(57)【要約】本明細書で提供されるのは、ＧＡＬＴタンパク質をコードする組換えＡＡＶベクターが本明細書において提供される。ガラクトース血症の処置のための組成物および方法も、本開示において提供される。本発明は、例えば、配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも８５％同一の配列またはこれらのそれぞれの同等物を含む単離されたポリヌクレオチドであって、必要に応じて、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つまたはそれより多くがその対応する野生型配列から修飾されていない、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも８５％同一の配列またはこれらのそれぞれの同等物を含む単離されたポリヌクレオチドであって、必要に応じて、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つまたはそれより多くがその対応する野生型配列から修飾されていない、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸もしくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸またはこれらの同等物をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドの相補物を含むポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１のポリヌクレオチドまたはその同等物を含むポリヌクレオチドであって、必要に応じて、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つまたはそれより多くが配列番号１から修飾されていないポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
プロモーターおよび／またはエンハンサー要素をさらに含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
標識をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項５もしくは６に記載のベクター。
【請求項８】
ベクターがＡＡＶベクターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項９】
キャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記キャプシドタンパク質が野生型キャプシドタンパク質または変異したキャプシドタンパク質である、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項５〜１０のいずれか一項に記載のベクターを含む単離された細胞。
【請求項１２】
ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（「ＧＡＬＴ」）をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクター。
【請求項１３】
ＧＡＬＴをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含み、必要に応じて、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つまたはそれより多くが配列番号１から修飾されていない、請求項１２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項１４】
ＧＡＬＴをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項１５】
ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ  ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶ  ｒｈ７４のものである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項１６】
ベクターが、ＡＡＶ９、ｒｈ７４、変異したｒｈ７４またはＡＡＶ  ＰＨＰ．Ｂのものである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項１７】
ベクターが、プロモーター、組織特異的調節エレメントまたは構成的プロモーターに機能的に連結されている、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項１８】
構成的プロモーターが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーターまたはＥＦ１プロモーターを含む、請求項１７に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項１９】
β−アクチンプロモーターがニワトリβ−アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーターである、請求項１８に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項２０】
配列番号２と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、必要に応じて、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つまたはそれより多くが配列番号２から修飾されていない、請求項１２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項２１】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項２２】
配列番号３と少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含み、必要に応じて、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つまたはそれより多くが配列番号３から修飾されていない、請求項１２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項２３】
配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項２４】
ＧＡＬＴ酵素をコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号４のアミノ酸配列をコードする、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項２５】
検出可能なまたは精製マーカーをさらに含む、請求項１２〜２４のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項２６】
請求項１２〜２４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターと１またはそれを超えるキャプシドタンパク質とを含むウイルス粒子。
【請求項２７】
キャプシドタンパク質が少なくとも１つの野生型キャプシドタンパク質を含む、請求項２６に記載のウイルス粒子。
【請求項２８】
キャプシドタンパク質が、少なくとも１つの天然に存在しないまたは変異したタンパク質を含む、請求項２６に記載のウイルス粒子。
【請求項２９】
キャプシドタンパク質が、少なくとも１つの野生型キャプシドタンパク質と少なくとも１つの変異したキャプシドタンパク質とを含む、請求項２６に記載のウイルス粒子。
【請求項３０】
キャプシドタンパク質が、アミノ酸位置５０２でのアスパラギンのイソロイシンへの置換、およびＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンのアルギニンへの必要に応じた置換、およびＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸位置５９１でのペプチドＹＩＧの挿入の群から選択される１またはそれを超える修飾を含む修飾されたＡＡＶｒｈ７４  ＶＰ１キャプシドタンパク質を含む、請求項２６に記載のウイルス粒子。
【請求項３１】
アミノ酸位置５０２でのアスパラギンのイソロイシンへの置換、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンのアルギニンへの置換およびＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸位置５９１でのペプチドＹＩＧの挿入の群から選択される１もしくはそれを超える修飾を含む修飾されたＡＡＶｒｈ７４  ＶＰ１キャプシドタンパク質もしくはその同等物をコードするポリヌクレオチドまたは１もしくはそれを超える修飾が前記修飾されたＡＡＶｒｈ７４  ＶＰ１キャプシドタンパク質中のアミノ酸と同一であるという条件で少なくとも８５％同一であるポリヌクレオチド。
【請求項３２】
アミノ酸位置５０２でのアスパラギンのイソロイシンへの置換、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンのアルギニンへの置換およびＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸位置５９１でのペプチドＹＩＧの挿入の群から選択される１もしくはそれを超える修飾を含む修飾されたＡＡＶｒｈ７４  ＶＰ１キャプシドタンパク質もしくはその同等物または１もしくはそれを超える修飾が前記修飾された（ｍｏｄｉｆｉｃｅ）ＡＡＶｒｈ７４  ＶＰ１キャプシドタンパク質中のアミノ酸と同一であるという条件で少なくとも８５％同一であるポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドの相補物。
【請求項３４】
請求項１〜１４、３１もしくは３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、請求項３２に記載のキャプシドタンパク質と、および／または請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のウイルス粒子と、および担体、必要に応じて薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
【請求項３５】
機能的なＧＡＬＴ酵素を細胞中に導入するための方法であって、請求項１〜１３、３１または３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２に記載のキャプシドタンパク質、請求項１４に記載の組成物または請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のウイルス粒子と前記細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項３６】
接触がエクスビボまたはインビボである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ガラクトース血症を処置することを必要とする対象においてガラクトース血症を処置するための方法であって、治療有効量の、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１４に記載の組成物、または請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のウイルス粒子を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３８】
ガラクトース血症に罹患している対象においてガラクトース代謝を増加させる方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１４に記載の組成物、または請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のウイルス粒子を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３９】
ガラクトース血症に罹患している対象における疾患症状を軽減する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４に記載の組成物、または請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のウイルス粒子を前記対象に投与することを含み、前記疾患症状が、黄疸、肝脾腫、肝細胞機能不全、低血糖、腎尿細管機能障害、筋緊張低下、敗血症、白内障、運動失調、振戦、減少した骨密度または原発性卵巣機能不全から選択される、方法。
【請求項４０】
ガラクトース血症が１型ガラクトース血症である、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
対象が哺乳動物である、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
対象がヒトである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
対象がヒト新生児である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ヒト新生児が、機能的ＧＡＬＴ遺伝子の発現の欠如についての遺伝子検査によって、投与のために選択されている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
投与されるのが、筋肉内注射、肝臓への局所送達または静脈内注射による、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
投与が全身投与を含む、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
投与が肝臓への局所送達を含む、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
請求項１〜１３、３１または３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２に記載のキャプシド、請求項１４に記載の組成物または請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のウイルス粒子の１つまたはそれより多くと、および使用説明書とを備えるキット。
【請求項４９】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む宿主細胞。
【請求項５０】
細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
細胞がパッケージング細胞である、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
請求項１〜１３、３１または３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドとヘルパー細胞株とを含む、ＡＡＶパッケージング系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、米国仮出願第６２／７２５，２２５号、２０１８年８月３０に基づく優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
背景
本開示は、一般的には、遺伝子治療の分野に関し、特にガラクトース血症の処置のための遺伝子治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、ガラクトース含有食品の食事制限以外には、ガラクトース血症患者に対する処置の選択肢は存在しない。ガラクトースを含まない食事を厳守しているにもかかわらず、多くの患者は、食品に含まれる少量のガラクトースと内因的に産生されるガラクトースのために、長期的な精神的および肉体的欠陥に苦しんでいる。したがって、効果的な処置に対する要求が当技術分野に存在する。本開示はこの要求を満たし、関連する利点も提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
開示された遺伝子治療は、脳を含むガラクトース血症患者の細胞にＧＡＬＴ遺伝子を効率的に送達することにより、持続的で長期の処置の選択肢をガラクトース血症患者に提供して、機能的ＧＡＬＴタンパク質の持続的発現および疾患症候の緩和を提供する。
【０００５】
この治療を達成するために、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（「ＧＡＬＴ」）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、または該ポリヌクレオチド配列から本質的になる、または該ポリヌクレオチドからなる、ポリヌクレオチドまたは組換えアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターが本明細書において提供される。一態様では、ＧＡＬＴをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含み、または該ヌクレオチド配列から本質的になり、または該ヌクレオチド配列からなる。一態様では、前記配列は、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つまたはそれより多くが配列番号１から修飾されていないという条件で、配列番号１と少なくとも８５％同一である（図４参照）。別の態様では、ＧＡＬＴをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含み、または該ヌクレオチド配列から本質的になり、または該ヌクレオチド配列からなる。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列またはその同等物をコードする。
【０００６】
一態様では、ベクターは、自己相補的ベクターまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ベクターである。
【０００７】
一態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）は、２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接するｓｃＡＡＶまたはｓｓＡＡＶなどのＡＡＶを含み、または該ＡＡＶから本質的になり、または該ＡＡＶからなる。これらのＩＴＲは、感染の後続の工程が開始し得る前に、第２の鎖の合成を開始するためのプライマーとしての役割を果たすために、配列の末端にヘアピンを形成する。第２の鎖の合成は、効率的な感染に対するいくつかの障害の１つであると考えられている。ｓｃＡＡＶのさらなる利点には、インビトロおよびインビボでの導入遺伝子発現の増加および延長が含まれる。したがって、一態様では、ＡＡＶは２つのＩＴＲをさらに含む。
【０００８】
