(57)【要約】  放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性タンパク質または免疫応答修飾物質などの生物学的応答修飾物質を含む、生物学的活性分子の生物学的活性を防護することに関連する組成物および方法が開示される。イムノアッセイチューブの表面上への噴霧乾燥中、例示的マイトジェンレクチン製剤に、少なくとも１つの放射線防護化合物、例えば、システイン、還元型グルタチオン、メラトニン、および／またはヒスチジンを含めることにより、驚くべきことに、本来であれば電子ビーム放射線滅菌の結果として生じるであろう生物学的（マイトジェン）活性損失から、レクチンが防護された。放射線防護化合物はまた、その他の生物学的活性分子も防護し、それらの生物学的活性を安定させて、それらが、放射線処理後に長期保管した後、生物学的活性を保持することを可能にする。
2021524362.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性分子の生物学的活性を防護する方法であって、
（ａ）水溶液中の生物学的活性分子を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、
（ｂ）放射線防護された混合物を放射線滅菌するステップであって、放射線滅菌後に、放射線防護された混合物中の生物学的活性分子の生物学的活性は、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌される生物学的活性分子のコントロール試料の生物学的活性よりも高く、それによって、生物学的活性分子の生物学的活性が、放射線滅菌中の放射線障害から防護される、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
放射線防護された混合物が、放射線滅菌ステップの前に乾燥される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保管期間中の、生物学的活性分子の複数の分子からの生物学的活性損失から、前記複数の分子を防護する方法であって、
（ａ）水溶液中の生物学的活性分子を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、
（ｂ）放射線防護された混合物を乾燥させて、乾燥された放射線防護された混合物を得るステップと、
（ｃ）乾燥された放射線防護された混合物を放射線滅菌するステップと、
（ｄ）乾燥された放射線防護された混合物を所定期間にわたり保管して、保管された乾燥された放射線防護された混合物を得るステップであって、放射線滅菌および前記期間にわたる保管後、保管された乾燥された放射線防護された混合物中の生物学的活性分子の生物学的活性は、乾燥され、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌され、その後前記期間にわたり保管された生物学的活性分子のコントロール試料の生物学的活性よりも高く、それによって、保管期間中の生物学的活性損失から、生物学的活性分子の複数の分子が防護される、ステップと
を含む方法。
【請求項４】
放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性分子の生物学的活性を防護する方法であって、
（ａ）水溶液中の生物学的活性分子を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、
（ｂ）放射線防護された混合物を乾燥させて、乾燥された放射線防護された混合物を得るステップと、
（ｃ）乾燥された放射線防護された混合物を放射線滅菌して、乾燥された放射線滅菌された放射線防護された混合物を得るステップであって、乾燥された放射線滅菌された放射線防護された混合物を再水和して、再水和された放射線滅菌された放射線防護された混合物を得た後、放射線滅菌後に、放射線防護された混合物中の生物学的活性分子の生物学的活性は、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌される生物学的活性分子のコントロール試料の生物学的活性よりも高く、それによって、生物学的活性分子の生物学的活性が、放射線滅菌中の放射線障害から防護される、ステップと
を含む方法。
【請求項５】
生物学的活性分子が、（ｉ）生物学的活性タンパク質、（ｉｉ）マイトジェン、（ｉｉｉ）抗体、（ｉｖ）酵素、（ｖ）サイトカイン、（ｖｉ）成長因子、（ｖｉｉ）ホルモン、および（ｖｉｉｉ）ＴＬＲアゴニスト活性を有する生物学的活性イミダゾキノリンのうち１つ以上を含む、請求項１、３、または４に記載の方法。
【請求項６】
マイトジェンが、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、およびポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
放射線防護化合物が、少なくとも１つの抗酸化化合物を含む、請求項１、３、または４に記載の方法。
【請求項８】
抗酸化化合物が、システイン、グルタチオン、およびメラトニンから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
放射線防護化合物がヒスチジンを含む、請求項１、３、または４に記載の方法。
【請求項１０】
放射線防護化合物が、放射線防護された混合物中に、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または５０ミリモル濃度で存在する、請求項１、３、または４に記載の方法。
【請求項１１】
生物学的活性がマイトジェン活性を含む、請求項１、３、または４に記載の方法。
【請求項１２】
マイトジェン活性が、リンパ球増殖誘導活性を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リンパ球増殖活性が、Ｔ細胞増殖誘導活性を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＬＲアゴニスト活性を有する生物学的活性イミダゾキノリンが、イミキモド、ガーディキモド、およびレシキモド（Ｒ８４８）のうち１つ以上を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性タンパク質の生物学的活性を防護する方法であって、
（ａ）水溶液中の生物学的活性タンパク質を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、
（ｂ）放射線防護された混合物を放射線滅菌するステップであって、放射線滅菌後に、放射線防護された混合物中の生物学的活性タンパク質の生物学的活性は、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌される生物学的活性タンパク質のコントロール試料の生物学的活性よりも高く、それによって、生物学的活性タンパク質の生物学的活性が、放射線滅菌中の放射線障害から防護される、ステップと
を含む方法。
【請求項１６】
放射線防護された混合物が、放射線滅菌ステップの前に乾燥される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
保管期間中の、生物学的活性タンパク質の複数の分子からの生物学的活性損失から、前記複数の分子を防護する方法であって、
（ａ）水溶液中の生物学的活性タンパク質を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、
（ｂ）放射線防護された混合物を乾燥させて、乾燥された放射線防護された混合物を得るステップと、
（ｃ）乾燥された放射線防護された混合物を放射線滅菌するステップと、
（ｄ）乾燥された放射線防護された混合物を所定期間にわたり保管して、保管された乾燥された放射線防護された混合物を得るステップであって、放射線滅菌および前記期間にわたる保管後、保管された乾燥された放射線防護された混合物中の生物学的活性タンパク質の生物学的活性は、乾燥され、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌され、その後所定期間にわたり保管された生物学的活性タンパク質のコントロール試料の生物学的活性よりも高く、それによって、保管期間中の生物学的活性損失から、生物学的活性タンパク質の複数の分子が防護される、ステップと
を含む方法。
【請求項１８】
放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性タンパク質の生物学的活性を防護する方法であって、
（ａ）水溶液中の生物学的活性タンパク質を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、
（ｂ）放射線防護された混合物を乾燥させて、乾燥された放射線防護された混合物を得るステップと、
（ｃ）乾燥された放射線防護された混合物を放射線滅菌して、乾燥された放射線滅菌された放射線防護された混合物を得るステップであって、乾燥された放射線滅菌された放射線防護された混合物を再水和して、再水和された放射線滅菌された放射線防護された混合物を得た後、放射線滅菌後に、放射線防護された混合物中の生物学的活性タンパク質の生物学的活性は、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌される生物学的活性タンパク質のコントロール試料の生物学的活性よりも高く、それによって、生物学的活性タンパク質の生物学的活性が、放射線滅菌中の放射線障害から防護される、ステップと
を含む方法。
【請求項１９】
生物学的活性タンパク質が、（ｉ）マイトジェン、（ｉｉ）抗体、（ｉｉｉ）酵素、（ｉｖ）サイトカイン、（ｖ）成長因子、および（ｖｉ）ホルモンのうち１つ以上を含む、請求項１５、１７、または１８に記載の方法。
【請求項２０】
マイトジェンが、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、およびポークウィードマイトジェンン（ＰＷＭ）から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
放射線防護化合物が、少なくとも１つの抗酸化化合物を含む、請求項１５、１７、または１８に記載の方法。
【請求項２２】
抗酸化化合物が、システイン、グルタチオン、およびメラトニンから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
放射線防護化合物がヒスチジンを含む、請求項１５、１７、または１８に記載の方法。
【請求項２４】
放射線防護化合物が、放射線防護された混合物中に、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または５０ミリモル濃度で存在する、請求項１５、１７、または１８に記載の方法。
【請求項２５】
生物学的活性がマイトジェン活性を含む、請求項１５、１７、または１８に記載の方法。
【請求項２６】
マイトジェン活性が、リンパ球増殖誘導活性を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
リンパ球増殖活性が、Ｔ細胞増殖誘導活性を含む、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本実施形態は、概して、インビトロ生物学的アッセイに関する。より具体的には、本開示は、本来であれば放射線滅菌の最中および／または後に活性が損なわれるであろう、および／または減じられるであろう、生物学的活性タンパク質および／または免疫応答修飾物質などの生物学的応答修飾物質を含むがこれらに限定されない生物学的活性分子の生物学的活性を維持、防護、および／もしくは回復し、ならびに／または安定させる組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者から取得した生体試料中に存在する免疫系細胞（例えば、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはその他の免疫系細胞）などの細胞の免疫学的活性のインビトロアッセイは、診断および予測の目的で、当該技術分野で周知である。例えば、全血試料またはそのような試料から分離した白血球は、細胞増殖、マイトジェンによる刺激、特異抗原による刺激、または病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、受容体、およびその他のアゴニストによる刺激に応答しての可溶性メディエーターの放出および／または活性化などの複数の測定値によって、免疫応答能を評価するために、インビトロで検査することができる。
