(57)【要約】  本開示は、血液疾患／異常、例えば鎌状赤血球症、ヘモクロマトーシス、血友病、およびベータサラセミアを処置するための方法および組成物を提供する。例えば、本開示は、HBG1／2のプロモーターを標的化して胎児型ヘモグロビンの発現を増大させる点変異を作り出す治療的なガイドRNAを提供する。別の例として、本開示は、HBB、第VIII因子、およびHFEの変異を標的化して鎌状赤血球症、ベータサラセミア、血友病、およびヘモクロマトーシスを処置する治療的なガイドRNAを提供する。本開示は、DNA上のアデノシンを脱アミノ化するCas9（例えばCas9ニッカーゼ）ドメインとアデノシンデアミナーゼとを含む融合蛋白質をもまた提供する。いくつかの態様では、融合蛋白質は、融合蛋白質をDNA配列（例えばHBG1またはHBG2プロモーター（protmoter）配列、またはHFE、GBB、もしくはF8遺伝子配列）へと標的化するガイドRNA（gRNA）などの核酸との複合体である。かかる複合体は胎児型ヘモグロビンの発現を増大させることまたはHFEの点（poing）変異（例えばC282Y）を修正することに有用であり得る。
2021500036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HBG1またはHBG2遺伝子のプロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上のアデノシン（A）核酸塩基を脱アミノ化するための方法であって、該方法が、プロモーターを塩基編集因子および塩基編集因子に結合したガイドRNAと接触させることを含み、ガイドRNA（gRNA）が、HBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む、前記方法。
【請求項２】
ガイド配列が、プロモーターの標的核酸配列に対して100%相補的である少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の一続きの核酸塩基を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
塩基編集因子が、標的核酸配列にニックを入れる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
標的核酸配列が：
【化１】
2021500036.tif 000189
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
標的核酸配列が、さらに5'末端に5'-CCT-3'を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸配列が、
【化２】
2021500036.tif 000190
を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ガイド配列が：
【化３】
2021500036.tif 000191
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ガイド配列が
【化４】
2021500036.tif 000192
を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸配列が：
【化５】
2021500036.tif 000193
を含み；
配列番号845の位置14のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ガイド配列が：
【化６】
2021500036.tif 000194
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸配列が、
【化７】
2021500036.tif 000195
を含み；
配列番号302の位置21のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、第2の標的核酸配列に対して相補的である第2のガイド配列を含む第2のgRNAを用いて、プロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上の第2のA核酸塩基を脱アミノ化することを含み：
（a）第2の標的核酸が配列番号845を含むか；
（b）第2のガイド配列が配列番号853を含むか；または
（c）（a）および（b）両方である、
請求項10または11に記載の方法。
【請求項１３】
gRNAのガイド配列が：
【化８】
2021500036.tif 000196
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
標的核酸配列が、
【化９】
2021500036.tif 000197
を含み；
配列番号303の位置15、17、18、または19のいずれか1つのTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、第2の標的核酸配列に対して相補的である第2のガイド配列を含む第2のgRNAを用いて、プロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上の第2のA核酸塩基を脱アミノ化することを含み：
（a）第2の標的核酸が配列番号845もしくは配列番号302を含むか；
（b）第2のガイド配列が配列番号853もしくは配列番号259を含むか；または
（c）（a）および（b）両方である、
請求項13または14に記載の方法。
【請求項１６】
gRNAのガイド配列が核酸配列：
【化１０】
2021500036.tif 000198
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的核酸配列が：
【化１１】
2021500036.tif 000199
を含み；
配列番号309の位置22のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、第2の標的核酸配列に対して相補的である第2のガイド配列を含む第2のgRNAを用いて、プロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上の第2のA核酸塩基を脱アミノ化することを含み：
（a）第2の標的核酸が配列番号845、配列番号302、もしくは配列番号303を含むか；
（b）第2のガイド配列が配列番号853、配列番号259、もしくは配列番号260を含むか；または
（c）（a）および（b）両方である、
請求項16または17に記載の方法。
【請求項１９】
gRNAのガイド配列が：
【化１２】
2021500036.tif 000200
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
標的核酸配列が、
【化１３】
2021500036.tif 000201
を含み；
配列番号310の位置19のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、第2の標的核酸配列に対して相補的である第2のガイド配列を含む第2のgRNAを用いて、プロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上の第2のA核酸塩基を脱アミノ化することを含み：
（a）第2の標的核酸が、配列番号845、配列番号302、配列番号303、もしくは配列番号309を含むか；
（b）第2のガイド配列が、配列番号853、配列番号259、配列番号260、もしくは配列番号266を含むか；または
（c）（a）および（b）両方である、
請求項19または20に記載の方法。
【請求項２２】
gRNAのガイド配列が：
【化１４】
2021500036.tif 000202
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
標的核酸配列が、
【化１５】
2021500036.tif 000203
を含み；
配列番号311の位置17のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
さらに、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法を行うことを含む、請求項22または23に記載の方法。
【請求項２５】
gRNAのガイド配列が核酸配列：
【化１６】
2021500036.tif 000204
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
プロモーターの標的核酸配列が、
【化１７】
2021500036.tif 000205
の核酸位置16および17にTを含み；
位置16または17のいずれか1つのTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、T→C変異をもたらす、
請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、第2の標的核酸配列に対して相補的である第2のガイド配列を含む第2のgRNAを用いて、プロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上の第2のA核酸塩基を脱アミノ化することを含み：
（a）第2の標的核酸が、配列番号845、配列番号302、配列番号303、配列番号309、もしくは配列番号311を含むか；
（b）第2のガイド配列が、配列番号853、配列番号259、配列番号260、もしくは配列番号266、もしくは配列番号268を含むか；または
（c）（a）および（b）両方である、
請求項25または26に記載の方法。
【請求項２８】
gRNAのガイド配列が：
【化１８】
2021500036.tif 000206
を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
標的核酸配列が、
【化１９】
2021500036.tif 000207
を含み；
配列番号313の位置15、16、または19のいずれか1つのTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、第2の標的核酸配列に対して相補的である第2のガイド配列を含む第2のgRNAを用いて、プロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上の第2のA核酸塩基を脱アミノ化することを含み：
（a）第2の標的核酸が、配列番号845、配列番号302、配列番号303、配列番号309、配列番号311、もしくは配列番号312を含むか；
（b）第2のガイド配列が、配列番号853、配列番号259、配列番号260、もしくは配列番号266、配列番号268、もしくは配列番号269を含むか；または
（c）（a）および（b）両方である、
請求項28または29に記載の方法。
【請求項３１】
gRNAのガイド配列が：
【化２０−１】
2021500036.tif 000208
【化２０−２】
2021500036.tif 000209
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
標的核酸配列が、
【化２１】
2021500036.tif 000210
を含み；
配列番号319の位置16、21、または22のいずれか1つのTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項28に記載の方法。
【請求項３３】
さらに、第2の標的核酸配列に対して相補的である第2のガイド配列を含む第2のgRNAを用いて、プロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上の第2のA核酸塩基を脱アミノ化することを含み：
（a）第2の標的核酸が配列番号845、配列番号302、配列番号303、配列番号309、配列番号311、配列番号312、もしくは配列番号313を含むか；
（b）第2のガイド配列が配列番号853、配列番号259、配列番号260、もしくは配列番号266、配列番号268、配列番号269、もしくは配列番号270を含むか；または
（c）（a）および（b）両方である、
請求項31または32に記載の方法。
【請求項３４】
gRNAのガイド配列が：
【化２２】
2021500036.tif 000211
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
標的核酸配列が、
【化２３】
2021500036.tif 000212
を含み；
配列番号320の位置17または18のいずれか1つのTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
さらに、第2の標的核酸配列に対して相補的である第2のガイド配列を含む第2のgRNAを用いて、プロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上の第2のA核酸塩基を脱アミノ化することを含み：
（a）第2の標的核酸が、配列番号845、配列番号302、配列番号303、配列番号309、配列番号311、配列番号312、配列番号313、もしくは配列番号319を含むか；
（b）第2のガイド配列が、配列番号853、配列番号259、配列番号260、もしくは配列番号266、配列番号268、配列番号269、配列番号270、もしくは配列番号276を含むか；または
（c）（a）および（b）両方である、
請求項34または35に記載の方法。
【請求項３７】
gRNAのガイド配列が：
【化２４】
2021500036.tif 000213
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
標的核酸配列が、
【化２５】
2021500036.tif 000214
を含み；
配列番号321の位置16または17のいずれか1つのTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、第2の標的核酸配列に対して相補的である第2のガイド配列を含む第2のgRNAを用いて、プロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上の第2のA核酸塩基を脱アミノ化することを含み：
（a）第2の標的核酸が、配列番号845、配列番号302、配列番号303、配列番号309、配列番号311、配列番号312、配列番号313、配列番号319、もしくは配列番号320を含むか；
（b）第2のガイド配列が、配列番号853、配列番号259、配列番号260、もしくは配列番号266、配列番号268、配列番号269、配列番号270、配列番号276、もしくは配列番号277を含むか；または
（c）（a）および（b）両方である、
請求項37または38に記載の方法。
【請求項４０】
gRNAのガイド配列が：
【化２６】
2021500036.tif 000215
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
標的核酸配列が、
【化２７】
2021500036.tif 000216
を含み；
配列番号322の位置16、17、または20のいずれか1つのTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
さらに、第2の標的核酸配列に対して相補的である第2のガイド配列を含む第2のgRNAを用いて、プロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上の第2のA核酸塩基を脱アミノ化することを含み：
（a）第2の標的核酸が、配列番号845、配列番号302、配列番号303、配列番号309、配列番号311、配列番号312、配列番号313、配列番号319、配列番号320、もしくは配列番号321を含むか；
（b）第2のガイド配列が、配列番号853、配列番号259、配列番号260、もしくは配列番号266、配列番号268、配列番号269、配列番号270、配列番号276、配列番号277、もしくは配列番号278を含むか；または
（c）（a）および（b）両方である、
請求項40または41に記載の方法。
【請求項４３】
gRNAのガイド配列が：
【化２８】
2021500036.tif 000217
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
標的核酸配列が、
【化２９】
2021500036.tif 000218
を含み；
配列番号323の位置15のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
さらに、第2の標的核酸配列に対して相補的である第2のガイド配列を含む第2のgRNAを用いて、プロモーターのセンスまたはアンチセンス鎖上の第2のA核酸塩基を脱アミノ化することを含み：
（a）第2の標的核酸が、配列番号845、配列番号302、配列番号303、配列番号309、配列番号311、配列番号312、配列番号313、配列番号319、配列番号320、配列番号321、もしくは配列番号322を含むか；
（b）第2のガイド配列が、配列番号853、配列番号259、配列番号260、もしくは配列番号266、配列番号268、配列番号269、配列番号270、配列番号276、配列番号277、配列番号278、もしくは配列番号279を含むか；または
（c）（a）および（b）両方である、
請求項43または44に記載の方法。
【請求項４６】
プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、プロモーター上のT−A塩基対がプロモーター上のC−G塩基対へと変異させられることをもたらす、請求項1〜45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、遺伝性高胎児型ヘモグロビン症（HPFH）に関連する配列をもたらす、請求項1〜46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HBG1遺伝子の転写の増大に至る、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HBG1蛋白質の増大に至る、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HBG2遺伝子の転写の増大に至る、請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HBG2蛋白質の増大に至る、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HBG1およびHBG2遺伝子両方の転写の増大に至る、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HBG1およびHBG2蛋白質の量の増大に至る、請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
HBG1またはHBG2遺伝子のプロモーターが、細胞内にある、請求項1〜53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
方法が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
細胞が、対象内にある、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
方法が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、遺伝性高胎児型ヘモグロビン症（HPFH）を対象に授ける、請求項56または57に記載の方法。
【請求項５９】
対象が、血液の疾患または異常を有する、請求項56〜58のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
疾患または異常が、貧血である、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
貧血が、鎌状赤血球貧血である、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
疾患または異常が、ベータサラセミアである、請求項59に記載の方法。
【請求項６３】
疾患または異常が、グロビン蛋白質をコードする遺伝子、または遺伝子のプロモーター上の変異によって引き起こされる、請求項59〜62のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
遺伝子がCYGB、HBA1、HBA2、HBB、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、HBM、HBQ1、HBZ、またはMBである、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
HFE遺伝子のセンスまたはアンチセンス鎖上のアデノシン（A）核酸塩基を脱アミノ化するための方法であって、該方法が、HFE遺伝子を塩基編集因子および塩基編集因子に結合したガイドRNAと接触させることを含み、ここでガイドRNAが、HFE遺伝子上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む、前記方法。
【請求項６６】
HFE遺伝子が、C→T変異を含む、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、C→T変異を修正する、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
HFE遺伝子が、Cys→Tyr変異を含む蛋白質をコードする、請求項66に記載の方法。
【請求項６９】
Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、Cys→Tyr変異を修正する、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
ガイド配列が、HFE遺伝子の標的核酸配列に対して100%相補的である少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の一続きの核酸を含む、請求項65〜69のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
塩基編集因子が標的配列にニックを入れる、請求項65〜70のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
HFE遺伝子上の標的核酸配列が：
【化３０】
2021500036.tif 000219
を含む、請求項65〜71のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
標的核酸配列が、さらに5'末端に5'-CCT-3'を含む、請求項72に記載の方法。
【請求項７４】
HFE遺伝子の標的核酸配列が、
【化３１】
2021500036.tif 000220
を含む、請求項65〜73のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
gRNAのガイド配列が、
【化３２−１】
2021500036.tif 000221
【化３２−２】
2021500036.tif 000222
を含む、請求項65〜74のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
gRNAのガイド配列が、さらに5'末端にGを含む、請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
gRNAのガイド配列が、核酸配列
【化３３】
2021500036.tif 000223
を含む、請求項65〜76のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
標的核酸配列が、
【化３４】
2021500036.tif 000224
を含み；
配列番号861の位置16のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項65〜77のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HFE遺伝子上のT−A塩基対がHFE遺伝子上のC−G塩基対へと変異させられることをもたらす、請求項65〜78のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、遺伝性ヘモクロマトーシス（HHC）に関連する配列を修正することをもたらす、請求項65〜79のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HFE遺伝子から転写されるHFE蛋白質の増大した機能に至る、請求項65〜80のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HFE安定性または半減期の増大に至る、請求項65〜81のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
HFE遺伝子が、細胞内にある、請求項65〜82のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
HFE遺伝子が、Cys→Tyr変異を含むHFE蛋白質をコードする、請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
HFE蛋白質がアミノ酸配列：
MGPRARPALLLLMLLQTAVLQGRLLRSHSLHYLFMGASEQDLGLSLFEALGYVDDQLFVFYDHESRRVEPRTPWVSSRISSQMWLQLSQSLKGWDHMFTVDFWTIMENHNHSKESHTLQVILGCEMQEDNSTEGYWKYGYDGQDHLEFCPDTLDWRAAEPRAWPTKLEWERHKIRARQNRAYLERDCPAQLQQLLELGRGVLDQQVPPLVKVTHHVTSSVTTLRCRALNYYPQNITMKWLKDKQPMDAKEFEPKDVLPNGDGTYQGWITLAVPPGEEQRYTCQVEHPGLDQPLIVIWEPSPSGTLVIGVISGIAVFVVILFIGILFIILRKRQGSRGAMGHYVLAER（配列番号750）の残基282のCys→Tyr変異（C282Y）を含む、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
細胞が、不死化リンパ芽球様細胞（LCL）である、請求項83〜85のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
方法が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項65〜86のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
細胞が、対象内にある、請求項65〜85のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
対象が、鉄蓄積異常を有する、請求項88に記載の方法。
【請求項９０】
鉄蓄積異常が、遺伝性ヘモクロマトーシス（HHC）である、請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
方法がｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項88〜90のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９２】
HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、対象の鉄蓄積異常の1つ以上の症状を改善する、請求項90に記載の方法。
【請求項９３】
HBB遺伝子のセンスまたはアンチセンス鎖上のアデノシン（A）核酸塩基を脱アミノ化するための方法であって、該方法が、HBB遺伝子を塩基編集因子および塩基編集因子に結合したガイドRNAと接触させることを含み、ここでガイドRNAが、HBB遺伝子上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む、前記方法。
【請求項９４】
HBB遺伝子が、C→T変異を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９５】
Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、C→T変異を修正する、請求項94に記載の方法。
【請求項９６】
HBB遺伝子が、Glu→Val変異またはGlu→Lys変異を含む蛋白質をコードする、請求項94に記載の方法。
【請求項９７】
Glu→Val変異またはGlu→Lys変異が、アミノ酸配列
【化３５】
2021500036.tif 000225
のアミノ酸位置6にある、請求項96に記載の方法。
【請求項９８】
Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、Glu→Val変異またはGlu→Lys変異を修正する、請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
ガイド配列が、HBB遺伝子の標的核酸配列に対して100%相補的である少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の一続きの核酸を含む、請求項93〜98のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
塩基編集因子が、標的配列にニックを入れる、請求項93〜99のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
HBB遺伝子上の標的核酸配列が：
【化３６】
2021500036.tif 000226
を含む、請求項93〜100のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
標的核酸配列が、
【化３７】
2021500036.tif 000227
を含み、
配列番号324の位置17のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項101に記載の方法。
【請求項１０３】
標的核酸配列が、
【化３８】
2021500036.tif 000228
を含み、
配列番号325の位置18のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項101に記載の方法。
【請求項１０４】
標的核酸配列が、
【化３９】
2021500036.tif 000229
を含み；
配列番号331の位置22のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項101に記載の方法。
【請求項１０５】
HBB遺伝子上の標的核酸配列が、
【化４０】
2021500036.tif 000230
を含み、
配列番号332の位置15のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項101に記載の方法。
【請求項１０６】
HBB遺伝子上の標的核酸配列が、
【化４１】
2021500036.tif 000231
を含み、
配列番号333の位置23のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項101に記載の方法。
【請求項１０７】
HBB遺伝子上の標的核酸配列が、
【化４２】
2021500036.tif 000232
を含み、
配列番号334の位置17のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項101に記載の方法。
【請求項１０８】
gRNAのガイド配列が、
【化４３】
2021500036.tif 000233
を含む、請求項93〜107のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
gRNAのガイド配列がさらに5'末端にGを含む、請求項108に記載の方法。
【請求項１１０】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HBB遺伝子上のT−A塩基対がHBB遺伝子上のC−G塩基対へと変異させられることをもたらす、請求項93〜109のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、鎌状赤血球症に関連する配列を修正することをもたらす、請求項93〜110のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HbCベータサラセミアに関連する配列を修正することをもたらす、請求項93〜110のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HBB遺伝子から転写されるベータグロビン蛋白質の増大した（increase）機能に至る、請求項93〜112のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、ベータグロビン安定性または半減期の増大に至る、請求項93〜113のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
HBB遺伝子が、細胞内にある、請求項93〜114のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項93〜115のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
細胞が、対象内にある、請求項93〜116のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
対象が、鎌状赤血球症を有する、請求項117に記載の方法。
【請求項１１９】
対象が、ベータサラセミアを有する、請求項117に記載の方法。
【請求項１２０】
対象がHbCベータサラセミア（ヘモグロビンC疾患）を有する、請求項119に記載の方法。
【請求項１２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項93〜120のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、対象の鎌状赤血球症の1つ以上の症状を改善する、請求項118に記載の方法。
【請求項１２３】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、ベータサラセミアの1つ以上の症状を改善する、請求項119または120に記載の方法。
【請求項１２４】
HBB遺伝子が、Glu→Lys変異を含む蛋白質をコードする、請求項94に記載の方法。
【請求項１２５】
Glu→Lys変異が、アミノ酸配列
【化４４】
2021500036.tif 000234
のアミノ酸位置26にある、請求項124に記載の方法。
【請求項１２６】
Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、Glu→Lys変異を修正する、請求項125に記載の方法。
【請求項１２７】
ガイド配列が、HBB遺伝子の標的核酸配列に対して100%相補的である少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の一続きの核酸を含む、請求項124〜126のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
塩基編集因子が、標的配列にニックを入れる、請求項124〜127のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
HBB遺伝子上の標的核酸配列が：
【化４５】
2021500036.tif 000235
を含む、請求項124〜128のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
HBB遺伝子上の標的核酸配列が、
【化４６】
2021500036.tif 000236
を含み、
配列番号335の位置15のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項129に記載の方法。
【請求項１３１】
HBB遺伝子上の標的核酸配列が、
【化４７】
2021500036.tif 000237
を含み、
配列番号336の位置16のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項129に記載の方法。
【請求項１３２】
HBB遺伝子上の標的核酸配列が、
【化４８】
2021500036.tif 000238
を含み、
位置19のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、
請求項129に記載の方法。
【請求項１３３】
gRNAのガイド配列が、
【化４９】
2021500036.tif 000239
を含む、請求項124〜132のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
gRNAのガイド配列が、さらに5'にGを含む、請求項133に記載の方法。
【請求項１３５】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HBB遺伝子上のT−A塩基対がHBB遺伝子上のC−G塩基対へと変異させられることをもたらす、請求項124〜134のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HbEベータサラセミアに関連する配列を修正することをもたらす、請求項124〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、HBB遺伝子から転写されるベータグロビン蛋白質の増大した（increase）機能に至る、請求項124〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、ベータグロビン安定性または半減期の増大をもたらす、請求項124〜137のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
HBB遺伝子が、細胞内にある、請求項124〜138のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項124〜139のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
細胞が、対象内にある、請求項124〜140のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
対象が、ベータサラセミアを有する、請求項141に記載の方法。
【請求項１４３】
対象が、HbEベータサラセミア（ヘモグロビンE疾患）を有する、請求項142に記載の方法。
【請求項１４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項124〜143のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、ベータサラセミアの1つ以上の症状を改善する、請求項141、142、または144に記載の方法。
【請求項１４６】
F8遺伝子を塩基編集因子および塩基編集因子に結合したガイドRNAと接触させることを含み、ガイドRNAが、F8遺伝子上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む、F8遺伝子のセンスまたはアンチセンス鎖上のアデノシン（A）核酸塩基を脱アミノ化するための方法。
【請求項１４７】
F8遺伝子が、C→T変異を含む、請求項146に記載の方法。
【請求項１４８】
Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、C→T変異を修正する、請求項147に記載の方法。
【請求項１４９】
F8遺伝子が、Arg→Cys変異を含む蛋白質をコードする、請求項148に記載の方法。
【請求項１５０】
Arg→Cys変異が、アミノ酸配列
【化５０−１】
2021500036.tif 000240
【化５０−２】
2021500036.tif 000241
のアミノ酸位置612にある、請求項149に記載の方法。
【請求項１５１】
Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、Arg→Cys変異を修正する、請求項150に記載の方法。
【請求項１５２】
ガイド配列が、F8遺伝子の標的核酸配列に対して100%相補的である少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の一続きの核酸を含む、請求項146〜151のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
塩基編集因子が標的配列にニックを入れる、請求項146〜152のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
F8遺伝子上の標的核酸配列が：
【化５１】
2021500036.tif 000242
を含む、請求項146〜153のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
F8遺伝子上の標的核酸配列が、
【化５２】
2021500036.tif 000243
を含み、
配列番号388の位置20のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、請求項154に記載の方法。
【請求項１５６】
F8遺伝子上の標的核酸配列が、
【化５３】
2021500036.tif 000244
を含み、
配列番号339の位置18のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸配列上のT→C変異をもたらす、請求項154に記載の方法。
【請求項１５７】
gRNAのガイド配列が、
【化５４】
2021500036.tif 000245
を含む、請求項146〜156のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
gRNAのガイド配列が、さらに5'末端にGを含む、請求項157に記載の方法。
【請求項１５９】
F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、F8遺伝子上のT−A塩基対がF8遺伝子上のC−G塩基対へと変異させられることをもたらす、請求項146〜158のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、血友病に関連する配列を修正することをもたらす、請求項146〜159のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
血友病が、血友病Aである、請求項160に記載の方法。
【請求項１６２】
F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、血友病に関連する配列を修正することをもたらす、請求項146〜161のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、F8遺伝子から転写される第VIII因子蛋白質の増大した機能に至る、請求項146〜162のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、第VIII因子安定性または半減期の増大に至る、請求項146〜163のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
F8遺伝子が、細胞内にある、請求項146〜164のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項146〜165のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
細胞が、対象内にある、請求項146〜166のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
対象が、血友病を有する、請求項167に記載の方法。
【請求項１６９】
対象が、血友病Aを有する、請求項168に記載の方法。
【請求項１７０】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項146〜169のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することが、対象の血友病の1つ以上の症状を改善する、請求項168または169に記載の方法。
【請求項１７２】
塩基編集因子が、（i）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）と（ii）アデノシンデアミナーゼとを含む融合蛋白質を含む、請求項1〜171のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
融合蛋白質が、さらに核局在シグナル（NLS）を含む、請求項172に記載の方法。
【請求項１７４】
NLSが、双節型NLSである、請求項173に記載の方法。
【請求項１７５】
NLSが、アミノ酸配列MKRTADGSEFEPKKKRKV（配列番号342）、KRTADGSEFEPKKKRKV（配列番号343）、またはPKKKRKV（配列番号4）を含む、請求項173または174に記載の方法。
【請求項１７６】
アデノシンデアミナーゼが、E. coli TadA（ecTadA）である、請求項172〜175のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、または802〜805のいずれか1つと少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%、または99.5%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%、または99.5%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、または802〜805のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、または802〜805のいずれか1つのアミノ酸配列からなる、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1のH36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のデアミナーゼの対応する変異の1つ以上を含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1のH36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のデアミナーゼの対応する変異のそれぞれを含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８３】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1のH36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のデアミナーゼの対応する変異の1つ以上を含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８４】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1のH36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のデアミナーゼの対応する変異のそれぞれを含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８５】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1のW23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のデアミナーゼの対応する変異の1つ以上を含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1のW23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のデアミナーゼの対応する変異のそれぞれを含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1のW23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のデアミナーゼの対応する変異の1つ以上を含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1のW23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のデアミナーゼの対応する変異のそれぞれを含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1のW23R、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のデアミナーゼの対応する変異の1つ以上を含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1のW23R、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のデアミナーゼの対応する変異のそれぞれを含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1の図7のABEのいずれか1つからの1つ以上の変異、または別のデアミナーゼの1つ以上の対応する変異を含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号1の図7のABEのいずれか1つからの変異、または別のデアミナーゼの対応する変異のそれぞれを含む、請求項172〜176のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９３】
核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）が、Cas9ドメイン、Cpf1ドメイン、CasXドメイン、CasYドメイン、C2c1ドメイン、C2c2ドメイン、またはC2c3ドメインである、請求項172〜192のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
Cas9ドメインが、デッドなCas9（dCas9）ドメイン、Cas9ニッカーゼ（nCas9）ドメイン、およびヌクレアーゼ活性なCas9ドメインからなる群から選択される、請求項193に記載の方法。
【請求項１９５】
Cas9ドメインが、Cas9ニッカーゼ（nCas9）ドメインである、請求項194に記載の方法。
【請求項１９６】
Cas9ニッカーゼドメインが、配列番号35に提示されているアミノ酸配列を含む、請求項195に記載の方法。
【請求項１９７】
融合蛋白質が、さらに、核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）とアデノシンデアミナーゼとの間に1つ以上のリンカーを含む、請求項172〜196のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９８】
1つ以上のリンカーが、配列番号10、37〜40、384〜386、685〜688、または800〜801のいずれか1つに提示されているアミノ酸配列を含む、請求項197に記載の方法。
【請求項１９９】
リンカーが、配列番号800に提示されているアミノ酸配列を含む、請求項198に記載の方法。
【請求項２００】
融合蛋白質が、さらに第2のアデノシンデアミナーゼを含む、請求項172〜199のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０１】
第2のアデノシンデアミナーゼが、ecTadAである、請求項200に記載の方法。
【請求項２０２】
第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼが同じである、請求項201に記載の方法。
【請求項２０３】
第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼが異なる、請求項201に記載の方法。
【請求項２０４】
第2のアデノシンデアミナーゼが、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項200〜203のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０５】
第2のアデノシンデアミナーゼが、配列番号1のアミノ酸配列からなる、請求項200〜203のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０６】
第2のアデノシンデアミナーゼが、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、または802〜805のいずれか1つと少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%、または99.5%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項200〜203のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０７】
第2のアデノシンデアミナーゼが、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、または802〜805のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項200〜203のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０８】
第2のアデノシンデアミナーゼが、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、または802〜805のいずれか1つのアミノ酸配列からなる、請求項200〜203のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０９】
第2のアデノシンデアミナーゼが、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%、または99.5%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項200〜203のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１０】
融合蛋白質が、構造：
［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］；
［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］；
［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［NLS］；または
［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［NLS］、
を含み；
napDNAbpがCas9ドメインであり、「−」が任意のリンカー配列の存在を指示する、
請求項172〜209のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１１】
Cas9ドメインが、Cas9ニッカーゼ（nCas9）である、請求項210に記載の方法。
【請求項２１２】
第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のデアミナーゼが、アミノ酸配列(SGGS)n-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)n（配列番号801）を含むリンカーを介して融合させられ、nが1、2、3、4、または5である、請求項200〜211のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１３】
第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のデアミナーゼが、アミノ酸配列(SGGS)2-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)2（配列番号800）を含むリンカーを介して融合させられる、請求項200〜212のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１４】
第1のアデノシンデアミナーゼまたは第2のアデノシンデアミナーゼが、アミノ酸配列(SGGS)n-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)n（配列番号801）を含むリンカーを介してnapDNAbpに融合させられ、nが1、2、3、4、または5である、請求項200〜213のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１５】
第1のアデノシンデアミナーゼまたは第2のアデノシンデアミナーゼが、アミノ酸配列(SGGS)2-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)2（配列番号800）を含むリンカーを介してnapDNAbpに融合させられる、請求項200〜214のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１６】
第1のアデノシンデアミナーゼが、配列番号805のアデノシンデアミナーゼであり；第2のアデノシンデアミナーゼが、配列番号1のアデノシンデアミナーゼである、請求項200〜215のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１７】
第1のアデノシンデアミナーゼが、配列番号804のアデノシンデアミナーゼであり；第2のアデノシンデアミナーゼが、配列番号1のアデノシンデアミナーゼである、請求項200〜215のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１８】
第1のアデノシンデアミナーゼが、配列番号803のアデノシンデアミナーゼであり；第2のアデノシンデアミナーゼが、配列番号1のアデノシンデアミナーゼである、請求項200〜215のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１９】
第1のアデノシンデアミナーゼが、配列番号802のアデノシンデアミナーゼであり；第2のアデノシンデアミナーゼが、配列番号1のアデノシンデアミナーゼである、請求項200〜215のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２０】
第1のアデノシンデアミナーゼが、配列番号682のアデノシンデアミナーゼであり；第2のアデノシンデアミナーゼが、配列番号1のアデノシンデアミナーゼである、請求項200〜215のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２１】
融合蛋白質が、さらに（ii）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）に結合したガイドRNAを含み、ガイドRNA（gRNA）が、HBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む、請求項172〜220のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２２】
ガイドRNAのガイド配列が、核酸配列
【化５５】
2021500036.tif 000246
を含む、請求項221に記載の方法。
【請求項２２３】
gRNAのガイド配列が、さらに5'末端にGを含む、請求項222に記載の方法。
【請求項２２４】
gRNAのガイド配列が、
【化５６】
2021500036.tif 000247
を含む、請求項222または223に記載の方法。
【請求項２２５】
融合蛋白質が、さらに（ii）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）に結合したガイドRNAを含み、ガイドRNAが、HFE遺伝子上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む、請求項172〜220のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２６】
gRNAのガイド配列が、核酸配列：
【化５７】
2021500036.tif 000248
を含む、請求項225に記載の方法。
【請求項２２７】
gRNAのガイド配列が、さらに、請求項226に列記されている配列のいずれか1つの5'末端にGを含む、請求項226に記載の方法。
【請求項２２８】
gRNAのガイド配列が、核酸配列
【化５８】
2021500036.tif 000249
を含む、請求項225〜227のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２９】
融合蛋白質が、さらに（ii）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）に結合したガイドRNAを含み、ガイドRNA（gRNA）が、HBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む、請求項172〜220のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３０】
ガイドRNAのガイド配列が、核酸配列
【化５９−１】
2021500036.tif 000250
【化５９−２】
2021500036.tif 000251
を含む、請求項229に記載の方法。
【請求項２３１】
gRNAのガイド配列が、さらに、請求項230に列記されている配列のいずれか1つの5'末端にGを含む、請求項230に記載の方法。
【請求項２３２】
融合蛋白質が、さらに（ii）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）に結合したガイドRNAを含み、ガイドRNAが、HBB遺伝子上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む、請求項172〜220のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３３】
gRNAのガイド配列が、核酸配列：
【化６０−１】
2021500036.tif 000252
【化６０−２】
2021500036.tif 000253
を含む、請求項232に記載の方法。
【請求項２３４】
gRNAのガイド配列が、さらに、請求項233に列記されている配列のいずれか1つの5'末端にGを含む、請求項233に記載の方法。
【請求項２３５】
融合蛋白質が、さらに（ii）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）に結合したガイドRNAを含み、ガイドRNAが、F8遺伝子上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む、請求項172〜220のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３６】
gRNAのガイド配列が、核酸配列：
【化６１】
2021500036.tif 000254
を含む、請求項235に記載の方法。
【請求項２３７】
gRNAのガイド配列が、さらに、請求項236に列記されている配列のいずれか1つの5'末端にGを含む、請求項236に記載の方法。
【請求項２３８】
塩基編集因子が、配列番号707のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項1〜237のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３９】
