(57)【要約】  各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む複製欠損バキュロウイルスゲノムと、各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子のうち１つを各々含むｎ個のトランスファーベクターの間の相同組換えによって、昆虫細胞において、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを調製する方法であって、ｎが少なくとも２に等しい整数である方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えバキュロウイルスを製造する方法であって、前記組換えバキュロウイルスのゲノムが、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含み、前記方法が、
ａ）ａ１）ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性であり、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む複製欠損バキュロウイルスゲノム、および
ａ２）ｉ）ｎ個のウイルス複製に必須の非機能性遺伝子のうち１つの機能を回復することを可能にするヌクレオチド配列、
ｉｉ）対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子のうち１つ
を各々含むｎ個のトランスファーベクター
の間の相同組換えによって、昆虫細胞において、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含む複製可能な組換えバキュロウイルスゲノムを調製する工程であって、
ｎ個のトランスファーベクターのヌクレオチド配列ｉ）のセットが、複製欠損バキュロウイルスゲノムの複製を回復可能であり、
ｎが、少なくとも２に等しい整数である、工程と、
ｂ）工程ａ）で得られた組換えバキュロウイルスゲノムを含む昆虫細胞において組換えバキュロウイルスを生成する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
−  ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性である複製欠損バキュロウイルスゲノム、および
−  各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を各々含む１つまたは複数のヌクレオチド配列
間の相同組換えによって、細菌細胞において、工程ａ１）の複製欠損バキュロウイルスゲノムが調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルス複製に必須の遺伝子が、１６２９（ＯＲＦ９）、Ｐｋ１（ＯＲＦ１０）、ｌｅｆ−１（ＯＲＦ１４）、ＯＲＦ３４、ｌｅｆ−１１（ＯＲＦ３７）、ｐ４７（ＯＲＦ４０）、ｌｅｆ８（ＯＲＦ５０）、ＤＮＡＪドメイン（ＯＲＦ５１）、ＯＲＦ５３、ｖｐ１０５４（ＯＲＦ５４）、Ｌｅｆ−９（ＯＲＦ６２）、ＤＮＡ Ｐｏｌ（ＯＲＦ６５）、ｌｅｆ−３（ＯＲＦ６７）、ＯＲＦ７３、ＯＲＦ７５、ＯＲＦ８１、ｐ９５（ＯＲＦ８３）、ｖｐ３９（ＯＲＦ８９）、ｌｅｆ−４（ＯＲＦ９０）、ｐ３３（ＯＲＦ９２）、ヘリカーゼ（ＯＲＦ９５）、ｖｐ８０（ＯＲＦ１０４）、ＯＲＦ１０６−１０７、ｏｄｖ−ｅｃ４３（ＯＲＦ１０９）、ｇｐ６４／６７（ＯＲＦ１２８）、ＯＲＦ１３２、ＯＲＦ１３３、ｏｄｖ−ｅｃ２７（ＯＲＦ１４４）、ＯＲＦ１４６、ｉｅ１（ＯＲＦ１４７）、ｌｅｆ−２（ＯＲＦ６）から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子が、各々、ウイルス複製に必須ではない遺伝子と隣接している、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ウイルス複製に必須ではない遺伝子が、Ｐｈ（ＯＲＦ８）、ＯＲＦ１１、ＯＲＦ１３、ｅｇｔ（ＯＲＦ１５）、ｖ−ユビキチン（ＯＲＦ３５）、３９Ｋ（ＯＲＦ３６）、ＯＲＦ３８、ｐ４３（ＯＲＦ３９）、ｌｅｆ−１２（ＯＲＦ４１）、ｐｃｎａ（ＯＲＦ４９）、ＯＲＦ５２、ＯＲＦ５５、Ｆｐ（ＯＲＦ６１）、ＯＲＦ６３、ｇｐ３７（ＯＲＦ６４）、ＯＲＦ６８、ＯＲＦ７２、ＯＲＦ７４、ＯＲＦ８２、ｃｇ３０（ＯＲＦ８８）、ＯＲＦ９１、ｐｉｆ−４（ＯＲＦ９６）、ｈｅ６５（ＯＲＦ１０５）、ＯＲＦ１０８、ＯＲＦ１１０、カテプシン（ＯＲＦ１２７）、ｐ２４（ＯＲＦ１２９）、ｐｐ３４（ＯＲＦ１３１）、ＯＲＦ１３４、ＯＲＦ１４５、ｏｄｖ−ｅ５６（ＯＲＦ１４８）、ＯＲＦ５から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子が各々、ウイルス複製に必須の非機能性遺伝子と隣接しているウイルス複製に必須ではない遺伝子の遺伝子座で組換えされる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
タンパク質成熟酵素が、シグナルペプチダーゼ、フューリン、プロタンパク質転換酵素、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、シャペロンタンパク質、イソメラーゼジスルフィド、アシルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、トランスグルタミナーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニル−トランスフェラーゼ、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ、パルミチルトランスフェラーゼ、タンパク質、ホスファターゼ、トランスペプチダーゼ、カルボキシラーゼ、ユビキチンリガーゼから選択される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
タンパク質成熟酵素をコードする導入遺伝子が各々、ウイルス複製に必須ではない遺伝子の遺伝子座で、好ましくは、ウイルス複製に必須の非機能性遺伝子に対して隣接していない、ウイルス複製に必須ではない遺伝子の遺伝子座で組換えされる、請求項２から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ウイルス複製に必須ではない遺伝子が、ｐｔｐ（ＯＲＦ１）、ｃｔｘ（ＯＲＦ３）、ＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ｏｄｖ−ｅ２６（ＯＲＦ１６）、ＯＲＦ１７、ＯＲＦ１８、ＯＲＦ１９、ＡＲＩＦ−１  ＯＲＦ２０−２１、ｐｉｆ２（ＯＲＦ２２）、タンパク質Ｆ（ＯＲＦ２３）、ｉａｐ１（ＯＲＦ２７）、ｌｅｆ６（ＯＲＦ２８）、ＯＲＦ２９、ＯＲＦ３０、ｓｏｄ（ＯＲＦ３１）、ｆｇｆ（ＯＲＦ３２）、ｇｔａ（ＯＲＦ４２）、ＯＲＦ４３、ＯＲＦ４４、ＯＲＦ４５、ｏｄｖ−ｅ６６（ＯＲＦ４６）、ＯＲＦ４７、ＯＲＦ５６、ＯＲＦ５７、ｃｈａＢ様（ＯＲＦ５８／５９）、ｃｈａＢ様（ＯＲＦ６０）、ｍｔａｓｅ（ＯＲＦ６９）、ｈｃｆ−１（ＯＲＦ７０）、ｉａｐ２（ＯＲＦ７１）、ＯＲＦ８６、ＯＲＦ８７、ＯＲＦ１１１、ＯＲＦ１１４、ｐｉｆ３（ＯＲＦ１１５）、ＯＲＦ１１６、ＯＲＦ１１７、ｐｉｆ（ＯＲＦ１１９）、ＯＲＦ１２０、ＯＲＦ１２１、ＯＲＦ１２２、ｐｋ２（ＯＲＦ１２３）、ＯＲＦ１２４、ｌｅｆ７（ＯＲＦ１２５）、キチナーゼ（ＯＲＦ１２６）、ｇｐ１６（ＯＲＦ１３０）、ｐ３５（ＯＲＦ１３５）、ｐ２６（ＯＲＦ１３６）、ｐ１０（ＯＲＦ１３７）、ｐ７４（ＯＲＦ１３８）、ＯＲＦ１４９、ＯＲＦ１５０、ｉｅ２（ＯＲＦ１５１）、ｐｅ３８（ＯＲＦ１５３）およびＯＲＦ１５４から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
昆虫細胞が、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５−ｂ１４、バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶに対して感受性の鱗翅目細胞株、株Ｓｆ２１、好ましくは、Ｓｆ９から選択される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
細菌細胞が、ＤＨ１０ＢおよびＥＬ３５０から選択される大腸菌である、請求項２から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
複製欠損バキュロウイルスゲノムが、ＢｍＮＰＶ、ＡｃＭＮＰＶ、ＡｐＮＰＶ、ＢｓＳＮＰＶ、ＣｆＭＮＰＶ、ＥｏＳＮＰＶ、ＨａＮＰＶ、ＨｚＮＰＶ、ＬｄＭＮＰＶ、ＭｂＭＮＰＶ、ＯｐＭＮＰＶ、ＳｌＭＮＰＶ、ＳｅＭＮＰＶまたはＴｅＮＰＶ、好ましくは、ＡｃＭＮＰＶのゲノムから選択される、またはそれらに由来するバキュロウイルスゲノムから得られる、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ｎが、２〜３１の範囲の、例えば、２〜１０の範囲の整数であり、好ましくは、ｎが、３以上である、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の製造方法によって得ることが可能な組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノムであって、
ａ）各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子と、
ｂ）式（Ｉ）：
［対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子］−［スペーサーヌクレオチド配列］−［機能性ウイルス複製に必須の遺伝子］（Ｉ）
のｎ個のヌクレオチド配列であって、
前記スペーサー核酸配列が、０〜６００ｐｂから構成され、
前記の機能性ウイルス複製に必須の遺伝子が、１６２９（ＯＲＦ９）、Ｐｋ１（ＯＲＦ１０）、ｌｅｆ−１（ＯＲＦ１４）、ＯＲＦ３４、ｌｅｆ−１１（ＯＲＦ３７）、ｐ４７（ＯＲＦ４０）、ｌｅｆ８（ＯＲＦ５０）、ＤＮＡＪドメイン（ＯＲＦ５１）、ＯＲＦ５３、ｖｐ１０５４（ＯＲＦ５４）、Ｌｅｆ−９（ＯＲＦ６２）、ＤＮＡ  Ｐｏｌ（ＯＲＦ６５）、ｌｅｆ−３（ＯＲＦ６７）、ＯＲＦ７３、ＯＲＦ７５、ＯＲＦ８１、ｐ９５（ＯＲＦ８３）、ｖｐ３９（ＯＲＦ８９）、ｌｅｆ−４（ＯＲＦ９０）、ｐ３３（ＯＲＦ９２）、ヘリカーゼ（ＯＲＦ９５）、Ｖｐ８０（ＯＲＦ１０４）、ＯＲＦ１０６−１０７、ｏｄｖ−ｅｃ４３（ＯＲＦ１０９）、ｇｐ６４／６７（ＯＲＦ１２８）、ＯＲＦ１３２、ＯＲＦ１３３、ｏｄｖ−ｅｃ２７（ＯＲＦ１４４）、ＯＲＦ１４６、ｉｅ１（ＯＲＦ１４７）、ｌｅｆ−２（ＯＲＦ６）から選択され、
ｎが、少なくとも２に等しい整数である、ｎ個のヌクレオチド配列と
を含む、組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノム。
【請求項１５】
Ｐｈ（ＯＲＦ８）、ＯＲＦ１１、ＯＲＦ１３、ｅｇｔ（ＯＲＦ１５）、ｖ−ユビキチン（ＯＲＦ３５）、３９Ｋ（ＯＲＦ３６）、ＯＲＦ３８、ｐ４３（ＯＲＦ３９）、ｌｅｆ−１２（ＯＲＦ４１）、ｐｃｎａ（ＯＲＦ４９）、ＯＲＦ５２、ＯＲＦ５５、Ｆｐ（ＯＲＦ６１）、ＯＲＦ６３、ｇｐ３７（ＯＲＦ６４）、ＯＲＦ６８、ＯＲＦ７２、ＯＲＦ７４、ＯＲＦ８２、ｃｇ３０（ＯＲＦ８８）、ＯＲＦ９１、ｐｉｆ−４（ＯＲＦ９６）、ｈｅ６５（ＯＲＦ１０５）、ＯＲＦ１０８、ＯＲＦ１１０、カテプシン（ＯＲＦ１２７）、ｐ２４（ＯＲＦ１２９）、ｐｐ３４（ＯＲＦ１３１）、ＯＲＦ１３４、ＯＲＦ１４５、ｏｄｖ−ｅ５６（ＯＲＦ１４８）、ＯＲＦ５から選択されるウイルス複製に必須ではないｎ個の遺伝子を含まない、請求項１４に記載の組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノム。
【請求項１６】
ａ）ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性であり、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む複製欠損バキュロウイルスゲノムと、
ｂ）ｉ）ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子のうち１つの機能を回復させることを可能にする核酸配列と、
ｉｉ）対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子と
を各々含むｎ個のトランスファーベクターとを含み、
ｎが少なくとも２に等しい整数である、相同組換えエレメントのセット。
【請求項１７】
請求項１４または１５に記載の組換えバキュロウイルスもしくは組換えバキュロウイルスゲノムまたは請求項１６に記載の相同組換えエレメントのセットを含む細胞。
【請求項１８】
ｎ個の対象のポリペプチドの製造のための、請求項１４または１５に記載の組換えバキュロウイルスもしくは組換えバキュロウイルスゲノムまたは請求項１７に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えバキュロウイルスを製造する方法であって、組換えバキュロウイルスのゲノムが、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々対象のポリペプチドをコードする少なくとも２つの導入遺伝子を含む方法、本方法によって得られるバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノム、相同組換えエレメントのセット、組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノムを含む細胞ならびに対象のポリペプチドの製造のためのバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノムの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バキュロウイルスは、節足動物に特異的な桿状ウイルスのファミリーであり、４９種を包含する４つの属（アルファバキュロウイルス（Ａｌｐｈａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、ベータバキュロウイルス（Ｂｅｔａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、デルタバキュロウイルス（Ｄｅｌｔａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、ガンマバキュロウイルス（Ｇａｍｍａｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ））を含む。バキュロウイルスは、哺乳動物またはその他の脊椎動物の細胞では複製可能ではない。
