(57)【要約】  （例えば、改善された単一分子シーケンシング等のための）方法及び／又はシステムの実施形態は、一組の標的核酸配列に関連する固有の分子識別子（ＵＭＩ）ベースの一組の分子を準備すること；前記一組のＵＭＩベースの分子、及び前記一組の標的核酸配列に相当する（例えば含む）一組の核酸分子に基づいて、一組のタグ付き核酸分子の生成を促進すること（例えば生成すること）；及び／又は前記一組のタグ付き核酸分子を用いて単一分子シーケンシングを促進すること（例えば行うこと）を含んでいてもよい。
2021500879.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一組の標的核酸配列に関連する、固有の分子識別子（ＵＭＩ）ベースの一組の分子を準備すること、
前記一組のＵＭＩベースの分子、及び、前記一組の標的核酸配列に対応する一組の核酸分子に基づいて、一組のタグ付き核酸分子の生成を促進すること、ここで、前記一組のタグ付き核酸分子の各タグ付き核酸分子は：
ランダムな「Ｎ」塩基セットを含むＵＭＩ領域、ここで、各ランダムな「Ｎ」塩基は、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基のうちのいずれか１つから選択される、及び
前記一組の標的核酸配列のうちの標的核酸配列に相当する標的領域
を含む、
単一分子シーケンシングを前記一組のタグ付き核酸分子を用いて促進すること、ここで、前記単一分子シーケンシングを行うことは：
第一の組の配列領域と第二の組の配列領域との間の比較を決定すること、ここで、前記第一の組の配列領域は、前記一組のタグ付き核酸分子のうちのシーケンシングされたあるタグ付き核酸分子の第一のＵＭＩ領域及び第一の標的領域を含み、前記第二の組の配列領域は前記一組のタグ付き核酸分子のうちのあるタグ付き核酸分子の第二のＵＭＩ領域及び第二の標的領域を含む、及び
前記第一の組の配列領域と前記第二の組の配列領域との間の前記比較に基づいて前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止すること、
を含む、改善された単一分子シーケンシングの方法。
【請求項２】
前記比較に基づいて前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することは、前記第一のＵＭＩ領域及び前記第一の標的領域が、前記第二のＵＭＩ領域及び前記第二の標的領域と一致することに呼応して、前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単一分子シーケンシングを促進することが、前記シーケンシングされたタグ付き核酸分子の前記第一の組の配列領域を決定すること、及び前記第一の組の配列領域を保存することを含み、前記第一の組の配列領域と前記第二の組の配列領域との間の前記比較を決定することが、前記第一の組の配列領域を、前記第二の組の配列領域との前記比較のために呼び出すことを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の組の配列領域を決定すること、前記第一の組の配列領域を保存すること、前記第一の組の配列領域と前記第二の組の配列領域との間の前記比較を決定すること、及び前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することが、それぞれ、前記単一分子シーケンシングの単回シーケンシングランの間に少なくとも実質的にリアルタイムで実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することが、前記比較、及び前記第一の組の配列領域と関連づけられたタグ付き核酸分子のシーケンシングについての定義された制限に基づいて、シーケンシングを停止することを含み、前記一組のタグ付き核酸分子が前記第一の組の配列領域と関連づけられた前記タグ付き核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記一組のＵＭＩベースの分子を調製することが、前記一組の標的核酸配列及び前記タグ付き核酸分子のシーケンシングについての前記定義された制限に基づいて、前記一組のタグ付き核酸分子の生成を促進するための多数の異なるＵＭＩ領域を決定することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一組のタグ付き核酸分子の前記ＵＭＩ領域の前記単一分子シーケンシングに基づいて、前記一組の核酸分子を含むサンプルから、微生物と関連する絶対分子数を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記単一分子シーケンシングを前記一組のタグ付き核酸分子で促進することが、前記一組の核酸分子からの過小に現れる核酸分子の検出及び絶対計数を改善するために前記単一分子シーケンシングを促進することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記一組の標的核酸配列が、第一の組の標的及び第二の組の標的のうちの少なくとも一方を含み、前記第一の組の標的が、１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的及び１８Ｓ  ｒＲＮＡ標的を含み、前記第二の組の標的が、１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的及びＨＰＶに関連する標的を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記単一分子シーケンシングを前記一組のタグ付き核酸分子で促進することが、read untilベースの技術で前記単一分子シーケンシングを促進することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
固有の分子識別子（ＵＭＩ）ベースの一組の分子、及び一組の標的核酸配列に対応する一組の核酸分子に基づいて、一組のタグ付き核酸分子の生成を促進すること、及び
前記一組のタグ付き核酸分子を用いた単一分子シーケンシングを促進すること、
を含み、前記単一分子シーケンシングを促進することは、
第一のＵＭＩ領域と第二のＵＭＩ領域との間の比較を決定すること、ここで、前記第一のＵＭＩ領域は、前記一組のタグ付き核酸分子のうちのシーケンシングされたあるタグ付き核酸分子のものであり、前記第二のＵＭＩ領域は、前記一組のタグ付き核酸分子のうちのあるタグ付き核酸分子のものであり；一組の配列領域及び第二の組の配列領域であり、前記第一の組の配列領域は、前記一組のタグ付き核酸分子のうちのシーケンシングされたタグ付き核酸分子の第一のＵＭＩ領域を含み、前記第二の組の配列領域は、前記一組のタグ付き核酸分子のうちのタグ付き核酸分子の第二のＵＭＩ領域及び第二の標的領域を含む、及び
前記第一のＵＭＩ領域と前記第二のＵＭＩ領域との間の前記比較に基づいて前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止すること、
を含む、改善された単一分子シーケンシングの方法。
【請求項１２】
前記比較を決定することが、前記第一のＵＭＩ領域、前記シーケンシングされたタグ付き核酸分子の第一の標的領域、前記第二のＵＭＩ領域、及び前記タグ付き核酸分子の第二の標的領域の間の前記比較を決定することを含み、前記第一の標的領域及び前記第二の標的領域が前記一組の標的核酸配列のうちのある標的核酸配列と関連し、前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することが、前記第一のＵＭＩ領域、前記第一の標的領域、前記第二のＵＭＩ領域、及び前記第二の標的領域の間の前記比較に基づいて前記シーケンシングを停止することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することが、前記比較、及び前記標的核酸配列に関連するタグ付き核酸分子のシーケンシングについての定義された制限に基づいて、前記シーケンシングを停止することを含み、前記一組のタグ付き核酸分子が前記標的核酸配列に関連するタグ付き核酸分子を含む、請求項１２に記載の前記方法。
【請求項１４】
前記標的核酸配列に関連するタグ付き核酸分子のシーケンシングについての前記定義された制限に基づいて前記標的核酸配列に関連する絶対分子数を決定することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記比較に基づいて前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することが、前記第一のＵＭＩ領域が前記第二のＵＭＩ領域と一致することに基づいて前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記一組のＵＭＩベースの分子が、複数の微生物分類群と関連する保存領域を標的とする規定された配列領域を含むＵＭＩベースのプライマーを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記一組のタグ付き核酸分子の生成を促進することは、前記一組の核酸分子のうちの過小に現れる核酸分子及び過大に現れる核酸分子と関連する一組のアンプリコンのバランスをとるために、前記一組のＵＭＩベースの分子及び前記一組の核酸分子に基づいて少なくとも一つの増幅プロセスを行うことを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記一組のタグ付き核酸分子の生成を促進することが：
前記一組の核酸分子のうちの、核酸分子の第一のサブセットを用いてＰＣＲ増幅プロセスを行うことに基づいて、核酸分子のＰＣＲ増幅サブセットを生成すること、及び
前記一組の核酸分子のうちの核酸分子の前記ＰＣＲ増幅サブセットと核酸分子のＰＣＲとは独立したサブセットとに基づいて前記一組のタグ付き核酸分子を生成すること、
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記一組の標的核酸配列が、抗生物質耐性及びウイルスカプシド遺伝子のうちの少なくとも１つに関連する標的核酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記一組のタグ付き核酸分子を用いて前記単一分子シーケンシングを促進することが、read untilベースの技術を用いて前記単一分子シーケンシングを促進することを含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１０月９日に出願された米国仮出願第６２／５６９，８５３号の利益を請求する。米国仮出願第６２／５６９，８５３号は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、概して、ゲノミクス及び分子生物学に関する。
【背景技術】
【０００３】
高スループットシーケンシング技術を使用して複雑な混合物中の標的を特定する場合に依然として対処が必要な１つの重要な課題は、過大に現れる（overrepresented）核酸標的が数回シーケンシングされて、前記初期核酸プール中における過小に現れる（underrepresented）分子の検出を妨害することである。過大に現れるテンプレート分子は数回シーケンシングされるために、シーケンシングランの出力されるシーケンシングリードの大部分を占める可能性があり、このことにより、過小に現れるテンプレート分子をシーケンシングするために使用できたはずのサイクルが消費されるおそれがある。
