(57)【要約】  歯周炎に罹患したヒト患者の歯周炎が軽度か又は進行性であるかを評価するシステム、キット、使用及び体外方法を開示する。当該システム及び方法は、クラスタ化技術を患者データの参照セットに適用して、適用されるバイオマーカーのセットをさらに識別する洞察に基づく。当該クラスタは、バイオマーカーである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）に基づいて決定される。実際の患者の分類は、２セットのバイオマーカーのどちらかの濃度を測定することに基づく。１のクラスタは、インターロイキン−１β（ＩＬ１β）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、コラーゲンテロペプチドを備える。他のクラスタは、ＨＧＦ及びメタロペプチダーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）を備える。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽度歯周炎又は進行性歯周炎であるヒト被験体を分類するシステムであって、以下の：
−前記被験体の口腔液試料の、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、インターロイキン−１β（ＩＬ１β）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、コラーゲンテロペプチド、及び場合によりメタロペプチダーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）、のバイオマーカーの濃度を測定する検出手段；
−前記被験体の口腔液試料中のバイオマーカーの測定濃度から分類結果を決定する、１又はそれ以上の処理ユニット；を含み、
ここで、前記システムは、第１段階で、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９を含むバイオマーカーのセットの濃度を測定して、第１段階濃度の測定結果を獲得し、前記処理ユニットは、前記第１段階濃度を処理して、第２段階でＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含むバイオマーカーのセットの濃度を測定するか否かの結果を提示し、それにより前記処理ユニットが、場合によっては、前記第１段階濃度を処理して、前記第２段階でＴＩＭＰ１の濃度を測定するように代替的に表示し、
前記システムは、第２段階濃度の測定結果を獲得して、それにより、処理ユニットが第２段階濃度を処理して、軽度又は進行性歯周炎の分類結果を提示する、
システム。
【請求項２】
ヒト被験体が歯周炎であることが疑われる、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
試料中のバイオマーカーの濃度を測定する検出手段を備えた、被験体の口腔液の前記試料を受け取る、１又はそれ以上の容器を備える、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
さらに、以下の：
システムの一部又はリモートインタフェースのいずれかである、前記表示をユーザに提示するユーザインタフェース；及び、
プロセッサからユーザインタフェースへ表示を転送する、１又はそれ以上の処理ユニットとユーザインタフェースとの間のデータ接続
を備える、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
口腔液試料を受け取り、全てのバイオマーカーの濃度を測定する検出手段を備える、単一の容器を備える、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
口腔液試料を受け取り、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を測定する検出手段を備える第１容器と、ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドの濃度を測定する第２容器と、ＨＧＦ及びＴＩＭＰ−１の濃度を測定する第３容器とを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
前記第２容器及び前記第３容器は、異なるモジュールとして提示され、いずれの容器もシステムに挿入されうる、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
プロセッサは、インターネットベースのアプリケーションにより機能しうる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９】
ヒト被験体が軽度歯周炎又は進行性歯周炎であるかを評価する体外方法であって、以下の：
−前記被験体由来の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度の測定する工程；
−測定結果を、（ｉ）歯周炎であることが知られている患者群の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を決定すること；（ｉｉ）前記患者から得られた結果からクラスタ化技術を用いて、２つの第１特定クラスタ及び第２非特定クラスタを獲得すること、より得られたクラスタセンタと比較して、前記被験体の測定結果が前記第１クラスタ又は第２クラスタのどちらに適合するかを判定する工程；
−前記被験体が第１クラスタに適合する場合は、さらに、前記被験体の口腔液試料のＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含むタンパク質の濃度を測定して、前記タンパク質について測定された共同濃度を反映する試験値を得る工程；
−前記被験体が第２クラスタに適合する場合は、前記被験体の口腔液試料の、場合によっては、さらに、ＴＩＭＰ１の濃度を測定して、前記ＴＩＭＰ１及び以前に測定されたＨＧＦの共同濃度を反映する試験値を得る工程；及び
−前記試験値を、進行性歯周炎に関連する共同濃度を同様の方法で反映する閾値と比較して、その結果が前記被験体の軽度歯周炎又は進行性歯周炎を表示するかを評価する工程；
を、含む、方法。
【請求項１０】
ヒト被験体が歯周炎であることが疑われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
閾値が、進行性歯周炎の存在に関連する参照試料のタンパク質について決定された濃度に基づく、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
唾液中の歯周炎用バイオマーカーの濃度を決定するキットであって、各々異なるバイオマーカーを指向し、かつ、各々、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＩＬ１−β、ＩＬ６、コラーゲンテロペプチド、及びＴＩＭＰ１に結合することができる、７つの検出試薬を含み、前記キットは、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９を含む第１セット、ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含む第２セット、並びにＴＩＭＰ１及びＨＧＦを含む第３セットである、３つの異なる前記バイオマーカーのセットの前記濃度を別個に処理する、キット。
【請求項１３】
前記検出試薬が、チップ、マイクロタイタープレート、ビーズ又は樹脂等の固体支持体上に収容される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ヒト患者由来の口腔液試料中のタンパク質の濃度に基づいて、歯周炎が疑われる前記ヒト患者の軽度歯周炎又は進行性歯周炎の診断する方法であって、以下の：
−前記ヒト患者の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を測定する工程；
−測定結果を、（ｉ）歯周炎であることが知られている患者群の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を決定し；（ｉｉ）前記患者から得られた結果からクラスタ化技術を用いて、２つの第１特定クラスタ及び第２非特定クラスタを得ることにより、得られたクラスタセンタと比較して、前記被験体の測定結果が前記第１クラスタ又は第２クラスタのどちらに適合するかを判定する工程；
−前記被験体が第１クラスタに適合する場合は、さらに、前記被験体の口腔液試料のＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含むタンパク質の濃度を測定して、前記タンパク質について測定された共同濃度を反映する試験値を得る工程；
−前記被験体が第２クラスタに適合する場合は、前記被験体の口腔液試料の、場合によっては、さらに、ＴＩＭＰ１の濃度を測定して、前記ＴＩＭＰ１及びそれ以前に測定されたＨＧＦの共同濃度を反映する試験値を得る工程；及び
−得られた試験値と、進行性歯周炎に関連する共同濃度を同様の方法で反映する閾値と比較して、その結果が前記被験体の軽度歯周炎又は進行性歯周炎を表示するかを評価する工程；
を含む、方法。
【請求項１５】
タンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９を検出し、（ｉ）タンパク質ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチド、又は（ｉｉ）タンパク質ＴＩＭＰ１を、別個に検出する方法であって、以下の：
（ａ）ヒト患者から口腔液試料を得る工程；及び
（ｂ）前記タンパク質を結合する検出試薬と試料を接触させて、各タンパク質と検出試薬との結合を検出して、前記タンパク質が試料中に存在するか否かを検出する工程；
を含む、方法。
【請求項１６】
