(57)【要約】本開示は、ニューロパチーの治療用の新たな組成物に関する。本開示の組成物は、糖尿病性潰瘍に局所的に適用された場合に糖尿病性ニューロパチーの治療の増加した有効性を提供する。
2021509675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において末梢性ニューロパチーを治療、予防、改善、または低減する方法であって、
対象に治療剤を含む組成物を投与することを含み、
前記対象が、罹患した領域中に少なくとも１つの傷害を受けた神経を有し、
前記投与するステップが、前記罹患した領域に前記組成物を局所的に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記治療剤が、１ミリリットル当たり、
ａ）少なくとも約１０００個のＣＦＵ−Ｆ細胞、
ｂ）少なくとも約１０００個のＣＦＵ−Ｆ細胞の内容物、
ｃ）少なくとも約１０５個のＣＤ９０陽性細胞、
ｄ）少なくとも約１０５個のＣＤ９０陽性細胞の内容物、
ｅ）少なくとも約１０ピコグラム（ｐｇ）のＨＤＧＦ、
ｆ）少なくとも約１０ｐｇのｂＦＧＦ、
ｇ）少なくとも約１０ｐｇのＢＤＮＦ、
ｈ）合わせて少なくとも約１０ｐｇのｂＦＧＦおよびＢＤＮＦ、ならびに
ｉ）最大で約１０ｐｇのＴＧＦ−ｂ１
から選択される１つまたは複数の細胞またはタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が糖尿病を患っており、または、前記末梢性ニューロパチーが糖尿病性ニューロパチーを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が１つまたは複数の糖尿病性足潰瘍（ＤＦＵ）を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記投与するステップが、３か月中に少なくとも２回、前記対象に前記組成物を局所的に投与することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記投与するステップが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日毎に前記対象に前記組成物を局所的に投与することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記罹患した領域が、創傷、任意選択的に潰瘍を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記治療剤が、加工された微小血管組織、間葉幹細胞（ＭＳＣ）調製物、脂肪組織からの間質血管画分（ＳＶＦ）、骨髄細胞調製物、および臍帯幹細胞からなる群から選択される複能性細胞調製物（ＭＣＰ）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記治療剤が、加工された微小血管組織、任意選択的にｍＶＡＳＣ（登録商標）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記加工された微小血管組織がヒト脂肪組織に由来する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記加工された微小血管組織が、
ａ）コラゲナーゼ処理、
ｂ）中性プロテアーゼ処理、
ｃ）細胞溶解、任意選択的に塩化アンモニウム細胞溶解、
ｄ）乾燥、任意選択的にフリーズドライ、空気乾燥、または凍結乾燥、
ｅ）凍結、任意選択的にフリーズドライまたは瞬間凍結、ならびに
ｆ）照射、任意選択的にガンマ照射または電子ビーム照射
から選択される１つまたは複数の処理を用いて加工されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が局所投与のために配合されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、粉末、クラッシャブルケーキ、フィルム、ゲル、軟膏、懸濁液、エマルション、濃縮物、コアセルベート、スキャフォールド、吸湿性粉末、または創傷ドレッシングもしくは被覆物を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象に前記組成物を投与することが、前記罹患した領域への前記組成物の接着を結果としてもたらす、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
神経感覚の改善、組織治癒、創傷閉鎖、潰瘍治癒、創傷再発の予防、柔軟性の増加、または疼痛の減少のうちの１つまたは複数を結果としてもたらす、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
潰瘍の治癒を改善し、前記領域中の神経感覚を改善し、または前記領域中の新たな潰瘍の再発率を低減する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記罹患した領域が、傷害を受けた神経の５、１０、１５、３０ｃｍ以内にある、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
治療剤を含む、それを必要とする対象において末梢性ニューロパチーを治療、予防、改善、または低減するための組成物であって、前記治療剤が、１ミリリットル当たり、
ａ）少なくとも約１０００個のＣＦＵ−Ｆ細胞、
ｂ）少なくとも約１０００個のＣＦＵ−Ｆ細胞の内容物、
ｃ）少なくとも約１０５個のＣＤ９０陽性細胞、
ｄ）少なくとも約１０５個のＣＤ９０陽性細胞の内容物、
ｅ）少なくとも約１０ピコグラム（ｐｇ）のＨＤＧＦ、
ｆ）少なくとも約１０ｐｇのｂＦＧＦ、
ｇ）少なくとも約１０ｐｇのＢＤＮＦ、
ｈ）合わせて少なくとも約１０ｐｇのｂＦＧＦおよびＢＤＮＦ、ならびに
ｉ）最大で約１０ｐｇのＴＧＦ−ｂ１
から選択される１つまたは複数の細胞またはタンパク質を含む、組成物。
【請求項１９】
前記対象が糖尿病を患っており、または、前記末梢性ニューロパチーが糖尿病性ニューロパチーを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記対象が１つまたは複数の糖尿病性足潰瘍（ＤＦＵ）を有する、請求項１８または請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記投与するステップが、３か月中に少なくとも２回、前記対象に前記組成物を局所的に投与することを含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記投与するステップが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日毎に前記対象に前記組成物を局所的に投与することを含む、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記罹患した領域が、創傷、任意選択的に潰瘍を含む、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記治療剤が、加工された微小血管組織、間葉幹細胞（ＭＳＣ）調製物、脂肪組織からの間質血管画分（ＳＶＦ）、骨髄細胞調製物、および臍帯幹細胞からなる群から選択される複能性細胞調製物（ＭＣＰ）を含む、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記治療剤が、加工された微小血管組織、任意選択的にｍＶＡＳＣ（登録商標）を含む、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記加工された微小血管組織がヒト脂肪組織に由来する、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記加工された微小血管組織が、
ｇ）コラゲナーゼ処理、
ｈ）中性プロテアーゼ処理、
ｉ）細胞溶解、任意選択的に塩化アンモニウム細胞溶解、
ｊ）乾燥、任意選択的にフリーズドライ、空気乾燥、または凍結乾燥、
ｋ）凍結、任意選択的にフリーズドライまたは瞬間凍結、ならびに
ｌ）照射、任意選択的にガンマ照射または電子ビーム照射
から選択される１つまたは複数の処理を用いて加工されている、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
局所投与のために配合されている、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
粉末、クラッシャブルケーキ、フィルム、ゲル、軟膏、懸濁液、エマルション、濃縮物、コアセルベート、スキャフォールド、吸湿性粉末、または創傷ドレッシングもしくは被覆物を含む、請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記対象に前記組成物を投与することが、前記罹患した領域への前記組成物の接着を結果としてもたらす、請求項１８〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
神経感覚の改善、組織治癒、創傷閉鎖、潰瘍治癒、創傷再発の予防、柔軟性の増加、または疼痛の減少のうちの１つまたは複数を結果としてもたらす、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
潰瘍の治癒を改善し、前記領域中の神経感覚を改善し、または前記領域中の新たな潰瘍の再発率を低減する、請求項１８〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
それを必要とする対象において末梢性ニューロパチーを治療、予防、改善、または低減する方法であって、
対象に治療剤を含む組成物を投与することを含み、
前記対象が、罹患した領域中に少なくとも１つの創傷を有し、かつ
前記投与するステップが、前記罹患した領域中の前記創傷に前記組成物を局所的に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
前記局所投与が、創傷１ｃｍ２当たり、
ｊ）少なくとも約１０００個のＣＦＵ−Ｆ細胞、
ｋ）少なくとも約１０００個のＣＦＵ−Ｆ細胞の内容物、
ｌ）少なくとも約１０５個のＣＤ９０陽性細胞、
ｍ）少なくとも約１０５個のＣＤ９０陽性細胞の内容物、
ｎ）少なくとも約１０ピコグラム（ｐｇ）のＨＤＧＦ、
ｏ）少なくとも約１０ｐｇのｂＦＧＦ、
ｐ）少なくとも約１０ｐｇのＢＤＮＦ、
ｑ）合わせて少なくとも約１０ｐｇのｂＦＧＦおよびＢＤＮＦ、ならびに
ｒ）最大で約１０ｐｇのＴＧＦ−ｂ１
