(57)【要約】  本発明は、培養された微生物及び／又はその成長副生成物を含む微生物ベースの組成物、これらの組成物を製造する方法、ならびに、例えば、ヒトの健康、農業、林業及び動物の畜産におけるそれらの使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機物中に存在するフィチン酸からリン酸塩を遊離する組成物であって、Wickerhamomyces anomalus酵母及び／又は１つ以上の微生物成長副生成物と担体とを含む組成物。
【請求項２】
前記成長副生成物は、フィターゼである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記酵母の培養から得られる発酵ブロスを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記酵母は、
糖蜜２〜５％、
尿素０．１〜０．３％及び
ペプトン２．０〜３．０％
を含む培養培地中で培養される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
１つ以上のバイオサーファクタントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記１つ以上のバイオサーファクタントは、糖脂質リポペプチド、フラボリピド、リン脂質、脂肪酸エステル化合物、リポタンパク質、リポ多糖−タンパク質複合体、及び／又は多糖−タンパク質−脂肪酸複合体である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
フィチン酸塩及び／又はフィチン酸の１つ以上の供給源をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
１つ以上の栄養素及び／又はプレバイオティクスをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
有機物中のフィチン酸からリンを遊離する方法であって、Wickerhamomyces anomalus酵母及び／又は１つ以上の微生物成長副生成物と担体とを含む組成物を、前記有機物に適用することを含む方法。
【請求項１０】
前記組成物と前記有機物とを混合することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機物は、作物残渣、糞、堆肥、庭塵芥、コーヒー粉、おがくず、蒸留穀物、リグニン及び醸造者の使用済み穀物から選択される有機廃棄物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記有機廃棄物は、農作物畑の表面に広がる作物残渣である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記有機物は、堆肥である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記有機物は、ナッツ、シード、マメ科植物、ジャガイモ及び豆から選択される植物体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記有機物は、土壌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
Wickerhamomyces anomalus酵母及び／又は１つ以上の微生物成長副生成物と担体とを含む組成物を土壌に適用して、前記土壌中に存在するフィチン酸からリン酸塩を遊離する、土壌を濃縮する方法。
【請求項１７】
前記組成物で前処理された有機廃棄物が土壌に適用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
植物が前記濃縮土壌中で生育されるか、又は生育されることになる、農業又は林業における生産を増進するためにさらに使用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記植物の成長及び／又は収量を増進するために使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記植物におけるリン欠乏を処置及び／又は予防するために使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
動物畜産における生産を増進する方法であって、有効量のWickerhamomyces anomalus酵母及び／又は１つ以上の微生物成長副生成物と、任意で、担体を含む組成物を、動物の飲料水及び／又は飼料に、栄養補助食品及び／又は消化補助食品として適用するか、又は前記組成物を処方することを含む、方法。
【請求項２２】
前記動物畜産は、家畜飼育である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記動物畜産は、水産養殖である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記動物におけるリン欠乏を処置及び／又は予防するために使用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ヒトの健康を増進する方法であって、有効量のWickerhamomyces anomalus酵母及び／又は１つ以上の微生物成長副生成物と担体とを含む組成物を、栄養補助食品及び／又は消化補助食品としてヒト対象に投与することを含む、方法。
【請求項２６】
前記組成物は、ヒト対象に経口投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象におけるリン欠乏を処置及び／又は予防するために使用される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
フィチン酸が、対象の消化管のミネラル吸収を損なうことを防止するために使用される、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願を相互参照
本出願は、２０１８年８月２０日出願の米国仮出願第６２／７１９，７６０号の優先権を主張するものであり、その全体が内容を参照することにより組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
農業、園芸、林業、畜産、及び水産養殖産業では、いくつかの共通の問題が、コストを低く保ちながら成長及び収量を最大化する能力を妨げている。これらには細菌、真菌、及び他の害虫や病原体によって引き起こされる感染症や寄生、飼料コストの高さ、化学肥料のコストの高さのほか、環境や健康への影響、農作物や家畜にリン等の必須栄養素を利用可能な形で提供することの難しさ等が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、再生不可能な資源の枯渇、及び温室効果ガス（ＧＨＧ）排出が環境及び世界の生態系の健康に及ぼす影響に関する懸念が高まっている。
【０００３】
リン（Ｐ）はすべての生体にとって必須の主要栄養素である。植物において、Ｐは、主に無機リン酸塩（Ｐｉ）として根によって根圏から取り込まれる。Ｐｉは、作物収量を最大にするために大量に必要とされる。しかしながら、土壌中では、リンの最大パーセンテージは、リン貯蔵分子、フィチン酸、又は塩形態のフィチン酸塩の形態で存在している。フィチン酸の加水分解は、部分的な酸又は塩基加水分解によって、又はホスファターゼ酵素を用いた加水分解によって、リン酸塩、イノシトール及び種々のイノシトールリン酸中間体を含む副生成物を用いて実施することができる。
【０００４】
フィチン酸の変換を触媒する酵素は、フィターゼとして知られている。フィターゼは、例えばBacillus subtilis及びPseudomonas spp.を含む細菌、Saccharomyces cerevisiaeを含む酵母、ならびにAspergillus terreus及びAspergillus ficuumを含む真菌等のある種の微生物によって生成される。フィターゼはまた、いくつかの植物種において少量で内因的に存在する。
【０００５】
土壌中のフィチン酸は、ほとんどの植物が取り込むことができず、未使用の土壌、ならびに土壌中の植物デトリタス及び他の有機物中に蓄積する。これは、根圏中の酵素レベルが低いこと、及び／又はフィチン酸塩が土壌固相に強く結合していることに起因する可能性がある。この障害を克服するための１つの戦略は、土壌結合フィチン酸を可溶化するための滲出物及び／又は酵素を生成する植物の能力を改善するべく、植物作物を遺伝子操作することである。しかしながら、このプロセスは費用がかかり、複雑であり、多くの消費者は、遺伝子組み換え作物の販売及び／又は消費に反対している。
【０００６】
リン欠乏はまた、家畜飼育における課題であり、そして、例えば、不妊症、哺乳動物における乳生産の減少、及び不適切な骨石灰化をもたらし得る。フィチン酸は、多くの穀物及びマメ科植物において見出されるが、化合物を代謝することができない、あるいはあまり代謝しない多くの非反芻動物の反栄養素であると考えられる。
【０００７】
ヒト及び他の単胃動物（例えば、ブタ、家禽及び魚）は、フィチン酸を代謝するのに必要な酵素を生成するとしても、不十分な量である。フィチン酸の加水分解は、結腸で起こるが、無機リンは小腸でのみ吸収されるため、栄養価はない。結果として、有意な量の栄養的に重要なリンは、ヒト及び／又は他の単胃動物に使われない。
【０００８】
さらに、フィチン酸は、カルシウム、鉄、亜鉛、マグネシウム、マンガン、銅及びモリブデン等のタンパク質及び二価カチオンと錯体を形成するため、動物の消化系へのバイオアベイラビリティを低下させる。例えば、大量のフィチン酸含有食品の摂取は、カルシウム、鉄及び／又は亜鉛欠乏等の、ヒトにおけるミネラル欠乏をもたらし得る。また、フィチン酸は、デンプンに結合し、その消化性及び溶解性に影響を及ぼす。したがって、単胃動物には、適切な成長及び健康を確保するために、無機リンを含有する栄養補助食品を与えなければならないことが多い。
【０００９】
動物及び微生物の遺伝子改変もまた、有機リン化合物の消化を改善するために試みられてきた。例えば、ブタも大腸菌も、フィターゼの生成及び／又は生成増加をコードする遺伝子を有するように操作されてきた。
【００１０】
他方、反芻動物は、フィチン酸を消化可能なリンに変換することができる酵素を生成する微生物を反芻胃に有することができる。しかし、土壌の植物バイオアベイラブルなリンが低い地域で、放し飼いや放牧されている反芻動物については、リン欠乏と対峙するために栄養補助食品が依然として必要であろう。さらに、動物に高消化性食餌（例えば、トウモロコシサイレージ）を与えた場合、反芻胃液通過速度が速くなって、有機リン化合物の消化が不完全となる可能性がある。
【００１１】
過去１００年にわたる人間の活動は、リンの枯渇とリンの汚染の両方に関連する特定の環境問題につながってきた。肥料の過剰使用等の持続不可能な農業慣行は、世界の回収可能なリン鉱石を着実に枯渇させ、土壌中に未使用のリン貯蔵物の蓄積を引き起こし、帯水層へのリン流出を生じさせた。さらに、家畜糞尿が地下水に浸出する際に、未消化のリン貯蔵物からの流出物もまた、河川及び湖に輸送され、富栄養化につながり得る。
【００１２】
