロモーター、ＣＤＳ、ターミネーター、タグ等）をレベル１デスティネーションベクター（ｐＭＬ１）内にクローニングし、ここでこれらは再使用可能で配列が検証された部分のライブラリーを形成する。モジュールおよびデスティネーションベクターの相補的設計によって、ひとたびｐＭＬ１内にクローニングされたら、これらのモジュールは、ＢｓａＩでの消化によって、ベクターから放出可能であることが確実である。
【０２１８】
第二のレベル（レベル２）で、配列が検証されたレベル１モジュールと適合するセットをｐＭＬ１から放出させ、そしてＢｓａＩ仲介Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応を用いて、レベル２デスティネーションベクター（ｐＭＬ２）に組み立て、真核生物ＴＵを含有するレベル２プラスミドの生成を導く。ふたたび、設計規則によって、組み立てられたＴＵ各々が、この場合はＡａｒＩまたはＢｓｍＢＩのいずれか（ＴＵを組み立てたｐＭＬ２ベクターに応じて）での消化によって、ｐＭＬ２ベクターから放出可能であることが確実である。
【０２１９】
レベル３では、レベル２で組み立てられたＴＵをｐＭＬ２プラスミドから放出させ、そして続いて、ＡａｒＩまたはＢｓｍＢＩ仲介Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応のいずれかを用いて、レベル３デスティネーションベクター（ｐＭＬ３）にともに連続して組み立て、機能するマルチ遺伝子構築物を形成し、これを次いで、望ましい発現宿主内に形質転換してもよい。
【０２２０】
レベル１：モジュールクローニング
レベル１で、ＰＣＲ産物として、または合成ポリヌクレオチド配列として（遺伝子合成企業より）のいずれかで、機能性ＴＵＭを生成し、そしてＢｓｍＢＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングによって、レベル１デスティネーションベクター（ｐＭＬ１）内にクローニングする。ｐＭＬ１ベクター内にクローニングするため、増幅されるＴＵＭ各々が、２つの収束性（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）ＢｓｍＢＩ部位、ＢｓｍＢＩ［ＣＴＣＧ］および［ＡＧＡＣ］ＢｓｍＢＩに隣接され、制限酵素切断に際して、ｐＭＬ１デスティネーションベクター中に存在するＢｓｍＢＩ部位のものと適合する粘着端を生じるように、ＰＣＲプライマーを設計する。したがって、ｐＭＬ１中に存在するＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングカセットは、ｌａｃＺαスコア化可能マーカーが隣接する２つの発散性ＢｓｍＢＩ部位からなる：５’−［ＣＴＣＧ］ＢｓｍＢＩ−ｌａｃＺα−ＢｓｍＢＩ［ＡＧＡＣ］−３’（図１１Ａ）。
【０２２１】
全長ＴＵの続く（すなわちレベル２）組み立てを可能にするため、各ＴＵＭに、５’端で４つのモジュール特異的ヌクレオチド（ＮＮＮＮ）が、そして３’端で４つのモジュール特異的ヌクレオチド（ＮＮＮＮ）が隣接するように、各ＴＵＭを設計し、これらをＰＣＲプライマー配列の一部として含める。増幅されるモジュールおよびｐＭＬ１ベクターの相補設計によって、増幅されるＴＵＭが、ＢｓｍＢＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応を用いてｐＭＬ１内にクローニングされた際、各ＴＵＭが収束性ＢｓａＩ認識部位に隣接されるようになり、そしてモジュールが、全長ＴＵの続く（すなわちレベル２）ＢｓａＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ組み立て中にｐＭＬ１から放出された際、モジュール特異的ヌクレオチド（ＮＮＮＮおよびＮＮＮＮ）がＢｓａＩ特異的４ｂｐオーバーハングとなることが確実である。したがって、ＰＣＲ産物（または合成ポリヌクレオチド）中の各モジュールの全体の構造は：５’−ＢｓｍＢＩ［ＣＴＣＧ］ＮＮＮＮ−ＴＵＭ−ＮＮＮＮｔｇ［ＡＧＡＣ］ＢｓｍＢＩ−３’（図１１Ｂ）の型を取り、これがＢｓｍＢＩ仲介性クローニング後、ｐＭＬ１中で、５’−ＢｓａＩ［ＮＮＮＮ］−ＴＵＭ−［ＮＮＮＮ］ＢｓａＩ−３’になる（図１１Ｃ）。
【０２２２】
各ＴＵＭはその隣接する４ヌクレオチドによって定義されるため、これらのモジュール特異的塩基は、各ＴＵＭのアドレス系を効果的に形成し、そしてこれらは、組み立てられたＴＵ内で、その位および配向を決定する。ＭｏＣｌｏおよびＧｏｌｄｅｎＢｒａｉｄ２．０の開発者らはすでに、部分交換可能性を促進するため３３、非常に多様なＴＵＭに関して、植物発現のため、一般的なシンタックスまたは標準アドレスセット（ＭｏＣｌｏ系においては「融合部位」そしてＧｏｌｄｅｎＢｒａｉｄ２．０においては「バーコード」と称される）を開発するよう一致協力して働いており、そしてこの標準はまた、本明細書において、糸状菌における発現のため、ＴＵのＭＩＤＡＳに基づく組み立てに関しても採用されている（図１２）。
【０２２３】
したがって、糸状菌発現に関して、ＰｒｏＵＴＲモジュール（プロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）およびＡＴＧ開始コドンを含む）は、モジュール特異的５’ヌクレオチドとしてＧＧＡＧを有し、そしてモジュール特異的３’ヌクレオチドとしてＡＡＴＧを有し（すなわち５’−ＧＧＡＧ−ＰｒｏＵＴＲ−ＡＡＴＧ−３’）、翻訳開始コドンを下線で示す。同様に、ＣＤＳモジュールはＡＡＴＧおよびＧＣＴＴに隣接され（すなわち５’−ＡＡＴＧ−ＣＤＳ−ＧＣＴＴ−３’）、一方、ＵＴＲｔｅｒｍモジュール（ポリアデニル化シグナルを含めて、３’ＵＴＲおよび３’非転写領域からなる）は、５’−ＧＣＴＴ−ＵＴＲｔｅｒｍ−ＣＧＣＴ−３’の型を有する。これらの３つのタイプのＴＵＭを増幅するためのＰＣＲプライマーの設計に関する考慮を表１２に示す。
【０２２４】
ｐＭＬ１におけるＴＵＭのＢｓｍＢＩ仲介性組み立て後、反応を、大腸菌株、例えばＤＨ５α（または同等物）に形質転換して、そしてスペクチノマイシン、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌを補充したＬＢプレート上に塗抹した。白色コロニーをスクリーニングすることによって、クローニングされたＴＵＭを宿するプラスミドを同定し、そして配列決定によって確認する。
【０２２５】
