(57)【要約】本開示は、活性剤、例えばオリゴヌクレオチドと複合体を形成するための化合物であって、式（３２１）に示される構造を有する化合物を提供する。本開示は、対応する複合体をさらに提供する。本開示の複合体は、肝細胞を特異的に標的し、オリゴヌクレオチド薬物の体内送達に関連する問題を効果的に解決でき、毒性が低く、送達されるオリゴヌクレオチドの高度な安定化を維持するとともに、優れた送達効率をさらに有する。    【化１】2021509402.tif 000182【選択図】図１６
2021509402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（３２１）に示される構造を有する化合物：
【化１】
2021509402.tif 000146
式中、
ｎ１は１〜３の整数であり、ｎ３は０〜４の整数であり、
各ｍ１、ｍ２及びｍ３はそれぞれ独立して２〜１０の整数であり、
各Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基から選択され、
Ｒ４は、共有結合により活性薬物又は活性剤と結合できる基であり、
各Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか１つ又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し、
各Ｓ１は独立してＭ１であり、任意の活性ヒドロキシ基は、もしあれば、いずれもヒドロキシ保護基で保護され、
各Ｍ１は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。
【請求項２】
各Ｌ１が独立してＡ１〜Ａ２６の基及びその任意の組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物：
【化２】
2021509402.tif 000147
式中、各ｊ１は独立して１〜２０の整数であり、
各ｊ２は独立して１〜２０の整数であり、
各Ｒ’は独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
各Ｒａは独立してＡ２７〜Ａ４５の基及びその任意の組合せからなる群から選択され、
【化３】
2021509402.tif 000148
各Ｒｂは独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
2021509402.tif 000149
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
【請求項３】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３の基及びその結合の組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１の基のうち少なくとも２つの結合の組合せである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ８及びＡ１０の基のうち少なくとも２つの結合の組合せである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｌ１の長さが３〜２５個の原子であり、前記Ｌ１の長さとは、Ｌ１において窒素含有骨格中のＮ原子に結合される原子からＳ１に結合される原子まで形成される最も長い原子鎖上の連鎖原子の個数を指す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｌ１の長さが４〜１５個の原子である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
ｊ１は２〜１０の整数であり、ｊ２は２〜１０の整数であり、Ｒ’はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１からなる群から選択され、ＲｂはＣ１−Ｃ５アルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
ｊ１は３〜５の整数であり、ｊ２は３〜５の整数であり、Ｒ’はメチル基、エチル基又はイソプロピル基であり、ＲａはＡ２７又はＡ２８であり、Ｒｂはメチル基、エチル基、イソプロピル基又はブチル基である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
ｎ１は１〜２の整数であり、ｎ３は０〜１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２〜３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
各ｍ１、ｍ２及びｍ３はそれぞれ独立して２〜５の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
保護されるヒドロキシ基がＹＣＯＯ−構造を有し、各Ｙが独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基及びＣ６−Ｃ１０アリール基からなる群から選択され、ハロゲン置換基及びＣ１−Ｃ６アルキル基からなる群から選択される１又は複数の置換基を任意に有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
各Ｙが独立して、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、モノクロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びＣ１−Ｃ６アルキルフェニル基からなる群から選択される、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
各Ｍ１が独立して糖である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
各Ｍ１が独立して単糖、二糖、三糖又は多糖である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
少なくとも１つのＭ１が修飾されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
各Ｍ１が、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロノニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース及びＬ−４−チオリボースからなる群から独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
少なくとも１つのＭ１がＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
各Ｍ１が、いずれもＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２１】
各Ｓ１が独立してＡ４６〜Ａ５４の基のうち１つである、請求項１に記載の化合物：
【化４】
2021509402.tif 000150
【請求項２２】
Ｓ１がＡ４９又はＡ５０である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｙがメチル基である、請求項２１又は２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ独立してＨ、メチル基又はエチル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ４は、リン酸ジエステル結合によりオリゴヌクレオチドに結合されることができる基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ４は、オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド上の基と反応してリン酸エステル結合を形成することができる第１の官能基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ４は第２の官能基をさらに含み、前記第２の官能基は、ヒドロキシ基もしくはアミノ基と共有結合を形成することができる、又は、ヒドロキシ基もしくはアミノ基と形成する共有結合により分子の残りの部分に結合される固相担体である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
前記第１の官能基が、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されるヒドロキシ基である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２９】
前記第２の官能基が、ホスホルアミダイト、カルボキシ基又はカルボン酸塩である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３０】
前記固相担体が、リン酸エステル結合、カルボン酸エステル結合及び／又はアミド結合により分子の残りの部分に結合される、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３１】
前記固相担体が樹脂である、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
前記カルボン酸塩が、金属カチオン、アンモニウム塩、第３級アミン又は第４級アンモニウムイオンを有するカルボン酸塩である、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３３】
前記カルボン酸塩が、トリエチルアミンカルボン酸塩又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ４が、ヒドロキシ基、−ＯＲｋ又は式（Ｃ３）に示される基を含む、請求項２６に記載の化合物：
【化５】
2021509402.tif 000151
（Ｃ３）
ただし、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、
2021509402.tif 000152
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
【請求項３５】
Ｒ４が、式（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される基を含む、請求項２７に記載の化合物：
【化６】
2021509402.tif 000153
式中、ｑ１は１〜４の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
2021509402.tif 000154
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
【請求項３６】
Ｒ４が、式（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ９’）、（Ｂ１０’）、（Ｂ１１’）又は（Ｂ１２’）に示される構造を有する、請求項２６又は２７に記載の化合物：
【化７】
2021509402.tif 000155
式中、ｑ１は１〜４の整数であり、ｑ２は１〜１０の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、ＳＰＳは固相担体を表し、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、
2021509402.tif 000156
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
【請求項３７】
ｑ１は１〜５の整数であり、ｑ２は１又は２である、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
式（４０３）〜（４４２）に示される構造を有する、請求項２６に記載の化合物：
【化８】
2021509402.tif 000157
2021509402.tif 000158
2021509402.tif 000159
2021509402.tif 000160
2021509402.tif 000161
2021509402.tif 000162
2021509402.tif 000163
2021509402.tif 000164
2021509402.tif 000165
2021509402.tif 000166
2021509402.tif 000167
式中、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表す。
【請求項３９】
Ｍ＋が、アルカリ金属カチオン、アンモニウムカチオン、第３級アミンにより形成されたカチオン又は第４級アンモニウムカチオンであり、Ｒｋが、トリチル基、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル又は４，４’，４’’−トリメトキシトリチルであり、ＳＰＳが樹脂を表す、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４０】
前記受容体が肝細胞表面の受容体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４１】
前記受容体が哺乳動物の細胞表面の受容体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４２】
前記受容体がヒト肝細胞におけるアシアロ糖タンパク質受容体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４３】
式（１）に示される構造を有する複合体：
【化９】
2021509402.tif 000168
式中、
ｎ１は１〜３の整数であり、ｎ３は０〜４の整数であり、
各ｍ１、ｍ２及びｍ３はそれぞれ独立して２〜１０の整数であり、
各Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基から選択され、
Ｒ３は活性薬物であり、
Ｒ２は、長さ１〜２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか１つ又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し、
各Ｌ１は、独立して長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか１つ又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し、
各Ｍ１は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから選択される１つである。
【請求項４４】
各Ｌ１がＡ１〜Ａ２６の基及びその任意の組合せからなる群から独立して選択される、請求項４３に記載の複合体：
【化１０】
2021509402.tif 000169
式中、各ｊ１は独立して１〜２０の整数であり、
各ｊ２は独立して１〜２０の整数であり、
各Ｒ’は独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
各Ｒａは、Ａ２７〜Ａ４５及びその任意の組合せからなる群から独立して選択され、
【化１１】
2021509402.tif 000170
各Ｒｂは独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
2021509402.tif 000171
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
【請求項４５】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３の基及びその結合の組合せからなる群から選択される、請求項４３に記載の複合体。
【請求項４６】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１の基のうち少なくとも２つの結合の組合せである、請求項４５に記載の複合体。
【請求項４７】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ８及びＡ１０の基のうち少なくとも２つの結合の組合せである、請求項４６に記載の複合体。
【請求項４８】
Ｌ１の長さが３〜２５個の原子である、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項４９】
Ｌ１の長さが４〜１５個の原子である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５０】
ｊ１は２〜１０の整数であり、ｊ２は２〜１０の整数であり、Ｒ’はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１から選択され、ＲｂはＣ１−Ｃ５アルキル基である、請求項４３に記載の複合体。
【請求項５１】
ｊ１は３〜５の整数であり、ｊ２は３〜５の整数であり、Ｒ’はメチル基、エチル基又はイソプロピル基であり、ＲａはＡ２７又はＡ２８であり、Ｒｂはメチル基、エチル基、イソプロピル基又はブチル基である、請求項５０に記載の複合体。
【請求項５２】
ｎ１は１〜２の整数であり、ｎ３は０〜１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２〜３である、請求項４３に記載の複合体。
【請求項５３】
ｍ１、ｍ２及びｍ３はそれぞれ独立して２〜５の整数である、請求項４３に記載の複合体。
【請求項５４】
ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項５３に記載の複合体。
【請求項５５】
保護されるヒドロキシ基がＹＣＯＯ−構造を有し、各Ｙが、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基及びＣ６−Ｃ１０アリール基からなる群から独立して選択され、ハロゲン置換基及びＣ１−Ｃ６アルキル基から選択される１又は複数の置換基を任意に有する、請求項４３に記載の複合体。
【請求項５６】
各Ｙが、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、モノクロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びＣ１−Ｃ６アルキルフェニル基から独立して選択される、請求項５５に記載の複合体。
【請求項５７】
各Ｍ１が独立して糖である、請求項４３に記載の複合体。
【請求項５８】
各Ｍ１が独立して単糖、二糖、三糖又は多糖である、請求項４３に記載の複合体。
【請求項５９】
少なくとも１つのＭ１が修飾されている、請求項４３に記載の複合体。
【請求項６０】
各Ｍ１が、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロノニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース及びＬ−４−チオリボースからなる群から独立して選択される、請求項４３に記載の複合体。
【請求項６１】
少なくとも１つのＭ１がＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、請求項６０に記載の複合体。
【請求項６２】
各Ｍ１がいずれもＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、請求項６０に記載の複合体。
【請求項６３】
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ独立してＨ、メチル基又はエチル基である、請求項４３に記載の複合体。
【請求項６４】
Ｒ３が、機能性オリゴヌクレオチドを含む、請求項４３に記載の複合体。
【請求項６５】
Ｒ３が、式Ａ５９に示される構造を有する基である、請求項６４に記載の複合体：
【化１２】
2021509402.tif 000172
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは機能性オリゴヌクレオチドである。
【請求項６６】
Ｒ２がＲ３上のＰ原子に結合される、請求項６５に記載の複合体。
【請求項６７】
Ｒ２が、Ｒ３におけるＰ原子とリン酸エステル結合を形成する、請求項６５に記載の複合体。
【請求項６８】
Ｒ２がＢ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’である、請求項４３に記載の複合体：
【化１３】
2021509402.tif 000173
式中、
2021509402.tif 000174
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、ｑ２は１〜１０の整数である。
【請求項６９】
式（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）、（２０）、（２１）又は（２２）に示される構造を有する、請求項６８に記載の複合体：
【化１４】
2021509402.tif 000175
2021509402.tif 000176
2021509402.tif 000177
2021509402.tif 000178
2021509402.tif 000179
【請求項７０】
前記機能性オリゴヌクレオチドが、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ拮抗剤、マイクロＲＮＡ模倣物、デコイオリゴヌクレオチド、免疫刺激物、Ｇ−四重鎖、選択的スプライスバリアント、一本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸、核酸アプタマー、ステムループＲＮＡ、ｍＲＮＡ断片、活性化ＲＮＡ又はＤＮＡからなる群から選択される、請求項６５に記載の複合体。
【請求項７１】
前記機能性オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチド又は二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項７０に記載の複合体。
【請求項７２】
前記機能性オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドであり、式Ａ５９におけるＰ原子が、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域に結合され、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域とは、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの一端に最も近い４個のヌクレオチドを指す、請求項７１に記載の複合体。
【請求項７３】
式Ａ５９におけるＰ原子が、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端に結合される、請求項７２に記載の複合体。
【請求項７４】
式Ａ５９におけるＰ原子が、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端に結合される、請求項７３に記載の複合体。
【請求項７５】
前記機能性オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記式Ａ５９におけるＰ原子が、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域に結合され、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の一端に最も近い４個のヌクレオチドを指す、請求項７１に記載の複合体。
【請求項７６】
式Ａ５９におけるＰ原子が、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の末端に結合される、請求項７５に記載の複合体。
【請求項７７】
式Ａ５９におけるＰ原子が、前記センス鎖の３’末端に結合される、請求項７６に記載の複合体。
【請求項７８】
式Ａ５９におけるＰ原子が、リン酸ジエステル結合により前記機能性オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合される、請求項７１〜７７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７９】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項７１及び７５〜７７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８０】
前記ｓｉＲＮＡにおける各ヌクレオチドが、独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記ｓｉＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖がヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、長さがいずれも１９ヌクレオチドであり、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖相補領域を形成し、前記ヌクレオチド配列２が、標的ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド断片である第１のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で相補的であり、前記標的ｍＲＮＡとは、肝細胞において異常に発現する遺伝子のｍＲＮＡを指す、請求項７９に記載の複合体。
【請求項８１】
前記標的ｍＲＮＡが、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ又はＨＣＶに対応するｍＲＮＡである、請求項８０に記載の複合体。
【請求項８２】
前記標的ｍＲＮＡが、Ｂ型肝炎ウイルスのｍＲＮＡ、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、又は、アポリポタンパクＣ３遺伝子から転写されたｍＲＮＡから選択される、請求項８１に記載の複合体。
【請求項８３】
前記ヌクレオチド配列１と前記第１のヌクレオチド配列断片とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３個以下であり、前記ヌクレオチド配列２とヌクレオチド配列Ｂとは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３個以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｂは、前記第１のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的なヌクレオチド配列である、請求項８０に記載の複合体。
【請求項８４】
前記ヌクレオチド配列１と前記第１のヌクレオチド配列断片とは、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列２と前記ヌクレオチド配列Ｂとは、ヌクレオチド差異が１つ以下である、請求項８３に記載の複合体。
【請求項８５】
前記ヌクレオチド配列２と前記ヌクレオチド配列Ｂとの間のヌクレオチド差異が、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２における１番目のヌクレオチドＺ’の位置での差異を含む、請求項８３又は８４に記載の複合体。
【請求項８６】
５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１における最後のヌクレオチドＺが、Ｚ’と相補的なヌクレオチドである、請求項８５に記載の複合体。
【請求項８７】
前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２が、基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である、請求項８０に記載の複合体。
【請求項８８】
前記センス鎖がヌクレオチド配列３をさらに含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列４をさらに含み、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが等しく、いずれも１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３が前記ヌクレオチド配列１の５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４が前記ヌクレオチド配列２の３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４が第２のヌクレオチド配列断片と相補的であり、前記第２のヌクレオチド配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおいて前記第１のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列４と同じヌクレオチド配列を指し、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４が、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である、請求項８０に記載の複合体。
【請求項８９】
前記ｓｉＲＮＡがヌクレオチド配列５をさらに含み、前記ヌクレオチド配列５は、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング端を構成する、請求項８０又は８８に記載の複合体。
【請求項９０】
前記ヌクレオチド配列５の長さが２ヌクレオチドであり、５’から３’に向かって、前記ヌクレオチド配列５が、連続した２個のデオキシシチジン一リン酸、連続した２個のウリジン一リン酸であり、又は、第３のヌクレオチド配列断片と相補的であり、前記第３のヌクレオチド配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおいて前記第１のヌクレオチド配列断片もしくは前記第２のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列５と等しいヌクレオチド配列を指す、請求項８９に記載の複合体。
【請求項９１】
前記センス鎖又はアンチセンス鎖の少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項８０〜８４、８６〜８８及び９０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９２】
前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、前記非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指し、ヌクレオチドアナログが、核酸におけるヌクレオチドを置換できる基であり、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドのいずれか１つとも異なる構造を有する、請求項９１に記載の複合体。
【請求項９３】
センス鎖及びアンチセンス鎖がいずれもフルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、前記フルオロ修飾ヌクレオチドがヌクレオチド配列１とヌクレオチド配列２に存在し、前記ヌクレオチド配列１におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項９２に記載の複合体。
【請求項９４】
５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列１の第７、８及び９位又は第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項９３に記載の複合体。
【請求項９５】
前記ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドが、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−置換アミノ修飾ヌクレオチド及び２’−デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）からなる群から選択され、前記ヌクレオチドアナログが、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される、請求項９２又は９４に記載の複合体。
【請求項９６】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドとは、前記ヌクレオチドにおいてリボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項９５に記載の複合体。
【請求項９７】
前記修飾基を有するリン酸エステル基が、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である、請求項９１に記載の複合体。
【請求項９８】
前記修飾基を有するリン酸エステル基が、式（２０１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である、請求項９７に記載の複合体：
【化１５】
2021509402.tif 000180
【請求項９９】
前記ｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステルが、
前記センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項９７に記載の複合体。
【請求項１００】
前記アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項９１、９２又は９７に記載の複合体。
【請求項１０１】
前記５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが、式（２０２）〜式（２０６）の１つに示されるヌクレオチドである、請求項１００に記載の複合体：
【化１６】
2021509402.tif 000181
ただし、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ及びメトキシ基からなる群から選択される基を表し、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ及びＴから選択される塩基を表す。
【請求項１０２】
前記５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが、式（２０２）、式（２０３）又は式（２０５）に示されるヌクレオチドである、請求項１０１に記載の複合体。
【請求項１０３】
請求項４３〜１０２のいずれか１項に記載の複合体の、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製への使用。
【請求項１０４】
前記特定の遺伝子が、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子及びアポリポタンパクＣ３遺伝子からなる群から選択される、請求項１０３に記載の使用。
【請求項１０５】
前記疾患が、慢性肝疾患、肝炎、肝線維化、肝過形成性疾患及び脂質異常からなる群から選択される、請求項１０３に記載の使用。
【請求項１０６】
前記脂質異常が高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項１０５に記載の使用。
【請求項１０７】
必要のある被験体において、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患を治療する方法であって、前記被験体に請求項４３〜１０２のいずれか１項に記載の複合体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１０８】
前記特定の遺伝子が、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子及びアポリポタンパクＣ３遺伝子からなる群から選択される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記疾患が、慢性肝疾患、肝炎、肝線維化、肝過形成性疾患及び脂質異常からなる群から選択される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記脂質異常が高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
請求項４３〜１０２のいずれか１項に記載の複合体を肝細胞と接触させることを含む、前記肝細胞における特定の遺伝子の発現の抑制方法。
【請求項１１２】
前記特定の遺伝子がＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ又はＨＣＶである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記特定の遺伝子が、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子及びアポリポタンパクＣ３遺伝子からなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
請求項４３〜１０２のいずれか１項に記載の複合体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、薬物の分野に関し、具体的には、活性薬物と複合体を形成することにより活性薬物を送達するための化合物及びその調製方法と使用に関する。本開示は、さらに当該化合物により形成された複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
低分子核酸薬物の開発では、送達系は、キー技術の一つである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そのうち、肝細胞に対する標的複合送達技術である低分子核酸送達系がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の１つの側面によれば、本開示は、式（３２１）に示される構造を有する化合物を提供する。
【０００５】
【化１】
2021509402.tif 000003
式中、
ｎ１は１〜３の整数であり、ｎ３は０〜４の整数であり、
各ｍ１、ｍ２及びｍ３は、それぞれ独立して２〜１０の整数であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基から選択され、
Ｒ４は、共有結合により活性薬物又は活性剤と結合できる基であり、
各Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか１つ又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し、
各Ｓ１は独立してＭ１であり、任意の活性ヒドロキシ基は、もしあれば、いずれもヒドロキシ保護基で保護され、
各Ｍ１が、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、各Ｌ１は独立してＡ１〜Ａ２６の基及びその任意の組合せからなる群から選択される。
【０００７】
【化２】
2021509402.tif 000004
式中、各ｊ１は独立して１〜２０の整数であり、
各ｊ２は独立して１〜２０の整数であり、
各Ｒ’は独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
各Ｒａは独立してＡ２７〜Ａ４５及びその任意の組合せからなる群から選択される。
【０００８】
【化３】
2021509402.tif 000005
各Ｒｂは独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
2021509402.tif 000006
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
【０００９】
本発明の１つの側面において、本開示は、式（１）に示される構造を有する複合体を提供する。
【００１０】
【化４】
2021509402.tif 000007
式中、
ｎ１は１〜３の整数であり、ｎ３は０〜４の整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３はそれぞれ独立して２〜１０の整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル又はＣ１−Ｃ１０アルコキシ基から選択され、
Ｒ３は活性薬物であり、
Ｒ２は、長さ１〜２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか１つ又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し、
各Ｌ１は独立して、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか１つ又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し、
各Ｍ１は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから選択される１つである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、各Ｌ１は、Ａ１〜Ａ２６の基及びその任意の組合せからなる群から独立して選択される。
【００１２】
【化５】
2021509402.tif 000008
式中、各ｊ１は独立して１〜２０の整数であり、
各ｊ２は独立して１〜２０の整数であり、
各Ｒ’は独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
各Ｒａは、独立して式Ａ２７〜Ａ４５の基及びその任意の組合せから選択される。
【００１３】
【化６】
2021509402.tif 000009
各Ｒｂは独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
2021509402.tif 000010
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
【００１４】
本発明の１つの側面において、本明細書は、本明細書で開示された複合体の、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
【００１５】
本発明の１つの側面において、本明細書は、被験体に本明細書で開示された複合体の有効量を投与することを含む、必要のある被験体において、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理状態又は疾患を治療する方法を提供する。
【００１６】
本発明の１つの側面において、本明細書は、本明細書で開示された複合体と接触させることを含む、肝細胞における特定の遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
【００１７】
本発明の１つの側面において、本明細書は、本明細書で開示された複合体を含むキットを提供する。
【００１８】
本開示の他の特徴と利点については、以下の文章において詳しく説明する。
【００１９】
［引用による組み込み］
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許又は特許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
添付の請求項では、本発明の新規な特徴を詳しく説明しており、本発明の特徴と利点については、説明的な実施形態について述べた以下の詳しい記載及び図面によって、よりよく理解されるであろう。これらの説明的な実施形態は、本発明の原理を利用するものである。
【図１Ａ−１Ｂ】ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソーム（Ｔｒｉｔｏｓｏｍｅ）における安定性試験の半定量的結果を示す。
【図２Ａ−２Ｂ】試験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのヒト血漿における安定性試験の半定量的結果を示す。
【図３Ａ−３Ｂ】試験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのサル血漿における安定性試験の半定量的結果を示す。
【図４−１１】１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラット血漿における複合体２４（図４）、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体２４（図５）、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラット血漿における複合体２４（図６）、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体２４（図７）、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラット血漿における複合体２５（図８）、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体２５（図９）、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラット血漿における複合体２５（図１０）、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ラットの肝臓と腎臓における複合体２５（図１１）、のＰＫ／ＴＫ血漿濃度又は組織濃度の経時的代謝曲線を示す。
【図１２Ａ−１２Ｄ】複合体２４がＧＳＣＭの発現を抑制するＩＣ５０値の測定を示し、それぞれＧＳＳＭ、ＰＳＣＭ及びＰＳＳＭと比較する。
【図１３−１５】本開示の複合体による体内でのＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図１６】本開示の複合体によるＨＢＶトランスジェニックマウスの血清中のＨＢｓＡｇ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図１７】本開示の複合体によるＨＢＶトランスジェニックマウスの血清中のＨＢＶ  ＤＮＡ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図１８】本開示の複合体２５によるＨＢＶトランスジェニックマウスの血清中のＨＢｓＡｇ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図１９】本開示の複合体によるＭ−ＴｇモデルにおけるＨＢｓＡｇ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図２０】本開示の複合体によるＭ−ＴｇモデルにおけるＨＢｓＡｇ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図２１】本開示の複合体による１．２８ｃｏｐｙのＨＢＶ−ＴｇモデルにおけるＨＢｓＡｇ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図２２−２４】本開示の複合体による標的ｍＲＮＡとオフターゲットｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図２５−２７】本開示の複合体による体内でのＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制作用を示す。
【図２８】本開示の複合体によるＨＢＶトランスジェニックマウスの血清中のＨＢｓＡｇ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図２９】本開示の複合体によるＨＢＶトランスジェニックマウスの血清中のＨＢｓＡｇ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図３０】８５日目における本開示の複合体によるＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する体内抑制作用を示す。
【図３１】複合体４３によるＨＢＶトランスジェニックマウスの血清中のＨＢｓＡｇ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図３２】複合体４３によるＨＢＶトランスジェニックマウスの血清中のＨＢＶ  ＤＮＡ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図３３−３４】複合体１６７のヒト由来とマウス由来のリソソーム溶解液における安定性を示す。
【図３５】複合体１６８による１．２８ｃｏｐｙのＨＢＶ−ＴｇモデルにおけるＨＢｓＡｇ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図３６】複合体１６８による１．２８ｃｏｐｙのＨＢＶ−ＴｇモデルにおけるＨＢｅＡｇ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図３７】複合体１６８による１．２８ｃｏｐｙのＨＢＶ−ＴｇモデルにおけるＨＢＶ  ＤＮＡ発現に対する経時的な抑制作用を示す。
【図３８Ａ−３８Ｂ】１４日目及び２８日目のＡＮＧＰＴＬ  ｍＲＮＡ発現の抑制率を示す。
【図３９Ａ−３９Ｂ】本開示の複合体による脂質に対する抑制率を示し、血清中の総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図４０Ａ−４０Ｂ】複合体１１５による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図４１Ａ−４１Ｂ】複合体１１５及び１１１による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図４２Ａ−４２Ｄ】異なる用量で複合体１１１による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図４３Ａ−４３Ｂ】複合体２５及び１６９による脂質に対する経時的な抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図４３Ｃ】ＡＮＧＰＴＬ  ｍＲＮＡ発現の抑制率を示す。
【図４４Ａ】１４日目の、肝臓におけるＡＰＯＣ３発現の抑制率を示す
【図４４Ｂ−４４Ｃ】異なる用量の複合体１４４による脂質に対する抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図４５Ａ−４５Ｂ】異なる用量の複合体１７０による脂質に対する抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【図４６Ａ−４６Ｄ】本開示の複合体による脂質に対する抑制率を示し、血清総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）で表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に本開示の発明を実施するための形態を詳しく説明する。また、ここで説明される発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、いかなる点でも本開示を限定することを意図しない。
【００２２】
（定義）
本開示の文脈において、特に説明がない限り、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ及びＡは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、特に、ビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＶＰで表される）、５’−リン酸ヌクレオチド（以下の実施例においてＰで表される）又は５’−チオリン酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＰｓで表される）を指している。
【００２３】
本開示の文脈において、説明される「相補」又は「逆相補」は、互換的に使用されてもよく、本分野において周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基のそれぞれと他方の鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。ＤＮＡにおいて、プリン塩基であるアデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）（又は、ＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）である）と対合し、プリン塩基であるグアニン（Ｇ）は、常にピリミジン塩基であるシトシン（Ｃ）と対合する。各塩基対は、いずれも１つのプリンと１つのピリミジンを含む。鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン（又はウラシル）と対合するとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖が相補的であり、鎖の塩基配列がその相補鎖の配列から推知できると考えられる。これに応じて、「ミスマッチ」は、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合して存在しないことを意味する。
【００２４】
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「基本的に逆相補的である」とは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「基本的に完全に逆相補的である」とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「完全に逆相補的である」とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチが存在しないことを指す。
【００２５】
本開示の文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列との間の「ヌクレオチド差異」とは、ヌクレオチド配列間に同じ位置のヌクレオチドの塩基が変化したことを指し、例えば、第２の配列においてヌクレオチド塩基がＡであり、第１の配列の同じ位置での塩基がＵ、Ｃ、Ｇ又はＴである場合に、当該位置で２つの配列間にヌクレオチド差異が存在すると考えられる。いくつかの実施形態において、ある位置のヌクレオチドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを用いる場合、当該位置でヌクレオチド差異が存在するとも考えられる。
【００２６】