から選択される１つまたは複数の細胞またはタンパク質を提供する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象が、神経損傷、傷害を受けた神経、糖尿病、または糖尿病性ニューロパチーを患っている、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの創傷が糖尿病性足潰瘍（ＤＦＵ）を含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記投与するステップが、３か月中に少なくとも２回、前記対象に前記組成物を局所的に投与することを含む、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記投与するステップが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日毎に前記対象に前記組成物を局所的に投与することを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記創傷が潰瘍を含む、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療剤が、加工された微小血管組織、間葉幹細胞（ＭＳＣ）調製物、脂肪組織からの間質血管画分（ＳＶＦ）、骨髄細胞調製物、および臍帯幹細胞からなる群から選択される複能性細胞調製物（ＭＣＰ）を含む、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記治療剤が、神経増殖因子（ＮＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、Ｊ１４７、クルクミン、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）またはその誘導体からなる群から選択される、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記治療剤が、加工された微小血管組織、任意選択的にｍＶＡＳＣ（登録商標）を含む、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記加工された微小血管組織がヒト脂肪組織に由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記加工された微小血管組織が、
ｍ）コラゲナーゼ処理、
ｎ）中性プロテアーゼ処理、
ｏ）細胞溶解、任意選択的に塩化アンモニウム細胞溶解、
ｐ）乾燥、任意選択的にフリーズドライ、空気乾燥、または凍結乾燥、
ｑ）凍結、任意選択的にフリーズドライまたは瞬間凍結、ならびに
ｒ）照射、任意選択的にガンマ照射または電子ビーム照射
から選択される１つまたは複数の処理を用いて加工されている、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物が局所投与のために配合されている、請求項３３〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物が、粉末、クラッシャブルケーキ、フィルム、ゲル、軟膏、懸濁液、エマルション、濃縮物、コアセルベート、スキャフォールド、吸湿性粉末、または創傷ドレッシングもしくは被覆物を含む、請求項３３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象に前記組成物を投与することが、前記罹患した領域への前記組成物の接着を結果としてもたらす、請求項３３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
神経感覚の改善、組織治癒、創傷閉鎖、潰瘍治癒、創傷再発の予防、柔軟性の増加、または疼痛の減少のうちの１つまたは複数を結果としてもたらす、請求項３３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
潰瘍の治癒を改善し、前記領域中の神経感覚を改善し、または前記領域中の新たな潰瘍の再発率を低減する、請求項３３〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、末梢性ニューロパチーといった神経損傷を治療するための組成物および方法に関する。特に、本開示は、神経損傷の治療用の局所的および注射可能な微小血管組織調製物を提供する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月８に出願された米国仮特許出願第６２／６１４，９４８号の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
神経損傷は、重篤度および関与する神経に依存して広範囲の症状群を有する一般的な状態である。損傷および再生の機序に関する多くの知識が存在するが、全的な機能回復を確実にする信頼できる治療は知られていない。
【０００４】
最も一般的な種類の神経損傷の中には、末梢性ニューロパチーといったいわゆる末梢神経損傷がある。末梢性ニューロパチーは、末梢神経が傷害または破壊されるあまりに一般的な状態である。その結果は、感情制御もしくは身体の部分の運動制御の喪失または領域中の疼痛もしくはヒリヒリした感覚である。それが自律神経を伴う場合、発汗または身体の領域中の血流を制御する能力の喪失が起こることがある。損傷、衝突、炎症、アルコールの乱用、医薬、および放射線といった多くの原因があるが、末梢性ニューロパチーのはるかに最も大きな原因は糖尿病である。
【０００５】
末梢性ニューロパチーの１つの重大な原因は糖尿病である。世界には３．８９億人の糖尿病患者がおり、その半分までが糖尿病性末梢性ニューロパチーを経験すると推定されている。感覚の喪失は、多くの場合に慢性創傷に繋がり、それは治癒が非常に困難である。治癒されない場合、これらの慢性創傷は、感染症、壊疽、および切断術に繋がる。米国において、毎年１２０万の糖尿病性足潰瘍があり、５１億ドルのコストでの７０，０００の切断術に繋がっている。
【０００６】
外傷は、末梢性ニューロパチーといった神経傷害の別の原因である。切断または圧砕された神経は時折、自発的に、または、場合により神経移行術もしくは神経ガイドチューブを使用して、外科的介入の助けと共に修復する。神経傷害の別の公知の原因はアルコールの過度の使用である。アルコール誘導性のニューロパチーは、単純にアルコールを控えることにより治り得る。他の形態のニューロパチーについては、重点的な研究の焦点ではあるが、治癒の成功はない。糖尿病性ニューロパチーの進行は、血糖レベルの注意深い制御により緩慢化され得るが、傷害を逆転させる方法を見出した者はいない。ニューロパチーの多くの事例における疼痛またはヒリヒリ感は、それと共に生きていくことが非常に厳しいものであり得るため、多くの治療はこれらの症状の緩和を目的とする。一般的な治療のいくつかとしては、疼痛緩和剤、抗炎症性薬物、経皮的電気神経刺激（ＴＥＮＳ）、抗うつ剤、および抗発作薬が挙げられる。糖尿病性足潰瘍（ＤＦＵ）の場合、感覚が通常は欠失しているため、これらの治療はほとんど価値がない。
【０００７】
糖尿病性潰瘍は、ニューロパチーにより引き起こされる感覚の欠如により主に発生すると考えられている。患者は、多くの場合に、罹患した区画への負荷を変化させながら形成していく創傷を感じることができない。創傷が形成されると、糖尿病患者において組織への乏しい血液供給から治癒は困難である。乏しい血液供給は、治癒のために必要とされる栄養分を組織から奪い、創傷において感染症が発生および持続することを可能とする。
【０００８】
糖尿病性潰瘍の標準治療は、創傷をデブリードして死および易感染性組織を除去し、抗生物質を使用して感染と戦い、創傷をヒドロコロイドドレッシングを用いて覆った後、そのドレッシングを閉塞性ドレッシングを用いて覆い、創傷をアンロードすることである。この標準的な施術は、そのような創傷の２４％のみにおいて治癒に繋がる。標準的な施術が失敗した場合、少数の追加のＦＤＡ承認済みの治療がある。増殖因子ＰＤＧＦ−ＢＢは、創傷への血液供給を改善し、治癒速度を増加させるために長年利用可能であった。血液供給はまた、繰返しの高圧酸素療法により改善され得る。これらの確立された両方の治療は高価であり、多くの創傷を依然として治癒しない。
【０００９】
様々な組織および細胞ベースの療法がＤＦＵを治療するために使用されている。製品およびアウトカムはかなり異なる。より一般的な組織製品としては、皮膚グラフト、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、および羊膜が挙げられ、最も普及している細胞療法は、血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）、骨髄吸引濃縮物（ＢＭＡＣ）、脂肪間質血管画分（ＳＶＦ）、および骨髄または脂肪から培養された間葉幹細胞（ＭＳＣ）である。皮膚グラフトは自明に好まれるように思われるが、それらは、多くの場合に、虚血部位において生着せず、またドナー部位において創傷を残す。ＳＩＳは、いくつかの有用な増殖因子の他に、創傷カバレージを提供すると主張されている。羊膜はより良好な創傷治癒結果を提供する。ＰＲＰは、患者の血液の一部を遠心分離して血小板を３〜７倍に濃縮することにより調製される。同様に、ＢＭＡＣは、骨髄を引き取り、それを遠心分離して骨髄幹細胞を濃縮することにより調製される。これらの２つの遠心分離された製造物は、測定が困難なほどにわずかな利益を提供してきた。対照的に、ＳＶＦおよびＭＳＣは、はるかに多くの数の複能性細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）を提供し、顕著な創傷逆転利益を提供することが報告されている。ＤＦＵの多くの主張される既存の治療のいずれも、しかしながら、関連するニューロパチーのいかなる目に付く治癒も提供しない。
【００１０】
したがって、末梢性ニューロパチーといった神経損傷の効果的な、手頃な治療の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、末梢性ニューロパチーといった神経損傷を治療するための組成物および方法に関する。特に、本開示は、神経損傷の治療用の局所的および注射可能な微小血管組織調製物を提供する。特に、本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載の組成物および方法は、末梢性ニューロパチーといった神経損傷を効果的に治療または予防することを発見した。
【００１２】
本発明の実施形態は、末梢神経組織傷害の修復および／または再生において有用な組成物および方法を含む。
【００１３】
本開示の実施形態は、哺乳動物において末梢神経傷害を治療もしくは予防し、または組織再生を促進する方法であって、前記哺乳動物に本開示の組成物を提供することを含む、方法を提供する。末梢神経傷害は、損傷、衝突、炎症、アルコールの乱用、医薬、放射線、または糖尿病に起因するものであってもよい。特定の実施形態では、末梢神経傷害は、外科的創傷、熱傷、損傷、移植片創傷、または皮膚病変の結果として存在する。一部の実施形態では、末梢神経傷害は糖尿病性ニューロパチーである。さらなる実施形態では、糖尿病性ニューロパチーは、糖尿病性足潰瘍（ＤＦＵ）などの糖尿病性潰瘍を伴う。
【００１４】
本開示の実施形態は、末梢性ニューロパチーの治療において有用な治療剤を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、組成物は局所的に適用される。他の実施形態では、組成物は、哺乳動物中に外科的に埋め込まれる。ある特定の実施形態では、組成物は、前記哺乳動物中の損傷または疾患の部位内にまたは該部位に隣接して埋め込まれる。関連する実施形態では、組成物は、前記哺乳動物の静脈内に提供される。
【００１５】
本開示の治療剤は、自己移植片、同種移植片、異種移植片、微小血管組織、複能性細胞、そのような細胞もしくは組織からの微小胞、および／または増殖因子を含んでもよい。一部の実施形態では、組成物は滅菌されており、かつ／または、前記組成物内のウイルスは不活性化されている。特定の実施形態では、治療剤は、局所投与（ｔｏｐｉｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のために配合されており、粉末、フィルム、ゲル、軟膏、懸濁液、エマルション、またはコアセルベートなどを含んでもよい。一実施形態では、治療剤は、乾燥した吸湿性粉末として配合される。より特定の実施形態では、組成物は、創傷に接着するように配合される。組成物は、創傷に直接的にまたは患者が感覚を有する場所からある程度の距離をおいて適用されてもよい。組成物は、３か月の期間中に１回より多くまたは少なくとも２回再適用されてもよい。組成物は、間隔をおいて、例えば、約３〜約１５日の間隔をおいて、再適用されてもよい。