マイトジェンは、細胞の有糸分裂を刺激することが知られているタンパク質を含み、非抗原特異的にリンパ球増殖を誘導する免疫学的試薬として使用されている。リンパ球マイトジェンは、リンパ球を刺激して増殖させ、および／または可溶性メディエーターを放出／分泌させるポリクローナル活性化因子であってもよく、非抗原刺激駆動リンパ球分子機序を用いる一方、抗原特異的受容体（免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をバイパスして上記を行って、容易に検出できる強いポリクローナル応答を引き起こし得る。例示的Ｔ細胞マイトジェンとしては、生物学的活性タンパク質であるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）が挙げられるが、これらは、レクチン（例えば、植物由来炭水化物結合タンパク質）である。別のレクチンであるポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）は、Ｔ細胞およびＢ細胞の双方を刺激することができる。さまざまな起源のマイトジェンレクチンについて記載がある（例えば、Shanmugham et al., 2006 Riv Biol. 99:227、Naeem et al., 2007 Curr. Protein Pept. Sci 8:261、Singh et al., 2014 Crit. Rev. Microbiol. 40:329）。シグナル伝達を活性化することができるリンパ球細胞表面分子に特異的に結合する一部の抗体もまた、マイトジェンとして作用することができる。
【０００３】
したがって、マイトジェンは、シグナル強度が低いため、または抗原特異的応答リンパ球の出現頻度が低いためにモノクローナルまたはオリゴクローナル応答の免疫検出が十分に高感度でない可能性がある試料中で容易に測定することができる強いポリクローナル応答を引き出す／刺激することによって、リンパ球含有試料中の全体的な免疫応答能を評価するのに特に有用である。
ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）ＴＢゴールドマイトジェンコントロールアッセイ（例えば、Mazurek et al., 2005 MMWR Recomm. Rep 54:49-55、Mazurek et al., 2010 MMWR Recomm. Rep. 59:1-25、Simpson et al., 2012 Heart Lung 41:553、Cho et al., 2012 Tuberc. Respir. Dis. (Seoul) 72:416、Woo et al., 2014 Clin. Chim. Acta 430:79）は、例えば、生物学的活性タンパク質ＰＨＡ（レクチン）をポリクローナルマイトジェンとして使用して強いインビトロＴ細胞応答を誘導し、そこから試料中に存在するＴ細胞の免疫応答状態を評価することができる。このテストでは、ＰＨＡは、好都合には、採血チューブの内面上のコーティングとして乾燥形態で提供される。マイトジェンコーティングチューブは、内面上にＰＨＡ含有溶液を噴霧乾燥させることによって製造され、その後、放射線滅菌（例えば、電子ビーム放射線、ガンマ線照射など）によって、存在する可能性のある潜在的汚染微生物が死滅または不活性化させる。滅菌環境を達成するために放射線の代わりに化学物質を使用することは、化学物質が、刺激中に細胞の生物学的活性に干渉することがあり、および／または他のアッセイ検出システムに干渉することがあるため、理想的ではない。電子ビーム放射線は、生物学的活性タンパク質のそのような放射線滅菌のための、当技術分野で既知の標準的技法である（例えば、Smith et al., 2016 Health Phys. 111(2 Suppl 2):S141、Silindir et al., 2012 PDA J Pharm Sci Technol. 66:184、Mehta et al., 1993 Med Device Technol. 4:24、Yaman, 2001 Curr. Opin. Drug Devel. 4:760）。
【０００４】
血液採取／培養チューブ内に滅菌環境を有し、それによって、既知の生物学的活性アッセイ構成要素（例えば、ＰＨＡなどのマイトジェンタンパク質）への曝露後に、生体試料（例えば、全血または単離末梢血白血球）中のリンパ球の免疫応答が、アッセイ／培養チューブ中に存在する汚染微生物に対する細胞応答によって変更または不明瞭にされないことが望ましい。さらに、採血チューブが患者の血液と直接接触し得るため、チューブの内容物が滅菌されていない場合、感染因子が患者に移るかもしれないリスクがある。
しかしながら、電子ビーム放射線滅菌は、タンパク質の構造的、生物学的、および／または免疫学的特性を著しく変更することが報告されており、それによって、そのような放射線の生物学的製剤および生物医学的製剤に対する潜在的に有害な作用についての懸念が生じている（例えば、Katial et al.、2002 J Allerg Clin Immunol 110:215、Terryn et al.、2007 Int J Pharm 343:4、Antebi et al.、2016 Rev Bras Ortop 51:224）。例えば、電子ビーム滅菌は、滅菌イムノアッセイ／培養チューブ内のタンパク質調製物、例えば、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）ＴＢゴールドマイトジェン採血チューブ中のＰＨＡ製剤の効力を劇的に減少させ、ロット間一貫性に影響を及ぼす。結果として、最終的な放射線滅菌による活性成分（例えば、マイトジェン）の生物活性の減少により、製造効率が低下することになる。したがって、生物活性の損失を補うために、採取チューブの製造に使用される原料（例えば、マイトジェンタンパク質）の投入量の増加が必要になるが、そのような増量の必要性は、製造コストの増加、および異なる製造バッチ間の望ましくないばらつきにつながることになる。
【０００５】
さまざまな刊行物が、放射線滅菌中に、溶媒含有量、温度、ｐＨ、酸素含有量、もしくはその他のパラメータを修正することにより、および／または滅菌手順中に、さまざまな安定剤を使用することにより、生体組織、細胞、および／または生体分子を放射線障害から防護する方法を教示している。これらの開示から、所与の安定剤もしくは安定剤の組み合わせによる、任意の特定の生体分子もしくは生体分子群の実用性、これらとの適合性、およびこれらの放射線防護、または他の条件を修正することによる放射線防護の達成は、予測することができず、むしろ、望ましくは防護されるべき生体分子について、経験的に決定しなければならないことは明らかである。
【０００６】
例えば、欧州特許第２２３６５２０号は、生体分子を凍結することを回避するように選択される条件下での、電磁放射線の有害作用から防護するための安定化を含め、生体分子の安定化を記載している。安定剤には、最低限必要とされる少なくとも２種の異なるアミノ酸および１８種もの異なるアミノ酸の使用が含まれ、２〜５種の異なるアミノ酸の組み合わせが好適である。米国特許第５７３０９３３号は、生体分子を外来タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたは変性コラーゲン）およびフリーラジカル捕捉剤／抗酸化剤と接触させ、照射前に、任意に凍結乾燥ステップで、凍結することによる、生体分子の放射線障害からの防護を記載している。米国特許第６９４６０９８号は、生物学的製剤に安定剤としてのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加してから、放射線滅菌を行なってプリオン、ウイルス、またはその他の病原体を死滅させることについて記載している。代替的安定剤の広範なリストが開示されており、これには脂肪酸、抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤、ヘパリン、およびチオール化合物が含まれるが、ＨＳＡのみが範例に記載されている。
米国特許第２００３００１２６８７号および米国特許第２００３００３１５８４号は、脂肪酸、フリーラジカル捕捉剤、抗酸化剤、糖類、選択されたアミノ酸およびジペプチド、Ｔｒｏｌｏｘ（ＣＡＳ  ５３１８８−０７−１）などを含め、多様な化合物群から選ばれた安定剤を使用した、組織または生体分子、例えば、免疫グロブリンの放射線防護を記載している。米国特許第２００３０１４３１０６号および米国特許第２００４００８６４２０号は、さまざまな抗酸化剤、脂肪酸、アミノ酸、ビタミン、および／またはフリーラジカル捕捉剤を使用した、組織、ならびにさまざまな血液、血清、および血漿タンパク質の放射線防護を記載している。米国特許第２００５００６９４５３号は、試料の特性（例えば、溶媒組成物、ｐＨ、温度など）を修正することによる、または広範な安定剤のリストのうちのいずれかを添加することによる、放射線滅菌中のウロキナーゼの防護を記載しているが、それらのうち少数のみが、範例において放射線防護を付与することが実証されている。
【０００７】
明らかに、放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性タンパク質およびその他の生物学的活性分子の生物学的活性を防護して、イムノアッセイ製品の品質および一貫性を向上させ、イムノアッセイ／培養チューブ／システムの製造に必要とされる原料の量を減少させることが必要とされている。本開示の発明の実施形態は、これらの必要に対処し、かつその他の関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
本開示の発明のある特定の態様によると、放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性を防護する方法であって、（ａ）水溶液中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、（ｂ）放射線防護された混合物を放射線滅菌するステップであって、放射線滅菌後に、放射線防護された混合物中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性は、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌される生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子のコントロール試料の生物学的活性よりも高く、それによって、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性が、放射線滅菌中の放射線障害から防護される、ステップとを含む方法が提供される。さらなる実施形態では、放射線防護された混合物は、放射線滅菌ステップの前に乾燥される。
【０００９】
別の実施形態では、保管期間中の、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の複数の分子からの生物学的活性損失から、前記複数の分子を防護する方法であって、（ａ）水溶液中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、（ｂ）放射線防護された混合物を乾燥させて、乾燥された放射線防護された混合物を得るステップと、（ｃ）乾燥された放射線防護された混合物を放射線滅菌するステップと、（ｄ）乾燥された放射線防護された混合物を所定期間にわたり保管して、保管された乾燥された放射線防護された混合物を得るステップであって、放射線滅菌および前記期間にわたる保管後、保管された乾燥された放射線防護された混合物中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性は、乾燥され、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌され、その後前記期間にわたり保管された生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子のコントロール試料の生物学的活性よりも高く、それによって、保管期間中の生物学的活性損失から、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の複数の分子が防護される、ステップとを含む方法が提供される。
ある特定の他の実施形態では、放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子、例えば、ＴＬＲアゴニスト活性を有する生物学的活性イミダゾキノリンの生物学的活性を防護する方法であって、（ａ）水溶液中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子、例えば、ＴＬＲアゴニスト活性を有する生物学的活性イミダゾキノリンを少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、（ｂ）放射線防護された混合物を乾燥させて、乾燥された放射線防護された混合物を得るステップと、（ｃ）乾燥された放射線防護された混合物を放射線滅菌して、乾燥された放射線滅菌された放射線防護された混合物を得るステップであって、乾燥された放射線滅菌された放射線防護された混合物を再水和して、再水和された放射線滅菌された放射線防護された混合物を得た後、放射線滅菌後に、放射線防護された混合物中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子（例えば、生物学的活性イミダゾキノリン）の生物学的活性は、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌される生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子（例えば、生物学的活性イミダゾキノリン）のコントロール試料の生物学的活性よりも高く、それによって、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子（例えば、生物学的活性イミダゾキノリン）の生物学的活性が、放射線滅菌中の放射線障害から防護される、ステップとを含む方法が提供される。ある特定のさらなる実施形態では、ＴＬＲアゴニスト活性を有する生物学的活性イミダゾキノリンは、イミキモド、ガーディキモド、およびレシキモド（Ｒ８４８）のうち１つ以上を含む。
