(57)【要約】  本発明の実施態様は、ポリヌクレオチド配列決定のための鋳型を製造する方法に関する。特に、本発明は、遷移金属錯体、例えば、パラジウム錯体またはニッケル錯体による固体支持体上に固定化された二本鎖ポリヌクレオチドの１以上の第一鎖の開裂による、配列決定に備えたクラスター化ポリヌクレオチドの線形化に関する。さらに本発明は、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４による、アゾベンゼンリンカーを含む固体支持体上に固定化された二重二本鎖ポリヌクレオチドの１以上の第二鎖の開裂による、クラスター化ポリヌクレオチドの線形化に関する。３’ホスフェート部分遮断基を含むヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドおよびフルオライド反応剤を使用してそれを除去する方法も開示される。
2021500003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、
二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含むものであり、ここで、第一鎖および第二鎖はその５’末端で固体支持体に固定化され、ここで、各第一鎖は遷移金属錯体による化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含み、ここで、遷移金属錯体はパラジウム錯体またはニッケル錯体であり；
二本鎖ポリヌクレオチドと遷移金属錯体の水溶液を接触させ、それにより第一開裂部位で１以上の第一鎖を開裂し、１以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し；そして
固体支持体から開裂第一核酸を除去する
ことを含む、方法。
【請求項２】
各第一鎖が固体支持体に固定化された第一伸長プライマーから伸長する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一伸長プライマーが第一開裂部位を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一伸長プライマーがＰ５配列または修飾Ｐ５配列を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
第一開裂部位が遷移金属錯体により化学開裂を受けることができる修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド部分を含む、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド部分がアリル基を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第一開裂部位が式(II’)：
【化１】
2021500003.tif 000061
〔式中、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を有する修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド部分を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド部分がチミン塩基を有する、請求項５〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
遷移金属錯体がパラジウム(０)錯体である、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
パラジウム(０)錯体がＰｄ(ＴＨＰ)２、Ｐｄ(ＴＨＰ)４、Ｐｄ(ＴＨＭ)４またはこれらの組み合わせである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
パラジウム(０)錯体がin situで産生される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
パラジウム(０)錯体が、１以上のパラジウム(II)化合物をトリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(ＴＨＰ)と混合することにより産生され、ここで、パラジウム(II)化合物がＮａ２ＰｄＣｌ４、(ＰｄアリルＣｌ)２、[Ｐｄアリル(ＴＨＰ)]Ｃｌおよび[Ｐｄアリル(ＴＨＰ)２]Ｃｌからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
パラジウム(０)錯体が、Ｐｄ(ＰＰｈ３)４をトリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィンと混合することにより産生される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
遷移金属錯体がニッケル(０)錯体である、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
ニッケル(０)錯体がニッケル(II)化合物からin situで産生される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
各開裂固定化第一鎖の３’末端が保護基を含む、請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
保護基が式(Ｉ)：
【化２】
2021500003.tif 000062
〔式中、
Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａまたは−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３であり；
ＲａがＣ１−４アルキル、ｔｅｒｔ−ブチル、アリル、ベンジルまたは９−フルオレニルメチルであり；
各Ｒｂが独立してＣ１−４アルキルおよびフェニルからなる群から選択され；そして
Ｒ２がＨ、Ｃ１−４アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造を有する３’末端ホスフェート部分である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
各第二鎖が固体支持体に固定化された第二伸長プライマーから伸長され、各第二鎖が第二開裂部位を含む、請求項１〜１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
第二伸長プライマーが第二開裂部位を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第二開裂部位がパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができない、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
第二伸長プライマーがＰ７ヌクレオチド配列または修飾Ｐ７ヌクレオチド配列またはＰ１７ヌクレオチド配列を含む、請求項１８〜２０の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
第二開裂部位が化学開裂、光開裂、酵素開裂およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂される、請求項１８〜２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
第二開裂部位が化学開裂により開裂され、ここで、第二開裂部位がジオールリンカーまたはアゾベンゼンリンカーを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ジオールリンカーが式(VIII)：
【化３】
2021500003.tif 000063
〔式中、
ｒが２、３、４、５または６であり；そして
ｓが２、３、４、５または６である。〕
の構造を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ジオールリンカーが過ヨウ素酸塩により開裂され得る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アゾベンゼンリンカーが式(Ｘ)：
【化４】
2021500003.tif 000064
〔式中、
Ｒ１がＨ、ヒドロキシルまたは保護ヒドロキシルであり；
Ｒ２がＨ、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６アルコキシであり；
各Ｒ３およびＲ４が独立してＨ、ハロ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ５または−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ６であり；
各Ｒ５およびＲ６が独立してＨ、Ｃ１−６アルキルまたはＣ６−１０アリールであり；
Ｘが−Ｃ(Ｏ)−、−ＣＨ２−または−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−であり；そして
各ｍ１、ｍ２およびｍ３が独立して１、２、３、４、５または６である。〕
の構造を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
アゾベンゼンリンカーがＮａ２Ｓ２Ｏ４により開裂され得る、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第二開裂部位が酵素開裂により開裂される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
二本鎖ポリヌクレオチドが共有結合により固体支持体に固定化される、請求項１〜２８の何れかに記載の方法。
【請求項３０】
複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、
二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、各二本鎖ポリヌクレオチドが第一鎖および第二鎖を含み、ここで、第一鎖および第二鎖がその５’末端で固体支持体に固定化され、ここで、各第一鎖が第一開裂部位を含み、ここで、各第二鎖がアゾベンゼンリンカーを含む第二開裂部位を含み；
第一開裂部位で１以上の第一鎖を開裂し、１以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し；
固体支持体から開裂第一核酸を除去し；
固定化第二鎖を配列決定し；
第二鎖に相補的な誘導体第一鎖を再合成し；そして
第二開裂部位で１以上の第二鎖を開裂し、１以上の開裂第二核酸および開裂固定化第二鎖を産生する
ことを含む、方法。
【請求項３１】
各第一鎖が固体支持体に固定化された第一伸長プライマーから伸長され、ここで、第一伸長プライマーが第一開裂部位を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第一開裂部位が化学開裂、光開裂、酵素開裂およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂される、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
各第二鎖が固体支持体に固定化された第二伸長プライマーから伸長され、ここで、第二伸長プライマーが第二開裂部位を含む、請求項３０〜３２の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
アゾベンゼンリンカーが式(Ｘ)：
【化５】
2021500003.tif 000065
〔式中、
Ｒ１がＨ、ヒドロキシルまたは保護ヒドロキシルであり；
Ｒ２がＨ、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６アルコキシであり；
各Ｒ３およびＲ４が独立してＨ、ハロ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ５または−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ６であり；
各Ｒ５およびＲ６が独立してＨ、Ｃ１−６アルキルまたはＣ６−１０アリールであり；
Ｘが−Ｃ(Ｏ)−、−ＣＨ２−または−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−であり；そして
各ｍ１、ｍ２およびｍ３が独立して１、２、３、４、５または６である。〕
の構造を含む、請求項３０〜３３の何れかに記載の方法。
【請求項３５】
アゾベンゼンリンカーをＮａ２Ｓ２Ｏ４により開裂する、請求項３０〜３４の何れかに記載の方法。
【請求項３６】
固定化第二鎖の配列決定が、固定化第二鎖に相補的な標識ヌクレオチドを連続的に取り込み、標識ヌクレオチドを検出することを含む、請求項３０〜３５の何れかに記載の方法。
【請求項３７】
各開裂固定化第一鎖の３’末端が保護基を含む、請求項３０〜３６の何れかに記載の方法。
【請求項３８】
３’末端開裂固定化第一鎖の保護基が誘導体第一鎖の再合成前に脱保護される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
さらに固体支持体から開裂第二核酸を除去し、誘導体第一鎖を配列決定することを含む、請求項３０〜３８の何れかに記載の方法。
【請求項４０】
オリゴヌクレオチドから３’末端保護基を除去する方法であって、
５’末端で固定化された複数のオリゴヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、ここで、オリゴヌクレオチドは各式(Ｉ)
【化６】
2021500003.tif 000066
〔式中、
Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａまたは−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３であり；
ＲａがＣ１−４アルキル、ｔｅｒｔ−ブチル、アリル、ベンジルまたは９−フルオレニルメチルであり；
各Ｒｂが独立してＣ１−４アルキルおよびフェニルからなる群から選択され；そして
Ｒ２がＨ、Ｃ１−４アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造を有する３’末端保護基を含み；そして
オリゴヌクレオチドと脱保護剤を接触させ、それにより、３’末端保護基を開裂して、各々遊離３’末端ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドを産生する
ことを含む、方法。
【請求項４１】
Ｒ１が−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
各Ｒｂがイソプロピルである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｒ２がヌクレオチドである、請求項４０〜４２の何れかに記載の方法。
【請求項４４】
脱保護剤がフッ化物イオンまたは塩基を含む、請求項４０〜４３の何れかに記載の方法。
【請求項４５】
脱保護剤がテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド(ＴＢＡＦ)、ＨＦ、ＮＨ４Ｆ、ＣｓＦ、ＮａＯＨおよびＫＯＨおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
固定化された複数の第一鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体であって、各第一鎖ポリヌクレオチドが遷移金属錯体による化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含み；ここで、遷移金属錯体がパラジウム錯体またはニッケル錯体でありおよびここで、複数の第一鎖ポリヌクレオチドがその５’末端で固体支持体に固定化されるものである、固体支持体。
【請求項４７】
各第一鎖ポリヌクレオチドが固体支持体に固定化された第一伸長プライマーを含む、請求項４６に記載の固体支持体。
【請求項４８】
第一伸長プライマーが第一開裂部位を含む、請求項４７に記載の固体支持体。
【請求項４９】
第一伸長プライマーがＰ５配列または修飾Ｐ５配列を含む、請求項４７または４８に記載の固体支持体。
【請求項５０】
第一開裂部位がパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができる修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、請求項４６〜４９の何れかに記載の固体支持体。
【請求項５１】
修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドがアリル基を含む、請求項５０に記載の固体支持体。
【請求項５２】
第一開裂部位が式(II’)：
【化７】
2021500003.tif 000067
〔式中、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を有する修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、請求項５１に記載の固体支持体。
【請求項５３】
修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドがチミン塩基を含む、請求項５０〜５２の何れかに記載の固体支持体。
【請求項５４】
第一伸長プライマーがＰ１５配列を含む、請求項５０〜５３の何れかに記載の固体支持体。
【請求項５５】
パラジウム錯体がパラジウム(０)錯体である、請求項４６〜５４の何れかに記載の固体支持体。
【請求項５６】
パラジウム錯体が１以上のパラジウム(II)化合物とトリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(ＴＨＰ)の混合によりin situで産生され、ここで、パラジウム(II)化合物がＮａ２ＰｄＣｌ４、(ＰｄアリルＣｌ)２、[Ｐｄアリル(ＴＨＰ)]Ｃｌおよび[Ｐｄアリル(ＴＨＰ)２]Ｃｌからなる群から選択される、請求項５５に記載の固体支持体。
【請求項５７】
パラジウム(０)錯体がＰｄ(ＰＰｈ３)４とトリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィンの混合により産生される、請求項５５に記載の固体支持体。
【請求項５８】
遷移金属錯体がニッケル(０)錯体である、請求項４６〜５４の何れかに記載の固体支持体。
【請求項５９】
ニッケル(０)錯体がニッケル(II)化合物からin situで産生される、請求項５８に記載の固体支持体。
【請求項６０】
第一開裂部位が化学開裂後３’遮断部分を産生する、請求項４６〜５９の何れかに記載の固体支持体。
【請求項６１】
３’遮断部分が式(Ｉ)：
【化８】
2021500003.tif 000068
〔式中、
Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａまたは−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３であり；
ＲａがＣ１−４アルキル、ｔｅｒｔ−ブチル、アリル、ベンジルまたは９−フルオレニルメチルであり；
各Ｒｂが独立してＣ１−４アルキルおよびフェニルからなる群から選択され；そして
Ｒ２がＨ、Ｃ１−４アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造を有するホスフェート部分を含む、請求項６０に記載の固体支持体。
【請求項６２】
式(Ｉ)の構造が式(Ｖ)：
【化９】
2021500003.tif 000069
〔式中、塩基が所望により保護されているアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
により表される、請求項６１に記載の固体支持体。
【請求項６３】
Ｒ１が−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３である、請求項６１または６２に記載の固体支持体。
【請求項６４】
Ｒｂがイソプロピルである、請求項６３に記載の固体支持体。
【請求項６５】
３’遮断部分が酵素反応または化学反応により除去され得る、請求項６０〜６４の何れかに記載の固体支持体。
【請求項６６】
さらに固定化された複数の第二鎖ポリヌクレオチドを含み、各第二鎖ポリヌクレオチドが第二開裂部位を含み、ここで、複数の第二鎖ポリヌクレオチドがその５’末端で固体支持体に固定化される、請求項４６〜６５の何れかに記載の固体支持体。
【請求項６７】
各第二鎖ポリヌクレオチドが固体支持体に固定化された第二伸長プライマーを含む、請求項６６に記載の固体支持体。
【請求項６８】
第二伸長プライマーが第二開裂部位を含む、請求項６７に記載の固体支持体。
【請求項６９】
第二開裂部位がパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができない、請求項６６〜６８の何れかに記載の固体支持体。
【請求項７０】
第二開裂部位が化学開裂、光開裂、酵素開裂およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂され得る、請求項６６〜６９の何れかに記載の固体支持体。
【請求項７１】
第二開裂部位が化学開裂により開裂され、ここで、第二開裂部位がジオールリンカーまたはアゾベンゼンリンカーを含む、請求項７０に記載の固体支持体。
【請求項７２】
ジオールリンカーが式(VIII)：
【化１０】
2021500003.tif 000070
〔式中、
ｒが２、３、４、５または６であり；そして
ｓが２、３、４、５または６である。〕
の構造を含む、請求項７１に記載の固体支持体。
【請求項７３】
アゾベンゼンリンカーが式(Ｘ)：
【化１１】
2021500003.tif 000071
〔式中、
Ｒ１がＨ、ヒドロキシルまたは保護ヒドロキシルであり；
Ｒ２がＨ、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６アルコキシであり；
各Ｒ３およびＲ４が独立してＨ、ハロ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ５または−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ６であり；
各Ｒ５およびＲ６が独立してＨ、Ｃ１−６アルキルまたはＣ６−１０アリールであり；
Ｘが−Ｃ(Ｏ)−、−ＣＨ２−または−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−であり；そして
各ｍ１、ｍ２およびｍ３が独立して１、２、３、４、５または６である。〕
の構造を含む、請求項７１に記載の固体支持体。
【請求項７４】
第二伸長プライマーがＰ７ヌクレオチド配列、修飾Ｐ７ヌクレオチド配列またはＰ１７ヌクレオチド配列を含む、請求項６７〜７０の何れかに記載の固体支持体。
【請求項７５】
第一および第二鎖ポリヌクレオチドが固体支持体表面上のポリマーまたはヒドロゲルコーティングとの共有結合を経て固体支持体に固定化される、請求項６６〜７４の何れかに記載の固体支持体。
【請求項７６】
ポリマーまたはヒドロゲルコーティングがＰＡＺＡＭを含む、請求項７５に記載の固体支持体。
【請求項７７】
固体支持体がフローセルを含む、請求項４６〜７６の何れかに記載の固体支持体。
【請求項７８】
式(II)：
【化１２】
2021500003.tif 000072
〔式中、
ＲがＨ、ＯＨまたはＯＰＧであり；
Ｒ１がＨまたはＰＧであり；
Ｒ２がＨ、ＰＧであるかまたは−ＯＲ２がホスフェートであり；
ＰＧがヒドロキシル保護基であり；そして
塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を含む、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項７９】
式(IIａ)：
【化１３】
2021500003.tif 000073
の構造を有する、請求項７８に記載の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項８０】
塩基がチミンである、請求項７８または７９に記載の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項８１】
請求項７９または８０に記載の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項８２】
オリゴヌクレオチドが式(III)：
【化１４】
2021500003.tif 000074
の構造を有する、請求項８１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８３】
オリゴヌクレオチドの５’末端(アスタリスクの位置)が固体支持体に結合している、請求項８１または８２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８４】
式(Ｉ)：
【化１５】
2021500003.tif 000075
〔式中、
Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａまたは−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３であり；
ＲａがＣ１−４アルキル、ｔｅｒｔ−ブチル、アリル、ベンジルまたは９−フルオレニルメチルであり；
各Ｒｂが独立してＣ１−４アルキルおよびフェニルからなる群から選択され；そして
Ｒ２がＨ、Ｃ１−４アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造の３’遮断部分を含む、ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項８５】
式(Ｉ)の構造が式(Ｖ)：
【化１６】
2021500003.tif 000076
〔式中、塩基が所望により保護されているアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
によっても表される、請求項８４に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項８６】
Ｒ１が−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３である、請求項８４または８５に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項８７】
Ｒｂがイソプロピルである、請求項８６に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項８８】
請求項８４〜８７の何れかに記載のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項８９】
式(VI)：
【化１７】
2021500003.tif 000077
の構造を有する、請求項８８に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権出願の引用による取り込み
本出願は、２０１８年５月１５日出願の米国仮出願６２／６７１,８１６および２０１９年１月３日出願の米国仮出願６２／７８８,０４５に基づく優先権の利益を主張し、この各々は、引用により全体として本明細書に包含させる。
【０００２】
電子形式の配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより提出したＡＳＣＩＩテキストファイルの電子配列表と共に出願された。電子配列表はILLINC363WOSEQLIST.txtなるファイル名の電子配列表として提供され、２０１９年５月１０日に作成され、最終的に保存され、２,８０６バイトサイズである。電子配列表の情報は、引用により全体として本明細書に包含させる。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
分野
本発明の実施態様は、ポリヌクレオチド配列決定のための鋳型を製造する方法に関する。特に、本発明は、固体支持体上に固定された二本鎖ポリヌクレオチドの１以上の第一鎖の化学開裂による、ある場合、パラジウム錯体またはニッケル錯体などの遷移金属錯体存在下での反応による配列決定に備えたクラスター化ポリヌクレオチドの線形化に関する。さらに、本発明は、固体支持体上の修飾プライマーの化学的脱保護に関する。
【０００４】
種々の核酸配列決定方法が当分野で知られる。米国特許５,３０２,５０９は、鋳型鎖に相補的な標識ポリヌクレオチドを連続的に取り込むためのＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼを使用する複数伸長反応の実施を含む、ポリヌクレオチド鋳型の配列決定方法を記載する。このような「合成による配列決定」(ＳＢＳ)反応において、鋳型鎖と塩基対形成した新規ポリヌクレオチド鎖が、鋳型鎖に相補的な個々のヌクレオチドの連続的取り込みにより、５’から３’方向で構築される。配列決定反応で使用する基質ヌクレオシド三リン酸は、連続的にヌクレオチドが加わるにつれて、取り込まれたヌクレオチドの構造(identity)の決定を可能とする、種々の３’標識で３’位置が標識される。
【０００５】
核酸配列決定反応のスループットを最大化するために、複数鋳型分子を並行して配列決定可能とすることが有利である。複数鋳型の並行処理は、核酸アレイテクノロジーの使用により達成され得る。これらのアレイは、一般に固相支持体材上に固定されたポリヌクレオチドの高密度マトリクスからなる。
【０００６】
固定化核酸アレイの製作のための種々の手順は文献に記載されている。ＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７の何れも、複数の同一固定化ポリヌクレオチド鎖および複数の同一固定化相補鎖から形成されたクラスターまたは「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物の固体支持体上への固定化を可能とする、核酸増幅の方法を記載する。このタイプのアレイは、ここでは、「クラスター化アレイ」と称する。これらの方法により調製したクラスター化アレイのＤＮＡコロニーに存在する核酸分子は、例えばＷＯ９８／４４１５２に記載のとおり、配列決定反応のための鋳型を提供できる。ＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７に記載のような固相増幅反応の産物は、固定化ポリヌクレオチド鎖と固定化相補鎖の対のアニーリングにより形成されたいわゆる「架橋」構造であり、両鎖は５’末端で固体支持体に結合している。核酸配列決定により適する鋳型を提供するために、少なくとも部分的に一本鎖である鋳型を産生するために「架橋」構造における固定化鎖の一方の実質的に全てまたは少なくとも一部を除去することが好ましい。こうして、一本鎖である鋳型の一部は、配列決定プライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能となる。「架橋」二本鎖核酸構造における一つの固定鎖の全てまたは一部を除去する手順は、「線形化」と称される。酵素開裂、光化学開裂または化学開裂を含むが、これらに限定されない線形化の種々の方法がある。線形化方法の非限定的例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／０１０２５１および米国特許公開２００９／００８８３２７および米国特許公開２００９／０１１８１２８に開示され、これらは、引用により全体として本明細書に包含させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
