(57)【要約】本発明は、二重特異性抗原結合分子ならびに関連融合タンパク質及びコンジュゲートに関する。詳細には、本発明は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の両方について特異性を有する二重特異性抗原結合分子ならびに関連融合タンパク質及びコンジュゲートに関する。さらなる一態様では、本発明は、コンジュゲートした免疫グロブリン様サメ可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）式（Ｉ）：
ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４    （Ｉ）
によって表されるアミノ酸配列
［式中、
ＦＷ１は、フレームワーク領域であり、
ＣＤＲ１は、ＣＤＲ配列であり、
ＦＷ２は、フレームワーク領域であり、
ＨＶ２は、超可変配列であり、
ＦＷ３ａは、フレームワーク領域であり、
ＨＶ４は、超可変配列であり、
ＦＷ３ｂは、フレームワーク領域であり、
ＣＤＲ３は、ＣＤＲ配列であり、
ＦＷ４は、フレームワーク領域である］を含む受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）特異性抗原結合分子と、
（ｉｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）特異性抗原結合分子と
を含む二重特異性抗原結合分子、またはその機能性バリアント。
【請求項２】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２（ＲＯＲ２）に結合しない、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子がヒトＲＯＲ１及びマウスＲＯＲ１（ｍＲＯＲ１）の両方に結合する、請求項１または請求項２のいずれかに記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が脱グリコシル化ＲＯＲ１に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が、
ＹＭＥＳＬＨＭＱＧＥＩＥＮＱＩ（配列番号３４）
ＣＱＰＷＮＳＱＹＰＨＴＨＴＦＴＡＬＲＦＰ（配列番号３５）
ＲＳＴＩＹＧＳＲＬＲＩＲＮＬＤＴＴＤＴＧＹＦＱ（配列番号３６）
ＱＣＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＰＰＴＡＳＰＧＹＳＤＥＹＥ（配列番号３７）
から選択される直鎖ペプチド配列に結合しない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
ＦＷ１が、２０〜２８アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＣＤＲ１が、ＤＴＳＹＧＬＹＳ（配列番号１）、ＧＡＫＹＧＬＡＡ（配列番号２）、ＧＡＫＹＧＬＦＡ（配列番号３）、ＧＡＮＹＧＬＡＡ（配列番号４）、またはＧＡＮＹＧＬＡＳ（配列番号５）から選択されるＣＤＲ配列であり、
ＦＷ２が、６〜１４アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＨＶ２が、ＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧ（配列番号６）、ＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳ（配列番号７）、またはＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳ（配列番号８）から選択される超可変配列であり、
ＦＷ３ａが、６〜１０アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＨＶ４が、ＮＫＲＡＫ（配列番号９）、ＮＫＲＴＭ（配列番号１０）、ＮＫＧＡＫ（配列番号１１）、またはＮＫＧＴＫ（配列番号１２）から選択される超可変配列であり、
ＦＷ３ｂが、１７〜２４アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＣＤＲ３が、ＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹ（配列番号１３）、ＱＳＧＭＡＩＤＩＧＳＧＨＧＹＮＷＹ（配列番号１４）、ＹＰＷＡＭＷＧＱＷＹ（配列番号１５）、ＶＦＭＰＱＨＷＨＰＡＡＨＷＹ（配列番号１６）、ＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹ（配列番号１７）、またはＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹ（配列番号１８）から選択されるＣＤＲ配列であり、
ＦＷ４が、７〜１４アミノ酸のフレームワーク領域である
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、またはそれに対して少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアント。
【請求項７】
ＦＷ１が、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号１９）、ＡＫＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号２０）、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴ（配列番号２１）、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号２２）、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴ（配列番号２３）、またはＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴ（配列番号２４）から選択され、ＦＷ２が、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧ（配列番号２５）、またはＴＹＷＹＲＫＮＰＧ（配列番号２６）から選択され、ＦＷ３ａが、ＧＲＹＶＥＳＶ（配列番号２７）、またはＧＲＹＳＥＳＶ（配列番号２８）から選択され、ＦＷ３ｂが、ＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号２９）、ＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡ（配列番号３０）、またはＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号３１）から選択され、かつＦＷ４が、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３２）、またはＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３３）から選択される、請求項６に記載の二重特異性抗原結合分子、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアント。
【請求項８】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が、
ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３９）、
ＡＫＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＤＩＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４０）、
ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡＫＹＧＬＡＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＹＰＷＡＭＷＧＱＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４１）、
ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡＫＹＧＬＦＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＶＦＭＰＱＨＷＨＰＡＡＨＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４２）、
ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４３）、
ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡＮＹＧＬＡＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４４）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＧＡＮＹＧＬＡＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＴＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４５）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＧＡＮＹＧＬＡＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４６）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４７）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＴＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４８）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４９）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアント。
【請求項９】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子がヒト化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が脱免疫化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
検出可能な標識、色素、毒素、薬物、プロドラッグ、放射性核種または生物学的活性分子にコンジュゲートされている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が、約０．０１〜５０ｎＭ、好ましくは０．１〜３０ｎＭ、さらにより好ましくは０．１〜１０ｎＭの親和定数でＲＯＲ１タンパク質と選択的に相互作用する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
ＲＯＲ１発現腫瘍細胞の殺滅を媒介することができる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
がん細胞増殖を阻害することができる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
ＲＯＲ１に結合した際に、形質膜陥入されることができる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
結合した際に、ＲＯＲ１またはＥＧＦＲを下方制御することができる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
ＲＯＲ１またはＥＧＦＲシグナル伝達を下方制御することができる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子を含む、組み換え融合タンパク質。
【請求項１９】
前記二重特異性抗原結合分子が１種または複数の生物学的活性タンパク質に融合している、請求項１８に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項２０】
前記特異性抗原結合分子が、１種または複数のリンカードメインを介して１種または複数の生物学的活性タンパク質に融合している、請求項１９に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項２１】
少なくとも１種の生物学的活性タンパク質が、免疫グロブリン、免疫グロブリンＦｃ領域、免疫グロブリンＦａｂ領域、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、インテイン、ＶＮＡＲドメイン、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨドメイン、またはスキャフォールドタンパク質である、請求項１９または２０のいずれかに記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項２２】
少なくとも１種の生物学的活性タンパク質が免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項２１に記載の組み換え融合タンパク質。
【請求項２３】
少なくとも１つの膜貫通領域及び少なくとも１つの細胞内ドメインに融合またはコンジュゲートした請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１種の二重特異性抗原結合分子を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２４】
好ましくは操作Ｔ細胞である、請求項２３に記載のキメラ抗原受容体を含む細胞。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸配列。
【請求項２６】
任意選択で、１つまたは複数の制御配列をさらに含む、請求項２５に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２８】
二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体を調製するための方法であって、請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、前記宿主細胞が前記結合分子を産生するような条件下で培養または維持することを含み、任意選択で、前記結合分子を単離することをさらに含む、前記方法。
【請求項２９】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体を含む、医薬組成物。
【請求項３０】
治療において使用するための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体。
【請求項３１】
がんの処置において使用するための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体。
【請求項３２】
前記がんがＲＯＲ１陽性がん種である、請求項３１に記載の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体。
【請求項３３】
前記がんが、リンパ腫及び白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液がん、ならびに神経芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、皮膚癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌または肝臓癌を含む固形腫瘍を含む群から選択される、請求項３１に記載の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体。
【請求項３４】
疾患を処置することを、それを必要とする患者において行うための医薬品の製造における、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体の使用。
【請求項３５】
処置を必要とする患者において疾患を処置する方法であって、前記患者に、治療上有効な投薬量の請求項１〜２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質もしくはキメラ抗原受容体、または請求項２９に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３６】
前記疾患ががんである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記がんがＲＯＲ１陽性がん種である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記がんが、リンパ腫及び白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液がん、ならびに神経芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、皮膚癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌または肝臓癌を含む固形腫瘍を含む群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
試料における標的分析物の存在をアッセイする方法であって、検出可能に標識された請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、または請求項１８〜２２に記載の態様の組み換え融合タンパク質を前記試料に添加すること、及び前記標的分析物への前記分子の結合を検出することを含む、前記方法。
【請求項４０】
対象において疾患の部位を撮像する方法であって、検出可能に標識された請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子または検出可能に標識された請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の組み換え融合タンパク質を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４１】
対象において疾患または医学的状態を診断する方法であって、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項１８〜２２に記載の組み換え融合タンパク質を投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
ＲＯＲ１への結合について、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異性抗原結合分子と競合する抗体、抗体断片もしくは抗原結合分子、またはＲＯＲ１及び／またはＥＧＦＲへの結合について、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子と競合するＲＯＲ１及びＥＧＦＲ二重特異性抗体、ＲＯＲ１及びＥＧＦＲ二重特異性抗体断片もしくはＲＯＲ１及びＥＧＦＲ二重特異性抗原結合分子。
【請求項４３】
がんに罹患している対象、もしくはその素質を診断する、または前記対象の状態の予後を得るためのキットであって、被験者からの試料中に存在する抗原の濃度を検出するための検出手段を含み、前記検出手段が、それぞれ任意選択で誘導体化されている請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の組み換え融合タンパク質、請求項２３に記載のＣＡＲ、または請求項２５に記載の核酸を含み、前記試料中の抗原の存在が、前記対象ががんに罹患していることを示唆する、前記キット。
【請求項４４】
前記抗原が、ＲＯＲ１タンパク質、より好ましくはその細胞外ドメインを含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記試料におけるＲＯＲ１陽性細胞の存在または非存在を同定する、または前記試料におけるその濃度を決定するために使用される、請求項４３に記載のキット。
【請求項４６】
アッセイが比較される陽性対照及び／または陰性対照を含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４７】
検出され得る標識をさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４８】
がんに罹患している対象、もしくはその素質を診断する、または前記対象の状態の予後を得るための方法であって、対象から得られた試料中に存在する抗原の濃度を検出することを含み、前記検出が、それぞれ任意選択で誘導体化されている請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の態様の組み換え融合タンパク質、請求項２３に記載のＣＡＲ、または請求項２５に記載の核酸配列を使用して達成され、前記試料中の抗原の存在が、前記対象ががんに罹患していることを示唆する、前記方法。
【請求項４９】
インビトロで、または患者において、ＲＯＲ１を発現する細胞を殺滅する、またはその成長を阻害する方法であって、前記細胞に、薬学的有効量または用量の（ｉ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の態様の組み換え融合タンパク質、請求項２５に記載の核酸、または請求項２３もしくは２５に記載のＣＡＲもしくは細胞、あるいは（ｉｉ）請求項２９に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５０】
前記ＲＯＲ１を発現する細胞ががん細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＲＯＲ１がヒトＲＯＲ１である、請求項４９または５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
インビトロで、または患者において、ＥＧＦＲを発現する細胞を殺滅する、またはその成長を阻害する方法であって、前記細胞に、薬学的有効量または用量の（ｉ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の態様の組み換え融合タンパク質、請求項２５に記載の核酸、または請求項２３もしくは２５に記載のＣＡＲもしくは細胞、あるいは（ｉｉ）請求項２９に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５３】
前記ＥＧＦＲを発現する細胞ががん細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
インビトロで、または患者において、ＲＯＲ１及びＥＧＦＲを発現する細胞を殺滅する、またはその成長を阻害する方法であって、前記細胞に、薬学的有効量または用量の（ｉ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の態様の組み換え融合タンパク質、請求項２５に記載の核酸、または請求項２３もしくは２５に記載のＣＡＲもしくは細胞、あるいは（ｉｉ）請求項２９に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５５】
前記ＲＯＲ１及びＥＧＦＲを発現する細胞ががん細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
式（ＩＩ）：
Ｘｂ−Ｘ−Ｘａ−ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４−Ｙａ−Ｙ−Ｙｂ  （ＩＩ）
によって表されるアミノ酸配列
［式中、
ＦＷ１は、フレームワーク領域であり、
ＣＤＲ１は、ＣＤＲ配列であり、
ＦＷ２は、フレームワーク領域であり、
ＨＶ２は、超可変配列であり、
ＦＷ３ａは、フレームワーク領域であり、
ＨＶ４は、超可変配列であり、
ＦＷ３ｂは、フレームワーク領域であり、
ＣＤＲ３は、ＣＤＲ配列であり、
ＦＷ４は、フレームワーク領域であり、
ここで、Ｘａ、Ｘｂ、Ｙａ及びＹｂは、存在しないか、またはＥＧＦＲ特異性結合分子であるかのいずれかであり、
Ｘａ、Ｘｂ、Ｙａ及びＹｂのうちの少なくとも１個は、ＥＧＦＲ特異性結合分子であり、
Ｘ及びＹは、任意選択のアミノ酸配列である］
を含む二重特異性抗原結合分子であって、前記二重特異性抗原結合分子が第２の部分にコンジュゲートしている、前記二重特異性抗原結合分子。
【請求項５７】
ＸまたはＹは個々に、存在しないか、または免疫グロブリン、免疫グロブリンＦｃ領域、免疫グロブリンＦａｂ領域、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、インテイン、ＶＮＡＲドメイン、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨドメイン、もしくはスキャフォールドタンパク質を含む群から選択されるかのいずれかである、請求項５６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５８】
前記コンジュゲーションが、前記特異性抗原結合分子のアミノ酸配列中のシステイン残基を介する、請求項５６または請求項５７のいずれかに記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５９】
前記コンジュゲーションが、前記特異性抗原結合分子のアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に組み込まれたチオール、アミノキシまたはヒドラジニル部分を介する、請求項５６または請求項５７のいずれかに記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６０】
前記第２の部分が、免疫グロブリン、免疫グロブリンＦｃ領域、免疫グロブリンＦａｂ領域、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、インテイン、ＶＮＡＲドメイン、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨドメイン、またはスキャフォールドタンパク質を含む群から選択される、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６１】
前記第２の部分が、検出可能な標識、色素、毒素、薬物、プロドラッグ、放射性核種または生物学的活性分子を含む群から選択される、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６２】
前記第２の部分が、
・  メイタンシノイド、
・  オーリスタチン、
・  アントラサイクリン、好ましくはＰＮＵ由来アントラサイクリン
・  アマニチン誘導体、好ましくはα−アマニチン誘導体、
・  カリケアマイシン、
・  ツブリシン、
・  デュオカルマイシン、
・  放射性同位体、例えば、227Ｔｈまたは225Ａｃ標識などのアルファ線放射性核種、
・  毒性ペイロードを含むリポソーム、
・  タンパク質毒素、
・  タキサン、
・  ピロールベンゾジアゼピン及び／または
・  インドリノベンゾジアゼピンシュードダイマー及び／または
・  スプライソソーム阻害薬、
・  ＣＤＫ１１阻害薬、
・  ピリジノベンゾジアゼピン
を含む群から選択される少なくとも１つの毒素である、請求項５６〜５９または６１のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６３】
前記特異性抗原結合分子が、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）特異性抗原結合分子である、請求項５６〜６２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６４】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体２（ＲＯＲ２）に結合しない、請求項６３に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６５】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子がヒトＲＯＲ１及びマウスＲＯＲ１（ｍＲＯＲ１）の両方に結合する、請求項６３または６４のいずれかに記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６６】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が脱グリコシル化ＲＯＲ１に結合する、請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６７】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が、
ＹＭＥＳＬＨＭＱＧＥＩＥＮＱＩ（配列番号３４）
ＣＱＰＷＮＳＱＹＰＨＴＨＴＦＴＡＬＲＦＰ（配列番号３５）
ＲＳＴＩＹＧＳＲＬＲＩＲＮＬＤＴＴＤＴＧＹＦＱ（配列番号３６）
ＱＣＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＰＰＴＡＳＰＧＹＳＤＥＹＥ（配列番号３７）
から選択される直鎖ペプチド配列に結合しない、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６８】
ＦＷ１が、２０〜２８アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＣＤＲ１が、ＤＴＳＹＧＬＹＳ（配列番号１）、ＧＡＫＹＧＬＡＡ（配列番号２）、ＧＡＫＹＧＬＦＡ（配列番号３）、ＧＡＮＹＧＬＡＡ（配列番号４）、またはＧＡＮＹＧＬＡＳ（配列番号５）から選択されるＣＤＲ配列であり、
ＦＷ２が、６〜１４アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＨＶ２が、ＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧ（配列番号６）、ＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳ（配列番号７）、またはＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳ（配列番号８）から選択される超可変配列であり、
ＦＷ３ａが、６〜１０アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＨＶ４が、ＮＫＲＡＫ（配列番号９）、ＮＫＲＴＭ（配列番号１０）、ＮＫＧＡＫ（配列番号１１）、またはＮＫＧＴＫ（配列番号１２）から選択される超可変配列であり、
ＦＷ３ｂが、１７〜２４アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＣＤＲ３が、ＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹ（配列番号１３）、ＱＳＧＭＡＩＤＩＧＳＧＨＧＹＮＷＹ（配列番号１４）、ＹＰＷＡＭＷＧＱＷＹ（配列番号１５）、ＶＦＭＰＱＨＷＨＰＡＡＨＷＹ（配列番号１６）、ＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹ（配列番号１７）、またはＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹ（配列番号１８）から選択されるＣＤＲ配列であり、
ＦＷ４が、７〜１４アミノ酸のフレームワーク領域である、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、またはそれに対して少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアント。
【請求項６９】
ＦＷ１が、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号１９）、ＡＫＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号２０）、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴ（配列番号２１）、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号２２）、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴ（配列番号２３）、またはＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴ（配列番号２４）から選択され、ＦＷ２が、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧ（配列番号２５）、またはＴＹＷＹＲＫＮＰＧ（配列番号２６）から選択され、ＦＷ３ａが、ＧＲＹＶＥＳＶ（配列番号２７）、またはＧＲＹＳＥＳＶ（配列番号２８）から選択され、ＦＷ３ｂが、ＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号２９）、ＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡ（配列番号３０）、またはＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号３１）から選択され、かつＦＷ４が、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３２）、またはＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３３）から選択される、請求項６３〜６８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアント。
【請求項７０】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が、
ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３９）、
ＡＫＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＤＩＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４０）、
ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡＫＹＧＬＡＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＹＰＷＡＭＷＧＱＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４１）、
ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡＫＹＧＬＦＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＶＦＭＰＱＨＷＨＰＡＡＨＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４２）、
ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４３）、
ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡＮＹＧＬＡＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４４）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＧＡＮＹＧＬＡＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＴＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４５）、ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＧＡＮＹＧＬＡＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４６）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４７）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＴＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４８）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４９）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６３〜６８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアント。
【請求項７１】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子がヒト化されている、請求項６３〜７０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７２】
前記ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が脱免疫化されている、請求項６３〜７０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７３】
前記ＥＧＦＲ特異性抗原結合分子が、免疫グロブリン、免疫グロブリンＦａｂ領域、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、インテイン、ＶＮＡＲドメイン、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨドメイン、またはスキャフォールドタンパク質を含む群から選択される、請求項５６〜７１のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重特異性抗原結合分子ならびに関連融合タンパク質及びコンジュゲートに関する。詳細には、本発明は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の両方について特異性を有する二重特異性抗原結合分子ならびに関連融合タンパク質及びコンジュゲートに関する。さらなる一態様では、本発明は、コンジュゲートした免疫グロブリン様サメ可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）は、９３７アミノ酸のグリコシル化Ｉ型１回膜貫通タンパク質である。細胞外領域は、Ｎ末端免疫グロブリンドメイン（Ｉｇ）、続く、システインリッチなフリズルドドメイン（ｆｉｚｚｌｅｄ  ｄｏｍａｉｎ、ｆｚ）、次いで、これが結合する膜近位クリングルドメイン（ｋｒ）から構成される３つの別個のドメインからなる。このタンパク質の細胞内領域は、シュードキナーゼドメイン、続く、プロリンリッチな領域に点在する２つのＳｅｒ／Ｔｈｒリッチなドメインを含有し、かつこの同じドメイン構造全体が、密接に関連するファミリーメンバーであるＲＯＲ２で保存されており、ＲＯＲ１は、ＲＯＲ２と高い配列同一性を共有している（Ｒｅｂａｇａｙ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１２，２，Ｂｏｒｃｈｅｒｄｉｎｇ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ，２０１４，５，４９６−５０２）。
【０００３】
ＲＯＲ１は、胚発生中に発現され、その際、神経堤細胞で、かつ発生後期の壊死及び指間帯で顕著に発現される。しかしながら、その発現は、誕生後に急速にサイレンシングされ、正常な成体組織にはほとんど存在しない（Ｆｕｋａｄａ  ＰＮＡＳ，２０１２，Ｂａｓｋａｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００８，１４，３９６，Ｂｒｏｏｍｅ  ＨＥ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２０１１，３５，１３９０、Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．２０１７，２３，３０６１−３０７１）。
【０００４】
ＲＯＲ１発現は、肺、乳房、膵臓、卵巣、結腸、頭頚部及び前立腺癌、黒色腫及び腎細胞癌（Ｚｈａｎｇ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０１２，１８１，１９０３−１９１０）、乳癌（Ｚｈａｎｇ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２，７，ｅ３１１２７、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの特許出願ＷＯ２０１１０５４００７）ならびに慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び急性リンパ芽急性白血病ＡＭＬ（Ｆｕｋｕｄａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００８，１０５，３０４７−３０５２、Ｂａｓｋａｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００８，１４，３９６−４０４、Ｄａｎｅｓｈｍａｎｅｓｈ  ＡＨ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００８，１２３，１１９０−１１９５、Ｄａｖｅ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，２０１２，７，ｅ５２６５５）を含む幅広い範囲の固形腫瘍及び血液悪性病変にわたって、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方で観察されている。