【発明の概要】
【０００４】
単一分子シーケンシング（ＳＭＳ）は、（例えばシーケンシング・バイ・シンセシス法等と比較して）様々な利点を有し得る。いくつかの例では、ＳＭＳはＤＮＡ分子の直接的特性決定を可能とし得る。ＳＭＳの現行の応用例としては、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及びＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅによって開発された技術が挙げられる。このようなプラットフォームは、ＤＮＡ分子のリアルタイムシーケンシングを可能にし得、これにより、適切なコンピュータハードウェア及びソフトウェアと組み合わせれば、シーケンシングデータのリアルタイムプロセッシングが可能となり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は方法のある実施形態の変形例をフローチャートに表したものを含む。
【図２】図２は方法のある実施形態の変形例をフローチャートに表したものを含む。
【図３】図３は方法のある実施形態の変形例をフローチャートに表したものを含む。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下の実施形態の記載は、実施形態を限定することを意図するものではなく、任意の当業者が製造及び使用を行うことを可能にすることを意図するものである。
【０００７】
１．概要
図１〜３に示すように、（例えば、改善された単一分子シーケンシング等のための）方法１００のいくつかの実施形態は、
一組の標的核酸配列に関連づけられた、固有の分子識別子（ＵＭＩ）ベースの一組の分子を準備すること−Ｓ１１０；
前記ＵＭＩベースの一組の分子と、前記一組の標的核酸配列に対応する（例えば含む等）一組の核酸分子とに基づく一組のタグ付き核酸分子の生成を促進する（例えば生成する等）こと−Ｓ１２０；及び／又は
前記一組のタグ付き核酸分子を用いた単一分子シーケンシングを、促進すること（例えば実施すること等）−Ｓ１３０を含んでいてもよい。
付加的又は代替的に、方法１００のいくつかの実施形態は、前記単一分子シーケンシングに基づいて分子数を決定することＳ１４０；及び／又は任意の他の適切なプロセスを含んでいてもよい。
【０００８】
ある具体的な例では、（例えば、改善された単一分子シーケンシングのための）方法１００は、
一組の標的核酸配列に関連づけられた一組のＵＭＩベースの分子（例えば、標的核酸配列の標的配列領域に相補的な標的関連領域を含むＵＭＩベースの分子群等）を準備すること；
前記一組のＵＭＩベースの分子と、前記一組の標的核酸配列に対応する（例えば、含む等）一組の核酸分子とに基づく一組のタグ付き核酸分子の生成を促進すること、ここで、前記一組のタグ付き核酸分子に属するそれぞれのタグ付き核酸分子は、ランダムな「Ｎ」塩基のセットを含む少なくとも１つのＵＭＩ領域と、前記一組の標的核酸配列に属する標的核酸配列に対応する少なくとも１つの標的領域とを含み、ランダムな「Ｎ」塩基のそれぞれは、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基から選択される；及び／又は
前記一組のタグ付き核酸分子を用いて単一分子シーケンシングを促進すること、ここで、前記単一分子シーケンシングを促進することは、
第一の組に属する配列領域と第二の組に属する配列領域との間の比較を決定すること（例えば、前記第一の組に属する配列領域と前記第二の組に属する配列領域との間の配列類似性を比較すること等）を含み、前記第一の組に属する配列領域は、前記一組のタグ付き核酸分子に属するシーケンシングされたあるタグ付き核酸分子（例えば、前記単一分子シーケンシングの同じシーケンシングランによりあらかじめシーケンシングされたタグ付き核酸分子）の第一のＵＭＩ領域と第一の標的領域とを含み、前記第二の組に属する配列領域は、前記一組のタグ付き核酸分子に属するあるタグ付き核酸分子の第二のＵＭＩ領域及び第二の標的領域を含む、及び、
前記第一の組に属する配列領域と前記第二の組に属する配列領域との間の比較に基づいて（例えば、前記タグ付き核酸分子が対応する分子数に寄与しないように；前記タグ付き核酸分子に対応する核酸配列が過大に現れないように；等々）、前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを（例えば、前記シーケンシングラン中に；等々）停止すること、を含む、
を含んでもよい。
【０００９】
ある具体的な例では、（例えば、改善された単一分子シーケンシングのための）方法１００は、
一組のＵＭＩベースの分子と、一組の標的核酸配列に対応する一組の核酸分子とに基づいて、一組のタグ付き核酸分子の生成を促進すること；及び／又は
前記一組のタグ付き核酸分子を用いた単一分子シーケンシングを促進すること、ここで、前記単一分子シーケンシングを促進することは、
第一のＵＭＩ領域と第二のＵＭＩ領域との間の比較を決定すること、ここで、前記第一のＵＭＩ領域は、前記一組のタグ付き核酸分子に属するシーケンシングされたあるタグ付き核酸分子のＵＭＩ領域であり、前記第二のＵＭＩ領域は、前記一組のタグ付き核酸分子に属するあるタグ付き核酸分子のＵＭＩ領域であり；一組の配列領域及び第二の組の配列領域、ここで、前記第一の組の配列領域は、前記一組のタグ付き核酸分子に属するシーケンシングされたタグ付き核酸分子の第一のＵＭＩ領域を含み、前記第二の組の配列領域は、前記一組のタグ付き核酸分子に属するタグ付き核酸分子の第二のＵＭＩ領域及び第二の標的領域を含む、及び
前記第一のＵＭＩ領域と前記第二のＵＭＩ領域との間の比較に基づいて前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止すること、を含む、
を含んでもよい。
【００１０】
付加的又は代替的に、方法１００及び／又はシステムのいくつかの実施形態は、
１又は複数のユーザー（例えば、対象；ヒト；動物；患者；植物；等々）からの１つ又は複数のサンプル（例えば、生物サンプル）を処理すること（例えば、採取すること；方法１００の実施形態の一部を促進するためにサンプル調製すること；方法１００の実施形態の一部を行うこと；等々）、サンプルの例としては、腸部位（例えば、便サンプル等に基づいて分析されるような）、皮膚部位、鼻部位、口部位、生殖器部位、及び／又は他の適切な生理学的部位などを含んでもよい１つ又は複数の採取部位から採取した生物サンプルが挙げられる；
微生物配列データセット（例えば、方法１００の実施形態の一部に関連する等の、タグ付された核酸分子を用いた単一分子シーケンシングに基づいて作成された微生物配列データセット；タグ付き核酸分子のＵＭＩ領域等のシーケンシングされたＵＭＩ領域に関連づけられたバイオインフォーマティック分析から作成された微生物配列データセット；標的核酸配列に関連する核酸分子の分子数を含む微生物配列データセット；等々）に基づいて、マイクロバイオーム特性（例えば、微生物組成特性；微生物機能特性；診断及び／又は療法に関連する等の微生物に関連する状態と関連する特性；等々）を決定すること
を含む、及び／又は別の様式で関連していてもよい。しかしながら、方法１００のいくつかの実施形態は、付加的又は代替的に、任意の適切なプロセスを含んでいてもよい。
【００１１】
方法１００及び／又はシステムのいくつかの実施形態は、ＵＭＩ分子の使用により単一分子シーケンシング（及び／又は他のシーケンシング技術）を改善する機能を果たすことができるが、これは、例えば、
過大に現れるテンプレート核酸分子及び過小に現れるテンプレート核酸分子を含むサンプルについてのシーケンシング結果を改善すること；
増幅プロセス（例えば、ＰＣＲプロセス）及び／又は濃縮（enrichment）プロセスに関連するバイアスを低減すること；
（例えば、クラスター生成プロセス中等の）ＤＮＡポリメラーゼと関連するエラーを低減すること；
（例えば、過大に現れるテンプレート核酸分子について用いられる、無駄に消費されるシーケンシングサイクルを低減することによる等）シーケンシング効率を改善すること；
核酸分子の直接的特性決定を可能にすること；及び／又は
他の任意の適切な改善を可能にすることによる改善。
ある具体的な例では、方法１００及び／又はシステムは、シーケンシング技術（例えば、リードアンティルベース（ｒｅａｄ  ｕｎｔｉｌ−ｂａｓｅｄ）のシーケンシング技術、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇイｉｅｓ社の技術等のナノポア技術、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の単一分子シーケンシング技術等の単一分子シーケンシング技術等）及びＵＭＩ分子を活用して、過大に現れるテンプレート核酸分子及び過小に現れるテンプレート核酸分子をシーケンシングすることに関連する問題を克服しつつ、リアルタイムシーケンシング及び／又は処理（例えば、同じシーケンシングラン中に、シーケンシングされている現在のタグ付き核酸分子を、先にシーケンシング済のタグ付き核酸分子と比較すること等）を実施できる。
【００１２】
付加的又は代替的に、方法１００及び／又はシステムのいくつかの実施形態は、（例えば、タグ付き核酸分子のＵＭＩ領域のシーケンシング及び／又は分析から決定される分子数等に基づいて）サンプル中に存在する微生物を定量するように機能することができ、そのような定量は、例えば、微生物に関連する特性（例えば、マイクロバイオーム組成；マイクロバイオーム機能等に関連する特性）の決定における使用のためのものである。しかしながら、微生物定量は任意の適切な方法で行うことができる。
【００１３】
付加的又は代替的に、方法１００及び／又はシステムのいくつかの実施形態は、微生物に関連する検出（例えば、サンプルの生命体の分類学的検出及び／又は定量、並びに同じサンプル中に存在又は発現する遺伝子の検出；保存分類学的遺伝子を有する生命体の方向性のある検出及び／又は定量、及び／又は、１つ又は複数の生物サンプル中の他の真核生物、原核生物、ウイルス性生命体、及び／又は特性決定済み又はまだ特性決定されていないＤＮＡを有する他の適切な微生物の偏りなく検出及び／又は定量；新規、未知、及び／又は未確認の潜在的な核酸標的の検出及び／又は定量；抗生物質耐性、毒性因子、分子マーカー、ウイルスカプシド遺伝子、関心のある適切な標的等に関連するもの等の、既知又は特定済みの核酸標的の偏りのない検出及び／又は定量）を促進する機能を果たすことができる。
【００１４】
方法１００及び／又はシステムのいくつかの実施形態の任意の適切な部分は、抗生物質耐性、毒性因子、分子マーカー、ウイルスカプシド遺伝子、関心のある適切な標的のうち１つ以上−を含む、−のためのものである、−を標的とする、−を用いる、−を処理する、−に対応する、及び／又は、−にその他の形で関連するものであってもよい。ある具体的な例では、方法１００及び／又はシステムのいくつかの実施形態は、以下を含むことができる：
シーケンシング、