【００１０】
上述の方法のある特定のさらなる実施形態では、生物学的活性タンパク質はマイトジェンであり、これは、ある特定のまたさらなる実施形態では、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、およびポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）から選択される。上述の方法のある特定の他のさらなる実施形態では、生物学的活性タンパク質は、（ｉ）マイトジェン、（ｉｉ）抗体、（ｉｉｉ）酵素、（ｉｖ）サイトカイン、（ｖ）成長因子、および（ｖｉ）ホルモンのうち１つ以上を含む。ある特定の実施形態では、放射線防護化合物は、少なくとも１つの抗酸化化合物を含み、これは、ある特定のさらなる実施形態では、システイン、グルタチオン、およびメラトニンから選択される。ある特定の実施形態では、放射線防護化合物は、ヒスチジンを含む。上述の方法のある特定の実施形態では、放射線防護化合物は、放射線防護された混合物中に、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または５０ミリモル濃度で存在する。ある特定の実施形態では、生物学的活性は、マイトジェン活性を含み、これは、ある特定のさらなる実施形態では、リンパ球増殖誘導活性を含む。ある特定のまたさらなる実施形態では、リンパ球増殖活性は、Ｔ細胞増殖誘導活性を含む。
【００１１】
本明細書に記載の発明のこれらおよびその他の態様および実施形態は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかになる。本明細書において言及される、および／または出願データシートに記載される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国（非米国）特許、外国特許出願、および非特許出版物はすべて、参照により、それぞれが個別に組み込まれているかのように、全体として本明細書に組み込まれる。本発明の態様および実施形態は、必要であれば、これらのさまざまな特許、出願、および出版物の概念を利用するために修正して、またさらなる実施形態を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】溶液中、２５ｋＧｙの電子ビーム放射線滅菌で処理されたＰＨＡ−Ｐ製剤における、生物学的活性の濃度依存的防護を示す図である。システイン（黒丸）およびメラトニン（白丸）を同じＰＨＡ−Ｐ製剤に、さまざまな最終濃度まで溶解させた。マイトジェン活性は、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）ＥＬＩＳＡを製造者の説明書に従って使用して（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）、血液ドナー６名からの全血試料中のＩＦＮ−γ分泌を測定することにより判定した。コントロール（ＰＨＡ−Ｐのみで、添加剤をまったく含まない）に対するマイトジェン活性の群平均パーセンテージを提示する。結果は、溶液中のシステインおよびメラトニンのマイトジェン活性の用量依存的防護を示した。
【図２】電子ビーム放射線滅菌中の、ＱｕａｎｔｉＴＦＥＲＯＮ（登録商標）マイトジェンコントロール採血チューブ中の噴霧乾燥ＰＨＡ−Ｐの生物学的活性損失からのマイトジェン効力の防護を示す図である。ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）マイトジェンコントロール採血チューブは、マイトジェン（ＰＨＡ）製剤にシステイン（液体マイトジェン製剤中最終濃度５ｍＭ）を補充して製造された。マイトジェン応答は、ドナー８名の群において、電子ビーム放射線滅菌処理済みおよび未処理のシステイン配合および非配合マイトジェンチューブ中で判定した。データは、未滅菌のコントロールマイトジェンチューブ（システインを含まない）であるコントロールに対する応答％に正規化した。図中のそれぞれの点は、ドナー１名からのデータ点を示す。結果は、システインが、マイトジェン応答に影響を与えないが、Ｅ−ビーム放射線滅菌で噴霧乾燥ＰＨＡ−Ｐのマイトジェン活性を防護することを示した。
【図３】ＰＨＡ中にシステイン５ｍＭ含有および非含有で製造後、電子ビーム放射線滅菌を行い、製造後示される月数の間保管したＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）マイトジェンコントロール採血チューブにおける、マイトジェン効力の差のパーセンテージを示す図である。ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）マイトジェンコントロール採血チューブは、システイン（液体マイトジェン製剤中最終濃度５．０ｍＭ）含有および非含有で製造され、Ｅ−ビーム放射線で滅菌された。マイトジェンチューブの生物学的（マイトジェン）活性は、経時的にテストし、システインが配合されていないマイトジェンチューブと比較した、システインが配合されたマイトジェンチューブの活性の効力差％として示した。図中のそれぞれの点は、各時点での群平均の活性％を示す。結果は、システインが配合されたマイトジェンチューブは、経時的に、システインが配合されていないマイトジェンチューブよりも高い活性％を有することを示し、システインを含むマイトジェンチューブが、システインを含まないチューブよりも経時的な活性の損失が少ないことを示唆した。
【図４】ドナー６名からの全血試料中のＩＦＮ−γ分泌により評価した、放射線防護化合物であるシステイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）による、抗ＣＤ３抗体のＴ細胞刺激活性のＥ−ビーム放射線からの防護を示す図である。
【図５】ドナー６名からの全血試料中のＩＦＮ−γ分泌により評価した、抗ＣＤ３抗体のＴ細胞刺激活性のＥ−ビーム放射線からの防護に対する、放射線防護化合物であるシステイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）の用量設定の作用を示す図である。
【図６】ドナー６名からの全血試料中のＩＦＮ−γ分泌により評価した、放射線防護化合物であるシステイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）による、ＴＬＲアゴニストイミダゾキノリン免疫応答修飾物質Ｒ８４８（レシキモド）のＮＫ細胞刺激活性のＥ−ビーム放射線からの防護を示す図である。
【図７】ドナー６名からの全血試料中のＩＦＮ−γ分泌により評価した、ＴＬＲアゴニストイミダゾキノリン免疫応答修飾物質Ｒ８４８（レシキモド）のＮＫ細胞刺激活性のＥ−ビーム放射線からの防護に対する、放射線防護化合物であるシステイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）の用量設定の作用を示す図である。
【図８】ドナー６名からの全血試料中のＩＦＮ−γ分泌により評価した、放射線防護化合物であるシステイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）による、抗ＣＤ３抗体のＴ細胞刺激活性とＴＬＲアゴニストイミダゾキノリン免疫応答修飾物質Ｒ８４８（レシキモド）とのＮＫ細胞刺激活性の組み合わせのＥ−ビーム放射線からの防護を示す図である。
【図９】ドナー６名からの全血試料中のＩＦＮ−γ分泌により評価した、抗ＣＤ３抗体のＴ細胞刺激活性とＴＬＲアゴニストイミダゾキノリン免疫応答修飾物質Ｒ８４８（レシキモド）とのＮＫ細胞刺激活性の組み合わせのＥ−ビーム放射線からの防護に対する、放射線防護化合物であるシステイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）の用量設定の作用を示す図である。
【図１０】ドナー６名からの全血試料中のＩＦＮ−γ分泌により評価した、放射線防護化合物であるシステイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）による、ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）のマイトジェン効力のＥ−ビーム放射線からの防護を示す図である。
【図１１】ドナー６名からの全血試料中のＩＦＮ−γ分泌により評価した、ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）のマイトジェン効力のＥ−ビーム放射線からの防護に対する、放射線防護化合物であるシステイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）の用量設定の作用を示す図である。
【図１２】ドナー６名からの全血試料中のＩＦＮ−γ分泌により評価した、放射線防護化合物であるシステイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）による、Ｔ細胞マイトジェンコンカナバリン（ｃｏｎｃｏｎａｖａｌｉｎ）Ａ（ＣｏｎＡ）のＴ細胞刺激活性のＥ−ビーム放射線からの防護を示す図である。
【図１３】ドナー６名からの全血試料中のＩＦＮ−γ分泌により評価した、Ｔ細胞マイトジェンコンカナバリン（ｃｏｎｃｏｎａｖａｌｉｎ）Ａ（ＣｏｎＡ）のＴ細胞刺激活性のＥ−ビーム放射線からの防護に対する、放射線防護化合物であるシステイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）の用量設定の作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ある特定の本開示の実施形態は、本来であれば放射線滅菌によって損なわれるであろう、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子、例えば、生物学的応答修飾物質または免疫応答修飾物質の生物学的活性が、放射線滅菌前に、その生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子を本明細書に規定する放射線防護化合物に接触させた場合、実質的に放射線防護され得る（例えば、適当なコントロールに対して統計的に有意に増加する）という驚くべき発見に関する。
【００１４】
より具体的には、また非限定的な例として、本明細書に記載のように、Ｔリンパ球に対するＰＨＡのマイトジェン活性は、内部にＰＨＡ溶液が噴霧乾燥されたイムノアッセイチューブを放射線滅菌することにより著しく減じられることがわかった。しかしながら、本明細書においてはじめて開示されるように、放射線滅菌前に、本明細書に規定する少なくとも１つの放射線防護化合物、例えば、１つ以上の放射線防護化合物、例えば、システイン、還元型グルタチオン、メラトニン、および／またはヒスチジンにＰＨＡを接触させた場合、放射線滅菌後のＰＨＡ生物学的活性、すなわち、ヒト全血試料中に存在する白血球に対するマイトジェン活性は、驚くべきことに、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌されたコントロールＰＨＡ試料の活性よりも高かった。これに加え、本明細書においてはじめて開示されるように、生物学的活性タンパク質（ＰＨＡ）を溶液中の放射線防護化合物と接触させて放射線防護された混合物を得ることによる防護効果は、噴霧乾燥および／またはフリーズドライ（例えば、凍結乾燥）などによって混合物を実質的に乾燥した後、予想外に持続した。さらに、実質的に乾燥した放射線防護された混合物は、驚くほど長期の安定性を示し、８か月を超える保管後に、生物学的活性の実質的な防護が示された。
【００１５】
これらおよび関連する実施形態は、したがって、滅菌環境で生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子（免疫応答修飾物質などの生物学的応答修飾物質を含む）を提供することが望まれ得る数多くの背景で有用となるが、これには例えば、生物学的活性タンパク質（またはその他の生物学的活性分子）の噴霧乾燥、脱水、および／もしくは乾燥調製物そのもの、または滅菌環境に関連する利益を得るために有利に放射線滅菌することができる、任意のタイプの容器（例えば、試験管、アッセイプレート、マイクロウェル、培養皿、血液検体容器、瓶、ビーカー、バイアル、アンプル、シリンジ、またはその他任意の適当な容器）の表面上の上記調製物がある。本明細書に記載のある特定の好適な実施形態は、さまざまなインビトロ免疫学的アッセイのいずれかに使用するための放射線防護されたタンパク質マイトジェンに関するが、企図される実施形態は、そのように限定されることを意図せず、他の生物学的活性タンパク質（例えば、免疫賦活性抗体）またはその他の生物学的活性分子（例えば、生物学的応答修飾物質、例えば、免疫応答修飾物質、例えば、イミダゾキノリンＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、例えば、実例としてであり、限定するものではないが、イミキモド、ガーディキモド、レシキモドなど）もまた、生物学的活性タンパク質または生物学的活性分子が、生物学的活性の実質的な損失なく、有利に放射線滅菌され得る形態において想定される。
【００１６】
生物学的活性
