(57)【要約】  複数の捕獲位置を含む基板を使用して、２つの異なるサイズの液滴を収集し融合させるための製造システム、方法及び物品を、本明細書で提供する。特定の実施形態では、複数の大きな前記液滴及び小さな前記液滴、ならびに前記複数の捕獲位置を含む前記基板からなる前記システムを、本明細書で提供し、そこで各前記捕獲位置は、前記大きな液滴のうちの１つだけ、及び前記大きい液滴が前記捕獲位置にすでに存在するときに、前記小さな液滴のうちの１つだけを捕獲するように構成される。具体的な実施形態にて、前記大きい及び／または前記小さい液滴は、それらが望ましい成分（例えば、細胞またはバーコード化ビーズ）を含むのを確実にするために、前記基板と接触する前に選別される。他の実施形態にて、各前記捕獲位置は、流体連通する１つ以上の捕捉ウェルからなる。いくつかの実施形態で、収集した前記大きい及び前記小さい液滴は、融合される（例えば、抗乳化剤または電気を介して）。
2021509024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システムであって、前記システムが、
ａ）      複数の第１液滴及び複数の第２液滴であって、前記第２液滴が前記第１液滴より小さい、前記複数の第１液滴及び前記複数の第２液滴と、
ｂ）複数の捕獲位置を含む基板と、を含み、
前記捕獲位置のそれぞれが、前記第１液滴のうちの１つだけを捕獲するように構成されており、
前記捕獲位置のそれぞれが、前記第１液滴が前記捕獲位置に存在するときに、前記第２液滴のうちの１つだけを捕獲するように更に構成される、前記システム。
【請求項２】
前記複数の第１液滴及び／または前記複数の第２液滴がそれぞれ、１つだけの細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記複数の第１液滴及び／または前記複数の第２液滴のそれぞれが、核酸バーコードの１つだけのビーズ及び／または種類を含有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記複数の第１液滴がそれぞれ１つだけのビーズを含有し、前記複数の第２液滴がそれぞれ１つだけの細胞を含有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記複数の第１液滴及び／または前記複数の第２液滴がそれぞれ、油中水滴を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
ｃ）フローセルを更に含み、前記基板が前記フローセルに位置する、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記複数の捕獲位置のそれぞれが、ｉ）１つだけの第１液滴及びｉｉ）１つだけの第２液滴を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
複数の第３液滴を更に含み、前記第３液滴が前記第２液滴より小さく、前記捕獲位置のそれぞれが、前記第１液滴及び前記第２液滴の両方が前記捕獲位置に存在するときに、前記第３液滴のうちの１つだけを捕獲するように更に構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記複数の捕獲位置のそれぞれが、１つだけの捕捉ウェルを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記複数の捕獲位置が複数の捕捉ウェルを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記複数の捕獲位置のそれぞれが、第１捕捉ウェル及び第２捕捉ウェルを含み、前記第２捕捉ウェルの直径が前記第１捕捉ウェルより小さく、前記第１及び前記第２捕捉ウェルが流体連通している、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記第１捕捉ウェルが前記第２捕捉ウェルより深い、または前記第１捕捉ウェルが前記第２捕捉ウェルと同じ深さを有する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記第１捕捉ウェルが１０μｍと３００μｍの間の直径を有する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第１捕捉ウェルが２５と２５０μｍの間の深さを有する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記第２捕捉ウェルが２５μｍと１２０μｍの間の直径及び／または深さを有する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記複数の第１液滴が４５と２００μｍの間の直径を有する、または前記複数の第２液滴が２５と１２０μｍの間の直径を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記第１捕捉ウェルが３０ピコリットルと２ナノリットルの間の液体容量を有し、及び／または前記第２捕捉ウェルが１０ピコリットルと１ナノリットルの間の液体容量を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
前記複数の捕獲位置が、少なくとも５０の捕獲位置を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
ｃ）以下
ｉ）ｍＲＮＡ配列が細胞から放出されるのを可能にする溶解試薬、
ｉｉ）Ａ）ポリＴ領域またはＲＮＡ特異的領域及びＢ）最初の５’尾部領域を含む、ＲＮＡ結合オリゴヌクレオチド、
ｉｉｉ）固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含むオリゴヌクレオチドのプール、
ｉｖ）逆転写酵素試薬、
ｖ）      バーコード配列を含む、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド、及び
ｖｉ）逆方向プライマー、のうちの少なくとも１つを備える、容器を更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
ｃ）液滴作製及び／または選別装置を更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
抗乳化剤を含む容器を更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記基板が１つ以上のフローチャネルを更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記基板が、電気パルスを前記複数の捕獲位置のうちの少なくともいくつかに分配するように構成される、少なくとも１つの埋め込みワイヤを更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記捕獲位置のそれぞれが、キャリア流体中の前記第１及び前記第２液滴の浮力に基づいて、前記第１液滴のうちの１つ及び前記第２液滴の１つを捕獲するように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２６】
方法であって、前記方法が、
ａ）      第１液滴のうちの１つだけを捕獲位置のそれぞれに捕捉するように、複数の前記捕獲位置を含む基板を含有するフローセル中に、複数の前記第１液滴を分配することと、
ｂ）      第２液滴のうちの１つだけを前記第１液滴のうちの１つを含有する前記捕獲位置のそれぞれに捕捉するように、前記フローセル中に複数の前記第２液滴を分配することと、を含み、前記第２液滴が前記第１液滴より小さい、前記方法。
【請求項２７】
任意の過剰な前記第１液滴が、工程ａ）の後で工程ｂ）の前に、流体によって前記基板から流し出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
任意の過剰な前記第２液滴が、工程ｂ）の後に、流体によって前記基板から流し出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ｃ）前記捕獲位置のそれぞれの前記第１及び前記第２液滴が１つの融合した液滴になるように前記基板を処理して、それにより複数の融合した液滴を作製することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記処理することが、前記フローセルの中に抗乳化剤を分配することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記処理することが、前記基板に電気を提供することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記基板が埋め込みワイヤを含み、前記基板に電気を前記提供することが、前記埋め込みワイヤにより電流を送ることを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｄ）界面活性剤が前記融合した液滴を安定させるように、前記フローセルの中に前記界面活性剤を含む液体を分配することを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
ｄ）前記フローセルから前記融合した液滴を容器の中に収集することを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記収集することが、前記複数の融合した液滴を前記複数の捕獲位置から浮かせて、前記フローセルから前記容器内に流れ出されるように、前記基板を反転させることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数の第１液滴及び／または前記複数の第２液滴がそれぞれ、１つだけの細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数の第１液滴及び／または前記複数の第２液滴のそれぞれが、核酸バーコードの１つだけのビーズ及び／または種類を含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
前記複数の第１液滴がそれぞれ１つだけのビーズを含有し、前記複数の第２液滴がそれぞれ１つだけの細胞を含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記複数の第１液滴及び／または前記複数の第２液滴がそれぞれ、油中水滴を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
ｄ）前記捕獲位置の中へ増幅試薬を分配することを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
ｅ）配列決定テンプレートの配列決定ライブラリが増幅反応を介して作製されるような条件の下で、前記捕獲位置で前記融合した液滴を処理することを更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記配列決定テンプレートのそれぞれが、ｉ）第１及び第２のバーコード配列またはその補体と、ｉｉ）ｍＲＮＡ配列からのコード領域の核酸配列またはその補体と、を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ｆ）前記配列決定ライブラリの少なくとも一部を配列決定することを更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
基板を含む製造物品であって、前記基板が複数の捕獲位置を含み、
前記捕獲位置のそれぞれが、第１の大きさの液滴のうちの１つだけを捕獲するように構成され、
前記捕獲位置のそれぞれが、前記第１の大きさの液滴が前記捕獲位置に存在するときに、第２の大きさの液滴のうちの１つだけを捕獲するように更に構成され、
前記第２の大きさの液滴が前記第１の大きさの液滴より小さい、前記製造物品。
【請求項４５】
前記基板がシリコンまたはプラスチックを含む、請求項４４に記載の物品。
【請求項４６】
前記基板がマイクロウェルチップを含む、請求項４４に記載の物品。
【請求項４７】
前記複数の捕獲位置が、少なくとも１００の捕獲位置を含む、請求項４４に記載の物品。
【請求項４８】
前記複数の捕獲位置のそれぞれが、第１捕捉ウェル及び第２捕捉ウェルを含み、前記第２捕捉ウェルの直径が前記第１捕捉ウェルより小さく、前記第１及び前記第２捕捉ウェルが流体連通している、請求項４４に記載の物品。
【請求項４９】
前記第１捕捉ウェルが前記第２捕捉ウェルより深い、請求項４８に記載の物品。
【請求項５０】
前記第１捕捉ウェルが前記第２捕捉ウェルと同じ深さを有する、請求項４８に記載の物品。
【請求項５１】
前記第１捕捉ウェルが３０ピコリットルと２ナノリットルの間の液体容量を有し、及び／または前記第２捕捉ウェルが１０ピコリットルと１ナノリットルの間の液体容量を有する、請求項４８に記載の物品。
【請求項５２】
前記第１の大きさの液滴が４５μｍと２００μｍの間の直径を有する、請求項４８に記載の物品。
【請求項５３】
前記第２の大きさの液滴が２５μｍと１２０μｍの間の直径を有する、請求項４８に記載の物品。
【請求項５４】
前記第１捕捉ウェルが２５μｍと２００μｍの間の直径を有する、請求項４８に記載の物品。
【請求項５５】
前記第１捕捉ウェルが３０μｍと１５０μｍの間の深さを有する、請求項４８に記載の物品。
【請求項５６】
前記第２捕捉ウェルが２５μｍと２００μｍの間の直径及び／または深さを有する、請求項４８に記載の物品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本出願は、２０１８年１月２日出願の米国仮特許出願第６２／６１２，７５５号に対する優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
米国連邦政府の支援に関する記述
本発明は、米国科学財団によって授与された助成金番号ＣＢＥＴ−１２６３８８９に基づく、政府支援を受けて行われた。米国政府は、本発明に一定の権利を有している。
【０００３】
複数の捕獲位置を含む基板を使用して、２つの異なるサイズの液滴を収集し融合させるための製造システム、方法及び物品を、本明細書で提供する。特定の実施形態では、複数の大きな液滴及び小さな液滴、ならびに複数の捕獲位置を含む基板からなるシステムを、本明細書で提供し、そこで各捕獲位置は、大きな液滴のうちの１つだけ、及び大きい液滴が捕獲位置にすでに存在するときに、小さな液滴のうちの１つだけを捕獲するように構成される。具体的な実施形態にて、大きい及び／または小さい液滴は、それらが望ましい成分（例えば、細胞またはバーコード化ビーズ）を含むのを確実にするために、基板と接触する前に選別される。他の実施形態にて、各捕獲位置は、流体連通する１つ以上の捕捉ウェルからなる。いくつかの実施形態で、収集した大きい及び小さい液滴は、融合される（例えば、抗乳化剤または電気を介して）。
【０００４】
〔背景技術〕
液滴ベースのマイクロ流体は、１細胞分解能にて種々の生物学的アッセイ（例えば、抗体スクリーニング（１、２）、酵素スクリーニング（３）、薬物スクリーニング（４）、ゲノミクス（５）、トランスクリプトミクス（６）、細胞間相互作用アッセイ（７〜８））で広く用いられている。液滴ベースのアッセイは、非混和性の二相流中の１細胞を区分して、ハイスループット解析を可能にする一方で、少量の液滴中の各細胞の特徴を保持する。細胞を液滴に封入する工程は、液滴中の細胞数（κ）が、
【０００５】
【数１】
2021509024.tif 000003
に示す、いわゆるポアソン分布（９）という不連続の確率分布に従う、確率処理であり、式中、λは液滴当たりの平均細胞数である。ここで、λは
【０００６】
【数２】
2021509024.tif 000004