分子数を決定すること（例えば、定量を促進するために、タグ付き核酸分子のＵＭＩ領域に基づいて絶対分子数を決定すること等）、
異なる標的配列を区別すること（例えば、ＵＭＩ領域と、Read Until技術及び／又は適切なシーケンシング技術とを組み合わせ使用すること等により区別する）、
特異的ＤＮＡフラグメントを選択すること（例えば、１６Ｓと１８Ｓ；１６ＳとＨＰＶ（例えば、ＨＰＶのＥｌ遺伝子）；及び／又は分類学的若しくは分類学非依存的配列の他の適切な組み合わせ、等の２以上の異なるライブラリから；サンプル内のＤＮＡ分子の存在量を正常化するため；等々）、及び／又は
部分的及び／又は完全長の分類学的マーカー遺伝子（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、等）、部分的及び／又は完全長のマーカー遺伝子（例えば、ウイルスカプシド遺伝子；抗生物質耐性と関連する遺伝子及び／又はマーカー；等々）、及び／又は任意の適切な遺伝子、マーカー、及び／又は標的のための、他の適切なプロセス。
ある具体的な例では、前記一組の標的核酸配列は、第一の組の標的及び第二の組の標的のうち少なくとも一方を含んでもよく、ここで、前記第一の組の標的は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的及び１８Ｓ  ｒＲＮＡ標的を含み、前記第二の組の標的は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的及びＨＰＶに関連する標的を含む。ある具体的な例では、前記一組の標的核酸配列は、抗生物質耐性及びウイルスカプシド遺伝子のうちの少なくとも一方と関連する標的核酸配列を含んでいてもよい。
【００１５】
しかしながら、方法１００及び／又はシステムのいくつかの実施形態は、任意の適切な機能性を含んでいてもよい。
【００１６】
方法１００（例えば、単一分子シーケンシングを促進すること−Ｓ１３０、等）及び／又はシステムのいくつかの実施形態の一部は、好ましくは、単一分子シーケンシングを含む、単一分子シーケンシングを行う、単一分子シーケンシングと関連する（例えば、単一分子シーケンシングのためのライブラリ調製を促進する等）、及び／又はこれら以外の様式で単一分子シーケンシングを促進する。単一分子シーケンシングは、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＳＭＲＴシーケンシング等）、ナノポアシーケンシング（例えば、Ｏｘｆｏｒｄナノポアシーケンシング等）、ロングリード（ｌｏｎｇ−ｒｅａｄ）シーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のロングリードシーケンシング等）、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子シーケンシング、単一分子シーケンシングと関連する任意の世代番号のシーケンシング技術（例えば、第二世代シーケンシング技術、第三世代シーケンシング技術、第四世代シーケンシング技術等）、及び／又は任意の他の適切な種類の単一分子シーケンシング、のうちいずれか１つ又は複数を含んでいてもよい。
【００１７】
ある変形例では、単一分子シーケンシングは増幅とは独立した様式で用いることができ、これにより、ＰＣＲ増幅及び／又は他の適切な増幅プロセスの間に導入されるバイアスを除くことができる。ある変形例では、単一分子シーケンシングはＤＮＡポリメラーゼとは独立して行うことができ、これにより、クラスター生成のステップの間にＤＮＡポリメラーゼによって導入される可能性のある誤りを回避することができる。
【００１８】
ある具体的な例においては、膜上のナノポアを用いて分子をシーケンシングし、特定のポアについてシーケンシングを停止させ、分析中のＤＮＡ分子を放出する、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ社のシーケンシング技術及び／又は他の適切なread untilベースの技術（例えば、ある条件が満たされるまでシーケンシングリードを読み取らせること等）を用いることができる。ある具体的な例においては、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ社のシーケンシング技術及び／又は他の適切なread untilベースの技術は、特定のＤＮＡフラグメント（例えば、２つの異なるライブラリ）の選択を少なくとも可能にすることができ、これにより、サンプル中のＤＮＡ分子（例えば、過小に現れるＤＮＡ分子；過大に現れるＤＮＡ分子；等々）の存在量を正常化及び／又はバランス化させることができる；及び／又は、特定のＤＮＡ分子のシーケンシングをある数に限定することが可能になり、例えば、特定のＤＮＡ分子について多数のリード値を得るのではなく所与の分子がシーケンシングされる回数を制限することができ、このような制限は、例えば、タグ付き核酸分子及び／又は他の適切な分子のＵＭＩ領域、標的領域、及び／又は他の適切な領域に基づくものであってもよい。
【００１９】
付加的又は代替的に、方法１００及び／又はシステムのいくつかの実施形態は、好ましくは、任意の適切なシーケンシング技術−を含む、−を行う、−に関連する（例えば、該シーケンシング技術のためのライブラリ準備を促進する等）、及び／又は、−をその他の様式で促進し、ここで、該シーケンシング技術としては、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術、キャピラリーシーケンシング、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング（例えば、マイクロ流体Ｓａｎｇｅｒシーケンシング等）、ピロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、及び／又はその他の適切なシーケンシング技術のうち任意の１つ又は複数が挙げられる。ＮＧＳ技術としては、ハイスループットシーケンシング（例えば、ハイスループットシーケンシング技術；超並列シグネチャーシーケンシング（massively parallel signature sequencing）、Ｐｏｌｏｎｙシーケンシング、４５４ピロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子シーケンシング等によって促進されたハイスループットシーケンシング）、任意の世代番号のシーケンシング技術（例えば、第二世代シーケンシング技術、第三世代シーケンシング技術、第四世代シーケンシング技術、等）、アンプリコン関連シーケンシング（例えば、標的化アンプリコンシーケンシング）、メタゲノム関連シーケンシング（例えば、メタトランスクリプトームシーケンシング、メタゲノムシーケンシング、等）、シーケンシング・バイ・シンセシス、トンネル電流シーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、質量分析シーケンシング、顕微鏡法に基づく技術、及び／又は任意の適切なＮＧＳ技術のいずれか１つ又は複数を挙げることができる。
【００２０】
方法１００及び／又はシステムのいくつかの実施形態は、１つ又は複数の微生物に関連する状態の（例えば、タグ付き核酸分子を用いた単一分子シーケンシングに由来する微生物配列データセット等に基づいて）特性決定及び／又は療法を促進するための単一分子シーケンシング及び／又は他の適切な態様（例えば、本明細書中に記載の態様）を改善することができ、この状態は、疾患、症状、原因（例えば、トリガー等）、障害、関連リスク（例えば、傾向スコア等）、関連重篤度、挙動（例えば、カフェイン摂取、習慣、食餌、等）、及び／又は微生物に関連する状態に関係する、その他任意の適切な態様のうちの１つ又は複数を含んでもよい。微生物に関連する状態は、疾患に関連する１つ又は複数の状態を含んでもよく、そのような疾患関連状態は、以下のいずれか１つ又は複数が含んでもよい：
胃腸に関連する状態（例えば、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、セリアック病、クローン病、鼓脹、痔疾患、便秘、逆流、血便、下痢、等）；
アレルギーに関連する状態（例えば、小麦、グルテン、乳製品、大豆、ピーナッツ、貝、木の実、卵、等に関連するアレルギー及び／又は不耐性）；
皮膚に関連する状態（例えば、にきび、皮膚筋炎、湿疹、酒さ、乾燥肌、乾癬、ふけ、光過敏症、等）；
歩行運動に関連する状態（例えば、痛風、関節リウマチ、骨関節炎、反応性関節炎、多発性硬化症、パーキンソン病、等）；
がんに関連する状態（例えば、リンパ腫；白血病；芽細胞腫；胚細胞腫瘍；カルシノーマ；肉腫；乳がん；前立腺がん；基底細胞がん；皮膚がん；結腸がん；肺がん；任意の適切な生理学的領域に関連するがん状態；等々）、
心血管に関連する状態（例えば、冠動脈性心疾患、炎症性心疾患、心臓弁膜症、肥満、卒中、等）、貧血状態（例えば、サラセミア；鎌状赤血球；悪性貧血；ファンコニ；溶血性；再生不良性；鉄欠乏；等々）、
神経関連状態（例えば、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、不安神経症、アスペルガー症候群、自閉症、慢性疲労症候群、うつ病、等）、
自己免疫に関連する状態（例えば、スプルー、ＡＩＤＳ、シェーグレン、紅斑性狼瘡、等）、
内分泌に関連する状態（例えば、肥満、グレーブス病、橋本甲状腺炎、代謝障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、等）、
ライム疾患状態、コミュニケーションに関連する状態、睡眠に関連する状態、代謝に関連する状態、体重に関連する状態、痛みに関連する状態、遺伝関連状態、慢性疾患、及び／又はその他任意の適切な種類の疾患関連状態。
付加的又は代替的に、微生物に関連する状態は、１つ又は複数のヒトの挙動状態を含んでもよく、該挙動状態は、カフェイン摂取、アルコール摂取、他の食品の摂取、栄養補助食品摂取、プロバイオティクス関連挙動（例えば、摂取、忌避、等）、他の食事挙動、習慣挙動（例えば、喫煙；低、中、及び／又は極端な運動状態等の運動状態、等）、閉経、他の生物学的プロセス、社会的挙動、他の挙動、及び／又はその他任意の適切なヒトの挙動状態のうち任意の１つ又は複数を含んでいてもよい。状態は、任意の適切な表現型（例えば、ヒト、動物、植物、菌体、等について測定可能な表現型）と関連づけることができる。
【００２１】
