(57)【要約】  本開示は腎オルガノイドおよびその製造法に関する。これらのオルガノイドおよび方法は、疾病モデリング、薬物スクリーニング、再生医療、および腎細胞の５倍スケールアップ生産（5 scaling up production）など、様々な用途で使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０個未満のネフロンを含む、腎オルガノイド。
【請求項２】
２５個未満のネフロンを含む、請求項１に記載の腎オルガノイド。
【請求項３】
１５個未満のネフロンを含む、請求項１に記載の腎オルガノイド。
【請求項４】
５〜１２個のネフロンを含む、請求項１に記載の腎オルガノイド。
【請求項５】
ＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、ＧＡＴＡ３、ＰＡＸ８、ＥＹＡ１、およびＣＩＴＥＤ１のうちのいずれか１つもしくは複数を高レベルで発現し、且つ／または、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＩＳ２、ＷＴ１、および／もしくはＣ−ＲＥＴのうちのいずれか１つもしくは複数を低レベルで発現する、細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
【請求項６】
ＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、およびＧＡＴＡ３を高レベルで発現する細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
【請求項７】
ＮＰＨＳ＋ポドサイト、ＬＴＬ＋近位尿細管セグメント、ＥＣＡＤ＋遠位尿細管セグメント、ＥＣＡＤ＋／ＧＡＴＡ３＋集合管、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
【請求項８】
Ｈ９、ｈＥＳ３、ｉＰＳＣ  ＧＡＰＴｒａｐ  ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ、ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２、ＣＬＲ１５０２．３、ｈＥＳ３  ＳＯＸ１７ｍＣｈｅｒｒｙ、またはＨ９  ＧＡＰＴｒａｐ  Ｌｕｃ２からなる群から選択される幹細胞由来である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
【請求項９】
１×１０4〜５×１０4個程度の細胞を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
【請求項１０】
１．５×１０4〜２．５×１０4個程度の細胞を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
【請求項１１】
２５０〜５００μｍ程度の直径を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
【請求項１２】
旋回培養下で少なくとも３週間生存する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
【請求項１３】
培養下で少なくとも４週間生存する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
【請求項１４】
そのネフロンが、集合管（ＧＡＴＡ３＋；ＥＣＡＤ＋）、初期遠位尿細管（ＧＡＴＡ３−；ＬＴＬ−；ＥＣＡＤ＋）、初期遠位尿細管（ＬＴＬ＋；ＥＣＡＤ−）、および糸球体（ＷＴ１＋）を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
【請求項１５】
腎オルガノイドの発生を促進するのに十分な条件下、細胞培地中で、中間中胚葉（ＩＭ）細胞集団を旋回することにより生じる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の腎オルガノイド。
【請求項１６】
前記細胞培地が２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する、請求項１５に記載の腎オルガノイド。
【請求項１７】
０．５×１０6〜１．５×１０6細胞／ｍｌのＩＭを旋回することによって生じる、請求項１５または請求項１６に記載の腎オルガノイド。
【請求項１８】
０．８×１０6〜１．２×１０6細胞／ｍｌのＩＭを旋回することにより生じる、請求項１５または請求項１６に記載の腎オルガノイド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の腎オルガノイドまたはその酵素消化物を含む、治療用組成物。
【請求項２０】
治療を必要とする対象に請求項１９に記載の組成物を投与することを含む、腎疾患の治療法。
【請求項２１】
ＦＧＦを含有する細胞培地中で中間中胚葉（ＩＭ）細胞集団を旋回することを含む、腎オルガノイドのインビトロ製造法。
【請求項２２】
前記ＩＭ細胞を培養液中で少なくとも５日間旋回し、最初の２４時間はＦＧＦ、ヘパリン、ＣＨＩＲ、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む細胞培地中で細胞を旋回することを含み、続く４日間はＦＧＦ、ヘパリン、およびＣＨＩＲを含む細胞培地中で細胞を培養することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
残り培養日数が、ＰＶＡおよびＭＣを含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞培地が１００〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記最初の２４時間がＦＧＦ、０．５〜１．５μｇ／ｍｌのヘパリン、０．５〜１．５μΜのＣＨＩＲ、および９〜１１μΜのＲＯＣＫ阻害剤を含有する細胞培地中で細胞を旋回することを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記続く４日間がＦＧＦ、０．５〜１．５μｇ／ｍｌのヘパリン、および０．５〜１．５μΜのＣＨＩＲを含有する細胞培地中で細胞を旋回することを含む、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記続く４日間がＦＧＦ９、ヘパリン、ＣＨＩＲ、ＭＶＡ、およびＰＶＣを含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＦＧＦを含有する細胞培地が０．０５〜０．２％のＭＶＡおよび０．０５〜０．２％のＰＶＣを含有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
残り培養日数が、０．０５〜０．２％のＰＶＡおよび０．０５〜０．２％のＭＣを含有するが、ＦＧＦ、ヘパリンＣＨＩＲ、およびＲＯＣＫ阻害剤は含有しない細胞培地中で細胞を培養することを含む、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩＭ細胞が３０〜９０ｒｐｍで旋回される、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩＭ細胞が１８〜２４日間旋回される、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＩＭ細胞が幹細胞集団を少なくとも７日間培養することによって製造され、最初の４〜５日間が少なくとも６μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含み、残り培養日数がＦＧＦおよび少なくとも０．５μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｗｎｔ／βカテニン作動薬がＣＨＩＲであり、前記ＦＧＦがＦＧＦ９である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＦＧＦを含有する細胞培地が１００〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＦＧＦを含有する細胞培地が０．５〜１．５μΜのＣＨＩＲを含有する、請求項３３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＦＧＦを含有する細胞培地が０．５〜１．５μｇ／ｍｌのヘパリンをさらに含有する、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＩＭ細胞がＥＤＴＡまたはトリプシンで解離され、旋回の前にメッシュスクリーンに通される、請求項２１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記幹細胞が多能性幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
０．５×１０6細胞／ｍｌ〜１．５×１０6細胞／ｍｌのＩＭを含むＩＭ細胞集団を旋回することを含む、請求項２１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項２１〜３９のいずれか一項に記載の方法によって製造される腎オルガノイド。
【請求項４１】
請求項１〜１８のいずれか一項または請求項４０に記載の腎オルガノイドを候補化合物と接触させることで、前記候補化合物が腎毒性であるかどうかを判定することを含む、腎毒性について候補化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４２】
前記候補化合物が小分子である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜１８のいずれか一項もしくは請求項４０に記載の腎オルガノイド、または請求項１９に記載の組成物の、腎臓、または腎細胞もしくは腎組織の製造における使用。
【請求項４４】
後方原始線条（ＰＰＳ）細胞集団をＦＧＦおよび４μΜ未満のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で２〜５日間培養することを含む、中間中胚葉（ＩＭ）細胞のインビトロ製造法。
【請求項４５】
中間中胚葉（ＩＭ）細胞のインビトロ製造法であって、幹細胞集団を少なくとも７日間培養することを含み、最初の４〜５日間が少なくとも６μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含み、残り培養日数がＦＧＦ９および少なくとも０．５μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４６】
前記ＦＧＦを含有する培地が０．５〜３μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記培地が０．８〜１．２μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記最初の４日間が少なくとも６μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含む、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記最初の４日間が７μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含む、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＦＧＦを含有する細胞培地が１００〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＦＧＦを含有する細胞培地がヘパリンをさらに含有する、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞培地が０．５〜２μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記幹細胞が多能性幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記組成物が静脈内投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物が腎動脈内注射、腎実質内注射、移植（implantation）、または腎被膜下移植（subcapsular transplantation）で投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項５６】
腎臓をバイオプリントする方法であって、
請求項１〜１８のいずれか一項または請求項４０に記載のオルガノイドからバイオインクを用意すること；
腎臓をバイオプリントすること、
を含む、方法。
【請求項５７】
請求項１〜１８のいずれか一項もしくは請求項４０に記載のオルガノイド、または請求項１９に記載の組成物の、腎臓、または腎細胞もしくは腎組織の製造における使用。
【請求項５８】
請求項２１〜３９のいずれか一項に記載の方法を用いて腎オルガノイドを製造することを含む、または請求項４４〜５３に記載の方法を用いてＩＭ細胞を製造することを含む、細胞療法用のネフロン細胞型の生成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は腎オルガノイドおよびその製造方法に関する。これらのオルガノイドおよび方法は、疾病モデリング、薬物スクリーニング、再生医療、および腎細胞のスケールアップ生産など、様々な用途で使用できる。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は老廃物の除去および体液量の維持において主要な役割を担っている。この機能の作動単位はネフロンとして知られている。ヒトの腎臓は、血液濾過に関与し、全て生後に生じる、２百万個に達する上皮ネフロン（epithelial nephron）を含有する。出生後のヒト腎臓にはネフロン前駆細胞は存在しない。このように前駆細胞集団が存在しないことは、ネフロンが自己複製できないということであるため、その後の傷害、加齢、および疾患が末期腎疾患（ＥＳＤＲ）に繋がるおそれがある。ＥＳＤＲ治療に用いられる治療法の選択肢の制限は、通常、既にダメージを受けた腎臓にさらなるストレスを及ぼす。腎疾患の末期において、利用可能ではあるが高額な治療法の選択肢は、透析および／または腎移植だけであり、これらは共に、不利点が大きく、患者の生活の質を害する。
【０００３】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）およびヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）の両方を含むヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化を、別個の細胞エンドポイントへと方向付けることで、腎臓をはじめとする様々なヒト組織のオルガノイドモデルを得ることが可能となった。Takasato et al. (2015) Nature, Vol. 526:564-568で論じられているものなどの、以前のオルガノイドモデルは高額であり、また、複雑な三次元構造を有するオルガノイドを製造する場合があり、イメージング応用とスクリーニング応用に用途が制限されている。また、これらのオルガノイドは、３週間の培養後に拡散の制限を受け、細胞数を増やす能力と成熟する能力が制限される場合がある。このことは、現在の腎オルガノイド製造プロトコルを、再生医療または疾病モデリング用の細胞供給源としては最適とは言えないものにしている。そのため、腎オルガノイドおよびその製造法が現在求められている。
【発明の概要】
【０００４】
驚くべきことに、本発明者らにより、三次元構造が単純化された腎オルガノイドが特定された。そのようなオルガノイドは、イメージングと長期培養がより簡単であるため有利である。従って、１つの例では、本開示は５０個未満のネフロンを含む腎オルガノイドを包含する。別の例では、前記腎オルガノイドは２５個未満のネフロンを含む。別の例では、前記腎オルガノイドは１５個未満のネフロンを含む。別の例では、前記腎オルガノイドは５〜１２個のネフロンを含む。１つの例では、腎オルガノイドは、腎オルガノイドの発生を促進するのに十分な条件下、細胞培地中で、中間中胚葉（ＩＭ）細胞集団を旋回することにより製造される。この例では、前記ＩＭ細胞培地は１８０〜２２０ｎｇ／ｍｌ程度のＦＧＦ９を含み得る。
【０００５】
１つの例では、腎オルガノイドは０．５×１０6〜１．５×１０6細胞／ｍｌのＩＭを旋回することによって製造される。別の例では、腎オルガノイドは０．８×１０6〜１．２×１０6細胞／ｍｌ程度のＩＭを旋回することによって製造される。別の例では、前記腎オルガノイドは、高レベルのネフロンマーカーを発現する細胞を含む。別の例では、前記腎オルガノイドは、ＰＡＸ２、ＬＨＸ１、ＳＩＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、およびＧＡＴＡ３のうちのいずれか１つまたは複数を高レベルに発現する細胞を含む。別の例では、前記腎オルガノイドは、ＰＡＸ２、ＬＨＸ１、ＳＩＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、およびＧＡＴＡ３を高レベルに発現する細胞を含む。別の例では、前記腎オルガノイドは、ＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、ＧＡＴＡ３、ＰＡＸ８、ＥＹＡ１、およびＣＩＴＥＤ１のうちのいずれか１つもしくは複数を高レベルで発現し、且つ／または、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＩＳ２、ＷＴ１、および／もしくはＣ−ＲＥＴのうちのいずれか１つもしくは複数を低レベルで発現する、細胞を含む。別の例では、前記腎オルガノイドは、ＰＡＸ２、ＬＨＸ１、ＳＩＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、ＧＡＴＡ３、ＰＡＸ８、ＥＹＡ１、およびＣＩＴＥＤ１を高レベルに発現する細胞を含む。
【０００６】
別の例では、前記腎オルガノイドは、Ｈ９、ｈＥＳ３、ｉＰＳＣ  ＧＡＰＴｒａｐ  ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ、ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２、ＣＬＲ１５０２．３、ｈＥＳ３  ＳＯＸ１７ｍＣｈｅｒｒｙ、またはＨ９  ＧＡＰＴｒａｐ  Ｌｕｃ２からなる群から選択される幹細胞由来である。
【０００７】
別の例では、前記腎オルガノイドは、低レベルの間質マーカーを発現する細胞を含む。別の例では、前記腎オルガノイドは、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＩＳ２、ＷＴ１および／またはＣ−ＲＥＴを低レベルに発現する細胞を含む。別の例では、前記腎オルガノイドは、ＮＰＨＳ＋ポドサイト、ＬＴＬ＋近位尿細管セグメント、ＥＣＡＤ＋遠位尿細管セグメント、ＥＣＡＤ＋／ＧＡＴＡ３＋集合管、またはこれらの組み合わせを含む。別の例では、前記腎オルガノイドは、１×１０4〜５×１０4個程度の細胞を含む。別の例では、前記腎オルガノイドは、１．５×１０4〜２．５×１０4個程度の細胞を含む。別の例では、前記腎オルガノイドは、２５０〜５００μｍ程度の直径を有する。別の例では、前記腎オルガノイドは、旋回培養下で少なくとも１８日間生存する。別の例では、前記腎オルガノイドは、旋回培養下で少なくとも３週間生存する。別の例では、前記腎オルガノイドは、旋回培養下で少なくとも４週間生存する。別の例では、前記腎オルガノイドのネフロンは、集合管（ＧＡＴＡ３＋；ＥＣＡＤ＋）、初期遠位尿細管（ＧＡＴＡ３−；ＬＴＬ−；ＥＣＡＤ＋）、初期遠位尿細管（ＬＴＬ＋；ＥＣＡＤ−）、および糸球体（ＷＴ１＋）を含む。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、本明細書で開示される腎オルガノイドの細胞が、旋回培養下で７日間経過後も（例えば７＋７日目）分裂し続けることも確認した。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、このことは、旋回培養を用いて製造されたオルガノイドが移植などの治療応用により適していることを示している可能性がある。
【０００９】
別の例では、本開示は、本明細書に記載の腎オルガノイドを含む組成物を包含する。別の例では、本開示は、本明細書に記載の腎オルガノイドまたはその消化物を含む組成物を包含する。例えば、本開示は、本明細書に記載の腎オルガノイドまたはその酵素消化物を含む組成物を包含する。
【００１０】
繰り返しになるが、いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本明細書で開示される腎オルガノイドの複雑さの低さが、当該腎オルガノイドを、移植用組成物の生産により適したものとしている可能性があると考えられている。例えば、複雑さが低い腎オルガノイドから生産された組成物は、奇形腫や軟骨を形成するのではなく、正しい細胞型により分化しやすい可能性がある。別の例では、本開示は、本明細書に記載の腎オルガノイドの酵素消化物を含む組成物を包含する。
【００１１】
別の例では、本開示は、治療を必要とする対象に本明細書に記載の組成物を投与することを含む、腎疾患の治療法を包含する。１つの例では、前記組成物はオルガノイド全体を含む。別の例では、前記組成物は本明細書で開示されるオルガノイドの消化物を含む。例えば、前記腎疾患は腎不全であり得る。１つの例では、前記組成物は静脈内投与される。別の例では、前記組成物は、腎動脈内注射、腎実質内注射、移植（implantation）、または腎被膜下移植（subcapsular transplantation）で投与される。
【００１２】
別の例では、本開示は、ＦＧＦを含有する細胞培地中で中間中胚葉（ＩＭ）細胞集団を旋回することを含む、腎オルガノイドのインビトロ製造法を包含する。
【００１３】
１つの例では、前記方法は、インビトロにおける、腎細胞型のスケールアップ生産のための対費用効果の高い手段を提供する。１つの例では、前記ＩＭ細胞は、ＦＧＦ、ＣＨＩＲ、およびヘパリンを含有する培地中で旋回される。１つの例では、ＩＭ細胞が培養液中で少なくとも５日間旋回され、最初の２４時間はＦＧＦ、ヘパリン、ＣＨＩＲ、およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する細胞培地中で細胞を旋回することを含み、続く４日間はＦＧＦ、ヘパリン、およびＣＨＩＲを含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む。この例では、ＲＯＣＫ阻害剤は前記細胞培地中に最初の２４時間存在し、それ以後の日数は細胞培地中に存在しない。１つの例では、前記細胞培地は１００〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。１つの例では、前記細胞培地は１８０〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。１つの例では、前記細胞培地はＰＶＡおよびＭＣを含有する。１つの例では、前記最初の２４時間は、ＦＧＦ、０．５〜１．５μｇ／ｍｌのヘパリン、０．５〜１．５μΜのＣＨＩＲ、および９〜１１μΜのＲＯＣＫ阻害剤を含有する細胞培地中で細胞を旋回することを含む。別の例では、前記続く４日間は、ＦＧＦ、０．５〜１．５μｇ／ｍｌのヘパリン、および０．５〜１．５μΜのＣＨＩＲを含有する細胞培地中で細胞を旋回することを含む。この例では、前記続く４日間の間、ＲＯＣＫ阻害剤は細胞培地に存在しない。別の例では、前記続く４日間は、ＦＧＦ９、ヘパリン、ＣＨＩＲ、ＭＣ、およびＰＶＡを含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む。別の例では、前記続く４日間は、ＦＧＦ９、ヘパリン、ＣＨＩＲ、０．０５〜０．２％のＭＣ、および０．０５〜０．２％のＰＶＡを含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む。別の例では、少なくとも５日間経過後の、前記残り培養日数、細胞は０．０５〜１．５％のＰＶＡおよび０．０５〜１．５％のＭＣを含有する細胞培地中で培養される。この例では、前記細胞培地は、ＦＧＦ９、ヘパリン、ＣＨＩＲ、およびＲＯＣＫ阻害剤のいずれも含有せずに、ＰＶＡおよびＭＣを含有し得る。別の例では、前記ＦＧＦを含有する細胞培地は少なくとも１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記ＦＧＦを含有する細胞培地は少なくとも１５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記ＦＧＦを含有する細胞培地は１５０〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記ＦＧＦを含有する細胞培地は１８０〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。
【００１４】
いくつかの例では、本明細書で開示される腎オルガノイドの製造法は、Takasato et al. (2015)に記載のものなど、旋回無しで製造されたオルガノイドから得られる細胞収率と比較して、細胞収率を向上させる。１つの例では、１０日間の旋回培養後、旋回培養に加えられたＩＭ細胞の開始数から３０倍の細胞収率増加が確認され得る。別の例では、１０日間の旋回培養後、旋回培養に加えられたＩＭ細胞の開始数から３５倍の細胞収率増加が確認され得る。別の例では、１２日間の旋回培養後、旋回培養に加えられたＩＭ細胞の開始数から４０倍の細胞収率増加が確認され得る。別の例では、１２日間の旋回培養後、旋回培養に加えられたＩＭ細胞の開始数から４５倍の細胞収率増加が確認され得る。別の例では、１２日間の旋回培養後、旋回培養に加えられたＩＭ細胞の開始数から３０〜４０倍の細胞収率増加が確認され得る。別の例では、１８日間の旋回培養後、旋回培養に加えられたＩＭ細胞の開始数から３０〜４０倍の細胞収率増加が確認され得る。