本明細書に記載されるとき、物質の生物学的活性とは、例えば、細胞、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物、およびヒトを含むがこれらに限定されない生物体に関連する、生体システム、経路、分子、または相互作用の任意の物理的または生化学的特性に影響を与え得る任意の活性を意味する。生物学的活性を有する物質の例としては、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、特に、生物学的活性タンパク質、例えば、酵素、抗体、糖タンパク質、レクチン、マイトジェンレクチンを含むマイトジェンタンパク質、小分子（例えば、生物活性小分子）、医薬組成物（例えば、薬物）、ワクチン、ＴＬＲアゴニスト活性を有するイミダゾキノリン（例えば、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド（Ｒ８４８）など）などの免疫応答修飾物質を含む生物学的応答修飾物質、炭水化物、脂質、ステロイド、ホルモン、ケモカイン、成長因子、サイトカイン、リポソーム、および毒素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
当業者は、生体システムの物理学的または生化学的特性に影響を与える物質の生物学的活性、例えば、免疫学的活性、免疫化学的活性、サイトカイン活性、ホルモン活性、および生物活性ペプチド活性、ならびにその他の細胞増殖（例えば、マイトジェン活性）および／または分化活性（例えば、Coligan et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJを参照）、シグナル伝達（例えば、Bonifacino et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Cell Biology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ）、免疫強化および／または免疫応答修飾物質活性、例えば、イミダゾキノリン、例えば、ＴＬＲアゴニストであるイミキモド、ガーディキモド、レシキモド（Ｒ８４８）など（例えば、Gerster et al., 2005 J. Med. Chem. 48:3481、Shukla et al., 2010 J. Med. Chem. 53:4450、Shi et al., 2012 ACS Med. Chem. Lett. 3(6):501-504、Tomai et al., Ch. 8, Toll-Like Receptor 7 and 8 Agonists for Vaccine Adjuvant Use, pp. 149-161、およびSkountzu et al., Ch. 20, Adjuvants for Skin Vaccination, pp. 399-419, in Immunopotentiators in Modern Vaccines, Schijns et al. (eds.), 2017 Academic Press, NYを参照）、遺伝子発現（例えば、Asubel、FM et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Molecular Biology、Wiley and Sons、Inc. Hoboken、NJ）、受容体−リガンド相互作用（例えば、Coligan et al. (Eds.) 2007 Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJを参照）、酵素活性（例えば、Eisenthal and Hanson (Eds.), Enzyme Assays, Second Edition, Practical Approaches series, No. 257. 2002, Oxford University Press, Oxford, UK、Kaplan and Colowick (Eds.), Preparation and Assay of Enzymes, Methods in Enzymology, (vols. 1, 2 and 6). 1955 and 1961, Academic Press, Ltd., Oxford, UKを参照）、および細胞毒性（例えば、細胞傷害性、興奮毒性）（例えば、Bus JS et al. (Eds) 2007 Current Protocols in Toxicology, Wiley and Sons, Inc. Hoboken, NJを参照）、アポトーシスおよびネクローシス（Green and Reed, 1998 Science 281(5381):1309-12、Green DR, 1998 Nature Dec 17: 629、Green DR, 1998 Cell 94(6):695-69、Reed, JC (Ed.), 2000 Apoptosis, Methods in Enzymology (vol. 322), Academic Press Ltd., Oxford, UK）、またはその他の生物学的活性を含み得るがこれらに限定されない、１つ以上の生物学的活性を判定するための適当なアッセイおよび方法を認知する。
【００１８】
本明細書で開示される好適な実施形態では、放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性タンパク質および／または別の生物学的活性分子（生物学的応答修飾物質、例えば、免疫応答修飾物質、例えば、ＴＬＲアゴニスト活性を有するイミダゾキノリン（例えば、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド（Ｒ８４８）を含む））の生物学的活性を実質的に防護する方法が提供される。ある特定のさらなる好適な実施形態では、生物学的活性タンパク質は、１つもしくは複数のマイトジェン、例えば、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ、および／もしくはＰＷＭのうち１つ以上であり、ならびに／または生物学的活性タンパク質は、抗体、サイトカイン、酵素、成長因子、およびホルモンのうち１つ以上を含み、ならびに／または生物学的活性分子は、１つもしくは複数のＴＬＲアゴニスト活性を有するイミダゾキノリン、例えば、イミキモド、ガーディキモド、および／もしくはレシキモド（Ｒ８４８）を含む免疫応答修飾物質を含む。
【００１９】
本明細書で開示されるある特定の好適な実施形態では、保管期間中の、ある特定の好適な実施形態では生物学的活性タンパク質であってもよく、ある特定の他の好適な実施形態では１つ以上の生物学的応答修飾物質、例えば、免疫応答修飾物質、例えば、ＴＬＲアゴニスト活性を有するイミダゾキノリン免疫応答修飾物質を含む生物学的活性分子であってもよい生物学的活性分子の複数の分子からの生物学的活性損失から、前記複数の分子を防護する方法であって、水溶液中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、放射線防護された混合物を乾燥させて、乾燥された放射線防護された混合物を得るステップと、乾燥された放射線防護された混合物を放射線滅菌するステップと、乾燥された放射線防護された混合物を所定期間にわたり保管して、保管された乾燥された放射線防護された混合物を得るステップであって、放射線滅菌および前記期間にわたる保管後、保管された乾燥された放射線防護された混合物中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性は、乾燥され、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌され、その後前記期間にわたり保管された生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子のコントロール試料の生物学的活性よりも高く、それによって、保管期間中の生物学的活性損失から、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の複数の分子が防護される、ステップとを含む方法が提供される。
【００２０】
保管期間は、特定の生物学的活性分子、そのような分子の特定の１つまたは複数の生物学的活性、放射線滅菌条件、放射線防護体、放射線防護された混合物を乾燥させる程度、保管条件（例えば、温度、相対湿度、雰囲気などを含む）、およびその他の要因に応じて大幅に異なり得る。典型的には、生物学的活性分子（例えば、生物学的活性タンパク質）が生物学的活性損失（例えば、適当なコントロールに対する生物学的活性の統計的に有意な減少）から防護される保管期間は、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２４か月、２５か月、２６か月、２７か月、２８か月、２９か月、３０か月、３１か月、３２か月、３３か月、３４か月、３５か月、３６か月であってもよいし、またはそれより長くてもよい。
【００２１】
生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性は、本明細書で開示されるある特定の実施形態によると、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子を含む組成物の放射線滅菌後、生物学的活性の完全な回復または生物学的活性の実質的な回復（例えば、少なくとも３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、または５０％、好ましくは、少なくとも５２％、５４％、５６％、５８％、または６０％、より好ましくは、少なくとも６２％、６４％、６６％、６８％、または７０％、より好ましくは、少なくとも７２％、７４％、７６％、または８０％の回復、より好適な実施形態では、典型的には、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、または８５％、より好ましくは、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、より好ましくは、少なくとも９５％、さらにより好ましくは、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超の回復）があった場合、実質的に防護され得る。
【００２２】
本明細書に記載されるある特定の実施形態では、水溶液中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子（生物学的活性生物学的応答修飾物質、例えば、免疫応答修飾物質、例えば、ＴＬＲアゴニスト活性を有するイミダゾキノリン免疫応答修飾物質を含む）を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させ、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得る。
放射線防護された混合物の放射線滅菌は、多数の公知の手順のいずれかにより達成することができ、これには例えば、Smith et al., 2016 Health Phys. 111(2 Suppl 2):S141、Silindir et al., 2012 PDA J Pharm Sci Technol. 66:184、Mehta et al., 1993 Med Device Technol. 4:24、Yaman, 2001 Curr. Opin. Drug Devel. 4:760、Katial et al., 2002 J Allerg Clin Immunol 110:215、Terryn et al., 2007 Int J Pharm 343:4、およびAntebi et al., 2016 Rev Bras Ortop 51:224により記載されているような電子ビーム放射線がある。
ある特定の好適な実施形態では、放射線防護された混合物は、放射線滅菌前に乾燥または実質的に乾燥され、これは典型的には、完全乾燥（例えば、統計的有意性をもって、すべてまたは実質的にすべての検出可能な溶媒が除去されている）であってもよい。保管される試料の性質およびその使用目的によって異なってもよいある特定の実施形態では、乾燥された、乾燥した、実質的に乾燥された、または実質的に乾燥した放射線防護された混合物を得るために、検出可能な溶媒の７５％超、８０％超、８２％超、８４％超、８６％超、８８％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超が除去されている。
【００２３】
本明細書に規定する生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子を放射線防護化合物に接触させて、放射線防護された混合物を得るステップの後、放射線防護された混合物は、さまざまな乾燥方法のいずれによって乾燥させてもよい。好適な乾燥方法は、凍結乾燥（例えば、不完全または完全真空下で凍結水溶液を乾燥させて、液体水を形成せずに、凍結固相から気相に昇華することによって、水の除去を促進するようなフリーズドライ）である。その他の乾燥技法、例えば、環境温度および気圧で、またはラミナーフローフードもしくは脱水チャンバー内で、または真空下を含めた減圧した環境気圧下で（例えば、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）などの真空ポンプによる）、溶媒（例えば、水）を蒸発させることによる乾燥も使用することができる。その他の乾燥方法も企図されており、例えば、限定するものではないが、放射熱乾燥、光源下での乾燥、脱水、窒素またはその他の気体下（例えば、好ましくは、流動する不活性ガス流下）での乾燥、乾燥溶媒またはその他の化学物質、例えば、揮発性有機溶媒、例えば、低級アルコール、低級アルカンおよびハロアルカン（例えば、ペンタン、ヘキサン、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素）、エーテル（例えば、テトラヒドロフラン）、酢酸エチル、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸、ピリジン、アセトン、またはその他の溶媒（好ましくは、無水形態）の使用、空気圧、ならびに蒸発を促進および加速するその他の方法が挙げられる。