【０００５】
加えて、ＲＯＲ１発現の上昇は、乳癌（Ｃｈｉｅｎ  ＨＰ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．，２０１６，４６８，５８９−５９５、Ｚｈａｎｇ）、卵巣癌（Ｚｈａｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．，２０１４，４：５８１１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０５８１１）、結腸直腸癌（Ｚｈｏｕ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７，８，３２８６４−３２８７２）、肺腺癌（Ｚｈｅｎｇ  ＹＺ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．，２０１６，６，３６４４７）及びＣＬＬ（Ｃｕｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１６，１２８，２９３１−２９４０）を含むいくつかのがん適応症について、不良な臨床転帰と関連すると報告されている。
【０００６】
ＲＯＲ１の発現パターン及び不良な臨床予後とのつながりと一致して、腫瘍化及び疾患進行におけるＲＯＲ１の機能的役割が、いくつかの異なるがん適応症について実証されている。ＲＯＲ１は、乳癌モデルにおいては上皮間葉転換及び転移を（Ｃｕｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１３，７３，３６４９−３６６０）、卵巣癌モデルにおいてはスフェロイド形成及び腫瘍生着を（Ｚｈａｎｇ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，２０１４，１１，１７２６６−１７２７１）促進する。ＲＯＲ１は、肺腺癌におけるＮＫＸ２−１／ＴＴＦ−１系統生存因子がん遺伝子の転写標的であり、その際、ＲＯＲ１はＥＧＦＲシグナル伝達を持続させ、かつアポトーシス促進性シグナル伝達を抑制し、ＲＯＲ１とＥＧＦＲとの間のＥＧＦ誘導性相互作用が観察されている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２０１２，２１，３４８−３６１、Ｉｄａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６，１０７，１５５−１６１）。他方で、乳癌遺伝子発現データベースの調査から、ＥＧＦＲ及びＲＯＲ１  ｍＲＮＡの同時発現が特記されている（Ｐｅｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２０１７，４２９，２９５４−２９７３）。ＲＯＲ１は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬に対する抵抗性を付与するカベオラ構造及びバイパスシグナル伝達機構を持続させるための足場として作用することも示されている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１６，７，１００６０）。ＲＯＲ１−ＨＥＲ３複合体を介するシグナル伝達はＨｉｐｐｏ−ＹＡＰ経路を調節し、乳癌骨転移を促進し（Ｌｉ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９，１２０６−１１９）、またこのタンパク質はＭｅｔ駆動腫瘍化を促進し得る（Ｇｅｎｔｉｌｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１１，７１，３１３２−３１４０）。他方で、ＣＬＬでは、ＲＯＲ１は、Ｗｎｔ５ａに応答してＲＯＲ２と共にヘテロ−オリゴマー化して、シグナルを伝達し、かつ増殖及び遊走を増強すると報告されている（Ｙｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０１６，２，５８５−５９８）。
【０００７】
がんの病理におけるＲＯＲ１の機能的役割と、正常な成体組織での発現の全般的欠如とを考慮すると、このがん胎児性タンパク質は、がん治療のための魅力的な標的である。ＲＯＲ１に対する抗体は、文献ＷＯ２０２１０９７３１３（４Ａ５  ｋｉｐｐｓ）、ＷＯ２０１４０３１１７４（ＵＣ９６１）、ＷＯ２０１６１８７２２０（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ）、ＷＯ２０１０１２４１８８（２Ａ２）、ＷＯ２０１２０７５１５８（Ｒ１１，Ｒ１２）、ＷＯ２０１１０５４００７（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏ）、ＷＯ２０１１０７９９０２（Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ）、ＷＯ２０１７１２７６６４、ＷＯ２０１７１２７６６４（ＮＢＥ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＳＣＲＩＰＰＳ）、ＷＯ２０１６０９４８４７（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ）、ＷＯ２０１７１２７４９９）に記載されており、ヒト化マウス抗ＲＯＲ１抗体であるＵＣ９６１が、再発または難治性慢性リンパ球性白血病のための治験に入っている。ＲＯＲ１を標的とするキメラ抗原受容体Ｔ細胞も報告されており（Ｈｕｄｅｃｅｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１３，１９，３１５３−６４）、ＵＣ９６１と、ＲＯＲ１を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞とを用いる前臨床霊長類研究は、明白な毒性を示さず、このことは、成体組織でのこのタンパク質の発現の全般的欠如と一致する（Ｃｈｏｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ，ｍｙｅｌｏｍａ  ＆  ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１５，Ｓ１６７、Ｂｅｒｇｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，２０１５，３，２０６）。
【０００８】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバーである。これは、４つの細胞外ドメイン、膜貫通領域、細胞内チロシンキナーゼドメイン及びカルボキシ末端テイルから構成される１７０ｋＤａ膜貫通タンパク質である。ＥＧＦＲの正常な機能は、上皮組織発生の調節に関連するが、ＥＧＦＲはいくつかの病的状態とも関連する。特に、ＥＧＦＲの過剰発現は、いくつかのがんと関連している。したがって、これは重要な薬物標的であり、多くの治療上のアプローチが適用されている。ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ブリガチニブ、イコチニブ、及びオシメルチニブなどのいくつかの小分子ベースのＥＧＦＲ阻害薬に加えて、ＥＧＦＲに対するいくつかの抗体が開発されている。抗ＥＧＦＲ抗体のセツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、及びマツズマブである。これらの抗体は、細胞外リガンド結合ドメインをブロックして、リガンド結合、その後のチロシンキナーゼドメインの活性化を妨げる。セツキシマブまたはマツズマブとの競合結合を示すシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）も、開発されている。
【０００９】
シングルドメイン結合分子は、別個の種からの一連のタンパク質に由来し得る。免疫グロブリンアイソトープ新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）は、元々はコモリザメ（Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ  ｃｉｒｒａｔｕｍ）及び他のサメならびにエイ種の血清中で見い出されたホモ二量体重鎖複合体である。ＩｇＮＡＲは、軽鎖を含有せず、典型的な免疫グロブリン構造とはまったく別である。各分子は、１つの単一可変ドメイン（ＶＮＡＲ）及び５つの定常ドメイン（ＣＮＡＲ）からなる。文献中の命名では、ＩｇＮＡＲを免疫グロブリンアイソトープ新規抗原受容体（ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）または免疫グロブリンアイソトープ新抗原受容体（ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と称し、これらの用語は同意語である。
【００１０】
サメＩｇＮＡＲには、定義された主要な型が３種あり、それらはＩ、ＩＩ及びＩＩＩ型として公知である（Ｋｏｖａｌｅｎａ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１４  １４（１０）１５２７−１５３９）。これらは、強い選択圧力下にあり、したがって、まれにしか置き換えられない非標準システイン残基の位置に基づき分類されている。
【００１１】
３種の型はすべて、標準的な免疫グロブリンフォールドを安定化する３５及び１０７位にある古典的な免疫グロブリン標準システインを、３６位にある不変のトリプトファンと一緒に有する。定義されたＣＤＲ２は存在しないが、それぞれフレームワーク２及び３において、ＴＣＲ  ＨＶ２及びＨＶ４とより近く類似する配列多様性の領域が定義されている。Ｉ型は、生殖細胞系がコードしたシステイン残基をフレームワーク２及びフレームワーク４に、かつ偶数個の追加のシステインをＣＤＲ３内にも有する。単離されてリゾチームと複合体化したＩ型ＩｇＮＡＲの結晶構造研究によって、これらのシステイン残基の寄与を決定することができた。フレームワーク２及び４のシステインは両方とも、ＣＤＲ３内のシステインと共にジスルフィド橋を形成して、ＣＤＲ３ループがＨＶ２領域に向かって強固に引っ張られた、密にパッキングされた構造を形成する。これまで、Ｉ型ＩｇＮＡＲは、コモリザメでしか同定されておらず、同じ目のメンバーを含めて他の板鰓類はすべて、ＩＩ型またはこの型の変形のみを有する。
【００１２】
ＩＩ型ＩｇＮＡＲは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３内に、これら２つの領域を近接状態で保持する分子内ジスルフィド結合を形成して、結合ポケットまたは結合溝をもたらす突出したＣＤＲ３を生じるシステイン残基を有すると定義される。Ｉ型配列は典型的に、ＩＩ型よりも長いＣＤＲ３を有しており、それぞれ平均して２１残基及び１５残基を有する。これは、Ｉ型ＣＤＲ３における２個以上のシステイン残基がそれらのフレームワーク２及び４カウンターパートと会合する強い選択圧力によると考えられる。体細胞変異の蓄積に関する研究によって、Ｉ型に比べてＩＩ型のＣＤＲ１では多数の変異がある一方で、Ｉ型のＨＶ２領域はＩＩ型よりも大きな配列多様性を示すことが示されている。この証拠は、抗原結合部位内で決定されたこれらの領域の位置とよく相関する。ＩＩＩ型として知られる第３のＩｇＮＡＲ型は、新生児において同定されている。ＩｇＮＡＲファミリーのこのメンバーは、（ＣＤＲ３を形成する）Ｄ１領域及びＤ２領域とＶ遺伝子との生殖細胞系融合によって、ＣＤＲ３内の多様性を欠いている。ほぼすべての既知のクローンは、１５残基のＣＤＲ３長を有し、ほとんどあるいはまったく配列多様性がない。
【００１３】
（ＩＩｂまたはＩＶ）型と称されるＶＮＡＲの別の構造型は、標準システイン残基を２個だけ（フレームワーク１及びフレームワーク３ｂ領域に）有する。これまで、この型は、ツノザメ（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７．４４（７）：ｐ．１７７５−１７８３、Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ  Ｏ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１３．２８８（２４）：ｐ．１７４０８−１９）で主に見い出されており、テンジクザメに由来する半合成Ｖ−ＮＡＲライブラリからも単離された（Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ，Ｖ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（３４）：ｐ．１２４４４−１２４４９）。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は一般に、二重特異性抗原結合分子に関する。具体的には、本発明は、ＲＯＲ１及びＥＧＦＲの両方に結合する能力を有する二重特異性分子に関する。
【００１５】
第１の態様では、
（ｉ）式（Ｉ）：
ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４    （Ｉ）
によって表されるアミノ酸配列
［式中、
ＦＷ１は、フレームワーク領域であり、
ＣＤＲ１は、ＣＤＲ配列であり、
ＦＷ２は、フレームワーク領域であり、
ＨＶ２は、超可変配列であり、
ＦＷ３ａは、フレームワーク領域であり、
ＨＶ４は、超可変配列であり、
ＦＷ３ｂは、フレームワーク領域であり、
ＣＤＲ３は、ＣＤＲ配列であり、
ＦＷ４は、フレームワーク領域である］
を含む受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）特異性抗原結合分子と、
（ｉｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）特異性抗原結合分子と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１６】
フレームワーク領域ＦＷ１は、好ましくは２０〜２８アミノ酸長、より好ましくは２２〜２６アミノ酸長、さらにより好ましくは２３〜２５アミノ酸長である。ある特定の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、２６アミノ酸長である。他の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、２５アミノ酸長である。さらに他の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、２４アミノ酸長である。
【００１７】
ＣＤＲ領域ＣＤＲ１は、好ましくは７〜１１アミノ酸長、より好ましくは８〜１０アミノ酸長である。ある特定の好ましい実施形態では、ＣＤＲ１は、９アミノ酸長である。他の好ましい実施形態では、ＣＤＲ１は、８アミノ酸長である。
【００１８】
フレームワーク領域ＦＷ２は、好ましくは６〜１４アミノ酸長、より好ましくは８〜１２アミノ酸長である。ある特定の好ましい実施形態では、ＦＷ２は、１２アミノ酸長である。他の好ましい実施形態では、ＦＷ２は、１０アミノ酸長である。他の好ましい実施形態では、ＦＷ２は、９アミノ酸長である。他の好ましい実施形態では、ＦＷ２は、８アミノ酸長である。
【００１９】
超可変配列ＨＶ２は、好ましくは４〜１１アミノ酸長、より好ましくは５〜１０アミノ酸長である。ある特定の好ましい実施形態では、ＨＶ２は、１０アミノ酸長である。ある特定の好ましい実施形態では、ＨＶ２は、９アミノ酸長である。他の好ましい実施形態では、ＨＶ２は、６アミノ酸長である。
【００２０】
フレームワーク領域ＦＷ３ａは、好ましくは６〜１０アミノ酸長、より好ましくは７〜９アミノ酸長である。ある特定の好ましい実施形態では、ＦＷ３ａは、８アミノ酸長である。ある特定の好ましい実施形態では、ＦＷ３ａは、７アミノ酸長である。
【００２１】
超可変配列ＨＶ４は、好ましくは３〜７アミノ酸長、より好ましくは４〜６アミノ酸長である。ある特定の好ましい実施形態では、ＨＶ４は、５アミノ酸長である。他の好ましい実施形態では、ＨＶ４は、４アミノ酸長である。
【００２２】
フレームワーク領域ＦＷ３ｂは、好ましくは１７〜２４アミノ酸長、より好ましくは１８〜２３アミノ酸長、さらにより好ましくは１９〜２２アミノ酸長である。ある特定の好ましい実施形態では、ＦＷ３ｂは、２１アミノ酸長である。他の好ましい実施形態では、ＦＷ３ｂは、２０アミノ酸長である。
【００２３】
ＣＤＲ領域ＣＤＲ３は、好ましくは８〜２１アミノ酸長、より好ましくは９〜２０アミノ酸長、さらにより好ましくは１０〜１９アミノ酸長である。ある特定の好ましい実施形態では、ＣＤＲ３は、１７アミノ酸長である。他の好ましい実施形態では、ＣＤＲ３は、１４アミノ酸長である。さらなる他の好ましい実施形態では、ＣＤＲ３は、１２アミノ酸長である。さらに他の好ましい実施形態では、ＣＤＲ３は、１０アミノ酸長である。
【００２４】
フレームワーク領域ＦＷ４は、好ましくは７〜１４アミノ酸長、より好ましくは８〜１３アミノ酸長、さらにより好ましくは９〜１２アミノ酸長である。ある特定の好ましい実施形態では、ＦＷ４は、１２アミノ酸長である。他の好ましい実施形態では、ＦＷ４は、１１アミノ酸長である。さらなる他の好ましい実施形態では、ＦＷ４は、１０アミノ酸長である。さらに他の好ましい実施形態では、ＦＷ４は、９アミノ酸長である。
【００２５】
好ましくは、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子は、受容体のチロシンキナーゼ様オーファン受容体２（ＲＯＲ２）には結合しない。より好ましくは、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子は、ヒトＲＯＲ１及びマウスＲＯＲ１（ｍＲＯＲ１）の両方に結合する。さらにより好ましくは、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子は、脱グリコシル化ＲＯＲ１に結合する。
【００２６】
本発明のある特定のＲＯＲ１特異性抗原結合分子は、
ＹＭＥＳＬＨＭＱＧＥＩＥＮＱＩ（配列番号３４）
ＣＱＰＷＮＳＱＹＰＨＴＨＴＦＴＡＬＲＦＰ（配列番号３５）
ＲＳＴＩＹＧＳＲＬＲＩＲＮＬＤＴＴＤＴＧＹＦＱ（配列番号３６）
ＱＣＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＰＰＴＡＳＰＧＹＳＤＥＹＥ（配列番号３７）
から選択される直鎖ペプチド配列に結合しない。
【００２７】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の好ましい実施形態では：
ＦＷ１は、２０〜２８アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＣＤＲ１は、ＤＴＳＹＧＬＹＳ（配列番号１）、ＧＡＫＹＧＬＡＡ（配列番号２）、ＧＡＫＹＧＬＦＡ（配列番号３）、ＧＡＮＹＧＬＡＡ（配列番号４）、またはＧＡＮＹＧＬＡＳ（配列番号５）から選択されるＣＤＲ配列であり、
ＦＷ２は、６〜１４アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＨＶ２は、ＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧ（配列番号６）、ＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳ（配列番号７）、またはＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳ（配列番号８）から選択される超可変配列であり、
ＦＷ３ａは、６〜１０アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＨＶ４は、ＮＫＲＡＫ（配列番号９）、ＮＫＲＴＭ（配列番号１０）、ＮＫＧＡＫ（配列番号１１）、またはＮＫＧＴＫ（配列番号１２）から選択される超可変配列であり、
ＦＷ３ｂは、１７〜２４アミノ酸のフレームワーク領域であり、
ＣＤＲ３は、ＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹ（配列番号１３）、ＱＳＧＭＡＩＤＩＧＳＧＨＧＹＮＷＹ（配列番号１４）、ＹＰＷＡＭＷＧＱＷＹ（配列番号１５）、ＶＦＭＰＱＨＷＨＰＡＡＨＷＹ（配列番号１６）、ＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹ（配列番号１７）、またはＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹ（配列番号１８）から選択されるＣＤＲ配列であり、
ＦＷ４は、７〜１４アミノ酸のフレームワーク領域であり、または
それに対して少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００２８】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の他の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号１９）、ＡＫＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号２０）、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴ（配列番号２１）、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号２２）、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴ（配列番号２３）、またはＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴ（配列番号２４）から選択され、ＦＷ２は、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧ（配列番号２５）、またはＴＹＷＹＲＫＮＰＧ（配列番号２６）から選択され、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＳＶ（配列番号２７）、またはＧＲＹＳＥＳＶ（配列番号２８）から選択され、ＦＷ３ｂは、ＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号２９）、ＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡ（配列番号３０）、またはＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号３１）から選択され、かつＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３２）、またはＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３３）から選択される、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００２９】
上に列挙したフレームワーク領域、相補性決定領域及び超可変領域の可能な組み合わせ及び順列のすべてが、本明細書において明示的に企図されている。
【００３０】
本発明の分子に関係して言及される配列同一性は、個々のＣＤＲ、ＨＶまたはＦＷのレベルで判断されてもよいし、または分子全体の長さにわたって判断されてもよい。記載のＣＤＲ、ＨＶ及びＦＷ配列はまた、その配列のＮ末端またはＣ末端でのアミノ酸の付加もしくは欠失によるか、または配列へのアミノ酸の挿入またはその欠失によるかに関わらず、より長くても、またはより短くてもよい。
【００３１】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の好ましい一実施形態では、ＦＷ１は、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号１９）であり、ＣＤＲ１は、ＤＴＳＹＧＬＹＳ（配列番号１）であり、ＦＷ２は、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧ（配列番号２５）であり、ＨＶ２は、ＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧ（配列番号６）であり、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＳＶ（配列番号２７）であり、ＨＶ４は、ＮＫＲＡＫ（配列番号９）であり、ＦＷ３ｂは、ＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号２９）であり、ＣＤＲ３は、ＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹ（配列番号１３）であり、かつＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３２）であり、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００３２】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の別の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、ＡＫＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号２０）であり、ＣＤＲ１は、ＤＴＳＹＧＬＹＳ（配列番号１）であり、ＦＷ２は、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧ（配列番号２５）であり、ＨＶ２は、ＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧ（配列番号６）であり、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＳＶ（配列番号２７）であり、ＨＶ４は、ＮＫＲＡＫ（配列番号９）であり、ＦＷ３ｂは、ＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号２９）であり、ＣＤＲ３は、ＱＳＧＭＡＩＤＩＧＳＧＨＧＹＮＷＹ（配列番号１４）であり、かつＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３２）であり、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００３３】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の別の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴ（配列番号２１）であり、ＣＤＲ１は、ＧＡＫＹＧＬＡＡ（配列番号２）であり、ＦＷ２は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧ（配列番号２６）であり、ＨＶ２は、ＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳ（配列番号７）であり、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＳＶ（配列番号２７）であり、ＨＶ４は、ＮＫＲＴＭ（配列番号１０）であり、ＦＷ３ｂは、ＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号２９）であり、ＣＤＲ３は、ＹＰＷＡＭＷＧＱＷＹ（配列番号１５）であり、かつＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３２）であり、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００３４】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の別の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴ（配列番号２１）であり、ＣＤＲ１は、ＧＡＫＹＧＬＦＡ（配列番号３）であり、ＦＷ２は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧ（配列番号２６）であり、ＨＶ２は、ＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳ（配列番号７）であり、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＳＶ（配列番号２７）であり、ＨＶ４は、ＮＫＲＴＭ（配列番号１０）であり、ＦＷ３ｂは、ＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号２９）であり、ＣＤＲ３は、ＶＦＭＰＱＨＷＨＰＡＡＨＷＹ（配列番号１６）であり、かつＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３２）であり、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００３５】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の別の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴ（配列番号２２）であり、ＣＤＲ１は、ＤＴＳＹＧＬＹＳ（配列番号１）であり、ＦＷ２は、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧ（配列番号２５）であり、ＨＶ２は、ＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧ（配列番号６）であり、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＳＶ（配列番号２７）であり、ＨＶ４は、ＮＫＧＡＫ（配列番号１１）であり、ＦＷ３ｂは、ＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号２９）であり、ＣＤＲ３は、ＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹ（配列番号１７）であり、かつＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３２）であり、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００３６】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の別の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴ（配列番号２３）であり、ＣＤＲ１は、ＧＡＮＹＧＬＡＡ（配列番号４）であり、ＦＷ２は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧ（配列番号２６）であり、ＨＶ２は、ＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳ（配列番号７）であり、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＳＶ（配列番号２７）であり、ＨＶ４は、ＮＫＲＴＭ（配列番号１０）であり、ＦＷ３ｂは、ＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号２９）であり、ＣＤＲ３は、ＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹ（配列番号１８）であり、かつＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３２）であり、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００３７】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の別の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴ（配列番号２４）であり、ＣＤＲ１は、ＧＡＮＹＧＬＡＳ（配列番号５）であり、ＦＷ２は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧ（配列番号２６）であり、ＨＶ２は、ＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳ（配列番号８）であり、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＳＥＳＶ（配列番号２８）であり、ＨＶ４は、ＮＫＧＴＫ（配列番号１２）であり、ＦＷ３ｂは、ＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡ（配列番号３０）であり、ＣＤＲ３は、ＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹ（配列番号１８）であり、かつＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３３）であり、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００３８】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の別の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴ（配列番号２４）であり、ＣＤＲ１は、ＧＡＮＹＧＬＡＳ（配列番号５）であり、ＦＷ２は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧ（配列番号２６）であり、ＨＶ２は、ＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳ（配列番号７）であり、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＳＥＳＶ（配列番号２８）であり、ＨＶ４は、ＮＫＲＴＭ（配列番号１０）であり、ＦＷ３ｂは、ＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡ（配列番号３０）であり、ＣＤＲ３は、ＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹ（配列番号１８）であり、及びＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３３）であり、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００３９】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の別の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴ（配列番号２４）であり、ＣＤＲ１は、ＤＴＳＹＧＬＹＳ（配列番号１）であり、ＦＷ２は、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧ（配列番号２５）であり、ＨＶ２は、ＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧ（配列番号６）であり、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＶＥＳＶ（配列番号２７）であり、ＨＶ４は、ＮＫＧＡＫ（配列番号１１）であり、ＦＷ３ｂは、ＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡ（配列番号３１）であり、ＣＤＲ３は、ＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹ（配列番号１７）であり、及びＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３３）であり、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００４０】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の別の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴ（配列番号２４）であり、ＣＤＲ１は、ＤＴＳＹＧＬＹＳ（配列番号１）であり、ＦＷ２は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧ（配列番号２６）であり、ＨＶ２は、ＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳ（配列番号８）であり、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＳＥＳＶ（配列番号２８）であり、ＨＶ４は、ＮＫＧＴＫ（配列番号１２）であり、ＦＷ３ｂは、ＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡ（配列番号３０）であり、ＣＤＲ３は、ＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹ（配列番号１７）であり、及びＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３３）であり、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００４１】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子の別の好ましい実施形態では、ＦＷ１は、ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴ（配列番号２４）であり、ＣＤＲ１は、ＤＴＳＹＧＬＹＳ（配列番号１）であり、ＦＷ２は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧ（配列番号２６）であり、ＨＶ２は、ＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧ（配列番号６）であり、ＦＷ３ａは、ＧＲＹＳＥＳＶ（配列番号２８）であり、ＨＶ４は、ＮＫＧＡＫ（配列番号１１）であり、ＦＷ３ｂは、ＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡ（配列番号３０）であり、ＣＤＲ３は、ＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹ（配列番号１７）であり、及びＦＷ４は、ＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３３）であり、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントである。
【００４２】
まださらに好ましい実施形態では、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子は、
ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３９）、
ＡＫＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＤＩＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４０）、
ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡＫＹＧＬＡＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＹＰＷＡＭＷＧＱＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４１）、
ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡＫＹＧＬＦＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＶＦＭＰＱＨＷＨＰＡＡＨＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４２）、
ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４３）、
ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡＮＹＧＬＡＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４４）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＧＡＮＹＧＬＡＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＴＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４５）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＧＡＮＹＧＬＡＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４６）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４７）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＴＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４８）、
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４９）
から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも４５％の配列同一性を有するその機能性バリアントを含む。
【００４３】
ＥＧＦＲ特異性抗原結合分子は、ＥＧＦＲに結合する任意の分子であってよい。特に、ＥＧＦＲ特異性抗原結合分子は、免疫グロブリン、免疫グロブリンＦａｂ領域、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、インテイン、ＶＮＡＲドメイン、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨドメイン、またはスキャフォールドタンパク質（アフィボディ、センチリン、ダルピン（ｄａｒｐｉｎ）など）を含む群から選択されてよい。好ましくは、ＥＧＦＲ特異性抗原結合分子は、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。
【００４４】
セツキシマブは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を阻害する承認されたモノクローナル抗体治療薬である。セツキシマブは、ＥＧＦ及び他のリガンドがＥＧＦＲと結合すること、別段に、ＥＧＦＲを活性化することを妨げる（すなわち、高親和性リガンド結合及び二量化に必要とされる受容体立体配座の拡張を妨げる）［Ｌｉ  ２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７  ３０１−３１１］。セツキシマブは、アミノ酸３８４〜４０８を含むＥＧＦＲドメイン内の特異的エピトープに結合する。
【００４５】
７Ｃ１２及び７Ｄ１２は、ＥＧＦＲ上のセツキシマブエピトープについて競合するラクダシングルドメイン抗体（ナノボディ）である［ＷＯ２００７０４２２８９Ａ２］。７Ｃ１２及び７Ｄ１２は両方とも、ＥＧＦＲ結合について高い親和性（低いｎＭ  ＫＤ）を示し［Ｒｏｏｖｅｒｓ  ２０１１  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９  ｐ２０１３，Ｇａｉｎｋａｍ  ２０１０  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ］、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合をブロックする［Ｓｃｈｍｉｔｚ  ２０１３  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２１  ｐ１２１４］。７Ｃ１２及び７Ｄ１２は、５アミノ酸異なり、７Ｃ１２が、ＥＧＦＲ結合についてより高いオフ速度を有する［Ｒｏｏｖｅｒｓ  ２０１１  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９  ｐ２０１３］。
【００４６】
マツズマブは、ＥＧＦＲを阻害する、もう１種の承認されたモノクローナル抗体治療薬である。マツズマブ結合は、高親和性リガンド結合及び受容体二量化に必要とされるＥＧＦＲドメイン再編成を立体的にブロックする［Ｓｃｈｍｉｅｄｅｌ  ２００８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １３（４）３６５−３７３］。マツズマブは、ドメインＩＩＩβ−ヘリックス（ＥＧＦＲのａａ４５４〜４６４）の大部分のＣ末端ストランドに先行するループに主に結合する。
【００４７】
９Ｇ８は、マツズマブＥＧＦＲエピトープについて競合するが［ＷＯ２００７０４２２８９Ａ２］、さらにＥＧＦＲドメインＩＩＩのＮ末端の方にあり、かつさらにドメインＩＩリガンド結合部位からの別個のＥＧＦＲエピトープを、すなわち、従来の抗体にはアクセス不可能な領域を有するｓｄＡｂ（ナノボディ）配列である［Ｓｃｈｍｉｔｚ  ２０１３  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２１  ｐ１２１４］。
【００４８】
本発明の第１の態様の二重特異性抗原結合分子において使用するためのｓｄＡｂの例には、限定されないが、結合についてセツキシマブまたはマツズマブと競合する分子が含まれる。好ましくは、ｓｄＡｂは、
７Ｃ１２：ＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＴＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８３）
７Ｄ１２：ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＡＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８４）
９Ｇ８：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＶＡＩＮＷＳＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＹＱＩＮＳＧＮＹＮＦＫＤＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８５）
３８Ｇ７：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＶＭＧＷＦＲＱＡＴＧＫＥＲＥＦＶＡＴＩＡＷＤＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＨＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＳＹＮＶＹＹＮＮＹＹＹＰＩＳＲＤＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号８６）
を含む群から選択される。
【００４９】
第１の態様の二重特異性抗原結合分子を形成するために、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子及びＥＧＦＲ特異性抗原結合分子を任意の順序で組み合わせることができる、すなわち、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子が、ＥＧＦＲ特異性抗原結合分子に対してＮ末端側であっても、またはその逆であってもよいことは分かるであろう。
【００５０】
さらに、高次の構築物、例えば、複数のＲＯＲ１特異性抗原結合分子及びＥＧＦＲ特異性抗原結合分子から構成される構築物も本明細書では企図されていることは分かるであろう。これらは、単一の一次アミノ酸配列の複数のコピー、例えば、ＲＯＲ１結合因子−ＥＧＦＲ結合因子−ＲＯＲ１結合因子、またはＥＧＦＲ結合因子−ＲＯＲ１結合因子−ＥＧＦＲ結合因子の形態をとってもよい。
【００５１】
第１の態様の二重特異性抗原結合分子は加えて、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子とＥＧＦＲ特異性抗原結合分子との間に、リンカー領域を含んでもよい。好ましいリンカーには、限定されないが、［Ｇ4Ｓ］xが含まれ、ここで、ｘは、１、２、３、４、５、５、６、７、８、９、または１０である。特定の好ましいリンカーは、［Ｇ4Ｓ］5である。他のリンカーには、限定されないが、ＰＧＶＱＰＳＰＧＧＧＧＳ（配列番号６３）（テンジクザメ−Ｇ４Ｓ）、ＰＧＶＱＰＡＰＧＧＧＧＳ（配列番号６４）（テンジクザメ−Ｇ４Ｓ  ＧＭ）が含まれ得る。異なるリンカーの異なる組み合わせを同じ構築物内で組み合わせることができることは分かるであろう。
【００５２】
第１の態様の二重特異性抗原結合分子はまた、Ｎ末端またはＣ末端付加の形態を取ってもよいし、または二重特異性結合分子のアミノ酸配列中のＲＯＲ１特異性抗原結合分子とＥＧＦＲ特異性抗原結合分子との間に配置されていてもよい追加のドメインを含んでもよい。第１の態様の二重特異性抗原結合分子の各ドメインは、上記のとおり、リンカー領域を介して連結されていてもよい。好ましい追加のドメインには、限定されないが、免疫グロブリン、免疫グロブリンＦｃ領域、免疫グロブリンＦａｂ領域、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、インテイン、ＶＮＡＲドメイン、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨドメイン、またはスキャフォールドタンパク質（アフィボディ、センチリン、ダルピンなど）が含まれる。特に好ましい追加のドメインは、免疫グロブリンＦｃ領域、好ましくはヒトＦｃ領域である。
【００５３】
本出願において明示的に企図されている組み合わせには、限定されないが：
一価ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ（Ｆｃ融合）二重特異性体：
Ｂ１−Ｆｃ−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｂ１
Ｂ１−Ｆｃ−９Ｇ８
９Ｇ８−Ｆｃ−Ｂ１
Ｐ３Ａ１−Ｆｃ−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｐ３Ａ１
Ｐ３Ａ１−Ｆｃ−９Ｇ８
９Ｇ８−Ｆｃ−Ｐ３Ａ１
Ｄ３−Ｆｃ−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｄ３
Ｄ３−Ｆｃ−９Ｇ８
９Ｇ８−Ｆｃ−Ｄ３
Ｅ９−Ｆｃ−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｅ９
Ｅ９−Ｆｃ−９Ｇ８
９Ｇ８−Ｆｃ−Ｅ９
二価ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ（Ｆｃ融合）二重特異性体：
Ｂ１−Ｂ１−Ｆｃ−７Ｃ１２
Ｂ１−７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｂ１
７Ｃ１２−Ｂ１−Ｆｃ−Ｂ１
７Ｃ１２−７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｂ１
７Ｃ１２−Ｂ１−Ｆｃ−７Ｃ１２
Ｂ１−７Ｃ１２−Ｆｃ−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｂ１−Ｂ１
Ｂ１−Ｆｃ−７Ｃ１２−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｂ１−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−７Ｃ１２−Ｂ１
Ｂ１−Ｆｃ−７Ｃ１２−Ｂ１
Ｂ１−Ｆｃ−Ｂ１−７Ｃ１２
Ｐ３Ａ１−Ｐ３Ａ１−Ｆｃ−７Ｃ１２
Ｐ３Ａ１−７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｐ３Ａ１
７Ｃ１２−Ｐ３Ａ１−Ｆｃ−Ｐ３Ａ１
７Ｃ１２−７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｐ３Ａ１
７Ｃ１２−Ｐ３Ａ１−Ｆｃ−７Ｃ１２
Ｐ３Ａ１−７Ｃ１２−Ｆｃ−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｐ３Ａ１−Ｐ３Ａ１
Ｐ３Ａ１−Ｆｃ−７Ｃ１２−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｐ３Ａ１−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−７Ｃ１２−Ｐ３Ａ１
Ｐ３Ａ１−Ｆｃ−７Ｃ１２−Ｐ３Ａ１
Ｐ３Ａ１−Ｆｃ−Ｐ３Ａ１−７Ｃ１２
Ｄ３−Ｄ３−Ｆｃ−７Ｃ１２
Ｄ３−７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｄ３
７Ｃ１２−Ｄ３−Ｆｃ−Ｄ３
７Ｃ１２−７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｄ３
７Ｃ１２−Ｄ３−Ｆｃ−７Ｃ１２
Ｄ３−７Ｃ１２−Ｆｃ−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｄ３−Ｄ３
Ｄ３−Ｆｃ−７Ｃ１２−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｄ３−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−７Ｃ１２−Ｄ３
Ｄ３−Ｆｃ−７Ｃ１２−Ｄ３
Ｄ３−Ｆｃ−Ｄ３−７Ｃ１２
Ｅ９−Ｅ９−Ｆｃ−７Ｃ１２
Ｅ９−７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｅ９
７Ｃ１２−Ｅ９−Ｆｃ−Ｅ９
７Ｃ１２−７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｅ９
７Ｃ１２−Ｅ９−Ｆｃ−７Ｃ１２
Ｅ９−７Ｃ１２−Ｆｃ−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｅ９−Ｅ９
Ｅ９−Ｆｃ−７Ｃ１２−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−Ｅ９−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｆｃ−７Ｃ１２−Ｅ９
Ｅ９−Ｆｃ−７Ｃ１２−Ｅ９
Ｅ９−Ｆｃ−Ｅ９−７Ｃ１２
一価ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ（非Ｆｃ）二重特異性体：
Ｂ１−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｂ１
９Ｇ８−Ｂ１
Ｂ１−９Ｇ８
Ｐ３Ａ１−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｐ３Ａ１
９Ｇ８−Ｐ３Ａ１
Ｐ３Ａ１−９Ｇ８
Ｄ３−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｄ３
９Ｇ８−Ｄ３
Ｄ３−９Ｇ８
Ｅ９−７Ｃ１２
７Ｃ１２−Ｅ９
９Ｇ８−Ｅ９
Ｅ９−９Ｇ８
二価ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ（非Ｆｃ）二重特異性体：
Ｂ１−Ｂ１−７Ｃ１２
Ｂ１−７Ｃ１２−Ｂ１
７Ｃ１２−Ｂ１−Ｂ１
Ｂ１−Ｂ１−９Ｇ８
Ｂ１−９Ｇ８−Ｂ１
９Ｇ８−Ｂ１−Ｂ１
Ｐ３Ａ１−Ｐ３Ａ１−７Ｃ１２
Ｐ３Ａ１−７Ｃ１２−Ｐ３Ａ１
７Ｃ１２−Ｐ３Ａ１−Ｐ３Ａ１
Ｐ３Ａ１−Ｐ３Ａ１−９Ｇ８
Ｐ３Ａ１−９Ｇ８−Ｐ３Ａ１
９Ｇ８−Ｐ３Ａ１−Ｐ３Ａ１
Ｄ３−Ｄ３−７Ｃ１２
Ｄ３−７Ｃ１２−Ｄ３
７Ｃ１２−Ｄ３−Ｄ３
Ｄ３−Ｄ３−９Ｇ８
Ｄ３−９Ｇ８−Ｄ３
９Ｇ８−Ｄ３−Ｄ３
Ｅ９−Ｅ９−７Ｃ１２
Ｅ９−Ｅ９−Ｄ３
７Ｃ１２−Ｅ９−Ｅ９
Ｅ９−Ｅ９−９Ｇ８
Ｅ９−９Ｇ８−Ｅ９
９Ｇ８−Ｅ９−Ｅ９
一価ＲＯＲ１、半減期延長されたＲＯＲ１×ＥＧＦＲ（非Ｆｃ）二重特異性体：
Ｂ１−ＢＡ１１−７Ｃ１２
Ｂ１−７Ｃ１２−ＢＡ１１
ＢＡ１１−Ｂ１−７Ｃ１２
ＢＡ１１−７Ｃ１２−Ｂ１
７Ｃ１２−Ｂ１−ＢＡ１１
７Ｃ１２−ＢＡ１１−Ｂ１
Ｂ１−ＢＡ１１−９Ｇ８
Ｂ１−９Ｇ８−ＢＡ１１
ＢＡ１１−Ｂ１−９Ｇ８
ＢＡ１１−９Ｇ８−Ｂ１
９Ｇ８−Ｂ１−ＢＡ１１
９Ｇ８−ＢＡ１１−Ｂ１
Ｐ３Ａ１−ＢＡ１１−７Ｃ１２
Ｐ３Ａ１−７Ｃ１２−ＢＡ１１
ＢＡ１１−Ｐ３Ａ１−７Ｃ１２
ＢＡ１１−７Ｃ１２−Ｐ３Ａ１
７Ｃ１２−Ｐ３Ａ１−ＢＡ１１
７Ｃ１２−ＢＡ１１−Ｐ３Ａ１
Ｐ３Ａ１−ＢＡ１１−９Ｇ８
Ｐ３Ａ１−９Ｇ８−ＢＡ１１
ＢＡ１１−Ｐ３Ａ１−９Ｇ８
ＢＡ１１−９Ｇ８−Ｐ３Ａ１
９Ｇ８−Ｐ３Ａ１−ＢＡ１１
９Ｇ８−ＢＡ１１−Ｐ３Ａ１
Ｄ３−ＢＡ１１−７Ｃ１２
Ｄ３−７Ｃ１２−ＢＡ１１
ＢＡ１１−Ｄ３−７Ｃ１２
ＢＡ１１−７Ｃ１２−Ｄ３
７Ｃ１２−Ｄ３−ＢＡ１１
７Ｃ１２−ＢＡ１１−Ｄ３
Ｄ３−ＢＡ１１−９Ｇ８
Ｄ３−９Ｇ８−ＢＡ１１
ＢＡ１１−Ｄ３−９Ｇ８
ＢＡ１１−９Ｇ８−Ｄ３
９Ｇ８−Ｄ３−ＢＡ１１
９Ｇ８−ＢＡ１１−Ｄ３
Ｅ９−ＢＡ１１−７Ｃ１２
Ｅ９−７Ｃ１２−ＢＡ１１
ＢＡ１１−Ｅ９−７Ｃ１２
ＢＡ１１−７Ｃ１２−Ｅ９
７Ｃ１２−Ｅ９−ＢＡ１１
７Ｃ１２−ＢＡ１１−Ｅ９
Ｅ９−ＢＡ１１−９Ｇ８
Ｅ９−９Ｇ８−ＢＡ１１
ＢＡ１１−Ｅ９−９Ｇ８
ＢＡ１１−９Ｇ８−Ｅ９
９Ｇ８−Ｅ９−ＢＡ１１
９Ｇ８−ＢＡ１１−Ｅ９
が含まれる。
【００５４】
ドメイン間のリンカーは優先的に、限定されないが（Ｇ4Ｓ）X（ここで、Ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）、ＰＧＶＱＰＳＰＧＧＧＧＳ（配列番号６３）（テンジクザメ−Ｇ４Ｓ）、ＰＧＶＱＰＡＰＧＧＧＧＳ（配列番号６４）（テンジクザメ−Ｇ４Ｓ  ＧＭ）であり、ここで異なるリンカーの異なる組み合わせを、同じ構築物内で組み合わせることができる。
【００５５】
それによって、追加のＣ末端（またはＮ末端）タグ配列が存在してもよいし、または存在しなくてもよい。
【００５６】
Ｃ末端タグには、限定されないが、精製を容易にするポリ−ヒスチジン配列（Ｈｉｓ６など）を含有するタグ、検出を可能にするｃ−Ｍｙｃ配列（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６８）など）を含有するタグ、及び／またはチオール反応性ペイロード及びプローブを使用してのラベリング及びバイオコンジュゲーションを可能にするシステイン残基を含有するタグ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。優先的なＣ末端タグには、限定されないが、
ＱＡＳＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＥＦＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６９）
ＱＡＣＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＥＦＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号６７）
ＱＡＣＫＡＨＨＨＨＨＨＧＡＥＦＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号７０）
ＡＡＡＨＨＨＨＨＨＧＡＥＦＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号７１）
ＡＣＡＨＨＨＨＨＨＧＡＥＦＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号７２）
ＱＡＳＧＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号７３）
ＱＡＣＧＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号７４）
ＱＡＣＫＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号７５）
ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号７６）
ＡＣＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号７７）
ＱＡＳＧＡ（配列番号７８）
ＱＡＣＧＡ（配列番号７９）
ＱＡＣＫＡ（配列番号８０）
ＡＣＡ（配列番号８１）
ＳＡＰＳＡ（配列番号８２）
が含まれる。
【００５７】
ドメインを、限定されないが、
ｈＩｇＧ１
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８７）
ｈＩｇＧ１（Ｓ２５２Ｃ）
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＣＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８８）
ｈＩｇＧ１（Ｓ４７３Ｃ）
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＣＬＳＰＧＫ（配列番号８９）を含むＦｃドメインへのＮ末端、Ｃ末端またはＮ末端及びＣ末端での両方の融合を介して組み合わせることもできる。
【００５８】
ここで、
７Ｃ１２は、
ＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＴＣＡＡＳＧＲＴＳＲＳＹＧＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＳＷＲＧＤＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＡＡＧＳＴＷＹＧＴＬＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨＧＡＥＦＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号９０）であり、
９Ｇ８は、
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＳＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＶＡＩＮＷＳＳＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＹＱＩＮＳＧＮＹＮＦＫＤＹＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＨＨＨＨＨＨＧＡＥＦＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号９１）であり、
Ｂ１は、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡＮＹＧＬＡＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４４）であり、
２Ｖは、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＬＡＩＳＴＲＳＹＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号６５）であり、
Ｐ３Ａ１は、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号４３）であり、
Ｄ３は、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号３９）であり、
Ｄ３Ｄ３は、
ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮ（配列番号９２）であり、
ＢＡ１１が、ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＰＬＹＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＴＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＭＳＴＮＩＷＴＧＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６６）である。
【００５９】
関連分野の当業者には、本明細書に記載のとおりの追加のドメインを含む二重特異性抗原結合分子が、一部の状況において、ＲＯＲ１及びＥＧＦＲを超える追加の特異性を含んでもよいことは明らかであろう。そのような構成も、本発明の範囲内である。
【００６０】
ＲＯＲ１特異性抗原結合分子は、ヒト化されていてもよい。ＲＯＲ１特異性抗原結合分子は、脱免疫化されていてもよい。本発明のヒト化配列の例には、限定されないが：
Ｂ１  Ｇ１
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＧＡＮＹＧＬＡＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＴＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４５）、
Ｂ１  Ｇ２
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＧＡＮＹＧＬＡＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４６）、
Ｐ３Ａ１  Ｖ１
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４７）、
Ｐ３Ａ１  Ｇ１
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＴＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４８）、
Ｐ３Ａ１  Ｇ２
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４９）、
Ｄ３ヒト化ＡＤＶ１
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５０）、
Ｄ３ヒト化ＡＤＶ２
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５１）、
Ｄ３ヒト化ＡＤＶ３
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＡＳＡＳＶＧＤＲＬＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＬＥＶＫ（配列番号５２）、
Ｂ１ヒト化Ｖ５
ＡＳＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＶＴＧＡＮＹＧＬＡＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＫＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５３）、
Ｂ１ヒト化Ｖ７
ＡＳＶＤＱＳＰＳＳＡＳＡＳＶＧＤＲＬＴＩＴＣＶＶＴＧＡＮＹＧＬＡＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＫＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＬＥＶＫ（配列番号５４）、
Ｄ３ヒト化ＥＬ  Ｖ１
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５５）、
Ｄ３ヒト化ＥＬ  Ｖ２
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５６）、
Ｄ３ヒト化ＥＬ  Ｖ３
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＦＳＧＳＧＳＫＲＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５７）、
Ｄ３ヒト化ＥＬ  Ｖ４
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＹＱＱＫＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５８）、及び
Ｄ３ヒト化ＥＬ  Ｖ５
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＹＱＱＫＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＦＳＧＳＧＳＫＲＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）
が含まれる。
【００６１】
ＥＧＦＲ特異性抗原結合分子は、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子のヒト化または脱免疫化とは独立に、ヒト化または脱免疫化されていてもよい。
【００６２】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、検出可能なラベル、色素、毒素、薬物、プロドラッグ、放射性核種または生物学的活性分子にコンジュゲートしていてもよい。コンジュゲーションは、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子及びＥＧＦＲ特異性抗原結合分子のいずれを介してもよい。加えて、コンジュゲーションは、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子及びＥＧＦＲ特異性抗原結合分子に融合した配列またはドメインを介してもよい。特に、コンジュゲーションは、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子及びＥＧＦＲ特異性抗原結合分子に融合したＦｃドメインまたは短いチオール含有配列を介する。
【００６３】
好ましくは、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子は、約０．０１〜５０ｎＭ、好ましくは０．１〜３０ｎＭ、さらにより好ましくは０．１〜１０ｎＭの親和定数で、ＲＯＲ１タンパク質と選択的に相互作用する。
【００６４】
さらに、二重特異性抗原結合分子は好ましくは、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞の死滅を媒介することができるか、またはがん細胞の増殖を阻害することができる。加えて、二重特異性抗原結合分子は好ましくは、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の死滅を媒介することができるか、またはがん細胞の増殖を阻害することができる。さらに、二重特異性抗原結合分子は好ましくは、ＲＯＲ１及びＥＧＦＲの両方を発現する腫瘍細胞の死滅を媒介することができるか、またはそのような細胞の増殖を阻害することができる。
【００６５】
二重特異性抗原結合分子は、ＲＯＲ１及び／またはＥＧＦＲに結合した際に、形質膜陥入されてもよい。他の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、ＲＯＲ１及び／またはＥＧＦＲに結合した際に、形質膜陥入されなくてもよい。
【００６６】
二重特異性抗原結合分子は、ＲＯＲ１及び／またはＥＧＦＲに結合した際に、ＲＯＲ１またはＥＧＦＲの細胞表面レベルまたは全タンパク質レベルを下方制御することができ得る。さらに、二重特異性抗原結合分子は、ＲＯＲ１またはＥＧＦＲシグナル伝達を下方制御することができ得る。二重特異性抗原結合分子は、ＲＯＲ１またはＥＧＦＲシグナル伝達を下方制御することができ得る。
【００６７】
二重特異性抗原結合分子の構成成分は、１つまたは複数のリンカードメインを介して連結されていてもよい。好ましいリンカーには、これに限定されないが、［Ｇ4Ｓ］x（ここで、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）が含まれる。特定の好ましいリンカーは、［Ｇ4Ｓ］3（配列番号６０）及び［Ｇ4Ｓ］5（配列番号６１）である。他の好ましいリンカーには、配列ＰＧＶＱＰＳＰ（配列番号６２）、ＰＧＶＱＰＳＰＧＧＧＧＳ（配列番号６３）及びＰＧＶＱＰＡＰＧＧＧＧＳ（配列番号６４）が含まれる。これらのリンカーは、タンパク質がＣＨＯ及び昆虫などのグリコシル化パターンが異なる発現系、ならびに発現されたタンパク質をグリコシル化しない発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される場合に、特に有用であり得る。
【００６８】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、任意の順序で、すなわち、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子をＮ末端またはＣ末端に置いて構築することができることも分かるであろう。
【００６９】
本発明の第２の態様では、第１の態様の二重特異性抗原結合分子を含む組み換え融合タンパク質を提供する。好ましくは、第２の態様の組み換え融合タンパク質において、二重特異性抗原結合分子は、１つまたは複数の生物学的活性タンパク質に融合している。二重特異性抗原結合分子は、１つまたは複数のリンカードメインを介して１つまたは複数の生物学的活性タンパク質に融合していてもよい。好ましいリンカーには、これに限定されないが、［Ｇ4Ｓ］x（ここで、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）が含まれる。特定の好ましいリンカーは、［Ｇ4Ｓ］3（配列番号６０）及び［Ｇ4Ｓ］5（配列番号６１）である。他の好ましいリンカーには、配列ＰＧＶＱＰＳＰ（配列番号６２）、ＰＧＶＱＰＳＰＧＧＧＧＳ（配列番号６３）及びＰＧＶＱＰＡＰＧＧＧＧＳ（配列番号６４）が含まれる。これらのリンカーは、組み換え融合タンパク質がＣＨＯ及び昆虫などのグリコシル化パターンが異なる発現系、ならびに発現されたタンパク質をグリコシル化しない発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される場合に、特に有用であり得る。
【００７０】
本発明の融合タンパク質は、任意の順序で、すなわち、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子をＮ末端、Ｃ末端に置いて、またはいずれの末端にも置かずに（例えば、より長いアミノ酸配列の途中に置いて）構築することができることも分かるであろう。さらに、二重特異性抗原結合分子のＲＯＲ１及びＥＧＦＲ構成成分が生物学的活性タンパク質によって分離されている融合タンパク質を記載する。非限定的例は、二重特異性抗原結合分子の２つの構成成分の間のＦｃドメインの存在であろう。所望の正確な構成に応じて、本明細書に記載のとおりの１つまたは複数のリンカードメインが含まれてもよい。
【００７１】
好ましい生物学的活性タンパク質には、限定されないが、免疫グロブリン、免疫グロブリンＦｃ領域、免疫グロブリンＦａｂ領域、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、インテイン、ＶＮＡＲドメイン、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨドメイン、またはスキャフォールドタンパク質（アフィボディ、センチリン、ダルピン（ｄａｒｐｉｎ）など）が含まれる。特に好ましい生物学的活性タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域である。
【００７２】
本発明の融合タンパク質の任意の部分を、コンジュゲーションを可能にするために操作してもよい。免疫グロブリンＦｃ領域を使用する好ましい一例では、これを、コンジュゲーション部位としてシステイン残基を含むように操作してもよい。好ましい導入システイン残基には、これに限定されないが、Ｓ２５２Ｃ及びＳ４７３Ｃ（Ｋａｂａｔナンバリング）が含まれ、これらはそれぞれ、ＥＵナンバリングにおけるＳ２３９Ｃ及びＳ４４２Ｃに対応する。
【００７３】
第２の態様に従い、複数のＶＮＡＲドメインを含む組み換え融合体を提供する。したがって、本発明の組み換え融合体は、ＶＮＡＲの二量体、三量体またはより高次の多量体であってもよい。そのような組み換え融合体において、各ＶＮＡＲの特異性は、同じでも、または異なってもよい。本発明の組み換え融合体には、これに限定されないが、各ＶＮＡＲドメインが異なる抗原に結合する、または単一抗原上の異なるエピトープに結合する（二重パラトピック結合因子である）二重特異性または三重特異性分子が含まれる。本明細書で使用する場合の「二重パラトピック」という用語は、所与の抗原上の複数のエピトープに結合する分子を包含することが意図されている。所与の抗原上の３つ以上のエピトープに結合する分子も、本明細書で企図されており、「二重パラトピック」という用語を使用する場合、これは、三重パラトピックまたは多重パラトピック分子の可能性も包含すると理解されるべきである。
【００７４】
また、第２の態様に従い、第１の態様の二重特異性抗原結合分子及びヒト化ＶＮＡＲドメインを含む組み換え融合体を提供する。ヒト化ＶＮＡＲドメインは、ソロＭＥＲ（ｓｏｌｏＭＥＲ）と称されることもあり、限定されないが、高い親和性でヒト血清アルブミンに結合するヒト化ＶＮＡＲであるＶＮＡＲ  ＢＡ１１が含まれる（Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１３  ＪＢＣ）。
【００７５】
ある特定の実施形態では、本発明の特異性結合分子または組み換え融合体は、精製を援助するＮ末端またはＣ末端タグと共に発現されてもよい。例には、これに限定されないが、Ｈｉｓ６及び／またはＭｙｃが含まれる。加えて、Ｎ末端またはＣ末端タグを、コンジュゲーション点として役立つ追加のシステイン残基を含むように、さらに操作してもよい。したがって、本発明のすべての態様における特異性結合分子または組み換え融合体に対する言及では、様々なＮ末端またはＣ末端タグを含むそのような分子を包含し、それらのタグもコンジュゲーションのために追加のシステインを含んでよいことも意図されていることは分かるであろう。
【００７６】
また、第２の態様に従い、第１の態様の二重特異性抗原結合分子及び組み換え毒素を含む組み換え融合体を提供する。組み換え毒素の例には、これに限定されないが、シュードモナス外毒素ＰＥ３８及びジフテリア毒素が含まれる。
【００７７】
本発明の第３の態様では、少なくとも１つの膜貫通領域及び少なくとも１つの細胞内ドメインに融合またはコンジュゲートしている、本発明の第１の態様によって定義されたとおりの少なくとも１個の二重特異性抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【００７８】
本発明はまた、第３の態様によるキメラ抗原受容体を含み、好ましくは操作Ｔ細胞である細胞を提供する。
【００７９】
本発明の第４の態様では、本発明の第１、第２、または第３の態様による二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸配列を提供する。
【００８０】
第４の態様による核酸配列を含むベクター及びそのような核酸を含む宿主細胞も提供する。
【００８１】
第１、第２または第３の態様の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体を調製するための方法を提供する。当該方法は、上記のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を、前記宿主細胞が二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体を産生するような条件下で培養または維持することを含み、任意選択で、二重特異性抗原結合分子、組み換え体融合タンパク質またはキメラ抗原受容体を単離することをさらに含む。
【００８２】
本発明の第５の態様では、第１、第２または第３の態様の二重特異性抗原結合分子、融合タンパク質またはキメラ抗原受容体を含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、様々な薬学的に許容される担体を含有してよい。本発明の医薬組成物は、限定されないが、静脈内、筋肉内、経口、腹腔内、または局所投与を含む当技術分野で知られている任意の適切な方法によって投与するためのものであってよい。好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、液剤、ゲル剤、散剤、錠剤、カプセル剤、またはフォーム剤の形態で調製することができる。
【００８３】
第１、第２または第３の態様の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体は、治療において使用するためのものであってよい。より具体的には、第１、第２または第３の態様の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体は、がんの処置において使用するためのものであってよい。好ましくは、がんは、ＲＯＲ１陽性がん種である。より好ましくは、がんは、リンパ腫及び白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液がん、ならびに神経芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、皮膚癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌または肝臓癌を含む固形腫瘍を含む群から選択される。
【００８４】
本明細書では、疾患を処置することを、それを必要とする患者において行うための医薬品の製造における、第１、第２または第３の態様の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体の使用も提供する。
【００８５】
さらに、本発明に従い、処置を必要とする患者において疾患を処置する方法を提供する。当該方法は、前記患者に、治療上有効な投薬量の第１、第２または第３の態様の二重特異性抗原結合分子、組み換え融合タンパク質またはキメラ抗原受容体あるいは第５の態様の医薬組成物を投与することを含む。