【００１５】
１つの例では、前記ＩＭ細胞は３０〜９０ｒｐｍで旋回される。別の例では、前記ＩＭ細胞は１８〜２４日間旋回される。
【００１６】
別の例では、前記ＩＭ細胞が幹細胞集団を少なくとも７日間培養することによって製造され、最初の４〜５日間は少なくとも６μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含み、残り培養日数はＦＧＦおよび少なくとも０．５μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む。１つの例では、前記Ｗｎｔ／βカテニン作動薬はＣＨＩＲである。これらの例では、前記ＦＧＦを含有する細胞培地は１００〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有し得る。これらの例では、前記ＦＧＦを含有する細胞培地は０．５〜１．５μΜのＣＨＩＲを含有し得る。これらの例では、前記ＦＧＦを含有する細胞培地は０．５〜１．５μｇ／ｍｌのヘパリンをさらに含有し得る。１つの例では、前記ＩＭ細胞は、ＥＤＴＡまたはトリプシンもしくはＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔで解離され、旋回の前にメッシュスクリーンに通される。１つの例では、前記幹細胞は多能性幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。１つの例では、前記幹細胞は、Ｈ９、ｈＥＳ３、ｉＰＳＣ、ＧＡＰＴｒａｐ  ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ、ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２、ＣＬＲ１５０２．３、ｈＥＳ３  ＳＯＸ１７ｍＣｈｅｒｒｙ、またはＨ９  ＧＡＰＴｒａｐ  Ｌｕｃ２からなる群から選択される。
【００１７】
本発明者らは、本開示の方法が比較的少ない開始細胞数しか必要としないことを確認した。これは、オルガノイドおよび細胞の培養の対費用効果の高いスケールアップを可能とするため、有利である。従って、別の例では、本開示の方法は、０．５×１０6細胞／ｍｌ〜３×１０6細胞／ｍｌのＩＭ細胞集団を旋回することを含む。別の例では、本開示の方法は、０．８×１０6細胞／ｍｌ〜１．２×１０6細胞／ｍｌ程度のＩＭ細胞集団を旋回することを含む。従って、１つの例では、本開示は、ＩＭ細胞集団を旋回することにより製造される、本明細書で開示される腎オルガノイドを包含する。腎オルガノイドを製造するためにＩＭ細胞集団の旋回に使用されるタイミングおよび培地の例が、本明細書で開示される。１つの例では、前記オルガノイドは、０．５×１０6細胞／ｍｌ〜３×１０6細胞／ｍｌのＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することによって製造される。別の例では、前記オルガノイドは、２×１０6個未満のＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することによって製造される。別の例では、前記オルガノイドは、０．５×１０6細胞／ｍｌ〜１．５×１０6細胞／ｍｌのＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することによって製造される。別の例では、前記オルガノイドは、０．８×１０6細胞／ｍｌ〜１．２×１０6細胞／ｍｌ程度のＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することによって製造される。
【００１８】
別の例では、本開示は本明細書に記載の方法によって製造された腎オルガノイドを包含する。
【００１９】
別の例では、本開示は、本明細書に記載の腎オルガノイドを候補化合物と接触させることで、その候補化合物が腎毒性であるかどうかを判定することを含む、腎毒性について候補化合物をスクリーニングする方法を包含する。１つの例では、前記候補化合物は小分子である。
【００２０】
別の例では、本開示は、本明細書に記載の腎オルガノイド、細胞集団または組成物の、腎臓、または腎細胞もしくは腎組織の製造における使用を包含する。別の例では、本開示は、本明細書に記載の腎オルガノイド、細胞集団または組成物の、腎疾患の治療における使用を包含する。いくつかの例では、細胞集団とは、腎オルガノイドの酵素消化から得られる細胞を指す。
【００２１】
驚くべきことに、本発明者らはまた、低濃度のＣＨＩＲを含有する培地中で幹細胞を培養し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を長期間活性化することが、改善された中間中胚葉の製造において有益であることを確認した。
【００２２】
１つの例では、本開示は、後方原始線条（posterior primitive streak）（ＰＰＳ）細胞集団をＦＧＦおよび４μΜ未満のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で２〜５日間培養することを含む、中間中胚葉（ＩＭ）細胞のインビトロ製造法を包含する。
【００２３】
別の例では、幹細胞がまずＣＨＩＲ中で７日間培養され、前記幹細胞は、高濃度のＣＨＩＲを含有する培地中で最初の４〜５日間培養された後、低濃度のＣＨＩＲおよびＦＧＦを含有する培地中で残り日数培養され得る。従って、別の例では、本開示は、中間中胚葉（ＩＭ）細胞のインビトロ製造法であって、幹細胞集団を少なくとも７日間培養することを含み、最初の４〜５日間が少なくとも６μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含み、残り培養日数がＦＧＦおよび少なくとも０．５μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む、前記方法を包含する。１つの例では、前記残り培養日数は、０．５〜３μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する、ＦＧＦを含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む。別の例では、前記残り培養日数は、０．８〜１．２μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する、ＦＧＦを含有する細胞培地中で細胞を培養することを含む。別の例では、前記最初の４日間は、少なくとも６μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含む。別の例では、前記最初の４日間は、７μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で幹細胞を培養することを含む。１つの例では、前記ＦＧＦを含有する細胞培地は、１００〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。１つの例では、前記ＦＧＦを含有する細胞培地は、１８０〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記ＦＧＦ９を含有する細胞培地は、ヘパリンをさらに含有する。例えば、前記細胞培地は、少なくとも１．０μｇ／ｍｌのヘパリンを含有し得る。１つの例では、前記幹細胞は多能性幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。別の例では、前記幹細胞は、Ｈ９、ｈＥＳ３、ｉＰＳＣ、ＧＡＰＴｒａｐ  ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ、ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２、ＣＬＲ１５０２．３、ｈＥＳ３  ＳＯＸ１７ｍＣｈｅｒｒｙ、またはＨ９  ＧＡＰＴｒａｐ  Ｌｕｃ２からなる群から選択される。
【００２４】
別の例では、本開示は、本明細書に記載のオルガノイドまたは細胞集団からバイオインクを準備し、腎臓をバイオプリントすることを含む、腎臓のバイオプリンティング法を包含する。いくつかの例では、細胞集団とは、腎オルガノイドの酵素消化から得られる細胞を指す。
【００２５】
別の例では、本開示は、本明細書に記載の腎オルガノイド、組成物または細胞集団の、腎臓、または腎細胞もしくは腎組織の製造における使用を包含する。別の例では、本開示は、本明細書に記載の方法またはＩＭ細胞集団を用いて腎オルガノイドを製造することを含む、細胞療法用のネフロン細胞型の生成法を包含する。
【００２６】
特に記載のない限り、本明細書におけるあらゆる例が、他のあらゆる例に準用して適用されると見なされるものとする。
【００２７】
本開示は、本明細書に記載の具体的な例によって範囲を限定されることはなく、これらの具体的な例は例示のみを目的にすることが意図されている。機能的に均等の生成物、組成物、および方法も、本明細書に記載される、本開示の範囲に明確に包含される。
【００２８】
本明細書の全体を通じて、特に記載のない限り、または文脈上他の意味に解すべき場合を除き、１つの工程、組成物、工程群、または組成物群への言及は、１および複数（すなわち、１または複数）のその工程、組成物、工程群、または組成物群を包含すると見なされるものとする。
【００２９】
以下、本開示を、添付の図面を参照しながら、下記の非限定的な実施例によって説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】浮遊培養における腎マイクロオルガノイドの生成。（Ａ）ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２細胞を用いて実施された分化の画像による、腎マイクロオルガノイド分化プロトコルの概要。（Ｂ）７＋１８日目の均一な腎マイクロオルガノイドを示している明視野画像（１００ｍｍスケール）。（Ｃ、Ｄ１およびＤ２）血管構造の発達を含む、マイクロオルガノイドの大きさおよび形状に非依存的なネフロン分節の形成を示している、マイクロオルガノイドの免疫蛍光および共焦点像（１００ｍｍスケール）。（Ｅ）ＦＧＦ９±１μΜ  ＣＨＩＲ９９０２１の場合の、７＋０日目のｑＰＣＲによる、中間中胚葉の遺伝子発現プロファイリングの平均変化倍率を示す棒グラフ。データは平均値を示している。（Ｆ）ＦＧＦ９  ±１μΜ  ＣＨＩＲ９９０２１処理の場合の、ＰＡＸ２の免疫蛍光（５０μｍスケール）（７＋１１日目）。
【図１−２】（Ｇ）腎マイクロオルガノイド内のネフロン区画の免疫蛍光および共焦点像；ポドサイト（ＮＰＨＳ１＋且つＭＡＦＢ＋）、近位尿細管（ＬＴＬ＋、ＣＵＢＮ＋、ＬＲＰ２＋、およびＨＮＦ４Ａ＋）、遠位尿細管（ＥＣＡＤ）、集合管（ＥＣＡＤ＋、ＧＡＴＡ３＋）、および内皮細胞（ＳＯＸ１７＋且つＰＥＣＡＭ１＋）（５０μｍスケール）。
【図２】浮遊培養下の腎マイクロオルガノイドは機能的な近位尿細管を示しており、初期のＷｎｔシグナル伝達は腎オルガノイドの発生および成熟に重要である。（Ａ）ＦＩＴＣアルブミン取り込みを示す、７＋１８日目の、腎マイクロオルガノイド尿細管の共焦点像（５μｍスケール）。（Ｂ）異なるネフロン分節を標識する抗体を用いた、７＋１８日目の、ｈＥＳ（Ｈ９  ＧＡＰ−Ｔｒａｐ  Ｌｕｃ２、ｈＥＳ３  ＳＯＸ１７ｍＣｈｅｎｙ）およびｉＰＳ（ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２およびＣＲＬ１５０２．３）を含む４種の異なる細胞株を用いて生成された腎マイクロオルガノイドの共焦点像（５０μｍスケール）。（Ｃ、ＤおよびＥ）明視野（Ｃ、１００μｍスケール）、およびＳＯＸ１７＋脈管構造を示す免疫蛍光共焦点像（Ｄ）、およびＭＥＩＳ１／２／３＋間質（Ｅ）（１００μｍスケール）を示す、３日間、４日間、５日間、および６日間の異なる日数の初期７μΜ  ＣＨＩＲ９９０２１処理に暴露後に生成された、ｈＥＳ３  ＳＯＸ１７ｍＣｈｅｒｒｙ由来マイクロオルガノイド。
【図３−１】マイクロオルガノイド内の腎臓分化の転写による確認。（Ａ）１１の異なるクラスターを示す、７＋１８日目のＣＲＬ１５０２−Ｃ３２マイクロオルガノイドのシングルセルＲＮＡ−ｓｅｑのＳｅｕｒａｔクラスタリング後のｔ−ＳＮＥプロット。
【図３−２】（Ｂ）クラスター内の重要なマーカー遺伝子のスケーリングされた遺伝子発現を示すヒートマップ。
【図３−３】（Ｃ）選択されたネフロン細胞型の重要マーカー遺伝子の発現を示すｔ−ＳＮＥプロット。色の強さは遺伝子毎にスケーリングされており、青色はより高発現である。
【図４−１】腎マイクロオルガノイドは効率的なｈＰＳＣ由来腎細胞のスケールアップのためのより良好なプラットフォームを提供する。（Ａ）７＋１１日目の標準的な腎オルガノイドの明視野画像（左、５００μｍスケール）、ネフロン構造がオルガノイドの縁に空間的に限定されていることを示す、標準的なオルガノイド全体の免疫蛍光および共焦点像（タイルスキャン）（中央、２００μｍスケール）、およびこのオルガノイド内のネフロンの拡大画像（右、２００μｍスケール）。（Ｂ）腎マイクロオルガノイドの明視野画像および単一の腎マイクロオルガノイドの拡大明視野画像、７＋１１日目の腎マイクロオルガノイドの共焦点像（２００μｍスケール）。
【図４−２】（Ｃ）異なる発生段階におけるオルガノイドの大きさの変化。（Ｄ）標準的なオルガノイドと比較した、経時的な開始細胞数からの総細胞数の変化およびマイクロオルガノイドのスケールアップ性（scalable capacity）。（Ｅ〜Ｆ）Ｄ７＋１８日目のＣ３２マイクロオルガノイドの免疫蛍光法およびビットプレーン社製Ｉｍａｒｉｓによる３次元再構成は、糸球体（ＮＰＨＳ１）、近位尿細管（ＬＴＬ＋）、遠位尿細管（ＥＣＡＤ＋）、集合管（ＥＣＡＤ＋、ＧＡＴＡ３＋）、および間質細胞（ＧＡＴＡ３＋）から始まる、分極化した、互いに接続された明確なネフロン分節を示した。
【図５−１】標準腎オルガノイドおよびマイクロオルガノイドの比較シングルセル転写プロファイリングは等価な腎形成性パターンを示す。（Ａ）７＋１８日目の腎マイクロオルガノイド（Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇ）および標準オルガノイド（Ｓｔａｎｄ−ｏｒｇ）の１０×ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータの統合Ｓｅｕｒａｔ解析後のｔ−ＳＮＥプロット（ＣＲＬ１５０２．３２）。（Ｂ）オルガノイドの種類で色分けされた、各クラスターの細胞型に対する、マイクロオルガノイドおよび標準オルガノイドの寄与を表す、ｔ−ＳＮＥプロット。
【図５−２】（Ｃ）それぞれの転写クラスターおよび分化系統型に割り当てられた、Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇデータセットまたはＳｔａｎｄ−ｏｒｇデータセットのそれぞれの比率を表す棒グラフ。（Ｄ）腎マイクロオルガノイドおよび標準オルガノイド間の各クラスターにおける腎臓マーカーの遺伝子発現を示すスプリットドットプロット。（Ｅ）Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇ内およびＳｔａｎｄ−ｏｒｇ内の、ネフロン関連遺伝子（ＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１）および間質関連遺伝子（ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＩＳ２）の、対数正規化された細胞当たりの数を示す、バイオリン図および散布図。（Ｆ）腎Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇおよびＳｔａｎｄ−ｏｒｇの、ＰＡＸ２およびＭＥＩＳ１／２／３の発現を示す免疫蛍光（５０μｍスケール）。
【図６】ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇ内およびｓｔａｎｄ−ｏｒｇ内のネフロンマーカーおよび間質マーカーの比較。（ＡおよびＢ）標準オルガノイドおよびマイクロオルガノイドのｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータにおける、ネフロン遺伝子および間質遺伝子についての、ｔ−ＳＮＥ特性プロット。
【図７】オールトランスレチノイン酸は、腎マイクロオルガノイドにおける糸球体成熟の改善に役立つ。旋回浮遊培養によって生成されたＣ３２旋回オルガノイドの免疫蛍光分析。（Ａ）ａｔＲＡ添加無しで生成されたオルガノイド。（Ｂ）７＋５日目〜７＋１０日目にａｔＲＡを用いて生成されたオルガノイドは糸球体ポドサイトの成熟の改善を示す。（Ｃ）異なる時点（７＋１１日目および７＋１８日目）におけるａｔＲＡ有り／無しで生成されたオルガノイドのｑＰＣＲ分析。
【図８】腎マイクロオルガノイドは薬物毒性スクリーニングのためのプラットフォームを提供する。アドリアマイシン処理（２４時間）は、アポトーシスマーカーであるＴＵＮＥＬの発現を増加させることにより、腎マイクロオルガノイドに対する用量依存的な毒性を誘導する（Ａ〜Ｃ）。（Ｄ）アドリアマイシン処理はまた、マイクロオルガノイドにおける腎臓特異的遺伝子の発現を減少させる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
特に記載がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、当該技術分野（例えば、分子生物学、細胞培養、幹細胞分化、細胞治療、遺伝子組み換え、疾病モデリング、生化学、生理学、および臨床研究）の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有すると見なされるものとする。
【００３２】
特に記載がない限り、本開示で使用される分子的手法および統計的手法は標準的な手順であり、当業者に周知のものである。このような手法は、以下のような典拠の文献に報告および説明がなされている：Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley and Sons）（１９８４年）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Cold Spring Harbour Laboratory Press）（１９８９年）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１巻および第２巻、ＩＲＬプレス社（IRL Press）（１９９１年）、Ｄ．Ｍ．ＧｌｏｖｅｒおよびＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１〜４巻、ＩＲＬプレス社（１９９５年および１９９６年）、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリケーション・アソシエーツ・アンド・ワイリー・インターサイエンス社（Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience）（１９８８年、現在までの全ての更新を含む）、Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（１９８８年）、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら（編）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（現在までの全ての更新を含む）、Ｍｉｃｈｏｓ  Ｏｄｙｓｓｅ（編）  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（シュプリンガー社（Springer））、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌａｎｚａ（編）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、第１巻、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（エルゼビア社（Elsevier））。
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の用語、並びに単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象を所望により包含する。すなわち、例えば、「腎オルガノイド」という場合、１または複数の腎オルガノイドを所望により包含する。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、特に指定がない限り、指定された値の±１０％、より好ましくは±５％、より好ましくは±１％、を指す。
【００３５】
用語「および／または」、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味していると理解され、両方の意味またはどちらかの意味を明示的に支持していると見なされるものとする。
【００３６】
本明細書の全体を通じて、語「含む（comprise）」、または「含む（comprises）」もしくは「含むこと（comprising）」などの変形は、記載された要素、整数、もしくは工程、または要素群、整数群、もしくは工程群の包含を意味するが、他の要素、整数、もしくは工程、または要素群、整数群、もしくは工程群の排除は意味していないと理解される。
【００３７】
様々な対象に、本開示の細胞組成物は投与され得る。１つの例では、前記対象は哺乳動物である。前記哺乳動物は、イヌもしくはネコなどのコンパニオンアニマル、またはウマもしくはウシなどの家畜動物であり得る。別の例では、前記対象はヒトである。「対象」、「患者」、または「個体」などの用語は、本開示においては文脈内で同義的に使用され得る用語である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「治療」とは、臨床病理の経過中に治療を受けている個体または細胞の自然経過を変化させるように設計された臨床的介入を指す。好ましい治療効果には、疾患増悪速度の減少、病状の改善または軽減、および寛解または予後の改善が含まれる。例えば、疾患に関連する１または複数の症状が緩和または除去されたならば、個体を「治療」できたことになる。１つの例では、用語「治療」とは、標的障害を逆転、防止、または遅延（軽減）することを目的とした、腎疾患、貧血症、エリスロポエチン欠乏、尿細管輸送不全、または糸球体濾過不全に対する、治療的処置および予防的または防止的な処置の両方を指す。治療を必要とするものとしては、腎疾患、貧血症、エリスロポエチン欠乏、尿細管輸送不全、または糸球体濾過不全を既に患っているもの、そのような障害に罹り易いもの、またはそのような障害が予防されるべきものが含まれる。１つの例では、治療は腎機能の安定化および／または改善を包含する。
【００３９】
「有効量」とは、目的の治療的成果または予防的成果を達成するために必要な用量および期間において、少なくとも有効な量を指す。有効量は、一回または複数回の投与で提供され得る。本開示のいくつかの例では、用語「有効量」は、本明細書で後述される腎臓の障害または異常の治療を達成するのに必要な量を指して用いられる。有効量は、治療対象の疾患または異常に応じて変化し、また、体重、年齢、人種的背景、性別、健康および／または体の状態、並びに治療対象の哺乳動物に関する他の要因によっても変化し得る。通例、有効量は、医療実施者による通例の治験および実験を通じて決定され得る、比較的広い範囲をとる（例えば「用量」範囲）。有効量は、単回用量で、または、治療期間に亘って１回もしくは数回反復される用量で、投与され得る。
【００４０】
「治療有効量」は、特定の腎障害（例えば、腎炎、腎細胞癌）の測定可能な改善を達成するのに必要な、少なくとも最小限の濃度を指す。本明細書において、治療有効量はまた、患者の病状、年齢、性別、および体重、並びに、個体において所望の応答を引き出す細胞組成物の能力などの要因によっても変化し得る。また、治療有効量は、治療に有益な作用が組成物のあらゆる毒性作用または有害作用を上回る量でもある。腎細胞癌の場合では、治療有効量は、がん細胞の数を減少させ；原発腫瘍サイズを減少させ；末梢器官へのがん細胞の浸潤を抑制し（すなわち、ある程度遅延し、場合によっては阻止し）；腫瘍の転移を抑制（すなわち、ある程度遅延し、場合によっては阻止し）；腫瘍の成長もしくは腫瘍の進行をある程度抑制もしくは遅延し；且つ／または、腎細胞癌と関連した１もしくは複数の症状をある程度軽減し得る。腎細胞癌治療において、インビボでの有効性は、例えば、生存期間、無増悪期間（ＴＴＰ）、奏功率（ＲＲ）、効果持続期間、および／または生活の質の評価によって測定され得る。
【００４１】
「中間中胚葉（ＩＭ）」細胞とは、運命確定（definitive）中胚葉から生じた胚体中胚葉細胞であって、後方原始線条から派生して、最終的に尿管および腎臓、並びに生殖腺などの他の組織を含む泌尿生殖器系へと発生し得るものを意味する。中間中胚葉に特徴的または代表的なマーカーの例として、ＰＡＸ２、ＯＳＲ１および／またはＬＨＸ１が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４２】