二本鎖ＤＮＡクラスターを線形化し、表面結合プライマーを脱保護するための、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの効率的部位特異的開裂を促進する酵素方法が知られる。現在、酵素は、種々の配列決定適用において、これらのタイプの反応の両者で広範に使用されている。しかしながら、酵素安定性、酵素材料の高原価、貯蔵および取り扱いに要する特殊条件、酵素活性の変動および配列読取りにおける高い背景強度を含む、種々の問題が酵素法にはある。それ故に、有効なＤＮＡ配列決定のために、代替の線形化および脱保護方法を開発する必要性がある。しかしながら、材料、条件および副産物が(ａ)オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよびデハブリダイゼーション、プライマーＰＣＲ伸長およびＤＮＡ合成を含む上流および下流反応に適合性でなければならないこと、(ｂ)酸性、塩基性および酸化的条件下で良好な安定性を示さなければならないこと、(ｃ)迅速かつクリーンな化学反応をすることおよび(ｄ)ヌクレオチド検出方法を妨害してはならないことを要するため、この状況での線形化工程に適用できる反応タイプに多くの制限がある。本発明は、上記制限を満たし、有効な代替手法である、化学開裂および脱保護工程を記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要約
本発明のある実施態様は、複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、ここで、各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含むものであり、ここで、第一鎖および第二鎖は、各々その５’末端で固体支持体に固定化されており、そして、各第一鎖は遷移金属錯体存在下で化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含み、ここで、遷移金属錯体はパラジウム錯体またはニッケル錯体であり；二本鎖ポリヌクレオチドと遷移金属錯体の水溶液を接触させ、それにより第一開裂部位で１以上の第一鎖を開裂し、１以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し；そして固体支持体から開裂第一核酸を除去することを含む、方法に関する。このような方法において、固定化第二鎖は、固体支持体から開裂第一核酸を除去後固体支持体上に残り、開裂固定化第一鎖とハイブリダイズしたままである。ある実施態様において、パラジウム(Ｐｄ)錯体はＰｄ(０)錯体である。ある実施態様において、ニッケル(Ｎｉ)錯体はＮｉ(０)錯体である。ある実施態様において、第一開裂部位はアリル官能基を含む。あるさらなる実施態様において、第一開裂部位はさらにホスフェート部分を含む。ある実施態様において、第一開裂部位はアリルホスフェート部分を含む修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
【０００９】
本発明はまた固体支持体上のオリゴヌクレオチドを化学脱保護する方法であって、固定化された複数のオリゴヌクレオチドを有する固体支持体を用意し、ここで、オリゴヌクレオチドは各々３’ヒドロキシルに化学脱保護を受け得るホスフェート基を含む修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドなどの保護基または修飾３’末端ホスフェート部分を含み、オリゴヌクレオチドと脱保護剤を反応させ、それにより保護基(例えば修飾３’末端ホスフェート部分)を開裂して、遊離３’ヒドロキシル基を有する固定化オリゴヌクレオチドを得ることを含む、方法に関する。ある態様において、保護基は、式(Ｉ)：
【化１】
2021500003.tif 000003
〔式中、ホスフェート部分は固定化オリゴヌクレオチドの３’末端のホスフェートであり；
Ｒ１は−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａまたは−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３であり；
ここで、ＲａはＣ１−４アルキル、ｔｅｒｔ−ブチル、アリル、ベンジルまたは９−フルオレニルメチルであり；そして
各Ｒｂは独立してＣ１−４アルキルおよびフェニルからなる群から選択され；そして
Ｒ２はＨ、Ｃ１−４アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造を有する３’末端ホスフェート部分である。
【００１０】
式(Ｉ)のある態様において、Ｒ１は−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａである。ある態様において、Ｒａは９−フルオレニルメチル、ベンジルまたはアリルである。ある態様において、Ｒ１は−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３である。ある態様において、各Ｒｂはイソプロピルである。ある態様において、各Ｒｂは独立してメチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチルまたはフェニルである。
【００１１】
ある態様において、脱保護剤はフッ化物イオン(例えば、ＴＢＡＦ、ＨＦまたはＣｓＦ)または弱塩基(例えば、水酸化ナトリウム)である。ある態様において、固定化オリゴヌクレオチドは、ここに記載するとおり第一鎖の化学開裂により産生された、開裂固定化第一鎖である。それ故に、ある態様において、第一鎖は、開裂および固体支持体から開裂第一核酸の除去後開裂固定化第一鎖に存在する修飾ヌクレオチドを含む。ここに記載する方法は、リード１完了後の開裂固定化第一鎖の３’ヒドロキシル保護基の除去を含む。ある実施態様において、開裂固定化第一鎖は末端ホスフェート基を含む。他の態様において、方法は、開裂および固体支持体から開裂第一核酸の除去後開裂固定化第一鎖の３’末端ホスフェートの遮断を含む。ある態様において、遮断は、固定化第二鎖の配列決定前の３’末端ホスフェートと遮断基であり、遮断基をリード１の完了後除去して、ここに記載する化学開裂方法による３’ヒドロキシル基を産生する。第二鎖の３’末端は、脱保護反応中および後、固定化開裂第一鎖とハイブリダイズしたままである。
【００１２】
他の態様において、３’ヒドロキシル保護基は、第一開裂後開裂固定化第一鎖に存在するホスフェート基または部分であり、方法は、Ｔ４ＰＮＫなどの脱リン酸酵素存在下のホスフェート基または部分の除去を含む。第二鎖の３’末端は、酵素脱保護反応中および後、固定化開裂第一鎖とハイブリダイズしたままである。
【００１３】
ある実施態様において、方法は、さらに、固体支持体から開裂第一核酸の除去後の固定化第二鎖の配列決定を含む。ある態様において、配列決定は、固定化第二鎖に相補的な標識ヌクレオチドの連続的取り込みおよび各連続的取り込み後の標識ヌクレオチドの検出を含む。ペアエンド配列決定において、二本鎖核酸の両鎖は最終的に配列決定され、このような場合、固定化第二鎖の配列決定をここでは「リード１」と称する。
【００１４】
他の実施態様において、各固定化第二鎖は、化学開裂を受けることができる第二開裂部位を含む。ある態様において、第二鎖の配列決定(リード１)および固定化開裂第一鎖からの３’ヒドロキシル保護基の除去後、方法は、さらに誘導体二本鎖ポリヌクレオチドを産生するための固定化第二鎖に対する相補体の合成を含み、ここで、各誘導体二本鎖ポリヌクレオチドは第二鎖および誘導体第一鎖を含み、ここで、誘導体第一鎖および第二鎖は、各々その５’末端で固体支持体に固定化される。本発明の方法は、第二開裂部位で１以上の第二鎖を開裂し、それにより１以上の開裂第二核酸および開裂固定化第二鎖を産生し、固体支持体から開裂第二核酸を除去することを含む。このような方法において、固定化誘導体第一鎖は、固体支持体から開裂第二核酸の除去後固体支持体上に残り、開裂固定化第二鎖とハイブリダイズしたままである。
【００１５】
このような実施態様のある場合において、第二鎖の第二開裂部位は化学開裂を受け得て、第二鎖は化学反応により開裂される。例えば、第二開裂部位は、１以上の隣接ジオール結合(これは、過ヨウ素酸反応剤での処理などの酸化より開裂され得る)、ジスルフィド結合(例えば、ＤＴＴなどの還元条件下またはホスフィンの存在下開裂可能)、オルト−ニトロベンジル基(例えば、光分解により開裂可能)、アゾベンゼン結合(例えば、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４の存在下開裂可能)、アルキル−セレン結合(例えば、過酸化水素などでの酸化により開裂可能)、シリルエーテル結合(例えば、フッ化物イオン、酸または塩基により開裂可能)またはアリルカルバメート結合(例えば、パラジウム錯体存在下開裂可能)を含む。ある態様において、結合は、第二開裂がヒドロキシル部分を遊離するように選択する。ある態様において、開裂はリンカー反応部位を除去する(例えば、隣接ジオールの酸化は２つの別々のカルボニル化合物を残し、ジオールはもはや存在しない)。ある態様において、第二開裂部位は第二鎖に沿った任意の位置であるが、好ましくは第二鎖の５’末端近くの主鎖に結合する(例えば、固体支持体への結合の近く)。ある実施態様において、第一鎖および第二鎖の化学開裂条件は異なり、第一鎖および第二鎖は同じ開裂条件により開裂され得ない(例えば、開裂部位は直交性である)。ある態様において、両開裂工程は化学開裂工程である必要はない。例えば、第一鎖を酵素反応で開裂してよく、一方第二鎖は化学反応により開裂され、または第一鎖を化学反応で開裂してよく、一方第二鎖は酵素反応により開裂される。
【００１６】
ある付加的な本発明の実施態様は、複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含むものであり、ここで、第一鎖および第二鎖はその５’末端で固体支持体に固定化され、ここで、各第一鎖は第一開裂部位を含み、ここで、各第二鎖はアゾベンゼンリンカーを含む第二開裂部位を含み；第一開裂部位で１以上の第一鎖を開裂し、１以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し；固体支持体から開裂第一核酸を除去し；固定化第二鎖を配列決定し；第二鎖に相補的な誘導体第一鎖を再合成し；そして第二開裂部位で１以上の第二鎖を開裂し、１以上の開裂第二核酸および開裂固定化第二鎖を産生することを含む、方法に関する。このような方法のある態様において、固定化誘導体第一鎖は、固体支持体から開裂第二核酸の除去後固体支持体上に残り、開裂固定化第二鎖とハイブリダイズしたままである。
【００１７】
ある態様において、方法は、さらに、固体支持体から開裂第二核酸除去後の固定化誘導体第一鎖の配列決定を含む。ある態様において、配列決定は、固定化誘導体第一鎖に固定化誘導体第一鎖に相補的な標識ヌクレオチドを連続的に取り込み、各連続的取り込み後標識ヌクレオチドを検出することを含む。ペアエンド配列決定において、二本鎖核酸の両鎖は最終的に配列決定され、このような場合、固定化誘導体第一鎖の配列決定をここでは「リード２」と称する。
【００１８】
本発明のある実施態様は、ペアエンド配列決定方法における化学反応により除去され得る３’遮断部分を製造する方法に関する(引用により全体として本明細書に包含させる米国公開２００９／００８８３２７に記載)。方法は、二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含むものであり、ここで、第一鎖および第二鎖はその５’末端で固体支持体に固定化され、ここで、各第一鎖は第一開裂部位を含み；第一開裂部位で１以上の第一鎖を開裂して、１以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し；そして３’遮断部分を開裂固定化第一鎖の３’末端に再導入し、ここで、３’遮断部分は化学反応により除去され得ることを含む。ある他の実施態様において、開裂固定化第一鎖の３’末端に３’遮断部分を導入する代わりに、３’遮断部分を、該開裂工程後に第一開裂部位から産生する。ある実施態様において、３’遮断部分は、ホスフェート部分を含む修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。このような実施態様のある場合において、３’遮断部分は修飾ヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシドはヌクレオシドの５’位に余分の−ＣＨ２ＯＨまたは保護−ＣＨ２ＯＨを含む。他のこのような実施態様において、３’遮断部分は修飾ヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシドはヌクレオシドの５’位に余分の−ＣＨ２ＮＨ２または保護−ＣＨ２ＮＨ２を含む。ある実施態様において、方法は、さらに、例えば、フッ素剤または塩基を含む水溶液中での、化学反応における３’遮断部分の除去を含む。
【００１９】
本発明のある実施態様は、固定化された複数の第一鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体に関し、各第一鎖ポリヌクレオチドはパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含み、ここで、複数の第一鎖ポリヌクレオチドはその５’末端で固体支持体に固定化される。ある実施態様において、固体支持体は、さらに固定化された複数の第二鎖ポリヌクレオチドを含み、各第二鎖ポリヌクレオチドは第二開裂部位を含み、ここで、複数の第二鎖ポリヌクレオチドはその５’末端で固体支持体に固定化される。ある実施態様において、パラジウム錯体はパラジウム(０)錯体である。ある実施態様において、第一開裂部位はアリル官能基を含む。ある実施態様において、第一開裂部位はアリルｄＴを含む。あるさらなる実施態様において、第一開裂部位は、化学開裂後開裂固定化第一鎖に残るホスフェート部分をさらに含む。ある実施態様において、ホスフェート部分は式(Ｉ)の構造を含む。ある実施態様において、第二開裂部位は、化学開裂、光開裂、酵素開裂またはこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂され得る。ある実施態様において、第二開裂部位は化学開裂反応により開裂される。このような実施態様のある場合において、第二開裂部位は、下記式(VIII)または(VIIIａ)のジオールリンカーまたは式(Ｘ)のアゾベンゼンリンカーを含み得る。
【００２０】
本発明はまた修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドおよびこのような化合物を製造する方法に関する。ある態様において、修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドは、式(II)：
【化２】
2021500003.tif 000004
〔式中、ＲはＨ、ＯＨまたはＯＰＧであり；Ｒ１はＨまたはＰＧであり；Ｒ２はＨ、ＰＧであるかまたは−ＯＲ２はホスフェート基であり；ＰＧはヒドロキシル保護基であり；塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を含む。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、−ＰＯ４−)。ある態様において、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは式(IIａ)：
【化３】
2021500003.tif 000005
の構造を有する。
【００２１】
ある態様において、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、式(II)の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドがオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに取り込まれ、ここで、アリル修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドの３’酸素が他方のヌクレオチドの５’末端に共有結合しているとき(構造は示していない)、式(II’)：
【化４】
2021500003.tif 000006
の構造を含む。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、−ＰＯ４−)。
【００２２】
他の態様において、オリゴヌクレオチドはアリルヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み、ここで、オリゴヌクレオチドは式(III)：
【化５】
2021500003.tif 000007
〔式中、各塩基は独立してアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の化合物であり；そしてオリゴヌクレオチドは所望により固体支持体に結合している。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、−ＰＯ４−)。
【００２３】
ある態様において、オリゴヌクレオチドの５’末端(アスタリスクの位置)は固体支持体に結合する。
【００２４】
さらに本発明は、アリルヌクレオチドをポリヌクレオチドに取り込むための化学反応剤に関し、ここで、該化学反応剤は式(IV)：
【化６】
2021500003.tif 000008
〔式中、ＰＧはＨまたはヒドロキシル保護基であり；そして塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の化合物である。
【００２５】
ある態様において、ＰＧは、弱酸性条件下で開裂可能な保護基である。ある態様において、ＰＧはトリチルまたはジメトキシトリチル(ＤＭＴ)である。
【００２６】
ある態様において、式(IV)の化合物を製造する方法は、式Ａ：
【化７】
2021500003.tif 000009
の化合物とビニルグリニャール試薬(例えばビニルＭｇＣｌまたはビニルＭｇＢｒ)を、所望により室温で反応させて、式Ｂ：
【化８】
2021500003.tif 000010
の化合物を形成することを含む。
【００２７】
ある態様において、方法は、式Ｃ
【化９】
2021500003.tif 000011
の化合物(所望によりフィッツナー・モファット酸化によりまたは１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)またはＮ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)、ジクロロ酢酸(ＤＣＡ)およびＤＭＳＯを使用して)を酸化して、式Ａの化合物を産生することを含む。
【００２８】
ある態様において、方法は、式Ｄ：
【化１０】
2021500003.tif 000012
の化合物とＴＢＤＰＳＣｌ(ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロライド)を、ワンポット法でビス−保護中間体を単離することなく塩基(例えばイミダゾール)、続いてＰＴＳＡ(ｐ−トルエンスルホン酸)などの弱酸存在下で反応させて、式Ｃの化合物を産生することを含む。
【００２９】
他の態様において、ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、式(Ｉ)：
【化１１】
2021500003.tif 000013
〔式中、Ｒ１は−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａまたは−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３であり；ＲａはＣ１−４アルキル、ｔｅｒｔ−ブチル、アリル、ベンジルまたは９−フルオレニルメチルであり；各Ｒｂは独立してＣ１−４アルキルおよびフェニルからなる群から選択され；そしてＲ２はＨ、Ｃ１−４アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造の３’遮断部分を含む。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、ＰＯ４−)。
【００３０】
他の態様において、３’ホスフェート修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは式(Ｖ)：
【化１２】
2021500003.tif 000014
〔式中、Ｒ１は−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａまたは−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３であり；
ＲａはＣ１−４アルキル、ｔｅｒｔ−ブチル、アリル、ベンジルまたは９−フルオレニルメチルであり；
各Ｒｂは独立してＣ１−４アルキルおよびフェニルからなる群から選択され；そして
塩基は所望により保護されているアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を含む。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、ＰＯ４−)。ある実施態様において、式(Ｖ)の化合物は、式(Ｖ’)の化合物から産生され得る。
【化１３】
2021500003.tif 000015
〔式中、ＸはＯまたはＮＨであり；Ｒ１’は保護ＯＨ(すなわち、−Ｏ−ＴＯＭ、−Ｏ−トリチル、−Ｏ−ＤＭＴ、−ＯＴＭＳ、−Ｏ−ＴＢＤＭＳ、−Ｏ−ＴＩＰＳ、−ＯＢｚ)または保護ＮＨ２(すなわち、−ＮＨ−Ｂｏｃ、−ＮＨ−Ｆｍｏｃ、−ＮＨ−ＣＢｚ、−ＮＨ−Ａｌｌｏｃ)であり；そしてＲ１はＮＨ２またはＯＨである。〕
【００３１】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは式(Ｖ)の３’ホスフェート修飾ヌクレオチドを含み、ここで、オリゴヌクレオチドは式(VI)：
【化１４】
2021500003.tif 000016
〔式中、Ｒ１は−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａまたは−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３であり；
ＲａはＣ１−４アルキル、ｔｅｒｔ−ブチル、アリル、ベンジルまたは９−フルオレニルメチルであり；
各Ｒｂは独立してＣ１−４アルキルおよびフェニルからなる群から選択され；
各塩基は独立して所望により保護されているアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の化合物である。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは所望により固体支持体に結合している。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、ＰＯ４−)。ある実施態様において、式(VI)の化合物は式(VI’)の化合物から製造され得る。
【化１５】
2021500003.tif 000017
〔式中、ＸはＯまたはＮＨであり；Ｒ１’は保護ＯＨ(すなわち、−Ｏ−ＴＯＭ、−Ｏ−トリチル、−Ｏ−ＤＭＴ、−ＯＴＭＳ、−Ｏ−ＴＢＤＭＳ、−Ｏ−ＴＩＰＳ、−ＯＢｚ,)または保護ＮＨ２(すなわち、−ＮＨ−Ｂｏｃ、−ＮＨ−Ｆｍｏｃ、−ＮＨ−ＣＢｚ、−ＮＨ−Ａｌｌｏｃ)であり；そしてＲ１はＮＨ２またはＯＨである。〕
【００３２】
式(Ｖ)または(VI)のある態様において、Ｒ１は−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａである。ある態様において、Ｒａは９−フルオレニルメチル、ベンジルまたはアリルである。ある態様において、Ｒ１は−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３である。ある態様において、各Ｒｂはイソプロピルである。ある態様において、各Ｒｂは独立してメチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチルまたはフェニルである。
【００３３】
本発明はまた３’ホスフェート修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチドに導入するための化学反応剤に関し、ここで、該化学反応剤は式(VII)：
【化１６】
2021500003.tif 000018
〔式中、Ｒ１は上に定義したとおりであり；ＰＧはＨまたはヒドロキシル保護基であり；そして塩基は所望により保護されているアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の化合物である。
【００３４】
式(VII)のある態様において、Ｒ１は−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａである。ある態様において、Ｒａは９−フルオレニルメチル、ベンジルまたはアリルである。ある態様において、Ｒ１は−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３である。ある態様において、各Ｒｂはイソプロピルである。ある態様において、各Ｒｂは独立してメチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチルまたはフェニルである。
【００３５】
本発明はまたポリヌクレオチドへの取り込みのためのジオールリンカーを製造する方法に関する。ある態様において、ジオールリンカーは、米国特許８,７１５,９６６に記載のジオールリンカーである。ある態様において、ジオールリンカーは、式(VIII)：
【化１７】
2021500003.tif 000019
〔式中、ｒは２、３、４、５または６であり；
ｓは２、３、４、５または６であり；
「ａ」酸素は第一ヌクレオチドの３’ヒドロキシル酸素であり；そして
「ｂ」酸素は第二ヌクレオチドの５’ヒドロキシル酸素である。〕
の構造を有する。
【００３６】
ある態様において、ジオールリンカーは式(VIIIａ)：
【化１８】
2021500003.tif 000020
〔式中、「ａ」および「ｂ」は上に定義したとおりである。〕
の構造を有する。
【００３７】
本発明は、式(VIII)または(VIIIａ)のリンカーのポリヌクレオチドへの取り込みのための化学反応剤を製造する方法に関し、ここで、該化学反応剤は式(IX)：
【化１９】
2021500003.tif 000021
〔式中、ｒは２、３、４、５または６(ある態様において、ｒは５)であり；
ｓは２、３、４、５または６(ある態様において、ｓは３)であり；そして
ＰＧは弱酸性条件下で除去可能な保護基である(例えば、トリチルまたはジメトキシトリチル)。〕
の化合物である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】イルミナの合成時解読(Sequencing-by-Synthesis)(ＳＢＳ)化学のワークフローの実施態様を図示する。
【００３９】
【図２Ａ】Ｐｄ(０)錯体で処理前後の非パターン化高プライマー密度フローセル(flow cell)表面のＴｙｐｈｏｏｎ画像を図示し、ここで、フローセル表面はアリル修飾プライマーが移植されている。
【００４０】
【図２Ｂ】図２Ａに記載するＰｄ(０)処理後の、アリル官能基がない対照プライマーが移植されたフローセル表面と比較したプライマー密度の変化を示す棒グラフである。
【００４１】
【図３Ａ】アリル修飾Ｐ５プライマーおよび標準Ｐ７プライマーを移植した非パターン化高プライマー密度フローセル(チャネル１〜４)と、標準Ｐ５／Ｐ７プライマー移植フローセル(チャネル５〜８)を比較した、ＴＥＴ色素表面蛍光ＱＣアッセイ(ＴＥＴ−ＱＣ)結果を示す棒グラフである。
【００４２】
【図３Ｂ】図３Ａに記載するＴＥＴ−ＱＣ後のフローセル表面のＴｙｐｈｏｏｎ画像を図示する。
【００４３】
【図４】標準フローセルおよび新規タイプのフローセルを使用したＭｉＳｅｑ(登録商標)２チャネル装置での配列決定データの％誤り率を図示する。
【００４４】
【図５Ａ】１〜１０当量ＴＨＰ(１０mg／mL、各条件Ｎ＝４)存在下Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２から単離した製剤の、(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２(６mM)、ＴＨＰ(６０mM)およびアスコルビン酸ナトリウム(６mM)(Ｎ＝２)の製剤と比較したＰ１５開裂活性を図示する。
【００４５】
【図５Ｂ】[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)２]Ｃｌおよび１当量以上のＴＨＰ(１２mM  Ｐｄ、各条件Ｎ＝２)を含む製剤の、(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２(６mM)、ＴＨＰ(６０mM)およびアスコルビン酸ナトリウム(６mM)(Ｎ＝２)の製剤と比較したＰ１５開裂活性を図示する。
【００４６】
【図６Ａ】in situで産生したＰｄ(０)反応剤と比較した、１０mM  Ｐｄ(ＴＨＭ)４に対するＮｏｖａＳｅｑTM平均リード１強度を示す。
【００４７】
【図６Ｂ】in situで産生したＰｄ(０)反応剤と比較した、１０mM  Ｐｄ(ＴＨＭ)４に対するＮｏｖａＳｅｑTM平均ＰｈｉＸ誤り率を示す。
【００４８】
【図７】(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２(６mM)、ＴＨＰ(６０mM)およびアスコルビン酸ナトリウム(６mM)の製剤と比較した、Ｐｄ(ＴＨＰ)２−４(１０mg／mL)のＰ１５開裂活性を示す。
【００４９】
【図８】Ｐｄ−ＴＨＰまたはＮｉ−ＴＨＰ処理後のＰ１５／Ｐ７プライマーを移植したフローセルの蛍光強度の棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
実施態様の詳細な記載
非酵素化学線形化ストラテジーは、各配列解読に先立ち架橋二本鎖ポリヌクレオチド構造を開裂するための魅力的な代替手段である。特に、化学物質は長期室温で保存でき、酵素と比較して比較的安価である。本発明は、配列決定用鋳型の産生のために固体支持体に固定化された二本鎖ポリヌクレオチドのクラスターを化学的に線形化する方法に関する。各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含む。第一鎖は、固体支持体に固定化された第一伸長プライマーの伸長により産生され、第二鎖は、固体支持体に固定化された第二伸長プライマーの伸長により産生される。第一および第二鎖の各々は開裂部位を含む。ある実施態様において、第一鎖は、パラジウム錯体またはニッケル錯体、例えば、Ｐｄ(０)錯体またはＮｉ(０)錯体により開裂され得る開裂部位を含む。特定の実施態様において、開裂部位は第一鎖の第一伸長プライマー部分に位置する。さらなる実施態様において、開裂部位は、アリル官能基を有するチミンヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログを含む。ある実施態様において、第二鎖は、化学反応剤、例えば、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４により開裂され得るアゾベンゼンリンカーを含む開裂部位を含む。あるいは、第二鎖は、過ヨウ素酸、例えば、ＮａＩＯ４により開裂され得る開裂部位を含む。ここに記載する方法を、Illumina(San Diego, CA)のＨｉＳｅｑ(登録商標)、ＭｉＳｅｑ(登録商標)またはＮｅｘｔＳｅｑ(登録商標)システムなどのシステムで合成による配列決定(ＳＢＳ)反応の一部として使用し得る。