【００１６】
ある特定の実施形態では、本開示の微小血管組織または複能性細胞は濃縮されていてもよい。本開示の組成物は、約１０５個のＣＤ９０＋細胞／ｃｍ２より大きい用量を提供する局所適用のために配合された複能性細胞を含んでもよい。他の実施形態では、本開示の組成物は、約１０００個のＣＦＵ−Ｆ／ｃｍ２より大きい用量において複能性細胞を含んでもよい。
【００１７】
特定の実施形態では、組成物は、増殖因子などの因子を含む。本開示の増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）、ヘパトーマ由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および／または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）であってもよい。増殖因子は、末梢神経の再生および／または創傷治癒を提供する量であってもよい。量の例としては、配合物１ｍｇ当たり、１０ｐｇより多くのｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、および／もしくはＨＤＧＦならびに／または約１０ｐｇ未満のＴＧＦ−β１が挙げられるがそれに限定されない。１つの効果的な組成物は、１ｎｇ／ｍｇより多くのＨＤＧＦを含んだ。
【００１８】
本開示の実施形態は、それを必要とする対象において末梢神経傷害を治療する方法であって、末梢神経傷害を有する対象を同定すること、および局所投与のために配合された治療有効量の治療剤を投与することを含む、方法を提供する。組成物は、罹患した領域中に局所的にまたは罹患した領域中の創傷に適用されてもよい。本開示の治療方法はまた、ニューロパチーに加えて創傷の治癒を助けてもよい。
【００１９】
本開示の実施形態は、それを必要とする対象において糖尿病性潰瘍を治療する方法であって、糖尿病性潰瘍を有する対象を同定すること、および局所投与のために配合された本開示の治療剤を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、方法を提供する。本開示の治療方法はまた、糖尿病性潰瘍を治癒してもよい。糖尿病性潰瘍は糖尿病性足潰瘍であってもよい。本開示の治療方法は、糖尿病性足潰瘍を治癒し、かつ再発性ＤＦＵの可能性を低減する。
【００２０】
一態様では、本開示は、それを必要とする対象において末梢性ニューロパチーを治療、予防、改善、または低減する方法であって、対象に治療剤を含む組成物を投与することを含み、対象が、罹患した領域中に少なくとも１つの傷害を受けた神経を有し、投与するステップが、罹患した領域に組成物を局所的に投与することを含む、方法を提供する。
【００２１】
別の態様では、本開示は、治療剤を含む、それを必要とする対象において末梢性ニューロパチーを治療、予防、改善、または低減するための組成物を提供する。
【００２２】
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において末梢性ニューロパチーを治療、予防、改善、または低減する方法であって、対象に治療剤を含む組成物を投与することを含み、対象が、罹患した領域中に少なくとも１つの創傷を有し、かつ、投与するステップが、罹患した領域中の創傷に組成物を局所的に投与することを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、足指がカメラから離れる方向に向いた、処置後の患者Ａの下腿を示す。患者Ａは、ヒドロコロイドドレッシングを用いた標準治療にもかかわらず治癒していない足底の糖尿病性足潰瘍を示した。デブリードマン後に、潰瘍は５．１ｃｍ２と測定され、ニューロパチーは膝までの半分に広がった。本開示に記載されるように調製した複能性細胞調製物（ＭＣＰ）を用いた局所処置の４週間後、ＤＦＵは３．５ｃｍ２と測定され、ニューロパチーの広がりは約１４ｃｍ低減された。
【図２】図２は、足指がカメラから離れる方向に向いた、処置後の患者Ｂの下腿を示す。患者Ｂは、ヒドロコロイドドレッシングを用いた標準治療にもかかわらず治癒していない足の内側の糖尿病性足潰瘍を示した。デブリードマン後に潰瘍は６．１ｃｍ２と測定され、ニューロパチーは膝までの半分にわたり広がった。ＭＣＰを用いた局所処置の４週間後、ＤＦＵは０．４ｃｍ２と測定され、ニューロパチーの広がりは約１６ｃｍ低減された。
【図３】図３は、ビヒクルを用いた処置後の対照とする対象の下腿を示す。患者Ｃは、ヒドロコロイドドレッシングを用いた標準治療にもかかわらず治癒していない足底の糖尿病性足潰瘍を示した。デブリードマン後に潰瘍は４．０ｃｍ２と測定され、ニューロパチーは膝までの距離の１／３に広がった。患者ＡおよびＢを処置するために使用した同じビヒクル溶液を用いたがＭＣＰを用いなかった局所処置の４週間後に、ＤＦＵは１．６ｃｍ２と測定されたが、ニューロパチーの広がりは有意に低減されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本開示は、末梢神経傷害および糖尿病性ニューロパチーなどの末梢性ニューロパチーといった神経損傷の治療において有用な、ならびに糖尿病性足潰瘍（ＤＦＵ）といった糖尿病性潰瘍の治療のための、組成物および方法に関する。
【００２５】
定義
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の目的のために、以下の用語を以下において定義する。
【００２６】
「ａ」および「ａｎ」という語は、特に記載されなければ、１つまたは複数を表す。
【００２７】
「約」は、参照とする量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重さまたは長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％程度まで異なる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重さまたは長さを意味する。「約」という用語との組合せにおいて使用される数値の文脈において議論される任意の実施形態では、約という用語は省略され得ることが特に想定される。
【００２８】
文脈が他に必要としなければ、本明細書および特許請求の範囲を通じて、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という語ならびに「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）および「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）などのその変形は、「含むがそれに限定されない」のような、開放的な、包括的な意味において解釈されるべきである。
【００２９】
「からなる」は、「からなる」という語句に後続するどんなものも含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列記された要素は必要または義務的であり、かつ、他の要素は存在してはならないことを指し示す。
【００３０】
「本質的にからなる」は、該語句の後に列記された任意の要素を含み、かつ、列記された要素について本開示において指定される活動または作用に干渉も寄与もしない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「本質的にからなる」という語句は、列記された要素は必要または義務的であるが、他の要素は任意選択的であり、列記された要素の活動または作用にそれらが影響するか否かに依存して存在してもよいまたは存在してはならないことを指し示す。
【００３１】
本明細書の全体を通じて「一実施形態」または「実施形態」（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）への言及は、該実施形態との関連において記載される特定の特質、構造または特徴が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体を通じた様々な場所における「一実施形態では」または「実施形態では」（ｉｎ  ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）という語句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を指すものではない。さらには、特定の特質、構造、または特徴は、１つまたは複数の実施形態において任意の好適な方式で組み合わせられてもよい。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「機能」および「機能的」などの用語は、生物学的な、酵素の、または治療的な機能を指す。
【００３３】
「増加した」または「増進した」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、本明細書に記載の量またはレベルの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、または５０倍またはより大きい倍数（例えば、１００、５００、１０００倍）（１より大きい全ての整数および間の小数の点、例えば、２．１、２．２、２．３、２．４などを含む）の増加を含んでもよい。
【００３４】
「減少した」または「低減された」または「より少ない」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、本明細書に記載の量またはレベルの約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、または５０倍またはより大きい倍数（例えば、１００、５００、１０００倍）（１より大きい全ての整数および間の小数の点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の減少を含んでもよい。
【００３５】
「から得られる」は、例えば細胞または組織などの試料が、所望の生物または所望の生物内の特定の組織などの特定の供給源から単離され、またはそれに由来することを意味する。
【００３６】
本明細書において使用される場合、文脈が他に明確にしなければ、「治療」および類似の語、例えば、「治療される」、「治療する」などは、有益なまたは所望の結果、例えば臨床結果を得るためのアプローチを指し示す。治療は、損傷、疾患もしくは状態の症状の低減もしくは改善、または損傷、疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを任意選択的に伴い得る。本明細書に記載の組成物の投与は、一部の実施形態では、そのような症状の１つまたは複数を治療してもよい。
【００３７】