また、ＩＭ細胞の製造が、そのＩＭ細胞が、他の細胞型（運命確定中胚葉など）が存在しない純粋または均一なＩＭ細胞集団であることを意味するものではないことを理解されたい。従って、「ＩＭ細胞」または「ＩＭ細胞集団」という場合、ＩＭ細胞を含む細胞または細胞集団を意味する。本発明によれば、ＩＭ細胞は、後方原始線条細胞を、より詳細に後述されるような、後方原始線条細胞のＩＭ細胞への分化を促進する１または複数の薬剤と接触させることにより製造されることが適切である。ＩＭ細胞は、後方原始線条細胞を、後方原始線条細胞のＩＭ細胞への分化を促進する１または複数の薬剤と接触させることにより製造されることが好ましい。
【００４３】
「後方原始線条（ＰＰＳ）」細胞とは、哺乳類の胚発生初期の胞胚に形成される原始線条構造体の後端の細胞、から得られる細胞、または前記後端の細胞に機能的且つ／もしくは表現型的に対応している細胞、を意味する。後方原始線条は、左右相称を確立し、原腸形成の部位を決定し、胚葉形成を開始する。通例、後方原始線条は中胚葉の前駆体（すなわち、予定中胚葉）であり、前方原始線条は内胚葉の前駆体（すなわち、予定内胚葉）である。後方原始線条に特徴的または代表的なマーカーの非限定的な例として、ブラキウリ（Brachyury）（Ｔ）が挙げられる。前方原始線条に特徴的または代表的なマーカーの非限定的な例としては、ＳＯＸ１７がある。ＭＩＸＬ１は後方原始線条および前方原始線条の両方によって発現され得る。
【００４４】
また、後方原始線条細胞の製造が、その後方原始線条細胞が、他の細胞型が存在しない純粋または均一な後方原始線条細胞集団であることを意味するものではないことを理解されたい。従って、「後方原始線条細胞」または「後方原始線条細胞集団」という場合、後方原始線条細胞を含む細胞または細胞集団を意味する。後方原始線条細胞は、ｈＰＳＣ細胞を、より詳細に後述されるような、ｈＰＳＣ細胞の後方原始線条細胞への分化を促進する１または複数の薬剤と接触させることにより製造される。例えば、前記１または複数の薬剤には、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、アクチビンＡ、および／またはＷｎｔ作動薬（ＣＨＩＲ９９０２１など）が含まれ得る。
【００４５】
腎オルガノイド
本開示は中間中胚葉（ＩＭ）細胞の製造を包含する。用語「中間中胚葉（ＩＭ）」は、本開示との関連においては、運命確定中胚葉から生じた胚体中胚葉細胞であって、後方原始線条から派生して、最終的に尿管および腎臓、並びに生殖腺などの他の組織を含む泌尿生殖器系へと発生し得るものを指して用いられる。中間中胚葉に特徴的または代表的なマーカーの例として、ＰＡＸ２、ＯＳＲ１および／またはＬＨＸ１が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４６】
１つの例では、これらのＩＭ細胞に「自己組織化」させ、腎オルガノイドを形成させるための培養条件が提供される。用語「腎オルガノイド」は、本開示との関連においては、元々の腎臓に存在する細胞自己組織化、構築、およびシグナル伝達相互作用の各側面を反復する、不均一な三次元細胞凝集塊を指して用いられる。Takasato et al. (2015) Nature, Vol. 526:564-568、国際公開第２０１４／１９７９３４号、および同第２０１６／０９４９４８号には、腎オルガノイドの例が記載されている。本開示との関連において、用語「腎臓オルガノイド（renal organoid）」および「腎オルガノイド（kidney organoid）」は同義的に使用され得る。
【００４７】
驚くべきことに、本発明者らにより、三次元構造が単純化された腎オルガノイドが特定された。そのようなオルガノイドは、イメージングと長期培養がより簡単であるため有利である。例えば、健常な成人は各腎臓に８０万から２００万個のネフロンを有し、典型的には１００万個程度である。対照的に、本開示に包含されるオルガノイドは、はるかにより少ない数のネフロンを含む。従って、１つの例では、本開示は、ネフロンの数が減少した、元々の腎臓の構造的特徴を備える腎オルガノイドを包含する。１つの例では、本開示に包含される腎オルガノイドは１または複数のネフロンを含み得る。１つの例では、ネフロンは、遠位尿細管、近位尿細管、初期ヘンレループ、および糸球体に分節化される。別の例では、オルガノイドは、内皮細胞、血管周囲細胞、および腎間質に囲まれた分節化ネフロンを含む。別の例では、本開示のオルガノイドは脈管構造の存在を示さない。
【００４８】
他の例では、本開示のオルガノイドは少なくとも部分的に血管新生が生じている。例えば、オルガノイドは、足突起を発達させ、血管新生を起こすポドサイトを含むネフロンから構成され得る。
【００４９】
１つの例では、腎オルガノイドはネフロン率（％）、間質率（％）および／または脈管構造率（％）の面から特徴付けされる。この例では、腎オルガノイドはシングルセルＲＮＡシーケンスを用いて特徴付けされ得る。シングルセルシーケンスの一例を以下に記載する。１つの例では、腎オルガノイドは少なくとも２０％の成熟ネフロンを含む。別の例では、腎オルガノイドは少なくとも２５％の成熟ネフロンを含む。別の例では、腎オルガノイドは少なくとも３０％の成熟ネフロンを含む。別の例では、腎オルガノイドは少なくとも３１％の成熟ネフロンを含む。別の例では、腎オルガノイドは少なくとも３２％の成熟ネフロンを含む。これらの例では、前記腎オルガノイドは少なくとも１５％の間質も含む。別の例では、前記腎オルガノイドは少なくとも２０％の間質も含む。別の例では、前記腎オルガノイドは少なくとも２５％の間質も含む。別の例では、前記腎オルガノイドは脈管構造を実質的に含まない。別の例では、前記腎オルガノイドは脈管構造を含まない。
【００５０】
１つの例では、本開示の腎オルガノイドは１００個未満のネフロンを含む。別の例では、本開示の腎オルガノイドは９０個未満、８０個未満、７０個未満、６０個未満のネフロンを含む。別の例では、本開示の腎オルガノイドは５０個未満のネフロンを含む。別の例では、本開示の腎オルガノイドは４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満のネフロンを含む。別の例では、本開示の腎オルガノイドは５個未満のネフロンを含む。別の例では、本開示の腎オルガノイドは４個未満、３個未満のネフロンを含む。
【００５１】
別の例では、本開示の腎オルガノイドは２〜１００個のネフロンを含む。別の例では、本開示の腎オルガノイドは２〜５０個のネフロンを含む。別の例では、本開示の腎オルガノイドは２〜１０個のネフロンを含む。別の例では、本開示の腎オルガノイドは５〜１２個のネフロンを含む。別の例では、本開示の腎オルガノイドは６〜１０個のネフロンを含む。別の例では、本開示の腎オルガノイドは２〜６個のネフロンを含む。別の例では、本開示の腎オルガノイドは２〜４個のネフロンを含む。
【００５２】
「ネフロン」は、血液／血漿からの老廃物の除去および体液量の維持で主要な役割を担う、腎臓の機能的な作動単位である。当業者は様々な方法を用いて、本明細書で開示されるオルガノイド内のネフロンを同定および計数できる。例えば、ネフロンは共焦点顕微鏡法および免疫蛍光標識を用いて可視化および計数できる（例えば、ＷＴ１＋糸球体；ＮＰＨＳ＋ポドサイト、ＬＴＬ＋ＥＣＡＤ−近位尿細管、ＥＣＡＤ＋遠位尿細管、およびＥＣＡＤ＋ＧＡＴＡ３＋集合管）。
【００５３】
通常、本開示に包含される腎オルガノイドの種の同定は、マウス、ヒトなどの哺乳類であるかどうかにかかわらず、当該腎オルガノイドの生成に用いられた細胞によって決定される。１つの例では、本開示は哺乳類腎オルガノイドを包含する。この例では、腎オルガノイドを生成するために哺乳類多能性幹細胞が使用される。哺乳類腎オルガノイドは、イヌもしくはネコなどのコンパニオンアニマル、またはウマもしくはウシなどの家畜動物由来の腎臓を代表するものであってもよい。すなわち、これらの例では、腎オルガノイドを生成するためにイヌ、ネコなどに由来する幹細胞が使用される。別の例では、前記哺乳類腎オルガノイドは、マウスまたはラット由来の腎臓を代表するものである。別の例では、前記腎オルガノイドは、カニクイザルまたはアカゲザルなどのより高次の霊長目由来の腎臓を代表するものである。別の例では、前記哺乳類腎オルガノイドは、ヒト由来の腎臓を代表するものである。腎オルガノイドを生成するために特定の種由来の多能性幹細胞が使用された場合、得られた腎オルガノイドはその種に基づいた同定がなされ得る。例えば、腎オルガノイドを生成するためにヒト幹細胞を使用した場合、得られた腎オルガノイドはヒト腎オルガノイドと同定され得る。すなわち、１つの例では、本開示に包含される腎オルガノイドは、ヒト幹細胞由来のヒト腎オルガノイドを包含する。腎オルガノイドを生成するのに好適な幹細胞の他の様々な例を以下に記載する。
【００５４】
別の例では、分子マーカーの発現に基づいて、腎オルガノイドが特徴付けされ得る。マーカー発現は、免疫組織化学または蛍光標識細胞分取などの様々な手法を用いて特徴付けされ得る。免疫組織化学は通常、目的マーカーに特異的な一次抗体の使用を含む。マーカーへの一次抗体の結合は、様々な公知の方法で可視化することができる。例えば、一次抗体を認識する標識化二次抗体が使用され得る。この例では、標識は、西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素、放射性同位元素、蛍光性レポーター、電気化学発光性タグであり得る。一次抗体への標識化二次抗体の結合は、細胞学的評価によって、または自動プレートリーダーを介して、検出され得る。
【００５５】
特定の例では、腎オルガノイドまたはその分節もしくは試料を特定の一次抗体と接触させる。次に、前記腎オルガノイドまたはその分節もしくは試料を洗浄することで未結合の一次抗体を除去し、その後、ペルオキシダーゼ酵素に連結した、前記一次抗体に特異的な二次抗体をこの試料に添加する。次に、前記腎オルガノイドまたはその分節もしくは試料を洗浄することで未結合の二次抗体を除去し、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）をこの試料に添加する。ＤＡＢの有色産物への変換を通例の細胞学的評価で可視化し、ここで、有色産物の存在は、前記マーカーが前記試料中に存在することを表す。１つの例では、有色産物のレベルは、ＩｍａｇｅＪまたは、パーキンエルマー社およびライカ社などの供給業者から市販されている他の様々なソフトウェアパッケージを用いて定量化され得る。
【００５６】
別の例では、代表的な腎オルガノイド、その集団、またはその分節もしくは試料から、細胞浮遊液が製造される。浮遊状態の細胞が、特定のマーカー（maker）に特異的な蛍光標識抗体と接触させられる。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）などの手法を用いて、特定のマーカーが陽性の細胞が同定される。
【００５７】
所与のマーカーが「陽性」であるといわれる細胞は、そのマーカーが細胞表面上にどの程度存在しているかに依存して、そのマーカーを低レベル（ｌｏまたはｄｉｍ）または高レベル（ｂｒｉｇｈｔ、ｂｒｉ）に発現し得る。ここで、これらの用語は、細胞の分取プロセスで用いられた蛍光または他のマーカーの強度に関するものである。ｌｏ（またはｄｉｍまたはｄｕｌｌ）とｂｒｉの差異は、分取対象の特定の細胞集団上の使用されたマーカーと関連させて理解される。細胞が所与のマーカーについて「陰性」であるとされる場合、その細胞は必ずしも完全に不在でなくてもよい。この用語は、マーカーがその細胞または集団によって比較的低いまたは非常に低いレベルで発現されており、検出可能に標識されても非常に少ないシグナルしか生じないこと、または、バックグラウンドレベル（例えば、アイソタイプ対照抗体を用いて検出されるレベル）を超えるレベルが検出不可であること、を意味する。
【００５８】
１つの例では、蛍光性レポーター遺伝子を用いて、本明細書に記載の腎オルガノイドのマーカーが検出され得る。例えば、特定のマーカーの発現をモニタリングすることにより、腎オルガノイドの発生またはそれを含む細胞をリアルタイムで追跡することができる。例えば、幹細胞が、所与の一連の条件下で、１または複数の蛍光性レポーターまたは化学発光性レポーターを発現するように、遺伝子改変され得る。レポーターを用いることで、細胞識別情報、細胞生存率、または細胞機能をリアルタイムで追跡することができる。
【００５９】
好適なレポーター遺伝子の例が以下に示されるが、内在性ＭＡＦＢ遺伝子座の開始コドンに挿入されたｍＴａｇＢＦＰ２蛍光性レポーター遺伝子を有する（ＭＡＦＢmTagBFP2/+）ノックインｉＰＳＣ株が作製される。ＭＡＦＢは発生中のポドサイトで高発現されるため、ＭＡＦＢの発現をモニタリングすることで、腎オルガノイド内のポドサイトの発生をリアルタイムで追跡することができる。本明細書で開示される方法での使用に好適なレポーター細胞株の他の例としては、ＧＡＴＡ３ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＥＴｔｄＴＯＭＡＴＯ、またはＳｉｘ２Ｃｒｅが挙げられる。
【００６０】
別の例では、腎オルガノイドは、１または複数のネフロンマーカーを高レベルで発現する細胞を含む。別の例では、腎オルガノイドは、ＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、ＧＡＴＡ３、ＰＡＸ８、ＥＹＡ１、およびＣＩＴＥＤ１のうちの１または複数を高レベルで発現する細胞を含む。例えば、腎オルガノイドは高レベルのＰＡＸ２を発現し得る。別の例では、腎オルガノイドは高レベルのＳＩＸ１を発現し得る。別の例では、腎オルガノイドは高レベルのＬＨＸ１を発現し得る。別の例では、腎オルガノイドは高レベルのＯＳＲ１を発現し得る。別の例では、腎オルガノイドは高レベルのＷＮＴ１１を発現し得る。別の例では、腎オルガノイドは高レベルのＧＡＴＡ３を発現し得る。別の例では、腎オルガノイドはＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、およびＧＡＴＡ３を高レベルで発現する細胞を含む。別の例では、腎オルガノイドは、ＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、ＧＡＴＡ３、ＰＡＸ８、ＥＹＡ１、およびＣＩＴＥＤ１を高レベルで発現する細胞を含む。これらの例では、腎オルガノイドは、少なくとも１００個のネフロンを有する腎オルガノイドと比較して、ＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、ＧＡＴＡ３、ＰＡＸ８、ＥＹＡ１、およびＣＩＴＥＤ１のうちの１または複数などの参照マーカーを高レベルで発現し得る。別の例では、腎オルガノイドは、５０個より多いネフロンを有する腎オルガノイドと比較して、ＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、ＧＡＴＡ３、ＰＡＸ８、ＥＹＡ１、およびＣＩＴＥＤ１のうちの１または複数などの参照マーカーを高レベルで発現し得る。別の例では、腎オルガノイドは、少なくとも１×１０5個の細胞を含む腎オルガノイドと比較して、ＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、およびＧＡＴＡ３のうちの１または複数などの参照マーカーを高レベルで発現し得る。別の例では、腎オルガノイドは、少なくとも１×１０6個の細胞を含む腎オルガノイドと比較して、ＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、およびＧＡＴＡ３のうちの１または複数などの参照マーカーを高レベルで発現し得る。別の例では、腎オルガノイドは、Takasato et al. (2015)に記載される腎オルガノイドなどの旋回無しで製造された腎オルガノイドと比較して、ＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、およびＧＡＴＡ３のうちの１または複数などの参照マーカーを高レベルで発現し得る。
【００６１】
別の例では、腎オルガノイドは低レベルのＷＴ１を発現する細胞を含む。別の例では、腎オルガノイドは低レベルのＣ−ＲＥＴを発現する細胞を含む。別の例では、腎オルガノイドは低レベルのＦＯＸＤ１を発現する細胞を含む。別の例では、腎オルガノイドは低レベルのＰＤＧＦＲＡを発現する細胞を含む。別の例では、腎オルガノイドは低レベルのＭＥＩＳ２を発現する細胞を含む。別の例では、腎オルガノイドはＷＴ１およびＣ−ＲＥＴを低レベルで発現する細胞を含む。別の例では、腎オルガノイドはＷＴ１、Ｃ−ＲＥＴ、およびＦＯＸＤ１を低レベルで発現する細胞を含む。これらの例では、腎オルガノイドは、少なくとも１００個のネフロンを有する腎オルガノイドと比較して、ＷＴ１、Ｃ−ＲＥＴ、およびＦＯＸＤ１のうちの１または複数などの参照マーカーを低レベルで発現し得る。別の例では、腎オルガノイドは、５０個より多いネフロンを有する腎オルガノイドと比較して、ＷＴ１、Ｃ−ＲＥＴ、およびＦＯＸＤ１のうちの１または複数などの参照マーカーを低レベルで発現し得る。
【００６２】
別の例では、腎オルガノイドは、高レベルのＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、およびＧＡＴＡ３、並びに低レベルのＷＴ１、Ｃ−ＲＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＩＳ２、およびＦＯＸＤ１を発現する細胞を含む。別の例では、腎オルガノイドは、高レベルのＰＡＸ２、ＳＩＸ１、ＬＨＸ１、ＯＳＲ１、ＷＮＴ１１、ＧＡＴＡ３、ＰＡＸ８、ＥＹＡ１、およびＣＩＴＥＤ１、並びに低レベルのＷＴ１、Ｃ−ＲＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＩＳ２、およびＦＯＸＤ１を発現する細胞を含む。
【００６３】
上記の例で、発現の高レベルおよび低レベルとは、Takasato et al. (2015) Nature, Vol. 526:564-568に記載される腎オルガノイドなどの旋回無しで培養された腎オルガノイドと比較してのものである。この例では、高発現は少なくとも１倍高い。別の例では、高発現は少なくとも１．５倍高い。別の例では、高発現は少なくとも２倍高い。１つの例では、低発現は少なくとも１／１倍低い。別の例では、低発現は少なくとも１／１．５倍低い。別の例では、低発現は少なくとも１／２倍低い。
【００６４】
発現レベルは、目的のマーカーに適したプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応などの手法を用いて測定することができる。例えば、全ＲＮＡが、オルガノイドから抽出され、逆転写され、ＰＣＲにかけられて、分析され得る。
【００６５】
１つの例では、腎オルガノイドは、ＷＴ１＋糸球体、ＮＰＨＳ＋ポドサイト、ＬＴＬ＋ＥＣＡＤ−近位尿細管、ＥＣＡＤ＋遠位尿細管、およびＥＣＡＤ＋ＧＡＴＡ３＋集合管のうちの１または複数を含むネフロンを含む。別の例では、腎オルガノイドは、ＮＰＨＳ＋ポドサイト、ＬＴＬ＋近位尿細管セグメント、ＥＣＡＤ＋遠位尿細管セグメント、およびＥＣＡＤ＋ＧＡＴＡ３＋集合管を含むネフロンを含む。上記で例示された成分を含む腎オルガノイドは様々な方法で同定できる。１つの例では、腎オルガノイドは、固定され、ホールマウントされた後、共焦点顕微鏡法および免疫蛍光標識法を用いて視覚的に評価され得る。
【００６６】
１つの例では、腎オルガノイドは、下記のスクリーニング法での使用後に、上記マーカーのうちの１または複数に基づいて特徴付けされ得る。別の例では、より広範な集団を示す腎オルガノイドが上記マーカーのうちの１または複数に基づいて特徴付けされた後、下記のスクリーニング法で用いるのに適したマーカーを発現する腎オルガノイドが選択され得る。例えば、腎オルガノイド集団が本明細書で開示される方法を用いて製造され得る。前記集団の腎オルガノイドにおいて上記マーカーのうちの１または複数の発現が確認された後、下記のスクリーニング法で用いるための腎オルガノイドが選択され得る。
【００６７】
別の例では、本開示のオルガノイドは０．５×１０4〜８×１０4個の細胞を含む。別の例では、腎オルガノイドは０．８×１０4〜７×１０4個の細胞を含む。別の例では、オルガノイドは１×１０4〜５×１０4個の細胞を含む。別の例では、オルガノイドは少なくとも１×１０4個の細胞を含む。別の例では、オルガノイドは３×１０4個未満の細胞を含む。別の例では、オルガノイドは２×１０4〜２．５×１０4個の細胞を含む。
【００６８】
別の例では、本開示のオルガノイドは２，５００μｍ未満の直径を有する。別の例では、本開示のオルガノイドは２，０００μｍ未満の直径を有する。別の例では、本開示のオルガノイドは１，０００μｍ未満の直径を有する。別の例では、本開示のオルガノイドは５００μｍ未満の直径を有する。別の例では、本開示のオルガノイドは４００μｍ未満の直径を有する。別の例では、本開示のオルガノイドは３００μｍ未満の直径を有する。別の例では、本開示のオルガノイドは１５０〜６００μｍの直径を有する。別の例では、本開示のオルガノイドは２００〜５００μｍの直径を有する。例えば、本開示のオルガノイドは２００μｍ〜２，０００μｍの直径を有し得る。別の例では、本開示のオルガノイドは２００μｍ〜１，０００μｍの直径を有し得る。別の例では、本開示のオルガノイドは２００μｍ〜４００μｍの直径を有し得る。別の例では、本開示のオルガノイド２００μｍ〜３００μｍの直径を有し得る。別の例では、本開示のオルガノイドは２５０μｍ〜３００μｍの直径を有し得る。
【００６９】
当業者には理解されることであるが、オルガノイドの大きさは、例えば、光学顕微鏡法、およびＩｍａｇｅＪなどの付随のソフトウェアによって測定できる。例えば、当業者は、その三次元構造の最も幅が広いポイントで幅を測定することにより、上記で例示された大きさのオルガノイドを特定できる。
【００７０】
別の例では、本開示のオルガノイドは培養下で少なくとも３週間生存する。別の例では、本開示のオルガノイドは培養下で少なくとも４週間生存する。別の例では、本開示のオルガノイドは培養下で少なくとも６週間生存する。別の例では、本開示のオルガノイドは培養下で少なくとも３〜４週間生存する。例えば、本明細書で開示される腎オルガノイドは、培養下で３〜６週間経過後にはじめて、拡散の制限（すなわち、オルガノイド構造を構成する細胞への栄養分の移動に影響を与える制限）を発達させ得る。これらの例では、前記期間は７＋１日目から測定される。従って、言い換えると、本開示のオルガノイドは少なくとも７＋２１日目、７＋２８日目、または７＋４２日目まで培養下で生存する。１つの例では、細胞増殖速度が拡散制限の尺度として用いられ得る。これは、細胞が十分な栄養分の非存在下では通例は分裂し続けないからである。従って、本明細書で開示されるオルガノイドにおける細胞増殖を経時的に追跡することで、拡散の制限がいつ起こるかを決定することができる。１つの例では、３〜６日間に亘る細胞増殖速度の減少が、拡散の制限を示す。別の例では、３〜６日間に亘る細胞増殖の停滞が、拡散の制限を示す。
【００７１】
本開示は、ヒト腎臓と比較して少数のネフロンを含む腎オルガノイドを包含する。当業者には理解されることであるが、腎オルガノイドは、人工産物であり、哺乳類の腎臓の生理学的特徴および生化学的特徴を多く共有しており、自然発生はしない。例えば、本明細書で開示される腎オルガノイドは、インタクトな脈管構造、および／または以下の特徴のうちの１もしくは複数、に関連していなくてもよい：
５０個未満のネフロンを有する；
０．５×１０4〜８×１０4個程度の細胞を含む；
１０００μｍ未満（好ましくは２５０〜３５０μｍ程度）の直径を有する；
組織や臓器の一部ではない独立した三次元構造である；および
インビトロで幹細胞の分化を含む方法によって製造される。
【００７２】
細胞組成物および治療法
本開示のオルガノイドまたは細胞が、治療用組成物を製造するために使用され得る。１つの例では、本明細書で開示されるオルガノイド全体が治療用組成物として提供され得る。別の例では、本開示は、本明細書で開示される腎オルガノイドから製造された細胞組成物を包含する。例えば、本開示のオルガノイドを酵素消化することによって、細胞組成物が作製される。例えば、トリプシンなどのプロテアーゼを単独またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と組み合わせて用いて、本明細書に記載のオルガノイドを消化することによって、細胞組成物が作製され得る。別の例では、コラゲナーゼＩおよび／またはコラゲナーゼＩＩ（例えば市販のｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）（ロシュ社））などのコラゲナーゼで、本明細書に記載のオルガノイドを消化することによって、細胞組成物が作製され得る。１つの例では、１または複数の細胞型を枯渇させるために、前記酵素消化物が部分純化または純化される。例えば、血管細胞および／または内皮細胞が枯渇され得る。別の例では、１または複数の細胞型を濃縮するために、前記酵素消化物が部分純化または純化される。例えば、ネフロン前駆細胞および／または尿管上皮前駆細胞の濃縮組成物を得るために、前記酵素消化物が部分純化または純化される。
【００７３】
別の例では、本開示に包含される組成物は、本明細書で開示される方法を用いて培養された細胞を含む。例えば、組成物は、高レベルのＰＡＸ２、ＬＨＸ１、およびＯＳＲ１（キャップ状間葉）、並びにＷｎｔ１１およびＧＡＴＡ３（尿管上皮）を発現する改善されたＩＭ細胞を含み得る。上記の例のように、ＩＭ細胞が本明細書に記載の方法を用いて培養され、部分純化または純化されることで、ネフロン前駆細胞および／または尿管上皮前駆細胞などの１または複数の細胞型が濃縮され得る。
【００７４】
従って、別の例では、本開示は、本明細書に記載の方法によって製造されたオルガノイドまたは細胞集団から純化されたネフロン前駆細胞および／または尿管上皮前駆細胞の集団を含む細胞組成物を包含する。
【００７５】