方法１００及び／又はシステムの実施形態は、単一のユーザーからの１つ又は複数の生物サンプルについて実施することができ、例えば、前記単一のユーザーからの１つ又は複数の生物サンプルからのシーケンシングライブラリの調製を促進するため、及び／又は前記シーケンシングライブラリ（例えば、タグ付き核酸分子を含むシーケンシングライブラリ等）を用いた単一分子シーケンシングを促進するために、方法１００の実施形態の一部を実施することに関連して実施することができる。付加的又は代替的に、実施形態は、一組のユーザー（例えば、前記ユーザーを含む対象の集団、前記ユーザーを除外した対象の集団、等）からの生物サンプルについて実施することができ、ここで前記一組のユーザーは、任意の適切な種類の特性（例えば、微生物に関連する状態、人口統計学的特徴挙動、マイクロバイオーム組成及び／又は機能、等に関連）について類似及び／又は非類似の対象を含んでいてもよい；ユーザーのサブグループ（例えば、方法１００の実施形態の一部に影響を及ぼす特性等の特性を共有するサブグループ等）について実施することができる；植物、動物、微生物（例えば、環境微生物群由来の微生物等）、及び／又はその他任意の適切な実体について実施することができる。したがって、一組のユーザー（例えば、対象の集団、対象のセット、ユーザーのサブグループ、等）に由来する情報を使用して、その後のユーザーのための追加的洞察（例えば、方法１００の実施形態の一部を実施する際に使用される実験パラメータに関連して；あるタグ付き核酸分子についてのシーケンシングを停止させる際に使用される配列領域判定基準に関連する等の追加的洞察）を提供することができる。ある変形例では、生物サンプルの合算セットは多種多様のユーザーと関連していていもよく、それらユーザーのために処理することができるが、それらユーザーは、例えば以下のうち１つ又は複数についてのユーザーを含む：異なる人口構成（例えば、性別、年齢、配偶者の有無、人種、国籍、社会経済的地位、性的指向、等）、異なる微生物に関連する状態（例えば、健康及び疾患状態；異なる遺伝学的傾向；等々）、異なる生活状況（例えば、独り暮らし、ペットと同居、重要な他者と同居、子どもと同居、等）、異なる食習慣（例えば、雑食性、菜食主義、完全菜食主義、糖分摂取、酸摂取、カフェイン摂取、等）、異なる挙動上の傾向（例えば、身体活動レベル、薬物使用、アルコール使用、等）、異なる可動レベル（例えば、所与の時間内で移動する距離に関連する）、及び／又はその他任意の適切な特徴（例えば、マイクロバイオーム組成及び／又は機能等に影響を及ぼす、相関する、及び／又はその他の方法で関連している特性）。いくつかの例では、ユーザー数が増加するにつれ方法１００の実施形態の一部で実施されるプロセスの予測力が増大し得るが、これは例えば、様々なユーザーを彼らのマイクロバイオームに基づいて特性決定することに関連して（例えば、前記ユーザーのサンプルの異なる採取部位に関連して等）予測力が増大し得、これは例えば、マイクロバイオームに関連する特性を本明細書中で記載する単一分子シーケンシングからのシーケンシング出力に基づいて決定することができる場合等であってもよい。しかしながら、方法１００及び／又はシステムの実施形態の一部は、任意の適切な単数又は複数の実体について任意の適切な１つ又は複数の方法で実施及び／又は構成することができる。
【００２２】
本明細書中に記載するデータ（例えば、標的核酸配列等の核酸配列；ＵＭＩ配列；ＵＭＩベースの分子について等の分子設計データ；シーケンシング入力及び／又はシーケンシング出力等のシーケンシングデータ；例えばシーケンシングを停止するためのシーケンシングパラメータ等の、シーケンシングデータ；ＵＭＩ関連タグ付けに関連するデータ；微生物配列データセット；マイクロバイオーム特性；ユーザーデータ；補足データ；微生物に関連する状態に関連づけられたデータ；微生物に関連する特性決定；等々）は、以下のうちの１つ又は複数を含む任意の適切な時間の指標（例えば、秒、分、時、日、週、等）と関連付けることができる：
いつデータを収集したかを示す時間指標（例えば、いつサンプルを収集したかを示す時間指標等）、
いつデータを判定したかを示す時間指標（例えば、いつ処理操作を開始し、完了したかを示す時間指標；いつタグ付標的分子をシーケンシングしたか、及び／又は、いつ関連データが保存されたを示す時間指標、等）、
いつ送信、受信、及び／又はその他の様式で処理したかを示す時間指標；
データによって記載されるコンテンツにコンテキストを提供する時間指標；
時間指標における変化；及び／又は
その他、時間に関連する任意の適切な指標。
本明細書中で記載する分子及び／又は任意の適切な生物学的成分は、任意の適切なサイズ（例えば、配列長さ等）を含んでいてもよい。配列領域及び／又はその他の適切な構成要素の比較は任意の適切な態様に従うものであってよく、これには、配列類似性（例えば、パーセンテージ；塩基数；ＵＭＩ領域及び／又は標的領域を含む任意の適切な配列領域に対して；等々）、完全配列一致、配列相違性，配列位置、標的の種類、配列領域の種類、関連する微生物の種類、微生物に関連する状態の種類、及び／又はその他任意の適切な態様、のうち任意の１つ又は複数が含まれる。
【００２３】
付加的又は代替的に、パラメータ、メトリクス、入力、出力、及び／又は他の適切なデータは、スコア、個々の値、合計値、二進値、相対値、等級、信頼水準、識別子、スペクトルに従った値、及び／又はその他任意の適切な種類の値のうちの、任意の１つ又は複数を含む値の種類と関連していてもよい。本明細書中に記載する任意の適切な種類のデータ、成分（例えば、生物学的成分）、（例えば、処理操作等の）生成物は、（例えば、異なるサンプル処理操作；モデル；混合物；シーケンシング技術等についての）入力として使用でき、（例えば、異なるモデル；モジュール；サンプル処理操作の生成物；等々）の出力として生成することができ、及び／又は、方法１００及び／若しくはシステムに関連する任意の適切な成分について任意の適切な様式で操作することができる。
【００２４】
本明細書中で記載する方法１００及び／又はプロセスの実施形態の１つ又は複数の例及び／又は部分は、本明細書中で記載するシステム、成分、及び／又は実体の１つ又は複数の例により、及び／又はそれらを使用して、非同期的に（例えば、連続的に）、同時に（例えば、マルチレプシング；方法１００の実施形態の一部における複数のサンプルの処理；シーケンシング分析に関連づけられた並行データ処理及び／又は方法１００の実施形態の一部；等々）、トリガー事象（例えば、方法１００の実施形態の一部の実行）と時間的に関連して（例えば、実質的に同時に、応答して、順次、前に、後に、等）、及び／又は任意の他の適切な順序で、任意の適切な時間及び頻度にて、実施することができる。
【００２５】
しかしながら、方法１００及び／又はシステムは任意の適切な様式で構成することができる。
【００２６】
２．１  ＵＭＩベースの分子の調製
方法１００の実施形態は、一組のタグ付き核酸分子の生成を促進する際等における、１つ又は複数の標的のタグ付け（例えば、ＵＭＩベースの分子；ＵＭＩ領域；リンカー領域等によるタグ付け）、増幅、及び／又は他の適切な処理を促進するために使用される分子を調製する機能を果たし得る、１つ又は複数の標的（例えば、一組の標的核酸配列；微生物に関連する標的；等々）に関連づけられたＵＭＩベースの分子（例えば、ＵＭＩベースのプライマー等）のセットを調製すること（例えば、決定すること、生成すること等）Ｓ１１０を含んでいてもよい。
【００２７】
標的（例えば、関心のある標的；既知又は特定された標的；未知又は先には未確認の標的；等々）は、バイオマーカー；遺伝子（例えば、遺伝子発現マーカー等）；配列領域（例えば、遺伝子配列；遺伝子、染色体、微生物に関連する状態、保存配列、突然変異、多型を特定する配列；アミノ酸配列；ヌクレオチド配列；等々）；核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡから得られるｃＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、等）細胞；小分子；タンパク質；ペプチド；１又は複数の微生物に関連する状態に関連する標的（例えば、１又は複数の微生物に関連する状態と関連する診断、予後、予測、及び／又は療法に情報を与える標的、等）；微生物組成に関連する標的（例えば、サンプル中に存在する微生物の分類学的分類を示す標的；任意の適切な分類群の微生物の存在、存在量、及び／又は不在を示すマーカー、等）及び／又は微生物機能（例えば、微生物と関連する機能的特性を示す標的等）；脂質；全核酸；全微生物；代謝産物；炭水化物；及び／又は標的の任意の適切な組み合わせ（例えば、複数のライブラリからの組み合わせ、等々）及び／又は種類、のうち任意の１つ又は複数を含んでいてもよい。ある具体的な例においては、標的は、部分的及び／又は完全長の分類学的マーカー遺伝子（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、等々）、部分的及び／又は完全長の遺伝子及び／又はマーカー（例えば、ウイルスカプシド遺伝子；抗生物質耐性に関連する遺伝子及び／又はマーカー；等々）、及び／又は任意の適切な遺伝子及び／又はマーカーを含んでいてもよい。
【００２８】
ＵＭＩベースの分子は、好ましくは、１つ又は複数の標的（例えば、微生物関連核酸標的等）に関連づけられており、そのような関連づけは、例えば、前記１つ又は複数の標的（例えば、核酸標的等）の１つ又は複数の配列領域に対し相補的である１つ又は複数の配列領域を含む標的関連領域を含む、前記標的を標的とする、前記標的により増幅可能である；前記標的によりプロセシング可能である；前記標的をタグ付けすることができる等であるが、付加的又は代替的に、任意の適切な成分と関連づけていてもよい。
【００２９】
ある変形例では、ＵＭＩベースの分子は、ＵＭＩベースのプライマー（例えば、１つ又は複数のＰＣＲプロセス等の１つ又は複数の増幅プロセスにおける使用のためのプライマー；１つ又は複数のＵＭＩ領域を含むプライマー；等々）を含んでいてもよいが、付加的又は代替的に、任意の適切な目的のために任意の適切な種類のＵＭＩベースの分子を含んでいてもよい。いくつかの例では、ＵＭＩベースのプライマーは、縮重プライマーを除外することができる（ここで例えば、縮重プライマーは、ＰＣＲプロセスの間にバイアスを導入し得るが、これは、例えば、前記縮重プライマーの配列に強く合致する標的の増幅が優先されてしまうことによるものであり、これによりＰＣＲ効率が様々となり、種々のテンプレートの検出の限界に影響を及ぼす；一方、ｍｉｎＩＯＮ等のプラットフォームは、プラットフォームが保存領域を標的とする定義された配列を有するプライマーと共に用いることができる場合、より長いリードの生成を可能にできる；等々）。ある具体的な例では、前記一組のＵＭＩベースの分子は、複数の微生物分類群に関連する保存領域を標的とする既定の配列領域を含むＵＭＩベースのプライマーを含んでいてもよい（例えば、そのようなプライマーの使用は、バイアスを低減することができ、及び／又は標的配列の選択的増幅を低減することができる、等々）。いくつかの例では、ＵＭＩベースのプライマー（例えば、複数の微生物分類群と関連する保存領域を標的とする既定の配列領域を含む等）は、様々なテンプレート標的の間で同じか又は類似した親和性を含んでもよく、これにより、タグ付き核酸分子を生成する際におけるＰＣＲベースのＵＭＩ組み入れから生じるネガティブな効果を低減できる。いくつかの例では、ＵＭＩベースのプライマーの使用は、種々の標的についてのシーケンシングの量を制御する際に用いることができ、その例としては、生成したデータの量が、異なる微生物分類群の特定、及び／又は任意の適切な標的の特定を可能にし得るまでシーケンシングを進行することが可能とされている場合である（ここで、例えば、標的を特定するために要求されるシーケンシングされた核酸分子の数、及び／又は前記シーケンシングリードの深さ等のシーケンシングの量は、具体的な標的に応じて変わり得る；等々）。
【００３０】