ベクターを作製するための組換えＡＡＶ骨格の非限定的な例には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ  ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶ  ｒｈ７４の群からのＡＡＶベクター血清型が含まれる。さらなる態様において、ベクター骨格は、ＡＡＶ９血清型、ｒｈ７４血清型または修飾されたＡＡＶｒｈ７４血清型である。アミノ酸位置５０２でのアスパラギンのイソロイシンへの置換、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンのアルギニンへの必要に応じた置換、およびＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸位置５９１でのペプチドＹＩＧもしくはＹＩＧＳＲの挿入の群から選択される１もしくはそれを超える修飾を含む修飾されたＡＡＶｒｈ７４  ＶＰ１キャプシドタンパク質もしくはその同等物をコードするポリヌクレオチド、または１もしくはそれを超える、もしくは２もしくはそれを超える、もしくは３もしくはそれを超える、もしくは４もしくはそれを超える修飾が修飾された（ｍｏｄｉｆｉｃｅ）ＡＡＶｒｈ７４  ＶＰ１キャプシドタンパク質中のアミノ酸と同一であるという条件で少なくとも８５％同一であるポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドの相補物も提供される。アミノ酸位置５０２でのアスパラギンのイソロイシンへの置換、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンのアルギニンへの必要に応じた置換、およびＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸位置５９１でのペプチドＹＩＧの挿入の群から選択される１もしくはそれを超える修飾を含む修飾されたＡＡＶｒｈ７４  ＶＰ１キャプシドタンパク質もしくはその同等物または１もしくはそれを超える、もしくは２もしくはそれを超える、もしくは３もしくはそれを超える、もしくは４もしくは修飾が修飾された（ｍｏｄｉｆｉｃｅ）ＡＡＶｒｈ７４  ＶＰ１キャプシドタンパク質中のアミノ酸と同一であるという条件で少なくとも８５％同一であるポリヌクレオチドも提供される。
【０００９】
ＧＡＬＴをコードするポリヌクレオチド配列は、必要に応じて、プロモーター、組織特異的調節エレメントまたは構成的プロモーターに機能的に連結されている。構成的プロモーターの非限定的な例には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターまたはＥＦ１プロモーターが含まれる。特定の態様において、β−アクチンプロモーターは、ニワトリβ−アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーターである。別の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫ１（ヒトまたはマウス）プロモーター、Ｐ５プロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＵＡＳプロモーター、Ａｃ５プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、Ｇａｌ１プロモーター、ＴＥＦ１、ＧＤＳプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーターまたはα−１−アンチトリプシンプロモーターから選択される。
【００１０】
さらなる態様において、ポリヌクレオチドまたは組換えＡＡＶは、エンハンサー要素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。非限定的な例には、ＣＭＶエンハンサー、ＷＰＲＥおよびＲＳＶエンハンサーが含まれる。
【００１１】
特定の態様において、組換えポリヌクレオチドまたはＡＡＶベクターは、配列番号２または配列番号３と少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含み、または該ヌクレオチド配列から本質的になり、または該ヌクレオチド配列からなる。一態様において、この配列は、野生型ＧＡＬＴ（図４を参照）配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つまたはそれより多くが配列番号２または３から修飾されていないという条件で、配列番号２または３と少なくとも８５％同一である。さらなる態様において、組換えＡＡＶベクターは、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含み、または該ヌクレオチド配列から本質的になり、または該ヌクレオチド配列からなる。
【００１２】
本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたはＡＡＶベクターは、検出可能マーカーまたは精製マーカーをさらに含むことができる。ポリヌクレオチドまたはベクターは、ポリヌクレオチドまたはベクターと、防腐剤または薬学的に許容され得る担体などの担体とを含む組成物として含有されることができる。
【００１３】
本明細書に記載のポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶベクターを含む細胞またはウイルス粒子も提供される。細胞は原核生物または真核生物であり得、パッケージング細胞株を含み得る。細胞およびウイルス粒子は、ベクターと防腐剤または薬学的に許容され得る担体などの担体とを含む組成物として含有されることができる。
【００１４】
ポリヌクレオチドおよびベクターは、治療方法またはその他の方法において有用であり、野生型のまたは修飾されたキャプシドタンパク質内に含有される。したがって、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される組換えポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶベクターを含むＡＡＶウイルス粒子、ならびに本明細書に開示される方法において使用するためのポリヌクレオチドおよび／またはウイルス粒子を含有する組成物である。さらに、ベクター、ポリヌクレオチドおよびそれらを含有するウイルス粒子を調製するための方法が提供される。一態様において、機能的ＧＡＬＴ酵素を細胞に導入するための方法であって、組換えポリヌクレオチドおよび／もしくはＡＡＶベクターまたはこれらを含有するキャプシドもしくはウイルス粒子、または本明細書に記載の組成物と細胞を接触させることを含む、方法が提供される。接触はエクスビボまたはインビボであり得る。
【００１５】
ガラクトース血症を処置することを必要とする対象においてガラクトース血症を処置するための方法であって、有効量の、組換えポリヌクレオチドおよび／もしくはＡＡＶベクター、組換えポリヌクレオチドおよび／もしくはＡＡＶベクターを含むウイルス粒子、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含み、または投与することから本質的になり、または投与することからなる方法も提供される。
【００１６】
一態様において、ガラクトース血症に罹患している可能性がある対象においてガラクトース代謝を増加させる方法であって、組換えポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶベクター、ウイルス粒子、または本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含み、または投与することから本質的になり、または投与することからなる方法も提供される。一態様において、送達される量は、処置を行っている専門家によって決定される有効量である。
【００１７】
さらに提供されるのは、ガラクトース血症に罹患している対象においてガラクトース血症と関連する疾患症状または症候を軽減する方法であって、組換えポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶベクター、ウイルス粒子または本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含み、または投与することから本質的になり、または投与することからなり、疾患症状が、黄疸、肝脾腫、肝細胞機能不全、低血糖、腎尿細管機能障害、筋緊張低下、敗血症、白内障、運動失調、振戦、減少した骨密度、成人女性（ａｄｕｌｔ  ｆｅｍａｌｅｓ）の生殖能力、ＧａｌＴ欠損症における運動機能障害および発育不全または原発性卵巣機能不全の１つまたはそれより多くを含む、方法である。一態様において、この方法は、対象をガラクトース血症に罹患していると特定すること、および、次いで、この方法によって特定された対象を処置することをさらに含む。一態様において、送達される量は、処置を行っている専門家によって決定される有効量である。
【００１８】
これらの方法のそれぞれにおいて、処置されるべきガラクトース血症は、１型ガラクトース血症、２型ガラクトース血症または３型ガラクトース血症である。特定の態様において、ガラクトース血症は１型ガラクトース血症である。
【００１９】
組換えポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶベクター、ウイルス粒子、または組成物は、筋肉内注射または静脈内注射によって投与される。あるいは、組換えポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶベクター、ポリヌクレオチドおよび／またはウイルス粒子、または組成物は、全身投与される。さらに、組換えポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶベクター、ウイルス粒子、または組成物は、注射、注入または移植による非経口投与である。さらなる態様において、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶベクター、ウイルス粒子、または組成物は、筋肉内注射または静脈内注射によって、その後、全身的に投与される。
【００２０】
組換えポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶベクター、ウイルス粒子、および／または本明細書に記載の組成物を含むキットも、本開示によって提供される。キットは、ポリヌクレオチド、ベクター、ウイルス粒子または組成物を作製および使用するための説明書を必要に応じて含有することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、３つの例示的なベクター：ｐＡＡＶ−ＣＢ−ＧＡＬＴ−ＷＰＲＥ−ｋａｎ（図１Ａ）、ｐＡＡＶ−ＣＢ−ｈＧＡＬＴ（図１Ｂ）およびｐＡＡＶ−ＣＢ−ｈＧＡＬＴ−ＷＰＲＥｖ２（図１Ｃ）のマップを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、３つの例示的なベクター：ｐＡＡＶ−ＣＢ−ＧＡＬＴ−ＷＰＲＥ−ｋａｎ（図１Ａ）、ｐＡＡＶ−ＣＢ−ｈＧＡＬＴ（図１Ｂ）およびｐＡＡＶ−ＣＢ−ｈＧＡＬＴ−ＷＰＲＥｖ２（図１Ｃ）のマップを示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、３つの例示的なベクター：ｐＡＡＶ−ＣＢ−ＧＡＬＴ−ＷＰＲＥ−ｋａｎ（図１Ａ）、ｐＡＡＶ−ＣＢ−ｈＧＡＬＴ（図１Ｂ）およびｐＡＡＶ−ＣＢ−ｈＧＡＬＴ−ＷＰＲＥｖ２（図１Ｃ）のマップを示す。
【００２２】
【図２】図２は、ｐＡＡＶ−ＣＢ−ＧＡＬＴ−ＷＰＲＥ−ｋａｎベクターの生体内分布を示す（図１Ａ）。
【００２３】
【図３】図３は、ｐＡＡＶ−ＣＢ−ＧＡＬＴ−ＷＰＲＥ−Ｋａｎベクターのベクターを使用して発現されたヒトＧＡＬＴタンパク質の発現を示す（図１Ａ）。
【００２４】
【図４】図４は、対応する野生型配列と比較した、本明細書に記載のＧＡＬＴをコードするコドン最適化された組換えポリヌクレオチドの配列アラインメントである。
【００２５】
【図５】図５は、ＡＡＶ９ベクターの生体内分布を示している。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ（ＷＴ）またはＧａｌＴ−／−（ＣＧ）雌マウスに、１Ｅ＋１２ウイルスゲノム（Ｖｇ）のＡＡＶ９／ｌｕｃＥＹＦＰレポーターウイルスを静脈内注射し、１週間後に組織を採取し、ｑＰＣＲによってベクターゲノムコピーのアッセイを行った。
【００２６】
【図６】図６はタンパク質発現を示している。プラスミドｐＡＡＶ−ＣＢ−ＧＡＬＴ−ＷＰＲＥまたはｐＡＡＶ−ＣＢ−ｌｕｃＥＹＦＰレポータープラスミドをＨＥＫ２９３細胞中に形質移入し、２日後に、ウエスタンブロット分析によってＧＡＬＴ発現のアッセイを行った。ＧＡＬＴ形質移入された細胞可溶化液（３０または３μｇ）、ＬｕｃＥＹＦＰ細胞可溶化液（１３８μｇ）、ＨｅｐＧ２内因性ＧＡＬＴタンパク質対照（１３５μｇ）、精製タグのためにわずかにより高い分子量を有する精製された、細菌によって発現されたＧＡＬＴタンパク質標準。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
本開示による実施形態は、以下でより完全に説明される。しかしながら、本開示の態様は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が綿密かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供されている。本明細書中の記述において使用される用語は、特定の実施形態を記述することを目的とするものに過ぎず、限定することは意図されていない。
【００２８】
別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義されているような用語は、本出願および関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書において明示的にそのように定義されていなければ、理想化されたまたは過度に形式張った意味で解釈されるべきではないことがさらに理解される。以下で明示的に定義されてはいないが、このような用語はそれらの一般的な意味に従って解釈されるべきである。
【００２９】
本明細書の記載において使用される用語は、特定の実施形態を記述することを目的とするものに過ぎず、本発明を限定することは意図されていない。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【００３０】
別段の記述がなければ、本技術の実施は、本分野の技術に属する、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの慣用技術を使用する。
【００３１】
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に記載されている本発明の様々な特徴は任意の組み合わせで使用できることが特に意図されている。さらに、本開示は、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略できることも企図している。例示するために、複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと明細書が述べている場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれかまたはこれらの組み合わせを省略することができ、単独でまたは任意の組み合わせで権利範囲から除外され得ることが特に意図されている。
【００３２】
特に明記しない限り、すべての特定された実施形態、特徴および用語は、列挙された実施形態、特徴または用語とそれらの生物学的同等物の両方を含むことを意図している。
【００３３】
範囲を含む全ての数的表記、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、適宜、１．０または０．１の増分によって、または＋／−１５％、または＋／−１０％、または＋／−５％、または＋／−２％の変動によって、（＋）または（−）に変動される近似値である。常に明示的に述べられているわけではないが、全ての数的表記には、「約」という用語が前置されていることが理解されるべきである。常に明示的に述べられているわけではないが、本明細書に記載されている試薬は単に例示であること、およびこのようなものと同等な試薬が本分野において知られていることも理解されるべきである。
【００３４】
本開示を通じて、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書が、識別引用によってまたはアラビア数字によって参照されている。アラビア数字によって識別される刊行物の完全な引用は、特許請求の範囲の直前に記載されている。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示は、本発明が関係する分野の技術水準をより完全に説明するために、参照によりその全体が本開示に組み込まれる。
定義
【００３５】
別段の記述がなければ、本技術の実施は、本分野の技術範囲に属する、有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。
【００３６】
本発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形も含むことを意図している。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「含む」という用語は、組成物および方法が表記された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することが意図される。本明細書で使用される場合、から本質的になるという移行句（および文法的変形）は、列挙された材料または工程、ならびに列挙された実施形態の基本的なおよび新規の特性に実質的に影響を及ぼさない材料または工程を包含すると解釈されるべきである。したがって、本明細書で使用される「から本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されるべきではない。「からなる」とは、微量を超えるその他の成分および本明細書に開示されている組成物を投与するための実質的な方法工程を除外することを意味するものとする。これらの移行語の各々によって定義される態様は、本開示の範囲に属する。
【００３８】
量または濃度などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」という用語は、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含することが意図される。
【００３９】
本明細書に開示される任意の成分、範囲、剤形などの選択を説明するために使用される場合の「許容され得る」、「有効な」、または「十分な」という用語は、前記成分、範囲、剤形などが開示された目的に対して適切であることを意図する。
【００４０】
また、本明細書において使用される場合、「および／または」は、関連する列記された項目の１つまたはそれより多くのあらゆるすべての可能な組み合わせのみならず、選択的に（「ｏｒ」）解釈される場合には、組み合わせの欠如も表し、これらを包含する。
【００４１】
本明細書で使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」という用語は、この名前に関連し、パルボウイルス科のディペンドパルボウイルス属に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。このウイルスの複数の血清型が遺伝子送達に適していることが知られており、公知の血清型はすべて、さまざまな組織タイプからの細胞に感染することができる。少なくとも１１個の連続番号が付けられたＡＡＶ血清型が当技術分野において公知である。本明細書に開示される方法において有用な非限定的な例示的血清型には、１１の血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、または変異形血清型、例えば、ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ  ＰＨＰ．Ｂのいずれもが含まれる。ＡＡＶ粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３という３つの主要なウイルスタンパク質を含む。一実施形態において、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ  ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶ  ｒｈ７４を指す。