【０００３】
バキュロウイルスゲノムは、８０から１８０ｋｐｂの間の大きさの環状の二本鎖ＤＮＡ分子から構成される。バキュロウイルスゲノムは、３９ｋＤａのカプシドタンパク質を含有するらせん形対称性のヌクレオカプシド内で６０５ｋＤａの高度に塩基性のタンパク質と会合している。ゲノムの大きさは、ヌクレオカプシドの長さを決定する。次いで、ヌクレオカプシドは、リポタンパク質エンベロープ中に封入されて、ウイルス粒子またはビリオンを形成する。これらの構造は、本質的におよそ３０ｋＤａの単一タンパク質（ポリヘドリン）から構成される結晶性または多角体マトリックスで覆われている場合がある。多角体は、さらなる保護を付与する外側の多糖エンベロープを有する、大きさが直径１〜１５μｍで変わる大きな構造である。
【０００４】
ゲノムが遺伝子修飾されているバキュロウイルスは、組換えタンパク質（すなわち、組換えバキュロウイルス）の製造のためにバイオテクノロジーにおいて使用される。これらの組換えバキュロウイルスは、昆虫細胞における侵入後、昆虫細胞の機構を用いて組換えタンパク質を製造しようとする。
【０００５】
組換えバキュロウイルスは、親バキュロウイルスのゲノム中に、その他の種に（例えば、ヒト、その他の脊椎動物、細菌およびウイルスに）由来する１つまたは複数の遺伝子を挿入することによって得られる。これらの遺伝子は、組換えバキュロウイルスゲノムを作製するためにウイルス性または細胞性プロモーター（例えば、ポリヘドリン遺伝子のプロモーター）の制御下に配置される。プロモーターは、外来遺伝子のメッセンジャーＲＮＡへの転写を可能にし、これは、次いで、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞においてタンパク質に翻訳される。この系を使用する利点は、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞における組換えタンパク質の産生レベルは、極めて重要であり得るということである。組換えタンパク質は、次いで、タンパク質が細胞内にある場合には感染細胞から精製されてもよく、または代わりに、タンパク質が分泌される場合には、培養培地から精製されてもよい。バキュロウイルス発現系は、工業において、研究所において広く使用されている。バキュロウイルス発現系の重要な生産性に加えて、この系は、生物学的に活性な組換えタンパク質を製造することを可能にするので高く評価されている。実際、昆虫細胞は、全般的に、適当な翻訳後修飾を得ることを可能にする。
【０００６】
しかし、特定のタンパク質は、昆虫細胞が実施可能ではない翻訳後修飾を必要とする。これらの翻訳後修飾は、普通、特定のタンパク質の成熟酵素によって実施される。
【０００７】
例えば、ヒト糖タンパク質の大部分は、いわゆる複雑なグリコシル化を有し、それらは、一般に、シアリル化される（図１２Ａ）。シアリル化は、特定のタンパク質の構造の安定化において重要な要素であり、これは、より可溶性にし、熱に対してより耐性にし、プロテアーゼに対してより耐性にする。タンパク質のシアリル化レベルは、血清におけるその半減期に直接的に影響を及ぼすことがあり、脱シアリル化タンパク質は、アシアロタンパク質に対する受容体によって迅速に捕獲される。この半減期モデルの例外、抗体がある。実際、抗体の半減期は、受容体ＦｃＲｎと呼ばれるドメインＦｃの受容体（ＦｃＲ）（「結晶化可能断片」：抗体の特定の定常領域に対するＦｃ（図１３））とのその相互作用によって本質的に制御される。しかし、グリコシル化、特に、Ａｓｎ２９７上のＩｇＧの定常領域のＣＨ２ドメイン中に存在するＮ−グリコシル化は、抗体の活性の制御において極めて重要な役割を有する（図１３）。実際、このＮ−グリコシル化の性質が、抗体のエフェクター活性と呼ばれるもの、例えば、抗体によって標的とされる腫瘍細胞を死滅させることを可能にしようとする活性の調節を可能にする。とりわけ、（ｉ）グリカンのコアからα１，６フコースが排除される場合には、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性）が極めて有意に増大されることおよび（ｉｉ）ＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）は、ガラクトースの存在に左右されることが実証された。最後に、機械的作用が依然として極めて議論の余地があるとしても、このグリカンモチーフのシアリル化は、抗体の炎症促進性活性の遮断にとって重要であり得る。
【０００８】
したがって、例えば、腫瘍を特異的に破壊するために、高度に細胞傷害性の抗体、高いＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を誘導可能な抗体を製造することが望まれる場合、理想は、ガラクトシル化抗体を製造することである。他方、リガンド、例えば、アポトーシスを誘導する、または代わりに、組織を特異的にマークすることによってイメージングを実施するための細胞受容体のリガンドとして単純に使用される抗体は、細胞の細胞毒性を誘導可能ではない抗体を使用することが望ましく、この場合には、シアリル化抗体は、最も適するものとなる。
【０００９】
昆虫細胞のＮ−グリコシル化能に関する多数の研究は、グリカンの付加が特異的である、つまり、組織によって発現された元のタンパク質で天然にグリコシル化されるものと同一のアスパラギン残基で常に実施される場合には（例えば、抗体のＡｓｎ２９７）、グリカンの構造は異なっており、それらは短く、複雑なグリカンではないことを極めて明確に示す（図１２Ｂ）。これらの末端切断構造は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩ）およびβ−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（β−１，４ＧａｌＴ）、シアリルトランスフェラーゼなどの複雑なグリカンの生合成に関与するいくつかの酵素の不在またはその低い活性および糖−ヌクレオチド、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの不在に起因することも示されている。
【００１０】
したがって、対象の正確に成熟したタンパク質を得る目的で、昆虫細胞の酵素的成熟能を完了することは重要である。
【００１１】
タンパク質成熟酵素をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスは、既に記載されている。
【００１２】
Palmberger et al. (2012)の論文は、同一遺伝子座中に２種のグリコシル化酵素をコードする配列をそのゲノム中に含む組換えバキュロウイルスに関する。このバキュロウイルスは、ＨＩＶの抗体３Ｄ６抗ｇｐ４１の製造のために使用される。抗体の重鎖および軽鎖をコードする２種の遺伝子が、このバキュロウイルスのゲノム中に挿入された。これらの組換えバキュロウイルスは、細菌においてバクミド（bacmid）（昆虫細胞において感染性の）から作製される。構築法は、異なる遺伝子（対象の遺伝子およびタンパク質成熟遺伝子）の反復組込みのためにＣｒｅ／Ｌｏｘ系およびＴｎ７転位を使用する。組換えバキュロウイルスを製造するためには、感染性組換えバクミドを単離ために異なる抗生物質での細菌の選択が必要であり、次いで、これがＤＮＡの形態で昆虫細胞中に導入される。
【００１３】
Chang et al. (2003)の論文には、単一遺伝子座において対象のポリペプチド（ヒトα１−アンチトリプシン）および一連のグリコシルトランスフェラーゼの両方を発現する組換えバキュロウイルスが開示されている。組換えは、非感染性線状化ウイルスＤＮＡを用いて昆虫細胞において実施される。トランスファーベクターを用いる相同組換えと連続するこのＤＮＡの修復は、環状およびこのような感染性ウイルスＤＮＡを再構築することを可能にする。
【００１４】
これらのバキュロウイルスを構築する方法は、対象の遺伝子および従来の組込み系で役に立つタンパク質成熟遺伝子の反復性組込みの工程に基づいている。
（ｉ）Ｔｎ７転位もしくはｃｒｅ／ｌｏｘ系などの細菌（Palmberger et al. 2012）における
（ｉｉ）または線状化ウイルスＤＮＡおよびトランスファーベクターの間における昆虫細胞における従来の相同組換え工程（Chang et al. 2003）のいずれかにおける。
【００１５】
両方の場合において、組み込まれる導入遺伝子各々について、選択の工程が必要であり、（ｉ）細菌では、導入遺伝子に隣接する抗生物質耐性遺伝子の存在に基づく選択が必要であり、または（ｉｉ）昆虫細胞では、各組換え工程は、ウイルスＤＮＡ中の、再度ウイルスＤＮＡを線状化し、新規組込みを実施できるための制限酵素の特異的切断のための新規の独特な部位の存在を必要とする。トランスファーベクターを用いる相同組換えと連続するこのＤＮＡの修復は、環状およびこのような感染性ウイルスＤＮＡを再構築することを可能にする。
【００１６】
したがって、実行することが容易な、バキュロウイルス発現系において対象の組換えタンパク質、とりわけ、抗体などのいくつかの別個のサブユニットを含むタンパク質を製造することを可能にする、とりわけ、工業規模で開発され得る、対象のタンパク質の適当な成熟を誘導可能である方法を開発する必要性は依然として存在する。
【００１７】
いくつかのペプチドサブユニットから構成される、対象の特定の組換えタンパク質を製造するために、各々サブユニットをコードするいくつかの導入遺伝子が、容易に、好ましくは単一工程で組み込まれ得るバキュロウイルス発現系を有することが特に必要である。
【００１８】
しかし、バキュロウイルスにおいていくつかの導入遺伝子を組み込むことができるために、これまでに知られている方法は、以下を必要とした：
−  いくつかの連続工程を実施し、各工程が、１つまたは２つの導入遺伝子の組込み可能（「ヘッドトゥーテイル（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ）」）であること。したがって、２つを超える導入遺伝子をバキュロウイルスゲノム中に単一工程で組み込むことは技術的に可能であるが、極めて骨の折れるものであった、
−  または複数の導入遺伝子を単一遺伝子座中に組み込むことのいずれか。しかし、いくつかの導入遺伝子から構成される大きなサイズのＤＮＡ断片（発現カセット）の組込みのための相同組換えは、ウイルスゲノムの再生を誘導せずには複雑であることが多く、不可能でさえある。したがって、いくつかの導入遺伝子の組込みの位置をバキュロウイルスのゲノム中に均一に広げることが好ましい。
【００１９】
対象の導入遺伝子を成功裏に組み込んだ組換えバキュロウイルスの選択工程を排除するために、以下の共同使用に基づく方法が提案された：
−  ウイルス複製に必要な遺伝子が非機能性であるバキュロウイルス、および
−  複製に必須の遺伝子の機能を回復することを可能にするヌクレオチド配列および対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むトランスファーベクター。
【００２０】
この方法は、とりわけ、特許出願ＷＯ０１／１２８２９およびPossee et al., 2008の論文に記載されている。
【００２１】
しかし、この方法は、１つまたは２つの対象の導入遺伝子を単一遺伝子座中に組み込むこと（ヘッドトゥーテイル）を可能にするだけである。非機能性でなくてはならない複製に必要な別の遺伝子に結合された、別の遺伝子座中に第３または第４の導入遺伝子を組み込むためには、操作は、数回反復されなければならない。
【００２２】
さらに、Posseeによって記載されたような複製に必須の遺伝子の上流または下流への導入遺伝子の組込みは、複製が変更され得る、したがって、ウイルスが不十分に複製する、すなわち、培養上清中に、野生ウイルスよりもかなり少ない含量の感染性ウイルス粒子を有する（ＰＦＵ／ｍｌ）ウイルスを作製可能である。
【発明の概要】
【００２３】
この知見に基づいて、本出願人は、均一な、安定な組換えバキュロウイルスを調製するための特に効率的であり、実行するのが容易である、組換えタンパク質、例えば、いくつかの別個のサブユニットを含む多量体タンパク質の製造のための工業レベルでの開発を想定することを可能にする方法を開発した。
【００２４】
第１の態様において、本発明は、組換えバキュロウイルスを製造するための方法であって、組換えバキュロウイルスのゲノムが、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含み、前記方法は、
ａ）ａ１）ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性であり、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む複製欠損組換えバキュロウイルスゲノム、および
ａ２）ｉ）ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子のうち１つの機能を回復することを可能にするヌクレオチド配列、
ｉｉ）対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子のうち１個