患者の軽度歯周炎又は進行性歯周炎の評価のバイオマーカーとしての、口腔液試料、又はヒト患者の試料における、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９タンパク質、並びに（ｉ）ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドタンパク質、又は（ｉｉ）タンパク質ＴＩＭＰ１の、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔ケアの分野で、唾液等の口腔液中のバイオマーカーに基づく歯周疾患の診断に関する。特に、本発明は、患者の歯周炎を軽度又は進行性に分類するキット、システム、使用、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周炎は、口腔微生物が原因となる慢性多因子性炎症性疾患であり、硬（骨）及び軟（歯周靭帯）組織の進行性破壊を特徴とし、最終的に歯の可動性及び喪失につながる。これは、歯肉組織の可逆的な感染及び炎症である歯肉炎とは区別されるべきである。炎症性歯周炎は最も一般的な慢性ヒト疾患の１つで、成人の歯の喪失の主原因である。歯周炎が口腔の健康に及ぼす実質的な悪影響に加えて、歯周炎が全身に影響を及ぼして、心疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、脳卒中）、糖尿病、妊娠合併症、関節リウマチ、及び呼吸器感染症を含むいくつかの全身性疾患の危険因子であるというエビデンスも蓄積されている。
【０００３】
したがって、歯周疾患の早期かつ正確な診断は、口腔及び全身の健康の観点から重要である。
【０００４】
歯周炎は、一般歯科診療ではこれまでほとんど診断されておらず（非特許文献１）、治療介入される比率が比較的低く、かなりの症例が未治療症である。現在の診断は、歯科医による不正確で主観的な口腔組織の状態の臨床検査（色、腫脹、プロービング時の出血の程度、プロービングポケットの深さ、及び口腔内Ｘ線による骨損失）に依存する。これらの従来の方法は時間がかかり、用いられる技術（ポケット深度、Ｘ線）によっては、現在の疾患活性又はさらなる疾患感受性よりもむしろ、過去の疾患活性等の病歴結果が反映される。したがって、より客観的、迅速、正確、かつ簡便な診断法であって、好ましくは非専門家でも実施しうる方法が望まれる。これにより、現在の疾患活性、及び歯周炎が進行する疑いがもたれる被験体の可能性が測定されることが望ましい。
【０００５】
唾液、又は口腔液は、長い間、口腔疾患及び全身性疾患の診断用流体として提唱されており、ラボオンチップという小型バイオセンサーの出現により、迅速なChair-side検査用のポイントオブケア診断法に、より高い科学的及び臨床的関心がもたれている。特に、歯周疾患の検出用の、組織炎症や衰弱に関連する炎症性バイオマーカーは、近接するためより容易に唾液に到達しやすく、唾液は歯周疾患検出の強力な可能性があることを示唆する。実際、この分野には大きな関心が寄せられ、有望な結果も示されているが、まだ明確な試験は出現していない。
【０００６】
バイオマーカーは、臨床症状を裏付ける生物学的指標であり、歯周疾患の臨床結果を診断する客観的尺度である。最終的には、実績が裏付けられたバイオマーカーを用いて、将来の疾患のリスクを評価し、極めて早期の段階で疾患を同定し、初期治療に対する反応を同定し、予防戦略を実施しうるのに用いることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Morgan RG (2001). Brit Dent J 191: 436-41
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
唾液バイオマーカー用ポイントオブケア検査の開発のこれまでの限界としては、Chair-sideアプリケーションに適応した技術が欠如することや、個々の試料で複数のバイオマーカーを分析できないことがあげられる。また、当該試験に含める複数のバイオマーカーの選択は、文献からは十分に対処されておらず、また、実用的な試験も実施されていない。
【０００９】
さらに、歯周炎の重症度は、軽度、中等度から進行性した疾患と、様々である。歯科医は、症状の重症度を容易に評価するために、歯周炎罹患患者を、軽度歯周炎（中等度の歯周炎を含む）の罹患患者と進行性歯周炎の罹患患者の２群に分類することが多い。しかし、当該評価を行う利用可能な方法は、消費者（自己診断）が行うことができない労働集約的方法を伴い、歯科医も全患者及び／又は全来院時に日常的に行うことはできない。
【００１０】
より簡便な方法、特に少量の唾液試料を患者から採取するか、できれば、患者自身が採取するだけでよい方法の提供が望まれる。当該試料が、体外診断装置に注入されて、測定に基づき、唾液試料を分類して、患者が、軽度歯周炎への罹患又は進行性歯周炎への罹患として分類される可能性の指標を返すことができるのが望ましい。バイオマーカーに基づいて体外アッセイを見出す際の特定の課題は、患者集団の固有の非均一性にもかかわらず、依然として限定された一連のバイオマーカーを発見し、望ましい診断感度及び特異度を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題をより良く解決するため、本発明は、一態様において、ヒト被験体を軽度歯周炎又は進行性歯周炎に分類するシステムに関し、前記システムは、以下の：
−前記被験体の口腔液試料の、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、インターロイキン−１β（ＩＬ１β）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、コラーゲンテロペプチド、及び場合によりメタロペプチダーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）、のバイオマーカーの濃度を測定する検出手段と；
−前記被験体の口腔液試料中のバイオマーカーの測定濃度から分類結果を決定する、１又はそれ以上の処理ユニットと；を含み、ここで、
−前記システムは、第１段階で、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９を含むバイオマーカーのセットの濃度を測定して、第１段階濃度の測定結果を獲得するように構成され、かつ、前記処理ユニットは、前記第１段階濃度を処理して、第２段階でＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含むバイオマーカーのセットの濃度を測定するか否かの結果を提示し、それにより前記処理ユニットが、場合によっては、前記第１段階濃度を処理して、前記第２段階でＴＩＭＰ１の濃度を測定するように代替的に表示し、それにより、処理ユニットが第２段階濃度を処理して、軽度又は進行性歯周炎の分類結果を提示するように構成される。
【００１２】
前記システムは、場合によっては、１又はそれ以上の処理ユニットから得られた結果を、情報を提示しうるインターフェース、特にグラフィカルユーザインタフェースに指向させうるデータ接続を含み、前記インターフェースは、システムの一部又はリモートインタフェースのいずれかである。
【００１３】
場合によっては、上記アイテムの１又はそれ以上、特にプロセッサは、「クラウド内」、すなわち固定マシン上ではなく、インターネットベースのアプリケーションによって機能することができる。
【００１４】
他の態様では、本発明は、歯周炎が疑われるヒト被験体が軽度歯周炎又は進行性歯周炎であるかを評価する体外方法を提供し、ここで、前記方法は以下の：
−前記被験体由来の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度の測定する工程；
−測定結果を、（ｉ）歯周炎であることが知られている患者群の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を決定すること；（ｉｉ）前記患者から得られた結果からクラスタ化技術を用いて、２つの第１特定クラスタ及び第２非特定クラスタを獲得すること、より得られたクラスタセンタと比較して、前記被験体の測定結果が前記第１クラスタ又は第２クラスタのどちらに適合するかを判定する工程；
−前記被験体が第１クラスタに適合する場合は、さらに、前記被験体の口腔液試料のＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含むタンパク質の濃度を測定して、前記タンパク質について測定された共同濃度を反映する試験値を得る工程；
−前記被験体が第２クラスタに適合する場合は、前記被験体の口腔液試料の、場合によっては、さらに、ＴＩＭＰ１の濃度を測定して、前記ＴＩＭＰ１及び以前に測定されたＨＧＦの共同濃度を反映する試験値を得る工程；及び
−前記試験値を、進行性歯周炎に関連する共同濃度を同様の方法で反映する閾値と比較して、その結果が前記被験体の軽度歯周炎又は進行性歯周炎を表示するかを評価する工程；を含む。
【００１５】
なおさらなる態様では、本発明は、口腔液での歯周炎用バイオマーカーの濃度を決定するキットを提供し、前記キットは、各々異なるバイオマーカーを指向し、かつ、各々、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＩＬ１−β、ＩＬ６、コラーゲンテロペプチド、及びＴＩＭＰ１に結合することができる、７つの検出試薬を備え、前記キットは、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９を含む第１セット、ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含む第２セット、並びにＴＩＭＰ１及びＨＧＦを含む第３セットである、３つの異なる前記バイオマーカーのセットの前記濃度を別個に処理する。
【００１６】
さらに他の態様では、ヒト患者由来の口腔液試料中のタンパク質の濃度に基づいて、歯周炎が疑われる前記ヒト患者の軽度歯周炎又は進行性歯周炎の診断する方法を提供し、以下の：
−前記ヒト患者の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を測定する工程；
−（ｉ）歯周炎であることが知られている患者群の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を決定し；（ｉｉ）前記患者から得られた結果からクラスタ化技術を用いて、２つの第１特定クラスタ及び第２非特定クラスタを得ることにより、得られたクラスタセンタと比較して、前記被験体の測定結果が前記第１クラスタ又は第２クラスタのどちらに適合するかを判定する工程；