ＭＩＤＡＳレベル１では、ＡａｒＩ、ＢｓａＩおよびＢｓｍＢＩのすべての内部認識部位をマスキングするかまたはＴＵＭから除去することが重要である。「順化（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ）」と称される、こうした禁じられた部位のマスキングまたは除去のプロセスは；（ｉ）遺伝子合成企業に配列を注文する際にこれらの部位を排除するか、（ｉｉ）定方向突然変異誘発を行うか、または（ｉｉｉ）ターゲットＤＮＡと三重鎖を形成するマスキング・オリゴヌクレオチドを用い、それによって制限酵素切断を防止することによって、達成可能である３０。ＩＩＳ型酵素を、突然変異誘発３４に、そしてＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ順化目的２７、３５に先に利用したのと同じ方式で、本発明者らは、内部ＩＩＳ型制限部位と重複し、そして該部位を破壊する単一ヌクレオチドミスマッチを含有するＰＣＲプライマー（順化プライマーと称する）を設計することによって、ＭＩＤＡＳモジュールを順化した。ＰＣＲ産物は、ＭＩＤＡＳにおいて、ＢｓｍＢＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応を用い、ともに組み立てられて、ｐＭＬ１において全長順化ＴＵＭを形成するよう設計されているため、ＭＩＤＡＳ順化プライマーが、５’端に適合オーバーハングを生成するＢｓｍＢＩ制限部位を含めて設計されることが重要である。
【０２２６】
レベル２：ＴＵ組み立て
レベル２では、ＢｓａＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応を用いて、クローニングされ、そして配列が検証されたレベル１  ＴＵＭの適合セット（例えばＰｒｏＵＴＲ、ＣＤＳおよびＵＴＲｔｅｒｍモジュール）を、ｐＭＬ２デスティネーションベクターに組み立て、完全（すなわち全長）真核ＴＵを含有するレベル２プラスミド（ｐＭＬ２エントリークローン）の生成を導いた。先に記載したモジュールアドレス標準は、順序だった方向性のある方式でＴＵの組み立てが進行し、１つのモジュールの３’端が次のモジュールの５’端と適合することを確実にする。
【０２２７】
ＰｒｏＵＴＲモジュールの５’端に位置するモジュール特異的塩基ＧＧＡＧ、およびＵＴＲｔｅｒｍモジュールの３’端に位置するＣＧＣＴは、ｐＭＬ２デスティネーションベクターのＢｓａＩ消化によって生成されるオーバーハングと適合し、そしてしたがって、これらの塩基は、レベル２組み立ての最も外側のクローニング境界を定義する。
【０２２８】
ＭＩＤＡＳにおいて、ＴＵを組み立て可能なレベル２（ｐＭＬ２）デスティネーションベクターは８つあり、その選択は、レベル３で産生するマルチ遺伝子プラスミドにおけるＴＵの望ましい配置、すなわち：（ｉ）マルチ遺伝子組み立てにＴＵを付加する望ましい順序、（ｉｉ）マルチ遺伝子プラスミドを組み立てる望ましい方向、および（ｉｉｉ）マルチ遺伝子プラスミド中の各ＴＵの望ましい配向に依存する。これらの特徴を以下にさらに論じる。
【０２２９】
ｐＭＬ２ベクターは、ＭＩＤＡＳの操作に非常に重要な特異的配列特徴の配置によって、互いに区別される。集合的にＭＩＤＡＳカセットと称されるこれらの配列特徴（図１３）は、ＴＵのレベル２組み立てを定義し、そしてレベル３で産生されるマルチ遺伝子構築物の組み立てを支配する。
【０２３０】
各ＭＩＤＡＳカセットは、（ｉ）隣接する発散性ＢｓａＩ認識部位を含むＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングカセットを有すること、（ｉｉ）ＡａｒＩおよびＢｓｍＢＩの認識部位の配置が異なること、そして（ｉｉｉ）ｌａｃＺαスコア化可能マーカーの存在または非存在によって定義される。これらの特徴は、さらに詳細に記載される。
【０２３１】
通常のＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングカセット（典型的には、青色／白色スクリーニングのため、ｌａｃＺα遺伝子を含有する）とは対照的に、８つのｐＭＬ２ベクターすべてにおけるＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングカセットは、発散性ＢｓａＩ認識部位が隣接する突然変異体大腸菌ｐｈｅＳ遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼに関する大腸菌遺伝子のプロモーターによって駆動される）を含有する。本明細書で用いる大腸菌ｐｈｅＳ遺伝子のＴｈｒ２５１Ａｌａ／Ａｌａ２９４Ｇｌｙ二重突然変異体は、フェニルアラニン類似体４−クロロ−フェニルアラニン、４ＣＰを補充したＬＢ培地上で増殖させた細胞に対して高い致死性を与える３６。ＴＵのＢｓａＩ仲介性レベル２組み立て中、突然変異体ｐｈｅＳ遺伝子は、ｐＭＬ２ベクターから除去され、そしてしたがって、これを負の選択マーカーとして用いてもよい。
【０２３２】
８つのｐＭＬ２ベクターを、ＭＩＤＡＳカセット中のｌａｃＺα遺伝子の存在または非存在に応じて、それぞれ、２つのクラス、「青色」および「白色」に分けてもよい（図１３を参照されたい）。４つの「青色」ｐＭＬ２ベクター（プラスミド名における「Ｂ」によって示される）および４つの「白色」ｐＭＬ２ベクター（プラスミド名における「Ｗ」によって示される）がある。「青色」および「白色」ベクターでは、ＭＩＤＡＳカセットにおけるＡａｒＩおよびＢｓｍＢＩ制限部位の相対配置もまた異なる。したがって、「青色」ベクターにおいて、全ＭＩＤＡＳカセットは、収束性ＢｓｍＢＩ部位に隣接し、そしてその中に発散性ＡａｒＩ部位が隣接するｌａｃＺα遺伝子が入れ子になる。「白色」ベクターにおいて、酵素配置は切り替えられ（全ＭＩＤＡＳカセットは、収束性ＡａｒＩ部位に隣接し、そしてその中に、２つの発散性ＢｓｍＢＩ部位が入れ子になる）、そしてｌａｃＺα遺伝子はない。ｐＭＬ２ベクター中のｌａｃＺα色素原マーカーは、ＴＵのレベル２  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ組み立て中には青色／白色スクリーニングに用いられない（レベル３クローニングのため留保される）が、ＴＵをその中に組み立てようとする「青色」または「白色」ベクターの選択は、レベル３でマルチ遺伝子構築物にＴＵが付加される順序を決定するであろうため、ＴＵのレベル２組み立て中に、この選択を行わなければならないことに注目することが重要である。同様に、ＡａｒＩおよびＢｓｍＢＩ部位はＴＵのレベル２組み立てには用いられず；その代わり、これらはマルチ遺伝子構築物のレベル３組み立てに組み込まれる。（＋）および（−）ベクターの間の相違を含めて、これらの考慮は、以下のレベル３の説明以下にさらに論じられる。
【０２３３】