ＵＭＩベースの分子（及び／又はプライマー及び／又は本明細書中に記載する他の分子等の他の適切な分子）は、好ましくは、１つ又は複数のＵＭＩ領域を含む（例えば、ここで、ＵＭＩベースの分子は単一のＵＭＩ領域を含んでいてもよく；ＵＭＩベースの分子は複数のＵＭＩ領域を含んでいてもよい；等々）。ＵＭＩ領域は、ランダムな「Ｎ」塩基（例えば、Ｎデオキシヌクレオチド塩基）のセットを含んでもよく、ここで、各々のランダムな「Ｎ」塩基は、「Ａ」アデニン塩基、「Ｇ」グアニン塩基、「Ｔ」チミン塩基、及び「Ｃ」シトシン塩基のいずれか１つから選択される。「Ｎ」塩基は、連続に位置してもよく（例えば、「Ｎ」塩基のストリング等）、離れて（例えば、所定塩基によって；任意の適切な配列領域によって、等により離れて）位置してもよく、及び／又はＵＭＩベースの分子の任意の適切な配列位置に位置し得る。ＵＭＩ領域は、任意の適切な配列長（例えば、少なくとも２「Ｎ」塩基；２１「Ｎ」塩基未満；任意の適切な数の「Ｎ」塩基；等々）を含んでいてもよい。ある具体的な例においては、ＵＭＩ領域（例えば、所与の反応について；所与のタグ付けプロセスについて；等々）は、各々、一定の長さ（例えば、１０ヌクレオチド長等）を含んでいてもよい。ある具体的な例では、異なる反応は、異なる長さのＵＭＩ領域に基づき得る（例えば、第一の反応について全てのＵＭＩ領域が１０ヌクレオチド長を含む；第二の反応について全てのＵＭＩ領域が１５ヌクレオチド長を含む；他の反応は、可変長を有するＵＭＩ領域を含み、例えば第三反応についてＵＭＩ領域は３〜１５ヌクレオチド長を含む；等々）。しかしながら、任意の適切な長さ（例えば、一定の長さ；可変長さ；等々）を有する、任意の数及び／又は種類のＵＭＩ領域を、１つ又は複数の反応について用いることができる。付加的又は代替的に、ＵＭＩ配列領域は、一定の（例えば、非ランダム等）ヌクレオチド配列を単独で含んでもよく、一定のヌクレオチド配列とランダムなヌクレオチド配列（例えば、「ＡＴＣＮＮＮＮＮ」配列、「ＮＮＡＴＣＮＮＮＮ」配列、「ＮＮＮＮＡＴＣ」配列、「ＮＮＡＴＣＮＮＧＴＮＮＮ：」配列、ここで、「Ｎ」塩基はランダムな「Ｎ」塩基等）との組み合わせで含んでもよく、及び／又はランダムなヌクレオチド配列単独で含んでいてもよい。
【００３１】
ＵＭＩ領域配列長さは、処理（例えば、定量、分化、出発核酸材料、等）される標的の量及び／又は種類に基づいて決定することができる。ここで例えば、ＵＭＩ領域が長いほど、より多数のランダムな塩基の組み合わせ及びより大きな固有の識別子セットを容易とする（これらは、例えば、分化される多数の種類の標的を分析するために使用される；多数のテンプレート、核酸材料、及び／又は遺伝子変異体を含むサンプルを分析するために使用される、等々）。一例においては、異なる長さ及び／又は配列のＵＭＩ領域を、出発核酸材料（例えば、腸、口、皮膚、性器、及び／又は鼻サンプルからの微生物から抽出された核酸等）の性質及び量に依存して使用及び／又は導入することができる。ある具体的な例においては、一組のＵＭＩベースの分子（例えば、前記一組のＵＭＩベースの分子のＵＭＩ領域等）の長さ及び／又は他の特性によって可能となる組み合わせの数は、出発材料中に存在するテンプレート核酸分子の数よりも少なくとも単一の分子分は多い必要があり、その上限値は任意の所与の組み合わせ数である。
【００３２】
一例では、前記ＵＭＩ領域は４ＮのＵＭＩ領域（例えば、４つの「Ｎ」塩基を含むＵＭＩ領域等）を含んでいてもよい。ある具体的な例では、前記ＵＭＩ領域は８ＮのＵＭＩ領域を含んでいてもよく、これは例えば１６Ｓ遺伝子の増幅プロセスのためのものであり、この際、例えば、１つ又は複数のタグ付け促進分子を添加でき、該タグ付け促進分子は、例えば、ＭｇＣｌ２、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、熱安定性核酸結合タンパク質（例えば、極度熱安定性一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質等）、及び／又は他の適切な成分のうちの１つ又は複数である。ただし、ＵＭＩ領域は、任意の適切な様式で構成することができる。
【００３３】
ＵＭＩベースの分子（及び／又は他の適切な分子、例えばプライマー及び／又は本明細書中で記載する他の分子）は、好ましくは１つ又は複数の標的関連領域を含む。標的関連領域は、好ましくは配列領域（例えば、遺伝子配列等）を含むが、付加的又は代替的に、任意の適切な種類の成分（例えば、標的と関連する任意の適切な成分；これは、例えば、標的と結合可能、標的とカップリング可能、標的と連結可能、標的に影響を及ぼす、標的に情報を与える、標的を修飾する、及び／又は標的と任意の適切な関係を有する、等々）を含んでいてもよい。標的関連領域は、好ましくは、１つ又は複数の標的（例えば、核酸標的の配列領域；核酸標的の他の適切な成分；等々）と関連する（例えば、前記標的に対して配列相補的である；前記標的を標的とする；前記標的で増幅可能である；前記標的でプロセッシング可能である；等々）。一例において、標的関連領域は、（例えば、核酸標的）の相補的な標的ＤＮＡ配列とアニーリング可能なＤＮＡ配列を含んでいてもよい。ある変形例では、標的関連領域は、複数の微生物分類群の間で保存されている配列と関連し得る。ある変形例では、標的関連領域は、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）が核酸標的及び／又は他の適切な成分をコピーし増幅するのを可能にするが、標的関連領域は任意の適切な機能性を含んでいてもよい。標的関連領域は、任意の適切な長さ（例えば、１５塩基長以上；任意の適切な数の塩基；等々）を含んでいてよい。あるいは、ＵＭＩベースの分子は標的関連領域を除外してもよい。しかしながら、標的関連領域（及び／又は他の適切な分子）は任意の適切な様式で構成することができる。
【００３４】
ＵＭＩベースの分子（及び／又は他の適切な分子、例えばプライマー及び／又は本明細書中に記載する他の分子）は、１つ又は複数のリンカー領域を含んでいてもよい（該リンカー領域は、タグ付き核酸分子の生成を改善する機能を果たし得るものであってもよく、これは例えば、核酸分子の標的配列へのプライマー結合と関連するものである；等々）。リンカー領域は、好ましくは、１つ又は複数の核酸標的（例えば、標的関連領域に関連する核酸標的等）に対する完全相補性がない（例えば、無相補性、部分相補性、等）。リンカー領域は、任意の適切な長さを含んでいてもよい（例えば、このリンカー領域が、例えばＵＭＩベースのプライマーセットの各ＵＭＩベースのプライマーについて、２１塩基未満の長さを含む；任意の適切な塩基数の長さを含む；等々）。リンカー領域は、好ましくは、ＵＭＩ領域と標的関連領域との間に位置する（例えば、ＵＭＩ配列領域と標的関連配列領域とを離間するように位置する、等）が、任意の適切な位置（例えば、任意の適切な配列位置等）に位置してよく、その例としては、各ＵＭＩベースの分子について（例えば、ＵＭＩベースのプライマーセットの各ＵＭＩベースのプライマーについて、等）、前記リンカー領域が前記ＵＭＩベースの分子のＵＭＩ領域と標的関連領域との間に位置する場合がある。ある具体的な例では、リンカー領域は、ＰＣＲ増幅におけるＵＭＩベースの分子の潜在的なネガティブな効果を制限する長さの配列を含んでいてもよい。あるいは、ＵＭＩベースの分子（及び／又は他の適切な分子）は、リンカー領域が排除されたものであってもよい。しかしながら、リンカー領域は、任意の適切な様式で構成することができる。
【００３５】
ＵＭＩベースの分子は、任意の適切なサイズ（例えば、任意の適切な配列長さ等）を含んでもよく、そして任意の適切な数及び／又は種類のＵＭＩベースの分子を方法１００の実施形態の一部で調製及び／又は使用することができる。
【００３６】
ある変形例では、ＵＭＩベースの分子を調製することは、古典的又は修正版の距離メトリクス（例えば、Ｈａｍｍｉｎｇ及び／又はＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ、等）を含む計算論的アプローチ及び／又は分析技術に基づいてＵＭＩベースの分子を設計すること、及びエラー補正を許容すること、及び、種々のテンプレート分子の同定を可能にすることを含んでいてもよい。ある具体的な例においては、ＵＭＩベースの分子は種々のテンプレート分子の間で異なるように設計される。ある具体的な例においては、距離メトリクスの使用により、ＵＭＩ領域を別のＵＭＩ領域に変換するために必要なヌクレオチド変化の数を調整することが可能になる。ある具体的な例では、第一のＵＭＩ領域（「ＡＡＡ」）を第二のＵＭＩ領域（「ＴＩＴ」）に変換するために、少なくとも３つの変化が必要である；この具体的な例について、前記変換を完成させるための最も簡単な方法は、第一のＵＭＩ領域においてすべてのＡをＴで置換することである。ある具体的な例においては、距離メトリクスの使用により、種々の分子をカウントするために使用できる、そして付加的又は代替的に、エラー修正システムとして使用できる、異なるＵＭＩの数を調整することが可能になる。付加的又は代替的に、任意の適切な距離メトリクス及び／又は分析技術を、ＵＭＩベースの分子の数を設計及び／又は決定する際に使用することができる。ある具体的な例では、ＵＭＩベースの分子セットを調製することは、前記一組の標的核酸配列、及び前記タグ付き核酸分子のシーケンシングについての定義された制限（例えば、標的核酸配列についての所望の量のシーケンシングと関連した所定の制限、等）に基づいて、前記一組のタグ付き核酸分子の生成を促進するための異なるＵＭＩ領域の数を決定すること（例えば、調整すること）を含む。
【００３７】
ＵＭＩベースの分子を調製することは、方法１００の実施形態の任意の適切な部分の前及び／又は後に行うことができ（例えば、タグ付標的分子の生成の前又は途中；タグ付標的分子の反復生成のため、タグ付標的分子の生成後；等々に行うことができ）、及び／又は任意の適切な時間及び頻度で行うことができる。ＵＭＩベースの分子を調製することは、一組のＵＭＩベースの分子を任意の適切な実体（例えば、第三者的実体であり、該第三者的実体が一組のタグ付標的分子を作製し、前記一組のタグ付標的分子を用いて単一分子シーケンシングを行うことを可能にするための提供である、等々）に提供することを含んでいてもよい。
【００３８】
しかしながら、ＵＭＩベースの分子Ｓ１１０の調製は、任意の適切なやり方で行うことができる。
【００３９】
２．２  タグ付標的分子の生成の促進
方法１００のいくつかの実施形態は、前記一組のＵＭＩベースの分子、及び一組の標的核酸配列に対応する（例えば、含む、等）一組の核酸分子に基づいて、一組のタグ付き核酸分子の生成を促進すること（例えば生成すること等）−Ｓ１２０−を含んでもよい。このことは、下流のシーケンシング（例えば、単一分子シーケンシング等）及び／又は微生物に関連する特性を決定するためのバイオインフォーマティクス分析（例えば、１又は複数の微生物に関連する状態についての診断及び／又は治療決定；等々）及び／又は適切な分析（例えば、分子計数）を促進するためのタグ付標的分子を得るのに機能することができる。
【００４０】
核酸分子（例えば、タグ付される核酸分子；等々）は、好ましくは１つ又は複数のサンプル（例えば、１又は複数の腸部位、皮膚部位、性器部位、鼻部位、口部位、及び／又は他の適切な身体部位から収集されたサンプル；生物サンプル；等々）由来である。
【００４１】
