(57)【要約】治療的に有効な量のPIC1が対象へ投与される、対象における全身性エリテマトーデスを処置する方法が提供される。治療的に有効な量のPIC1が対象へ投与される、輸血関連急性肺損傷を処置する方法も提供される。PIC1は、対象における免疫複合体による補体系の活性化およびNET形成をモジュレートすることができる。PIC1は、対象におけるミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性を阻害することもできる。2021509916.tif 000019
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的に有効な量のPIC1を対象へ投与する工程を含む、対象における全身性エリテマトーデス（SLE）を処置する方法。
【請求項２】
治療的に有効な量のPIC1を対象へ投与する工程を含む、対象における輸血関連急性肺損傷（TRALI）を処置する方法。
【請求項３】
対象が輸血を投与される前、対象が輸血を投与された後、および/または輸血中に、PIC1が投与される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
対象における免疫複合体による補体系の活性化およびNET形成をモジュレートするために有効である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
対象におけるNETによって媒介される炎症性組織傷害を阻害するために有効である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
NET形成が、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスのうちの少なくとも一つによって刺激される、請求項4または請求項5記載の方法。
【請求項７】
PIC1が対象におけるミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性を阻害する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
PIC1が非経口投与される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
対象がヒトである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
PIC1が、1個または複数個のPEGモエティを含むペプチドである、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
PIC1がPA-dPEG24である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
PA-dPEG24が、
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の配列を含む、請求項11記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2018年1月9日出願の米国仮出願第62/615,183号、2018年6月6日出願の米国仮出願第62/681,458号、および2018年10月17日出願の米国仮出願第62/746,649号に基づく優先権を主張するものであり、それらの各々の開示は、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本願は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含有している。2019年1月7日に作成された該ASCIIコピーは、Seqlist.txtという名前であり、16,143バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
背景
NETとは、好中球が、抗微生物分子によって装飾されたDNAの網目状構造物に変化することによって、感染を封じ込める手段である。NETは、全身性エリテマトーデス（SLE）および輸血関連急性肺損傷（TRALI）のような広範囲の炎症性疾患および自己免疫疾患の病原に寄与することが示されている。
【０００４】
SLEの病原は極めて複雑であるが、二つの主要な要因は、免疫複合体によって開始される補体活性化およびNET形成である。C4およびC3の消費をもたらす古典経路補体活性化を開始する免疫複合体は、古くから認識されており、ループス腎炎に寄与する［1〜3］。しかしながら、NETは、より最近、SLE病原に寄与することが認識された［4〜6］。
【０００５】
TRALIは、輸血に関連した罹患率および死亡率の主因である。TRALIは、同種血液製剤輸血を受容してから6時間以内に起こる急性肺損傷として定義される。TRALIは、一過性の白血球減少症および血小板減少症を証明する臨床検査、ならびに胸部X線による両側性浸潤と共に、呼吸困難、発熱、低血圧、低酸素血症、および肺水腫を一般的に特徴とする。死亡率は5〜10％であり、患者の大多数（70〜90％）が人工呼吸および血行動態補助を必要とする。有効な薬理学的介入が存在しないため、現在の標準治療はもっぱら支持療法に限定されている。
【０００６】
TRALIの病態生理学は複雑である。臨床的には、ドナー血液製剤中のヒト白血球抗原またはヒト好中球同種抗原に対する抗体が、TRALI症例の大多数を引き起こすと考えられている。非抗体媒介性または非免疫性のTRALIは、一般的に、血小板または赤血球の輸血後に起こり、症例の11〜39％を占める。抗体媒介性TRALIおよび非抗体媒介性TRALIの両方の病態生理学を研究するため、多数の動物モデルが確立されている。好中球が、抗体媒介性TRALIの病原において中心的な役割を果たすが、臨床報告および動物モデルデータは、関与する抗体のクラスに依って、単球、リンパ球、血小板、および内皮細胞もTRALIに寄与し得ることを示唆している。補体活性化も、様々な抗体媒介性動物モデルにおけるTRALIの発症のために必要とされ、臨床TRALI症例における病理学的過程に寄与する。
【０００７】
動物モデルは、抗体によって媒介される宿主好中球の活性化が、肺毛細血管における隔離を誘導し、それが組織損傷をもたらすことを証明した。これらの活性化された好中球は、マウスモデルにおけるTRALI病原に寄与する好中球細胞外トラップ（NET）を放出する。NETバイオマーカー、例えば、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）、ヌクレオソーム、およびDNAは、TRALI患者から収集された血清中に検出されている。
【０００８】
ミエロペルオキシダーゼ（MPO）は、好中球に見出されるヘムベースのペルオキシダーゼである。MPOは、細胞の乾重量の30％を占める、好中球に存在する主要な酵素である。MPOの主な機能は、好中球が侵入微生物を死滅させるのを助けるため、次亜塩素酸を生成することである。しかしながら、MPOによる次亜塩素酸の生成は、宿主組織の傷害ももたらすことができ、多くの炎症性疾患において実質損傷に直接寄与することが示されている。例えば、MPOは、嚢胞性線維症において肺実質傷害に寄与する。直接の抗微生物活性に加えて、MPOは、好中球細胞外トラップ（NET）作出の重要な経路においても作用することが示されている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図1A〜1Cは、補体エフェクターによってアッセイされた、熱凝集IgG免疫複合体によって開始される補体活性化の、PA-dPEG24による阻害を示すグラフである。図1Aは、PA-dPEG24が、熱凝集IgG（Agg-IgG）免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるC5a生成を阻害したことを示す。示されたデータは、独立した実験（n＝5）の平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図１Ｂ】図1A〜1Cは、補体エフェクターによってアッセイされた、熱凝集IgG免疫複合体によって開始される補体活性化の、PA-dPEG24による阻害を示すグラフである。図1Bは、熱凝集IgG（Agg-IgG）免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるiC3b生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。示されたデータは、独立した実験（n＝4）の平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図１Ｃ】図1A〜1Cは、補体エフェクターによってアッセイされた、熱凝集IgG免疫複合体によって開始される補体活性化の、PA-dPEG24による阻害を示すグラフである。図1Cは、熱凝集IgG（Agg-IgG）免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるSC5b-9生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。示されたデータは、独立した実験（n＝6）の平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図２Ａ】図2A〜2Cは、補体エフェクターによってアッセイされた、卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体によって開始される補体活性化の、PA-dPEG24による阻害を示すグラフである。図2Aは、卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるC5a生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。示されたデータは、独立した実験（n＝4）の平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図２Ｂ】図2A〜2Cは、補体エフェクターによってアッセイされた、卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体によって開始される補体活性化の、PA-dPEG24による阻害を示すグラフである。図2Bは、卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるiC3b生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。示されたデータは、独立した実験（n＝4）の平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図２Ｃ】図2A〜2Cは、補体エフェクターによってアッセイされた、卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体によって開始される補体活性化の、PA-dPEG24による阻害を示すグラフである。図2Cは、卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるSC5b-9生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。2mM PA-dPEG24で、測定されたSC5b-9は、検出下限であった。示されたデータは、独立した実験（n＝3）の平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図３Ａ】図3A〜3Cは、補体エフェクターによってアッセイされた、C1-抗C1q免疫複合体によって開始される補体活性化の、PA-dPEG24による阻害を示すグラフである。図3Aは、Cl-抗C1q免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるC5a生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。示されたデータは、独立した実験（n＝4）の平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図３Ｂ】図3A〜3Cは、補体エフェクターによってアッセイされた、C1-抗C1q免疫複合体によって開始される補体活性化の、PA-dPEG24による阻害を示すグラフである。図3Bは、Cl-抗C1q免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるiC3b生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。示されたデータは、独立した実験（n＝4）の平均値±SEMである。
【図３Ｃ】図3A〜3Cは、補体エフェクターによってアッセイされた、C1-抗C1q免疫複合体によって開始される補体活性化の、PA-dPEG24による阻害を示すグラフである。図3Cは、Cl-抗C1q免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるSC5b-9生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。示されたデータは、独立した実験（n＝4）の平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図４】図4は、蛍光顕微鏡法によってアッセイされた、PMAによって開始されるヒト好中球（PMN）によるNET形成の、PA-dPEG24による阻害、および遊離DNAのPicoGreen定量化を示す。1段目は、未刺激の好中球を示し、2段目は、PMAおよび過酸化水素（H2O2）によって刺激された好中球を示し、3段目は、5mM PA-dPEG24（PIC1）の存在下でPMA＋H2O2によって刺激された好中球を示す。1列目は、DNAを可視化するため、DAPIによって探索されたスライドを示し、2列目は、抗MPO抗体によって探索されたスライドを示す。グラフは、PicoGreenによってアッセイされた、PMA＋H2O2によって刺激されたヒト好中球によるNET生成の、PA-dPEG24（5mM）による阻害を示す。示されたデータは、独立した実験（n＝3）の平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図５】図5は、DNA（DAPI）、好中球エラスターゼ（抗NE抗体）、およびヒストンH3（抗ヒストンH3抗体）についての蛍光顕微鏡法によってアッセイされた、PMAによって開始されるヒト好中球（PMN）によるNET形成の、PA-dPEG24による阻害を示す。1段目は、未刺激の好中球を示し、2段目は、PMAおよび過酸化水素（H2O2）によって刺激された好中球を示し、3段目は、5mM PA-dPEG24（PIC1）の存在下でPMA＋H2O2によって刺激された好中球を示す。1列目は、DNAを可視化するため、DAPIによって探索されたスライドを示し、2列目は、抗好中球エラスターゼ抗体によって探索されたスライドを示し、3段目は、抗ヒストンH3抗体によって探索されたスライドを示す。代表的なイメージが示される。