各ＴＵの配向（転写方向）は、ｐＭＬ２「順方向」ベクター（プラスミド名における「Ｆ」によって示される）またはｐＭＬ２「逆方向」ベクター（プラスミド名における「Ｒ」によって示される）のいずれかに各ＴＵを組み立てることによって、自由に定義されうる。ｐＭＬ２「逆方向」ベクターは、ｐＭＬ２「順方向」ベクターにおけるＢｓａＩ融合部位に比較して切り替えられたＢｓａＩ認識部位（ＴＵのＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ組み立てのため）を有する。したがって、ｐＭＬ２「順方向」ベクターは、５’−［ＧＧＡＧ］ＢｓａＩ−ｐｈｅＳ→−ＢｓａＩ［ＣＧＣＴ］−３’に配向されたｐｈｅＳに基づくＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅカセットを有し、一方、ｐＭＬ２「逆方向」ベクターは、切り替えられたＢｓａＩ認識部位：５’−［ＡＧＣＧ］ＢｓａＩ−←ｐｈｅＳ−ＢｓａＩ［ＣＴＣＣ］−３’を有し；ここで矢印は、突然変異体ｐｈｅＳ遺伝子の転写の方向を示す。
【０２３４】
組み立て反応で形質転換された大腸菌ＤＨ５α細胞（または同等物）を、カナマイシンおよび４ＣＰを補充したＬＢプレート上に塗抹した際、クローニングされたレベル１モジュールとは対照的に、ｐＭＬ２デスティネーションベクターは、カナマイシン耐性を与え、レベル１モジュール主鎖に対する効率的な対抗選択を可能にする一方、突然変異体ｐｈｅＳ遺伝子は、いかなる親ｐＭＬ２デスティネーションプラスミドに対しても強力な負の選択を提供する。
【０２３５】
レベル３：マルチ遺伝子構築物の組み立て
ＭＩＤＡＳレベル３では、ｐＭＬ２プラスミド中で組み立てられたＴＵを、レベル３デスティネーションベクター（ｐＭＬ３）内に連続して装填し（バイナリー組み立てによる）、マルチ遺伝子構築物を形成する。
【０２３６】
レベル３でのマルチ遺伝子構築物の組み立ては、「青色」および「白色」ｐＭＬ２ベクター中に位置するＭＩＤＡＳカセットにおいて、ＡａｒＩおよびＢｓｍＢＩ制限部位の相対配置に決定的に依存し；青色ベクターに比較して、白色ベクターにおけるこれらの制限部位の入れ子になりそして反転した配置は、ＭＩＤＡＳマルチ遺伝子組み立てプロセスを定義する特徴である。「青色」ベクターにおいて、全ＭＩＤＡＳカセットは隣接する収束性ＢｓｍＢＩ部位を有し、そしてその中に入れ子になるのは発散性ＡａｒＩ部位が隣接するｌａｃＺα遺伝子である。「白色」ベクターにおいて、酵素配置は逆転し（全ＭＩＤＡＳカセットは、隣接する収束性ＡａｒＩ部位を有し、そしてその中に入れ子になるのは、２つの発散性ＢｓｍＢＩ部位である）、そしてｌａｃＺα遺伝子はない。図１４に例示するように、「青色」および「白色」ベクター中の制限部位の入れ子および反転は、「白色」ＭＩＤＡＳカセットに組み立てられたＴＵを、ＡａｒＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応を用いて、「青色」ＭＩＤＡＳカセット内に挿入してもよく、そして逆に、「青色」ＭＩＤＡＳカセットに組み立てられたＴＵを、ＢｓｍＢＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応を用いて、「白色」ＭＩＤＡＳカセット内にクローニングしてもよいことを意味する。このクローニングサイクル（すなわち「白色」および「青色」ｐＭＬ２エントリークローンの間の交替）を、無制限に反復してもよい。
【０２３７】
レベル３デスティネーションベクター、ｐＭＬ３中に見られるＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングカセットは、発散性ＡａｒＩ部位が隣接したｌａｃＺα遺伝子からなり：［ＣＡＴＴ］ＡａｒＩ−ｌａｃＺα−ＡａｒＩ［ＣＧＴＡ］、したがってＭＩＤＡＳレベル３組み立ては常に、ｐＭＬ３、およびｐＭＬ２「白色」デスティネーションベクター内に組み立てられているＴＵの間の、ＡａｒＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応を用いて開始される（すなわち第一のＴＵが常に付加されている）（図１４）。次いで、生成されたプラスミドを、ｐＭＬ２「青色」デスティネーションベクター内にクローニングされたＴＵとのＢｓｍＢＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応に用いる。さらに、それぞれ、ｐＭＬ２「白色」およびｐＭＬ２「青色」エントリークローンを用いて、ＡａｒＩおよびＢｓｍＢＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応を交互に行うこのアプローチにしたがうことによって、さらなるＴＵを付加する。したがって、マルチ遺伝子構築物内にＴＵをクローニングすることによって生成される各プラスミドは、ＴＵ付加の次のサイクルのためのデスティネーションベクターとなる（図１４）。
【０２３８】
各クローニングサイクル後、大腸菌ＤＨ５α細胞（または同等物）を、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応で形質転換し、スペクチノマイシン、ＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌを補充したＬＢプレート上に塗抹し、そして青色／白色スクリーニングによって、陽性クローンを同定する。スペクチノマイシンは、レベル３プラスミドを取り込んだ細胞を選び出し、そしていかなるｐＭＬ２プラスミド主鎖に対しても逆選択する（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｓｅｌｅｃｔ）。ｐＭＬ２「青色」ベクター中に存在するｌａｃＺα色素原マーカーは、先に、ＴＵのレベル２組み立て中に利用されなかったが、ここで、マルチ遺伝子組み立てレベル（レベル３）では、青色／白色スクリーニングに用いられるようになることに注目されたい。したがって、ＡａｒＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応を用いて、マルチ遺伝子構築物に組み立てられるＴＵに関しては、分析のため、白色コロニーを摘み取り、一方、ＢｓｍＢＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応を用いて、マルチ遺伝子構築物に組み立てられるＴＵは、青色コロニーを摘み取ることによって、分析される（表１３を参照されたい）。
【０２３９】
