(57)【要約】  本開示は、ペプチドまたは多価ポリペプチドと抗癌剤とを含む医薬組成物に関する。一部の実施形態では、抗癌剤はペプチドまたは多価ポリペプチドにコンジュゲートしている。本開示はまた、ペプチドまたは多価ポリペプチドを使用して、癌を処置するかまたは癌細胞増殖を低減する方法にも関する。一部の態様では、ペプチドまたは多価ポリペプチドは、抗癌剤の有効性、抗癌剤の癌細胞へのターゲティング、または両方を増強する。【選択図】図１Ａ
2021509679.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容される担体、
抗癌剤、および
抗癌剤にコンジュゲートした治療用ペプチドであって、該治療用ペプチドは、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８の配列、または
中心骨格、リンカー配列、および少なくとも２つのアームを有する構築物であって、
各アームが、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８のコア配列からなり、各アームがリンカー配列を介して中心骨格に連結している前記構築物、を含む、
を含む、医薬組成物であって、
式中、
Ｘ１はＨまたはＮであり、
Ｘ２はＰまたはＱであり、
Ｘ３はＳまたはＨであり、
Ｘ４はＨ、Ｔ、またはＬであり、
Ｘ５はＰもしくはＫであるか、または存在せず、
Ｘ６はＲ、Ｌ、もしくはＳであるか、または存在せず、
Ｘ７はＳもしくはＬであるか、または存在せず、
Ｘ８はＧであるか、または存在しない、
前記医薬組成物。
【請求項２】
薬学的に許容される担体、
抗癌剤、および
治療用ペプチドであって、該治療用ペプチドは、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８の配列、または
中心骨格、リンカー配列、および少なくとも２つのアームを有する構築物であって、
各アームが、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８のコア配列からなり、各アームがリンカー配列を介して中心骨格に連結している前記構築物、を含む、
を含む医薬組成物であって、
式中、
Ｘ１はＨまたはＮであり、
Ｘ２はＰまたはＱであり、
Ｘ３はＳまたはＨであり、
Ｘ４はＨ、Ｔ、またはＬであり、
Ｘ５はＰもしくはＫであるか、または存在せず、
Ｘ６はＲ、Ｌ、もしくはＳであるか、または存在せず、
Ｘ７はＳもしくはＬであるか、または存在せず、
Ｘ８はＧであるか、または存在しない、
前記医薬組成物。
【請求項３】
癌細胞増殖を低減する方法であって、細胞を、癌細胞増殖を低減するのに十分な量の請求項１または２に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む前記方法。
【請求項４】
癌の処置を必要とする対象における癌を処置する方法であって、対象に、対象における癌進行を遅らせるのに十分な量の請求項１または２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む前記方法。
【請求項５】
癌細胞増殖を低減する方法であって、
細胞を抗癌剤と接触させるステップ、および
細胞を治療用ペプチドと接触させるステップであって、該治療用ペプチドは、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８の配列、または
中心骨格、リンカー配列、および少なくとも２つのアームを有する構築物であって、
各アームが、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８のコア配列からなり、各アームがリンカー配列を介して中心骨格に連結している前記構築物、を含む、前記ステップ、
を含み、
式中、
Ｘ１はＨまたはＮであり、
Ｘ２はＰまたはＱであり、
Ｘ３はＳまたはＨであり、
Ｘ４はＨ、Ｔ、またはＬであり、
Ｘ５はＰもしくはＫであるか、または存在せず、
Ｘ６はＲ、Ｌ、もしくはＳであるか、または存在せず、
Ｘ７はＳもしくはＬであるか、または存在せず、
Ｘ８はＧであるか、または存在せず、
該抗癌剤および該治療用ペプチドは、癌細胞増殖を低減するのに十分な量である、前記方法。
【請求項６】
癌の処置を必要とする対象における癌を処置する方法であって、
対象に抗癌剤を投与するステップ、および
対象に治療用ペプチドを投与するステップであって、該治療用ペプチドは、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８の配列、または
中心骨格、リンカー配列、および少なくとも２つのアームを有する構築物であって、
各アームが、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８のコア配列からなり、各アームがリンカー配列を介して中心骨格に連結している前記構築物、を含む、前記ステップ、
を含み、
式中、
Ｘ１はＨまたはＮであり、
Ｘ２はＰまたはＱであり、
Ｘ３はＳまたはＨであり、
Ｘ４はＨ、Ｔ、またはＬであり、
Ｘ５はＰもしくはＫであるか、または存在せず、
Ｘ６はＲ、Ｌ、もしくはＳであるか、または存在せず、
Ｘ７はＳもしくはＬであるか、または存在せず、
Ｘ８はＧであるか、または存在せず、
該抗癌剤および該治療用ペプチドは、対象における癌進行を遅らせるのに十分な量である、前記方法。
【請求項７】
Ｘ１がＮである、Ｘ２がＱである、Ｘ３がＨである、Ｘ４がＴである、Ｘ５がＰである、かつ／またはＸ６がＲである、請求項１もしくは２に記載の医薬組成物、または請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのコア配列がＮＱＨＴＰＲ（配列番号１）を含む、請求項１もしくは２に記載の医薬組成物、または請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
構築物がトリリジン中心骨格および４つのアームを含み、少なくとも１つのリンカー配列が、ＧＧＧＳ（配列番号３）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４）、ＳＳＳＳ（配列番号５）、およびＳＳＳＳＳＳＳＳ（配列番号６）からなる群から選択される、請求項１、２、７、および８のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドおよびＣａ２＋依存性レクチン型受容体ファミリーメンバー１０Ａ（ＣＬＥＣ１０Ａ）が、−３５ｋＪ／ｍｏｌより高い結合エネルギー（ΔＧ’）を有する、請求項１、２、および７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドおよびＣａ２＋依存性レクチン型受容体ファミリーメンバー１０Ａ（ＣＬＥＣ１０Ａ）が、０．０１から０．２μＭの平衡解離定数（ＫＤ）を有する、請求項１、２、および７から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドが、Ｃａ２＋依存性レクチン型受容体ファミリーメンバー１０Ａ（ＣＬＥＣ１０Ａ）の細胞へのエンドサイトーシスを惹起するのに十分な量である、請求項１、２、および７から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドが、腹腔免疫細胞集団を増加させるのに十分な量である、請求項１、２、および７から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
腹腔免疫細胞が、ＣＤ３を発現するＴ細胞；ＣＤ３、ＮＫ１．１、およびＣＤ６９を発現する活性化ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞；ＣＤ３−、ＮＫ１．１、およびＣＤ６９を発現する活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；ＣＤ４を発現するＴ細胞；ＣＤ４およびＣＤ６９を発現する活性化Ｔ細胞；ＣＤ８を発現する細胞傷害性Ｔ細胞；ＣＤ８およびＣＤ６９を発現する活性化細胞傷害性Ｔ細胞；ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、およびＣＤ８６を発現する成熟活性マクロファージ；ＣＤ１１ｃを発現する樹状細胞（ＤＣ）；ＣＤ１１ｃおよびＣＤ８６を発現する活性化ＤＣ；ＣＤ１９を発現するＢ細胞；ＣＤ１９、ＣＤ７３、ＣＤ８０、およびＣＤ２７３を発現するメモリーＢ細胞；ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物または方法。
【請求項１５】
腹腔免疫細胞が、ＣＤ３を発現するＴ細胞；ＣＤ３、ＮＫ１．１、およびＣＤ６９を発現する活性化ＮＫＴ細胞；ＣＤ４を発現するＴ細胞；ＣＤ８を発現する細胞傷害性Ｔ細胞；ＣＤ１１ｃを発現するＤＣ；ＣＤ１１ｃおよびＣＤ８６を発現する活性化ＤＣ；ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物または方法。
【請求項１６】
ペプチドが、ＩＦＮ−γの放出を誘導するのに十分な量である、請求項１、２、および７から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
抗癌剤が、化学療法薬、癌免疫療法薬、光増感薬、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１、２、および７から１６のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
化学療法薬が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、抗ウイルス薬、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物または方法。
【請求項１９】
アルキル化剤が、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、マイトマイシンＣ（ＭＴＣ）、およびテモゾロミドからなる群から選択され、代謝拮抗剤が、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、ゲムシタビン（ｄＦｄＣ）、ヒドロキシ尿素（ＨＵ）、およびメトトレキセート（ＭＴＸ）からなる群から選択され、抗腫瘍抗生物質が、ブレオマイシン、ダクチノマイシン（ｃｏｓｍｅｇｅｎ）、およびダウノルビシン（ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ、ルビドマイシン）からなる群から選択され、抗ウイルス薬が、アシクロビル（Ａｃｙ）、ホスカルネット（ＦＯＳ）、およびガンシクロビル（ｇａｎ）からなる群から選択され、有糸分裂阻害剤が、デメコルシン、ドセタキセル（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、エリブリン（ｈａｌａｖｅｎ）、イクサベピロン（ｉｘｅｍｐｒａ）、パクリタキセル（ｔａｘｏｌ）、およびビンブラスチンからなる群から選択され、トポイソメラーゼ阻害剤が、カンプトテシン（ＣＰＴ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、イリノテカン（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、およびトポテカン（ｈｙｃａｍｔｉｎ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物または方法。
【請求項２０】
癌免疫療法薬が、細胞免疫療法薬、抗体療法薬、サイトカイン療法薬、およびポリサッカライドＫからなる群から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物または方法。
【請求項２１】
細胞免疫療法薬が、シプロイセル−Ｔ（ｐｒｏｖｅｎｇｅ）、チサゲンレクロイセル（ｋｙｍｒｉａｈ）、およびアキシカブタゲンシロロイセル（ｙｅｓｃａｒｔａ）からなる群から選択され、抗体療法薬が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＰＤ−Ｌ２抗体からなる群から選択され、サイトカイン療法薬が、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、およびＩＬ−２からなる群から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物または方法。
【請求項２２】
抗ＣＤ２０抗体が、オファツムマブ（ａｒｚｅｒｒａ）、およびリツキシマブ（ｒｉｔｕｘａｎ、ｍａｂｔｈｅｒａ）からなる群から選択され、抗ＣＤ５２抗体が、アレムツズマブ（ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）であり、抗ＰＤ−１抗体が、ニボルマブ（ｏｐｄｉｖｏ）、およびペムブロリズマブ（ｋｅｙｔｒｕｄａ）からなる群から選択され、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ（ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（ｂａｖｅｎｃｉｏ）、およびデュルバルマブ（ｉｍｆｉｎｚｉ）からなる群から選択され、抗ＣＴＬＡ−４抗体が、イピリムマブ（ｙｅｒｖｏｙ）である、請求項２１に記載の医薬組成物または方法。
【請求項２３】
抗癌剤が、ＳＴＩＮＧリガンド、化学療法薬、および光線力学療法薬からなる群から選択される、請求項１および７から２２のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
抗癌剤が、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、５，６−ジメチルキサンテノン−酢酸（ＤＭＸＡＡ））、ドキソルビシン、クロリンｐ６、またはそれらの組合せを含む、請求項２３に記載の医薬組成物または方法。
【請求項２５】
抗癌剤が環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を含む、請求項２４に記載の医薬組成物または方法。
【請求項２６】
ペプチドと抗癌剤が、化学的コンジュゲーションまたは酵素によるコンジュゲーションによってコンジュゲートしている、請求項１および７から２５のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
化学的コンジュゲーションが、リジンアミドカップリング、またはシステインをベースとするコンジュゲーションを含み、酵素によるコンジュゲーションが、ソルターゼを使用するペプチド転移、微生物のトランスグルタミナーゼを使用するペプチド転移、またはＮ−グリカン操作を含む、請求項２６に記載の医薬組成物または方法。
【請求項２８】
治療用ペプチドが、活性化カルボン酸エステルを含むリンカーを介して抗癌剤にコンジュゲートしている、請求項１および７から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ペプチドがＣ末端システインをさらに含み、抗癌剤がスルフヒドリル（−ＳＨ）基またはヨード基を含み、システインが−ＳＨ基またはヨード基にコンジュゲートしている、請求項１および７から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ペプチドがＣ末端カルボキシル基をさらに含み、抗癌剤がアミノ基を含み、ペプチドと抗癌剤がカルボジイミド誘導体によりコンジュゲートしている、請求項１および７から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ペプチドがＣ末端アミノ基をさらに含み、抗癌剤が無水物基またはカルボキシル基を含み、ペプチドと抗癌剤がカルボジイミド誘導体によりコンジュゲートしている、請求項１および７から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ペプチドと抗癌剤がビオチン−アビジンにより連結している、請求項１および７から２７のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
抗癌剤とペプチドが、１０：１から１２：１の間の平均モル比を有する、請求項１、２、および７から３２のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項３から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
癌細胞が、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＡＳＧＰＲ−１、ＣＬＥＣ４Ｆ、またはそれらの組合せを発現する、請求項３から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
癌が腹膜癌である、請求項３から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、肝細胞癌腫、カポジ肉腫、肺癌、リンパ腫、悪性黒色腫、黒色腫、中皮腫、転移性黒色腫肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌、および扁平上皮肺癌からなる群から選択される、請求項３から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
癌が卵巣癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗癌剤の投与が、ペプチドの投与の少なくとも１日前に行われる、請求項４および６から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
抗癌剤の投与が、ペプチドの投与の少なくとも３０日前に行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ペプチドの量が、対象の体重１ｋｇ当たり１ｎｍｏｌから１，０００ｎｍｏｌの範囲内である、請求項４および６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
対象がヒトである、請求項４および６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ペプチドが対象において抗原性ではない、請求項４および６から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
治療用ペプチドが、ＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲ（配列番号２）の配列、または中心骨格、リンカー配列、および少なくとも２つのアームを有する構築物であって、少なくとも１つのアームがＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲ（配列番号２）を含み、各アームがリンカー配列を介して中心骨格に連結している、前記構築物を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
抗癌剤が環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を含み、治療用ペプチドが、中心骨格、リンカー配列、および４つのアームを有する構築物であって、各アームが、ＮＱＨＴＰＲ（配列番号１）のコア配列からなり、リンカー配列を介して中心骨格に連結している、前記構築物を含み、治療用ペプチドとＣＤＮがリンカーを介してコンジュゲートしている、請求項３に記載の方法。
【請求項４５】
抗癌剤が環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を含み、治療用ペプチドが、中心骨格、リンカー配列、および４つのアームを有する構築物であって、各アームが、ＮＱＨＴＰＲ（配列番号１）のコア配列からなり、リンカー配列を介して中心骨格に連結している、前記構築物を含み、治療用ペプチドとＣＤＮがリンカーを介してコンジュゲートしている、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１８年１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６１４，９５６号、および２０１８年７月１７日に出願された同第６２／６９９，３４５号の利益を主張する。これらのそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子出願された文書の参照による組込み
