(57)【要約】  本明細書において、少なくとも第１の成分核酸分子および第２の成分核酸分子から識別子核酸分子をアセンブルすることによってデジタル情報を記憶するためのシステムおよび方法を提供する。システムは、基板の座標上に第１の成分核酸分子を含む第１の溶液の第１の液滴を吐出するように構成された第１のプリントヘッドと、第１および第２の成分核酸分子が基板上でコロケートされるように、基板の座標上に第２の成分核酸分子を含む第２の溶液の第２の液滴を吐出するように構成された第２のプリントヘッドとを含み得る。システムは、第１および第２の成分核酸分子を物理的に連結するように基板の座標上に反応ミックスを吐出するか、第１および第２の成分核酸分子を物理的に連結するために必要な条件を提供するか、またはその両方であるフィニッシャーを含み得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第１の成分核酸分子および第２の成分核酸分子から識別子核酸分子をアセンブルすることによってデジタル情報を記憶するためのシステムであって、
（ａ）基板の座標上に前記第１の成分核酸分子を含む第１の溶液の第１の液滴を吐出するように構成された第１のプリントヘッドと、
（ｂ）前記第１および第２の成分核酸分子が前記基板上で並べられるように、前記基板の前記座標上に前記第２の成分核酸分子を含む第２の溶液の第２の液滴を吐出するように構成された第２のプリントヘッドと、
（ｃ）前記第１および第２の成分核酸分子を物理的に連結するように前記基板の前記座標上に反応ミックスを吐出するか、前記第１および第２の成分核酸分子を物理的に連結するために必要な条件を提供するか、またはその両方であるフィニッシャーと
を含むシステム。
【請求項２】
前記識別子核酸分子が、記号列において記号位置および記号値を表すように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記フィニッシャーが、前記基板の前記座標上に前記反応ミックスを吐出するように構成された第３のプリントヘッドを含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４】
前記フィニッシャーが、インキュベーター、プーリングシステム、またはその両方をさらに含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記フィニッシャーが、前記第１のプリントヘッドが前記第１の液滴を前記座標上に吐出する前に、前記第２のプリントヘッドが前記第２の液滴を前記座標上に吐出する前に、またはその両方で前記座標上に前記反応ミックスを吐出する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
前記基板を、前記第１のプリントヘッド、前記第２のプリントヘッド、および前記フィニッシャーを超えて移動させる少なくとも１つのローラーをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
前記少なくとも１つのローラーが、前記基板の線形の移動を提供する、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記少なくとも１つのローラーが、一定速度での前記基板の前記線形の移動を達成するリール・トゥ・リールシステムの一部である、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記基板が、連続する材料ループを形成し、前記少なくとも１つのローラーが、前記基板の前記座標に前記第１のプリントヘッド、前記第２のプリントヘッド、および前記フィニッシャーを複数回通過させるローラーのセットの一部である、請求項６に記載のシステム。
【請求項１０】
前記基板が、前記第１の液滴、第２の液滴、および反応ミックスが吐出される第１の表面、ならびに前記第１の表面とは反対側の第２の表面を有し、前記少なくとも１つのローラーが前記第２の表面に接触するが、前記第１の表面には接触しない、請求項６〜９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１１】
少なくとも１つの谷を含む第２のローラーをさらに含み、前記少なくとも１つの谷が前記座標と位置揃えするように、前記第２のローラーが前記第１の表面に接触する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
第２のローラーをさらに含み、前記第２のローラーが前記第２の表面に接触するが、前記第１の表面には接触しないように、前記基板が、前記少なくとも１つのローラーと前記第２のローラーとの間で１８０度回転するか、またはらせん軌道にある、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
前記座標が、前記基板上の他の座標から１マイクロメートルから２００マイクロメートルの間の直径または間隔を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第１および第２の液滴が各々、１ｐＬから５０ｐＬの間の体積を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記基板の座標と前記第１および第２のプリントヘッドとの間のアライメントを維持するために、前記基板の動きをリアルタイムで追跡するレジスターをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記第１および第２の溶液が色素を組み入れ、前記システムが、前記第１および第２の液滴の適切な吐出を確認するカメラを含むスポットイメージャーをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記基板上の前記第１および第２の液滴を乾燥させるスポットドライヤーをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記第１のプリントヘッドが、前記基板の異なる座標で前記第１の溶液の液滴を吐出する第１の複数のノズルを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記第１のプリントヘッドが、前記基板の異なる座標で第３の溶液の液滴を吐出する第２の複数のノズルをさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記基板をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２１】
前記基板が低結合性プラスチックを含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記基板が、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）またはポリプロピレンを含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記第１および第２のプリントヘッドが、前記基板の動きと比較してある角度でシステム内に搭載され、前記角度が前記座標上でのオーバープリントを可能にする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２４】
前記第１のプリントヘッドが、ＭＥＭＳ薄膜ピエゾ方式インクジェットヘッドまたはＭＥＭＳサーマル方式インクジェットヘッドである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２５】
前記第１および第２のプリントヘッドが、同じトラックに沿って位置して前記座標上に液滴を吐出し、前記システムが、対応するトラックにおける別の座標上に液滴を吐出するために少なくとも１つの追加のトラックに沿って位置する追加のプリントヘッドをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２６】
前記フィニッシャーが、反応のインキュベーションにとって最適な固定された内部温度を有する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２７】
前記フィニッシャーが、インキュベーションの間、前記反応ミックスの蒸発を制御する固定された湿度レベルを有する、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記フィニッシャーが、濃縮を防止するためにインキュベーション前に前記基板を加熱するヒーターを含む、請求項２５または２６に記載のシステム。
【請求項２９】
前記フィニッシャーが、前記基板上の異なる座標からの複数の反応物を容器に統合するプーリングシステムを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３０】
前記フィニッシャーが、統合前に前記基板の前記座標上に反応阻害剤を吐出する、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記容器が、反応阻害剤を含むプーリング溶液を含有する、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３２】
前記反応阻害剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項３０〜３１のいずれかに記載のシステム。
【請求項３３】
前記基板上の異なる座標から回収した液体から核酸を捕捉する膜をさらに含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３４】
前記基板から核酸を取り出すスクレイパーをさらに含む、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３５】
異なる座標からの前記複数の反応物が、プールされた後に前記複数の反応物がその内容物を維持することを可能にするエマルションに共にプールされる、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３６】
前記基板が、非混和性の液体またはオイルによってコーティングされる、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記座標上にオイルを吐出するオイルディスペンサーをさらに含む、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３８】
前記基板が、前記第１および第２の成分核酸分子に結合するビーズによってコーティングされるか、またはパターン形成される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３９】
前記座標上にビーズを吐出するビーズディスペンサーをさらに含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４０】
前記反応ミックスがリガーゼを含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４１】
前記第１の溶液、前記第２の溶液、および前記反応ミックスのうちの少なくとも１つが添加剤を含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記添加剤が、前記第１の溶液と前記第１のプリントヘッド、前記第２の溶液と前記第２のプリントヘッド、または前記反応ミックスと前記フィニッシャーとの間の適合性を可能にするように構成される、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記添加剤が、前記第１の溶液、前記第２の溶液、または前記反応ミックスの蒸発を軽減する、請求項４１〜４２のいずれかに記載のシステム。
【請求項４４】
前記添加剤が、湿潤剤、界面活性剤、および殺生物剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４５】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載のシステムを操作するための指示を実行するように構成されたコンピュータプロセッサをさらに含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４６】
核酸分子をアセンブルするためのシステムであって、
（ａ）基板の座標上に第１の成分核酸分子を含む第１の溶液の第１の液滴を吐出するように構成された第１のプリントヘッドと、
（ｂ）前記第１および第２の成分核酸分子が前記基板上でコロケートされるように、前記基板の前記座標上に前記第２の成分核酸分子を含む第２の溶液の第２の液滴を吐出するように構成された第２のプリントヘッドと、
（ｃ）前記第１および第２の成分核酸分子を物理的に連結するように前記基板の前記座標上に反応ミックスを吐出するか、前記第１および第２の成分核酸分子を物理的に連結するために必要な条件を提供するか、またはその両方であるフィニッシャーとを含むシステム。
【請求項４７】
前記フィニッシャーが、前記基板の前記座標上に前記反応ミックスを吐出するように構成された第３のプリントヘッドを含む、請求項４６に記載のシステム。
【請求項４８】
前記フィニッシャーが、インキュベーター、プーリングシステム、または両方をさらに含む、請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
前記フィニッシャーが、前記第１のプリントヘッドが前記第１の液滴を前記座標上に吐出する前に、前記第２のプリントヘッドが前記第２の液滴を前記座標上に吐出する前に、またはその両方で前記座標上に前記反応ミックスを吐出する、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５０】
前記アセンブルされた核酸が、遺伝子コードＤＮＡ、ペプチドコードＤＮＡ、またはＲＮＡコードＤＮＡを含む、請求項４６に記載のシステム。
【請求項５１】
前記アセンブルされた核酸が、ＤＮＡアプタマーライブラリーを含む、請求項４６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「ＰＲＩＮＴＥＲ−ＦＩＮＩＳＨＥＲ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＦＯＲ  ＤＡＴＡ  ＳＴＯＲＡＧＥ  ＩＮ  ＤＮＡ」と題する、２０１８年５月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／６７２，５００号；「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ−ＢＡＳＥＤ  ＤＡＴＡ  ＳＴＯＲＡＧＥ」と題する２０１８年５月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／６７２，４９５号；および「ＳＹＳＴＥＭ  ＦＯＲ  ＤＡＴＡ  ＳＴＯＲＡＧＥ  ＩＮ  ＤＮＡ」と題する、２０１９年２月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／８０９，８７０号の優先権および恩典を主張する。上記で参照した出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
核酸デジタルデータ記憶は、情報を符号化し、長期間にわたって記憶するための安定した手法であり、データは、磁気テープまたはハードドライブ記憶システムよりも高い密度で記憶される。加えて、低温および乾燥条件で保管される核酸分子に記憶されたデジタルデータを、６０，０００年もの年数またはそれより長い年数を経た後に取得することができる。
【０００３】
核酸分子に記憶されたデジタルデータにアクセスするために、核酸分子をシークエンシングすることができる。しかるが故に、核酸デジタルデータ記憶は、長期間にわたって記憶またはアーカイブされる大量の情報を有し得るが稀にしかアクセスされないデータを記憶させるための理想的な方法であり得る。
【０００４】
現行の方法は、配列内の塩基間の関係をデジタル情報（例えば、２進コード）に直接変換するような、塩基毎の核酸配列へのデジタル情報（例えば、２進コード）の符号化に依拠する。デジタル符号化された情報のビットストリームまたはバイトに読み込むことができる、塩基毎の配列に記憶されたデジタルデータのシークエンシングは、エラーを起こしやすい可能性があり、塩基毎のデノボ核酸合成の費用が高価であり得るため符号化費用が嵩み得る。核酸デジタルデータ記憶を実施する新規方法の機会は、あまり費用が嵩まず、商業的インプリメンテーションがより容易である、データの符号化および取得のための手法を提供し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示のシステム、アセンブリ、および方法は、一般的にデジタル情報を記憶するＤＮＡ分子の創出に関する。例えば、成分核酸分子（例えば、成分）を選択し、ウェビングなどの基板材料上に個々に吐出する。成分は、同一場所に位置するように基板上の同じ位置（例えば、座標）に印刷または吐出される。成分は、自己アセンブルするように、または別のやり方で既定の順序で選別し、識別子核酸分子（例えば、識別子）を形成するように構成される。各識別子は、記号列（例えばビットストリーム）における特定の記号（例えば、ビットまたは一連のビット）またはその記号位置（例えば、ランクまたはアドレス）に対応する。成分をアセンブルするために、システムは、同じ位置に反応ミックスを印刷または吐出し、それによって成分を位置揃えして識別子を形成することができる。あるいはまたは加えて、システムは成分を位置揃えする特定の温度などの、成分を物理的に連結させるために必要な条件を提供することができる。形成後、複数の識別子を、記号列全体の少なくとも一部を表す識別子のプールに組み合わせることができる。
【０００６】
本明細書において、少なくとも第１の成分核酸分子および第２の成分核酸分子から識別子核酸分子をアセンブルすることによってデジタル情報を記憶するためのシステムおよびアセンブリを提供する。システムは、（ａ）基板の座標上に第１の成分核酸分子を含む第１の溶液の第１の液滴を吐出するように構成された第１のプリントヘッドと、（ｂ）第１および第２の成分核酸分子が基板上でコロケートされるように、基板の座標上に第２の成分核酸分子を含む第２の溶液の第２の液滴を吐出するように構成された第２のプリントヘッドと、（ｃ）第１および第２の成分核酸分子を物理的に連結するように基板の座標上に反応ミックスを吐出するか、第１および第２の成分核酸分子を物理的に連結するために必要な条件を提供するか、またはその両方であるフィニッシャーとを含み得る。一般的に、第１および第２のプリントヘッドは、様々な成分を印刷または吐出する任意の数のプリントヘッドの列および対応するノズルを含むシステムの一部であり得る。
【０００７】
一部のインプリメンテーションでは、識別子核酸分子は、記号列における記号位置および記号値を表す。例えば、列における各記号は、対応する記号位置を表す対応する識別子を有し得る。特に、識別子は、対応する記号値が１である場合に創出され得るが、０値を有する記号を表す識別子は創出されない。列における記号の全ての識別子が創出される場合、プール内の特定の識別子の存在が、対応する記号位置に関して１の値を表すが、プール内の特定の識別子の非存在が、対応する記号位置の０の値を表すように、列の識別子分子をプール内で組み合わせることができる。対応する記号値が０である場合に識別子が創出されるが、１の値を有する記号を表す識別子が創出されない、代替アプローチをとってもよい。一部のインプリメンテーションでは、フィニッシャーは、基板の座標上に反応ミックスを吐出するように構成される第３のプリントヘッドを含む。フィニッシャーは、インキュベーター、プーリングシステム、またはその両方をさらに含み得る。インキュベーターは、成分をアセンブルして識別子核酸分子を形成するために、反応を進行させるために必要な特定の温度条件または条件のセットを提供し得る。以下に、プーリングシステムを考察する。
【０００８】
一部のインプリメンテーションでは、フィニッシャーは、第１のプリントヘッドが座標上に第１の液滴を吐出する前に、第２のプリントヘッドが座標上に第２の液滴を吐出する前に、またはその両方で座標上に反応ミックスを吐出する。一般的に、フィニッシャーは、任意の時間で、任意の液滴が吐出される前、第１の液滴が吐出された後であるが、最後の液滴が吐出される前、または全ての液滴が吐出された後に、座標上に反応ミックスを吐出してもよい。
【０００９】
一部のインプリメンテーションでは、システムは、第１のプリントヘッド、第２のプリントヘッド、およびフィニッシャーを超えて基板を移動させる少なくとも１つのローラーを含む。一部のインプリメンテーションでは、ローラーは、基板の線形の移動を提供する。一般的に、ローラーは、第１および第２のプリントヘッドならびにフィニッシャーの各々を１回限りまたは複数回通過し得る、基板の二次元または三次元の移動を提供してもよい。一部のインプリメンテーションでは、ローラーは、一定速度での基板の線形の移動を達成するリール・トゥ・リールシステムの一部である。
【００１０】
一部のインプリメンテーションでは、基板は、連続する材料ループを形成し、少なくとも１つのローラーは、基板の座標上に、第１のプリントヘッド、第２のプリントヘッド、およびフィニッシャーを複数回通過させるローラーのセットの一部である。一般的に、基板上に吐出される材料の任意のこすれまたは起こり得る汚れを防止するために、少なくとも１つのローラーが基板上のいずれの座標にも接触しないようにシステムを構成することが望ましいであろう。特に、基板は、第１の液滴、第２の液滴、および反応ミックスが吐出される第１の表面、ならびに第１の表面とは反対側の第２の表面を有し、少なくとも１つのローラーは、第２の表面に接触するが第１の表面には接触しない。あるいは、たとえローラーの少なくとも１つが第１の表面に接触しても、ローラーは、材料が吐出される座標のいずれかに接触することを回避するように溝を有し得る。
【００１１】
一部のインプリメンテーションでは、システムは、少なくとも１つの谷を含む第２のローラーを含み、第２のローラーは、少なくとも１つの谷が座標と位置揃えするように、第１の表面に接触する。一部のインプリメンテーションでは、システムは、第２のローラーが第２の表面に接触し、第１の表面に接触しないように、基板が、少なくとも１つのローラーと第２のローラーとの間で１８０度回転するか、またはらせん軌道にある、第２のローラーを含む。
【００１２】
一部のインプリメンテーションでは、座標は、基板上の他の座標から１マイクロメートルから２００マイクロメートルの間の直径または間隔を有する。一部のインプリメンテーションでは、第１および第２の液滴は各々、１ｐＬ〜５０ｐＬの間の体積を有する。
【００１３】
一部のインプリメンテーションでは、システムは、基板の座標と第１および第２のプリントヘッドとの間のアライメントを維持するために基板の動きをリアルタイムで追跡するレジスターを含む。一部のインプリメンテーションでは、第１および第２の溶液は、色素を組み入れ、システムは第１および／または第２の液滴の適切な吐出を確認するカメラを含むスポットイメージャーを含む。
【００１４】
一部のインプリメンテーションでは、システムは、基板上の第１および第２の液滴を乾燥させるスポットドライヤーを含む。一部のインプリメンテーションでは、第１のプリントヘッドは、基板の異なる座標で第１の溶液の液滴を吐出する第１の複数のノズルを含む。一部のインプリメンテーションでは、第１のプリントヘッドは、基板の異なる座標で第３の溶液の液滴を吐出する第２の複数のノズルを含む。
【００１５】
一部のインプリメンテーションでは、システムは、基板を含む。一部のインプリメンテーションでは、基板は、低結合性プラスチックを含む。一部のインプリメンテーションでは、基板は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）またはポリプロピレンを含む。
【００１６】
一部のインプリメンテーションでは、第１および第２のプリントヘッドは、基板の動きに対して座標上でのオーバープリントを可能にするある角度でシステム内に搭載される。一部のインプリメンテーションでは、第１のプリントヘッドは、ＭＥＭＳ薄膜ピエゾ方式インクジェットヘッドまたはＭＥＭＳサーマル方式インクジェットヘッドである。一部のインプリメンテーションでは、第１および第２のプリントヘッドは、座標上で液滴を吐出するために同じトラックに沿って位置し、システムは、対応するトラックにおける別の座標上に液滴を吐出するために少なくとも１つの追加のトラックに沿って位置する追加のプリントヘッドを含む。
【００１７】
一部のインプリメンテーションでは、フィニッシャーは、反応のインキュベーションにとって最適な固定された内部温度を有する。一部のインプリメンテーションでは、フィニッシャーは、インキュベーションの間に反応ミックスの蒸発を制御する固定された湿度レベルを有する。一部のインプリメンテーションでは、フィニッシャーは、濃縮を防止するためにインキュベーション前に基板を加熱するヒーターを含む。一部のインプリメンテーションでは、フィニッシャーは、基板の異なる座標からの複数の反応物を容器に統合するプーリングシステムを含む。一部のインプリメンテーションでは、フィニッシャーは、統合前に基板の座標上に反応阻害剤を吐出する。
【００１８】
一部のインプリメンテーションでは、容器は、プーリング溶液反応阻害剤を含有する。一部のインプリメンテーションでは、反応阻害剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【００１９】
一部のインプリメンテーションでは、システムは、基板上の異なる座標から回収した液体から核酸を捕捉する膜を含む。一部のインプリメンテーションでは、システムは、基板から核酸を取り出すスクレイパーを含む。一部のインプリメンテーションでは、異なる座標からの複数の反応物は、プールされた後に複数の反応物がその内容物を維持することを可能にするエマルションに共にプールされる。
【００２０】
一部のインプリメンテーションでは、基板は、非混和性の液体またはオイルによってコーティングされる。一部のインプリメンテーションでは、システムは、座標上にオイルを吐出するオイルディスペンサーを含む。一部のインプリメンテーションでは、基板は、第１および第２の成分核酸分子に結合するビーズによってコーティングされるか、またはパターン形成される。一部のインプリメンテーションでは、システムは、座標上にビーズを吐出するビーズディスペンサーを含む。
【００２１】
一部のインプリメンテーションでは、反応ミックスはリガーゼを含む。一部のインプリメンテーションでは、第１の溶液、第２の溶液、および反応ミックスは添加剤を含む。一部のインプリメンテーションでは、添加剤は、第１の溶液と第１のプリントヘッド、第２の溶液と第２のプリントヘッド、または反応ミックスとフィニッシャーとの適合性を可能にするように構成される。一部のインプリメンテーションでは、添加剤は、第１の溶液、第２の溶液、または反応ミックスの蒸発を軽減する。一部のインプリメンテーションでは、添加剤は、湿潤剤、界面活性剤、および殺生物剤のうちの少なくとも１つを含む。
【００２２】
一部のインプリメンテーションでは、システムは、システムを操作するための指示を実行するように構成されたコンピュータプロセッサを含む。指示は、（１）例えばローラーのセットを制御することによって、基板を、プリントヘッドを超えて移動させるための指示のセット、および（２）各プリントヘッドまたは対応するノズルが溶液を吐出する時間を指定するための指示の別のセットを含み得る。
【００２３】
ある態様では、本開示は、核酸分子をアセンブルするためのシステムであって、（ａ）基板の座標上に第１の成分核酸分子を含む第１の溶液の第１の液滴を吐出するように構成された第１のプリントヘッドと、（ｂ）第１および第２の成分核酸分子が基板上でコロケートされるように、基板の座標上に第２の成分核酸分子を含む第２の溶液の第２の液滴を吐出するように構成された第２のプリントヘッドと、（ｃ）第１および第２の成分核酸分子を物理的に連結するように基板の座標上に反応ミックスを吐出するか、第１および第２の成分核酸分子を物理的に連結するために必要な条件を提供するか、またはその両方であるフィニッシャーとを含むシステムを提供する。