食品を大規模生産する経済的コスト、及び使用可能なリン資源の枯渇は、世界的に人間及び動物の健康、ならびに農業及び畜産の持続可能性に負担をかけ続けている。動物及びヒトのための植物、豚及び微生物、ならびに栄養補助食品の遺伝的組換えは、この問題に対峙する現在ある方法のうちのいくつかであるが、リンの完全な枯渇を避けるためにはさらなる努力がなされなければならない。したがって、再生不可能なリン資源をリサイクルし、保存するために、使用可能なリンを作物廃棄物等の有機物から回収することができる、持続可能なリン管理の方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、微生物、ならびにバイオサーファクタント、代謝産物及び／又は酵素等の成長副生成物を提供する。本発明はまた、これらの微生物及びそれらの副生成物を生成及び使用する方法を提供する。利点を挙げると、本発明の微生物ベースの生成物及び方法は、環境にやさしく、操作しやすく、費用効果が高い。
【００１４】
好ましい実施形態において、本発明は、培養された微生物及び／又はその成長副生成物を含む微生物ベースの組成物、これらの組成物を製造する方法、ならびに、例えば、ヒトの健康、農業、林業及び動物の畜産におけるそれらの使用方法を提供する。一般に、微生物ベースの組成物は、例えば、土壌、植物体、作物残渣及び糞尿等のフィチン酸含有有機物からリンを遊離させることができる。さらに、微生物ベースの組成物は、森林再生及び作物の成長及び収量を向上させるために使用することができる。さらに、この組成物は、動物及びヒトのための栄養補助食品として、ならびに微生物の培養のための増殖培地サプリメントとして使用することができる。
【００１５】
本発明の微生物ベースの組成物の微生物は、好ましくは１つ以上の有用な成長副生成物（例えば、酵素）を生成し得る生物学的に純粋な酵母である。好ましくは、酵素はフィターゼである。特定の実施形態において、酵母は、Wickerhamomyces anomalus（Pichia anomala）及び／又は近縁種（例えば、同系列及び／又は属に属する）である。
【００１６】
本発明の微生物ベースの組成物は、小規模から大規模にわたる培養プロセスを通して得ることができる。これらの培養プロセスには、水中培養、固相発酵（ＳＳＦ）、及びハイブリッド（hybrid）、修飾（modification）、及び／又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
組成物中の酵母は、活性又は不活性形態であり得る。さらに、この組成物はまた、酵母の培養から得られる液体発酵ブロス、特に、細胞成分及び微生物成長副生成物（例えば、バイオサーファクタント、代謝産物及び／又は酵素）を含み得る。ある実施形態において、組成物は、酵母細胞を含まない発酵ブロスを含む。
【００１８】
利点を挙げると、組成物の直接使用は、さらなる安定化、保存、及び貯蔵なしに、微生物の高い生存率を保持し、異物及び望ましくない微生物からの汚染の可能性を低減し、及び／又は微生物成長副生成物の活性を維持する。
【００１９】
特定の実施形態において、組成物は、１つ以上のバイオサーファクタントをさらに含む。バイオサーファクタントは、精製された形態、又は粗形態で添加することができ、粗形態とは、バイオサーファクタント生成微生物の培養から得られる上清中に存在することを意味する。粗形態は、任意で、残留栄養素、他の微生物成長副生成物、微生物及び／又は細胞成分を含むことができる。ある実施形態において、バイオサーファクタントは、微生物ベースの組成物の微生物によって生成される。
【００２０】
ある実施形態において、バイオサーファクタントは、例えば、糖脂質（例えば、ソホロリピド、ラムノリピド、セロビオースリピド、マンノシルエリトリトールリピド及びトレハロースリピド）、リポペプチド（例えば、サーファクチン、イチュリン、フェンギシン、アンスロファクチン及びリケニシン）、フラボリピド、リン脂質（例えば、カルジオリピン）、脂肪酸エステル化合物、ならびにリポタンパク質、リポ多糖−タンパク質複合体、及び多糖−タンパク質−脂肪酸複合体等の高分子量ポリマーから選択される。
【００２１】
特定の実施形態において、組成物は、担体をさらに含む。担体は、酵母又は酵母副生成物が生存可能なまま標的部位に送達されることを可能にする、又は不活性酵母の場合、有効であるために必要な成分の活性を保持する、当該分野で公知の任意の適切な担体であってよい。
【００２２】
ある実施形態において、組成物は、有機及び／又は無機リンの供給源をさらに含む。例えば、亜麻種子及びアーモンドは、フィチン酸の一般的な供給源である。
【００２３】
微生物ベースの組成物は、例えば、液体懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥又は噴霧乾燥粉末、ペレット、顆粒、ゲル、錠剤、カプセル、及び／又は他の形態として、適用様式及び標的部位に応じて処方することができる。特定の実施形態において、組成物は、それが培養された容器から採取した後に、ほとんど、又は全く処理せずに液体形態で利用される。
【００２４】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えば、微生物培養全体の使用のために、例えば、精製された微生物代謝産物単独よりも利点を有する。これらの利点には、酵母細胞壁の外表面の一部として高濃度のマンノタンパク質があること、酵母細胞壁中のβ−グルカンの存在、培養物中のバイオサーファクタントの存在、ならびに培養物中の溶媒及び他の代謝産物（例えば、ビタミン、ミネラル、炭水化物及びタンパク質源）の存在のうちの１つ以上が含まれる。これらの利点は、活性又は不活性酵母を使用する場合に得られる。
【００２５】
特定の実施形態において、微生物、ならびに微生物の代謝産物及び他の副生成物は、互いに相乗的に作用する。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、微生物の成長副生成物を生成する方法を提供し、微生物は、成長副生成物の成長及び生成に適切な条件下で培養され。任意で、副生成物を精製する。ある実施形態において、植物デトリタス等のフィチン酸源が増殖培地に含まれる。
【００２７】
ある実施形態において、生成された成長副生成物は、精製されず、代わりに、例えば、それが生成された発酵培地を含む粗形態で利用され、本発明による成長副生成物の例を挙げると、酵素、酸、溶剤、エタノール、タンパク質、アミノ酸、バイオサーファクタントその他が含まれる。特定の実施形態において、酵素フィターゼを含む微生物ベースの組成物を生成する方法が提供される。
【００２８】
本発明は、有機物中に存在するフィチン酸から、例えば、無機リン酸の形態でリンを遊離させる方法をさらに提供し、この方法は、有効量の本発明の微生物ベースの組成物を有機物に適用することを含む。微生物は、適用時に生存（生存可能）又は不活性のいずれかであり得る。
【００２９】
生存微生物の場合、微生物は適用場所でin situで成長し、活性化合物又は成長副生成物を現場で生成することができる。その結果、高濃度の微生物及び有益な成長副生成物を、処置場所で容易かつ連続的に得ることができる。
【００３０】
この目的のために、この方法は、適用中の微生物の成長を増進するための材料を添加すること（例えば、微生物の成長を促進するための栄養素及び／又はプレバイオティクスを添加すること）を含み得る。
【００３１】
一実施形態において、本方法は、適用前に微生物ベースの組成物を培養する工程をさらに含む。好ましくは、微生物ベースの組成物の全部又は一部が、適用場所又はその近く、例えば、その場所から３００マイル未満で培養される。
【００３２】
利点を挙げると、組成物を本方法に従って有機物と接触させると、組成物中の微生物生成フィターゼは、有機物中のフィチン酸と反応し、フィチン酸の加水分解を触媒し、使用可能なリン副生成物の放出を、例えば、無機リン酸の形態で経時で引き起こすことができる。
【００３３】
特定の実施形態において、有機物は、例えば、残ったトウモロコシの茎、トウモロコシの葉、トウモロコシの穂軸、小麦わら、大豆わら、米殻、他の植物の茎、葉、根及び一部を含むことができる、採取後の作物残渣等の有機廃棄物である。
【００３４】
例えば、ナッツ、種子及びマメ科植物、植物ベースの堆肥、糞尿、トウモロコシからの残渣、セルロース又はバイオマスエタノール製造（例えば、蒸留穀物、リグニン及び醸造者の使用済み穀物）、おがくず、使用済みコーヒー粉、及び庭塵芥（例えば、樹木、生垣及び芝刈り）等の植物ベースの物質を含む、他の種類の有機物も想定される。
【００３５】
ある実施形態において、リン酸塩放出が起こる速度を、微生物ベースの組成物を適用する前に、有機物を細断、破砕、又は任意の個片のサイズを減少することによっては早めることができる。
【００３６】
一実施形態において、組成物は、有機物上に注がれ、噴霧され、又は散布された後、任意で、当技術分野で知られている任意の標準的な混合デバイス又は技法を使用して混合される。さらなる成分、例えば、水又は栄養素（例えば、微生物成長及び／又は植物成長のための栄養素）もまた適用することができる。
【００３７】
一実施形態において、有機廃棄物は、採取後の農作物畑に残された作物残渣である。作物残渣が分解することにつれて、植物の成長に必要な栄養素が土壌中に放出される。本発明は、この分解プロセスによって放出される利用不可能な形態のリンを植物吸収形態に変換するために使用することができる。例えば、この組成物は、畑に残された作物残渣に直接適用することができる。作物残渣及び組成物は、土壌の表面上に残され、又は土壌中で耕される。
【００３８】
一実施形態において、堆肥を畑に適用する前に、組成物を堆肥に添加し、組成物中のフィターゼがフィチン酸の加水分解を触媒することを可能にし、次いで、堆肥を肥料として畑又は森林に適用する。
【００３９】
この組成物はまた、その供給源から収集され、別の場所で一緒に混合された有機物に適用することができる。処理された有機物は、所望の適用場所（例えば、農作物畑）に輸送されて、例えば、生物肥料として使用することができる。
【００４０】
本方法の一実施形態において、有機物は土壌である。本発明の組成物を土壌に直接適用し、組成物を土壌中に混合するか、又はそれを土壌中に浸透させることにより、この方法を用いて、植物吸収性リン貯蔵物で補充することによって土壌を肥沃にすることができる。利点を挙げると、本方法によれば、土壌中のフィチン酸塩又はフィチン酸からのリン酸塩の遊離により、収量を増加させ、作物及び生産物の品質を向上させることができる。
【００４１】
一実施形態において、動物飼育（例えば、家畜飼育又は水産養殖）における生産を増進する方法が提供され、微生物ベースの組成物が、栄養補助食品及び／又は消化補助食品として動物の水及び／又は飼料に適用される。一実施形態において、微生物ベースの組成物が栄養補助食品及び／又は消化補助食品としてヒトに投与される、ヒトの健康を増進する方法が提供される。利点を挙げると、組成物中のフィターゼの存在がフィチン酸及び／又はリン酸塩を天然に含有する食物源からのリンの吸収の増加を可能にし、動物の飼料の補助として必要とされる無機リン酸塩の量を減少させ、かつリン欠乏を防ぐ補助となる。
【００４２】
特定の実施形態において、本微生物ベースの組成物中に有利な生化学的生成微生物が存在するために、本方法はまた、有害な生物が有機廃棄物中に滞留するのを防止する補助ともなり得る。例えば、糞尿及び分解作物残渣は、糞尿又は残渣と共に成長する植物に有害であり得る特定の害虫、真菌及び細菌を引き付けるものである。Wickerhamomyces anomalusのようなキラー酵母は、これらの望ましくない害虫の多くを制御するのに有用な代謝産物を生成することができる。
【００４３】