【００２４】
試料の乾燥は、簡単な目視検査および触感（すなわち、ピペットチップで軽くたたくこと）により判定して、すべての水分が蒸発または除去されていることを確認することができる。一部の実施形態では、好ましくは、達成された乾燥の程度を確認するための水分インジケーターが含まれていてもよい。例えば、試料中の含水量の（目視可能な色変化または比色分析により）検出可能なインジケーターとして、塩化コバルトが含まれていてもよい。水分インジケーター、例えば、含水量を判定するために物質の誘電体含有量を測定する電子デバイス（例えば、Ａｑｕａ−Ｓｐｅａｒ（商標）、Ｍａｓｔｒａｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、ダグラス、英国）もまた、これらおよび関連する実施形態の一部での使用に企図されている。乾燥剤、例えば、水分インジケーターを備えた硫酸カルシウム（すなわち、Ｄｒｉｅｒｉｔｅ（登録商標）、Ｗ．Ａ．Ｈａｍｍｏｎｄ  Ｄｒｉｅｒｉｔｅ  Ｃｏ．、オハイオ州クセニア）または五酸化リンもまた、本開示のある特定の実施形態での使用に企図されている。
【００２５】
放射線防護化合物
本明細書の他の部分にも記載されるように、本開示は、本来であれば放射線滅菌によって損なわれるであろう、本明細書に規定する生物学的活性分子、例えば、生物学的活性タンパク質の生物学的活性が、放射線滅菌前に、その生物学的活性分子を本明細書に規定する放射線防護化合物に接触させて、放射線滅菌を受ける放射線防護された混合物を形成した場合、実質的に放射線防護され得る（例えば、防護されていない適当なコントロール、例えば、放射線防護体の不在下で放射線滅菌を受けた同じ生物学的活性分子（例えば、生物学的活性タンパク質）のコントロールの生物学的活性に対して統計的に有意に増加する）という予想外の発見に関する。
ある特定の安定剤により付与される、生体組織、細胞、または生体分子の少なくとも一部の構造的および／または機能的属性を維持または部分的に維持する、ある特定の放射線防護効果の以前の観察結果（例えば、上記に概説したようなもの）にもかかわらず、当業者は、本開示の特徴の組み合わせに到達することを合理的に予想しなかったであろう。
【００２６】
したがって、放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性を実質的に防護する方法であって、水溶液中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、放射線防護された混合物を放射線滅菌するステップであって、放射線滅菌後に、放射線防護された混合物中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性は、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌される生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子のコントロール試料の生物学的活性よりも高く（例えば、適当なコントロールに対して統計的に有意に増加する）、それによって、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性が、放射線滅菌中の放射線障害から実質的に防護される、ステップとを含む方法が本明細書においてはじめて開示される。ある特定のさらなる実施形態では、放射線防護された混合物は、放射線滅菌ステップの前に実質的に乾燥される。
【００２７】
同様に本明細書においてはじめて開示されるのは、放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性を実質的に防護する方法であって、水溶液中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物と接触させて、放射線滅菌前に、放射線防護された混合物を得るステップと、放射線防護された混合物を実質的に乾燥させて、実質的に乾燥した放射線防護された混合物を得るステップと、実質的に乾燥した放射線防護された混合物を放射線滅菌して、実質的に乾燥した放射線滅菌された放射線防護された混合物を得るステップであって、実質的に乾燥した放射線滅菌された放射線防護された混合物を再水和して、再水和された放射線滅菌された放射線防護された混合物を得た後、放射線滅菌後に、放射線防護された混合物中の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性は、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌される生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子のコントロール試料の生物学的活性よりも高く（例えば、適当なコントロールに対して統計的に有意に増加する）、それによって、生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性が、放射線滅菌中の放射線障害から実質的に防護される、ステップとを含む方法である。
より具体的には、本開示によると、ヒトおよびその他の哺乳動物の末梢血リンパ球においてマイトジェンとして作用する生物学的活性タンパク質、例えば、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ、もしくはＰＷＭ、または抗ＣＤ３抗体の生物学的活性が、電子ビーム放射線滅菌に感受性があり、放射線滅菌を受けていない同じマイトジェンの活性に対して減少する（例えば、適当なコントロールに対して統計的に有意に低下する）ことがはじめて示される。さらに、本明細書においてはじめて開示されるように、そのようなマイトジェンの生物学的活性は、本明細書に規定する少なくとも１つの放射線防護化合物と接触させて、放射線防護された混合物を形成してから、この混合物を放射線滅菌に供することによって、活性を損なう電子ビーム放射線の作用から防護する（例えば、適当なコントロールに対して統計的に有意に増加する）ことができる。
【００２８】
本開示はまた、本明細書に記載の方法では、本マイトジェンに生物活性防護を付与する放射線防護化合物が、システイン、メラトニン、グルタチオン、およびヒスチジンのうち１つ以上を含んでもよい（またはこれらのうち１つ以上からなってもよい）ことをはじめて教示する。
またさらに、本開示は、ここに規定する放射線防護化合物（例えば、システイン、メラトニン、グルタチオン、およびヒスチジンのうち１つ以上を含んでもよく、またはこれらのうち１つ以上からなってもよい）を本生物学的活性タンパク質マイトジェン（例えば、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ、および／もしくはＰＷＭ、または抗ＣＤ３抗体）または免疫応答修飾物質（例えば、ＴＬＲアゴニスト活性を有するイミダゾキノリン、例えば、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド（Ｒ８４８）など）と組み合わせて、本明細書に規定するように実質的に乾燥（例えば、凍結乾燥）して、実質的に乾燥した放射線防護された混合物として放射線滅菌に供してもよい放射線防護された混合物を形成することができ、そのような乾燥された形態でも、放射線防護化合物の存在により、マイトジェンの生物学的活性は、放射線防護化合物が除外されたコントロール試料のマイトジェン活性に対して維持される（例えば、その活性が、適当なコントロールと比較して、統計的に有意に増加する）ことをはじめて教示する。
【００２９】
したがって、本開示は、本明細書に記載の実質的に乾燥した放射線防護された混合物の形態で、マイトジェンと一緒に存在するときの防護能を含め、そのような能力を有することがこれまで予想されなかったであろう放射線防護化合物を使用した、当該技術がこれまで理解できなかった方法による、マイトジェンおよびその他の生物学的活性分子の放射線防護を教示する。例えば、本マイトジェン以外のタンパク質に対して、溶液中で放射線防護特性を有するとしてこれまで認識されていた剤は、本明細書において、驚くべきことに、本明細書に記載のような異なる物理的状態で（例えば、溶液中ではなく、凍結乾燥されて実質的に乾燥した放射線防護された混合物として）マイトジェンと一緒に存在するときに、さまざまなタンパク質（例えば、本マイトジェン）に対して放射線防護作用を示すと記載されている。このような特性は、本開示以前には予想されなかったであろう。
【００３０】
したがって、ある特定の好適な実施形態では、１つ以上の生物学的活性タンパク質、例えば、本明細書に記載のマイトジェン、例えば、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ、および／もしくはＰＷＭ、ならびに／または１つ以上の生物学的活性免疫応答修飾物質、例えば、本明細書に記載のイミダゾキノリンＴＬＲアゴニスト、例えば、イミキモド、レシキモド（Ｒ８４８）、および／またはガーディキモドを少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物、例えば、システイン、グルタチオン、メラトニン、および／またはヒスチジンと接触させて、生物学的活性タンパク質および／または免疫応答修飾物質と放射線防護化合物との乾燥を同時に進め、それによって実質的に乾燥した放射線防護された混合物を得ることができ、その後、この混合物を放射線滅菌して、実質的に乾燥した放射線滅菌された放射線防護された混合物を得ることができる。
ある特定の好適な実施形態では、１つ以上の生物学的活性タンパク質は、細胞表面受容体に対する抗体、例えば、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５２、および／またはＣＤ２８に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでもよく、この抗体またはその抗原結合性フラグメントを少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物、例えば、システイン、グルタチオン、メラトニン、および／またはヒスチジンと接触させて、生物学的活性タンパク質と放射線防護化合物との乾燥を同時に進め、それによって実質的に乾燥した放射線防護された混合物を得ることができ、その後、この混合物を放射線滅菌して、実質的に乾燥した放射線滅菌された放射線防護された混合物を得ることができる。
【００３１】
ある特定の他の好適な実施形態では、１つ以上の生物学的活性タンパク質は、抗原、例えば、特異的結合相互作用において、適応免疫系の選択要素により認識され得るペプチドまたはタンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合性フラグメント、Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性フラグメントなど）を含んでもよく、この抗原を少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物、例えば、システイン、グルタチオン、メラトニン、および／またはヒスチジンと接触させて、生物学的活性タンパク質と放射線防護化合物との乾燥を同時に進め、それによって実質的に乾燥した放射線防護された混合物を得ることができ、その後、この混合物を放射線滅菌して、実質的に乾燥した放射線滅菌された放射線防護された混合物を得ることができる。
【００３２】
ある特定の他の好適な実施形態では、１つ以上の生物学的活性タンパク質は、サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２などを含んでもよく、これを少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物、例えば、システイン、グルタチオン、メラトニン、および／またはヒスチジンと接触させて、生物学的活性タンパク質と放射線防護化合物との乾燥を同時に進め、それによって実質的に乾燥した放射線防護された混合物を得ることができ、その後、この混合物を放射線滅菌して、実質的に乾燥した放射線滅菌された放射線防護された混合物を得ることができる。
ある特定の好適な実施形態では、１つ以上の生物学的活性分子は、タンパク質、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡのうち１つ以上を含んでもよく、これを少なくとも１つの可溶性放射線防護化合物、例えば、システイン、グルタチオン、メラトニン、および／またはヒスチジンと接触させて、生物学的活性分子と放射線防護化合物との乾燥を同時に進め、それによって実質的に乾燥した放射線防護された混合物を得ることができ、その後、この混合物を放射線滅菌して、実質的に乾燥した放射線滅菌された放射線防護された混合物を得ることができる。