【００４２】
「ガラクトース血症」という用語は、ガラクトースを代謝する対象の能力に影響を与える遺伝性障害を指す。食品（乳製品など）中の乳糖は、酵素ラクターゼによってグルコースとガラクトースに分解される。ガラクトース血症を有する個体では、ガラクトースのさらなる代謝のために必要とされる酵素（ガラクトキナーゼおよびガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）が大幅に減少しまたは完全に失われ、様々な組織内に毒性レベルのガラクトースまたはガラクトース１−リン酸（どの酵素が欠落しているかに応じて）を引き起こして、古典的なガラクトース血症の場合のように、黄疸、肝腫大（肝臓の肥大）、腎尿細管機能障害、筋緊張低下、敗血症、肝細胞機能不全、肝硬変、腎不全、白内障、嘔吐、発作、低血糖、嗜眠、脳損傷および卵巣機能不全を含むがこれらに限定されない疾患症状をもたらす。したがって、これらの症状は、対象におけるガラクトース血症に関連する場合、本開示の方法によって適切に処置することもできる。
【００４３】
対象中で欠損している酵素に基づいて、ガラクトース血症は、１型ガラクトース血症（ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）、２型ガラクトース血症（ガラクトキナーゼ）および３型ガラクトース血症（ＵＤＰガラクトースエピメラーゼ）に分類できる。一実施形態において、１型、２型または３型ガラクトース血症を処置するために、本明細書に開示されている組換えベクターまたは方法を使用することができる。別の実施形態において、組換え体または方法は、１型ガラクトース血症を処置するために使用され得る。ガラクトース血症は多くの疾患症状と関連しているので、別の実施形態では、本開示は、ガラクトース血症に罹患している対象における疾患症状を軽減する方法であって、疾患症状が、黄疸、肝腫大（肝臓の肥大）、腎尿細管機能障害、筋緊張低下、敗血症、肝細胞機能不全、肝硬変、腎不全、白内障、嘔吐、発作、低血糖、嗜眠、脳損傷または卵巣機能不全から選択される、方法を提供する。
【００４４】
ガラクトース血症と関連する他の疾患症状には、発話障害（ｓｐｅｅｃｈ  ｄｅｆｉｃｉｔ）、運動失調症、フリードライヒ運動失調症、測定異常、骨密度の低下または早期卵巣機能不全が含まれるが、これらに限定されない。これらの症状も、本開示の方法によって処置することができる。
【００４５】
本明細書で使用される「細胞」という用語は、原核細胞または真核細胞のいずれかを指し得、必要に応じて、対象または市販の入手源から取得される。
【００４６】
「真核細胞」は、モネラ界を除く全ての生物界を含む。真核細胞は、膜に結合された核を通じて容易に識別することができる。動物、植物、真菌および原生生物は、真核生物、すなわち、内部の膜および細胞骨格によって、その細胞が複雑な構造へと組織されている生物である。最も特徴的な膜に結合された構造は核である。具体的に記載されていなければ、「宿主」という用語には、例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の細胞を含む、真核生物宿主が含まれる。真核細胞または真核生物宿主の非限定的な例には、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、トリ、爬虫類およびヒト、例えば、ＨＥＫ２９３細胞および２９３Ｔ細胞が含まれる。
【００４７】
通常、核またはいずれかの他の膜結合型細胞小器官を欠く「原核細胞」は、細菌と古細菌という２つのドメインに分けられる。これらの細胞は、染色体ＤＮＡに加えて、エピソームと呼ばれる環状ループ中に遺伝情報を含有することもできる。細菌細胞は非常に小さく、およそ動物のミトコンドリアのサイズである（直径約１〜２μｍ、長さ１０μｍ）。原核細胞は、棹形状、球形およびらせん状という３つの主要な形状を特徴としている。真核生物のような精巧な複製過程を経る代わりに、細菌細胞は二分裂によって分裂する。例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細菌、大腸菌およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌などがあるが、これらに限定されない。
【００４８】
核酸配列に対して適用される場合の「コードする」という用語は、その原型の状態でまたは当業者に周知の方法によって操作された場合に、転写および／または翻訳されてポリペプチドおよび／またはその断片に対するｍＲＮＡを産生することができれば、ポリペプチドを「コードする」と称されるポリヌクレオチドを表す。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補物であり、コード配列はアンチセンス鎖から推定することができる。
【００４９】
「同等物」または「生物学的同等物」という用語は、特定の分子、生物学的または細胞材料を指すときに互換的に使用され、所望の構造または機能をなお維持しながら最小限の相同性を有するものを意図する。同等のポリペプチドの非限定的な例には、少なくとも６０％、もしくは少なくとも６５％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドもしくはポリペプチド配列、または高ストリンジェンシーの条件下でこのようなポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドもしくはその相補物によってコードされるポリペプチドが含まれる。高ストリンジェンシーの条件は、本明細書に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。あるいは、その同等物とは、参照ポリヌクレオチド、例えば野生型ポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはその相補物によってコードされるポリペプチドである。
【００５０】
同等のポリペプチドの非限定的な例には、参照ポリヌクレオチドに対して、少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。同等物は、高ストリンジェンシーの条件下で参照ポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドまたはその相補物も意図する。
【００５１】
別の配列に対してあるパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、整列されたときに、２つの配列を比較すると、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が同一であることを意味する。アラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、本分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ  ７．７．１に記載されているものを用いて決定することができる。特定の実施形態では、初期設定パラメータがアラインメントのために使用される。非限定的な例示的なアラインメントプログラムは、初期設定パラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、例示的なプログラムには、以下の初期設定パラメータを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰが含まれる。遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ディスクリプション＝５０配列；ソート＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴに見出すことができる。配列同一性およびパーセント同一性は、それらをｃｌｕｓｔａｌＷ（Ｗｅｂアドレス：ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能、最終アクセス日は２０１７年１月１３日）中に組み込むことで決定することができる。
【００５２】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列中の位置が同一の塩基またはアミノ酸によって占められるときに、その分子はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は、これらの配列によって共有される合致または相同な位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同な」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、または２５％未満の同一性を共有する。
【００５３】
「相同性」または「同一性」または「類似性」はまた、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する２つの核酸分子を指すこともある。
【００５４】
「ハイブリダイゼーション」は、１またはそれを超えるポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を表す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３またはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などの、より大規模な過程中の工程を構成し得る。
【００５５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。穏やかなハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高いストリンジェンシーの条件の例としては、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分〜２４時間であり、１、２またはそれを超える洗浄工程を有し、洗浄のインキュベーション時間は、約１、２または１５分である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭシトラート緩衝液である。他の緩衝液系を使用するＳＳＣの同等物を使用できることが理解される。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程および／または転写されたｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳される過程を表す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００５７】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」または「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写および翻訳されるときに生成されるアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。
【００５８】
「転写制御下」は、当技術分野で十分に理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与する、または転写を促進する要素に機能的に連結されていることに依存することを示す。「機能的に連結された」は、ポリヌクレオチドが細胞内で機能できるように、ポリヌクレオチドが配置されていることを意図する。一態様において、本発明は、下流配列、例えば、自殺遺伝子、ＶＥＧＦ、１６５Ａ  ＶＥＧＦ、ｔｅｔ活性化因子などに機能的に連結されたプロモーターを提供する。
【００５９】
ポリヌクレオチドに対して適用される場合の「コードする」という用語は、その原型の状態でまたは当業者に周知の方法によって操作された場合に、転写および／または翻訳されてポリペプチドおよび／またはその断片に対するｍＲＮＡを産生することができれば、ポリペプチドを「コードする」と称されるポリヌクレオチドを表す。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補物であり、コード配列はアンチセンス鎖から推定することができる。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、実質的に他の材料が存在しない分子または生物製剤または細胞性材料を表す。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、特定の指定された効果を達成することを意図するために、任意の分子、生物製剤または細胞材料を修飾するために使用され得る。
【００６２】
本明細書において使用される場合、「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー性形態を表すために互換的に使用される。このため、本用語には、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然の、化学的にもしくは生化学的に修飾された、非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子などのコード配列の発現を制御する任意の配列を表す。プロモーターは、例えば、恒常的、誘導性、抑制可能または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、そこにおいて転写の開始および速度が調節されるポリヌクレオチド配列の領域である調節配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子がそこに結合し得る遺伝要素を含有し得る。非限定的な例示的なプロモーターには、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーターまたはＥＦ１プロモーターが含まれる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ニワトリβ−アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーター（例えば、配列番号２の４３９〜７０８の番号が付けられた塩基対もしくは配列番号３の６４４〜９２１の番号が付けられた塩基対またはこれらの各々の同等物）である。
【００６４】
特定の標的特異性を有するさらなる非限定的な例示的プロモーターが本明細書の以下に記載されており、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１（ヒトまたはマウス）、Ｐ５、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、ＵＡＳ、Ａｃ５、ポリヘドリン、ＣａＭＫＩＩａ、Ｇａｌ１、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｈ１、Ｕ６およびα−１−アンチトリプシンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。合成由来のプロモーターは、遍在的または組織特異的な発現のために使用され得る。さらに、そのいくつかが上に記されているウイルス由来のプロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＨＩＶ、アデノウイルスおよびＡＡＶプロモーターは、本明細書に開示される方法において有用であり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、転写効率を増大させるためにエンハンサーに結合される。エンハンサーの非限定的な例には、ＲＳＶエンハンサーまたはＣＭＶエンハンサー（例えば、配列番号２の１５３〜４３２の番号が付けられた塩基対）が含まれる。
【００６５】
エンハンサーは、標的配列の発現を増加させる調節エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターおよびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含有するポリヌクレオチドである。たとえば、レトロウイルスの末端反復配列は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種性」であり得る。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、自然の状態で、ゲノム中の特定の遺伝子と連結されているものである。「外因性」または「異種性」エンハンサー／プロモーターは、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって誘導されるように、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）を用いて遺伝子に並置されているエンハンサー／プロモーターである。
【００６６】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は互換的に使用され、これらの最も広い意味において、アミノ酸、アミノ酸類縁体またはペプチド模倣物の２またはそれを超えるサブユニットの化合物を表す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の態様において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書において使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンならびにＤおよびＬ型光学異性体の両方、アミノ酸類縁体およびペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれかを表す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、例えば形質転換の過程によって細胞内に配置されたときにベクターが複製され得るような無傷のレプリコンを含む非染色体核酸を指す。ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性であり得る。ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、改変されたバキュロウイルス、パポウイルスまたはその他に改変された天然に存在するウイルスが含まれる。核酸を送達するための例示的な非ウイルス性ベクターには、裸のＤＮＡ；単独でまたは陽イオン性ポリマーと組み合わせて、陽イオン性脂質と複合体を形成したＤＮＡ；陰イオン性および陽イオン性リポソーム；ＤＮＡ−タンパク質複合体および異種ポリリジン、規定された長さのオリゴペプチドおよびポリエチレンイミンなどの、場合によってリポソーム中に含有された陽イオン性ポリマーと縮合したＤＮＡを含む粒子；ならびにウイルスとポリリジン−ＤＮＡを含む三元複合体の使用が含まれる。
【００６８】
「ウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボまたはインビトロのいずれかで、宿主細胞中に送達されるべきポリヌクレオチドを含む組換え的に産生されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが含まれる。セムリキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビスウイルスベースのベクターなどのアルファウイルスベクターも、遺伝子治療および免疫治療において使用するために開発されてきた。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４−４３９およびＹｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３−８２７を参照のこと。