−前記被験体が第１クラスタに適合する場合は、さらに、前記被験体の口腔液試料のＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含むタンパク質の濃度を測定して、前記タンパク質について測定された共同濃度を反映する試験値を得る工程；
−前記被験体が第２クラスタに適合する場合は、前記被験体の口腔液試料の、場合によっては、さらに、ＴＩＭＰ１の濃度を測定して、前記ＴＩＭＰ１及びそれ以前に測定されたＨＧＦの共同濃度を反映する試験値を得る工程；及び
−得られた試験値と、進行性歯周炎に関連する共同濃度を同様の方法で反映する閾値と比較して、その結果が前記被験体の軽度歯周炎又は進行性歯周炎を表示するかを評価する工程；を含む。
【００１７】
他の態様では、本発明は、タンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９を検出し、（ｉ）タンパク質ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチド、又は（ｉｉ）タンパク質ＴＩＭＰ１を、別個に検出する方法であって、以下の：
（ａ）ヒト患者から口腔液試料を得る工程；及び
（ｂ）前記タンパク質を結合する検出試薬と試料を接触させて、各タンパク質と検出試薬との結合を検出して、前記タンパク質が試料中に存在するか否かを検出する工程；を含む、方法を提供する。
【００１８】
なお、さらなる態様では、本発明は、患者の軽度歯周炎又は進行性歯周炎の評価のバイオマーカーとしての、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９タンパク質、並びに（ｉ）ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドタンパク質、又は（ｉｉ）タンパク質ＴＩＭＰ１の、口腔液試料、又はヒト患者の試料における、使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本開示の方法で使用するシステムの概略図である。
【図２】シルエット値を示すグラフである。
【図３】患者集団データのクラスタ化の結果を示す図である。
【図４】試料スコアをクラスタ１又はクラスタ２に割り当てる方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
一般的な意味では、本発明は、クラスタ化技術を患者データの参照セットに適用し、次いで、適用されるバイオマーカーのセットをさらに識別する賢明な洞察に基づく。これは、特に、患者集団の固有の非均一性に対処するのに役立つ。
【００２１】
参照セットは、歯周炎であることが知られている患者の唾液等の口腔液の試料を採取して得ることができる。この知識は、異なる診断法に基づき、特に、歯科医又は他の歯科医療専門家による検査で行われるような、従来の方法で行われる。参照セットについては、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９の濃度を測定する。その後、結果をクラスタ化技術に供する。これは、当業者に公知のいかなる技術をもいう。したがって、一例として、「ｋ−Ｍｅａｎｓ」クラスタリング技術をＨＧＦ、ＭＭＰ８及びＭＭＰ９の濃度読み取りに適用することができる。その結果、同定された２つのクラスタ各々についてクラスタセンタが得られる。例えば、３つのバイオマーカーＢ１、Ｂ２、及びＢ３の場合は：
【００２２】
【数１】
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これらのクラスタセンタは、被験体ＵがクラスタＣ１に属し、被験体Ｔ−ＵがクラスタＣ２に属する、Ｔ人の被験体のバイオマーカー読取値から算出される。数Ｔは、少なくとも２、例えば少なくとも１０、例えば少なくとも２０、例えば少なくとも３０、好ましくは少なくとも４０である。また、より大きな臨床データセットから２つ以上のデータ点を選択し、これらの選択されたデータ点をクラスタの記述のために適用することも考えられる。本発明は、特に、２つのクラスタを得るために、クラスタ化を適用することに基づく。その場合、特定クラスタである第１クラスタが得られる。これは、できるだけ多くの被験体（すなわち、上記Ｕの被験体数）が０．８以上、０．９以上、例えば０．９５以上、又は１に近いシルエット値で表される類似の結果を示しうるクラスタをいう。同様に、対応するクラスタ（被験体Ｔ−Ｕ）は、０から１の間で変化するシルエット値によって表される、非特定のクラスタである。
【００２３】
本発明を提供するにあたり、本発明者らは、以下に記載する臨床試験の結果を参酌して、両クラスタの分類モデルをさらに同定した。それによれば、一般には、いかなる標準機械学習分類をも用いうることが理解されるであろう。本開示では、分類プロセスは、ｋ−Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｓ分類を用いて例示される。
【００２４】
分類の特徴として、ＩＬ１−β、ＩＬ６、コラーゲンテロペプチドを用いたクラスタＣ１について、ｋ＝７の場合、「軽度歯周炎」と「進行性歯周炎」を分類すると、得られる精度は８８．１％である。
【００２５】
バイオマーカーＴＩＭＰ１及びＨＧＦを分類の特徴として用い、ｋ＝３であるクラスタＣ２について、「軽度歯周炎」及び「進行性歯周炎」を分類すると、得られる精度は８１．２５％である。
【００２６】
本発明の方法の実施においては、まず、試験される被験体の口腔液の試料が、クラスタ化に関連するバイオマーカーの決定に供される。口腔液とは、一般に、唾液又は歯肉溝滲出液をいう。唾液試料は、口腔内から得られる唾液であってもよく、又は吐出物として得られてもよい。唾液試料はまた、試料リンス液、典型的には、例えば、滅菌水、で口腔内をすすいだ後、リンス液を採取することにより得られる、当該リンス液で希釈された唾液を含む唾液を含む試料であってよい。ここで、用語「口腔液」としては、唾液そのもの、吐出液、唾液を含む口腔洗浄液、歯肉溝滲出液、歯肉溝滲出液を含む口腔洗浄液があげられる。好ましくは、口腔液は唾液試料である。用語「唾液試料」としては、口腔内から得られた唾液、吐出物として得られた唾液、及び滅菌水等の試料液を用いた口腔洗浄液から得られた唾液があげられる。以下、単に「試料」という。
【００２７】
次に、試料を、２つのクラスタのいずれかの実際の分類用に選択されたバイオマーカーの決定に供する。これにより、２つの試料、又は同一試料の異なる２滴を用いて２段階試験を実施しうる。あるいは、単一試料を用いて、関連する全てのバイオマーカーを決定することもできる。ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９のデータは、必要に応じてデータ処理され、本発明を実施するのに用いられるシステム内の処理ユニットに利用できるように、クラスタセンタとの比較が行われる。この比較は、被験体がどのクラスタに属するかを示す表示を返す。これが第１クラスタである場合、ＩＬ１−β、ＩＬ６、コラーゲンテロペプチドについて得られたデータを処理し、閾値と比較して、軽度又は進行性歯周炎の存在を決定する。被験体が第２クラスタに属する場合、ＨＧＦ（単一試料の場合は、前記第１段階で適用されたものと同じ測定に基づく）、及びＴＩＭＰ１について得られたデータを処理し、対応する閾値と比較する。
【００２８】
あるいは、被験体が第２クラスタに属する場合、検査結果は不特定と判断される。そのような実施形態では、本発明は、（全ての態様では）被験体が、被験体の歯周炎を分類するために、さらなる検査を受ける必要があるか否かを決定することができる。特定が明確な第１クラスタに属さない被験体は、その時点では、さらなる濃度測定の被験体とはならない。これは、分類がより正確である可能性の高い被験体のみに、バイオマーカー検出をさらに行うための資源の使用や、必要なさらなる治療を限定するという利点がある。他の被験体は、その後、通常の歯科診療により、後の段階でモニタリングされる。
【００２９】
本発明に適用されるタンパク質は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、インターロイキン−１β（ＩＬ１β）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、コラーゲンテロペプチド、及びメタロペプチダーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）である。
【００３０】
ＨＧＦは傍分泌細胞増殖、運動性及び形態形成因子である。間葉系細胞から分泌され、主に上皮細胞や内皮細胞を標的として作用するが、造血前駆細胞にも作用する。ＨＧＦは筋形成及び創傷治癒に主要な役割を果たすことが示される。細胞分裂促進、細胞運動、マトリックス浸潤刺激能は、血管新生、腫瘍形成、及び組織再生において中心的に機能する。ＨＧＦは上皮細胞増殖を刺激し、結合組織の癒着再生を妨げる。ＨＧＦは様々な疾患における疾患活性を示す血清マーカーとして知られる。
【００３１】
ＩＬ−１βはサイトカインのインターロイキン１ファミリーの一員である。このサイトカインは、プロタンパク質として活性化されたマクロファージによって産生され、カスパーゼ１（ＣＡＳＰ１／ＩＣＥ）によるタンパク質分解により、活性型にプロセシングされる。このサイトカインは、炎症反応の重要なメディエーターであり、細胞増殖、分化、及びアポトーシスを含む様々な細胞活性に関与する。
【００３２】
ＩＬ−６は、炎症誘発性サイトカイン及び抗炎症性ミオカインとして作用するインターロイキンである。ヒトではＩＬ６遺伝子にコードされる。インターロイキン６は、Ｔ細胞及びマクロファージによって分泌され、免疫応答を刺激する。例えば、感染中及び外傷後、特に、熱傷又は炎症につながる他の組織損傷の際、そのような免疫応答を刺激する。ＩＬ−６は感染防御にも関与するが、マウスでは、細菌性肺炎球菌に対する耐性にＩＬ−６が必要であることが示されているからである。さらに、骨芽細胞はＩＬ−６を分泌して、破骨細胞形成を刺激する。多くの血管の中膜にある平滑筋細胞は、炎症誘発性サイトカインとしてＩＬ−６も産生する。
【００３３】