【図６】図6は、蛍光顕微鏡法によってアッセイされた、MPOによって開始されるヒト好中球（PMN）によるNET形成の、PA-dPEG24による阻害、および遊離DNAのPicoGreen定量化を示す。1段目は、未刺激の好中球を示し、2段目は、MPOおよび過酸化水素（H2O2）によって刺激された好中球を示し、3段目は、PA-dPEG24（PIC1）の存在下でMPO＋H2O2によって刺激された好中球を示し、4段目は、PA-dPEG24（PIC1）のみと共にインキュベートされた好中球を示す。1列目は、DNAを可視化するため、DAPIによって探索されたスライドを示し、2列目は、抗MPO抗体によって探索されたスライドを示す。グラフは、PicoGreenによってアッセイされた、MPO＋過酸化水素によって刺激されたヒト好中球によるNET生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。示されたデータは、独立した実験（n＝3）の平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図７Ａ】図7A〜7Cは、蛍光顕微鏡法によってアッセイされた、免疫複合体によって活性化された血清によって開始されるヒト好中球（PMN）によるNET形成の、PA-dPEG24による阻害、および遊離DNAのPicoGreen定量化を示す。図7Aは、単独でインキュベートされたPMN（未処理）、正常ヒト血清（NHS）と共にインキュベートされたPMN、免疫複合体（IC）単独と共にインキュベートされたPMN、または免疫複合体によって活性化された血清（IC血清）と共にインキュベートされたPMNによって誘導されたNET形成を示す。
【図７Ｂ】図7A〜7Cは、蛍光顕微鏡法によってアッセイされた、免疫複合体によって活性化された血清によって開始されるヒト好中球（PMN）によるNET形成の、PA-dPEG24による阻害、および遊離DNAのPicoGreen定量化を示す。図7Bは、PicoGreenによってアッセイされた、免疫複合体によって活性化された血清（IC血清）によって刺激されたヒト好中球によるNET生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。示されたデータは、独立した実験（n＝4）の平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図７Ｃ】図7A〜7Cは、蛍光顕微鏡法によってアッセイされた、免疫複合体によって活性化された血清によって開始されるヒト好中球（PMN）によるNET形成の、PA-dPEG24による阻害、および遊離DNAのPicoGreen定量化を示す。図7Cにおいて、1段目は、未刺激の好中球を示し、2段目は、免疫複合体によって活性化されたヒト血清（IC血清）および過酸化水素（H2O2）によって刺激された好中球を示し、3段目は、PA-dPEG24（PIC1）の存在下でIC血清＋H2O2によって刺激された好中球を示す。1列目は、DNAを可視化するため、DAPIによって探索されたスライドを示し、2列目は、抗MPO抗体によって探索されたスライドを示す。
【図８】図8Aおよび8Bは、ラットへのヒトRBC輸血の最適化の結果を示す。図8Aにおいては、ヒトRBCの輸血前（0）、または15％（◆、n＝3）、30％（▲、n＝3）、もしくは45％（■、n＝3）の輸血の0.5分後、5分後、20分後、60分後、120分後、もしくは360分後に収集されたラット血漿の中に存在する遊離ヘモグロビンを、分光測光法によって測定した。シャム動物の一群（●、n＝3）も同様に分析した。図8Bにおいては、ヒトRBCの15％（●、n＝3）、30％（■、n＝3）、または45％（▲、n＝3）の輸血からの生存ヒトRBCのパーセントを、輸血後0.5分目、5分目、20分目、60分目、120分目、および360分目に、フローサイトメトリーによって測定されるFITCコンジュゲート抗ヒトCD235a（グリコホリンA）モノクローナル抗体を使用して検出した。クリアランス動態を、ベースライン時（0分）の注射されたRBCに対して標準化した。示されたデータは、平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図９Ａ】図9A〜9Dは、LPSによる「第1ヒット」が、輸血によって誘導される肺損傷のために必要とされることを示す。シャムラット（図9A）、LPSの非存在下でミスマッチRBCの30％（図9B）、45％（図9C）の輸血を受容したラット、およびLPS投与後に30％の輸血を受容したラット（図9D）に由来する肺の代表的な組織学（ヘマトキシロンおよびエオシン）染色が示される。LPSの非存在下で輸血を受容した動物は、シャム処理を受けた動物において見られるような正常な肺構造を示し、30％の輸血の前にLPSを受容した動物は、重度の好中球浸潤および肺胞細胞壁の肥厚を示した。バーは100μmを表す。組織は、室温で20倍の倍率で顕微鏡（BX50、Olympus）によって観察された。イメージは、デジタルカメラ（DP70、Olympus）によって取得された。
【図９Ｂ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｃ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｄ】図9Aの説明を参照のこと。
【図１０】図10A〜10Cは、LPSによる「第1ヒット」が、白血球減少症を誘導することを示すグラフである。LPS前処理を受容していないかまたはLPS前処理を受けたラットから、30％ミスマッチRBCの注入前に、血液を収集した（輸血前、n＝22）。輸血の4時間後に、LPSなしで輸血されたラット（輸血のみ、n＝5）またはLPSありで輸血されたラット（輸血＋LPS、n＝3）から、再び血液を収集した。WBCおよび好中球（図10A）、単球（図10B）、ならびにリンパ球（図10C）のレベルが報告される。示されたデータは、平均値および平均値の標準偏差である。
【図１１Ａ】図11A〜11Dは、予防的に投与されたPIC1が、急性肺損傷を減弱させることを示す。図11Aは、シャム動物（n＝7）、媒体（n＝5）またはPIC1（n＝8）によって予防的に処理された動物について測定された総肺重量を示す。示されたデータは、平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。シャムラット（図11B）、媒体を受容したラット（図11C）、およびPIC1を受容したラット（図11D）に由来する肺の代表的な組織学（ヘマトキシロンおよびエオシン）染色が示される。PIC1を受容した動物は、シャム処理を受けた動物において見られるような正常な肺構造を示し、媒体を受容した動物は、肺胞腔の浸潤影および肺胞細胞壁の肥厚を示した。バーは100μmを表す。組織は、室温で20倍の倍率で顕微鏡（BX50、Olympus）によって観察された。イメージは、デジタルカメラ（DP70、Olympus）によって取得された。
【図１１Ｂ】図11Aの説明を参照のこと。
【図１１Ｃ】図11Aの説明を参照のこと。
【図１１Ｄ】図11Aの説明を参照のこと。
【図１２】図12A〜12Bは、PIC1が、好中球によって媒介される肺損傷および肺内のMPO活性を低下させることを示すグラフである。図12Aにおいては、媒体を受容した動物（n＝7）およびPIC1を受容した動物（n＝9）について、好中球浸潤および細胞壁肥厚についてのH＆E切片の盲検的段階分けを、0〜4のスケールでスコア化した：0＝正常肺、1＝軽度の肺病変、2＝中等度の肺病変、3＝やや重度の肺病変、4＝重度の肺病変。箱は四分位数を示し、ひげは25パーセンタイルであり、実線は平均値である。図12Bにおいては、MPO活性を測定するため、抗体捕獲によって、均質化された肺組織からMPOを単離した。0分から10分まで25秒毎に、試料を過酸化水素およびADHP溶液と合わせ、マイクロプレートリーダにおいて535nmの励起波長および590nmの放射波長で直ちに読み取った。MPO（陽性対照、+CTR、n＝3）およびPBS（陰性対照、-CTR、n＝3）を、媒体を受容した動物（n＝2）およびPIC1を受容した動物（n＝3）からの試料と共に分析した。各試料をトリプリケートで評価した。示されたデータは、平均値および平均値の標準偏差である。単純のため、5分および10分の時点のみが示される。
【図１３Ａ】図13A〜13Dは、PIC1が白血球減少症を低下させることを示すグラフである。血液を、媒体（n＝5）またはPIC1（n＝8）を受容したラットから収集した。WBC（図13A）、リンパ球（図13B）、好中球（図13C）、および単球（図13D）のレベルが報告される。示されたデータは、平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図１３Ｂ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１３Ｃ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１３Ｄ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１４】図14は、PIC1が循環血中の遊離DNAのレベルを低下させることを示すグラフである。媒体（n＝3）またはPIC1（n＝3）を受容した動物に由来する血漿試料を、PicoGreenと共にインキュベートした。マイクロプレートリーダにおいて485nmの励起波長および520nmの放射波長で、蛍光を読み取った。各動物についての遊離DNA測定は、全て、トリプリケートで行われた。示されたデータは、平均値および平均値の標準誤差（SEM）である。
【図１５】図15は、TRALIのPIC1による阻害のモデルを図示する。この動物モデルにおいて、LPSによる第1ヒット、その後の30％ヒトRBC輸血は、MPOによって媒介される活性酸素種（ROS）生成およびネトーシスをもたらす、好中球の隔離および活性化によって媒介される肺傷害からなるTRALI様表現型をもたらす。補体によって媒介される溶血に由来する遊離ヘムも、ROS形成に寄与する。PIC1は、補体によって媒介される溶血、C3aおよびC5aの生成、ROS形成、ならびにMPOによって媒介されるネトーシスおよびROS形成を阻害し、従って、TRALIを阻害することができる。このモデルにおいて、補体アナフィラトキシンC3aおよびC5aは、好中球活性化における直接の役割が不明であるため、点線矢印として示されている。
【図１６】図16は、増加する濃度のMPOについての、MPOによって媒介されるTMBの酸化の、PIC1による用量応答阻害を示すグラフである。
【図１７】図17は、IP注射された、増加する用量の精製されたMPOが、腹腔洗浄液試料におけるTMB過酸化の増加を示すグラフである。増加する量の精製されたMPOがIP注射され、1時間後に、動物が静脈切開、安楽死、および腹腔洗浄を受けた。腹腔洗浄液上清によるTMBの酸化を測定した（n＝4）。示されたデータは、独立した動物の平均値±SEMである。
【図１８】図18は、増加する用量の精製されたMPO IPが、腹腔洗浄液試料中の遊離DNAの増加を示すグラフである。増加する量の精製されたMPOがIP注射され、1時間後に、動物が静脈切開、安楽死、および腹腔洗浄を受けた。腹腔洗浄液上清中の遊離DNAを、PicoGreenアッセイを介して測定した（n＝4）。示されたデータは、独立した動物の平均値±SEMのである。
【図１９】図19は、腹腔内MPO時間的経過実験の結果を示すグラフである。精製されたMPO（0.1mg）がIP注射され、増加する間隔で、動物が静脈切開、安楽死、および腹腔洗浄を受けた。腹腔洗浄液上清によるTMBの酸化を測定した（n＝4）。示されたデータは、独立した動物の平均値±SEMである。
【図２０】図20は、腹腔内MPO時間的経過実験の結果を示すグラフである。精製されたMPO（0.1mg）がIP注射され、増加する間隔で、動物が静脈切開、安楽死、および腹腔洗浄を受けた。腹腔洗浄液上清中の遊離DNAを、PicoGreenアッセイを介して測定した（n＝4）。示されたデータは、独立した動物の平均値±SEMである。
【図２１】図21〜23は、PIC1の用量を増加させながらの腹腔内MPOを示すグラフである。精製されたMPO（0.1mg）がIP注射され、その直後に、増加する用量のPIC1がIP注射された。IP注射の2時間後に、動物は静脈切開、安楽死、および腹腔洗浄を受けた。図21は、腹腔洗浄液上清によるTMBの酸化を示す（n＝4）。図21〜23において、示されたデータは、独立した動物の平均値±SEMである。
【図２２】図21〜23は、PIC1の用量を増加させながらの腹腔内MPOを示すグラフである。精製されたMPO（0.1mg）がIP注射され、その直後に、増加する用量のPIC1がIP注射された。IP注射の2時間後に、動物は静脈切開、安楽死、および腹腔洗浄を受けた。図22は、PicoGreenアッセイを介して測定された腹腔洗浄液上清中の遊離DNAを示す（n＝4）。図21〜23において、示されたデータは、独立した動物の平均値±SEMである。
【図２３】図21〜23は、PIC1の用量を増加させながらの腹腔内MPOを示すグラフである。精製されたMPO（0.1mg）がIP注射され、その直後に、増加する用量のPIC1がIP注射された。IP注射の2時間後に、動物は静脈切開、安楽死、および腹腔洗浄を受けた。図23は、PicoGreenアッセイを介して測定された血漿中の遊離DNAを示す（n＝4）。図21〜23において、示されたデータは、独立した動物の平均値±SEMである。
【発明の概要】
【００１０】
一つの局面において、対象における全身性エリテマトーデス（SLE）を処置する方法が提供される。本法は、治療的に有効な量のPIC1を対象へ投与する工程を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、PIC1は、対象が輸血を投与される前、対象が輸血を投与された後、および/または輸血中に投与される。いくつかの態様において、本法は、対象における免疫複合体による補体系の活性化およびNET形成をモジュレートするために有効である。いくつかの態様において、本法は、対象におけるNETによって媒介される炎症性組織傷害を阻害するために有効である。いくつかの態様において、NET形成は、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスのうちの少なくとも一つによって刺激される。