１つの例では、本明細書で開示される治療用組成物は、薬剤的に許容できる担体および／または賦形剤を含む。用語「担体」および「賦形剤」とは、活性化合物の保存、投与、および／または生物活性を促進するための、当該技術分野において従来使用されている組成物を指す（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、マック出版社（Mac Publishing Company）（１９８０年）を参照）。担体はまた、活性化合物の望ましくないあらゆる副作用を低減し得る。好適な担体は、例えば安定な担体であり、例えば、組成物中の他の成分と反応できない担体である。１つの例では、担体は、治療に使用される用量および濃度で、受容者に、重大な局所的有害作用も全身的有害作用も引き起こさない。
【００７６】
本開示に好適な担体としては、従来使用されている担体が挙げられ、例えば、食塩水、ブドウ糖水溶液、ラクトース、リンゲル液、緩衝液、ヒアルロナン、およびグリコールが例示的な液体担体であり、特に（等張である場合）水剤用のものである。好適な医薬担体および賦形剤としては、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【００７７】
別の例では、担体は培地組成物であり、例えばその中で、細胞またはオルガノイド全体が増殖または懸濁される。例えば、そのような培地組成物は、それが投与された対象にいかなる有害作用も引き起こさない。１つの例では、前記細胞培地は本明細書で開示される基本培地を含み得る。１つの例では、前記基本培地はＰＶＡおよびＭＣを含有し得る。例えば、前記基本培地は０．０５〜０．５％のＰＶＡおよび０．０５〜０．５％のＭＣを含有し得る。
【００７８】
１つの例では、担体または賦形剤は、細胞を適切なｐＨに維持することによって生物活性を発揮する緩衝活性をもたらし、例えば、担体または賦形剤はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは、細胞および因子と最小限にしか相互作用せず、且つその細胞および因子の迅速な放出を可能とするため、担体または賦形剤として魅力的であり、そのような場合、本開示の組成物は、注射などによって、血流中に、または腎臓に、または腎臓を取り囲むもしくは隣接した領域に、直接適用するための液体として、製造され得る。従って、１つの例では、本明細書で開示される細胞組成物またはオルガノイド全体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の状態で提供される。
【００７９】
別の例では、細胞組成物またはオルガノイド全体は、受容者に適合性であり、受容者に有害でない産物に分解する足場に組み込みまたは埋め込みされ得る。これらの足場は、受容者である対象に移植される細胞に支持および保護を与える。天然および／または合成の生分解性足場がそのような足場の例である。様々な足場が本開示の実施で使用可能であり得る。例示的な足場としては、生物分解性足場が挙げられるが、これに限定はされない。天然の生分解性足場としては、コラーゲン足場、フィブロネクチン足場、およびラミニン足場が挙げられる。細胞移植用足場に好適な合成材料も、広範な細胞成長および細胞機能を支持できるはずである。そのような足場は再吸収可能な足場であってもよい。好適な足場としては、ポリグリコール酸足場が挙げられ、例えばVacanti, et al. J. Ped. Surg. 23 :3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38: 145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88:753-9 1991で説明されており；あるいは、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの合成ポリマーが挙げられる。別の例では、細胞は、ゲル状足場（アップジョン社（Upjohn Company）製のＧｅｌｆｏａｍなど）に含まれた状態で投与され得る。別の例では、細胞は脱細胞化腎臓足場に含まれた状態で投与され得る。１つの例では、細胞は脱細胞化ヒト腎臓またはその細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分に含まれた状態で投与され得る。
【００８０】
１つの例では、前記組成物は有効量または治療有効量の細胞またはオルガノイド全体を含む。別の例では、細胞またはオルガノイド全体は、当該細胞またはオルガノイドを対象の血液循環へと脱出させないが、当該細胞またはオルガノイドによって分泌された因子は血液循環に進入させる、容器内に収容される。このように、細胞またはオルガノイドに因子を対象の血液循環中へと分泌させることで、可溶性因子は対象に投与され得る。同様に、このような容器は、可溶性因子の局所的なレベルを増加させるために対象内のある部位に移植されてもよく、例えば、腎臓内または腎臓付近に移植される。
【００８１】
１つの例では、本明細書で開示される組成物は、例えば静脈内投与、動脈内投与、または腹腔内投与などにより、全身投与され得る。１つの例では、本明細書で開示される組成物は静脈内投与される。別の例では、組成物は動脈内投与される。別の例では、組成物は、正常腎臓または患部腎臓への、腎動脈内注射、腎実質内注射、または腎被膜下移植により投与される。別の例では、組成物は移植される。例えば、オルガノイド全体が対象の腎臓のすぐ傍に移植され得る。
【００８２】
１つの例では、本開示の細胞組成物は凍結保存され得る。細胞またはオルガノイド全体の凍結保存は当該技術分野において公知の低速冷却法または「高速」凍結プロトコルを用いて実行され得る。好ましくは、凍結保存法は、未凍結の細胞またはオルガノイド全体と比較した場合に同様の、凍結保存された細胞またはオルガノイド全体の表現型、細胞表面マーカー、および成長速度を維持する。凍結保存組成物は凍結保存液を含み得る。凍結保存液のｐＨは通例６．５〜８であり、好ましくは７．４である。
【００８３】
凍結保存液の例としては、非発熱性等張液が含まれ、例えば、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ（登録商標）などである。１００ｍＬのＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ（登録商標）は、５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）；５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ6Ｈ11ＮａＣ7）；３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、ＵＳＰ（Ｃ2Ｈ3ＮａＯ2・３Ｈ2Ｏ）；３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣ１）；および３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ）を含有する。ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ（登録商標）は抗菌剤を含有しない。
【００８４】
１つの例では、本開示は、治療を必要とする対象に本明細書で開示される組成物を投与することを含む、細胞療法を包含する。例えば、本開示は、治療を必要とする対象に本明細書で開示される組成物を投与することにより、腎疾患を治療する方法を包含する。用語「腎疾患」は、本開示との関連においては、過剰な体液、電解質、および老廃物の血液からの、血液濾過および除去の機能を発揮する、腎臓の能力の消失を引き起こす、あらゆるステージまたは程度の急性または慢性の腎不全と関連した障害を指して用いられる。腎疾患の例としては、貧血症（エリスロポエチン欠乏）、およびミネラル不均衡（ビタミンＤ欠乏）などの内分泌機能障害が挙げられる。腎疾患は腎臓由来の腎疾患であってもよいし、心不全、高血圧症、糖尿病、自己免疫疾患、もしくは肝疾患または薬剤誘発性毒性を含む（がこれらに限定はされない）種々の異常に続発する腎疾患であってもよい。１つの例では、腎疾患は腎臓への急性傷害後に発生する慢性腎不全の状態であり得る。例えば、虚血および／または毒物暴露による腎臓への傷害が急性腎不全を引き起こす場合があり；急性腎障害後の不完全な回復が慢性腎不全の発生に繋がる場合がある。腎疾患の他の例としては、先天性ネフローゼ症候群（ＣＮＳ）（ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群およびフィンランド型腎症を含む）、巣状分節性糸球体腎炎（focal segmental glomerulonephritis）（ＦＳＧＳ）、アルポート症候群、およびピアソン症候群が挙げられる。
【００８５】
１つの例では、本開示は、治療を必要とする対象に本明細書で開示されるオルガノイド全体を移植することにより、腎疾患を治療する方法を包含する。別の例では、本開示は、治療を必要とする対象に本明細書で開示される細胞組成物を投与することにより、腎疾患を治療する方法を包含する。
【００８６】
他の例では、本明細書で開示される組成物または細胞は、脱細胞化された腎臓足場の再細胞化のために与えられ得る。別の例では、本開示は、本明細書で開示される組成物または細胞を含むバイオマテリアルまたは足場を包含する。
【００８７】
幹細胞
本開示の各態様は幹細胞の培養を包含する。用語「幹細胞」は、本開示との関連においては、特定の状況下でより特殊化または分化した表現型に分化する能力または可能性を有し、特定の状況下で実質的に分化せずに増殖する能力を保持する、前駆細胞サブセットを指して用いられる。１つの例では、幹細胞という用語は、通常、自然発生的な母細胞であって、胎児性の細胞および組織の多様化の進行で起こるような、子孫がしばしば様々な方向に分化によって、例えば完全な個性を獲得することによって、特殊化するものを指す。細胞分化は通例多くの細胞分裂を介して起こる複雑なプロセスである。分化細胞は多分化能細胞に由来し得るが、その多分化能細胞はそれ自体が多分化能細胞などから派生したものである。これらの多分化能細胞は各々が幹細胞と見なされ得るが、各々が生じ得る細胞型の範囲はかなり幅があり得る。分化細胞の中には、発生能がより大きい細胞を生じる能力を有するものもある。そのような能力は天然のものであってもよいし、種々の因子による処置で人為的に誘導したものであってもよい。多くの生物例で、幹細胞は、２種以上の別々の細胞型の子孫を生み出すことができるため「多分化能」であるが、これは「幹細胞性（stem-ness）」に必要なものではない。自己複製が、古典的な幹細胞の定義の、他の一部である。原理的には、自己複製は２つの主要な機構のどちらからによって起こり得る。幹細胞は非対称に分裂し、一方の娘細胞は幹細胞性状態を保持し、他方の娘細胞は異なる他の特殊な機能および表現型をいくつか発現し得る。あるいは、集団内の幹細胞の一部が、２つの幹細胞に対称的に分裂することにより、全体として集団内にいくらかの幹細胞を維持し、一方で集団内の他の細胞は分化した子孫のみを生じ得る。
【００８８】
１つの例では、前記幹細胞はヒト幹細胞である。１つの例では、前記幹細胞は培養により増殖したヒト幹細胞集団である。１つの例では、幹細胞はインビトロまたはエキソビボで培養増殖され得る。１つの例では、培養増殖された幹細胞は、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回継代されたものである。
【００８９】
１つの例では、前記幹細胞は多能性幹細胞である。別の例では、幹細胞はヒト胚性幹細胞である。通常、多能性幹細胞は多能性状態の時にＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＳＥＡ１の発現を示し、これらのマーカーの発現は分化に伴って通常は消失する。別の例では、幹細胞はヒト胚性幹細胞である。用語「ヒト胚性幹細胞」、並びに「ｈＥＳ」および「ｈＥＳＣ」などのその略語は、ヒトの胚または胚盤胞から派生した、それから入手可能な、またはそれに由来する細胞であって、自己複製し、且つ多能性であるか、または成体動物に存在する全ての細胞型を生み出せる全能性であるものを指す。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、例えば、ヒトインビボ着床前胚、インビトロ受精胚、または胚盤胞期へと増殖した一細胞ヒト胚、から得られたヒト胚盤胞から単離され得る。
【００９０】
別の例では、前記幹細胞は人工多能性幹細胞である。例えば、前記幹細胞はヒト人工多能性幹細胞であり得る。用語「人工多能性幹細胞」およびその略語である「ｉＰＳＣ」は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびｃ−ＭＹＣの好ましい組み合わせを含む、転写因子などの、外来遺伝子の発現を通じて多能性状態に再プログラムされた、あらゆる種類のヒト成人体細胞から誘導可能、入手可能、または由来する細胞を指す。ヒトｉＰＳＣは、ｈＥＳＣと同等レベルの多能性を示すが、自家療法用に患者から入手することができ、並行して遺伝子修正（gene correction）を行って、または行わずに、その後分化させて細胞送達できる。人工多能性幹細胞の好適な生成法は、例えば、米国特許第７，６１５，３７４号および米国特許出願公開第２０１４２７３２１１号、Barberi et al; Plos medicine, Vol 2(6):0554-0559 (2005)、およびVodyanik et al. Cell Stem cell, Vol 7:718-728 (2010)に記載されている。１つの例では、ｉＰＳＣは線維芽細胞に由来する。別の例では、ｉＰＳＣは血液に由来する。例えば、ｉＰＳＣは白血球に由来する。別の例では、ｉＰＳＣは線維芽細胞に由来する。別の例では、ｉＰＳＣは白血球または線維芽細胞に由来する。
【００９１】
１つの例では、前記幹細胞はＨ９またはｈＥＳ３である。従って、１つの例では、本開示は、Ｈ９幹細胞由来である、本明細書で開示される腎オルガノイドを包含する。別の例では、本開示は、ｈＥＳ３幹細胞由来である、本明細書で開示される腎オルガノイドを包含する（Kao et al., 2016; Ng et al., 2016; van den Berg et al., 2018）。例えば、前記腎オルガノイドはｈＥＳ３−ＳＯＸ１７ｍＣｈｅｒｒｙ由来またはＨ９  ＧＡＰＴｒａｐＬｕｃ２由来であり得る。従って、１つの例では、本開示は、Ｈ９幹細胞またはｈＥＳ３幹細胞由来である、５０個未満のネフロンを含む腎オルガノイドを包含する。別の例では、前記腎オルガノイドは、１５個未満のネフロンを含み、Ｈ９幹細胞またはｈＥＳ３幹細胞由来である。これらの例では、前記幹細胞はレポーター遺伝子を発現し得る。
【００９２】
別の例では、前記幹細胞はｉＰＳＣ  ＧＡＰＴｒａｐ  ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ、ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２、またはＣＬＲ１５０２．３である（Briggs et al., 2013; Takasato et al., 2015）。従って、１つの例では、本開示は、ｉＰＳＣ  ＧＡＰＴｒａｐ  ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ由来である、本明細書に記載の腎オルガノイドを包含する。
【００９３】
従って、１つの例では、本開示は、ｉＰＳＣ  ＧＡＰＴｒａｐ  ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ由来、ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２由来、またはＣＬＲ１５０２．３由来である、５０個未満のネフロンを含む腎オルガノイドを包含する。別の例では、前記腎オルガノイドは、１５個未満のネフロンを含み、ｉＰＳＣ  ＧＡＰＴｒａｐ  ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ、ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２、またはＣＬＲ１５０２．３に由来する。同様に、これらの例でも、前記幹細胞はレポーター遺伝子を発現し得る。
【００９４】
１つの例では、特定の対象および／または疾患を代表する腎オルガノイドを製造することが好ましい場合がある。この実施形態の様々な例を以下に記載する。このセクションは、腎オルガノイドの製造に使用され得るｉＰＳ細胞に関したものである。１つの例では、前記ヒトｉＰＳ細胞は遺伝的な腎疾患を有するヒト対象由来である。この例では、血液試料が遺伝的腎疾患を有する対象から単離され、ｉＰＳ細胞が前記血液試料中の細胞（例えば白血球）から誘導され得る。前記対象は種々の例示的な遺伝的腎疾患のうちの１つを有し得る。例としては、先天性ネフローゼ症候群（ＣＮＳ）（ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群およびフィンランド型腎症を含む）、巣状分節性糸球体腎炎（focal segmental glomerulonephritis）（ＦＳＧＳ）、アルポート症候群、およびピアソン症候群が挙げられる。従って、１つの例では、本開示は、先天性ネフローゼ症候群（ＣＮＳ）（ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群およびフィンランド型腎症を含む）、巣状分節性糸球体腎炎（focal segmental glomerulonephritis）（ＦＳＧＳ）、アルポート症候群、およびピアソン症候群からなる群から選択される、腎疾患を代表する腎オルガノイドを包含する。従って、１つの例では、前記腎オルガノイドはＣＮＳを代表するものである。別の例では、前記腎オルガノイドはステロイド抵抗性ネフローゼ症候群を代表するものである。
【００９５】
１つの例では、発生中の腎臓および／または腎疾患をモデル化するために、腎オルガノイドが使用され得る。従って、１つの例では、本開示は、腎臓の発生をモデル化するために使用される、本明細書で開示される腎オルガノイドを包含する。別の例では、本開示は、腎疾患をモデル化するために使用される、本明細書で開示される腎オルガノイドを包含する。１つの例では、前記腎疾患はＣＮＳまたは上記疾患のうちの別のものである。この例では、上記腎疾患を有する対象からｉＰＳ細胞を誘導し、それから腎オルガノイドを製造することによって、疾患はモデル化され得る。この例では、腎疾患の発達に重要であるか重要である可能性がある対象由来のｉＰＳ細胞の遺伝子に変異を導入するために、遺伝子編集が使用され得る（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集）。他の例では、対象由来のｉＰＳ細胞の変異を修正するために、遺伝子編集が使用される。１つの例では、アイソジェニックな遺伝子編集ｉＰＳ細胞が生成され得る（例えば、Forbes et al. (2018) Am J Hum Genet. 102:816-831）。腎臓の発生および疾患は、下記（例えば、７＋１５日目）のうちの１または複数などの様々な発生段階の腎オルガノイドを用いて、長い期間をかけて（例えば、２日間、５日間、１０日間、またはそれより長い日数）、モデル化され得る。これらの例では、オルガノイド糸球体はグループで培養され、各グループは異なる発生段階（例えば、７＋１１日目、７＋１５日目、７＋１８日目、７＋２０日目）を代表しており、且つ／または一定の期間培養され得る（例えば２日間、５日間、および１０日間の旋回培養）。腎オルガノイドは、発生または疾患のステージを決定するための、視覚的評価、免疫組織化学、遺伝子およびタンパク質の発現解析などを用いて評価され得る。１つの例では、腎オルガノイドはまた、これらの試験時には腎毒性物質、候補化合物および／または治療化合物と接触させられ、腎毒性および／または治療効果が測定され得る。上記で言及したように、上記の例で使用された腎オルガノイドは、レポーター遺伝子を発現するように遺伝子改変されたｉＰＳ細胞から生成することができる。
【００９６】
細胞培養法
用語「培地（media）」または「培地（medium）」とは、細胞培養と関連して使用されている場合、細胞を取り囲んでいる環境の構成要素を含む。培地は、細胞分化およびオルガノイド形成に十分な条件に寄与し、且つ／またはそれを実現するものと想定される。培地は、固体、液体、気体、または相および物質の混合物であり得る。培地は、細胞成長を持続しない液体培地だけでなく、液体増殖培地も含み得る。培地には、寒天、アガロース、ゼラチン、およびコラーゲンマトリックスなどのゼラチン質の培地も含まれる。例示的な気体培地としては、ペトリ皿または他の固相もしくは半固相上で増殖している細胞が暴露される気相が挙げられる。用語「培地」は、細胞とまだ接触していなくとも、細胞培養での使用が意図される物質を指す。
【００９７】
本開示の方法で用いられる培地は、幹細胞またはＩＭ細胞の培養に用いられる培地を基本培地として用いて作製され得る。基本培地としては、例えば、イーグル最小必須（ＭＥＭ）培地が挙げられ、幹細胞またはＩＭ細胞の培養に使用できるものであれば特に制限はされない。さらに、本開示の培地は、脂肪酸または脂質、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、緩衝剤、無機塩などのあらゆる成分を含有し得る。本開示で用いられる細胞培地は、全ての必須アミノ酸を含有しており、可欠アミノ酸を含有する場合もある。通常、アミノ酸は必須アミノ酸（Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｈｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）と可欠アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｉｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ）とに分類される。他の例では、基本培地は、例えば、既知組成培地であるＡＰＥＬ、ｍＴＥＳＲ−Ｅ６、またはＥ８（ステムセル・テクノロジーズ社（StemCell technologies））を含む。基本培地は、タンパク質不含ハイブリドーマ培地（ＰＦＨＭ）（例えば３．５％）も添加され得る。１つの例では、基本培地は血清代替物を添加される。例えば、基本培地はＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（サーモ・フィッシャー社）を添加され得る。
【００９８】
当業者には理解されることであるが、本明細書で開示される培地は時間と共に交換する必要がある。培地交換の適切なタイミングを特定することは、当業者の技能の範囲に十分に含まれると考えられる。例えば、培地の交換が必要である時期を指示するための、細胞培地中に一般に使用される、様々な市販の変色指示薬が存在する。目安として、マルチウェル培養皿での細胞培養の場合は、培地は２４時間または４８時間毎に交換され得る。例えば、培地は２日毎に交換され得る。
【００９９】
腎オルガノイド
本開示は腎オルガノイドの製造法を包含する。１つの例では、腎オルガノイドは、中間中胚葉（ＩＭ）細胞集団を含む培地を旋回することにより製造される。１つの例では、前記ＩＭ細胞は浮遊培養下で旋回される。誤解を避けるため、本開示との関連において、「浮遊培養」とは、単一細胞または小細胞塊が振盪液体培地中で浮遊しながら増殖する、細胞培養を指して用いられる。例えば、前記単一細胞または小細胞塊は浮遊培養下で増殖して腎オルガノイドを形成する。
【０１００】
１つの例では、前記ＩＭ細胞培地はＦＧＦを含有する。いくつかの例では、前記ＦＧＦは、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６、およびＦＧＦ２０を含むＦＧＦ９スーパーファミリーから選択され得る。いくつかの例では、前記ＦＧＦはＦＧＦ９である。例えば、前記ＩＭ細胞培地は７日目から少なくとも７＋１０日目までＦＧＦを含有し得る。１つの例では、前記ＩＭ細胞培地は７日目から少なくとも７＋１５日目までＦＧＦを含有し得る。ＦＧＦ濃度の例を以下に記載する。例えば、前記細胞培地は少なくとも５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも１５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも３５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも５００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は１００ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は１８０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。別の例では、前記細胞培地は１９０ｎｇ／ｍｌ〜２１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含有する。
【０１０１】
１つの例では、前記ＩＭ細胞培地はＦＧＦ９を含有し得る。１つの例では、前記細胞培地は少なくとも５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも１５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも３５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも５００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は１００ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は１８０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は１９０ｎｇ／ｍｌ〜２１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。