ＭＭＰは、コラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、エラスチン、及びフィブロネクチン等の細胞外マトリックス成分の分解に関与する酵素のファミリーである。それらは、生理学的及び病理学的条件で歯周靭帯（ＰＤＬ）リモデリングの中心的役割を果たす。好中球コラゲナーゼ、又はＰＭＮＬコラゲナーゼ（ＭＮＬ−ＣＬ）としても知られるＭＭＰ−８は、大部分の哺乳動物の結合組織に存在するコラーゲンプロテアーゼ酵素である。
【００３４】
ＭＭＰ−９は、９２ｋＤａＩＶ型コラゲナーゼ、９２ｋＤａゼラチナーゼ又はゼラチナーゼＢ（ＧＥＬＢ）としても知られる、細胞外マトリックスの分解に関与する亜鉛メタロプロテイナーゼファミリーに属する酵素の一群であるマトリキシンである。ＴＩＭＰ１は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びディスインテグリンメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ及びＡＤＡＭＴＳ）を制御する阻害分子である。ＭＭＰの制御において、ＴＩＭＰ１は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成、創傷治癒、及び妊娠において重要な役割を果たす。
【００３５】
上記７つのタンパク質は、当該技術分野において公知である。当業者であれば、それらの構造、及び口腔流体試料等の水性試料中でそれらを検出する方法を知っている。以下、上記のタンパク質バイオマーカーを、「本発明のバイオマーカーパネル」という。一実施形態では、本発明のバイオマーカーパネルは、上記タンパク質バイオマーカーの３つのセットからなる。
【００３６】
好ましくは、本発明のバイオマーカーパネルは、本発明の各セットで同定されたタンパク質バイオマーカーを超えない範囲からなる。本発明のバイオマーカーパネル、及び人口統計学的データ（例えば、年齢、性別）等の他のバイオマーカー及び／又はデータを、歯周炎のタイプの決定に適用されるデータのセットに含めることができる。
【００３７】
しかしながら、本発明の望ましい利点は、被験体の歯周炎の分類が、好ましくは、最大、上記で同定された７つのバイオマーカー以下を測定して決定できることである。あるいは、すべてのバイオマーカーが同一試料で測定されない場合、第１クラスタでは６種類のバイオマーカー（ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチド）のみ、又は第２クラスタでは４種類のバイオマーカー（ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、及びＴＩＭＰ１）のみが測定される。特に、決定には、他のデータを用いる必要がなく、有利には、簡便かつ単純な診断テストを提供する。
【００３８】
本方法は、必要に応じて、少量の試料、例えば液滴サイズ、を被験体から採取すればよい。上記のように、これは、単一試料、又はいずれかの段階用の２つの異なる試料であってよい。試料の大きさは、通常、０．１μｌ〜２ｍｌ、例えば、１〜２ｍｌの範囲であり、それにより、より少量、例えば、０．１〜１００μｌを体外装置処理に用いることができるし、より大きな試料、例えば、最大２０ｍｌ、例えば、７．５〜１７ｍｌを採取することもできる。
【００３９】
この試料は、体外診断装置に注入され、関連するタンパク質の濃度を測定し、上記のように２段階で診断結果を返す軽度歯周炎、又は進行性歯周炎の可能性に基づいて被験体を分類する。
【００４０】
本発明は簡便に用いられるため、歯周炎であるか、又は歯周炎を発症するリスクが高い歯科患者の大部分を、定期的に（例えば、定期的な歯科チェックの一部として、又は自宅においてさえ）検査しうる。これにより、とりわけ、軽度歯周炎が進行性歯周炎に進行する前にその存在を検出でき、歯周炎の進行を防止する口腔ケアをよりタイミングよく行うことができる。あるいは、例えば、歯周炎のリスクが高いことが知られる患者が、初めて検査を受ける場合、この方法により、歯周炎が軽度であるか進行しているかを同定できる。また、本方法は、以前に進行性歯周炎と診断された患者の治療後、歯周炎が軽度に改善したかを確認することに適用できる。特に、本方法は自己診断にも適し、試料を採取し、それを装置に注入する工程は、患者自身が行うことができる。
【００４１】
本発明が、歯周炎が軽度か、又は進行性かを決定するために実施される場合、患者は、通常、歯周炎であることが疑われるか、又は歯周炎であることが知られうる。したがって、特定の実施形態では、本方法では、歯周炎が疑われるか又は知られているヒト患者の、軽度歯周炎又は進行性歯周炎を評価する。
【００４２】
本発明の方法は、通常、１又はそれ以上の検出試薬を用いて、適用可能なバイオマーカーパネルを含む前記タンパク質、及び、場合によっては、さらなるバイオマーカータンパク質を検出することを含む。
【００４３】
「検出する」とは、バイオマーカータンパク質の濃度を測定、定量、スコアリング、又はアッセイすることをいう。バイオマーカータンパク質を含む生物学的化合物を評価する方法は、当技術分野で公知である。タンパク質バイオマーカーを検出する方法には、直接的測定、及び間接的測定が含まれることは認識される。当業者であれば、特定のバイオマーカータンパク質をアッセイする適当な方法を選択することができるであろう。
【００４４】
タンパク質バイオマーカーに関する「濃度」という用語には、その通常の意味、すなわち、体積中のタンパク質の存在量が定められる。タンパク質濃度は、通常、体積当たりの質量で測定され、最も典型的にはｍｇ／ｍｌ又はμｇ／ｍｌであるが、ときにはｐｇ／ｍｌと低い値になる場合もある。他の尺度は、モル度（又はモル濃度）、モル／Ｌ、又は「Ｍ」である。濃度は、公知の、決定された、又は予め決定された容量の試料中のタンパク質の量を検出して決定することができる。
【００４５】
濃度を決定することにかえて、試料中のタンパク質バイオマーカーの絶対量を決定するか、又は試料中のバイオマーカーの質量分画、例えば、試料中の他のすべてのタンパク質の合計に対するバイオマーカーの量、を決定してもよい。
【００４６】
「検出試薬」とは、目的タンパク質バイオマーカーに特異的に（又は選択的に）結合し、相互作用し、又は検出する、薬剤、又は化合物である。そのような検出試薬は、タンパク質バイオマーカーに優先的に結合する抗体、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
用語「特異的に（又は選択的に）結合する」又は「特異的な（又は選択的な）免疫反応性がある」は、検出試薬をいう場合、タンパク質及び他の生物学的製剤の不均一な集団におけるタンパク質バイオマーカーの存在を決定する結合反応をいう。したがって、指定された免疫アッセイ条件下では、特定の検出試薬（例えば、抗体）は、バックグラウンドの少なくとも２倍で特定のタンパク質に結合し、試料中に存在する他のタンパク質に実質的に有意な量ではｑ結合しない。このような条件下での特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性のために選択される抗体が必要な場合がある。様々な免疫アッセイ形式を用いて、特定のタンパク質と特異的な免疫反応性の抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ（酵素免疫測定法）は、タンパク質と特異的に免疫反応性のある抗体を選択する常套手段として用いられる（免疫測定法の形式及び特異的免疫反応性を決定するために用いることができる条件を記載するものとしては、例えば、Harlow  &  Lane,  Antibodies,  A  Laboratory  Manual(1988)を参照）。通常、特異的又は選択的反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍であり、より典型的には、バックグラウンドの１０〜１００倍を超えるであろう。
【００４８】
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子若しくは免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされるポリペプチドリガンド、又はそれらの断片であって、エピトープ（本明細書で用いられる場合、全抗体の修飾により産生された抗体断片、又は組換えＤＮＡ方法を用いて新規に合成された抗体断片を含む。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体を含む）を特異的に結合し、認識するものをいう。認識された免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ及びラムダ軽鎖定常領域遺伝子、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー重鎖定常領域遺伝子、及び無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子があげられる。抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼによる消化により産生される多数の十分に特徴付けられた断片として存在する。これは、例えば、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２断片を含む。用語「抗体」はまた、本明細書中で用いられる場合、全抗体の修飾により産生された抗体断片、又は組換えＤＮＡ方法を用いて新規に合成された抗体断片を包含し、また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は単鎖抗体を包含し、抗体の「Ｆｃ」部分は、１又はそれ以上の重鎖定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むが、重鎖可変領域を含まない免疫グロブリン重鎖の部分をいう。抗体は、二重特異性抗体、例えば、第１抗原に特異的に結合する第１可変領域及び異なる第２抗原に特異的に結合する第２可変領域がある抗体であってよい。少なくとも１つの二重特異性抗体を用いると、必要な検出試薬の数を減らすことができる。
【００４９】