本発明の方法は、有機廃棄物材料のリサイクル、ならびに特定の有機物中に残留するビタミン、ミネラル、及び、重要なリンの放出を可能にする。さらに、この組成物及び方法は、生分解性で毒物学的に安全な成分を利用する。したがって、本発明は、「グリーン」な処置として、農業、林業、及び畜産における生産を増進するため、ならびにヒトの健康を増進するために使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明は、培養された微生物及び／又は微生物成長副生成物を含む微生物ベースの組成物、これらの組成物を製造する方法、ならびに、例えば、ヒトの健康、農業、林業、及び動物の畜産におけるそれらの使用の方法を提供する。概して、微生物ベースの組成物は、例えば、土壌、植物体、作物残渣及び糞尿等のフィチン酸含有有機物からリンを遊離させることができる。さらに、微生物ベースの組成物は、森林再生及び作物の成長及び収量を向上させるために使用することができる。さらに、この組成物は、例えば、リン欠乏を防ぐための動物及びヒトのための栄養補助食品として、ならびに微生物の培養のための増殖培地サプリメントとして使用することができる。
【００４５】
本発明の微生物ベースの組成物の微生物は、好ましくは、１つ以上の有用な成長副生成物（例えば、酵素）を生成し得る生物学的に純粋な酵母である。好ましくは、酵素はフィターゼである。特定の実施形態において、酵母は、Wickerhamomyces anomalus（Pichia anomala）、又は近縁酵母（例えば、同じ属及び／又は系列に属する）である。
【００４６】
本発明はさらに、有機物中に存在するフィチン酸からリン酸を遊離させる方法を提供し、この方法は、有効量の本発明の微生物ベースの組成物を有機物に適用することを含む。微生物は、適用時に生存（生存可能）又は不活性のいずれかであり得る。利点を挙げると、組成物を主題の方法に従って有機物と接触させると、組成物中の微生物生成フィターゼは有機物中のフィチン酸の加水分解を触媒し、使用可能なリン副生成物の放出を、例えば、無機リン酸の形態で経時で引き起こすことができる。
【００４７】
選択した定義
本明細書中で使用される場合、「微生物ベースの組成物」とは、微生物又は他の細胞培養物の成長の結果として生成された成分を含む組成物を意味する。このように、微生物ベースの組成物は、微生物自体及び／又は微生物成長副生成物を含む。微生物は、プランクトン性であっても、バイオフィルム形態であっても、又は両方の混合物であってもよい。成長副生成物は、例えば、代謝産物（例えば、バイオサーファクタント、酵素）、細胞膜成分、タンパク質、及び／又は他の細胞成分であり得る。微生物は、無傷であっても溶解されていてもよい。細胞は組成にないか、又は、例えば、組成物１ミリリットル当たり、少なくとも１×１０4、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、１×１０9、１×１０10、１×１０11、１×１０12以上のＣＦＵで存在していてもよい。
【００４８】
本発明はさらに、所望の結果を達成するために実際に適用される生成物である「微生物ベースの生成物」を提供する。微生物ベースの生成物は、単に、微生物培養プロセスから採取された微生物ベースの組成物とすることができる。あるいは、微生物ベースの生成物は、添加されたさらなる成分を含むことができる。これらの追加の成分は、例えば、安定剤、緩衝剤、担体（例えば、水又は塩溶液）、さらなる微生物増殖をサポートするために添加された栄養素、非栄養増殖増強剤（enhancer）、及び／又は微生物及び／又はそれが適用される環境中の組成物の追跡を容易にする薬剤を含むことができる。微生物ベースの生成物はまた、微生物ベースの組成物の混合物を含むことができる。微生物ベースの生成物はまた、これらに限定されないが、濾過、遠心分離、溶解、乾燥、精製等のような何らかの方法で処理された微生物ベースの組成物の１つ以上の成分を含んでもよい。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、微生物の培養において「採取された（harvested）」は、微生物ベースの組成物の一部又は全部を増殖容器から取り出すことを指す。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「単離された」又は「精製された」分子又は化合物は、実質的に他の化合物、例えば、天然に関連する細胞物質を含まない。精製又は単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は、天然に存在する状態でそれに隣接する遺伝子又は配列を含まない。精製又は単離されたポリペプチドは、天然に存在する状態でそれに隣接するアミノ酸又は配列を含まない。
【００５１】
本明細書で使用される「生物学的に純粋な培養物」は、天然に関連する材料から単離されたものである。好ましい実施形態において、培養物は、全ての他の生細胞から単離されている。さらなる好ましい実施形態において、生物学的に純粋な培養物は、天然に存在するのと同じ微生物の培養物と比較して有利な特徴を有する。有利な特徴は、例えば、１つ以上の所望の成長副生成物の生産が向上することである。
【００５２】
特定の実施形態において、精製された化合物は、目的の化合物の少なくとも６０重量％である。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％の目的化合物である。例えば、精製された化合物は、重量基準で少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％、又は１００%（ｗ/ｗ）の所望の化合物である。純度は、任意の適切な標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって測定される。
【００５３】
「代謝産物」とは、代謝によって生成される任意の物質（すなわち、成長副生成物）又は特定の代謝プロセスに参加するのに必要な物質をいう。代謝産物は、代謝の出発物質、中間体、又は最終産物である有機化合物であり得る。代謝産物の例としては、バイオポリマー、酵素、酸、溶剤、アルコール、タンパク質、ビタミン、ミネラル、微量元素、アミノ酸、及びバイオサーファクタントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「調節（modulate）」は、変化（例えば、増加又は減少）と区別なく用いられる。このような変化は、本明細書中に記載されるような標準的な公知の方法で検出される。
【００５５】
本明細書で示される範囲は、その範囲内の全ての値について簡潔にしたものと理解される。例えば、１〜２０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、ならびに、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９等の前述の整数の間のすべての介在する１０進値からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は下位範囲を含むと理解される。下位範囲に関して、範囲のいずれかの終点から延びる「入れ子下位範囲」が特に考えられる。例えば、１〜５０の例示的な範囲の入れ子下位範囲は、一方向だと、１〜１０、１〜２０、１〜３０、及び１〜４０、又は他方向だと５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０、及び５０〜１０を含むことができる。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「減少する」は、少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の負の変化をいい、「増加する」は、少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の正の変化をいう。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「参考」は、標準又は対照条件をいう。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「界面活性剤（surfactant）」とは、液体と気体の間、２種類の液体間、液体と固体の間の表面張力（界面張力）を低下させる表面活性剤をいう。界面活性剤は、例えば、洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、分散剤等として作用する。「バイオサーファクタント(biosurfactant)」とは、生体が生成する界面活性剤である。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「フィチン酸」には、イノシトールヘキサキスホスフェート、ＩＰ６、イノシトールポリホスフェート、フィチン酸塩及びフィチン、ならびにフィチン酸分子の任意の他の塩及び／又は形態が含まれる。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「農業」は、食品、繊維、バイオ燃料、医薬品、化粧品、サプリメント、装飾目的及び他の用途のための植物及び／又は真菌の栽培、培養及び繁殖を意味する。本発明によれば、農業にはまた、園芸、造園、園芸、植物保護、果樹園及び樹木栽培が含まれる。さらに、本明細書での農業には、土壌科学（例えば、ペドロジー及びエダホロギー）ならびに農学、又は土壌及び作物生産のケア、モニタリング及び管理が含まれる。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「家畜」は、食品、繊維及び労働等の商品を生産するために農業又は工業環境で飼育される任意の家畜をいう。「家畜飼育」は、動物畜産の一形態とみなされ、これらの動物の繁殖、飼育、育成、維持及び／又は屠殺を含む。家畜は、畑、農場、又は動物飼養経営体等で放し飼いで生産することができる。家畜という用語に含まれる動物の種類には、アルパカ、肉牛及び乳牛、バイソン、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ミュール、アセス、イヌ、ラクダ、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、モルモット、及びスクワブが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「水産養殖」、「水中養殖」、「水産畜産」又は「魚養殖」は、動物畜産の形態であり、魚養殖場における水産動物の繁殖、飼育、及び採取を含む。水産養殖は、集約的（高密度の人工囲いで魚を飼育する技術に頼る）又は広範囲（海洋、又は天然及び人工の湖、湾、河川、フィヨルド、又は他の水域で行われる）であり得る。養殖には、囲い、池、タンク、水槽、ケージ、又は水路内で市場規模に成長させた、ふ化魚介類からの魚介類の製造が含まれる。さらに、水産養殖には、開放水域又は閉鎖水域における海洋生物の養殖を伴う海洋養殖が含まれる。さらに、水産養殖には、野生個体群又は沿岸生息地を再構築するために、ふ化魚介類が野生に放出される、在庫修復又は増強が含まれる。さらに、水産養殖には、水族館取引のための装飾魚の生産、ならびに水槽内に収容された装飾魚の畜産が含まれる。養殖することができる種としては、淡水魚又は塩水魚及び貝類があり、装飾魚、食用魚、スポーツ魚、餌魚、甲殻類、軟体動物、藻類、海野菜、又は魚卵が含まれる。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「魚養殖場」は、水産養殖するための任意の水環境である。本開示による養殖場には、池、潅漑溝、河川、湖、海洋、フィヨルド、タンク、水槽、ケージ、又は水路を含む、人工又は天然のあらゆるタイプの水環境又は水環境の区域が含まれる。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「害虫」は、ヒト又はヒト関連（例えば、農業、園芸、動物畜産）に対して破壊的で、有害な、ヒト以外の任意の生物である。害虫は、感染、寄生及び／又は病気を引き起こすことがある。害虫は、これらに限定されないが、節足動物、ウイルス、真菌、細菌、寄生虫、原生動物、及び／又は線虫を含む、単細胞又は多細胞生物である。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、「処置する（treating）」とは、状態や障害の程度、徴候又は症状を根絶、軽減、改善、逆転又は予防することをいい、そして、必要とされるものではないが、状態又は障害の完全な治癒を含む。治療は、障害を治癒、改善、又は部分的に改善することである。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、状況又は発生を「予防（preventing）」とは、その開始又は進行を遅延させることを意味する。場合によっては、予防することは絶対的ではなく、状況又は発生が依然として起こり得が、遅延を伴うことを意味する。