【００６９】
別の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。特定の関連する実施形態において、プロモーターは、誘導性テトラサイクリンプロモーターである。Ｔｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系により、研究者は、Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ（１９９２；Ｔｅｔ−Ｏｆｆ）およびＧｏｓｓｅｎら（１９９５；Ｔｅｔ−Ｏｎ）によって記述された制御された高レベルの遺伝子発現系を直ちに利用できる。Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系では、テトラサイクリン（Ｔｃ）またはドキシサイクリン（Ｄｏｘ；Ｔｃ誘導体）が培地から除去されると、遺伝子発現がオンになる。対照的に、Ｔｅｔ−Ｏｎ系では、Ｄｏｘを追加することによって、発現がオンになる。いずれの系でも、ＴｃまたはＤｏｘの濃度の変化に応じて遺伝子発現を厳密に制御できる。Ｔｅｔ系での最大発現レベルは非常に高く、ＣＭＶなどの強力な恒常的哺乳動物プロモーターから得られる最大レベルと比べて遜色がない（Ｙｉｎら、１９９６）。他の誘導性哺乳動物発現系とは異なり、Ｔｅｔ系における遺伝子調節は高度に特異的であるため、多面発現効果または非特異的誘導によって、結果の解釈が複雑化することがない。大腸菌では、Ｔｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）がＴｎ１０トランスポゾン上のテトラサイクリン耐性オペロンの遺伝子を負に調節する。ＴｅｔＲは、Ｔｃの不存在下でｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔＯ）に結合することにより、これらの遺伝子の転写を遮断する。ＴｅｔＲおよびｔｅｔＯは、哺乳類の実験系において使用するための調節および誘導の基礎を提供する。Ｔｅｔ−Ｏｎ系では、調節タンパク質は、ＴｅｔＲ中の４つのアミノ酸変化によって作出された「リバース」Ｔｅｔリプレッサー（ｒＴｅｔＲ）に基づいている（Ｈｉｌｌｅｎ＆Ｂｅｒｅｎｓ，１９９４；Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５）。得られたタンパク質ｒｔＴＡ（リバースｔＴＡはテトラサイクリン活性化タンパク質とも呼ばれる）は、ｐＴｅｔ−Ｏｎ調節プラスミドによってコードされている。この遺伝子は、ＧＡＬＴ遺伝子とは別個のベクター中に存在してもよく、または同一の遺伝子上にコードされてもよい。
【００７０】
関連する実施形態において、ベクターは、さらに、テトラサイクリン活性化タンパク質をコードする核酸およびテトラサイクリン活性化タンパク質の発現を調節するプロモーターを含み、またはこれらから本質的になり、またはこれらからなる。
【００７１】
本明細書に記載されたベクター、単離された細胞、ウイルスパッケージング系および方法において有用なその他の誘導性の系には、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、二量体化の化学的誘導物質およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節が含まれる。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「組換え発現系」または「組換えベクター」という用語は、組換えによって形成された特定の遺伝物質の発現のための１つまたは複数の遺伝的構築物を指す。
【００７３】
「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞中に運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、ミセル、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌、またはバキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターならびに様々な真核生物および原核生物宿主中での発現について記載されており、単純なタンパク質発現のための他、遺伝子治療のために使用され得る当技術分野で典型的に使用されるその他の組換えビヒクルである。
【００７４】
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞または組織に送達することができる。本明細書で使用される「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、「形質導入」などは、導入のために使用される方法とは関係なく、宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチド（「導入遺伝子」と呼ばれることもある）の導入を指す用語である。このような方法には、ベクター媒介性遺伝子導入（例えば、ウイルス感染／形質移入、または他の様々なタンパク質ベースまたは脂質ベースの遺伝子送達複合体による）などの様々な周知の技術、ならびに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術（電気穿孔、「遺伝子銃」送達およびポリヌクレオチドの導入のために使用される他のさまざまな技術など）が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定的にまたは一過性に維持され得る。安定した維持には、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性を有する複製起点を含有すること、または染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）などの宿主細胞のレプリコン中にもしくは核もしくはミトコンドリアの染色体中に組み込まれることが通例必要とされる。当技術分野において公知であり、本明細書に記載されているように、多くのベクターが、哺乳動物細胞への遺伝子の導入を媒介することができることが知られている。
【００７５】
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合、プラスミドは環状であり、二本鎖である。プラスミドは、微生物の集団内での水平的な遺伝子導入のための機序を提供し、通例、所定の環境状態下での選択における利点を提供する。プラスミドは、競争的な生態的地位において、天然に存在する抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を運搬し得、または産生されるタンパク質が同様の状況下で毒素として作用し得る。
【００７６】
遺伝子工学において使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と呼ばれる。多くのプラスミドがこのような用途のために市販されている。複製されるべき遺伝子は、特定の抗生物質に対して細胞を耐性にする遺伝子とＤＮＡ断片をこの位置に挿入することを容易にする一般的に使用される数個の制限部位を含有する短い領域である多重クローニング部位（ＭＣＳ、またはポリリンカー）とを含有するプラスミドのコピー中に挿入される。プラスミドのもう１つの主な用途は、大量のタンパク質を作ることである。この場合、研究者は関心対象の遺伝子を有するプラスミドを含有する細菌を増殖させる。細菌が抗生物質耐性を与えるタンパク質を産生するのと同じように、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように細菌を誘導することもできる。
【００７７】
遺伝子導入がアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＤＮＡウイルスベクターによって媒介される態様において、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部を含むポリヌクレオチドおよび導入遺伝子を指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、５０を超える血清型を含む、比較的十分に性質決定された均質なウイルスの群である。アデノウイルスは、宿主細胞ゲノム中への組み込みを必要としない。組換えＡｄ由来のベクター、特に組換えおよび野生型ウイルスの生成の可能性を低減するものも構築されている。このようなベクターは、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）およびＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｇｅｎｅ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ）などの入手先から商業的に入手可能である。野生型ＡＡＶは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる高い感染性および特異性を有する。Ｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｔｏｔｈ（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１３（６）：４２１−４３３，Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６を参照。
【００７８】
プロモーターと、ポリヌクレオチドをその中に機能的に連結することができるクローニング部位とを両方を含有するベクターは、本分野において周知である。このようなベクターは、ＲＮＡをインビトロまたはインビボで転写することが可能であり、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの入手先から商業的に入手可能である。発現および／またはインビトロでの転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、追加または変更して、転写または翻訳のいずれかのレベルで発現を妨害しまたは低下させ得る余分の潜在的な不適切な別の翻訳開始コドンまたはその他の配列を除去することが必要であり得る。あるいは、発現を増強するために、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンのすぐ５’に挿入することができる。
【００７９】
遺伝子送達ビヒクルには、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセ、および標的化されたウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体も含まれる。標的化抗体またはその断片も含むリポソームは、本明細書に開示される方法において使用することができる。細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、タンパク質形質移入の非限定的な技術によって、細胞または細胞集団への本明細書に記載されたタンパク質の直接的な導入を行うことが可能であり、あるいは本明細書に開示されたタンパク質の発現を増強しおよび／またはその活性を増大させることができる培養条件は他の非限定的な技術である。
【００８０】
本明細書において使用される場合、「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」という用語は、新たに合成された分泌性または膜ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端終端に通常存在するアミノ酸配列を意図する。「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」は、ポリペプチドを特定の細胞位置に、例えば、細胞膜を横切って、細胞膜中にまたは核内に誘導するように作用する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、局在化の後に除去される。シグナルペプチドの例は、当技術分野において周知である。非限定的な例は、米国特許第８，８５３，３８１号、同第５，９５８，７３６号および同第８，７９５，９６５号に記載されているものである。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「ウイルスキャプシド」または「キャプシド」という用語は、ウイルス粒子のタンパク質性シェルまたはコートを指す。キャプシドは、ウイルスゲノムをキャプシドで封入し、保護し、輸送し、宿主細胞中に放出するように機能する。キャプシドは一般に、タンパク質のオリゴマー構造サブユニット（「キャプシドタンパク質」）で構成されている。本明細書で使用される場合、「キャプシドで封入された」という用語は、ウイルスキャプシド内に封入されていることを意味する。
【００８２】
本明細書で使用される場合、ウイルスまたはプラスミドに関する「ヘルパー」という用語は、本明細書に開示される改変されたＡＡＶなどのウイルス粒子または組換えウイルス粒子の複製およびパッケージングに必要な追加の成分を提供するために使用されるウイルスまたはプラスミドを指す。ヘルパーウイルスによってコードされる成分には、ビリオンの構築、キャプシド形成、ゲノム複製および／またはパッケージングに必要とされる任意の遺伝子が含まれ得る。例えば、ヘルパーウイルスは、ウイルスゲノムの複製に必要な酵素をコードし得る。ＡＡＶ構築物との使用に適したヘルパーウイルスおよびプラスミドの非限定的な例には、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）またはヘルペスウイルス（ウイルス）が含まれる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの標準的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、同時感染するヘルパーウイルスによって特定の機能が与えられた細胞中でのみ増殖する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶの一般的な情報および総説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９−２２８およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３−１７６４，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。さまざまな血清型は、構造的にも機能的にも、遺伝子レベルにおいてさえ非常に密接に関連していることが周知であるので、これらの総説中で記載されている同じ原則が、これらの総説の刊行日より後に特性が明らかとなったさらなるＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予測される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５−１７４  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．；およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１−６１（１９７４）を参照）。たとえば、すべてのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに示し、すべてがＡＡＶ２中で発現されるもののような３つの関連するキャプシドタンパク質を有している。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿って血清型間での広範な交差ハイブリッド形成を明らかにするヘテロ二本鎖分析および「末端逆位配列」（ＩＴＲ）に対応する類似した自己アニーリングセグメントの末端での存在によってさらに示唆される。類似の感染性パターンも、各血清型における複製機能が類似の制御調節下にあることを示唆する。
【００８４】
本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１またはそれを超える関心対象のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。このようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードし、発現するベクターで形質移入された宿主細胞中に存在する場合に、複製され、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされ得る。
【００８５】
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシドで封入されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種のポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達されるべき導入遺伝子などの、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、通例、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と表記される。したがって、このようなベクターはＡＡＶベクター粒子内に含有されるので、ＡＡＶベクター粒子の産生は、必然的にＡＡＶベクターの産生を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。たとえば、ＡＡＶ−１の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７で提供されている。ＡＡＶ−２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４（１９８３）に提供されている。ＡＡＶ−３の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９で提供されている。ＡＡＶ−４の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９で提供されている。ＡＡＶ−５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６で提供されている。ＡＡＶ−６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００  １８６２で提供されている。ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９で提供されている。ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）に提供されている。ＡＡＶ−１０ゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６（２００６）に提供されている。ＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶ  ｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている。米国特許第９，４３４，９２８号は、キャプシドタンパク質および自己相補的ゲノムの配列も提供する。一態様において、ゲノムは自己相補的ゲノムである。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシドでの封入／パッケージングおよび宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用性配列は、ＡＡＶ  ＩＴＲ内に含有されている。３つのＡＡＶプロモーター（相対的なマップ位置に対して、ｐ５、ｐｌ９およびｐ４０と名付けられている）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐｉ９）は、単一のＡＡＶイントロンの（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）選択的スプライシングと相まって、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０）の産生をもたらすＲｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製に最終的に関与する複数の酵素特性を持つ。ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位が、３つの関連するキャプシドタンパク質の産生に関与している。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ��１５８：９７−１２９（１９９２）に概説されている。