【０１０２】
別の例では、上記レベルのＦＧＦ９はＦＧＦ２に置き換えられる。例えば、前記ＩＭ細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。別の例では、前記細胞培地は１００ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。別の例では、前記細胞培地は１８０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。別の例では、前記細胞培地は１９０ｎｇ／ｍｌ〜２１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。
【０１０３】
別の例では、上記レベルのＦＧＦ９はＦＧＦ１６に置き換えられる。例えば、前記ＩＭ細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含み得る。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含有する。別の例では、前記細胞培地は１００ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含有する。別の例では、前記細胞培地は１８０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含有する。別の例では、前記細胞培地は１９０ｎｇ／ｍｌ〜２１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含有する。
【０１０４】
別の例では、上記レベルのＦＧＦ９はＦＧＦ２０に置き換えられる。例えば、前記ＩＭ細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有する。別の例では、前記細胞培地は１００ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有する。別の例では、前記細胞培地は１８０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有する。別の例では、前記細胞培地は１９０ｎｇ／ｍｌ〜２１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有する。１つの例では、ＦＧＦは５日間の旋回培養後に培地から除去される。１つの例では、ＦＧＦは６日間の旋回培養後に培地から除去される。１つの例では、ＦＧＦは４〜６日間の旋回培養後に培地から除去される。
【０１０５】
１つの例では、前記培地にＷｎｔ／βカテニン作動薬を添加することにより、腎形成がオルガノイドにおいて惹起される。用語「Ｗｎｔ／βカテニン作動薬」とは、本開示との関連において、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路との関連の中ではＧＳＫ３（例えば、ＧＳＫ３−β）を阻害するが、他の非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路との関連の中では阻害しないことが好ましい、分子を指すように用いられる。いくつかの例では、前記Ｗｎｔ／βカテニン作動薬はＧＳＫ３β阻害剤である。Ｗｎｔ／βカテニン作動薬の例としては、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）、ＬｉＣｌ、ＳＢ−２１６７６３、ＣＡＳ８５３２２０−５２−７、並びにサンタクルーズバイオテクノロジー社（Santa Cruz Biotechnology）およびＲ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）などの供給業者から市販されている他のＷｎｔ／βカテニン作動薬が挙げられる。
【０１０６】
従って、１つの例では、前記ＩＭ細胞培地は上記レベルのＦＧＦおよびＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。例えば、前記ＩＭ細胞培地は少なくとも０．５μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は少なくとも０．６μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は少なくとも０．７μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は少なくとも０．８μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は少なくとも０．９μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は約１μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１．１μΜ以下のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１．２μΜ以下のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１．３μΜ以下のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１．４μΜ以下のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１．５μΜ以下のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。前記培地が、Ｗｎｔ／βカテニン作動薬の濃度に対するこれらの上限および下限をあらゆる組み合わせで含み得ることは理解されよう。別の例では、前記細胞培地は０．５μΜ〜１．５μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は０．８μΜ〜１．２μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。１つの例では、前記細胞培地は少なくとも０．５μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は少なくとも０．６μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は少なくとも０．７μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は少なくとも０．８μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は少なくとも０．９μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は約１μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１．１μΜ以下のＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１．２μΜ以下のＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１．３μΜ以下のＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１．４μΜ以下のＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１．５μΜ以下のＣＨＩＲを含有し得る。前記培地が、ＣＨＩＲの濃度に対するこれらの上限および下限をあらゆる組み合わせで含み得ることは理解されよう。別の例では、前記細胞培地は０．５μΜ〜１．５μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は０．８μΜ〜１．２μΜのＣＨＩＲを含有し得る。
【０１０７】
別の例では、前記ＩＭ細胞培地は、Ｙ−２７６３２（ステムセルテクノロジーズ社）などのＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫｉ）を含有し得る。１つの例では、前記細胞培地は少なくとも８μΜのＲＯＣＫｉを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は約１０μΜのＲＯＣＫｉを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１２μΜ以下のＲＯＣＫｉを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は８μΜ〜１２μΜのＲＯＣＫｉを含有し得る。
【０１０８】
上記の例において、前記ＩＭ細胞培地は、ＦＧＦ９と、ＣＨＩＲなどのＷｎｔ／βカテニン作動薬と、ヘパリン、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、およびメチルセルロース（ＭＣ）のうちの１つまたは複数または全てと、を含有し得る。別の例では、前記細胞培地はＲＯＣＫｉも含有し得る。
【０１０９】
１つの例では、前記ＩＭ細胞培地は少なくとも０．５μｇ／ｍｌのヘパリンを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は約１μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する。別の例では、前記細胞培地は１．５μｇ／ｍｌ以下のヘパリンを含有する。別の例では、前記細胞培地は２μｇ／ｍｌ以下のヘパリンを含有する。別の例では、前記細胞培地は０．２μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する。別の例では、前記細胞培地は０．５μｇ／ｍｌ〜１．５μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する。別の例では、前記細胞培地は０．８μｇ／ｍｌ〜１．２μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する。
【０１１０】
１つの例では、前記ＩＭ細胞培地は少なくとも０．０５％のＰＶＡを含有する。別の例では、前記細胞培地は約０．１％のＰＶＡを含有する。別の例では、前記細胞培地は０．１５％以下のＰＶＡを含有する。別の例では、前記細胞培地は０．１％〜０．１５％のＰＶＡを含有する。
【０１１１】
１つの例では、前記ＩＭ細胞培地は少なくとも０．０５％のＭＣを含有する。別の例では、前記細胞培地は約０．１％のＭＣを含有する。別の例では、前記細胞培地は０．１５％未満のＭＣを含有する。別の例では、前記細胞培地は０．１％〜０．１５％のＭＣを含有する。
【０１１２】
本開示との関連において、「旋回する」、「旋回」、および「旋回すること」という用語は同義的に使用され、円形パターン、ねじれパターン、またはらせん形パターンの細胞培地の動きを指す。１つの例では、細胞培地は細胞培養物に円運動の十分な撹拌を加えることにより旋回される。例えば、細胞培養物はオービタルシェーカーを用いて旋回され得る。細胞培養を旋回するのに好適な装置の他の例としては、シェーカープラットフォーム、シェーカー恒温器、または回転フラスコが挙げられる。旋回のｒｐｍが適切であると、ＩＭ細胞の凝集とオルガノイドの形成が可能となる。
【０１１３】
１つの例では、前記ＩＭ細胞培養は少なくとも３０ｒｐｍで旋回される。別の例では、前記細胞培養は少なくとも４０ｒｐｍで旋回される。別の例では、前記細胞培養は少なくとも５０ｒｐｍで旋回される。別の例では、前記細胞培養は少なくとも６０ｒｐｍで旋回される。別の例では、前記細胞培養は少なくとも７０ｒｐｍで旋回される。別の例では、前記細胞培養は少なくとも８０ｒｐｍで旋回される。別の例では、前記細胞培養は４０〜８０ｒｐｍで旋回される。別の例では、前記細胞培養は５０〜７０ｒｐｍで旋回される。別の例では、前記細胞培養は５５〜６５ｒｐｍで旋回される。別の例では、前記細胞培養は３０〜１５０ｒｐｍで旋回される。別の例では、前記細胞培養は３０〜９０ｒｐｍで旋回される。
【０１１４】
１つの例では、ＩＭ細胞は少なくとも５日間培養される。別の例では、ＩＭ細胞は少なくとも７日間培養される。別の例では、ＩＭ細胞は少なくとも１０日間培養される。別の例では、ＩＭ細胞は少なくとも１２日間培養される。別の例では、ＩＭ細胞は少なくとも１４日間培養される。別の例では、ＩＭ細胞は少なくとも２０日間培養される。別の例では、ＩＭ細胞は最長４２日間培養される。別の例では、ＩＭ細胞は５〜２０日間培養される。別の例では、ＩＭ細胞は５〜１８日間培養される。別の例では、ＩＭ細胞は７〜１４日間培養される。例えば、ＩＭ細胞は旋回されながら少なくとも１０日間培養される。例えば、ＩＭ細胞は少なくとも２０日間旋回され得る。別の例では、ＩＭ細胞は少なくとも３０日間旋回され得る。
【０１１５】
１つの例では、ＩＭ細胞は１０〜３０日間旋回される。別の例では、ＩＭ細胞は１５〜３０日間旋回される。
【０１１６】
１つの例では、ＩＭ細胞集団は解離され、上記培地中で旋回培養される。１つの例では、ＩＭ細胞はＥＤＴＡを用いて解離され得る。別の例では、ＩＭ細胞はトリプシンまたはＴｒｙｐＬＥを用いて解離され得る。１つの例では、解離されたＩＭ細胞は、メッシュスクリーンに通された後にさらに培養される。１つの例では、細胞は解離後に少なくとも１２日間旋回培養される。別の例では、細胞は解離後に少なくとも１３日間旋回培養される。別の例では、細胞は解離後に少なくとも１４日間旋回培養される。別の例では、細胞は解離後に少なくとも１５日間旋回培養される。別の例では、細胞は解離後に少なくとも２０日間旋回培養される。別の例では、細胞は解離後に少なくとも２５日間旋回培養される。別の例では、細胞は解離後に少なくとも３５日間旋回培養される。別の例では、細胞は解離後に５〜１８日間旋回培養される。
【０１１７】
他の例では、本明細書に記載のＩＭ細胞は様々な成分を含む様々な培地で培養され得る。例えば、細胞は、各段階が異なる培地と関連付けられた、段階的な培養にかけられ得る。１つの例では、ＩＭ細胞は２段階で旋回培養される。この例では、１段階目の培地は上記レベルのＦＧＦ（ＦＧＦ９など）、ＣＨＩＲ、ＲＯＣＫｉ、ヘパリン、ＰＶＡ、およびＭＣを含み、２段階目の培地は上記レベルのＦＧＦ（ＦＧＦ９など）、ＣＨＩＲ、ヘパリン、ＰＶＡ、およびＭＣを含む。例えば、１段階目の培地は２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９、１μΜのＣＨＩＲ、１０μΜのＲＯＣＫｉ、１μｇ／ｍｌのヘパリン、０．１％のＰＶＡ、および０．１％のＭＣを含み、２段階目の培地はＦＧＦ９、１μΜのＣＨＩＲ、１μｇ／ｍｌのヘパリン、０．１％のＰＶＡ、および０．１％のＭＣを含み得る。
【０１１８】
別の例では、ＩＭ細胞は３段階で旋回培養される。この例では、１段階目および２段階目の培地は上記定義の通りであり、３段階目の培地は上記レベルのＰＶＡおよびＭＣを含む。例えば、３段階目の培地は０．１％のＰＶＡおよび０．１％のＭＣを含み得る。
【０１１９】
１つの例では、ＩＭ細胞は１段階目の培地中で１日間培養された後、２段階目の培地中で４日間培養される。１つの例では、細胞は１段階目の培地中で１８〜２４時間培養された後、２段階目の培地中で４日間培養される。これらの例では、細胞は３段階目の培地中で７〜２０日間さらに培養され得る。別の例では、細胞は３段階目の培地中で少なくとも１５日間さらに培養され得る。別の例では、細胞は３段階目の培地中で少なくとも３０日間さらに培養され得る。
【０１２０】
また本発明者らは、約５〜１０日間の旋回培養後にＩＭ細胞にレチノイン酸を添加することにより、オルガノイドの糸球体成熟が改善される（糸球体ポドサイト成熟の改善）ことも確認した。従って、１つの例では、レチノイン酸が５〜１０日間の旋回培養後に細胞培地に添加される。１つの例では、オールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）が細胞培地に添加される。１つの例では、少なくとも０．０７μΜのレチノイン酸が細胞培地に添加される。別の例では、少なくとも０．１μΜのレチノイン酸が細胞培地に添加される。別の例では、少なくとも０．２μΜのレチノイン酸が細胞培地に添加される。別の例では、少なくとも０．５μΜのレチノイン酸が細胞培地に添加される。
【０１２１】
別の例では、少なくとも１．５μΜのレチノイン酸が細胞培地に添加される。１つの例では、少なくとも１．８μΜのレチノイン酸が細胞培地に添加される。１つの例では、少なくとも２．０μΜのレチノイン酸が細胞培地に添加される。別の例では、少なくとも２．５μΜのレチノイン酸が細胞培地に添加される。別の例では、１．５μΜ〜３μΜのレチノイン酸が細胞培地に添加される。別の例では、２．０μΜ〜３μΜのレチノイン酸が細胞培地に添加される。
【０１２２】
別の例では、１段階目および２段階目の培地は上記定義の通りであり、３段階目の培地は上記レベルのＰＶＡ、ＭＣ、およびａｔＲＡを含む。例えば、３段階目の培地は０．１％のＰＶＡおよび０．１％のＭＣ、２．５μＭのａｔＲＡを含み得る。
【０１２３】
本発明者らは、少数のＩＭ細胞を適切な培地中で旋回培養にかけることにより、単純三次元構造を有する腎オルガノイドの発生が方向付けられ得ることを確認した。従って、１つの例では、本開示の方法は、５×１０5個未満のＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は、４×１０5個未満のＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は、３×１０5個未満のＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は、１×１０5個未満のＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は、５×１０4個のＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は、４×１０4個のＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は、１×１０4〜１×１０5個のＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は、２×１０4〜１×１０5個のＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は、５×１０3〜３×１０5個のＩＭ細胞を含むＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。
【０１２４】
別の例では、本開示の方法は１×１０5細胞／ｍｌ〜５×１０6細胞／ｍｌのＩＭ細胞を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は５×１０5〜４×１０6細胞／ｍｌのＩＭ細胞を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は５×１０5〜３×１０6細胞／ｍｌのＩＭ細胞を旋回することを包含する。他の例では、本開示の方法は５×１０6細胞／ｍｌ未満のＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は４×１０6細胞／ｍｌ未満のＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は３×１０6細胞／ｍｌ未満のＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は２×１０6細胞／ｍｌ未満のＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は１×１０6細胞／ｍｌ以下のＩＭ細胞集団を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は５×１０5〜２×１０6細胞／ｍｌのＩＭ細胞を旋回することを包含する。別の例では、本開示の方法は５×１０5〜１．５×１０6細胞／ｍｌのＩＭ細胞を旋回することを包含する。これらの例では、５，０００〜１５，０００個程度のオルガノイドが製造され得る。別の例では、８，０００〜１０，０００個程度のオルガノイドが製造され得る。これらの例では、総細胞数は培養期間に亘って旋回培養開始時の細胞数から３０〜４０倍に増加する。これらの例では、Takasato et al. (2015) Nature, Vol. 526:564-568に記載されるプロトコルを用いた総細胞数の増加と比較して、総細胞数は３〜４倍増加する。この例では、総細胞数は１×１０5〜５×１０6細胞／ｍｌ程度から３×１０6〜２×１０8 細胞／ｍｌ程度まで増加する。
【０１２５】
１つの例では、前記ＩＭ細胞は本明細書で開示される方法によって得られる。
【０１２６】
１つの例では、本開示は、腎オルガノイドの製造法であって、
幹細胞集団を７日間培養することでＩＭ細胞を製造する工程であって、最初の４〜５日間は前記幹細胞を高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬（ＣＨＩＲなど）中で培養することを含み、残り日数は前記細胞をＦＧＦ９および低濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で培養することを含む、前記工程；
前記ＩＭ細胞を解離する工程；
ＩＭ細胞をＦＧＦ９を含有する細胞培地中で少なくとも５日間旋回することにより、腎オルガノイドを製造する工程であって、最初の２４時間は前記細胞をＦＧＦ９、ヘパリン、低濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬、およびＲＯＣＫｉを含有する細胞培地中で培養することを含み、その後の３日間または４日間は前記細胞をＦＧＦ９、ヘパリン、低濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬、ＰＶＡ、およびＭＣを含有する細胞培地中で培養することを含む、前記工程、
を含む、腎オルガノイドの製造法を包含する。
【０１２７】
上記の例では、幹細胞は７日間培養され、最初の４日間は前記幹細胞を高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬（ＣＨＩＲなど）中で培養することを含み、残り日数は前記細胞をＦＧＦ９および低濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で培養することを含み得る。１つの例では、前記Ｗｎｔ／βカテニン作動薬はＣＨＩＲである。１つの例では、高濃度のＣＨＩＲは約３μΜ〜約１２μΜである。別の例では、高濃度のＣＨＩＲは約４μΜ〜約１０μΜ、約５μΜ〜約９μΜ、約６μΜ〜約８μΜ、約６．５μΜ〜約８μΜ、または約６．５μΜ〜約７μΜである。１つの例では、低濃度のＣＨＩＲは１μΜである。１つの例では、ＩＭ細胞はトリプシンを用いて解離される。別の例では、細胞はＥＤＴＡを用いて解離される。１つの例では、ＩＭ細胞は２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する細胞培地中で少なくとも４日間旋回され、最初の２４時間は前記細胞を２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９、１μｇ／ｍｌのヘパリン、１μΜのＣＨＩＲ、および１０μΜのＲＯＣＫｉを含有する細胞培地中で培養することを含み、その後の３日間または４日間は前記細胞を２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９、１μｇ／ｍｌのヘパリン、１μΜ、０．１％のＰＶＡ、および０．１％のＭＣを含有する細胞培地中で培養することを含む。
【０１２８】
別の例では、前記方法は、ＰＶＡおよびＭＣを含有するが、ＣＨＩＲもＦＧＦ９も含有しない細胞培地中で、細胞を旋回することをさらに含む。１つの例では、前記細胞培地は０．１％のＰＶＡおよび０．１％のＭＣを含有する。１つの例では、細胞は、ＰＶＡおよびＭＣを含有するが、ＣＨＩＲもＦＧＦ９も含有しない細胞培地中で５日間以上旋回される。
【０１２９】
中間中胚葉
驚くべきことに、本発明者らはまた、低濃度のＣＨＩＲを含有する培地中で幹細胞を培養し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達をより長い期間活性化することが、改善された中間中胚葉の製造において有益であることを確認した。このインビトロ培養法は、腎オルガノイドを製造するために、後方原始線条（ＰＰＳ）細胞および中間中胚葉（ＩＭ）細胞を経由して幹細胞を分化させるための系を提供する。
【０１３０】
従って、１つの例では、本開示は、後方原始線条（ＰＰＳ）細胞集団をＦＧＦおよび４μΜ未満のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で２〜５日間培養することを含む、中間中胚葉（ＩＭ）細胞のインビトロ製造法を包含する。
【０１３１】
ＦＧＦおよびＷｎｔ／βカテニン作動薬の好適な濃度、並びに好適な培養期間は、最初の３日間または４日間の培養後の期間の中間中胚葉（ＩＭ）細胞の製造法に関連して、以下に記載される通りである。
【０１３２】