【００８６】
好ましくは、がんは、ＲＯＲ１陽性がん種である。より好ましくは、がんは、リンパ腫及び白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液がん、ならびに神経芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、皮膚癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌または肝臓癌を含む固形腫瘍を含む群から選択される。
【００８７】
本明細書では、試料における標的分析物の存在をアッセイする方法も提供する。当該方法は、検出可能に標識された、第１の二重特異性抗原結合分子、または第２の態様の組み換え融合タンパク質を試料に添加すること、及び標的分析物へのその分子の結合を検出することを含む。
【００８８】
加えて、本明細書では、対象において疾患の部位を撮像する方法も提供する。当該方法は、検出可能に標識された第１の態様の二重特異性抗原結合分子または検出可能に標識された第２の態様の組み換え融合タンパク質を対象に投与することを含む。
【００８９】
本明細書では、対象において疾患または医学的状態を診断する方法も提供する。当該方法は、第１の態様の二重特異性抗原結合分子または第２の態様の組み換え融合タンパク質を投与することを含む。
【００９０】
本明細書では、ＲＯＲ１への結合について、第１の態様のＲＯＲ１特異性抗原結合分子と競合する抗体、抗体断片または抗原結合分子も企図されている。本明細書では、ＲＯＲ１及びＥＧＦＲへの結合について、第１の態様の二重特異性抗原結合分子と競合する抗体、抗体断片または抗原結合分子も企図されている。抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）の文脈で使用する場合の「競合する」という用語は、試験下の抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその機能性断片）が、共通の抗原（例えば、第１の態様の二重特異性抗原結合分子の場合にはＲＯＲ１またはＥＧＦＲ）への本明細書に定義の抗原結合分子（例えば、第１の態様の二重特異性抗原結合分子）の特異性結合を妨害または阻害するアッセイによって決定されるような、抗原結合タンパク質同士の競合を意味する。
【００９１】
本明細書では、がんに罹患している対象、もしくはその素質を診断する、または対象の状態の予後を得るためのキットも記載する。当該キットは、被験者からの試料中に存在する抗原の濃度を検出するための検出手段を含み、その際、検出手段は、それぞれ任意選択で誘導体化されている第１の態様の二重特異性抗原結合分子、第２の態様の組み換え融合タンパク質、第３の態様のキメラ抗原受容体または第４の態様の核酸配列を含み、試料中の抗原の存在が、対象ががんに罹患していることを示唆する。好ましくは、抗原は、ＲＯＲ１タンパク質、より好ましくはその細胞外ドメインを含む。より好ましくは、キットを、試料におけるＲＯＲ１陽性細胞の存在または非存在を同定する、または試料におけるその濃度を決定するために使用する。当該キットは、アッセイが比較される陽性対照及び／または陰性対照及び／または検出され得る標識を含んでもよい。
【００９２】
本発明は、がんに罹患している対象、もしくはその素質を診断する、または対象の状態の予後を得るための方法も提供する。当該方法は、対象から得られた試料中に存在する抗原の濃度を検出することを含み、その際、その検出が、それぞれ任意選択で誘導体化されている第１の態様の二重特異性抗原結合分子、第２の態様の組み換え融合タンパク質、第３の態様のキメラ抗原受容体または第４の態様の核酸配列を使用して達成され、試料中の抗原の存在が、対象ががんに罹患していることを示唆する。
【００９３】
本明細書では、インビトロで、または患者において、ＲＯＲ１を発現する細胞を死滅させる、またはその成長を阻害する方法も企図されている。当該方法は、その細胞に、薬学的有効量または用量の（ｉ）第１の態様の二重特異性抗原結合分子、第２の態様の組み換え融合タンパク質、第３の態様の核酸配列、または第４の態様によるＣＡＲもしくは細胞、あるいは（ｉｉ）第５の態様の医薬組成物を投与することを含む。好ましくは、ＲＯＲ１を発現する細胞は、がん細胞である。より好ましくは、ＲＯＲ１は、ヒトＲＯＲ１である。
【００９４】
本明細書では、インビトロで、または患者において、ＥＧＦＲを発現する細胞を死滅させる、またはその成長を阻害する方法も企図されている。当該方法は、その細胞に、薬学的有効量または用量の（ｉ）第１の態様の二重特異性抗原結合分子、第２の態様の組み換え融合タンパク質、第３の態様の核酸配列、または第４の態様によるＣＡＲもしくは細胞、あるいは（ｉｉ）第５の態様の医薬組成物を投与することを含む。好ましくは、ＥＧＦＲを発現する細胞は、がん細胞である。
【００９５】
本明細書では、インビトロで、または患者において、ＲＯＲ１及びＥＧＦＲの両方を発現する細胞を死滅させる、またはその成長を阻害する方法も企図されている。当該方法は、その細胞に、薬学的有効量または用量の（ｉ）第１の態様の二重特異性抗原結合分子、第２の態様の組み換え融合タンパク質、第３の態様の核酸配列、または第４の態様によるＣＡＲもしくは細胞、あるいは（ｉｉ）第５の態様の医薬組成物を投与することを含む。好ましくは、ＲＯＲ１及びＥＧＦＲを発現する細胞は、がん細胞である。
【００９６】
本発明の第６の態様では、式（ＩＩ）：
Ｘｂ−Ｘ−Ｘａ−ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４−Ｙａ−Ｙ−Ｙｂ  （ＩＩ）
によって表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
式中、
ＦＷ１は、フレームワーク領域であり、
ＣＤＲ１は、ＣＤＲ配列であり、
ＦＷ２は、フレームワーク領域であり、
ＨＶ２は、超可変配列であり、
ＦＷ３ａは、フレームワーク領域であり、
ＨＶ４は、超可変配列であり、
ＦＷ３ｂは、フレームワーク領域であり、
ＣＤＲ３は、ＣＤＲ配列であり、
ＦＷ４は、フレームワーク領域であり、
ここで、Ｘａ、Ｘｂ、Ｙａ及びＹｂは、存在しないか、またはＥＧＦＲ特異性結合分子であるかのいずれかであり、
Ｘａ、Ｘｂ、Ｙａ及びＹｂのうちの少なくとも１個は、ＥＧＦＲ特異性結合分子であり、
Ｘ及びＹは、任意選択のアミノ酸配列であり、
特異性抗原結合分子は第２の部分にコンジュゲートしている。
【００９７】
ある特定の好ましい実施形態では、本発明のこの態様による二重特異性抗原結合分子は追加的に、第３、第４または第５の部分にコンジュゲートしていてもよい。さらなる部分のコンジュゲーションも企図されている。場合によっては、第３、第４または第５の部分は、第２の部分にコンジュゲートしていてもよい。したがって、本発明のこの態様による部分のいずれも、それにコンジュゲートした追加の部分を有してもよいことは理解されるであろう。下に提示するとおりの第２の部分の好ましい特徴の説明は、必要な変更を加えれば、第３、第４、第５またはそれ以上の順位の部分にも当てはまる。
【００９８】
好ましくは、ＸまたはＹは個々に、存在しないか、あるいは免疫グロブリン、免疫グロブリンＦｃ領域、免疫グロブリンＦａｂ領域、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、インテイン、ＶＮＡＲドメイン、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨドメイン、もしくはスキャフォールドタンパク質（アフィボディ、センチリン、ダルピンなど）、または限定されないが、シュードモナス外毒素ＰＥ３８、ジフテリア毒素を含む毒素を含む群から選択されるかのいずれかである。
【００９９】
好ましくは、コンジュゲーションは、特異性抗原結合分子のアミノ酸配列中のシステイン残基を介する。システイン残基は、任意選択の配列ＸまたはＹ（存在する場合）を含めて、配列中のどこにあってもよい。
【０１００】
コンジュゲーションは、特異性抗原結合分子のアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に組み込まれたチオール、アミノキシまたはヒドラジニル部分を介してもよい。
【０１０１】
好ましくは、第２の部分は、検出可能な標識、色素、毒素、薬物、プロドラッグ、放射性核種または生物学的活性分子を含む群から選択される。
【０１０２】
より好ましくは、第２の部分は、
・  メイタンシノイド、
・  オーリスタチン、
・  アントラサイクリン、好ましくはＰＮＵ由来アントラサイクリン
・  カリケアマイシン、
・  アマニチン誘導体、好ましくはα−アマニチン誘導体、
・  ツブリシン、
・  デュオカルマイシン、
・  放射性同位体、例えば、227Ｔｈまたは225Ａｃなどのアルファ線放射性核種、
・  毒性ペイロードを含むリポソーム、
・  タンパク質毒素、
・  タキサン、
・  ピロールベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）
・  インドリノベンゾジアゼピンシュードダイマー及び／または
・  スプライソソーム阻害薬、
・  ＣＤＫ１１阻害薬、
・  ピリジノベンゾジアゼピン
を含む群から選択される少なくとも１つの毒素である。
【０１０３】
この態様による他の好ましい実施形態では、第２の部分は、免疫グロブリン、免疫グロブリンＦｃ領域、免疫グロブリンＦａｂ領域、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、インテイン、ＶＮＡＲドメイン、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨドメイン、もしくはスキャフォールドタンパク質（アフィボディ、センチリン、ダルピンなど）、または限定されないが、シュードモナス外毒素ＰＥ３８、ジフテリア毒素を含む毒素を含む群からのものであってよい。
【０１０４】
特に好ましい実施形態では、第２の部分は、この態様による特異性抗原結合分子と同じでも、または異なってもよいＶＮＡＲドメインである。したがって、化学的コンジュゲーションによって結合されたＶＮＡＲドメインの二量体、三量体またはより高次の多量体が、本明細書では明示的に企図されている。このような実施形態では、それぞれ個々のＶＮＡＲドメインは、他のＶＮＡＲドメインと同じ抗原特異性を有してもよいし、またはそれらは異なってもよい。
【０１０５】
この態様によると、特異性抗原結合分子は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）特異性抗原結合分子であってよい。これは、本発明の第１の態様に関連して上記したとおりのＲＯＲ１特異性抗原結合分子であってよい。したがって、第１、第２及び第３の態様に関連して上記した好ましい特徴のいずれも、必要な変更を加えれば、第６の態様に当てはまる。
【０１０６】
好ましくは、ＥＧＦＲ特異性抗原結合分子は、免疫グロブリン、免疫グロブリンＦａｂ領域、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、インテイン、ＶＮＡＲドメイン、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨドメイン、もしくはスキャフォールドタンパク質（アフィボディ、センチリン、ダルピンなど）を含む群から選択される。
【０１０７】
第６の態様の二重特異性抗原結合分子は、治療において使用するためのものであってよい。より具体的には、第６の態様の二重特異性抗原結合分子は、がんの処置において使用するためのものであってよい。好ましくは、がんは、ＲＯＲ１陽性がん種である。より好ましくは、がんは、リンパ腫及び白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液がん、ならびに神経芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、皮膚癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌または肝臓癌を含む固形腫瘍を含む群から選択される。
【０１０８】
本明細書では、疾患を処置を、それを必要とする患者において行うための医薬品の製造における、第６の態様の二重特異性抗原結合分子の使用も提供する。
【０１０９】
第６の態様の二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、様々な薬学的に許容される担体を含有してよい。
【０１１０】
さらに、本発明に従い、処置を必要とする患者において疾患を処置する方法を提供する。当該方法は、前記患者に、治療上有効な投薬量の第６の態様の二重特異性抗原結合分子または第６の態様の特異性抗原結合分子を含む医薬組成物を投与することを含む。
【０１１１】
好ましくは、がんは、ＲＯＲ１陽性がん種である。より好ましくは、がんは、リンパ腫及び白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液がん、ならびに神経芽細胞腫、腎臓癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、皮膚癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌または肝臓癌を含む固形腫瘍を含む群から選択される。
【０１１２】
本明細書では、試料における標的分析物の存在をアッセイする方法も提供する。当該方法は、検出可能に標識された第６の態様の二重特異性抗原結合分子を前記試料に添加すること、及び標的分析物へのその分子の結合を検出することを含む。
【０１１３】
加えて、本明細書では、対象において疾患の部位を撮像する方法を提供する。当該方法は、検出可能に標識された第６の態様の二重特異性抗原結合分子を対象に投与することを含む。
【０１１４】
本明細書では、対象において疾患または医学的状態を診断する方法も提供する。当該方法は、第６の態様の二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。
【０１１５】
本発明の第７の態様では、式（ＩＩ）：
Ｘｂ−Ｘ−Ｘａ−ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４−Ｙａ−Ｙ−Ｙｂ  （ＩＩ）
によって表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
式中、
ＦＷ１は、フレームワーク領域であり、
ＣＤＲ１は、ＣＤＲ配列であり、
ＦＷ２は、フレームワーク領域であり、
ＨＶ２は、超可変配列であり、
ＦＷ３ａは、フレームワーク領域であり、
ＨＶ４は、超可変配列であり、
ＦＷ３ｂは、フレームワーク領域であり、
ＣＤＲ３は、ＣＤＲ配列であり、
ＦＷ４は、フレームワーク領域であり、
ここで、Ｘａ、Ｘｂ、Ｙａ及びＹｂは、非存在であるか、ＥＧＦＲ特異性結合分子であるかのいずれかであり、
Ｘａ、Ｘｂ、Ｙａ及びＹｂのうちの少なくとも１個は、ＥＧＦＲ特異性結合分子であり、
Ｘ及びＹは、任意選択のアミノ酸配列である。
【０１１６】
本発明の第７の態様に関連して記載した特徴はすべて、必要な変更を加えれば、第７の態様の分子に当てはまる。
【０１１７】
さらに、本発明の上述の態様のいずれかに関して記載した特徴はいずれも、必要な変更を加えれば、本発明の他の態様と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ＶＮＡＲドメインを提示する抗ＲＯＲ１ファージモノクローナル：ＥＬＩＳＡにおけるヒトまたはマウス組み換えＲＯＲ１−Ｆｃへの結合。Ｂ１、Ｐ３Ａ１及びＥ７−特異性ＲＯＲ１結合因子、Ｈ２−非特異性ファージ。
【図２】ヒトＲＯＲ１（Ｂ１及びＥ７）及びマウスＲＯＲ１（Ｐ３Ａ１及びＣＰＦ７）を用いた合成ＶＮＡＲライブラリーのスクリーニングから得られたＲＯＲ１結合配列。配列は、Ｃ末端Ｈｉｓ6Ｍｙｃタグを含まずに、及び含んで示されている（斜体がＨｉｓ6  Ｍｙｃ配列）。
【図３】ヒトＲＯＲ１を用いた免疫化ＶＮＡＲライブラリーの生成：マウスまたはヒトＲＯＲ１に結合する３種のツノザメの免疫化前後の血漿の分析。
【図４】免疫化ＶＮＡＲライブラリーからの抗ＲＯＲ１ファージモノクローナル：ＥＬＩＳＡにおけるヒトまたはマウス組み換えＲＯＲ１−Ｆｃへの結合。ファージ上に提示されたＥ９及びＤ３特異性ＲＯＲ１結合因子、Ｈ１非特異性ＶＮＡＲ結合因子。
【図５】マウスＲＯＲ１を用いた免疫化ＶＮＡＲライブラリーのスクリーニングから得られたＲＯＲ１結合配列Ｅ９及びＤ３。配列は、Ｃ末端Ｈｉｓ6Ｍｙｃタグを含まずに、及び含んで示されている（斜体がＨｉｓ６  Ｍｙｃ配列）。
【図６】室温での５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰバッファーｐＨ６．０中のタグ無しのＶＮＡＲ、ＶＮＡＲ  ６ｘＨｉｓ及びＶＮＡＲ−Ｈｉｓ6−Ｍｙｃの遠ＵＶ  ＣＤスペクトル。
【図７】ＶＮＡＲの再フォーマット。Ａ：単量体ＶＮＡＲ、Ｂ：ホモ二量体、Ｃ：Ｃ末端分子間ジスルフィド結合を介してコンジュゲートしたホモ二量体、Ｄ：ヘテロ二量体、Ｅ：ＶＮＡＲ  ＩｇＧ  Ｆｃ融合体、Ｆ：ＩｇＧ  Ｆｃ−ＶＮＡＲ融合体、Ｇ：ＶＮＡＲ−（ＩｇＧ  Ｆｃ）−ＶＮＡＲ融合体。
【図８】ｈＲＯＲ１へのＢ１  Ｃ末端で結合したホモ二量体の結合。ＥＬＩＳＡによるヒトＲＯＲ１へのＢ１、Ｂ１  Ｃ末端チオール（Ｂ１  ＳＨ）及びＢ１  Ｃ末端ジスルフィド二量体（Ｂ１  Ｓ−Ｓ  Ｂ１）の結合。
【図９】フローサイトメトリーによるＡ５４９（ＲＯＲ１高）肺癌細胞へのＶＮＡＲ（Ｈｉｓ6Ｍｙｃタグ）分子の細胞表面結合。Ｂ１及びＥ７モノマーならびにＰ３Ａ１−Ｐ３Ａ１二量体は、試験されたすべての濃度で、Ａ５４９細胞に強く結合する。ＣＰＦ７及びＰ３Ａ１モノマーは、５０μｇ／ｍＬで、Ａ５４９細胞に結合する。ＶＮＡＲ結合を、ＰＥ−抗ＭｙｃタグＡｂ（ＣＳＴ）を使用して検出し、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して解析した。
【図１０】ＶＮＡＲ  ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質において使用されたリンカーマウスＩｇＧ及びリンカーヒトＩｇＧ配列。操作ｈＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質は、部位特異的ラベルを可能にするために、操作システイン置換を、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ配列中に、例えば、Ｓ２５２Ｃ位（Ｋａｂａｔナンバリング）を組み込んでいる。
【図１１】インテイン切断試薬及び対応するＶＮＡＲ  Ｃ末端誘導体。
【図１２】ＥＬＩＳＡによるヒト、マウス及びラットＲＯＲ１ならびにヒトＲＯＲ２へのＶＮＡＲ結合。すべてのＶＮＡＲが、ＲＯＲ１に対して交差反応性な種であることが見い出された。ＶＮＡＲクローンのいずれも、ヒトＲＯＲ２とは交差反応しなかった。
【図１３】フローサイトメトリーによる、Ａ４２７（ＲＯＲ１低）と比較した、Ａ５４９（ＲＯＲ１高）肺癌細胞系へのＶＮＡＲ細胞表面結合。ＰＥ−抗Ｍｙｃ  Ａｂ（ＣＳＴ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーターを使用して、ＶＮＡＲ結合を検出した。
【図１４】４℃または３７℃で２時間にわたるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞へのＶＮＡＲの細胞表面結合。３７℃での細胞表面シグナルの減少は、ＲＯＲ１内在化を示唆している。ＶＮＡＲ結合を、ＰＥ−抗ＭｙｃタグＡｂ（ＣＳＴ）を使用して検出し、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂ１）またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーターを使用して解析した。
【図１５】Ａ４２７（ＲＯＲ１低）と比較した、Ａ５４９（ＲＯＲ１高）肺癌細胞系へのＶＮＡＲ−ｈＦｃ分子細胞表面結合を示す棒グラフ。ＶＮＡＲ  ｈＦｃ結合を、ＰＥ−抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ／Ｓｔｒａｔｅｃｈ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーターを使用して検出した。
【図１６】ＶＮＡＲ−Ｆｃ融合体の内在化。４℃または３７℃での２時間にわたるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞へのＶＮＡＲ−Ｆｃの細胞表面結合。３７℃での細胞表面シグナルの減少は、ＲＯＲ１内在化を示唆している。ＶＮＡＲ−Ｆｃ結合を、ＰＥ−抗ヒト抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーターを使用して検出した。
【図１７】ＶＮＡＲは、グリコシル化とは無関係に、ヒトＲＯＲ１に結合する。Ａ：ｈＲＯＲ１（レーン２）及び脱グリコシル化ｈＲＯＲ１（レーン３）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。分子量マーカー（レーン１）。Ｂ：ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲ。Ｂ１、Ｐ３Ａ１−Ｐ３Ａ１及びＤ３−Ｄ３は、ＥＬＩＳＡによると、脱グリコシル化ｈＲＯＲ１に同等に良好に結合する。Ｃ：Ｂ１  ｍＦｃは、ＥＬＩＳＡによると、グリコシル化及び脱グリコシル化ｈＲＯＲ１に同等に良好に結合する。折り畳まれていないｈＲＯＲ１（２８ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％サルコシルで還元）への結合は、立体構造エピトープ（複数可）へのＢ１  ＶＮＡＲ結合と一致して、有意に減少した。
【図１８】Ｂ１は、ＳＥＣによると、ＲＯＲ１  Ｉｇドメインと共に複合体を形成する。Ａ：Ｂ１  ｈｉｓを含む、及び含まないヒトＲＯＲ１  Ｉｇドメイン（それぞれオレンジ色及び青色）の重ね合わせたＳＥＣ分析（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。Ｂ：ピーク画分のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。
【図１９】予め捕捉されたＢ１  Ｈｉｓ6Ｍｙｃ  ＶＮＡＲを伴う／伴わない場合の、ｈＲＯＲ１へのＶＮＡＲの結合を示すＳＰＲセンソグラム。２Ｖ単量体または二量体は、これらの条件のいずれの下でも、結合しなかった。
【図２０】Ｂ１及びＰ３Ａ１は、ＥＬＩＳＡによると、選択された直鎖ＲＯＲ１ペプチドに結合しない。ヒトＲＯＲ１への結合が、陽性対照として含められる。
【図２１−１】Ｂ１、Ｐ３Ａ１、Ｄ３及びＤ３−Ｄ３は、ＥＬＩＳＡによると、選択された直鎖ＲＯＲ１ペプチドに結合しない。ヒトＲＯＲ１への結合が、陽性対照として含められる。
【図２１−２】Ｂ１、Ｐ３Ａ１、Ｄ３及びＤ３−Ｄ３は、ＥＬＩＳＡによると、選択された直鎖ＲＯＲ１ペプチドに結合しない。ヒトＲＯＲ１への結合が、陽性対照として含められる。
【図２２−１】競合ＥＬＩＳＡ実験。
【図２２−２】競合ＥＬＩＳＡ実験。
【図２３】競合ＥＬＩＳＡ実験。
【図２４】種々のＲＯＲ１ドメインへのＢ１、Ｐ３Ａ１、Ｄ３単量体及びＤ３−Ｄ３二量体の結合。
【図２５】ベンズアルデヒドフルオレセインへのＢＡ１１アミノキシコンジュゲーションの図。
【図２６】マレイミドフルオレセインへのＢＡ１１チオールコンジュゲーションの図。
【図２７】マレイミドフルオレセインへのＢＡ１１  Ｃ末端システイン誘導コンジュゲーションの図。
【図２８−１】コンジュゲーションのために使用されるラベル及びペイロードの例。
【図２８−２】コンジュゲーションのために使用されるラベル及びペイロードの例。
【図２９】Ｂ１  ＭＭＡＥコンジュゲートの分析。Ａ：Ｂ１  ｈｉｓ  ｍｙｃ誘導体及びコンジュゲートのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析（レーン１：Ｂ１アミノキシ、２：Ｂ１オキシムＭＭＡＥ、３：Ｂ１オキシム  ｖｃ  ＭＭＡＥ、４：Ｂ１  ＳＨ  ｖｃ  ＭＭＡＥ）。Ｂ〜Ｆ：Ｂ１  ｈｉｓ  ｍｙｃ  誘導体及びコンジュゲートのエレクトロスプレー質量スペクトル。Ｂ：Ｂ１  ＳＨ（予測質量；１４９０８．９Ｄａ、実測質量１４９０８．４Ｄａ）、Ｃ：Ｂ１  ＳＨ  ｖｃ  ＭＭＡＥ（予測質量１６２２５．５Ｄａ、実測質量１６２２５．５Ｄａ）、Ｄ：Ｂ１アミノキシ（予測質量１４９３７．４Ｄａ、実測質量１４９３６．５Ｄａ）；Ｅ：Ｂ１オキシムＭＭＡＥ（予測質量１６０１５．４Ｄａ、実測質量１６０１６．７Ｄａ）；Ｆ：Ｂ１オキシム  ｖｃ  ＭＭＡＥ（予測質量１６３３４．４Ｄａ、実測質量１６３３４．２Ｄａ）。
【図３０】対Ａ４２７（ＲＯＲ１低）と比較した、Ａ５４９（ＲＯＲ１高）肺癌細胞系におけるＢ１−、Ｐ３Ａ１−及び２Ｖ−ｈＦｃ分子と、ＭＭＡＥ−コンジュゲートされたバージョンとの細胞表面結合。ＶＮＡＲ  ｈＦｃ結合を、ＰＥ−抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ／Ｓｔｒａｔｅｃｈ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーターを使用して検出した。
【図３１−１】ＶＮＡＲ  ｈＦｃコンジュゲートの分析。Ａ及びＢ：ＶＮＡＲ  ｈＦｃ（Ｓ２５２Ｃ）タンパク質及びコンジュゲート（それぞれ４〜１２％及び１２％Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓゲル）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。レーン１：未処理タンパク質、２：再び折り畳みされたタンパク質及び３：ＭＭＡＥコンジュゲート（ＤＴＴでの還元を伴う、及び伴わない）。Ｃ及びＤ：それぞれＭＭＡＥコンジュゲーションの前後の脱グリコシル化還元ＶＮＡＲ  ｈＦｃ（Ｓ２５２Ｃ）融合タンパク質の質量分光分析の例。予測質量：未コンジュゲートは３８，９９７．８Ｄａ、ＭＭＡＥコンジュゲート（ＤＡＲ２）は４０，３１０．０Ｄａ。Ｅ及びＦ：ＶＮＡＲ  ｈＦｃ（Ｓ４７３Ｃ）タンパク質コンジュゲートのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。レーン３：ＭＭＡＥコンジュゲート及び４：ＡＦ４８８コンジュゲート（ＤＴＴでの還元を伴う、及び伴わない）。Ｇ及びＨ：それぞれ脱グリコシル化還元Ｂ１およびＰ３Ａ１  ｈＦｃ（Ｓ４７３Ｃ）ＭＭＡＥコンジュゲートの質量分光分析。予測質量：Ｂ１コンジュゲートは４０，１７０．５Ｄａであり、Ｐ３Ａ１コンジュゲートは４０，３０８．５Ｄａである（２のＤＡＲ）［＊は、インソースフラグメンテーションによる、ＭＳアーチファクトに対応する］。  Ｉ及びＪ：それぞれ脱グリコシル化還元Ｂ１およびＰ３Ａ１  ｈＦｃｈＦｃ（Ｓ４７３Ｃ）ＡＦ４８８コンジュゲートの質量分光分析。予測質量：Ｂ１コンジュゲートは３９，５５２．４Ｄａであり、Ｐ３Ａ１コンジュゲートは３９，６９０．４Ｄａである（２のＤＡＲ）。
【図３１−２】ＶＮＡＲ  ｈＦｃコンジュゲートの分析。Ａ及びＢ：ＶＮＡＲ  ｈＦｃ（Ｓ２５２Ｃ）タンパク質及びコンジュゲート（それぞれ４〜１２％及び１２％Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓゲル）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。レーン１：未処理タンパク質、２：再び折り畳みされたタンパク質及び３：ＭＭＡＥコンジュゲート（ＤＴＴでの還元を伴う、及び伴わない）。Ｃ及びＤ：それぞれＭＭＡＥコンジュゲーションの前後の脱グリコシル化還元ＶＮＡＲ  ｈＦｃ（Ｓ２５２Ｃ）融合タンパク質の質量分光分析の例。予測質量：未コンジュゲートは３８，９９７．８Ｄａ、ＭＭＡＥコンジュゲート（ＤＡＲ２）は４０，３１０．０Ｄａ。Ｅ及びＦ：ＶＮＡＲ  ｈＦｃ（Ｓ４７３Ｃ）タンパク質コンジュゲートのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。レーン３：ＭＭＡＥコンジュゲート及び４：ＡＦ４８８コンジュゲート（ＤＴＴでの還元を伴う、及び伴わない）。Ｇ及びＨ：それぞれ脱グリコシル化還元Ｂ１およびＰ３Ａ１  ｈＦｃ（Ｓ４７３Ｃ）ＭＭＡＥコンジュゲートの質量分光分析。予測質量：Ｂ１コンジュゲートは４０，１７０．５Ｄａであり、Ｐ３Ａ１コンジュゲートは４０，３０８．５Ｄａである（２のＤＡＲ）［＊は、インソースフラグメンテーションによる、ＭＳアーチファクトに対応する］。  Ｉ及びＪ：それぞれ脱グリコシル化還元Ｂ１およびＰ３Ａ１  ｈＦｃｈＦｃ（Ｓ４７３Ｃ）ＡＦ４８８コンジュゲートの質量分光分析。予測質量：Ｂ１コンジュゲートは３９，５５２．４Ｄａであり、Ｐ３Ａ１コンジュゲートは３９，６９０．４Ｄａである（２のＤＡＲ）。
【図３２−１】ＶＮＡＲ  ｈＦｃ  ＰＢＤ二量体、アマニチン及びＰＮＵコンジュゲートの図。
【図３２−２】ＶＮＡＲ  ｈＦｃ  ＰＢＤ二量体、アマニチン及びＰＮＵコンジュゲートの図。
【図３３】種々のヒトがん細胞系のパネルにおける、Ｂ１  ｍＦｃ  ＭＭＡＥまたは２Ｖ  ｍＦｃ−ＭＭＡＥ分子での処理（７２時間）後の細胞生存率。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、培養中の代謝活性な細胞の数と相関するＡＴＰを定量化した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して決定した。
【図３４】２種の異なるヒトがん細胞系（ＤＵ１４５及びＪｅｋｏ−１）における、ＶＮＡＲ  ｈＦｃ  ＰＢＤコンジュゲートでの処理（９６時間）後の細胞生存率。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、培養中の代謝活性な細胞の数と相関するＡＴＰを定量化した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して決定した。ＶＮＡＲ  ｈＦｃコンジュゲートを、ＶＮＡＲ  ｈＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｓ２５２Ｃ）融合体をＭＡ  ＰＥＧ４  ｖａ  ＰＢＤと反応させることによって生成した（図３２を参照されたい）。
【図３５】２種の異なるヒトがん細胞系（ＰＡ−１及びＫａｓｕｍｉ−２）においてＶＮＡＲ  ｈＦｃ  ＰＢＤ、ＳＧ３１９９  ＰＢＤ及びＰＮＵ（ＰＥＧ４  ｖｃ  ＰＡＢ  ＤＭＡＥ  ＰＮＵ１５９６８２）コンジュゲートで処理（９６時間）した後の細胞生存率。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、培養中の代謝活性な細胞の数と相関するＡＴＰを定量化した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して決定した。それによって、ＶＮＡＲ  ｈＦｃコンジュゲートを、ＶＮＡＲ  ｈＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｓ２５２Ｃ）融合体をＭＡ  ＰＥＧ４  ｖａ  ＰＢＤ、ＭＡ  ＰＥＧ８  ｖａ  ＰＡＢ  ＳＧ３１９９、ＭＡ  ＰＥＧ４  ｖｃ  ＰＡＢ  ＤＭＡＥ  ＰＮＵ  １５９６８２と反応させることによって生成した（図３２を参照されたい）。
【図３６Ａ】親分子と比較しての、様々な細胞系への二重特異性分子Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２の細胞表面結合。Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２は、結合の増加を示している。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＰＥ−コンジュゲート抗ヒト二次抗体を使用して検出を行った（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。６６ｎＭのタンパク質を施与。
【図３６Ｂ】親分子と比較しての、様々な細胞系への二重特異性分子Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２の細胞表面結合。Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２は、結合の増加を示している。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＰＥ−コンジュゲート抗ヒト二次抗体を使用して検出を行った（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。３５７ｎＭのタンパク質を施与。
【図３６Ｃ】親分子と比較しての、様々な細胞系への二重特異性分子Ｐ３Ａ１ｈＦｃ７Ｃ１２の細胞表面結合。Ｐ３Ａ１ｈＦｃ７Ｃ１２は、結合の増加を示している。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＰＥ−コンジュゲート抗ヒト二次抗体を使用して検出を行った（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
【図３７Ａ】Ａ５４９細胞（高ＲＯＲ１、高ＥＧＦＲ）へのＲＯＲ１−、ＥＧＦＲ−、及びＥＧＦＲ−ＲＯＲ１二重特異性分子の細胞表面結合。Ｈｉｓ６Ｍｙｃタグ付きタンパク質の結合を、検出のためにＰＥ−抗Ｍｙｃタグ抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価した（ＣＳＴ）。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、分析を行った。
【図３７Ｂ】ＰＡ−１細胞（高ＲＯＲ１、中／低ＥＧＦＲ）へのＲＯＲ１−、ＥＧＦＲ−、及びＥＧＦＲ−ＲＯＲ１二重特異性分子の細胞表面結合。Ｈｉｓ６Ｍｙｃタグ付きタンパク質の結合を、検出のためにＰＥ−抗Ｍｙｃタグ抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価した（ＣＳＴ）。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、分析を行った。
【図３７Ｃ】Ａ４２７細胞（低ＲＯＲ１、低ＥＧＦＲ）へのＲＯＲ１−、ＥＧＦＲ−、及びＥＧＦＲ−ＲＯＲ１二重特異性分子の細胞表面結合。Ｈｉｓ６Ｍｙｃタグ付きタンパク質の結合を、検出のためにＰＥ−抗Ｍｙｃタグ抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価した（ＣＳＴ）。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、分析を行った。Ａ４２７は低ＲＯＲ１であるので、予測されたとおり、ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ二重特異体は、親ＥＧＦＲ結合因子に対して、わずかな結合の増加しか示していない。
【図３８】様々な細胞系への７Ｃ１２ｈＦｃ融合体及びｈＦｃ−７Ｃ１２融合体の細胞表面結合の比較。ｈＦｃのＣ末端への７Ｃ１２の融合は、７Ｃ１２がｈＦｃタンパク質のＮ末端に融合されている場合と比較して、細胞系上のＥＧＦＲへの結合の減少を示している。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＰＥ−コンジュゲート抗ヒト二次抗体を使用して検出を行った（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
【図３９】Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２顕微鏡写真。親分子と比較して、二重特異性分子Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２の４℃での細胞表面結合の増加及び３７℃での２時間にわたるインキュベーションの後の内在化が、Ａ５４９細胞で観察された。画像は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＩｎＣｅｌｌ  ２０００を使用して得た。ヘキスト色素を使用して核（青色）を染色し、ＡＦ４８８−抗ヒトＡｂ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してＶＮＡＲ  ｈＦｃ分子（緑色）を検出し、かつＡＦ６４７−抗ウサギＡｂ（ＣＳＴ）を使用してＬａｍｐ−１またはＥＥＡ１（赤色）を検出した。
【図４０】Ｐ３Ａ１ｈＦｃ７Ｃ１２顕微鏡写真。親分子と比較して、二重特異性分子Ｐ３Ａ１ｈＦｃ７Ｃ１２の４℃での細胞表面結合の増加及び３７℃での２時間にわたるインキュベーションの後の内在化が、Ａ５４９細胞で観察された。画像は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＩｎＣｅｌｌ  ２０００を使用して得た。ヘキスト色素を使用して核（青色）を染色し、ＡＦ４８８−抗ヒトＡｂ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してＶＮＡＲ  ｈＦｃ分子（緑色）を検出し、かつＡＦ６４７−抗ウサギＡｂ（ＣＳＴ）を使用してＬａｍｐ−１またはＥＥＡ１（赤色）を検出した。
【図４１】Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２共局在。二重特異性分子Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２は、３７℃で２時間にわたるインキュベーションの後に、ＥＥＡ１（初期エンドソーム抗原１）と、かつある程度はＬａｍｐ−１（リソソームマーカー−１）とＡ５４９細胞中で共局在すると思われる。
【図４２】４℃及び３７℃でのフローサイトメトリー分析による、（Ａ）二重特異性を含む９Ｇ８及び（Ｂ）二重特異性を含む７Ｃ１２でのＡ５４９内在化アッセイデータ。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＰＥ−抗Ｍｙｃ  Ａｂ（ＣＳＴ）を使用して検出を行った。
【図４３】（Ａ）Ｂ１ｈＦｃ、ｈＦｃ７Ｃ１２及びＢ１ｈＦｃ７Ｃ１２によるＲＯＲ１の下方制御、（Ｂ）Ｂ１ｈＦｃ、ｈＦｃ７Ｃ１２及びＢ１ｈＦｃ７Ｃ１２によるＥＧＦＲの下方制御。ＲＯＲ１またはＥＧＦＲ受容体の細胞表面発現を、それぞれＰＥ−ＲＯＲ１  ２Ａ２  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＰＥ−ＡＹ１３  ＥＧＦＲ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して評価した。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、分析を行った。データは、０時間対照レベルに対する％として示されている。
【図４４】（Ａ）Ｐ３Ａ１ｈＦｃ、ｈＦｃ７Ｃ１２及びＰ３Ａ１ｈＦｃ７Ｃ１２によるＲＯＲ１の下方制御、（Ｂ）Ｐ３Ａ１ｈＦｃ、ｈＦｃ７Ｃ１２及びＰ３Ａ１ｈＦｃ７Ｃ１２によるＥＧＦＲの下方制御。ＲＯＲ１またはＥＧＦＲ受容体の細胞表面発現を、それぞれＰＥ−ＲＯＲ１  ２Ａ２  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＰＥ−ＡＹ１３  ＥＧＦＲ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して評価した。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、分析を行った。データは、０時間対照レベルに対する％として示されている。
【図４５】（Ａ）Ｄ３Ｄ３ｈＦｃ、ｈＦｃ７Ｃ１２及びＤ３Ｄ３ｈＦｃ７Ｃ１２によるＲＯＲ１の下方制御、（Ｂ）Ｄ３Ｄ３ｈＦｃ、ｈＦｃ７Ｃ１２及びＤ３Ｄ３ｈＦｃ７Ｃ１２１によるＥＧＦＲの下方制御。ＲＯＲ１またはＥＧＦＲ受容体の細胞表面発現を、それぞれＰＥ−ＲＯＲ１  ２Ａ２  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＰＥ−ＡＹ１３  ＥＧＦＲ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して評価した。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ  フローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、分析を行った。データは、０時間対照レベルに対する％として示されている。
【図４６】ＢＬＩを用いた、ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ二重特異性分子の同時ＲＯＲ１及びＥＧＦＲ結合の例。構築物は、固定化ｈＲＯＲ１と結合し、次いで、ＥＧＦＲがセンサー表面上を通過するとＥＧＦＲと結合することが示されている。ＥＧＦＲがセンサー表面を流れる場合、単一特異性ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲ  Ｂ１は、ＥＧＦＲ結合部分を含有しないので、シグナルの追加の上昇は観察されない。
【発明を実施するための形態】
【０１１９】
上述の配列に加えて、次の配列を明示的に開示する。これらの配列のうちのいくつかは、本明細書に記載の本発明の分子の例に関連する。
2021509014.tif 000002
【０１２０】
詳細な説明
本発明は一般に、特異性抗原結合分子に関する。具体的には、本発明は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）に特異性な免疫グロブリン様サメ可変新抗原受容体（ＶＮＡＲ）ならびに関連融合タンパク質、キメラ抗原受容体、コンジュゲート、及び核酸、さらには、それらに伴う方法を提供する。ＲＯＲ１特異性ＶＮＡＲドメインは、本明細書において、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子と記載される。