タグ付標的分子（例えば、タグ付標的核酸分子）は、好ましくは１つ又は複数のＵＭＩベースの分子（例えば、ＵＭＩ領域、リンカー領域、及び／又はＵＭＩベースの分子の適切な領域；等々）でタグ付けされた（例えば、取り付けられた；連結された；カップリングされた；等々）１つ又は複数の標的（例えば、標的を含む成分；例えば、標的配列領域を含む全核酸及び／又は核酸フラグメント、等）を含むが、付加的又は代替的に、１つ又は複数の標的と関連し、任意の適切な分子でタグ付けされた任意の適切な成分を含んでいてもよい。前記一組のタグ付標的分子を生成することは、一組のＵＭＩベースの分子（例えば、ＵＭＩベースのプライマー等）及び１つ又は複数の生物サンプルに基づく（例えば、これらを使用する；これらを用いて処理する；これを用いて増幅プロセスを行う；等々）（例えば、前記１つ又は複数の生物サンプルの成分を、前記一組のＵＭＩベースの分子及び／又は前記一組のＵＭＩベースの分子の成分でタグ付けすること；等々）が、付加的又は代替的に、任意の適切な成分に基づいてもよい。
【００４２】
一組のタグ付標的分子の生成を促進することは、１つ又は複数の増幅プロセスに基づいていてもよい（例えば、該増幅プロセスを含む；該増幅プロセスからの成果を用いる；等々）。増幅プロセス（例えば、前記一組のタグ付標的分子を生成することに関連する増幅プロセス；方法１００の実施形態の任意の適切な部分に関連する増幅プロセス；等々）は、１つ又は複数のＰＣＲプロセス（例えば、固相ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、多重ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ナノＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ等）を含んでいてもよいが、付加的又は代替的に、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、自己持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、及び／又は任意の他の適切な増幅プロセスのうちの１つ又は複数を含んでいてもよい。ある具体的な例においては、多段階ＰＣＲプロセスをタグ付標的分子（例えば、タグ付き核酸分子等）の生成を促進する際に用いることができる、これは例えば、２０１８年６月２０日付で出願された米国特許出願第１６／０１３，８５８号に記載された及び／又は類似の任意の適切なやり方で行われる。付加的又は代替的に、方法１００及び／又はシステムの実施形態の任意の適切な部分は、２０１８年６月２０日付で出願された米国特許出願第１６／０１３，８５８号に記載及び／又は類似の任意の適切なアプローチを含む、適用する、使用する、及び／又は関連するものであってもよい。米国特許出願第１６／０１３，８５８号は、参照により、その全体が本明細書中に取り込まれる。
【００４３】
しかしながら、任意の適切なＰＣＲプロセス及び／又は他の増幅プロセスを実施すること（例えば、前記一組のタグ付標的分子を生成することに関連して実施すること；方法１００の実施形態の任意の適切な部分に関連して実施すること；等々）は、任意の適切なやり方で実施することができる。付加的又は代替的に，増幅とは独立したプロセスを、タグ付き核酸分子を生成するために使用できる。一例において、タグ付標的核酸分子の種々のサブセットを作製することができる（例えば、ＰＣＲで生成されたタグ付標的核酸分子の１つ又は複数のサブセットとＰＣＲとは独立したタグ付標的核酸分子の１つ又は複数のサブセットとを含むタグ付標的核酸分子のセット等）。ある具体的な例では、一組のタグ付き核酸分子の生成を促進することは、前記核酸分子セットに属する核酸分子の第一のサブセットを用いてＰＣＲ増幅プロセスを実施することに基づいて核酸分子のＰＣＲ増幅サブセットを生成すること；及び核酸分子のＰＣＲ増幅サブセットと前記核酸分子セットに属する核酸分子のＰＣＲとは独立したサブセットとに基づいて一組のタグ付き核酸分子を生成することを含む。
【００４４】
一組のタグ付標的分子を生成することは、付加的又は代替的に、１つ又は複数のタグ付け促進分子（例えば、核酸標的に対するＵＭＩベースの分子の組み込み等、タグ付けに関連して効率及び／又は汎用性を改善するために使用できる分子；効率に関連して等、増幅プロセスを改善するために使用できる分子；等々）に基づいていてもよい（例えば、前記タグ付け促進分子を使用してもよく；前記タグ付け促進分子を用いて処理してもよく；前記タグ付け促進分子を用いて増幅プロセスを実施してもよい；等々）。タグ付け促進分子は、ＭｇＣｌ２、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、熱安定性核酸結合タンパク質、ベタイン、ホルムアミド、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ＮＰ−４０、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、有機及び／又は無機エンハンサー要素、化合物、塩、小分子、生体分子、及び／又は、タグ付けを促進するように構成されたその他任意の適切な分子のうち、いずれか１つ又は複数を含んでいてもよい。
【００４５】
タグ付標的分子の生成を促進すること（及び／又は任意の適切な分子をタグ付けすること）は、任意の適切な時間及び頻度で行うことができる（例えば、即シーケンシング可能な（sequencing-ready）タグ付標的分子を生成する前；Sequencing-readyタグ付標的分子を生成する間又はその後、例えば反復生成物生成アプローチにおけるSequencing-readyタグ付標的分子を生成する間又はその後、等に実施できる）。タグ付標的分子の生成を促進することは、ＵＭＩベースの分子を第三者的実体及び／又は適切な実体（例えば、タグ付標的分子を生成するために必要なサンプル処理を行う第三者的実体及び／又は適切な実体；等々）に対して提供することに基づき得る。
【００４６】
ある変形例では、一組のタグ付標的分子を生成することは、（例えば、ＰＣＲに基づくプロセスに加えて、又はＰＣＲに基づくプロセスの代わりに、等）１つ又は複数のフラグメント化プロセス、ライゲーションプロセス、及び／又は他の適切なプロセスを実施することを含んでいてもよく、これは例えば、核酸標的（及び／又は１つ又は複数の生物サンプルの他の適切な成分等）等の１つ又は複数の標的をＵＭＩベースの分子でタグ付けするために行われる。一例において、前記一組のタグ付標的分子を生成することは、１つ又は複数の生物サンプル（例えば、関心のある標的に対応する標的配列等の、１つ又は複数の核酸標的を含むフラグメントを生成するため；１つ又は複数の生物サンプルからフラグメントを生成するため；等々）を用いる酵素的プロセス及び機械的プロセスのうち少なくとも１つ（例えば、酵素的及び／又は機械的フラグメント化等）に基づいてフラグメントを生成すること；及び、前記ＵＭＩベースの分子及び前記フラグメントのためにライゲーションプロセス（例えば、リガーゼ酵素を用いたブラントエンドライゲーション等）を実施すること（例えば、前記ＵＭＩベースの分子を前記フラグメントとライゲーションすること等）を含んでいてもよく、前記ライゲーションプロセスは、例えば標的分子（例えば、標的ＮＤＡ；シーケンシングライブラリ構築のため；等）を増幅する前などに実施することができる。一例において、前記一組のタグ付標的分子を生成することは、少なくとも１つの生物サンプルから核酸フラグメントを生成すること；及び前記一組のＵＭＩベースの分子を前記核酸フラグメントにライゲーションすること、を含んでいてもよい。いくつかの例では、１つ又は複数のフラグメント化プロセス及び／又はライゲーションプロセスを実施すると、あらゆる可能な分子を無差別にタグ付けすることになり得る（例えば、溶液中の場合）が、一方、いくつかの例では、ＰＣＲプロセス（例えば、本明細書中で記載するＰＣＲプロセス等）を用いて一組のタグ付標的分子を生成することは、ＵＭＩタグ付けのための特異的ターゲティング（例えば、標的ＤＮＡ配列への特異的ターゲティング）を促進することができる。（例えば、生成したフラグメント、及び／又は他の分子をタグ付けするため；等々の）ＵＭＩタグ付けのために使用されるライゲーションプロセスにおいては、フラグメント化プロセスを実施するタグ付標的分子を生成するためのＰＣＲプロセスにおいて使用されるＵＭＩベースの分子の種類と同じ、類似、又は異なるＵＭＩベースの分子を用いることができる。ある具体的な例においては、タグ付標的核酸分子の増幅（例えば、シーケンシングライブラリ構築のための増幅、等）前に、酵素的及び／又は機械的フラグメント化後にリガーゼ酵素を用いたブラントエンドライゲーションを用いて核酸分子（例えば、標的核酸配列に対応する核酸分子等）をＵＭＩベースの分子によりタグ付けすることができる。ある変形例において、ＰＣＲベースの標識について、フラグメント化法内で、突出及び／又は粘着末端を生成する酵素は、任意の適切なライゲーションプロセスと組み合わせて付加的又は代替的に用いることができ、これには、平滑末端と粘着末端フラグメント化との任意の組み合わせ及び／又は適切なライゲーションプロセスが含まれる。ある変形例において、ＰＣＲベースの標識について、核酸分子中にＤＮＡ配列（例えば、トランスポゾン）を挿入する酵素を使用して、ＵＭＩベースの分子によるタグ付けを行うことができ、これは例えば、任意の適切なライゲーションプロセス（例えば、本明細書中で記載するもの等）との組み合わせで行われる。
【００４７】
しかしながら、１つ又は複数のフラグメント化プロセス及び／又はライゲーションプロセス、及び／又はタグ付標的核酸分子の生成を促進するための任意の適切なプロセスを実施することは、任意の適切なやり方で実施することができる。
【００４８】
付加的又は代替的に、タグ付き核酸分子の生成を促進することは、種々のアンプリコンからなるライブラリのバランスをとること（例えば正常化）を含んでもよく、これは例えば、２０１８年９月７日付で出願された米国特許出願第１６／１２５，６１９号に記載されているやり方で、及び／又は類似のやり方で行うことができる。米国特許出願第１６／１２５，６１９号は、参照により本明細書中に組み込まれる。種々のアンプリコンからなるライブラリのバランスをとること、及び／又は方法１００の実施形態の適切な部分を実施することにより、過小に現れるテンプレートのシーケンシングを妨害する過大に現れる分子を防止でき、そのような妨害としては、例えば、同定されるまでに多数のシーケンシングサイクルを必要とする過大に現れるテンプレート分子が、過小に現れる分子のシーケンシングを妨げ得る場合が挙げられる。ある具体的な例では、一組のタグ付き核酸分子の生成を促進することは、一組の核酸分子における過小に現れる核酸分子及び過大に現れる核酸分子と関連する一組のアンプリコンのバランスをとるために、一組のＵＭＩベースの分子及び一組の核酸分子に基づいて、少なくとも１つの増幅プロセスを実施することを含んでいてもよい。ある変形例では、追加のＰＣＲプロセス（例えば、３ステップＰＣＲプロセスによる；等々）及び／又は適切な増幅プロセスは、異なるアンプリコンからなるライブラリのバランスをとることを可能にし得る。しかしながら、アンプリコンライブラリ及び／又は他の適切な成分のバランスをとることは、任意の適切なやり方で行うことができる。