従って、１つの例では、本開示は、幹細胞集団をＣＨＩＲを含有する細胞培地中で約７日間培養することを含み、最初の３日間または４日間の培養後にＦＧＦ９などのＦＧＦが前記培地に添加される、中間中胚葉（ＩＭ）細胞の製造法を包含する。１つの例では、最初の３日間または４日間の培養後に、５０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９が前記培地に添加される。別の例では、最初の３日間または４日間の培養後に、５０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９が前記培地に添加される。別の例では、最初の３日間または４日間の培養後に、５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９が前記培地に添加される。別の例では、最初の３日間または４日間の培養後に、１００ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９が前記培地に添加される。別の例では、最初の３日間または４日間の培養後に、１５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９が前記培地に添加される。別の例では、最初の３日間または４日間の培養後に、１７５ｎｇ／ｍｌ〜２２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９が前記培地に添加される。別の例では、最初の３日間または４日間の培養後に、１９０ｎｇ／ｍｌ〜２１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９が前記培地に添加される。別の例では、最初の３日間または４日間の培養後に、１９５ｎｇ／ｍｌ〜２０５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９が前記培地に添加される。別の例では、最初の３日間または４日間の培養後に、約２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９が前記培地に添加される。１つの例では、最初の３日間または４日間の培養後に、ヘパリンも前記培地に添加される。１つの例では、最初の３日間または４日間の培養後に０．５μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌのヘパリンが前記培地に添加される。別の例では、最初の３日間または４日間の培養後に０．５μｇ／ｍｌ〜１．５μｇ／ｍｌのヘパリンが前記培地に添加される。別の例では、最初の３日間または４日間の培養後に０．８μｇ／ｍｌ〜１．２μｇ／ｍｌのヘパリンが前記培地に添加される。別の例では、最初の３日間または４日間の培養後に１μｇ／ｍｌのヘパリンが前記培地に添加される。１つの例では、４日間の培養後に、上記レベルのＦＧＦおよびヘパリンが前記培地に添加される。１つの例では、前記幹細胞はＣＨＩＲを含有する細胞培地中で７日間培養される。
【０１３３】
特に、本発明者らは、幹細胞を高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬（ＣＨＩＲなど）中で培養した後、前記幹細胞を低濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬およびＦＧＦ（ＦＧＦ９など）中で培養することにより、改善されたＩＭ細胞が製造されたことを確認した。例えば、改善されたＩＭ細胞は、高レベルのＰＡＸ２、ＬＨＸ１、およびＯＳＲ１（キャップ状間葉（cap mesenchyme））、並びにＷｎｔ１１およびＧＡＴＡ３（尿管上皮）を発現する。従って、１つの例では、幹細胞は、高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬（ＣＨＩＲなど）を含有する培地中で培養された後、低濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬およびＦＧＦ（ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ２０またはＦＧＦ２など）を含有する培地中で培養され得る。
【０１３４】
１つの例では、本開示は、幹細胞集団を高濃度のＣＨＩＲを含有する細胞培地中で培養した後、前記幹細胞集団を低濃度のＣＨＩＲおよびＦＧＦ（ＦＧＦ９など）を含有する細胞培地中で培養することを含む、中間中胚葉（ＩＭ）細胞の製造法を包含する。この例では、「高濃度」のＣＨＩＲは少なくとも５μΜであり、「低濃度」のＣＨＩＲは３μΜ未満である。別の例では、「高濃度」のＣＨＩＲは少なくとも６μΜであり、「低濃度」のＣＨＩＲは２μΜ未満である。別の例では、「高濃度」のＣＨＩＲは７μΜであり、「低濃度」のＣＨＩＲは１μΜ以下である。
【０１３５】
従って、別の態様では、本開示の方法は、中間中胚葉（ＩＭ）細胞のインビトロ製造法を包含する。１つの例では、前記ＩＭ細胞製造法は、幹細胞集団を約７日間培養することを含み、最初の４〜５日間は前記幹細胞を高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬（ＣＨＩＲなど）中で培養することを含み、残り日数は前記細胞をＦＧＦ９および低濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で培養することを含む。１つの態様では、前記ＩＭ細胞製造法は、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、幹細胞集団をＦＧＦ９および少なくとも０．５μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有する細胞培地中で培養することを含む。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は少なくとも０．６μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は少なくとも０．７μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は少なくとも０．８μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は少なくとも０．９μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は約１μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は１．１μΜ以下のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は１．２μΜ以下のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は１．３μΜ以下のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は１．４μΜ以下のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は１．５μΜ以下のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後、前記培地が、Ｗｎｔ／βカテニン作動薬の濃度に対するこれらの上限および下限をあらゆる組み合わせで含み得ることは理解されよう。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は０．５μΜ〜１．５μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は０．８μΜ〜１．２μΜのＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。従って、１つの例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞培地は２μΜ未満のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＷｎｔ／βカテニン作動薬中の培養後に、前記細胞��地は１．５μΜ未満のＷｎｔ／βカテニン作動薬を含有し得る。
【０１３６】
１つの例では、前記Ｗｎｔ／βカテニン作動薬はＣＨＩＲである。従って、１つの例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記細胞培地は少なくとも０．５μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記細胞培地は少なくとも０．６μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記細胞培地は少なくとも０．７μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記細胞培地は少なくとも０．８μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記細胞培地は少なくとも０．９μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記細胞培地は約１μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記細胞培地は０．５μΜ〜１．５μΜのＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記細胞培地は０．８μΜ〜１．２μΜのＣＨＩＲを含有し得る。従って、１つの例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記細胞培地は２μΜ未満のＣＨＩＲを含有し得る。別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記細胞培地は１．５μΜ未満のＣＨＩＲを含有し得る。
【０１３７】
１つの例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記培地は上記で例示されたような低濃度のＣＨＩＲおよびＦＧＦ９を含有し得る。１つの例では、前記細胞培地は少なくとも５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも１５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも３５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は少なくとも５００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は１００ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は１８０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。別の例では、前記細胞培地は１９０ｎｇ／ｍｌ〜２１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含有する。
【０１３８】
別の例では、上記レベルのＦＧＦ９はＦＧＦ２に置き換えられる。
【０１３９】
例えば、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。別の例では、前記細胞培地は１００ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。別の例では、前記細胞培地は１８０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。別の例では、前記細胞培地は１９０ｎｇ／ｍｌ〜２１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。
【０１４０】
別の例では、上記レベルのＦＧＦ９はＦＧＦ１６に置き換えられる。例えば、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含有する。別の例では、前記細胞培地は１００ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含有する。別の例では、前記細胞培地は１８０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含有する。別の例では、前記細胞培地は１９０ｎｇ／ｍｌ〜２１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１６を含有する。
【０１４１】
別の例では、上記レベルのＦＧＦ９はＦＧＦ２０に置き換えられる。例えば、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有し得る。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有する。別の例では、前記細胞培地は５０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有する。別の例では、前記細胞培地は１００ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有する。別の例では、前記細胞培地は１８０ｎｇ／ｍｌ〜２２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有する。別の例では、前記細胞培地は１９０ｎｇ／ｍｌ〜２１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含有する。
【０１４２】
１つの例では、前記高濃度ＣＨＩＲを含有する培地はＦＧＦを含有しない。
【０１４３】
別の例では、最初の４〜５日間の高濃度のＣＨＩＲ中の培養後に、前記細胞培地は上記で例示されたような低濃度のＣＨＩＲ、上記で例示されたレベルのＦＧＦおよびヘパリンを含有し得る。１つの例では、前記低濃度のＣＨＩＲおよびＦＧＦを含有する細胞培地はヘパリンも含有する。この例では、前記細胞培地は１μｇ／ｍｌのヘパリンを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は１．５μｇ／ｍｌのヘパリンを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は２μｇ／ｍｌのヘパリンを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は０．５μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌのヘパリンを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は０．５μｇ／ｍｌ〜１．５μｇ／ｍｌのヘパリンを含有し得る。別の例では、前記細胞培地は０．８μｇ／ｍｌ〜１．２μｇ／ｍｌのヘパリンを含有し得る。
【０１４４】
１つの例では、本開示の方法は、上記のＩＭ細胞製造法と、上記で例示された腎オルガノイド製造法におけるこれらのＩＭ細胞の使用と、を組みわせることを包含する。
【０１４５】
１つの例では、幹細胞を、上記のＩＭ細胞製造法を用いて培養した後、解離し、上記の旋回培養下で培養することで、腎オルガノイドが製造され得る。この例では、ＩＭ細胞はＥＤＴＡ、トリプシン、またはＴｒｙｐＬＥを用いて解離され得る。別の例では、細胞を、ＥＤＴＡを用いて解離した後、メッシュスクリーンに通し、上記の旋回培養下で培養することで、腎オルガノイドが製造され得る。別の例では、細胞を、トリプシンを用いて解離した後、遠心し、得られたペレットを再懸濁して上記の旋回培養下に置くことで、腎オルガノイドが製造され得る。
【０１４６】
本開示によって包含される腎オルガノイドは培養日数に基づいて説明することができる。この培養日数は、幹細胞からＩＭ細胞を製造するための日数（Ｘ）およびＩＭ細胞から腎オルガノイドを形成させるための日数（Ｙ）を含む、２つの成分に分けることができる。１つの例では、幹細胞からのＩＭ細胞の製造とＩＭ細胞からの腎オルガノイドの製造とを区別する工程は、ＩＭ細胞の解離工程である。幹細胞からＩＭ細胞を製造するための培養日数とＩＭ細胞から腎オルガノイドを形成させるための日数とを表す１つの方法が、Ｘ＋Ｙ日目である（例えば、７＋１２日目は、７日間かけて幹細胞からＩＭ細胞を製造した後、ＩＭ細胞を解離し、１２日間かけてＩＭ細胞からオルガノイドを形成することを説明している（すなわち、Ｙ＝オルガノイドとしての日数））。
【０１４７】
１つの例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋１２日目の腎オルガノイドである。別の例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋１４日目の腎オルガノイドである。別の例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋１５日目以後の腎オルガノイドである。別の例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋１７日目の腎オルガノイドである。
【０１４８】
別の例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋２０日目の腎オルガノイドである。別の例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋２２日目の腎オルガノイドである。別の例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋２５日目の腎オルガノイドである。別の例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋３０日目の腎オルガノイドである。別の例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋１３日目〜７＋３０日目のものである。別の例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋１４日目〜７＋３０日目のものである。別の例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋１５日目〜７＋３０日目のものである。別の例では、本開示に包含される腎オルガノイドは７＋１５日目〜７＋２５日目のものである。上記の例で、ＩＭ細胞が８、９、または１０日間培養されてもよい（すなわち、８＋Ｙ日目、９＋Ｙ日目、または１０＋Ｙ日目）。
【０１４９】
別の例では、本明細書で開示される腎オルガノイドの細胞は７＋７日目の後に増殖する。別の例では、本明細書で開示される腎オルガノイドの細胞は７＋１０日目の後に増殖する。別の例では、本明細書で開示される腎オルガノイドの細胞は７＋１２日目の後に増殖する。別の例では、本明細書で開示される腎オルガノイドの細胞は７＋５日目〜７＋１０日目に増殖する。別の例では、本明細書で開示される腎オルガノイドの細胞は７＋５日目〜７＋１２日目に増殖する。これらの例では、細胞増殖の検出は、本明細書で開示される方法を用いてオルガノイド集団を作製し、特定の時点（例えば、７＋５日目、７＋７日目、７＋１０日目など）で前記集団からオルガノイドを単離および解離し、例えば、自動セルカウンター（例えばライフテクノロジーズ社）におけるトリパンブルー色素排除試験を用いて各時点の細胞数を求めることにより、行うことができる。
【０１５０】
スクリーニング
本開示に包含される腎オルガノイドは様々なスクリーニング用途に使用され得る。１つの例では、腎オルガノイドは毒性のスクリーニングに使用され得る。例えば、腎オルガノイドは腎毒性のスクリーニングに使用され得る。
【０１５１】
従って、１つの例では、本開示は、本明細書で開示される腎オルガノイドを候補化合物と接触させることと、その候補化合物が腎毒性であるかどうかを判定することとを含む、腎毒性について候補化合物をスクリーニングする方法を包含する。
【０１５２】
１つの例では、本明細書に記載の腎オルガノイドを候補化合物と接触させた後、腎毒性副作用が評価される。例示的な腎毒性副作用としては、直接的な尿細管への作用、ポドサイト傷害、間質性腎炎、および糸球体腎炎が挙げられる。腎毒性はまた、市販ツールを用いたバイオマーカー発現分析をはじめとする、インビトロにおけるあらゆる適切な腎細胞機能検査で評価または測定することができ、市販ツールとしては、例えば、キアゲン社製のＨｕｍａｎ  Ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ＲＴ2  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲ  Ａｒｒａｙまたはユーロフィン社（Eurofins）製Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＨＣＡ）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙが挙げられる。別の例では、候補化合物との接触後、本明細書で開示される腎オルガノイド内の糸球体細胞の急性アポトーシスを測定することにより、腎毒性が評価される。他の例では、腎毒性は、透過型電子顕微鏡または走査型電子顕微鏡などの電子顕微鏡法を用いて評価され得る。腎毒性を示す判定基準の他の例としては、ポドサイトマーカーの遺伝子発現またはタンパク質発現の消失、および足突起の消失（消去の消失（loss of effacement））が挙げられる。
【０１５３】
別の例では、本開示は、候補化合物が治療上有効であるかどうかを判定するための条件下で、本明細書で開示される腎オルガノイドを候補化合物と接触させることで、腎疾患の治療における治療効果について候補化合物をスクリーニングする方法を包含する。この例では、前記方法は、腎毒性化合物の存在下で、本明細書で開示される腎オルガノイドを候補化合物と接触させ、候補化合物が治療上有効であるかどうかを判定することを含み得る。
【０１５４】
治療効果のスクリーニングの他の例には、腎疾患を表す腎オルガノイドの評価が包含される。例えば、前記腎疾患は、先天性ネフローゼ症候群（ＣＮＳ）（ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群およびフィンランド型腎症を含む）、巣状分節性糸球体腎炎（focal segmental glomerulonephritis）（ＦＳＧＳ）、アルポート症候群、およびピアソン症候群からなる群から選択され得る。１つの例では、前記腎疾患はＣＮＳである。
【０１５５】
用語「治療効果」は、本開示との関連においては、候補化合物またはそれを含む組成物の、治療上有益な作用があらゆる毒性効果または有害効果を上回っている、応答を指して用いられる。治療効果は、腎細胞機能の改善；腎細胞機能の維持；腎細胞機能の低下の抑制（すなわち、ある程度の遅延、場合によっては阻止）；腎細胞死の抑制（すなわち、ある程度の遅延、場合によっては阻止）に基づいて判定することができる。１つの例では、治療効果は、適切なポドサイトタンパク質の存在、およびポドサイトタンパク質が適切に極性化されているという証拠に基づいて判定される。一例として、ポドサイトの膜におけるＮＰＨＳ１、ＮＰＨＳ２、およびＮＥＰＨ−１の局在化が挙げられ、この場合、ＮＰＨＳ１、ＮＰＨＳ２、およびＮＥＰＨ−１は免疫組織化学で判定される。
【０１５６】
腎疾患を代表する腎オルガノイドを用いた研究においては、腎毒性および治療効果が、無病腎オルガノイドにおける対応する腎細胞機能に基づいて確認される所定の基準と比較して判定され得る。別の例では、腎細胞機能の改善が、腎疾患を代表する腎オルガノイドと健常腎臓を代表する腎オルガノイドとの間での腎細胞機能の比較に基づいて判定され得る。
【０１５７】
腎オルガノイドを腎毒性化合物および候補化合物と接触させることを含む研究においては、腎細胞機能の改善が、腎毒性化合物と接触していない腎オルガノイドおよび／または腎毒性化合物単独と接触した腎オルガノイドとの比較に基づいて判定され得る。
【０１５８】
用語「候補化合物」は、本開示との関連においては、スクリーニング対象の薬剤を指して用いられる。候補化合物としては、例えば、低分子量有機化合物（例えば、約５０〜約２，５００Ｄａの分子量を有する有機分子）などの小分子、ペプチドまたはその模倣剤、ペプチドリガンドおよび非ペプチドリガンドを含むリガンド、ポリペプチド、アプタマーなどの核酸分子、ペプチド核酸分子、並びにこれらの成分、組み合わせ、および誘導体を挙げることができる。
【０１５９】
「接触」、「暴露」、または「適用」などの用語は、本開示においては文脈内で同義的に使用され得る用語と見なされる。接触という用語は、候補化合物が本明細書で開示される糸球体と接触させられることを必要とする。１つの例では、前記化合物は、水溶性または水非混和性である場合、細胞培地中に溶解され得る。あるいは、適切な基質が、前記化合物の中に浸され、培養下の腎オルガノイドに撒かれ得る。揮発性の候補化合物のスクリーニングにおいては、本明細書で開示される腎オルガノイドが、前記化合物を含む空気または他の気体混合物に暴露され得る。あるいは、腎オルガノイドが、細胞培地中の前記揮発性化合物の溶液または懸濁液に暴露され得る。同様に、可能であれば、揮発性の化合物は、溶解または安定化されたものであり得る。あるいは、適切な基質が、前記化合物の中に浸され、培養下の腎オルガノイドに撒かれ得る。
【０１６０】
本開示の方法の実施においては、複数の候補化合物が腎オルガノイドと接触させられ得る。例えば、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１（least 11）、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、少なくとも５５種、少なくとも６０種、少なくとも７０種、少なくとも８０種、少なくとも９０種、少なくとも１００種、少なくとも２００種、少なくとも３００種、少なくとも４００種、少なくとも５００種、少なくとも６００種、少なくとも７００種、少なくとも８００種、少なくとも９００種、少なくとも１，０００種、少なくとも２，０００種、少なくとも３，０００種、少なくとも５，０００種、少なくとも１０，０００種、少なくとも２０，０００種、少なくとも４０，０００種、少なくとも５０，０００種、少なくとも１００，０００種、少なくとも２００，０００種、またはそれ以上の候補化合物が腎オルガノイドと接触させられ得る。１つの例では、候補化合物は同一または別個の腎オルガノイドと接触させられ得る。例えば、候補化合物の特定の組み合わせがスクリーニングされ得る。