【００２４】
一部のインプリメンテーションでは、フィニッシャーは、基板の座標上に反応ミックスを吐出するように構成された第３のプリントヘッドを含む。フィニッシャーは、インキュベーター、プーリングシステム、または両方をさらに含み得る。一般的に、フィニッシャーは、任意の時点で反応ミックスを吐出し得る。具体的には、反応ミックスは、第１のプリントヘッドが座標上に第１の液滴を吐出する前に、第２のプリントヘッドが座標上に第２の液滴を吐出する前に、または両方で座標に吐出され得る。
【００２５】
一部のインプリメンテーションでは、アセンブルされた核酸分子は、遺伝子コードＤＮＡ、ペプチドコードＤＮＡ、またはＲＮＡコードＤＮＡを含む。アセンブルされた核酸分子は、ＤＮＡアプタマーライブラリーを含み得る。
参照による引用
【００２６】
本明細書で言及される全ての公表文献、特許および特許出願は、個々の公表文献、特許または特許出願各々が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる公表文献および特許または特許出願が、本明細書に収載される本開示と相反する場合は、本明細書は、一切のそのような相反する物質に取って代わるおよび／または優先するように意図されている。
【００２７】
本発明の新規特色を添付の特許請求の範囲において詳しく記載する。本発明の特色および利点のより良好な理解は、本発明の原理を利用する例示的なインプリメンテーションを記載する以下の詳細な説明、および添付の図面（同様に、本明細書における「図面」および「図」）を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、インクジェットプリンティングを使用して迅速かつハイスループット様式で成分からＤＮＡ識別子をアセンブルすることによって、ＤＮＡにデジタル情報を記憶させるための例としてのシステムを例証する図である。システムおよびその異なる実施形態を、本明細書において以降「プリンター−フィニッシャーシステム」または「ＰＦＳ」と称する。
【００２９】
【図２】図２は、プリンターサブシステムの例をより詳細に示す図である。プリントヘッドは、ウェブの同じ座標に異なる成分をオーバープリントするように設計される。
【００３０】
【図３−１】図３Ａ〜Ｄは、プリンターにおけるプリントヘッドの例を描く図である。
【図３−２】図３Ａ〜Ｄは、プリンターにおけるプリントヘッドの例を描く図である。
【００３１】
【図４】図４は、プリンター内のプリントヘッドの可能な配置を描く図である。
【００３２】
【図５】図５は、プリンターサブシステムにおけるスポットイメージャーの例としてのセットアップを実証する図である。
【００３３】
【図６】図６は、フィニッシャーサブシステムの例をより詳細に示す図である。基板の各座標上に反応ミックスを吐出する部分に加えて、フィニッシャーはまた、統合前に基板の各座標上に反応阻害剤を吐出する部分も含み得る。
【００３４】
【図７】図７は、インキュベーション相の間にフィニッシャーを通じてウェブを通過させるためのローラーのループの例を示す図である。
【００３５】
【図８】図８は、インキュベーションの間に予想される平衡体積に及ぼす反応ミックスグリセロール組成物およびフィニッシャー湿度の効果を例証する図である。
【００３６】
【図９】図９は、ウェブからの全ての反応を１つの容器に統合する例としてのプーリングシステムを例証する図である。
【００３７】
【図１０】図１０は、ＰＦＳを通じてのデータ転送パイプラインの実施形態の概略図を描く図である。
【００３８】
【図１１】図１１は、４つのモジュール：シャーシモジュール、プリントエンジンモジュール、インキュベーターモジュール、およびプーリングモジュールを含むＰＦＳの実施形態を例証する図である。
【００３９】
【図１２】図１２は、反応液滴をエマルションにプールするＰＦＳの実施形態を例証する図である。
【００４０】
【図１３】図１３は、ウェビング上に印刷された後、反応液滴がオイル（または別の非混和性の液体）によってコーティングされるＰＦＳの実施形態を例証する図である。
【００４１】
【図１４】図１４は、反応液滴が、印刷されたＤＮＡ成分に結合するビーズを含有するＰＦＳの実施形態を例証する図である。
【００４２】
【図１５】図１５は、ビーズに結合したＤＮＡ成分がエマルションを使用して識別子にどのように処理され得るかの例を例証する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
定義
用語「成分」は、本明細書で使用される場合、核酸配列を一般に指す。成分は、区別可能な配列であることがある。成分は、他の核酸配列または分子を生成するように、１つまたは複数の他の成分と連結またはアセンブルされることもある。
【００４４】
用語「層」は、本明細書で使用される場合、成分の群またはプールを一般に指す。各層は、１つの層内の成分が別の層内の成分と異なるような、１セットの区別可能な成分を含むことがある。１つまたは複数の層からの成分は、１つまたは複数の識別子を生成するようにアセンブルされることもある。
【００４５】
用語「識別子」は、本明細書で使用される場合、より大きいビット列内のビット列の位置および値を表す、核酸分子または核酸配列を一般に指す。より一般的には、識別子は、記号列中の記号を表す、または記号列中の記号に対応する、任意のオブジェクトを指すことがある。一部のインプリメンテーションでは、識別子は、１つまたは複数の連結された成分を含み得る。
【００４６】
用語「識別子ライブラリー」は、本明細書で使用される場合、デジタル情報を表す記号列中の記号に対応する識別子の集合体を一般に指す。一部のインプリメンテーションでは、識別子ライブラリー中の所与の識別子の非存在は、特定の位置における記号値を示すことができる。１つまたは複数の識別子ライブラリーを、識別子のプール、群、またはセットの中で組み合わせることができる。各識別子ライブラリーは、識別子ライブラリーを識別する一意のバーコードを含むこともある。
【００４７】
用語「核酸」は、本明細書で使用される場合、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはこれらのバリアントを一般に指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、またはそのバリアントから選択される１つまたは複数のサブユニットを含み得る。ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵ、またはそのバリアントを含み得る。ヌクレオチドは、成長核酸鎖に組み込むことができる任意のサブユニットを含み得る。そのようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵであることもあり、あるいはより多くの相補的Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵのうちの１つに特異的であり得る、またはプリン（すなわち、ＡもしくはＧ、またはそのバリアント）もしくはピリミジン（すなわち、Ｃ、ＴもしくはＵ、またはそのバリアント）と相補的であり得る、任意の他のサブユニットであることもある。一部の例では、核酸は、一本鎖状または二本鎖状であり得、一部の場合には、核酸分子は環状である。
【００４８】
用語「核酸分子」または「核酸配列」は、本明細書で使用される場合、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）もしくはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）のどちらかかまたはその類似体である、様々な長さを有し得る、多量体型のヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを一般に指す。用語「核酸配列」は、ポリヌクレオチドのアルファベット表現を指すことがあり、あるいは、この用語は、物理的なポリヌクレオチド自体に適用されることもある。このアルファベット表現を、中央処理装置を有するコンピュータ内のデータベースに入力し、核酸配列または核酸分子を記号またはビットにマッピングするために、したがってデジタル情報を符号化するために、使用することができる。核酸配列またはオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体および／または改変ヌクレオチドを含むこともある。
【００４９】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、一本鎖核酸配列を一般に指し、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）という、またはポリヌクレオチドがＲＮＡの場合はアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）という、４つのヌクレオチド塩基の特異的配列で、概して構成されている。
【００５０】
改変ヌクレオチドの例としては、ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｄ４６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノプリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子は、塩基部分が（例えば、相補的ヌクレオチドと水素結合を形成するために通常は利用可能である１つもしくは複数の原子が、および／または相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することが通常はできない１つもしくは複数の原子が）修飾されていることもあり、糖部分が修飾されていることもあり、またはリン酸骨格が修飾されていることもある。核酸分子は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル（ＮＨＳ）などのアミン反応性部分の共有結合を可能にするためにアミノアリル−ｄＵＴＰ（ａａ−ｄＵＴＰ）およびアミノヘキシルアクリルアミド（aminohexhylacrylamide）−ｄＣＴＰ（ａｈａ−ｄＣＴＰ）などのアミン修飾基を含有することもある。
【００５１】
用語「プライマー」は、本明細書で使用される場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸合成のための出発点としての役立つ核酸鎖を一般に指す。一例では、ＤＮＡ試料の複製中に、複製を触媒する酵素が、ＤＮＡ試料に結合したプライマーの３’末端で複製を開始し、反対側の鎖をコピーする。
【００５２】
用語「ポリメラーゼ」または「ポリメラーゼ酵素」は、本明細書で使用される場合、ポリメラーゼ反応を触媒することができる任意の酵素を一般に指す。ポリメラーゼの例としては、限定ではないが、核酸ポリメラーゼが挙げられる。ポリメラーゼは、天然に存在することもあり、または合成されることもある。ポリメラーゼの例は、Φ２９ポリメラーゼまたはその誘導体である。一部の場合には、転写酵素またはリガーゼ（すなわち、結合の形成を触媒する酵素）が、新たな核酸配列を構築するために、ポリメラーゼと併せてまたはポリメラーゼの代替として使用される。ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、熱安定性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変ポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼΦ２９（ファイ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、ＰｆｕポリメラーゼＰｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｗポリメラーゼ、ＳｓｏポリメラーゼＰｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、ＭｔｈポリメラーゼＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｃａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するクレノウ断片ポリメラーゼ、ならびにこれらのバリアント、改変産物および誘導体が挙げられる。
【００５３】
２進コードの形での、コンピュータデータなどの、デジタル情報は、記号の配列または記号列を含み得る。２進コードは、例えば、ビットと呼ばれる２つの２進記号、通常は０および１、を有する２進法を使用して、テキストまたはコンピュータプロセッサ命令を符号化することまたは表すことができる。デジタル情報は、非２進記号の配列を含み得る非２進コードの形で表すことができる。符号化された各記号を、一意のビット列（または「バイト」）に再び割り当てることができ、一意のビット列またはバイトを、バイト列またはバイトストリームに配列することができる。所与のビットについてのビット値は、２つの記号のうちの１つ（例えば、０または１）であり得る。Ｎビットの列を含むことができるバイトは、合計２Ｎの一意のバイト値を有することができる。例えば、８ビットを含むバイトは、合計２８または２５６の可能な一意のバイト値を生じさせることができ、２５６バイトの各々は、バイトで符号化することができる２５６の可能な区別可能な記号、文字または命令のうちの１つに対応し得る。生データ（例えば、テキストファイルおよびコンピュータ命令）を、バイト列またはバイトストリームとして表すことができる。ｚｉｐファイル、または生データを含む圧縮データファイルを、バイトストリームで記憶することもでき、これらのファイルを圧縮形でバイトストリームとして記憶し、そしてその後、コンピュータにより読み取られる前に生データに復元することができる。
概要
【００５４】
インクジェットプリンターシステムを使用してデジタル情報を核酸に符号化するこれまでの方法は、核酸の塩基毎の合成に依存しており、これは費用が高く、かつ時間がかかり得る。例えば、インクジェットプリンターに基づく技術はこれまで、マイクロリアクターチップ上でのオリゴヌクレオチド合成のために使用されている。しかし、これらの技術は、各合成ラウンドの間に単一のオリゴヌクレオチドを付加するために、４ステップ（脱保護、カップリング、キャッピング、および酸化）の固相ホスホロアミダイトサイクル反応の利用を必要とする塩基毎の合成を利用している。本明細書に記載される新規方法は、各成分（例えば、核酸配列）が、基板上に吐出され（例えば、印刷され）、成分の各々が単一の反応で物理的に連結されるように反応混合物および／または条件が提供される成分の組合せ配置を使用して、デジタル情報を符号化することができる。
【００５５】
情報は、核酸配列に記憶させることができる。本開示のいくつかの態様では、本明細書において１つまたは複数の成分から構築される識別子にデジタル情報を符号化する方法が提供される。各成分は、核酸配列を含み得る。プリンター−フィニッシャーシステム（またはＰＦＳ）として公知であるプリントに基づくシステムを使用して、識別子を構築するための成分をコロケートしてアセンブルすることができる。ＰＦＳは、２つのサブシステム、すなわちプリンターおよびフィニッシャーを含み得る。ＰＦＳは、１つのシステム、すなわち成分および反応ミックスの両方を基板上に吐出するプリンターを含み得る。一部のインプリメンテーションでは、２つのサブシステムは結合され、個々の機能に関して互いに従属し得る。他のインプリメンテーションでは、２つのサブシステムは分離しており、独立して機能することが可能であり得る。
情報を核酸配列に符号化するおよび書き込む方法
【００５６】
ある態様では、本開示は、情報を核酸配列に符号化する方法を提供する。核酸配列に情報を符号化する方法は、（ａ）情報を記号列に変換するステップと、（ｂ）記号列を複数の識別子にマッピングするステップと、（ｃ）複数の識別子の少なくともサブセットを含む識別子ライブラリーを構築するステップとを含み得る。複数の識別子のうちの個々の識別子は、１つまたは複数の成分を含み得る。１つまたは複数の成分のうちの個々の成分は、核酸配列を含み得る。記号列中の各位置における各記号は、区別可能な識別子に対応し得る。個々の識別子は、記号列中の個々の位置の個々の記号に対応し得る。さらに、記号列中の各位置における１つの記号は、識別子の非存在に対応し得る。例えば、「０」および「１」の２進記号（例えば、ビット）列における「０」の出現各々が、識別子の非存在に対応し得る。
【００５７】
別の態様では、本開示は、核酸ベースのコンピュータデータ記憶のための方法を提供する。核酸ベースのコンピュータデータ記憶のための方法は、（ａ）コンピュータデータを受信するステップと、（ｂ）コンピュータデータを符号化する核酸配列を含む核酸分子を合成するステップと、（ｃ）核酸配列を有する核酸分子を記憶させるステップとを含み得る。コンピュータデータは、合成された核酸分子の少なくともサブセットに符号化され、核酸分子の各々の配列に符号化されないことがある。
【００５８】
別の態様では、本開示は、核酸配列に情報を書き込むおよび記憶させる方法を提供する。この方法は、（ａ）情報を表す仮想識別子ライブラリーを受信または符号化するステップと、（ｂ）識別子ライブラリーを物理的に構築するステップと、（ｃ）識別子ライブラリーの１つまたは複数の物理的コピーを１つまたは複数の別々の位置に記憶させるステップとを含み得る。識別子ライブラリーの個々の識別子は、１つまたは複数の成分を含み得る。１つまたは複数の成分のうちの個々の成分は、核酸配列を含み得る。
【００５９】
別の態様では、本開示は、核酸ベースのコンピュータデータ記憶のための方法を提供する。核酸ベースのコンピュータデータ記憶のための方法は、（ａ）コンピュータデータを受信するステップと、（ｂ）コンピュータデータを符号化する少なくとも１つの核酸配列を含む核酸分子を合成するステップと、（ｃ）少なくとも１つの核酸配列を含む核酸分子を記憶させるステップとを含み得る。核酸分子を合成するステップは、塩基毎の核酸合成の非存在下でのステップであり得る。
【００６０】
別の態様では、本開示は、核酸配列に情報を書き込むおよび記憶させる方法を提供する。核酸配列に情報を書き込むおよび記憶させる方法は、（ａ）情報を表す仮想識別子ライブラリーを受信または符号化するステップと、（ｂ）識別子ライブラリーを物理的に構築するステップと、（ｃ）識別子ライブラリーの１つまたは複数の物理的コピーを１つまたは複数の別々の位置に記憶させるステップとを含み得る。識別子ライブラリーの個々の識別子は、１つまたは複数の成分を含み得る。１つまたは複数の成分のうちの個々の成分は、核酸配列を含み得る。
核酸配列に記憶された情報を読み取る方法
【００６１】
別の態様では、本開示は、核酸配列に符号化された情報を読み取る方法を提供する。核酸配列に符号化された情報を読み取る方法は、（ａ）識別子ライブラリーを用意するステップと、（ｂ）識別子ライブラリー中に存在する識別子を識別するステップと、（ｃ）識別子ライブラリー中に存在する識別子から記号列を生成するステップと、（ｄ）記号列から情報をコンパイルするステップとを含み得る。識別子ライブラリーは、組合せ空間からの複数の識別子のサブセットを含み得る。識別子のサブセットの個々の識別子各々は、記号列中の個々の記号に対応し得る。識別子は、１つまたは複数の成分を含み得る。成分は、核酸配列を含み得る。
【００６２】
情報を本明細書の他の箇所に記載されているように１つまたは複数の識別子ライブラリーに書き込むことができる。識別子を、本明細書の他の箇所に記載の任意の方法を使用して構築することができる。本明細書の他の箇所に記載の任意の方法を使用して、記憶されたデータをコピーすることおよび記憶されたデータにアクセスすることができる。
【００６３】
識別子は、符号化された記号の位置、符号化された記号の値、または符号化された記号の位置と値の両方に関する情報を含み得る。識別子は、符号化された記号の位置に関する情報を含むことがあり、識別子ライブラリー中の識別子の存在または非存在は、記号の値を示すことができる。識別子ライブラリー中の識別子の存在は、２進列中の第１の記号値（例えば、第１のビット値）を示すことができ、識別子ライブラリー中の識別子の非存在は、２進列中の第２の記号値（例えば、第２のビット値）を示すことができる。二進法で、識別子ライブラリー中の識別子の存在または非存在に関するビット値を偏らせることで、アセンブルされる識別子の数を低減させることができ、したがって、書き込み時間を短縮することができる。一例では、識別子の存在は、マッピングされた位置における「１」のビット値を示すことができ、識別子の非存在は、マッピングされた位置における「０」のビット値を示すことができる。
【００６４】
１つの情報についての記号（例えば、ビット値）の生成は、記号（例えば、ビット）をマッピングまたは符号化することができる識別子の存在または非存在を識別することを含み得る。識別子の存在または非存在の決定は、識別子の存在を検出するために存在する識別子をシークエンシングすることまたはハイブリダイゼーションアレイを使用することを含み得る。一例では、符号化された配列の復号および読み取りを、シークエンシングプラットフォームを使用して行うことができる。シークエンシングプラットフォームの例は、２０１４年８月２１日に出願された米国特許出願第１４／４６５，６８５号；２０１３年５月２日に出願された米国特許出願第１３／８８６，２３４号；および２００９年３月９日に出願された米国特許出願第１２／４００，５９３号に記載されており、その各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
一例では、核酸符号化データの復号は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇなどの、核酸鎖の塩基毎のシークエンシングにより果たすことができ、またはキャピラリー電気泳動による断片化解析などの、特定の核酸配列の存在もしくは非存在を示すシークエンシング技術を利用することにより果たすことができる。シークエンシングは、可逆的ターミネーターの使用を利用することもある。シークエンシングは、天然または非天然（例えば、操作された）ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の使用を利用することもある。あるいは、または加えて、核酸配列の復号は、光学的、電気化学的または化学的シグナルを生成する任意の方法を含むがこれらに限定されない、様々な分析技術を使用して行うことができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、サンガーシークエンシング、ハイスループットシークエンシング、１塩基合成反応、単一分子シークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、ＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、次世代シークエンシング、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、クローナルシングルマイクロアレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガンシークエンシング、マクサム（Maxim）・ギルバートシークエンシング、または大規模並列シークエンシングを含むがこれらに限定されない、様々なシークエンシング手法を使用することができる。
【００６６】
様々な読み出し方法を使用して、符号化された核酸から情報を引き出すことができる。一例では、マイクロアレイ（または任意の種類の蛍光ハイブリダイゼーション）、デジタルＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、および様々なシークエンシングプラットフォームをさらに使用して、符号化された配列、および伸長によりデジタル符号化されたデータを、読み出すことができる。
【００６７】
識別子ライブラリーは、情報についてのメタデータを提供する補足核酸配列、情報を隠蔽もしくはマスクする補足核酸配列、またはメタデータの提供も情報のマスクもする補足核酸配列を、さらに含み得る。補足核酸を識別子の識別と同時に識別することができる。あるいは、識別子を識別する前または識別した後に、補足核酸を識別することができる。一例では、補足核酸配列は、符号化された情報の読み取り中に識別されない。補足核酸配列を識別子と区別できないこともある。識別子インデックスまたはキーを使用して、補足核酸分子と識別子を差別化することができる。
【００６８】
より少ない核酸分子の使用を可能にするように入力ビット列を再符号化することにより、データの符号化および復号効率を高めることができる。例えば、符号化方法で３つの核酸分子（例えば、識別子）にマッピングされ得る「１１１」部分列が高度に出現する入力列を受信した場合、それを、核酸分子の空集合にマッピングされ得る「０００」部分列に再符号化することができる。「０００」の代替入力部分列を「１１１」に再符号化することもできる。この再符号化方法は、データセット中の「１」の数が低減され得るため、データを符号化するために使用される核酸分子の総量を低減させることができる。この例では、データセットの総サイズを、新しいマッピング命令を指定するコードブックに対応するように増加させることができる。符号化および復号効率を高めるための代替方法は、可変長を短縮するように入力列を再符号化することであり得る。例えば、「１１１」を「００」に再符号化することができ、これは、データセットのサイズを縮小し、データセット中の「１」の数を低減させることができる。
【００６９】
検出を容易にするために識別子を特異的に設計することにより、核酸符号化データを復号する速度および効率を制御する（例えば、高める）ことができる。例えば、検出を容易にするために設計される核酸配列（例えば、識別子）は、それらの光学的、電気化学的、化学的または物理学的特性に基づいて呼び出すことおよび検出することがより容易であるヌクレオチドの大部分を含む核酸配列を含み得る。操作された核酸配列は、一本鎖状または二本鎖状のどちらであってもよい。操作された核酸配列は、核酸配列の検出可能な特性を向上させる合成または非天然ヌクレオチドを含むこともある。操作された核酸配列は、全て天然ヌクレオチドを含むこともあり、全て合成もしくは非天然ヌクレオチドを含むこともあり、または天然ヌクレオチドと合成ヌクレオチドと非天然ヌクレオチドの組合せを含むこともある。合成ヌクレオチドとしては、ヌクレオチド類似体、例えば、ペプチド核酸、ロックド核酸、グリコール核酸およびトレオース核酸を挙げることができる。非天然ヌクレオチドとしては、ｄＮａＭ、３−メトキシ−２−ナフチル基を含有する人工ヌクレオシド、およびｄ５ＳＩＣＳ、６−メチルイソキノリン−１−チオン−２−イル基を含有する人工ヌクレオシド、を挙げることができる。操作された核酸配列は、増強された光学的特性などの、単一の増強された特性のために設計されることもあり、または設計される核酸配列は、増強された光学的および電気化学的特性もしくは増強された光学的および化学的特性などの、複数の増強された特性を考慮して設計されることもある。
【００７０】
操作された核酸配列は、核酸配列の光学的、電気化学的、化学的または物理的特性を向上させない、反応性天然、合成および非天然ヌクレオチドを含むこともある。核酸配列の反応性成分は、核酸配列に向上した特性を付与する化学的部分の付加を可能にし得る。各核酸配列は、単一の化学的部分を含むこともあり、または複数の化学的部分を含むこともある。化学的部分の例としては、蛍光部分、化学発光部分、酸性または塩基性部分、疎水性または親水性部分、および核酸配列の酸化状態または反応性を変更する部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