と定義され、ｃは細胞懸濁液の濃度であり、Ｖｄｒｏｐは各液滴の量である。各液滴に１細胞より多く（κ＞１）封入することによって生じる誤差を回避するために、Ｐ（κ＞１、ポアソン）≪１になるように、低濃度（λ≪１）で細胞を流さなければならない。その結果、大部分の液滴は空になって、それはスクリーニングスループットを低減させ、試薬のコストを増加させる。アッセイが一般的な液滴の一対の２つの粒子の共封入を必要とするとき、この問題は更に顕著になる。
【０００７】
細胞粒子または細胞の対の共封入は、１細胞分泌分析（１）、１細胞ｍＲＮＡ配列決定（Ｄｒｏｐ−ｓｅｑ）（６）及び細胞間コミュニケーション研究（１０）の重要な工程である。ほとんどの場合、アッセイ工程は、明白な１細胞の研究結果を得るために、細胞及び粒子、または２つの細胞の１対１の組み合わせを厳密に必要とする。共流方式によって２つの異なる粒子を対にする従来の方法は、２つの稀事象での低確率ポアソン統計を増加させることからもたらされる、低い対形成化効率が欠点である（図１ａ）。結果が大部分、同じ種類の粒子の１つの粒子または粒子の対を有するものを含む、陰性液滴である場合、それによって、試料が失われて、下流の解析に誤差が生じる。このような陰性液滴の存在も、能動的選別を使用して、一対の２つの所望の粒子で陽性液滴を富化するという可能性を基本的に排除する（１１、１２）。
【０００８】
ポアソン統計の制限を解決するために、いくつかの研究が代わりの封入方法を検討した。例えば、Ｅｄｄら（１３）は、流体力学効果によって自己配列した細胞列を作製して、同じ頻度で、液滴生成処理によって流れ集中ゾーンで液滴を細胞内に注入する工程を同時発生させた。この方法から、液滴中の１細胞の高占有率が得られた。その後、Ｌａｇｕｓら（１４）は、上述のものに類似する同期化機構に基づく、２つの異なる細胞型を共流させることによる細胞の対の共封入を証明した。あるいは、Ａｂａｔｅら（１５）は、チャネルにぎっしり詰まって、整然と封入を達成して、効率及び精度の組み合わせを増加させ得る、機械的に変形可能な粒子を使用した。この方法は、ｉｎＤｒｏｐ１細胞ｍＲＮＡ配列決定の細胞ビーズ対の共封入に更に適用された（１６）。しかし、これらの方法のすべては、実用的な用途での厳しい規制を満たすことを必要とする。例えば、自己配列した細胞列を形成することは、細胞のサイズの均一性及び高密度を必要とする。最密充填した粒子は、軟性材料（例えば、ヒドロゲル）からのみ作製され得る。これらの方法は、すべて受動的であり、したがって、最適な結果を得るために、このような特定の良好に制御された操作条件を必要とする。更に、水と油の流入の間のバランスを調節するために必要な膨大な時間のために、既存の方法によって最小化した試料損失と共に高い共封入収率を得ることはまだ困難である。求められているのは、所望の対象物の１対１の封入を可能にする、より頑強な方法である。
【０００９】
〔発明の概要〕
複数の捕獲位置を含む基板を使用して、２つの異なるサイズの液滴を収集し融合させるための製造システム、方法及び物品を、本明細書で提供する。特定の実施形態では、複数の大きな液滴及び小さな液滴、ならびに複数の捕獲位置を含む基板からなるシステムを、本明細書で提供し、そこで各捕獲位置は、大きな液滴のうちの１つだけ、及び大きい液滴が捕獲位置にすでに存在するときに、小さな液滴のうちの１つだけを捕獲するように構成される。具体的な実施形態にて、大きい及び／または小さい液滴は、それらが望ましい成分（例えば、細胞またはバーコード化ビーズ）を含むのを確実にするために、基板と接触する前に選別される。他の実施形態にて、各捕獲位置は、流体連通する１つ以上の捕捉ウェルからなる。いくつかの実施形態で、収集した大きい及び小さい液滴は、融合される（例えば、抗乳化剤または電気を介して）。
【００１０】
いくつかの実施形態で、ａ）複数の第１液滴及び複数の第２液滴であって、第２液滴は第１液滴より小さい（例えば、１０％．．．２５％．．．５０％．．．１００％．．．または２５０％大きい）、複数の第１液滴及び複数の第２液滴と、ｂ）複数の捕獲位置（例えば、少なくとも２つ．．．１５つ．．．１５０つ．．．２０００つ．．．または５０００つ）を含む基板と、を含み、捕獲位置のそれぞれは、第１液滴のうちの１つだけを捕獲するように構成されており、捕獲位置のそれぞれは、第１液滴が捕獲位置に存在するとき、更に第２液滴のうちの１つだけを捕獲するように構成される、システムを提供する。いくつかの実施形態で、第２（小さい）液滴に対する第１（大きい）液滴の直径の比は、約１．６〜２：１（例えば、１に対して１．６．．．１．８．．．２．０）である。
【００１１】
特定の実施形態で、複数の第１液滴及び／または複数の第２液滴のそれぞれは、１つだけの細胞を含有する。具体的な実施形態で、複数の第１液滴及び／または複数の第２液滴のそれぞれは、核酸バーコードの１つだけのビーズ及び／または種類を含有する。更なる実施形態で、複数の第１液滴はそれぞれ１つだけのビーズを含有し、複数の第２液滴はそれぞれ１つだけの細胞を含有する。特定の実施形態で、複数の第１液滴及び／または複数の第２液滴はそれぞれ、油中水滴を含む。更なる実施形態で、システムはｃ）フローセルを更に含み、そこで基板はフローセルに位置する。
【００１２】
特定の実施形態で、複数の捕獲位置のそれぞれは、ｉ）１つだけの第１液滴及びｉｉ）１つだけの第２液滴を含む。他の実施形態にて、システムは、複数の第３液滴を更に含み、第３液滴は第２液滴より小さく、捕獲位置のそれぞれは、第１液滴及び第２液滴の両方が捕獲位置に存在するときに、第３液滴のうちの１つだけを捕獲するように更に構成される。
【００１３】
いくつかの実施形態で、複数の捕獲位置のそれぞれは、１つだけの捕捉ウェルを含む。追加の実施形態で、複数の捕獲位置は、複数の捕捉ウェルを含む。他の実施形態にて、複数の捕獲位置のそれぞれは、第１捕捉ウェル及び第２捕捉ウェルを含み、第２捕捉ウェルの直径は、第１捕捉ウェルより小さく、第１及び第２捕捉ウェルは流体連通している。いくつかの実施形態で、第１捕捉ウェルは、１０μｍと３００μｍの間（例えば、１０．．．５０．．．１５０．．．３００μｍ）の直径を有する。具体的な実施形態にて、第１捕捉ウェルは、２５〜２００μｍの直径を有する。特定の実施形態で、第１捕捉ウェルは、５と２５０μｍの間（例えば、５．．．５０．．．１２５．．．２２５．．．及び２５０μｍ）の深さを有する。特定の実施形態で、第１捕捉ウェルは、２５〜２００μｍの深さ及び３０〜１５０μｍの深さを有する。いくつかの実施形態で、第２捕捉ウェルは、５μｍと２８０μｍの間（例えば、５．．．２５．．．７５．．．１５０．．．２００．．．２２５．．．及び２８０μｍ）の直径及び／または深さを有する。いくつかの実施形態で、第２捕捉ウェルは、２５〜１２０μｍまたは２５〜２００μｍの直径及び／または深さを有する。具体的な実施形態にて、第１捕捉ウェルは、第２捕捉ウェルより深い。他の実施形態にて、第１捕捉ウェルは第２捕捉ウェルと同じ深さである。追加の実施形態で、複数の第１液滴は、２０と２２０μｍの間（例えば、２０．．．２５．．．５０．．．７５．．．１２５．．．１５５．．．１８５…または２２０）の直径を有する、または前記複数の第２液滴は、２０と２２０μｍの間（例えば、２０．．．２５．．．５０．．．７５．．．１２５．．．及び２２０）の直径を有する。特定の実施形態で、複数の第１液滴は、４５〜２００μｍの直径を有する。他の実施形態にて、複数の第２液滴は、２５〜１２０μｍの直径を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態で、第１捕捉ウェルは、３０ピコリットルと１０ナノリットルの間（例えば、３０ｐＬ．．．２５０ｐＬ．．．７５０ｐＬ．．．１．０ｎＬ．．．及び１０ｎＬ）の液体容量を有し、及び／または第２捕捉ウェルは、１０ピコリットルと４ナノリットルの間（例えば、３０ｐＬ．．．２５０ｐＬ．．．７５０ｐＬ．．．１．０ｎＬ．．．及び４ｎＬ）液体容量を有する。更なる実施形態で、複数の捕獲位置は、少なくとも５０つの捕獲位置（例えば、少なくとも５０つ．．．９６つ．．．３８２つ．．．１０００つ．．．５０００つ．．．１０，０００つまたはそれ以上）を含む。
【００１５】
具体的な実施形態にて、システムは、ｃ）ｉ）ｍＲＮＡ及び／または他の生体分子が細胞から放出されるのを可能にする溶解試薬、ｉｉ）逆転写酵素試薬、ｉｉｉ）ポリ（Ｔ）領域及び／またはＲＮＡ特異的領域を含む、ＲＮＡ結合オリゴヌクレオチド、ｉｖ）それぞれが固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、オリゴヌクレオチドのプール、ｖ）バーコード配列を含む、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド、及びｖｉ）逆方向プライマー、のうちの少なくとも１つを備える、容器を更に含む。
【００１６】
特定の実施形態で、システムは、ｃ）液滴作製及び／または選別装置を更に含む。他の実施形態で、システムは、抗乳化剤を含む容器を更に含む。更なる実施形態で、基板は、１つ以上のフローチャンネルを更に含む。追加の実施形態で、基板は、電気パルスを複数の捕獲位置のうちの少なくともいくつかに分配するように構成される、少なくとも１つの埋め込みワイヤを更に含む。具体的な実施形態にて、捕獲位置のそれぞれは、キャリア流体中の第１及び第２液滴の浮力に基づいて、第１液滴のうちの１つ及び第２液滴の１つを捕獲するように構成される。更なる実施形態で、キャリア流体は油を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態で、ａ）第１液滴のうちの１つだけを捕獲位置のそれぞれに捕捉するように、複数の捕獲位置を含む基板を含有するフローセル中に、複数の第１液滴を分配することと、ｂ）第２液滴のうちの１つだけを捕獲位置のそれぞれに捕捉するように、フローセル中に複数の第２液滴を分配することであって、そこで第２液滴は第１液滴より小さい、複数の第２液滴を分配することと、の方法が、本明細書で提供される。
【００１８】
特定の実施形態で、任意の過剰な第１液滴は、工程ａ）の後で工程ｂ）の前に、流体によって基板から流し出される。特定の実施形態で、任意の過剰な第２液滴は、工程ｂ）の後に、流体によって基板から流し出される。特定の実施形態で、方法は、ｃ）捕獲位置のそれぞれの第１及び第２液滴が１つの融合した液滴になるように基板を処理して、それにより複数の融合した液滴を作製することを更に含む。特定の実施形態で、処理することは、フローセルに抗乳化剤を分配することを含む。特定の実施形態にて、処理することは、基板に電気を提供することを含む。更なる実施形態で、基板は埋め込みワイヤを含み、そこで基板に電気を提供することは、埋め込みワイヤにより電流を送ることを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態で、方法は、ｄ）界面活性剤が融合した液滴を安定させるように、フローセル中に界面活性剤を含む液体を分配することを更に含む。追加の実施形態で、方法は、ｄ）フローセルから融合した液滴を容器に収集することを更に含む。他の実施形態にて、収集することは、複数の融合した液滴を複数の捕獲位置から浮かせて、フローセルから容器内に流れ出されるように、基板を逆さにすることを含む。追加の実施形態で、複数の第１液滴及び／または複数の第２液滴のそれぞれは、１つだけの細胞を含有する。特定な実施形態で、複数の第１液滴及び／または複数の第２液滴のそれぞれは、核酸バーコードの１つだけのビーズ及び／または種類を含有する。更なる実施形態で、複数の第１液滴はそれぞれ１つだけのビーズを含有し、複数の第２液滴はそれぞれ１つだけの細胞を含有する。
【００２０】
いくつかの実施形態で、複数の第１液滴及び／または複数の第２液滴はそれぞれ、油中水滴を含む。特定の実施形態で、方法は、ｄ）捕獲位置中へ増幅試薬を分配することを更に含む。他の実施形態にて、方法は、ｅ）配列決定テンプレートの配列決定ライブラリが増幅反応を介して作製されるような条件の下で、捕獲位置で融合した液滴を処理することを更に含む。特定の実施形態にて、配列決定テンプレートのそれぞれは、ｉ）第１及び第２のバーコード配列またはその補体と、ｉｉ）ｍＲＮＡ配列からのコード領域の核酸配列またはその補体と、を含む。更なる実施形態で、方法は、ｆ）配列決定ライブラリの少なくとも一部を配列決定することを更に含む。
【００２１】
いくつかの実施形態で、基板を含む製造物品を本明細書で提供し、基板は複数の捕獲位置を含み、捕獲位置のそれぞれは、第１の大きさの液滴のうちの１つだけを捕獲する（例えば、液滴が基板上を（例えば、フローセル中を）流されるとき）ように構成され、捕獲位置のそれぞれは、第１の大きさの液滴が捕獲位置に存在するとき、第２の大きさの液滴のうちの１つだけを捕獲する（例えば、液滴が基板上を（例えば、フローセル中を）流されるとき）ように構成され、第２の大きさの液滴は第１の大きさの液滴より小さい。
【００２２】
特定の実施形態で、基板は、シリコンまたはプラスチックを含む。更なる実施形態にて、基板は、マイクロウェルチップ（例えば、５１８４のウェルを含むＷＡＦＥＲＧＥＮ  ＳＭＡＲＴＣＨＩＰ）を備える。更なる実施形態で、複数の捕獲位置は、少なくとも２５の捕獲位置（例えば、少なくとも２５．．．７５．．．３８６．．．６００．．．１０００．．．４０００．．．１０，０００またはそれ以上）を含む。他の実施形態にて、複数の捕獲位置のそれぞれは、第１捕捉ウェル及び第２捕捉ウェルを含み、第２捕捉ウェルの直径は、第１捕捉ウェルより小さく、第１及び第２捕捉ウェルは流体連通している。いくつかの実施形態で、第１捕捉ウェルは、１０μｍと３００μｍの間（例えば、１０．．．５０．．．１５０．．．３００μｍ）の直径を有する。特定の実施形態で、第１捕捉ウェルは、５と２５０μｍの間（例えば、５．．．５０．．．１２５．．．２２５．．．及び２５０μｍ）の深さを有する。いくつかの実施形態で、第２捕捉ウェルは、５μｍと２８０μｍの間（例えば、５．．．２５．．．７５．．．１５０．．．２００．．．２２５．．．及び２８０μｍ）の直径及び／または深さを有する。特定の実施形態にて、第１捕捉ウェルは、第２捕捉ウェルより深い。更なる実施形態にて、第１捕捉ウェルは、第２捕捉ウェルと同じ深さである。いくつかの実施形態で、第１捕捉ウェルは、３０ピコリットルと１０ナノリットルの間（例えば、３０ｐＬ．．．２５０ｐＬ．．．７５０ｐＬ．．．１．０ｎＬ．．．及び１０ｎＬ）の液体容量を有し、及び／または第２捕捉ウェルは、１０ピコリットルと４ナノリットルの間（例えば、３０ｐＬ．．．２５０ｐＬ．．．７５０ｐＬ．．．１．０ｎＬ．．．及び４ｎＬ）液体容量を有する。いくつかの実施形態で、第１の大きさの液滴は、２０μｍと２２０μｍの間（例えば、２０．．．５０．．．１００．．．１５０．．．２２０μｍ）の直径を有する。追加の実施形態で、第２の大きさの液滴は、２０μｍと２２０μｍの間（例えば、２０．．．８．．．２９．．．５５．．．１００．．．１５０．．．２２０μｍ）の直径を有する。特定の実施形態で、複数の第１液滴は、４５〜２００μｍの直径を有する。他の実施形態にて、複数の第２液滴は、２５〜１２０μｍの直径を有する。
【００２３】
特定の実施形態にて、捕獲位置は反応試料を含む。いくつかの実施形態で、反応試料は、細胞可溶化物、細胞、緩衝剤、水、ポリメラーゼ分子、核酸分子、バーコード化オリゴヌクレオチド、及び検出可能な標識分子からなる群から選択される、少なくとも１つの成分を含む。
【００２４】
特定の実施形態で、基板は熱伝導素子を含む。更なる実施形態にて、基板は、温度制御環境（例えば、サーモサイクラー、または加熱冷却プレートによって囲む）に置かれている。いくつかの実施形態で、基板は、１つ以上の液滴の融合事象の同じ及び／または異なるステージで異なる温度に設定される。
【００２５】
〔図面の簡単な説明〕
（図１）パネルａ〜ｄを示す。パネルａは、２つの異なる粒子の封入に関する、従来の共流方式を示す。２つの個々のポアソン事象のため、一対の２つの異なる粒子を含有する液滴の集団は、わずかな部分を構成する。図１のｂは、最初に１つの粒子を封入する液滴を選別して、続いて、それぞれが異なる粒子を含有する、２つの選別した液滴を対にして融合することを含む方法を示す。その結果、選別した液滴のほぼ１００％は、１つの粒子だけを含有する。そうして、融合した液滴は、正確に２つの異なる粒子を含むことがわかる。図１のｃは、液滴作製／選別装置のＣＡＤ配置を示す（上面図）。図１のパネルｄは、流れ集中ゾーンの寸法を示す。大きな（８０μｍ）液滴を作製するには、Ｂ＝Ｃ＝６０μｍ、Ａ＝Ｄ＝７０μｍ、チャネル高さ＝７０μｍである。小さな（４０μｍ）液滴については、Ａ＝Ｂ＝３０μｍ、Ｃ＝２５μｍ、Ｄ＝４０μｍ、チャネル高さ＝４５μｍである。