【０１６１】
１つの例では、候補化合物は標識後にスクリーニングされる。１つの例では、前記候補化合物は組成物であり得る。例えば、前記候補化合物は、製剤中に存在するものであるか、または、化合物もしくは分子の混合物を含み得る。例えば、前記候補化合物は血清であり得る。例えば、前記候補化合物は腎疾患を患う対象から単離された血清であり得る。１つの例では、前記血清はＣＮＳを患う対象から単離される。例えば、前記血清はステロイド抵抗性ネフローゼ症候群を患う対象から単離され得る。別の例では、前記血清は腎移植をしたことがある対象から単離される。別の例では、前記血清は、腎移植後に発症したネフローゼ症候群を患う対象から単離される。
【０１６２】
例示的な腎毒性物質としては、アミノグリコシド系抗生物質、βラクタム系抗生物質、シスプラチン、造影剤、ＮＳＡＩＤ、ＡＣＥ阻害剤、リチウム、ＣｓＡ、およびフェニトインなどの抗てんかん剤が挙げられる。
【０１６３】
様々な期間培養された腎オルガノイドが本明細書で開示されるスクリーニング用途に使用され得る。すなわち、一例として、７＋１５日目以後の腎オルガノイドがスクリーニングで使用され得る。別の例では、７＋１８日目〜７＋２５日目の腎オルガノイドがスクリーニングで使用され得る。別の例では、未成熟腎オルガノイドがスクリーングで使用され得る。例えば、７＋１１日目〜７＋１８日目のものがスクリーングで使用され得る。様々な例で、ＩＭ細胞はより長く培養されてもよく、すなわち、８＋Ｙ日目、９＋Ｙ日目、または１０＋Ｙ日目の腎オルガノイドがスクリーングで使用され得る。
【０１６４】
１つの例では、前記スクリーニング法は、候補化合物を腎オルガノイドのライブラリーと接触させることを含む。例えば、様々な発生段階の腎オルガノイドを用いて候補化合物がスクリーニングされ得る。例えば、７＋１０日目、７＋１５日目、および７＋２５日目の腎オルガノイドが使用され得る。別の例では、種々の腎疾患を代表する腎オルガノイドを用いて候補化合物がスクリーニングされ得る。
【０１６５】
当業者には理解されることであるが、候補化合物をスクリーニングするように構成され得る種々のスクリーニング手順が存在する。例えば、本明細書で開示される腎オルガノイドが、シングルウェルフォーマットまたはマルチウェルフォーマットに準備され、候補化合物と一定期間接触させられ得る。１つの例では、腎オルガノイドはマルチウェルプレートに準備される。１つの例では、１個の腎オルガノイドが１ウェル当たりに準備される。別の例では、２個の腎オルガノイドが１ウェル当たりに準備される。別の例では、３個の腎オルガノイドが１ウェル当たりに準備される。別の例では、４個の腎オルガノイドが１ウェル当たりに準備される。別の例では、５個の腎オルガノイドが１ウェル当たりに準備される。別の例では、１０個の腎オルガノイドが１ウェル当たりに準備される。別の例では、２０個以上の腎オルガノイドが１ウェル当たりに準備される。１つの例では、腎オルガノイドは９６ウェルプレートに準備される。
【０１６６】
ハイスループットスクリーニング法が本開示に包含される。この例では、ハイスループットスクリーニングは、多数の候補化合物を含有するライブラリーの準備を含む。次に、そのようなライブラリーは、所望のレベルの活性（例えば、治療効果）を示すライブラリーメンバー（例えば、特定の化学種またはサブクラス）を同定するための１または複数のアッセイにおいてスクリーニングされる。
【０１６７】
ハイスループットスクリーニングシステムは市販されており、通例は、全試料および全試薬のピペッティング、液体の分注、時限式のインキュベーション、およびアッセイに適した検出器での培養プレート（例えば、９６ウェルフォーマット）の最終読み取りを含む、全ての手順を自動化している。これらの構成可能なシステムは、高度な柔軟性およびカスタム性だけでなく、高速スタートアップも実現する。そのようなシステムの製造業者（例えば、インビトロジェン社、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社など）は、詳細な使用プロトコルを提供している。
【０１６８】
１つの例では、上記方法は、治療効果を示す化合物のセレクションをさらに含む。例えば、腎毒性物質の存在下で、且つ／または腎疾患を代表する腎オルガノイドと接触させられた場合に、腎細胞機能を維持する；腎細胞機能の低下を抑制する（すなわち、ある程度遅延し、場合によっては、阻止する）；腎細胞死を抑制する（すなわち、すなわち、ある程度遅延し、場合によっては、阻止する）、化合物である。別の例では、上記方法は、腎毒性を低減する化合物のセレクションをさらに含む。例えば、糸球体腎炎を抑制する化合物がセレクションされ得る。別の例では、腎細胞機能を改善する化合物がセレクションされ得る。これらの例では、腎細胞機能は、キアゲン社製のＨｕｍａｎ  Ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ＲＴ2  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲ  ＡｒｒａｙまたはＨｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔなどを含む市販のツールを用いて、バイオマーカー発現に基づいて測定され得る。
【０１６９】
オーダーメイド医療および層別化
対象における腎疾患を代表する腎オルガノイドにおいて治療効果を示す候補化合物は、前記対象においても治療効果を示す可能性が高い。従って、１つの例では、これらの腎オルガノイドは、対象における腎疾患の治療または予防に影響する可能性が高い薬剤のセレクションに使用され得る。
【０１７０】
別の例では、複数の対象における腎疾患を代表する腎オルガノイドが作製され得る。これらの腎オルガノイドは、複数の対象における腎疾患の治療もしくは予防に影響する可能性が高い薬剤のセレクション、または特定の薬剤による治療に応答する可能性が高い対象群の特定、に使用され得る。このような方法は、腎疾患の治療能について試験中の薬剤の臨床試験において対象を層別化するのに有用であり得る。腎オルガノイドスクリーニングに基づいて対象集団を分類することにより、遺伝的要因による治療成績のばらつきが排除または低減され、候補薬剤の有効性がより正確に評価され得る。従って、１つの例では、本開示は、治療薬の臨床試験の対象群を層別化するための方法であって、対象群からｉＰＳ細胞集団を入手すること、各対象のｉＰＳ細胞集団から腎オルガノイドまたは腎オルガノイド集団を生成すること、前記腎オルガノイドを治療薬と接触させること、前記治療薬に治療効果があるかどうかを判定すること、並びに、前記判定結果を利用して、前記治療法に応答する可能性が高い対象をセレクションすること、を含む前記方法を包含する。この例では、前記方法は、腎オルガノイドを治療薬および腎毒性物質と接触させた後、前記治療薬に治療効果があるかどうかを判定すること、を含んでもよい。治療薬の例としては、上記の候補化合物が挙げられ、例えば、１または複数の小分子、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、ウイルス、細菌、幹細胞、腎疾患患者由来血清を含む血清などである。誤解を避けるためであるが、血清は、特定の腎疾患を患う対象から単離され、本明細書で開示される腎オルガノイドと接触させられ得る。腎疾患の様々な例が本明細書に記載されるが、血清はこれらの疾患を代表する様々な対象から単離され得る。対象から血清を単離する方法は当該技術分野において公知のものである。１つの例では、血清は遠心分離を用いて全血試料から精製される。
【０１７１】
バイオプリンティング
１つの例では、本開示は、本明細書で開示される組成物または細胞を用いて製造された、腎臓もしくは他のネフロン含有臓器、オルガノイド、または臓器様構造体などの、「バイオプリントされた」腎構造体を包含する。「バイオプリントされた」または「バイオプリントする」などの用語は、本開示との関連においては、自動化された、コンピューター援用の、三次元プロトタイピング装置（例えば、バイオプリンター）と適合する方法による、正確な三次元細胞積層（例えば、細胞液、細胞含有ゲル、細胞浮遊液、細胞濃縮物、多細胞凝集体（multicellular aggregate）、多細胞体（multicellular body）、バイオインクなど）を利用する方法を指して使用されている。バイオプリンティングに好適な方法の例は国際公開第２０１２／０５４１９５号および国際公開第２０１３／０４００８７号で開示されている。１つの例では、バイオプリンティングは、ヒドロゲル足場を用いて、ヒト細胞を所望の配置に設置し、ヒト臓器を再現する、臓器プリンティング装置（例えばＯｒｇａｎｏｖｏ（インベテック社（Invetech））を用いて実施される。
【０１７２】
１つの例では、腎構造体はバイオインクからバイオプリントされる。用語「バイオインク」とは、本開示との関連においては、本明細書に記載の組成物または細胞を含む液状、半固体、または固体の配合物を指して使用されている。１つの例では、バイオインクは、細胞液、細胞凝集物、細胞を含むゲル、多細胞体、または組織を含む。別の例では、前記バイオインクは支持材をさらに含む。
【０１７３】
本開示に包含されるバイオプリントされた腎構造体は、腎臓またはその構成要素の１または複数の機能的特徴を有するか、あるいは、腎臓またはその構成要素の１または複数の機能的特徴を発達させることができる。例えば、バイオプリントされた腎構造体は、糸球体、傍糸球体装置、間質組織、集合管、ボーマン嚢、近位曲尿細管および／または遠位曲尿細管を含み得る。１つの例では、前記バイオプリントされた腎構造体は血管新生が生じていない。別の例では、前記バイオプリントされた腎構造体は、細動脈、動脈、静脈および／または毛細血管などの脈管構造を含む。
【０１７４】
１つの例では、バイオプリントされた腎構造体は、宿主に、植え込み可能であるかまたは養子移入可能である。
【０１７５】
組成物／キット
１つの例では、本開示は、スクリーニング用途に使用されるキットまたはアッセイに関する。例えば、本開示は、腎毒性および／または治療効果についての候補化合物のスクリーニングで使用されるキットまたはアッセイを包含する。１つの例では、本明細書に記載の腎オルガノイドが培養下で準備された後、候補化合物が腎オルガノイドと接触させられ、腎毒性および／または治療効果についてスクリーニングされ得る。従って、１つの例では、本開示は、スクリーニングに使用される場合、本明細書で開示される腎オルガノイドを培養下で含む、アッセイを包含する。１つの例では、前記アッセイは腎毒性スクリーニングに使用される。１つの例では、前記アッセイは治療効果スクリーニングに使用される。１つの例では、腎オルガノイドは、培地または培養下の腎オルガノイドを維持するための他の成分と共に提供される。１つの例では、腎オルガノイドは、本開示の方法を実施するための書面での指示書と共に提供される。１つの例では、前記アッセイは本明細書に記載の腎オルガノイドを含む。他の例では、前記アッセイは２個以上の腎オルガノイドを含む。例えば、前記アッセイは１０個、２０個、３０個、またはそれ以上の腎オルガノイドを含み得る。腎オルガノイドは、シングルウェルフォーマットまたは９６ウェルプレートなどのマルチウェルフォーマットで提供される。
【実施例】
【０１７６】
実施例１：ｈＰＳＣの培養および維持
ヒトＥＳ細胞（Ｈ９細胞）を、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー上、１０％ＫＯＳＲ（ライフテクノロジーズ社）およびｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。細胞を８０％コンフルエントまで培養した後、ＴｒｙｐＬＥ（ライフテクノロジーズ社）を用いて解離した。分化後、ＥＳ細胞をＭＥＦフィーダーの非存在下、ＭＥＦ馴化培地およびｂＦＧＦ中で、マトリゲル（コーニング社）表面に馴染ませた。
【０１７７】
ヒトｉＰＳ細胞を、Ｇｅｌｔｒｅｘ（ライフテクノロジーズ社）被覆プレート上、Ｅ８培地（ライフテクノロジーズ社）中で、個々のコロニーとして増殖させた。ｉＰＳ細胞の継代は、細胞が６０〜７０％コンフルエントに達したら、または３日毎に、ＥＤＴＡを用いて１回行った。
【０１７８】
ＴｒｙｐＬＥを用いてｈＰＳＣを単一細胞に解離し、細胞をマトリゲル被覆プレート（matrigel coated plated）上に１５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。細胞数は血球計算盤を用いて測定した。マトリゲル順応ｈＥＳ細胞を、ＭＥＦ馴化培地を用いて播種した。ヒトｉＰＳ細胞を、単一細胞として、Ｅ８培地中、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（１：１００希釈）を用いて、マトリゲル被覆プレート上に、一晩かけて播種した。
【０１７９】
実施例２：改善されたＩＭの製造
ｈＰＳＣまたはｈＥＳを、最初の４日間、３．５％のタンパク質不含ハイブリドーマ培地（ＰＦＨＭ）（サーモ・フィッシャー社）を含んだＡＰＥＬ２培地もしくはＴｅＳＲ−Ｅ６培地（ステムセル・テクノロジーズ社）中、ＡＰＥＬ培地（ステムセル・テクノロジーズ社）中、またはＥ６培地（ステムセル・テクノロジーズ社）中、高濃度のＣＨＩＲ（７μΜ）に細胞に暴露することで、中間中胚葉に分化させた。２日目に培地を交換した。培養物を、追加で３日間（播種から５〜７日目）、低濃度のＣＨＩＲ（１μΜ）、並びにＦＧＦ９およびヘパリンに暴露した（図１Ａ、実施例１〜３）。これにより中間中胚葉（ＩＭ）細胞の混合物が誘導される。
【０１８０】
７＋０日目の旋回浮遊培養物に対しｑＰＣＲで遺伝子発現プロファイルを行ったところ、低濃度且つ長期間のＣＨＩＲ暴露を加えることで、短期間の暴露と比較して、キャップ状間葉細胞で増加が引き起されることが示された（図ＩＥ、左パネル）。ＰＡＸ２、ＬＨＸ１、およびＯＳＲ１細胞の発現は、短期間ＣＨＩＲ暴露群と比較して２倍超に高くなった（図ＩＥ、左パネル）。低濃度のＣＨＩＲへの細胞の暴露により、尿管上皮でも増加が引き起こされ、例えば、ＷＮＴ１１およびＧＡＴＡ３の発現が、短期間ＣＨＩＲ暴露群と比較して２倍超に増加した（図ＩＥ、右パネル）。低濃度のＣＨＩＲの添加によってＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達をより長期間活性化することが、改善された中間中胚葉の製造法であることが示された。
【０１８１】
実施例３：旋回浮遊培養
７日目、実施例２の方法を用いて製造したＩＭ細胞を、１ｍｌのＥＤＴＡ溶液を用いて解離し、１ｍｌのＥＤＴＡ中、３７℃で３分間さらにインキュベートし、ＩＭ細胞層を乱さないようにＥＤＴＡ溶液を吸引除去した（図１Ａ）。また、ＩＭ細胞を１．５ｍｌのＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを用いて３７℃で３分間解離し、余剰ＴｒｙｐＬＥＴＭを１５ｍｌファルコンチューブ内で１５００ＲＰＭの遠心分離で除去した。
【０１８２】
１段階目の培地（基礎培地、２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９、１μｇ／ｍｌのヘパリン、１μΜのＣＨＩＲ、０．１％のＰＶＡ、０．１％のＭＣ）（２ｍｌ）を、１０μΜのＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫｉ、１：１０００希釈  １０μΜ、ステムセル・テクノロジーズ社）と共に添加し、ギルソン社製ピペットを用いて細胞を細胞集塊として穏やかに剥離した。この細胞浮遊液を６ｃｍ2低接着ディッシュ（グライナー・バイオ社（Greiner bio））に移し、４０μｍセルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社）に通した。
【０１８３】
１段階目の培地を５ｍｌまで補充し、ディッシュを、３７℃、５％ＣＯ2の標準的な細胞培養用恒温器内の、ラテック社製（Ratek）オービタルシェーカー内で、６０ｒｐｍで旋回した。オービタルシェーカー上の培養ディッシュに配置してから２４時間以内に、直径２０〜４０μｍのオルガノイドが自然に形成された。２４時間の旋回培養後、１段階目の培地を２段階目の培地（基礎培地、２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９、１μｇ／ｍｌのヘパリン、１μΜのＣＨＩＲ、０．１％のＰＶＡ、０．１％のＭＣ）と交換した。細胞を２段階目の培地中でさらに４日間培養した。７＋５日目から、全てのオルガノイドは、１日置きに３段階目の培地（基礎培地、０．１％のＰＶＡ、０．１％のＭＣ）で培地交換し、７＋１８日目まで培養した。
【０１８４】
凝集の１８日後（７＋１８日目）、明視野の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色によって、各腎オルガノイドが尿細管上皮構造を示していることが確認され、共焦点顕微分析によって、６〜１０個のネフロンの存在が確認された（図１および図２）。これらのネフロンは、初期のパターン形成および分節化の証拠を示している。ＮＰＨＳ１およびＭＡＦＢの陽性染色から、糸球体の形成が明らかとなった。近位ネフロン分節はＥｐＣＡＭ+であり、ＬＴＬ陽性、ＣＵＢＮ陽性、ＬＲＰ２陽性、且つＨＮＦ４Ａ陽性に染色された（図１Ｇ）。ＬＴＬ+分節は、前記培地添加の２４時間以内に、ＦＩＴＣ−アルブミンをエンドサイトーシスで取り込むことができ、これにより、機能的なアルブミン取り込み経路が示された。遠位ネフロン分節はＥＣＡＤおよびＥｐＣＡＭで染色され、推定の集合管はＥＣＡＤ+／ＧＡＴＡ３+であった。ＳＯＸ１７ｍＣｈｅｒｒｙレポーター細胞株（Ng et al., 2016）を用いて腎オルガノイドを生成する場合は、内皮細胞（ＰＥＣＡＭ１+／ＳＯＸ１７+）の存在にも注目した（図ＩＤ；図２Ｃ、図２Ｄ、および図２Ｅ）。ヒト多能性幹細胞株間でプロトコルを交換可能であることを示すものとして、ｈＥＳＣレポーター株（Ｈ９  ＧＡＰＴｒａｐＬｕｃ２、ｈＥＳ３−ＳＯＸ１７ｍＣｈｅｒｒｙ）（Kao et al., 2016; Ng et al., 2016; van den Berg et al., 2018）およびヒトｉＰＳＣ（ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２、ＣＲＬ１５０２．３）（Briggs et al., 2013; Takasato et al., 2015）を含む、４種類の異なる細胞株から腎オルガノイドを生成できたというデータが報告されている。全てのｈＰＳＣ株は前記プロトコルに均一に応答し、腎オルガノイドへと同様にパターン形成した（図２Ｂ）。
【０１８５】
実施例４：腎オルガノイドパターン形成に対する、古典的Ｗｎｔシグナル伝達の持続期間、濃度、およびタイミングの影響
腎オルガノイドプロトコル内の分化を最適化するため、ｈＰＳＣの単層を、固定濃度のＣＨＩＲ９９０２１（７μΜ）を用いて、種々の期間（３、４、５、および６日間）刺激した後、低濃度のＣＨＩＲ、並びにＦＧＦ９およびヘパリンの存在下で７日目まで培養を続けた（図２Ｃ、図２Ｄ、および図２Ｅ）。１８日後、共焦点顕微鏡を用いて、得られた腎オルガノイドの腎構造を評価した（図２Ｃ、図２Ｄ、および図２Ｅ）。３日間だけの古典的Ｗｎｔ活性化では、腎臓の形態を生じさせることができなかった（図２Ｂ、左パネル）。代わりに、存在する上皮性構造は、大きな包嚢性管腔を有する不明確な上皮を示し、ネフロン形成の証拠は示さなかった。７μΜのＣＨＩＲ９９０２１を用いた４日間または５日間の初期誘導により、内皮細胞および間質性間質細胞（interstitial stromal cell）をそれぞれ示す、周囲のＳＯＸ１７+集団およびＭＥＩＳｌ／２／３+集団の存在を含んで、パターン形成ネフロンを含有する腎オルガノイドが生成された（図２Ｃ、図２Ｄ、および図２Ｅ、中央パネル）。しかし、６日間のＷｎｔ活性化では、より大きくＮＰＨＳ１染色されたより大きな腎オルガノイドが生成されたが、上皮性構造が明らかに損なわれた、拡張されたＭＥＩＳ１+間質集団が含まれた（図２Ｃ、図２Ｄ、および図２Ｅ、右パネル）。７μΜのＣＨＩＲ９９０２１による４日間の初期誘導が最適であると確認されたため、さらなる研究ではこれを用いた。
【０１８６】
実施例５：腎オルガノイドの解離
腎オルガノイドは直径およそ２５０〜３００μｍの不均一な上皮性構造である。刺激の強い酵素を用いると、細胞表面マーカーが破壊され、後の使用のための細胞識別情報が失われる場合がある。冷活性プロテアーゼ（ＬｉｂｅｒａｓｅＴＭ、ロシュ社）を用いて穏やかに解離を行うと、単一生細胞が最も多く得られる。５ｍｌセロロジカルピペットを用いて腎オルガノイドを１５ｍｌファルコンチューブに移し、定着させた。培地上清を吸引除去した後、オルガノイドペレットを０．１Ｍ  ＰＢＳで３回洗浄した。次に、オルガノイドを５００μｌの１μｇ／ｍｌ  Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）溶液で処理し、５分毎に粉砕し続けながら４℃で２０分間インキュベートした。２０分後、腎オルガノイドの単一細胞への解離が完了し、これを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で２回洗浄することでＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）を不活性化し、最終的な細胞ペレットを１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に懸濁した。
【０１８７】
実施例６：中間中胚葉細胞の旋回は浮遊培養で腎マイクロオルガノイドを生成する
既存の腎オルガノイド生成法は、手間が掛かり、高額であり、生成されるオルガノイドの品質が低い。本発明者らは、経済的で、簡便で、且つ高速の、浮遊培養下の腎オルガノイド生成法を編み出した。以前の方法とは異なり、最低限の解離および単層の低速旋回、その後の低付着培養プレートにける培養の結果、細胞凝集塊が中間中胚葉（ＩＭ）の分化段階（７日目）で形成される。これにより、以前の方法を用いて生成される腎オルガノイドよりもずっと少ない、８，０００〜１０，０００個の腎オルガノイドが形成される。１８日間の浮遊培養後、それぞれの腎オルガノイドには、ポドサイトを含有する近位上皮、遠位上皮、および糸球体の形成を含む、初期のパターン形成および分節化の証拠を有する、６〜１０個程度のネフロンが含まれる。
【０１８８】
重要なこととして、シングルセル転写プロファイリングによって、これらの小型オルガノイドと従来方法を用いて製造された標準オルガノイドとが、細胞の多様性および成熟に関して等価であることが明らかとなった。この定方向分化アプローチを用いた結果、２１日間の培養中に３０〜４０倍の細胞増殖が引き起こされ、これは、Takasato et al. (2015) Nature, Vol. 526:564-568に基づいたアプローチなどの従来のアプローチと比較して、１×１０6個のオルガノイド由来腎細胞当たり３〜４倍の収量改善および１／４倍のコスト減少となった。
【０１８９】
図１Ａに例示され、実施例１〜３で説明された本開示の方法は、０．１％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および０．１％のメチルセルロース（ＭＣ）を旋回培養の培地に添加することで、中間中胚葉（ＩＭ）細胞の凝集力を強化して、自発的に三次元球状オルガノイドへと凝集させることを含む。２４時間の旋回培養後、このオルガノイドは外側ラミニン基底膜（outer laminin basement membrane）を形成した。
【０１９０】
追加で１２〜１８日間培養したＣ３２オルガノイドを収集し、ホールマウントし、共焦点顕微鏡分析用にＮＰＨＳ染色、ＬＴＬ染色、ＥＣＡＤ染色、およびＧＡＴＡ３染色を行った。脈管構造の存在を評価するために、このオルガノイドを、マウス抗ヒトＣＤ３１（１：３００、ＢＤバイオサイエンス社）で染色し、成熟近位尿細管についてはヤギ抗ヒトＣＵＢＮを用いた。７＋１２日目のオルガノイドの蛍光免疫染色分析によって、ＧＡＴＡ３陽性の間質細胞を含む、ネフリン陽性の糸球体、ＬＴＬ陽性の近位尿細管、ＥＣＡＤ陽性の遠位尿細管、およびＥＣＡＤ／ＧＡＴＡ３二重陽性の集合管細胞という、特徴的な発現の形で、主要なネフロン分節化が示され（図１Ｇ、図４Ｅ、および図４Ｆ）、これは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌオルガノイドシステム（図４Ａ）と同等のものであった。ネフロン数（各オルガノイドに５〜１０個のネフロン）および腎細胞以外の種類の存在に関して、旋回腎マイクロオルガノイドは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌオルガノイドと比べて単純な形態を示す。
【０１９１】
まとめると、これらの結果は、浮遊液旋回法が、全てのネフロン分節を有する複雑な多細胞性腎オルガノイドを生じる能力を有する組織化されたオルガノイドを形成させることを示している。この方法を、ヒトｉＰＳ細胞株だけでなくヒトＥＳ細胞株も用いて試験したところ、オルガノイドが上手く形成された。ＡＰＥＬ、ＡＰＥＬ２、およびＥ６などの種々の基本培地条件が、本開示の方法に好適であることが示された。従って、本方法は、オーダーメイド医療、薬物スクリーニング、および再生細胞療法のための腎細胞培養のスケールアップに有用であり得る。
【０１９２】
実施例７：ｉＰＳ由来腎細胞のスケールアップに好適な浮遊培養下の腎マイクロオルガノイド
