(57)【要約】  本発明は、３つ以上のトリウイルスからの外来抗原をコードし発現する新規組換え多価非病原性マレック病ウイルス構築物および多価家禽ウイルスワクチンの使用方法を開示する。【選択図】図１
2021500876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つの異種ヌクレオチド配列を含む組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐ）であって、ここで、
第１異種ヌクレオチド配列が第１ニワトリ病原体からの１以上の抗原をコードし、第２異種ヌクレオチド配列が第２ニワトリ病原体からの１以上の抗原をコードし、第３異種ヌクレオチド配列が第３ニワトリ病原体からの１以上の抗原をコードし、
第１異種ヌクレオチド配列、第２異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列のそれぞれがｒＭＤＶｎｐゲノムの非必須部位に位置し、ならびに
第１ニワトリ病原体、第２ニワトリ病原体および第３ニワトリ病原体が全て、互いに異なるウイルス種であり、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）とは異なるウイルス種である、組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐ）。
【請求項２】
第１ニワトリ病原体が伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）であり、第２ニワトリ病原体が伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）であり、第３ニワトリ病原体がニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である、請求項１記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項３】
第１異種ヌクレオチド配列が伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスウイルスタンパク質２（ＩＢＤＶ  ＶＰ２）のコード配列を含み、第２異種ヌクレオチド配列が伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ（ＩＬＴＶ  ｇＤ）のコード配列および伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｉ（ＩＬＴＶ  ｇＩ）のコード配列を含み、第３異種ヌクレオチド配列がニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ  Ｆ）のコード配列を含む、請求項２記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項４】
第１異種ヌクレオチド配列が第１異種核酸または第２異種核酸により含まれ、第２異種ヌクレオチド配列が第１異種核酸または第２異種核酸により含まれ、第３異種ヌクレオチド配列が第１異種核酸または第２異種核酸により含まれ、
第１異種核酸がｒＭＤＶｎｐゲノム内の第１非必須部位に位置し、第２異種核酸がｒＭＤＶｎｐゲノム内の第２非必須部位に位置し、
第１非必須部位と第２非必須部位とが同じまたは異なる、請求項１、２または３記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項５】
第１非必須部位と第２非必須部位とが同じ部位であり、ＵＳ２部位、ＵＬ５４．５部位、ＵＬ７／８部位、ＵＬ４０部位、ＵＬ４３部位、ＵＬ４５／４６部位、ＵＬ５５部位、ＵＳ１０部位、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の領域、ＵＳ２とＳＯＲＦ３との間の領域、遺伝子間領域１（ＩＧ１）部位、遺伝子間領域２（ＩＧ２）部位および遺伝子間領域（ＩＧ３）からなる群から選択される、請求項４記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項６】
第１非必須部位と第２非必須部位とが２つの異なる部位であり、それらの２つの異なる部位が、ＵＳ２部位、ＵＬ５４．５部位、ＵＬ７／８部位、ＵＬ４０部位、ＵＬ４３部位、ＵＬ４５／４６部位、ＵＬ５５部位、ＵＳ１０部位、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の領域、ＵＳ２とＳＯＲＦ３との間の領域、遺伝子間領域１（ＩＧ１）部位、遺伝子間領域２（ＩＧ２）部位および遺伝子間領域（ＩＧ３）からなる群から個々に選択される、請求項４記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項７】
第１異種核酸が第１異種ヌクレオチド配列および第２異種ヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸が第３異種ヌクレオチド配列を含み、
第１異種ヌクレオチド配列がＩＢＤＶ  ＶＰ２のコード配列を含み、第２異種ヌクレオチド配列がＩＬＴＶ  ｇＤのコード配列およびＩＬＴＶ  ｇＩのコード配列を含み、第３異種ヌクレオチド配列がＮＤＶ  Ｆのコード配列を含む、請求項４、５または６記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項８】
第１異種核酸が配列番号２１のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸が配列番号２２のヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項９】
第１異種核酸が、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸が配列番号２６のヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１０】
第１異種核酸が第２異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸が第１異種ヌクレオチド配列を含み、
第１異種ヌクレオチド配列がＩＢＤＶ  ＶＰ２のコード配列を含み、第２異種ヌクレオチド配列がＩＬＴＶ  ｇＤのコード配列およびＩＬＴＶ  ｇＩのコード配列を含み、第３異種ヌクレオチド配列がＮＤＶ  Ｆのコード配列を含む、請求項４、５または６記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１１】
第１異種核酸が配列番号２８のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸が配列番号２７のヌクレオチド配列を含み、または第１異種核酸が配列番号３１のヌクレオチドを含み、第２異種核酸が配列番号３２のヌクレオチド配列を含む、請求項１０記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１２】
第１異種核酸が第１異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列を含み、
第２異種核酸が第２異種ヌクレオチド配列を含み、
第１異種ヌクレオチド配列がＩＢＤＶ  ＶＰ２のコード配列を含み、第２異種ヌクレオチド配列がＩＬＴＶ  ｇＤのコード配列およびＩＬＴＶ  ｇＩのコード配列を含み、第３異種ヌクレオチド配列がＮＤＶ  Ｆのコード配列を含む、請求項４、５または６記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１３】
第１異種核酸が配列番号３０のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸が配列番号２９のヌクレオチド配列を含む、請求項１２記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１４】
第１異種ヌクレオチド配列および第２異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列が全て、同じ非必須部位に位置する、請求項１、２または３記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１５】
非必須部位が、ＵＳ２部位、ＵＬ５４．５部位、ＵＬ７／８部位、ＵＬ４０部位、ＵＬ４３部位、ＵＬ４５／４６部位、ＵＬ５５部位、ＵＳ１０部位、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の領域、ＵＳ２とＳＯＲＦ３との間の領域、遺伝子間領域１（ＩＧ１）部位、遺伝子間領域２（ＩＧ２）部位および遺伝子間領域（ＩＧ３）からなる群から選択される、請求項１４記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１６】
第１異種ヌクレオチド配列および第２異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列が全て、異なる非必須部位に位置する、請求項１、２または３記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１７】
３つの異なる非必須部位が、ＵＳ２部位、ＵＬ５４．５部位、ＵＬ７／８部位、ＵＬ４０部位、ＵＬ４３部位、ＵＬ４５／４６部位、ＵＬ５５部位、ＵＳ１０部位、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の領域、ＵＳ２とＳＯＲＦ３との間の領域、ＩＧ１部位およびＩＧ２からなる群から個々に選択される、請求項１６記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１８】
第１異種ヌクレオチド配列および第２異種ヌクレオチド配列が第１非必須部位に位置し、第３異種ヌクレオチド配列が第２非必須部位に位置する、請求項１、２または３記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１９】
第１異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列が第１非必須部位に位置し、第２異種ヌクレオチド配列が第２非必須部位に位置する、請求項１、２または３記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項２０】
第２異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列が第１非必須部位に位置し、第１異種ヌクレオチド配列が第２非必須部位に位置する、請求項１、２または３記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項２１】
第１非必須部位および第２非必須部位が、ＵＳ２部位、ＵＬ５４．５部位、ＵＬ７／８部位、ＵＬ４０部位、ＵＬ４３部位、ＵＬ４５／４６部位、ＵＬ５５部位、ＵＳ１０部位、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の領域、ＵＳ２とＳＯＲＦ３との間の領域、遺伝子間領域１（ＩＧ１）部位、遺伝子間領域２（ＩＧ２）部位および遺伝子間領域（ＩＧ３）からなる群から個々に選択される、請求項１８、１９または２０記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項２２】
第１異種ヌクレオチド配列のＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列が第１プロモーターの制御下で機能的に存在し、第２異種ヌクレオチド配列のＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列が第２プロモーターの制御下で機能的に存在し、第２異種ヌクレオチド配列のＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列が第３プロモーターの制御下で機能的に存在し、ＮＤＶ  Ｆをコードする第３異種ヌクレオチド配列が第４プロモーターの制御下で機能的に存在する、請求項３、４、５、６、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項２３】
第１プロモーター、第２プロモーター、第３プロモーターおよび第４プロモーターが全て異なる、請求項２２記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項２４】
第２プロモーターが内因性ＩＬＴＶ  ｇＤのプロモーターであり、第３プロモーターが内因性ＩＬＴＶ  ｇＩのプロモーターであり、第１プロモーターおよび第４プロモーターが、マウスサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｍＣＭＶ  ＩＥ１）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｈＣＭＶ  ＩＥ１）プロモーターおよびニワトリβ−アクチンプロモーターからなる群から個々に選択される、請求項２２または２３記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項２５】
第１プロモーターがｍＣＭＶ  ＩＥ１であり、第４プロモーターがｈＣＭＶ  ＩＥ１である、請求項２４記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項２６】
第１非必須部位がＵＳ２部位であり、第２非必須部位がＵＬ５４．５部位である、請求項６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４または２５記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項２７】
第１非必須部位がＵＬ５４．５部位であり、第２非必須部位がＵＳ２部位である、請求項６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４または２５記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項２８】
ｒＭＤＶｎｐが組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）である、前記請求項のいずれか１項記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項２９】
ｒＭＤＶｎｐが組換えマレック病ウイルス血清型２（ｒＭＤＶ２）である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項３０】
前記請求項のいずれか１項記載のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物。
【請求項３１】
請求項３０記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
【請求項３２】
請求項３１記載のワクチンを投与することを含む、ＮＤＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＤＶ、ＭＤＶおよびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるウイルスに対するニワトリの防御を補助するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１７年１０月１２日付け出願の米国仮特許出願第６２／５７１，５２４号および２０１８年９月１１日付け出願の米国仮特許出願第６２／７２９，６７３号（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、３つ以上のトリウイルスからの外来抗原をコードし発現する新規組換え多価非病原性マレック病ウイルス構築物ならびに家禽ワクチンにおけるこれらの多価組換え非病原性マレック病ウイルス構築物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
病原性家禽ウイルスはニワトリを衰弱させるだけでなく、養鶏業者に大きな損害を及ぼす。なぜなら、生じる疾患のほとんどは伝染性であり、家禽業は大規模監禁飼育施設に大きく依存しているからである。若いニワトリに対するワクチン接種が、しばしば、これらのウイルスと闘うための唯一の実用的な手段である。弱毒化または死滅家禽ウイルスワクチンは市場において依然として重要であるが、近年、病原性ウイルスタンパク質抗原を発現する組換えウイルス構築物を含有するワクチンの開発にかなりの資源が費やされてきている。更に、複数のウイルス病原体からの外来遺伝子を発現する安定かつ有効な多価組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐと略称される）ベクターを構築するために、相当な努力がなされている。そのような多価ワクチンは、ニワトリに行う注射の回数を最小にするのに役立ち、それにより、ワクチン接種されるニワトリの不快感およびストレスを軽減し、労働および原料のコストを有意に減少させるであろう。そのような単一の多価構築物でのワクチン接種は、複数の組換え一価ｒＭＤＶｎｐ構築物を含有する代替的多価ｒＭＤＶｎｐワクチンよりも好ましいであろう。なぜなら、これらの代替的ワクチンは、少なくとも現時点では、単一のウイルス病原体に対してしか防御をもたらしていないからである。そのような代替的ワクチンの失敗は、おそらく、一価ｒＭＤＶｎｐ構築物の１つがその他の一価ｒＭＤＶｎｐ構築物より増殖しすぎて、有意な免疫応答をこれらの他の一価ｒＭＤＶｎｐ構築物が誘導するのを妨げることによるものであろう。いずれの場合にも、複数のウイルス病原体からの外来遺伝子を発現する安定かつ有効な多価組換えｒＭＤＶｎｐベクターを構築するための過去の相当な努力にもかかわらず（実際、そのようなワクチンは２０年以上前に示唆されていた［例えば、Ｕ．Ｓ．５，９６５，１３８を参照されたい］）、最近になって初めて、２以上の他の病原体からの抗原をコードする組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴと略称される）を含む多価ワクチンが安定かつ有効であると示された。
【０００４】
ワクチン接種により防除されうる１つの家禽ウイルス疾患として、マレック病が挙げられる。マレック病は、世界中でニワトリに悪影響を及ぼす病原性疾患である。マレック病は、主に、２〜５月齢の若いニワトリにおいて生じる。臨床徴候には、四肢の１以上の進行性麻痺、脚の麻痺による協調障害、翼が冒されることによる四肢の垂下、および頚筋が冒されることによる頭位低下が含まれる。急性の場合には、重篤な機能低下が生じうる。嚢および胸腺萎縮も生じうる。
【０００５】
マレック病の病原体は、二本鎖ＤＮＡゲノムを有する細胞結合ウイルスであるマレック病ウイルス血清型１（ＭＤＶ１と略称される）である。ＭＤＶ１は、（ｉ）細胞溶解を引き起こしうる、Ｂ細胞への感染、および（ｉｉ）Ｔ細胞リンパ腫を誘発しうる、Ｔ細胞への潜伏感染の両方を引き起こすリンパ親和性トリアルファヘルペスウイルスである。ビルレント（毒性、病原性）ＭＤＶ１株に密接に関連しているマレック病ウイルス血清型２（ＭＤＶ２と略称される）はニワトリヘルペスウイルス３として従来から公知のものであり、ニワトリにおいて病原性をほとんど又は全く有さないことが示されている自然弱毒化ＭＤＶ株である［Ｐｅｔｈｅｒｂｒｉｄｇｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５８：１１−１７（２００９）］。ＳＢ−１は、ＭＤＶ１に対するワクチンにおいて有用であることが示されている特異的ＭＤＶ２株である［例えば、ＭｕｒｔｈｙおよびＣａｌｎｅｋ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２６（２）５４７−５５３（１９７９）を参照されたい］。
【０００６】
もう１つの密接に関連しているアルファヘルペスウイルスであるマレック病ウイルス血清型３（ＭＤＶ３と略称される）は、シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴと略称される）として、より広く知られており、家禽シチメンチョウの非病原性ウイルスである［例えば、Ｋｉｎｇｈａｍら，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：１１２３−１１３５（２００１）を参照されたい］。一般に使用されている２つのＨＶＴ株はＰＢ１株およびＦＣ１２６株である。ＨＶＴもニワトリにおいて非病原性であるが、それはＭＤＶ１に対する長く持続する防御免疫応答をニワトリにおいて誘導する。したがって、ＨＶＴは、ＨＶＴよりウイルス血症性であるがより低安全性だとみなされているＳＢ−１と一般に組合されて、ビルレントＭＤＶ１に対する家禽ワクチンにおいて長年使用されている。あるいは、特にビルレントなＭＤＶ１株でトリ集団をチャレンジする場合には、ＨＶＴはリスペン（Ｒｉｓｐｅｎ’ｓ）ワクチンと組合されうる。リスペンワクチンは、低ビルレントＭＤＶ１株から誘導され次いで細胞継代により更に弱毒化された分離体である。しかし、リスペン株はニワトリの高感受性系統に対して幾らかのビルレンスを保有している。
【０００７】
ＨＶＴの完全ゲノムの配列は既に開示されており［Ａｆｏｎｓｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（２）：９７１−９７８（２００１）］、ほとんどのアルファヘルペスウイルスと同様に、ＨＶＴは相当数の潜在的非必須挿入部位を有する［例えば、Ｕ．Ｓ．５，１８７，０８７；Ｕ．Ｓ．５，８３０，７４５；Ｕ．Ｓ．５，８３４，３０５；Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３；Ｕ．Ｓ．５，９２８，６４８；Ｕ．Ｓ．５，９６１，９８２；Ｕ．Ｓ．６，１２１，０４３；Ｕ．Ｓ．６，２９９，８８２  Ｂ１を参照されたい］。ＨＶＴは遺伝的修飾に適していることも示されており、したがって、組換えベクターとして長年使用されている［ＷＯ  ８７／０４４６３］。したがって、組換えＨＶＴベクターは、例えばニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）［Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１１：３４９−３５８（１９９３）；Ｒｅｄｄｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１４：４６９−４７７（１９９６）］、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）［Ｄａｒｔｅｉｌら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１１：４８１−４９０（１９９５）；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６（１１）：５６３７−５６４５（２００２）］および伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）［Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，５４（４）：１２５１−１２５９（２０１０）；ＷＯ  ９２／０３５５４；Ｕ．Ｓ．６，８７５，８５６］に由来する抗原をコードする外来遺伝子を発現することが報告されている。ＭＤＶ２の全ゲノム配列も公知である［ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃ．ｎｒ：ＡＢ０４９７３５．１およびＰｅｔｈｅｒｂｒｉｄｇｅら，前掲を参照されたい］。ＭＤＶ２のゲノム構成はＨＶＴのものに非常に類似しており、特にＵＳ領域はＨＶＴのものと同一である［Ｋｉｎｇｈａｍら，前掲を参照されたい］。
【０００８】
また、ＨＶＴゲノムの特異的領域がＭＤＶ１ゲノムの対応領域により置換されている、新規トリヘルペスウイルス（ＮＡＨＶ）として公知の組換えキメラウイルスが構築されている。ＮＡＨＶは、他の家禽ウイルスに由来する抗原をコードする外来遺伝子を発現させるためにも使用されている［Ｕ．Ｓ．５，９６５，１３８；Ｕ．Ｓ．６，９１３，７５１］。
【０００９】
ＭＤＶと同様に、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶまたはＩＬＴと略称される）は、世界中でニワトリに悪影響を及ぼすアルファヘルペスウイルスである［Ｆｕｃｈｓら，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８：２６１−２７９（２００７）］。ＩＬＴＶは、呼吸機能低下、息切れ、および血の混じった滲出物の喀出により特徴づけられる急性呼吸疾患をニワトリにおいて引き起こす。ウイルス複製は気道の細胞に限定され、ここで、感染は気管内で組織びらん及び出血を引き起こす。
【００１０】
ニューカッスル病はニワトリのもう１つの高伝染性かつ衰弱性疾患である。ニューカッスル病の病原体はニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である。ＮＤＶはモノネガウイルス目に属し、パラミクソウイルス科に含まれる。ニューカッスル病ウイルスは非セグメント化マイナス鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ＮＤＶは、それらのビルレンスに従い、３つの異なる病理型に分類されている。ＮＤＶの非病原性長潜伏期性株による家禽の感染は実質的に無症候性である。これとは全く対照的に、亜病原性（中病原性）および短潜伏期性（高病原性）ＮＤＶ株は、致死的となりうる重篤な疾患を引き起こす。ＮＤＶのほとんどの型は呼吸系および／または神経系に感染し、息切れ及び斜頚を引き起こしうる。
【００１１】
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶまたはＩＢＤと略称される）はガンボロ病ウイルスとも称され、伝染性ファブリキウス嚢病の原因因子である。ＩＢＤＶはニワトリのリンパ系組織の急性高伝染性ウイルス感染を引き起こし、その主要標的は、トリの必須免疫器官であるファブリキウス嚢である。感受性トリ集団における罹患率は高く、急速な体重減少および中等度ないし高度の死亡率を示す。該疾患から回復したニワトリは、ファブリキウス嚢（の一部）の破壊のため、免疫不全を示しうる。これはそれらを二次感染症に特に罹りやすくする。
【００１２】
ＩＢＤＶはビルナウイルス科のメンバーである。この科のウイルスは、二本鎖ＲＮＡの２つのセグメント（ＡおよびＢ）からなるゲノムを有する。２つのＩＢＤＶ血清型（血清型１および２）が存在し、これらはウイルス中和（ＶＮ）試験により区別されうる。血清型１ウイルスはニワトリに対して病原性であることが示されており、血清型２ウイルスはシチメンチョウにおいて亜急性疾患を引き起こすに過ぎない。歴史的には、ＩＢＤＶ血清型１ウイルスは、現在は「古典的」ＩＢＤウイルスとして公知であるただ１つの型からなるものであった。その後、いわゆる「変異」ＩＢＤＶ株が出現した。ＩＢＤＶの古典的株および変異株は、モノクローナル抗体のパネルを使用するウイルス中和試験により、またはＲＴ−ＰＣＲにより同定され、区別されうる［Ｗｕら，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，５１：５１５−５２６（２００７）］。よく知られている古典的ＩＢＤＶ株には、Ｄ７８、ファラガー（Ｆａｒａｇｈｅｒ）５２／７０およびＳＴＣが含まれ、一方、８９／０３は、よく知られた変異株である。多数の生または不活化ＩＢＤＶワクチン、例えばＮＯＢＩＬＩＳ（登録商標）Ｇｕｍｂｏｒｏ  Ｄ７８（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）のような生ワクチンが商業的に入手可能である。
【００１３】
前記のとおり、ＨＶＴは、マレック病に対する有意な防御をもたらす抗原および組換えベクターの両方として機能しうるため、それは現在、ＩＬＴＶを防ぐＩｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＩＬＴ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈにより販売されている）；ならびに共にＮＤＶを防ぐＩｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＮＤ−ＳＢ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈにより販売されている）  Ｖｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（登録商標）ＨＶＴ−ＮＤＶ（Ｃｅｖａにより販売されている）；ならびに共にＩＢＤＶを防ぐＶａｘｘｉｔｅｋ（登録商標）ＨＶＴ＋ＩＢＤ（Ｍｅｒｉａｌ；旧称：Ｇａｌｌｉｖａｃ（商標）ＨＶＴ−ＩＢＤ）およびＶｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（商標）ＨＶＴ−ＩＢＤ（Ｃｅｖａ）のような多価ワクチンのためのプラットフォームベクターとして使用されている。注目すべきことに、Ｉｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＩＬＴは２つの外来遺伝子、すなわち、ＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇｌを含み、これは安全で有効で安定であることが判明している。しかし、これらの２つの外来遺伝子は同一病原体に由来し、更に、それらは本来、重複しており、ＩＬＴＶに対する適切な免疫化を可能にするためには共発現される必要がある。より最近になって、ＨＶＴ−ＩＬＴＶ−ＮＤＶを含む安全で有効で安定である組換え多価ワクチンが開示された［ＵＳ  ８，９３２，６０４  Ｂ２およびＵ．Ｓ．９，４０９，９５４  Ｂ２（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする］。初期ＨＶＴ−ＮＤＶ−ＩＢＤＶも開示されているが、対応製品の開発中の長期試験に際して、主要構築物の１つであるＨＶＰ３０９は十分な遺伝的安定性も異種インサートの持続的発現も示さなかった［ＷＯ  ２０１３／０５７，２３５］。その後、より安定した効率的な構築物が開発された［ＷＯ  ２０１６／１０２６４７］。他の組換えＨＶＴ構築物も記載されている［例えば、ＵＳ  ９，１１４，１０８、ＵＳ  ９，５５５，０１６、ＵＳ  ９，５５５，０９６およびＵＳ  ２０１８／０１６３２３０  Ａ１を参照されたい］。