最も単純な配置では、ＭＩＤＡＳは、２つのｐＭＬ２デスティネーションベクターのみ：１つの「白色」ベクターおよび１つの「青色」ベクターを用いてマルチ遺伝子組み立てを達成しうる（図１５Ａ）。８つのｐＭＬ２ベクターの全セットを提供して：（ｉ）成長中のマルチ遺伝子構築物に各ＴＵを付加する順序、（ｉｉ）各ＴＵの望ましい配向（すなわち転写の方向）および（ｉｉｉ）組み立ての極性、すなわち次に来るＴＵをマルチ遺伝子構築物内に装填する方向に関する最大の使用者制御を可能にする。
【０２４０】
第一に、そして先に記載したように、成長中のマルチ遺伝子構築物への各ＴＵの付加の順序は、ＴＵを組み立てる「白色」または「青色」ｐＭＬ２デスティネーションベクターの選択によって支配される。
【０２４１】
第二に、そしてレベル２の特徴を論じた際に先に記載したように、ＴＵの配向（転写の方向）は、ＴＵを組み立てる「順方向」または「逆方向」ｐＭＬ２ベクターの選択によって自由に定義されうる。いずれかの配向でＴＵを組み立てるオプションを含むようにＭＩＤＡＳを拡張すると、ベクター一揃いは、４つのｐＭＬ２プラスミドに拡張される（図１３および図１５Ｂを参照されたい）。
【０２４２】
第三に、マルチ遺伝子組み立ての極性（すなわち新規ＴＵが、成長中のマルチ遺伝子組み立てに付加される方向）もまた、この場合、「プラス」（＋）または「マイナス」（−）極性のいずれかのｐＭＬ２デスティネーションベクターにおいてＴＵを組み立てることによって、自由に定義されうる（図１３）。レベル３組み立てのためのｐＭＬ２（＋）エントリークローンの使用により、次に付加されるＴＵが、ｐＭＬ３中に見られるＳｐｅｃＲ遺伝子の転写の方向と同じ方向で付加される、すなわちマルチ遺伝子構築物中で次に組み立てられるＴＵが、ｐＭＬ２（＋）エントリークローンを用いて付加されたＴＵの右側に付加されることが確実である（図１５Ａおよび図１５Ｂに例示する通り）。対照的に、レベル３組み立てのためのｐＭＬ２（−）エントリークローンの使用により、次に付加されるＴＵが、ｐＭＬ３中に見られるＳｐｅｃＲ遺伝子の転写の方向と反対方向で付加され、したがってマルチ遺伝子構築物内に装填される次のＴＵが、ｐＭＬ２（−）エントリークローンを用いて付加されたＴＵの左側に付加されることが確実である。しかし、両方の極性のエントリークローン（すなわちｐＭＬ２（＋）およびｐＭＬ２（−）エントリークローンの両方）を用いて、マルチ遺伝子構築物を構築すると、これは、ＭＩＤＡＳに、新規ＴＵをレベル３組み立てに付加する方向を切り替える能力を与え、そして図１５Ｃに示す仮説的な組み立てに関しては、すべて続いて付加するＴＵは、ＴＵ３およびＴＵ２間に入れ子になるであろうことを示す。
【０２４３】
細菌および真菌株
大腸菌のルーチンの増殖を、ＬＢブロス中、３７℃で行った。化学的にコンピテントな大腸菌ＨＳＴ０８  Ｓｔｅｌｌａｒ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）をルーチンの形質転換およびプラスミドの維持に用いた。この研究に用いたペニシリウム・パキシリ株を表７に示す。
【０２４４】
ＭＩＤＡＳレベル１モジュールクローニングのためのプロトコル
スピンカラムプロトコルを用いてＰＣＲ増幅モジュールを精製し、そしてＢｓｍＢＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ組み立てによって、ＭＩＤＡＳレベル１プラスミドｐＭＬ１内にクローニングした。典型的には、ミニプレップ由来の１〜２μＬ（およそ５０〜２００ｎｇ）のｐＭＬ１プラスミドＤＮＡを、各１〜２μＬの精製ＰＣＲ断片、１μＬのＢｓｍＢＩ（２０Ｕ／μＬ）、１μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（２０Ｕ／μＬ）および２μＬの１０ｘＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液と、２０μＬの総反応体積中で混合した。反応を３７℃で１〜３時間インキュベーションし、そしてアリコット（典型的には２〜３μＬ）を、熱ショックによって、３０μＬの大腸菌ＨＳＴ０８  Ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細胞に形質転換した。回復期間（すなわち２５０μＬのＳＯＣ培地の添加および３７℃で１時間のインキュベーション）後、形質転換混合物のアリコットを、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを補充したＬＢ寒天プレート上に塗抹した。プレートを３７℃で一晩インキュベーションし、そして白色コロニーを分析のために選択した。
【０２４５】
ＭＩＤＡＳレベル２  ＴＵ組み立てのためのプロトコル
レベル１でクローニングしたモジュールを用いて、全長ＴＵを、ＢｓａＩ仲介性Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ組み立てによって、ＭＩＤＡＳレベル２プラスミドに組み立てた。典型的には４０ｆｍоｌのｐＭＬ２プラスミドＤＮＡを、各４０ｆｍоｌのレベル１エントリークローンのプラスミド  ＤＮＡ、１μＬのＢｓａＩ−ＨＦ（２０Ｕ／μＬ）、１μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（２０Ｕ／μＬ）および２μＬの１０ｘＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液と、２０μＬの総反応体積中で混合した。以下のパラメータ：４５サイクルの（３７℃２分間および１６℃５分間）、その後５０℃５分間、および８０℃１０分間を用いて、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００ペルチェサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で、反応をインキュベーションした。レベル１組み立てに関して記載するように反応を形質転換し、そして７５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１．２５ｍＭ  ４ＣＰを含有するＬＢ寒天プレート上に塗抹した。３７℃で一晩インキュベーションした後、分析のためコロニーを摘み取った。
【０２４６】
ＭＩＤＡＳレベル３マルチ遺伝子組み立てのためのプロトコル