塩基編集因子が、配列番号708のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項1〜237のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４０】
塩基編集因子が、配列番号709のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項1〜237のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４１】
塩基編集因子が、配列番号710のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項1〜237のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４２】
塩基編集因子が、配列番号711のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項1〜237のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４３】
20%、19%、18%、16%、14%、12%、10%、8%、6%、4%、2%、1%、0.5%、0.2%、または0.1%未満のインデル形成を引き起こす、請求項1〜242のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４４】
A核酸塩基を脱アミノ化する効率が、少なくとも5%である、請求項1〜243のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４５】
A核酸塩基を脱アミノ化する効率が、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または98%である、請求項244に記載の方法。
【請求項２４６】
（a）（i）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）と（ii）DNA上のアデノシンを脱アミノ化することができるアデノシンデアミナーゼとを含む塩基編集因子融合蛋白質をコードする核酸配列；および
（b）ガイドRNA、またはガイドRNAをコードする発現コンストラクト、
を含み、
ガイドRNAが、
（i）HBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター；
（ii）HFE遺伝子；
（iii）HBB遺伝子；または
（iv）F8遺伝子、
のセンスまたはアンチセンス鎖上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む、
核酸コンストラクトを含むキット。
【請求項２４７】
標的核酸配列が、HBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター上の核酸配列である、請求項246に記載のキット。
【請求項２４８】
標的核酸配列が、核酸配列：
【化６２】
2021500036.tif 000255
を含む、請求項247に記載のキット。
【請求項２４９】
標的核酸が、さらに、請求項238に列記されている配列のいずれか1つの5'末端に5'-CCT-3'を含む、請求項248に記載のキット。
【請求項２５０】
プロモーター上の標的核酸配列が、核酸配列
【化６３】
2021500036.tif 000256
を含む、請求項247〜249のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５１】
標的核酸配列が、HFE遺伝子上の核酸配列である、請求項246に記載のキット。
【請求項２５２】
HFE遺伝子上の標的核酸配列が、核酸配列：
【化６４】
2021500036.tif 000257
を含む、請求項250に記載のキット。
【請求項２５３】
標的核酸が、さらに、請求項241に列記されている配列のいずれか1つの5'末端に5'-CCT-3'を含む、請求項251に記載のキット。
【請求項２５３】
HFE遺伝子上の標的核酸配列が核酸配列
【化６５】
2021500036.tif 000258
を含む、請求項250〜252のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５４】
標的核酸配列が、HBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター上の核酸配列である、請求項246に記載のキット。
【請求項２５５】
標的核酸配列が、核酸配列：
【化６６−１】
2021500036.tif 000259
【化６６−２】
2021500036.tif 000260
を含む、請求項254に記載のキット。
【請求項２５６】
標的核酸配列が、HBB遺伝子上の核酸配列である、請求項256に記載のキット。
【請求項２５７】
HBB遺伝子上の標的核酸配列が、核酸配列：
【化６７】
2021500036.tif 000261
を含む、請求項256に記載のキット。
【請求項２５８】
標的核酸配列が、F8遺伝子上の核酸配列である、請求項246に記載のキット。
【請求項２５９】
F8遺伝子上の標的核酸配列が、核酸配列：
【化６８】
2021500036.tif 000262
を含む、請求項258に記載のキット。
【請求項２６０】
ガイドRNAが、核酸配列
【化６９】
2021500036.tif 000263
を含むガイド配列を含む、（i）本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかと（ii）ガイドRNAとを含む複合体。
【請求項２６１】
ガイドRNAが、核酸配列
【化７０】
2021500036.tif 000264
を含むガイド配列を含む、（i）本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかと（ii）ガイドRNAとを含む複合体。
【請求項２６２】
ガイドRNAが、核酸配列
【化７１−１】
2021500036.tif 000265
【化７１−２】
2021500036.tif 000266
を含むガイド配列を含む、（i）本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかと（ii）ガイドRNAとを含む複合体。
【請求項２６３】
ガイドRNAが、核酸配列
【化７２−１】
2021500036.tif 000267
【化７２−２】
2021500036.tif 000268
を含むガイド配列を含む、（i）本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかと（ii）ガイドRNAとを含む複合体。
【請求項２６４】
ガイドRNAが、核酸配列
【化７３】
2021500036.tif 000269
を含むガイド配列を含む、（i）本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかと（ii）ガイドRNAとを含む複合体。
【請求項２６５】
核酸配列
【化７４−１】
2021500036.tif 000270
【化７４−２】
2021500036.tif 000271
【化７４−３】
2021500036.tif 000272
を含むガイドRNA（sgRNA）。
【請求項２６６】
ガイドRNAが、シングルガイドRNA（sgRNA）である、請求項265に記載のガイドRNA。
【請求項２６７】
請求項265または266に記載のガイドRNAをコードする核酸。
【請求項２６８】
請求項267に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２６９】
ベクターが、ガイドRNAの発現を駆動する異種プロモーターを含む、請求項268に記載のベクター。
【請求項２７０】
請求項260もしくは264に記載の複合体；請求項265もしくは266に記載のガイドRNA；請求項267に記載の核酸；または請求項268もしくは269に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項２７１】
さらに薬学的に許容し得る賦形剤を含む、請求項270に記載の医薬組成物。
【請求項２７２】
さらにカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーを含む、請求項270または271に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
核酸配列の標的化された編集、例えば、標的化された切断、またはゲノムDNA上への特異的な改変の標的化された導入は、遺伝子機能の研究のための高度に有望なアプローチであり、ヒト遺伝子疾患のための新たな治療を提供するポテンシャルをもまた有する。多くの遺伝子疾患は原理的にはゲノム上の特定の場所における特定のヌクレオチド変化を奏することによって処置され得るので（例えば、疾患に関連する遺伝子の特定のコドン上のA→GまたはT→C変化）、かかる正確な遺伝子編集を達成するためのプログラム可能なやり方の開発は、強力な新たな研究ツール、および遺伝子編集に基づく治療学への潜在的な新たなアプローチ両方にあたる。
【発明の概要】
【０００２】
本開示は、血液疾患／異常、例えば鎌状赤血球症、ヘモクロマトーシス、血友病、およびベータサラセミアを処置するための方法および組成物を提供する。例えば、本開示は、HBG1／2のプロモーターを標的化して胎児型ヘモグロビンの発現を増大させる点変異を作り出す治療的なガイドRNAを提供する。別の例として、本開示は、HBB、第VIII因子、およびHFEの変異（例えば病原性の変異（mutaion））を標的化して鎌状赤血球症、ベータサラセミア（例えばHbCおよびHbE）、血友病、およびヘモクロマトーシスを処置する治療的なガイドRNAを提供する。本明細書において提供されるガイドRNAは塩基編集因子蛋白質（例えばアデノシン塩基編集因子）と複合体化させられて遺伝子または遺伝子プロモーター上に点変異を作り出し得、これが病原性の変異を修正するか、非病原性の点変異を作り出すか、または遺伝子の発現を調節し得る（例えば増大させる）。
【０００３】
本明細書においては、アデノシンデアミナーゼと核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（例えばCas9）とを用いてポリヌクレオチド（例えばDNA）を改変する組成物、キット、および方法が提供される。本開示のいくつかの側面は、DNAのコンテキストにおけるアデノシンの加水分解的な脱アミノ化（イノシンを形成し、これはグアニン（G）のように塩基対形成する）を触媒する核酸塩基編集蛋白質を提供する。DNAに作用するいかなる公知の天然に存在するアデノシンデアミナーゼもない。代わりに、公知のアデノシンデアミナーゼはRNA（例えばtRNAまたはmRNA）に作用する。この欠点を克服するために、DNA基質を受け入れデオキシアデノシン（dA）をデオキシイノシンへと脱アミノ化するように、第1のデオキシアデノシンデアミナーゼが進化させられた。かかるアデノシンデアミナーゼは2017年8月3日出願の国際出願No.：PCT/US2017/045,381に記載されている；これの内容全体はここに参照によって組み込まれる。Escherichia coliからのtRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ（ADAT）（tRNAアデノシンデアミナーゼAから、TadA）がdCas9またはCas9ニッカーゼドメインに共有結合的に融合させられ、コンストラクトのデアミナーゼ部分に変異を含有する融合蛋白質がアセンブリされた。E. coli TadA（ecTadA）に加えて、他の天然に存在するアデノシンデアミナーゼ、例えばヒトADAR（RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ）、マウスADA（アデノシンデアミナーゼ）、およびヒトADAT2がdCas9またはCas9ニッカーゼドメインに融合させられて、アデノシン核酸塩基編集因子（ABE）融合蛋白質コンストラクトを作り出し得る。これらの融合蛋白質の指向的進化は、特にゲノム編集の現行のCas9ヌクレアーゼによって媒介されるHDR法と比較したときに、低いオフターゲット改変とインデル（確率的な挿入または欠失）形成の低い率とによって標的A−T塩基対をG−C塩基対に効率的に変換するプログラム可能なアデノシン塩基編集因子をもたらした。本明細書において開示されるABEは、疾患関連点変異を修正するためおよび疾患抑圧点変異（例えば一ヌクレオチド多型）を導入するため両方に用いられ得る。
【０００４】
アデノシンデアミナーゼを進化させることによって、核酸塩基編集蛋白質のデアミナーゼドメイン上の変異が作られた。例えば、DNA上のアデノシンを脱アミノ化することができるecTadAバリアントは次の変異の1つ以上を包含する：配列番号1のW23L、W23R、R26G、H36L、N37S、P48S、P48T、P48A、I49V、R51L、N72D、L84F、S97C、D108N、A106V、H123Y、G125A、A142N、S146C、D147Y、R152H、R152P、E155V、I156F、K157N、およびK161T。しかしながら、DNA上のアデノシンを脱アミノ化することができるバリアントを作り出すためには、相同な変異が他のアデノシンデアミナーゼ上に作られ得るということは了解されるはずである。図7は本明細書において開示される方法にとって有用であり得るecTadAバリアントを例解している。
【０００５】
本明細書において提供される例では、進化した融合蛋白質の一般構造を有する例示的な核酸塩基編集因子、例えばecTadA(D108X；X＝G、V、またはN)−XTEN−nCas9が、真核細胞（例えば、Hek293T哺乳類細胞）などの細胞においてA→Gトランジション変異を触媒した。他の例では、例示的な核酸塩基編集因子は2つのecTadAドメインと核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）とを含有する。2つのecTadAドメインは同じであるか（例えばホモ二量体）、または2つの異なるecTadAドメインであり得る（例えばヘテロ二量体（例えば野生型ecTadAおよびecTadA(A106V/D108N)））。例えば、核酸塩基編集因子は一般構造ecTadA−ecTadA＊−nCas9を有し得、ここでecTadA＊は配列番号1の1つ以上の変異を含む進化したecTadAにあたる。本明細書において提供されるecTadAバリアントを含有する核酸塩基編集因子の追加の例は、哺乳類細胞における核酸塩基編集因子の性能の改善を実証する。
【０００６】
いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、本明細書に記載されるアデノシン核酸塩基編集因子は、ecTadAバリアントを用いることによって、DNA上のA塩基を脱アミノ化するように働き、イノシン形成を介してA→G変異を引き起こす。イノシンは選好的にCと水素結合し、DNA複製の間にA→G変異をもたらす。共有結合的にCas9（または別の核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質）にテザリングされたときには、アデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）は目当ての遺伝子に局在させられ、ssDNA基質上のA→G変異を引き起こす。この編集因子は、A→G復帰を要求する疾患に関係する遺伝子の一ヌクレオチド多型（SNP）を標的化し復帰させるために用いられ得る。この編集因子は、Tの反対側のAをGへと変異させることによって、T→C復帰を要求する疾患に関係する遺伝子の一ヌクレオチド多型（SNP）を標的化し復帰させるためにもまた用いられ得る。それから、Tは例えば塩基除去修復メカニズムによってCによって置き換えられ得るか、またはDNA複製の爾後のラウンドにおいて変化させられ得る。それゆえに、本明細書に記載されるアデノシン塩基編集因子は、疾患または異常に関連しないヌクレオチド配列を与えるためにA核酸塩基を脱アミノ化し得る。いくつかの側面では、本明細書に記載されるアデノシン塩基編集因子は遺伝子プロモーター上のアデノシン（A）核酸塩基を脱アミノ化することに有用であり得る。いくつかの態様では、脱アミノ化は遺伝子の転写を誘導することに至る。遺伝子の転写の誘導は、遺伝子によってコードされる蛋白質（例えば遺伝子産物）の発現の増大に至る。塩基編集因子に結合したガイドRNA（gRNA）は、プロモーター上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む。いくつかの態様では、標的核酸配列はHBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター上の核酸配列（nucelic acid seqeuence）である。いくつかの態様（embodimetn）では、プロモーター上の標的核酸配列は核酸配列
【化１】
2021500036.tif 000003
を含む。いくつかの態様では、プロモーター上の標的核酸（nuclic acid）配列は核酸配列
【化２】
2021500036.tif 000004
を含む。いくつかの態様では、プロモーター上の標的核酸配列は配列番号838〜845のいずれか1つの核酸位置14のTを含み（太字で示されている）、位置14のTに対して相補的であるA核酸塩基の脱アミノ化は標的核酸配列上のT→C変異をもたらす。いくつかの態様では、標的核酸はさらに配列番号838〜845のいずれか1つの5'末端に5'-CCT-3'を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは、プロモーター上の標的核酸配列に対して100%相補的である少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または26個の一続きの核酸を含む。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は核酸配列5'-UCAUGUGGGGAAGGGGCCCCCAAG-3'（配列番号846）、5'-CAUGUGGGGAAGGGGCCCCCAAG-3'（配列番号847）、5'-AUGUGGGGAAGGGGCCCCCAAG-3'（配列番号848）、5'-UGUGGGGAAGGGGCCCCCAAG-3'（配列番号849）、5'-GUGGGGAAGGGGCCCCCAAG-3'（配列番号850）、5'-UGGGGAAGGGGCCCCCAAG-3'（配列番号851）、5'-GGGGAAGGGGCCCCCAAG-3'（配列番号852）、または5'-GGGAAGGGGCCCCCAAG-3'（配列番号853）を含む。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は核酸配列5'-GUGGGGAAGGGGCCCCCAAG-3'（配列番号850）を含む。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は配列番号254〜280のいずれか1つの核酸配列を含む。いくつかの態様では、塩基編集因子は、（i）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）と（ii）アデノシンデアミナーゼとを含む融合蛋白質を含み、目当ての標的配列に対して相補的であるガイドRNAとの組み合わせで用いられて、核酸塩基を脱アミノ化する（demainate）。いくつかの態様では、核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）はCas9ドメインである。いくつかの態様（ebodiment）では、Cas9ドメインはCas9ニッカーゼ（nCas9）である。アデノシンデアミナーゼ（deaminse）は本明細書に記載されるいずれかのアデノシンデアミナーゼであり得る。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（demainse）は配列番号1の1つ以上の変異を含むE. coli TadA（ecTadA）である。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）は配列番号1のアミノ酸配列を含むecTadAである。
【０００７】
それゆえに、いくつかの側面では、本明細書に記載される塩基編集因子およびガイドRNA複合体は、HBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター上のC→T変異によって引き起こされる疾患または異常を処置することに有用であり得る。いくつかの態様では、疾患または異常は血液のものである。ある種の態様では、疾患または異常は貧血である。いくつかの態様では、貧血は鎌状赤血球貧血である。例えば、HBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター上の-198C→T変異はγ−グロビン発現レベルの減少に至り、これは鎌状赤血球症（SCD）およびβサラセミアの発生を促進し得る。プロモーター上のアデノシン核酸塩基の脱アミノ化は、HBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター上のT−A塩基対がプロモーター上のC−G塩基対へと変異させられることをもたらす。アデノシン核酸塩基の脱アミノ化は、遺伝性高胎児型ヘモグロビン症（HPFH）で促進される配列を促進する。いくつかの態様では、プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することはHBG1遺伝子の転写の増大に至る。いくつかの態様では、プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することはHBG1蛋白質の量の増大に至る。いくつかの態様では、プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することはHBG2遺伝子の転写の増大に至る。いくつかの態様では、プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することはHBG2蛋白質の量の増大に至る。いくつかの態様では、プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、HBG1およびHBG2遺伝子両方の転写の増大に至る。いくつかの態様では、プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、HBG1およびHBG2蛋白質両方の量の増大に至る。
【０００８】
なお別の側面では、本明細書に記載されるアデノシン塩基編集因子は、遺伝子上のアデノシン（A）核酸塩基を脱アミノ化して遺伝子の点変異を修正することに有用であり得る。いくつかの態様では、遺伝子はコドンの変異を含み得、これが野生型コドンと比較して変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。塩基編集因子に結合したガイドRNA（gRNA）は、遺伝子上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む。いくつかの態様では、標的核酸配列はHFE遺伝子上の核酸配列（nucelic acid seqeuence）である。いくつかの態様では、HFE遺伝子はC→T変異を含む。本明細書に記載される塩基編集因子およびガイドRNAの複合体によるTに対して相補的なA核酸塩基の脱アミノ化は、C→T変異を修正する（例えば図7を見よ）。いくつかの態様（embodimetn）では、プロモーター上の標的核酸配列は核酸配列を含む。いくつかの態様では、HFE遺伝子はCys→Tyr変異（例えばC282Y）を含むヒトヘモクロマトーシス（HFE）蛋白質をコードする。本明細書に記載される塩基編集因子およびガイドRNAの複合体によるTに対して相補的なA核酸塩基の脱アミノ化は、HFE蛋白質のCys→Tyr変異を修正し、野生型蛋白質の発現をもたらす。いくつかの態様では、HFE遺伝子上の標的核酸配列は核酸配列5'-GGGTGCTCCACCTGGTACGTATAT-3'（配列番号854）、5'-GGGTGCTCCACCTGGTACGTATA-3'（配列番号855）、5'-GGGTGCTCCACCTGGTACGTAT-3'（配列番号856）、5'-GGGTGCTCCACCTGGTACGTA-3'（配列番号857）、5'-GGGTGCTCCACCTGGTACGT-3'（配列番号858）、5'-GGGTGCTCCACCTGGTACG-3'（配列番号859）、5'-GGGTGCTCCACCTGGTAC-3'（配列番号860）、または5'-GGGTGCTCCACCTGGTA-3'（配列番号861）を含む。いくつかの態様では、標的核酸はさらに配列番号854〜861の核酸配列のいずれか1つの5'末端に5'-CCT-3'を含む。いくつかの態様では、HFE遺伝子上の標的核酸配列は核酸配列5'-GGGTGCTCCACCTGGTACGT-3'（配列番号858）を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HFE遺伝子上の標的核酸配列に対して100%相補的である少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または26個の一続きの核酸を含む。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は核酸配列
【化３】
2021500036.tif 000005
を含む。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は、さらに、配列番号862〜869の核酸配列のいずれか1つの5'末端にGを含む。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は核酸配列5'-GACGUACCAGGUGGAGCACCC-3'（配列番号870）を含む。いくつかの態様では、塩基編集因子は、（i）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）と（ii）アデノシンデアミナーゼとを含む融合蛋白質を含み、目当ての標的配列に対して相補的であるガイドRNAとの組み合わせで用いられて、核酸塩基を脱アミノ化する（demainate）。いくつかの態様では、核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）はCas9ドメインである。いくつかの態様（ebodiment）では、Cas9ドメインはCas9ニッカーゼ（nCas9）である。アデノシンデアミナーゼ（deaminse）は本明細書に記載されるいずれかのアデノシンデアミナーゼであり得る。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（demainse）は配列番号1の1つ以上の変異を含むE. coli TadA（ecTadA）である。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）は配列番号1のアミノ酸配列を含むecTadAである。
【０００９】
それゆえに、いくつかの側面では、本明細書に記載される塩基編集因子およびガイドRNAの複合体は、HFE遺伝子上のC→T変異によって引き起こされる疾患または異常を処置することに有用であり得る。いくつかの態様では、異常は鉄蓄積異常である。いくつかの態様（embodimetn）では、鉄蓄積異常は遺伝性ヘモクロマトーシス（HHC）である。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、HFE遺伝子上のT−A塩基対がHFE遺伝子上のC−G塩基対へと変異させられることをもたらす。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、HFE遺伝子から転写されるHFE蛋白質機能の増大に至る。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、遺伝性ヘモクロマトーシス（HHC）に関連する配列を修正することをもたらす。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは鉄蓄積異常の1つ以上の症状を改善する。
【００１０】
いくつかの態様では、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼは核酸分子上のアデノシンを脱アミノ化することができる。いくつかの態様では、アデノシン核酸塩基を脱アミノ化する方法は、細胞の核酸分子を（i）アデノシン塩基編集因子および（ii）ガイドRNAを含む複合体とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させることを含む。いくつかの態様では、アデノシン核酸塩基を脱アミノ化する方法は、細胞の核酸分子を（i）アデノシン塩基編集因子および（ii）ガイドRNAを含む複合体とｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることを含む。いくつかの態様では、アデノシン核酸塩基を脱アミノ化する方法は、細胞の核酸分子を（i）アデノシン塩基編集因子および（ii）ガイドRNAを含む複合体と接触させることを含み、細胞は対象内にある。いくつかの態様では、細胞は不死化リンパ芽球様細胞（LCL）である。本開示の他の側面は融合蛋白質を提供し、Cas9ドメインと、アデノシンデアミナーゼドメイン、例えばDNA上のアデノシンを脱アミノ化することができる操作されたデアミナーゼドメインとを含む。いくつかの態様では、融合蛋白質は核局在配列（NLS）、イノシン塩基除去修復の阻害因子（例えばdISN）、および／または1つ以上のリンカーの1つ以上を含む。
【００１１】
いくつかの側面では、本開示はデオキシリボ核酸（DNA）基質上のアデノシンを脱アミノ化することができるアデノシンデアミナーゼを提供する。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは細菌、例えばE. coliまたはS. aureusからである。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼはTadAデアミナーゼである。いくつかの態様では、TadAデアミナーゼはE. coli TadAデアミナーゼ（ecTadA）である。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のD108X変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、Xは野生型蛋白質に見いだされるアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、XはG、N、V、A、またはYである。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のD108N変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のA106X変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、Xは野生型蛋白質に見いだされるアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、XはV、G、I、L、またはAである。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のA106V変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のA106XおよびD108X変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、Xは野生型蛋白質に見いだされるアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のA106VおよびD108N変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様（emodiment）では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はA106X、D108X、D147X、E155X、L84X、H123X、およびI156X変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、Xは野生型蛋白質に見いだされるアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はA106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、およびI156F変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼはA106X、D108X、D147X、E155X、L84X、H123X、I156X、H36X、R51X、S146X、およびK157X変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、Xは野生型蛋白質に見いだされるアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はA106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I156F、H36L、R51L、S146C、およびK157N変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンはA106X、D108X、D147X、E155V、L84X、H123X、I156X、H36X、R51X、S146X、K157X、W23X、P48X、およびR152X変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、Xは野生型蛋白質に見いだされるアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼはA106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I156F、H36L、R51L、S146C、K157N、W23R、P48A、およびR152P変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼは本明細書において提供される変異の1つ以上をいずれかの組み合わせで含有し得るという��とは了解されるはずである。
【００１２】
別の側面では、本開示は、広げられた標的配列適合性を有するアデノシン核酸塩基編集因子（ABE）を提供する。一般的に、自然のecTadAはtRNAArgのアンチコドンループの配列UAC（例えば標的配列）のアデニンを脱アミノ化する。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかなどの1つ以上のecTadAドメインを含むABEの実用性を拡大するために、アデノシン核酸塩基編集因子複合体の編集効率を損なうことなしにプロトスペーサー配列内の幅広い種々の標的配列を認識するように、アデノシンデアミナーゼ蛋白質が最適化された。いくつかの態様では、標的配列は5'-NAN-3'であり、NはT、C、G、またはAである。例えば、標的配列は図3Aに示されている。いくつかの態様では、標的配列は5'-TAC-3'を含む。いくつかの態様では、標的配列は5'-GAA-3'を含む。
【００１３】
いくつかの態様では、塩基編集因子は配列番号707のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、塩基編集因子は配列番号708のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、塩基編集因子は配列番号709のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、塩基編集因子は配列番号710のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、塩基編集因子は配列番号711のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００１４】
別の側面では、本開示は医薬組成物を提供し、（i）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）と（ii）アデノシンデアミナーゼと（iii）融合蛋白質を目当ての標的配列へと導くガイドRNAとを含む融合蛋白質を含む複合体；および任意に薬学的に許容し得る賦形剤を含む。アデノシンデアミナーゼは、本明細書に記載されるアデノシンデアミナーゼドメインのいずれか、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。いくつかの態様では、napDNAbpはCas9ドメインである。いくつかの態様では、Cas9ドメインはCas9ニッカーゼ（nCas9）である。いくつかの態様では、ガイドRNAは、融合蛋白質をHBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーターへと導くガイド核酸配列を含む。いくつかの態様では、ガイド核酸配列は配列番号846〜853の核酸配列を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは、融合蛋白質をHFE遺伝子へと導く核酸配列を含む。いくつかの態様では、ガイド核酸配列は配列番号862〜870の核酸配列を含む。いくつかの態様では、医薬組成物はその必要がある対象に（例えば、疾患または異常を処置するために）投与される。いくつかの態様では、対象は血液疾患を有する。いくつかの態様では、血液疾患は貧血である。いくつかの態様では、貧血は鎌状赤血球貧血である。いくつかの態様では、対象は鉄蓄積異常を有する。いくつかの態様では、鉄蓄積異常は遺伝性ヘモクロマトーシス（HHC）である。なお別の側面では、本開示（dislcosure）はキットを提供し、（a）（i）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）および（ii）アデノシンデアミナーゼを含む融合蛋白質をコードする核酸配列と；（b）（a）の配列の発現を駆動する異種プロモーターと；（c）ガイドRNAバックボーンをコードする発現コンストラクトとを含む核酸コンストラクトを含み、コンストラクトは、ガイドRNAバックボーン上への標的配列と同一のまたは相補的な核酸配列のクローニングを許すように位置したクローニング部位を含む。アデノシンデアミナーゼは、本明細書に記載されるアデノシンデアミナーゼドメインのいずれか、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。いくつかの態様では、napDNAbpはCas9ドメインである。いくつかの態様では、Cas9ドメインはCas9ニッカーゼ（nCas9）である。いくつかの態様では、ガイドRNAは、融合蛋白質をHBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーターへと導く核酸配列を含む。いくつかの態様では、標的核酸配列は配列番号838〜845のいずれか1つの核酸配列を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは、融合蛋白質をHFE遺伝子へと導く核酸配列を含む。いくつかの態様では、標的核酸配列は配列番号854〜861のいずれか1つの核酸配列を含む。
【００１５】
上の概要は、限定しない様式で、本明細書において開示されるテクノロジーの態様、利点、特徴、および使用のいくつかを例解することを意味されている。本明細書において開示されるテクノロジーの他の態様、利点、特徴、および使用は、発明を実施するための形態、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】図1Aから1CはA・T→G・C塩基編集因子（ABE）による塩基編集の範囲および概観を示している。図1A：ClinVarデータベースの公知の病原性ヒトSNPを修正するために要求される塩基対変化の相対的分布。図1B：アデノシン（A）の加水分解的な脱アミノ化はイノシン（I）を形成し、これはポリメラーゼ酵素によってグアノシン（G）として読まれる。
【図１−２】図1C：ABEによって媒介されるA・T→G・C塩基編集戦略。ABEは、天然には存在することが公知でない仮想上のデオキシアデノシンデアミナーゼと触媒的に障害されたCas9とを含有する。それらはガイドRNAによってプログラムされる様式で目当ての二本鎖DNA標的に結合し、「Rループ」複合体として一本鎖DNAの小さいバブルを暴露する。デオキシアデノシンデアミナーゼドメインはこの一本鎖バブル内におけるデオキシアデノシン→デオキシイノシン形成を触媒する。DNA修復または複製後に、標的部位において、元々のA・T塩基対はG・C塩基対によって置き換えられる。
【００１７】
【図２−１】図2Aから2CはABEの蛋白質進化および操作を示している。図2A：RNAアデノシンデアミナーゼから出発してDNAデオキシアデノシンデアミナーゼを進化させるための戦略。E. coli細胞のライブラリは、それぞれが、触媒的にデッドなCas9（dCas9）に融合した変異体ecTadA（TadA＊）遺伝子を発現するプラスミドと抗生物質耐性を復元するためには1つ以上のA・T→G・C変異を要求する欠陥がある抗生物質耐性遺伝子を発現するセレクションプラスミドとを持つ。変異およびセレクションの各ラウンドから生残するTadA＊バリアントからの変異は哺乳類ABEアーキテクチャに輸入され、プログラム可能なA・T→G・C塩基編集活性についてヒト細胞によってアッセイされた。図2B：進化の各ラウンドから生じた進化したABEのサブセットの遺伝子型。本研究においてキャラクタリゼーションされた全ての57個の進化したABE遺伝子型の列記については、図7を見よ。二量体化状態（単量体、進化したTadA＊ドメインのホモ二量体、または野生型TadA−進化したTadA＊のヘテロ二量体）およびリンカー長さ（アミノ酸数による）もまた列記されている。変異はそれらが同定された進化のラウンドに基づいて着色されている。
【図２−２】図2C：tRNAArg2と複合体化したS. aureus TadAの構造（PDB 2B3J）（示されていない）に対してアラインメントされたE. coli TadAデアミナーゼ構造（PDB 1Z3A）の3つの像。tRNAのUACアンチコドンループは野生型TadAの内在性の基質である。TadA二量体およびtRNAアンチコドンループが左に示されている；基質アデノシンの上流のUのリボースの2'ヒドロキシル基に近い残基が真中に示されている；ABE進化の間に変異したUAC基質の周囲の残基が右に示されている。野生型残基は、進化の各ラウンドから出現した変異に、および図2Bの遺伝子型表に対応するように着色されている。
【００１８】
【図３−１】図3Aから3Cは、早期および中期の進化したABEがヒトゲノムDNA部位におけるA・T→G・C塩基編集を媒介するということを示している。図3A：ヒト染色体上の対応する場所（右）と19個のヒトゲノムDNA試験部位（左）の表。赤色の編集されるAの配列コンテキスト（標的モチーフ）が各部位について示されている。PAM配列が青色で示されている。
【図３−２】図3B：6つのヒトゲノムDNA部位におけるラウンド1およびラウンド2 ABEのHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。図3C：6つのヒトゲノムDNA部位におけるラウンド3、ラウンド4、およびラウンド5 ABEのHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。ABE2.9編集が比較のために示されている。値およびエラーバーは異なる日に行われた3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映している。ホモ二量体は融合したTadA＊−TadA＊−Cas9ニッカーゼアーキテクチャを指示し；ヘテロ二量体は融合したwtTadA−TadA＊−Cas9ニッカーゼアーキテクチャを指示する。配列は一番上から一番下に配列番号91〜109に対応する。
【００１９】
【図４】図4Aおよび4Bは、後期の進化したABEがより多大な活性およびより広い配列適合性によってゲノムDNA編集を媒介するということを示している。図4A：6つのヒトゲノムDNA部位におけるラウンド6およびラウンド7 ABEのHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。ABE5.3編集が比較のために示されている。図4B：ヒトゲノム部位の拡大されたセットにおけるラウンド6およびラウンド7 ABEのHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。部位1〜17は、まとめると、標的Aをフランキングするあらゆる可能なNAN配列コンテキストを包含している。ABE5.3編集が比較のために示されている。値およびエラーバーは異なる日に行われた3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映している。図4Aおよび4Bに示されている全てのABEはwtTadA−TadA＊−Cas9ニッカーゼアーキテクチャのヘテロ二量体である。
【００２０】
【図５−１】図5Aから5Cは後期ABEの活性ウインドウおよび産物純度を示している。図5A：2つのヒトゲノムDNA部位のプロトスペーサー位置1-9における、後期ABEのHEK293T細胞の相対的なA・T→G・C塩基編集効率。これらは一緒になってこれらの位置のそれぞれにAを置く。値は、各ABEについて2つの部位のそれぞれにおける観察された最大の効率＝1に対して正規化されている。
【図５−２】図5B：試験された全ての19個のヒトゲノムDNA部位のプロトスペーサー位置1〜18および20における後期ABEのHEK293T細胞の相対的なA・T→G・C塩基編集効率。値は、各ABEについて19部位のそれぞれにおける観察された最大の効率＝1に対して正規化されている。
【図５−３】図5C：ABE7.10もしくはABE7.9と対応するsgRNAとによって処置されたHEK293T細胞のまたは無処置のHEK293T細胞の、2つの代表的なヒトゲノムDNA部位における産物分布。インデル頻度が右に示されている。
【図５−４】図5C：ABE7.10もしくはABE7.9と対応するsgRNAとによって処置されたHEK293T細胞のまたは無処置のHEK293T細胞の、2つの代表的なヒトゲノムDNA部位における産物分布。インデル頻度が右に示されている。図5Aおよび5Bでは、値およびエラーバーは異なる日に行われた3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映している。配列は一番上から一番下に配列番号110〜111に対応する。
【００２１】
【図６−１】図6Aから6Cは、ABE7.10によって媒介される塩基編集およびCas9によって媒介されるHDRの比較、ならびに2つの疾患に関係するSNPへのABE7.10の適用を示している。図6A：5つのヒトゲノムDNA部位を標的化した、ABE7.10によってまたはCas9ヌクレアーゼおよびssDNAドナー鋳型によって（CORRECT HDR法41を踏襲して）処置されたHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。図6B：図6Aに記載されている通り処置されたHEK293T細胞におけるインデル形成の比較。
【図６−２】図6C：疾患抑圧SNPをインストールするためまたは疾患を誘導するSNPを修正するためのABEの適用。一番上：HEK293T細胞のHBG1およびHBG2遺伝子のプロモーター領域上の、ABE7.10によって媒介される−198T→C変異（シーケンシングデータ表に示されているものに対して相補的な鎖上）。標的Aはプロトスペーサーの位置7にある。一番下：LCL細胞のHFE遺伝子のC282Y変異のABE7.10によって媒介される復帰。この変異は遺伝性ヘモクロマトーシスの頻繁な原因である。標的Aはプロトスペーサーの位置（positon）5にある。
【図６−３】図6C：疾患抑圧SNPをインストールするためまたは疾患を誘導するSNPを修正するためのABEの適用。一番上：HEK293T細胞のHBG1およびHBG2遺伝子のプロモーター領域上の、ABE7.10によって媒介される−198T→C変異（シーケンシングデータ表に示されているものに対して相補的な鎖上）。標的Aはプロトスペーサーの位置7にある。一番下：LCL細胞のHFE遺伝子のC282Y変異のABE7.10によって媒介される復帰。この変異は遺伝性ヘモクロマトーシスの頻繁な原因である。標的Aはプロトスペーサーの位置5にある。
【００２２】
【図７−１】図7は本研究に記載される全てのABEの遺伝子型表を示している。変異はそれらが同定された進化のラウンドに基づいて着色されている。
【図７−２】図7は本研究に記載される全てのABEの遺伝子型表を示している。変異はそれらが同定された進化のラウンドに基づいて着色されている。
【図７−３】図7は本研究に記載される全てのABEの遺伝子型表を示している。変異はそれらが同定された進化のラウンドに基づいて着色されている。
【００２３】
【図８−１】図8Aから8Dは追加の早期ABEバリアントの塩基編集効率を示している。図8A：6つのヒトゲノム標的DNA部位における、Cas9ニッカーゼに融合した種々の野生型RNAアデニンデアミナーゼのHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。値は異なる日に行われた3つの生物学的レプリケートの平均および標準偏差を反映している。図8B：6つのヒトゲノム標的DNA部位における、変えられた融合の向きおよびリンカー長さを有するABE2編集因子のHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。
【図８−２】図8C：DNA上のイノシンに結合する2つの蛋白質、触媒的に不活性化されたアルキル-アデノシングリコシラーゼ（AAG）またはエンドヌクレアーゼV（EndoV）に融合したABE2編集因子の、6つのヒトゲノム標的DNA部位におけるHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。図8D：AAGありまたはなしの部位1におけるHAP1細胞のABE2.1のA・T→G・C塩基編集効率。図8Bおよび8Cの値およびエラーバーは、異なる日に行われた3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映している。
【００２４】
【図９−１】図9は、ABE2.1と6つのヒトゲノム部位のそれぞれを標的化するsgRNAとによって処置されたHEK293T細胞の高スループットDNAシーケンシング分析を示している。1つの代表的なレプリケートが示されている。無処置のHEK293T細胞からのデータが比較のために示されている。
【図９−２】図9は、ABE2.1と6つのヒトゲノム部位のそれぞれを標的化するsgRNAとによって処置されたHEK293T細胞の高スループットDNAシーケンシング分析を示している。1つの代表的なレプリケートが示されている。無処置のHEK293T細胞からのデータが比較のために示されている。
【図９−３】図9は、ABE2.1と6つのヒトゲノム部位のそれぞれを標的化するsgRNAとによって処置されたHEK293T細胞の高スループットDNAシーケンシング分析を示している。1つの代表的なレプリケートが示されている。無処置のHEK293T細胞からのデータが比較のために示されている。
【００２５】
【図１０−１】図10Aから10Cは、追加のABE2およびABE3バリアントの塩基編集効率、ならびにE. coliにおける抗生物質セレクション生残についてA142NをTadA＊−dCas9融合体に追加する効果を示している。図10A：異なる操作された二量体状態を有するABE2バリアントの、6つのヒトゲノム標的DNA部位におけるHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。プロットされているデータは3つの生物学的レプリケートの平均値である。図10B：それらの二量体状態（TadA＊−TadA＊−Cas9ニッカーゼのホモ二量体、または野生型TadA−TadA＊−Cas9ニッカーゼのヘテロ二量体）、TadA−TadAリンカーの長さ、およびTadA−Cas9ニッカーゼリンカーの長さが異なるABE3.1バリアントの、6つのヒトゲノム標的DNA部位におけるHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。ABE遺伝子型およびアーキテクチャについては図7を見よ。
【図１０−２】図10C：スペクチノマイシン耐性遺伝子のI89T欠陥を標的化するsgRNAと進化ラウンド4において同定されたA142N変異を欠くかまたは含有するTadA＊−dCas9編集因子とを発現するE. coli細胞の、256μg/mLのスペクチノマイシンを有する2×YT寒天上におけるコロニー形成単位。標的部位における首尾良いA・T→G・C塩基編集はスペクチノマイシン耐性を復元する。図10Aおよび10Bの値およびエラーバーは、異なる日に行われた3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映している。
【００２６】
【図１１−１】図11Aおよび11Bは追加のABE5バリアントの塩基編集効率を示している。図11A：ラウンド5ライブラリのスペクチノマイシンセレクションから単離された2対の変異を有する2つのABE3.1バリアントの、6つのヒトゲノム標的DNA部位におけるHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。
【図１１−２】図11B：異なるリンカー長さを有するABE5バリアントの6つのヒトゲノム標的DNA部位におけるHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。ABE遺伝子型およびアーキテクチャについては図7を見よ。値およびエラーバーは、異なる日に行われた3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映している。
【００２７】
【図１２−１】図12Aから12Cは17個のゲノム部位におけるABE7バリアントの塩基編集効率を示している。ABE7.1〜7.5（図12A）およびABE7.6〜7.10（図12B）の17個のヒトゲノム標的DNA部位におけるHEK293T細胞のA・T→G・C塩基編集効率。ABE遺伝子型およびアーキテクチャについては図7を見よ。
【図１２−２】図12C：ABE7.8〜7.10の6つのヒトゲノム標的DNA部位におけるU20S細胞のA・T→G・C塩基編集効率。HEK293T細胞と比較してU20S細胞で観察されたより低い編集効率は、2つの細胞株間のトランスフェクション効率の違いと整合する；HEK293T細胞の65-80%と比較して、本研究で用いられた条件下では、約40から55%という典型的なトランスフェクション効率がU20S細胞において観察された。値およびエラーバーは、異なる日に行われた3つの独立した生物学的レプリケートの平均およびs.d.を反映している。
【００２８】
【図１３】図13は、進化および操作のラウンドがABEプロセッシビティーを増大させたということを示している。進化および操作の各ラウンドから出現した最も活性なABEについて、6から17個のヒトゲノム標的DNA部位における近傍の標的A間の計算された平均の正規化された連鎖不平衡（LD）。より高いLD値は、同じDNA鎖（同じシーケンシングリード）上の近傍のAもまた編集される場合に、ABEがあるAを編集することがより蓋然的であるということを指示する。編集効率から独立しているために、LD値は0から1まで正規化されている。値およびエラーバーは、異なる日に行われた3つの独立した生物学的レプリケートからの正規化されたLD値の平均およびs.d.を反映している。
【００２９】
【図１４−１】図14Aおよび14Bは、5つの後期ABEバリアントとHBG1およびHBG2のプロモーター上の−198Tを標的化するsgRNAとによって処置されたHEK293T細胞の高スループットDNAシーケンシング分析を示している。HBG1（図14A）およびHBG2（図14B）プロモーター標的におけるDNA配列の1つの代表的なレプリケートが示されている。ABEによって媒介される塩基編集は、シーケンシングデータ表に示されているものに対して相補的な鎖上の−198T→C変異をインストールする。無処置のHEK293T細胞からのデータが比較のために示されている。
【図１４−２】図14Aおよび14Bは、5つの後期ABEバリアントとHBG1およびHBG2のプロモーター上の−198Tを標的化するsgRNAとによって処置されたHEK293T細胞の高スループットDNAシーケンシング分析を示している。HBG1（図14A）およびHBG2（図14B）プロモーター標的におけるDNA配列の1つの代表的なレプリケートが示されている。ABEによって媒介される塩基編集は、シーケンシングデータ表に示されているものに対して相補的な鎖上の−198T→C変異をインストールする。無処置のHEK293T細胞からのデータが比較のために示されている。
【図１４−３】図14Aおよび14Bは、5つの後期ABEバリアントとHBG1およびHBG2のプロモーター上の−198Tを標的化するsgRNAとによって処置されたHEK293T細胞の高スループットDNAシーケンシング分析を示している。HBG1（図14A）およびHBG2（図14B）プロモーター標的におけるDNA配列の1つの代表的なレプリケートが示されている。ABEによって媒介される塩基編集は、シーケンシングデータ表に示されているものに対して相補的な鎖上の−198T→C変異をインストールする。無処置のHEK293T細胞からのデータが比較のために示されている。
【図１４−４】図14Aおよび14Bは、5つの後期ABEバリアントとHBG1およびHBG2のプロモーター上の−198Tを標的化するsgRNAとによって処置されたHEK293T細胞の高スループットDNAシーケンシング分析を示している。HBG1（図14A）およびHBG2（図14B）プロモーター標的におけるDNA配列の1つの代表的なレプリケートが示されている。ABEによって媒介される塩基編集は、シーケンシングデータ表に示されているものに対して相補的な鎖上の−198T→C変異をインストールする。無処置のHEK293T細胞からのデータが比較のために示されている。
【００３０】
【図１５】図15は、塩基編集因子ABE7.10とHBG1／2のプロモーター領域を標的化する12個のgRNAとを用いる塩基編集データを示している。gRNA標的配列のアイデンティティーは（1）配列番号259、（2）配列番号260、（3）配列番号266、（4）配列番号267、（5）配列番号268、（6）配列番号269、（7）配列番号270、（8）配列番号276、（9）配列番号277、（10）配列番号278、（11）配列番号279、および（12）配列番号280である。
【００３１】
定義
コンテキストが明瞭に別様に指示しない限り、本明細書および請求項において用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は単数および複数形を包含する。それゆえに、例えば、「薬剤」の参照は単一の薬剤および複数のかかる薬剤を包含する。
【００３２】
用語「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」は脱アミノ化反応を触媒する蛋白質または酵素を言う。いくつかの態様では、デアミナーゼはアデノシンデアミナーゼであり、これはアデニンまたはアデノシンの加水分解的な脱アミノ化を触媒する。いくつかの態様では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインはアデノシンデアミナーゼであり、アデノシンまたはデオキシアデノシンからそれぞれイノシンまたはデオキシイノシンへの加水分解的な脱アミノ化を触媒する。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼはデオキシリボ核酸（DNA）上のアデニンまたはアデノシンの加水分解的な脱アミノ化を触媒する。本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼ（例えば操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化したアデノシンデアミナーゼ）は細菌などのいずれかの生物からであり得る。いくつかの態様では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインはある生物からの天然に存在するデアミナーゼのバリアントである。いくつかの態様では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは天然に存在しない。例えば、いくつかの態様では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然に存在するデアミナーゼと少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは細菌、例えばE.coli、S. aureus、S. typhi、S. putrefaciens、H. influenzae、またはC. crescentusからである。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼはTadAデアミナーゼである。いくつかの態様では、TadAデアミナーゼはE. coli TadAデアミナーゼ（ecTadA）である。いくつかの態様では、TadAデアミナーゼは短縮型E. coli TadAデアミナーゼである。例えば、短縮型ecTadAは全長ecTadAに対して相対的に1つ以上のN末端アミノ酸を失っていることがある。いくつかの態様では、短縮型ecTadAは全長ecTadAに対して相対的に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、または20個のN末端アミノ酸残基を失っていることがある。いくつかの態様では、短縮型ecTadAは全長ecTadAに対して相対的に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、または20個のC末端アミノ酸残基を失っていることがある。いくつかの態様では、ecTadAデアミナーゼはN末端メチオニンを含まない。
【００３３】
いくつかの態様では、TadAデアミナーゼはN末端短縮型TadAである。ある種の態様では、アデノシンデアミナーゼはアミノ酸配列：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD（配列番号1）
を含む。
【００３４】
いくつかの態様では、TadAデアミナーゼは全長E. coli TadAデアミナーゼである。例えば、ある種の態様では、アデノシンデアミナーゼはアミノ酸配列：
MRRAFITGVFFLSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD（配列番号84）
を含む。
【００３５】
しかしながら、本願に有用な追加のアデノシンデアミナーゼが当業者には明らかであり、本開示の範囲内であるということは了解されるはずである。例えば、アデノシンデアミナーゼはADATのホモログであり得る。例示的なADATホモログは限定なしに：
Staphylococcus aureus TadA：
MGSHMTNDIYFMTLAIEEAKKAAQLGEVPIGAIITKDDEVIARAHNLRETLQQPTAHAEHIAIERAAKVLGSWRLEGCTLYVTLEPCVMCAGTIVMSRIPRVVYGADDPKGGCSGSLMNLLQQSNFNHRAIVDKGVLKEACSTLLTTFFKNLRANKKSTN（配列番号8）
Bacillus subtilis TadA：
MTQDELYMKEAIKEAKKAEEKGEVPIGAVLVINGEIIARAHNLRETEQRSIAHAEMLVIDEACKALGTWRLEGATLYVTLEPCPMCAGAVVLSRVEKVVFGAFDPKGGCSGTLMNLLQEERFNHQAEVVSGVLEEECGGMLSAFFRELRKKKKAARKNLSE（配列番号9）