【００１４】
しかし、３つ以上の異なる病原体からの異種抗原を有効に発現しうる安定な多価組換えＭＤＶｎｐ構築物の明らかな利点、およびそれらを設計するための相当な努力にもかかわらず、これまでのところ何も達成されていない。実際、そのような組換えＭＤＶｎｐ構築物を構築するための過去の試みの失敗は、３つ以上の異なるウイルス病原体からの外来抗原の、ＭＤＶｎｐ構築物内への挿入が、その構築物に過度な負担をかけて、観察される安定性欠如をもたらすという、当技術分野における一般的な統一見解につながっている。したがって、いずれかの与えられた多価組換えＭＤＶｎｐの、ワクチンとしての適合性は、３つ以上の家禽ウイルスの特有の組合せから得られる異種抗原の組合せを該組換えＭＤＶｎｐが含む場合には、よく見ても予測不可能なままである。したがって、３つ以上の異なる非ＭＤＶ１家禽ウイルス病原体に対して防御するための唯一の有効成分として多価ワクチンにおいて使用されうる安定な新規組換えＭＤＶｎｐベクターを構築することにより、積み重なった産業上の失敗を克服することが明らかに必要とされている。
【００１５】
本明細書中のいずれの参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であると自認するものと解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】Ｕ．Ｓ．５，９６５，１３８
【特許文献２】Ｕ．Ｓ．５，１８７，０８７
【特許文献３】Ｕ．Ｓ．５，８３０，７４５
【特許文献４】Ｕ．Ｓ．５，８３４，３０５
【特許文献５】Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３
【特許文献６】Ｕ．Ｓ．５，９２８，６４８
【特許文献７】Ｕ．Ｓ．５，９６１，９８２
【特許文献８】Ｕ．Ｓ．６，１２１，０４３
【特許文献９】Ｕ．Ｓ．６，２９９，８８２  Ｂ１
【特許文献１０】ＷＯ  ８７／０４４６３
【特許文献１１】ＷＯ  ９２／０３５５４；Ｕ．Ｓ．６，８７５，８５６
【特許文献１２】Ｕ．Ｓ．５，９６５，１３８；Ｕ．Ｓ．６，９１３，７５１
【特許文献１３】ＵＳ  ８，９３２，６０４  Ｂ２
【特許文献１４】Ｕ．Ｓ．９，４０９，９５４  Ｂ２
【特許文献１５】ＷＯ  ２０１３／０５７，２３５
【特許文献１６】ＵＳ  ９，１１４，１０８
【特許文献１７】ＵＳ  ９，５５５，０１６
【特許文献１８】ＵＳ  ９，５５５，０９６
【特許文献１９】ＵＳ  ２０１８／０１６３２３０  Ａ１
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｐｅｔｈｅｒｂｒｉｄｇｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５８：１１−１７（２００９）
【非特許文献２】ＭｕｒｔｈｙおよびＣａｌｎｅｋ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２６（２）５４７−５５３（１９７９）
【非特許文献３】Ｋｉｎｇｈａｍら，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：１１２３−１１３５（２００１）
【非特許文献４】Ａｆｏｎｓｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（２）：９７１−９７８（２００１）
【非特許文献５】Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１１：３４９−３５８（１９９３）
【非特許文献６】Ｒｅｄｄｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１４：４６９−４７７（１９９６）
【非特許文献７】Ｄａｒｔｅｉｌら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１１：４８１−４９０（１９９５）
【非特許文献８】Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６（１１）：５６３−５６４５（２００２）
【非特許文献１０】Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，５４（４）：１２５１−１２５９（２０１０）
【非特許文献１１】Ｆｕｃｈｓら，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８：２６１−２７９（２００７）
【非特許文献１２】Ｗｕら，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，５１：５１５−５２６（２００７）
【発明の概要】
【００１８】
発明の概括
したがって、本発明は、複数のウイルス病原体からの外来遺伝子を発現するベクターとしての使用のための新規多価組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐ）を提供する。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）である。他の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは組換えマレック病ウイルス血清型２（ｒＭＤＶ２）である。本発明のｒＭＤＶｎｐ、例えばｒＨＶＴまたはｒＭＤＶ２は、病原性家禽ウイルスに対する安全かつ有効な多価ワクチンにおいて使用されうる。したがって、本発明は、３つ以上の外来ニワトリウイルス病原体からの抗原をコードし発現する組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐ）ベクター（ＨＶＴベクターを含む）を提供する。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）からの１以上の抗原、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）からの１以上の抗原およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）からの１以上の抗原をコードする。より詳細な実施形態においては、そのようなｒＭＤＶｎｐベクターは、病原性ＭＤＶ、病原性ＩＢＤＶ、病原性ＮＤＶおよび／または病原性ＩＬＴＶの感染から生じる臨床徴候からニワトリを防御するワクチン接種を行うのを助ける。ワクチンは、好ましくは、胚形成の第１８〜１９日の、および１日齢以降の雛の健常動物のワクチン接種に有効である。
【００１９】
特定の実施形態においては、組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐ）は、そのゲノムの非必須部位の１以上において、第１ニワトリ病原体からの１以上の抗原をコードする第１異種ヌクレオチド配列、第２ニワトリ病原体からの１以上の抗原をコードする第２異種ヌクレオチド配列、および第３ニワトリ病原体からの１以上の抗原をコードする第３異種ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、第１ニワトリ病原体、第２ニワトリ病原体および第３ニワトリ病原体は全て、トリ（鳥類）ウイルスである。より詳細な実施形態においては、第１ニワトリ病原体、第２ニワトリ病原体および第３ニワトリ病原体は全て、互いに異なるウイルス種であり、マレック病ウイルスとは異なるウイルス種である。このタイプの特定の実施形態においては、第１ニワトリ病原体は伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）であり、第２ニワトリ病原体は伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）であり、第３ニワトリ病原体はニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である。
【００２０】
特定のｒＭＤＶｎｐの実施形態においては、第１異種ヌクレオチド配列は伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスウイルスタンパク質２（ＩＢＤＶ  ＶＰ２）をコードし、および／または第２異種ヌクレオチド配列は伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ（ＩＬＴＶ  ｇＤ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｉ（ＩＬＴＶ  ｇＩ）、もしくはＩＬＴＶ  ｇＩとＩＬＴＶ  ｇＤとの両方をコードし、および／または第３異種ヌクレオチド配列はニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ  Ｆ）をコードする。より詳細なｒＭＤＶｎｐの実施形態においては、第１異種ヌクレオチド配列は伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスウイルスタンパク質２（ＩＢＤＶ  ＶＰ２）をコードし、第２異種ヌクレオチド配列は伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ（ＩＬＴＶ  ｇＤ）および伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｉ（ＩＬＴＶ  ｇＩ）をコードし、ならびに第３異種ヌクレオチド配列はニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ  Ｆ）をコードする。
【００２１】
したがって、本発明の特定のｒＭＤＶｎｐの実施形態においては、第１異種ヌクレオチド配列、第２異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノム内の３つの異なる非必須部位に位置する。特定の実施形態においては、前記の３つの異なる部位は、ＵＳ２部位、ＵＬ５４．５部位、ＵＬ７／８部位、ＵＬ４０部位、ＵＬ４３部位、ＵＬ４５／４６部位、ＵＬ５５部位、ＵＳ１０部位、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の領域、ＵＳ２とＳＯＲＦ３との間の領域、ＩＧ１部位、ＩＧ２部位およびＩＧ３部位からなる群から個々に選択される。このタイプの特定の実施形態においては、第１非必須部位はＵＳ２部位であり、第２非必須部位はＵＬ５４．５部位であり、第３非必須部位はＵＬ４５／４６部位である。
【００２２】
もう１つの実施形態においては、第１異種ヌクレオチド配列、第２異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノム内の第１非必須部位またはｒＭＤＶｎｐゲノム内の第２非必須部位に位置する。このタイプの特定の実施形態においては、第１非必須部位と第２非必須部位とは同一である（すなわち、唯一の非必須挿入部位が存在する）。このタイプの特定の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＳ２部位である。このタイプの他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ５４．５部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ７／８部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ４０部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ４５／４６部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ５５部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＳ１０部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位は、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の領域である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＳ２とＳＯＲＦ３との間の領域である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＩＧ１部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＩＧ２部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＩＧ３部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ４３部位である。
【００２３】
更に他のタイプの実施形態においては、第１非必須部位と第２非必須部位とは異なる。それらの２つの異なる部位は、ＵＳ２部位、ＵＬ５４．５部位、ＵＬ７／８部位、ＵＬ４０部位、ＵＬ４３部位、ＵＬ４５／４６部位、ＵＬ５５部位、ＵＳ１０部位、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の領域、ＵＳ２とＳＯＲＦ３との間の領域、ＩＧ１部位、ＩＧ２部位およびＩＧ３部位からなる群から個々に選択される。。特定の実施形態においては、第１異種ヌクレオチド配列および第２異種ヌクレオチド配列は第１非必須部位に位置し、第３異種ヌクレオチド配列は第２非必須部位に位置する。他の実施形態においては、第１異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列は第１非必須部位に位置し、第２異種ヌクレオチド配列は第２非必須部位に位置する。更に他の実施形態においては、第２異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列は第１非必須部位に位置し、第１異種ヌクレオチド配列は第２非必須部位に位置する。このタイプの好ましい実施形態においては、第１異種ヌクレオチド配列は伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスウイルスタンパク質２（ＩＢＤＶ  ＶＰ２）をコードし、第２異種ヌクレオチド配列は伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ（ＩＬＴＶ  ｇＤ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｉ（ＩＬＴＶ  ｇＩ）またはＩＬＴＶ  ｇＩとＩＬＴＶ  ｇＤとの両方をコードし、第３異種ヌクレオチド配列はニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ  Ｆ）をコードする。
【００２４】
このタイプの或る実施形態においては、第１非必須部位におけるＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質およびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列と、第２非必須部位におけるＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列とを含むｒＭＤＶｎｐは、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列に対して５’になるように構築される。このタイプの他の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列に対して５’になるように構築される。
【００２５】
代替的実施形態においては、第１非必須部位におけるＮＤＶ  Ｆタンパク質およびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列と、第２非必須部位におけるＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含むｒＭＤＶｎｐは、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列に対して５’になるように構築される。このタイプの他の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列に対して５’になるように構築される。
【００２６】
更に他の代替的実施形態においては、第１非必須部位におけるＮＤＶ  Ｆタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列と、第２非必須部位におけるＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列とを含むｒＭＤＶｎｐは、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列に対して５’になるように構築される。このタイプの代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列の５’になるように構築される。
【００２７】
このタイプの特定の実施形態においては、第１非必須部位はＵＳ２部位であり、第２非必須部位はＵＬ５４．５部位である。代替的実施形態においては、第１非必須部位はＵＬ５４．５部位であり、第２非必須部位はＵＳ２部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＳ２部位であり、第２非必須部位はＵＬ４５／４６部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＬ４５／４６部位であり、第２非必須部位はＵＳ２部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＬ５４．５部位であり、第２非必須部位はＵＬ４５／４６部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＬ４５／４６部位であり、第２非必須部位はＵＬ５４．５部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＳ２部位であり、第２非必須部位はＵＬ５５部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＬ５５部位であり、第２非必須部位はＵＳ２部位である。
【００２８】
したがって、本発明のｒＭＤＶｎｐベクターは、これらの外来タンパク質抗原の任意の組合せをコードする異種ヌクレオチド配列を含みうる。特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を含む。更に他の実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質は配列番号６のアミノ酸配列を含む。更に他の実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質は配列番号８のアミノ酸配列を含む。更に他の実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。更に、本発明はまた、これらのアミノ酸配列の１以上をコードするヌクレオチド配列の任意の組合せを含むｒＭＤＶｎｐベクター（それらの全てをコードする特定の実施形態を含む）を提供する。
【００２９】
ｒＭＤＶｎｐの更に他の実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を含む。このタイプの或る実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質は配列番号６のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＮＤＶ  Ｆタンパク質は配列番号８のアミノ酸配列を含む。類似実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＮＤＶ  Ｆタンパク質は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。より詳細な実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質は配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＮＤＶ  Ｆタンパク質は配列番号８のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列のいずれかを含む。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００３０】
関連実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質は配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質は配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされる。更に他の実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質は、配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされる。更に他の実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質は配列番号７のヌクレオチド配列によってコードされる。更に他の実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質は配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００３１】
同様に、本発明のｒＭＤＶｎｐベクターは、そのような異種ヌクレオチド配列の任意の組合せを含む異種核酸を含みうる。ある実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、ｒＭＤＶｎｐゲノム内の第１非必須部位に位置する第１異種核酸と、ｒＭＤＶｎｐゲノム内の第２非必須部位に位置する第２異種核酸とを含み、ここで、第１異種核酸は第１異種ヌクレオチド配列と第２異種ヌクレオチド配列との両方を含み、一方、第２異種核酸は第３異種ヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
このタイプの或る実施形態においては、第１異種核酸は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タンパク質、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）タンパク質および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、一方、第２異種核酸は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）Ｆタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このタイプの或る実施形態においては、第１異種核酸は、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列の５’になるように構築され、および／またはｒＭＤＶｎｐゲノム内に挿入される。このタイプの他の実施形態においては、第１異種核酸は、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列の５’になるように構築され、および／またはｒＭＤＶｎｐゲノム内に挿入される。代替的実施形態においては、第１異種核酸は、ＮＤＶ  Ｆタンパク質およびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、一方、第２異種核酸は、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このタイプの或る実施形態においては、第１異種核酸は、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列の５’になるように構築され、および／またはｒＭＤＶｎｐゲノム内に挿入される。このタイプの代替的実施形態においては、第１異種核酸は、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列の５’になるように、最初の異種核酸が構築され、および／またはｒＭＤＶｎｐゲノム内に挿入される。
【００３３】
更に他の代替的実施形態においては、第１異種核酸は、ＮＤＶ  Ｆタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含み、一方、第２異種核酸は、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このタイプの或る実施形態においては、第１異種核酸は、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩをコードする異種ヌクレオチド配列の５’になるように構築され、および／またはｒＭＤＶｎｐゲノム内に挿入される。このタイプの代替的実施形態においては、第１異種核酸は、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列に対して５’になるように構築され、および／またはｒＭＤＶｎｐゲノム内に挿入される。
【００３４】
更に、本発明はまた、これらのヌクレオチド配列の任意の組合せをコードするｒＭＤＶｎｐベクターを提供し、それに包含される特定の実施形態においては、第１異種核酸は配列番号１、３および５のヌクレオチド配列をコードし、第２異種核酸は配列番号７のヌクレオチド配列を含む。代替的実施形態においては、第１異種核酸は配列番号１、３および５のヌクレオチド配列をコードし、第２異種核酸は配列番号９のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００３５】
特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの前記の２つの異なる非必須部位は、ＵＳ２部位、ＵＬ５４．５部位、ＵＬ７／８部位、ＵＬ４０部位、ＵＬ４３部位、ＵＬ４５／４６部位、ＵＬ５５部位、ＵＳ１０部位、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の領域、ＵＳ２とＳＯＲＦ３との間の領域、遺伝子間領域１（ＩＧ１）部位、遺伝子間領域２（ＩＧ２）部位および遺伝子間領域（ＩＧ３）からなる群から個々に選択される。
【００３６】
ある実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの第１非必須部位はＵＳ２部位であり、ｒＭＤＶｎｐの第２非必須部位はＵＳ２部位以外の非必須部位である。他の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの第１非必須部位はＵＬ５４．５部位であり、ｒＭＤＶｎｐの第２非必須部位はＵＬ５４．５部位以外の非必須部位である。このタイプの特定の実施形態においては、第１非必須部位はＵＳ２部位であり、第２非必須部位はＵＬ５４．５部位である。代替的実施形態においては、第１非必須部位はＵＬ５４．５部位であり、第２非必須部位はＵＳ２部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＳ２部位であり、第２非必須部位はＵＬ４５／４６部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＬ４５／４６部位であり、第２非必須部位はＵＳ２部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＬ５４．５部位であり、第２非必須部位はＵＬ４５／４６部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＬ４５／４６部位であり、第２非必須部位はＵＬ５４．５部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＳ２部位であり、第２非必須部位はＵＬ５５部位である。このタイプの更にもう１つの実施形態においては、第１非必須部位はＵＬ５５部位であり、第２非必須部位はＵＳ２部位である。関連実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの第１非必須部位はＵＬ５４．５であり、ｒＭＤＶｎｐの第２非必須部位はＵＬ７／８部位である。更に他の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの第１非必須部位はＵＬ５４．５であり、ｒＭＤＶｎｐの第２非必須部位はＵＳ１０部位である。関連実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの第２非必須部位はＵＳ２部位であり、ｒＭＤＶｎｐの第１非必須部位はＵＬ７／８部位である。更に他の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの第２非必須部位はＵＳ２部位であり、ｒＭＤＶｎｐの第１非必須部位はＵＳ１０部位である。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００３７】