[0002]本明細書と同時に提出され、以下のように同定されるコンピュータ可読のアミノ酸配列表は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる：２０１９年１月３日に作成された「Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ」という名称の１つの１，４７９バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【０００３】
[0003]本発明は、治療用ペプチドを含む組成物、および癌の処置のための対象への化学療法薬または免疫療法薬と組み合わせたその使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]癌は世界的に、依然として死の主な原因の１つである。癌に対する治療剤を用いた処置は、薬物が全身投与（経口、皮下、または静脈内）されて、健康な細胞に対して負の効果を発揮するため、著しいレベルの毒性を伴うことが多い。毒性を軽減する試みは、少なくとも腫瘍が触知可能である場合には、薬物を腫瘍に直接注射することを必要とする。癌には、孤立性腫瘍を生成しないものも、より播種性のものも、後期ステージにおいて他の部位に転移しているものもある。したがって、癌細胞が体内のどこで生じようと、癌細胞を選択的に標的とする必要がある。加えて、毒性を低減し費用を削減するために、抗癌剤がはるかに低い濃度で送達され、かつ腫瘍中に効率的に蓄積され得るように、エンドサイトーシスを増強する必要がある。
【０００５】
[0005]癌治療における別の主要な欠点は、薬物耐性である。例えば、パクリタキセルは現在、微小管を安定化させ、細胞を細胞周期のＧ２／Ｍ境界期で停止させることによって作用する化学療法薬として使用されている［９５、９６］。細胞分裂の阻害は腫瘍の成長を妨げるが、薬物の効力は、薬物が体から排出されるにつれて徐々に消失する。パクリタキセルは多くの場合、ＤＮＡに結合して複製を阻止するプラチナ系薬物と組み合わされる［９７、９８］。これらの薬物を用いて処置された患者は、著しいレベルの毒性を経験する。反復投薬は多くの場合、薬物への耐性をもたらす。全てではないにしても、大半の癌療法は、通例異なる様式を有する２種以上の薬物の組合せの使用から恩恵を受ける（例えば［１３９］）。したがって、パクリタキセルまたは他の抗癌剤と、毒性を付加しない薬物とを組み合わせる必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
[0006]本発明によれば、前述のおよび他の目的および利点は、糖の模倣物であり、効果的な抗癌剤である治療用ペプチドによって達成される。治療用ペプチドは、単独療法として効果的であるが、予期せぬことに、組合せとして別個にまたは一緒に（単一の組成物として）投与される場合、化学療法薬または免疫療法薬等の他の抗癌剤により優れた有効性を与える。さらに、抗癌剤（例えば細胞毒性薬）をペプチドに共有結合によって連結して、そのコンジュゲートを単一の分子として投与することは、抗癌剤を特異的な腫瘍細胞にターゲティングすることに関する特定の利益を付与する。
【０００７】
[0007]本発明のある態様において、本発明は、治療用ペプチド、抗癌剤、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、ペプチドと抗癌剤が、例えばリンカーを介してコンジュゲートしている、医薬組成物を提供する。本発明の別の態様において、本発明は、治療用ペプチド、抗癌剤、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、ペプチドと抗癌剤がコンジュゲートしていない、医薬組成物を提供する。
【０００８】
[0008]本発明の別の態様において、本発明は、癌細胞増殖を低減する方法を提供する。第１の実施形態では、方法は、癌細胞を、癌細胞増殖を低減するのに十分な量の医薬組成物と接触させるステップを含む。特定の一実装形態では、ペプチドと抗癌剤は、例えばリンカーを介してコンジュゲートしている。別の実装形態では、ペプチドと抗癌剤はコンジュゲートしていない。第２の実施形態では、方法は、癌細胞を抗癌剤と接触させるステップ、および細胞を治療用ペプチドと接触させるステップを含み、抗癌剤および治療用ペプチドは、癌細胞増殖を低減するのに十分な量である。
【０００９】
[0009]本発明の別の態様において、本発明は、癌の処置を必要とする対象における癌を処置する方法を提供する。第１の実施形態では、方法は、対象に、対象における癌進行を遅らせるのに十分な量の医薬組成物を投与するステップを含む。一実装形態では、ペプチドと抗癌剤はコンジュゲートしている。別の実装形態では、ペプチドと抗癌剤はコンジュゲートしていない。第２の実施形態では、方法は、対象に抗癌剤を投与するステップ、および対象に治療用ペプチドを投与するステップを含み、抗癌剤および治療用ペプチドは、対象における癌進行を遅らせるのに十分な量である。
【００１０】
[0010]一実施形態では、治療用ペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（式中、Ｘ１はＨまたはＮであり；Ｘ２はＰまたはＱであり；Ｘ３はＳまたはＨであり；Ｘ４はＨ、Ｔ、またはＬであり；Ｘ５はＰもしくはＫであるか、または存在せず；Ｘ６はＲ、Ｌ、もしくはＳであるか、または存在せず；Ｘ７はＳもしくはＬであるか、または存在せず、Ｘ８はＧであるか、または存在しない）の配列を含む。別の実施形態では、治療用ペプチドは、中心骨格、リンカー配列、および少なくとも２つのアームを有する構築物であって、各アームが、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８のコア配列からなり、各アームがリンカー配列を介して中心骨格に連結している（式中、Ｘ１はＨまたはＮであり；Ｘ２はＰまたはＱであり；Ｘ３はＳまたはＨであり；Ｘ４はＨ、Ｔ、またはＬであり；Ｘ５はＰもしくはＫであるか、または存在せず；Ｘ６はＲ、Ｌ、もしくはＳであるか、または存在せず；Ｘ７はＳもしくはＬであるか、または存在せず、Ｘ８はＧであるか、または存在しない）、構築物を含む。さらなる実施形態では、Ｘ１はＮであるか、Ｘ２はＱであるか、Ｘ３はＨであるか、Ｘ４はＴであるか、Ｘ５はＰであるか、Ｘ６はＲであるか、またはそれらの組合せである。一実施形態では、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８はＮＱＨＴＰＲ（配列番号１）である。別の実施形態では、配列またはコア配列はＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲ（配列番号２）である。
【００１１】
[0011]一態様では、治療用ペプチドは、ＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲ（配列番号２）の配列、または中心骨格、リンカー配列、および少なくとも２つのアームを有する構築物であって、少なくともアームがＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲ（配列番号２）を含み、各アームがリンカー配列を介して中心骨格に連結している、構築物を含み、ペプチドと抗癌剤はコンジュゲートしている。特定の実施形態では、ペプチドと抗癌剤はリンカーを介してコンジュゲートしている。
【００１２】
[0012]別の態様では、構築物はトリリジン中心骨格および４つのアームを含み、少なくとも１つのリンカー配列は、ＧＧＧＳ（配列番号３）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４）、ＳＳＳＳ（配列番号５）、およびＳＳＳＳＳＳＳＳ（配列番号６）からなる群から選択される。
【００１３】
[0013]好ましいペプチドは、ＣＬＥＣ１０Ａに対して、−３５ｋＪ／ｍｏｌより高い結合エネルギー（ΔＧ’）、ＣＬＥＣ１０Ａに対して０．０１〜０．２μＭの平衡解離定数（ＫＤ）を有するか、対象において抗原性ではないか、またはそれらの組合せである。好ましくは、ペプチドは、ＣＬＥＣ１０Ａの細胞へのエンドサイトーシスを惹起する、免疫細胞集団を増加させる、腹腔免疫細胞集団を増加させる、ＩＦＮ−γの放出を誘導する、またはそれらの組合せに十分な量である。別の態様では、ペプチドの量は、対象の体重１ｋｇ当たり１ｎｍｏｌ〜１，０００ｎｍｏｌの範囲内である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００１４】
[0014]一実施形態では、抗癌剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、抗ウイルス薬、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学療法薬である。第１の実装形態では、抗癌剤は、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、マイトマイシンＣ（ＭＴＣ）、およびテモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）からなる群から選択されるアルキル化剤である。第２の実装形態では、抗癌剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、ゲムシタビン（ｄＦｄＣ）、ヒドロキシ尿素（ＨＵ）、およびメトトレキセート（ＭＴＸ）からなる群から選択される代謝拮抗剤である。第３の実装形態では、抗癌剤は、ブレオマイシン、ダクチノマイシン（ｃｏｓｍｅｇｅｎ）、およびダウノルビシン（ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ、ルビドマイシン）からなる群から選択される抗腫瘍抗生物質である。第４の実装形態では、抗癌剤は、アシクロビル（Ａｃｙ）、ホスカルネット（ＦＯＳ）、およびガンシクロビル（ｇａｎ）からなる群から選択される抗ウイルス薬である。第５の実装形態では、抗癌剤は、デメコルシン、ドセタキセル（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、エリブリン（ｈａｌａｖｅｎ）、イクサベピロン（ｉｘｅｍｐｒａ）、パクリタキセル（ｔａｘｏｌ）、およびビンブラスチンからなる群から選択される有糸分裂阻害剤である。第６の実装形態では、抗癌剤は、カンプトテシン（ＣＰＴ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、イリノテカン（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、およびトポテカン（ｈｙｃａｍｔｉｎ）からなる群から選択されるトポイソメラーゼ阻害剤である。
【００１５】
[0015]さらに別の実施形態では、抗癌剤は、細胞免疫療法薬、抗体療法薬、サイトカイン療法薬、ポリサッカライドＫ、およびそれらの組合せからなる群から選択される癌免疫療法薬である。第１の実装形態では、抗癌剤は、シプロイセル−Ｔ（ｐｒｏｖｅｎｇｅ）、チサゲンレクロイセル（ｋｙｍｒｉａｈ）、およびアキシカブタゲンシロロイセル（ｙｅｓｃａｒｔａ）からなる群から選択される細胞免疫療法薬である。第２の実装形態では、抗癌剤は、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＰＤ−Ｌ２抗体からなる群から選択される抗体療法薬である。第３の実装形態では、抗癌剤は、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、およびＩＬ−２からなる群から選択されるサイトカイン療法薬である。
【００１６】
[0016]治療用ペプチドにコンジュゲートする例示的な抗癌剤としては、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、５，６−ジメチルキサンテノン−酢酸（ＤＭＸＡＡ））、ドキソルビシン、クロリンｐ６が挙げられる。
【００１７】
[0017]ある特定の実施形態では、ペプチドと抗癌剤は、化学的コンジュゲーションによってコンジュゲートしている。第１の実装形態では、ペプチドと抗癌剤は、リジンアミドカップリングを介してコンジュゲートしている。第２の実装形態では、ペプチドと抗癌剤は、システインをベースとするコンジュゲーションを介してコンジュゲートしている。別の実施形態では、ペプチドと抗癌剤は、酵素によるコンジュゲーションによってコンジュゲートしている。第１の実装形態では、ペプチドと抗癌剤は、ソルターゼを使用するペプチド転移を介してコンジュゲートしている。第２の実装形態では、ペプチドと抗癌剤は、微生物のトランスグルタミナーゼを使用するペプチド転移を介してコンジュゲートしている。第３の実装形態では、ペプチドと抗癌剤は、Ｎ−グリカン操作を介してコンジュゲートしている。別の実施形態では、リンカーは活性化カルボン酸エステルを含有する。
【００１８】
[0018]別の態様では、治療用ペプチドはＣ末端システインをさらに含み、抗癌剤はスルフヒドリル（−ＳＨ）基またはヨード基を含み、システインは−ＳＨ基またはヨード基にコンジュゲートしている。別の態様では、治療用ペプチドはＣ末端カルボキシル基をさらに含み、抗癌剤はアミノ基を含み、ペプチドと抗癌剤はカルボジイミド誘導体によりコンジュゲートしている。別の態様では、治療用ペプチドと抗癌剤はビオチン−アビジンにより連結している。
【００１９】
[0019]さらに別の態様では、抗癌剤とペプチドは１０：１から１２：１の間の平均モル比を有する。
[0020]好ましい例示的な実施形態では、抗癌剤は環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を含み、治療用ペプチドは、中心骨格、リンカー配列、および４つのアームを有する構築物であって、各アームが、ＮＱＨＴＰＲ（配列番号１）のコア配列からなり、リンカー配列を介して中心骨格に連結している、構築物を含み、治療用ペプチドとＣＤＮはリンカーを介してコンジュゲートしている。
【００２０】
[0021]特定の実施形態では、癌は腹膜癌である。さらなる例示的な実施形態では、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、肝細胞癌腫、カポジ肉腫、肺癌、リンパ腫、悪性黒色腫、黒色腫、中皮腫、転移性黒色腫肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌、または扁平上皮肺癌である。
【００２１】
[0022]より詳細には、ある特定の実施形態では、癌細胞は、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＡＳＧＰＲ−１、ＣＬＥＣ４Ｆ、またはそれらの組合せを発現し、抗癌剤の投与は、ペプチドの投与の少なくとも１日、または少なくとも３０日前に行われる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】[0023]図１Ａ〜１Ｃ。（図１Ａ）四価ペプチドｓｖＬ４の構造。（図１Ｂ）ｓｖＬ４のサブセットとして合成されたペプチド。（図１Ｃ）四価ペプチドｓｖ６Ｄの構造。
【図２】[0024]図２。Ｃａ２＋依存性レクチン型受容体ファミリーメンバー１０Ａ（ＣＬＥＣ１０Ａ）およびアシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＰＲ１）に対するｓｖＬ４およびｓｖ６Ｄの結合活性。ｓｖＬ４のサブセットの固相結合アッセイを、組換えヒトＡＳＧＰＲ−１（縞）またはＣＬＥＣ１０Ａ（無地）を用いて実施した。図は４回の独立した実験の代表的なデータを示す。
【図３】[0025]図３Ａ〜３Ｄ。ＧａｌＮＡｃの模倣物としてのｓｖ６Ｄ。（図３Ａ）組換えラットＣＬＥＣ１０ＡおよびヒトＡＳＧＰＲ−１への多価ＧａｌＮＡｃ−ＰＡＡ（ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）の結合の、ｓｖ６Ｄによる阻害。反応混合物は、およそ２００ピコモルのビオチニル化ＧａｌＮｃ−ＰＡＡ、および増加濃度のペプチドを含んだ。図は、３回の独立した実験の平均値を含む。（図３Ｂ）ビオチニル化ｓｖ６ＤまたはＧａｌＮＡｃ−ＰＡＡを、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートした６Ｄ配列（ＮＱＨＴＰＲ）に対して産生されたウサギ抗血清と共にインキュベートした。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて結合が検出された。２回の実験において類似したデータが得られた。（図３Ｃ）ＣＬＥＣ１０ＡおよびＡＳＧＰＲ−１それぞれへのｓｖ６Ｄ（縞）またはｓｖＬ４（無地）の結合の、ＥＧＴＡによる阻害。ＥＧＴＡ（１ｍＭ）を、アッセイに対して指示された最終濃度に添加した。結合したＣＬＥＣ１０Ａの保持を、ビオチニル化抗ＣＬＥＣ１０Ａ（ヤギＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とのインキュベーション、およびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いた検出によって決定した（薄い灰色の円）。３回の実験において類似したデータが得られた。（図３Ｄ）アッセイにおけるペプチドの濃度の関数としての、ヒト組換えＣＬＥＣ１０ＡおよびＡＳＧＰＲ−１へのｓｖＬ４およびｓｖ６Ｄの結合。図は、４つの別個のアッセイを表す。これらのデータの逆数プロットからのＫＤ値±Ｓ．Ｄ．は本明細書に提供される。
【図４】[0026]図４Ａ〜４Ｃ。ｓｖ６Ｄの受容体へのドッキング。（図４Ａ）ｓｖ６Ｄ（ＮＱＨＴＰＲＧＧ）を含むアームの、ＡＳＧＰＲ−１の炭水化物認識ドメイン（受託番号１ＤＶ８）への、ＣＡＢＳ−ｄｏｃｋを用いたｉｎ  ｓｉｌｉｃｏドッキング（ＲＭＳＤ＝０．７６１１Å）［１０５］。ペプチドは、空間充填分子構造を描写する赤い陰影で囲まれている。（図４Ｂ）ＡｒｇｕｓＬａｂ  ４．０．１において表示された（図４Ａ）の構造（予測結合エネルギーΔＧ’＝−４０ｋＪ／ｍｏｌ）。ペプチドと相互作用する結合部位におけるアミノ酸は、黄色で空間充填構造として着色される。ｓｖ６Ｄは、炭素を灰色、窒素を青色、酸素を赤色で着色される。ＧａｌＮＡｃの特異性を決定するＱＰＤ配列の位置を示す。（図４Ｃ）ＣＬＥＣ１０Ａの構造を、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ  Ｄｅｅｐ  Ｖｉｅｗ［１０６、１０７］を用いて、ＡＳＰＧＲ−１の構造から生成した。ドッキングを、ＣＡＢＳ−ｄｏｃｋを用いてモデル化し（ＲＭＳＤ＝１．４２１Å）、ＡｒｇｕｓＬａｂ  ４．０．１にダウンロードした（予測結合エネルギーΔＧ’＝−３８ｋＪ／ｍｏｌ）。結合部位およびペプチドは（図４Ｂ）と同様に着色する。タンパク質のヘリックス構造およびベータ鎖二次構造は、着色されたリボンとして示す。
【図５】[0027]図５Ａ〜５Ｂ。混合白血球反応。５×１０３個のヒト単球由来未熟樹状細胞と、１×１０５個の負の選択を受けるＣＤ３＋Ｔ細胞との同種異系混合物を、様々な濃度のｓｖ６Ｄと共にインキュベートした。（図５Ａ）培養５日後における、ＩＦＮ−γの放出に対する培地中のｓｖ６Ｄの濃度の効果。図は、一元配置分散分析によって分析した、３回繰り返した実験の結果を示し、１０ｎＭ  ｓｖ６Ｄにおいてρ＝０．００６４である。（図５Ｂ）ＰＢＳとの対照インキュベーションと比較した、（図５Ａ）における１０ｎＭ  ｓｖ６Ｄと共にインキュベートした培養の培地におけるＩＦＮ−γの出現の時間経過。
【図６】[0028]図６。ペプチドに媒介されるＣＬＥＣ１０Ａの内部移行。ＣＬＥＣ１０Ａのエンドサイトーシスは、Ｃａ２＋を細胞質基質へ輸送するための機構であり、Ｃａ２＋−カルモジュリンを介してカルシウム依存性ホスファターゼおよびキナーゼを活性化させる。末梢血単核細胞を、室温で３０分間、Ｆｌｕｏ−４  ＡＭと共に暗所にてインキュベートした。次いで、細胞に４８０ｎｍの光を２分間照射した後、ｓｖ６Ｄを１０ｎＭになるまで添加した。蛍光を５１０ｎｍでモニタリングした。エステル化Ｆｌｕｏ−４  ＡＭは、細胞質基質において加水分解し、Ｃａ２＋との蛍光キレートを形成する。