診断法には、感度及び特異度がある。診断アッセイの「感度」とは、検査が陽性であった罹患患者の比率（「真陽性」の比率）である。アッセイで検出されなかった罹患患者は「偽陰性」である。罹患しておらず、アッセイでも陰性であった被験体を「真陰性」という。診断アッセイの「特異度」は１から偽陽性率を差し引いたもので、「偽陽性」率は、検査で陽性となった罹患していない被験体の比率と定義される。
【００５０】
本発明のバイオマーカータンパク質は、いかなる手段によっても試料中で検出することができる。バイオマーカー検出の好ましい方法は、抗体系アッセイ、タンパク質アレイアッセイ、質量分析（ＭＳ）系アッセイ、及び（近）赤外分光法系アッセイである。例えば、免疫アッセイとしては、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、蛍光イムノアッセイ等の技術を用いる競合的、及び非競合的アッセイシステムがあげられるが、これらに限定されない。当該アッセイは常套手段であり、当技術分野において周知である。例示的なイムノアッセイを、以下に簡単に記載する（しかし、これに限定されることを意図しない）。
【００５１】
免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）添加ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０、又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＮａＣ１、ｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％トラシロール）等の溶解緩衝液で細胞の集団を溶解し、当該細胞溶解液に目的の抗体を添加し、４℃で一定期間（例えば、１〜４時間）インキュベートし、プロテインＡ及び／又はプロテインＧのセファロースビーズを当該細胞溶解液に添加し、約１時間以上４℃でインキュベートし、溶解緩衝液でビーズを洗浄し、ＳＤＳ／試料緩衝液でビーズを再懸濁することを含む。抗体の特定抗原に対する免疫沈降能は、例えば、ウェスタンブロット分析で評価することができる。当業者であれば、抗体の抗原結合を高め、バックグラウンドを減少させる（例えば、セファロースビーズで細胞溶解物を予備洗浄する）ために修正されうるパラメータに関する知識があるであろう。
【００５２】
ウェスタンブロット分析は、一般に、タンパク質試料の調製、ポリアクリルアミドゲル中でのタンパク質試料の電気泳動（例えば、抗原の分子量に応じて８〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、当該タンパク質試料のポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦ又はナイロン等の膜への移動、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡ又は脱脂乳を含むＰＢＳ）での膜のブロッキング、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中での膜の洗浄、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（目的の抗体）を用いた膜のブロッキング、洗浄緩衝液での膜の洗浄、ブロッキング緩衝液で希釈した酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、又は放射性分子（例えば、３２Ｐ又は１２５Ｉ）に結合した（例えば、抗ヒト抗体を認識する一次抗体を認識する）二次抗体を用いた膜のブロッキング、洗浄緩衝液での膜の洗浄、及び当該抗原の検出、を含む。当業者であれば、検出されるシグナルを高め、バックグラウンドノイズを減少させるために修正できるパラメータに関する知識があるであろう。
【００５３】
ＥＬＩＳＡは、通常、抗原（すなわち、目的のバイオマーカータンパク質又はその断片）を調製し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングし、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）等の検出可能な化合物に結合した目的の抗体をウェルに添加し、一定期間インキュベートし、及び抗原の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡでは、目的の抗体を検出可能な化合物に結合させる必要はなく、代わりに、検出可能な化合物に結合させた（目的の抗体を認識する）二次抗体をウェルに添加してもよい。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、コーティングされたウェルに抗原を添加した後、検出可能な化合物に結合した二次抗体を添加することができる。当業者は、検出されたシグナルを高めるため、当技術分野で公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーション同様、修正できるパラメータに関する知識があるであろう。
【００５４】
複数のマーカーを用いるため、本発明の方法の第２段階では、これらのバイオマーカーの結合濃度に基づいて閾値を決定する。この閾値は、被験体が軽度歯周炎、又は進行性歯周炎に分類されるかを決定する。本発明は、上記のバイオマーカーの組み合わせの測定に基づき、歯周炎が、軽度、又は進行性であることが、十分な精度で検出されうるという洞察を反映する。
【００５５】
本発明の方法の第２段階は、前記タンパク質について測定された共同濃度を反映する試験値を決定することを含む。共同濃度値は、測定された濃度を入力し、かつ、これらの値を算術演算して得られるいかなる値であってよい。これは、例えば、濃度の単純な加算であってよい。また、各濃度を当該濃度の所望の重量を反映する係数で乗算した後、その結果を合計することを含むこともできる。また、濃度を互いに乗算すること、又は乗算、除算、減算、指数化、及び加算のいかなる組み合わせを含んでもよい。さらに、濃度をある乗数まで上げることもできる。
【００５６】
その結果得られた共同濃度値を、進行性歯周炎の存在に関連する共同濃度を同じ方法で反映する閾値と比較する。この比較により、検査値が、唾液が検査を受けた被験体の進行性歯周炎の存在を示すのか、又は軽度歯周炎の存在を示すか、を評価することができる。
【００５７】
閾値は、例えば、進行性歯周炎の存在と関連する参照試料、すなわち、進行性歯周炎と診断された被験体で同じタンパク質について測定された濃度に基づいて、同様の方法で得られた共同濃度値であってよい。典型的には、共同濃度と同じかそれ以上であることを反映する値は、被験体における進行性歯周炎の存在を示す。同様に、検査を受けた歯周炎患者の唾液中の共同濃度が低いことを反映する値は、歯周炎が軽度又は中等度である（すなわち、進行していない）ことを示す。しかし、進行性歯周炎を示す試験値が閾値を下回り、軽度歯周炎を示す試験値が閾値を上回るように、（例えば、負の乗数を用いて）閾値を計算することも可能であることが理解されよう。
【００５８】
閾値はまた、進行性、及び非進行性（軽度及び／又は中等度）歯周炎の既知の診断を受けた患者を含む、一連の試料中の本発明のバイオマーカータンパク質の濃度を測定することに基づいて決定することもできる。それにより、測定された濃度値を、可能であれば機械学習法を含む統計分析に供することができ、望ましい感度及び特異度で、軽度又は中等度の歯周炎に分類された被験体及び進行性歯周炎に罹患した患者に分類された被験体を識別することができる。これにより、所望の閾値を得ることができる。この閾値に基づき、検査試料を同じ濃度測定に供し、次いで、閾値を得るのと同様の方法で当該濃度値を処理し、閾値と比較可能な共同濃度値を決定し、それにより、当該検査試料を、軽度、又は進行性の歯周炎に分類することができる。
【００５９】
興味深い実施形態では、共同濃度値は、以下のようなスコア形式で得られる。数値（タンパク質濃度値、例えば、ｎｇ／ｍｌ）を各測定に割り当て、これらの値を、線形又は非線形の組み合わせを用いて、ゼロから１の間のスコアで計算する。上記のように、閾値を被験体のセットに基づいて決定する場合、通常、（以下に示すように）０〜１のスコアは共同濃度を入力するシグモイド関数を用いて計算される。
【００６０】
スコアがある閾値を超えると、その方法は、被験体が進行性歯周炎であることを示す。当該閾値は、所望の感度及び特異度に基づいて選択されてよい。
【００６１】
本発明によれば、被験体に対して「軽度又は進行性歯周炎分類」を行うとは、歯周炎が疑われる被験体に関することが理解されるであろう。これは、例えば、おそらく歯周炎の程度の識別能がないにもかかわらず、以前に実施された歯周炎の診断に基づくか、又は例えば、被験体の口腔の健康状態記録から疑われるかのいずれかである。それにもかかわらず、バイオマーカー測定の第１段階、すなわち、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を測定することは、被験体が実際に歯周炎であるか、及び当該被験体が第１クラスタに属する患者であるか、を共に評価するのに用いることもできる。
【００６２】
当該技術分野において認められている臨床定義は、以下に基づく：
歯肉指数（ＧＩ）
以下の場合、ロベン修正歯肉指数（ＭＧＩ）を０〜４の尺度で評価し、それに基づいて全口腔歯肉指数を記録する：
−  ０＝炎症がない、
−  １＝軽度の炎症；色の変化は小さく、辺縁又は乳頭状歯肉ユニットの全部ではない、いずれかの部分の質感にわずかな変化がある、
−  ２＝軽度の炎症；ただし、辺縁全体又は乳頭部に及ぶ；
−  ３＝中等度の炎症；硝子体炎、発赤、浮腫及び／又は辺縁部又は乳頭部の肥大、
−  ４＝重度の炎症；顕著な発赤、辺縁又は乳頭状歯肉ユニットの浮腫及び／又は肥厚、自然出血、うっ血、潰瘍形成。探傷深度（ＰＤ）
探傷深度は、手動歯周プローブＵＮＣ−１５を用いて、最小ｍｍ単位で記録する。探傷深度とは、プローブ先端（ポケット底部と仮定）から遊離歯肉縁までの距離である。
【００６３】
歯肉後退（ＲＥＣ）
歯肉後退は、手動歯周プローブＵＮＣ−１５を用いて、最小ｍｍ単位で記録する。歯肉後退は、遊離歯肉縁からセメント−エナメル質接合部までの距離である。歯肉後退は正の数値、歯肉過成長は負の数値で示される。
【００６４】
臨床的付着喪失（ＣＡＬ）