シークエンシングプラットフォームを核酸配列に符号化された情報の復号および読み取りのために特異的に設計することができる。シークエンシングプラットフォームを一本鎖または二本鎖核酸分子のシークエンシング専用にすることができる。シークエンシングプラットフォームは、個々の塩基を読み取ること（例えば、塩基毎のシークエンシング）により、または核酸分子（例えば、識別子）に組み込まれた全核酸配列（例えば、成分）の存在もしくは非存在を検出することにより、核酸符号化データを復号することができる。シークエンシングプラットフォームは、無差別な試薬の使用、読み取り長の延長の使用、および検出可能な化学的部分の付加による特定の核酸配列の検出の使用を含むことができる。シークエンシング中のより多くの無差別な試薬の使用は、より速い塩基呼び出しを可能にすることにより読み取り効率を高めることができ、その結果としてシークエンシング時間を短縮することができる。読み取り長の延長の使用は、符号化された核酸のより長い配列を読み取り毎に復号することを可能にし得る。検出可能な化学的部分タグの付加は、化学的部分の存在または非存在により核酸配列の存在または非存在の検出を可能にし得る。例えば、情報のビットを符号化する各核酸配列に、一意の光学的、電気化学的または化学的シグナルを生成する化学的部分で、タグ付けすることができる。その一意の光学的、電気化学的または化学的シグナルの存在または非存在は、「０」または「１」ビット値を示すことができる。核酸配列は、単一の化学的部分を含むこともあり、または複数の化学的部分を含むこともある。データを符号化するための核酸配列の使用の前に、化学的部分を核酸配列に付加させることができる。あるいは、または加えて、データの符号化後だが、データを復号する前に、化学的部分を核酸配列に付加させることができる。化学的部分タグを核酸配列に直接付加させることができ、または核酸配列が合成または非天然ヌクレオチドアンカーを含むことができ、そのアンカーに化学的部分タグを付加させることができる。
【００７２】
符号化および復号エラーを最小限にするまたは検出するために、一意のコードを適用することができる。符号化および復号エラーは、偽陰性（無作為試料抽出に含まれない核酸分子または識別子）によって起こることがある。エラー検出コードの一例は、識別子ライブラリーに含まれている可能な識別子の連続セット中の識別子の数を計数するチェックサム配列であり得る。識別子ライブラリーの読み取り中に、チェックサムは、識別子のその連続セットからの取得期待数を示すことができ、識別子は、その期待数が満たされるまで読み取りのための試料抽出を継続することができる。一部のインプリメンテーションでは、チェックサム配列をＲ識別子の連続セット毎に含めることができ、この場合のＲは、サイズが１、２、５、１０、５０、１００、２００、５００もしくは１０００に等しいまたはそれより大きいこともあり、または１０００、５００、２００、１００、５０、１０、５もしくは２未満であることもある。Ｒの値が小さいほど、エラー検出は良好である。一部のインプリメンテーションでは、チェックサムは、補足核酸配列であり得る。例えば、７個の核酸配列（例えば、成分）を含むセットを、積スキームで識別子を構築するための核酸配列（層Ｘ中の成分Ｘ１〜Ｘ３、および層Ｙ中のＹ１〜Ｙ３）と補足チェックサムのための核酸配列（Ｘ４〜Ｘ７およびＹ４〜Ｙ７）という、２つの群に分けることができる。チェックサム配列Ｘ４〜Ｘ７は、層Ｘの０、１、２または３個の配列が層Ｙの各メンバーとアセンブルさせるかどうかを示すことができる。あるいは、チェックサム配列Ｙ４〜Ｙ７は、層Ｙの０、１、２または３個の配列が層Ｘの各メンバーとアセンブルされるかどうかを示すことができる。この例では、識別子｛Ｘ１Ｙ１、Ｘ１Ｙ３、Ｘ２Ｙ１、Ｘ２Ｙ２、Ｘ２Ｙ３｝を有する元の識別子ライブラリーを、次のプールになるようにチェックサムを含むように補足することができる：｛Ｘ１Ｙ１、Ｘ１Ｙ３、Ｘ２Ｙ１、Ｘ２Ｙ２、Ｘ２Ｙ３、Ｘ１Ｙ６、Ｘ２Ｙ７、Ｘ３Ｙ４、Ｘ６Ｙ１、Ｘ５Ｙ２、Ｘ６Ｙ３｝。チェックサム配列をエラー補正に使用することもできる。例えば、上記データセットにおけるＸ１Ｙ１の非存在、ならびにＸ１Ｙ６およびＸ６Ｙ１の存在は、Ｘ１Ｙ１核酸分子がデータセットから欠けているという推測を可能にし得る。チェックサム配列は、識別子が、識別子ライブラリーの試料抽出または識別子ライブラリーのアクセスされる部分から欠けているかどうかを示すことができる。欠けているチェックサム配列の場合、ＰＣＲまたは親和性タグ付きプローブハイブリダイゼーションなどのアクセス方法は、それを増幅および／または単離することができる。一部のインプリメンテーションでは、チェックサムは、補足核酸配列でないこともある。その場合、チェックサムを情報に直接符号化することができ、その結果、それらは識別子により表される。
【００７３】
データ符号化および復号のノイズを、回文として識別子を構築することにより、例えば、積スキームにおいて単一成分ではなく成分の回文ペアを使用することにより、低減させることができる。次いで、異なる層からの成分のペアを回文様式（例えば、成分ＸおよびＹについてＸＹではなくＹＸＹ）で互いにアセンブルすることができる。この回文方法を、より多くの数の層（例えば、ＸＹＺではなくＺＹＸＹＺ）に拡大することができ、この回文方法により、識別子間の誤った交差反応の検出が可能になり得る。
【００７４】
識別子への過剰（例えば、大過剰）な補足核酸配列の付加は、シークエンシングによる符号化された識別子の回収を妨げることがある。情報の復号の前に、識別子を補足核酸配列によって濃縮することができる。例えば、識別子末端に特異的なプライマーを使用する核酸増幅反応により、識別子を濃縮することができる。あるいは、または加えて、特異的プライマーを使用するシークエンシング（例えば、１塩基合成反応）により、試料プールを濃縮することなく情報を復号することができる。両方の復号方法において、復号キーがなければ、または識別子の組成について何かのことが分かっていなければ、情報を濃縮または復号することは困難であり得る。親和性タグベースのプローブの使用などの代替アクセス方法を利用することもできる。
バイナリ配列データを符号化するためのシステム
【００７５】
デジタル情報を核酸（例えば、ＤＮＡ）に符号化するためのシステムは、ファイルおよびデータ（例えば、生データ、圧縮されたｚｉｐファイル、整数データ、および他の形態のデータ）をバイトに変換し、バイトを核酸、一般にはＤＮＡのセグメントまたは配列、またはこれらの組合せに符号化するためのシステム、方法およびデバイスを含み得る。
【００７６】
ある態様では、本開示は、核酸を使用してバイナリ配列データを符号化するためのシステムを提供する。核酸を使用してバイナリ配列データを符号化するためのシステムは、デバイスおよび１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含み得る。デバイスは、識別子ライブラリーが構築されるように構成することができる。（ｉ）情報を記号列に翻訳するため、（ｉｉ）記号列を複数の識別子にマッピングするため、および（ｉｉｉ）少なくとも複数の識別子のサブセットを含む識別子ライブラリーを構築するために、１つまたは複数のコンピュータプロセッサを個別にまたは集合的にプログラミングすることができる。複数の識別子の個々の識別子は、記号列の個々の記号に対応し得る。複数の識別子の個々の識別子は、１つまたは複数の成分に含み得る。１つまたは複数の成分の個々の成分は、核酸配列を含み得る。
【００７７】
別の態様では、本開示は、核酸を使用してバイナリ配列データを読み取るためのシステムを提供する。核酸を使用してバイナリ配列データを読み取るためのシステムは、データベースおよび１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含み得る。データベースは、情報を符号化する識別子ライブラリーを記憶し得る。（ｉ）識別子ライブラリー中の識別子を識別するため、（ｉｉ）（ｉ）で識別された識別子から複数の記号を生成するため、および（ｉｉｉ）複数の記号から情報をコンパイルするために、１つまたは複数のコンピュータプロセッサを個別にまたは集合的にプログラミングすることができる。識別子ライブラリーは、複数の識別子のサブセットを含み得る。複数の識別子の各個の識別子は、記号列内の個々の記号に対応し得る。識別子は、１つまたは複数の成分を含み得る。成分は、核酸配列を含み得る。
【００７８】
デジタルデータを符号化するためのシステムを使用する方法の非限定的なインプリメンテーションは、デジタル情報をバイトストリームの形態で受け取るステップを含み得る。バイトストリームを個々のバイトに構文解析し、核酸インデックス（または識別子のランク）を使用してバイト内のビットの位置をマッピングし、ビット値１またはビット値０のいずれかに対応する配列を識別子に符号化する。デジタルデータを取得するステップは、１つまたは複数のビットにマッピングされる核酸の配列（例えば、識別子）を含む核酸試料または核酸プールについてシークエンシングし、識別子のランクを参照してその識別子が核酸プール内に存在するかどうかを確認し、各配列についての位置およびビット値情報を、デジタル情報の配列を含むバイトに復号する。
【００７９】
核酸分子に符号化され、書き込まれた情報を符号化し、書き込み、コピーし、アクセスし、読み取り、復号するためのシステムは、単一の統合された単位であってもよく、上述の操作の１つまたは複数が実行されるように構成された複数の単位であってもよい。情報を核酸分子（例えば、識別子）に符号化し、書き込むためのシステムは、デバイスおよび１つまたは複数のコンピュータプロセッサを含み得る。１つまたは複数のコンピュータプロセッサは、情報が記号列（例えば、ビットの列）に構文解析されるようにプログラミングすることができるものである。コンピュータプロセッサは、識別子のランクを生じさせることができるものである。コンピュータプロセッサは、記号を２つまたはそれよりも多くのカテゴリーにカテゴリー化するものである。１つのカテゴリーは、識別子ライブラリー中の対応する識別子の存在によって表される記号を含み得、他のカテゴリーは、識別子ライブラリー中の対応する識別子の非存在によって表される記号を含み得る。コンピュータプロセッサは、識別子ライブラリー中に識別子が存在することによって表される記号に対応する識別子をアセンブルするようにデバイスを方向付けることができるものである。
【００８０】
デバイスは、複数の領域、セクション、またはパーティションを含み得る。識別子をアセンブルするための試薬および成分をデバイスの１つまたは複数の領域、セクション、またはパーティションに保管することができる。層をデバイスのセクションの別々の領域に保管することができる。層は、１つまたは複数の一意の成分を含み得る。１つの層内の成分は、別の層の成分と重複しない一意のものであり得る。領域またはセクションは容器を含み得、パーティションはウェルを含み得る。各層を別々の容器またはパーティションに保管することができる。各試薬または核酸配列を別々の容器またはパーティションに保管することができる。その代わりに、またはそれに加えて、試薬を組み合わせて、識別子構築のためのマスターミックスを形成することができる。デバイスは、試薬、成分間、および鋳型をデバイスの１つのセクションから別のセクションに組み合わされるように転送することができる。デバイスは、アセンブリ反応を完了させるための条件をもたらすことができるものである。例えば、デバイスは、加熱、撹拌、および反応進行の検出をもたらすことができるものである。構築された識別子を、１つまたは複数のその後の反応が行われて、識別子の１つまたは複数の末端にバーコード、共通配列、可変配列、またはタグが付加されるように方向付けることができる。次いで、識別子を領域またはパーティションに方向付けて、識別子ライブラリーを生成することができる。１つまたは複数の識別子ライブラリーをデバイスの各領域、セクション、または個々のパーティションに保管することができる。デバイスは、圧力、真空、または吸引を使用して流体（例えば、試薬、成分間、鋳型）を転送することができる。
【００８１】
識別子ライブラリーをデバイスに保管することができるまたは別々のデータベースに移すことができる。データベースは、１つまたは複数の識別子ライブラリーを含み得る。データベースは、識別子ライブラリーを長期保管するための条件（例えば、識別子の分解を低減するための条件）をもたらすものであり得る。識別子ライブラリーは、粉末、液体、または固体の形態で保管することができる。より安定な保管のために識別子の水溶液を凍結乾燥させることができる。あるいは、識別子を、酸素の非存在下（例えば、嫌気的記憶条件）で記憶させることができる。データベースは、紫外線光防護、温度の低下（例えば、冷蔵または凍結）、ならびに分解性化学物質および酵素からの保護をもたらすものであり得る。データベースに移す前に、識別子ライブラリーを凍結乾燥または凍結させることができる。識別子ライブラリーは、ヌクレアーゼを不活化するためにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および／または核酸分子の安定性を維持するために緩衝剤を含み得る。
【００８２】
データベースは、識別子に情報を書き込む、情報をコピーする、情報にアクセスする、または情報を読み取るデバイスとカップリングしていてもよく、当該デバイスを含んでもよく、当該デバイスとは分離されていてもよい。コピー、アクセスまたは読み取りの前に識別子ライブラリーの一部をデータベースから除去することができる。データベースから情報をコピーするデバイスは、情報を書き込むデバイスと同じデバイスであっても異なるデバイスであってもよい。情報をコピーするデバイスは、一定分量の識別子ライブラリーをデバイスから抽出し、その一定分量を試薬および構成物と組み合わせて、識別子ライブラリーの一部または全部を増幅することができる。デバイスは、増幅反応の温度、圧力、および撹拌を制御することができるものである。デバイスは、パーティションを含んでよく、１つまたは複数の増幅反応を、識別子ライブラリーを含むパーティションで行うことができる。デバイスは、識別子の１つよりも多くのプールを同時にコピーすることができる。
【００８３】
コピーされた識別子をコピーデバイスからアクセスデバイスに移すことができる。アクセスデバイスは、コピーデバイスと同じデバイスであってよい。アクセスデバイスは、別々の領域、セクション、またはパーティションを含み得る。アクセスデバイスは、親和性タグと結合した識別子を分離するための１つまたは複数のカラム、ビーズレザバー、または磁気領域を有し得る。その代わりに、またはそれに加えて、アクセスデバイスは、１つまたは複数のサイズ選択ユニットを有し得る。サイズ選択ユニットは、アガロースゲル電気泳動または核酸分子をサイズ選択するための任意の他の方法を含み得る。コピーおよび抽出は、デバイスの同じ領域で実施されてもよく、デバイスの異なる領域で実施されてもよい。
【００８４】
アクセスされたデータを同じデバイスにおいて読み取ることができ、アクセスされたデータを別のデバイスに移すことができる。読み取りデバイスは、識別子を検出し、識別するための検出ユニットを含み得る。検出ユニットは、シークエンサー、ハイブリダイゼーションアレイ、または識別子の存在または非存在を識別するための他のユニットの一部であってよい。シークエンシングプラットフォームは、核酸配列に符号化された情報の復号および読み取り専用に設計されたものであってよい。シークエンシングプラットフォームは、一本鎖または二本鎖核酸分子のシークエンシング専用のものであってよい。シークエンシングプラットフォームは、個々の塩基を読み取ることによって（例えば、塩基毎のシークエンシング）、または核酸分子（例えば、識別子）内に組み入れられた核酸配列全体（例えば、成分）の存在もしくは非存在を検出することによって核酸符号化データを復号することができるものである。あるいは、シークエンシングプラットフォームは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇなどのシステムまたはキャピラリー電気泳動による断片化解析であってよい。その代わりに、またはそれに加えて、核酸配列の復号は、これだけに限定されないが、光学的シグナル、電気化学的シグナル、または化学的シグナルを生じさせる任意の方法を含めた、デバイスによってインプリメントされる様々な解析技法を使用して実施することができる。
【００８５】
核酸分子中への情報保管は、これだけに限定されないが、長期の情報保管、機密情報保管、および医学的情報の保管を含めた種々の適用を有し得る。ある例では、人の医学的情報（例えば、病歴および記録）を核酸分子中に保管し、その彼または彼女に保有させることができる。情報は、体外に保管することもでき（例えば、着用できるデバイス中に）、体内に保管することもできる（例えば、皮下カプセル中に）。患者が診療所または病院に運び込まれた場合に、試料をデバイスまたはカプセルから取得することができ、核酸シークエンサーを使用して情報を復号することができる。核酸分子中への個人的な診断記録の保管により、コンピュータおよびクラウドに基づく保管システムの代替をもたらすことができる。核酸分子中への個人的な診断記録の保管により、診断記録がハッキングされる事例または蔓延を減少させることができる。カプセルに基づく診断記録の保管に使用される核酸分子は、ヒトゲノム配列に由来するものであってよい。ヒトゲノム配列を使用することにより、万一カプセルが破損し漏出した場合の核酸配列の免疫原性を低減することができる。
成分をアセンブルするための化学的方法
【００８６】
本明細書に提供される反応および方法は、１つまたは複数の成分から識別子をアセンブルするために本明細書に記載のシステムにおいて使用することができる。例えば、本明細書に提供される異なる化学的方法に関して異なる反応混合物を、異なる成分をアセンブルするためにシステムのフィニッシャーにおいて使用することができる。
Ａ．オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥＰＣＲ）アセンブリ
【００８７】
ＯＥＰＣＲでは、成分を、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸、またはそのバリアントもしくはアナログ）を含む反応においてアセンブルすることができる。成分は、一本鎖または二本鎖核酸であり得る。互いに隣接してアセンブルされる成分は、相補的３’末端、相補的５’末端、または１つの成分の５’末端と隣接する成分の３’末端の間の相同性を有し得る。これらの末端領域は、「ハイブリダイゼーション領域」と称され、ＯＥＰＣＲ中の成分間のハイブリダイズした接合部の形成を容易にすることを目的とするものであり、１つの入力成分（またはその相補物）の３’末端がその意図された隣接成分（またはその相補物）の３’末端とハイブリダイズする。次いで、アセンブルされた二本鎖産物を、ポリメラーゼ伸長によって形成する。次いで、この産物を、その後のハイブリダイゼーションおよび伸長を通じてより多くの成分とアセンブルすることができる。
【００８８】
一部のインプリメンテーションでは、ＯＥＰＣＲは、３つの温度：融解温度、アニーリング温度、および伸長温度の間をサイクルさせることを含み得る。融解温度は、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変えること、ならびに成分内または成分間での二次構造またはハイブリダイゼーションの形成を除去することを目的とするものである。一般には、融解温度は、高く、例えば、摂氏９５度を超える。一部のインプリメンテーションでは、融解温度は、少なくとも摂氏９６度、９７度、９８度、９９度、１００度、１０１度、１０２度、１０３度、１０４度、または少なくとも１０５度であり得る。他のインプリメンテーションでは、融解温度は、最大で摂氏９５度、９４度、９３度、９２度、９１度、または最大で９０度であり得る。融解温度が高いほど核酸およびそれらの二次構造の解離が改善されるが、核酸またはポリメラーゼの分解などの副作用も引き起こし得る。融解温度は、反応に少なくとも１秒間、２秒間、３秒間、４秒間、または少なくとも５秒間、またはそれよりも長く、例えば、３０秒間、１分間、２分間、または３分間にわたって適用することができる。
【００８９】
アニーリング温度は、意図された隣接成分（またはそれらの相補物）の相補的な３’末端間のハイブリダイゼーションの形成を容易にすることを目的とするものである。一部のインプリメンテーションでは、アニーリング温度は、意図されたハイブリダイズした核酸形成の算出された融解温度と対応し得る。他のインプリメンテーションでは、アニーリング温度は、前記融解温度から摂氏１０度またはそれよりも高い温度以内であり得る。一部のインプリメンテーションでは、アニーリング温度は、少なくとも摂氏２５度、３０度、５０度、５５度、６０度、６５度、または少なくとも７０度であり得る。融解温度は、成分間の意図されたハイブリダイゼーション領域の配列に依存し得る。ハイブリダイゼーション領域が長いほど融解温度が高くなり得、グアニンまたはシトシンヌクレオチドのパーセント含有量が高いハイブリダイゼーション領域ほど融解温度が高くなり得る。したがって、特定のアニーリング温度で最適にアセンブルするように意図されたＯＥＰＣＲ反応用の成分を設計することが可能であり得る。アニーリング温度は、反応に少なくとも１秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、２０秒間、２５秒間、または少なくとも３０秒間にわたって、またはそれよりも長く適用することができる。
【００９０】
伸長温度は、１つまたは複数のポリメラーゼ酵素によって触媒されるハイブリダイズした３’末端の核酸鎖延長を開始させ、またそれを容易にすることを目的とするものである。一部のインプリメンテーションでは、伸長温度を、ポリメラーゼが核酸結合強度、延長スピード、延長安定性、または忠実度に関して最適に機能する温度に設定することができる。一部のインプリメンテーションでは、伸長温度は、少なくとも摂氏３０度、４０度、５０度、６０度、または少なくとも７０度、またはそれよりも高い温度であり得る。アニーリング温度は、反応に少なくとも１秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、２０秒間、２５秒間、３０秒間、４０秒間、５０秒間、または少なくとも６０秒間にわたって、またはそれよりも長く適用することができる。推奨される伸長時間は、予測される延長の１キロベース当たり約１５〜４５秒間であり得る。
【００９１】
ＯＥＰＣＲの一部のインプリメンテーションでは、アニーリング温度と伸長温度は同じであってよい。したがって、２ステップ温度サイクルを３ステップ温度サイクルの代わりに使用することができる。複合アニーリングおよび伸長温度の例としては、摂氏６０度、６５度、または７２度が挙げられる。
【００９２】
一部のインプリメンテーションでは、ＯＥＰＣＲを１つの温度サイクルで実施することができる。そのようなインプリメンテーションには、ただ２つの成分の意図されたアセンブリが伴い得る。他のインプリメンテーションでは、ＯＥＰＣＲを複数の温度サイクルで実施することができる。ＯＥＰＣＲにおけるいかなる所与の核酸も、１つのサイクルでは最大で１つの他の核酸としかアセンブルできない。これは、アセンブリ（または伸長または延長）を核酸の３’末端でしか行うことができず、また、各核酸は３’末端を１つしか有することができないからである。したがって、複数の成分のアセンブリには複数の温度サイクルが必要になり得る。例えば、４種の成分のアセンブルには、３つの温度サイクルが伴い得る。６種の成分のアセンブルには５つの温度サイクルが伴い得る。１０種の成分のアセンブルには９つの温度サイクルが伴い得る。一部のインプリメンテーションでは、最低限必要なものよりも多くの温度サイクルを使用することによりアセンブリ効率を上昇させることができる。例えば、２種の成分をアセンブルするために４つの温度サイクルを使用することにより、１つの温度サイクルのみを使用するよりも多くの産物をもたらすことができる。これは、成分のハイブリダイゼーションおよび延長が、各サイクルにおいて成分の総数のうちごく一部で起こる統計学的事象だからである。したがって、アセンブルされた成分の総画分は、サイクルの増加と共に増加させることができる。
【００９３】
温度サイクリングの考慮事項に加えて、ＯＥＰＣＲにおける核酸配列の設計がそれらの互いとのアセンブリの効率に影響を及ぼす可能性がある。長いハイブリダイゼーション領域を有する核酸は、所与のアニーリング温度で、短いハイブリダイゼーション領域を有する核酸と比較してより効率的にハイブリダイズし得る。これは、より長いハイブリダイズ産物はより多数の安定な塩基対を含有し、したがって、全体的なハイブリダイズ産物がより短いハイブリダイズ産物よりも安定であり得るからである。ハイブリダイゼーション領域は、少なくとも１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、もしくは少なくとも１０塩基、またはそれよりも多くの塩基の長さを有し得る。
【００９４】
高グアニンまたはシトシン含有量のハイブリダイゼーション領域は、所与の温度で、低グアニンまたはシトシン含有量のハイブリダイゼーション領域よりも効率的にハイブリダイズし得る。これは、グアニンとシトシンが、アデニンとチミンよりも安定な塩基対を形成するからである。ハイブリダイゼーション領域は、０％から１００％の間の任意のグアニンまたはシトシン含有量（ＧＣ含量としても公知）を有し得る。例えば、ハイブリダイゼーション領域は、０％から５％、５％から１０％、１０％から１５％、１５％から２０％、２０％から２５％、２５％から３０％、３０％から３５％、３５％から４０％、４０％から４５％、４５％から５０％、５０％から５５％、５５％から６０％、６０％から６５％、６５％から７０％、７０％から７５％、７５％から８０％、８０％から８５％、８５％から９０％、９０％から９５％、または９５％から１００％のグアニンまたはシトシン含有量を有し得る。
【００９５】
ハイブリダイゼーション領域の長さおよびＧＣ含量に加えて、ＯＥＰＣＲの効率に影響を及ぼし得る核酸配列設計の態様がさらに多く存在する。例えば、成分内での望ましくない二次構造の形成により、その意図された隣接成分とのハイブリダイゼーション産物を形成するその能力が妨げられる恐れがある。これらの二次構造は、ヘアピンループを含み得る。核酸についての可能な二次構造の型およびそれらの安定性（例えば、融解温度）は、配列に基づいて予測することができる。設計空間検索アルゴリズムを使用して、効率的なＯＥＰＣＲのための適当な長さおよびＧＣ含量の基準を満たす核酸配列を決定すると同時に、潜在的に阻害性の二次構造を有する配列を回避することができる。設計空間検索アルゴリズムは、遺伝的アルゴリズム、ヒューリスティック検索アルゴリズム、ｔａｂｕ検索のようなメタ−ヒューリスティック検索戦略、分枝限定検索アルゴリズム、動的プログラミングに基づくアルゴリズム、制約された組合せ最適化アルゴリズム、最急降下に基づくアルゴリズム、ランダム化検索アルゴリズム、またはこれらの組合せを含み得る。
【００９６】
同様に、ホモ二量体（同じ配列の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子）および望ましくないヘテロ二量体（それらの意図されたアセンブリパートナーに加えて他の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列）の形成により、ＯＥＰＣＲが妨げられる恐れがある。核酸内の二次構造と同様に、ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成は、核酸設計の間にコンピュータによる計算方法および設計空間検索アルゴリズムを使用して予測し、説明することができる。
【００９７】
より長い核酸配列またはより高いＧＣ含量により、ＯＥＰＣＲでの望ましくない二次構造、ホモ二量体、およびヘテロ二量体の形成の増加が生じ得る。したがって、一部のインプリメンテーションでは、より短い核酸配列またはより低いＧＣ含量を使用することにより、より高いアセンブリ効率が導かれ得る。これらの設計原理により、より効率的なアセンブリに関して、長いハイブリダイゼーション領域または高いＧＣ含量を使用する設計戦略が打ち消され得る。そのように、一部のインプリメンテーションでは、高いＧＣ含量の長いハイブリダイゼーション領域ではなく低いＧＣ含量の短い非ハイブリダイゼーション領域を使用することによってＯＥＰＣＲを最適化することができる。核酸の全体的な長さは、少なくとも１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、６０塩基、７０塩基、８０塩基、９０塩基、または少なくとも１００塩基、またはそれよりも多くの塩基であり得る。一部のインプリメンテーションでは、アセンブリ効率が最適化される核酸のハイブリダイゼーション領域の最適な長さおよび最適なＧＣ含量が存在し得る。