【０１２１】
新規または新抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）は、軟骨魚類の血清において見い出される約１６０ｋＤａのホモ二量体タンパク質である（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ａ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５．３７４（６５１８）：ｐ．１６８−１７３、Ｄｏｏｌｅｙ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３．４０（１）：ｐ．２５−３３、Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ，２０１２．４（６）：ｐ．６７３−６８５））。各分子は、単一のＮ末端可変ドメイン（ＶＮＡＲ）及び５つの定常ドメイン（ＣＮＡＲ）からなる。ＩｇＮＡＲドメインは、免疫グロブリン−スーパーファミリーのメンバーである。ＶＮＡＲは、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体可変ドメインならびに細胞接着分子に対して構造的類似性及び多少の配列類似性を有する密に折り畳まれたドメインであり、古典的免疫グロブリン及びＴ細胞受容体のＮ可変末端ドメインに対する類似性によって、ＶＮＡＲと称される。ＶＮＡＲは、免疫グロブリンに対して限定的な配列相同性、例えば、ＶＮＡＲとヒト軽鎖配列との間で２５〜３０％の類似性を共有する（Ｄｏｏｌｅｙ，Ｈ．ａｎｄ  Ｆｌａｊｎｉｋ，Ｍ．Ｆ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５．３５（３）：ｐ．９３６−９４５）。
【０１２２】
Ｋｏｖａｌｅｖａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１４．１４（１０）：ｐ．１５２７−１５３９及びＺｉｅｌｏｎｋａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ  ｍＡｂｓ  ２０１５．７（１）：ｐ．１５−２５は、ＶＮＡＲの構造的特徴付け及び生成の概要を提供しており、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
ＶＮＡＲは、古典的免疫グロブリン抗体の先祖から進化したとは考えられない。ＶＮＡＲの明瞭に異なる構造的特徴は、従来の免疫グロブリン可変ドメイン中に存在するＣＤＲ２ループに相当する配列の短縮化及びＩｇＮＡＲ構造には存在しない、軽鎖ドメインとの会合を通常は可能にする疎水性ＶＨ／ＶＬ界面残基の欠如である。さらに、古典的免疫グロブリンとは異なり、一部のＶＮＡＲサブタイプは、外来システイン残基をＣＤＲ領域に含み、その外来システイン残基は、ＣＤＲ１及び３にＮ末端で隣接するフレームワーク１及び３領域中のシステイン間の標準免疫グロブリンスーパーファミリー橋に加えて、ジスルフィド橋を形成することが観察されている。
【０１２４】
これまでに、サメＩｇＮＡＲには、定義された型が３種あり、それらはＩ、ＩＩ及びＩＩＩ型として知られている。これらは、強い選択圧力下にあり、したがって、まれにしか置き換えられない非標準システイン残基の位置に基づき分類されている。
【０１２５】
３種の型はすべて、標準的な免疫グロブリンフォールドを安定化する３５及び１０７位（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  ｅｄ．１９９１，Ｂｅｔｈｅｓｄａ：ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨにおいてのとおりのナンバリング）にある古典的な免疫グロブリン標準システインを、３６位にある不変のトリプトファンと一緒に有する。定義されたＣＤＲ２自体は存在しないが、それぞれフレームワーク２及び３において、ＴＣＲ  ＨＶ２及びＨＶ４とより近くに類似する配列多様性の領域が定義されている。Ｉ型は、生殖細胞系がコードしたシステイン残基をフレームワーク２及びフレームワーク４に、かつ偶数個の追加のシステインをＣＤＲ３内にも有する。単離されてリゾチームと複合体化したＩ型ＩｇＮＡＲの結晶構造研究によって、これらのシステイン残基の寄与を決定することができた。フレームワーク２及び４のシステインは両方とも、ＣＤＲ３内のシステインと共にジスルフィド橋を形成して、ＣＤＲ３ループがＨＶ２領域に向かって強固に引っ張られた、密にパッキングされた構造を形成する。これまで、Ｉ型ＩｇＮＡＲは、コモリザメでしか同定されておらず、同じ目のメンバーを含めて他の板鰓類はすべて、ＩＩ型またはこの型の変形のみを有する。
【０１２６】
ＩＩ型ＩｇＮＡＲは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３内に、これら２つの領域を近接状態で保持する分子内ジスルフィド結合を形成して、結合ポケットまたは結合溝をもたらす突出したＣＤＲ３（図２）を生じるシステイン残基を有すると定義される。Ｉ型配列は典型的に、ＩＩ型よりも長いＣＤＲ３を有しており、それぞれ平均して２１残基及び１５残基を有する。これは、Ｉ型ＣＤＲ３における２個以上のシステイン残基がそれらのフレームワーク２及び４カウンターパートと会合する強い選択圧力によると考えられる。体細胞変異の蓄積に関する研究によって、Ｉ型に比べてＩＩ型のＣＤＲ１では多数の変異がある一方で、Ｉ型のＨＶ２領域はＩＩ型よりも大きな配列多様性を示すことが示されている。この証拠は、抗原結合部位内で決定されたこれらの領域の位置とよく相関する。
【０１２７】
ＩＩＩ型として知られる第３のＩｇＮＡＲ型は、新生児において同定されている。ＩｇＮＡＲファミリーのこのメンバーは、（ＣＤＲ３を形成する）Ｄ１領域及びＤ２領域とＶ遺伝子との生殖細胞系融合によって、ＣＤＲ３内の多様性を欠いている。ほぼすべての既知のクローンは、１５残基のＣＤＲ３長を有すし、ほとんどあるいはまったく配列多様性がない。
【０１２８】
（ＩＩｂまたはＩＶ）型と称されるＶＮＡＲの別の構造型は、標準システイン残基を２個だけ（フレームワーク１及びフレームワーク３ｂ領域に）有する。これまで、この型は、ツノザメで主に見い出されており（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７．４４（７）：ｐ．１７７５−１７８３、Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ  Ｏ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１３．２８８（２４）：ｐ．１７４０８−１９）、テンジクザメに由来する半合成Ｖ−ＮＡＲライブラリからも単離された（Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ，Ｖ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（３４）：ｐ．１２４４４−１２４４９）。
【０１２９】
しかしながら、ＶＮＡＲ配列から形成された合成ライブラリーから単離された特異性ＶＮＡＲは、高い親和性で他のタンパク質に結合し得ること（Ｓｈａｏ  Ｃ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７．４４（４）：ｐ．６５６−６５；ＷＯ２０１４／１７３９５９）、及び軟骨魚類が抗原で免疫化され得、抗原に結合する応答ＩｇＮＡＲが得られるので、ＩｇＮＡＲは適応免疫系の一部であること（Ｄｏｏｌｅｙ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３．４０（１）：ｐ．２５−３３；ＷＯ２００３／０１４１６１）が判明している。ＩｇＮＡＲは、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体の機構と同様に、Ｖ様配列とＤ及びＪ配列とを組み合わせ結合するための機構を有することが判明している（Ｚｉｅｌｏｎｋａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ  ｍＡｂｓ  ２０１５．７（１）：ｐ．１５−２５によって概説されている）。
【０１３０】
ＶＮＡＲ結合表面は、他の天然免疫グロブリン中の可変ドメインとは異なり、４つの多様性領域：ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４及びＣＤＲ３に由来し（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４．３０５（５６９１）：ｐ．１７７０−１７７３、Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ，Ｖ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，２００５．１４（１１）：ｐ．２９０１−２９０９、Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００７．３６７（２）：ｐ．３５８−３７２も参照されたい）、それらは、ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４の順序でフレームワーク配列の介在によって結合している。天然軽鎖パートナーの欠如と、ＣＤＲ２の欠如との組み合わせによって、ＶＮＡＲは、脊椎動物界において天然に存在する最小の結合ドメインとなっている。
【０１３１】
ＩｇＮＡＲは、いくつかの付随的な特徴をラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ及びラマ）において見い出される重鎖単独免疫グロブリン（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｏｎｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ；ＨＣＡｂ）と共有している（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９３．３６３，４４６−４４８、Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９．１９８（３）：ｐ．１５７−７４）。ＩｇＮＡＲとは異なり、ＨＣＡｂは、明らかに免疫グロブリンファミリーに由来し、標準免疫グロブリンに対して著しい配列相同性を共有する。重要なことに、ＶＮＡＲの重要な特徴点の１つは、この分子が、古典的免疫グロブリンまたはＨＣＡｂとは異なり、その進化のいずれの時点においても、パートナー軽鎖を有さなかったことである。Ｆｌａｊｎｉｋ  Ｍ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ２０１１．９（８）：ｅ１００１１２０  ａｎｄ  Ｚｉｅｌｏｎｋａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ  ｍＡｂｓ  ２０１５．７（１）：ｐ．１５−２５は、ＶＮＡＲと、ラクダ科からの免疫グロブリン由来ＶＨＨ単一結合ドメインとの間の類似性及び相違、ならびにそれらの考えられ得る別個の進化起源についてコメントしている。
【０１３２】
ＲＯＲ１に対する抗体が文献で報告されているが、ヒト、マウス及びラットＲＯＲ１の細胞外ドメイン間の、ならびにヒトＲＯＲ１及びＲＯＲ２ファミリーメンバー間の高い配列同一性は、高親和性ｈＲＯＲ１特異性結合作用物質を生成することが並大抵なことではないことを意味している。加えて、大きなサイズの抗体は、固形腫瘍に貫入するそれらの可能性を損ない、立体的要因によって、標的タンパク質の領域をアクセス不可能にし、これはオリゴマー化または受容体クラスター化が観察される細胞表面タンパク質では特に深刻であり得る。
【０１３３】
結果として、当技術分野では、抗体とは異なる機能的または物理的特徴または特性を有する改善された抗ＲＯＲ１結合タンパク質剤、ならびにＲＯＲ１発現と関連する悪性病変のための治療薬及び診断薬の開発が必要とされている。本発明は、そのような薬剤を本明細書に記載のＲＯＲ１特異性抗原結合分子の形態で提供する。
【０１３４】
本明細書に記載のＲＯＲ１特異性抗原結合分子は、ヒト及びマウスＲＯＲ１の両方に結合することが判明している。さらに、本発明のＲＯＲ１特異性抗原結合分子は、脱グリコシル化形態のＲＯＲ１に結合し、従来技術に記載の抗ＲＯＲ１抗体と関連するいくつかの直鎖ペプチドには結合しない。したがって、本明細書に記載のＲＯＲ１特異性抗原結合分子は、ＲＯＲ１配列中の新規のエピトープに結合すると考えられる。
【０１３５】
がん細胞系への本発明のＲＯＲ１特異性抗原結合分子の結合、さらには、内在化が実証されている。これによって、がん、具体的には、ＲＯＲ１を発現するがんの処置においてそのような分子を使用する可能性が確認される。
【０１３６】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバーである。これは、４つの細胞外ドメイン、膜貫通領域、細胞内チロシンキナーゼドメイン及びカルボキシ末端テイルから構成される１７０ｋＤａ膜貫通タンパク質である。ＥＧＦＲの正常な機能は、上皮組織発生の調節に関連するが、ＥＧＦＲはいくつかの病的状態とも関連する。特に、ＥＧＦＲの過剰発現は、いくつかのがんと関連付けられている。したがって、これは重要な薬物標的であり、多くの治療上のアプローチが適用されている。ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ブリガチニブ、イコチニブ、及びオシメルチニブなどのいくつかの小分子ベースのＥＧＦＲ阻害薬に加えて、ＥＧＦＲに対する多くの抗体が開発されている。抗ＥＧＦＲ抗体のセツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、及びマツズマブである。これらの抗体は、細胞外リガンド結合ドメインをブロックして、リガンド結合、その後のチロシンキナーゼドメインの活性化を妨げる。セツキシマブまたはマツズマブとの競合結合を示すシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）も、開発されている。
【０１３７】
本発明者らは、ＲＯＲ１特異性ＶＮＡＲ及びＥＧＦＲ結合分子をベースに、二重特異性抗原結合分子を作製した。二重特異性抗原結合分子で使用することができる数種の融合タンパク質を含むＲＯＲ１特異性抗原結合分子の様々な形態が記載される。免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質、さらには、ホモ及びヘテロ二量体の両方も記載される。Ｆｃドメインへのタンパク質の融合は、タンパク質溶解性及び安定性を改善し、血漿半減期を顕著に増加させ、かつ全体的な治療有効性を改善することができる。
【０１３８】
意外にも、これらの二重特異性抗原結合分子は、同等の構成分子と比較して、結合及び内在化の顕著な改善を示す。
【０１３９】
本発明者らはまた、様々な部分及びペイロードにコンジュゲートしたＶＮＡＲ分子を初めて作製した。したがって、本発明は、化学的にコンジュゲートしたＶＮＡＲも提供する。より具体的には、数種のコンジュゲートした形式のＲＯＲ１特異性抗原分子を提供する。そのような分子は、記載の二重特異性抗原結合分子に含まれ得る。さらに本明細書では、様々な形式で様々なペイロードに化学的にコンジュゲートした二重特異性ＲＯＲ１／ＥＧＦＲ特異性抗原分子を提供する。具体的には、本発明者らは、Ｆｃ領域を含み、コンジュゲートがＦｃ領域を介して提供されているＲＯＲ１／ＥＧＦＲ二重特異性組み換え融合タンパク質を提供している。具体例では、Ｆｃドメイン中のＳ２３９ＣまたはＳ４４２Ｃ変異（ＥＵナンバリング、ＫａｂａｔナンバリングにおけるＳ２５２Ｃ及びＳ４７３Ｃに相当）が、コンジュゲーション部位として使用される。チオール反応性ペイロード及び標識とのコンジュゲーションを容易にするために、短いシステイン含有タグ配列を付加された二重特異性ＲＯＲ１／ＥＧＦＲ特異性抗原分子も生成した。
【０１４０】
さらに、本発明者らは、意外にも、ＲＯＲ１結合作用物質に対するＥＧＦＲ結合ドメイン（９Ｇ８または７Ｃ１２）の配向に依存して、Ａ５４９細胞及びＰＡ１細胞への結合の増加が観察されることを見出した。ＥＧＦＲ結合作用物質がＲＯＲ１結合作用物質に対してＣ末端で融合している場合、同じ構築物であるが、ＲＯＲ１結合作用物質に対してＮ末端で融合しているＥＧＦＲ結合作用物質である構築物と比較して、細胞表面結合が損なわれる。したがって、構築物内のドメインの配向の変化が、細胞表面への二重特異性薬剤の見掛けの親和性を変更するための方法をもたらす。
【０１４１】
同様の意外な観察が、Ｆｃ融合タンパク質の状況にあった（図３８）。ＥＧＦＲ結合作用物質７Ｃ１２がＦｃ断片のＣ末端に融合している場合（ｈＦｃ  ７Ｃ１２）、ＥＧＦＲ＋ｖｅ細胞系Ａ５４９、ＰＡ−１及びＡ４２７への結合は、対応するＮ末端融合体（７Ｃ１２  ｈＦｃ）と比較して、一貫して低かった。それによって、ＲＯＲ１−ＥＧＦＲ二重特異性結合作用物質の細胞−表面結合の特徴を、対応するＦｃ融合タンパク質の適切な設計を介して調節することが可能となる。
【０１４２】
定義
本発明の抗原特異性結合分子は、ＶＮＡＲ分子の合成ライブラリーに、または軟骨魚類の免疫化に由来するライブラリーに由来するアミノ酸配列を含む。ＶＮＡＲ、ＩｇＮＡＲ及びＮＡＲという用語は、互換的にも使用され得る。
【０１４３】
アミノ酸は本明細書では、１文字コード、もしくは３文字コードまたはその両方のいずれかで表される。
【０１４４】
「親和性精製」という用語は、分子の精製であって、その分子を化学的または結合パートナーに特異的に誘引または結合させて、その分子をパートナー部分に結合または誘引させたままで不純物から分離することを可能にする組み合わせまたは複合体を形成することに基づく、当該分子の精製を意味する。
【０１４５】
「相補性決定領域」またはＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３）という用語は、その存在が典型的に抗原結合に関係しているＶＮＡＲドメインのアミノ酸残基を指す。各ＶＮＡＲは典型的に、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３と識別される２つのＣＤＲ領域を有する。加えて、各ＶＮＡＲドメインは「超可変ループ」（ＨＶ）からのアミノ酸を含み、これらも抗原結合に関係し得る。一部の例では、相補性決定領域は、ＣＤＲ領域及び超可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。他の例では、抗原結合は、単一のＣＤＲまたはＨＶからの残基のみを含んでもよい。ＶＮＡＲ分子について一般に許容されている命名法によれば、ＣＤＲ２領域は存在しない。
【０１４６】
「フレームワーク領域」（ＦＷ）は、ＣＤＲ残基以外のＶＮＡＲ残基である。各ＶＮＡＲは典型的に、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂ及びＦＷ４と識別される５つのフレームワーク領域を有する。
【０１４７】
ＶＮＡＲにおけるＦＷ、ＣＤＲ及びＨＶ領域の間の境界は、固定することを意図したものではなく、したがって、これらの領域の長さ及び組成の多少の変化が予期されるべきである。このことは、特に、これらの領域の解析において実施されてきた研究を参照すれば、当業者には理解されるであろう（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  （２０１６）  １１  （８）、Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎ  （２０１４）  ５９，１９４−１９９、Ｚｉｅｌｏｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２０１５）．１７，（４）  ３８６−３９２、Ｆｅｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （２０１０）  ４００．１５５−１７０、Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （２０１３）  ２８８．１７４０８−１７４１９、Ｄｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）  ＰＮＡＳ  １０３  （６）．１８４６−１８５１）。本発明の分子は、本明細書ではＦＷ、ＣＤＲ及びＨＶ領域への言及によって定義されるが、これらの厳密な定義によって限定されるものではない。したがって、ＶＮＡＲドメインの構造としての当技術分野における理解に即した変化が明示的に、本明細書では企図されている。
【０１４８】
「コドンセット」は、所望のバリアントアミノ酸をコードするために使用される一連の異なるヌクレオチド三連配列を指す。オリゴヌクレオチドのセットは、コドンセットによって提供されるすべての可能なヌクレオチド三連子の組み合わせを表し、所望のアミノ酸グループをコードする配列を含み、例えば固相合成によって合成され得る。コドン命名の標準形式はＩＵＢコードのものであり、当技術分野において知られており、本明細書に記載される。
【０１４９】
コドンセットは典型的に、イタリック体の３つの大文字、例えば、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなどによって表される。したがって、「非ランダムコドンセット」は、本明細書に記載のとおり、部分的に、好ましくは完全にアミノ酸選択基準を満たす選択アミノ酸をコードするコドンセットを指す。ある特定の位置で選択されたヌクレオチド「縮退」を伴うオリゴヌクレオチドの合成は当技術分野において周知であり、例えばＴＲＩＭアプローチ（Ｋｎａｐｐｅｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９），２９６，５７−８６）；Ｇａｒｒａｒｄ  ＆  Ｈｅｎｎｅｒ，Ｇｅｎｅ  （１９９３），１２８，１０３）がある。ある特定のコドンセットを有するオリゴヌクレオチドのそのようなセットは、市販の核酸合成剤（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能である）を用いて合成することもできるし、または市販で（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから）得ることもできる。特定のコドンセットを有して合成されるオリゴヌクレオチドのセットは典型的に、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、全体の配列でのコドンセットによって確立される相違性を含む。本発明によって使用されるオリゴヌクレオチドは、ＶＮＡＲ核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、好都合であれば、制限酵素部位を含んでもよい。
【０１５０】
「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養」は、（文脈が別段に示していない限り）互換的に用いられ、そのような名称は、細胞または細胞系のすべての後代を含む。したがって、例えば、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」のような用語は、転換数にかかわらず誘導される最初の対象細胞及び培養を含む。意図的または偶発的な変異により、すべての後代はＤＮＡ内容が正確に同一でなくてもよいことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされるような同じ機能または生物学的活性を有する変異後代が含まれる。
【０１５１】
発現に言及する際の「制御配列」は、特定の宿主生物において作動可能に結合したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適切な制御配列には、例えば、プロモーター、任意選択で、オペレーター配列、リボソーム結合部位などが含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどの制御配列を用いる。
【０１５２】
「コートタンパク質」という用語は、少なくとも一部がウイルス粒子の表面に存在するタンパク質を意味する。機能的な見方からは、コートタンパク質は、宿主細胞におけるウイルス構築プロセス中にウイルス粒子に会合し、他の宿主細胞に感染するまで、構築されたウイルスに会合したままである任意のタンパク質である。
【０１５３】
特定のアッセイにおける化学成分の「検出限界」は、そのアッセイについてバックグラウンドレベルを超えて検出され得るその化学成分の最低濃度である。例えば、ファージＥＬＩＳＡにおいて、特定の抗原結合フラグメントを提示する特定のファージについての「検出限界」は、特定のファージが、抗原結合フラグメントを提示しない対照ファージが発するシグナルを上回るＥＬＩＳＡシグナルを発するときのファージ濃度である。
【０１５４】
「融合タンパク質」及び「融合ポリペプチド」は、互いに共有結合する２つの部分を有するポリペプチドを指し、各部分は異なる特性を有するポリペプチドである。この特性は、インビトロまたはインビボの活性などの生物学的特性であってもよい。特性は、標的抗原への結合、反応の触媒作用などの単一の化学的特性または物理的特性であってもよい。２つの部分は、１つのペプチド結合によって直接、または１個または複数のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して結合していてもよい。一般に、２つの部分及びリンカーは、互いにリーディングフレーム内にある。好ましくは、ポリペプチドの２つの部分は、異種または異なるポリペプチドから得られる。
【０１５５】
本明細書における「融合タンパク質」という用語は、一般的に、水素結合もしくは塩橋を含む化学的手段によって、またはタンパク質合成を介したペプチド結合によって、またはその両方によって互いに連結される１種または複数のタンパク質を意味する。典型的に、融合タンパク質は、ＤＮＡ組み換え技術によって調製され、かつ本明細書では、組み換え融合タンパク質と称されることもある。
【０１５６】
「異種ＤＮＡ」は、宿主細胞に導入される任意のＤＮＡである。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及び融合体またはこれらの組み合わせを含む様々な供給源に由来してもよい。ＤＮＡは、宿主細胞もしくは受容細胞と同一の細胞もしくは細胞型に由来するＤＮＡ、または異なる細胞型、例えば、同種異系もしくは異種の供給源に由来するＤＮＡを含んでもよい。任意選択で、ＤＮＡは、マーカーまたは選択遺伝子、例えば、抗生物質耐性遺伝子、温度耐性遺伝子などを含んでもよい。
【０１５７】
「高度に多様な位置（ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、既知のアミノ酸配列及び／または天然に存在する抗体または抗原結合断片を比較する場合に、その位置で表されるいくつかの異なるアミノ酸を有する軽鎖及び重鎖の可変領域に位置するアミノ酸の位置を指す。高度に多様な位置は、典型的にはＣＤＲまたはＨＶ領域にある。
【０１５８】
「同一性」は、配列の比較によって決定されるとおりの、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列における関係を示す。また、同一性は、場合によっては、そのような配列間のマッチングによって決定されるとおりの、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度（相同性）を意味する。２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定するためにいくつもの方法が存在するが、同一性を決定するために一般的に採用される方法は、コンピュータプログラムで体系化されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムには、限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５，４０３）が含まれる。
【０１５９】
好ましくは、タンパク質のアミノ酸配列は、ＨＧＭＰ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）によって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５，４０３−４１０）のデフォルトパラメータを用いて、アミノ酸レベルで、本明細書に開示のアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の同一性を有する。
【０１６０】
より好ましくは、タンパク質配列は、核酸またはアミノ酸レベルで、本明細書に示されているアミノ酸配列に対して、少なくとも４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、さらにより好ましくは９５％（さらにより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有し得る。
【０１６１】
また、タンパク質は、ＨＧＭＰよって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを用いて、本明細書に開示の配列と少なくとも４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含んでもよい。
【０１６２】
「ライブラリー」は、複数のＶＮＡＲまたはＶＮＡＲ断片の配列（例えば、本発明のポリペプチド）、またはこれらの配列をコードする核酸であって、その配列が本発明の方法によってこれらの配列に導入されるバリアントアミノ酸の組み合わせが異なるものを指す。
【０１６３】
「ライゲーション」は、２つの核酸断片間でホスホジエステル結合を形成するプロセスである。２つの断片をライゲーションするために、断片の末端は互いに適合しなければならない。場合によっては、末端は、エンドヌクレアーゼで切断された後、直接適合するであろう。しかしながら、ライゲーションに適合させるために、エンドヌクレアーゼで切断した後に一般的に産生される突出末端を平滑末端に変換することが、初めに必要なことがある。末端を平滑化するために、ＤＮＡを、適切なバッファー中で、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ約１０単位とともに、１５℃で少なくとも１５分間にわたって処理する。次いで、フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿またはシリカ精製によってＤＮＡを精製する。互いにライゲーションされるＤＮＡ断片を、ほぼ等モル量で溶液中に入れる。また、溶液は、ＡＴＰ、リガーゼバッファー、及びＴ４  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼをＤＮＡ０．５μｇに対して約１０単位で含有する。ＤＮＡをベクターにライゲーションさせる場合、適切な制限エンドヌクレアーゼ（複数可）を用いる切断によってベクターをまず直鎖化する。次いで、ライゲーション段階におけるセルフライゲーションを防止するため、直鎖化した断片をバクテリアアルカリホスファターゼまたは子ウシ腸ホスファターゼで処理する。
【０１６４】
「変異」は、野生型配列などの参照ヌクレオチド配列に対するヌクレオチド（複数可）の欠失、挿入または置換である。
【０１６５】
「天然の」または「天然に存在する」ＶＮＡＲは、非合成源、例えば、エクスビボで得られる組織源、または板鰓亜綱の動物の血清から同定されるＶＮＡＲを指す。これらのＶＮＡＲは、天然または別段に誘導された、免疫応答の任意の型において産生されるＶＮＡＲを含み得る。天然ＶＮＡＲは、これらの抗体を構成する、またはコードするアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用する場合、天然ＶＮＡＲは、「合成ＶＮＡＲ」とは異なり、合成ＶＮＡＲは、例えば、ある特定の位置にある１個または１個よりも多いアミノ酸を異なるアミノ酸で置換する、欠失する、または付加して、その異なるアミノ酸が、供給源の抗体配列とは異なる抗体配列をもたらすことによって、供給源またはテンプレートの配列から変化したＶＮＡＲ配列を指す。
【０１６６】
「核酸構築物」という用語は一般に、クローニングによって得られる、または化学合成によって生成される、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのＲＮＡでもよい、任意の長さの核酸を指す。ＤＮＡは、一本鎖でも、または二本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡは、コードセンス鎖であってもよいし、または非コードもしくはアンチセンス鎖でもよい。治療的使用では、核酸構築物は好ましくは、処置される対象において発現し得る形態である。
【０１６７】
核酸に関する場合の「作動可能に連結した」とは、その核酸が他の核酸配列との機能的な関係に置かれていることを意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダー用のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現した場合に、ポリペプチド用のＤＮＡに作動可能に連結している。プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結している。またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように位置している場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」とは、結合するＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合、リーディングフレーム内で近接していることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接している必要はない。結合は、便利な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが、従来の方法に従って用いられる。
【０１６８】
「タンパク質」という用語は、一般的に、ペプチド結合によって互いに連結した複数のアミノ酸残基を意味する。これは、ペプチド、オリゴペプチド、オリゴマーまたはポリペプチドと互換的に用いられ、同じものを意味し、それらの糖タンパク質及び誘導体を含む。また、「タンパク質」という用語では、タンパク質の断片、類似体、バリアント及び誘導体を含むことも意図されており、その際、その断片、類似体、バリアント及び誘導体は、参照タンパク質と本質的に同一の生物学的活性または機能を保持する。タンパク質類似体及び誘導体の例には、ペプチド核酸及びＤＡＲＰｉｎｓ（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が含まれる。
【０１６９】
タンパク質の断片、類似体、バリアントまたは誘導体は、由来する元のタンパク質配列の長さに依存して、少なくとも２５、好ましくは３０もしくは４０、または最長５０もしくは１００、または６０〜１２０アミノ酸長であってよい。９０〜１２０、１００〜１１０アミノ酸が、一部の例では好都合であることもある。
【０１７０】
タンパク質の断片、誘導体、バリアントまたは類似体は、（ｉ）１個または複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換されているもの（そのように置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものでも、またはコードされないものでもよい）、または（ｉｉ）１個または複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）追加のアミノ酸が、ポリペプチドの精製に用いられるリーダーまたは補助配列などの成熟ポリペプチドに融合されているものである。そのような断片、誘導体、バリアントまたは類似体は、本明細書における教示から、当業者の範囲内にあるとみなされる。
【０１７１】
「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法（リン酸トリエステル、亜リン酸またはホスホラミダイト化学など、固相技術を使用）によって化学的に合成される、短い、１本鎖または２本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。遺伝子の核酸配列全体が公知であるか、またはコード鎖に相補的な核酸配列が利用可能である場合、さらなる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用されることを含む。別法では、標的アミノ酸配列が既知である場合、各アミノ酸残基について既知の好ましいコード残基を用いて、有望な核酸配列を推定してもよい。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルまたは分子サイズカラムで、または沈殿によって精製することができる。ＤＮＡが非核酸不純物（極性、非極性、イオン性などであってよい）から分離されたとき、ＤＮＡは「精製される」。
【０１７２】
本明細書で使用する場合、「供給源」または「テンプレート」ＶＮＡＲは、本明細書に記載の基準に従って多様化が実行される際に、その抗原結合配列がテンプレート配列として機能するＶＮＡＲまたはＶＮＡＲ抗原結合断片を指す。抗原結合配列は一般に、ＶＮＡＲ内に、好ましくは少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくはフレームワーク領域を含む。
【０１７３】
「転写調節要素」は、次の構成要素を１つまたは複数含む：エンハンサー要素、プロモーター、オペレーター配列、リプレッサー遺伝子、及び転写終結配列。
【０１７４】
「形質転換」は、細胞がＤＮＡを取り込んで「形質転換体」となるプロセスを意味する。ＤＮＡの取り込みは、永続的でも、または一時的でもよい。「形質転換体」は、ＤＮＡと関連する表現型の発現（例えば、ＤＮＡによってコードされるタンパク質によって与えられる抗生物質耐性）によって証拠付けられるように、ＤＮＡを取り込んで保持している細胞である。
【０１７５】
融合タンパク質（ポリペプチド）または異種ポリペプチド（ファージと異種）などの出発または参照ポリペプチド（例えば、供給源のＶＮＡＲまたはそのＣＤＲ）の「バリアント」または「変異体」は、（１）出発または参照ポリペプチドのものとは異なるアミノ酸配列を有する、及び（２）天然または合成変異のいずれかを通じて出発または参照ポリペプチドに由来したポリペプチドである。そのようなバリアントは、例えば、目的のポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／または挿入、及び／または置換を含む。例えば、（供給源のＶＮＡＲまたは抗原結合断片内で対応する位置で見い出されるアミノ酸に関して）バリアントアミノ酸を有する配列をコードする非ランダムコドンセットを含むオリゴヌクレオチドを用いて生成される本発明の融合ポリペプチドは、供給源のＶＮＡＲまたは抗原結合断片に関わる変異ポリペプチドとなる。したがって、バリアントＣＤＲは、出発または参照ポリペプチド配列（供給源のＶＮＡＲまたは抗原結合断片など）に関してバリアント配列を含むＣＤＲを指す。この文脈において、バリアントアミノ酸は、出発または参照ポリペプチド配列（供給源のＶＮＡＲまたは抗原結合断片など）中の対応する位置にあるアミノ酸とは異なるアミノ酸を指す。最終構築物が所望の機能的特徴を持つことを条件として、最終的なバリアントまたは変位構築物を得るために、欠失、挿入または置換の任意の組み合わせを行ってもよい。また、アミノ酸の変化によって、グリコシル化部位の数または位置の変化など、ポリペプチドの翻訳後プロセスが変更されてもよい。
【０１７６】
「野生型」もしくは「参照」配列または「野生型」もしくは「参照」タンパク質／ポリペプチド（コートタンパク質、または供給源ＶＮＡＲのＣＤＲなど）は、バリアントポリペプチドが変異の導入を通じてもたらされる参照配列であってもよい。一般に、所与のタンパク質の「野生型」配列は、天然において最も一般的な配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、天然において最も一般的に見い出される遺伝子配列である。変異は、天然プロセス、人為的手段のいずれかを通じて、「野生型」遺伝子（したがって、それがコードするタンパク質）に導入されてもよい。このようなプロセスの産物は、元の「野生型の」タンパク質または遺伝子の「バリアント」または「変異」形態である。
【０１７７】