【００２６】
（図２）図２のａは、液滴作製／選別及び液滴融合装置からなる、マイクロ流体システムの一実施形態の代表的な概略図を示す。図２のｂは、代表的な液滴作製工程を示す。それぞれ１つの粒子を含有する、油中の水の液滴は、流れ集中構造で発生する。図２のｃは、代表的な液滴選別工程を示す。（ｂ）で作製する液滴は、光活性化選別によって、下流の液滴融合装置に接続する上流の排出チャネルに選別される。白い破線の円は、レーザー光線を照らして液滴光信号を収集する、埋め込み光ファイバに隣接する照合ゾーンの位置を示す。融合装置は、２つの異なるサイズの液滴が捕捉されて対にされる、１１５２つの捕獲位置からなる。図２のｄは、融合装置で、直径８０μｍのマイクロビーズを含有する液滴と対になった、直径４０μｍの１つの細胞を含有する液滴の画像を示す。スケールバーは１００μｍ。図２のｅは、代表的な液滴融合装置の上面図を示す。外線はマイクロ流体チャネルの構造を表し、内部パターンはマイクロウェルの配列を表す。Ｌ＝２５ｍｍ、ｗ＝２ｍｍ。アレイサイズ＝９行×１２８列＝１１５２のマイクロウェル。図２のｆは、装置の側面図を示す（図面は縮尺どおりではない）。ｈ１＝１００μｍ、ｈ２＝５００μｍ、ｈ３＝４０μｍ、ｈ４＝７０μｍ。図２のｇは、アレイの格子構造を示す。ａ１＝４５μｍ、ａ２＝８０μｍ、ａ３＝１４０μｍ。
【００２７】
（図３）異なるオリジナル油（Ｑ０）、水（Ｑｗ）及び分散油（Ｑｓ）の流量（μｌ／分）の下で、作製した液滴の直径Ｄ（μｍ）及びスループット（ｓ−１）。２つの異なる開口構造（２５μｍ×４０μｍ及び７０μｍ×７０μｍ）を備える装置は、直径４０±４μｍ及び８０±８μｍの液滴を作製するために使用する。Ｑｓは、２つの隣接する液滴の間の最小距離Ｓ〜ｌ２＊Ｄを保証するために設定される。したがって、Ｑｓ＝（Ｓ・Ｑｗ）−Ｑｏ。図３のｂ及びｃは、実施例１に記載されている液滴作製／選別装置から作製する、液滴の画像を示す。図３のｂは、マイクロビーズを含有する直径８０μｍの液滴を示す。液滴の約９８％は、１つ以上のビーズを含有する。図３のｃは、細胞を含有する直径４０μｍの液滴を示す。液滴の約９９．９４％は、１つ以上の細胞を含有する。
【００２８】
（図４）ａ〜ｄは、代表的な液滴の捕捉、対形成、融合工程の経時的な概略図（側面図）及び画像（上面図）を示す。黒の矢印は、各工程で優勢だった力を示す。（ａ）液滴融合装置に導入された８０μｍ（大きい）液滴は、最初に浮力によって捕獲位置に落ち着く。底部チャネルの流量は、液滴捕捉中はほとんどゼロであり、非捕捉液滴を洗い流している間は０より大きい。（ｂ）同様に、４０μｍ（小さい）液滴を捕捉して、すでに捕獲位置に捕捉されている大きな液滴と対にする。（ｃ）抗乳化剤を含有する外部の流れを使用して、抵抗力によって２つの対になった液滴を作製して、それを融合させる。（ｄ）再安定化させた後、液滴は装置を反転させることにより放出され得る。（ｅ）１１５２つのマイクロウェルの融合装置中の投入液滴の数対捕捉液滴の数大きな点と小さい点は、それぞれ８０μｍ（大きい）及び４０μｍ（小さい）液滴を示す。保持率（灰色の破線）は、捕捉液滴の数／投入液滴の数と定義される。占有（右軸）は、捕捉液滴の数／利用可能な捕捉位置の数と定義される。
【００２９】
（図５）ａは、代表的な液滴融合装置で融合した液滴の走査画像を示す。蛍光性Ｈｅｌａ細胞及びマイクロビーズは、各液滴中に１対１で共封入される。図５ｂは、細胞の数（κａ）及びビーズの数（κｂ）を含む液滴の割合を示すヒストグラムを示す。共流法から生じる推定される共封入は、λａ＝λｂ＝１または０．１のポアソン統計にも基づいてプロットされる。５セットの実験を繰り返した（各試験の液滴の平均数＝１０８０）。
【００３０】
（図６）Ａは、空の液滴（ピーク値−０．１Ｖ）及びビーズを含有する液滴から検出される、時系列の散乱光信号（濃い線）を示す。薄い線は、選別事象を起こすＴＴＬ信号を示す。ｘ軸は、システムのクロック表示を表す（時間：分：秒：ミリ秒）。図６のＢは、細胞を含有する液滴から検出される蛍光信号を示す。空の液滴には蛍光分子がなく、したがって、検出することができない。図６のＣ及びＤは、（Ａ）及び（Ｂ）から抽出したビーズ（Ｃ）及び細胞（Ｄ）の検出ピーク値のヒストグラムである。薄い線は、選別ゲート値を示す。
【００３１】
（図７）空の液滴及び細胞を含有する液滴から検出される、散乱信号を示す。薄い線は、細胞選別事象が蛍光標識なしで引き起こされ得ることを示す。これは、混合細胞集団（例えば、血液）を含む試料から、大きい細胞（例えば、循環癌細胞）を小さい細胞（例えば、赤血球）と区別するためにも使用できる。
【００３２】
（図８）Ａは、電気パルスを介して（誘電力により液滴融合を生じさせる）正確な液滴融合の繰り返しを可能にする、両側に沿った一対の埋め込み電線を含む、マルチウェルアレイを示す。図８のＢの左側は図８Ａの拡大図に示し、図８のＢの右側はマルチウェルアレイの透過光の画像を示す。矢印は、高電圧電源に接続する電線を示す。
【００３３】
（図９）Ａは、１つの大きな液滴だけを受けて（液滴の浮力によって上へ浮く）、大きな液滴が適所にあるならば、１つの小さくサイズ設定された液滴だけを受ける（再度、液滴の浮力によって上へ浮く）ようにサイズ設定されるマイクロウェルである、代表的な捕獲位置の側面図を示す。大きい及び小さい液滴が浮力の代わりに重力によって捕獲されることを除いて、図９のＢは同じ代表的な捕獲位置を示す。図９のＣは、最初に流れる１つの最大液滴（例えば、直径８０μｍ）だけを最初に捕捉して、そうして２番目に流れる１つの中型の液滴（例えば、直径４０μｍ）だけを捕捉して、最後に３番目に流れる１つの最小液滴（例えば、直径２０μｍ）だけを捕捉するようにサイズ設定される、３つの相互連結したマイクロウェルからなる代表的な捕獲位置の上面図を示す。３つの捕捉した液滴は、本明細書に記載のとおり融合されることができる（例えば、抗乳化剤または電荷を加えることによって）。図９のＤは、図９のＣに示す捕獲位置に第４のマイクロウェルを加える、代表的な捕獲位置を示す。この第４のマイクロウェルは、図９Ｃの最小液滴より更に小さく（例えば、直径８μｍ）、最後に流れる液滴を受ける。更に小さいウェル（例えば、５、６、７またはそれ以上の液滴を捕獲するのに役立つ）を加える追加の実施形態は、本明細書の方法で構築され使用され得る。
【００３４】
（図１０）Ａ（左側）は、種々の捕獲位置を含む、代表的なフローセルの上面図を示す。捕獲位置は、２つの融合マイクロウェル（大きなウェルに連結される小さいウェル）及び捕獲セル内に液滴を収集するように位置する捕獲ペグ（正方形及び長方形）からなり、図１０のＡの右側に示される。操作中、小さい大きさの液滴（例えば、細胞を含む）は、最初にフローセル中に入れられる。図１０のＢは、小さい液滴が小さいマイクロウェルを占領すると、他の小さい液滴は同じウェルを占領することからブロックされて、次の占領されていない小さいウェルに捕獲されるまで、長方形と正方形の捕獲ペグの間を流れる様子を示す（点線の小さい液滴で示す）。図１０のＣは、大きい液滴（例えば、バーコードを含む）がフローセル中に流される第２工程と、それらが大きなマイクロウェルを占領する様子を示す。大きい液滴が捕獲されると、他の大きい液滴は占有ウェルの横を流れて、次の空の大きなウェルに捕獲される（点線の大きい液滴で示す）。捕捉された液滴は、本明細書に記載されるように融合されることができる（例えば、抗乳化剤または電気によって）。
【００３５】
（図１１）実施例４からＳｏｒｔ  Ｎ’融合プラットフォームを使用する、１細胞ＲＴ−ＬＡＭＰアッセイの概略図を示す。（ａ）ＬＡＭＰ試薬を含有する液滴（液滴Ａ）は、最初に液滴作製器１によって作製されて、融合装置に格納される。（ｂ）１つの細胞及び溶解緩衝液を含有する液滴（液滴Ｂ）を作製して、融合装置内に選別する。液滴Ａ及び液滴Ｂを固定して、浮力及び物理トラップによって対にする。（ｃ）対にした液滴を、電気流体力学力によって融合させる。ＲＴ−ＬＡＭＰ反応は、３０分間、６２℃で実行されて、画像に基づく蛍光測定が続く。（ｄ）液滴の成分。（ｅ）ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の原理。
【００３６】
（図１２）実施例４から選択Ｎ’融合装置の２工程ＲＴ−ＬＡＭＰの可視化を示す。ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の前（ａ）及びその後（ｂ）の液滴の蛍光画像。（ｃ）ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の前後での正規化した強度変化（Ｉ＿ｂ−Ｉ＿ａ）／Ｉ＿ａ。拡大した透過光及び蛍光画像は、それぞれ、融合前（ｄ）及び融合／ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の後（ｅ）の細胞含有液滴を有する融合ウェルを示す。融合後のＲＴ−ＬＡＭＰ反応のない融合ウェルの同じ画像（ｆ）。
【００３７】
（図１３）実施例４から融合装置効率の定量を示す。（ａ）液滴格納アレイの対になった液滴の画像。破線の円は、液滴Ｂに複数の細胞があることを示す。（ｂ）液滴の捕獲、対形成及び融合の効率。斜め線の入った棒グラフは、１つ以上の細胞を含む液滴を示す。
【００３８】
（図１４）実施例４の最適なＲＴ−ＬＡＭＰ効率における２工程の溶解−増幅反応を示す。（ａ）１工程及び２工程ＲＴ−ＬＡＭＰ反応プロトコルの概略図。１工程プロトコルで、細胞懸濁液（２Ｅ５及び２Ｅ６細胞／ｍＬ）２．５μＬを、ＲＴ−ＬＡＭＰ混合物２２．５μＬに加えた。２工程プロトコルで、ｊｕｒｋａｔ細胞の懸濁液（４Ｅ５及び４Ｅ６細胞／ｍＬ）５０μＬを、最初に溶解緩衝液５０μＬに加えて、溶解した細胞溶液２．５μＬを、ＲＴ−ＬＡＭＰ混合物２２．５μＬに加えた。プライマーセットは、ＨＭＢＳ遺伝子から配列を検出するように設計されている。それから細胞及びＲＴ−ＬＡＭＰ混合物は、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラーに置かれて、３０分間６２℃でインキュベートされる。（ｂ）異なる条件下でのリアルタイム定量的測定の代表的な結果。（ｃ）異なるアッセイ条件の表。Ｃｑは、反応が対数期に達している臨界時間であり、ＲＦＵは相対蛍光強度である。Ｃｑ及びＲＦＵは直接的な測定値であり、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラーで測定される。
【００３９】
（図１５）３つの異なるプロトコルによる実施例４からのＲＴ−ＬＡＭＰ結果の箱ひげ図を示す。各点は、１細胞を表す。正規化した強度変化は（Ｉ−Ｉ＿０）／Ｉ＿０と定義され、そこで、Ｉはエンドポイント強度であり、Ｉ＿０は各液滴の初期強度である。実験条件は、反応器の大きさを２５μｌから１．２ｎＬ液滴まで低減することを除いて、図１３と同じである。
【００４０】
（図１６）プロトコルＡ及び他の２つの細胞系（Ｎｕｒｏ−２ａ及びＫ５６２）による、図１５の実験の繰り返しを示す。
【００４１】
定義
本明細書で使用する場合「バーコード」という用語は、バーコードが識別されることと関連している、ポリヌクレオチドのいくつかの特徴を割り当てる核酸配列を意味する。いくつかの実施形態で、識別されるポリヌクレオチドの特徴は、ポリヌクレオチドが由来する試料（例えば、細胞）またはウェル（例えば、マルチウェル装置）である。いくつかの実施形態で、バーコードは、約または少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またそれ以上の長さのヌクレオチドである。いくつかの実施形態で、バーコードは、１０、９、８、７、６または５のヌクレオチドの長さより短い。いくつかの実施形態で、いくつかのポリヌクレオチドと関連するバーコードは、他のポリヌクレオチドと関連するバーコードとは異なる長さである。一般的に、バーコードは十分な長さであり、それらが関連するバーコードに基づいて試料の識別を可能にするために十分に異なる配列を含む。いくつかの実施形態で、複数のバーコードの各バーコードは、複数のヌクレオチド位置（例えば、少なくとも１つのヌクレオチド位置（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０つまたはそれ以上のヌクレオチド位置）のそれぞれの他のバーコードとは異なる。複数のバーコードは、試料のプールで表されることができ、各試料は、プールの他の試料に由来するポリヌクレオチドに含有されるバーコードとは異なる、１つ以上のバーコードを含むポリヌクレオチドを含む。１つ以上のバーコードを含むポリヌクレオチドの試料は、プールされることができ、その後、それらが接合されるバーコード配列に基づいて識別されることができる。一般に、バーコードは、標的ポリヌクレオチドに接合されるとき、標的ポリヌクレオチドが由来する試料またはウェルの識別子として役立つ、核酸配列を含む。
【００４２】
本明細書で使用する場合「プライマー」という用語は、ヌクレオチド配列を増幅するために増幅方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））で使用できる、オリゴヌクレオチドを指す。通常、ポリヌクレオチド配列の増幅のためのＰＣＲプライマーのうちの少なくとも１つは、そのポリヌクレオチド配列に関して配列特異的である。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源及び使用する方法を含む、多くの要因に依存する。例えば、診断及び予知用途に関して、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、通常少なくとも１０または１５または２０または２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それは、それより少ないヌクレオチドまたはそれより多くのヌクレオチドを含むことができる。プライマーの適当な長さを決定する際に関連する要因は、当業者であれば容易に認識する。
【００４３】
本明細書で使用する場合「プライマー対」または「プライマーの対」という用語は、２つのプライマー、順方向プライマー及び逆方向プライマーを指し、それは、適切な条件下で適切な標的核酸に曝露されるとき、標的核酸の一部を増幅するために使用できる。
【００４４】
本明細書で使用する場合「プライマーセット」または「プライマーのセット」という用語は、それらの全長にわたって配列で同一ではない（例えば、異なるバーコード配列またはＵＭＩを含む）一方で、標的核酸の同じハイブリダイゼーション部位と結合して、増幅反応で同じ役割（例えば、順方向プライマー、逆方向プライマー：など）を実行する、２つ以上のプライマーを指す。
【００４５】
〔発明を実施するための形態〕
複数の捕獲位置を含む基板を使用して、２つの異なるサイズの液滴を収集し融合させるための製造システム、方法及び物品を、本明細書で提供する。特定の実施形態では、複数の大きな液滴及び小さな液滴、ならびに複数の捕獲位置を含む基板からなるシステムを、本明細書で提供し、そこで各捕獲位置は、大きな液滴のうちの１つだけ、及び大きい液滴が捕獲位置にすでに存在するときに、小さな液滴のうちの１つだけを捕獲するように構成される。具体的な実施形態にて、大きい及び／または小さい液滴は、それらが望ましい成分（例えば、細胞またはバーコード化ビーズ）を含むのを確実にするために、基板と接触する前に選別される。他の実施形態にて、各捕獲位置は、流体連通する１つ以上の捕捉ウェルからなる。いくつかの実施形態で、収集した大きい及び小さい液滴は、融合される（例えば、抗乳化剤または電気を介して）。
【００４６】