本明細書において使用される場合、文脈が他に明確にしなければ、「予防」、および類似の語、例えば、「予防される」、「予防する」などは、損傷、疾患または状態の発症または再発を予防し、阻害し、またはその可能性を低減するためのアプローチを指し示す。それはまた、損傷、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発生もしくは再発を予防し、阻害し、もしくはその可能性を低減すること、または任意選択的に、損傷、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅延させもしくは損傷、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発生もしくは再発を遅延させるためのアプローチを指す。本明細書において使用される場合、「予防」および類似の語はまた、損傷、疾患または状態の強度、効果、症状および／または負荷を低減することを含む。
【００３８】
本明細書において使用される場合、組成物の「有効量」または「治療有効量」は、所望の生物学的効果、例えば、有益な臨床結果などに影響するために充分な量である。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「糖尿病」は、身体の細胞がグルコースを適切に代謝できない代謝性疾患である。Ｉ型糖尿病において、膵島細胞が膵臓において破壊されるため、身体中のインスリンレベルはグルコース代謝のために不充分となる。ＩＩ型糖尿病において、患者の細胞はインスリンに対して不応性となるため、グルコースを適切に使用する能力を喪失する。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「神経損傷」は、糖尿病、アルコール、虚血、および外傷が挙げられるがそれに限定されない任意の原因からの神経への傷害、疾患、機能不良または損傷を指す。外傷の種類としては、鈍力外傷、穿刺創傷、および裂傷が挙げられる。虚血は、不充分な血液供給または他の要因により引き起こされることがある。神経損傷は、したがって、概しては、健常対象における神経機能と同じ程度まで対象の神経が機能しないことを引き起こす任意の意図的または非意図的な、疾患に関するまたは疾患に関しない、局在性または全身性の、表面または深部組織の損傷を指す。本明細書において使用される場合、「ニューロパチー」は、神経傷害または疾患などにより引き起こされる、神経損傷の特定の形態を指す。ニューロパチーは、対象の感覚（疼痛、ヒリヒリ感、刺すような感覚、痺れ）、運動（筋肉衰弱もしくは消耗症）、または臓器機能（汗腺、血管緊張）に対する効果により立証されてもよい。「末梢性ニューロパチー」という用語は、末梢神経に影響するニューロパチーの形態を指す。末梢性ニューロパチーは、糖尿病性ニューロパチーまたは非糖尿病性ニューロパチーのいずれかを含んでもよい。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「罹患した領域」は、神経傷害に起因する異常な感覚または刺激への応答を経験する対象の身体の区画を指す。罹患した領域は、傷害を受けた神経の約５、１０、１５、２０、２５、または３０ｃｍ以内の領域であってもよい。罹患した領域の寸法は、傷害を受けた神経への傷害の種類または重篤度により決定される。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「糖尿病性ニューロパチー」は、末梢性ニューロパチーの最も一般的な形態を指す。それは糖尿病に起因し、通常、遠位の肢に影響する。理論により縛られるものではないが、糖尿病性ニューロパチーは、多くの場合に、神経への血流の低減を起源とすると考えられる。それは、徐々の痺れ、ヒリヒリ感、または疼痛により特徴付けられ、患者の脚および腕を上がることがある。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「創傷」という用語は、皮膚を通る破れを指す。それは、皮膚の急性の割れ目または皮膚により提供される障壁における慢性の欠陥（潰瘍とも称される）であってもよい。創傷としては、穿刺創傷、裂傷、擦過傷、および他の機序による皮膚分解が挙げられる。創傷としては、意図的な（例えば、外科的な）創傷および非意図的な損傷、例えば、疾患または偶発的な損傷などにより引き起こされるものが挙げられる。
【００４４】
本明細書において使用される場合、例えば複能性細胞に関する、「単離された」という用語は、その天然の環境から除去されることを意味する。例えば、細胞は、その天然の環境において共に存在する材料の一部または全てから分離されている場合に、単離されている。
【００４５】
本明細書において使用される「加工された微小血管組織」という用語は、小さい断片に解離された微小血管組織を指す。一部の実施形態では、加工された微小血管組織は、乾燥、照射、または配合されている。一部の実施形態では、加工された微小血管組織は複能性細胞を含む。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「複能性細胞」は、２つまたはより多くの異なる専門家された細胞種に分化する能力を維持する細胞を指す。複能性細胞としては、幹細胞および複能性前駆細胞が挙げられる。複能性細胞の例としては、間葉幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、内皮前駆細胞、脂肪幹細胞、血管周細胞および臍帯幹細胞が挙げられるがそれに限定されない。本明細書に記載の方法による滅菌または保存後に、複能性細胞は、成長、増殖、または分化する能力を喪失してもよいことが理解される。「複能性細胞調製物」および「ＭＣＰ」という用語は、天然の状態において見出される共に存在する材料の少なくとも一部から単離され、かつ、供給源組織中での状態からそれに含有される細胞が変化するようにまたは濃度が増加するように酵素的に、化学的に、物理的に、または照射により加工されている複能性細胞を指す。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「ｍＶＡＳＣ（登録商標）」は、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｉｎｃ．により供給される複能性細胞調製物製品を指す。ｍＶＡＳＣ（登録商標）は、無菌の既製品のヒト同種移植片微小血管組織である。
【００４８】
「自己移植」（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）および「自己移植」（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）などの用語は、組織ドナーが組織から製造される組成物のレシピエントでもある治療を指す。
【００４９】
「同種移植」（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）および「同種移植」（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）などの用語は、組織ドナーが組織から製造される組成物のレシピエントと同じ種であるが、同じ個体ではない治療を指す。
【００５０】
「異種移植」（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）および「異種移植」（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）などの用語は、組織ドナーが組織から製造される組成物のレシピエントとは異なる種である治療を指す。
【００５１】
本明細書において使用される場合、「濃縮された」という用語は、複能性細胞などの標的の混合物中の濃度または頻度を増加させるプロセスを指す。これは、異質の細胞、組織もしくは液体を複能性細胞から除去することによりおよび／または細胞培養においてそれらを拡大増殖することにより達成され得る。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「治療剤」という用語は、薬物、生物学的製剤、組織、および／または細胞を含んでもよい、神経損傷、例えば、末梢性ニューロパチーの治療を意図した組成物を指す。一部の実施形態では、治療剤は、ＭＣＰまたは１つもしくは複数の薬物、生物学的製剤、組織、および／もしくは細胞と組み合わせたＭＣＰである。組成物はまた、安定化剤、乳化剤、粘着剤および他の医薬配合剤を含有してもよい。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「増殖因子」という用語は、細胞成長、増殖、治癒、および細胞分化を刺激することができる天然に存在する物質を指す。通常、それはタンパク質またはステロイドホルモンである。増殖因子は、様々な細胞プロセスを調節するために重要である。増殖因子は、典型的には、細胞間のシグナル伝達分子として作用する。例は、標的細胞の表面上の特定の受容体に結合するサイトカインおよびホルモンである。それらは、多くの場合に、細胞の分化および成熟を促進し、それは増殖因子間で異なる。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「脳由来神経栄養因子」、または「ＢＤＮＦ」は、カノニカルな神経増殖因子に関する、増殖因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーである。神経栄養因子は、脳および末梢において見出される。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「塩基性線維芽細胞増殖因子」または「ｂＦＧＦ」は、ＦＧＦ２またはＦＧＦ−βとしても公知であり、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。ｂＦＧＦは血管新生を媒介し、ヒト胚性幹細胞培養培地の不可欠な成分であり、該増殖因子は、細胞が未分化状態に留まるために必要である。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「ヘパトーマ由来増殖因子」または「ＨＧＤＦ」は、増殖、血管新生、および神経栄養活性を呈するタンパク質を指し、臓器発生に関与することが示唆されている。それはまた、高移動度群タンパク質１様２（ＨＭＧ−１Ｌ２）として公知である。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「トランスフォーミング増殖因子ベータ１」または「ＴＧＦ−β１」は、サイトカインのトランスフォーミング増殖因子ベータスーパーファミリーのポリペプチドメンバーである。それは、細胞成長、細胞増殖、細胞分化およびアポトーシスといった多くの細胞機能を行う分泌タンパク質である。
【００５８】
「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」としては、ヒトまたは家畜動物において使用するために許容されるものとして米国食品医薬品局により承認された任意の佐剤、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素／着色剤、香味促進剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、等張剤、溶媒または乳化剤が挙げられるがそれに限定されない。
【００５９】
「医薬組成物」は、本発明の組成物、および、哺乳動物、例えば、ヒトへの治療剤の送達のために当該技術分野において一般に認められている媒体の配合物を指す。そのような媒体は、したがって、任意の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
【００６０】