【００１２】
前記の局面の様々な態様において、PIC1は、対象におけるミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性を阻害する。様々な態様において、PIC1は、非経口投与される。様々な態様において、対象は、ヒトである。ある種の態様において、PIC1は、1個または複数個のPEGモエティを含むペプチドである。ある種の態様において、PIC1は、PA-dPEG24である。ある種の態様において、PA-dPEG24は、
2021509916.tif 000003
の配列を含む。
【００１３】
別の局面において、対象における輸血関連急性肺損傷（TRALI）を処置する方法が提供される。本法は、治療的に有効な量のPIC1を対象へ投与する工程を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、PIC1は、対象が輸血を投与される前、対象が輸血を投与された後、および/または輸血中に投与される。いくつかの態様において、本法は、対象における免疫複合体による補体系の活性化およびNET形成をモジュレートするために有効である。いくつかの態様において、本法は、対象におけるNETによって媒介される炎症性組織傷害を阻害するために有効である。いくつかの態様において、NET形成は、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスのうちの少なくとも一つによって刺激される。
【００１５】
前記の局面の様々な態様において、PIC1は、対象におけるミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性を阻害する。様々な態様において、PIC1は、非経口投与される。様々な態様において、対象は、ヒトである。ある種の態様において、PIC1は、1個または複数個のPEGモエティを含むペプチドである。ある種の態様において、PIC1は、PA-dPEG24である。ある種の態様において、PA-dPEG24は、
2021509916.tif 000004
の配列を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語が、当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中に記載されたものに類似しているかまたは等価である方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得るが、適当な方法および材料を以下に記載する。
【００１７】
「阻害」という用語は、個々のもしくは複合体内の酵素、タンパク質、ペプチド、因子、副生成物、もしくはそれらの誘導体の生物学的機能の低下；インビボもしくはインビトロの生物学的なタンパク質、ペプチド、もしくはそれらの誘導体の量の低下；または関連する一連の生物学的反応もしくは化学的反応を含むことが公知の生物学的なイベントの連鎖、カスケード、もしくは経路の中断をさす。従って、「阻害」という用語は、例えば、対照試料と比較した補体カスケードの単一の成分の量の低下、成分もしくは成分の複合体の形成の速度もしくは全量の低下、または細胞溶解、コンバターゼ酵素の形成、補体由来膜侵襲複合体の形成、炎症、もしくは炎症性疾患のような転帰をもたらす、複雑な過程もしくは一連の生物学的反応の全体活性の低下を記載するために使用され得る。インビトロアッセイにおいて、「阻害」という用語は、いくつかの生物学的イベントまたは化学的イベントの測定可能な低下をさすことができるが、「阻害性」であるために、測定可能な低下が完全である必要はないことを、当業者は認識するであろう。
【００１８】
「PIC1」という用語は、
2021509916.tif 000005
のポーラーアソータント（polar assortant）（PA）配列を含むペプチドをさし、同一のアミノ酸配列を含むがPEG化のような修飾を含むペプチドもさす。「PIC1バリアント」という用語は、
2021509916.tif 000006
のPA配列と少なくとも85％同一、または少なくとも90％同一、または少なくとも95％同一、または少なくとも99％同一であるが、100％同一ではない配列を含むペプチドをさす。PIC1バリアントには、PA配列のアミノ酸のうちの少なくとも1個が欠失しているペプチドが含まれ得る。PIC1バリアントには、アミノ酸がPA配列に挿入されているペプチドが含まれ得る。PIC1バリアントには、PA配列のアミノ酸のうちの少なくとも1個が、アラニンのような他のアミノ酸、修飾型アミノ酸、またはサルコシン（Sar）のようなアミノ酸誘導体に置換されているペプチドが含まれ得る。
【００１９】
「対象」という用語は、本明細書中で使用されるように、診断、予後予測、または治療が望まれる任意の対象を意味する。例えば、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、または（類人猿、サル、オランウータン、もしくはチンパンジーのような）非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（cattle）、またはウシ(cow)であり得る。
【００２０】
「治療的に有効な量」という用語は、本明細書中で使用されるように、有意義な患者の利益を示すために十分な各活性成分の全量をさす。ペプチド化合物の治療的に有効な量は、処置される状態、状態の重症度、投与の時間、投与のルート、利用される化合物の排泄速度、処置の期間、含まれる同時治療、ならびに対象の年齢、性別、体重、および状態等のような、いくつかの因子に依って変動する。当業者は、治療的に有効な量を決定することができる。従って、当業者は、最大の治療効果を得るため、投薬量を滴定し、投与ルートを修飾する必要があり得る。
【００２１】
本明細書中で使用されるように、「処置する」、「処置すること」、または「処置」とは、障害（例えば、本明細書中に記載された障害）もしくはその症状を改善するか、または障害（例えば、本明細書中に記載された障害）もしくはその症状の進行を防止するかもしくは遅延させるために有効な量、様式（例えば、投与スケジュール）、および/またはモード（例えば、投与ルート）で、治療を投与することをさす。これは、例えば、統計的に有意な程度、または当業者が検出可能な程度の、障害またはその症状に関連したパラメータの改善によって、例えば、証拠付けられてよい。有効な量、様式、またはモードは、対象に依って変動し得、対象のために調整され得る。障害またはその症状の進行を防止するかまたは遅延させることによって、処置は、罹患したまたは診断された対象における障害またはその症状に起因する悪化を防止するかまたは遅延させることができる。
【００２２】
一つの局面において、治療的に有効な量のPIC1またはPIC1バリアントを対象へ投与する工程を含む、対象における炎症を阻害する方法が提供される。別の局面において、治療的に有効な量のPIC1またはPIC1バリアントを対象へ投与する工程を含む、対象における炎症性障害を処置する方法が提供される。
【００２３】
関連する局面において、対象における炎症を処置しかつ/または防止する方法において使用するためのPIC1またはPIC1バリアントが提供される。本法は、治療的に有効な量のPIC1またはPIC1バリアントを含む組成物を、それを必要とする対象へ投与する工程を含む。
【００２４】
PIC1およびPIC1バリアントの例には、表1にリストされたペプチドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００２５】
（表１）
2021509916.tif 000007
2021509916.tif 000008
【００２６】
いくつかの態様において、PIC1は、1個または複数個のPEGモエティを含む。PEGモエティは、PEG化によって、N末端、C末端、またはN末端およびC末端の両方に付着させられ得る。一つまたは複数の態様において、24個のPEGモエティがN末端に付着させられる。一つまたは複数の態様において、24個のPEGモエティがC末端に付着させられる。一つまたは複数の態様において、24個のPEGモエティが、N末端およびC末端に付着させられる。一つまたは複数の態様において、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、または24個のPEGモエティが、N末端に付着させられる。一つまたは複数の態様において、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、または24個のPEGモエティが、C末端に付着させられる。一つまたは複数の態様において、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、または24個のPEGモエティが、N末端およびC末端の両方に付着させられる。
【００２７】
PIC1ペプチドは、合成ペプチドであってよい。合成ペプチドは、インビトロで調製される。合成ペプチドは、当技術分野において公知の様々な方法によって調製されてよい。例えば、合成ペプチドは、ペプチドが形成されるよう、個々のアミノ酸を連続的にカップリングすることによって調製されてよい。いくつかの態様において、個々のアミノ酸のカルボキシル基が、成長中のペプチド鎖のアミノ末端に連続的にカップリングされる。不要の副反応がカップリング過程中に起こるのを防止するため、保護基が使用されてもよい。ペプチド合成は、液相で行われてもよいし、または固相で行われてもよい。
【００２８】
例示的なPIC1ペプチドには、PA-dPEG24（ポーラーアソータント（PA）配列を含み、C末端に24個のPEGモエティを含むペプチド）、（C末端に20個のPEGモエティを含む）PA-dPEG20、（C末端に16個のPEGモエティを含む）PA-dPEG16、（C末端に12個のPEGモエティを含む）PA-dPEG12、（C末端に8個のPEGモエティを含む）PA-dPEG08、（C末端に6個のPEGモエティを含む）PA-dPEG06、（C末端に4個のPEGモエティを含む）PA-dPEG04、（C末端に3個のPEGモエティを含む）PA-dPEG03、および（C末端に2個のPEGモエティを含む）PA-dPEG02が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００２９】
PIC1ペプチドは、カスケードの開始成分C1に結合し、その活性化を阻止することによって、補体の古典経路を阻害することができる［19、20］。PA-dPEG24は、PIC1ファミリーの15アミノ酸PEG化ペプチドである。PA-dPEG24は、免疫複合体によって開始される補体活性化を阻害することができ、NET形成を阻害することもできる。PA-dPEG24は、多様な免疫複合体による補体活性化を一貫して阻害することができ、いくつかの刺激によって開始されるNET形成も阻害することができる。
【００３０】
いくつかの態様において、PIC1は、対象におけるネトーシスを阻害するために有効である。いくつかの態様において、投与されたPIC1は、対象におけるMPO活性を阻害する。様々な態様において、対象は、ヒトである。ネトーシスとは、好中球が、好中球細胞外トラップ（NET）として染色体DNAを放出することによって、細胞死を受ける過程である。NETは、網目状であり、クロマチン線維および抗微生物分子から構成される。いくつかの態様において、ネトーシスは、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスのうちの少なくとも一つによって刺激される。
【００３１】
PIC1は、図16に示されるように、MPOによって媒介される酸化を阻害する。PA-dPEG24は、エクスビボの臨床CF痰試料中のMPOのペルオキシダーゼ効果を阻害することができ、インビトロの精製されたMPOについても阻害することができる。PA-dPEG24は、インビトロで、ヘモグロビンおよびミオグロビンを含む他のヘムベースのペルオキシダーゼのペルオキシダーゼ活性も阻害する。PA-dPEG24は、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、精製されたMPO、および免疫複合体によって活性化されたヒト血清のいずれかによって刺激されるNET形成のような、インビトロのNET形成を阻害することができる。
【００３２】
PIC1ペプチドは、疾患における免疫複合体による補体系の活性化およびNET形成をモジュレートするため、対象へ投与され得る。例示的な疾患には、ループス腎炎、血清病、遅延型過敏（III型過敏）反応、感染性心内膜炎、自己免疫性糸球体腎炎、クリオグロブリン血症、シェーグレン症候群、小型血管炎、ANCA関連血管炎、硬皮症、およびその他の炎症性もしくは自己免疫性の血管炎疾患、例えば、糸球体腎症、急性呼吸窮迫症候群、急性肺損傷、輸血関連急性肺損傷、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、乾癬、1型糖尿病、2型糖尿病、抗リン脂質抗体症候群、痛風、クローン病、潰瘍性大腸炎、横紋筋融解症、肥満/メタボリックシンドローム、ヴェーゲナー肉芽腫症（WG）、血栓症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、敗血症、未熟児網膜症（ROP）、子癇前症、歯周炎、新生児慢性肺疾患（CLD）、壊死性腸炎（NEC）、インフルエンザ誘発性間質性肺炎、炎症性肺疾患（ILD）、炎症性腸疾患（IBD）、癌における炎症、または気管支肺異形成症（BPD）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３３】
ある種の態様において、PIC1（例えば、PA-dPEG24）は、NET形成および/またはネトーシスを実質的に阻害する。他の態様において、PIC1（例えば、PA-dPEG24）は、NETによって媒介される炎症性組織傷害を阻害するかまたは実質的に阻害する。
【００３４】
別の局面において、治療的に有効な量のPIC1を対象へ投与する工程を含む、対象における全身性エリテマトーデス（SLE）を処置する方法が提供される。
【００３５】
関連する局面において、対象におけるSLEを処置しかつ/または防止する方法において使用するためのPIC1またはPIC1バリアントが提供される。方法は、治療的に有効な量のPIC1またはPIC1バリアントを含む組成物を、それを必要とする対象へ投与する工程を含む。
【００３６】