【００８７】
ＡＡＶは、例えば遺伝子治療において外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてＡＡＶを魅力的なものとする特有の特徴を備えている。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞傷害性であり、ヒトおよびその他の動物の自然感染は、無症状、無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性がある。さらに、ＡＡＶは、ゆっくり分裂している細胞および分裂していない細胞を形質導入し、実質的にこれらの細胞の生涯にわたって、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中でクローニングされたＤＮＡとして挿入されるため、組換えゲノムの構築が実行可能となる。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムキャプシド形成を指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されているので、（複製および構造キャプシドタンパク質、ｒｅｐ−ｃａｐをコードする）ゲノムの内部およそ４．３ｋｂの一部または全部は外来ＤＮＡに置き換えられ得る。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質はトランスで提供され得る。ＡＡＶのもう１つの重要な特徴は、非常に安定で頑強なウイルスであるということである。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活化するために使用される条件（５６°〜６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性をより低くする。ＡＡＶは凍結乾燥されることさえあり得る。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は重複感染に対して耐性がない。
【００８８】
複数の研究により、筋肉中での長期（＞１．５年）の組換えＡＡＶ媒介性タンパク質発現が実証されている。Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，８：６５９−６６９（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２−１４０８７（１９９６）；およびＸｉａｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８−８１０８（１９９６）を参照。Ｃｈａｏら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２：６１９−６２３（２０００）およびＣｈａｏら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，４：２１７−２２２（２００１）も参照。さらに、筋肉は高度に血管形成されているので、組換えＡＡＶ形質導入は、Ｈｅｒｚｏｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：５８０４−５８０９（１９９７）およびＭｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：１３９２１−１３９２６（１９９７）に記載されているように、筋肉内注射後に体循環中に導入遺伝子産物の出現をもたらした。さらに、Ｌｅｗｉｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９−８７７５（２００２）は、骨格筋線維が正しい抗体のグリコシル化、折り畳みおよび分泌のために必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉が分泌型タンパク質治療薬の安定した発現をすることが可能であることを示している。本発明の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、ＧＡＬＴをコードする核酸分子（例えば、配列番号１）および該核酸分子に隣接する１またはそれを超えるＡＡＶ  ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ  ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、ＡＡＶ  ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ  ｒｈ７４を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型化されたｒＡＡＶの作製は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶ変異形、例えばキャプシド変異を有するｒＡＡＶも企図されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００−１９０９（２０１４）を参照されたい。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が当技術分野でにおいて公知である。
【００８９】
本明細書で使用される場合、ウイルスキャプシドタンパク質に関する「外部」という用語は、組み立てられたウイルスキャプシドにおいて外側に面しているキャプシドタンパク質の表面、ドメイン、領域または末端を指す。ウイルスキャプシドタンパク質に関する「内部」という用語は、組み立てられたウイルスキャプシドにおいて内側に面しているキャプシドタンパク質の表面、ドメイン、領域または末端（アミノ末端またはカルボキシ末端）を指す。組み立てられたウイルスキャプシドに関して使用される場合、「内部」という用語は、ウイルスキャプシドの内側にあるキャプシドで取り囲まれた空間およびこの取り囲まれた空間に曝露されているキャプシドの内側に面した表面を指す。内部空間は、ウイルスキャプシドタンパク質によって、キャプシドで取り囲まれており、ウイルスゲノムなどの核酸、ウイルスタンパク質、宿主またはパッケージング細胞のタンパク質、ならびに複製、ビリオンの組み立て、キャプシド形成および／またはパッケージングの間にパッケージングされるまたはキャプシドで封入される任意のその他の成分または因子を含み得る。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「接合された」という用語は、ウイルスキャプシドタンパク質をＧＡＬＴタンパク質またはその同等物に付着、結合、融合および／または連結する任意の方法を指す。接合の非限定的な例には、ＧＡＬＴタンパク質またはその同等物およびウイルスキャプシドタンパク質が、ＧＡＬＴタンパク質またはその同等物およびウイルスキャプシドタンパク質の両方に対する遺伝子を含む単一のポリヌクレオチドによってコードされている組換え融合タンパク質、ＧＡＬＴ−インテインタンパク質およびウイルスキャプシド−インテインタンパク質のモジュラーインテインをベースとした組み立て、ＧＡＬＴタンパク質またはその同等物とウイルスキャプシドタンパク質との間に化学結合を形成させる翻訳後修飾ならびにＧＡＬＴまたはその同等物とウイルスキャプシドタンパク質との１またはそれを超えるリンカーを介した連結が含まれる。いくつかの実施形態において、接合は、ウイルスキャプシドタンパク質とその同等物の間での一時的または一過性の会合状態であり得る。例えば、ＧＡＬＴまたはその同等物は、オキシム結合など、感染の後の段階でまたは特定の細胞微小環境内でｐＨまたはイオン勾配の変化に対して感受性を有するポリマーを介してウイルスキャプシドタンパク質に一過性に連結され得る（例えば、Ｊｉｎら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１１，１２（１０），ｐｐ  ３４６０−３４６８およびＹｏｓｈｉｄａら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１３  Ｎｏｖ；１０（１１）：１４９７−１５１３を参照）。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、「標識された」組成物を生成するために、検出されるべき組成物、例えば、ポリヌクレオチドまたは抗体などのタンパク質に直接的または間接的に接合される直接的または間接的に検出可能な化合物または組成物を意味する。本用語は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの、挿入された配列の発現時にシグナルを提供する、ポリヌクレオチドに接合された配列も含む。標識は、単独で検出可能であり得（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。標識は、小規模の検出に適することができ、または高処理スクリーニングにより適することができる。したがって、適切な標識には、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。標識は単に検出してもよく、または定量化してもよい。単に検出される応答は、一般に、その存在が単に確認されるだけの応答を含むのに対して、定量化される応答は、一般に、強度、極性化および／またはその他の特性などの定量化可能な（例えば、数値で報告可能な）値を有する応答を含む。発光または蛍光アッセイでは、検出可能な応答は、結合に実際に関与するアッセイ成分と会合した発光団もしくは蛍光団を使用して直接的に、または別の（例えば、レポーターまたは指示薬）成分と会合した発光団または蛍光団を使用して間接的に生成され得る。
【００９２】
シグナルを生成する発光標識の例には、生物発光および化学発光が含まれるが、これらに限定されない。検出可能な発光応答は、一般に、発光信号の変化または発生を含む。アッセイ成分を発光標識するための適切な方法および発光団は当技術分野において公知であり、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（６ｔｈ  ｅｄ．）に記載されている。発光プローブの例には、エクオリンおよびルシフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
適切な蛍光標識の例には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイト（Ｍａｌａｃｉｔｅ）グリーン、スチルベン、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが含まれるが、これらに限定されない。他の適切な光学色素は、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（６ｔｈ  ｅｄ．）に記載されている。
【００９４】
別の態様では、蛍光標識は、細胞表面マーカーなどの、細胞または組織の表面中または表面上に存在する細胞成分への共有結合を促進するように官能基が付与されている。適切な官能基には、イソチオシアナート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステルおよびハロゲン化スルホニルが含まれるが、これらに限定されず、これらのすべては、蛍光標識を第２の分子に付着させるために使用され得る。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、薬剤、マーカーまたは第２の標識剤のいずれかへの付着部位に依存する。
【００９５】
蛍光標識の付着は、細胞成分もしくは化合物に直接的に、またはリンカーを介して行うことができる。蛍光標識を中間体に間接的に連結する際に使用するのに適した結合対には、抗原／抗体、例えば、ローダミン／抗ローダミン、ビオチン／アビジンおよびビオチン／ストレプタビジンが含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
「固体支持体」という語は、「培養プレート」、「遺伝子チップ」または「マイクロアレイ」などの非水性表面を指す。このような遺伝子チップまたはマイクロアレイは、当業者に公知の多くの技術によって診断および治療の目的のために使用することができる。１つの技術において、オリゴヌクレオチドは、米国特許第６，０２５，１３６号および同第６，０１８，０４１号に概説されているものなど、ハイブリダイゼーションアプローチによってＤＮＡ配列を決定するために遺伝子チップ上に付着および配列される。本発明のポリヌクレオチドは、プローブに改変することができ、プローブは、次いで、遺伝子配列の検出に使用することができる。このような技術は、例えば、米国特許第５，９６８，７４０号および同第５，８５８，６５９号に記載されている。Ｋａｙｅｍら、米国特許第５，９５２，１７２号およびＫｅｌｌｅｙら、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：４８３０−４８３７によって記載されているように、プローブは、核酸配列の電気化学的検出のために、電極表面に付着させまたは貼り付けることもできる。
【００９７】
「組成物」は、活性ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体と、不活性（例えば、検出可能な標識）または活性（例えば、遺伝子送達ビヒクル）な別の化合物または組成物との組み合わせを意味することを意図している。
【００９８】
「薬学的組成物」は、活性ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは抗体と、固体支持体などの不活性または活性な担体との組み合わせを含み、組成物をインビトロ、インビボまたはエクスビボでの診断または治療用途に適したものにすることが意図される。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、および油／水または水／油エマルジョンなどのエマルジョン、ならびに様々なタイプの湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれをも包含する。組成物は、安定剤および防腐剤を含むこともできる。担体、安定剤および佐剤の例については、Ｍａｒｔｉｎ（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ）を参照されたい。
【０１００】
診断または処置の「対象」は、細胞または哺乳動物などの動物またはヒトである。対象は特定の種に限定されず、診断または処置の対象となる非ヒト動物を含み、感染の対象となるものまたは動物モデル、例えば、サル、ラット、マウス、チンチラなどのネズミ科の動物、イヌなどのイヌ科の動物、ウサギなどのウサギ科の動物、家畜、スポーツ用動物およびペットである。ヒトの患者もこの用語に含まれる。
【０１０１】
「組織」という用語は、本明細書では、生きているもしくは死んだ生物の組織、または生きているもしくは死んだ生物に由来し、もしくはこれを模倣するように設計された任意の組織を指すために使用される。組織は、健康であり得、病気であり得、および／または遺伝的変異を有し得る。生物学的組織は、任意の単一の組織（例えば、相互に接続され得る細胞の集合）、または生物の身体の器官または部分または領域を構成する組織の群を含み得る。組織は均質な細胞材料を含み得、または組織は、例えば、肺組織、骨格組織および／もしくは筋肉組織を含み得る胸部を含む身体の領域中に見られるような複合構造であり得る。例示的な組織には、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆管、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓および腸（これらの任意の組み合わせを含む）に由来する組織が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、対象中の疾患を「処置する」または対象中の疾患の「処置」は、（１）疾患の症候に対する素因があるもしくは疾患の症候をいまだ示していない対象において症候または疾患が起こることを予防すること、（２）疾患を阻止しもしくはその発達を停止すること、または（３）疾患もしくは疾患の症候を軽減しもしくは疾患もしくは疾患の症候の後退を引き起こすことを表す。本分野において理解されるとおり、「処置」は、臨床的結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本技術において、有益なまたは所望の結果としては、１またはそれを超える症候の緩和または軽減、症状（疾患を含む）の程度の縮小、症状（疾患を含む）の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、症状（疾患を含む）の遅延または減速、症状（疾患を含む）の進行、軽減または寛解、状態および緩解（部分的であるか、完全であるかを問わない）の１つまたはそれより多くを含むことができるが、これらに限定されず、検出可能かまたは検出不能かを問わない。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を達成するのに十分な量を意味することを意図している。治療的または予防的適用の文脈において、有効量は、問題となっている症状の種類および重症度、ならびに一般的な健康、年齢、性別、体重および薬学的組成物に対する耐性などの個々の対象の特徴に依存するであろう。遺伝子治療の文脈において、いくつかの実施形態では、有効量は、対象において欠損している遺伝子の部分的なまたは完全な機能の回復をもたらすのに十分な量である。他の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子の有効量は、対象において遺伝子の発現をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、ガラクトース代謝の増加を必要とする対象においてガラクトース代謝を増加させるのに必要とされる量である。当業者は、これらのおよびその他の要因に応じて適切な量を決定することができるであろう。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、有効量は、問題の適用の大きさおよび性質に依存するであろう。有効量は、目的の対象の性質および感受性ならびに使用されている方法にも依存する。当業者は、これらのおよびその他の考慮事項に基づいて有効量を決定することができるであろう。有効量は、実施形態に応じて、組成物の１またはそれを超える投与を含み得る。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「投与する」または「投与」という用語は、動物またはヒトなどの対象への物質の送達を意味することを意図している。投与は、処置の過程を通じて継続的にまたは断続的に、１つの用量で実施することができる。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的および処置されている対象の年齢、健康または性別によって変動する。単回または複数回の投与を実施することができ、用量レベルおよびパターンは、処置を行う医師によってまたはペットおよび動物の場合には処置を行う獣医師によって選択される。適切な投薬用製剤および薬剤を投与する方法は本分野において公知である。投与経路も決定することができ、最も効果的な投与経路を決定する方法は当業者に公知であり、処置のために使用される組成物、処置の目的、処置されている対象の健康状態または疾患段階および標的細胞または組織によって異なる。投与経路の非限定的な例には、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、脳室下、硬膜外、脳内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、眼内、腹腔内、子宮内、皮内、皮下、経皮、経粘膜および吸入が含まれる。
