(57)【要約】ヘルペスウイルスガンマ（１）３４．５遺伝子（γ１３４．５）またはγ１３４．５遺伝子と少なくとも約７０％の相同性を有する核酸の発現を減少させる、前記遺伝子または前記核酸の改変、病原性を生じない、ＰＫＲ回避タンパク質をコードする第２のウイルス核酸配列、および腫瘍関連抗原をコードする第３の核酸配列を含む、改変核酸配列を有するヘルペスウイルスを含む、キメラ腫瘍溶解性ウイルスを記載する。また、がんを有する対象を処置するか、またはがん発症のリスクを有する対象にワクチン接種するための、キメラ腫瘍溶解性ウイルスを使用する方法を記載する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘルペスウイルスガンマ（１）３４．５遺伝子（γ１３４．５）または前記γ１３４．５遺伝子と少なくとも約７０％の相同性を有する核酸の発現を減少させる、前記遺伝子または前記核酸の改変、
病原性を生じない、ＰＫＲ回避タンパク質をコードする第２のウイルス核酸配列、および
腫瘍関連抗原をコードする第３の核酸配列
を含む、改変核酸配列を有するヘルペスウイルス
を含むキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２】
前記ヘルペスウイルスが、αヘルペスウイルスである、請求項１に記載のキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３】
前記ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１ヘルペスウイルスである、請求項２に記載のキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４】
前記ヘルペスウイルスγ１３４．５遺伝子の前記改変が、前記γ１３４．５遺伝子の欠失または変異を含む、請求項１に記載のキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５】
前記第２のウイルス核酸配列が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸である、請求項１に記載のキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６】
前記ＣＭＶ核酸が、ＩＲＳ−１遺伝子または前記ＩＲＳ−１遺伝子と少なくとも７０％の相同性を有する核酸を含む、請求項５に記載のキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７】
前記腫瘍関連抗原が、樹状細胞結合ペプチドを含む、請求項１に記載のキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８】
前記腫瘍関連抗原が、分泌タンパク質である、請求項１に記載のキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９】
前記腫瘍関連抗原が、神経膠芽腫関連抗原である、請求項１に記載のキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１０】
前記腫瘍関連抗原が、ＥｐｈＡ２である、請求項１に記載のキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１１】
前記第３の核酸配列が、前記キメラ腫瘍溶解性ウイルスのγ１３４．５座位に挿入されている、請求項１に記載のキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１２】
前記ヘルペスウイルスが、前記第３の核酸配列によりコードされる腫瘍関連抗原とは異なる腫瘍関連抗原をコードする第４の核酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１３】
ヘルペスウイルスガンマ（１）３４．５遺伝子（γ１３４．５）または前記γ１３４．５遺伝子と少なくとも約７０％の相同性を有する核酸の発現を減少させる、前記遺伝子または前記核酸の改変、
病原性を生じない、ＰＫＲ回避タンパク質をコードする第２のウイルス核酸配列、および
腫瘍関連抗原をコードする第３の核酸配列
を含む、改変核酸配列を有するヘルペスウイルス
を含むキメラ腫瘍溶解性ウイルスと対象のがん細胞とを接触させることにより、前記対象におけるがんを処置する方法。
【請求項１４】
前記ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１ヘルペスウイルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヘルペスウイルスγ１３４．５遺伝子の前記改変が、前記γ１３４．５遺伝子の欠失または変異を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記がんが、腺癌、肝芽腫、肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、骨髄腫、膀胱がん、脳がん、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、皮膚がん、肝臓がん、肺がん、結腸がん、子宮頸がん、乳がん、腎臓がん、食道癌、頭頸部癌、精巣がん、結腸直腸がん、前立腺がん、および膵臓がんからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが、神経膠芽腫である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記がん細胞が、ｅｘ  ｖｉｖｏで接触する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記がん細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで接触する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記キメラ腫瘍溶解性ウイルスが、薬学的に許容される担体により投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象に化学療法または放射線療法を投与することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍関連抗原が、処置する前記がんに見出されるものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍関連抗原が、ＥｐｈＡ２である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１ヘルペスウイルスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のウイルス核酸配列が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヘルペスウイルスが、前記第３の核酸配列によりコードされる腫瘍関連抗原とは異なる腫瘍関連抗原をコードする第４の核酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記キメラ腫瘍溶解性ウイルスが、持続的抗腫瘍効果をもたらす、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
がんに対して対象を免疫する方法であって、前記対象に、
ヘルペスウイルスガンマ（１）３４．５遺伝子（γ１３４．５）または前記γ１３４．５遺伝子と少なくとも約７０％の相同性を有する核酸の発現を減少させる、前記遺伝子または前記核酸の改変、
病原性を生じない、ＰＫＲ回避タンパク質をコードする第２のウイルス核酸配列、および
腫瘍関連抗原をコードする第３の核酸配列
を含む、改変核酸配列を有するヘルペスウイルス
を含むキメラ腫瘍溶解性ウイルスを投与するステップを含み、前記キメラ腫瘍溶解性ウイルスが、がんに対して前記対象を免疫するのに有効な条件下で投与される、方法。
【請求項２９】
前記ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１ヘルペスウイルスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヘルペスウイルスγ１３４．５遺伝子の前記改変が、前記γ１３４．５遺伝子の欠失または変異を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記がんが、腺癌、肝芽腫、肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、骨髄腫、膀胱がん、脳がん、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、皮膚がん、肝臓がん、肺がん、結腸がん、子宮頸がん、乳がん、腎臓がん、食道癌、頭頸部癌、精巣がん、結腸直腸がん、前立腺がん、および膵臓がんからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記がんが、神経膠芽腫である、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月３１日出願の米国特許仮出願第６２／７２５，８０９号および２０１８年９月１４日出願の米国特許仮出願第６２／７３１，３６５号の利益を主張し、この両方は、参照により本明細書において組み込まれる。
【０００２】
政府の資金提供
本発明は、国立衛生研究所により与えられた認可番号ＣＡ０７１９３３の下、政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにより電子的に提出した配列表を含み、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年８月２４日に作成された、このＡＳＣＩＩによる前記コピーは、ＮＣＨ−０２７８６１ＵＳ  ＰＲＯ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５と名付けられ、８，６２１バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
背景
がん免疫療法は、腫瘍細胞根絶のための免疫系のプライミングを含む新規の治療選択肢である。免疫療法は、進行期の固形腫瘍を有する患者のための手術、放射線療法、化学療法、または抗体療法のような古典的治療選択肢の有効性の制限を克服するために使用されている。免疫療法的手法による処置に成功している腫瘍もあるが、さらに抵抗性である腫瘍もある。固形腫瘍および変異荷重がより低い腫瘍（例えば、小児がん）は、標的とするのにさらに困難である。しかし、このように変異量が低い場合は、トランスフォーメーションに寄与し潜在的免疫療法標的となる膜結合胎児性抗原（例えば、ＥｐｈＡ２、ＧＤ２、ＩＬ１３Ｒａ２、ＥＧＦＲ  ＶＩＩＩ）を発現することが多い。Gros  et  al.,  Nature  medicine,  22:433-8  (2016)。
【０００５】
免疫療法における２つの有望なエリアは、腫瘍（Phuphanich  et  al.,  Cancer  immunology,  immunotherapy:  CII,  62:125-35  (2013)）および腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）に対してワクチン接種するために樹状細胞を抗原ペプチドのカクテルでパルスするものである。Markert  et  al.,  Mol  Ther.,  17:199-207  (2009)。これらは異なる手法であるが、両戦略は、抗腫瘍免疫の誘導により有効性を発揮する可能性がある。Brown  MC,  Gromeier  M.,  Curr  Opin  Virol.,  13:81-5  (2015)。ウイルス免疫療法は、腫瘍細胞を優先的に標的とするが正常細胞を温存する、生物抗がん剤に基づく。腫瘍溶解性ＨＳＶは、脳腫瘍を含む広範ながん型の臨床試験において安全に使用されている。ウイルス複製および宿主免疫媒介応答が抗腫瘍応答にどのように寄与するかの機構的理解の向上とともに、次の新たな遺伝子が、これらの有効性および／または安全性プロファイルを向上させるように操作されている。Ghonime  MG,  Cassady  KA.,  Cancer  immunology  research  2018;6:1499-510。
【０００６】
神経膠腫は、最も頻繁に生じる原発性悪性脳腫瘍であり、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、最も致死的かつ治療不応性のがんのうちの１つである。進行までの中位時間およびこのような患者の生存期間中央値が過去５０年に最小限の変化しかなかったため、新たな集学的治療戦略が必要である。遺伝子改変されたＨＳＶは、複製可能な腫瘍溶解性ベクターとして魅力的であり、これらのゲノムによって、集学的治療手法のための高レベルの導入遺伝子発現が促進される。これらの安全性は、臨床試験において実証されているが、第１世代ｏＨＳＶは、腫瘍の不十分な複製により制限されている。Markert  et  al.,  Rev  Med  Virol,  10(1):  p.  17-30  (2000)。不十分な複製は、γ１３４．５遺伝子の除去を指示する安全措置に起因し、これは、神経毒性を防ぐだけでなく、翻訳停止を誘発する宿主インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達経路に対するウイルス抵抗性をも抑止する。Wakimoto  et  al.,  Gene  Ther,  10(11):  p.  983-90  (2003)。
【０００７】
また、効率的複製に必要とされるいくつかのｏＨＳＶ遺伝子は、宿主遺伝子発現および抗原プロセシング経路を活発に抑制する。ＨＳＶ−１コード化ＩＣＰ４７、ＵＳ３キナーゼ、およびｇＢタンパク質は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子へのペプチドローディングまたはこれらの表面発現を抑制する。Fruh  et  al.,  Nature,  375(6530):  p.  415-8  (1995)、Imai  et  al.,  PLoS  One,  8(8):  p.  e72050  (2013)。同様に、ｏＨＳＶにおけるビリオン宿主遮断（ＶＨＳ）タンパク質により、感染細胞における宿主細胞転写物の分解を介して潜在的腫瘍抗原を含む宿主遺伝子発現が減少する。Taddeo  et  al.,  J  Virol,  87(8):  p.  4516-22  (2013)。このようなウイルスタンパク質の協調作用により、免疫監視機構による選択的ウイルス遺伝子発現および感染細胞の被覆（cloaking）が可能となる。したがって、有効な抗ＧＢＭ応答を誘発するためのｏＨＳＶの使用は、ＧＢＭにおける免疫抑制状態を効率的に復帰させ、ＴＡＡに対する獲得応答を特異的に増強するウイルスを必要とする可能性がある。
【０００８】
ｏＨＳＶ感染それ自体は、免疫抑制腫瘍微小環境を一過性に復帰させ、適応応答を刺激すると考えられる。Iizuka  et  al.,  Int  J  Cancer,  118(4):  p.  942-9  (2006)。宿主細胞抗ウイルス応答により、自然免疫細胞（好中球、ＮＫ細胞、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージ）の動員および活性化ならびに後続の適応（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）応答の刺激を生じるＩＦＮおよびサイトカインシグナル伝達が誘導される。Miller  et  al.,  Cancer  Res,  60(20):  p.  5714-22  (2000)。これは、ウイルス排除に寄与するが、抗腫瘍応答を間接的に刺激するとも考えられる。Parker  et  al.,  Cancer  Gene  Ther,  12(4):  p.  359-68  (2005)。いくつかの研究では、この仮説を支持している。第１に、炎症促進性遺伝子（ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α）を発現するように操作したｏＨＳＶにより、抗腫瘍効果が増強されている。例えば、ＩＬ−１２およびＣＣＬ２発現ｏＨＳＶによる処置により、ウイルス複製が減少することなく、活性化マクロファージおよびＴ細胞の動員が増加し、生存が向上した。第２に、既存のＨＳＶ免疫によりｏＨＳＶ有効性および生存が向上し、この生存優位性は、免疫抑制マウスにおいて失われる。Miller  et  al.,  Mol  Ther,  7(6):  p.  741-7  (2003)。最終的に、Δγ１３４．５ｏＨＳＶ（Ｇ２０７）の第Ｉｂ相臨床試験の転写アレイ解析では、長期生存マウス（＞６ｍｓ）として抗ＧＢＭ活性に寄与した抗ウイルス免疫応答が、非応答マウス（生存＜３ｍｓ）と比較して、炎症性およびインターフェロン刺激遺伝子発現を大いに示したことを示唆する。
【０００９】
ウイルス療法は、成熟した実験的療法であり、一部の場合では、ＦＤＡ承認を有する。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）導入遺伝子を組み込む弱毒単純ヘルペスウイルスであるＴａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（Ｔ−ＶＥＣ）は、切除不可能なステージ３および４の進行型黒色腫の病巣内注射による処置のためのファースト・イン・クラスのＦＤＡ承認腫瘍溶解性ＨＳＶである。Pol  et  al.,  Oncoimmunology,  5:e1115641  (2016)。免疫療法として、ウイルスの反復投与およびウイルスの他の免疫調節物質との併用により、治療抵抗性黒色腫を有する患者における臨床応答が改善した。Ｃ１３４は、別の次世代ｏＨＳＶであり、タンパク質翻訳および複製が、ＰＡＭＰ感知およびＩＦＮシグナル伝達が欠損した細胞において第１世代ｏＨＳＶを超えて向上している。非悪性細胞では、Ｃ１３４によってＩＲＦ３媒介ＩＦＮおよびサイトカインシグナル伝達が誘導されることにより、腫瘍細胞において効率的なウイルス複製が制限される。Cassady  et  al.,  Journal  of  Virology,  86:610-4  C134  (2012)では、後のウイルスタンパク質合成を維持して第１世代ウイルスよりも良好に複製し、これにより細胞変性効果（ＣＰＥ）および抗原負荷が増加するが、親Δγ１３４．５ＨＳＶと同等に安全なままである（１８〜２０）。腫瘍溶解性ＨＳＶは、感染細胞におけるウイルス複製および溶解により生じる直接的抗腫瘍活性を有するだけでなく、全抗腫瘍活性に寄与する免疫応答をも誘発する。ＯＶを導入すると、細胞損傷を確実に引き起こし、ウイルス感染細胞からの腫瘍抗原の放出を生じ、ウイルス感染の間に産生された炎症促進性病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）および損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、サイトカインおよびケモカインにより、免疫応答および腫瘍関連免疫抑制の復帰が刺激される。Russell  SJ,  Barber  GN.,  Cancer  cell,  33:599-605  (2018)。
これらの固有の抗原性のため、腫瘍は、免疫監視を逃れるように進化し、緩慢な病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）および損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）応答と、抗原プロセシング機構、例えば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ経路、プロテオソームサブユニット潜伏感染膜タンパク質（ＬＭＰ）２およびＬＭＰ７、タパシン、ならびに抗原プロセシング（ＴＡＰ）タンパク質と関連する輸送体の下方調節による不完全な抗原提示とを有する。Johnsen  et  al.,  J.  of  immunology,  163:4224-31  (1999)。したがって、腫瘍抗原の発現は下方調節され、明白な腫瘍細胞を認識して寛容性を促進する細胞傷害性Ｔリンパ球の能力は妨害される。Maeurer  et  al.,  J  Clin  Invest.,  98(7):1633-41  (1996)。腫瘍溶解性ウイルス複製により、細胞死が生じ、炎症促進性ＤＡＭＰおよびＰＡＭＰ応答が最終的に誘導され、死んだかまたは損傷したウイルス感染腫瘍細胞のファゴサイトーシスが促進される。ウイルス感染は、免疫寛容の破壊および自己抗原に対する自己免疫の誘導において十分に記載されている。Steed  AL,  Stappenbeck  TS.,  Curr  Opin  Immunol.,  31:102-7  (2014)。ＨＳＶは、例外ではなく、全身性自己免疫反応（多形性紅斑）（Lucchese  A.,  Autoimmun  Rev,  17:576-81  (2018)）、Ｔ細胞媒介角膜炎（Buela  KA,  Hendricks  RL,  J  Immunol,  194:379-87  (2015)）および持続性自己免疫脳炎（Nosadini  et  al.,  Dev  Med  Child  Neurol  59:796-805  (2017)）を誘導し得る。ウイルスによって、溶解感染の間に強固な炎症応答および免疫媒介応答が誘導される。すべてのウイルスのように、これは、抗ウイルス応答から生き延びるように進化し、溶解相における免疫応答のピークを限局する。Cassady  et  al.,  Viruses,  4;8  pii  E43  (2016)。経時的に、この炎症応答および免疫媒介応答によりウイルス溶解感染が制限されると、自然および適応免疫応答が誘発され、これによって、Ｔ細胞により媒介される長期免疫応答を生じる。Melzer  et  al.,  Biomedicines,  5(1).  pii:  E8  (2017)。ｏＨＳＶ感染により、免疫エフェクターが動員されるが、感染細胞において宿主遺伝子発現も減少し、選択的ウイルス遺伝子発現が可能となり、即時の宿主免疫検出が抑制される。感染細胞においてタンパク質翻訳を維持し、その上、ＩＦＮ応答を刺激するＣ１３４の能力により、Ｃ１３４は、集学的治療プラットフォームとして特に適するものとなっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Gros  et  al.,  Nature  medicine,  22:433-8  (2016)
【非特許文献２】Phuphanich  et  al.,  Cancer  immunology,  immunotherapy:  CII,  62:125-35  (2013)
【非特許文献３】Markert  et  al.,  Mol  Ther.,  17:199-207  (2009)
【非特許文献４】Brown  MC,  Gromeier  M.,  Curr  Opin  Virol.,  13:81-5  (2015)
【非特許文献５】Ghonime  MG,  Cassady  KA.,  Cancer  immunology  research  2018;6:1499-510
【非特許文献６】Markert  et  al.,  Rev  Med  Virol,  10(1):  p.  17-30  (2000)
【非特許文献７】Wakimoto  et  al.,  Gene  Ther,  10(11):  p.  983-90  (2003)。
【非特許文献８】Fruh  et  al.,  Nature,  375(6530):  p.  415-8  (1995)
【非特許文献９】Imai  et  al.,  PLoS  One,  8(8):  p.  e72050  (2013)
【非特許文献１０】Taddeo  et  al.,  J  Virol,  87(8):  p.  4516-22  (2013)
【非特許文献１１】Iizuka  et  al.,  Int  J  Cancer,  118(4):  p.  942-9  (2006)
【非特許文献１２】Miller  et  al.,  Cancer  Res,  60(20):  p.  5714-22  (2000)
【非特許文献１３】Parker  et  al.,  Cancer  Gene  Ther,  12(4):  p.  359-68  (2005)
【非特許文献１４】Miller  et  al.,  Mol  Ther,  7(6):  p.  741-7  (2003)
【非特許文献１５】Pol  et  al.,  Oncoimmunology,  5:e1115641  (2016)
【非特許文献１６】Cassady  et  al.,  Journal  of  Virology,  86:610-4  C134  (2012)
【非特許文献１７】Russell  SJ,  Barber  GN.,  Cancer  cell,  33:599-605  (2018)
【非特許文献１８】Johnsen  et  al.,  J.  of  immunology,  163:4224-31  (1999)
【非特許文献１９】Maeurer  et  al.,  J  Clin  Invest.,  98(7):1633-41  (1996)
【非特許文献２０】Steed  AL,  Stappenbeck  TS.,  Curr  Opin  Immunol.,  31:102-7  (2014)
【非特許文献２１】Lucchese  A.,  Autoimmun  Rev,  17:576-81  (2018)
【非特許文献２２】Buela  KA,  Hendricks  RL,  J  Immunol,  194:379-87  (2015)
【非特許文献２３】Nosadini  et  al.,  Dev  Med  Child  Neurol  59:796-805  (2017)
【非特許文献２４】Cassady  et  al.,  Viruses,  4;8  pii  E43  (2016)
【非特許文献２５】Melzer  et  al.,  Biomedicines,  5(1).  pii:  E8  (2017)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