【００３３】
放射線滅菌後、実質的に乾燥した放射線滅菌された放射線防護された混合物を再水和して（例えば、生化学、生物学、および／または免疫学技術の当業者であれば精通しているであろう、水または水性溶媒、例えば、水ベースバッファー中への再懸濁および／または溶解による）、再水和された放射線滅菌された放射線防護された混合物を得ることができる。放射線滅菌後、放射線防護された混合物中の生物学的活性タンパク質の生物学的活性は、放射線防護化合物の不在下で放射線滅菌される生物学的活性タンパク質のコントロール試料の生物学的活性よりも高い（例えば、適当なコントロールに対して統計的に有意に増加する）。本明細書に開示される実施形態は、それによって、予想外にも、放射線滅菌中の放射線障害から、生物学的活性タンパク質の生物学的活性を実質的に防護する。
本開示による好適な放射線防護化合物は、システイン、メラトニン、グルタチオン、およびヒスチジンを含む。ある特定の実施形態では、放射線防護化合物は、放射線防護化合物であるシステイン、メラトニン、グルタチオン、およびヒスチジンのうち１つ、２つ、３つ、または４つすべてを含んでもよく、ある特定の他の実施形態では、放射線防護化合物は、放射線防護化合物であるシステイン、メラトニン、グルタチオン、およびヒスチジンのうち１つ、２つ、３つ、または４つすべてからなってもよい。実地では、これらの化合物の調達、取扱い、保管、および可溶化は、周知であり、公知の方法および下記の実施例を含めた本開示に従って、本方法に容易に適合することができる。本明細書に規定する放射線防護化合物は、本明細書に規定する生物学的活性タンパク質（例えば、マイトジェン、例えば、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ、ＰＷＮ）またはその他の生物学的活性分子の生物学的活性（例えば、マイトジェン活性）を実質的に防護するのに有効な濃度で、本明細書に記載の放射線防護された混合物中に存在してもよい。典型的には、放射線防護化合物は、少なくとも０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ、３．０ｍＭ、４．０ｍＭ、５．０ｍＭ、６．０ｍＭ、７．０ｍＭ、８．０ｍＭ、９．０ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、または４００ｍＭの濃度、およびそれらの中間の任意の濃度で存在してもよい。本明細書で開示される放射線防護化合物の構造は、下記に示す。
【００３４】
理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載の放射線防護化合物の一部は、抗酸化剤および／またはフリーラジカル捕捉剤に特徴的な機能的特性を示し得る。しかしながら、本実施形態は、このような放射線防護化合物が、本来であれば放射線滅菌の結果として生じるであろう生物学的活性の低下から、本明細書に記載の生物学的活性タンパク質またはその他の生物学的活性分子、具体的には、哺乳動物の末梢血リンパ球に対するマイトジェンである本明細書に記載の生物学的活性タンパク質を防護する能力に関して、そのように限定されることを意図しない。
【００３５】
Ｌ−システイン（２−アミノ−３−スルフヒドリルプロパン酸）は下記の構造（Ｉ）を有する。
【化１】
2021524362.tif 000003
[I]
【００３６】
グルタチオン（還元型）（γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシン）は、以下の構造（ＩＩ）を有する。
【化２】
2021524362.tif 000004
[II]
メラトニン（Ｎ−アセチル−５−メトキシトリプタミン）は下記の構造（ＩＩＩ）を有する。
【化３】
2021524362.tif 000005
[III]
【００３７】
ヒスチジンは、下記の構造（ＩＶ）を有する。
【化４】
2021524362.tif 000006
[IV]
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態の実施は、そうでないことが特に示されない限り、当技術の技能の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術における従来の方法を使用することが理解され、これらの方法の多くは、説明の目的で下記に記載される。そのような技術は、文献において、十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY (2009)、Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, New York 1995、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Ed., 2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.), 2nd Ed., 1995, Oxford Univ. Press, UK、Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984) IRL/ Oxford Univ. Press, UK、Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985) IRL/ Oxford Univ. Press, UK、Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984) IRL/ Oxford Univ. Press, UK、Culture of Animal Cells (R. Freshney, 2010) John Wiley & Sons, NY、Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984), John Wiley & Sons, NY、およびその他同様の文献を参照されたい。
【００３９】
免疫化学的アッセイおよび細胞免疫学的アッセイを含む免疫学的アッセイ、ならびに生体試料採取および処理（例えば、血液、リンパ液、唾液、痰、膿、生検など）、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のための標準的技法を使用することができる。免疫化学反応および酵素反応、ならびに精製技法は、市販の試薬を製造業者の指定に従って使用して、または当該技術分野で一般に遂行されるように、または本明細書に記載のように実施することができる。これらおよび関連する技法および手順は、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、また、本明細書の全体を通して引用および考察されているさまざまな概括的およびより特殊な文献に記載されているように、実施することができる。特定の定義が示されない限り、本明細書に記載の分子生物学、細胞および分子免疫学、生化学、統計化学、有機合成化学、ならびに医薬品および製薬化学に関連して使用される用語、ならびにそれらの検査手順および技法は、当該技術分野で周知かつ一般に使用されているものである。組換え技術、分子生物学的および／または細胞もしくは微生物学的方法、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤化、送達、ならびに患者の診断および／または処置のための標準的技法を使用することができる。
【００４０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容からそうでないことが明らかに示されない限り、複数の指示対象を含む。本明細書全体を通して、文脈上そうでないことが要求されない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という語または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含むこと）」などの変化形は、提示される要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を包含することを暗示するものであるが、あらゆる他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を除外することを暗示するものではないことを理解されたい。本明細書中の各実施形態は、そうでないことが明示的に記載されない限り、他のすべての実施形態に準用される。
【００４１】
均等物
説明の目的で、本発明の特定のステップ、要素、実施形態、および応用を本明細書に図示および記載してきたが、当然ながら、本発明は、特に前述の教示に照らして、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者により修正を加えることができることから、それらに限定されないことを理解されたい。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除き、限定されない。
【００４２】
その他の参考文献
Meltz ML, Reiter RJ, Herman TS, Kumar KS (March 1999). "Melatonin and protection from whole-body irradiation: survival studies in mice". Mutat. Res. 425 (1): 21-7. Reiter RJ, Herman TS, Meltz ML (December 1996). "Melatonin and radioprotection from genetic damage: in vivo/in vitro studies with human volunteers". Mutat. Res. 371 (3-4): 221-8. Reiter RJ, Herman TS, Meltz ML (February 1998). "Melatonin reduces gamma radiation-induced primary DNA damage in human blood lymphocytes". Mutat. Res. 397 (2): 203-8. Tan DX, Manchester LC, Terron MP, Flores LJ, Reiter RJ (January 2007). "One molecule, many derivatives: a never-ending interaction of melatonin with reactive oxygen and nitrogen species?". J. Pineal Res. 42 (1): 28-42.
Tan DX, Chen LD, Poeggeler B, Manchester LC, Reiter RJ (1993).  "Melatonin: a potent, endogenous hydroxyl radical scavenger". Endocrine J. 1: 57-60. Pohanka M (2011). "Alzheimer’s disease and related neurodegenerative disorders: implication and counteracting of melatonin". Journal of Applied Biomedicine 9 (4): 185-196. Reiter RJ, Manchester LC, Tan DX (September 2010). "Neurotoxins: free radical mechanisms and melatonin protection". Curr Neuropharmacol 8 (3): 194-210. Poeggeler B, Saarela S, Reiter RJ, Tan DX, Chen LD, Manchester LC, Barlow-Walden LR (November 1994). "Melatonin - a highly potent endogenous radical scavenger and electron donor: new aspects of the oxidation chemistry of this indole accessed in vitro". Ann. N. Y. Acad. Sci. 738: 419-20. Arnao MB, Hernandez-Ruiz J (May 2006). "The physiological function of melatonin in plants". Plant Signal Behav 1 (3): 89-95.Pieri C、Marra M、Moroni F、Recchioni R、Marcheselli F (1994). "Melatonin: a peroxyl radical scavenger more effective than vitamin E". Life Sci. 55 (15): PL271-6.
Wade et al. 1998 J. Nutritional Biochem. 9(6):308-315).