レベル２で組み立てた全長ＴＵを用いて、ＡａｒＩ（ｐＭＬ２「白色」ベクター内にクローニングされたＴＵに関して）またはＢｓｍＢＩ（ｐＭＬ２「青色」ベクター内にクローニングされたＴＵに関して）のいずれかを用い、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ組み立てを交互に行うことによって、レベル３デスティネーションベクターにおいて、マルチ遺伝子組み立てを生成した。典型的には、４０ｆｍоｌのレベル３デスティネーションベクタープラスミドＤＮＡを、４０ｆｍоｌのレベル２エントリークローンプラスミドＤＮＡ、１μＬのＢｓａＩ−ＨＦ（２０Ｕ／μＬ）、１μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（２０Ｕ／μＬ）および２μＬの１０ｘＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液と、２０μＬの総反応体積中で混合した。以下のパラメータ：４５サイクルの（３７℃２分間および１６℃５分間）、その後３７℃５分間、および８０℃１０分間を用いて、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００ペルチェサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で、反応をインキュベーションした。レベル１組み立てに関して記載するように反応を形質転換し、そして５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび５０μｇ／ｍＬ  Ｘ−Ｇａｌを補充したＬＢ寒天プレート上に塗抹した。プレートを３７℃で一晩インキュベーションした。ＡａｒＩ仲介性組み立て反応に関しては、分析のために白色コロニーを選択する一方、ＢｓｍＢＩ仲介性組み立て反応に関しては、青色コロニーを選択した。
【０２４７】
真菌研究に用いる培地および試薬
微量元素を含むＣＤＹＥ（Ｃｚａｐｅｘ−Ｄｏｘ／酵母エキス）培地を脱イオン水で作製し、そして該培地は、３．３４％（ｗ／ｖ）Ｃｚａｐｅｘ−Ｄｏｘ（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ、英国ハンプシャー）、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ、英国ハンプシャー）、および０．５％（ｖ／ｖ）微量元素溶液を含有した。寒天プレートに関しては、Ｓｅｌｅｃｔ寒天（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）を１．５％（ｗ／ｖ）まで添加した。
【０２４８】
微量元素溶液を脱イオン水中で作製し、そして該溶液は、０．００４％（ｗ／ｖ）塩化コバルト（ＩＩ）六水和物（Ａｊａｘ  Ｆｉｎｅｃｈｅｍ、ニュージーランド・オークランド）、０．００５％（ｗ／ｖ）硫酸銅（ＩＩ）五水和物（Ｓｃｈａｒｉａｕ、スペイン・バルセロナ）、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ・ダルムシュタット）、０．０１４％（ｗ／ｖ）硫酸マンガン（ＩＩ）四水和物、および０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸亜鉛七水和物（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ・ダルムシュタット）を含有した。該溶液を、１滴の１２Ｍ塩酸とともに保存した。
【０２４９】
再生（ＲＧ）培地を脱イオン水で作製し、そして該培地は、２％（ｗ／ｖ）麦芽エキス（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ、英国ハンプシャー）、２％（ｗ／ｖ）Ｄ（＋）−無水グルコース（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢＶＢＡ、ベルギー・ルーベン）、１％（ｗ／ｖ）真菌用ペプトン（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ、英国ハンプシャー）、および２７．６％スクロース（ＥＣＰ  Ｌｔｄ．  Ｂｉｒｋｅｎｈｅａｄ、ニュージーランド・オークランド）を含有した。培地をプレートに用いるか（１．５％ＲＧＡ）、または重層するか（０．８％ＲＧＡ）いずれかに応じて、Ｓｅｌｅｃｔ寒天（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）をそれぞれ、１．５％または０．８％（ｗ／ｖ）添加した。
【０２５０】
真菌プロトコル−プロトプラスト調製
形質転換用の真菌プロトプラストの調製は、修飾を伴い、Ｙｅｌｔｏｎら３７にしたがった。１００ｍＬ三角フラスコ中、微量元素を含むＣＤＹＥ培地の５つの２５ｍＬアリコットに、５ｘ１０６胞子を接種し、そして振盪しながら（２００ｒｐｍ）、２８℃で２８時間インキュベーションした。５つのフラスコすべてから、発酵ブロスを無菌の毛羽立ったライナーで濾過し、そして合わせた菌糸体を無菌水で３回、そしてＯＭ緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４および１．２Ｍ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４．２Ｈ２ＯでｐＨ５．８にする）で１回リンスした。菌糸体の重量を測定し、菌糸体１グラムあたり１０ｍＬのフィルター滅菌溶解酵素溶液（トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来の溶解酵素（Ｓｉｇｍａ）を、ＯＭ緩衝液中、１０ｍｇ／ｍＬで再懸濁することによって調製）に再懸濁し、そして８０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１６時間インキュベーションした。プロトプラストを、２５０ｍＬ三角フラスコ内に、無菌の毛羽立ったライナーを通じて濾過した。濾過したプロトプラストのアリコット（５ｍＬ）を１５ｍＬの無菌遠心管内に移し、そして２ｍＬのＳＴ緩衝液（０．６Ｍソルビトールおよび０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を重層した。チューブを２６００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離した。各チューブ中、ＯＭおよびＳＴ緩衝液間で形成されるプロトプラストの白色層を、無菌１５ｍＬ遠心管内に移し（２ｍＬアリコットで）、５ｍＬのＳＴＣ緩衝液（１Ｍソルビトール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および５０ｍＭ  ＣａＣｌ２）中にピペットで再懸濁することによって穏やかに洗浄し、そして２６００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離した。上清をデカントし、そして多数のチューブからペレットにしたプロトプラストを、ＳＴＣ緩衝液の５ｍＬアリコット中に再懸濁することによって合わせた。ＳＴＣ緩衝液洗浄を３回反復した後、プロトプラストを単一の１５ｍＬ遠心管内にプールした。最終プロトプラストペレットを、５００μＬのＳＴＣ緩衝液に再懸濁し、そしてプロトプラスト濃度を血球計数板で概算した。プロトプラストストックを希釈して、ＳＴＣ緩衝液１ｍＬあたり１．２５ｘ１０８プロトプラストの最終濃度にした。プロトプラストのアリコット（１００μＬ）を真菌形質転換に直ちに用い、そして過剰なプロトプラストを、１．７ｍＬ微量遠心管中、８％ＰＥＧ溶液（８０μＬのプロトプラストを２０μＬのＳＴＣ緩衝液中の４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００に添加した）中で保持し、そして−８０℃で保存した。