本開示の文脈において、特に本開示に記載された複合分子又はｓｉＲＮＡ複合体の調製方法を説明する際に、特に説明がない限り、ヌクレオシドモノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｏｎｏｍｅｒ）とは、調製するＲＮＡ配列に応じて、前記「未修飾又は修飾ＲＮＡホスホルアミダイト（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）」がそれぞれいわれる固相ホスホルアミダイト合成に用いられることを指す。固相ホスホルアミダイト合成は、本分野においてＲＮＡを合成する周知の方法である。本開示の他の場所で、ＲＮＡホスホルアミダイトは、ヌクレオシドホスホルアミダイト（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）とも呼ばれる。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品として購入可能である。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、２つの文字間又は記号間のものでないダッシュ（「−」）は、置換基の結合点を示すために用いられている。例えば、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基により結合する。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「任意の」又は「任意に」とは、続いて記載する事象又は状況が発生してもよく、発生しなくてもよいこと、並びに当該記載が事象又は状況が発生した場合と発生しない場合を含むことを指す。例えば、「任意に置換されたアルキル」は、以下の文章で定義される「アルキル」及び「置換アルキル」を含む。１又は複数の置換基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及び／又は本質的に不安定ないかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されないと、当業者に理解される。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「アルキル」とは、特定の数の炭素原子を有する直鎖と分岐鎖を指し、前記特定の数は、通常１〜２０個の炭素原子、例えば、１〜１０個の炭素原子、１〜８個又は１〜６個の炭素原子である。例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキルは、１〜６個の炭素原子の直鎖と分岐鎖アルキルを含む。特定の数の炭素を有するアルキル残基を言及する場合、当該数の炭素を有する全ての分岐鎖及び直鎖形式を含むことを意図する。したがって、例えば、「ブチル」は、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、ｎ−プロピル及びイソプロピルを含む。アルキレンは、アルキルのサブセットであり、アルキルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素−炭素二重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から１分子の水素を除去することにより得られる。当該基は、二重結合がシス又はトランス配置であってもよい。典型的なアルケニルとしては、ビニルと、プロパ−１−エン−１−イル、プロパ−１−エン−２−イル、プロパ−２−エン−１−イル（アリル）、プロパ−２−エン−２−イル等のプロペニルと、ブタ−１−エン−１−イル、ブタ−１−エン−２−イル、２−メチルプロパ−１−エン−１−イル、ブタ−２−エン−１−イル、ブタ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル等のブテニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルケニルは、２〜２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態においては、２〜１０個、２〜８個又は２〜６個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニルのサブセットであり、アルケニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキル基を指し、前記炭素−炭素三重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から２分子の水素を除去することにより得られる。典型的なアルキニルとしては、エチニルと、プロパ−１−イン−１−イル、プロパ−２−イン−１−イル等のプロピニルと、ブタ−１−イン−１−イル、ブタ−１−イン−３−イル、ブタ−３−イン−１−イル等のブチニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルキニルは、２〜２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態においては、２〜１０、２〜８又は２〜６個の炭素原子を有する。アルキニレンは、アルキニルのサブセットであり、アルキニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、酸素橋により結合した特定の数の炭素原子のアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、２−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２−ヘキシルオキシ、３−ヘキシルオキシ、３−メチルペンチルオキシ等がある。アルコキシは、通常１〜１０個、１〜８個、１〜６個又は１〜４個の、酸素橋により結合した炭素原子を有する。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、「アリール」とは、環炭素原子から水素原子を除去することにより芳香族単環式又は多環式炭化水素環系から誘導される基を指す。前記芳香族単環式又は多環式炭化水素環系は、水素及び６〜１８個の炭素原子の炭素のみを含有し、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状、非局在化（４ｎ＋２）π−電子系を含む。アリールとしては、フェニル、フルオレニル及びナフチル等の基を含むが、これらに限定されない。アリーレンは、アリールのサブセットであり、アリールと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「シクロアルキル」とは、通常３〜７個の環炭素原子を有する非芳香族炭素環を指す。環は、飽和であってもよいし、１又は複数の炭素−炭素二重結合を有してもよい。シクロアルキルの実例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル及びシクロヘキセニル、並びにノルボルナン（ｎｏｒｂｏｒｎａｎｅ）等の架橋及びカゴ状環状基を含む。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン置換基」又は「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを指し、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を含む。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン化アルキル」とは、特定の数の炭素原子が１又は複数、最大許容数までのハロゲン原子で置換された、上記のように定義されるアルキル基を指す。ハロゲン化アルキルの実例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２−フルオロエチル及びペンタフルオロエチルを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
「複素環基」とは、２〜１２個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜６個のヘテロ原子とを含む、安定した３〜１８員非芳香族環状基を指す。明細書において特に説明がない限り、複素環基は、単環、二環、三環又は四環系であり、縮合環又は架橋環系を含んでもよい。複素環基におけるヘテロ原子は、任意に酸化されてもよい。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。複素環基は、一部飽和又は完全飽和である。複素環基は、環の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。このような複素環基の実例としては、ジオキサニル、チオフェニル［１，３］ジスルホニル（ｔｈｉｅｎｙｌ［１，３］ｄｉｔｈｉａｎｙｌ）、デカヒドロイソキノリニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドール、オクタヒドロイソインドール、２−オキサピペラジニル、２−オキサピペリジル、２−オキサピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリスルホニル（ｔｒｉｔｈｉａｎｙｌ）、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１−オキソチオモルホリニル及び１，１−ジオキソチオモルホリニルを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
「ヘテロアリール」とは、２個〜１７個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜６個のヘテロ原子とを含む、３〜１８員芳香族環ラジカルから誘導される基を指す。本明細書で用いられる場合、ヘテロアリールは、単環、二環、三環又は四環系であってもよく、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状非局在化（４ｎ＋２）π−電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合環又は架橋環系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子は任意に酸化される。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。ヘテロアリールは、環中の任意の原子により分子の残りの部分に結合する。ヘテロアリールの実例としては、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドール、１，３−ベンゾジオキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル（ｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｄｉｏｘｅｐｉｎｙｌ）、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジニル、１，４−ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｙｌ）、ベンゾジジオキシニル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎｙｌ）、ベンゾピラニル、ベンゾピロニル、ベンゾフリル、ベンゾフラノニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、カルバゾリル、シンノリル、シクロペンタ［ｄ］ピリミジニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］シンノリル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２−ｃ］ピリダジニル、ジベンゾフリル、ジベンゾチオフェニル、フリル、フラノニル、フロ［３，２−ｃ］ピリジル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル、インドール、インダゾリル、イソインドール、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、５，８−メタノール−５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、ナフチリジニル、１，６−ナフチリジノニル、オキサジアゾリル、２−オキサアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−オクタヒドロベンゾ［Ｈ］キナゾリニル、１−フェニル−１Ｈ−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピリジル、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、５，６，７���８−テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８−テトラヒドロピリド［４，５−ｃ］ピリダジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、チエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３−ｃ］ピリジル及びチオフェニル（即ち、チエニル）を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本開示において各種のヒドロキシ保護基を用いることができる。一般的には、保護基は、化学官能基を特定の反応条件に不敏感にすることができ、且つ分子の残りの部分を実質的に損傷することなく分子中の当該官能基に付加する、及びそれから除去することができる。代表的なヒドロキシ保護基は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２，４８，２２２３〜２３１１、及びＧｒｅｅｎｅとＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第二版、第二章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１に開示されており、それらは、それぞれ引用により全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去されることができる。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）「９−ｐｈｅｎｙｌｘａｎｔｈｅｎ−９−ｙｌ（Ｐｉｘｙｌ）」及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｍｏｘ）「９−（ｐ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｘａｎｔｈｅｎ−９−ｙｌ（Ｍｏｘ）」を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、Ｔｒ（トリチル）、ＭＭＴｒ（４−メトキシトリチル）、ＤＭＴｒ（４，４’−ジメトキシトリチル）及びＴＭＴｒ（４，４’，４’’−トリメトキシトリチル）を含む。
【００４０】
「被験体」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋動物を指す。本発明の被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル又は他の種類のマカク属のサル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、「治療」、「軽減」又は「改善」は、ここで互換的に使用されてもよい。これらの用語は、有益な又は所望の結果を得る方法を指し、治療効果を含むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根絶又は改善することを意味する。また、治療効果は、患者が依然として潜在的障害の苦痛を受ける可能性があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する１又は複数の生理的症状を根絶又は改善することにより、患者に改善が観察されて得られる。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、「防止」と「予防」は互換的に使用されてもよい。これらの用語は、有益又は所望の結果を得る方法を指し、予防効果を含むが、これに限定されない。「予防効果」を得るために、当該疾患に対する診断が行っていないかもしれないが、複合体又は組成物を特定の疾患に罹患するリスクのある患者に投与し、又は疾患の１又は複数の生理的症状が報告された被験体に投与することができる。
【００４３】
＜複合分子＞
１つの側面において、本明細書には、活性剤又は活性薬物を送達するための複合分子が開示されている。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、組織特異的標的に用いられる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、細胞表面の受容体と結合する。この目的のために、いかなる細胞表面の受容体又はバイオマーカー又はその一部も、適切であると考えられる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、特定の組織に特有の受容体に特異的に結合し、組織特異的標的を実現する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、肝細胞表面の受容体を特異的に標的し、肝組織を特異的に標的する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、肝細胞に特有の細胞表面の受容体を特異的に標的する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合分子は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＡＳＧＰＲ）を特異的に標的する。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、「活性剤」及び「活性薬物」は互換的に使用されてもよく、いずれも本明細書で開示された複合分子により送達されることができる分子を指す。いくつかの実施形態において、活性剤は、肝細胞に送達されることが望まれる試薬である。これらの試薬は、当業者によく知られており、機能性ヌクレオチド、例えば、機能性オリゴヌクレオチド、特に本明細書で開示されたものを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本開示は、式（３２１）に示される構造を有する複合分子を提供する。
【００４６】
【化７】
2021509402.tif 000011
式中、
ｎ１は１〜３の整数であり、ｎ３は０〜４の整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３はそれぞれ独立して２〜１０の整数であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基から選択され、
Ｒ４が、共有結合により活性薬物又は活性剤と結合できる基であり、
各Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し、
各Ｓ１は独立してＭ１であり、任意の活性ヒドロキシ基は、もしあれば、いずれもヒドロキシ保護基で保護され、
各Ｍ１は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ｎ１は、１〜３の整数であってもよく、ｎ３は、０〜４の整数であってもよく、前記複合分子において少なくとも２つのＳ１基が存在することを確保する。いくつかの実施形態において、ｎ１＋ｎ３≧２であり、これにより、当該複合分子により形成された複合体において、Ｍ１リガンドの個数が少なくとも３個であり、Ｍ１リガンドと肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、細胞内取込み作用により複合体が細胞に取り込まれることを促進することができる。実験から分かるように、Ｍ１リガンドの個数が３個以上である場合、Ｍ１リガンドと肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容易さ、構造／プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの実施形態において、ｎ１は１〜２の整数であり、ｎ３は０〜１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２〜３である。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、それぞれ独立して２〜１０の整数から選択される場合、当該複合分子により形成された複合体において、複数のＭ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に適合させることができると考えられる。本開示により提供される複合分子をより簡略化し、より合成しやすく、及び／又はコストを低下させるために、本開示のいくつかの実施形態によれば、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、それぞれ独立して２〜５の整数であり、１つの実施形態において、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である。
【００４９】
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシから選択される場合、本開示により提供される複合分子の性質を変化させることなく、いずれも本開示の目的を実現することができることは、当業者に理解され得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立してＨ、メチル基又はエチル基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、いずれもＨである。
【００５０】
Ｒ４は、本開示の複合分子により送達される活性剤に結合できる基である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、待本開示の複合分子により送達されるオリゴヌクレオチドに結合できる基である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、共有結合によりオリゴヌクレオチドに結合することができる基である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、リン酸ジエステル結合によりオリゴヌクレオチドに結合することができる基である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、窒素含有骨格上のＮ原子との結合を実現し、オリゴヌクレオチド複合体の合成に適切な反応部位を提供するために選択される。本開示の文脈において、「窒素含有骨格」とは、鎖構造を指し、結合されるＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５の炭素原子とＮ原子が互いに結合されている。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、適当な方法で窒素含有骨格上のＮ原子に結合されることができる基であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ４には、窒素含有骨格上のＮ原子に結合される部位及び反応させてリン酸ジエステル結合によりオリゴヌクレオチドに複合されることができる任意の官能基が含まれる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、オリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチド上の基と反応してリン酸エステル結合を形成することができる第１の官能基、及びヒドロキシ基もしくはアミノ基と共有結合を形成することができる第２の官能基を含み、又は、前記共有結合により結合された固相担体を含む。いくつかの実施形態において、第１の官能基は、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である。いくつかの実施形態において、第２の官能基は、ホスホルアミダイト、カルボキシ基又はカルボン酸塩である。いくつかの実施形態において、第２の官能基は、ヒドロキシ基又はアミノ基により形成された共有結合を介して分子の他の部分に結合される固相担体である。いくつかの実施形態において、前記固相担体は、リン酸エステル結合、カルボン酸エステル結合又はアミド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は樹脂である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基、−ＯＲｋ又は式（Ｃ３）に示される基を含み、及び／又は前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される基を含む。
【００５３】
【化８】
2021509402.tif 000012
式中、ｑ１は１〜４の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
2021509402.tif 000013
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
【００５４】
いくつかの実施形態において、第１の官能基は、ホスホルアミダイト官能基、例えば、式（Ｃ３）に示される基を含み、当該ホスホルアミダイト官能基は、ヌクレオチド上の任意位置のヒドロキシ基、例えば、２’位のヒドロキシ基又は３’位のヒドロキシ基とカップリングし、酸化を介してリン酸ジエステル結合を形成し、複合分子をオリゴヌクレオチドに複合させることができる。したがって、第２の官能基が存在しなくても、本明細書で開示された複合分子は、ヌクレオチドに複合されることができる。この場合に、複合分子は、ヌクレオチド配列における末端ヌクレオチド上のヒドロキシ基と反応することに適しており、後の酸化過程においてリン酸ジエステル結合を形成することによって、本開示の複合分子をオリゴヌクレオチドに複合する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、保護されたヒドロキシ基を含む。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、固相担体と反応性のある基を含み、固相担体を含む複合分子を提供する。いくつかの実施形態において、第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）又は（Ｃ３）に示されるように、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホスホルアミダイトを含む。カルボキシ基又はカルボン酸塩は、固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基又はアミノ基とエステル化反応又はアミド化反応し、カルボン酸エステル結合により結合される固相担体又はアミド結合により結合される固相担体を含む複合分子を形成することができる。ホスホルアミダイトは、汎用の固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基とカップリング反応し、後の酸化を介してリン酸ジエステル結合により結合される固相担体を形成することができる。これにより、本発明の１つの側面によれば、このような複合分子により本開示の複合体を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、まず、複合分子と固相担体を縮合又はカップリング反応によって結合し、その後、固相ホスホルアミダイト合成方法によりヌクレオシドモノマーを加え、オリゴヌクレオチドに複合される本開示の複合分子を含む本開示の複合体を得ることを含む。いくつかの実施形態において、ホスホルアミダイト固相合成過程において、第１の官能基は、脱保護され、その後、カップリング反応条件でヌクレオシド上のホスホルアミダイト基とカップリングする。
【００５６】
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、ヒドロキシ基もしくは保護されたヒドロキシ基を含む第１の官能基、及びカルボン酸エステル結合、アミド結合もしくはリン酸ジエステル結合、又はカルボン酸エステル結合、アミド結合もしくはリン酸ジエステル結合により結合された固相担体を含む第２の官能基を含む。いくつかの実施形態において、第２の官能基は、式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される基である。いくつかの実施形態において、第２の官能基が固相担体を含む場合、前記固相担体を含む複合分子は、本開示の複合体の調製に用いられる。したがって、本発明の１つの側面において、前記複合分子により本開示の複合体を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、固相担体を含む複合分子とヌクレオシドモノマーをホスホルアミダイト固相合成方法に従い反応させ、本開示の複合分子をオリゴヌクレオチドに複合することを含む。いくつかの実施形態において、前記固相担体を含む複合分子は、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホスホルアミダイトを有する複合分子と固相担体とを反応させて内部で得ることができる。いくつかの実施形態において、複合分子は、供給者により提供されてもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、−ＣＯＯ−Ｍ＋で表されてもよく、ここで、Ｍ＋は、カチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンＮＨ４＋又は有機アンモニウムカチオンから選択される。いくつかの実施形態において、前記金属イオンは、アルカリ金属イオン、例えば、Ｋ＋又はＮａ＋であってもよい。溶解性を向上させ、反応をスムーズに行う考慮から、いくつかの実施形態において、有機アンモニウムカチオンは、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン又は第４級アンモニウムカチオン、例えば、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムカチオンである。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、トリエチルアミンカルボン酸塩又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である。
【００５８】
本開示のいくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ９’）、（Ｂ１０’）、（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ１１’）又は（Ｂ１２’）に示される基である。
【００５９】
【化９】
2021509402.tif 000014
式中、ｑ１は１〜４の整数であり、ｑ２は１〜１０の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。いくつかの実施形態において、ｑ１は１又は２である。いくつかの実施形態において、ｑ２は１〜５の整数である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）又は（Ｂ１０）に示される基を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ１１）又は（Ｂ１２）に示される基を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、Ｒｋは、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４−メトキシトリチル基）、ＤＭＴｒ（４，４’−ジメトキシトリチル基）、ＴＭＴｒ（４，４’，４’−トリメトキシトリチル基）の１又は複数である。いくつかの実施形態において、ＲｋはＤＭＴｒである。
【００６１】
Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有する。便宜上、Ｌ１は、線形アルキレン基として定義されるが、例えば上述の取替及び／又は置換によって生じるアミンやアルケニル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。本開示の目的のために、Ｌ１の長さは、２つの結合点を結合する鎖における原子数である。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環（例えば、ヘテロシクリレン又はヘテロアリーレン）を、１個の原子とする。
【００６２】
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ｍ１リガンド（又は対応するＳ１基）と窒素含有骨格上のＮ原子を結合し、本開示の複合体に肝標的機能を提供するという役割を果たす。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、式Ａ１〜Ａ２６の基のいずれか１つ又はその任意の組合せから選択される。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１及びＡ１３のいずれか１つ又は任意の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１の少なくとも２つの組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ８、Ａ１０の少なくとも２つの組合せである。
【００６３】
いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３〜２５、３〜２０、４〜１５又は５〜１２個の原子であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０個の原子である。本開示に係るいくつかの実施形態において、ｊ１は２〜１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ１は３〜５の整数である。いくつかの実施形態において、ｊ２は２〜１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ２は３〜５の整数である。Ｒ’はＣ１−Ｃ４アルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つである。Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、いくつかの実施形態において、Ｒａは、Ａ２７又はＡ２８である。Ｒｂは、Ｃ１−Ｃ５アルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである。いくつかの実施形態において、それぞれ式Ａ１〜Ａ２６におけるｊ１、ｊ２、Ｒ’、Ｒａ、Ｒｂを選択することにより、複合分子により形成されたオリゴヌクレオチド複合体において、Ｍ１リガンドと窒素含有骨格上のＮ原子との結合を実現し、Ｍ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合により適合させる。
【００６４】
各Ｍ１は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭ１は、肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭ１は、哺乳動物の細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭ１は、ヒト肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭ１は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合できるリガンドである。
【００６５】
いくつかの実施形態において、Ｍ１は、哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対して親和力を有する可能性があるいずれか１つのリガンドであり、これらのリガンドの種類は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭ１は糖である。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は糖である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭ１は、単糖、二糖、三糖又は多糖である。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は、単糖、二糖、三糖又は多糖である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭ１は修飾糖である。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は修飾糖である。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は、独立して多糖、修飾多糖、単糖又は単糖誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、Ｍ１のそれぞれ又は少なくとも１つは、独立してグルコース及びその誘導体、マンノース及びその誘導体、ガラクトース及びその誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその誘導体、フコース及びその誘導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導体、アラビノース及びその誘導体、フルクトース及びその誘導体並びにシアル酸からなる群から選択されることが可能である。
【００６６】
いくつかの実施形態において、Ｍ１のそれぞれ又は少なくとも１つは、独立してＤ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロノニトリル（２，５−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｄ−ａｌｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース、Ｌ−４−チオリボースから選択されることが可能である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＭ１はＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は、いずれもＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。リガンドの選択については、例えば、ＣＮ１０５３７８０８２Ａの開示内容を参照してもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【００６７】
ＣＮ１０５３７８０８２Ａには、修飾オリゴヌクレオチド及び複合基を含む化合物が開示されており、前記複合基は、少なくとも１つのリン結合基又は中性結合基及び１又は複数のリガンドを含む。各リガンドは、多糖、修飾多糖、マンノース、ガラクトース、マンノース誘導体、ガラクトース誘導体、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、α−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロノニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース又はＬ−４−チオリボースから選択される。当該化合物は、細胞における核酸転写物の量又は活性を低下させることができるといわれている。
【００６８】
ＷＯ２０１６０７７３２１Ａ１には、ＨＢＶ遺伝子を特異的に標的する多くのｓｉＲＮＡ及びその送達方法が開示されており、ｓｉＲＮＡのヌクレオチドを修飾することにより、ｓｉＲＮＡの血清安定性を向上させる。当該文献には、ｓｉＲＮＡ複合体がさらに開示されており、さらには、複数種のｓｉＲＮＡ複合体が具体的に開示されている。
【００６９】
ＷＯ２０１６１６８２８６Ａ１には、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を特異的に標的する多くのｓｉＲＮＡ及びその送達方法が開示されており、ｓｉＲＮＡのヌクレオチドを修飾することにより、ｓｉＲＮＡの血清安定性を向上させる。当該文献には、ｓｉＲＮＡ複合体がさらに開示されている。
【００７０】
Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌｇａｃｔｏｓａｍｉｎｅ、ＧａｌＮＡｃ）は、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体と結合するリガンドである。アシアロ糖タンパク質受容体（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＡＳＧＰＲ）は、肝細胞により特異的に発現される細胞内取込み型受容体である。近年、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）は、標的分子として用いられ、低分子ＲＮＡを肝臓に送達する。例えば、アルナイラム社（Ａｌｎｙｌａｍ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）は、ＧａｌＮＡｃ複合技術に基づくｓｉＲＮＡが、マウス体内で干渉活性を発揮することをはじめて報告した（Ｎａｉｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１４，１３６，１６９５８−１６９６１）。文章には、３つのクラスターのＧａｌＮＡｃに複合されるｓｉＲＮＡが、体内及び体外実験においていずれも良好な送達活性を示すことが報告された。皮下投与するマウス体内実験から、単回用量のＥＤ５０が１ｍｇ／ｋｇであり、単回注射用量が１ｍｌ以下であることが確認された。長期間投与実験において、１週間に１回皮下注射することにより、９ヶ月と長い安定した干渉活性を得ることができる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、Ｓ１は、独立してＭ１である。いくつかの実施形態において、Ｓ１は、独立してＭ１において少なくとも１つの活性ヒドロキシ基がヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、Ｓ１は、独立してＭ１における活性ヒドロキシ基（存在する場合）が全てヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、当業者によく知られているいかなるヒドロキシ保護基も、Ｍ１における活性ヒドロキシ基を保護するために用いることができる。いくつかの実施形態において、保護されたヒドロキシ基は、式ＹＣＯＯ−で表され、各Ｙは、独立してＣ１−Ｃ１０アルキル及びＣ６−Ｃ１０アリールからなる群から選択され、ハロゲン置換基及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択される１又は複数の置換基で任意に置換されてもよい。いくつかの実施形態において、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、モノクロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びＣ１−Ｃ６アルキルフェニル基からなる群から独立して選択される。
【００７２】
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、それぞれ独立して式Ａ４６〜Ａ５４の基からなる群から選択される。
【００７３】
【化１０】
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【００７４】
いくつかの実施形態において、Ｓ１は式Ａ４９又はＡ５０である。
【００７５】
いくつかの実施形態において、各Ｙは、独立してメチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、モノクロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基の１つである。本開示の複合分子を簡略化する目的で、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本開示の複合分子は、式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する。
【００７７】
【化１１】
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【００７８】
以上の式（４０３）〜（４２２）中、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、Ｍ＋は、金属カチオン、アンモニウムカチオン、第３級アミンにより形成されたカチオン又は第４級アンモニウムカチオンの１つである。いくつかの実施形態において、Ｍ＋は、
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である。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本開示の複合分子は、式（４２３）、（４２４）、（４２５）、（４２６）、（４２７）、（４２８）、（４２９）、（４３０）、（４３１）、（４３２）、（４３３）、（４３４）、（４３５）、（４３６）、（４３７）、（４３８）、（４３９）、（４４０）、（４４１）又は（４４２）に示される構造を有してもよい。
【００８０】
【化１２】
2021509402.tif 000023
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【００８１】
以上の式（４２３）〜（４４２）中、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表す。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本開示の複合分子は、式（５０３）、（５０４）、（５０５）、（５０６）、（５０７）、（５０８）、（５０９）、（５１０）、（５１１）、（５１２）、（５１３）、（５１４）、（５１５）、（５１６）、（５１７）、（５１８）、（５１９）、（５２０）、（５２１）又は（５２２）に示される構造を有する。
【００８３】
【化１３】
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【００８４】
以上の式（５０３）〜（５２２）中、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチルを表し、構造
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は、対応するカルボン酸とトリエチルアミンにより形成された塩を表す。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本開示の複合分子は、式（５２３）、（５２４）、（５２５）、（５２６）、（５２７）、（５２８）、（５２９）、（５３０）、（５３１）、（５３２）、（５３３）、（５３４）、（５３５）、（５３６）、（５３７）、（５３８）、（５３９）、（５４０）、（５４１）又は（５４２）に示される構造を有してもよい。
【００８６】
【化１４】
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【００８７】
以上の式（５２３）〜（５４２）中、ＳＰＳは固相担体を表し、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチルを表す。
【００８８】
＜本開示の複合分子の調製＞
当業者は、任意の合理的な合成経路により本開示の複合分子を調製してもよい。
【００８９】
本開示のいくつかの実施形態において、式（３２１）に示される複合分子の調製方法は、有機溶剤において、エステル化反応条件で、アルカリとエステル化触媒の存在下で、式（３１３）に示される化合物を環状酸無水物と接触させ、イオン交換を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む。
【００９０】
【化１５】
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式中、
Ｒ６は、式（３２１）におけるＲ４を提供する基である。いくつかの実施形態において、例えば、Ｒ６は、式（Ａ６１）に示される構造を有する。
【００９１】
【化１６】
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（Ａ６１）
【００９２】
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。Ｒｉは、窒素含有骨格上のＮ原子と結合し、ＲｋＯと結合して遊離ヒドロキシ基が結合できる任意の基であり、Ｒｋはヒドロキシ保護基である。この場合、Ｒ４に第１の官能基であるヒドロキシ保護基及び第２の官能基である式（Ｃ１）又は（Ｃ２）に示される基が含まれる、式（３２１）の化合物が得られる。いくつかの実施形態において、Ｒ６はＢ７又はＢ８である。
【００９３】
【化１７】
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式中、ｑ２及びＲｋそれぞれの定義は、前述したとおりである。
【００９４】
前記エステル化反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が８〜４８時間であることを含み、１つの実施形態において、前記エステル化反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が２０〜３０時間であることを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種を含む。いくつかの実施形態において、前記エポキシ溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランである。いくつかの実施形態において、前記エーテル溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。前記式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【００９６】
いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物は、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の１つであり、いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物はコハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１〜５：１である。
【００９７】
前記エステル化触媒は、当該エステル化反応を触媒する任意の触媒であってもよく、例えば、当該触媒は、４−ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１〜５：１である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、前記塩基は、任意の無機塩基、有機塩基又はこれらの組合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、塩基は第３級アミンである。いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミンと式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜２０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１〜１０：１である。
【００９９】
前記イオン交換作用は、式（３２１）の化合物を所望のカルボン酸又はカルボン酸塩の形式に変換するためのものであり、イオン交換方法は、当業者に公知であり、適切なイオン交換溶液と交換条件を用い、Ｍ＋カチオンを有する複合分子を得ることができる。いくつかの実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエチルアミンリン酸塩溶液を用いて行われる。いくつかの実施形態において、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度が０．２〜０．８Ｍであり、いくつかの実施形態において、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度が０．４〜０．６Ｍである。いくつかの実施形態において、式（３１３）の化合物に対して、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の用量が３〜６Ｌ／ｍｏｌであり、他のいくつかの実施形態において、４〜５Ｌ／ｍｏｌである。
【０１００】
任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３２１）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出する、又は、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、縮合反応条件で、有機溶剤において、縮合剤、縮合触媒及び第３級アミンの存在下で、上記イオン交換生成物をアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させることをさらに含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基であるヒドロキシ保護基及び第２の官能基である式（Ｃ１’）に示される基が含まれる式（３２１）の化合物が得られる。
【０１０２】
前記固相担体は、ｓｉＲＮＡの固相合成に用いられる担体の１つであり、そのうちのいくつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキシ基又はアミノ官能基を含む固相担体から選択されてもよく、いくつかの実施形態において、前記固相担体は、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。いくつかの実施形態において、前記アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂は、粒子径１００〜４００メッシュ（ｍｅｓｈ）、表面におけるアミノ基又はヒドロキシ基の担持量０．２〜０．５ｍｍｏｌ／ｇというパラメーターを有する。式（３２１）に示される化合物と固相担体との比が１０〜４００μｍｏｌ化合物／グラムの固相担体（μｍｏｌ／ｇ）である。いくつかの実施形態において、前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との比が５０〜２００μｍｏｌ／ｇである。
【０１０３】