臨床的付着喪失は、各部位における探傷深度＋後退の和として計算される。
【００６５】
プロービング時出血（ＢＯＰ）
プロービング後、各部位の出血の有無を評価し、プロービング後３０秒以内に出血が生じた場合は、その部位のスコアを１と割り当て、それ以外は、スコア０を割り当てる。
【００６６】
その結果、得られる被験体群（患者群）の定義は以下の通りであり、軽度から中等度の歯周炎群、及び進行性歯周炎群が本発明に関連する：
−  健常群（Ｈ）：全部位でＰＤ３ｍｍ以下（ただし、最終立位大臼歯の遠位部では４ｍｍポケットまで可）、近位付着喪失部位がない、部位の１０％以下でＧＩが２．０以上、％ＢＯＰスコア１０％以下；
−  歯肉炎群（Ｇ）：３０％を超える部位でＧＩが３．０以上、近位付着喪失部位がない、ＰＤが４ｍｍを超える部位がない、％ＢＯＰスコアが１０％を超える；
−  軽度〜中等度の歯周炎群（ＭＰ）：８本以上の歯の歯間ＰＤが５〜７ｍｍ（約２〜４ｍｍのＣＡＬに等しい）、％ＢＯＰスコア＞３０％
−  進行性歯周炎群（ＡＰ）：１２本以上の歯間ＰＤが７ｍｍ以上（ＣＡＬ約５ｍｍ以上と等しい）、％ＢＯＰスコア＞３０％
一実施形態では、本発明の方法は、図１に概略的に示すシステムを用いる。当該システムは、そこで統合された様々な装置構成要素（ユニット）を備える単一装置であってよい。当該システムはまた、その様々な構成要素、又はその一部を、別個の装置とすることができる。図１に示す構成要素は、測定装置（Ａ）、グラフィカルユーザインタフェース（Ｂ）、及びコンピュータ処理ユニット（Ｃ）である。
【００６７】
上記のように、本発明のシステムは、インターフェースへのデータ接続を備え、インターフェース自体は、システムの一部でも、遠隔インターフェースであってもよい。後者は、実際のインターフェースを提供するために、他の装置、好ましくはスマートフォン、又はタブレットコンピュータ等のハンドヘルド装置を用いられる。このような場合のデータ接続は、好ましくは、Ｗｉ−Ｆｉ、又はＢｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）等、他の技術、又は標準による無線データ転送を含む。
【００６８】
測定装置（Ａ）は、例えば、装置（Ａ）に挿入可能なカートリッジ（Ａ１）上に唾液を滴下して、１又はそれ以上の試料を受け取るように構成される。当該装置は、同一試料から、該当するタンパク質の濃度を決定できる既存の装置であってよい。上記のように、これは、本発明のシステムで実施される方法の２つの段階に関与する可能性のある７つのタンパク質の全ての測定を参照することができる。また、各々が関与する３つの異なるタンパク質バイオマーカーセット（すなわち、［ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９］、［ＩＬ１−β、ＩＬ６、コラーゲンテロペプチド］、及び［ＨＧＦ、ＴＩＭＰ１］）のいずれかを決定するように構成された異なるユニットを参照することもできる。
【００６９】
処理ユニット（Ｃ）は、部位（Ａ）からタンパク質濃度の数値を受け取る。当該ユニット（Ｃ）は、本発明の方法の２つの段階を実行することを可能にするソフトウェア（通常、組み込みソフトウェア）を備える。第１段階では、これはクラスタセンタとの比較をもたらす。
【００７０】
例えば、新規患者のバイオマーカーの測定値が以下：
【００７１】
【数２】
2021501326.tif 000004
の場合：
患者Ｐ１の読取値とクラスタＣ１及びＣ２の間の距離が計算される。様々な距離マトリクスがあるが、本開示では、例としてユークリッド距離を用いる。Ｐ１及びＣ１の距離をｄ（Ｐ１，Ｃ１）とし、Ｐ１及びＣ２の距離をｄ（Ｐ２，Ｃ２）とすると、
【００７２】
【数３】
2021501326.tif 000005
ｄ（Ｐ１，Ｃ１）がｄ（Ｐ２，Ｃ２）以下の場合、Ｐ１はＣ１に属する。同様に、ｄ（Ｐ１，Ｃ１）がｄ（Ｐ２，Ｃ２）より大きい場合、Ｐ１はＣ２に属する。
【００７３】
このクラスタセンタとの比較は、図４のように示すことができる。ここでは、個々の試料Ｑ（ここでは、図示したように、Ｘ，Ｙ，Ｚ）をクラスタに割り当てる必要がある。選択肢は以下のように３つある：
１．距離Ａ−Ｑ  ＜  距離Ｂ−Ｑの場合、クラスタＣ１：点Ｘ
２．距離Ａ−Ｑ  ＞  距離Ｂ−Ｑの場合、クラスタＣ２：点Ｙ
３．距離Ａ−Ｑ  ＝  距離Ｂ−Ｑの場合、非特定：点Ｚ（注：ここではＣ１に割り当てる）
第２段階では、ユニットＣは、０から１の間のスコア（Ｓ）を計算するように構成される。ソフトウェアは、閾値（Ｔ）の数値をさらに含む。計算値（Ｓ）が（Ｔ）を超える場合、ユニット（Ｃ）はＧＵＩ（Ｂ）に「進行性歯周炎」の表示（Ｉ）を出力し、そうでない場合は「軽度歯周炎」を出力する。さらなる実施形態では、（Ｓ）の特定の値を用いて、表示（Ｉ）が行われる確実性を示すことができる。これは確率スコアであり、０．５が可能な閾値であり、例えば、スコアＳ＝０．８は進行性歯周炎の確率を示す。興味深い選択肢は以下のとおりである：
スコアＳに基づき、確実性を直接表示しうる。すなわち、Ｓ＝０．８は８０％の確実性を意味する
−  スコアＳに基づき、２次的、又は３次的な表示を行うことができる
−  ＳがＴより小さい場合は軽度歯周炎、ＳがT以上の場合は進行性歯周炎
−  ＳがＲ１より小さい場合は軽度歯周炎、SがＲ１以上、Ｒ２より小さい場合は非特定
−  ＳがＲ２以上の場合は進行性歯周炎
さらに、このような２次的、又は３次的な表示に確実性を付与しうる。この確実性は、選択した閾値（Ｔ，Ｒ１，Ｒ２）からのスコアＳの距離によって決定される。
【００７４】
スコアの特定の計算は、例えば、以下の公式：
【００７５】
【数４】
2021501326.tif 000006
を適用するシグモイド関数によって実行することができる。
ここでＮは、用いるタンパク質／バイオマーカーの数である。ｃ０、ｃ１等は係数（数値）、Ｂ１、Ｂ２等は各々タンパク質濃度である。
【００７６】
係数の決定は、学習手順により行うことができる：
−  進行性歯周炎のＮ１症例と軽度歯周炎のＮ２症例を選択する。
軽度歯周炎でない被験体はスコアＳ＝０、進行性歯周炎の被験体はスコアＳ＝１とする。
−  各被験体から試料を採取し、上記のようにバイオマーカーの組み合わせのタンパク質濃度を測定する。
−  タンパク質濃度とスコアのロジスティック回帰を行う。
＊  他の回帰又は機械学習法（線形回帰、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、ロジスティック回帰）を用いて、タンパク質濃度に基づき、被験体が歯肉炎であるか、又は健康な口腔状態であるかを予測する分類を訓練することができる。
【００７７】
上記のシステムに関し、本発明はまた、さらなる態様において、ヒト被験体を軽度歯周炎又は進行性歯周炎に分類するシステムを提供する。このシステムは、以下の：
−  前記被験体の口腔液試料の、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、インターロイキン−１β（ＩＬ１β）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、コラーゲンテロペプチド、及び場合によりメタロペプチダーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）、のバイオマーカーの濃度を測定する検出手段；
−  前記被験体の口腔液試料中のバイオマーカーの測定濃度から分類結果を決定する、１又はそれ以上の処理ユニット；
場合によっては、前記１又はそれ以上の処理ユニットから得られた結果を、インターフェース、特に、情報を提示しうるグラフィカルユーザインタフェースに指向しうるデータ接続であって、前記インターフェースは、システムの一部又はリモートインタフェースのいずれかである、データ接続；を含む。
【００７８】
上記のように、タンパク質検出手段は公知であり、当業者は容易に利用しうる。通常、被験体の口腔試料を受け入れ、検出手段を備える、１又はそれ以上の容器が提供される。オプションのインターフェース（又はリモートインタフェースへのデータ接続）は、特に、情報を提示しうるグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）であり、ＧＵＩは、テキストベースのユーザインタフェース、タイプ化コマンドラベル、又はテキストナビゲーションの代わりに、グラフィカルアイコン、及び二次的表記等の視覚的インジケータを介して、ユーザが電子機器に作用しうる、ユーザインタフェース系であり；ＧＵＩは、一般に公知の、典型的には、ＭＰ３プレーヤー、ポータブル・メディア・プレーヤー、ゲーム用装置、スマートフォン、及び小型の家庭用、職場用、産業用制御装置等のハンドヘルドモバイル装置で用いられ；上記のように、インターフェースは、場合によっては、例えば、被験体の年齢、性、ＢＭＩ（ボディ・マス・インデックス）等の情報を入力しうるように選択することができる。
【００７９】
プロセッサは、被験体の口腔試料中のバイオマーカーのセットの検出濃度から、被験体が属するクラスタの表示を含む診断結果を決定でき、また、第２段階では、被験体が軽度歯周炎又は進行性歯周炎に分類されるかを決定でき、またできるように適合される。
【００８０】
本発明はまた、唾液中の歯周炎用バイオマーカーの濃度を決定するキットを、単独で、又は前記システムの一部として提供する。前記キットは各々異なるバイオマーカーを指向し、かつ、各々、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＩＬ１−β、ＩＬ６、コラーゲンテロペプチド、及びＴＩＭＰ１に結合することができる、７つの検出試薬、及び前記ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９を含む第１セット、ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含む第２セット、並びにＴＩＭＰ１及びＨＧＦを含む第３セットである、３つの異なる前記バイオマーカーのセットを備え、前記濃度を別個に処理する。本発明の方法については上記のように、キットは、３つの別個のバイオマーカーのセットの別個のセットの検出試薬を備えても、又は１のセットが関与する全てのバイオマーカーを備える検出試薬を備えてもよい。後者の場合、処理ユニットは、関連するバイオマーカーのセットを反映するように濃度測定結果を処理するように構成される。