マイクロ流体液滴の２つ（またはそれ以上）の異なる粒子の共封入は、種々のハイスループット１細胞アッセイ（例えば、単離した少量の生化学反応及び細胞間相互作用）を達成する方法を提供する。しかし、ポアソン統計により制限されるので、従来の共流法の共封入速度は、最適条件の下でさえ低い。液滴の最高１３．５％だけが各粒子のちょうど１つを含むが、空のまたは対になってない粒子を含有する残りは、廃棄物になる。したがって、低い共封入効率により、液滴ベースのアッセイは、微量の細胞を含む生物学的用途で非実用的になる。共封入効率を上昇させる液滴融合方式を提供する、方法、システム、物品及び組成物を本明細書で提供する（例えば、図１のｂを参照）。
【００４７】
特定の実施形態で、例えば、個々に１つの細胞または１つのビーズを含有する２つの異なる種類の液滴（または、３もしくは４つ以上）を作製して、光活性化液滴選別（または、他の種類の選別）によって空の液滴を除去する、方法を本明細書で提供する。次に、２つ（または、それ以上）の異なる種類の液滴は１対１の対にされて、正確に２つ（または、それ以上）の異なる物体を含有する液滴を作製するために融合される。これまで、わずかな総量の選別した液滴（例えば、５０μｍのうちの１，０００つの液滴は、全容量がわずか６５ｎｌである）を非常に難しいオフチップで取り扱うこと、及び正確な１対１の対形成を必要とするので、効率的な選別後の液滴融合は、実現不可能な方法として認識されていた。２つの液滴列の同期化を必要とする連続対形成法（１７）は多数の液滴で良好に機能するように見えるが、その全体の回収率は、流れ調整工程で失われる液滴のため低く、したがって少量の液滴を融合するのには適していない。並列融合法は少量の液滴を良好に扱うことができる（１８、１９）が、その共封入効率は報告されなかった。本明細書の方法及び装置は、１つのシステムで、例えば、継ぎ目のない液滴の作製、選別、捕捉、対形成及び融合を可能して、分析の複雑さを低減する。所望の粒子は能動的に選択されて、液滴内部で正確に１対１で対になり、したがって、ポアソン統計による試料損失を解決する。
【００４８】
特定の実施形態で、液滴は、基板に曝露する前に選別される。特定の実施形態で、所望の成分（例えば、１つの細胞、バーコード、ビーズまたは他の試薬）を含む液滴は、所望の液滴だけを収集するために選別され、そうして、それは本明細書に含まれる基板上を流される。特定の実施形態で、選別方法は、特に本明細書で記載する液滴選別方法に関して、国際特許第ＷＯ２０１６１９３７５８号に記載されており、それはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
特定の実施形態で、２つ（または、それ以上）の液滴が捕獲位置に一緒に存在する場合、それらは、例えば抗乳化剤または電流を使用して融合されることができる。図８に示す電流装置を使用する１つの代表的なプロトコルが続く。この代表的なプロトコルで、図８の融合装置によって、プロトコルが、液滴中ＰＣＲの連続処理を実行し、液滴中の逆転写がそれに続き、液滴ベースのハイスループット１細胞ｍＲＮＡ配列決定に関する効率及び遺伝子範囲を精査することを増加させるのを可能にする。このプロトコルは、最初に大きい（例えば、８０ミクロン）液滴を作製するのを可能にして、そこに、バーコード化細胞合成ビーズ（本明細書に参照により組み込まれる「Ｄｒｏｐ−ｓｅｑ」ｐａｐｅｒ，Ｃｅｌｌ２０１５，１６１：１２０２−１２１４で使用したものに類似するが相補的）及びＰＣＲ試薬は含まれる。ＰＣＲ工程は、合成ビーズからの細胞バーコードを、液滴溶液中の何十倍も濃縮した遊離細胞バーコードプライマー内に増幅させる。これらの大きい（例えば、８０μｍ）液滴を融合装置内へ選別して、大きなウェルを完全に満たすのを終了した後、細胞溶解及び逆転写のための試薬を含有する小さい（例えば、４０μｍ）液滴を選別して、誘電力により液滴融合を生じさせる、埋め込みワイヤを通して加えた一連の電気パルスを使用する（図８の装置を参照）。温度感受性逆転写試薬の付加をＰＣＲ反応から切り離すことが可能になるので、この工程は重要である。融合した液滴が不安定にならないので、それらは、融合した液滴が大きすぎてウェルに入らなくなるまで、次の回の融合に適している。したがって、小さい（例えば、４０μｍ）液滴を選別することができ、それぞれは、同じ装置内に１つの蛍光性１細胞を含み、非常に効果的なプライミング及び遺伝子回収のプライマー−アンプリファイア液滴への融合（ＰＣＲによる）を可能にする。プライマー−ビーズを使用する２つの主要な制限を解決するので、ＰＣＲ工程は重要である。１）それは、数倍高い濃度の逆転写プライマーを逆転写に提供する。２）逆転写を溶液に変換し、それはｍＲＮＡプライミングにおけるビーズの空間制限を除去して、短いプライマーが非常に大きいｍＲＮＡ分子上へハイブリッド形成するために更に自由に拡散するので、プライミング効率を上昇させる。
【００５０】
特定の実施形態で、本明細書の基板は、複数の捕獲位置を含む。特定の実施形態で、基板はマルチウェル装置（例えば、プレートまたはチップ）である。本明細書の基板（複数の捕獲位置を含む）の全体のサイズは変化することができ、それは、例えば厚さは数ミクロン〜数ミリメートルまたはセンチメートル、及び幅もしくは長さは数ミクロン〜５０ミリメートルまたはセンチメートルの範囲であり得る。通常、基板を含む装置全体のサイズは、幅及び／または長さ約１０ｍｍ〜約２００ｍｍ及び厚さ約１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲である。いくつかの実施形態で、基板（例えば、チップ）は、幅約４０ｍｍ×長さ４０ｍｍ×厚さ３ｍｍである。
【００５１】
基板上の捕捉ウェルの総数は、装置が使用される特定の用途によって変化し得る。アレイの捕捉ウェルの密度は、特定の用途によって変化し得る。捕捉ウェルの密度ならびに捕捉ウェルのサイズ及び容積は、所望の用途、及び例えば、本発明の方法が使用される（例えば、細胞が捕捉ウェル内に入れられる実施形態において）微生物の種、ウェルで実行される反応の種類、検出技術などの要因に応じて変化できる。
【００５２】
本発明は、基板の捕捉ウェルの数によって制限されない。多数のウェルは、装置に組み込まれることができる。種々の実施形態にて、装置上の捕捉ウェルの総数は、約１００〜約２，０００、または約５，０００〜約１００，０００（例えば、９６００のウェル、３５４００のウェルまたは１５３，６００のウェル）である。例えば、正方形チップは、１２５×１２５の捕捉ウェルを含むことができる。いくつかの実施形態で、捕捉ウェルのアレイは列と行で配置される。基板は、その内部に任意の好適な数のアレイ列（例えば２、４、８、１２、１６、２４、３６、４８、６４、７２、９６、１００、１２０、１９６、２５０より多い）、または任意の数の列（例えば、５０）もしくは範囲（例えば、１６〜９６、４８〜１９６など）を含むことができる。基板は、その内部に任意の好適な数の行（例えば２、４、８、１２、１６、２４、３６、４８、６４、７２、９６、１００、１２０、１９６、２５０より多い）、または任意の数の行（例えば、５０）もしくは範囲（例えば、１６〜９６、４８〜１９６など）を含むことができる。いくつかの実施形態で、アレイの列及び／または行は、列と直角の行によりＸ／Ｙ格子を形成するように構成される。他の実施形態にて、行及び／または列はずれている。このような実施形態で、列及び行は、互いに対して非垂直な配向にあり得る（例えば、９０度より小さい）。他のこのような実施形態で、列及び／または行は、直線の代わりにジグザグを形成できる。他の実施形態で、捕捉ウェルは、図１０ａに示すように、１つのチャネルに作製されて、ジグザクのトンネルとして配置されることができる。
【００５３】
基板の捕捉ウェルは、任意の便利なサイズ、形状または容積で作製され得る。断面領域は、円形、楕円形、卵形、円錐形、矩形、三角形、多角形、または他の任意の形状でもよい。ウェルの任意の所与の深さの断面領域も、サイズ及び形状が変化し得る。各捕捉ウェルのくぼみは、様々な形状を取ることができる。例えば、捕捉ウェル内のくぼみは、直線または湾曲した壁で分割されて、分けられているが隣接する区画を形成する、または円形の壁で分割されて、内側及び外側の環状区画を形成することができる。特定の実施形態で、捕捉ウェルの側部ウェルの一部は、それが隣接する（例えば、小さい）捕捉ウェルに流体連通するように側部で低減される。
【００５４】
体積に対する内側表面の比率が高いウェルは、材料でコーティングされて、所望する場合、その内部に含有する反応物がウェルの内側表面と相互作用し得る可能性を減らすことができる。試薬が望ましくなく内側表面と相互作用する、またはそれと付着する傾向がある場合、コーティングは特に有用である。反応物の特性に応じて、疎水性または親水性コーティングを選択できる。様々な適切なコーティング材料を、当技術分野で利用可能である。材料のいくつかは、表面に共有結合的に付着でき、他のものは、非共有結合性相互作用を介して表面に付着できる。コーティング材料の非限定例は、シラン化試薬（例えば、ジメチルクロロシラン、ジメチジクロロシラン、ヘキサメチルジシラザンまたはトリメチルクロロシラン）、ポリマレイミド、シリコン処理試薬（例えば、酸化ケイ素、ＡＱＵＡＳＩＬ及びＳＵＲＦＡＳＩＬ）が挙げられる。追加の好適なコーティング材料は、ブロック剤（例えば、アミノ酸）、またはこれらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、ポリアデニル酸及びポリマレイミドを含むポリマーである。特定のコーティング材料は、加熱、放射線を介して及び化学反応によって、表面に架橋され得る。
【００５５】
代表的な基板（複数の捕獲位置を有する）は、約０．５ｍｍ〜１０ｍｍ（例えば、３．５ｍｍ）の厚さを有することができる。基板の長さ及び幅は、ＳＢＳ対応プレート（例えば、９６のウェルプレート、３８４のウェルプレートまたは１５３６のウェルプレート）と同じまたはほぼ同じサイズでもよい。基板の捕捉ウェルは、例えば、一般に周知のフォトリソグラフィ技術を使用して形成され得る。捕捉ウェルは、例えば、湿式ＫＯＨエッチング技術、異方性乾式エッチング技術、機械的穿孔、射出成形及び／または熱成形（例えば、熱エンボス加工）を使用して形成され得る。
【００５６】
いくつかの実施形態で、試料は、液滴中に含有される、または液滴を介して、基板の捕捉ウェルの全部または一部の中に入れられる（または、試料は捕捉ウェルにすでに存在する）。例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を含む試料は、捕捉ウェルに含まれる、または入れられる。類似または同一の試料は捕捉ウェルの全部または一部の中にあり得る、または異なる試料は異なる捕捉ウェルの中にあり得る。いくつかの実施形態で、試料は細胞を含む。いくつかの実施形態で、１つの細胞は各捕捉ウェル内に入れられる。いくつかの実施形態で、捕捉ウェルは細胞可溶化物を含む。細胞（複数可）の溶解は捕捉ウェル内で起きる場合がある、または細胞可溶化物は捕捉ウェル中に入れられ得る。特定の実施形態にて、１細胞は液滴を介して各捕捉ウェルの中に入れられて、その後細胞は捕捉ウェルで溶解して、各ウェルに１細胞溶解物を作製する。
【００５７】
いくつかの実施形態で、プライマーは固有の分子識別子（ＵＭＩ）として役立つセグメントを含み、それは、液滴を介して捕捉ウェルに提供される、またはすでに捕捉ウェルに存在する。ＵＭＩは、プライマーセットの各プライマーについて固有な、ランダム化した核酸配列である。それらが同じ反応または反応条件で作製されるときでも、ＵＭＩは、特定の増幅生成物の識別及び／または分化を可能にする。ＵＭＩは通常、長さ４〜２０（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはその間の範囲）のヌクレオチドである。ＵＭＩの長さは、捕捉ウェルまたは作製される核酸生成物の数に基づいて選択されることができ、その結果、各プライマー、したがって各核酸生成物は、固有かつ識別可能なＵＭＩを統計上有する。
【００５８】
いくつかの実施形態で、プライマーは１つ以上のバーコード化配列を含み、それは、液滴を介して捕捉ウェルに提供される、またはすでに捕捉ウェルに存在する。いくつかの実施形態で、バーコード配列は、増幅生成物核酸の供給源の識別を可能にする核酸セグメントである（例えば、本明細書に記載のシステム及び方法を使用して、それをプールした後）。例えば、いくつかの実施形態で、バーコードによって、配列決定したｃＤＮＡが細胞、ウェル、サブアレイ、本明細書の基板及び／またはそれを作製した実験と相関するのを可能にする。いくつかの実施形態で、バーコードは、核酸の１つ以上の特徴（例えば、由来する細胞型、核酸もしくは細胞が曝露した条件、作製した日付、または作製した基板もしくは作製した捕捉ウェル）と相関している。いくつかの実施形態で、プライマー（または、プライマー対）は、核酸標的に関する情報の複数の部分に相関する、複数のバーコード配列を含む。特定の実施形態にて、プライマー対の第１プライマーは少なくとも１つのバーコードを含み、プライマー対の第２プライマーは少なくとも１つの第２バーコードを含む（例えば、それが得られた個々の捕捉ウェルに相関する）。特徴を表す配列（例えば、バーコード）は、それに基づくソースウェル識別を提供するために、任意の好適な長さであり得る。例えば、いくつかの実施形態で、特徴を表す配列（例えば、バーコード）は、長さ３〜１０（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０またはその間の任意の範囲（例えば、４〜８、３〜６など））のヌクレオチドである。
【００５９】
いくつかの実施形態で、試薬は、核酸増幅／分析のための基板の捕捉ウェルに含まれている及び／または加えられる。基板の液体中に含まれる試薬は、その中で実施される反応に依存する。一実施形態にて、捕捉ウェルは、核酸増幅反応を行う試薬を含む。試薬は、イムノアッセイ、これに限定されないが核酸増幅を含む核酸検出アッセイのための試薬であり得る。試薬は、装置のユニットで乾燥状態または液状態であり得る。一実施形態にて、捕捉ウェルは、以下の試薬、プローブ、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰのうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態で、ウェルは、プローブ、プライマー及びポリメラーゼを含む溶液を含有する。種々の実施形態で、各捕捉ウェルは、ゲノム中のポリヌクレオチド標的のためのプライマー、及びプライマーが標的と結合した場合、濃度依存信号を発するプライマーと関連するプローブを含む。別の実施形態で、基板の少なくとも１つの捕捉ウェルは、順方向ＰＣＲプライマー、逆方向ＰＣＲプライマー、及び少なくとも１つのＦＡＭ標識化ＭＧＢクエンチＰＣＲプローブを含む、溶液を含有する。一実施形態にて、プライマー対は捕捉ウェル内に分配され、それから乾燥する（例えば、凍結によって）。それから、ユーザは、試料、プローブ及び／またはポリメラーゼを選択的に分配できる（例えば、ナノ分配）。
【００６０】
本発明の他の実施形態で、捕捉ウェルは、乾燥形状で上述の溶液のいずれかを含有できる。この実施形態で、この乾燥形状は、捕捉ウェルにコーティングされていることができる、または捕捉ウェルの底に注がれることができる。ユーザは、分析前に、各捕捉ウェルに、液体試料（例えば、水、緩衝剤、生体試料または環境試料、水と捕捉細胞の混合物など）を含有する液滴を加える。この実施形態で、乾燥させた反応混合物を含む基板は、ライナーで封止され得る、別の位置に格納され得る、またはそこに輸送され得る。
【００６１】
核酸試料（例えば、各捕捉ウェルの１細胞によって）を含有する基板は、ＰＣＲにより実行される遺伝子タイピング、遺伝子発現または他のＤＮＡ分析のために使用できる。プレートで実行される分析は、これに限定されないが、ＤＮＡ分析（例えば、ＴＡＱＭＡＮ、ＴＡＱＭＡＮゴールド、ＳＹＢＲゴールド及びＳＹＢＲグリーン）であり、他の分析（例えば、受容体結合、酵素及び他のハイスループットスクリーニング分析）も含む。いくつかの実施形態で、ＲＯＸ標識化プローブが、内部標準物質として使用される。
【００６２】