前記有機溶剤は、当業者に既知の任意の適切な溶剤又は混合溶剤であってもよい。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記エポキシ溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３１３）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が２０〜２００Ｌ／ｍｏｌであり、１つの実施形態において、５０〜１００Ｌ／ｍｏｌである。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾトリアゾール４（３Ｈ）−オン及び／又はＯ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであってもよい。いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートである。前記縮合剤と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜２０：１であり、他の実施形態において１：１〜５：１である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン及び／又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、前記第３級アミンと式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜２０：１であり、いくつかの実施形態において、１：１〜５：１である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、得られた縮合反応生成物をキャッピング反応条件で、有機溶剤において、キャッピング試薬及びアシル化触媒と接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることをさらに含む。前記キャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避けるために、まだ反応していないすべての活性官能基を除去することである。前記キャッピング反応の条件としては、反応温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が１〜１０ｈであり、いくつかの実施形態において、３〜６ｈである。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、ｓｉＲＮＡ固相合成に用いられるキャッピング試薬であってもよい。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬Ａ（ｃａｐＡ）及びキャッピング試薬Ｂ（ｃａｐＢ）からなる。キャッピング試薬Ａは、Ｎ−メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、Ｎ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が１：１０〜１：１である。いくつかの実施形態において、１：３〜１：１である。いくつかの実施形態において、ピリジンとアセトニトリルの総体積とＮ−メチルイミダゾールとの体積比が１：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１〜７：１である。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬Ｂは、酢酸無水物であり、いくつかの実施形態において、キャッピング試薬Ｂは、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積比が１：１〜１：１０であり、他のいくつかの実施形態において１：２〜１：６である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、前記Ｎ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液の体積と式（３１３）の化合物の質量との比が５ｍｌ／ｇ〜５０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態において、１５ｍｌ／ｇ〜３０ｍｌ／ｇである。前記酢酸無水物のアセトニトリル溶液の体積と式（３１３）の化合物の質量との比が０．５ｍｌ／ｇ〜１０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態において、１ｍｌ／ｇ〜５ｍｌ／ｇである。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、キャッピング試薬は、等モル量の酢酸無水物とＮ−メチルイミダゾールである。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３１３）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１０〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５〜３０Ｌ／ｍｏｌである。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、エステル化又はアミド化反応に使用できる任意の触媒、例えばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、４−ジメチルアミノピリジンである。前記触媒と式（３１３）に示される化合物との質量比が０．００１：１〜１：１であり、いくつかの実施形態において、０．０１：１〜０．１：１である。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、任意の適切な方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗浄し、濾過し、未反応の反応物、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去することにより、式（３２１）の化合物を得ることができ、前記有機溶剤は、アセトニトリル、ジクロロメタン又はメタノールから選択され、いくつかの実施形態において、有機溶剤は、アセトニトリルである。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される複合分子の調製方法は、有機溶剤において、カップリング反応条件で、カップリング試薬の存在下で、式（３１３）に示される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基であるヒドロキシ保護基及び第２の官能基である式（Ｃ３）に示される基が含まれる式（３２１）の化合物が得られる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、カップリング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、式（３１３）の化合物とホスホルジアミダイトとのモル比が１：１〜１：５０であってもよく、例えば１：５〜１：１５である。式（３１３）の化合物とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：１００であってもよく、例えば１：５０〜１：８０である。反応時間が２００〜３０００秒であってもよく、例えば５００〜１５００秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィンであってもよく、市販品として購入されてもよく、又は本分野で公知の方法により調製されてもよい。カップリング試薬は、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾールの１種又は複数種から選択され、例えば、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、無水アセトニトリルであることが好ましい。式（３１３）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであってもよく、例えば、５〜２０Ｌ／ｍｏｌであってもよい。当該カップリング反応を行うことにより、式（３１３）の化合物におけるヒドロキシ基とホスホルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、カップリング反応条件で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離生成物をヒドロキシ基含有固相担体と接触させることをさらに含む。その後、キャッピング反応、酸化反応を行い、単離して式（３２１）の化合物を得る。この場合、Ｒ４に第１の官能基であるヒドロキシ保護基及び第２の官能基である式（Ｃ３’）に示される基が含まれる式（３２１）の化合物が得られる。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、前記固相担体は、核酸固相合成に使用できる固相担体であり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体（例えば、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ３００  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、構造が式Ｂ８０に示される）であってもよい。
【０１１５】
【化１８】
2021509402.tif 000045
【０１１６】
脱保護反応は、本分野において周知である。いくつかの実施形態において、脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒、例えば５０〜１５０秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における−ＤＭＴｒ（４，４’−ジメトキシトリチル）保護基とのモル比が２：１〜１００：１であってもよく、例えば３：１〜５０：１である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担体の表面に反応活性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、後のカップリング反応を行うことができる。
【０１１７】
カップリング反応条件及びカップリング試薬は、以上のように選択してもよい。当該カップリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホルアミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、キャッピング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、反応時間が５〜５００秒であり、例えば１０〜１００秒である。キャッピング試薬と用量は、以上のように選択してもよい。
【０１１９】
酸化反応条件としては、温度が０〜５０℃であってもよく、例えば、１５〜３５℃であってもよく、反応時間が１〜１００秒、例えば５〜５０秒であり、酸化試薬は、例えば、ヨウ素であってもよい（いくつかの実施形態において、ヨウ素水として提供する）。いくつかの実施形態において、酸化試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１：１〜１００：１であり、５：１〜５０：１であることが好ましい。いくつかの実施形態において、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１〜１：１：３の混合溶剤で行われる。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式Ｂ７又はＢ８であり、この場合、式（３１３）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件で、アミド化反応縮合剤及び第３級アミンの存在下で、式（３１４）に示される化合物を式（Ａ−１）に示される化合物又は式（Ａ−２）に示される化合物と接触させ、単離して式（３１３）に示される化合物を得る、という調製方法により得ることができる。
【０１２１】
【化１９】
2021509402.tif 000046
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１、ｑ２及びＲｋそれぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０１２２】
前記アミド化反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が１〜４８時間であってもよい。いくつかの実施形態において、前記アミド化反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が２〜１６時間である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アルコール溶剤、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記アルコール溶剤は、メタノール、エタノール及びプロパノールの１種又は複数種であり、他のいくつかの実施形態において、エタノールである。いくつかの実施形態において、前記エポキシ溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランである。いくつかの実施形態において、前記エーテル溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。いくつかの実施形態において、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１４）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、１つの実施形態において、３〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリルオキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）又はＯ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、さらなる実施形態において、３−ジエトキシホスホリルオキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン４（３Ｈ）−オンである。前記アミド化反応縮合剤と式（３１４）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、さらなる実施形態において、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミンと式（３１４）に示される化合物とのモル比が３：１〜２０：１であり、１つの実施形態において、５：１〜１０：１である。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、式（Ａ−１）及び式（Ａ−２）の化合物は、任意の適当な方法により調製されてもよい。例えば、ＲｋがＤＭＴｒ基である場合、グリセリン酸カルシウムとＤＭＴｒＣｌを反応させて式（Ａ−１）の化合物を調製することができる。同様に、３−アミノ−１，２−プロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、ＤＭＴｒＣｌと反応させて式（Ａ−２）の化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭素原子数４〜１３、１つの実施形態においては４〜８の環状酸無水物であってもよい。当業者であれば容易に理解できるように、前記環状酸無水物の選択は、（Ａ−２）の化合物におけるｑ２の異なる値に対応し、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水物である場合、ｑ２＝１であり、前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、ｑ２＝２であり、以下類推してもよい。
【０１２７】
いくつかの変形において、式（３１４）に示される化合物を、前記環状酸無水物、３−アミノ−１，２−プロパンジオール及びＤＭＴｒＣｌと順に反応させることにより、式（３１３）の化合物を調製することもできる。当業者であれば容易に理解できるように、これらの変形は、式（３１３）の化合物の構造と機能に影響を与えることがなく、かつ、当業者が上記方法により容易に実現されるものである。
【０１２８】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１３）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１３）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１３）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、式（３１４）に示される化合物は、有機溶剤において、脱保護反応条件下で、式（３１５）に示される化合物をハロ酢酸と接触させ、単離して前記式（３１４）に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。
【０１３０】
【化２０】
2021509402.tif 000047
式中、Ｒ７は、式（３３０）、（３３１）、（３３２）又は（３３３）に示される基から選択され、１つの実施形態において、Ｒ７の構造が式（３３０）に示される。
【０１３１】
【化２１】
2021509402.tif 000048
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０１３２】
前記ハロ酢酸は、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、クロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸から選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸である。
【０１３３】
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が０．１〜２４時間であってもよく、１つの実施形態において、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が０．５〜１６時間である。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記エポキシ溶剤は、１つの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１５）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、さらなる実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０１３５】
前記ハロ酢酸と前記式（３１５）に示される化合物とのモル比が５：１〜１００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１０：１〜５０：１である。
【０１３６】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１４）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１４）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８及びＣ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１４）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０１３７】
式（３１５）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応縮合剤と第３級アミンの存在下及び縮合反応条件下で、式（３１７）に示される化合物を式（３１６）に示される化合物と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０１３８】
【化２２】
2021509402.tif 000049
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０１３９】
式（３１６）の化合物としては、例えば、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１４，１３６，１６９５８−１６９６１に開示された化合物を用いてもよく、又は、式（３１６）の化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、ＵＳ  ８，１０６，０２２  Ｂ２の実施例１に開示された方法を参照していくつかの式（３１６）の化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、前記縮合反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が０．１〜２４時間であり、いくつかの実施形態において、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が０．５〜１６時間である。
【０１４１】
前記式（３１６）に示される化合物と前記式（３１７）に示される化合物とのモル比が２：１〜１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記エポキシ溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、１つの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３１７）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであってもよく、１つの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリルオキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート又は４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩であり、さらなる実施形態において、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩であってもよい。前記アミド化反応縮合剤と式（３１７）に示される化合物とのモル比が２：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０１４４】
前記第３級アミンは、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであってもよく、いくつかの実施形態において、Ｎ−メチルモルホリンであり、前記第３級アミンと式（３１７）に示される化合物とのモル比が３：１〜２０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、５：１〜１０：１である。
【０１４５】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１５）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１５）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８及びＣ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１５）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、式（３１７）の化合物と十分な量の式（３１６）の化合物を一度反応させるだけで所望の式（３１５）の化合物を生成し、式（３１５）の化合物は、各Ｓ１−Ｌ１基同士が同じである。いくつかの実施形態において、必要に応じて、式（３１７）の化合物を、異なる式（３１６）の化合物、即ち、Ｌ１及び／又はＳ１が異なる式（３１６）の化合物とバッチ反応させることにより、生成された式（３１５）の化合物に２種類以上のＳ１及び／又はＬ１を含ませることができる。例えば、１ｅｑの式（３１７）の化合物と２ｅｑの第１の式（３１６）の化合物を接触させ、式（３１７）の化合物における２つの末端第一級アミン基に第１のＳ１−Ｌ１基を結合した後、続いて（ｎ３＋ｎ１−１）ｅｑの第２の式（３１６）の化合物と接触させ（ｎ３及びｎ１の定義と値の範囲は、前述したとおりである）、式（３１７）の化合物における（ｎ３＋ｎ１−１）個の第二級アミン基に第２のＳ１−Ｌ１基を結合することができる。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、式（３１７）に示される化合物は、有機溶剤の存在下で、脱保護反応条件下で、式（３１８）に示される化合物をメチルアミン水溶液と接触させ、単離して式（３１７）に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。
【０１４８】
【化２３】
2021509402.tif 000050
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０１４９】
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０〜１５０℃であり、反応時間が５〜７２時間であってもよく、いくつかの実施形態において、反応温度が２０〜８０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０１５０】
前記有機溶剤は、アルコールから選択されてもよく、いくつかの実施形態において、メタノール、エタノール及びイソプロパノールの１つであり、いくつかの実施形態において、メタノールであり、式（３１８）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１〜２０Ｌ／ｍｏｌであってもよく、１つの実施形態において、１．５〜１０Ｌ／ｍｏｌである。
【０１５１】
前記メチルアミン水溶液の濃度が３０〜４０質量％であってもよく、メチルアミンと式（３１８）に示される化合物とのモル比が１０：１〜５００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、５０：１〜２００：１である。
【０１５２】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１７）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１７）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８及びＣ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１７）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、式（３１８）に示される化合物は、有機溶剤の存在下で、置換反応条件で、式（３１９）に示される化合物を、トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタン、いくつかの実施形態においてトリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０１５４】
【化２４】
2021509402.tif 000051
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０１５５】
前記置換反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が５〜７２時間であってもよく、１つの実施形態において、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０１５６】
トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンは、市販品として得られることができ、トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンと式（３１９）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１：１〜３：１である。
【０１５７】
前記有機溶剤は、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であってもよい。前記エポキシ溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル溶剤は、１つの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、１つの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、１つの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１９）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、１つの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０１５８】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１８）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１８）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメタン＝０．０１：１〜０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石油エーテル＝０．１：１：１：１〜１：１：１：１で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８及びＣ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１８）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、式（３１９）に示される化合物は、有機溶剤において、置換反応条件で、式（３２０）に示される化合物をトリフルオロ酢酸エチルと接触させ、単離して式（３１９）に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。
【０１６０】
【化２５】
2021509402.tif 000052
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ溶剤、エーテル溶剤、ハロゲン化アルキル溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記エポキシ溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、いくつかの実施形態において、前記エーテル溶剤は、１つの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、いくつかの実施形態において、前記ハロゲン化アルキル溶剤は、１つの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２０）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、１〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０１６２】
前記置換反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が５〜７２時間であってもよく、いくつかの実施形態において、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０１６３】
式（３２０）の化合物は、市販品として得られ、又は、当業者により既知の方法を用いて得ることができる。例えば、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３＝３、ｎ１＝１、ｎ３＝２であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５がいずれもＨである場合、式（３２０）の化合物は、アルファ・エイサー社（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  Ｉｎｃ．）から市販品として得ることができる。
【０１６４】
前記トリフルオロ酢酸エチルと式（３２０）に示される化合物とのモル比が２：１〜１０：１であってもよく、１つの実施形態において、３：１〜５：１である。
【０１６５】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１９）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１９）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメタン＝０．０１：１〜０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石油エーテル＝０．１：１：１：１〜１：１：１：１で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８及びＣ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１９）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０１６６】
＜複合体＞
他の側面において、本開示は、式（１）に示される構造を有する複合体を提供する。
【０１６７】
【化２６】
2021509402.tif 000053
式中、
ｎ１は１〜３の整数であり、ｎ３は０〜４の整数であり、
各ｍ１、ｍ２及びｍ３が独立して２〜１０の整数であり、
各Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル又はＣ１−Ｃ１０アルコキシ基から選択され、いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ独立してＨ、メチル基又はエチル基から選択され、
Ｒ３は活性薬物であり、いくつかの実施形態において、Ｒ３が機能性オリゴヌクレオチドを含み、
Ｒ２は、長さ１〜２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）から選択されるいずれか１つ又は複数の基で任意に置換され、
各Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し、いくつかの実施形態において、Ｌ１は、式Ａ１〜Ａ２６の基又はその任意の組合せから選択されてもよく、Ａ１〜Ａ２６の構造と定義は、前述したとおりである。
【０１６８】
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５及びＭ１は、前述したように定義される。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、式（３２１）の化合物におけるＲ４基が反応を経て活性薬物に結合して形成された結合基である。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、式（３２１）の化合物におけるＲ４基が反応を経て機能性オリゴヌクレオチドに結合して形成された結合基である。いくつかの実施形態において、Ｒ２基には、窒素含有骨格上のＮ原子に結合される結合部位及びＲ３におけるＰ原子に結合される結合部位がともに含まれる。いくつかの実施形態において、Ｒ２における窒素含有骨格上のＮ原子に結合される部位は、Ｎ原子とアミド結合を形成し、前記Ｒ３におけるＰ原子に結合される部位は、Ｐ原子とリン酸エステル結合を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’であってもよい。
【０１７０】
【化２７】
2021509402.tif 000054
ただし、
2021509402.tif 000055
は、基が共有結合的に結合する部位を表し、ｑ２の選択と値の範囲は、前述したとおりである。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、Ａ５９に示される構造の基である。
【０１７２】
【化２８】
2021509402.tif 000056
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、いくつかの実施形態において、Ｅ１はＯＨ又はＳＨであり、Ｎｕは機能性オリゴヌクレオチドである。
【０１７３】
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」基又は分子とは、対応するリガンドと共有結合を形成できる基又は分子を指し、複合基又は分子及びそのリガンドは、いずれも特定の機能を有する。これに応じて、「複合体」とは、当該化学基とそのリガンドが共有結合的に結合することにより形成された化合物を指す。さらには、「オリゴヌクレオチド複合体」は、特定の機能を有する１又は複数の複合基がオリゴヌクレオチドに共有結合的に結合して形成された化合物を表す。いくつかの実施形態において、本明細書で開示された複合体は、オリゴヌクレオチド複合体である。本開示の文脈において、「複合分子」は、反応することによりオリゴヌクレオチドに複合され、最終的に本開示のオリゴヌクレオチド複合体を形成することができる特定の化合物である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡであり、この場合、本開示の複合体は、ｓｉＲＮＡ複合体である。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、複合体は、式（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）、（２０）、（２１）又は（２２）に示される構造を有する。
【０１７５】
【化２９】
2021509402.tif 000057
2021509402.tif 000058
2021509402.tif 000059
2021509402.tif 000060
2021509402.tif 000061
【０１７６】
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体におけるオリゴヌクレオチドは、機能性オリゴヌクレオチドである。機能性オリゴヌクレオチドとは、標的配列との間に安定的で特異的なハイブリダイゼーションを生じさせることで、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ＲＮＡａ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）、アンチセンス核酸技術、エキソンスキッピング（ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ）技術等の原理により、標的遺伝子の発現を上向き調節又は下向き調節し、又はｍＲＮＡの選択的スプライシングシングを引き起こすことができるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの側面において、機能性オリゴヌクレオチドは、標的タンパク質との間に安定的で特異的な結合を生じることができる核酸構造であってもよい。また、当業者であれば容易に理解できるように、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ自体又はその断片）も、同様に、本開示により提供される複合分子と複合して複合体を形成することにより、標的送達、例えば、肝標的送達を実現し、ｍＲＮＡから転写されてきたタンパク質の発現を調節することに適用される。したがって、文脈において、「機能性オリゴヌクレオチド」の概念は、ｍＲＮＡ又はその断片を含んでもよい。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、標的配列と相互に作用し、標的配列分子の正常機能に影響することができ、例えば、ｍＲＮＡの開裂や翻訳阻害、又は、エキソンスキッピングによるｍＲＮＡの選択的スプライシングシングなどを発生させる。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、標的配列の塩基と相補的である。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、標的配列における８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の塩基と相補的であり、又は標的配列と完全に相補的であることが可能である。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、標的配列と相補的でない１、２又は３個の塩基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及び修飾を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記機能性オリゴヌクレオチドは、一本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡキメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）、又は、二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）である。
【０１７８】
これにより、いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体に適した機能性オリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡ（ａｎｔｉｍｉＲ）、マイクロＲＮＡ拮抗剤（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、マイクロＲＮＡ模倣物（ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉｍｉｃｓ）、デコイオリゴヌクレオチド（ｄｅｃｏｙ）、免疫刺激物（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）、Ｇ−四重鎖（Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）、選択的スプライスバリアント（ｓｐｌｉｃｅ  ａｌｔｅｒｉｎｇ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、アンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）、核酸アプタマー（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｐｔａｍｅｒ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓａＲＮＡ）、ステムループＲＮＡ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ＲＮＡ）又はＤＮＡの１つであってもよい。ＷＯ２０１５／００６７４０Ａ２には、異なるリガンドがオリゴヌクレオチドに複合される複合体が開示されており、リガンドは、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によりオリゴヌクレオチドに結合される。前記オリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、抗マイクロＲＮＡ（ａｎｔｉｍｉＲ）、マイクロＲＮＡ拮抗剤（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、マイクロＲＮＡ模倣物（ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉｍｉｃｓ）、デコイオリゴヌクレオチド（ｄｅｃｏｙ）、免疫刺激物（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）、Ｇ−四重鎖（Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）、選択的スプライスバリアント（ｓｐｌｉｃｅ  ａｌｔｅｒｉｎｇ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、アンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ステムループＲＮＡ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ＲＮＡ）又はＤＮＡから選択される１つである。これらの複合体は、オリゴヌクレオチドの体内送達において良好な安定性を示す。さらなる実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体に適した機能性オリゴヌクレオチドは、ＷＯ２００９０８２６０７Ａ２、ＷＯ２００９０７３８０９Ａ２又はＷＯ２０１５００６７４０Ａ２に開示されたオリゴヌクレオチドであり、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、活性剤、例えば、機能性オリゴヌクレオチドの肝標的送達効率を向上させることにより、特定の細胞、例えば、肝細胞における特定の遺伝子の異常発現を調節し、機能性オリゴヌクレオチドと細胞における標的配列との間の相互作用を強化することができる。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、肝臓に発現する内因性遺伝子であってもよく、肝臓で繁殖する病原体遺伝子であってもよい。肝細胞に異常に発現する遺伝子は、例えば、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ、ＨＣＶ等の遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態において、前記肝細胞に異常に発現する遺伝子は、ＨＢＶ遺伝子、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子又はＡＰＯＣ３遺伝子である。本開示の文脈において、ＨＢＶ遺伝子とは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ＿００３９７７．１に示される配列を有する遺伝子を指し、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子とは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１４４９５．３に示されるｍＲＮＡ配列を有する遺伝子を指し、ＡＰＯＣ３遺伝子とは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００００４０．１に示されるｍＲＮＡ配列を有する遺伝子を指す。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、「標的配列」は、標的ｍＲＮＡである。本開示の文脈において、「標的ｍＲＮＡ」とは、例えば、肝細胞に異常に発現する遺伝子が対応するｍＲＮＡを指し、過剰発現遺伝子が対応するｍＲＮＡであってもよいし、過少発現遺伝子が対応するｍＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態において、疾患はｍＲＮＡの過剰発現に起因する場合が多いので、標的ｍＲＮＡは、過剰発現遺伝子が対応するｍＲＮＡであることが好ましい。本開示のいくつかの実施形態において、上記異常発現遺伝子に対応する標的ｍＲＮＡは、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ、ＨＣＶ等の遺伝子が対応するｍＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態において、前記標的ｍＲＮＡは、対応するＨＢＶ遺伝子、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子又はＡＰＯＣ３遺伝子から転写されたｍＲＮＡであってもよい。
【０１８１】
式Ａ５９におけるＰ原子は、オリゴヌクレオチド配列における任意の可能な位置に結合されてもよく、例えば、オリゴヌクレオチドの任意のヌクレオチドに結合されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体における機能性オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡ又はアプタマー）である。この場合、式Ａ５９におけるＰ原子は、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域に結合されてもよく、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの末端領域とは、前記一本鎖オリゴヌクレオチドにおいてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの任意の末端に結合される。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体における機能性オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ又はＤＮＡ）であり、前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、前記式Ａ５９におけるＰ原子は、前記二本鎖オリゴヌクレオチドにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端領域に結合され、前記末端領域とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指し、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の任意の末端に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、前記センス鎖の３’末端に結合される。式Ａ５９におけるＰ原子が二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の上記位置に結合される場合に、本開示により提供されるオリゴヌクレオチド複合体は、細胞に入り込んだ後、巻き戻されるときに、単独の二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を放出し、標的ｍＲＮＡがタンパク質を翻訳する過程を遮断し、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
【０１８３】
式Ａ５９におけるＰ原子は、オリゴヌクレオチド配列におけるヌクレオチド上の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチドの５’位、ヌクレオチドの２’位、ヌクレオチドの３’位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記オリゴヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合されてもよい。いくつかの具体的な実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、二本鎖オリゴヌクレオチド配列においてセンス鎖の３’末端のヌクレオチドの３’ヒドロキシ基を脱水素した酸素原子に結合され、又は、式Ａ５９におけるＰ原子は、二本鎖オリゴヌクレオチド配列においてセンス鎖におけるヌクレオチドの２’−ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合され、又は、式Ａ５９におけるＰ原子は、二本鎖オリゴヌクレオチド配列においてセンス鎖の５’末端のヌクレオチドの５’ヒドロキシ基中の水素原子を置換することによりヌクレオチドに結合される。
【０１８４】
限定されることを望まないが、以下の実施形態及び実施例において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体における機能性オリゴヌクレオチドが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である場合を詳しく説明する。この場合、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、ｓｉＲＮＡ複合体である。本明細書の文脈において、説明の便宜上、これらの実施形態におけるｓｉＲＮＡ複合体を、本開示のｓｉＲＮＡ複合体とも称する。これは、本開示のオリゴヌクレオチド複合体におけるオリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡでしかあり得ないことを示すものではなく、逆に、前記オリゴヌクレオチド、ひいては活性薬物は、本開示の他の代替物又は当業者によく知られている他の代替物であってもよい。ｓｉＲＮＡ複合体の詳しい説明により、他の活性薬物又は機能性オリゴヌクレオチドが、本開示により提供される複合分子に複合される際にも、類似の作用を有するものと予想することができる。
【０１８５】
ｓｉＲＮＡが構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオチド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知である。通常、活性化、即ち、機能性ｓｉＲＮＡの長さは、約１２〜４０ヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、約１５〜３０ヌクレオチドであり、前記ｓｉＲＮＡにおける各ヌクレオチドは、独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであってもよく、安定性を向上させるために、前記ｓｉＲＮＡにおける少なくとも１つのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
【０１８６】
本開示の発明者は、以下の実施形態に記載されるｓｉＲＮＡが高い活性及び／又は安定性を有するので、本開示において発明の目的とするｓｉＲＮＡとして用いることができることを見出した。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ複合体のｓｉＲＮＡ（以下、本開示のｓｉＲＮＡともいう）における各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、当該ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列２を含む。前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、長さがいずれも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドであり、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖相補領域を形成し、前記ヌクレオチド配列２は、第１のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で相補的であり、前記第１のヌクレオチド配列断片は、標的ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド配列断片である。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡとは、３ｍｇ／ｋｇの濃度で、少なくとも５０％のＨＢＶ遺伝子発現、少なくとも５０％のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現又は少なくとも５０％のＡＰＯＣ３遺伝子発現を抑制できるｓｉＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡとは、濃度が３ｍｇ／ｋｇであるとき、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又は８０％のＨＢＶ遺伝子、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子又はＡＰＯＣ３遺伝子発現を抑制できるものを指す。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列１と前記第１のヌクレオチド配列断片とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３個以下であり、前記ヌクレオチド配列２とヌクレオチド配列Ｂとは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３個以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｂは、前記第１のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的なヌクレオチド配列である。制限されることを望まないが、これらの特定のヌクレオチド差異により、ｓｉＲＮＡ複合体の抑制能力を顕著に低下させることがなく、これらの特定のヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡ複合体も、本開示の保護範囲内にある。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、基本的に逆相補的、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列１と前記第１のヌクレオチド配列断片は、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列２と前記ヌクレオチド配列Ｂは、ヌクレオチド差異が１つ以下である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列２と前記ヌクレオチド配列Ｂとの間のヌクレオチド差異は、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２における１番目のヌクレオチドＺ’の位置での差異を含む。いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１における最後のヌクレオチドＺは、Ｚ’と相補的なヌクレオチドである。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列３をさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列４をさらに含み、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが等しく、いずれも１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３は、前記ヌクレオチド配列１の５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、前記ヌクレオチド配列２の３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４は、第２のヌクレオチド配列断片と相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおいて前記第１のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列４と同じヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である。したがって、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、１９〜２３ヌクレオチドであってもよい。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列５をさらに含み、前記ヌクレオチド配列５は、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング端（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を構成し、いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列５の長さが１又は２ヌクレオチドである。このように、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が、１９／２０、１９／２１、２０／２１、２０／２２、２１／２２、２１／２３、２２／２３、２２／２４、２３／２４又は２３／２５であってもよい。