【００９８】
ＯＥＰＣＲ反応におけるより多数の区別可能な核酸は、予測されるアセンブリ効率に干渉し得る。これは、より多数の区別可能な核酸配列により、望ましくない分子間相互作用、特にヘテロ二量体の形態のより高い確率が生じ得るからである。したがって、多数の成分をアセンブルするＯＥＰＣＲの一部のインプリメンテーションでは、効率的なアセンブリのための核酸配列の制約はよりストリンジェントになり得る。
【００９９】
予測される最終的なアセンブルされた産物を増幅するためのプライマーをＯＥＰＣＲ反応に含めることができる。次いで、ＯＥＰＣＲ反応を、単に構成する成分間でより多くのアセンブリを創出することによってだけでなく、完全なアセンブルされた産物を従来のＰＣＲの様式で指数関数的に増幅することによってもアセンブルされた産物の収率を改善するために、より多くの温度サイクルを用いて実施することができる。
【０１００】
アセンブリ効率を改善するために添加剤をＯＥＰＣＲ反応に含めることができる。例えば、ベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、非イオン性界面活性剤、ホルムアミド、マグネシウム、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはこれらの組合せの添加。添加剤含有量（体積当たりの重み）は、少なくとも０％、１％、５％、１０％、もしくは少なくとも２０％、またはそれよりも多くであり得る。
【０１０１】
種々のポリメラーゼをＯＥＰＣＲのために使用することができる。ポリメラーゼは、天然に存在するものであっても合成されたものであってもよい。ポリメラーゼの例は、Φ２９ポリメラーゼまたはその誘導体である。一部の場合では、新しい核酸配列を構築するために、転写酵素またはリガーゼ（すなわち、結合の形成を触媒する酵素）をポリメラーゼと併せてまたはポリメラーゼの代替として使用する。ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変ポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼΦ２９（ファイ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｗポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｃａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、白金  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、ＫＡＰＡポリメラーゼ、Ｑ５ポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するクレノウ断片ポリメラーゼ、ならびにそのバリアント、改変製品および誘導体が挙げられる。異なるポリメラーゼは、異なる温度で安定かつ最適に機能し得る。さらに、異なるポリメラーゼは異なる性質を有する。例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼのような一部のポリメラーゼは、核酸延長の間のより高い忠実度に寄与し得る３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を示し得る。一部のポリメラーゼは延長の間にリーディング配列を動かし得、一方、他のポリメラーゼは、それらを分解し得るまたは延長を停止し得る。Ｔａｑのような一部のポリメラーゼは、アデニン塩基を核酸配列の３’末端に組み入れる。このプロセスはＡ尾部付加と称され、また、アデニン塩基の付加により、意図された隣接成分間の設計された３’相補性が破壊され得るので、このプロセスはＯＥＰＣＲに対して阻害性であり得る。ＯＥＰＣＲは、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（またはＰＣＡ）とも称され得る。
Ｂ．ライゲーションアセンブリ
【０１０２】
ライゲーションアセンブリでは、別々の核酸を、１つまたは複数のリガーゼ酵素および追加的な補因子を含む反応でアセンブルする。補因子は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含み得る。ライゲーションの間、１つの核酸鎖の３’末端を別の核酸鎖の５’末端と共有結合により連結し、したがって、アセンブルされた核酸を形成する。ライゲーション反応の成分は、平滑末端化された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、または部分的にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡであり得る。核酸の末端を１つにまとめる戦略は、リガーゼ酵素の実行可能な基質の頻度を増大させるものであり、したがって、リガーゼ反応の効率を改善するために使用することができる。平滑末端化されたｄｓＤＮＡ分子は、リガーゼ酵素が作用し得る疎水性スタックを形成する傾向があるが、核酸を１つにまとめるためのより上首尾の戦略は、それらがアセンブルすることが意図されている成分の突出との相補性を有する５’または３’一本鎖突出のいずれかを有する核酸成分を使用することであり得る。後者の例では、塩基−塩基ハイブリダイゼーションに起因してより安定な核酸２重鎖が形成され得る。
【０１０３】
二本鎖核酸が一方の末端に突出鎖を有する場合、同じ末端の他方の鎖は、「くぼみ」と称することができる。まとめると、くぼみと突出は、「粘着末端」としても公知の「付着末端」を形成する。付着末端は、３’突出と５’くぼみ、または５’突出と３’くぼみのいずれであってもよい。２つの意図された隣接成分間の付着末端は、相補性を有し、したがって、両方の付着末端の突出がハイブリダイズし、したがって、各突出末端が他の成分のくぼみの始めと直接隣接するように設計することができる。これにより、リガーゼの作用によって「シール」する（リン酸ジエステル結合を通じて共有結合により連結する）ことができる「ニック」（二本鎖ＤＮＡ切断）が形成される。一方の鎖または他方の鎖、または両方の鎖のいずれのニックもシールすることができる。熱力学的に、付着末端を形成する分子の上の鎖および下の鎖は、会合した状態と解離した状態を移動し得、したがって、付着末端は、一過性の形成であり得る。しかし、２種の成分間の付着末端２重鎖の一方の鎖に沿ったニックがシールされると、逆の鎖のメンバーが解離したとしても共有結合性の連結が残存する。次いで、連結した鎖が、逆の鎖の意図された隣接メンバーが結合することができる鋳型になり、シールすることができるニックが再度形成される。
【０１０４】
付着末端は、ｄｓＤＮＡを１つまたは複数のエンドヌクレアーゼで消化することによって創出することができる。エンドヌクレアーゼ（制限酵素と称することができる）は、ｄｓＤＮＡ分子のいずれかの末端または両末端の特異的な部位（制限部位と称することができる）を標的とし、ねじれ型切断を創出し得（時には消化と称される）、したがって、付着末端が残される。消化により、パリンドローム突出（それ自体の逆相補物である配列を有する突出）が残される。その場合、同じエンドヌクレアーゼで消化される２種の成分は、リガーゼを用いてそれに沿ってアセンブルすることができる相補的な付着末端を形成し得る。消化およびライゲーションは、エンドヌクレアーゼおよびリガーゼが適合する場合には同じ反応において共に行うことができる。反応は、摂氏４度、１０度、１６度、２５度、または３７度などの均一温度で行うことができる。または、反応は、複数の温度間、例えば、摂氏１６度と摂氏３７度の間のサイクルであってよい。複数の温度間でサイクルさせることにより、サイクルの異なる部分の間に消化およびライゲーションを各々それらのそれぞれの最適な温度で進行させることが可能になる。
【０１０５】
消化およびライゲーションを別々の反応で実施することが有益な場合がある。例えば、所望のリガーゼおよび所望のエンドヌクレアーゼが異なる条件で最適に機能する場合。または、例えば、ライゲーション産物がエンドヌクレアーゼの新しい制限部位を形成する場合。これらの例では、制限酵素消化、次いでライゲーションを別々に実施することがより良好であり得、また、おそらく、制限酵素をライゲーションの前に除去することがさらに有益であり得る。核酸を酵素からフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、磁気ビーズ捕捉、および／またはシリカ膜吸着、洗浄、および溶出によって分離することができる。複数のエンドヌクレアーゼを同じ反応において使用することができるが、エンドヌクレアーゼが互いに干渉せず、同様の反応条件下で機能することを確実にするために注意を払うべきである。２種のエンドヌクレアーゼを使用し、一方のエンドヌクレアーゼによりｄｓＤＮＡ成分の両末端に直交性の（非相補的な）付着末端を創出することができる。
【０１０６】
エンドヌクレアーゼ消化により、付着末端にリン酸化された５’末端が残される。リガーゼは、リン酸化された５’末端に対してのみ機能することができ、リン酸化されていない５’末端に対しては機能することができない。そのように、消化とライゲーションの間に中間の５’リン酸化ステップのいかなる必要もない場合がある。付着末端にパリンドローム突出を有する消化されたｄｓＤＮＡ成分はそれ自体とライゲーションする可能性がある。自己ライゲーションを防止するために、ライゲーション前に前記ｄｓＤＮＡ成分を脱リン酸化することが有益であり得る。
【０１０７】
複数のエンドヌクレアーゼが異なる制限部位を標的とし得るが、適合する突出（互いに逆相補物である突出）が残される。２種のそのようなエンドヌクレアーゼを用いて創出された付着末端のライゲーション産物では、ライゲーション部位にいずれのエンドヌクレアーゼの制限部位も含有しないアセンブルされた産物がもたらされ得る。そのようなエンドヌクレアーゼにより、ただ２つのエンドヌクレアーゼを使用し、反復的な消化−ライゲーションサイクルを実施することによってプログラム可能に複数の成分をアセンブルすることができるバイオブリックアセンブリなどのアセンブリ方法の基礎が形成される。図２０は、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩを適合する突出と共に使用した消化−ライゲーションサイクルの例を例示する。
【０１０８】
一部のインプリメンテーションでは、付着末端を創出するために使用されるエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型制限酵素であり得る。これらの酵素は、固定数の塩基をこれらの酵素の制限部位から特定の方向に切り出し、したがって、これらの酵素によって生成される突出の配列をカスタマイズすることができる。突出配列はパリンドロームである必要はない。同じＩＩＳ型制限酵素を使用して、複数の異なる付着末端を同じ反応においてまたは複数の反応において創出することができる。さらに、１つまたは複数のＩＩＳ型制限酵素を使用して、適合する突出を有する成分を同じ反応でまたは複数の反応で創出することができる。ＩＩＳ型制限酵素によって生成される２つの付着末端間のライゲーション部位は、それにより新しい制限部位が形成されないように設計することができる。さらに、ＩＩＳ型制限酵素部位を、ｄｓＤＮＡにおいて、制限酵素が付着末端を有する成分を生成する際にそれ自体の制限部位を切断するように位置させることができる。したがって、ＩＩＳ型制限酵素により生成した複数の成分間のライゲーション産物は、いかなる制限部位も含有しない場合がある。
【０１０９】
ＩＩＳ型制限酵素を反応においてリガーゼと混合して、成分の消化とライゲーションを一緒に実施することができる。反応の温度を２つまたはそれよりも多くの値の間でサイクルさせて、最適な消化およびライゲーションを促進することができる。例えば、消化を摂氏３７度で最適に実施することができ、ライゲーションを摂氏１６度で最適に実施することができる。より一般的には、反応を少なくとも摂氏０度、５度、１０度、１５度、２０度、２５度、３０度、３５度、４０度、４５度、５０度、５５度、６０度、または６５度またはそれよりも高い温度値の間をサイクルさせることができる。複合させた消化およびライゲーション反応を使用して、少なくとも２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、または２０種の成分間、またはそれよりも多くをアセンブルすることができる。ＩＩＳ型制限酵素を活用して付着末端を創出するアセンブリ反応の例としては、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングとしても公知）またはモジュラークローニング（ＭｏＣｌｏとしても公知）が挙げられる。
【０１１０】
ライゲーションの一部のインプリメンテーションでは、エキソヌクレアーゼを使用して、付着末端を有する成分を創出することができる。３’エキソヌクレアーゼを使用して、ｄｓＤＮＡから３’末端をチューバックし（ｃｈｅｗ  ｂａｃｋ）、したがって、５’突出を創出する。同様に、５’エキソヌクレアーゼを使用して、ｄｓＤＮＡから５’末端をチューバックし、したがって、３’突出を創出する。異なるエキソヌクレアーゼは異なる性質を有し得る。例えば、エキソヌクレアーゼは、ｓｓＤＮＡに作用するかどうかに関わりなく、リン酸化された５’末端に作用するのかリン酸化されていない５’末端に作用するのかに関わりなく、ニックで開始することができるかどうかに関わりなく、またはそれらの活性を５’くぼみ、３’くぼみ、５’突出、もしくは３’突出において開始することができるかどうかに関わりなく、それらのヌクレアーゼ活性の方向が異なり得る（５’から３’へまたは３’から５’へ）。異なる型のエキソヌクレアーゼとしては、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ヌクレアーゼＢＡＬ＿３１、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、およびＴ７エキソヌクレアーゼが挙げられる。
【０１１１】
エキソヌクレアーゼを反応においてリガーゼと一緒に使用して、複数の成分をアセンブルすることができる。反応は、固定温度で行うこともでき、各々がリガーゼまたはエキソヌクレアーゼそれぞれに理想的な複数の温度の間をサイクルさせることもできる。ポリメラーゼをアセンブリ反応にリガーゼおよび５’から３’へのエキソヌクレアーゼと一緒に含めることができる。そのような反応における成分は、互いに隣接してアセンブルすることが意図された成分がそれらの端部に相同な配列を共有するように設計することができる。例えば、成分Ｙとアセンブルされる成分Ｘは、５’−ｚ−３’形態の３’端部配列を有し得、成分Ｙは、５’−ｚ−３’形態の５’端部配列を有し得、ここで、ｚは、任意の核酸配列である。本発明者らは、そのような形態の相同な端部配列を、「ギブソンオーバーラップ」と称する。５’エキソヌクレアーゼによりギブソンオーバーラップを有するｄｓＤＮＡ成分の５’末端がチューバックされると、互いとハイブリダイズする適合する３’突出が創出される。次いで、ハイブリダイズした３’末端がポリメラーゼの作用によって鋳型成分の末端までまたは一方の成分の伸長した３’突出が隣接成分の５’くぼみを満たす点まで伸長し、それにより、リガーゼによってシールすることができるニックが形成され得る。ポリメラーゼ、リガーゼ、およびエキソヌクレアーゼを一緒に使用するそのようなアセンブリ反応は、多くの場合、「ギブソンアセンブリ」と称される。ギブソンアセンブリは、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、およびＴａｑリガーゼを使用し、反応を摂氏５０度でインキュベートすることによって実施することができる。前記例では、好熱性リガーゼであるＴａｑを使用することにより、反応における３つの型の酵素全てに適した温度である摂氏５０度で反応を進行させることが可能になる。
【０１１２】
「ギブソンアセンブリ」という用語は、一般に、ポリメラーゼ、リガーゼ、およびエキソヌクレアーゼが関与する任意のアセンブリ反応を指す。ギブソンアセンブリを使用して、少なくとも２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または少なくとも１０種、またはそれより多くの成分をアセンブルすることができる。ギブソンアセンブリは、一段階の等温性反応として行うこともでき、１つまたは複数の温度でのインキュベーションを伴う多段階反応として行うこともできる。例えば、ギブソンアセンブリは、少なくとも３０度、４０度、５０度、６０度、または少なくとも７０度、またはそれよりも高い温度で行うことができる。ギブソンアセンブリのインキュベーション時間は、少なくとも１分間、５分間、１０分間、２０分間、４０分間、または少なくとも８０分間であり得る。
【０１１３】
ギブソンアセンブリ反応は、意図された隣接成分間のギブソンオーバーラップがある特定の長さであり、ヘアピン、ホモ二量体、または望ましくないヘテロ二量体などの望ましくないハイブリダイゼーション事象を回避する配列などの配列特色を有する場合に、最適に行うことができる。一般に、少なくとも２０塩基のギブソンオーバーラップが推奨される。しかし、ギブソンオーバーラップは、少なくとも１塩基、２塩基、３塩基、５塩基、１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、６０塩基、または少なくとも１００塩基、またはそれよりも多くの長さの塩基であり得る。ギブソンオーバーラップのＧＣ含量は、０％から１００％の間のいずれかであり得る。例えば、ギブソンオーバーラップのＧＣ含量は、０％から５％、５％から１０％、１０％から１５％、１５％から２０％、２０％から２５％、２５％から３０％、３０％から３５％、３５％から４０％、４０％から４５％、４５％から５０％、５０％から５５％、５５％から６０％、６０％から６５％、６５％から７０％、７０％から７５％、７５％から８０％、８０％から８５％、８５％から９０％、９０％から９５％、または９５％から１００％であり得る。
【０１１４】
ギブソンアセンブリは、一般に、５’エキソヌクレアーゼを用いて説明されるが、この反応は、３’エキソヌクレアーゼを用いて行うこともできる。３’エキソヌクレアーゼによりｄｓＤＮＡ成分の３’末端がチューバックされると、ポリメラーゼにより、３’末端が伸長することによって作用が打ち消される。この動的プロセスを、２種の成分（ギブソンオーバーラップを共有する）の５’突出（エキソヌクレアーゼによって創出される）がハイブリダイズし、ポリメラーゼにより一方の成分の３’末端がその隣接成分の５’末端に行くのに十分に伸長し、したがって、リガーゼによってシールすることができるニックが残されるまで続けることができる。
【０１１５】
ライゲーションの一部のインプリメンテーションでは、付着末端を有する成分は、酵素的なものとは対照的に、完全な相補性を共有しない２つの一本鎖核酸またはオリゴを一緒に混合することによって合成的に創出することができる。
【０１１６】
付着末端ライゲーションにおけるオリゴのインデックス領域およびハイブリダイゼーション領域（複数可）は、成分の適当なアセンブリが容易になるように設計することができる。長い突出を有する成分は、所与のアニーリング温度で、短い突出を有する成分と比較してより効率的に互いとハイブリダイズすることができる。突出は、少なくとも１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１５塩基、２０塩基、もしくは少なくとも３０塩基、またはそれよりも多くの塩基の長さを有し得る。
【０１１７】
高グアニンまたはシトシン含有量を含有する突出を有する成分は、それらの相補的な成分と、所与の温度で、低グアニンまたはシトシン含有量を含有する突出を有する成分よりも効率的にハイブリダイズし得る。これは、グアニンとシトシンが、アデニンとチミンよりもより安定な塩基対を形成するからである。突出は、０％から１００％の間のいずれかのグアニンまたはシトシン含有量（ＧＣ含量としても公知）を有し得る。
【０１１８】
突出配列と同様に、オリゴのＧＣ含量およびインデックス領域の長さもライゲーション効率に影響を及ぼし得る。これは、各成分の上の鎖および下の鎖が安定に結合していれば付着末端成分がより効率的にアセンブルすることができるからである。したがって、より高いＧＣ含量、より長い配列、およびより高い融解温度を促進する他の特色を有するインデックス領域を設計することができる。しかし、インデックス領域および突出配列（複数可）の両方に関して、ライゲーションアセンブリの効率に影響を及ぼし得るオリゴ設計の態様がさらに多く存在する。例えば、成分内での望ましくない二次構造の形成により、その意図された隣接成分とアセンブルされた産物を形成するその能力が妨げられる恐れがある。これは、インデックス領域内、突出配列内、またはその両方の二次構造に起因して起こり得る。これらの二次構造は、ヘアピンループを含み得る。オリゴの可能な二次構造の型およびそれらの安定性（例えば、融解温度）は、配列に基づいて予測することができる。設計空間検索アルゴリズムを使用して、有効な成分を形成するための適当な長さおよびＧＣ含量の基準を満たすオリゴ配列を決定すると同時に、潜在的に阻害性の二次構造を有する配列を回避することができる。設計空間検索アルゴリズムは、遺伝的アルゴリズム、ヒューリスティック検索アルゴリズム、ｔａｂｕ検索のようなメタ−ヒューリスティック検索戦略、分枝限定検索アルゴリズム、動的プログラミングに基づくアルゴリズム、制約された組合せ最適化アルゴリズム、最急降下に基づくアルゴリズム、ランダム化検索アルゴリズム、またはこれらの組合せを含み得る。
【０１１９】
同様に、ホモ二量体（同じ配列のオリゴとハイブリダイズするオリゴ）および望ましくないヘテロ二量体（それらの意図されたアセンブリパートナーに加えて他のオリゴとハイブリダイズするオリゴ）の形成により、ライゲーションが妨げられる恐れがある。成分内の二次構造と同様に、ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成は、予測し、オリゴ設計の間にコンピュータによる計算方法および設計空間検索アルゴリズムを使用して説明することができる。
【０１２０】
より長いオリゴ配列またはより高いＧＣ含量により、ライゲーション反応内での望ましくない二次構造、ホモ二量体、およびヘテロ二量体の形成の増加が生じ得る。したがって、一部のインプリメンテーションでは、より短いオリゴまたはより低いＧＣ含量を使用することにより、より高いアセンブリ効率が導かれ得る。これらの設計原理により、より効率的なアセンブリに関して、長いオリゴまたは高いＧＣ含量を使用する設計戦略が打ち消され得る。そのように、各成分を構成するオリゴに関して、ライゲーションアセンブリ効率が最適化されるような最適な長さおよび最適なＧＣ含量が存在し得る。ライゲーションに使用されるオリゴの全体的な長さは、少なくとも１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、６０塩基、７０塩基、８０塩基、９０塩基、または少なくとも１００塩基、またはそれよりも多くの塩基であり得る。ライゲーションに使用されるオリゴの全体的なＧＣ含量は、０％から１００％の間のいずれかであり得る。例えば、ライゲーションに使用されるオリゴの総ＧＣ含量は、０％から５％、５％から１０％、１０％から１５％、１５％から２０％、２０％から２５％、２５％から３０％、３０％から３５％、３５％から４０％、４０％から４５％、４５％から５０％、５０％から５５％、５５％から６０％、６０％から６５％、６５％から７０％、７０％から７５％、７５％から８０％、８０％から８５％、８５％から９０％、９０％から９５％、または９５％から１００％であり得る。
【０１２１】
付着末端ライゲーションに加えて、ライゲーションは、一本鎖核酸間でステープル（または鋳型または架橋）鎖を使用して行うこともできる。この方法は、ステープル鎖ライゲーション（ＳＳＬ）、鋳型により導かれるライゲーション（ＴＤＬ）、または架橋鎖ライゲーションと称することができる。ＴＤＬでは、２つの一本鎖核酸を鋳型上に隣接的にハイブリダイズさせ、したがって、リガーゼによってシールすることができるニックを形成する。付着末端ライゲーションと同じ核酸設計考慮事項がＴＤＬにも当てはまる。鋳型とそれらの意図された相補的な核酸配列の間のより強力なハイブリダイゼーションにより、ライゲーション効率の上昇を導くことができる。したがって、鋳型の両側でのハイブリダイゼーション安定性（または融解温度）を改善する配列特色により、ライゲーション効率を改善することができる。これらの特色は、より長い配列の長さおよびより高いＧＣ含量を含み得る。鋳型を含めたＴＤＬにおける核酸の長さは、少なくとも５塩基、１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、６０塩基、７０塩基、８０塩基、９０塩基、または少なくとも１００塩基、またはそれよりも多くの塩基であり得る。鋳型を含めた核酸のＧＣ含量は、０％から１００％の間のいずれかであり得る。例えば、鋳型を含む核酸のＧＣ含量は、０％から５％、５％から１０％、１０％から１５％、１５％から２０％、２０％から２５％、２５％から３０％、３０％から３５％、３５％から４０％、４０％から４５％、４５％から５０％、５０％から５５％、５５％から６０％、６０％から６５％、６５％から７０％、７０％から７５％、７５％から８０％、８０％から８５％、８５％から９０％、９０％から９５％、または９５％から１００％であり得る。
【０１２２】
ＴＤＬでは、付着末端ライゲーションと同様に、配列空間検索アルゴリズムを用いる核酸構造予測ソフトウェアを使用することにより、望ましくない二次構造を回避する成分および鋳型配列を設計するために注意を払うことができる。ＴＤＬにおける成分は、二本鎖の代わりに一本鎖であり得るので、露出した塩基に起因して望ましくない二次構造の発生率がより高くなる可能性がある（付着末端ライゲーションと比較）。
【０１２３】
ＴＤＬは、平滑末端化されたｄｓＤＮＡ成分を用いて実施することもできる。そのような反応では、ステープル鎖が２つの一本鎖核酸を適当に架橋するためには、まずステープルが、完全な一本鎖相補物を置き換えるまたは部分的に置き換えることが必要な可能性がある。ｄｓＤＮＡ成分を用いたＴＤＬ反応を容易にするために、ｄｓＤＮＡを最初に高温でインキュベートすることで融解させることができる。次いで、反応を冷却し、したがって、ステープル鎖がそれらの適当な核酸相補物にアニーリングすることを可能にすることができる。このプロセスは、ｄｓＤＮＡ成分と比較して比較的高い濃度の鋳型を使用することによってさらにいっそう効率的なものにすることができ、したがって、結合に関して鋳型が適当な全長ｓｓＤＮＡ相補物に打ち勝つことが可能になる。２つのｓｓＤＮＡ鎖がそれらの鋳型およびリガーゼによってアセンブルされたら、次いで、そのアセンブルされた核酸が逆の全長ｓｓＤＮＡ相補物の鋳型になり得る。したがって、ＴＤＬを用いた平滑末端化されたｄｓＤＮＡのライゲーションを、融解（より高い温度でのインキュベーション）およびアニーリング（より低い温度でのインキュベーション）の複数のラウンドを通じて改善することができる。このプロセスは、リガーゼサイクリング反応、またはＬＣＲと称することができる。適当な融解温度およびアニーリング温度は核酸配列に依存する。融解温度およびアニーリング温度は、少なくとも摂氏４度、１０度、２０度、２０度、３０度、４０度、５０度、６０度、７０度、８０度、９０度、または１００度であり得る。温度サイクルの数は、少なくとも１回、５回、１０回、１５回、２０回、１５回、３０回、またはそれよりも多くであり得る。
【０１２４】