【図７−１】[0029]図７Ａ〜７Ｄ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける腹膜細胞の増大。マウスに１ｎｍｏｌ／ｇ体重の用量でｓｖＬ４、ｓｖ６Ｄ、またはｓｖＣ１を皮下注射した。腹膜洗浄において回収した各集団の細胞は、細胞数（千単位）として表す。各処置群の３匹のマウスからの細胞を分析のためにプールした。各集団の細胞の数を、全ての群からの総細胞の平均回収に対して正規化した。各細胞型に関して、左側、中央、および右側の棒のセットはそれぞれ、ｓｖＬ４、ｓｖ６Ｄ、またはｓｖＣ１を用いて処置したマウスからの試料を表す。マウスに、０、２、および４日目に注射し、細胞を各注射の２４時間後に収集した。１日目は白抜きの棒、３日目は灰色の棒、５日目は黒色の棒である。活性化マーカーを発現する集団はアスタリスクによって示す。
【図７−２】[0029]図７Ａ〜７Ｄ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける腹膜細胞の増大。マウスに１ｎｍｏｌ／ｇ体重の用量でｓｖＬ４、ｓｖ６Ｄ、またはｓｖＣ１を皮下注射した。腹膜洗浄において回収した各集団の細胞は、細胞数（千単位）として表す。各処置群の３匹のマウスからの細胞を分析のためにプールした。各集団の細胞の数を、全ての群からの総細胞の平均回収に対して正規化した。各細胞型に関して、左側、中央、および右側の棒のセットはそれぞれ、ｓｖＬ４、ｓｖ６Ｄ、またはｓｖＣ１を用いて処置したマウスからの試料を表す。マウスに、０、２、および４日目に注射し、細胞を各注射の２４時間後に収集した。１日目は白抜きの棒、３日目は灰色の棒、５日目は黒色の棒である。活性化マーカーを発現する集団はアスタリスクによって示す。
【図７−３】[0029]図７Ａ〜７Ｄ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける腹膜細胞の増大。マウスに１ｎｍｏｌ／ｇ体重の用量でｓｖＬ４、ｓｖ６Ｄ、またはｓｖＣ１を皮下注射した。腹膜洗浄において回収した各集団の細胞は、細胞数（千単位）として表す。各処置群の３匹のマウスからの細胞を分析のためにプールした。各集団の細胞の数を、全ての群からの総細胞の平均回収に対して正規化した。各細胞型に関して、左側、中央、および右側の棒のセットはそれぞれ、ｓｖＬ４、ｓｖ６Ｄ、またはｓｖＣ１を用いて処置したマウスからの試料を表す。マウスに、０、２、および４日目に注射し、細胞を各注射の２４時間後に収集した。１日目は白抜きの棒、３日目は灰色の棒、５日目は黒色の棒である。活性化マーカーを発現する集団はアスタリスクによって示す。
【図７−４】[0029]図７Ａ〜７Ｄ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける腹膜細胞の増大。マウスに１ｎｍｏｌ／ｇ体重の用量でｓｖＬ４、ｓｖ６Ｄ、またはｓｖＣ１を皮下注射した。腹膜洗浄において回収した各集団の細胞は、細胞数（千単位）として表す。各処置群の３匹のマウスからの細胞を分析のためにプールした。各集団の細胞の数を、全ての群からの総細胞の平均回収に対して正規化した。各細胞型に関して、左側、中央、および右側の棒のセットはそれぞれ、ｓｖＬ４、ｓｖ６Ｄ、またはｓｖＣ１を用いて処置したマウスからの試料を表す。マウスに、０、２、および４日目に注射し、細胞を各注射の２４時間後に収集した。１日目は白抜きの棒、３日目は灰色の棒、５日目は黒色の棒である。活性化マーカーを発現する集団はアスタリスクによって示す。
【図８−１】[0030]図８Ａ〜８Ｃ。ｓｖ６Ｄとパクリタキセルとの組合せ研究。（図８Ａ）雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＩＤ８卵巣癌細胞株を移植した。この実験において、疾患の進行は急速であり、生存中央値は６５日であった。ｓｖ６Ｄ（０．１ｎｍｏｌ／ｇ）または３腹腔内用量（４５、４７、および４９日目）のクレモホール中１８μｇ／ｇのパクリタキセルを用いた隔日の皮下処置の２週間後の５８日目に測定したマウスの体重を示す。適用可能な場合に不等分散のウェルチ補正を用いるｔ検定によるこれらのデータの分析は、ｓｖ６Ｄ対ＰＢＳまたは無処置ではρ＜０．０５、パクリタキセル対ＰＢＳまたは無処置ではρ＜０．０５を示した。パクリタキセルの効果とｓｖ６Ｄの効果との間に統計的な差はなかった。（図８Ｂ）ｓｖ６Ｄの隔日の注射を、ペプチド単独では５０日目に、それ以前に４５から４９日目の間にパクリタキセルを用いて処置したマウスに対しては１００日目に開始した。図は、１２１日目のマウスの重量を示す。ｔ検定によるデータセットの分析は、パクリタキセル対ＰＢＳではρ＜０．０５、パクリタキセル対ｓｖ６Ｄでは差はなく、パクリタキセル対パクリタキセル＋ｓｖ６Ｄではρ＜０．０５を示した。（図８Ｃ）パクリタキセル、ｓｖ６Ｄ、またはパクリタキセル処置の５０日後にｓｖ６Ｄの隔日の皮下注射を開始したそれら２種の組合せを用いて処置したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示すグラフである。マンテル・コックスのログランク検定、ｐ（ｓｖ６Ｄ／パクリタキセル対ＰＢＳ）＜０．０００１。
【図８−２】[0030]図８Ａ〜８Ｃ。ｓｖ６Ｄとパクリタキセルとの組合せ研究。（図８Ａ）雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＩＤ８卵巣癌細胞株を移植した。この実験において、疾患の進行は急速であり、生存中央値は６５日であった。ｓｖ６Ｄ（０．１ｎｍｏｌ／ｇ）または３腹腔内用量（４５、４７、および４９日目）のクレモホール中１８μｇ／ｇのパクリタキセルを用いた隔日の皮下処置の２週間後の５８日目に測定したマウスの体重を示す。適用可能な場合に不等分散のウェルチ補正を用いるｔ検定によるこれらのデータの分析は、ｓｖ６Ｄ対ＰＢＳまたは無処置ではρ＜０．０５、パクリタキセル対ＰＢＳまたは無処置ではρ＜０．０５を示した。パクリタキセルの効果とｓｖ６Ｄの効果との間に統計的な差はなかった。（図８Ｂ）ｓｖ６Ｄの隔日の注射を、ペプチド単独では５０日目に、それ以前に４５から４９日目の間にパクリタキセルを用いて処置したマウスに対しては１００日目に開始した。図は、１２１日目のマウスの重量を示す。ｔ検定によるデータセットの分析は、パクリタキセル対ＰＢＳではρ＜０．０５、パクリタキセル対ｓｖ６Ｄでは差はなく、パクリタキセル対パクリタキセル＋ｓｖ６Ｄではρ＜０．０５を示した。（図８Ｃ）パクリタキセル、ｓｖ６Ｄ、またはパクリタキセル処置の５０日後にｓｖ６Ｄの隔日の皮下注射を開始したそれら２種の組合せを用いて処置したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示すグラフである。マンテル・コックスのログランク検定、ｐ（ｓｖ６Ｄ／パクリタキセル対ＰＢＳ）＜０．０００１。
【図９】[0031]図９Ａ〜９Ｂ。ｓｖ６Ｄと抗ＰＤ−１との組合せ研究。（図９Ａ）実験の設計と、卵巣癌細胞株ＩＤ８、ならびに抗ＰＤ−１およびｓｖ６Ｄを用いた処置を移植したＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存の延長。抗ＰＤ−１（ラット抗マウス、クローン２９Ｆ．１Ａ１２）は、１用量当たり２００μｇのタンパク質で４１から４９日目の間に１日おきに腹腔内投与した（白色の棒）。ｓｖ６Ｄは、０．１ｎｍｏｌ／ｇで３６、５１、または８７日目から１日おきに皮下投与した（灰色の棒）。生存データをマンテル・コックスのログランク検定によって分析してρ値を決定した。（図９Ｂ）抗ＰＤ−１および／またはｓｖ６Ｄを用いて処置したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。図は、群１、３、６、および８の生存を示す。群３に関して、マンテル・コックスのログランク検定のｐ＝０．００３は、組合せを用いた処置と抗体単独を用いた処置との間の有意性を示す。抗ＰＤ−１は四角、ｓｖ６Ｄは濃い三角、抗ＰＤ−１に続くｓｖ６Ｄ（図９Ａの群３）は薄い三角、ＰＢＳは円である。
【図１０】[0032]図１０。ｓｖＬ４およびｓｖ６Ｄの抗原性に関する試験。ウサギにおいて、ｓｖＬ４またはｓｖ６Ｄの配列のＫＬＨコンジュゲートに対する抗血清を生成し、１：１０に希釈した。マウス血清を、３か月にわたるｓｖＬ４の隔日の注射後に収集し、ＰＢＳで１：１に希釈し、プロテインＡ／Ｇでコートしたウェルに添加した。ビオチニル化ｓｖＬ４またはｓｖ６Ｄをウェルに添加し、結合したペプチドを、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて検出した。図は、別個にアッセイした各群の８匹の処置マウスからの血清の平均値を含む。
【図１１−１】[0033]図１１Ａ〜１１Ｂ。ｓｖ６Ｄ−抗原コンジュゲートによるＴ細胞の活性化。Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのｓｖ６Ｄまたはｓｖ６Ｄ−ＭＯＧ（ＭＯＧ＝ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質３５−５５）の週１回の注射後のＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ曝露時のＩＦＮ−γ産生（図１１Ａ）およびＩＬ−２産生（図１１Ｂ）。２回目の注射の１週間後、脾臓および右鼠径リンパ節組織を組み合わせ、均質化して、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を単離させ、これらの細胞を非Ｔ細胞抗原提示細胞と混合し、ＰＢＳ、ｓｖ６Ｄ、またはｓｖ６Ｄ−ＭＯＧと共に７２時間インキュベートした。ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）およびＩ（イオノマイシン）を陽性対照として追加した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ｓｖ６Ｄによって媒介されて樹状細胞の細胞質基質に至った抗原の交差提示を示した。
【図１１−２】[0033]図１１Ａ〜１１Ｂ。ｓｖ６Ｄ−抗原コンジュゲートによるＴ細胞の活性化。Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのｓｖ６Ｄまたはｓｖ６Ｄ−ＭＯＧ（ＭＯＧ＝ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質３５−５５）の週１回の注射後のＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ曝露時のＩＦＮ−γ産生（図１１Ａ）およびＩＬ−２産生（図１１Ｂ）。２回目の注射の１週間後、脾臓および右鼠径リンパ節組織を組み合わせ、均質化して、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を単離させ、これらの細胞を非Ｔ細胞抗原提示細胞と混合し、ＰＢＳ、ｓｖ６Ｄ、またはｓｖ６Ｄ−ＭＯＧと共に７２時間インキュベートした。ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）およびＩ（イオノマイシン）を陽性対照として追加した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ｓｖ６Ｄによって媒介されて樹状細胞の細胞質基質に至った抗原の交差提示を示した。
【図１２】[0034]図１２Ａ〜１２Ｂ。環状ジヌクレオチドとのコンジュゲーション。（図１２Ａ）環状ジヌクレオチドｃ［Ｇ（２’，５’）ｐ−２’−ＡＨＣ−Ａ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＮ、ＡＨＣ＝６−アミノヘキシルカルバモイル）を、カルボジイミド反応によってＮ−アセチル化ｓｖ６Ｄにコンジュゲートした。（図１２Ｂ）コンジュゲートは、はるかに低い濃度で活性化因子を送達する。１型ＩＦＮ経路の活性化を検出するように操作されたヒトＴＨＰ１単球（ＴＨＰ１−ＤｕａｌＴＭ細胞、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ペプチドＣＤＮコンジュゲートを添加した後、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地においてｓｖ６Ｄと共に２０時間インキュベートした。培地を回収し、次いでルシフェラーゼ検出試薬（Ｑｕａｎｔｉ−ＬｕｃＴＭ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）と共にインキュベートして、ＳＴＩＮＧ経路の活性化に応答して分泌されたルシフェラーゼをアッセイした。光子を、分光蛍光光度計を用いて検出した。コンジュゲートは、環状ジヌクレオチド単独よりも２桁超効果的であった。コンジュゲートは、ＣＬＥＣ１０Ａを発現し、それゆえに腫瘍微小環境内にＩＦＮ−βを産生し得る、Ｍ２マクロファージおよび腫瘍細胞を標的とする。ＳＴＩＮＧタンパク質は約５μＭのＫＤでＣＤＮを結合し［１０８、１０９］、それゆえにコンジュゲートは、はるかに低い濃度で活性化因子を送達する。
【図１３】[0035]図１３。ドキソルビシンとのコンジュゲーション。Ｎ−アセチル化ｓｖ６Ｄとドキソルビシンを、グルタルアルデヒドとの反応によってカップリングさせた。反応をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５ゲルろ過カラムに通し、これは遊離ドキソルビシンを保持したが、ペプチドと薬物との共溶出によって示されるように、コンジュゲートを通過させた。
【図１４】[0036]図１４Ａ〜１４Ｂ。光感受性クロリンとのコンジュゲーション。（図１４Ａ）ｓｖ６ＤのＮ−アセチル化誘導体のＣ末端アミン基は、プルプリン−１８の無水物基と反応して、クロリンｐ６を連結する。（図１４Ｂ）（左）エタノール中のコンジュゲーションの生成物の蛍光スペクトル、および（右）エタノール中の本来のプルプリン−１８試料の蛍光スペクトル。コンジュゲートは、腫瘍に注射されて赤色光に曝露された場合、腫瘍細胞を選択的に死滅させ得る。
【図１５】[0037]図１５。ｓｖＬ４と、マウスＳＴＩＮＧのリガンドであるＤＭＸＡＡ（５，６−ジメチルキサンテノン−酢酸）との間のコンジュゲーション。ＤＭＸＡＡは、遊離カルボン酸基を含有する化合物の一例として示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
[0038]本明細書に記載される技術は、免疫系の刺激を提供し、さらに、癌細胞による受容体ＣＬＥＣ１０Ａの発現によって癌細胞の標的化を直接可能にする。
[0039]樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージは、強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を達成する。Ｔ細胞活性化は、ＤＣのＭＨＣクラスＩ複合体からＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原特異的受容体（ＴＣＲ）への、および／またはＭＨＣクラスＩＩ複合体からＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異的ＴＣＲへの抗原の提示を伴う［１］。Ｔ細胞の持続可能な活性化は、ＤＣによって提示される２つのシグナルを必要とし、１つは相補的な抗原特異的Ｔ細胞を活性化する抗原そのものであり、もう１つは、抗原が非自己であり破壊されるべきであることを保証する共刺激シグナルである。第２のシグナルは、Ｔ細胞の生存および活性を持続させるために必要とされ、いくつかの因子、例えばＤＣの共刺激受容体（すなわち、ＣＤ４０、ＣＤ８０／８６）、または共阻害因子に対する抗体（すなわち、抗ＰＤ−１もしくは抗ＣＴＬＡ−４）によって提供され得る［２、３］。疾患状態に起因する因子が必要なシグナルを提供する場合もあるが、これは後期エンドソーム／リソソーム区画内の内部受容体による食作用および認識の結果である。特に、ウイルスの食作用および分解は、ＴＬＲ９によって認識されるＣｐＧ配列において豊富なオリゴヌクレオチド断片を生成し、ＩＦＮαおよびＩＦＮβ等の１型インターフェロンの放出を最終的にもたらすシグナルを開始する［４、５］。加えて、ウイルス感染により生じ得るような、細胞の細胞質基質における外来核酸の出現は、ＳＴＩＮＧ経路を惹起し、これもまた結果としてＩ型インターフェロン産生をもたらす（下記を参照のこと）。しかし、癌細胞もまた、抑制シグナルを放出し、免疫系を逃れることができる。
【００２４】
免疫療法の標的としてのＣＬＥＣ１０Ａ
[0040]ペプチドは特有な形で免疫療法に適合する。ペプチドは、設計に柔軟性があり、容易に大規模に合成され、水溶性で、比較的安定である。ワクチンとしての使用は長期にわたり成功を収めてきた歴史を有するが、高いアビディティでレクチン型受容体に選択的に結合するペプチドもまた設計されている［１〜３、およびそれらの参照文献］。受容体に媒介される免疫療法におけるペプチドの使用は、ペプチドが、炭水化物リガンドを模倣し、内因性リガンドよりも桁違いに大きいアビディティで、免疫系の細胞によって発現される細胞表面の制御性レクチン型受容体に結合する能力に基づいている。多価リガンドと多量体受容体との相互作用は、結合アビディティの劇的な増加をもたらし、最大半量結合濃度を低ナノモル範囲に減少させる。
【００２５】
[0041]一部の効果的な抗癌療法は、異なる細胞型に作用する補完薬を併用する。例えば、現在普及している免疫療法薬は、Ｔ細胞の阻害性受容体、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム死−１（ＰＤ−１）受容体、または多くの癌細胞に発現するＰＤ−１受容体のリガンドであるＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻止する抗体である。抗体に対する戦略的補完は、糖鎖模倣ペプチドを用いて樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージを活性化する能力である。Ｃ型（Ｃａ２＋依存性）レクチン（ＣＬＥＣ）の、これらのペプチドの標的としての可能性は、免疫系の戦略的要にて細胞におけるＣ型レクチン受容体の発現、ならびに自然および獲得免疫系の増大を促進するペプチドの能力に依存する［４、５］。
【００２６】
[0042]ＣＬＥＣ１０Ａ（ＣＤ３０１）は、癌の免疫療法に関して戦略上重要なエンドサイトーシス受容体である［６〜８］。ＣＬＥＣ１０Ａは、免疫系の上流で機能するＤＣによって発現される。Ｃ型レクチン受容体は糖リガンドを結合するためにＣａ２＋を必要とし、これにより結合部位の正確な構造と、糖水酸基との配位結合との両方を達成する［９〜１２］。ＣＬＥＣ１０Ａ（マクロファージガラクトース型レクチン、ＭＧＬとも称される）は、真皮ＤＣ、未熟末梢ＤＣ、選択的活性化Ｍ２ａマクロファージ、および他の組織に発現する［６、７、１３〜１６］。ＣＬＥＣ１０Ａは、エンドサイトーシス受容体であり、リガンドをＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ抗原プロセシングおよび提示経路に送達する一方で最も重要な細胞内Ｃａ２＋シグナルを開始する［１７］。Ｃａ２＋およびリガンドは、初期エンドソームにおいて受容体から解離する。リガンドは、Ｔ細胞への提示のためにＭＨＣクラスＩおよびＩＩ経路を介してプロセシングされ、Ｃａ２＋は細胞質基質に移送され、受容体は再利用される［１７、１８］。細胞質基質のＣａ２＋の上昇は、遍在するセカンドメッセンジャーであり［１９、２０］、成熟の刺激、リンパ節への遊走、およびＴ細胞の刺激に関与する［２１、２２］。
【００２７】