【０１９４】
１つの実施形態において、前記ヌクレオチド配列５の長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列５は、連続した２個のチミジンデオキシヌクレオチド、又は連続した２個のウリジンヌクレオチドであり、又は、第３のヌクレオチド配列断片と相補的であり、前記第３のヌクレオチド配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおいて前記第１のヌクレオチド配列断片に隣接し、又は前記第２のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列５に等しいヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が１９／２１又は２１／２３であり、このとき、本開示のｓｉＲＮＡは、顕著な肝細胞ｍＲＮＡサイレンシング活性を有する。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、修飾ヌクレオチド基を含まず、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、修飾ヌクレオチド基を含む。
【０１９６】
現在、本分野においては、骨格修飾（ヌクレオチド間結合修飾ともいい、例えば、リン酸基修飾）、リボース基修飾及び塩基修飾等を含む、ｓｉＲＮＡの修飾に使用できる複数種の方法がある（例えば、Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｋ．，Ｇ．Ｆ．Ｄｅｌｅａｖｅｙ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ：ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ，２００８．１３（１９−２０）：ｐ．８４２〜５５を参照し、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
【０１９７】
本開示の文脈において、用いられる用語「修飾ヌクレオチド」は、そのリボース基が修飾され、例えば、２’位のヒドロキシ基が他の基で置換されたヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、又は修飾塩基を有するヌクレオチドを含む。
【０１９８】
本開示のいくつかの実施形態において、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の少なくとも１つのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である。言い換えれば、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において少なくとも１本の一本鎖のリン酸−リボース骨格中のリン酸エステル基及び／又はリボース基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基及び／又は修飾基を有するリボース基（又は修飾リン酸エステル基及び／又は修飾リボース基）である。本開示のいくつかの実施形態において、前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖におけるヌクレオチドは、全て修飾ヌクレオチドである。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
【０２００】
「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、以下の式（２０７）に示される構造を有する。
【０２０１】
「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、独立して、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログである。
【０２０２】
リボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドは、当業者に公知であり、これらのヌクレオチドは、例えば、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−置換アミノ修飾ヌクレオチド又は２’−デオキシヌクレオチドである。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（２０８）に示される、メトキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（２０９）に示される、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、２’−アミノ修飾ヌクレオチドは、式（２１０）に示される。いくつかの実施形態において、２’−デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）は、式（２１１）に示される。
【０２０４】
【化３０】
2021509402.tif 000062
【０２０５】
ヌクレオチドアナログとは、核酸におけるヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと異なる基を指す。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチドアナログは、例えば、イソヌクレオチド、架橋核酸（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＢＮＡ）ヌクレオチド又は非環式ヌクレオチドであってもよい。
【０２０６】
ＢＮＡヌクレオチドとは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。ＢＮＡは、五員環、六員環、又は七員環の、「固定された」Ｃ３’−エンド糖パッカリングを有する架橋構造を含んでもよい。通常当該橋を当該リボース環の２’−、４’−位に取り込んで２’、４’−ＢＮＡヌクレオチド、例えば、式（２１２）に示されるＬＮＡ、式（２１３）に示されるＥＮＡ、及び式（２１４）に示されるｃＥＴ  ＢＮＡを提供する。
【０２０７】
【化３１】
2021509402.tif 000063
【０２０８】
非環式ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖環が開環されたヌクレオチド、例えば、式（２１５）に示されるアンロックド核酸（ＵＮＡ）ヌクレオチド、及び式（２１６）に示されるグリセロール核酸（ＧＮＡ）ヌクレオチドである。
【０２０９】
【化３２】
2021509402.tif 000064
ただし、ＲはＨ、ＯＨ又はアルコキシ（Ｏ−アルキル）である。
【０２１０】
イソヌクレオチドとは、塩基のリボース環における位置が変化したヌクレオチドを指し、例えば、式（２１７）又は（２１８）に示される、塩基がリボース環の１’−位から２’−位又は３’−位に移行した化合物である。
【０２１１】
【化３３】
2021509402.tif 000065
式中、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ又はＴ等の核酸の塩基を表し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ又は上述した非フッ素化基である。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ又はＧＮＡである。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
【０２１３】
文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」、「２’−フルオロ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’−ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチド」及び「２’−フルオロリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドの２’−ヒドロキシ基がフッ素で置換された、式（２０７）に示される構造を有するものを指し、「メトキシ修飾ヌクレオチド」、「２’−メトキシ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチド」及び「２’−メトキシリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドリボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換された、式（２０８）に示されるものを指す。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖における前記ヌクレオチド配列１の第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、及び／又は前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖における前記ヌクレオチド配列１の第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、及び／又は前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが２’−メトキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖における前記ヌクレオチド配列１の第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、及び／又は５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖における前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
【０２１５】
本開示に記載されたｓｉＲＮＡのいくつかの具体的な実施形態において、前記ヌクレオチドは、リン酸基修飾を含む。本開示の文脈において、リン酸基上の修飾は、１つの実施形態において、以下の式（２０１）に示されるチオリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）修飾であり、即ち、硫黄原子でリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子を置換することにより、チオリン酸ジエステル結合でリン酸ジエステル結合を置換する。いくつかの実施形態において、当該修飾により、ｓｉＲＮＡの構造を安定化させ、塩基対合の高い特異性と高い親和力を維持する。
【０２１６】
【化３４】
2021509402.tif 000066
【０２１７】
本開示のいくつかの実施形態により、前記ｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つに結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の５’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の３’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のうち少なくとも一箇所に結合されて存在する。
前記センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間。
【０２１８】
本開示のいくつかの実施形態により、前記ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖配列の５’末端のヌクレオチドは、５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、５’−リン酸ヌクレオチドは、式（２０２）に示される構造を有してもよい。
【０２２０】
【化３５】
2021509402.tif 000067
【０２２１】
慣用の前記５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドの種類は、当業者に公知であり、例えば、Ａｎａｓｔａｓｉａ  Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ａｎｄ  Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｋ．  Ｗａｔｔｓ，Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５（３）：２３８〜４８には、以下の式（２０３）〜（２０６）に示される４つのヌクレオチドが開示されている。
【０２２２】
【化３６】
2021509402.tif 000068
ただし、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ及びメトキシ基からなる群から選択される基を表し、
Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される塩基を表す。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（２０３）に示される、ビニルリン酸エステル（ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、ＶＰ）修飾を含むヌクレオチド、式（２０２）に示される、５’−リン酸ヌクレオチド、又は、式（２０５）に示される、５’−チオリン酸修飾ヌクレオチドである。
【０２２４】
本開示の発明者は、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ複合体は、血清安定性が顕著に向上しているとともに、明らかに低下していない標的ｍＲＮＡサイレンシング活性及び優れた体内遺伝子発現抑制効果をさらに示していることを、意外にも見出した。それにより、本開示のｓｉＲＮＡ複合体が高い体内送達効率を有することが示された。本開示のいくつかの実施形態により、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、例えば、表１Ａ〜１Ｆに示されるｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ複合体である。
【０２２５】
［表１］
ｓｉＲＮＡ配列
【表１Ａ】
2021509402.tif 000069
2021509402.tif 000070
【表１Ｂ】
2021509402.tif 000071
2021509402.tif 000072
【表１Ｃ】
2021509402.tif 000073
【表１Ｄ】
2021509402.tif 000074
【表１Ｅ】
2021509402.tif 000075
2021509402.tif 000076
2021509402.tif 000077
【表１Ｆ】
2021509402.tif 000078
2021509402.tif 000079
＊Ｓ：センス鎖、ＡＳ：アンチセンス鎖
【０２２６】
上記の表において、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、いくつかの実施形態において、ビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＶＰで表される）、５’−リン酸ヌクレオチド（以下の実施例においてＰで表される）又はチオリン酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＰｓで表される）である。
【０２２７】
当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌクレオシドモノマーは、市販品を購入してもよく、既知の方法により調製してもよい。
【０２２８】
＜オリゴヌクレオチド複合体の調製＞
任意の合理的な合成経路により本開示のオリゴヌクレオチド複合体を調製してもよい。例えば、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、以下の方法により調製することができる。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれ前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含むことを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチド配列と接触させ、式（３２１）に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチド配列に結合することをさらに含む。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、当該方法は、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精製する工程をさらに含む。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記調製方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’端のヌクレオシドモノマーと接触させ、式（３２１）に示される化合物を配列における１番目のヌクレオチドに結合させ、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、（３２１）の化合物は、Ｒ４に、第１の官能基である保護されたヒドロキシ基、及び第２の官能基である式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される基が含まれる、式（３２１）に示される化合物であり、１番目のヌクレオシドモノマーと結合する前に、式（３２１）の化合物を脱保護し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、複合分子が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程と、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドの他方の鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精製してセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記調製方法は、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、固相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体に結合されたアンチセンス鎖を得る工程と、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固相担体に結合されたアンチセンス鎖と接触させ、Ｒ４にホスホルアミダイトである第１の官能基が含まれる式（３２１）の化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させる工程と、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精製してオリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。前記オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖に複合分子が結合されている。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖の３’末端に結合され、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、
（１）上記固相担体が結合された式（３２１）の化合物（以下、固相担体が結合されたＬ複合分子ともいう）における保護基Ｒｋを除去し、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、当該固相担体が結合されたＬ複合分子をヌクレオシドモノマーと接触させ、Ｌ複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
（２）当該Ｌ複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’−５’の方向に従いホスホルアミダイト固相合成方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成すること、
（３）ホスホルアミダイト固相合成方法により、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成すること、
（４）ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を得ることを含む。
【０２３３】
工程（１）において、当該固相担体が結合されたＬ複合分子における保護基Ｒｋを除去する方法は、脱保護条件で、式（３２１）の化合物を脱保護試薬と接触させることを含む。脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒であり、いくつかの実施形態において、５０〜１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と式（３２１）の化合物のモル比が１０：１〜１０００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、５０：１〜５００：１である。
【０２３４】
前記カップリング反応条件とカップリング試薬としては、上記カップリング反応に適した任意の条件と試薬を用いてもよい。いくつかの実施形態において、採用される固相合成方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いる。
【０２３５】
いくつかの実施形態において、前記カップリング反応の条件としては、反応温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃である。式（３２１）の化合物とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１〜１：５０であってもよく、いくつかの実施形態において、１：２〜１：５であり、式（３２１）の化合物とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：５０であってもよく、いくつかの実施形態において、１：３〜１：１０であり、反応時間が２００〜３０００秒であってもよく、いくつかの実施形態において、５００〜１５００秒である。カップリング試薬は、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾール、５−ベンジルチオ１Ｈ−テトラゾールから選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、無水アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであってもよく、いくつかの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２３６】
工程（２）において、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、上記工程で調製されたＬ複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’−５’の方向に従いｓｉＲＮＡ複合体のセンス鎖Ｓを合成する。この場合、Ｌ複合分子は、得られたセンス鎖の３’末端に結合される。
【０２３７】
工程（２）及び（３）における前記固相合成の他の条件としては、ヌクレオシドモノマーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応条件、酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬の種類と用量を含み、本明細書では、本分野で通常用いられる各種の試薬、用量及び条件を採用する。
【０２３８】
例えば、いくつかの実施形態において、工程（２）及び（３）において、前記固相合成では、以下の条件を用いてもよい。
【０２３９】
ヌクレオシドモノマーの脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒であり、いくつかの実施形態において、５０〜１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における４，４’−ジメトキシトリチル保護基とのモル比は、２：１〜１００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、３：１〜５０：１である。
【０２４０】
カップリング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１〜１：５０であってもよく、いくつかの実施形態において、１：５〜１：１５であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：１００であってもよく、いくつかの実施形態において、１：５０〜１：８０であり、反応時間とカップリング試薬の選択は、前記と同じである。
【０２４１】
キャッピング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が５〜５００秒であり、いくつかの実施形態において、１０〜１００秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１：１００〜１００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１：１０〜１０：１である。キャッピング試薬として等モル量の酢酸無水物とＮ−メチルイミダゾールを用いる場合に、酢酸無水物、Ｎ−メチルイミダゾール及び固相担体に結合される核酸配列のモル比が１：１：１０〜１０：１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１：１：２〜２：２：１である。
【０２４２】
酸化反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が１〜１００秒であり、いくつかの実施形態において、５〜５０秒であり、酸化試薬は、いくつかの実施形態において、ヨウ素である（さらなる実施形態において、ヨウ素水として提供する）。酸化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、１：１〜１００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、５：１〜５０：１である。いくつかの実施形態において、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１〜１：１：３の混合溶剤で行われる。硫化反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が５０〜２０００秒であり、いくつかの実施形態において、１００〜１０００秒であり、硫化試薬は、いくつかの実施形態において、キサンタンヒドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、１０：１〜１０００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１０：１〜５００：１である。いくつかの実施形態において、前記硫化反応は、アセトニトリル：ピリジン＝１：３〜３：１の混合溶剤で行われる。
【０２４３】
本開示により提供される方法により、全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、アニールする前、当該方法は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさらに含む。単離方法は、当業者に公知であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩することを含む。
【０２４４】
合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去するには、ｓｉＲＮＡ合成において通常の切断と脱保護方法により行われてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を濃アンモニア水と接触させ、脱保護過程において、Ａ４６〜Ａ５４の基の保護基ＹＣＯＯ−をヒドロキシ基に変換させ、Ｓ１基を対応するＭ１基に変換させ、式（１）に示される複合体を生成する。ここで、前記濃アンモニア水は、濃度が２５〜３０重量％のアンモニア水であってもよく、濃アンモニア水の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．２ｍｌ／μｍｏｌ〜０．８ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。
【０２４５】
合成されたヌクレオチド配列に少なくとも１つの２’−ＴＢＤＭＳ保護がある場合、前記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素酸塩と接触させることにより、当該２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去することをさらに含む。この場合、得られた目的とするｓｉＲＮＡ配列には、対応するヌクレオシドにおいて遊離の２’−ヒドロキシ基を有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．４ｍｌ／μｍｏｌ〜１．０ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。このように本開示のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
【０２４６】
精製及び脱塩する方法は、当業者によく知られている。例えば、分取用イオンクロマトグラフィー精製カラムを用いて、ＮａＢｒ又はＮａＣｌの勾配溶出によって、核酸の精製を行い、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩することができる。
【０２４７】
合成過程において、常に核酸配列の純度と分子量を検出し、合成品質をよりよく制御することができる。検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分子量を測定することができる。
【０２４８】
アニール方法も、当業者によく知られている。例えば、簡単に合成されたセンス鎖（Ｓ鎖）とアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）を等モル比で注射用水に混合して７０〜９５℃に加熱し、その後室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このように本開示のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
【０２４９】
本開示の複合体を得た後、いくつかの実施形態において、例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等の方法により合成されたｓｉＲＮＡ複合体の特徴を明らかにし、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、目的設計のｓｉＲＮＡ複合体であるとともに、合成されたｓｉＲＮＡの配列が、合成するｓｉＲＮＡの配列と一致し、例えば、上記表１に示される配列の１つと一致していると確認することもできる。
【０２５０】
＜本開示の複合体の使用＞
本開示に示されるように、前記複合体は、ある活性剤を細胞に送達し、このような送達を必要とする可能性がある疾患又は状況を治療又は予防するために用いることができる。何ら理論に束縛されることを望まないが、複合分子の空間配列は、標的細胞表面の受容体面に特に有効であり、負荷された活性剤を細胞と接触させると考えられる。いくつかの実施形態において、このような複合体は、肝細胞を標的するオリゴヌクレオチド複合体である。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、優れた肝標的特異性を有するので、複合された機能性オリゴヌクレオチドを肝部に効率よく送達し、肝細胞における特定の遺伝子の発現を効果的に調節することができる。よって、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、広い応用の将来性がある。
【０２５２】
本開示のいくつかの実施形態により、本開示は、本開示のオリゴヌクレオチド複合体の、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製への使用を提供する。前記特定の遺伝子は、肝臓に発現する内因性遺伝子であってもよいし、肝臓で繁殖する病原体遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、例えば、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ又はＨＣＶである。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子又はアポリポタンパクＣ３遺伝子である。これに応じて、前記疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及び脂質異常（血中脂質異常）から選択される。いくつかの実施形態において、前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、本明細書は、必要のある患者に本開示のオリゴヌクレオチド複合体を投与することを含む、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、例えば、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ又はＨＣＶである。いくつかの実施形態において、前記特定の遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子及びアポリポタンパクＣ３遺伝子から選択される。これに応じて、前記疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患、肝過形成性疾患及び脂質異常から選択される。いくつかの実施形態において、前記脂質異常は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である。いくつかの実施形態において、本開示により提供される複合体は、望まない細胞増殖を特徴とする疾患、血液疾患、代謝性疾患及び炎症を特徴とする疾患を含む、他の肝臓疾患を治療するために用いることもできる。肝臓の増殖性疾患は、良性又は悪性疾患、例えば、癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝転移又は肝芽腫であってもよい。肝臓血液学的又は炎症性疾患は、血液凝固因子、補体媒介炎症又は線維化に関する疾患であってもよい。肝臓の代謝性疾患は、脂質異常及びグルコースの調節の不規則性を含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、肝疾患に関与する遺伝子配列と高度に相同な配列を有する１又は複数のオリゴヌクレオチドを使用することを含む。
【０２５４】
本開示のいくつかの実施形態により、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ複合を前記肝細胞と接触させることを含む、肝細胞における特定の遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
【０２５５】
本開示のオリゴヌクレオチド複合体を、必要のある患者に投与することにより、遺伝子発現を調節する機構により肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患を予防及び／又は治療する目的を達成することができる。したがって、本開示のオリゴヌクレオチド複合体は、本明細書で開示された病理学的状態又は疾患の予防及び／又は治療に用い、又は本明細書で開示された病理学的状態又は疾患の予防及び／又は治療のための薬物の調製に用いることができる。
【０２５６】
本明細書で用いられる用語「薬剤投与／投与」とは、オリゴヌクレオチド複合体等の複合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化することにより所望の効果を生じさせる方法又は経路により、複合体を被験体の体内に送達することを指す。本開示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与を含むが、これらのみに限られていない。一般的には、局所投与により、被験体の体循環よりも多くのオリゴヌクレオチド複合体が特定の部位に送達されるが、全身投与により、前記オリゴヌクレオチド複合体が患者の体循環に送達される。本開示が肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患の予防及び／又は治療手段を提供することを意図することを考慮すると、いくつかの実施形態において、薬物を肝臓に送達することができる投与方法を採用する。
【０２５７】
本分野で既知の任意の適切な経路で患者に投与することができ、前記経路としては、経口投与又は胃腸外経路（非経口経路）、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気管内投与（エアロゾル）、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与（口腔内投与と舌下投与を含む）を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、１日、１週間、２週間、１ヶ月又は１年に１回若しくは複数回であってもよい。
【０２５８】
本開示に記載されたオリゴヌクレオチド複合体の用量は、本分野における通常の用量であってもよく、前記用量は、各種のパラメーター、特に患者の年齢、体重及び性別により確認されてもよい。細胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定し、例えば、ＬＤ５０（５０％の群体を死亡させる用量）及びＥＤ５０（定量的反応において、５０％の最大反応強度を引き起こすことができる用量を指し、定性的反応において、５０％の実験対象に陽性反応を発生させることができる場合の用量を指す）を測定してもよい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデータに基づいてヒト用量の範囲を得ることができる。
【０２５９】
本開示に記載された複合体を投与する場合、例えば、雄性又は雌性、６〜１２週齢、体重１８〜２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ又はＣ３Ｈ／ＨｅＮＣｒｌＶｒマウスに対して、前記オリゴヌクレオチド複合体におけるオリゴヌクレオチドの量として計算し、機能性オリゴヌクレオチドと複合分子により形成されたオリゴヌクレオチド複合体を送達するためには、複合体により送達されたオリゴヌクレオチドの用量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、いくつかの実施形態において、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施形態において、０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、他のいくつかの実施形態において、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ体重であり、他のいくつかの実施形態において、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。本開示に記載されたオリゴヌクレオチド複合体を投与する場合、上記用量を参照してもよい。
【０２６０】
また、本開示のオリゴヌクレオチド複合体を、特定の遺伝子が異常に発現している肝細胞に導入することにより、遺伝子発現調節機構により肝細胞における当該特定の遺伝子の発現の抑制という目的を達成することもできる。いくつかの実施形態において、前記肝細胞は、肝炎細胞であり、いくつかの実施形態において、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞である。いくつかの実施形態において、前記肝細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７等の肝癌細胞系又は単離した初代肝細胞から選択されてもよく、いくつかの実施形態において、Ｈｕｈ７肝癌細胞である。
【０２６１】
本開示により提供される方法により特定の遺伝子の肝細胞における発現を抑制する場合に、提供されるオリゴヌクレオチド複合体における機能性オリゴヌクレオチドの用量は、当業者が得ようとする効果により容易に確定するものである。例えば、いくつかの実施形態において、前記オリゴヌクレオチド複合体は、ｓｉＲＮＡ複合体であり、提供されるｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ用量は、標的遺伝子の発現を低減するのに十分であり、１ｐＭ〜１μＭ、０．０１ｎＭ〜１００ｎＭ、又は０．０５ｎＭ〜５０ｎＭ又は０．０５ｎＭ〜約５ｎＭの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を達成するのに必要な量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細胞層の数、送達経路（局所か全身か）等を含む、各種の因子により変化する。送達部位における濃度は、標的細胞又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。
（発明の効果）
【０２６２】
いくつかの実施形態において、本開示により提供される複合体は、体内でより高いオリゴヌクレオチド送達効率、より低い毒性、よりよい安定性及び／又はより高い活性を有する。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の標的遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝内ＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の動物モデルにおける肝内ＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のヒト対象におけるＨＢＶ発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＨＢＶ表面抗原発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝内ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の動物モデルにおける肝内ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のヒト対象におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝内ＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の動物モデルにおける肝内ＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のヒト対象におけるＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、明らかなオフターゲット効果を示していない。オフターゲット効果は、例えば、標的遺伝子でない遺伝子の発現の抑制であってもよい。オフターゲット遺伝子発現の結合／抑制がオンターゲット遺伝子効果に比べて５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％のレベルを下回る場合、当該オフターゲット効果が顕著ではないと考えられている。
【０２６３】
本開示のいくつかの実施形態によれば、本開示の複合体は、ｓｉＲＮＡを肝臓に効果的に送達し、優れたＨＢＶ遺伝子発現抑制性質を示すことができる。例えば、低いオフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝臓における８７．４％〜９２．２％のＨＢＶ遺伝子発現を抑制する。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、Ｂ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原の発現を効果的に低下させ、３ｍｇ／ｋｇの用量で９６．９％のＨＢＶ表面抗原発現抑制率及び９５．４％のＨＢＶ  ＤＮＡ抑制率を達成することができる。いくつかの実施形態において、本発明により提供される複合体は、最長１４０日間の期間にわたって、低用量でＨＢＶ発現に対して優れた抑制作用を示す。
【０２６４】
本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供される複合体は、ｓｉＲＮＡを肝臓に効果的に送達し、優れたＨＢＶ遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、低いオフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝臓における少なくとも６９．３％、又は７８．１〜８９．１％のＨＢＶ遺伝子発現を抑制する。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、Ｂ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原の発現を効果的に低下させ、３ｍｇ／ｋｇの用量で９８．４％のＨＢＶ表面抗原発現抑制率及び９５．８％のＨＢＶ  ＤＮＡ抑制率を達成する。いくつかの実施形態において、参照複合体に比べて、本発明により提供される特異的複合体は、最長８４日間の期間にわたって、低用量でＨＢＶ発現に対して優れた抑制作用を示す。
【０２６５】
本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供される複合体は、ｓｉＲＮＡを肝臓に効果的に送達し、優れたＨＢＶ遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、低いオフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝臓における少なくとも４８．５％、又は７６．８〜８０．０％のＨＢＶ遺伝子発現を抑制することができる。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、さらに、Ｂ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原の発現を効果的に低下させ、ひいては３ｍｇ／ｋｇの用量で８４．６％のＨＢＶ表面抗原発現抑制率及び８５．６％のＨＢＶ  ＤＮＡ抑制率を達成する。いくつかの実施形態において、参照複合体に比べて、本発明により提供される複合体は、最長２１日間の期間にわたって、低用量でＨＢＶ発現に対してより高い抑制作用を示す。
【０２６６】
本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供される複合体は、ｓｉＲＮＡを肝臓に効果的に送達し、優れたＨＢＶ遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、低いオフターゲット効果を有するとともに、１ｍｇ／ｋｇの用量でＢ型肝炎モデルマウスの肝臓における少なくとも６０．１％、又は、１つの実施形態において、８０．７〜８４．５％のＨＢＶ  Ｘ遺伝子領域の遺伝子発現を抑制することができる。いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、さらに、Ｂ型肝炎モデルマウスにおけるＨＢＶ表面抗原の発現を効果的に低下させ、ひいては３ｍｇ／ｋｇの用量で９４．８％のＨＢＶ表面抗原発現抑制率及び９５．８％のＨＢＶ  ＤＮＡ抑制率を達成する。いくつかの実施形態において、参照複合体に比べて、本発明により提供される複合体は、最長５６日間の期間にわたって、低用量でＨＢＶ発現に対して優れた抑制作用を示す。
【０２６７】
本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供される複合体は、ｓｉＲＮＡを肝臓に効果的に送達し、優れたＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、１ｍｇ／ｋｇの用量で高脂血症モデルマウスの肝臓における少なくとも５７．３％のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現を抑制し、３ｍｇ／ｋｇの用量で、遺伝子抑制率が最大９０．４％である。いくつかの実施形態において、参照複合体に比べて、本開示により提供される複合体は、低用量と低使用頻度では、最長４９日間の期間にわたって優れたＡＮＧＰＴＬ３発現抑制と脂質低下作用を示す。
【０２６８】
本開示の１つの実施形態によれば、本開示により提供される複合体は、ｓｉＲＮＡを肝臓に効果的に送達し、優れたＡＰＯＣ３遺伝子発現抑制性質を示すことができ、例えば、３ｍｇ／ｋｇの用量で高脂血症モデルマウスの肝臓における少なくとも７５％のＡＰＯＣ３遺伝子発現を抑制する。いくつかの実施形態において、参照複合体に比べて、本開示により提供される複合体は、低用量と低使用頻度で、最長６５日間の期間にわたって優れた脂質抑制作用を示す。
【０２６９】
ある実施形態において、本開示に記載された複合体は、動物モデルにおいて低い毒性を示し、良好な安全性を示す。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の複合体について、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて有効濃度の１００倍まで（有効濃度を３ｍｇ／ｋｇとして）投与しても、明らかな毒性反応が認められない。
【０２７０】
上記例示から、本明細書により提供される複合体は、標的細胞表面の受容体に有効であり、負荷された活性剤を、受容体を発現する細胞に送達することが示される。また、複合分子がそれ以外の細胞表面の受容体およびそれ以外の活性剤に適応でき、これらの受容体を発現する細胞の活性剤を標的化することができると考えられる。
【０２７１】
＜キット＞
他の側面において、本明細書は、以上のような複合体を含むキットを提供する。
【０２７２】
いくつかの実施形態において、本明細書により提供されるキットは、１つの容器において複合体を含む。いくつかの実施形態において、本明細書により提供されるキットは、薬学的に許容できる添加剤を含む容器を含む。いくつかの実施形態において、本明細書により提供されるキットは、薬学的に許容できる添加剤、例えば、安定化剤又は防腐剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書により提供されるキットは、少なくとも１種の追加の治療剤を含む。いくつかの実施形態において、当該キットは、本開示に記載された複合体を含む治療剤と異なる少なくとも１種の追加の治療剤を容器に含む。いくつかの実施形態において、前記キットは、複合体と薬学的に許容できる添加剤又は他の成分（存在する場合）を混合するための説明書を含む。
【０２７３】
本開示のキットにおいて、前記複合体及び／又は薬学的に許容できる添加剤は、任意の形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍結乾燥形式として提供されてもよい。いくつかの実施形態において、複合体及び／又は薬学的に許容できる添加剤は、基本的にクリーン及び／又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示のキットで無菌水を提供する。
【実施例】
【０２７４】
以下に実施例により本開示を詳しく記述する。特に説明がない限り、以下の実施例で用いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ等の操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬＢｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載された方法を参照して行われる。
【０２７５】
ＨＥＫ２３９Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．２ｖ％シアノマイシン二重耐性物（ｃｙａｎｏｍｙｃｉｎ  ｂｉｒｅｓｉｓｔａｎｔ）（ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
【０２７６】
Ｈｕｈ７細胞は、中国科学院幹細胞バンクから購入され、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
【０２７７】
別に説明がない限り、以下の調製例１２〜調製例１５で合成されたｓｉＲＮＡ複合体で細胞をトランスフェクションした場合、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、具体的な操作については、メーカーにより提供される説明書を参照のこと。
【０２７８】
別に説明がない限り、以下で提供される試薬割合は、いずれも体積比（ｖ／ｖ）として計算される。
【０２７９】
別に説明がない限り、用いられる動物モデルは以下のとおりである。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス：北京維通利華実験動物技術有限公司から購入する。
ＳＤラット：北京維通利華実験動物技術有限公司により提供される。
ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７Ｂ／６Ｎ−Ｔｇ（１．２８ＨＢＶ）／Ｖｓｔ（ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ａ）：北京維通達生物技術有限公司から購入する。実験前にＣＯＩ＞１０４のマウス（以下、単に１．２８ｃｏｐｙマウスともいう）を選択した。
ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊ：北京大学医学部実験動物科学部から購入する。実験前にＳ／ＣｏＶ＞１０のマウスを選択した。
ＨＢＶトランスジェニックマウス：Ｍ−ＴｇＨＢＶと命名され、上海市公衆衛生センター動物部から購入され、トランスジェニックマウスの作製方法は、Ｒｅｎ  Ｊ．ら、Ｊ．  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ２００６，７８：５５１〜５６０に記載された。
ＡＡＶ−ＨＢＶトランスジェニックマウス：文献の方法（董小岩ら、Ｃｈｉｎ  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０１０，Ｍａｙ  ２５，２６（５）：６７９〜６８６）により調製された。ｒＡＡＶ８−１．３ＨＢＶ、Ｄ型（ａｙｗ）ウイルス（北京五加和分子医学研究所有限公司から購入され、１×１０１２ウイルスゲノム（ｖ．ｇ．）／ｍＬ、ロット番号２０１６１２３０１１）について、無菌ＰＢＳでｒＡＡＶ８−１．３ＨＢＶを５×１０１１ｖ．ｇ．／ｍＬに希釈し、マウス１匹あたり希釈されたｒＡＡＶ８−１．３ＨＢＶを２００μＬ注射した（即ち、マウス１匹あたり１×１０１１ｖ．ｇ．注射した）。ウイルスを注射した後の２８日目に、全てのマウスに対して眼窩採血（約１００μＬ）を行い、血清を回収してＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡを検出するために用いられた。
低濃度ＡＡＶ−ＨＢＶトランスジェニックマウス：実験前に、ウイルスを無菌ＰＢＳで１×１０１１ｖ．ｇ．／ｍＬに希釈し、マウス１匹あたり１００μＬのウイルスを注射し、即ち、マウス１匹あたり１×１０１０ｖ．ｇ．注射したこと以外、上記とほぼ同じモデリング方法を採用した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス：６〜８週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入する。
ｏｂ／ｏｂマウス：６〜８週齢、常州キャヴェンス実験動物有限公司から購入する。
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス：Ｂ６、ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂから購入する。
メタボリックシンドロームサル：全て雄性、北京大学分子医学研究所非ヒト霊長類研究センターにより提供される。
【０２８０】
（調製例１）Ｌ−９複合分子（複合分子１）の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子１（以下、Ｌ−９複合分子ともいう）を合成した。
【０２８１】
（１−１）ＧＡＬ−５の合成（Ｌ−９複合分子の末端セグメントの分子）
【０２８２】
【化３７】
2021509402.tif 000080
【０２８３】
（１−１ａ）ＧＡＬ−２の合成
１００．０ｇのＧＡＬ−１（Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩、ＣＡＳ番号：１７７２−０３−８、寧波弘翔生化公司から購入、４６３．８ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で５４０ｍｌの酢酸無水物（Ｅｎｏｘ社から購入、５５６５．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌反応した。反応液を１０Ｌの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを２Ｌの氷水で洗浄した後、完全に溶解させるまでアセトニトリル／トルエン混合溶剤（アセトニトリル：トルエンの体積比＝１：１）を加え、溶剤を蒸発乾固し、１３０．０ｇの白色固形製品ＧＡＬ−２を得た。
【０２８４】
（１−１ｂ）ＧＡＬ−３の合成
工程（１−１ａ）で得られたＧＡＬ−２（３５．１ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）２１３ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、２４．０ｇのＴＭＳＯＴｆ（ＣＡＳ番号：２７６０７−７７−８、マックリン社から購入、１０８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。
【０２８５】
反応液に４００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、１Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、均一に攪拌し、有機相を分離し、水相をジクロロエタンにより１回あたり３００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄してから、洗浄して得られた有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、２６．９ｇの淡黄色の粘稠な水飴状製品ＧＡＬ−３を得た。
【０２８６】
（１−１ｃ）ＧＡＬ−４の合成
工程（１−１ｂ）で得られたＧＡＬ−３（２６．９ｇ、８１．７ｍｍｏｌ）を１３６ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した４Å分子篩粉３０ｇを加え、９．０ｇの５−ヘキセン−１−オール（ＣＡＳ番号：８２１−４１−０、Ａｄａｍａｓ−ｂｅｔａ社から購入、８９．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、氷浴下で窒素保護下で９．０８ｇのＴＭＳＯＴｆ（４０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に３００ｍｌのジクロロエタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて１０分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、残りの水相を３００ｍｌのジクロロエタンで１回抽出し、全ての有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄してから、洗浄して得られた有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、４１．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ−４を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
【０２８７】
（１−１ｄ）ＧＡＬ−５の合成
工程（１−１ｃ）に記載された方法により得られたＧＡＬ−４（１４．９ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）を７７ｍｌのジクロロメタンと７７ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ１０３ｍｌの脱イオン水及び２９．７ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：７７９０−２８−５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１３８．８ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（ＣＡＳ番号：１４８９８−６７−０、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２３８ｍｇ、１．１４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液に３００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを約７．５に調整し、有機相を分離し、残りの水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、抽出して得られた有機相を捨てた。抽出して得られた水相を固形クエン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．８５ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ−５を得た。
【０２８８】
以下、上記方法により得られたＧＡＬ−５化合物を用い、以下のプロセス経路でＬ−９複合分子を合成した。
【０２８９】
【化３８】
2021509402.tif 000081
【０２９０】
（１−２）Ｍ−１１−Ｔ３の合成：
【０２９１】
【化３９】
2021509402.tif 000082
Ｊ−０（１．８８３ｇ、１０ｍｍｏｌ、アルファ・エイサー社から購入）を２５ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、トリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加えて氷水浴で０℃まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２ｈ反応させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を１８ｈ発泡乾燥させ、５．３４２ｇの固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３を得、さらに精製することなく、そのまま後の反応に用いた。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２２Ｆ９Ｎ４Ｏ３、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４７７．３５、実測値：４７７．６５。
【０２９２】
（１−３）Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒの合成：
【０２９３】
【化４０】
2021509402.tif 000083
Ｍ−１１−Ｔ３粗製品（５．３４２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、得られた反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５１８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させ、反応溶液を１回あたり２０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで２回洗浄し、さらに２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、７．７６３ｇの固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒを得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ３４Ｈ３６Ｆ９Ｎ４Ｏ３、［Ｍ＋Ｎａ］＋、理論値：７４１．２５、実測値：７４１．５３。固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒは、精製することなく、引き続き次のＭ−１８−Ｔｒの合成に使用した。
【０２９４】
（１−４）Ｍ−１８−Ｔｒの合成：
【０２９５】
【化４１】
2021509402.tif 000084
工程（１−３）で得られたＭ−１１−Ｔ３−Ｔｒ粗製品（７．７６３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０質量％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応させ、不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物に２００ｍｌの体積比１：１のＤＣＭ：メタノール混合溶剤を加え、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を発泡乾燥させて２．８８７ｇの純粋品Ｍ−１８−Ｔｒを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．４７−７．３９  （ｍ，６Ｈ），７．３２−７．２４  （ｍ，６Ｈ），７．１９−７．１２  （ｍ，３Ｈ），２．６０−２．４７  （ｍ，４Ｈ），２．４６−２．１９  （ｍ，１３Ｈ），１．７０−１．５５  （ｍ，４Ｈ），１．４０  （ｐ，Ｊ  ＝６．８  Ｈｚ，２Ｈ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２８Ｈ３９Ｎ４、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４３１．６５、実測値：４３２．６１。
【０２９６】
（１−５）Ｌ−５−Ｔｒの合成：
【０２９７】
【化４２】
2021509402.tif 000085
工程（１−４）で得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）と工程（１−１）で得られたＧＡＬ−５（６．９３ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、Ｎ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）及び４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。２００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して７．４９ｇの純粋品Ｌ−５−Ｔｒを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．８３−７．１０  （ｍ，４Ｈ），７．６７−７．６０  （ｍ，１Ｈ），７．４４−７．３４  （ｍ，６Ｈ），７．３３−７．２４  （ｍ，６Ｈ），７．２０−７．１５  （ｍ，３Ｈ），５．２２  （ｓ，３Ｈ），４．９７  （ｄ，Ｊ  ＝１１．３  Ｈｚ，３Ｈ），４．４９  （ｄ，Ｊ  ＝８．４  Ｈｚ，３Ｈ），４．０６−３．０７  （ｍ，９Ｈ），３．９５−３．８３  （ｍ，３Ｈ），３．７７−３．６４  （ｍ，３Ｈ），３．４５−３．３５  （ｍ，３Ｈ），３．１２−２．８７  （ｍ，８Ｈ），２．３０−２．１５  （ｍ，３Ｈ），２．１１−１．９８  （ｍ，２２Ｈ），１．９５−１．８４  （ｍ，１１Ｈ），１．８１−１．６１  （ｍ，１４Ｈ），１．５４−１．３６  （ｍ，１４Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７１８．８１、実測値：１７１８．０３。
【０２９８】
（１−６）Ｌ−８の合成：
【０２９９】
【化４３】
2021509402.tif 000086
工程（１−５）で得られたＬ−５−Ｔｒ（５．９４ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させ、得られた反応液に１００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８となるように調節し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。精製には、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．２６ｇの純粋品Ｌ−８を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  ７．８４  （ｄ，Ｊ  ＝９．０  Ｈｚ，３Ｈ），７．２７−７．２３  （ｍ，１Ｈ），７．１３−７．１８  （ｍ，１Ｈ），５．２２  （ｄ，Ｊ  ＝３．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．９７  （ｄｄ，Ｊ  ＝１１．３，３．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．４８  （ｄ，Ｊ  ＝８．４  Ｈｚ，３Ｈ），４．０９−３．９８  （ｍ，９Ｈ），３．８８  （ｄｄ，Ｊ  ＝１９．３，９．３  Ｈｚ，３Ｈ），３．７５−３．６６  （ｍ，３Ｈ），３．４４−３．３８  （ｍ，３Ｈ），３．１７−３．３０  （ｍ，４Ｈ），３．１０−２．９７  （ｍ，４Ｈ），２．３５−２．２０  （ｍ，６Ｈ），２．１５−２．０８  （ｍ，９Ｈ），２．０７−１．９８  （ｍ，１３Ｈ），１．９４−１．８７  （ｍ，９Ｈ），１．８１−１．７４  （ｍ，９Ｈ），１．６５−１．４２  （ｍ，１８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７７．５９、実測値：１４７７．２３。
【０３００】
（１−７ａ）Ａ−１の合成
【０３０１】
【化４４】
2021509402.tif 000087
ＤＭＴｒＣｌ（４，４’−ビスメトキシトリチルクロリド、３８．１２ｇ、１１２．５ｍｍｏｌ）を４５０ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、ＤＬ−グリセリン酸カルシウム水和物（１２．８８ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で２２ｈ反応させ、得られた反応液を濾過し、ケーキを２００ｍｌのＤＣＭでリンスし、濾液を乾燥させるまで減圧濃縮し、残存物を５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩（ｐＨ＝７〜８）で１回あたり２００ｍｌで２回洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．３５〜１：１：１：０．５５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、２００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で１回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩減圧乾燥させ、２０．７ｇの白色固形製品Ａ−１を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．４６  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝６．５，２．３，１．１  Ｈｚ，１Ｈ），７．４０−７．２８  （ｍ，７Ｈ），６．８９−６．８１  （ｍ，４Ｈ），４．８４  （ｄ，Ｊ  ＝５．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−４．２４  （ｍ，１Ｈ），４．２９  （ｓ，６Ｈ），３．９２  （ｄｄ，Ｊ  ＝１２．４，７．０  Ｈｚ，１Ｈ），３．６７  （ｄｄ，Ｊ  ＝１２．３，７．０  Ｈｚ，１Ｈ），２．５２  （ｑ，Ｊ  ＝６．３  Ｈｚ，６Ｈ），１．０３  （ｔ，Ｊ  ＝６．３  Ｈｚ，９Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ２３Ｏ６、［Ｍ−Ｈ］−、理論値：４０７．１５、実測値：４０６．９２。
【０３０２】
（１−７ｂ）Ｌ−７の合成：
【０３０３】
【化４５】
2021509402.tif 000088
工程（１−６）で得られたＬ−８（２．２６２ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）及び工程（１−７ａ）で得られたＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を混合し、１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリルオキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させ、１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、全ての有機相をあわせ、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、４．９００ｇの粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．３３６ｇの純粋品Ｌ−７を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．９０−７．７８  （ｍ，４Ｈ），７．７５−７．６４  （ｍ，１Ｈ），７．３８−７．１８  （ｍ，９Ｈ），６．９１−６．８３  （ｍ，４Ｈ），５．２５−５．１０  （ｍ，４Ｈ），４．９７  （ｄｄ，Ｊ  ＝１１．２，３．２  Ｈｚ，３Ｈ），４．４８−４．３０  （ｍ，４Ｈ），４．０２  （ｓ，９Ｈ），３．９３−３．８４  （ｍ，３Ｈ），３．７６−３．６６  （ｍ，９Ｈ），３．４５−３．３５  （ｍ，３Ｈ），３．２４−２．９８  （ｍ，１０Ｈ），２．３０−２．２０  （ｍ，２Ｈ），２．１１−１．８８  （ｍ，３１Ｈ），１．８０−１．４０  （ｍ，２８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９０Ｈ１２８Ｎ７Ｏ３５、［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１５６４．６５、実測値：１５６４．８８。
【０３０４】
（１−８）Ｌ−９の合成：
【０３０５】
【化４６】
2021509402.tif 000089
工程（１−７ｂ）で得られたＬ−７（２．３００ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．３７８ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．４６２ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を混合して１３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＰＥＡ（０．８１４ｇ、６．３０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌した。５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で得られた反応液を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して２．７７４ｇの粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、６０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．８７４ｇの純粋品Ｌ−９複合分子（複合分子１）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  ８．５８  （ｄ，Ｊ  ＝４．２  Ｈｚ，１Ｈ），７．９４−７．８２  （ｍ，３Ｈ），７．４１−７．２９  （ｍ，５Ｈ），７．２２  （ｄ，Ｊ  ＝８．１  Ｈｚ，５Ｈ），６．８９  （ｄ，Ｊ  ＝８．３  Ｈｚ，４Ｈ），５．４９−５．３７  （ｍ，１Ｈ），５．２１  （ｄ，Ｊ  ＝３．０  Ｈｚ，３Ｈ），４．９７  （ｄ，Ｊ  ＝１１．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．４９  （ｄ，Ｊ  ＝８．２  Ｈｚ，３Ｈ），４．０２  （ｓ，９Ｈ），３．８８  （ｄｄ，Ｊ  ＝１９．４、９．４  Ｈｚ，３Ｈ），３．７７−３．６５  （ｍ，９Ｈ），３．５０−３．３９  （ｍ，６Ｈ），３．１１−２．９０  （ｍ，５Ｈ），２．６１−２．５４  （ｍ，４Ｈ），２．４７−２．４１  （ｍ，２Ｈ），２．２６−２．１７  （ｍ，２Ｈ），２．１５−１．９５  （ｍ，２２Ｈ），１．９２−１．８４  （ｍ，９Ｈ），１．８０−１．７０  （ｍ，１０Ｈ），１．６５−１．３５  （ｍ，１７Ｈ）、１．３１−１．１９  （ｍ，４Ｈ），０．９６  （ｔ，Ｊ  ＝７．１  Ｈｚ，９Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９４Ｈ１３２Ｎ７Ｏ３８、［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１６６４．７２、実測値：１６６５．０３。得られたＬ−９複合分子の構造が式（５０３）に示される。
【０３０６】
（調製例２）Ｐ−９複合分子（複合分子２）の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子２（以下、Ｐ−９複合分子ともいう）を合成した。
【０３０７】
【化４７】
2021509402.tif 000090
【０３０８】
（２−１）ＧＡＬ５−Ｃ４−１の合成
４０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに上記（１−１）に記載された方法により得られたＧＡＬ−５（１３．４３ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、４−アミノ酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩（５．８７ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１３．６５ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１１．６３ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を加え、均一に溶解させた後室温で５時間攪拌反応させた。得られた反応液に３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで単離した水相を１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、洗浄して得られた有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄してから、洗浄して得られた有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して３０．３ｇの油状物粗製品ＧＡＬ５−Ｃ４−１を得、そのまま次の反応を行った。
【０３０９】
（２−２）ＧＡＬ５−Ｃ４−２の合成
工程（２−１）で得られたＧＡＬ５−Ｃ４−１粗製品（３０．３ｇ、３０ｍｍｏｌ）を１８０ｍｌギ酸に溶解させ、室温で１６時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発し、粗製品をカラムクロマトグラフィーにより精製し（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出した）、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計１４．８４ｇの目的生成物ＧＡＬ５−Ｃ４−２を得た。
【０３１０】
（２−３）Ｐ−６の合成：
工程（１−４）に記載された方法により得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）と工程（２−２）で得られたＧＡＬ５−Ｃ４−２（８．２４ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにＮ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。２００ｍｌのジクロロメタンで得られた反応液を希釈し、それぞれ１００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計８．２７ｇの純粋品Ｐ−６を得た。
【０３１１】
（２−４）Ｐ−７の合成：
上記（２−３）で得られたＰ−６（６．８２ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させた。得られた反応液に１００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８となるように調節し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルで精製し、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計４．８２ｇのＰ−７を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ７８Ｈ１２７Ｎ１０Ｏ３３、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７３２．９１、実測値：１７３５．７３。
【０３１２】
（２−５）Ｐ−８の合成：
【０３１３】
【化４８】
2021509402.tif 000091
Ｐ−７（２．６５３ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾトリアゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、全ての有機相をあわせ、１０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計２．７９３ｇの純粋品Ｐ−８を得た。
【０３１４】
（２−６）Ｐ−９の合成：
Ｐ−８（４９０ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（６９ｍｇ、０．６９３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、６８ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ）を混合して２．３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１４９ｍｇ、１．１５５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２１ｈ攪拌反応させた。得られた反応液を５０ｍｌのジクロロメタンで希釈し、さらに１００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、８０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計２００ｍｇの純粋品Ｐ−９複合分子（複合分子２）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０６Ｈ１５３Ｎ１０Ｏ４１、［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１９２１．０５、実測値：１９２０．９７。得られたＰ−９複合分子の構造が式（５０４）に示される。
【０３１５】
（調製例３）Ｒ−４複合分子（複合分子３）の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子３（以下、Ｒ−４複合分子ともいう）を合成した。
【０３１６】
【化４９】
2021509402.tif 000092
【０３１７】
（３−１）ＧＡＬ−Ｃ７−１の合成
工程（１−１ｂ）に記載された方法により得られたＧＡＬ−３（２６．４ｇ、８０．２ｍｍｏｌ）を１３４ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、６０ｇの４Å分子篩粉を加え、さらに７−オクテン−１−オール（１１．３ｇ、８８．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ、ＴＭＳＯＴｆ、８．９ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて洗浄し、有機相を分離し、残りの水相を１００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出した。全ての有機相をあわせ、２５０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄してから、洗浄して得られた有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して３３．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ−Ｃ７−１を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
【０３１８】
（３−２）ＧＡＬ−Ｃ７−２の合成
工程（３−１）で得られたＧＡＬ−Ｃ７−１（３３．３ｇ、７２．８ｍｍｏｌ）を１６０ｍｌのジクロロメタンと１６０ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ２１６ｍｌの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム（６２．３ｇ、２９１．２ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（４９８ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を加えて自然に室温まで昇温し２３時間攪拌反応させた。得られた反応液に２００ｍｌの水を加えて希釈し、攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを７．５に調節し、有機相を分離し、残りの水相をジクロロメタンで３回抽出し、抽出して得られた有機相を捨て、抽出して得られた水相を固形クエン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出した）により精製して２２．４ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ−Ｃ７−２を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ３２ＮＯ１１、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４７６．５０、実測値：４７５．９４。
【０３１９】
（３−３）Ｒ−１の合成：
工程（１−４）に記載された方法により得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）とＧＡＬ−Ｃ７−２（７．３６ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにＮ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。得られた反応液を２００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、それぞれ１００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して７．８２ｇの純粋品Ｒ−１を得た。
【０３２０】
（３−４）Ｒ−２の合成：
Ｒ−１（６．２３ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させた。得られた反応液に１００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８となるように調節し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品２００〜３００メッシュの順相シリカゲルで精製し、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．４９ｇの純粋品Ｒ−２を得た。
【０３２１】
（３−５）Ｒ−３の合成：
Ｒ−２（２．３９１ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリルオキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出した。全ての有機相をあわせ、１０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩減圧乾燥させ粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．６４２ｇの純粋品Ｒ−３を得た。
【０３２２】
（３−６）Ｒ−４の合成：
Ｒ−３（７９５ｍｇ、０．４０７４ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８２ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１００ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１００ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８ｈ攪拌反応させた。５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で得られた反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、全ての有機相をあわせ、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、３０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して５０５ｍｇの純粋品Ｒ−４複合分子（複合分子３）を得た。得られたＲ−４複合分子の構造が式（５０７）に示される。
【０３２３】
（調製例４）ＬＡ−４複合分子（複合分子４）の調製
以下のプロセス経路により、複合分子４（以下、ＬＡ−４複合分子ともいう）を合成できると予期した。得られるＬＡ−４複合分子の構造が式（５１２）に示される。
【０３２４】
【化５０】
2021509402.tif 000093
【０３２５】
（調製例５）ＬＢ−４複合分子（複合分子５）の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子５（以下、ＬＢ−４複合分子ともいう）を合成した。
【０３２６】
【化５１】
2021509402.tif 000094
【０３２７】
（５−１）ＬＢ−１の合成：
工程（１−６）に記載された方法により得られたＬ−８（５．０ｇ、３．３８６ｍｍｏｌ）、アジピン酸無水物（８７０ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、８２７ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）を混合して１３０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２．２ｇ、１６．９３１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で４ｈ攪拌反応させた。得られた反応液に７０ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで４回抽出し、全ての有機相をあわせ、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．２〜１：１：１：１で勾配溶出した。溶剤を減圧蒸発乾固して４．２６７ｇの純粋品ＬＢ−１を得た。
【０３２８】
（５−２）ＬＢ−２の合成：
工程（５−１）に記載された方法により得られたＬＢ−１（４．６９７ｇ、２．７５３ｍｍｏｌ、２バッチの生成物をあわせたもの）、３−アミノ−１，２−プロパンジオール（３１３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、９５３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（７００ｍｇ、６．８８４ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのアセトニトリルと３ｍｌのメタノールの混合物に順に加え、室温で一晩攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発し、残存物をカラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン：メタノール＝１：０．０７〜１：０．５で勾配溶出した）により精製し、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、３．２７ｇの目的生成物ＬＢ−２を得た。
【０３２９】
（５−３）ＬＢ−３の合成：
ＬＢ−２（２．２７ｇ、１．３５３ｍｍｏｌ）を１４ｍｌの無水ピリジンで溶解させた。さらに４，４’−ビスメトキシトリチルクロリド（６８８ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩攪拌反応させた。１５０ｍｌのメタノールを加えてクエンチングし反応、乾燥させるまで溶剤を蒸発した。残存物をカラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン：メタノール＝１：０．０５〜１：０．２で勾配溶出した）により精製し、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、１．６４７ｇの目的生成物ＬＢ−３を得た。
【０３３０】
（５−４）ＬＢ−４の合成：
ＬＢ−３（８２２ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８３ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１０２ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＰＥＡ（２７０ｍｇ、２．０７５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で一晩攪拌反応させた。得られた反応液を０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で３回洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり２ｍｌで３回抽出した。全ての有機相をあわせ、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、５ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エーテルでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：２０で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して７８７ｍｇの構造が式（５１３）に示される純粋品ＬＢ−４複合分子（複合分子５）を得た。
【０３３１】
（調製例６）Ｖ−７複合分子（複合分子６）の合成
以下のプロセス経路により、構造が式（５１４）に示される複合分子６（以下、Ｖ−７複合分子ともいう）を合成できると予期した。
【０３３２】
【化５２】
2021509402.tif 000095
【０３３３】
（調製例７）Ｗ−７複合分子（複合分子７）の調製
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子７（以下、Ｗ−７複合分子ともいう）を合成した。
【０３３４】
【化５３】
2021509402.tif 000096
【０３３５】
（７−１）Ｗ−１の合成：
Ｗ−０（２．０２４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにトリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、氷浴で０℃程度まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２ｈ反応させた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を１８ｈ発泡乾燥させ、５．８３５ｇの固形粗製品Ｗ−１を得た。
【０３３６】
（７−２）Ｗ−２の合成：
Ｗ−１粗製品（５．８３５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５１８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させた。得られた反応液を２０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで２回洗浄し、さらに２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、８．０１２ｇの固形粗製品Ｗ−２を得た。固形粗製品Ｗ−２は、処理されることなく、次の脱保護反応を行った。
【０３３７】
（７−３）Ｗ−３の合成：
Ｗ−２粗製品（８．０１２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、さらに１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０ｗｔ％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物に２００ｍｌの体積比１：１のＤＣＭ−メタノール混合溶剤を加え、得られた有機相を５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで３回抽出した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで残存物を一晩発泡乾燥させ、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させて３．０６２ｇの純粋品Ｗ−３を得た。
【０３３８】
（７−４）Ｗ−４の合成：
Ｗ−３（６７５ｍｇ、１．５１７ｍｍｏｌ）とＧＡＬ−Ｃ７−２（２．６０ｇ、５．４６ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．５７ｇ、１２．１４ｍｍｏｌ）を加え、最後に３−ジエトキシホスホリルオキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、１．８１６ｇ、６．０４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２．５ｈ攪拌反応させた。得られた反応液を１００ｍｌのジクロロメタンで希釈した。それぞれ８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び８０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品を２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して１．６１０ｇの純粋品Ｗ−４を得た。
【０３３９】
（７−５）Ｗ−５の合成：
Ｗ−４（１．６１ｇ、０．８８６ｍｍｏｌ）を１２５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸（３．５ｍｌ、４２．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ｈ反応させた。得られた反応液に１５０ｍｌピリジンを加えて中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．２６ｇの純粋品Ｗ−５を得た。
【０３４０】
（７−６）Ｗ−６の合成：
Ｗ−５（１．２５ｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）と工程（１−７ａ）に記載された方法により得られたＡ−１（１．２１ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を混合して１２ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリルオキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、０．７１２ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（０．６１５ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３ｈ攪拌反応させた。８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出した。全ての有機相をあわせ、１０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、１８５ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．１〜１：１：０．７で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．５７ｇの純粋品Ｗ−６を得た。
【０３４１】
（７−７）Ｗ−７の合成：
Ｗ−６（１．２３８ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．１８９ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．２３１ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を混合して７ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＥＡ（０．４０７ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌反応させた。得られた反応液を５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で洗浄し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出した。全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、３０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．０３３ｇの純粋品Ｗ−７複合分子（複合分子７）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０１Ｈ１４６Ｎ７Ｏ３８、［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１７６３．９２、実測値：１７６３．２１。得られたＷ−７複合分子の構造が式（５１５）に示される。
【０３４２】
（調製例８）Ｘ−７複合分子（複合分子８）の調製
以下のプロセス経路により、構造が式（５２１）に示される複合分子８（以下、Ｘ−７複合分子ともいう）を合成できると予期した。
【０３４３】
【化５４】
2021509402.tif 000097
【０３４４】
（調製例９）Ｋ−３複合分子（比較複合分子１）の調製
本調製例では、以下の方法に従い、Ｋ−３複合分子（以下、比較複合分子１ともいう）を合成した。
【０３４５】
【化５５】
2021509402.tif 000098
【０３４６】
（９−１）Ｋ−１の合成：
６０ｍｌのジクロロメタンに工程（１−７ａ）に記載された方法により得られたＡ−１（３．０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（６．２ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、３．９ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌反応させた後、上記溶液をＫ−０（５．６ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）に加え、室温で１時間５０分間反応させた。反応液を３０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注入し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで３回抽出した。全ての有機相をあわせ、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に濾過濃縮した。粗製品をカラムで精製し、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１０：２：０．１〜４：４：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させ、２．２ｇの白色固形製品Ｋ−１を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８．０２  （ｓ，１Ｈ），７．４３  （ｄ，Ｊ  ＝７．８  Ｈｚ，２Ｈ），７．３４−７．１７  （ｍ，７Ｈ），６．８７  （ｄ，Ｊ  ＝８．６  Ｈｚ，４Ｈ），４．０５  （ｄ，Ｊ  ＝５．２  Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．２０−３．０１  （ｍ，５Ｈ），２．６０−２．３８  （ｍ，１２Ｈ），１．６０−１．３９  （ｍ，８Ｈ），１．２４  （ｓ，１Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ３３Ｈ４７Ｎ４Ｏ５、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：５７９．３５、実測値：５７９．２６。
【０３４７】
（９−２）Ｋ−２の合成：
３ｍｌのジクロロメタンに（１−１）に記載された方法により得られたＧＡＬ−５（４８３ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）、３−ジエトキシホスホリルオキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（３５９ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、３１０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した後、Ｋ−１（１７４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間反応させた。反応液を１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注入し、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、全ての有機相をあわせ、１０ｍｌの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に濾過濃縮した。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、ジクロロメタン：メタノール＝２０：１で溶出し、溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、真空油ポンプで乾燥発泡させ、２０５ｍｇの黄色固形製品Ｋ−２を得た。
【０３４８】
（９−３）Ｋ−３の合成：
１．１ｍｌのジクロロメタンにＫ−２（２０５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（２２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、７１ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応させた。反応液を０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩溶液で１回あたり０．５ｍｌで３回洗浄し、１回あたり洗浄して得られた水相を０．５ｍｌのジクロロメタンで１回逆抽出した。全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を濃縮除去し、真空油ポンプで乾燥発泡させ、２１８ｍｇの淡黄色固形製品Ｋ−３複合分子（比較複合分子１）を得た。
【０３４９】
（調製例１０）本調製例は、（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子（比較複合分子２）の合成を説明するためのものである
本調製例では、ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１における実施例１〜４に記載された調製方法により、構造が下式に示される化合物４７（本明細書では、（ＧａｌＮＡｃ）３複合分子（比較複合分子２）という）を合成した。