概要
神経膠腫は、最も頻繁に生じる原発性悪性脳腫瘍であり、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、最も致死的かつ治療不応性のがんのうちの１つである。現在のレジメンと関連する死亡率および病的状態に基づけば、新たな治療選択肢が必要であることは明らかである。腫瘍溶解性ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）は、治療不応性のがんのための新規の治療を代表し、初期相の臨床試験における有効性を実証した。ｏＨＳＶは、腫瘍細胞における溶解複製により直接的抗腫瘍効果を媒介するが、より最近のデータは、ｏＨＳＶの間接的免疫刺激作用がこれらの有効性に、より大きな影響を有し得ることを示唆する。この点では、ｏＨＳＶ感染により、宿主細胞抗ウイルスシグナル伝達経路が誘発され、これにより抗ウイルスおよび抗腫瘍の両免疫応答がプライムされる。本発明者らは、腫瘍においてタンパク質を合成してより良好に複製し（直接的腫瘍溶解特性）、免疫刺激能が増強された（間接的特性）、新規のｏＨＳＶ（Ｃ１３４）を創製した。また、本発明者らは、腫瘍タンパク質（腫瘍関連抗原：ＴＡＡ）の発現によって、腫瘍に対する免疫応答が刺激され、これらが分泌されて特殊な抗原提示免疫細胞に結合するようにＴＡＡを操作することにより、「ワクチン接種」されてウイルスが消失した後であっても長期抗腫瘍免疫応答が誘導されることを示した。また、本発明者らは、これらによって、感染細胞から分泌されてプロフェッショナル抗原提示細胞を標的とする腫瘍抗原を発現するようにＣ１３４を操作することにより、ウイルス抗原に対する応答ではなく、腫瘍特異的免疫応答が増強され得ることを実証した。
【００１２】
配列の簡単な説明
配列番号１は、単純ヘルペスウイルス１に由来するγ１３４．５遺伝子である。
【化１】
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【化２】
2021534786.tif 000004
配列番号２は、ヒトサイトメガロウイルスに由来するＩＲＳ−１配列である。
【化３】
2021534786.tif 000005
【化４】
2021534786.tif 000006
配列番号３は、ヒトサイトメガロウイルスに由来するＴＲＳ−１配列である。
【化５】
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【化６】
2021534786.tif 000008
配列番号４は、ヒトサイトメガロウイルスに由来するＩＲＳ１およびＴＲＳ１配列の共有１３０アミノ酸領域である。
【化７】
2021534786.tif 000009
【００１３】
配列番号５は、ＥｐｈＡ２  Ｆｕｌｌ−ＭＬを発現する完全ウイルスゲノムｖ１キメラＨＳＶであるＨＳＶ−Ｃ１３４由来「Ｃ１７０」である（Ｃ１３４＋ｐＣＫ１２０１）。図１９Ｄを参照されたい。
【００１４】
配列番号６は、ＥｐｈＡ２−Ｆｕｌｌ−ＭＬＭを発現する完全ウイルスゲノムｖ１キメラＨＳＶであるＨＳＶ−Ｃ１３４由来Ｃ１７１である（Ｃ１５４＋ｐＣＫ１２００）。図１９Ｅを参照されたい。
【００１５】
配列番号７は、ＥｐｈＡ２−Ｅｃｔｏ−ＭＬを発現する完全ウイルスゲノムｖ１キメラＨＳＶであるＨＳＶ−Ｃ１３４由来Ｃ１７２である（Ｃ１５４＋ｐＣＫ１２０５）。図１９Ｆを参照されたい。
【００１６】
配列番号８は、ＥｐｈＡ２−Ｅｃｔｏ−ＭＬＭを発現する完全ウイルスゲノムｖ１キメラＨＳＶであるＨＳＶ−Ｃ１３４由来Ｃ１７３である（Ｃ１５４＋ｐＣＫ１２０７）。図１９Ｇを参照されたい。
【００１７】
配列番号９は、ＥｐｈＡ２−Ｅｎｄｏ−ＭＬを発現する完全ウイルスゲノムｖ１キメラＨＳＶであるＨＳＶ−Ｃ１３４由来Ｃ１７４である（Ｃ１５４＋ｐＣＫ１２１０）。図１９Ｈを参照されたい。
【００１８】
配列番号１０は、ＥｐｈＡ２  Ｅｎｄｏ−ＭＬＭを発現する完全ウイルスゲノムｖ１キメラＨＳＶであるＨＳＶ−Ｃ１３４由来Ｃ１７５である（Ｃ１５４＋ｐＣＫ１２１２）。図１９Ｉを参照されたい。
【００１９】
配列番号１１は、ヒト配列に由来するｈＥｐｈＡ２  ＭＬ抽出配列である。
【化８】
2021534786.tif 000010
【化９】
2021534786.tif 000011
【化１０】
2021534786.tif 000012
【００２０】
配列番号１２は、ヒト配列に由来するｈＥｐｈＡ２  ＭＬＭ抽出配列である。
【化１１】
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【化１２】
2021534786.tif 000014
【００２１】
配列番号１３は、ヒト配列に由来するｈＥｐｈＡ２  ＧＰＮＭＢ標的である。
【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Ｃ１３４から発現したＥｐｈＡ２誘導体を示す概略図である。（Ａ）ＵＬ３／ＵＬ４遺伝子間領域からのＩＲＳ１発現およびγ１３４．５の欠失を含む、Ｃ１３４  ｏＨＳＶの構成である。ｐＣＫ１１３６シャトルベクターを使用して、Ｅｇｒ１駆動ＧＦＰ発現カセットをＣ１３４に挿入し、Ｃ１５４と名付けた（Ｂ）。（Ｃ〜Ｆ）マウスＥｐｈＡ２誘導体をｐＣＫ１１３６にクローニングして、Ｃ１５４におけるＧＦＰの組換えおよび置き換えを行う。野生型分泌リーダー配列を維持し、Ｃ末端Ｍｙｃタグを利用して内在性タンパク質をＣ１３４発現タンパク質から識別する。（Ｃ）完全長ＥｐｈＡ２である。（Ｄ〜Ｆ）細胞外（Ｅｃｔｏ、Ｄ、Ｅ）または細胞内（Ｅｎｄｏ、Ｆ）ＥｐｈＡ２ドメインを包含するＥｐｈＡ２の分泌短縮化バリアントは、ナイーブリーダー配列および膜貫通ドメインの欠失を使用して生成する。（Ｅ、Ｆ）Ｃ末端ＤＣ標的化ドメインを有する分泌ＥｐｈＡ２バリアントである。
【００２３】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、Ａ）Ｃ１３４がΔγ１３４．５ウイルス（Ｃ１０１）よりも１０００倍多く複製するＵ８７  ＩＣ腫瘍モデル、およびＢ）複製の優位性を有しないＮｅｕｒｏ２Ａモデルにおける、ｏＨＳＶ回収および生存試験の複合を示すグラフである（挿入断片：４８ｈｐｉでのウイルス回収）。
【００２４】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、Ｃ１３４誘導液性および細胞媒介免疫を示す画像である。（Ａ）ＤＢＴおよびＮｅｕｒｏ２Ａ細胞ライセートに対する液性反応性の血清に基づく検出である。血清は、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウス、またはＤＢＴ腫瘍でチャレンジし、生理食塩水、Ｒ３６１６もしくはＣ１３４で処置したＢａｌｂ／ｃマウスから採取した。血清は、１：２０４８で希釈し、ウエスタン解析の一次抗体として使用した。同一の動物から単離した過剰量の脾細胞をＤＢＴ細胞（１０：１）の集密した単層に加えた。３日後、細胞発現を、ＤＢＴ刺激の非存在下で播種した細胞と比較し、細胞媒介細胞傷害性を、残存するＤＢＴ細胞のＭａｙ−Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ染色により可視化した（Ｂ）。
【００２５】
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、ＧＰＮＭＢ特異的ファージおよび融合タンパク質結合を示すグラフである。（Ａ）ＧＰＮＭＢ特異的コンセンサス配列を、ＧＰＮＭＢ−Ｆｃに対する４回目のファージパニング後に同定した。２９３Ｔおよび２９３Ｔ−ＧＰＮＭＢ細胞の混合物に加えた、ファージクローン（Ｂ）または分泌リーダーにより操作し、ＧＰＮＭＢ結合コンセンサス配列と遺伝的に融合させたＦｃＥ（Ｃ）のＧＰＮＭＢ結合特異性である。ＧＰＮＭＢ発現およびファージ／分泌タンパク質結合をフローサイトメトリーにより評価した。
【００２６】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ｏＨＳＶ複製に基づいて感受性および抵抗性細胞株に分類され得る、悪性神経膠腫腫瘍株を示すグラフである。ＤＢＴ腫瘍は、高度抵抗性ＭＧ腫瘍細胞である。ＨＳＶ感染に対する腫瘍細胞感受性の解析（％ＨＳＶ陽性）および残存する細胞の絶対数（％相対細胞数）である。ＭＧは、ウイルス細胞溶解に対するこれらの感受性に基づいてｏＨＳＶ感受性および抵抗性腫瘍に層別化することができ、ＤＢＴ腫瘍細胞が高度にｏＨＳＶ抵抗性であることを示す。Ｂ）ＤＢＴ  ＣＮＳ腫瘍からのウイルス回収試験では、Ｃ１３４およびＲ３６１６が、このようなＣＮＳ腫瘍において等しく複製することが示される。ｏＨＳＶ処置マウスＣＮＳ腫瘍による、ＨＳＶ  ＤＮＡの限界プラーク希釈およびｑＰＣＲを実施すると、Ｒ３６１６（第１世代ｏＨＳＶ）およびＣ１３４（第２世代ｏＨＳＶ）複製の差は示されない。
【００２７】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、ｏＨＳＶ抗腫瘍活性に寄与する直接的ウイルス媒介細胞溶解以外の機構を示すｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＢＴ腫瘍試験を示すグラフである。これまでの試験では、Ｃ１３４においてｏＨＳＶ感受性腫瘍に対する直接的腫瘍溶解活性が向上することが示される。しかし、一部の腫瘍（例えば、ＤＢＴ、ＣＴ２Ａ、ＧＬ２６１）は、ＨＳＶ複製およびウイルス細胞溶解活性に対して抵抗性である。同所ＤＢＴ腫瘍担持マウスをｏＨＳＶ（１×１０７ｐｆｕ）または生理食塩水で処置した。Ｃ１３４では、生存が有意に向上した（ｐ＝０．００３）。ＩＣＰ３４．５（−）ウイルスであるＲ３６１６は、生理食塩水処置に優っては生存が向上しなかったが、それにもかかわらず、何分の１（約１／３）かのＲ３６１６またはＣ１３４マウスは、長期生存マウスとなった（＞３７日）。生存マウスは、別の位置（側腹）においてＤＢＴ腫瘍で再チャレンジした。生存マウスでは、腫瘍成長がナイーブ（腫瘍無経験）対照マウスよりも有意に緩徐であり、抗腫瘍免疫応答が、このような生存マウスの長期生存に寄与したことを示唆した。
【００２８】
【図７】図７は、Ｃ１３４の反復処置により生存が延長されることを示すグラフである。Ｃ１３４の反復投与により生存が延長され得るかどうかを確認するために、Ｗｉｎｎ型アッセイを実施した。簡潔には、Ｂａｌｂ／ＣマウスにｏＨＳＶ感染腫瘍細胞（ＭＯＩ  １）を移植し、次いで、８日後に再処置した（１×１０７ｐｆｕ）。結果は、過去の試験と同様に、ＤＢＴ腫瘍は、生理食塩水で処置したマウスに対して急速に致死的となったことを示す（生存期間中央値１４日）。対照的に、Ｃ１３４反復投与により、ＤＢＴ脳腫瘍を有するマウスの生存が延長された（生存期間中央値５５日に対して単回投与試験では３３日）。また、コホートは、ウイルス（ＥＧＦＰ）を発現するＣ１３４外来抗原で処置して、ウイルスからの外来抗原発現により抗腫瘍免疫応答が向上したかどうかを確認した。対照コホートは、マイトマイシンＣ処理腫瘍細胞を接種した。Ｍｉｔｏ−Ｃ処理腫瘍細胞は複製しないが、生存可能なままであり、マウスを腫瘍抗原（ｏＨＳＶ処置に非依存）に曝露して、図９に示すその後の試験を行う。
【００２９】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、炎症促進性サイトカイン発現により生存が向上することを示す概略図およびグラフである。Ａ）Ｃ１３４に基づくｍＩＬ−１２発現ｏＨＳＶであるＣ００２の概略図である。同所ＤＢＴ腫瘍担持Ｂａｌｂ／Ｃマウスを１×１０７ｐｆｕのＣ１３４またはＣ００２（Ｃ１３４＋ｍＩＬ−１２）により処置すると、生存が生理食塩水処置に優って有意に向上する。Ｃ１３４由来のＴ細胞活性炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−１２）の発現により、ＤＢＴ同系腫瘍モデルにおいてＣ１３４抗腫瘍活性がさらに延長する。
【００３０】
【図９】図９は、ｏＨＳＶ処置により抗腫瘍免疫応答が、ナイーブマウスまたは既存の腫瘍抗原に曝露したマウス（Ｍｉｔｏ−Ｃ）において見られる応答よりも刺激され、再チャレンジマウスにおいて腫瘍成長が有意に減少したことを示すグラフである。
【００３１】
【図１０】図１０Ａ〜Ｃは、ＨＳＶ免疫およびｏＨＳＶ抗腫瘍有効性に対するこの作用を示すグラフである。炎症促進性サイトカイン発現と同様に、既存のＨＳＶ免疫を有するマウスがＴ細胞活性の増強を示し、これにより抗腫瘍効果の向上が結果として生じることを仮定した。この仮説を試験するために、Ｂａｌｂ／ＣコホートをＨＳＶ（ｏｐｔｉｐｒｅｐ  Ｒ３６１６  ３．３３×１０６ｐｆｕ  ＩＭ  ｄ２１およびｄ７を腫瘍移植前に）で免疫した。次いで、ＤＢＴ腫瘍（１×１０５細胞）を移植し、腫瘍移植後１週間に（これまでの試験と一致して）、ＨＳＶ免疫およびＨＳＶナイーブコホートを１×１０７ｐｆｕのｏＨＳＶ（Ｃ１３４（図１０Ｂ）またはＣ００２（図１０Ｃ））または生理食塩水（図１０Ａ）で処置した。結果は、既存のＨＳＶ免疫では、生理食塩水またはＣ１３４生存に対して作用を有しなかったことを示す。
【００３２】
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、Ｃ１３４に基づく腫瘍抗原発現ｏＨＳＶの複合画像および概略図である。Ａ）共焦点顕微鏡法により、細胞において発現したＥｐｈＡ２の細胞分布が示される（Ｍｙｃタグ化ＥｐｈＡ２、トランスゴルジ網、ＤＡＰＩ核）。完全長ＥｐｈＡ２は、膜結合型であるが、細胞内および細胞外ドメインは、細胞内に分布する。Ｂ）ウイルス発現抗原の同定およびこの抗原発現細胞への方向付けを可能とするエピトープドメインを３’末端に含むＣ１３４  ＥｐｈＡ２腫瘍抗原発現構築物であるＣ１７０〜Ｃ１７５の概略図である。Ｃ）免疫染色試験では、ｏＨＳＶ発現完全長および細胞内ＥｐｈＡ２ドメインは、細胞結合型のままであるが（Ｃ１７０、Ｃ１７１、Ｃ１７４およびＣ１７５）、ｏＨＳＶ発現ＥｐｈＡ２細胞外ドメインは、培地に分泌されることが示される（Ｃ１７２、Ｃ１７３）。
【００３３】
【図１２Ａ−１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＥｐｈＡ２発現ウイルス構築および検証を示す概略図および画像である。（Ａ）Ｃ１３４に基づくウイルスを使用した相同組換えにより構築した、抗原発現ウイルスであるＣ１７０およびＣ１７２の概略図である。ここでは、強力なＭＮＤプロモーターにより駆動する、完全長Ｃ５７ｂｌ６  ＥｐｈＡ２遺伝子（Ｃ１７０）または細胞外ドメイン（Ｃ１７２）をコードする配列をｇ１３４．５遺伝子ドメインに導入した。（Ｂ）ＤＮＡハイブリダイゼーション試験では、親ウイルスとは異なる予測ＤＮＡ断片サイズを確認した。（Ｃ）免疫蛍光では、明確な細胞分布特徴（Ｃ１７０膜結合染色、Ｃ１７２  ＩＣ染色）：緑色はＥｐｈＡ２、赤色染色はトランスゴルジ網、青色はＤＡＰＩによる核染色が示された（Ｄ）。感染マウス神経膠腫細胞および上清のウエスタンブロットでは、Ｃ１７０が予測細胞関連タンパク質１２５ｋｄを発現し、Ｃ１７２が細胞関連および分泌タンパク質６０ｋｄを産生することが示される。
【００３４】
【図１３Ａ−１３Ｄ】図１３Ａ〜Ｄは、Ｂ６マウス神経膠腫（ＣＴ２Ａ）（図１３ＡおよびＣ）およびＭＰＮＳＴ（図１３ＢおよびＤ）（６７Ｃ４）細胞における、ウイルス複製（図１３Ａおよび１３Ｂ）および細胞傷害性（図１３Ｃおよび１３Ｄ）を示すグラフである。（Ａ）ウイルス回収試験では、Ｃ１７０およびＣ１７２が、目的のマウス腫瘍株において親ウイルス（Ｃ１３４）と同様に複製することが示される。（Ｂ）ｉｎｃｕｃｙｔｅを使用したウイルス細胞傷害性アッセイおよび感染多重度（ＰＦＵ／細胞）１での感染では、Ｃ１３４およびＣ１７０により類似の細胞傷害性が誘導され、腫瘍株が直接的細胞傷害性の差を示すことが示される。
【００３５】
【図１４Ａ−１４Ｅ】図１４Ａおよび１４Ｂは、２つの異なる同系腫瘍モデルにおけるＣ１７０のｉｎ  ｖｉｖｏでの試験を示すグラフである。（Ａ）Ｃ１７０は、ＣＴ２Ａ同所モデルにおける生存を有意に向上させた、唯一の試験ウイルスである。上のパネルは、実験設計およびウイルス処置の概略図を示す。下のパネルは、Ｃ１７０処置後の生存期間中央値および全生存期間の向上を示すＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ曲線を示す（Ｂ）。また、Ｃ１７０により、高度抵抗性マウス６７Ｃ４マウスＭＰＮＳＴ腫瘍モデルにおいて腫瘍成長が有意に減少した（独立した試料のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ解析、＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．００５両側解析）。
【００３６】
【図１５Ａ−１５Ｈ】図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＴ２Ａ脳腫瘍ＴＩＬ免疫表現型決定：生理食塩水灌流後のＣＴ２Ａ腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）の解析を示すグラフおよび画像である。（Ａ）注射後Ｄ６に生理食塩水（４１，９４８）、Ｃ１３４（２７５，５９４）およびＣ１７０（２７３．１７４）処置マウスから単離した全ＴＩＬならびに関連するリンパ球（ピンク）および骨髄細胞（黒色、オレンジおよび青色）の組成の比率による円グラフの概要である。円グラフの下の数は、リンパ球／脳試料の絶対数を表す。（Ｂ）Ｃ１７０により、全Ｔ細胞浸潤が有意に増加する。（Ｃ）両方のｏＨＳＶ（Ｃ１３４およびＣ１７０）により、ＣＤ４集団が増加し、（Ｄ）Ｃ１７０により、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞が有意に増加し、（Ｅ）（ＣＤ２５＋）ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞が活性化した。（Ｆ）ＣＤ８エフェクター様（ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ−）およびセントラルメモリー様（ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ＋）集団解析のさらなるＣＤ８表現型解析のためのゲーティングの例および代表的流れ図である。（Ｇ）Ｃ１３４およびＣ１７０の両方により、ＣＤ８  Ｔエフェクター様集団（ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ−）が増加するが、Ｃ１７０のみにより（Ｈ）処置後Ｄ６にＣＤ８セントラルメモリー様集団が増加する。
【００３７】
【図１６Ａ−１６Ｉ】図１６Ａ〜１６Ｉは、生理食塩水およびｏＨＳＶ処理６７Ｃ４側腹腫瘍の免疫表現型解析を示すグラフおよび画像であり、生理食塩水またはＣ１３４処理試料と比較した場合、（Ａ）Ｃ１７０により、腫瘍におけるＣＤ１１ｂ骨髄細胞集団の相対的比率が有意に減少し、（Ｂ）免疫抑制ＭＤＳＣ様（ＣＤ１１ｂ＋、ＧＲ１＋）集団が有意に減少することを示す。Ｃ１７０処理により、脳腫瘍モデル結果と同様に、腫瘍において（ＣＤ８＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ＋）セントラルメモリー様集団が有意に増加する。ＴＩＬの変化に加えて、Ｃ１７０処理はまた、末梢集団に対する作用を有した。（Ｄ）初期Ｔ細胞（ＣＤ９０＋）および骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋）集団ゲーティングの代表的な例である。Ｃ１７０処理により、末梢において（Ｅ）ＣＤ１１ｂ（＋）細胞および（Ｆ）ＣＤ１１ｂ＋、ＧＲ１＋ＭＤＳＣ様集団が減少する。Ｃ１７０では、末梢において（Ｇ）Ｔ細胞または（Ｈ）ＣＤ４（＋）Ｔ細胞集団は有意には増加しないが、（Ｉ）ＣＤ８  Ｔ細胞集団は確かに増加する。
【００３８】
【図１７Ａ−１７Ｂ】図１７Ａおよび１７Ｂは、腫瘍に対するアブスコパル効果および免疫メモリーを示すスキームおよびグラフである。Ｃ１７０処置脳腫瘍生存マウスでは、ＣＴ２Ａ側腹腫瘍再チャレンジ時に、ＣＴ２Ａ腫瘍再成長が、ナイーブ（腫瘍に未曝露のマウス）またはＣ１３４処置生存マウスよりも良好に抑制される。（Ａ）実験設計概略図を示す。（Ｂ）腫瘍成長曲線では、ナイーブまたはｏＨＳＶ処置長期生存マウスの側腹におけるＣＴ２Ａ移植後の腫瘍成長の有意な減少を示す。
【００３９】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｆは、生理食塩水およびｏＨＳＶ処置マウスによるＴ細胞機能試験の概要であり、Ｃ１７０処置により、長期生存マウスの末梢における抗原特異的Ｔ細胞応答が誘導されることを示す。生理食塩水（青色の棒）またはｏＨＳＶ処置マウス（赤色の棒はＣ１３４、緑色の棒はＣ１７０）由来の脾細胞を解析した。開始時には、ペプチドパルスに使用した集団に差は存在しなかったが、１０μｍのＥｐｈＡ２または１０μＭのＯＶＡペプチド（陰性対照）のパルス後には、Ｃ１７０処置マウスにおいて、これらの（Ｂ）ＣＤ２５（＋）、（Ｃ）ＧＺＭＢ（＋）および（Ｄ）ＣＤ２５＋の活性が有意に増加し、ＧＺＭＢ＋二重染色ＣＤ８＋集団は、ＥｐｈＡ２特異的集団応答を意味する。（Ｅ）ＣＤ８（＋）ＧＺＭＢ（＋）集団およびゲーティング、ならびに（Ｆ）ＧＺＭＢ  ＣＤ２５の二重陽性ゲーティング集団の代表的流れ図を示す。
【００４０】
【図１９Ａ−１９Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−１０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−１１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−１２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−１３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−１４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−１５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−１６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−１７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−１８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−１９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−２０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−２１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−２２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−２３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−２４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−２５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−２６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−２７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−２８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−２９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−３０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−３１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−３２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−３３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−３４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−３５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−３６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｄ−３７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−１０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−１１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−１２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−１３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−１４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−１５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−１６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−１７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−１８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−１９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−２０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−２１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−２２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−２３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