全てのライゲーションを固定温度反応または多重温度反応で実施することができる。ライゲーション温度は、少なくとも摂氏０度、４度、１０度、２０度、２０度、３０度、４０度、５０度、または６０度またはそれよりも高い温度であり得る。リガーゼ活性に最適な温度は、リガーゼの型に応じて異なり得る。さらに、反応において成分が隣り合うまたはハイブリダイズする速度は、それらの核酸配列に応じて異なり得る。より高いインキュベーション温度により、より速い拡散を促進し、したがって、成分が一時的に隣り合うまたはハイブリダイズする頻度を増大させることができる。しかし、温度の上昇により、塩基対結合の破壊、したがって、これらの隣り合ったまたはハイブリダイズした成分２重鎖の安定性の低下も生じ得る。ライゲーションの最適な温度は、アセンブルされる核酸の数、それらの核酸の配列、リガーゼの型、ならびに反応添加剤などの他の因子に依存し得る。例えば、４塩基の相補的な突出を有する２つの付着末端成分は、摂氏４度でＴ４リガーゼを用いると、摂氏２５度でＴ４リガーゼを用いるよりも速くアセンブルすることができる。しかし、２５塩基の相補的な突出を有する２つの付着末端成分は、摂氏２５度でＴ４リガーゼを用いると、摂氏４度でＴ４リガーゼを用いるよりも速くアセンブルすることができ、また、おそらく、４塩基の突出をいずれの温度でライゲーションするよりも速くアセンブルすることができる。ライゲーションの一部のインプリメンテーションでは、アニーリングのために、リガーゼの添加前に成分を加熱し、ゆっくりと冷却することが有益であり得る。
【０１２５】
ライゲーションを使用して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれよりも多くの核酸をアセンブルすることができる。ライゲーションインキュベーション時間は、最大で３０秒間、１分間、２分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、１時間、またはそれよりも長い時間であり得る。より長いインキュベーション時間により、ライゲーション効率を改善することができる。
【０１２６】
ライゲーションには５’リン酸化末端を有する核酸が必要な場合がある。５’リン酸化末端を有さない核酸成分は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（またはＴ４  ＰＮＫ）などのポリヌクレオチドキナーゼとの反応でリン酸化することができる。ＡＴＰ、マグネシウムイオン、またはＤＴＴなどの他の補因子が反応中に存在し得る。ポリヌクレオチドキナーゼ反応は、摂氏３７度で３０分間行うことができる。ポリヌクレオチドキナーゼ反応温度は、少なくとも摂氏４度、１０度、２０度、２０度、３０度、４０度、５０度、または６０度であり得る。ポリヌクレオチドキナーゼ反応のインキュベーション時間は、最大で１分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、６０分間、またはそれよりも長い時間であり得る。あるいは、核酸成分は、改変された５’リン酸化を用いて合成的に（酵素的なものとは対照的に）設計し、製造することができる。それらの５’末端にアセンブルされる核酸のみにリン酸化が必要になり得る。例えば、ＴＤＬにおける鋳型は、アセンブルされるものではないので、リン酸化されていなくてよい。
【０１２７】
ライゲーション効率を改善するために、添加剤をライゲーション反応に含めることができる。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１，２−プロパンジオール（１，２−Ｐｒｄ）、グリセロール、Ｔｗｅｅｎ−２０またはこれらの組合せの添加。ＰＥＧ６０００が特に有効なライゲーション増強剤であり得る。ＰＥＧ６０００は、クラウディング剤として作用することによってライゲーション効率を上昇させ得る。例えば、ＰＥＧ６０００は、リガーゼ反応溶液中の空間を占める凝集した小塊を形成し、リガーゼと成分をより近づけ得る。添加剤含有量（体積当たりの重み）は、少なくとも０％、１％、５％、１０％、２０％、またはそれよりも多くであり得る。
【０１２８】
種々のリガーゼをライゲーションのために使用することができる。リガーゼは、天然に存在するものであっても合成されたものであってもよい。リガーゼの例としては、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、９ｏＮ（商標）ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、およびＳｐｌｉｎｔＲ  ＤＮＡリガーゼが挙げられる。異なるリガーゼは、異なる温度で安定かつ最適に機能し得る。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼは熱安定性であり、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは熱安定性ではない。さらに、異なるリガーゼは異なる性質を有する。例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは平滑末端化されたｄｓＤＮＡをライゲーションすることができるが、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼは平滑末端化されたｄｓＤＮＡをライゲーションすることができない。
【０１２９】
ライゲーションを使用して、シークエンシングアダプターを核酸のライブラリーに付着させることができる。例えば、ライゲーションを、核酸ライブラリーの各メンバーの末端の共通の付着末端またはステープルを用いて実施することができる。核酸の一方の末端の付着末端またはステープルが他方の末端のものと区別可能な場合、シークエンシングアダプターを非対称にライゲーションすることができる。例えば、フォワードシークエンシングアダプターを核酸ライブラリーのメンバーの一方の末端にライゲーションすることができ、リバースシークエンシングアダプターを核酸ライブラリーのメンバーの他方の末端にライゲーションすることができる。あるいは、平滑末端化されたライゲーションを使用して、アダプターを平滑末端化された二本鎖核酸のライブラリーに付着させることができる。フォークアダプターを使用して、各末端で等価である平滑末端または付着末端のいずれかを有する核酸ライブラリーにアダプターを非対称に付着させることができる（例えば、Ａ尾部など）。
【０１３０】
ライゲーションは、熱失活（例えば、摂氏６５度で少なくとも２０分間のインキュベーション）、変性剤の添加、またはＥＤＴＡなどのキレート剤の添加によって阻害され得る。
Ｃ．制限酵素消化
【０１３１】
制限酵素消化は、制限エンドヌクレアーゼ（または制限酵素）が核酸上のそれらの同類の制限部位を認識し、その後、前記制限部位を含有する核酸を切断する（または消化する）反応である。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、またはＩＶ型制限酵素を制限酵素消化のために使用することができる。ＩＩ型制限酵素が核酸消化のための最も効率的な制限酵素であり得る。ＩＩ型制限酵素は、パリンドローム制限部位を認識し、認識部位内の核酸を切断することができる。前記制限酵素（およびそれらの制限部位）の例としては、ＡａｔＩＩ（ＧＡＣＧＴＣ）、ＡｆｅＩ（ＡＧＣＧＣＴ）、ＡｐａＩ（ＧＧＧＣＣＣ）、ＤｐｎＩ（ＧＡＴＣ）、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）、ＮｇｅＩ（ＧＣＴＡＧＣ）、およびさらに多くが挙げられる。ＤｐｎＩおよびＡｆｅＩなどのいくつかの制限酵素は、それらの制限部位を中央で切断することができ、したがって、平滑末端化されたｄｓＤＮＡ産物が残される。ＥｃｏＲＩおよびＡａｔＩＩなどの他の制限酵素は、それらの制限部位を中心から外れて切断し、したがって、付着末端（またはねじれ型の末端）を有するｄｓＤＮＡ産物が残される。いくつかの制限酵素は、不連続の制限部位を標的とし得る。例えば、制限酵素ＡｌｗＮＩは、制限部位ＣＡＧＮＮＮＣＴＧを認識し、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧのいずれかである。制限部位は、長さ少なくとも２塩基、４塩基、６塩基、８塩基、１０塩基、またはそれよりも多くの塩基であり得る。
【０１３２】
いくつかのＩＩ型制限酵素は、それらの制限部位の外側の核酸を切断する。この酵素は、ＩＩＳ型またはＩＩＧ型制限酵素に下位分類することができる。前記酵素は、パリンドロームでない制限部位を認識することができる。前記制限酵素の例としては、ＧＡＡＡＣを認識し、２塩基（同じ鎖）および６塩基（逆の鎖）さらに下流にねじれ型切断を創出するＢｂｓＩが挙げられる。別の例としては、ＧＧＴＣＴＣを認識し、１塩基（同じ鎖）および５塩基（逆の鎖）さらに下流にねじれ型切断を創出するＢｓａＩが挙げられる。前記制限酵素をゴールデンゲートアセンブリまたはモジュラークローニング（ＭｏＣｌｏ）のために使用することができる。ＢｃｇＩ（ＩＩＧ型制限酵素）などのいくつかの制限酵素は、その認識部位の両末端にねじれ型切断を創出し得る。制限酵素は、それらの認識部位から少なくとも１塩基、５塩基、１０塩基、１５塩基、２０塩基、またはそれよりも遠く離れた核酸を切断し得る。前記制限酵素は、それらの認識部位の外側でねじれ型切断を創出し得るので、得られる核酸突出の配列を任意に設計することができる。これは、得られる核酸突出の配列が制限部位の配列とカップリングする、それらの認識部位内にねじれ型切断を創出する制限酵素とは対照的である。制限酵素消化によって創出される核酸突出は、長さ少なくとも１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、またはそれよりも多くの塩基であり得る。制限酵素により核酸を切断する場合、得られる５’末端はリン酸を含有する。
【０１３３】
１つまたは複数の核酸配列を制限酵素消化反応に含めることができる。同様に、１つまたは複数の制限酵素を一緒に制限酵素消化反応に使用することができる。制限酵素消化は、カリウムイオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、ＢＳＡ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）、またはこれらの組合せを含めた添加剤および補助因子を含有し得る。制限酵素消化反応は、摂氏３７度で１時間インキュベートすることができる。制限酵素消化反応は、少なくとも摂氏０度、１０度、２０度、３０度、４０度、５０度、または６０度の温度でインキュベートすることができる。最適な消化温度は酵素に依存し得る。制限酵素消化反応は、最大で１分間、１０分間、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、またはそれよりも長くインキュベートすることができる。より長いインキュベーション時間により、消化の増大をもたらすことができる。
Ｄ．核酸増幅
【０１３４】
核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応、またはＰＣＲを用いて実行することができる。ＰＣＲでは、核酸の出発プール（鋳型プールまたは鋳型と称される）をポリメラーゼ、プライマー（短い核酸プローブ）、ヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびその類似体またはバリアントなど）、ならびにベタイン、ＤＭＳＯ、およびマグネシウムイオンなどの追加的な補助因子および添加剤と組み合わせることができる。鋳型は、一本鎖核酸であっても二本鎖核酸であってもよい。プライマーは、鋳型プール中の標的配列に相補的であり、ハイブリダイズするように合成的に構築された短い核酸配列であり得る。プライマーは、鋳型プール中の標的配列に相補的であり、ハイブリダイズするように合成的に構築された短い核酸配列であり得る。一般には、ＰＣＲ反応には２種のプライマーが存在し、一方は標的鋳型の上の鎖のプライマー結合性部位に相補であり、他方は第１の結合性部位よりも下流の、標的鋳型の下の鎖のプライマー結合性部位に相補的である。これらのプライマーがそれらの標的に結合する５’から３’への配向は、それらの間の核酸配列を首尾よく複製し、指数関数的に増幅するために、互いに向かい合っていなければならない。「ＰＣＲ」とは、一般には、特に前記形態の反応を指し得るが、より一般的には、あらゆる核酸増幅反応を指すためにも使用され得る。
【０１３５】
一部のインプリメンテーションでは、ＰＣＲは、３つの温度：融解温度、アニーリング温度、および伸長温度の間をサイクルさせることを含み得る。融解温度は、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変えること、ならびにハイブリダイゼーション産物および二次構造の形成を除去することを目的とするものである。一般には、融解温度は、高く、例えば、摂氏９５度を超える。一部のインプリメンテーションでは、融解温度は、少なくとも摂氏９６度、９７度、９８度、９９度、１００度、１０１度、１０２度、１０３度、１０４度、または１０５度であり得る。他のインプリメンテーションでは、融解温度は、最大で摂氏９５度、９４度、９３度、９２度、９１度、または９０度であり得る。融解温度が高いほど核酸およびそれらの二次構造の解離が改善されるが、核酸またはポリメラーゼの分解などの副作用も引き起こされる恐れがある。融解温度は、反応に少なくとも１秒間、２秒間、３秒間、４秒間、５秒間、またはそれよりも長く、例えば、３０秒間、１分間、２分間、または３分間にわたって適用することができる。複雑なまたは長い鋳型を用いたＰＣＲにはより長い最初の融解温度ステップが推奨される場合がある。
【０１３６】
アニーリング温度は、プライマーとそれらの標的鋳型の間のハイブリダイゼーションの形成を容易にすることを目的とするものである。一部のインプリメンテーションでは、アニーリング温度は、プライマーの算出された融解温度と対応し得る。他のインプリメンテーションでは、アニーリング温度は、前記融解温度から摂氏１０度またはそれよりも高い温度以内であり得る。一部のインプリメンテーションでは、アニーリング温度は、少なくとも摂氏２５度、３０度、５０度、５５度、６０度、６５度、または７０度であり得る。融解温度は、プライマーの配列に依存し得る。プライマーが長いほど融解温度が高くなり得、グアニンまたはシトシンヌクレオチドのパーセント含有量が高いプライマーほど融解温度が高くなり得る。したがって、特定のアニーリング温度で最適にアセンブルするように意図されたプライマーを設計することが可能であり得る。アニーリング温度は、反応に少なくとも１秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、２０秒間、２５秒間、または３０秒間にわたって、またはそれよりも長く適用することができる。アニーリングを確実にすることを補助するために、プライマー濃度を高くするまたは量を飽和させることができる。プライマー濃度は、５００ナノモル（ｎＭ）であり得る。プライマー濃度は、最大で１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ、またはそれよりも高い濃度であり得る。
【０１３７】
伸長温度は、１つまたは複数のポリメラーゼ酵素によって触媒されるプライマーの３’末端核酸鎖延長を開始させ、容易にすることを目的とするものである。一部のインプリメンテーションでは、伸長温度をポリメラーゼが核酸結合強度、延長スピード、延長安定性、または忠実度に関して最適に機能する温度に設定することができる。一部のインプリメンテーションでは、伸長温度は、少なくとも摂氏３０度、４０度、５０度、６０度、または７０度、またはそれよりも高い温度であり得る。アニーリング温度は、反応に少なくとも１秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、２０秒間、２５秒間、３０秒間、４０秒間、５０秒間、または６０秒間にわたって、またはそれよりも長く適用することができる。推奨される伸長時間は、予測される延長の１キロベース当たりおよそ１５〜４５秒間であり得る。
【０１３８】
ＰＣＲの一部のインプリメンテーションでは、アニーリング温度と伸長温度は同じであってよい。したがって、２ステップ温度サイクルを３ステップ温度サイクルの代わりに使用することができる。複合アニーリングおよび伸長温度の例としては、摂氏６０度、６５度、または７２度が挙げられる。
【０１３９】
一部のインプリメンテーションでは、ＰＣＲを１つの温度サイクルで実施することができる。そのようなインプリメンテーションは、標的化された一本鎖鋳型核酸を二本鎖核酸に変えることを伴い得る。他のインプリメンテーションでは、ＰＣＲを複数の温度サイクルで実施することができる。ＰＣＲが効率的であれば、各サイクルで標的核酸分子の数が２倍になり、それにより、元の鋳型プールからの標的化された核酸鋳型の数の指数関数的な増加が生じることが予想される。ＰＣＲの効率は変動し得る。したがって、各ラウンドで複製される標的化された核酸の実際のパーセントは、１００％より多いまたは少ない可能性がある。各ＰＣＲサイクルで突然変異したおよび組み換えられた核酸などの望ましくないアーチファクトが導入される可能性がある。この潜在的な害を縮小するために、忠実度が高く処理能力が高いポリメラーゼを使用することができる。さらに、限られた数のＰＣＲサイクルを使用することができる。ＰＣＲは、最大で１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、またはそれよりも多くのサイクルを伴い得る。
【０１４０】
一部の実施形態では、複数の区別可能な標的核酸配列を１つのＰＣＲで一緒に増幅することができる。各標的配列が共通のプライマー結合性部位を有する場合、全ての核酸配列を、同じプライマーセットを用いて増幅することができる。あるいは、ＰＣＲは、各々が区別可能な核酸を標的とすることが意図された複数のプライマーを含み得る。前記ＰＣＲは多重ＰＣＲと称することができる。ＰＣＲは、最大で１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、またはそれよりも多くの区別可能なプライマーを伴い得る。複数の区別可能な核酸標的を有するＰＣＲでは、各ＰＣＲサイクルにより、標的化された核酸の相対的な分布が変化する可能性がある。例えば、均一な分布が歪んだまたは非均一に分布したものになる可能性がある。この潜在的な害を縮小するために、最適なポリメラーゼ（例えば、高忠実度および配列頑強性を有する）および最適なＰＣＲ条件を使用することができる。アニーリングおよび伸長の温度および時間などの因子を最適化することができる。さらに、限られた数のＰＣＲサイクルを使用することができる。
【０１４１】
ＰＣＲの一部のインプリメンテーションでは、鋳型中のその標的化プライマー結合性部位に対して塩基ミスマッチを有するプライマーを使用して標的配列を突然変異させることができる。ＰＣＲの一部のインプリメンテーションでは、５’末端に余分の配列（突出として公知）を有するプライマーを使用して、その標的化された核酸に配列を付着させることができる。例えば、５’末端にシークエンシングアダプターを含有するプライマーを使用して、シークエンシングのための核酸ライブラリーを調製および／または増幅することができる。ある特定のシークエンシング技術のための十分な富化のために、シークエンシングアダプターを標的とするプライマーを使用して核酸ライブラリーを増幅することができる。
【０１４２】
一部のインプリメンテーションでは、プライマーが鋳型の一方の鎖のみ（両方の鎖ではなく）標的とする場合、線形ＰＣＲ（または非対称ＰＣＲ）を使用する。線形ＰＣＲでは、各サイクルから複製される核酸はプライマーと相補的なものではなく、したがって、プライマーはその核酸に結合しない。したがって、プライマーは、各サイクルで元の標的鋳型のみを複製し、したがって、線形（指数関数的なものとは対照的な）増幅になる。線形ＰＣＲからの増幅は従来の（指数関数的な）ＰＣＲほど高速でない可能性があるが、最大収率はより大きい可能性がある。理論的に、線形ＰＣＲにおけるプライマー濃度は、従来のＰＣＲではそうなるような、サイクルの増加および収率の上昇での制限因子にはならない。指数関数的増幅後線形増幅ＰＣＲ（Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ−ＰＣＲ）（またはＬＡＴＥ−ＰＣＲ）は、特に高収率を可能にし得る線形ＰＣＲの改変バージョン。
【０１４３】
核酸増幅の一部のインプリメンテーションでは、融解、アニーリング、および伸長のプロセスを単一の温度で行うことができる。そのようなＰＣＲは、等温性ＰＣＲと称することができる。等温性ＰＣＲでは、プライマー結合に有利になるように十分に相補的な核酸の鎖を互いから解離させるまたは置き換えるために温度に依存しない方法を活用することができる。この戦略としては、ループ媒介性等温増幅、鎖置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅法、およびニッキング酵素増幅反応が挙げられる。等温性核酸増幅は、最大で摂氏２０度、３０度、４０度、５０度、６０度、または７０度またはそれよりも高い温度で行うことができる。
【０１４４】
一部のインプリメンテーションでは、ＰＣＲは、試料中の核酸の量を数量化するための蛍光プローブまたは色素をさらに含み得る。例えば、色素を二本鎖核酸に挿入することができる。前記色素の例は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎである。蛍光プローブは、蛍光単位が付着した核酸配列であってもよい。蛍光単位は、プローブが標的核酸とハイブリダイズし、その後伸長ポリメラーゼ単位から改変されると放出され得る。前記プローブの例としては、ＴａｑＭａｎプローブが挙げられる。そのようなプローブをＰＣＲおよび光学的測定ツール（励起および検出のための）と併せて使用して、試料中の核酸濃度を数量化することができる。このプロセスは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはリアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）と称することができる。
【０１４５】
一部のインプリメンテーションでは、ＰＣＲを複数の鋳型分子のプールに対してではなく単一の分子鋳型に対して（単一分子ＰＣＲと称することができるプロセスで）実施することができる。例えば、エマルジョン−ＰＣＲ（ｅＰＣＲ）を使用して、単一の核酸分子を油エマルジョン中の水滴の中に封入することができる。水滴はＰＣＲ試薬も含み得、水滴を、ＰＣＲのための必要な温度サイクリングが可能な温度調節された環境で保持することができる。このように、複数の自蔵式ＰＣＲ反応を同時にハイスループットで行うことができる。界面活性物質を用いて油エマルジョンの安定性を改善することができる。マイクロ流体チャネルを通じて圧力を用いて液滴の動きを制御することができる。マイクロ流体デバイスは、液滴を創出するため、液滴を分割するため、液滴を同化させるため、材料を液滴中に注射するため、ならびに液滴をインキュベートするために使用することができる。油エマルジョン中の水滴のサイズは、少なくとも１ピコリットル（ｐＬ）、１０ｐＬ、１００ｐＬ、１ナノリットル（ｎＬ）、１０ｎＬ、１００ｎＬ、またはそれよりも大きいサイズであり得る。
【０１４６】
一部のインプリメンテーションでは、単一分子ＰＣＲを固相基板上で実施することができる。例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ固相増幅法またはその変形が挙げられる。鋳型プールを固相基板に暴露させ、ここで、固相基板は、鋳型をある特定の空間分解能で固定化することができるものである。次いで、各鋳型の空間的近傍でブリッジ増幅を行い、それにより、単一分子を基板上でハイスループット様式で増幅することができる。
【０１４７】
ハイスループット単一分子ＰＣＲは、互いに妨げる可能性がある区別可能な核酸のプールを増幅するために有用であり得る。例えば、複数の区別可能な核酸が共通配列領域を共有する場合、この共通領域に沿った核酸間の組換えがＰＣＲ反応中に起こり、その結果、新しい、組み換えられた核酸がもたらされる可能性がある。単一分子ＰＣＲでは、区別可能な核酸配列が互いに区画化され、したがって、相互作用することができないので、この潜在的な増幅エラーが防止される。単一分子ＰＣＲは、シークエンシングのための核酸を調製するために特に有用であり得る。単一分子ＰＣＲは、鋳型プール中のいくつかの標的の絶対的定量化のためにも有用であり得る。例えば、デジタルＰＣＲ（またはｄＰＣＲ）では、区別可能な単一分子ＰＣＲ増幅シグナルの頻度を使用して、試料中の出発核酸分子の数を推定する。
【０１４８】
ＰＣＲの一部のインプリメンテーションでは、全ての核酸に共通するプライマー結合性部位に対するプライマーを使用し、核酸の群を非弁別的に増幅することができる。例えば、プライマー結合性部位に対するプライマーは、プール中の全ての核酸に隣接している。これらの共通部位を一般的な増幅に用いて合成核酸ライブラリーを創出またはアセンブルすることができる。しかし、一部のインプリメンテーションでは、ＰＣＲを使用する。例えば、プライマーを前記標的化された核酸のサブセットにおいてのみ存在するプライマー結合性部位と使用することによって、標的化された核酸のサブセットをプールから選択的に増幅することができる。合成核酸ライブラリーは、サブライブラリーをより一般的なライブラリーから選択的に増幅するために、目的の潜在的サブライブラリーに属する核酸全てがそれらの端部に共通のプライマー結合性部位を共有する（サブライブラリー中では共通するが、他のサブライブラリーとは区別可能な）ように創出またはアセンブルすることができる。一部のインプリメンテーションでは、ＰＣＲを核酸アセンブリ反応（例えば、ライゲーションまたはＯＥＰＣＲなど）と組み合わせて、完全にアセンブルされたまたは潜在的に完全にアセンブルされた核酸を部分的にアセンブルされたまたはミスアセンブルされた（または意図されたものではないもしくは望ましくない）副産物から選択的に増幅することができる。例えば、アセンブリは、核酸を各端部配列上のプライマー結合性部位と、完全にアセンブルされた核酸産物のみが増幅のための必須の２つのプライマー結合性部位を含有するようにアセンブルすることを伴い得る。前記例では、部分的にアセンブルされた産物は、プライマー結合性部位を有する端部配列のいずれも含有しないまたはその一方のみを含有する可能性があり、したがって、増幅されないはずである。同様に、ミスアセンブルされた（または意図されたものではないもしくは望ましくない）産物は、端部配列のいずれも含有しないもしくはその一方のみを含有する、または両方の端部配列を含有するが誤った配向であるもしくは誤った量の塩基によって分離されている。したがって、前記ミスアセンブルされた産物は、増幅されないかまたは増幅されて誤った長さの産物が創出されるはずである。後者の場合、誤った長さの増幅されたミスアセンブルされた産物を、正しい長さの増幅された完全にアセンブルされた産物から、アガロースゲルでのＤＮＡ電気泳動、その後のゲル抽出などの核酸サイズ選択方法によって分離することができる。
【０１４９】
核酸増幅の効率を改善するために、ＰＣＲに添加剤を含めることができる。例えば、ベタイン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、非イオン性界面活性剤、ホルムアミド、マグネシウム、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはこれらの組合せの添加。添加剤含有量（体積当たりの重み）は、少なくとも０％、１％、５％、１０％、２０％、またはそれよりも多くであり得る。
【０１５０】