【０３５０】
【化５６】
2021509402.tif 000099
【０３５１】
（調製例１１）本調製例は、ＦＩＮ−２複合分子（比較複合分子３）の調製を説明するためのものである
本調製例では、Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１５，１６，９０３−９０８に記載された調製方法を参照し、以下のプロセス経路により、ＦＩＮ−２複合分子（比較複合分子３）を合成した。
【０３５２】
（１１−１）ＰＲＯ−１０化合物の合成
【０３５３】
【化５７】
2021509402.tif 000100
【０３５４】
（１１−１−１）ＰＲＯ−７の合成
２．９３ｇのＰＲＯ−６（Ｌ−ヒドロキシプロリン、ＣＡＳ番号：５１−３５−４、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２２．４ｍｍｏｌ）を２２．５ｍｌの１，４−ジオキサン（１，４−ｄｉｏｘａｎｅ）に溶解させ、３４ｍｌの１０％（ｗ／ｗ）Ｎａ２ＣＯ３の水溶液を加え、６．９５４ｇのＦｍｏｃ−Ｃｌ（クロロギ酸−９−フルオレニルメチル、ＣＡＳ番号：２８９２０−４３−６、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２６．８ｍｍｏｌ）を５６．５ｍｌの１，４−ジオキサンに溶解させ、氷浴下で反応混合物に加え、自然に室温まで昇温し一晩反応させた。反応液を１５０ｍｌの氷水に注入し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで１回あたり１００ｍｌで３回抽出し、得られた有機相を捨て、残りの水相を濃ＨＣｌでｐＨ≦５となるように調節し、１００ｍｌの酢酸エチルで２回抽出し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固して７．８３ｇの白色泡状固形製品ＰＲＯ−７を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９１  （ｔ，Ｊ  ＝７．２  Ｈｚ，２Ｈ），７．６７  （ｄ，Ｊ  ＝７．５  Ｈｚ，２Ｈ），７．４８−７．３９  （ｍ，２Ｈ），７．３８−７．２７  （ｍ，２Ｈ），５．１７  （ｓ，１Ｈ），４．２７  （ｓ，２Ｈ），４．２３−４．１１  （ｍ，２Ｈ），３．５５−３．４１  （ｍ，３Ｈ），２．３１−２．１０  （ｍ，１Ｈ），２．０８−１．８８  （ｍ，１Ｈ）．  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ）  Ｃ２０Ｈ１９ＮＯ５  ［Ｍ−Ｈ］−３５２．１１９０、実測値３５２．１０３３．
【０３５５】
（１１−１−２）ＰＲＯ−８の合成
７．８３ｇのＰＲＯ−７（２２．２ｍｍｏｌ）を８０ｍｌのＴＨＦに溶解させ、油浴で６５℃に加熱し、還流状態で３６．６ｍｌの２ｍｏｌ／ＬのＢＨ３−Ｍｅ２ＳのＴＨＦ溶液（ＣＡＳ番号１３２９２−８７−０、百霊威（Ｊ＆Ｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社から購入、７３．２ｍｍｏｌ）を加え、３時間還流反応を続けた。反応液を流出させ、メタノールで残りの固体を溶解させ、攪拌下で反応液に気体がなくなるまでメタノールを加えてから３０分間攪拌し続け、溶剤を減圧留去した後、残存物を石油エーテルで３回精製して７．１ｇの白色固形生成物ＰＲＯ−８を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９１  （ｔ，Ｊ  ＝６．７  Ｈｚ，２Ｈ），７．６７  （ｄ，Ｊ  ＝７．２  Ｈｚ，２Ｈ），７．４９−７．３９  （ｍ，２Ｈ），７．３８−７．２６  （ｍ，２Ｈ），５．１８  （ｄｄ，Ｊ  ＝６．１，３．８  Ｈｚ，１Ｈ），４．２８  （ｓ，２Ｈ），４．２３−４．１３  （ｍ，２Ｈ），３．５５−３．３８  （ｍ，２Ｈ），２．３２−２．１１  （ｍ，１Ｈ），２．０８−１．８９  （ｍ，１Ｈ）．  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ）  Ｃ２０Ｈ２１ＮＯ４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋３６２．１３６８、実測値３６２．１０１２．
【０３５６】
（１１−１−３）ＰＲＯ−９の合成
７．１ｇのＰＲＯ−８（２１ｍｍｏｌ）を１００ｍｌピリジンに溶解させ、１４．２ｇのＤＭＴｒ−Ｃｌ（４，４’−ビスメトキシトリチルクロリド、４２ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌反応させた。溶剤を減圧留去し、粗製品を酢酸エチルで溶解した後に塩類不純物を濾過除去し、溶剤を減圧留去した後、シリカゲルカラムで残存物を精製した。精製のために、ＤＣＭに溶解させた粗製品を、アルカリ化のためにピリジンで前処理されたシリカゲルカラムに負荷した。１％（ｖ／ｖ）ピリジンを含むＤＣＭでＤＭＴｒ−Ｃｌを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、８．２ｇの白色固形生成物ＰＲＯ−９を得た。ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ）  Ｃ４１Ｈ３９ＮＯ６  ［Ｍ＋Ｎａ］＋６６４．２６７５、実測値６６４．２３４８，Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（ロット番号ＪＪＳ１６０３２４−１）純度９４．２０％。
【０３５７】
（１１−１−４）ＰＲＯ−１０の合成
８．２ｇのＰＲＯ−９（１２．８ｍｍｏｌ）を６４ｍｌのＤＭＦに溶解させ、４０ｍｌのピペリジン（３８４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌反応させた。反応液を３００ｍｌの氷水に注入し、酢酸エチルで１回あたり１５０ｍｌで３回抽出し、得られた有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で洗浄した後、洗浄して得られた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後、残存物をシリカゲルカラムで精製し、精製のために、ＤＣＭに溶解させた粗製品を、アルカリ化のためにピリジンで前処理されたシリカゲルカラムに負荷した。１％（ｖ／ｖ）ピリジンを含むＤＣＭでＦｍｏｃを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、４．６５ｇの白色固形生成物ＰＲＯ−１０を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．４０  （ｄ，Ｊ  ＝７．２  Ｈｚ，２Ｈ），７．３５−７．１８  （ｍ，７Ｈ），６．９３−６．８４  （ｍ，４Ｈ），４．５６  （ｄ，Ｊ  ＝３．９  Ｈｚ，１Ｈ），４．１２  （ｓ，１Ｈ），３．７４  （ｓ，６Ｈ），３．４６−３．３７  （ｍ，１Ｈ），２．８８  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝１８．５，１０．０，５．５  Ｈｚ，２Ｈ），２．７５  （ｄｄ，Ｊ  ＝８．７，５．８  Ｈｚ，１Ｈ），２．６２  （ｄｄ，Ｊ  ＝１１．０，２．７  Ｈｚ，１Ｈ），１．７４−１．６５  （ｍ，１Ｈ），１．４０  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝１２．９，８．５，５．９  Ｈｚ，１Ｈ），ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ）  Ｃ２６Ｈ２９ＮＯ４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋４４２．１９９４、実測値４４２．１９９９，Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（ロット番号ＪＪＳ１６０３２９−１）純度９７．０７％。
【０３５８】
（１１−２）ＦＩＮ−１の合成
【０３５９】
【化５８】
2021509402.tif 000101
（１−１）に記載された方法により得られたＧＡＬ−５（４．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、３．９ｇのＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＣＡＳ番号：７０８７−６８−５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、３０ｍｍｏｌ）及び３．８ｇのＨＢＴＵ（ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ、Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＣＡＳ番号：９４７９０−３７−２、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１１ｍｍｏｌ）を順に加え、室温で１０分間攪拌して反応液を得た。工程（１２−４）で得られたＰＲＯ−１０（４．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を４０ｍｌＤＭＦに溶解させた後、上記反応液に加え、反応液に無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、室温で２時間攪拌した。反応液を１２０ｍｌの氷水に注入し、酢酸エチルで１回あたり６０ｍｌで３回抽出し、得られた有機相をあわせ、それぞれ２０ｍｌの水、２０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、洗浄して得られた有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去し、残存物をシリカゲルカラムで精製した。精製のために、サンプルを、アルカリ化のためにピリジンで前処理されたシリカゲルカラムに負荷した。１％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン及び１％（ｖ／ｖ）メタノールを含むジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液で溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．５ｇの淡黄色泡状固形製品ＦＩＮ−１を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．８３  （ｄ，Ｊ  ＝９．２  Ｈｚ，１Ｈ），７．３２  （ｔ，Ｊ  ＝６．６  Ｈｚ，４Ｈ），７．２０  （ｔｄ，Ｊ  ＝８．９，３．５  Ｈｚ，５Ｈ），６．９３−６．８４  （ｍ，４Ｈ），５．２１  （ｄ，Ｊ  ＝３．２  Ｈｚ，１Ｈ），５．０４−４．９０  （ｍ，２Ｈ），４．４９  （ｓ，１Ｈ），４．４０  （ｄ，Ｊ  ＝４．４  Ｈｚ，０．８Ｈ），４．３１  （ｄ，Ｊ  ＝５．０  Ｈｚ，０．２Ｈ），４．１５  （ｓ，１Ｈ），４．０３  （ｓ，３Ｈ），３．９３  （ｓ，１Ｈ），３．７４  （ｓ、７Ｈ）、３．５９  （ｄｔ，Ｊ  ＝１２．０，６．０  Ｈｚ，１Ｈ），３．５０−３．４０  （ｍ，１Ｈ），３．３９−３．２５  （ｍ，３Ｈ），３．１３  （ｄｄ，Ｊ  ＝８．９，５．２  Ｈｚ，１Ｈ），３．００  （ｄｑ，Ｊ  ＝９．３，５．３，４．３  Ｈｚ，１Ｈ），２．２２  （ｓ，２Ｈ），２．０７  （ｓ，３Ｈ），１．９９  （ｓ，３Ｈ），１．９０  （ｓ，４Ｈ），１．７４  （ｓ，３Ｈ），１．５０  （ｓ，３Ｈ），１．３６  （ｓ，１Ｈ）。Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（ロット番号ＬＪ１６０４２２）純度９５．４５％。
【０３６０】
（１１−３）ＦＩＮ−２の合成
【０３６１】
【化５９】
2021509402.tif 000102
工程（１１−２）で得られたＦＩＮ−１（３．０ｇ、３．５３ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、窒素保護下で２．１３ｇのＰＡ（ビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィン、Ａｄａｍａｓ社、商品番号１１３５６Ｂ、７．０６ｍｍｏｌ）、３４６ｍｇのテトラゾール（ＣＡＳ番号：２８８−９４−８、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、４．９４ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌反応させ、１０ｍｌのＤＭＦを追加し、１時間攪拌反応させ続けた。溶剤を減圧留去した後、残存物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製のために、ＤＣＭに溶解させた粗製品を、アルカリ化のためにピリジンで前処理されたシリカゲルカラムに負荷し、酢酸エチルで溶出させ、溶出液を回収し、溶剤を減圧留去し、４．５ｇの無色シロップ状粗製品を得た。完全に溶解させるまで粗製品を５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液で溶解させ、（Ｃ−１８、３３０ｇ、３００Å）中圧精製カラムでサンプルを精製し、カラムを予め１％（ｖ／ｖ）ピリジンを含むアセトニトリル溶液でアルカリ化し、勾配溶出して製品を回収し、溶剤を減圧留去して２．２ｇの白色粉末製品ＦＩＮ−２複合分子（比較複合分子３）を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １４８．０４，１４７．９４，１４７．６２，１４７．１９、リンスペクトル純度９２％、Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ純度９０．５４％。
【０３６２】
（調製例１２）本調製例は、Ｚ−４複合分子（複合分子１５３）の調製を説明するためのものである
本調製例では、以下の方法に従い、複合分子１５３（以下、Ｚ−４複合分子ともいう）を合成した。
【０３６３】
【化６０】
2021509402.tif 000103
【０３６４】
（１２−１）Ｚ−１の合成：
工程（７−３）に記載された方法により得られたＷ−３（１．５０ｇ、３．３７ｍｍｏｌ）と工程（２−２）に記載された方法により得られたＧＡＬ５−Ｃ４−２（７．１８ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を混合して３４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（３．４８ｇ、２６．９６ｍｍｏｌ）を加え、その後、３−ジエトキシホスホリルオキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、４．０４ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４．５時間攪拌反応させた。得られた反応液を１００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び８０ｍｌの飽和食塩水でそれぞれ有機相を洗浄し、全ての有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、粗製品を２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝３０：１〜１５：１で勾配溶出し、溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して３．９７ｇの純粋品Ｚ−１を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９８Ｈ１４３Ｎ１０Ｏ３３、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９８７．９８、実測値：１９８７．９０。
【０３６５】
（１２−２）Ｚ−２の合成：
Ｚ−１（３．９７ｇ、２．００ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸（１０．９４１ｇ、８４．８５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応させた。得られた反応液を中性になるまでピリジンを加えて中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ、１０％ピリジンでシリカゲルの酸性を中和し、１‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１０：１〜２：１で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３．４９ｇの純粋品Ｚ−２を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ７９Ｈ１２９Ｎ１０Ｏ３３、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７４６．９４、実測値：１７４６．９０。
【０３６６】
（１２−３）Ｚ−３の合成：
工程（１−７ａ）に記載の方法により得られたＺ−２（３．４９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）及びＡ−１（３．０６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を混合して３０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、１．８０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ジイソプロピルエチルアミン（１．５５ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３時間攪拌反応させた。得られた反応液に１００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を１回あたり３０ｍｌで２回洗浄し、水相を１０ｍｌのジクロロメタンで抽出した。全ての有機相をあわせ、５０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、得られた有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、２００ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝２５：１〜１５：１で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．２ｇの純粋品Ｚ−３を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０３Ｈ１５１Ｎ１０Ｏ３８、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：２１３６．０２、実測値：２１３６．２０。
【０３６７】
（１２−４）Ｚ−４の合成：
Ｚ−３（２．１０ｇ、０．９８３ｍｍｏｌ）を、ＤＩＥＡ（６３５ｍｇ、４．９１５ｍｍｏｌ）を含む１４．８ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２４０ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸無水物（１９７ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８時間攪拌反応させた。５０ｍｌのジクロロメタンを加えて得られた反応液を希釈し、８０ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで２回抽出した。全ての有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。粗製品をカラムで精製し、１８８ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１０：１〜３：１で勾配溶出し、溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．９５ｇの構造が式（４２２）に示される純粋品Ｚ−４複合分子（複合分子１２）を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０７Ｈ１５５Ｎ１０Ｏ４１、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９３５．０７、実測値：１９３５．２９。
【０３６８】
（調製例１３）Ｌ１０−ｓｉＨＢａ１複合体（複合体９）の調製
本調製例では、Ｌ−９複合分子（複合分子１）を出発とし、以下の方法に従い、Ｌ１０−ｓｉＨＢａ１複合体（以下、複合体９ともいう）を調製した。
【０３６９】
（１３−１）Ｌ−１０化合物の合成：
【０３７０】
【化６１】
2021509402.tif 000104
【０３７１】
この工程において、Ｌ−９複合分子を固相担体に結合することにより、Ｌ−１０化合物を調製した。
【０３７２】
工程（１−８）で得られたＬ−９複合分子（０．２３３ｇ、０．１１２６ｍｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、０．０６４ｇ、０．１６８９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、０．０２９ｇ、０．２２５２ｍｍｏｌ）を混合し、１９ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、室温で５分間攪拌した。アミノメチル樹脂（０．９０１ｇ、１００〜２００メッシュ、アミノ基担持量４００μｍｏｌ／ｇ、南開和成社から購入）を反応液に加え、２５℃でシェーカーで反応を行い、回転数２２０回転／分間、１５ｈ反応させた後濾過した。残存物をＤＣＭで１回あたり３０ｍｌで２回リンスし、アセトニトリルで１回あたり３０ｍｌで３回リンスし、３０ｍｌのエチルエーテルで１回リンスし、真空油ポンプで２ｈ乾燥させた。表２に示す配合割合に従いキャッピング反応を行った。
【０３７３】
【表２】
2021509402.tif 000105
ここで、Ｃａｐ１及びＣａｐ２は、キャッピング試薬溶液であり、Ｃａｐ１は、２０％（ｖ／ｖ）Ｎ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合物における溶液であり、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が３：５であり、Ｃａｐ２は、２０％（ｖ／ｖ）酢酸無水物のアセトニトリル溶液であった。
【０３７４】
Ｃａｐ１、Ｃａｐ２、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びアセトニトリルを上記反応混合物に加え、２５℃でシェーカーで反応を行い、回転数２００回転／分間、５時間反応させた。反応液を濾過し、残存物をアセトニトリルで１回あたり３０ｍｌで３回リンスし、溶剤を乾燥させるまで蒸発し、真空油ポンプで混合物を減圧下で一晩乾燥させ、１．１００ｇ、担持量９０．８μｍｏｌ／ｇの、構造が式（５２３）に示されるＬ−１０化合物（即ち、固相担体に結合されたＬ−９複合分子）を得た。
【０３７５】
（１３−２）Ｌ１０−ｓｉＨＢａ１複合体のセンス鎖の合成
本工程において、ｓｉＲＮＡ複合体のｓｉＲＮＡは、番号ｓｉＨＢａ１の配列であった。
ｓｉＨＢａ１
センス鎖：５’−ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ−３’（配列番号１）、
アンチセンス鎖：５’−ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ−３’（配列番号２）
【０３７６】
ホスホルアミダイト固相合成方法により、上記工程で調製されたＬ−１０化合物を出発とし、上記配列順序３’−５’の方向に従い一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング及び酸化の４つの反応を含む。合成条件は、以下のように規定された。
【０３７７】
ヌクレオシドモノマーを０．１Ｍ濃度のアセトニトリル溶液で提供し、各工程の脱保護反応の条件が同じであり、即ち、温度が２５℃であり、反応時間が７０秒であり、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％ｖ／ｖ）であり、ジクロロ酢酸と固相担体における４，４’−ジメトキシトリチル保護基とのモル比が５：１であった。
【０３７８】
各カップリング反応条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１０であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：６５であり、反応時間が６００秒であり、カップリング試薬は、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールの０．５Ｍアセトニトリル溶液であった。
【０３７９】
各キャッピング条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であった。キャッピング試薬溶液は、モル比が１：１であるＣａｐ１とＣａｐ２の混合溶液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、酢酸無水物：Ｎ−メチルイミダゾール：固相担体に結合される核酸配列＝１：１：１であった。
【０３８０】
各酸化反応条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であり、酸化試薬が０．０５Ｍのヨウ素水であった。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が３０：１であった。反応をテトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１の混合溶剤で行った。
【０３８１】
切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量が０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、液体を除去し、残存物を乾燥させるまで真空濃縮した。アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量について、０．４ｍｌ／μｍｏｌのＮ−メチルピロリドンで製品を溶解させた後、０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン及び０．６ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去した。精製と脱塩：分取用イオンクロマトグラフィーカラム（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ）により、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸の精製を実現した。具体的には、溶出剤Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤Ｂ＝１００：０〜５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにより脱塩し、充填剤がＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５であり、脱イオン水で溶出した。
【０３８２】
検出：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）を用いて検出したところ、純度が９２．４％であり、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分子量を分析したところ、理論値７２５３．９６、実測値７２５３．１２であった。
【０３８３】
これにより、当該工程においてＬ−９複合分子を得られたセンス鎖の３’末端に結合し、Ｌ−９複合分子がｓｉＲＮＡの３’末端に複合されるｓｉＲＮＡのセンス鎖Ｓを得た。
【０３８４】
（１３−３）アンチセンス鎖の合成
本工程において、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ｌｏａｄｅｄ  ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．）により、Ｌ１０−ｓｉＨＢ１複合体のアンチセンス鎖ＡＳを合成した。センス鎖合成と同じ条件によりｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖ＡＳを得、固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化反応条件、脱保護と切断、単離条件を含む。
【０３８５】
検出：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）により検出したところ、純度が９３．２％であり、分子量を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析した。理論値６６７５．０４、実測値６６７４．５０であった。
【０３８６】
（１３−４）Ｌ１０−ｓｉＨＢａ１複合体の合成
Ｓ鎖及びＡＳ鎖をそれぞれ注射用水溶液に溶解させ、４０ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。これらを等モル比で混合し、５０℃で１５分間加熱し、室温まで冷却した後、これらを水素結合により二本鎖構造を形成させた。
【０３８７】
上記合成が完了した後、超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ超純水装置で自作、抵抗率１８．２ＭΩ＊ｃｍ（２５℃））を用いて複合体を０．２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、分子量の理論値Ｓ：７２５３．９６、ＡＳ：６６７５．０４、分子量の実測値Ｓ：７２５３．２４、ＡＳ：６６７４．６１であり、実測値が理論値と一致しており、合成された複合体が、Ｌ−９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが確定された。Ｌ１０−ｓｉＨＢａ１複合体（複合体９）の構造が式（３）に示される。
【０３８８】
（調製例１４）複合体１６〜１８、２４〜２６、４２〜４３、６２、７８、１０５、１０９、１１１、１１５、１４４及び１５４〜１７１の調製
１）複合ｓｉＲＮＡが、表３Ａ〜３Ｇに示される複合体１６〜１８、２４〜２６、４２〜４３、６２、７８、１０５、１０９、１１１、１１５、１４４、１５７〜１６３及び１６７〜１７１に対応する配列を有し、２）目的配列における２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、当該２つのヌクレオチドのうち後のヌクレオチドの結合における酸化反応工程の代わりに以下の硫化反応工程を用い、各工程の硫化反応条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が３００秒であり、硫化試薬がキサンタンヒドリドであり、硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１２０：１であり、アセトニトリル：ピリジン＝１：１の混合溶剤で反応を行い、３）目的配列における全てのヌクレオチドの２’−位がいずれも修飾ヒドロキシ基である場合、切断と脱保護条件では、リボースにおける２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去する工程を含まないこと以外は、調製例１３と同じ方法によって表題複合体を調製し、本開示の複合体１６〜１８、２４〜２６、４２〜４３、６２、７８、１０５、１０９、１１１、１１５、１４４、１５７〜１６３及び１６７〜１７１を調製した。
【０３８９】
また、Ｌ−９複合分子の代わりにそれぞれ以下の複合分子を用い、上記調製例２で得られたＰ−９複合分子（複合分子２）を用いて複合体１６４を調製し、上記調製例７で得られたＷ−７複合分子（複合分子７）を用いて複合体１５５、１５６及び１６５を調製し、上記調製例１２で得られたＺ−４複合分子（複合分子１２）を用いて複合体１５４及び１６６を調製し、複合ｓｉＲＮＡが、それぞれ表３Ａ〜３Ｇに示される複合体１５４〜１５６及び１６４〜１６６に対応する配列であり、表３Ａ〜３Ｇにより上記複合体にそれぞれ番号を付け、これらの構造がそれぞれ式（３）、式（４）、式（１５）及び式（２２）に示されること以外は、調製例１３と同じ方法によって、複合体１５４〜１５６及び１６４〜１６６を調製した。液体クロマトグラフィー質量分析計により複合体の分子量を検出したところ、複合体１４２の理論値Ｓ：７６４９．５５、ＡＳ：６９９１．４６、実測値Ｓ：７６４９．１、ＡＳ：６９９１、複合体１７０の理論値Ｓ：７６４９．５５、ＡＳ：６９９５．４７、実測値Ｓ：７６４８．８、ＡＳ：６９９４．８、複合体１７１の理論値Ｓ：７６４９．５５、ＡＳ：７０１１．５３、実測値Ｓ：７６４８．８、ＡＳ：７０１０．９、複合体１１５の理論値Ｓ：７５８４．５、ＡＳ：７００７．４６、実測値Ｓ：７５８４、ＡＳ：７００６．２、複合体１０９の理論値Ｓ：７５８４．５、ＡＳ：６９３１．４７、実測値Ｓ：７５８４、ＡＳ：６９３０．９、複合体１０６の理論値Ｓ：７５７２．４７、ＡＳ：６９０７．４１、実測値Ｓ：７５７１．８、ＡＳ：６９０６．９、複合体１１３の理論値Ｓ：７５８４．５、ＡＳ：７０１１．４７、実測値Ｓ：７５８４、ＡＳ：７０１１．３、複合体１７の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：６９６１．５２、実測値Ｓ：７５０３．４、ＡＳ：６９６０．９、複合体２５の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：７０３７．５１、実測値Ｓ：７５０３．６、ＡＳ：７０３６．９、複合体１８の理論値Ｓ：８２１８．８３、ＡＳ：７７０３．０５、実測値Ｓ：８２１８、ＡＳ：７７０２．５、複合体１６の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：６９８５．５８、実測値Ｓ：７５１６．５、ＡＳ：６９８４．９、複合体１５９の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：７０５７．５８、実測値Ｓ：７５０３．６、ＡＳ：７０５７、複合体１６０の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：７０４１．５２、実測値Ｓ：７５０３．６、ＡＳ：７０４０．８、複合体１６１の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：７０６５．５８、実測値Ｓ：７５１６．６、ＡＳ：７０６４．５、複合体１６２の理論値Ｓ：７５０４．３４、ＡＳ：７１３９．６８、実測値Ｓ：７５１５．６、ＡＳ：７１３８．９、複合体１６３の理論値Ｓ：７５１６．３７、ＡＳ：７０８１．６４、実測値Ｓ：７５１５．６、ＡＳ：７０８０．９、複合体６２の理論値Ｓ：７４８５．３、ＡＳ：７１６１．７、実測値Ｓ：７４８４．４、ＡＳ：７１６０．９、複合体７８の理論値Ｓ：７４２３．２２、ＡＳ：７２０７．７８、実測値Ｓ：７４２２．６、ＡＳ：７２０７．２、複合体４２の理論値Ｓ：７４０７．２２、ＡＳ：７２０８．７７、実測値Ｓ：７４０６．４、ＡＳ：７２０８．１、複合体４３の理論値Ｓ：７４０７．２２、ＡＳ：７１７０．７２、実測値Ｓ：７４０６．５、ＡＳ：７１７０．１という結果であり、測定値が理論値と一致していた。
【０３９０】
［表３］
ｓｉＲＮＡ複合体
【表３Ａ】
2021509402.tif 000106
2021509402.tif 000107
2021509402.tif 000108
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【０３９１】
【表３Ｂ】
2021509402.tif 000110
2021509402.tif 000111
2021509402.tif 000112
【０３９２】
【表３Ｃ】
2021509402.tif 000113
2021509402.tif 000114
【０３９３】
【表３Ｄ】
2021509402.tif 000115
2021509402.tif 000116
【０３９４】
【表３Ｅ】
2021509402.tif 000117
2021509402.tif 000118
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2021509402.tif 000120
2021509402.tif 000121
【０３９５】
【表３Ｆ】
2021509402.tif 000122
2021509402.tif 000123
2021509402.tif 000124
【０３９６】
【表３Ｇ】
2021509402.tif 000125
2021509402.tif 000126
＊Ｓ：センス鎖、ＡＳ：アンチセンス鎖
注釈：大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、ｄＴは、デオキシチミンヌクレオチドを表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−メトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、ＶＰは、当該文字ＶＰの右側の１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Ｐは、当該文字Ｐの右側の１つのヌクレオチドがリン酸エステルヌクレオチドであることを表し、Ｐｓは、当該文字Ｐｓの右側の１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、Ｔｍｏｅは、２’−メトキシエトキシ修飾チミンヌクレオチドを表す。
【０３９７】
ビニルリン酸エステル及び２’−メトキシ修飾ウリジンモノマー（ＶＰ−Ｕｍ）は、以下の方法に従い合成された。
【０３９８】
【化６２】
2021509402.tif 000127
【０３９９】
（１４−１）ＶＰ−Ｕ−２の合成
以下の方法に従い、ＶＰ−Ｕ−２分子を合成した。
【０４００】
【化６３】
2021509402.tif 000128
２’−メトキシ修飾ウラシルヌクレオシド（２’−ＯＭｅ−Ｕ、５１．３０ｇ、９１．６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ、５０．３５ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１２．４７ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）を混合して４５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、室温で２０時間攪拌反応させた。ＤＭＦを留去し、残存物を６００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後、３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて洗浄し、単離した水相をジクロロメタン（ＤＣＭ）で１回あたり３００ｍｌで３回抽出した。全ての有機相をあわせ、５％シュウ酸で水相をｐＨ＜５になるまで洗浄し、乾燥させるまで溶剤を蒸発した後でＶＰ−Ｕ−１粗製品を得、そのまま後のＶＰ−Ｕ−２の合成に使用した。
【０４０１】
ＶＰ−Ｕ−１粗製品を１００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後、氷浴を施して１０分間攪拌し、さらに、予め４℃の冷蔵庫で冷却された４５０ｍｌの２％ｐ−トルエンスルホン酸溶液（溶剤が、体積比３：７のメタノール−ジクロロメタン混合溶剤である）を加え、１０分間反応させた。さらに２００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて反応をクエンチングし、得られた有機相に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝８になるまで洗浄した。水相をあわせ、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、全ての有機相をあわせ、さらに２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、乾燥させるまで溶剤を蒸発した。残存物を２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５〜１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させて計４０．００ｇの純粋品ＶＰ−Ｕ−２を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝７．８  Ｈｚ，１Ｈ），７．６４  （ｄｔｄ，Ｊ  ＝５．１，４．０，２．２  Ｈｚ，４Ｈ），７．４１−７．３０  （ｍ，６Ｈ），６．７９  （ｄ，Ｊ  ＝４．７  Ｈｚ，１Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝７．６  Ｈｚ，１Ｈ），４．９４  （ｔ，Ｊ  ＝７．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．１２  （ｔｄ，Ｊ  ＝４．６，３．９  Ｈｚ，１Ｈ），４．０５  （ｄｄ，Ｊ  ＝４．８、４．０  Ｈｚ，１Ｈ），３．９６  （ｔ，Ｊ  ＝４．７  Ｈｚ，１Ｈ），３．６８  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝１１．８，７．０，４．６  Ｈｚ，１Ｈ），３．５７−３．４６  （ｍ，１Ｈ），３．３９  （ｓ，３Ｈ），１．０５  （ｓ，８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２６Ｈ３３Ｎ２Ｏ６Ｓｉ、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４９７．２１、実測値：４９７．４５。
【０４０２】
（１４−２）ＶＰ−Ｕ−４の合成：
【０４０３】
【化６４】
2021509402.tif 000129
ＶＰ−Ｕ−２（１９．８４ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１６．４８ｇ、８０．０ｍｍｏｌ）、ピリジン（４．２０ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（６．６１ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）を混合して２００ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、室温で２０時間攪拌反応させて反応液を得た。別に、メチレンジホスホン酸テトラエチル（２１．４４ｇ、７４．４ｍｍｏｌ）を１２０ｍｌのＴＨＦに溶解させ、氷浴で降温し、氷浴温度でｔ−ＢｕＯＫ（１１．３６ｇ、１０１．２ｍｍｏｌ）を加え、氷浴温度で１０分間反応させた後、室温まで昇温して０．５時間反応させた後、約１時間かけて前述した反応液に加え、氷浴温度で１ｈ反応させた後、室温まで昇温して１８時間反応させた。水を加えて反応をクエンチングし、単離した水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出した。全ての有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄した後に乾燥させるまで溶剤を蒸発した。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル＝１：１〜１：４で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させて計１４．００ｇの純粋品ＶＰ−Ｕ−４を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝７．８  Ｈｚ，１Ｈ），７．６４  （ｄｔｄ，Ｊ  ＝５．１，４．０，２．２  Ｈｚ，４Ｈ），７．４１−７．３０  （ｍ，６Ｈ），６．８２−６．７１  （ｍ，２Ｈ），５．９０  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝２５．９、１５．０，１．０  Ｈｚ，１Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝７．６  Ｈｚ，１Ｈ），４．３６−４．２１  （ｍ，３Ｈ），４．１８  （ｔ，Ｊ  ＝４．９  Ｈｚ，１Ｈ），４．０５  （ｄｄｑ，Ｊ  ＝９．７，８．５，６．９  Ｈｚ，２Ｈ），３．８７  （ｔ，Ｊ  ＝４．８  Ｈｚ，１Ｈ），３．３９  （ｓ，３Ｈ），１．３２  （ｔｄ，Ｊ  ＝６．９，０．７  Ｈｚ，６Ｈ），１．０５  （ｓ，８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ３１Ｈ４２Ｎ２Ｏ８ＰＳｉ、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：６２９．２４、実測値：６２９．５１。
【０４０４】
（１４−３）ＶＰ−Ｕ−５の合成：
【０４０５】
【化６５】
2021509402.tif 000130
ＶＰ−Ｕ−４（１４．００ｇ、２２．２９ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させ、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（１７．９６ｇ、１１１．４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で完全に反応させるまで２０時間攪拌した。そのまま溶剤を乾燥させるまで蒸発し、１回あたり５０ｍｌのジクロロメタンで溶解してから蒸発乾固する操作を２回繰り返し、粗製品を得た。粗製品を２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５〜１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、残存物を真空油ポンプで発泡乾燥させて計６．７０ｇの純粋品ＶＰ−Ｕ−５を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝７．８  Ｈｚ，１Ｈ），６．７７  （ｄｄ，Ｊ  ＝１５．０，６．２  Ｈｚ，１Ｈ），５．９９−５．８２  （ｍ，２Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝７．６  Ｈｚ，１Ｈ），５．２７  （ｄ，Ｊ  ＝５．１  Ｈｚ，１Ｈ），５．１０  （ｄｄ，Ｊ  ＝５．３，４．７  Ｈｚ，１Ｈ），４．２９  （ｄｄｑ，Ｊ  ＝９．８，８．６，７．０  Ｈｚ，２Ｈ），４．１７  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝６．２，５．２，１．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．１２−３．９８  （ｍ，３Ｈ），３．３９  （ｓ，２Ｈ），１．３２  （ｔｄ，Ｊ  ＝６．９，０．６  Ｈｚ，６Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２４Ｎ２Ｏ８Ｐ、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：３９１．１３、実測値：３９１．３８。
【０４０６】
（１４−４）ＶＰ−Ｕ−６の合成：
【０４０７】
【化６６】
2021509402.tif 000131
アルゴン保護条件で１０ｍｌの無水ジクロロメタンにＶＰ−Ｕ−５（３９１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ピリジントリフルオロアセテート（０．２３２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（０．０９９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィン（０．４５２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を留去し、残存物をカラムクロマトグラフィーにより精製し（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、ジクロロメタン：アセトニトリル（０．５ｗｔ％トリエチルアミンを含む）＝３：１〜１：３で勾配溶出した）、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計５０８ｍｇの目的生成物ＶＰ−Ｕ−６を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６１  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １５０．３４，１５０．２９，１７．０７，１５．５０．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ４１Ｎ４Ｏ９Ｐ２、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：５９１．２３、実測値：５９１．５５。ＶＰ−Ｕ−６が目的生成物ＶＰ−Ｕｍであり、ヌクレオシドモノマーとしてＲＮＡ鎖の合成に関与することを示した。
【０４０８】
以下の方法を用いて５’−リン酸エステル修飾をアンチセンス鎖の５’端に結合した。
【０４０９】
原料は、以下の式ＣＰＲ−Ｉの構造を有するリン酸化構造モノマーであり、蘇州吉瑪により提供され、番号はＣａｔ＃１３〜２６０１−ＸＸであった。
【０４１０】
【化６７】
2021509402.tif 000132
【０４１１】
アンチセンス鎖の全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行って式ＣＰＲ−Ｉのモノマーをアンチセンス鎖の５’末端に結合した。その後、以下の条件で切断と脱保護を行い、アンチセンス鎖を得た。
【０４１２】
合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、ヌクレオチド配列について、アンモニア水の用量が０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、５５℃で１６時間反応させ、液体を除去し、残存物を真空で乾燥させるまで濃縮した。アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量について、０．４ｍｌ／μｍｏｌのＮ−メチルピロリドンで製品を溶解させた後、０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン及び０．６ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去した。精製と脱塩：分取用イオンクロマトグラフィーカラム（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ）により、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸を精製した。具体的には、溶出剤Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤Ｂ＝１００：０〜５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにより脱塩し、充填剤がＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５であり、脱イオン水で溶出した。
【０４１３】
目的生成物が５’−チオリン酸エステル修飾を有する場合に、結合する際に、上記酸化反応条件の代わりに硫化反応条件を用いたこと以外は、上記と同じ工程により硫化反応を行った。
【０４１４】
上記合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖に対して、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）を用いて純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分子量を分析し、合成された核酸配列が表５における各実施例及び比較例に対応するｓｉＲＮＡであることを確認した。
【０４１５】
（調製例１５）表３Ａ〜３Ｇにおける他の複合体の調製
また、１）複合体３１〜３７、５２〜５８、６８〜７４、８４〜９０、１２１〜１２７、１４６〜１５２及び比較複合体４〜５、７〜８、１０〜１３について、Ｌ−９複合分子の代わりに上記調製例２〜１０又は１２で得られた複合分子２〜８又は１２及び比較複合分子１〜２を用い（例えば、Ｌ−９複合分子の代わりにＰ−９複合分子（複合分子２）を用いた場合、複合体３１、５２、６８、８４、１２１及び１４６という番号にＰ１０が付された複合体を得ると予期し、Ｌ−９複合分子の代わりにＲ−４複合分子（複合分子３）を用いた場合、複合体３２、５３、６９、８５、１２２及び１４７という番号にＲ５が付された複合体を得ると予期し、以下類推してもよい）、２）複合ｓｉＲＮＡが、表３Ａ〜３Ｇに示される複合体１０〜１５、１９〜２３、２７〜４１、４４〜６１、６３〜７７、７９〜１０４、１０６〜１０８、１１０、１１２〜１１４、１１６〜１４１、１４３〜１５２及び比較複合体４〜５、７〜８、１０〜１７に対応する配列を有し、３）目的配列における２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、当該２つのヌクレオチドのうち後のヌクレオチドの結合における酸化反応工程の代わりに調製例１３に記載された硫化反応工程を用い、４）目的配列における全てのヌクレオチドの２’−位がいずれも修飾ヒドロキシ基である場合、切断と脱保護条件では、リボースにおける２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去する工程を含まないこと以外は、調製例１３と同じ方法により、表３Ａ〜３Ｇにおける他のｓｉＲＮＡ複合体を調製できると予期した。これにより、複合体１０〜１５、１９〜２３、２７〜４１、４４〜６１、６３〜７７、７９〜１０４、１０６〜１０８、１１０、１１２〜１１４、１１６〜１４１、１４３〜１５２及び比較複合体４〜５、７〜８、１０〜１７を調製できると予期し、表３Ａ〜３Ｇによりそれらにそれぞれ番号を付けた。これらの本開示の複合体の構造は、それぞれ式（３）、（４）、（７）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（２１）又は（２２）に示され、各比較複合体の構造は、それぞれ式（９０１）、式（９０２）に示される。
【０４１６】
【化６８】
2021509402.tif 000133
ただし、Ｎｕは、比較複合体４〜５、７〜８及び１０〜１３におけるｓｉＲＮＡである。
【０４１７】
（調製例１６）比較複合体６及び９の合成
上記工程（１１−３）で得られたＦＩＮ−２を用いて比較複合体６及び９を合成した。汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ｌｏａｄｅｄ  ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ）を用い、ＦＩＮ−２の３回の反応循環によりＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮをＲＮＡセンス鎖の３’末端に複合した後、固相合成を行ったことのみ以外、ＲＮＡ固相合成条件、脱保護条件は、前述した工程（１１−２）に記載された核酸固相合成と一致した。
【０４１８】
Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１５，１６，９０３−９０８に記載された方法を参照してＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮ複合基の結合を行い、具体的には、まず、上記汎用の固相担体におけるヒドロキシ保護基を除去し、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下でＦＩＮ−２複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング反応及び酸化反応を行った後、固相担体に結合されたＦＩＮ複合分子を得た。また、当該固相担体に結合されたＦＩＮ複合分子におけるヒドロキシ保護基ＤＭＴｒを除去し、別のＦＩＮ−２複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング反応及び酸化反応を行い、再び上記脱保護−カップリング−キャッピング−酸化工程を１回繰り返し、３番目のＦＩＮ−２複合分子を結合させ、これにより固相担体に結合された複合基（ＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮ）を得た。その後、固相担体に結合される複合基から、ヌクレオチドモノマーを結合し、最終的に３’末端に複合される複合基（ＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮ）を有するＲＮＡセンス鎖を得た。
【０４１９】
上記反応において、前記の脱保護、カップリング、キャッピング、酸化反応の条件、溶剤及び試薬は、工程（１１−２）に記載された核酸固相合成方法と同じであった。
【０４２０】
その後、調製例１２と同じ方法により切断と脱保護、精製と脱塩、検出、アニールを行い、最終的に比較複合体６及び９（以下単にＦＩＮ複合体ともいうことがある）を得た。液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．から購入、型番：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、実測値が理論値と一致しており、合成されたＦＩＮ−ｓｉＨＢａ１Ｍ１ＳＰ複合体が、以下の式（９０３）に示される目的設計の化合物であることが確定された。
【０４２１】
【化６９】
2021509402.tif 000134
ただし、Ｎｕは、比較複合体６又は９におけるｓｉＲＮＡである。
【０４２２】
上記複合体を調製した後、標準的な手段により固体粉末として凍結乾燥させて保存し、使用に備えた。必要な場合、例えば注射用水又は生理食塩水を用いて溶解させ所望の濃度の溶液として用いてもよい。
【０４２３】
（実験例１）本実験では、本開示の複合体の毒性について証明している。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、マウス１匹あたり１００ｍｇ／ｋｇ又は２００ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡとして計算、０．９％塩化ナトリウム水溶液の形で、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬ又は２０ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍＬ／ｋｇ使用）の複合体２４をそれぞれ単回皮下投与し、持続的に観察した期間中、動物の死亡はなく、薬物の副作用に関連する臨床症状も認められず、投与した２４ｈ後、臨床病理学的検査及び肉眼解剖のいずれにおいても異常が認められなかった。上記結果から明らかなように、本開示の複合体は、動物レベルの毒性が低い。
【０４２４】
（実験例２）本実験では、本開示の複合体の安定性を証明している
（実験例２−１）体外リソソーム溶解液における安定性
複合体２４、２５、４２、４３、６２、７８及び比較配列１（それぞれｓｉＲＮＡ濃度が２０μＭである０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり１２μｌ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのマウストリトソーム（ＸｅｎｏｔｅｃｈＩｎｃ．から購入、番号Ｒ０６１０ＬＴ、Ｎｏ．１６１００６９、最終濃度０．２ｍＵ／μＬ）と均一に混合し、３７℃で恒温培養した。それぞれ０ｈ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈの各時点で５μｌの試料（サンプル）を取り出し、それぞれ１５μＬの９Ｍ尿素水溶液に加えて変性させた後、４μｌの試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：各１．５μｌの等モル量の上記複合体（２０μＭ）を、それぞれ７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、それぞれ１５μＬの９Ｍ尿素水溶液に加えて変性させた後、４μＬの試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加えて均一に混合し、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。各複合体の参照サンプルは、電気泳動図においてＣｏｎと記している。
【０４２５】
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、冷凍保存サンプルにおける各群の全てのサンプルをそれぞれ４μｌの試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社から購入、２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）と混合した後、２０μｌの混合液を前述したゲルに負荷し、２０ｍＡで１０分間電気泳動した後、４０ｍＡで３０分間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルをＧｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ、Ｃａｔ．１３Ｇ１２０３）で１０分間染色した後にイメージングを行い、結果を図１Ａに示した。
【０４２６】
前記比較配列１は以下のとおりである。
センス鎖：５’−ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ−３’（配列番号２５０）、
アンチセンス鎖：５’−ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ−３’（配列番号２５１）。
【０４２７】
同じ方法により、複合体１０５、１０９、１１１及び１１５に対して６ｈ以内での安定性を測定し、結果を図１Ｂに示した。
【０４２８】
図１Ａ〜１Ｂは、ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソームにおける安定性の半定量的検出結果を示す。結果から、本開示の複合体は、トリトソームにおいて長期間維持して分解されず、非常に良好な安定性を示すことができることが示された。
【０４２９】
（実験例２−２）ヒト血漿における体外安定性
複合体２４、２５、４２、４３、６２、７８及び比較配列１（それぞれｓｉＲＮＡ濃度が２０μＭである０．９ｗｔ％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり１２μｌ）をそれぞれ１０８μＬの９０％ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、ＰＢＳで希釈）と均一に混合して３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間の各時点で１０μＬの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存し、使用に備えた。同時に、等モル量の各複合体（２μＭ、２μｌ）を８μｌの１×ＰＢＳと均一に混合して、１０μＬのヒト血漿処理されていないサンプルを得た（Ｃｏｎと記した）。２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、冷凍保存サンプルにおける各群の全てのサンプルをそれぞれ４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）と混合した後、前述したゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルを１×Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した後にイメージングを行い、結果を図２Ａに示した。前記比較配列１は以下のとおりである。
センス鎖：５’−ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ−３’（配列番号２５０）、
アンチセンス鎖：５’−ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ−３’（配列番号２５１）。
【０４３０】
同じ方法により、複合体１０５、１０９、１１１及び１１５に対して７２ｈ以内での安定性を測定し、結果を図２Ｂに示した。
【０４３１】
図２Ａと２Ｂは、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのヒト血漿における安定性の半定量的検出結果を示す。結果から分かるとおり、本開示の複合体は、ヒト血漿中で最長７２ｈでも分解されず、ヒト血漿における優れた安定性を示した。
【０４３２】
（実験例２−３）サル血漿における体外安定性
複合体２４、２５、４２、４３、６２、７８及び比較配列２（それぞれｓｉＲＮＡ濃度が２０μＭの０．９ｗｔ％塩化ナトリウム水溶液として提供、１群あたり１２μｌ、前記比較配列２は、センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ配列番号８０及び配列番号８１に示される配列を有するが、いずれの複合分子とも複合していないｓｉＲＮＡであった）をそれぞれ１０８μＬの９０％カニクイザル血漿（Ｍｏｎｋｅｙ  ｐｌａｓｍａ、鴻泉生物から購入、ＨＱ７００８２、ＰＢＳで希釈）と均一に混合して３７℃で恒温培養した。０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間の各時点でそれぞれ１０μＬの試料を取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、各サンプルを１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後、１０μＬをとって使用に備えた。同時に、等モル量の以上の各複合体（２μＭ、２μｌ）を８μｌの１×ＰＢＳと均一に混合して、１０μＬのサル血漿処理されていないサンプルを得た（Ｃｏｎと記した）。２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記希釈されたサンプルにおける各群の全てのサンプルを４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルーの水溶液）と混合した後、前述したゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルを１×Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した後にイメージングを行い、結果を図３Ａに示した。
【０４３３】
同じ方法により、複合体１０５、１０９、１１１及び１１５及び比較配列２に対して７２ｈ以内での安定性を測定し、結果を図３Ｂに示した。
【０４３４】
図３Ａと３Ｂは、被験ｓｉＲＮＡの体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結果を示している。本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、カニクイザル血漿中で最長７２ｈでも分解されていないことが分かり、サル血漿における優れた安定性を示した。
【０４３５】
（実験例３）本実験では、複合体２４及び２５のラット体内での薬物動力学について説明している
本実験例では、それぞれ各実験群のラット（１群あたりラット１０匹、雌雄はそれぞれ半分ずつ）に複合体２４及び複合体２５を皮下注射投与し、単回用量を１０ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇとして実施した。その後、各時点でのラット血漿の薬物濃度及び肝臓、腎臓組織の薬物濃度を検出した。
【０４３６】
まず、ＰＲＩＳＴＩＭＡ  ７．２．０版データシステムにより、ＳＤラットをラットの体重に応じて性別でランダムに分け、その後、設計された用量でそれぞれ複合体に投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量は１０及び５０ｍｇ／ｋｇであり、１ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌの０．９％塩化ナトリウム水溶液の形とし、体積は１０ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与前及び薬剤投与後の５分間（±３０秒）、３０分間（±１分間）、１時間（±２分間）、２時間（±２分間）、６時間（±５分間）、２４時間（±１０分間）、４８時間（±２０分間）、７２時間（±２０分間）、１２０時間（±３０分間）、１６８時間（±３０分間）に、それぞれ頸静脈からラット全血を採取した。その後全血サンプルを２〜８℃で遠心力１８００×ｇで１０分間遠心して血漿を単離し、血漿サンプルをチューブに約７０μＬ放置し、残りの同一サンプルを別のチューブに放置し、いずれも検出するまで−７０〜−８６℃で冷凍保存した。薬剤投与後それぞれ約２４、４８、７２、１２０、１６８時間でラットの肝臓、腎臓組織を採取し、採取方法は、ラットの体重に応じてペントバルビタールナトリウムで麻酔し（６０ｍｇ／ｋｇ腹腔注射）、腹大動脈から採血してラットを安楽死させ、肉眼解剖を行ったことを含む。各ラットの肝臓、腎臓をサンプリングし、１ｍＬの冷凍保存チューブに保存し、検出・分析するまで、−６８℃以下で保存した。
【０４３７】
ＨＰＬＣ−ＦＬＤ（蛍光検出高速液体クロマトグラフィー）によりラット血漿及び肝臓、腎臓組織における複合体２４及び２５の濃度を定量的に検出し、具体的には、以下の工程による。
（１）組織塊が８０ｍｇ以下となるまで組織を粉砕し、その後、組織と細胞溶解液（Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、供給者：Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、番号：ＭＴＣ０９６Ｈ）を加えて６６．７ｍｇ／ｍＬの組織ホモジネートとして調製した。
（２）組織ホモジネートを超音波（１５０Ｗ、３０ｓ）処理して細胞を破砕した。
（３）各群の組織サンプルに対して、組織サンプルを７５μＬを９６ウェルのＰＣＲプレートに加え、５μＬのプロテアーゼＫ（供給者：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号：２５５３０−０１５）、１０μＬの１０ｗｔ％アセトニトリルと０．０１ｗｔ％ツウィーン２０の混合水溶液を加えた。
血漿サンプルに対して、２０μＬの血漿を９６ウェルのＰＣＲプレートに加え、４５μＬの組織と細胞溶解液、５μＬのプロテアーゼＫ及び２０μＬの１０ｗｔ％アセトニトリルと０．０１ｗｔ％ツウィーン２０の混合液を加えた。
（４）プレートをシールし、ＰＣＲ器（供給者：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、型番：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００）に放置し、６５℃で４５分間培養した。
（５）培養終了後、１０μＬの３Ｍ  ＫＣｌの水溶液（供給者：Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、番号：６０１３５−２５０ＭＬ）を加え、振とうして均一にし、４℃で、３２００ｒｃｆで１５分間遠心した。
（６）各群の組織サンプルに対して、８０μＬの上清液を１２０μＬのハイブリッド混合物（配合方法：０．５ｍＬの６μＭ  ＰＮＡプローブ（供給者：杭州泰禾生物科技有限公司）、１ｍＬの２００ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ／ｐＨ＝８、５ｍＬの８Ｍ尿素水溶液、３．５ｍＬのＨ２Ｏ、２ｍＬのアセトニトリル）に加えた。
各群の血漿サンプルに対して、４０μＬの上清液を１６０μＬのハイブリッド混合物（配合方法：０．５ｍＬの６μＭ  ＰＮＡプローブ、１ｍＬの２００ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ／ｐＨ＝８、５ｍＬの８Ｍ尿素水溶液、７．５ｍＬのＨ２Ｏ、２ｍＬのアセトニトリル）に加えた。
（７）プレートをシールし、ＰＣＲ器に放置し、９５℃で１５分間培養し、直ちに氷の上に５分間放置した。
（８）サンプルを別の円錐底９６ウェルプレートに移し、振とうして均一にし、３２００ｒｃｆで１分間遠心した。
（９）サンプルを負荷して検出し、ＨＰＬＣ−ＦＬＤを用いて定量的に分析した（液相系供給者：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、クロマトグラフ型番：ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００）。
【０４３８】
分析結果を図４〜図１１に示した。図４〜図７は、それぞれ複合体２４のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線及びラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示し、図８〜図１１は、複合体２５のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線及びラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線を示した。具体的には、
図４は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体２４のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図５は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体２４のラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線である。
図６は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体２４のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図７は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体２４のラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線である。
図８は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体２５のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図９は、投与量が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体２５のラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線である。
図１０は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体２５のラット血漿におけるＰＫ／ＴＫ血漿濃度の経時的代謝曲線である。
図１１は、投与量が５０ｍｇ／ｋｇであるとき、複合体２５のラット肝臓及び腎臓におけるＰＫ／ＴＫ組織濃度の経時的代謝曲線である。
【０４３９】
図４〜図１１の結果から分かるように、低用量（１０ｍｇ／ｋｇ）でも比較的高用量（５０ｍｇ／ｋｇ）でも、複合体２４及び２５のラット血漿における濃度は、いずれも数時間で検出限界以下まで急速に低下しているが、肝臓組織においてはいずれも少なくとも１６８ｈ高い安定したレベルの濃度を維持した。このことから、Ｌ−９複合分子を複合させることにより、得られたｓｉＲＮＡ複合体は、特異的に肝臓において顕著に富化して安定化することができ、高度な標的性が示された。
【０４４０】
（実験例４）本実験では、異なる複合分子により形成された複合体による、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける標的ｍＲＮＡに対する抑制効果を証明している。
まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをランダムに分けた（いずれも雌性）。実験群をそれぞれ複合体１５８（５匹のマウス）及び比較複合体１４で番号を付け（５匹のマウス）、ＰＢＳ対照群（８匹のマウス）に番号を付けた。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇの異なる単回用量で皮下投与した。投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。異なる用量を得るために、複合体を０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌで０．９％塩化ナトリウム水溶液に溶解させた。薬剤投与後の７２ｈで動物を死亡させ、肝臓を回収し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにでＲＮＡＶｚｏｌ  （ＶＩＧＯＲＯＵＳ、ｌｏｔ：１６１Ｇ）で全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０４４１】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＴＴＲ  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。具体的には、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｌｏｔ＃００００２２３６７７、ＲＥＦ：Ａ３５００）を用いてその説明書により抽出された全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。次に、蛍光定量的ＰＣＲ器（ＡＢＩ  Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ）によりｓｉＲＮＡによる肝組織におけるｍＴＴＲ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該検出方法では、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＴＴＲに対するプライマー及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いてそれぞれｍＴＴＲ及びＧＡＰＤＨを検出した。
【０４４２】
検出プライマーの配列については、表４を参照のこと。
【０４４３】
【表４】
2021509402.tif 000135
【０４４４】
当該リアルタイムＰＣＲ法では、ｍＴＴＲ  ｍＲＮＡの発現量は、ＴＴＲ遺伝子発現残量パーセントで表し、以下の等式により算出した。
ＴＴＲ遺伝子発現残量＝（試験群ＴＴＲ遺伝子のコピー数／試験群ＧＡＰＤＨのコピー数）／（対照群ＴＴＲ遺伝子のコピー数／対照群ＧＡＰＤＨのコピー数）×１００％
【０４４５】
その後、下式により複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率を算出した。
ｍＲＮＡ抑制率＝（１−ＴＴＲ遺伝子発現残量）×１００％
【０４４６】
対照群は、本実験においてＰＢＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を表５に示した。
【０４４７】
【表５】
2021509402.tif 000136
【０４４８】
結果から分かるように、用いられるｓｉＲＮＡ配列及び修飾はいずれも同じであるが、複合体１５８による標的ｍＲＮＡに対する抑制率は、比較複合体１４よりも顕著に高かった。
【０４４９】
以下の実験例５〜実験例１１において、ｓｉＲＮＡ標的位置及び配列関連性実験により、表３Ａから３ＦにおけるｓｉＲＮＡ複合体の性質と効果を検証した。
【０４５０】
（実験例５）表３ＡのｓｉＲＮＡ複合体の効果を検証した実験
（実験例５−１）複合体２６のオフターゲット効果を検証した実験
Ｋｕｍｉｃｏ  Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  ＤＮＡ  ｓｅｅｄ  ａｒｍ  ｉｓ  ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８．３６（７），２１３６−２１５１に記載された方法により、検出プラスミドを構築し、被検ｓｉＲＮＡ複合体とともにＨＥＫ２９３Ａ細胞にコトランスフェクションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キットを用い、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。具体的な工程は以下のとおりである。
【０４５１】
１、検出プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）プラスミドにより４つの組換えプラスミドを構築した。ＧＳＣＭは、オンターゲットプラスミドを表し、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭは、オフターゲットプラスミドを表す。
（１）ＧＳＣＭは、被検複合体のアンチセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含む。
（２）ＰＳＣＭは、被検複合体のセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含む。
（３）ＧＳＳＭは、被検複合体のアンチセンス鎖の５’端から１〜８位のヌクレオチド配列と完全に相補的な目的配列を含む。被検複合体におけるアンチセンス鎖の５’端から９〜２１位のヌクレオチド配列とその対応する目的配列とは、相補的にミスマッチした。ミスマッチルールは、被検複合体のアンチセンス鎖の５’端から第９〜２１位の任意の位置でのＧ、Ｃ、Ａ又はＵヌクレオチドが、それぞれ目的配列の対応する位置でヌクレオチドＴ、Ａ、Ｃ又はＧとミスマッチしたことである。
（４）ＰＳＳＭは、被検複合体のセンス鎖の５’端から１〜８位のヌクレオチド配列と完全に相補的な目的配列を含む。被検複合体におけるセンス鎖の５’端から９〜２１位のヌクレオチド配列とその対応する目的配列とは、相補的にミスマッチした。ミスマッチルールは、被検複合体のセンス鎖の５’端から第９〜２１位の任意の位置でのＧ、Ｃ、Ａ又はＵヌクレオチドが、それぞれ目的配列の対応する位置でヌクレオチドＴ、Ａ、Ｃ又はＧとミスマッチしたことである。
【０４５２】
目的配列をｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２プラスミドのＸｈｏ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ部位に嵌め込んだ。
【０４５３】
２、トランスフェクション
９６ウェルプレートに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用説明書により、ｓｉＲＮＡと、プラスミドごとにそれぞれ１１群の一定の濃度のｓｉＲＮＡが対応している上記各プラスミドをコトランスフェクションした。具体的には、プラスミドをウェルあたり１０ｎｇずつトランスフェクションし、ウェルずつ０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を用い、ウェルずつコトランスフェクションされたｓｉＲＮＡの最終濃度は、１００ｎＭ〜０．０００１ｎＭ（４倍シリーズの希釈物）であり、１群あたり３個の複製ウェルがあった。
【０４５４】
３、検出
２４時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット（Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｃａｔ．Ｅ２９４０）を用い、使用説明書によりＨＥＫ２９３Ａ細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。各特定の濃度の試験群では、複合体処理なしを対照（ｃｏｎ）とした。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベル（Ｆｉｒ）に対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベル（Ｒｅｎ）で標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）した。ｓｉＲＮＡの異なる濃度で測定された活性結果により、用量−効果曲線をプロットし、Ｇｒａｐｈａｄ５．０ソフトウェアの関数ｌｏｇ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及び応答−変化傾きを用い、以下の式により曲線モデリングを行った。
【０４５５】
【数１】
2021509402.tif 000137
式中、
Ｙは、残存ｍＲＮＡの発現レベルであり、
Ｘは、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡの濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが定常期の最低と最高との間の半分である場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
【０４５６】
用量効果曲線に基づいて算出することにより、ＧＳＣＭに対応する被験複合体のＩＣ５０値を確定し、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ又はＰＳＳＭと比較した。
【０４５７】
複合体２４については、結果を図１２Ａ〜１２Ｄに示し、ＧＳＣＭに対応し、複合体２４のＩＣ５０値を算出したところ、０．００１９ｎＭであり、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ又はＰＳＳＭに比べて、複合体２４は、ｓｉＲＮＡの各濃度でいずれも明らかな抑制作用がなく、本開示のｓｉＲＮＡ複合体が体外で高い活性及び低いオフターゲット効果を有することが示された。
【０４５８】
（実験例５−２）本実験では、表３ＡにおけるｓｉＲＮＡ複合体の体内でのＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を証明している
本実験例では、複合体１６及び２４によるＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／ＪにおけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を調べた。
【０４５９】
まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスを血清ＨＢｓＡｇの含有量別にランダムに分け（いずれも雌性、１群あたりマウス４匹）、それぞれ複合体１６及び複合体２４で番号を付け、生理食塩水（ＮＳ）対照群を追加した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、１ｍｇ／ｋｇの単回用量を皮下に使用し、複合体の濃度はそれぞれ０．９％塩化ナトリウム水溶液における０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌであり、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与後の１４日目に動物を死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズした。さらにＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０４６０】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及びβ−アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びβ−アクチンを検出した。
【０４６１】
検出プライマーの配列を表５Ａに示した。
【０４６２】
【表５Ａ】
2021509402.tif 000138
【０４６３】
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現量は、ＨＢＶ遺伝子発現残量で表され、以下の等式により算出した。
ＨＢＶ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／試験群β−アクチンのコピー数）／（対照群ＨＢＶ遺伝子のコピー数／対照群β−アクチンのコピー数）×１００％。図において、ＨＢＶ  Ｘ／β−アクチンｍＲＮＡ発現量と記している。
【０４６４】
その後、下式により複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率を算出した。
ｍＲＮＡに対する抑制率＝（１−ＨＢＶ遺伝子発現残量）×１００％
【０４６５】
対照群は、本実験においてＮＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図１３に示した。
【０４６６】
他の実験では、以下の条件で実験をさらに２回行った。
【０４６７】
投与されるｓｉＲＮＡ複合体を複合体１７、２５、１５９及び１６０に変更して実験を行い、７日目にデータを回収したこと以外は、上記と同じ方法を採用した。
【０４６８】
投与されるｓｉＲＮＡ複合体を複合体２４、１６１、１６２及び１６３に変更して実験を行い、２８日目にデータを回収し、各複合体について、１ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇの２つの用量で投与した（投与体積を変化させず、複合体溶液の濃度を相応に調整した）こと以外は、上記と同じ方法を採用した。結果をそれぞれ図１４〜１５に示した。
【０４６９】
上記結果から分かるように、試験時点の異なる複数回の実験では、全ての上記本開示の複合体は、いずれも高いマウス体内ＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現抑制活性を示した。
【０４７０】
（実験例５−３）本実験では、ＨＢＶトランスジェニックマウスにおいて、表３Ａにおける、異なる複合分子を有するｓｉＲＮＡ複合体によるｍＲＮＡに対する抑制効果を証明している
実験例４の方法により、４４ＢｒｉのＨＢＶマウスにおいて、表５Ａの検出配列をプライマーとして複合体２５、１６４、１６５及び１６６による標的ｍＲＮＡ抑制効率を検出した。結果をそれぞれ表６Ａに示した。
【０４７１】
【表６Ａ】
2021509402.tif 000139
【０４７２】
表６Ａから分かるように、本開示の各種の複合分子により形成されたｓｉＲＮＡ複合体は、マウスの体内での優れた標的ｍＲＮＡ抑制効率を有する。
【０４７３】
（実験例５−４）本実験では、ＨＢＶトランスジェニックマウスの血清において、表３ＡにおけるｓｉＲＮＡ複合体によるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する抑制効率の時間関連性試験を示している
ＡＡＶ−ＨＢＶマウスモデルを用い、動物を成功にモデリングした後、血清中のＨＢｓＡｇの含有量別にランダムに分け（１群あたり５匹）、１群あたりそれぞれ複合体２４、２５及び比較複合体１５を投与し、ＮＳをブランク対照として用いた。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量が３ｍｇ／ｋｇであり、薬物を０．６ｍｇ／ｍｌの０．９ｗｔ％塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積が５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与前（Ｄ０と記した）及び薬剤投与後の７、１４、２１、２８、５６、８４、１１２、１４０、１５４、１６８、１８２日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを検出した。その間、検出結果から、血清中のＨＢｓＡｇの含有量が初期値に近くなった、又はそれを超えた場合、当該対象の検出を停止させた。
【０４７４】
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清が２０μｌ以上であった。ＨＢｓＡｇ  ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清中のＨＢｓＡｇの発現レベルを検出した。ＱＩＡａｍｐ  ９６  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ説明書を参照して血清中のＤＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを行い、ＨＢＶ  ＤＮＡの発現レベルを検出した。
【０４７５】
標準化されたＨＢｓＡｇの発現レベル＝（薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
ＨＢｓＡｇ抑制率＝（１−薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢｓＡｇ当量（ＵＩ）で表される。
【０４７６】
標準化されたＨＢＶ  ＤＮＡの発現＝（薬剤投与後のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量／薬剤投与前のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量）×１００％。
ＨＢＶ  ＤＮＡ抑制率＝（１−薬剤投与後のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量／薬剤投与前のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量）×１００％。
ここで、ＨＢＶ  ＤＮＡ含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数で表される。
【０４７７】
結果を図１６及び図１７に示した。図１６の結果から分かるように、ＮＳ陰性対照群は、薬剤投与後の異なる時点でいかなる抑制作用も示さなかったのに対して、複合体２４及び２５は、薬剤投与後の異なる時点でいずれも優れたＨＢｓＡｇ抑制効果を示した。特に３ｍｇ／ｋｇの用量で、複合体２４は、最長１４０日間の期間にわたって常に高い血清中のＨＢｓＡｇの抑制率を示しており、ＨＢＶ遺伝子の発現を長期間安定的で効果的に抑制することができることを示した。
【０４７８】
図１７の結果から分かるように、各実施例のｓｉＲＮＡ複合体は、同様に効率的なＨＢＶ  ＤＮＡ発現抑制を示し、最長８４日間の期間にわたって、いずれも高い抑制率を維持した。
【０４７９】
それに対して、比較複合体１５は、最初の２８日間で各実施例において類似のｍＲＮＡ抑制効果を実現したが、その以降、抑制効果が明らかに低下し、図１６及び図１７に示される抑制効果の持続時間は、同じ用量レベルでの複合体２４及び２５に比べて明らかに短かった。
【０４８０】
以下の点以外は上記と同じ方法によりさらに実験を４回行い、血清ＨＢｓＡｇを検出した。
【０４８１】
ＡＡＶ−ＨＢＶ低濃度マウスモデルを採用し、複合体２５を用いて、用量はそれぞれ３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇであり、対照群には生理食塩水ＮＳを投与し、１４０日目まで試験を行った。結果を図１８に示した。
【０４８２】
Ｍ−Ｔｇモデルを採用し、複合体１７及び２５を用いて、用量はそれぞれ３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇであり、対照群にはＰＢＳを投与し、７０日目まで試験を行った。結果を図１９に示した。
【０４８３】
Ｍ−Ｔｇモデルを採用し、複合体２６の用量はそれぞれ５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇであり、比較複合体１５の用量は５ｍｇ／ｋｇであり、対照群にはＰＢＳを投与し、７８日目まで試験を行った。結果を図２０に示した。
【０４８４】
１．２８ｃｏｐｙモデルを採用し、複合体２４を用いて、用量は３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇであり、２１０日目まで試験を行った。結果を図２１に示した。
【０４８５】
上記各種の用量については、各複合体を同じ用量体積で用いるとともに、相応に投与するために、複合体溶液の濃度を個別に調節した。
【０４８６】
図１８〜２１から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、複数種の動物モデルにおいて、いずれも持続的で効率的な血清ＨＢｓＡｇ抑制効率を示し、規律的な用量依存性を示した。
【０４８７】
（実験例６）表３Ｂ〜３ＤにおけるｓｉＲＮＡ複合体の効果を検証した実験
（実験例６−１）複合体４３、６２及び７８のオフターゲット効果試験
各複合体について、対応する複合体におけるｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列と完全に相補的に対合する目的配列により、オンターゲットプラスミドＧＳＣＭを構築した。また、それぞれ対応する複合体のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列と完全に同じであって、対応する複合体のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列の１〜８位と相補的に対合する、又は対応する複合体のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列の１〜８位と同じ目的配列を用いて、オフターゲットプラスミドＧＳＳＭ、ＰＳＣＭ及びＰＳＳＭを構築した。それ以外は、実験例５−１に記載された方法に従い、複合体４３、６２及び７８のオフターゲット効果をそれぞれ検証した。結果をそれぞれ図２２〜２４に示した。図２２〜２４の結果から分かるように、以上の全ての複合体は、標的ｍＲＮＡに対して良好な抑制作用を有するだけでなく、オフターゲット効果も低かった。
【０４８８】
（実験例６−２）本実験では、マウス体内で本開示の複合体によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効果を証明している
本実験例では、ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊにおいて複合体２５、４２、４３、６２及び７８によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を調べた。
【０４８９】
まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスを血清ＨＢｓＡｇの含有量別にランダムに分け（いずれも雌性、１群あたりマウス４匹）、それぞれ番号を付け、ＮＳ群を対照群として追加した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出した。それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｌ／ｋｇの用量で複合体２５及び複合体４２を皮下投与し、０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液として投与し、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与後の７日目に動物を死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズした。その後、Ｔｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０４９０】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及びβ−アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びβ−アクチンを検出した。
【０４９１】
検出プライマーの配列を表５Ａに示した。
【０４９２】
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現量及び複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率の算出方法は、実験例５−２と同じである。
【０４９３】
対照群は、本実験においてＮＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図２５に示した。
【０４９４】
他の実験において、以下の条件でさらに実験を２回行った。
【０４９５】
投与されるｓｉＲＮＡ複合体を複合体４３、６２、７８及び２５に変更して実験を行い、７日目に検出データを回収したこと以外は、上記と同じ方法を採用した。結果を図２６に示した。
【０４９６】
投与されるｓｉＲＮＡ複合体を複合体４２、４３及び２５に変更して実験を行い、複合体４２及び２５について、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇ（ここで、用量体積を変化させず、複合体溶液の濃度をそれぞれ調整した）の用量で投与し、検出に用いたプライマー配列を表５Ｂに示される配列に変更したこと以外は、上記と同じ方法を採用した。結果を図２７に示した。
【０４９７】
【表５Ｂ】
2021509402.tif 000140
【０４９８】
図２６及び図２７から分かるように、全ての上記本開示の複合体は、マウス体内でのＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対していずれも高い抑制活性を有する。異なるＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制効果はほぼ一致した。
【０４９９】
（実験例６−３）本実験では、ＨＢＶトランスジェニックマウスの血清において、表３ＢにおけるｓｉＲＮＡ複合体によるＨＢｓＡｇ発現及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する抑制効率の時間関連性試験を示している
ＡＡＶ−ＨＢＶ低濃度モデルマウスを用いた。動物モデルの構築に成功した後、血清中のＨＢｓＡｇの含有量別にランダムに分けた（１群あたりマウス５匹）。１群あたりそれぞれ複合体４３を投与し、ＰＢＳをブランク対照として用いた。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出した。皮下に単回投与し、用量は３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの２つのグループであり、使用濃度はそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ又は０．２ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液であり、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与前と薬剤投与後の７、１４、２１、２８、５６、８４、１１２、１２６及び１４０日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを検出した。
【０５００】
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清は２０μｌ以上であった。ＨＢｓＡｇ  ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清中のＨＢｓＡｇの含有量を検出した。
【０５０１】
標準化されたＨＢｓＡｇの発現＝（薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
ＨＢｓＡｇ抑制率＝（１−薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢｓＡｇ当量（ＵＩ）で表される。
【０５０２】
結果を図２８に示した。図２８の結果から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、ＮＳ陰性対照群が抑制作用を示していないのに対して、複合体４３は、薬剤投与後の異なる時点でいずれも優れたＨＢｓＡｇ抑制効果を示し、最長１００日間の期間にわたって高い血清ＨＢｓＡｇ抑制率を示し続け、ＨＢＶ遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制することができることを示した。
【０５０３】
さらなる実験では、上記方法により、Ｍ−Ｔｇモデルマウスにおいて、複合体２４、６２及び７８をそれぞれ３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、使用濃度が０．６ｍｇ／ｍｌ又は０．２ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９ｗｔ％塩化ナトリウム水溶液であり、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。試験を８５日目まで行った。結果を図２９及び３０に示した。
【０５０４】
図２９の結果から分かるように、複合体２４、６２及び７８は、いずれも最長８５日間の長期間にわたる有効な血清ＨＢｓＡｇ抑制効果を示した。図３０から分かるように、薬剤投与後の８５日目に、３ｍｇ／ｋｇ用量群の複合体２４及び７８は、それぞれ６８．６％及び６２％のＨＢＶ  ｍＲＮＡ抑制率を示した。
【０５０５】
さらなる実験では、上記方法により、１．２８ｃｏｐｙモデルマウスにおいて、それぞれ３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量で複合体４３を用い、使用濃度がそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ又は０．２ｍｇ／ｍｌの複合体の０．９％塩化ナトリウム水溶液であり、投与体積が５ｍｌ／ｋｇであり、試験を８５日目まで行った。実験例５−４の方法によりＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡの抑制効果を検出した。結果を図３１及び３２に示した。
【０５０６】
図３１及び３２の結果から分かるように、１．２８ｃｏｐｙマウスにおいて、本開示の複合体４３は、最長８５日間の期間にわたってＨＢＶ発現及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する効率的な抑制を示し続けた。
【０５０７】
（実験例７）複合体１６７及び１６８の効果を検証した実験
（実験例７−１）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体外で高い活性を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を有することを証明している。
本実験例では、複合体１６８の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）及びオフターゲット効果を調べた。具体的には、複合体１６８が、完全マッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が複合体１６８のアンチセンス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的であり、又は一致している）又はシード領域がマッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が複合体１６８のアンチセンス鎖の１〜８位のヌクレオチド配列と相補的であり、又は一致している）を標的する活性を測定した。
【０５０８】
複合体１６８におけるｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の配列と完全に相補的な目的配列を用いてオンターゲットプラスミドＧＳＣＭを構築し、複合体１６８におけるｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列と完全に同じ目的配列、複合体１６８におけるｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列の１〜８位と相補的に対合する目的配列、又は複合体１６８におけるｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列の１〜８位と同じ目的配列を用い、それぞれオフターゲットプラスミドＧＳＳＭ、ＰＳＣＭ及びＰＳＳＭを構築したこと以外は、実験例５−１の方法により、複合体１６８を検証した。実験結果から分かるように、上記の全ての複合体は、標的ｍＲＮＡに対して高い抑制作用を有するだけでなく（ＩＣ５０＝０．０５１３ｎＭ）、低いオフターゲット効果をさらに示した。
【０５０９】
（実験例７−２）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体のリソソーム溶解液における体外安定性を証明している
調製例１で得られた複合体１６７及び比較配列１（ｓｉＲＮＡ濃度として計算し、それぞれ２０μＭの０．９ｗｔ％塩化ナトリウム水溶液であり、１群あたり６μｌ、比較配列１をＮＣと記した）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのマウス由来のリソソーム溶解液（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から購入、番号Ｒ０６１０ＬＴ、最終濃度は０．２ｍＵ／μＬ）と均一に混合して３７℃で恒温培養した。０、１、２、４、６、２４時間の各時点でそれぞれ５μｌの試料を取り出し、それぞれ１５μＬの９Ｍ尿素水溶液に加えて変性させ、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存し、使用に備えた。０時間は、ｓｉＲＮＡ複合体をリソソーム溶解液と均一に混合した後、直ちに取り出した試験の時点を表す。同時に、複合体１６７及び比較配列１に対して、それぞれ等モル量のｓｉＲＮＡ（２０μＭ、１．５μｌ）を７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ  ５．０）及び１μＬの脱イオン水と均一に混合し、さらに３０μｌの９Ｍ尿素水溶液に加えて変性させ、次に、８μＬの６×試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ水溶液、３６重量％グリセリン、０．０６重量％ブロムフェノールブルー）と均一に混合し、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存し、反応をクエンチングした。これにより、リソソーム溶解液で処理されていない被験サンプル（電気泳動図においてＭと記している）を作製した。１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合した。２０μＬの各試験に用いたサンプルをゲルに負荷し、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルを１×Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した後にイメージングを行った。結果を図３３に示した。
【０５１０】
ヒト由来のリソソーム溶解液の代わりにマウス由来のリソソーム溶解液（Ｒａｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒｉｔｏｓｏｍｅｓ、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から購入、番号Ｒ０６１０．ＬＴ、最終濃度０．２ｍＵ／μＬ）を用いたこと以外は、同じ方法により複合体１６７及び比較配列１（図３４においてＮＣと記している）におけるマウス由来のリソソーム溶解液の安定性を測定した。結果を図３４に示した。
【０５１１】
図３３及び３４から、本開示の複合体は、ヒト由来のリソソーム溶解液及びマウス由来のリソソーム溶解液のいずれにおいても、満足できる安定性を示し、少なくとも２４時間分解されずに維持できることを示した。
【０５１２】
（実験例７−３）本実験では、本開示の複合体のマウス体内でのＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を証明している