[0043]ＣＬＥＣ１０Ａは、末端Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含有する構造に高度に特異的な病原体認識受容体である。細胞膜結合型および分泌型糖タンパク質のＯ−グリコシル化の第１のステップは、ＧａｌＮＡｃをセリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）の水酸基に付着させる最大２０種の別々のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧＡＬＮＴ）のファミリーによって、ゴルジにおいて行われる［２３］。この反応は、より大きなＯ−グリカンの合成、および上皮組織の維持を担う主要な糖タンパク質であるムチンの産生に必須である［２４］。癌腫細胞のほとんど普遍的な特徴は、ＧａｌＮＡｃのみがＳｅｒ／Ｔｈｒに付着している、Ｔｎ抗原として公知の構造である伸長不全（aborted）Ｏ−グリカンの発現である［２５］。１つまたは複数のＴｎ抗原を有する総計９６種の糖タンパク質がヒトＴリンパ芽球細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞株）において同定され、３３種の糖タンパク質がヒト乳腺癌腫細胞（ＭＣＦ７細胞株）において同定された［２６］。Ｔｎ構造の抗原性はマウスにおいて実証され、誘導された抗体は移植した腫瘍細胞株に対する保護を提供した［２７、２８］。ムチン由来ペプチドへの複数のＴｎ抗原の付加は、免疫原性を増強し、これらの糖ペプチドのワクチンとしての使用を促進した［２８〜３２］。腫瘍細胞はまた、ＴＦ抗原（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）も発現する［２５、３３］。ＴｎおよびＴＦ抗原の出現は、典型的な三糖または四糖Ｏ−連結型グリカンの不完全な集合の結果であると考えられているが、近年の証拠は、膜トラフィッキング事象によって駆動される調節経路の変化が癌細胞上により短いグリカンを生じさせることを示唆している［３４］。誰もがこれらの抗原に対する抗体を保有し、これらの抗体は腸内細菌叢に存在し、また癌腫を有する患者は、遅延過敏反応によって示されるように、Ｔｎ／ＴＦ感受性Ｔ細胞を有する［３５、３６］。
【００２８】
[0044]ＣＬＥＣ１０Ａの効率的な会合は、単一のＧａｌＮＡｃ残基よりも桁違いに大きいアビディティを受容体に提供する多価リガンド、例えば９つのＴｎ部分を有するＭＵＣ１タンパク質の断片［７、３２、３７］、または多量体Ｔｎ−ペプチド構造［２８、３８］を必要とする。免疫応答は、ＤＣのＣＬＥＣ１０Ａの三量体によるリガンドの内部移行［３９］、抗原プロセシング、数日にわたる流入領域リンパ節への遊走、およびその後の抗原特異的ナイーブＴ細胞への抗原の提示［４０〜４２］によって開始される。Ｔｎを有する大きな糖タンパク質はエンドリソソーム区画において捕捉される［３２］一方で、より小さな糖ペプチドはＨＬＡＩ／ＨＬＡＩＩ区画においてさらにプロセシングされ［７、３２］、リガンドの構造は細胞応答に影響を及ぼす。
【００２９】
[0045]肝細胞のＩＩ型Ｃ型レクチンアシアロ糖タンパク質受容体−１（ＡＳＧＰＲ−１、アシュウェル・モレル受容体、ＣＬＥＣ４Ｈ１）もまたＧａｌＮＡｃ含有構造を結合する［４３、４４］。ＡＳＧＰＲ−１は、ＧａｌよりもＧａｌＮＡｃに対して６０倍大きい選好性を有する［４５］。健康なラットの各肝細胞は、アシアロ−オロソムコイドの結合部位としての４〜５×１０５個のＡＳＧＰＲ−１の分子［４６］、またはＡＳＧＰＲ−１の標的となる抗体によって決定された１．８×１０６個の分子［４７］を発現し、受容体に関して０．８〜１μＭの表面濃度を提供する。Ｇａｌはアシアロ−オロソムコイドの多価グリカンの末端糖であるが［４８］、そのタンパク質は２〜７×１０−９ＭのＫＤでＡＳＧＰＲ−１を結合する［４６、４９］。結合したグリカンが末端シアル酸を失っている血液タンパク質および細胞はＡＳＧＰＲ−１を結合し、分解のためにリガンドを内部移行する［４４］。他の主要なＧａｌＮＡｃ／Ｇａｌ特異的受容体としては、肝臓のクッパー細胞によって発現されるＩＩ型Ｃ型レクチンＣＬＥＣ４Ｆ［５０］、およびＧａｌに対する選好性を有するスカベンジャーＣ型レクチン受容体［５１］が挙げられる。マウスはＭＧＬの２つの形態、すなわちＧａｌに特異的なＭＧＬ１、およびＧａｌＮＡｃに特異的なＭＧＬ２を発現する［１３］。ヒトＣＬＥＣ１０ＡはマウスＭＧＬ２に類似し、ＧａｌＮＡｃを優先的に結合し、Ｔｎ抗原等の末端ＧａｌＮＡｃ含有残基を認識する［１４］。
【００３０】
[0046]配列のエクソンＢの１３７位および１４０位にＴｎ構造を有する高度にグリコシル化した細胞膜タンパク質ＣＤ４５［２６］が、ＣＬＥＣ１０Ａ／ＭＧＬの内因性リガンドとして同定された［５２］。Ｔｎ抗原は、模倣ペプチドであるｓｖＬ４およびｓｖ６Ｄよりもはるかに低いアビディティで受容体に結合し［３８］、単一の糖を有する完全な糖タンパク質の親和性（ＫＩ≒２３μＭ［５３］）は、ペプチドの親和性よりも桁違いに小さいが、これらの構造体は、競合阻害物質であると考えられる。ＣＤ４５はいくつかのアイソフォームとして発現し、全長タンパク質は細胞外の可変領域にエクソンＡ、Ｂ、およびＣを含有する［５４、５５］。エクソンＢ含有アイソフォームへのＣＬＥＣ１０Ａの結合は、Ｔ細胞活性の減弱化、アポトーシス、および免疫抑制を引き起こす［５２］。しかしながら、Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ４５のより短いアイソフォーム、例えばエクソンＢを欠くＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＡの発現をもたらす［５６〜５９］。ＤＣの成熟はＣＬＥＣ１０Ａの下方制御をもたらし［５２］、活性化ＤＣによるＴ細胞活性化の、ＣＤ４５による阻害を最小限にし得る。
【００３１】
本発明の設計
[0047]ＧａｌＮＡｃを含有するＣＬＥＣ１０Ａの天然リガンドが、低い親和性で結合し、かつ抗原性であることを考慮して、ＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るＧａｌＮＡｃの多価ペプチド模倣物を設計した。ファージディスプレイライブラリのスクリーニングから現れた四価の１２アミノ酸のペプチド配列であるｓｖＬ４は、以前に特性決定された［６０］。ｓｖＬ４を、ｓｖ６Ｄと称される、ｓｖＬ４のＣ末端の６マーの配列を有する四価構造としてさらに洗練した（図１Ｂ〜１Ｃ）。ｓｖ６Ｄは、ｓｖＬ４の結合活性を保持し、より強力な免疫細胞の刺激因子である。ｓｖ６ＤおよびｓｖＬ４は、ＧａｌＮＡｃに特異的なレクチンに高いアビディティで結合する。ＭＨＣ結合データベースを用いたペプチドの配列の分析は［６１、６２］、ペプチドがヒトにおけるＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される可能性も、抗体の産生を誘導する可能性も高くないと予測した。実際、抗体は、３か月にわたる隔日の皮下注射後のマウス血清において検出されなかった。重要なことに、ペプチドの皮下注射は、腹膜腔における免疫細胞の増殖および成熟を刺激した。
【００３２】
[0048]ＣＬＥＣ１０Ａ発現は、骨髄系前駆細胞の分化中に上方制御される［６３］。場合により、これらの細胞に結合するペプチドは、腹膜腔において成熟活性化免疫細胞に分化する細胞の増殖を誘導する。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らのデータは、ｓｖ６ＤおよびｓｖＬ４は真皮ＤＣおよび未熟末梢ＤＣのＣＬＥＣ１０Ａを会合し、細胞の成熟を促進するという仮説を支持する。リンパ組織内でのＴ細胞と成熟ＤＣとの相互作用は、それらの活性化をもたらす。ＤＣは、自然免疫を支持するＮＫ細胞等の他の種類の細胞の活性化をもたらす多方向および相互のクロストークを介した免疫系の制御に不可欠である［６４、６５］。抗癌手法としての効力は、卵巣癌のマウスモデルにおける腹水の蓄積の阻害によって実証されている。例えば、ｓｖ６Ｄは、化学療法薬であるパクリタキセル、さらには免疫療法薬である抗ＰＤ−１の有効性を劇的に増強した（図８Ａ〜８Ｃ、９Ａ〜９Ｂ）。
【００３３】
[0049]ヒト血液ＤＣのレクチン型受容体、およびグリカンのアレイの結合度の分析は、結合したグリカンのうちでは、末端ＧａｌＮＡｃ残基を有するものが顕著であったことを明らかにした［６６］。Ｒａｐｏｐｏｒｔらは、ワクチンをＤＣに送達するための最適なベクターを評価し、ＭＧＬ（ＣＬＥＣ１０Ａ）が有望な標的であると結論した。グリカン−ＰＡＡコンジュゲートを結合することに関するＩＣ５０は、約２０μＭであった［６６］。しかしながら、ｓｖ６Ｄ等の多価ペプチドは、１０ｎＭ付近の濃度で最適な細胞応答を達成する（図５Ｂ）。さらに、予備データは、ｓｖ６ＤがＴ細胞を抗原に対してｉｎ  ｖｉｖｏで効果的に活性化させることを示す。
【００３４】
[0050]ＣＬＥＣ１０Ａの内因性リガンドはＴｎ抗原（ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）であり、これは、上に記載したように、ＣＤ４５のエクソンＢ含有アイソフォームに関する構造を除いて健康な細胞にはほとんど見出されない。しかしながら、Ｔｎ抗原は、癌腫細胞においては高いレベルで発現する［３５、３６、６７］。さらに、多くの癌細胞型がＣＬＥＣ１０Ａを発現するとして同定されている［６８、６９］。悪性黒色腫、膀胱、乳房、腎臓、肺扁平上皮、非小細胞肺、小細胞肺、卵巣、肝細胞癌腫、膵臓、および前立腺の癌細胞は、これらに含まれる。受容体の発現はＲＮＡレベルで検出されており、タンパク質は、発現する場合、一般に細胞表面に出現する。受容体およびリガンドの存在は、腫瘍細胞の接着をもたらす可能性があり、保護機能として働くと期待される。ｓｖ６Ｄ（図１Ｂ〜１Ｃ）等の高アビディティ合成リガンドは、ＣＬＥＣ１０Ａ受容体を結合し、次に細胞と細胞との接着を減少させ、免疫系をＴｎ抗原に感作させ、腫瘍細胞を破壊に関してより好都合にすることができる。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ、Ｍ２）は、免疫抑制シグナルを腫瘍微小環境内に産生する［１５］。高アビディティ合成リガンドは、腫瘍関連マクロファージ（Ｍ２）を修飾するために、すなわちマクロファージをＭ１表現型へ再分極させるか、または抑制性細胞を排除するために使用することもできる。薬物の腫瘍関連細胞へのターゲティングに関する本明細書における発明は、第１に受容体へのｓｖ６Ｄの結合の特異性を確立することに基づく。したがって、本発明が記載するように、薬物を腫瘍細胞に特異的にターゲティングできるということは、癌の処置における前進である。
【００３５】
必須の抗癌サイトカインであるインターフェロン−ベータ
[0051]インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）は、疾患に対する内因性防御機構によって産生される最も重要な抗ウイルスおよび抗癌サイトカインである。ＩＦＮ−βの役割の解明につながる最初の発見は、１９７６年に、哺乳動物細胞のインターフェロン処理が二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の存在下でタンパク質合成の阻害を引き起こすという観察によってなされた［７０］。この知見の直後に、２’−５’オリゴアデニレート（２〜５Ａ）、２〜５Ａ合成酵素（ＯＡＳ）、および潜在性リボヌクレアーゼであるＲＮアーゼＬの発見が続いた［７０〜７２］。これらの役者達は、感染に対する最も重要な細胞の抗ウイルス応答として認識されるようになった［７３、７４］。ＲＮＡ含有ウイルスが細胞質基質において脱外被する場合、ｄｓＲＮＡは、ＡＴＰを２〜５Ａに変換するＯＡＳを活性化させる。ＲＮアーゼＬは、２〜５Ａ結合の際に生じる二量体化によって活性化する。活性化したヌクレアーゼはｄｓＲＮＡを切断し、ウイルスの複製を阻止する。加えて、細胞のＲＮＡもまた分解され、これによりタンパク質合成を阻害し、最終的にアポトーシスを引き起こす［７５］。しかしながら、この過程において、短鎖ＲＮＡ断片は、ＲＮＡヘリカーゼであるＲＩＧ−１およびＭＤＡ５、アダプターであるＩＰＳ−１、ならびに転写因子であるＩＲＦ−３およびＮＦ−κＢを介してＩＦＮ−βの発現を誘導する［７６、７７］。ＩＦＮ−βは感染した細胞によって分泌され、隣接する細胞にて受容体に結合して、ＯＡＳの発現の上方制御をもたらし、近接する細胞のウイルス複製に対する感受性を増強する。感染に対する増強した感受性は、結果としてより急速なアポトーシスを生じ、それによって感染の拡大を阻止する。
【００３６】
[0052]ＲＮアーゼＬ／ＯＡＳ経路は細胞を外来ＲＮＡ、特にウイルスｄｓＲＮＡから保護するが、ｄｓＤＮＡに対する保護は環状ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）合成酵素（ｃＧＡＳ）およびインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）によって提供される［７８〜８０］。ＳＴＩＮＧは、小胞体に関連する、３７９個のアミノ酸からなるタンパク質である。必須の自然免疫制御因子としてのＳＴＩＮＧの最初の報告は２００８年に発表され［８１］、ｃＧＡＳの役割は２０１１年に立証された［８２］。ｄｓＤＮＡは細胞質基質においてｃＧＡＳに結合し、ｃＧＡＳはＧＴＰおよびＡＴＰの存在下でｃＧＡＭＰを合成する。ｃＧＡＭＰの分子は、ＥＲにおけるＳＴＩＮＧの二量体に結合し［８３］、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）との複合体において核周辺領域への再配置を開始する。その後、リン酸化したＴＢＫ１はＩＲＦ３およびＮＦ−κＢをリン酸化し、これらは核内に移動して、１型ＩＦＮおよび炎症性サイトカインの遺伝子を含む免疫遺伝子の転写を活性化する［７９］。ｃＧＡＳによる自然免疫応答は、放射性薬［８４］または化学療法薬のいずれかを介したＤＮＡ損傷によって惹起される可能性が高い。結果として生じるＳＴＩＮＧの活性化および１型インターフェロンの放出は、ＤＣによる成熟および抗原提示を促進する［８０］。腫瘍細胞の食作用もまたＳＴＩＮＧ依存性サイトカイン産生を惹起することができ、ＣＤ８＋  ＣＴＬの活性化、および他の獲得免疫細胞応答を容易にする［７９、８５］。ＳＴＩＮＧ依存性抗腫瘍免疫は、腫瘍微小環境において産生される１型ＩＦＮに依存していた［８３、８６］。
【００３７】
[0053]２〜５Ａ／ＲＮアーゼＬ経路とＳＴＩＮＧ／ｃＧＡＳ経路の両方は、インターフェロン制御因子であるＩＲＦ３の作用を介して誘導される１型ＩＦＮを必要とする［７７、８５、８６］。これらの経路の治療効果の最も重要なメディエーターはＩＦＮ−βである。ＩＦＮは、腫瘍細胞の増殖を阻止し、アポトーシスを誘導する［８７］。ＩＦＮ処置の副作用としては、インフルエンザ様症状が挙げられ、ＩＦＮの作用のために、組織損傷が注射部位に生じる場合がある。感染した細胞または癌性細胞の死がこれらの経路の最終目標であるが、生物への負担が大きい可能性がある。ＩＦＮ−β産生の持続した活性化は、細胞に、宿主の免疫細胞のアポトーシスを最終的にもたらすストレス応答への悪循環を引き起こす可能性がある［７３］。
【００３８】
光線力学療法
[0054]１９８０年代半ば以来、光線力学療法は有望な抗癌手法として発展してきた［８８、８９］。ヘマトポルフィリンの誘導体は、癌細胞によって選択的に取り込まれ、癌細胞を光感受性にすることが見出された。この技術の制限は、ヘマトポルフィリン誘導体が６００ｎｍより長い波長で光を弱く吸収することであった。結果として、組織の強い吸光度のために、体の表面またはその付近に生じる腫瘍のみが接触可能である。Ｈｏｏｂｅｒら［９０］は、クロロフィルからプルプリン−１８を調製し、その化合物の無水物形態が６９５ｎｍで強い最大吸光度を有することを示した。無水物基が加水分解によって開環してクロリン−ｐ６を生成した場合、最大吸光度は６６２ｎｍにシフトしたが、依然として光線力学療法を支持し得る波長であった。これらの生成物は、細胞死滅に関して約１０−８ＭのＩＣ５０濃度を有した［９０］。
【００３９】
[0055]より近年の進展は、７００ｎｍ付近に最大吸光度を有する多様な長波長色素を探索した［９１、９２］。これらの色素は、体内に深く透過し得る赤色光において癌細胞の死滅を効果的に光増感する。さらなる進展は、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲ等の腫瘍細胞マーカーを標的とするモノクローナル抗体への色素のコンジュゲーションを伴った。
【００４０】
[0056]本明細書に記載される本発明は、特異的な腫瘍関連細胞を標的として免疫系を調節するための、ＣＬＥＣ受容体のリガンドの使用に関する。一例として、光増感剤色素または細胞毒性薬は、腫瘍細胞を標的とするためにｓｖ６Ｄ等のペプチドとコンジュゲートすることができる。本発明は、種々のリガンドまたは投与回数／用量を用いて、疾患に対する適切な免疫応答を達成するための手段を提供する。
【００４１】
[0057]本明細書では、説明を目的として、本発明の様々な態様の徹底した理解を提供するために多数の具体的かつ詳細な説明が記載される。しかしながら、構造、構成要素、および方法は、本発明を曖昧にすることを避けるために、全般的に示されるかまたは論じられる場合があるということが当業者によって理解されるだろう。多くの場合、材料および操作の説明は、本発明の様々な形態を実行することができるほど十分である。開示される本発明が適用され得る多くの異なる代替的な技術および処置が存在すること、ならびに本発明の全範囲は以下に記載する例に限定されないことは注意されるべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４２】
[0058]本開示は、医薬組成物、癌細胞増殖を低減する方法、および癌の処置を必要とする対象における癌を処置する方法に関する。医薬組成物は、治療用ペプチド、抗癌剤、および薬学的に許容される担体を含む。癌細胞増殖を低減する方法は、細胞を治療用ペプチドと接触させるステップ、および癌細胞を抗癌剤と接触させるステップを含む。癌の処置を必要とする対象における癌を処置する方法は、治療用ペプチドおよび抗癌剤を対象に投与するステップを含む。
【００４３】
[0059]本明細書および特許請求の範囲において使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞およびその活用形は、非限定的な意味で使用され、その語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目は除外されないことを意味する。加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、ただ１つの要素が存在するということを文脈が明確に必要としない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は通例「少なくとも１つ」を意味する。
【００４４】
[0060]一実施形態では、治療用ペプチドは、５〜８アミノ酸の配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（式中、Ｘ１はＨまたはＮであり；Ｘ２はＰまたはＱであり；Ｘ３はＳまたはＨであり；Ｘ４はＨ、Ｔ、またはＬであり；Ｘ５はＰもしくはＫであるか、または存在せず；Ｘ６はＲ、Ｌ、もしくはＳであるか、または存在せず；Ｘ７はＳもしくはＬであるか、または存在せず；Ｘ８はＧであるか、または存在しない）を含む。一部の実装形態では、Ｘ１はＨであるか、Ｘ２はＱであるか、Ｘ３はＨであるか、Ｘ４はＴであるか、Ｘ５はＰであるか、Ｘ６はＲであるか、Ｘ７は存在しないか、Ｘ８は存在しないか、またはそれらの組合せである。非限定的な好ましい実装形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＴであり、Ｘ５はＰであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ７およびＸ８は存在しない、すなわち、治療用ペプチドはＮＱＨＴＰＲ（配列番号１）を含む。他の実装形態では、治療用ペプチドはＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲ（配列番号２）を含む。
【００４５】