【００５１】
図１は、イルミナＳＢＳ化学の標準ワークフローの実施態様を記載する。先ず、固体支持体表面に固定化された複数のＰ５／Ｐ７プライマーを含む固体支持体を用意する。Ｐ５およびＰ７プライマーの各々は配列内に開裂部位を有する。ある実施態様において、Ｐ５プライマーの開裂部位はデオキシウリジン(Ｕ)である。ある実施態様において、Ｐ７プライマーの開裂部位は８−オキソ−グアニンヌクレオチド(ｏｘｏ−Ｇ)である。配列決定する一組の標的ＤＮＡ分子が固定化Ｐ５／Ｐ７プライマーとハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション後、元の標的ＤＮＡ分子が除去され、Ｐ５／Ｐ７プライマーを含む伸長ポリヌクレオチドの相補コピーのみが残される。この工程は「シーディング」工程としても知られる。次いで、伸長Ｐ５／Ｐ７ポリヌクレオチドが「架橋増幅」と称される手順により増幅され、両鎖が５’末端で固体支持体に結合した二本鎖クラスターが形成される。「クラスター化」工程後、第一線形化が、Ｐ５プライマーを含む伸長ポリヌクレオチドの一部を除去するために実施される。ある実施態様において、このような除去は、Ｐ５プライマーのＵ位置を開裂するための酵素ＵＳＥＲを使用する酵素開裂反応を促進する。第一ラウンドのＳＢＳ(リード１)後、再び二本鎖ポリヌクレオチドを形成させるための再合成を実施する。次いで、第二線形化が、Ｐ７プライマーを含む伸長ポリヌクレオチドの一部を除去するために実施される。ある実施態様において、このような除去はＰ７プライマーのｏｘｏ−Ｇ位置を開裂するための酵素ＦＰＧを使用する酵素開裂反応を促進する。次いで、第二ラウンドのＳＢＳが実施され(リード２)、標的ＤＮＡが配列決定される。
【００５２】
Ｐ５およびＰ７プライマーが、ＨｉＳｅｑ(登録商標)、ＭｉＳｅｑ(登録商標)、ＮｅｘｔＳｅｑ(登録商標)およびGenome Analyzer(登録商標)プラットフォームでの配列決定のためにIllumina, Inc.から市販されているフローセルの表面で使用される。プライマー配列は米国特許公開２０１１／００５９８６５Ａ１に記載され、これは、引用により全体として本明細書に包含させる。
【００５３】
ペアエンド配列決定のための標準Ｐ５およびＰ７プライマー配列は次のものを含む。
Ｐ５：ペアエンド  ５’→３’
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡＣ(配列番号１)
Ｐ７：ペアエンド  ５’→３’
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ＊ＡＴ(配列番号２)
ここで、Ｇ＊は８−オキソ−グアニンである。
【００５４】
所望により、Ｐ５およびＰ７プライマーの一方または両方はポリＴテイルを含み得る。ポリＴテイルは、一般に上記配列の５’末端に位置するが、ある場合、３’末端に位置し得る。ポリＴ配列は、例えば、２〜２０の任意の数のＴヌクレオチドを含み得る。
【００５５】
ポリＴスペーサーと共にＰＡＺＡＭ被覆フローセルで使用する標準Ｐ５およびＰ７プライマー配列は次のものを含む。
ポリＴスペーサーを伴うＰ５プライマー：
５’−アルキン−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡＣ(配列番号３)
ポリＴスペーサーを伴うＰ７プライマー：
５’−アルキン−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ＊ＡＴ(配列番号４)
ここで、Ｇ＊は８−オキソ−グアニンである。
さらなるプライマー配列は、シングルリードＳＢＳのための一組のＰ５およびＰ７プライマーを含む。
Ｐ５：シングルリード：５’→３’
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ(配列番号７)
Ｐ７：シングルリード５’→３’
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ(配列番号８)
【００５６】
標準Ｐ５／Ｐ７プライマーまたはオリゴが、例えば、Ｐｄ錯体またはＮｉ錯体による化学開裂を受けることができる第一または第二開裂部位を取り込むために修飾されるとき、ここで使用する、Ｐ５／Ｐ７プライマーの修飾は、Ｐ５／Ｐ７配列における既存のヌクレオチド(またはヌクレオシド)の、異なる化学成分、例えば、部位特異的化学開裂を可能とする特定の官能基を有する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログでの置き換えまたは置換をいう。修飾はまた既存のＰ５／Ｐ７配列への新規化学成分の挿入もいうことができ、ここで、該新規化学成分は部位特異的化学開裂を受けることができる。ある実施態様において、修飾Ｐ５／Ｐ７プライマーは、それぞれ、次のものを含むＰ１５／Ｐ１７プライマーをいう。
Ｐ１５プライマー５’→３’
５’−アルキン−ＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＸＣＴＡＣＡＣ(配列番号５)
ここで、スキーム１に示すとおりＸ＝アリルＴヌクレオシド。
Ｐ１７プライマー５’→３’
５’−アルキン−ＴＴＴＴＴＴＹＹＹＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ(配列番号６)
ここで、Ｙは、例えば、引用により全体として本明細書に明示的に包含させる米国公開２０１２／０３０９６３４に開示の過ヨウ素酸のような反応剤での酸化により、化学開裂に付されるジオールリンカーである。ある実施態様において、ジオールリンカーは、ここに記載する式(VIII)または(VIIIａ)を含む。
【００５７】
定義
ここで使用する見出しは構成目的のためのみであり、記載する主題を限定すると解釈してはならない。
【００５８】
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。用語「含む」ならびに他の形態、例えば「含み」、「包含する」および「包含し」の使用は、限定的ではない。用語「有する」ならびに他の形態、例えば「有し」、「含有する」および「含有し」は、限定的ではない。本明細書で使用する限り、仮定句であれ、特許請求の範囲の主文であれ、用語「含む」および「含み」は、制限のない意味を有するとして解釈される。すなわち、上記用語は、用語「少なくとも有する」または「少なくとも含む」と同義と解釈される。例えば、方法の文脈で使用するとき、用語「含む」は、方法が少なくともその言及する工程を含むが、さらなる工程も含み得ることを意味する。化合物、組成物またはデバイスについて使用するとき、用語「含む」は、化合物、組成物またはデバイスが少なくともその言及する特性または成分を含むが、さらなる特性または成分も含み得ることを意味する。
【００５９】
ここで使用する、一般的有機略語は次のとおり定義される：
【表１】
2021500003.tif 000022
【表２】
2021500003.tif 000023
【００６０】
ここで使用する、用語「共有結合的に結合」または「共有結合」は、原子間の電子対の共有により特徴づけられる、化学結合の形成をいう。例えば、共有結合的に結合ポリマーコーティングは、他の手段、例えば、接着または静電気的相互作用による表面への結合と比較して、基質の官能化表面と化学結合を形成するポリマーコーティングをいう。
【００６１】
ここで使用する、用語「伸長プライマー」は、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、ここで、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、標的一本鎖核酸分子の配列と特異的に結合できる。ハイブリダイゼーション手順後、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、標的核酸分子と相補的である配列を含むように伸長される。幾つかの例において、用語「伸長プライマー」は「増幅プライマー」と相互交換可能に使用される。
【００６２】
ここで使用する、用語「核酸」および「ヌクレオチド」は、当分野でのそれらの使用に一致し、かつ天然に存在する種またはその機能的アナログを含むことを意図する。特に有用な核酸の機能的アナログは、核酸と配列特異様式でハイブリダイズできるかまたは特定のヌクレオチド配列の複製の鋳型として使用され得る。天然に存在する核酸は、一般にホスホジエステル結合を含む主鎖を有する。アナログ構造は、当分野で知られる多様なもののいずれかを含む、代替の主鎖結合を有し得る。天然に存在する核酸は、一般にデオキシリボース糖(例えば、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)に見られる)またはリボース糖(例えば、リボ核酸(ＲＮＡ)に見られる)を有する。核酸は、これらの糖部分の当分野で知られる多様なアナログの何れかを有するヌクレオチドを含み得る。核酸は天然または非天然ヌクレオチドを含み得る。これに関し、天然デオキシリボ核酸はアデニン、チミン、シトシンまたはグアニンからなる群から選択される１以上の塩基を有することができ、リボ核酸はウラシル、アデニン、シトシンまたはグアニンからなる群から選択される１以上の塩基を有することができる。核酸またはヌクレオチドに含まれ得る有用な非天然塩基は当分野で知られる。用語「プローブ」または「標的」は、核酸と関連して使用するとき、ここに示す方法または組成物における核酸についての語義的定義を意図し、他に明示されているものを超えて、核酸の構造または機能を必ずしも制限しない。用語「プローブ」および「標的」は、タンパク質、小分子、細胞などのような他の試験対象にも同様に適用され得る。
【００６３】
ここで使用する、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ(例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ)、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)、合成オリゴヌクレオチドおよび合成核酸アナログを含む核酸全般をいう。ポリヌクレオチドは、天然または非天然塩基またはこれらの組み合わせおよび天然または非天然主鎖結合、例えば、ホスホロチオエート、ＰＮＡまたは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡまたはこれらの組み合わせを含み得る。幾つかの例において、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、同義に使用される。
【００６４】
ここで使用する用語「開裂部位」は、ポリヌクレオチドの一部が開裂反応により除去され得る部分であるポリヌクレオチド配列の位置をいう。開裂部位の位置は、好ましくは予め決定されており、開裂位置が前もって分かっていない無作為開裂とは異なって、開裂位置が前もって決定されていることを意味する。
【００６５】
ここで使用する、用語「固体支持体」は、水性液体に不溶性である強固な基質をいう。基質は非多孔性でも、多孔性でもよい。基質は、所望により液体を取り込むことができるが(例えば、多孔性により)、一般に基質が液体を取り込んだときに実質的に膨潤せず、液体を乾燥により除去したときに実質的に収縮しない程度に十分強固である。非多孔性固体支持体は、一般に液体またはガス不透過性である。固体支持体の例は、ガラスおよび修飾または官能化ガラス、プラスチック(例えば、アクリール樹脂、ポリスチレンおよびスチレンと他の物質のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロンＴＭ、環状オレフィン、ポリイミドなど)、ナイロン、セラミクス、樹脂、ゼオノア、シリカまたはシリコンおよび修飾シリコンを含むシリカ−ベースの物質、炭素、金属、無機ガラス、光ファイバ束およびポリマーを含むが、これらに限定されない。幾つかの実施態様のための特に有用な固体支持体は、フローセルの構成物であるかまたはフローセル装置内にある。固体支持体は、平面表面(例えば、フローセル)または非平面表面(例えば、ビーズ)を有し得る。
【００６６】
置換基がジラジカル(すなわち、分子の残りへの結合の２点を有する)として記載されている限り、置換基は、特に断らない限り任意の方向の配置で結合し得る。それ故に、例えば、−ＡＥ−または
【化２０】
2021500003.tif 000024
として記載される置換基は、Ａが分子の左端結合点に結合するように配置されている置換基ならびにＡが分子の右端結合点に結合するように配置されている場合を含む。
【００６７】
パラジウム(Ｐｄ)またはニッケル(Ｎｉ)による第一化学線形化の方法
本発明のある実施態様は、複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、ここで、各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含むものであり、ここで、第一鎖および第二鎖は、各々その５’末端で固体支持体に固定化されており、そして、各第一鎖は開裂反応剤の存在下で化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含み；二本鎖ポリヌクレオチドと開裂反応剤を接触させ、それにより第一開裂部位で１以上の第一鎖を開裂し、１以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し；そして固体支持体から開裂第一核酸を除去することを含む、方法に関する。ある態様において、開裂部位はＰｄ錯体またはＮｉ錯体存在下、開裂を受け得る。ある態様において、開裂反応剤はＰｄ錯体またはＮｉ錯体の水溶液である。ある態様において、開裂反応剤はin situで調製される。
【００６８】
ここに記載するＰｄ／Ｎｉ線形化方法のある実施態様において、各第一鎖は固体支持体に固定化された第一伸長プライマーから伸長する。このような実施態様のある場合において、第一伸長プライマーは、ここに記載するＰ５もしくはＰ７配列またはＰ５もしくはＰ７に相補的な配列であるヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、第一伸長プライマーはＰ５ヌクレオチド配列(配列番号１)を含む。さらなる実施態様において、第一伸長プライマーはポリＴスペーサーＰ５ヌクレオチド配列(配列番号３)を含む。ある実施態様において、第一伸長プライマーはＰ５プライマーである。さらなる実施態様において、第一伸長プライマーはポリＴスペーサーＰ５プライマーである。さらなる実施態様において、第一伸長プライマーは、ここに記載するＰ５もしくはＰ７配列またはＰ５もしくはＰ７に相補的である配列であるヌクレオチド配列を含み、ここで、配列の１ヌクレオチドはパラジウム錯体存在下での開裂に感受性である修飾ヌクレオチドに置き換えられている。ある態様において、第一伸長プライマーは、ここに記載するＰ１５のヌクレオチド配列(配列番号５)を含む。
【００６９】
ここに記載するＰｄ／Ｎｉ線形化方法のある実施態様において、第一伸長プライマーは第一開裂部位を含む。あるさらなる実施態様において、第一開裂部位は、例えばパラジウム錯体による化学開裂を受けることができる修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは式(II)：
【化２１】
2021500003.tif 000025
〔式中、ＲはＨ、ＯＨまたはＯＰＧであり；Ｒ１はＨまたはＰＧであり；Ｒ２はＨ、ＰＧであるかまたは−ＯＲ２はホスフェート基であり；ＰＧはヒドロキシル保護基であり；塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を有する。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、−ＰＯ４−)。ある態様において、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは式(IIａ)：
【化２２】
2021500003.tif 000026
の構造を有する。
【００７０】
ある実施態様において、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド部分を取り込む第一開裂部位は、式(II’)
【化２３】
2021500003.tif 000027
の構造を有し、ここで、アリル修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドの３’酸素が他方のヌクレオチドの５’末端に共有結合している(構造は示していない)。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、−ＰＯ４−)。
【００７１】
あるさらなる実施態様において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは検出可能標識、例えば、蛍光標識でさらに標識され得る。ある実施態様において、修飾ヌクレオチドはヌクレオチドまたはヌクレオシドの５’炭素にビニル置換基を含み、そうして５’ヒドロキシル基に関してアリル部分を形成する。ある実施態様において、ジヌクレオチド単位がアリルホスフェート部分を伴う開裂部位を含むように、５’ヒドロキシル基は第二ヌクレオチドの３’ホスフェートに接続される。ある実施態様において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、チミン(Ｔ)ヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログである。さらなる実施態様において、３’ヒドロキシル保護(または遮断)基、例えば、ホスフェート部分(式(II’)に示す)は、第一鎖の化学開裂後、開裂固定化第一鎖に残る。このような実施態様のある場合において、第二ヌクレオチドの３’ホスフェート部分は修飾ヌクレオシドアナログの５’−炭素位置に共有結合する(すなわち、ホスフェート基は修飾ヌクレオチドの５’ヒドロキシルを含む)。ある実施態様において、開裂部位は第一伸長プライマーの３’末端付近、例えば、第一伸長プライマーの３’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド距離内に位置する。ある他の実施態様において、開裂部位は第一伸長プライマーの５’末端付近、例えば、第一伸長プライマーの５’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド距離内に位置する。ある場合、効率的ＤＮＡ再合成を確実にするために、開裂部位は、好ましくは第一プライマーの３’末端に向かって、例えば、２〜８または３〜７または４〜６ヌクレオチド距離内に位置する。ある実施態様において、第一伸長プライマーはＰ５プライマーであり、第一開裂部位はＰ５プライマー配列に位置する(例えば、修飾ヌクレオチドは、１ヌクレオチド付加または置き換えにより、Ｐ５プライマー配列に取り込まれる)。それ故に、ここに開示するＰ５配列(配列番号１または配列番号３)は、Ｐｄ／Ｎｉ錯体による化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含むように修飾され、そうして修飾Ｐ５プライマーが形成される。ある実施態様において、修飾Ｐ５プライマーはここに開示するＰ１５プライマー(配列番号５)を含むかまたはＰ１５プライマーである。
【００７２】
パラジウム反応剤
ここに記載するＰｄ線形化方法のある実施態様において、化学線形化方法に使用するＰｄ錯体は水可溶性である.このような実施態様のある場合において、Ｐｄ錯体はＰｄ(０)錯体である。幾つかの例において、Ｐｄ(０)錯体を、アルケン、アルコール、アミン、ホスフィンまたは金属ハイドライドのような反応剤によるＰｄ(II)錯体の還元によりin situ産生し得る。適当なパラジウム源は、Ｎａ２ＰｄＣｌ４、(ＰｄＣｌ(Ｃ３Ｈ５))２、[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)]Ｃｌ、[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)２]Ｃｌ、Ｐｄ(ＯＡｃ)２、Ｐｄ(Ｐｈ３)４、Ｐｄ(ｄｂａ)２およびＰｄ(ＴＦＡ)２を含む。このような実施態様のある場合において、Ｐｄ(０)錯体は、Ｎａ２ＰｄＣｌ４からin situで産生される。他の実施態様において、パラジウム源はアリルパラジウム(II)クロライド二量体[(ＰｄＣｌ(Ｃ３Ｈ５))２]である。ある実施態様において、Ｐｄ(０)錯体は、Ｐｄ(II)錯体とホスフィンの混合により水溶液中で産生される。適当なホスフィンは、水可溶性ホスフィン、例えばトリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(ＴＨＰ)、トリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン(ＴＨＭ)、１,３,５−トリアザ−７−ホスファアダマンタン(ＰＴＡ)、ビス(ｐ−スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物カリウム塩、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(ＴＣＥＰ)およびトリフェニルホスフィン−３,３’,３’’−トリスルホン酸三ナトリウム塩を含む。
【００７３】
ある実施態様において、Ｐｄ(０)は、in situでのＰｄ(II)錯体[(ＰｄＣｌ(Ｃ３Ｈ５))２]とＴＨＰの混合により製造される。Ｐｄ(II)錯体とＴＨＰのモル比は、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９または１：１０であり得る。あるさらなる実施態様において、アスコルビン酸またはその塩(例えば、アスコルビン酸ナトリウム)などの１以上の還元剤が添加され得る。
【００７４】
ある実施態様において、Ｐｄ(０)は、[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)]Ｃｌ、[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)２]ＣｌなどのＰｄ(II)前触媒とさらなるＴＨＰの混合により製造される。[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)]Ｃｌおよび[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)２]Ｃｌを、(ＰｄＣｌ(Ｃ３Ｈ５))２と１〜５当量のＴＨＰを反応させることにより製造でき、それらを化学線形化反応への使用前に単離し得る。
【００７５】
ある他の実施態様において、Ｐｄ(０)錯体はＰｄ(ＴＨＭ)４、Ｐｄ(ＴＨＰ)２、Ｐｄ(ＴＨＰ)３またはＰＤ(ＴＨＰ)４またはこれらの組み合わせである。
【００７６】
ニッケル反応剤
ここに記載するＮｉ線形化方法のある実施態様において、化学線形化方法において使用するＮｉ錯体は水可溶性である。このような実施態様のある場合において、Ｎｉ錯体はＮｉ(０)錯体である。幾つかの例において、Ｎｉ錯体は、Ｎｉ(II)化合物のアルケン、アルコール、アミン、ホスフィンまたは金属ハイドライドのような反応剤での還元によりin situで産生され得る。ある実施態様において、Ｎｉ(II)化合物はＮｉＣｌ２である。適当なホスフィンは、トリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(ＴＨＰ)、トリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン(ＴＨＭ)、１,３,５−トリアザ−７−ホスファアダマンタン(ＰＴＡ)、ビス(ｐ−スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物カリウム塩、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(ＴＣＥＰ)およびトリフェニルホスフィン−３,３’,３’’−トリスルホン酸三ナトリウム塩などの水可溶性ホスフィンを含む。ある実施態様において、Ｎｉ錯体は、ＮｉＣｌ２と１〜１０当量のＴＨＰの混合により製造される。
【００７７】
本発明のある実施態様は、複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含むものであり、ここで、各第一鎖は固体支持体に固定化された修飾Ｐ５プライマーから伸長し、各第二鎖は固体支持体に固定化されたＰ７プライマーから伸長し、第一鎖および第二鎖両者はその５’末端で固体支持体に固定化され、ここで、各修飾Ｐ５プライマーはＰｄ(０)錯体による化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含み；二本鎖ポリヌクレオチドとＰｄ(０)錯体の水溶液を接触させ、それにより第一開裂部位で１以上の第一鎖を開裂し、１以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し；そして固体支持体から開裂第一核酸を除去することを含む、方法に関する。ある実施態様において、第一開裂部位は、アリル官能基を有する修飾Ｔヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。開裂部位は、さらに３’遮断部分、例えば、ホスフェート部分を含んでよく、これは、開裂固定化第一鎖の３’−ＯＨを遮断するために、Ｐｄ開裂反応後第一鎖に残る。ある実施態様において、３’遮断部分はホスフェート基を含む修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み、これは、化学反応または酵素反応により脱保護され得る。ある実施態様において、修飾Ｐ５プライマーはＰ１５を含むかまたはＰ１５である。
【００７８】
３’−脱保護
本発明のある実施態様は、オリゴヌクレオチドから３’末端保護基を除去する方法であって、５’末端で固定化された複数のオリゴヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、ここで、オリゴヌクレオチドは各々ここに記載する式(Ｉ)の構造を有する３’末端保護基を含み；そして、オリゴヌクレオチドと脱保護剤を接触させ、それにより、３’末端保護基を開裂して、各々遊離３’末端ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドを産生することを含む、方法に関する。３’末端修飾ホスフェート部分は、式(Ｉ)：
【化２４】
2021500003.tif 000028
〔式中、Ｒ１は−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａまたは−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３であり；ＲａはＣ１−４アルキル、ｔｅｒｔ−ブチル、アリル、ベンジルまたは９−フルオレニルメチルであり；各Ｒｂは独立してＣ１−４アルキルおよびフェニルからなる群から選択され；そしてＲ２はＨ、Ｃ１−４アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造を有する。
【００７９】
あるさらなる実施態様において、保護基は、式(Ｖ)：
【化２５】
2021500003.tif 000029
〔式中、塩基は所望により保護されているアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を含む。ある実施態様において、式(Ｉ)または(Ｖ)における１以上のホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、ＰＯ４−)。
【００８０】
式(Ｉ)または(Ｖ)のある実施態様において、Ｒ１は−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａである。ある実施態様において、Ｒａは９−フルオレニルメチル、ベンジルまたはアリルである。ある実施態様において、Ｒ１は−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３である。ある実施態様において、各Ｒｂはイソプロピルである。ある実施態様において、各Ｒｂは独立してメチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチルまたはフェニルである。
【００８１】
ある実施態様において、式(Ｉ)または(Ｖ)の修飾ホスフェート基は、フルオライド含有反応剤または塩基などの化学脱保護剤により除去され得る。非限定的例はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド(ＴＢＡＦ)、ＨＦ、ＮＨ４Ｆ、ＣｓＦ、ＮａＯＨおよびＫＯＨおよびこれらの組み合わせを含む。
【００８２】
ここに記載するＰｄ／Ｎｉ線形化方法のある実施態様において、第一線形化後、固定化第一鎖の残りの部分は非保護３’末端ヒドロキシル基を有し、方法は、さらにＰｄ／Ｎｉ開裂反応後の開裂固定化第一鎖の残りの部分の３’末端の遮断を含む。このような実施態様のある場合において、遮断は、３’ヒドロキシル保護基としての開裂固定化第一鎖の３’末端のリン酸化を含む。ある他の実施態様において、各開裂固定化第一鎖の３’末端は保護基を含む。このような実施態様のある場合において、遮断効果は、開裂固定化第一鎖の３’−ＯＨに対する遮断基として役立つ、開裂反応後開裂固定化第一鎖に残るホスフェート部分または修飾ホスフェート部分により達成され得る。ある実施態様において、修飾ホスフェート部分は、ここに記載する式(Ｉ)または(Ｖ)の構造を含む。
【００８３】
ホスフェート基または修飾ホスフェート基は、固定化第二鎖に相補的である誘導体第一鎖を産生するために、ＤＮＡ再合成前に除去される。ある実施態様において、３’末端保護基は、Ｔ４ＰＮＫなどのホスファターゼにより除去され得るホスフェート基である。ある他の実施態様において、３’末端保護基は、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド(ＴＢＡＦ)、ＨＦ、ＮＨ４Ｆ、ＣｓＦ、ＮａＯＨまたはＫＯＨまたはこれらの組み合わせなどのフルオライド含有反応剤または塩基により除去され得る式(Ｉ)または(Ｖ)の修飾ホスフェート基である。
【００８４】
第二線形化の方法
ここに記載するＰｄ／Ｎｉ線形化方法のある実施態様において、各第二鎖は固体支持体に固定化された第二伸長プライマーから伸長され、各第二鎖は第二開裂部位を含む。このような実施態様のある場合において、第二伸長プライマーは、ここに記載するＰ５もしくはＰ７配列またはＰ５もしくはＰ７に相補的である配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、第二伸長プライマーはＰ７ヌクレオチド配列(配列番号２)を含む。さらなる実施態様において、第二伸長プライマーはポリＴスペーサーＰ７ヌクレオチド配列(配列番号４)を含む。ある態様において、第二伸長プライマーは、修飾ヌクレオチドが取り込まれた(配列に３’ヒドロキシル保護基を有する塩基を付加するか配列における塩基を置き換える)Ｐ５またはＰ７であるヌクレオチド配列を含む。さらなる実施態様において、第二伸長プライマーはＰ１７プライマー(配列番号６)を含む。ある実施態様において、第二伸長プライマーはＰ７プライマーである。さらなる実施態様において、第二伸長プライマーはポリＴスペーサーＰ７プライマーである。他の実施態様において、第二伸長プライマーはＰ１７プライマーである。
【００８５】