−２４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−２５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−２６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−２７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−２８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−２９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−３０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−３１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−３２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−３３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−３４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−３５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−３６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｅ−３７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−１０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−１１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−１２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−１３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−１４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−１５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−１６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−１７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−１８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−１９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−２０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−２１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−２２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−２３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−２４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−２５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−２６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−２７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−２８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−２９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−３０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−３１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−３２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−３３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−３４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−３５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｆ−３６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−１０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−１１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−１２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−１３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−１４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−１５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−１６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−１７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−１８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−１９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−２０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−２１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−２２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−２３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−２４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−２５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−２６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−２７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−２８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−２９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−３０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−３１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−３２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−３３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−３４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−３５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｇ−３６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−１０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−１１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−１２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−１３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−１４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−１５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−１６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−１７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−１８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−１９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−２０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−２１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−２２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−２３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−２４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−２５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−２６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−２７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−２８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−２９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−３０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−３１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−３２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−３３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−３４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−３５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｈ−３６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−１０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−１１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−１２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−１３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−１４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−１５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−１６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−１７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−１８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−１９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−２０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−２１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−２２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−２３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−２４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−２５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−２６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−２７】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−２８】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−２９】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−３０】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−３１】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−３２】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−３３】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−３４】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−３５】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【図１９Ｉ−３６】図１９Ａ〜１９Ｉは、本明細書に記載する例となるキメラ腫瘍溶解性ウイルスの概略図（図１９Ａ〜１９Ｃ）ならびにＣ１７０（図１９Ｄ）、Ｃ１７１（図１９Ｅ）、Ｃ１７２（図１９Ｆ）、Ｃ１７３（図１９Ｇ）、Ｃ１７４（図１９Ｈ）およびＣ１７５（図１９Ｉ）の全ウイルスゲノム配列である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
詳細な説明
本発明では、ヘルペスウイルスガンマ（１）３４．５遺伝子（γ１３４．５）またはγ１３４．５遺伝子と少なくとも約７０％の相同性を有する核酸の発現を減少させる、前記遺伝子または前記核酸の改変、病原性を生じない、ＰＫＲ回避タンパク質をコードする第２のウイルス核酸配列、および腫瘍関連抗原をコードする第３の核酸配列を含む、改変核酸配列を有するヘルペスウイルスを含む、キメラ腫瘍溶解性ウイルスを提供する。また、がんを有する対象を処置するか、またはがん発症のリスクを有する対象にワクチン接種するための、キメラ腫瘍溶解性ウイルスを使用する方法を記載する。
【００４２】
他に定義しない限り、本明細書において使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明の明細書において使用する用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、本発明を制限することを意図しない。本明細書において言及するすべての論文、特許出願、特許、および他の参考文献は、これらの全体が参照により組み込まれる。
【００４３】
値の範囲が提示される場合、文脈上明白に他に指示しない限り下限の１０分の１の単位までの、その範囲の上限と下限との間に介在する各値、およびその定められた範囲における他の任意の定められたかまたは介在する値は、本発明の範囲内に包含されることが理解される。このようなより小さな範囲の上限および下限は、独立してより小さな範囲に含まれ得、また、定められた範囲において特に除外されるいくらかの限界を条件として、本発明の範囲内に包含される。定められた範囲が限界の片方または両方を含む場合、このような含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲はまた、本発明において含まれる。
【００４４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他に指示しない限り複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「ａ  ｓａｍｐｌｅ（試料）」への言及は、複数のこのような試料をも含み、「ｔｈｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（スプライシング調節タンパク質）」への言及は、１つまたは複数のタンパク質分子への言及を含む等である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、基礎値からの＋／−１０％の偏差を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」は、リン酸基、および置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである交換可能な有機塩基に連結する複数のヌクレオチド（すなわち、糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を指す。また、用語は、ポリヌクレオシド（すなわち、リン酸を除去したポリヌクレオチド）およびポリマーを含有する他の任意の有機塩基を含むものとする。プリンおよびピリミジンは、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然に存在する核酸塩基および天然に存在しない核酸塩基、置換および非置換の芳香族部分を含むが、これらに限定されない。天然核酸は、デオキシリボースまたはリボースリン酸骨格を有する。人工または合成ポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは無細胞系において重合させた任意のポリヌクレオチドであり、同一または類似の塩基を含有するが、天然リボースリン酸骨格以外の種類の骨格を含有し得る。このような骨格は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸骨格の他のバリアントを含む。他のこのような改変は、当業者に周知である。したがって、用語、核酸は、例えば、塩基および／または糖の置換または改変を有する核酸をも包含する。
【００４７】
用語「塩基」は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを包含する。塩基は、プリンおよびピリミジンを含み、これらは天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然アナログをさらに含む。プリンおよびピリミジンの合成誘導体は、新たな反応基、例えば、それらに限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびハロゲン化アルキルを配置する改変を含むが、これらに限定されない。
【００４８】
「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用し、ペプチド結合により連結するアミノ酸残基の鎖からなる化合物を指す。ポリペプチドの「活性部分」は、完全長ポリペプチド未満のペプチドを意味するが、これは、測定可能な生物活性を保持し、生物学的検出を保持する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍」は、良性または悪性（がん性）であろうと、原発部位病変または転移であろうと、任意の新生物の成長、増殖または細胞集団を指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、哺乳動物における疾患または状態の１つまたは複数の症状を（熟練の医師により判断した場合、ある程度）緩和する組成物の量を指す。加えて、「治療有効量」の組成物は、疾患もしくは状態と関連するかまたはこの原因となる正常な生理学的または生化学的パラメーターに部分的または完全に戻す量を意味する。当技術分野において熟練の臨床医は、治療有効量の組成物を決定して、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、経口、または吸入により投与する場合、特定の疾患状態または障害を処置または予防することができる。治療的に有効とするために必要とされる組成物の正確な量は、多くの患者特有の考慮すべき事項に加えて、例えば、活性薬剤の特定の活性、利用する送達デバイス、薬剤の物理的特徴、投与の目的などの多数の因子に依存する。しかし、治療有効量の決定は、本明細書に記載する開示の理解について通常の技術を有する臨床医の技術の範囲内である。
【００５１】
「処置する」、「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」等は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの症状を減らすかもしくは抑制することによる状態の向上、疾患の進行の遅延、疾患の発症の予防または遅延等を含む、疾患のリスクを有するかまたはこれに苦しむ患者に利益をもたらす任意の作用を指す。また、処置は、望ましくない増殖細胞を部分的または全体的に破壊するとともに、正常細胞に対する破壊作用が最小限であることを含む。リスクを有する対象は、対象ががんを発症するという平均を上回るリスクを有すると判定されている対象であり、これは、例えば、家族歴またはがんを発症する素因を生じる遺伝子の検出により判定され得る。
【００５２】
用語「対象」は、本明細書で使用される場合、それらに限定されないが、サルおよびヒトを含む霊長類、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）（例えば、ウマ（ｈｏｒｓｅ））、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）（例えば、イヌ（ｄｏｇ））、ネコ、種々の飼い慣らされた家畜（例えば、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ブタ（ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ等のような有蹄動物）ならびに飼い慣らされたペットおよび動物園において維持されている動物を含む、哺乳動物の種を指す。
【００５３】
「腫瘍溶解性ウイルス」は、がん細胞に優先的に感染して死滅させるウイルスを指す。感染がん細胞は、腫瘍崩壊により破壊されて、他のがん細胞にさらに感染する新たな感染性ウイルス粒子の放出を生じる。
【００５４】
「キメラウイルス」は、種々のウイルス由来の核酸配列を含むウイルスを指す。例えば、キメラウイルスは、ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の核酸材料を含むウイルスであり得る。
【００５５】
他に定義しない限り、本明細書において使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００５６】
キメラ腫瘍溶解性ウイルス
一態様では、本発明では、ヘルペスウイルスガンマ（１）３４．５遺伝子（γ１３４．５）またはγ１３４．５遺伝子と少なくとも約７０％の相同性を有する核酸の発現を減少させる、前記遺伝子または前記核酸の改変、病原性を生じない、ＰＫＲ回避タンパク質をコードする第２のウイルス核酸配列、および腫瘍関連抗原をコードする第３の核酸配列を含む、改変核酸配列を有するヘルペスウイルスを含む、キメラ腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
【００５７】
このようなＨＳＶ組換え体の腫瘍における選択的複製は、ウイルス神経毒性遺伝子γ１３４．５の欠失により達成することができる。ＨＳＶ−１神経毒性遺伝子の欠失により、このような腫瘍溶解性ウイルスの安全な投与が可能となる。Δγ１３４．５ウイルスは、非分裂正常細胞に侵入可能であるが、このようなウイルスは、活発に分裂する細胞、例えば、腫瘍細胞を除いて効率的に複製することができない。Chou  et  al.,  Science  250(4985):  1262-6  (1990)。したがって、このようなウイルスは、腫瘍選択性ウイルスである。Δγ１３４．５ウイルスは、前臨床動物モデルにおける悪性脳腫瘍の治療に対する有意な有効性を示しており、米国（Markert  et  al.,  Gene  Ther.  7(10):  867-74  (2000)）および英国（Rampling  et  al.,  Gene  Ther.  7(10):  859-66  (2000)）の両方の第Ｉおよび第ＩＩ相試験において安全であることが実証されている。しかし、弱毒ＨＳＶ−１（Δγ１３４．５）組換え体は、ウイルスタンパク質を効率的に合成することが不可能であり、これによりウイルス複製が制限される。Shah  et  al.,  J.  Neurooncol.  65(3):  203-26  (2003)。しかし、ＰＫＲ回避遺伝子を組み込むと、神経毒性もなく、ＰＫＲにより媒介されるタンパク質の遮断が阻害される。
【００５８】
キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルスガンマ（１）３４．５遺伝子（γ１３４．５）またはγ１３４．５遺伝子と少なくとも約７０％の相同性を有する核酸の発現を減少させる、前記遺伝子または前記核酸の改変を含む。γ１３４．５遺伝子になされ得る改変は、１つまたは複数の変異、欠失、挿入および置換を含む。したがって、ヘルパーウイルス核酸配列への改変は、ＨＳＶ−１からのγ１３４．５遺伝子（配列番号１）の完全または部分的欠失を含み得る。改変は、外因性停止コドンまたは他の１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入を含み得る。改変は、γ１３４．５遺伝子の発現を変更する、プロモーターの変異もしくは欠失または外因性プロモーターの挿入を含み得る。改変は、コドンフレームシフトを生じる１つまたは複数のヌクレオチドの挿入を含み得る。その上、キメラの第２のウイルス核酸配列は、γ１３４．５遺伝子の代わりに使用し得る。また、γ１３４．５遺伝子への改変は、γ１３４．５遺伝子に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を含む、少なくとも約７０〜９９％の相同性を有する核酸の改変であり得る。一部の実施形態では、ヘルペスウイルスγ１３４．５遺伝子の改変は、γ１３４．５遺伝子の欠失または変異を含む。本明細書に記載の改変するための方法は、当業者に周知である。
【００５９】
本発明のキメラ腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルスに基づく。遺伝子改変されたヘルペスウイルスは、いくつかの理由のため、腫瘍溶解性ベクターとして魅力的である：１）組換えヘルペスウイルスを構築するための手順が十分確立されている。２）ウイルス複製能に影響せずに複数の遺伝子を欠失および／または治療的外来遺伝子で置き換えることができる。３）ヘルペスウイルスの生物学ならびにヒトおよび非ヒト霊長類におけるこの挙動による多くの経験が文献に存在する。４）改変ヘルペスウイルスは、標準抗ウイルス薬療法に対する感受性を「備わった（built-in）」安全フィーチャとして保持するように操作することができる。その上、単純ヘルペスウイルスのゲノムサイズが１５２ｋｂであることにより、３０ｋｂまたはそれよりも大きいサイズの遺伝子の移入が可能となる。
【００６０】
１２０種を上回る動物ヘルペスウイルスが存在する。すべてのヘルペスウイルスは、３つのサブセット：アルファ（α）、ベータ（β）およびガンマ（γ）ヘルペスウイルスに分類される。８種のヒトヘルペスウイルスが存在し、３つのサブセットに分割される。アルファヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、ＨＳＶ−２および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）を含む。ベータヘルペスウイルスは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）を含む。ガンマヘルペスウイルスは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）およびガンマカポジ肉腫ヘルペスウイルスを含む。したがって、一部の実施形態では、キメラ腫瘍溶解性ウイルスに含まれるヘルペスウイルスは、αヘルペスウイルスであるが、さらなる実施形態では、キメラ腫瘍溶解性ウイルスに含まれるヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ヘルペスウイルスである。
【００６１】
キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルスガンマ（１）３４．５遺伝子（γ１３４．５）またはγ１３４．５遺伝子と少なくとも約７０％の相同性を有する核酸の発現を減少させる、前記遺伝子または前記核酸の改変、および病原性を生じない、ＰＫＲ回避タンパク質をコードする第２のウイルス核酸配列を含む。ヘルペスウイルス核酸改変は、タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）回避遺伝子の発現の減少を、改変非存在下の回避遺伝子の発現と比較して生じる。第２のウイルス配列は、遺伝子の神経毒性機能を有しない、ＰＫＲ回避遺伝子のタンパク質合成機能を含むタンパク質をコードする。したがって、キメラウイルスは、野生型ヘルペスウイルスと比較して神経毒性の低下を有する。また、本明細書に記載するように、提供するキメラウイルスは、例えば、Δγ１３４．５ＨＳＶなどの既存の弱毒ヘルペスウイルスと比較して、タンパク質合成および／または複製の増強を有する。提供するキメラウイルスの第２の核酸配列により、第２のウイルス核酸配列の非存在下のキメラウイルスのタンパク質合成または複製と比較して、タンパク質合成または複製が増強される。提供するキメラウイルスの第２の核酸配列によって、ＰＫＲ活性化の阻害、ｅＩＦ−２αリン酸化の阻害、またはｅＩＦ−２α脱リン酸化の増強によるタンパク質合成および複製が増強され得る。
【００６２】
キメラ腫瘍溶解性ウイルスの第２のウイルス核酸配列は、感染腫瘍細胞におけるＰＫＲ回避遺伝子、タンパク質合成および複製のうちの１つの表現型は含むが、ＰＫＲ回避遺伝子、ＰＫＲにより媒介される病原性、例えば、神経毒性の他の表現型は含まない。言い換えれば、第２のウイルス核酸配列は、ＰＫＲにより媒介されるタンパク質の遮断を阻害し、神経毒性はない。したがって、第２のウイルス核酸配列は、任意のＰＫＲ回避遺伝子または病原性を生じない同等の遺伝子であり得る。第２のウイルス核酸配列は、相同ウイルスに由来し得る。したがって、提供するキメラウイルスの第２のウイルス核酸配列は、αヘルペスウイルス核酸配列、Ｐヘルペスウイルス核酸配列、またはγヘルペスウイルス核酸配列であり得る。したがって、提供するキメラウイルスのウイルス核酸配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸配列であり得る。
【００６３】
提供するキメラウイルスにおいて使用することが可能な、適する核酸配列の例は、ＩＲＳ−１（配列番号２）およびＴＲＳ−１（配列番号３）またはこれらの相同遺伝子を含むが、これらに限定されない。提供するキメラウイルスは、ＩＲＳ−１遺伝子を含み得る。また、提供するキメラウイルスは、ＩＲＳ−１遺伝子に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の相同性を含む、少なくとも約７０〜９９％の相同性を有する核酸を含み得る。提供するキメラウイルスは、ＴＲＳ−１遺伝子またはこの相同遺伝子を含み得る。また、提供するキメラウイルスは、ＴＲＳ−１遺伝子に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の相同性を含む、少なくとも約７０〜９９％の相同性を有する核酸を含み得る。
【００６４】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ＩＲＳ１およびＴＲＳ１タンパク質は、細胞における小胞輸送およびリソソーム選別に関与する、２つの真核生物遺伝子Ｎｅｄｄ４およびＴＳＧ１０１と独立的に相互作用する共有１３０アミノ酸（ａａ）領域を有する。以下の実施例に記載するように、ＴＲＳ１またはＩＲＳ１のいずれかを含むキメラウイルスは、類似のタンパク質合成表現型を有する。したがって、提供するキメラウイルスは、ＩＲＳ１およびＴＲＳ１の共有１３０ａａ領域に対応する核酸配列を含み得る（配列番号４）。また、提供するキメラウイルスは、配列番号４に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の相同性を含む、少なくとも約７０〜９９％の相同性を有する核酸を含む。
【００６５】
本明細書に記載するように、相同性および同一性の用語の使用は、類似性と同一のことを意味することが理解される。したがって、例えば、相同性の単語の使用が、２つの非天然配列間で使用される場合、これは、これらの２つの配列間の進化的関係を必ずしも示していないが、むしろこれらの核酸配列間の類似性または関連性に目を向けていることが理解される。２つの進化的に関連する分子間の相同性を判定するための方法の多くは、それらが進化的に関連するかどうかにかかわらず配列類似性を測定する目的のために、任意の２つまたはそれよりも多い核酸またはタンパク質に日常的に適用されている。
【００６６】
一般には、開示する遺伝子および本発明のタンパク質の公知の任意のバリアントおよび誘導体または生じ得るものを定義する１つの方式は、公知の特異的配列との相同性に関してバリアントおよび誘導体を定義することによるものであることが理解される。また、本明細書に開示する特定の配列のこの同一性は、本明細書の他の部分において考察する。一般には、本明細書において開示する遺伝子およびタンパク質のバリアントは、定められた配列または天然配列に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９パーセントの相同性を典型的に有する。当業者は、２つのタンパク質または核酸、例えば、遺伝子の相同性を判定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、２つの配列のアラインメント後に算出して相同性を最高レベルとすることができる。
【００６７】
相同性を算出する別の方式は、公表されたアルゴリズムにより実施することができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith  and  Waterman,  Adv.  Appl.  Math.  2:  482  (1981)の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman  and  Wunsch,  J.  Mol.  Biol.  48:  443  (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson  and  Lipman,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  85:2444  (1988)の類似法の検索により、アルゴリズム（Genetics  Computer  Group,  575  Science  Dr.,  Madison,  Wis.によるWisconsin  Genetics  Software  PackageのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行により、または検査により行い得る。
【００６８】
同一の種類の相同性は、核酸についても、例えば、Zuker,  M.  Science  244:48-52,  1989、Jaeger  et  al.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  86:7706-7710,  1989、Jaeger  et  al.  Methods  Enzymol.  183:281-306,  1989に開示されているアルゴリズムにより得ることができ、これらは、少なくとも核酸アラインメントと関連する材料についての参照により本明細書において組み込まれる。方法のいずれかを典型的に使用可能であり、ある特定の場合では、このような種々の方法の結果は異なり得ることが理解されるが、熟練の技術者は、同一性が、このような方法の少なくとも１つにより見出される場合、配列が、定められた同一性を有すると言われ、本明細書に開示されることを理解する。
【００６９】
例えば、本明細書で使用される場合、別の配列に対する特定のパーセント相同性を有するものとして列挙する配列は、上記のいずれか１つまたは複数の方法により算出した場合、列挙する相同性を有する配列を指す。例えば、第１の配列は、本明細書に定義するように、Ｚｕｋｅｒ算出法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出された場合、他の算出法のいずれかにより算出した場合に第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有しなくても、第２の配列に対して、８０パーセントの相同性を有する。別の例としては、第１の配列は、本明細書に定義するように、Ｚｕｋｅｒ算出法およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ算出法の両方を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出された場合、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ算出法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ算出法、Ｊａｅｇｅｒ算出法、または他の算出法いずれかにより算出した場合に第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有しなくても、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有する。さらに別の例では、第１の配列は、本明細書に定義するように、それぞれの算出方法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出された場合、実際は、種々の算出法により種々の相同性のパーセンテージが算出されることが多くても、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有する。
【００７０】
開示する核酸は、例えば、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換を含有し得る。これらおよび他の分子の非限定的な例は、本明細書において考察する。例えば、ベクターが細胞において発現する場合、発現したｍＲＮＡは、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵから典型的に構成されることが理解される。
【００７１】
ヌクレオチドアナログは、塩基、糖、またはリン酸部分いずれかの一部の種類の改変を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドへの改変は、当技術分野において周知であり、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２−アミノアデニンを含む。
【００７２】
また、腫瘍関連抗原をさらに含む、本明細書において開示するキメラ腫瘍溶解性ウイルスを含むウイルスベクターを本明細書において提供する。したがって、標的細胞を本明細書において提供するウイルスベクターに接触させるステップを含む、腫瘍関連抗原を細胞に送達する方法を提供する。送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏであり得る。ウイルスベクターのキメラ腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルス侵入に必要とされる改変ＨＳＶ糖タンパク質をコードする遺伝子を含み得る。組換えＨＳＶは、腫瘍特異的受容体を介して腫瘍細胞に排他的に侵入するように構築されている。Zhou  and  Roizman,  J.  Virol.  79(9):  5272-7  (2005)。
【００７３】
本明細書に記載するものなどの、細胞に送達される核酸は、発現制御系を典型的に含有する。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系に挿入される遺伝子は、所望の遺伝子産物の発現の制御に役立つプロモーターおよび／またはエンハンサーを通常含有する。プロモーターは一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの１つまたは複数の配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要とされるコアエレメントを含有し、上流エレメントおよび応答エレメントを含有し得る。
【００７４】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源、例えば、ポリオーマ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくは、サイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、ベータアクチンプロモーターから得てもよい。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、好都合には、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含有するＳＶ４０制限断片として得られる（Fiers  et  al.,  Nature,  273:  113  (1978)）。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、好都合には、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として得られる（Greenway,  P.  J.  et  al.,  Gene  18:  355-360  (1982)）。もちろん、宿主細胞または関連種のプロモーターも、本発明において有用である。
【００７５】
エンハンサーは、転写開始部位から一定ではない距離において機能するＤＮＡの配列を一般に指し、転写ユニットに対して５’または３’のいずれかに存在し得る。その上、エンハンサーは、イントロン内ならびにコード配列それ自体内に存在し得る。これらは通常、１０〜３００塩基対（ｂｐ）の長さであり、ｃｉｓに機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加させるように機能する。また、エンハンサーは、転写の調節を媒介する応答エレメントを含有することが多い。プロモーターも、転写の調節を媒介する応答エレメントを含有し得る。エンハンサーは、遺伝子の発現の調節を決定することが多い。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテインおよびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在公知であるが、一般的発現のために真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを典型的に使用する。好ましい例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーター、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、これらの機能を誘発する光または特異的な化学現象のいずれかにより特異的に活性化され得る。系は、試薬、例えば、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンにより調節することができる。また、照射、例えば、ガンマ線照射、またはアルキル化剤への曝露により、ウイルスベクター遺伝子発現を増強させる方式が存在する。
【００７７】
プロモーター領域は、構成的プロモーターとして作用して、転写される転写ユニット領域の発現を最大化し得る。ある特定の構築物では、プロモーター領域は、特定の細胞型において特定の時にのみ発現する場合でも、すべての真核生物細胞型において活性であり得る。この種類の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（完全長プロモーター）およびレトロウイルスベクターＬＴＲである。すべての特異的調節性エレメントをクローニングおよび使用して、特定の細胞型、例えば、黒色腫細胞において選択的に発現する発現ベクターを構築することができることがわかっている。例えば、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア細胞に由来する細胞において遺伝子を選択的に発現させるのに使用されている。また、このような腫瘍特異的プロモーターは、本明細書に記載するキメラウイルスならびにウイルスベクターに組み込むことができる。
【００７８】
また、真核生物宿主細胞において使用する発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響し得る、転写の終止に必要とされる配列を含有し得る。このような領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化セグメントとして転写される。また、３’非翻訳領域は、転写終結部位を含む。また、転写ユニットが、ポリアデニル化領域を含有することが好ましい。この領域の１つの利益は、転写されたユニットが、ｍＲＮＡのようにプロセシングされて輸送される可能性を上昇させることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルが、導入遺伝子構築物において使用されることが好ましい。ある特定の転写ユニットでは、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。また、構築物の発現またはこの安定性を向上させるために、転写されたユニットが、他の標準配列を単独または上記の配列と組み合わせて含有することが好ましい。
【００７９】
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達されているかどうか、および送達されると発現するかを判定するために使用する。マーカー遺伝子は、例えば、βガラクトシダーゼをコードする大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ｌａｃＺ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。また、マーカーは、イメージング技術において使用し得る。したがって、マーカーをコードするキメラベクターは、がん細胞または腫瘍を可視化するために使用し得る。マークされた領域のサイズまたはマーカーの強度は、例えば、がんの進行、退縮、または治癒を評価するために使用し得る。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「マーカー」は、目的の分子に直接的（例えば、ポリペプチドまたは核酸に組み込まれる蛍光分子）または間接的（例えば、タグを組み込んだ活性化可能な基質、ペプチド、受容体融合タンパク質、一次抗体、または二次抗体を含む、発現した遺伝子レポーターの活性化または発現した遺伝子レポーターへの結合により）に結合させることが可能な任意の検出可能なタグを意味する。「マーカー」は、イメージング法により可視化することが可能な任意のタグである。検出可能なタグは、放射線不透過性物質、放射標識、蛍光標識、発光タンパク質、磁気標識、または微小気泡（その全体が本明細書に組み込まれるEllega  et  al.  Circulation,  108:336-341,  2003に記載されている、循環系に残存して超音波検査により検出可能な均一サイズの空気で満たされた気泡）であり得る。検出可能なタグは、局在化に適するガンマ放射体、ベータ放射体、およびアルファ放射体、ポジトロン放射体、Ｘ線放射体、超音波反射体（微小気泡）、および蛍光放射体からなる群から選択され得る。適する蛍光化合物は、フルオレセインナトリウム、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄスルホニルクロリド（de  Belder  &  Wik,  Carbohydr.  Res.44(2):251-57  (1975)）ならびに近赤外線において蛍光性の化合物、例えば、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などを含む。また、放射性トレーサーの投与後に検出可能な遺伝子レポーター、例えば、ｈＳＳＴｒ２、チミジンキナーゼ（ヘルペスウイルス、ヒトミトコンドリアなど由来）およびＮＩＳ（ナトリウム／ヨウ化物共輸送体）を含む。発光タンパク質は、各種のルシフェラーゼを含む。当業者は、単なる日常的実験により、分子を標識するのに適する他の蛍光化合物を熟知するまたは確認することができる。
【００８１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのモニタリングは、例えば、生物発光イメージング、平面ガンマカメライメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、光ベースのイメージング、磁気共鳴画像法および分光法、蛍光イメージング（特には、近赤外線）、拡散光トモグラフィー、超音波検査（非標的微小気泡造影、および標的微小気泡造影を含む）、ＰＥＴイメージング、蛍光相関分光法、ｉｎ  ｖｉｖｏでの２光子顕微鏡法、光干渉断層撮影、スペックル顕微鏡法、低分子レポーター、ナノ結晶標識ならびに第２高調波イメージングを使用して実行することができる。上述のイメージング技術を使用して、種々の炎症特異的プロモーター制御下のレポーター遺伝子は、特異的な誘導の後に検出される。
【００８２】
このような技術は、他のイメージング技術と組み合わせて適用することができる。例えば、腫瘍塊のモニタリングは、ＣＭＶルシフェラーゼに対して陽性の腫瘍細胞を使用して達成することができる。加えて、２つのルシフェラーゼ酵素は、例えば、ＣＭＶルシフェラーゼ（ホタル由来）およびｃｏｘ２Ｌルシフェラーゼ（ウミシイタケ由来）を使用して同時に画像化することができる。他のレポーターおよびプロモーターは、このような例とともに使用することができ、その一部は上に開示している。
【００８３】
腫瘍関連抗原
キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍関連抗原をコードする第３の核酸配列を含む。本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞により産生された任意の抗原を含む。「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞のみに存在し、他の任意の細胞には存在しない抗原であり得るか、または一部の腫瘍細胞および一部の正常細胞にも存在する抗原であり得る。腫瘍関連抗原は、例えば、変異した癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の産物、過剰発現もしくは異常に発現した細胞タンパク質、癌ウイルスにより産生された腫瘍抗原、癌胎児性抗原、変化した細胞表面糖脂質および糖タンパク質、または細胞型特異的分化抗原を含み得る。