【００６７】
微生物ベースの組成物
本発明は、有益な微生物、ならびにバイオサーファクタント、代謝産物、酸、溶剤及び／又は酵素等の１つ又は複数の微生物成長副生成物を含む微生物ベースの組成物を提供する。さらに、本発明は、微生物ベースの組成物を生成するための材料及び方法を提供する。
【００６８】
利点を挙げると、本発明による微生物ベースの組成物は、非毒性であり（例えば、摂取毒性は５ｇ／ｋｇ体重を超える）、例えば、ヒト又は動物の皮膚又は消化管に刺激及び／又は毒性を引き起こすことなく、高濃度で適用することができる。
【００６９】
特定の実施形態において、本発明の微生物は、生物学的に純粋なキラー酵母である。特に、本発明は、Pichia属に属するキラー酵母を利用する。さらにより具体的には、一実施形態において、微生物はWickerhamomyces anomalus（Pichia anomala）である。Pichia kudriavzevii、P. guilliermondii、及びP. occidentalisのような他のフィターゼ生成酵母もまた利用することができる。
【００７０】
一実施形態において、組成物は、約１×１０6〜１×１０12、１×１０7 〜１×１０11、１×１０8 〜１×１０10、又は１×１０9  ＣＦＵ／ｍｌの微生物を含む。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明の微生物ベースの組成物は、生及び／又は不活性培養物及び／又は微生物によって生成された微生物代謝産物及び／又は任意の残留栄養素を含有する発酵ブロスを含むことができる。組成物は、例えば、少なくとも重量基準で、１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％ブロスであり得る。組成物中のバイオマスの量は、重量基準で、例えば、間の全てのパーセンテージを含む０％〜１００％のいずれか、又は例えば、５ｇ／ｌ〜１８０ｇ／ｌ以上、又は１０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌであり得る。
【００７２】
発酵産物は、抽出又は精製することなく直接使用することができる。所望であれば、抽出及び精製は、文献に記載されている標準的な抽出及び／又は精製方法又は技法を用いて容易に行うことができる。
【００７３】
ある実施形態において、組成物は、酵素、バイオサーファクタント、溶剤、酸、タンパク質、ミネラル及び／又はビタミン等の追加の粗形態又は精製微生物成長生成物をさらに含む。粗形態代謝産物は、例えば、微生物の培養から生じる発酵ブロス中の代謝産物沈殿物を含む液体混合物の形態をとることができる。この粗形態溶液は、約２５％〜約７５％、約３０％〜約７０％、約３５％〜約６５％、約４０％〜約６０％、約４５％〜約５５％、又は約５０％の純粋な代謝産物を含むことができる。
【００７４】
好ましい実施形態において、組成物は、フィターゼ等のホスファターゼ酵素を含む。フィターゼは、加水分解時に、無機リンの形態を放出するリンの有機形態であるフィチン酸又はフィチン酸塩の加水分解を触媒する。フィターゼは、組成物中に存在する微生物の増殖の結果として組成物中に存在することができ、又はフィターゼは、他のフィターゼ生成微生物によって別々に生成され、粗形態及び／又は精製形態で組成物に添加することができる。
【００７５】
特定の実施形態において、組成物中のフィターゼ（又は他の酵素）の濃度は、１〜１０，０００ｕ／ｍｌ、１００〜９，０００ｕ／ｍｌ、又は２００〜８，０００ｕ／ｍｌである。
【００７６】
さらに、一実施形態において、組成物はバイオサーファクタントを含む。バイオサーファクタントは、組成物中に存在する微生物の増殖の結果として組成物中に存在することができ、又はバイオサーファクタントは、他の微生物によって別々に生成され、粗形態及び／又は精製された形態で組成物に添加することができる。
【００７７】
バイオサーファクタントは、様々な表面への微生物の付着を阻害し、バイオフィルムの形成を妨げ、強力な乳化及び解乳化特性を有することができる。さらに、バイオサーファクタントは、例えば、魚養殖場及び水槽において、水の表面張力及び界面張力を減少させることができる。
【００７８】
ある実施形態において、バイオサーファクタントは、例えば、糖脂質（例えば、ソホロリピド、ラムノリピド、セロビオースリピド、マンノシルエリトリトールリピド及びトレハロースリピド）、リポペプチド（例えば、サーファクチン、イチュリン、フェンギシン、アンスロファクチン及びリケニシン）、フラボリピド、リン脂質（例えば、カルジオリピン）、脂肪酸エステル化合物、ならびにリポタンパク質、リポ多糖−タンパク質複合体、及び多糖−タンパク質−脂肪酸複合体等の高分子量ポリマーから選択される。
【００７９】
特定の実施形態において、組成物中の１つ以上のバイオサーファクタントの濃度は、０．００１〜９０重量%（ｗｔ%）、好ましくは０．０１〜５０ｗｔ%、より好ましくは０．１〜２０ｗｔ%である。バイオ界面活性剤は、さらに、約０．０１ｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約５０．０ｇ／Ｌ、約１．０〜約１０．０ｇ／Ｌ、又は約２．０〜約５．０ｇ／Ｌで存在することができる。
【００８０】
土壌濃縮処方
一実施形態において、組成物は、好ましくは土壌、種、植物全体、又は植物の一部（根、塊茎、茎、花及び葉が挙げられるが、これらに限定されない）への適用のために処方される。特定の実施形態において、組成物は、例えば、液体、粉塵、顆粒、微小顆粒、ペレット、湿潤性粉末、流動性粉末、エマルジョン、マイクロカプセル、油、又はエアロゾルとして処方される。
【００８１】
組成物の効果を改善又は安定化するために、組成物を適切なアジュバントとブレンドし、次いで、必要に応じて、そのまま、又は希釈後に使用することができる。好ましい実施形態において、組成物は、液体、濃縮液体、又は水及び他の成分と混合して液体生成物を形成することができる乾燥粉末又は顆粒として処方される。
【００８２】
一実施形態において、組成物は、乾燥生成物の貯蔵及び輸送中の浸透圧を促進するために、浸透物質として、又はそれに加えて、グルコース（例えば、糖蜜の形態で）、グリセロール及び／又はグリセリンを含むことができる。
【００８３】
組成物は、単独で、又は他の化合物及び／又は方法と組み合わせて、植物の健康、成長及び／又は収量を効率的に増進するために、及び／又は第１及び第２の微生物の成長を補うために使用することができる。例えば、一実施形態において、その組成は、マグネシウム、リン、窒素、カリウム、セレン、カルシウム、硫黄、鉄、銅、亜鉛等の植物及び／又は微生物成長を高めるための栄養素及び／又は微量栄養素、ならびに、ケルプエキス、フルボ酸、キチン、フミン酸塩及び／又はフミン酸等の１つ又は複数のプレバイオティクスを併用することができる。正確な材料及びその量は、本開示の利益を有する栽培者又は農業科学者が判断することができる。
【００８４】
組成物は、他の農業化合物及び／又は作物管理システムと組み合わせて使用することもできる。一実施形態において、組成物は、任意で、例えば、天然及び／又は化学殺虫剤、忌避剤、除草剤、肥料、水処理剤、非イオン性界面活性剤及び／又は土壌改良剤を含むことができ、又はそれらと共に適用することができる。しかしながら、組成物は、ベノミル、ドデシルジメチルアンモニウムクロリド、二酸化水素／ペルオキシ酢酸、イマジリル、プロピコナゾール、テブコナゾール、又はトリフルミゾールを含まず、かつ／又はこれらと共に使用されないのが好ましい。
【００８５】
組成物を相溶性化学添加剤と混合する場合、化学物質は、好ましくは、本組成物を添加する前に水で希釈する。
【００８６】
さらなる成分、例えば、緩衝剤、担体、同じ又は異なる設備で製造された他の微生物ベースの組成物、粘度調整剤、防腐剤、微生物増殖のための栄養素、追跡剤、殺生物剤、他の微生物、界面活性剤、乳化剤、潤滑剤、溶解性制御剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、安定剤及び耐紫外線剤を組成物に添加することができる。
【００８７】
ヒト又は動物用の栄養補助食品処方
特定の実施形態において、組成物は、ヒト及び／又は動物の栄養補助食品又は消化補助食品として処方される。
【００８８】
特定の実施形態において、食餌における酵母の使用は、タンパク質及び／又は多糖類の豊富な供給源となる。一実施形態において、本組成物は、ヒト及び／又は動物の食餌を補足し、及び／又は健康及び／又は健康な状態を促進するための追加の栄養素、例えば、アミノ酸（必須アミノ酸を含む）、ペプチド、タンパク質、ビタミン、微量元素、脂肪、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロール、酵素、プレバイオティクス、及び微量ミネラルの供給源を含むことができる。
【００８９】
好ましい組成物は、ビタミン及び／又はミネラルを任意の組み合わせで含む。本発明の組成物において使用するビタミンは、例えば、ビタミンＡ、Ｅ、Ｋ３、Ｄ３、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチン酸、塩化コリン、イノシトール及びパラアミノ安息香酸を含むことができる。ミネラルは、例えば、カルシウム、コバルト、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、セレン及び亜鉛の塩を含むことができる。他の成分としては、抗酸化剤、ベータ−グルカン、胆汁酸塩、コレステロール、酵素、カロテノイド、及び他の多くが挙げることができるが、これらに限定されない。典型的なビタミン及びミネラルは、例えば、毎日の摂取が推奨されるが、推奨される毎日の量（ＲＤＡ）の正確な量は変化し得る。組成物は、好ましくは、ＲＤＡビタミン、ミネラル及び微量ミネラルの複合体を含み、かつＲＤＡは確立されていないが、健康な哺乳動物生理学において有益な役割を有する栄養素も含む。
【００９０】