治療的に標的とされ得るSLE病原の二つの主要な局面は、免疫複合体によって開始される補体活性化および好中球による好中球細胞外トラップ（NET）形成である。理論によって拘束されることは望まないが、SLE患者の血中の抗C1q抗体の役割は、活発に研究されている領域であり、抗C1q抗体の存在とループス腎炎との間の強力な関連を証明する相当のデータが蓄積されつつある［7、8］。研究者は、ELISA型アッセイにおいて、表面に結合したSLE患者由来の抗C1q抗体が、古典経路およびレクチン経路を活性化することができることも示した［9］。従って、抗C1q抗体は、病原において、そしてSLE様免疫複合体の形成において役割を果たしている可能性がある。
【００３７】
免疫複合体は、補体を活性化して、ヒト好中球と相互作用し、それを刺激することができる補体活性化のエフェクター（例えば、C5a、非溶解（sublytic）濃度の膜侵襲複合体等）を生成することができる［10〜13］。しかしながら、免疫複合体が好中球によるNETの生成を誘導することができることを記載している文献は、この過程におけるFc受容体の役割に注目している［14〜17］。文献が免疫複合体とNETとの間の関係を示す場合、この過程における補体活性化の寄与は、不明なままである。Akong-Mooreら［18］は、NET形成の主要な経路が、MPO、ならびに過酸化水素および塩化物イオンから次亜塩素酸を生成するというその第1の機能を介して起こり得ることを示唆した。NET形成は、MPO阻害剤を利用することによって阻止され得る。
【００３８】
いくつかの態様において、PIC1は、対象におけるネトーシスを阻害するために有効である。いくつかの態様において、ネトーシスは、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスのうちの少なくとも一つによって刺激される。PIC1は、免疫複合体補体活性化およびNET形成をモジュレートするために投与され得る。一つの態様において、PIC1は、PA-dPEG24である。一つの態様において、PIC1は、C1-抗C1q免疫複合体をモジュレートするために使用され得る。一つの態様において、PIC1は、免疫複合体活性化およびNET形成を阻害するために使用され得る。ある種の態様において、PIC1は、炎症誘発性補体エフェクターの生成を制限するために使用され得る。一つの態様において、PIC1は、C5aおよびsC5b-9の生成を制限するために使用され得る。ある種の態様において、PIC1は、PMAによって刺激されたヒト好中球によるNET形成を阻害する。
【００３９】
いくつかの態様において、投与されたPIC1は、対象におけるMPO活性を阻害する。PIC1は、MPOによって刺激されたヒト好中球によるNET形成を阻害するために使用され得る。ある種の局面によると、PIC1は、免疫複合体によって活性化された血清によって刺激されたヒト好中球によるNET形成を阻害するために使用され得る。ある種の局面に従って、PIC1は、非経口送達される。様々な態様において、対象は、ヒトである。
【００４０】
ある種の局面によると、PIC1は、SLE、ループス腎炎、血清病、遅延型過敏（III型過敏）反応、感染性心内膜炎、自己免疫性糸球体腎炎、クリオグロブリン血症、シェーグレン症候群、小型血管炎、ANCA関連血管炎、硬皮症、およびその他の炎症性または自己免疫性の血管炎疾患、糸球体腎症、急性呼吸窮迫症候群、急性肺損傷、輸血関連急性肺損傷、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、乾癬、1型糖尿病、2型糖尿病、抗リン脂質抗体症候群、痛風、クローン病、潰瘍性大腸炎、横紋筋融解症、ならびに肥満/メタボリックシンドロームを処置するため、免疫複合体による補体活性化および好中球形成をモジュレートするために使用され得る。
【００４１】
実施例1の実験は、PA-dPEG24が、免疫複合体によって開始される補体活性化および炎症誘発性補体エフェクターの生成を阻害することができることを証明する。これは、補体阻害ペプチドが、SLE、ループス腎炎、血清病、遅延型過敏（III型過敏）反応、感染性心内膜炎、自己免疫性糸球体腎炎、クリオグロブリン血症、シェーグレン症候群、小型血管炎、ANCA関連血管炎、硬皮症、およびその他の炎症性または自己免疫性の血管炎疾患、糸球体腎症、急性呼吸窮迫症候群、急性肺損傷、輸血関連急性肺損傷、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、乾癬、1型糖尿病、2型糖尿病、抗リン脂質抗体症候群、痛風、クローン病、潰瘍性大腸炎、横紋筋融解症、ならびに肥満/メタボリックシンドロームのような、免疫複合体による補体系の活性化が不可欠な役割を果たす疾患における病原の局面を緩和することができることを示唆している。さらに、Clおよび抗C1q抗体は、抗C1q抗体を有するSLE患者の血漿中に形成されることが予測され得る免疫複合体の型をモデル化するため、新規の免疫複合体において利用され得る。PA-dPEG24は、試験された他の免疫複合体と一致して、Cl-抗C1q免疫複合体による補体活性化も阻止した。
【００４２】
免疫複合体によって開始された補体によって活性化されたヒト血清は、例えば、実施例1において証明されるように、NET形成を開始することができる。結果は、驚くべきものであり、免疫複合体自体がFc受容体を介してNET形成を開始することができるという過去の観察とは対照的である［14〜17］。実施例1の実験条件の下では、免疫複合体によって開始される補体活性化のNET形成への寄与は、単独の免疫複合体よりはるかに大きかった。理論によって拘束されることは望まないが、活動性SLE疾患における免疫複合体の存在のため、免疫複合体によって開始される補体活性化は、SLEにおけるNET形成の重要な機序であり得る。
【００４３】
実施例1における実験は、PMA、MPO、または免疫複合体によって開始された補体によって活性化されたヒト血清によって開始される、ヒト好中球によるNET形成を、PA-dPEG24が阻害することができることも示す。理論によって拘束されることは望まないが、少なくとも、MPOによって媒介される経路を介してNET形成を刺激するPMAの能力［18］、および精製されたMPOを利用した本明細書中に記載された結果に基づき、PA-dPEG24は、MPOによって媒介される経路を阻害することによって、NET形成を阻止する。免疫複合体によるヒト血清の活性化が起こった後にNET形成を阻害するPA-dPEG24の能力は、NET形成が、MPOによって媒介される経路の阻止によって起こり得ることを示唆している。PA-dPEG24ペプチドは、両方の古典経路補体活性化を阻止し、ネトーシスを阻害することができる。PA-dPEG24およびその他のPIC1タンパク質は、SLE病原の現在標的とされていない二つの局面に作用することによって、SLEを処置する方法において有用であり得る。
【００４４】
別の局面において、治療的に有効な量のPIC1を対象へ投与する工程を含む、対象における輸血関連急性肺損傷（TRALI）を処置する方法が提供される。
【００４５】
関連する局面において、対象におけるTRALIを処置しかつ/または防止する方法において使用するためのPIC1またはPIC1バリアントが提供される。本法は、治療的に有効な量のPIC1またはPIC1バリアントを含む組成物を、それを必要とする対象へ投与する工程を含む。
【００４６】
輸血関連急性肺損傷（TRALI）は、輸血によって開始される呼吸困難の疾患であり、輸血関連死の主因である。肺実質の好中球浸潤を引き起こす、ミスマッチ赤血球を利用したTRALIの新規「2ヒット」ラットモデルが、本明細書中に記載される。2ヒットラットモデルは、この新しいTRALIモデルにおいて、肺損傷の減弱における補体C1のペプチド阻害剤（PIC1）の役割を査定することを可能にする。
【００４７】
TRALIの新規のモデルが本明細書中に記載され、データは、このモデルにおいてTRALIによって媒介される疾患を減弱させるPIC1の能力を示している。LPSを「第1ヒット」として利用し、抗体依存性（例えば、H2Kd、HLA等）または抗体非依存性（例えば、老化RBC、リゾPC、およびRBC上清等）のいずれかによる刺激を「第2ヒット」として利用する、多様な種における多数の「2ヒット」モデルが、文献中に公開されている。本明細書中に記載されたモデルは、同系赤血球を使用したRBCの輸血とは対照的に、抗体によって開始される補体によって媒介される、注入された赤血球の溶血を「第2ヒット」として使用するという点で、独特である。ヒトRBCのA抗原に対する既存の抗体を保有しているウィスターラットは、A型またはAB型のヒト赤血球の輸血後に、活発な血管内溶血をもたらすことができる古典補体活性化を開始することができる。
【００４８】
PIC1は多機能性の分子である。AIHTRモデルにおいて、PIC1は、古典補体経路活性化および膜侵襲複合体（MAC）によるRBC溶解を抑制することによって、輸血されたミスマッチRBCの溶血を阻害することができる。PIC1は、MPOのペルオキシダーゼ活性と同様に、遊離ヘム、ヘモグロビン、およびミオグロビンのペルオキシダーゼ活性も阻害する抗酸化分子としてインビトロで機能し得る。
【００４９】
いくつかの態様において、PIC1は、対象が輸血を投与される前、対象が輸血を投与された後、および/または輸血中に投与される。
【００５０】
いくつかの態様において、PIC1は、対象におけるネトーシスを阻害するために有効である。様々な態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、ネトーシスは、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスのうちの少なくとも一つによって刺激される。
【００５１】
いくつかの態様において、投与されたPIC1は、対象におけるMPO活性を阻害する。さらに、PIC1は、MPOによって媒介されるネトーシスを阻害することができる。理論によって拘束されることは望まないが、PIC1は、大量の好中球の肺組織への浸潤を低下させることができ、補体活性化を阻害し、アナフィラトキシンC3aおよびC5aの生成、ならびにMACによって媒介される溶血を防止することによって、TRALIを減弱させることができる（図15）。PIC1は、インビトロで、遊離ヘモグロビンおよびMPOからペルオキシダーゼによって生成されるROS活性、ならびにネトーシスを減弱させることができる。
【００５２】
現在、TRALIを処置する薬理学的介入は存在せず、現在の標準治療は、人工呼吸および血行動態補助からなっている。本明細書中に記載された動物モデルは、TRALIをもたらす濃厚RBCの大量の輸血を患者が必要とする、外傷様臨床シナリオをモデル化することができる。古典経路補体活性化、MPOによって媒介されるROS形成、およびネトーシスを阻害することによって、LPS注入後のミスマッチRBCからのTRALI様病原を阻止するPIC1の能力は、PIC1が、TRALI病原の複数の局面を軽減するための薬理学的薬剤としての可能性を有することを示唆している。
【００５３】
デオキシリボヌクレアーゼの鼻腔内投与は、動物モデルにおいてTRALIの症状を低下させ、このことから、NET形成の阻害が有用な治療戦略となり得ることが示唆された。NET形成の主要な経路は、塩化物イオンおよび過酸化水素からの次亜塩素酸、ならびにMPOに由来する活性酸素種の生成における第1の役割を通して、好中球によって生成されたMPOによって媒介され得る。ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）によって刺激されるNET形成は、インビトロでMPO阻害剤ABAHによって阻害され得、このことは、NET形成を阻害するための別の可能性のある機序を明らかにしている。
【００５４】
ミスマッチ赤血球の輸血を利用した急性血管内溶血性輸血副作用（AIHTR）のラットモデルにおいて、ラット種は、ヒト赤血球のA抗原に対する既存の抗体を有しており、それが、A型またはAB型のドナーに由来するヒト赤血球の輸血の後に頑強なAITHRをもたらす。このAIHTRモデルは、急性腎損傷および高度に炎症性の全身応答を生じる、抗体によって開始される古典補体経路活性化を引き起こし得る。抗体によって開始される補体活性化および好中球の動員の病原性局面は、炎症性応答が肺に向けられた場合、このモデルがTRALI表現型を与えるために適合し得ることを示唆している。
【００５５】
抗体によって媒介される補体系の活性化は、開始複合体C1に、IgMまたは複数のIgGが結合し、活性化および下流エフェクター機能（即ち、C3a、C5a、および膜侵襲複合体形成）を誘発する、古典補体経路によって指図される。古典補体経路のPIC1ペプチド阻害剤は、抗体によって媒介される活性化を防止するため、C1複合体の認識分子であるC1qに結合することができる。PIC1誘導体PA-dPEG24
2021509916.tif 000009
は、インビトロおよびインビボの両方で、古典経路活性化を阻害し、ラットへ血管内投与された時、30秒までに補体活性化の＞90％の全身的な阻害を達成することができることが証明されている。PIC1誘導体は、インビトロで、古典補体経路によって媒介されるABOミスマッチ溶血を阻害することが以前に示されているが、PIC1は、AIHTRのラットモデルにおいて、ミスマッチ赤血球の輸血直前または輸血後に投与された時、抗体によって開始された補体によって媒介される溶血を阻害することができる。さらに、PIC1は、インビトロで、MPOのペルオキシダーゼ活性およびネトーシスを阻害することも示されている。独特のミスマッチ赤血球ベースの「2ヒット」TRALIモデルが開発され、PIC1の予防的投与が、急性肺損傷およびこの呼吸症候群のその他の特徴を軽減することを証明した。
【実施例】
【００５６】
本発明は、以下の実施例によっても説明され、証明される。しかしながら、本実施例および本明細書中のその他の例の使用は、例示的なものに過ぎず、本発明または例証された用語の範囲および意味を限定するものでは決してない。同様に、本発明は、本明細書中に記載された具体的な好ましい態様に限定されない。実際、本発明の多くの修飾および変動が、本明細書を参照することによって、当業者に明白となり、そのような変動は、本発明の本旨または範囲から逸脱することなく作成され得る。従って、本発明は、特許請求の範囲が権利を有する等価物の完全な範囲と共に、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【００５７】
実施例1
本実施例は、ヒト血清における免疫複合体によって媒介される補体活性化のインビトロアッセイ、およびヒト好中球によるNET形成についてのアッセイにおける、補体Clのペプチド阻害剤（PIC1）の試験を記載する。
【００５８】
健常ドナーから血液を得た。PA-dPEG24
2021509916.tif 000010