種々のポリメラーゼをＰＣＲのために使用することができる。ポリメラーゼは、天然に存在するものであっても合成されたものであってもよい。ポリメラーゼの例は、Φ２９ポリメラーゼまたはその誘導体である。一部の場合では、新しい核酸配列を構築するために、転写酵素またはリガーゼ（すなわち、結合の形成を触媒する酵素）をポリメラーゼと併せてまたはポリメラーゼの代替として使用する。ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変ポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼΦ２９（ファイ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｗポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ  ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｃａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、白金  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、ＫＡＰＡポリメラーゼ、Ｑ５ポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するクレノウ断片ポリメラーゼ、ならびにそのバリアント、改変製品および誘導体が挙げられる。異なるポリメラーゼは、異なる温度で安定かつ最適に機能し得る。さらに、異なるポリメラーゼは異なる性質を有する。例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼのような一部のポリメラーゼは、核酸伸長の間、より高い忠実度に寄与し得る３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を示し得る。一部のポリメラーゼは伸長の間リーディング配列を動かし得、一方、他のポリメラーゼは、それらを分解し得るまたは伸長を停止し得る。Ｔａｑのような一部のポリメラーゼは、アデニン塩基を核酸配列の３’末端に組み入れる。さらに、一部のポリメラーゼは、他のポリメラーゼよりも高い忠実度および処理能力を有し得、増幅された核酸収率のために最小の突然変異を有することが重要である場合、および区別可能な核酸の分布のために増幅全体を通して均一な分布を維持することが重要である場合のシークエンシング調製などのＰＣＲ適用により適切であり得る。
Ｅ．サイズ選択
【０１５１】
サイズ選択技法を使用して特定のサイズの核酸を試料から選択することができる。一部のインプリメンテーションでは、サイズ選択を、ゲル電気泳動またはクロマトグラフィーを使用して実施することができる。核酸の液体試料を固定相またはゲル（またはマトリックス）の一方の電極にロードすることができる。ゲルの負極が、核酸試料がロードされる電極になり、ゲルの陽極が逆の電極になるようにゲルにわたって電圧の差異をかけることができる。核酸は負に荷電したリン酸骨格を有するので、ゲルを渡って陽極に移動する。核酸のサイズにより、核酸がゲルを通る相対的な移動スピードが決定される。したがって、サイズが異なる核酸は、ゲル上でそれらが移動するにつれて分解される。電圧の差異は、１００Ｖまたは１２０Ｖであり得る。電圧の差異は、最大で５０Ｖ、１００Ｖ、１５０Ｖ、２００Ｖ、２５０Ｖ、またはそれよりも大きい差異であり得る。電圧の差異が大きいほど核酸移動のスピードおよびサイズ分解能が大きくなり得る。しかし、電圧の差異が大きいと、核酸またはゲルの損傷も生じ得る。より大きなサイズの核酸を分解するために、より大きな電圧の差異が推奨される場合がある。典型的な移動時間は１５分間から６０分間の間であり得る。移動時間は、最大で１０分間、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、またはそれよりも長い時間であり得る。より高い電圧と同様に、より長い移動時間により、より良好な核酸分解能を導くことができるが、核酸損傷の増大が導かれ得る。より大きなサイズの核酸を分解するために、より長い移動時間が推奨される場合がある。例えば、２００塩基の核酸を２５０塩基の核酸から分解するためには、１２０Ｖという電圧の差異および３０分という移動時間が十分であり得る。
【０１５２】
ゲル、またはマトリックスの性質は、サイズ選択プロセスに影響を及ぼし得る。ゲルは、一般には、ＴＡＥ（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ）またはＴＢＥ（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）などの伝導性緩衝剤中に分散したアガロースまたはポリアクリルアミドなどのポリマー物質を含む。ゲル中の物質（例えば、アガロースまたはアクリルアミド）の含有量（体積当たりの重み）は、最大で５％、１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、またはそれよりも多くであり得る。含有量が高いほど移動スピードが低下し得る。より小さな核酸を分解するために、より高い含有量が好ましい場合がある。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を分解するためにはアガロースゲルがより良好であり得る。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を分解するためにはポリアクリルアミドゲルがより良好であり得る。好ましいゲル組成物は、核酸型およびサイズ、添加剤（例えば、色素、染料、変性溶液、またはローディング緩衝剤）の適合性ならびに先行する下流の適用（例えば、ゲル抽出、次いでライゲーション、ＰＣＲ、またはシークエンシング）に依存し得る。アガロースゲルは、ゲル抽出に関してポリアクリルアミドゲルよりも単純であり得る。抽出プロセスにおけるホウ酸（酵素阻害剤）持ち越し汚染により下流の酵素反応が阻害される可能性があるので、ＴＡＥはＴＢＥほど良好な伝導体ではないが、同様にゲル抽出に関してはより良好であり得る。
【０１５３】
ゲルは、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）または尿素などの変性溶液をさらに含み得る。ＳＤＳは、例えば、タンパク質を変性させるためまたは核酸を潜在的に結合したタンパク質から分離するために使用することができる。尿素は、ＤＮＡの二次構造を変性させるために使用することができる。例えば、尿素により、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに変換することができる、または尿素により、フォールディングされたｓｓＤＮＡ（例えば、ヘアピン）をフォールディングされていないｓｓＤＮＡに変換することができる。ｓｓＤＮＡを正確に分解するために尿素−ポリアクリルアミドゲル（ＴＢＥをさらに含む）を使用することができる。
【０１５４】
試料をゲルに異なるフォーマットで組み入れることができる。一部のインプリメンテーションでは、ゲルは、試料を手動でロードすることができるウェルを含有し得る。１つのゲルが複数の核酸試料を流すための複数のウェルを有し得る。他のインプリメンテーションでは、ゲルを、核酸試料（複数可）を自動的にロードするマイクロ流体チャネルに付着させることができる。各ゲルはいくつかのマイクロ流体チャネルの下流にあってもよく、ゲル自体が別々のマイクロ流体チャネルを占有していてもよい。ゲルの寸法が核酸検出（または可視化）の感度に影響を及ぼし得る。例えば、薄いゲルまたはマイクロ流体チャネルの内側にあるゲル（例えば、バイオアナライザまたはテープステーション中のものなど）により、核酸検出の感度を改善することができる。核酸検出ステップは、正しいサイズの核酸断片を選択し、抽出するために重要であり得る。
【０１５５】
核酸サイズ参照のためにゲルにラダーをロードすることができる。ラダーは、核酸試料を比較することができる種々のサイズのマーカーを含有し得る。異なるラダーは異なるサイズ範囲および分解能を有し得る。例えば、５０塩基のラダーは、５０塩基、１００塩基、１５０塩基、２００塩基、２５０塩基、３００塩基、３５０塩基、４００塩基、４５０塩基、５００塩基、５５０塩基、および６００塩基のところにマーカーを有し得る。前記ラダーは、５０塩基から６００塩基のサイズ範囲内の核酸を検出し、選択するために有用であり得る。ラダーは、試料中の種々のサイズの核酸の濃度を推定するための標準物質として使用することもできる。
【０１５６】
核酸試料およびラダーをローディング緩衝剤と混合して、ゲル電気泳動（またはクロマトグラフィー）プロセスを容易にすることができる。ローディング緩衝剤は、核酸の移動の追跡を補助するための色素およびマーカーを含有し得る。ローディング緩衝剤は、核酸試料が試料ロードウェル（ランニング緩衝剤中に浸されていてもよい）の底部に沈むことを確実にするために、ランニング緩衝剤（例えば、ＴＡＥまたはＴＢＥ）よりも密度の高い試薬（例えば、グリセロールなど）をさらに含み得る。ローディング緩衝剤は、ＳＤＳまたは尿素などの変性剤をさらに含み得る。ローディング緩衝剤は、核酸の安定性を改善するための試薬をさらに含み得る。例えば、ローディング緩衝剤は、核酸をヌクレアーゼから保護するためのＥＤＴＡを含有し得る。
【０１５７】
一部のインプリメンテーションでは、ゲルは、核酸に結合し、異なるサイズの核酸を光学的に検出するために使用することができる染料を含み得る。染料は、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、またはその両方に特異的なものであってよい。異なる染料を異なるゲル物質に適合させることができる。いくつかの染料は、可視化のために光源光（または電磁波）からの励起を必要とする。光源光は、ＵＶ（紫外線）または青色光であり得る。一部のインプリメンテーションでは、染料をゲルに電気泳動前に添加することができる。他のインプリメンテーションでは、染料をゲルに電気泳動後に添加することができる。染料の例としては、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、銀染色、またはメチレンブルーが挙げられる。ある特定のサイズのｄｓＤＮＡを可視化するための信頼できる方法は、例えば、アガロースＴＡＥゲルをＳＹＢＲ  ＳａｆｅまたはＥｔＢｒ染色と一緒に使用することである。ある特定のサイズのｓｓＤＮＡを可視化するための信頼できる方法は、例えば、尿素−ポリアクリルアミドＴＢＥゲルをメチレンブルーまたは銀染色と一緒に使用することである。
【０１５８】
一部のインプリメンテーションでは、ゲルを通る核酸の移動を、電気泳動に加えて他の方法によって駆動することができる。例えば、重力、遠心分離、真空、または圧力を使用して、核酸を駆動してゲルを通し、その結果、それらの核酸をサイズに応じて分解することができる。
【０１５９】
刃または剃刀を使用してある特定のサイズの核酸をゲルから抽出して、核酸を含有するゲルのバンドを切り出すことができる。切り出しがある特定のバンドで的確に行われること、および、切り出しにより、異なる望ましくないサイズのバンドに属し得る核酸が首尾よく排除されることを確実にするために、適当な光学的検出技法およびＤＮＡラダーを使用することができる。ゲルバンドを緩衝剤と一緒にインキュベートしてゲルバンドを溶解させ、したがって、核酸を緩衝液中に放出させることができる。加熱または物理的撹拌により、溶解のスピードを上げることができる。あるいは、ゲルバンドを、緩衝剤中で、ゲル溶解を必要とせずにＤＮＡの緩衝液中への拡散を可能にするために十分に長くインキュベートすることができる。次いで、緩衝剤を残りの固相ゲルから、例えば、吸引または遠心分離によって分離することができる。次いで、核酸を溶液からフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、磁気ビーズ捕捉、および／またはシリカ膜吸着などの標準の精製または緩衝剤交換技法、洗浄、ならびに溶出を使用して精製することができる。このステップで核酸を濃縮することもできる。
【０１６０】
ゲル切り出しの代替として、ある特定のサイズの核酸を、ゲルから流出させることによってゲルから分離することができる。移動している核酸は、ゲルに埋め込まれたかまたはゲルの最後にあるたらい（またはウェル）を通過し得る。移動プロセスについて時間を計るまたは光学的にモニタリングし、したがって、ある特定のサイズの核酸群がたらいに入ったら、試料をたらいから収集することができる。収集は、例えば吸引によって行うことができる。次いで、核酸を、収集された溶液からフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、磁気ビーズ捕捉、および／またはシリカ膜吸着などの標準の精製または緩衝剤交換技法、洗浄、ならびに溶出を使用して精製することができる。このステップで核酸を濃縮することもできる。
【０１６１】
核酸サイズ選択のための他の方法としては、質量分光測定または膜に基づく濾過を挙げることができる。膜に基づく濾過の一部のインプリメンテーションでは、核酸を、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、またはその両方のいずれかに優先的に結合し得る膜（例えば、シリカ膜）を通過させる。膜は、少なくともある特定のサイズの核酸を優先的に捕捉するように設計することができる。例えば、膜を、２０塩基未満、３０塩基未満、４０塩基未満、５０塩基未満、７０塩基未満、９０塩基未満、またはそれよりも多くの塩基未満の核酸を濾過して取り除くように設計することができる。前記膜に基づくサイズ選択技法は、ゲル電気泳動またはクロマトグラフィーほどストリンジェントでない可能性がある。
Ｆ．核酸捕捉
【０１６２】
親和性タグ付き核酸を核酸捕捉のための配列特異的なプローブとして使用することができる。プローブを、核酸のプール内の標的配列と相補的になるように設計することができる。その後、プローブを核酸プールと一緒にインキュベートし、その標的とハイブリダイズさせることができる。インキュベーション温度は、ハイブリダイゼーションを容易にするためにプローブの融解温度を下回るようにすることができる。インキュベーション温度は、プローブの融解温度を摂氏５度下回る温度まで、１０度下回る温度まで、１５度下回る温度まで、２０度下回る温度まで、２５度下回る温度まで、またはそれよりも大きく下回るまであってよい。ハイブリダイズした標的を、親和性タグに特異的に結合する固相基板に捕捉することができる。固相基板は、膜、ウェル、カラム、またはビーズであり得る。複数のラウンドの洗浄により、ハイブリダイズしなかった核酸を全て標的から除去することができる。洗浄は、洗浄の間の標的配列の安定な固定化を容易にするためにプローブの融解温度を下回る温度で行うことができる。洗浄温度は、プローブの融解温度を摂氏５度下回る温度まで、１０度下回る温度まで、１５度下回る温度まで、２０度下回る温度まで、２５度下回る温度まで、またはそれよりも大きく下回る温度までであってよい。最終的な溶出ステップにより、核酸標的を固相基板から、ならびに親和性タグ付きプローブから回収することができる。溶出ステップは、核酸標的の溶出緩衝剤中への放出を容易にするためにプローブの融解温度を上回る温度で行うことができる。溶出温度は、プローブの融解温度を摂氏５度上回る温度まで、１０度上回る温度まで、１５度上回る温度まで、２０度上回る温度まで、２５度上回る温度まで、またはそれよりも大きく上回る温度までであってよい。
【０１６３】
ある特定のインプリメンテーションでは、固相基板に結合したオリゴヌクレオチドは、例えば、酸、塩基、酸化、還元、熱、光、金属イオン触媒作用、置換反応または脱離反応化学、または酵素的切断などの条件に対する暴露によって、固相基板から除去され得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、切断可能な連結部分を通して固相支持体に付着し得る。例えば、固相基板を官能化して、標的化オリゴヌクレオチドに共有結合するための切断可能なリンカーを提供してもよい。一部の実施形態では、リンカー部分は、６原子またはそれより多くの長さのリンカーであり得る。一部の実施形態では、切断可能リンカーは、ＴＯＰＳ（合成あたり２個のオリゴヌクレオチドの）リンカー、アミノリンカー、または光切断可能リンカーであり得る。
【０１６４】
一部のインプリメンテーションでは、ビオチンを、固相基板上のストレプトアビジンによって固定化される親和性タグとして使用することができる。ビオチン化オリゴヌクレオチドを、核酸捕捉プローブとして使用するために設計し、製造することができる。オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端をビオチン化することができる。オリゴヌクレオチドの内部のチミン残基をビオチン化することもできる。オリゴ上のビオチンを増加させることにより、ストレプトアビジン基板でのより強力な捕捉をもたらすことができる。オリゴの３’末端のビオチンにより、ＰＣＲの間にオリゴが伸長するのを遮断することができる。ビオチンタグは、標準のビオチンのバリアントであってよい。例えば、ビオチンバリアントは、ビオチン−ＴＥＧ（トリエチレングリコール）、二重ビオチン、ＰＣビオチン、デスチオビオチン−ＴＥＧ、およびビオチンアジ化物／アジドであり得る。二重ビオチンにより、ビオチン−ストレプトアビジン親和性を増大させることができる。ビオチン−ＴＥＧは、ＴＥＧリンカーで分離された核酸上のビオチン基に付着する。これにより、ビオチンが核酸プローブの機能、例えば、その標的とのハイブリダイゼーションに干渉するのを防止することができる。核酸ビオチンリンカーをプローブに付着させることもできる。核酸リンカーは、標的とハイブリダイズすることが意図されていない核酸配列を含み得る。
【０１６５】
ビオチン化核酸プローブは、その標的にいかによくハイブリダイズすることができるかを考慮して設計することができる。融解温度を高く設計された核酸プローブは、それらの標的により強力にハイブリダイズし得る。より長い核酸プローブ、ならびにＧＣ含量がより高いプローブは、融解温度が上昇するので、より強力にハイブリダイズし得る。核酸プローブは、少なくとも５塩基、１０塩基、１５塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、または１００塩基、またはそれよりも多くの塩基の長さを有し得る。核酸プローブは、０％から１００％の間のいずれかのＧＣ含量を有し得る。プローブの融解温度がストレプトアビジン基板の温度許容度を超えないことを確実にするために注意を払うことができる。核酸プローブは、オフターゲットの核酸を有するヘアピン、ホモ二量体、およびヘテロ二量体などの阻害性二次構造が回避されるように設計することができる。プローブ融解温度とオフターゲットの結合の間にトレードオフが存在し得る。融解温度が高く、オフターゲットの結合が低い最適なプローブの長さおよびＧＣ含量が存在し得る。合成核酸ライブラリーは、その核酸が効率的なプローブ結合性部位を含むように設計することができる。
【０１６６】
固相ストレプトアビジン基板は磁気ビーズであってよい。磁気ビーズを、磁気ストリップまたはプレートを使用して固定化することができる。磁気ストリップまたはプレートを容器と接触させて、磁気ビーズを容器に固定化する。逆に、磁気ストリップまたはプレートを容器から取り出して磁気ビーズを容器壁から溶液中に放出させることができる。異なるビーズの性質がそれらの適用に影響を及ぼし得る。ビーズは、種々のサイズを有し得る。例えば、ビーズは、直径１マイクロメートル（μｍ）から３マイクロメートル（μｍ）の間のいずれかであってよい。ビーズは、最大で１マイクロメートル、２マイクロメートル、３マイクロメートル、４マイクロメートル、５マイクロメートル、１０マイクロメートル、１５マイクロメートル、２０マイクロメートル、または２０マイクロメートルを超える直径を有し得る。ビーズ表面は疎水性であっても親水性であってもよい。ビーズを遮断性タンパク質、例えば、ＢＳＡでコーティングすることができる。使用前に、ビーズが核酸に非特異的に結合するのを防止するために、ビーズを洗浄するまたは遮断性溶液などの添加剤で前処理することができる。
【０１６７】
ビオチン化プローブを磁性ストレプトアビジンビーズとカップリングした後に核酸試料プールと一緒にインキュベートすることができる。このプロセスは、直接捕捉と称することができる。あるいは、ビオチン化プローブを核酸試料プールと一緒にインキュベートした後に磁性ストレプトアビジンビーズを添加することができる。このプロセスは、間接的な捕捉と称することができる。間接的な捕捉方法により、標的の収率を改善することができる。核酸プローブが短いほど、磁気ビーズにカップリングするために必要な時間量を少なくすることができる。
【０１６８】
核酸プローブと核酸試料の最適なインキュベーションは、プローブの融解温度を摂氏１〜１０度またはそれよりも大きく下回る温度で行うことができる。インキュベーション温度は、最大で摂氏５度、１０度、２０度、３０度、４０度、５０度、６０度、７０度、８０度、またはそれよりも高い温度であり得る。推奨されるインキュベーション時間は１時間であり得る。インキュベーション時間は、最大で１分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、またはそれよりも長い時間であり得る。インキュベーション時間が長いほど良好な捕捉効率を導くことができる。ビオチン−ストレプトアビジンカップリングを可能にするために、ストレプトアビジンビーズの添加後にさらに１０分間のインキュベーションを行うことができる。この追加的な時間は、最大で１分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、またはそれよりも長い時間であり得る。インキュベーションは、ナトリウムイオンなどの添加剤を伴う緩衝液中で行うことができる。
【０１６９】
核酸プールが一本鎖核酸である場合（二本鎖とは対照的に）、プローブとその標的のハイブリダイゼーションを改善することができる。ｓｓＤＮＡプールをｄｓＤＮＡプールから調製することには、一般にプール中の全ての核酸配列の端部に結合する１つのプライマーを用いて線形ＰＣＲを実施することが必要になり得る。核酸プールが合成により創出またはアセンブルされたものである場合、この共通のプライマー結合性部位を合成設計に含めることができる。線形ＰＣＲの産物はｓｓＤＮＡになる。核酸捕捉のためのより多くの出発ｓｓＤＮＡ鋳型をより多くの線形ＰＣＲのサイクルで生成することができる。
【０１７０】
核酸プローブがそれらの標的とハイブリダイズし、磁性ストレプトアビジンビーズとカップリングした後、ビーズを磁石によって固定化し、いくつかのラウンドの洗浄を行うことができる。非標的核酸を除去するためには３〜５回の洗浄で十分であり得るが、それよりも多いまたは少ないラウンドの洗浄を使用することができる。増やした洗浄各々により、標的化されていない核酸をさらに減少させることができるが、標的核酸の収率も低下し得る。洗浄ステップの間の標的核酸とプローブの適当なハイブリダイゼーションを容易にするために、低インキュベーション温度を使用することができる。摂氏６０度、５０度、４０度、３０度、２０度、１０度、または５度またはそれよりも低いという低さの温度を使用することができる。洗浄緩衝剤は、ナトリウムイオンを伴うトリス緩衝液を含み得る。
【０１７１】
ハイブリダイズした標的の磁気ビーズ−カップリングしたプローブからの最適な溶出を、プローブの融解温度と等しいまたはそれよりも高い温度で行うことができる。温度が高いほど、標的のプローブからの解離が容易になる。溶出温度は、最大で摂氏３０度、４０度、５０度、６０度、７０度、８０度、または９０度、またはそれよりも高い温度であり得る。溶出インキュベーション時間は、最大で１分間、２分間、５分間、１０分間、３０分間、６０分間またはそれよりも長い時間であり得る。典型的なインキュベーション時間はおよそ５分間であり得るが、より長いインキュベーション時間により、収率を改善することができる。溶出緩衝剤は、ＥＤＴＡなどの添加剤を伴う水またはトリス緩衝液であってよい。
【０１７２】
区別可能な部位のセットのうちの少なくとも１つ、または複数を含有する標的配列の核酸捕捉を、それらの部位の各々に対して複数の区別可能なプローブを用いて１つの反応で実施することができる。区別可能な部位のセットのあらゆるメンバーを含有する標的配列の核酸捕捉を、その特定の部位に対するプローブを使用して区別可能な部位各々に対して１つの反応である一連の捕捉反応で実施することができる。一連の捕捉反応後の標的の収率は低い可能性があるが、捕捉された標的をその後ＰＣＲで増幅することができる。核酸ライブラリーが合成により設計されたものである場合、標的は、ＰＣＲのために共通のプライマー結合性部位を有するように設計することができる。
【０１７３】
一般的な核酸捕捉のために共通のプローブ結合性部位を有する合成核酸ライブラリーを創出またはアセンブルすることができる。これらの共通部位を、完全にアセンブルされたまたは潜在的に完全にアセンブルされた核酸をアセンブリ反応から選択的に捕捉し、それにより、部分的にアセンブルされたまたはミスアセンブルされた（または意図されたものではないもしくは望ましくない）副産物を濾過して取り除くために使用することができる。例えば、アセンブリには、各端部配列にプローブ結合性部位を有する核酸を、完全にアセンブルされた核酸産物のみが、各プローブを使用して一連の２つの捕捉反応を通るのに必要な必須の２つのプローブ結合性部位を含有するようにアセンブルする。前記例では、部分的にアセンブルされた産物は、プローブ部位のいずれも含有しないまたは一方のみを含有する可能性があり、したがって、最終的に捕捉されないはずである。同様に、ミスアセンブルされた（または意図されたものではないもしくは望ましくない）産物は、端部配列のいずれも含有しないまたはその一方のみを含有する可能性がある。したがって、前記ミスアセンブルされた産物は、最終的に捕捉されない可能性がある。ストリンジェンシーを増大させるために、アセンブリの各成分に共通のプローブ結合性部位を含めることができる。各成分に対してプローブを使用したその後の一連の核酸捕捉反応により、完全にアセンブルされた産物（各成分を含有する）のみをアセンブリ反応のあらゆる副産物から単離することができる。その後のＰＣＲにより、標的富化を改善することができ、その後のサイズ選択により、標的ストリンジェンシーを改善することができる。
【０１７４】
一部のインプリメンテーションでは、核酸捕捉を使用して、標的化された核酸のサブセットをプールから選択的に捕捉することができる。例えば、前記標的化された核酸のサブセットにおいてのみ存在する結合性部位を有するプローブを使用することによって。合成核酸ライブラリーは、サブライブラリーをより一般的なライブラリーから選択的に捕捉するために、目的の潜在的なサブライブラリーに属する核酸の全てが共通のプローブ結合性部位を共有する（サブライブラリー中では共通であるが、他のサブライブラリーとは区別可能な）ように創出またはアセンブルすることができる。
Ｇ．凍結乾燥
【０１７５】
凍結乾燥は、脱水プロセスである。核酸および酵素の両方を凍結乾燥することができる。凍結乾燥された物質は、より長い寿命を有し得る。凍結乾燥プロセスを通して機能的産物（例えば、活性酵素）を維持するために、化学的安定剤などの添加剤を使用することができる。スクロースおよびトレハロースなどの二糖を化学的安定剤として使用することができる。
Ｈ．ＤＮＡ設計
【０１７６】
合成ライブラリー（例えば、識別子ライブラリー）を構築するための核酸の配列（例えば、成分）は、合成、シークエンシング、およびアセンブリの複雑化が回避されるように設計することができる。さらに、当該配列は、合成ライブラリーの構築費用が低減するように、かつ、合成ライブラリーを保管することができる寿命が改善されるように設計することができる。
【０１７７】
核酸は、合成するのが難しい場合がある長いホモポリマーの列（または繰り返された塩基配列）が回避されるように設計することができる。核酸は、２を超える、３を超える、４を超える、５を超える、６を超える、７を超えるまたはそれよりも長いホモポリマーの長さが回避されるように設計することができる。さらに、核酸は、それらの合成プロセスを阻害する可能性があるヘアピンループなどの二次構造の形成が回避されるように設計することができる。例えば、予測ソフトウェアを使用して、安定な二次構造を形成しない核酸配列を生成することができる。合成ライブラリーを構築するための核酸は、短く設計することができる。核酸が長いほど合成が難しく、費用がかかる可能性がある。核酸が長いほど、合成の間の突然変異の機会も増大する。核酸（例えば、成分）は、最大で５塩基、１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、６０塩基またはそれよりも多くの塩基であり得る。