本開示を実施するための様式
ＡＡＶベクター、キャプシドおよび調製方法
【０１０６】
本明細書において、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（「ＧＡＬＴ」）をコードするポリヌクレオチド配列を含み、または該ポリヌクレオチド配列から本質的になり、または該ポリヌクレオチド配列からなる組換えポリヌクレオチドまたはアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターが提供される。一態様では、ＧＡＬＴをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９７％、もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含み、または該ヌクレオチド配列から本質的になり、または該ヌクレオチド配列からなる。一態様では、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ、または７つ、または８つ、または９つ、または１０、またはそれより多く、またはすべてが、配列番号１から修飾されていないという条件で、配列は、配列番号１と少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または９７％、または９９％同一である。別の態様では、ＧＡＬＴをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含み、または該ヌクレオチド配列から本質的になり、または該ヌクレオチド配列からなる。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列またはその同等物をコードする。
【０１０７】
一態様では、ベクターは、自己相補的ベクターまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ベクターである。
【０１０８】
一態様では、ＡＡＶは、２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接するｓｃＡＡＶまたはｓｓＡＡＶなどのＡＡＶを含み、または該ＡＡＶから本質的になり、または該ＡＡＶからなる。これらのＩＴＲは、感染の後続の工程が開始し得る前に、第２の鎖の合成を開始するためのプライマーとしての役割を果たすために、配列の末端にヘアピンを形成する。第２の鎖の合成は、効率的な感染に対するいくつかの障害の１つであると考えられている。ｓｃＡＡＶのさらなる利点には、インビトロおよびインビボでの導入遺伝子発現の増加および延長が含まれる。したがって、一態様では、ＡＡＶは２つのＩＴＲをさらに含む。
【０１０９】
ベクターを作製するための組換えＡＡＶ骨格の非限定的な例には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ  ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶ  ｒｈ７４の群からのＡＡＶベクター血清型が含まれる。さらなる態様において、ベクター骨格は、ＡＡＶ９血清型、ｒｈ７４血清型または修飾されたＡＡＶｒｈ７４血清型である。
【０１１０】
ＧＡＬＴをコードするポリヌクレオチド配列は、必要に応じて、プロモーター、組織特異的調節エレメントまたは構成的プロモーターに機能的に連結されている。構成的プロモーターの非限定的な例には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターまたはＥＦ１プロモーターが含まれる。特定の態様において、β−アクチンプロモーターは、ニワトリβ−アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーターである。別の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫ１（ヒトまたはマウス）プロモーター、Ｐ５プロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＵＡＳプロモーター、Ａｃ５プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、Ｇａｌ１プロモーター、ＴＥＦ１、ＧＤＳプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーターまたはα−１−アンチトリプシンプロモーターから選択される。
【０１１１】
さらなる態様において、組換えポリヌクレオチドまたはＡＡＶは、エンハンサー要素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。非限定的な例には、ＣＭＶエンハンサー、ＷＰＲＥおよびＲＳＶエンハンサーが含まれる。
【０１１２】
特定の態様では、組換えポリヌクレオチドまたはＡＡＶベクターは、配列番号２または配列番号３と少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または９７％、または９９％同一のヌクレオチド配列を含み、または該ヌクレオチド配列から本質的になり、または該ヌクレオチド配列からなる。。一態様では、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ、または７つ、または８つ、または９つ、または１０、またはそれより多く、またはすべてが、配列番号２または３から修飾されていないという条件で、配列は、配列番号２または３と少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または９７％、または９９％同一である。さらなる態様において、組換えＡＡＶベクターは、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含み、または該ヌクレオチド配列から本質的になり、または該ヌクレオチド配列からなる。
【０１１３】
本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドまたはＡＡＶベクターは、検出可能マーカーまたは精製マーカーをさらに含むことができる。ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、ベクターおよび担体、例えば保存剤または薬学的に許容され得る担体を含む組成物として含有されることができる。
【０１１４】
ＡＡＶベクター送達は、現在、ウイルスの自然の指向性に基づく、または標的組織中への直接注射による組織標的化のための血清型選択の使用に依存している。最大の治療効果を達成するために全身送達が必要とされる場合、血清型の選択は、組織特異的プロモーターと組み合わされた組織標的化のために利用できる唯一の選択肢である。したがって、ＡＡＶベクターは組織指向性を備えたキャプシド中にパッケージングすることができる。
【０１１５】
いくつかの態様において、ベクターは、野生型または改変されたキャプシド粒子であるウイルスキャプシド中に封入される。一態様において、本開示は、キャプシドタンパク質、単離されたポリヌクレオチド、キャプシドタンパク質の調製方法、組換えウイルス粒子、およびウイルス粒子を生成するための組換え発現系を提供する。一実施形態において、野生型キャプシドタンパク質を含む、もしくは野生型キャプシドタンパク質から本質的になる、もしくは野生型キャプシドタンパク質からなるウイルスキャプシドタンパク質、または１〜７つのアミノ酸のアミノ酸置換もしくは挿入によって修飾されたウイルスキャプシドタンパク質。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、必要に応じてＡＡＶ９、ＡＡＶ  ＰＨＰ．Ｂ、または修飾されたＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。たとえば、ＡＡＶ  ＰＨＰ．Ｂは、肝臓指向性を低下させるために、ＡＡＶ９  ＶＰ１のアミノ酸４９８がアスパラギンからリジンに修飾されている。さらなる実施形態において、修飾は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸位置５０２でのアスパラギンのイソロイシンへの置換または同等の修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンのアルギニンへの置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸位置５９１でのペプチドＹＩＧまたはＹＩＧＳＲの挿入である。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有し、および／または正常なｒｈ７４受容体結合を変化させる可能性が高い領域中に配置される。これらのポリペプチドの同等物およびこれらのペプチドの同等物をコードするポリヌクレオチドも提供され、ここで、同等物は、アミノ酸およびポリヌクレオチドの１もしくはそれより多く、２もしくはそれより多く、３もしくはそれより多く、４もしくはそれより多く、５もしくはそれより多く、６もしくはそれより多く、７もしくはそれより多く、または全部が変異した配列から改変されていないという条件で、少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または９７％、または９９％の配列同一性を有する。
【０１１６】
ウイルス、例えば、ＡＡＶは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスパッケージング系などのウイルスパッケージング系を使用してパッケージングすることができる。いくつかの実施形態において、パッケージングは、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドおよび細胞株を使用することによって達成される。ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドは、細胞中への遺伝物質の送達を容易にする要素および配列を含有する。別の態様において、ヘルパープラスミドまたはヘルパープラスミドを含むポリヌクレオチドは、パッケージング細胞株がヘルパープラスミドによる追加の形質移入を必要としないように、パッケージング細胞株のゲノム中に安定して組み込まれる。
【０１１７】
ヘルパープラスミドは、例えば、複製不全ＡＡＶをパッケージするために必要とされる全てのビリオンタンパク質をトランスにコードする複製不全ウイルスゲノムに由来する少なくとも１つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列であって、複製能を有するＡＡＶの産生なしに高い力価で複製不全ＡＡＶをパッケージングすることが可能なビリオンタンパク質を産生するための少なくとも１つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含み得る。ウイルスＤＮＡ配列は、ウイルスのウイルス５’ＬＴＲの原型エンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠き、ヘルパーゲノムをパッケージングすることに関与するｐｓｉ機能配列と３’ＬＴＲの両方を欠くが、外来のポリアデニル化部位、例えばＳＶ４０ポリアデニル化部位ならびにそこでのウイルス産生が所望される細胞種内での効率的な転写を指示する外来のエンハンサーおよび／プロモーターをコードする。ウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）などの白血病ウイルスである。
【０１１８】
外来のエンハンサーおよびプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）最初期（ＩＥ）エンハンサーおよびプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域または固有のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターに連結されたＨＣＭＶ  ＩＥエンハンサーであり得る。ヘルパープラスミドは、プラスミドベースの発現ベクターによってコードされる２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなり得、例えば、第一のヘルパー配列が同種指向性ＭＭＬＶまたはＧＡＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有し、第二のヘルパー配列がｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する。宿主域を決定するＥｎｖ遺伝子は、異種指向性、両指向性、同種指向性、多指向性（ミンクフォーカス形成）もしくは１０Ａ１マウス白血病ウイルスｅｎｖタンパク質、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ  ｅｎｖタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質、水疱性口内炎（Ｓｔｏｍａｔｉｔｕｓ）ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、ヒトＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ）Ｉ型およびＩＩ型ｅｎｖ遺伝子産物をコードする遺伝子、上記ｅｎｖ遺伝子の１つまたはそれより多くの組み合わせに由来するキメラエンベロープ遺伝子または上記ｅｎｖ遺伝子産物の細胞質および膜貫通ならびに所望の標的細胞上の特異的な表面分子に対して作られたモノクローナル抗体をコードするキメラエンベロープ遺伝子に由来し得る。
【０１１９】
パッケージング過程において、高力価組換えレトロウイルス含有上清を産生するために、ヒト胎児由来腎臓細胞、例えば、２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）などの、ウイルスを産生することが可能な哺乳動物細胞の第一集団中に、ヘルパープラスミドおよびＡＡＶウイルスタンパク質をコードするプラスミドが一過性に同時形質移入される。本発明の別の方法では、この一過性に形質移入された細胞の第一の集団は、次いで、標的細胞に外来遺伝子を高い効率で形質導入するために、哺乳動物の標的細胞とともに共培養される。
パッケージング系
【０１２０】
本発明は、骨格がプラミド、ウイルスに由来する上記のとおりのベクターと、パッケージングプラスミドと、エンベローププラスミドとを含むウイルスパッケージング系も提供する。パッケージングプラスミドは、ヌクレオシド、キャプシドおよびマトリックスタンパク質を含有する。パッケージングプラスミドの例は、特許文献、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２６２，０４９号；同第６，９９５，２５８号；同第７，２５２，９９１号および同第５，７１０，０３７号にも記載されている。この系は、エンベローププラスミドによって提供される偽型化されたエンベロープタンパク質をコードするプラスミドも含有する。偽型化されたウイルスベクターは、他のエンベロープに包まれたウイルスに由来する糖タンパク質を保有する、または機能的部分を含むベクター粒子からなる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２６２，０４９号を参照されたい。好ましい態様において、エンベローププラスミドは、ウイルス粒子を細胞または細胞集団に非特異的に結合させないエンベロープタンパク質をコードする。ウイルス粒子の特異性は、粒子中に挿入された抗体結合ドメインによって付与される。適切なエンベロープタンパク質の例には、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）ＺＺドメインを含有するものが含まれるが、これらに限定されない。エンベロープ中で使用する糖タンパク質の選択は、粒子が接合され得る抗体によって部分的に決定される。
【０１２１】
本開示は、適切なパッケージング細胞株も提供する。一態様において、パッケージング細胞株は、ＨＥＫ−２９３細胞株である。他の適切な細胞株が当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第７，０７０，９９４号；同第６，９９５，９１９号；同第６，４７５，７８６号；同第６，３７２，５０２号；同第６，３６５，１５０号および同第５，５９１，６２４号内の特許文献に記載されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
本発明は、さらに、ウイルスベクターをパッケージングするのに適した条件下で、上記のようにパッケージング細胞株をウイルス系で形質導入することを含む、または形質導入することから本質的になる、または形質導入することからなる、偽型化されたＡＡＶ粒子を作製する方法を提供する。このような条件は当技術分野において公知であり、本明細中に簡潔に記載されている。偽型化されたウイルス粒子は、当業者に公知の方法、例えば、遠心分離を使用して、細胞上清から単離することができる。このような単離された粒子が、本発明によってさらに提供される。
【０１２３】
本発明は、さらに、この方法によって作製された単離されたポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶウイルス粒子を提供する。偽型化されたウイルス粒子は、本明細書に記載されており、ＧＡＬＴタンパク質またはその同等物（例えば、配列番号４または上記されているとおりの配列番号４の同等物）をコードするポリヌクレオチドを含み、または該ポリヌクレオチドから本質的になり、または該ポリヌクレオチドからなる。
【０１２４】
単離された偽型化された粒子は、事前に選択された細胞受容体を結合する能力を保持する抗体または抗体断片（例えば、少なくともＦｃドメインを含有する断片）のうちの１またはそれより多くに接合することができる。
【０１２５】
抗体は種特異的ではない。換言すれば、抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得、マウス、ヒツジ、ヒトまたは他の種であり得る。さらに、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。
宿主細胞
【０１２６】