このタイプの特定の実施形態においては、第１非必須部位と第２非必須部位とは同じである（すなわち、唯一の非必須挿入部位が存在する）。このタイプの特定の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＳ２部位である。このタイプの他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ５４．５部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ７／８部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ４０部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ４５／４６部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ５５部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＳ１０部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の領域である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＳ２とＳＯＲＦ３との間の領域である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＩＧ１部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＩＧ２部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＩＧ３部位である。このタイプの更に他の実施形態においては、唯一の非必須挿入部位はＵＬ４３部位である。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００３８】
ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質およびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、外因性プロモーター、すなわち、ＭＤＶｎｐにおいては天然で見出されないプロモーターの制御下で機能的に存在しうる。ある実施形態においては、これらの３つのヌクレオチド配列は、異なるプロモーターの制御下で機能的に存在しうる。すなわち、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列は第１プロモーターの制御下で機能的に存在し、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列は第２プロモーターの制御下で機能的に存在し、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は第３プロモーターの制御下で機能的に存在し、ここで、第１プロモーター、第２プロモーターおよび第３プロモーターは全て異なる。特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内因性ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター（すなわち、ＩＬＴＶにとって内因性）である。ある実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内因性ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターである。このタイプの特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内因性ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターであり、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内因性ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターである。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００３９】
ある実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質またはＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターの少なくとも１つはマウスサイトメガロウイルス前初期（ｍＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターである。関連実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質またはＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターの少なくとも１つはヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターまたはその誘導体（例えば、株ＡＤ１６９由来）である。他の実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質またはＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターの少なくとも１つはモルモットサイトメガロウイルス前初期プロモーターである。他の実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質またはＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターの少なくとも１つはニワトリβ−アクチンプロモーターである。更に他の実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質またはＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターの少なくとも１つは偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇｐＸプロモーターである。
【００４０】
特定の実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはｍＣＭＶ  ＩＥプロモーターである。関連実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターまたはその誘導体（例えば、株ＡＤ１６９由来）である。他の実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはモルモットサイトメガロウイルス前初期プロモーターである。更に他の実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはニワトリベータアクチン遺伝子プロモーターである。
【００４１】
ある実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターはヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターである。他の実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターは偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇｐＸプロモーターである。関連実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターはニワトリベータアクチン遺伝子プロモーターである。更に他の実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
【００４２】
より詳細な実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはｍＣＭＶ  ＩＥプロモーターであり、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内因性ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターであり、ＩＬＴＶ  ｇＩをコードするヌクレオチド配列のためのプロモータータンパク質は内因性ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターであり、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはｈＣＭＶ  ＩＥプロモーターである。他の特定の実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター（またはその誘導体）であり、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内因性ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターであり、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内因性ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターであり、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはｈＣＭＶ  ＩＥプロモーターである。更に他の特定の実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはニワトリβ−アクチンプロモーターであり、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内因性ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターであり、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内因性ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターであり、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはｈＣＭＶ  ＩＥプロモーターである。
【００４３】
ある実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質およびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列の挿入を含む本発明のｒＭＤＶｎｐは１以上の外因性転写終結配列をも含む。このタイプの特定の実施形態においては、転写終結配列は、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に存在する。特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列は１つの転写終結配列を共有し、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は別のものを有する。より詳細な実施形態においては、転写終結配列の少なくとも１つはネコヘルペスウイルスＵＳ−９（ＦＨＶ  ＵＳ−９）ポリアデニル化配列を含む。更に詳細な実施形態においては、転写終結配列の少なくとも１つはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化配列を含む。
【００４４】
ある実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質は１以上の外因性転写終結配列をも含む。このタイプの特定の実施形態においては、転写終結配列は、ＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に存在する。関連実施形態においては、転写終結配列の少なくとも１つは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ  ＴＫ）ポリアデニル化配列を含む。代替的実施形態においては、転写終結配列の少なくとも１つはヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）ポリアデニル化配列を含む。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００４５】
本発明はまた、（ｉ）ｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子プロモーターまたはｈＣＭＶプロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列、（ｖｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、および（ｖｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列（ｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＬ５４．５部位におけるもの）を含むｒＭＤＶｎｐを提供する。このタイプの特定の実施形態においては、配列番号２１のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＬ５４．５部位内に含まれる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、（ｉ）ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｉｉ）ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列、および（ｉｉｉ）ｈＣＭＶ  ＩＥ転写終結配列（そのゲノムのＵＳ２部位におけるもの）を更に含む。このタイプの特定の実施形態においては、配列番号２２のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位内に含まれる。
【００４６】
本発明は更に、（ｉ）ｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子プロモーターまたはｈＣＭＶプロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列、（ｖｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、および（ｖｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列（ｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位におけるもの）を含むｒＭＤＶｎｐを提供する。このタイプの特定の実施形態においては、配列番号２４のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位内に含まれる。このタイプの更に他の実施形態においては、配列番号２５のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位内に含まれる。このタイプのより詳細な実施形態においては、配列番号２３のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位内に含まれる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは更に、（ｉ）ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｉｉ）ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列、および（ｉｉｉ）ｈＣＭＶ  ＩＥ転写終結配列（そのゲノムのＵＬ５４．５部位におけるもの）を含む。このタイプの特定の実施形態においては、配列番号２６のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＬ５４．５部位内に含まれる。
【００４７】
更に、本発明はまた、（ｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列、（ｖ）ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｖｉ）ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列、および（ｖｉｉ）ｈＣＭＶ  ＩＥ転写終結配列（ｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＬ５４．５部位におけるもの）を含むｒＭＤＶｎｐを提供する。このタイプの特定の実施形態においては、配列番号３１のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＬ５４．５部位内に含まれる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは更に、（ｉ）ｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列、および（ｉｉｉ）転写終結配列（ｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位におけるもの）を含む。このタイプの特定の実施形態においては、配列番号３２のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位内に含まれる。
【００４８】
本発明はまた、（ｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列、（ｖ）ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｖｉ）ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列、（ｖｉｉ）ｈＣＭＶ  ＩＥ転写終結配列（ｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位におけるもの）を含むｒＭＤＶｎｐを提供する。このタイプの特定の実施形態においては、配列番号２８のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位内に含まれる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは更に、（ｉ）ｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列、および（ｉｉｉ）転写終結配列（ｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＬ５４．５部位におけるもの）を含む。このタイプの特定の実施形態においては、配列番号２７のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＬ５４．５部位内に含まれる。
【００４９】
本発明は更に、（ｉ）ｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｖ）ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列および（ｖｉ）ｈＣＭＶ  ＩＥ転写終結配列（ｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位におけるもの）を含むｒＭＤＶｎｐを提供する。このタイプの特定の実施形態においては、配列番号３０のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位内に含まれる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは更に、（ｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、および（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列（そのゲノムのＵＬ５４．５部位内に含まれるもの）を含む。このタイプの特定の実施形態においては、配列番号２９のヌクレオチド配列はｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＬ５４．５部位内に含まれる。
【００５０】
本発明はまた、（ｉ）ｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｖ）ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列および（ｖｉ）ｈＣＭＶ  ＩＥ転写終結配列（ｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＬ５４．５部位におけるもの）を含むｒＭＤＶｎｐを提供する。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは更に、（ｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、および（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列（そのゲノムのＵＳ２部位内に含まれるもの）を更に含む。
【００５１】
本発明はまた、（ｉ）ｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｖ）ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列および（ｖｉ）ｈＣＭＶ  ＩＥ転写終結配列（ｒＭＤＶｎｐゲノムのＵＳ２部位におけるもの）、ならびに（ｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、および（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列（そのゲノムのＵＬ７／８部位内に含まれるもの）を含むｒＭＤＶｎｐを提供する。
【００５２】
より詳細な実施形態においては、本発明は、第１異種核酸と第２異種核酸とを含むｒＨＶＴを提供する。第１異種核酸は（ｉ）マウスサイトメガロウイルス前初期（ｍＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列、（ｖｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、および（ｖｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、この組換え核酸のヌクレオチド配列の特定の５’から３’への順序は（ｉ）〜（ｖｉｉ）である。より詳細な実施形態においては、転写終結配列はＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。このタイプのより一層詳細な実施形態においては、第１異種核酸はｒＨＶＴゲノムのＵＳ２部位に存在する。第２異種核酸は、５’から３’への方向で以下の順序で、（ｉ）ヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、（ｉｉ）ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列および（ｉｉｉ）転写終結配列を含む組換え核酸を含む。より詳細な実施形態においては、転写終結配列はヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）ポリアデニル化配列を含む。このタイプのより詳細な実施形態においては、第２異種核酸はｒＨＶＴゲノムのＵＬ５４．５部位に位置する。
【００５３】
したがって、本発明は、ＨＶＴゲノムの別個の非必須部位内にそれぞれが挿入された２つの異種核酸を含む組換えＨＶＴ（ｒＨＶＴ）を含む。ある実施形態においては、第１異種核酸は、（ｉ）マウスサイトメガロウイルス前初期（ｍＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列、（ｖｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、および（ｖｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、この組換え核酸のヌクレオチド配列の特定の５’から３’への順序は（ｉ）〜（ｖｉｉ）である。第２異種核酸は、以下の５’から３’の順序で、（ｉ）ヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、（ｉｉ）ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列、および（ｉｉｉ）転写終結配列を含む。特定の実施形態においては、第１異種核酸はＵＳ２部位内に挿入され、第２異種核酸はＵＬ５４．５部位内に挿入される。このタイプの特定の実施形態においては、第１異種核酸は配列番号２３のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸は配列番号２６のヌクレオチド配列を含む。代替的実施形態においては、第２異種核酸はＵＳ２部位内に挿入され、第１異種核酸はＵＬ５４．５部位内に挿入される。このタイプの或る実施形態においては、第１異種核酸は配列番号２１のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸は配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。
【００５４】
他の実施形態においては、第１異種核酸は（ｉ）マウスサイトメガロウイルス前初期（ｍＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、（ｖ）ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列、および（ｖｉ）転写終結配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、この組換え核酸のヌクレオチド配列の特定の５’から３’への順序は（ｉ）〜（ｖｉ）である。第２異種核酸は、以下の５’から３’への順序で、（ｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、および（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列を含む。特定の実施形態においては、第１異種核酸はＵＳ２部位内に挿入され、第２異種核酸はＵＬ５４．５部位内に挿入される。特定の実施形態においては、第１異種核酸は配列番号３０のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸は配列番号２９のヌクレオチド配列を含む。代替的実施形態においては、第２異種核酸はＵＳ２部位内に挿入され、第１異種核酸はＵＬ５４．５部位内に挿入される。
【００５５】