本実験例では、ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊにおいて、複合体１６７及び複合体１６８のｓｉＲＮＡ複合体によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を調べた。
【０５１３】
まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスを血清中のＨＢｓＡｇの含有量別にランダムに分け（いずれも雌性、１群あたりマウス５匹）、それぞれＰＢＳ及び複合体１６７、複合体１６８を投与した。ここで、ＰＢＳ群では、各動物の皮下に５ｍｌ／ｋｇの１×ＰＢＳを投与し、複合体１６７又は複合体１６８に対して、単回皮下投与し、それぞれの用量は１ｍｇ／ｋｇであり、複合体が０．２ｍｇ／ｍｌ濃度の０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与後の２８日目に全ての動物を死亡させた。肝臓を回収し、ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０５１４】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶに対するプライマー及びβ−アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びβ−アクチンを検出した。
【０５１５】
検出プライマーの配列を表５Ｇに示した。
【０５１６】
【表５Ｇ】
2021509402.tif 000141
【０５１７】
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現量及び複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率の算出方法は、実験例５−２と同じであった。結果を以下の表６Ｇに示した。
【０５１８】
他の実験では、複合体１６７及び１６８で検出するための投与されるｓｉＲＮＡ複合体を置換し、用量を変化させたこと以外は、上記と同じ方法を採用した。結果を以下の表６Ｇに示した。
【０５１９】
【表６Ｇ】
2021509402.tif 000142
【０５２０】
上記結果から分かるように、本開示の全ての複合体は、いずれも高いマウス体内でのＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現抑制活性を示した。本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、体内送達効率が良好であることも示された。
【０５２１】
（実験例７−４）本実験では、ＨＢＶトランスジェニックマウスの血清において、表３ＢにおけるｓｉＲＮＡ複合体によるＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡ発現量に対する抑制効率の時間関連性試験を示している
１．２８ｃｏｐｙモデルにおいて、これらのマウスをランダムに分けた（１群あたりマウス６匹、雌雄各半分）。各群にそれぞれ生理食塩水及び異なる用量の複合体１６８を投与した。生理食塩水群に５ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を皮下注射した。複合体群に対して、全ての動物について、体重に応じて投与量を算出した。皮下に単回投与し、用量はそれぞれ３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇであり、複合体がそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ又は０．２ｍｇ／ｍｌの０．９ｗｔ％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与前と薬剤投与後の７、１３、２１、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６、１４０及び１５４日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡレベルを検出した。
【０５２２】
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清は２０μｌ以上であった。ＨＢｓＡｇ  ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清中のＨＢｓＡｇの含有量を検出し、ＨＢｅＡｇ  ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清中のＨＢｅＡｇの含有量を検出し、ＱＩＡａｍｐ  ９６  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔの説明書を参照して血清中のＤＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを行い、ＨＢＶ  ＤＮＡの発現レベルを検出した。
【０５２３】
標準化されたＨＢｓＡｇの発現＝（薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
ＨＢｓＡｇ抑制率＝（１−薬剤投与後のＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢｓＡｇ当量（ＵＩ）で表される。
【０５２４】
標準化されたＨＢｅＡｇの発現＝（薬剤投与後のＨＢｅＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｅＡｇの含有量）×１００％。
ＨＢｅＡｇ抑制率＝（１−薬剤投与後のＨＢｅＡｇの含有量／薬剤投与前のＨＢｅＡｇの含有量）×１００％。ここで、ＨＢｅＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢｅＡｇ当量（ＵＩ）で表される。
【０５２５】
標準化されたＨＢＶ  ＤＮＡの発現＝（薬剤投与後のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量／薬剤投与前のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量）×１００％。
ＨＢＶ  ＤＮＡ抑制率＝（１−薬剤投与後のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量／薬剤投与前のＨＢＶ  ＤＮＡの含有量）×１００％。
ここで、ＨＢＶ  ＤＮＡの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりのＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数で表される。
【０５２６】
結果を図３５〜３７に示した。図３５から分かるように、生理食塩水が施された陰性対照群は、薬剤投与後の異なる時点で抑制作用を示しなかったのに対して、複合体１６８は、薬剤投与後の異なる時点で、いずれもＨＢｓＡｇに対して優れたＨＢｓＡｇ抑制効果を示した。特に、３ｍｇ／ｋｇ群は、最長１００日間の期間にわたって常に９０％以上の血清ＨＢｓＡｇ抑制率を示し、ＨＢＶ遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制することができることを示した。
【０５２７】
図３６から分かるように、ｓｉＲＮＡ複合体は同様にＨＢｅＡｇの発現を抑制でき、３ｍｇ／ｋｇ用量群は、最長７０日間にわたって、血清ＨＢｅＡｇの発現に対する抑制率が常に５０％以上であった。
【０５２８】
図３７の結果から分かるように、ｓｉＲＮＡ複合体は、ＨＢＶ  ＤＮＡの発現を効率よく抑制し、最長１５４日間の期間にわたって常に高い抑制率を維持することもできた。
【０５２９】
（実験例８）表３ＥにおけるｓｉＲＮＡ複合体の効果を検証した実験
（実験例８−１）本実験では、表３ＥにおけるｓｉＲＮＡ複合体の体内でのＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量の抑制効率に対する影響について説明している
本実験例では、複合体１０５、１０９、１１１及び１１５による正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対する抑制率を調べた。
【０５３０】
正常ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）をランダムに分け（１群あたり５匹）、それぞれ各群のマウスに複合体１０５、１０９、１１１、１１５及びＰＢＳを投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、ｓｉＲＮＡ複合体の用量は（ｓｉＲＮＡの量として）３ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇであり、複合体がそれぞれ０．３ｍｇ／ｍｌ及び０．０３ｍｇ／ｍｌ濃度の０．９ｗｔ％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は１０ｍＬ／ｋｇであった。薬剤投与後の１４日目及び２８日目にそれぞれ１つのバッチのマウスを死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０５３１】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＡＮＧＰＴＬ３に対するプライマー及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いてそれぞれＡＮＧＰＴＬ３及びＧＡＰＤＨを検出した。
【０５３２】
検出プライマーの配列を表５Ｅに示した。
【０５３３】
【表５Ｅ】
2021509402.tif 000143
【０５３４】
ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量は、ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量＝（試験群ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量／試験群ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量）／（対照群ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量／対照群ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量）×１００％という等式により算出した。
【０５３５】
複合体のＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制率は、ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現量抑制率＝［１−（試験群ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量／試験群ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量）／（対照群ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量／対照群ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量）］×１００％という等式により算出した。対照群は、本実験においてＰＢＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図３８Ａと３８Ｂに示した。
【０５３６】
図３８Ａと３８Ｂの結果から明らかなように、上記ｓｉＲＮＡ複合体は、いずれも優れたＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現抑制活性を示した。
【０５３７】
上記実験対象の眼窩から採取された血液（約１００μｌ）を遠心して血清を得、さらにＰＭ１Ｐ０００／３全自動血清生化学分析装置（ＳＡＢＡ、イタリア）を用いて血清中の総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を検出し、脂質結果を標準化処理し、脂質レベルの抑制率は、抑制率＝（１−薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）×１００％という等式により算出した。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリドを指す。検出結果を図３９Ａと３９Ｂに示した。
【０５３８】
図３９Ａと３９Ｂの結果から分かるように、異なる用量の複合体１０５、１０９、１１１及び１１５で治療されたマウスの血清においてＣＨＯとＴＧの含有量は明らかに低下しており、かつ、少なくとも薬剤投与後の２８日間、脂質レベルの低下が認められた。
【０５３９】
（実験例８−２）本開示のｓｉＲＮＡ複合体による脂質に対する影響
Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓモデルマウスに対して、ＴＧ含有量＞２ｍｍｏｌ／Ｌとしてランダムに分け（１群あたりマウス５匹）、複合体１１５、及びＰＢＳブランク対照を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量は３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇであり、複合体をそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ濃度の０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与前と薬剤投与後の７、１４、２１、２８、３５、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６、１４０、１５４及び１６８日目にマウスの眼窩から採血し、血清ＣＨＯ及びＴＧレベルを検出した。
【０５４０】
眼窩から１回あたり約０．１ｍｌ採血し、遠心後の血清は２０μｌ以上であった。ＰＭ１Ｐ０００／３全自動血清生化学分析装置（ＳＡＢＡ、イタリア）を用いて血清中の総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を検出した。
【０５４１】
脂質結果を標準化処理した。
標準化された脂質レベル＝（薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）。
脂質レベルの抑制率＝（１−薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）×１００％。
【０５４２】
結果を図４０Ａと４０Ｂに示した。
【０５４３】
図４０Ａと４０Ｂから分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、複合体１１５は、最長１６８日間の期間にわたってＴＧ及びＣＨＯを明らかに低下させる効果を有し、マウス体内でのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制できることを示した。
【０５４４】
他の実験において、ｏｂ／ｏｂモデルマウスを採用し、複合体１１１、複合体１１５及び比較複合体１６を単独で投与し、各複合体を３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇでそれぞれ投与し、薬剤投与後の０、７、１４、２１、２８、３５及び４１日目にデータを採取したこと以外は、上記と同じ方法を採用した。その結果を図４１Ａ〜４１Ｂに示した。
【０５４５】
図４１Ａ〜４１Ｂの結果から分かるように、本開示の複合体１１１及び１１５は、４１日間の期間にわたってｏｂ／ｏｂマウス体内の脂質レベルを持続的に低下させ、優れた抑制活性を示すことができる。
【０５４６】
他の実験においては、複合体１１１及び比較複合体１６を単独で投与し、各複合体を３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇでそれぞれ投与し、複合体がそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ濃度の０．９ｗｔ％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は５ｍｌ／ｋｇであり、薬剤投与後の０、７、１４、２１、２８、３５、４２、５６及び７０日目にＣＨＯ値及びＴＧ値を検出したこと以外は、上記と同じ実験方法を採用した。その結果を図４２Ａ〜４２Ｄに示した。
【０５４７】
図４２Ａ〜４２Ｄから分かるように、本開示の複合体１１１は、７０日間に脂質を持続的に低下させることができ、同じ用量での比較複合体１６よりも優れていた。
【０５４８】
（実験例８−３）本実験では、表３Ａにおいて異なる複合分子を有するｓｉＲＮＡ複合体によるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率及び非ヒト霊長類動物の脂質に対する影響について説明している
メタボリックシンドロームに罹患したサル（全て雄性）に対して、１２匹中、８匹が複合体１６９を投与した実験群、４匹が複合体２５を投与した対照群となるように分け、サルの基礎データを測定して観察し、３週間にわたり１週間ごとに１回採血し、脂質レベル（ＴＧ、ＣＨＯ、ＨＤＬ）を検出した。その後、複合体１６９及び複合体２５（そのｓｉＲＮＡが、完全に関連していないｍＲＮＡを標的するため、比較複合体として用いられた）を投与し、全ての動物について体重に応じて薬物用量を算出した。単回皮下注射し、用量は９ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ数として）であり、１００ｍｇ／ｍｌの０．９ｗｔ％ＮａＣｌの水溶液として投与され、各投与部位の用量体積は２ｍｌ以下であった。薬剤投与前と薬剤投与後の７、１４、２１、２８、３５日目に採血し、各時点で血清ＴＧ及びＣＨＯレベルを検出した。
【０５４９】
脂質結果を標準化処理し、標準化された脂質レベル＝（薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）である。
【０５５０】
脂質レベルの抑制率＝（１−薬剤投与後の試験群における脂質の含有量／薬剤投与前の試験群における脂質の含有量）×１００％。
薬剤投与前の試験群における脂質の含有量：薬剤投与前３週間の脂質の含有量の平均値。図４３Ａと図４３ＢにおいてＤ０と記している。
【０５５１】
０日目（投与当日）及び２８日目に肝穿刺生検を行って肝臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。肝臓を回収し、ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０５５２】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＡＮＧＰＴＬ３に対するプライマー及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いてそれぞれＡＮＧＰＴＬ３及びＧＡＰＤＨを検出した。
【０５５３】
検出プライマーの配列を表６Ｅに示した。
【０５５４】
【表６Ｅ】
2021509402.tif 000144
【０５５５】
ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの発現量及びＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡに対する抑制率の算出は、実験例８−１と同じであった。対照群は、本実験においてＰＢＳが施された対照群サルであり、試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群サルであった。結果を図４３Ａ〜４３Ｃに示した。
【０５５６】
図４３Ａ〜４３Ｃから分かるように、複合体１６９は、明らかなＴＧ低下効果及びＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現抑制を示し、薬剤投与後の２８日目に８２．７％のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子ｍＲＮＡを低下させた。
【０５５７】
（実験例９）表３ＦにおけるｓｉＲＮＡ複合体の効果の実験
（実験例９−１）本実験では、表３ＦにおけるｓｉＲＮＡ複合体の体内でのＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を証明している
本実験例では、複合体１４４のヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス（Ｂ６、ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂから購入され）体内での肝臓組織におけるＡＰＯＣ３発現レベルに対する抑制率を調べた。
【０５５８】
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス（６〜８週齢、トリグリセリド＞２ｍｍｏｌ／Ｌ）を１群あたりマウス５匹でランダムに分け、それぞれ各群のマウスに複合体１４４及び複合体２５（そのｓｉＲＮＡが、完全に関連していないｍＲＮＡを標的するため、比較複合体として用いられた）を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、ｓｉＲＮＡ複合体の用量は（ｓｉＲＮＡの量として）それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇであり、複合体がそれぞれ０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌ濃度の０．９ｗｔ％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は５ｍＬ／ｋｇであった。薬剤投与後の１４日目にマウスを死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）で全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０５５９】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、β−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＡＰＯＣ３に対するプライマー及びβ−アクチンに対するプライマーを用いてそれぞれＡＰＯＣ３及びβ−アクチンを検出した。
【０５６０】
検出プライマーの配列を表７Ｆに示した。
【０５６１】
【表７Ｆ】
2021509402.tif 000145
【０５６２】
ＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現量は、ＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現量＝（試験群におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現量／試験群におけるβ−アクチンｍＲＮＡの発現量）／（対照群におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現量／対照群におけるβ−アクチンｍＲＮＡの発現量）×１００％という等式により算出した。
【０５６３】
複合体によるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制率は、抑制率＝［１−（試験群におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現量／試験群におけるβ−アクチンｍＲＮＡの発現量）／（対照群におけるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの発現量／対照群におけるβ−アクチンｍＲＮＡの発現量）］×１００％という式により算出される。対照群は、本実験においてＰＢＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図４４Ａに示した。
【０５６４】
図４４Ａの結果から、複合体１４４は、トランスジェニックマウスにおけるヒトＡＰＯＣ３遺伝子に対して顕著な体内抑制活性を示すことが示された。
【０５６５】
（実験例９−２）本実験では、実施例１４４のｓｉＲＮＡ複合体の体内での脂質含有量に対する影響について説明している
本実験例では、実施例１４４のｓｉＲＮＡ複合体のヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス（Ｂ６、ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂから購入）体内での血清中総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）含有量に対する影響を調べた。
【０５６６】
ヒトＡＰＯＣ３トランスジェニックマウス（６〜８週齢、ＴＧ含有量＞２ｍｍｏｌ／Ｌ）を、（１）ＮＳコントロール群、（２）複合体１４４  ３ｍｇ／ｋｇ群、（３）複合体１４４  １ｍｇ／ｋｇ群にランダムに分けた（１群あたりマウス７匹）。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、ｓｉＲＮＡ複合体がそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌ濃度の０．９ｗｔ％塩化ナトリウム水溶液として提供され、投与体積は５ｍＬ／ｋｇであった。
【０５６７】
薬剤投与前（０日目と記す）、及び薬剤投与後の７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、６３、７７、９１、１１２、１３３、１４７、１５４、１６１、１７５及び１８９日目にそれぞれ眼窩採血（約１００μＬ）を行い、遠心して血清を得た。さらにＰＭ１Ｐ０００／３全自動血清生化学分析装置（ＳＡＢＡ、イタリア）を用いて血清中の総コレステロール（ＣＨＯ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の含有量を検出し、脂質結果を標準化処理し、標準化された脂質レベル及び脂質レベルの抑制率の算出方法は、実験例８−３と同じであった。検出結果を図４４Ｂと４４Ｃに示した。
【０５６８】
図４４Ｂと４４Ｃから分かるように、実施例のｓｉＲＮＡ複合体は、最長１８９日間にわたってＴＧ及びＣＨＯを明らかに低下させる効果を有し、ヒトＡＰＯＣ３遺伝子の発現を長期間安定的で効率的に抑制することができることを示した。
【０５６９】
他の実験においては、投与複合体１７０を０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇでそれぞれ投与し（投与体積を変化させず、複合体溶液の濃度を相応に調整した）、薬剤投与後の１１２日目にデータを採取したこと以外は、上記と同じ方法を用いた。結果を図４５Ａと４５Ｂに示した。
【０５７０】
図４５Ａと４５Ｂの結果から分かるように、複合体１７０は、最長１１２日間の期間にわたって、トランスジェニックマウス体内の脂質及びＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡレベルを持続的に低下させることができ、当該低下効果は、明らかな用量依存効果を示している。
【０５７１】
他の実験においては、複合体１４４、１７０、１７１及び比較複合体４を投与し、各複合体を１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇで投与し（投与体積を変化させず、複合体溶液の濃度を相応に調整した）、薬剤投与後の１１２日目にデータを採取したこと以外は、上記と同じ方法により、マウスの血清総コレステロール（ＣＨＯ）及び総脂質（ＴＧ）を測定した。結果を図４６Ａ〜図４６Ｄに示した。
【０５７２】
図４６Ａ〜図４６Ｄの結果から分かるように、複合体１４４、１７０及び１７１は、最長１１２日間の期間にわたって、いずれもトランスジェニックマウスにおける脂質に対する持続的な低下作用を示し、持続的な低下効果は、全体として比較複合体４よりも優れていた。
【０５７３】
以上に本開示の発明を実施するための形態を詳しく記載したが、本開示は、上記実施形態の具体的な細部に限定されず、本開示の技術的思想の範囲で、本開示の技術的解決手段に対して複数種の簡単な変形をすることができ、これらの簡単な変形は、いずれも本開示の保護範囲に属する。
【０５７４】
説明すべきこととして、上記発明を実施するための形態に記載された各具体的な技術的特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要な重複を避けるために、本開示では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。
【０５７５】
また、本開示の各種の異なる実施形態は任意の組合せで実施されることもでき、本開示の精神から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本開示に開示された内容とみなすべきである。
【図１Ａ】
2021509402.tif 000183
【図１Ｂ】
2021509402.tif 000184
【図２Ａ】
2021509402.tif 000185
【図２Ｂ】
2021509402.tif 000186
【図３Ａ】
2021509402.tif 000187
【図３Ｂ】
2021509402.tif 000188
【図４】
2021509402.tif 000189
【図５】
2021509402.tif 000190
【図６】
2021509402.tif 000191
【図７】
2021509402.tif 000192
【図８】
2021509402.tif 000193
【図９】
2021509402.tif 000194
【図１０】
2021509402.tif 000195
【図１１】
2021509402.tif 000196
【図１２Ａ】
2021509402.tif 000197
【図１２Ｂ】
2021509402.tif 000198
【図１２Ｃ】
2021509402.tif 000199
【図１２Ｄ】
2021509402.tif 000200
【図１３】
2021509402.tif 000201
【図１４】
2021509402.tif 000202
【図１５】
2021509402.tif 000203
【図１６】
2021509402.tif 000204
【図１７】
2021509402.tif 000205
【図１８】
2021509402.tif 000206
【図１９】
2021509402.tif 000207
【図２０】
2021509402.tif 000208
【図２１】
2021509402.tif 000209
【図２２】
2021509402.tif 000210
【図２３】
2021509402.tif 000211
【図２４】
2021509402.tif 000212
【図２５】
2021509402.tif 000213
【図２６】
2021509402.tif 000214
【図２７】
2021509402.tif 000215
【図２８】
2021509402.tif 000216
【図２９】
2021509402.tif 000217
【図３０】
2021509402.tif 000218
【図３１】
2021509402.tif 000219
【図３２】
2021509402.tif 000220
【図３３】
2021509402.tif 000221
【図３４】
2021509402.tif 000222
【図３５】
2021509402.tif 000223
【図３６】
2021509402.tif 000224
【図３７】
2021509402.tif 000225
【図３８Ａ】
2021509402.tif 000226
【図３８Ｂ】
2021509402.tif 000227
【図３９Ａ】
2021509402.tif 000228
【図３９Ｂ】
2021509402.tif 000229
【図４０Ａ】
2021509402.tif 000230
【図４０Ｂ】
2021509402.tif 000231
【図４１Ａ】
2021509402.tif 000232
【図４１Ｂ】
2021509402.tif 000233
【図４２Ａ】
2021509402.tif 000234
【図４２Ｂ】
2021509402.tif 000235
【図４２Ｃ】
2021509402.tif 000236
【図４２Ｄ】
2021509402.tif 000237
【図４３Ａ】
2021509402.tif 000238
【図４３Ｂ】
2021509402.tif 000239
【図４３Ｃ】
2021509402.tif 000240
【図４４Ａ】
2021509402.tif 000241
【図４４Ｂ】
2021509402.tif 000242
【図４４Ｃ】
2021509402.tif 000243
【図４５Ａ】
2021509402.tif 000244
【図４５Ｂ】
2021509402.tif 000245
【図４６Ａ】
2021509402.tif 000246
【図４６Ｂ】
2021509402.tif 000247
【図４６Ｃ】
2021509402.tif 000248
【図４６Ｄ】
2021509402.tif 000249
【配列表】
2021509402000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月27日(2020.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（３２１）に示される構造を有する化合物：
【化１】
2021509402.tif 000250
式中、
ｎ１は１〜３の整数であり、ｎ３は０〜４の整数であり、
各ｍ１、ｍ２及びｍ３はそれぞれ独立して２〜１０の整数であり、
各Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基から選択され、
Ｒ４は、共有結合により活性薬物又は活性剤と結合できる基であり、
各Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか１つ又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し、
各Ｓ１は独立してＭ１であり、任意の活性ヒドロキシ基は、もしあれば、いずれもヒドロキシ保護基で保護され、
各Ｍ１は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。
【請求項２】
各Ｌ１が独立してＡ１〜Ａ２６の基及びその任意の組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物：
【化２】
2021509402.tif 000251
式中、各ｊ１は独立して１〜２０の整数であり、
各ｊ２は独立して１〜２０の整数であり、
各Ｒ’は独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
各Ｒａは独立してＡ２７〜Ａ４５の基及びその任意の組合せからなる群から選択され、
【化３】
2021509402.tif 000252
各Ｒｂは独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
2021509402.tif 000253
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
【請求項３】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３の基及びその結合の組合せからなる群から選択される、又は
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１の基のうち少なくとも２つの結合の組合せである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｌ１の長さが３〜２５個の原子、又は４〜１５個の原子であり、前記Ｌ１の長さとは、Ｌ１において窒素含有骨格中のＮ原子に結合される原子からＳ１に結合される原子まで形成される最も長い原子鎖上の連鎖原子の個数を指す、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
各ｍ１、ｍ２及びｍ３はそれぞれ独立して２〜５の整数である、又は、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
各Ｍ１が、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロノニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース及びＬ−４−チオリボースからなる群から独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ４は、リン酸ジエステル結合によりオリゴヌクレオチドに結合されることができる基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ４は、オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド上の基と反応してリン酸エステル結合を形成することができる第１の官能基を含む、又は
Ｒ４は第２の官能基をさらに含み、前記第２の官能基は、ヒドロキシ基もしくはアミノ基と共有結合を形成することができる、又は、ヒドロキシ基もしくはアミノ基と形成する共有結合により分子の残りの部分に結合される固相担体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記第１の官能基が、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されるヒドロキシ基である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記第２の官能基が、ホスホルアミダイト、カルボキシ基又はカルボン酸塩である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
式（４０３）〜（４４２）に示される構造を有する、請求項８に記載の化合物：
【化８】
2021509402.tif 000254
2021509402.tif 000255
2021509402.tif 000256
2021509402.tif 000257
2021509402.tif 000258
2021509402.tif 000259
2021509402.tif 000260
2021509402.tif 000261
2021509402.tif 000262
2021509402.tif 000263
2021509402.tif 000264
2021509402.tif 000265
式中、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表す。
【請求項１２】
Ｍ＋が、アルカリ金属カチオン、アンモニウムカチオン、第３級アミンにより形成されたカチオン又は第４級アンモニウムカチオンであり、Ｒｋが、トリチル基、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル又は４，４’，４’’−トリメトキシトリチルであり、ＳＰＳが樹脂を表す、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記受容体が肝細胞表面の受容体である、又は、前記受容体がヒト肝細胞におけるアシアロ糖タンパク質受容体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
式（１）に示される構造を有する複合体：
【化９】
2021509402.tif 000266
式中、
ｎ１は１〜３の整数であり、ｎ３は０〜４の整数であり、
各ｍ１、ｍ２及びｍ３はそれぞれ独立して２〜１０の整数であり、
各Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基から選択され、
Ｒ３は活性薬物であり、
Ｒ２は、長さ１〜２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか１つ又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し、
各Ｌ１は、独立して長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか１つ又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有し、
各Ｍ１は、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから選択される１つである。
【請求項１５】
各Ｌ１がＡ１〜Ａ２６の基及びその任意の組合せからなる群から独立して選択される、請求項１４に記載の複合体：
【化１０】
2021509402.tif 000267
式中、各ｊ１は独立して１〜２０の整数であり、
各ｊ２は独立して１〜２０の整数であり、
各Ｒ’は独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
各Ｒａは、Ａ２７〜Ａ４５及びその任意の組合せからなる群から独立して選択され、
【化１１】
2021509402.tif 000268
各Ｒｂは独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、
2021509402.tif 000269
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
【請求項１６】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３の基及びその結合の組合せからなる群から選択される、又は
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１の基のうち少なくとも２つの結合の組合せである、請求項１５に記載の複合体。
【請求項１７】
Ｌ１の長さが３〜２５個の原子、又は４〜１５個の原子である、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１８】
ｍ１、ｍ２及びｍ３はそれぞれ独立して２〜５の整数である、又は、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１９】
各Ｍ１が独立して単糖、二糖、三糖又は多糖である、又は
各Ｍ１が、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロノニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース及びＬ−４−チオリボースからなる群から独立して選択される、請求項１４に記載の複合体。
【請求項２０】
Ｒ３が、機能性オリゴヌクレオチドを含む、又は、Ｒ３が、式Ａ５９に示される構造を有する基である、請求項１４に記載の複合体：
【化１２】
2021509402.tif 000270
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは機能性オリゴヌクレオチドである。
【請求項２１】
Ｒ２が、Ｒ３におけるＰ原子とリン酸エステル結合を形成する、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】
式（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）、（２０）、（２１）又は（２２）に示される構造を有する、請求項１４に記載の複合体：
【化１４】
2021509402.tif 000271
2021509402.tif 000272
2021509402.tif 000273
2021509402.tif 000274
2021509402.tif 000275
2021509402.tif 000276
【請求項２３】
前記機能性オリゴヌクレオチドが、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ拮抗剤、マイクロＲＮＡ模倣物、デコイオリゴヌクレオチド、免疫刺激物、Ｇ−四重鎖、選択的スプライスバリアント、一本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸、核酸アプタマー、ステムループＲＮＡ、ｍＲＮＡ断片、活性化ＲＮＡ又はＤＮＡからなる群から選択される、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２４】
前記機能性オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドであり、式Ａ５９におけるＰ原子が、前記一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端に結合される、又は、
前記機能性オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、式Ａ５９におけるＰ原子が、前記センス鎖の３’末端に結合される、請求項２３に記載の複合体。
【請求項２５】
前記ｓｉＲＮＡにおける各ヌクレオチドが、独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記ｓｉＲＮＡがセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖がヌクレオチド配列１を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列２を含み、前記ヌクレオチド配列１と前記ヌクレオチド配列２は、長さがいずれも１９ヌクレオチドであり、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖相補領域を形成し、前記ヌクレオチド配列２が、標的ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド断片である第１のヌクレオチド配列断片と少なくとも一部で相補的であり、前記標的ｍＲＮＡとは、肝細胞において異常に発現する遺伝子のｍＲＮＡを指す、請求項２３に記載の複合体。
【請求項２６】
前記標的ｍＲＮＡが、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ又はＨＣＶに対応するｍＲＮＡである、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２７】
前記ヌクレオチド配列１と前記第１のヌクレオチド配列断片とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３個以下であり、前記ヌクレオチド配列２とヌクレオチド配列Ｂとは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３個以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｂは、前記第１のヌクレオチド配列断片と完全に逆相補的なヌクレオチド配列である、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２８】
前記ヌクレオチド配列２と前記ヌクレオチド配列Ｂとの間のヌクレオチド差異が、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２における１番目のヌクレオチドＺ’の位置での差異を含む、請求項２７に記載の複合体。
【請求項２９】
前記センス鎖がヌクレオチド配列３をさらに含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列４をさらに含み、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４は、長さが等しく、いずれも１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列３が前記ヌクレオチド配列１の５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４が前記ヌクレオチド配列２の３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列４が第２のヌクレオチド配列断片と相補的であり、前記第２のヌクレオチド配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおいて前記第１のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列４と同じヌクレオチド配列を指し、前記ヌクレオチド配列３と前記ヌクレオチド配列４が、基本的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である、請求項２５に記載の複合体。
【請求項３０】
前記ｓｉＲＮＡがヌクレオチド配列５をさらに含み、前記ヌクレオチド配列５は、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、前記アンチセンス鎖の３’オーバーハング端を構成する、請求項２５に記載の複合体。
【請求項３１】
前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、前記非フルオロ修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指し、ヌクレオチドアナログが、核酸におけるヌクレオチドを置換できる基であり、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドのいずれか１つとも異なる構造を有する、請求項２５に記載の複合体。
【請求項３２】
センス鎖及びアンチセンス鎖がいずれもフルオロ修飾ヌクレオチド及び非フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、前記フルオロ修飾ヌクレオチドがヌクレオチド配列１とヌクレオチド配列２に存在し、前記ヌクレオチド配列１におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列１の第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列２におけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列２の第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項３１に記載の複合体。
【請求項３３】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドとは、前記ヌクレオチドにおいてリボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項３１に記載の複合体。
【請求項３４】
前記ｓｉＲＮＡにおいて、少なくとも１つのリン酸エステル基は、チオリン酸エステルであり、前記チオリン酸エステルが、
前記センス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項２５に記載の複合体。
【請求項３５】
前記アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項２５に記載の複合体。
【請求項３６】
必要のある被験体において、肝細胞における特定の遺伝子の発現による病理学的状態又は疾患を治療するための治療薬であって、前記被験体に請求項１４に記載の複合体の有効量を投与する、治療薬。
【請求項３７】
前記特定の遺伝子が、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、アンジオポエチン様タンパク質３遺伝子及びアポリポタンパクＣ３遺伝子からなる群から選択される、請求項３６に記載の治療薬。
【請求項３８】
前記疾患が、慢性肝疾患、肝炎、肝線維化、肝過形成性疾患及び脂質異常からなる群から選択される、請求項３６に記載の治療薬。
【請求項３９】
前記脂質異常が高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項３８に記載の治療薬。
【請求項４０】
肝細胞と接触させるための請求項１４に記載の複合体を含む、前記肝細胞における特定の遺伝子の発現抑制剤。
【請求項４１】
前記特定の遺伝子がＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９、ＳＣＤ１、ＴＩＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ１、ＦＶＩＩ、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、ＨＢＶ又はＨＣＶである、請求項４０に記載の発現抑制剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
１つの実施形態において、前記ヌクレオチド配列５の長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列５は、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド、又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチドであり、又は、第３のヌクレオチド配列断片と相補的であり、前記第３のヌクレオチド配列断片とは、標的ｍＲＮＡにおいて前記第１のヌクレオチド配列断片に隣接し、又は前記第２のヌクレオチド配列断片に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列５に等しいヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が１９／２１又は２１／２３であり、このとき、本開示のｓｉＲＮＡは、顕著な肝細胞ｍＲＮＡサイレンシング活性を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９７】
ビニルリン酸エステル及び２’−メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー（ＶＰ−Ｕｍ）は、以下の方法に従い合成された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５７１】
他の実験においては、複合体１４４、１７０、１７１及び比較複合体１７を投与し、各複合体を１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇで投与し（投与体積を変化させず、複合体溶液の濃度を相応に調整した）、薬剤投与後の１１２日目にデータを採取したこと以外は、上記と同じ方法により、マウスの血清総コレステロール（ＣＨＯ）及び総脂質（ＴＧ）を測定した。結果を図４６Ａ〜図４６Ｄに示した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５７２】
図４６Ａ〜図４６Ｄの結果から分かるように、複合体１４４、１７０及び１７１は、最長１１２日間の期間にわたって、いずれもトランスジェニックマウスにおける脂質に対する持続的な低下作用を示し、持続的な低下効果は、全体として比較複合体１７よりも優れていた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2021509402.tif 000277
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９】
2021509402.tif 000278
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３３】
2021509402.tif 000279
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３４】
2021509402.tif 000280
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４３Ａ】
2021509402.tif 000281
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４３Ｂ】
2021509402.tif 000282
【国際調査報告】
2021509402.tif 000283
2021509402.tif 000284
2021509402.tif 000285
2021509402.tif 000286