下記の実施例は、説明のために提示されるにすぎず、限定するものではない。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
放射線滅菌からのＰＨＡマイトジェン活性の放射線防護
簡潔に言うと、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢゴールドマイトジェンコントロールアッセイチューブは、製造者（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）から入手し、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｐ）の溶液を標準的な採血チューブの内壁上に噴霧乾燥して製造された。次いで、標準的手順に従って高エネルギー電子ビーム処理（Ｅ−ビーム）を使用した放射線によって、採血チューブを滅菌した。
【００４４】
放射線滅菌した採血チューブ中のＰＨＡの全血試料に対するマイトジェン活性は、製造者の説明書（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）に従ってＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）ＥＬＩＳＡを使用して、採血チューブ中でインキュベートした全血試料からの血漿中のＩＦＮ−γ濃度を判定することによって評価した。１つの代表的実験の結果を表１に示す。電子ビーム（例えば、Ｅ−ビーム）処理またはγ照射のいずれかによって採血チューブ上の噴霧乾燥ＰＨＡを放射線滅菌することによって、全血試料によるＩＦＮ−γ放出を誘導する採血チューブの能力についてテストしたときの、採血チューブのマイトジェン効力が劇的に減じられた。標準的なＥ−ビーム処理は、噴霧乾燥ＰＨＡのマイトジェン活性をコントロールレベルの約５５％まで減少させた。ＰＨＡマイトジェン活性は、２回の放射線滅菌（２×Ｅ−ビーム）後にはより一層低下した。この活性損失は、放射線量の増加と比例していた（表１）。
【００４５】
【表１】
2021524362.tif 000007
【００４６】
これらの結果は、放射線滅菌を受けていないチューブのＰＨＡマイトジェン活性レベルにより近いＰＨＡマイトジェン活性レベルを有する放射線滅菌済みチューブを提供するためには、各チューブ上にＰＨＡを増量して噴霧乾燥させなければならないことを示唆した。
したがって、候補放射線防護化合物を、ＰＨＡマイトジェン活性に対するそれらの効果について選択および選別した。最初の選択として、放射線滅菌前でも、噴霧乾燥ＰＨＡ製剤に含めたときに、単独ではマイトジェン活性を有意に変更しない（例えば、適当なコントロールに対して、統計的に有意に増加または減少させない）、候補放射線防護化合物を特定した。表２に示すように、候補放射線防護化合物のシステイン５０ｍＭまたは候補放射線防護化合物のメラトニン１０ｍＭを含有するＰＨＡ−Ｐ製剤は、未補充ＰＨＡ調製物に相当するＰＨＡマイトジェン活性を示した。
【００４７】
【表２】
2021524362.tif 000008
【００４８】
次に、ＰＨＡマイトジェン活性に干渉しなかった候補放射線防護化合物を、放射線滅菌中のマイトジェン活性損失からＰＨＡを防護するそれらの能力についてテストした。ＰＨＡ液体製剤にＬ−システイン、還元型グルタチオン、またはメラトニンを最終濃度５．０ｍＭまで添加することにより、８．３ｋＧｙ、１６．７ｋＧｙ、および２５ｋＧｙのＥ−ビームでの放射線滅菌処理後、ＰＨＡマイトジェン活性損失が一部防止された（表３）。いずれの候補放射線防護化合物も含まないＰＨＡ液体製剤（表３、「コントロール」）は、８．３ｋＧｙでの放射線滅菌処理後、そのマイトジェン活性の１１％しか有さなかった。これと比較して、Ｌ−システイン、還元型グルタチオン、またはメラトニンを含む噴霧乾燥ＰＨＡ製剤は、８．３ｋＧｙでの同じ線量の放射線滅菌処理後に、コントロールレベルのマイトジェン活性のそれぞれ６８％、５３％、および５３％を示し、したがって、実質的に防護されたマイトジェン活性を保持した。
【００４９】
【表３】
2021524362.tif 000009
【００５０】
本明細書で特定される防護化合物を含有する液体ＰＨＡ製剤もまた、より高線量での放射線滅菌後、すなわち、１６．７ｋＧｙおよび２５ｋＧｙのＥ−ビーム処理後に、ＰＨＡマイトジェン活性を実質的に防護する能力を示した。
Ｌ−システインおよびメラトニンの線量−効果防護能をさらに評価した。Ｌ−システインをＰＨＡ−Ｐ製剤に１．０〜５０ｍＭまで溶解させた。水溶性が低いため、まず、１００％エチルアルコール中で２００ｍＭのメラトニン原液を調製した。次に、これらの原料をＰＨＡ−Ｐ製剤に添加して、最終濃度０．２〜１０ｍＭにした。Ｅ−ビーム処理後、ＰＨＡ−Ｐ製剤の効力を全血試料でテストし、製造者の説明書に従ってＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）ＥＬＩＳＡ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）を使用して、マイトジェン活性を判定した。
図１に結果をまとめる。ＰＨＡ−Ｐ製剤中のＬ−システインの濃度を１．０ｍＭから１０ｍＭに増加することにより、その２５ｋＧｙでのＰＨＡマイトジェン活性の放射線防護は、ＰＨＡコントロール製剤（添加剤として放射線防護化合物を含有せず、放射線滅菌処理に供していないもの）のマイトジェン活性レベルの５．９％から３８％に増強された。
【００５１】
採血チューブ中の噴霧乾燥ＰＨＡの放射線滅菌に起因するＰＨＡマイトジェン効力損失を減少させる能力について、Ｌ−システインをさらにテストした。噴霧乾燥ＰＨＡを含有する採血チューブ（噴霧乾燥ステップにおける放射線防護化合物なし）を放射線滅菌に供し、全血試料に対するＰＨＡマイトジェン活性を上述のようにテストした。システイン（５ｍＭ）が噴霧乾燥ＰＨＡ製剤中に存在するが、チューブが放射線滅菌を受けていない場合、全血試料に対するＰＨＡマイトジェン応答は、コントロール（放射線防護なし、放射線滅菌なし）レベルの平均９４．８％（図２、左棒）であり、システインが非滅菌マイトジェンチューブでマイトジェン応答を変更しないことを示した。放射線滅菌ステップは、ＰＨＡマイトジェン活性をコントロール（放射線防護なし、放射線滅菌なし）レベルの５６％に減少させた（図２、中央棒）。システイン（５ｍＭ）が噴霧乾燥ＰＨＡ製剤中に存在し、チューブを放射線滅菌に供した場合、全血試料に対するＰＨＡマイトジェン応答は、コントロール（放射線防護なし、放射線滅菌なし）レベルの５６％（システインなし）から７２％（５ｍＭ  ｃｙｓ）に増加した（図２、右棒）。
【００５２】
（実施例２）
ＰＨＡマイトジェン活性の放射線防護体防護の保管安定性
マイトジェン（噴霧乾燥ＰＨＡ）チューブは、実施例１に記載のように製造および放射線滅菌し、システインを添加していないＰＨＡ調製物とシステイン５．０ｍＭを含有するＰＨＡ調製物とを比較した。噴霧乾燥ＰＨＡのマイトジェン活性に対する、システインの放射線防護効果の長期保管安定性も評価した。
噴霧乾燥および放射線滅菌後、チューブをさまざまな期間保存してから、前述のようにマイトジェン活性についてテストした。最初の試験時点（製造後、１か月以内）で、システインを含まずに作成されたマイトジェン含有チューブは、システインを含んで製造されたものと同様のレベルのマイトジェン活性を有した（図３）。しかしながら、製造後８か月超にわたるその後の時点でテストでは、システインを含有するチューブが、システインを含まずに製造されたチューブよりも比較的高いレベルのマイトジェン活性を保持することが示された。
【００５３】
（実施例３）
放射線滅菌からの抗ＣＤ３抗体Ｔ細胞刺激活性の放射線防護
本例は、放射線滅菌の作用から生物学的活性抗体の活性を防護するための、本明細書に記載の放射線防護化合物の使用について説明する。本例では、材料および方法は、本明細書において別段に指定のない限り、本質的に実施例１および２において前述のとおりである。
抗ＣＤ３抗体試料をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に溶解させ、濃度６６．７μｇ／ｍＬまで希釈してから、１０ｍＭのシステイン（Ｃｙｓ）または３ｍＭのグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）の存在下または不在下で、さまざまな線量のＥ−ビーム照射に曝露した。ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）（ＱＦＮ）Ｎｉｌチューブ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）中で全血１ｍＬ当たり抗ＣＤ３抗体を０．１０μｇを使用して、無作為に選択されたドナー６名の群から取得したヒト全血試料中に存在するＴ細胞によるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）分泌を誘導する能力を判定することによって、処理後の抗体試料のＴ細胞刺激活性についてテストした。ＱＦＮ  Ｎｉｌチューブ中で全血試料を抗ＣＤ３抗体と共にインキュベーションした後、血液処理、血漿回収、および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるＩＦＮ−γ検出をＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢゴールドプラス添付文書（ＱＦＮ−ＴＢゴールドプラス、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）に記載の製造者の説明書に従って実施したが、ただし、血漿試料は、８点標準曲線をテストする直前に、ＥＬＩＳＡキットＧｒｅｅｎ  Ｄｉｌｕｅｎｔに１対１０で希釈した。
【００５４】
機能的抗ＣＤ３抗体は、全血培養物中のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌を誘導するＴ細胞応答を引き出すことができる。Ｅ−ビーム照射中に１０ｍＭのシステインまたは３．０ｍＭのＧ−ＳＨにより防護された抗ＣＤ３抗体によって全血試料中で引き出されるＩＦＮγ応答の代表的結果を防護されていないコントロール試料（未補充ＤＰＢＳ中で照射）と比較して、図４に示す。線量８．３ｋＧｙ以上でのＥ−ビーム処理は、抗ＣＤ３抗体をＤＰＢＳのみの中で照射したとき（白丸）、この抗体の活性（ｙ軸の群平均ＩＦＮ−γ応答、図４）を完全に無効にした。対照的に、１０ｍＭのシステイン（Ｃｙｓ、黒四角）または３．０ｍＭのＧ−ＳＨ（黒丸）のいずれかも含有するＤＰＢＳ中で照射したＥ−ビーム処理抗ＣＤ３抗体試料は、最大２５ｋＧｙのＥ−ビーム線量でも刺激活性を維持した（図４）。したがって、ＣｙｓおよびＧ−ＳＨはどちらも、Ｅ−ビーム放射線で処理した抗ＣＤ３抗体の活性を明らかに防護した。
２５ｋＧｙのＥ−ビーム照射で処理された抗体試料における、ＣｙｓおよびＧ−ＳＨの両放射線防護体により付与される、抗ＣＤ３活性に対する防護効果は、Ｃｙｓ（黒丸）およびＧ−ＳＨ（黒四角）の双方において、１．０ｍＭから１０ｍＭまでの線量依存的増加を示した（図５）。
【００５５】
（実施例４）
放射線滅菌からのＲ８４８（レシキモド）ＴＬＲアゴニスト活性の放射線防護
本例は、放射線滅菌の作用からイミダゾキノリン免疫応答修飾物質（Ｒ８４８）のＴＬＲアゴニスト活性を防護するための、本明細書に記載の放射線防護化合物の使用について説明する。本例では、材料および方法は、本明細書において別段に指定のない限り、本質的に実施例１〜３において前述のとおりである。