【０２５１】
真菌プロトコル−Ｐ．パキシリの形質転換
ＶｏｌｌｍｅｒおよびＹａｎｏｆｓｋｙ３８、ならびにＯｌｉｖｅｒら３９から修飾した、真菌形質転換を、ＳＴＣ緩衝液中で新鮮に調製したか、または８％ＰＥＧ溶液中で保存した（上述の通り）いずれかの１００μＬ（１．２５ｘ１０７）プロトプラストを含有する１．７ｍＬ微量遠心管中で行った。２μＬのスペルミジン（Ｈ２Ｏ中５０ｍＭ）、５μＬヘパリン（ＳＴＣ緩衝液中、５ｍｇ／ｍＬ）、および５μｇのプラスミドＤＮＡ（２５０μｇ／ｍＬ）を含有する溶液を、プロトプラストに添加し、そして氷上で３０分間インキュベーションした後、９００μＬの４０％ＰＥＧ溶液（ＳＴＣ緩衝液中、４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００）を添加した。形質転換混合物を、氷上でさらに１５〜２０分間インキュベーションし、無菌５０ｍＬチューブ中、１７．５ｍＬの０．８％ＲＧＡ培地（５０℃にあらかじめ温める）に移し、反転によって混合し、そして３．５ｍＬアリコットを１．５％ＲＧＡプレート上に分配した。２５℃で一晩インキュベーションした後、５ｍＬの０．８％ＲＧＡ（固形培地１ｍＬ当たり、１５０μｇの最終濃度を達成するために十分なジェネテシンを含有する）を各プレート上に重層した。プレートを２５℃でさらに４日間インキュベーションし、そして個々のコロニーから胞子を摘み取り、そして１５０μｇ／ｍＬジェネテシンを補充したＣＤＹＥ寒天プレート上にストリークした。ストリークしたプレートを２５℃でさらに４日間インキュベーションした。個々のコロニー由来の胞子を、５０μＬの０．０１％（ｗ／ｖ）ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に再懸濁し、そして胞子懸濁物の５ｘ５μＬアリコットを、１５０μｇ／ｍＬジェネテシンを補充した新規ＣＤＹＥ寒天プレート上にトランスファーした。胞子形成プレートを２５℃で４日間インキュベーションし、そして胞子ストックを以下のように調製した。胞子形成プレート由来のコロニープラグを、２ｍＬの０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に懸濁し、そして８００μＬの懸濁した胞子を、１．７ｍＬ微量遠心管中、２００μＬの５０％（ｗ／ｖ）グリセロールと混合した。胞子ストックを用いて、５０ｍＬのＣＤＹＥ培地に接種し、液体窒素中でフラッシュ凍結し、そして−８０℃で保存した。
【０２５２】
インドールジテルペン産生および抽出
真菌形質転換体を、微量元素を含む５０ｍＬのＣＤＹＥ培地中、振盪装置培養（≧２００ｒｐｍ）において、脱脂綿でキャップした２５０ｍＬ三角フラスコ中、２８℃で７日間増殖させた。毛羽立ったライナーを通じた濾過によって、菌糸体を発酵ブロスから単離し、５０ｍＬ遠心管（Ｌａｂ  Ｓｅｒｖ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、そして２−ブタノン中で≧４５分間、菌糸体を激しく振盪する（≧２００ｒｐｍ）ことによって、インドールジテルペンを抽出した。
【０２５３】
薄層クロマトグラフィ
２−ブタノン上清（抽出されたインドールジテルペンを含有する）を、固相シリカゲル６０アルミニウムプレート（Ｍｅｒｃｋ）上の薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）分析に用いた。インドールジテルペンを、９：１のクロロホルム：アセトニトリルまたは８：２のジクロロメタン：アセトニトリルでクロマトグラフし、そしてエールリッヒ試薬（２４％（ｖ／ｖ）ＨＣｌおよび５０％エタノール中の１％（ｗ／ｖ）ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド）で視覚化した。
【０２５４】
液体クロマトグラフィ−質量分析
ＴＬＣによって陽性結果が出た形質転換体から、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）のために試料を調製した。したがって、２−ブタノン上清（抽出されたインドールジテルペンを含有する）の１ｍＬ試料を１．７ｍＬ微量遠心管に移し、そして２−ブタノンを一晩蒸発させた。内容物を１００％アセトニトリルに再懸濁し、そしてＬＣ−ＭＳバイアル内に０．２μｍ膜を通じて濾過した。ＬＣ−ＭＳ試料を、０．２００ｍＬ／分の流速で泳動する、ＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００標準ＬＣ系（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に取り付けた逆相Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｃｃｕｃｏｒｅ  ２．６μｍ  Ｃ１８（５０ｘ２．１ｍｍ）カラム上でクロマトグラフし、そして多工程勾配法を用いて、０．０１％ギ酸を含有するアセトニトリル水溶液で溶出させた（表１４）。ｍａＸｉｓＴＭ  ＩＩ四重極飛行時間型質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）上のインライン分析を通じて質量スペクトルを捕捉した。
【０２５５】
ＮＭＲ分析のための大規模インドールジテルペン精製