更に他の実施形態においては、第１異種核酸は（ｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列、（ｖ）ヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、（ｖｉ）ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列、および（ｖｉｉ）転写終結配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、この組換え核酸のヌクレオチド配列の特定の５’から３’への順序は（ｉ）〜（ｖｉｉ）である。第２異種核酸は、以下の５’から３’への順序で、（ｉ）マウスサイトメガロウイルス前初期（ｍＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列、（ｉｉｉ）転写終結配列を含む。特定の実施形態においては、第１異種核酸はＵＳ２部位内に挿入され、第２異種核酸はＵＬ５４．５部位内に挿入される。このタイプの特定の実施形態においては、第１異種核酸は配列番号２８のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸は配列番号２７のヌクレオチド配列を含む。代替的実施形態においては、第２異種核酸はＵＳ２部位内に挿入され、第１異種核酸はＵＬ５４．５部位内に挿入される。このタイプの特定の実施形態においては、第１異種核酸は配列番号３１のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸は配列番号３２のヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
本発明は更に、本発明の任意のｒＭＤＶｎｐ（例えば、ｒＨＶＴ）の製造方法を提供する。ある実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むように、第１異種核酸を構築する。このタイプの特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をそれぞれコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはそれらのそれぞれの内因性プロモーターである。関連実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子プロモーターまたはｈＣＭＶプロモーターである。
【００５７】
ついで第１異種核酸を本発明のｒＭＤＶｎｐの非必須部位内に挿入する。ある実施形態においては、第１異種核酸は発現カセットである。このタイプの特定の実施形態においては、発現カセットは配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
該製造方法は更に、第２異種核酸を構築し、同様にｒＭＤＶｎｐの非必須部位内に挿入することを含みうる。特定の実施形態においては、第２異種核酸はヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、ＮＤＶ  Ｆタンパク質のコード配列および転写終結配列を含む。ある実施形態においては、第２異種核酸は発現カセットである。このタイプの特定の実施形態においては、発現カセットは配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、第１異種核酸はｒＭＤＶｎｐの第１非必須部位内に挿入され、第２異種核酸はｒＭＤＶｎｐの第２非必須部位内に挿入される。ある実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの第１非必須部位はＵＬ５４．５部位である。関連実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの第２非必須部位はＵＳ２部位である。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの第１非必須部位はＵＳ２部位であり、ｒＭＤＶｎｐの第２非必須部位はＵＬ５４．５部位である。このタイプの特定の実施形態においては、第１異種核酸は配列番号２３のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸は配列番号２６のヌクレオチド配列を含む。このタイプの他の実施形態においては、第１異種核酸は配列番号２４のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸は配列番号２６のヌクレオチド配列を含む。このタイプの更に他の態様において、第１異種核酸は配列番号２５のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸は配列番号２６のヌクレオチド配列を含む。ある実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの製造方法はｒＨＶＴの製造方法である。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐの製造方法はｒＭＤＶ２の製造方法である。
【００５９】
したがって、１つの態様においては、本発明は、本発明のｒＭＤＶｎｐ（例えば、ｒＨＶＴ）を含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。特定の実施形態においては、これらの免疫原性組成物および／またはワクチンは安定であり安全であり、比較的強い抗原発現および／または効力を有する。これに代えて、またはこれに加えて、本発明のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンは、ニワトリへの該免疫原性組成物および／またはワクチンの投与の後、ＩＬＴＶおよび／またはＩＢＤＶおよび／またはＮＤＶおよび／またはＭＤＶ１によって引き起こされる疾患に対するニワトリの防御を補助する。
【００６０】
本発明は更に、付与される免疫原性を改善し増大させるために追加的なＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＮＤＶおよび／またはＭＤＶ抗原と更に組合された本発明の任意のｒＭＤＶｎｐ（例えば、ｒＨＶＴ）を含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。このタイプの特定の実施形態においては、抗原は弱毒化または穏やかな生変異体ＩＢＤＶ（例えば、ＩＢＤＶ  ８９／０３）である。このタイプのもう１つの特定の実施形態においては、抗原は弱毒化（または穏やかな生）ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、例えばＮＤＶ  Ｃ２である。このタイプの更にもう１つの特定の実施形態においては、抗原は弱毒化マレック病ウイルス、例えばＳＢ１である。更に、本発明はまた、ＭＤＶ、ＩＬＴＶまたはＮＤＶ以外の病原体に関する抗原を更にコードする本発明の任意のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。
【００６１】
本発明はまた、そのようなワクチンおよび／または免疫原性組成物を家禽対象（例えば、ニワトリ）に投与することにより、ＩＬＴＶおよび／またはＩＢＤＶおよび／またはＮＤＶおよび／またはＭＤＶ１により引き起こされる疾患に対する家禽の防御を補助するための方法を提供する。このタイプの特定の実施形態においては、本発明のワクチンは皮下投与される。他の実施形態においては、本発明のワクチンは卵内投与される
本発明のこれらの及び他の態様は、後記の図面および詳細な説明を参照することにより、より良く理解されるであろう。
【００６２】
発明の詳細な説明
本発明は、３つ以上の外来病原性ニワトリウイルスからの抗原をコードし発現する単一のｒＭＤＶｎｐベクターを構築することを可能にするために、過去の失敗を克服するものである。特定の実施形態においては、本発明のｒＭＤＶｎｐは３つ以上のトリウイルスからの外来抗原タンパク質をコードし発現する。特定の実施形態においては、トリウイルスはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）である。そのようなｒＭＤＶｎｐベクターは、マレック病、伝染性ファブリキウス嚢病（ガンボロ病）、伝染性喉頭気管炎ウイルスおよび／またはニューカッスル病ウイルスに対する防御を補助するワクチンおよび／または免疫原性組成物において使用されうる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。本発明は更に、追加的なＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＮＤＶおよび／もしくはＭＤＶ抗原ならびに／またはＭＤＶ、ＩＬＴＶ、ＮＤＶもしくはＩＢＤＶ以外のニワトリ病原体由来の１以上の抗原と組合された本発明の任意のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物ならびに／またはワクチンを提供する。完全に異なる態様においては、ＮＤＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＤＶからの外来抗原をコードし発現する組換えベクターはｒＭＤＶｎｐではなく、キメラマレック病ウイルスであり、これは、ＨＶＴベクターにおける対応物と置換するＭＤＶ１からの特定されたゲノム配列を含有し、例えば、新規トリヘルペスウイルス（ＮＡＨＶ）である［例えば、ＵＳ  ６，９１３，７５１を参照されたい］。
【００６３】
本発明前には、ＵＳ１０領域内に挿入されたＮＤＶ遺伝子を含有するＨＶＴベクターが既に構築されていた。このＨＶＴ−ＮＤＶベクターは、安定であること、および十分なレベルの対応ＮＤＶ遺伝子産物、ＮＤＶ  Ｆタンパク質を発現して、ワクチン接種されたニワトリをビルレント（毒性、病原性）ＮＤＶチャレンジに対して防御することが示された。また、ＨＶＴ  ＵＬ５４．５領域内に挿入されたＩＬＴＶ遺伝子のペアを含有するＨＶＴベクターが既に構築されていた。このＨＶＴ−ＩＬＴＶベクターは、安定であること、ならびに十分なレベルの対応ＩＬＴＶ遺伝子産物、ＩＬＴＶ  ｇＩおよびｇＤタンパク質を発現して、ワクチン接種されたニワトリをビルレントＩＬＴＶチャレンジウイルスに対して防御することが示された。より最近になって、他の多価構築物も報告されている。
【００６４】
より詳細には、別個の構築物におけるＵＳ１０部位内へのＮＤＶ−Ｆ遺伝子の挿入ならびにＵＬ５４．５部位内へのＩＬＴＶ  ｇＤおよびｇＩ遺伝子の挿入を含む構築物の成功に基づいて、ＮＤＶとＩＬＴＶとの両方に対する防御のための多価ＨＶＴ構築物が設計された［ＵＳ  ８，９３２，６０４  Ｂ２を参照されたい］。しかし、意外なことに、組織培養におけるこの多価構築物の継代の後、該組換えウイルスは、ＩＬＴＶｇＤ  ＩＬＴＶｇＩおよびＮＤＶ  Ｆタンパク質を発現するその能力を喪失した。これは幾つかの二重組換えｒＨＶＴ構築物に当てはまることが判明した。実際、これらの組換えウイルスは不安定であり、ワクチンとしての更なる開発に不適当であった。これらの知見は、ＮＤＶ  Ｆタンパク質ならびにＩＬＴＶｇＤおよびＩＬＴＶｇＩタンパク質の両方を安定に発現しうる単一多価ｒＨＶＴベクターの設計が、既存情報から推定されうる簡単なプロセスではなかったことを示している。実際、そのような安定かつ有効な多価ｒＨＶＴベクターが仮にも可能であったならば、それらの設計は、用いられる挿入部位と挿入されるべき外来遺伝子との関係を少なくとも含む複雑な相互作用の予想不可能な組合せを前提とする必要があった。したがって、ｒＨＶＴ構築物の設計は依然として公知技術から予測不可能である。これは、３つ以上のトリウイルス病原体からの異種抗原をコードするｒＭＤＶｎｐの場合には、より一層大きな問題であると思われる。
【００６５】
前記で大まかに示した明らかな難題にもかかわらず、そして３つ以上の異なるウイルス病原体からの外来抗原をＭＤＶｎｐ構築物内に挿入することがその構築物に過度な負担をかけて安定性の欠如を招くという一般的な統一見解にもかかわらず、本発明は、驚くべきことに、ＩＬＴＶからの２つの遺伝子、ＩＢＤＶからの１つの遺伝子およびＮＤＶからの１つの遺伝子が単一のＭＤＶｎｐ内に挿入された安定な組換えＭＤＶｎｐベクターを提供する。したがって、そのような単一のｒＭＤＶｎｐ構築物は、４つの主要な病原性家禽ウイルスに対する防御を補助するワクチンにおける唯一の有効成分として使用されうる。
【００６６】
本発明の特定の実施形態においては、４つの外来抗原をコードするヌクレオチド配列が単一ＨＶＴのゲノムの非必須領域の１以上に挿入される。したがって、そのような組換えＨＶＴベクターは、ＭＤＶ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶ感染に対する防御をもたらすために使用されうるはずである。従来は、これらの４つのウイルスに対する防御のためには、複数の異なるｒＨＶＴベクターが必要であったが、これらは互いの抗原性の干渉を引き起こしうる。
【００６７】
したがって、本発明は、単一の組換えＭＤＶｎｐのみを家禽および／または家禽卵に接種することによりＭＤＶ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶ感染に対する同時防御をもたらすため、現在の方法と比較して有利である。特に、卵内に注射されうる体積には制限があるため、本発明は、追加的ワクチンが卵内経路で投与されることを可能にし、更に、２つのベクターではなくただ１つのワクチンしか必要とされないため、本発明は製造コストを削減する。
【００６８】
更に、本発明は、同一ワクチンおよび／または免疫原性組成物中に異なるｒＭＤＶｎｐ構築物を含む実施形態を含む。このタイプの或る実施形態においては、該ワクチンおよび／または免疫原性組成物はｒＭＤＶ２およびｒＨＶＴの両方を含み、それらのそれぞれは１以上の外来抗原をコードしている。実際、一方の構築物が他方の構築物と比べて有意に増殖し過ぎることを必然的に招く、２つのｒＨＶＴの組合せとは異なり、ｒＨＶＴとｒＭＤＶ２との組合せはそのような有意な過剰増殖を招かないことが報告されている。したがって、特定の実施形態においては、本発明のワクチンは、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質およびＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードするｒＨＶＴを、更に別の家禽ウイルス抗原をコードするｒＭＤＶ２と共に含む。これまでのところ、３つの異なる家禽ウイルスからの外来抗原をコードし発現し、そして尚も安定なままであり、対応する３つのウイルスでのビルレントチャレンジに対して及びビルレントＭＤＶに対してワクチン接種ニワトリを防御するのに十分なレベルの対応抗原を発現しうるｒＭＤＶｎｐは全く示されていなかった。
【００６９】
したがって、本発明は、本発明の任意のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。また、本発明は、本発明のそのようなワクチンおよび／または免疫原性組成物を投与することにより、ＩＬＴＶおよび／またはＩＢＤＶおよび／またはＮＤＶおよび／またはＭＤＶ１によって引き起こされる疾患に対する家禽の防御を補助する（そして或る実施形態においては該疾患に対して家禽を防御する）ための方法を提供する。特定の実施形態においては、家禽対象はニワトリである。このタイプの特定の実施形態においては、本発明のワクチンは皮下投与される。他の実施形態においては、本発明のワクチンは、卵内投与される。好ましい実施形態においては、本発明のｒＭＤＶｎｐワクチンは安全かつ安定かつ有効である。
【００７０】
本発明をより十分に理解するために、以下の定義を記載する。
【００７１】
説明の便宜を図るための単数形の用語の使用は、そのように限定されることを何ら意図するものではない。したがって、例えば、「ポリペプチド」を含む組成物に対する言及は、そのようなポリペプチドの１以上に対する言及を含む。
【００７２】
本明細書中で用いる「非病原性マレック病ウイルス」または「ＭＤＶｎｐ」または「ｎｐＭＤＶ」は、家禽における病原性をほとんど又は全く示さないＭＤＶ科ウイルスである。「ＭＤＶｎｐ」なる語は、継代されている又は同様に操作されている天然に存在するＭＤＶを含むが、キメラウイルス、例えば新規トリヘルペスウイルス（ＮＡＨＶ）を生成するように、１つのＭＤＶ血清型のゲノムの特定の領域が、異なるＭＤＶ血清型の対応領域により置換されているウイルス構築物を含まない。ある実施形態においては、ＭＤＶｎｐはＨＶＴである。他の実施形態においては、ＭＤＶｎｐはＭＤＶ２である。このタイプの特定の実施形態においては、ＭＤＶ２はＳＢ１である。
【００７３】
本明細書中で用いる、異種ヌクレオチド配列（例えば、外来遺伝子）をコードするように遺伝的に修飾されているＭＤＶｎｐは、「組換えＭＤＶｎｐ」または「ｒＭＤＶｎｐ」として定義される。「ｒＭＤＶｎｐ」なる語は、異種ヌクレオチド配列をコードするように遺伝的に修飾された天然に存在するＭＤＶｎｐを含むが、キメラウイルス、例えば新規トリヘルペスウイルス（ＮＡＨＶ）を生成するように、１つのＭＤＶ血清型のゲノムの特定領域が、異なるＭＤＶ血清型の対応領域により置換されれたウイルス構築物を含まない。
【００７４】
本明細書中で用いる「新規トリヘルペスウイルス」（「ＮＡＨＶ」）は、シチメンチョウウイルスのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）において天然に存在するユニーク長ウイルスゲノム領域と、マレック病ウイルス１（ＭＤＶ１）において天然に存在するユニーク短ウイルスゲノム領域とを含む組換えキメラウイルスである［ＵＳ５，９６５，１３８、ＵＳ  ６，１８３，７５３、ＵＳ  ６，９１３，７５１  Ｂ２を参照されたい］。好ましい実施形態においては、ＮＡＨＶは、シチメンチョウウイルスのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）において天然に存在するユニーク長ウイルスゲノム領域、マレック病ウイルス１（ＭＤＶ１）において天然に存在するユニーク短ウイルスゲノム領域およびＨＶＴの反復ウイルス領域を含む［ＵＳ  ６，９１３，７５１  Ｂ２を参照されたい］。
【００７５】
本明細書中で用いる「非必須部位」は、その部位内への異種ヌクレオチド配列の挿入が、宿主細胞内でＭＤＶｎｐ（またはＮＡＶＨ）が複製することを妨げない、ＭＤＶｎｐゲノム内（またはＮＡＶＨゲノム内）の部位である。非必須部位は、それが存在するオープンリーディングフレームによって（例えば、ＵＳ２部位）、または２つのオープンリーディングフレーム間の領域によって（例えばＵＬ７／８部位）、一般に特定される。「非必須部位」なる語の使用は、ＭＤＶｎｐ（またはＮＡＶＨ）が宿主細胞内でのその複製能を維持するために異種核酸の挿入が行われる必要がある所与オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（または２つのオープンリーディングフレーム間の領域）に単一のユニークなヌクレオチド位置しか存在しないことを示唆することさえも何ら意図していない。。
【００７６】
本明細書において、ｒＭＤＶｎｐ（またはＮＡＨＶ）が、ｒＭＤＶｎｐゲノム（またはＮＡＨＶゲノム）の非必須部位内に「挿入」された所与核酸を含むと記載されている場合、それは、該所与核酸が、ＭＤＶｎｐ（またはＮＡＨＶ）のその非必須部位に位置する異種核酸であることを意味する。したがって、ｒＭＤＶｎｐゲノムの第１非必須部位内に挿入された第１核酸と、ｒＭＤＶｎｐゲノムの第２非必須部位内に挿入された第２核酸とを含むｒＭＤＶｎｐは、ｒＭＤＶｎｐゲノムの第１非必須部位に位置する第１異種核酸と、ｒＭＤＶｎｐゲノムの第２非必須部位に位置する第２異種核酸とを含むｒＭＤＶｎｐと同等である（逆も同様である）。
【００７７】
本明細書中で用いる「家禽」なる語はニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジを含みうる。
【００７８】
本明細書中で用いる「ワクチン」は、野生型微生物の感染から生じる臨床疾患からの防御を少なくとも補助するのに十分な程度に強力な免疫応答、すなわち、該疾患の予防を補助する、および／または該疾患を予防する、改善する若しくは治療するのに十分な程度に強力な免疫応答を、動物に投与されると誘導する、典型的には例えば水含有液のような薬学的に許容される担体と組合された１以上の抗原を含む、動物（ある実施形態においてはヒトを含むが、他の実施形態は特にヒト以外に対するものである）への適用に適した組成物である。
【００７９】
本明細書中で用いる「防御を補助（する）」なる語はいずれかの感染徴候からの完全な防御を要するわけではない。例えば、「防御を補助（する）」は、該防御が、チャレンジ後に根本的感染の症状が少なくとも軽減されるのに、ならびに／または該症状を引き起こす根本的な細胞的、生理的もしくは生化学的な原因もしくはメカニズムの１以上が軽減および／もしくは排除されるのに十分であることを意味しうる。この文脈において用いる「軽減」は、感染の生理的状態だけでなく感染の分子的状態をも含む感染状態に関するものであると理解される。
【００８０】
本発明のワクチンは本発明の少なくとも１つの安定なｒＭＤＶｎｐを含む。ｒＭＤＶｎｐが表現型において安定だとみなされるのは、元の株（ストック）からの少なくとも１０回の組織培養継代の後、またはワクチン接種されたトリからのウイルスの再分離の後、免疫蛍光アッセイにおいて発現タンパク質に特異的な抗体の結合により示された場合に、検査されたウイルスプラークの少なくとも９０％が挿入外来抗原の発現に関して陽性である場合である。
【００８１】
また、本発明のワクチンは有効であり、好ましくは、疾患に関連した臨床徴候または病変からのＮＤＶに対する少なくとも７０％の防御および／またはＩＢＤＶに対する少なくとも７０％の防御および／またはＩＬＴＶに対する少なくとも７０％の防御および／またはＭＤＶに対する少なくとも６０％の防御を少なくとももたらす。より好ましくは、該ワクチンは、好ましくは、疾患に関連した臨床徴候または病変からのＮＤＶに対する少なくとも８０％の防御、ＩＢＤＶに対する少なくとも８０％の防御、ＩＬＴＶに対する少なくとも８０％の防御、およびＭＤＶに対する少なくとも７０％の防御を少なくとももたらす。より一層好ましくは、該ワクチンは、ＵＳＤＡによって確立され米国連邦規則基準タイトル９、パート１１３（Ｔｉｔｌｅ  ９  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ，ｐａｒｔ  １１３）（９ＣＦＲ  １１３）『動物製品の標準要件（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）』に定められた指針に従い、認可を得るためには、生ウイルスワクチンは、ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶの場合には、疾患に関連した臨床徴候または病変からの少なくとも９０％の防御をもたらす必要があり、ＭＤＶの場合には少なくとも８０％の防御をもたらす必要がある。
【００８２】
本明細書中で用いる「多価ワクチン」は、２以上の異なる抗原を含むワクチンである。このタイプの特定の実施形態においては、多価ワクチンは２以上の異なる病原体に対して被投与者の免疫系を刺激する。
【００８３】
本明細書中で用いる「アジュバント」は、免疫事象のカスケードを促進または増強して、最終的に、より良好な免疫応答、すなわち、抗原に対する統合された身体的応答を招きうる物質である。アジュバントは、一般に、免疫応答の生成に要求されないが、この応答を促進または増強する。
【００８４】
本明細書中で用いる「薬学的に許容される」なる語は、修飾される名詞が医薬品における使用に適していることを表すために形容詞的に用いられる。それが、例えば医薬ワクチンにおける賦形剤を示すために用いられる場合、それは、該組成物のその他の成分に適合性であり意図される被投与者に有害でないものとして、賦形剤を特徴づける。
【００８５】
本明細書中で用いる「全身投与」は、特定の部位、例えば胃腸管（例えば、経口または直腸投与によるもの）および呼吸系（例えば、鼻腔内投与によるもの）に対してではなく体全体に影響を及ぼす、体の循環系（心血管系およびリンパ系を含む）内への投与である。全身投与は、例えば、筋組織内（筋肉内）、真皮（皮内または経皮）、皮膚の下（皮下）、粘膜の下（粘膜下）、静脈の中（静脈内）などへの投与により行われうる。
【００８６】
本明細書中で用いる「非経口投与」なる語は皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および注入を含む。
【００８７】
「およそ」なる語は「約」なる語と互換的に用いられ、値が、示されている値の２５％以内であることを意味し、すなわち、「およそ」１００アミノ酸残基を含有するペプチドは７５〜１２５アミノ酸残基を含有しうる。
【００８８】
本明細書中で用いる「ポリペプチド」なる語は「タンパク質」および「ペプチド」なる語と互換的に用いられ、ペプチド結合により連結された２以上のアミノ酸を含む重合体を意味する。本明細書中で用いる「ポリペプチド」なる語は有意な断片またはセグメントを含み、少なくとも約８アミノ酸、一般には少なくとも約１２アミノ酸、典型的には少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、そして特に好ましい実施形態においては、少なくとも約３０アミノ酸またはそれ以上（例えば、３５、４０、４５、５０アミノ酸など）のアミノ酸残基の伸長を含む。そのような断片は、全ての実用的な組合せにおける実質的に全ての位置で出発および／または終止する末端、例えば残基１、２、３などで出発し、例えば１５５、１５４、１５３などで終止する末端を有しうる。
【００８９】
所望により、ポリペプチドは、遺伝子により又はｍＲＮＡによりコードされる或るアミノ酸残基を欠くことが可能である。例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ分子は、最終的なタンパク質から切断され該最終的タンパク質の一部とはなり得ないポリペプチドのＮ末端上のアミノ酸残基の配列（すなわち、シグナル配列）をコードしうる。
【００９０】
特定のタンパク質（例えば、タンパク質抗原）に関して本明細書中で用いる「抗原断片」なる語は、抗原性である、すなわち、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体のような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用しうる、そのタンパク質の断片（完全長タンパク質から単一アミノ酸を欠いているに過ぎない大きな断片を含む）である。例えば、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質の抗原断片は、抗原性であるＶＰ２タンパク質の断片である。好ましくは、本発明の抗原断片は抗体および／またはＴ細胞受容体認識に関して免疫優性である。特定の実施形態においては、所与のタンパク質抗原に関する抗原断片は、完全長タンパク質の抗原性の少なくとも２５％を保持する、そのタンパク質の断片である。好ましい実施形態においては、抗原断片は全長タンパク質の抗原性の少なくとも５０％を保持する。より好ましい実施形態においては、それは完全長タンパク質の抗原性の少なくとも７５％を保持する。抗原断片は５〜１０アミノ酸の小さなものであることが可能であり、あるいは全く逆に、完全長タンパク質から単一アミノ酸を欠いているに過ぎない大きな断片であることが可能である。特定の実施形態においては、抗原性断片は２５〜１００アミノ酸残基を含む。
【００９１】
本明細書中で用いるアミノ酸配列がもう１つのアミノ酸配列に対して１００％「相同」であるのは、それらの２つのアミノ酸配列が同一であり、および／または後記の中性もしくは保存的置換のみにより異なる場合である。したがって、アミノ酸配列がもう１つのアミノ酸配列に対して約８０％「相同」であるのは、それらの２つのアミノ酸配列の約８０％が同一であり、および／または中性もしくは保存的置換のみにより異なる場合である。
【００９２】
配列内の残基が、しばしば、機能的に等価なアミノ酸残基により置換されて、保存的アミノ酸置換が生じうる。そのような変化が、本明細書中で用いる「保存的置換」なる語が意味するものである。例えば、配列内の１以上のアミノ酸残基は、機能的等価体として作用する、類似した極性のもう１つのアミノ酸により置換されて、サイレント変化が生じうる。配列内のアミノ酸の置換は、該アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されうる。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含有するアミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。そのような変化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点により決定される見掛け分子量に影響を及ぼさないと予想されるであろう。
【００９３】
特に好ましい保存的置換としては、正電荷が維持されうる、ＡｒｇからＬｙｓへの置換およびその逆の置換；負電荷が維持されうる、ＡｓｐからＧｌｕへの置換およびその逆の置換；遊離−ＯＨが維持されうる、ＴｈｒからＳｅｒへの置換；ならびに遊離ＮＨ２が維持されうる、ＡｓｎからＧｌｎへの置換が挙げられる。アミノ酸は以下の類似基においても置換可能である：（１）プロリン、アラニン、グリシン、セリンおよびトレオニン；（２）グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸およびアスパラギン酸；（３）ヒスチジン、リジンおよびアルギニン；（４）システイン；（５）バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン；ならびに（６）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
【００９４】