ここに記載するＰｄ／Ｎｉ線形化方法のある実施態様において、第二伸長プライマーは第二開裂部位を含む。このような実施態様のある場合において、第二開裂部位はパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができない。ある態様において、第二開裂部位は、化学開裂、光開裂、酵素開裂またはこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂され得る。ある実施態様において、第二開裂部位は酵素開裂反応により開裂され得る。ある実施態様において、第二伸長プライマーはここに開示するＰ７プライマー(配列番号２または配列番号４)であり、第二開裂部位はｏｘｏ−Ｇである。このような実施態様のある場合において、開裂反応に使用する酵素はＦＰＧである。
【００８６】
ある他の実施態様において、第二開裂部位は化学開裂反応により開裂され得る。このような実施態様のある場合において、第二伸長プライマーは、ここに記載する方式による化学開裂に感受性である修飾ヌクレオチドを含むように修飾されたＰ７プライマーを含むかまたはＰ７プライマーである。ある実施態様において、第二伸長プライマーは、ここに開示するＰ１７プライマー(配列番号６)を含むかまたはＰ１７プライマーであり、第二開裂部位は過ヨウ素酸、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムでの処理により開裂可能な１以上のジオール結合を含む。このような実施態様のある場合において、ジオールリンカーは、式(VIII)：
【化２６】
2021500003.tif 000030
〔式中、ｒは２、３、４、５または６；
ｓは２、３、４、５または６であり；
「ａ」酸素は第一ヌクレオチドの３’ヒドロキシル酸素であり；そして
「ｂ」酸素は第二ヌクレオチドの５’ヒドロキシル酸素である。〕
の構造を含む。
【００８７】
ある実施態様において、ジオールリンカーは式(VIIIａ)：
【化２７】
2021500003.tif 000031
〔式中、「ａ」および「ｂ」は上に定義したとおりである。〕
の構造を含む。
【００８８】
ある他の実施態様において、第二開裂部位は、化学開裂剤、例えば、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４により開裂され得るアゾベンゼンリンカーを含む。このような実施態様のある場合において、アゾベンゼンリンカーは、式(Ｘ)：
【化２８】
2021500003.tif 000032
〔式中、Ｒ１はＨ、ヒドロキシルまたは保護ヒドロキシルであり；Ｒ２はＨ、Ｃ１−６アルキルまたはＣ１−６アルコキシであり；各Ｒ３およびＲ４は独立してＨ、ハロ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ５または−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ６であり；各Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、Ｃ１−６アルキルまたはＣ６−１０アリールであり；Ｘは−Ｃ(Ｏ)−、−ＣＨ２−または−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−であり；そして各ｍ１、ｍ２およびｍ３は独立して１、２、３、４、５または６である。〕
の構造を含む。ある態様において、Ｒ１はヒドロキシルである。ある他の態様において、Ｒ１は−ＯＢｚなどの保護ヒドロキシルである。ある態様において、Ｒ３は−Ｃ(Ｏ)ＯＲ５である。ある態様において、Ｒ３は−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ６である。このような態様において、Ｒ５およびＲ６は、独立してメチル、エチル、イソプロピルまたはｔ−ブチルなどのＣ１−６アルキルである。ある他の態様において、Ｒ３はＨである。ある態様において、Ｒ２はＨである。ある態様において、Ｒ４はＨである。ある態様において、Ｘは−ＣＨ２−である。ある他の態様において、Ｘは−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−である。ある態様において、ｍ１は２、３または４である。ある態様において、ｍ２は１、２または３である。ある態様において、ｍ３は１、２または３である。
【００８９】
式(Ｘ)のアゾベンゼンリンカーのある実施態様において、一つの末端酸素原子が、例えば、式(Ｘａ)または式(Ｘｂ)：
【化２９】
2021500003.tif 000033
の構造で、さらにホスフェート基に結合する。
ある態様において、「ａ」酸素は第一ヌクレオチドの３’ヒドロキシル酸素である。ある態様において、「ｂ」酸素は第二ヌクレオチドの５’ヒドロキシル酸素である。ある他の態様において、「ｂ」酸素は第一ヌクレオチドの３’ヒドロキシル酸素である。ある他の態様において、「ａ」酸素は第二ヌクレオチドの５’ヒドロキシル酸素である。
【００９０】
式(Ｘａ)または(Ｘｂ)のアゾベンゼンリンカーは、化学反応剤によりオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに取り込まれ得て、ここで、該化学反応剤は式(XIａ)または(XIｂ)：
【化３０】
2021500003.tif 000034
〔式中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｘ、ｍ１、ｍ２およびｍ３は(Ｘ)で定義され；そして
ＰＧは弱酸性条件下で除去可能な保護基(例えば、トリチルまたはジメトキシトリチル)である。〕
のホスホロアミダイト化合物である。
【００９１】
さらなる本発明の実施態様は、複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含むものであり、ここで、第一鎖および第二鎖はその５’末端で固体支持体に固定化され、ここで、各第一鎖は第一開裂部位を含み、ここで、各第二鎖はアゾベンゼンリンカーを含む第二開裂部位を含み；第一開裂部位で１以上の第一鎖を開裂し、１以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し；固体支持体から開裂第一核酸を除去し；固定化第二鎖を配列決定し；第二鎖に相補的な誘導体第一鎖を再合成し；そして第二開裂部位で１以上の第二鎖を開裂し、１以上の開裂第二核酸および開裂固定化第二鎖を産生することを含む、方法に関する。このような方法のある実施態様において、各第一鎖は固体支持体に固定化された第一伸長プライマーから伸長され、ここで、第一伸長プライマーは第一開裂部位を含む。このような方法のある実施態様において、第一開裂部位は化学開裂、光開裂、酵素開裂およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂され得て、例えば、第一開裂部位はここに記載するＰｄ／Ｎｉ方法または酵素方法(例えば、ＵＤＧ)により開裂され得る。このような実施態様のある場合において、第一伸長プライマーはＰ５、修飾Ｐ５またはＰ１５を含む。ある実施態様において、各第二鎖は固体支持体に固定化された第二伸長プライマーから伸長され、ここで、第二伸長プライマーは第二開裂部位を含む。このような実施態様のある場合において、アゾベンゼンリンカーは、ここに記載する式(Ｘ)、(Ｘａ)または(Ｘｂ)の構造を含む。ある実施態様において、アゾベンゼンリンカーはＮａ２Ｓ２Ｏ４により開裂される。ある実施態様において、固定化第二鎖の配列決定は、固定化第二鎖に相補的な標識ヌクレオチドを連続的に取り込み、標識ヌクレオチドを検出することを含む。ある実施態様において、各開裂固定化第一鎖の３’末端は、保護基、例えば、ホスフェート基またはここに記載する式(Ｉ)または(Ｖ)の構造を含む修飾ホスフェート部分を含む。保護基は、酵素反応(例えば、酵素Ｔ４ＰＮＫ)または化学脱保護、例えば、式(Ｉ)の構造または(Ｖ)を含む修飾ホスフェート部分の脱保護についてここに記載するフルオライド含有反応剤または塩基で除去され得る。ある実施態様において、方法は、さらに、固体支持体から開裂第二核酸を除去し、誘導体第一鎖を配列決定することを含む。ある実施態様において、固定化誘導体第一鎖は、固体支持体から開裂第二核酸の除去後固体支持体上に残り、開裂固定化第二鎖とハイブリダイズしたままである。
【００９２】
ここに記載する第一および第二線形化方法のある実施態様において、二本鎖ポリヌクレオチドは共有結合により固体支持体に固定化される。ある実施態様において、二本鎖ポリヌクレオチドは、固体支持体上のヒドロゲルまたはポリマーコーティングと共有結合する。ある実施態様において、ヒドロゲルまたはポリマーコーティングはＰＡＺＡＭを含む。ある実施態様において、ヒドロゲルまたはポリマーコーティングも、例えば、表面に沈着した官能化シランとの反応により、固体支持体表面に共有結合される。ある実施態様において、官能化シランはノルボルネン由来シランである。シラン化処理固体支持体上のヒドロゲルまたはポリマーコーティングおよびヒドロゲルまたはポリマー被覆固体支持体にポリヌクレオチドまたはプライマーを移植する方法の非限定的例は、米国公開２０１４／００７９９２３および２０１５／０００５４４７に開示され、これらを引用により全体として本明細書に包含させる。
【００９３】
Ｐｄ線形化のための移植固体支持体
本発明のある実施態様は、固定化された複数の第一鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体に関し、各第一鎖ポリヌクレオチドは化学開裂(例えば、ここに記載するパラジウム錯体またはニッケル錯体により)を受け得る第一開裂部位を含み、ここで、複数の第一鎖ポリヌクレオチドは５’末端で固体支持体に固定化される。
【００９４】
ここに記載する固体支持体のある実施態様において、各第一鎖は固体支持体に固定化された第一伸長プライマーを含むかまたは第一伸長プライマーから伸長する。このような実施態様のある場合において、第一伸長プライマーは、ここに記載するＰ５もしくはＰ７配列またはＰ５もしくはＰ７に相補的である配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、第一伸長プライマーはＰ５ヌクレオチド配列(配列番号１)を含む。さらなる実施態様において、第一伸長プライマーはポリＴスペーサーＰ５ヌクレオチド配列(配列番号３)を含む。ある実施態様において、第一伸長プライマーはＰ５プライマーである。さらなる実施態様において、第一伸長プライマーはポリＴスペーサーＰ５プライマーである。ある実施態様において、Ｐ５またはＰ７配列は、開裂部位の少なくとも一部を形成する修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むように、修飾される。
【００９５】
ここに記載する固体支持体のある実施態様において、第一伸長プライマーは第一開裂部位を含む。あるさらなる実施態様において、第一開裂部位は、例えばパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができる修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。このような実施態様のある場合において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドはＴヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログである。このような実施態様のある場合において、開裂部位は、アリル官能基、例えば、Ｔヌクレオシドアナログの５’−炭素位置にビニル置換を含むＴヌクレオシドアナログを含み、そうして５’ヒドロキシル基に関してアリル部分が形成される。このような実施態様のある場合において、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、ここに記載する式(II)の構造を含む。ある実施態様において、５’ヒドロキシル基は、ジヌクレオチド単位がアリルホスフェート部分を伴う開裂部位を含むように、第二ヌクレオチドの３’ホスフェートに結合される。このような実施態様のある場合において、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、ここに記載する式(II’)の構造を含む。ある実施態様において、第一伸長プライマーはＰ１５プライマーを含むかまたはＰ１５プライマーである。さらなる実施態様において、開裂部位は、第二ヌクレオチドに３’保護(または遮断)部分、例えば、ホスフェート部分も含む。遮断部分は、第一鎖の化学開裂後開裂固定化第一鎖に残る。ある実施態様において、第二ヌクレオチドの３’ホスフェート部分は修飾ヌクレオシドアナログの５’−炭素位置に共有結合する(すなわち、ホスフェート基は修飾ヌクレオチドの５’ヒドロキシルを含む)。ある実施態様において、開裂固定化第一鎖に残る遮断基はここに記載する式(Ｉ)または(Ｖ)の構造を含み、これは、フルオライド含有化合物または塩基などの化学脱保護反応剤で除去され得る。ある実施態様において、開裂固定化第一鎖に残る遮断基は、ホスファターゼ(例えば、Ｔ４ＰＮＫ)により除去され得るホスフェート基である。ある実施態様において、開裂部位は第一伸長プライマーの３’末端付近、例えば、第一伸長プライマーの３’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド距離内に位置する。ある他の実施態様において、開裂部位は第一伸長プライマーの５’末端付近、例えば、第一伸長プライマーの５’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド距離内に位置する。ある場合、効率的ＤＮＡ再合成を確実にするために、開裂部位は、好ましくは第一プライマーの３’末端に向かって、例えば、２〜８または３〜７または４〜６ヌクレオチド距離内に位置する。ある実施態様において、第一伸長プライマーはＰ５プライマーであり、第一開裂部位はＰ５プライマー配列に位置する(例えば、修飾ヌクレオチドは、１ヌクレオチド付加または置き換えにより、Ｐ５プライマー配列に取り込まれる)。それ故に、ここに開示するＰ５配列(配列番号１または配列番号３)は、Ｐｄ／Ｎｉ錯体による化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含むように修飾され、そうして修飾Ｐ５プライマーが形成される。ある実施態様において、修飾Ｐ５プライマーはここに開示するＰ１５プライマー(配列番号���)を含むかまたはＰ１５プライマーである。あるさらなる実施態様において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、さらに、検出可能標識、例えば、蛍光標識で標識され得る。検出可能標識は、完了直後、移植反応の直接定量化を可能とする。
【００９６】
ここに記載する固体支持体のある実施態様において、化学線形化方法に使用するＰｄ錯体は水可溶性である。このような実施態様のある場合において、Ｐｄ錯体はＰｄ(０)錯体である。幾つかの例において、Ｐｄ(０)錯体を、アルケン、アルコール、アミン、ホスフィンまたは金属ハイドライドのような反応剤によるＰｄ(II)錯体の還元によりin situで産生し得る。適当なパラジウム源はＮａ２ＰｄＣｌ４、(ＰｄＣｌ(Ｃ３Ｈ５))２、[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)]Ｃｌ、[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)２]Ｃｌ、Ｐｄ(Ｐｈ３)４、Ｐｄ(ＯＡｃ)２、Ｐｄ(ｄｂａ)２およびＰｄ(ＴＦＡ)２を含む。このような実施態様のある場合において、Ｐｄ(０)錯体は、Ｎａ２ＰｄＣｌ４からin situで産生される。他の実施態様において、パラジウム源はアリルパラジウム(II)クロライド二量体[(ＰｄＣｌ(Ｃ３Ｈ５))２]である。ある実施態様において、Ｐｄ(０)錯体は、Ｐｄ(II)錯体とホスフィンの混合により水溶液中で産生される。適当なホスフィンは、トリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(ＴＨＰ)、トリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン(ＴＨＭ)、１,３,５−トリアザ−７−ホスファアダマンタン(ＰＴＡ)、ビス(ｐ−スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物カリウム塩、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(ＴＣＥＰ)およびトリフェニルホスフィン−３,３’,３’’−トリスルホン酸三ナトリウム塩などの水可溶性ホスフィンを含む。ある実施態様において、Ｐｄ(０)は、in situで[(ＰｄＣｌ(Ｃ３Ｈ５))２]、[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)]Ｃｌまたは[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)２]ＣｌとＴＨＰを混合することにより産生され得る。アスコルビン酸またはその塩(例えば、アスコルビン酸ナトリウム)などの１以上の還元剤が添加され得る。ある実施態様において、Ｐｄ(０)錯体はＰｄ(ＴＨＭ)４、Ｐｄ(ＴＨＰ)２、Ｐｄ(ＴＨＰ)３またはＰＤ(ＴＨＰ)４またはこれらの組み合わせである。
【００９７】
ここに記載する固体支持体のある実施態様において、化学線形化に使用されるＮｉ錯体は水可溶性である。このような実施態様のある場合において、Ｎｉ錯体はＮｉ(０)錯体である。幾つかの例において、Ｎｉ錯体は、ここに記載するＰｄ(II)からＰｄ(０)への還元に使用するものに類似する反応剤によるＮｉ(II)化合物(例えばＮｉＣｌ２)の還元により、in situで産生され得る。ある実施態様において、Ｎｉ錯体は、ＮｉＣｌ２と１〜１０当量のＴＨＰの混合により製造される。
【００９８】
ここに記載する固体支持体のある実施態様において、固体支持体は、さらに固定化された複数の第二鎖ポリヌクレオチドを含み、各第二鎖ポリヌクレオチドは第二開裂部位を含み、ここで、複数の第二鎖ポリヌクレオチドはその５’末端で固体支持体に固定化される。このような実施態様のある場合において、各第二鎖ポリヌクレオチドは固体支持体に固定化された第二伸長プライマーを含むかまたは第二伸長プライマーから伸長する。このような実施態様のある場合において、第二伸長プライマーは、ここに記載するＰ５もしくはＰ７配列またはＰ５もしくはＰ７に相補的である配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、第二伸長プライマーはＰ７ヌクレオチド配列(配列番号２)を含む。さらなる実施態様において、第二伸長プライマーはポリＴスペーサーＰ７ヌクレオチド配列(配列番号４)を含む。他の実施態様において、第二伸長プライマーはＰ１５配列(配列番号６)を含む。ある実施態様において、第二伸長プライマーはＰ７プライマーである。さらなる実施態様において、第二伸長プライマーはポリＴスペーサーＰ７プライマーである。ある実施態様において、Ｐ７プライマーまたはポリＴスペーサーＰ７プライマーは、８−オキソ−グアニンを除去し、化学的に開裂可能なリンカー、例えば、１以上のジオール単位を挿入するために修飾される。さらに他の実施態様において、第二伸長プライマーはＰ１７プライマーである。ある実施態様において、第二伸長プライマーは第二開裂部位を含む。このような実施態様のある場合において、Ｐ５、Ｐ７またはＰ１７配列は、開裂可能リンカーを伴う修飾ヌクレオチドを含むように修飾される。あるさらなる実施態様において、第二開裂部位は第一化学線形化反応で使用されるパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができない。第二開裂部位は、化学開裂、光化学開裂、酵素開裂またはこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂され得る。ある実施態様において、第二開裂部位は酵素開裂反応により開裂され得る。このような実施態様のある場合において、第二伸長プライマーはここに開示するＰ７プライマー(配列番号２または配列番号４)であり、第二開裂部位はｏｘｏ−Ｇである。他の実施態様において、第二開裂部位は化学開裂反応により開裂され得る。例えば、第二開裂部位は、１以上の隣接ジオール結合(これは、過ヨウ素酸反応剤での処理のような酸化により開裂され得る)、ジスルフィド結合(例えば、ＤＴＴなどの還元条件下またはホスフィンの存在下開裂可能)、オルト−ニトロベンジル基(例えば、光分解により開裂可能)、アゾベンゼン結合(例えば、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４の存在下開裂可能)、アルキル−セレン結合(例えば、過酸化水素などでの酸化により開裂可能)、シリルエーテル結合(例えば、フッ化物イオン、酸または塩基により開裂可能)またはアリルカルバメート結合(例えば、パラジウム錯体存在下開裂可能)を含み得る。これらの結合は、化学開裂後少なくとも１つの遊離ヒドロキシル基を産生できる。このような実施態様のある場合において、第二伸長プライマーは、ここに開示するＰ１７プライマー(配列番号６)を含むかまたはＰ１７プライマーであり、第二開裂部位は、酸化、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムでの処理により開裂され得る１以上のジオール結合を含む。ある実施態様において、ジオールリンカーは、ここに記載する式(VIII)または(VIIIａ)の構造を含む。ある実施態様において、アゾベンゼンリンカーは、ここに記載する式(Ｘ)、(Ｘａ)または(Ｘｂ)の構造を含む。
【００９９】
本発明のある実施態様は、固定化された複数の第一鎖ポリヌクレオチドおよび複数の第二鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体に関し、各第一鎖ポリヌクレオチドは固体支持体に固定化された修飾Ｐ５プライマーから伸長し、修飾Ｐ５プライマーは第一開裂部位を含み；各第二鎖ポリヌクレオチドは固体支持体に固定化されたＰ７プライマーから伸長し、Ｐ７プライマーは第二開裂部位を含み；ここで、第一および第二鎖ポリヌクレオチドの両者はその５’末端で固体支持体に固定化され、ここで、第一開裂部位はＰｄ(０)錯体またはＮｉ(０)錯体などのＰｄ錯体またはＮｉ錯体による化学開裂を受けることができる。ある実施態様において、第一開裂部位は、ここに記載するとおりアリル官能基を有する修飾Ｔヌクレオシドを含む。開裂部位は、開裂固定化第一鎖ポリヌクレオチドの３’−ＯＨを遮断するために、Ｐｄ／Ｎｉ開裂反応後に第一鎖ポリヌクレオチドに残る３’末端遮断部分として役立ち得る部分、例えば、ホスフェートまたは修飾ホスフェート部分をさらに含み得る。
【０１００】
ここに記載する固体支持体のある実施態様において、第一および第二鎖ポリヌクレオチドは、固体支持体表面上のポリマーまたはヒドロゲルコーティングとの共有結合により固体支持体に固定化される。ある実施態様において、ヒドロゲルまたはポリマーコーティングはＰＡＺＡＭを含む。ある実施態様において、ヒドロゲルまたはポリマーコーティングも、例えば、表面に沈着した官能化シランとの反応により、固体支持体表面に共有結合される。ある実施態様において、官能化シランはノルボルネン由来シランである。ある実施態様において、固体支持体はフローセルを含むまたはフローセルである。
【０１０１】
固体支持体表面
ある実施態様において、プライマー移植前の固体支持体表面は、官能化分子で被覆された領域およびコーティングがない不活性領域の両者を含む。このような実施態様のある場合において、官能化分子コーティングはヒドロゲルまたはポリマーコーティングである。被覆領域は反応部位を含むことができ、それ故に、化学結合またはハイブリダイゼーションもしくは共有結合性反応などの他の分子相互作用を介する分子の結合に使用できる。ある実施態様において、被覆領域(例えば、反応性特性、チャネル、パッド、ビーズまたはウェル)および不活性領域(間隙領域と称する)は、パターンまたは格子を形成するために交互であり得る。このようなパターンは一次元的または二次元的であり得る。ある実施態様において、不活性領域はガラス領域、金属領域、マスク領域または間隙領域またはこれらの組み合わせから選択され得る。あるいは。これらの材料は反応性領域を形成し得る。不活性または反応性は、基質で使用する化学および手順による。ある実施態様において、固体支持体表面はガラス領域を含む。他の実施態様において、表面は金属領域を含む。
【０１０２】
ある実施態様において、ここに記載する固体支持体はフローセルの少なくとも一部を形成するかまたはフローセル内に位置する。このような実施態様のある場合において、フローセルは、官能化分子コーティング、例えば、ポリマーまたはヒドロゲルコーティングを介して固体支持体表面に結合したポリヌクレオチドをさらに含む。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドクラスター内でフローセルに存在し、ここで、ポリヌクレオチドクラスターのポリヌクレオチドは、ヒドロゲルまたはポリマーコーティングを介してフローセルの表面に結合する。このような実施態様のある場合において、ポリヌクレオチドが結合しているフローセル本体の表面は固体支持体と考えられる。他の実施態様において、ヒドロゲルまたはポリマー被覆表面を有する別の固体支持体がフローセルの本体に挿入される。好ましい実施態様において、フローセルは複数のレーンまたは複数のセクターに分割されるフローチャンバーであり、ここで、複数のレーンまたは複数のセクターの１以上は、共有結合的に結合したここに記載するヒドロゲルまたはポリマーコーティングで被覆された表面を含む。ここに記載するフローセルのある実施態様において、単一ポリヌクレオチドクラスター内に結合したポリヌクレオチドは、同一または類似するヌクレオチド配列を有する。ここに記載するフローセルのある実施態様において、異なるポリヌクレオチドクラスターの結合ポリヌクレオチドは異なるまたは類似しないヌクレオチド配列を有する。ここに示す方法または組成物で使用できるフローセルおよびフローセルを製造するための基質の例は、Illumina, Inc.(San Diego, CA)から市販されているものまたは各々引用により本明細書に包含させる米国公開２０１０／０１１１７６８Ａ１および２０１２／０２７０３０５に記載のものを含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
ＰＡＺＡＭ
固体支持体表面のヒドロゲルまたはポリマーコーティングの一つの実施態様は、次の二つの反復単位を含むポリアクリルアミドコポリマーである、ＰＡＺＡＭを含む。
【化３１】
2021500003.tif 000035
【０１０４】
ある実施態様において、ＰＡＺＡＭは線状ポリマーである。ある他の実施態様において、ＰＡＺＡＭは、軽度に架橋したポリマーである。ＰＡＺＡＭは、ここに示す組成物または方法での使用のために官能化または修飾され得る。ＰＡＺＡＭおよびそのアナログの製造は、引用により全体として本明細書に包含させる、米国特許９,０１２,０２２に開示される。
【０１０５】
３’遮断基
ＳＢＳサイクル中、一つの取り込みしか生じないことを確実にするために、構造的修飾(「保護基」)が、１ヌクレオチドしか取り込まれないことを確実にするために、成長中の鎖に付加される各標識ヌクレオチドに付加される。保護基を有するヌクレオチドが付加された後、次いで、保護基を、配列決定されるＤＮＡの完全性を妨害しない反応条件下、除去される。次いで、配列決定サイクルを、次の保護、標識ヌクレオチドの取り込みで継続し得る。
【０１０６】
ＤＮＡ配列決定で有用であるために、ヌクレオチドおよびより一般にヌクレオチド三リン酸は、一般に、そのポリヌクレオチド鎖への取り込みのために使用されたポリメラーゼが、塩基がヌクレオチドに付加された後も複製を続けることを防止するために、３’−ヒドロキシ保護基が必要である。ヌクレオチドに付加でき、なお適当である基のタイプに大きな制限がある。保護基は、ポリヌクレオチド鎖にさらなるヌクレオチド分子が付加されるのを防止しながら、同時にポリヌクレオチド鎖に損傷を与えることなく糖部分から容易に除去可能でなければならない。さらに、修飾ヌクレオチドは、そのポリヌクレオチド鎖への取り込みに使用するポリメラーゼまたは他の適切な酵素に抵抗性でなければならない。それ故に、理想的保護基は長期安定性を示し、ポリメラーゼ酵素により効率的に取り込まれ、二次的なまたはさらなるヌクレオチド取り込みを遮断し、かつポリヌクレオチド構造に損傷を与えない穏やかな条件下、好ましくは水性条件下除去される能力を有しなければならない。
【０１０７】
可逆性保護基は以前に報告されている。例えば、Metzker et al.(Nucleic Acids Research, 22 (20): 4259-4267, 1994)は、８つの３’修飾２−デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸(３’修飾ｄＮＴＰ)の合成および使用および取り込み活性について２つのＤＮＡ鋳型アッセイでの試験を開示する。ＷＯ２００２／０２９００３は、ポリメラーゼ反応におけるＤＮＡの成長中の鎖の３’−ＯＨ基をキャップするためのアリル保護基の使用を含み得る、配列決定方法を記載する。他の可逆性保護基およびＤＮＡ適合条件下でのその脱保護方法は、国際出願公開ＷＯ２００４／０１８４９７およびＷＯ２０１４／１３９５９６に開示のアジドメチルまたは修飾アジドメチル基であり、引用により全体として本明細書に包含させる。
【０１０８】
ここに記載する３’−ＯＨ遮断基の一つの実施態様は、ホスファターゼにより除去され得るホスフェート基である。
【０１０９】
検出可能標識
ここに記載するある実施態様は、検出可能標識の使用に関する。検出は、蛍光スペクトロスコピーまたは他の光学手段を含む任意の適当な方法により実施され得る。好ましい標識はフルオロフォアであり、これは、エネルギー吸収後、既定の波長で放射線を放出する。多くの適当な蛍光標識が知られる。例えば、Welch et al.(Chem. Eur. J. 5(3):951-960, 1999)は、本発明で使用できるダンシル官能化蛍光部分を開示する。Zhu et al.(Cytometry 28:206-211, 1997)は、蛍光標識Ｃｙ３およびＣｙ５の使用を記載し、これはまた本発明でも使用され得る。試用に適する標識は、Prober et al.(Science 238:336-341, 1987); Connell et al.(BioTechniques 5(4):342-384, 1987)、Ansorge et al.(Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987)およびSmith et al.(Nature 321:674, 1986)にも記載される。他の市販の蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミン(ＴＭＲ、テキサスレッドおよびＲｏｘを含む)、ａｌｅｘａ、ボディピー、アクリジン、クマリン、ピレン、ベンズアントラセンおよびシアニンを含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
ある実施態様において、検出可能標識を、ここに記載する方法および固体支持体でＰｄ開裂を受け得る、ポリヌクレオチドの第一開裂部位に使用し得る。特に、第一開裂部位は標識修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含み得る。このアプローチは、現在のイルミナの製造ワークフローをさらに合理化し得る。ある実施態様において、ここに記載するアリル修飾Ｐ５プライマーは、移植反応終了直後の直接の定量化を可能とする蛍光タグを含むように修飾でき、このような定量化工程を実施するための別のハイブリダイゼーションアッセイの必要性を除く。