[0061]好ましい実施形態では、ペプチドは、中心骨格、リンカー配列、および少なくとも２つのアームを有する構築物であって、各アームが、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８のコア配列からなり、各アームがリンカー配列を介して中心骨格に連結している（式中、Ｘ１はＨまたはＮであり；Ｘ２はＰまたはＱであり；Ｘ３はＳまたはＨであり；Ｘ４はＨ、Ｔ、またはＬであり；Ｘ５はＰもしくはＫであるか、または存在せず；Ｘ６はＲ、Ｌ、もしくはＳであるか、または存在せず；Ｘ７はＳもしくはＬであるか、または存在せず；Ｘ８はＧであるか、または存在しない）、構築物を含む多価構造ポリペプチドである。一部の実装形態では、Ｘ１はＨであるか、Ｘ２はＱであるか、Ｘ３はＨであるか、Ｘ４はＴであるか、Ｘ５はＰであるか、Ｘ６はＲであるか、Ｘ７は存在しないか、Ｘ８は存在しないか、またはそれらの組合せである。非限定的な好ましい実装形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＴであり、Ｘ５はＰであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ７およびＸ８は存在しない、すなわち、治療用ペプチドはＮＱＨＴＰＲ（配列番号１）を含む。他の実装形態では、治療用ペプチドはＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲ（配列番号２）を含む。
【００４６】
[0062]本明細書で使用する場合、「構築物」は分子全体として定義され、アームと連結した中心骨格を含む。非限定的な実施形態では、構築物は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のアーム、好ましくは２〜８つのアームに連結している中心骨格を含む。好ましい実施形態では、構築物は、４つのアームに連結している中心骨格を含む。構築物内の各アームは、同じまたは異なる治療用配列および／またはリンカーからなっていてもよい。典型的には、複数のアームのうちの少なくとも１つは、直前の段落に記載したペプチド配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８を含む。好ましい一実施形態では、治療用配列はアーム間で同じである。別の好ましい実施形態では、それぞれのアームの治療用配列はＮＱＨＴＰＲ（配列番号１）を含む。
【００４７】
[0063]「中心骨格」は、アームを付着させるための構造を提供する。中心骨格は、末端官能基を有する分子の枝部が結合する少なくとも２つの官能基を有するコア分子、例えばペプチドアームが付加されるトリリジンに基づく。そのような分子は、コア分子から枝分かれした単量体の数に応じて変動する数の枝部を提示するように開発または創製することができる。各枝部の各末端官能基は、アームに対する付着手段を提供する。好ましい中心骨格の非限定的な例としては、エチレンジアミン（１，２−エタンジアミン）、エチレングリコール（１，２−ジヒドロキシエタン）、グリセロール等のポリオール、３，５−ジアミノ安息香酸、１，３，５−トリアミノベンゼン、および中鎖のモノカルボキシル−ジアミノ化合物が挙げられる。好ましくは、モノカルボキシル−ジアミノ化合物は２〜１０炭素長の範囲内である。そのような化合物の非限定的な例は、２，３−ジアミノプロピオン酸、および２，６−ジアミノカプロン酸である。より好ましい実施形態では、モノカルボキシル−ジアミノ化合物は６炭素長である。光を吸収する芳香族中心骨格を提供する化合物もまた、ペプチド濃度を決定することに関して有益であり得る。モノカルボキシル−ジアミノ化合物のカルボキシル基は、ビオチン誘導体を含むＣ末端タグの付加を可能にする。好ましい実施形態では、中心骨格はトリリジンコア（それぞれが自身のカルボキシル基を介して中心リジン残基のアミノ基の１つに結合する２つのリジン残基に結合する中心分子としてのリジン残基）を含み、アームの中心骨格（トリリジン中心骨格）を提供する。
【００４８】
[0064]「アーム」は、治療用配列に加えてリンカー配列を含む。「リンカー配列」は、中心骨格をコア配列に接続するペプチド鎖または他の分子を含む。好ましい実施形態では、リンカー配列は、これらに限定されないが、ある特定のリンカーペプチド配列、ポリエチレングリコール、６−アミノカプロン酸（６−アミノヘキサン酸）、８−アミノオクタン酸、およびデキストランを含む。最も好ましい実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＧＳ（配列番号３）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４）、ＳＳＳＳ（配列番号５）、ＳＳＳＳＳＳＳＳ（配列番号６）、またはそれらの変形である。リンカー配列の長さは調整することができ、例えばリンカー配列ＧＧＧＳ（配列番号３）は、可変長を提供するために繰り返すことができ、例えば２回繰り返しても（ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４））、３回以上繰り返してもよく、追加のセリン残基は、同様に多様な長さのリンカー配列を作製するためにＳＳＳＳに付加されてもよい。一部の実施形態では、「アーム」のＮ末端アミノ基は、コンジュゲーション反応への干渉を防止するためにアセチル化される。
【００４９】
[0065]一部の態様では、ペプチドおよびＣＬＥＣ１０Ａは、−３０ｋＪ／ｍｏｌより高い、−３５ｋＪ／ｍｏｌより高い、または−４０ｋＪ／ｍｏｌより高い結合エネルギー（ΔＧ’）を有する。他の態様では、ペプチドおよびＣＬＥＣ１０Ａは、−２０から−５０ｋＪ／ｍｏｌの間、またはその間の任意の他の数値範囲、例えば−２０から−４５ｋＪ／ｍｏｌの間、−２５から−４５ｋＪ／ｍｏｌの間、−２５から−４０ｋＪ／ｍｏｌの間、−３０から−４０ｋＪ／ｍｏｌの間、もしくは−３０から−３５ｋＪ／ｍｏｌの間等の結合エネルギー（ΔＧ’）を有する。当技術分野で公知であるように、結合エネルギー（ΔＧ’）が高くなるほど（結合の強さが大きくなるほど）、結合エネルギーはより負になる。
【００５０】
[0066]一部の実施形態では、ペプチドおよびＣＬＥＣ１０Ａは、０．００１〜０．３５μＭ、またはその間の任意の他の数値範囲、例えば０．００１〜０．３μＭ、０．００２〜０．３μＭ、０．００２〜０．２５μＭ、０．００５〜０．２５μＭ、０．００５〜０．２μＭ、０．０１〜０．２μＭ、もしくは０．０１〜０．１５μＭ等の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。他の実施形態では、ペプチドおよびＣＬＥＣ１０Ａは、０．００１〜０．３５μＭ、またはその間の任意の他の数値範囲、例えば０．００１〜０．３μＭ、０．００２〜０．３μＭ、０．００２〜０．２５μＭ、０．００５〜０．２５μＭ、０．００５〜０．２μＭ、０．０１〜０．２μＭ、もしくは０．０１〜０．１５μＭ等の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【００５１】
[0067]一部の態様では、ペプチドは、ＣＬＥＣ１０Ａの細胞へのエンドサイトーシスを惹起するのに十分な量である。一部の実施形態では、ペプチドは、免疫細胞集団、例えば腹腔免疫細胞集団を増加させるのに十分な量である。腹腔免疫細胞の非限定的な例としては、ＣＤ３を発現するＴ細胞；ＣＤ３、ＮＫ１．１、およびＣＤ６９を発現する活性化ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞；ＣＤ３−、ＮＫ１．１、およびＣＤ６９を発現する活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；ＣＤ４を発現するＴ細胞；ＣＤ４およびＣＤ６９を発現する活性化Ｔ細胞；ＣＤ８を発現する細胞傷害性Ｔ細胞；ＣＤ８およびＣＤ６９を発現する活性化細胞傷害性Ｔ細胞；ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、およびＣＤ８６を発現する成熟活性マクロファージ；ＣＤ１１ｃを発現する樹状細胞（ＤＣ）；ＣＤ１１ｃおよびＣＤ８６を発現する活性化ＤＣ；ＣＤ１９を発現するＢ細胞；またはＣＤ１９、ＣＤ７３、ＣＤ８０、およびＣＤ２７３を発現するメモリーＢ細胞等が挙げられる。好ましい実施形態では、ペプチドは、ＣＤ３を発現するＴ細胞；ＣＤ３、ＮＫ１．１、およびＣＤ６９を発現する活性化ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞；ＣＤ４を発現するＴ細胞；ＣＤ８を発現する細胞傷害性Ｔ細胞；ＣＤ１１ｃを発現するＤＣ；ＣＤ１１ｃおよびＣＤ８６を発現する活性化ＤＣ；ならびにそれらの組合せからなる群から選択される腹腔免疫細胞を増加させるのに十分な量である。
【００５２】
[0068]一部の実施形態では、ペプチドは、免疫細胞集団を１０〜５００％、またはその間の任意のパーセント数、例えば１０〜４５０％、２０〜４５０％、２０〜４００％、４０〜４００％、４０〜３５０％、８０〜３５０％、８０〜３００％、１００〜３００％、１００〜２５０％、もしくは１５０〜２００％等増加させるのに十分な量である。他の実施形態では、ペプチドは、免疫細胞集団を少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％等増加させるのに十分な量である。
【００５３】
[0069]一部の態様では、ペプチドは、ＩＦＮ−γを放出させるのに十分な量である。他の態様では、ペプチドは、マクロファージをＭ１表現型へ再分極させるか、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を排除するか、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を修飾するか、またはそれらの組合せに十分な量である。さらなる態様では、ペプチドは、Ｔｒｅｇ細胞を減少させる、ならびに／またはマクロファージ、樹状細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、およびナチュラルキラー細胞からなる群から選択される免疫細胞の成熟を促進するのに十分な量である。さらなる態様では、ペプチドまたはポリペプチドは、対象において抗原性ではない。
【００５４】
[0070]一部の態様では、ペプチドおよび抗癌薬は、癌細胞増殖を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％等低減するのに十分な量である。他の態様では、ペプチドおよび抗癌薬は、癌細胞増殖を５〜９５％、またはその間の任意のパーセント数、例えば１０〜９０％、１０〜８０％、２０〜８０％、２０〜７０％、３０〜７０％、３０〜６０％、もしくは４０〜６０％等低減するのに十分な量である。
【００５５】
[0071]一部の態様では、ペプチドおよび抗癌薬は、腫瘍成長を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％等遅らせるのに十分な量である。他の態様では、ペプチドおよび抗癌薬は、腫瘍成長を５〜９５％、またはその間の任意のパーセント数、例えば５〜９０％、１０〜９０％、１０〜８０％、２０〜８０％、２０〜７０％、３０〜７０％、３０〜６０％、もしくは４０〜６０％等遅らせるのに十分な量である。
【００５６】
[0072]「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞応答を、特にエフェクターＴ細胞誘導または増殖の抑制または下方制御によって阻害するＴ細胞を指す。したがって、これらの細胞は、免疫学的寛容を誘導することができる。ＣＤ２５、ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＦｏｘｐ３のうちの少なくとも１種の発現は、制御性Ｔ細胞を示す。大部分の制御性Ｔ細胞はＣＤ４＋であるが、ＣＤ８＋もあり得る。制御性Ｔ細胞の別の指標は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子−４（ＣＴＬＡ−４）またはグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）の高発現である。
【００５７】
[0073]本明細書で使用する場合、「抗癌剤」とは、悪性または癌性疾患の処置に効果的な任意の薬物を指す。抗癌剤の主要な種類の非限定的な例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然物、またはホルモン等が挙げられる。抗癌剤の非限定的な例としては、化学療法薬、癌免疫療法薬、または光増感薬等が挙げられる。
【００５８】
[0074]本明細書で使用する場合、「化学療法」という用語は、化学物質の使用による疾患の処置、とりわけ細胞毒性薬および他の薬物による癌の処置を指す。化学療法薬の非限定的な例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、抗ウイルス薬、有糸分裂阻害剤、またはトポイソメラーゼ阻害剤等が挙げられる。アルキル化剤の非限定的な例としては、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、マイトマイシンＣ（ＭＴＣ）、またはテモゾロミド等が挙げられる。代謝拮抗剤の非限定的な例としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、ゲムシタビン（ｄＦｄＣ）、ヒドロキシ尿素（ＨＵ）、またはメトトレキセート（ＭＴＸ）等が挙げられる。抗腫瘍抗生物質の非限定的な例としては、ブレオマイシン、ダクチノマイシン（ｃｏｓｍｅｇｅｎ）、またはダウノルビシン（ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ、ルビドマイシン）等が挙げられる。抗ウイルス薬の非限定的な例としては、アシクロビル（Ａｃｙ）、ホスカルネット（ＦＯＳ）、またはガンシクロビル（ｇａｎ）等が挙げられる。有糸分裂阻害剤の非限定的な例としては、デメコルシン、ドセタキセル（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、エリブリン（ｈａｌａｖｅｎ）、イクサベピロン（ｉｘｅｍｐｒａ）、パクリタキセル（ｔａｘｏｌ）、またはビンブラスチン等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤の非限定的な例としては、カンプトテシン（ＣＰＴ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、イリノテカン（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、またはトポテカン（ｈｙｃａｍｔｉｎ）等が挙げられる。
【００５９】
[0075]「免疫療法」という用語は、本明細書で使用する場合、免疫応答を誘導、増強、または抑制することによる疾患または状態の処置を指す。癌免疫療法薬の非限定的な例としては、細胞免疫療法薬、抗体療法薬、サイトカイン療法薬、またはポリサッカライドＫ等が挙げられる。細胞免疫療法薬の非限定的な例としては、シプロイセル−Ｔ（ｐｒｏｖｅｎｇｅ）、チサゲンレクロイセル（ｋｙｍｒｉａｈ）、またはアキシカブタゲンシロロイセル（ｙｅｓｃａｒｔａ）等が挙げられる。「免疫チェックポイント」という用語は、本明細書で使用する場合、自己寛容を維持し、末梢組織における生理的免疫応答の持続時間および大きさを調節して、付随する組織損傷を最小限にするのに非常に重要な免疫系の阻害経路を指す。
【００６０】
[0076]抗体療法薬の非限定的な例としては、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ２抗体等が挙げられる。サイトカイン療法薬の非限定的な例としては、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、またはＩＬ−２等が挙げられる。抗ＣＤ２０抗体の非限定的な例としては、オファツムマブ（ａｒｚｅｒｒａ）、またはリツキシマブ（ｒｉｔｕｘａｎ、ｍａｂｔｈｅｒａ）等が挙げられる。抗ＣＤ５２抗体の非限定的な例は、アレムツズマブ（ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）である。抗ＰＤ−１抗体の非限定的な例としては、ニボルマブ（ｏｐｄｉｖｏ）、またはペムブロリズマブ（ｋｅｙｔｒｕｄａ）等が挙げられる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の非限定的な例としては、アテゾリズマブ（ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（ｂａｖｅｎｃｉｏ）、またはデュルバルマブ（ｉｍｆｉｎｚｉ）等が挙げられる。抗ＣＴＬＡ−４抗体の非限定的な例は、イピリムマブ（ｙｅｒｖｏｙ）である。
【００６１】
[0077]「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用する場合、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に収載されていることを意味する。
【００６２】
[0078]「担体」という用語は、有効成分と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、液体、例えば水ならびに、石油、動物、野菜、または合成起源の油、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油等を含む油であり得る。薬学的担体の非限定的な例としては、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、澱粉ペースト、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、尿素、ナノ粒子、リポソーム、カチオン性リポソーム、またはミセル等が挙げられる。加えて、他の賦形剤が使用されてもよい。
【００６３】
[0079]「有効量」または「治療有効量」とは、自然および獲得免疫系を調節、ならびに／または対象における疾患を処置もしくは予防し、それゆえに対象に所望の治療効果をもたらすのに効果的な、本発明の治療用ペプチドまたは組成物の量を意味する。典型的な組成物および剤形は、１種または複数種の賦形剤を含み得る。好適な賦形剤は薬学の分野の当業者に周知であり、好適な賦形剤の非限定的な例は本明細書に提供される。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．（１９９０）を参照のこと。
【００６４】
[0080]癌の非限定的な例としては、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、肝細胞癌腫、カポジ肉腫、肺癌、リンパ腫、悪性黒色腫、黒色腫、中皮腫、転移性黒色腫肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌、または扁平上皮肺癌等が挙げられる。好ましくは、癌は卵巣癌等の腹膜癌である。
【００６５】
[0081]一部の態様では、単位投薬量のペプチドは、隔日、３、４、５、もしくは６日ごと、または毎週投与される。本発明のペプチドの単一の単位剤形は、患者への経口、粘膜（例えば、点鼻、舌下、経膣、頬側、もしくは直腸）、非経口（例えば、皮下、静脈内、ボーラス注射、筋肉内、もしくは動脈内）、または経皮投与に好適である。剤形の非限定的な例としては、錠剤；カプレット剤；軟弾性ゼラチンカプセル剤等のカプセル剤；カシェ剤；トローチ剤；ロゼンジ剤；分散剤；坐剤；軟膏剤；パップ剤（湿布剤）；ペースト剤；粉末剤；包帯剤；クリーム剤；硬膏剤；液剤；貼付剤；エアゾール剤（例えば点鼻スプレー剤または吸入剤）；ゲル剤；懸濁剤（例えば、水性もしくは非水性液体懸濁剤、水中油型エマルション、または油中水型液体エマルション）、液剤、およびエリキシル剤を含む、患者への経口または粘膜投与に好適な液体剤形；患者への非経口投与に好適な液体剤形；ならびに患者への非経口投与に好適な液体剤形を提供するために再構成することができる滅菌固体（例えば結晶または非晶質固体）が挙げられる。ペプチドは、好ましくは非経口経路、最も好ましくは皮下経路を介して投与される。一部の態様では、ペプチドは静脈内投与される。
【００６６】