【０１７８】
アセンブリ反応の成分になる核酸は、そのアセンブリ反応が容易になるように設計することができる。効率的なアセンブリ反応には、一般には、隣接成分間のハイブリダイゼーションが伴う。配列は、これらのオンターゲットのハイブリダイゼーション事象が促進されると同時に潜在的なオフターゲットのハイブリダイゼーションが回避されるように設計することができる。ロックド核酸（ＬＮＡ）などの核酸塩基修飾を使用して、オンターゲットのハイブリダイゼーションを強化することができる。これらの修飾核酸を、例えば、ステープル鎖ライゲーションにおけるステープルとして、または付着鎖ライゲーションにおける付着末端として使用することができる。合成核酸ライブラリー（または識別子ライブラリー）を構築するために使用することができる他の修飾塩基としては、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモｄＵ、デオキシウリジン、反転ｄＴ、反転ジデオキシ−Ｔ、ジデオキシ−Ｃ、５−メチルｄＣ、デオキシイノシン、Ｓｕｐｅｒ  Ｔ、Ｓｕｐｅｒ  Ｇ、または５−ニトロインドールが挙げられる。核酸は、１つまたは複数の同じまたは異なる修飾塩基を含有し得る。前記修飾塩基のいくつかは、より高い融解温度を有し、したがって、アセンブリ反応において特異的なハイブリダイゼーション事象を容易にするために有用であり得る天然の塩基類似体（例えば、５−メチルｄＣおよび２，６−ジアミノプリン）である。前記修飾塩基のいくつかは、全ての天然の塩基に結合することができ、したがって、望ましい結合性部位内に可変配列を有し得る核酸とのハイブリダイゼーションを容易にするために有用であり得るユニバーサル塩基（例えば、５−ニトロインドール）である。アセンブリ反応におけるそれらの有益な役割に加えて、これらの修飾塩基は、プライマーおよびプローブの核酸のプール内のそれらの標的核酸との特異的な結合を容易にするので、プライマー（例えば、ＰＣＲ用）およびプローブ（例えば、核酸捕捉用）に有用であり得る。
【０１７９】
核酸は、シークエンシングが容易になるように設計することができる。例えば、核酸は、二次構造、ひと続きのホモポリマー、反復配列、およびＧＣ含量が高すぎるまたは低すぎる配列などの典型的なシークエンシング複雑化が回避されるように設計することができる。ある特定のシークエンサーまたはシークエンシング方法は、エラープローンであり得る。合成ライブラリー（例えば、識別子ライブラリー）を構成する核酸配列（または成分）は、互いからのある特定のハミング距離で設計することができる。このように、シークエンシングにおいて塩基分解能エラーが高い率で生じる場合であっても、エラーを含有する配列のひと続きをなおそれらの最も可能性がある核酸（または成分）にマッピングし戻すことができる。核酸配列は、少なくとも１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基またはそれよりも多くの塩基の突然変異というハミング距離で設計することができる。ハミング距離の代替距離メトリクスを使用して、設計される核酸間の最小の必要距離を規定することもできる。
【０１８０】
いくつかのシークエンシング方法および計器では、アダプター配列またはプライマー結合性部位などの特定の配列を含有させるために入力核酸が必要になる。これらの配列は、「方法特異的配列」と称することができる。前記シークエンシング計器および方法の典型的な予備的ワークフローには、方法特異的配列を核酸ライブラリーとアセンブルすることが伴う。しかし、合成核酸ライブラリー（例えば、識別子ライブラリー）が特定の計器または方法でシークエンシングされることが前もって分かっている場合には、これらの方法特異的配列を、ライブラリー（例えば、識別子ライブラリー）を含む核酸（例えば、成分）中に設計することができる。例えば、合成核酸ライブラリーのメンバー自体が個々の核酸成分からアセンブルされるのと同じ反応ステップで、合成核酸ライブラリーのメンバー上にシークエンシングアダプターをアセンブルすることができる。
【０１８１】
核酸は、ＤＮＡ損傷を容易にし得る配列が回避されるように設計することができる。例えば、部位特異的ヌクレアーゼに対する部位を含有する配列を回避することができる。別の例として、ＵＶＢ（紫外線−Ｂ）光により、隣接するチミンがピリミジン二量体を形成し、次いでそれによりシークエンシングおよびＰＣＲが阻害されることが引き起こされ得る。したがって、合成核酸ライブラリーがＵＶＢに暴露される環境で保管されることが意図されている場合、その核酸配列を隣接するチミン（すなわち、ＴＴ）が回避されるように設計することが有益であり得る。
識別子ライブラリーを構築するためのシステム
【０１８２】
既に記載したように、プリンター−フィニッシャーシステム（またはＰＦＳ）として公知のプリントに基づくシステムを使用して、識別子を構築するための成分をコロケートしてアセンブルすることができる。
【０１８３】
本明細書において、情報を記憶させるために１つまたは複数の成分から識別子をアセンブルするためのシステムであって、（ａ）１つまたは複数の成分を基板上に吐出するためのプリンターであって、１つまたは複数の成分の各々が核酸配列を含むプリンターと、（ｂ）前記基板上の前記１つまたは複数の成分をアセンブルするためのフィニッシャーであって、１つまたは複数の核酸配列を物理的に連結するために必要な反応混合物および／または条件を提供するフィニッシャーとを含むシステムを提供する。
【０１８４】
一部のインプリメンテーションでは、前記プリンターは、複数のプリントヘッドをさらに含み、前記複数の各プリントヘッドは、１つまたは複数の成分を含む。一部のインプリメンテーションでは、前記プリンターは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多くのプリントヘッドを有する。一部のインプリメンテーションでは、前記複数の各プリントヘッドは、異なる成分を含む。一部のインプリメンテーションでは、各プリントヘッドは、少なくとも１つのノズルを含む。一部のインプリメンテーションでは、各プリントヘッドは、ノズル列を含む。一部の実施形態では、各プリントヘッドは、少なくとも１個、２個、３個、４個、またはそれより多くのノズル列を含む。一部のインプリメンテーションでは、プリントヘッドは、各々が同じインクを吐出するノズルのセットであると考慮され得る。一部の実施形態では、ノズル列は、同じインクを吐出する。一部のインプリメンテーションでは、ノズル列における特定のサブセットのノズルは、前記ノズル列における他のノズルとは異なるインクを吐出する。一部のインプリメンテーションでは、ノズル列は、少なくとも２０個、４０個、６０個、８０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、またはそれより多くのノズルを含む。一部の実施形態では、ノズル列における一部または全てのノズルを分離することができる。一部のインプリメンテーションでは、前記プリントヘッドは、前記成分を含む液滴を前記基板上に吐出する。一部のインプリメンテーションでは、前記プリントヘッドは、反応ミックスを含む液滴を前記基板上に吐出する。一部のインプリメンテーションでは、前記液滴は、体積中で少なくとも１ピコリットル、２ピコリットル、３ピコリットル、４ピコリットル、５ピコリットル、６ピコリットル、７ピコリットル、８ピコリットル、９ピコリットル、または１０ピコリットルである。一部のインプリメンテーションでは、前記液滴は、体積中で少なくとも１０ピコリットル、２０ピコリットル、３０ピコリットル、４０ピコリットル、５０ピコリットル、６０ピコリットル、７０ピコリットル、または８０ピコリットルである。一部のインプリメンテーションでは、前記プリンターは、プリンターベースをさらに含む。一部のインプリメンテーションでは、前記プリンターは、レジスター、スポットイメージャー、および／またはスポットドライヤーをさらに含む。一部のインプリメンテーションでは、前記１つまたは複数の成分は、溶液中にある。一部のインプリメンテーションでは、前記１つまたは複数の成分は、乾燥成分である。一部のインプリメンテーションでは、前記反応混合物はリガーゼを含む。リガーゼを使用して、核酸配列を含む異なる成分をライゲーションすることができる。一部のインプリメンテーションでは、前記条件は、温度条件である。一部のインプリメンテーションでは、前記基板は、前記プリンターおよび／または前記フィニッシャーの中を、線形の移動で通過する。一部のインプリメンテーションでは、前記線形の移動は、リール・トゥ・リールシステムによって制御される。一部のインプリメンテーションでは、前記スポットイメージャーは、カメラである。一部のインプリメンテーションでは、前記１つまたは複数の成分は、色素をさらに含む。一部のインプリメンテーションでは、前記反応ミックスは、色素を含む。色素は任意の核酸色素であり得る。色素は可視色素であり得る。
【０１８５】
一部のインプリメンテーションでは、前記基板は、ポリマー材料をさらに含む。一部のインプリメンテーションでは、前記プリントヘッドは、ＭＥＭＳ（微小電気機械システム）薄膜ピエゾ方式インクジェットヘッドまたはＭＥＭＳサーマル方式インクジェットヘッドである。一部のインプリメンテーションでは、前記１つまたは複数の成分は、添加剤を含む。一部のインプリメンテーションでは、添加剤は、前記１つまたは複数の成分と前記プリントヘッドとの適合性を提供する。一部のインプリメンテーションでは、添加剤は、溶質、湿潤剤、または界面活性剤である。一部のインプリメンテーションでは、前記スポットイメージャーは、ラインスキャン検査原理を使用する。一部のインプリメンテーションでは、前記フィニッシャーは、フィニッシャーベースをさらに含む。
【０１８６】
一部のインプリメンテーションでは、前記フィニッシャーは、スポット湿潤剤、スポットイメージャー、および／またはプーリングサブシステムをさらに含む。一部のインプリメンテーションでは、前記フィニッシャーは、プリントヘッドをさらに含む。一部のインプリメンテーションでは、前記フィニッシャーのプリントヘッドは、少なくとも１ｐＬ、５ｐＬ、１０ｐＬ、５０ｐＬ、１００ｐＬ、または２００ｐＬを有する体積を吐出する。一部のインプリメンテーションでは、前記フィニッシャーは、反応インキュベーションにとって最適である固定された内部温度を含む。一部のインプリメンテーションでは、前記フィニッシャーは、ローラーのループを含む。
プリンターベースシステム
【０１８７】
ＰＦＳは、各々が１つまたは複数の核酸分子を基板上に印刷することが可能である１つまたは複数のプリントヘッドの使用を伴い得る。生成すべき識別子ライブラリーを考慮して、所与のビットストリームを符号化する全ての識別子をアセンブルするタスクを、サブタスクに分割することができ、各サブタスクは識別子ライブラリーの一部を生成するステップを含む。この部分を、識別子ライブラリーの「セクター」と呼ぶことができる。セクターのサイズは、ＰＦＳによるセクターの生成におけるいかなるエラーもＰＦＳによって検出または補正され得るように選択することができる。エラーは、作動不良プリントヘッド、印刷の間または後の成分の意図しない混合、プリントヘッドによって吐出される試薬または核酸の体積の変動、プリントヘッドと基板上の標的座標（またはスポット）との間のミスアライメント、または高湿度もしくは低湿度による乾燥もしくは湿潤を含むがこれらに限定されないいくつかの起源によって引き起こされ得る。これらの原因のいくつかは、生成すべき１つまたは複数の識別子が生成されないというエラーをもたらし得る。このタイプのエラーは、欠損識別子エラーと呼ぶことができる。
【０１８８】
原因に応じて、一部の欠損識別子エラーは、ＰＦＳによって検出され得る。例えば、ＰＦＳは、１つまたは複数のカメラを使用して印刷されたセクターの全てまたは一部を自動的に検査し得る。ＰＦＳは、各印刷されたセクターの１つまたは複数のイメージを連続的にまたはプログラム可能な間隔で捕捉し、それらのイメージをコンピュータプロセシングに供し、指定された各反応が基板上で印刷されているか否かを検出することができる。別の実施形態では、ＰＦＳは、１つまたは複数のプリントヘッド上の１つまたは複数のノズルを連続的にまたはプログラム可能な間隔でモニターすることができ、およびそれらが反応物を基板上に印刷する際のノズルのイメージまたはビデオを捕捉することができる。ＰＦＳは、捕捉されたビデオまたはイメージをイメージプロセシングに供して、全ての意図される試薬および核酸液滴が反応に送達されたか否かを検出することができる。監視カメラは、可視光または他の周波数帯の光を使用してもよい。別の実施形態では、ＰＦＳは、基板の試験領域における全てのプリントヘッド上の全てのノズルからの１つまたは複数の試験パターンを定期的に印刷してもよい。ＰＦＳは、スポットイメージャーまたはカメラまたは一部の他のデバイスによる試験パターンプリンティングの結果を視覚的に捕捉または分析し、出力を分析に供してもよい。別の実施形態では、ＰＦＳは、試験パターンを印刷して、例えばゲル電気泳動などの１つまたは複数の化学的確認方法を使用してそれを分析してもよい。
【０１８９】
視覚的分析後、ＰＦＳが、指定された識別子の全てをアセンブルするために必要な一部または全ての成分が反応に印刷されなかったと結論した場合、ＰＦＳは、この結論をエラーログに報告し得る。ＰＦＳを制御する制御ソフトウェアは、印刷の間連続的にまたは後にこのログを分析し、そのような欠損識別子エラーを含有するセクターを再度プリントするように選択してもよい。ログから、制御ソフトウェアは、作動不良プリントヘッドまたはノズルを特定し、スペアのプリントヘッドまたはノズルを使用して残りのセクターを印刷してもよい。一実施形態では、制御ソフトウェアはまた、そのような不完全なセクターが最終的な識別子ライブラリーに含まれないように下流のプロセシングステップから欠損識別子エラーを有するセクターを除外してもよい。
【０１９０】
アセンブルされる識別子ライブラリーを指定して、指定ファイルのセットを介してＰＦＳに転送することができる。生成すべき識別子ライブラリーは、ブロックと呼ばれるより小さい単位のセットにおいて指定され得る。指定ファイルは、ＤＮＡ成分から識別子ライブラリーをアセンブルするために使用されるスキームを含有する書き込み指定ファイル、スキーム特異的パラメータのリスト、およびブロック指定ファイル名のリストを含む。ブロック指定は、ブロックメタデータファイルおよびブロックデータファイルを含み得る。ブロックメタデータファイルは、その長さ、ハッシュ、および他の構築物定義パラメータなどのブロックに関する情報を記載する。ブロックデータファイルは、ＰＦＳによって生成される識別子のセットを指定する。ブロックデータファイルは、データ圧縮アルゴリズムを使用して圧縮され得る。ブロックを含む識別子は、ツリー、トライ木、リスト、またはビットマップなどの、しかしこれらに限定されない指定されたデータ構造の形態で指定され得る。
【０１９１】
例えば、産物スキームを使用して生成される識別子ライブラリーを、成分ライブラリーパーティションスキームを含有するブロックメタデータファイル、および各層に使用される可能な成分の名称の一覧を用いて指定することができる。ブロックデータファイルは、トライの根から葉への各道が識別子を表し、道に沿った各ノードによりその識別子のその層において使用される成分名が指定される、シリアライズされたトライデータ構造として構成された生成される識別子を含有し得る。ブロックデータファイルは、このトライを、根から開始し、各ノードの左側の子ノードを見に行った後、ノード自体を見に行き、次いで、右側の子ノードを見に行く順序で横断することによってシリアライズすることを含み得る。
【０１９２】
ＰＦＳは、入ってきた指定ファイルに関する入力列をモニターし得る。新規指定を検出すると、ＰＦＳは、書き込み指定を読み、適切なプリントヘッドまたはノズルに供給された必要な成分によってそれ自身をプログラムすることができる。ＰＦＳは、ブロックメタデータおよびデータファイルを読み、それらを処理して、プリントヘッドのプリント指示を生成することができる。ＰＦＳは、各ブロックに関するこれらの指示をプリントヘッドに送り、プリントヘッドから各セクターに関するステータス情報を得ることができる。正確にまたは完全に印刷することができなかったセクターをログに報告し、自動的に再プリントすることができる。
例示的なＰＦＳ
【０１９３】
図１は、インクジェットプリンティング、例えばサーマル方式インクジェットプリンティング、バブルインクジェットプリンティング、および圧電方式インクジェットプリンティングを使用して、迅速かつハイスループット様式で成分からＤＮＡ識別子をアセンブルすることによって、ＤＮＡにデジタル情報を記憶させるシステムを例証する。システムおよびその異なるインプリメンテーションは、本明細書において以降「プリンター−フィニッシャーシステム」またはＰＦＳと称され、２つのサブシステム、すなわちプリンター１２０およびフィニッシャー１３０を含み得る。一部のインプリメンテーションでは、２つのサブシステム１２０、１３０は、個々に機能するためには互いに付着して従属し得る。他のインプリメンテーションでは、２つのサブシステム１２０、１３０は、分離していてもよく、独立して機能することが可能であり得る。
【０１９４】
プリンター１２０は、各々が溶液中のＤＮＡ成分（またはコプト）を含有するか、または一部のインプリメンテーションでは乾燥ＤＮＡ成分を含有する、プリントヘッド１２２の列を含む。本発明者らは、区別可能なＤＮＡ成分の各水溶液を「インク」または「カラー」と称することがある。プリントヘッド１２２は、基板（またはウェブもしくはウェビング）の座標上にｐＬスケールの液滴をプログラム可能に（オンデマンド方式で）吐出し得る。座標は、１マイクロメートル（μｍ）の直径／間隔、１０μｍの直径／間隔、５０μｍの直径／間隔、１００μｍの直径／間隔、１５０μｍの直径／間隔、２００μｍの直径／間隔、またはそれより多くであり得る。プリンターシステム１２０への入力は、水性成分／基板を含む。プリンターシステム１２０からの出力は、基板上の乾燥した多層スポットを含む。プリンター１２０の環境は乾燥（蒸発性）であり得る。
【０１９５】
フィニッシャー１３０は、成分を識別子にアセンブルするための反応ミックス（例えば、リガーゼミックス）を吐出するための機器部分（例えば、プリントヘッド）を含む。フィニッシャーシステム１３０への入力。フィニッシャー１３０は、基板（またはウェブもしくはウェビング）の各座標上に反応ミックスを吐出し得る。次いで、フィニッシャー１３０は、反応をインキュベートし、このように、基板からのアセンブルされた識別子を単一のプール１３２に統合する前にアセンブリを可能にし得る。一部のインプリメンテーションでは、反応ミックスは、フィニッシャーの部分としてではなくプリンターの部分として各座標に吐出され得る。他のインプリメンテーションでは、反応ミックスは、ＤＮＡ成分の前に各座標に吐出され得る。一部の実施形態では、可視色素を、反応混合物に組み入れることができる。
【０１９６】
基板（またはウェブ）１３６は、線形の（一次元的）動きによってプリンターおよびフィニッシャーの中を自動的に通過し得る。一定速度での線形の移動は、リール・トゥ・リールシステム（ローラー・トゥ・ローラー）１３４によって達成され得る。一部のインプリメンテーションでは、一定速度での線形の移動は、再循環または連続的なウェビングによって達成され得る。一部の実施形態では、一定速度での線形の移動は、スネイルトレイルに従うウェビングを使用して達成され得る。例えば、図７を参照されたい。一部のインプリメンテーションでは、一定速度での線形の移動は、らせん軌道に従うウェビングを使用して達成され得る。一部のインプリメンテーションでは、一定速度での線形の移動は、１８０度ねじれた軌道に従うウェビングを使用して達成され得る。例として、ウェビングは、システムによって各ローラーで１８０度のターンを受け、ウェビングは、表面を上にして全てのローラーを通過する。他のインプリメンテーションでは、基板を固定して、プリントヘッドを基板の上で二次元に移動させてもよい（例えば、ラスターパターンで）。
【０１９７】
図２は、プリンターサブシステム１２０をより詳細に示す。プリンターベース１２１は、プリントエンジン１２２、スポットイメージャー１２６、およびスポットドライヤー１２８を提供するウェブドライブを有するプリンターベースを含む。プリントエンジンは、アドレス指定スキームを支持するために印刷およびオーバープリントする。プリントエンジン１２２は、プリントヘッドを含み得る。プリントヘッドは、ウェブ１３６上の同じ座標に異なる成分をオーバープリントする、またはコロケートする、または重層するように設計される。単一のノズル、単一のプリントヘッド、複数のノズル、複数のプリントヘッド、またはその任意の組合せが、同じ座標上に成分をオーバープリントすることができる。プリントヘッドに加えて、プリンターは、必要に応じてレジスター１２４、スポットイメージャー１２６、およびスポットドライヤー１２８を含み得る。
【０１９８】
レジストレーションは、スポットのアライメント（マルチパスシステムの場合）を含む。レジスター１２４は、基板の座標上とプリントヘッドの間のアライメントを維持することを目的とするものである。これは、レジスターが基板の動きをリアルタイムで追跡することを可能にする特殊なマーキングによって基板を標識することによって達成され得る。他のインプリメンテーションでは、レジストレーションは、ローラー上のエンコーダーからの基板位置をデッドレコニングすることによって達成され得る。ウェブに沿ったアライメントの制御は、プリントヘッドからの吐出動作の時間を調整することによって行うことができる。ウェブを超えてのアライメントでは、基板またはプリントヘッドのいずれかがアクチュエーターを使用して移動する必要があり得る。
【０１９９】
スポットイメージャー１２６は、成分添加の確認を提供する。スポットイメージャー１２６は、成分または反応混合物の適切な吐出を確認することを目的とするカメラであり得る。スポットイメージャー１２６の機能を容易にするために、可視色素を、成分インクまたは反応混合物に組み入れてもよい。
【０２００】
スポットドライヤー１２８は、プリントヘッドの間で、またはプリンターを出る際に（例えば、基板が、プリンターを出た際に圧延されることが意図される場合）印刷された液滴を乾燥させることを目的とするものである。プリントヘッド間での液滴の乾燥は、オーバープリントプロセスの間に特定の座標に液体があふれ出るのを防止するために有用であり得る。各々のプリントヘッドは、少なくとも１ｐＬ、５ｐＬ、１０ｐＬ、２０ｐＬ、３０ｐＬ、４０ｐＬ、５０ｐＬ、またはそれより多くの液滴を吐出し得る。一部のインプリメンテーションでは、少なくとも１個、５個、１０個、２０個、５０個、１００個、またはそれより多くのプリントヘッドが、同じ座標に吐出し得る。
【０２０１】
プリンターサブシステムは、必要に応じて、基板およびコーティングモジュール１２９を含み得る。基板およびコーティングモジュール１２９は、ウェブ材料プラスコーティング／パターニングを含む。基板は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）またはポリプロピレンのような低結合性プラスチックなどの材料であってもよく、またはそれらの材料によってコーティングされてもよい。
【０２０２】
図３Ａ〜Ｄは、プリンター（例えば、図１のプリンター１２０）におけるプリントヘッド３００の例を描く。プリントヘッドは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くのインク（区別可能な成分溶液）を含有し得る。この特定の例では、本発明者らは、各ノズル列に関して１つのインクが提供される、最大４つのインクを含有し得るプリントヘッド３００を考慮する。加えてプリントヘッドは、インクあたり複数のノズル、例えば３００個のノズルを含有し得る。ある特定の例では、一部または全てのノズルによってアドレス可能なウェブ座標のセットは、ノズルが適切に位置揃えしていないために分離し得るが、それによって各インクはプリントヘッドを通じて線形に移動する基板の同じ座標上にオーバープリントし得る。または異なるインクのノズルは、所望のピッチで印刷するために適切な間隔を空けていない場合がある。これらの問題を解決するために、プリントヘッドは、所望のピッチで成分インクのオーバープリントを可能にするためにある角度で（ウェブの動きに対して）搭載され得る。図３Ｂ〜Ｄに例証するように、１６７μｍピッチで４つのインクのオーバープリントを可能にするためには約９度の回転で十分である。具体的には、図３Ｃは、プリントヘッドノズル３０２、３０４、３０６、３０８の４つの列を示す。列３０２、３０４、３０６、２０８の各々は、異なる成分を吐出し得る。基板３１２（矢印３１２によって指摘されるラインから上方および右に対角線方向に伸長する）は、プリントヘッド３００の下を線形に移動する。プリントヘッドの８．７度の回転のために、基板３１２上の座標３１４は、ライン３０７に沿って列３０２、３０４、３０６、３０８においてノズルのすぐ下を通過し、各ノズルは、座標３１４上に成分を蓄積し得る。図３Ｄに示すように、複数のプリントヘッド３００、３１０、３２０を、複数の基板上での同時印刷を可能にするために並行に配置することができる。一例では、プリントヘッドを作動させて、それらをオーバープリントにとって適したアライメントにすることができる。プリントヘッドは、ＭＥＭＳ（微小電気機械システム）薄膜ピエゾ方式インクジェットヘッドまたはＭＥＭＳサーマル方式インクジェットヘッドであり得る。プリントヘッドとの適合性を容易にするために成分インクに添加剤を添加してもよい。例えば、トリスのような溶質を添加して伝導性を増加することができる。一例として、湿潤剤または界面活性剤（例えば、グリセロール）を添加して、吐出品質およびプリントヘッドノズルの寿命を改善することができる。
【０２０３】
図４は、プリンター内のプリントヘッドの可能な配置を描く。基板は、長軸方向に通過していると仮定され、それによって異なるトラック（Ｔ１からＴ４）上のプリントヘッドが独立した座標上に印刷しているが、同じトラックに沿ったプリントヘッドは基板上の同じ座標上に印刷することができる（オーバープリント）。基板は、座標あたりより多くのＤＮＡ成分を受信するように、各回で新規プリントヘッド（または同じインクを充填した同じプリントヘッド）で、プリンターの中を複数回通過することができる。しかし、非常に多数のプリントヘッドが各トラックに沿って位置する場合、構築される識別子の所望の数に関して十分な数の成分を組み入れるために１回の通過で必要十分であり得る。例えば、識別子が各８個の成分の１０個の層の産物スキームで構築され（ギガビットを超えるデータを記憶させるために十分な８１０個の識別子を可能にする）、各プリントヘッドが４つの成分を印刷することができる場合、基板上の１回の通過で全ての成分セットがコロケーションにあることを可能にするために、トラックに沿って２０個のプリントヘッドを搭載すれば十分であり得る。複数のトラックは、基板（ウェブ）のより効率的な使用を可能にし、それによって基板をより短くすることを可能にし、よりハイスループット様式で識別子を構築することを可能にする。トラックよりも基板上の幅（長軸）が大きい場合、基板（またはプリントヘッドシャーシ）は、各通過後に長軸方向にシフトし、長さに沿うのではなく基板の幅に沿って空の基板上の印刷を可能にする。別の実施形態では、個別のプリンターベースシステムが、同じ基板の分離した部分に印刷し得る。
【０２０４】
図５は、プリンターサブシステムにおけるスポットイメージャーの例としてのセットアップを実証する。スポットイメージャーは、ラインスキャン検査原理を使用し得る。例えば、スポットイメージャーは、コンピュータシステム５２０、ディスプレイ５１０、ラインスキャンカメラ５３０、回転ドラム５４０、およびエンコーダー５５０を含み得る。コンピュータシステム５２０は、ラインスキャンカメラ５３０と通信している。例えば、コンピュータシステム５２０は、ラインスキャンカメラ５２０に制御信号を送信することができ、ラインスキャンカメラ５３０は、イメージデータをコンピュータシステム５２０に送信する。コンピュータシステム５２０およびラインカメラシステム５３０は、無線または有線接続を介して通信し得る。ラインスキャンカメラ５３０を介して回収されたイメージデータは、ディスプレイ５１０に表示される。図５に示すように、ラインスキャンカメラ５３０は、ドラム５４０のイメージを捕捉することができ、次いでこれがディスプレイ５１０に表示され得る。