スケールアップに対する浮遊培養の評価のために、実施例１および実施例２に記載の通りに、Ｃ３２  ｉＰＳ細胞を分化させてＩＭを生成した。７＋０日目からサイズおよび培養下の総細胞数を測定することで、オルガノイドの成長をモニターした（図４Ｃおよび図４Ｄ）。
【０１９３】
旋回浮遊培養を用いて生成されたＣ３２オルガノイドの明視野画像は、サイズの増加および上皮構造の維持を示した（図４Ａおよび図４Ｂ）。オルガノイドのサイズは、ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ顕微鏡法用ソフトウェア（ニコン社）において、最大１０個のランダムに抽出したオルガノイドの明視野画像で測定した。最大１０個のオルガノイドのランダムサンプルを様々な成長速度間隔で採取し、オルガノイドの直径を測定した。サイズは小から大の範囲で報告した。時間の経過とともに一貫したオルガノイドサイズの増加が観察され、直径３０μｍ〜３００μｍのオルガノイドが検出された（図４Ｃ）。総細胞数は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを用いて解離後に評価し、血球計算盤を用いて手動で計数した。７＋０日目の播種密度と比較して、７＋１２日目から７＋１８日目までに、４０倍の細胞数増加が観察された（図４Ｄ）。
【０１９４】
実施例８：浮遊培養下の腎マイクロオルガノイドは組織化されたネフロン分節および明確な尿細管管腔を示す
従来のＴｒａｎｓｗｅｌｌオルガノイドは複雑な形態を示し、これが個々のネフロンの３次元構造の研究を制限している。本明細書に記載の方法によって製造された旋回腎マイクロオルガノイドは、はるかに単純であり、且つ含まれるネフロンの数が少ない。
【０１９５】
このオルガノイドは、明確な３次元形態を示すため、３次元空間でのネフロンの研究が可能となる。Ｃ３２由来の腎オルガノイドを、実施例１〜３に記載の方法を用いて生成し、ＮＰＨＳ１、ＬＴＬ、ＥＣＡＤ、およびＧＡＴＡ３に対する抗体を用いて免疫染色を行って、ハイスループット共焦点顕微鏡で各ネフロン分節を可視化し、Ｚ方向の解像度はピンホールにマッチさせた。
【０１９６】
腎オルガノイドを１５ｍｌのファルコン（flacon）チューブに採取し、ＰＢＳで洗浄（２回）して余分な培地を除去し、新たに調製した２％ＰＦＡで４℃で２０分間固定した。次に、オルガノイドを０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄して余分なＰＦＡを除去し、染色するまでＰＢＳＴ中で４℃で保存した。固定したオルガノイドを、１０％ロバ血清含有ＰＢＳＴ（ブロッキング用緩衝液）で少なくとも１時間ブロッキングした後、ブロッキング用緩衝液で希釈した一次抗体と共にインキュベートした。腎オルガノイドの分化能の評価は、主要なネフロンセグメントの染色によって確認したが、使用した一次抗体は以下の通りであった：ヒツジ抗ヒトＮＰＨＳ１（１：３００、Ｒ＆Ｄシステムズ社）、ビオチン抗ヒトＬＴＬ（１：３００、ベクター・ラボラトリーズ社）、マウス抗ヒトＥＣＡＤ（１：３００、ライフテクノロジーズ社）、およびウサギ抗ヒトＧＡＴＡ３（１：３００、セル・シグナリング・テクノロジーズ社）、マウス抗ヒトＣＤ３１（１：３００、ＢＤバイオサイエンス社）、およびヤギ高ヒトＣＵＢＮ（１：３００、サンタ・クルーズ社）、およびＬＲＰ２（１：３００、サフィア・バイオサイエンス社（Sapphire Bioscience））。オルガノイドを一次抗体中で４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳＴで５回洗浄し、その後、種を一致させた、蛍光標識を有する二次抗体と共にインキュベートした。染色後、Dodt HU et al (Dodt et al., 2007)により以前に報告されたように、オルガノイドを、種々の濃度のメタノールを用いて脱水した後、ＢＡＢＢ（ベンジルアルコールおよび安息香酸ベンジル、１：２の比率）を用いて清澄化した。清澄化したオルガノイドをＭａｔＴｅｋガラス底ディッシュにマウントし、倒立ツァイス社製（Zeiss）ＬＳＭ  ７８０顕微鏡を用いて共焦点顕微鏡法を実施した。ＺＥＮソフトウェア（ツァイス社）を用いて画像を解析した。
【０１９７】
Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを使用して画像を解析し、取得した共焦点画像の３Ｄレンダリングを再構築した（図４Ｅおよび図４Ｆ）。３Ｄ画像は、糸球体（ＮＰＨＳ１）、近位尿細管（ＬＴＬ＋）、遠位尿細管（ＥＣＡＤ＋）、集合管（ＥＣＡＤ＋ＧＡＴＡ３＋）および間質細胞（ＧＡＴＡ３＋）から始まる、分極化した、互いに接続された明確なネフロン分節を示した（図５Ｅ）。スニッピングツールを用いて、尿細管細胞内に形成された内腔を可視化させた（図５Ｆ）。図５Ｅおよび図５Ｆの結果は、本明細書に記載の旋回法が、３Ｄ空間における、発生中の腎オルガノイドの形態研究を可能にする上で有用であることを示している。
【０１９８】
実施例９：シングルセルＲＮＡシーケンス解析は有望な腎臓表現型を示す
旋回腎オルガノイドをさらに広範囲に特徴付けるために、７＋１８日目におけるＣ３２由来腎マイクロオルガノイドのシングルセルＲＮＡシーケンス解析を行った。４０〜５０個程度の腎マイクロオルガノイドおよび１個の標準オルガノイド全体を、同じｈＰＳＣ株（ＡＰＥＬ培地中のＣＲＬ１５０２．Ｃ３２）を用いて、７＋１８日目まで培養した。オルガノイドを回収し、ＰＢＳで３回洗浄して余分な培地を除去した。オルガノイドを、５分毎に１ｍｌピペットで撹拌しながら、１μｇ／ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）（ロシュ社）液４００μｌで４℃で２０分間処理した。２０分以内にオルガノイドは単一細胞（singe cell）に解離した。細胞培地（cell culture medial）（２ｍｌ）を添加して、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）を不活性化した。細胞を１３００〜１５００ｒｐｍで３〜５分間遠心分離し、ペレットを形成させた。上清を除去し、ペレットを新鮮なＤＭＥＭ  Ｆ１２培地に再懸濁し、２０μｍのセルストレーナーを通過させて塊を除去し、分析まで氷上で保存した。生存率および細胞数を、自動セルカウンター（ライフテクノロジーズ社）でのＦＡＣＳおよびトリパンブルー色素排除試験によって分析した。細胞は分析まで氷上で保存した。大口径１ｍｌピペットチップを用いて細胞を十分に混合し、約４０００個の生細胞をＲＮＡシーケンス解析に使用した。テンエックス・ゲノミクス社（10× Genomics）の技術で開発されたＣｈｒｏｍｉｕｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  ３’  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用した。試料の調製はテンエックス・ゲノミクス社のシングルセルプロトコルに従って実施した（詳細は、オンラインでアクセス可能なＣｈｒｏｍｉｕｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  ３’  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔｓ  ｖ２  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅに掲載）。シングルセル浮遊液、ゲルビーズ、パーティショニングオイルを１０ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ  Ｃｈｉｐの適切なウェルにロードする。１０ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ  Ｃｈｉｐを１０ｘ  Ｇａｓｋｅｔで固定し、完全なアセンブリを１０ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒにロードする。これにより、細胞毎に固有のＵＭＩを含有する油滴でコーティングされたシングルセルの浮遊液が自動的に生成される。この浮遊液は、転写物を増幅するために従来のＲＴ−ＰＣＴに採用される。
【０１９９】
ナノリットルスケールのＧｅｌ  Ｂｅａｄ−Ｉｎ−ＥＭｕｌｓｉｏｎｓ（ＧＥＭＳ）およびＵＭＩを用いて、細胞をバーコーディングして各細胞のトランスクリプトームを個別にインデックス化した。磁気ビーズを用いて、バーコーディング後に残った試薬およびプライマーを除去する。完全長のバーコード付加ｃＤＮＡを用いてトランスクリプトームをＰＣＲ増幅し、ライブラリー構築に十分な量を生成した。これらのライブラリーを、２つの異なるリードでＵＭＩおよびｃＤＮＡ断片について同時に配列決定した。シングルセル解像度での発現データの研究を可能にするＣｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒ（商標）を用いて、ライブラリー解析を実施した。Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒパイプライン（ｖｌ．３．１）を用いて、サンプルの逆多重化、バーコードのプロセシング、およびシングルセル遺伝子計数を行った（Zheng et al., 2017）。サンプルを逆多重化して、各サンプルについて一対のＦＡＳＴＱファイルを作成した。配列情報を含むリードをＧＲＣｈ３８参照ゲノムにアラインメントした。細胞バーコードをフィルタリングして空の液滴を除去し、ＰＣＲ重複は細胞バーコード、ＵＭＩおよび遺伝子ＩＤのユニークな組み合わせをセレクションすることによって除去したところ、最終的な結果は遺伝子発現マトリックスとなり、これがさらなる解析に用いられ、このようにして、シングルセル解像度での発現データの研究が可能となる。Ｓｅｕｒａｔ  Ｒパッケージ（バージョン２．３．１）を用いて、細胞クラスタリング、細胞型分類、および遺伝子発現の差異を示すためのさらなる解析を行った。
【０２００】
Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒで作成された遺伝子発現マトリックスを、品質管理およびさらなる解析のためにＳｅｕｒａｔ（Satija et al., 2015）にインポートした。全ての細胞を初期フィルタリングにかけて、３個未満の細胞で発現された遺伝子、および２００個未満の遺伝子を発現した細胞を除去した。さらなるフィルタリングにより、１５％を超えるミトコンドリア転写物を有する１つの細胞を除去した。Ｓｓｃｒａｎのｃｙｃｌｏｎｅ機能（Lun et al., 2016; Scialdone et al., 2015）を用いて、各細胞がＧ１期、Ｓ期またはＧ２Ｍ期のいずれにあるかの可能性に関連するスコアを割り当て、このスコアリングに基づいて細胞周期の期を割り当てた。
【０２０１】
発現データを正規化し、スケーリングし、ＵＭＩの数、ミトコンドリア発現の割合、リボソーム発現の割合、およびＧ２Ｍスコアに関連する変動性を、ＳｅｕｒａｔのＳｃａｌｅＤａｔａ機能を用いて回帰推測した。細胞は、Ｓｅｕｒａｔに実装されている共有最近傍モジュラリティ最大化ベースのクラスタリングアルゴリズムを用いて、最初の１５個の主成分および分解能値１．２を用いてクラスタリングした。対数変化倍率が０．２５以上の、クラスター間で発現差がある遺伝子を見つけるために、ＳｅｕｒａｔのＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ機能を用いてマーカー遺伝子リストを作成した。
【０２０２】
標準オルガノイドと腎オルガノイドのデータセットの複合解析のために、上記のようにＣｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒで遺伝子−細胞マトリックスを作成した。３個未満の細胞で発現された遺伝子、および２００個未満の遺伝子を有した細胞について、全ての細胞を初期フィルタリングにかけた。各データセットを正規化し、スケーリングし、ＵＭＩの数、ミトコンドリア発現の割合、リボソーム発現の割合、並びにＳ、Ｇ１、およびＧ２Ｍスコアに対する回帰をＳｃｒａｎで作成した。クラスタリングは、ＲｕｎＣＣＡ機能およびＡｌｉｇｎＳｕｂｓｐａｃｅ機能を用いてＳｅｕｒａｔで算出された、アライメントされた複合成分に基づかせた（Butler et al., 2018）。複合データセットについて、クラスタリングを解像度０．６で実行した（Butler et al., 2018）。
【０２０３】
本明細書に記載の方法および従来のＴｒａｎｓｗｅｌｌ法により製造されたオルガノイドのシングルセルＲＮＡ遺伝子発現プロファイリングを解析した。細胞内に存在する遺伝子に基づいて、ＵＭＩ数をｔＳＥプロットとしてプロットし、自動クラスタリングを行った（図６Ａ〜図６Ｂ）。すべてのクラスターのＧＯエンリッチメント解析では、２２．３％のネフロン、３７．５％の全間質、９．８％の血管組織が示され（図６Ａ）、旋回腎マイクロオルガノイドでは、３２．５％の成熟ネフロン（キャップ状間葉およびネフロン前駆体を除く）、２５．９％の間質が示されたが、旋回Ｃ３２オルガノイドでは血管組織の存在は示されなかった（図６Ｂ）。すなわち、旋回腎マイクロオルガノイドは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌオルガノイドと比較して、腎臓発生のより良好なマーカーを示した。腎マイクロオルガノイドはまた、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ培養オルガノイドと比較して、ネフロン構成の強化を示した（図４）。
【０２０４】
実施例１０：腎オルガノイド内の腎臓分化の転写検証
腎オルガノイド内に存在する細胞型の特性評価を、シングルセルＲＮＡシーケンス（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を用いて実行した。２０〜３０個の腎オルガノイドのプールを、冷活性プロテアーゼＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）を用いて単一生細胞に解離した。その結果、８９．４％の単一細胞が生成され、そのうち８８．５％の細胞が生細胞であった（データ未記載）。Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒ（テンエックス・ゲノムクス社）を用いて、細胞当たりのＵＭＩ数のマトリックスを作成し、これを、Ｓｅｕｒａｔ  Ｒパッケージ（バージョン２．３．１）を使用するさらなる解析のために、インポートした（Satija et al., 2015）。フィルタリングされたデータは、細胞当たりの発現遺伝子の中央値が３７５９個である、１６７３個の細胞を示した。Ｓｅｕｒａｔ  Ｒパッケージを用いたクラスタリングにより、解像度０．６で７つの異なる細胞クラスターが生成された（図３Ａおよび図３Ｂ、表１）。差動発現試験を実施して各クラスターのマーカーを同定し、各クラスター内の上位の有意にアップレギュレーションされた遺伝子についての遺伝子オントロジーおよび機能的エンリッチメント解析を、ＰＡＮＴＨＥＲ遺伝子オントロジー群を用いて実施した（Mi et al., 2013；表１）。
【０２０５】
【表１】
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【０２０６】
ホールマウントオルガノイドの免疫蛍光法を用いると明白であるが、内皮（クラスター１のサブセット）およびポドサイト（クラスター６、１８個の細胞）は、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑデータの中のごく少数の個々の細胞によって表された。クラスター３（２９３個の細胞）およびクラスター５（１２２個の細胞）は、腎臓のネフロン上皮と一致する遺伝子の発現を示し、クラスター０は腎小胞（kidney vesicle）／Ｓ字体（S-shaped body）の遺伝子（初期ネフロン）の発現を示し、一方、上皮細胞クラスター５はＧＦＲＡ１などの遠位尿細管／集合管マーカーの発現を示した（図３Ｃ）。クラスター２は、以前に筋原性ウィルムス腫瘍と関連付けられた（Hueber et al., 2009）、間質マーカーＰＡＸ３だけでなく、ネフロン前駆体マーカーＳＩＸ１、ＳＩＸ２、およびＣＩＴＥＤ１の発現を示した。クラスター２の細胞は、ＭＹＦ５およびＭＹＦ６などの筋原性運命のマーカーも発現しているが、ＰＡＸ７、ＭＹＯＤ１、およびＴＢＸ６は発現していない。最大のクラスターを表すクラスター０（４３０個の細胞）は、初期腎小胞マーカーのＰＡＸ２、ＰＡＸ８、ＬＨＸ１、およびＪＡＧ１、並びにヒトＰマーカーのＬＹＰＤ１およびＤＡＰＬ１の発現を有する、より運命決定されたネフロン前駆体の特徴を示した（Lindstrom et al., 2018）。クラスター１（３３７個の細胞）は、ＰＤＧＦＲＢおよびＭＥＩＳ２のような間葉系の特徴を示した。クラスター４は、初期ネフロンマーカーであるカドヘリンＣＤＨ６を発現しながら、以前に腎オルガノイドにおいて報告されていたような（Wu et al., 2017）、神経オフターゲット集団の存在を示唆する神経転写性の特徴を示した。この解析により、免疫蛍光レベルで腎オルガノイド内で観察された細胞型の識別情報が強く裏付けられた。
【０２０７】
実施例１１：標準オルガノイドおよび腎オルガノイドの比較シングルセル転写プロファイリングは、腎形成のパターニングの等価性を示している。腎オルガノイド内の細胞成分を別の腎オルガノイド法と直接比較するために、腎オルガノイドのｓｃＲＮＡ−ｓｅｑデータを、同じｉＰＳＣ細胞株（ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２）およびTakasato et al, 2016の標準腎オルガノイドプロトコルを使用して生成された１４２１個の腎オルガノイド細胞からのデータと組み合わせた。この２つのデータセットを、相関成分解析後に動的時間伸縮法を使用するＳｅｕｒａｔ（Butler et al., 2018）に実装されたアライメントアルゴリズムを用いて組み合わせた。クラスタリングによって、運命決定されたネフロン前駆体（クラスター０）、ネフロン上皮（クラスター６）、ポドサイト（クラスター７）、間質（クラスター１および３）、内皮細胞（クラスター５）、ＰＡＸ３+ve細胞（クラスター２）、および神経オフターゲット集団（クラスター４）を表す、組み合わされたデータセット内の８つの転写クラスターが同定された（図５Ａおよび図５Ｂ）。各クラスターに帰属する細胞の割合は様々であったが、全てのクラスターは両方のデータセットに示された（図５Ｂ〜図５Ｄ）。各クラスターのキーマーカーの直接比較は、プロトコル間で各クラスターに寄与する割合に明らかな違いがあったが（図５Ｂと図５Ｃ）、両方のプロトコルの間で任意の所与のクラスターで同定された細胞間に強い転写一致があった（図５Ｄ）ことを示している。腎オルガノイドにおいて同定された神経オフターゲット集団は、標準オルガノイドでも明らかであった。全体的に、腎オルガノイドデータセットは、標準オルガノイドデータセットよりも、ネフロン細胞の割合が高く、間質細胞の割合が低かった（図５Ｅ）。標準オルガノイドと比較して、腎オルガノイドにおける、ＰＡＸ２発現ネフロン細胞の増加およびＭＥＩＳ１／２／３発現間質細胞の減少が、ホールマウントオルガノイドの免疫蛍光分析を用いて確認された（図５Ｆおよび図６）。
【０２０８】
実施例１２：腎オルガノイドはｈＰＳＣ由来腎臓細胞の効率的なスケールアップのためのより良好なプラットフォームを提供する
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）フィルター上で培養した標準的な腎オルガノイドは、生成されたオルガノイド組織のサイズのために、培養３週間後に拡散制限に直面する可能性がある（図４Ａ）。この期間後のネフロン分節の免疫蛍光染色によって、ネフロン構造がオルガノイドの縁に空間的に制限されていることが示唆された。対照的に、腎オルガノイドは、構造全体に腎尿細管を含んでいる（図４Ｂ）。また、オービタルシェーカーを用いて腎オルガノイドを同時に大量に形成することができ、標準的なオルガノイドプロトコルに伴う手作業による面倒な工程を回避することがでる。その結果、標準的なオルガノイドプロトコルでは６０分で３０個程度のオルガノイドが生成されるのに対し、５〜１０分で８０００〜１００００個程度の均一サイズの腎オルガノイドを生成することができる。腎オルガノイドは、標準オルガノイド（３０００〜５０００μｍ）と比較して、はるかに小さい最終サイズ（２５０〜３００μｍ）を示す（図４Ｃ）。免疫蛍光法によって示されたように、標準オルガノイド内に形成されるネフロンは、腎オルガノイドと比較して、組織の周縁に存在する（図４Ａ）。しかし、これらの構造は、腎オルガノイドよりもはるかに大きい。それぞれのアプローチの効率およびコストを直接比較するために、ｉＰＳＣレポーター株およびｈＥＳＣレポーター株を用いて各々生成した標準オルガノイドおよび腎オルガノイドを、総細胞数の定量化のために、７日目から分化プロトコルの複数の時点で、解離させてシングルセル浮遊液にした（図４Ｄ）。標準オルガノイドでは、７＋７日目以降はオルガノイドあたりの総細胞数に重大変化は見られなかったが、腎オルガノイドでは７＋１２日目まで総細胞数の増加が続いた。全体として、細胞数は標準オルガノイド条件下では８〜１０倍に増加したが、腎オルガノイドの場合は３０〜４０倍まで増加した。これは、この改変されたプロトコルを使用した場合、細胞収量が３〜４倍に改善されることを表している。
【０２０９】
実施例１３：オールトランスレチノイン酸の添加は糸球体ポドサイトの成熟を改善する
オールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）の添加が、実施例１〜３に記載の旋回培養法で製造されたオルガノイドの糸球体成熟を促進するかどうかを決定するために、７＋０日目以後の培地にａｔＲＡを添加した。オールトランスレチノイン酸（２．５μΜ）をＣ３２由来旋回オルガノイドに７＋５日目から７＋１０日目まで添加した（図５）。７＋１８日目後、免疫蛍光分析によって、ａｔＲＡの添加は対照群と比較してポドサイト表現型を改善することが示された（図７Ａおよび図７Ｂ）。この結果を、７＋１１日目および７＋１８日目の試料のｍＲＮＡ発現、ｑＰＣＲ分析で確認したところ、２．５μΜのａｔＲＡの添加は、対照と比較して、ＮＰＨＳ１などの糸球体マーカーおよびＣＵＢＮのような近位尿細管マーカーの発現を増加させることが示された（図７Ｃ）。
【０２１０】
実施例１４：腎マイクロオルガノイドにおける薬物毒性試験
インビトロにおける腎臓の薬物毒性の試験に、本明細書に記載の浮遊培養法を使用することの適合性を評価するために、薬物毒性試験を実施した。７＋１８日目にこの方法で作製されたオルガノイドを回収し、２４ウェル低付着プレート内の２５０μｌの培地中、各処理群に無作為に割り付けた。オルガノイドを、様々な濃度の細胞傷害性薬剤アドリアマイシン（０、２．５および５μｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。刺激後、培地を除去し、ＴＵＮＥＬ染色を用いたアポトーシスの蛍光免疫染色分析用にオルガノイドを２％ＰＦＡで固定し、一部のオルガノイドはＲＮＡ解析用に溶解させた（図８Ａ〜図８Ｄ）。
【０２１１】
実施例１５：腎オルガノイド製造の改善のまとめ
上記の例示的な方法から得られた腎オルガノイドは、シングルセル転写レベルで、以前に報告された腎オルガノイドプロトコル（Takasato et al., 2016; Takasato et al., 2015）の中に存在するものと同等の、腎臓ネフロン上皮、間質、および内皮細胞成分の、信頼性の高い形成を示す。しかしながら、培養条件を変更することにより、相対的な細胞収量が３〜４倍に改善され、１００万個の腎臓細胞あたりの生成コストが１／４倍に少なった。ｈＥＳ３  ＳＯＸ１７ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｈ９  ＧＡＰＴｒａｐ  Ｌｕｃ２、およびｉＰＳＣ  ＧＡＰＴｒａｐ  ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ蛍光レポーター株を含む、２つの異なるｈＥＳＣ（Ｈ９およびｈＥＳ３）および３つの異なるｉＰＳＣ株（ｉＰＳＣ  ＧＡＰＴｒａｐ  ｔｄ−  Ｔｏｍａｔｏ、ＣＲＬ１５０２．Ｃ３２、およびＣＬＲ１５０２．３）を用いて、腎オルガノイド生成の成功を反復できたことから、例示された方法のロバストネスは明らかである。
【０２１２】
当業者には理解されることであるが、特定の実施形態に示されたような本開示には、広く記述された本開示の要旨を逸脱しない範囲で、多数の変形および／または変更を実施することができる。従って、これらの実施形態は、あらゆる点で、例示的であって、限定するものではないと見なされるべきである。
【０２１３】
本願は、２０１７年１０月３１日に出願されたオーストラリア特許出願公開第２０１７９０４４２４号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願公開は参照によって本明細書に援用される。
【０２１４】
本明細書で説明および／または参照された全ての刊行物は、その全体が本明細書に援用される。
【０２１５】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等の説明は、単に本発明の背景を提供することを目的とするものである。これらの事項のいずれかまたは全てが、先行技術の基礎の一部を形成していること、または本願の各請求の優先日以前に存在していた本発明に関連する分野における一般的な知識であったことを認めるものとは見なされない。
【０２１６】
参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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