【００８４】
一部の実施形態では、キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、複数の異なる腫瘍関連抗原を発現させることが可能である。例えば、一部の実施形態では、ヘルペスウイルスは、第３の核酸配列によりコードされる腫瘍関連抗原とは異なる腫瘍関連抗原をコードする第４の核酸配列を含む。
【００８５】
種々の抗原（例えば、腫瘍関連抗原、微生物抗原）またはこれらの抗原部分は、上記のように、イムノアッセイによって、当技術分野において公知の抗原、あるいは抗体もしくはＭＨＣ分子に結合可能であるか（抗原性）または免疫応答を生じることが可能である（免疫原性）と判定された抗原の中から、目的の抗原としての使用のために選択され得る。また、さらなる有用な抗原またはこの誘導体は、判定基準、例えば、がんにおける抗原の関与（Norrby  (1985)  Vaccines  85,  Lerner,  et  al.  (eds.),  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.,  pp.  388-389）、種類もしくは群の特異性、患者の抗血清もしくは免疫細胞による認識、および／または抗原に特異的な抗血清もしくは免疫細胞の防御効果の実証により同定することができる。
【００８６】
目的のいかなる抗原も本明細書において提供する方法および組成物において利用することができるが、非限定的な例としては、がんと関連するか、由来するか、または関連すると予想される、腫瘍関連抗原またはこの抗原部分が挙げられる。このような場合では、目的の腫瘍関連抗原は、それらに限定されないが、腺癌、肝芽腫、肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、骨髄腫、膀胱がん、脳がん、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、皮膚がん、肝臓がん、肺がん、結腸がん、子宮頸がん、乳がん、腎臓がん、食道癌、頭頸部癌、精巣がん、結腸直腸がん、前立腺がん、および膵臓がん、またはこれらの任意の抗原部分を含む、任意の型のがんに由来し得る。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、神経膠芽腫関連抗原である。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、処置するがんに見出されるものである。
【００８７】
多くの型の腫瘍細胞は、正常細胞において見出されない抗原を発現する。腫瘍関連抗原として知られるこのような抗原は、治療的抗がんワクチンの標的として集中的に研究されている。例となる腫瘍関連抗原は、リンパ球抗原６複合体、Ｋ座位（ＬＹ６Ｋ）、細胞分裂周期関連１（ＣＤＣＡ１）、インスリン様成長因子ＩＩ  ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＭＰ−３）、キネシンファミリーメンバー２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）、カドヘリン３（ＣＤＨ３）、酸性でシステインに富む分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）、細胞分裂周期４５リガンド（ＣＤＣ４５Ｌ）、ＤＥＰドメイン含有１（ＤＥＰＤＣ１）、Ｍ期リンタンパク質１（ＭＰＨＯＳＰＨ１）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ヒト上皮成長因子受容体２／神経芽細胞腫（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、変異上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、黒色腫抗原（ＭＡＧＥ）、ムチン１（ＭＵＣ−１）およびニューヨーク食道扁平上皮癌１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ、ｇｐ１００、メランＡ／Ｍａｒｔ−１、チロシナーゼ、マンマグロビンＡ、ｐ５３、リビン（ｌｉｖｉｎ）、サバイビン、βアクチン／４／ｍ、ミオシン／ｍ、ＨＳＰ７０−２／ｍ、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７ＯＪ、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＭＵＣ−１、ｓＴｎ、グロボＨ、ＷＴ１、ＰＲ１、Ｅ７５、ｒａｓ、ＡＦＰ、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１および２、ｐ５３変異体、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＰＶ１６Ｅ７、βカテニン、ＣＤＫ４、ＣＤＣ２７、αアクチニン４、ＴＲＰ１／ｇｐ７５、ＴＲＰ２、ガングリオシド、ＷＴ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＣＤ２０、テロメラーゼ、ＭＡＲＴ−１、またはこれらの抗原部分である。Hirayama  et  al.  2016,  Int.  Immunol.  Advance  Access  May  28  pp  1-26を参照されたい。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＥｐｈＡ２である。
【００８８】
さらに、上述の腫瘍関連抗原のバリアントをも包含する。このようなバリアントは、特定の腫瘍関連抗原と少なくとも同一の必須の抗原活性を有する。さらに、本発明により言及されるバリアントは、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失および／または付加のために異なるアミノ酸配列を有するものであり、バリアントのアミノ酸配列がさらに、特定の腫瘍関連抗原のアミノ酸配列に対して、好ましくは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であることが理解される。２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、当技術分野において周知のアルゴリズムにより判定することができる。
【００８９】
第３の核酸配列は、当業者に公知および本明細書に記載の方法を使用して、キメラ腫瘍溶解性ウイルスを発現するヌクレオチド配列に挿入することができる。例えば、ｐＣＫ１１６６ベクター（Cassady  et  al.,  J.  Virol  86(a),  p.  610-4  (2012)）を、腫瘍関連抗原を発現させるための配列を含む導入遺伝子発現カセットの組換えに基づく挿入に使用することができる。一部の実施形態では、第３の核酸配列は、キメラ腫瘍溶解性ウイルスのγ１３４．５座位に挿入される。
【００９０】
一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、結合タンパク質を含むか、またはキメラ腫瘍溶解性ウイルスに感染した細胞によるこの分泌を増加させるように改変する。例えば、一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、樹状細胞結合ペプチドを含む。他の実施形態では、腫瘍関連抗原は、分泌タンパク質である。適する樹状細胞結合ペプチドは、樹状細胞関連ヘパラン硫酸プロテオグリカン−インテグリンリガンドに結合するものを含む。
【００９１】
作製の方法
本明細書に開示するキメラ腫瘍溶解性ウイルスおよび開示の方法の実施に必要とされる組成物は、他に特に述べない限り、特定の試薬または化合物のために、当業者に公知の任意の方法を使用して作製することができる。例えば、核酸は、標準的化学合成方法を使用して作製することができるか、または酵素的方法または他の公知の任意の方法を使用して生成することができる。このような方法は、標準的酵素消化の後のヌクレオチド断片単離（例えば、Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  2nd  Edition  (Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.,  1989)  Chapters  5,  6を参照）から、例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎのＳｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成機（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．のＭｏｄｅｌ  ８７００自動合成機またはＡＢＩのＭｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を使用したシアノエチルホスホロアミダイト方法による純粋合成方法までの範囲にわたり得る。また、オリゴヌクレオチドの作製に有用な合成方法は、Ikuta  et  al.,  Ann.  Rev.  Biochem.  53:323-356  (1984)（ホスホトリエステラーゼおよび亜リン酸トリエステル法）およびNarang  et  al.,  Methods  Enzymol.,  65:610-620  (1980)（ホスホトリエステラーゼ法）により記載されている。タンパク質核酸分子（protein  nucleic  acid  molecule）は、Nielsen  et  al.,  Bioconjug.  Chem.  5:3-7  (1994)により記載されているものなどの公知の方法を使用して作製することができる。
【００９２】
キメラ腫瘍溶解性ウイルスおよびウイルスベクターは、実施例に記載するように組換えにより、または多くの標準的実験マニュアル、例えば、Davis  et  al.,  Basic  Methods  in  Molecular  Biology  (1986)およびSambrook  et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  2nd  Ed.、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.  (1989)に記載されているように組換えウイルスを作製する他の方法により作製することができる。類似の方法を使用して、本明細書に記載のウイルスベクターを作製する方法において、目的の遺伝子を導入する。例えば、組換えウイルスは、ＤＮＡ共トランスフェクションの後に相同組換えを使用して構築することができる。この例では、細胞は、目的の遺伝子を含有する少なくとも２つの異なるウイルスを共トランスフェクトすることができ、子孫ウイルスプラークを、マーカー発現の消失に基づいて精製することができる。候補ウイルスの正確な遺伝子構成の最終的検証は、本明細書に記載の核酸に対するプローブを使用したＤＮＡハイブリダイゼーション試験により検証することができる。
【００９３】
本明細書に記載する核酸配列は、ゲノムＤＮＡライブラリーなどの天然の供給源から標準的クローニングおよびスクリーニング技術を使用して得てもよく、または周知の市販の技術を使用して合成することができる。
【００９４】
核酸配列を組換えにより使用する場合、核酸配列は、成熟ポリペプチドそれ自体のコード配列、または他のコード配列、例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、プレもしくはプロもしくはプレプロタンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするものを有するリーディングフレーム内に成熟ポリペプチドのコード配列を含み得る。また、核酸配列は、非コード５’および３’配列、例えば、転写された非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位ならびにｍＲＮＡを安定化する配列を含有し得る。
【００９５】
核酸は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅（ＰＣＲ）反応のためのプライマーとして使用して、ポリペプチドをコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、高い配列類似性を有する他の遺伝子（各種由来のホモログおよびオルソログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し得る。
【００９６】
種由来のホモログおよびオルソログを含む、本明細書に記載する核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標識したプローブまたはこの断片を用いて、適切なライブラリー（当業者により理解されるもの）をスクリーニングするステップと、前記ポリヌクレオチド配列を含有する完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するステップとを含むプロセスにより得ることができる。このようなハイブリダイゼーション技術は、熟練の技術者に周知である。
【００９７】
がん処置
一態様では、本発明では、改変核酸配列を有するヘルペスウイルスを含むキメラ腫瘍溶解性ウイルスと対象のがん細胞とを接触させることにより対象におけるがんを処置する方法を提供する。改変核酸配列は、ヘルペスウイルスガンマ（１）３４．５遺伝子（γ１３４．５）またはγ１３４．５遺伝子と少なくとも約７０％の相同性を有する核酸の発現を減少させる、前記遺伝子または前記核酸の改変、病原性を生じない、ＰＫＲ回避タンパク質をコードする第２のウイルス核酸配列、および腫瘍関連抗原をコードする第３の核酸配列を含む。キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書に記載するバリアントおよび実施形態のいずれかであり得る。例えば、一部の実施形態では、ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ヘルペスウイルスであるが、さらなる実施形態では、第２のウイルス核酸配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核酸である。
【００９８】
本発明では、本明細書に記載のキメラ腫瘍溶解性ヘルペスウイルスを使用して、がんを処置することを必要とする対象におけるがんを処置する方法を提供する。用語「がん」は、正常な成長制御に対する感受性を失った細胞の増殖により生じるか、または前記増殖を特徴とする増殖性障害を指す。同一組織型のがんは、通常、同一の組織において生じ、これらの生物学的特徴に基づいて種々の亜型に分類され得る。がんの４つの一般的カテゴリーは、癌（上皮細胞由来）、肉腫（結合組織または中胚葉系由来）、白血病（造血組織由来）およびリンパ腫（リンパ組織由来）である。
【００９９】
キメラ腫瘍溶解性ウイルスと対象のがん細胞とを接触させることにより、対象におけるがんを処置する方法を記載する。接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施することができる。標的細胞は、固形腫瘍細胞であり得る。また、開示するキメラウイルスを使用して、前がん状態、例えば、子宮頸部および肛門異形成、他の異形成、高度異形成、過形成、異型過形成、または新形成を処置することができる。したがって、標的細胞は、腺癌、肝芽腫、肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、骨髄腫、膀胱がん、脳がん、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、皮膚がん、肝臓がん、肺がん、結腸がん、子宮頸がん、乳がん、腎臓がん、食道癌、頭頸部癌、精巣がん、結腸直腸がん、前立腺がん、または膵臓がんであり得る。標的細胞は、外胚葉由来がん細胞であり得る。標的細胞は、脳がん細胞であり得る。したがって、標的細胞は、神経芽腫細胞、神経膠腫細胞、または神経膠芽腫細胞であり得る。標的細胞は、乳がん細胞であり得る。標的細胞は、肝芽腫細胞または肝臓がん細胞であり得る。標的細胞を死滅させる方法は、細胞死を促進させるための当技術分野において公知の追加のステップをさらに含み得る。
【０１００】
また、本明細書において提供するキメラ腫瘍溶解性ウイルスとがん細胞とを接触させるステップを含む、対象におけるがんを処置する方法を本明細書において提供する。がんは、腺癌、肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、骨髄腫、肝芽腫、膀胱がん、脳がん、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、皮膚がん、肝臓がん、肺がん、結腸がん、子宮頸がん、乳がん、腎臓がん、食道癌、頭頸部癌、精巣がん、結腸直腸がん、前立腺がん、および膵臓がんからなる群から選択され得る。したがって、がんは、神経膠腫であり得る。さらなる実施形態では、がんは、神経膠芽腫であり得る。がんは、神経芽細胞腫であり得る。がんは、乳がんであり得る。また、がんは、膵臓がんまたは肝芽腫であり得る。
【０１０１】
神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、浸潤性および末梢性免疫細胞機能を抑制する。腫瘍は、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０およびプロスタグランジンＥ２を分泌し、これらは、Ｔリンパ球の免疫認識およびサイトカイン産生を下方調節する。腫瘍内の制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）および腫瘍関連マクロファージは、ＩＬ−１０産生の増加に寄与し、これは、浸潤性Ｔエフェクター細胞を機能的に障害する。ＧＢＭにおいて特異的に発現または上方調節される、いくつかの腫瘍抗原が同定されているが、腫瘍微小環境における免疫抑制および悪性細胞における機能障害性抗原プロセシング経路により、獲得免疫応答が減弱する。Mohme  et  al.,  Cancer  Treat  Rev,  40(2):248-58  (2014)。
【０１０２】
本明細書に記載するように、がん処置のために使用するキメラ腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍関連抗原をコードする第３の核酸配列を含む。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞のみに存在し、他のいかなる細胞にも存在しない抗原であり得るか、または一部の腫瘍細胞および一部の正常細胞にも存在する抗原であり得る。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、処置するがんに見出されるものである。例えば、ＥｐｈＡ２は、神経膠芽腫が一般に発現する腫瘍関連抗原である。したがって、神経膠芽腫を処置する場合、キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍関連抗原ＥｐｈＡ２を発現するように改変することができる。
【０１０３】
抗ウイルス免疫応答は、キメラ腫瘍溶解性ウイルスの作用に寄与する。キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、自然（例えば、好中球、ＮＫ細胞、およびマクロファージ）および適応（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）免疫応答の両方を動員するインターフェロンシグナル伝達、ならびに抗原認識の向上を誘導する。また、キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、免疫抑制腫瘍環境を復帰させ、抗腫瘍免疫認識を刺激する。腫瘍関連抗原をキメラ腫瘍溶解性ウイルスに含むと、ワクチンによる手法が増強されて、ワクチン接種による作用に基づく持続的抗腫瘍効果をもたらすキメラ腫瘍溶解性ウイルスが生じる。
【０１０４】
本発明による方法は、キメラ腫瘍溶解性ウイルス単独の投与、または動物が、手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫療法、ホルモン療法およびレーザー療法からなる群から選択される１つもしくは複数のがん処置をも受けている併用療法を含む。
【０１０５】
一般には、任意の併用療法は、化学療法薬、抗体のような標的化剤、キナーゼ阻害剤、ホルモン剤等のうちの１つまたは複数を含む。また、併用療法は、それらに限定されないが、抗体投与、ワクチン投与、細胞傷害剤、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチドアナログ、および生物応答修飾物質の投与を含む通常療法を含む。２つまたはそれよりも多く組み合わせた化合物を、ともにまたは逐次的に使用し得る。例えば、当技術分野において周知であり、本明細書に記載の組成物と組み合わせて処置として使用することができる抗がん剤は、本明細書で使用される場合、がんを処置するために使用し得る医薬であり、がん性細胞を直接死滅させる能力を一般に有する、第１選択の「化学療法剤」または第１選択の化学療法を含むがそれに限定されない。
【０１０６】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、代謝拮抗物質、天然産物、ホルモンおよびアンタゴニスト、ならびに各種の薬剤が挙げられる。アルキル化剤の例としては、ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン（ｓａｒｃｏｌｙｓｉｎ））およびクロラムブシル；エチレンイミンおよびメチルメラミン、例えば、ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）およびストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）；ＤＮＡ合成アンタゴニスト、例えば、リン酸エストラムスチン；ならびにトリアジン、例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ジメチル−トリアゼノイミダゾールカルボキサミド）およびテモゾロミドが挙げられる。代謝拮抗物質の例としては、葉酸アナログ、例えば、メトトレキセート（アメトプテリン）；ピリミジンアナログ、例えば、フルオロウラシン（fluorouracin）（５−フルオロウラシル、５−ＦＵ、５ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン、ＦＵｄＲ）、シタラビン（シトシンアラビノシド）およびゲムシタビン；プリンアナログ、例えば、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン（6-niercaptopurine）、６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン、ＴＧ）およびペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン、デオキシコホルマイシン）、クラドリビンおよびフルダラビン；ならびにトポイソメラーゼ阻害剤、例えば、アムサクリンが挙げられる。天然産物の例としては、ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチン；タキサン、例えば、パクリタキセル（アブラキサン）およびドセタキセル（タキソテール）；エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシドおよびテニポシド；カンプトテシン、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン（ｒｕｂｉｄｏｍｙｃｉｎ））、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン（マイトマイシンＣ）、イダルビシン、エピルビシン；酵素、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ；ならびに生物応答修飾物質、例えば、インターフェロンアルファおよびインターロイキン２が挙げられる。ホルモンおよびアンタゴニストの例としては、黄体形成ホルモンアゴニスト、例えば、ブセレリン；副腎皮質ステロイド、例えば、プレドニゾンおよび関連する調製物；プロゲスチン、例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、および関連する調製物；エストロゲンアンタゴニスト、例えば、タモキシフェンおよびアナストロゾール；アンドロゲン、例えば、プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン、および関連する調製物；アンドロゲンアンタゴニスト、例えば、フルタミドおよびビカルタミド；ならびにゴナドトロピン放出ホルモンアナログ、例えば、ロイプロリドが挙げられる。各種の薬剤の例としては、サ���ドマイド、白金配位錯体、例えば、シスプラチン（ｃｚｓ−ＤＤＰ）、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロン；置換尿素、例えば、ヒドロキシ尿素；メチルヒドラジン誘導体、例えば、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）；副腎皮質抑制薬、例えば、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド；ＲＸＲアゴニスト、例えば、ベキサロテン；ならびにチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、イマチニブが挙げられる。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、用語「放射線療法レジメン」または「放射線療法」は、がん性細胞を死滅させるための放射線の投与を指す。放射線は、細胞内の種々の分子と相互作用するが、細胞死を生じる主要な標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。しかし、放射線療法はまた、細胞膜および核膜ならびに他の細胞小器官に損傷を生じることが多い。ＤＮＡ損傷は、通常、糖リン酸骨格における１本および２本鎖切断に関与する。その上、ＤＮＡおよびタンパク質の架橋が存在することがあり、これは、細胞機能を破壊し得る。放射線の種類に応じて、ＤＮＡ損傷の機構は、生物学的効果比が異なるのと同様に異なり得る。例えば、重粒子（すなわち、陽子、中性子）は、ＤＮＡを直接損傷し、高い生物学的効果比を有する。一方、電磁放射線は、短命な、細胞の水の電離により主に生じるヒドロキシフリーラジカルにより作用する間接電離を生じる。放射線の臨床適用は、外照射（外部の供給源からの）および近接照射療法（患者に移植または挿入した放射線の供給源を使用）からなる。外照射は、Ｘ線および／またはガンマ線からなるが、近接照射療法は、アルファ粒子またはベータ粒子を崩壊および放射する放射性核をガンマ線とともに利用する。