ある実施形態において、フィチン酸源及び／又はフィチン酸源は、組成物と予め混合され、組成物中のフィターゼと接触すると、組成物は、ヒト又は動物対象への投与時に、容易に利用可能な無機リンを提供することができる。フィチン酸塩及び／又はフィチン酸の供給源は、例えば、アーモンド、クルミ、亜麻種子、マメ科植物、エンバク、及び全粒穀物であり得る。
【００９１】
一実施形態において、組成物は、予め作られたウェット又はドライ動物飼料をさらに含むことができ、予め作られた飼料は、動物がすぐに摂取できるように調理及び／又は加工されている。例えば、微生物及び／又は成長副生成物は、予め作られた飼料に注いで、混合する、又は微生物及び／又は成長副生成物は、ドライ動物飼料片、例えば、モルセル、キブル又はペレットの外側上のコーティングとして作用するものであってもよい。
【００９２】
一実施形態において、組成物は、動物飼料を製造するための原料をさらに含むことができ、原料は、微生物及び／又は成長副生成物とともに、次いで、加熱及び／又は処理されて、増強されたドライ又はウェット飼料製品を製造する。
【００９３】
ある実施形態において、組成物は、腸内での有益な微生物の成長を支持するためのプレバイオティクスをさらに含む。プレバイオティクスは、例えば、フルクタン及びキシランに由来する発酵性繊維、イヌリン、フルクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖を含むことができる。プレバイオティクスを含有することが知られている食品には、例えば、チコリー根、タマネギ、ニンニク、ネギ、オートミール、コムギふすま、アスパラガス、食用タンポポの葉、エルサレム・アーティチョーク、及びバナナが含まれる。
【００９４】
一実施形態において、組成物は、経口消費可能な製品として処方され、動物又はヒト対象に経口投与することができる。
【００９５】
本発明による経口消費製品は、消費、栄養、口腔衛生又は嗜好に適した任意の製剤又は組成物であり、ヒト又は動物の口腔に導入され、一定期間そこに留まり、次いで嚥下される（例えば、サプリメント、消費の準備ができた食物）か、又は再び口腔から取り出される（例えば、チューインガム又は口腔衛生又は医療用口腔洗浄剤の製品）ことを意図した製品である。これらの製品には、ヒト又は動物が加工、半加工又は未加工の状態で摂取することを意図したすべての物質又は製品が含まれる。これはまた、それらの製造、処置又は処理の間に経口消費可能な製品（特に食品及び医薬品）に添加され、ヒト又は動物の口腔に導入されることが意図される物質を含む。
【００９６】
経口消費製品はまた、ヒト又は動物によって嚥下され、次いで、改変されていない、調製された、又は加工された状態で消化されることが意図される物質を含むこともでき、本発明による経口消費製品はまた、製品と一緒に嚥下されることも意図されるか、又は嚥下が予想される、ケーシング、コーティング、又はその他のカプセルを含む。
【００９７】
特定の実施形態において、組成物は、例えば、エネルギー源、栄養素及び／又は他の健康促進サプリメント、フレーバー、防腐剤、ｐＨ調整剤、甘味料及び／又は色素である成分をさらに含むことができる。
【００９８】
一実施形態において、組成物は、水の添加によって飲用可能な流体に再構成することができる脱水粉末又は濃縮物として処方される。一実施形態において、組成物は、ブレンドされたスムージー又はミルクシェイクとして処方される。
【００９９】
一実施形態において、組成物は、ＧＩ管に直接投与するために処方することができる。例えば、組成物は、結腸鏡検査を介して近位下部ＧＩに、注腸又は直腸管を介して遠位下部ＧＩに、及び経鼻胃管、十二指腸管、及び内視鏡検査／胃鏡検査を介して上部ＧＩ管に投与するために処方することができる。
【０１００】
特定の実施形態において、本発明は、ヒト又は動物の消化管におけるリン吸収を増加させることによって、ヒト又は動物の全体的な健康及び健康な状態を増進するために使用することができる。
【０１０１】
微生物の発酵
本発明は、微生物を培養し、微生物代謝産物及び／又は成長副生成物を生成するための方法を利用する。より具体的には、本発明は、バイオマス、細胞外代謝産物、残留栄養素及び／又は細胞内成分の生成のための材料及び方法を提供する。
【０１０２】
本発明は、微生物の培養、及び小規模（例えば、実験室設定）から大規模（例えば、工業設定）までの任意の所望の規模での微生物代謝産物の生成に適した培養プロセスを利用する。これらの培養プロセスには、浸漬培養／発酵、固相発酵（ＳＳＦ）、ならびにそれらの組み合わせ、ハイブリッド（hybrid）及び／又は修飾（modification）変形例が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、「発酵」又は「培養」は、制御された条件下での細胞の成長をいう。成長は、好気性又は嫌気性であり得る。
【０１０４】
本発明に従って使用される微生物増殖容器は、工業的使用のための任意の発酵槽又は培養反応器であり得る。一実施形態において、容器は、機能制御／センサを有してもよく、又はｐＨ、酸素、圧力、温度、撹拌機シャフト電力、湿度、粘度及び／又は微生物密度及び／又は代謝産物濃度等の培養プロセスにおける重要な因子を測定するために機能制御／センサに接続されてもよい。
【０１０５】
容器はまた、容器内の微生物の増殖成長（例えば、細胞数及び成長相の測定）をモニターすることもできる。あるいは、毎日のサンプルを容器から採取し、希釈プレーティング技術等の当技術分野で公知の技術によりを行ってもよい。
【０１０６】
好ましい実施形態において、複数の微生物増殖容器を含む微生物増殖設備は、所望の規模で、新鮮な高密度の微生物及び／又は目的の微生物成長副生成物を生成する。微生物増殖設備は、適用場所又はその近くに配置してもよい。この設備は、バッチ培養、準連続培養、又は連続培養で高密度の微生物ベースの組成物を生成する。
【０１０７】
分配された微生物増殖設備は、微生物ベースの生成物が使用される場所（例えば、畑又は魚養殖場）に配置することができる。例えば、微生物増殖設備は、使用場所から３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、１５、１０、５、３、又は１マイル未満であってもよく、又は使用場所に直接配置されてもよい。
【０１０８】
特定の実施形態において、生成はローカル及び／又は分散発酵法を使用して行っても、行わなくてもよく、これは従来の方法もまた、本発明に従って利用することができることを意味する。しかしながら、本明細書に記載されるようなローカル及び／又は分散された微生物増殖設備は、利点を挙げると、上流の処理遅延、サプライチェーンのボトルネック、不適切な貯蔵、及び有用な製品の適時の配送及び適用を妨げる他の不測の事態のために製品品質が損なわれる、遠方の工業規模の生産者に頼っていうという現在の問題に対する解決策を提供する。
【０１０９】
微生物増殖設備は、微生物自体、微生物代謝産物、及び／又は微生物が成長するブロスの他の成分を含む、新鮮な微生物ベースの組成物を生成する。所望であれば、組成物は、高密度の栄養細胞、不活性細胞、増殖体、又は栄養細胞、不活性細胞及び／又は増殖体の混合物を有することができる。
【０１１０】
利点を挙げると、組成物を指定した場所で使用するために調整することができる。一実施形態において、微生物増殖設備は、微生物ベースの生成物が使用される場所又はその近くに位置する。微生物増殖設備は、例えば、太陽光、風力、及び／又は水力発電を利用することによって、電力系統なしで操業することができる。
【０１１１】
微生物増殖設備は、目的地の地理との相乗効果を改善するために、微生物ベースの生成物を調整する能力によって、製造の汎用性を提供する。例えば、本発明のシステムは、天然に存在するローカル微生物及びそれらの代謝副生成物の能力を利用することができる。ローカル微生物は例えば、塩耐性、高温で成長する能力、及び／又は特定の代謝産物を生成する能力に基づいて同定することができる。
【０１１２】
微生物ベースの生成物は、従来の生産の安定化、保管、長期保存、及び広範な輸送プロセスを必要とせずに、現場又は適用場所の近くで生成されるので、はるかに高い密度の生存（又は不活性）微生物及び／又はその繁殖体を生成することができ、それによって、現場適用で使用するために、はるかに少ない体積の微生物ベースの生成物を必要とするか、又は必要な場合にはるかに高い密度の微生物適用を可能にする。これは、異物及び望ましくない微生物からの汚染の可能性を減少させ、微生物成長副生成物の活性を維持し、細胞を安定化させる理由なしに、効率的なスケールダウンされたバイオリアクター（例えば、より小さい発酵タンク及びより少ない容量の出発材料、栄養素、ｐＨ制御剤、及び脱泡剤等）を可能にする。ローカルに生成された微生物の高密度、強固な培養物は、栄養細胞の安定化を受けたものや、しばらくサプライチェーンに在庫していたものより、畑でより有効である。
【０１１３】
微生物ベースの生成物のローカル生成によってまた、生成物に発酵ブロスを容易に含めることができる。ブロスは、発酵中に生成される、ローカル使用に特に適した薬剤を含有することができる。これによって、生成物の可搬性がさらに促進される。
【０１１４】
輸送時間の短縮によって、微生物及び／又はそれらの代謝産物の新鮮なバッチの製造及び配送が、地域の要求に応じた時間及び体積で可能になる。例えば、発酵の２４時間以内のローカルな製造及び配送は、純粋で高い細胞密度の組成物を、実質的に低い輸送コストで可能にする。より効果的で強力な微生物接種材料の開発における急速な進歩の見通しを考えると、微生物ベースの生成物を即時に送達するこの能力から、消費者は多大な恩恵を受けることになる。
【０１１５】
一実施形態において、培養方法が従来の方法を使用して行われても、ローカル又は分散システムを使用して行われても、糖蜜、尿素及びペプトンを含む培養培地を利用する。
【０１１６】
一実施形態において、糖蜜の濃度は、２〜６％、好ましくは４％である。一実施形態において、尿素の濃度は、０．０１〜１．０％、好ましくは０．２％である。一実施形態において、ペプトンの濃度は、１．０〜５％、好ましくは２．５％である。
【０１１７】
一実施形態において、本方法は、窒素源を用いて培養物を補給することを含む。窒素源は、例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素、及び／又は塩化アンモニウムとすることができる。これらの窒素源は、単独又は２種以上の組み合わせで使用することができる。
【０１１８】
培養方法は、成長する培養物を酸素化するものである。一実施形態において、低酸素含有空気を除去し、酸素化空気を入れるために、緩流空気を利用する。酸素化空気は、液体の機械的攪拌のためのインペラ、及び液体へ酸素を溶解するための液体に気泡を供給する空気スパージャを含む機構を介して日々補給される周囲空気であってもよい。
【０１１９】
本方法は、培養物に炭素源を補給することをさらに含むことができる。炭素源は、典型的には、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、及び／又はマルトース等の炭水化物、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、及び／又はピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール、及び／又はグリセロール等のアルコール、大豆油、米ぬか油、キャノーラ油、ヒマワリ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油、及び／又はアマニ油等の油脂である。これらの炭素源は単独又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１２０】