関連実施形態においては、２つの高度に相同なＤＮＡ配列がそれら自身の相同性により又はそれらがコードするアミノ酸の相同性により特定されうる。そのような配列比較は、配列データバンクにおいて入手可能な標準的なソフトウェアを使用して行われうる。特定の実施形態においては、２つの高度に相同なＤＮＡ配列は、約８０％の同一性、より好ましくは約９０％の同一性、より一層好ましくは約９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。より詳細には、２つの高度に相同なアミノ酸配列は約８０％の同一性、より一層好ましくは約９０％の同一性、より一層好ましくは約９５％の同一性を有する。
【００９５】
本明細書中で用いる、タンパク質およびＤＮＡ配列の同一性（％）は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から商業的に入手可能なＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｖ９およびＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムのようなソフトウェアをアライメントデフォルトパラメータおよび同一性用デフォルトパラメータで使用して決定されうる。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０を参照されたい。ＣｌｕｓｔａｌＷは例えばＥＭＢＬＩ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からＤｏｓ、ＭａｃｉｎｔｏｓｈおよびＵｎｉｘプラットフォームに無料でダウンロード可能である。このダウンロードリンクはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／において見出される。これらの及び他の入手可能なプログラムは、同じ又は類似デフォルトパラメータを使用して、配列類似性を決定するためにも使用されうる。
【００９６】
本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」または「核酸」または「核酸分子」なる語は互換的に用いられ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび更には合成ＤＮＡ配列（これらに限定されるものではない）を含むヌクレオチドを含む分子を示す。これらの語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの当技術分野で公知の塩基類似体のいずれかを含む核酸分子をも含むと想定される。
【００９７】
核酸「（を）コード（する）配列」または特定のタンパク質もしくはペプチドを「コードする配列」は、適当な調節要素の制御下に配置された場合にインビトロまたはインビボで転写されポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。
【００９８】
コード配列の境界は５’末端の開始コドンおよび３’末端の翻訳停止コドンにより決定される。コード配列には、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、トリ）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列および更には合成ＤＮＡ配列が含まれうるが、これらに限定されるものではない。転写終結配列はコード配列の３’側に位置しうる。
【００９９】
「機能的に連結」は、そのように記載されている成分がそれらの通常の機能を果たすように配置されている、要素の配置を意味する。したがって、コード配列に機能的に連結されている制御要素は該コード配列の発現を引き起こしうる。該制御要素は、それが該コード配列の発現を導くように機能する限り、該コード配列に連続している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列がプロモーターとコード配列との間に存在することが可能であり、該プロモーターは該コード配列に「機能的に連結」されていると尚もみなされうる。
【０１００】
本明細書中で用いる「転写終結配列」なる語は「ポリアデニル化調節要素」と互換的に用いられ、一般にＤＮＡコード領域の下流に存在し、そのＤＮＡコード配列の転写の完全な終結に要求されうる配列である。転写終結因子は、コード領域のＲＮＡへの転写の終結に関与する調節ＤＮＡ要素である。一般に、そのような要素は、ＲＮＡポリメラーゼ複合体に転写を停止させる二次構造を有する例えばヘアピン構造のような断片をコードする。したがって、転写終結因子は常に、翻訳される領域からの停止コドンの下流、すなわち、３’非翻訳領域に位置する。
【０１０１】
本明細書中で用いる「発現カセット」は、プロモーターおよびそのプロモーターに機能的に連結された異種コード配列を少なくとも含む組換え核酸である。多数のそのような実施形態においては、発現カセットは転写終結配列を更に含む。したがって、ｒＭＤＶｎｐゲノムの非必須部位内への発現カセットの挿入はｒＭＤＶｎｐによる異種コード配列の発現をもたらしうる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。他の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【０１０２】
本明細書中で用いる「異種ヌクレオチド配列」は、天然では生じない核酸を得るために組換え法により本発明のヌクレオチド配列に付加されるヌクレオチド配列である。特定の実施形態においては、本発明の「異種ヌクレオチド配列」はタンパク質抗原（例えば、本発明のｒＭＤＶｎｐベクターに対する「外来遺伝子」によりコードされるもの）、例えばＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質および／またはＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードしうる。異種ヌクレオチド配列は融合（例えば、キメラ）タンパク質をもコードしうる。この場合、そのようなタンパク質抗原は「外来抗原」またはより詳細には「外来タンパク質抗原」と称されうる。
【０１０３】
異種ヌクレオチド配列は融合（例えば、キメラ）タンパク質をもコードしうる。また、異種ヌクレオチド配列は、調節および／または構造特性を含有するペプチドおよび／またはタンパク質をコードしうる。他のそのような実施形態においては、異種ヌクレオチド配列は、組換え核酸が発現された後、本発明のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質またはペプチドを検出する手段として機能するタンパク質またはペプチドをコードしうる。更にもう１つの実施形態においては、異種ヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列を検出する手段として機能しうる。異種ヌクレオチド配列は、制限部位、調節部位、プロモーターなどを含む非コード配列を含みうる。「異種核酸」は異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
本発明の抗原をコードする核酸の、ｒＭＤＶｎｐベクター内への挿入は、該核酸と該ベクターとの両方の末端が和合性制限部位を含む場合に容易に達成される。これが行われ得ない場合には、制限エンドヌクレアーゼ切断により生じる一本鎖核酸突出（例えば、ＤＮＡ突出）を再消化して平滑末端を得ることにより、ヌクレオチド配列および／またはベクターの末端を修飾することが、あるいは該一本鎖末端を適当なポリメラーゼで埋めることにより、同じ結果を得ることが必要かもしれない。あるいは、所望の部位は、例えば、ヌクレオチド配列（リンカー）を該末端上に連結することにより生じうる。そのようなリンカーは、所望の制限部位を定める特異的オリゴヌクレオチド配列を含みうる。制限部位は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによっても生成されうる［例えば、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１（１９８８）を参照されたい］。該切断ベクターおよび該ＤＮＡ断片は、必要に応じて、ホモポリマー尾部接合によっても修飾されうる。あるいは、組換えヌクレオチド配列はデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成されうる。
【０１０５】
タンパク質抗原およびタンパク質抗原をコードする核酸
ＩＬＴＶ  ｇＤ遺伝子は、４８，４７７ダルトンの分子量を有する４３４アミノ酸長の糖タンパク質をコードしているようだが、３７７アミノ酸残基のみを含むＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質を与える下流開始コドンが実際のコドンであると示唆している者もいる［Ｗｉｌｄら，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）］。ＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子は、３９，７５３ダルトンの分子量を有する３６２アミノ酸長の糖タンパク質をコードしている［参照により本明細書に組み入れるＵ．Ｓ．６，８７５，８５６］。ＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩの天然および／または実験室由来変異体をコードする核酸が、ここに例示されているものの代わりに使用されうる。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質またはその抗原断片をコードする組換え核酸（例えば、発現カセット）を含む。関連実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％を超える、および／または９５％を超える、および／または９８％を超える、および／または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質は配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【０１０７】
本発明の或る実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質またはその抗原断片をコードする組換え核酸（例えば、発現カセット）を含む。関連実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％を超える、および／または９５％を超える、および／または９８％を超える、および／または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態においては、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質は配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【０１０８】
前記のとおり、ＩＢＤＶはビルナウイルス科のメンバーであり、これは、２本鎖ＲＮＡの２つのセグメント（ＡおよびＢ）からなるゲノムを有する。大きい方のセグメントＡは１１０ｋＤａのポリタンパク質をコードし、これは後に自己タンパク質分解により切断されて、成熟ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を生成する。これらのうち、ＶＰ２およびＶＰ３はビリオンの構造キャプシドタンパク質であり、ＶＰ２タンパク質が主要宿主防御免疫原である。ＩＢＤＶの場合、２つの血清型（血清型１および２）が存在し、これらはウイルス中和（ＶＮ）試験により区別されうる。血清型１ウイルスはニワトリに病原性であることが示されており、一方、血清型２  ＩＢＤＶはシチメンチョウにおける亜急性疾患を引き起こすに過ぎない。歴史的には、ＩＢＤＶ血清型１ウイルスは、現在は「古典的」ＩＢＤウイルスとして公知であるただ１つの型からなるものであったが、その後、いわゆる「変異」ＩＢＤＶ株が出現した。本発明の特定の実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、古典的な型であるＩＢＤＶからのＶＰ２タンパク質をコードする。そのような遺伝子はよく知られており、それらの配列情報は容易に入手可能である［例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃ．ｎｒ：Ｄ００８６９（Ｆ５２／７０）、Ｄ００４９９（ＳＴＣ）またはＡＦ４９９９２９（Ｄ７８）を参照されたい］。あるいは、この遺伝子は、ビルナウイルスを操作するための通常の技術を用いて、天然から分離される古典的ＩＢＤＶのゲノムから得られうる。古典的な型のＩＢＤＶは、血清学または分子生物学的技術を用いて容易に特定されうる。
【０１０９】
本発明の特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質またはその抗原断片をコードする組換え核酸（例えば、発現カセット）を含む。関連実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％を超える、および／または９５％を超える、および／または９８％を超える、および／または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質は配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【０１１０】
ＩＢＤＶに対する通常のワクチン接種は、弱毒化ＩＢＤＶ株を使用して、家禽の生涯の可能な限り早期に行われるが、これらは、ＩＢＤＶに対するＭＤＡのレベルが十分に低下した場合にのみ適用可能であり、これは一般には孵化の約１５〜２０日後である。多数の「生」または不活化ＩＢＤＶワクチン、例えば、Ｎｏｂｉｌｉｓ（商標）Ｇｕｍｂｏｒｏ  Ｄ７８（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）のような「生」ワクチンが商業的に入手可能である。
【０１１１】
ＮＤＶは非セグメント化マイナス鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、これは約１５ｋｂのサイズを有し、６つの遺伝子を含有し、それらのうちの１つが、いわゆる「融合」糖タンパク質（Ｆタンパク質）をコードするＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子である。Ｆタンパク質は宿主細胞へのＮＤＶの付着および侵入に関与しており、免疫優性タンパク質として、それはＮＤＶに対する有効な免疫応答の基礎となりる。ＮＤＶ  Ｆタンパク質は天然Ｆ０タンパク質として発現され、これは細胞外ペプチダーゼにより切断されると活性化される。
【０１１２】
ＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子は、例えば、一般的な長潜伏期性ＮＤＶワクチン株であるＮＤＶクローン３０から誘導されうる。本発明の或る実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号８のアミノ酸配列を含むＮＤＶ  Ｆタンパク質またはその抗原断片をコードする組換え核酸（例えば、発現カセット）を含む。関連実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％を超える、および／または９５％を超える、および／または９８％を超える、および／または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むＮＤＦ  Ｆタンパク質をコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質は配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【０１１３】
本発明の関連実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＮＤＶ  Ｆタンパク質またはその抗原断片をコードする組換え核酸（例えば、発現カセット）を含む。他の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％を超える、および／または９５％を超える、および／または９８％を超える、および／または９９％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含むＮＤＦ  Ｆタンパク質をコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態においては、ＮＤＶ  Ｆタンパク質は配列番号９のヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態においては、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【０１１４】
Ｆタンパク質遺伝子の天然および／または実験室由来変異体をコードする核酸は、長潜伏期性、亜病原性または短潜伏期性ＮＤＶのいずれからも同等に適用可能であろう。なぜなら、Ｆタンパク質遺伝子配列自体はこれらの種々のＮＤＶ病理型において高度に保存されているからである。
【０１１５】
本発明のｒＭＤＶｎｐによりコードされるニワトリ病原体タンパク質抗原のヌクレオチドおよび／またはタンパク質配列は、公的に利用可能なデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅにおいても見出されうる。
【０１１６】
プロモーターおよびポリアデニル化調節要素
プロモーターは、下流コード領域の転写を指令する、生物のゲノム上の機能的領域である。したがって、プロモーターは遺伝子のコード領域の上流に位置する。プロモーターにより指令されるｍＲＮＡ合成は「転写開始部位」（ＴＳＳ）から始まる。産生されたｍＲＮＡは今度は、遺伝子の開始コドンから始まるタンパク質へと翻訳され、該開始コドンはオープンリーディングフレームにおける最初のＡＴＧ配列（ｍＲＮＡにおける最初のＡＵＧ）である。典型的には、ＴＳＳは開始コドンの３０〜４０ヌクレオチド上流に位置する。ＴＳＳは、例えばＲＡＣＥ技術により、遺伝子のｍＲＮＡの５’末端を配列決定することにより決定されうる。一般に、プロモーターは開始コドンのＡの位置（これは一般にＡ＋１として示される）の約１０００ヌクレオチド上流に含まれ、ほとんどのプロモーターはヌクレオチド−５００とＡ＋１との間に位置する。
【０１１７】
プロモーターの命名法は、一般に、それが発現を制御する遺伝子の名称に基づく。例えば、マウスサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｍＣＭＶ−ＩＥ１）プロモーター「ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーター」は、ｍＣＭＶからの初期１遺伝子（ＩＥ１遺伝子）の発現を本質的に駆動する、したがって、その遺伝子の直上流に位置するプロモーターを意味する。ＩＥ１−遺伝子は詳細に記載されており、明確に認識可能な遺伝子であるため、そして幾つかのｍＣＭＶのゲノムは（全体的または部分的に）配列決定されているため、そのようなプロモーターは通常の技術により容易に特定されうる。例えば、基本的なプロトコールにおいては、プロモーターは、２つの連続する遺伝子の間の領域（例えば、上流遺伝子のポリＡシグナルから下流遺伝子のＴＳＳまで）を大雑把にサブクローニングすることによって容易に得られうる。ついで、プロモーターは標準的な試験により特定可能であり、例えば、プロモーターと疑われる部分を徐々に小さくしたものによりマーカー遺伝子を発現させることにより特定されうる。
【０１１８】
一般に、プロモーターは、転写の時間、持続時間、条件およびレベルに影響を及ぼす調節因子の結合に関与する幾つかの認識可能な調節領域、例えばエンハンサー領域を含有する。エンハンサー領域は一般に上流に位置するが、プロモーターは、転写因子の結合およびＲＮＡポリメラーゼ自体の指令に関与する、より下流の領域をも含有する。この下流領域は、一般に、幾つかの保存されたプロモーター配列要素、例えばＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックスおよびＧＣボックスを含有する。
【０１１９】
エンハンサー領域と下流領域との両方を含むプロモーターは「完全」プロモーターと称され、下流領域のみを含むプロモーターは「コア」プロモーターと称される。
【０１２０】
（ウイルス）ベクターにおける（異種）遺伝子の発現のためのプロモーターは、その下流コード配列の転写を有効に駆動できる必要がある。これは、一般に、コード配列に「機能的に連結された」プロモーターと称され、その場合、該遺伝子は該プロモーターの「制御下」にあり、または該プロモーター「により駆動」される。これは、発現カセットにおいて、プロモーターおよび遺伝子コード配列が有効に接近して同一核酸上で見出され、それらの間に、コード配列の有効な転写を妨げるシグナルまたは配列が存在しないことを一般に意味する。
【０１２１】
ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは当技術分野でよく知られており、種々の商業的供給源、例えば、クローニングおよび発現のための市販プラスミドの供給者から容易に入手可能である。ＩＥ１遺伝子は「主要ＩＥ遺伝子」とも称される。ｍＣＭＶ−ＩＥ１タンパク質はｐｐ８９とも称される。Ｄｏｒｓｃｈ−Ｈａｓｌｅｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：８３２５−８３２９（１９８５）］はｍＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子プロモーターを１９８５年に記載しており、異種発現におけるこのプロモーターの使用はＷＯ  ８７／０３．９０５およびＥＰ  ７２８．８４２にも記載されている。完全なｍＣＭＶ  ＩＥ遺伝子座のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋからアクセッション番号Ｌ０６８１６．１として入手可能である（２００４年３月以降）。ｍＣＭＶ自体は当初はアクセッション番号ＶＲ−１９４としてＡＴＣＣから入手可能であり、最近になって、これはアクセッション番号ＶＲ−１３９９として継続されている。
【０１２２】
本発明の１つの実施形態においては、ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは、ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子のエンハンサー領域とコアプロモーター領域との両方を含む完全プロモーターである。完全ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターのサイズは約１．４ｋｂである。しかし、本発明は、ｍＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子プロモーターだけでなく、本発明で使用される組換えＤＮＡ発現カセットを構成するその他の要素の長さの幾らかの変動をも許容する。これは、クローニングおよび構築に用いられる厳密な条件における差異から生じうる。例えば、この変動は、異なる制限酵素部位、ＰＣＲクローニングプライマー、または使用するクローニング分子の末端を適合させるための異なる条件を使用することから生じうる。その結果、全体的な発現カセットの安定性ならびに比較的強力な抗原発現および／または効力に影響を及ぼすことなく、構成要素の長さの（より小さい又はより大きい）幾らかの変動が生じうる。その場合、これらの長さの差異は重要ではなく、本発明の範囲内である。したがって、「約１．４ｋｂ」のｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは１．４ｋｂ±約２５％である。特定の実施形態においては、プロモーターは１．４ｋｂ±約２０％である。更に他の実施形態においては、変動（分散）は１．４ｋｂ±約１５％、１．４ｋｂ±約１２％、１．４ｋｂ±約１０％、１．４ｋｂ±約８％、１．４ｋｂ±約６％、１．４ｋｂ±約５％、１．４ｋｂ±約４％、１．４ｋｂ±約３％、１．４ｋｂ±約２％または更には１．４ｋｂ±約１％でありうる。
【０１２３】
同様に、同等に有効かつ安定であるプロモーター要素のホモログまたは変異体が使用されうる。したがって、ある実施形態においては、本発明のｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは、配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または更には９９％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ分子でありうる。特定の実施形態においては、ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは配列番号１３のヌクレオチド配列からなる。
【０１２４】
本発明のｒＭＤＶｎｐにおけるタンパク質抗原またはその抗原断片をコードする異種遺伝子の発現を導くために、多数の代替的プロモーターが使用されうる。具体例には、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇｐＸプロモーター［ＷＯ  ８７／０４４６３を参照されたい］、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター、配列番号１７のヌクレオチド配列を含むニワトリベータアクチン遺伝子プロモーター、タウン株（Ｔｏｗｎｅ  Ｓｔｒａｉｎ）ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター配列番号１６、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター（ＡＤ１６９株由来）の誘導体、配列番号１１のヌクレオチド配列を含むＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、および配列番号１２のヌクレオチド配列を含むＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター［例えば、Ｕ．Ｓ．６，１８３，７５３  Ｂ１号を参照されたい］、ヒトサイトメガロウイルス前初期１（ｈＣＭＶ  ＩＥ１）遺伝子プロモーター［Ｕ．Ｓ．５，８３０，７４５；Ｕ．Ｓ．５，９８０，９０６］、およびニワトリベータアクチン遺伝子プロモーター［ＥＰ  １  ２９８  １３９  Ｂ１］が含まれる。ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子の特定の異種プロモーターはマウス（ｍＣＭＶ  ＩＥ１）サイトメガロウイルスプロモーターである。このタイプの特定の実施形態においては、ｍＣＭＶ  ＩＥ１は配列番号１３のヌクレオチド配列を含む［例えば、ＥＰ  ７２８，８４２；ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０８１１２１を参照されたい］。
【０１２５】
ＤＮＡコード領域の下流のポリアデニル化調節要素の含有は、しばしば、コードＤＮＡ配列の転写を終結させるために必要である。したがって、多数の遺伝子はそれらのコード配列の下流末端にポリアデニル化調節要素を含む。多数のそのような調節要素が特定されており、本発明のｒＭＤＶｎｐにおいて使用されうる。本明細書中で例示されるポリアデニル化調節要素の具体例には、配列番号１８のヌクレオチド配列を含むネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）ＵＳ−９ポリアデニル化シグナル、および配列番号１９のヌクレオチド配列を含むヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼポリアデニル化シグナルが含まれる。ターミネーター配列（終結配列）およびポリアデニル化配列はまた、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）遺伝子、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の前初期（ＩＥ）遺伝子、ＡＤ  １６９株、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来しうる。
【０１２６】
ワクチンおよび免疫原性組成物
本発明は、組換えＭＤＶｎｐの使用、該ＭＤＶｎｐを構築するために使用される核酸分子、もしくはそれを増殖させるための宿主細胞、またはそれらのいずれかの組合せに関するものであり、それらは全て、本発明においては、家禽用ワクチンの製造のためのものである。したがって、本発明は、本発明の多価組換えＭＤＶｎｐを含むワクチンおよび／または免疫原性組成物を提供する。そのようなワクチンは、伝染性ファブリキウス嚢病（ガンボロ病）および／またはマレック病および／またはＩＬＴＶ感染に関連した疾患および／またはＮＤＶ感染に関連した疾患の予防を補助するために、ならびに／あるいはそれらを予防するために使用されうる。本発明のワクチンは予防的および／または治療的治療のために使用されることが可能であり、したがって、感染および／またはその臨床疾患症状の確立および／または進行を妨げうる。
【０１２７】