本明細書で使用する場合の「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、例えば、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を指すことができ、特定の免疫エフェクター細胞に人工の特異性をグラフトする操作受容体を包含する。ＣＡＲを用いて、Ｔ細胞にモノクローナル抗体またはＶＮＡＲなどの抗原特異性結合タンパク質の特異性を付与し、それによって、例えば、養子細胞療法で使用するための多数の特異性Ｔ細胞の生成を可能にすることができる。ＣＡＲは、例えば、細胞の特異性を腫瘍関連抗原へ導き得る。ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含み得る。特定の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ膜貫通及びエンドドメインに融合したモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体を含む。他の特定の態様では、ＣＡＲは、本明細書に記載のＶＮＡＲドメインとＣＤ３−ゼータ膜貫通及びエンドドメインとの融合体を含む。他のＣＡＲ設計の特異性は、受容体のリガンド（例えば、ペプチド）に、またはデクチンなどのパターン認識受容体に由来し得る。特定の実施形態では、Ｂ系列分子ＣＤ１９に特異性のＣＡＲを使用することによりＴ細胞の特異性を向け直すすることによって、悪性Ｂ細胞を標的とすることができる。ある特定の場合には、抗原認識ドメインのスペーシングを変更して、活性化誘導細胞死を減少させることができる。ある特定の場合には、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／またはＯＸ４０などの、追加の共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。場合によっては、共刺激分子、撮像（例えば、陽電子放射型断層撮影法）用レポーター遺伝子、プロドラッグが加えられた際に条件付きでＴ細胞を排除する遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体などを含めて、分子をＣＡＲと共に同時発現させることができる。
【０１７８】
本明細書で使用する場合の「コンジュゲーション」という用語は、２つ以上の化学的部分を化学的に結合する任意の方法を指し得る。典型的には、コンジュゲーションは、共有結合を介する。本発明の場合、化学的部分の少なくとも１つは、ポリペプチドであり、場合によっては、コンジュゲーションは、２つ以上のポリペプチドを含み、そのうちの１つまたは複数は、組み換えＤＮＡ技術によって生成されていてもよい。ポリペプチドをコンジュゲートするためのいくつかのシステムが、当技術分野で知られている。例えば、コンジュゲーションは、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドを使用して、ポリペプチド分子中に存在するリシン残基を介して、またはマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステルを使用して、ポリペプチド分子中に存在するシステイン残基を介して達成することができる。一部の実施形態では、コンジュゲーションは、限定されないが、エステル、炭酸エステル、カルバマート、スルファート、ホスファート、アシルオキシアルキルエーテル、アセタール、及びケタール、ヒドラゾン、オキシム及びジスルフィド結合を含む生理学的に切断可能な結合を含む短時間作用型の分解可能な結合を介して生じる。一部の実施形態では、カテプシンファミリーメンバーなどの細胞内または細胞外酵素によって切断可能であり、還元条件または酸性ｐＨ下で切断可能であるリンカーを導入すると、コンジュゲートしているポリペプチドまたはタンパク質から、コンジュゲート部分を開放することができる。
【０１７９】
コンジュゲーションの特に好ましい方法は、インテインをベースとする技術（米国特許出願第２００６２４７４１７号）の使用である。簡単に述べると、目的のタンパク質は、操作インテインドメインのＮ末端融合体として発現される（Ｍｕｉｒ  ２００６  Ｎａｔｕｒｅ  ４４２，５１７−５１８）。その後のタンパク質−インテイン結合でのＮ−Ｓアシルシフトが、チオエステル結合した中間体をもたらし、これは、ビス−アミノキシ剤またはアミノ−チオールで化学的に切断されると、それぞれ所望のタンパク質Ｃ末端アミノキシまたはチオール誘導体をもたらし得る（図１１）。これらのＣ末端アミノキシ及びチオール誘導体をそれぞれ化学選択的にアルデヒド／ケトン及びマレイミド官能化部分と反応させると、部位特異的Ｃ末端修飾タンパク質を得ることができる（図２５〜２７）。
【０１８０】
コンジュゲーションの別の好ましい方法では、ＶＮＡＲは、ＶＮＡＲのＣ末端領域に、もしくはその付近にあるか、または短いＣ末端ｔａｇ配列内に組み込まれた追加のシステインと共に直接発現され、マレイミド官能化部分などのチオール反応性ペイロードとのコンジュゲーションを可能にする。
【０１８１】
本明細書において言及する場合のコンジュゲーションでは、いくつかの有用な特性を付与し得るリンカー部分の使用を包含することも意図されている。リンカー部分には、限定されないが、ポリ−グリシン、ｇｌｙ−ｓｅｒ、ｖａｌ−ｃｉｔまたはｖａｌ−ａｌａなどのペプチド配列が含まれる。ある特定の場合には、リンカー部分を、ある特定の条件下で、例えば、酵素、求核性／塩基性試薬、還元剤、光照射、求電子性／酸性試薬、有機金属及び金属試薬、または酸化試薬の使用を介して切断することができるように選択することができるか、またはリンカーを、そのような条件下での切断に抵抗するように特異的に選択することができる。
【０１８２】
いくつかの目的を達成するように、ポリペプチドを、様々な機能性部分にコンジュゲートすることができる。免疫原性及び抗原性を減少させるために、または溶解性を改善するために、機能性部分の例には、限定されないが、ポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれる。さらなる非限定的例には、治療薬または細胞傷害性薬物へのポリペプチドのコンジュゲーションが含まれる。
【０１８３】
「検出可能な標識」という用語は本明細書において、実体が分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段によって可視化され得る、または別段に検出され得ることを明記するために使用される。検出可能な標識は、測定することができ、強度が、結合した実体の量に比例するシグナルをその標識が生成するように選択することができる。タンパク質及びペプチドを標識及び／または検出するための広範囲の様々なシステムが当技術分野で公知である。標識は、直接的に検出することができるか（すなわち、検出可能にするための何らかのさらなる反応または操作を必要としない、例えば、フルオロフォアは直接的に検出可能である）、または間接的に検出することができる（すなわち、検出可能である別の実体との反応または結合によって検出可能になる、例えば、ハプテンは、フルオロフォアなどのレポーターを含む適切な抗体との反応後に、免疫染色によって検出可能である）。適切な検出可能な作用物質には、限定されないが、放射性核種、フルオロフォア、化学発光剤、マイクロ粒子、酵素、カロリメトリック標識、磁気標識、ハプテン、分子ビーコン、及びアプタマービーコンが含まれる。
【０１８４】
インビトロで、または患者においてＲＯＲ１を発現する細胞を死滅させる、またはその成長を阻害する方法が本明細書では企図されている。一般に、細胞の文脈で本明細書にて使用する場合の「死滅させること」とは、細胞死をもたらすことを意味する。これは、壊死もしくは他の細胞損傷、またはアポトーシスの誘導などのいくつかの機構によって達成され得る。本明細書において使用する場合の「成長を阻害すること」または「増殖を阻害すること」という語句では、細胞発生の阻止、より具体的には、細胞分裂の阻止を包含することが意図されている。
【０１８５】
次の実施例を参照することで、本発明はさらに理解されるであろう。
【実施例】
【０１８６】
実施例１−特異性抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲ配列の生成
合成ライブラリーからの特異性ＶＮＡＲ配列
２つの選択キャンペーンを、特異性ＲＯＲ１結合因子についてＶＮＡＲ合成ドメインライブラリー（ＷＯ２０１４１７３９５９）をスクリーニングするために採用した。第１のキャンペーンは、ヒトＲＯＲ１抗原を使用し、第２のキャンペーンは、マウスＲＯＲ１抗原を使用した。抗原提示及び選択プロセスを補助するために、両方の組み換えＲＯＲ１タンパク質を製造者指示に従ってビオチン化した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｃａｔ  Ｎ  ２１３２７）。ストレプトアビジンコーティングされたビーズ上に固定化された、これらのビオチン化ＲＯＲ１抗原を使用して、ＶＮＡＲドメインを３ラウンドの選択後に単離した。選択の後に、かつ個々のクローンのスクリーニングの後に、ＶＮＡＲドメインをディスプレイするモノクローナルファージのうちの７０％（ヒトＲＯＲ１タンパク質に対して選択）がヒト及びマウスＲＯＲ１に対して特異性であるが、密接に関連するＲＯＲ２タンパク質に対しては特異性ではないことが見い出された（この選択からのリードクローンは、Ｂ１（４０％）及びＥ７（３０％）と呼ばれた（図１）。同様に、マウスＲＯＲ１で選択されたモノクローナルファージのうちの４５％が、ヒト及びマウスＲＯＲ１に対して特異性であったが、ＲＯＲ２には特異性ではなかった（この選択からのリードクローンは、Ｐ３Ａ１と呼ばれた。図１）。マウスＲＯＲ１スクリーニングから得られた別の特異性クローンは、２００種のスクリーニングされたクローンのうち、単一配列として存在したＣＰＦ７であった。
【０１８７】
ヒトＲＯＲ１を用いたスクリーニングから得られた配列は、Ｂ１及びＥ７であり、マウスＲＯＲ１を用いたスクリーニングから得られた配列は、Ｐ３Ａ１及びＣＰＦ７である。（図２）
【０１８８】
免疫化ライブラリーからの特異性ＶＮＡＲ配列
ライブラリーの構築。
Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｄｏｍａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｈａｒｋ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２に記載されているとおりに、３匹のツノザメを組み換えヒトＲＯＲ１タンパク質の細胞外ドメインで免疫化し、標的特異性ＩｇＮＡＲ免疫応答を、免疫後血清の分析によってモニターした。免疫化前及び免疫化後の血清試料を動物から採取し、ＥＬＩＳＡにおいて抗原結合について試験した。すべての動物において１６週間後に、ヒトＲＯＲ１に特異性のＩｇＮＡＲ力価の上昇が観察された（図３）。マウスＲＯＲ１に対する免疫後血清の特異性も観察され、これは、種間反応性ＲＯＲ１特異性ＩｇＮＡＲ結合因子が免疫化動物中に存在することを示している（図３）。
【０１８９】
Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｄｏｍａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｈａｒｋ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２に記載されたとおり、ＶＮＡＲレパートリー（ＩｇＮＡＲの結合部位）をツノザメ血液から、特異性ＰＣＲプライマーを使用して増幅し、バクテリオファージＭ１３遺伝子のインフレームのコートタンパク質ｐＩＩＩを含有するファージディスプレイベクターにクローニングした。ライブラリーサイズを計算したが、これを表１に示す：
2021509014.tif 000003
【０１９０】
抗原特異性ＶＮＡＲ配列についての免疫化ライブラリーのスクリーニング
組み換えマウスＲＯＲ１タンパク質を、免疫化ライブラリー（ＥＬＳＩ５〜７）をスクリーニングするために使用した。合成ライブラリーをスクリーニングするために使用されたプロトコルと同様のプロトコルに従って、ストレプトアビジンコーティングされたビーズ上に固定化されたビオチン化ＲＯＲ１抗原を使用して、ＶＮＡＲドメインを３ラウンドの選択後に単離した。選択プロセス後に、ＶＮＡＲドメインをディスプレイするモノクローナルファージのうちの４５％（３つのライブラリーからの合計アウトプットから）がヒト及びマウスＲＯＲ１に対して特異性であった。ＲＯＲ１特異性ＶＮＡＲの１／３が配列Ｄ３を有し（図４及び５）、残りの２／３が配列Ｅ９を有することが見い出された（図４及び５）。
【０１９１】
マウスＲＯＲ１を用いたスクリーニングから得られた配列はＥ９及びＤ３である（図５）。
【０１９２】
すべてのリード抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲタンパク質をＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉまたはＨＥＫ２９３哺乳類細胞で発現させ、それぞれ周辺質画分または細胞上清からＩＭＡＣ精製した。
【０１９３】
方法
血清ＥＬＩＳＡにおけるＩｇＮＡＲ力価
次のプロトコルを使用して、ＥＬＩＳＡを実施した：
１．ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬのヒトＲＯＲ１−ＦｃまたはマウスＲＯＲ１−Ｆｃ１００μＬ／ウェルでコーティングする。４℃で終夜インキュベートする。
２．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
３．プレートを、２００μＬ／ウェルの２％（ｗ／ｖ）Ｍ−ＰＢＳを添加することによってブロックし、３７℃で１時間にわたってインキュベートする。
４．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
５．ツノザメ血清をＰＢＳ中で、１：１０以上から１：１０００まで連続希釈し、１００μＬ／ウェルで添加する。室温で１時間にわたってインキュベートする。
６．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
７．ＰＢＳＴ中でハイブリドーマ組織培養上清として希釈された１００μＬ／ウェルの一次抗体（マウスモノクローナル抗ＩｇＮＡＲ抗体、ＧＡ８）を添加する。
８．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
９．ＰＢＳ中で希釈された１００μＬ／ウェルの適切な二次抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲートを添加する。１時間にわたってインキュベートする。
１０．プレートをＰＢＳＴで２回、続いて、ＰＢＳで２回洗浄する。
１１．１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質をプレートに添加し、シグナルの出現／飽和の開始までインキュベートする。１００μＬ／ウェルの０．１８Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を添加することによって、発色を停止する。
１２．マイクロタイタープレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで読み取る。
【０１９４】
ライブラリーのスクリーニング
１．選択のためのライブラリーファージを救出するために、ライブラリーグリセロールストックからの培養物を３７℃及び２５０ｒｐｍで、２×ＴＹ、２％グルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン中で、０．５のＯＤ６００まで成長させた。
２．細胞を１０9  Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（ＮＥＢ）で重複感染させ、次いで、終夜、２×ＴＹ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン中で、２５℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。
３．ファージを細菌培養物から２回、ＰＥＧ−沈澱させ（２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌ）、得られたファージペレットをＰＢＳ１ｍＬ中で再懸濁させた。
４．２％（ｗ／ｖ）ＭＰＢＳでプレブロックしておいたＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１２０５Ｄ）２００μＬを４００ｎＭビオチン化マウスＲＯＲ１で、２０ｒｐｍで回転させながら室温で１時間にわたってコートした。
５．ライブラリーファージを、１時間にわたって回転させながら室温でＤｙｎａｂｅａｄｓとインキュベートすることによって選択解除し、次いで、抗原コーティングされたビーズに添加した。
６．ビーズをＰＢＳＴで５〜１０回、及びＰＢＳで５〜１０回洗浄し、８分間にわたって１００ｍＭ  ＴＥＡ４００μＬ中で回転させることによって溶離し、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２００μＬを添加することによって中和した。
７．Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞（１０ｍＬ）を、溶離されたファージ３００μＬで、３０分間にわたって３７℃で感染させ、終夜３７℃で、２％（ｗ／ｖ）グルコース及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＹＥ寒天プレート上で成長させた。
８．さらに３回のラウンドの選択を行い、産出物を抗原特異性結合について、モノクローナルファージ及び周辺質抽出物ＥＬＩＳＡによってヒトまたはマウスＲＯＲ１に対してスクリーニングした。ファージ結合因子を、ＨＲＰ−コンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２７９４２１０１）を使用して検出し、周辺質タンパク質を、ＨＲＰ−コンジュゲート抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ、１１８  １４１  ５０  ００１）を使用して検出した。
【０１９５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＶＮＡＲ発現
１．終夜培養物を、リン酸塩、１％グルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＢ培地中で１：５０希釈し、３７℃で激しく振盪（２５０ｒｐｍ）しながら終日インキュベートする。
２．細胞を３，０００×ｇでの遠心分離によって、２０分間にわたって２０℃でペレット化する。
３．同じ体積の、リン酸塩、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＢ培地（グルコース不含）中に細胞を再懸濁させる。
４．ＩＰＴＧを１ｍＭ  ＩＰＴＧの最終濃度まで添加し、１６℃で終夜（１６時間）、２５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。
５．細胞を６，０００×ｇでの遠心によって３０分間にわたって収集する（ペレットは、この時点で−２０℃で凍結させることができた）。
６．ペレットを１０％培養体積の氷冷ＴＥＳ中に再懸濁させ、氷上で、１５分間にわたって穏やかに振盪する。
７．等体積の氷冷５ｍＭ  ＭｇＳＯ4（２．５ｍＭの最終濃度のＭｇＳＯ4で）を添加し、さらに１５分間にわたって氷上で穏やかに振盪し続ける。
８．懸濁液を１５，０００×ｇでの遠心分離によって３０分間にわたって４℃でペレット化し、放出された周辺質タンパク質を含有する上清を清浄なＦａｌｃｏｎに慎重にデカンテーションする。
９．１０×ＰＢＳ  ｐＨ７．４［１×ＰＢＳの最終濃度］を、Ｐｅｒｉ−Ｐｒｅｐ抽出物に添加し、その後、ＩＭＡＣインキュベートする。
【０１９６】
ＨＥＫ２９３におけるＶＮＡＲ発現
１０ｍＬ培養物では水（滅菌濾過）中にＤＮＡ１０μｇ。
５０ｍＬバイオリアクター管中の細胞１０ｍＬ（約１０6／ｍＬ）（新鮮培地中で指数関数的に成長する細胞）を使用する。
ＯｐｔｉＭＥＭ培地をＤＮＡに、５００μＬの全体積まで添加する。
ＰＥＩ２５μＬ（水中で作製された１ｍｇ／ｍＬストック）を別の５００μＬＯｐｔｉＭＥＭ培地に添加する。
ＤＮＡ及びＰＥＩを室温で最高１５分間にわたってインキュベートする。
培地中のＰＥＩ５００μＬを、培地中のＤＮＡ各５００μＬに混合する。
室温で２０〜３０分間にわたってインキュベートして、複合体の形成を促進する。
混合物１ｍＬを細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ2で、１４０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。
翌日、トリプトン０．５％の最終濃度を得るために２０％（ｗ／ｖ）トリプトン２５０μＬを細胞１０ｍＬに添加することによって、細胞にフィーディングする。
３〜５日間にわたって、細胞を発現させたままにする。
細胞を回転させ、上清を分泌タンパク質について評価して、産生率を決定する。
１０×ＰＢＳ  ｐＨ７．４［１×ＰＢＳの最終濃度］をＰｅｒｉ−Ｐｒｅｐ抽出物に添加し、その後、ＩＭＡＣインキュベートする。
タンパク質生産に必要な場合には、このプロトコルを拡大または縮小することができる。
【０１９７】
タンパク質発現（拡大）
ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲタンパク質は、いくつかの異なる発現系において多くの異なる形態で十分に発現した。タンパク質精製、取り扱い及びタンパク質分析を補助するＨｉｓ及びＨｉｓ6Ｍｙｃを含む標準Ｃ末端タグの添加は、標的ＲＯＲ１へのＲＯＲ１  ＶＮＡＲの結合に影響を及ぼさなかった（表２）。
2021509014.tif 000004
【０１９８】
加えて、円偏光二色性によって測定されたとおり（図６−ＶＮＡＲのＣＤスペクトル）（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＫ）、ＶＮＡＲ  Ｃ末端タグはＶＮＡＲ構造に影響を及ぼさない。
【０１９９】
ＶＮＡＲはまた、マウス及びヒトＩｇＧ  Ｆｃ配列に遺伝子融合して発現され、操作インテインへのＮ末端の融合体として、標識及び薬物への部位特異的コンジュゲーションを可能にした。使用される発現系には、Ｅ．ｃｏｌｉ（周辺質及び細胞質発現）、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯ（Ｅｖｉｔｒｉａ  Ｆｃ融合タンパク質）が含まれる。
【０２００】
実施例２−ＶＮＡＲの再フォーマッティング
ホモ二量体
標準ＧｌｙＳｅｒベースのリンカーを使用する遺伝子融合によって、ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲを、ホモ二量体に成功裏に再フォーマッティングした（図７Ｂ）。ホモ二量体は、ＳＰＲ及びＥＬＩＳＡによると、組み換えｈＲＯＲ１に対する親和性の上昇、ならびにフローサイトメトリーによると、ＲＯＲ１陽性がん細胞系上の細胞表面ＲＯＲ１への結合の増加を有することが示された（図９）。フローサイトメトリー実験については、実施例４においてより詳細に記載する。
【０２０１】
加えて、ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲホモ二量体を、化学的コンジュゲーションを介して成功裏に生成した。ＶＮＡＲは、インテイン融合タンパク質として発現され、システアミンで切断されてＣ末端チオール誘導体を生成し、次いで、これは、Ｃ末端分子間ジスルフィド形成を介して、ホモ二量体へと自己会合した（図７Ｃ）。これらのジスルフィド結合ホモ二量体は、ＥＬＩＳＡによると、組み換えｈＲＯＲ１への結合親和性の上昇を示した（図８）。インテイン融合タンパク質の生成については、実施例８においてより詳細に論述する。
【０２０２】
ヘテロ二量体
ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲヘテロ二量体を、標準ＧｌｙＳｅｒリンカーによる遺伝子融合によって生成し（図７Ｄ）、これは、組み換えＲＯＲ１及びＲＯＲ１陽性細胞への特異性結合について高い親和性を実証した。ヘテロ二量体ＶＮＡＲタンパク質を、化学的コンジュゲーションによって生成することもできる。
【０２０３】
結合の特徴付けの実験結果を表３及び表４にまとめる（実施例３を参照されたい）。
【０２０４】
ＶＮＡＲ  Ｆｃ融合タンパク質
Ｆｃドメインへのタンパク質の融合は、タンパク質溶解性及び安定性を改善し、血漿半減期を顕著に上昇させ、かつ全体的な治療有効性を改善することができる。ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲを、標準ＧｌｙＳｅｒリンカーを介して、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ（ｍＦｃ）のＮ末端に、かつヒトＩｇＧ１（ｈＦｃ）のＮ及びＣ末端の両方に遺伝子融合させた（図７Ｅ、Ｆ、Ｇ）。Ｆｃ配列の例
マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ（ｍＦｃ）
ＥＰＲＧＰＴＩＫＰＣＰＰＣＫＣＰＡＰＮＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＩＫＤＶＬＭＩＳＬＳＰＩＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＬＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＳＶＲＡＰＱＶＹＶＬＰＰＰＥＥＥＭＴＫＫＱＶＴＬＴＣＭＶＴＤＦＭＰＥＤＩＹＶＥＷＴＮＮＧＫＴＥＬＮＹＫＮＴＥＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＭＹＳＫＬＲＶＥＫＫＮＷＶＥＲＮＳＹＳＣＳＶＶＨＥＧＬＨＮＨＨＴＴＫＳＦＳＲＴＰＧＫ（配列番号９３）
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（ｈＦｃ）
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９４）
【０２０５】
ＶＮＡＲ  Ｆｃ融合タンパク質を、ＣＨＯ  Ｋ１細胞中で分泌タンパク質として発現させ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）（Ｅｖｉｔｒｉａ、スイス）を使用して培地から精製した。精製タンパク質をＳＥＣ（ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ、Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及び質量分光分析法によって分析して、配列及びタンパク質完全性を確認した。得られたＶＮＡＲ  Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＰＲによると組み換えヒトＲＯＲ１（表６）及びＲＯＲ１陽性細胞と高い親和性で結合し（図１５）、ＲＯＲ１陽性細胞に内在化することが示された。ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲを、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ配列中に、例えば、Ｓ２５２ＣまたはＳ４７３Ｃ位（Ｋａｂａｔナンバリング）に操作システイン置換を組み込まれていて部位特異的標識が可能となった操作ｈＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質にも遺伝子融合させた（図１０）。
【０２０６】
ＶＮＡＲインテイン融合タンパク質を発現させるための典型的な方法
インテイン融合として発現させるために、ＶＮＡＲをコードするＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ発現のために最適化し（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｔｈｅｒｍｏ）、ｐＴＸＢ１ベクター（ＮＥＢ）及びその誘導体のＮｄｅＩ／ＳａｐＩ部位にクローニングした。これは、操作インテインドメインに融合し、次いで、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）に融合してキチンカラムでの精製が可能となっている目的のＶＮＡＲタンパク質をコードする遺伝子をもたらす。ｐＴＸＢ１ベクター誘導体は、代替のインテインを融合タンパク質としてコードする。
【０２０７】
形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を１Ｌシェーカーフラスコ内でＯＤ６００＝約０．６になるまで成長させ、２時間にわたって４℃でコールドショックし、次いで、タンパク質発現を０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで、１８℃で終夜誘導した。細胞を溶解バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５％グリセロール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％サルコシル、１ｍＭ  ＡＥＢＳＦ）中での音波処理によって溶解させ、遠心して細胞破片を除去した。ＶＮＡＲインテイン融合タンパク質を清澄化細胞溶解産物から、キチンビーズ（ＮＥＢ、Ｓ６６５１）上での固定化によって精製した。ビーズを溶解バッファー、続いて、切断バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．９、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）で十分に洗浄し、ＶＮＡＲを、４００ｍＭジオキシアミン、もしくはＯ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビスヒドロキシルアミン、または１００ｍＭシステインもしくはシステアミン中での終夜の化学的切断によってビーズから放出して、ＶＮＡＲの対応するＣ末端アミノキシ、Ｃ末端システインまたはＣ末端チオール誘導体を生成した（図１１）。
【０２０８】
次いで、切断ＶＮＡＲ上清をＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ２６／６０  ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＩＭＡＣ（ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってさらに精製した。濃度を、２８０ｎｍでの吸光度から、アミノ酸配列から予測される理論吸光係数を使用して決定した。すべてのタンパク質を、還元型及び非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析ならびに質量分光分析によって特徴付けた。所望のジスルフィド結合の形成を質量分光分析によって確認した。
【０２０９】
実施例３−抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲの特徴付け−ＳＰＲ及びＥＬＩＳＡによるＲＯＲ１及びＲＯＲ２への結合
ＲＯＲ１  ＶＮＡＲ結合因子の種間交差反応性
可溶性ＶＮＡＲタンパク質クローン（Ｂ１、Ｐ３Ａ１及びＤ３）を、陽性対照抗体２Ａ２及び抗ＲＯＲ２特異性抗体対照と共に、ヒト、マウス及びラットＲＯＲ１との種間交差反応性について分析した。２Ａ２は、抗ヒトＲＯＲ１特異性マウスモノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｃａｔ  ＃  ３５７８０２）であり、抗ＲＯＲ２抗体は、Ｒ＆Ｄ（Ｃａｔ  ＃  ＭＡＢ２０６４）からの市販のモノクローナルマウス抗体である。
【０２１０】
ＶＮＡＲ  Ｂ１は、マウス及びヒトＲＯＲ１の両方に対して非常に強い結合因子であることが観察された。すべてのＶＮＡＲが、ヒト、マウス及びラット起源から誘導されたＲＯＲ１に対して種間交差反応性である（表３及び表４）。ＶＮＡＲクローンのいずれも、ヒトＲＯＲ２と交差反応しなかった（表３）。
【０２１１】
ヒトＲＯＲ１、ヒトＲＯＲ２、マウスＲＯＲ１またはラットＲＯＲ１への結合反応速度の決定
結合反応速度を、Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）機器（ＳｅｎｓｉＱ／Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して決定した。ＲＯＲ１−ｈＦｃまたはＲＯＲ２−ｈＦｃ融合タンパク質（細胞外ドメイン）を酢酸ナトリウムｐＨ５バッファー中で、アミンカップリングを使用してＣＯＯＨ2チップに固定化した。ＶＮＡＲ及びＶＮＡＲ−Ｆｃ分子を様々な濃度で試験し、Ｋａ（Ｍ-1ｓ-1）、Ｋｄ（ｓ-1）及びＫＤ（ｎＭ）値を、Ｑｄａｔソフトウェア（ＳｅｎｓｉＱ／Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して決定した。ＲＯＲ１  ２Ａ２  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＲＯＲ２  ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２への陽性／陰性結合のための対照として含めた。２Ｖは、対照ＶＮＡＲ配列であり、ナイーブＶＮＡＲライブラリーに由来するので、このタンパク質群の代表であるが、既知の標的は有さない。
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【０２１２】
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【０２１３】
単量体及び多量体形式（ホモ及びヘテロ二量体形態の両方）でヒトＲＯＲ１  ＥＣＤに高い親和性で結合し、密接に関連するファミリーメンバーのヒトＲＯＲ２への結合を示さず、かつＲＯＲ１のマウス及びラットオルソログに高い親和性で交差反応するＶＮＡＲタンパク質が開発された。二量体としてのＰ３Ａ１及びＤ３タンパク質の再フォーマッティングは、ヒトＲＯＲ１への結合親和性を有意に上昇させ、解離速度定数の大幅な減少が観察された。
【０２１４】
ｈＲＯＲ１へ化学的にコンジュゲートしたＢ１ホモ二量体の結合も、ＥＬＩＳＡによって評価した。この分子を生成するために、Ｂ１誘導体を、特有のＣ末端チオール官能性を伴って、システアミンでの対応するＢ１−インテイン融合タンパク質前駆体の化学的切断を介して生成した。分子間ジスルフィド結合形成を使用して、２つのタンパク質のＣ末端を共有結合させて、非天然であるが定義されたトポロジーのホモ二量体を生成した（Ｂ１−Ｓ−Ｓ−Ｂ１、図７Ｃ）。ｈＲＯＲ１へのＢ１−Ｓ−Ｓ−Ｂ１の結合を、ＥＬＩＳＡによってＢ１と比較した。
【０２１５】
簡単に述べると、ＥＬＩＳＡ法は次のとおりであった。ウェルを抗原１００ｎｇでコーティングし、覆いをして室温で２時間にわたってインキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ））でウェルあたり４００μＬで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳＴ中４％スキムミルク粉末（ｗ／ｖ）で、１時間にわたって３７℃でブロックした。プレートを前と同様に洗浄し、さらにＰＢＳのみで追加で洗浄した。結合タンパク質を４％ミルクＰＢＳＴ中で希釈し、終夜４℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回、ＰＢＳで３回洗浄し、結合を、適切な二次検出抗体を使用して４％ミルクＰＢＳＴ中で、室温で１時間検出した。使用された二次抗体には、下記が含まれる：
抗ｃ−Ｍｙｃ、ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｒ９５１−２５）
ウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ、ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ  ＃ａｂ６７５９）
ウサギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ、ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ  ＃ａｂ９７０４６）
マウス抗ポリＨｉｓ、ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ７０５８）
プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＴＭＢ基質１００μＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＃３４０２９）を添加し、反応を室温で１０分間にわたって進行させた。２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4１００μＬを添加して、反応をクエンチした。プレートを短時間遠心し、その後、４５０ｎｍでの吸光度をＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）で読み取った。Ｂ１モノマー及びＣ末端チオール誘導体はヒトＲＯＲ１に強く結合したものの、ヒトＲＯＲ１結合の増加が、化学的に結合されたＢ１−Ｓ−Ｓ−Ｂ１二量体で観察された（図８）。
【０２１６】
実施例４−抗ＥＧＦＲ−ＲＯＲ１  ＶＮＡＲの特徴付け−フローサイトメトリーによる細胞結合及び内在化
細胞表面結合
０．１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液と共に３７℃で約１０分間にわたって、または細胞が容易に外れるまでインキュベートすることによって、接着したヒトがん細胞を組織培養フラスコから取り外した。細胞を１５ｍＬ管内で氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ５ｍＬ中で再懸濁させ、１５００ｒｐｍで、５分間にわたって４℃で遠心した。上清を除去し、細胞ペレットをＰＢＳ／２％ＦＣＳ１〜２ｍＬ中で再懸濁させた。細胞の計数を、Ｚ１  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して行い、試験試料あたり５×１０5細胞を分取した。細胞をＶＮＡＲ（Ｈｉｓ6Ｍｙｃタグ付き）、ＶＮＡＲ−Ｆｃ分子またはＲＯＲ１  ｍＡｂ、ＥＧＦＲ  ｍＡｂ及びＩｇＧ対照のいずれか１００μＬと共に１時間にわたって氷上でインキュベートした。過剰のＶＮＡＲ、ＶＮＡＲ−ＦｃまたはｍＡｂを、氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ５ｍＬを添加することによって除去し、続いて、１５００ｒｐｍで５分間にわたって４℃で遠心した。上清を除去し、第２の洗浄を、細胞ペレットを氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ１ｍＬ中に再懸濁させ、かつさらなる氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ４ｍＬを添加することによって行った。試料を再び、１５００ｒｐｍで５分間にわたって４℃で遠心した。上清を除去し、過剰の液体を、管をティッシュペーパーに当てることによって除去した。適切な二次抗体を使用して、結合したＶＮＡＲ（Ｈｉｓ6Ｍｙｃ）、ＶＮＡＲ−ｈＦｃ、ＶＮＡＲ−ｍＦｃまたはＲＯＲ  ｍＡｂ（それぞれＰＥ−抗Ｍｙｃタグ抗体（ＣＳＴ）、ＰＥ−抗ヒト抗体（ＪＩＲ  ｌａｂｓ／Ｓｔｒａｔｅｃｈ）、及びＰＥ−抗マウス抗体（ＪＩＲ／Ｓｔｒａｔｅｃｈ））を検出した。細胞を、選択された二次抗体と共に３０分間にわたって氷上でインキュベートした。細胞を洗浄して、前に記載されたとおりに過剰の抗体を除去した。細胞ペレットを氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ０．５ｍＬに再懸濁させ、氷上で暗所にて放置して、その後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）フローサイトメーターのいずれかで分析した。
【０２１７】
３７℃及び４℃でのインキュベーション後の細胞−表面染色の対比
簡単に述べると、５×１０5細胞をＶＮＡＲ、ＶＮＡＲ−Ｆｃ、ＲＯＲ１  ２Ａ２  ｍＡｂ、ＥＧＦＲ  ＡＹ１３ｍＡｂまたはＩｇＧ１対照と共に、１時間にわたって氷上でインキュベートした。細胞を、氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ５ｍＬを添加し、続いて、１５００ｒｐｍで５分間にわたって４℃で遠心することによって２回洗浄した。最終遠心ステップの後に、過剰の上清を除去し、管をティッシュペーパーに当てた。各細胞ペレットをＰＢＳ／２％ＦＣＳ２００μＬ中に再懸濁させ、氷上に、または３７℃に２時間にわたって置いた。結合したＶＮＡＲ（Ｈｉｓ6Ｍｙｃタグ付き）、ＶＮＡＲ−ｈＦｃ、ＶＮＡＲ、ＲＯＲ１  ２Ａ２ｍＡｂまたはＥＧＦＲ  ＡＹ１３ｍＡｂを、ＰＥ−コンジュゲート抗Ｍｙｃタグ抗体（ＣＳＴ）、ＰＥ−コンジュゲート抗ヒト抗体（ＪＩＲ／Ｓｔｒａｔｅｃｈ）またはＰＥ−コンジュゲート抗マウス抗体（ＪＩＲ／Ｓｔｒａｔｅｃｈ）のいずれかを使用して検出した。氷上でインキュベートした試料に対する３７℃でのシグナルの減少は、ＲＯＲ１内在化を示している。
【０２１８】
４℃に対して３７℃でのインキュベーション後の細胞−表面結合の減少が、抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲ構築物（図１４）及び抗ＥＧＦＲ−ＲＯＲ１  ＶＮＡＲ分子（図４２Ａ及び４２Ｂ）で観察され、これは、ＲＯＲ１及びＥＧＦＲによるタンパク質の結合及び内在化と一致する。
【０２１９】
がん細胞系のパネルへのＶＮＡＲの結合
図９は、ＲＯＲ１高Ａ５４９肺腺癌細胞に結合する抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲの結合についての代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示している。
図１３は、フローサイトメトリーによる、ＲＯＲ１高Ａ５４９肺腺癌細胞及びＲＯＲ１低肺癌細胞系Ａ４２７への種々のＶＮＡＲの結合を示している。