Ｒ８４８（レシキモド、ＣＡＳ  １４４８７５−４８−９）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による生物学的反応を刺激することができるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストであり、その活性は、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）Ｎｉｌチューブ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）ＱＦＮ全血培養系で測定することができる。Ｒ８４８試料をＤＰＢＳに濃度６６．７μｇ／ｍＬで溶解させ、１０ｍＭのＣｙｓまたは３ｍＭのＧ−ＳＨの存在下または不在下で、さまざまな線量のＥ−ビーム照射で処理した。ＱＦＮ  Ｎｉｌチューブ中で全血１ｍＬ当たりＲ８４８を１．０μｇ使用して、無作為に選択されたドナー６名の群から採取したヒト全血試料中に存在する白血球に対する、処理後のＲ８４８試料の生物学的活性（インビトロインキュベーション中にＩＦＮγ放出を引き出す能力）についてテストした。ＱＦＮチューブ中でＲ８４８試料と共にインキュベーションした後、全血試料処理、血漿回収、およびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡをＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢゴールドプラス添付文書（ＱＦＮ−ＴＢゴールドプラス、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）に従って実施したが、ただし、血漿試料は、８点標準曲線をテストする直前に、ＥＬＩＳＡキットＧｒｅｅｎ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：１０に希釈した。
【００５６】
１０ｍＭのＣｙｓまたは３．０ｍＭのＧ−ＳＨの存在下で照射したＲ８４８試料に付与された放射線防護効果を示す代表的結果をビヒクルコントロール（ＤＰＢＳ）中で照射したＲ８４８と比較して、図６に示す。線量８．３ｋＧｙ以上でのＥ−ビーム処理は、ＤＰＢＳのみの中で調製したＲ８４８（白丸）の活性（ｙ軸の群平均ＩＦＮ−γ応答、図６）を完全に無効にした。対照的に、１０ｍＭのＣｙｓ（黒四角）または３．０ｍＭのＧ−ＳＨ（黒丸）のいずれかを含有するＥ−ビーム処理Ｒ８４８試料は、Ｒ８４８の刺激活性を保持した。
２５ｋＧｙのＥ−ビームで処理された試料における、ＣｙｓおよびＧ−ＳＨのＲ８４８活性に対する防護効果は、Ｃｙｓ（黒丸）およびＧ−ＳＨ（黒四角）の双方において、１．０ｍＭから１０ｍＭまでの線量依存的増加を示した（図７）。
【００５７】
（実施例５）
放射線滅菌からの抗ＣＤ３抗体Ｔ細胞刺激活性とＲ８４８（レシキモド）ＴＬＲアゴニスト活性との組み合わせの放射線防護
本例は、放射線滅菌の作用から、生物学的活性抗体とイミダゾキノリンＴＬＲアゴニスト免疫応答修飾物質（Ｒ８４８）との活性の組み合わせを防護するための、本明細書に記載の放射線防護化合物の使用について説明する。本例では、材料および方法は、本明細書において別段に指定のない限り、本質的に実施例１〜４において前述のとおりである。
同量の抗ＣＤ３とＲ８４８との組み合わせである、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）Ｍｏｎｉｔｏｒ（ＱＦＭ）試薬（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）を、ＤＰＢＳに濃度３３．５μｇ／ｍＬで溶解させ、１０ｍＭのシステイン（Ｃｙｓ）または３ｍＭのグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）の存在下または不在下で、さまざまな線量のＥ−ビーム照射で処理した。ＱＦＮ  Ｎｉｌチューブ中で全血１ｍＬ当たりＱＦＭを０．０５μｇ使用して、無作為に選択されたドナー６名の群から採取したヒト全血試料中に存在する白血球に対する、処理後の試料の生物学的活性（インビトロインキュベーション中にＩＦＮγ放出を引き出す能力）についてテストした。ＱＦＮチューブ中でＱＦＭ試料と共にインキュベーションした後、全血試料処理、血漿回収、およびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡをＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢゴールドプラス添付文書（ＱＦＮ−ＴＢゴールドプラス、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）に従って実施したが、ただし、血漿試料は、８点標準曲線をテストする直前に、ＥＬＩＳＡキットＧｒｅｅｎ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：１０に希釈した。
【００５８】
１０ｍＭのＣｙｓまたは３．０ｍＭのＧ−ＳＨの存在下で照射したＱＦＭ試料に付与された放射線防護効果を示す代表的結果をコントロール（ＤＰＢＳ）と比較して、図８に示す。線量８．３ｋＧｙ以上でのＥ−ビーム処理は、未補充ＤＰＢＳのみの中で調製した刺激性の抗ＣＤ３／Ｒ８４８の組合せ（白丸）の活性（ｙ軸の群平均ＩＦＮ−γ応答、図８）を完全に無効にした。対照的に、抗ＣＤ３およびＲ８４８の刺激活性は、１０ｍＭのＣｙｓ（黒四角）または３．０ｍＭのＧ−ＳＨ（黒丸）のいずれかを含有するＰＢＳＤ中でＥ−ビーム照射した放射線防護体含有試料中では維持された。
２５ｋＧｙのＥ−ビームで処理された試料における、抗ＣＤ３とＲ８４８との活性の組み合わせに対する、ＣｙｓおよびＧ−ＳＨの防護効果は、Ｃｙｓ（黒丸）およびＧ−ＳＨ（黒四角）の双方において、１．０ｍＭから１０ｍＭまでの線量依存的増加を示した（図９）。
【００５９】
（実施例６）
放射線滅菌からのポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）マイトジェン活性の放射線防護
本例は、放射線滅菌の作用から生物学的活性レクチンの活性を防護するための、本明細書に記載の放射線防護化合物の使用について説明する。本例では、材料および方法は、本明細書において別段に指定のない限り、本質的に実施例１〜５において前述のとおりである。
ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）試料をＤＰＢＳに濃度３３．３μｇ／ｍＬで溶解させ、１０ｍＭのシステイン（Ｃｙｓ）または３ｍＭのグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）の存在下または不在下でさまざまな線量のＥ−ビーム照射で処理した。ＱＦＮ  Ｎｉｌチューブ中で全血１ｍＬ当たりＰＷＭを１．０μｇ使用して、無作為に選択されたドナー６名の群から採取したヒト全血試料中に存在する白血球に対する、処理後のＰＷＭ試料の生物学的活性（インビトロインキュベーション中にＩＦＮγ放出を引き出す能力）をテストした。ＱＦＮチューブ中でＰＷＭ試料と共にインキュベーションした後、全血試料処理、血漿回収、およびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡをＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢゴールドプラス添付文書（ＱＦＮ−ＴＢゴールドプラス、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）に従って実施したが、ただし、血漿試料は、８点標準曲線をテストする直前に、ＥＬＩＳＡキットＧｒｅｅｎ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：１０に希釈した。
【００６０】
１０ｍＭのＣｙｓまたは３．０ｍＭのＧ−ＳＨの存在下で照射したＰＷＭ試料に付与された放射線防護効果を示す代表的結果をコントロール（ＤＰＢＳ）と比較して、図１０に示す。線量８．３ｋＧｙ以上でのＥ−ビーム処理は、未補充ＤＰＢＳのみの中で調製および照射したコントロールＰＷＭ試料（白丸）の活性（ｙ軸の群平均ＩＦＮ−γ応答、図１０）を完全に無効にした。対照的に、ＰＷＭの刺激活性は、１０ｍＭのＣｙｓ（黒四角）または３．０ｍＭのＧ−ＳＨ（黒丸）のいずれかを含有するＰＢＳＤ中でＥ−ビーム照射した放射線防護体含有試料中では維持された。
２５ｋＧｙのＥ−ビームで処理された試料における、ＣｙｓおよびＧ−ＳＨのＰＷＭ活性に対する防護効果は、Ｃｙｓ（黒丸）およびＧ−ＳＨ（黒四角）の双方において、１．０ｍＭから１０ｍＭまでの線量依存的増加を示した（図１１）。
【００６１】
（実施例７）
放射線滅菌からのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）マイトジェン活性の放射線防護
本例は、放射線滅菌の作用から生物学的活性レクチンの活性を防護するための、本明細書に記載の放射線防護化合物の使用について説明する。本例では、材料および方法は、本明細書において別段に指定のない限り、本質的に実施例１〜６において前述のとおりである。
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）は、Ｔ−リンパ球を活性化させるレクチンとして知られている。ＣｏｎＡ試料をＤＰＢＳに濃度３３３３μｇ／ｍＬで溶解させ、１０ｍＭのシステイン（Ｃｙｓ）または３ｍＭのグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）の存在下または不在下でさまざまな線量のＥ−ビーム照射で処理した。
ＱＦＮ  Ｎｉｌチューブ中で全血１ｍＬ当たりＣｏｎＡを１００μｇ使用して、無作為に選択されたドナー６名の群から採取したヒト全血試料中に存在する白血球に対する、処理後のＣｏｎＡ試料の生物学的活性（インビトロインキュベーション中にＩＦＮγ放出を引き出す能力）についてテストした。ＱＦＮチューブ中でＣｏｎＡ試料と共にインキュベーションした後、全血試料処理、血漿回収、およびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡをＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢゴールドプラス添付文書（ＱＦＮ−ＴＢゴールドプラス、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ジャーマンタウン）に従って実施したが、ただし、血漿試料は、８点標準曲線をテストする直前に、ＥＬＩＳＡキットＧｒｅｅｎ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：１０に希釈した。
【００６２】
１０ｍＭのＣｙｓまたは３．０ｍＭのＧ−ＳＨの存在下で照射したＣｏｎＡ試料に付与された放射線防護効果を示す代表的結果をコントロール（ＤＰＢＳ）と比較して、図１２に示す。線量８．３ｋＧｙ以上でのＥ−ビーム処理は、未補充ＤＰＢＳのみの中で調製および照射したコントロールＣｏｎＡ試料（白丸）の活性（ｙ軸の群平均ＩＦＮ−γ応答、図１２）を完全に無効にした。対照的に、ＣｏｎＡの刺激活性は、１０ｍＭのＣｙｓ（黒四角）または３．０ｍＭのＧ−ＳＨ（黒丸）のいずれかを含有するＰＢＳＤ中でＥ−ビーム照射した放射線防護体含有試料中では維持された。
２５ｋＧｙのＥ−ビームで処理された試料における、ＣｙｓおよびＧ−ＳＨのＣｏｎＡ活性に対する防護効果は、Ｃｙｓ（黒丸）およびＧ−ＳＨ（黒四角）の双方において、１．０ｍＭから１０ｍＭまでの線量依存的増加を示した（図１３）。
【００６３】
上述のさまざまな実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。２０１８年５月１８日に出願された米国仮特許第６２／６７３，６７１号を含め、本明細書において言及される、および／または出願データシートに記載される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許出版物はすべて、参照により全体として本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要であれば、これらのさまざまな特許、出願、および出版物の概念を利用するために修正して、またさらなる実施形態を提供することができる。
【００６４】
上記の詳細な説明を踏まえて、実施形態にこれらおよびその他の変更を行なってもよい。一般に、添付の特許請求の範囲では、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定するものと解釈すべきではなく、そのような特許請求の範囲に権利が与えられるすべての範囲の均等物に加え、可能な実施形態すべてを含むものと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示によって制限されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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