本発明の組換えＭＤＶｎｐは、当分野において現在実施されている多数の手段により増殖されうる。例えば、本発明の組換えＭＤＶｎｐは初代ニワトリ細胞のインビトロ培養の使用により増殖されうる。例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を使用した後記実施例を参照されたい。ＣＥＦはニワトリ胚のトリプシン処理により調製されうる。また、ＣＥＦを単層内でプレーティングし、ついでＭＤＶｎｐに感染させることが可能である。この特定の方法は工業規模の製造に容易に大規模化されうる。
【０１２８】
したがって、本発明のもう１つの態様は、本発明の組換えＭＤＶｎｐを宿主細胞に感染させ、該感染宿主細胞を回収し、ついで該回収感染宿主細胞を薬学的に許容される担体と混合する工程を含む、本発明のワクチンの製造方法に関する。感染、培養および回収のための適切な方法は当技術分野でよく知られており、本明細書に記載および例示されている。
【０１２９】
典型的には、感染宿主細胞を尚も無傷なままで回収して、組換えＭＤＶｎｐをその細胞結合形態で得る。これらの細胞を適切な担体組成物中に取り込ませて、貯蔵および凍結のための安定化をもたらすことが可能である。感染細胞をガラスアンプル内に充填することが可能であり、該アンプルを密封し、凍結させ、液体窒素中で貯蔵する。したがって、本発明の或る実施形態においては、本発明のワクチンおよび／または免疫原性組成物は凍結保存され、したがって、凍結感染細胞を保護するための凍結保護剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
【０１３０】
あるいは、組換えＭＤＶｎｐが組換えＨＶＴである場合には、それを、例えば、培養終了時の超音波処理により、その宿主細胞から単離し、ついで安定剤中に取り込ませ、安定な貯蔵のために凍結乾燥させ、あるいは貯蔵のために液体体積の減少に付し、ついで投与前または投与時に液体希釈剤中で還元（再構成）することが可能である。そのような還元は、例えば、ワクチン等級の水を使用して達成されうる。ある実施形態においては、多価ワクチンの凍結乾燥部分は１以上の抗原を含むことが可能であり、希釈剤は１以上の他の抗原を含むことが可能である。
【０１３１】
特定の実施形態においては、本発明のワクチン（またはその一部）は、例えば、ＷＯ  ２０１０／１２５０８４（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている方法により製造される錠剤および／またはスフェアとしての凍結乾燥形態でありうる。特に、そのような急速崩壊性錠剤／スフェアの製造方法を記載している、ＷＯ  ２０１０／１２５０８４の１５ページ２８行〜２７ページ９行の実施例を参照されたい。ワクチンの全身投与を可能にするために、そのような凍結乾燥形態は希釈剤に容易に溶解されうる。
【０１３２】
ワクチンおよび免疫原性組成物は、生理的に許容されるバッファーおよび塩類液など、ならびに薬学的に許容されるアジュバントを含みうるが、必ずしも含む必要はない。アジュバントは、免疫応答を改善するのに、および／またはワクチン製剤の安定性を増強するのに有用でありうる。アジュバントは典型的には免疫系の非特異的刺激因子として記載されているが、免疫系の特異的部分を標的化するためにも有用でありうる。この活性を有する１以上の化合物がワクチンに加えられうる。したがって、本発明の特定のワクチンはアジュバントを更に含みうる。アジュバントとして使用されうる化合物の例には、アルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウム）、代謝可能な油および代謝不可能な油、鉱油、例えば、鉱油溶液中のマンニドオレアート誘導体（例えば、Ｓｅｐｐｉｃ  ＳＡ，ＦｒａｎｃｅのＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７０）、および軽油、例えば、ＤＲＡＫＥＯＬ  ６ＶＲ、ブロック重合体、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、ビタミンおよびミネラル（限定的なものではないが、ビタミンＥ、ビタミンＡ、セレンおよびビタミンＢ１２を含む）ならびにＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３３】
免疫刺激物質と称されることもある他の適切なアジュバントには、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、単球、リンパ球の細胞培養からの上清、リンパ器官からの細胞、植物、細菌または寄生生物からの細胞調製物および／または抽出物（スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）またはリポ多糖調製物）ならびにマイトジェンが含まれるが、これらに限定されるものではない。一般に、アジュバントは本発明の抗原と同時に投与される。しかし、それに加えて又はその代わりに、アジュバントはワクチン接種前の２週間以内および／またはワクチン接種後の或る期間にわたって（すなわち、該抗原、例えば本発明の組換えＭＤＶｎｐが組織内に存続する限り）投与されうる。
【０１３４】
本発明のワクチンおよび／または免疫原性組成物は、いずれかの経路により、例えば、卵内、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、皮内注射を含む非経口投与により、スカリフィケーションにより、経口投与により、またはそれらのいずれかの組合せにより投与されうる。
【０１３５】
更に、本発明の多価組換えＭＤＶｎｐは、付与される免疫原性を改善し増強するための追加的なＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＮＤＶおよび／もしくはＭＤＶ抗原、ならびに／または他の病原体に対する免疫防御を得るためのそのような他の病原体の抗原と組合され、ならびに／またはそれらと共に使用されうる。これらの追加的抗原は、本発明のワクチンの安全性、比較的強力な抗原発現を伴う安定性および有効性に負の影響を及ぼさない生もしくは死滅全微生物、他の組換えベクター、細胞ホモジネート、抽出物、タンパク質またはいずれかの他のそのような誘導体でありうる。
【０１３６】
本発明の多価組換えＭＤＶｎｐと追加的ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶおよび／またはＩＬＴＶ抗原との組合せは、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶまたはＩＬＴＶの非常にビルレントな野外株が例えば特定の地理的領域内に広がっている場合に有利でありうる。これに関して、本発明の多価組換えＭＤＶｎｐとＭＤＶ１、ＭＤＶ２またはＨＶＴとの組合せはリスペンス（Ｒｉｓｐｅｎｓ）（ＭＤＶ１）株、ＳＢ１（ＭＤＶ２）株、ＦＣ−１２６（ＨＶＴ）株および／またはＰＢ１（ＨＶＴ）株を含む。ＩＢＤＶに対する応答を改善するために、多価組換えＭＤＶｎｐは、ＩＢＤＶワクチン株、例えば穏やかな生ＩＢＤＶワクチン株、例えばＤ７８（クローン化中間株）、ＰＢＧ９８、Ｃｕ−１、ＳＴ−１２（中間株）または８９／０３（生デラウェア変異株）と多価ワクチン中で組合されうる。
【０１３７】
本発明の多価組換えＭＤＶｎｐと共に抗原として使用されうる他の微生物の例には、以下のものが含まれる：（ｉ）ウイルス、例えば伝染性気管支炎ウイルス、トリインフルエンザウイルス、アデノウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、ニワトリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、アヒルペストウイルス（アヒルウイルス性腸炎）、鳩痘ウイルス、禽類白血症ウイルス、トリニューモウイルスおよびレオウイルス、（ｉｉ）細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、オルニトバクテリウム・リノトラケアレ（Ｏｒｎｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、ヘモフィルス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、パスツレカ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エリシペロスリックス・ルシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エリシペラス属種（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ  ｓｐｅｃ．）、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｅｃ．）およびクロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）、（ｉｉｉ）寄生生物、例えばエイメリア属種（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｅｃ．）、ならびに（ｉｖ）真菌、例えばアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃ．）。本発明の特定の実施形態においては、本発明の組換えＭＤＶｎｐは穏やかな生ＮＤＶワクチン株、例えばワクチン株Ｃ２と組合されうる。そのような株の多くは市販ワクチンにおいて使用される。
【０１３８】
該組合せワクチン（混合ワクチン）は、本発明の組換えＭＤＶｎｐをウイルスまたは細菌または真菌または寄生生物または宿主細胞あるいはこれらのいずれか及び／又は全ての混合物の調製物と一緒にすることを含む種々の方法で製造されうる。特定の実施形態においては、そのような組合せワクチンの成分は別々に簡便に製造され、ついで一緒にされ、同一ワクチン容器内に充填される。
【０１３９】
前記のとおり、本発明のワクチンは、非常に若い齢における又は卵内の１回の接種により、例えば１以上の家禽疾患に対するニワトリへの安全かつ有効な免疫防御をもたらすために有利に使用されうる。あるいは、家禽ワクチンのいずれの当業者にも明らかなとおり、前記の組合せは、本発明の多価組換えＭＤＶｎｐおよび追加的抗原が同時に適用されないワクチン接種計画をも含みうるであろう。例えば、組換えＭＤＶｎｐは卵内に適用可能であり、ＮＤＶ  Ｃ２および／またはＩＢＤＶ株（例えば、８９／０３）は後の時間／日に適用可能であろう。
【０１４０】
したがって、本発明のワクチンは単一用量または複数用量でトリ対象に投与されうる。例えば、本発明のワクチンは孵化日および／または第１６〜１８日（胚日）ＥＤの卵内に適用されうる。複数用量が投与される場合、それらは、免疫学的に有効な量で、該ワクチンの製剤に適した方法および時間に、同時または連続的に投与されうる。したがって、本発明のワクチンは初回ワクチン接種として有効に働くことが可能であり、初回ワクチン接種の後、同一ワクチンの又は異なるワクチン製剤（例えば、古典的な不活化アジュバント化全ウイルスワクチン）での追加ワクチン接種が行われ、免疫増強がもたらされうる。あるいは、本発明のワクチンは追加ワクチン接種として単独でトリ対象に投与されうる。
【０１４１】
本発明のワクチンの用量当たりの体積は、意図される適用経路に従い最適化されうる。卵内接種は一般に０．０５〜０．５ｍｌ／卵の体積で適用され、非経口注射は一般に０．１〜１ｍｌ／トリの体積で行われる。いずれの場合にも、ワクチン用量体積の最適化は当業者の能力の範囲内に十分に含まれる。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、後記の実施例２に記載されているＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ構築物を作製するための挿入断片の概要図である。要するに、これは、反復領域にそれぞれが隣接している２つのユニーク領域と、ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ  ６７０−１４ウイルスを再構築するために必要なクローン化断片とからなるＨＶＴゲノムの概要図である。分断遺伝子（ＵＬ５４．５またはＵＳ２）および隣接遺伝子に対する挿入遺伝子カセット（ｍＩＥ−ＩＢＤＶ−ｖｐ２およびＩＬＴＶ−ｇＤ／ｇＩまたはｈＩＥ−ＮＤＶ−Ｆ）の配向は拡大表示部分に示されている。凡例：ＴＲＬ：末端反復長領域、ＵＬ：ユニーク長領域、ＩＲＬ：内部反復長領域、ＩＲＳ：内部反復短領域、ＵＳ：ユニーク短領域、ＴＲＳ：末端反復短領域。
【図２】図２は、ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴ／ＮＤＶ構築物＃２を作製するための挿入断片の概要図である。２つのＨＶＴ挿入部位はＵＬ５４．５およびＵＳ２である。［前記図１の説明も参照されたい］。
【図３】図３は、ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴ／ＮＤＶ構築物＃３を作製するための挿入断片の概要図である。２つのＨＶＴ挿入部位はＵＬ５４．５およびＵＳ２である。［前記図１の説明も参照されたい］。
【図４】図４は、ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴ／ＮＤＶ構築物＃４を作製するための挿入断片の概要図である。２つのＨＶＴ挿入部位はＵＬ５４．５およびＵＳ２である。［前記図１の説明も参照されたい］。
【図５】図５は、ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴ／ＮＤＶ構築物＃５を作製するための挿入断片の概要図である。２つのＨＶＴ挿入部位はＵＬ５４．５およびＵＳ２である。［前記図１の説明も参照されたい］。
【０１４３】
本発明は、本発明の典型例として記載されている以下の非限定的な実施例を参照することにより、より良く理解されうる。以下の実施例は、本発明の実施形態をより十分に例示するために記載されており、いかなる点においても、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１４４】
実施例
実施例１
組換えＨＶＴ／ＩＬＴＶ／ＩＢＤＶ／ＮＤＶウイルスベクターの構築
（ｉ）２つの伝染性喉頭気管炎ウイルスタンパク質抗原、（ｉｉ）伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスタンパク質抗原および（ｉｉｉ）ニューカッスル病ウイルスタンパク質抗原をコードし発現する組換え多価非病原性マレック病ウイルス構築物を製造した。本発明は、Ｉｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＩＬＴ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈにより販売）およびＶａｘｘｉｔｅｋ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌにより販売）のような２つの組換えＨＶＴワクチンが同じ動物に投与された場合に見られるワクチン干渉の問題を克服するものである。更に、本発明は、ＭＤＶ以外の３つの異なるウイルス病原体からの抗原をコードする最初の組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐ）を独自に提供する。
【０１４５】
組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）構築物を作製した。この場合、３つの家禽病原体、すなわち、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）からの抗原ドナー物質をＨＶＴベクター内に挿入した［ＵＳ  ８，９３２，６０４  Ｂ２、ＷＯ  ２０１３／０５７，２３５、ＷＯ  ２０１６／１０２６４７および２０１６年６月１７日付け出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．６２／３５１，４７１（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）も参照されたい］。ドナー物質は以下のものを含む：ＩＬＴＶ，ＮＶＳＬチャレンジ株，ロット＃８３−２からの３．５６３ｋｂのＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［ヌクレオチド１０５３２〜１４０９４位；Ｗｉｌｄら，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）：Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］であって、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の全長遺伝子ならびに糖タンパク質Ｅからの部分コード領域（アミノ酸１〜１０１）およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４〜９８５）をコードするもの；ＮＤＶ，クローン３０株，融合タンパク質（Ｆ）遺伝子のコード領域（ヌクレオチド４５４４〜６２０５位；Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒら（１９９９）；Ａｃｃ．＃Ｙ１８８９８）（ウイルスプロモーターにより駆動されるもの）およびそれに続く終結配列からなる発現カセット；ならびにＩＢＤＶ，ファラガー（Ｆａｒａｇｈｅｒ），型Ｆ５２／７０株，ウイルスタンパク質２（ｖｐ２）遺伝子のコード領域（ウイルスプロモーターにより駆動されるもの）およびそれに続く終結配列からなる発現カセット。例示されている実施形態においては、ＩＢＤＶ  ＶＰ２発現を駆動するプロモーターはマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）株ＡＴＣＣ  ＶＲ−１９４の前初期（ＩＥ）に由来し、一方、ＮＤＶ  Ｆ発現のためのプロモーターはヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ），ＡＤ１６９株の前初期（ＩＥ）遺伝子に由来する。ＩＢＤＶ  ＶＰ２のための終結（ターミネーター）およびポリアデニル化配列はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来し、一方、ＮＤＶ  Ｆのための終結およびポリアデニル化配列はヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の前初期（ＩＥ）遺伝子に由来する。第１異種核酸用のドナー物質をＵＬ５４．５部位（１１１２４０／１１１２４１位，Ａｆｏｎｓｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（２）：９７１−９７８（２００１）；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基２１と２２との間）内に挿入し、一方、第２異種核酸のためのドナー物質をＵＳ２部位（１４０５４０／１４０５４１，Ａｆｏｎｓｏら（２００１）前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基１２４と１２５との間）内に挿入した［図１を参照されたい］。
【０１４６】
遺伝的安定性および表現型安定性は任意の新規組換えウイルスワクチン候補の安全性ならびに比較的強い抗原発現および／または有効性プロファイルの主要要素である。ＨＶＴバックボーン内に挿入されるＩＢＤＶ／ＩＬＴＶおよびＮＤＶ発現カセットはウイルス複製に本質的には必要とされず、したがって、組織培養継代におけるウイルスストックの増幅中の突然変異により失われうる。満足しうるワクチン候補は、外来遺伝子インサートの発現を喪失する突然変異を容易に引き起こしてはならない。ワクチン候補が安定だとみなされるのは、ウイルスプラークの少なくとも９０％が、組織培養における１０回以上の継代の後に挿入外来抗原タンパク質を発現することが実証されうる場合である。
【０１４７】
コスミド再構成法によりヘルペスウイルスが作製可能であることは仮性狂犬病ウイルスに関して既に示されていた［ｖａｎ  Ｚｉｊｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６２：２１９１−２１９５（１９８８）］。この方法は後に、組換えＨＶＴベクターを構築するために用いられ［組換えＨＶＴベクターの構築について開示されている方法に関して参照により本明細書に組み入れるＵ．Ｓ．５，８５３，７３３を参照されたい］、本発明の組換えＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶベクターを構築するために用いられた。この方法においては、全ＨＶＴゲノムを、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて構築された幾つかの大きな重複サブゲノム断片として、細菌ベクター内にクローニングする［Ｍａｎｉａｔｉｓら，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８２）；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］。コスミドベクターｐＷＥ１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；現在は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））内にクローニングされた、せん断されたウイルスＤＮＡから、ＨＶＴ株ＦＣ１２６コスミドライブラリーを誘導した。また、幾つかの大きなゲノムＤＮＡ断片を酵素ＢａｍＨＩでの制限消化により単離し、ｐＷＥ１５またはプラスミドベクターｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）内にクローニングした。Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３に記載されているとおり、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞内へのこれらの断片のコトランスフェクションは、該断片の重複領域にわたる相同組換えにより生じるＨＶＴゲノムの再生をもたらす。該コトランスフェクション前に該サブゲノム断片の１以上へと挿入を直接的に操作すると、この方法は、該挿入を含有する高頻度のウイルスを与える。５個の重複サブゲノムクローンが、ＦＣ１２６  ＨＶＴを得るために必要であり、全てのＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ組換えウイルスの作製の基礎となった。
【０１４８】
ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ  ６７０−１４．１−１Ａ１またはＡ２の構築
三重組換えＨＶＴベクターウイルスＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ  ６７０−１４．１−１は、ＨＶＴ  ＵＬ５４．５部位内に挿入されたＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ発現カセットと、ＨＶＴ  ＵＳ２部位内に挿入されたＮＤＶ発現カセットとを含有する。ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ  ６７０−１４．１−１のコスミド再生を、本質的にはＵ．Ｓ．５，８５３，７３３［例えば、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８］に記載されているとおりに行った。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＬ５４．５領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号４０７−３１．１Ｃ１によってカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［６７２−０１．Ａ４０および６７２−０７．Ｃ４０、ならびにこれらの２つと重複しており、ＵＬ５４．５遺伝子座内にＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（４８４−１０５０−２６４１−１０８５９）］から得た。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＳ領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号３７８−５０によってカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［ｐＳＹ６４０および５５６−６０．６、ならびにこれらの２つと重複しており、ＵＳ２遺伝子座内にＮＤＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（１３２２−４８．１）］から得た。
【０１４９】
９個の線状化構築物（２個のコスミドおよび７個のプラスミド）の組を全て一緒に、標準的なＣａＣｌ２トランスフェクション法を用いて、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）内にトランスフェクトし、得られたウイルスストックを２回、プラーク精製した。
【０１５０】
ＦＣ１２６  ＨＶＴを作製するためのサブゲノム断片の説明
サブゲノムクローン４０７−３２．２Ｃ３
コスミド４０７−３２．２Ｃ３はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡの約４０，１７０塩基対の領域を含有する［左末端−３９，７５４位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］。この領域はＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｆ’、Ｌ、Ｐ、Ｎ１、Ｅ、Ｄ、および２，０９２塩基対の断片Ｂを含む。
【０１５１】
サブゲノムクローン１７２−０７．ＢＡ２
プラスミド１７２−０７．ＢＡ２はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡの２５，９３１塩基対の領域を含有する。それは、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ  Ｂ断片［３７，６６３〜６３，５９３位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］をプラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）内にクローニングすることにより構築された。
【０１５２】
サブゲノムクローン４０７−３２．５Ｇ６
コスミド４０７−３２．５Ｇ６はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡの３９，４０４塩基対の領域を含有する［６１，８５２〜１０１，２５５位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］。この領域はＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｋ１、Ｍ、Ｋ２、および１，７４２塩基対の断片Ｂ、および３，８８０塩基対の断片Ｊを含む。
【０１５３】
サブゲノムクローン４０７−３２．１Ｃ１
コスミド４０７−３２．１Ｃ１はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡの３７，４４４塩基対の領域を含有する［９６，０９５〜１３３，５３８位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］。この領域はＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｊ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｏ、および１，２８１塩基対の断片Ｋ２、および６，６９１塩基対の断片Ａを含む。
【０１５４】
サブゲノムクローン３７８−５０
プラスミド３７８−５０はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡの２８，８９７塩基対の領域を含有する［Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８を参照されたい］。この領域はＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ａを含む。それは、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ  Ａ断片［１２６８４８〜１５５７４４位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］をコスミドｐＷＥ１５内にクローニングすることにより構築された。
【０１５５】
ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ  ６７０−１４．１−１Ａ１またはＡ２を作製するための追加的な挿入断片（図１を参照されたい）