を各々含むｎ個のトランスファーベクター
の間の相同組換えによって、昆虫細胞において、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含む複製可能なバキュロウイルスゲノムを調製する工程であって、
ｎ個のトランスファーベクターのヌクレオチド配列ｉ）のセットが、複製欠損バキュロウイルスゲノムの複製を回復可能であり、
ｎが、少なくとも２に等しい整数である、工程と、
ｂ）工程ａ）で得られた組換えバキュロウイルスゲノムを含む昆虫細胞において組換えバキュロウイルスを生成する工程と
を含む、方法に関する。
【００２５】
第２の態様では、本発明は、
ａ）式（Ｉ）：
［対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子］−［スペーサーヌクレオチド配列］−［機能性ウイルス複製に必須の遺伝子］（Ｉ）
のｎ個のヌクレオチド配列であって、
前記の核酸配列のスペーサーが、０〜６００ｐｂ、好ましくは、１〜６００塩基対から構成され、
前記の機能性ウイルス複製に必須の遺伝子が、１６２９（ＯＲＦ９）、Ｐｋ１（ＯＲＦ１０）、ｌｅｆ−１（ＯＲＦ１４）、ＯＲＦ３４、ｌｅｆ−１１（ＯＲＦ３７）、ｐ４７（ＯＲＦ４０）、ｌｅｆ８（ＯＲＦ５０）、ＤＮＡＪドメイン（ＯＲＦ５１）、ＯＲＦ５３、ｖｐ１０５４（ＯＲＦ５４）、Ｌｅｆ−９（ＯＲＦ６２）、ＤＮＡ  Ｐｏｌ（ＯＲＦ６５）、ｌｅｆ−３（ＯＲＦ６７）、ＯＲＦ７３、ＯＲＦ７５、ＯＲＦ８１、ｐ９５（ＯＲＦ８３）、ｖｐ３９（ＯＲＦ８９）、ｌｅｆ−４（ＯＲＦ９０）、ｐ３３（ＯＲＦ９２）、ヘリカーゼ（ＯＲＦ９５）、Ｖｐ８０（ＯＲＦ１０４）、ＯＲＦ１０６−１０７、ｏｄｖ−ｅｃ４３（ＯＲＦ１０９）、ｇｐ６４／６７（ＯＲＦ１２８）、ＯＲＦ１３２、ＯＲＦ１３３、ｏｄｖ−ｅｃ２７（ＯＲＦ１４４）、ＯＲＦ１４６、ｉｅ１（ＯＲＦ１４７）、ｌｅｆ−２（ＯＲＦ６）から選択され、
ｎが、少なくとも２に等しい整数である、ｎ個のヌクレオチド配列と、
ｂ）各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子と
を含む、組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノムに関する。
【００２６】
第３の態様では、本発明は、
ａ）ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性であり、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む複製欠損バキュロウイルスゲノムと、
ｂ）ｉ）ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子のうち１つの機能を回復することを可能にする核酸の配列、
ｉｉ）対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子
を各々含むｎ個のトランスファーベクターと
を含み、
ｎは、少なくとも２に等しい整数である、
相同組換えエレメントのセットに関する。
【００２７】
第４の態様では、本発明は、本発明による組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノムまたは本発明による相同組換えエレメントのセットを含む細胞に関する。
【００２８】
第５の態様では、本発明は、ｎ個の対象のポリペプチドの製造のための、本発明による組換えバキュロウイルスもしくは組換えバキュロウイルスゲノムまたは本発明による細胞の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＢａｃＭｉｄ１の調製工程を例示する図である。  キャプション：  ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム  ポリヘドリンまたはＰＨ：ポリヘドリンをコードするバキュロウイルス遺伝子：ウイルス複製に必須ではない遺伝子。  ＯＲＦ６０３：タンパク質６０３をコードするバキュロウイルス遺伝子、必須ではない遺伝子。  ＯＲＦ１６２９：タンパク質１６２９をコードするバキュロウイルス遺伝子：ウイルス複製に必須の遺伝子  ｐＶＴ：プラスミドトランスファーベクター。  Ｍｉｎｉ−Ｆ：細菌複製の起源。  ＫａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子を発現する細菌発現カセット。  ＡｍｐＲ：アンピシリン耐性遺伝子を発現する細菌発現カセット。  組換え断片：標的ＤＮＡに組み込むための発現カセットを含有するＤＮＡの断片。この断片は、Ｒｅｄリコンビナーゼによる相同組換えを受ける領域を特異的に標的とすることができる発現カセットのいずれかの側にフランキング領域を有する。
【図２】図２は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、ＢａｃＭｉｄ２の調製のための遺伝子ｄｎａ  ｐｏｌの部分的欠失の工程を例示する図である。  キャプション：  ｇｐ３７：糖タンパク質ｇｐ３７をコードするバキュロウイルス遺伝子、ウイルス複製に必須ではない遺伝子。  ｇｐ３７  Δ２５２  ａａ：２５２個のＮ末端アミノ酸をコードする領域から欠失された遺伝子ｇｐ３７。  ＤＮＡＰｏｌ：ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードするバキュロウイルス遺伝子、ウイルス複製に必須の遺伝子。  ＤＮＡＰｏｌ・Δ４６６  ａａ：４６６個のＣ末端アミノ酸をコードする領域から欠失されたｄｎａ  ｐｏｌ遺伝子。  ＨｙｇｒｏＲ：ハイグロマイシン耐性遺伝子を発現する細菌発現カセット。  組換え断片：標的ＤＮＡに組み込むための発現カセットを含有するＤＮＡの断片。この断片は、Ｒｅｄリコンビナーゼによる相同組換えを受ける領域を特異的に標的とすることができる発現カセットのいずれかの側にフランキング領域を有する。
【図３】図３は、ＢａｃＭｉｄ３の調製のためのｇｐ６４をコードする遺伝子の部分的欠失の工程を例示する図である。  キャプション：  Ｃｈｉｔ：キチナーゼをコードするバキュロウイルス遺伝子、ウイルス複製に必須ではない遺伝子。  Ｃａｔｈ：ウイルスカテプシンをコードするバキュロウイルス遺伝子、ウイルス複製に必須ではない遺伝子。  ｇｐ６４：ウイルス糖タンパク質ｇｐ６４をコードするバキュロウイルス遺伝子、ウイルス複製に必須の遺伝子。  ｇｐ６４・Δ１８８  ａａ：１８８個のＣ末端アミノ酸をコードする領域から欠失された遺伝子ｇｐ６４。  ＺｅｏＲ：ゼオシン耐性遺伝子を発現する細菌発現カセット。  組換え断片：標的ＤＮＡに組み込むための発現カセットを含有するＤＮＡの断片。この断片は、Ｒｅｄリコンビナーゼによる相同組換えを受ける領域を特異的に標的とすることができる発現カセットのいずれかの側にフランキング領域を有する。
【図４】図４は、導入遺伝子Ｘを含む組換えバキュロウイルスゲノムの作製のための、トランスファーベクターｐＶＴ／ｇｐ３７およびＢａｃＭｉｄ２ととものその使用を例示する図である。  キャプション：  ｐＶＴ：プラスミドトランスファーベクター。  ｇｐ３７：糖タンパク質ｇｐ３７をコードするバキュロウイルス遺伝子、ウイルス複製に必須ではない遺伝子。  ＤＮＡＰｏｌ：ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードするバキュロウイルス遺伝子、ウイルス複製に必須の遺伝子。  ＤＮＡＰｏｌ．Δ４６６  ａａ：４６６個のＣ末端アミノ酸をコードする領域から欠失されたｄｎａ  ｐｏｌ遺伝子。  外来遺伝子：対象の導入遺伝子。  Ｐ：導入遺伝子の発現を制御するウイルス性または細胞性プロモーター。  ＨｙｇｒｏＲ：ハイグロマイシン耐性遺伝子を発現する細菌発現カセット。
【図５】図５は、導入遺伝子Ｘを含む組換えバキュロウイルスゲノムの作製のための、ＢａｃＭｉｄ２ととものトランスファーベクターＰＨ  ｐＶＴ／ＰＨの構築および使用を例示する図である。  キャプション：  ｐＶＴ／ＰＨ：ポリヘドリントランスファーベクタープラスミド。  ＰＨ：ポリヘドリンをコードするバキュロウイルス遺伝子のすべてまたは一部、ウイルス複製に必須ではない遺伝子。  ＯＲＦ６０３：タンパク質６０３をコードするバキュロウイルス遺伝子、必須ではない遺伝子。  ＯＲＦ１６２９：タンパク質１６２９をコードするバキュロウイルス遺伝子、ウイルス複製に必須の遺伝子。  外来遺伝子：対象の導入遺伝子。  Ｐ：導入遺伝子の発現を制御するウイルス性または細胞性プロモーター。  ＫａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子を発現する細菌発現カセット。  Ｍｉｎｉ−Ｆ：細菌複製の起源。
【図６】図６は、抗体の重鎖を含む組換えバキュロウイルスゲノムの作製のための、ＢａｃＭｉｄ２ととものトランスファーベクターｐＶＴ／ｇｐ３７Ｃγの構築および使用を例示する図である。  キャプション：  ｐＶＴ：プラスミドトランスファーベクター。  ｐＶＴ／ｇｐ３７−Ｃγ１：免疫グロブリンの重鎖に対して特異的なプラスミドトランスファーベクター。  Ｃγ１：ヒト免疫グロブリンの定常ドメインγ１をコードするＤＮＡｃ。  ＶＨ：免疫グロブリンの重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡｃ。  ＤＮＡＰｏｌ：ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードするバキュロウイルス遺伝子、ウイルス複製に必須の遺伝子。  ＤＮＡＰｏｌΔ４６６  ａａ：４６６個のＣ末端アミノ酸をコードする領域から欠失されたＤＮＡＰｏｌ遺伝子。  Ｐ：導入遺伝子の発現を制御するウイルス性または細胞性プロモーター。  ＨｙｇｒｏＲ：ハイグロマイシン耐性遺伝子を発現する細菌発現カセット。  ＰＳ：シグナル配列をコードするＤＮＡｃ（重鎖の分泌）。
【図７】図７は、抗体の軽鎖を含む組換えバキュロウイルスゲノムの作製のための、ＢａｃＭｉｄ２ととものトランスファーベクターｐＶＴ／ＰＨＣκの構築および使用を例示する図である。  キャプション：  ＯＲＦ６０３：タンパク質６０３をコードするバキュロウイルス遺伝子。  ＯＲＦ１６２９：タンパク質１６２９をコードするバキュロウイルス遺伝子：ウイルス複製に必須の遺伝子。  Ｍｉｎｉ−Ｆ：細菌複製の起源。  ｐＶＴ：プラスミドトランスファーベクター。  ｐＶＴ／ＰＨ−Ｃκ：免疫グロブリンの軽鎖に対して特異的なプラスミドトランスファーベクター。  Ｃκ：ヒト免疫グロブリンのκ定常ドメインをコードするＤＮＡｃ。  ＶＬ：免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡｃ。  Ｐ：導入遺伝子の発現を制御するウイルス性または細胞性プロモーター。  ＫａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子を発現する細菌発現カセット。  ＰＳ：シグナル配列をコードするＤＮＡｃ（軽鎖の分泌）。
【図８】図８は、導入遺伝子を含む組換えバキュロウイルスゲノムの作製のための、ＢａｃＭｉｄ３ととものベクターｐＶＴ／Ｃｈｉｔ−Ｃａｔｈの構築およびその使用を例示する図である。  キャプション：  ｐＶＴ  Ｃｈｉｔ／Ｃａｔｈ：２つの必須ではない遺伝子、キチナーゼをコードするＣｈｉＡおよびカテプシンをコードするＣａｔｈを含む領域の遺伝子座で組換え可能なプラスミドトランスファーベクター。  ｇｐ６４Δ１８８  ａａ：１８８個のＣ末端アミノ酸をコードする領域から欠失されたｇｐ６４遺伝子、必須である遺伝子。  外来遺伝子：対象の導入遺伝子。  Ｐ：導入遺伝子の発現を制御するウイルス性または細胞性プロモーター。  ＺｅｏＲ：ゼオシン耐性遺伝子を発現する細菌発現カセット。
【図９】図９は、Ａ）同一トランスフェクションの際に作製された３つの精製独立組換えバキュロウイルスのゲノムのサザンブロットによる解析であり、Ｂ）プロテインＡセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での精製後の組換え抗体の解析である。  キャプション：  Ａ：抗体１３Ｂ８ＩＩを発現する３種の独立組換えバキュロウイルスのゲノムの組織の解析。これらのバキュロウイルスは、単回トランスフェクション実験から単離された。κ軽鎖の定常領域に対して特異的なプローブ：プローブＣκおよび重鎖ガンマ１の定常領域に対して特異的なプローブ：プローブＣκ１をそれぞれ用いて実施したハイブリダイゼーションは、３種の組換えウイルスの正確な同一の組織化を実証する。  Ｂ．精製組換え抗体のポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ、２−メルカプトエタノール）における電気泳動および銀染色による解析。組換えバキュロウイルスに感染した細胞の培養培地中に分泌された抗体は、プロテインＡセファロースカラムで精製された。  ＰＣ１：プラスミドコントロール、κ軽鎖の遺伝子を含有するプラスミド。  ＰＣ２：プラスミドコントロール、重鎖γ１、Ｒ１−３、組換えバキュロウイルス１、２および３の遺伝子を含有するプラスミド。  ＭＷ：サイズマーカー。
【図１０】図１０は、ｆｌｕウイルスのタンパク質Ｍ、ＨＡおよびＮＡを発現する三重組換えウイルスのゲノムのサザンブロットによる解析である。  キャプション：  Ｍ：マトリックスタンパク質をコードするｆｌｕウイルスの遺伝子。  ＨＡ：血球凝集素をコードするｆｌｕウイルスの遺伝子。  ＮＡ：ノイラミニダーゼをコードするｆｌｕウイルスの遺伝子。  ｂｐ：塩基対で表されるＤＮＡ断片のサイズ。