表５は、様々なＲＯＲ１高及びＲＯＲ１低がん細胞系へのＶＮＡＲタンパク質の結合についてのフローサイトメトリーデータの概要を示している。
2021509014.tif 000007
【０２２０】
試験されたＲＯＲ１結合ＶＮＡＲの大部分について染色がほとんど観察されないか、まったく観察されなかったＲＯＲ１低がん細胞系と比較して、ＲＯＲ１発現がん細胞系へのＶＮＡＲの強固な結合が観察される。
【０２２１】
Ｐ３Ａ１−Ｐ３Ａ１についての細胞表面染色は、Ｂ１またはＤ３−Ｄ３タンパク質についてほどには強固ではなく、これは、これらの結合因子のエピトープの相違と、細胞の状況において、ＲＯＲ１の細胞外ドメインの一部の領域が結合について、他のものよりも潜在的にアクセスしやすいこととを反映している可能性がある。
【０２２２】
実施例５−抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲ−Ｆｃ融合タンパク質の特徴付け−ＳＰＲによるＲＯＲ１及びＲＯＲ２への結合ならびに細胞表面結合及び内在化
ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲを、標準ＧｌｙＳｅｒリンカーを介して、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ（ｍＦｃ）のＮ末端ならびにヒトＩｇＧ１（ｈＦｃ）のＮ末端及びＣ末端に融合させて発現させた。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合体も生成したが、そのために、Ｆｃ領域中のＳｅｒ２３５（Ｋａｂａｔナンバリング）をＣｙｓで置き換えた（図１０）。
【０２２３】
ＳＰＲによるＲＯＲ１及びＲＯＲ２への結合
上記で概説した手順を使用して、ヒト、マウス及びラットＲＯＲ１及びヒトＲＯＲ２へのＶＮＡＲ−Ｆｃ融合体の結合をＳＰＲによって決定した。
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【０２２４】
表６に示されているとおり、抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲ−Ｆｃタンパク質は高い親和性で、ヒトＲＯＲ１に結合し、ヒトＲＯＲ２への結合は観察されなかった。マウス及びラットＲＯＲ１  ＥＣＤへの強固な結合も観察された。ＶＮＡＲ−Ｆｃ融合体として、ＲＯＲ１結合についてのＫDみかけ値の大幅な減少が、対応するＶＮＡＲモノマーに対して観察される。これは、ＳＰＲ実験において二価様式でＲＯＲ１−チップ表面に結合する、これらのＶＮＡＲ−Ｆｃ融合体と一致する。Ｎ末端及びＣ末端ＶＮＡＲ  Ｆｃ融合体の両方が高い親和性で、ヒトＲＯＲ１には結合するが、ヒトＲＯＲ２には結合しない。
【０２２５】
がん細胞系へのＶＮＡＲの結合
がん細胞系のパネルの表面へのＶＮＡＲ−Ｆｃ融合体の結合をフローサイトメトリーによって、すでに概説した方法を使用して測定した。図１５は、固定濃度のタンパク質でのフローサイトメトリーによる、ＲＯＲ１高Ａ５４９肺腺癌細胞及びＲＯＲ１低肺癌細胞系Ａ４２７への種々のＶＮＡＲ−Ｆｃ融合体の結合を示している。表７に、ＶＮＡＲ−Ｆｃタンパク質と様々なＲＯＲ１高がん細胞系との結合データをまとめている。
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【０２２６】
ＲＯＲ１低がん細胞系と比較して、ＲＯＲ１発現がん細胞系へのＶＮＡＲの強固な結合が観察され、その際、試験されたＲＯＲ１結合ＶＮＡＲの大部分について、染色はほとんど、またはまったく検出されなかった。
【０２２７】
平均細胞−表面染色の差は、タンパク質が細胞表面上に発現される場合に、ＲＯＲ１の異なる領域が他の領域よりもアクセスしやすい可能性があることを示し得る。がん細胞上のＲＯＲ１のアクセスしにくい領域を標的とするためには、立体的に閉塞されるであろう大きな抗体ではなく、ＶＮＡＲなどの小さなタンパク質結合因子を使用することが有利であろう。
【０２２８】
３７℃及び４℃でのインキュベーション後の細胞−表面染色の対比
３７℃または４℃でのインキュベーション後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞へのＶＮＡＲ−Ｆｃ融合体の結合をフローサイトメトリーによって、すでに記載の方法を使用して決定した。試験したＢ１−ｈＦｃ、Ｐ３Ａ１−ｈＦｃ、Ｄ３−ｈＦｃ及びＤ３Ｄ３−ｈＦｃタンパク質について、４℃に対して、３７℃ではインキュベーション後に、細胞−表面染色が減少したが（図１６）、これは、これらのＶＮＡＲ−ｈＦｃ融合タンパク質の結合及び内在化と一致した。
【０２２９】
４℃及び３７℃でのインキュベーション後の免疫蛍光による内在化の対比
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ及びマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ融合タンパク質の細胞局在は、免疫蛍光によって、これらのドメインを標的とする蛍光標識された二次抗体を使用して検出することができる。免疫蛍光法を使用して、がん細胞上のＲＯＲ１によるＶＮＡＲ−Ｆｃの内在化を検出した。
【０２３０】
黒色透明底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、細胞付着を補助するために１００μｇ／ｍＬのコラーゲンＩ（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした。細胞を完全成長培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、コーティングされた９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ2、３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。翌日、培地を除去し、血清非含有培地（Ｇｉｂｃｏ）に取り換え、終夜放置した。翌朝、培地を除去し、細胞を様々な濃度のＶＮＡＲ−Ｆｃ分子で処理した。プレートを氷上で３０分間にわたってインキュベートした。処理物を除去し、ウェルあたりＰＢＳ／２％ＦＣＳ１００μＬに取り換えた。１つのプレートを氷上に保持し、他のプレートは３７℃、５％ＣＯ2で、２時間にわたって置いた。この２時間のインキュベーションの後に、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ溶液を除去し、細胞を氷冷ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで、２０分間にわたって氷上で固定化した。ＰＦＡ溶液を除去し、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で作製した０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ）に、１５分間にわたって室温で取り換えた。このステップで、細胞膜は透過処理される。二次抗体染色を、ＡＦ４８８−抗ヒトＡｂ（１：２５０；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して行って、ＶＮＡＲ−ｈＦｃ融合タンパク質を検出した。すべての二次抗体作業ストックを、０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ／ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で作製した。プレートを４℃で終夜、暗所でインキュベートした。翌日、二次ＡＦ４８８−コンジュゲート抗体を除去し、細胞を０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ／ＰＢＳ／２％ＦＣＳを使用して３回洗浄した。Ｌａｍｐ−１抗体（１：２００；ＣＳＴ）またはＥＥＡ１抗体（１：５０；ＣＳＴ）を添加して、それぞれリソソーム及び初期エンドソーム区画を検出した。プレートを暗所で、室温で２時間にわたってインキュベートした。次いで、Ｌａｍｐ−１及びＥＥＡ１抗体を除去し、細胞を０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ／ＰＢＳ／２％ＦＣＳで３回洗浄した。次いで、ＡＦ６４７−抗ウサギ抗体（１：１０００；ＣＳＴ）を添加して、Ｌａｍｐ１及びＥＥＡ１抗体結合を検出した。暗所で室温での２時間にわたるさらなるインキュベーションを行い、その後、ＡＦ６４７−二次抗体を除去し、細胞を０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ／ＰＢＳ／２％ＦＣＳで３回洗浄した。細胞核を、０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ／ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１０μＭ  Ｈｏｅｃｈｓｔ試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用して２０分間にわたって、室温にて暗所で染色した。最後に、この溶液を除去し、ＰＢＳに取り換えた。プレートを４℃で、暗所で貯蔵し、その後、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＩｎＣｅｌｌ  ２０００機器を使用して撮像した。
【０２３１】
３７℃で２時間にわたるインキュベーション後に、Ｂ１  ｈＦｃ及びＢ１  ｍＦｃの内在化がＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞で観察された。ＶＮＡＲ−Ｆｃ−ＲＯＲ１複合体は、内在化後にＬａｍｐ−１及びＥＥＡ１染色と重なるようであり、これは、初期エンドソーム及びリソソーム区画を介したＲＯＲ１細胞輸送を示唆する。試料を氷上で２時間にわたってインキュベートすると、ＲＯＲ１−ＶＮＡＲ−Ｆｃ染色は主に細胞表面にとどまった。２Ｖ  Ｆｃタンパク質（非結合陰性対照ＶＮＡＲ）とのインキュベーション後には、細胞表面結合または内在化は観察されなかった。Ｂ１−ｈＦｃ及びＢ１−ｍＦｃは、ＲＯＲ１低肺癌細胞系Ａ４２７によって内在化されなかった。
【０２３２】
実施例６−ヒト化及びさらなる操作
２種のリードＲＯＲ１結合ＶＮＡＲのいくつかのヒト化配列誘導体を、２つの異なる戦略を使用して生成した。
【０２３３】
ヒト化配列を、ヒト生殖細胞系列Ｖκ１配列、ＤＰＫ−９に基づき設計した。例えば、Ｐ３Ａ１  Ｖ１では、ＶＮＡＲのフレームワーク領域１、３及び４を変異させて、ＤＰＫ−９のフレームワーク領域とアラインさせた。
【０２３４】
第２の戦略は、ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲの結合ループを、すでにヒト化されているＶＮＡＲフレームワークにグラフトすることを含む（Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ  ＪＢＣ  ２０１３  ２８８（２４）  １７４０８−１７４１９、ＷＯ２０１３／１６７８８３）。第１の構築物（Ｇ１）では、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３ループのみをグラフとした。第２の構築物（Ｇ２）は、ＣＤＲ及びＨＶループの両方をグラフトさせた。
【０２３５】
ヒト化／グラフトされたＶＮＡＲ配列の例：
Ｂ１  Ｇ１  ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＧＡＮＹＧＬＡＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＴＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４５）
Ｂ１  Ｇ２  ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＧＡＮＹＧＬＡＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４６）
Ｐ３Ａ１  Ｖ１  ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４７）
Ｐ３Ａ１  Ｇ１  ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＫＥＱＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＴＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４８）
Ｐ３Ａ１  Ｇ２  ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＹＷＹＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＲＡＲＥＡＲＨＰＷＬＲＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４９）
Ｄ３ヒト化ＡＤＶ１
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５０）
Ｄ３ヒト化ＡＤＶ２
ＴＲＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５１）
Ｄ３ヒト化ＡＤＶ３
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＡＳＡＳＶＧＤＲＬＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＳＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＬＥＶＫ（配列番号５２）
Ｂ１ヒト化Ｖ５
ＡＳＶＤＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＶＴＧＡＮＹＧＬＡＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＫＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５３）
Ｂ１ヒト化Ｖ７
ＡＳＶＤＱＳＰＳＳＡＳＡＳＶＧＤＲＬＴＩＴＣＶＶＴＧＡＮＹＧＬＡＡＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＳＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＫＡＹＰＷＧＡＧＡＰＷＬＶＱＷＹＤＧＡＧＴＫＬＥＶＫ（配列番号５４）
【０２３６】
ヒト化構築物をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現にコドン最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって合成された。Ｐ３Ａ１配列は、ＶＮＡＲドメインを連結する［Ｇ4Ｓ］5リンカーを含む二量体として設計された。すべてのヒト化配列を、次のＣ末端Ｈｉｓ6ｍｙｃタグを用いて生成した：
ＱＡＳＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＥＦＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧ（配列番号９５）
【０２３７】
「ＶＮＡＲインテイン融合タンパク質を発現するための典型的な方法」セクションにおいて前に記載されたとおり、これらのタンパク質をコードするＤＮＡをインテイン発現ベクターにサブクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、精製した。
【０２３８】
Ｄ３のさらなるヒト化バージョンを次のとおり作製した：
Ｄ３ヒト化ＥＬ  Ｖ１
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５５）
Ｄ３ヒト化ＥＬ  Ｖ２
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５６）
Ｄ３ヒト化ＥＬ  Ｖ３
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＦＳＧＳＧＳＫＲＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５７）
Ｄ３ヒト化ＥＬ  Ｖ４
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＹＱＱＫＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５８）
Ｄ３ヒト化ＥＬ  Ｖ５
ＡＳＶＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＶＬＴＤＴＳＹＧＬＹＳＴＳＷＹＱＱＫＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＦＳＧＳＧＳＫＲＡＫＳＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＫＡＱＳＧＭＡＩＳＴＧＳＧＨＧＹＮＷＹＤＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）
【０２３９】
ヒト化ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲバリアントは、ＳＰＲによると、ヒトＲＯＲ１への高親和性結合及び改善された熱安定性を示した。ＳＰＲを、前に記載されたとおりに、チップ表面に固定化されたヒトＲＯＲ１  ＥＣＤ−Ｆｃを使用して行った。熱安定性アッセイでは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムをＰｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ（商標）色素キット（Ｔｈｅｒｍｏ）と共に使用した。このアッセイミックスを、タンパク質が２０μＬで２０μＭの最終濃度であるように設定した。Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ（商標）バッファー５μＬを８×Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ（商標）Ｄｙｅ２．５μＬと共に添加した。アッセイをＳｔｅｐＯｎｅソフトウェアを使用して実行し、データを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ（商標）ソフトウェアを使用して分析した。データはすべて、第１の微分解析からのデータである。
【０２４０】
2021509014.tif 000010
【０２４１】
Ｂ１のＨＶ及び／またはＣＤＲループをヒト化ＶＮＡＲフレームワークにグラフトすること、ならびにＰ３Ａ１配列をヒトＤＰＫ−９配列からの領域に置換することで、安定的であり、かつそれぞれナノモル及びピコモル親和性でのｈＲＯＲ１結合を維持する、実質的に操作されたタンパク質が得られた。
【０２４２】
実施例７−エピトープマッピング
脱グリコシル化ヒトＲＯＲ１へのタンパク質の結合
ＥＬＩＳＡを使用して、グリコシル化及び脱グリコシル化ヒトＲＯＲ１タンパク質へのＶＮＡＲ結合を比較した。脱グリコシル化ヒトＲＯＲ１を生成するために、０．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を終夜、室温で、ＲＯＲ１タンパク質２μｇあたり１ＵのＰＮＧアーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ）と共にインキュベートした。対照であるグリコシル化ヒトＲＯＲ１を平行して、ＰＮＧアーゼＦを添加せずに調製した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析は、ＰＮＧアーゼＦ処理へのシフトを示し、ＲＯＲ１脱グリコシル化と一致した（図１７Ａ）。
【０２４３】
これらのＲＯＲ１タンパク質を使用して、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、「抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲ特徴付け」セクションにおいて前に記載されたとおりに、ＥＬＩＳＡを行った。ＶＮＡＲ（Ｂ１、Ｐ３Ａ１−Ｐ３Ａ１、Ｄ３−Ｄ３、Ｂ１  ｍＦｃ）はＥＬＩＳＡによるとグリコシル化及び脱グリコシル化ＲＯＲ１タンパク質の両方に同等に良好に結合し（図１７Ｂ及び１７Ｃ）、ＲＯＲ１結合がＲＯＲ１グリコシル化とは関係がないことを示している。
【０２４４】
折り畳まれていないｈＲＯＲ１（２８ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％Ｓａｒｋｏｓｙｌで還元）へのＢ１の結合は有意に減少し、立体構造エピトープ（複数可）へのＢ１  ＶＮＡＲ結合と一致した（図１７Ｃ）。
【０２４５】
ＳＥＣによるＲＯＲ１  ＩｇドメインへのＢ１の結合
Ｂ１  ＶＮＡＲは、ＳＥＣによるとＲＯＲ１  Ｉｇドメインと複合体を形成する（図１８）。１：１のＶＮＡＲ：ＲＯＲ１ドメインまたはＲＯＲ１ドメイン対を氷上で３０分間にわたってインキュベートし、次いで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にＰＢＳ中で流し、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。これらの条件下で、Ｂ１は、ＲＯＲ１  Ｉｇドメインと共に複合体を形成した。
【０２４６】
エピトープビニング実験
結合競合の試験を、ＳＰＲを使用して完了した。ヒトＲＯＲ１（ｈＲＯＲ１）を、アミンカップリングによってＣＯＯＨ2チップのフローチャネル１及び３（ＦＣ１及びＦＣ３）に固定化した。ＦＣ２を参照チャネルとして使用した。次いで、選択したＶＮＡＲ、例えば、Ｂ１、Ｐ３Ａ１二量体；またはＲＯＲ１  ２Ａ２  ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をＦＣ１上のｈＲＯＲ１に捕捉させた。次いで、試験分析物を、ｉ）すでに捕捉されているＶＮＡＲもしくはＲＯＲ１  ２Ａ２ｍＡｂのいずれか伴うｈＲＯＲ１への、またはｉｉ）結合ＶＮＡＲもしくはｍＡｂの非存在下のｈＲＯＲ１への結合について評価した。ｈＲＯＲ１チップ表面を各試験分析物の後に、グリシンｐＨ２を使用して再生させた。次の分析物を試験する前に、ＶＮＡＲまたはＲＯＲ１  ２Ａ２  ｍＡｂを再び、ＦＣ１などでｈＲＯＲ１に捕捉させた。結合反応速度を、ＱＤａｔソフトウェアを使用して決定した。非競合分子では、結合反応速度及びセンソグラムプロファイルは、同様であり／ｈＲＯＲ１＋／−捕捉結合因子に影響を与えなかった。競合分子では、センソグラムプロファイル及び結合反応速度は著しく変化した。
【０２４７】
図１９は、Ｂ１との事前インキュベーションを伴わない、及び伴う、ヒトＲＯＲ１へのＶＮＡＲの結合についての代表的なセンサグラム及び結合反応速度を示している。結果は、Ｂ１及びＰ３Ａ１  ＶＮＡＲがｈＲＯＲ１への結合について、相互に競合せず、ＲＯＲ１  ｍＡｂ  ２Ａ２とも競合しないことを示した。Ｂ１  ＶＮＡＲをチップ表面上のｈＲＯＲ１に捕捉させた場合、Ｂ１のさらなる結合が著しく妨害されたが、しかしながら、ｈＲＯＲ１へのＰ３Ａ１単量体、Ｐ３Ａ１二量体またはＲＯＲ１  ２Ａ２  ｍＡｂの結合プロファイルは、事前捕捉されたＢ１の非存在及び存在下で同じであった（図１９）。捕捉されたＢ１  ＶＮＡＲの非存在及び存在下でのｈＲＯＲ１へのこれらの分子の結合について得られた反応速度パラメーターによって、これらはＢ１と競合しないことが確認される（予測されるとおり、それ自体と競合するＢ１を除く）。
【０２４８】
Ｐ３Ａ１誘導体または２Ａ２  ｍＡｂの事前捕捉を伴う、及び伴わないｈＲＯＲ１へのＶＮＡＲの結合も同様に評価した。結果を（表９）にまとめるが、これは、Ｂ１、Ｐ３Ａ１及び２Ａ２が相互に競合しないが、予期されるとおりそれら自体とは競合し、したがって、ｈＲＯＲ１の異なる領域に結合することを示した。
2021509014.tif 000011
【０２４９】
抗ＲＯＲ１ペプチドを使用しての抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲのエピトープマッピング
ＥＬＩＳＡ分析を使用して、リード抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲドメインであるＢ１、Ｐ３Ａ１及びＤ３がＲＯＲ１上の同じ、または重複するエピトープ（４種のＥＣＤペプチドとしてここでは定義される）に結合するかどうかを決定した。ＥＬＩＳＡプレートに固定化されたペプチドとの直接的な結合（ＰＢＳ及びＤＭＳＯ中）の最初の分析は、ＶＮＡＲのどれも、いずれのペプチドにも結合しなかったが、同じＥＬＩＳＡの一部として含まれた固定化ＥＣＤ  ｈＲＯＲ１−Ｆｃタンパク質対照には結合したことを示した（図２０及び図２１）。このことをさらに調査するために、競合アッセイを設計し、その際、ＶＮＡＲを漸増濃度の４種の試験ペプチド（またはヒトＲＯＲ１  ＥＣＤ−Ｆｃ）と共に溶液中でインキュベートし、次いで、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化されたＲＯＲ１−Ｆｃへの残留結合の評価を観察した。ＶＮＡＲと、陽性対照として使用されたヒトＲＯＲ１  ＥＣＤ−Ｆｃとの間での競合が明らかであった。しかしながら、ペプチドの存在下では、シグナルの減少は明らかでなく、これは、これらの特異性ＥＣＤペプチドへのＶＮＡＲの結合が起こらなかったことを明らかに示した（図２２及び図２３）。
【０２５０】
さらに、Ｂ１、Ｐ３Ａ１及びＤ３ＶＮＡＲは、ｈＲＯＲ１のＥＣＤ全体にわたるいずれの重複する直鎖１５マーペプチドとも結合しない。これらは、バッファー含有ＳＤＳ中で、還元条件、すなわち典型的にはタンパク質を変性する条件下で事前に音波処理されたｈＲＯＲ１にも結合しない（Ｐｅｐｓｃａｎデータは図示せず）。総合すると、これは、Ｂ１、Ｐ３Ａ１及びＤ３  ＶＮＡＲが、ヒトＲＯＲ１  ＥＣＤタンパク質上の別個の立体構造エピトープ（複数可）に結合することを示している。
【０２５１】
ＥＣＤペプチドへのＶＮＡＲの直接的な結合
次のペプチドを合成し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中に溶解させた：
ペプチド１−−ＹＭＥＳＬＨＭＱＧＥＩＥＮＱＩ（配列番号３４）
ペプチド２−−ＲＳＴＩＹＧＳＲＬＲＩＮＬＤＴＴＤＴＧＹＦＱ（配列番号３８）
ペプチド３−−ＣＱＰＷＮＳＱＹＰＨＴＨＴＦＴＡＬＲＦＰ（配列番号３５）
ペプチド４−−ＱＣＶＡＴＮＧＫＥＶＶＳＳＴＧＶＬＦＶＫＦＧＰＰＰＴＡＳＰＧＹＳＤＥＹＥ（配列番号３７）
ペプチド５−−  ＲＳＴＩＹＧＳＲＬＲＩＲＮＬＤＴＴＤＴＧＹＦＱ（配列番号３６）
【０２５２】
ＥＬＳＳ１から単離されたクローンＢ１及びＰ３Ａ１を単量体として、及び免疫化ライブラリーからのＤ３を単量体及びホモ二量体の両方として評価した。
【０２５３】
Ｂ１及びＰ３Ａ１の両方がＲＯＲ１への結合を示し、その際、４種のペプチドのどれに対しても結合は明らかでなかった。ＨＳＡが非特異性対照として含まれた（図２０）。
【０２５４】
しかしながら、ペプチド２はＰＢＳ中に不溶性であるので、直接的な結合ＥＬＩＳＡを、２５％ＤＭＳＯ中に溶解させたペプチドで繰り返した。Ｄ３及びタンパク質二量体融合体としてのＤ３−Ｄ３が、これらのデータセットには含まれ、再び、ペプチドへの結合は観察されなかった（図２１）。
【０２５５】
方法
直接的ペプチド結合ＥＬＩＳＡ
１．９６ウェルプレートをＰＢＳ中１０もしくは５０ｎＭ  ｈｕＲＯＲ１−ＦｃまたはＰＢＳもしくは２５％ＤＭＳＯ中１０μＭペプチドでコーティングした。終夜４℃でインキュベートした。
２．ＰＢＳで２回洗浄した。
３．２００μＬ／ウェルの４％ＭＰＢＳで１時間にわたって室温でブロックした。
４．ＰＢＳで２回洗浄した。
５．１μｇ／ｍＬ（６７ｎＭ）のＢ１またはＰ３Ａ１、１０μｇ／ｍＬ（６７０ｎＭ）のＤ３及びＤ３−Ｄ３を添加し、プレート全体を１：３系列希釈した。１時間にわたって室温でインキュベートした。
６．ＰＢＳで３回洗浄した。
７．プレートを抗ｈｉｓ−ＨＲＰ  ＳＩＧＭＡ１００μ（ＰＢＳＴ中１：１０００）と共に１時間にわたって室温でインキュベートした。
８．ＰＢＳＴで２回及びＰＢＳで２回洗浄した。
９．１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加した。１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で反応を停止した。
【０２５６】
ＶＮＡＲ及びＲＯＲ１ペプチドの競合アッセイ
競合アッセイを、上記方法に記載のとおり、ＰＢＳ中で再構成した４種のペプチドすべてで行った。これらのアッセイでは、結合は、ＶＮＡＲ  Ｂ１またはＰ３Ａ１では、典型的な結合ＥＬＩＳＡ形式で固定化された４種のペプチドのいずれに対しても観察されなかった（図２２）。したがって、これらのペプチドが、Ｂ１またはＰ３Ａ１によって認識されるＲＯＲ１上のエピトープを表す証拠はなかった。
【０２５７】
図２１で使用した条件に従って（ペプチド２がＰＢＳ中に不溶性であるので）、競合アッセイをすべて、２５％ＤＭＳＯ中に溶解させたペプチドで繰り返した。このアッセイのために、Ｄ３及びＤ３−Ｄ３二量体も、これらのデータセットに含まれた。これらの結果によって、ＶＮＡＲドメインであるＢ１、Ｐ３Ａ１及びＤ３が、試験された４種のペプチドによって表されるものとは異なる１つのエピトープ（または複数のエピトープ）を認識することが確認された。
【０２５８】
方法
競合ＥＬＩＳＡ
１．９６ウェルプレートをＰＢＳ中で、Ｐ３Ａ１では５０ｎＭのｈｕＲＯＲ１−Ｆｃ、Ｂ１、Ｄ３及びＤ３−Ｄ３二量体では１０ｎＭのｈｕＲＯＲ１−Ｆｃでコーティングした。終夜４℃でインキュベートした。
２．ＰＢＳで２回洗浄した。
３．２００μＬ／ウェルの４％ＭＰＢＳで１時間にわたって室温でブロックした。
４．ＰＢＳで２回洗浄した。
５．３０分間にわたって室温で以下をプレインキュベートした：
・Ｂ１＝１５ｎＭと
１μＭの出発濃度のペプチド（ＰＢＳまたは２５％ＤＭＳＯ中）（次いで、プレート全体を１：３系列希釈）、
または１００ｎＭの出発濃度のｈｕＲＯＲ１−Ｆｃ（次いで、プレート全体を１：３系列希釈）、
・Ｐ３Ａ１＝６７０ｎＭと、
５０μＭの出発濃度のペプチド（ＰＢＳまたは２５％ＤＭＳＯ中）（次いで、プレート全体を１：３系列希釈）
または１μＭの出発濃度のｈｕＲＯＲ１−Ｆｃ（次いで、プレート全体を１：３系列希釈）、
・Ｄ３＝６７ｎＭと、
５００ｎＭの出発濃度のペプチドまたはｈｕＲＯＲ１−Ｆｃ（ＰＢＳまたは２５％ＤＭＳＯ中）（次いで、プレート全体を１：３系列希釈）、
・Ｄ３−Ｄ３＝０．６７ｎＭと、
５００ｎＭの出発濃度のペプチドまたはｈｕＲＯＲ１−Ｆｃ（ＰＢＳまたは２５％ＤＭＳＯ中）（次いで、プレート全体を１：３系列希釈）、
６．１００μＬ／ウェルのプレインキュベートした試料を添加する。１時間、室温でインキュベートした。
７．ＰＢＳで３回洗浄した。
８．プレートを１００μＬ／ウェルの抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ（ＰＢＳＴ中１：１０００）と共にインキュベートした。１時間、室温でインキュベートした。
９．ＰＢＳＴで２回及びＰＢＳで２回洗浄した。
１０．１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加した。５０μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で反応を停止した。
【０２５９】
組み換えＲＯＲ１ドメインを使用しての抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲのエピトープマッピング
ＲＯＲ１  ＥＣＤは、３種の別個のタンパク質ドメイン、すなわちＩｇ様、Ｆｒｉｚｚｌｅ及びＫｒｉｎｇｌｅから構成される。これらのＶＮＡＲのそれぞれによって認識されるエピトープがＲＯＲ１タンパク質全体の特異性サブドメイン内にあるかどうかを決定するために、次のＥＬＩＳＡ分析を行った。
【０２６０】
ＲＯＲ１ドメインへのＶＮＡＲの直接的な結合
抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲであるＢ１、Ｐ３Ａ１及びＤ３を、直接結合ＥＬＩＳＡによって、ヒトＲＯＲ１の３種の細胞外ドメイン（Ｉｇ様、Ｆｒｉｚｚｌｅ及びＫｒｉｎｇｌｅ）への結合について評価した。Ｂ１及びＰ３Ａ１は単量体として評価し、Ｄ３は、単量体及びホモ二量体（Ｄ３−Ｄ３）の両方として評価した。２Ａ２抗ＲＯＲ１抗体も、陽性対照としてアッセイに組み込んだ。
【０２６１】
Ｂ１及び２Ａ２はＩｇ様ドメインを認識したが、しかしながら、Ｉｇ様ドメインへのこの結合は、細胞外ｈｕＲＯＲ１全体のそれらの結合と比較してかなり弱かった。Ｐ３Ａ１は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメインを認識したが、この場合も、インタクトなＲＯＲ１タンパク質への結合に比べて弱い結合であった（図２４及び表１０）。Ｄ３及びＤ３−Ｄ３ホモ二量体は、全長ＲＯＲ１  ＥＣＤには結合したが、個々のＲＯＲ１  ＥＣＤサブドメインには結合しないことが観察された（図２４及び表１０）。
【０２６２】
結果をすべて表１０にまとめる。
2021509014.tif 000012
【０２６３】
方法
ＲＯＲ１ドメインへの直接結合ＥＬＩＳＡ
１．９６ウェルプレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのｈｕＲＯＲ１−ＦｃまたはｈｕＲＯＲ１ドメインでコーティングした。終夜４℃でインキュベートした。
２．ＰＢＳで２回洗浄した。
３．２００μＬ／ウェルの４％ＭＰＢＳで１時間にわたって室温でブロックした。
４．ＰＢＳで２回洗浄した。
５．Ｄ３、Ｄ３−Ｄ３二量体または２Ａ２  ｍＡｂをＶＮＡＲでは１０μｇ／ｍＬの出発濃度で、ｍＡｂでは１：１５０希釈で添加した。プレート全体を３倍系列希釈した。１時間にわたって室温でインキュベートした。
６．ＰＢＳで３回洗浄した。
７．プレートを１００μＬの抗ｃ−ｍｙｃ−ＨＲＰ（ＰＢＳＴ中１：１０００）と共に１時間にわたって室温でインキュベートした。
８．ＰＢＳＴで２回及びＰＢＳで２回洗浄した。
９．１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加した。１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で反応を停止した。
【０２６４】
実施例８−ＶＮＡＲコンジュゲーション化学
部位特異的ＶＮＡＲコンジュゲーションのためのコンセプトの証明としてのＢＡ１１の標識
現在、ＶＮＡＲに標識及び薬物を部位特異的コンジュゲーションするための方法は存在せず、したがって、そのようなコンジュゲーション方法を確立することが必要とされている。ＶＮＡＲ  ＢＡ１１は、高い親和性でヒト血清アルブミンに結合するＥ０６のヒト化バリアントであり（Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１３  ＪＢＣ）、半減期延長技術としての用途がある。ＢＡ１１を、部位特異的にコンジュゲートしたＶＮＡＲを良好な収率で、ＶＮＡＲドメインの結合活性を損なわずに生成することができるかを決定するためのモデルＶＮＡＲとして使用した。ＶＮＡＲのＣ末端は、その標的に結合するために一般に使用されるＶＮＡＲの領域であるＣＤＲ１及び３ならびにＨＶ２及び４領域の遠位にある。
【０２６５】
したがって、インテインをベースとする技術（米国特許出願公開第２００６２４７４１７号）を使用して、様々な化学によるＶＮＡＲのＣ末端へのペイロードの部位特異的コンジュゲーションを評価した。簡単に述べると、目的のタンパク質を操作インテインドメインのＮ末端融合体として発現させる（Ｍｕｉｒ  ＴＷ  ２００６  Ｎａｔｕｒｅ  ４４２，５１７−５１８）。その後のタンパク質−インテイン結合でのＮ→Ｓアシルシフトにより、ビス−アミノキシ作用物質またはアミノ−チオールで化学的に切断すると、それぞれ所望のタンパク質Ｃ末端アミノキシまたはチオール誘導体を得ることができるチオエステル結合中間体が生じる（図１１）。これらのＣ末端アミノキシ及びチオール誘導体を化学選択的に、それぞれアルデヒド／ケトン及びマレイミド官能化部分と反応させると、部位特異的Ｃ末端修飾タンパク質を得ることができる（図２５〜２７）。このアプローチを使用して、ＢＡ１１フルオレセインコンジュゲートを、オキシム及びチオエーテル形成化学を介して、良好な収率で生成し、これらのコンジュゲートは、ヒト血清アルブミンタンパク質への結合を維持した。
【０２６６】
初めに、キチンビーズに固定化したＢＡ１１インテイン−ＣＢＤ融合タンパク質を、前に記載されたとおりに、典型的な収量である１０ｍｇ／Ｌ以上で、Ｅ．ｃｏｌｉでのサイトゾル発現から生成した。次いで、この前駆体融合タンパク質を水性緩衝条件下で、種々の小分子作用物質を用いて切断して、Ｃ末端に特有の化学反応性官能基を有するＢＡ１１を生成した。
【０２６７】
ＢＡ１１−アミノキシの生成（図１１）
固定化ＢＡ１１インテイン−ＣＢＤ融合タンパク質を切断バッファーｐＨ６．９中４００ｍＭジオキシアミン（ＮＨ2−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−ＮＨ2）中で終夜切断して、切断率約７５％を得た。
【０２６８】
ＢＡ１１アミノキシを含有する切断上清を流出させ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ２６／６０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．９、２００ｍＭ  ＮａＣｌ中で精製した。これによって、可溶性で誘導体化された、折り畳まれたタンパク質が２ｍｇ／Ｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ超の収量で得られた。すべてのタンパク質を還元型及び非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析ならびに質量分光分析によって特徴付けた。所望のジスルフィド結合の形成を質量分光分析によって確認した。
【０２６９】
ＢＡ１１−オキシム−フルオレセインの生成（図２５）
精製ＢＡ１１アミノキシを、１０％アセトニトリル及び１０ｍＭアニリン触媒を含むｐＨ５．５バッファー中の３モル当量のベンズアルデヒド−ｐｅｇ−フルオレセインと、室温で終夜混合した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及び質量分光分析は９８％以上の反応率を示し、コンジュゲートを上記のとおりのＳＥＣによって精製し、還元型及び非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析ならびに質量分光分析によって確認した。
【０２７０】
ＢＡ１１  Ｃ末端チオール誘導体の生成（図１１）
キチンビーズ上に固定化されたＢＡ１１インテイン−ＣＢＤ融合タンパク質を、２ｍＭ  ＴＣＥＰを含む切断バッファー中の１００ｍＭシステアミン（Ｓｉｇｍａ）中で終夜切断して、ＶＮＡＲの対応するＣ末端チオール誘導体を生成した。ＢＡ１１チオールを含有する切断上清を流出させ、２ｍＭ  ＴＣＥＰで処理して、導入されたＣ末端チオール基上のあらゆるシステアミン付加物を還元し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ２６／６０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．９、２００ｍＭ  ＮａＣｌ中でタンパク質精製した。ＢＡ１１  ＳＨについて収量約１．６ｍｇ／Ｌ  Ｅ．ｃｏｌｉが得られた。すべてのタンパク質を還元型及び非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析ならびに質量分光分析によって特徴付けた。所望のジスルフィド結合及び遊離Ｃ末端チオールの形成を質量分光分析によって確認した。
【０２７１】
ＢＡ１１−Ｃ末端チオール−マレイミド−ｐｅｇ−フルオレセインの生成（図２６）
Ｃ末端チオールを伴って生成されたＢＡ１１（ＢＡ１１  ＳＨ）を、最終０．３％ＤＭＦを含むｐＨ６．９バッファー中で、室温で０．５〜１時間、４モル当量のマレイミド−ｐｅｇ−フルオレセインと混合した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及び質量分光分析は、９８％以上の反応率を示した。コンジュゲートを上記のとおりのＳＥＣによって精製し、還元型及び非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析ならびに質量分光分析によって確認した。
【０２７２】
ＢＡ１１  Ｃ末端システイン誘導体の生成（図１１）
キチンビーズ上に固定化されたＢＡ１１  Ｉｎｔｅｉｎ−ＣＢＤ融合タンパク質を、２ｍＭ  ＴＣＥＰを含む切断バッファー中の１００ｍＭシステイン中で終夜切断して、ＶＮＡＲの対応するＣ末端システイン誘導体を生成した。ＢＡ１１  Ｃｙｓを含有する切断上清を流出させ、２ｍＭ  ＴＣＥＰで処理して、導入されたＣ末端チオール基上のあらゆるシステイン付加物を還元し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ２６／６０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．９、２００ｍＭ  ＮａＣｌ中でタンパク質精製した。ＢＡ１１−ｃｙｓについて収量約３ｍｇ／Ｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ超が得られた。すべてのタンパク質を還元型及び非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析ならびに質量分光分析によって特徴付けた。所望のジスルフィド結合及び遊離Ｃ末端チオールの形成を質量分光分析によって確認した。