特定の実施形態で、核酸分析、配列決定、増幅、検出などのための試薬は、核酸試料（例えば、ウェル当たり１細胞からの溶解物）を含む捕捉ウェルに加えられる。いくつかの実施形態で、このような試薬は、それらが本明細書に記載のシステムを使用してプールされた後、種々の標識化オリゴヌクレオチドを区別するために、核酸の標識化（例えば、ｍＲＮＡ分子）、及び／または細胞／ウェルソースの標識化、及び／またはマルチウェル装置の特定のサブアレイソースの標識化における、バーコード化で使用する成分を含む。このようなバーコード化手法及び試薬の実施例は、核酸をバーコード化及び配列決定することに関連する条件及び試薬を含む、米国特許公開第２００７／００２０６４０号、同第２０１２／００１００９１号、米国特許第８，８３５，３５８号、同第８，４８１，２９２号、Ｑｉｕら（Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３３，４７５−４８１，  ２００３）、Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７Ｏｃｔ；３５（１９）：ｅ１３０）、Ｃｒａｉｇら参照文献（Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，Ｏｃｔｏｂｅｒ，５（１０）：８８７−８９３）、Ｂｏｎｔｏｕｘら（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２００８，８：４４３−４５０）、Ｅｓｕｍｉら（Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｓ．，２００８，６０：４３９−４５１）、Ｈｕｇら（Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．，Ｂｉｏｌ．，２００３，２２１：６１５−６２４）、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（ＰＮＡＳ，９７（５）：１９７６−１９８１；２０００）、Ｈｏｌｌａｓ及びＳｃｈｕｌｅｒ（Ｌｅｃｔｕｒｅ  Ｎｏｔｅｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌｕｍｅ２８１２，２００３，ｐｐ  ５５−６２）、及び国際特許第ＷＯ２０１４２０１２７２号に記載されており、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
いくつかの実施形態で、捕捉ウェルからの核酸を配列決定する。蛍光ベースの配列決定手法を含む、多くのＤＮＡ配列決定技術は当技術分野において周知である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ，１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。いくつかの実施形態で、当技術分野で理解されている自動配列決定技術を利用する。いくつかの実施形態で、システム、装置及び方法は、分割したアンプリコンの並列配列決定を使用する（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｖｉｎ  ＭｃＫｅｒｍａｎらへの国際ＰＣＴ特許出願第ＷＯ２００６０８４１３２号）。いくつかの実施形態で、ＤＮＡ配列決定は、並行オリゴヌクレオチド伸長によって達成される（Ｍａｃｅｖｉｃｚらに対する米国特許第５，７５０，３４１号及びＭａｃｅｖｉｃｚらに対する米国特許第６，３０６，５９７号を参照。両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。配列決定技術の追加の実施例は、Ｃｈｕｒｃｈ  ｐｏｌｏｎｙ技術（Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２０，５５−６５、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５Ｓｃｉｅｎｃｅ３０９，１７２８−１７３２、米国特許第６，４３２，３６０号、同第６，４８５，９４４号、同第６，５１１，８０３号。それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、４５４ピコ力価パイロシークエンス技術（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５Ｎａｔｕｒｅ４３７，３７６−３８０、米国特許第２００５０１３０１７３号。それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、Ｓｏｌｅｘａ一塩基付加技術（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，６，３７３−３８２、米国特許第６，７８７，３０８号、同第６，８３３，２４６号。それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、Ｌｙｎｘ超並列シグネチャー配列決定技術（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：６３０−６３４、米国特許第５，６９５，９３４号、同第５，７１４，３３０号。それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＡｄｅｓｓｉＰＣＲコロニー技術（Ａｄｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２８，Ｅ８７、国際特許第ＷＯ０００１８９５７号。それらの全体が参照により本願明細書に組み込まれる）を含む。使用される可能性もある「次世代シーケンス」技術と称される一組の方法が現れている（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ，５５：６４１−６５８，２００９、ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６。それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。次世代シーケンス（ＮＧＳ）法は、以前の配列決定法と比較して低コストを目的として、超並列、ハイスループットな方法という一般的な特徴を共有する。ＮＧＳ法は大まかに、テンプレート増幅を必要とするものとそれを必要としないものに分けられることができる。増幅を必要とす��方法としては、４５４技術プラットフォームとしてＲｏｃｈｅから市販されている（例えば、ＧＳ２０及びＧＳ  ＦＬＸ）パイロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａから市販されているＳｏｌｅｘａプラットフォーム、及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているＳｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）プラットフォームが挙げられる。一分子配列決定として知られる非増幅法は、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓから市販されているＨｅｌｉＳｃｏｐｅプラットフォーム、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰＡＣ  ＢＩＯ  ＲＳ  ＩＩ）及び他の市販されているプラットフォームである。
【００６４】
特定の実施形態で、複数の捕獲位置を備える基板からなる本明細書に記載のマイクロ流体装置は、多層ソフトリソグラフィ技術で製造される。このような技術の一例は以下のとおりである。マイクロ流体パターンを有する成形型を製造するために、ＳＵ−８フォトレジストは、４インチのシリコンウエハ上へスピンコーティングされる。フォトレジスト膜の厚さは、ＳＵ−８フォトレジストの反復コーティング、スピン時間及びスピン速度によって変化し得る。焼成後に、フォトレジストの追加の溶媒は蒸発して、フォトレジストは紫外線の下に露出し、架橋を開始する。そうして、露光後の焼成工程は、曝露領域を硬化するために適用されて、永続性架橋エポキシを形成する。最後に、残留するフォトレジストは、ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ製ＳＵ−８ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ及びイソプロパノールによって洗い流す（例えば、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍのマニュアルの中の処理時間、温度などの詳細なパラメータを参照）。Ｓｕ−８成形型の準備ができた後、ポリ−ジメチルシロキサン（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４）及び硬化剤を１０：１の比率で混合し、Ｓｕ−８成形型に注いで、８時間６５℃で焼成して、マイクロ流体チャネルを複製する。硬化したＰＤＭＳを０．７５ｍｍの生検パンチでくり抜いて、投入口／放出口を形成する。マイクロウェルアレイ及び流体チャネルを含有する２層のＰＤＭＳは、例えば図２Ｆに示すように、その後酸素プラズマによる表面活性化によってスライドガラスに結合される（Ｆｅｍｔｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）。微小電極は、１５０℃でマイクロチャネル内に低融点合金（例えば、２４７はんだ）を注入することにより作製される（例えば、図８Ａに示すように）。他の実施形態で、マイクロ流体装置はあるいは、他の方法（例えば、熱可塑性ポリカーボネート（ＰＣ）とエポキシ結合の正確な射出成形、ＰＣの正確な３Ｄ印刷、及びガラスのレーザーマイクロマシニング）によって製造され得る。
【００６５】
〔実施例〕
実施例１
複数の捕獲位置基板の二重の液滴捕捉及び融合
この実施例は、複数の捕獲位置基板の二重の液滴捕捉及びそのような共捕捉した液滴の融合のための、システム及び方法を記載する。
【００６６】
方法
マイクロ流体システム
この実施例で使用される代表的なマイクロ流体システムは、２つの下位要素装置、内蔵型光活性化選別機能を備える液滴作製装置（図２のａ〜ｃ）、及びその収集口に接続した液滴融合装置（図２のａ、ｄ）からなる。これらの装置の両方とも、標準ソフトリソグラフィ法によってポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作製されており、微小電極は、はんだごてを使用して製造される。すべての装置のチャネルは、液滴が濡らすのを防ぐために、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクチル）シランによってシラン化される。
【００６７】
液滴作製／選別装置
液滴作製／選別装置は、所望の液滴だけを選別して、その収集チャネルへ導く、能動的液滴選別機能（２０）を組み込む。装置の流れ集束ゾーン構造が、直径８０μｍ及び４０μｍの２つの異なるサイズを有する油中水滴（ＨＦＥ７５００、３Ｍ）を作製するように、異なるサイズの２つのノズルを使用する（図１のｃ）。液滴は、油中の２％のＥＡ界面活性剤（ＲＡＮ  ｂｉｏｔｅｃｈ）で安定化させる。液滴が埋め込んだ光ファイバ（Ｆ−ＭＣＢ−Ｔ、Ｎｅｗｐｏｒｔ）前方の照合ゾーンへ移動すると、それらは１０倍対物レンズによって焦点を合わせたレーザービーム（４５０ｎｍ、５０ｍＷ）によって照らされる（図１のｄ）。蛍光及び散乱光は光ファイバで収集されて、２つの光電子倍増管（Ｈ９３０６−０３、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）により検出される。ダイクロイックミラー（５００ＬＰ）及び２つのバンドパスフィルタ（ＣＷ４５０ｎｍ及び５２５ｎｍ）は、蛍光及び散乱光を分離するために使用する。それから信号を、電気回路によってリアルタイムで処理する。所望の信号を発する液滴は、微小電極で高圧ＡＣパルス（２ｋＶｐｐ未満、３０ｋＨｚ）を起動させる。空の液滴が、下方の流体抵抗の後に完全に廃棄チャネル内に流入する一方で、微小電極周辺の強いＡＣ電界による誘電泳動効果は、収集チャネルに信号を発する液滴を引き入れる（図１のｃ）。
【００６８】
液滴融合装置
液滴融合装置は、チャネルの上面にある独自に設計した１１５２のマイクロウェルアレイを含む、フローチャネルである。直接上流の収集チャネルに接続するので、融合装置は、浮力トラップによって液滴を捕捉する。この実施例のキャリア流体は、３Ｍ  Ｎｏｖｅｃ  ＨＦＥ７５００油である（他のフルオロカーボン油（例えば、ＦＣ４０）も使用できることに留意する）。各マイクロウェルは、正確に２つの液滴の異なるサイズに適合するように設計されている（図２のｄ、図２（対照）のｅ〜ｇ）。直径８０μｍの液滴は最初にチャネル（高さ５００μｍ）に流されて、すべてのマイクロウェルが満たされるまで、マイクロウェルに捕獲される（図４のａ）。それから直径４０μｍの液滴は選別されて、捕獲され、マイクロウェルで１対１の対にされて８０μｍの液滴になる（図４のｂ）。捕獲されていない過剰な液滴を洗い流した後に、２％（ｖ／ｖ）のペルフルオロブタノール（ＰＦＯ）を含有する油を、融合事象を引き起こす抗乳化剤として装置のチャネル内に流す（図４のｃ）。その後に、２％のＥＡ界面活性剤入りの油を再び装置のチャネルに流して、融合した液滴を再安定化させ、それから装置を反転させてマイクロウェルから放出する（図４のｄ）。本装置の液滴捕捉及び融合の効率を、視覚化のために赤色及び緑色の食用色素を含有する２色の液滴で特徴づけた（図４のｅ）。共封入実験は、青色の蛍光色素（ｎｕｃｌｅｉ−ｂｌｕｅ、ｔｈｅｒｍａｌ  ｆｉｓｈｅｒ）で染色したＨｅｌａ細胞を使用し、３０μｍのマイクロビーズ（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−６５Ｓ）を、１６％（ｖ／ｖ）のＯｐｔｉＰｒｅｐ密度勾配媒体（Ｓｉｇｍａ）入りのＰＢＳ溶液中に懸濁させて、細胞凝集を回避した。
【００６９】
結果及び考察
２つの粒子種を含有する液滴の２つの異なるサイズを、連続して作製し選別する。
【００７０】
マイクロ流体装置の流体力学的捕獲は、１細胞の捕捉で広く使用されている（２１）。しかし、サイズ変化を示す細胞型の不均一性は、流体力学的捕獲のサイズに基づく捕捉機構を、不均一な生体試料で不適切にする。あるいは、流れ集束構造（２２）は、不均一なサイズの１細胞を捕捉する理想的な手段を提供する、均一サイズの単分散型微小液滴中に１細胞を封入することができる。この方法は最初に、すべての細胞を封入するのに十分大きいが更に捕捉チャンバに適合する、一定サイズの液滴の作製を必要とする。多くの他の研究が液滴形成の機序を解明したが、考慮されるべき多くの寸法及び流体パラメータに起因して望ましい液滴サイズを作製するための単純なスケーリング則が存在しない（２３）。装置の流れ集束領域の開口部の高さ（ｈ）及び幅（ｗ）は、液滴の大きさを制御している最も重要なパラメータである。考慮されるべき２つの設計基準がある。第１にチャネルサイズは、チャンバで細胞を機械的に溶解させる、またはマイクロ流体チャンバを詰まらせるのを回避するのに十分に大きい必要がある。第２に液滴サイズは原則として、その単分散性を維持すると共に、分析スループットを最大化するためにできるだけ小さくなければならない。したがって最適化された装置設計は一般に、サイズが所望の液滴サイズよりわずかに小さく、細胞またはビーズより大きい、開口部を組み込まなければならない。
【００７１】