【図１１】図１１は、Ａでは、二重特異性抗体の構造を例示する図であり、Ｂでは、プロテインＡセファロースカラムで精製された二重特異性抗体のポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動による解析である。  キャプション：  Ａ：二重特異性抗体の構造の図表表示。Ｌ１：抗体１の軽鎖、Ｌ２、抗体２の軽鎖。  Ｂ：ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって解析される精製された二重特異性抗体。タンパク質は、銀染色によって明らかにされた。（１）還元条件下（ＳＤＳ、２−メルカプトエタノール）での電気泳動。（２）非還元条件下での電気泳動。Ｈ：抗体の重鎖、Ｌ：抗体の軽鎖、Ｈ２Ｌ４：二重特異性抗体の組成：対応する領域ＶＨ１−ＣＨ１およびＶＨ２−ＣＨ１に対して特異的方法で対形成された２つのヒンジ領域＋４つの軽鎖（２つの鎖のＬ１＋２つの鎖のＬ２）のレベルで４つのジスルフィド橋によって結合された２つの融合された重鎖。
【図１２】図１２は、（Ａ）ヒト細胞および（Ｂ）鱗翅目細胞によって合成された糖タンパク質に結合されたグリカン構造の表示である。
【図１３】図１３は、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）の表示である。Ｎ−グリカンに結合されたアスパラギン残基２９７、（Ａｓｎ２９７）が、菱形によって表されている。ガラクトースおよびシアル酸の存在のような、このＮ−グリコシル化の性質は、特定のエフェクター活性、例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの調節を可能にするので、抗体の構造の重要な要素であり得る。
【図１４】図１４は、ＢａｃＭｉｄ２／ＭＰＴ（ＭＰＴ：翻訳後修飾）、すなわち、ゲノムが各々グリカン生合成酵素をコードする導入遺伝子を含むＢａｃＭｉｄ２−またはより一般的に、ゲノムが各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含むＢａｃＭｉｄ２の構築に必要な種々の工程の表示である。  図１４は、ＢａｃＭｉｄ２の遺伝子間領域ｏｒｆ３５（ｖ−ｕｂｉ）−ｏｒｆ３６（３９ｋ）（ＩＧ３５／３６）中のＧＮＴ−ＩＩをコードする導入遺伝子の組込みを具体的に例示する。  ２つの発現カセットが、プラスミドｐＵＣ中に事前にクローニングされた領域ＩＧ３５／３６中に連続的に挿入された（ｉ）初期ウイルスプロモーター（表２を参照のこと）およびＧＮＴ−ＩＩをコードする遺伝子から構成されるウイルス発現カセットおよび（ｉｉ）ゼオシン耐性遺伝子（ＺｅｏＲ）を制御する細菌発現カセット。２つのカセットを含有する「組換え断片」は、２種の制限エンドヌクレアーゼによる上記のプラスミドの消化によって作製された。後者は、エレクトロポレーションによって細菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２中に導入された。相同組換えは、組換え断片のフランキング領域と、２つの発現カセットの組込みを可能にするＢａｃＭｉｄ２のＤＮＡの間でＲｅｄリコンビナーゼによって起こった。このように得られた組換え細菌は、ゼオシンを用いて選択され、次いで、この抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子は、簡単な消化／修復／再ライゲーションによってバクミドのＤＮＡから排除された。ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩと呼ばれる得られたバクミドは、エレクトロポレーションによって、細菌ＥＬ３５０（ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴ−ＩＩ）中に再導入された。
【図１５】図１５は、ＢａｃＭｉｄ２−ｆｕｒおよびＢａｃＭｉｄ２Ｇａｌ−Ｆｕｒを示す。  ＡおよびＢ：ＢａｃＭｉｄ  ＢａｃＦｕｒおよびＢａｃＧａｌ−Ｆｕｒのゲノム組織化の制御。Ａ．２つのバクミドのＤＮＡはＥｃｏＲＩによって消化され、作製された断片が１％のアガロースゲルで分離され、次いで、臭化エチジウムを用いて染色された。Ｂ．ＤＮＡは、サザン技術に従ってナイロンメンブレンに移された。メンブランは、Ｓｆ９細胞によって発現された遺伝子ｆｕｒに対して特異的なプローブとともにインキュベートされた。  キャプション：  Ａ：臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル、ウェル１：制限プロフィールＢａｃＭｉｄ２Ｇａｌ−ＦｕｒのＥｃｏＲＩ、ウェル２：制限プロフィールＢａｃＭｉｄ２−ＦｕｒのＥｃｏＲＩ。Ｂ：サザンブロット、ウェル１：制限プロフィールＢａｃＭｉｄ２Ｇａｌ−ＦｕｒのＥｃｏＲＩ、ウェル２：制限プロフィールＢａｃＭｉｄ２−ＦｕｒのＥｃｏＲＩ。  ＣおよびＤ：ウイルスＨＩＶ−１のポリタンパク質Ｐｒ５５Ｇａｇおよびｇｐ１６０を同時発現する２つの組換えウイルスは、１つはＢａｃＭｉｄ２から構築され、もう一方はＢａｃＭｉｄ２−Ｆｕｒから構築された。Ｓｆ９細胞に、種々のウイルスを用いて４８時間感染させ、培養上清中に分泌されたタンパク質を、「Ｒｅｔｒｏ  Ｃｏｎｃｅｎｔｉｎ（商標）Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ＳＢＩ、参照ＲＶ１００Ａ−１）」の溶液を用いて濃縮するか、濃縮せず、次いで、変性および還元条件下で１０％のポリアクリルアミドゲル上に沈殿させ、次いで、ウエスタンブロットによって解析した。Ｃ．タンパク質は、抗ｇｐ１２０抗体（参照Ａｂ２１１７９、Ａｂｃａｍ）を用いて明らかにされた。Ｄ．タンパク質は、抗Ｐｒ５５Ｇａｇ抗体（参照６３９１７、Ａｂｃａｍ）を用いて明らかにされた。  キャプション：  ＢＡＣＷＴ：野生バキュロウイルス、ＢＡＣｇｐ１６０／Ｇａｇ／Ｆｕｒ：ＨＩＶ−１のｇｐ１６０およびポリタンパク質Ｐｒ５５Ｇａｇならびに細胞Ｓｆ９のフューリンを発現する三重組換えバキュロウイルス、ＢＡＣｇｐ１６０／Ｇａｇ：ＨＩＶ−１のｇｐ１６０およびポリタンパク質Ｐｒ５５Ｇａｇを発現する二重組換えバキュロウイルス、ＢＡＣｇｐ１２０：ＨＩＶ−１のｇｐ１２０を発現する単一組換えバキュロウイルス、ＢＡＣＧａｇ：ＨＩＶ−１のポリタンパク質Ｐｒ５５Ｇａｇを発現する単一組換えバキュロウイルス。
【図１６】図１６は、二重または単一組換えバキュロウイルスゲノムの作製のためのＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌ（ＢａｃＧａｌ）の使用の原理の表示である。Ａ．二重組換えバキュロウイルスゲノムの作製  ２つの対象の導入遺伝子が、そのそれぞれのトランスファーベクター、一対ＧＮＥ／ＧＥ  ＰＨ／１６２９を標的とするｐＶＴ／ＰＨおよび一対ＧＮＥ／ＧＥ  ｇｐ３７／ＤＮＡＰｏｌを標的とするｐＶＴ／ｇｐ３７にクローニングされる。Ｓｆ９細胞は、２つのｐＶＴおよびＢａｃＭｉｄ２−ＧａｌのＤＮＡを用いてトランスフェクトされる。相同組換えの際に、２つの対象の導入遺伝子が、ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌのゲノムに組み込まれるが、同時に、ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌ由来の非機能性遺伝子１６２９およびｄｎａｐｏｌが機能性コピーによって置換される。これらの事象は、結果として、細菌複製の起源の排除および感染性組換えバキュロウイルスゲノムの生成をもたらす。次いで、組換えバキュロウイルスが産生され、培養培地中に分泌され、次いで、ファージプラークアッセイ法によってクローニングされる。  Ｂ．単一組換えバキュロウイルスゲノムの作製。  対象の遺伝子が、トランスファーベクターｐＶＴ／ｇｐ３７にクローニングされる。Ｓｆ９細胞は、導入遺伝子を含むｐＶＴ／ｇｐ３７、導入遺伝子を含有しないｐＶＴ／ＰＨおよびＢａｃＭｉｄ２−ＧａｌのＤＮＡを用いてトランスフェクトされる。相同組換えの際、２つの遺伝子座においてバクミドの修復、したがって、感染性バキュロウイルスの生成がある。  キャプション：  ＧＥ：必須である遺伝子  ＧＮＥ：必須ではない遺伝子  ｐＶＴ／ＰＨ：一対ＧＮＥ／ＧＥ  ＰＨ／１６２９を標的とするトランスファーベクター  ｐＶＴ／ｇｐ３７：一対ＧＮＥ／ＧＥ  ｇｐ３７／ＤＮＡＰｏｌを標的とするトランスファーベクター  ＤＮＡ  ＰｏｌＮＦ：非機能性ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子  ＤＮＡ  ＰｏｌＦ：機能性ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子  １６２９ＮＦ：非機能性タンパク質１６２９をコードする遺伝子  １６２９Ｆ：機能性タンパク質１６２９をコードする遺伝子  β１，４ＧａｌＴ：β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ  ＧＮＴ−ＩＩ：ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ  ＫａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子  ｍｉｎｉ−Ｆ：細菌複製の起源  ＰＨ：ポリヘドリン遺伝子
【図１７】図１７は、ガラクトシル化抗体を発現する二重組換えバキュロウイルスゲノムの調製の原理の表示である。Ｓｆ９細胞が、ｐＶＴ／Ｈ（図６を参照のこと）、ｐＶＴ／Ｌ（図７を参照のこと）およびＢａｃＭｉｄ２−ＧａｌのＤＮＡを用いてトランスフェクトされる。相同組換えの際に、重鎖および軽鎖をコードする導入遺伝子が、ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌのゲノムに組み込まれるが、同時に、ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌ由来の非機能性遺伝子１６２９およびｄｎａｐｏｌが、機能性コピーによって置換され、これが、バキュロウイルスゲノムを感染性にする。次いで、組換えバキュロウイルスが産生され、培養培地中に分泌され、次いで、ファージプラークアッセイ法によってクローニングされる。  キャプション：  ＧＥ：必須である遺伝子  ＧＮＥ：必須ではない遺伝子  ｐＶＴ／ＰＨ：一対ＧＮＥ／ＧＥ  ＰＨ／１６２９を標的とするトランスファーベクター  ｐＶＴ／ｇｐ３７：一対ＧＮＥ／ＧＥ  ｇｐ３７／ＤＮＡＰｏｌを標的とするトランスファーベクター  ＤＮＡ  ＰｏｌＮＦ：非機能性ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子  ＤＮＡ  ＰｏｌＦ：機能性ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子  １６２９ＮＦ：非機能性タンパク質１６２９をコードする遺伝子  １６２９Ｆ：機能性タンパク質１６２９をコードする遺伝子  β１，４  ＧａｌＴ：β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ  ＧＮＴ−ＩＩ：ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ  ＫａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子  ｍｉｎｉ−Ｆ：細菌複製の起源  ＰＨ：ポリヘドリン遺伝子
【図１８】図１８は、ＢａｃＭｉｄ２またはＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌから作製された組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞によって産生された抗体のウエスタンブロットおよびレクチンブロットによる解析を表す。これらのヒト抗体（組換え抗体１３Ｂ８ＩＩは、定常ヒトドメインを有する）またはそのパラトープにグリコシル化を有さないマウス抗体、したがって、解析は、その定常ドメインに由来するＮ−グリコシル化の性質を明らかにする。  キャプション：  ＡおよびＢ．ウエスタンブロット。Ａ：メンブレンは、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ全抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート型（参照ＮＡ９３３Ｖ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともにインキュベートされた。Ｂ：メンブレンは、ヒツジ抗マウスＩｇＧ全抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート型（参照ＮＡ９３１Ｖ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともにインキュベートされた。  Ａ．ウェル１：Ｒｏｃｈｅ製の「Ｄｉｇ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」キットにおいて供給されたフェチュイン（Fetuin）（６１〜６８ｋＤａ）、このα２，３およびα２，６シアリル化タンパク質は、ＳＮＡ、ＭＡＡまたはｄｉＣＢＭＡについてにかかわらず、レクチンブロットを用いる解析のための陽性対照を構成する。供給業者によれば、このタンパク質のモル質量（＊）は、６８から６１ｋＤａの間で変わり、ウェル２：組換え抗体１３Ｂ８ＩＩ／ＢａｃＧａｌ、ウェル３：組換え抗体１３Ｂ８ＩＩ／ＢａｃＭａｎ。  Ｂ．ウェル１：組換えマウス抗体／ＢａｃＧａｌ、ウェル２：組換えマウス抗体／ＢａｃＭａｎ。  Ｃ．レクチンブロット。メンブレンは、ビオチンがコンジュゲートされたＲＣＡ１２０の存在下でインキュベートされた。実施例１７に記載されたように、レクチンの存在が、明らかにされた。  ウェル１：フェチュイン（６１〜６８ｋＤａ）ウェル２：組換えマウス抗体／ＢａｃＭａｎ、ウェル３：組換えマウス抗体／ＢａｃＧａｌ、ウェル４：組換え抗体１３Ｂ８ＩＩ／ＢａｃＭａｎ、ウェル５：組換え抗体１３Ｂ８ＩＩ／ＢａｃＧａｌ。