一態様では、本開示は、それを必要とする対象において末梢性ニューロパチーを治療、予防、改善、または低減する方法であって、対象に治療剤を含む組成物を投与することを含み、対象が、罹患した領域中に少なくとも１つの傷害を受けた神経を有し、投与するステップが、罹患した領域に組成物を局所的に投与することを含む、方法を提供する。
【００６１】
別の態様では、本開示は、治療剤を含む、それを必要とする対象において末梢性ニューロパチーを治療、予防、改善、または低減するための組成物を提供する。
【００６２】
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において末梢性ニューロパチーを治療、予防、改善、または低減する方法であって、対象に治療剤を含む組成物を投与することを含み、対象が、罹患した領域中に少なくとも１つの創傷を有し、かつ、投与するステップが、罹患した領域中の創傷に組成物を局所的に投与することを含む、方法を提供する。
【００６３】
一部の実施形態では、治療剤は、１ミリリットル当たりに、少なくとも約１０００個のＣＦＵ−Ｆ細胞、少なくとも約１０００個のＣＦＵ−Ｆ細胞の内容物、少なくとも約１０５個のＣＤ９０陽性細胞、少なくとも約１０５個のＣＤ９０陽性細胞の内容物、少なくとも約１０ピコグラム（ｐｇ）のＨＤＧＦ、少なくとも約１０ｐｇのｂＦＧＦ、少なくとも約１０ｐｇのＢＤＮＦ、合わせて少なくとも約１０ｐｇのｂＦＧＦおよびＢＤＮＦ、ならびに最大で約１０ｐｇのＴＧＦ−ｂ１から選択される１つまたは複数の細胞またはタンパク質を含む。
【００６４】
一部の実施形態では、対象は糖尿病を患っており、または、末梢性ニューロパチーは糖尿病性ニューロパチーを含む。
【００６５】
一部の実施形態では、対象は１つまたは複数の糖尿病性足潰瘍（ＤＦＵ）を有する。
【００６６】
一部の実施形態では、投与するステップは、３か月中に少なくとも２回、対象に組成物を局所的に投与することを含む。
【００６７】
一部の実施形態では、投与するステップは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日毎に対象に組成物を局所的に投与することを含む。
【００６８】
一部の実施形態では、罹患した領域は、創傷、任意選択的に潰瘍を含む。
【００６９】
一部の実施形態では、治療剤は、加工された微小血管組織、間葉幹細胞（ＭＳＣ）調製物、脂肪組織からの間質血管画分（ＳＶＦ）、骨髄細胞調製物、および臍帯幹細胞からなる群から選択される複能性細胞調製物（ＭＣＰ）を含む。
【００７０】
一部の実施形態では、治療剤は、加工された微小血管組織、任意選択的にｍＶＡＳＣ（登録商標）を含む。
【００７１】
一部の実施形態では、加工された微小血管組織はヒト脂肪組織に由来する。
【００７２】
一部の実施形態では、加工された微小血管組織は、コラゲナーゼ処理、中性プロテアーゼ処理、細胞溶解、任意選択的に塩化アンモニウム細胞溶解、乾燥、任意選択的にフリーズドライ、空気乾燥、または凍結乾燥、凍結、任意選択的にフリーズドライまたは瞬間凍結、および照射、任意選択的にガンマ照射または電子ビーム照射から選択される１つまたは複数の処理を用いて加工されている。
【００７３】
一部の実施形態では、組成物は局所投与のために配合されている。
【００７４】
一部の実施形態では、組成物は、粉末、クラッシャブルケーキ、フィルム、ゲル、軟膏、懸濁液、エマルション、濃縮物、コアセルベート、スキャフォールド、吸湿性粉末、または創傷ドレッシングもしくは被覆物を含む。
【００７５】
一部の実施形態では、対象に組成物を投与することは、罹患した領域への組成物の接着を結果としてもたらす。
【００７６】
一部の実施形態では、方法は、神経感覚の改善、組織治癒、創傷閉鎖、潰瘍治癒、創傷再発の予防、柔軟性の増加、または疼痛の減少のうちの１つまたは複数を結果としてもたらす。
【００７７】
一部の実施形態では、方法は、潰瘍の治癒を改善し、領域中の神経感覚を改善し、または領域中の新たな潰瘍の再発率を低減する。
【００７８】
一部の実施形態では、罹患した領域は、傷害を受けた神経の５、１０、１５、３０ｃｍ以内にある。
【００７９】
治療剤組成物
本開示は、ニューロパチーなどの神経損傷を治療および／または予防するための治療剤を提供する。
【００８０】
複能性細胞の多くの潜在的な供給源がある。表１は、一般的な供給源の多くを供給源組織中の所望の細胞の頻度と共に列記する。
【表１−１】
2021509675.tif 000003
【表１−２】
2021509675.tif 000004
【００８１】
複能性細胞は、天然の組織の残りと共に頻繁に使用され、場合によりそれらは組織から単離され、多くの場合にそれらは数を拡大増殖するために培養される。様々な組織からの複能性細胞の調製方法は当該技術分野において公知である。典型的には、間葉幹細胞（ＭＳＣ）を生育するためのプロトコールが複能性細胞の数を拡大増殖するために使用される。
【００８２】
複能性細胞製造物、血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）または骨髄吸引濃縮物（ＢＭＡＣ）は、創傷床中もしくは創傷の外周の周りへの注射によりＤＦＵを治療するために使用され、または部位に細胞を保持するためにフィブリン糊を用いて適用されている。そのような治療は、創傷治癒を改善することが報告されている。ＰＲＰおよびＢＭＡＣのそのような適用は、ニューロパチーに対して効果を示していない。
【００８３】
複能性細胞は、傷害を受けた神経に隣接する組織中に注射されまたはニューロパチーの治療として全身的に提供されている。神経傷害が外科的に治療される場合、複能性細胞は、神経の修復を助けるために使用される神経ガイドチューブ中に含められている。そのような治療の成功のいくつかの報告があるが、糖尿病性ニューロパチー患者においてではない。
【００８４】
フリーズドライおよび滅菌された複能性細胞は治療的利益を維持し、またはさらに増進する。これらの種類の複能性細胞の調製のための関連する方法は、米国特許出願第１５／６３３，３１１号、米国特許出願第１４／４２９，５１１号、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６０１８１号において提供される。一部の場合には、そのような複能性細胞は、１）室温で貯蔵された場合に複数年にわたり安定であり、２）１分またはそれ未満において使用のために用意でき、３）同種レシピエントまたは異種レシピエントにおいてさえ効果的であり、４）疾患伝染のリスクを示さず、かつ５）細胞の不適切な分化または拡大増殖の危険を示さない。
【００８５】
本開示は、複能性細胞調製物を用いる驚くべき結果を提示する。本発明者らは、神経損傷の治療のために複能性細胞の局所適用を用いた予想外の成功を実証した。一部の実施形態では、本開示は、傷害を受けた神経により罹患した領域（例えば、糖尿病性創傷）に局所的に大用量の複能性細胞を適用することに関する方法を提供する。本発明者らは、ＤＦＵの治癒におけるはっきりとした改善および驚くべきことに治療した肢における末梢性ニューロパチーの実質的な逆転を観察した。
【００８６】
複能性細胞の用量を決定するための様々な方法は本開示により提供される。一部の実施形態では、本開示の複能性細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１１７＋、またはＣＤ２７１＋である大用量の細胞を含む。一部の実施形態では、本開示の複能性細胞は、マーカーＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ２７１、または当該技術分野において公知の幹細胞用の他のマーカーを使用して二重、三重、または四重陽性の大用量の細胞を含む。本発明者らは、一部の場合には、これらの方法を使用する細胞の定量化は幹細胞の数を過剰推定することを観察した。したがって、一部の実施形態では、本開示の方法は、形成される線維芽細胞様コロニー（ＣＦＵ−Ｆ）の数を計数することによる限界希釈アッセイにおいて複能性細胞調製物中の幹細胞を定量化することを含む。本発明者らは、しかしながら、一部は培養条件において生育し得ないため、ＣＦＵ−Ｆ法は、幹細胞の数を過少推定する場合があることを観察する。したがって、一部の実施形態では、方法は、ＣＦＵ−ＦおよびＣＤ９０＋細胞について複能性細胞調製物をアッセイすることを含む。一部の実施形態では、本開示の組成物は、治療される創傷１平方ｃｍ当たり少なくとも１０００個のＣＦＵ−Ｆまたは１０５個のＣＤ９０＋細胞を含む。
【００８７】
治療される創傷１平方ｃｍ当たり１０００個より多くのＣＦＵ−Ｆまたは１０５個より多くのＣＤ９０＋細胞においてこれらの加工された複能性細胞をＤＦＵに適用した場合、その治療された肢において創傷治癒の劇的な改善および末梢性ニューロパチーの逆転が観察された。治癒およびニューロパチーの最大の改善は、加工された複能性細胞をＤＦＵに局所的に直接的に適用した場合に見られた。他の症例において、加工された複能性細胞が局部的に注射される場合に改善がある。
【００８８】
一部の実施形態では、治療剤は、加工された微小血管組織、複能性細胞、複能性細胞調製物（ＭＣＰ）、ならびに、限定されないがサイトカインおよび増殖因子などの他の成分のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、本開示の組成物は、インタクトな細胞膜を有する複能性細胞（「インタクトな複能性細胞」）を含む。一部の実施形態では、本開示の組成物はインタクトな複能性細胞を含まない。一部の実施形態では、本開示の組成物は、最大で約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、または約７０％の複能性細胞がインタクトな細胞膜を有する複能性細胞を含む。一部の実施形態では、本開示の組成物は、最大で約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、または約７０％の複能性細胞が生存可能である、すなわち、「生複能性細胞」である、複能性細胞を含む。本開示の組成物はインタクトな複能性細胞を含んでもよく、または含まなくてもよい。特定の実施形態では、本開示の組成物は、いかなるインタクトな複能性細胞も含まないまたはいかなる生複能性細胞も含まないまたはいかなる生細胞も含まない。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は複能性細胞の断片または細胞膜を含む。本開示の組成物は生および／または死複能性細胞を含んでもよい。
【００８９】
本開示の組成物は、任意の哺乳動物組織、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、またはウマなどの哺乳動物から得られた組織から調製されてもよい。本開示の組成物は、自己、同種または異種対象を治療するために使用されてもよい。したがって、剤、細胞、または組織は、治療される対象から、または異なるドナー対象（例えば、ヒトもしくは他の動物）から得られてもよく、異なるドナー対象は、治療される対象と同じまたは異なる種であってもよい（例えば、対象がヒトである場合、ドナーは非ヒト動物、例えば、霊長動物であってもよい）。特定の実施形態では、剤、細胞、または組織は、治療される対象と同じ種の同種ドナー、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物ドナーから得られる。特定の実施形態では、ドナー動物は健常ドナーである。一部の実施形態では、組成物は、供給源組織において観察されるより高い濃度において１つまたは複数の増殖因子を含む。一部の実施形態では、増殖因子は、組成物の他の成分と同じ供給源組織に由来するが、加工により濃縮されている（すなわち、増殖因子は供給源組織に内因性である）。一部の実施形態では、増殖因子は外因性、すなわち、問題とする供給源以外の供給源に由来する。増殖因子は、商用の供給元から得られてもよく、組換えにより作製されてもよく（例えば、細菌、昆虫細胞、もしくは哺乳動物発現系において）、または天然の供給源（例えば、ドナー）から単離されてもよい。組成物中の増殖因子または他の生物学的製剤は、組織から単離されてもよく、または培養において生育された細胞もしくは微生物から回収されてもよい。