は、HPLCおよび質量分析によって確認された≧95％の純度で、PolyPeptide Group（San Diego, CA）によって製造された。凍結乾燥PA-dPEG24は、0.01M Na2HP04緩衝剤を含む普通の生理食塩水において37.5mMで可溶化された。精製されたMPOは、Lee Biosolutions（Maryland Heights, MO）から購入された。静脈内免疫グロブリンは、Baxter Healthcare Corporation（Westlake Village, CA）から、卵白アルブミンは、Sigma Aldrich（St Louis, MO）から、抗卵白アルブミン抗体は、Abeam（Cambridge, MA）から購入された。ヤギ抗C1qおよびヒトClは、Complement Technology（Tyler TX）から購入された。PMA（ホルボール12-ミリステート13-アセテート）および過酸化水素は、Fisher Scientific（Hampton, NH）から購入された。
【００５９】
補体許容性GVBS++緩衝液は、0.1％ゼラチン、0.15M CaCl2、および1mM MgCl2を含むベロナール緩衝生理食塩水であった［29］。補体阻害性緩衝液GVBS-は、0.1％ゼラチンおよび10mM EDTAを含むベロナール緩衝生理食塩水であった。プールされた正常ヒト血清（NHS）は、以前に記載されたように調製された［29］。
【００６０】
免疫複合体によるNHSの活性化は、以下のように実施された。NHSを、補体活性化を誘導するため、3種の異なる型の免疫複合体（IC）によって刺激した。熱凝集IgGは、50mg/mlの静脈内免疫グロブリンを63℃で30分間インキュベートすることによって生成された［26］。卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体は、0.01mlの抗卵白アルブミン抗体を等しい体積の0.25mg/mlの卵白アルブミンと共に37℃で30分間インキュベートし、次いで、4℃で一晩保管することによって作成された。Cl免疫複合体は、0.02mlの抗C1qヤギ血清を5μlの200μg/mlのClと共に30℃で30分間インキュベートし、次いで、氷水浴中に置くことによって形成された。C5aおよびC5b-9のアッセイのため、NHSの活性化は、0.3mlのGVBS++緩衝液において、5％NHSを滴定濃度のPA-dPEG24と共に室温で30分間プレインキュベートすることによって実施された。次いで、2mlの熱凝集IVIgもしくは卵白アルブミンICのいずれか、または5μlのC1-抗C1q ICを、37℃で30分間、混合物に添加した。この反応を、等しい体積のGVBS-の添加によって中止した。iC3b検出のためには、1％NHSが使用され、プロトコルの残りは同一のままであった。
【００６１】
ELISAは、以下のように実施された。試料は、C5a、iC3b、およびSC5b-9についてのELISAを使用してアッセイされた。C5a ELISA kit（R＆D Systems）は、製造業者の説明に従って使用された。iC3bおよびSC5b-9についてのELISAは、以前に記載されたように実施された［30］。iC3b ELISAにおいては、ヤギ抗ヒトC3抗体（Complement Technology, Tyler TX）が捕獲のため、マウス抗ヒトiC3b抗体（Quidel, San Diego CA）が探索のため、ヤギ抗マウスHRP抗体が検出のため、使用された。SC5b-9 ELISAにおいては、ウサギ抗ヒトSC5b-9抗体（Complement Technology）が捕獲のため、マウス抗ヒトSC5b-9モノクローナル抗体（Quidel）が探索のため、ニワトリ抗マウスHRP抗体が検出のため、使用された。比色定量的検出は、TMBによって実施され、H2SO4によって中止され、450nmでBioTek Synergy HTプレートリーダにおいて読み取られた。
【００６２】
健常ボランティアの血液に由来する好中球は、以前に記載されたように［31］、Hypaque-Ficollステップグラジエント遠心分離、デキストラン沈降、および低張溶解によって、ヘパリン添加血液から精製された。
【００６３】
好中球細胞外トラップアッセイは、以下のように、マイクロタイタープレートにおいて実施された。単独のRPMI培地、または0.05％のH2O2もしくは12nM PMAもしくは8μg/ml MPOもしくは様々な濃度のPA-dPEG24が添加されたRPMI培地を含む96穴組織培養プレートにおいて、2.0×105個の好中球をインキュベートすることによって、NETの形成が誘導された。免疫複合体血清によって誘導されるNET形成のための活性化された血清は、0.3mlのGVBS++中の5％NHSに5μｌの卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体を添加することによって作成された。この組み合わせが、37℃で30分間インキュベートされ、次いで、0.05mlがRPMI中の好中球に添加された。次いで、細胞が、5％CO2インキュベータにおいて37℃で1.5時間インキュベートされた。
【００６４】
NET形成は以下のように定量的にアッセイされた。NETマイクロタイタープレートウェルアッセイから回収された上清において、PicoGreenによって遊離DNAが測定された［18］。500単位のモノコッカル（monococcal）ヌクレアーゼ（Fisher）が、37℃のインキュベータにおいて10分間、放出された細胞外DNAの消化を可能にするため、各ウェルに添加された。次いで、その調製物が隣接したウェルに等分され、調製されたPICO green試薬（Fisher）と1:1で混合された。次いで、蛍光が、励起485nm/放射528nmでBioTekマイクロプレートリーダにおいて定量化された。
【００６５】
NET形成が蛍光顕微鏡法によってアッセイされた。精製されたヒト好中球が、以下のように、ガラススライド上でアッセイされた。細胞がチューブにおいてRPMI培地および前述の示された刺激と合わせられ、次いで、疎水性スライドマーカーによって囲まれたガラススライドに等分された。スライドが、5％CO2インキュベータにおいて37℃で1.5時間、37℃で1.5時間インキュベートされた。スライドが、4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒドによって固定された。
【００６６】
全ての染色のため、以下の条件が使用された。スライドがPBSで洗浄され、室温で1時間、ブロッキング溶液（PBS中の2％正常ヤギ血清＋2％ウシ血清アルブミン）においてインキュベートされた。次いで、スライドが、室温で1時間、PBS中2％BSAにおいて、1:300の一次抗体と共にインキュベートされた。スライドが、PBSで3回洗浄され、PBS中2％BSAにおいて、1:1000の蛍光標識二次抗体または0.25pg/ml最終のDAPI（Southern Biotech）において、室温で1時間インキュベートされた。次いで、スライドがPBSで3回洗浄され、イメージングされた。細胞は、BX50、Olympus顕微鏡にマウントされたDP70デジタルカメラ（Olympus Center, Valley Forge, PA）を使用して可視化された。使用された染色抗体対は、ウサギ抗MPO（Thermo Scientific）およびウサギ抗ヒストンH3（Abcam）と、二次ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488（Novus Biologicals）であった。また、マウス抗エラスターゼ（Invitrogen）が、二次ヤギ抗マウスAlexa Fluor 568（Novus Biologicals）と共に使用された。
【００６７】
統計分析は、以下のように実施された。定量データが、Excel（Microsoft, Redmond, WA）を使用して、平均値、標準誤差（SEM）、およびスチューデントt検定［32］を決定して分析された。
【００６８】
PA-dPEG24は、免疫複合体によって開始される補体活性化を阻害することが示された。免疫複合体によって開始される補体活性化を阻害するPA-dPEG24の能力を評価するため、熱凝集IgGの原型免疫複合体刺激薬［25、26］を、プールされた正常ヒト血清（NHS）において利用した。補体活性化に起因する3種の重要なエフェクター：主要な炎症誘発性アナフィラトキシンC5a、C3活性化の切断生成物iC3b、および膜侵襲複合体C5b-9をアッセイした。データは、図1A〜1Cに示される。図1Aは、PA-dPEG24が、熱凝集IgG（Agg-IgG）免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるC5a生成を阻害することを示す。5回の独立した実験を実施し、SEMを示した。図1Bは、熱凝集IgG（Agg-IgG）免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるiC3b生成のPA-dPEG24による阻害を示す。4回の独立した実験を実施し、SEMを示した。図1Cは、熱凝集IgG（Agg-IgG）免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるSC5b-9生成のPA-dPEG24による阻害を示す。6回の独立した実験を実施し、SEMを示した。
【００６９】
各アッセイについて、PA-dPEG24は、阻害剤なしと比較して、熱凝集IgGによる刺激の後、エフェクターの同化を用量依存的に阻害した。統計的に有意な阻害が、≧0.5mM PA-dPEG24で、各アッセイにおいて達成された（P＜0.05）。C5aについて、1mM PA-dPEG24は、阻害剤なしの熱凝集IgGと比較して、61％の低下をもたらす（P＝0.002）。これらの結果は、PA-dPEG24が、ヒト血清における免疫複合体によって開始される補体活性化を阻害することができることを示唆している。
【００７０】
補体活性化の動物モデルにおいて最もしばしば利用される抗原-抗体免疫複合体である熱凝集IgGによる結果の確認を提供するため、次いで、卵白アルブミンおよび抗卵白アルブミンを試験した［27、28］。卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体を、NHSにおける補体活性化を刺激するために使用し、同一の3種のエフェクターC5a、iC3b、およびC5b-9を測定した。PA-dPEG24は、各補体エフェクターの生成を用量依存的に阻害し、単独の卵白アルブミン-抗卵白アルブミンと比較して、統計的に有意な阻害が、≧0.25mM PA-dPEG24で達成された（P＜0.03）。データは、図2A〜2Cに示される。図2Aは、卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるC5a生成のPA-dPEG24による阻害を示す。4回の独立した実験を実施し、SEMを示した。図2Bは、卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるiC3b生成のPA-dPEG24による阻害を示す。4回の独立した実験を実施し、SEMを示した。図2Cは、卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清（NHS）におけるSC5b-9生成のPA-dPEG24による阻害を示す。2mM PA-dPEG24で、測定されたSC5b-9は、検出下限であった。3回の独立した実験を実施し、SEMを示した。これらの結果は、PA-dPEG24が、ヒト血清における免疫複合体によって開始される補体活性化を阻害することができるという付加的な確信を提供する。
【００７１】
SLEを有する患者のサブセットにおける抗C1q抗体の重要性のため、ヒトC1および抗C1q抗体(ヤギ)の免疫複合体を生成した。これらの免疫複合体は、NHSを活性化し、C5a、iC3b、およびSC5b-9の頑強な生成をもたらした。データは、図3A〜3Cに示される。
【００７２】
図3Aは、C1-抗C1q免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清(NHS)におけるC5a生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。4回の独立した実験を実施し、SEMを示した。図3Bは、Cl-抗C1q免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清(NHS)におけるiC3b生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。4回の独立した実験を実施し、SEMを示した。図3Cは、Cl-抗C1q免疫複合体によって刺激された正常ヒト血清(NHS)におけるSC5b-9生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。4回の独立した実験を実施し、SEMを示した。
【００７３】
PA-dPEG24は、各濃度で、NHSにおけるCl-抗C1qによるC5aの生成を用量依存的に阻害した(P≦0.03)。Cl-抗C1qによるiC3bの生成は、2mM PA-dPEG24によって、NHSベースラインに類似したレベルにまで阻害された(P＜0.02)。PA-dPEG24は、≧0.13mMの濃度について、Cl-抗C1qによるSC5b-9の生成を用量依存的に阻害した(P＜0.03)。これらの結果は、PA-dPEG24が、ヒト血清におけるCl-抗C1q免疫複合体によって開始される補体活性化を阻害することができることを示す。
【００７４】
PA-dPEG24は、PMAによって開始されるヒト好中球によるNET形成を阻害することが示された。PA-dPEG24が好中球細胞外トラップ(NET)を阻害することができるか否かを評価するため、精製されたヒト好中球および一般的に利用される刺激、ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)を、Akong-Mooreら［18］によって記載された方法と同様に、使用した。細胞外DNAおよびミエロペルオキシダーゼ(NETの2種の主要成分)を、それぞれ、DNAおよび抗MPO抗体によって可視化した。
【００７５】