【０１１１】
検出可能標識のためのリンカー
ここに記載するある実施態様において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基を、上記のとおり検出可能標識に結合し得る。このような実施態様のある場合において、使用するリンカーは開裂可能である。開裂可能リンカーの使用は、必要であれば、標識が検出後除去され、その後取り込まれる何らかの標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドとの何らかの干渉シグナルを回避し得ることを確実とし。
【０１１２】
ある他の実施態様において、使用するリンカーは開裂不可能である。本発明の標識ヌクレオチドが取り込まれる各場合において、その後ヌクレオチドが取り込まれる必要がないならば、標識をヌクレオチドから除去する必要はない。
【０１１３】
開裂可能リンカーは当分野で知られ、慣用の化学をリンカーのヌクレオチド塩基および標識への結合に使用できる。リンカーを、酸、塩基、求核剤、親電子物質、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素への暴露を含む、任意の適当な方法により開裂させ得る。ここに記載するリンカーは、３’−Ｏ−保護基結合の開裂に使用したのと同じ触媒でも開裂され得る。適当なリンカーを、Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sonsに記載のとおり、標準化学保護基から抜粋し得る。固相合成での使用に適するさらなる開裂可能リンカーは、Guillier et al.(Chem. Rev. 100:2092-2157, 2000)に開示される。
【０１１４】
用語「開裂可能リンカー」の使用は、リンカー全体が、例えば、ヌクレオチド塩基から、除去されることを必要とすることを含意することは意図しない。検出可能標識が塩基に結合しているならば、ヌクレオシド開裂部位は、リンカー上の、開裂後にリンカーがヌクレオチド塩基に結合したままであることを確実にする位置に位置し得る。
【０１１５】
検出可能標識が塩基に結合しているならば、リンカーは、ワトソン・クリック塩基対形成がなお実施され得る限り、ヌクレオチド塩基の任意の位置で結合し得る。プリン塩基の場合、リンカーがプリンまたは好ましいデアザプリンアナログの７位を介して、８修飾プリンを介して、Ｎ−６修飾アデノシンまたはＮ−２修飾グアニンを介して結合しているならば、好ましい。ピリミジンについて、結合は、好ましくはシトシン、チミジンまたはウラシルの５位およびシトシンのＮ−４位置を介する。
【０１１６】
ある実施態様において、リンカーは、３’−ＯＨ保護基に類似する官能基からなり得る。これは、標識および保護基両者を除去するために一処理工程しか必要としないため、脱保護および脱保護手順をより効率的にする。特に好ましいリンカーは、ホスフィン開裂可能アジド含有リンカーである。
【０１１７】
開裂方法
種々の開裂方法を、線形化工程における二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖の開裂、例えばここに記載する第二鎖ポリヌクレオチドの開裂のために使用し得る。適当な開裂方法の好ましいが、限定的ではない実施態様を、下にさらに詳述する。
【０１１８】
Ａ)化学開裂
用語「化学開裂」は、二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖の開裂を促進／達成するために非核酸および非酵素化学反応剤を利用する、あらゆる方法を包含する。必要であれば、二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖は、特定の開裂部位、好ましくは予め決定され開裂部位での化学開裂反応を可能とするために、１以上の非ヌクレオチド化学部分および／または非天然ヌクレオチドおよび／または非天然主鎖結合を含み得る。一つの非限定的実施態様において、二本鎖核酸分子の一鎖は、過ヨウ素酸(例えば、過ヨウ素酸ナトリウム)での処理による開裂を可能とするジオール結合を含み得る。ジオール結合は、開裂部位に配置でき、その正確な位置は使用者により選択され得る。１を超えるジオールが開裂部位に挿入され得ることが理解される。
【０１１９】
ポリヌクレオチド鎖への取り込みに適するホスホロアミダイト化学に基づくジオールリンカー単位は、Fidelity Systems, Inc.(Gaithersburg, MD, USA)から市販される。１以上のジオール単位を、自動化化学ＤＮＡ合成の標準方法を使用して、ポリヌクレオチドに取り込ませ得る。ジオールリンカーを固体支持体から最適距離で配置するために、１以上のスペーサー分子を、ジオールリンカーと固体支持体への結合位置の間に含ませ得る。スペーサー分子は非ヌクレオチド化学部分であり得る。ジオールリンカーと組み合わせて使用するためのホスホロアミダイト化学に基づく適当なスペーサー単位もまたFidelity Systems, Inc.から提供される。ジオールリンカーは、ジオールの開裂を促進する任意の物質であり得る「開裂剤」での処理により開裂させる。好ましい開裂剤は、過ヨウ素酸、好ましくは過ヨウ素酸ナトリウム(ＮａＩＯ４)水溶液である。ジオールを開裂するための開裂剤(例えば、過ヨウ素酸)での処理後、開裂産物を、開裂反応で産生された反応性種を中和するために、「キャッピング剤」で処理し得る。この目的のために適当なキャッピング剤は、エタノールアミンなどのアミンを含む。有利には、キャッピング剤(例えば、エタノールアミン)を、反応性種が形成されると直ちにキャッピングされるように、開裂剤(例えば、過ヨウ素酸)との混合物に含ませ得る。
【０１２０】
二本鎖核酸分子の一鎖の開裂を達成するための、ジオール結合と開裂剤(例えば、過ヨウ素酸)の組み合わせが、過ヨウ素酸が核酸完全性およびヒドロゲル表面の化学と適合性であるため、固体支持ポリアクリルアミドヒドロゲル上の核酸分子の線形化のために好ましい。しかしながら、官能化シランで被覆した支持体を含む、他の表面上に固定化された核酸の線形化のためにもジオール方法は使用され得る。
【０１２１】
さらなる実施態様において、開裂すべき鎖(または固相増幅により製造した場合には、この鎖が由来する増幅プライマー)は、化学還元剤、例えば、トリス(２−カルボキシエチル)−リン酸塩酸塩(ＴＣＥＰ)での開裂を可能とするジスルフィド基を含み得る。
【０１２２】
Ｂ)二本鎖分子における非塩基部位の開裂
「非塩基部位」は、塩基成分が除かれている、ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオシド位置として定義される。非塩基部位は、ヌクレオシド残基の加水分解により生理的条件下でＤＮＡに自然に生じ得るが、人工的条件下化学的にまたは酵素の作用により形成させることもできる。形成されたら、非塩基部位は開裂(例えば、エンドヌクレアーゼまたは他の一本鎖開裂酵素での処理、熱またはアルカリへの暴露)により、ポリヌクレオチド鎖の部位特異的開裂のための手段となり得る。
【０１２３】
非限定的実施態様において、非塩基部位を、二本鎖ポリヌクレオチドの一鎖上の予め決定され位置に作製し、次いで、先ずデオキシウリジン(Ｕ)を二本鎖核酸分子の予め決定され開裂部位に取り込むことにより、開裂し得る。これは、例えば、固相ＰＣＲ増幅による二本鎖核酸分子の製造に使用するプライマーの一つにＵを含ませることにより、達成され得る。次いで、酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ(ＵＤＧ)を使用してウラシル塩基を除去し、一鎖上に非塩基部位を産生し得る。次いで、非塩基部位を含むポリヌクレオチド鎖を、エンドヌクレアーゼ(例えばEndoIVエンドヌクレアーゼ、ＡＰリアーゼ、ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼ、EndoVIIIグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼ)、熱またはアルカリでの処理により、非塩基部位で開裂させ得る。
【０１２４】
非塩基部位を使用して、配列決定プライマーとして作用する遊離３’−ヒドロキシル部分を産生し得る。両増幅プライマーが、連続して開裂され得るように修飾されるならば、第二開裂を使用して、第一鎖を表面から開裂し得る。第一(または第二)プライマーは一酵素(ＵＤＧ)により開裂され得るウラシル塩基を含み、第二(または第一)プライマーは、第二、直交性酵素、ＦＰＧグリコシラーゼにより開裂され得る８−オキソ−グアニン塩基を含む。第二非塩基部位開裂を使用して、Ｇ塩基が配列決定の第一サイクルとして取り込まれるようにまたは開裂二本鎖が配列決定プライマーの溶液でのハイブリダイゼーションを可能とするように変性され得るように、表面に結合した配列決定プライマーを残す。
【０１２５】
Ｃ)リボヌクレオチドの開裂
１以上のリボヌクレオチドの、そうしなければデオキシリボヌクレオチド(さらなる非ヌクレオチド化学部分、非天然塩基または非天然主鎖結合を伴うまたは伴わない)を含むポリヌクレオチド鎖への取り込みは、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の選択的開裂を可能とする化学剤を使用するまたはリボヌクレアーゼ(ＲＮＡｓｅ)開裂のための部位を提供し得る。それ故に、本発明はまた、このような化学開裂剤またはＲＮａｓｅを使用する、１以上の連続リボヌクレオチドを含む部位での(二本鎖核酸分子の)一鎖の開裂による、配列決定鋳型の産生も包含する。好ましくは開裂すべき鎖は、化学開裂のための予め決定された部位を提供するための、単一リボヌクレオチドを含む。
【０１２６】
デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の選択的開裂が可能な適当な化学開裂剤は金属イオン、例えば希土類金属イオン(特にＬａ３＋、特にＴｍ３＋、Ｙｂ３＋またはＬｕ３＋(Chen et al., Biotechniques, 2002, 32: 518-520; Komiyama et al. Chem. Commun. 1999, 1443-1451))、Ｆｅ(３)またはＣｕ(３)または高ｐＨへの暴露、例えば、水酸化ナトリウムなどの塩基での処理を含む。「デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の選択的開裂」は、化学開裂剤が、同条件下では２デオキシリボヌクレオチド間のホスホジエステル結合を開裂できないことを意味する。リボヌクレオチドの塩基組成は、一般に重要ではないが、化学(または酵素)開裂を最適化するために選択できる。例として、開裂を金属イオン、特に希土類金属イオンへの暴露により実施するならば、ｒＵＭＰまたはｒＣＭＰが一般に好ましい。
【０１２７】
リボヌクレオチドは、一般に二本鎖核酸分子の一鎖に取り込まれ、二本鎖分子の２つの相補鎖がアニールされるとき一本鎖であるその領域に位置することができる(すなわち５’オーバーハング部分にある)。特に、二本鎖核酸分子が順方向および逆方向増幅プライマーを使用する固相ＰＣＲ増幅により製造されるならば、その一方は、少なくとも一つのリボヌクレオチドを含み、ＰＣＲ増幅に使用する標準ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、リボヌクレオチド鋳型を複製できない。それ故に、固相ＰＣＲ反応の産物は、該リボヌクレオチドおよび該リボヌクレオチドの上流の増幅プライマーのあらゆる残りを含む、オーバーハング５’領域を含む。
【０１２８】
リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの間または２つのリボヌクレオチドの間のホスホジエステル結合は、ＲＮａｓｅによっても開裂され得る。適切な基質特異性のあらゆるエンドサイトーシスリボヌクレアーゼがこの目的で使用され得る。リボヌクレオチドが、二本鎖分子の２つの相補鎖がアニールされるとき一本鎖である領域(すなわち５’オーバーハング部分にある)に存在するならば、ＲＮａｓｅは、リボヌクレオチド含有一本鎖に特異性を有するエンドヌクレアーゼである。リボヌクレアーゼでの開裂のために、２以上の連続リボヌクレオチド、好ましくは２〜１０または５〜１０連続リボヌクレオチドが含まれることが好ましい。リボヌクレオチドの正確な配列は、あるＲＮａｓｅがある残基後の開裂に特性を有する以外、一般に重要ではない。適当なＲＮａｓｅは、例えば、ＣおよびＵ残基後を開裂するＲＮａｓｅＡを含む。それ故に、ＲＮａｓｅＡで開裂するとき、開裂部位は、ＣまたはＵである少なくとも一つのリボヌクレオチドを含まなければならない。
【０１２９】
１以上のリボヌクレオチドを取り込むポリヌクレオチドは、適切なリボヌクレオチド前駆体を用いるオリゴヌクレオチド化学合成の標準技法を使用して、容易に合成され得る。二本鎖核酸分子が固相核酸増幅で製造されたら、増幅反応に使用するプライマーの一方に１以上のリボヌクレオチドを取り込むのが簡便である。
【０１３０】
Ｄ)光化学開裂
用語「光開裂」または「光化学開裂」は、二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖の開裂を達成するために光エネルギーを利用するあらゆる方法をいう。光化学開裂のための予め決定された部位は、二本鎖分子の鎖の一方における非ヌクレオチド化学スペーサー単位により提供され得る。適当な光化学開裂可能スペーサーは、Glen Research, Sterling, Virginia, USAにより供給される、ＰＣスペーサーホスホロアミダイト(４−(４,４’−ジメトキシトリチルオキシ)ブチラミドメチル)−１−(２−ニトロフェニル)−エチル]−２−シアノエチル−(Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト)を含む。スペーサー単位は、ＵＶ光源への暴露により開裂され得る。このスペーサー単位は、オリゴヌクレオチドの化学合成の標準技法を使用して、固体表面への結合を可能とするチオホスフェート基と共に、ポリヌクレオチドの５’末端に結合され得る。便利には、このスペーサー単位は、固相増幅による光開裂可能二本鎖核酸分子の合成に使用される順方向または逆方向増幅プライマーに取り込まれ得る。
【０１３１】
Ｅ)ＰＣＲストッパー
他の実施態様において、二本鎖核酸を、順方向および逆方向プライマーを使用する固相増幅により合成でき、その一方は、「ＰＣＲストッパー」を含む。「ＰＣＲストッパー」は、その点を超えて複製され得ないように、増幅に使用されるポリメラーゼのリードスルー(read-through)を阻止する任意の部分(ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド)である。その結果、ＰＣＲストッパー含有プライマーの伸長に由来する増幅鎖が、５’オーバーハング部分を含むこととなる。この５’オーバーハング(ＰＣＲストッパー自体以外)は、主に天然主鎖結合を有する天然に存在するデオキシリボヌクレオチドから構成でき、すなわち単に一本鎖ＤＮＡのストレッチであり得る。次いで、分子を一本鎖ＤＮＡの開裂に選択的であるが、二本鎖ＤＮＡはしない開裂剤(例えば、酵素)、例えばマングビーンヌクレアーゼの使用により５’オーバーハング領域で開裂され得る。
【０１３２】
ＰＣＲストッパーは、本質的に増幅反応に使用されるポリメラーゼのリードスルーを阻止する任意の部分であり得る。適当なＰＣＲストッパーは、ヘキサエチレングリコール(ＨＥＧ)、非塩基部位およびペプチド核酸(ＰＮＡ)などのＤＮＡアナログを含むポリメラーゼのリードスルーを阻止するあらゆる非天然または修飾ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
安定な非塩基部位が、安定な非塩基部位を含む適切なスペーサー単位を使用する化学オリゴヌクレオチド合成中に導入され得る。例として、Glen Research, Sterling, Virginia, USAから市販の非塩基フラン(５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−１’,２’−ジデオキシリボース−３’−[(２−シアノエチル)−(Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト)スペーサーが、非塩基部位導入のために化学オリゴヌクレオチド合成中に取り込まれ得る。このような部位は、こうして、固相増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーに容易に導入され得る。非塩基部位が順方向または逆方向増幅プライマーに導入されるならば、得られた増幅産物は、非塩基部位(一本鎖形態で)を含む一鎖に５’オーバーハングを有する。次いで、一本鎖非塩基部位は、適当な化学剤(例えば、アルカリへの暴露)または酵素(例えば、ＡＰエンドヌクレアーゼVI、Shida el al., Nucleic Acids Research, 1996, Vol.24, 4572-4576)の作用により、開裂され得る。
【０１３４】
Ｆ)ペプチドリンカーの開裂
開裂部位を、ペプチド分子が核酸分子の一鎖に結合した、接合体構造の製造により、二本鎖核分子の一鎖に導入することもできる。続いてペプチド分子は、適切な特異性のペプチダーゼ酵素または非酵素化学または光化学開裂の任意の他の適当な手段により開裂され得る。一般に、ペプチドと核酸の接合体は、二本鎖核酸分子の一鎖のみへのペプチドの共有結合により形成され、ペプチド部分はこの鎖の５’末端で、固体表面への結合点に隣接して、接合される。二本鎖核酸が固相増幅により製造されるならば、ペプチド接合体は、増幅プライマーの一方の５’末端に取り込まれ得る。明らかに、このプライマーのペプチド成分はＰＣＲ増幅中に複製されず、故に、「架橋」増幅産物は、一鎖に開裂可能５’ペプチド「オーバーハング」を含む。
【０１３５】
ペプチドが核酸の５’末端に接合しているペプチドと核酸の接合体は、当分野で一般に知られる技法を使用して製造され得る。一つのこのような技法において、所望のアミノ酸およびヌクレオチド配列のペプチドおよび核酸成分を、例えば、標準自動化化学合成技法により別々に合成し、次いで、水性／有機溶液中で接合し得る。例として、Glen Researchから市販のＯＰｅＣTMシステムは、Ｎ末端チオエステル官能化ペプチドの５’−システイニルオリゴヌクレオチドへの「天然ライゲーション」に基づく。ペンタフルオロフェニルＳ−ベンジルチオスクシネートは、標準Ｆｍｏｃベースの固相ペプチドアセンブリの最終カップリング工程で使用される。トリフルオロ酢酸での脱保護は、溶液中で、Ｎ末端Ｓ−ベンジルチオスクシニル基で置換されたペプチドを産生する。Ｏ−ｔｒａｎｓ−４−(Ｎ−ａ−Ｆｍｏｃ−Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチルスルフェニル−１−システイニル)アミノシクロヘキシルＯ−２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトは、標準ホスホロアミダイト固相オリゴヌクレオチドアセンブリにおける最終カップリング工程で使用される。アンモニア水溶液での脱保護は、溶液中で、５’−Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチルスルフェニル−Ｌ−システイニル官能化オリゴヌクレオチドを産生する。修飾ペプチドのチオベンジル末端は、チオフェノールの使用によりチオフェニルアナログに変換され、一方修飾オリゴヌクレオチドはトリス(カルボキシエチル)ホスフィンに還元される。これら２中間体のカップリング、続く「天然ライゲーション」工程は、オリゴヌクレオチド−ペプチド接合体の形成に至る。
【０１３６】
ペプチドおよび核酸を含む接合体鎖は、選択表面と適合性である、当分野で知られる任意の適当な共有結合技法を使用して、固体支持体に共有結合され得る。例えば、固体支持ポリアクリルアミドヒドロゲル表面への共有結合は、ペプチド成分の「遊離」末端(すなわち核酸と接合していない末端)上へのチオホスフェート基の結合により達成され得る。ペプチド／核酸接合体構造が固相ＰＣＲ増幅で使用する増幅プライマーであるならば、固体支持体への結合は、核酸成分の３’末端を遊離のままにしなければならない。
【０１３７】
ペプチド成分は、任意の選択ペプチダーゼ酵素により開裂可能であるように選択でき、その多くが当分野で知られる。ペプチダーゼの性質は特に限定されないが、ペプチダーゼがペプチド成分のどこかを開裂することだけが必要である。同様に、ペプチド成分の長さおよびアミノ酸配列は、選択ペプチダーゼによる「開裂可能」に必要である以外、特に限定されない。
【０１３８】
核酸成分の長さおよび正確な配列も特に制限されず、任意の所望の配列であり得る。核酸成分が固相ＰＣＲにおけるプライマーとして機能すべきであるならば、その長さおよびヌクレオチド配列は、増幅される鋳型のアニーリングを可能とするように選択される。
【０１３９】
変性
開裂に使用する方法の任意の実施態様において、開裂反応の産物は、固体支持体に結合していない開裂鎖の部分を除去するために、変性条件に付され得る。適当な変性条件は、標準分子生物学プロトコールを参照して、当業者である読者に明らかである(Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Current Protocols, eds., Ausubel et al.)。変性(および続く開裂鎖の再アニーリング)は、部分的にまたは実質的に一本鎖である配列決定鋳型の産生をもたらす。次いで、配列決定反応を、配列決定プライマーと鋳型の一本鎖部分のハイブリダイゼーションにより開始し得る。
【０１４０】
他の実施態様においては、配列決定を、開裂鎖の一部を除去するために変性する必要なく、開裂工程後すぐに開始し得る。開裂工程が、なお相補鎖とハイブリダイズする一開裂鎖上の遊離３’ヒドロキシル基を産生するならば、初期変性工程を必要とせず、鎖置換ポリメラーゼ酵素を使用して、この点から配列決定を進め得る。特に、鎖置換配列決定を、ニッキングエンドヌクレアーゼでの開裂またはエンドヌクレアーゼ、熱またはアルカリ処理での非塩基部位の加水分解による鋳型産生と共に使用し得る。
【０１４１】
配列決定方法
ある実施態様において、ここに記載する固体支持体および方法を、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定に使用し得る。このような実施態様のある場合において、方法は、(ａ)ポリヌクレオチドポリメラーゼと基質表面に(例えば、ここに記載するポリマーまたはゲルコーティングの何れかにより)結合した非線形化ポリヌクレオチドクラスターを接触させ；(ｂ)１以上のヌクレオチドがポリヌクレオチドポリメラーゼにより利用されたとき、検出可能シグナルが生じるように基質の表面にヌクレオチドを提供し；(ｃ)１以上の結合ポリヌクレオチド(または結合ポリヌクレオチドから産生された１以上のクラスター)でシグナルを検出し；そして(ｄ)工程(ｂ)および(ｃ)を繰り返し、それにより基質結合ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する工程を含み得る。
【０１４２】
核酸配列決定は、当分野で知られる種々の手順により、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するのに使用され得る。好ましい方法において、合成による配列決定(ＳＢＳ)を利用して、基質の表面に結合した(例えば、ここに記載するポリマーコーティングの何れかにより)ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定し得る。このような手順において、１以上のヌクレオチドが、ポリヌクレオチドポリメラーゼと結合する鋳型ポリヌクレオチドに提供される。ポリヌクレオチドポリメラーゼは、１以上のヌクレオチドを、ポリヌクレオチド鋳型と相補的である新たに合成された核酸鎖に取り込む。合成は、鋳型ポリヌクレオチドの一端で共有結合する鋳型ポリヌクレオチドの一部またはユニバーサルもしくは非可変核酸の一部と相補的であるオリゴヌクレオチドプライマーから開始される。ヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドに対して取り込まれるにつれて、検出可能シグナルが産生され、それは、どのヌクレオチドが配列決定手順の各工程中に取り込まれているかの決定を可能とする。この方法で、少なくとも鋳型ポリヌクレオチドの一部に相補的な核酸の配列が産生でき、それにより少なくとも鋳型ポリヌクレオチドの一部のヌクレオチド配列の決定を可能とする。
【０１４３】
フローセルは、本発明の方法により産生され、合成による配列決定(ＳＢＳ)またはサイクルでの反応剤の反復送達を含む他の検出技法に付されるアレイの収容に便利な形式を提供する。例えば、第一ＳＢＳサイクルを開始するために、１以上の標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、ここに示す方法により製造した核酸アレイを収容するフローセル内に／通して流し得る。プライマー伸長が標識ヌクレオチドを取り込ませるアレイの部位が検出され得る。所望により、ヌクレオチドは、さらにヌクレオチドがプライマーに付加されたら、さらなるプライマー伸長を停止させる可逆性停止性質を含み得る。例えば、可逆性ターミネーター部分を有するヌクレオチドアナログを、脱遮断剤が該部分を除去するために送達されるまで、続く伸長が生じ得ないようにプライマーに付加し得る。それ故に、可逆性停止を使用する実施態様について、脱遮断剤がフローセルに供給され得る(検出が生じる前または後に)。洗浄を種々の供給工程の間で実施し得る。次いで、プライマーをｎヌクレオチド伸長するためにサイクルをｎ回反復し、それにより長さｎの配列が検出することができる。本発明の方法により産生されたアレイでの使用に容易に適用させ得るＳＢＳ方法、流体システムおよび検出プラットフォームの例は、例えば、Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)、ＷＯ０４／０１８４９７；ＵＳ７,０５７,０２６；ＷＯ９１／０６６７８；ＷＯ０７／１２３７４４；ＵＳ７,３２９,４９２；ＵＳ７,２１１,４１４；ＵＳ７,３１５,０１９；ＵＳ７,４０５,２８１およびＵＳ２００８／０１０８０８２に記載され、この各々を引用により全体として本明細書に包含させる。
【０１４４】
フローセルを用いる上記方法のある実施態様において、１タイプのヌクレオチドしか、一フロー工程中のフローセルに存在しない。このような実施態様のある場合において、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびそのアナログからなる群から選択され得る。フローセルを用いる上記方法の他の実施態様において、複数の種々のタイプのヌクレオチドが一フロー工程中にフローセルに存在する。このような方法において、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびそのアナログから選択され得る。
【０１４５】
フローセルに存在する基質の表面上のポリマーコーティングに結合したポリヌクレオチドの１以上について各フロー工程中に取り込まれたヌクレオチドまたはヌクレオチドの決定は、ポリヌクレオチド鋳型でまたはその近辺で生じたシグナルの検出により達成される。上記方法のある実施態様において、検出可能シグナルは光学シグナルを含む。他の実施態様において、検出可能シグナルは非光学シグナルを含む。このような実施態様において、非光学シグナルは、ポリヌクレオチド鋳型の１以上でのまたはその近辺のｐＨ変化を含む。
【０１４６】
本発明の基質の適用および使用は、ここでは核酸について例示している。しかしながら、他の検体がここに示す基質に結合し、分析され得ることが理解される。１以上の検体は、本発明の基質中または基質上に存在し得る。本発明の基質は、検体の検出または検体との合成反応の実施に特に有用である。それ故に、検出、特徴づけ、修飾、合成などが行われるべき多様な検体のいずれもが、ここに示す基質中または基質上に存在し得る。検体の例は、核酸(例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのアナログ)、タンパク質、多糖、細胞、抗体、エピトーブ、受容体、リガンド、酵素(例えば、キナーゼ、ホスファターゼまたはポリメラーゼ)、小分子薬物候補などを含むが、これらに限定されない。基質は、検体のライブラリーからの複数の異なる種を含み得る。例えば、種は、抗体ライブラリーからの異なる抗体、核酸ライブラリーからの異なる配列を有する核酸、タンパク質イブラリーからの異なる構造および／または機能を有するタンパク質、小分子のコンビナトリアルライブラリーからの薬物候補などであり得る。
【０１４７】
ある実施態様において、検体は基質上で、各特性(features)が個々に区別できるように各特性に分配され得る。例えば、各検体の単一分子は、個々の特性に存在し得る。あるいは、検体は、コロニーまたは集団として存在し得て、分離されなくてもよい。コロニーまたは集団は、単一種の検体しか含まない(複数コピーにもかかわらず)点で、均一であり得る。核酸を例にとると、基質の各特性は、核酸のコロニーまたは集団を含み、該コロニーまたは集団内の全核酸は、同一ヌクレオチド配列を有し得る(一本鎖または二本鎖)。このようなコロニーは、上記したとおり、クラスター増幅または架橋増幅により作製できる。標的配列の複数反復は、ローリングサークル増幅法を使用して作製したコンカテマーなどのように、単一核酸分子に存在し得る。それ故に、基質の形体は、単一種の検体の複数コピーを含み得る。あるいは、一つの特性を有する検体のコロニーまたは集団は、２以上の異なる種を含み得る。例えば、基質上の１以上のウェルは、各々２以上の異なる核酸種(すなわち異なる配列を有する核酸分子)を有する混合コロニーを含み得る。混合コロニーの２以上の核酸種は、無視できない量で存在でき、例えば、混合コロニー中の１を超える核酸の検出を可能とする。
【実施例】
【０１４８】
さらなる実施態様を、次の実施例でさらに詳述する。これは、決して特許請求の範囲の範囲を限定すると解釈されてはならない。
【０１４９】
一般的表面調製プロトコール
浄化ＨｉＳｅｑ(登録商標)フローセルのシラン化
ノルボルネン官能化フローセルを、ＹＥＳ(Yield Engineering Systems)シラン化チャンバーまたはデシケーターを使用する化学蒸着(ＣＶＤ)方法により製造する。ＣＶＤ操作は、一般に６０℃で１〜２４時間行う。
【化３２】
2021500003.tif 000036
【０１５０】
ＰＡＺＡＭカップリング
次いで、シラン化フローセルを、複数のツーリングオプションを使用して被覆および移植し得る。例えば、イルミナ配列決定のためのｃＢｏｔ完全自動化クローンクラスター産生システム(Illuminaから入手可能)を、これらのオプションの実施に使用し得る。典型的方法において、フローセルに先ずＩＰＡ／Ｈ２Ｏ(１：１；１００μL／分、２分)を流す。次に、ＤＩ水をチャネルを通して流す(１００μL／分、２分)。一定量の０.５ｗｔ％ＰＡＺＡＭ(水性)溶液を調製する(８チャネルに十分)。ポリマーをチャネルに流す(１００μL／分、２分)。ＰＡＺＡＭカップリング工程は、６０℃で、１時間かけて完了する。この工程の完了後、次の移植工程の準備で、チャネルに水で流す。ポリマーコーティング工程完了後、フローセルは、４℃で緩衝液(例えば、食塩水−クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)緩衝液)中保存できる。あるいは、移植工程は、ＰＡＺＡＭコーティング直後に完了させ得る。
【０１５１】
ＰＡＺＡＭ被覆フローセルの移植およびＱＣ