[0082]ある特定の態様では、ペプチドは、対象の体重１ｋｇ当たり約０．１〜１，５００ｎｍｏｌの単位投薬用量、またはその間の任意の投薬用量、例えば約０．２〜１，５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約０．２〜１，４００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約０．４〜１，４００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約０．４〜１，３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約０．６〜１，３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約０．６〜１，２００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約０．８〜１，２００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約０．８〜１，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ、もしくは対象の体重１ｋｇ当たり約１ｎｍｏｌ〜１，０００ｎｍｏｌで投与される。他の態様では、ペプチドは、約３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重〜約１５００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、約３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重〜約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、約３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重〜約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、または約０．１ｎｍｏｌ  ｋｇ体重〜約１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の単位投薬用量で投与される。さらなる態様では、ペプチドは、約１５００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重未満、例えば、約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ、または約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇの単位投薬用量で投与される。一態様では、ペプチドは、約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約７５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約７５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１μｍｏｌ／ｋｇ、約１０μｍｏｌ／ｋｇ、または約５０μｍｏｌ／ｋｇの単位投薬用量で投与され得る。
【００６７】
[0083]単位投薬用量は対象に依存する。マウスからより大型の動物およびヒトへの慣例的に使用される換算法は、等価表面積である。好ましい一実施形態では、対象はマウスであり、ｓｖ６Ｄは、マウスの体重１ｋｇ当たり約１００ｎｍｏｌ（例えば９０〜１１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の皮下注射によって投与される。第２の好ましい実施形態では、対象はラットであり、ｓｖ６Ｄは、ラットの体重１ｋｇ当たり約５０ｎｍｏｌ（例えば４５〜５５ｎｍｏｌ／ｋｇ）の皮下注射によって投与される。第３の好ましい実施形態では、対象はイヌであり、ｓｖ６Ｄは、イヌの体重１ｋｇ当たり約１５ｎｍｏｌ（例えば１３．５〜１６．５ｎｍｏｌ／ｋｇ）の皮下注射によって投与される。第４の好ましい実施形態では、対象はヒトであり、ｓｖ６Ｄは、ヒトの体重１ｋｇ当たり約８ｎｍｏｌ（例えば７．２〜８．８ｎｍｏｌ／ｋｇ）の皮下注射によって投与される。
【００６８】
[0084]一部の実施形態では、ペプチドと抗癌剤との組合せ療法は別個に投与される。一部の態様では、ペプチドは、抗癌剤を投与する前に免疫系に抗原刺激を与えるために最初に投与される。例えば、ペプチドは、抗癌剤の投与の少なくとも２週間、少なくとも１０日、少なくとも１週間、少なくとも５日、少なくとも３日、または少なくとも１日前に投与される。他の態様では、ペプチドの投与は、抗癌剤の投与後も継続される。さらなる態様では、ペプチドの投与は、抗癌剤を投与する経過と同時である。非限定的な実施形態では、ペプチドの投与は、約１日から１年の間、またはその間の任意の期間、例えば約１日〜１０か月、約１週間〜１０か月、約１週間〜８か月、約１か月〜８か月、約１か月〜６か月、約２か月〜６か月、約２か月〜４か月、または約３か月等続く。
【００６９】
[0085]一部の実施形態では、ペプチドおよび抗癌剤は、組み合わされた薬物が単回適用として投与され得る配合物において投与される。
[0086]一部の態様では、ペプチドと抗癌剤、例えば光増感剤色素または細胞毒性薬とは、リンカーを介してコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ペプチドと抗癌剤は、化学的コンジュゲーションによってコンジュゲートしている。化学的コンジュゲーションの非限定的な例としては、リジンアミドカップリング、またはシステインをベースとするコンジュゲーション等が挙げられる。本明細書で使用する場合、「リジンアミドカップリング」または「アミドカップリング」とは、抗癌剤と、ペプチドのリジン残基の溶媒接触性のイプシロン−アミノ基とを、活性化カルボン酸エステルを含有するリンカーを使用して接続するコンジュゲーション方法を指す。本明細書で使用する場合、「システインをベースとするコンジュゲーション」とは、ペプチドのシステイン残基の側鎖スルフヒドリル（−ＳＨ）基と、抗癌剤に導入されたチオール反応性官能基との間の特異的反応に依存するコンジュゲーション方法を指す。他の実施形態では、ペプチドと抗癌剤は、酵素によるコンジュゲーションによってコンジュゲートしている。酵素によるコンジュゲーションの非限定的な例としては、ソルターゼを使用するペプチド転移、微生物のトランスグルタミナーゼを使用するペプチド転移、またはＮ−グリカン操作等が挙げられる。
【００７０】
[0087]一部の態様では、ペプチドと、抗癌剤、例えばＳＴＩＮＧリガンド（例えば環状ジヌクレオチド（ＣＤＮもしくはｃ［Ｇ（２’，５’）ｐ−２’−ＡＨＣ−Ａ（３’，５’）ｐ］  ＡＨＣ＝６−アミノヘキシルカルバモイル、または５，６−ジメチルキサンテノン−酢酸（ＤＭＸＡＡ））、化学療法薬（例えばドキソルビシン）、あるいは光線力学療法薬（例えばクロリンｐ６）等とはコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ペプチドはＣ末端システインをさらに含み、抗癌剤はスルフヒドリル（−ＳＨ）基またはヨード基を含み、システインは−ＳＨ基またはヨード基にコンジュゲートしている。他の実施形態では、ペプチドはＣ末端カルボキシル基をさらに含み、抗癌剤はアミノ基を含み、ペプチドと抗癌剤はカルボジイミド誘導体によりコンジュゲートしている。他の実施形態では、ペプチドはＣ末端アミノ基をさらに含み、抗癌剤は無水物基またはカルボキシル基を含み、ペプチドと抗癌剤はカルボジイミド誘導体によりコンジュゲートしている。さらなる実施形態では、ペプチドと抗癌剤は、ビオチン−アビジン相互作用を介して連結している。さらなる実施形態では、ペプチドはビオチンに付着するＣ末端リジンをさらに含み、抗癌剤は、ビオチン含有化合物、例えばＴＬＲ９のリガンドであるビオチンタグ付きオリゴヌクレオチドである。
【００７１】
[0088]本明細書で使用する場合、「光線力学療法薬」とは、特異的な波長の光に曝露された場合に、付近の細胞を死滅させる形態の酸素を生成する光増感薬または光増感剤を指す。
【００７２】
[0089]一部の実施形態では、ペプチドのコンジュゲーションは、抗癌剤の癌細胞への輸送を少なくとも１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、または５００倍増加させる。他の実施形態では、ペプチドのコンジュゲーションは、抗癌剤の癌細胞への輸送を１〜２，０００倍、またはその間の任意の数値、例えば１０〜２，０００倍、２０〜２，０００倍、２０〜１，８００倍、５０〜１，８００倍、５０〜１，５００倍、１００〜１，５００倍、１００〜１，２００倍、３００〜１，２００倍、３００〜１，０００倍、または４００〜８００倍等増加させる。
【００７３】
[0090]さらなる実施形態では、ペプチドのコンジュゲーションは、ＳＴＩＮＧリガンドのＩＦＮ−β産生を少なくとも１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、または５００倍増加させる。他の実施形態では、ペプチドのコンジュゲーションは、ＳＴＩＮＧリガンドのＩＦＮ−β産生を１〜２，０００倍、またはその間の任意の数値、例えば１０〜２，０００倍、２０〜２，０００倍、２０〜１，８００倍、５０〜１，８００倍、５０〜１，５００倍、１００〜１，５００倍、１００〜１，２００倍、３００〜１，２００倍、３００〜１，０００倍、または４００〜８００倍等増加させる。
【００７４】
[0091]一部の態様では、ペプチドのコンジュゲーションは、癌細胞増殖を低減するかまたは癌進行を遅らせるのに十分な抗癌剤の量を、ペプチドにコンジュゲートしていない場合の抗癌剤の等価用量に必要とされる量と比べて少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％等減少させる。他の態様では、ペプチドのコンジュゲーションは、癌細胞増殖を低減するかまたは癌進行を遅らせるのに十分な抗癌剤の量を、ペプチドにコンジュゲートしていない場合の抗癌剤の等価用量に必要とされる量と比べて２０〜９９．９％、またはその間の任意のパーセント数、例えば２５〜９９．９％、２５〜９９．８％、３０〜９９．８％、３０〜９９．７％、３５〜９９．７％、３５〜９９．６％、４０〜９９．６％、４０〜９９．５％、５０〜９９．５％、または５０〜９９％等減少させる。
【００７５】
[0092]一部の実施形態では、抗癌剤とペプチドは、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、または約１２：１等の平均モル比を有する。他の実施形態では、抗癌剤とペプチドは、１：１０から１２：１の間、またはその間の任意の数値、例えば１：８から１２：１の間、１：８から１０：１の間、１：６から１０：１の間、１：６から８：１の間、１：４から８：１の間、１：４から６：１の間、１：２から６：１の間、１：２から４：１の間、または１：２から２：１の間等の平均モル比を有する。
【００７６】
[0093]好ましくは、本明細書に記載される方法によって処置される対象は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタであり、より好ましくは、対象はヒトである。好ましくは、本明細書に記載される癌細胞は、哺乳動物癌細胞、例えば、マウス癌細胞、ラット癌細胞、ネコ癌細胞、イヌ癌細胞、サル癌細胞、ウマ癌細胞、ウシ癌細胞、ヒツジ癌細胞、ブタ癌細胞であり、より好ましくは、癌はヒト癌細胞である。
【００７７】
[0094]一部の態様では、腫瘍細胞は、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＡＳＧＰＲ−１、ＣＬＥＣ４Ｆ、またはそれらの組合せを発現する。
[0095]組成物または方法の最も好ましい実装形態では、抗癌剤は環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を含み、治療用ペプチドは、中心骨格、リンカー配列、および４つのアームを有する構築物であって、各アームが、ＮＱＨＴＰＲ（配列番号１）のコア配列からなり、リンカー配列を介して中心骨格に連結している、構築物を含み、治療用ペプチドとＣＤＮは、例えばリンカーを介してコンジュゲートしている。
【実施例】
【００７８】
実施例１．方法
[0096]ペプチドの合成。ｓｖＬ４の機能配列を、カタツムリＨｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ由来のＧａｌＮＡｃ特異的レクチンを用いた１２マーのファージディスプレイライブラリ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）のスクリーニングにより同定した［６０、１１１］。コンセンサス配列を、受容体への結合に関する、リガンド密度とエントロピー因子との関数としてのアビディティの概念に基づいて四価構造に組み込んだ［４４、４９、１１２〜１１４］。多価ペプチドを、ＣＢＬ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  ＬＬＣ（Ｐａｔｒａｓ、Ｇｒｅｅｃｅ）によるＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−保護アミノ酸を利用した標準的な固相化学によって合成した。トリリジン「コア」を固相レジン上で合成し、配列ＧＧＳで伸長した。Ｃ末端がＧである複数の「アーム」を標準的な化学によって別個に合成し、コアを有する溶液中で縮合した［１１５］。Ｃ末端における修飾は、アミド基（タグ無し）、またはε−ビオチニル−リジニル−アミドを有する伸長鎖からなった。配列ＧＧＧＳ（配列番号３）を、模倣物配列とトリリジンコアとの間のリンカー配列として構造に含めた。ｓｖＬ４の誘導体もまた合成して、配列のサブセットが異なる活性を有するかを決定した。ペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中５％〜２５％アセトニトリルの勾配を使用した６０℃のカラム温度でＸＤＢ−Ｃ８カラムでのＨＰＬＣによって９５％超に精製した。正確な合成および純度を含む合成産物の品質を、ＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ質量分析法によって評価した。凍結乾燥ペプチドを１００ｍＭ  ＮａＣｌに溶解し、ｐＨ５に中和し、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５カラム（２．５×１０ｃｍ）に吸着させた。カラムを２００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄して、確実にリポ多糖（ＬＰＳ）を除去した後に、ｓｖＬ４を５００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。ＬＰＳは、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムから溶出したペプチド溶液において検出されなかった（＜０．０１ＥＵ／１０ｍｇペプチド）。ペプチドの濃度を、２１０ｎｍにおける実験的に決定された消散係数である２２ＯＤ単位／ｍｇ／ｍｌを用いて決定した。
【００７９】
[0097]結合アッセイ。固相結合アッセイを、ストレプトアビジン、プロテインＡ／Ｇ、またはニッケルでコートしたマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ）で実施した。Ｈｉｓタグ付きまたはＦｃ融合組換え受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）をＰＢＳ中で再構成した。十分な受容体をウェルに添加して、コーティングを飽和させた。Ｈｉｓタグ付き受容体を、Ｎｉコーティングの規定の許容量の５倍過剰で各ウェルに添加して、ペプチドの非特異的結合を最小限にした。ウェルを結合緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄して、結合していない受容体を除去し、５０μＬの結合緩衝液中２μＭビオチニル化ペプチドを添加し、１時間インキュベートした。ウェルを結合緩衝液で４回洗浄し、次いでペルオキシダーゼとコンジュゲートした５０μＬの１μｇ／ｍＬストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に１時間インキュベートした。ウェルを結合緩衝液で５回洗浄し、５０μＬのペルオキシダーゼ基質（１−ＳｔｅｐＴＭ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した。数分かけて顕色させた後、５０μＬの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を用いて反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。結合したストレプトアビジンを、アッセイの条件下、ペルオキシダーゼの特異的活性（吸光度／ｎｇタンパク質コンジュゲート／分）によって定量化した。
【００８０】
[0098]フローサイトメトリー。１０週齢の健康なＣ５７ＢＬ／６雄マウスにペプチドを隔日で皮下注射した。投薬の２４時間後、氷冷ＰＢＳ（３％ＦＢＳを含有）を腹膜腔に注射し、腹部を優しくマッサージし、次いで流体を収集して、特異的バイオマーカーの評価のためにＫ２ＥＤＴＡ処理チューブへ移すことによって、腹膜細胞をマウスから単離した。各群の３匹のマウスからの細胞をプールし、計数し、ＦＡＣＳチューブへ分割した（チューブ１本当たり１×１０６個の細胞）。細胞を、３％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中で１回洗浄し、次いで、製造業者によって推奨されるように、１００μＬの緩衝液中、細胞１０６個当たり０．２５〜１μｇの蛍光コンジュゲート抗体で染色した（表１）。
【００８１】
[0099]細胞を、４℃で３０分間、暗所にて抗体と共にインキュベートした。染色後、細胞をＰＢＳ／３％ＦＢＳで２回洗浄し、直ちにＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて分析した。分析において現れる各色の単一染色チューブ、および染色していない対照試料を使用して補正を実施した。フローサイトメトリーデータの収集、およびＦｌｏｗＪｏソフトウェア、バージョン１０．０．６（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いた分析は、Ｂｉｏｍｏｄｅｌｓ  ＬＬＣ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）によって実施された。
【００８２】
【表１】
2021509679.tif 000003
【００８３】
[0100]サイトカインアッセイ。同種異系混合白血球反応を、Ａｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）によるＸ−ＶＩＶＯ２０培地（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）において１×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養した５×１０３個のヒト単球由来ＤＣを用いて実施した。培地中のＩＦＮ−γを、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙアッセイキット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて５日の期間にわたってアッセイした。ペプチドの皮下注射に対するｉｎ  ｖｉｖｏでのサイトカイン応答の分析のために、６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをイソフルランで麻酔し、５×１０５個の４Ｔ１乳癌細胞を第４乳房脂肪体に接種した。腫瘍が少なくとも５００ｍｍ３の体積に達したとき、動物を３匹ずつの群に無作為化し、０．１または１．０ｎｍｏｌ／ｇいずれかのｓｖＬ４を投薬した。投薬の４時間後、末端血液を群１つ当たり３匹の動物から収集し、血清を調製した。血清は、同じ手順で健康なＢａｌｂ／ｃマウスからも収集した。乳癌を有するマウスおよび健康なマウスからの血清におけるサイトカイン／ケモカインのレベルの変化を、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）によるマウスＬ−３０８膜アレイを用いて分析した（表２）。
【００８４】