【００４９】
ある変形例では、一組のタグ付標的分子を生成することは、少なくとも１つのＰＣＲプロセス及び少なくとも１つのライゲーションプロセスの組み合わせ（例えば、直列的組み合わせ；並列的組み合わせ；等々）を含んでいてもよい。例えば、一組のタグ付標的分子を生成することは、
プライマーのセット（例えば、１つ又は複数の標的関連領域、リンカー領域、及び／又は任意の他の適切な成分、等を含む）を用いてＰＣＲプロセスを実施すること、これは、例えば、ＰＣＲ効率及び標的増幅を増加させるためでもよい；及び、
１つ又は複数のＵＭＩベースの分子（例えば、１つ又は複数のＵＭＩ領域、アダプター領域、及び／又は他の適切な成分等を含む）を用いて、ライゲーションプロセスを実施すること、これは、例えば、前記ＰＣＲプロセスの産物（例えば、増幅された核酸標的等）に対してＵＭＩベースの分子を添加するためでもよい、
を含んでいてもよい。一例において、前記一組のタグ付標的分子を生成することは、少なくとも１つの生物サンプル、及び一組の標的のうち少なくとも１つの標的と関連する標的関連領域を含むプライマーセットに基づいてＰＣＲプロセスを実施すること；並びに、一組のＵＭＩベースの分子を前記ＰＣＲプロセスの産物にライゲーションすること、を含んでいてもよい。しかしながら、１つのＰＣＲプロセス及び少なくとも１つのライゲーションプロセスの組み合わせを実行することは、任意の適切なやり方で行うことができる。
【００５０】
一組のタグ付標的分子を生成すること（及び／又は方法１００の実施形態の適切な部分）は、１つ又は複数の精製プロセス（例えば、任意の適切な成分を精製するため；任意の適切な成分を除去するため；等々）を実施することを含んでいてもよい。一例において、一組のタグ付標的分子を生成することは、第一の増幅プロセスの生成物に対して精製プロセスを実施して、第一の増幅プロセスの産物からＵＭＩベースのプライマーセットのＵＭＩベースのプライマーを除去する（及び／又は他の適切な成分を除去する、等）ことを含んでいてもよい。いくつかの例において、方法１００は、本明細書中に記載する増幅プロセス（例えば、タグ付標的分子産物のプールを生成するために使用されるＰＣＲプロセス、等）から得られる産物の精製プロセスを実施すること、例えば、ＵＭＩベースのプライマーの第一のセットを用いて実施されるＰＣＲベースの増幅プロセスから得られる産物を精製すること、を含んでいてもよい。精製プロセスは、シリカベースのＤＮＡ結合ミニカラム、固相可逆的固定化（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＰＲＩ）磁気ビーズ（例えば、スケールアップ及び自動化のため等）、生物サンプルからの核酸の沈殿（例えば、アルコールベースの沈殿法を使用）、液−液ベースの精製技術（例えば、フェノール−クロロホルム抽出）、クロマトグラフィーベースの精製技術（例えば、カラム吸着）、核酸と結合し溶出環境（例えば、溶出液を有する、ｐＨシフトを提供する、温度シフトを提供する、等の溶出環境）の存在下で核酸を放出するように構成された結合部分に結合した粒子（例えば、磁気ビーズ、浮遊ビーズ、サイズ分布を有するビーズ、超音波応答性ビーズ（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｂｅａｄｓ）等）の使用を含む精製技術、及び／又は任意の適切な精製プロセスのうちのいずれか１つ又は複数を含んでいてもよい。ある具体的な例では、磁気ビーズは、少量のＰＣＲプロセス産物の精製を可能にし得るが、これは、例えば、ＤＮＡとカルボキシルでコーティングされたビーズとの静電相互作用によるものである。付加的又は代替的に、精製プロセスは、（例えば、方法１００の実施形態の任意の適切な部分に関連して、等）任意の適切なやり方で実施することができる。
【００５１】
しかしながら、タグ付標的分子（例えば、タグ付き核酸分子等）を生成することＳ１２０は、任意の適切なやり方で行うことができる。
【００５２】
２．３  単一分子シーケンシングを促進すること
方法１００の実施形態は、一組のタグ付き核酸分子を用いた単一分子シーケンシングを促進することＳ１３０を含んでもよく、これは、ＵＭＩを用いた単一分子シーケンシング（例えば、read untilベースのシーケンシング等）を、過小に現れるテンプレート分子及び／又は特定の標的テンプレート分子（例えば、濃縮（enrichment）のためのもの）に対して過大に現れるテンプレート分子のシーケンシングに関連する問題を克服するために活用するように機能することができる。ある具体的な例においては、単一分子シーケンシングを促進することＳ１３０は、例えば、シーケンシングランの間にリアルタイムで、シーケンシングされている各核酸分子を同定するように機能することができる。ある具体的な例では、単一分子シーケンシングを一組のタグ付き核酸分子で促進することは、検出を改善するため、シーケンシングエラー率を減少させるため、及び／又は一組の核酸分子からの過小に現れる核酸分子の絶対計数を改善するために、単一分子シーケンシングを促進することを含む。ある具体的な例では、単一分子シーケンシングを一組のタグ付き核酸分子で促進することは、単一分子シーケンシングをread untilベースの技術（及び／又は適切なシーケンシング技術等）で促進することを含む。
【００５３】
ある変形例では、単一分子シーケンシングを前記一組のタグ付き核酸分子で促進することＳ１３０は、シーケンシングされたあるタグ付き核酸分子の第一の組の配列領域とあるタグ付き核酸分子の第二の組の配列領域との間の比較を決定することＳ１３２；タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することＳ１３４（例えば、前記比較に基づいて；タグ付き核酸分子を放出することによって、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅシーケンシング用膜上のナノポアの孔からタグ付き核酸分子を放出することによって；等々）；特定の標的核酸配列のシーケンシングを制限することＳ１３６（例えば、特定の標的核酸配列に関連づけられたタグ付き核酸分子について；等々）；及び／又は他の適切なプロセスを含んでいてもよい。
【００５４】
単一分子シーケンシングを促進することＳ１３０は、単一分子シーケンシングを促進することＳ１３０の任意の適切な部分（例えば、Ｓ１３２、Ｓ１３４、Ｓ１３６に関連する部分）を、実質的にリアルタイムで、及び／又はリアルタイムで実施することを含んでいてもよく、例えば、シーケンシングラン中に当該実施することを含んでいてもよい。ある具体的な例においては、シーケンサーにより生成されたデータのバイオインフォーマティック処理をリアルタイムで実施して、配列タグ付き核酸分子のデータと現在シーケンシングされているタグ付き核酸分子のデータとの比較を可能にする。これにより、特定のタグ付き核酸分子のシーケンシングを停止すること（例えば、過大に現れる核酸分子を停止することにより、過小に現れる核酸分子のシーケンシングを可能にする；等々）を可能にできる。
【００５５】
単一分子シーケンシングを促進することＳ１３０は、付加的又は代替的に、配列領域（例えば、異なるタグ付き核酸分子の配列領域、例えば、既シーケンシング済のタグ付き核酸分子及び現在シーケンシングされているタグ付き核酸分子の配列領域、等）間の比較を決定することＳ１３２を含んでもよい。当該比較を決定することは、１つ又は複数の核酸分子のシーケンシングを停止するか否かを決定するため及び／又は任意の適切なプロセスのための１つ又は複数の状態を評価する機能を果たすことができる。
【００５６】
配列領域を比較することは、好ましくは、シーケンシングされたあるタグ付き核酸分子の第一のＵＭＩ領域及び／又は第一の標的領域を、あるタグ付き核酸分子（例えば、現在シーケンシングされているタグ付き核酸分子、等）の第二のＵＭＩ領域及び／又は第二の標的領域と比較することを含む。
【００５７】
ある具体的な例では、前記第一のＵＭＩ領域の配列を前記第二のＵＭＩ領域の配列と比較することができ、前記第一の標的領域の配列を前記第二の標的領域の配列と比較することができる。ある具体的な例では、比較を決定することは、第一の組の配列領域と第二の組の配列領域との間の比較を決定することを含んでもよく、ここで、前記第一の組の配列領域は前記一組のタグ付き核酸分子のうちのシーケンシングされたあるタグ付き核酸分子の第一のＵＭＩ領域と第一の標的領域とを含み、前記第二の組の配列領域は前記一組のタグ付き核酸分子のうちのあるタグ付き核酸分子の第二のＵＭＩ領域と第二の標的領域とを含み；ここで、例えば、前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することは、前記第一の組の配列領域と前記第二の組の配列領域との間の比較に基づくものであってもよい。
【００５８】
ある具体的な例では、前記比較を決定することは、前記第一のＵＭＩ領域、前記シーケンシングされたタグ付き核酸分子の第一の標的領域、前記第二のＵＭＩ領域、及び前記タグ付き核酸分子の第二の標的領域間の比較を決定することを含み、前記第一及び前記第二の標的領域は、前記一組の標的核酸配列のうちのある標的核酸配列（例えば、同じ標的核酸配列等）と関連し、ここで、例えば、前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することは、前記第一のＵＭＩ領域、前記第一の標的領域、前記第二のＵＭＩ領域、及び前記第二の標的領域間の比較に基づいて（例えば、前記第一のＵＭＩ領域と前記第二のＵＭＩ領域との間の一致、及び前記第一の標的領域と前記第二の標的領域との間の一致に基づいて；等々）シーケンシングを停止することを含んでいてもよい。
【００５９】
ある具体的な例では、前記単一分子シーケンシングを促進することは、シーケンシングされたタグ付き核酸分子の前記第一の組の配列領域（例えば、１つ若しくは複数のＵＭＩ領域及び／又は１つ若しくは複数の標的領域等）を決定すること；及び前記第一の組の配列領域を保存すること（例えば、前記シーケンシングシステムに関連するコンピューティングシステムに；前記シーケンシングシステムのコンピューティングサブシステムに；等々）を含んでもよく、ここで、前記第一の組の配列領域と前記第二の組の配列領域との間の比較を決定することは、前記第二の組の配列領域（例えば、現在シーケンシングされているタグ付き核酸分子の１つ若しくは複数のＵＭＩ領域及び／又は１つ若しくは複数の標的領域等）と比較するために前記第一の組の配列領域を呼び出すことを含んでいてもよい。しかしながら、配列領域間の１つ又は複数の比較を決定することＳ１３２は任意の適切なやり方で行うことができる。
【００６０】
単一分子シーケンシングを促進することＳ１３０は、付加的又は代替的に、１つ又は複数の核酸分子（例えば、タグ付き核酸分子等）のシーケンシングを停止することを決定することＳ１３４を含んでもよく、これは、１つ又は複数の分子のシーケンシングを停止する機能を果たすことができ、例えば、過小に現れるテンプレート分子、特定の標的分子、及び／又は任意の適切な種類の分子の十分なシーケンシングを可能にする。
【００６１】