【００８１】
好ましくは、前記キットは、チップ、マイクロタイタープレート、又は前記検出試薬を備えるビーズ若しくは樹脂等の固体支持体を備える。いくつかの態様では、キットは、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）等の質量分析プローブを備える。
【００８２】
当該キットはまた、非結合検出試薬又は前記バイオマーカー（サンドイッチ型アッセイ）に特異的な洗浄液及び／又は検出試薬を提供することができる。
【００８３】
本発明はまた、ヒト患者由来の口腔液試料中のタンパク質の濃度に基づいて、歯周炎が疑われる前記ヒト患者の軽度歯周炎又は進行性歯周炎の診断する方法であって、以下の：
−  前記ヒト患者の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を測定する工程；
−  測定結果を、（ｉ）歯周炎であることが知られている患者群の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を決定し；（ｉｉ）前記患者から得られた結果からクラスタ化技術を用いて、２つの第１特定クラスタ及び第２非特定クラスタを得ることにより、得られたクラスタセンタと比較して、前記被験体の測定結果が前記第１クラスタ又は第２クラスタのどちらに適合するかを判定する工程；
−前記被験体が第１クラスタに適合する場合は、さらに、前記被験体の口腔液試料のＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含むタンパク質の濃度を測定して、前記タンパク質について測定された共同濃度を反映する試験値を得る工程；
−  前記被験体が第２クラスタに適合する場合は、前記被験体の口腔液試料の、場合によっては、さらに、ＴＩＭＰ１の濃度を測定して、前記ＴＩＭＰ１及びそれ以前に測定されたＨＧＦの共同濃度を反映する試験値を得る工程；及び
−  得られた試験値と、進行性歯周炎に関連する共同濃度を同様の方法で反映する閾値と比較して、その結果が前記被験体の軽度歯周炎又は進行性歯周炎を表示するかを評価する工程；を含む。
【００８４】
場合によっては、本態様の方法はさらに、患者の歯周炎を治療する工程を含む。当該治療工程は、公知の治療薬の投与、若しくは歯科処置、又は治療薬投与及び歯科処置の組合せを含むことができる。公知の治療薬としては、抗菌剤含有剤、例えば、洗口剤、チップ、ゲル又はミクロスフェアの投与があげられる。歯周炎治療に用いられる典型的な抗菌薬はクロルヘキシジンである。他の治療薬としては、抗生物質、典型的には経口投与される抗生物質、及びドキシサイクリン等の酵素抑制剤があげられる。公知の非外科的治療処置としては、スケーリング及びルートプレーニング（ＳＲＰ）があげられる。公知の外科的処置としては、外科的ポケット整復、フラップ手術、歯肉移植又は骨移植があげられる。
【００８５】
本発明はさらにタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９を検出し、（ｉ）タンパク質ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチド、又は（ｉｉ）タンパク質ＴＩＭＰ１を、別個に検出する方法であって、以下の：
（ａ）ヒト患者から口腔液試料を得る工程；及び
（ｂ）前記タンパク質を結合する検出試薬と試料を接触させて、各タンパク質と検出試薬との結合を検出して、前記タンパク質が試料中に存在するか否かを検出する工程；を含む
以下の非限定的な実施例を参照して、本発明をさらに例示する。
【実施例】
【００８６】
被験体５８例を用いた臨床試験では、軽度歯周炎と診断された患者は３１名、進行性歯周炎と診断された患者は２７名であった。Ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングによる、ＨＧＦ、ＭＭＰ８及びＭＭＰ９を用いた全被験体のクラスタ化を行った。ｋは２から１０まで変化させたことに注意されたい。各ｋについて、全５８被験体のシルエット値の平均値を算出した。
【００８７】
シルエット係数は凝集と分離（https://cs.fit.edu/~pkc/classes/ml-internet/silhouette.pdf参照）を組み合わせたものである。以下の３工程からなる工程にて、各点のシルエット係数の計算方法を説明する。
１．  ｉ番目の対象について、そのクラスタ内の他の全ての対象との平均距離を計算する。この値をａｉという。
２．  ｉ番目の対象と、その対象を含まないクラスタについて、そのクラスタ内の全ての対象に対する当該対象の平均距離を計算し、全てのクラスタについて、最小値を求める。この値をｂｉとする。
３．  ｉ番目の対象のシルエット係数はｓｉ＝（ｂｉ−ａｉ）／ｍａｘ（ａｉ，ｂｉ）である。
【００８８】
シルエット係数の値は−１と１の間で変化することができる。負の値は好ましくないが、それは、クラスタ内の点までの平均距離であるａｉが、他のクラスタ内の点までの最小平均距離であるｂｉよりも大きい場合に対応するからである。シルエット係数を正（ａｉ＜ｂｉ）にし、ａｉ＝０のときの最大値を１と仮定するため、可能な限り０に近づけることが望ましい。
【００８９】
クラスタの平均シルエット係数は、単にクラスタに属する点のシルエット係数の平均を取って計算すればよい。全ての点の平均シルエット係数を計算すれば、クラスタ化の利点の全体的な尺度が得られる。
【００９０】
図２は、ｋ値を２から１０まで変化させたときのシルエット値の平均を示す。この図から、ｋ＝９のときにシルエット値が最大値に達したことが明らかである。ｋ＝９のシルエットプロットを図３に示す。
【００９１】
シルエットプロットは、クラスタ１の平均が１に極めて近いため、クラスタ１がきわめて良好に特定されることを示す。クラスタ１を特定するには、以下の２つの条件を満たす必要がある：
−  選択したクラスタの平均シルエット値は最高であること
−  選択したクラスタには、全データ点の少なくとも４０％が含まれること（この具体例では、患者５８例中４２例（７２％）がクラスタ１に分類される）。
【００９２】
しかし、その他の点は、明確で異なるクラスタを形成しない。したがって、クラスタ１に該当しない点はすべてクラスタ２に配置される。クラスタ２は、非特定クラスタという。
【００９３】
ひとたびクラスタが特定されると、次の工程は、適当なバイオマーカーのリストを用いて患者がどのクラスタに属するかを同定し、次に分類を実施して、患者の軽度又は進行性歯周炎への罹患を評価する。これらの手順の詳細は以下のとおりである：
フェーズ１：ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９（又はこれらの組み合わせ）の濃度を測定する。得られた測定値を用いて、患者がクラスタＣ１又はクラスタＣ２に属するかどうかを決定する。
【００９４】
フェーズ２：フェーズ１の患者がクラスタＣ１かクラスタＣ２かに応じて、特定のタンパク質の濃度を測定する。
【００９５】
患者がクラスタＣ１に属する場合、軽度／進行性歯周炎の分類に用いうる上位３つのタンパク質バイオマーカーは、ＩＬ１−β、ＩＬ６、コラーゲンテロペプチドである。
【００９６】
以下の表は、上記上位３つのタンパク質バイオマーカーの異なる組み合わせを用いたクラスタ１（４２例の患者を被験体とした臨床試験に基づく）の精度結果を示す：
【００９７】
【表１】
2021501326.tif 000007
したがって、患者がクラスタ１に属する場合、ＩＬ１−β、ＩＬ６、コラーゲンテロペプチドは、患者が軽度歯周炎又は進行性歯周炎であることを８８．１％の精度で同定できるバイオマーカーである。同様に、ＩＬ６及びコラーゲンテロペプチドのみを用いる場合の精度は７８．６％である。
【００９８】
患者がクラスタＣ２に属する場合、軽度／進行性歯周炎の分類に用いられうる上位３つのタンパク質バイオマーカーは、ＴＩＭＰ１とＨＧＦである。
【００９９】
以下の表は、上記上位３つのタンパク質バイオマーカーの異なる組み合わせを用いたクラスタ２（１６名の患者を被験体とした臨床試験に基づく）の精度結果を示す：
【０１００】
【表２】
2021501326.tif 000008
ＩＬ６＿ｄは、患者の治療前後で得られたＩＬ６読取値の差を示すことに留意されたい。決定されるべきバイオマーカーとしてＴＩＭＰ１及びＨＧＦを選択すると、２つの測定値間の差の（より複雑な）決定を考慮する必要性がなくなることが分かる。
【０１０１】
本発明は、図面及び明細書に図示及び記載があるが、当該図示及び記載は、例示的又は説明的であり、限定されるものではなく、本発明は、開示された実施形態に限定されない。
【０１０２】
例えば、異なるバイオマーカー用検出試薬を異なるユニットで提示しうる。あるいは、好都合には、本発明のキットは、第１段階で用いられる、ＨＧＦ、ＭＭＰ−８、及びＭＭＰ−９タンパク質バイオマーカー用検出試薬の固定セット、及び第２段階で用いられる２つのセットのいずれか又は両方用の検出試薬を含む可撓性（別個の）モジュールを備えることができる。さらなる別の態様では、単一の別個のモジュールを、第２段階バイオマーカーの４つの全てについて用いうる。
【０１０３】
開示された実施形態に対する他の変形例は、当業者であれば、図面、開示、及び添付の請求の範囲を検討して、クレームされた発明を理解し、実施することができる。クレームの用語「備える・含む」は、他の要素又はステップを排除するものではなく、単数名詞は、複数が含まれないことではない。本発明の特定の特徴が、単に相互に異なる従属クレームに記載されているという事実は、当該特徴の組み合わせを有利には用いられないことを示すものではない。クレームの引用符号は、その範囲を限定するものと解釈してはならない。
【０１０４】
要すれば、歯周炎に罹患したヒト被験体の軽度歯周炎又は進行性歯周炎を評価するシステム及び体外方法が開示される。当該システム及び方法は、クラスタ化技術を患者データの参照セットに適用し、適用されるバイオマーカーのセットをさらに識別する洞察に基づく。クラスタは、バイオマーカーである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）に基づいて決定する。被験体の実際の分類は、２つのバイオマーカーのセットのいずれかの濃度測定に基づいて行われる。１のクラスタには、インターロイキン−１β（ＩＬ１β）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、コラーゲンテロペプチドがある。もう一つのクラスタには、ＨＧＦ及びメタロペプチダーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）がある。