サブゲノムクローン４８４−１０５０−２６４１−１０８５９
挿入プラスミド４８４−１０５０−２６４１−１０８５９は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体（ＡａｔＩＩ−ＰｖｕＩＩ欠失体）内にクローニングされた、ユニーク長領域から誘導されたゲノムＨＶＴ  ＤＮＡの８６３６塩基対の領域［１０９４８９〜１１８１２４位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。それはＡｓｃＩ部位に隣接しており、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｉ、Ｓ、および１３３７塩基対の断片Ｇ、および１１７７塩基対の断片Ｆを含む。ＨＶＴ  ＵＬ５４．５オープンリーディングフレーム内のＸｈｏＩ部位［１１１２４０／１１１２４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基２１と２２との間］内に以下の２つの要素が挿入されている：ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＩＢＤＶ古典型Ｆ５２／７０、ファラガー株、ウイルスタンパク質２遺伝子（ＶＰ２）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルからなる発現カセット、ならびにそれに続く、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、および糖タンパク質Ｅからの部分コード領域（アミノ酸１〜１０１）、およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４〜９８５）をコードする、ＩＬＴＶ，ＮＶＳＬチャレンジ株，Ｌｏｔ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［１０５３２〜１４０９４位；Ｗｉｌｄら，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）；Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］。ＩＢＤＶ  ＶＰ２、ＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子はＨＶＴ  ＵＬ５４．５遺伝子に対して逆方向に転写される。
【０１５６】
サブゲノムクローン６７２−０１．Ａ４０
プラスミド６７２−０１．Ａ４０は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体内にクローニングされた、ユニーク長領域から誘導されたゲノムＨＶＴ  ＤＮＡの１４，７３１塩基対の領域［９６０９５〜１１０８２５位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。この領域はＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｇ、Ｊ、および１２８１塩基対のＫ２を含む。
【０１５７】
サブゲノムクローン６７２−０７．Ｃ４０
プラスミド６７２−０７．Ｃ４０は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体内にクローニングされた、ユニーク長領域から誘導されたゲノムＨＶＴ  ＤＮＡの１２，５２０塩基対の領域［１１６９４８〜１２９４６７位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。この領域はＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｆ、Ｏおよび２６２０塩基対のＡを含む。
【０１５８】
サブゲノムクローン１３２２−４８．１
挿入プラスミド１３２２−４８．１は、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）内にクローニングされた、ＨＶＴユニーク短領域の７３１１塩基対のＥｃｏＲＩ断片［１２６８８０〜１４４１９０位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＮＤＶ，クローン３０株，融合遺伝子（Ｆ）、およびＨＣＭＶ  ＩＥ遺伝子からの転写終結配列からなる発現カセットをＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子内のユニークＳｔｕＩ部位［１４０５４０／１４０５４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基１２４と１２５との間］内にクローニングする。ＮＤＶ  Ｆ遺伝子はＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子に対して逆方向に転写される。
【０１５９】
サブゲノムクローンｐＳＹ６４０
プラスミドｐＳＹ６４０は、ＢａｍＨＩ断片Ａから誘導されたゲノムＨＶＴ  ＤＮＡの約１３，６００塩基対の領域［１２６８４８〜１４０５４０；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作製するために、ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から開始しＢａｍＨＩ  Ａ断片の末端まで続くＵＳ２遺伝子の上流に位置するＤＮＡの領域をプラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）内にクローニングした。
【０１６０】
サブゲノムクローン５５６−６０．６
プラスミド５５６−６０．６は、ＢａｍＨＩ断片Ａから誘導されたゲノムＨＶＴ  ＤＮＡの約１２，５００塩基対の領域［約１４３３００〜１５５７４４位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作製するために、ＵＳ２遺伝子の下流に位置するＤＮＡの領域（ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から開始しＢａｍＨＩ  Ａ断片の末端まで続く）をｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）内にクローニングし、ついでエキソヌクレアーゼで処理して、Ｓｔｕ部位から約１５０ｂｐを「破砕」し、ｐＢＲ３２２プラスミドベクター内に再クローニングした。
【０１６１】
標準的なＣａＣｌ２トランスフェクション法
二次ＣＥＦを６ウェル培養プレート上に播き、３８℃、５％  ＣＯ２で２４時間インキュベートし、コンフルエントな単層が形成する。各ウェルに関して、総量０．５μｇ  ＤＮＡのコスミドおよびプラスミドをヘペスバッファー中で混合し、沈殿が今にも生じようとするまで１２５ｍＭ  ＣａＣｌ２を滴下した。この混合物を該ＣＥＦ細胞単層に加え、２〜３時間インキュベートした。上清を除去し、１５％  グリセロールの上層を加え、該細胞上で１分間維持した。ついでこれを取り出し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、新鮮な培地を加え、細胞を２日間インキュベートした。次に細胞をトリプシン処理により回収し、より大きなプレート上に播き、すなわち、最初は６ｃｍのプレート上に播き、ついで１０ｃｍのプレート上に播き（３日後）、５０〜９０％  ＣＰＥが得られるまで、感染を２回拡大させた。次に該増幅トランスフェクト化細胞をトリプシン処理により回収し、１０−３〜１０−４の希釈液を６ｃｍプレート上でＣＥＦ単層と共にプレーティングし、インキュベートした。翌日、該プレートを寒天で覆い、ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶの多数の個々のプラークを単離し、ＣＥＦ上で増幅した。６ｃｍのプレート上のＣＥＦのコンフルエント単層に、１０−４〜１０−５に希釈された第１ラウンド精製ストックを感染させ、細胞をインキュベートすることにより、各ウイルスストックを再度プラーク精製した。翌日、プレートを寒天で覆い、ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶの多数の個々のプラークを単離し、ＣＥＦ上で増幅した。
【０１６２】
実施例２
組換えＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶウイルスストックは、組織培養における連続継代の後、該ＩＢＤＶ、ＩＬＴＶおよびＮＤＶタンパク質の発現に関して、表現型において安定である
それぞれ別々のコトランスフェクションストックからのＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶの２つのプラーク精製分離体を二次ＣＥＦ細胞上で１５回連続継代し、挿入されたＩＬＴＶ、ＮＤＶおよびＩＢＤＶ遺伝子の発現に関して免疫蛍光アッセイにおいて評価した。
【０１６３】
組織培養継代ストックの作製
各組織培養継代のために、コンフルエントな二次ＣＥＦ単層に５０〜１００μＬのウイルスストックを接種し、それを、ＣＰＥが明らかになるまで、３８℃、５％  ＣＯ２で２〜５日間インキュベートした。次に細胞をトリプシン処理により回収した（継代１（Ｐ１））。このプロセスを繰り返して、更なる継代ストックを調製した（Ｐ２〜Ｐ１５）。
【０１６４】
表現型安定性分析
６ウェルプレートに二次ＣＥＦ単層を植えた。該細胞に、種々の継代レベル（Ｐ０〜Ｐ１５または希釈剤のみ）で回収されたウイルスストックを接種した。ウェル当たりの計数可能なプラーク数が得られるように、プレートを複数の希釈度での接種に付し、３８℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。５日間のインキュベーションの後、上清をデカントし、ＣＥＦ単層を７０％  アセトンで１５〜３０℃で約２０分間固定した。アセトン溶液をデカントし、細胞を風乾させた後、ＩＬＴＶ  ｇＤ（ポリクローナルウサギ抗ＩＬＴＶ  ｇＤ）、ＩＬＴＶ  ｇＩ（ポリクローナルウサギ抗ＩＬＴＶ  ｇＩ）、ＮＤＶ  Ｆ（Ｍａｂ＃５７）およびＩＢＤＶ  ＶＰ２（ＭＣＡ  ＧＤＶ−Ｒ６３）一次抗体で染色した。約１．５時間のブロッキング工程の後、ＰＢＳ中の５％  ヤギ血清  ＋  ０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（ウェル当たり２ｍＬ）をディッシュに加え、ついで加湿インキュベーター内で３６〜３９℃でインキュベートする。一次抗体を適宜希釈し、ウェル当たり２ｍＬで加え、ついで加湿インキュベーター内で３６〜３９℃で１．３時間インキュベートした。
【０１６５】
抗体インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ＋  ０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で３回洗浄した。ＦＩＴＣ標識二次抗体溶液（ウサギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ）を１：５０で調製し、２ｍＬを各ウェルに加えた。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ  ＋  ０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で３回洗浄し、蛍光スコープ下で検査し、プラークを蛍光染色に関して陽性または陰性として評価した。ついでプレートを白色光顕微鏡下で検査し、プラークを再計数した。各継代レベルにおける蛍光プラークの割合を以下の表１に示す。どちらの分離体も、継代レベル１５で、４つ全ての抗原（９０％以上）に関して、許容可能な発現レベルを維持している。
【表２】
2021500876.tif 000005
【０１６６】
実施例３
組換えＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶウイルスストックは、ワクチン接種およびトリからの回収の後、該ＩＬＴＶ、ＮＤＶおよびＩＢＤＶタンパク質の発現に関して、表現型において安定である
ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ  ６７０−１４．１−１の２つの分離体（Ａ１分離体およびＡ２分離体）からワクチンを製造し、２１日齢のニワトリの２つの群に皮下経路により接種するために使用した。陰性対照群として利用するため、第３群のトリには希釈剤のみをワクチン接種した。３羽のトリからのプール化脾臓サンプルをワクチン接種後４週間にわたって週２回収集し、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）上のウイルス分離のために処理した。細胞変性効果が明らかに視認可能であった場合には、単層を固定し、ＩＢＤＶ  ＶＰ２、ＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩおよびＮＤＶ  Ｆタンパク質の発現に関して、各タンパク質に特異的な抗体を使用する免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によりプラークを分析した。
【０１６７】
表現型安定性分析
６ウェルプレートに二次ＣＥＦ単層を植えた。細胞に５×１０６個の脾臓細胞を接種し、それを３８℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。５日間のインキュベーションの後、上清をデカントし、ＣＥＦ単層を７０％  アセトンで１５〜３０℃で約２０分間固定した。アセトン溶液をデカントし、細胞を風乾させた後、ＩＬＴＶ  ｇＤ（ポリクローナルウサギ抗ＩＬＴＶ  ｇＤ）、ＩＬＴＶ  ｇＩ（ポリクローナルウサギ抗ＩＬＴＶ  ｇＩ）、ＮＤＶ  Ｆ（Ｍａｂ＃５７）およびＩＢＤＶ  ＶＰ２（ＭＣＡ  ＧＤＶ−Ｒ６３）一次抗体で染色した。約０．５時間のブロッキング工程の後、ＰＢＳ中の５％  ヤギ血清  ＋  ０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（ウェル当たり２ｍＬ）をディッシュに加え、ついで加湿インキュベーター内で３６〜３９℃でインキュベートする。一次抗体を適宜希釈し、ウェル当たり２ｍＬで加え、ついで加湿インキュベーター内で３６〜３９℃で１時間インキュベートした。抗体インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ  ＋  ０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で３回洗浄した。ＦＩＴＣ標識二次抗体溶液（ウサギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ）を１：５０で調製し、２ｍＬを各ウェルに加えた。プレートを加湿インキュベーター内で３６〜３９℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ  ＋  ０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で３回洗浄し、蛍光スコープ下で検査し、プラークを蛍光染色に関して陽性（＋）または陰性（−）として評価した。ついでプレートを白色光顕微鏡下で検査し、プラークを再計数した。各継代レベルにおける蛍光プラークの割合を以下の表２に示す。
【表３】
2021500876.tif 000006
【０１６８】
実施例４
個々の構築物の２つの分離体に関するＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ有効性データ
ビルレント伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）またはビルレント伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）またはビルレントマレック病ウイルス（ＭＤＶ）でのチャレンジに対して防御するためのワクチン候補としての単一構築物ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ  ６７０−１４の有効性を実証するために、以下の４つの研究を行った。
【０１６９】
第１の研究においては、１日齢の特定病原体除去（ＳＰＦ）雛ニワトリにＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ  ６７０−１４．１−１Ａ２ワクチン候補を接種した。対照は、ワクチン接種を受けていない第２群を含んでいた。ワクチン接種後第２８日に、ワクチン接種された雛ニワトリおよびワクチン未接種対照雛ニワトリを気管内（ＩＴ）経路によりビルレントＩＬＴＶ／ＵＳＤＡロットＬＴ  ９６−３でチャレンジした。ついでトリを疾患の臨床徴候に関して１０日間観察した。表３の結果は、６７０−１４．１−１Ａ２ワクチンがチャレンジからの部分的防御をもたらしたことを示している。ワクチンの第２クローンである６７０−１４．１−１Ａ１を使用して、第２の研究を行った。表４の結果は防御における顕著な改善を示している。したがって、６７０−１４．１−１Ａ１ワクチン候補を使用して、次の２つの研究を行った。これらの結果は、ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶが安定かつ有効でありうるという証拠を示している。
【表４】
2021500876.tif 000007
【０１７０】
第３の研究においては、１日齢の特定病原体除去（ＳＰＦ）雛ニワトリにＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ  ６７０−１４．１−１Ａ１ワクチンを接種した。対照は第２のワクチン未接種群を含んでいた。ワクチン接種後第２８日に、ワクチン接種された雛ニワトリおよびワクチン未接種対照雛ニワトリを眼内（ＩＯ）経路によりビルレントＩＢＤＶ／ＣＳ８９株でチャレンジした。ついでトリを疾患の臨床徴候に関して１０日間観察し、嚢を採取し、ＩＢＤＶに合致する肉眼的病変に関して組織学的に検査し、欧州薬局方９．０（０４／２０１３：０５８７）に従い評価した。表５の結果は、６７０−１４．１−１Ａ１ワクチンがチャレンジからの１００％の防御をもたらしたことを示している。
【表５】
2021500876.tif 000008
【０１７１】
第４の研究においては、１日齢の特定病原体除去（ＳＰＦ）雛ニワトリにＨＶＴ／ＩＢＤ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ  ６７０−１４．１−１Ａ１ワクチンを接種した。対照はワクチン未接種雛ニワトリの第２群を含んでいた。ワクチン接種後第５日に、ワクチン接種した雛ニワトリおよびワクチン未接種対照雛ニワトリを腹腔内（ＩＡ）経路によりビルレントＭＤＶ／ＧＡ株でチャレンジした。ついでトリを疾患の臨床徴候に関して５０日間観察し、死亡または安楽死後、ＭＤＶに合致する肉眼的病変に関して検査した。表６の結果は、６７０−１４．１−１Ａ１ワクチンがチャレンジからの９５％の防御をもたらしたことを示している。要約すると、これらの結果は、ＨＶＴ／ＩＢＤ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶワクチンが安定かつ有効でありうることを示している。それはまた、多価ＨＶＴ構築物においてコードされる外来抗原の上限に関する信頼性が、安定かつ有効な多価ＨＶＴワクチンにとって達成されていないことにもつながる。
【表６】
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【０１７２】
実施例５
追加的なＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ構築物
ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃２の構築
三重組換えＨＶＴベクターウイルスＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃２は、ＨＶＴ  ＵＬ５４．５部位内に挿入されたＮＤＶ発現カセットと、ＨＶＴ  ＵＳ２部位内に挿入されたＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ発現カセットとを含有する。ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃２のコスミド再生を、本質的にはＵ．Ｓ．５，８５３，７３３［例えば、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８］に記載されているとおりに行った。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＬ５４．５領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号４０７−３１．１Ｃ１によってカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［６７２−０１．Ａ４０および６７２−０７．Ｃ４０、ならびにこれらの２つと重複しており、ＵＬ５４．５遺伝子座内にＮＤＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（６５４−４５：３２５３４１ ＩＥ−Ｆ／１Ｃ１）］から得た。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＳ領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号３７８−５０によってカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［ｐＳＹ６４０および５５６−６０．６、ならびにこれらの２つと重複しており、ＵＳ２遺伝子座内にＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（２２８５０９−ＩＬＴ−４３５Ｖｅｃ６）］から得た。
【０１７３】
９個の線状化構築物（２個のコスミドおよび７個のプラスミド）の組を全て一緒に、標準的なＣａＣｌ２トランスフェクション法を用いて、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）内にトランスフェクトし、得られたウイルスストックを２回、プラーク精製した。
【０１７４】
ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃３の構築
三重組換えＨＶＴベクターウイルスＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃３は、ＨＶＴ  ＵＬ５４．５部位内に挿入されたＩＢＤＶ発現カセットと、ＨＶＴ  ＵＳ２部位内に挿入されたＩＬＴＶ／ＮＤＶ発現カセットとを含有する。ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃３のコスミド再生を、本質的にはＵ．Ｓ．５，８５３，７３３［例えば、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８］に記載されているとおりに行った。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＬ５４．５領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号４０７−３１．１Ｃ１によってカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［６７２−０１．Ａ４０および６７２−０７．Ｃ４０、ならびにこれらの２つと重複しており、ＵＬ５４．５遺伝子座内にＩＢＤＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（ＶＰ２／１Ｃ１＃８）］から得た。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＳ領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号３７８−５０によってカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［ｐＳＹ６４０および５５６−６０．６、ならびにこれらの２つと重複しており、ＵＳ２遺伝子座内にＩＬＴＶ／ＮＤＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（１３３２−４７．Ａ２）］から得た。９個の線状化構築物（２個のコスミドおよび７個のプラスミド）の組を全て一緒に、標準的なＣａＣｌ２トランスフェクション法を用いて、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）内にトランスフェクトし、得られたウイルスストックを２回、プラーク精製した。
【０１７５】
ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃４の構築
三重組換えＨＶＴベクターウイルスＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃４は、ＨＶＴ  ＵＬ５４．５部位内に挿入されたＩＬＴＶ発現カセットと、ＨＶＴ  ＵＳ２部位内に挿入されたＩＢＤＶ／ＮＤＶ発現カセットとを含有する。ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃４のコスミド再生を、本質的にはＵ．Ｓ．５，８５３，７３３［例えば、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８］に記載されているとおりに行った。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＬ５４．５領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号４０７−３１．１Ｃ１によってカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［６７２−０１．Ａ４０および６７２−０７．Ｃ４０、ならびにこれらの２つと重複しており、ＵＬ５４．５遺伝子座内にＩＬＴＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（１３３２−２３．７）］から得た。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＳ領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号３７８−５０によってカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［ｐＳＹ６４０および５５６−６０．６、ならびにこれらの２つと重複しており、ＵＳ２遺伝子座内にＩＢＤＶ／ＮＤＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（４３５Ｖｅｃ６０）］から得た。９個の線状化構築物（２個のコスミドおよび７個のプラスミド）の組を全て一緒に、標準的なＣａＣｌ２トランスフェクション法を用いて、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）内にトランスフェクトし、得られたウイルスストックを２回、プラーク精製した。
【０１７６】
ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃５の構築
三重組換えＨＶＴベクターウイルスＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃５は、ＨＶＴ  ＵＬ５４．５部位内に挿入されたＩＬＴＶ／ＮＤＶ発現カセットと、ＨＶＴ  ＵＳ２部位内に挿入されたＩＢＤＶ発現カセットとを含有する。ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃５のコスミド再生を、本質的にはＵ．Ｓ．５，８５３，７３３［例えば、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８］に記載されているとおりに行った。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＬ５４．５領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号４０７−３１．１Ｃ１によってカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［６７２−０１．Ａ４０および６７２−０７．Ｃ４０、ならびにこれらの２つと重複しており、ＵＬ５４．５遺伝子座内にＩＬＴＶ／ＮＤＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（１３３２−２９．４）］から得た。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＳ領域内への組込みを可能にするために、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３におけるコスミド番号３７８−５０によってカバーされる領域を、今回は、より小さい３つのプラスミド［ｐＳＹ６４０および５５６−６０．６、ならびにこれらの２つと重複しており、ＵＳ２遺伝子座内にＩＢＤＶ発現カセットを含有する１つの導入プラスミド（４３５Ｖｅｃ６０）］から得た。９個の線状化構築物（２個のコスミドおよび７個のプラスミド）の組を全て一緒に、標準的なＣａＣｌ２トランスフェクション法を用いて、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）内にトランスフェクトし、得られたウイルスストックを２回、プラーク精製した。