【００９０】
様々な実施形態では、微小血管組織組成物または複能性細胞は、多数の異なる組織のいずれかから調製される。特定の実施形態では、組織は非胚組織である。例えば、特定の実施形態では、本開示の組成物を調製するために使用される組織は、血管組織または微小血管組織、例えば、脂肪組織、皮膚、骨、腱組織、分娩後組織、骨髄、または筋肉組織などである。
【００９１】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、１つまたは複数の複能性細胞、分化した細胞、細胞外マトリックスの成分、増殖因子、血管新生剤、抗炎症剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および／または分化剤を含む。細胞外マトリックス成分としては、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、様々なコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびトロンボスポンジン、ならびに本明細書に記載の他のものが挙げられるがそれに限定されない。
【００９２】
様々な実施形態では、組成物の貯蔵寿命は、１つまたは複数の生物学的活性を維持しながら室温で少なくとも約１週間、少なくとも約１か月、少なくとも約２か月、少なくとも約６か月、またはより長い。特定の実施形態では、組成物は、少なくとも約１か月間、少なくとも約２か月間、少なくとも約４か月間、少なくとも約６か月間、または少なくとも約１年間約４℃において貯蔵された場合に測定可能な血管新生、抗炎症、および／または組織治癒活性を保持する。本明細書に記載の組成物の特定の実施形態では、組成物は、少なくとも約１か月間、少なくとも約２か月間、少なくとも約４か月間、少なくとも約６か月間、または少なくとも約１年間約−２０℃において貯蔵された場合に測定可能な血管新生、抗炎症、または組織治癒活性を保持する。特定の実施形態では、測定可能な血管新生、抗炎症、または組織治癒活性は、本明細書に記載の任意のものといったｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて測定された場合に、貯蔵前の活性の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％である。
【００９３】
解離した組織、または結果として得られる組成物といったそれから単離された細胞および他の組織成分は、例えば、微生物、例えば、細菌、ウイルス、および真菌、またはプリオンなどによる汚染を低減または除去するために任意選択的に滅菌される。特定の実施形態では、複能性細胞および／または他の組織成分を含む組成物は、照射を使用して滅菌される。電子ビーム、Ｘ線、ガンマ線、または紫外放射線などの放射線を使用する滅菌方法が存在する。特定の実施形態では、滅菌は、解離した組織、またはそれから単離された細胞および他の組織成分を、約０．５〜約５．０Ｍｒａｄ、もしくは約１．０〜約３．０Ｍｒａｄの範囲内、または約１．０Ｍｒａｄ、もしくは約１．５Ｍｒａｄ、もしくは約２．０Ｍｒａｄ、もしくは約２．５Ｍｒａｄ、もしくは約３．０Ｍｒａｄ、もしくは約３．５Ｍｒａｄ、もしくは約４．０Ｍｒａｄ、もしくは約４．５Ｍｒａｄ、もしくは約５．０Ｍｒａｄ（またはそれらの値の間のガンマ放射線の任意の量）の線量のガンマ放射線に曝露することにより行われる。特定の実施形態では、滅菌は、解離した組織、またはそれから単離された細胞および他の組織成分を、約０．５〜約５．０Ｍｒａｄ、もしくは約１．０〜約３．０Ｍｒａｄの範囲内、または約１．０Ｍｒａｄ、もしくは約１．５Ｍｒａｄ、もしくは約２．０Ｍｒａｄ、もしくは約２．５Ｍｒａｄ、もしくは約３．０Ｍｒａｄ、もしくは約３．５Ｍｒａｄ、もしくは約４．０Ｍｒａｄ、もしくは約４．５Ｍｒａｄ、もしくは約５．０Ｍｒａｄ（またはそれらの値の間の電子ビーム放射線の任意の量）の線量の電子ビーム放射線に曝露することにより行われる。多くの場合に、供給源により生成される放射線量よりも組成物が暴露される放射線量を測定することがより容易である。特定の実施形態では、滅菌のためのＥビームまたはガンマ放射線レベルは、約９ｋＧｙ〜約５０ｋＧｙ、または約９ｋＧｙ〜約２０ｋＧｙ、または約２０ｋ〜約３０ｋＧｙ、または約３０ｋＧｙ〜約４０ｋＧｙ（またはそれらの値の間の放射線の任意の量）である。一部の実施形態では、滅菌のためのＥビームまたはガンマ放射線レベルは約９ｋＧｙ〜約１７ｋＧｙである。一部の実施形態では、組成物は、滅菌照射により加工されたＭＣＰを含む。一部の実施形態では、組成物は、滅菌照射により加工された加工された微小血管組織を含む。
【００９４】
加えて、解離した組織、またはそれから単離された細胞および他の組織成分は、ウイルスを不活性化するために処理されてもよい。ウイルスを不活性化する方法は当該技術分野において公知であり、滅菌について上記したような照射の使用が挙げられる。ウイルスを不活性化する他の方法が使用されてもよく、該方法としては、酸もしくは塩基処理、漂白、アルデヒドもしくはエチレンオキシド溶液、または熱が挙げられる。組成物を凍結乾燥または凍結するために使用される凍結保護剤（ｃｒｙｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）および他の賦形剤はまた、放射線から保護してもよいことが理解される。例えば、低温と共に糖およびアルブミン（または他の安定化タンパク質）は、細胞への放射線傷害から保護する。したがって、特定の実施形態では、滅菌またはウイルス不活性化は凍結乾燥後に行われる。
【００９５】
特定の実施形態では、本開示の組成物中に存在する細胞の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満は生存可能である。いくつかの実施形態では、実質的に全ての細胞は生存可能でない。本明細書において使用される場合、「生存可能」という用語にはその通常の意味が与えられ、適切な条件下、例えば、同じ細胞または細胞の種類が増殖することが予期されない条件下において培養された場合、例えば、本明細書に記載されるように加工されない場合に、増殖することができる細胞も指す。他の実施形態では、前記組成物中に存在する細胞の約２％未満または約１％未満は生存可能である。特定の実施形態では、組成物中に存在するいずれの細胞または実質的にいずれの細胞も生存可能でない。したがって、「生存可能でない」という用語は、適切な条件下、例えば、同じ細胞が増殖することが予期されない条件下において培養された場合、例えば、本明細書に記載されるように加工されない場合に、細胞が増殖することができないことを意味する。
【００９６】
本開示によれば、本明細書に記載の組成物内の細胞は生存可能でなくてもよく、かつ対象への移植後に長期に持続しなくてもよいが、組成物は対象において応答のカスケードを誘発し、それが治癒の改善、炎症の低減、または血管新生の増加に繋がることが理解される。本開示に記載の複能性細胞調製物（ＭＣＰ）および加工された微小血管組織組成物は、損傷したまたは疾患の組織、例えば、神経損傷（ｎｅｒｖｅ  ｉｎｕｒｙ）など、例えば、末梢神経組織の治癒を促進または誘導するために生存可能な幹細胞または幹細胞全体を含む必要はない。加えて、本開示の組成物は、加工された組織およびその様々な成分、例えば、解離した組織、細胞、例えば、複能性細胞（例えば、幹細胞）、細胞膜、細胞外マトリックス成分、および組成物を調製するために使用される組織試料内に存在するまたは該組織試料と関連付けられる様々な増殖因子、血管新生因子、抗炎症剤、サイトカイン、分化剤などを含んでもよい。組成物はまた、他の供給源から得られた成分から調製されてもよい。
【００９７】
一部の実施形態では、本開示の方法により投与される組成物は、生複能性細胞、薬物、および／または生物学的因子、例えば、増殖因子、血管新生剤、抗炎症剤、サイトカイン、もしくは分化剤を含んでもよい。例えば、増殖因子または血管新生剤は、塩基性線維芽細胞増殖因子、他の線維芽細胞増殖因子、骨形成タンパク質、肝細胞増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β１および／もしくはβ３、または血管内皮細胞増殖因子から選択されてもよい。内因性に見出されるまたは本開示の組成物に外因的に加えられる追加の治療剤としては、表２に列記される任意のものが挙げられる。本開示の一実施形態では、治療剤組成物は、ｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＧＦ−β１、ＨＤＧＦ、またはその組合せを含む。
【表２−１】
2021509675.tif 000005
【表２−２】
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【表２−３】
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【００９８】
一部の実施形態では、治療剤は、神経増殖因子（ＮＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、Ｊ１４７、クルクミン、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）またはこれらの誘導体からなる群から選択される。
【００９９】
本明細書において使用される場合、「ＮＧＦ」は、ある特定の標的ニューロンの成長、維持、増殖、および生存の調節に主に関与する神経栄養因子および神経ペプチドを指す。ＮＧＦは最初に、ｐｒｏＮＧＦと称される３つのタンパク質（α−ＮＧＦ、β−ＮＧＦ、およびγ−ＮＧＦ）の１３０ｋＤａの複合体において発現される。この複合体のガンマサブユニットはセリンプロテアーゼとして作用して、ベータサブユニットのＮ末端を切断し、それにより、タンパク質を機能的なＮＧＦに活性化させる。実施形態では、治療剤はｐｒｏＮＧＦまたはＮＧＦのいずれかである。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「ＧＤＮＦ」は、ヒトにおいてＧＤＮＦ遺伝子によりコードされるタンパク質を指す。ＧＤＮＦは、多くの種類のニューロンの生存を促進する効力がある小さいタンパク質である。それは、ＧＦＲα受容体、特にＧＦＲα１を通じてシグナルを伝達する。
【０１０１】
Ｊ１４７は、加速加齢のマウスモデルにおいてアルツハイマー病および加齢の両方に対して効果が報告された実験薬物である。Ｊ１４７は以下の化学構造を有する：
【化１】
2021509675.tif 000008
【０１０２】
クルクミンは、一部の植物により産生される明黄色の化学物質である。それはうこんの主要なクルクミノイドである。クルクミンは以下の化学構造を有する：
【化２】
2021509675.tif 000009
【０１０３】