[0101]乳房腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおける、０．１ｎｍｏｌ／ｇのｓｖＬ４に応答するリンパ球および単球活性化のマーカーを、健康なマウスと比較する。３匹の動物からの血清を、３０８種の可溶性因子のアレイを用いる分析のためにプールした。（対照値が無視できるかまたは低かった場合、処理試料の倍率増加は高く現れる）。
【００８５】
【表２】
2021509679.tif 000004
【００８６】
[0102]抗原性アッセイ。ｓｖＬ４またはｓｖ６Ｄの１つのアームの配列をキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートし、２週間間隔でウサギに注射した（総計３回の注射）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｉｎｃ．、Ｇａｒｄｎｅｒ、ＭＡ）。最後の注射の２週間後、血清を調製した。マウスにペプチドを１日おきに３か月の期間にわたって注射し（総計約４５回の注射）、次いで血液を心臓穿刺によって収集し、血清を調製した。ウサギ血清は１：１０に希釈し、一方でマウス血清は０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で１：１または１：５に希釈した。血清を、プロテインＡ／Ｇ（Ｐｉｅｒｃｅ）でコートしたマイクロタイターウェルにおいて９０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで５０μＬの１μＭビオチニル化ｓｖＬ４またはｓｖ６Ｄと共に１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄し、１μｇ／ｍＬストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートと共に１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄した。ペルオキシダーゼ活性を上記の結合アッセイの項目に従ってアッセイした。
【００８７】
[0103]動物。Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から取得した。腹膜細胞の集団に対するペプチドの皮下注射の効果に関する研究を、Ｂｉｏｍｏｄｅｌｓ  ＬＬＣ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡのＡＡＡＬＡＣ認定施設において実施した。卵巣癌のマウスモデルを用いた研究を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋａｎｓａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＫＳにおいて行った。卵巣上皮癌株ＩＤ８［１１０］の細胞を雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹膜腔に、細胞６×１０６個の用量で移植した。全ての動物を、これらの研究全体を通して少なくとも週１回体重測定した。腹水の蓄積を体重の増加によってモニタリングし、末期行動が発現した場合は動物を安楽死させた。実験の終了前に癌と無関係ないかなる理由でも安楽死させた動物はいなかった。カプラン・マイヤー生存曲線を、マンテル・コックスのログランク検定によって分析した。
【００８８】
実施例２．組換え受容体への結合
[0104]固相結合アッセイを、組換えヒト受容体を用いて実施した。３種類の結合アッセイを本研究において使用し、その全てにおいて四価ペプチドのアームは完全な可動性を有することができた。（ｉ）ビオチニル化ペプチドを、ストレプトアビジンでコートしたマイクロタイターウェルにおいて結合し、組換えヒト受容体と共にインキュベートした。徹底的な洗浄の後、結合した受容体を、受容体特異的抗体にコンジュゲートしたペルオキシダーゼによって測定した。（ｉｉ）免疫グロブリンＩｇＧのＦｃドメインと融合した受容体の細胞外ドメインを、プロテインＡ／Ｇでコートしたウェルにおいて結合した。ビオチニル化ペプチドを受容体と共にインキュベートし、徹底的な洗浄の後、結合したペプチドを、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて測定した。または、（ｉｉｉ）ポリＨｉｓタグを有する組換え受容体をニッケルでコートしたウェルに結合し、ビオチニル化ペプチドと共にインキュベートした。ｓｖＬ４およびｓｖ６ＤはＨｉｓ残基を含有しており（図１Ａ、１Ｃ）、Ｎｉコーティングに結合することができるが、これは十分なポリＨｉｓタグ付き受容体を添加してＮｉコーティングを飽和させることによって最小限にした。
【００８９】
[0105]これらのアッセイにおいて、ｓｖＬ４はＣＬＥＣ１０Ａに結合し、またＧａｌＮＡｃ模倣性の確証として、ＡＳＧＰＲ−１にも結合した（図２Ａ）。ｓｖＬ４の１２マーの配列に関する有意なコンセンサスがＧａｌＮＡｃ特異的レクチンを用いたファージディスプレイライブラリのスクリーニングにおいて見出されたが［６０］、その配列のサブセットを合成して、全長ｓｖＬ４と比較したＮ末端側半分およびＣ末端側半分（図１Ｂ）の活性を試験した。図２Ａに示すように、Ｃ末端側半分（ｓｖ６Ｄ）は、全長配列と同程度に強くＣＬＥＣ１０ＡおよびＡＳＧＰＲ−１に結合した。Ｎ末端側半分（ｓｖＣ１）の保持力は、空のウェルのレベル付近であった。ｓｖＬ４配列の中央部分（ｓｖＤ２）は、これらの受容体に弱く結合した。
【００９０】
[0106]他の受容体に関する調査は、ｓｖＬ４またはｓｖ６Ｄが単球およびＤＣに発現したレクチン型受容体であるＣＬＥＣ９Ａ［１２３］、マンノース特異的レクチン型受容体であるＤＣ−ＳＩＧＮ［１２２、１２４、１２５］、または複合グリカンの末端Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ配列に特異的なＳｉｇｌｅｃ−１［１２６、１２７］に有意に結合しないことを示した。結合は、ヒアルロン酸の受容体であるＣＤ４４［１２８］に関してもＩＬ−４の受容体であるＩＬ−４Ｒ（図２Ｂ）に関しても検出されなかった。本発明者らはこれまでのところアッセイした受容体のうち、クッパー細胞によって発現されるＧａｌＮＡｃ結合受容体であってＡＳＧＰＲ−１と相同でもあるＣＬＥＣ４Ｆ［５０］を含む、ＧａｌＮＡｃに特異的な受容体にペプチドは結合した。
【００９１】
[0107]ｓｖ６Ｄが実際の糖結合部位と相互作用するかをさらに決定するために、ｓｖ６Ｄが結合に関してＧａｌＮＡｃ−ＰＡＡと競合する能力をアッセイした。図３Ａに示すように、ｓｖ６Ｄは、ラット由来のＣＬＥＣ１０ＡおよびヒトＡＳＧＰＲ−１へのＧａｌＮＡｃ−ＰＡＡの結合を阻害した。この実験は、ペプチドが多価ＧａｌＮＡｃ−ＰＡＡよりも１桁超大きいアビディティを有することを示唆する。ｓｖ６Ｄの模倣性に関するさらなる支持は、ウサギにおいて、ＫＬＨにコンジュゲートしたｓｖ６Ｄ配列（ＮＱＨＴＰＲ）（配列番号１）に対して産生された抗血清もまたＧａｌＮＡｃ−ＰＡＡを結合したという知見であった（図３Ｂ）。
【００９２】
[0108]Ｃ型レクチンへの糖リガンドの結合は、タンパク質の３つまたは４つの部位で結合したＣａ２＋を必要とする［１０〜１２、１２２］。これらの部位からのＣａ２＋の除去は、結合部位の構造を緩和させ、タンパク質の残りの部分の有意な変化を伴わずに糖結合活性の喪失を引き起こす。したがって、本発明者らは、ペプチドが糖結合部位でこれらの受容体に結合するか否かはＣａ２＋のキレート化によって確認することができると推論した。実際、ペプチドの結合は、低濃度のＥＧＴＡを用いたＣａ２＋のキレート化によって完全に阻害された（図３Ｃ）。
【００９３】
[0109]濃度に対するＣＬＥＣ１０ＡまたはＡＳＧＰＲ−１との結合曲線の二重逆数プロットから、ｓｖ６Ｄに関してそれぞれ０．１５±０．０２μＭおよび０．１２±０．０１μＭのＫＤ値を得た（図３Ｄ）。ＣＬＥＣ１０ＡおよびＡＳＧＰＲ−１それぞれへのｓｖＬ４の結合に関する対応する値である０．２４±０．０４μＭおよび０．２１±０．０３μＭを得た（図３Ｄ）。多価であることは、受容体への結合のｋｏｆｆ速度を減少させることによってアビディティを劇的に増加させるが［１２９、１３０］、アビディティは有限値を有し、このことはアッセイにおける徹底的な洗浄のステップのために平衡ＫＤがわずかに上昇し得ることを示唆する。ＡＳＧＰＲ−１に関するＩＣ５０＝４５．６±２．７μＭである多グリコシル化タンパク質のアシアロフェツイン［４９］は、７５μＭでＡＳＧＰＲ−１へのｓｖＬ４（０．２μＭ）の結合を５３％阻害し、これは決定されたＫＤ値と一致した。
【００９４】
実施例３．ＧａｌＮＡｃの模倣物としてのペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリング
[0110]徹底的な特性決定研究は、ペプチドｓｖ６ＤがＧａｌＮＡｃの正真正銘の模倣物であることを実証した。さらに、ｓｖ６ＤはＧａｌＮＡｃ特異的受容体であるＣＬＥＣ１０ＡおよびＡＳＧＰＲ−１に強く結合した（図３Ａ〜３Ｄ）。ｓｖ６ＤのヒトＧａｌＮＡｃ特異的レクチンに結合する能力をさらに検討するために、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分子モデリングを実施した。ＣＬＥＣ１０Ａの結晶構造は報告されていないが、ＡＳＧＰＲ−１（ＣＬＥＣ４Ｈ１）の結晶構造は決定された［１２］。ＣＬＥＣ１０ＡとＡＳＧＰＲ−１との間の広範囲にわたる相同性は、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ  Ｄｅｅｐ  Ｖｉｅｗを用いたＣＬＥＣ１０Ａの適当な構造の生成を可能にした［１０６、１０７］。ＣＡＢＳ−ｄｏｃｋモデリングプログラム［１０５］を使用して、ペプチドがＡＳＧＰＲ−１およびＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るかを予測した。この方法は、事前の割当てを伴わずにタンパク質上の結合部位を検索し、最も可能性の高いペプチド立体構造を定義する。ドッキングプログラムは、ｓｖＬ４をヘアピン立体構造における炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）に収容した（ＲＭＳＤ＝０．８６８Å）。
【００９５】
[0111]図４Ａに示すように、長さ寸法がおよそ糖残基の２倍である、より短いｓｖ６Ｄは、ＡＳＧＰＲ−１のＣＲＤ内に収容された。類似した結合予測を、完全に可動性のペプチドをタンパク質の表面特性に適合させる［１１８、１１９］ブラインド・ドッキングプログラムであるｐｅｐＡＴＴＲＡＣＴ［１１６］およびＭＤｏｃｋＰｅＰ［１１７］を用いて取得した。
【００９６】
[0112]ＡＳＧＰＲ−１、および相同性のためにＣＬＥＣ１０Ａは、正に荷電したペプチドの結合アビディティに静電相互作用を介して寄与し得る酸性ＧａｌＮＡｃ結合部位を有する。ドッキングプログラムは、ＧａｌＮＡｃ残基へのＣ型レクチンの結合を特定する配列Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（ＱＰＤ）（図４Ｂに示される）［１２０、１２１］付近のＡｒｇ（Ｒ）残基を有するペプチドを配向する。マンノース受容体およびＤＣ−ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−３結合ノンインテグリン、ＣＤ２０９）において生じるように［１２２］、マンノースの結合の決定基として説明されている配列であるＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ（ＥＰＮ）へのＱＰＤのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの交換は、ＣＬＥＣ１０Ａへのｓｖ６Ｄの予測された結合を有意には変化させなかった。ペプチドの可動性は、Ａｒｇ残基と負に荷電したＡｓｐまたは付近のＧｌｕとの相互作用を可能にする可能性が高い。
【００９７】
[0113]ＣＡＢＳ−ｄｏｃｋプログラムは、著しく弱い予測結合エネルギーと共に、ＤＣ−ＳＩＧＮへのｓｖ６Ｄのはるかに弱い結合（ＲＭＳＤ＝４．４７７〜７．４０５Å、ＡＳＧＰＲ−１およびＣＬＥＣ１０Ａの０．７６１１〜１．４２１Åと比較）を予測した。ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合の不足は、以下に記載するように、おそらくはＣＲＤ内の受容体のアミノ酸配列の低い相同性に起因する。これらの結果は、ＣＲＤにおけるペプチド結合の特異性が、大半のペプチド−タンパク質相互作用に典型的であるように［１１８］、主としてタンパク質表面の特性によって提供されることを示唆する。Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ由来のＧａｌＮＡｃ特異的レクチンのＣＲＤの立体構造はＣ型レクチンのものに類似しているが［１１１］、カタツムリレクチンはＱＰＤ配列、またはＣＬＥＣ１０Ａとの有意な相同性を欠く。しかしながら、ＣＡＢＳ−ｄｏｃｋプログラムはｓｖ６Ｄの結合に関して予測結合エネルギーΔＧ’＝−３８ｋＪ／ｍｏｌと共にＲＭＳＤ＝１．６０４Åを示した。
【００９８】
実施例４．ペプチドを用いたＤＣおよびＴ細胞の活性化
[0114]ＤＣによって発現されたＣＬＥＣ１０Ａへのペプチドの結合は、Ｔ細胞の成熟および潜在的活性化を刺激すると予想される［１７］。この仮説を、ヒト単球由来ＤＣをＴ細胞と共培養する実験によって検証した。ＤＣによるＣＬＥＣ１０Ａ（ＣＤ３０１）の発現をフローサイトメトリーによって確立した。ｓｖ６Ｄを様々な濃度で培地に添加し、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生をアッセイした。図５Ａに示すように、１０ｎＭ  ｓｖ６Ｄで最大量のＩＦＮ−γが産生された。ＩＦＮ−γの有意な放出は、インキュベーションの３日後、すなわちＤＣ成熟のために必要とされる時間で生じた（図５Ｂ）。これらの結果は、細胞活性に対する効果に最適なｓｖ６Ｄの濃度が図３Ｄと同様の化学結合アッセイから得られるＫＤよりも１桁小さいことを示唆する。
【００９９】
[0115]ｓｖ６Ｄの直接的な作用は、ＣＬＥＣ１０Ａのリガンド誘導エンドサイトーシスに由来する。図３Ｃに示すように、ＣＬＥＣ１０Ａへのｓｖ６Ｄの結合はＣａ２＋を必要とする。多価ペプチドによって結合される場合、通常ではホモ三量体として存在する受容体の内部移行は、複合体を初期エンドソームへもたらす（図６）。エンドソームからのＣａ２＋の搬出、およびその後の小胞の酸性化は、ＣＲＤにおけるＣａ２＋イオンの解離を引き起こし、Ｃａ２＋イオンは、細胞質基質へ輸送され、カルモジュリンによる結合に利用可能となる［１７］。その結果、Ｃａ２＋依存性酵素活性が活性化し、これにはカルシニューリン等のホスファターゼ、カルパイン等のプロテアーゼ、およびＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼβの活性化が含まれる。
【０１００】
[0116]ＣＬＥＣ１０Ａへのリガンドの結合は、受容体のエンドサイトーシス、および細胞へのＣａ２＋の移送を惹起する。シグナル伝達経路はＣａ２＋濃度の増加により活性化し、ホスファターゼおよびキナーゼの活性化をもたらす［１７］。カルシニューリンは、広範な基質特異性を有するホスファターゼであり、活性に関してＣａ２＋を必要とし、下流の中間体の急速な脱リン酸化の誘導のための容易な機構を提供する。反対に、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼβは、リン酸化によってＡＭＰ活性化キナーゼを活性化させ、タンパク質、すなわちインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）の活性を増強する［１３１、１３２］。ＳＴＩＮＧの活性化は、ＩＦＮ−βの発現および放出、ならびに抗感染性かつ抗癌性の自然免疫応答をもたらす。したがって、ＣＬＥＣ１０Ａのリガンドによって媒介されるＣａ２＋の流入は、ＩＦＮ−βの産生の増加を支持し得る。
【０１０１】
[0117]ＩＦＮ−βの抗癌活性は精力的な探求の対象となっている［７８、７９、８６］。ｓｖ６ＤがＳＴＩＮＧ経路を活性化することができるか否かを決定するために、ＩＳＧ５４（インターフェロン刺激遺伝子）プロモーターの制御下でルシフェラーゼに関するレポーター遺伝子を発現するレポーター細胞として遺伝子操作されたヒトＴＨＰ１単球（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ｓｖ６Ｄ、およびＳＴＩＮＧを結合することが公知の環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）と共にインキュベートした。これらの細胞は培地中にルシフェラーゼを分泌し、このことは発光反応によってアッセイすることができる。図１２Ｂに示すように、反応による検出可能な光の生成を達成するために、ＣＤＮのマイクロモル濃度を必要とした。
【０１０２】
[0118]ｓｖ６Ｄ−ＣＤＮコンジュゲートが１型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）の産生のためのＳＴＩＮＧ経路の活性化を誘導する能力を、レポーター細胞として遺伝子操作されたヒトＴＨＰ１単球（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をコンジュゲートと共にインキュベートすることによって試験した。ＳＴＩＮＧ経路の活性化は酵素、すなわちルシフェラーゼの分泌を引き起こし、このことは供給業者の説明書によって説明されるように培地においてアッセイすることができる。この経路の最初のステップは細胞の細胞質にあるため、細胞質基質によるｓｖ６Ｄの利用が必須であり、このことは図１１Ａ〜１１Ｂに例示されるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化によって実証された。ルシフェラーゼ活性は、ナノモル範囲の濃度のｓｖ６Ｄ−環状ジヌクレオチドコンジュゲートと共にインキュベートした培養の培地において検出されたが、環状ジヌクレオチドを用いた細胞の処理は、ルシフェラーゼ活性を検出するためにマイクロモル範囲の濃度を必要とした（図１２Ｂ）。理論に拘束されることを望むものではないが、環状ジヌクレオチドが細胞膜を十分に通過しないことを考慮すると、コンジュゲートによるより低い濃度での経路の誘導における最も重要な要因は、受容体に媒介された細胞への侵入である可能性が高かった。環状ジヌクレオチドに関するＳＴＩＮＧタンパク質のＫＤはおよそ５μＭである［１０８、１０９］。しかしながら、ルシフェラーゼはナノモル濃度のｓｖ６Ｄ−ＣＤＮコンジュゲートと共にインキュベートした細胞の培地において検出された。データは、ペプチドｓｖ６Ｄが活性化因子を送達することにおいて天然リガンドそれ自体よりも桁違いに効果的であることを示唆する。
【０１０３】
実施例５．健康なマウスの腹膜腔における免疫細胞の応答
[0119]ペプチドの生理活性をｉｎ  ｖｉｖｏで探索するために、ペプチドをマウスに皮下注射した。細胞集団の微小な変化が健康な動物の血液において観察された。対照的に、腹膜洗浄における総細胞の分析により、Ｂａｌｂ／ｃマウスは小細胞の大きな集団（低ＦＳｃ）と細胞内の微小な複雑性（低ＳＳｃ）とを含有したが、この細胞の集団はＣ５７ＢＬ／６マウスでは微小であったことが明らかとなった。これらの観察は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹膜細胞は高い「リンパ球」対「マクロファージ」比を発現するが、Ｃ５７ＢＬ系統ではその逆が生じるというＦｅｓｔｉｎｇら［１３３］の結果を裏付ける。ペプチドの注射後の２４時間以内に、小細胞の集団はＢａｌｂ／ｃマウスでは大部分が消滅したが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは増加した。これらの細胞を同定する試みは、これらの細胞が、増殖がペプチドを用いた処置に高度に応答性である骨髄前駆細胞集団を含むことを示唆した。
【０１０４】