PMAおよび過酸化水素によって刺激されたヒト好中球は、細胞外DNAおよび細胞外MPOの蛍光顕微鏡法によって可視化された多くのNETを生成した。図4は、蛍光顕微鏡法および遊離DNAのPicoGreen定量化によってアッセイされた、PMAによって開始されるヒト好中球（PMN）によるNET形成の、PA-dPEG24による阻害を示す。1段目は、未刺激の好中球を示し、2段目は、PMAおよび過酸化水素（H2O2）によって刺激された好中球を示し、3段目は、5mM PA-dPEG24（PIC1）の存在下でPMA＋H2O2によって刺激された好中球を示す。1列目は、DNAを可視化するため、DAPIによって探索されたスライドであり、2列目は、抗MPO抗体によって探索されたスライドである。グラフは、PicoGreenによってアッセイされた、PMA＋H2O2によって刺激されたヒト好中球によるNET生成の、PA-dPEG24（5mM）による阻害を示す。3回の独立した実験を実施し、SEMを示した。
【００７６】
5mM PA-dPEG24の存在下で、PMAおよび過酸化水素は、蛍光顕微鏡法によって同定され得るNETを生成しなかった。次いで、マイクロタイタープレートウェルにおいて刺激されたヒト好中球の上清から、PicoGreenベースのアッセイにおいて、遊離DNAを測定することによって、NET形成を定量化した。PA-dPEG24（5mM）は、PMAおよび過酸化水素の存在下で、阻害剤なしと比較して、2.6倍、遊離DNA同化を阻害することができた（P＝0.01）（図4）。PA-dPEG24についてのこの低下は、PMAなしのベースラインと類似したレベルまでであった。
【００７７】
蛍光顕微鏡法も、同一の実験条件を利用して実施されたが、付加的なNETの構成要素、細胞外好中球エラスターゼおよびヒストンH3が探索された。図5は、DNA（DAPI）、好中球エラスターゼ（αNE）、およびヒストンH3（αヒストン）について蛍光顕微鏡法によってアッセイされた、PMAによって開始されるヒト好中球（PMN）によるNET形成の、PA-dPEG24による阻害を示す。1段目は、未刺激の好中球を示し、2段目は、PMAおよび過酸化水素（H2O2）によって刺激された好中球を示し、3段目は、5mM PA-dPEG24（PIC1）の存在下でPMA＋H2O2によって刺激された好中球を示す。1列目は、DNAを可視化するため、DAPIによって探索されたスライドであり、2列目は、抗好中球エラスターゼ抗体によって探索されたスライドであり、3段目は抗ヒストンH3抗体によって探索された。代表的なイメージが示される。
【００７８】
前記のものは、PMAおよび過酸化水素による刺激が、豊富なNET形成をもたらし、それが、PA-dPEG24（5mM）の存在下で阻害されたことを示す。これらの結果は、PA-dPEG24が、PMAによって刺激されるヒト好中球によるNET形成を阻害することができることを示唆している。
【００７９】
PA-dPEG24は、MPOによって開始されるヒト好中球によるNET形成を阻害することが示された。Akong-Mooreら［18］は、MPOが、PMAによって刺激されるNET形成における重大なメディエーターであることを示唆しているが、これは、精製されたMPOを使用して試験されなかった。PMAの代わりに、精製されたMPOを、NET形成のための刺激として使用して、精製されたヒト好中球によって、前記の実験を繰り返した。精製されたMPOおよび過酸化水素による好中球の刺激は、DAPI染色および抗MPO染色によって可視化された広範なNET形成を引き起こした。図6は、蛍光顕微鏡法および遊離DNAのPicoGreen定量化によってアッセイされた、MPOによって開始されるヒト好中球（PMN）によるNET形成の、PA-dPEG24による阻害を示す。1段目は、未刺激の好中球を示す。2段目は、MPOおよび過酸化水素（H2O2）によって刺激された好中球を示す。3段目は、PA-dPEG24（PIC1）の存在下でMPO＋H2O2によって刺激された好中球を示し、4段目は、PA-dPEG24のみ（PIC1）と共にインキュベートされた好中球を示す。1列目は、DNAを可視化するため、DAPIによって探索されたスライドを示す。2列目は、抗MPO抗体によって探索されたスライドを示す。グラフは、PicoGreenによってアッセイされた、MPO＋過酸化水素によって刺激されたヒト好中球によるNET生成の、PA-dPEG24による阻害を示す。3回の独立した実験を実施し、SEMを示した。
【００８０】
MPOおよび過酸化水素の存在下でのNET形成は、PA-dPEG24（5mM）によって阻止された。単独のPA-dPEG24と共にインキュベートされた好中球は、蛍光顕微鏡法によって正常に見えた。NET形成をPicoGreen測定によって定量化した時、1.1mMのPA-dPEG24は、阻害剤なしのMPOによる刺激と比較して、遊離DNAの30％の低下をもたらし（P＝0.02）、4.5mMのPA-dPEG24は、遊離DNAの3.7倍の低下をもたらした（P＝0.001）（図6）。MPO＋4.5mM PA-dPEG24の存在下で、測定された遊離DNAは、未刺激の好中球と統計的に異なっていなかった。これらの結果は、PA-dPEG24が、MPOによって媒介される経路を介したNET形成を阻害することを示唆している。
【００８１】
PA-dPEG24は、免疫複合体によって開始されるヒト好中球によるNET形成を阻害する。免疫複合体によって開始された補体によって活性化されたヒト血清と、ヒト好中球によるNET形成との間の可能性のある関係を評価した。図2の実験において実施されたように、正常ヒト血清中の補体を、卵白アルブミン-抗卵白アルブミン免疫複合体によって活性化した。次いで、免疫複合体によって開始された補体によって活性化されたヒト血清を、精製されたヒト好中球と共にインキュベートしたところ、PicoGreenによる遊離DNA測定によって定量化されたNET形成がもたらされた。最初に、NETの生成についての免疫複合体自体の相対的寄与を、免疫複合体によって開始された補体によって活性化されたヒト血清と比較して評価した。免疫複合体自体の存在は、単独の好中球と比較して、NET形成を有意に増加させなかった（P＝0.39）（図7A）。しかしながら、免疫複合体による血清中の補体の活性化は、バックグラウンドを差し引いた後、単独の免疫複合体と比較して、NET形成を＞20倍増加させた（P＝0.009）。これらの結果は、免疫複合体によって開始された補体によって活性化された血清が、NET形成のための強力な刺激であることを初めて証明している。
【００８２】
過酸化水素が、免疫複合体によって活性化された血清によるNET形成をさらに増強するか否かを決定するため、試験したところ、過酸化水素はシグナルをおよそ2倍にした（図7B）。免疫複合体による血清の補体活性化が既に起こった後にPA-dPEG24を添加して、ネトーシスのPA-dPEG24による阻害の試験を実施した。従って、ネトーシスに対するPA-dPEG24の効果は、補体活性化の下流で起こった。免疫複合体によって活性化された血清および過酸化水素の存在下で、2.2mM PA-dPEG24は、阻害剤なしと比較して、遊離DNAを23％減少させ（P＝0.037）、4.5mM PA-dPEG24は、遊離DNAを3倍減少させた（P＜0.001）（図7B）。これらの条件は、蛍光顕微鏡法によっても可視化された（図7C）。PA-dPEG24（5mM）および免疫複合体によって開始された補体によって活性化された血清の存在下で、NETは、蛍光顕微鏡法によって同定されなかった。
【００８３】
これらの所見は、免疫複合体によって活性化されたヒト血清が、NETを形成するようヒト好中球を刺激することができること、これがPA-dPEG24によって阻害され得ることを示唆している。NET形成の阻害は、血清中で補体活性化が起こった後に起こり、従って、開始刺激は影響されなかったため、PA-dPEG24によるネトーシスの阻害は、驚くべき所見であった。これらの結果は、免疫複合体によって開始された補体によって活性化された血清が、MPOによって媒介される経路を介して、ネトーシスを引き起こすことができるという新規の概念を示唆しており、そのネトーシスは、PA-dPEG24によって阻止された。総合すると、これらの実験は、PA-dPEG24が、多様な刺激によって開始されるヒト好中球によるNET形成を阻害することができることを一貫して示している。
【００８４】
結論として、リードPIC1誘導体、PA-dPEG24
2021509916.tif 000011
は、C1-抗C1q免疫複合体を含む複数の型の免疫複合体によって開始される補体活性化を用量依存的に阻害して、C5aおよび膜侵襲複合体（sC5b-9）を含む炎症誘発性補体エフェクターの生成を制限することができた。PA-dPEG24は、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）、または免疫複合体によって活性化されたヒト血清によって刺激されたヒト好中球によるNET形成も用量依存的に阻害することができた。これらの結果は、PA-dPEG24によるNETの阻害が、NET形成のMPO経路の阻止によって起こることを示唆している。総合すると、これらの結果は、PA-dPEG24が、免疫複合体による補体系の活性化およびNET形成を阻害することができることを証明しており、そのことは、現在の薬理学的処置によって解決されていないSLE病原の二つの重要な局面をモジュレートするための治療アプローチとして、PIC1ペプチドを使用することができることを示唆している。
【００８５】
実施例2
本実施例においては、ウィスターラットをリポ多糖によって予備刺激し、その後、ラットが既存の抗体を有しているミスマッチ赤血球の30％の輸血を行った。シャム動物および媒体動物が、対照として使用され、動物のサブグループは、輸血の2分前にPIC1を受容した。4時間目に、全血球計算のため、血液を単離した。単離された肺組織を、ヘマトキシロンおよびエオシンによって染色し、肺組織内のミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性を、機能アッセイにおいて定量化した。血漿中の遊離DNAを、PicoGreen染色によって検出した。
【００８６】
赤血球輸血を利用するこの新規「2ヒット」モデルは、頑強なTRALI表現型を与えた。媒体対照と比較して、PIC1によって処理された動物の肺は、肺傷害、好中球浸潤、および肺組織内のMPO活性の低下を示した。さらに、PIC1を受容したラットは、以前にTRALIと関連付けられた好中球細胞外トラップ形成の減弱を示唆する、血中の遊離DNAの低下を示した。以下に示される結果は、PIC1が、TRALIの新規動物モデルにおいて急性肺損傷を減弱させることを証明する。
【００８７】
留置頚静脈カテーテルを有する青年期雄ウィスターラット（200〜250g）は、Hilltop Lab Animalsから購入され、Eastern Virginia Medical School（EVMS）IACUC（Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認されたプロトコルの下で使用された。
【００８８】
精製されたヒト赤血球（RBC）を生成するために使用された健常ヒトボランティアによって提供されたAB血液は、EVMSによって承認されたInstitutional Review Boardプロトコル（EVMS IRB #02-06-EX 0216）の下で書面によるインフォームドコンセントの後に得られた。動物実験の午前中に取得されたヒトRBCを、以前に記載されたように加工した。ヒト血液を、遠心分離によってHistopaque勾配で精製した。次いで、RBCを白血球および血小板から分離し、生理食塩水に再懸濁させた。ラット（200g）は、名目上40％のヘマトクリットを有する名目上14mLの循環血液体積を有する。輸血のため、ラットへのおよそ30％の輸血をもたらす、80％ヘマトクリットのおよそ2mLのヒトRBCを注入した。
【００８９】
前記の実験から生成された血漿を、以前に記載されたように、分光測光法を使用して遊離ヘモグロビンについて分析した。ドナー赤血球を水によって溶血させて標準曲線を生成し、その標準曲線から、各試料中の溶血した赤血球の量を、遊離ヘモグロビン測定によって計算した。
【００９０】
フローサイトメトリーは、DXP 8 Color 488/637/407アップグレード（Cytek Development, Freemont, CA, USA）と共に、FACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA）を使用して実施された。データは、Cytek FlowJo CEバージョン7.5.110.6を使用して取得された。各試料の赤血球について選択されたおよそ1×105イベントを、それぞれ、単一標識フロー（single labeled flow）について集めた。データを、FlowJo Xバージョン10.0.7r2（FlowJo LLC）を使用して分析した。
【００９１】
単一標識フローのため、血漿を分離した後に収集された細胞を、洗浄し、希釈し、凝集を最小化するため、室温で振とうしながら、20分間、GVBS（0.1％ゼラチン、0.01mol/L EDTA（エチレンジアミン四酢酸）を含むベロナール緩衝生理食塩水（VBS））中1:200のFITCコンジュゲート抗ヒトCD235a（グリコホリンA、eBioscience）によって染色した。抗体対照は、1:200のマウスIgG2bアイソタイプコントロールFITC（eBioscience）からなっていた。
【００９２】
H＆Eによって染色された肺組織は、実験群（媒体のみによって処理された動物およびPIC1によって処理された動物）を不明にして、臨床医によって分析された。好中球浸潤および細胞壁肥厚を、0〜4のスケールでスコア化した：0＝正常肺、1＝軽度の肺病変、2＝中等度の肺病変、3＝やや重度の肺病変、4＝重度の肺病変。
【００９３】
ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性アッセイは、以下のように実施された。凍結肺組織を切り刻み、50mMリン酸カリウム中で氷上で均質化し、4℃で15分間10,000 RPMで遠心分離した後、上清を廃棄した。肺組織内の好中球からMPOを可溶化するため、ペレットを、500mlの50mMヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（HTAB）に再懸濁させ、超音波処理によって均質化し、液体窒素中で急速凍結させた。この過程を2回繰り返し、次いで、試料を4℃で10分間10,000RPMで遠心分離し、上清を収集した。
【００９４】
これらの試料中のペルオキシダーゼ活性を、以前に記載されたように、試料からのMP0の抗体捕獲の後、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン（ADHP, Amplex Red）を使用して測定した。蛍光を、BioTekマイクロプレートリーダを使用して、535nmの励起波長および590nmの放射波長で、0〜600秒まで25秒間隔で読み取り、1ウェル当たり25のデータ点を得た。精製されたMPOを陽性対照として、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を陰性対照として、使用した。全ての活性アッセイをトリプリケートで実施した。