【０１０８】
がんに対する免疫
本発明の別の態様では、がんに対して対象を免疫する方法を提供する。方法は、ヘルペスウイルスガンマ（１）３４．５遺伝子（γ１３４．５）またはγ１３４．５遺伝子と少なくとも約７０％の相同性を有する核酸の発現を減少させる、前記遺伝子または前記核酸の改変、病原性を生じない、ＰＫＲ回避タンパク質をコードする第２のウイルス核酸配列、および腫瘍関連抗原をコードする第３の核酸配列を含む、改変核酸配列を有するヘルペスウイルスを含む、キメラ腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与するステップを含み、キメラ腫瘍溶解性ウイルスが、がんに対して対象を免疫するのに有効な条件下で投与される。一部の実施形態では、キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、薬学的に許容される担体とともに投与される。
【０１０９】
キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書に記載するバリアントおよび実施形態のいずれかであり得る。例えば、一部の実施形態では、ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ヘルペスウイルスであるが、さらなる実施形態では、ヘルペスウイルスγ１３４．５遺伝子の改変は、γ１３４．５遺伝子の欠失または変異を含む。
【０１１０】
キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書に記載する任意の型のがんに対して対象を免疫するために使用し得る。例えば、一部の実施形態では、がんは、腺癌、肝芽腫、肉腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、骨髄腫、膀胱がん、脳がん、頭頸部扁平上皮癌、卵巣がん、皮膚がん、肝臓がん、肺がん、結腸がん、子宮頸がん、乳がん、腎臓がん、食道癌、頭頸部癌、精巣がん、結腸直腸がん、前立腺がん、および膵臓がんからなる群から選択される。さらなる実施形態では、がんは、神経膠芽腫である。
【０１１１】
免疫は、がんが対象において発症する可能性を低下させるために使用し得る。一部の実施形態では、キメラ腫瘍溶解性ウイルスは、がん（例えば、神経膠芽腫）を発症するリスクを有するものとして同定されている対象に投与される。対象は、がん発症の家族歴、がんのリスクの上昇と関連する遺伝子の同定、または放射線もしくは他の発がん性材料への曝露の結果として、がん発症のリスクを有し得る。
【０１１２】
製剤および投与方法
本明細書に記載するキメラ腫瘍溶解性ウイルスおよびウイルスベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで薬学的に許容される担体により投与することができる。「薬学的に許容される」により、生物学的に望ましくないものでもその他の方法で望ましくないものでもない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的作用も、それが含まれている医薬組成物の他の成分のいずれかとの有害な相互作用も生じることなく、核酸またはベクターとともに、対象に投与することが可能である。担体は、当然、当業者に周知のように、対象において、活性成分のいかなる分解をも最小化するように、およびいかなる有害な副作用をも最小化するように選択される。
【０１１３】
材料は、溶液、懸濁液中に存在し得る（例えば、微小粒子、リポソーム、または細胞に組み込む）。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的とし得る。ビヒクルは、例えば「ステルス」および他の抗体コンジュゲートリポソーム（結腸癌に対する脂質媒介薬物標的化を含む）、細胞特異的リガンドを介するＤＮＡの受容体媒介標的化、リンパ球媒介腫瘍標的化、およびマウス神経膠腫細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの高度特異的治療レトロウイルス標的化である。一般には、受容体は、構成的またはリガンド誘導のいずれかによるエンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン被覆ピットにおけるこのような受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に侵入し、受容体が選別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面へ再循環するか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソームに分解される。内部移行経路は、多様な機能、例えば、養分の取込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見的侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節に役立つ。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド結合価、およびリガンド濃度に応じて、１つよりも多い細胞内経路に従う。
【０１１４】
医薬組成物は、分子、この場合では、選択されるウイルスまたはウイルスベクターに加えて、担体、増粘剤、希釈剤、バッファー、保存剤、界面活性剤等を含み得る。薬学的担体は、当業者に公知である。最も典型的なこれらは、ヒトへの薬物の投与のための標準的担体であり、溶液、例えば、滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝液を含む。適する担体およびこれらの製剤は、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy  (19th  ed.)  ed.  A.  R.  Gennaro,  Mack  Publishing  Company,  Easton,  Pa.  1995に記載されている。典型的には、適量の薬学的に許容される塩は、製剤を等張性とするために製剤において使用する。薬学的に許容される担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８、より好ましくは、約７〜約７．５である。さらなる担体は、持続放出調製物、例えば、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含むことがあり、このマトリクスは、成形品、例えば、フィルム、リポソームまたは微小粒子の形態である。ある特定の担体が、例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、より好ましい場合があることは当業者に明らかである。
【０１１５】
非経口投与のための調製物は、無菌の水性または非水性液剤、懸濁剤、および乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブオイル、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、乳液または懸濁液を含み、生理食塩水および緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補給剤、電解質補給剤（例えば、ブドウ糖リンゲル液をベースとするもの）等を含む。保存剤および他の添加物、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等も存在し得る。
【０１１６】
組成物の一部は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸、ならびに有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸による反応により、または無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムと、有機塩基、例えば、モノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミンとによる反応により形成された、薬学的に許容される酸または塩基付加塩として潜在的に投与され得る。
【０１１７】
ウイルスおよびベクターは、局所的または全身的処置が必要であるかどうか、および処置されるエリアに応じて、いくつかの方式により投与することができる。投与は、局所、経口、吸入、または非経口、例えば、点滴静注、皮下、腹腔内または筋肉内注射によるものであり得る。開示するウイルスおよびベクターは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与することができる。したがって、提供するウイルスおよびベクターの脳への投与は、頭蓋内、硬膜下、硬膜外、または大槽内であり得る。例えば、提供するウイルスおよびベクターは、定位送達により腫瘍に直接投与することができる。また、ＣＮＳの腫瘍への送達は、ウイルスまたはベクターを、血液脳関門の通過および血中での生存を可能とする部分と組み合わせる場合、血管内送達によるものであり得ることが理解される。したがって、血液脳関門の透過性を高める薬剤を組み合わせることができる。薬剤は、例えば、エラスターゼおよびリポ多糖を含む。提供するウイルスおよびベクターは、頸動脈を介して投与する。別の態様では、提供するウイルスおよびベクターは、当技術分野において公知または本明細書に記載のものなどのリポソームにより投与する。提供するウイルスおよびベクターは、血管内または腫瘍への直接注射により、脳以外のがんに投与することができる。
【０１１８】
組成物の非経口投与は、使用する場合、一般に、注射により特徴付けられる。注射剤は、溶液もしくは懸濁液、注射前の液体中の懸濁物の溶液に適する固形形態のいずれかとして、または乳液として、通常の形態に調製することができる。非経口投与のためのさらに最近改定された手法は、徐放または持続放出系を使用して一定投与量を維持することを含む。例えば、そこに教示される方法について、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。
【０１１９】
また、ウイルスまたはウイルスベクターに分子を連結（コンジュゲート）させて、例えば、細胞取込みを増強することが可能である。コンジュゲートは、ウイルスまたはウイルスベクターに化学的に連結させることができる。このようなコンジュゲートは、脂質部分、例えば、コレステロール部分を含むが、これらに限定されない（Letsinger  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  1989,  86:6553-6556）。
【０１２０】
本明細書に記載するウイルスおよびウイルスベクターは、例えば、対流強化送達により投与してもよく、これは、腫瘍間質における総体流を介してウイルスの分布を拡大させるためにアデノウイルスおよびＡＡＶとともに使用されている。Chen  et  al.,  J.  Neurosurg.  103(2):311-319  (2005)。また、遺伝子改変は、ウイルス拡散を増強させるために使用されている。例えば、融合性糖タンパク質遺伝子の挿入により、抗神経膠腫作用が増強された腫瘍溶解性ウイルスが作製された。Fu  et  al.,  Mol.  Ther.  7(6):  748-54  (2003)。したがって、本明細書に記載するウイルスベクターは、このような遺伝子を含み得る。
【０１２１】
投与量
必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重および全身状態、処置する疾患の重症度、使用する特定のウイルスまたはベクター、投与方式等に応じて、対象により異なる。したがって、すべての組成物の正確な量を特定することは不可能である。しかし、適量は、本明細書において教示する日常的実験のみを使用して当業者により決定することができる。
【０１２２】
組成物を投与するための有効用量およびスケジュールは、経験的に決定してもよく、このような決定は、当技術分野の範囲内である。例えば、迅速なスクリーニングならびに潜在的毒性および実験的療法の有効性の評価のための機構をもたらすいくつかの脳腫瘍モデルが存在する。臨床試験に使用する６つの別々のヒト神経膠腫異種移植モデルが存在する。Pandita  et  al.,  Genes  Chromosomes  Cancer  39(1):  29-36  (2004)。また、化学的またはウイルス的に誘導された実験的腫瘍と一般に関連する外来抗原を発現しない、自然発症同系神経膠腫モデルが利用可能である。Hellums  et  al.,  Neuro-oncol.  7(3):  213-24  (2005)。多様ながんのための他の動物モデルは、例えば、ジャクソン研究所、６００  Ｍａｉｎ  Ｓｔｒｅｅｔ  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍｅ．０４６０９  ＵＳＡから得ることができ、ここでは、数百のがんマウスモデルを提供する。腫瘍体積の直接的（組織学）および機能的測定値（生存）の両方を、腫瘍溶解療法に対する応答をモニタリングするために使用することができる。このような方法は、実験に必要な動物数が増加する集団を評価するために、代表的動物の犠牲を含む。腫瘍におけるルシフェラーゼ活性の測定により、動物の犠牲なしに腫瘍体積を評価する代替方法がもたらされ、縦断的集団に基づく治療解析が可能となる。
【０１２３】
組成物の投与のための投与量範囲は、疾患の症状が影響される所望の効果をもたらすのに十分に広いものである。用量は、有害な副作用、例えば、望まない交差反応、アナフィラキシー反応等を生じるほど大量であってはならない。投与量は、任意の禁忌症の場合は、個々の医師により調整することができる。投与量は、変化してもよく、１日または数日間、毎日１回または複数回の用量投与により投与することができる。
【０１２４】
ウイルス回収および免疫組織化学的検査は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス複製および拡散のモニタリングに良好に使用されている。また、ウイルスによる生物発光および蛍光タンパク質発現は、腫瘍におけるウイルス複製および拡散の間接的モニタリングに使用することができる。蛍光レポータータンパク質（ｄ２ＥＧＦＰおよびｄｓＲＥＤモノマー）または生物発光マーカー（ホタルルシフェラーゼ）をコードする遺伝子は、組換えウイルスにおいて一般に使用されている。これらだけでなく、組換えウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニングおよび選択をも促進させる。また、レポーター遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験におけるウイルス活性の間接的モニタリングを可能とする。
【０１２５】
提供するキメラウイルスは、既存の弱毒ヘルペスウイルスと比較して低用量の投与を必要とする。提供するキメラウイルスは、通常の弱毒ヘルペスウイルス、例えば、Δγ１３４．５ＨＳＶと比較して生存を有意に向上させ、低用量において有効である。例えば、開示するキメラ腫瘍溶解性ウイルスは、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８および１０９ｐｆｕを含む約１０３ｐｆｕから、またはその間の任意の量において有効である。したがって、キメラウイルスの用量は、５×１０３から５×１０６ｐｆｕ、より好ましくは５×１０４から５×１０５であり得る。
【０１２６】
以下の実施例は、例示目的のために含まれ、本発明の範囲を制限することは意図しない。
【実施例】
【０１２７】
（実施例１）
ｏＨＳＶ構築物および樹状細胞標的化
ＧＢＭは、実験的療法における関心をもたらす、最も致死的かつ治療不応性のがんのうちの１つである。２種類の実験的療法（樹状細胞免疫療法およびｏＨＳＶ療法）は、成人ＧＢＭについての最近の初期相の臨床試験において有効性が実証された。Phuphanich  et  al.,  Cancer  Immunol  Immunother,  62(1):  p.  125-35  (2013)。これらは異なる手法であるが、両戦略は、抗腫瘍免疫の誘導を介して有効性を発揮する可能性がある。腫瘍溶解性ＨＳＶの有効性は、これまでには腫瘍細胞の直接的複製に基づく溶解に起因したが、宿主細胞抗ウイルス応答のウイルス活性化は、そのような応答によって強力な抗腫瘍効果エフェクターが動員され、獲得免疫応答を刺激するため、別の有意な効果としてますます認識されている。多くのｏＨＳＶの腫瘍細胞選択性は、γ１３４．５神経毒性遺伝子の欠失（Δγ１３４．５ｏＨＳＶ）に基づいており、この欠失により、ＣＮＳへの直接接種に関してこれらが安全となるが、腫瘍におけるこれらの複製もまた衰弱する。これを克服するために、遠縁のヘルペスウイルスであるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来のＩＲＳ１遺伝子を発現する、キメラΔγ１３４．５ｏＨＳＶ（Ｃ１３４）を創製した。Shah  et  al.,  Gene  Ther,  14(13):  p.  1045-54  (2007)。Ｃ１３４は、第１世代ｏＨＳＶとは異なりタンパク質翻訳を維持し、これにより、ウイルスがより病原性とならずに腫瘍細胞におけるウイルス複製の向上が生じる。Ｃ１３４は、強固なＩＦＮ応答を誘発して、結果的に自然および獲得エフェクター細胞集団の動員および活性化が向上する。Cassady  et  al.,  J  Virol,,  86(1):  p.  610-4  (2012)。
【０１２８】
本発明者らは、Ｃ１３４のタンパク質翻訳および免疫刺激特性を利用して、ウイルスゲノムから直接神経膠腫抗原を過剰発現させることにより腫瘍抗原に対する交差感作を増大させた。本発明者らは、ウイルスに基づく導入遺伝子発現は効率的であり、潜在的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含む、宿主細胞遺伝子発現を抑制するＨＳＶ経路を、感染時に避け得ることをこれまでに実証した。Shu  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A,  110(18):  p.  E1669-75  (2013)。加えて、本発明者らは、樹状細胞（ＤＣ）への標的化結合のために、感染細胞から分泌されるようにＣ１３４発現ＴＡＡを操作した。ＧＢＭおよびＨＳＶ感染細胞における抗原プロセシング経路は減弱されるが、ＨＳＶ感染により、隣接細胞におけるＭＨＣ発現が増強されて、活性化ＤＣが周囲組織に動員される。したがって、分泌ＴＡＡによってＡＰＣにおける取込みおよび交差提示の可能性が高まり、ＤＣ標的化エレメントのＴＡＡへの融合によってこの活性が増強されるはずである。
【０１２９】
Δγ１３４．５ｏＨＳＶと比較すると、Ｃ１３４処置後の動物生存の向上が、抗腫瘍免疫の刺激により部分的に媒介されるようである。これまでの試験では、側腹ＧＢＭモデルにおけるｏＨＳＶ投与の反復により、抗ＧＢＭ獲得免疫が誘導され得ることが実証された。Iizuka  et  al.,  Int  J  Cancer,  118(4):  p.  942-9  (2006)。本発明者らは、Ｃ１３４およびΔγ１３４．５ｏＨＳＶ投与の後に誘導された免疫応答のレベルおよび特異度を比較した。また、ウイルス抗原に向けられる応答に対して、各ウイルスにより抗腫瘍応答が誘導される程度を評価した。本発明者らは、Ｃ１３４により抗腫瘍獲得免疫応答が増強され、このような応答は、この有効性についての主要な機構であると考える。
【０１３０】
ＥｐｈＡ２シャトルベクター構築：Ｃ１３４のγ１３４．５座位への導入遺伝子発現カセットの組換えに基づく挿入にｐＣＫ１１３６ベクターを使用した（図１Ａ、Ｂ）。Cassady  et  al.,  J  Virol,  86(1):  p.  610-4  (2012)。このベクターでは、マウスＥｇｒ−１プロモーターを利用して導入遺伝子発現を駆動する。本発明者らは、この戦略をこれまでに使用して、Ｃ１３４のＧＦＰ発現誘導体（Ｃ１５４）を作製した。図１Ｃ〜Ｆに示すように、４つの別々のＥｐｈＡ２誘導体をｐＣＫ１１３４に挿入すると、最初の誘導体は、Ｃ末端Ｍｙｃタグを有する完全長ＥｐｈＡ２リーディングフレームをコードする（図１Ｃ）。分泌バリアントでは、ＥｐｈＡ２コード配列は、細胞外ドメイン（図１Ｄ〜Ｅ）または細胞質ドメインのいずれかを包含するようにトランケートする。ＥｐｈＡ２の最初の２８Ｎ末端残基の細胞質ドメイン（ａａ５７５〜９７７）との融合により、ＥｐｈＡ２リーダー配列の切断能が回復し、これにより、分泌のための細胞内ドメインが変更されるはずである（図１Ｆ）。すべての構築物は、Ｃ１３４発現ＥｐｈＡ２を感染腫瘍細胞のそれから識別するＣ末端Ｍｙｃタグを含有する。本発明者らは、ＤＣ細胞を標的とするいくつかのペプチドを同定した（図４）。ＤＣ標的化では、マウスＤＣ結合ペプチドコード配列は、分泌ＥｐｈＡ２バリアントのＣ末端に操作することができる（図１Ｅ〜Ｆ）。
【０１３１】
ｏＨＳＶ構築および検証：各ｐＣＫ１１３６−ＥｐｈＡ２バリアントを、ウサギ皮膚細胞への共トランスフェクションによるＣ１５４との組換えに使用した。個々のＧＦＰ陰性プラークを連続的に継代および精製して、さらなる特性決定を行った。ウイルスクローン内のＥｐｈＡ２発現カセットを配列決定した。ウイルスに基づくＥｐｈＡ２発現によりＥｐｈＡ２レベルの上昇が生じることを検証するために、ＧＬ２６１細胞にＣ１３４およびＣ１３４−ＥｐｈＡ２誘導体を感染させた。ＥｐｈＡ２レベル（総合およびＭｙｃタグ化）を、感染細胞ライセートのウエスタン解析により測定した。分泌バリアントの発現は、ＥＬＩＳＡにより評価し、ＤＣ標的化は、樹状細胞への結合のフローサイトメトリー検出により評価した。ウイルス回収アッセイは、すべてのｏＨＳＶが等しい複製率を有することを確実とするために使用した。
【０１３２】
本発明者らは、Ｃ１３４に基づく抗原発現により、マウス同所ＧＢＭモデルにおけるＧＢＭ特異的ＣＴＬ応答および生存が増強されるかどうかを評価した。同所ＧＬ２６１腫瘍を同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて確立する。試験の最初のセットでは、Ｃ１３４またはＣ１３４発現完全長ＥｐｈＡ２バリアントをｅｘ  ｖｉｖｏで感染させた細胞をｉ．ｃ．により移植したマウスにおける生存を比較した。マウスは、移植後５日目および１５日目に再処置し、ＥｐｈＡ２特異的応答を評価した。
【０１３３】
また、本発明者らは、分泌および標的化によりＥｐｈＡ２特異的応答が増加するかどうかを判定した。動物試験を行って、ＤＣ標的化ＥｐｈＡ２バリアント（図１Ｅ、Ｆ）の分泌により生存が向上するかどうかを評価した。また、本発明者らは、非標的化ＥｐｈＡ２バリアント（図１Ｄ）を評価して、分泌および／または標的化による分泌が、結果の向上の原因であるかどうかを確かめた。実験では、ＥｐｈＡ２発現Ｃ１３４誘導体、特には、分泌およびＤＣを標的化するバリアントにより、ＧＬ２６１腫瘍を有するマウスの生存が向上することが示された。
【０１３４】
Ｃ１３４により、マウス脳腫瘍モデルにおいて、複製依存性および非依存性生存利益が媒介される。ヒトＵ８７ＧＢＭ細胞株における予備試験では、Ｃ１３４が、Δγ１３４．５ウイルスと比較して１０００倍高い複製率を有し、Ｕ８７腫瘍を有する免疫不全動物における生存の向上を結果として生じることが実証された（図２Ａ）。しかし、Ｃ１３４はまた、複製の優位性が存在しない同系Ｎｅｕｒｏ２Ａ腫瘍を担持する免疫適格マウスにおいて防御性である（図２Ｂ）。このようなデータは、Ｃ１３４が、また、免疫刺激能を増強した可能性があることを示唆する。同系ＧＢＭモデルにおけるこの現象を試験するために、マウスにＤＢＴ細胞をｉ．ｃ．により移植し、生理食塩水、Δγ１３４．５（Ｒ３６１６）またはＣ１３４  ｏＨＳＶで処置した。その後、各コホートにおける生存動物は、ＤＢＴ側腹腫瘍で再チャレンジした。次いで、生存動物から得た血清および脾細胞を免疫反応性について評価した。図３Ａに示すように、非処置およびすべての処置群から採取した血清では、ＤＢＴおよびＮｅｕｒｏ２Ａ（Ｎ２Ａ）の両細胞ライセートにおいて共通バンドを検出した。しかし、Ｃ１３４処置マウスの血清では、４０００倍に希釈した後であっても、両細胞株の抽出物においてユニークな約６０ＫＤａのバンドを認識した（矢印）。同様に、ＤＢＴ細胞傷害性は、Ｃ１３４処置マウスから採取した１０倍過剰の混合脾細胞により達成した（図３Ｂ）。このような試験では、抗腫瘍免疫のＣ１３４に基づく刺激が実証され特定のＴＡＡに対して免疫を方向付けることにより、このような作用が増強され得ることが示唆された。
【０１３５】
抗腫瘍免疫の誘導のためのＥｐｈＡ２バリアントのＣ１３４に基づく発現に加えて、本発明者らは、このような応答を増強するＤＣ標的化ドメインの組込みを評価した。ファージディスプレイを使用して、本発明者らは、骨髄細胞由来ＤＣに結合するペプチドをこれまでに同定し、ペプチドは、ＮおよびＣ末端タンパク質融合物として組み込む場合、結合機能を維持する。Alberti  et  al.,  Gene  Ther,  20(7):  p.  733-41  (2013)。また、本発明者らは、樹状細胞関連ヘパラン硫酸プロテオグリカン−インテグリンリガンド（ＤＣＨＩＬ／ＧＰＮＭＢ）に結合する１２マーのペプチドを最近同定した（図４Ａ）。樹状細胞上でのＧＰＮＭＢ発現により、メモリーおよびエフェクターＴ細胞活性化が、シンデカン４との共阻害剤相互作用を介して妨げられる。このようなペプチドにより、ＧＰＮＭＢ発現ＡＰＣに対する抗原の標的化およびＧＰＮＭＢ媒介Ｔ細胞抑制の阻害の両方が可能となり得る。
【０１３６】
（実施例２）
ｏＨＳＶ抗腫瘍応答をモデル化するためのＤＢＴ悪性神経膠腫細胞株の評価