【図１９】図１９は、多重組換えバキュロウイルスゲノムの調製および新規ＢａｃＭｉｄＳｉａ、ＢａｃＭｉｄＳｉａ６−ＩＩの第２世代の構築のためのＢａｃＭｉｄ２−Ｓｉａの使用を記載する図である。図１９Ａでは、導入遺伝子１および２は、それぞれ、一対ＧＮＥ／ＧＥ  ＰＨ／１６２９を標的とするｐＶＴ／ＰＨに、および一対ＧＮＥ／ＧＥ  ｇｐ３７／ＤＮＡＰｏｌを標的とするｐＶＴ／ｇｐ３７にクローニングされる。ＢａｃＭｉｄ−Ｓｉａのゲノムは、α２，３シアリル化［α２，３シアリルトランスフェラーゼ］（ＢａｃＭｉｄ２−Ｓｉａ３またはＢａｃＳｉａ３）またはα２，６シアリル化［α２，６シアリルトランスフェラーゼ］（ＢａｃＭｉｄ２−Ｓｉａ６またはＢａｃＳｉａ６およびＢａｃＭｉｄ２Ｓｉａ６−ＩＩまたはＢａｃＳｉａ６−ＩＩ）またはα２，３＋α２，６シアリル化［α２，３シアリルトランスフェラーゼ＋α２，６シアリルトランスフェラーゼ］（ＢａｃＭｉｄ２−Ｓｉａ３／６またはＢａｃＳｉａ３／６）に必要なすべての遺伝子および糖ヌクレオチドＣＭＰ−ＮｅｕＡＣの生合成に必要な２つの遺伝子を備えている。Ｓｆ９細胞は、２つのｐＶＴおよびＢａｃＭｉｄ−Ｓｉａのうち１つのＤＮＡを用いてトランスフェクトされる。相同組換えの際、２つの導入遺伝子がＢａｃＭｉｄ２−Ｓｉａのゲノムに組み込まれるが、同時に、ＢａｃＭｉｄ２−Ｓｉａ由来の非機能性遺伝子１６２９およびｄｎａｐｏｌが、機能性コピーによって置換され、これが、バキュロウイルスゲノムを感染性にする。次いで、組換えバキュロウイルスが産生され、培養培地中に分泌され、次いで、ファージプラークアッセイ法によってクローニングされる。  キャプション：  ＧＥ：必須である遺伝子  ＧＮＥ：必須ではない遺伝子  ｐＶＴ／ＰＨ：一対ＧＮＥ／ＧＥ  ＰＨ／１６２９を標的とするトランスファーベクター  ｐＶＴ／ｇｐ３７：一対ＧＮＥ／ＧＥ  ｇｐ３７／ＤＮＡＰｏｌを標的とするトランスファーベクター  ＤＮＡ  ＰｏｌＮＦ：非機能性ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子  ＤＮＡ  ＰｏｌＦ：機能性ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子  １６２９ＮＦ：非機能性タンパク質１６２９をコードする遺伝子  １６２９Ｆ：機能性タンパク質１６２９をコードする遺伝子  β１，４  ＧａｌＴ：β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ  ＧＮＴ−ＩＩ：ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ  α２，３  ＳＴ：α２，３シアリルトランスフェラーゼ  α２，６  ＳＴ：α２，６シアリルトランスフェラーゼ  ＫａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子  ｍｉｎｉ−Ｆ：細菌複製の起源  ＰＨ：ポリヘドリン遺伝子    図１９Ｂは、構築が実施例１４に記載されているＢａｃＭｉｄ２Ｓｉａ６−ＩＩの２つのクローンのゲノムのサザンブロットによる解析である。  キャプション：  ａ：ＢａｃＭｉｄ２Ｓｉａ６−ＩＩの２つのクローン（１および２）のＥｃｏＲＩによる消化の電気泳動プロフィールの、ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１、４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳ（Ｔ）と比較した解析は、領域Ｐｉｆ１におけるカセットＳＴ６ＧａｌＩの組込みが、３１２２ｐｂおよび６１３８ｐｂの２つの断片ＥｃｏＲＩをもたらすことを示す。  ｂ：ＳＴ６ＧａｌＩに特異的なプローブを用いて実施したハイブリダイゼーションによって、３１２２ｐｂおよび６１３８ｐｂの２つの断片ＥｃｏＲＩおよび対照プラスミド（ＰＣ）、ＳＴ６ＧａｌＩ遺伝子を含有するプラスミドのマーキングを確認することを可能にし、得られた２つのバクミドの正しい、同一の組織化を実証する。ＭＷ：Ｓｍａｒｔ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）
【図２０】図２０は、異なるバクミドから作製された異なるウイルスによって発現されたウイルスタンパク質ｇｐ６４のグリコシル化のウエスタンブロットおよびレクチンブロットによる解析を表す。糖タンパク質ｇｐ６４は、バキュロウイルスの主要な糖タンパク質であり、バキュロウイルスの表面に位置付けられる。この糖タンパク質は、ガラクトシル化およびシアリル化されることが可能であることが示された。細胞は異なる組換えウイルスに感染した。培養上清中に分泌されたバキュロウイルスは沈降され、次いで、ウエスタンブロットによって、次いで、レクチンブロットによって解析されるべき溶解バッファーに取り入れられた。  Ａ．ウエスタンブロット。メンブレンは、抗体抗ｇｐ６４  ＡｃＶ５（参照ＳＣ６５４９９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートされた。  ＢおよびＣ：レクチンブロット。Ｂ．メンブレンは、ＳＮＡ、α２，６結合されたシアル酸を特異的に認識するレクチン（Ｃ）α２，３結合されたシアル酸を、より低い程度に、α２，６結合されたシアル酸を認識するレクチンジ−ＣＢＭ４０の存在下でインキュベートされた。  キャプション：  Ｆｅｔ：フェチュイン  Ｍｑ：分子量マーカー  ＳＴ３：バクミドＢａｃＳｉａ３から作製されたウイルス  ＳＴ６：バクミドＢａｃＳｉａ６から作製されたウイルス  ＳＴ３／６：バクミドＢａｃＳｉａ３／６から作製されたウイルス  Ｍａｎ：バクミドＢａｃＳｉａ２から作製されたウイルス
【図２１】図２１は、ＢａｃＳｉａ６から作製された組換えバキュロウイルスのおかげで産生された組換えタンパク質Ｘのウエスタンブロットおよびレクチンブロットによる解析を表す。このタンパク質は可溶性であり、以下の解析は、精製タンパク質で実施された。ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動、次いで、メンブレンへの移動後、タンパク質は、ウエスタンブロットによる解析のための特異的抗体（Ａ）またはレクチンブロットに特異的なレクチン、ＳＮＡ（Ｂ）またはＭＡＡ（Ｃ）のいずれかの存在下でインキュベートされた。  キャプション：  ウェル１、タンパク質Ｘは、ＢａｃＭｉｄ２から作製された組換えバキュロウイルスを用いるＳｆ９細胞の感染後に産生された。ウェル２、タンパク質Ｘは、ＢａｃＳｉａ６から作製された組換えバキュロウイルスを用いるＳｆ９細胞の感染後に産生された。ウェル３、ＣＨＯ細胞において産生された市販のタンパク質Ｘ。実施例１７に記載されたように、レクチンの存在が明らかにされた。ＭＷ：分子量マーカー（染色済みマーカー、Ｂｉｏｌａｂｓ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐ７７０６）。
【図２２】図２２は、ＢａｃＳｉａ６から作製された組換えバキュロウイルスのおかげで産生されたタンパク質ＶＳＶｇのウエスタンブロットおよびレクチンブロットによる解析を表す。タンパク質ＶＳＶｇは膜性であり、解析は感染Ｓｆ９細胞のペレットで実施された。  ＡおよびＢ：タンパク質ＶＳＶｇの解析。  Ａ．ウエスタンブロット、ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動、次いで、メンブレンへの移動後、タンパク質をＶＳＶｇに対して向けられた特異的抗体（マウス抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート型、参照Ａ５９７７  Ｓｉｇｍａ）の存在下でインキュベートした。  キャプション：  ウェル１、フェチュイン、ウェル２および３、ＢａｃＳｉａ６（ウェル２）またはＢａｃｍｉｄ２（ウェル３）から作製されたタンパク質ＶＳＶｇを発現する組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞。  Ｂ．レクチンブロット。ニトロセルロースメンブレンに移されたタンパク質は、α２，６結合されたシアル酸の残基に対して特異的なレクチンＳＮＡ（セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ）凝集素）の存在下に置かれた。実施例１７に記載されたように、レクチンの存在が明らかにされた。  ＣおよびＤ。ウイルスタンパク質ｇｐ６４の解析。  本発明者らはまた、シアリル化ＶＳＶｇを発現する組換えバキュロウイルスはまた、シアリル化ｇｐ６４を有していることを確認した。そうするために、培養上清に分泌されたバキュロウイルスは沈降され、次いで、ウエスタンブロットによって、次いで、レクチンブロットによって解析されるべき溶解バッファーに取り入れられた。Ｃ．ウエスタンブロット、ｇｐ６４が、特異的抗体（抗体抗ｇｐ６４  ＡｃＶ５、参照ＳＣ６５４９９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて明らかにされた。Ｄ．レクチンブロット。実施例１７に記載されるような、レクチンＳＮＡの存在下。  キャプション：  ウェル１、フェチュイン、ウェル２および３、タンパク質ＶＳＶｇを発現する、ＢａｃＭｉｄ２−Ｓｉａ６（ウェル２）またはＢａｃｍｉｄ２（ウェル３）から作製された組換えバキュロウイルスに感染した細胞の培養上清から調製されたバキュロウイルスの粒子。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本発明の文脈内で、表現「バキュロウイルス」は、節足動物に特異的な桿状ウイルスを指すととられる。バキュロウイルスは、一般に、バキュロウイルスゲノムを封入するヌクレオカプシドを含む。バキュロウイルスの例として、ＢｍＮＰＶ、ＡｃＭＮＰＶ、ＡｐＮＰＶ、ＢｓＳＮＰＶ、ＣｆＭＮＰＶ、ＥｏＳＮＰＶ、ＨａＮＰＶ、ＨｚＮＰＶ、ＬｄＭＮＰＶ、ＭｂＭＮＰＶ、ＯｐＭＮＰＶ、ＳｌＭＮＰＶ、ＳｅＭＮＰＶおよびＴｅＮＰＶがある。
【００３１】
本発明の文脈内で、表現「バキュロウイルスゲノム」は、特に、バキュロウイルスコーディングおよび非コーディングヌクレオチド配列のすべてを含むバキュロウイルスの遺伝物質の全体を指すととられる。
【００３２】
本発明の文脈内で、表現「複製欠損バキュロウイルスゲノム」とは、バキュロウイルスゲノムが、昆虫細胞において複製するその能力を失ったような方法で、ウイルス複製に必須の少なくとも２つの遺伝子が欠失（全体的にまたは部分的に）または突然変異しているバキュロウイルスゲノムを指すととられる。例えば、ウイルス複製に必須の遺伝子は、もはや自身を発現しないかまたは転写され、次いで、非機能性タンパク質に翻訳される。したがって、欠失（全体的にまたは部分的に）または突然変異された遺伝子は、「ウイルス複製に必須の非機能性遺伝子」と呼ばれる。ウイルス複製欠損バキュロウイルスゲノムは、当業者に周知の分子生物学技術を使用して親のバキュロウイルスゲノムから製造され、とりわけ、親のバキュロウイルスゲノムにおいてヌクレオチド配列の挿入および／または欠失を可能にする。好ましくは、複製欠損バキュロウイルスウイルスゲノムは、細菌細胞内で複製することを可能にする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。細菌細胞内で複製を可能にするヌクレオチド配列は、本発明の意味では対象の導入遺伝子ではない。細菌複製エレメントの一例として、ヌクレオチド配列「Ｍｉｎｉ−Ｆ」がある。このような複製エレメントは、先行技術において周知である。細菌細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。細菌細胞内で複製することを可能にするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルスゲノムは、名称「バクミド」によって知られている。好ましくは、複製欠損バキュロウイルスゲノムはまた、複製欠損バキュロウイルスゲノムによってトランスフェクトされた細菌細胞を選択または同定することを可能にする１つまたは複数の選択マーカーをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。選択ヌクレオチド配列は、本発明の意味では対象の導入遺伝子ではない。それは、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子および／またはテトラサイクリン耐性遺伝子であり得る。
【００３３】
本発明の文脈内で、表現「組換えバキュロウイルスゲノム」は、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含むバキュロウイルスゲノムを指すととられる。用語、本発明による「組換えバキュロウイルスゲノム」は、本発明による方法の実施によって得られるバキュロウイルスゲノム、すなわち、複製欠損バキュロウイルスゲノムと、ｎ個のトランスファーベクターの間の相同組換えによって得られるバキュロウイルスゲノムに対応する。
【００３４】
本発明の文脈内で、表現「組換えバキュロウイルス」は、ゲノムが、組換えバキュロウイルスゲノムであるバキュロウイルス、すなわち、ゲノムが、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含むバキュロウイルスを指すととられる。組換えバキュロウイルスは、昆虫細胞において組換えバキュロウイルスゲノムの複製後に製造され得る。組換えバキュロウイルスは、昆虫細胞に感染可能である。好ましくは、本発明による組換えバキュロウイルスは、昆虫細胞に対して感染性である。
【００３５】
「遺伝子」は、転写され、次いで、ポリペプチドに、例えば、タンパク質に翻訳されることが可能であるヌクレオチド配列を指すととられる。次いで、ポリペプチドをコードする遺伝子について述べる。
【００３６】