Salmonella typhimurium（S. typhimurium）TadA：
MPPAFITGVTSLSDVELDHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNHRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVLQNYRLLDTTLYVTLEPCVMCAGAMVHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLIDVLHHPGMNHRVEIIEGVLRDECATLLSDFFRMRRQEIKALKKADRAEGAGPAV（配列番号371）
Shewanella putrefaciens（S. putrefaciens）TadA：
MDEYWMQVAMQMAEKAEAAGEVPVGAVLVKDGQQIATGYNLSISQHDPTAHAEILCLRSAGKKLENYRLLDATLYITLEPCAMCAGAMVHSRIARVVYGARDEKTGAAGTVVNLLQHPAFNHQVEVTSGVLAEACSAQLSRFFKRRRDEKKALKLAQRAQQGIE（配列番号372）
Haemophilus influenzae F3031（H. influenzae）TadA：
MDAAKVRSEFDEKMMRYALELADKAEALGEIPVGAVLVDDARNIIGEGWNLSIVQSDPTAHAEIIALRNGAKNIQNYRLLNSTLYVTLEPCTMCAGAILHSRIKRLVFGASDYKTGAIGSRFHFFDDYKMNHTLEITSGVLAEECSQKLSTFFQKRREEKKIEKALLKSLSDK（配列番号373）
Caulobacter crescentus（C. crescentus）TadA：
MRTDESEDQDHRMMRLALDAARAAAEAGETPVGAVILDPSTGEVIATAGNGPIAAHDPTAHAEIAAMRAAAAKLGNYRLTDLTLVVTLEPCAMCAGAISHARIGRVVFGADDPKGGAVVHGPKFFAQPTCHWRPEVTGGVLADESADLLRGFFRARRKAKI（配列番号374）
Geobacter sulfurreducens（G. sulfurreducens）TadA：
MSSLKKTPIRDDAYWMGKAIREAAKAAARDEVPIGAVIVRDGAVIGRGHNLREGSNDPSAHAEMIAIRQAARRSANWRLTGATLYVTLEPCLMCMGAIILARLERVVFGCYDPKGGAAGSLYDLSADPRLNHQVRLSPGVCQEECGTMLSDFFRDLRRRKKAKATPALFIDERKVPPEP（配列番号375）
を包含する。
【００３６】
用語「塩基編集因子（BE）」または「核酸塩基編集因子（NBE）」は、核酸配列（例えばDNAまたはRNA）内の塩基（例えばA、T、C、G、またはU）に改変を作ることができるポリペプチドを含む薬剤を言う。いくつかの態様では、塩基編集因子は核酸内の塩基を脱アミノ化することができる。いくつかの態様では、塩基編集因子はDNA分子内の塩基を脱アミノ化することができる。いくつかの態様では、塩基編集因子はDNA上のアデニン（A）を脱アミノ化することができる。いくつかの態様では、塩基編集因子は、アデノシンデアミナーゼに融合した核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）を含む融合蛋白質である。いくつかの態様では、塩基編集因子はアデノシンデアミナーゼに融合したCas9蛋白質である。いくつかの態様では、塩基編集因子はアデノシンデアミナーゼに融合したCas9ニッカーゼ（nCas9）である。いくつかの態様では、塩基編集因子はアデノシンデアミナーゼに融合したヌクレアーゼ不活性なCas9（dCas9）である。いくつかの態様では、塩基編集因子は、塩基除去修復の阻害因子、例えばUGIドメインまたはdISNドメインに融合させられる。いくつかの態様では、融合蛋白質は、デアミナーゼとUGIまたはdISNドメインなどの塩基除去修復の阻害因子とに融合したCas9ニッカーゼを含む。いくつかの態様では、融合蛋白質のdCas9ドメインは配列番号52のD10AおよびH840A変異または配列番号108〜357のいずれかの対応する変異を含み、これはCas9蛋白質のヌクレアーゼ活性を不活性化する。いくつかの態様では、融合蛋白質はD10A変異を含み、配列番号52の残基840のヒスチジンまたは配列番号108〜357のいずれかの対応する変異を含み、これはCas9が核酸二重鎖の1つの鎖のみを切断することができるようにする。Cas9ニッカーゼの例が配列番号35に示されている。
【００３７】
本明細書において用いられる用語「リンカー」は、2つの分子または部分、例えば、例えばヌクレアーゼ不活性なCas9ドメインおよび核酸編集ドメイン（例えばアデノシンデアミナーゼ）などの融合蛋白質の2つのドメインを連結する結合（例えば共有結合）、化学基、または分子を言う。いくつかの態様では、リンカーがCas9ヌクレアーゼドメインを包含するRNAによってプログラム可能なヌクレアーゼのgRNA結合ドメインと核酸編集蛋白質の触媒ドメインとを接合する。いくつかの態様では、リンカーがdCas9と核酸編集蛋白質とを接合する。典型的には、リンカーは2つの基、分子、または他の部分の間に位置するかまたはそれらによってフランキングされ、共有結合を介して各1つに接続され、それゆえに2つを接続する。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸または複数のアミノ酸（例えばペプチドまたは蛋白質）である。いくつかの態様では、リンカーは有機分子、基、ポリマー、または化学的な部分である。いくつかの態様では、リンカーは配列番号10、37〜40、384〜386、685〜688、または800〜801のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが5〜100アミノ酸、例えば、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35〜40、40〜45、45〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜150、または150〜200アミノ酸である。より長いまたはより短いリンカーもまた企図される。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGSETPGTSESATPES（配列番号10）を含み、これはXTENリンカーともまた言われ得る。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGS（配列番号37）を含む。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列(SGGS)2-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)2（配列番号800）を含み、これは(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2ともまた言われ得る。いくつかの態様では、リンカーは、(SGGS)n（配列番号37）、(GGGS)n（配列番号38）、(GGGGS)n（配列番号39）、(G)n、(EAAAK)n（配列番号40）、(GGS)n、SGSETPGTSESATPES（配列番号10）、(SGGS)n-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)n（配列番号801）、もしくは（XP）nモチーフ、またはこれらのいずれかの組み合わせを含み、nは独立して1および30の間の整数であり、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15である。
【００３８】
本明細書において用いられる用語「変異」は、配列、例えば核酸もしくはアミノ酸配列内のある残基の、別の残基による置換、または配列内の1つ以上の残基の欠失もしくは挿入を言う。典型的には、変異は、元々の残基、次に配列内の残基の位置、および新たに置換された残基のアイデンティティーを同定することによって本明細書に記載される。本明細書において提供されるアミノ酸置換（変異）を作るための種々の方法が当分野において周知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)）によって提供される。
【００３９】
用語「核局在配列」または「NLS」は、例えば核輸送による細胞核への蛋白質の輸入を促進するアミノ酸配列を言う。核局在配列は当分野において公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、NLS配列は、2001年5月31日にWO/2001/038547として公開された2000年11月23日出願のPlank et al.，国際PCT出願PCT/EP2000/011690に記載されており、これの内容は、例示的な核局在配列のそれらの開示について参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、NLSはアミノ酸配列PKKKRKV（配列番号4）、MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC（配列番号5）、MKRTADGSEFEPKKKRKV（配列番号342）、またはKRTADGSEFEPKKKRKV（配列番号343）を含む。
【００４０】
用語「核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質」または「napDNAbp」は、napDNAbpを特定の核酸配列へとガイドするガイド核酸（nuclic acid）などの核酸（例えばDNAまたはRNA）と会合する蛋白質を言う。例えば、Cas9蛋白質は、ガイドRNAに対して相補的である（has）特定のDNA配列へとCas9蛋白質をガイドするガイドRNAと会合し得る。いくつかの態様では、napDNAbpはクラス2微生物CRISPR−Casエフェクターである。いくつかの態様では、napDNAbpはCas9ドメイン、例えばヌクレアーゼ活性なCas9、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、またはヌクレアーゼ不活性なCas9（dCas9）である。核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質の例は、限定なしに、Cas9（例えばdCas9およびnCas9）、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2C3、およびアルゴノートを包含する。しかしながら、核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質はRNAに結合する核酸によってプログラム可能な蛋白質をもまた包含するということは了解されるはずである。例えば、napDNAbpは、napDNAbpをRNAへとガイドする核酸と会合し得る。他の核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質もまた本開示の範囲内であるが、それらは本開示においては具体的に列記されずにあり得る。
【００４１】
用語「Cas9」または「Cas9ドメイン」は、Cas9蛋白質またはその断片（例えば、Cas9の活性な、不活性な、もしくは部分的に活性なDNA 切断ドメイン、および／またはCas9のgRNA結合ドメインを含む蛋白質）を含むRNAによってガイドされるヌクレアーゼを言う。Cas9ヌクレアーゼは場合によってはcasnlヌクレアーゼまたはCRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連ヌクレアーゼともまた言われる。CRISPRは、可動遺伝子エレメント（ウイルス、転移エレメント、および接合プラスミド）からの保護を提供する適応免疫システムである。CRISPRクラスターは、スペーサー、祖先由来の可動性エレメントに対して相補的な配列を含有し、侵入核酸を標的化する。CRISPRクラスターは転写され、CRISPR RNA（crRNA）へとプロセシングされる。II型CRISPRシステムでは、プレcrRNAの正しいプロセシングは、trans-encoded small RNA（tracrRNA）、内在性のリボヌクレアーゼ3（rnc）、およびCas9蛋白質を要求する。tracrRNAは、プレcrRNAのリボヌクレアーゼ3によって支援されるプロセシングのためのガイドとしての用をなす。爾後に、Cas9／crRNA／tracrRNAは、スペーサーに対して相補的な線状または環状dsDNA標的をエンド的に切断する。crRNAに対して相補的でない標的鎖が最初にエンド的に切られ、それから3'-5'エキソ的にトリミングされる。天然には、DNA結合および切断は典型的には蛋白質および両方のRNAを要求する。しかしながら、crRNAおよびtracrRNA両方の側面を1個のRNA種に組み込むように、シングルガイドRNA（「sgRNA」または単純に「gNRA」）が操作され得る。例えば、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821 (2012)を見よ。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。Cas9は、CRISPRリピート配列中の短いモチーフ（PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己対非自己を区別することを助ける。Cas9ヌクレアーゼ配列および構造は当業者に周知である（例えば、"Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 4658-4663 (2001)；"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471: 602-607 (2011)；および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337: 816-821 (2012)を見よ。これらのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。Cas9オーソログは種々の種において記載されており、S. pyogenesおよびS. thermophilusを包含するが、これらに限定されない。追加の好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は本開示に基づいて当業者には明らかであろう。かかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems"（2013）RNA Biology 10:5, 726-737に開示されている生物および座位からのCas9配列を包含する；これの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、Cas9ヌクレアーゼは不活性な（例えば不活性化された）DNA切断ドメインを有し、つまりCas9はニッカ���ゼである。
【００４２】
ヌクレアーゼ不活性化したCas9蛋白質は交換可能に「dCas9」蛋白質（ヌクレアーゼ「デッド」なCas9から）と言われ得る。不活性なDNA切断ドメインを有するCas9蛋白質（またはその断片）を作り出すための方法は公知である（例えばJinek et al., Science. 337: 816-821 (2012)；Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28；152(5): 1173-83を見よ。これらのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、2つのサブドメイン、HNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvC1サブドメインを包含することが公知である。HNHサブドメインはgRNAに対して相補的な鎖を切断し、RuvC1サブドメインは非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異はCas9のヌクレアーゼ活性をサイレンシングし得る。例えば、変異D10AおよびH840AはS. pyogenes Cas9のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Jinek et al., Science. 337:816-821 (2012)；Qi et al., Cell. 28; 152(5): 1173-83 (2013)）。いくつかの態様では、Cas9の断片を含む蛋白質が提供される。例えば、いくつかの態様では、蛋白質は2つのCas9ドメインのうちの1つ：（1）Cas9のgRNA結合ドメイン；または（2）Cas9のDNA切断ドメインを含む。いくつかの態様では、Cas9またはその断片を含む蛋白質は「Cas9バリアント」と言われる。Cas9バリアントはCas9またはその断片に対して相同性を共有する。例えば、Cas9バリアントは、野生型Cas9と少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約96%同一、少なくとも約97%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、少なくとも約99.5%同一、または少なくとも約99.9%同一である。いくつかの態様では、Cas9バリアントは、野生型Cas9と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはより多くのアミノ酸変化を有し得る。いくつかの態様では、断片が野生型Cas9の対応する断片と少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約96%同一、少なくとも約97%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、少なくとも約99.5%同一、または少なくとも約99.9%同一であるように、Cas9バリアントはCas9の断片（例えばgRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン）を含み得る。いくつかの態様では、断片は対応する野生型Cas9のアミノ酸長さの少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%である。
【００４３】
いくつかの態様では、断片は長さが少なくとも100アミノ酸である。いくつかの態様では、断片は長さが少なくとも100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、または1300アミノ酸である。いくつかの態様では、野生型Cas9はStreptococcus pyogenesからのCas9（NCBI参照配列：NC_017053.1、配列番号47（ヌクレオチド）；配列番号48（アミノ酸））に対応する。
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGGCAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAATCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAGAAATGGCTTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAGCGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGCGCCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGGGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGATATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTACAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCATTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTACTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA（配列番号47）
【化４−１】
2021500036.tif 000006
【化４−２】
2021500036.tif 000007
【００４４】
いくつかの態様では、野生型Cas9は配列番号49（ヌクレオチド）および／または配列番号50（アミノ酸）に対応するか、またはそれを含む：
ATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGACATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATCACATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGA（配列番号49）
【化５−１】
2021500036.tif 000008
【化５−２】
2021500036.tif 000009
【００４５】
いくつかの態様では、野生型Cas9はStreptococcus pyogenesからのCas9（NCBI参照配列：NC_002737.2、配列番号51（ヌクレオチド）；およびUniport参照配列：Q99ZW2、配列番号52（アミノ酸）に対応する。
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA（配列番号51）
【化６−１】
2021500036.tif 000010
【化６−２】
2021500036.tif 000011
【００４６】
いくつかの態様では、Cas9は：Corynebacterium ulcerans（NCBI Ref：NC_015683.1、NC_017317.1）；Corynebacterium diphtheria（NCBI Ref：NC_016782.1、NC_016786.1）；Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref：NC_021284.1）；Prevotella intermedia（NCBI Ref：NC_017861.1）；Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref：NC_021846.1）；Streptococcus iniae（NCBI Ref：NC_021314.1）；Belliella baltica（NCBI Ref：NC_018010.1）；Psychroflexus torquisl（NCBI Ref：NC_018721.1）；Streptococcus thermophilus（NCBI Ref：YP_820832.1）；Listeria innocua（NCBI Ref：NP_472073.1）；Campylobacter jejuni（NCBI Ref：YP_002344900.1）；Geobacillus stearothermophilus（NCBI Ref：NZ_CP008934.1）；もしくはNeisseria meningitidis（NCBI Ref：YP_002342100.1）からのCas9を、またはいずれかの他の生物からのCas9を言う。
【００４７】
いくつかの態様では、dCas9は、部分的にまたは丸ごと、Cas9ヌクレアーゼ活性を不活性化する1つ以上の変異を有するCas9アミノ酸配列に対応するか、またはそれを含む。例えば、いくつかの態様では、dCas9ドメインは配列番号52のD10AおよびH840A変異または別のCas9の対応する変異を含む。いくつかの態様では、dCas9は配列番号53のアミノ酸配列を含む。
dCas9(D10AおよびH840A)：
【化７】
2021500036.tif 000012
【００４８】
いくつかの態様では、Cas9ドメインはD10A変異を含むが、配列番号52で提供されるアミノ酸配列の位置840、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する位置の残基はヒスチジンのままである。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、触媒残基H840の存在は、Cas9が標的のAの反対側のTを含有する編集されない（例えば脱アミノ化されない）鎖を切断する活性を維持する。（例えばdCas9のA840からの）H840の復元は、Aを含有する標的鎖の切断はもたらさない。かかるCas9バリアントは、gRNAによって定義される標的配列に基づく特異的な場所において一本鎖DNA切断（ニック）を作り出す能力があり、編集されない鎖の修復に至り、終局的には、編集されない鎖上のT→C変化をもたらす。このプロセスの概略図が図1Cに示されている。簡潔には、いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、アデノシンデアミナーゼ、例えばDNA上のアデノシンを脱アミノ化する操作されたアデノシンデアミナーゼによって、A−T塩基対のAはイノシン（I）へと脱アミノ化され得る。Tを有する編集されない鎖にニックを入れることは、ミスマッチ修復メカニズムを介するTの取り除きを促進する。UGIドメインまたは触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼ（dISN）はイノシン特異的ヌクレアーゼを（例えば立体的に）阻害し得、それによってイノシン（I）の取り除きを防止する。
【００４９】
他の態様では、D10AおよびH840A以外の変異を有するdCas9バリアントが提供され、これらは例えばヌクレアーゼ不活性化されたCas9（dCas9）をもたらす。かかる変異は、例として、D10およびH840における他のアミノ酸置換、またはCas9のヌクレアーゼドメイン内の他の置換（例えば、HNHヌクレアーゼサブドメインおよび／またはRuvC1サブドメイン上の置換）を包含する。いくつかの態様では、dCas9のバリアントまたはホモログ（例えば配列番号53のバリアント）が提供され、これらが配列番号10と少なくとも約70%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、少なくとも約99.5%同一、または少なくとも約99.9%同一である。いくつかの態様では、dCas9のバリアント（例えば、配列番号53のバリアント）が提供され、配列番号53よりも約5アミノ酸、約10アミノ酸、約15アミノ酸、約20アミノ酸、約25アミノ酸、約30アミノ酸、約40アミノ酸、約50アミノ酸、約75アミノ酸、約100アミノ酸、またはより多くだけ短いかまたは長いアミノ酸配列を有する。
【００５０】
いくつかの態様では、本明細書において提供されるCas9融合蛋白質は、Cas9蛋白質の全長アミノ酸配列、例えば本明細書において提供されるCas9配列の1つを含む。しかしながら、他の態様では、本明細書において提供される融合蛋白質は全長Cas9配列ではなくその断片のみを含む。例えば、いくつかの態様では、本明細書において提供されるCas9融合蛋白質はCas9断片を含み、断片はcrRNAおよびtracrRNAまたはsgRNAに結合するが、例えばそれがヌクレアーゼドメインの短縮型バージョンのみを含むかまたはヌクレアーゼドメインを全く含まないという点で、機能的なヌクレアーゼドメインを含まない。
【００５１】
好適なCas9ドメインおよびCas9断片の例示的なアミノ酸配列が本明細書において提供されており、Cas9ドメインおよび断片の追加の好適な配列は当業者には明らかであろう。
【００５２】
いくつかの態様では、Cas9は：Corynebacterium ulcerans（NCBI Ref：NC_015683.1、NC_017317.1）；Corynebacterium diphtheria（NCBI Ref：NC_016782.1、NC_016786.1）；Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref：NC_021284.1）；Prevotella intermedia（NCBI Ref：NC_017861.1）；Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref：NC_021846.1）；Streptococcus iniae（NCBI Ref：NC_021314.1）；Belliella baltica（NCBI Ref：NC_018010.1）；Psychroflexus torquisl（NCBI Ref：NC_018721.1）；Streptococcus thermophilus（NCBI Ref：YP_820832.1）；Listeria innocua（NCBI Ref：NP_472073.1）；Campylobacter jejuni（NCBI Ref：YP_002344900.1）；Geobacillus stearothermophilus（NCBI Ref：NZ_CP008934.1）；またはNeisseria meningitidis（NCBI Ref：YP_002342100.1）からのCas9を言う。
【００５３】
追加のCas9蛋白質（例えば、ヌクレアーゼデッドなCas9（dCas9）、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、またはヌクレアーゼ活性なCas9）は本開示の範囲内であり、それらのバリアントおよびホモログを包含するということは了解されるはずである。例示的なCas9蛋白質は、限定なしに、下で提供されるものを包含する。いくつかの態様では、Cas9蛋白質はヌクレアーゼデッドなCas9（dCas9）である。いくつかの態様では、dCas9はアミノ酸配列（配列番号34）を含む。いくつかの態様では、Cas9蛋白質はCas9ニッカーゼ（nCas9）である。いくつかの態様では、nCas9はアミノ酸配列（配列番号35）を含む。いくつかの態様では、Cas9蛋白質はヌクレアーゼ活性なCas9である。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ活性なCas9はアミノ酸配列（配列番号36）を含む。
例示的な触媒的に不活性なCas9（dCas9）：
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号34）
例示的なCas9ニッカーゼ（nCas9）：
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号35）
例示的な触媒的に活性なCas9：
DKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号36）
【００５４】
いくつかの態様では、Cas9は、単細胞原核微生物のあるドメインおよび界を構成する古細菌（例えば、ナノ古細菌）からのCas9を言う。いくつかの態様では、Cas9はCasXまたはCasYを言い、これらは例えばBurstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21に記載されており、これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。ゲノム解像度のメタゲノミクスを用いて、生命の古細菌ドメインにおける最初に報告されたCas9を包含するいくつものCRISPR−Casシステムが同定された。この分岐したCas9蛋白質は、ほとんど研究されていないナノ古細において、活性なCRISPR−Casシステムの一部として見出された。細菌では、2つの以前には未知のシステム、CRISPR−CasXおよびCRISPR−CasYが発見された。これらはこれまで発見された最もコンパクトなシステムの一員である。いくつかの態様では、Cas9はCasXまたはCasXのバリアントを言う。いくつかの態様では、Cas9はCasYまたはCasYのバリアントを言う。他のRNAによってガイドされるDNA結合蛋白質が核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）として用いられ得、本開示の範囲内であるということは、了解されるはずである。
【００５５】
いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかの核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）はCasXまたはCasY蛋白質であり得る。いくつかの態様では、napDNAbpはCasX蛋白質である。いくつかの態様では、napDNAbpはCasY蛋白質である。いくつかの態様では、napDNAbpは、天然に存在するCasXまたはCasY蛋白質と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも（at ease）99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、napDNAbpは天然に存在するCasXまたはCasY蛋白質である。いくつかの態様では、napDNAbpは、配列番号417〜419のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも（at ease）99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、napDNAbpはいずれかの1つの配列番号417〜419のアミノ酸配列を含む。他の細菌種からのCasXおよびCasYもまた本開示に従って用いられ得るということは了解されるはずである。
CasX（uniprot.org/uniprot/F0NN87; uniprot.org/uniprot/F0NH53）
＞tr|F0NN87|F0NN87_SULIH CRISPR関連Casx蛋白質 OS=Sulfolobus islandicus（HVE10/4株）GN=SiH_0402 PE=4 SV=1
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYEFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIIAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVRIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRYLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTGSKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG（配列番号417）
＞tr|F0NH53|F0NH53_SULIR CRISPR関連蛋白質, Casx OS=Sulfolobus islandicus（REY15A株）GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYKFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIMAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVSIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRDLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTGSKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG（配列番号418）
CasY（ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1）
＞APG80656.1 CRISPR関連蛋白質CasY [非培養Parcubacteria群細菌]
MSKRHPRISGVKGYRLHAQRLEYTGKSGAMRTIKYPLYSSPSGGRTVPREIVSAINDDYVGLYGLSNFDDLYNAEKRNEEKVYSVLDFWYDCVQYGAVFSYTAPGLLKNVAEVRGGSYELTKTLKGSHLYDELQIDKVIKFLNKKEISRANGSLDKLKKDIIDCFKAEYRERHKDQCNKLADDIKNAKKDAGASLGERQKKLFRDFFGISEQSENDKPSFTNPLNLTCCLLPFDTVNNNRNRGEVLFNKLKEYAQKLDKNEGSLEMWEYIGIGNSGTAFSNFLGEGFLGRLRENKITELKKAMMDITDAWRGQEQEEELEKRLRILAALTIKLREPKFDNHWGGYRSDINGKLSSWLQNYINQTVKIKEDLKGHKKDLKKAKEMINRFGESDTKEEAVVSSLLESIEKIVPDDSADDEKPDIPAIAIYRRFLSDGRLTLNRFVQREDVQEALIKERLEAEKKKKPKKRKKKSDAEDEKETIDFKELFPHLAKPLKLVPNFYGDSKRELYKKYKNAAIYTDALWKAVEKIYKSAFSSSLKNSFFDTDFDKDFFIKRLQKIFSVYRRFNTDKWKPIVKNSFAPYCDIVSLAENEVLYKPKQSRSRKSAAIDKNRVRLPSTENIAKAGIALARELSVAGFDWKDLLKKEEHEEYIDLIELHKTALALLLAVTETQLDISALDFVENGTVKDFMKTRDGNLVLEGRFLEMFSQSIVFSELRGLAGLMSRKEFITRSAIQTMNGKQAELLYIPHEFQSAKITTPKEMSRAFLDLAPAEFATSLEPESLSEKSLLKLKQMRYYPHYFGYELTRTGQGIDGGVAENALRLEKSPVKKREIKCKQYKTLGRGQNKIVLYVRSSYYQTQFLEWFLHRPKNVQTDVAVSGSFLIDEKKVKTRWNYDALTVALEPVSGSERVFVSQPFTIFPEKSAEEEGQRYLGIDIGEYGIAYTALEITGDSAKILDQNFISDPQLKTLREEVKGLKLDQRRGTFAMPSTKIARIRESLVHSLRNRIHHLALKHKAKIVYELEVSRFEEGKQKIKKVYATLKKADVYSEIDADKNLQTTVWGKLAVASEISASYTSQFCGACKKLWRAEMQVDETITTQELIGTVRVIKGGTLIDAIKDFMRPPIFDENDTPFPKYRDFCDKHHISKKMRGNSCLFICPFCRANADADIQASQTIALLRYVKEEKKVEDYFERFRKLKNIKVLGQMKKI（配列番号419）
【００５６】
本明細書において用いられる用語「有効量」は、所望の生物学的応答を誘起するために十分である生物学的に活性な薬剤の量を言う。例えば、いくつかの態様では、核酸塩基編集因子の有効量は、核酸塩基編集因子によって変異させられる特異的に結合された標的部位の変異を誘導するために十分である核酸塩基編集因子の量を言い得る。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質の、例えば核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質とデアミナーゼドメイン（例えばアデノシンデアミナーゼドメイン）とを含む融合蛋白質の有効量は、融合蛋白質によって編集される特異的に結合された標的部位の編集を誘導するために十分である融合蛋白質の量を言い得る。当業者によって了解されるであろう通り、薬剤、例えば融合蛋白質、核酸塩基編集因子、デアミナーゼ、ハイブリッド蛋白質、蛋白質二量体、蛋白質（もしくは蛋白質二量体）およびポリヌクレオチドの複合体、またはポリヌクレオチドの有効量は、種々の因子、例えば所望の生物学的応答に、例えば編集されるべき特定のアレル、ゲノム、または標的部位に、標的化されようとする細胞または組織に、および用いられようとする薬剤に依存して変わり得る。
【００５７】
本明細書において用いられる用語「核酸」および「核酸分子」は、核酸塩基と酸性部分とを含む化合物、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを言う。典型的には、ポリマー核酸、例えば3ヌクレオチド以上を含む核酸分子は線状分子であり、その中の隣接ヌクレオチド同士はホスホジエステル連結部を介して互いに連結される。いくつかの態様では、「核酸」は個々の核酸残基（例えばヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を言う。いくつかの態様では、「核酸」は3つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を言う。本明細書において用いられる用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも3ヌクレオチドのストリング）を言うために交換可能に用いられ得る。いくつかの態様では、「核酸」はRNAならびに一および／または二本鎖DNAを包摂する。核酸は、例えばゲノム、転写物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、プラスミド、コスミド、染色体、クロマチド、または他の天然に存在する核酸分子のコンテキストにおいて、天然に存在し得る。他方で、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば組換え体DNAもしくはRNA、人工染色体、操作されたゲノム、もしくはその断片、または合成DNA、RNA、DNA／RNAハイブリッドであり得、あるいは天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオシドを包含する。さらにその上、用語「核酸」、「DNA」、「RNA」、および／または類似の用語は、核酸アナログ、例えばホスホジエステルバックボーン以外を有するアナログを包含する。核酸は、天然のソースから精製、組換え体発現システムを用いて産生および任意に精製、化学合成などされ得る。適当なところでは、例えば化学合成された分子のケースでは、核酸は、ヌクレオシドアナログ、例えば化学修飾された塩基または糖を有するアナログ、ならびにバックボーン修飾を含み得る。別様に指示されない限り、核酸配列は5'→3'方向で提出される。いくつかの態様では、核酸は、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学修飾塩基；生物学的修飾塩基（例えばメチル化塩基）；インターカレーション塩基；修飾糖（例えば、2'−フルオロリボース、リボース、2'−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび5'−N−ホスホロアミダイト連結部）であるか、またはそれを含む。
【００５８】
本明細書において用いられる用語「プロモーター」は、そこで核酸配列の残りの転写の開始および速度がコントロールされる核酸配列のコントロール領域を言う。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子などの制御蛋白質および分子が結合し得る部分領域をもまた含有し得る。
【００５９】
用語「蛋白質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は本明細書においては交換可能に用いられ、ペプチド（アミド）結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基のポリマーを言う。用語はいずれかのサイズ、構造、または機能の蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドを言う。典型的には、蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは少なくとも3アミノ酸の長さであろう。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々の蛋白質または蛋白質の集まりを言い得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸の1つ以上は修飾され得、例えば、化学的実体、例えば炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化、または他の改変のためのリンカーなどの追加による。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは単分子でもまたあり得、または多分子複合体であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する蛋白質またはペプチドの単に断片であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するか、組換え体か、もしくは合成か、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。本明細書において用いられる用語「融合蛋白質」は、少なくとも2つの異なる蛋白質からの蛋白質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを言う。1つの蛋白質は融合蛋白質のアミノ末端（N末端）部分にまたはカルボキシ末端（C末端）部分（protein）に置かれ得、それゆえにそれぞれ「アミノ末端融合蛋白質」または「カルボキシ末端融合蛋白質」を形成する。蛋白質は、異なるドメイン、例えば核酸結合ドメイン（例えば、標的部位への蛋白質の結合を導くCas9のgRNA結合ドメイン）と核酸切断ドメインまたは核酸編集蛋白質の触媒ドメインとを含み得る。いくつかの態様では、蛋白質は、蛋白質性の一部、例えば核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列と、有機化合物、例えば核酸切断薬剤として作用し得る化合物とを含む。いくつかの態様では、蛋白質は、核酸、例えばRNAとの複合体であるかまたは会合している。本明細書において提供される蛋白質のいずれかは当分野において公知のいずれかの方法によって産生され得る。例えば、本明細書において提供される蛋白質は組換え体蛋白質発現および精製によって産生され得、これはペプチドリンカーを含む融合蛋白質に特に適している。組換え体蛋白質発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)）によって記載されているものを包含し、これの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６０】
用語「RNAによってプログラム可能なヌクレアーゼ」および「RNAによってガイドされるヌクレアーゼ」は本明細書においては交換可能に用いられ、切断の標的ではない1つ以上のRNA（単数または複数）と複合体を形成する（例えば結合または会合する）ヌクレアーゼを言う。いくつかの態様では、RNAによってプログラム可能なヌクレアーゼは、RNAとの複合体であるときに、ヌクレアーゼ：RNA複合体と言われ得る。典型的には、結合したRNA（単数または複数）はガイドRNA（gRNA）と言われる。gRNAは2つ以上のRNAの複合体としてまたは1個のRNA分子として存在し得る。1個のRNA分子として存在するgRNAはシングルガイドRNA（sgRNA）と言われ得るが、「gRNA」は、1個の分子または2つ以上の分子の複合体どちらかとして存在するガイドRNAを言うために交換可能に用いられる。典型的には、1個のRNA種として存在するgRNAは2つのドメインを含む：（1）ガイド配列と言われる、標的核酸に対して相同性を共有する（例えば、かつ標的へのCas9複合体の結合を導く）ドメイン；および（2）Cas9蛋白質に結合するドメインである。いくつかの態様では、ドメイン（1）はHBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター上の配列と相同性を共有する。いくつかの態様では、ドメイン（1）は配列5'-GTGGGGAAGGGGCCCCCAAGAGG-3'（配列番号2）と相同性を共有する。いくつかの態様では、ドメイン（1）はHFE遺伝子上の配列と相同性を共有する。いくつかの態様では、ドメイン（1）は配列5'-TATACGTACCAGGTGGAGCACCCAGG-3'（配列番号3）と相同性を共有する。いくつかの態様では、ドメイン（2）はtracrRNAとして公知の配列に対応し、ステムループ構造を含む。例えば、いくつかの態様では、ドメイン（2）はJinek et al., Science 337:816-821（2012）によって提供されているtracrRNAと同一または相同である。これの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。gRNAの他の例（例えばドメイン2を包含するもの）は、「Switchable Cas9 Nucleases And Uses Thereof」と題する2013年9月6日出願のU.S.仮特許出願U.S.S.N.61/874,682および「Delivery System For Functional Nucleases」と題する2013年9月6日出願のU.S.仮特許出願U.S.S.N.61/874,746に見いだされ得る。それぞれの内容全体はそれらの全体が参照によってここに組み込まれる。いくつかの態様では、gRNAはドメイン（1）および（2）の2つ以上を含み、「拡張型gRNA」と言われ得る。例えば、拡張型gRNAは例えば2つ以上のCas9蛋白質に結合し、本明細書に記載される通り、2つ以上の別個の領域において標的核酸に結合するであろう。gRNAは標的部位を相補するヌクレオチド配列を含み、これは前記標的部位へのヌクレアーゼ／RNA複合体の結合を媒介し、ヌクレアーゼ：RNA複合体の配列特異性を提供する。いくつかの態様では、RNAによってプログラム可能なヌクレアーゼは、（CRISPR関連システム）Cas9エンドヌクレアーゼ、例えばStreptococcus pyogenesからのCas9（Csn1）である（例えば、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J. J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663 (2001)； "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607 (2011)；および "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821 (2012)を見よ。これらのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６１】
RNAによってプログラム可能なヌクレアーゼ（例えばCas9）は標的DNA切断部位に対するRNA：DNAハイブリダイゼーションを用いるので、これらの蛋白質は原理的にはガイドRNAによって指定されるいずれかの配列へと標的化される能力がある。部位特異的切断のために（例えばゲノムを改変するために）Cas9などのRNAによってプログラム可能なヌクレアーゼを用いる方法は当分野において公知である（例えば、Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)；Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)；Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)；Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)；Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids research (2013)；Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)を見よ；これらのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００６２】
本明細書において用いられる用語「対象」は個々の生物、例えば個々の哺乳動物を言う。いくつかの態様では、対象はヒトである。いくつかの態様では、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様では、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの態様では、対象は齧歯類である。いくつかの態様では、対象はヒツジ、ヤギ、畜牛、ネコ、またはイヌである。いくつかの態様では、対象は脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの態様では、対象は研究動物である。いくつかの態様では、対象は遺伝子操作されており、例えば遺伝子操作された非ヒト対象である。対象はどちらかの性別および発生のいずれかのステージであり得る。
【００６３】
用語「標的部位」は、デアミナーゼ、またはデアミナーゼを含む融合蛋白質（例えば本明細書において提供されるdCas9−アデノシンデアミナーゼ融合蛋白質）によって脱アミノ化される核酸分子上の配列を言う。
【００６４】
用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される通り、疾患もしくは異常またはそれの1つ以上の症状を逆行させるか、軽減するか、その始まりを遅延させるか、またはその進行を阻害することを狙った臨床的介入を言う。本明細書において用いられる用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される通り、疾患もしくは異常またはそれの1つ以上の症状を逆行させるか、軽減するか、その始まりを遅延させるか、またはその進行を阻害することを狙った臨床的介入を言う。いくつかの態様では、処置は、1つ以上の症状が発生した後におよび／または疾患が診断された後に投与され得る。他の態様では、処置は、例えば症状の始まりを防止するかもしくは遅延させるかまたは疾患の始まりもしくは進行を阻害するために、症状の不在下において投与され得る。例えば、処置は、（例えば、症状の既往に照らしておよび／または遺伝学的もしくは他の感受性因子に照らして）症状の始まりに先立って感受性の個体に投与され得る。処置は、例えばそれらの再発を防止するかまたは遅延させるために、症状が解消した後にもまた継続され得る。
【００６５】
本明細書において用いられる用語「組換え体」は、蛋白質または核酸のコンテキストにおいて、天然には存在せず、ヒトの操作の産物である蛋白質または核酸を言う。例えば、いくつかの態様では、組換え体蛋白質または核酸分子は、いずれかの天然に存在する配列と比較して少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、または少なくとも7つの変異を含むアミノ酸またはヌクレオチド配列を含む。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本開示のいくつかの側面は、核酸塩基アデニンを脱アミノ化する蛋白質に関する。本開示は、デオキシリボ核酸（DNA）上のデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化する（すなわち、アミン基を取り除く）ことができるアデノシンデアミナーゼ蛋白質を提供する。例えば、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼはDNAのデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化することができる。本開示の他の側面は、アデノシンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載される通りDNA上のデオキシアデノシンを脱アミノ化するアデノシンデアミナーゼ）と特定のヌクレオチド配列に結合することができるドメイン（例えばCas9またはCpf1蛋白質）とを含む融合蛋白質を提供する。アデノシンデアミナーゼによるアデノシンの脱アミノ化は点変異に至り得、このプロセスは本明細書において核酸編集と言われる。例えば、アデノシンはイノシン残基に変換され得、これは典型的にはシトシン残基と塩基対形成する。かかる融合蛋白質はとりわけ核酸配列の標的化された編集にとって有用である。かかる融合蛋白質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのDNAの標的化された編集に、例えば変異体細胞または動物の作製に；標的化された変異の導入に、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏの細胞の、例えば爾後に同じまたは別の対象に再導入されるある対象から得られた細胞の遺伝子の欠陥の修正に；およびｉｎ  ｖｉｖｏの標的化された変異の導入に、例えば対象の遺伝子の欠陥の修正または疾患関連遺伝子の非活性化変異の導入に用いられ得る。例として、A→GまたはT→C変異を作ることによって処置され得る疾患は、本明細書において提供される核酸塩基編集因子を用いて処置され得る。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、鎌状赤血球貧血などのある種の貧血は、典型的には成体ではサイレンシングされる胎児型ヘモグロビンなどのヘモグロビンの発現を誘導することによって処置され得る。1つの例として、HBG1およびHBG2遺伝子発現を駆動するプロモーター上の−198TをCに変異させることは、HBG1およびHBG2の増大した発現をもたらす。
【００６７】
別の例、遺伝子のG→A変異からもたらされる異常のあるクラスは鉄蓄積異常であり、ここではHFE遺伝子がG→A変異を含み、これがC282Y変異体HFE蛋白質の発現をもたらす。それゆえに、本明細書に記載されるアデノシン塩基編集因子は、かかるG→A変異の標的化された編集（例えば標的化されたゲノム編集）のために利用され得る。本発明は、デアミナーゼおよび核酸塩基編集因子を利用するデアミナーゼ、融合蛋白質、核酸、ベクター、細胞、組成物、方法、キット、システムなどを提供する。
【００６８】
いくつかの態様では、本明細書において提供される核酸塩基編集因子は、1つ以上の蛋白質ドメインを一緒に融合させ、それによって融合蛋白質を作り出すことによって作られ得る。ある種の態様では、本明細書において提供される融合蛋白質は、融合蛋白質の塩基編集活性（例えば効率、選択性、および特異性）を改善する1つ以上の特徴を含む。例えば、本明細書において提供される融合蛋白質は、縮減されたヌクレアーゼ活性を有するCas9ドメインを含み得る。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質は、ヌクレアーゼ活性を有さないCas9ドメイン（dCas9）、またはCas9ニッカーゼ（nCas9）と言われる二重鎖DNA分子の1つの鎖を切るCas9ドメインを有し得る。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、触媒残基（例えばH840）の存在は、Cas9が標的Aの反対側のTを含有する編集されない（例えば脱アミノ化されない）鎖を切断する活性を維持する。Cas9の触媒残基の変異（例えばD10→A10）は、標的A残基を含有する編集される鎖の切断を防止する。かかるCas9バリアントは、gRNAによって定義される標的配列に基づく特異的な場所において一本鎖DNA切断（ニック）を作り出す能力があり、編集されない鎖の修復に至り、終局的には、編集されない鎖上のT→C変化をもたらす。
【００６９】
アデノシンデアミナーゼ
本開示のいくつかの側面はアデノシンデアミナーゼを提供する。いくつかの態様では、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼはアデニンを脱アミノ化することができる。いくつかの態様では、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼはDNAのデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化することができる。アデノシンデアミナーゼはいずれかの好適な生物（例えばE. coli）に由来し得る。いくつかの態様では、アデニンデアミナーゼは、本明細書において提供される変異（例えばecTadAの変異）のいずれかに対応する1つ以上の変異を包含する天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。当業者は、当分野において周知の方法によって、例えば配列アラインメントおよび相同残基の決定によって、いずれかの相同な蛋白質およびそれぞれのコード核酸上の対応する残基を同定する能力があるであろう。従って、当業者は、本明細書に記載される変異のいずれか、例えばecTadA上に同定される変異のいずれかに対応する変異を、いずれかの天然に存在するアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadAに対する相同性を有する）上に作り出す能力があるであろう。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは原核生物からである。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは細菌からである。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼはEscherichia coli、Staphylococcus aureus、Salmonella typhi、Shewanella putrefaciens、Haemophilus influenzae、Caulobacter crescentus、またはBacillus subtilisからである。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼはE. coliからである。
【００７０】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、802〜805のいずれか1つに提示されるアミノ酸配列のいずれか1つ、または本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼが1つ以上の変異（例えば、本明細書において提供される変異のいずれか）を包含し得るということは了解されるはずである。本開示は、いずれかのデアミナーゼドメインに、ある種のパーセント同一性プラス本明細書に記載される変異のいずれかまたはそれらの組み合わせを提供する。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、802〜805に提示されるアミノ酸配列のいずれか1つ、または本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、802〜805に提示されるアミノ酸配列のいずれか1つ、または本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、または少なくとも170個の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【００７１】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼはecTadA配列番号1のD108X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のD108G、D108N、D108V、D108A、もしくはD108Y変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のD108N変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。しかしながら、追加のデアミナーゼが類似にアラインメントされて、本明細書において提供される通り変異させられ得る相同なアミノ酸残基を同定し得るということは了解されるはずである。