【０２０５】
図６は、フィニッシャーサブシステム１３０をより詳細に示す。フィニッシャーサブシステム１３０は、ウェブドライブを有するフィニッシャーベース１４０、インキュベーション緩衝液、および吐出の提供、スポット湿潤剤１４４、スポットイメージャー１４６、およびプーリングサブシステム１４８を含む。反応ミックスを基板の各座標上に吐出する部分に加えて、フィニッシャーは、統合前に基板１３６の各座標上に反応阻害剤を吐出する部分１４２も含み得る。これらの吐出部分はプリントヘッドであり得る。それらはオンデマンドプリントヘッドであり得るが、ウェブに沿った各座標が吐出を受けると予想され得ることから、連続的印刷もまた十分であり得る。吐出体積は、ＤＮＡ成分が既に吐出されている各座標の面積を覆うために十分でなければならない。吐出体積は、少なくとも１ｐＬ、５ｐＬ、１０ｐＬ、２０ｐＬ、３０ｐＬ、４０ｐＬ、５０ｐＬ、６０ｐＬ、７０ｐＬ、８０ｐＬ、９０ｐＬ、１００ｐＬ、１５０ｐＬ、２００ｐＬ、またはそれより大きい体積であり得る。プリントヘッドは、ＭＥＭＳ（微小電気機械システム）薄膜ピエゾ方式インクジェットヘッドまたはＭＥＭＳサーマル方式インクジェットヘッドであり得る。プリントヘッドとの適合性を容易にするために、吐出された液体（例えば、マスターミックスまたは阻害ミックス）に添加剤を添加してもよい。例えば、トリスのような溶質を添加して伝導性を増加することができる。別の例として、湿潤剤または界面活性剤を添加して、吐出品質およびプリントヘッドノズルの寿命を改善することができる。さらに、ノズル−空気界面ならびに液滴が吐出された後の両方での蒸発を制御するために、グリセロールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような湿潤剤を添加してもよい。これらの湿潤剤は、反応産物の収量を増加させることによって反応ミックスにさらに利益を与え得る。
【０２０６】
プリンターサブシステムと同様に、フィニッシャーはまた、ウェブをプリントヘッドと位置揃えするためにおよび適切な吐出を確保するためにそれぞれ、レジスターおよびスポットイメージャー１４６を含み得る。スポットイメージャーの機能を容易にするために、可視色素を吐出される液体に組み入れてもよい。
【０２０７】
フィニッシャーは、反応ミックスの吐出後にローラー１３４のいくつかのループ（ウェビングのループを形成するために意図されるローラーの構成）をさらに含むことができ、それによってウェブ（基板）１３６上の反応物を反応統合前により長期間インキュベートすることができる。フィニッシャーは、反応物のインキュベーションにとって最適な固定された内部温度、例えば摂氏４度、１２度、２５度、３７度、またはそれより高い温度を含み得る。インキュベーション相の間に吐出された反応ミックスの蒸発を遅らせるよう制御するために、フィニッシャーは、固定された高い湿度レベルを含み得る。フィニッシャーサブシステム１３０の湿度レベルは、インキュベーション期間を通じて湿潤スポットの維持を制御するスポット湿潤剤１４４によって制御され得る（例えば、基板がローラー１３４の上を通過する間）。
【０２０８】
最後に、フィニッシャーは、インキュベーション後に全ての識別子アセンブリ反応を１つの容器に統合するためにプーリングシステム１４８を含み得る。反応阻害はこのステップの前に起こり得るか、またはこのステップの間に起こり得る。
【０２０９】
図７は、インキュベーション相の間にフィニッシャーの中にウェブを通過させるためのローラー７１０、７２０のループの例を示す。ウェブのループ形成により、より限定された空間内でより長いインキュベーションが可能となる。例えば、ウェブが１８０ｍｍ／ｓでシステムの中を移動する場合、５分間のインキュベーション時間では、インキュベートされるウェブの長さ約６０ｍが必要であるが、いくつかのループにより、この長さを、約６０ｍの線形トンネルではなくより限定された空間内でインキュベートすることが可能となる。インキュベーション時間がより短ければ、インキュベートされるウェブ長さをより短くすることが可能であり得る。例えば、４５秒間のインキュベーション時間は、約９ｍのインキュベートされるウェブの長さを可能にし得るが、１０秒間のインキュベーション時間は、約２ｍのインキュベートされるウェブの長さを可能にし得る。これらのインキュベートされるウェブの長さがより短い場合では、インキュベーションを小さい空間内に限定するために必要なウェブループはより少なくなり得る。
【０２１０】
ローラーループの幾何学のために、ウェビング７４０は、ある特定のローラー７２０を、表面を上にして通過し、他のローラー７１０では表面を下にして通過する。
【０２１１】
図の底部は、ウェブの移動経路に沿ったローラー７１０の断面を実証する。ローラーは、基板７４０の接点の間に谷（または溝、ポケット、もしくは他の任意のへこみ）７３０を含有するように設計することができ、それによって反応物（例えば、成分が吐出される座標）が谷の中を妨害されずに通過することができる。あるいは、ウェブは、それが表面を上にした構成（すなわち、１８０度ねじれた経路）でローラーの上を常に通過するように、ローラー間で１８０度回転してもよい。あるいは、ウェビングは、ローラーのセット周囲のウェビングの環状経路が、反応物を含有するウェビングの面がローラーに確実に接触しないように、インキュベーターの中でらせん軌道を移動し得る。同様に、シリンダー周囲にリボンを巻くことまたはグリップテープをテニスラケットに適用することも考慮する。
【０２１２】
一部のインプリメンテーションでは、ウェビングは、再循環または連続的なウェビングである。一部のインプリメンテーションでは、ウェビングは、リール・トゥ・リールシステム（ローラー・トゥ・ローラー）である。一部のインプリメンテーションでは、ウェビングは、スネイルトレイルに従う。例えば、図７を参照されたい。一部のインプリメンテーションでは、ウェビングはらせん軌道に従う。一部のインプリメンテーションでは、ウェビングは、１８０度ねじれた経路に従う。例として、ウェビングは、システムによって各ローラーで１８０度のターンを受け、ウェビングは、表面を上にした構成で全てのローラーを通過する。
【０２１３】
図８は、インキュベーションの間に予想される平衡体積に及ぼす反応ミックスグリセロール組成物およびフィニッシャー湿度の効果を例証する。粒子は、液相および気相の間を遷移する水分子を表す。液滴８２０は、ウェブ８１０において吐出された反応物を表す。外側に影を付けた領域は、水を表し、中央の影を付けた領域はグリセロールを表し、内側の影を付けた領域は溶質（例えば、ＤＮＡ、酵素／リガーゼ、塩／マグネシウム、トリス）を表す。高い湿度および高いグリセロール条件は、元の組成物と最も類似の平衡反応組成物をもたらす。しかし、平衡時の反応組成の変化は有益であり得る。例えば、ＤＮＡ成分の相対量の増加は、識別子のより高い産生収量をもたらし得る。同様に、グリセロール含有量の増加は、識別子産生を促進する込み合い効果を創出し得る。反応効率は、ある特定の溶質（塩のような）濃度の増加によって負の影響を受け得るが、反応ミックスに存在する最初の溶質を、意図的に過少濃縮して、反応液滴がその平衡時の組成および体積まで蒸発した後、最適な濃度で存在するように設計することができる。
【０２１４】
図９は、ウェブからの全ての反応物を１つの容器に統合するプーリングシステムを例証する。一連のローラー９０２は、ウェブ９１０を、噴霧洗浄機９１４、ならびにウェブ９１０からの反応物およびその識別子産物を捕捉するように設計された回収リザーバー９４２の中へと誘導する。このプロセスにおいて体積が過剰に蓄積するのを防止するために、回収液は、核酸を捕捉するために設計された膜の中を連続的または繰り返し流れ得る。例えば、膜は、シリカ膜であり得て、回収液は核酸の膜への結合を促進するために、ＤＮＡ結合緩衝液９１２であり得る。回収液は、統合体積中で反応が進行しないように反応を阻害するための添加剤をさらに含み得る。例えば、反応がライゲーション反応である場合、回収液は、リガーゼからのマグネシウムイオンをキレート化し、したがって反応を阻害するようにＥＤＴＡ（例えば、２５ｍＭ）を含有し得る。結合緩衝液は、一実施形態では、結合緩衝液の体積を最小限にするために、１つまたは複数の結合カラムの中を再循環することができる。ウェブ９１０は、ウェブ９１０からＤＮＡを除去するために液体によって湿潤化され、これは回収リザーバー内で液体中にウェブ９１０を沈めることと組み合わせることができる。ウェブ９１０または液体（例えば、力学的、流体、または超音波）の撹拌および／または加熱を使用して、ウェブ９１０からのＤＮＡの放出を促進してもよい。スクレイパー９１８は、この場合もウェブ９１０からＤＮＡの除去を助けるために、物理的スクレイパー、液体ジェットまたはガス（例えば、空気）ジェットであり得る。ウェブ９１０からのＤＮＡの放出を助けるために、１つまたは複数のスプレーを使用してもよい。
【０２１５】
ＤＮＡが、膜上に捕捉された後、これを、溶出およびさらなる評価のためにシステム（機械）から取り出すことができる。さらなる評価は、ＤＮＡをゲル上で泳動させるステップおよび予想される識別子の長さに対応するバンドサイズを選択するステップ（それによって、他の可能なオフターゲット産物から識別子を精製するステップ）を含み得る。本実施例では、標的識別子の長さは３００ｂｐである。ＤＮＡ出力を、必要に応じて、ゲルまたは他の濾過９４０の中に通過させてＤＮＡデータ９３０を得てもよく、これを凍結乾燥してもよい。
【０２１６】
反応ミックスを添加してプーリングの前または間に阻害する代わりに、このシステムでは、反応がプーリングステップで起こる別の実施形態が存在する。この実施形態では、成分は、インキュベーションプロセスの間ではアニールされるがアセンブルされず、次いでそれらを、成分を識別子にアセンブルするために反応ミックスおよび適切な環境条件（例えば、温度、ｐＨ、塩）を含有するプール中で共に統合する。この実施形態は、アニールされた成分がプールされると、反応の残りがシステム（機械）の外部で進行し得ることから、ウェブ９１０上でより短いインキュベーション時間を可能にし、フィニッシャーにおいてより厳密でないハードウェア必要条件を可能にし得る。この実施形態では、プールした反応物中の異なる識別子の成分間での望ましくない交叉アセンブリを防止するために、プーリングの前および間に成分が互いに強く確実にアニールすることに特に注意を払う必要がある。これは、強いアニーリングのために長い付着末端（およびハイブリダイゼーション領域）を有する成分を使用すること、ならびにアニールした産物を維持するためおよび非アニール産物の拡散を制限するためにプーリングステップにおいてより低い温度を使用することを伴い得る。
【０２１７】
図１０は、ＰＦＳを通じたデータ転送パイプラインの実施形態の概略図を描く。図１０は、１Ｔｂのデータを含有するソースストリーム１００２で開始する。ソースストリーム１００２は、コーデック１００４に転送され、ジョブモジュール１００６に供給される。ジョブモジュール１００６は、各ソースストリームおよび／またはコーデックファイルに関してジョブファイル、ブロックレコード、およびブロックデータを作成する。この情報を、ブロックモニター１００８に供給する。ジョブモジュール１００６は、ブロックモニター１００８と通信するジョブモニター１０１６によってモニターされる。ブロックモニター１００８は新規ブロックを観察し、ブロックの確認および印刷するためにこれらをパイプラインへ添加する。ジョブモジュール１００６からブロックデータ１０１０を分離し、ブロックリーダー１０１２に送信し、ここで必要なインクおよびプリントヘッドの構成を処理し、ブロックデータを印刷する。次いで、ブロックデータを、ブロックデータ１０１０およびデータ転送の精度を試験するように構成された「チャープ」を含むプリント可能なフレーム１０１４に変換する。次いで、フレーム１０１４を、プリンター１０３４と通信するドキュメントプリンターモジュール１０１８に送信する。例えば、ドキュメントプリンターモジュール１０１８は、フレーム１０１４をプリンター１０３４に送信して印刷させ、プリンター１０３４は、ドキュメントプリンター１０１８にフィードバックを送信する。いかなる破損１０２０も、フィニッシュコントローラー１０２２に通信し、テキストファイルまたは他の記憶方法１０２４に書き込まれる。ドキュメントプリンター１０１８と電子的に通信することに加えて、プリンター１０３４は、物理的ウェブセクター１０３６を受信する。ウェブセクター１０３６は、１つのコーナーでマーカーによって位置を確認される。各ウェブセクターは、一意のＩＤコードを有する。プリンター１０３２は、成分１０３２をウェブ上に蓄積する。次いでウェブは、フィニッシャー１０２６に続く。フィニッシャー１０２６は、フィニッシュコントローラー１０２２と通信する。フィニッシュコントローラー１０２２は、フレームまたは部分フレームに関する情報を送信し、フィニッシャー１０２６を完了させ、フィニッシャー１０２６は、フィニッシュコントローラー１０２２にフィードバックを送信する。プリンターおよびフィニッシャーシステム１０３４、１０２６の両方からのフィードバックは、フレームのセクター割付の記録、印刷時のウェブレジストレーションの調整、および品質管理、および不成功フレームの記録を容易にする。フィニッシャー１０２６を出た後、ウェブは印刷されて完了し１０２８、ＤＮＡスポット１０３０を有する基板をもたらし、次いでこれをプーリングシステムまたは他の任意の適した記憶方法に送る。
【０２１８】
図１１は、４つのモジュール：シャーシモジュール、プリントエンジンモジュール、インキュベーターモジュール、およびプーリングモジュールを含むＰＦＳの実施形態を例証する。シャーシモジュールの機能は、システムの全てのモジュールを通じてウェビングの移動を駆動する、安定化する、および制御するベースシステムを提供することであり得る。プリントエンジンモジュールの機能は、ＤＮＡ成分ならびに他の材料および試薬をウェビングにおける反応液滴に印刷することであり得る。インキュベーターモジュールの機能は、反応液滴中の産物（例えば、アセンブルされたＤＮＡまたは識別子）収量の改善のための時間および環境制御を提供することであり得る。プーラーモジュールの機能は、ウェビングからの反応液滴を除去して１つの容器にそれらを統合することであり得る。
【０２１９】
一部の実施形態では、反応液滴は、酵素ライゲーションを通じてＤＮＡ識別子をアセンブルすることができる。一部の実施形態では、反応液滴は、クリックケミストリーを通じてＤＮＡ識別子をアセンブルすることができる。
【０２２０】
一部の実施形態では、インキュベーターモジュールは、１００メートル、５０メートル、２５メートル、１０メートル、５メートル、１メートル、または０．１メートル、またはそれ未満のウェビングを含み得る。一部の実施形態では、ＰＦＳは、インキュベーターモジュールを有しなくてもよい。
【０２２１】
一部の実施形態では、プリントエンジンまたはインキュベーターは、ウェビングにおいて反応液滴が蒸発する際に反応液滴中の体積を補充するために間欠的なプリントヘッドまたは吐出サブモジュールを含有することができる。
【０２２２】
一部の実施形態では、ＰＦＳの中を通過するウェビングは、プリントエンジンの前でロールから巻き戻され、プーラー後にロール上で再度巻くことができる。一部の実施形態では、ウェビングは、プーラー後にプリントエンジンを再度通過する連続的なループを形成し得る。
【０２２３】
図１２は、反応液滴をエマルション１２６０にプールするＰＦＳの実施形態を例証する。エマルション１２６０は、反応液滴と混和性ではないオイルまたは任意の液体を含むことができ、それによって反応液滴１２５０が、プールされた後でもその内容物を維持することを可能にする。ＰＦＳのウェビング１２２０は、プリントヘッド１２１０の下を通過する（例えば、ローラー１２３０および１２４０を介して）前にオイルによってコーティングすることができる。反応液滴１２５０は、エマルション中でそのサイズおよび形状を制御するために界面活性剤および他の添加剤を含有し得る。界面活性剤および添加剤はまた、エマルション内の安定性を促進し、異なる反応液滴の間の融合を防止することができる。プールされた乳化反応液滴を、マイクロ流体デバイスの中に通過させることができる。プールされた乳化反応液滴をインキュベートすることができる。その上、プールされた乳化反応液滴を凝集させて、エマルションから単離することができる。
【０２２４】
図１３は、反応液滴１３５０が、ウェビング１３２０上に印刷された後に、オイル（または別の非混和性の液体）１３７０によってコーティングされるＰＦＳの実施形態を例証する。オイルコーティングは、ウェビング１３２０がローラー１３３０および１３４０を介してプリントヘッドクラスター１３１０の下を通過する際に、反応液滴１３５０上にオイルを印刷、吐出、または噴霧するオイル吐出サブモジュール１３８０によって起こり得る。オイルは、ウェビング１３２０上の反応液滴の蒸発を弱めるかまたは防止することができる。反応液滴は、界面活性剤および他の添加剤を含有し得る。オイルで覆われた反応液滴１３７０を、エマルション１３９０にプールすることができる。プールされた乳化反応液滴は、マイクロ流体デバイスの中に通過させることができる。プールされた乳化反応液滴をインキュベートすることができる。その上、プールされた乳化反応液滴を凝集させて、エマルションから単離することができる。
【０２２５】
図１４は、反応液滴１４５０が印刷したＤＮＡ成分に結合するビーズを含有するＰＦＳの一実施形態を例証する。ビーズは、ＤＮＡに結合するシリカ、カルボキシル基、またはアミンもしくはイミダゾール部分によってコーティングすることができる。あるいはまたは加えて、ビーズを、ビオチン結合を通じてＤＮＡ成分に結合するストレプトアビジンによってコーティングしてもよい。ビオチンは、光切断可能リンカーまたはＵＶ切断可能リンカーによってＤＮＡ成分に連結され得る。
【０２２６】
ウェビング１４２０は、プリントヘッド１４１０の下を通過する（例えば、ローラー１４３０および１４４０を介して）前にビーズによって広く覆うことができ、またはビーズによってパターン形成することができる。あるいは、または加えて、ビーズを、反応液滴１４５０の各々に蓄積または印刷してもよい。反応液滴は、ビーズへのＤＮＡ結合を促進する添加剤を含有し得る。ビーズは、反応液滴あたり１個、２個、３個、５個、１０個、２０個、５０個、１００個またはそれより多くの量であり得る。
【０２２７】
反応液滴１４５０は、ＤＮＡのビーズへのさらなる会合を防止する溶液１４６０中にプールすることができる。溶液１４６０は、ＢＳＡなどの遮断剤を含有し得る。プールした溶液中のＤＮＡ結合ビーズを溶液から分離して、乾燥させることができる１４７０。分離は遠心分離を通じて起こり得る。別の実施形態では、ビーズは磁性であり得て、それらは磁石によって分離することができる。
【０２２８】
プールしたＤＮＡ結合ビーズ（乾燥１４７０または溶液１４６０中）を、乳化した反応液滴中にさらに封入してもよい。一実施形態では、ＤＮＡ結合ビーズは各々、マイクロフルイディクスを使用して反応液滴中に封入される。別の実施形態では、ＤＮＡ結合ビーズは各々、液滴が自然に形成するように、反応溶液およびオイル（または別の非混和性の液体）を混合することによって反応液滴中で封入される。自然形成する反応液滴のＤＮＡ結合ビーズに対する比率は、反応液滴が１つより多くのＤＮＡ結合ビーズを含有する可能性がないように調整することができる。反応液滴は、そのサイズを制御するために、または他の反応液滴の融合を防止するために界面活性剤または他の添加剤を含有し得る。
【０２２９】
反応液滴は、ビーズ上のＤＮＡを解離させる試薬を含有し得る。反応液滴は、識別子を形成するためにＤＮＡ成分を共にライゲーションする試薬を含有し得る、反応液滴は、酵素リガーゼならびにＡＴＰ、ＤＴＴ、または塩などのライゲーション補助因子を含有し得る。
【０２３０】
ＤＮＡが、光切断可能なまたはＵＶ切断可能な結合を通じてビーズに結合する場合、ＤＮＡは、エマルションを適切な波長（例えば、光またはＵＶ）の電磁波に曝露することによってビーズから放出され得る。
【０２３１】
図１５は、ビーズに結合したＤＮＡ成分がエマルションを使用して識別子にどのように処理され得るかの例を例証する。ステップ１５１０では、ＤＮＡ結合ビーズを提供する。ＤＮＡ結合ビーズを１５２０で乳化し、反応ミックス液滴中で封入したＤＮＡ結合ビーズをオイル中に浸漬する。次いで、ＤＮＡを解離させて、混合物１５３０を得る。解離したＤＮＡ混合物をインキュベートし、１５４０のアセンブルされたＤＮＡをもたらす。
【０２３２】
例示的なインプリメンテーションを、本明細書において示し記載してきたが、そのようなインプリメンテーションは、単なる例として提供されることは当業者に明白であろう。複数の変更、変化、および置換が当業者に想起されるであろう。本明細書に記載のインプリメンテーションに対する様々な代替を使用してもよいと理解すべきである。
ＰＦＳサイズを減少させるための例としての改変
【０２３３】
図１１に既に記載したように、ＰＦＳは、４つのモジュール：シャーシ、プリントエンジン、インキュベーター、およびプーラーを含み得る。１Ｔｂの情報をＤＮＡに符号化するＰＦＳの場合、各モジュールのサイズの近似値は以下の表に記載する通りであり得る。
表1.モジュールサイズの近似値
【表１】
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【０２３４】
ＰＦＳのサイズを減少させるために、個々のモジュールのサイズを低減させてもよく、またはモジュールを除去してもよい。サイズを減少させるための改変の例は、以下を含み得る：
（１）プリントエンジンにおけるプリントヘッド容量を増加させること。カスタムプリントヘッドまたは追加のプリントヘッドのいずれかを使用して、ノズルカラム数を３倍（またはそれより大きい倍数の増加）にすることができる。これは、ウェビングにおけるプリント反応の数ならびにプリント幅を３倍にすることができる。
（２）再循環ウェビングを使用すること。例えばＰＦＳは、１Ｔｂの情報を符号化するために十分な反応を印刷するために２１キロメートルのポリプロピレンウェビングを使用することができる。ウェビングリール（またはロール）を使用せずに済むように、再循環ウェビングを、ロール・トー・ロールウェビングの代替として使用してもよい。回収試験から、ＤＮＡを、プーラー中のウェブから容易に取り出すことができることが示されている。
（３）ライゲーション反応時間を短縮すること。これによって、より小さいインキュベートターの使用またはインキュベーターを全く使用しないことが容易になり得る。収量を犠牲にすることなくライゲーション反応時間を減少させるために、ケミストリーを最適化してより高いライゲーション速度を満たすことができる。
（４）室温および周囲条件でライゲーションを実施すること。これにより、インキュベーターモジュールの必要がなくなり得る。
（５）反応液滴の体積を維持するため、またはライゲーションをプーラー後に開始させるもしくは継続させることを可能にするために、オイルエマルションを使用すること。これにより、インキュベーターモジュールの必要がなくなり得る。
【０２３５】
例示的な実施形態を、本明細書において示し記載してきたが、そのような実施形態は、単なる例として提供されることは当業者に明白であろう。複数の変更、変化、および置換が当業者に想起されるであろう。本明細書に記載の実施形態に対する様々な代替を使用してもよいと理解すべきである。
組合せＤＮＡアセンブリの方法およびシステムの適用
【０２３６】
成分を大きな定義された識別子のセットに組合せアセンブリするための本明細書に記載の方法およびシステムをこれまでに情報技術（例えば、データ記憶、計算、および暗号法）に関するものとして記載した。しかし、これらのシステムおよび方法は、より一般的には、ハイスループット組合せＤＮＡアセンブリの任意の適用のために使用することができる。
【０２３７】
一実施形態では、アミノ酸の鎖を符号化する組合せＤＮＡのライブラリーを創出することができる。それらのアミノ酸の鎖は、ペプチドまたはタンパク質のいずれかを表し得る。アセンブリのためのＤＮＡ断片は、コドン配列を含み得る。断片がそれに沿ってアセンブルされる接合部は、コンビナトリアルライブラリーの全てのメンバーに共通する機能的にまたは構造的に不活性なコドンであり得る。あるいは、断片がそれにそってアセンブルされる接合部は、後にプロセシングされたペプチド鎖に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡから最終的に除去されるイントロンであり得る。ある特定の断片は、コドンではなく、コドンの各組合せ列で一意にタグ付けされた（他のアセンブルされたバーコードと組み合わせて）バーコード配列であり得る。アセンブルされた産物（バーコード＋コドンの列）を一緒にプールし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現アッセイのために液滴の中に封入することができる、または、一緒にプールし、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現アッセイのために細胞に導入してそれを形質転換することができる。アッセイは、蛍光出力を有し得、したがって、液滴／細胞を蛍光強度によって選別してビンの中に入れ、その後、それらのＤＮＡバーコードを、各コドン列を特定の出力と相関付けるためにシークエンシングすることができる。
【０２３８】
別の実施形態では、ＲＮＡを符号化する組合せＤＮＡのライブラリーを創出することができる。例えば、アセンブルされたＤＮＡは、マイクロＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡの組合せを表し得る。プールされたｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにおけるＲＮＡ発現アッセイを、液滴または細胞のいずれかを用い、また、どの液滴または細胞がどのＲＮＡ配列を含有するかに関する追跡を維持するためにバーコードを用いて上記の通り実施することができる。しかし、出力自体がＲＮＡシークエンシングデータである場合には、一部のプールされたアッセイを液滴または細胞の外で行うことができる。そのようなプールされたアッセイの例としては、ＲＮＡアプタマースクリーニングおよび試験（例えば、ＳＥＬＥＸ）が挙げられる。
【０２３９】
別の実施形態では、代謝経路内の遺伝子を符号化する組合せＤＮＡのライブラリーを創出することができる。各ＤＮＡ断片は、遺伝子発現構築物を含有し得る。断片がそれに沿ってアセンブルされる接合部は、遺伝子間にある不活性なＤＮＡ配列を表し得る。プールされたｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにおける遺伝子経路発現アッセイを、液滴または細胞のいずれかを用いて、また、どの液滴または細胞がどの遺伝子経路を含有するかに関する追跡を維持するためのバーコードを用いて上記の通り実施することができる。
【０２４０】
別の実施形態では、異なる遺伝子調節エレメントの組合せを有する組合せＤＮＡのライブラリーを創出することができる。遺伝子調節エレメントの例としては、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、リボソーム結合性部位（ＲＢＳ）、イントロン、エクソン、プロモーター、ターミネーター、および転写因子（ＴＦ）結合性部位が挙げられる。プールされたｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにおける遺伝子発現アッセイを、液滴または細胞のいずれかを用い、また、どの液滴または細胞がどの遺伝子調節構築物を含有するかに関する追跡を維持するためのバーコードを用いて上記の通り実施することができる。
【０２４１】
別の実施形態では、組合せＤＮＡアプタマーのライブラリーを創出することができる。ＤＮＡアプタマーのリガンドに結合する能力を試験するためにアッセイを実施することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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