本発明の文脈内で「導入遺伝子」は、バキュロウイルスのゲノム中に天然には存在しない遺伝子を指すととられる。例えば、ヒト起源の遺伝子、動物起源の遺伝子、植物起源の遺伝子、ウイルス起源の遺伝子または細菌起源の遺伝子であり得る。本発明の文脈内で、導入遺伝子は、「タンパク質成熟酵素をコードする導入遺伝子」または「対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子」のいずれかである。
【００３７】
「別個の導入遺伝子」は、同一ヌクレオチド配列を有さない導入遺伝子を指すととられる。
【００３８】
導入遺伝子は、本発明の意味で、昆虫細胞におけるその発現のために適当なエレメントの制御下に配置される。「適当なエレメント」は、メッセンジャーＲＮＡ（ＲＮＡｍ）へのその転写のために、およびＲＮＡｍのポリペプチドへの翻訳のために必要なエレメントのセットを指すととられる。転写に必要なエレメントの中で、プロモーターは、特別な重要性を負う。構成プロモーターであっても、調節プロモーターであってもよく、バキュロウイルス起源のものであっても、節足動物起源のもの（例えば、昆虫起源のもの）であってもよい。重要な点は、選択されたプロモーターが昆虫細胞における導入遺伝子の発現に適している。一般的に言えば、本発明における使用におけるプロモーターは、調節配列を含有するように修飾されてもよいということである。プロモーターの例として、プロモーターポリヘドリン、プロモーターＰ１０、ポリヘドリン由来の合成プロモーターおよびＰ１０プロモーター、バキュロウイルスＣｆＭＮＰＶのプロモーターＩＥ１、バキュロウイルスＬｄＭＮＰＶのプロモーターＩＥ１、バキュロウイルスＯｐＭＮＰＶのプロモーターｇｐ６４、エビウイルスＷＳＳＶ（白点症候群ウイルス）のプロモーターＩＥ１、ジュノニア・コエニア（Ｊｕｎｏｎｉａ  ｃｏｅｎｉａ）のデンソウイルス（ＪｃＤＮＶ）のプロモーターＰ９、カイコ、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の細胞性プロモーターＡ３（アクチン３）を引用することが可能である。特定の実施形態では、１つまたは複数の導入遺伝子は、野生プロモーターＰ１０（配列番号１）に由来する合成プロモーター、好ましくは、合成プロモーターＰ１０Ｓ１Ａ（配列番号２）またはＰ１０Ｓ１Ｂ（配列番号３）の制御下に配置される。
【００３９】
「発現カセット」は、一般に、１つまたは複数の遺伝子およびその発現に適したエレメント、例えば、導入遺伝子および昆虫細胞におけるその発現に適したエレメントからなるヌクレオチド配列を指すととられる。
【００４０】
「タンパク質成熟酵素」は、タンパク質の成熟に関与する酵素を指すととられる。特に、タンパク質成熟酵素によって操作される成熟は、安定なタンパク質および／またはその生物活性のすべてもしくは一部を有するタンパク質の製造につながる。例えば、タンパク質成熟酵素は、タンパク質のペプチド配列のレベルで（例えば、切断によって）、フォールディングレベルで（これは、例えば、シャペロンタンパク質の場合である）、グリコシル化レベルで、または任意のその他の翻訳後修飾、例えば、リン酸化もしくはメチル化などのレベルで作用し得る。タンパク質成熟酵素は、シグナルペプチダーゼ、フューリン、プロタンパク質転換酵素、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、シャペロンタンパク質、イソメラーゼジスルフィド、アシルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、トランスグルタミナーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ、パルミチルトランスフェラーゼ、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、トランスペプチダーゼ、カルボキシラーゼおよび／またはユビキチンリガーゼであり得る。
【００４１】
「グリコシルトランスフェラーゼ」は、一般にリン酸によって活性化された糖（ドナー）から、アクセプター分子（通常、アルコールまたはアミン）への単糖の転移を触媒可能である酵素を指すととられる。転移アクセプターはまた、ペプチド残基、通常、Ｏ−グリコシル化（Ｏ−マンノース、Ｏ−フコース、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ、Ｏ−ガラクトースおよびＯ−グルコース）の際のセリン、トレオニンもしくはより稀にはチロシン、ヒドロキシリジンおよびヒドロキシプロリンまたはＮ−グリコシル化の際のアスパラギンであり得る。活性化されたマンノースはまた、トリプトファンへ転移されて、Ｃ−マンノシルトリプトファンを形成し得る。グリコシルトランスフェラーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＢ、ＶＩおよびＩＸ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えば、ベータ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１、２、３、４、５、６および７から選択される、例えば、ベータ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、ＮｅｕＡｃシンターゼ、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１および２、タンパク質−Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ１および２、タンパク質−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ１、タンパク質−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１（ＦＵＴ１〜ＦＵＴ１１）およびシアリルトランスフェラーゼ、例えば、α２，３シアリルトランスフェラーゼおよびα２，６シアリルトランスフェラーゼから選択され得る。
【００４２】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸の鎖を指すととられる。例えば、ポリペプチドは、タンパク質、タンパク質サブユニット、タンパク質断片または簡単にアミノ酸の鎖であり得る。一般に、ポリペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸から形成される。
【００４３】
「対象のポリペプチド」または「組換え対象のポリペプチド」は、導入遺伝子によってコードされるポリペプチドを指すととられる。例えば、対象のポリペプチドは、多量体タンパク質のサブユニットであり得る。治療的および／または診断的に対象のポリペプチド、すなわち、治療または診断において使用され得るポリペプチドであることが有利である。
【００４４】
「対象の別個のポリペプチド」は、アミノ酸の同一配列を有さないポリペプチドを指すととられる。
【００４５】
「別個のサブユニット」は、アミノ酸の同一配列を有さない多量体タンパク質のサブユニットを指すととられる。したがって、「ｎ個の別個のサブユニットを含むタンパク質」は、各々、非共有結合および／または共有結合によって一緒に結合されるアミノ酸の特定の配列を有するｎ個のサブユニットを含むタンパク質である。
【００４６】
「多量体タンパク質」は、いくつかのサブユニットを含むタンパク質を指すととられる。多量体タンパク質は、いくつかの同一サブユニット（ホモ多量体タンパク質）またはいくつかの別個のサブユニット（ヘテロ多量体タンパク質）を含み得る。
【００４７】
「タンパク質複合体」は、互いとの機能的または構造的結合を有するいくつかのタンパク質から構成されるアセンブリー、例えば、「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）または多酵素複合体を指すととられる。
【００４８】
本発明によれば、表現「複製」または「ウイルス複製」は、バキュロウイルスゲノムおよびバキュロウイルスの複製の両方に及ぶと理解される。昆虫細胞におけるバキュロウイルスの複製にとって昆虫細胞におけるバキュロウイルスゲノムの複製が必須であることを考えると。したがって、ウイルス複製に必須の遺伝子は、昆虫細胞におけるバキュロウイルスの複製にとって必須である遺伝子を指すととられる。昆虫細胞におけるバキュロウイルスの複製は、感染性バキュロウイルスの作製を可能にする。したがって、本発明の方法は、細胞、とりわけ、昆虫細胞において感染性組換えバキュロウイルスを作製することを可能にする。
【００４９】
本発明の文脈内で、表現「相同組換え」は、２つの異なるヌクレオチド配列間の相同配列の存在を必要とする２つの異なるヌクレオチド配列間での遺伝情報の交換を指すととられる。
【００５０】
用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用され、所望の活性（例えば、抗原に結合される）を示す限り、その起源にかかわらない抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体の断片を含むがそれに制限されない、文献において広く記載される種々の抗体構造を包含する。単一特異的、多重特異的抗体、例えば、二重特異的であり得る。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭであり得る。抗体の断片の例として、それだけには限らないが、断片Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディー、ｓｃＦｖ／Ｆｃ、ラクダ科型の抗体（例えば、ＶＨＨ）、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【００５１】
組換えバキュロウイルスを調製する方法
本発明は、組換えバキュロウイルスを製造する方法であって、組換えバキュロウイルスのゲノムが、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含み、前記方法は、
ａ）ａ１）ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性であり、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む複製欠損バキュロウイルスゲノム、および
ａ２）ｉ）ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子のうち１つの機能を回復することを可能にするヌクレオチド配列、
ｉｉ）対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子のうち１個
を各々含むｎ個のトランスファーベクター
の間の相同組換えによって、昆虫細胞において、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含む複製可能なバキュロウイルスゲノムを調製する工程であって、
ｎ個のトランスファーベクターのヌクレオチド配列ｉ）のセットが、複製欠損バキュロウイルスゲノムの複製を回復可能であり、
ｎが、少なくとも２に等しい整数である、工程と、
ｂ）工程ａ）で得られた組換えバキュロウイルスゲノムを含む昆虫細胞において組換えバキュロウイルスを生成する工程と
を含む、方法に関する。
【００５２】
各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子は、ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性であり、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む複製欠損バキュロウイルスウイルスゲノムと組換えされる、ｎ個のトランスファーベクターによって担われる。組換え後、各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子は、組換えバキュロウイルスのゲノム中に組み込まれる。
【００５３】
工程ａ）
組換えは、昆虫細胞において、（ａ１）ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性であり、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む複製欠損バキュロウイルスゲノムと、（ａ２）ｎ個のトランスファーベクターの間で起こる。
【００５４】
組換えは、本発明の文脈内で、昆虫細胞において単一工程で起こり、これは、どのような組み込まれる導入遺伝子の数ｎであってもそのようなものであることが有利である。すなわち、各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子の、複製欠損バキュロウイルスゲノムとの組換えは、昆虫細胞において同時にまたは準同時に起こる。この同時組換えは、所望の組換えバキュロウイルスゲノムを迅速に、単一工程で製造することを可能にするので本発明の方法の主な利点の１つである。
【００５５】
特定の実施形態では、複製欠損バキュロウイルスゲノムは、ＢｍＮＰＶ、ＡｃＭＮＰＶ、ＡｐＮＰＶ、ＢｓＳＮＰＶ、ＣｆＭＮＰＶ、ＥｏＳＮＰＶ、ＨａＮＰＶ、ＨｚＮＰＶ、ＬｄＭＮＰＶ、ＭｂＭＮＰＶ、ＯｐＭＮＰＶ、ＳｌＭＮＰＶ、ＳｅＭＮＰＶまたはＴｅＮＰＶ、好ましくは、ＡｃＭＮＰＶのゲノムから選択される、またはそれらに由来するバキュロウイルスゲノムから得られる。
【００５６】
好ましい実施形態では、方法で実施される複製欠損バキュロウイルスゲノムは、環状形態である。したがって、本発明による方法は、複製欠損ゲノムの線状化を必要としない。
【００５７】
トランスファーベクターはまた、細菌細胞内で複製することを可能にする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含有し得る。それらはまた、トランスファーベクターを用いて形質転換された細菌細胞を選択または同定することを可能にする選択マーカーをコードする遺伝子を含有し得る。
【００５８】