このプロトコールは、ｃＢｏｔシステム(ＩＬＭＮ)を使用するＨｉＳｅｑ(登録商標)フローセルの移植の方法を記載する。移植方法は、アリル修飾Ｐ５配列オリゴプライマーおよびジオール修飾Ｐ７配列プライマーが約１：１比でＰＡＺＡＭ表面に共有結合するフローセル表面を提供する。典型的移植混合物を標準イルミナ方法に従い調製し、使用するプライマー濃度に依存する。用いる典型的プライマー濃度は約１〜２０μMであり、ターゲティングプライマー密度２０〜２５００００単位(蛍光カウント)である。ＱＣ工程を、ｃＢｏｔシステムを使用して標準イルミナ方法に従い実施し、その後Ｔｙｐｈｏｏｎ(蛍光フラットベッドスキャナー)で画像処理する。
【０１５２】
ＱＣ後、フローセルのチャネルを５×ＳＳＣ(６０μL／分、総体積＝３００μL／フローセル)で流して、水酸化ナトリウム(デハブリダイゼーション工程実施のために使用)を除去する。
【０１５３】
次いで、移植フローセルを下流生化学手順(クラスター化、配列決定)実施前に４℃で保存する。
【０１５４】
実施例１
この実施例で、修飾チミンヌクレオシドアナログを含む修飾オリゴヌクレオチドを、二本鎖対形成性質およびＰＣＲ伸長性質を妨害することなく、生物学的条件下で化学反応剤により効率的に開裂される特定の部位として使用した。
【０１５５】
特に、オリゴヌクレオチドは、５’−Ｃ位置のビニル基結合と共に単一修飾Ｔ−ヌクレオシドを含んだ。水性緩衝液中のＮａ２ＰｄＣｌ４または(ＰｄアリルＣｌ)２およびＴＨＰの溶液で処理すると(in situでパラジウム(０)錯体を産生)、オリゴヌクレオチドは修飾Ｔ位置で開裂し、得られた短いオリゴは３’末端にホスフェート基を含んだ。この反応を下記スキーム１に図示し、ここで、Ｎｕは求核剤である。
【化３３】
2021500003.tif 000037
【０１５６】
修飾Ｔヌクレオシドホスホロアミダイトの合成をスキーム２に記載する。出発物質は市販されている。主要な反応段階は＞７０％収率であった。修飾Ｔヌクレオシドを含む最終ＤＮＡオリゴヌクレオチドの優れた収率も報告された。
【化３４】
2021500003.tif 000038
【０１５７】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン−３’−Ｏ−ＴＢＤＰＳ(２)。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン(１)(１５ｇ、１当量、２７.５４mmol)を１時間高真空下乾燥させた。無水ＤＣＭ(３００ml)をＮ２下加えた。この溶液に先ずイミダゾール(４.６９ｇ、２.５当量、６９mmol)を固体として、次いでｔ−ブチルジフェニルシリルクロライド(９.１ml、１.３当量、３５.８mmol)を加えた。反応混合物を、Ｎ２下、ｒｔで１時間撹拌した。ＴＬＣで反応の完了を確認した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液(１００ml)で反応停止させ、５分間撹拌した。ＤＣＭ(１００ml)を反応混合物に加え、水層をＤＣＭで２回抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３(２００ml)、次いで塩水(２００ml)で洗浄した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥後、溶媒を減圧下除去し、減圧下で十分乾燥させて、２を白色／明黄色泡状物として得た。化合物２を粗製で次工程に使用した。LC-MS (ESおよびCI): (-ve) m/z 782 (M-H+), (-ve) m/z 817 (M+Cl-). 1H NMR (CDCl3) δ 0.99 (s, 9H, tBu), 1.27 (s, 3H, Me), 1.96-2.06 (m, 1H, H-2'), 2.25-2.35 (m, 1H, H-2'), 2.80 (dd, J=4, 12Hz, 1H, H-5'), 3.15 (dd, J=4, 12Hz, 1H, H-5'), 3.71 (s, 6H, OMe), 3.96-4.01 (m, 1H, H-4'), 4.45-4.50 (m, 1H, H-3'), 6.42 (dd, J=8, 12Hz, 1H, H-1'), 6.79-6.72 (m, 4H, aromatics), 7.68-7.00 (m, 24H, aromatics+CH), 8.01 (s, 1H, NH)
【０１５８】
３’−Ｏ−ＴＢＤＰＳ−チミジン(３)。粗製５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン−３’−Ｏ−ＴＢＤＰＳ(２)(最大２７.５４mmol)を、Ｎ２下、無水ＭｅＯＨ(３００ml)に溶解した。ＴＦＡ(１０体積％、３０ml)を加え、反応物を、Ｎ２下、２時間３０分撹拌した。反応の完了はＴＬＣによった。飽和ＮａＨＣＯ３(２００ml)で反応を注意深く停止させ、ｒｔで１０分間撹拌した。ＭｅＯＨを減圧下除去した。残存混合物をＤＣＭ(３００ml)で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で分配した。水相をＤＣＭで２回抽出し、次いで有機相を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮した。粗製物質をカラム(Biotage、１００ｇ  Ultra-Si、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ)で精製して、化合物３を白色泡状物として得た(13.15g, 99%)。LC-MS(ESおよびCI): (-ve) m/z 479 (M-H+), (+ve) m/z 481 (M+H+). 1H NMR (d6 DMSO) δ 1.46 (s, 9H, tBu), 2.15 (s, 3H, Me), 2.35-2.53 (m, 2H, H2’), 3.57-3.67 (m, 1H, H5’), 3.77-3.87 (m, 1H, H5’), 4.30-4.36 (m, 1H, H4’), 4.80-4.86 (m, 1H, H3’), 5.41 (t, J=5.2Hz, 1H), 6.72 (dd, J=8.7, 5.7Hz, 1H), 7.82-7.94 (m, 6H, aromatics+CH), 8.00-8.05 (m, 5H, aromatics), 11.73 (s, 1H, NH)
【０１５９】
化合物(３)の別の合成。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン(１、４０ｇ、７３.４mmol)を、ＴＢＤＰＳＣｌ(１.３当量)およびイミダゾール(２.５当量)でＤＣＭ(０.１２７Ｍ)中、ｒｔで２時間、続いてＰＴＳＡ(３当量)でメタノール(０.０９７Ｍ)中１時間処理して、化合物(３)を、ワンポット製造で、１００％収率で得た。シリル化工程後後処理を必要とせず、溶媒蒸発および一夜乾燥工程を省き、空気に曝しながら反応させた。ＴＦＡの代わりのＰＴＳＡの使用は、チミジンヌクレオシドのリボースの酸触媒転位を減少させた。
【０１６０】
３’−Ｏ−ＴＢＤＰＳ−５’アルデヒド−チミジン(４)。３’−Ｏ−ＴＢＤＰＳ−チミジン(３)(５.１６ｇ、１当量、１０.７５mmol)を、高真空レーン下で一夜および４Å  ＭＳで乾燥させた。次いで、無水ＤＣＭ(２５０ml)を化合物３および４Å  ＭＳにＮ２加え、次いで氷浴で４℃に冷却した。デス・マーチン・ペルヨージナンをＮ２下少しずつ加え(３×１.８２３ｇ、１.２当量、１２.９mmol)、反応物を、Ｎ２下、４℃で１時間３０分撹拌した。反応をＬＣＭＳにより確認した。反応物をｒｔに温め、反応物をＮ２下４時間または反応完了まで撹拌した。完了したら、Ｎａ２ＳＯ３溶液(１００ml)を反応物に加え、ｒｔで１０分撹拌した。２相を分離し、水相をＤＣＭで２回抽出した。有機相を次いでＮａ２ＣＯ３および飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮した。粗製物質を高減圧下で一夜乾燥させて、次工程に備えた。トルエンとの共蒸発を同様に行い、乾燥度を改善させ得る。LC-MS(ESおよびCI): (-ve) m/z 477 (M-H+), (-ve) m/z 513 (M+Cl-), (+ve) m/z 479 (M+H+), (+ve) m/z 501 (M+Na+);(-ve) m/z 495 (水和物-H+), (+ve) m/z 519 (水和物+Na+)。
【０１６１】
アルデヒド(４)の別の合成。化合物(３、０.５ｇ)を、ＥＤＣ(３当量)およびＤＣＡ(０.５当量)でＤＭＳＯ中、ｒｔで６時間処理して、化合物(４)を、デス・マーチン・ペルヨージナン方法で観察されたカルボン酸への過剰酸化物の副生を避けて(およびカルボン酸副生物質を消去するために次工程で大過剰のグリニャール試薬の添加が必要)、フィッツナー・モファット酸化により得た。
【０１６２】
３’−Ｏ−ＴＢＤＰＳ−５’ビニル−チミジン(５)。３’−Ｏ−ＴＢＤＰＳ−５’アルデヒド−チミジン(４)(５.１６ｇ、１当量、１０.７５mmol)を、高真空レーン下で一夜および４Å  ＭＳで乾燥させた。次いで、無水ＴＨＦ(１５０ml)を、Ｎ２下化合物３および４Å  ＭＳに加えた。１Ｍ  臭化ビニルマグネシウムのＴＨＦ溶液(２１.５ml、２当量、２１.５mmol)を、ｒｔで３０分かけて非常にゆっくり加えた。反応物をｒｔでＮ２下２時間撹拌し、ＬＣＭＳで確認した。必要であれば、若干余分の臭化ビニルマグネシウム(０.３当量、３.２２ml)を滴下し、反応物をさらに１時間撹拌し得る。完了したら、１Ｍ  ＡｃＯＨの水溶液(６０ml、ｐＨ＝６)を反応物に加え、ｒｔで１０分撹拌した。反応物をＤＣＭで希釈し、２相を分離した。水相をＤＣＭで２回抽出した。次いで有機相を２回飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮した。残留物をカラム(Biotage、１００ｇ  ｋｐＳｉ、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ)で精製して、化合物５をクリーム色泡状物として得た(２.０１ｇ、２工程で３７％)。LC-MS(ESおよびCI): (-ve) m/z 505 (M-H+), (-ve) m/z 541 (M+Cl-), (+ve) m/z 507 (M+H+). 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 1.01 (d, J=10.1 Hz, 9H, tBu), 1.80 (s, 3H, Me), 2.02-2.22 (m, 2H, H2’), 3.48-3.54 (m, 0.6H, H5’）, 3.81 (t, J=2.2 Hz, 0.6H, H4’), 3.97-4.02 (m, 0.4H, H4’), 4.13-4.22 (m, 0.4H, H5’), 4.33-4.50 (dm, 1H, H3’), 4.82-5.17 (m, 2H, CH2=CH-), 5.24-5.43 (m, 0.4H, CH2=CH-), 5.52-5.75 (m, 0.6H, CH2=CH-), 6.04-6.29 (ddd, J=21.2, 8.3, 6.0 Hz, 1H, H1’), 7.26-7.46 (m, 7H, Arom + CH), 7.50-7.66 (m, 4H, Arom), 8.23 (s, 1H, NH)
【０１６３】
アリルアルコール(５)の別の合成。アルデヒド(４)を、塩化ビニルマグネシウム(２.５当量)でＴＨＦ中、ｒｔで処理して、化合物(５)を得た。ブロマイドの代わりのクロライド反応剤の使用は、所望の生成物のクロライドバリアントの導入なく、所望の生成物の臭素化アナログ(上記方法で１４％)の産生を減少できた。
【０１６４】
３’−Ｏ−ＴＢＤＰＳ−５’ビニル−５’ＤＭＴ−チミジン(６)。３’−Ｏ−ＴＢＤＰＳ−５’ビニル−チミジン(５)(２.０１ｇ、１当量、３.９７mmol)を、高真空レーンで一夜乾燥させた。ＡｇＮＯ３を加え、固体を高真空下、さらに３０分乾燥させた。無水ＤＣＭをＮ２下反応物に加え、次いでコリジン(１.０５ml、２当量、７.９４mmol)および最後にＤＭＴ−Ｃｌ(２.０２ｇ、１.５当量、５.９６mmol)を固体として加えた。反応物をＮ２下３時間撹拌し、完了をＴＬＣ(ＰＥ／ＥｔＯＡｃ、６：４＋１％ＮＥｔ３)で確認した。次いで反応物をＤＣＭで希釈し、セライトで濾過し、固体をさらなるＤＣＭで洗浄した。次いで、溶液を１％Ｈ２ＳＯ４(６０ml)で分配し、ＤＣＭで抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３で２回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮して、粗製６を泡状物として得た。これをさらに精製することなく次工程で使用した。LC-MS(ESおよびCI): (-ve) m/z 807 (M-H+), (+ve) m/z 809 (M+H+)
【０１６５】
別法：化合物(５、６.７ｇ、１３.２mmol)および２,３,５−コリジンの無水ＤＣＭ溶液を、モレキュラー・シーブで３０分間乾燥させた。得られた次いで、溶液を４,４’−ジメトキシトリフェニルメチルクロライド(６.７ｇ)およびモレキュラー・シーブを仕込んだフラスコに加えた。ＡｇＮＯ３を加え、反応物を１時間撹拌した。得られた混合物をＤＣＭ(４０mL)で希釈し、珪藻土で濾過し、ＤＣＭ(３×４０mL)で濯いだ。ＭｅＯＨ(２４０mL)を濾液に加え、混合物を１０分間撹拌し、次いで分液漏斗に移し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液(２×４００mL)で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、減圧下濃縮して、粗製生成物を黄色泡状物として得た。
【０１６６】
５’ビニル−５’ＤＭＴ−チミジン(７)。３’−Ｏ−ＴＢＤＰＳ−５’アリル−５’ＤＭＴ−チミジン(６)(１当量、先の工程から３.９７mmol)を、高真空レーン下乾燥させた。無水ＴＨＦ(１２ml)をＮ２下加え、４℃に冷却した。１Ｍ  ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液(４.３７ml、１.１当量、４.３７mmol)を４℃で滴下した。４℃で５分間の後、反応物をｒｔに温め、Ｎ２下３時間撹拌した。反応の完了はＴＬＣ(ＰＥ／ＥｔＯＡｃ、３：７＋１％ＮＥｔ３)によった。反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で分配した。水相をＥｔＯＡｃで抽出し、次いで有機相を飽和ＮａＨＣＯ３、次いで塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下濃縮した。残留物をカラム(Biotage、２５ｇ  ＫｐＳｉ、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＋１％ＮＥｔ３)で精製して、化合物７を白色泡状物として得た(１.８１ｇ、２工程で８０％)。LC-MS(ESおよびCI): (-ve) m/z 569(M-H+), (+ve) m/z 571(M+H+). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.46 (s, 1H, Me), 1.65 (s, 2H, Me), 1.97-2.13 (m, 2H, H2’), 3.64 (m, 1H, H4’), 3.85 (dd, J=8.0, 4 Hz, 0.4H, H5’), 3.92 (dd, J=8.0, 4 Hz, 0.6H, H5’), 4.31-4.45 (m, 1H, H3’), 4.55-4.86 (m, 2H, CH=CH2-), 5.27 (dd, J=7.4, 4.8 Hz, 1H, OH), 5.52-5.71 (m, 1H, CH=CH2-), 6.11 (dt, J=8.1, 5.8 Hz, 1H, H1’), 6.86 (dd, J=8, 4 Hz, 4H, Arom.), 7.13-7.35 (m, 7H, Arom. +CH), 7.40-7.50 (m, 3H, Arom.), 11.35 (s, 1H)
【０１６７】
５’ビニル−５’ＤＭＴ−チミジン−ホスホロアミダイト(８)。５’ビニル−５’ＤＭＴ−チミジン(８００mg、１.４mmol)を、高真空レーン下乾燥させた。無水ＤＣＭ(７ml)をＮ２下加え、モレキュラー・シーブと１０分間、ｒｔで撹拌した。溶液に、ヒューニッヒ塩基(０.７４ml、４.２mmol)、続いて２−シアノエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(４０７μl、０.５２mmol)を加えた。反応物を、ｒｔでＮ２下３時間撹拌した。反応の完了はＴＬＣ(ＰＥ／ＥｔＯＡｃ、４：６)によった。反応減圧下濃縮した。残留物をカラム(Biotage、２５ｇ  ＫｐＳｉ、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＋１％ＮＥｔ３)で精製して、化合物８を白色泡状物として得た(９３０mg)。LC-MS(ESおよびCI): (-ve) m/z 770(M-H+), (+ve) m/z 771(M+H+). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.96-1.27 (m, 21H), 1.50 (d, J=5.9 Hz, 1H), 1.66 (s, 3H), 2.02-2.37 (m, 3H), 2.58-2.74 (m, 2H), 2.78 (td, J=5.8, 3.9 Hz, 1H), 3.46-3.69 (m, 6H), 3.76-3.93 (m, 2H), 3.96-4.10 (m, 2H), 4.61 (ddd, J=17.5, 14.2, 8.6 Hz, 2H), 4.68-4.98 (m, 3H), 5.43-5.79 (m, 1H), 6.04 (dt, J=9.6, 5.1 Hz, 1H), 6.13 (dt, J=10.7, 6.9 Hz, 0H), 6.85 (ddt, J=8.2, 5.2, 2.4 Hz, 6H), 7.09-7.34 (m, 11H), 7.34-7.50 (m, 4H), 11.37 (d, J=6.1 Hz, 1H). 31P NMR (162 MHz, DMSO) δ 147.94, 147.16, 147.03
【０１６８】
開裂効率分析
開裂効率を、高プライマー密度ＰＡＺＡＭ表面(４０〜６０ｋ)で評価した。(非パターン化)ＨｉＳｅｑ(登録商標)フローセルを、ここに記載する標準法に従い調製した。ノルボルネン由来シランを、ＣＶＤ方法、続いて基質表面へのポリマー(ＰＡＺＡＭ)のクリックカップリング、続いてポリマー表面にアリルＴヌクレオシドアナログ(５’−アルキン−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ、ここで、Ｘは上記修飾Ｔヌクレオシドが取り込まれた位置を示す)を含む修飾Ｐ７オリゴを移植するための第二クリックカップリング法を使用して、基質表面に沈着させた。
【０１６９】
修飾Ｐ７オリゴを標準Ｐ７オリゴと類似密度でＰＡＺＡＭフローセルに移植した。修飾Ｐ７オリゴの移植効率も、標準５’官能化Ｐ５およびＰ７オリゴに類似した。フローセル表面を、１mM  Ｎａ２ＰｄＣｌ４、１０mM  ＴＨＰの１×ＥＡ取り込み混合物(５０mM  エタノールアミン−ＨＣｌ(ｐＨ９.９)、５０mM  ＮａＣｌおよび０.０５％Ｃｈａｐｓ含有)溶液で、６０℃で１０分間処理した。ＴＥＴ−ＱＣアッセイを、in situで作製されたＰｄ(０)錯体で処理後の表面からのアリルＴ修飾Ｐ５オリゴの開裂の成功の証明に使用した。
【０１７０】
図２Ａは、Ｐｄ(０)処理前後のフローセル表面のＴｙｐｈｏｏｎ画像を図示する。図２Ｂは、修飾Ｐ５オリゴと標準対照で処理したフローセル表面を比較する、Ｐｄ(０)処理前後のプライマー密度の変化を示す。低プライマー密度および高プライマー密度範囲両者で、修飾Ｐ５オリゴを移植したＰｄ(０)処理フローセル表面は、蛍光強度の相当な変化を示した。結果は、この方法を使用して、極めて効率的な開裂(約９５％、蛍光アッセイ)を示唆した。比較して、標準Ｐ５オリゴ移植フローセル表面は蛍光強度に大きな変動は示さず、標準Ｐ５オリゴはＰｄ(０)錯体で開裂されなかったことを示した。
【０１７１】
配列決定ラン結果分析
上記修飾アリルＴヌクレオシドが効果的開裂を受ける能力を、短配列決定ランの実施によりさらに分析した。この実験において、フローセルを、上記に準じて製造した。それ故に、アリル−Ｔ修飾Ｐ５アルキンオリゴおよび標準Ｐ７アルキンオリゴを、種々の表面プライマー密度でＰＡＺＡＭ被覆フローセルに移植した。効率的再合成を確実にするために、アリル修飾の位置を、修飾Ｐ５オリゴの３’末端に向けてさらにシフトさせた。ＳＢＳフローセル製作に使用した移植プライマーの配列は、次のとおり記載される。
Ｐ５：５’−アルキン−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＸＣＴＡＣＡＣ
Ｐ７：５’−アルキン−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ(８−オキソＧ)ＡＴ
Ｘ＝スキーム１に記載のとおりアリル修飾。
【０１７２】
典型的開裂条件は、アリル−Ｐ５移植表面とＮａ２ＰｄＣｌ４／ＴＨＰ溶液の６０℃で１０分間のインキュベーションを含む。Ｐｄ(０)処理ＰＡＺＡＭ表面はこれらの条件で安定であり、数百サイクルの配列決定を支持するために進められ得る。さらに、他の副反応は検出されず、Ｐ７オリゴの続く開裂で、ＰＥＴ再合成により間接的に決定されるとおり、影響を受けないままであり、アリルアプローチの直交性および特異性が確認された。
【０１７３】
図３Ａは、非パターン化高プライマー密度フローセルに由来するＴＥＴ色素表面蛍光ＱＣアッセイ(ＴＥＴ−ＱＣ)を示す棒グラフである。チャネル１〜４において、表面はアリル修飾Ｐ５オリゴおよび標準Ｐ７オリゴで移植された。チャネル５〜８において、表面は標準Ｐ５／Ｐ７オリゴで移植された。結果は修飾および標準Ｐ５オリゴ間で同等であった。図３Ｂは、図３Ａに記載するＴＥＴ−ＱＣ後のフローセル表面のＴｙｐｈｏｏｎ画像を図示する。同様に、両者で検出可能なシグナルが残っていなかったため、チャネル間の可視差異は特定されなかった。予備的データは、クラスター密度の点で修飾Ｐ５オリゴおよび標準Ｐ５オリゴに特に差はないことを示唆した。
【０１７４】
Ｎａ２ＰｄＣｌ４／ＴＨＰＩを含む開裂溶液は、室温で数日の保存で安定であり、時間が経った混合物がなおアリル修飾Ｐ５オリゴを開裂できることも観察された。
【０１７５】
実施例２
この実施例で、ここに記載するＰｄ(０)線形化方法およびジオール開裂方法を、Ｐ１５／Ｐ１７プライマーを移植した新規タイプのフローセルで試験し、ＭｉＳｅｑ(登録商標)(２チャネル装置として設定)で配列決定データを集め、Ｐ５／Ｐ７プライマーを移植した標準フローセルと比較し、図１に記載する酵素線形化に使用した。新規フローセルおよび標準フローセル両者ともＰＡＺＡＭポリマーで被覆し、表面のプライマー密度は両タイプのプライマーで約２００Ｋを目指した。
【０１７６】
配列決定は、両フローセルでＮｏｖａＳｅｑTM取り込み混合物で行い、２０℃で画像処理を実施した。各線形化工程(リード１およびリード２)前、フローセルをｅｘｏ処理して、何らかの過剰の未使用表面プライマーを除去した。標準表面プライマー(Ｐ５／Ｐ７)について、線形化をリード１ではＵＳＥＲ酵素(ＬＭＸ１)で３８℃で２０分インキュベーションおよびリード２ではＦｐＧ酵素で４０℃で２０分インキュベーションで実施した。新規Ｐ１５／Ｐ１７表面プライマーについて、線形化をリード１ではＴＨＰおよびアスコルビン酸ナトリウム含有パラジウム混合物(６０mM／６mM／６mM)で６０℃で２分インキュベーションおよびリード２では過ヨウ素酸ナトリウム混合物で２０℃で１０分フラッシュで実施した。これらのデータに示される配列決定ライブラリーはＰｈｉＸであり、ランは２×１５１サイクルであった。配列決定結果を下記表に要訳する。
【表３】
2021500003.tif 000039
【０１７７】
配列決定データは、Ｐｄ(０)補助化学線形化が配列決定で良好に働き、初期測定基準は、標準と比較して極めて類似することを示唆する。クラスター通過フィルター(％ＰＦ)、フェージング／プレフェージング、％アライメントは、Ｐ５／Ｐ７およびＰ１５／Ｐ１７表面プライマー両者で等しい。％誤差はＰ１５／Ｐ１７移植フローセルのリード１でわずかに高かったが、なおかなり良好(図４に示すとおり)であり、フローセル間変動も同様に生じ得る。リード２の％誤り率は同等である。さらに、線形化に必要な時間は、新規タイプのフローセルを使用したとき、リード２で２倍およびリード１で１０倍減少した。
【０１７８】
実施例３
この実施例で、実施例１に記載したアリルＴヌクレオシドを、現在のイルミナの製造ワークフローをさらに合理化するために、検出可能標識(すなわち、蛍光標識)でさらにタグ付けし得る。色素標識アリルＴヌクレオシドがＰ５オリゴに取り込まれたら、それは、完了直後、移植反応の直接定量化を可能とする。現在の手順において、この工程は別のハイブリダイゼーションアッセイとして実施される。
【０１７９】
色素標識修飾Ｔヌクレオチドを使用するＰｄ(０)開裂反応を、先の実施例に記載するものに類似する合成方法を使用して、スキーム３に図説する。
【化３５】
2021500003.tif 000040
【０１８０】
実施例４
この実施例で、ジオールリンカー反応剤をスキーム４に記載のとおり製造した。本方法は、米国特許８,７１５,９６６に記載される合成を改善する。
【化３６】
2021500003.tif 000041
【０１８１】
ジオール−１。本方法は、ジオール−１の合成の溶媒としてＤＭＦを省く。ＤＭＦは、エマルジョン形成および水相への生成物の望ましくない分布により水性抽出を複雑にし、先に報告された手順では、後処理前のその除去は時間がかかった。先のＤＭＦ／ＤＣＭ混合物はＥｔＯＡｃに変えられ、これは、処理時間を３日から１〜２日に短縮する(クロマトグラフィーを含む)。さらに、先の方法ではビス−トリチル化副生成物の形成が収率を下げた。反応剤添加の順序を、ヘキサンジオール／ＤＩＰＥＡの混合物への固体ＤＭＴｒ−Ｃｌの少量ずつの添加からヘキサンジオール／ＤＭＴｒ−Ｃｌの混合物への液体ＤＩＰＥＡの滴下へ変えることにより、所望の生成物への反応の選択性が約１０％改善した。ある実施態様において、この反応の生成物を、ＤＭＴｒ−ＯＨおよびビス−トリチル化副生成物除去のためのクロマトグラフィーをせずに、粗製で使用し得る。
【０１８２】
ジオール−３。ＴＰＡＰ／触媒ＮＭＯを使用する先の酸化方法は、対応するカルボン酸への過剰酸化をもたらし、最大３〜４日かかった。ここで、ＴＰＡＰ／ＮＭＯを、ＤＣＭおよびＮａＨＣＯ３水溶液の二相混合物中のＴＥＭＰＯ／漂白剤に置き換えた。漂白剤を残りの反応剤の混合物に滴下し、漂白剤添加が完了したら、反応は完了した。生成物は水性抽出により単離され、過剰酸化は最小であり、６６〜９２％の収率であり、全手順は速かった(１.５日)。他の実施態様において、ジオール−３およびジオール−４の合成は、中間体クロマトグラフィー工程を省くために短縮され得る。過剰のｔＢｕＯＫは、出発物質における何らかのカルボン酸物質の中和に必要であり得る。
【０１８３】
ジオール−２。ジオール−２の合成の先の方法は、反応完了を確実にするために、４８時間還流と、３６時間での幾つかの操作を必要とした。反応濃度増加は、４８時間から１２〜２４時間への還流時間短縮を可能とした。先のプロトコールにおいて、粗製ジオール−２を水で抽出した。水の除去が必要であり(続く工程が感湿性であるため)、これは、スケール依存的に時間を要した。工程は、ジオール−２のＤＣＭでの抽出ならびに何らかの酢酸除去および溶媒除去時間最小化のためのＮａＨＣＯ３水溶液での洗浄により改善された。全処理時間は３日から２日に短縮された。生成物は、ＤＣＭ中の原液として保存した。溶液を、ジオール−４反応前、３Å  モレキュラー・シーブ上で一夜保存した。
【０１８４】
あるいは、ジオール−２を、精製を単純化するために対応するアルコールに加水分解し得る。次いでアルコールを続く工程で使用して、ジオール−４を直接提供する。
【０１８５】
ジオール−５。クロマトグラフィー精製工程を省き、処理時間を１日縮めた。さらに、ＤＭＦをＤＣＭに変えて、水性後処理中の溶媒／洗浄溶液体積減少を可能とすることにより、手順の効率を改善し得る。
【０１８６】
ジオール−６。クロマトグラフィー精製工程を省き得る。
【０１８７】
ジオール−７。ジオール−７の合成は、ＴＢＡＦを使用するエステル化および脱シリル化の２つの短縮手順を含む。先に報告された手順において、顕著な１,４−アセチル移動がＴＢＡＦでの脱シリル化中観察され相当量の望まない副生成物、ジオール−７Ｍの形成をもたらした。
【化３７】
2021500003.tif 000042
【０１８８】
この物質は、全体的収率およびジオール−７純度を減少させた。さらに、ジオール−７Ｍの続く工程への残留が、１級アルコールではなく、２級アルコール上にホスホロアミダイトを有する、ジオール−８Ｍを産生させる。プライマーへの取り込みは、非開裂可能リンカーをもたらす。本方法において、市販ＴＢＡＦバッチから望まないＮａＯＨを除去するために、ＴＢＡＦ工程をＡｃＯＨで緩衝化した。ＡｃＯＨが多すぎると、ＤＭＴｒ保護基が喪失する。反応を、１.７５当量ＡｃＯＨおよび出発物質への暴露前のＴＢＡＦとＡｃＯＨの前混合で実施した。さらに、先の方法は、後処理前のＴＨＦの蒸発を含み、現在の方法はこの蒸発工程を省き、生成物の塩基誘発分解を減じるための水相のｐＨ７への注意深い中和を含んだ。最後に、エステル化工程後のクロマトグラフィー精製は省かれている。
【０１８９】
あるいは、ジオール−５からジオール−７の合成方法は、さらなるクロマトグラフィー工程を除き、さらに短縮され得る。纏めて、本手順を、６回ではなく３回のクロマトグラフィー工程を含んで実施でき、粗製物質をジオール−４、ジオール−７およびジオール−８段階で精製する。
【０１９０】
実施例５
この実施例は、ヒドロキシル保護基として働くＡ−ＴＯＭモノマー、修飾３’ホスフェート部分の合成を記載する。(ＴＯＭ＝トリ−イソプロピルシリルオキシメチル)
【化３８】
2021500003.tif 000043
【０１９１】
工程１. ＤＭＴアデノシンのベンゾイル化(Ａ−ＯＢｚ)
【化３９】
2021500003.tif 000044
Ｎ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−５’−ＯＤＭＴ−Ｄ−アデノシン(１１.２ｇ、１７mmol)および溶媒(１：３比のピリジン／ＤＣＭ混合物、１１ml  ピリジン、３３ml  ＤＣＭ)を室温で混合して、溶液を得た。反応フラスコを０℃に冷却し、それにＤＭＡＰ(０.４１ｇ、３.４１mmol)および塩化ベンゾイル(３.９ｇ(３.２ml)、３４.１mmol)を加えた。室温に温めながら一夜撹拌し(反応進行をＴＬＣモニタリング)、極めて薄い橙色混合物と一部白色固体沈殿を得た。溶媒を、減圧下、温度＜４０℃で除去した。残留物をＡｃＯＥｔ(約５００mL)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で２回(２×２５０mL)、水(２５０mL)で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒蒸発およびトルエンとの共蒸発後、白色泡状物が得られ、一定重量となるまで減圧下乾燥させた。物質を精製することなく次工程で使用した。
【０１９２】
工程２. 脱トリチル化(Ａ−ＯＨ)
【化４０】
2021500003.tif 000045