上記に記載され、参照により本明細書に組み込まれる、単離されたポリヌクレオチド、ウイルス粒子、ベクターおよびパッケージング系を含み、またはこれらから本質的になり、またはこれらからなる、単離された細胞または細胞の集団がさらに提供される。一態様では、単離された細胞は、パッケージング細胞株である。
【０１２７】
本明細書に記載のＧＡＬＴタンパク質またはその同等物をコードするポリヌクレオチド配列と、ＧＡＬＴをコードする核酸の発現を制御する恒常的または誘導性プロモーターとを含む、またはこれらから本質的になる、またはこれらからなる単離された細胞または細胞の集団も提供される。一実施形態において、プロモーターは、本明細書に記載されているような誘導性プロモーターである。別の態様において、プロモーターは、本明細書に記載されているような構成的プロモーターである。さらなる態様において、ＧＡＬＴをコードする核酸は、配列番号１もしくはその同等物を含み、または配列番号１もしくはその同等物から本質的になり、または配列番号１もしくはその同等物からなる。一態様では、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ、または７つ、または８つ、または９つ、または１０、またはそれより多く、またはすべてが、配列番号１から修飾されていないという条件で、配列は、配列番号１と少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または９７％、または９９％同一である。さらなる実施形態において、単離された細胞は、さらに、テトラサイクリン活性化タンパク質をコードする核酸およびテトラサイクリン活性化タンパク質の発現を調節するプロモーターを含み、またはこれらから本質的になり、またはこれらからなる。一実施形態では、テトラサイクリン活性化タンパク質の発現を調節するプロモーターは、構成的プロモーターである。関連する実施形態では、プロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）またはＣＭＶプロモーターである。
【０１２８】
特定の実施形態において、単離された細胞は、ＧＡＬＴタンパク質をコードする配列番号１のポリヌクレオチドを含む核酸もしくはその生物学的同等物を含み、または該核酸もしくはその生物学的同等物から本質的になり、または該核酸もしくはその生物学的同等物からなる。関連する実施形態において、ＧＡＬＴの生物学的同等物は、高ストリンジェンシーの条件下で配列番号１の相補物とハイブリッドを形成し、ＧＡＬＴタンパク質（例えば、配列番号４）をコードする核酸を含む。別の実施形態において、その生物学的同等物は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸を含み、一態様では、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つまたは２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ、または７つ、または８つ、または９つ、または１０またはそれより多く、または全ては、配列番号１から修飾されていない（図４を参照）。さらなる態様において、ＧＡＬＴタンパク質は野生型ヒトＧＡＬＴタンパク質である。
【０１２９】
本明細書に記載の単離された細胞は、マウス、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌｓ）、スポーツ動物、ペット、ウマおよび霊長類の群の種の細胞のいずれでもあり得、特に、ヒト細胞であり得る。
【０１３０】
特定の実施形態において、本明細書に記載の単離された細胞は、特定のレベルのＧＡＬＴタンパク質を含む。ＧＡＬＴタンパク質のレベルは、望ましいレベルのタンパク質を産生する適切な構成的プロモーターを選択することによって、または産生されるタンパク質の量を調節する誘導性の系を使用することによって達成することができる。これらのプロモーターおよび誘導性の系は以前に記載されている。一実施形態において、単離された細胞は、少なくとも、約１×１０−７ｎｇ、約３×１０−７ｎｇ、約５×１０−７ｎｇ、約７×１０−７ｎｇ、約９×１０−７ｎｇ、約１×１０−６ｎｇ、約２×１０−６ｎｇ、約３×１０−６ｎｇ、約４×１０−６ｎｇ、約６×１０−６ｎｇ、約７×１０−６ｎｇ、約８×１０−６ｎｇ、約９×１０−６ｎｇ、約１０×１０−６ｎｇ、約１２×１０−６ｎｇ、約１４×１０−６ｎｇ、約１６×１０−６ｎｇ、約１８×１０−６ｎｇ、約２０×１０−６ｎｇ、約２５×１０−６ｎｇ、約３０×１０−６ｎｇ、約３５×１０−６ｎｇ、約４０×１０−６ｎｇ、約４５×１０−６ｎｇ、約５０×１０−６ｎｇ、約５５×１０−６ｎｇ、約６０×１０−６ｎｇ、約６５×１０−６ｎｇ、約７０×１０−６ｎｇ、約７５×１０−６ｎｇ、約８０×１０−６ｎｇ、約８５×１０−６ｎｇ、約９０×１０−６ｎｇ、約９５×１０−６ｎｇ、約１０×１０−５ｎｇ、約２０×１０−５ｎｇ、約３０×１０−５ｎｇ、約４０×１０−５ｎｇ、約５０×１０−５ｎｇ、約６０×１０−５ｎｇ、約７０×１０−５ｎｇ、約８０×１０−５ｎｇまたは約９０×１０−５ｎｇのＧＡＬＴタンパク質を含み、またはＧＡＬＴタンパク質から本質的になり、またはＧＡＬＴタンパク質からなる。
治療組成物および方法
【０１３１】
本開示は、ガラクトース血症を処置するための治療用遺伝子ベクター組成物および治療法を提供する。ガラクトース血症は、ＧＡＬＴ遺伝子（ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）中の劣性単一遺伝子欠損によって引き起こされる希少疾患である。ｇｈｒ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／ＧＡＬＴを参照されたい。ガラクトース血症は、米国の４５，０００人におよそ１人の新生児に発症する。幸いなことに、ガラクトース血症は全国的な新生児スクリーニングプログラムで早期に検出される。唯一の処置は、乳糖およびガラクトースのすべての供給源を子供の食事から取り除くことである。ガラクトース制限による早期処置は、重症型の本疾患において有益であり、命を救うが、他の食品中に含有される低レベルのガラクトースおよび内因的に産生されたガラクトースに由来する、
言語および認知障害ならびに神経筋から神経筋へのおよび卵巣の毒性に起因する身体障害などの長期的な合併症が通常存在する。
【０１３２】
ベクターの様々な実施形態が本明細書に記載されている。一実施形態において、本明細書で提供されるベクターおよび該ベクターを使用する方法は、本開示によって提供されるガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（「ＧＡＬＴ」）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、または該ポリヌクレオチド配列から本質的になる、または該ポリヌクレオチド配列からなる組換えアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターの有効量の投与を含み、または該投与から本質的になり、または該投与からなる。一態様において、ＧＡＬＴをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または９７％、または９９％同一のヌクレオチド配列を含む。一態様において、野生型配列から修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ、または７つ、または８つ、または９つ、または１０、またはそれより多く、またはすべてが、配列番号１から修飾されていないという条件で、配列は、配列番号１と少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または９７％、または９９％同一である（図４参照）。別の態様において、ＧＡＬＴをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列をコードする。一態様において、ポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶベクターは、ベクターの生体内分布を決定するためのルシフェラーゼまたはＧＦＰのいずれかのレポーター遺伝子を含有する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶベクターは、ヒト（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００１５５．３またはＮＭ＿００１２５８３３２．１）、マウス（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１３０２５１１．１またはＮＭ＿０１６６５８．３）、ラット（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０１３０８９．２）、チンパンジー（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿００３９５１４１４．４またはＸＭ＿００１１６３４１９．６）または他の種由来のＧＡＬＴ遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を含み、または該ポリヌクレオチド配列から本質的になり、または該ポリヌクレオチド配列からなる。別の実施形態において、ポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶベクターは、ヒトＧＡＬＴ遺伝子のコドン最適化されたバージョン（配列番号１および図４）を含むポリヌクレオチド配列を含み、または該ポリヌクレオチド配列から本質的になり、または該ポリヌクレオチド配列からなる。ＡＡＶベクターの１つは、ｐｓｃＡＡＶ−ＣＢ−ｈＧＡＬＴ（配列番号２）として特定される。別の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ｐＡＡＶ−ＣＢ−ｈＧＡＬＴ−ＷＰＲＥｖ２（配列番号３）として特定される。ｐｓｃＡＡＶ−ＣＢ−ｈＧＡＬＴベクターは、ヒトＧＡＬＴ遺伝子（ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）のコドン最適化されたバージョン（配列番号１および図４）を駆動する小さなＳＶ４０イントロンを有する恒常的ＣＢＡプロモーターを含む。
【０１３３】
一態様において、ＡＡＶベクターは、ヒトＧＡＬＴタンパク質（例えば、配列番号４）、マウスＧＡＬＴタンパク質（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２８９４４０．１）、ラットＧＡＬＴタンパク質（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０１３１０７．１）、チンパンジーＧＡＬＴタンパク質（例、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００３９５１４６３．１）または他の種からのＧＡＬＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ヒトＧＡＬＴタンパク質（例えば、配列番号４）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１３４】
一態様において、ＡＡＶはＡＡＶ９血清型である。別の血清型または改変されたキャプシドウイルスを使用して、神経細胞指向性を最適化することができる。別のベクターには、標準的なＡＡＶ９よりも高い神経細胞指向性のための改変されたＡＡＶ９血清型ベクター、例えば、神経細胞を標的とするベクターを同定するためにＣｒｅ−ｌｏｘ組換え系を使用するＰＨＰ．Ｂが含まれる。あるいは、ＡＡＶ９  ＰＨＰ．Ｂは、肝臓指向性を低下させるために、アスパラギンからリジンへ修飾されたＶＰ１のアミノ酸４９８を有する。変異したいくつかのアミノ酸を有するＡＡＶｒｈ７４のさらなる変異形は、脳を含む非常に広範な組織指向性のために使用することができる。
【０１３５】
一態様において、ＡＡＶベクターは、１〜７個のアミノ酸のアミノ酸置換または挿入によって修飾されたウイルスキャプシドタンパク質を含む、または該ウイルスキャプシドタンパク質から本質的になる、または該ウイルスキャプシドタンパク質からなる修飾されたウイルスキャプシドタンパク質内に含有される。出願人は、３つの変異体を生成した。変異体の１つ（ＡＡＶｍｕｔ４、ＶＰ１キャプシドのアミノ酸５０２においてアスパラギンからイソロイシンへ）は、最大５６倍（組織に応じて３〜５６倍の増加）高い形質導入効率で、試験したすべての組織への遺伝子送達を全般的に増加させる。別の変異体（ＡＡＶｍｕｔ５、ＶＰ１キャプシドのアミノ酸５０５においてトリプトファンからアルギニンへ）は、心臓への遺伝子送達をＡＡＶｒｈ７４のほぼ５０倍に増加させる。第３の変異体（ＡＡＶＹＩＧ５９１）は、衛星細胞指向性にかかわらず、筋肉幹細胞と考えられる衛星細胞上に主として見出される受容体を標的とする。特に、ＡＡＶＹＩＧ５９１を設計するためのＡＡＶ結晶構造およびアルファ７ベータ１インテグリンに関する出願人の知識に基づくと、骨格筋に対する親和性がより高く、肝臓に対する親和性がより低いと考えられている。
【０１３６】
理論に拘束されることなく、出願人は、患者への全体的な用量を増加させることなく、筋肉に到達する有効用量を増加させることによって、患者への治療効果が達成されることを予想する。治療効果を達成するために必要とされる総投与量を減らすことにより、患者に送達されるウイルス抗原がより少なくなり、理想的にはベクターに対する免疫応答が低下し、安全性が向上する。後期臨床試験を実施するのに十分な遺伝子治療医薬品を製造することは、さらなる開発における主要なハードルである。治療効果を達成するために必要な用量を減らすことは、製造の必要性の低減、製造コストの削減、臨床試験開発の迅速化、およびより多くの患者を処置する能力の向上をもたらすであろう。
【０１３７】
したがって、本開示は、修飾されたキャプシドタンパク質内に含有されるＡＡＶベクター、単離されたポリヌクレオチド、修飾されたキャプシドタンパク質の調製方法、組換えウイルス粒子および修飾されたウイルス粒子の生成のための組換え発現系に関する。本開示の一態様は、１〜７個のアミノ酸のアミノ酸置換または挿入によって修飾されたウイルスキャプシドタンパク質を含む、または該ウイルスキャプシドタンパク質から本質的になる、または該ウイルスキャプシドタンパク質からなる修飾されたウイルスキャプシドタンパク質に関する。いくつかの実施形態において、ウイルスキャプシドタンパク質は、必要に応じてＡＡＶ９、ＡＡＶ  ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１である。さらなる実施形態において、修飾は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸位置５０２でのアスパラギンのイソロイシンへの置換または同等の修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸５０５でのトリプトファンのアルギニンへの置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）を含む。いくつかの実施形態において、修飾は、衛星細胞、必要に応じて筋肉幹細胞上に主として見出される受容体を標的とする。いくつかの実施形態において、修飾は、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１のアミノ酸位置５９１でのペプチドＹＩＧの挿入である。いくつかの実施形態において、このペプチドは、α７β１インテグリンに対して高い親和性を有し、および／または正常なｒｈ７４受容体結合を変化させる可能性が高い領域中に配置される。
【０１３８】
２つの例示的なベクターのプラスミド骨格が本明細書に開示されている。第１のベクターは、ルシフェラーゼおよび増強された黄色蛍光タンパク質から構成されるレポーター融合タンパク質のＣＢＡプロモーター／エンハンサー駆動発現を含有する。一態様では、ルシフェラーゼおよび増強された黄色蛍光タンパク質配列が除去されている。このベクターは、標準的なＡＡＶ９血清型キャプシドまたは変異体キャプシドの内側に一本鎖ウイルスとしてパッケージングすることができる。別の態様では、ＡＡＶは、コドン最適化されたヒトＧＡＬＴ遺伝子（配列番号１）またはその同等物の発現を駆動するＣＢＡプロモーター／エンハンサーを有する自己相補的ベクターを含有する。このベクターは、標準的なＡＡＶ９血清型キャプシド中にパッケージングすることができる。このベクターは、高レベルのヒトＧＡＬＴタンパク質を提供することができる。ｌｕｃ−ＥＹＦＰレポーターウイルスは、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ（または同様のもの）を使用するさまざまな時点でのインビボルシフェラーゼ染色によって、またはさまざまな時点で組織を採取し、ＥＹＦＰもしくはルシフェラーゼ活性のいずれかの遺伝子発現をアッセイすることによって、生体内分布および遺伝子発現に関して評価することができる。試料をさらに取得し、ｑＰＣＲによるベクターゲノムの定量化を評価し得る。投与は、疾患を発症した新生仔動物（生後１日目または２日目）を開始することができる。動物モデルでは、マウスの子に顔面静脈から注射し（ｊｏｖｅ．ｃｏｍ／ｖｉｄｅｏ／５２０３７／ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ−ｉｎ−ｎｅｏｎａｔａｌ−ｍｉｃｅを参照）、４週間後にＧＦＰ発現によってベクターの生体内分布を探すことができる。通常の固形飼料を与えられた母親から生まれたホモ接合性のＧＡＬＴ欠損マウスは、ノックアウト（ＫＯ）マウスモデルにおけるベクターの指向性および生体内分布の優れた指標となり得る。
【０１３９】
本開示は、担体と修飾されたタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、プラスミド、宿主細胞または発現系の１つまたはそれより多くとを含む組成物も提供する。さらに、修飾されたタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、プラスミド、宿主細胞または発現系の１つまたはそれより多くと使用説明書とを備えるキットが提供される。組成物は、特定の投与様式のために処方することができる。
投与
【０１４０】
本開示の組換えポリヌクレオチド、ベクター（例えば、ＡＡＶ）、ウイルス粒子または組成物の投与は、処置の期間を通じて、連続的または断続的に、１つの用量で実施することができる。投与は、限局性、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、脳室下、硬膜外、脳内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、眼内、腹腔内、子宮内、皮内、皮下、経皮、経粘膜および吸入を含むがこれらに限定されない、任意の適切な投与様式を通じて為され得る。一実施形態において、組換えベクターまたは組成物は、筋肉内注射または静脈内注射によって投与される。別の実施形態において、組換えＡＡＶベクターまたは組成物は全身投与される。別の実施形態において、組換えＡＡＶベクターまたは組成物は、注射、注入または移植による非経口（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）投与である。一態様において、ＡＡＶベクターまたはＧＡＬＴポリヌクレオチドは、肝臓へ局所的に送達される。
【０１４１】
投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的および処置されている対象によって変動する。処置を行う医師によって選択される用量レベルおよびパターンで、単回または複数回の投与が実施され得る。投与量は投与経路によって影響を受け得ることに注意されたい。適切な投薬用製剤および薬剤を投与する方法は本分野において公知である。このような適切な投与量の非限定的な例は、投与あたり最小１Ｅ＋９ベクターゲノムから最大１Ｅ＋１７ベクターゲノムであり得る。