【０１７７】
ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃２を作製するための追加的挿入断片（図２を参照されたい）
サブゲノムクローン６５４−４５：３２５３４１ ＩＥ−Ｆ／１Ｃ１
挿入プラスミド６５４−４５：３２５３４１ ＩＥ−Ｆ／１Ｃ１は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体（ＡａｔＩＩ−ＰｖｕＩＩ欠失体）内にクローニングされた、ゲノムＨＶＴユニーク長領域の８６３６塩基対の領域［１０９４８９〜１１８１２４位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。それはＡｓｃＩ部位に隣接しており、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｉ、Ｓ、および１３３７塩基対の断片Ｇ、および１１７７塩基対の断片Ｆを含む。ＨＶＴ  ＵＬ５４．５オープンリーディングフレーム内のＸｈｏＩ部位［１１１２４０／１１１２４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基２１と２２との間］内に、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＮＤＶ，クローン３０株，融合遺伝子（Ｆ）、およびＨＣＭＶ  ＩＥ遺伝子からの転写終結配列からなる発現カセットが挿入されている。ＮＤＶ  Ｆ遺伝子はＨＶＴ  ＵＬ５４．５遺伝子に対して逆方向に転写される。
【０１７８】
サブゲノムクローン２２８５０９−ＩＬＴ−４３５Ｖｅｃ６［国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４６６２を参照されたい］
挿入プラスミド２２８５０９−ＩＬＴ−４３５Ｖｅｃ６は、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）内にクローニングされた、ＨＶＴユニーク短領域の７３１１塩基対のＥｃｏＲＩ断片［１２６８８０〜１４４１９０位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子内のユニークＳｔｕＩ部位［１４０５４０／１４０５４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基１２４と１２５との間］内に以下の２つの要素が挿入されている：ＭＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＩＢＤＶ古典型Ｆ５２／７０、ファラガー株、ウイルスタンパク質２遺伝子（ＶＰ２）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルからなる発現カセット、ならびにそれに続く、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、および糖タンパク質Ｅからの部分コード領域（アミノ酸１〜１０１）、およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４〜９８５）をコードする、ＩＬＴＶ，ＮＶＳＬチャレンジ株，Ｌｏｔ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［１０５３２〜１４０９４位；Ｗｉｌｄら，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）；Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］。ＩＢＤＶ  ＶＰ２、ＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子はＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子に対して逆方向に転写される。
【０１７９】
ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃３を作製するための追加的挿入断片（図３を参照されたい）
サブゲノムクローンＶＰ２／１Ｃ１＃８
挿入プラスミドＶＰ２／１Ｃ１＃８は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体（ＡａｔＩＩ−ＰｖｕＩＩ欠失体）内にクローニングされた、ゲノムＨＶＴユニーク長領域の８６３６塩基対の領域［１０９４８９〜１１８１２４位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。それはＡｓｃＩ部位に隣接しており、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｉ、Ｓ、および１３３７塩基対の断片Ｇ、および１１７７塩基対の断片Ｆを含む。ＨＶＴ  ＵＬ５４．５オープンリーディングフレーム内のＸｈｏＩ部位［１１１２４０／１１１２４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基２１と２２との間］内に、ＭＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＩＢＤＶ古典型Ｆ５２／７０、ファラガー株、ウイルスタンパク質２遺伝子（ＶＰ２）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルからなる発現カセットが挿入されている。ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子はＨＶＴ  ＵＬ５４．５遺伝子に対して逆方向に転写される。
【０１８０】
サブゲノムクローン１３３２−４７．Ａ２
挿入プラスミド１３３２−４７．Ａ２は、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）内にクローニングされた、ＨＶＴユニーク短領域の７３１１塩基対のＥｃｏＲＩ断片［１２６８８０〜１４４１９０位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子内のユニークＳｔｕＩ部位［１４０５４０／１４０５４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基１２４と１２５との間］内に以下の２つの要素が挿入されている：糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、および糖タンパク質Ｅからの部分コード領域（アミノ酸１〜１０１）、およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４〜９８５）をコードする、ＩＬＴＶ，ＮＶＳＬチャレンジ株，Ｌｏｔ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［１０５３２〜１４０９４位；Ｗｉｌｄら，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）；Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］；ならびにそれに続く、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＮＤＶ，クローン３０株，融合遺伝子（Ｆ）、およびＨＣＭＶ  ＩＥ遺伝子からの転写終結配列からなる発現カセットが挿入されている。ＩＬＴＶ  ｇＤ、ＩＬＴＶ  ｇＩおよびＮＤＶ  Ｆ遺伝子はＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子に対して逆方向に転写される。
【０１８１】
ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃４を作製するための追加的挿入断片（図４を参照されたい）
サブゲノムクローン１３３２−２３．７
挿入プラスミド１３３２−２３．７は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体（ＡａｔＩＩ−ＰｖｕＩＩ欠失体）内にクローニングされた、ゲノムＨＶＴユニーク長領域の８６３６塩基対の領域［１０９４８９〜１１８１２４位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。それはＡｓｃＩ部位に隣接しており、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｉ、Ｓ、および１３３７塩基対の断片Ｇ、および１１７７塩基対の断片Ｆを含む。ＨＶＴ  ＵＬ５４．５オープンリーディングフレーム内のＸｈｏＩ部位［１１１２４０／１１１２４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基２１と２２との間］内に、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、および糖タンパク質Ｅからの部分コード領域（アミノ酸１〜１０１）、およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４〜９８５）をコードする、ＩＬＴＶ，ＮＶＳＬチャレンジ株，Ｌｏｔ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［１０５３２〜１４０９４位；Ｗｉｌｄら，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）；Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］が挿入されている。ＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子はＨＶＴ  ＵＬ５４．５遺伝子に対して逆方向に転写される。
【０１８２】
サブゲノムクローン４３５Ｖｅｃ６０
挿入プラスミド４３５Ｖｅｃ６０は、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）内にクローニングされた、ＨＶＴユニーク短領域の７３１１塩基対のＥｃｏＲＩ断片［１２６８８０〜１４４１９０位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子内のユニークＳｔｕＩ部位［１４０５４０／１４０５４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基１２４と１２５との間］内に以下の２つの要素が挿入されている：ＭＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＩＢＤＶ古典型Ｆ５２／７０、ファラガー株、ウイルスタンパク質２遺伝子（ＶＰ２）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルからなる発現カセット、ならびにそれに続く、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＮＤＶ，クローン３０株，融合遺伝子（Ｆ）、およびＨＣＭＶ  ＩＥ遺伝子からの転写終結配列からなる発現カセット。ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ  Ｆ遺伝子は共に、ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子に対して逆方向に転写される。
【０１８３】
ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ／ＮＤＶ＃５を作製するための追加的挿入断片（図５を参照されたい）
サブゲノムクローン１３３２−２９．４［Ｕ．Ｓ．９，４０９，９５４  Ｂ２を参照されたい］
挿入プラスミド１３３２−２９．４は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体（ＡａｔＩＩ−ＰｖｕＩＩ欠失体）内にクローニングされた、ゲノムＨＶＴユニーク長領域の８６３６塩基対の領域［１０９４８９〜１１８１２４位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。それはＡｓｃＩ部位に隣接しており、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｉ、Ｓ、および１３３７塩基対の断片Ｇ、および１１７７塩基対の断片Ｆを含む。ＨＶＴ  ＵＬ５４．５オープンリーディングフレーム内のＸｈｏＩ部位［１１１２４０／１１１２４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基２１と２２との間］内に以下の２つの要素が挿入されている：糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、および糖タンパク質Ｅからの部分コード領域（アミノ酸１〜１０１）、およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４〜９８５）をコードする、ＩＬＴＶ，ＮＶＳＬチャレンジ株，Ｌｏｔ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［１０５３２〜１４０９４位；Ｗｉｌｄら，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）；Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］、ならびにそれに続く、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＮＤＶ，クローン３０株，融合遺伝子（Ｆ）、およびＨＣＭＶ  ＩＥ遺伝子からの転写終結配列からなる発現カセット。ＩＬＴＶ  ｇＤ、ＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子およびＮＤＶ  Ｆ遺伝子はＨＶＴ  ＵＬ５４．５遺伝子に対して逆方向に転写される。
【０１８４】
サブゲノムクローン４３５Ｖｅｃ６
挿入プラスミド４３５Ｖｅｃ６は、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）内にクローニングされた、ＨＶＴユニーク短領域の７３１１塩基対のＥｃｏＲＩ断片［１２６８８０〜１４４１９０位；Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子内のユニークＳｔｕＩ部位［１４０５４０／１４０５４１位，Ａｆｏｎｓｏら，２００１，前掲；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６，アミノ酸残基１２４と１２５との間］内に、ＭＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＩＢＤＶ古典型Ｆ５２／７０、ファラガー株、ウイルスタンパク質２遺伝子（ＶＰ２）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルからなる発現カセットが挿入されている。：ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子はＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子に対して逆方向に転写される。
【０１８５】
本実施例において開示されているＨＶＴ／ＩＬＴＶ／ＩＢＤＶ／ＮＤＶウイルスベクターにおいて使用される配列は以下の実施例７において配列番号２３および２６〜３２として示されている。
【０１８６】
実施例６
失敗した構築物
組換えベクターワクチンウイルスは、定義上は、外来遺伝子を運搬し発現するように設計されている。これらの外来遺伝子の転写および発現が、親ウイルスと比較して、組換えウイルスに増殖上の不利益をもたらすならば、これらの遺伝子がワクチンの製造中に失われる可能性がある。このため、ワクチン候補は遺伝的安定性と表現型安定性との両方に関して試験される必要がある。
【０１８７】
また、用いられる防御基準は、ＵＳＤＡによって確立され米国連邦規則基準タイトル９、パート１１３（Ｔｉｔｌｅ  ９  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ，ｐａｒｔ  １１３）（９ＣＦＲ  １１３）『動物製品の標準要件（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）』に定められているものである。認可を得るためには、生ウイルスワクチンは、ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶの場合には、疾患に関連した臨床徴候または病変からの少なくとも９０％の防御をもたらす必要があり、ＭＤＶの場合には少なくとも８０％の防御をもたらす必要がある。
【０１８８】
ウイルス構築物の遺伝的安定性は、最高予想ワクチン生産レベル、組織培養における所定回数の継代の後のサザンブロット分析により判定され、元の分離体からのＤＮＡと比較された。ウイルスストックから抽出されたＤＮＡを制限酵素で消化し、膜に転移させ、挿入外来遺伝子の存在の検出用に設計されたプローブでハイブリダイズさせる。遺伝的安定性はＰＣＲ分析によっても決定されうる。外来ＤＮＡ内の又は外来ＤＮＡに隣接したＤＮＡにアニーリングするように設計されたＰＣＲプライマーを使用して、組織培養における継代の前および後の両方で、ウイルスＤＮＡ鋳型から既知サイズの断片を増幅させることが可能であろう。
【０１８９】
ウイルス構築物の表現型安定性は、これらの挿入外来遺伝子のタンパク質産物に対する抗体での個々のウイルスプラークの免疫学的染色により判定された。これらの組換えワクチンによりもたらされる防御は、動物の免疫系を刺激するためのこれらのタンパク質産物の発現に基づいている。ほとんどの場合、外来タンパク質発現に関して陽性に染色されるウイルスの割合が９０％を下回ると、組織培養におけるウイルス増殖能に有害である可能性が高いため、ワクチン候補として不適切である。
【０１９０】
以下の表７Ａおよび７Ｂから容易に理解されるとおり、ほとんどのｒＭＤＶｎｐ構築物は、これらの２つの基準、すなわち、比較的強い抗原発現および／または有効性を伴う安定性を満たしていない。表７Ａは、異種インサートの１つがＩＢＤＶ抗原をコードする、複数の異種インサートを含有する一連の組換えＨＶＴ構築物を示す。結果が示すとおり、表７Ａにおける構築物の全ては、比較的強い抗原発現を伴う安定性および／または有効性の基準を満たさなかった。
【表７】
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【０１９１】
以下の表７Ｂは一連の１１個の組換えＨＶＴ構築物および１つの単独のＮＡＨＶ構築物を示し、それらのそれぞれは、異種インサートの少なくとも１つがＮＤＶ抗原またはＩＬＴＶ抗原のいずれかをコードする、複数の異種インサートを含む１（１  表７Ｂにおけるデータは、本出願の共同発明者の１人により署名された宣言においてＵ．Ｓ．８，９３２，６０４  Ｂ２の論告中に米国特許商標局に提出された）。結果が示すとおり、表７Ｂにおける構築物の全ては、比較的強い抗原発現を伴う安定性および／または有効性の基準を満たさなかった。
【表８】
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【０１９２】
実施例７
配列
以下の配列が該例示ｒＨＶＴ構築物において使用されている。以下に示すコード配列は個々の終止コドンを含み、これは、該コード配列がコードしているタンパク質抗原の特性を改変することなく代替的終止コドンで容易に置換されうる。
【表９】
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【０１９３】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態により範囲において限定されない。実際、本明細書に記載されているものに加えて本発明の種々の修飾が前記説明から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０１９４】
更に、核酸またはポリペプチドに関して示されている全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために示されていると理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月18日(2020.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つの異種ヌクレオチド配列を含む組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐ）であって、ここで、
第１異種ヌクレオチド配列が第１ニワトリ病原体からの１以上の抗原をコードし、第２異種ヌクレオチド配列が第２ニワトリ病原体からの１以上の抗原をコードし、第３異種ヌクレオチド配列が第３ニワトリ病原体からの１以上の抗原をコードし、
第１異種ヌクレオチド配列、第２異種ヌクレオチド配列および第３異種ヌクレオチド配列のそれぞれがｒＭＤＶｎｐゲノムの非必須部位に位置し、ならびに
第１ニワトリ病原体が伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）であり、第２ニワトリ病原体が伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）であり、第３ニワトリ病原体がニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である、組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐ）。
【請求項２】
第１異種ヌクレオチド配列が伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスウイルスタンパク質２（ＩＢＤＶ  ＶＰ２）のコード配列を含み、第２異種ヌクレオチド配列が伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ（ＩＬＴＶ  ｇＤ）のコード配列および伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｉ（ＩＬＴＶ  ｇＩ）のコード配列を含み、第３異種ヌクレオチド配列がニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ  Ｆ）のコード配列を含んでおり、
第１異種ヌクレオチド配列が第１異種核酸または第２異種核酸により含まれ、第２異種ヌクレオチド配列が第１異種核酸または第２異種核酸により含まれ、第３異種ヌクレオチド配列が第１異種核酸または第２異種核酸により含まれ、
第１異種核酸がｒＭＤＶｎｐゲノム内の第１非必須部位に位置し、第２異種核酸がｒＭＤＶｎｐゲノム内の第２非必須部位に位置し、
第１非必須部位と第２非必須部位とが同じまたは異なる、請求項１記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項３】
第１異種核酸がＩＬＴＶ  ｇＤのコード配列、ＩＬＴＶ  ｇＩのコード配列およびＮＤＶ  Ｆのコード配列を含み、第２異種核酸がＩＢＤＶ  ＶＰ２のコード配列を含む、請求項２記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項４】
第１異種核酸が配列番号２８のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸が配列番号２７のヌクレオチド配列を含み、または第１異種核酸が配列番号３１のヌクレオチドを含み、第２異種核酸が配列番号３２のヌクレオチド配列を含む、請求項３記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項５】
第１異種核酸がＩＢＤＶ  ＶＰ２のコード配列およびＮＤＶ  Ｆのコード配列を含み、
第２異種核酸がＩＬＴＶ  ｇＤのコード配列およびＩＬＴＶ  ｇＩのコード配列を含む、請求項２記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項６】
第１異種核酸が配列番号３０のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸が配列番号２９のヌクレオチド配列を含む、請求項５記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項７】
第１異種核酸がＩＢＤＶ  ＶＰ２のコード配列、ＩＬＴＶ  ｇＤのコード配列およびＩＬＴＶ  ｇＩのコード配列を含み、第２異種核酸がＮＤＶ  Ｆのコード配列を含む、請求項２記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項８】
第１異種核酸が配列番号２３のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸が配列番号２６のヌクレオチド配列を含むか、または、第１異種核酸配列が配列番号２１のヌクレオチド配列を含み、第２異種核酸が配列番号２２のヌクレオチド配列を含む、請求項３記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項９】
第１非必須部位および第２非必須部位が、ＵＳ２部位、ＵＬ５４．５部位、ＵＬ７／８部位、ＵＬ４０部位、ＵＬ４３部位、ＵＬ４５／４６部位、ＵＬ５５部位、ＵＳ１０部位、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の領域、ＵＳ２とＳＯＲＦ３との間の領域、遺伝子間領域１（ＩＧ１）部位、遺伝子間領域２（ＩＧ２）部位および遺伝子間領域（ＩＧ３）からなる群から選択される、請求項２、３、４、５、６、７または８記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１０】
第１異種ヌクレオチド配列のＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコード配列がマウスサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｍＣＭＶ  ＩＥ１）プロモーターの制御下で機能的に存在し、第２異種ヌクレオチド配列のＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコード配列が内因性ＩＬＴＶ  ｇＤのプロモーターの制御下で機能的に存在し、第２異種ヌクレオチド配列のＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコード配列が内因性ＩＬＴＶ  ｇＩのプロモーターの制御下で機能的に存在し、ＮＤＶ  Ｆのコード配列がヒトサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｈＣＭＶ  ＩＥ１）プロモーターの制御下で機能的に存在する、請求項２、３、５、７または９記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１１】
第１非必須部位がＵＳ２部位であり、第２非必須部位がＵＬ５４．５部位である、請求項２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１２】
第１非必須部位がＵＬ５４．５部位であり、第２非必須部位がＵＳ２部位である、請求項２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１３】
ｒＭＤＶｎｐが組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）である、請求項１乃至１２のいずれか１項記載のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか１項記載のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物。
【請求項１５】
請求項１４記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
【請求項１６】
請求項１５記載のワクチンを投与することを含む、ＮＤＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＤＶ、ＭＤＶおよびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるウイルスに対するニワトリの防御を補助するための方法。
【国際調査報告】
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2021500876.tif 000113
2021500876.tif 000114
2021500876.tif 000115