Ａ−ＯＢｚ(１３.６９ｇ、未精製、１７mmol)をジクロロメタン／メタノール混合物(１：１、３００ml)に溶解し、窒素下０℃に冷却した。トリフルオロ酢酸(２.７５ml、３６mmol)をシリンジを介して添加した。反応物を、室温に温めながら１時間撹拌した。ＴＬＣで反応の進行をモニターした。０℃で固形ＮａＨＣＯ３(３ｇ、３６mmol)添加により、反応停止させた。温度＜４０℃で溶媒を除去し、残留物をＡｃＯＥｔ(約８００mL)で希釈し、水(５×２５０ml)で５回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下乾燥させて、白色泡状物を得た。カラムクロマトグラフィー(１：１石油エーテル／酢酸エチルから酢酸エチルの勾配溶出)での精製により、標的生成物を白色粉末として得た。(５.０ｇ、６０％収率(２工程)、１００％酢酸エチル中Ｒｆ＝０.３５)  1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.25 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.07 (ddt, J=10.1, 7.0, 1.4 Hz, 4H), 7.75-7.68 (m, 1H), 7.68-7.62 (m, 1H), 7.62-7.51 (m, 4H), 6.64 (dd, J=8.6, 5.9 Hz, 1H), 5.68 (dt, J=6.1, 1.9 Hz, 1H), 5.28 (t, J=5.7 Hz, 1H), 4.31 (td, J=4.4, 1.8 Hz, 1H), 3.72 (tdd, J=11.8, 6.4, 4.7 Hz, 2H), 3.19 (ddd, J=14.4, 8.7, 6.1 Hz, 1H), 2.75 (ddd, J=14.1, 5.9, 1.8 Hz, 1H)
【０１９３】
工程３. 酸化
【化４１】
2021500003.tif 000046
モレキュラー・シーブ(４Å)を含むＡ−ＯＨ(１.０ｇ、２.１８mmol)のジクロロメタン(５０ml)を、窒素ガス下、０℃に冷却した。別のフラスコで、デス・マーチン・ペルヨージナン(１.１１ｇ、２.６１mmol)を、モレキュラー・シーブでジクロロメタン(１０ml)に溶解した。デス・マーチン溶液をＡ−ＯＨに加え、室温に温めた。ＬＣＭＳで反応をモニターし、１時間後、飽和重炭酸ナトリウム溶液で反応停止させた。反応停止混合物をジクロロメタン(約２５０ml)で希釈し、重炭酸ナトリウム溶液(１００ml)および水(２×１００ml)で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下乾燥させて、白色泡状物を得て、これをさらに精製することなく次工程で使用した。
【０１９４】
工程４. ウィッティヒ反応(Ａ−ＣＨ＝ＣＨ２)
【化４２】
2021500003.tif 000047
メチルトリフェニルホスホニウムブロマイド(５.８３ｇ、１６mmol)を、撹拌子、モレキュラー・シーブおよび窒素ラインを含むオーブン乾燥二首丸底フラスコで乾燥ＴＨＦ(４０ml)と混合した。フラスコの首の一つは、固体添加チューブにカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドを保持した。溶液を０℃に冷却した。カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドを、添加チューブを、空気にさらされることなくまたはシステムを開放することなく固体が撹拌溶液に落ちることを可能にするジョイントに回すことにより添加した。溶液は濁った白色から黄色に変わった。０℃で１時間撹拌した。注：この工程の全固体反応剤は、五酸化リン存在下、高真空で一夜乾燥させた。シリンジ、針、撹拌子、活性化モレキュラー・シーブも同じタンクで乾燥させた。
【０１９５】
黄色固体を、Ａ−ＣＨＯ(２.５ｇ、５.４４mmol)のＴＨＦ(１５ml)溶液に、０℃でワイドゲージ針およびシリンジで加えた。黄色から橙色に色が変化した。０℃で３時間撹拌し、ＬＣＭＳでモニターした。
【０１９６】
反応混合物を、水(３００ml)およびＡｃＯＥｔ(３００mL)を含むフラスコに０℃で注加することにより、反応物を後処理した。１０分間撹拌し、その後分液漏斗に移した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液(３×１００ml)および塩水(１００ml)で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下乾燥させて、褐色−黄色泡状物。カラムクロマトグラフィー(ジクロロメタンから５％メタノール／ＤＣＭで勾配溶出)での精製により、標的生成物をクリーム状黄色泡状物として得た。(２.５９ｇ、５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ中Ｒｆ＝０.５３)  1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.21 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.05 (d, J=7.2 Hz, 2H), 7.65 (t, J=7.4 Hz, 1H), 7.57 (q, J=7.9, 7.3 Hz, 3H), 6.50 (t, J=6.7 Hz, 1H), 6.06 (ddd, J=17.2, 10.4, 6.7 Hz, 1H), 5.55 (d, J=4.4 Hz, 1H), 5.29 - 5.10 (m, 2H), 4.42 (p, J=4.2 Hz, 1H), 4.30 (dd, J=6.7, 3.6 Hz, 1H), 2.94 (dt, J=13.1, 6.4 Hz, 1H), 2.40 (ddd, J=13.3, 6.5, 4.3 Hz, 1H)
【０１９７】
工程５. ジオール酸化(Ａ−ＯＨＯＨ)
【化４３】
2021500003.tif 000048
Ａ−ＣＨ２ＣＨ２(０.６８ｇ、１.４９mmol)のＴＨＦ(７ml)溶液を、撹拌子を備え、窒素下にあるフラスコに入れた。４−メチルモルホリンＮ−オキシド(０.２６２ｇ、２.２３５mmol)を固体として測り取り、反応フラスコに加えた。水(７ml)も加えた。四酸化オスミウム(４％水溶液、２８５μl、０.０４５mmol)を反応フラスコに加えた。反応物を４０℃で一夜加熱した。反応進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳでモニターした。固体としてのチオ硫酸ナトリウムを加えて、反応停止させた。混合物を３０分間撹拌し、その後酢酸エチル(１５０ml)および重炭酸ナトリウム溶液で後処理した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液(３×１００ml)で３回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下乾燥させて、灰白色のゆっくり結晶化する固体を得た。カラムクロマトグラフィー(ジクロロメタンから１０％メタノール／ＤＣＭでの勾配溶出)での精製により、標的生成物を無色油状物として得た。(０.１３ｇ、１９％収率、５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ中Ｒｆ＝０.２８)  1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.25 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.07 (ddt, J=9.6, 7.2, 1.4 Hz, 4H), 7.74-7.68 (m, 1H), 7.68-7.62 (m, 1H), 7.62-7.47 (m, 5H), 6.62 (dd, J=8.9, 5.8 Hz, 1H), 5.82 (dt, J=5.8, 1.5 Hz, 1H), 5.48 (d, J=5.1 Hz, 1H), 4.69 (t, J=5.5 Hz, 1H), 4.31 (dd, J=5.0, 1.5 Hz, 1H), 3.81 (p, J=5.3 Hz, 1H), 3.48 (dh, J=22.3, 5.5 Hz, 2H), 3.18 (ddd, J=14.4, 9.0, 5.9 Hz, 1H), 2.70 (ddd, J=14.4, 6.0, 1.5 Hz, 1H)
【０１９８】
工程６. シリル化(Ａ−ＯＨＴＯＭ)
【化４４】
2021500003.tif 000049
Ａ−ＯＨＯＨ(０.１２８ｇ、０.２６２mmol)のＤＣＭ溶液を、撹拌子および窒素ラインを含むフラスコ中、ＤＣＭ(１.５ml)に溶解した。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルスズジクロライド(８０mg、０.２６２mmol)およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(１８２μl、１.０５mmol)を、室温で３０分間加えた。トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチルクロライド(ＴＯＭ−Ｃｌ、７９μl、０.３４１mmol)をマイクロピペットで加えた。反応進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳでモニターした。反応物を、一夜室温に置いた。反応後処理を酢酸エチル(２００ml)中で実施した。飽和重炭酸ナトリウム溶液(３×１００ml)で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下乾燥させて、黄色／褐色油状物を得た。カラムクロマトグラフィー(ジクロロメタンから８％メタノール／ＤＣＭの勾配溶出)による精製により、標的生成物を黄色−白色泡状物として得た(０.１４ｇ、７９％収率、５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ中Ｒｆ＝０.５)  1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.25 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.73-8.65 (m, 1H), 8.06 (tt, J=7.5, 1.4 Hz, 4H), 7.76-7.62 (m, 2H), 7.62-7.46 (m, 4H), 6.61 (dd, J=8.9, 5.7 Hz, 1H), 5.82 (d, J=5.7 Hz, 1H), 5.65 (d, J=5.3 Hz, 1H), 4.84 (s, 2H), 4.27 (dd, J=5.4, 1.5 Hz, 1H), 4.06-3.93 (m, 1H), 3.62 (ddd, J=42.1, 10.3, 5.2 Hz, 2H), 3.22 (ddd, J=14.7, 9.1, 5.8 Hz, 1H), 2.74-2.65 (m, 1H), 0.94 (m, 21H, TOM)
【０１９９】
工程７. トリチル化(Ａ−ＴＯＭ−ＤＭＴ)
【化４５】
2021500003.tif 000050
乾燥Ａ−ＯＨＴＯＭ(０.１４ｇ、０.２０７mmol)、(４,４’−ジメトキシトリフェニルメチルクロライド(ＤＭＴ−Ｃｌ、０.１０５ｇ、０.３１１mmol)および硝酸銀(５３mg、０.３１１mmol)を、乾燥ＤＣＭ(１.５ml)およびコリジン(２,４,６−トリメチルピリジン)(５５μl、０.４１４mmol)と共にフラスコに仕込んだ。反応物を室温で３時間撹拌した。反応進行をＴＬＣおよびＬＣＭＳでモニターした。反応混合物をＤＣＭ(１００ml)で希釈し、焼結ガラス漏斗で濾過した。ＤＣＭ溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液(５×１００ml)で洗浄した。ＤＣＭ層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下乾燥させて、黄色／褐色油状物を得た。カラムクロマトグラフィー(ジクロロメタンから１０％メタノール／ＤＣＭでの勾配溶出)での精製により、標的生成物を粘性黄色油状物として得た(０.１７ｇ、８５％収率、５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ中Ｒｆ＝０.４６)。
【０２００】
工程８. (Ａ−３’ＯＨ)
【化４６】
2021500003.tif 000051
メタノールおよびＴＨＦの混合物(４：５、計０.９ml)中のＡ−ＴＯＭ−ＤＭＴ(５６mg、５６μmol)の溶液を０℃に冷却した。水酸化ナトリウム(４Ｍ、０.１ml、過剰)を加え、０℃で１５分間撹拌した。ＴＬＣおよびＬＣＭＳで反応をモニターした。酢酸(１Ｍ、０.５ml)を使用して、ｐＨがｐＨ８を下回らないことを確認しながら反応停止させた。反応混合物を酢酸エチル(ＥＡ、１００ml)で希釈し、溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液(３×５０ml)で洗浄した。ＥＡ層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下乾燥させた。残留物をカラムクロマトグラフィー(ＥＡ／石油エーテル(２５％)から１００％ＥＡの勾配溶出)で精製して、白色泡状物を得た(０.０２ｇ、４０％収率、１００％ＥＡ中Ｒｆ＝０.３８)。
【０２０１】
工程９. ホスホロアミダイト形成(原子モノマー)
【化４７】
2021500003.tif 000052
Ａ−３’ＯＨ(９２mg、１０５μmol)を、モレキュラー・シーブおよび磁気撹拌子を含むフラスコに加え、その後ＴＨＦ(乾燥、０.２ml)を室温で窒素ガス下加えた。Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(１１０μl、６３０μmol)をＴＨＦ溶液に加えた。最後に、２−シアノエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(３８μl、１６９μmol)をマイクロピペットで加えた。反応物を窒素下室温で撹拌した。ＴＬＣで反応をモニターした。反応が完了したら、溶媒を減圧下除去した。残留物を室温で石油エーテル(３×２０ml)で洗浄した。次いで、残留物をＤＣＭに溶解し、濾過してモレキュラー・シーブを除去した。再び減圧下乾燥させ、その後カラムクロマトグラフィー(ＥＡ／石油エーテル(２０％)から７５％ＥＡで勾配溶出)で精製して、粘性無色油状物を得た(８０mg、７０％収率)  1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.17 (s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.06-7.99 (m, 2H), 7.64 (td, J=7.1, 1.2 Hz, 1H), 7.58-7.46 (m, 4H), 7.36 (ddd, J=15.4, 9.0, 2.8 Hz, 4H), 7.29 (t, J=7.4 Hz, 2H), 7.27-7.17 (m, 1H), 6.92-6.83 (m, 4H), 6.34 (dd, J=9.0, 5.9 Hz, 1H), 4.78-4.71 (m, 1H), 4.68 (q, J=6.6, 4.6 Hz, 1H), 4.52 (dd, J=8.5, 4.9 Hz, 1H), 4.27 (d, J=7.1 Hz, 1H), 3.85-3.69 (m, 8H), 3.62 (dp, J=10.4, 6.7 Hz, 1H), 3.34-3.22 (m, 1H), 2.78 (td, J=5.8, 1.9 Hz, 2H), 2.64 (td, J=8.8, 4.7 Hz, 1H), 2.26-2.16 (m, 1H), 2.08 (d, J=0.7 Hz, 6H), 1.21 (dd, J=15.4, 5.6 Hz, 9H), 1.12 (d, J=6.7 Hz, 6H), 0.99-0.88 (m, 2H), 0.83 (dd, J=6.3, 4.5 Hz, 18H)
【０２０２】
実施例６
モデルジヌクレオチド(Ｃ−Ｔｏｍ−Ａ)の合成
【化４８】
2021500003.tif 000053
化合物Ｃ−アミダイト(１２５mg、０.１５mmol)およびＡ−ＯＨ−Ｔｏｍ(６４mg、０.１mmol)を、減圧下、一夜Ｐ２Ｏ５で乾燥させ、無水アセトニトリル(１ml)に溶解した。Ｎ２下、エチルチオテトラゾール(ＥＴＴ、３２.５mg、０.２５mmol)を加えた。混合物をｒｔで１５分間撹拌した。ＴＬＣおよびＬＣ−ＭＳは、出発物質Ａ−ＯＨ−Ｔｏｍの完全消費を示した。デカン(５Ｍ、０.１ml)およびＤＣＭ(１ml)中のｔ−ＢｕＯＯＨ溶液を反応混合物に加え、１５分間ｒｔで撹拌した。反応混合物をＮａＨＣＯ３水溶液に注加し、水相をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機相を蒸発させ、ＮａＯＨ(０.１Ｍ、Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ／ＭｅＯＨ＝１／４／５  ｖ／ｖ中１ml)でｒｔで１時間処理した。次いで、混合物をＴＨＦ／ＭｅＯＨ(５ml／４ml)中のＨＣｌ(１Ｍ)で０.５時間処理した。反応混合物を濃縮し、Ｈ２ＯおよびＥｔＯＡｃに分配した。所望の生成物が水相から回収され、ＲＰ  ＨＰＬＣ(ＴＥＡＢ  ０.１Ｍ／ＣＨ３ＣＮ)でさらに精製した。
【０２０３】
モデル化合物Ｃ−ＴＯＭ−Ａでの開裂試験
【化４９】
2021500003.tif 000054
Ｃ−ＴＯＭ−Ａの原液を種々の脱保護条件下処理した。反応進行をＲＰ  ＨＰＬＣでモニターした。中間体Ｃ−Ａは、ＴＯＭ基がＣ−ＴＯＭ−Ａから除かれているが、ホスフェート結合が開裂されていない化合物である。下記表１は、種々の反応条件下および脱保護反応剤での脱保護結果を要約する。
【表４】
2021500003.tif 000055
【０２０４】
実施例７
この実施例で、Ｐｄ(０)錯体を製造する別法が記載され、その化学開裂活性を実施例１に記載したアリルパラジウム(II)クロライド二量体(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２およびＴＨＰからin situで産生されたＰｄ(０)錯体と比較した。in situで産生されたＰｄ(０)錯体と対照的に、一部パラジウム(II)前触媒は、化学線形化反応、例えば、Ｐ１５プライマーの化学開裂への使用前に製造および単離された。これらのＰｄ(II)前触媒は単離形態では不活性であるが、便利にはＴＨＰ存在下でin situで活性Ｐｄ(０)に還元される。これらの代替Ｐｄ前触媒は生成物安定性を改善し、貯蔵寿命を延長し得る。
【０２０５】
製造方法
(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２を、窒素下、乾燥、脱気テトラヒドロフランに溶解し、テトラヒドロフラン溶液として添加した１〜１０当量のＴＨＰで処理した。油状物の分離が観察され、油分を上清の傾捨により分離した。この油状物質を減圧下乾燥させて、黄色〜褐色または橙色粘性油状物を得た。これらの物質は水に高度に可溶性であった。１〜２当量のＴＨＰを加えたとき、[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)]Ｃｌと[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)２]Ｃｌの混合物が単離され、その両者ともＰｄ(II)錯体であった。５当量ＴＨＰを加えたとき、[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)２]Ｃｌのクリーンサンプルが得られた。これらの二つのＰｄ(II)錯体を単離し、特徴づけした。１０当量ＴＨＰを加えたとき、Ｐ１５線形化のために活性なＰｄ(０)物質が得られた。
【０２０６】
[Pd(C3H5)(THP)]Cl: 31P NMR (162 MHz, D2O): d 14 (s) ppm. 13C NMR (101 MHz, D2O): d 118.7 (d, J=5.0 Hz), 81.7 (d, J=29 Hz), 62.1 (d, J=15 Hz), 26.5 (s), 20.5 (d, J=25.0 Hz) ppm. LC-MS: [アリルPd(THP)]+;予測:355 Da, 実測:355 Da。
【０２０７】
[Pd(C3H5)(THP)2]Cl: 31P NMR (162 MHz, D2O): d 10 (s) ppm. 13C NMR (101 MHz, D2O): d 122.7 (t, J=5.3 Hz), 71.2 (t, J=14 Hz), 61.8 (t, J=7.6 Hz), 26.7 (s), 22.1 (t, J=13 Hz) ppm. LC-MS: [アリルPd(THP)2]+;予測:563 Da, 実測:563 Da. 
【０２０８】
Ｐ１５開裂への使用
(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２の１当量、２当量、５当量および１０当量処理で単離したＴＨＰ物質を、水性緩衝液中、１０mg／mLで製剤した。Ｐ１５開裂に対するこれらの製剤の活性を、ＨＰＬＣベースのアッセイを使用して評価した。このアッセイにおいて、Ｐ１５プライマー(１０μM)溶液を、１０％ｖ／ｖの各製剤で処理し、１０分間、３８℃でインキュベートし、次いで希釈およびスピンカラム処理により反応停止させ、ＨＰＬＣにより分析した。パーセンテージ開裂を、Ｐ１５と開裂産物のピーク面積の比から計算する。
【０２０９】
[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)]Ｃｌおよび[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)２]Ｃｌ((Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２と１〜５当量ＴＨＰの混合により得た)の水性製剤は、他の添加物非存在下で、Ｐ１５開裂について不活性であった。しかしながら、(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２と１０当量ＴＨＰの混合から単離した物質の水性製剤は、(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２(６mM)、ＴＨＰ(６０mM)およびアスコルビン酸ナトリウム(６mM)からin situで調製したＰｄ混合物と、同等なＰ１５開裂活性を提供した。結果は図５Ａに示された。ｄ(II)前触媒[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)]Ｃｌおよび[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)２]Ｃｌは、便利には調製中またはさらなるＴＨＰ水溶液での処理によるその使用時にin situで活性化されたことが観察された。[Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)(ＴＨＰ)２]Ｃｌは、水溶液(１２mM  Ｐｄ)で製剤したとき、１当量以上のＴＨＰでの処理時に活性となることが示された。Ｐ１５開裂性能は、(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２(６mM)、ＴＨＰ(６０mM)およびアスコルビン酸ナトリウム(６mM)の混合物からin situで調製したＰｄ(０)混合物を、対照サンプルの点で超えた(図５Ｂ)。
【０２１０】
実施例８
この実施例で、別の単離可能Ｐｄ(０)錯体Ｐｄ(ＴＨＭ)４を、ホスフィンリガンドトリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン(ＴＨＭ)を使用して調製した。その開裂活性を、実施例１に記載したアリルパラジウム(II)クロライド二量体(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２およびＴＨＰからin situで産生したＰｄ(０)錯体と比較した。
【０２１１】
調製：Ｐｄ(ＴＨＭ)４を、Ellis, et al., Inorg. Chem., 1992, 31, 14に記載のプロトコールを使用して、調製および単離した。水溶液を１０mM濃度で製剤し、その性能を、(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２(１０mM)およびＴＨＰ(１００mM)を使用して、in situで産生したＰｄ(０)と比較した。
【０２１２】
Ｐｄ(０)誘発線形化を示すために、配列決定を、Ｐ１５／Ｐ７表面プライマー(デュアルインデックスサイクルで２×１５１)を移植したＳ４フローセルを使用するＮｏｖａＳｅｑTM装置で実施した。Ｘｐワークフローをナノ(レーン１および３)およびＰＣＲ遊離(レーン２および４)ライブラリー(４５０bp挿入物)と共に使用した。リード１  ＳＢＳ化学前に、(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２(１０mM)、ＴＨＰ(１００mM)およびアスコルビン酸ナトリウム(１０mM)[レーン１〜２]；またはＰｄ(ＴＨＭ)４水溶液(１０mM)[レーン３〜４]からなるＰｄ混合物を使用して、線形化を実施した。リード２線形化を、ＦｐＧ酵素含有反応剤を使用して実施した。配列決定計量は、両Ｐｄ線形化方法で一般に同等であった。Ｐｄ(ＴＨＭ)４での高リード１強度およびパーセンテージ再合成は、線形化が成功したことを示した(図６Ａ)。ヒトおよびＰｈｉＸ誤り率は両方法で同等であった(図６Ｂ)。配列決定結果を下記表に要約する(表２)。
【表５】
2021500003.tif 000056
【０２１３】
実施例９
この実施例で、活性Ｐｄ(０)錯体調製のための別経路を記載する。Ｐｄ(ＴＨＰ)２−４を、Ｐｄ(ＰＰｈ３)４とＴＨＰをリガンド交換反応により調製し、単離した。その開裂活性を、実施例１に記載したアリルパラジウム(II)クロライド二量体(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２およびＴＨＰからin situで産生したＰｄ(０)錯体と比較した。
【０２１４】
製造方法
窒素下、Ｐｄ(ＰＰｈ３)４を乾燥、脱気ジクロロメタンに溶解して、黄色溶液を得た。ＴＨＰ水溶液(４.１当量)を加えて二相混合物とし、をれを２.５時間撹拌した。黄色が有機層から水層に移った。反応物を有機層を取り除き、水相をさらなるＤＣＭで洗浄して後処理した。水相を減圧下乾燥させ、テトラヒドロフランと共蒸発させ、得られた橙色油状物を高真空下乾燥させた。収率はほぼ定量的であった。生成物ＬＣ−ＭＳ分析は、Ｐｄ(ＴＨＰ)２の存在を示した。[Pd(THP)2+H+;予測:523 Da, 実測:523 Da]。
【０２１５】
Ｐ１５線形化への使用
Ｐｄ(ＴＨＰ)２−４を、水性緩衝液中、１０mg／mLで製剤し、そのＰ１５開裂活性をプレートベースのアッセイを使用して評価した。このアッセイは、Ｐ１５／Ｐ１７表面プライマーを移植した９６ウェルプレートを使用した。挿入蛍光色素を、リード１線形化前後に存在する二本鎖ＤＮＡの定量化に使用し、パーセンテージ開裂を、残存二本鎖ＤＮＡの量から計算し得る。Ｐｄ(ＴＨＰ)２−４の製剤について、Ｐ１５開裂活性は(Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２(６mM)、ＴＨＰ(６０mM)およびアスコルビン酸ナトリウム(６mM)からin situで調製したＰｄ混合物と同等であった(図７)。この２つの方法は、同等な開裂性能を有したことが観察された。
【０２１６】
実施例１０
この実施例で、別のニッケルベースの化学開裂剤を調製し、アリルｄＴヌクレオチド含有ＤＮＡ鎖の開裂において試験した。
【０２１７】
先ず、ＴＨＰおよびＴＨＭホスフィンリガンド両者を種々の当量で使用して、ニッケル錯体の調製においてＮｉＣｌ２と反応させた。Ｎｉ−ＴＨＰ(１：４または１：１０比)は、実施例１に記載するパラジウム含有反応剤と同じ開裂産物を製造した。興味深いことに、ホスフィンリガンドが短いアルキル鎖を有する(ゆえに円錐角が小さい)Ｎｉ−ＴＨＭは、ニッケルと錯体化させたとき、同じ開裂活性を示さなかった。
【０２１８】
Ｎｉ−ＴＨＰの表面上の開裂活性を試験し、Ｐｄ−ＴＨＰと比較した。実験を、Ｐ１５／Ｐ７プライマーおよびトレーサーオリゴを移植したＨｉＳｅｑTMフローセルで実施した。トレーサーオリゴは、配列内に４つのアリルｄＴおよび３’蛍光標識を有する。Ｎｉ−ＴＨＰまたはＰｄ−ＴＨＰ錯体によるアリルｄＴの開裂により、フローセルからの蛍光シグナルは消光される。フローセルは１.１μM  Ｐ１５／Ｐ７およびさらなる５％〜４０％トレーサーオリゴを移植され、次いでＴｙｐｈｏｏｎで走査して、移植の成功を確認した。化学線形化を６０℃で１０分間実施した。レーン１〜４は、対照としてＰｄ−ＴＨＰ錯体((Ｐｄ(Ｃ３Ｈ５)Ｃｌ)２(１０mM)、ＴＨＰ(１００mM)およびアスコルビン酸ナトリウム(１０mM)からin situで産生)で処理し、レーン５〜８は１０mM  Ｎｉ−ＴＨＰ(１：１０)錯体で処理した。次いで、蛍光強度をＴｙｐｈｏｏｎで得て、化学線形化の程度を確認した。レーンのレイアウト：５％トレーサー＝５５nM(レーン１、５)；１０％トレーサー＝１１０nM(レーン２、６)；２０％トレーサー＝２２０nM(レーン３、７)；４０％トレーサー＝４４０nM(レーン４、８)。図８は、開裂前後の正規化中央蛍光強度を示し、Ｎｉ−ＴＨＰは、Ｐｄ−ＴＨＰと同等な効率的開裂活性を示した。
【０２１９】
実施例１１
この実施例で、亜ジチオン酸ナトリウム(Ｎａ２Ｓ２Ｏ４)水溶液による化学線形化のための生体直交型開裂可能リンカーとしての、別のアゾ−アレーンベースのリンカーを記載する。
【０２２０】
スキーム５および６は、それぞれアゾ−ホスホロアミダイト１および２の製造を図示する。
【０２２１】
【化５０】
2021500003.tif 000057
化合物５. Ｎ２下、メチル２−アミノ−５−ヨードベンゾエート(４)(２.７７ｇ、１０mmol)、Ｐｄ(ＰＰｈ３)４(１.１５９mg、１mmol)、ＣｕＩ(３８１mg、２mmol)、Ｅｔ３Ｎ(４.２mL、３０mmol)およびプロパルギルアルコール(１.７５ml、３０mmol)のＤＭＦ(２０mL)懸濁液を、ｒｔで１５時間撹拌した。ＴＬＣ分析(石油エーテル：酢酸エチル１：１)は、出発物質の完全な消費を示した。２００ml  飽和ＮａＣｌ溶液で反応停止させた。酢酸エチル：石油エーテル１：１(２００ml)を混合物に加え、水層を酢酸エチル：石油エーテル１：１で３回抽出した。ＭｇＳＯ４で合わせた有機層を乾燥後、溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル：酢酸エチル８０：２０から酢酸エチル)で精製して、化合物５を黄色油状物として得た(１.８８ｇ、９２％)。1H NMR (CDCl3) δ 3.78 (s, 3H), 4.25 (s, 2H, ≡CCH2), 7.27-7.36 (m, 2H, arom.H), 7.58-7.65 (m, 1H, arom.H)
【０２２２】
化合物６. Ｎ２下、化合物５(１.８８mg、９.２mmol)およびイミダゾール(１.８３ｇ、２７.６mmol)の乾燥ＤＭＦ(２５ml)溶液にｔ−ブチルジフェニルシリルクロライド(１.０６ｇ、１２mmol)を加えた。ＴＬＣで反応を追跡し、１時間、室温で撹拌後完了した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液で反応停止させ、酢酸エチル：石油エーテル１：１(２×)で抽出した。ＭｇＳＯ４で合わせた有機層を乾燥後、溶媒を減圧下除去した。次いで、粗製混合物をＥｔＯＨに溶解し、ＥｔＳｉＨおよびＰｄ−Ｃ(１０％)で処理した。反応混合物をＮ２下、１６時間還流した。ＴＬＣ分析(石油エーテル：酢酸エチル８：２)は、出発物質の完全な消費を示した。反応混合物を濾過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテルから石油エーテル：酢酸エチル１：１)で精製して、化合物６を黄色油状物として得た(３.３７ｇ、８２％)。1H NMR (CDCl3) δ 1.04 (s, 9H, 3xCH3), 1.70-1.77 (m, 2H, CH2), 2.56 (t, 2H, CH2), 3.58 (t, 2H, OCH2), 3.60 (s, 3H, OCH3), 6.62-6.65 (m, 1H, arom.H), 7.03-7.06 (m, 1 H, arom.), 7.27-7.63 (m, 11H, arom.H)