一実施形態において、微生物の増殖因子及び微量栄養素が培地に含まれる。これは、それらが必要とするビタミンの全てを生成することができない微生物を増殖させる場合に特に好ましい。鉄、亜鉛、銅、マンガン、モリブデン及び／又はコバルトのような微量元素を含む無機栄養素もまた、培地に含めてよい。さらに、ビタミン、必須アミノ酸、及び微量元素の供給源は、例えば、トウモロコシ粉等の穀粉又はミールの形態で、酵母エキス、ジャガイモエキス、牛エキス、大豆エキス、バナナ皮エキス等のエキスの形態で、又は精製された形態で含まれ得る。例えば、タンパク質の生合成に有用なアミノ酸（例えば、Ｌ−アラニン）もまた含めることができる。
【０１２１】
一実施形態において、無機塩も含まれ得る。使用可能な無機塩は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸水素マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、及び／又は炭酸ナトリウムとすることができる。これらの無機塩は単独又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１２２】
ある実施形態において、培養方法には、培養プロセスの前及び／又は間に、液体培地中に追加の酸及び／又は抗菌剤を付加することがさらに含まれていてもよい。汚染から培養物を保護するために、抗菌剤又は抗生物質を使用することができる。例えば、Streptomyces erythromycin、ホップ又はホップ酸、及び／又は少量、例えば、５０〜１００ｐｐｍのソホロリピド又は他の生物界面活性剤を、抗菌剤として栄養培地に添加することができる。さらに、消泡剤を添加して、培養中の泡の形成及び／又は蓄積を防止することもできる。
【０１２３】
混合物のｐＨは、目的の微生物に適したものとする。緩衝剤や、炭酸塩及びリン酸塩等のｐＨ調整剤を使用して、ｐＨを好ましい値付近に安定化させることができる。ｐＨ制御はまた、培養物の汚染を防止するために使用することもできる。例えば、培養は、酵母増殖に適した低いｐＨ（例えば、３．０〜３．５）で開始され、次いで、酵母蓄積後に増加され（例えば、４．５〜５．０）、発酵の残りの間、安定化することができる。金属イオンが高濃度で存在する場合には、液体媒体中にキレート剤を使用する必要がある。
【０１２４】
微生物は、プランクトン形態で、又はバイオフィルムとして成長させることができる。バイオフィルムの場合、容器は、その中に微生物をバイオフィルム状態で成長させることができる基質を有することができる。システムはまた、例えば、バイオフィルム成長特性を促進及び／又は改善する刺激（せん断力応力等）を与える能力を有していてもよい。
【０１２５】
一実施形態において、微生物の培養方法は、約５℃〜約１００℃、好ましくは、１５〜６０℃、より好ましくは、２５〜５０℃で実施される。さらなる実施形態において、培養は、一定温度で連続的に実施されてもよい。他の実施形態において、培養を異なる温度で行ってもよい。
【０１２６】
一実施形態において、方法及び培養プロセスで使用される装置は無菌である。反応器／容器のような培養装置は、滅菌ユニット、例えば、オートクレーブから分離されてもよいが、それに接続されてもよい。培養装置はまた、接種を開始する前にin situで滅菌する滅菌ユニットを有していてもよい。空気は、当技術分野で公知の方法によって滅菌することができる。例えば、周囲空気は、容器内に導入される前に、少なくとも１つのフィルタを通過することができる。他の実施形態において、培地は、低温殺菌されてもよく、又は任意で、全く加熱されなくてもよく、低水分活性及び低ｐＨを利用して、細菌増殖を制御してもよい。
【０１２７】
他の実施形態において、培養システムは自己滅菌であってもよく、これは培養される生物が抗菌成長副生成物又は代謝産物の生成により、他の生物からの汚染を防止できることを意味する。
【０１２８】
一実施形態において、界面活性剤、酵素、代謝産物、及び／又は他のタンパク質は本発明の微生物株を、その成長と生成に適切な条件下で培養し、任意で、目的の微生物成長副生成物を濃縮かつ精製することによって生成される。好ましい実施形態において、成長副生成物は酵素、さらにより好ましくは、フィターゼである。
【０１２９】
目的の微生物によって生成される微生物成長副生成物は、微生物中に保持したり、増殖培地中に分泌させることができる。任意で、増殖培地は、微生物成長副生成物の活性を安定化する化合物を含んでいてもよい。
【０１３０】
発酵ブロスのバイオマス含量は、例えば、５ｇ／ｌ〜１８０ｇ／ｌ以上、又は１０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌである。
【０１３１】
増殖容器から微生物ベースの生成物を採取するときには、微生物成長から生じる微生物及び／又はブロスを、増殖容器から取り出し、例えば、即時使用のために、配管を介して移すことができる。微生物は、活性又は不活性形態か、又は活性及び不活性微生物の組み合わせを含み得る。
【０１３２】
組成物（微生物、ブロス、又は微生物及びブロス）はまた、例えば、意図される使用、意図される適用方法、発酵タンクのサイズ、及び微生物増殖設備から使用場所への輸送の任意の様式を考慮して、適切なサイズの容器に入れることができる。したがって、微生物ベースの組成物を入れる容器は、例えば、１ガロン〜１，０００ガロン以上であってもよい。特定の実施形態において、容器は、２ガロン、５ガロン、２５ガロン、又はそれ以上である。
【０１３３】
採取された生成物が容器に入れられ、及び／又配管を通して運ばれる（その他使用のために輸送される）ときに、さらなる成分を添加することができる。添加剤は、例えば、緩衝剤、担体、同じ又は異なる設備で製造される他の微生物ベースの組成物、粘度調整剤、防腐剤、微生物成長のための栄養素、追跡剤、農薬、及び意図される用途に特定の他の成分であり得る。
【０１３４】
一実施形態において、微生物培養組成物は全て、培養の完了時に（例えば、所望の細胞密度、又はブロス中の特定の代謝産物の密度を達成した際に）取り出される。このバッチ手順では、全く新しいバッチが最初のバッチの採取時に開始される。
【０１３５】
他の実施形態において、発酵産物の一部のみが、任意の時点で取り出される。本実施形態において、生細胞を有するバイオマスが新たな培養バッチのための接種物として容器内に残る。取り出される組成物は、無細胞ブロスであってもよいし、細胞を含有していてもよい。このようにして、準連続システムが生成される。
【０１３６】
微生物ベースの生成物の調製
本発明の１つの微生物ベースの生成物は、単に、微生物及び／又は微生物によって生成される微生物代謝産物及び／又は任意の残留栄養素を含有する発酵ブロスである。発酵産物は、抽出又は精製することなく直接使用することができる。所望であれば、抽出及び精製は、文献に記載されている標準的な抽出及び／又は精製方法又は技術を用いて容易に行うことができる。
【０１３７】
微生物ベースの生成物中の微生物は、活性又は不活性形態であり得る。微生物ベースの生成物は、活性微生物と不活性微生物との組み合わせを含有していてもよい。
【０１３８】
微生物ベースの生成物は、さらなる安定化、保存、及び貯蔵なしに使用することができる。利点を挙げると、これらの微生物ベースの生成物の直接使用は、微生物の高い生存率を保持し、異物及び望ましくない微生物からの汚染の可能性を低減し、微生物成長副生成物の活性を維持する。
【０１３９】
微生物の成長に起因する微生物及び／又はブロスは増殖容器から取り出し、例えば、直ちに使用するために、配管を介して移すことができる。他の実施形態において、前述のように、組成物（微生物、ブロス、又は微生物とブロス）は適切なサイズの容器に入れることができる。
【０１４０】
増殖容器から微生物ベースの組成物を採取する際、採取された生成物は容器に入れられ、及び／又は配管を通して運ばれる（その他使用のために輸送される）ときに、さらなる成分を添加することができる。添加剤は、例えば、緩衝剤、担体、アジュバント、同じ又は異なる設備で製造された他の微生物ベースの組成物、粘度調整剤、防腐剤、微生物増殖のための栄養剤、追跡剤、殺生体情報剤、他の微生物、非生物学的界面活性剤、乳化剤、潤滑剤、溶解性制御剤、ｐＨ調整剤、安定剤、耐紫外線剤及び意図された使用に特定の他の成分である。
【０１４１】
一実施形態において、組成物は、好ましい値に近いｐＨを安定化するために、有機酸及びアミノ酸又はそれらの塩を含む緩衝剤をさらに含んでもよい。微生物ベースの組成物のｐＨは、目的の微生物に適したものとする。
【０１４２】
適切な緩衝剤としては、クエン酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、アスパラギン酸塩、マロン酸塩、グルコセプトン酸塩、ピルビン酸塩、ガラクタレート、グルカル酸塩、タルトロン酸塩、グルタミン酸塩、グリシン、リジン、グルタミン、メチオニン、システイン、アルギニン及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。またリン酸及び亜リン酸又はそれらの塩が用いられてよい。合成緩衝剤を使用することが適切であるが、有機及びアミノ酸又はそれらの塩等の天然緩衝剤を使用することが好ましい。
【０１４３】
さらなる実施形態において、ｐＨ調整剤は、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム又は重炭酸カリウム、塩酸、硝酸、硫酸及びそれらの混合物を含む。
【０１４４】
一実施形態において、重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、又は重リン酸ナトリウム等の塩の水性調製物等の追加の成分を、微生物ベースの組成物に含めることができる。
【０１４５】
利点を挙げると、微生物ベースの生成物は、微生物が増殖したブロスを含んでいてもよい。生成物は、例えば、少なくとも重量基準で、１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％ブロスとすることができる。生成物中のバイオマスの量は、重量基準で、例えば、それらの間の全てのパーセンテージを含めて０％〜１００％のいずれかであってよい。
【０１４６】
特定の実施形態において、本発明の微生物ベースの組成物は、さらに担体を含む。担体は、酵母又は酵母成長副生成物が標的植物、土壌、動物、魚等に、産物が生存可能なまま送達されることを可能にする、又は不活性酵母の場合は、有効であるために必要な成分を保持する、当該分野で公知の任意の適切な担体であればよい。
【０１４７】
担体は、錠剤、カプセル、顆粒又は粉末形態に処方するための固体ベースの乾燥材料から構成することができ、あるいは、液体又はゲル形態に処方するための液体又はゲルベースの材料から構成することができる。例えば、担体は、水、生理食塩水、生体高分子、天然植物繊維、粘土、サイレージ、バーミキュライト、軽石、又は紙スラッジ等の材料を含むことができる。
【０１４８】
特定の実施形態において、特に農業において、微生物ベースの組成物は、組成物の効力を増大させるためのアジュバントをさらに含むことができる。一実施形態において、アジュバントは、ケルプエキス、キチン、フルボ酸、フミン酸及びフミン酸塩のうちの１つ以上から選択される。
【０１４９】