【図１】
2021501326.tif 000009
【図２】
2021501326.tif 000010
【図３】
2021501326.tif 000011
【図４】
2021501326.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月12日(2020.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験体を軽度歯周炎又は進行性歯周炎に分類するシステムであって、以下の：
−被験体の口腔液試料の、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、インターロイキン−１β（ＩＬ１β）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、コラーゲンテロペプチド、及び場合によりメタロペプチダーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）、のバイオマーカーの濃度を測定する検出手段；
−前記被験体の口腔液試料中のバイオマーカーの測定濃度から分類結果を決定する、１又はそれ以上の処理ユニット；を含み、
ここで、前記システムは、第１段階で、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９を含むバイオマーカーのセットの濃度を測定して、第１段階濃度の測定結果を獲得し、前記処理ユニットは、前記第１段階濃度を処理して、第２段階でＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含むバイオマーカーのセットの濃度を測定するか否かの結果を提示し、それにより前記処理ユニットが、場合によっては、前記第１段階濃度を処理して、前記第２段階でＴＩＭＰ１の濃度を測定するように代替的に表示し、
前記システムは、第２段階濃度の測定結果を獲得して、それにより、処理ユニットが第２段階濃度を処理して、軽度又は進行性歯周炎の分類結果を提示する、
システム。
【請求項２】
ヒト被験体が歯周炎であることが疑われる、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
試料中のバイオマーカーの濃度を測定する検出手段を備えた、被験体の口腔液の前記試料を受け取る、１又はそれ以上の容器を備える、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
さらに、以下の：
システムの一部又はリモートインタフェースのいずれかである、前記表示をユーザに提示するユーザインタフェース；及び、
プロセッサからユーザインタフェースへ表示を転送する、１又はそれ以上の処理ユニットとユーザインタフェースとの間のデータ接続
を備える、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
口腔液試料を受け取り、全てのバイオマーカーの濃度を測定する検出手段を備える、単一の容器を備える、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
口腔液試料を受け取り、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を測定する検出手段を備える第１容器と、ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドの濃度を測定する第２容器と、ＨＧＦ及びＴＩＭＰ−１の濃度を測定する第３容器とを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
前記第２容器及び前記第３容器は、異なるモジュールとして提示され、いずれの容器もシステムに挿入されうる、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
プロセッサは、インターネットベースのアプリケーションにより機能しうる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９】
ヒト被験体が軽度歯周炎又は進行性歯周炎であるかを評価する体外方法であって、以下の：
−被験体由来の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度の測定する工程；
−測定結果を、（ｉ）歯周炎であることが知られている患者群の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を決定すること；（ｉｉ）前記患者から得られた結果からクラスタ化技術を用いて、２つの第１特定クラスタ及び第２非特定クラスタを獲得すること、より得られたクラスタセンタと比較して、前記被験体の測定結果が前記第１クラスタ又は第２クラスタのどちらに適合するかを判定する工程；
−前記被験体が第１クラスタに適合する場合は、さらに、前記被験体の口腔液試料のＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含むタンパク質の濃度を測定して、前記タンパク質について測定された共同濃度を反映する試験値を得る工程；
−前記被験体が第２クラスタに適合する場合は、前記被験体の口腔液試料の、場合によっては、さらに、ＴＩＭＰ１の濃度を測定して、前記ＴＩＭＰ１及び以前に測定されたＨＧＦの共同濃度を反映する試験値を得る工程；及び
−前記試験値を、進行性歯周炎に関連する共同濃度を同様の方法で反映する閾値と比較して、その結果が前記被験体の軽度歯周炎又は進行性歯周炎を表示するかを評価する工程；
を、含む、方法。
【請求項１０】
ヒト被験体が歯周炎であることが疑われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
閾値が、進行性歯周炎の存在に関連する参照試料のタンパク質について決定された濃度に基づく、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
唾液中の歯周炎用バイオマーカーの濃度を決定するキットであって、各々異なるバイオマーカーを指向し、かつ、各々、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＩＬ１−β、ＩＬ６、コラーゲンテロペプチド、及びＴＩＭＰ１に結合することができる、７つの検出試薬を含み、前記キットは、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９を含む第１セット、ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含む第２セット、並びにＴＩＭＰ１及びＨＧＦを含む第３セットである、３つの異なる前記バイオマーカーのセットの前記濃度を別個に処理し、前記検出試薬が、チップ、マイクロタイタープレート、ビーズ又は樹脂などの固体支持体上に収容される、キット。
【請求項１３】
ヒト患者由来の口腔液試料中のタンパク質の濃度に基づいて、歯周炎が疑われる前記ヒト患者の軽度歯周炎又は進行性歯周炎の診断する方法であって、以下の：
−前記ヒト患者の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を測定する工程；
−測定結果を、（ｉ）歯周炎であることが知られている患者群の口腔液試料中のタンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９の濃度を決定し；（ｉｉ）前記患者から得られた結果からクラスタ化技術を用いて、２つの第１特定クラスタ及び第２非特定クラスタを獲得することにより、得られたクラスタセンタと比較して、前記被験体の測定結果が前記第１クラスタ又は第２クラスタのどちらに適合するかを判定する工程；
−前記被験体が第１クラスタに適合する場合は、さらに、前記被験体の口腔液試料のＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドを含むタンパク質の濃度を測定して、前記タンパク質について測定された共同濃度を反映する試験値を得る工程；
−前記被験体が第２クラスタに適合する場合は、前記被験体の口腔液試料の、場合によっては、さらに、ＴＩＭＰ１の濃度を測定して、前記ＴＩＭＰ１及びそれ以前に測定されたＨＧＦの共同濃度を反映する試験値を得る工程；及び
−得られた試験値と、進行性歯周炎に関連する共同濃度を同様の方法で反映する閾値と比較して、その結果が前記被験体の軽度歯周炎又は進行性歯周炎を表示するかを評価する工程；
を含む、方法。
【請求項１４】
タンパク質ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９を検出し、（ｉ）タンパク質ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチド、又は（ｉｉ）タンパク質ＴＩＭＰ１を、別個に検出する方法であって、以下の：
（ａ）ヒト患者から口腔液試料を得る工程；及び
（ｂ）前記タンパク質を結合する検出試薬と試料を接触させて、各タンパク質と検出試薬との結合を検出して、前記タンパク質が試料中に存在するか否かを検出する工程；
を含む、方法。
【請求項１５】
患者の軽度歯周炎又は進行性歯周炎の評価のバイオマーカーとしての、口腔液試料、又はヒト患者の試料における、ＨＧＦ、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ９タンパク質、並びに（ｉ）ＩＬ１−β、ＩＬ６、及びコラーゲンテロペプチドタンパク質、又は（ｉｉ）タンパク質ＴＩＭＰ１の、使用。
【国際調査報告】
2021501326.tif 000013
2021501326.tif 000014
2021501326.tif 000015
2021501326.tif 000016