クルクミンおよびその誘導体は、アルツハイマー病（ＡＤ）、およびパーキンソン病（ＰＤ）といった神経変性疾患ならびに悪性腫瘍の治療として示唆されている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０１３  Ｊｕｌ；１１（４）：３３８−３７８）。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、「ＩＧＦ−１」は、ヒトにおいてＩＧＦ１遺伝子によりコードされるタンパク質を指す。ＩＧＦ−１は、インスリンに分子構造が類似したホルモンである。ＩＧＦ−１は、少なくとも２つの細胞表面受容体チロシンキナーゼ：ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）およびインスリン受容体に結合する。ＩＧＦ−１は、ＡＫＴシグナル伝達経路の最も強力な天然の活性化因子の１つ、細胞の成長および増殖の刺激因子、ならびにプログラム細胞死の強力な阻害剤である。
【０１０５】
本開示の組成物は、一部の実施形態では、損傷したまたは疾患の組織の治癒を促進する。一部の実施形態では、本開示の組成物は組織治癒活性を有する。本明細書において使用される場合、組成物の「組織治癒活性」は、同様に治療されたが組成物への曝露を伴わない類似の組織、または１つもしくは複数の治療剤（例えば、ＭＣＰもしくは加工された微小血管組織）を有しない試験組成物と同じもしくは類似の成分を含む対照組成物（もしくは「ビヒクル」）と比較して組成物に曝露された損傷したまたは疾患の組織（例えば、末梢神経傷害）の改善された治癒（例えば、修復または再生）を促進する組成物の能力である。改善された治癒は、完全な治癒までの時間、生成される新たな組織の量、結果として生じる治癒した組織の強度、または結果として生じる治癒した組織の機能性が挙げられるがそれに限定されない任意の適切な手段を使用して測定される。適切な指標の例としては、肢の感覚または糖尿病性潰瘍の創傷修復の増加または改善が挙げられるがそれに限定されない。特定の実施形態では、本開示の組成物は１つまたは複数の生物学的活性を有する。例えば、ある特定の実施形態では、組成物は抗炎症または血管新生活性を有する。ある特定の関連する実施形態では、組成物は血管形成または組織治癒を促進する。これらの効果の組合せがいくつかの実施形態において達成される。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は抗炎症活性を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物に曝露したまたはそれと接触させた損傷したまたは疾患の組織（例えば、炎症応答を起こしている損傷したまたは疾患の組織）は、損傷したまたは疾患の組織を同様に治療したが本開示の組成物に曝露せずかつそれと接触させなかった場合と比較して低減された炎症を呈する。ある特定の実施形態では、本開示の組成物に曝露したまたはそれと接触させた組織中の炎症の量は、損傷したまたは疾患の組織を本開示の組成物に曝露せずかつそれと接触させなかった場合の炎症の量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％低減される。炎症は、当該技術分野において利用可能な任意の手段により測定されてもよく、該手段としては、例えば、組織学的に観察される場合の罹患した組織中に観察されるリンパ球の数が挙げられるがそれに限定されない。
【０１０７】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて測定されてもよい抗炎症活性を有する。ある特定の実施形態では、本開示の組成物の存在下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて測定される炎症の量は、本開示の組成物の非存在下または対照組成物の存在下での同じアッセイにおいて測定される炎症の量より少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％少ない。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは混合リンパ球反応である。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は血管新生活性を有する。特定の実施形態では、本開示の組成物に曝露したまたはそれと接触させた損傷したまたは疾患の組織（例えば、炎症応答を起こしている損傷したまたは疾患の組織）は、損傷したまたは疾患の組織を同様に治療したが本開示の組成物に曝露せずかつそれと接触させなかった場合と比較して増加した血管新生を呈する。ある特定の実施形態では、本開示の組成物に曝露したまたはそれと接触させた組織中の血管新生の量は、損傷したまたは疾患の組織を本開示の組成物に曝露せずかつそれと接触させなかった場合の血管新生の量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、または少なくとも約５００％増加する。血管新生は、当該技術分野において利用可能な任意の手段により測定されてもよく、該手段としては、例えば、後肢虚血モデルが挙げられるがそれに限定されない。
【０１０９】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて測定されてもよい血管新生活性を有する。ある特定の実施形態では、本開示の組成物の存在下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイにおいて測定される活性の量は、本開示の組成物の非存在下または対照組成物の存在下での同じアッセイにおいて測定される活性の量より少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、または少なくとも約５００％高い。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイはマトリゲル移植アッセイである。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは内皮細胞遊走アッセイである。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、管形成アッセイ、浸潤アッセイ、または節アッセイ（ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ）である。
【０１１０】
それを必要とする対象に本発明の組成物を投与する目的のために、組成物は医薬組成物として配合されてもよい。本開示の医薬組成物は、本開示の組成物ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体および／または希釈剤を含む。本発明の組成物は、それを必要とする対象において損傷、疾患または障害の治療または予防をもたらすために充分な量、すなわち、治療有効量において医薬組成物中に存在する。
【０１１１】
薬学的に許容される賦形剤、担体および／または希釈剤は当業者によく知られている。液体溶液として配合される組成物について、許容される担体および／または希釈剤としては生理食塩水および無菌水が挙げられ、任意選択的に酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および他の一般的な添加物を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、本発明の組成物を適切な薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と合わせることにより調製することができ、固体、半固体、液体またはエアロゾル形態、例えば、粉末、顆粒、溶液、注射液、吸入剤、およびマイクロスフェアの調製物に配合されてもよい。これらの組成物はまた、分散剤、表面活性剤、結合剤および潤滑剤を含有してもよい。当業者は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ  １９９０において開示されるものなどの、適切な方式において、および承認された実施にしたがって、本発明の組成物をさらに配合することができる。一部の実施形態では、組成物は、例えば、粉末、クリーム、軟膏、または他の局所組成物として、局所投与のために配合されている。
【０１１２】
使用方法
本開示は、本開示の任意の組成物または治療剤を使用してニューロパチーなどの神経損傷を治療または予防する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の治療剤を含む組成物を、神経傷害を患っているまたは患っていることが疑われる対象に投与することを含む。一部の実施形態では、神経損傷は末梢性ニューロパチーである。一部の実施形態では、神経損傷は糖尿病性ニューロパチーである。一部の実施形態では、投与するステップは、神経損傷の部位においてまたはその近くにおいて対象に組成物を注射することを含む。一部の実施形態では、投与するステップは、神経損傷、末梢神経傷害、または末梢性ニューロパチーの区画上または該区画中に局所的に組成物を適用することを含む。一部の実施形態では、組成物は、ニューロパチーの区画中にまたはニューロパチーに罹患した領域中の創傷に局所的に適用される。一部の実施形態では、対象はＤＦＵを患っており、かつ、組成物は足に注射される。一部の実施形態では、対象はＤＦＵを患っており、かつ、組成物は足に局所的に適用される。一部の実施形態では、対象はＤＦＵを患っており、組成物はＭＣＰならびに任意選択的に１つまたは複数の他の治療剤を含み、かつ、組成物は足の潰瘍に局所的に適用される。
【０１１３】
本開示の組成物を投与する経路としては、局所、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、経口、経鼻、移植、埋込み、注射、カテーテルを介する送達、外用、経皮、吸入、非経口、および鼻腔内が挙げられるがそれに限定されない。組成物は、マトリックス、ゲル、または他のスキャフォールド中で投与されてもよい。本明細書において使用される非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技術を含む。加えて、本発明の組成物は、修復または増強を必要とする部位に外科的に埋め込まれ、注射され、送達され（例えば、カテーテルもしくはシリンジによる）、または他に直接的もしくは間接的に投与されてもよい。例えば、本開示の組成物は、対象における損傷または疾患の部位中にまたはそれに隣接して外科的に導入されてもよい。一部の実施形態では、投与は静脈内である。組成物は、特定の投与の経路のために配合されてもよい。特定の実施形態では、方法は、組織修復のための外科的、虚血の治療のための静脈内、疼痛および炎症の治療のための関節空間への注射、創傷への局所、ならびに末梢血管疾患の治療のための筋肉中への注射である。
【０１１４】
本開示は、糖尿病性足潰瘍などの創傷への局所投与を想定する。一部の実施形態では、局所投与は、同じまたは類似の創傷への同じまたは類似の組成物の注射と比較して改善された治療および／または創傷治癒を結果としてもたらす。一部の実施形態では、ＤＦＵへの局所投与は、足への同じまたは類似の組成物の注射より良好なＤＦＵの治療を結果としてもたらす。しかしながら、本発明の組成物は多くの経路により投与されてもよいが、本発明の別の重要な態様は、ニューロパチーに罹患した区画における創傷への治療剤の局所送達が他の投与の経路よりニューロパチーの治療においてはるかに効果的であったという発見である。局所投与は、健常な神経の近くにおいてまたはそれから離して、例えば、最も近い健常な神経から最大３０センチメートル離して、行われてもよい。