高レベルの新規インドールジテルペンを産生する真菌形質転換体を、「インドールジテルペン産生および抽出」以下に記載したように、微量元素を含むＣＤＹＥ培地≧１リットル中で増殖させた。菌糸体を、攪拌バーを含有する１リットルのショットボトルにプールした。２−ブタノンを添加し、そして攪拌しながら（≧７００ｒｐｍ）、インドールジテルペンを一晩抽出した。抽出物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ（登録商標））を通じて濾過し、そしてシリカカラムによる粗精製のため、回転蒸発させながらシリカ上に乾燥装填（ｄｒｙ  ｌｏａｄｅｄ）した後、セミ分取ＨＰＬＣによって最終精製した。粗抽出物の１ｍＬアリコットを、８．００ｍＬ／分の流速で泳動する、ＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００標準ＬＣ系（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に取り付けたセミ分取逆相Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ５μｍ  Ｃ１８（２）１００Å（２５０ｘ１５ｍｍ）カラム上に注入した。多工程勾配法を、インドールジテルペンの異なるセットの精製のために最適化した。各インドールジテルペンの純度を、ＬＣ−ＭＳによって評価し、そして構造をＮＭＲによって同定した。
【０２５６】
ＮＭＲ
重水素化クロロホルム中でＮＭＲ試料を調製した。標準一次元プロトンおよび炭素−１３  ＮＭＲ、二次元相関分光測定（ＣＯＳＹ）、異種核単一量子相関分光測定（ＨＳＱＣ）および異種核多重結合相関分光測定（ＨＭＢＣ）によって化合物を分析した。
【０２５７】
本明細書に言及する表１〜１４を以下に示す：
表１．  推定上のノズリスポル酸遺伝子クラスターにおける予測される遺伝子の機能的割り当て
【０２５８】
【表１−１】
2021500868.tif 000002
【０２５９】
【表１−２】
2021500868.tif 000003
【０２６０】
ＩＤＴクラスター中の遺伝子の命名は、Ａ．ニジュランス（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）命名慣用にしたがい、ここで、遺伝子は、斜字フォントで書き表す、種を示す小文字の三文字接頭語を含み、その後、遺伝子機能を示す大文字の一文字接尾語が続く、名称を与えられる（例えばｐａｘＣ）。対応するタンパク質産物の命名は、接頭語の最初の文字が大文字であり、そして全体の名称が通常（非斜字）フォントで書き表されることを除いて、同じ規則にしたがう（例えばＰａｘＣはｐａｘＣのタンパク質産物である）。したがって、ｎｏｄ名は、ＮＡＡ  １０遺伝子クラスター中の各Ｈ．プリシシドゥム遺伝子に割り当てられた。既知のＩＤＴ経路に見られる遺伝子と相同性を共有する（予測される翻訳産物の＞３５％アミノ酸同一性）Ｈ．プリシシドゥム遺伝子の後にはアステリスク（＊）を示し、そしてｎｏｄＲを除いて、既知の確認された遺伝子に対応する文字を示す（例えばｎｏｄＣによってコードされるタンパク質はｐａｘＣのタンパク質産物と５２．８％のアミノ酸同一性を共有する）。既知のＩＤＴ遺伝子と相同性を共有しない遺伝子は、確認されたＩＤＴ遺伝子のいずれとも共有されない文字を割り当てられた。特に、クラスターは、２セットのパラログ遺伝子（互いに＞４０％のアミノ酸同一性を共有する）を含有し、我々はこれらを、数字を用いて区別した（すなわちｎｏｄＤ１／ｎｏｄＤ２およびｎｏｄＹ１／ｎｏｄＹ２）。１０に設定した「予期閾値（ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）」および６に設定した「ワードサイズ」で、非冗長タンパク質配列データベースに対して、ＢＬＡＳＴｐ（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）を用いて最も近いマッチを同定した。１１のギャップオープニングペナルティおよび１のギャップ伸長ペナルティで、条件付き組成スコアマトリックス調節（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を伴い、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを適用した。
【０２６１】
表２．  ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（「Ｃ」酵素）の類似性マトリックス
【０２６２】
【表２】
2021500868.tif 000004
【０２６３】
薄いグレーの影の領域はアミノ酸残基に関する％同一性スコアを示し、そして濃いグレーの影の領域は％類似性スコアを示す。
表３．  ３−ゲラニルゲラニルインドールエポキシダーゼ（「Ｍ」酵素）の類似性マトリックス
【０２６４】
【表３】
2021500868.tif 000005
【０２６５】
薄いグレーの影の領域はアミノ酸残基に関する％同一性スコアを示し、そして濃いグレーの影の領域は％類似性スコアを示す。
表４．  インドールジテルペンシクラーゼ（「Ｂ」酵素）の類似性マトリックス
【０２６６】
【表４】
2021500868.tif 000006
【０２６７】
薄いグレーの影の領域はアミノ酸残基に関する％同一性スコアを示し、そして濃いグレーの影の領域は％類似性スコアを示す。
表５．  インドールジテルペンプレニルトランスフェラーゼの類似性マトリックス（ＮｏｄＤ１およびＮｏｄＤ２に比較した「Ｄ」および「Ｅ」酵素）
【０２６８】
【表５】
2021500868.tif 000007
【０２６９】
薄いグレーの影の領域はアミノ酸残基に関する％同一性スコアを示し、そして濃いグレーの影の領域は％類似性スコアを示す。
表６．  インドールジテルペンＦＡＤ依存性酸化的シクラーゼ（「Ｏ」酵素）の類似性マトリックス
【０２７０】
【表６】
2021500868.tif 000008
【０２７１】
薄いグレーの影の領域はアミノ酸残基に関する％同一性スコアを示し、そして濃いグレーの影の領域は％類似性スコアを示す。
表７．  本研究で用いた真菌種の表
【０２７２】
【表７】
2021500868.tif 000009
【０２７３】
表８．  転写単位モジュール（ＴＵＭ）の増幅のためのＰＣＲプライマー
【０２７４】
【表８−１】
2021500868.tif 000010
【０２７５】
【表８−２】
2021500868.tif 000011
【０２７６】
【表８−３】
2021500868.tif 000012
【０２７７】
【表８−４】
2021500868.tif 000013
【０２７８】
【表８−５】
2021500868.tif 000014
【０２７９】