【００７２】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のA106X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のA106V変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００７３】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のE155X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xの存在は野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のE155D、E155G、もしくはE155V変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のE155V変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００７４】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のD147X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xの存在は野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のD147Y変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００７５】
本明細書において提供される変異のいずれか（例えば配列番号1のecTadAアミノ酸配列に基づく）は、他のアデノシンデアミナーゼ、例えばS. aureus TadA（saTadA）または他のアデノシンデアミナーゼ（例えば細菌アデノシンデアミナーゼ）に導入され得るということは了解されるはずである。ecTadA上の変異した残基に対して相同である他のアデノシンデアミナーゼからのアミノ酸残基をどのようにして同定するかは当業者には明らかであろう。それゆえに、ecTadA上に同定される変異のいずれかは、相同なアミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼ上に作られ得る。本明細書において提供される変異のいずれかは個々にまたはいずれかの組み合わせでecTadAまたは別のアデノシンデアミナーゼ上に作られ得るということもまた了解されるはずである。例えば、アデノシンデアミナーゼは、ecTadA配列番号1のD108N、A106V、E155V、および／もしくはD147Y変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含有し得る。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、ecTadA配列番号1の次の群の変異（変異の群同士は「；」によって分離されている）または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む：D108NおよびA106V；D108NおよびE155V；D108NおよびD147Y；A106VおよびE155V；A106VおよびD147Y；E155VおよびD147Y；D108N、A106V、およびE55V；D108N、A106V、およびD147Y；D108N、E55V、およびD147Y；A106V、E55V、およびD147Y；ならびにD108N、A106V、E55V、およびD147Y。しかしながら、本明細書において提供される対応する変異のいずれかの組み合わせはアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadA）上に作られ得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは図7に示されている変異の1つ以上を含み、これはecTadA上に作られた個々の変異および変異の組み合わせを同定している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは本明細書において提供されるいずれかの変異または変異の組み合わせを含む。
【００７６】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のL84X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のL84F変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００７７】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のH123X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のH123Y変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００７８】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のI156X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のI156Fまたは別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００７９】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のL84X、A106X、D108X、H123X、D147X、E155X、およびI156Xからなる群から選択される1、2、3、4、5、6、もしくは7つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を指示している。
【００８０】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のL84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、およびI156Fからなる群から選択される1、2、3、4、5、6、もしくは7つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のS2A、I49F、A106V、D108N、D147Y、およびE155Vからなる群から選択される1、2、3、4、5、もしくは6つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のH8Y、A106T、D108N、N127S、およびK160Sからなる群から選択される1、2、3、4、もしくは5つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含む。
【００８１】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のA142X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のA142N、A142D、A142G変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のA142N変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００８２】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のH36X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のH36L変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００８３】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のN37X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のN37TもしくはN37S変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のN37S変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００８４】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のP48X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のP48T、P48S、P48A、もしくはP48L変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のP48T変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のP48S変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のP48A変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００８５】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のR51X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のR51HもしくはR51L変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のR51L変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００８６】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のS146X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のS146RもしくはS146C変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のS146C変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００８７】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のK157X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のK157N変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００８８】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のW23X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のW23RもしくはW23L変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のW23R変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のW23L変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００８９】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のR152X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のR152PもしくはR52H変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のR152P変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のR152H変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００９０】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のR26X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のR26G変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００９１】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のI49X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のI49V変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００９２】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のN72X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のN72D変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００９３】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のS97X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のS97C変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００９４】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のG125X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のG125A変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００９５】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）はecTadA配列番号1のK161X変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号1のK161T変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。
【００９６】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のW23X、H36X、N37X、P48X、I49X、R51X、N72X、L84X、S97X、A106X、D108X、H123X、G125X、A142X、S146X、D147X、R152X、E155X、I156X、K157X、および／もしくはK161X変異の1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼの1つ以上の対応する変異を含み、ここで、Xの存在は野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のW23L、W23R、H36L、P48S、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、および／もしくはK157N変異の1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼの1つ以上の対応する変異を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1に対応する図7で提供されている変異の1つ以上、または別のアデノシンデアミナーゼの1つ以上の対応する変異を含む。
【００９７】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のA106XおよびD108Xから選択される1もしくは2つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなり、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のA106VおよびD108Nから選択される1もしくは2つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなる。
【００９８】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のA106X、D108X、D147X、およびE155Xから選択される1、2、3、もしくは4つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなり、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のA106V、D108N、D147Y、およびE155Vから選択される1、2、3、もしくは4つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のA106V、D108N、D147Y、およびE155V変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含むか、またはそれからなる。
【００９９】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のL84X、A106X、D108X、H123X、D147X、E155X、およびI156Xから選択される1、2、3、4、5、6、もしくは7つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなり、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のL84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、およびI156Fから選択される1、2、3、4、5、6、もしくは7つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のL84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、およびI156F変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含むか、またはそれからなる。
【０１００】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のH36X、R51X、L84X、A106X、D108X、H123X、S146X、D147X、E155X、I156X、およびK157Xから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは11個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなり、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のH36L、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157Nから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは11個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のH36L、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含むか、またはそれからなる。
【０１０１】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のH36X、P48X、R51X、L84X、A106X、D108X、H123X、S146X、D147X、E155X、I156X、およびK157Xから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなり、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のH36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157Nから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）は、配列番号1のH36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含むか、またはそれからなる。
【０１０２】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のH36X、P48X、R51X、L84X、A106X、D108X、H123X、A142X、S146X、D147X、E155X、I156X、およびK157Xから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、もしくは13個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなり、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のH36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157Nから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、もしくは13個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のH36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含むか、またはそれからなる。
【０１０３】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のW23X、H36X、P48X、R51X、L84X、A106X、D108X、H123X、A142X、S146X、D147X、E155X、I156X、およびK157Xから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、もしくは14個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなり、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のW23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157Nから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、もしくは14個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のW23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含むか、またはそれからなる。
【０１０４】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のW23X、H36X、P48X、R51X、L84X、A106X、D108X、H123X、S146X、D147X、R152X、E155X、I156X、およびK157Xから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、もしくは14個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなり、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のW23R、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、およびK157Nから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、もしくは14個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ（deaminse）は、配列番号1のW23R、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含むか、またはそれからなる。
【０１０５】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のW23X、H36X、P48X、R51X、L84X、A106X、D108X、H123X、A142X、S146X、D147X、R152X、E155X、I156X、およびK157Xから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなり、ここで、Xは野生型アデノシンデアミナーゼの対応するアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸の存在を指示している。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のW23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、およびK157Nから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異（単数もしくは複数）を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1のW23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、およびK157N変異、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含むか、またはそれからなる。
【０１０６】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1に対応する図7で提供されている変異の1つ以上または別のデアミナーゼの対応する変異の1つ以上を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、図7で提供されている配列番号1のバリアントまたは別のアデノシンデアミナーゼ（deaminse）の対応するバリアントを含むか、またはそれからなる。
【０１０７】
アデノシンデアミナーゼ（例えば第1のまたは第2のアデノシンデアミナーゼ）は、図7に示されているアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadAアデノシンデアミナーゼ）のいずれかの提供される変異の1つ以上を含み得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、図7に示されているアデノシンデアミナーゼ（例えばecTadAアデノシンデアミナーゼ）のいずれかの変異の組み合わせを含む。例えば、アデノシンデアミナーゼは変異W23R、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、およびK157Nを（配列番号1に対して相対的に）含み得、これはABE7.10として図7に示されている。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは変異H36L、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157Nを（配列番号1に対して相対的に）含み得る。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは配列番号lに対して相対的に変異の次の組み合わせのいずれかを含み、ここで、組み合わせの各変異は「_」によって分離されており、変異の各組み合わせは括弧内にある：（A106V_D108N）、（R107C_D108N）、
（H8Y_D108N_S127S_D147Y_Q154H）、（H8Y_R24W_D108N_N127S_D147Y_E155V）、
（D108N_D147Y_E155V）、（H8Y_D108N_S127S）、（H8Y_D108N_N127S_D147Y_Q154H）、（A106V_D108N_D147Y_E155V）、（D108Q_D147Y_E155V）、（D108M_D147Y_E155V）、（D108L_D147Y_E155V）、（D108K_D147Y_E155V）、（D108I_D147Y_E155V）、（D108F_D147Y_E155V）、（A106V_D108N_D147Y）、（A106V_D108M_D147Y_E155V）、
（E59A_A106V_D108N_D147Y_E155V）、（E59A cat dead_A106V_D108N_D147Y_E155V）、
（L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156Y）、
（L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）、（D103A_D014N）、
（G22P_D103A_D104N）、（G22P_D103A_D104N_S138A）、（D103A_D104N_S138A）、
（R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F）、
（E25G_R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F）、
（E25D_R26G_L84F_A106V_R107K_D108N_H123Y_A142N_A143G_D147Y_E155V_I156F）、
（R26Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F）、
（E25M_R26G_L84F_A106V_R107P_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F）、
（R26C_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F）、
（L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_A143L_D147Y_E155V_I156F）、
（R26G_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F）、
（E25A_R26G_L84F_A106V_R107N_D108N_H123Y_A142N_A143E_D147Y_E155V_I156F）、
（R26G_L84F_A106V_R107H_D108N_H123Y_A142N_A143D_D147Y_E155V_I156F）、
（A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V）、（R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V）、
（E25D_R26G_A106V_R107K_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V）、
（R26G_A106V_D108N_R107H_A142N_A143D_D147Y_E155V）、
（E25D_R26G_A106V_D108N_A142N_D147Y_E155V）、
（A106V_R107K_D108N_A142N_D147Y_E155V）、（A106V_D108N_A142N_A143G_D147Y_E155V）、（A106V_D108N_A142N_A143L_D147Y_E155V）、
（H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）、
（N37T_P48T_M70L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_I49V_E155V_I156F）、
（N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K161T）、
（H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_Q154H_E155V_I156F）、
（N72S_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F）、
（H36L_P48L_L84F_A106V_D108N_H123Y_E134G_D147Y_E155V_I156F）、
（H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（H36L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F）、
（L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T）、
（N37S_R51H_D77G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）、
（R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（D24G_Q71R_L84F_H96L_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_K160E）、
（H36L_G67V_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146T_D147Y_E155V_I156F）、
（Q71L_L84F_A106V_D108N_H123Y_L137M_A143E_D147Y_E155V_I156F）、
（E25G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L）、
（L84F_A91T_F104I_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）、
（N72D_L84F_A106V_D108N_H123Y_G125A_D147Y_E155V_I156F）、
（P48S_L84F_S97C_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）、
（W23G_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）、
（D24G_P48L_Q71R_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F_Q159L）、
（L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F）、
（H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（N37S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_K161T）、
（L84F_A106V_D108N_D147Y_E155V_I156F）、
（R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K161T）、
（L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K161T）、
（L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E_K161T）、
（L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N_K160E）、
（R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）、
（R74A_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）、
（L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）、
（R74Q_L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）、
（L84F_R98Q_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F）、
（L84F_A106V_D108N_H123Y_R129Q_D147Y_E155V_I156F）、
（P48S_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F）、（P48S_A142N）、
（P48T_I49V_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_D147Y_E155V_I156F_L157N）、
（P48T_I49V_A142N）、
（H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（H36L_P48T_I49V_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_A142N_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T）、
（H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152H_E155V_I156F_K157N）、
（H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）、（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）、
（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N）、
（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）、
（W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146R_D147Y_E155V_I156F_K161T）、
（W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）、
（H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N）。
【０１０８】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、802〜805のいずれか1つまたは本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95、98%、99%、または99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、802〜805に提示されるアミノ酸配列のいずれか1つまたは本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、802〜805に提示されるアミノ酸配列のいずれか1つまたは本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、または少なくとも166個の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、802〜805のいずれか1つ、または本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684、802〜805のいずれか1つ、または本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかのアミノ酸配列からなる。下で提供されるecTadA配列はecTadA（配列番号1）からであり、ただしN末端メチオニン（M）は不在である。下で提供されるsaTadA配列はsaTadA（配列番号8）からであり、ただしN末端メチオニン（M）は不在である。明瞭性のために、種々のアミノ酸変異を同定するために用いられるアミノ酸付番スキームは、E. coli TadAではecTadA（配列番号1）、S. aureus TadAではsaTadA（配列番号8）に由来する。配列番号1（ecTadA）または配列番号8（saTadA）に関連したアミノ酸変異は下線付きによって指示されている。
ecTadA
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD（配列番号64）
ecTadA（D108N）
【化８】
2021500036.tif 000013
ecTadA（D108G）
【化９】
2021500036.tif 000014
ecTadA（D108V）
【化１０】
2021500036.tif 000015
ecTadA（H8Y、D108N、およびN127S）
【化１１】
2021500036.tif 000016
ecTadA（H8Y、D108N、N127S、およびE155D）
【化１２】
2021500036.tif 000017
ecTadA（H8Y、D108N、N127S、およびE155G）
【化１３】
2021500036.tif 000018
ecTadA（H8Y、D108N、N127S、およびE155V）
【化１４】
2021500036.tif 000019
ecTadA（A106V、D108N、D147Y、およびE155V）
【化１５】
2021500036.tif 000020
ecTadA（L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、I156F）
【化１６】
2021500036.tif 000021
ecTadA（S2A、I49F、A106V、D108N、D147Y、E155V）
【化１７】
2021500036.tif 000022
ecTadA（H8Y、A106T、D108N、N127S、K160S）
【化１８】
2021500036.tif 000023
ecTadA（R26G、L84F、A106V、R107H、D108N、H123Y、A142N、A143D、D147Y、E155V、I156F）
【化１９】
2021500036.tif 000024
ecTadA（E25G、R26G、L84F、A106V、R107H、D108N、H123Y、A142N、A143D、D147Y、E155V、I156F）
【化２０】
2021500036.tif 000025
ecTadA（E25P、R26G、L84F、A106V、R107K、P108N、H123Y、A142N、A143G、P147Y、E155V、I156F）
【化２１】
2021500036.tif 000026
ecTadA（R26Q、L84F、A106V、P108N、H123Y、A142N、P147Y、E155V、I156F）
【化２２】
2021500036.tif 000027
ecTadA（E25M、R26G、L84F、A106V、R107P、D108N、H123Y、A142N、A143D、D147Y、E155V、I156F）
【化２３】
2021500036.tif 000028
ecTadA（R26C、L84F、A106V、R107H、D108N、H123Y、A142N、D147Y、E155V、I156F）
【化２４】
2021500036.tif 000029
ecTadA（L84F、A106V、P108N、H123Y、A142N、A143L、P147Y、E155V、I156F）
【化２５】
2021500036.tif 000030
ecTadA（R26G、L84F、A106V、P108N、H123Y、A142N、P147Y、E155V、I156F）
【化２６】
2021500036.tif 000031
ecTadA（E25A、R26G、L84F、A106V、R107N、P108N、H123Y、A142N、A143E、P147Y、E155V、I156F）
【化２７】
2021500036.tif 000032
ecTadA（L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、I156F）
【化２８】
2021500036.tif 000033
ecTadA（N37T、P48T、L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、I156F）
【化２９】
2021500036.tif 000034
ecTadA（N37S、L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、I156F）
【化３０】
2021500036.tif 000035
ecTadA（H36L、L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、I156F）
【化３１】
2021500036.tif 000036
ecTadA（L84F、A106V、D108N、H123Y、S146R、D147Y、E155V、I156F）
【化３２】
2021500036.tif 000037
ecTadA（H36L、P48L、L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、I156F）
【化３３】
2021500036.tif 000038
ecTadA（H36L、L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、K57N、I156F）
【化３４】
2021500036.tif 000039
ecTadA（H36L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F）
【化３５】
2021500036.tif 000040
ecTadA（L84F、A106V、D108N、H123Y、S146R、D147Y、E155V、I156F）
【化３６】
2021500036.tif 000041
ecTadA（N37S、R51H、L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、I156F）
【化３７】
2021500036.tif 000042
ecTadA（R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、I156F、K157N）
【化３８】
2021500036.tif 000043
ecTadA（R51H、L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、I156F、K157N）
【化３９】
2021500036.tif 000044
ecTadA（P48S）
【化４０】
2021500036.tif 000045
ecTadA（P48T）
【化４１】
2021500036.tif 000046
ecTadA（P48A）
【化４２】
2021500036.tif 000047
ecTadA（A142N）
【化４３】
2021500036.tif 000048
ecTadA（W23R）
【化４４】
2021500036.tif 000049
ecTadA（W23L）
【化４５】
2021500036.tif 000050
ecTadA（R152P）
【化４６】
2021500036.tif 000051
ecTadA（R152H）
【化４７】
2021500036.tif 000052
ecTadA（L84F、A106V、D108N、H123Y、D147Y、E155V、I156F）
【化４８】
2021500036.tif 000053
ecTadA（H36L、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、K157N）
【化４９】
2021500036.tif 000054
ecTadA（H36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、K157N）
【化５０】
2021500036.tif 000055
ecTadA（H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、K157N）
【化５１】
2021500036.tif 000056
ecTadA（W23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、K157N）
【化５２】
2021500036.tif 000057
ecTadA（H36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、K157N）
【化５３】
2021500036.tif 000058
ecTadA（W23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、K157N）
【化５４】
2021500036.tif 000059
ecTadA（W23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、K157N）
【化５５】
2021500036.tif 000060
ecTadA（W23R、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、K157N）
【化５６】
2021500036.tif 000061
【０１０９】
核酸塩基編集因子のCas9ドメイン
いくつかの側面では、核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）はCas9ドメインである。限定しない例示的なCas9ドメインが本明細書において提供される。Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性なCas9ドメイン、ヌクレアーゼ不活性なCas9ドメイン、またはCas9ニッカーゼであり得る。いくつかの態様では、Cas9ドメインはヌクレアーゼ活性なドメインである。例えば、Cas9ドメインは二重鎖核酸の両方の鎖（例えば、二重鎖DNA分子の両方の鎖）を切るCas9ドメインであり得る。いくつかの態様では、Cas9ドメインは、配列番号108〜357に提示されるアミノ酸配列のいずれか1つを含む。いくつかの態様では、Cas9ドメインは、配列番号108〜357に提示されるアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Cas9ドメインは、配列番号108〜357に提示されるアミノ酸配列のいずれか1つと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50以上、またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Cas9ドメインは、配列番号108〜357に提示されるアミノ酸配列のいずれか1つと比較して、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、または少なくとも1200個の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
いくつかの態様では、Cas9ドメインはヌクレアーゼ不活性なCas9ドメイン（dCas9）である。例えば、dCas9ドメインは二重鎖核酸分子のどちらかの鎖を切断することなしに（例えばgRNA分子を介して）二重鎖核酸分子に結合し得る。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ不活性なdCas9ドメインは、配列番号52に提示されているアミノ酸配列のD10X変異およびH840X変異、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含み、ここで、Xはいずれかのアミノ酸変化である。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ不活性なdCas9ドメインは、配列番号52に提示されているアミノ酸配列のD10A変異およびH840A変異、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。1つの例として、ヌクレアーゼ不活性なCas9ドメインは配列番号54に提示されているアミノ酸配列を含む（クローニングベクターpPlatTET−gRNA2、アクセッションNo.BAV54124）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号54；例えばQi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression"  Cell. 2013; 152(5): 1173-83を見よ。これの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１１１】
追加の好適なヌクレアーゼ不活性なdCas9ドメインは本開示の範囲内であり、本開示および当分野の知識に基づいて当業者には明らかであろう。かかる追加の例示的な好適なヌクレアーゼ不活性なCas9ドメインはD10A／H840A、D10A／D839A／H840A、およびD10A／D839A／H840A／N863A変異体ドメインを包含するが、これらに限定されない（例えばPrashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838を見よ。これの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様では、dCas9ドメインは、本明細書において提供されるdCas9ドメインのいずれか1つと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Cas9ドメインは、配列番号108〜357に提示されているアミノ酸配列のいずれか1つと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Cas9ドメインは、配列番号108〜357に提示されているアミノ酸配列のいずれか1つと比較して、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、または少なくとも1200個の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
いくつかの態様では、Cas9ドメインはCas9ニッカーゼである。Cas9ニッカーゼは、二重鎖核酸分子（例えば二重鎖DNA分子）の1つの鎖のみを切断することができるCas9蛋白質であり得る。いくつかの態様では、Cas9ニッカーゼは二重鎖核酸分子の標的鎖を切断し、Cas9ニッカーゼがCas9に結合したgRNA（例えばsgRNA）と塩基対形成する（相補的である）鎖を切断するということを意味する。いくつかの態様では、Cas9ニッカーゼはD10A変異を含み、配列番号52の位置840のヒスチジン、または配列番号108〜357のいずれかの変異を有する。1つの例として、Cas9ニッカーゼは配列番号35に提示されているアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様では、Cas9ニッカーゼは二重鎖核酸分子の非標的の塩基編集されない鎖を切断し、Cas9ニッカーゼがCas9に結合したgRNA（例えばsgRNA）と塩基対形成しない鎖を切断するということを意味する。いくつかの態様では、Cas9ニッカーゼはH840A変異を含み、配列番号52の位置10のアスパラギン酸残基、または配列番号108〜357のいずれかの対応する変異を有する。いくつかの態様では、Cas9ニッカーゼは、本明細書において提供されるCas9ニッカーゼのいずれか1つと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。追加の好適なCas9ニッカーゼは本開示の範囲内であり、本開示および当分野の知識に基づいて当業者には明らかであろう。
縮減されたPAM排他性を有するCas9ドメイン
【０１１３】
本開示のいくつかの側面は、異なるPAM特異性を有するCas9ドメインを提供する。典型的には、S. pyogenesからのCas9（spCas9）などのCas9蛋白質は特定の核酸領域に結合するためには古典的NGG PAM配列を要求し、ここで「NGG」の「N」はアデニン（A）、チミン（T）、グアニン（G）、またはシトシン（C）であり、Gはグアニンである。これはゲノム中の所望の塩基を編集する能力を限定し得る。いくつかの態様では、本明細書において提供される塩基編集融合蛋白質は正確な場所に位置することを必要とし、例えばここでは標的塩基が4塩基領域（例えば「脱アミノ化ウインドウ」）内にあり、これがPAMのおよそ15塩基上流である。Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016)を見よ。これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。いくつかの態様では、脱アミノ化ウインドウは2、3、4、5、6、7、8、9、または10塩基領域内にある。いくつかの態様では、脱アミノ化ウインドウはPAMの5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25塩基上流である。従って、いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、古典的（例えばNGG）PAM配列を含有しないヌクレオチド配列に結合することができるCas9ドメインを含有し得る。非古典的PAM配列に結合するCas9ドメインは当分野において記載されており、当業者には明らかであろう。例えば、非古典的PAM配列に結合するCas9ドメインはKleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015)；およびKleinstiver, B. P., et al, "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)に記載されている；それぞれの内容全体は参照によってここに組み込まれる。
【０１１４】
いくつかの態様では、Cas9ドメインはStaphylococcus aureusからのCas9ドメイン（SaCas9）である。いくつかの態様では、SaCas9ドメインはヌクレアーゼ活性なSaCas9、ヌクレアーゼ不活性なSaCas9（SaCas9d）、またはSaCas9ニッカーゼ（SaCas9n）である。いくつかの態様では、SaCas9はアミノ酸配列配列番号55を含む。いくつかの態様では、SaCas9は、配列番号55のN579X変異、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含み、XはNを除くいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、SaCas9は、配列番号55のN579A変異、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１１５】
いくつかの態様では、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは非古典的PAMを有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様では、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインはNNGRRT PAM配列を有する核酸配列に結合し得、ここでN＝A、T、C、またはG、R＝AまたはGである。いくつかの態様では、SaCas9ドメインは、配列番号55のE781X、N967X、およびR1014X変異の1つ以上、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、SaCas9ドメインは、配列番号55のE781K、N967K、およびR1014H変異の1つ以上、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの1つ以上の対応する変異を含む。いくつかの態様では、SaCas9ドメインは、配列番号55のE781K、N967K、もしくはR1014H変異、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１１６】
いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号55〜57のいずれか1つと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは配列番号55〜57のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは配列番号55〜57のいずれか1つのアミノ酸配列からなる。
【０１１７】
例示的なSaCas9配列
【化５７】
2021500036.tif 000062
【０１１８】
下線付きかつ太字である配列番号55の残基N579は、SaCas9ニッカーゼを生み出すように（例えばA579へと）変異させられ得る。
例示的なSaCas9n配列
【０１１９】
【化５８−１】
2021500036.tif 000063
【化５８−２】
2021500036.tif 000064
【０１２０】
SaCas9ニッカーゼを生み出すように配列番号55のN579から変異させられ得る配列番号56の残基A579は、下線付きかつ太字である。
例示的なSaKKH Cas9
【０１２１】
【化５９】
2021500036.tif 000065
【０１２２】
SaCas9ニッカーゼを生み出すように配列番号55のN579から変異させられ得る配列番号57の残基A579は、下線付きかつ太字である。SaKKH Cas9を生み出すように配列番号55のE781、N967、およびR1014から変異させられ得る配列番号57の残基K781、K967、およびH1014は、下線付きかつ斜体である。
【０１２３】
いくつかの態様では、Cas9ドメインはStreptococcus pyogenesからのCas9ドメイン（SpCas9）である。いくつかの態様では、SpCas9ドメインはヌクレアーゼ活性なSpCas9、ヌクレアーゼ不活性なSpCas9（SpCas9d）、またはSpCas9ニッカーゼ（SpCas9n）である。いくつかの態様では、SpCas9はアミノ酸配列配列番号58を含む。いくつかの態様では、SpCas9は、配列番号58のD9X変異、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含み、XはDを除くいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、SpCas9は、配列番号58のD9A変異、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様では、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメイン、またはSpCas9nドメインは非古典的PAMを有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様では、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメイン、またはSpCas9nドメインはNGG、NGA、またはNGCG PAM配列を有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様では、SpCas9ドメインは、配列番号58のD1134X、R1334X、およびT1336X変異の1つ以上、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、SpCas9ドメインは、配列番号58のD1134E、R1334Q、およびT1336R変異の1つ以上、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様では、SpCas9ドメインは、配列番号58のD1134E、R1334Q、およびT1336R変異、または配列番号108〜35で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様では、SpCas9ドメインは、配列番号58のD1134X、R1334X、およびT1336X変異の1つ以上、または配列番号108〜35で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、SpCas9ドメインは、配列番号58のD1134V、R1334Q、およびT1336R変異の1つ以上、または配列番号108〜35で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様では、SpCas9ドメインは、配列番号58のD1134V、R1334Q、およびT1336R変異、または配列番号108〜35で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様では、SpCas9ドメインは、配列番号58のD1134X、G1217X、R1334X、およびT1336X変異の1つ以上、または配列番号108〜35で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、SpCas9ドメインは、配列番号58のD1134V、G1217R、R1334Q、およびT1336R変異の1つ以上、または配列番号108〜35で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様では、SpCas9ドメインは、配列番号58のD1134V、G1217R、R1334Q、およびT1336R変異、または配列番号108〜35で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。