【０１４２】
本明細書に記載されている方法のいくつかの実施形態において、対象に投与されるウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ）の数は、約１０９〜約１０１７の範囲である。特定の実施形態において、約１０１０〜約１０１２、約１０１１〜約１０１３、約１０１１〜約１０１２、約１０１１〜約１０１４、約５×１０１１〜約５×１０１２または約１０１２〜約１０１３のウイルス粒子が対象に投与される。
【０１４３】
さらなる態様において、本開示のポリヌクレオチド、ウイルス粒子および組成物は、他の処置、例えば、ガラクトース血症およびその関連する障害または症状に適した承認された処置と組み合わせて投与することができる。非限定的な例には、対象の食事からラクトースおよび／またはガラクトースを低減または除去しながら、本開示のウイルスベクターまたは組成物によるガラクトース血症の処置が含まれる。
【０１４４】
処置および／または修復の成功は、以下の１つまたはそれより多くが検出されたときに判定される：処置された対象の疾患、障害または症状の症候の１つまたはそれより多くの緩和または改善、対象の疾患、障害または症状の程度の減少、疾患、障害または症状の安定した（すなわち、悪化していない）状態、疾患、障害または症状の進行の遅延または緩徐化および疾患、障害または症状の改善または緩和。いくつかの実施形態において、処置の成功は、対象から単離された１またはそれを超える細胞、組織または器官中に修復された標的ポリヌクレオチドの存在を検出することによって判定される。いくつかの実施形態において、処置の成功は、対象から単離された１またはそれを超える細胞、組織または器官中に修復された標的ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの存在を検出することによって判定される。
【０１４５】
一実施形態において、組換えポリヌクレオチドおよび／またはウイルスベクターは、対象中のＧＡＬＴ遺伝子を修復することができる。いくつかの実施形態において、処置に成功した細胞、組織、器官または対象における修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと未修復の標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの比は、約１．５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１０００：１、約１０，０００：１、約１００，０００：１または約１，０００，０００：１である。修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量または比は、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＰＣＲ、配列決定、質量分析、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、次世代シーケンシング、イムノブロットおよびＥＬＩＳＡを含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の方法によって決定することができる。
キット
【０１４６】
本明細書に記載されているポリヌクレオチド、薬剤、ベクターまたは組成物は、いくつかの実施形態において、治療、診断または研究用途でのそれらの使用を容易にするために、薬学的または診断用または研究用キットに組み立てられ得る。いくつかの実施形態において、本開示のキットは、本明細書に記載されている、修飾されたウイルスキャプシドタンパク質、単離されたポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、組換えウイルス粒子、組換え発現系、修飾されたＡＡＶ、修飾された細胞、単離された組織、組成物または薬学的組成物の１つまたはそれより多くを含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、キットは、使用説明書をさらに含む。具体的には、このようなキットは、意図された用途およびこれらの薬剤の適切な使用を説明する説明書とともに、本明細書に記載されている１またはそれを超える薬剤を含み得る。一例として、一実施形態において、キットは、キットの１またはそれを超える成分を混合するための、ならびに／または試料を単離および混合し、対象に適用するための説明書を含み得る。特定の実施形態において、キット中の薬剤は、特定の用途および薬剤の投与方法に適した薬学的製剤および投薬量である。研究目的のキットは、さまざまな実験を実行するための適切な濃度または量で成分を含有し得る。
【０１４８】
キットは、本明細書に記載された方法の使用を容易にするように設計され得、多くの形態をとることができる。キットの各組成物は、該当する場合、液体形態（例えば、溶液で）または固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供され得る。特定の場合において、組成物のいくつかは、例えば、キットとともに提供されてもよくまたは提供されなくてもよい適切な溶媒またはその他の種（例えば、水または細胞培養培地）の添加によって、（例えば、活性形態へと）構成可能またはその他処理可能であり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、保存溶液（例えば、凍結保存溶液）で提供され得る。保存溶液の非限定的な例には、ＤＭＳＯ、パラホルムアルデヒドおよびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）が含まれる。いくつかの実施形態において、保存溶液は、ある量のメタロプロテアーゼ阻害剤を含有する。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「説明書」は、指示および／または奨励の要素を規定することができ、典型的には、特許請求された方法、組換えベクターまたは組成物のパッケージ上のまたはパッケージングに付随する書面での指示を含む。説明書には、当該説明書がキットと関連付けられるべきことを使用者が明確に認識できるような任意の様式で提供される任意の口頭でのまたは電子的な指示、たとえば、視聴覚的（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネットおよび／またはウェブベースの通信手段なども含まれ得る。いくつかの実施形態において、書面での指示は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式であり、その指示は、動物投与のための製造、使用または販売の機関による承認も反映することができる。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されている構成要素の任意の１つまたはそれより多くを１またはそれを超える容器中に含有する。したがって、いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されている薬剤を収容する容器を含み得る。薬剤は、液体、ゲルまたは固体（粉末）の形態であり得る。薬剤は無菌的に調製され、注射器中に梱包され、冷蔵されて出荷され得る。あるいは、それはバイアルまたは貯蔵用のその他の容器中に収容され得る。第２の容器は、無菌的に調製された他の薬剤を有し得る。あるいは、キットは、注射器、バイアル、チューブまたはその他の容器中にあらかじめ混合されて出荷された活性剤を含み得る。キットは、注射器、局所塗布装置またはＩＶ針チューブおよび袋など、対象に薬剤を投与するために必要とされる構成要素の１もしくはそれより多くまたはすべてを有し得る。
【０１５１】
本明細書に記載の治療法は、その治療法のための患者を特定および選択するために、適切な診断技術と組み合わせることができる。例えば、ＧＡＬＴ遺伝子中の変異を特定するための遺伝子検査を提供することができる。したがって、変異を有する患者は、治療に適していると特定され得る。
【実施例】
【０１５２】
インビトロ投与
ベクターゲノムに対するプラスミド、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子に対するプラスミドならびにＡＡＶを生成するために必要なアデノウイルスヘルパー機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを使用する標準的な三重形質移入法によって、ウイルス粒子を作製する。ＰＥＩを使用して無血清懸濁液で増殖させたＨＥＫ２９３細胞中に、これらの３つのプラスミドを形質移入する。形質移入の４日後に、ウイルスを回収し、標準的な方法によって精製する。同様の疾患モデルおよび血清型に基づいて静脈内投与した場合、有効な用量は１０１２〜１０１４Ｖｇ／ｋｇの範囲である。ＡＡＶｍｕｔ４は、肝臓特異的な結合に関与する領域への修飾を含み、中枢神経系および筋肉を含む他の多くの標的組織へのより幅広い指向性をウイルスに付与する。
【０１５３】
プラスミドｐＡＡＶ−ＣＢ−ＧＡＬＴ−ＷＰＲＥ−Ｋａｎ（図１）を一過性形質移入によりＨＥＫ２９３細胞に形質移入し、２日後に細胞を溶解し、採取したタンパク質をアクリルアミドゲル上で泳動し、ナイロンメンブレンに転写し、抗ヒトＧＡＬＴ抗体とそれに続く検出用のＩＲ色素標識二次抗体で探索した。図３に示されるように、レーン１は、Ｙ軸上に示されるサイズを有する分子量マーカーである。レーン２は１μｌのＧＡＬＴ形質移入細胞可溶化液であり、レーン３は０．１μｌのＧＡＬＴ形質移入細胞可溶化液、レーン４は形質移入および細胞対照として使用されるｌｕｃＥＹＦＰレポータープラスミドで形質移入されたＨＥＫ２９３細胞の５μｌの可溶化液であって、内因的に発現された少量の天然ヒトＧＡＬＴタンパク質も示しており、レーン５は空であり、レーン６は天然ヒトＧＡＬＴタンパク質を示すＨｅｐＧ２細胞可溶化液であり、レーン７は空であり、レーン８〜１０は、精製のために使用されたタグのためにわずかにより高い移動度を有する、細菌によって発現された増加する濃度のＧＡＬＴタンパク質標準を示す。
インビボ投与
【０１５４】
第一に、古典的ガラクトース血症に関連する長期合併症を処置するために承認されたＡＡＶによって媒介される遺伝子ベースの治療または一切の遺伝子ベースの治療が存在しないので、本明細書に開示されるＧＡＬＴ遺伝子治療アプローチは、非常に革新的である。第二に、この技術に加えて、開示されている治療法は、離れた器官における異常なガラクトース代謝を正常化するために、肝臓への局所的な遺伝子送達を使用することができる。
【０１５５】
Ｔａｎｇ，Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ，（２０１４）：１１７２−１１７９に記載されているように、新たなＧＡＬＴ遺伝子トラップされた（ＧａｌＴ欠損）マウスモデルを使用した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ手順（Ｌｉ，Ｙ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．（２０１１）１０２（１）：３３−４０を使用して、ホモ接合型のＧａｌＴ遺伝子トラップされたマウス中でＧＡＬＴ活性の完全な不存在が確認された。ホモ接合型のＧａｌＴ遺伝子トラップされたマウスのさらなる特性評価により、新生ＧａｌＴ欠損仔におけるガラクトース感受性、成体の雌における生殖能力の低下、運動機能障害および両性のＧａｌＴ欠損マウスにおける発育不全が明らかになった（Ｔａｎｇら、（２０１４）、上記；Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｂ．ら、（２０１６）４７０（１）：２０５−２１２；Ｃｈｅｎら、（２０１７）Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．４０（１）：１３１−１３７）。
【０１５６】
図６に示されるように、ＡＡＶ９−ＧＡＬＴベクター（図１および２を参照）のＨＥＫ２９３細胞株への形質導入は、豊富なＧＡＬＴタンパク質の産生をもたらした。ＧＡＬＴタンパク質の発現は、強力なＣＢＡプロモーター／エンハンサーを、生理学的レベルに近いＧＡＬＴタンパク質を生成するプロモーターで必要に応じて置き換えることによって変更することができる。
【０１５７】
生体内分布：ＡＡＶ９ベクターは中枢神経系（ＣＮＳ）を含む幅広い生体内分布を有するのに対し、ＡＡＶ８は主にマウスの肝臓を標的とすることが確立されている。したがって、ＧＡＬＴおよびコドン最適化されたＧＡＬＴの投与は、ＡＡＶ８ベクターを使用して行うことができる。４週齢の野生型およびＧａｌＴ欠損マウスの血管系を介したベクターの送達により、２つの群間での生体内分布の差を評価することができる。最初の事として、雄および雌のマウス中への尾静脈を介した、ｌｕｃＥＹＦＰレポーター構築物を発現する１Ｅ＋１２Ｖｇの各ＡＡＶベクター（群当たり性別当たりＮ＝５、Ｎは、「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ−Ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌａｙｅｄ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ」という表題の文書中に説明されているように、毒性／生体内分布研究のためのＦＤＡのガイドラインに基づく）を行う。屠殺前に４週間、マウスを毎週画像化する。対照は、ＧＡＬＴ遺伝子挿入物なしのベクターを注射された年齢および性別を一致させた動物である。４週間後、動物を屠殺し、固定液で灌流し、脳、心臓、腎臓、肝臓、目および性腺を単離する。ＥＹＦＰに対して顕微鏡的に染色するために組織を切片化し、各組織の一部はゲノムＤＮＡ１μｇあたりのベクターゲノムのｑＰＣＲ測定のために使用する。別の制御された投与では、食事中の１０％および２０％ガラクトースをマウスに負荷する。
【０１５８】
投薬量研究：これとは別に、群当たり１２匹のマウス（性別あたり群あたりＮ＝６）に加えて選択された血清型の空ベクターを注射された対照群で、雄および雌の４週齢ＧａｌＴ欠損マウスに、それぞれマウス当たり、１Ｅ＋１０、１Ｅ＋１１または１Ｅ＋１２ｖｇでのＡＡＶ９−ＧＡＬＴ（またはＡＡＶ８−ＧＡＬＴ）ベクターの３つの異なる用量の１つを静脈内注射する。動物は最長６か月間監視し、運動協調性および生殖適応度の潜在的な改善について検査する。体重減少または不活動などの処置の明白な生理学的悪影響についても、動物を監視およびアッセイする。
【０１５９】
行動分析：神経障害に対する処置の機能的影響を定量化するために、６月齢での行動能力についてマウス（群あたりｎ＝１２）を試験する。行動試験には、モリス水迷路での認知および水泳能力、ならびにロータロッドでの運動機能が含まれる。マウスの運動失調に関連する運動障害を決定するために、支持のために動物がその体を受動的に使用することに代えて、四肢を交互にしてロッドに沿って動物を歩かせる改変されたロータロッドを使用する。訓練のために、２分間で６ＲＰＭまで速度を徐々に増加させる。２分間休憩した後、６ＲＰＭで最長２分間（動物が試験に失敗した場合には、より短い時間）、マウスを試験する。野生型（ＷＴ）の正常なマウスと比較して負荷を増大するために、各マウスに対して１２ＲＰＭで試験を繰り返すことができる。各マウスは、５分間の休息期間の後、各速度で３回試験する。６か月の終わりに、すべてのマウスを安楽死させ、資格を有する病理学者による病理学のためのＨ＆Ｅ組織学とともに、脳およびその他の組織のさまざまな領域中での、ウエスタンによるＧＡＬＴ遺伝子発現およびｑＰＣＲによるベクターゲノム含有量について評価する。
【０１６０】
雌マウスの生殖能力評価：雌マウスの生殖適応度は、定期的に発情周期を監視し、６か月の終わりに卵胞数を数えることによって評価する。発情周期および卵胞数の正常化の兆候のみでも、これらの動物における生殖能力の改善についての十分に優れた指標である。
均等物
【０１６１】
本発明は上記実施形態に関連して説明されてきたが、前述の説明および実施例は、本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内に属するその他の態様、利点および修正が、当業者には明らかであろう。
【０１６２】
さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の観点で記載されている場合、当業者は、これにより、本発明がマーカッシュ群の任意の各構成要素または構成要素の亜群の観点でも記載されていることを認識するであろう。
【０１６３】
本明細書中で参照されるすべての技術刊行物および特許刊行物が、参照により組み込まれる。
【化１−１】
2021534766.tif 000003
【化１−２】
2021534766.tif 000004
配列番号１
コドン最適化されたＧＡＬＴ配列
【化２】
2021534766.tif 000005
配列番号２−ｐＡＡＶ−ＣＢ−ｈＧＡＬＴ
変異したＩＴＲ：ヌクレオチド（ＮＴ）：１−１０６
ＣＭＶエンハンサー：ＮＴ：１５３−４３２
ニワトリβアクチンプロモーター：ＮＴ  ４３９−７０８
変更されたＳＶ４０イントロン：７７４−８３３
ヒトＧＡＬＴ：１００４−２１４３
ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル：ＮＴ  ２１８６−２３３２
ＩＴＲ：ＮＴ：２４１２−２５５２
アンピシリン耐性遺伝子：ＮＴ  ３４５５−４３１５
プラスミド複製起点（ｏｒｉ）：ＮＴ：４４７０−５０８９
【化３−１】
2021534766.tif 000006
【化３−２】
2021534766.tif 000007
【化３−３】
2021534766.tif 000008
配列番号３：ｐＡＡＶ−ＣＢ−ｈＧＡＬＴ−ＷＰＲＥｖ２−ＫＡＮ
変異したＩＴＲ：ヌクレオチド（ＮＴ）：１−１４５
ＣＭＶエンハンサー：ＮＴ：１９０−５５１
ニワトリβアクチンプロモーター：ＮＴ  ５５２−８３４
キメライントロン：９２９−１１０３
ヒトＧＡＬＴ：１１６０−２２９９
ウッドチャック肝炎ウイルス位置応答要素（ＷＰＲＥ）：ＮＴ  ２３３４−２９２７
ポリＡシグナル（ＢＧＨｐＡ）：ＮＴ  ２９４２−３１７６
ＩＴＲ：ＮＴ：３４４９−３５９２
ＫＡＮ遺伝子：ＮＴ  ５１４５−５９６０
【化４−１】
2021534766.tif 000009
【化４−２】
2021534766.tif 000010
【化４−３】
2021534766.tif 000011
【化４−４】
2021534766.tif 000012
配列番号４：
【化５】
2021534766.tif 000013
配列番号５：
Ｒｈ７４  ＶＰ１アミノ酸配列
【化６】
2021534766.tif 000014
配列番号６
Ｒｈ７４  ＶＰ１  ＤＮＡ
【化７−１】
2021534766.tif 000015
【化７−２】
2021534766.tif 000016
配列番号７−ＫＡＮ遺伝子翻訳産物
【化８】
2021534766.tif 000017
ＡＡＶ  ｒｈ７４コンセンサス配列アラインメント
ＡＡＶｒｈ７４
ＡＡＶｒｈ７４−Ｎ５０２Ｉ−キャプシド
Ｒｈ７４  ＹＩＧ５９１キャップタンパク質
【化９−１】
2021534766.tif 000018
【化９−２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2021534766000001.app
【国際調査報告】
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2021534766.tif 000029
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