免疫応答は、抗腫瘍療法（生物製剤、放射線療法、化学療法）に寄与する長期抗腫瘍効果の重要な成分として次第に認識されている。過去には、研究者らは、免疫応答の重要性およびｏＨＳＶ媒介抗腫瘍活性におけるこの役割を疑った。このような研究により、免疫媒介抗腫瘍応答に主に依存するｉｎ  ｖｉｖｏでのモデルを開発することが可能となった。図５Ａに示すように、ＤＢＴ悪性神経膠腫細胞株は、他の神経膠腫細胞株とは対照的に、ｏＨＳＶ感染および細胞変性効果に対して高度に抵抗性である。
【０１３７】
このモデルを使用して、本発明者らは、本発明の第１世代および第２世代組換えウイルス間の腫瘍溶解活性における差、ならびにサイトカイン発現、投与スケジュール、および既存の免疫が、間接的抗腫瘍応答にどのように影響するかを確認することができた。過去のＣＮＳ腫瘍モデルとは対照的に、ウイルス収量は、ｉｎ  ｖｉｖｏの第１世代および第２世代ｏＨＳＶ間で等しく、直接的ウイルス細胞溶解は、この同系神経膠腫における抗腫瘍活性に有意には寄与せず（図５）、このため、免疫媒介抗腫瘍効果の評価が単独で可能となる。
【０１３８】
ＤＢＴモデルでは、Ｃ１３４は、ＣＮＳ腫瘍においてウイルス複製が等しいにもかかわらず（図５Ｂ）、第１世代Δγ１３４．５ｏＨＳＶよりもやはり優れている（図６Ａ）。これは、ウイルスの細胞変性活性（複製に非依存性）の差が存在するか、または免疫媒介応答が異なることを示唆する。過去の神経芽細胞腫に基づく試験では、本発明者らは、免疫応答が、この差に寄与することを確認した。胸腺欠損ヌードマウスのＣＮＳにおけるＮ２Ａ腫瘍の移植により、ｏＨＳＶ抗腫瘍療法のいかなる生存優位性も排除された。免疫応答が、この抗腫瘍応答に寄与したかどうかを試験するために、ＤＢＴ腫瘍細胞を、生存マウスおよびナイーブマウスの側腹に移植した。これまでにｏＨＳＶで処置した生存マウスでは、再チャレンジの間に腫瘍成長が抑制され、循環する抗腫瘍免疫が、このような生存マウスにおいて生じたことを示唆した。対照的に、移植した腫瘍は、ｏＨＳＶおよび腫瘍無経験のナイーブマウスにおいて制御不能となった。このような試験により、抗腫瘍免疫応答がｏＨＳＶ療法に寄与し、これは、単一動物または腫瘍型にユニークなものではないという認識が強まる。
【０１３９】
ｗｉｎｎ型アッセイを実施して、抗腫瘍免疫応答がプライムされ得るかどうかを判定した。このような試験では、試験したウイルスのすべての反復投与により、第１世代および第２世代Ｃ１３４  ｏＨＳＶの両方について、ｏＨＳＶ抗腫瘍活性が向上することが確認された（図７）。また、このような試験は、ｏＨＳＶ由来の外来抗原発現により生存が延長され得ることを示唆する（図７：Ｃ１５４：Ｃ１３４＋ＥＧＦＰ）。また、試験では、Ｃ１３４由来の炎症促進性ｍＩＬ−１２サイトカイン発現により免疫応答をプライムすると、神経膠腫モデルにおいても生存が延長されることが検証された（図８、Ｃ００２対Ｃ１３４）。これまでの試験では、神経芽細胞腫ＣＮＳモデルにおいて類似の利益が示された。このような試験により、神経膠腫についても、この利益が確認される。
【０１４０】
また、試験では、ｏＨＳＶ療法による長期抗腫瘍利益が確認された。ｏＨＳＶ処置により、腫瘍抗原単独に曝露したマウスに対して耐久性の抗腫瘍免疫が向上した（図９）。ｏＨＳＶ媒介抗腫瘍免疫は、循環免疫応答であるようであり、生存マウスが遠位部位に移植した腫瘍を拒絶可能であったため、常在メモリー細胞を必要としなかった。
【０１４１】
本発明者らは、既存の免疫により免疫応答が向上し、腫瘍に対する巻き添え損傷が増加し得ると仮定したが、これらの知見は、既存のＨＳＶ免疫によりｏＨＳＶ抗腫瘍効果が向上しないことを示唆し、生存は向上しなかった（図１０ＡおよびＢ）。「非武装の」ｏＨＳＶ（Ｒ３６１６およびＣ１３４）では、既存の免疫は、利益のないものであったが、有害でもなかった。
【０１４２】
予想外にも、既存の免疫が、ウイルスＣ００２を発現するＣ１３４に基づくｍＩＬ−１２サイトカインに対して有害であることが見出された（図１０Ｃ）。これまでに考察したように、ＩＬ−１２の発現（Ｔ細胞活性化を増強する）により、Ｃ１３４抗腫瘍活性が有意に向上した（図８）。本発明者らは、Ｃ００２により、このようなプライムされたＴ細胞の抗腫瘍活性が向上すると予測した。しかし、ＨＳＶ免疫により、この組換え体が悪影響を受けることでＩＬ−１２発現によってもたらされるいかなる優位性をも排除され、これが、ＨＳＶ免疫マウスにおいてＣ１３４と同等に有効であるだけとなることが見出された。本発明者らは、既存の免疫を有するマウスにおいて接種後初めの数日間、Ｃ００２が複製もしないと判定した。また、定量的ＰＣＲ試験では、ウイルスＩＬ−１２導入遺伝子発現を調べている。ＩＬ−１２発現の消失により、この試験において、Ｃ００２（Ｃ１３４＋ｍＩＬ１２）がＣ１３４  ｏＨＳＶと同様に挙動した理由が説明され得る。
【０１４３】
この知見は、予測しなかったものであり、ＨＳＶナイーブおよびＨＳＶ経験個体におけるｏＨＳＶ活性に対する異なる寄与体が存在することを示唆し、いくつかの新たな問題を提起する。ｏＨＳＶ活性のこの消失は、ウイルスを発現する「武装」導入遺伝子に特異的であるのか、またはＩｌ−１２を発現するウイルスは、抗ＨＳＶ免疫応答を増強するこれらの能力がユニークであるのか。既存の免疫により、ｏＨＳＶ（第１世代Δγ１３４．５およびＣ１３４）のすべての複製による直接的および間接的抗腫瘍寄与の変化が、免疫動物において制限されるのか。本発明者らの過去の試験では、全ｏＨＳＶ抗腫瘍活性の尺度として生存を使用した。この読み出し情報は、直接的および間接的抗腫瘍効果を複合する。過去の試験では、「正味の抗腫瘍効果」が変化しないことを示したが、既存の免疫により、相対的寄与である直接的（ウイルス細胞溶解）および間接的免疫媒介抗腫瘍効果が変化し得る。これは、強固なウイルス遺伝子発現に依存する、本発明者らの最新世代武装ｏＨＳＶ（例えば、Ｃ００２またはＭ００２）に関する特に重要な問題である。
【０１４４】
本発明者らは、６つの異なるＣ１３４に基づく腫瘍抗原発現ウイルスを創製および検証した（図１１にまとめる）。それぞれウイルス６種について２つの分離株（ウイルス１２種）を採取し、名付け（Ｃ１７０〜１８１）、ＤＮＡハイブリダイゼーション、導入遺伝子発現、細胞内抗原局在化、および感染の間の細胞分泌により検証した（図５）。達成すべき残存事項は、ＭＢＰタグ機能（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原提示細胞［ＡＰＣ］への結合）の証拠を示すことである。
【０１４５】
まとめると、本発明者らは、免疫応答がｏＨＳＶ療法に寄与し、この応答が耐久性の抗腫瘍効果を向上させるようにモジュレート可能であることを明解に示す、腫瘍モデルを検証することができた。また、本発明者らは、これが、ウイルスに対する免疫応答を生じるには十分でないことを見出した。実際、抗ウイルス免疫応答に着目すると、第１または第２世代ｏＨＳＶは妨害されなかったが、これにより、武装サイトカイン発現ウイルスで処置したマウスの生存は確かに影響された。腫瘍抗原発現ｏＨＳＶ（Ｃ１７０〜Ｃ１８１）の開発により、抗腫瘍および抗ウイルス免疫応答の役割のさらなる分析が可能となる。
【０１４６】
（実施例３）
抗原発現腫瘍溶解性ウイルス−集学的抗腫瘍ワクチン標的化共有抗原
ウイルスに基づく腫瘍関連胎児性抗原（ＴＡＦＡ）発現により、ＯＶ免疫療法抵抗性の腫瘍において抗腫瘍免疫が向上するかどうかを判定するために、本発明者らは、マウス（Ｂ６）ＴＡＦＡ  Ｅｐｈｒｉｎ  Ａ２をコードするＣ１３４に基づくウイルス（Ｃ１７０）を創製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両Ｂ６同系モデルを使用して、本発明者らは、ウイルスＴＡＦＡ発現がＯＶ抗腫瘍活性およびＥｐｈＡ２に対する免疫応答にどのように影響するかを調査した。結果は、Ｃ１３４に基づくＥｐｈＡ２発現により、抗腫瘍効果が向上し、腫瘍関連免疫浸潤物が変化し、抗腫瘍メモリー応答、アブスコパル効果および特異的抗ＥｐｈＡ２  Ｔ細胞応答の誘発が、Ｃ１３４処置コホートと比較して向上することを示す。このような興奮させる知見により、「自己」ＴＡＦＡの免疫認識を増強させるようにＯＶを改変することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍ワクチン接種のためのウイルスを使用する手法としてこの戦略を利用することができることが確認される。
【０１４７】
材料および方法
細胞株およびウイルス
ＣＴ２Ａ細胞は、Ｂｏｓｔｏｎ  ＣｏｌｌｅｇｅのＤｒ．Ｓｅｙｆｒｉｅｄの厚意により提供され、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に増殖させた。６７Ｃ−４は、Ｄｒ．Ｔｉｍ  Ｃｒｉｐｅの厚意により提供され、このものは、彼の共同研究者であるＤｒ．Ｎａｎｃｙ  Ｒａｔｎｅｒが開発し、彼に提供されたものであり、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中に維持した。腫瘍株は、ＡＴＣＣ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用したマイコプラズマ汚染についての試験で陰性であった。本発明者らの試験における遺伝的浮動を最小化するために「低」継代形態の細胞株に戻る前に試験において比較的低い継代数（＜１２継代）を有する腫瘍細胞を使用した。ウイルスは、これまでに記載されているが（Ghonime  et  al.,  Translational  oncology,  11:86-93  (2017)）、簡潔には、ＨＳＶ−１（Ｆ）株およびＲ３６１６、Δγ１１３４．５組換え体は、Ｄｒ．Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｒｏｉｚｍａｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）の厚意により提供された。Chou  et  al.,  Science,  250:1262-6  (1990)。Ｃ１３４は、これまでに記載されている。Shah  et  al.,  Gene  Ther,  14:1045-54  (2007)。簡潔には、Ｃ１３４は、ＵＬ３／ＵＬ４遺伝子間領域のＣＭＶ  ＩＥプロモーターの制御下でＨＣＭＶ  ＩＲＳ１遺伝子を含有するΔγ１１３４．５ウイルスである。Cassady  KA.,  J  Virol,  79:8707-15  (2005)。Ｃ１５４は、Ｃ１３４のＥＧＦＰ発現バージョンである。
ウイルス拡散アッセイ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
【０１４８】
Ｂ７６、Ｂ９６、６７Ｃ−４および５ＮＰＣＩＳ細胞を、４８ウェル透明平底ポリスチレン組織培養処理マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）内に播種し、一晩３７℃で付着させた。翌日、細胞にＥＧＦＰ発現第２世代ｏＨＳＶ−１（Ｃ１５４）を指示する感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、アッセイの終了まで３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターを内部に収容したＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭプラットフォームを使用してプレートをモニタリングした。３つの反復物（replicate）から１ウェルあたり９つの画像を１０×対物レンズを使用して３時間毎に３日間取得し、次いで、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｂａｓｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して解析した。緑色チャネル取得時間は、位相差に加えて４００ｍｓであった。
【０１４９】
動物試験
動物試験は、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ；プロトコール番号ＡＲ１６−０００８８）により認可され、ＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓにより確立されたガイドラインに従って実施した。２つの同系Ｃ５７／Ｂｌ６腫瘍モデルをこのような試験において使用した：脳内ＣＴ２Ａ神経膠腫腫瘍モデルおよび側腹６７Ｃ４悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）モデル。
【０１５０】
側腹腫瘍モデルでは、６７Ｃ−４  ＭＰＮＳＴ細胞２×１０６を、６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）の側腹に皮下注射した。腫瘍サイズは、移植後にノギスで隔週に測定し、腫瘍体積は、長さ×幅×深さにより算出した。腫瘍が２５〜１５０ｍｍ３のサイズに達した場合、動物をプールし、以下に考察するように、同等の平均腫瘍サイズを有する特定の群にランダムに分類した。マウスは、４日目（最後のＲＵＸ投与の１日後）にビヒクル、Ｃ１３４またはＣ１７０（ＰＢＳ中１０％のグリセリン１００μＬに３．５×１０７）を腫瘍内（ＩＴ）に処置し、１週間後に再度処置した。試験は、３回反復して生物学的妥当性を確実とした。
【０１５１】
生存試験では、総腫瘍体積／マウスが２０００ｍｍ３を上回るか、個々の腫瘍が＞１５００ｍｍ３となるまで、最初の処置後１週間に３回、腫瘍体積について動物をモニタリングした。全腫瘍サイズがこのような基準を上回ると、ＩＡＣＵＣの要件に基づいてマウスを屠殺した。細胞動員解析およびｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現では、以下に記載するように、最初のＣ１３４またはＣ１７０注射の６日後に腫瘍を収集した。腫瘍をＰＢＳで洗浄し、小片に細かく刻んだ。次いで、コラゲナーゼＤ（２ｍｇ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ）およびＤＮａｓｅ  Ｉ（０．０１ｍｇ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０により３０分間３７℃の振盪プラットフォーム上で組織を消化した。コラゲナーゼ消化の後、単核細胞を含有する培地を濾過し、４００×ｇで１０分間、４℃の遠心分離を行い、生じる細胞を１％のＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０に再懸濁し、次いで、フローサイトメトリー解析およびＲＮＡ抽出に使用した。ＣＤ８枯渇試験では、上記と同様にＲＵＸでマウスを処置したが、ＲＵＸ療法の開始時に、マウスを抗ＣＤ８枯渇またはアイソタイプ処置コホートにランダム化した。マウスを抗ＣＤ８（クローン２．４３、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）１００μｇまたはアイソタイプ対照（クローンＬＴＦ−２、ラットＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）で腹腔内に（ＩＰ）毎週２回、実験を通して処置した。次いで、マウスをＩＴ  Ｃ１３４で上記のように処置した。ＣＤ８枯渇を定量するために、マウスは、尾静脈放血を受け（ＣＤ８枯渇の開始後１週間）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ８ｂ（クローン：Ｈ３５−１７．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＣＤ８＋Ｔ細胞集団を解析した。
【０１５２】
ＩＣ腫瘍移植および処置
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをＥｎｖｉｇｏ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤから入手した。生存試験では、５％のメチルセルロース中ＣＴ２Ａを１×１０５で同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳内に注射し、５日後にビヒクルまたはウイルス（１×１０７ＰＦＵ／１０μｌ）で、これまでに記載のように処置した。Russell  SJ,  Barber  GN.,  Cancer  cell,  33:599-605  (2018)。マウスを毎日評価し、瀕死のマウスを屠殺し、日付を記録した。生存曲線は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析および生存期間中央値を使用して判定し、９５％信頼区間を算出した。ログ・ランク検定を適用して、群間の生存を比較した。試験は、２回反復して生物学的妥当性を確実とした。
【０１５３】
ウイルス複製（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
６７Ｃ−４腫瘍を６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６において上記のように確立した。腫瘍が２５〜１５０ｍｍ３のサイズに達した場合、マウスをランダム化し、Ｃ１３４またはＣ１７０で腫瘍内処置した（１０％グリセリンおよびＰＢＳの１００μＬ中３．５×１０７ｐｆｕ）。ウイルス処置後１、３および５日目に、腫瘍試料を収集し、均質化した。ＤＮｅａｓｙ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）により製造業者の指示に従ってＤＮＡを抽出した。ウイルス回収は、Ｔａｑｍａｎ定量的ＰＣＲにより測定した。Ghonime  et  al.,  Translational  oncology,  11:86-93  (2017)。簡潔には、抽出したＤＮＡ試料を、次のＨＳＶ特異的プライマーおよびＨＳＶポリメラーゼのためのプローブとともにインキュベートした。増幅産物のＨＳＶゲノム等価物を、ＳｔｅｐＯｎｅ  ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して三連の試料から測定し、陽性対照ＤＮＡ配列（１０６〜１０１コピー）の対数的希釈物に対して比較した。記述統計解析（平均値およびＳＤ）を使用して、試料間のＤＮＡコピー数の差をＰｒｉｓｍ７８．０統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して比較した。
【０１５４】
ＲＮＡ単離
全ＲＮＡは、Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して製造業者の指示に従って腫瘍試料から単離した。ＲＮＡ量および純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣ）を使用して判定した。全ＲＮＡを２μｇ使用し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して製造業者の指示に従ってｃＤＮＡを合成した。
【０１５５】
フローサイトメトリー
腫瘍からの単一細胞懸濁液をこれまでに記載されているように得た。Leddon  et  al.,  Molecular  therapy  oncolytics,  1:14010  (2015)。簡潔には、腫瘍をＰＢＳで洗浄し、小片に細かく刻んだ。次いで、コラゲナーゼＤ（２ｍｇ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ）およびＤＮａｓｅ  Ｉ（０．０１ｍｇ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０により３０分間３７℃の振盪プラットフォーム上で組織を消化した。コラゲナーゼ消化の後、単核細胞を含有する培地を濾過し、４００×ｇで１０分間、４℃の遠心分離を行い、生じる細胞を１％のＦＢＳを補充したＰＢＳに再懸濁し、次いで、フローサイトメトリー解析に使用した。腫瘍からの単一細胞懸濁液をＲＢＣ溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ）で溶解し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中１％のＦＢＳおよび１ｍＭのＥＤＴＡ）中５％のマウスＦｃブロッキング試薬（２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でブロッキングした。細胞を次の抗体染色パネルで標識して適応免疫細胞を解析した：（１）ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）のＣＤ１１ｂ−Ｖｉｏｌｅｔ４２１（Ｍ１／７０）、ＣＤ４−ＢＶ７８５（ＧＫ１．５）、ＣＤ２５−ＰＥ（７Ｄ４）、ＣＤ８ａ−ＢＶ５１０（５３−６．７）、ＣＤ３ε−ＢＶ７１１（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４４−ＡＰＣ、ＣＤ４５−ＢＶ６０５、ＮＫｐ４６−ＰＥ−Ｃｙ７およびＢ２２０−ＡＦ４８８（ＲＡ３−６Ｂ２）。死細胞は、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｎｅａｒ／ＩＲ染色（ＡＰＣ−Ｃｙ７）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣ）による染色により除外した。単一試料を上記の染色パネルにより３０分間、氷上で染色し、ＦＡＣＳバッファーで１回洗浄した。標識後、細胞を１％のパラホルムアルデヒド中に固定し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で解析した。解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア、バージョン１０．０．３（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して行った。
【０１５６】
ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭウイルス拡散アッセイ
細胞を、９６ウェル透明平底ポリスチレン組織培養処理マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）内に播種し、一晩付着させた。Ｃ１３４またはＣ１７０を指示するＭＯＩで加え、アッセイの終了まで３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターを内部に収容したＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭプラットフォームにプレートを移した。３つの技術的反復物から１ウェルあたり４つの画像を１０×対物レンズを使用して３時間毎に３日間取得し、次いで、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｂａｓｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して解析した。緑色チャネル取得時間は、位相差に加えて４００ｍｓであった。
【０１５７】
ウエスタンブロット
腫瘍試料からの細胞ライセートを、氷上のｃｏｍｐｌｅｔｅミニプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を加えた崩壊バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のβ−メルカプトエタノール、０．０４％のブロモフェノールブルー）中に採取した。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して判定した。試料を９８℃で５分間変性させ、氷上で冷却し、ＰＡＧＥにより分け、ニトロセルロース膜（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）に移し、５％の粉乳（Ｓ．Ｔ．Ｊｅｒｒｅｌｌ  Ｃｏ．）またはウシ血清アルブミン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により室温で１時間ブロッキングした。膜は、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を加えたＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳＴ）で希釈した一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ＲＩＧ−Ｉ（クローンＤ１４Ｇ６）、ＭＤＡ−５（クローンＤ７４Ｅ４）およびｐ−ＳＴＡＴ−１（クローン５８Ｄ６）に対する一次抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから、アクチン（クローンＣ４）に対する抗体をＣｈｅｍｉｃｏｎから購入した。膜は、ＴＢＳＴで繰返し洗浄し、ＴＢＳＴで希釈した（１：２０，０００希釈）、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ−５およびｐ−ＳＴＡＴ−１に対するＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ（Ｐｉｅｒｃｅ）またはアクチンに対するヤギ抗マウス（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに室温で１時間インキュベートし、その後、ＴＢＳＴで洗浄した。膜は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して培養し、ｘ線フィルム（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に曝露した。
【０１５８】
ＥｐｈＡ２のクラスＩ（Ｋｂ）制限ペプチドエピトープを有する脾細胞のペプチドパルス
処置腫瘍担持マウス由来の脾細胞（５×１０５）を丸底９６ウェルプレートに播種し、１０μＭのＥｐｈＡ２ペプチド（６７１−ＦＳＨＨＮＩＩＲＬ−６７９）で６時間刺激または刺激しなかった。試料は、ブレフェルジンＡ（Ｇｏｌｇｉ−ｐｌｕｇ（商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）１μｌ／ｍＬを含有するタンパク質輸送阻害剤とともに６時間インキュベートした後、フローサイトメトリー染色を行い、ＣＤ８  Ｔリンパ球をフローサイトメトリーにより解析して、グランザイムＢ細胞内染色および活性化した（ＣＤ２５）。
【０１５９】
統計解析