【０１２４】
いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号58〜62のいずれか1つと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号58〜62のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号58〜62のいずれか1つのアミノ酸配列からなる。
例示的なSpCas9
DKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号58）
例示的なSpCas9n
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号59）
例示的なSpEQR Cas9
【化６０】
2021500036.tif 000066
【０１２５】
SpEQR Cas9を生み出すように配列番号58のD1134、R1334、およびT1336から変異させられ得る配列番号60の残基E1134、Q1334、およびR1336は、下線付きかつ太字である。
例示的なSpVQR Cas9
【化６１】
2021500036.tif 000067
【０１２６】
SpVQR Cas9を生み出すように配列番号58のD1134、R1334、およびT1336から変異させられ得る配列番号61の残基V1134、Q1334、およびR1336は、下線付きかつ太字である。
例示的なSpVRER Cas9
【化６２−１】
2021500036.tif 000068
【化６２−２】
2021500036.tif 000069
【０１２７】
SpVRER Cas9を生み出すように配列番号58のD1134、G1217、R1334、およびT1336から変異させられ得る配列番号62の残基V1134、R1217、Q1334、およびR1336は、下線付きかつ太字である。
【０１２８】
高フィデリティCas9ドメイン
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される核酸塩基編集因子の高フィデリティCas9ドメインを提供する。いくつかの態様では、高フィデリティCas9ドメインは、対応する野生型Cas9ドメインと比較して、Cas9ドメインとDNAの糖−リン酸バックボーンとの間の静電相互作用を減少させる1つ以上の変異を含む操作されたCas9ドメインである。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、DNAの糖−リン酸バックボーンとの減少した静電相互作用を有する高フィデリティCas9ドメインは、より少ないオフターゲット効果を有し得る。いくつかの態様では、Cas9ドメイン（例えば野生型Cas9ドメイン）は、Cas9ドメインとDNAの糖−リン酸バックボーンとの間の結びつきを減少させる1つ以上の変異を含む。いくつかの態様では、Cas9ドメインは、Cas9ドメインとDNAの糖−リン酸バックボーンとの間の結びつきを少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、またはより多くだけ減少させる1つ以上の変異を含む。
【０１２９】
いくつかの態様では、本明細書において提供されるCas9融合蛋白質のいずれかは、配列番号52で提供されるアミノ酸配列のN497X、R661X、Q695X、および／もしくはQ926X変異の1つ以上、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、本明細書において提供されるCas9融合蛋白質のいずれかは、配列番号52で提供されるアミノ酸配列のN497A、R661A、Q695A、および／もしくはQ926A変異の1つ以上、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様では、Cas9ドメインは、配列番号52で提供されるアミノ酸配列のD10A変異、または配列番号108〜357で提供されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異を含む。いくつかの態様では、（例えば本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかの）Cas9ドメインは、配列番号62に提示されているアミノ酸配列を含む。高フィデリティを有するCas9ドメインが当分野において公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、高フィデリティを有するCas9ドメインは、Kleinstiver, B.P., et al. "High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects." Nature 529, 490-495 (2016)；およびSlaymaker, I.M., et al. "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity." Science 351, 84-88 (2015)に記載されている；それぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
本明細書において提供される塩基編集因子のいずれか、例えば本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼ塩基編集因子のいずれかは、高フィデリティ塩基編集因子、例えば高フィデリティアデノシン塩基編集因子を作り出すように本明細書に記載されるCas9ドメインを改変することによって、高フィデリティ塩基編集因子へと変換され得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、高フィデリティCas9ドメインはdCas9ドメインである。いくつかの態様では、高フィデリティCas9ドメインはnCas9ドメインである。
配列番号10のCas9に関連した変異が太字および下線で示されている高フィデリティCas9ドメイン
【０１３１】
【化６３】
2021500036.tif 000070
核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質
【０１３２】
本開示のいくつかの側面は核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質を提供し、これらは塩基編集因子などの蛋白質を特定の核酸（例えばDNAまたはRNA）配列までガイドするために用いられ得る。核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質は、限定なしに、Cas9（例えばdCas9およびnCas9）、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2C3、およびアルゴノートを包含する。Cas9とは異なるPAM特異性を有する核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質の1つの例は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats from Prevotella and Francisella 1（Cpf1）である。Cas9に類似に、Cpf1もまたクラス2 CRISPRエフェクターである。Cpf1はCas9とは別個の特徴を有するロバストなDNA干渉を媒介するということが示されている。Cpf1はtracrRNAを欠く1個のRNAによってガイドされるエンドヌクレアーゼであり、それはTリッチなプロトスペーサー隣接モチーフ（TTN、TTTN、またはYTN）を利用する。その上、Cpf1は互い違いのDNA二本鎖切断によってDNAを切断する。16個のCpf1ファミリー蛋白質のうち、AcidaminococcusおよびLachnospiraceaeからの2つの酵素は効率的なゲノム編集活性を有することがヒト細胞において示されている。Cpf1蛋白質は当分野において公知であり、以前に記載されている。例えばYamano et al., "Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA." Cell (165) 2016, p. 949-962；これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。
【０１３３】
いくつかの態様では、核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）は微生物CRISPR−Casシステムのシングルエフェクターである。微生物CRISPR−Casシステムのシングルエフェクターは、限定なしに、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、およびC2c3を包含する。典型的には、微生物CRISPR−Casシステムはクラス1およびクラス2システムに分けられる。クラス1システムはマルチサブユニットエフェクター複合体を有し、クラス2システムは単一の蛋白質エフェクターを有する。例えば、Cas9およびCpf1はクラス2エフェクターである。Cas9およびCpf1に加えて、3つの別個のクラス2 CRISPR−Casシステム（C2c1、C2c2、およびC2c3）がShmakov et al., "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems", Mol. Cell, 2015 Nov 5; 60(3): 385-397によって記載されており、これの内容全体は参照によってここに組み込まれる。
ヌクレアーゼによってプログラム可能なDNA結合蛋白質とアデノシンデアミナーゼとを含む融合蛋白質
【０１３４】
本開示のいくつかの側面は、核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）とアデノシンデアミナーゼとを含む融合蛋白質を提供する。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは塩基編集因子である。いくつかの態様では、napDNAbpはCas9ドメイン、Cpf1ドメイン、CasXドメイン、CasYドメイン、C2c1ドメイン、C2c2ドメイン、C2c3ドメイン、またはアルゴノートドメインである。いくつかの態様では、napDNAbpは本明細書において提供されるいずれかのnapDNAbpである。本開示のいくつかの側面は、Cas9ドメインとアデノシンデアミナーゼとを含む融合蛋白質を提供する。Cas9ドメインは本明細書において提供されるCas9ドメインまたはCas9蛋白質のいずれかであり得る（例えばdCas9またはnCas9）。いくつかの態様では、本明細書において提供されるCas9ドメインまたはCas9蛋白質のいずれか（例えばdCas9またはnCas9）は、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと融合させられ得る。いくつかの態様では、融合蛋白質は構造：NH2−［アデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−COOH；またはNH2−［napDNAbp］−［アデノシンデアミナーゼ］−COOHを含む。
【０１３５】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼとnapDNAbp（例えばCas9ドメイン）とを含む融合蛋白質はリンカー配列を包含しない。いくつかの態様では、リンカーがアデノシンデアミナーゼドメインおよびnapDNAbpの間に存在する。いくつかの態様では、上の一般アーキテクチャに用いられている「−」は任意のリンカーの存在を指示する。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpは本明細書において提供されるリンカーのいずれかを介して融合させられる。例えば、いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpは下で「リンカー」と題するセクションにおいて提供されるリンカーのいずれかを介して融合させられる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpは、1および（and and）200アミノ酸の間を含むリンカーを介して融合させられる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpは、長さが1から5、1から10、1から20、1から30、1から40、1から50、1から60、1から80、1から100、1から150、1から200、5から10、5から20、5から30、5から40、5から60、5から80、5から100、5から150、5から200、10から20、10から30、10から40、10から50、10から60、10から80、10から100、10から150、10から200、20から30、20から40、20から50、20から60、20から80、20から100、20から150、20から200、30から40、30から50、30から60、30から80、30から100、30から150、30から200、40から50、40から60、40から80、40から100、40から150、40から200、50から60、50から80、50から100、50から150、50から200、60から80、60から100、60から150、60から200、80から100、80から150、80から200、100から150、100から200、または150から200アミノ酸を含むリンカーを介して融合させられる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpは、長さが3、4、16、24、32、64、100、または104アミノ酸を含むリンカーを介して融合させられる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpは、SGSETPGTSESATPES（配列番号10）、SGGS（配列番号37）、SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS（配列番号384）、SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS（配列番号385）、またはGGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS（配列番号386）のアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合させられる。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpは、XTENリンカーともまた言われ得るアミノ酸配列SGSETPGTSESATPES（配列番号10）を含むリンカーを介して融合させられる。いくつかの態様では、リンカーは長さが24アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES（配列番号685）を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが32アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列(SGGS)2-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)2（配列番号800）を含み、これは(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2ともまた言われ得る。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列(SGGS)n-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)n（配列番号801）を含み、nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。いくつかの態様では、リンカーは長さが40アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS（配列番号686）を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが64アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS（��列番号687）を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが92アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS（配列番号688）を含む。
核局在配列（NLS）を含む融合蛋白質
【０１３６】
いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質はさらに1つ以上の核標的化配列、例えば核局在配列（NLS）を含む。いくつかの態様では、NLSは、（例えば核輸送による）細胞核内へのNLSを含む蛋白質の輸入を促進するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかはさらに核局在配列（NLS）を含む。いくつかの態様では、NLSは融合蛋白質のN末端に融合させられる。いくつかの態様では、NLSは融合蛋白質のC末端に融合させられる。いくつかの態様では、NLSはIBR（例えばdISN）のN末端に融合させられる。いくつかの態様では、NLSはIBR（例えばdISN）のC末端に融合させられる。いくつかの態様では、NLSはnapDNAbpのN末端に融合させられる。いくつかの態様では、NLSはnapDNAbpのC末端に融合させられる。いくつかの態様では、NLSはアデノシンデアミナーゼのN末端に融合させられる。いくつかの態様では、NLSはアデノシンデアミナーゼのC末端に融合させられる。いくつかの態様では、NLSは1つ以上のリンカーを介して融合蛋白質に融合させられる。いくつかの態様では、NLSはリンカーなしで融合蛋白質に融合させられる。いくつかの態様では、NLSは本明細書において提供または参照されるNLS配列のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、NLSは配列番号4または配列番号5に提示されているアミノ酸配列を含む。追加の核局在配列は当分野において公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、NLS配列はPlank et al.，PCT/EP2000/011690に記載されており、これの内容は例示的な核局在配列のそれらの開示について参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、NLSはアミノ酸配列PKKKRKV（配列番号4）、MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC（配列番号5）、MKRTADGSEFEPKKKRKV（配列番号342）、またはKRTADGSEFEPKKKRKV（配列番号343）を含む。
【０１３７】
いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpを有する例示的な融合蛋白質の一般アーキテクチャは次の構造のいずれか1つを含み、ここで、NLSは核局在配列（例えば本明細書において提供されるいずれかのNLS）であり、NH2は融合蛋白質のN末端であり、COOHは融合蛋白質のC末端である。アデノシンデアミナーゼ、napDNAbp、およびNLSを含む融合蛋白質：
NH2−［NLS］−［アデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−COOH；
NH2−［アデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−［napDNAbp］−COOH；
NH2−［アデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［NLS］−COOH；
NH2−［NLS］−［napDNAbp］−［アデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［napDNAbp］−［NLS］−［アデノシンデアミナーゼ］−COOH；および
NH2−［napDNAbp］−［アデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−COOH。
【０１３８】
いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質はリンカーを含まない。いくつかの態様では、リンカーがドメインまたは蛋白質の1つ以上（例えばアデノシンデアミナーゼ、napDNAbp、および／またはNLS）の間に存在する。いくつかの態様では、上の一般アーキテクチャに用いられている「−」は任意のリンカーの存在を指示する。
【０１３９】
本開示のいくつかの側面は、核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）と少なくとも2つのアデノシンデアミナーゼドメインとを含む融合蛋白質を提供する。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、（例えばシスのまたはトランスの）アデノシンデアミナーゼの二量体化は、融合蛋白質が核酸塩基を改変、例えばアデニンを脱アミノ化する能力（例えば効率）を改善し得る。いくつかの態様では、融合蛋白質のいずれかは2、3、4、または5つのアデノシンデアミナーゼドメインを含み得る。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは2つのアデノシンデアミナーゼを含む。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは2つのアデノシンデアミナーゼのみを含有する。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ同士は同じである。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼは本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかである。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼ同士は異なる。いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼは本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかであり、第2のアデノシンは本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかであるが、第1のアデノシンデアミナーゼと同一ではない。1つの例として、融合蛋白質は、第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼを含み得、これらは両方がecTadA（配列番号1）からのA106V、D108N、D147Y、およびE155V変異を含有する配列番号72のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、融合蛋白質は、配列番号1からのH36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異を含有する配列番号682のアミノ酸配列を含む第1のアデノシンデアミナーゼと、野生型ecTadA（配列番号1）のアミノ（amino amino）酸配列を含む第2のアデノシンデアミナーゼドメインとを含み得る。いくつかの態様では、融合蛋白質は、配列番号1からのH36L、P48S、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異を含有する配列番号802のアミノ酸配列を含む第1のアデノシンデアミナーゼと、野生型ecTadA（配列番号1）のアミノ（amino amino）酸配列を含む第2のアデノシンデアミナーゼドメインとを含み得る。いくつかの態様では、融合蛋白質は、配列番号1からのW23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、E155V、I156F、およびK157N変異を含有する配列番号803のアミノ酸配列を含む第1のアデノシンデアミナーゼと、野生型ecTadA（配列番号1）のアミノ（amino amino）酸配列を含む第2のアデノシンデアミナーゼドメインとを含み得る。いくつかの態様では、融合蛋白質は、配列番号1からのW23L、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、A142N、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、およびK157N変異を含有する配列番号804のアミノ酸配列を含む第1のアデノシンデアミナーゼと、野生型ecTadA（配列番号1）のアミノ（amino amino）酸配列を含む第2のアデノシンデアミナーゼドメインとを含み得る。いくつかの態様では、融合蛋白質は、配列番号1からのW23R、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F、およびK157N変異を含有する配列番号805のアミノ酸配列を含む第1のアデノシンデアミナーゼと、野生型ecTadA（配列番号1）のアミノ（amino amino）酸配列を含む第2のアデノシンデアミナーゼドメインとを含み得る。2つのアデノシンデアミナーゼドメインを含む追加の融合蛋白質コンストラクトが図7に例解されている。
【０１４０】
いくつかの態様では、融合蛋白質は2つのアデノシンデアミナーゼを含む（例えば第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼ）。いくつかの態様では、融合蛋白質は第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼを含む。いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼは融合蛋白質中において第2のアデノシンデアミナーゼのN末端にある。いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼは融合蛋白質中において第2のアデノシンデアミナーゼのC末端にある。いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のデアミナーゼは直接的にまたはリンカーを介して融合させられる。いくつかの態様では、リンカーは、本明細書において提供されるリンカーのいずれか、例えば「リンカー」セクションに記載されているリンカーのいずれかである。いくつかの態様では、リンカーは配列番号10、37〜40、384〜386、685〜688、または800〜801のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが32アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列(SGGS)2-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)2（配列番号800）を含み、これは(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2ともまた言われ得る。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列(SGGS)n-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)n（配列番号801）を含み、nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼは第2のアデノシンデアミナーゼと同じである。いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼは本明細書に記載されるアデノシンデアミナーゼのいずれかである。いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼは異なる。いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼは本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかである。いくつかの態様では、第2のアデノシンデアミナーゼは本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかであるが、第1のアデノシンデアミナーゼと同一ではない。いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼはecTadAアデノシンデアミナーゼである。いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼは、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684のいずれか1つに提示されているアミノ酸配列のいずれか1つ、または本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと少なくとも（at least least）60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼは配列番号1のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第2のアデノシンデアミナーゼは、配列番号1、64〜84、420〜437、672〜684のいずれか1つに提示されているアミノ酸配列のいずれか1つ、または本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと少なくとも（at least least）60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第2のアデノシンデアミナーゼは配列番号1のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、表4で提供されているコンストラクト（例えば、pNMG−371、pNMG−477、pNMG−576、pNMG−586、およびpNMG−616）のいずれか1つに示されている通り、融合蛋白質の第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼはecTadA（配列番号1）の変異または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含む。いくつかの態様では、融合蛋白質は、表4のコンストラクト（例えば、pNMG−371、pNMG−477、pNMG−576、pNMG−586、およびpNMG−616）のいずれか1つの2つのアデノシンデアミナーゼ（例えば第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼ）を含む。
【０１４１】
いくつかの態様では、第1のアデノシンデアミナーゼ、第2のアデノシンデアミナーゼ、およびnapDNAbpを有する例示的な融合蛋白質の一般アーキテクチャは、次の構造のいずれか1つを含み、ここで、NLSは核局在配列（例えば本明細書において提供されるいずれかのNLS）であり、NH2は融合蛋白質のN末端であり、COOHは融合蛋白質のC末端である。
【０１４２】
第1のアデノシンデアミナーゼ、第2のアデノシンデアミナーゼ、およびnapDNAbpを含む融合蛋白質。
NH2−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−COOH；
NH2−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［napDNAbp］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−COOH；
NH2−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［napDNAbp］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
【０１４３】
いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質はリンカーを含まない。いくつかの態様では、リンカーがドメインまたは蛋白質の1つ以上（例えば第1のアデノシンデアミナーゼ、第2のアデノシンデアミナーゼ、および／またはnapDNAbp）の間に存在する。いくつかの態様では、上の一般アーキテクチャに用いられている「−」は任意のリンカーの存在を指示する。
【０１４４】
第1のアデノシンデアミナーゼ、第2のアデノシンデアミナーゼ、napDNAbp、およびNLSを含む融合蛋白質。
NH2−［NLS］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−COOH；
NH2−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−COOH；
NH2−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−［napDNAbp］−COOH；
NH2−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［NLS］−COOH；
NH2−［NLS］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−［napDNAbp］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［NLS］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−COOH；
NH2−［NLS］−［napDNAbp］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［napDNAbp］−［NLS］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［napDNAbp］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［napDNAbp］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−COOH；
NH2−［NLS］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−COOH；
NH2−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−COOH；
NH2−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−［napDNAbp］−COOH；
NH2−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［NLS］−COOH；
NH2−［NLS］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−［napDNAbp］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［NLS］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［napDNAbp］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−COOH；
NH2−［NLS］−［napDNAbp］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［napDNAbp］−［NLS］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［napDNAbp］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−COOH；
NH2−［napDNAbp］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［NLS］−COOH；
【０１４５】
いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質はリンカーを含まない。いくつかの態様では、リンカーがドメインまたは蛋白質の1つ以上（例えば第1のアデノシンデアミナーゼ、第2のアデノシンデアミナーゼ、napDNAbp、および／またはNLS）の間に存在する。いくつかの態様では、上の一般アーキテクチャに用いられている「−」は任意のリンカーの存在を指示する。
【０１４６】
本開示の融合蛋白質は1つ以上の追加の特徴を含み得るということは了解されるはずである。例えば、いくつかの態様では、融合蛋白質は、細胞質局在配列、搬出配列、例えば核搬出配列、または他の局在配列、および融合蛋白質の可溶化、精製、または検出にとって有用である配列タグを含み得る。本明細書において提供される好適な蛋白質タグは、ビオチンカルボキシラーゼキャリア蛋白質（BCCP）タグ、mycタグ、カルモジュリンタグ、FLAGタグ、ヘマグルチニン（HA）タグ、ヒスチジンタグもしくはHisタグともまた言われるポリヒスチジンタグ、マルトース結合蛋白質（MBP）タグ、nusタグ、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）タグ、緑色蛍光蛋白質（GFP）タグ、チオレドキシンタグ、Sタグ、Softag（例えば、Softag1、Softag3）、strepタグ、ビオチンリガーゼタグ、FlAsHタグ、V5タグ、およびSBPタグを包含するが、これらに限定されない。追加の好適な配列は当業者には明らかであろう。いくつかの態様では、融合蛋白質は1つ以上のHisタグを含む。
【０１４７】
リンカー
ある種の態様では、リンカーが本明細書に記載される蛋白質または蛋白質ドメインのいずれかを連結するために用いられ得る。リンカーは共有結合ほども単純であり得る。または、それは長さが多くの原子のポリマーリンカーであり得る。ある種の態様では、リンカーはポリペプチドであるか、またはアミノ酸に基づく。他の態様では、リンカーはペプチド様ではない。ある種の態様では、リンカーは共有結合（例えば、炭素−炭素結合、ジスルフィド結合、炭素−ヘテロ原子結合など）である。ある種の態様では、リンカーはアミド連結部の炭素−窒素結合である。ある種の態様では、リンカーは、環式または非環式の、置換または無置換の、分枝または非分枝の、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカーである。ある種の態様では、リンカーはポリマー性である（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）。ある種の態様では、リンカーはアミノアルカン酸の単量体、二量体、またはポリマーを含む。ある種の態様では、リンカーはアミノアルカン酸を含む（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ−アラニン、3−アミノプロパン酸、4−アミノブタン酸、5−ペンタン酸など）。ある種の態様では、リンカーはアミノヘキサン酸（Ahx）の単量体、二量体、またはポリマーを含む。ある種の態様では、リンカーは炭素環式部分（例えばシクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の態様では、リンカーはポリエチレングリコール部分（PEG）を含む。他の態様では、リンカーはアミノ酸を含む。ある種の態様では、リンカーはペプチドを含む。ある種の態様では、リンカーはアリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある種の態様では、リンカーはフェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤（例えば、チオール、アミノ）の取り付けを促進するように官能化された部分を包含し得る。いずれかの求電子剤がリンカーの一部として用いられ得る。例示的な求電子剤は、活性化エステル、活性化アミド、マイケル受容体、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートを包含するが、これらに限定されない。
【０１４８】
いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸または複数のアミノ酸（例えばペプチドまたは蛋白質）である。いくつかの態様では、リンカーは結合（例えば共有結合）、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。いくつかの態様では、リンカーは長さが5〜100アミノ酸、例えば、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35〜40、40〜45、45〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、または150〜200アミノ酸である。より長いまたはより短いリンカーもまた企図される。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGSETPGTSESATPES（配列番号10）を含み、これはXTENリンカーともまた言われ得る。いくつかの態様では、リンカーは長さが32アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列(SGGS)2-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)2（配列番号800）を含み、これは(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2ともまた言われ得る。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列を含み、nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGS（配列番号37）を含む。いくつかの態様では、リンカーは(SGGS)n（配列番号37）、(GGGS)n（配列番号38）、(GGGGS)n（配列番号39）、(G)n、(EAAAK)n（配列番号40）、(SGGS)n-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)n（配列番号801）、(GGS)n、SGSETPGTSESATPES（配列番号10）、もしくは（XP）nモチーフ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含み、nは独立して1および30の間の整数であり、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様では、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15である。いくつかの態様では、リンカーはSGSETPGTSESATPES（配列番号10）およびSGGS（配列番号37）を含む。いくつかの態様では、リンカーはSGGSSGSETPGTSESATPESSGGS（配列番号384）を含む。いくつかの態様では、リンカーはSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS（配列番号385）を含む。いくつかの態様では、リンカーはGGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS（配列番号386）を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが24アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES（配列番号685）を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが40アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS（配列番号686）を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが64アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS（配列番号687）を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが92アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS（配列番号688）を含む。本明細書において提供されるリンカーのいずれかが、第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼ；アデノシンデアミナーゼ（例えば第1のまたは第2のアデノシンデアミナーゼ）およびnapDNAbp；napDNAbpおよびNLS；またはアデノシンデアミナーゼ（例えば第1のまたは第2のアデノシンデアミナーゼ）およびNLSを連結するために用いられ得るということは了解されるはずである。
【０１４９】
いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかはアデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbpを含み、これらはリンカーを介して互いに融合させられる。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼを含み、これらはリンカーを介して互いに融合させられる。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかはNLSを含み、これは、アデノシンデアミナーゼ（例えば第1のおよび／または第2のアデノシンデアミナーゼ）、核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）、および／または塩基修復の阻害因子（IBR）に融合させられ得る。特定の適用のためのデアミナーゼ活性にとって最適な長さを達成するために、アデノシンデアミナーゼ（例えば操作されたecTadA）およびnapDNAbp（例えばCas9ドメイン）の間のならびに／または第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼの間の種々のリンカー長さおよびフレキシビリティーが使用され得る（例えば、形態(GGGGS)n（配列番号38）、(GGGGS)n（配列番号39）、および(G)nの非常にフレキシブルなリンカーから、形態(EAAAK)n（配列番号40）、(SGGS)n（配列番号37）、SGSETPGTSESATPES（配列番号10）（例えば、Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to Fokl nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32 (6): 577-82を見よ；内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）、および（XP）nのより剛直なリンカーの範囲である）。いくつかの態様では、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15である。いくつかの態様では、リンカーは(GGS)nモチーフを含み、nは1、3、または7である。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのアデノシンデアミナーゼおよびnapDNAbp、ならびに／または第1のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列SGSETPGTSESATPES（配列番号10）、SGGS（配列番号37）、SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS（配列番号384）、SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS（配列番号385）、またはGGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS（配列番号386）を含むリンカーを介して融合させられる。いくつかの態様では、リンカーは長さが24アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES（配列番号685）を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが32アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーは長さが32アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列(SGGS)2-SGSETPGTSESATPES-(SGGS)2（配列番号800）を含み、これは(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2ともまた言われ得る。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列を含み、nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。いくつかの態様では、リンカーは長さが40アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS（配列番号686）を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが64アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS（配列番号687）を含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが92アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーはアミノ酸配列PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS（配列番号688）を含む。
【０１５０】
本開示のいくつかの側面はCas9ドメインとアデノシンデアミナーゼとを含む融合蛋白質を提供する。例示的な融合蛋白質は、限定なしに、次の融合蛋白質を包含する（明瞭性の目的のために、アデノシンデアミナーゼドメインは太字で示されており；ecTadAデアミナーゼドメインの変異は太字の下線付きで示されており；XTENリンカーは斜体で示されており；UGI/AAG/EndoVドメインは太字の斜体で示されており；NLSは下線付きの斜体で示されている）：
ecTadA(wt)-XTEN-nCas9-NLS：
【化６４−１】
2021500036.tif 000071
【化６４−２】
2021500036.tif 000072
ecTadA(D108N)-XTEN-nCas9-NLS：（哺乳類コンストラクト，DNAに対して活性，A→G編集）：
【化６５−１】
2021500036.tif 000073
【化６５−２】
2021500036.tif 000074
ecTadA(D108G)-XTEN-nCas9-NLS：（哺乳類コンストラクト，DNAに対して活性，A→G編集）：
【化６６】
2021500036.tif 000075
ecTadA(D108V)-XTEN-nCas9-NLS：（哺乳類コンストラクト，DNAに対して活性，A→G編集）：
【化６７】
2021500036.tif 000076
（細菌の）進化の第1ラウンドからもたらされたバリアント
ecTadA(H8Y_D108N_N127S)-XTEN-dCas9：
【化６８】
2021500036.tif 000077
（細菌の）進化の第2ラウンドからの濃縮されたバリアント
ecTadA(H8Y_D108N_N127S_E155X)-XTEN-dCas9；X=D、G、またはV：
【化６９−１】
2021500036.tif 000078
【化６９−２】
2021500036.tif 000079
ABE7.7：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-SGGS-NLS
【化７０−１】
2021500036.tif 000080
【化７０−２】
2021500036.tif 000081
pNMG-624アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-32a.a.リンカー-ecTadA(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)-24a.a.リンカー-nCas9-SGGS-NLS
【化７１−１】
2021500036.tif 000082
【化７１−２】
2021500036.tif 000083
ABE3.2：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(L84F_A106V_D108N_H123Y_D147Y_E155V_I156F)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-SGGS-NLS
【化７２−１】
2021500036.tif 000084
【化７２−２】
2021500036.tif 000085
ABE5.3：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-SGGS-NLS
【化７３】
2021500036.tif 000086
pNMG-558アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-32a.a.リンカー-ecTadA(H36L_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)-24a.a.リンカー-nCas9-SGGS-NLS
【化７４−１】
2021500036.tif 000087
【化７４−２】
2021500036.tif 000088
pNMG-576アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-GGS-NLS
【化７５−１】
2021500036.tif 000089
【化７５−２】
2021500036.tif 000090
pNMG-577アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-GGS-NLS
【化７６−１】
2021500036.tif 000091
【化７６−２】
2021500036.tif 000092
pNMG-586アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-GGS-NLS
【化７７−１】
2021500036.tif 000093
【化７７−２】
2021500036.tif 000094
ABE7.2：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-GGS-NLS
【化７８−１】
2021500036.tif 000095
【化７８−２】
2021500036.tif 000096
pNMG-620アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-GGS-NLS
【化７９−１】
2021500036.tif 000097
【化７９−２】
2021500036.tif 000098
pNMG-617アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-GGS-NLS
【化８０−１】
2021500036.tif 000099
【化８０−２】
2021500036.tif 000100
pNMG-618アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142A_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-GGS-NLS
【化８１−１】
2021500036.tif 000101
【化８１−２】
2021500036.tif 000102
pNMG-620アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-GGS-NLS
【化８２−１】
2021500036.tif 000103
【化８２−２】
2021500036.tif 000104
pNMG-621アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-32a.a.リンカー-ecTadA(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)-24a.a.リンカー-nCas9-GGS-NLS
【化８３−１】
2021500036.tif 000105
【化８３−２】
2021500036.tif 000106
pNMG-622アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-32a.a.リンカー-ecTadA(H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)-24a.a.リンカー-nCas9-GGS-NLS
【化８４−１】
2021500036.tif 000107
【化８４−２】
2021500036.tif 000108
pNMG-623アミノ酸配列：ecTadA(野生型)-32a.a.リンカー-ecTadA(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)-24a.a.リンカー-nCas9-GGS-NLS
【化８５−１】
2021500036.tif 000109
【化８５−２】
2021500036.tif 000110
ABE6.3：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-SGGS-NLS
【化８６−１】
2021500036.tif 000111
【化８６−２】
2021500036.tif 000112
ABE6.4：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(H36L_P48S_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-SGGS-NLS
【化８７−１】
2021500036.tif 000113
【化８７−２】
2021500036.tif 000114
ABE7.8：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-SGGS-NLS
【化８８−１】
2021500036.tif 000115
【化８８−２】
2021500036.tif 000116
ABE7.9：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(W23L_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_A142N_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-SGGS-NLS
【化８９−１】
2021500036.tif 000117
【化８９−２】
2021500036.tif 000118
ABE7.10：ecTadA(野生型)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-ecTadA(W23R_H36L_P48A_R51L_L84F_A106V_D108N_H123Y_S146C_D147Y_R152P_E155V_I156F_K157N)-(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2-nCas9-SGGS-NLS
【化９０−１】
2021500036.tif 000119
【化９０−２】
2021500036.tif 000120
【０１５１】
いくつかの態様では、融合蛋白質は、配列番号11〜28、387、388、440、691〜711のいずれか1つに提示されているアミノ酸配列のいずれか1つ、または本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、融合蛋白質は、配列番号11〜28、387、388、440、691〜711に提示されているアミノ酸配列のいずれか1つ、または本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、融合蛋白質は、配列番号11〜28、387、388、440、691〜711に提示されているアミノ酸配列のいずれか1つ、または本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかと比較して、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400、少なくとも1500、少なくとも1600、少なくとも1700、少なくとも1750、または少なくとも1800個の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
ガイド核酸との核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）の複合体