【０２２３】
化合物８. レゾルシノール(２.２ｇ、２０mmol)およびＫ２ＣＯ３(２.７６ｇ、２０mmol)のＤＭＦ(４０ml)懸濁液に、ｔｅｒｔ−ブチル４−ブロモブタノエート(２.２ｇ、１０mmol)をＮ２下加えた。反応混合物をｒｔで１５時間撹拌した。ＴＬＣ分析(石油エーテル：酢酸エチル７：３)は、出発物質レゾルシノールの９０％消費を示した。３００ml  飽和ＮａＣｌ溶液で反応停止させた。酢酸エチル：石油エーテル１：１(３００ml)を反応混合物に加え、水層を酢酸エチル：石油エーテル１：１で３回抽出した。ＭｇＳＯ４で合わせた有機層を乾燥後、溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテルから石油エーテル：酢酸エチル５０：５０)で精製して、化合物８を黄色油状物として得た(２.２ｇ、８８％)。1H NMR (CDCl3) δ 1.27 (s, 9H),1.91-1.98 (m, 2H, CH2), 2.22 (t, 2H, CH2), 3.27 (t, 2H, OCH2), 6.36-6.46 (m, 3 arom.H), 7.09 (t, 1 arom.H)
【０２２４】
化合物９. 化合物５(４５０mg、１mmol)をアセトン／水(１：１)溶液(２.５mL)に溶解した。混合物を０℃に冷却し、濃ＨＣｌ(０.５mL)を加えた。５分後、亜硝酸ナトリウム(９３mg、１.２mmol)の水(１mL)溶液を滴下し、混合物を１時間、０℃で撹拌した。同時に、化合物８(２５２mg、１mmol)、Ｎａ２ＣＯ３(２１０mg、２mmol)およびＮａＯＨ(１６０mg、４mmol)をアセトン／水(１：１)溶液(３mL)に溶解した。第一溶液を、第二溶液に０℃で滴下した。添加完了後、混合物をｒｔに温め、さらに１時間撹拌した。反応混合物を１Ｍ  ＨＣｌで中和し、次いでＤＣＭ(３×５０mL)で抽出した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテルから石油エーテル：酢酸エチル１：１)で精製した。化合物９を橙色／赤色油状物として得た(４００mg、５６％)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.02 (s, 9H, 3xCH3), 1.27 (s, 9H), δ 1.69-1.76 (m, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.20 (t, 2H, CH2), 2.53 (t, 2H, CH2), 3.34 (t, 2H, OCH2), 3.54 (t, 2H, OCH2), 3.62 (s, 3H, OCH3), 6.36-6.46 (m, 4 arom.H), 7.00-7.06 (m, 1 H, arom.H), 7.09 (t, 1 arom.H), 7.27-7.63 (m, 11H, arom.H)
【０２２５】
化合物１１. 化合物９(３.５５ｇ、５mmol)をＤＣＭ(５０ml)に溶解した。溶液をＴＦＡ(１０ml)でｒｔで処理し、一夜撹拌した。次いで、ＴＦＡを減圧下除去し、トルエンと共蒸発させた。残留物をＮａＣｌとＤＣＭに分配した。水層をＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製生成物をＴＨＦ(１５ml)に溶解し、ＴＢＡＦ(１Ｍ、５ml)で処理した。ＴＬＣで反応をモニターした(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９０：１０)。溶媒を減圧下除去し、残留物をＮａＣｌとＤＣＭ(＋１０％ＭｅＯＨ)に分配した。水層をＤＣＭ(＋１０％ＭｅＯＨ)で３回抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。残留物をピリジンと３回共蒸発させた。残留物をＰｙ／ＣＨ３ＣＮ(１０／１０ml)に溶解し、ヒューニッヒ塩基(３.７ml、１５mmol)、ＤＭＴ−Ｃｌ(５.０７ｇ、１５mmol)を加えた。混合物をｒｔで２時間撹拌した。ＴＣＬ(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９５：５)は、反応の完了を示した。混合物を濃縮し、ＤＣＭに溶解し、Ｎａ２ＣＯ３で洗浄した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル：酢酸エチル８：２から酢酸エチル＋１％ＮＥｔ３)で精製した。化合物１１を橙色／赤色油状物として得た(２.３７ｇ、６６％)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.70-1.79 (m, 2H, CH2), 1.90-1.97 (m, 2H, CH2), 2.24 (t, 2H, CH2), 2.54 (t, 2H, CH2), 3.26 (t, 2H, OCH2), 3.58 (t, 2H, OCH2), 3.63 (s, 3H, OCH3), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-6.89 (m, 4H, aromatics), 7.03-7.06 (m, 1 H, arom.H), 7.10 (t, 1 arom.H), 7.13-7.63 (m, 13H, arom.H)
【０２２６】
化合物１２. 化合物１１(１.０５ｇ、１.４６mmol)およびＤＭＡＰ(１８mg、０.１５mmol)を、Ｎ２下、７mlの無水ピリジンに溶解した。次いで、反応混合物を０℃に冷却し、塩化ベンゾイル(０.５ml、４.４mmol)を滴下した。反応混合物をゆっくりｒｔに温め、１時間撹拌し、その間溶液は濁った。ＴＬＣ分析は、出発物質の完全な消費を示した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液で反応停止させた。水層をＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル：酢酸エチル８：２  ｔｏ酢酸エチル＋１％ＮＥｔ３)で精製して、化合物１２を黄色油状物として得た(９３０mg、７８％)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.69-1.76 (m, 2H, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.20 (t, 2H, CH2), 2.53 (t, 2H, CH2), 3.24 (t, 2H, OCH2), 3.54 (t, 2H, OCH2), 3.62 (s, 3H, OCH3), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-6.86 (m, 4H, aromatics), 7.01 (t, 1 arom.H), 7.04-7.11 (m, 3 H, arom.H), 7.13-7.63 (m, 13H, arom.H), 7.94-8.36 (m, 3H, arom.H)
【０２２７】
化合物１３. 化合物１２(３４０mg、０.５mmol)を、Ｎ２下、３mlの無水ＤＭＦに溶解し、ヒューニッヒ塩基(０.２６ml、１.５mmol)を加えた。次いで、反応混合物をＴＳＴＵ(１９６mg、０.６５mmol)で処理し、ｒｔに維持した。３０分後、ＴＬＣ分析(ＥｔＯＡｃ)は反応完了を示した。次いで、３−アミノプロパノール(３８μl、０.５mol)を反応混合物に加え、ｒｔで４時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、出発物質の完全な消費を示した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液で反応停止させた。水層をＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、キシレン(３×)と共蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル：酢酸エチル８：２から酢酸エチル＋１％ＮＥｔ３)で精製して、化合物１３を橙色油状物として得た(３２０mg、７３％)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.67-1.79 (m, 4H, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.20 (t, 2H, CH2), 2.53 (t, 2H, CH2), 3.24 (t, 2H, OCH2), 3.45 (t, 2H, OCH2), 3.51 (t, 2H, NCH2), 3.54 (t, 2H, OCH2), 3.69 (s, 3H, OCH3), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-6.86 (m, 4H, aromatics), 7.01 (t, 1 arom.H), 7.04-7.11 (m, 3 H, arom.H), 7.13-7.69 (m, 13H, arom.H), 7.94-8.40 (m, 3H, arom.H)。
【０２２８】
化合物１. 化合物１３(３２０mg、０.３６mmoles)を、高真空レーン下乾燥させた。無水ＤＣＭ(２ml)をＮ２下加え、モレキュラー・シーブと１０分間、ｒｔで撹拌した。溶液に、ヒューニッヒ塩基(０.１９ml、１.１mmoles)、続いて２−シアノエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(１０２mg、０.４３mmol)を加えた。反応物を、ｒｔでＮ２下３時間撹拌した。反応をＴＬＣ(ＰＥ／ＥｔＯＡｃ、８：２)で追跡した。反応物を減圧下シロップ状まで濃縮した。残留物をカラム(石油エーテル：酢酸エチル８：２から酢酸エチル、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＋１％ＮＥｔ３)で精製して、化合物１を橙色油状物として得た(１９０mg、５０％)。生成物は、カラム上で一部分解した。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.96-1.27 (m, 12H), 1.68-1.79 (m, 4H, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.20 (t, 2H, CH2), 2.53 (t, 2H, CH2), 2.58 - 2.74 (m, 2H, CH2CN), 3.24 (t, 2H, OCH2), 2.93 (m, 2H, NCH), 3.44 (t, 2H, NCH2), 3.42-3.54 (m, 4H, OCH2), 3.69 (s, 3H, OCH3), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-7.01 (m, 5H, aromatics), 7.04-7.11 (m, 3 H, arom.H), 7.13-7.69 (m, 13H, arom.H), 7.94-8.40 (m, 3H, arom.H)。
【０２２９】
【化５１】
2021500003.tif 000058
化合物１５. Ｎ２下、化合物１４(３.６ｇ、２０mmol)およびイミダゾール(３.７２ｇ、６０mmol)の乾燥ＤＭＦ(２５ml)溶液に、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロライド(２.３ｇ、２６mmol)を加えた。ＴＬＣで反応を追跡し、１時間、ｒｔで撹拌後完了した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液で反応停止させ、酢酸エチル：石油エーテル１：１(２×)で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥後、反応混合物を濾過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテルから石油エーテル：酢酸エチル１：１)で精製して、化合物１５をオフ・イエロー色油状物として得た(７.１９ｇ、８６％)。1H NMR (DMSO-d6) δ 0.99 (s, 9H, 3xCH3), 3.38-3.46 (m, 2H, NCH2), 3.92 (t, 2H, OCH2), 5.59 (s, 2H, NH2), 6.50-6.54 (d, 2 H, arom.H), 7.37-7.66 (m, 13H, arom.H), 8.05 (d, 1H, NH)
【０２３０】
化合物１６. Ｎ２下、化合物１５(８４０mg、２mmol)の乾燥ＤＣＭ(１０ml)溶液に、ニトロシルテトラフルオロボレート(２３４mg、２mmol)を０℃で加えた。ＴＬＣで反応を追跡し、出発物質は、１時間、０℃で撹拌後消失した。次いで、化合物８(７５６mg、３mmol)を反応混合物に加えた。反応混合物をゆっくりｒｔに温め、４時間撹拌した。ＴＬＣで反応を追跡した。完了後、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で反応停止させ、ＤＣＭ(２×)で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥後、反応混合物を濾過し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテルから石油エーテル：酢酸エチル１：１)で精製して、化合物１６を橙色油状物として得た(１.１２ｇ、８２％)。1H NMR (DMSO-d6) δ 0.99 (s, 9H, 3xCH3), 1.27 (s, 9H, 3xCH3), 1.91-1.98 (m, 2H, CH2), 2.22 (t, 2H, CH2), 3.27 (t, 2H, OCH2), 3.38-3.46 (m, 2H, NCH2), 3.92 (t, 2H, OCH2), 6.36-6.46 (m, 3 arom.H), 6.50-6.56 (d, 2 H, arom.H), 7.10 (t, 1 arom.H), 7.37-7.66 (m, 13H, arom.H), 8.06 (d, 1H, NH)
【０２３１】
化合物１７. 化合物１６(１.１ｇ、１.６４mmol)およびＤＭＡＰ(２０mg、０.１６mmol)を、Ｎ２下、８mlの無水ピリジンに溶解した。次いで、反応混合物を０℃に冷却し、塩化ベンゾイル(０.１７ml、１.５mmol)を滴下した。反応混合物をゆっくりｒｔに温め、１時間撹拌し、その間溶液は濁った。ＴＬＣ分析は、出発物質の完全な消費を示した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液で反応停止させた。水層をＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機層をＨ２ＳＯ４で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。得られた粗製混合物をＤＣＭ(１４ml)に溶解した。溶液をＴＦＡ(１.４ml)でｒｔで処理し、一夜撹拌した。ＴＬＣで反応をモニターした(石油エーテル：酢酸エチル１：１)。ＴＦＡを減圧下除去し、トルエンと共蒸発させた。残留物をＮａＣｌとＤＣＭに分配した。水層をＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製生成物をＴＨＦ(８ml)に溶解し、ＴＢＡＦ(１Ｍ、１.６ml)で処理した。ＴＬＣで反応をモニターした(ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９：１１)。溶媒を減圧下除去し、残留物をＮａＣｌとＤＣＭ(＋１０％ＭｅＯＨ)に分配した。水層をＤＣＭ(＋１０％ＭｅＯＨ)で３回抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(ＤＣＭからＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９：１)で精製した。化合物１７を橙色／赤色油状物として得た(５１５ｇ、６４％)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.56-1.64 (m, 2H, CH2), 2.01 (t, 2H, CH2), 3.24 (t, 2H, NCH2), 3.52 (t, 2H, OCH2), 4.25 (t, 2H, OCH2), 6.79-6.89 (m, 1H, arom.H), 7.03-7.06 (m, 1 H, arom.H), 7.13-7.63 (m, 10H, arom.H), 8.56 (t, 1H, NH)
【０２３２】
化合物１８. 化合物１７(５００mg、１mmol)をｐｙ／ＣＨ３ＣＮ(５／５ml)に溶解し、ヒューニッヒ塩基(０.８７ml、５mmol)、ＤＭＴ−Ｃｌ(１ｇ、３mmol)を加えた。混合物をｒｔで２時間撹拌した。ＴＣＬ(ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９５：５)は、反応の完了を示した。混合物を濃縮し、ＤＣＭに溶解し、Ｎａ２ＣＯ３で洗浄した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル：酢酸エチル８：２から酢酸エチル＋１％ＮＥｔ３)で精製した。化合物１８を橙色／赤色油状物として得た(６５３mg、８３％)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.16-1.24 (m, 2H, CH2), 2.01 (t, 2H, CH2), 3.24 (t, 2H, NCH2), 3.52 (t, 2H, OCH2), 3.69 (s, 6H, OMe), 4.25 (t, 2H, OCH2), 6.76-6.89 (m, 4H, arom.H), 7.03-8.23 (m, 21H, arom.H), 8.86 (t, 1H, NH)
【０２３３】
化合物１９. 化合物１８(３５０mg、０.５mmol)を、Ｎ２下、３mlの無水ＤＭＦに溶解し、ヒューニッヒ塩基(０.２６ml、１.５mmol)を加えた。次いで、反応混合物をＴＳＴＵ(１９６mg、０.６５mmol)で処理し、ｒｔに維持した。３０分後、ＴＬＣ分析(石油エーテル：ＥｔＯＡｃ  ２：８)は反応完了を示した。次いで、３−アミノプロパノール(３８μl、０.５mol)を反応混合物に加え、ｒｔで４時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、出発物質の完全な消費を示した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液で反応停止させた。水層をＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、キシレン(３×)と共蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル：酢酸エチル８：２から酢酸エチル＋１％ＮＥｔ３)で精製して、化合物１９を橙色油状物として得た(２２３mg、５２％)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.67-1.79 (m, 4H, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.05 (t, 2H, CH2), 2.53 (t, 2H, CH2), 3.24 (t, 2H, OCH2), 3.45 (t, 2H, OCH2), 3.51 (t, 2H, NCH2), 3.57 (t, 2H, OCH2), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-6.86 (m, 4H, aromatics), 7.01 (t, 1 arom.H), 7.04-7.11 (m, 3 H, arom.H), 7.13-7.69 (m, 13H, arom.H), 7.74-8.40 (m, 4H, arom.H), 8.76 (t, 1H, NH)
【０２３４】
化合物２. 化合物１９(２２３mg、０.２６mmol)を、高真空レーン下乾燥させた。無水ＤＣＭ(１.５ml)をＮ２下加え、モレキュラー・シーブと１０分間、ｒｔで撹拌した。溶液に、ヒューニッヒ塩基(０.１４ml、０.７８mmol)を加え、続いて２−シアノエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(７６μl、０.３４mmol)。反応物を、ｒｔでＮ２下３時間撹拌した。ＴＬＣで反応を追跡した(ＰＥ／ＥｔＯＡｃ、２：８)。反応物を減圧下シロップ状まで濃縮した。残留物をカラム(石油エーテル：酢酸エチル８：２から酢酸エチル＋１％ＮＥｔ３)で精製して、化合物２を橙色油状物として得た(１５２mg、５６％)。生成物は、カラム上で一部分解した。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.96-1.27 (m, 12H), 1.68-1.79 (m, 4H, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.19-2.22 (m, 2H, CH2), 2.51-2.54 (m, 2H, CH2), 2.58 - 2.74 (m, 2H, CH2CN), 3.22-3.26 (m, 2H, OCH2), 2.93 (m, 2H, NCH), 3.44 (t, 2H, NCH2), 3.42-3.54 (m, 4H, OCH2), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-7.01 (m, 5H, aromatics), 7.04-7.11 (m, 3 H, arom.H), 7.13-7.69 (m, 13H, arom.H), 7.94-8.40 (m, 3H, arom.H), 8.76 (t, 1H, NH)
【０２３５】
次いで、２つのアゾ−ホスホロアミダイト化合物１および２をそれぞれ取り込んだ二つの短オリゴ(オリゴアゾ−１およびオリゴアゾ−２)を合成して、開裂効率を評価した。オリゴアゾ−１は、４５０nmで吸収し、橙色であった。開裂後、アゾ結合は破壊され、橙色の退色に至る。０.１Ｍ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ４溶液をｒｔで添加後、オリゴ溶液の橙色はすぐに退色し、これはアゾ結合の極めて効率的な開裂を示す。オリゴアゾ−１および開裂産物のＨＰＬＣ分析もまた同じ結果を確認する。オリゴアゾ−２開裂試験のＨＰＬＣ分析は、０.１Ｍ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ４溶液でｒｔでの処理による、アゾ結合のクリーンで、直ぐの破壊を示した。
【０２３６】
オリゴアゾ−１：５’−ＧＡＸ１ＣＴＡ−３’
【化５２】
2021500003.tif 000059
【０２３７】
オリゴアゾ−２：５’−ＧＡＸ２ＣＴＡ−３’
【化５３】
2021500003.tif 000060
【０２３８】
さらに、オリゴアゾ−１とＳＢＳ配列決定反応剤の互換性も試験した。先ず、１０μMのオリゴアゾ−１(１０μL)を、９０μLの取り込み混合物(ＩＭＸ)、開裂混合物(ＣＭＳ)および走査混合物(ＵＳＭ)中、６０℃で６０分間インキュベートした。ＨＰＬＣ分析は、オリゴアゾ−１がＩＭＸで完全に安定であり、９０％オリゴアゾ−１がＣＭＳ中で分解し、５０％オリゴアゾ−１がＵＳＭ中で残ることを示した。オリゴアゾ−２でわずかな改善が示された。分解は、両オリゴをＣＭＳ溶液(１０μL)中６０℃で６０分間インキュベートしたとき、オリゴアゾ−１の６６％分解に比して、オリゴアゾ−２で４４％であった。
【図１】
2021500003.tif 000078
【図２Ａ】
2021500003.tif 000079
【図２Ｂ】
2021500003.tif 000080
【図３Ａ】
2021500003.tif 000081
【図３Ｂ】
2021500003.tif 000082
【図４】
2021500003.tif 000083
【図５Ａ】
2021500003.tif 000084
【図５Ｂ】
2021500003.tif 000085
【図６Ａ】
2021500003.tif 000086
【図６Ｂ】
2021500003.tif 000087
【図７】
2021500003.tif 000088
【図８】
2021500003.tif 000089
【配列表】
2021500003000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月17日(2020.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体であって、各二本鎖ポリヌクレオチドが固定化された第一鎖および第二鎖を含むものであり、各第一鎖が遷移金属錯体による化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含み；ここで、遷移金属錯体がパラジウム錯体またはニッケル錯体でありおよびここで、第一鎖および第二鎖がその５’末端で固体支持体に固定化されるものである、固体支持体。
【請求項２】
各第一鎖ポリヌクレオチドが固体支持体に固定化された第一伸長プライマーを含み、所望により第一伸長プライマーが第一開裂部位を含み、所望により第一伸長プライマーがＰ５配列または修飾Ｐ５配列を含む、請求項１に記載の固体支持体。
【請求項３】
第一開裂部位がパラジウム錯体またはニッケル錯体により化学開裂を受けることができる修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み、好ましくは修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドがアリル基を含む、請求項１または２に記載の固体支持体。
【請求項４】
第一開裂部位が式(II’)：
【化１】
2021500003.tif 000090
〔式中、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を有する修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、請求項３に記載の固体支持体。
【請求項５】
第一開裂部位が化学開裂後３’遮断部分を産生する、請求項１〜４の何れかに記載の固体支持体。
【請求項６】
３’遮断部分が式(Ｉ)：
【化２】
2021500003.tif 000091
〔式中、
Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａまたは−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３であり；
ＲａがＣ１−４アルキル、ｔｅｒｔ−ブチル、アリル、ベンジルまたは９−フルオレニルメチルであり；
各Ｒｂが独立してＣ１−４アルキルおよびフェニルからなる群から選択され；そして
Ｒ２がＨ、Ｃ１−４アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
または
式(Ｖ)：
【化３】
2021500003.tif 000092
〔式中、塩基が所望により保護されているアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を有するホスフェート部分を含む、請求項５に記載の固体支持体。
【請求項７】
各第二鎖ポリヌクレオチドが第二開裂部位を含み、そして所望により第二伸長プライマーが固体支持体に固定化されている、請求項１〜６の何れかに記載の固体支持体。
【請求項８】
第二開裂部位がパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができず、所望により第二開裂部位が化学開裂により開裂され、第二開裂部位がジオールリンカーまたはアゾベンゼンリンカーを含む、請求項７に記載の固体支持体。
【請求項９】
複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、
請求項１〜８の何れかに記載の固体支持体を用意し；
二本鎖ポリヌクレオチドを遷移金属錯体の水溶液を接触させ、それにより第一開裂部位で１以上の第一鎖を開裂し、１以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し；そして
固体支持体から開裂第一核酸を除去する
ことを含む、方法。
【請求項１０】
遷移金属錯体がパラジウム(０)錯体、好ましくはＰｄ(ＴＨＰ)２、Ｐｄ(ＴＨＰ)４、Ｐｄ(ＴＨＭ)４またはこれらの組み合わせであるか、またはニッケル(０)錯体であり、所望によりin situ で産生される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第二開裂部位が化学開裂、光開裂、酵素開裂およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
式(II)：
【化４】
2021500003.tif 000093
〔式中、
ＲがＨ、ＯＨまたはＯＰＧであり；
Ｒ１がＨまたはＰＧであり；
Ｒ２がＨ、ＰＧであるかまたは−ＯＲ２がホスフェートであり；
ＰＧがヒドロキシル保護基であり；そして
塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
または式(IIａ)：
【化５】
2021500003.tif 000094
の構造を含む、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み、所望により、式(III)：
【化６】
2021500003.tif 000095
の構造を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
式(Ｉ)：
【化７】
2021500003.tif 000096
〔式中、
Ｒ１が−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨＣ(Ｏ)ＯＲａまたは−ＯＣＨ２ＯＳｉ(Ｒｂ)３であり；
ＲａがＣ１−４アルキル、ｔｅｒｔ−ブチル、アリル、ベンジルまたは９−フルオレニルメチルであり；
各Ｒｂが独立してＣ１−４アルキルおよびフェニルからなる群から選択され；そして
Ｒ２がＨ、Ｃ１−４アルキル、所望により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
または式(Ｖ)：
【化８】
2021500003.tif 000097
〔式中、塩基が所望により保護されているアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造の３’遮断部分を含む、ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の何れかのヌクレオチドを含むか、所望により、式(VI)：
【化９】
2021500003.tif 000098
の構造を有する、オリゴヌクレオチド。
【国際調査報告】
2021500003.tif 000099
2021500003.tif 000100
2021500003.tif 000101
2021500003.tif 000102
2021500003.tif 000103