直径４０μｍ及び８０μｍの液滴を作製する２つの異なる装置設計が検討されて、それは、最高のスループットで哺乳細胞または人工的なマイクロビーズ（６０μｍ未満）のほとんどをそれぞれ封入することができる。図３は、水及びオイル流量（Ｑｗ及びＱｏ）の異なる組み合わせから得られる、異なる液滴サイズの形成を示す。水／オイル流量比を調整することによって、両方の装置は設計特異性を達成した（陰影のついた領域）。作製の後、液滴は、界面を安定化させるために短いチャネルを通って流されて、分散油は、各液滴の間の適切な距離を提供するために加えられた。液滴の存在自体が、チャネルの中を流れている他の液滴に対して、追加の流体抵抗を生じさせる。したがって、２つの隣接する液滴の間に十分な間隔を作成することは、Ｙ字状放出口接合にて液滴の間の物理的干渉を防ぐ際に重要である。電界が存在するまたはそれが存在しないところで、すべての液滴が収集チャネルまたは廃棄チャネル内に流入するまで、最適な離間距離は、油対水流の比を調整することによって得られる。ここで分散油の流量Ｑｓは、Ｑｓ＝（Ｓ・Ｑｗ）−Ｑｏで得られて、Ｓ＝１２は、液滴直径によって正規化された液滴間の距離を表し、それは分散相対連続相の容積比にほぼ等しい。水流量が５μｌ／分を超えるとき、適用した電界が、収集チャネル内に確実にすべての液滴をそらせることができなかったことがわかった。この実施例において、これにより一般的に、選別のスループットの上限を４０μｍの液滴に関して２０００ｓ−１及び８０μｍの液滴に関して３００ｓ−１にそれぞれ設定する。
【００７２】
次に、蛍光標識したＨｅｌａ細胞及び非蛍光マイクロビーズを用いて、液滴作製／選別装置の性能の正確さを確認した。確認工程は、１，５００細胞／μｌ及び１８０〜２００ビーズ／μｌの懸濁液で、それぞれ４０μｍの１細胞を含有する液滴、ならびに８０μｍの１ビーズを含有する液滴を作製することから始めた。このような濃度はそれぞれ、液滴４０μｍ当たり０．０５細胞（ａ＝０．０５）、液滴８０μｍ当たり０．０５ビーズ（λｂ＝０．０５）に対応する。装置の選別処理はその後に実行されて、廃棄される空の液滴と共に、少なくとも１細胞またはビーズを含有する選別した液滴は９８％以上になった（図３のｂ〜ｃ）。選別した液滴の小集団（２．５％未満）は、選別工程から容易に除外されない液滴または凝集塊を含むことがわかった。しかし、これらの不良な液滴の作製は、試料濃度を更に希釈することによって、または凝集塊を除去するための事前の濾過工程によって最小化され得る。信号対雑音比（ＳＮＲ）及び選別ゲートの設定の両方は、偽陰性出力の比率を決定した。偽陰性液滴は、選別されていない細胞またはビーズのいずれかを含む。適切な選別ゲートを適用することによって、偽陰性出力率を１％未満まで抑制した（図６）。散乱光に基づく細胞選別も機能するが、弱信号の小さいＳＮＲのため、高い偽陰性出力率になった（図７）。
【００７３】
液滴の捕捉、対形成及び融合
効率的に２つの液滴を正確に１対１で融合する技術的課題は、重要である。この実施例は方策を記載し、そこで、液滴は連続的に作製され選別されて、２つの液滴を同期させる問題を解決する。この実施例で、融合装置の投入口は、マイクロボア管を介して、液滴作製／選別装置の収集口に直接接続している。オンチップ動作は、オフチップ動作の間に現れる表面張力により液滴が破壊されるのを防ぐと共に、損失を生じさせずに液滴が移動するのを保証する。液滴融合装置は、液滴作製／選別装置への大きな背圧も加えない必要があり、したがって液滴作製／選別装置から生じる流速を妨げない必要がある。流れ方向に沿った流体力学上の圧力勾配によって駆動される、従来の液滴融合技術で、これらの要件を満たすことは困難である。その代わりに、この実施例では、流れ方向と直交する垂直な捕獲力を生じさせる浮力を利用する方法を使用した。この特徴は、個々の選別機能を妨害せずに、満たされた融合装置の例えば「ホットスワップ」も可能にした。
【００７４】
対処した別の課題は、高い液滴保持率を得ることであり、それは、投入液滴の数に対する捕捉液滴の数の比率で得られる。従来の液滴融合実験の大部分は、ほとんどすべての捕捉位置の充填を確実にするために大量の液滴を必要とする。これが高い占有率になる一方で、かなりの液滴は消費されて、著しく低い保持率になる。それに対し、本発明の選別後／配列方法は、融合位置で非常に少ない液滴数を保持して、高い保持率及び捕獲位置での高い占有率を同時に達成することができる。
【００７５】
図４のａ〜ｄは、融合装置の側面図、ならびに直径８０μｍの緑色の（大きい）液滴及び直径４０μｍの赤色の（小さい）液滴の対を融合させるワークフローを示す。装置のチップは、１，１５２の捕獲位置を有しており、そのそれぞれは、直径８０μｍ及び直径４０μｍの液滴をそれぞれ捕獲する大きなマイクロウェル及び小さなマイクロウェルからなる。最初に、装置内に緑色に染色した大きい液滴を流して、その大きな寸法のフローチャネルは流速を落とし、導入された液滴が、チャネルの上部に沿ってゆっくり移動して、停滞するのを可能にした。緑色の液滴の所望の数（下で詳述される）が収集されると、上流の選別動作をオフにして、液滴選別装置から管をはずした。それから、液滴は、融合装置を傾けることによって空の捕獲位置内に流れていき、そうして大きいマイクロウェルの中に捕獲された。この動作は、すべての液滴が捕獲位置にゆっくりと充填される、良好な傾斜制御及び目視確認を可能にする、光学顕微鏡下で実行される。装置の傾斜方向、角度、速度及び大きさを慎重に制御することによって、融合装置の中に適切な浮力を加えて、高い占有率及び保持率の両方を達成することができる。投入液滴の数がオンチップの捕獲位置より少ないとき（１，１５２のウェル／チップ）、ほぼ１００％の保持率を得ることができるとわかった（図４のｅ、正方形）。ほぼ１００％の占有率は、わずか１２００の液滴を装置内に入れることによっても達成できる（図４のｅ、正方形）。すべての大きなマイクロウェルが直径８０μｍの液滴で満たされると、外部の油流を導入して、捕捉されていない過剰な液滴を洗い流した。捕捉された液滴は、洗浄工程の間、１０ｍｍ／秒未満の流速で安定して捕捉位置に残ったままだった。
【００７６】
次に、小さい直径４０μｍの液滴を融合装置内に流して、以前に大きい直径８０μｍの液滴を捕捉した大きいマイクロウェルに隣接する、小さいマイクロウェルを同様の動作で満たした（図４のｂ）。すべての捕獲位置が液滴の対で満たされると、再度外部の油流を導入して過剰な液滴を洗い流した。４００未満の小さい液滴が装置に流されるときに、約１００％の保持率及び対形成率を達成することができるが、総投入数が８００へ増加すると、この比率は約８０％に低下する（図４のｅ、三角形）。この特定の実施例で留意すべきことは、８７％の占有率を達成するには約２０００の小さい液滴を流す必要があり、保持率は５０％に減少する（図４のｅ、三角形）。小さい直径４０μｍの液滴の効率の低い全体の捕捉率は、小さいサイズの液滴が小さいマイクロウェルを流れる機会が少ないという事実によって説明され得る。一方で、小さい液滴は比較的強い抵抗力を経験し、それはその動きを遅くする。最後に、５％のＰＦＯを含有する外部の油を装置内に流すと、２つの隣接する液滴は不安定になって融合する（図４のｃ）。２種類の液滴の間の境界面に存在するＰＦＯ分子は、表面張力を増加させる。油流により提供される追加の圧力は、２つの液滴の間に物理的接触を生成して、それは融合事象を引き起こす。直径４０μｍの液滴が直径８０μｍの液滴と接触する前にＰＤＭＳチャネル表面を濡らしたので、液滴の対の非常に小さい断片だけは融合しなかった（通常、１％未満）。ＥＡ界面活性剤で再安定化させた後、融合した液滴は、装置チップを反転させることによって捕捉位置から放出された（図４のｄ）。
【００７７】
１細胞及びマイクロビーズの共封入
上述の同じシステムを使用して、１，３００のビーズを含有する液滴（直径８０μｍ）及び２，０００の蛍光細胞を含有する液滴（直径４０μｍ）を１１５２の捕獲位置のアレイを有する融合装置に、連続的に選別した。捕獲位置のほぼ１００％はビーズを含有する液滴で満たされ、これらの液滴の８５％はその後捕獲された細胞を含有する液滴と対にされた。すべての液滴対を融合した後に、各液滴中の細胞数及びビーズ数を数えた。図５は、装置の融合した液滴の光学画像を示し（図５のａ）、５つの装置から計数した全液滴Ｎ＝５，４００上の細胞及びビーズを含有する液滴の比率をプロットする（図５のｂ）。７４．５％の液滴が、一対の１つのビーズ及び１つの細胞を正確に封入するとわかった。更に１５％の液滴は、融合する前の液滴の対形成の失敗のため、１つのビーズだけを含有した。更に７．９％の液滴は、複数のビーズ及び／または細胞を封入し、その結果、（ｋａ、ｋｂ）、＝（０、２）、（２、０）、（１、２）、（２、１）となり、これによって細胞またはビーズのダブレットが、選別した液滴のいくつかの中に存在している。そのうえ、残りは、空または非融合液滴を含む。一般に、上記の条件を使用し、この実施例の装置を使用して、融合液滴中に１ビーズ及び１細胞の１対１の対を得る確率は、
【００７８】
【数３】
2021509024.tif 000005
によって得られ、式中、ηは、図５のｅで画定する融合アレイの直径４０μｍの液滴の占有率である。Ｐλ（ｋａ＝１｜ｋａ≧１，ポアソン）は、１細胞を含有する選別液滴を作製する確率であり、Ｐλｂ（ｋｂ＝１｜ｋｂ≧１，ポアソン）は１ビーズを含有する選別液滴を作製する確率である。図５のｂは、従来の方式で予測される共封入の結果も示し、それは、
【００７９】
【数４】
2021509024.tif 000006
のように２つの個々のポアソン統計比率に乗算することによって簡単に得られる。λａ＝λｂ＝１になる液滴当たりの１細胞／ビーズの濃度で、１対１の対形成率は、Ｐ１，１（ｋａ＝ｋｂ＝１，ポアソン＝１３．５％の最大比率になる。しかし、高確率（３２％）の複数の細胞／ビーズを含有する液滴がある。このような集団は、１つの細胞及び１つのビーズの正確な一対を有する所望の液滴の集団より２．４倍多い。１対粒子を超えて含有する液滴の割合を最小化することは、実用的な液滴ベースの分析法で重要である。例えば、Ｄｒｏｐ−ｓｅｑ分析は、細胞と固有のｓｓＤＮＡバーコードで改変したビーズの間の１対１の対を必要とする。このようなビーズが１細胞を超えて対にされる場合、それは複数の細胞からｍＲＮＡ分子を捕捉する可能性がある。異なる細胞から得られるｃＤＮＡは、同じバーコードで標識されて、同じ細胞からのｃＤＮＡとして認識される。したがって、この特定のビーズから抽出した転写情報は不正確になり、間違ったデータの解釈につながる。これを回避するために、従来のＤｒｏｐ−ｓｅｑ分析は低濃度の細胞（ビーズ）を使用し、それは液滴１０つ当たり約１細胞（ビーズ）に等しい（λａ＝λｂ＝０．１）。ポアソン統計に制限されるので、分析は、誤差を低減させる（すなわち、不正確な細胞とビーズ対形成の確率を０．１３６まで下げる）ために、細胞（ビーズ）の９０％が無駄になるのと同程度まで試料を希釈する必要がある。それに対して、能動的選別及び下流融合による本方法は、細胞及びビーズの１５％ならびに５０％の試料損失をそれぞれ増加させずに、０．０８３と同程度の低い誤差になる、同程度の高さの細胞とビーズの対形成の精度を達成する。実際、ポアソン統計ではなく、それが液滴融合装置設計によって単独で測定される際、損失は一定のままである。その結果、このような精度は、試料損失に影響を及ぼさない方法で試料濃度を低減することによって、更に向上することができる。
【００８０】
この実施例は、液滴選別及び融合を連結して、液滴内部の２つの異なる粒子の１対１の対形成を達成する、マイクロ流体システムを記載する。この方法は、ポアソン統計によって決定される従来の共流構成に起因する、著しい試料損失を排除した。粒子は、確率的な処理を含まずに、選別及び融合装置で能動的に捕捉されて対形成される。この実施例で得られた１対１の対形成の効率は７４．４％に達し、それは、従来のポアソン分布に制限された対形成効率１３．５％と比較して、対形成の精度及び収率の両方の著しい改善を表す。液滴保持率が、ポアソン統計ではなく、試料損失を支配する装置設計で決定されることがわかった。この実施例は、受動的な封入、光活性選別、ストップフロー捕捉、サイズ選択的対形成、及び高度に統合されたプラットフォームのオンデマンド型融合を含む、多用途の液滴操作配列を示す。それらが光学的に区別されることができる限り、開発したプラットフォームは、粒子の物理的特性（サイズ、形状、剛性．．．など）に制約を課さない。システムは、広範囲の試料密度を有する分析を実行する能力を示す。液滴融合装置のマイクロウェルの数は更に、その単純な設計に起因して、十から数千以上まで計測可能である。更にシステムは、液滴融合の前後での装置内試験を可能にし、それは、対形成の質の直接測定、及び融合後の反応の直接観察をそれぞれ可能にする。システムの用途の広さによって、それは広範囲の分析に適するようになる。例えば、それは、プライマー／抗体でコーティングしたマイクロビーズを用いて、２つの異なる細胞型または１細胞の転写／プロテオミクス分析の間の細胞間相互作用を調べるために使用され得る。
【００８１】
実施例２
１細胞トランスクリプトームのプロファイリング
この実施例は、１細胞のハイスループット及び高収率なｍＲＮＡ配列決定ためのシステムと方法を記載する。
【００８２】
方法
実施例１が、プライマーを含有する液滴及び１細胞を含有する液滴を１対１で融合するために行ったように、この実施例は、同じマイクロ流体システム、液滴作製／選別装置、ならびに液滴融合装置を使用する。この液滴対形成−融合方法は、それが多くの高コストな逆転写試薬を節約する際に、更に費用効果が高くなる利点を有する。例えば、複数の融合装置用に液滴８０μｍを作製するために、わずか５μＬの逆転写試薬を使用する。同じ試料サイズを実行するために、それは、「ｄｒｏｐ−ｓｅｑ」及び「ｉｎ−ｄｒｏｐ」のような実験の少なくとも１０倍の逆転写試薬を使用する。
【００８３】
１細胞からのｍＲＮＡ情報をプロファイルするために、ＵＭＩ及びバーコードを含有する逆転写プライマーは、ＤＮＡ配列にｍＲＮＡを複製するために使用され、次世代配列決定のポリ連鎖反応（ＰＣＲ）によってその後増幅される。各プライマーは、５’末端から３’末端まで、ＰＣＲ特異的配列、１２マーのＵＭＩ配列、スペーサー配列、２０マーのバーコード及び２５マーのポリｄＴからなる。同じ液滴のプライマーは、同じバーコードによって、同じ細胞（すなわち、同じ液滴中の）からすべてのｍＲＮＡ分子にタグ付けすると共に、独自に各ｍＲＮＡ分子を識別する、固有のＵＭＩ及び同じバーコードを含む。プライマーを含有する液滴８０μｍは最初に作製されて、融合装置内に選別される。続いて、１細胞を含有する液滴４０μｍが作製され、１対１の対形成するために選別されて、その後の細胞溶解及びｍＲＮＡ複製のために、プライマーを含有する液滴８０μｍと融合される。
【００８４】
プライマーを含有する液滴の作製
プライマーを含有する液滴を作製する１つの方法は、液滴８０μｍに逆転写プライマーを接合したマイクロビーズを封入することである。プライマー接合マイクロビーズは、「ｄｒｏｐ−ｓｅｑ」（６）及び「ｉｎ−ｄｒｏｐ」（１６）文献に記載されるように得ることができ。
【００８５】
第２の方法は、非常に効果的なプライミング及び遺伝子収率のために液滴中のプライマーをＰＣＲ増幅することである。プライマー−ビーズを使用する２つの主要な制限を解決するので、ＰＣＲ工程は重要である。１）それは、数倍高い濃度の逆転写プライマーを逆転写に提供する。２）逆転写を溶液に変換し、それはｍＲＮＡプライミングにおけるビーズの空間制限を除去して、短いプライマーが非常に大きいｍＲＮＡ分子上へハイブリッド形成するために更に自由に拡散するので、プライミング効率を上昇させる。要するに、液滴８０μｍは同様に作製されて、増幅したプライマーを有する通常のＰＣＲ反応溶液に封入される、各液滴のＰＣＲテンプレートを接合したマイクロビーズを含む。マイクロビーズの一本鎖ＤＮＡテンプレートは、５’末端から３’末端まで、３０マーのポリｄＡ配列、２０マーのバーコード及び２５マーのスペーサーを含む。増幅したプライマーのそれぞれは、５’末端から３’末端まで、ＰＣＲハンドル配列、固有のランダムな１２マーＵＭＩ、及びテンプレートのスペーサーへの逆相補体である２５マーの配列を含む。テンプレート−マイクロビーズを含有する液滴を封止して、融合装置に選別した後、ＰＣＲ反応は、アダプタを使用して市販のサーマルサイクラーで実行され、各マイクロビーズからのテンプレートの逆相補的配列を増幅させる。増幅した一本鎖ＤＮＡ分子は、自由に拡散性ｍＲＮＡ逆転写プライマーになり、それぞれは、５’末端から３’末端まで、ＰＣＲハンドル配列、固有のランダムな１２マーのＵＭＩ配列、２５マーのスペーサー配列、２０マーのバーコード及びおよそ３０マーのポリｄＴからなる。