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか、例えば本明細書において提供されるアデノシン塩基編集因子のいずれかと、融合蛋白質のnapDNAbpに結合したガイド核酸とを含む複合体を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書において提供されるガイドRNAのいずれかに結合した本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか（例えばアデノシン塩基編集因子）を提供する。いくつかの態様では、融合蛋白質（例えばアデノシン塩基編集因子）のnapDNAbpはCas9ドメイン（例えば、dCas9、ヌクレアーゼ活性なCas9、またはCas9ニッカーゼ）であり、これがガイドRNAに結合させられる。いくつかの態様では、本明細書において提供される複合体は、核酸上に変異を作り出すように、例えば、遺伝子（例えばHFE、HBB、もしくはF8）の点変異を修正するように、またはプロモーターのコントロール下にある1つ以上の蛋白質（例えばガンマグロビン蛋白質）の発現を調節するためにプロモーター（例えばHBG1もしくはHBG2プロモーター）を変異させるように構成される。
【０１５３】
いくつかの態様では、ガイドRNAは、標的配列、例えば標的DNA配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBG1またはHBG2遺伝子のプロモーター領域、例えばヒトHBG1またはHBG2遺伝子のプロモーター領域上のDNA配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を含む。いくつかの態様では、ヒトヘモグロビンサブユニットガンマ1（HBG1）は遺伝子ID：3047のHBG1である。いくつかの態様では、ヒトヘモグロビンサブユニットガンマ2（HBG2）は遺伝子ID：3048のHBG2である。いくつかの態様では、HBG1またはHBG2プロモーターはヒト、チンパンジー、類人猿、サル、犬、マウス、またはラットプロモーターである。いくつかの態様では、HBG1またはHBG2プロモーターはヒトHBG1またはHBG2プロモーターである。いくつかの態様では、HBG1またはHBG2プロモーターはHBG1またはHBG2遺伝子の100から300ヌクレオチド上流である。いくつかの態様では、HBG1またはHBG2プロモーターはHBG1またはHBG2遺伝子の100から300、110から290、120から280、130から270、140から260、150から250、160から240、160から230、170から220、180から210、または190から200ヌクレオチド上流である。いくつかの態様では、HBG1発現を駆動するプロモーターは、HBG1の198ヌクレオチド上流であるTを含む（−198T）。いくつかの態様では、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか（例えばアデノシン塩基編集因子）と複合体化させられるgRNAは、HBG1またはHBG2に対して相対的に位置−198のTを標的化するように設計され、TからCへの変異に至る。例示的なHBG1およびHBG2プロモーター配列がそれぞれ配列番号344および345として提供されている。例示的なHBG1およびHBG2プロモーター領域は例示的であり、限定していることを意味されないということは了解されるはずである。
【０１５４】
いくつかの態様では、HBG1またはHBG2プロモーターは、核酸の5'末端にCCTを有する下の配列、例えば配列番号838〜846、297〜323、および配列番号838〜846のいずれか1つの核酸配列を含む。いくつかの態様では、Cへの変異のために標的化されるTは下の配列中で太字で指示される。
【化９１−１】
2021500036.tif 000121
【化９１−２】
2021500036.tif 000122
【０１５５】
いくつかの態様では、本明細書において提供される複合体のいずれかは、上で提供されている核酸配列（例えば、さらに5'末端にCCTを含む配列番号838〜845、297〜323、および配列番号838〜845）のいずれか1つに対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を有するgRNAを含む。gRNAのガイド配列は、標的配列に対して相補的ではない1つ以上のヌクレオチドを含み得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はgRNAの5'末端にある。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はさらにgRNAの5'末端にGを含む。いくつかの態様では、gRNAの5'末端のGは標的配列と相補的ではない。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は、標的配列（例えば、本明細書において提供される標的配列のいずれか）に対して相補的ではない1、2、3、4、5、6、7、または8ヌクレオチドを含む。というこプロモーター配列は個体同士のゲノム間で変わり得るとは了解されるはずである。それゆえに、本開示は、ヒトのゲノム上のHBG1またはHBG2プロモーター標的配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を有するgRNAを提供する。
【０１５６】
いくつかの態様では、gRNAは、下で提供される配列番号846〜853および254〜280のいずれか1つを含むガイド配列を含む。
【化９２−１】
2021500036.tif 000123
【化９２−２】
2021500036.tif 000124
【０１５７】
個体同士のゲノム上の標的配列が変わり得るということから、配列番号846〜853および254〜280で提供されるRNA配列が1核酸塩基以上だけ変わり得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、本明細書において提供されるガイドRNA配列のいずれかのガイド配列は、配列番号846〜853および254〜280のいずれか1つ（on）に対して相対的に1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の核酸塩基変化を包含し得る。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はさらにgRNAの5'末端にGを含む。従って、本願は、さらにそれらの5'末端にGを含む配列番号846〜853および254〜280を提供する。
【０１５８】
いくつかの態様では、ガイドRNAは、標的配列、例えばヘモクロマトーシス（HFE）遺伝子上の標的DNA配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは、ヒトHFE遺伝子上のDNA配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を含む。いくつかの態様では、HFE遺伝子はヒト、チンパンジー、類人猿、サル、犬、マウス、またはラットHFE遺伝子である。いくつかの態様では、HFE遺伝子はヒトHFE遺伝子である。いくつかの態様では、HFE遺伝子は遺伝子ID：3077のHFE遺伝子であり、これはHH、HFE1、HLA−H、MVCD7、およびTFQTL2ともまた言われている。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、この遺伝子によってコードされるHFE蛋白質は、MHCクラス1型蛋白質に類似の膜蛋白質であり、ベータ2ミクログロブリン（ベータ2M）と会合する。この蛋白質は、トランスフェリンとのトランスフェリン受容体の相互作用を制御することによって鉄吸収を制御するように機能すると思われている。鉄蓄積異常の遺伝性ヘモクロマトーシスは、この遺伝子の欠陥からもたらされる劣性の遺伝子異常である。少なくとも9つの選択的スプライシングバリアントがこの遺伝子について記載されている。追加のバリアントもまた見いだされている。
【０１５９】
HFE遺伝子の例示的なコード配列が下に示されている。ここで、アミノ酸残基282のCys（C）→Tyr（Y）変異（C282Y）を引き起こすAに変異させられる野生型Gは太字および下線付きで示されている。いくつかの態様では、この変異はヘモクロマトーシス（例えば遺伝性ヘモクロマトーシス）を引き起こす：
【化９３−１】
2021500036.tif 000125
【化９３−２】
2021500036.tif 000126
【０１６０】
上のHFE核酸コード配列からコードされる例示的なHFEアミノ酸配列が下で（配列番号750）に示されており、ここで、ヘモクロマトーシスではYに変異している位置282のCは太字および下線付きで指示されている：
【化９４】
2021500036.tif 000127
【０１６１】
いくつかの態様では、HFE遺伝子はHFE遺伝子のコード配列上にG→A変異を含み、これがHFE蛋白質のC→Y変異を引き起こす。例えば、配列番号750のC282Y変異である。いくつかの態様では、HFE遺伝子は配列番号871の核酸残基845のG→A変異を含み、これがコードされるHFE蛋白質のC→Y変異を引き起こす。いくつかの態様では、本明細書において提供される複合体は、ヘモクロマトーシスを引き起こすHFEのC→Y変異（例えば、配列番号750のC282Y変異）を修正するように設計される。HFEのコード配列は個体（indvidual）間で変わり得るということは了解されるはずである。それゆえに、ヘモクロマトーシスを引き起こすHFEのC→Y変異を修正するためには、本明細書において提供されるgRNAのいずれかのガイド配列は、かかる違いを考慮するように操作され得る。
【０１６２】
いくつかの態様では、HFE遺伝子は、核酸の5'末端にCCTを有する配列番号854〜861および配列番号854〜861などの下の配列のいずれか1つの核酸配列を含む。いくつかの態様では、Cへの変異のために標的化されるTは下の配列では太字で指示されている。標的Tの反対側のAは、本明細書において提供される複合体のいずれかを用いて脱アミノ化され得る。下で提供される配列はHFE遺伝子のコード配列の部分の逆相補物である。
【化９５】
2021500036.tif 000128
【０１６３】
いくつかの態様では、本明細書において提供される複合体のいずれかは、上で提供されている核酸配列（例えば、5'末端にCCTを有する配列番号854〜861および配列番号854〜861）のいずれか1つに対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を有するgRNAを含む。gRNAのガイド配列は標的配列に対して相補的ではない1つ以上のヌクレオチドを含み得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はgRNAの5'末端にある。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はさらにgRNAの5'末端にGを含む。いくつかの態様では、gRNAの5'末端のGは標的配列と相補的ではない。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は、標的配列（例えば、本明細書において提供される標的配列のいずれか）に対して相補的ではない1、2、3、4、5、6、7、または8ヌクレオチドを含む。HFE遺伝子配列が個体同士のゲノム間で変わり得るということは了解されるはずである。それゆえに、本開示は、ヒトのゲノム上のHFE遺伝子標的配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を有するgRNAを提供する。
【０１６４】
いくつかの態様では、gRNAは下で提供される配列番号862〜869のいずれか1つを含むガイド配列を含む。
【化９６】
2021500036.tif 000129
【０１６５】
個体同士のゲノム上の標的配列が変わり得るということから、配列番号862〜869で提供されるRNA配列は1核酸塩基以上だけ変わり得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、本明細書において提供されるガイドRNA配列のいずれかのガイド配列は、配列番号862〜869のいずれかに対して相対的に1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の核酸塩基変化を包含し得る。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はさらにgRNAの5'末端にGを含む。従って、本願は、さらにそれらの5'末端にGを含む配列番号862〜869を提供する。
【０１６６】
いくつかの態様では、ガイドRNAは、標的配列、例えばベータグロビン（HBB）遺伝子上の標的DNA配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは、ヒトHBB遺伝子のDNA配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を含む。いくつかの態様では、HBB遺伝子はヒト、チンパンジー、類人猿、サル、犬、マウス、またはラットHBB遺伝子である。いくつかの態様では、HBB遺伝子はヒトHBB遺伝子である。いくつかの態様では、HBB遺伝子は遺伝子ID：3043のHBB遺伝子であり、これはECYT6、CD113t−C、およびベータグロビンともまた言われている。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、ヘモグロビンサブユニットベータはグロビン蛋白質であり、これがアルファグロビン（HBA）と併せて成人のヘモグロビンの最も頻繁な形態を構成している。遺伝子の変異は蛋白質のいくつかのバリアントを産生し、これらはヘモグロビンC疾患（HbC）およびヘモグロビンE疾患（HbE）を包含する鎌状赤血球症およびベータサラセミアなどの遺伝子異常への関与が示されている。
【０１６７】
HBB遺伝子の例示的なコード配列が下に示されている。いくつかの態様では、この配列が変異させられて（例えばA→T変異）、鎌状赤血球症（蛋白質のE6V変異）を引き起こす。いくつかの態様では、この配列が変異させられて（例えばG→A変異）、HbC（蛋白質のE6K変異）を引き起こす。いくつかの態様では、この配列が変異させられて（例えばG→A変異）、HbE（蛋白質のE26K変異）を引き起こす。
【０１６８】
例示的なHBB遺伝子：
【化９７−１】
2021500036.tif 000130
【化９７−２】
2021500036.tif 000131
【０１６９】
例示的なHBBアミノ酸配列が下で（配列番号340）に示されており、ここで、鎌状赤血球症ではVにまたはHbCではKに変異している位置6のEは、太字および下線付きで指示されている。HbEではKに変異している位置26のEもまた太字および下線付きで指示されている。
【化９８】
2021500036.tif 000132
【０１７０】
いくつかの態様では、HBB遺伝子はHBB遺伝子のコード配列上にG→AまたはA→T変異を含み、これはHBBのE6V、E6K、またはE26K変異を引き起こす。例えば、配列番号340のE6V、E6K、またはE26K変異である。いくつかの態様では、本明細書において提供される複合体は、それぞれ鎌状赤血球症、HbC、およびHbEを引き起こすHBBのE6V、E6K、またはE26K変異を修正する（例えば、病原性のV変異を非病原性のA変異に変化させる）ように設計される。HBBのコード配列が個体間で変わり得るということは了解されるはずである。それゆえに、本明細書において提供される変異を修正するためには、本明細書において提供されるgRNAのいずれかのガイド配列はかかる違いを考慮するように操作され得る。
【０１７１】
いくつかの態様では、HBB遺伝子は配列番号324〜337などの下の配列のいずれか1つの核酸配列またはその逆相補物を含む。いくつかの態様では、Cへの変異のために標的化されるTは下の配列では太字で指示されている。標的Tの反対側のAは本明細書において提供される複合体のいずれかを用いて脱アミノ化され得る。
【化９９−１】
2021500036.tif 000133
【化９９−２】
2021500036.tif 000134
【０１７２】
いくつかの態様では、本明細書において提供される複合体のいずれかは、上で提供されている核酸配列（例えば配列番号324〜337）のいずれか1つに対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を有するgRNAを含む。gRNAのガイド配列は標的配列に対して相補的ではない1つ以上のヌクレオチドを含み得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はgRNAの5'末端にある。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はさらにgRNAの5'末端にGを含む。いくつかの態様では、gRNAの5'末端のGは標的配列と相補的ではない。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は、標的配列（例えば本明細書において提供される標的配列のいずれか）に対して相補的ではない1、2、3、4、5、6、7、または8ヌクレオチドを含む。BB遺伝子配列は個体同士のゲノム間で変わり得るということは了解されるはずである。それゆえに、本開示は、ヒトのゲノム上のHBB遺伝子標的配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を有するgRNAを提供する。
【０１７３】
いくつかの態様では、gRNAは下で提供される配列番号281〜294のいずれか1つを含むガイド配列を含む。配列番号281〜290は鎌状赤血球症を処置するように設計されている（例えば、非病原性である位置6のAを有するようにE6V変異を変化させる）。配列番号291はHbC（例えばE6K変異）を処置するように設計されている。配列番号292〜294はHbE（例えばE26K変異）に対して設計されている。
【化１００−１】
2021500036.tif 000135
【化１００−２】
2021500036.tif 000136
【０１７４】
個体同士のゲノム上の標的配列が変わり得るということから、配列番号281〜294で提供されるRNA配列が1核酸塩基以上だけ変わり得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、本明細書において提供されるガイドRNA配列のいずれかのガイド配列は、配列番号281〜294のいずれかに対して相対的に1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の核酸塩基変化を包含し得る。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はさらにgRNAの5'末端にGを含む。従って、本願は、さらにそれらの5'末端にGを含む配列番号281〜294を提供する。
【０１７５】
いくつかの態様では、ガイドRNAは、標的配列、例えば凝固第VIII因子（F8）遺伝子上の標的DNA配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは、ヒトF8遺伝子上のDNA配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を含む。いくつかの態様では、F8遺伝子はヒト、チンパンジー、類人猿、サル、犬、マウス、またはラットF8遺伝子である。いくつかの態様では、F8遺伝子はヒトF8遺伝子である。いくつかの態様では、F8遺伝子は遺伝子ID：2157のF8遺伝子であり、これはAHF、F8B、F8C、HEMA、FVIII、およびDXS1253Eともまた言われている。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、F8は凝固第VIII因子をコードし、これは血液凝固の本来の経路に関与する；第VIII因子は第IXa因子のコファクターであり、これはCa+2およびリン脂質の存在下において第X因子を活性化形態Xaへと変換する。この遺伝子の欠陥は頻繁な劣性X連鎖凝固異常の血友病Aをもたらす。
【０１７６】
F8遺伝子の例示的なコード配列が配列番号347として提供されている。いくつかの態様では、この配列が変異させられて（例えばC→T変異）、血友病A（蛋白質のR612C変異）を引き起こす。
【０１７７】
例示的な凝固第VIII因子アミノ酸配列が下で（配列番号341）に示されており、ここで、血友病AではCに変異している位置612のRは太字および下線付きで指示されている。
【０１７８】
【化１０１−１】
2021500036.tif 000137
【化１０１−２】
2021500036.tif 000138
【０１７９】
いくつかの態様では、F8遺伝子はF8遺伝子のコード配列上にC→T変異を含み、これが凝固第VIII因子のR→C変異を引き起こす。例えば、配列番号341のR612C変異である。いくつかの態様では、本明細書において提供される複合体は、血友病Aを引き起こすF8のR→C（例えばR612C）変異を修正するように設計される。F8のコード配列が個体（indvidual）間で変わり得るということは了解されるはずである。それゆえに、本明細書において提供される変異を修正するためには、本明細書において提供されるgRNAのいずれかのガイド配列はかかる違いを考慮するように操作され得る。
【０１８０】
いくつかの態様では、F8遺伝子は配列番号338〜339などの下の配列のいずれか1つの核酸配列またはその逆相補物を含む。いくつかの態様では、Cへの変異のために標的化されるTは下の配列では太字で指示されている。標的Tの反対側のAは、本明細書において提供される複合体のいずれかを用いて脱アミノ化され得る。
【化１０２】
2021500036.tif 000139
【０１８１】
いくつかの態様では、本明細書において提供される複合体のいずれかは、上で提供されている核酸配列（例えば配列番号338〜339）のいずれか1つに対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を有するgRNAを含む。gRNAのガイド配列は標的配列に対して相補的ではない1つ以上のヌクレオチドを含み得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はgRNAの5'末端にある。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はさらにgRNAの5'末端にGを含む。いくつかの態様では、gRNAの5'末端のGは標的配列と相補的ではない。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は、標的配列（例えば、本明細書において提供される標的配列のいずれか）に対して相補的ではない1、2、3、4、5、6、7、または8ヌクレオチドを含む。F8遺伝子配列は個体同士のゲノム間で変わり得るということは了解されるはずである。それゆえに、本開示は、ヒトのゲノム上のF8遺伝子標的配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の一続きの核酸を含むガイド配列を有するgRNAを提供する。
【０１８２】
いくつかの態様では、gRNAは、下で提供される配列番号295〜296のいずれか1つを含むガイド配列を含み、これらは血友病A（例えば、例えば配列番号341のR612C変異）を処置するように設計されている。
【化１０３】
2021500036.tif 000140
【０１８３】
個体同士のゲノム上の標的配列が変わり得るということから、配列番号295〜296で提供されるRNA配列が1核酸塩基以上だけ変わり得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、本明細書において提供されるガイドRNA配列のいずれかのガイド配列は、配列番号295〜295のいずれかに対して相対的に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の核酸塩基変化を包含し得る。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列はさらにgRNAの5'末端にGを含む。従って、本願は、さらにそれらの5'末端にGを含む配列番号295〜296を提供する。
【０１８４】
いくつかの態様では、ガイド核酸（例えばガイドRNA）は15〜150ヌクレオチドの長さであり、標的配列に対して相補的である少なくとも10個の一続きのヌクレオチドのガイド配列を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは少なくとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、または150ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、ガイドRNAは、標的配列、例えば本明細書において提供されるHBG1もしくはHBG2プロモーター配列のいずれかまたは本明細書において提供されるHFE、HBBもしくはF8標的配列のいずれかに対して相補的である15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40個の一続きのヌクレオチドのガイド配列を含む。いくつかの態様では、標的配列はDNA配列である。いくつかの態様では、標的配列は哺乳動物のゲノム上の配列である。いくつかの態様では、標的配列はヒトのゲノム上の配列である。いくつかの態様では、標的配列の3'末端は直ちに古典的PAM配列（NGG）に隣接する。いくつかの態様では、ガイド核酸（例えばガイドRNA）は、疾患または異常、例えば遺伝性高胎児型ヘモグロビン症（HPFH）、ベータサラセミア、遺伝性ヘモクロマトーシス（HHC）、鎌状赤血球症、HbC、HbE、または血友病（例えば血友病A）に関連する配列に対して相補的である。
アデノシンデアミナーゼと核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）ドメインとを含む融合蛋白質を用いる方法
【０１８５】
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される融合蛋白質、またはガイド核酸（例えばgRNA）と核酸塩基編集因子とを含む複合体を用いる方法を提供する。例えば、本開示のいくつかの側面は、DNAまたはRNA分子を本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかとかつ少なくとも1つのガイド核酸（例えばガイドRNA）と接触させることを含む方法を提供し、ガイド核酸（例えばガイドRNA）は、標的配列に対して100%相補的である少なくとも10個の（例えば少なくとも10、15、20、25、または30個の）一続きのヌクレオチドの配列（例えば、DNA標的配列に結合するガイド配列）を含む。いくつかの態様では、標的配列の3'末端は直ちに古典的PAM 配列（NGG）に隣接する。いくつかの態様では、標的配列の3'末端は直ちには古典的PAM配列（NGG）に隣接しない。いくつかの態様では、標的配列の3'末端は直ちにAGC、GAG、TTT、GTG、またはCAA配列に隣接する。
ヘモ（hema）グロビンを発現する
【０１８６】
本開示のいくつかの側面は、疾患抑圧変異を細胞（例えば哺乳類細胞）に導入する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、塩基編集因子（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか）およびgRNAを用いてヘモグロビン遺伝子（例えばHBG1および／またはHBG2）の発現を調節する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、塩基編集因子（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか）およびgRNAを用いてHBG1および／またはHBG2のプロモーター領域にA→Tおよび／またはT→C変異を作り出す方法を提供する。
【０１８７】
稀な良性状態の遺伝性高胎児型ヘモグロビン症（HPFH）を有するヒトは、鎌状赤血球貧血を包含するいくつかのβ−グロビン疾患に対して耐性である。ある種の患者では、この表現型は、正常では出生前後のヒトにおいてサイレンシングされる胎児型ヘモグロビンの持続した発現を可能にするγ−グロビン遺伝子HBG1およびHBG2のプロモーター上の変異によって媒介される。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、HBG1またはHBG2のプロモーター領域の1つ以上の変異を作り出すことは、β−グロビン疾患を処置するためにHBG1および／またはHBG2の発現を増大させ得る。
【０１８８】
いくつかの態様では、方法は、プロモーターを塩基編集因子および塩基編集因子に結合したガイドRNAと接触させることによって、HBG1またはHBG2遺伝子のプロモーター上のアデノシン核酸塩基（A）を脱アミノ化することを包含し、ここで、ガイドRNA（gRNA）は、HBG1および／またはHBG2遺伝子のプロモーター上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む。HBG1およびHBG2遺伝子のプロモーターは、本明細書に記載されるHBG1およびHBG2プロモーターの配列のいずれかを包含し得るということは了解されるはずである。いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は、HBG1またはHBG2のプロモーター配列上の標的核酸配列に対して100%相補的である少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、またはより多くの一続きの核酸を含む。
【０１８９】
いくつかの態様では、方法はさらに標的配列にニックを入れることを含み、これは、gRNAのガイド配列に対して相補的である標的配列にニックを入れるCas9ニッカーゼ（nCas9）などの核酸によってプログラム可能な結合蛋白質（napDNAbp）を用いることによって達成され得る。いくつかの態様では、プロモーター上の標的核酸配列は、核酸配列
【化１０４】
2021500036.tif 000141
または配列番号297〜323のいずれか1つ、
を含む。配列番号838〜845の核酸のいずれかはさらにそれらの5'末端に5'-CCT-3'を含み得るということは了解されるはずである。
【０１９０】
いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は核酸配列
【化１０５−１】
2021500036.tif 000142
【化１０５−２】
2021500036.tif 000143
または配列番号254〜280のいずれか1つ、
を含む。配列番号846〜853または254〜280の核酸のいずれかはさらにそれらの5'末端にGを含み得るということは了解されるはずである。
【０１９１】
いくつかの態様では、HBG1またはHBG2のプロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、プロモーター上のT−A塩基対がプロモーター上のC−G塩基対へと変異させられることをもたらす。いくつかの態様では、プロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは遺伝性高胎児型ヘモグロビン症（HPFH）に関連する配列をもたらす。いくつかの態様では、遺伝性高胎児型ヘモグロビン症は、胎児型ヘモグロビン（例えばヘモグロビンF）が成人期に発現される良性状態を特徴とする。いくつかの態様では、HPFHは、2歳以上、5歳以上、10歳以上、15歳以上、20歳以上、25歳以上、または30歳以上の対象における胎児型ヘモグロビンの発現を特徴とする。いくつかの態様では、それが2歳以上、5歳以上、10歳以上、15歳以上、20歳以上、25歳以上、または30歳以上の正常な対象よりも少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、またはより多く多大であるレベルで発現する場合に、HPFHは成体において発現されていると考えられる。
【０１９２】
いくつかの態様では、HBG1遺伝子のプロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、健康な成体またはHBG1を発現する胎児に対して相対的に、少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、500%、1000%、またはより多くだけ、HBG1遺伝子の転写の増大に至る。いくつかの態様では、HBG2遺伝子のプロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、健康な成体またはHBG1を発現する胎児に対して相対的に、少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、500%、1000%、またはより多くだけ、HBG2遺伝子の転写の増大に至る。いくつかの態様では、HBG1遺伝子のプロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、健康な成体またはHBG1を発現する胎児に対して相対的に、少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、500%、1000%、またはより多くだけ、増大した（increase）HBG1蛋白質レベルに至る。いくつかの態様では、HBG2遺伝子のプロモーター上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、健康な成体またはHBG2を発現する胎児に対して相対的に、少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、500%、1000%、またはより多くだけ、HBG2蛋白質レベルの増大に至る。
【０１９３】
いくつかの態様では、方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば培養細胞によって行われる。いくつかの態様では、方法はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様では、方法はｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様では、方法は対象の細胞に対して行われる。いくつかの態様では、対象は血液の疾患または異常を有するか、または有することを疑われる。いくつかの態様では、疾患または異常は貧血である。いくつかの態様では、貧血は鉄欠乏性貧血、再生不良性貧血、溶血性貧血、サラセミア（thalassaemia）、鎌状赤血球貧血、悪性貧血、またはファンコニ貧血である。いくつかの態様では、疾患または異常は、グロビン蛋白質、例えばCYGB、HBA1、HBA2、HBB、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、HBM、HBQ1、HBZ、またはMBをコードする遺伝子または遺伝子のプロモーターの変異によって引き起こされる。
HFE遺伝子の変異を修正する
【０１９４】
本開示のいくつかの側面は、塩基編集因子（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか）およびgRNAを用いてHFE遺伝子の点変異を修正する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、塩基編集因子（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか）およびgRNAを用いてHFE遺伝子上にA→Gおよび／またはT→C変異を作り出す方法を提供する。いくつかの態様では、本開示はHFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基（A）を脱アミノ化するための方法を提供し、方法は、HFE遺伝子を塩基編集因子および塩基編集因子に結合したガイドRNAと接触させることを含み、ここで、ガイドRNAはHFE遺伝子上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む。いくつかの態様では、HFE遺伝子はC→TまたはG→A変異を含む。いくつかの態様では、HFE遺伝子のC→TまたはG→A変異はHFE遺伝子によってコードされるHFE蛋白質の機能を障害する。いくつかの態様では、HFE遺伝子のC→TまたはG→A変異は、HFE遺伝子によってコードされるHFE蛋白質の機能を少なくとも1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または少なくとも99%だけ障害する。いくつかの態様では、HFE蛋白質の機能は鉄吸収である。
【０１９５】
いくつかの態様では、Tに対して相補的なアデノシン（A）核酸塩基を脱アミノ化することは、HFE遺伝子のC→TまたはG→A変異を修正する。いくつかの態様では、HFE遺伝子のC→TまたはG→A変異は、HFE遺伝子によってコードされるHFE蛋白質のCys（C）→Tyr（Y）変異に至る。いくつかの態様では、Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、HFE蛋白質のCys→Tyr変異を修正する。
【０１９６】
いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は、HFE遺伝子の標的核酸配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35個の一続きの核酸を含む。いくつかの態様では、塩基編集因子は、ガイド配列に対して相補的である標的配列にニックを入れる。いくつかの態様では、HFE遺伝子上の標的核酸配列は核酸配列：
【化１０６】
2021500036.tif 000144
を含む。配列番号854〜861の核酸のいずれかはさらにそれらの5'末端に5'-CCT-3'を含み得るということは了解されるはずである。
【０１９７】
いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は核酸配列：
【化１０７】
2021500036.tif 000145
を含む。配列番号862〜869の核酸のいずれかはさらにそれらの5'末端にGを含み得るということは了解されるはずである。
【０１９８】
いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、HFE遺伝子上のT−A塩基対がHFE遺伝子上のC−G塩基対へと変異させられることをもたらす。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、遺伝性ヘモクロマトーシス（HHC）に関連する配列を修正することをもたらす。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することはHFE蛋白質機能の増大をもたらす。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、野生型HFE蛋白質機能と比較して、少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも100%までのHFE蛋白質機能の増大をもたらす。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することはヘモクロマトーシスの1つ以上の症状の減少をもたらす。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは鉄吸収機能の増大に至る。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、鉄吸収の正常レベル、例えばヘモクロマトーシスを有さない対象の鉄吸収のレベルの少なくとも（least）1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または少なくとも99%までの鉄吸収機能の増大に至る。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、HFE遺伝子から転写されるHFE蛋白質の機能の増大に至る。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、例えば少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または少なくとも99%だけ、HFE安定性または半減期の増大に至る。
【０１９９】
いくつかの態様では、HFE遺伝子は培養中の細胞（例えば、不死化リンパ芽球様細胞（LCL））または対象内の細胞などの細胞内にある。いくつかの態様では、HFE遺伝子はCys→Tyr変異を含むHFE蛋白質をコードする。いくつかの態様では、HFE蛋白質はアミノ酸配列配列番号750の残基282のCys→Tyr変異（C282Y）を含み、ここで位置282のCysは太字で示されている：
【化１０８】
2021500036.tif 000146
【０２００】
いくつかの態様では、方法はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様では、方法はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様では、方法はｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様では、方法は対象の細胞に対して行われる。いくつかの態様では、対象は鉄蓄積異常を有するか、または有することを疑われる。いくつかの態様では、対象はヘモクロマトーシスを有するか、または有することを疑われる。いくつかの態様では、対象は遺伝性ヘモクロマトーシス（HHC）を有するか、または有することを疑われる。いくつかの態様では、対象はHFE遺伝子の変異を有し、ここでは、Aに変異している野生型G（例えば、配列番号871のG845A変異）がCys（C）→Tyr（Y）変異を例えば配列番号750のアミノ酸残基282に引き起こす（C282Y）。いくつかの態様では、この変異はヘモクロマトーシス（例えば遺伝性ヘモクロマトーシス）を引き起こす。いくつかの態様では、HFE遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、対象の鉄蓄積異常の1つ以上の症状を改善する。
【０２０１】
HBB遺伝子の変異を修正する／作り出す
本開示のいくつかの側面は、塩基編集因子（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか）およびgRNAを用いてHBB遺伝子の点変異を修正するかまたは非病原性である点変異を作り出す方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、塩基編集因子（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか）およびgRNAを用いてHBB遺伝子上にA→Gおよび／またはT→C変異を作り出す方法を提供する。いくつかの態様では、本開示はHBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基（A）を脱アミノ化するための方法を提供し、方法は、HBB遺伝子を塩基編集因子および塩基編集因子に結合したガイドRNAと接触させることを含み、ここで、ガイドRNAは、HBB遺伝子上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む。いくつかの態様では、HBB遺伝子はA→TまたはG→A変異を含む。いくつかの態様では、HBB遺伝子のA→TまたはG→A変異は、HBB遺伝子によってコードされるベータグロビン蛋白質の機能を障害する。いくつかの態様では、HBB遺伝子のA→TまたはG→A変異は、HBB遺伝子によってコードされるHBB蛋白質の機能を少なくとも1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または少なくとも99%だけ障害する。いくつかの態様では、HBB蛋白質の機能は酸素運搬能である。いくつかの態様では、A→T変異は鎌状赤血球症を引き起こし、T：A塩基対をC：G塩基対に変化させることは、ヘモグロビンが多量体化する能力を例えば少なくとも1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または少なくとも99%だけ減少させる非病原性の点変異を生み出す。
【０２０２】
いくつかの態様では、Tに対して相補的なアデノシン（A）核酸塩基を脱アミノ化することは、HBB遺伝子のC→TまたはG→A変異を修正するかまたは非病原性の変異を作り出す。いくつかの態様では、HBB遺伝子のA→TまたはG→A変異は、HBB遺伝子によってコードされるHBB蛋白質のE→V変異またはE→K変異に至る。いくつかの態様では、Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、HBB蛋白質のE→K変異を修正する。例えば、Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、例えば配列番号340と比較して、HBBのE6K（HbC）またはE26K（HbE）変異を修正する。いくつかの態様では、Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは病原性の変異を非病原性の変異へと変化させる。例えば、HBBのE6V変異（例えば配列番号340と比較して）は、非病原性の変異を生み出すために、位置6にAを作り出すように変異させられ得る（例えばV6A変異）。
【０２０３】
いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は、HBB遺伝子の標的核酸配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35個の一続きの核酸を含む。いくつかの態様では、塩基編集因子は、ガイド配列に対して相補的である標的配列にニックを入れる。いくつかの態様では、HBB遺伝子上の標的核酸配列は核酸配列：
【化１０９】
2021500036.tif 000147
を含む。
【０２０４】
いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は核酸配列：
【化１１０−１】
2021500036.tif 000148
【化１１０−２】
2021500036.tif 000149
を含む。配列番号281〜294の核酸のいずれかはさらにそれらの5'末端にGを含み得るということは了解されるはずである。
【０２０５】
いくつかの態様では、HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、HBB遺伝子上のT−A塩基対がHBB遺伝子上のC−G塩基対へと変異させられることをもたらす。いくつかの態様では、HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、HbCもしくはHbEに関連する配列を修正することをもたらすか；または非病原性の変異を作り出すことをもたらす。いくつかの態様では、HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することはHBB蛋白質機能の増大をもたらす。いくつかの態様では、HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、野生型HBB蛋白質機能と比較して少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも100%までのHBB蛋白質機能の増大をもたらす。いくつかの態様では、HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、鎌状赤血球症、HbC、またはHbEの1つ以上の症状の減少をもたらす。いくつかの態様では、HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、酸素運搬機能の増大を、またはベータグロビンの多量体化の減少もしくは細胞鎌形化の減少をもたらす。いくつかの態様では、HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、酸素運搬機能の正常レベル、例えば鎌状赤血球、HbC、および／またはHbEを有さない対象の酸素運搬機能（例えば、酸素飽和）のレベルの少なくとも（least）1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または少なくとも99%までの、酸素運搬機能の増大をもたらす。いくつかの態様では、HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、HBB遺伝子から転写されるHBB蛋白質の機能の増大に至る。いくつかの態様では、HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、例えば少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または少なくとも99%だけ、HBB安定性または半減期の増大に至る。
【０２０６】
いくつかの態様では、HBB遺伝子は培養中の細胞または対象内の細胞などの細胞内にある。いくつかの態様では、HBB遺伝子はE→VまたはE→K変異を含むHBB蛋白質をコードする。いくつかの態様では、HBB蛋白質はアミノ酸配列配列番号340の残基6にE→V変異（E6V）を含み（鎌状赤血球症）、ここで位置6のEは太字で示されている。いくつかの態様では、HBB蛋白質はアミノ酸配列配列番号340の残基6にE→K変異（E6K）を含み（HbC）、ここで位置6のEは太字で示されている。いくつかの態様では、HBB蛋白質はアミノ酸配列配列番号340の残基6にE→K変異（E26K）を含み（HbE）、ここで位置26のEは太字で示され、下線付きである：
【化１１１】
2021500036.tif 000150
【０２０７】
いくつかの態様では、方法はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様では、方法はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様では、方法はｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様では、方法は対象の細胞に対して行われる。いくつかの態様では、対象は鉄蓄積異常を有するか、または有することを疑われる。いくつかの態様では、対象は鎌状赤血球症またはベータサラセミアを有するか、または有することを疑われる。いくつかの態様では、対象はHbCまたはHbEを有するか、または有することを疑われる。いくつかの態様では、対象はHBB遺伝子の変異を有し、野生型AがTに変異させられているか、または野生型GがAに変異させられている。いくつかの態様では、HBB遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、対象の鎌状赤血球症、HbC、またはHbEの1つ以上の症状を改善する。
F8遺伝子の変異を修正する
【０２０８】
本開示のいくつかの側面は、塩基編集因子（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか）およびgRNAを用いてF8遺伝子の点変異を修正する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、塩基編集因子（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか）およびgRNAを用いてF遺伝子上にA→Gおよび／またはT→C変異を作り出す方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基（A）を脱アミノ化するための方法を提供し、方法はF8遺伝子を塩基編集因子および塩基編集因子に結合したガイドRNAと接触させることを含み、ここで、ガイドRNAはF8遺伝子上の標的核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む。いくつかの態様では、F8遺伝子はC→TまたはG→A変異を含む。いくつかの態様では、F8遺伝子のC→TまたはG→A変異は、F8遺伝子によってコードされる凝固第VIII因子蛋白質の機能を障害する。いくつかの態様では、F8遺伝子のC→TまたはG→A変異は、F8遺伝子によってコードされる凝固第VIII因子蛋白質の機能を、少なくとも1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または少なくとも99%だけ障害する。いくつかの態様では、凝固第VIII因子蛋白質の機能は凝血である。
【０２０９】
いくつかの態様では、Tに対して相補的なアデノシン（A）核酸塩基を脱アミノ化することは、F8遺伝子のC→TまたはG→A変異を修正する。いくつかの態様では、F8遺伝子のC→TまたはG→A変異は、F8遺伝子によってコードされる第VIII因子蛋白質のR→C変異に至る。いくつかの態様では、Tに対して相補的なアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、第VIII因子蛋白質のR→C変異を修正する。
【０２１０】
いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は、F8遺伝子の標的核酸配列に対して100%相補的である少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35個の一続きの核酸を含む。いくつかの態様では、塩基編集因子は、ガイド配列に対して相補的である標的配列にニックを入れる。いくつかの態様では、F8遺伝子上の標的核酸配列は核酸配列：
【化１１２】
2021500036.tif 000151
を含む。
【０２１１】
いくつかの態様では、gRNAのガイド配列は核酸配列：
【化１１３】
2021500036.tif 000152
を含む。配列番号295〜296の核酸のいずれかはさらにそれらの5'末端にGを含み得るということは了解されるはずである。
【０２１２】
いくつかの態様では、F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、F8遺伝子上のT−A塩基対がF8遺伝子上のC−G塩基対へと変異させられることをもたらす。いくつかの態様では、F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、血友病（例えば血友病A）に関連する配列を修正することをもたらす。いくつかの態様では、F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは第VIII因子蛋白質機能の増大をもたらす。いくつかの態様では、F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、野生型第VIII因子蛋白質機能と比較して、少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも100%までの第VIII因子蛋白質機能の増大をもたらす。いくつかの態様では、F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは血友病の1つ以上の症状の減少をもたらす。いくつかの態様では、F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは凝血機能の増大をもたらす。いくつかの態様では、F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、凝血機能の正常レベル、例えば血友病を有さない対象の凝血機能のレベルの少なくとも（least）1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または少なくとも99%までの凝血機能の増大をもたらす。いくつかの態様では、F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、F8遺伝子から転写される第VIII因子蛋白質の機能の増大に至る。いくつかの態様では、F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、例えば少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または少なくとも99%だけ、第VIII因子安定性または半減期の増大に至る。
【０２１３】
いくつかの態様では、F8遺伝子は培養中の細胞または対象内の細胞などの細胞内にある。いくつかの態様では、F8遺伝子はR→C変異を含む第VIII因子蛋白質をコードする。いくつかの態様では、第VIII因子蛋白質はアミノ酸配列配列番号341の残基612にR→C変異（R612C）を含み、ここで位置612のRは太字で示されている：
【化１１４−１】
2021500036.tif 000153
【化１１４−２】
2021500036.tif 000154
【０２１４】
いくつかの態様では、方法はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様では、方法はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様では、方法はｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様では、方法は対象の細胞に対して行われる。いくつかの態様では、対象は血友病を有するか、または有することを疑われる。いくつかの態様では、対象は血友病Aを有するか、または有することを疑われる。いくつかの態様では、対象はF8遺伝子の変異を有し、ここでは野生型GがAに変異しており（that is）、これがR→C変異を例えば配列番号341のアミノ酸残基612（R612C）に引き起こす。いくつかの態様では、この変異は血友病（例えば血友病A）を引き起こす。いくつかの態様では、F8遺伝子上のアデノシン核酸塩基を脱アミノ化することは、対象の血友病の1つ以上の症状を改善する。
【０２１５】
いくつかの態様では、標的DNA配列は疾患または異常に関連する配列を含む。いくつかの態様では、標的DNA配列は疾患または異常に関連する点変異を含む。いくつかの態様では、融合蛋白質（例えばアデノシンデアミナーゼとCas9ドメインとを含む）または複合体の活性は点変異の修正をもたらす。いくつかの態様では、標的DNA配列は疾患または異常に関連するG→AまたはC→T点変異を含み、変異体A塩基の脱アミノ化は疾患または異常に関連しない配列をもたらす。いくつかの態様では、標的DNA配列は蛋白質をコードし、点変異はコドン上にあり、野生型コドンと比較して変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの態様では、変異体Aの脱アミノ化は変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの態様では、変異体Aの脱アミノ化は野生型アミノ酸をコードするコドンをもたらす。いくつかの態様では、接触させることは対象内においてｉｎ  ｖｉｖｏである。いくつかの態様では、対象は疾患または異常を有するか、またはそう診断されている。
【０２１６】
いくつかの態様は、本明細書において提供されるDNA編集融合蛋白質を用いる方法を提供する。いくつかの態様では、融合蛋白質は、標的核酸塩基、例えばA残基を脱アミノ化することによって核酸に点変異を導入するために用いられる。いくつかの態様では、標的核酸塩基の脱アミノ化は、遺伝子の欠陥の修正、例えば遺伝子産物の機能喪失に至る点変異の修正をもたらす。いくつかの態様では、遺伝子の欠陥は、疾患または異常、例えば遺伝性ヘモクロマトーシスに関連する。いくつかの態様では、本明細書において提供される方法は、遺伝子の発現を調節する（例えば増大させるかまたは減少させる）遺伝子（例えばHBG1またはHBG2）のプロモーターに点変異を導入するために用いられる。例えば、いくつかの態様では、DNA編集融合蛋白質を使用してHBG1またはHBG2のプロモーター領域に点変異導入してHBG1またはHBG2の発現を増大させる方法が本明細書において提供される。いくつかの態様では、かかる点変異は対象のHBG1またはHBG2の発現を増大させ得、これは鎌状赤血球貧血を包含するβ−グロビン疾患を処置することにとって有用であり得る。
【０２１７】
いくつかの態様では、本明細書において提供される方法の目的は、機能異常の遺伝子の機能をゲノム編集によって復元することである。本明細書において提供される核酸塩基編集蛋白質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばヒト細胞培養物の疾患関連変異を修正することによって、遺伝子編集に基づくヒト治療学について検証され得る。本明細書において提供される核酸塩基編集蛋白質、例えば核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（例えばCas9）とアデノシンデアミナーゼドメインとを含む融合蛋白質が、いずれかのG→AまたはC→T単一点変異を修正するために用いられ得るということは当業者によって理解されるであろう。第1のケースでは、変異体AからIへの脱アミノ化が変異を修正し、後者のケースでは、変異体Tと塩基対形成しているAの脱アミノ化、次に複製のラウンドまたは次に塩基編集修復活性が変異を修正する。
【０２１８】
本開示は、本明細書において提供されるDNA編集融合蛋白質によって修正され得る点変異に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患と診断された対象の処置のための方法を提供する。例えば、いくつかの態様では、かかる疾患、例えば貧血またはヘモクロマトーシスを有する対象に、有効量のアデノシンデアミナーゼ融合蛋白質を投与することを含む方法が提供され、これが、遺伝子（例えばHFE）の点変異を修正するかまたは遺伝子のプロモーター領域（例えばHBG1またはHBG2のプロモーター領域）に変異を導入する。いくつかの態様では、疾患は遺伝子疾患である。いくつかの態様では、疾患は貧血に関連する疾患である。いくつかの態様では、疾患は鉄蓄積疾患（例えば遺伝性ヘモクロマトーシス）である。いくつかの態様では、疾患はリソソーム蓄積症である。点変異を修正することまたは非活性化変異を疾患関連遺伝子に導入することによって処置され得る他の疾患は当業者には公知であろう。本開示はこれについて限定されない。
【０２１９】
いくつかの態様では、融合蛋白質は古典的PAMを認識し、ゆえに、それぞれフランキング配列上に古典的PAM、例えばNGGを有する病原性のG→AまたはC→T変異を修正し得る。例えば、古典的PAMを認識するCas9蛋白質は、配列番号52によって提供されるStreptococcus pyogenes Cas9のアミノ酸配列、または配列番号52のRuvCおよびHNHドメインを含むその断片と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２２０】
本明細書において開示される通りCas9ドメインとアデノシンデアミナーゼとを含む融合蛋白質のいずれかを、標的部位、例えば編集されるべき点変異を含む部位へと標的化するためには、典型的には、融合蛋白質をガイドRNA、例えばsgRNAと一緒に共発現することが必要であるということは当業者には明らかであろう。本明細書において他所でより詳細に説明される通り、ガイドRNAは、典型的には、Cas9結合を許すtracrRNAフレームワークと、Cas9：核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質に配列特異性を授けるガイド配列とを含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは構造5'-[ガイド配列]-guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuu-3'（配列番号389）を含み、ガイド配列は標的配列に対して相補的である配列を含む。いくつかの態様では、ガイド配列は表2で提供されているヌクレオチド配列のいずれかを含む。ガイド配列は典型的には20ヌクレオチドの長さである。Cas9：核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質を特定のゲノム標的部位へと標的化ことにとって好適なガイドRNAの配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。かかる好適なガイドRNA配列は、典型的には、編集されるべき標的ヌクレオチドの上流または下流の50ヌクレオチド以内の核酸（nucleic）配列に対して相補的であるガイド配列を含む。提供される融合蛋白質のいずれかを特定の標的配列へと標的化ことにとって好適ないくつかの例示的なガイドRNA配列が本明細書において提供される。追加のガイド配列が、それらの座位を包含して下で表3に示されている。