図３に示すように、１つ又は複数の核酸分子のシーケンシングを停止することは、好ましくは、配列領域間の１つ又は複数の比較（例えば、Ｓ１３２におけるように決定される比較、等）に基づく。ある具体的な例では、ＵＭＩ領域と標的領域（及び／又は適切な非ＵＭＩ領域）との所与の組み合わせがすでにシーケンシングされ、シーケンシングされているＵＭＩ領域と標的領域との現在の組み合わせと一致する場合、シグナル（例えば、デジタルシグナル等）を前記シーケンサーに提供することができ、前記反応を停止させることができる（例えば、これにより、前記シーケンシングシステム自体の機能面における改善を可能にすることができる；等々）。ある具体的な例では、前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することは比較に基づくことができ、前記第一のＵＭＩ領域及び前記第一の標的領域が前記第二のＵＭＩ領域及び前記第二の標的領域と一致することに呼応して前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することを含む。ある具体的な例においては、read untilベースの技術は、特定のＵＭＩ領域、標的領域、及び／又はタグ付き核酸分子の適切な領域についてスキャニングして、特定の領域又は成分を含まない（例えば、ＵＭＩ領域を含まない等）核酸分子についてシーケンシングを停止するため（例えば、シーケンシングのリード、及び／又は他の適切な出力を拒絶するため）、用いることができる。ある具体的な例では、任意の適切な領域間（例えば、シーケンシングされたタグ付き核酸分子の第一のＵＭＩ領域とタグ付き核酸分子の第二のＵＭＩ領域との間；核酸分子のその他適切な種類の領域間；等々）の任意の適切な一致を、シーケンシングを停止するための条件として用いることができる。ある具体的な例では、タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することは比較に基づくことができ、前記第一のＵＭＩ領域が前記第二のＵＭＩ領域と一致することに基づいてタグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することを含む。
【００６２】
ある具体的な例においては、前記単一分子シーケンシングを促進することは、シーケンシングシステム（例えば、単一分子シーケンシングシステム等）によって生成された前記データストリームを（例えば、リアルタイムで；等々）読み取るために処理ソフトウェアを用いることを含んでもよく、前記データストリームは、その後、シーケンシング領域間の比較を決定すること（例えば、Ｓ１３２と同様に比較を決定すること）、及び／又は１つ又は複数の核酸分子のシーケンシングを停止すること（例えば、Ｓ１３４と同様に停止すること、例えば前記比較に基づく；等々）、及び／又は前記核酸分子の配列読み込みを継続すること、において分析することができる。ある具体的な例では、（例えば、シーケンシングされたタグ付き核酸分子等の）前記第一の組の配列領域を決定すること、前記第一の組の配列領域を保存すること、前記第一の組の配列領域と前記第二の組の配列領域（例えば、現在シーケンシングされているタグ付き核酸分子等のタグ付き核酸分子の第二の組の配列領域；等々）との間の比較を決定すること、及び／又は前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することは、前記単一分子シーケンシングの単回のシーケンシングランの間に少なくとも実質的にリアルタイムで行うことができる。
【００６３】
付加的又は代替的に、シーケンシングを停止することは、任意の適切な条件（例えば、シーケンシングに関連する条件）に基づいてなされてもよく、例えば、配列リード、シーケンシングされた領域、定義された制限、及び／又は任意の適切な条件に基づいてなされてもよい。しかしながら、シーケンシングを停止することＳ１３４は任意の適切なやり方で行うことができる。
【００６４】
単一分子シーケンシングを促進することは、付加的又は代替的に、核酸分子のシーケンシングを制限することを含んでいてもよく、該制限することは、特定の核酸分子（例えば、特定のタグ付き核酸分子）のシーケンシングをある特定の量（例えば、数等）に制限する機能を果たすことができ、このような制限は、例えば、前記特定の核酸分子のＵＭＩ領域、標的領域、及び／又は適切な領域の同定に基づくものでもよい。核酸分子のシーケンシングを制限することは、核酸分子に対応する標的核酸配列についての定義された制限に基づくものであってもよく、ここで、例えば、定義された異なる制限により、所与の標的核酸配列についてシーケンシングされる核酸分子の量に対する制限を設定できる。ある具体的な例においては、前記タグ付き核酸分子のシーケンシングを停止することは、前記比較、及び前記第一の組の配列領域に関連した、タグ付き核酸分子のシーケンシングについての定義された制限（例えば、前記第一の組の配列領域の配列に対応する配列領域を含むタグ付き核酸分子についての制限）（例えば、前記タグ付き核酸分子に対応する標的核酸分子配列について定義された制限に達した場合；タグ付き核酸分子の当該種類について所定の制限に達した場合；等々）に基づいて前記シーケンシングを停止することを含み、ここで、前記一組のタグ付き核酸分子は、前記第一の組の配列領域に関連づけられたタグ付き核酸分子を含む。しかしながら、核酸分子のシーケンシングを制限することＳ１３６は、任意の適切なやり方で行うことができる。
【００６５】
単一分子シーケンシングを促進することＳ１３０は、任意の適切な時間及び頻度で行うことができる。単一分子シーケンシングを促進することは、第三者的実体及び／又は適切な実体に対してＵＭＩベースの分子を提供すること、及び／又はタグ付き核酸分子の生成を手助けすることに基づくことができる（前記第三者的実体及び／又は適切な実体は、例えば、前記タグ付標的分子を生成するために必要なサンプル調製を行い；前記単一分子シーケンシングの一部を行い、例えばサンプルローディングと関連する一部を行い；ここで、第一当事者は、比較決定、シーケンシングの停止、及び／又はシーケンシングの制限と関連するプロセスを実施してもよい；等々）。
【００６６】
しかしながら、単一分子シーケンシングを促進することＳ１３０は、任意の適切な方法で行うことができる。
【００６７】
２．４  分子数を決定すること
付加的又は代替的に、方法１００の実施形態は、前記単一分子シーケンシングに基づいて分子数を決定することＳ１４０を含んでもよく、これは、１つ又は複数の標的（例えば、標的核酸配列；タグ付き核酸分子に関連づけられた標的；等々）についての分子数に関連するメトリクスを決定する機能を果たし得る。分子数は、絶対分子数；シーケンシングリード量と関連する計数；及び／又は任意の適切な分子数に関連するメトリクスのうちのいずれか１つ又は複数を含んでいてもよい。分子数を決定することは、好ましくは、タグ付き核酸分子のＵＭＩ領域の同定及び／又は分析に基づき、ここで、例えば、ＵＭＩ領域のＵＭＩ配列が、１つ又は複数のサンプル中に存在する１つ又は複数の標的の特定及び／又は定量に用いられてもよい。
【００６８】
ある具体的な例では、方法１００は、一組のタグ付き核酸分子のＵＭＩ領域の単一分子シーケンシングに基づいて、一組の核酸分子を含むサンプルから微生物と関連付けられる絶対分子数を決定することを含んでいてもよい。ある具体的な例では、方法１００は、標的核酸配列に関連するタグ付き核酸分子のシーケンシングの定義された制限に基づいて、標的核酸配列に関連する絶対分子数を決定し、ここで、例えば、定義された制限（例えば、シーケンシングを停止する際、及び／又は核酸分子のシーケンシングを制限する際に、付加的又は代替的に使用される定義された制限；等々）が、１つ又は複数の分子数に関連するメトリクスを決定する際に情報を与え得る、及び／又は使用できる（例えば、前記定義された制限が、分子数が前記定義された制限によって示される数よりも多いことはないことを示す；等々）。
【００６９】
分子数を決定することは、任意の適切な時間及び頻度で行うことができる（例えば、シーケンシングラン中にリアルタイムで；実質的にリアルタイムで、例えばシーケンシングランの直後；ＵＭＩ領域のシーケンシング及び／又は分析後の任意の時間；等々で行うことができる）。
【００７０】
しかしながら、分子数を決定することＳ１４０は任意の適切なやり方で行うことができる。
【００７１】
３．その他
しかしながら、方法１００の実施形態は、対象からの生物サンプルの受領、対象からの生物サンプルの処理、生物サンプル由来のデータの分析、及び対象の特異的マイクロバイオーム組成及び／又は機能的特性にしたがってカスタマイズされた診断、及び／又はプロバイオティクスに基づく治療法を提供するために使用できるモデルを生成すること、を促進するように構成された任意の他の適切なブロック又はステップを含んでいてもよい。
【００７２】
方法１００及び／又はシステムの実施形態は、任意のバリエーション（例えば、実施形態、変形例、例、具体例、図等）を含む様々なシステム成分及び様々な方法プロセスのあらゆる組み合わせ及びバリエーションを含んでもよく、ここで、本明細書中で記載する方法１００の実施形態及び／又はプロセスの一部は、本明細書中で記載するシステム及び／又は他の実体の１つ又は複数の例、要素、成分、及び／又はその他の態様により、及び／又はそれらを用いることによって、非同期的に（例えば、連続的に）、同時に（例えば、並行して）、又はその他任意の適切な順序で行うことができる。
【００７３】
本明細書中で記載するバリエーション（例えば、実施形態、変形例、例、具体例、図等）のいずれも、及び／又は本明細書中で記載する前記バリエーションのいずれの部分も、付加的又は代替的に、組み合わせ、集約、除外、使用、順次実施、並行実施、及び／又はその他の様式で適用することができる。
【００７４】
方法１００及び／又はシステムの実施形態の一部は、少なくとも部分的には、コンピュータ可読指令を保存するコンピュータ可読媒体を受容するように構成された機械として具体化及び／又は行うことができる。前記指令は、前記システムと一体化されていてもよいコンピュータ実行可能要素によって実行されてもよい。前記コンピュータ可読媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ、ＥＥＰＲＯＭ、光デバイス（ＣＤ若しくはＤＶＤ）、ハードドライブ、フロッピドライブ、又は任意の適切なデバイス等の任意の適切なコンピュータ可読媒体上に保存することができる。前記コンピュータ実行可能要素は、汎用プロセッサ又はアプリケーション特異的プロセッサであってもよいが、任意の適切な専用ハードウェア又はハードウェア／ファームウェア組み合わせデバイスが、代替的又は付加的に、前記指令を実行してもよい。
以上の詳細な説明並びに図面及びクレームから当業者が理解するように、クレームで規定される範囲から逸脱することなく方法１００の実施形態、システム、及び／又はバリエーションに修正及び変更を加えることができる。
【図１】
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【図２】
2021500879.tif 000004
【図３】
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【国際調査報告】
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