[0120]増加が成熟免疫細胞において生じるかを検査するために、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスからの腹膜細胞を、表１に記載したマーカーで細胞を染色した後にフローサイトメトリーによって分析した。マクロファージ、ＤＣ、Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の数倍の増加がＢａｌｂ／ｃマウスへのｓｖＬ４（１ｎｍｏｌ／ｇ）の単回注射の２４時間後に見出されたが、有意な増加はＣ５７ＢＬ／６マウスへの２回目の注射後にのみ生じた。この観察をより徹底的に探索するために、ｓｖＬ４またはｓｖ６ＤをＣ５７ＢＬ／６マウスに、０、２、または４日目に注射した。腹膜細胞を各注射の２４時間後にフローサイトメトリーによって検査した。図７Ａ〜７Ｄに、Ｆ４／８０  ＣＤ１１ｂ  ＣＤ８６（成熟活性マクロファージ）；ＣＤ１１ｃ（ＤＣ）；ＣＤ１１ｃ  ＣＤ８６（活性化ＤＣ）；ＣＤ４  ＣＤ６９（活性化Ｔ細胞）；ＣＤ８  ＣＤ６９（活性化細胞傷害性Ｔ細胞）；ＮＫ１．１  ＣＤ３＋  ＣＤ６９（活性化ＮＫＴ細胞）；ＮＫ１．１  ＣＤ３−  ＣＤ６９（活性化ＮＫ細胞）；ＣＤ１９（Ｂ細胞）；およびＣＤ１９  ＣＤ７３  ＣＤ８０  ＣＤ２７３（メモリーＢ細胞）の細胞数として表した結果を示す。これらの成熟活性化細胞の数は、各注射と共に増加し続けた。全体として、ｓｖ６Ｄに対する応答はｓｖＬ４に対する応答よりも大きく、ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋、およびＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ８６＋）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋）、ならびにＮＫＴ細胞（ＮＫ１．１、ＣＤ３＋）の大きな増加を伴ったが、ＣＤ１９＋Ｂ細胞はｓｖＬ４により強く応答した。平均蛍光強度は有意には変化せず、ペプチドが成熟細胞集団の増大を促進したことを示唆した。対照として、ｓｖＬ４およびｓｖ６Ｄによって誘導した腹膜細胞集団の増大を、図２Ａに示すようにＣＬＥＣ１０Ａに結合しないｓｖＣ１の場合と比較した。ｓｖＣ１を用いて処置した動物からの特異的細胞型の集団は、５日の期間にわたって有意には増加しなかった。これらのデータは、マウスにおいて、低用量のｓｖＬ４およびｓｖ６Ｄが腹膜腔における成熟活性免疫細胞の数倍の増加を誘導したことを実証する。
【０１０５】
[0121]ｓｖＬ４の標的が、単球の活性化を達成するその後のクロストークシグナル伝達を伴うリンパ球に位置するかを決定するために、組換え活性化遺伝子であるｒａｇの活性を欠くＲＡＧ−／−マウスにｓｖＬ４を注射する実験を実施した。組換えを実施してＶ（Ｄ）Ｊ組換えによる抗原特異的抗体を生成する能力は、ＢおよびＴ細胞前駆体がその表面に機能性抗原受容体を産生するために必要とされ、機能性ｒａｇ遺伝子を有しない場合、これらの細胞はアポトーシスを起こす［１３２］。ｓｖＬ４を用いた処置に対するＲＡＧ−／−マウスの腹膜腔における単球の応答は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける反応と本質的に同じであった。ＢおよびＴ細胞の欠損は単球の成熟を低下させず、ｓｖＬ４が骨髄系統内の標的に作用することを示唆した。
【０１０６】
実施例６．卵巣癌のマウスモデルにおけるペプチドの有効性
[0122]ペプチドに対する腹腔免疫細胞の強い応答のため、本発明者らはペプチドが腹膜臓器の癌を処置するのに効果的となり得るかを試験した。マウス卵巣癌細胞株（ＩＤ８）をＣ５７ＢＬ／６雌マウスの腹膜腔に、０日目に移植した。この系において、腹膜腔における腫瘍進行は、初めは緩慢であるが、その後急速に進行し、最終的に腹水の蓄積を伴う［１１０］。肉眼で観察される腫瘍の起源細胞（seeds）が存在する場合（それは大半の女性が診断されるステージと類似している［１３４、１３５］）、ｓｖ６Ｄを用いた処置を慣例的に移植の４５日後に開始した。癌の進行は、腹水蓄積の指標としての動物の体重によってモニタリングした。
【０１０７】
[0123]ｓｖ６Ｄの有効性を、微小管を安定化させ、動原体の機能を妨害し、細胞を有糸分裂のＧ２／Ｍ境界期で停止させる［９５、９６］、標準治療の化学療法薬であるパクリタキセルの有効性と比較した。図８Ａ〜８Ｃに例示される実験において、疾患の進行は急速であり、腹水蓄積の証拠は処置を開始した４５日目に既に観察されていた。処置の２週間後、数匹の対照マウスの疾患は既に末期まで進行していたが、０．１ｎｍｏｌ／ｇ体重の用量のｓｖ６Ｄまたはパクリタキセルを用いて処置したマウスの重量は、有意には増加していなかった。この観察は、最初に明らかとなったとき、ｓｖ６Ｄを用いた処置が腹水の蓄積を抑制することを示唆した。
【０１０８】
[0124]次いで、本発明者らはｓｖ６Ｄがパクリタキセルと組み合わせて効果的となり得るかを調べた。本研究において、疾患は比較的緩慢に進行し、末期の中央値は１２２日目であった。処置を４５日目に開始した場合、ｓｖ６Ｄは再び腹水の蓄積を抑制し、１２０日目の半分の動物で有意な重量増加を伴わなかった（図８Ｂ）。０．１ｎｍｏｌ／ｇの用量でのｓｖ６Ｄの有効性はパクリタキセルの有効性に匹敵し、生存中央値はおよそ１４１日であった（図８Ｃ）。癌細胞は最終的にパクリタキセル処置から逃れるため、これらの結果は、パクリタキセルを用いた処置の５０日後で、この群において腹水の蓄積が最初に観察された１００日目にｓｖ６Ｄを用いた処置の開始をもたらした。その後の３週間にわたって、ｓｖ６Ｄの隔日での注射は、動物の重量のさらなる増加を完全に抑制した（図８Ｂ）。ｓｖ６Ｄを用いた継続した処置の結果、１６９日の中央値まで、動物の生存の劇的な延長をもたらした（図８Ｃ）。
【０１０９】
[0125]ペプチドｓｖ６Ｄは、全生存を延ばすための化学療法薬の有効性を増強するのにきわめて効果的である。パクリタキセルは現在、微小管を安定化させ、細胞を細胞周期のＧ２／Ｍ境界期で停止させることによって作用する化学療法薬として使用されている［９５、９６］。細胞分裂の阻害は腫瘍の成長を妨げるが、薬物の効力は、薬物が体から排出されるにつれて徐々に消失する。パクリタキセルは多くの場合、ＤＮＡに結合して複製を阻止するプラチナ系薬物と組み合わされる［９７、９８］。これらの薬物を用いて処置された患者は、著しいレベルの毒性を経験する。反復投薬は多くの場合、薬物への耐性をもたらす。本発明者らのデータは、ｓｖ６Ｄが毒性を付与しない効果的な組合せ薬として役立ち得ることを示す。全生存期間は、パクリタキセルを用いた処置に続いてｓｖ６Ｄを用いた処置が行われる場合、倍加する。しかしながら、ｓｖ６Ｄは免疫細胞の増殖を誘導するため、処置の開始は、パクリタキセルの細胞周期阻害作用が消失するまで遅延された［９９］。
【０１１０】
実施例７．抗ＰＤ−１と組み合わせたｓｖ６Ｄの有効性
[0126]ペプチドｓｖ６Ｄは、全生存を延ばすための免疫療法薬の有効性を増強するのにもきわめて効果的である。モノクローナル抗マウスＰＤ−１の腹腔内注射は、卵巣癌モデルのマウスにおいて適度に効果的である［１０２、１０３］。本発明者らは、ｓｖ６Ｄが抗ＰＤ−１の効力を延長し得るかを試験した。５用量の抗ＰＤ−１（ＰＢＳ中２００μｇ）を４１から４９日目の間、隔日で腹腔内注射した。ｓｖ６Ｄを、抗ＰＤ−１を用いた処置の直後に皮下注射し、研究の終了まで隔日で継続した（図９Ａ、群３）。抗ＰＤ−１を用いて処置した群へのｓｖ６Ｄの投与を、動物の重量が増加し始めた後、８７日目まで遅延させた場合（群５）、腹水形成の本質的に完全な抑制が数週間持続した。
【０１１１】
[0127]具体的には、図９Ａに示す研究において、抗ＰＤ−１単独の注射（群１）は、対照としてのビヒクルであるＰＢＳの注射（群８）を有意に超える寿命の延長をもたらさなかった。対照的に、ｓｖ６Ｄの隔日の注射（群７）は最長の生存を実現した。抗ＰＤ−１とｓｖ６Ｄとの組合せ（群４）もまた最長の生存を実現し、ｓｖ６Ｄが免疫療法薬である抗ＰＤ−１に応答しない個体を救済できることを実証した。ｓｖ６Ｄを用いた１週間の処置の後に１週間の休止期間を有する群６は、ＰＢＳを用いて処置した動物よりもわずかに長く生存するのみであった。この観察は、ＤＣのＣ型レクチン受容体に対する抗体を用いた処置後１週間以内にマウスにおいて観察されたＴ細胞の非応答性に類似しているようである［１７、１３６］。処置は動物の生存の高度に有意な延長を実現した（図９Ｂ）。
【０１１２】
[0128]卵巣癌を有する患者は、阻害性受容体ＰＤ−１に対する抗体（ヒト療法におけるペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｕｍａｂ）またはニボルマブ）を用いた処置の間、１５％の全奏効率を有する［１００、１０１］。抗体はマウスモデルにおいて非常に適度な効力を呈する［１０２、１０３］。ペプチドｓｖ６Ｄ単独は、抗ＰＤ−１よりも大幅に腹水の蓄積を阻害し、抗体との組合せにおいても効果的であった。本発明者らのペプチド薬は、「高い奏効率と関連しない卵巣癌においては特に重要であるが、抗癌処置は、低医療費、低毒性、および高「利益」（抗腫瘍応答）と関連する場合、優れていると考えられる」と結論したＨａｍａｎｉｓｈｉら［１０４］によって記載される基準を満たす。
【０１１３】
実施例８．ペプチド処置の毒性
[0129]重量増加は、腹膜腔に播種した卵巣癌の本モデルにおける疾患進行の良好な尺度であるが、平均群重量の考察は複雑である。これはそのままの生物学的モデルであるため、固有のばらつきが存在する。処置群内の個々の動物の疾患が進行するにつれ、処置群内の重量のばらつきは大きくなる。個々の動物が末期の疾患に達し、安楽死させる場合、平均群重量は低下することがあり、群内のばらつきは小さくなる。この複雑性を考慮すると、処置群内の疾患の進行の低減が統計的有意性を達成した重量の差に反映されているいくつかの事例が残っていた。
【０１１４】
[0130]薬物投与中および薬物投与後、マウスの行動に変化はなく、ペプチド処置に関係する明白な毒性がないことを示したということを指摘することは重要である。さらに、同じ領域へのペプチドの反復注射は、結果として線維組織または肉芽腫組織の明らかな炎症も形成も生じなかった。ペプチドを結合する抗体を、１ｎｍｏｌ／ｇのｓｖＬ４またはｓｖ６Ｄを隔日で３か月間注射したマウスからの血清において検出する試みは陰性であり（図１０）、このことはペプチドがマウスにおいて抗原性ではないことを示した。
【０１１５】
[0131]ｓｖ６Ｄはマウスにおいて抗原性ではないが（図１０）、ペプチドがＤＣの細胞質基質に到達するかを決定することは重要である。ｓｖ６ＤがＴＨ１応答を開始し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するかを試験するために、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ３５−５５）の断片をｓｖ６ＤのＣ末端に付着させ、マウスに注射した。０．１ｎｍｏｌ／ｇのペプチドの２回目の週１回の注射の１週間後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、コンジュゲートにｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露した。図１１Ａに示すように、ＩＦＮ−γの強い放出が両種のＴ細胞で生じた。高レベルのＩＬ−２もまたＣＤ４＋Ｔ細胞によって放出された（図１１Ｂ）。これらの観察は、ワクチン接種、およびクローンＴ細胞増殖の刺激に対する強い応答に典型的である。「ビヒクル」であるｓｖ６Ｄは、ｓｖ６Ｄ−ＭＯＧを用いて処置した動物由来の細胞からでさえＩＦＮ−γ放出を誘導せず、抗原であるＭＯＧ３５−５５もまた、ｓｖ６Ｄに付着していない場合は同様であった。ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答は、コンジュゲートが細胞質基質、および交差提示によってＭＨＣクラスＩ経路に実際に到達したことを示唆した［９３］。エンドソーム経路内において、コンジュゲートを、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化のためにＭＨＣクラスＩＩ複合体にも負荷した［９４］。
【０１１６】
[0132]ペプチドが細胞傷害性サイトカインの有意な放出を誘導したかを決定するために、乳癌４Ｔ１細胞を移植した雌Ｂａｌｂ／ｃマウスから血清を収集した。腫瘍が１０〜１２日の期間にわたり約５００ｍｍ３のサイズに成長した後、ｓｖＬ４を０．１または１．０ｎｍｏｌ／ｇの用量で皮下注射した。注射の４時間後に血清を調製し、３０８種のサイトカイン／ケモカインのアレイを用いて分析した。処置マウス対非処置マウスの選択されたサイトカインの量の比を表２に記載する。
【０１１７】
[0133]いくつかのサイトカインは非処置マウスにおいて無視できる値を有し、それゆえに処置動物（低い場合であれ）対非処置動物の比は高い値を有した。健康なＢａｌｂ／ｃマウスを用いた別個の実験において取得した処置試料対非処置試料の比を比較のために表２の右側の欄に示す。ペプチドを用いて処置した健康なマウスの血清における最も著しい増加は、可溶性ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエーター、ＴＮＦＲＳＦ１４とも称される）の量にあり、これは血清中に顕著なタンパク質であり、処置後４時間以内でおよそ１０倍増加した。腫瘍を有するマウスでは、処置動物における可溶性ＨＶＥＭのレベルは健康な処置マウスにおけるレベルと同等であったが、非処置動物におけるレベルは健康な対照マウスにおけるレベルよりも高かった。興味深いことに、腫瘍を有するマウスにおいて大きく上昇したサイトカインは多くの場合、ｓｖＬ４に応答して健康なマウスにおいては減少したか、または変化を示さなかった。血清における炎症性サイトカインの量は毒性レベルに達していないようであった。
【０１１８】
[0134]重要なことに、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を放出したＴ細胞は、曝露した場合、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはＴＮＦ−αのいずれに関しても有意な量を放出しなかった。これらのデータは、ｓｖ６ＤがＩＬ−４、ＩＬ１０、およびＩＬ−１３等の免疫抑制性サイトカインを生成せずに液性応答を開始することができることを示す。ＤＣによるＴ細胞の活性化は、抗原に対する抗体の生成の最初のステップである。
【０１１９】
実施例９．ｓｖ６Ｄによる薬物のＣＬＥＣ１０Ａ発現細胞へのターゲティング
スキーム１．化学物質を送達するビヒクルとしてのｓｖ６Ｄ
[0135]ペプチドの合成中、Ｃ末端をいくつかの手段によって修飾してもよい。第１に、アミノ酸であるシステインを付加してＣ末端にスルフヒドリル基を付与する。この−ＳＨ基に、−ＳＨ基を有する別の化合物を酸化によって連結して−Ｓ−Ｓ−基にしてもよい。さらに、ヨード基を含有する化合物は、Ｃ末端システインの−ＳＨ基と反応して、いくつかの異なる種類、例えば色素、メチルアクリレート等の反応基を含有する化合物等を連結してもよい。
【０１２０】
【化１】
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【０１２１】
スキーム２．ＳＴＩＮＧ経路の活性化のための環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）の付着
[0136]Ｃ末端カルボキシル基を有するように作られたＮ−アセチル化ペプチドは、カルボジイミド誘導体により別の分子のＮ末端アミノ基に連結することができる。したがって、アミノ基を含有する、ＳＴＩＮＧのリガンドであるＣＤＮ［７９］をｓｖ６ＤのＣ末端カルボキシル基に連結した。このコンジュゲートを、レポーター細胞株ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いて試験し、ＩＦＮ−βを生じるＳＴＩＮＧ経路を活性化することにおいてＣＤＮそれ自体よりも５００倍効果的であることを見出した。
【０１２２】
[0137]ｓｖ６Ｄ−ＣＤＮコンジュゲートが１型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）の産生のためのＳＴＩＮＧ経路の活性化を誘導する能力を、レポーター細胞として遺伝子操作されたヒトＴＨＰ１単球（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をコンジュゲートと共にインキュベートすることによって試験した。ＳＴＩＮＧ経路の活性化は酵素、すなわちルシフェラーゼの分泌を引き起こし、このことは供給業者の説明書によって説明されるように培地においてアッセイすることができる。この経路の最初のステップは細胞の細胞質にあるため、細胞質基質によるｓｖ６Ｄの利用が必須であり、このことは図１１に例示されるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化によって実証された。ルシフェラーゼ活性は、ナノモル範囲の濃度のｓｖ６Ｄ−環状ジヌクレオチドコンジュゲートと共にインキュベートした培養の培地において検出されたが、環状ジヌクレオチドを用いた細胞の処理は、ルシフェラーゼ活性を検出するためにマイクロモル範囲の濃度を必要とした（図１２）。環状ジヌクレオチドが細胞膜を十分に通過しないことを考慮すると、コンジュゲートによるより低い濃度での経路の誘導における最も重要な要因は、受容体に媒介された細胞への侵入である可能性が高かった。環状ジヌクレオチドに関するＳＴＩＮＧタンパク質のＫＤはおよそ５μＭであり［１０８、１０９］、このことは、ペプチドｓｖ６Ｄが活性化因子を送達することにおいて天然リガンドそれ自体よりも桁違いに効果的であることを示唆する。
【０１２３】
[0138]ｓｖＬ４に関しては、活性結合配列はＣ末端の６アミノ酸であるため、Ｎ末端側半分は、アミノ基と反応する化合物を付着させるリンカーとして役立ち得る。例えば、カルボキシル基を有する化合物は、カルボジイミド誘導体によりペプチドのＮ末端アミノ基に連結することができる（図１５）。したがって、カルボキシル基を含有する、マウスＳＴＩＮＧのリガンドである分子のＤＭＸＡＡ（５，６−ジメチルキサンテノン−酢酸）［１３２］をｓｖ６ＤのＮ末端アミノ基に連結した。このコンジュゲートは、ＳＴＩＮＧを結合し、ＩＦＮ−βを生じる経路を活性化する。
【０１２４】
スキーム３．細胞毒性薬であるドキソルビシンのカップリング
[0139]アセチル化Ｎ−末端、およびアミノ基を有するＣ末端リンカーと合成したｓｖ６Ｄを、ドキソルビシンと、そのアミノ基を介してグルタルアルデヒドとの反応によってカップリングさせた。腫瘍細胞および免疫抑制マクロファージにおけるＣＬＥＣ１０Ａの発現は、ｓｖ６Ｄにコンジュゲートしたドキソルビシン等の細胞毒性薬をターゲティングすることによってこれらの細胞の数を減少させる機会を提供する。ドキソルビシンは、毒性だが強力な抗癌薬であり、細胞特異的送達により提供される場合、副作用を軽減する一方で有効性を高めることができる［１３７］。
【０１２５】
スキーム４．光増感薬であるクロリンｐ６のｓｖ６Ｄへの付着
[0140]Ｎ末端アセチル基とＣ末端における遊離アミノ基とを有するｓｖ６Ｄを調製した。プルプリン−１８は求核性アミン基と容易に反応する無水物基を含有し、結果としてペプチドと誘導体であるクロリンｐ６との間のアミド連結をもたらす（図１４Ａ〜１４Ｂ）。クロロフィル誘導体は、赤色光に曝露された場合、細胞死滅の強力な光増感薬であり、クロリンｐ６に関するＩＣ５０は３０ｎＭである［９０］。コンジュゲートの利点は、光増感薬を、ＣＬＣ１０Ａを発現する腫瘍細胞にターゲティングして、選択的に赤色光に曝露することができることである。クロリンは暗所においては毒性ではない。
【０１２６】
参考文献
【０１２７】
【表３−１】
2021509679.tif 000006
【０１２８】
【表３−２】
2021509679.tif 000007
【０１２９】
【表３−３】
2021509679.tif 000008
【０１３０】
【表３−４】
2021509679.tif 000009
【０１３１】
【表３−５】
2021509679.tif 000010
【０１３２】
【表３−６】
2021509679.tif 000011
【０１３３】
【表３−７】
2021509679.tif 000012
【０１３４】
【表３−８】
2021509679.tif 000013
【０１３５】
【表３−９】
2021509679.tif 000014
【０１３６】
【表３−１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021509679.tif 000037
2021509679.tif 000038