【００９５】
ラット血漿中の遊離DNAを、以前に記載されたように、PicoGreenによって測定した。簡単に説明すると、血漿試料を10mMトリスHCl、1mM EDTA、pH8.0（TE）緩衝液で1:10希釈し、50uLの各試料を、1:200希釈されたPicoGreen（Life Technologies）50uLと共にウェルに添加し、遮光しながら室温で10分間インキュベートした。DNA標準曲線をTE緩衝液において調製した。次いで、蛍光を、BioTekマイクロプレートリーダを使用して、485nmの励起波長および520nmの放射波長で読み取った。全ての遊離DNA測定をトリプリケートで行った。
【００９６】
平均値および標準誤差を、独立した実験から計算し、スチューデントt検定を使用して統計的比較を行った（Microsoft Excel XP）。
【００９７】
急性血管内溶血性輸血副作用（AIHTR）のラットモデルにおいて、15％のミスマッチRBCの輸血は、血管内溶血および急性腎傷害をもたらした。このモデルにおいては、ウィスターラットにおける天然に循環する抗A抗体が、古典補体活性化および注入された赤血球の溶血を開始する。AIHTRモデルがTRALI表現型を模倣するために適合しているか否かを確認するため、漸増する用量のミスマッチRBC輸血（15％、30％、または45％）を、最初に試験し、30％の輸血が、ほぼ最大量の補体によって媒介される溶血を生じることを決定した（図8A）。45％の輸血における飽和は、補体活性化を開始するために十分なクラスタ形成によって赤血球に結合する抗体の量を超えた可能性が高いことを示唆している。30％の輸血は、フローサイトメトリーによって査定されたように、15％および45％の輸血と比較して、RBC生存率の中間の表現型を生じた（図8B）。輸血後4時間目に、45％の輸血でさえ、組織学的な肺傷害は起こらなかった（図9A〜9C）。
【００９８】
30％の輸血の後に、輸血前の細胞数と比較して、血液中の白血球（WBC）（P＝1.08×10-6）、好中球（P＝2.70×10-13）、および単球（P＝2.59×10-7）の有意な増加が観察された。白血球は、動員されたが、肺には局在しなかった（図10A〜10B）。興味深いことに、30％の輸血の後に、血流中のリンパ球の有意な減少が起こった（P＝0.015）（図10C）。
【００９９】
TRALIの他の動物モデルは、典型的には、（参照において概説されている）炎症性応答を肺に向ける「2ヒット」モデルを利用する。「第1ヒット」を誘導する一つの方法は、静脈内注入の後に肺の毛細血管床に最初に遭遇し、「第2ヒット」による顕性の傷害のために予備刺激する可能性が高いLPSの注入である。30％のミスマッチ赤血球の輸血による「第2ヒット」の30分前に「第1ヒット」として与えられた2mg/kg LPS IV注射は、輸血後4時間目に、肺組織への大量の好中球浸潤と共に、劇的な肺傷害をもたらした（図9D）。LPSによる「第1ヒット」の非存在下で30％の輸血を受容した動物と比較して、血流中のWBC（P＝9.8×10-5）、好中球（P＝4.5×10-4）、および単球（P＝0.004）の有意な低下、ならびにリンパ球（P＝0.006）のさらなる低下によって、血管内白血球レベルの対応する変化も観察された（図10A〜10C）。このモデルにおける循環白血球の低下は、TRALI患者において報告された一過性の白血球減少症を模倣する。総合すると、これらの結果は、この輸血によって開始される補体活性化によるモデルが、TRALIの多くの局面と一致する、重度の好中球によって媒介される肺疾患をもたらすことを証明する。
【０１００】
このモデルにおいて観察された血管内溶血の炎症性のため、輸血されるヒトRBCの百分率の増加が、LPSによる「第1ヒット」の非存在下で、肺におけるTRALI様表現型を誘導するか否かを決定するため、試験した。15〜45％のヒトRBCの輸血は、LPSによる「第1ヒット」の非存在下で、急性肺損傷をもたらさなかった。LPSによる「第1ヒット」が追加された時、TRALI様病原が組織学によって観察され、肺実質への重度の好中球浸潤および白血球減少症のような、好中球によって媒介される肺損傷のその他の特徴が検出された。このモデルにおいてTRALIを誘導するための「第1ヒット」としてのLPSの必要性は、必須であり、文献中に報告されている、TRALIのラット、マウス、ヒツジ、およびブタにおける多数の「2ヒット」モデルと一致している。
【０１０１】
「2ヒット」TRALIモデルを確立するため、ウィスターラットモデルを最適化するため、ある量（15％、30％、または45％）のヒトRBCを、ラットに最初に注入した。全ての手法について、バイタルサインをモニタリングしながら、実験の経過中、ケタミンおよびアセプロマジンによって、ラットを鎮静させた。ラットの群は、留置頚静脈カテーテルを通して血管内にヒトRBCの輸血を受容した。輸血前、次いで、輸血後0.5分目、5分目、20分目、60分目、120分目、および360分目に、動物から、血液試料を、EDTA microtainerチューブ（Becton Dickinson）に収集した。血漿を分離し、細胞を沈降させるため、これらの試料を2,655×gで5分間遠心分離した。血漿を等分し、以下に記載されるように、細胞ペレットを別々に加工した。変動する量のヒトRBC（15〜45％）によるパイロット実験に基づき、30％のヒトRBC輸血が、3時間にわたって頑強な補体によって媒介される溶血を生成し、TRALIモデルのために選択された（図8Aおよび8B）。
【０１０２】
「2ヒット」モデルのため、ラットを前記のように鎮静させ、（参照において概説されている）他のTRALIモデルと同様に、リポ多糖（LPS、腸炎菌（Salmonella enterica serotype enteritidis）由来、2mg/kg［Millipore-Sigma］）を、「第1ヒット」として、留置頚静脈カテーテルを通して血管内投与した。この30分後に、30％のミスマッチRBC輸血を「第2ヒット」として投与した。血液試料を、血液化学の分析のため、LPS投与前およびRBC輸血後4時間目に収集した（SuperChem and CBC, Antech Diagnostics）。最終採血の完了時に、動物をイソフルオレン（isofluorene）およびギロチンを使用して安楽死させた。組織病理学のための器官を収集するため、剖検を完了させた。各動物から取得された肺を計量し、次いで、ホルマリン中に保管するか、または-70℃で凍結させた。ホルマリン固定された組織のヘマトキシロンおよびエオシン（H＆E）で染色された切片を、盲検的に調査した。
【０１０３】
PIC1の予防的な投与がTRALI病原を減弱させるか否かを決定するため、この輸血ベースの抗体によって開始される補体によって媒介されるTRALIモデルを利用した。IV LPS注入の28分後に、160mg/kgのPIC1または媒体対照をIV投与し、その後、30％のミスマッチRBC輸血を行った。PIC1を受容した動物については、160mg/kgのPEG化誘導体PA-dPEG24（PolyPeptide Group）を含むおよそ0.05Mヒスチジン［pH6.0］、0.15M NaClを、ヒトRBC輸血の2分前に投与した。160mg/kgというPIC1用量の選択は、以前に報告されたような血管内溶血ウィスターラットモデルにおいて確立された。単独の媒体を受容した動物およびシャム動物の群も、含まれていた。
【０１０４】
輸血の4時間後に、血液を収集し、肺組織を採集した。PIC1は、組織学および肺重量によって査定される急性肺損傷、肺組織への好中球浸潤、白血球隔離、ならびにMPO活性および血流中の遊離DNAによって定量化される好中球活性化を低下させることが見出された。PIC1の非存在下で、これらの動物において誘導されたTRALI様損傷に加えて、肉眼的形態学、器官重量、ならびにクレアチニン、BUN/クレアチニン、および肝酵素AST（SGOT）の血中レベルの増加（示されないデータ）によって査定されるような、有意な急性腎損傷（AKI）が観察され、それは、15％の輸血されたヒトRBCの溶血によって放出された遊離ヘモグロビンに起因し得る、AIHTRモデルにおいて以前に報告されたAKIと一致していた。この型の腎臓に対する終末器官傷害は、抗体によって媒介されるTRALIのマウスモデルにおいても報告されている。媒体を受容した動物と比較した時、PIC1によって処理された動物は、低下した腎臓重量、ならびにクレアチニン、BUN/クレアチニン、およびASTの血中レベルの低下を有していた（示されないデータ）。従って、LPSによる前処理の存在下での30％の輸血でさえ、PIC1は、腎臓を損傷から保護し、これは、AIHTRモデルにおけるPIC1の防御効果と一致する。
【０１０５】
実施例3
本実施例は、PIC1の予防的な投与が急性肺損傷を低下させることを示す。ヒトRBCの輸血の直前または後のPIC1のIV投与は、AIHTRモデルにおいて溶血および腎傷害の両方を軽減した。PIC1が新規「2ヒット」モデルにおいてTRALIを減弱させるか否かを確認するため、ラットに、第1ヒットとして2mg/kg LPS IVを投与した。28分後に、ラットは、160mg/kg PIC1または媒体のみのいずれかを受容し、その2分後に、第2ヒットとして、ミスマッチRBCの30％のIV輸血を受容した。AIHTRモデルにおける効力に基づき、160mg/kgというPIC1の用量を利用した。輸血の4時間後に、動物を屠殺し、肺重量を決定し、肺組織を組織学によって評価した。
【０１０６】
媒体対照動物に由来する肺は、肺内の増加した細胞充実性と一致して、シャム動物（p＝0.006）と比較して、重量の有意な増加を示した（図11A）。対照的に、PIC1によって処理された群に由来する肺は、媒体対照動物（p＝0.001）と比較して、肺重量の有意な低下を示し、シャム動物（p＝0.432）のものとは有意に異なっていなかった（図11A）。ヘマトキシロンおよびエオシン（H＆E）で染色された切片は、正常な肺組織学（図11B）を示したシャム動物と比較して、媒体によって処理された動物が、大量の好中球浸潤と共に、肺胞腔の著しい浸潤影および肺胞細胞壁の肥厚を示すことを予想通り明らかにした（図11C）。対照的に、PIC1によって予防的によって処理された動物は、肺構造の減少した損傷を示した（図11D）。
【０１０７】
実施例4
本実施例は、PIC1が、好中球によって媒介される肺損傷、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性、および白血球減少症を低下させることを示す。このモデルにおける好中球によって媒介される肺損傷の減弱におけるPIC1の役割を評価するため、媒体によって処理された動物およびPIC1によって処理された動物に由来するH＆E切片の好中球浸潤および細胞壁肥厚について盲検的段階分けを実施した。好中球浸潤および細胞壁肥厚を、0のスコアが正常肺を示し、4のスコアが重度の肺損傷を意味する0〜4のスケールでスコア化した。肺重量の低下および組織学的分析と一致して、PIC1を受容した動物は、媒体対照動物と比較して有意に改善された肺損傷スコアを有していた（p＝0.003）（図12A）。1.5という平均値ならびに25および75の四分位数におけるはるかに狭い分布を有していた、PIC1によって処理された動物と比較して、媒体対照動物は、より高度の傷害を示し、2.0という平均値およびより広い分布を有していた。
【０１０８】
このTRALIモデルにおいて好中球の病原における役割をさらに評価するため、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）を介して好中球によって媒介される肺傷害に対する、PIC1の効果を評価した。MPOは、好中球顆粒中の主要なペルオキシダーゼ酵素であり、多くの肺疾患において、次亜塩素酸およびその他の活性酸素種の形成、ならびに好中球細胞外トラップ（NET）を介して、炎症性肺傷害に寄与する。TRALI肺組織においてMPO活性が検出され得るか否かを確認するため、PIC1を受容した動物または媒体対照動物の組織ホモジネートからの細胞外MPOを、抗体捕獲方法論によって単離し、その後、過酸化水素の存在下で、Amplex Redの蛍光レゾルフィンへのMPOによって媒介される酸化を行った。蛍光を25秒毎に0〜10分まで読み取った。媒体を受容した動物と比較して、PIC1によって処理された動物は、5分目（p＝0.005）および10分目（p＝0.002）にMPO活性の有意に低下したレベルを有していた（図12B）。
【０１０９】
一過性白血球減少症は、肺組織における好中球の隔離に起因し得、TRALIの動物モデルにおいても、TRALIを有する患者においても観察されている。図10のデータも参照すること。媒体によって処理された動物と比較して、PIC1によって処理された動物の免疫細胞の循環レベルを確認するため、血液を安楽死前に回収した。媒体を受容した動物と比較して、PIC1によって処理された動物は、白血球（p＝0.043）およびリンパ球（p＝0.048）の血中レベルの有意な増加を示した（図13Aおよび13B）。さらに、循環する好中球および単球も、媒体を受容した動物と比較して、PIC1によって処理された動物の血流中において数が増加している傾向を示したが、統計的有意性には到達しなかった（好中球、p＝0.101；単球、p＝0.229）（それぞれ、図13Cおよび13D）。
【０１１０】
実施例5
本実施例は、PIC1が、循環血中の好中球細胞外トラップ（NET）バイオマーカーのレベルを低下させることを示す。TRALIのマウスモデルにおいて、活性化された好中球は、急性肺損傷に寄与するNETを放出することができ、TRALI患者の血中においては、NETバイオマーカーである遊離DNAが上昇している。循環血中の遊離DNAのレベルに対してPIC1が効果を及ぼすか否かを確認するため、PIC1または媒体を受容した動物に由来する血漿中のDNAレベルを、PicoGreenアッセイにおいて定量化した。媒体を受容した動物と比較して、PIC1によって処理された動物から単離された血漿中の遊離DNAのレベルは、有意に低下した（p＝0.02）（図14）。総合すると、組織学、肺組織内のMPO活性の低下、白血球減少症の欠如、および循環血中の遊離DNAの低下によって査定されたような、好中球によって媒介される肺損傷の低下は、PIC1が、この新規TRALI動物モデルにおいて、免疫細胞によって媒介される急性肺損傷を低下させることを証明している。
【０１１１】
実施例6