【０２２１】
塩基編集因子効率
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかが有意な割合のインデルを作り出すことなしに特定のヌクレオチド塩基を改変することができるという認識に基づく。本明細書において用いられる「インデル」は核酸内のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を言う。かかる挿入または欠失は遺伝子のコード領域内のフレームシフト変異に至り得る。いくつかの態様では、核酸上に多数の挿入または欠失（すなわちインデル）を作り出すことなしに、核酸中の特定のヌクレオチドを効率的に改変する（例えば、変異させるかまたは脱アミノ化する）塩基編集因子を作り出すことが望ましい。ある種の態様では、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかは、インデルに対してより多大な割合の意図される改変（例えば点変異または脱アミノ化）を作り出すことができる。いくつかの態様では、本明細書において提供される塩基編集因子は、1：1よりも多大である意図される点変異対インデルの比を作り出すことができる。いくつかの態様では、本明細書において提供される塩基編集因子は、少なくとも1.5：1、少なくとも2：1、少なくとも2.5：1、少なくとも3：1、少なくとも3.5：1、少なくとも4：1、少なくとも4.5：1、少なくとも5：1、少なくとも5.5：1、少なくとも6：1、少なくとも6.5：1、少なくとも7：1、少なくとも7.5：1、少なくとも8：1、少なくとも10：1、少なくとも12：1、少なくとも15：1、少なくとも20：1、少なくとも25：1、少なくとも30：1、少なくとも40：1、少なくとも50：1、少なくとも100：1、少なくとも200：1、少なくとも300：1、少なくとも400：1、少なくとも500：1、少なくとも600：1、少なくとも700：1、少なくとも800：1、少なくとも900：1、または少なくとも1000：1、またはより多くである、意図される点変異対インデルの比を作り出すことができる。意図される変異およびインデルの数は、いずれかの好適な方法、例えば下の実施例で用いられる方法を用いて決定され得る。いくつかの態様では、インデル頻度を計算するためには、インデルが存在し得るウインドウの両側をフランキングする2つの10bp配列に対する厳密なマッチについて、シーケンシングリードがスキャンされる。厳密なマッチが見つからない場合には、リードは分析から除外される。このインデルウインドウの長さが厳密に参照配列にマッチするばあいには、リードはインデルを含有しないと分類される。インデルウインドウが参照配列よりも2塩基以上長いかまたは短い場合には、シーケンシングリードはそれぞれ挿入または欠失として分類される。
【０２２２】
いくつかの態様では、本明細書において提供される塩基編集因子は核酸のある領域におけるインデルの形成を限定することができる。いくつかの態様では、領域は、塩基編集因子によって標的化されるヌクレオチド、または塩基編集因子によって標的化されるヌクレオチドから2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド以内の領域である。いくつかの態様では、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかは、核酸のある領域におけるインデルの形成を1%未満、1.5%未満、2%未満、2.5%未満、3%未満、3.5%未満、4%未満、4.5%未満、5%未満、6%未満、7%未満、8%未満、9%未満、10%未満、12%未満、15%未満、または20%未満に限定することができる。ある核酸領域に形成されるインデルの数は、核酸（例えば細胞のゲノム内の核酸）が塩基編集因子に暴露される時間の量に依存し得る。いくつかの態様では、インデルの数または割合は、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも7日、少なくとも10日、または少なくとも14日の核酸（例えば細胞のゲノム中の核酸）を塩基編集因子に暴露することの後に決定される。
【０２２３】
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかが、有意な数の意図されない変異、例えば意図されない点変異を作り出すことなしに、核酸（例えば対象のゲノム内の核酸）上に点変異などの意図される変異を効率的に作り出すことができるという認識に基づく。いくつかの態様では、意図される変異は、意図される変異を作り出すように特異的に設計されたgRNAに結合した特異的な塩基編集因子によって作り出される変異である。いくつかの態様では、意図される変異は疾患または異常に関連する変異である。いくつかの態様では、意図される変異は疾患または異常に関連するアデニン（A）→グアニン（G）点変異である。いくつかの態様では、意図される変異は疾患または異常に関連するチミン（T）→シトシン（C）点変異である。いくつかの態様では、意図される変異は遺伝子のコード領域内のアデニン（A）→グアニン（G）点変異である。いくつかの態様では、意図される変異は遺伝子のコード領域内のチミン（T）→シトシン（C）点変異である。いくつかの態様では、意図される変異は、終止コドン、例えば遺伝子のコード領域内の未成熟終止コドンを作り出す点変異である。いくつかの態様では、意図される変異は終止コドンを削除する変異である。いくつかの態様では、意図される変異は遺伝子のスプライシングを変える変異である。いくつかの態様では、意図される変異は遺伝子の制御配列（例えば遺伝子プロモーターまたは遺伝子リプレッサー）を変える変異である。いくつかの態様では、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかは、1:1よりも多大である意図される変異対意図されない変異（例えば意図される点変異:意図されない点変異）の比を作り出すことができる。いくつかの態様では、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかは、少なくとも1.5：1、少なくとも2：1、少なくとも2.5：1、少なくとも3：1、少なくとも3.5：1、少なくとも4：1、少なくとも4.5：1、少なくとも5：1、少なくとも5.5：1、少なくとも6：1、少なくとも6.5：1、少なくとも7：1、少なくとも7.5：1、少なくとも8：1、少なくとも10：1、少なくとも12：1、少なくとも15：1、少なくとも20：1、少なくとも25：1、少なくとも30：1、少なくとも40：1、少なくとも50：1、少なくとも100：1、少なくとも150：1、少なくとも200：1、少なくとも250：1、少なくとも500：1、または少なくとも1000：1、またはより多くである、意図される変異対意図されない変異（例えば意図される点変異:意図されない点変異）の比を作り出すことができる。本明細書の「塩基編集因子効率」セクションに記載されている塩基編集因子の特徴は、本明細書において提供される融合蛋白質または融合蛋白質を用いる方法のいずれかに適用され得るということは了解されるはずである。
【０２２４】
核酸を編集するための方法
本開示のいくつかの側面は核酸を編集するための方法を提供する。いくつかの態様では、方法は核酸の核酸塩基（例えば、二本鎖DNA配列の塩基対）を編集する方法である。いくつかの態様では、方法は、a）塩基編集因子（例えば、アデノシンデアミナーゼに融合したCas9ドメイン）およびガイド核酸（例えばgRNA）を含む複合体と核酸（例えば二本鎖DNA配列）の標的領域を接触させ、標的領域は標的化された核酸塩基対を含むステップと、b）前記標的領域の鎖分離を誘導するステップと、c）標的領域の一本鎖上の前記標的核酸塩基対の第1の核酸塩基を第2の核酸塩基に変換するステップと、d）前記標的領域の1つの鎖しか切らないステップとを含み、ここで、第1の核酸塩基の塩基に対して相補的な第3の核酸塩基は第2の核酸塩基に対して相補的な第4の核酸塩基によって置き換えられる。いくつかの態様では、方法は核酸上の20%未満のインデル形成をもたらす。いくつかの態様では、ステップbは省かれるということは了解されるはずである。いくつかの態様では、第1の核酸塩基はアデニンである。いくつかの態様では、第2の核酸塩基は脱アミノ化されたアデニン、またはイノシンである。いくつかの態様では、第3の核酸塩基はチミンである。いくつかの態様では、第4の核酸塩基はシトシンである。いくつかの態様では、方法は19%未満、18%、16%、14%、12%、10%、8%、6%、4%、2%、1%、0.5%、0.2%、または0.1%未満のインデル形成をもたらす。いくつかの態様では、方法は、さらに、第4の核酸塩基に対して相補的である第5の核酸塩基によって第2の核酸塩基を置き換えることを含み、それによって、意図される編集された塩基対（例えばA：T→G：C）を作り出す。いくつかの態様では、第5の核酸塩基はグアニンである。いくつかの態様では、意図される塩基対の少なくとも5%が編集される。いくつかの態様では、意図される塩基対の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%が編集される。
【０２２５】
いくつかの態様では、標的ヌクレオチド上の意図される産物対意図されない産物の比は少なくとも2：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1、90：1、100：1、もしくは200：1、またはより多くである。いくつかの態様では、意図される点変異対インデル形成の比は1：1、10：1、50：1、100：1、500：1、もしくは1000：1よりも多大、またはより多くである。いくつかの態様では、切られる一本鎖（ニックが入る鎖）はガイド核酸にハイブリダイゼーションさせられる。いくつかの態様では、切られる一本鎖は第1の核酸塩基を含む鎖の反対側である。いくつかの態様では、塩基編集因子はCas9ドメインを含む。いくつかの態様では、第1の塩基はアデニンであり、第2の塩基はG、C、A、またはTではない。いくつかの態様では、第2の塩基はイノシンである。いくつかの態様では、第1の塩基はアデニンである。いくつかの態様では、第2の塩基はG、C、A、またはTではない。いくつかの態様では、第2の塩基はイノシンである。いくつかの態様では、塩基編集因子は編集される鎖の塩基除去修復を阻害する。いくつかの態様では、塩基編集因子は編集されない鎖を保護するかまたは結合する。いくつかの態様では、塩基編集因子はUGI活性を含む。いくつかの態様では、塩基編集因子は触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼを含む。いくつかの態様では、塩基編集因子はニッカーゼ活性を含む。いくつかの態様では、意図される編集される塩基対はPAM部位の上流である。いくつかの態様では、意図される編集される塩基対はPAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド上流である。いくつかの態様では、意図される編集される塩基対はPAM部位の下流である。いくつかの態様では、意図される編集される塩基対はPAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド下流（downstream stream）である。いくつかの態様では、方法は古典的（例えばNGG）PAM部位を要求しない。いくつかの態様では、核酸塩基編集因子はリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは長さが1〜25アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーは長さが5〜20アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーは長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸である。いくつかの態様では、標的領域は標的ウインドウを含み、標的ウインドウは標的核酸塩基対を含む。いくつかの態様では、標的ウインドウは1〜10ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、標的ウインドウは長さが1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、または1ヌクレオチドである。いくつかの態様では、標的ウインドウは長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである。いくつかの態様では、意図される編集される塩基対は標的ウインドウ内にある。いくつかの態様では、標的ウインドウは意図される編集される塩基対を含む。いくつかの態様では、方法は本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかを用いて行われる。いくつかの態様では、標的ウインドウは脱アミノ化ウインドウである。
【０２２６】
いくつかの態様では、本開示はヌクレオチドを編集するための方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は二本鎖DNA配列の核酸塩基対を編集する方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、a）二本鎖DNA配列の標的領域を塩基編集因子およびガイド核酸（例えばgRNA）を含む複合体と接触させ、ここで標的領域は標的核酸塩基対を含むこと、b）前記標的領域の鎖分離を誘導すること、c）標的領域の一本鎖上の前記標的核酸塩基対の第1の核酸塩基を第2の核酸塩基に変換すること、d）前記標的領域の1つの鎖しか切らないことを含み、第1の核酸塩基の塩基に対して相補的な第3の核酸塩基は第2の核酸塩基に対して相補的な第4の核酸塩基によって置き換えられ、第2の核酸塩基は第4の核酸塩基に対して相補的である第5の核酸塩基によって置き換えられ、それによって意図される編集された塩基対を作り出し、意図される編集された塩基対を作り出す効率は少なくとも5%である。いくつかの態様では、ステップbは省かれるということは了解されるはずである。いくつかの態様では、意図される塩基対の少なくとも5%が編集される。いくつかの態様では、意図される塩基対の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%が編集される。いくつかの態様では、方法は、19%未満、18%、16%、14%、12%、10%、8%、6%、4%、2%、1%、0.5%、0.2%、または0.1%未満のインデル形成を引き起こす。いくつかの態様では、標的ヌクレオチドにおける意図される産物対意図されない産物の比は、少なくとも2：1、5：1、10：1、20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1、80：1、90：1、100：1、もしくは200：1、またはより多くである。いくつかの態様では、意図される点変異対インデル形成の比は、1：1、10：1、50：1、100：1、500：1、もしくは1000：1、またはより多くよりも多大である。いくつかの態様では、切られる一本鎖はガイド核酸にハイブリダイゼーションさせられる。いくつかの態様では、切られる一本鎖は第1の核酸塩基を含む鎖の反対側である。いくつかの態様では、第1の塩基はアデニンである。いくつかの態様では、第2の核酸塩基はG、C、A、またはTではない。いくつかの態様では、第2の塩基はイノシンである。いくつかの態様では、塩基編集因子は編集される鎖の塩基除去修復を阻害する。いくつかの態様では、塩基編集因子は編集されない鎖を（例えば塩基除去修復から（form））保護するかまたは結合する。いくつかの態様では、核酸塩基編集因子はUGI活性を含む。いくつかの態様では、塩基編集因子は触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼを含む。いくつかの態様では、核酸塩基編集因子はニッカーゼ活性を含む。いくつかの態様では、意図される編集される塩基対はPAM部位の上流である。いくつかの態様では、意図される編集される塩基対はPAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド上流である。いくつかの態様では、意図される編集される塩基対はPAM部位の下流である。いくつかの態様では、意図される編集される塩基対はPAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド下流（downstream stream）である。いくつかの態様では、方法は古典的（例えばNGG）PAM部位を要求しない。いくつかの態様では、核酸塩基編集因子はリンカーを含む��いくつかの態様では、リンカーは長さが1〜25アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーは長さが5〜20アミノ酸である。いくつかの態様では、リンカーは長さが10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸である。いくつかの態様では、標的領域は標的ウインドウを含み、標的ウインドウは標的核酸塩基対を含む。いくつかの態様では、標的ウインドウは1〜10ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、標的ウインドウは長さが1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、または1ヌクレオチドである。いくつかの態様では、標的ウインドウは長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドである。いくつかの態様では、意図される編集される塩基対は標的ウインドウ内に存在する。いくつかの態様では、標的ウインドウは意図される編集される塩基対を含む。いくつかの態様では、核酸塩基編集因子は本明細書において提供される塩基編集因子のいずれか1つである。
【０２２７】
医薬組成物
本開示の他の側面は、本明細書に記載されるアデノシンデアミナーゼ、融合蛋白質、または融合蛋白質−gRNA複合体のいずれかを含む医薬組成物に関する。本明細書において用いられる用語「医薬組成物」は医薬使用のために製剤される組成物を言う。いくつかの態様では、医薬組成物は薬学的に許容し得る担体をさらに含む。いくつかの態様では、医薬組成物は追加の薬剤を含む（例えば、特異的送達のため、半減期を増大させる、または他の治療的な化合物）。
【０２２８】
ここで用いられる用語「薬学的に許容し得る担体」は、体の1つの部位（例えば送達部位）から別の部位（例えば、体の臓器、組織、または部分）に化合物を運搬または輸送することに関わる、薬学的に許容し得る材料、組成物、または基剤、例えば液体または固体のフィラー、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、またはステアリン酸（steric acid））、または溶媒封入材料を意味する。薬学的に許容し得る担体は、製剤の他の成分と適合性でありかつ対象の組織にとって有害でないという意味で「受け入れられる」（例えば、生理学的に適合性、無菌、生理的なpHなど）。薬学的に許容し得る担体としての用をなし得る材料のいくつかの例は：（1）糖、例えばラクトース、グルコース、およびスクロース；（2）澱粉、例えばコーンスターチおよび馬鈴薯澱粉；（3）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、および酢酸セルロース；（4）粉末化トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク；（8）賦形剤、例えばココアバターおよび座薬ワックス；（9）油、例えばピーナッツオイル、綿実油、サフラワー油、ごま油、オリーブ油、コーン油、および大豆油；（10）グリコール、例えばプロピレングリコール；（11）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（PEG）；（12）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（13）寒天；（14）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（15）アルギン酸；（16）パイロジェン不含水；（17）等張食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ酸無水物；（22）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸；（23）血清コンポーネント、例えば血清アルブミン、HDL、およびLDL；（22）Ｃ２−Ｃ１２アルコール、例えばエタノール；ならびに（23）医薬製剤に使用される他の非毒性の適合性の物質を包含する。湿潤剤、着色料、離型剤、コーティング剤、甘味料、フレーバー剤、香料、保存料、および抗酸化剤もまた製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容し得る担体」、または同類などの用語は本明細書において交換可能に用いられる。
【０２２９】
いくつかの態様では、医薬組成物は、対象への送達のために、例えば遺伝子編集のために製剤される。本明細書に記載される医薬組成物を投与する好適な経路は、限定なしに：外用、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、経鼓室、臓器内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静注、血管内、骨内、眼周辺、腫瘍内、脳内、および脳室内投与を包含する。
【０２３０】
いくつかの態様では、本明細書に記載される医薬組成物は有疾患部位（例えば腫瘍部位）に局所投与される。いくつかの態様では、本明細書に記載される医薬組成は、注射によって、カテーテルの手段によって、座薬の手段によって、またはインプラントの手段によって対象に投与され、インプラントは多孔質、非多孔質、またはゼラチン質材料であり、膜、例えばシラスティック（sialastic）膜、またはファイバーを包含する。
【０２３１】
他の態様では、本明細書に記載される医薬組成物はコントロールされた放出システムによって送達される。1つの態様では、ポンプが用いられ得る（例えば、Langer, 1990, Science 249: 1527-1533；Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201；Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574を見よ）。別の態様では、ポリマー材料が用いられ得る（例えば、Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984)；Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61を見よ。Levy et al., 1985, Science 228: 190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105をもまた見よ）。他のコントロールされた放出システムは例えば上記Langerにおいて論じられている。
【０２３２】
いくつかの態様では、医薬組成物は、慣例的な手続きに従って、対象、例えばヒトへの静注または皮下投与に適応した組成物として製剤される。いくつかの態様では、注射による投与のための医薬組成物は無菌の等張水系緩衝液中の溶液である。必要なところでは、医薬は、可溶化剤、および注射の部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔をもまた包含し得る。一般的に、成分は、例えば、活性な薬剤の数量を指示するアンプルまたはサシェットなどの気密容器中の乾燥した凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、別々に、またはユニット剤形中で一緒に混合されてどちらかで供給される。医薬が輸液によって投与されるべきところでは、それは無菌の医薬グレードの水または食塩水を含有する輸液ボトルによって配液され得る。医薬組成物が注射によって投与されるところでは、成分が投与に先立って混合され得るように、無菌の注射のための水または食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２３３】
全身投与のための医薬組成物は、液体、例えば無菌食塩水、乳酸加リンゲル液、またはハンクス液であり得る。加えて、医薬組成物は固体形態であり得、使用に直ちに先立って再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた企図される。
【０２３４】
医薬組成物は、脂質粒子またはベシクル、例えばリポソームまたはマイクロ結晶内に含有され得、これもまた非経口投与にとって好適である。組成物がその中に含有される限り、粒子は単層ラメラまたは複層ラメラなどのいずれかの好適な構造であり得る。化合物は、膜融合性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、低いレベル（5-10mol%）のカチオン性脂質を含有し、かつポリエチレングリコール（PEG）コーティングによって安定化された、「安定化されたプラスミド−脂質粒子」（SPLP）中に捕捉され得る（Zhang Y. P. et al, Gene Ther. 1999, 6: 1438-47）。正荷電脂質、例えばN−［1−（2，3−ジオレオイルオキシ）プロピル］−N，N，N−トリメチル−アンモニウム（amonium）メチルサルフェートまたは「DOTAP」が、かかる粒子およびベシクルにとって特に好ましい。かかる脂質粒子の調製は周知である。例えばU.S.特許No.4,880,635；4,906,477；4,911,928；4,917,951；4,920,016；および4,921,757を見よ；これらのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２３５】
本明細書に記載される医薬組成物は例えばユニットドーズとして投与またはパッケージングされ得る。本開示の医薬組成物を参照して用いられるときに、用語「ユニットドーズ」は、対象のための単位的な用量として好適な物理的に個別になったユニットを言い、各ユニットは、要求される希釈剤；すなわち担体または基剤と結びつけられた、所望の治療効果を産生するように計算された予め決定された数量の活性材料を含有する。
【０２３６】
さらに、医薬組成物は、（a）本発明の化合物を凍結乾燥形態で含有する容器と（b）注射のための薬学的に許容し得る希釈剤（例えば滅菌水）を含有する第2の容器とを含む医薬キットとして提供され得る。薬学的に許容し得る希釈剤は本発明の凍結乾燥化合物の水戻しまたは希釈のために用いられ得る。任意に、かかる容器（単数または複数）には、医薬または生物学的産物の製造、使用、または販売を規制する政府当局によって定められた形態の注意書きが結びつけられ得、この注意書きはヒト投与のための製造、使用、または販売の当局による認可を反映する。
【０２３７】
別の側面では、上に記載されている疾患の処置にとって有用な材料を含有する製造品が包含される。いくつかの態様では、製造品は容器およびラベルを含む。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を包含する。容器はガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。いくつかの態様では、容器は、本明細書に記載される疾患を処置するために有効である組成物を内包し、無菌のアクセスポートを有し得る。例えば、容器は、皮下注射針によって刺通可能なストッパーを有する静注溶液バッグまたはバイアルであり得る。組成物中の活性な薬剤は本発明の化合物である。いくつかの態様では、容器上のまたは結びつけられたラベルは、組成物が選ばれた疾患を処置するために用いられるということを指示する。製造品は、さらに、薬学的に許容し得る緩衝剤、例えばリン酸緩衝食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液を含む第2の容器を含み得る。それは、商業のおよび使用者の立場から望ましい他の材料をさらに包含し得、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用の説明書を有するパッケージインサートを包含する。
【０２３８】
キット、ベクター、細胞
本開示のいくつかの側面はキットを提供し、デオキシリボ核酸（DNA）分子上のアデノシンを脱アミノ化することができるアデノシンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む。いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかをコードする。いくつかの態様では、ヌクレオチド配列はアデノシンデアミナーゼの発現を駆動する異種プロモーターを含む。
【０２３９】
本開示のいくつかの側面はキットを提供し、（a）本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼに融合したnapDNAbp（例えばCas9ドメイン）、またはnapDNAbp（例えばCas9ドメイン）およびアデノシンデアミナーゼを含む融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列と；（b）（a）の配列の発現を駆動する異種プロモーターとを含む核酸コンストラクトを含む。いくつかの態様では、キットはさらにガイド核酸バックボーン（例えばガイドRNAバックボーン）をコードする発現コンストラクトを含み、コンストラクトは、ガイド核酸（例えばガイドRNAバックボーン）上への標的配列と同一のまたは相補的な核酸配列のクローニングを許すように位置したクローニング部位を含む。
【０２４０】
本開示のいくつかの側面は細胞を提供し、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼ、融合蛋白質、または複合体のいずれかを含む。いくつかの態様では、細胞は、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼまたは融合蛋白質のいずれかをコードするヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、細胞は本明細書において提供されるヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む。
【０２４１】
上のレポーターシステムの例示的な態様の記載は例解目的のためのみに提供されており、限定していることを意味されていない。追加のレポーターシステム、例えば上で詳細に記載されている例示的なシステムの変形もまた本開示によって包摂される。
【０２４２】
しかしながら、本開示および当分野の知識に基づいて、追加の融合蛋白質が当業者には明らかであろうということは了解されるはずである。
【０２４３】
本発明のこれらのおよび他の態様の機能および利点は下の実施例からより詳しく理解されるであろう。次の実施例は本発明の利益を例解することおよび特定の態様を記載することを意図されているが、本発明の全範囲を例示することは意図されていない。従って、実施例は本発明の範囲を限定することを意味されていないということは理解されるであろう。
【実施例】
【０２４４】
下の例において提供されるデータは、DNAのコンテキストにおいてアデノシンを加水分解的な脱アミノ化（イノシンを形成し、これはグアニン（G）のように塩基対形成する）を触媒することができる塩基編集因子の操作を記載する。DNAに作用するいかなる公知の天然に存在するアデノシンデアミナーゼもない。代わりに、公知のアデノシンデアミナーゼはRNA（例えばtRNAまたはmRNA）に作用する。DNA基質を受け入れデオキシアデノシン（dA）をデオキシイノシンへと脱アミノ化するように、第1のデオキシアデノシンデアミナーゼを進化させた。1つの例として、DNAに作用するアデノシンデアミナーゼを操作するために、Escherichia coliからのtRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ（ADAT）（tRNAアデノシンデアミナーゼAから、TadA）を用いて進化実験を行った。簡潔には、ecTadAを共有結合的にdCas9ドメインに融合させ、コンストラクトのデアミナーゼ部分に変異を含有するこの融合体のライブラリをアセンブリした。下に記載される進化実験では、ecTadAのいくつかの変異はecTadAがDNA上のアデノシンを脱アミノ化する能力を改善することが見いだされた。ここでは、細菌およびヒト細胞におけるA・TからG・C塩基対へのプログラム可能な変換を媒介するアデニン塩基編集因子（ABE）の指向的進化、操作、およびキャラクタリゼーションを報告する。実際に、公知の病原性の一ヌクレオチド多型のおよそ半分はC・G→T・Aトランジションである。ゆえに、プログラム可能で効率的でかつ正確な様式でA・T塩基対をG・C塩基対に変換する能力は、遺伝子疾患を研究および処置するための作業を実質的に前進させ得る。ABE効率および配列一般性を最大化するための鋭意の進化および操作はABE7.10などの第7世代アデニン塩基編集因子をもたらした。これらは、非常に高い産物純度（典型的には＞99%）かつ無処置の細胞のものに匹敵する非常に低いインデル率（典型的には≦0.1%）で、標的A・TをG・C塩基対に効率的に変換する（ヒト細胞の17個のゲノム部位において平均で53%となる）。次の例では、ABE7バリアントが現行のCas9ヌクレアーゼによって媒介されるHDR法よりも効率的にかつクリーンに点変異を導入し、Cas9ヌクレアーゼよりも少ないオフターゲットゲノム改変を誘導し、培養ヒト細胞において疾患関連SNPを修正するためおよび疾患抑圧SNPを導入するため両方に用いられ得るということが示される。
【０２４５】
それぞれシトシンおよび5−メチルシトシンの自然発生的な加水分解的脱アミノ化からのウラシルおよびチミンの形成は1,2、ヒトにおいては1日あたり細胞あたり推定上100〜500回起こり1、全ての公知の病原性SNPのおよそ半分を占めるC・G→T・A変異をもたらし得る（図1A）。ゆえに、未改変の細胞のゲノムDNA上の標的座位においてA・T塩基対をG・C塩基対に変換する能力は、疾患に関連するヒトSNPの実質的な画分の修正を可能にし得る。
【０２４６】
塩基編集はゲノム編集のある形態であり、これは、二本鎖DNA切断（DSB）、相同組換え修復（HDR）プロセス、またはドナーDNA鋳型を要求することなしに、標的ゲノム座位における1つの塩基対から別のものへの直接的な不可逆的変換を可能にする3-5。点変異を導入するための標準的なゲノム編集法と比較して、塩基編集はより効率的に進み得6、ずっと少数の望まれない産物、例えば確率的な挿入もしくは欠失（インデル）または転座を有する4,6-8。
【０２４７】
最も頻繁に用いられる塩基編集因子は第3世代設計（BE3）であり、これらは、（i）DSBを作り得ない触媒的に障害されたCRISPR−Cas9変異体、（ii）Cas9によって作出される一本鎖DNAバブル上の小さいウインドウ（約5ヌクレオチド）内のCをウラシル（U）に変換する一本鎖特異的シチジンデアミナーゼ、（iii）塩基編集効率および産物純度を減少させるウラシル切り出しおよび下流のプロセスを妨げるウラシルグリコシラーゼ阻害因子（UGI）9、ならびに（iv）編集されないDNA鎖にニックを入れ、G含有DNA鎖を置き換えるための細胞性のミスマッチ修復を導くニッカーゼ活性6,9からなる。一緒になって、これらのコンポーネントは効率的かつ永久的なC・G→T・A塩基対変換を細菌、酵母4,10、植物11,12、ゼブラフィッシュ13、哺乳類細胞14,15、マウス16,17、およびさらにはヒト胚18,19において可能にする。塩基編集の可能性は、異なるプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）適合性7、狭まった編集ウインドウ7、向上したDNA特異性8、および低分子依存性20を有する塩基編集因子の開発によって拡大した。第4世代塩基編集因子（BE4およびBE4−Gam）はさらにC・G→T・A編集効率および産物純度を改善する9。
【０２４８】
今まで、全ての報告された塩基編集因子はC・G→T・A変換を媒介する。本研究では、蛋白質進化および操作を用いて、細菌およびヒト細胞においてDNA上のA・TをG・C塩基対に変換するアデニン塩基編集因子（ABE）の新たなクラスを開発した。ABE7.10などの第7世代ABE（図7）は、約50%という典型的な効率でかつ非常に高い程度の産物純度（＞99%）で、ヒト細胞の幅広い範囲の標的ゲノム座位においてA・TをG・Cに変換し、BE3の典型的な性能特徴を超える。ABEは塩基編集の範囲を多大に拡大し、以前に記載されている塩基編集因子と一緒になって、生細胞のゲノム上における全ての4つのトランジション変異（C→T、A→G、T→C、およびG→A）のプログラム可能なインストールを可能にする。
【０２４９】
例1−DNAに対して作動するアデニンデアミナーゼの進化
アデノシンの加水分解的な脱アミノ化はイノシンを生み出す（図1B）。ポリメラーゼ活性部位の制約内では、イノシンはCと最も安定に対形成し、ゆえにGとして読まれるかまたは複製される21。既存の塩基編集因子のシチジンデアミナーゼドメインをアデニンデアミナーゼによって置き換えることは、理論上はABEを提供し得るが（図1C）、いかなる酵素もDNA上のアデニンを脱アミノ化することは公知でない。アデニンデアミナーゼの全ての報告された例は、遊離のアデニン、遊離のアデノシン、RNA上のもしくは誤対合したRNA:DNAヘテロ二重鎖上のアデノシンをプロセシングするか22、または奇妙なことに一本鎖DNA上のC→U形成を触媒するが23、本作業は、始めに、E. coli TadA24-26、ヒトADAR27,28、マウスADA29、およびヒトADAT230,31を包含する天然のアデニンデアミナーゼによってBE3のAPOBEC1コンポーネントを置き換えて（補足の配列1）、一本鎖DNAの高い有効モル濃度がDNAに対するそれらの不良な活性を克服し得るという見込みを試験した。残念ながら、これらのアデニンデアミナーゼ−Cas9 D10Aニッカーゼ融合体をコードするプラスミドDNAコンストラクトを対応するシングルガイドRNA（sgRNA）と一緒にHEK293T細胞にトランスフェクションしたときには、無処置の細胞のものよりも上のいかなる有意なA・T→G・C編集も観察されなかった（図8A）。これらの結果は、試験された天然のアデニンデアミナーゼ酵素がDNAをプロセシングする能力がないことが、ABEへのそれらの直接的な使用を不可能にするということを示唆している。
【０２５０】
これらの結果から、天然に存在するRNAアデニンデアミナーゼから出発して、基質としてDNAを受け入れるアデニンデアミナーゼバリアントを進化させることを目指した。クリティカルな位置に点変異を含有する抗生物質耐性遺伝子を作出することによって、塩基編集のための細菌セレクションを開発した（表8および補足の配列2）。塩基編集因子によるこれらの変異の復帰は、抗生物質の存在下における細菌生残を可能にする。セレクションを検証するために、BE26（dCas9およびUGIに融合したAPOBEC1シチジンデアミナーゼ）の細菌コドン最適化されたバージョンを用いた。なぜなら、細菌は、BE3によるより効率的な塩基編集を可能にするニック主導型のミスマッチ修復機構を欠くからである32。標的変異の選び方、プロモーター強さ、セレクションプラスミドコピー数、インキュベーション時間、および抗生物質セレクションストリンジェンシーを最適化した後に、BE2と塩基編集を不活性化変異へと導くようにプログラムされたsgRNAとによって、触媒残基にA・T→G・C変異（H193R）を含有する欠陥があるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CamR）の首尾良いレスキューが観察され、1μg/mLから32μg/mLへのクロラムフェニコール最小阻害濃度（MIC）増大をもたらした。DNAシーケンシングは、セレクションから生残した細菌細胞は、CamR機能を復元するC・G→T・A変異を含有するということを確認した。
【０２５１】
次に、CamR遺伝子にC・G→T・A変異を導入し、1μg/mLクロラムフェニコールというMICを授けるH193Y置換を作出することによって、セレクションプラスミドをABE活性に適応させた（表8および補足の配列2）。H193Y変異におけるA・T→G・C変換はクロラムフェニコール耐性を復元するはずであり、それによって、クロラムフェニコールの存在下における細菌生残にABE活性を連結する。
【０２５２】
以前に記載されている塩基編集因子6-9は、一本鎖DNAに対して作動および二本鎖DNAを拒否するシチジンデアミナーゼ酵素の使用を活用している。この一本鎖DNA要件は、Cas9によって作出される一本鎖バブル内のヌクレオチドの小さいウインドウにデアミナーゼ活性をフォーカスし、標的ヌクレオチド（単数または複数）以外における望まれない脱アミノ化事象を最小化するためにクリティカルである。TadAはtRNAアデニンデアミナーゼであり24、これはtRNAArgの一本鎖アンチコドンループ上のアデニンをイノシン（I）に変換する。E. coli TadAは元々の塩基編集因子に用いられているAPOBECファミリーの酵素と相同性を共有しており33、構造研究は、いくつかのABOBECはTadAに結合したtRNAのものに似た立体配座で一本鎖DNAに結合するということを明らかにした33。TadAは（ADARとは対照的に34）低分子活性化因子を要求せず、（ADAとは違って29）ポリ核酸に作用する。これらの考察に基づいて、DNAアデニンデアミナーゼを進化させるための作業の出発点として、E. coli TadAを選んだ。
【０２５３】
編集因子のCas9部分の好都合な特性を変えることを避けるために、コンストラクトのアデニンデアミナーゼ部分のみに変異を含有するecTadA−dCas9融合体のバイアスのないプラスミドライブラリを作出した。もたらされたプラスミドライブラリをCamR H193Yセレクションを持つE. coliに形質転換し、約5.0×106個の形質転換体を2から16μg/mLクロラムフェニコールを含有する培地にプレーティングした（図2A）。生残コロニーはTadA変異A106VおよびD108Nについて強く濃縮されていた（図2B）。tRNAArgと複合体化した構造が報告されているホモログS. aureus TadA35との進化したE. coli TadAの配列アラインメントは、D108の側鎖が基質アデノシンの直ちに上流のウリジンヌクレオチドのリボースの2'−OH基との水素結合を作るということを予測している（図2C）。D108の変異は蓋然的にはこの水素結合を廃し、それによって、基質結合部位にDNAを受け入れるエネルギー的な機会費用を減少させる。DNAシーケンシングは、セレクションから生残した全ての細菌クローンがCamR上の標的化部位における実質的なA・T→G・C復帰を示すということを確認した。まとめると、これらの結果は、TadA D108のまたはそれの近くの変異が、TadAがDNA基質に対するアデニン脱アミノ化を行うことを可能にするということを指示している。
【０２５４】
TadAのA106VおよびD108N変異を哺乳類コドン最適化されたTadA−Cas9ニッカーゼ融合体コンストラクト上に組み込んだ。これは、所望の塩基編集アウトカムを支持するように細胞性のDNAミスマッチ修復を操作するために、細菌進化に用いたdCas9をBE3に用いたCas9 D10Aニッカーゼによって置き換え、かつC末端核局在シグナル（NLS）を追加する。もたらされたTadA＊−XTEN−nCas9−NLSコンストラクトをABE1.2と名付けた。ここで、TadA＊は進化したTadAバリアントにあたり、XTENはBE3に用いられている16アミノ酸リンカーである6。ABE1.2および6つのヒトゲノム部位を標的化するsgRNAを発現するプラスミドのトランスフェクションは（図3A）、非常に低いが観察可能なA→G編集効率（3.2±0.88%；別様に指摘されない限り、全ての編集効率はトランスフェクションされた細胞の濃縮なしの3つの生物学的レプリケートの平均±SDとして報告されている）を、ヒトゲノム上の6つの多様な標的部位において（図2A）、PAMを位置21〜23としてカウントしてプロトスペーサー位置5においてまたはそれの近くにおいて（図3B）もたらした。これらのデータは、低レベルのA・T→G・C変換を触媒することができるABEが蛋白質進化および操作の第1ラウンドから出現するということを確認した。
【０２５５】
例2−改善されたデアミナーゼバリアントおよびABEアーキテクチャ
進化の第2ラウンドによって、ABE1.2の編集効率を改善することを目指した。ABE1.2バリアントのバイアスのないライブラリを前の通り作り出し、もたらされたTadA＊1.2−dCas9変異体に、細菌内において、ラウンド1に用いたものより高濃度のクロラムフェニコール（16から128μg/mL）によって負荷をかけた（表7および8）。進化のこの第2ラウンドから、TadA上において基質に隣接するヘリックス上に在ると予測される2つの変異D147YおよびE155Vが同定された（図2C）。哺乳類細胞では、ABE2.1（ABE1.2＋D147Y＋E155V）は、試験された6つのゲノム部位においてABE1.2よりも2から7倍高い活性を見せ、平均で11±2.9%のA・T→G・C塩基編集をもたらした（図3B）。
【０２５６】
次に、追加の蛋白質操作によって、ABE2.1編集効率を改善することを目指した。TadA（2.1）＊ドメインをN末端の代わりにCas9ニッカーゼのC末端に融合することは、編集活性の完全な喪失をもたらし（図7および8B）、BE3による以前の知見と整合した6。TadA（2.1）＊およびCas9ニッカーゼの間のリンカー長さをもまた変えた。ABE2.1における元々の16残基XTENリンカーよりも2倍長いリンカー（32アミノ酸、(SGGS)2-XTEN-(SGGS)2）を有するABE2バリアント（ABE2.6）は、ABE2.1と比較してやや高い編集効率をオファーし、今や、試験された6つのゲノム座位において平均で14±2.4%となった（図7および8B）。
【０２５７】
ウラシルN−グリコシラーゼ（UNG）がDNAからのウラシルの取り除きを触媒および塩基除去修復を開始するメカニズムと類似に、アルキルアデニンDNAグリコシラーゼ（AAG）はDNA上のイノシンのグリコシド結合の切断を触媒する36,37。イノシン切り出しがABE性能を妨げるかどうかを試験するために、イノシン塩基除去修復（BER）の潜在的なソースを最小化するように設計されたABE2バリアントを作出した。AAGの公知の蛋白質阻害因子の不在から、内在性のAAGがイノシン中間体にアクセスすることをブロックすることを試みた。イノシン結合または取り除きに関わる酵素の触媒的に不活性化されたバージョン：ヒトAAG（E125Q変異によって不活性化されている38）またはE. coli EndoV（D35A変異によって不活性化されている39）を、ABE2.1のC末端に別々に融合することによった。ABE2.1−AAG（E125Q）（ABE2.2）もABE2.1−EndoV（D35A）（ABE2.3）も、HEK293T細胞においてABE2.1と比較して変えられたA・T→G・C編集効率を見せなかった（図7および8C）。実際に、野生型AAGを含有するHap1細胞と比較して、AAGを欠くHap1細胞にABE2.1を用いることは、塩基編集効率の増大、産物純度の増大、またはインデル頻度の減少をもたらさなかった（図8D）。その上、ABE2.1は試験された6つの座位において事実上いかなるインデル（≦0.1%）またはA・T→非G・C産物（≦0.1%）も誘導せず、イノシン中間体の非効率的な切り出しと整合した（図11Aから11B）。一緒にすると、これらの観察は、ABEによって作出されるイノシン中間体の細胞性の修復が非効率的であるということを強く示唆しており、BERなどのプロセスを損壊する必要を無用にする。この状況は、塩基編集効率および産物純度を最大化ならびにインデル形成を抑圧するためにはウラシル切り出しを阻害することに強く依存するBE3およびBE4のものとは対照的である6,9。
【０２５８】
最後のABE2操作の研究として、ヒト細胞の塩基編集効率におけるTadA＊二量体化状態の役割を検討した。その自然の形態では、TadAはホモ二量体として作動し、1つの単量体はA→I脱アミノ化を触媒し、別の単量体はtRNA基質のドッキングステーションとして作用する40。E. coliにおけるセレクションの間には、内在性のTadAが非触媒性の単量体としての用をなすということが推測される。哺乳類細胞では、追加の野生型のまたは進化したTadA単量体をテザリングすることは、分子間ABE二量体化への依拠を最小化することによって編集効率を改善し得るということが仮想される。実際に、ABE2.1と野生型TadAまたはTadA＊2.1どちらかを共発現してトランスでABE2.1：TadAまたはABE2.1：TadA＊2.1二量体形成を促進すること（それぞれABE2.7およびABE2.8）、ならびにABE2.1のN末端への進化したまたは野生型どちらかのTadAの直接的な融合（それぞれABE2.9およびABE2.10）は、編集効率を実質的に改善した（図3B、7、および10A）。融合したTadA−ABE2.1アーキテクチャ（ABE2.9）は最も高い編集効率をオファーすることが同定され（6つのゲノム座位において平均で20±3.8%となり、かつ各部位においてABE1.2から7.6±2.6倍の平均の改善）、全ての爾後の実験に用いた（図2Bおよび3B）。2つの野生型TadAドメインを含有しかついかなる進化したTadA＊ドメインも含有しないコントロールABEバリアントは、試験された6つのゲノム部位におけるA・T→G・C編集をもたらさず（図10A）、二量体化単独はABE活性を媒介するには不十分であるということを確認した。
【０２５９】
これらの結果はABE編集効率の重要なコンポーネントとしてのTadA二量体化の関与を示したので、TadA−ABE2融合体中の2つのTadAサブユニットのどれがA→I触媒作用を担うのかを決定した。不活性化E59A変異24をABE2.9のN末端のまたは内側のTadA単量体どちらかに導入し、それぞれABE2.11またはABE2.12を作り出した。不活性化されたN末端TadAサブユニットを有するバリアント（ABE2.11）はABE2に匹敵する編集効率を実証したが、不活性化された内側のTadAサブユニットを有するバリアントは全ての編集活性を失った（図7および10A）。これらの結果は、内側のTadAサブユニットがA→I触媒作用を担っているということを立証している。
【０２６０】
例3−標的のサブセットを効率的に編集するABE
次に、A・T→G・C編集効率をさらに増大させるために、TadA＊2.1−dCas9（内在性のE. coli TadAとのまたはそれ自体とのトランスの二量体化に依拠する）から出発して、細菌進化の第3ラウンドを行った。2つの早期終止コドン（Q4stopおよびW15stop）をカナマイシン耐性遺伝子（KanR，アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ，表8および補足の配列2）に導入することによって、セレクションのストリンジェンシーを増大させた。未成熟終止コドンを修正するためには、変異のそれぞれはA・T→G・C復帰を要求する。進化ラウンド3セレクションプラスミドを持つホスト細胞のMICは約8μg/mLカナマイシンであった。カナマイシン耐性を復元するためには、同じプラスミド上の両方のKanR変異の塩基編集が要求される（表8）。TadAドメインに変異を含有するTadA＊2.1−dCas9バリアントのライブラリを16から128μg/mLのカナマイシンの存在下においてこのより高ストリンジェンシーのセレクションに付し、3つの新たなTadA変異：L84F、H123Y、およびI157Fの強い濃縮をもたらした。これらの変異をABE2.9哺乳類コンストラクト上に輸入して、ABE3.1を作り出した（図2B）。HEK293T細胞では、ABE3.1は、6つの試験された部位において平均で29±2.6%となる編集効率、ABE2.9からの各部位におけるA・T→G・C変換の1.6倍の平均の増大、およびABE1.2からの11倍の平均の改善をもたらした（図3C）。2つのTadA単量体の間またはTadA＊およびCas9ニッカーゼの間のより長い（64または100アミノ酸）リンカーもまた試験し、ABE3.1と比較して編集効率への負の効果が観察された（図7および10B）。
【０２６１】
ABE3.1によって媒介される塩基編集効率は、編集されるAをCACコンテキストのプロトスペーサー位置5に置く部位1（65±4.2%の変換）などのいくつかの部位では高かったが、編集されるAをGAGコンテキストに置く部位5などの他の部位では、編集効率はかなり低かった（8.3±0.67%の変換）（図3C）。標的Aの周囲の異なる配列コンテキストを有する6つのゲノム座位からの結果は、ラウンド1〜3からのABEがYACの標的配列コンテキストを強く好んだということを示唆しており、ここでY＝TまたはCである。この配列コンテキスト選好性は、蓋然的には、tRNAArgのアンチコドンループのUACコンテキストのAを脱アミノ化する自然のE. coli TadAの基質特異性から受け継がれた。しかしながら、塩基編集適用についてのABEの実用性はかかる標的配列の制限によって多大に限定されるであろう。
【０２６２】
ABE3.1のYAC配列選好性を克服するために、標的Aの上流および下流のヌクレオチドと相互作用することが予測されるTadA残基に変異導入をフォーカスする第4の進化キャンペーンを開始した。S. aureus TadA／tRNA共結晶構造の点検は35、E. coli TadA E25、R26、R107、A142、およびA143に対応するtRNA基質のアンチコドンループと直接的に接触する残基を明らかにした。ランダム化された残基をこれらの位置に含有するTadA＊2.1−dCas9ライブラリ（表7）を新たな細菌セレクションに付した。これにおいては、非YAC標的（GAT。これはスペクチノマイシン耐性蛋白質のT89I変異を引き起こす）のA・T→G・C変換が抗生物質耐性を復元する（表8および補足の配列2）。セレクションプラスミドを持つ細胞内のライブラリ構成員（約32μg/mLスペクチノマイシンのMIC、表8）に高濃度のスペクチノマイシン（64から512μg/mL）によって負荷をかけた。生残細菌は強くTadA変異A142Nに収斂した。TadA＊4.3−dCas9（TadA＊3.1＋A142N−dCas9）を有する細菌細胞の見かけ上のA・T→G・C塩基編集効率はスペクチノマイシンMICから判断してTadA＊3.1−dCas9よりも高かったが（図10C）、一般的には、ABE4.3は哺乳類細胞においてはABE3.1と比較して減少した塩基編集効率（平均で16±5.8%となる）を見せた（図2Bおよび3C）。A142N変異はコンテキスト依存的な様式で塩基編集を益し得るということが仮想され、進化の後々のラウンドにおいてその包含を再考した（下を見よ）。
【０２６３】
ABE触媒性能を増大させ標的配列適合性を広げるために、進化の第5ラウンドを行った。前の通り、TadA＊ドメイン上にバイアスのない変異を含有するTadA＊3.1−dCas9バリアントのライブラリを作り出した（表7）。より速い速度論を有するABEコンストラクトを支持するために、進化の以前のラウンド（約14h）の半分のみの継続期間（7h）に渡ってABE発現を許した後に、このライブラリをより高ドーズのクロラムフェニコール（≧128μg/mL）によるCamR H193Yセレクションに付した。生残クローンはTadAのNおよびC末端ドメインの近くに種々の変異を含有した。驚くべきことに、これらの変異のコンセンサスセット（H36L、R51L、S146C、およびK157N）をABE3.1に輸入し、ABE5.1を作出することは、HEK293T細胞における総体的な編集効率を1.7±0.29倍だけ減少させた（図2Bおよび3C）。
【０２６４】
ABE5.1はABE2.1による以前の二量体化状態実験から7つの変異を包含したので、これらの新たな変異の蓄積は、非触媒性のN末端TadAサブユニットがその構造的役割を哺乳類細胞において演ずる能力を障害し得るということが推測された。E. coliでは、内在性の野生型TadA単量体がトランスに提供され、可能性として、細菌セレクション表現型と哺乳類細胞編集効率との間の相違を説明する。ゆえに、進化したTadA＊バリアントの代わりに野生型TadAを、ABE5バリアントのN末端の非触媒性のTadAドメインに用いる効果を検査した。これらの研究は、内側の進化したTadA＊に融合した野生型E. coli TadAからなるヘテロ二量体コンストラクト（ABE5.3）が、2つの同一の進化したTadA＊ドメインを有するホモ二量体ABE5.1と比較して多大に改善された編集効率を見せるということを明らかにした。6つのゲノム試験部位におけるABE5.3編集効率は平均で39±5.9%となり、ABE5.1に対して相対的に2.9±0.78倍という各部位における平均の改善を有した（図2Bおよび3C）。ABE3.1と比較して、ABE5.3は各試験部位において平均で1.8±0.39倍だけ編集効率を増大させた。重要なことに、ABE5.3は広げられた配列適合性をもまた示し、これは今や部位3（AAG）、部位4（CAA）、部位5（GAG）、および部位6（GAC）を包含する非YAC標的の22〜33%編集を可能にした（図3C）。
【０２６５】
並行して、ラウンド5ライブラリを、ラウンド4に用いられた非YACスペクチノマイシンセレクションに付した。高度に濃縮されたいかなる変異も出現しなかったが、このセレクションから出現した2つの遺伝子型N72D＋G125A；およびP48S＋S97C（図7）からの新たな変異を、爾後のライブラリ作製ステップに包含した。ABE3.1へのこれらの変異の単純な追加（それぞれABE5.13およびABE5.14を作り出す）は編集効率を改善しなかった（図7および11A）。
【０２６６】
ABE3リンカー研究は、32アミノ酸よりもかなり長いリンカーがABE活性を減少させるということを実証したので（図7および10B）、ABE5リンカーを最適化するために、より洗練されたアプローチを取った。TadAドメイン間またはTadAおよびCas9ニッカーゼ間に24、32、または40残基リンカーを含有する8つのヘテロ二量体野生型TadA−TadA＊ABE5.3バリアント（ABE5.5からABE5.12）を、HEK293T細胞において試験し、塩基編集効率のいかなる明らかな改善ももたらさなかった（図7および11B）。それゆえに、全ての爾後の研究は、2つの32残基リンカーを有するヘテロ二量体wtTadA−TadA＊−Cas9ニッカーゼを含有するABE5.3アーキテクチャを用いた。
【０２６７】
例4−広い配列適合性を有する高活性なABE
進化の第6ラウンドは、DNAシャッフリングによっていずれかの有益でない変異を取り除くことと、ひとたび他の変異による負のエピスタシスから開放されるとABE性能への異なる効果を有し得る進化の以前のラウンドからの変異を再検査することとを狙った。ラウンド1から5までの進化したTadA＊−dCas9バリアントを野生型E .coli TadAと併せてシャッフリングし、スペクチノマイシン耐性T89Iセレクションプラスミドを持つE. coliに形質転換し、384μg/mLスペクチノマイシンを足した培地でセレクションした。2つの変異がこのセレクションから強く濃縮された：P48S/TおよびA142Nである（ラウンド4から最初に見られた）。これらの変異を別々にまたは一緒にどちらかでABE5.3に追加し、ABE6.1からABE6.6を形成した（図7）。ABE6.3（ABE5.3+P48S）は、試験された6つのゲノム部位のそれぞれにおけるABE5.3に対して相対的に1.3±0.28倍高い平均のA・T→G・C編集と、47±5.8%という平均変換効率とをもたらした（図2Bおよび4A）。P48はTadA結晶構造中において基質アデニン核酸塩基および2'−ヒドロキシルから〜5Aに在ると予測されており（図2C）、この残基をSerへと変異させることはデオキシアデノシン基質との適合性を改善し得るということが推測された。ほとんどの部位では、A142N変異を含有するABE6バリアントはこの変異を欠くABEよりも活性ではなかったが、プロトスペーサー上の位置7に標的Aを含有する部位6におけるABE6.4（ABE6.3+A142N）による編集は、ABE6.3による編集よりも1.5±0.13倍効率的、かつABE5.3による編集よりも1.8±0.16倍効率的であった（図4A）。これらの結果は、A142Nバリアントが位置5よりもPAMに近い標的アデニンの改善された編集をオファーし得るということを示唆している。
【０２６８】
6つのラウンドの進化および操作は実質的な改善を生み出したが、ABE6編集因子は、標的Aの近くに複数のアデニンを含有する標的配列、例えば部位3（AAG）および部位4（CAA）において、縮減された編集効率（約20〜40%）を依然として被った（図4A）。この課題に対処するために、進化の第7ラウンドを行った。これにおいては、TadA＊6−dCas9バリアントのフレッシュに作り出されたライブラリをカナマイシン耐性遺伝子上の2つの別々の部位へと標的化した：TATモチーフを編集することを要求するラウンド3に用いたQ4stop変異、およびTAA配列を編集することを要求する新たなD208N変異である（表7および8、補足の配列2）。ラウンド7セレクションプラスミドを持つホスト細胞のMICは8μg/mLカナマイシンであった（表8）。変異したTadA＊6−dCas9バリアントのバイアスのないライブラリをE. coliに形質転換し、64μg/mLから384μg/mLカナマイシンを含有する培地でセレクションした。生残クローンは3つの濃縮された変異セット：W23L/R、P48A、およびR152H/Pを含有した。
【０２６９】
これらの変異を別々にまたは組み合わせで哺乳類細胞ABEに導入することは（ABE7.1からABE7.10）、A・T→G・C編集効率の実質的な増大を、特に複数のA残基を含有する標的においてもたらした（図2B、4A、4B、7、12A、および12B）。ABE7.10は、平均効率58±4.0%、かつABE6.3に対して相対的に1.3±0.20倍（図4A）およびABE1.2と比較して29±7.4倍の各部位における平均の改善によって、6つのゲノム試験部位を編集した。変異の解析は、新たな変異の全ての3つが編集効率の増大に寄与するということを明らかにしたが（図7、12A、および12B）、R152P置換は特に注目に値する。アラインメントされたecTadA結晶構造は、R152がC末端ヘリックス上にあり、tRNA基質のUACアンチコドンループ上のCに接触するということを予測している（図2Bおよび2C）。ArgからProへの置換はこのヘリックスを遮断し、塩基特異的な酵素：DNA相互作用を廃し得るということが推測される。
例5−後期ABEのキャラクタリゼーション
【０２７０】
ラウンド5〜7からの最も有望なABEを綿密にキャラクタリゼーションした。17個のヒトゲノム標的の拡大されたセットを選んだ。これらは標的Aをプロトスペーサーの位置5または7に置き、まとめると、全ての可能なNAN配列コンテキストを包含している（図3A）。総体的には、A・T→G・C編集効率の強い改善がHEK293T細胞においてABE5からABE7バリアントへの進行の間に観察された（図4B）。総体的に最も活性な編集因子ABE7.10の塩基編集効率は試験された17部位において平均で53±3.7%となり、これらの部位のうち11個において50%を超え、34〜68%の範囲であった（図4Aおよび4B）。これらの効率は好都合にBE3の典型的なC・G→T・A編集効率に匹敵する6。
【０２７１】