【０１１５】
本開示の組成物は、例えば局所適用のために、ハイドロゲル溶液中に懸濁されてもよい。好適なハイドロゲルの例としては、ＲＡＤ１６などの自己集合性ペプチドが挙げられる。代替的に、適用前に、治療剤を含有するハイドロゲル溶液を硬化させてマトリックスを形成してもよい。ハイドロゲルは、共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開格子構造を作る有機ポリマー（天然または合成）であってもよい。ハイドロゲルを形成するために使用され得る材料の例としては、コラーゲン、ヒアルロン酸塩、多糖、例えばアルギネートおよびその塩、ペプチド、ポリホスファジン、およびポリアクリレート（これらはイオン的に架橋される）、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックポリマー（それぞれ温度もしくはｐＨにより架橋される）、またはコアセルベートが挙げられる。
【０１１６】
特定の実施形態では、組成物は、凍結乾燥された吸湿性粉末として、創傷、例えば糖尿病性足潰瘍に、局所的に適用される。創傷は次に、適切な創傷ドレッシングを用いて被覆されてもよい。
【０１１７】
本開示の組成物はまた、創傷への適用を促進するためにドレッシングまたはスキャフォールド中に含まれてもよい。組成物はまた、創傷に噴霧される水性溶液であってもよい。
【０１１８】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、ニューロパチーなどの神経損傷を治療または予防するために使用される。創傷は、外科的創傷、皮膚病変、熱傷、損傷、移植片創傷、または糖尿病性創傷が挙げられるがそれに限定されない任意の数の原因に起因するものであってもよい。皮膚病変は、静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡、熱傷または医原性移植創傷であってもよい。本開示の治療剤の治癒活性から利益を得ることができるニューロパチーまたは他の神経損傷としては、例えば、糖尿病、虚血事象、裂傷、衝突損傷、ＨＩＶ、外科的介入、放射線または化学療法の結果としてもたらされるものが挙げられるがそれに限定されない。
【０１１９】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、例えば損傷または組織傷害の部位において、血管新生または血管再建を促進または刺激するためにさらに使用される。
【０１２０】
本開示の組成物は、単独でまたは損傷もしくは疾患を治療もしくは予防するための１つもしくは複数の他の治療剤もしくは手順と組み合わせて使用されてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、傷害を受けた組織への血液供給を富化するためおよび／または組織再生を促進するために、本開示の組成物は、血小板リッチ血漿と組み合わせて使用されてもよい。１つまたは複数の他の治療剤または手順と組み合わせて使用される場合、本開示の組成物は、他の治療剤または手順を用いる治療の前に、同じもしくは重なり合う期間に、または後に提供または使用されてもよい。
【０１２１】
別の治療剤と組み合わせて使用される場合、本開示の組成物は、他の剤とは別々に提供されてもよく、または他の治療剤も含有する医薬組成物中、例えば、１つが本開示の組成物である２つもしくはより多くの治療剤を含む共配合物中に存在してもよい。特定の実施形態では、本開示の組成物および追加の治療剤の両方は、同じインプラント、マトリックスまたはスキャフォールドと合わせられまたは関連付けられている。
【０１２２】
本発明の組成物は治療有効量において投与され、治療有効量は、用いられる特定の組成物の活性；本発明の組成物が投与される対象の年齢、体重、全般的健康、性別および食事；投与の様式および時間；対象における組成物の排出、流出、または破壊の速度；ならびに治療される損傷、疾患、または状態の種類、サイズ、または重篤度が挙げられるがそれに限定されない要因に依存して変化する。本開示の組成物は、一部の実施形態では、他には同等のＭＣＰまたは加工された微小血管組織組成物において見出されるより高い濃度の特定の因子を含む。例えば、組成物は、創傷１ｃｍ２当たり１０５個より多くのＣＤ９０＋細胞（または細胞が投与前にさらに加工されて細胞膜が破砕される場合にそのようなＣＤ９０＋細胞の内容物）を送達する。ある特定の実施形態では、組成物は、１ｃｍ２当たり１０００個より多い線維芽細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）（または１０００個のＣＦＵ−Ｆを有するがさらに加工された細胞組成物の内容物）を送達する。さらに他の実施形態では、組成物は、創傷１ｃｍ２当たり＞１０ｐｇのｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、および／またはＨＤＧＦかつ＜１０ｐｇのＴＧＦ−β１の送達を可能とする。
【０１２３】
本開示の方法は、１、２またはより多くの用量において治療剤または１つもしくは複数の治療剤を含む組成物を投与することにより実施されてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、治療剤または１つもしくは複数の治療剤を含む組成物は、単回用量として、複数回用量としてまたはある期間にわたる繰返しの用量において投与される。治療剤または１つもしくは複数の治療剤を含む組成物は、患者の必要に応じて３時間毎、１日毎、３日毎、７日毎、１０日毎、１４日毎、２８日毎またはより長い間隔毎に投与されてもよい。
【０１２４】
以上において要約し、以下においてさらに詳細に示す方法は、実施者により採用されるある特定の行為を記載するが、それらはまた、別の集団によりそれらの行為が為されることの指示を含むことができると理解されるべきである。したがって、「微小血管組織を投与する」などの行為は、「微小血管組織の投与を指示すること」を含む。
【実施例】
【０１２５】
実施例１：複能性細胞調製物の特徴付け
これらの実験の目的は、複能性細胞に基づくＤＦＵを治療するための簡便な新たな製造物を開発および試験することであった。我々は、１平方ｃｍ当たり少なくとも１０００個のＣＦＵ−Ｆまたは１０５個のＣＤ９０＋細胞の用量を標的化した。我々は、脂肪をミンチし、コラゲナーゼおよび中性プロテアーゼを用いて消化し、塩化アンモニウムを用いて赤血球細胞を溶解した後のヒト脂肪組織から単離した複能性細胞を使用した。
【０１２６】
複能性細胞のバッチをヒト脂肪組織から製造し、バイアルに入れた後、契約した研究室において目的の表現型および一部の増殖因子について特徴付けた。細胞数および表現型をＩＮＣＥＬＬ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）により測定し、増殖因子をＡｓｓａｙＧａｔｅ（Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）においてＥＬＩＳＡにより測定した。表現型の結果は５．５×１０５個のＣＤ９０＋細胞／バイアルを示す。
【０１２７】
赤血球細胞を除去するために、試料を塩化アンモニウム溶液に供した。調製物を１ｍｌの総体積においてＥＬＩＳＡによりアッセイし、以下の表の結果を与えた。ＨＤＧＦ（ヘパトーマ由来増殖因子）をコロラド州立大学のプロテオミクス研究室において定量化した。
【表３】
2021509675.tif 000010
【０１２８】
実施例２：ニューロパチーを有する肢の創傷への局所送達
実施例１において特徴付けたような複能性細胞の調製物を凍結乾燥し、ガンマ照射により滅菌した。結果として得られたケーキは多孔性であり、もろく、粉末に容易に圧砕される。標準的な創傷ケアの施術にしたがったデブリードマンおよび洗浄後に粉末を糖尿病性足潰瘍上に（局所的に）散布した。創傷を次に、Ｓｔｅｒｉ−ｓｔｒｉｐｓ（３Ｍ、Ｓｔ．  Ｐａｕｌ、ＭＮ）を用いて適所に保持された閉塞性ドレッシング（Ａｄａｐｔｉｃ  Ｔｏｕｃｈ（商標）、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）を用いて被覆した。２人の患者に複能性細胞調製物を与え、対照患者に複能性細胞の追加なしに同じケアを与えた。複能性細胞およびドレッシングの再適用前にＤＦＵの治癒を週毎に測定した。患者の末梢性ニューロパチーの程度をＶｏｎ  Ｆｒｅｙの方法を使用して測定し、該方法では、軟正力において屈曲するモノフィラメント線維を使用して肢をプロービングして、患者が繊維を感じることができるまで脚を上に動かした。
【０１２９】
図１は、ヒドロコロイドドレッシングを用いた標準治療にもかかわらず治癒していない足底の糖尿病性足潰瘍を示した患者Ａについての結果を示す。デブリードマン後に、潰瘍は５．１ｃｍ２と測定され、ニューロパチーは膝までの半分に広がった。４週間後、ＤＦＵは３．５ｃｍ２と測定され、ニューロパチーの広がりは約１４ｃｍ低減された。この患者において、ニューロパチーの逆転は、医薬を必要とするかなり重篤な疼痛を伴った。ＤＦＵが全的に治癒した時に治療剤の適用を中止したが、ニューロパチーは治癒し続け、付随する疼痛はその後に全的に消散した。
【０１３０】
図２は、ヒドロコロイドドレッシングを用いた標準治療にもかかわらず治癒していない足の内側の糖尿病性足潰瘍を示した患者Ｂについての結果を示す。デブリードマン後に潰瘍は６．１ｃｍ２と測定され、ニューロパチーは膝までの半分にわたり広がった。４週間後、ＤＦＵは０．４ｃｍ２と測定され、ニューロパチーの広がりは約１６ｃｍ低減された。彼女の創傷は全的に治癒し、ニューロパチーの改善は複能性細胞調製物を用いた処置の完了後に持続した。
【０１３１】
図３は、対照データを示し、該データでは、患者Ｃは、ヒドロコロイドドレッシングを用いた標準治療にもかかわらず治癒していない足底の糖尿病性足潰瘍を示した。デブリードマン後に潰瘍は４．０ｃｍ２と測定され、ニューロパチーは膝までの距離の１／３に広がった。４週間後、ＤＦＵは１．６ｃｍ２と測定され、ニューロパチーの広がりは約１ｃｍ低減された。１２週時にＤＦＵは治癒しておらず、ニューロパチーにほとんど変化はなかった。
【０１３２】
図１および図２に示されるように、複能性細胞処置は患者のニューロパチーに劇的な影響力を有した。５週目までに、患者ＡおよびＢの両方は、長年において初めて足底に何らかの感覚を有した。対照的に、図３に示すように、対照患者Ｃはほとんど効果を示さなかった。
【０１３３】
実施例３：ニューロパチーを有する肢における皮下注射
糖尿病性ニューロパチーを有する成人男性は、左足首より下の感覚の大部分を喪失した。実施例２において使用したものと同じ調製物の４回の皮下注射を用いて１回の外来の間に彼を処置した。各注射は、１ｍｌの通常生理食塩水中に溶解した２７５，０００個のＣＤ９０＋細胞からなるものであった。患者は後に、左足の感覚の６０％の改善を報告し、改善は足首から注射の領域まで広がった。したがって、調製物は、ニューロパチーに対して有益な影響力を有したが、以前に記載した患者におけるＤＦＵに局所的に剤を適用した場合ほどは顕著でなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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