本実施例は、PA-dPEG24が、インビボでMPO活性およびNET形成を阻害することができる程度を試験するための実験を記載する。ラットにおける炎症性腹膜炎モデルを、腹腔内（IP）注射された精製されたMPOを利用して開発した。
【０１１２】
ヒト好中球MPO（Lee Biosolutions）を、各実験のために必要なそれぞれの用量へ無菌の生理食塩水で希釈した。PA-dPEG24（PolyPeptide Group）の形態のPIC1を、可溶化し、0.5Mヒスチジン緩衝液で希釈し、pH6.5に調整し、次いで、各実験のために使用されるそれぞれの用量の各々に希釈した。
【０１１３】
Eastern Virginia Medical School IRBによって承認されたプロトコル（#17-008）の下で実施された実験において、ウィスターラットを鎮静させ、精製されたMPOをIP注射した。体重およそ200gの16週齢雄ウィスターラットを、これらの実験において使用した。ラットは、全ての手法の前に、ケタミンおよびアセプロマジンによる鎮静を受容した。次いで、それらは、生理食塩水中のMPOの1mlのIP注射を受容した。示された時間間隔の後、K2EDTA Microtainer（BD）に250mclの血液を得るため、尾静脈切開を実施した。次いで、動物をFatalPlus IVによって安楽死させた。次いで、20mlの氷冷PBSによる腹腔洗浄を、IV注射後のマッサージならびに鈍い針および注射器による腹膜の小孔からの抽出によって実施した。
【０１１４】
以下のように実施された試料加工によって、細胞を沈降させ、上清を、MPOによるTMBの過酸化について試験した。細胞およびその他の砕片を沈降させるため、腹腔洗浄液を1500×gで5分間遠心分離した。得られた腹腔洗浄液上清を、さらなる分析のため、等分し、凍結させた。細胞ペレットを、生理食塩水によって最初の体積に再懸濁させ、細胞を血球計数器で計数した。血漿を、ラベンダートップ血液収集チューブの遠心分離の後に収集した。
【０１１５】
MPO活性アッセイは、以下のように実施された。腹水を、標準曲線のための純粋なMPOと共に、96穴プレートにおいて0.1mlで連続的に滴定した後、0.1mlの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）（Fisher）を添加した。1分後に、反応を中止するため、0.1mlの2.5M H2SO4を添加し、プレートを450nmで読み取った。標準曲線からの線形回帰を使用して、MPO活性を各試料について計算した。
【０１１６】
MPOによって媒介される腹膜炎の用量応答実験を、以下のように実施した。MPOによって媒介されるペルオキシダーゼ活性およびNET形成を示す精製されたMPOの用量を決定するため、用量応答パイロット実験を実施した。精製されたMPOを、0.01mg、0.03mg、および0.1mgの用量でラットへIP注射した。1時間後に、ラットを安楽死させ、腹腔洗浄を実施した。結果は図17に示される。MPO用量が0.1mgまで増加するにつれ、TMBベースのアッセイによって測定される腹腔洗浄液中のペルオキシダーゼ活性が増加する傾向（P＝0.12）が証明された。
【０１１７】
腹腔洗浄液上清において、ネトーシスのマーカーとしての遊離DNAを、PicoGreenアッセイを介して測定した。腹水または血漿を、標準曲線のためのDNA（Invitrogen）と共に、96穴プレートにおいて0.1mlで連続的に滴定し、Quant-iT PicoGreen（Fisher）アッセイにおいて使用した。PicoGreen溶液を、キット説明書によって指図された通りに希釈し、試料に添加し、それを暗所で10分間インキュベートし、次いで、励起480nm/放射520nmで蛍光マイクロプレートリーダで読み取った。標準曲線からの線形回帰を使用して、DNA濃度を各試料について定量化した。
【０１１８】
図18に示される結果。用量が0.1mg MPOの用量まで増加するにつれ、遊離DNAが増加する傾向が認められた（P＝0.19）。これらの実験の結果は、最高用量、即ち、0.1mgのMPOが、より低い試験された用量より高い活性を示す可能性がより高い、用量応答関係を示唆した。
【０１１９】
要約すると、ラットにおいてIP注射されたMPOは、腹腔における過酸化活性の増加（図17）、およびネトーシスを示唆する遊離DNAの増加（図18）をもたらした。
【０１２０】
次いで、MPOによって媒介される腹膜炎の時間的経過実験を実施した。時間的経過実験は、このモデルにおける精製されたMPOの最適な腹腔内滞留時間を評価するため、実施された。MPOをより高い0.1mgの用量でIP投与し、MPO注射後1時間目、2時間目、および4時間目に、安楽死の後に、腹腔洗浄を実施した。図19に示されるように、MPOペルオキシダーゼ活性の10倍の増加が、注射後2時間目に証明され（P＝0.005）、4時間目にさらなる増加はなかった。図20に示されるように、遊離DNAの8倍の増加が、注射後2時間目に証明された（P＝0.03）。これらの結果は、IP注射された精製されたMPOが、注射後2時間目に、腹腔洗浄液中のペルオキシダーゼ活性およびネトーシスを増加させることを示唆した。
【０１２１】
次いで、MPOによって媒介される腹膜炎におけるMPOおよびネトーシスの阻害に対する、PIC1、具体的には、PA-dPEG24の効果をアッセイした。精製されたMPOを腹腔に接種した後、直ちに、即ち、1分後に、一連の増加する用量（1mg、5mg、および20mg）のPA-dPEG24をIP注射し、その2時間後に、静脈切開、安楽死、および腹腔洗浄を行った。PA-dPEG24を投与しない対照を使用した。前述の方法によるMPO活性アッセイおよび遊離DNAアッセイを、0mg、1mg、5mg、および20mgのPA-dPEG24の用量の各々について実施した。
【０１２２】
MPO活性アッセイについての結果は、図21に示され、遊離DNAアッセイ（腹腔洗浄液上清中の遊離DNA）については、図22に示される。このモデルにおいてIP注射されたPIC1は、腹腔における過酸化活性の減少を示し（図21）、ネトーシスの減少の傾向を示した（図22）。具体的には、20mgの用量（100mg/kg）のPA-dPEG24は、MPO注射後のPA-dPEG24なしと比較して、TMBによるペルオキシダーゼ活性の5倍の減少を示した（P＝0.015）。MPO活性の統計的に有意な減少（P＜0.019）は、5mg（25mg/kg）および1mg（5mg/kg）のPA-dPEG24用量についても証明された。腹水中の遊離DNAの減少の傾向（P＝0.11）は、PA-dPEG24なしと比較して、20mg（100mg/kg）の用量のPA-dPEG24について認められなかった。
【０１２３】
遊離DNAを血漿においても測定し、結果を図23に示した。類似した傾向が見出され、遊離DNAは、MPO注射後のPIC1なしと比較して、最高用量のPA-dPEG24で最低であった（P＝0.22）。これらの結果は、PA-dPEG24が、この精製されたMPOによる腹膜炎モデルにおいて、インビボで、MPOによって媒介されるペルオキシダーゼ活性を減少させることができることを証明している。結果は、PA-dPEG24が、インビボで、MPOによって媒介されるネトーシスを減少させることができることも示唆している。
【０１２４】
参考文献
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2021509916.tif 000013
2021509916.tif 000014
2021509916.tif 000015
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【０１２５】
本明細書中に引用された刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参照が、各参照が参照によって組み入れられると個々
に具体的に示され、その全体が本明細書中に示されたのと同一の程度に、参照によって本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2021509916.tif 000021
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月9日(2020.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における急性肺損傷を治療するためのPIC1ペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項２】
対象における急性呼吸窮迫症候群を治療するためのPIC1ペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項３】
前記PIC1ペプチドが、対象における炎症を阻害するために有効である、請求項1または2記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記PIC1ペプチドが、対象における炎症性組織傷害を阻害するために有効である、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記PIC1ペプチドが、対象における正常な肺構造を保つために有効である、請求項1〜4のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記PIC1ペプチドが、肺損傷、肺組織への好中球の浸潤、および肺組織におけるMPO活性のうちの1つまたは複数を阻害するために有効である、請求項1〜5のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記PIC1ペプチドが、対象における補体系の免疫複合体活性化をモジュレートするために有効である、請求項1〜6のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記PIC1ペプチドが、対象におけるNET形成をモジュレートするために有効である、請求項1〜7のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記NET形成が、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスのうちの少なくとも1つによって刺激される、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記NET形成がウイルスによって刺激される、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記PIC1ペプチドが、IALILEPICCQERAA (SEQ ID NO: 1)の配列を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記PIC1ペプチドが、IALILEPICCQERAA-dPEG24 (SEQ ID NO: 19)の配列を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記PIC1ペプチドが、対象の体重1 kg当たり5〜160 mgの用量で投与される、請求項1〜12のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記PIC1ペプチドが、対象の体重1 kg当たり5〜100 mgの用量で投与される、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
静脈内投与のために製剤化されている、請求項1〜14のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ミエロペルオキシダーゼ（MPO）は、好中球に見出されるヘムベースのペルオキシダーゼである。MPOは、細胞の乾重量の30％を占める、好中球に存在する主要な酵素である。MPOの主な機能は、好中球が侵入微生物を死滅させるのを助けるため、次亜塩素酸を生成することである。しかしながら、MPOによる次亜塩素酸の生成は、宿主組織の傷害ももたらすことができ、多くの炎症性疾患において実質損傷に直接寄与することが示されている。例えば、MPOは、嚢胞性線維症において肺実質傷害に寄与する。直接の抗微生物活性に加えて、MPOは、好中球細胞外トラップ（NET）作出の重要な経路においても作用することが示されている。
[本発明1001]
治療的に有効な量のPIC1を対象へ投与する工程を含む、対象における全身性エリテマトーデス（SLE）を処置する方法。
[本発明1002]
治療的に有効な量のPIC1を対象へ投与する工程を含む、対象における輸血関連急性肺損傷（TRALI）を処置する方法。
[本発明1003]
対象が輸血を投与される前、対象が輸血を投与された後、および/または輸血中に、PIC1が投与される、本発明1002の方法。
[本発明1004]
対象における免疫複合体による補体系の活性化およびNET形成をモジュレートするために有効である、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
対象におけるNETによって媒介される炎症性組織傷害を阻害するために有効である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
NET形成が、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスのうちの少なくとも一つによって刺激される、本発明1004または本発明1005の方法。
[本発明1007]
PIC1が対象におけるミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性を阻害する、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
PIC1が非経口投与される、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
対象がヒトである、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
PIC1が、1個または複数個のPEGモエティを含むペプチドである、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
PIC1がPA-dPEG24である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
PA-dPEG24が、
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の配列を含む、本発明1011の方法。
【国際調査報告】
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