ＴＵＭ（すなわちプロモーター（ＰｒｏＵＴＲ）、コード配列（ＣＤＳ）、およびターミネーター（ＵＴＲｔｅｒｍ））の増幅に用いる順方向および逆方向ＰＣＲプライマーを列挙する。順化目的（すなわちＡａｒＩ、ＢｓａＩまたはＢｓｍＢＩの内部部位の除去）のためにＴＵＭ断片を増幅するために用いるプライマーに薄いグレーで影をつける。ｎｏｄ  ＣＤＳの増幅のためのテンプレートは、ヒポキシロン・プリシシドゥム株ＡＴＣＣ（登録商標）７４２４５ＴＭ由来のゲノムＤＮＡであった２５。ｐａｘ遺伝子ＴＵＭの増幅のためのテンプレートは、ペニシリウム・パキシリ株ＡＴＣＣ（登録商標）２６６０１ＴＭ（ＰＮ２０１３）由来のゲノムＤＮＡであった２４。ｔｒｐＣ  ＰｒｏＵＴＲモジュール、ｎｐｔＩＩ  ＣＤＳモジュール（ジェネテシンに耐性を与える）、およびｔｒｐＣＵＴＲｔｅｒｍモジュールを産生するために用いるＰＣＲ産物はすべて、プラスミドｐＩＩ９９より増幅された４１。ＢｓｍＢＩ認識部を強調し（ｃｇｔｃｔｃ）、ＢｓｍＢＩ切断後に生成されるオーバーハングをより明るいグレーの影で示す。各ＴＵＭに隣接し、そしてＭＩＤＡＳモジュール各々のアドレス系の基礎を形成する５’（接頭）および３’（接尾）ヌクレオチド塩基を、それぞれ、明るいグレーおよび暗いグレーで示す。
【０２８０】
表９．  ＭＩＤＡＳレベル１プラスミドライブラリー：ｐＭＬ１におけるＴＵＭの組み立て
【０２８１】
【表９】
2021500868.tif 000015
【０２８２】
この表は、本発明者らがＭＩＤＡＳレベル２  ＴＵ（表１０）を組み立てるために用いた、ＭＩＤＡＳレベル１  ＴＵＭを示す。各ＴＵＭに隣接する４塩基接頭および接尾（５’から３’）を表の上部に示し、ともにＴＵＭに結合して、ＭＩＤＡＳレベル２  ＴＵを作製する配列を強調する。これらの４塩基隣接領域を明るいグレー（順方向アドレス）および暗いグレー（逆方向アドレス）で、プライマーの表（表８）に示す。
【０２８３】
表１０．  ＭＩＤＡＳレベル２プラスミドライブラリー：ｐＭＬ２デスティネーションベクターにおけるＴＵの組み立て
【０２８４】
【表１０】
2021500868.tif 000016
【０２８５】
この表は、異種発現研究のため、ＭＩＤＡＳレベル３マルチ遺伝子プラスミドを組み立てるために用いた、ＭＤＩＡＳレベル２  ＴＵの構築を示す。産生したレベル２エントリープラスミドの名称をグレーで影を付けたカラムに示す。ＴＵを、含有するＣＤＳによって示し、そしてｐＭＬ２デスティネーションベクターによって決定されるＴＵ配向を、レベル２の説明における矢じり（順方向（Ｆ）デスティネーションベクターに関しては→、そして逆方向（Ｒ）デスティネーションベクターに関しては←）によって示す。
【０２８６】
表１１．  ＭＩＤＡＳレベル３プラスミドライブラリー：ｐＭＬ３におけるマルチ遺伝子組み立て
【０２８７】
【表１１−１】
2021500868.tif 000017
【０２８８】
【表１１−２】
2021500868.tif 000018
【０２８９】
表は、マルチ遺伝子プラスミドを構築するために用いたレベル２エントリークローンおよびレベル３デスティネーションベクターを示す。レベル３組み立ての各サイクル中に産生されたプラスミドの名称をグレーの影のカラムに示す。レベル３プラスミドを生成するために用いたレベル３組み立て反応の数は、工程カラムの数字によって示される。ＴＵには、含有するＣＤＳの名称で注釈をつける。ＴＵ配向を矢じりによって示す。
【０２９０】
表１２．  ｐＭＬ１にクローニングしようとするＰｒｏＵＴＲ、ＣＤＳおよびＵＴＲｔｅｒｍモジュールの増幅のための一般的なプライマー設計
【０２９１】
【表１２】
2021500868.tif 000019
【０２９２】
ＴＵＭの増幅に用いた順方向および逆方向ＰＣＲプライマーの一般的な特徴を列挙する。ＢｓｍＢＩ認識部位を色付けして示し（ｃｇｔｃｔｃ）、ＢｓｍＢＩ切断後に生じるオーバーハングをグレーの影によって示す。各ＴＵＭに隣接し、そしてＭＩＤＡＳモジュール各々のアドレス系の基礎を形成する５’および３’ヌクレオチド特異的塩基を、それぞれ、明るいグレーおよび暗いグレーで示す。
【０２９３】
表１３．  「白色」および「青色」ｐＭＬ２ベクター中で組み立てるＴＵを用いて、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング反応を交互に行うことによって、レベル３マルチ遺伝子組み立てを構築する。
【０２９４】
【表１３】
2021500868.tif 000020
【０２９５】
該表は、４つのＴＵを含有する仮説上のマルチ遺伝子構築物を産生するために用いたクローニング工程を示し、各列は、投入プラスミド（レベル２エントリークローンおよびデスティネーションプラスミド）、組み立てに用いたＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応のタイプ、産物プラスミドおよびスクリーニングしたコロニーのタイプを示す。
【０２９６】
表１４．  真菌抽出物ＬＣ−ＭＳ分析に用いた多工程アセトニトリル勾配
【０２９７】
【表１４】
2021500868.tif 000021
【０２９８】
産業適用
本発明は、インドールジテルペン化合物、特にＮＡの産生に産業適用を有する。
参考文献
【０２９９】
【化１−１】
2021500868.tif 000022
【０３００】
【化１−２】
2021500868.tif 000023
【０３０１】
【化１−３】
2021500868.tif 000024
【０３０２】
【化１−４】
2021500868.tif 000025
【図１】
2021500868.tif 000026
【図２】
2021500868.tif 000027
【図３】
2021500868.tif 000028
【図４】
2021500868.tif 000029
【図５】
2021500868.tif 000030
【図６】
2021500868.tif 000031
【図７】
2021500868.tif 000032
【図８】
2021500868.tif 000033
【図９】
2021500868.tif 000034
【図１０】
2021500868.tif 000035
【図１１】
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【図１２】
2021500868.tif 000037
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021500868.tif 000042
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2021500868.tif 000044
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