次に、後期ABEの塩基編集活性ウインドウをさらにキャラクタリゼーションすることを目指した。Aがプロトスペーサー上の2から9までのあらゆる奇数位置（部位18）またはあらゆる偶数位置（部位19）どちらかに見つかるように、2つのsgRNAのどちらかによって標的化され得る交互の5'-A-N-A-N-A-N-3'配列を含有するヒトゲノム部位を選んだ（図3A）。もたらされた編集アウトカム（図5A）は、試験された全ての19部位のあらゆるプロトスペーサー位置における編集効率の分析と一緒になって（図5B）、後期バリアントの活性ウインドウがおよそ4〜6ヌクレオチドの幅であり、PAMを位置21〜23としてカウントして、ABE7.10ではプロトスペーサー位置約4〜7、ABE6.3、ABE7.8、およびABE7.9では位置約4〜9であるということを示唆している（図5Aから5C）。正確な編集ウインドウ範囲は標的依存的な様式で変わり得るということが指摘され（表1）、これはBE3およびBE4に当てはまる。ABE7.8、ABE7.9、およびABE7.10を部位1〜6においてU20S細胞でもまた試験し、HEK293T細胞と類似の編集結果が得られ（図12C）、ABE活性がHEK293T細胞に限定されないということを実証した。
【０２７２】
HEK293T細胞の6から17個のゲノム部位におけるABE編集からの個々の高スループットDNAシーケンシングリードの分析は、編集ウインドウ内の近傍のアデニン同士における塩基編集アウトカムが統計的に独立した事象ではないということを明らかにしている。近傍の標的アデニン間の平均の正規化された連鎖不平衡（LD）はABE進化が進むと着実に増大し、その結果、ABE1.2、ABE3.1、ABE5.3、およびABE7.10の正規化されたLDは平均でそれぞれ0.17±0.12、0.56±0.27、0.67±0.25、および0.94±0.08となった（図14Aおよび14B）。ゆえに、早期ABEは近傍のアデニン同士をより独立して編集するが、後期ABEは近傍のアデニン同士をよりプロセッシブに編集し、同じDNA鎖上の近傍のAもまた編集される場合には、あるAを編集することがより蓋然的である。これらの知見は、進化の過程において、TadAが、編集ウインドウ内の追加のAが変換される前の基質放出の蓋然性を減少させる速度論的な変化を進化させ得、BE3の挙動に類似のプロセッシビティーをもたらしたということを示唆している6。
【０２７３】
シチジンのBE3によって媒介される塩基編集から生じ得るC→非T編集物およびインデルの形成とは対照的に、試験された17個のゲノムNAN部位において、ABEはHEK293TおよびU20S細胞において非常にクリーンにA・TをG・Cに変換し、無処置のコントロール細胞のものに類似の平均で＜0.1%のインデルを有し、無処置の細胞のものよりも上のいかなる観察されるA→非G編集も有さない（図5Cおよび表1）。最近、BE3の望まれない産物はウラシル切り出しおよび下流の修復プロセスから生ずるということが示された9。BE3と比較して全ての試験されたABEバリアントの目覚ましい産物純度は、DNAからイノシンを取り除く酵素の活性または存在量がUNGのものと比較して低くあり得、アデニン塩基編集後の最小限の塩基除去修復しかもたらさないということを示唆している。
【０２７４】
ABE7.10によって触媒されるA・T→G・C編集効率を、技術水準のCas9ヌクレアーゼによって媒介されるHDR法のCORRECTのものと比較した41。HEK293T細胞の5つのゲノム座位において、3.3%から10.6%のインデルによって、0.47%から4.2%までの範囲である平均の標的変異頻度が、CORRECT HDR法を用いて、最適化された48h条件下でHEK293T細胞において観察された（図6A）。これらの同じ5つのゲノム座位において、ABE7.10は48h後に10〜35%、120h後に55〜68%という平均の標的変異頻度をもたらし（図6A）、＜0.1%のインデルを有した（図6B）。標的変異:インデル比は平均でCORRECT HDRでは0.43、ABE7.10では＞500となり、産物選択性の＞1,000倍の改善にあたり、ABE7.10を支持した。これらの結果は、ABE7.10が現行のCas9ヌクレアーゼによって媒介されるHDR法よりもかなり高い効率でA・T→G・C点変異を導入し得、ずっと少数の望まれない産物を有するということを実証している。
【０２７５】
次に、ABE7バリアントのオフターゲット活性を検査した。ABEのオフターゲット活性を網羅的にプロファイリングするいかなる方法もなお存在しないので、オフターゲットABE編集はCas9ヌクレアーゼが特定のガイドRNAと複合体化しているときに編集される同じオフターゲット部位において主として起こるということを仮定した。これはBE3に当てはまることが観察されている6,8,9,42。3つの良くキャラクタリゼーションされたガイドRNA（HEK部位2、3、および4を標的化する）43およびCas9ヌクレアーゼまたはABE7バリアントどちらかによってHEK293T細胞を処置し、オンターゲット座位と、ゲノムワイドGUIDE−Seq法によって同定されたこれらのガイドRNAに関連する12個の最も活性なオフターゲットヒトゲノム座位とをシーケンシングした43。Cas9によるオンターゲットインデルの効率およびABE7.10によるオンターゲット塩基編集の効率両方は平均で54%となった（表2〜4）。Cas9ヌクレアーゼによる検出可能な改変（≧0.2%のインデル）が12個の公知のオフターゲット座位のうち9つ（75%）で観察された（図6Cおよび表2〜4）。対照的に、同じsgRNAと複合体化したときに、ABE7.10、ABE7.9、またはABE7.8は、12個の公知のCas9オフターゲット部位のうち4つ（33%）のみにおいて≧0.2%のオフターゲット塩基編集に至った。その上、9つの確認されたCas9オフターゲット座位は14%インデルという平均効率で改変されたが、4つの確認されたABEオフターゲット座位は平均で1.3%のみのA・T→G・C変異によって改変された（表2〜4）。9つの確認されたCas9オフターゲット座位のうち7つはABE活性ウインドウ内に少なくとも1つのAを含有したが、これらの7つのオフターゲット座位のうち3つはABE7.8、7.9、または7.10によって検出可能には編集されなかった。一緒になって、これらのデータは、編集可能なAを含有するオフターゲット部位でさえも、ABE7バリアントがCas9ヌクレアーゼよりもオフターゲットゲノム改変をしがちではなくあり得るということを示唆している。加えて、ABE処置後に、オンターゲットまたはオフターゲットプロトスペーサーの外においては、ABEによって誘導されるA・T→G・C編集のいかなる検出される証拠もなかった。
例6−ヒト疾患に関係する変異のABEによって媒介される修正およびインストール
【０２７６】
最後に、哺乳類細胞において病原性の変異を修正および疾患抑圧変異を導入するABEのポテンシャルを試験した。ｂ−グロビン遺伝子の変異は種々の血液疾患を引き起こす。稀な良性状態HPFH（遺伝性高胎児型ヘモグロビン症）を有するヒトは、鎌状赤血球貧血を包含するいくつかのｂ−グロビン疾患に対して耐性である。ある種の患者では、この表現型は、正常では出生前後のヒトにおいてサイレンシングされる胎児型ヘモグロビンの持続した発現を可能にするｇ−グロビン遺伝子HBG1およびHBG2のプロモーター上の変異によって媒介される44,45。プロトスペーサー位置7に標的A・T塩基対を置くことによって、HBG1発現を駆動するプロモーター上の−198TをCにかつHBG2発現を駆動するプロモーター上の−198TをCに同時に変異させるようにABEをプログラムするsgRNAを設計した。これらの変異はイギリス型HPFHを授けることが公知であり、成体における胎児型ヘモグロビン産生を可能にする46。ABE7.10は、HEK293T細胞においてそれぞれ29%および30%の効率でHBG1およびHBG2プロモーターに所望のT・A→C・G変異をインストールした（図6Cおよび14）。
【０２７７】
鉄蓄積異常の遺伝性ヘモクロマトーシス（HHC）は常染色体劣性遺伝子異常であり、HFE蛋白質のC282Y変異をもたらすヒトHFE遺伝子のヌクレオチド845のG→A変異によって頻繁に引き起こされる47,48。この変異は肝臓鉄ホルモンヘプシジンの不十分な産生に至り、過剰な腸の鉄吸収と血清中フェリチンの可能性として生命を脅かす上昇とをもたらす。ABE7.10および標的Aをプロトスペーサー位置5に置くガイドRNAをコードするDNAを、HFE C282Yゲノム変異を持つ不死化リンパ芽球様細胞株（LCL）にトランスフェクションした。トランスフェクションに対するLCL細胞の極度の耐性が原因で、トランスフェクションされた細胞を単離し、もたらされたゲノムDNAのHTSによって編集効率を測定した。Tyr282からCys282コドンへのクリーンな変換がトランスフェクションされた細胞からのトータルDNAシーケンシングリードの28%で観察され、オンターゲット座位における望まれない編集またはインデルのいかなる証拠も有さなかった（図6C）。遺伝子コンポーネントを有するグロビン症、HHC、および他の疾患にとっての潜在的な将来の臨床治療へとこれらのABE編集戦略を開発するためには、かなりの追加の研究が必要とされるが、これらの例は、まとめると、ヒト細胞において、疾患駆動変異を修正し、遺伝子疾患表現型を抑圧することが公知の変異をインストールするABEのポテンシャルを実証している。
【０２７８】
概要としては、7つのラウンドの進化および操作は、当初はDNA上の標的座位のアデニンを脱アミノ化するいかなる能力も見せなかった蛋白質（野生型TadA−dCas9融合体）を、DNAを弱く編集する形態（ABE1およびABE2）、部位の限定されたサブセットを効率的に編集するバリアント（ABE3、ABE4、およびABE5）、ならびに、終局的には、広い配列適合性を有する高活性なアデニン塩基編集因子（ABE6およびABE7）に転換した。ABEの開発は、塩基編集の可能性と、二本鎖DNA切断を導入することなしにゲノム編集によって対処され得る病原性のSNPの画分とを多大に拡大する（図1A）。加えて、ABEは、63個の非同義的なコドン変化、開始コドンの破壊または作出、未成熟終止コドンの破壊、スプライシングドナーまたはアクセプター部位の修復、および制御配列の改変を包含する、広い実用性の正確な遺伝子変化を作るためにもまた用いられ得る。一般的なA・T→G・C塩基編集には、ABE7.10が推奨される。標的Aがプロトスペーサー位置8〜10にあるときには、ABE7.9、ABE7.8、またはABE6.3はABE7.10よりも高い編集効率をオファーし得るが、これらの位置における変換効率は典型的にはプロトスペーサー位置4〜7よりも低い。BE3およびBE4と一緒になって9、これらのABEは、生細胞の標的座位における全ての4つのトランジション変異の直接的なインストールを可能にし、最小限の望まれない副産物しか有さないことによって、ゲノム編集の分野を前進させる。
【０２７９】
データの入手可能性．ABE6.3、ABE7.8、ABE7.9、およびABE7.10をコードする発現ベクターはAddgeneから入手可能である。高スループットDNAシーケンシングデータはNCBI配列リードアーカイブに寄託する。
方法
【０２８０】
一般的な方法．別様に指摘されない限り、DNA増幅はPhusion U Green多重PCRマスターミックス（ThermoFisher Scientific）またはQ5ホットスタート高フィデリティ2×マスターミックス（New England BioLabs）を用いるPCRによって実施した。本研究において作り出された全ての哺乳類細胞および細菌プラスミドは、以前に記載された通りUSERクローニング法を用いてアセンブリし49、出発材料遺伝子鋳型は、細菌または哺乳類コドン最適化されたgBlock遺伝子断片（Integrated DNA Technologies）どちらかとして合成的にアクセスされた。全てのsgRNA発現プラスミドは、所望のsgRNA標的部位に対応する可変20nt配列を含有するPCR産物の1ピース平滑末端ライゲーションによって構築した。本研究に用いた全てのsgRNAプラスミドの合成に用いたプライマーおよび鋳型は表5に列記されている。全ての哺乳類ABEコンストラクト、sgRNAプラスミド、および細菌コンストラクトは、recA-であるMach1 T1Rコンピテントセル（Thermo Fisher Scientific）に形質転換し、グリセロールストックとして−80℃で保存した。分子生物学グレードのHyclone水（GE Healthcare Life Sciences）を全てのアッセイおよびPCR反応に用いた。進化実験および哺乳類細胞アッセイに用いた全てのベクターは、エンドトキシンの取り除きを包含するZympPUREプラスミドミディプレップ（Zymo Research Corportion）を用いて精製した。進化の間のプラスミド維持またはセレクションどちらかに用いた抗生物質はGold Biotechnologyから購入した。
【０２８１】
細菌TadA＊ライブラリの作製（進化ラウンド1〜3、5、および7）．簡潔には、変異導入されたE. coli TadA遺伝子を含有するPCR産物と編集因子プラスミドの残りの部分を含有するPCR産物（XTENリンカー、dCas9、sgRNA、選択可能なマーカー、複製起点、およびプロモーターを包含する）との2ピースUSERアセンブリによって、細菌ABEコンストラクトのライブラリを作り出した。具体的には、75ng〜1.2μgの鋳型を含有する8×25μLのPCR反応によって、製造者のプロトコールを踏襲したMutazyme II（Agilent Technologies）とプライマーNMG−823および824（表6）とを用いて、変異を出発鋳型に導入した（表7）。増幅後に、もたらされたPCR産物をプールし、MinElute PCR精製キット（Qiagen）を用いてポリメラーゼおよび反応緩衝液から精製した。PCR産物をDpn1（NEB）によって37℃で2hに渡って処置して、いずれかの残存鋳型プラスミドを消化した。爾後に、0.5μg/mL臭化エチジウムを含有する1%アガロースゲルを用いるゲル電気泳動によって、所望のPCR産物を精製した。PCR産物をQIAquickゲル抽出キット（Qiagen）を用いてゲルから抽出し、30μLのH2Oによって溶出した。ゲル精製後に、適当なUSERジャンクション配列を断片の5'および3'末端にインストールするために、変異導入されたecTadA DNA断片を、プライマーNMG−825およびNMG−826によって（表6）、Phusion U Green多重PCRマスターミックスを用いて増幅した（8×50 PCR反応、66℃アニーリング、20s伸長）。もたらされたPCR産物をゲル電気泳動によって精製した。次に、細菌塩基編集因子プラスミド鋳型のバックボーン（表7）を、製造者のプロトコールを踏襲して、プライマーNMG−799およびNMG−824（表6）ならびにPhusion U Green多重PCRマスターミックスによって増幅した（98ウェルPCRプレートのウェルあたり100μL、トータル5〜6プレート、Tm 66℃、4.5min伸長）。各PCR反応を300mLのPB DNA結合緩衝液（Qiagen）と組み合わせ、溶液の25mLをHiBind DNAミディカラム（Omega Bio-Tek）にローディングした。結合したDNAを5カラム体積のPE洗浄緩衝液（Qiagen）によって洗浄し、DNA断片をカラムあたり800μLのH2Oによって溶出した。両方のDNA断片をNanoDrop 1000分光光度計（Themo Fisher Scientific）を用いて定量した。
【０２８２】
次の条件で、以前に報告されたUSERアセンブリ手続き49を踏襲して、TadA＊ライブラリをアセンブリした：0.22pmolのecTadAの変異導入されたDNA断片1、0.22pmolのプラスミドバックボーン断片2、1UのUSER（ウラシル特異的切り出し試薬，New England Biolabs）酵素、および1UのDpnI酵素（New England Biolabs）を、10μLのUSERアセンブリ混合物あたり、pH7.9の50mM酢酸カリウム，20Mm Tris−酢酸，10mM酢酸マグネシウム，100μg/mL BSA（1×CutSmart緩衝液，New England Biolabs）と組み合わせた。一般的には、進化の各ラウンドは約1mLのUSERアセンブリ混合物（22nmolの各DNAアセンブリ断片）を要求し、これは複数の8ウェルPCRストリップの10μLアリコートに分配した。反応を60minに渡って37℃に温め、それから3minに渡って80℃に加熱して2つの酵素を変性させた。アセンブリ混合物をサーモサイクラーによって0.1℃/sで12℃までゆっくり冷却して、2つのUSERジャンクションのフレッシュに作り出された末端のアニーリングを促進した。
【０２８３】
手に入れたコンストラクトのライブラリについて、5volのPB緩衝液（Qiagen）をアセンブリ反応混合物に追加することと、材料をMinEluteカラムに結合することと（カラムあたり480μL）によって、変性した酵素および反応緩衝液をアセンブリ混合物から取り除いた。ABEのハイブリダイゼーションしたライブラリコンストラクトをカラムあたり30μLのH2Oによって溶出し、この溶出された材料の2μLを20μLのNEB10−ベータエレクトロコンピテントE. coliに追加し、Lonza 4D−Nucleofectorシステムによって、細菌プログラム5を用いて16ウェルNucleocuvetteストリップ中でエレクトロポレーションした。進化の典型的なラウンドは約300のエレクトロポレーションを用いて500〜1000万コロニー形成単位（cfu）を作り出した。フレッシュにエレクトロポレーションされたE. coliを200mLの予温したDavis富栄養培地（DRM）中で37℃において回復させ、カルベニシリン（プラスミド維持のため）を30μg/mLで追加する前に、200rpmで振盪しながら500mLベント付きバッフル付きフラスコ内において15minに渡ってインキュベーションした。培養物を37℃において200rpmで振盪しながら18hに渡ってインキュベーションした。プラスミドライブラリをカラムあたり200μLの予温した水によって溶出したことを除いては、製造者の手続きを踏襲してZympPUREプラスミドミディプレップキットによってプラスミドライブラリを単離した（DNAカラムあたり50mL培養物）。進化ラウンド1〜3、5、および7は、軽微な変形によって、対応するライブラリを作り出すためにこの手続きを踏襲した（表7）。
【０２８４】
部位飽和細菌TadA＊ライブラリ（進化ラウンド4）の作製．ecTadAのArg24、Glu25、Arg107、Ala142、およびAla143における変異導入は、ecTadA＊(2.1)−dCas9を鋳型として用い、適当に設計された縮重NNK含有プライマーによって増幅して達成された（表6）。簡潔には、ecTadA＊(2.1)−dCas9鋳型を2つのプライマーセット：NMG−1197＋NMG−1200およびNMG−1199＋NMG−1200によって、Phusion U Green多重PCRマスターミックスを用いて別々に増幅し、それぞれPCR産物1およびPCR産物2を形成した。両方のPCR産物をPB結合緩衝液およびMiniEluteカラムを用いて個々に精製し、200μLのPCR反応あたり20μLのH2Oによって溶出した。第3のPCR反応では、1μLのPCR産物1および1μLのPCR産物2を外側のウラシル含有プライマーNMG−1202およびNMG−1197と組み合わせ、Phusion U Green多重PCRマスターミックスを用いて増幅して、フランキングするウラシル含有USERジャンクションを有する所望のオーバーラップ伸長PCR産物を形成した。第4のPCR反応では、ecTadA＊(2.1)−dCas9をNMG−1201およびNMG−1198によって増幅して、USERアセンブリのためのバックボーンDNA断片を作り出した。両方のUSERアセンブリ断片のDpnI消化およびゲル精製後に、オーバーラップ伸長PCR産物（ecTadAの所望のNNK変異を含有する）を上に記載されている通りUSERアセンブリによってecTadA＊(2.1)−dCas9バックボーン上に組み込んだ。フレッシュに作り出されたNNKライブラリをNEB10−ベータエレクトロコンピテントE. coliに形質転換し、DNAを上に記載されている通り収穫した。
【０２８５】
DNAシャッフリングした細菌TadA＊ライブラリの作製（進化ラウンド6）．DNAシャッフリングは、ヌクレオチド交換および切り出しテクノロジー（NExT）のDNAシャッフリング法の改変バージョンによって達成された50。各10mMのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP/dUTP（3部のdUTP：7部のdTTP）の溶液をフレッシュに調製した。次に、TadA＊断片を、等モル濃度の進化ラウンド1〜5から単離された20fmolのTadA＊−XTEN−dCas9細菌コンストラクトのプールから、1×ThermoPol反応緩衝液中のTaq DNAポリメラーゼ（NEB）、プライマーNMG−822およびNMG−823（表6）、ならびに各400μMのdATP、dCTP、dGTP、およびdUTP/dTTP（3:7）を用いて増幅した（Tm 63℃、1.5min伸長時間）。フレッシュに作り出されたウラシル含有DNAライブラリ断片をゲル電気泳動によって精製し、QIAquickゲル抽出キット（Qiagen）によって抽出し、抽出カラムあたり20μLのH2Oによって溶出した。精製されたDNA産物を40μLあたり2UのUSER酵素によって1×CutSmart緩衝液中で37℃において消化し、消化が完全であるまで分析的アガロースゲル電気泳動によってモニタリングした。出発材料がもはや観察されないときに（典型的には37℃で3〜4h）、反応を10volのPN1結合緩衝液（Qiagen）によってクエンチした。必要とされる場合には、追加のUSER酵素を反応に追加した。消化された材料を製造者のプロトコールを用いてQiaexIIキット（Qiagen）によって精製し、DNA断片をカラムあたり50μLの予温したH2Oによって溶出した。
【０２８６】
精製したシャッフリングしたTadA＊断片を内側プライマー伸長手続きによって全長TadA＊−XTENdCas9産物へと再アセンブリした。溶出された消化されたDNA断片（25μL）を、0.5mM MgSO4を足した1×ThermoPol緩衝液中において、4UのVentポリメラーゼ（NEB）、各800μMのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、1UのTaq DNAポリメラーゼと組み合わせた。再アセンブリ手続きのサーモサイクラープログラムは次であった：3minの94℃、40サイクルの30sの92℃における変性，30℃から出発しかつサイクルあたり1℃を追加する増大していく温度における60sのアニーリング（冷却勾配＝1℃/s），およびサイクルあたり追加の4sを有する60sの72℃における伸長、10minの72℃の1つの最終サイクルによって終了。再アセンブリされた産物を次の条件でPCRによって増幅した：15μLの未精製の内側アセンブリを、各1μMのUSERプライマーNMG−825およびNMG−826、100μLのPhusion U Green多重PCRマスターミックス、ならびにH2Oと200μLの最終体積で組み合わせ、63℃のアニーリング、30sの伸長時間。PCR産物をゲル電気泳動によって精製し、前の通りUSERプライマーNMG−799およびNMG−824によるバックボーンの増幅から作り出された対応するフランキングするUSERジャンクションを有する対応するecTadA＊−XTEN−dCas9バックボーン上に、USER法を用いてアセンブリした。NEB10−ベータエレクトロコンピテントE. coliへのハイブリダイゼーションされたライブラリの形質転換後に、製造者の手続きを踏襲してZymoPUREプラスミドミディプレップキットを用いて、進化6コンストラクトのライブラリを単離した。
【０２８７】
TadAバリアントの細菌進化．以前に記載された株S103051を全ての進化実験に用い、進化の各ラウンドに特異的な適当なセレクションプラスミドを持つ細菌のエレクトロコンピテントバージョンを以前に記載された通り調製した49（表7）。簡潔には、上に記載されている通り調製された2μLのフレッシュに作り出されたTadA＊ライブラリ（300〜600ng/μL）を、標的セレクションプラスミドを含有する22μLのフレッシュに調製されたエレクトロコンピテントS1030細胞に追加し、Lonza 4D−Nucleofectorシステムによって、細菌プログラム5を用いて16ウェルNucleocuvetteストリップ中でエレクトロポレーションした。典型的なセレクションは5〜10×106cfuを用いた。エレクトロポレーション後に、フレッシュに形質転換されたS1030細胞を、トータルで250mLの予温したDRM培地中で、37℃において200rpmで振盪しながら15minに渡って回復させた。この手短な回復インキュベーション後に、セレクションプラスミドを維持するための適当な抗生物質と併せて、ライブラリプラスミドを維持するためのカルベニシリンを30μg/mLの最終濃度で追加した；各ラウンドに用いた抗生物質を包含するセレクション条件の列記については、表7を見よ。プラスミド維持抗生物質の追加の直後に、100mMのL−アラビノースを培養物に追加してTadA＊−dCas9融合体ライブラリ構成員の翻訳を誘導し、これらはPBADプロモーターから発現された。進化ラウンド5のインキュベーション時間は7hのみであることを除いて、培養物は37℃において200rpmで振盪しながら18hに渡って飽和まで増殖させた）。
【０２８８】
1.8%寒天−2×YT、30μg/mLのプラスミド維持抗生物質、および抗生物質単独を持つS1030株のMICよりも上であることが予め決定されたある濃度のセレクション抗生物質を含有する4つの500cm2の培養スクエアディッシュのそれぞれに10mLの飽和培養物をプレーティングすることによって、ライブラリ構成員に負荷をかけた（表8）。プレートを37℃で2日に渡ってインキュベーションし、約500個の生残コロニーを単離した。これらのコロニーからのTadA＊遺伝子をプライマーNMG−822およびNMG−823によるPCRによって増幅し（表6）、DNAシーケンシングに供した。並行して、コロニーを別々に96ディープウェルプレート上の1mL DRM培養物に接種し、37℃、200r.p.mで一晩増殖させた。各一晩培養物のアリコート（100μL）をプールし、プラスミドDNAを単離し、TadA＊遺伝子をUSERプライマーNMG−825およびNMG−826によって増幅した（表6）。上に記載されているUSERアセンブリプロトコールによって、TadA＊遺伝子を再びプラスミドバックボーン上にサブクローニングした（XTENリンカー−dCas9および適当なガイドRNAを含有する）。この濃縮されたライブラリを適当なS1030（+セレクションプラスミド）エレクトロコンピテント細胞に形質転換し、維持抗生物質およびL−Araとインキュベーションし、セレクション条件によって再負荷をかけた。2日のインキュベーション後に、300〜400個の生残クローンを上で記載されている通り単離し、それらのTadA＊遺伝子をシーケンシングした。各セレクションラウンドから生じた変異を哺乳類ABEコンストラクト上に輸入し、下に記載される通り哺乳類細胞において試験した。
【０２８９】
一般的な哺乳類細胞培養条件．HEK293T（ATCC CRL−3216）およびU20S（ATTC HTB−96）はATCCから購入し、10%（v/v）ウシ胎児血清（FBS）を足したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）プラスGlutaMax（ThermoFisher Scientific）によって培養および継代した。Hap1（Horizon Discovery，C631）およびHap1 AAG細胞（Horizon Discovery，HZGHC001537c002）は10%（v/v）FBSを足したイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）プラスGlutaMax（ThermoFisher Scientific）によって維持した。HFE遺伝子にC282Y変異を含有するリンパ芽球様細胞株（LCL）（Coriell Biorepository，GM14620）は20%FBSを足したロズウェルパーク記念研究所培地1640（RPMI−1640）プラスGlutaMax（ThermoFisher Scientific）によって維持した。全ての細胞型は37℃において5%CO2でインキュベーション、維持、および培養した。
【０２９０】
HEK293T組織培養トランスフェクションプロトコールおよびゲノムDNA調製．抗生物質の不在下で増殖させたHEK293T細胞を48ウェルポリDリジンコートプレート（Corning）に播種した。播種の12〜14h後に、細胞を、およそ70%コンフルエンシーにおいて、製造者のプロトコールに従う1.5μLのLipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）、ならびに750ngのABEプラスミド、250ngのsgRNA発現、および10ngのGFP発現プラスミド（Lonza）によってトランスフェクションした。別様に書かれていない限り、細胞を5日に渡って培養し、第3日に培地交換を有した。培地を取り除き、細胞を1×PBS溶液（Thermo Fisher Scientific）によって洗浄し、直接的に組織培養プレートの各ウェルへの100μLのフレッシュに調製されたリシス緩衝液（10mM Tris−HCl，pH7.0，0.05%SDS，25μg/mLプロテイナーゼK（ThermoFisher Scientific）の追加によって、ゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNA混合物を96ウェルPCRプレートに移し、37℃で1hに渡ってインキュベーションし、次に、30minに渡る80℃酵素変性ステップであった。哺乳類細胞ゲノムDNA増幅に用いたプライマーは表9に列記されている。
【０２９１】
HAP1およびHAP1 AAG-細胞のヌクレオフェクションならびにゲノムDNA抽出．製造者のプロトコールに従ってSE Cell Line 4D−Nucleofector XキットSを用いて、HAP1およびHAP1 AAG-細胞をヌクレオフェクションした。簡潔には、4D−NucleofectorプログラムDZ−113を用いて300ngのABEプラスミドおよび100ngのsgRNA発現プラスミドによって4×105細胞をヌクレオフェクションし、250μLの培地によって48ウェルポリDリジンコート培養プレート上で3日に渡って培養した。DNAは上に記載されている通り抽出した。
【０２９２】
U20S細胞のヌクレオフェクションおよびゲノムDNA抽出.製造者のプロトコールに従ってSG Cell Line 4D−Nucleofector Xキット（Lonza）を用いて、U20S細胞をヌクレオフェクションした。簡潔には、16ウェルNucleocuvetteストリップ（ウェルあたり20μLの細胞）中で、4D−NucleofectorプログラムEH−100を用いて、500ngのABEプラスミドおよび100ngのsgRNA発現プラスミドと併せて20μLのSG緩衝液中において、1.25×105細胞をヌクレオフェクションした。フレッシュにヌクレオフェクションされた細胞を48ウェルポリDリジンコート培養プレート上の250μLの培地に移した。細胞を5日に渡ってインキュベーションし、培地を毎日交換した。DNAは上に記載されている通り抽出した。
【０２９３】
LCL HFE C828Y細胞のエレクトロポレーション．Gene Pulser Xcellエレクトロポレータ（BioRad）および0.4cmギャップGene Pulserエレクトロポレーションキュベット（BioRad）を用いて、LCL細胞をエレクトロポレーションした。簡潔には、1×107のLCL細胞を250μLのRPMI−160プラスGlutaMaxに再懸濁した。この培地に、ABE7.10、GFP、およびHFE遺伝子のC282Y変異を標的化する対応するsgRNAを発現する65μgのプラスミドを追加した。混合物を予冷却された0.4cmギャップエレクトロポレーションキュベットに追加し、細胞／DNA混合物をキュベット中で氷上において10minに渡ってインキュベーションした。細胞に250Vかつ950μFで3msに渡ってパルスをかけた。細胞を10minに渡って再び氷上に移し、それから、T−75フラスコ内の20%FBSを足した15mLの予温したRPMI−160に移した。次の日に、追加の5mLの培地をフラスコに追加し、細胞を放置してトータルで5日に渡ってインキュベーションした。インキュベーション後に、細胞を遠心によって単離し、400μLの培地に再懸濁し、40μmストレーナー（Thermo Fisher Scientific）によって濾過し、FACSAria IIIフローサイトメータ（Becton Dickenson Biosciences）を用いてGFP蛍光についてソーティングした。GFP陽性細胞を500μLの培地を含有する1.5mLチューブに回収した。遠心後に、培地を取り除き、細胞を600μLの1×PBS（Thermo Fisher Scientific）によって2回洗浄した。ゲノムDNAは上に記載されている通り抽出した。
【０２９４】
ABE7.10および「CORRECT」法を用いる相同組換え修復の間の比較52．抗生物質の不在下で増殖させたHEK293T細胞を48ウェルポリDリジンコートプレート（Corning）に播種した。12〜14h後に、細胞を、約70%コンフルエンシーにおいて、750ngのCas9または塩基編集因子プラスミド、250ngのsgRNA発現プラスミド、1.5μLのLipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）、およびHDRアッセイでは0.7μgの一本鎖ドナーDNA鋳型（100nt，PAGE精製，IDTから）によって、製造者の説明書に従ってトランスフェクションした。100mer一本鎖オリゴヌクレオチドドナー鋳型が表10に列記されている。
【０２９５】
製造者の説明書に従ってAgencourt DNAdvanceゲノムDNA単離キット（Beckman Coulter）を用いて、ゲノムDNAをトランスフェクションの48h後に収穫した（CORRECT法の開発の間にTessier-Lavigne et. al.52によって記載されている通り）。サイズ選択的なDNA単離ステップが、爾後のPCR増幅およびシーケンシングステップにおいて一本鎖ドナーDNA鋳型によるコンタミネーションのいかなるリスクもないということを保証した。ドナーオリゴ鋳型を増幅する最小限のリスクしかないということを保証するように、増幅プライマーを再設計した。
【０２９６】
ゲノムDNAサンプルの高スループットDNAシーケンシング（HTS）．目当ての領域と適当なIlluminaフォワードおよびリバースアダプターとに対する相同性を含有するプライマーによるPCRによって、目当てのゲノム部位を増幅した（表9）。本研究において論じられる全てのゲノム部位についてこの第1ラウンドのPCR（PCR1）に用いたプライマー対は、表9に見いだされ得る。具体的には、25μLの所与のPCR1反応をアセンブリし、0.5μMの各フォワードおよびリバースプライマー、1μLのゲノムDNA抽出物、ならびに12.5μLのPhusion U Green多重PCRマスターミックスを含有した。PCR反応は次の通り実施した：2minの95℃、それから30サイクルの［15sの95℃，20sの62℃，および20sの72℃］、次に2minの最終の72℃伸長。PCR産物は臭化エチジウムを足した2%アガロースゲル上でDNA標準（Quick-Load 100bp DNAラダー）との比較によって確かめた。二次PCR反応（PCR2）では、ユニークIlluminaバーコード化プライマー対を各サンプルに追加した。具体的には、25μLの所与のPCR2反応をアセンブリし、0.5μMの各フォワードおよびリバースユニークillumineバーコード化プライマー対、2μLの未精製のPCR1反応混合物、ならびに12.5μLのQ5ホットスタート高フィデリティ2×マスターミックスを含有した。バーコード化PCR2反応は次の通り実施した：2minの95℃、それから15サイクルの［15sの95℃，20sの61℃，および20sの72℃］、次に2minの最終の72℃伸長。PCR産物は、2%アガロースゲルによる電気泳動によって、QIAquickゲル抽出キットを用いて精製し、30μLのH2Oによって溶出した。製造者のプロトコールに従って、DNA濃度をKAPAライブラリ定量キット−Illumina（KAPA Biosystems）によって定量し、Illumina MiSeq機器によってシーケンシングした。
【０２９７】
一般的なHTSデータ分析．シーケンシングリードはMiSeq Reporter（Illumina）によってデマルチプレックスした。参照配列に対するアンプリコン配列のアラインメントは、改善された出力フォーマットを有するMatlabスクリプトを用いて以前に記載された通り行った（補足の注1）。簡潔には、Smith-Watermanアルゴリズムを用いて、インデルなしの配列を参照配列に対してアライメントした；30未満のクオリティスコアを有する塩基は「N」に変換して、シーケンシングエラーの結果としての塩基ミスコールを防止した。インデルは、ベースコールの半分より多くがQ30のクオリティスコアよりも下のシーケンシングリードがフィルターアウトされる以前に記載されたMatlabスクリプトの改変バージョンを用いて別々に定量した（補足の注2）。インデルは、予測されたCas9切断部位の周囲の30bpウインドウ内に1bpよりも多大かまたはそれに等しい挿入または欠失を含有するリードとしてカウントした。
【０２９８】
HBG1およびHBG2座位の相同性が原因で、単一のPCR反応で両方の座位を増幅するであろうプライマーが設計された。これらの2つのゲノム部位の配列をコンピュータで分離するために、このアンプリコンが関わるシーケンシング実験は別々のPythonスクリプトを用いてプロセシングした（補足の注3）。簡潔には、ベースコールの半分より多くがQ30よりも下である場合には、リードは無視し、Q30よりも下のクオリティスコアを有するベースコールは「N」に変換した。HBG1またはHBG2リードは、部位間で異なる2つのSNPを含有する37bp配列に対する厳密なマッチを有すると同定された。ベースコールおよびインデルのウインドウは、プロトスペーサー配列を中心とする43bpウインドウの両側の10bpフランキング配列に対する厳密なマッチによって定義された。インデルは、このベースコールウインドウが長さが≧1bp異なったリードとしてカウントした。このPythonスクリプトは、同一のクオリティ（＜1,000分の1という推定上のベースコールエラー率）を有する出力を、アラインメントステップの不在が原因でずっと少ない時間で生み出す。
【０２９９】
編集されたリードのトータル数を首尾良くシーケンシングされたリードのトータル数の割合として計算するために、アラインメントアルゴリズムによって測定された編集されたリードの画分を、［1−インデルを含有するリードの画分］によって乗算した。
【０３００】
連鎖不平衡分析．カスタムのPythonスクリプト（補足の注4）を用いて、編集確率を一次標的A（P1）、二次標的A（P2）、ならびに一次および二次標的A両方（P1,2）において算定した。それから、連鎖不平衡（LD）をP1,2−（P1×P2）として評価した。LD値はMin（P1（1−P2）,（1−P1）P2）の正規化係数によって正規化した。この正規化はアレル頻度についてコントロールし、0から1の正規化LD値を生み出す。
例7−鎌状赤血球およびベータサラセミアなどのヒト疾患を処置するための、HBG1/2プロモーター上の変異のABEによって媒介されるインストール
【０３０１】
図15に指示されているsgRNAは、成体において胎児型ヘモグロビン上方制御を授ける公知の変異の、またはそれらの近くの部位に主としてフォーカスしたHBG1／2プロモーター上の部位を標的化する。ABE7.10および個々のsgRNAプラスミド（750ngの編集因子、250ngのガイド）をHEK293T細胞にリポフェクションした。HEK293T細胞における3日の発現後に、培地をアスピレーションし、フレッシュな培地を追加した。さらなる2日の増殖後に、DNAを抽出した。PCRを実施してHBG1／2プロモーター領域を増幅した。PCR産物をIllumina MiSeqを用いてシーケンシングし、編集物を各サンプルについて定量した。指示されているガイドによって処置された細胞について、ウインドウ内に観察された最も高い編集が図15にプロットされている。これらの結果は、成体において胎児型ヘモグロビンを上方制御し得る変異が導入され得るということを立証している。かかる変異の導入は鎌状赤血球症およびベータサラセミアにとって治療的であり得る。
【０３０２】
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43 Tsai, S. Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology 33, 187-197, doi: 10.1038/nbt.3117 (2015).
44 Traxler, E. A. et al. A genome-editing strategy to treat β-hemoglobinopathies that recapitulates a mutation associated with a benign genetic condition. Nature medicine 22, 987-990, doi: 10.1038/nm.4170 (2016).
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47 Townsend, A. & Drakesmith, H. Role of HFE in iron metabolism, hereditary haemochromatosis, anaemia of chronic disease, and secondary iron overload. The Lancet 359, 786-790, doi: 10.1016/S0140-6736(02)07885-6 (2002).
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【０３０３】
表1．対応するsgRNA発現プラスミドの共トランスフェクションによる、17個のゲノム部位における無処置の HEK293T細胞およびABE6.3、ABE7.8、ABE7.9、またはABE7.10によって処置されたHEK293T細胞のHTSシーケンシング結果および%インデル。1つの任意に選んだレプリケートを示している：全てのレプリケートのデータはNCBIシーケンシングリードアーカイブから入手可能である。
【表１−１】
2021500036.tif 000155
【表１−２】
2021500036.tif 000156
【表１−３】
2021500036.tif 000157
【表１−４】
2021500036.tif 000158
【表１−５】
2021500036.tif 000159
【表１−６】
2021500036.tif 000160
【表１−７】
2021500036.tif 000161
【表１−８】
2021500036.tif 000162
【表１−９】
2021500036.tif 000163
【表１−１０】
2021500036.tif 000164
【表１−１１】
2021500036.tif 000165
【表１−１２】
2021500036.tif 000166
【表１−１３】
2021500036.tif 000167
【表１−１４】
2021500036.tif 000168
【表１−１５】
2021500036.tif 000169
【表１−１６】
2021500036.tif 000170
【表１−１７】
2021500036.tif 000171
【０３０４】
表2．S. pyogenes Cas9 ヌクレアーゼについて以前にキャラクタリゼーションされたHEK2 オンターゲットおよびオフターゲット部位におけるABE7.8、ABE7.9、およびABE7.10の活性1。
【表２】
2021500036.tif 000172
【０３０５】
表3．S. pyogenes Cas9 ヌクレアーゼによるオンターゲットおよびオフターゲット改変について以前にキャラクタリゼーションされたHEK3部位におけるABE7.8、ABE7.9、およびABE7.10の活性1。
【表３−１】
2021500036.tif 000173
【表３−２】
2021500036.tif 000174
【０３０６】
表4．S. pyogenes Cas9 ヌクレアーゼによるオンターゲットおよびオフターゲット改変について以前にキャラクタリゼーションされたHEK4部位におけるABE7.8、ABE7.9、およびABE7.10の活性1。HEK4 オフターゲット部位3はABE処置によって相当のインデル形成を示したが、この座位はCas9 ヌクレアーゼによる並外れて高い（89%）インデル形成をもまた示し、Cas9ニッカーゼによる処置によってインデル形成を見せた唯一の試験オフターゲット部位であった。この座位は並外れて脆弱であるということと、ここのインデル形成は、ABEによって媒介されるアデニン脱アミノ化からよりもむしろ単純に部位にニックを入れることから生ずるということとが推測される。
【表４−１】
2021500036.tif 000175
【表４−２】
2021500036.tif 000176
【０３０７】
表5．sgRNAプラスミドを作り出すために用いたプライマー。20nt標的プロトスペーサーを赤で示している。標的DNA配列が「G」から開始しないときには、「G」をプライマーの5'末端に追加した。なぜなら、ヒトU6プロモーターは転写開始部位に「G」を好むからである2-4。以前に記載されているpFYF sgRNAプラスミド5をPCR増幅のための鋳型として用いた。
【表５】
2021500036.tif 000177
【０３０８】
表6．細菌TadA＊ライブラリを作り出すために用いたプライマー。
【表６】
2021500036.tif 000178
【０３０９】
表7．E. coliによるTadA＊変異導入およびセレクションの各ラウンドに用いた出発コンストラクト。全てのプラスミドは、SC101複製起点、カルベニシリンによるプラスミド維持のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子、TadA＊−dCas9発現を駆動するPBADプロモーター、およびsgRNA転写を駆動するlacプロモーターを含有する。細菌セレクションの間に用いた塩基編集因子のアーキテクチャは：TadA＊−リンカー(16aa)−dCas9である。
【表７】
2021500036.tif 000179
【０３１０】
表8．抗生物質セレクションプラスミドおよびそれらの対応するE. coli抗生物質最小阻害濃度（MIC）。
【表８】
2021500036.tif 000180
【０３１１】
表9．哺乳類細胞ゲノムDNA増幅に用いたプライマー。
【表９−１】
2021500036.tif 000181
【表９−２】
2021500036.tif 000182
【０３１２】
表10．HDR実験において試験した100mer一本鎖オリゴヌクレオチドドナー鋳型（ssODN）。
【表１０】
2021500036.tif 000183
【０３１３】
補足の配列1．本研究に用いたアデニンデアミナーゼのDNA配列。
細菌コドン最適化されたecTadA（野生型）：
ATGTCTGAAGTCGAATTTAGCCACGAATACTGGATGCGTCACGCGCTGACGCTGGCGAAACGTGCCTGGGATGAGCGGGAAGTGCCGGTCGGCGCGGTATTAGTGCATAACAATCGGGTAATCGGCGAAGGCTGGAACCGCCCGATTGGTCGCCATGATCCCACCGCACATGCAGAAATCATGGCCCTGCGGCAGGGTGGTCTGGTGATGCAAAATTATCGTCTGATCGACGCCACGTTGTATGTCACGCTTGAACCATGTGTAATGTGTGCCGGAGCGATGATCCACAGTCGCATTGGTCGCGTGGTCTTTGGTGCGCGTGACGCGAAAACTGGCGCTGCGGGATCTTTAATGGATGTGCTGCATCATCCGGGTATGAATCACCGAGTGGAAATTACGGAAGGAATACTGGCGGATGAGTGCGCGGCGTTGCTCAGTGACTTCTTTCGCATGCGCCGCCAGGAAATTAAAGCGCAGAAAAAAGCGCAATCCTCGACGGAT（配列番号31）
哺乳類コドン最適化されたecTadA（野生型）：
ATGTCCGAAGTCGAGTTTTCCCATGAGTACTGGATGAGACACGCATTGACTCTCGCAAAGAGGGCTTGGGATGAACGCGAGGTGCCCGTGGGGGCAGTACTCGTGCATAACAATCGCGTAATCGGCGAAGGTTGGAATAGGCCGATCGGACGCCACGACCCCACTGCACATGCGGAAATCATGGCCCTTCGACAGGGAGGGCTTGTGATGCAGAATTATCGACTTATCGATGCGACGCTGTACGTCACGCTTGAACCTTGCGTAATGTGCGCGGGAGCTATGATTCACTCCCGCATTGGACGAGTTGTATTCGGTGCCCGCGACGCCAAGACGGGTGCCGCAGGTTCACTGATGGACGTGCTGCATCACCCAGGCATGAACCACCGGGTAGAAATCACAGAAGGCATATTGGCGGACGAATGTGCGGCGCTGTTGTCCGACTTTTTTCGCATGCGGAGGCAGGAGATCAAGGCCCAGAAAAAAGCACAATCCTCTACTGAC（配列番号32）
哺乳類コドン最適化されたmADA：
ATGGCCCAGACACCCGCATTCAACAAACCCAAAGTAGAGTTACACGTCCACCTGGATGGAGCCATCAAGCCAGAAACCATCTTATACTTTGGCAAGAAGAGAGGCATCGCCCTCCCGGCAGATACAGTGGAGGAGCTGCGCAACATTATCGGCATGGACAAGCCCCTCTCGCTCCCAGGCTTCCTGGCCAAGTTTGACTACTACATGCCTGTGATTGCGGGCTGCAGAGAGGCCATCAAGAGGATCGCCTACGAGTTTGTGGAGATGAAGGCAAAGGAGGGCGTGGTCTATGTGGAAGTGCGCTATAGCCCACACCTGCTGGCCAATTCCAAGGTGGACCCAATGCCCTGGAACCAGACTGAAGGGGACGTCACCCCTGATGACGTTGTGGATCTTGTGAACCAGGGCCTGCAGGAGGGAGAGCAAGCATTTGGCATCAAGGTCCGGTCCATTCTGTGCTGCATGCGCCACCAGCCCAGCTGGTCCCTTGAGGTGTTGGAGCTGTGTAAGAAGTACAATCAGAAGACCGTGGTGGCTATGGACTTGGCTGGGGATGAGACCATTGAAGGAAGTAGCCTCTTCCCAGGCCACGTGGAAGCCTATGAGGGCGC
AGTAAAGAATGGCATTCATCGGACCGTCCACGCTGGCGAGGTGGGCTCTCCTGAGGTTGTGCGTGAGGCTGTGGACATCCTCAAGACAGAGAGGGTGGGACATGGTTATCACACCATCGAGGATGAAGCTCTCTACAACAGACTACTGAAAGAAAACATGCACTTTGAGGTCTGCCCCTGGTCCAGCTACCTCACAGGCGCCTGGGATCCCAAAACGACGCATGCGGTTGTTCGCTTCAAGAATGATAAGGCCAACTACTCACTCAACACAGACGACCCCCTCATCTTCAAGTCCACCCTAGACACTGACTACCAGATGACCAAGAAAGACATGGGCTTCACTGAGGAGGAGTTCAAGCGACTGAACATCAACGCAGCGAAGTCAAGCTTCCTCCCAGAGGAAGAGAAGAAGGAACTTCTGGAACGGCTCTACAGAGAATACCAA（配列番号33）
哺乳類コドン最適化されたhADAR2（触媒ドメイン）：
ATGCATCTCGATCAAACCCCGAGCCGCCAACCAATCCCGAGTGAAGGCCTGCAACTGCATCTGCCACAAGTTCTGGCGGATGCCGTTAGCCGCCTGGTCTTGGGTAAGTTCGGTGATCTGACAGACAACTTTTCTAGTCCACATGCTCGCCGTAAGGTGCTGGCTGGCGTTGTGATGACCACAGGTACAGACGTCAAAGATGCTAAAGTGATTTCTGTGTCTACTGGCACGAAGTGCATTAACGGCGAATATATGTCTGACCGTGGCTTAGCGCTTAACGATTGTCATGCCGAAATCATCTCCCGTCGTTCATTGCTTCGCTTCCTGTACACGCAGTTGGAACTGTATCTGAATAACAAAGACGATCAGAAGCGTTCTATTTTCCAGAAGTCTGAGCGCGGCGGGTTCCGTCTTAAAGAGAATGTGCAGTTTCACCTTTATATTTCAACCTCTCCTTGTGGTGATGCCCGTATTTTTTCACCACACGAACCTATTTTAGAGGAACCGGCCGATCGTCATCCGAACCGCAAAGCCCGTGGGCAGCTGCGTACGAAAATCGAATCAGGTGAAGGCACCATTCCCGTCCGCTCCAATGCGAGCATTCAAACGTGGGACGGTGTGTTACAGGGCGAACGCCTGTTAACCATGAGCTGCTCAGACAAAATTGCACGTTGGAACGTGGTAGGCATCCAGGGCTCGTTATTGAGCATTTTCGTGGAGCCGATTTATTTTAGTTCCATCATTTTGGGCTCACTCTACCACGGCGATCACCTTAGCCGCGCGATGTACCAGCGCATTAGTAACATCGAAGATTTACCGCCCCTGTATACCCTGAACAAACCACTGTTAAGCGGTATTTCTAACGCGGAGGCGCGTCAGCCTGGTAAAGCCCCGAACTTCAGTGTGAACTGGACTGTGGGTGATTCTGCAATTGAGGTAATTAACGCGACGACGGGTAAAGATGAACTGGGCCGTGCCTCTCGTCTGTGTAAACACGCGCTGTACTGTCGTTGGATGCGCGTGCACGGTAAAGTTCCCAGTCATCTGTTACGTAGCAAGATCACCAAGCCAAATGTCTACCACGAATCGAAGCTGGCCGCGAAAGAATACCAAGCGGCTAAGGCGCGTCTGTTCACCGCCTTTATTAAGGCTGGCTTAGGGGCCTGGGTGGAAAAACCAACCGAGCAAGATCAATTCAGTCTGACCCCG（配列番号41）
哺乳類コドン最適化されたhADAT2：
ATGGAGGCGAAGGCGGCACCCAAGCCAGCTGCAAGCGGCGCGTGCTCGGTGTCGGCAGAGGAGACCGAAAAGTGGATGGAGGAGGCGATGCACATGGCCAAAGAAGCCCTCGAAAATACTGAAGTTCCTGTTGGCTGTCTTATGGTCTACAACAATGAAGTTGTAGGGAAGGGGAGAAATGAAGTTAACCAAACCAAAAATGCTACTCGACATGCAGAAATGGTGGCCATCGATCAGGTCCTCGATTGGTGTCGTCAAAGTGGCAAGAGTCCCTCTGAAGTATTTGAACACACTGTGTTGTATGTCACTGTGGAGCCGTGCATTATGTGTGCAGCTGCTCTCCGCCTGATGAAAATCCCGCTGGTTGTATATGGCTGTCAGAATGAACGATTTGGTGGTTGTGGCTCTGTTCTAAATATTGCCTCTGCTGACCTACCAAACACTGGGAGACCATTTCAGTGTATCCCTGGATATCGGGCTGAGGAAGCAGTGGAAATGTTAAAGACCTTCTACAAACAAGAAAATCCAAATGCACCAAAATCGAAAGTTCGGAAAAAGGAATGTCAGAAATCT（配列番号42）
【０３１４】
補足の配列2．本研究に用いた抗生物質耐性遺伝子のDNA配列。不活性化変異は太字で示している。
クロラムフェニコール耐性遺伝子（CamR）H193Y：
【化１１５】
2021500036.tif 000184
カナマイシン耐性遺伝子（KanR）Q4STOPおよびW15STOP：
【化１１６】
2021500036.tif 000185
スペクチノマイシン耐性遺伝子（SpectR）T89I：
【化１１７−１】
2021500036.tif 000186
【化１１７−２】
2021500036.tif 000187
カナマイシン耐性遺伝子（KanR）Q4STOPおよびD208N：
【化１１８】
2021500036.tif 000188
補足の注1．ベースコールのためのMatlabスクリプト。
補足の注2．インデル分析のためのMatlabスクリプト。
補足の注3．HBG1およびHBG2塩基編集およびインデルの分析のためのPythonスクリプト。
【０３１５】
均等物および範囲、参照による組み込み
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の態様の多くの均等物を認識するか、または慣例的に過ぎない実験作業を用いて特定する能力があるであろう。本発明の範囲は上の記載に限定されることを意図されず、むしろ添付の請求項において提示される通りである。
【０３１６】
反対に指示されないかまたはコンテキストから別様に明白でない限り、請求項において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は1つまたは1つよりも多くを意味し得る。反対に指示されないかまたはコンテキストから別様に明白でない限り、「または」を群の1つ以上の構成員間に包含する請求項または記載は、群の構成員の1つ、1つよりも多く、または全てが所与の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に関係する場合には満足していると考えられる。本発明は、群の厳密に1つの構成員が所与の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に関係する態様を包含する。本発明は、群の構成員の1つよりも多くまたは全てが所与の産物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別様に関係する態様を包含する。
【０３１７】
さらにその上、本発明は、請求項または記載の関係する部分の1つ以上からの1つ以上の限定、要素、節、記述用語などが別の請求項に導入される全ての変形、組み合わせ、および順列を包摂するということは理解されるはずである。例えば、別の請求項に従属するいずれかの請求項は、同じ元の請求項に従属するいずれかの他の請求項に見いだされる1つ以上の限定を包含するように改変され得る。さらにその上、別様に指示されないか、または矛盾もしくは非整合が生ずるであろうということが当業者にとって明白でない限り、請求項が組成物を記載しているところでは、本明細書において開示される目的のいずれかのために組成物を用いる方法が包含され、本明細書において開示される作る方法または当分野において公知の他の方法のいずれかに従って組成物を作る方法が包含されるということは理解されるはずである。
【０３１８】
要素が列記として、例えばマーカッシュ群フォーマットで提出されているところでは、要素の各下位群もまた開示されており、いずれかの要素（単数または複数）が群から取り除かれ得るということは理解されるはずである。用語「含む」は開放的であることを意図され、追加の要素またはステップの包含を許容するということもまた指摘される。一般的に、本発明または本発明の側面が特定の要素、特徴、ステップなどを含むと言われるところでは、ある種の本発明の態様または本発明の側面がかかる要素、特徴、ステップなどからなるかまたは本質的になるということは理解されるはずである。単純の目的のために、それらの態様は本明細書においていちいち具体的には提示しなかった。それゆえに、1つ以上の要素、特徴、ステップなどを含む本発明の各態様では、本発明は、それらの要素、特徴、ステップなどからなるかまたは本質的になる態様をもまた提供する。
【０３１９】
範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上、別様に指示されないかまたはコンテキストおよび／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現されている値は、コンテキストが明瞭に別様に述べていない限り、本発明の異なる態様において、書かれている範囲内のいずれかの特定の値を、範囲の下限の単位の十分の一までとり得るということが理解されるべきである。別様に指示されないかまたはコンテキストおよび／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現されている値は所与の範囲内のいずれかの部分範囲をとり得るということもまた理解されるはずであり、部分範囲のエンドポイントは、範囲の下限の単位の十分の一と同じ正確度で表現される。
【０３２０】
加えて、本発明のいずれかの特定の態様は請求項のいずれか1つ以上からはっきりと除外され得るということが理解されるべきである。範囲が与えられているところでは、範囲内のいずれかの値は請求項のいずれか1つ以上からはっきりと除外され得る。本発明の組成物および／または方法のいずれかの態様、要素、特徴、適用、または側面はいずれか1つ以上の請求項から除外され得る。簡潔さの目的のために、1つ以上の要素、特徴、目的、または側面が除外される態様の全てが本明細書においてはっきりと提示されているわけではない。
【０３２１】
本明細書において言及される全ての公開物、特許、および配列データベースエントリーは、上で列記されている項目を包含して、各個々の公開物または特許が参照によって組み込まれることを具体的にかつ個々に指示される場合と同様にそれらの全体がここに参照によって組み込まれる。不一致のケースでは、本明細書におけるいずれかの定義を包含する本願が優先される。
【図１−１】
2021500036.tif 000273
【図１−２】
2021500036.tif 000274
【図２−１】
2021500036.tif 000275
【図２−２】
2021500036.tif 000276
【図３−１】
2021500036.tif 000277
【図３−２】
2021500036.tif 000278
【図４】
2021500036.tif 000279
【図５−１】
2021500036.tif 000280
【図５−２】
2021500036.tif 000281
【図５−３】
2021500036.tif 000282
【図５−４】
2021500036.tif 000283
【図６−１】
2021500036.tif 000284
【図６−２】
2021500036.tif 000285
【図６−３】
2021500036.tif 000286
【図７−１】
2021500036.tif 000287
【図７−２】
2021500036.tif 000288
【図７−３】
2021500036.tif 000289
【図８−１】
2021500036.tif 000290
【図８−２】
2021500036.tif 000291
【図９−１】
2021500036.tif 000292
【図９−２】
2021500036.tif 000293
【図９−３】
2021500036.tif 000294
【図１０−１】
2021500036.tif 000295
【図１０−２】
2021500036.tif 000296
【図１１−１】
2021500036.tif 000297
【図１１−２】
2021500036.tif 000298
【図１２−１】
2021500036.tif 000299
【図１２−２】
2021500036.tif 000300
【図１３】
2021500036.tif 000301
【図１４−１】
2021500036.tif 000302
【図１４−２】
2021500036.tif 000303
【図１４−３】
2021500036.tif 000304
【図１４−４】
2021500036.tif 000305
【図１５】
2021500036.tif 000306
【配列表】
2021500036000001.app
【国際調査報告】
2021500036.tif 000307
2021500036.tif 000308
2021500036.tif 000309
2021500036.tif 000310
2021500036.tif 000311
2021500036.tif 000312
2021500036.tif 000313