【００８６】
逆転写及び次世代配列決定ライブラリの増幅
逆転写プライマーを接合したマイクロビーズを含有する液滴８０μｍを利用する実験において、細胞を含有する液滴４０μｍは、実施例１で説明したように融合される。液滴８０μｍが溶解緩衝液及び逆転写試薬も含有するので、細胞は融合した後に溶解する。次の逆転写反応及び次世代配列決定ライブラリ増幅は、「ｄｒｏｐ−ｓｅｑ」（６）及び「ｉｎ−ｄｒｏｐ」（１６）文献で見つけることができる。
【００８７】
プライマーを増幅した液滴を利用する実験において、２つの連続する電気による融合事象を使用する（図８を参照）。プライマーを増幅した液滴８０μｍは、最初に溶解緩衝液及び逆転写試薬を含有する液滴４０μｍに融合されて、上述のように等価な液滴８０μｍを作製する。最初の融合事象の後、液滴サイズだけが約８３μｍに変化するので、細胞を含有する液滴４０μｍは、「ｉｎ−ｄｒｏｐ」（１６）文献に記載のもの及び市販のＳＭＡＲＴ−ｓｅｑ２プロトコルと類似する、細胞溶解ならびに次の逆転写及び配列決定ライブラリ増幅のために再び融合され得る。
【００８８】
実施例３
非常に効果的な細胞収率及びｍＲＮＡ収率を有する、１細胞ｍＲＮＡ配列決定。
【００８９】
この実施例は、図８に示すように電気マルチウェル型アレイを使用する。この装置は、液滴内部で、細胞溶解及びその後の生化学及び酵素反応を連続的に実行する。一般に、最初に、生化学及び／または酵素試薬を含有する直径約１３０μｍの液滴を作製して、それを対形成−融合装置内に選別し、大きなウェルをすべて満たす。次に、濃度２倍の界面活性剤を含む溶解緩衝液と細胞懸濁液を共流させることによって、直径約６０μｍの細胞溶解液滴を、同じ対形成−融合装置の中に作製する。図８の装置の種類は、２つの水相が同じ液滴に共封入されるまで、細胞懸濁液及び溶解緩衝液を分離する剪断流れを制御する。２つの水相を拡散させて混合するのにいくらかの時間を必要とするので、細胞は、検出及び選別位置で液滴形成の直後に溶解しない。実際、対形成−融合装置に選別した後、その核膜を含む細胞が、約２０秒で完全に溶解しただけだったことがわかった。化学／酵素試薬を含有する液滴の量が細胞溶解液滴の約１０倍である場合、界面活性剤の濃度は、液滴融合及びその抑制効果が除去された後に約１１倍に希釈される。しかし、融合した液滴の直径だけが約３％増大するので、それは、融合の次のラウンドで確実に大きなウェルに残っている。
【００９０】
バーコーディングしたｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズと逆転写試薬を共流させることによって、最初に大きな液滴を対形成−融合装置に選別して、反応ウェルのそれぞれを満たす。それから、１細胞を含んでいる小さな液滴を作製し、選別して、１対１で対形成し、上述のように大きい液滴に融合させる。小さいものとは対照的に、直径６０μｍの液滴を使用することで、多い量で生じる大きい浮力に起因して、対形成ウェルでそれらを捕捉するのが容易になり、したがって細胞収率は大部分の充填条件の下で９８％を超える（図１３）。第２に、電気ベースの融合は、界面活性剤（２つの対になった液滴の安定性を低減させることができ、どういうわけか、融合した液滴中の水溶液が、液滴から拡散するのが非常に容易になる）を使用することと比較して、一定の利点を有する。これは、最適温度（例えば、５０℃）で液滴中の逆転写を実行するとき、困難になる可能性がある。図８の電気ベースの種類の装置が誘電力を使用して２つの液滴を融合させる際、融合した液滴は非常に安定したままである。融合した液滴のサイズは、３０分間、５０℃にて液滴中の逆転写インキュベーションした後、最小限の水性拡散または蒸発があることを示す、無視できる変化があった。基板が、バルク反応より非常に少ない量で高濃度である場合、液滴中のｍＲＮＡ逆転写が非常に効率的であると仮定する。実際、細胞溶解と２倍の界面活性剤の長所を組み合わせると、このプロトコルは、他の液滴ベースの１細胞配列決定プラットフォームと比較したとき、総配列リードの２倍未満を使用して、細胞当たり同じ遺伝子を検出することができ、それは、ＳＣＲＢ−Ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡｓｅｑ技術を使用可能な、最高ｍＲＮＡ収率のすべての固有な分子識別子として使用される低細胞スループットプラットフォーム）と適合する［（Ｚｉｅｇｅｎｈａｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１７，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６５：６３１−６４３）の図３］。液滴中の逆転写は、他のすべて液滴ベースのプラットフォームによって使用されるバルク反応で起きる、異なる細胞間の遺伝子検出汚染も完全に回避する。
【００９１】
実施例４
１細胞ｍＲＮＡの検出
この実施例は、オフチップ及びオンチップの液滴移行を排除する、液滴選別及び静止液滴融合を連続的に統合する、複合型プラットフォームを記載する。この方法は、静止アレイ形式の２つ以上の異なる種類の液滴の添加剤による融合を可能にする。１細胞反応器に溶解緩衝液とＲＴ−ＬＡＭＰ（逆転写ループ介在等温増幅）の混合物を連続的に加えることによって、その遺伝子発現によって異なる細胞型を区別することを可能にする、単純かつ迅速なｍＲＮＡ検出技術を示した。細胞分離、選別、溶解及びＲＮＡ検出を含む、完全オンチップワークフローは、多種多様な１細胞分析に頑強な実験パイプラインを提供する。
【００９２】
ＳｏｒｔＮ融合プラットフォームを使用する、１細胞ＲＴ−ＬＡＭＰ分析のワークフロー
Ｓｃ−ＲＴ−ＬＡＭＰ分析には２つの重要な工程、細胞溶解及びＲＴ−ＬＡＭＰ反応があり、それは、液滴Ａ及び液滴Ｂで別々に実行した（図１１）。ＬＡＭＰ反応混合物、蛍光色素及び金属消光剤を含有する液滴Ａは、最初に流れ集束構造によって作製されて、融合装置に集められた（図１１のａ、ｄ）。融合装置は、大きいフローチャネル及びその上面のマイクロウェルチャンバのアレイからなる。マイクロウェルの形状は、異なるサイズの２つの液滴（液滴Ａ：１３０μｍ、液滴Ｂ：６０μｍ）だけに適合するように設計された。これによって、各マイクロウェルチャンバが物理的接触により２つの液滴を格納するのが可能になる。反応混合物を有する液滴は、装置を傾けることによってフローチャネルを通って広がり、マイクロウェルチャンバ内に流れ出ることができる。フローチャネルに残っている捕捉されていない液滴は、追加の油流を適用することにより洗浄され得る。
【００９３】
次に、細胞及び緩衝剤を含有する液滴は、１細胞懸濁液及び溶解／ＰＢＳ緩衝液を共流させることによって作製した（図１１のｂ）。１細胞を含有する液滴を分化するために、細胞を蛍光色素で事前に染色した。同じ装置の中で、１細胞を含有する液滴（液滴Ｂ）は、ＦＡＤＳ（蛍光活性化液滴選別）によって収集口に直ちに選別され、マイクロボア管を介して融合装置へ移された。選別後の液滴Ｂはマイクロウェルの残りのスペースを占有し、液滴Ａ及びＢの対を形成した。液滴対は、ＡＣ電極界によって１つの液滴に融合した（図１１のｃ）。細胞溶解が、界面活性剤が存在した場所によって、液滴Ｂまたは融合液滴のいずれかで起こった。細胞が溶解した後、６２℃でＲＴ−ＬＡＭＰ反応を開始した（図１１のｅ）。６つのＬＡＭＰプライマーを、特定のｍＲＮＡの６つの領域を標的にするために使用した。標的ｍＲＮＡが液滴（細胞）の中に存在する場合、指数関数的な増幅を開始することができ、非常に短い時間（１０〜２０分）で大量のＤＮＡ産物を作製した。ＬＡＭＰ反応の検出は、蛍光強度の変化に基づいた。図１２は、１細胞ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の前（図１２のａ、ｂ）及びその後（図１２のｄ、ｅ，ｆ）の蛍光画像を示す。蛍光信号の増加は、精製されたＤＮＡテンプレートの約３．４倍である。細胞可溶化物は、細胞異質性のため、信号の広い分布を示す（図１２のｃ、ｅ，ｆ）。沈殿したＬＡＭＰ産物の存在は、白色光画像でも確認できる（図１２のｅ）。１回の実験は、わずか２０μｌのＲＴ−ＬＡＭＰ試薬を使用して１時間で終了できる。１つの装置に６７６のマイクロウェルを備える設計を使用した。１実験当たりの細胞数は、マイクロウェルアレイの数を変える、または複数の融合装置に連続的に液滴を選別することによって容易に拡大できる。
【００９４】
１細胞捕捉の実施
この液滴操作パイプラインの性能を評価するために、液滴捕捉、液滴対形成、１細胞分離及び液滴融合を含む、各工程の効率を試験した（図１３）。各工程の効率は、１つの装置のマイクロウェルの総数によって分けられる、所望の液滴を含むマイクロウェルの数として定義する。第１工程で、ＬＡＭＰ反応物を有する液滴が入れられて、９９．６％の平均捕獲効率を得た。塵または破片の望ましくなく捕捉のため、ときおり空のウェルがあった。第２工程で、細胞を含有する小さい液滴が入れられて、９９．３％の平均対形成効率を得た。対形成効率のわずかな減少は、反復する液滴捕獲からの誤差の蓄積のためだった。すべての液滴対の中で、その７％は複数の細胞を含み、それはポアソン分布で予測した４．９％の推定値よりわずかに高い
【００９５】
【数５】
2021509024.tif 000007
。その高い数のダブレット比は、不成功の解離による細胞のクラスターによってもたらされたと判明した。液滴中に複数の細胞がある可能性は、細胞懸濁液の高い希釈率、または１細胞懸濁液の改善した調製プロトコルによって最小化することができる。共流または添加剤による融合のいずれかによる、従来の液滴融合方法で、希釈を高めることは試薬コストを増加させることを示す。本方法で、細胞または反応混合物を有する液滴を別々に作製するので、希釈した試料の唯一のコストは、液滴を選別する時間が長くなることである。これは、最高３０ｋＨｚの液滴選別速度などの高い選別スループットで相殺されることができる。最後に、液滴対は、液滴アレイ全体にわたるＡＣ電界の短いパルス（８００Ｖｐ、１０Ｋｈｚ、持続０．５秒）で融合された。９９％超を達成した平均融合効率は、ＬＡＭＰ反応混合物及び１細胞を含有する９１．７％のマイクロウェル、ならびに７％の複数の細胞を有するものの最終効率をもたらした。残りの１．３％のマイクロウェルは、１液滴または融合していない液滴対を含んだ。液滴融合の失敗は、隣接する液滴と物理的接触を形成できない、より小さいサイズのいくつかの外れ値の液滴が原因だった。
【００９６】
ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の最適化
溶解緩衝液中の可溶化界面活性剤Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０はポリマー連鎖反応（ＰＣＲ）に良好な影響力を示したが、ＬＡＭＰ反応に関しては類似の研究がない。ＬＡＭＰ分析のＮＰ−４０濃度を最適化するために、限られたｊｕｒｋａｔ細胞（２５μｌの反応器当たりの５００及び５，０００細胞）による、直接的な細胞溶解及びＲＴ−ｑＬＡＭＰによるｍＲＮＡ増幅の３つの条件を、リアルタイムＰＣＲ装置を使用して試験した。図１４は、異なるプロトコルのリアルタイムＬＡＭＰの結果を示す（図１４のｂ、ｃ）。高濃度のＮＰ−４０（０．５％、プロトコルＢ）を含有するＬＡＭＰ反応混合物は、低濃度のＮＰ−４０（０．２５％、プロトコルＣ）より多くの抑制効果を示した。それは、低濃度のＮＰ−４０が、ＲＴ転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼの良好な活性をもたらすことを示唆する。しかし、哺乳動物細胞を溶解させるためのＮＰ−４０の典型的な濃度が約０．５〜１％なので、ＮＰ−４０濃度を更に低減する場合、それが十分な溶解効果を有することができない可能性がある。したがって、最初に０．５％のＮＰ−４０に細胞を溶解させることと、１：１０の希釈率（プロトコルＣ）でＬＡＭＰ反応混合物に細胞可溶化物を加えることと、の２工程プロトコルを設計した。これは、溶解工程で高濃度のＮＰ−４０を維持したが、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応ではその抑制効果を最小化した。リアルタイムＲＴ−ＬＡＭＰの結果は、２工程プロトコルが、低濃度のＮＰ−４０による１工程プロトコルよりわずかに良好な性能を有することも示唆する。
【００９７】
１細胞及びバルクＲＴ−ＬＡＭＰ分析の比較
従来のバルク分析の結果と、本発明の新しい液滴ベースの１細胞分析の間の関係を検討するために、ＲＴ−ＬＡＭＰ分析の反応器の容積を２５マイクロリットルから１．３ナノリットルまで縮小させた。反応器当たりの細胞数も約５００から１細胞まで減らして、反応器の数は１から６７６まで増加した。２工程プロトコルが両方の１工程プロトコルより良い感度を有する、１細胞分析での類似の傾向を観察した。興味深いことに、０．２５％のＮＰ−４０での２工程プロトコルと１工程プロトコルの間に有意差があるとわかったが、バルク分析では小さい違いがあるだけだった。それは、異なる数の初期テンプレートで説明できる。バルク分析で、何百もの細胞からのＲＮＡテンプレートを有し、ＬＡＭＰ反応は非常に感度が高いため、わずか数十のテンプレートが連鎖反応を開始させるために必要だった。溶解または増幅条件が最適でなくても、増幅工程を開始する大きな機会はまだある。しかし、１細胞分析で、初期テンプレートは非常に珍しい。分析の失敗での任意の工程及び結果の間に、その貴重で精巧なｍＲＮＡテンプレートを失う可能性がある。したがって、２工程プロトコルを、反応の感受性を最大化するために使用できる。更に特定の配列または細胞型の検出限界を特徴づけるために、ＲＮＡスパイクイン実験を実施できる。
【００９８】
種々の細胞型にわたるＨＭＢＳ遺伝子発現の測定
２つのヒト細胞系（Ｊｕｒｋａｔ及びＫ５６２）及びマウス細胞系（Ｎｕｒｏ−２Ａ）のＨＭＢＳ遺伝子発現を、このシステムを使用して測定した。約６００細胞の各細胞系及び１つのバックグラウンド群（液滴はＰＢＳ緩衝液だけを含む）は、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応のための個々の融合チップに選別された。文献に記載されるように、骨髄組織として、Ｋ５６２細胞は高水準のＨＭＢＳタンパク質を発現し、それらは通常、ＨＭＢＳ遺伝子の検出の陽性対照とみなされる。一方で、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、中間のＨＭＢＳ発現を有するとみなされる。図１５は、本発明のｓｃ−ＲＴ−ＬＡＭＰ分析の定量化結果を示す。ｊｕｒｋａｔ及びＫ５６２細胞系の両方は、Ｎｕｒｏ−２Ａ及び陰性対照（それぞれ、０．９％及び５％）より高いＨＭＢＳ遺伝子を発現する集団（それぞれ、６２％及び９６％）を示す。プライマーがヒトヒドロキシメチルビランシンターゼ遺伝子のために特別に設計されていたので、結果は予想に一致する。更に、ｊｕｒｋａｔ細胞より、Ｋ５６２から高い平均信号を観察した。これは、Ｋ５６２細胞群がｊｕｒｋａｔ細胞より少ないＣｑ値を示す（支持データ）バルク測定からの結果とも整合している。
【００９９】
このプラットフォームのループ介在等温増幅を使用することによって、標的ｍＲＮＡは、１細胞溶解物を有する液滴で３０分以内に自発的に増幅され、急速かつ高特異的な転写物測定を可能にした。３つの異なる試料、Ｋ５６２、ｊｕｒｋａｔ及びＮｕｒｏ−２Ａ細胞系は、このプラットフォームを使用してスクリーニングした。高いＨＭＢＳ発現レベルを示しているヒト細胞（Ｋ５６２及びｊｕｒｋａｔ）は、マウス細胞及び陰性対照と明らかに区別された。更にＫ５６２細胞は、予想どおり、統計分析でｊｕｒｋａｔ細胞より高いＨＭＢＳ発現レベルを示した。
【０１００】
参照文献
１．Ｍａｚｕｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，２０１３，８，８７０−８９１．
２．Ｋｏｎｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１３，３，３１７９．
３．Ｓｊｏｓｔｒｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１４，１４，８０６−１３．
４．Ｓｈｅｍｂｅｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１６，１６，１３１４−１３３１．
５．Ｒｏｔｅｍ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１５，３３，１１６５−７２．
６．Ｍａｃｏｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１５，１６１，１２０２−１２１４．
７．Ｋｏｎｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，２０１６，１８，２５９−８４．
８．Ｓａｎｔｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．（Ｃａｍｂ）．，２００９，  １，５９５−６０１．
９．Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１５，３４３９−３４５９．
１０．Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１５，６：３．
１１．Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１３，１３，１７１−１７８．
１２．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１５，１５，３９８９−３９９３．
１３．Ｅｄｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２００８，８，１２６２−１２６４．
１４．Ｌａｇｕｓ  ａｎｄ  Ｅｄｄ，ＲＳＣ  Ａｄｖ．，２０１３，３，２０５１２．
１５．Ａｂａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２００９，９，２６２８−２６３１．
１６．Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１５，１６１，１１８７−１２０１．
１７．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１４，１４，５０９−１３．
１８．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ．Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２０１６，  ２０  ，１−９．
１９．Ｆｒａｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１１，１１，４２２８．
２０．Ｂａｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２００９，９，１８５０−８．
２１．Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，  ４  ，３７４．
２２．Ａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，２００３，８２，３６４−３６６．
２３．Ｂａｒｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１０，１０，２０３２．
本明細書に記載のすべての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の上述の方法及び構成要素の様々な修正及び変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明白であろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本発明がこのような特定の実施形態に過度に制限されてはならないことは理解されよう。実際、関連分野の当業者には明らかである本発明を実施するための記載されている方法の種々の変更は、以下の特許請求の範囲内であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】パネルａ〜ｄを示す。パネルａは、２つの異なる粒子の封入に関する、従来の共流方式を示す。２つの個々のポアソン事象のため、一対の２つの異なる粒子を含有する液滴の集団は、わずかな部分を構成する。図１のｂは、最初に１つの粒子を封入する液滴を選別して、続いて、それぞれが異なる粒子を含有する、２つの選別した液滴を対にして融合することを含む方法を示す。その結果、選別した液滴のほぼ１００％は、１つの粒子だけを含有する。そうして、融合した液滴は、正確に２つの異なる粒子を含むことがわかる。図１のｃは、液滴作製／選別装置のＣＡＤ配置を示す（上面図）。図１のパネルｄは、流れ集中ゾーンの寸法を示す。大きな（８０μｍ）液滴を作製するには、Ｂ＝Ｃ＝６０μｍ、Ａ＝Ｄ＝７０μｍ、チャネル高さ＝７０μｍである。小さな（４０μｍ）液滴については、Ａ＝Ｂ＝３０μｍ、Ｃ＝２５μｍ、Ｄ＝４０μｍ、チャネル高さ＝４５μｍである。
【図２】図２のａは、液滴作製／選別及び液滴融合装置からなる、マイクロ流体システムの一実施形態の代表的な概略図を示す。図２のｂは、代表的な液滴作製工程を示す。それぞれ１つの粒子を含有する、油中の水の液滴は、流れ集中構造で発生する。図２のｃは、代表的な液滴選別工程を示す。（ｂ）で作製する液滴は、光活性化選別によって、下流の液滴融合装置に接続する上流の排出チャネルに選別される。白い破線の円は、レーザー光線を照らして液滴光信号を収集する、埋め込み光ファイバに隣接する照合ゾーンの位置を示す。融合装置は、２つの異なるサイズの液滴が捕捉されて対にされる、１１５２つの捕獲位置からなる。図２のｄは、融合装置で、直径８０μｍのマイクロビーズを含有する液滴と対になった、直径４０μｍの１つの細胞を含有する液滴の画像を示す。スケールバーは１００μｍ。図２のｅは、代表的な液滴融合装置の上面図を示す。外線はマイクロ流体チャネルの構造を表し、内部パターンはマイクロウェルの配列を表す。Ｌ＝２５ｍｍ、ｗ＝２ｍｍ。アレイサイズ＝９行×１２８列＝１１５２のマイクロウェル。図２のｆは、装置の側面図を示す（図面は縮尺どおりではない）。ｈ１＝１００μｍ、ｈ２＝５００μｍ、ｈ３＝４０μｍ、ｈ４＝７０μｍ。図２のｇは、アレイの格子構造を示す。ａ１＝４５μｍ、ａ２＝８０μｍ、ａ３＝１４０μｍ。
【図３】異なるオリジナル油（Ｑ０）、水（Ｑｗ）及び分散油（Ｑｓ）の流量（μｌ／分）の下で、作製した液滴の直径Ｄ（μｍ）及びスループット（ｓ−１）。２つの異なる開口構造（２５μｍ×４０μｍ及び７０μｍ×７０μｍ）を備える装置は、直径４０±４μｍ及び８０±８μｍの液滴を作製するために使用する。Ｑｓは、２つの隣接する液滴の間の最小距離Ｓ〜ｌ２＊Ｄを保証するために設定される。したがって、Ｑｓ＝（Ｓ・Ｑｗ）−Ｑｏ。図３のｂ及びｃは、実施例１に記載されている液滴作製／選別装置から作製する、液滴の画像を示す。図３のｂは、マイクロビーズを含有する直径８０μｍの液滴を示す。液滴の約９８％は、１つ以上のビーズを含有する。図３のｃは、細胞を含有する直径４０μｍの液滴を示す。液滴の約９９．９４％は、１つ以上の細胞を含有する。
【図４】ａ〜ｄは、代表的な液滴の捕捉、対形成、融合工程の経時的な概略図（側面図）及び画像（上面図）を示す。黒の矢印は、各工程で優勢だった力を示す。（ａ）液滴融合装置に導入された８０μｍ（大きい）液滴は、最初に浮力によって捕獲位置に落ち着く。底部チャネルの流量は、液滴捕捉中はほとんどゼロであり、非捕捉液滴を洗い流している間は０より大きい。（ｂ）同様に、４０μｍ（小さい）液滴を捕捉して、すでに捕獲位置に捕捉されている大きな液滴と対にする。（ｃ）抗乳化剤を含有する外部の流れを使用して、抵抗力によって２つの対になった液滴を作製して、それを融合させる。（ｄ）再安定化させた後、液滴は装置を反転させることにより放出され得る。（ｅ）１１５２つのマイクロウェルの融合装置中の投入液滴の数対捕捉液滴の数大きな点と小さい点は、それぞれ８０μｍ（大きい）及び４０μｍ（小さい）液滴を示す。保持率（灰色の破線）は、捕捉液滴の数／投入液滴の数と定義される。占有（右軸）は、捕捉液滴の数／利用可能な捕捉位置の数と定義される。
【図５】ａは、代表的な液滴融合装置で融合した液滴の走査画像を示す。蛍光性Ｈｅｌａ細胞及びマイクロビーズは、各液滴中に１対１で共封入される。図５ｂは、細胞の数（κａ）及びビーズの数（κｂ）を含む液滴の割合を示すヒストグラムを示す。共流法から生じる推定される共封入は、λａ＝λｂ＝１または０．１のポアソン統計にも基づいてプロットされる。５セットの実験を繰り返した（各試験の液滴の平均数＝１０８０）。
【図６】Ａは、空の液滴（ピーク値−０．１Ｖ）及びビーズを含有する液滴から検出される、時系列の散乱光信号（濃い線）を示す。薄い線は、選別事象を起こすＴＴＬ信号を示す。ｘ軸は、システムのクロック表示を表す（時間：分：秒：ミリ秒）。図６のＢは、細胞を含有する液滴から検出される蛍光信号を示す。空の液滴には蛍光分子がなく、したがって、検出することができない。図６のＣ及びＤは、（Ａ）及び（Ｂ）から抽出したビーズ（Ｃ）及び細胞（Ｄ）の検出ピーク値のヒストグラムである。薄い線は、選別ゲート値を示す。
【図７】空の液滴及び細胞を含有する液滴から検出される、散乱信号を示す。薄い線は、細胞選別事象が蛍光標識なしで引き起こされ得ることを示す。これは、混合細胞集団（例えば、血液）を含む試料から、大きい細胞（例えば、循環癌細胞）を小さい細胞（例えば、赤血球）と区別するためにも使用できる。
【図８】Ａは、電気パルスを介して（誘電力により液滴融合を生じさせる）正確な液滴融合の繰り返しを可能にする、両側に沿った一対の埋め込み電線を含む、マルチウェルアレイを示す。図８のＢの左側は図８Ａの拡大図に示し、図８のＢの右側はマルチウェルアレイの透過光の画像を示す。矢印は、高電圧電源に接続する電線を示す。
【図９】Ａは、１つの大きな液滴だけを受けて（液滴の浮力によって上へ浮く）、大きな液滴が適所にあるならば、１つの小さくサイズ設定された液滴だけを受ける（再度、液滴の浮力によって上へ浮く）ようにサイズ設定されるマイクロウェルである、代表的な捕獲位置の側面図を示す。大きい及び小さい液滴が浮力の代わりに重力によって捕獲されることを除いて、図９のＢは同じ代表的な捕獲位置を示す。図９のＣは、最初に流れる１つの最大液滴（例えば、直径８０μｍ）だけを最初に捕捉して、そうして２番目に流れる１つの中型の液滴（例えば、直径４０μｍ）だけを捕捉して、最後に３番目に流れる１つの最小液滴（例えば、直径２０μｍ）だけを捕捉するようにサイズ設定される、３つの相互連結したマイクロウェルからなる代表的な捕獲位置の上面図を示す。３つの捕捉した液滴は、本明細書に記載のとおり融合されることができる（例えば、抗乳化剤または電荷を加えることによって）。図９のＤは、図９のＣに示す捕獲位置に第４のマイクロウェルを加える、代表的な捕獲位置を示す。この第４のマイクロウェルは、図９Ｃの最小液滴より更に小さく（例えば、直径８μｍ）、最後に流れる液滴を受ける。更に小さいウェル（例えば、５、６、７またはそれ以上の液滴を捕獲するのに役立つ）を加える追加の実施形態は、本明細書の方法で構築され使用され得る。
【図１０】Ａ（左側）は、種々の捕獲位置を含む、代表的なフローセルの上面図を示す。捕獲位置は、２つの融合マイクロウェル（大きなウェルに連結される小さいウェル）及び捕獲セル内に液滴を収集するように位置する捕獲ペグ（正方形及び長方形）からなり、図１０のＡの右側に示される。操作中、小さい大きさの液滴（例えば、細胞を含む）は、最初にフローセル中に入れられる。図１０のＢは、小さい液滴が小さいマイクロウェルを占領すると、他の小さい液滴は同じウェルを占領することからブロックされて、次の占領されていない小さいウェルに捕獲されるまで、長方形と正方形の捕獲ペグの間を流れる様子を示す（点線の小さい液滴で示す）。図１０のＣは、大きい液滴（例えば、バーコードを含む）がフローセル中に流される第２工程と、それらが大きなマイクロウェルを占領する様子を示す。大きい液滴が捕獲されると、他の大きい液滴は占有ウェルの横を流れて、次の空の大きなウェルに捕獲される（点線の大きい液滴で示す）。捕捉された液滴は、本明細書に記載されるように融合されることができる（例えば、抗乳化剤または電気によって）。
【図１１】実施例４からＳｏｒｔ  Ｎ’融合プラットフォームを使用する、１細胞ＲＴ−ＬＡＭＰアッセイの概略図を示す。（ａ）ＬＡＭＰ試薬を含有する液滴（液滴Ａ）は、最初に液滴作製器１によって作製されて、融合装置に格納される。（ｂ）１つの細胞及び溶解緩衝液を含有する液滴（液滴Ｂ）を作製して、融合装置内に選別する。液滴Ａ及び液滴Ｂを固定して、浮力及び物理トラップによって対にする。（ｃ）対にした液滴を、電気流体力学力によって融合させる。ＲＴ−ＬＡＭＰ反応は、３０分間、６２℃で実行されて、画像に基づく蛍光測定が続く。（ｄ）液滴の成分。（ｅ）ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の原理。
【図１２】実施例４から選択Ｎ’融合装置の２工程ＲＴ−ＬＡＭＰの可視化を示す。ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の前（ａ）及びその後（ｂ）の液滴の蛍光画像。（ｃ）ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の前後での正規化した強度変化（Ｉ＿ｂ−Ｉ＿ａ）／Ｉ＿ａ。拡大した透過光及び蛍光画像は、それぞれ、融合前（ｄ）及び融合／ＲＴ−ＬＡＭＰ反応の後（ｅ）の細胞含有液滴を有する融合ウェルを示す。融合後のＲＴ−ＬＡＭＰ反応のない融合ウェルの同じ画像（ｆ）。
【図１３】実施例４から融合装置効率の定量を示す。（ａ）液滴格納アレイの対になった液滴の画像。破線の円は、液滴Ｂに複数の細胞があることを示す。（ｂ）液滴の捕獲、対形成及び融合の効率。斜め線の入った棒グラフは、１つ以上の細胞を含む液滴を示す。
【図１４】実施例４の最適なＲＴ−ＬＡＭＰ効率における２工程の溶解−増幅反応を示す。（ａ）１工程及び２工程ＲＴ−ＬＡＭＰ反応プロトコルの概略図。１工程プロトコルで、細胞懸濁液（２Ｅ５及び２Ｅ６細胞／ｍＬ）２．５μＬを、ＲＴ−ＬＡＭＰ混合物２２．５μＬに加えた。２工程プロトコルで、ｊｕｒｋａｔ細胞の懸濁液（４Ｅ５及び４Ｅ６細胞／ｍＬ）５０μＬを、最初に溶解緩衝液５０μＬに加えて、溶解した細胞溶液２．５μＬを、ＲＴ−ＬＡＭＰ混合物２２．５μＬに加えた。プライマーセットは、ＨＭＢＳ遺伝子から配列を検出するように設計されている。それから細胞及びＲＴ−ＬＡＭＰ混合物は、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラーに置かれて、３０分間６２℃でインキュベートされる。（ｂ）異なる条件下でのリアルタイム定量的測定の代表的な結果。（ｃ）異なるアッセイ条件の表。Ｃｑは、反応が対数期に達している臨界時間であり、ＲＦＵは相対蛍光強度である。Ｃｑ及びＲＦＵは直接的な測定値であり、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラーで測定される。
【図１５】３つの異なるプロトコルによる実施例４からのＲＴ−ＬＡＭＰ結果の箱ひげ図を示す。各点は、１細胞を表す。正規化した強度変化は（Ｉ−Ｉ＿０）／Ｉ＿０と定義され、そこで、Ｉはエンドポイント強度であり、Ｉ＿０は各液滴の初期強度である。実験条件は、反応器の大きさを２５μｌから１．２ｎＬ液滴まで低減することを除いて、図１３と同じである。
【図１６】プロトコルＡ及び他の２つの細胞系（Ｎｕｒｏ−２ａ及びＫ５６２）による、図１５の実験の繰り返しを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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