【０２７３】
ＢＡ１１−Ｃ末端システイン−マレイミド−ｐｅｇ−フルオレセインの生成（図２７）
Ｃ末端システインを伴って生成されたＢＡ１１（ＢＡ１１  ｃｙｓ）を４モル当量のマレイミド−ｐｅｇ−フルオレセインと、ｐＨ６．９バッファー中、最終０．３％ＤＭＦと共に、室温で０．５〜１時間混合した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及び質量分光分析は、ＢＡ１１  ｃｙｓについて反応率６０〜８０％を示し、比較的低い反応率は、著しいＢＡ１１  ｃｙｓ二量体形成によるものであった。コンジュゲートを上記のとおりのＳＥＣによって精製し、還元型及び非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析ならびに質量分光分析によって確認した。
【０２７４】
血清アルブミンへのＢＡ１１ならびに対応するＣ末端誘導体及びコンジュゲートの結合をＳＰＲによって決定した。
【０２７５】
ヒト、マウス、ラット及びカニクイザル血清アルブミンへの半減期延長ＶＮＡＲ（ＢＡ１１）またはフルオレセイン−コンジュゲートＢＡ１１の結合反応速度の決定
結合反応速度を、ＳＰＲを使用して決定した。血清アルブミンまたは陰性対照タンパク質を次のとおりに、最適化されたバッファー条件を使用するアミンカップリングによって、ＣＯＯＨ2チップに固定化した：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）を酢酸ナトリウムｐＨ５バッファー中で固定化した。ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）及びカニクイザル血清アルブミン（ＣＳＡ）を酢酸ナトリウムｐＨ４．５バッファー中で、ならびに陰性対照ニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）タンパク質を酢酸ナトリウムｐＨ５．５バッファー中で固定化した。
【０２７６】
分析物（ＢＡ１１、ＢＡ１１−フルオレセインまたは２Ｖ陰性対照結合因子）を様々な濃度で試験し、Ｋa（Ｍ-1ｓ-1）、Ｋd（ｓ-1）及びＫD（ｎＭ）値を、ＱＤａｔソフトウェア（ＳｅｎｓｉＱ／Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して決定した。各分析物試験実験について、選択された血清アルブミンタンパク質への結合を陰性対照タンパク質（ＨＥＬ）と共にアッセイした。
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【０２７７】
すべてのＢＡ１１誘導体及びコンジュゲートが、ｐＨ７．４及びｐＨ５．５の両方で、種々の血清アルブミンタンパク質への高い親和性結合を示した。したがって、記載の方法は、そのタンパク質の結合活性を維持したＶＮＡＲの部位特異的修飾及びコンジュゲーションのための強固で高度に柔軟なアプローチを提供する。
【０２７８】
ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲ−ＡＦ４８８及びＭＭＡＥコンジュゲート
Ｃ末端インテイン融合タンパク質としてのＲＯＲ１結合ＶＮＡＲの発現は、特有のＣ末端アミノキシ及びＣ末端チオール基を有するＲＯＲ１結合ＶＮＡＲの生成を可能にした。これは次に、それぞれオキシム形成コンジュゲーション化学及びマレイミド化学を介しての蛍光標識及び細胞傷害性ペイロードへの部位特異的Ｃ末端コンジュゲーションを可能にした。使用される標識及びペイロードの例が図２８に示されている。
【０２７９】
キチンビーズ上で固定化されたＲＯＲ１結合ＶＮＡＲインテインＣＢＤ融合タンパク質を上記のとおり生成した。
【０２８０】
ＶＮＡＲ−ｏｘ−ｖｃＭＭＡＥ及びＶＮＡＲ−ｏｘ−ＭＭＡＥの生成
固定化ＶＮＡＲインテイン融合タンパク質を、切断バッファーｐＨ６．９中の４００ｍＭ  Ｏ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビスヒドロキシルアミン（ＮＨ2−Ｏ−（ＣＨ2）3−Ｏ−ＮＨ2）で、室温で終夜切断した。得られた、Ｃ末端アミノキシ基を含有するＶＮＡＲ（ＶＮＡＲアミノキシ）をＩＭＡＣまたはＳＥＣによって精製し、３モル当量のベンズアルデヒドＰＥＧ２  ｖｃ  ＰＡＢ  ＭＭＡＥまたはベンズアルデヒドＰＥＧ４  ＭＭＡＥと、最終１０ｍＭアニリン触媒を含む１０％アセトニトリル中で、室温で終夜反応させた。コンジュゲートをＩＭＡＣまたはＳＥＣによって精製し、滅菌濾過し、所望の物質の形成及び最終純度を、還元型及び非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析ならびに質量分光分析によって確認した（図２９）。
【０２８１】
ＶＮＡＲ−Ｓ−ｍａｌ−ｖｃＭＭＡＥの生成
固定化ＶＮＡＲインテイン融合タンパク質を、２ｍＭ  ＴＣＥＰを含む切断バッファーｐＨ６．９中の１００ｍＭシステアミンで、室温で終夜切断した。得られた、Ｃ末端チオール基を含有するＶＮＡＲ（ＶＮＡＲ  ＳＨ）をＩＭＡＣまたはＳＥＣによって精製し、４モル当量のＭＣ  ｖｃ  ＰＡＢ  ＭＭＡＥまたはｍａｌＡＦ４８８と反応させた。コンジュゲートをＩＭＡＣまたはＳＥＣによって精製し、滅菌濾過し、所望の物質の形成及び最終純度を、還元型及び非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析ならびに質量分光分析法によって確認した（図２９）。
【０２８２】
抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲ−ＭＭＡＥコンジュゲートの特徴付け−ＳＰＲによるＲＯＲ１及びＲＯＲ２への結合ならびにフローサイトメトリーによる細胞表面結合
ＳＰＲによるＲＯＲ１及びＲＯＲ２へのＶＮＡＲコンジュゲートの結合
ヒトＲＯＲ１  ＥＣＤに結合するＶＮＡＲ−ＭＭＡＥコンジュゲート及びＶＮＡＲ−フルオレセインコンジュゲートの能力をＳＰＲによって、上記の手順を使用して決定した。
【０２８３】
表１２に示されているとおり、Ｃ末端アミノキシＶＮＡＲへのベンズアルデヒドペイロードのオキシムライゲーションを介して；Ｃ末端チオールＶＮＡＲへのマレイミド官能化ペイロードのチオエーテルライゲーションを介して、かつＣ末端システインＶＮＡＲへのマレイミド官能化ペイロードのチオエーテルライゲーションを介して調製されたＶＮＡＲコンジュゲートはすべて、ヒトＲＯＲ１について高い親和性を維持するが、ヒトＲＯＲ２には結合しない。コンジュゲートを、酵素切断可能なリンカー（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）または切断不可能なリンカーを使用して調製し、これらは、ヒトＲＯＲ１への同様の結合を示した。
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【０２８４】
がん細胞系へのＶＮＡＲコンジュゲートの結合
がん細胞系へのＢ１及びＰ３Ａ１  ＭＭＡＥコンジュゲートの結合を、フローサイトメトリーによって上記の方法を使用して決定した。Ｂ１及びＰ３Ａ１コンジュゲートは、フローサイトメトリーによると固定濃度のタンパク質で、ＲＯＲ１高  Ａ５４９肺腺癌細胞への結合を維持し、かつＲＯＲ１低肺癌細胞系Ａ４２７に結合しない。
【０２８５】
ＶＮＡＲ  ｍＦｃ融合タンパク質コンジュゲート
Ｂ１  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ及び非結合２Ｖ  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ融合タンパク質を、抗体鎖間ジスルフィドの部分的還元及び標識付加（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ  １０４５  ｃｈａｐｔｅｒ  ９；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  ２００５の方法）からアレンジしたプロトコルを介して、ｍａｌ  ＡＦ４８８及びｍｃ  ｖｃ  ＰＡＢ  ＭＭＡＥで標識した。簡単に述べると、１ｍＭ  ＥＤＴＡが添加されたＰＢＳ＋１００ｍＭ  Ｌ−Ａｒｇ中１ｍｇ／ｍＬのＶＮＡＲ  ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃタンパク質を、２．７５モル当量の新鮮なＴＣＥＰで、３７℃で２時間、部分的に還元した。遊離タンパク質チオールに対して１．１モル当量のマレイミド標識を添加し、氷上で４５分間インキュベートし、Ｌ−システインを添加して反応を停止させた。反応物を透析して、未反応の標識／薬物を除去し、滅菌濾過し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した。典型的なＤＡＲはＢ１−ｍＦｃ−ＡＦ４８８では４．４、及び２Ｖ−ｍＦｃ−ＡＦ４８８では３．９である。
【０２８６】
ＶＮＡＲ  ｈＦｃ融合タンパク質薬物コンジュゲート
ＡＤＣを生成する別のアプローチは、抗体の軽鎖及び重鎖の位置にシステイン置換または付加を組み込むことであり、これらのシステインは、部位特異的標識のための反応性チオール基を提供する（Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ２００８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，９２５  −  ９３２，Ｊｅｆｆｒｅｙ  ２０１３，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ２０１６）。
【０２８７】
抗ＲＯＲ１  ＶＮＡＲを、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ配列にシステイン置換であるＳ２５２ＣまたはＳ４７３Ｃ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含む操作ｈＩｇＧ１  Ｆｃドメインに遺伝子融合させた。これは、蛍光ラベル（ＡＦ４８８）及び細胞傷害性薬物のマレイミド誘導体での部位特異的標識を可能にした（ＭＣ  ｖｃ  ＰＡＢ  ＭＭＡＥ、ＭＣ  ｖｃ  ＰＡＢ  ＮＨＣ6  α−アマニチン、ＭＡ  ＰＥＧ４  ｖａ  ＰＢＤ、ＭＡ  ＰＥＧ８  ｖａ  ＰＡＢ  ＳＧ３１９９、ＭＡ  ＰＥＧ４  ｖｃ  ＰＡＢ  ＤＭＡＥ  ＰＮＵ  １５９６８２）（図３２）。
【０２８８】
ＶＮＡＲ−ｈＦｃ−薬物コンジュゲートの生成
ＶＮＡＲ  Ｆｃ  Ｓ２５２Ｃを標識するための部分的還元、リフォールディング及び標識方法を文献（Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ，２００８  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１３  Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ）からアレンジした。簡単に述べると、１ｍｇ／ｍＬ  ＶＮＡＲ  ｈＦｃ溶液を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ＋１００ｍＭ  Ｌ−アルギニンｐＨ７．４中で調製した。２０モル当量のＴＣＥＰを添加し、４℃で最低４８時間にわたってインキュベートした。３０モル当量のＤＨＡＡを添加し、ｐＨを６．５に調節し、室温で１時間にわたってインキュベートした。リフォールディングされたＶＮＡＲ  Ｆｃ  Ｓ２５２Ｃを十分に透析するか、またはＰＢＳ＋５０ｍＭ  Ｌ−アルギニンにバッファー交換し、ＵＶによって定量化し、その後、４モル当量のマレイミド標識／薬物溶液と、室温で、標識／薬物に応じて１時間から終夜反応させた。コンジュゲートをそのまま透析／バッファー交換するか、またはさらにＳＥＣまたはＩＥＸによって精製し、その後に、透析／バッファー交換した。
【０２８９】
このアプローチを使用して、Ｂ１、Ｐ３Ａ１及び２Ｖ  Ｆｃ融合タンパク質のＭＭＡＥコンジュゲートを生成し、それによって、対応するｈＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｓ２５２Ｃ）誘導体を、酵素切断可能な（カテプシンＢ）リンカーを組み込まれたマレイミド官能化ＭＭＡＥペイロードで標識した。
【０２９０】
同様のアプローチを使用して、Ｂ１−ｈＦｃ−７Ｃ１２及びＰ３Ａ１−ｈＦｃ−７Ｃ１２融合タンパク質のＭＭＡＥコンジュゲートを生成した。
【０２９１】
最終コンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分光分析によって、標識付加が定量的に進行して、２の薬物抗体比（ＤＡＲ）を有する高度に純粋で均一なＶＮＡＲ−ｈＦｃ−ＭＭＡＥコンジュゲートが得られたことが決定された（図３１）。同様の手順を使用して、システイン操作ＶＮＡＲ−ｈＦｃ融合タンパク質のＰＢＤ二量体、α−アマニチン及びＰＮＵコンジュゲートを生成した（Ｌｅｖｅｎａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。それによって、ＶＮＡＲ（Ｂ１、Ｐ３Ａ１、２Ｖ）ｈＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｓ２５２Ｃ）融合体をＭＣ  ｖｃ  ＰＡＢ  ＮＨＣ6α−アマニチン、ＭＡ  ＰＥＧ４  ｖａ  ＰＢＤ、ＭＡ  ＰＥＧ８  ｖａ  ＰＡＢ  ＳＧ３１９９、ＭＡ  ＰＥＧ４  ｖｃ  ＰＡＢ  ＤＭＡＥ  ＰＮＵ  １５９６８２と反応させた（図３２）。
【０２９２】
ｈＲＯＲ１及びがん細胞系へのＶＮＡＲ−ｈＦｃ−ＭＭＡＥコンジュゲートの結合
ヒトＲＯＲ１  ＥＣＤに結合するＶＮＡＲ−ｈＦｃコンジュゲートの能力をＳＰＲによって、上記の手順を使用して決定した。
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【０２９３】
Ｂ１及びＰ３Ａ１  ＶＮＡＲ−ｈＩｇＧ  Ｆｃ（Ｓ２５２Ｃ）−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートは、ＲＯＲ１への高い親和性結合を示したが、ヒトＲＯＲ２には結合しない。２Ｖは、非結合ＶＮＡＲであり、対応する２Ｖ−ｈＦｃ薬物コンジュゲートは非結合対照として生成された。
【０２９４】
ＲＯＲ１高Ａ５４９肺腺癌細胞系及びＲＯＲ１低Ａ４２７肺癌細胞系へのＢ１及びＰ３Ａ１  ｈＦｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートの結合を、フローサイトメトリーによって、上記の方法を使用して決定した。
【０２９５】
図３０は、Ｂ１及びＰ３Ａ１  ｈＦｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートがＲＯＲ１高がん細胞には強固に結合するが、ＲＯＲ１低がん細胞には結合しないことを示している。他方で、２Ｖ−ｈＦｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートは、いずれの細胞系にも結合しない。
【０２９６】
抗ＥＧＦＲ−ＲＯＲ１  ＶＮＡＲ薬物コンジュゲートで処理されたがん細胞でのインビトロ細胞生存率
細胞を白色透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間にわたってインキュベートした。翌日、希釈系列を各試験作用物質について１０倍作業ストックで構成した。１０倍ストック溶液１０μＬを細胞プレートに（ウェルあたり９０μＬ）、マルチチャンネルピペットを使用して添加した。これは、ウェルへの１：１０希釈及び最高濃度１０００ｎＭ（カラム１）から０．０５ｎＭ（カラム１０）までの範囲の用量応答をもたらした。ビヒクル対照（ＰＢＳ）１０μＬを対照ウェル（カラム１１及び１２）に添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2で９６時間にわたってインキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏ試薬を製造者の指示に従って使用して、細胞生存率を評価した。簡単に述べると、アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温と平衡化し、その後、室温のＣｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏ試薬１００μＬを各１００μＬアッセイウェルに添加した。プレートをプレートシェーカー上に２分間にわたって６００ｒｐｍで置いた。プレートをさらに１０分間にわたって室温で静置させ、その後、Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ）を使用して、発光読み出しを測定した。データを、未処理（ビヒクルのみ）対照ウェルでの平均を計算し、各処理ウェルについて対照に対する％を決定することによって解析した。次いで、対照データの％をＬｏｇ［処理］濃度に対してプロットし、ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアでの非線形回帰フィッティングを使用して得た。
【０２９７】
図３３は、Ｂ１−ｍＦｃ−ｖｃＭＭＡＥ及び２Ｖ−ｍＦｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートによるＲＯＲ１陽性がん細胞系Ａ５４９（肺腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、ＤＵ１４５（前立腺癌）、Ｋａｓｕｍｉ−２（ＡＬＬ細胞）及びＪｅｋｏ１（ＭＣＬ細胞）の細胞殺滅についての用量反応曲線を、対応するＩＣ５０値と共に示している。Ｂ１−ｈＦｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートは、ＲＯＲ１陽性がん細胞の強力な細胞殺滅を示し、細胞系のそれぞれすべてで、対応する２Ｖ−ｍＦｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートよりも優れた効力を示す。
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【０２９８】
図３４は、Ａ）Ｂ１−ｈＦｃ−ＰＢＤ、Ｄ３−ｈＦｃ−ＰＢＤ及び２Ｖ−ｈＦｃ−ＰＢＤコンジュゲートによるＲＯＲ１陽性ＤＵ１４５前立腺癌細胞、ならびにＢ）Ｂ１−ｈＦｃ−ＰＢＤ、Ｐ３Ａ１−ｈＦｃ−ＰＢＤ、Ｄ３−ｈＦｃ−ＰＢＤ及び２Ｖ−ｈＦｃ−ＰＢＤコンジュゲートによるＲＯＲ１陽性Ｊｅｋｏ１  ＭＣＬ細胞の細胞殺滅についての用量反応曲線を、対応するＩＣ５０値と共に示している。Ｂ１−ｈＦｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートは、ＲＯＲ１陽性がん細胞の強力な細胞殺滅を示し、対応する２Ｖ−ｍＦｃ−ｖｃＭＭＡＥコンジュゲートよりも大幅に強力である。
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【０２９９】
ＲＯＲ１を標的とするＶＮＡＲ−ＰＢＤコンジュゲートは、両方のがん細胞系の強力な殺滅を示し、２Ｖ−ｈＦｃ−ＰＢＤコンジュゲートに対して効力の増大を示し、その際、Ｂ１−ｈＦｃコンジュゲートでのＩＣ５０値は、２Ｖ−ｈＦｃコンジュゲートよりも少なくとも４９倍低い。
【０３００】
図３５は、Ｂ１−ｈＦｃ−ＰＮＵ、２Ｖ−ｈＦｃ−ＰＮＵコンジュゲート（ＰＥＧ４−ｖｃ  ＰＡＢ  ＤＭＡＥ  ＰＮＵ  １５９６８２）、Ｐ３Ａ１−ｈＦｃ−ＰＢＤ、Ｄ３−ｈＦｃ−ＰＢＤ及び２Ｖ−ｈＦｃ−ＰＢＤコンジュゲートならびにＢ１−ｈＦｃ  ＳＧ３１９９  ＰＢＤ及び２Ｖ−ｈＦｃ  ＳＧ３１９９  ＰＢＤコンジュゲートによるＲＯＲ１陽性ＰＡ−１卵巣癌細胞（Ａ、Ｃ、Ｅ）及びＫａｓｕｍｉ−２Ｂ細胞前駆体白血病細胞（Ｂ、Ｄ、Ｆ）の細胞殺滅についての用量反応曲線を、対応するＩＣ５０値と共に示している。
【０３０１】
2021509014.tif 000018
【０３０２】
ＲＯＲ１を標的とするＶＮＡＲ−コンジュゲートは、ＰＡ−１及びＫａｓｕｍｉ−２がん細胞系の両方の強力な死滅を示し、かつ対応する２Ｖ−ｈＦｃコンジュゲートに対して効力の上昇を示し、その際、いくつかのＲＯＲ１を標的とするコンジュゲートでのＩＣ５０値は、対応する２Ｖ−ｈＦｃコンジュゲート対照よりも＞１００倍低い。
【０３０３】
実施例１０−ＲＯＲ１  ＶＮＡＲ二重特異体
ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲのための二重特異性標的の組み合わせは、例えば、
半減期延長のためのＨＳＡ、ＲＯＲ１及び血清アルブミンＲＴＫ、例えば、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ３の二重特異性結合、細胞表面上のＥＧＦＲ及びＲＯＲ１またはＨＥＲ３及びＲＯＲ１の両方を標的とする二重特異性標的化を含む。
【０３０４】
ＣＤ３  ＢｉＴＥアプローチ、ＲＯＲ１  ＶＮＡＲ二重特異体として使用するためのＣＤ３結合配列の例
抗ＣＤ３  ｓｃＦｖクローンＯＫＴ３（ＷＯ２０１４０２８７７６  Ｚｙｎｇｅｎｉａ）ならびに配向及びそのヒト化誘導体
ＶＨ−［Ｇ4Ｓ］3−ＶＬ
ＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＳ（配列番号９６）
ヒト化抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ＵＣＨＴ１（Ａｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ  ２００４  １０１（４６）１６２６８−１６２７３）及びその誘導体
ＶＬ−［Ｇ4Ｓ］3−ＶＨ
ＭＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＫＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＡＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＬＴＶＦＳ（配列番号９７）
【０３０５】
実施例１１−ＲＯＲ１  ＣＡＲ−Ｔアプローチ
本出願に記載のＲＯＲ１特異性抗原結合分子をベースとするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生成することができる。さらに、そのようなＣＡＲを発現する操作Ｔ細胞も生成することができ、これを次いで、例えば、養子細胞療法で使用することができる。
【０３０６】
簡単に述べると、ＲＯＲ１特異性ＣＡＲをコードする核酸構築物を生成することができる。ＲＯＲ１特異性ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び本明細書に記載のＲＯＲ１特異性抗原結合分子を含む細胞外ドメインを含んでよい。次いで、この核酸構築物を、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）などのウイルスベクターに組み込むことができる。
【０３０７】
Ｔ細胞は、処置を必要とする患者から単離することができ、それを次いで、例えば、レトロウイルストランスフェクションまたはＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ−９などのアプローチを使用する遺伝子編集によって、ＣＡＲをコードする核酸構築物を発現するように修飾することができる。
【０３０８】
次いで、操作Ｔ細胞を、がんの処置など、状態を処置するために、患者に再注入することができる。
【０３０９】
実施例１２−ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ二重特異性分子の特徴付け
ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗原結合分子の構築
ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗原結合分子を、ＥＧＦＲナノボディー結合因子である７Ｃ１２または９Ｇ８を使用して構築した。７Ｃ１２はＥＧＦ結合をブロックし、高いＥＧＦＲ親和性（低いｎＭ）を示し、かつ関連する７Ｄ１２（５ａａの配列の相違）よりも高いオフ速度を有するので、７Ｃ１２を選択した。やや異なるＥＧＦＲエピトープに結合し、かつやや異なる機構を介してＥＧＦＲ阻害を誘発する９Ｇ８も選択した。
【０３１０】
［Ｇ4Ｓ］5リンカー配列を使用して、ＥＧＦＲナノボディをＲＯＲ１特異性ＶＮＡＲのＢ１、Ｄ３及びＤ３Ｄ３、Ｐ３Ａ１に融合した。Ｈｉｓ６Ｍｙｃタグが精製及び検出のために含まれた。
【０３１１】
チオール反応性ペイロード及び標識とのコンジュゲーションを容易にするために、ＶＮＡＲとＨｉｓ６Ｍｙｃタグとの間にＱＡＣＧＡ（配列番号７９）の短い配列、または別法では  ナノボディとＨｉｓ６Ｍｙｃタグとの間に配列−ＡＣＡ−（配列番号８１）を含有する融合体も生成した。
【０３１２】
加えて、ＲＯＲ１特異性抗原結合分子、ＥＧＦＲ特異性ナノボディ及びヒトＦｃ領域を含む融合タンパク質を構築した。
【０３１３】
ＲＯＲ１及びＥＧＦＲ受容体数の決定
いくつかのヒトがん細胞系について、ＰＥ−コンジュゲートＲＯＲ１（２Ａ２）ｍＡｂ及びＰＥ−コンジュゲートＥＧＦＲ（ＡＹ１３）ｍＡｂ（両方ともＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＲＯＲ１及びＥＧＦＲ細胞受容体数を決定した。簡単に述べると、５×１０5細胞を５μｇ／ｍＬのＰＥ−コンジュゲートＲＯＲ１  ２Ａ２ｍＡｂと共に、または５μｇ／ｍＬのＰＥ−コンジュゲートＥＧＦＲ（ＡＹ１３）ｍＡｂと共に、１時間にわたって氷上で、暗所でインキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ５ｍＬに再懸濁させ、かつ１５００ｒｐｍで５分間にわたって４℃で遠心することによって２回洗浄した。Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、製造者の指示に従って使用した。分析をＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で行った。受容体数（平均ｎ＝２）が表１７に示されている。
【０３１４】
細胞パネルの特徴付け
細胞表面結合
０．１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液と共に３７℃で約１０分間にわたって、または細胞が容易に外れるまでインキュベートすることによって、接着したヒトがん細胞を組織培養フラスコから取り外した。細胞を１５ｍＬ管内で氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ５ｍＬ中で再懸濁させ、１５００ｒｐｍで、５分間にわたって４℃で遠心した。上清を除去し、細胞ペレットをＰＢＳ／２％ＦＣＳ１〜２ｍＬ中で再懸濁させた。細胞の計数を、Ｚ１  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して行い、試験試料あたり５×１０5細胞を分取した。懸濁細胞を同様に処理したが、最初の剥離ステップは必要なかった。細胞をＶＮＡＲ（Ｈｉｓ6Ｍｙｃタグ付き）、ＶＮＡＲ−Ｆｃ分子またはＲＯＲ１  ｍＡｂ、ＥＧＦＲ  ｍＡｂ及びＩｇＧ対照のいずれか１００μＬと共に１時間にわたって氷上でインキュベートした。過剰のＶＮＡＲ、ＶＮＡＲ−ＦｃまたはｍＡｂを、氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ５ｍＬを添加することによって除去し、続いて、１５００ｒｐｍで５分間にわたって４℃で遠心した。上清を除去し、第２の洗浄を、細胞ペレットを氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ１ｍＬ中に再懸濁させ、かつさらなる氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ４ｍＬを添加することによって行った。試料を再び、１５００ｒｐｍで５分間にわたって４℃で遠心した。上清を除去し、過剰の液体を、管をティッシュペーパーに当てることによって除去した。適切な二次抗体を使用して、結合したＶＮＡＲ（Ｈｉｓ6Ｍｙｃ）、ＶＮＡＲ−ｈＦｃ、またはＲＯＲ  ｍＡｂ（ＰＥ−抗Ｍｙｃタグ抗体（ＣＳＴ）、ＰＥ−抗ヒト抗体（ＪＩＲ  ｌａｂｓ／Ｓｔｒａｔｅｃｈ）、及びＰＥ−抗マウス抗体（ＪＩＲ／Ｓｔｒａｔｅｃｈ）を検出した。細胞を、選択された二次抗体と共に３０分間にわたって氷上でインキュベートした。細胞を洗浄して、前に記載されたとおりに過剰の抗体を除去した。細胞ペレットを氷冷ＰＢＳ／２％ＦＣＳ０．５ｍＬに再懸濁させ、氷上にて暗所で放置して、その後、Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）フローサイトメーターで分析した。
【０３１５】
二重特異性分子をスクリーニングするために、様々なレベルのＲＯＲ１−ＥＧＦＲを発現する５種の細胞系からなるパネルを選択した。これらの細胞系を表１７に示す。
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【０３１６】
Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２二重特異性分子の細胞表面結合を、前に記載されたとおり、Ａ５４９、ＰＡ−１、Ａ４２７、Ｋａｓｕｍｉ−２及びＭｖ４−１１細胞においてフローサイトメトリーを４℃で使用して調査した。Ａ５４９及びＰＡ−１細胞系において、Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２二重特異性分子とその親シングルドメイン分子Ｂ１ｈＦｃ及びｈＦｃ７Ｃ１２との間で、シグナルの上昇が観察された（図３６Ａ及び３６Ｂ）。ＲＯＲ１が低いＥＧＦＲ陽性細胞系Ａ４２７においても、シグナルの上昇が観察された。受容体陰性Ｍｖ４−１１細胞への結合は観察されなかった。
【０３１７】
Ｐ３Ａ１ｈＦｃ７Ｃ１２二重特異性分子の結合をＡ５４９、ＰＡ−１、Ａ４２７及びＫａｓｕｍｉ−２細胞において、再びフローサイトメトリーを４℃で使用して調査した。Ａ５４９細胞系において、Ｐ３Ａ１ｈＦｃ７Ｃ１２二重特異性分子とその親シングルドメイン分子Ｐ３Ａ１ｈＦｃ及びｈＦｃ７Ｃ１２との間で、シグナルの上昇が観察される（図３６Ｃ）。
【０３１８】
Ｆｃ部分を含まないＲＯＲ１及びＥＧＦＲ二重特異性結合作用物質も、２種の異なる配向、すなわちＲＯＲ１−ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ−ＲＯＲ１において、細胞−表面結合について評価した（図３７Ａ、３７Ｂ及び３７Ｃ）。
図３７Ａは、Ａ５４９細胞（高ＲＯＲ１、高ＥＧＦＲ）への細胞表面結合を示している。個々のＲＯＲ１及びＥＧＦＲ結合ドメインに対するＲＯＲ１−ＥＧＦＲ二重特異性結合作用物質での結合の上昇が明らかに、ある特定の構築物について観察される。
図３７Ｂは、ＰＡ−１細胞（高ＲＯＲ１、中／低ＥＧＦＲへの細胞表面結合を示している。この場合も、個々のＲＯＲ１及びＥＧＦＲ結合ドメインに対するＲＯＲ１−ＥＧＦＲ二重特異性結合作用物質での結合の上昇が明らかに観察される。
【０３１９】
しかしながら、図３７Ｃに示されているとおり、Ａ４２７細胞（低ＲＯＲ１、低ＥＧＦＲ）では、ＲＯＲ１−ＥＧＦＲ二重特異性結合作用物質の結合の上昇は観察されず、これは、ＲＯＲ１＋ＥＧＦＲ＋細胞の表面上のＲＯＲ１及びＥＧＦＲの両方を標的とする二重特異性作用物質と一致する。
【０３２０】
意外にも、Ａ５４９細胞及びＰＡ１細胞への結合の上昇は、ＲＯＲ１結合作用物質に対するＥＧＦＲ結合ドメイン（９Ｇ８または７Ｃ１２）の配向に依存する。ＥＧＦＲ結合作用物質がＣ−ＲＯＲ１結合作用物質に対してＣ末端に融合している場合、同じ構築物であるが、ＥＧＦＲ結合作用物質がＲＯＲ１結合作用物質に対してＮ末端に融合している構築物と比較すると、細胞−表面結合が損なわれる。したがって、構築物内でのドメインの配向を変化させることで、細胞表面への二重特異性作用物質の見掛けの親和性を変化させるための方法が得られる。
【０３２１】
同様の観察が、Ｆｃ融合タンパク質の状況で観察された（図３８）。ＥＧＦＲ結合作用物質７Ｃ１２がＦｃ断片のＣ末端に融合している場合（ｈＦｃ  ７Ｃ１２）、ＥＧＦＲ＋ｖｅ細胞系Ａ５４９、ＰＡ−１及びＡ４２７への結合は、対応するＮ末端融合体（７Ｃ１２  ｈＦｃ）と比較して一貫して低い。これによって、ＲＯＲ１−ＥＧＦＲ二重特異性結合作用物質の細胞−表面結合特徴を、対応するＦｃ融合タンパク質の適切な設計によって調節することができる。
【０３２２】
内在化実験
ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗原結合分子の内在化を、Ａ５４９細胞において免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡法を使用して調査した。
【０３２３】
黒色透明底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、細胞付着を補助するために１００μｇ／ｍＬのコラーゲンＩ（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした。細胞を完全成長培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、コーティングされた９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ2、３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。翌日、培地を除去し、血清非含有培地（Ｇｉｂｃｏ）に取り換え、終夜放置した。翌朝、培地を除去し、細胞をＶＮＡＲ−Ｆｃ分子で処理した。プレートを氷上で３０分間にわたってインキュベートした。処理物を除去し、ウェルあたりＰＢＳ／２％ＦＣＳ１００μＬに取り換えた。１つのプレートを氷上に保持し、他のプレートは３７℃、５％ＣＯ2に、２時間にわたって置いた。この２時間のインキュベーションの後に、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ溶液を除去し、細胞を氷冷ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで、２０分間にわたって氷上で固定化した。ＰＦＡ溶液を除去し、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で作製した０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ）に、１５分間にわたって室温で取り換えた。このステップで、細胞膜は透過処理される。二次抗体染色を、ＡＦ４８８−抗ヒトＡｂ（１：２５０；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して行って、ＶＮＡＲ−ｈＦｃ融合タンパク質を検出した。すべての二次抗体作業ストックを、０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ／ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で作製した。プレートを４℃で終夜、暗所でインキュベートした。翌日、二次ＡＦ４８８−コンジュゲート抗体を除去し、細胞を０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ／ＰＢＳ／２％ＦＣＳを使用して３回洗浄した。Ｌａｍｐ−１抗体（１：２００；ＣＳＴ）またはＥＥＡ１抗体（１：５０；ＣＳＴ）を添加して、それぞれリソソーム及び初期エンドソーム区画を検出した。プレートを暗所にて室温で２時間にわたってインキュベートした。次いで、Ｌａｍｐ−１及びＥＥＡ１抗体を除去し、細胞を０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ／ＰＢＳ／２％ＦＣＳで３回洗浄した。次いで、ＡＦ６４７−抗ウサギ抗体（１：１０００；ＣＳＴ）を添加して、Ｌａｍｐ１及びＥＥＡ１抗体結合を検出した。暗所にて室温での２時間にわたるさらなるインキュベーションを行い、その後、ＡＦ６４７−二次抗体を除去し、細胞を０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ／ＰＢＳ／２％ＦＣＳで３回洗浄した。細胞核を、０．０５％Ｓａｐｏｎｉｎ／ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１０μＭ  Ｈｏｅｃｈｓｔ試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用して２０分間にわたって、室温にて暗所で染色した。最後に、この溶液を除去し、ＰＢＳに取り換えた。プレートを４℃にて暗所で貯蔵し、その後、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＩｎＣｅｌｌ  ２０００機器を使用して撮像した。
【０３２４】
図３９に示されているとおり、Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２は、３７℃での２時間後に、Ａ５４９細胞によって明らかに、かつ著しく内在化される。対照的に、親分子Ｂ１ｈＦｃ及びｈＦｃ７Ｃ１２は、より低いレベルの内在化を、ｈＦｃ７Ｃ１２では、わずかな細胞においてのみ示した。
【０３２５】
同様に、Ｐ３Ａ１ｈＦｃ７Ｃ１２は、３７℃での２時間後に、Ａ５４９細胞によって内在化される（図４０）。親分子ｈＦｃ７Ｃ１２は、低レベルの内在化をわずかな細胞においてのみ示す。
【０３２６】
加えて、Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２は、Ａ５４９細胞において初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）及びリソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）と共局在することが示された（図４１）。
【０３２７】
非Ｆｃ  ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗原結合分子の内在化を、前に記載されたとおりにフローサイトメトリーを使用して調査した（図４２Ａ及び４２Ｂ）。ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗原結合分子での蛍光シグナルは、４℃に対して、３７℃でのインキュベーション後に有意に低く、これは、標的結合の際の二重特異性タンパク質の内在化を示している。
【０３２８】
表面受容体下方制御
Ａ５４９細胞におけるＲＯＲ１及びＥＧＦＲの発現を、Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２での処理後に、２４時間にわたってモニターした。図４３Ａに示されているとおり、Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２は、ＲＯＲ１を一時的に下方制御する。Ｂ１ｈＦｃ７Ｃ１２は、より長時間の作用でＥＧＦＲも下方制御する：ＥＧＦＲレベルは、２４時間後にもなお、未処理レベルには戻らない（図４３Ｂ）。
【０３２９】
Ｐ３Ａ１ｈＦｃ７Ｃ１２及びＤ３Ｄ３ｈＦｃ７Ｃ１２によるＲＯＲ１及びＥＧＦＲの下方制御が観察される一方で、これらの二重特異性構築物によるＥＧＦＲの下方制御は、あまり明白ではない（図４４〜４５）。
【０３３０】
ＲＯＲ１及びＥＧＦＲタンパク質への結合
ＲＯＲ１及びＥＧＦＲ標的の両方と同時に結合するＲＯＲ１×ＥＧＦＲ二重特異性抗原結合分子の能力をＢＬＩによって確認した（図４６）。ｈＲＯＲ１をセンサー上に固定化し、二重特異性構築物または構成成分の単一特異性結合因子をそのセンサーの上に流して、ＲＯＲ１結合を確認した。次いで直ちに、ＥＧＦＲを、センサー上に通過させ、次いで、ＥＧＦＲへのＲＯＲ１固定化された二重特異性結合因子の結合を、シグナルの第２の上昇によって評価した。
【０３３１】
種々の二重特異性構築物の選択物の代表例が図４６に示されている。単一特異性ＲＯＲ１結合ＶＮＡＲ  Ｂ１は、ＥＧＦＲ結合部分を含有しないので、ＥＧＦＲがセンサーの表面上に流される場合に、シグナルの追加の上昇は観察されない。
【０３３２】
ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ  Ｆｃ融合分子による細胞殺滅
ＲＯＲ１×ＥＧＦＲ  Ｆｃ融合分子の効力をいくつかの細胞系において調査した。結果を表１８にまとめる。Ｂ１ｈＦｃ−７Ｃ１２−ＭＭＡＥ及びＰ３Ａ１ｈＦｃ−７Ｃ１２−ＭＭＡＥ分子の両方が、ｈＦｃ７Ｃ１２−ＭＭＡＥ単独よりも効力があることが示された。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【図３９】
2021509014.tif 000068
【図４０】
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【図４１】
2021509014.tif 000070
【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
2021509014.tif 000074
【図４６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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