統計解析は、Ｐｒｉｓｍ８（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して実施した。多重比較（指定されたＨｏｌｋ−ＳｉｄｈａｍまたはＫｒｕｓｋａｌ  Ｗａｌｌａｃｅ）の補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを、複数の細胞株を含む解析または他の方法で指定された解析に使用した。２つの処置群間の腫瘍成長を経時的に比較するために、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用した。生存は、ログ・ランクアッセイを使用して評価し、データは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を使用して示した。すべての解析では、統計学的有意性のカットオフをＰ＜０．０５において設定した。次の表示法を使用した：（ｎｓ）Ｐ＞０．０５、（＊）Ｐ≦０．０５、（＊＊）Ｐ≦０．０１、（＊＊＊）Ｐ≦０．００１。
【０１６０】
結果
ＥｐｈＡ２発現ｏＨＳＶ構築および特性決定
正常細胞とがん細胞とを識別する免疫系の能力は、がん免疫療法に必須であり、悪性細胞による十分な抗原性の保持に基づく。Coulie  et  al.,  Nature  reviews  Cancer,  14:135-46  (2014)。しかし、腫瘍細胞は、免疫媒介除去を逃れるこれらの抗原性を失い得る。抗原性の消失は、いくつかの機構、例えば、免疫原性腫瘍抗原を欠くかまたは変異させるがん細胞の免疫選択、抗原プロセシング機構の調節不全、または腫瘍抗原提示の妨害（例えば、主要組織適合性発現の下方調節または消失）により生じ得る。Schreiber  et  al.,  Science,  331:1565-70  (2011)。本発明者らは、治療的抵抗の免疫認識および抗原性を増強する手法を探求した。本発明者らは、共有胎児性抗原（多くの腫瘍において発現する）を発現する腫瘍溶解性ウイルスを操作することにより、このような胎児性抗原に対する免疫療法応答を向上させ、免疫寛容を破壊するウイルスの自然な傾向を十分に利用することができると仮定した。Ehl  et  al.,  J  Exp  Med.,  187:763-74  (1998)。
【０１６１】
この仮説を試験するために、悪性神経膠腫、肉腫、および多くの癌（乳がん、前立腺（prostrate）がん、卵巣がん、膵臓がんおよび結腸直腸がん）において広範に発現する腫瘍関連「共有」胎児性抗原（Ｅｐｈｒｉｎ  Ａ２）を発現する腫瘍溶解性ＨＳＶを創製した。Tandon  et  al.,  Expert  Opin  Ther  Targets.  15:31-51  (2011)。試験では、このような「自己」腫瘍関連胎児抗原に存在する柔軟なプラットフォームとしてのウイルスの使用に着目したため、Ｃ５７ＢＬ／６  Ｅｐｈｒｉｎ  Ａ型受容体２（ＥｐｈＡ２）の完全長の分泌細胞外ドメインを発現するｏＨＳＶ組換え体（Ｃ１７０およびＣ１７２）を、図１２Ａに概説するように構築した。ＥｐｈＡ２遺伝子を含有するＨＳＶ組換え体は、ＤＮＡハイブリダイゼーション試験により遺伝的に検証し、ＥｐｈＡ２タンパク質発現は、正しいタンパク質サイズについてウエスタンブロットにより（図１２Ｂ）、局在化について免疫蛍光により（図１２Ｃ）、および細胞培養に基づく試験においてフローサイトメトリーにより（図１２Ｄ）検証した。結果は、Ｃ１７０が、予想したＭＷ９７ｋｄの細胞関連ＥｐｈＡ２を発現し（図１２Ｂ）、感染細胞において膜分布することを示す（図１２Ｃ）。また、フローサイトメトリー試験では、Ｃ１７０感染により、ＣＴ２Ａ（Ｃ５７ＢＬ／６に基づくＭＧ）および６７Ｃ−４（Ｃ５７ＢＬ／６に基づくＭＰＮＳＴ）腫瘍株のいずれにおいても天然に生じるそれよりもＥｐｈＡ２表面発現が増加することが示される。上に示すように、この新たなウイルスの目標は、ＯＶ処理腫瘍に対する免疫療法応答を向上させることであった。したがって、本発明者らは、ＥｐｈＡ２挿入および発現がウイルス複製、拡散および直接的腫瘍溶解活性にどのように影響したかを最初に評価した。これを試験するために、Ｃ１７０およびＣ１３４（親ウイルス）複製および細胞変性活性を、ヒトおよびマウス腫瘍株において比較した。予測したように、両方のウイルスは、ＣＴ２Ａ（マウスＭＧ株）、Ｕ８７（ヒトＭＧ株）、８８１４（ヒトＭＰＮＳＴ）および６７Ｃ−４（マウスＭＰＮＳＴ株）において同等のウイルス複製を有する。これは、新たな導入遺伝子挿入物により、腫瘍株におけるウイルス複製が変化しなかったことを示唆する。Ｉｎｃｕｙｔｅ  ｚｏｏｍを使用した細胞増殖のリアルタイム評価では、Ｃ１３４およびＣ１７０の両方により、ＣＴ２Ａ腫瘍細胞成長が等しく減少し、高度に抵抗性の６７Ｃ−４モデルにおいて、いずれのウイルス（Ｃ１３４およびＣ１７０）も、高感染多重度であっても細胞成長を直接的に有意には抑制されないことが示された（図１３Ａ〜Ｄ）。対照的に、両方のウイルスにより、ＣＴ２Ａ腫瘍細胞成長がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＯＩ  １および１０において阻害された。結果は、Ｃ１７０およびＣ１３４が同様に複製、拡散し、ｖｅｒｏ細胞ならびにヒトおよびマウス腫瘍株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞変性活性を示して、２つの異なるＣ５７ＢＬ／６腫瘍株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｏＨＳＶ腫瘍溶解活性の差を強調することを示す。
【０１６２】
２つの異なる高度抵抗性同系モデルにおいてＣ１７０により腫瘍成長が減少し、生存が向上する
次いで、本発明者らは、治療的抵抗ＣＴ２Ａ同系脳腫瘍モデルにおける新たなＥｐｈＡ２発現ｏＨＳＶ−１（Ｃ１７０およびＣ１７２）の抗腫瘍活性の評価について探求した。ＣＴ−２Ａ腫瘍は、Ｓｉｅｆｒｉｅｄらにより化学的誘導を使用して確立されたＣ５７ＢＬ／６に基づく未分化星状細胞腫である。Seyfried  et  al.,  Molecular  and  chemical  neuropathology,  17:147-67  (1992)。ＣＴ２Ａ腫瘍モデルでは、治療困難としているヒトＧＢＭの多くの特徴を再現する。ヒト腫瘍のように、ＣＴ−２Ａ腫瘍は、放射線および化学抵抗性であり、高い腫瘍内細胞不均一性により浸潤性であり、神経幹細胞と類似性を共有する（無血清培地において培養し、幹細胞マーカー、例えば、ＣＤ１３３、Ｏｃｔおよびネスチンを発現すると、ニューロスフィアを形成する）。Oh  et  al.,  J  Transl  Med.,  12:107  (2014)。同所ＣＴ２Ａ腫瘍を担持するマウスは、ｏＨＳＶ（１×１０７ＰＦＵ）または生理食塩水で処置し、生存をモニタリングした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験と一致して、Ｃ１３４およびＣ１７０は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのこの腫瘍モデルにおいて等しく複製する。等しい複製能にもかかわらず、Ｃ１７０のみが、全動物生存を向上させることが可能であった。Ｃ１７０マウスの生存期間中央値は、４３日であったのに対して、偽、Ｃ１７２およびＣ１３４処置マウスは、それぞれ２９および３０日であった（図１４Ａ）。その上、Ｃ１７０の一部および限られた数のＣ１３４処置マウスでは、これらの腫瘍が除去され、免疫応答が、ｏＨＳＶ抗腫瘍活性に寄与し得ることを示唆した。また、最初の試験では、Ｃ１７０（ＥＣおよびＩＣの両ドメインを含む、完全長ＥｐｈＡ２を発現するＣ１３４に基づくウイルス）により生存が向上したが、ＥｐｈＡ２の分泌ＥＣドメインを発現するＣ１７２ウイルスは無効であり、生理食塩水処置と変わらないことが示された。これは、ウイルスにより発現したある特定のＥｐｈＡ２ドメインが、ＯＶ抗腫瘍効果に役立つことを示唆する。
【０１６３】
ｏＨＳＶ抗腫瘍活性におけるこの差が、ＣＴ２Ａ腫瘍モデルに限られるかどうかを判定するために、完全長ＥｐｈＡ２発現ｏＨＳＶおよびＣ１３４を、同一の腫瘍抗原、ＥｐｈＡ２を共有する抵抗性同系腫瘍モデル（６７Ｃ４  ＭＰＮＳＴ）において調べた。Ghonime  et  al.,  Cancer  immunology  research,  6:1499-510  (2018)。また、Ｃ１７２は、ＣＴ２Ａモデルにおいていかなる生存利益も示さなかったため、このような試験から除外した。本発明者らは、図１４Ｂに示すように、６７Ｃ−４腫瘍細胞上でのＥｐｈＡ２の発現を確認し、Ｃ１７０感染時にＥｐｈＡ２発現の上方調節を認めた。本発明者らは、Ｃ１７０の単回処置により、Ｃ１３４および偽処置群と比較して、腫瘍成長が有意に減弱することを見出し、そのことは、Ｃ１７０が、より良い抗腫瘍活性を有し、ＥｐｈＡ２抗原を共有するいかなる腫瘍モデルにおいても有効であり得ることを示唆した。
Ｃ１７０処置により脳腫瘍における白血球浸潤が変更される
【０１６４】
上に示すように、Ｃ１３４およびＣ１７０の両方は、腫瘍モデルにおいて等しく複製し、これにより、本発明者らによる他の試験に基づいて、等しい直接的抗腫瘍活性を有すると予測した。次いで、本発明者らは、ＯＶ処置に関する免疫応答に着目した。これを評価するために、処置動物由来の免疫細胞浸潤物を調べて、Ｃ１７０、Ｃ１３４および生理食塩水処置マウスの間の差を確認し、処置動物を屠殺し、生理食塩水による灌流を行って、偽、Ｃ１３４およびＣ１７０処置腫瘍担持マウスから脳を収集し、免疫細胞浸潤物を比較した。結果は、図１５に示すように、親腫瘍溶解性ＨＳＶ−１（Ｃ１３４）およびＥｐｈＡ２発現ウイルス（Ｃ１７０）の両方において、腫瘍への白血球遊走が増加したことを示す。注目すべきは、円グラフに示すように、Ｃ１７０が、Ｔ細胞対骨髄細胞のバランスにおけるわずかな上昇を示し、Ｃ１７０処置コホートにおいてＴ細胞が優勢となった。また、Ｃ１３４により、かなりのＴ細胞浸潤が誘導されたが、これとともに脳への骨髄細胞の動員も増強された。次いで、Ｔ細胞集団の組成を調べ、Ｃ１３４およびＣ１７０の両方によりＴ細胞遊走が誘導されたが、Ｃ１７０のみによりＴＭＥにおけるＴ細胞の絶対数の統計学的に有意な増加が誘導されたことを確認した（図１５）。両方のウイルスによりＣＤ４Ｔの数の有意な増加が生じたが、Ｃ１７０のみによりＣＤ８Ｔ細胞の数の有意な増加が生じ、これは、観察された抗腫瘍効果における、このような細胞の鍵となる役割を示唆し得る。観察された抗腫瘍効果の基礎をなす機構を解明するために、ＣＤ８Ｔ細胞の種々のサブセットを調べた。両方のウイルスにより、ＣＤ２５活性化マーカーによって図に示すように、ＣＤ８Ｔ活性化が誘導され、ＴＭＥにおけるエフェクターＣＤ８  Ｔ（ＣＤ８  ＴＥＦＦ）細胞の数が増加し、Ｃ１７０処置マウスにおける数が高い傾向があったことが見出された。しかし、Ｃ１７０のみにより、図１５に示すように、セントラルメモリーＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ８  ＴＣＭ）集団数が有意に増加した。Hu  G,  Wang  S.,  Scientific  reports,  7:10376  (2017)。
【０１６５】
また、本発明者らは、ｏＨＳＶ処置６７Ｃ−４  ＭＰＮＳＴ腫瘍および末梢を免疫細胞プロファイルについて調べた。脳腫瘍モデルからの結果と一致して、Ｃ１７０処置腫瘍により、骨髄集団および骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の減少ならびにＴＣＭ集団の有意な増加が再度実証された（図１６）。その上、生理食塩水およびｏＨＳＶ処置動物由来の脾細胞により、Ｃ１７０処置６７Ｃ−４腫瘍担持マウスにおける、骨髄細胞集団および骨髄細胞由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の有意な減少ならびにＣＤ８Ｔ細胞の有意な増加が示された（図１６）。既存の試験では、骨髄細胞およびＭＤＳＣ集団のこの変化（図１６）ならびにＣＤ８  Ｔ細胞集団の増加は、脳腫瘍モデルからの結果と関連し、一致していることが示されている。Katoh  H,  Watanabe  M.,  Mediators  of  inflammation  2015,  159269  (2015)。
【０１６６】
腫瘍抗原発現腫瘍溶解性ウイルスにより全身性メモリーおよび耐久性抗腫瘍抗原応答が発達する
Ｃ１７０処置マウスにより腫瘍においてセントラルメモリー集団が誘導されることを示す結果に基づいて、本発明者らは、次いで、ｏＨＳＶ療法に応答した処置マウスにより、腫瘍抗原を発現するウイルスに対する全身性メモリーが発達したかどうかを調べた。
【０１６７】
Ｃ１７０およびＣ１３４により、ＣＴ２Ａモデルにおいて長期生存マウスが現れ、機能性試験を使用したこの仮説を試験するユニークな機会をもたらした。したがって、Ｃ１３４およびＣ１７０処置コホートならびに年齢を合わせたナイーブマウス由来のＣＴ２Ａからの長期生存マウスを再チャレンジして、耐久性抗腫瘍応答の発達を確認した。図１７Ａ〜１７Ｂに示すように、長期生存マウスおよびナイーブマウスをＣＴ２Ａ側腹腫瘍でチャレンジした場合、Ｃ１７０長期生存マウスのみにおいて腫瘍成長が減少した。初期の表現型データと一致して、これは、Ｃ１７０によって、循環し、ＣＴ２Ａ腫瘍を確認し得る耐久性メモリー集団がユニークに誘導され、アブスコパル効果（すなわち、局在化された治療の範囲を上回った腫瘍の収縮）が生じることを示唆する。
【０１６８】
このメモリー応答をさらに調べるために、次いで、６７Ｃ４腫瘍モデル試料を調べた。脳腫瘍モデルとは対照的に、６７−Ｃ４腫瘍試験において処置したマウスを同時に（ナイーブマウスの腫瘍が＞１５００ｍｍ３である場合）ならびに別の試験において処置後６日目にすべて屠殺した。これにより、種々の処置コホート間のＴ細胞機能性応答の差および腫瘍溶解性ウイルス発現腫瘍抗原ＥｐｈＡ２に対する末梢における全身性メモリーの発達を調べることが可能となった。ＭＨＣ−１によるペプチドパルス機能性アッセイでは、ＥｐｈＡ２の免疫優性ペプチド（Ｈ−２Ｄｂ；６７１−ＣＦＳＨＨＮＩＩＲＬ−６７９）が６時間制限された。刺激から６時間後のＣＤ８Ｔのパーセンテージの変化は存在しなかったが、図１８に示すように、Ｃ１７０で処置したマウス由来のＣＤ８Ｔのみが、強固な活性化（ＣＤ２５発現）およびエフェクターサイトカイン（ＧｚｍＢ）の発現を示したことが見出され、このようなマウスが、曝露時に腫瘍抗原に応答し得る循環抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を有することを示唆した。
【０１６９】
図１９Ａ〜１９Ｃは、本明細書に記載するウイルスの概略図である。このようなウイルスでは、マウスＥｐＨＡ２遺伝子は、一部の細胞株および実施例における使用のためのものである。もちろん、ウイルスは、ヒトＥｐｈＡ２遺伝子をコードするように改変することができる。また、例となる配列のバリエーションおよびアイソフォームは、本開示により包含する。図１９Ｄ〜Ｉでは、本明細書に記載するいくつかのキメラウイルスの全ゲノムウイルス配列を開示する。
【０１７０】
本明細書において引用するすべての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に利用可能な資料の完全な開示は、参照により組み込まれる。前述の詳細な説明および実施例は、理解を深めるために示すものにすぎない。そこから不必要な制限を何ら解釈すべきではない。本発明は、特許請求の範囲により定義される本発明に含まれる、当業者に明らかな変形形態のために、示され記載される正確な詳細に制限されない。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｃ】
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【図１２Ａ−１２Ｄ】
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【図１３Ａ−１３Ｄ】
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【図１４Ａ−１４Ｅ】
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【図１５Ａ−１５Ｈ】
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【図１６Ａ−１６Ｉ】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ−１９Ｃ】
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【図１９Ｄ−１】
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【図１９Ｄ−２】
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【図１９Ｄ−３】
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【図１９Ｄ−４】
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【図１９Ｄ−５】
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【図１９Ｄ−６】
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【図１９Ｄ−７】
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【図１９Ｄ−８】
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【図１９Ｄ−９】
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【図１９Ｄ−１０】
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【図１９Ｄ−１１】
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【図１９Ｄ−１２】
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【図１９Ｄ−１３】
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【図１９Ｄ−１４】
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【図１９Ｄ−１５】
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【図１９Ｄ−１６】
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【図１９Ｄ−１７】
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【図１９Ｄ−１８】
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【図１９Ｄ−１９】
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【図１９Ｄ−２０】
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【図１９Ｄ−２１】
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【図１９Ｄ−２２】
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【図１９Ｄ−２３】
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【図１９Ｄ−２４】
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【図１９Ｄ−２５】
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【図１９Ｄ−２６】
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【図１９Ｄ−２７】
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【図１９Ｄ−２８】
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【図１９Ｄ−２９】
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【図１９Ｄ−３０】
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【図１９Ｄ−３１】
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【図１９Ｄ−３２】
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【図１９Ｄ−３３】
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【図１９Ｄ−３４】
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【図１９Ｄ−３５】
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【図１９Ｄ−３６】
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【図１９Ｄ−３７】
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【図１９Ｅ−１】
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【図１９Ｅ−２】
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【図１９Ｅ−３】
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【図１９Ｅ−４】
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【図１９Ｅ−５】
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【図１９Ｅ−６】
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【図１９Ｅ−７】
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【図１９Ｅ−８】
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【図１９Ｅ−９】
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【図１９Ｅ−１０】
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【図１９Ｅ−１１】
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【図１９Ｅ−１３】
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【図１９Ｅ−１４】
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【図１９Ｅ−１５】
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【図１９Ｅ−１６】
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【図１９Ｅ−１７】
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【図１９Ｅ−２０】
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【図１９Ｅ−２１】
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【図１９Ｅ−３０】
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【図１９Ｅ−３１】
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【図１９Ｅ−３２】
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【図１９Ｅ−３７】
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【図１９Ｆ−１】
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【図１９Ｆ−２】
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【図１９Ｆ−３】
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【図１９Ｆ−４】
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【図１９Ｆ−５】
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【図１９Ｆ−６】
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【図１９Ｆ−７】
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【図１９Ｆ−２６】
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【図１９Ｉ−３２】
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【図１９Ｉ−３３】
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【図１９Ｉ−３４】
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【図１９Ｉ−３５】
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【図１９Ｉ−３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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