任意で、組成物は、使用前に貯蔵することができる。貯蔵時間は短いのが好ましい。したがって、貯蔵時間は、６０日未満、４５日未満、３０日未満、２０日未満、１５日未満、１０日未満、７日未満、５日未満、３日未満、２日未満、１日未満、又は１２時間未満であってもよい。好ましい実施形態において、生細胞が製品中に存在する場合、製品は例えば、２０℃、１５℃、１０℃、又は５℃未満等の低温で貯蔵され、一方、バイオさーふぁくたんと組成物は、典型的には周囲温度で貯蔵することができる。
【０１５０】
特定の実施形態において、本発明の微生物ベースの生成物は、例えば、微生物培養全体の使用のために、例えば、精製された微生物代謝産物単独よりも利点を有する。これらの利点には、酵母細胞壁の外表面の一部として高濃度のマンノタンパク質があること、酵母細胞壁中のβ−グルカンの存在、培養物中のバイオサーファクタントの存在、及び培養物中の溶媒及び他の代謝産物の存在のうちの１つ以上が含まれる。これらの利点は、活性又は不活性酵母を使用する場合に得られる。
【０１５１】
微生物ベースの組成物は、例えば、液体懸濁液、エマルジョン、凍結又は噴霧乾燥粉末、顆粒、ペレット、又はゲルの形態で、微生物ベースの生成物として処方することができる。好ましくは、組成物は、液体形態で利用されるが、特定の用途に適切な他の処方も想定される。
【０１５２】
一実施形態において、特に、家畜や水産養殖用途で使用するために、微生物ベースの生成物は、ペレット当たり均一な濃度の微生物ベースの組成物を含む飼料ペレットとして処方することができる。加圧粉砕を含む、飼料ペレットを製造するために当技術分野で公知の方法を使用して、それらを製造することができる。好ましくは、ペレット化プロセスは、「低温」ペレット化、又は高熱もしくは蒸気を使用しないプロセスである。
【０１５３】
一実施形態において、特に、水産用途では、微生物株は、不活性な微生物ベースの組成物を生成する目的で培養される。組成物は、所望の微生物を培養し、微生物を微小流動化（又はタンパク質変性を引き起こさないことが当技術分野で公知の任意の他の方法によって）によって不活化し、低温殺菌し、濃縮形態の食品に添加することによって調製される。一実施形態において、不活性化は、低温殺菌温度（酵母細胞の１００％を不活性化するのに十分な時間、６５℃〜７０℃まで）で起こり、ｐＨ値を約１０．０まで増加させる。これは、細胞の部分的加水分解を誘導し、その中の栄養成分の遊離を可能にする。次に、組成物を約７．０〜７．５のｐＨまで中和し、加水分解の種々の成分を混合する。すると、得られた微生物ベースの生成物を、例えば、魚飼料及び魚養殖水の処理に使用することができる。
【０１５４】
本発明の微生物ベースの生成物は、発酵増殖培地中に存在する代謝産物及び栄養素から細胞が分離されている従来の生成物と比較して特に有利である。
【０１５５】
本発明に従って増殖した微生物株
本発明のシステム及び方法に従って増殖する微生物は、例えば、細菌、酵母及び／又は真菌である。これらの微生物は、天然の微生物、又は遺伝的に改変された微生物であってもよい。例えば、微生物は、特定の特徴を示すために特定の遺伝子で形質転換することができる。微生物はまた、所望の株の突然変異体であってもよい。本明細書中で使用される、「突然変異体」は、参考微生物の株、遺伝的変異体又はサブタイプを意味し、突然変異体は、参考微生物と比較して、１つ以上の遺伝的変異（例えば、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失、重複、フレームシフト突然変異又は反復拡大）を有する。突然変異体を作製するための手順は、微生物学的技術分野において周知されえている。例えば、ＵＶ突然変異誘発及びニトロソグアニジンは、この目的のために広く使用されている。
【０１５６】
好ましい実施形態において、微生物は遺伝的に修飾されていない。
【０１５７】
特定の好ましい実施形態において、微生物は「キラー酵母」として知られる任意の酵母であり、本明細書で使用される場合、「キラー酵母」は毒素タンパク質又は糖タンパク質の分泌を特徴とする酵母の株を意味し、その株自身が免疫である。このような酵母は限定されるものではないが、Wickerhamomyces（例えば、Wanomalus）、Pichia（例えば、Panomala、P. guilliermondii、P. occidentalis、P. kudriavzevii）、Hansenula、Saccharomyces、Hanseniaspora（例えば、Huvarum）、Debaryomyces（例えば、Dhansenii）、Candida、Cryptococcus、Kluyveromyces、Torulopsis、Ustilago（例えば、Umaydis）、Williopsis、Zygosaccharomyces（例えば、Zbailii）その他を含み得る。
【０１５８】
特定の実施形態において、本発明は、フィターゼ生成キラー酵母を利用する。さらにより具体的には、本発明の微生物は、Wickerhamomyces anomalus（Pichia anomala）を含む。
【０１５９】
これらの酵母は、有利な代謝産物を生成する能力を含む、本発明に有用な多くの有益な特徴を有する。例えば、Wanomalusは、エキソ−β−１，３−グルカナーゼ活性があり、広範囲の病原性真菌の成長を制御又は阻害することができる。さらに、５〜７日間培養した場合、Wanomalusは水の表面／界面張力を低下させることができ、抗菌特性及び抗真菌特性を示す糖脂質バイオサーファクタントを生成する。
【０１６０】
種々の副生成物に加えて、これらの酵母は、フィターゼを生成し得、そして多数のタンパク質（５０％までの乾燥細胞バイオマスを含む）、脂質及び炭素源、ならびに全範囲のミネラル及びビタミン（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３（ＰＰ）、Ｂ５、Ｂ７（Ｈ）、Ｂ６、Ｅ）を提供することができる。
【０１６１】
他の微生物株もまた、本発明に従って使用することができ、他の微生物株は、例えば、ヒトの健康、農業、園芸、景観、林業、家畜飼育及び水産養殖において、生成を増進する際に有用な大量の酵素（特にフィターゼ）、酸、タンパク質、バイオサーファクタント、ミネラル又はビタミンを蓄積することができる。ある実施形態において、Pichia及び／又はWickerhamomycesクレードの他の部類、例えば、P. anomala、P. guilliermondii、P. occidentalis、及び／又はP. kudriavzeviiが利用される。
【０１６２】
有機物からリン酸塩を遊離させる方法
特定の実施形態において、本発明は、フィチン酸含有有機物からリン酸塩を遊離させるための、環境に優しく、費用効率の高い材料及び方法を提供する。一実施形態において、本発明の組成物を利用して作物成長及び収量を増大させるために、土壌を肥沃にするための方法も提供される。他の実施形態において、本発明の組成物を利用して、家畜及び／又は養殖魚に給餌するための方法が提供される。さらに他の実施形態において、本発明の組成物を利用するヒト対象の健康を増進するための方法が提供される。
【０１６３】
この方法は、有機廃棄物材料のリサイクル、ならびにその中に残留するビタミン、ミネラル、及び重要なリンの放出を可能にする。さらに、この組成物及び方法は、生分解性であり、そして毒物学的に安全な成分を利用する。したがって、本発明は、農業、林業、及び畜産における生産を増進するために、そして「グリーン」な処置としてヒトの健康を増進するために使用することができる。
【０１６４】
特定の実施形態において、本方法は、有機物中に存在するフィチン酸からリン酸を遊離するために使用され、この方法は、有効量の本発明の微生物ベースの組成物を有機物に適用することを含む。例えば、水又は他の栄養素（例えば、栄養素及び／又はプレバイオティクス）等のさらなる成分を適用することもできる。微生物は、適用時に生存（生存可能）か不活性のいずれかとすることができる。
【０１６５】
生存微生物の場合、微生物は適用場所でin situで増殖可能であり、任意の活性化合物又は成長副生成物を現場で生成することができる。その結果、高濃度の微生物及び有益な成長副生成物を、処置場所で容易かつ連続的に得ることができる。
【０１６６】
この目的で、本方法は、適用中、微生物の増殖を増大するための材料を添加すること（例えば、微生物の成長を促進するための栄養素を添加すること）を含むことができる。
【０１６７】
一実施形態において、本方法は、適用前に微生物ベースの組成物を培養する工程をさらに含む。好ましくは、微生物ベースの組成物の全部又は一部が、適用場所又はその近く、例えば、その場所から３００マイル未満で培養される。
【０１６８】
本明細書中で使用される場合、組成物又は生成物を標的又は部位に「適用する」、又は標的又は部位を「処置する」とは、組成物又は生成物がそこで効果を有し得るように、組成物又は生成物を標的又は部位と接触させることをいう。この効果は、例えば、微生物の成長及び／又は代謝産物、酵素、バイオサーファクタント又は他の成長副生成物の行動による。利点を挙げると、本発明の組成物を本発明の方法に従って有機物と接触させると、組成物中のフィターゼが、有機物中のフィチン酸塩又はフィチン酸の加水分解を触媒することができ、植物、ヒト及び動物によって、例えば、無機リン酸の形態で吸収可能なリン副生成物の放出を引き起こす。
【０１６９】
一実施形態において、本微生物ベースの組成物の適用は、有機物に組成物を注ぐ、噴霧、又は散布し、次いで、任意で、当技術分野で知られている任意の標準的な混合デバイス又は技術を用いて、組成物を有機物と混合することを含む。
【０１７０】
一実施形態において、本微生物ベースの組成物は、その供給源から集められ有機物に適用し、別の位置で混合することができる。次いで、処理された有機物を、所望の適用場所（例えば、農作物畑）に輸送して、例えば、生物肥料として使用することができる。
【０１７１】
特定の実施形態において、本方法に従って処理される有機物は、例えば、残ったトウモロコシの茎、トウモロコシの葉、トウモロコシの穂軸、小麦わら、大豆わら、米殻、他の植物の茎、葉、根及び一部を含むことができる、採取後の作物残渣等の有機廃棄物である。例えば、植物ベースの堆肥、糞尿、トウモロコシからの残渣、セルロース又はバイオマスエタノール製造（例えば、蒸留穀物、リグニン及び醸造者の使用済み穀物）、おがくず、使用済みコーヒー粉、及び庭塵芥（例えば、樹木、生垣及び芝刈り）を含む、他のタイプの有機廃棄物も想定される。
【０１７２】
特定の実施形態において、本方法に従って処理される有機物は、フィチン酸塩又はフィチン酸を含有する植物体である。例えば、有機植物体は、種子（例えば、アマニ、亜麻種子、ナタネ種子、ダイズ、及びヒマワリ種子）、ジャガイモ、穀物（例えば、小麦、米、ふすま、大麦、トウモロコシ、ライ麦、及びエンバク）、マメ科植物（例えば、ウズラ豆、インゲン豆、白インゲン豆及びピーナッツ）又はナッツ（例えば、アーモンド、ブラジルナッツ、ヘーゼルナッツ、及びクルミ）であり得る。
【０１７３】
ある実施形態において、微生物ベースの組成物を適用する前に、任意の個々の断片の有機物を細断するか、破砕するか、又はそのサイズを縮小することによって、リン酸塩放出が起こる速度を早めることができる。
【０１７４】
一実施形態において、有機物は、採取後の農作物畑に残留する作物残渣である。作物残渣が分解することにつれて、植物の成長に必要な栄養素が土壌中に放出される。本発明を用いて、この分解プロセスによって放出される利用不可能な形態のリンを植物吸収性形態に変換することができる。例えば、この組成物は、畑に残された作物残渣に直接適用することができる。作物残渣及び組成物は、土壌の表面上に残す、又は土壌中で耕すことができる。
【０１７５】
本方法の一実施形態において、有機物は土壌である。本発明の微生物ベースの組成物は土壌に直接適用することができ、又は微生物ベースの組成物で前処理された有機物を土壌に適用することができる。任意で、組成物及び／又は前処理された有機物は、例えば、耕うんによって土壌中に混合することができ、又は組成物を混合せずに土壌中に浸透させることができる。
【０１７６】
特定の実施形態において、組成物は、機械的練り込みなしに土壌表面に適用される。土壌適用の有益な効果は、降雨、スプリンクラー、洪水、又は滴下潅漑によって活性化され、その後、例えば、植物の根に送達することができる。
【０１７７】
一実施形態において、本方法によって、根の健康及び成長を増進することによって、植物の健康、成長及び／又は収量を増大することができる。より具体的には、一実施形態において、本方法は、植物の根が成長している根圏の特性、例えば、栄養素及び／又は水分保持特性を改善するために使用することができる。
【０１７８】
さらに、一実施形態において、本方法は、根圏に１つ以上の有益な微生物を接種するために使用することができる。例えば、好ましい実施形態において、本組成物の微生物は、根圏にコロニーを形成し、根が成長している植物に、保護及び栄養を含む複数の利点が得られる。
【０１７９】
植物及び／又はそれらの環境は、植物を栽培するプロセス中の任意の時点で処理することができる。例えば、組成物は、種子が植え付けられる前、それと同時に、又はその後に土壌に適用することができる。それはまた、植物が開花、結実、及び落葉の間及び／又は後を含む、植物の発育及び成長の間のその後の任意の時点で適用することができる。
【０１８０】
一実施形態において、本方法は、大規模林業及び／又は農業環境で使用することができる。本方法は、水、肥料又は他の液体組成物を作物、森林、牧草地、果樹園又は畑に供給するために使用される潅漑システムに接続されたタンクに組成物を投与することを含む。このように、植物及び／又は植物を囲む土壌は、例えば、土壌注入、土壌浸漬、又はセンターピボット潅漑システムを使用することによって、又はまき溝の上にスプレー、又はスプリンクラーもしくは点滴灌漑によって、土壌処理組成物で処理することができる。利点を挙げると、本方法は、一度に何百エーカーもの作物、森林、牧草地、果樹園又は田園を処理するのに適している。
【０１８１】
一実施形態において、本方法は、庭、都市景観、又は温室等のより小規模な環境で使用することができる。そのような場合、本方法は、潅漑システム、ハンドヘルド芝生及び庭用噴霧器、及び／又は標準的なハンドヘルド給水缶を使用する適用を含むことができる。
【０１８２】
利点を挙げると、本方法は、種子の発芽を促進し、森林再生及び造園における苗木及び若木の生存を増加させ、作物収量を増加させ、そして、例えば、フィターゼ、アミノ酸、タンパク質、ビタミン及び微量元素のような有益な微生物代謝産物の存在により、この濃縮土壌中で成長する生産物及び植物産物の品質を向上させることができる。さらに、植物バイオマス（及び関連する土壌微生物バイオマス）の増加は、増加した炭素レベルを抑えるので、植物の成長及び健全性の増大は、大気炭素レベルを減少させる重大な手段である。さらに、植物の生育環境（例えば、土壌）におけるフィターゼの存在は、植物におけるリン欠乏の処置及び／又は予防を可能にする。
【０１８３】
特定の実施形態において、本微生物ベースの組成物中において、有利な生化学的生成微生物が存在するために、本方法はまた、有害な生物が有機廃棄物中に滞留するのを防止するのを補助にもなる。例えば、糞尿及び分解作物残渣は、糞尿又は残渣により成長する植物に有害な特定の害虫、真菌及び細菌を引き付けるものである。Wickerhamomyces anomalusのようなキラー酵母は、これらの望ましくない害虫の多くを制御するのに有用な代謝産物を生成することができる。
【０１８４】
一実施形態において、動物飼育（例えば、家畜飼育又は水産養殖）における生産を増進する方法が提供され、微生物ベースの組成物は、栄養補助食品及び／又は消化補助食品として、動物の飼料又は飲料水とともに処方されるか、又はそれに適用される。栄養補助食品及び／又は消化補助食品として、微生物ベースの生成物は、とりわけ、アミノ酸、タンパク質、ビタミン及び微量元素の供給源、ならびにフィターゼの存在による動物の消化管におけるリン吸収を補助することができる。
【０１８５】
家畜の場合、微生物ベースの組成物は、従来の家畜飼料と共に飼い葉桶に入れることができ、すると、動物は組成物を摂取することができる。一実施形態において、組成物を飼料成分と混合し、均一な均質化ペレットに処方することができる。
【０１８６】
養殖魚の場合、組成物は、例えば、液体溶液の形態で、又は乾燥粉末、ミール、又は飼料フレークもしくはペレットとして、魚養殖水等の魚の環境に適用することができる。
【０１８７】
一実施形態において、微生物ベースの組成物は、栄養補助食品及び／又は消化補助食品としてヒト対象に投与される、ヒトの健康を増進する方法が提供される。好ましい実施形態において、組成物は経口投与される。
【０１８８】
栄養補助食品及び／又は消化補助食品として、組成物及び方法は、とりわけ、アミノ酸、タンパク質、ビタミン及び微量元素の供給源、ならびにフィターゼの存在による対象の消化管におけるリン吸収の補助を提供することができる。さらに、組成物は、フィチン酸が、対象の消化管による、例えば、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄、マンガン、銅、及び／又はモリブデン等のミネラルの吸収を損なうことを防止するのを補助することができ、それによって、これらのミネラルの欠乏を防止する。
【０１８９】
利点を挙げると、ヒト又は動物が組成物を摂取する場合、組成物中のフィターゼの存在は、例えば、天然にリン酸塩及び／又はフィチン酸を含有する食物供給源からのリンの吸収を増加させること、食物を補助するために必要とされる無機リン酸塩の量を減少させること、フィチン酸の摂取に関連するリン欠乏及び／又は他のミネラル欠乏を処置及び／又は予防することによって、成長及び健康を増進させることができる。
【０１９０】
実施例
本発明及び多くの利点は、例示としての以下の実施例により、理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の方法、用途、実施形態及び変形を例示するものである。本発明を限定するものではない。本発明に関して、数多くの変更や修正を行うことができる。
【０１９１】
実施例１  フィターゼ生成のための酵母発酵
酵母、例えば、Wickerhamomyces anomalus（Pichia anomala）の培養から生じる酵母発酵生成物は、フィチン酸又はフィチン酸塩含有有機物からリンを遊離させるために有用である。
【０１９２】
２５〜３０℃でWanomalusを培養する４８〜７２時間後の発酵ブロスは、酵母細胞懸濁液と、例えば、９，０００ｕ／ｍＬまでのフィターゼ、ならびに他の酵母成長副生成物及び細胞成分を含有することができる。細胞は、液体培地から分離するか、又はその中に保持することができる。
【０１９３】
酵母発酵産物（フィターゼ及び、任意で、生存又は不活性酵母細胞を含む液体培地）は、有機物、土壌、植物根、水、動物飼料及び／又は栄養補助食品に直接適用することができる。それは、採取時に直接使用することができ、又は貯蔵し、所望の処置場所に輸送することができる。利点を挙げると、本発明の方法は、例えば、リンの保全、及び環境中のリン欠乏の解決に有用である。
【０１９４】
実施例２  Wickerhamomyces anomalusを用いたフィターゼ生成の計算
Wickerhamomyces anomalusを、糖蜜（２．０〜５．０％又は３．０〜４．０％）、尿素（０．１〜１．３％又は０．１５〜０．２％）、ペプトン（２．０〜３．０％又は２．２〜２．５％）の増殖培地を用いて、ｐＨを５．０に調整した発酵反応器中で７２時間増殖させた。他の微生物を使用する、及び／又は他の増殖培地処方を使用するフィターゼの典型的な微生物生成は、より低い濃度、約３００〜５００ｕ／ｍｌのフィターゼを生じる。
【０１９５】
種子を破壊／破砕することにより、ゴマ種子からフィチン酸を採取した。次に、種子部分（５ｇ）を１０ｍＬの水に添加し、混合した。培地及び細胞をフィターゼの存在について試験した。０．２ Ｍグリシン緩衝剤を用いてｐＨを４に調整し、フィチン酸のｐＨも４に調整した。
【０１９６】
３日後、６つの異なる基準を調製することによってフィターゼ活性を測定した。
０）５５０マイクロリットルの水
１）１０マイクロリットルの５０ｍＭリン酸カリウム及び５４０マイクロリットルの水
２）２０マイクロリットルの５０ｍＭリン酸カリウム及び５３０マイクロリットルの水
３）３０マイクロリットルの５０ｍＭリン酸カリウム及び５２０マイクロリットルの水
４）４０マイクロリットルの５０ｍＭリン酸カリウム及び５１０マイクロリットルの水
５）５０マイクロリットルの５０ｍＭリン酸カリウム及び５００マイクロリットルの水
【０１９７】
１５個のフィチン酸ブランクを、５００μＬのフィチン酸、２５μＬの０．２Ｍグリシン緩衝剤及び２５μＬの水を使用して調製した。
【０１９８】
１５個のフィターゼサンプルブランクを、２５μｌのフィターゼ、２５μｌの０．２Ｍグリシン緩衝剤及び５００μｌの水を使用して調製した。
【０１９９】
５００μＬのフィチン酸、２５μＬの０．２Ｍグリシン緩衝剤及び２５μＬのフィターゼを用いて、１５個のフィターゼ試料を調製した。
【０２００】
４ｍｌのアセトン−モリブデン酸アンモニウム−Ｈ2 ＳＯ4（５０ｍｌ−２５ｍｌ−２５ｍｌ）を６つの基準の各々に添加した。
【０２０１】
サンプル及びブランクの各々を３７℃で３０分間水浴に移した。３０分後、４ｍＬのアセトン−モリブデン酸アンモニウムＨ２ＳＯ４溶液を、試料及びブランクの各々に迅速に添加して、リン酸塩を沈殿させた。次に、それらを遠心分離し、３００μｌの上清を６００μｌの水に溶解した。
【０２０２】
次に、５００μｌの全てのサンプル、ブランク及び基準をＶａｒｉｏｓｃａｎ機器ウェルプレートに充填し、吸光度を４００ｎｍで測定した。
【０２０３】
標準値を３回測定し、それらの平均をとった。標準０値を、標準１〜５の各値から引いて、特定の濃度のリン酸塩の吸光度に相関する数を得た。各標準の平均吸光度を表１に示す。サンプル及びブランクの平均吸光度を表２に示す。
【０２０４】
【表１】
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【表２】
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【０２０５】
放出されたリン酸のミリモル（ｍＭ）を求めるために、フィターゼサンプルブランクの平均吸光度を、フィチン酸ブランクの平均吸光度に加算し、フィターゼサンプルの平均吸光度から減算した。得られた数は、０．０１２ ＯＤであった。放出されたリン酸塩の値は０．１９８ｍＭであった。
【数１】
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【０２０６】
最後に、上記の式１に従って、反応器中のフィターゼ濃度は、７９２単位／ｍｌと計算された。
【国際調査報告】
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