本発明の方法の主な利点の１つは、複製欠損ウイルスバキュロウイルスゲノムの、複製する能力が、ｎ個のトランスファーベクターとの組換えによって回復される点である。実際、ｎ個のトランスファーベクターの各々は、対象のポリペプチドをコードするｎ個導入遺伝子のうちの１つに加えて、ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子のうちの１つの機能を回復させることを可能にするヌクレオチド配列をコードする。したがって、ｎ個のトランスファーベクターのセットとの組換えのみが、複製欠損バキュロウイルスゲノムの複製を回復させることを可能にする。したがって、本発明の方法は、対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスのゲノムのみが、感染性組換えバキュロウイルス生成できることを保証する。この方法は、対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを同定するための高価な時間のかかる試験を使用することを避ける。
【００５９】
好ましい実施形態では、ウイルス複製に必須の遺伝子は、１６２９（ＯＲＦ９）、Ｐｋ１（ＯＲＦ１０）、ｌｅｆ−１（ＯＲＦ１４）、ＯＲＦ３４、ｌｅｆ−１１（ＯＲＦ３７）、ｐ４７（ＯＲＦ４０）、ｌｅｆ８（ＯＲＦ５０）、ＤＮＡＪドメイン（ＯＲＦ５１）、ＯＲＦ５３、ｖｐ１０５４（ＯＲＦ５４）、Ｌｅｆ−９（ＯＲＦ６２）、ＤＮＡ  Ｐｏｌ（ＯＲＦ６５）、ｌｅｆ−３（ＯＲＦ６７）、ＯＲＦ７３、ＯＲＦ７５、ＯＲＦ８１、ｐ９５（ＯＲＦ８３）、ｖｐ３９（ＯＲＦ８９）、ｌｅｆ−４（ＯＲＦ９０）、ｐ３３（ＯＲＦ９２）、ヘリカーゼ（ＯＲＦ９５）、Ｖｐ８０（ＯＲＦ１０４）、ＯＲＦ１０６−１０７、ｏｄｖ−ｅｃ４３（ＯＲＦ１０９）、ｇｐ６４／６７（ＯＲＦ１２８）、ＯＲＦ１３２、ＯＲＦ１３３、ｏｄｖ−ｅｃ２７（ＯＲＦ１４４）、ＯＲＦ１４６、ｉｅ１（ＯＲＦ１４７）およびｌｅｆ−２（ＯＲＦ６）から選択される。これらの遺伝子は、それらがウイルス複製に必須ではない遺伝子に隣接しているので好ましい。したがって、好ましい実施形態では、複製欠損バキュロウイルスウイルスゲノムでは、ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子は、各々、ウイルス複製に必須ではない遺伝子と隣接している。本出願中で詳述されるように、ｎ個の導入遺伝子は、非機能性であるウイルス複製に必須の遺伝子に隣接している、ウイルス複製に必須ではない遺伝子の遺伝子座で各々組換えされる。ウイルス複製に必須ではない遺伝子は、バキュロウイルスゲノムの複製にとって必須ではないことを考えると、組換えは、組換えバキュロウイルスゲノムの複製する能力に影響を及ぼさない。
【００６０】
ｎ個の導入遺伝子は、ウイルス複製に必須ではない遺伝子内または２つの非必須遺伝子の間の遺伝子間領域中、または代わりに、ウイルス複製に必須の遺伝子の上流もしくは下流のいずれかに組み込まれる。
【００６１】
導入遺伝子が必須遺伝子の上流または下流に組み込まれる場合には（ｏｒｆ５１の下流に遺伝子ＳＴ３を組み込んだ、実施例１２に記載されるＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１、４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳ−ＳＴ３（またはＢａｃＳｉａ３）の構築）、しかし、このように作製されたバキュロウイルスは、生存可能であっても変更された複製、したがって相対的に低いウイルス力価を有し得る。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態によれば、ｎ個の導入遺伝子は、ウイルス複製に必須ではないｎ個の遺伝子内に組み込まれ、これが、複製サイクルの過程でかなりより安定なバキュロウイルスを得、したがって、工業製品を想定するのに十分なウイルス力価を得ることを可能にする。
【００６３】
ウイルス複製に必須ではない遺伝子内への導入遺伝子の組込みの例は、実施例において、とりわけ、実施例９において、遺伝子Ｃｈｉｔ／Ｃａｔｈにおける遺伝子ｆｕｒの組込みを用いて、実施例１０において、遺伝子ｅｇｔにおける遺伝子β１，４ＧａｌＴの組込みを用いて、実施例１２において、遺伝子ｉａｐ２における遺伝子ＮｅｕＡｃシンターゼおよびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼの組込みを用いておよび実施例１４において、ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳのＯＲＦ１１９（ＰＩＦ１）における導入遺伝子α２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ＳＴ６ＧａｌＩ）のクローニングに対して記載されている。
【００６４】
本発明の意味において、２つの遺伝子が互いに続く場合、ウイルス複製に必須の非機能性遺伝子は、ウイルス複製に必須ではない遺伝子に隣接する、またはバキュロウイルスのゲノム上で部分的に重複する、好ましくは、その他の遺伝子は、ウイルス複製に必須の非機能性遺伝子とウイルス複製に必須ではない遺伝子の間に含まれない。２つの前記遺伝子は、スペーサーヌクレオチド配列、例えば、非コーディングスペーサーヌクレオチド配列によって分離されていることが有利である。特に、スペーサーヌクレオチド配列は、１ｐｂ〜６００ｐｂの範囲の長さを有する。また、分離しないヌクレオチド配列（すなわち０ｐｂ）が、２つの前記遺伝子を分離すること、すなわち、２つの前記遺伝子が、バキュロウイルスのゲノム上に並んで配置される、または部分的に重複することも可能である。あるいは、スペーサーヌクレオチド配列は、ウイルス複製に必須ではない遺伝子を含んでもよい。
【００６５】
本出願人は、ウイルス複製に必須ではない遺伝子に隣接するウイルス複製に必須の非機能性遺伝子の選択が特に有利であり、均一な相同組換えを得、したがって、均一な組換えバキュロウイルスゲノムを得ることを可能にすることに気付いた。別の場所で説明したように、ｎ個のベクターの完全な組換えのみが、昆虫細胞において複製可能な組換えバキュロウイルスゲノムを得ることを可能にする。したがって、本発明による方法によって調製された組換えバキュロウイルスのゲノムは、９０％超まで、有利には、９５％超まで、好ましくは、９９％超まで、完全に好ましい方法では、およそ１００％均一である、例えば、本発明による方法によって調製された組換えバキュロウイルスゲノムは、すべて同一である。
【００６６】
特定の実施形態では、ウイルス複製に必須ではない遺伝子は、Ｐｈ（ＯＲＦ８）、ＯＲＦ１１、ＯＲＦ１３、ｅｇｔ（ＯＲＦ１５）、ｖ−ユビキチン（ＯＲＦ３５）、３９Ｋ（ＯＲＦ３６）、ＯＲＦ３８、ｐ４３（ＯＲＦ３９）、ｌｅｆ−１２（ＯＲＦ４１）、ｐｃｎａ（ＯＲＦ４９）、ＯＲＦ５２、ＯＲＦ５５、Ｆｐ（ＯＲＦ６１）、ＯＲＦ６３、ｇｐ３７（ＯＲＦ６４）、ＯＲＦ６８、ＯＲＦ７２、ＯＲＦ７４、ＯＲＦ８２、ｃｇ３０（ＯＲＦ８８）、ＯＲＦ９１、ｐｉｆ−４（ＯＲＦ９６）、ｈｅ６５（ＯＲＦ１０５）、ＯＲＦ１０８、ＯＲＦ１１０、カテプシン（ＯＲＦ１２７）、ｐ２４（ＯＲＦ１２９）、ｐｐ３４（ＯＲＦ１３１）、ＯＲＦ１３４、ＯＲＦ１４５、ｏｄｖ−ｅ５６（ＯＲＦ１４８）、ＯＲＦ５から選択される。
【００６７】
ウイルス複製に必須の遺伝子／ウイルス複製に必須ではない遺伝子の一対は、以下の表１に列挙される一対から選択されることが有利である：
【００６８】
【表１−１】
2021500052.tif 000002
【表１−２】
2021500052.tif 000003
【００６９】
灰色線／太字は、実施例１、２および３のバキュロウイルスにおける非機能性必須遺伝子を表す。
【００７０】
有利な実施形態では、ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子の機能を回復させることが可能なｎ個のヌクレオチド配列は、各々、表１に列挙されるものなどのウイルス複製に必須の非機能性遺伝子と組換えされ、一方で、対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子は、各々、ウイルス複製に必須ではない遺伝子の遺伝子座と組換えされ、前記の必須ではない遺伝子は、表１に提示されるものなどの相同組換えのこの工程の間に機能が回復される前記の必須遺伝子に隣接する遺伝子である。
【００７１】
したがって、機能が回復される必須遺伝子が、遺伝子１６２９（ＯＲＦ９）である場合には、対象のペプチドをコードする導入遺伝子は、必須ではない遺伝子Ｐｈ（ＯＲＦ８）中に組み込まれ、機能が回復される必須遺伝子が、遺伝子Ｐｋ１（ＯＲＦ１０）である場合には、対象のペプチドをコードする導入遺伝子は、必須ではない遺伝子ＯＲＦ１１中に組み込まれ、表１に列挙される隣接する遺伝子の各対についてそのようである。
【００７２】
本発明による方法は、相同分子間組換えの機序を実施する。一般的に言えば、相同組換えの機序は、複製欠損バキュロウイルスゲノムとｎ個のトランスファーベクター間の相同ヌクレオチド配列の交換からなる。これらのヌクレオチド配列は、同一である場合も、実質的に相同である場合もある。
【００７３】
特に有利な実施形態では、トランスファーベクターは、対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現カセットのいずれかの側に、複製欠損バキュロウイルスゲノムに対して相同なフランキング配列を含む。フランキング配列の、複製欠損バキュロウイルスゲノムの対応する部分との相同性の程度は、変わり得るが、分子間組換えを可能にするように十分でなくてはならない。本発明の目的上、７０％超が好ましく、有利には、８０％超、好ましくは、９０％超および完全に好ましい方法では、およそ１００％、好ましくは、同一である。さらに、相同性の短い領域は、分子間組換えを可能にするのに十分であり得る、すなわち、配列と、複製欠損バキュロウイルスゲノム中のその相同配列間で共通の少なくとも１０の連続するヌクレオチド（または塩基対）。本発明の文脈内で、フランキング配列の長さは、１０ｐｂ（すなわち、１０塩基対）〜１０ｋｂ（すなわち、１０，０００塩基対）、有利には、１００ｐｂ〜６ｋｂ、好ましくは、２００ｐｂ〜６ｋｂ、完全に好ましい方法では、４００ｐｂ〜６ｋｂの範囲であり得る。したがって、ｎ個のトランスファーベクターのフランキング配列の間に位置する遺伝物質は、複製欠損バキュロウイルスゲノムのフランキング配列に対して相同な２つの配列の間に位置する遺伝物質と置き換わる。この分子間交換は、昆虫細胞において感染性組換えバキュロウイルスを生成可能な組換えバキュロウイルスゲノムを得ることを可能にする。
【００７４】
本発明によれば、ｎ個のトランスファーベクターのヌクレオチド配列ｉ）（すなわち、ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子の機能を回復させることを可能にするヌクレオチド配列）のセットは、複製欠損バキュロウイルスゲノムの複製を回復可能である。実際、分子間交換は、ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子の機能を回復させることを可能にする。言い換えれば、ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子の機能の回復は、相同組換えが正確に起こるときに生じる。これは、ｎ個のトランスファーベクターが各々、ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子のうち１つの機能を回復させることを可能にするヌクレオチド配列を含むという事実に起因する。
【００７５】
例えば、ｎ＝２の場合、ウイルス複製に必須の２つの遺伝子が非機能性である複製欠損バキュロウイルスゲノムが、ウイルス複製に必須の２つの非機能性遺伝子のうち１つの機能を回復させることを可能にするヌクレオチド配列を各々含む２つのトランスファーベクターと組換えされる。これは、第１のトランスファーベクターとの組換えが、ウイルス複製に必須の第１の非機能性遺伝子の機能を回復させることを可能にし、第２のトランスファーベクターとの組換えが、ウイルス複製に必須の第２の非機能性遺伝子の機能を回復させることを可能にすることを意味する。したがって、２つのトランスファーベクターの、複製欠損バキュロウイルスゲノムとの組換えのみが、ウイルス複製に必須の２つの非機能性遺伝子の機能を回復させること、したがって、複製欠損バキュロウイルスゲノムの複製を回復させることを可能にする。この２つの必須遺伝子の機能の回復は、昆虫細胞において感染性組換えバキュロウイルスを作製可能な組換えバキュロウイルスゲノムを得ることを可能にする。
【００７６】
したがって、本発明の方法によれば、複製欠損バキュロウイルスゲノムの複製を回復させるには、ｎ個のトランスファーベクターを用いる組換えまたは多重組換えが必要である。
【００７７】
驚くべき方法では、本発明者らは、多重組換えが、昆虫細胞において同時に単一工程で行われ得ることを実証した。これは、複製欠損バキュロウイルスゲノムおよびｎ個のトランスファーベクターが、昆虫細胞中に同時に導入され得る、すなわち、複製欠損バキュロウイルスゲノムおよびｎ個のトランスファーベクターが昆虫細胞中に同時に導入される、言い換えれば、複製欠損バキュロウイルスゲノムおよびｎ個のトランスファーベクターが昆虫細胞中に単一工程で導入される、これは、どのようなトランスファーベクターの数ｎであってもそのようなものであるので特に有利である。単一工程での多重組換えは、均一な組換えバキュロウイルスゲノムを容易に、迅速に得ることを可能にする。
【００７８】
本発明による方法は、各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを製造することを可能にする。ｎ個の対象のポリペプチドのセットは、例えば、いくつかのサブユニットを含むタンパク質を形成し得る。ｎ個の対象のポリペプチドのセットはまた、タンパク質複合体、例えば、ＶＬＰの構成タンパク質であり得る。ｎ個の対象のポリペプチドのセットは、各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子を含む組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞によって産生される。
【００７９】
したがって、特定の実施形態では、ｎ個の対象のポリペプチドは、いくつかの別個の対象のタンパク質を形成する。単一ポリペプチド鎖を含むいくつかの別個の対象のタンパク質、いくつかの同一サブユニットを含むいくつかの別個の対象のタンパク質および／またはいくつかの別個のサブユニットを含むいくつかの別個の対象のタンパク質を含み得る。ｎ個の対象のポリペプチドによって形成される別個の対象のタンパク質の数は、ｎ以下となる。例えば、３つの対象のポリペプチド（ｎ＝３）は、（ｉ）単一ポリペプチド鎖を含む第１の対象のタンパク質および２つの別個のサブユニットを含む第２の対象のタンパク質、（ｉｉ）各々単一ポリペプチド鎖を含む３つの別個の対象のタンパク質、（ｉｉｉ）いくつかの同一サブユニットを含む第１の対象のタンパク質および２つの別個のサブユニットを含む第２の対象のタンパク質または（ｉｖ）各々いくつかの同一サブユニットを含む３つの別個の対象のタンパク質を形成し得る。
【００８０】
別の特定の実施形態では、ｎ個の対象のポリペプチドは、単一タンパク質を形成する。この実施形態では、タンパク質は、次いで、ｎ個の別個のサブユニットを含み、サブユニットの各々は、ｎ個の対象のポリペプチドのうちの１つである。
【００８１】
したがって、本発明による方法は、いくつかの別個のサブユニットを含む対象のタンパク質、例えば、すべてのサブユニットを含む場合のみ活性である対象のタンパク質をコードする導入遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを調製するのに特に有利である。サブユニットは、一般に、非共有結合（例えば、疎水結合）および／または共有結合（例えば、２つのシステイン間のジスルフィド橋）によって一緒に結合されている。本発明の方法は、したがって、多量体タンパク質、例えば、抗体または抗体断片をコードする導入遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを調製するのに特に有利である。
【００８２】
トランスファーベクターの数は、製造しようとされる別個の対象のポリペプチドの所望の数に応じて変わる。例えば、２つのトランスファーベクターが、２つの別個のサブユニットを含むタンパク質のために使用され、３つのトランスファーベクターが、３つの別個のサブユニットを含むタンパク質のために使用されるなど。各トランスファーベクターは、その他のトランスファーベクター中に含まれるその他の対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子とは異なる対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むことが有利である。特定の実施形態では、トランスファーベクターは、各々対象のポリペプチドをコードする２つ以上の導入遺伝子、例えば、２つの導入遺伝子を含み得る。この特定の実施形態では、導入遺伝子、好ましくは、遺伝子座あたり最大で２つの導入遺伝子が、同一遺伝子座中に存在し得る。
【００８３】
ｎは、２〜３１の範囲の、例えば、２〜１０の範囲の整数であることが有利である。例えば、いくつかの別個のサブユニットを含む対象のタンパク質について、ｎの値は、前記の対象のタンパク質の別個のサブユニットの数に対応する。
【００８４】
特定の実施形態では、ｎ＝２である。この場合には、以下の実施を区別することが可能である：
−  ２つの導入遺伝子は各々、２つのサブユニットを含むタンパク質のサブユニットをコードし、２つの導入遺伝子は各々、２つの別個のサブユニットを含むタンパク質の別個のサブユニットをコードすることが有利である。例えば、第１の導入遺伝子は、抗体の軽鎖をコードし、第２の導入遺伝子は、抗体の重鎖をコードする。このような例示的立体配置は、実施例６に記載されている。２つの別個のサブユニットを含むタンパク質はまた、単一特異性抗体または２つの別個のサブユニットを含むペプチドホルモンであり得る、または
−  ２つの導入遺伝子は各々、別個の対象のポリペプチドをコードする。例えば、２つの別個の対象のポリペプチドは、２つのウイルスタンパク質のセット、多重酵素複合体、タンパク質複合体、例えば、２つの別個のタンパク質から構成されるＶＬＰを構成する。
【００８５】
図１６、１７および１９は、２つの対象の導入遺伝子を含むバキュロウイルスゲノムの表示を図式的に例示する。
【００８６】
特定の実施形態では、ｎ＝３である。この場合には、以下の実施を区別することが可能である：
−  ３つの導入遺伝子は各々、３つのサブユニットを含むタンパク質のサブユニットをコードし、３つの導入遺伝子は各々、３つの別個のサブユニットを含むタンパク質の別個のサブユニットをコードすることが有利である。３つの別個のサブユニットを含むタンパク質は、二重特異性抗体または３つの別個のサブユニットを含むペプチドホルモンであり得る。例えば、第１の導入遺伝子は、二重特異性抗体の第１の軽鎖をコードし、第２の導入遺伝子は、二重特異性抗体の第２の軽鎖をコードし、第３の導入遺伝子は、二重特異性抗体の重鎖をコードする、または
−  ３つの導入遺伝子は各々、別個の対象のポリペプチドをコードする。例えば、３つの対象のポリペプチドは、３つのウイルスタンパク質のセット、多重酵素複合体、タンパク質複合体、例えば、３つの別個のタンパク質から構成されるＶＬＰを構成する。このような例示的立体配置は、実施例７に提示され、ｆｌｕウイルスの３つのタンパク質の製造のために「ＢａｃＭｉｄ３」が使用される（図１０も参照のこと）。
【００８７】
この特定の実施形態のために、複製に必須である遺伝子１６２９、ＤＮＡｐｏｌおよびｇｐ６４が非機能性である、実施例３に記載されるバキュロウイルスＢａｃＭｉｄ３が、これら３種の導入遺伝子の同時組込みのために使用され得る。特定の実施形態では、ｎ＝４である。この場合には、以下の実施を区別することが可能である：
−  ４つの導入遺伝子は各々、４つのサブユニットを含むタンパク質のサブユニットをコードし、４つの導入遺伝子は各々、４つの別個のサブユニットを含むタンパク質の別個のサブユニットをコードすることが有利である。４つの別個のサブユニットを含むタンパク質は、４つの別個のサブユニットを含むペプチドホルモンであり得る、または、
−  ４つの導入遺伝子は各々、別個の対象のポリペプチドをコードする。例えば、４つの対象のポリペプチドは、４つのウイルスタンパク質のセット、多重酵素複合体、タンパク質複合体、例えば、４つの別個のタンパク質から構成されるＶＬＰを構成する。
【００８８】
本発明の方法の実施によって製造される組換えバキュロウイルスは、細菌細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含まないことが有利である。適宜、細菌細胞内で複製欠損バキュロウイルスゲノムを複製することを可能にする核酸配列は、昆虫細胞における相同組換えの工程の間に排除され得る。
【００８９】
工程ａ）は、トランスファーベクターおよび複製欠損バキュロウイルスゲノムの昆虫細胞への導入後に実施される。この導入は、先行技術において広く記載されている技術を用いて実施され得る。とりわけ、リン酸カルシウム技術、ＤＥＡＥデキストラン技術、エレクトロポレーション、浸透圧ショックに基づく方法、マイクロインジェクションまたはリポソームの使用に基づく方法、好ましくは、リポフェクションを引用することが可能である。本発明による方法は、ｎ個のトランスファーベクターおよび複製欠損バキュロウイルスゲノムを、昆虫細胞中に単一工程で導入することを可能にするので特に有利である。昆虫細胞中に導入される複製欠損バキュロウイルスゲノムおよびトランスファーベクターの量は変わり得る。複製欠損バキュロウイルスゲノムの量に関して、ｎ個のトランスファーベクターの各々を５倍多い量使用することが好ましい。複製欠損バキュロウイルスゲノムは、昆虫細胞中に、環状形態で、すなわち、事前に線状化されずに導入されることが有利である。線状化は、バキュロウイルスゲノムは複製欠損であるので、環状形態でさえ、ウイルス複製に必須の非機能性遺伝子を含むので不必要である。線状化工程がないことは、本発明の方法の大きな利点の１つである。
【００９０】
上記で詳述したように、タンパク質成熟酵素は、ペプチダーゼシグナル、フューリン、プロタンパク質転換酵素、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、タンパク質シャペロン、ジスルフィドイソメラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、トランスグルタミナーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニル−トランスフェラーゼ、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ、パルミチルトランスフェラーゼ、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、トランスペプチダーゼ、カルボキシラーゼまたはユビキチンリガーゼから選択され得る。
【００９１】
タンパク質成熟酵素の選択は、対象のポリペプチド、とりわけ、対象のポリペプチドが受けなければならない成熟の種類に応じて変わる。例えば、対象のポリペプチドが、対象のグリコシル化タンパク質、例えば、抗体のサブユニットを形成する場合には、成熟酵素は、所望のグリコシル化を得ることを可能にする１つまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼであり得る。当業者ならば、所望のグリコシル化の機能として適したグリコシルトランスフェラーゼを容易に選択できよう。例えば、グリコシルトランスフェラーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＢ、ＶＩ、ＩＸ、ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１、２、３、４、５、６および７から選択される、例えば、ベータ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンターゼ、ＮｅｕＡｃシンターゼ、シアリルトランスフェラーゼ（例えば、α２，３シアリルトランスフェラーゼまたはα２，６シアリルトランスフェラーゼ）、タンパク質−Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１および２、タンパク質−Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ１および２、タンパク質−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ１、タンパク質−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１（ＦＵＴ１〜ＦＵＴ１１）から選択され得る。
【００９２】
特定の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、ベータ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼから選択される１つまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼである。
【００９３】
工程ａ１
特定の実施形態では、工程ａ１）の複製欠損バキュロウイルスゲノムは、細菌細胞において、
ｉ）ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性である複製欠損バキュロウイルスゲノムと、
ｉｉ）各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を各々含む１つまたは複数のヌクレオチド配列
の間の相同組換えによって調製される。
【００９４】
したがって、この特定の実施形態では、本発明の方法は、
ａ’）細菌細胞において、
ａ’１）ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性である複製欠損バキュロウイルスゲノムと、
ａ’２）各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を各々含む１つまたは複数のヌクレオチド配列
の間の相同組換えによって、ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性であり、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む第１の複製欠損バキュロウイルスゲノムを調製する工程と、
ａ）昆虫細胞において、
ａ１）工程ａ）から得られた第１の複製欠損バキュロウイルスゲノムと、
ａ２）ｉ）ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子のうち１つの機能を回復させることを可能にするヌクレオチド配列と、
ｉｉ）対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子のうち１つ
を各々含むｎ個のトランスファーベクター
の間の相同組換えによって、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々対象のポリペプチド（組換えバキュロウイルスゲノム）をコードするｎ個の導入遺伝子を含む複製可能な第２のバキュロウイルスゲノムを調製する工程であって、
ｎ個のトランスファーベクターのヌクレオチド配列のセットｉ）は、第１の複製欠損バキュロウイルスゲノムの複製を回復可能であり、
ｎは、少なくとも２に等しい整数である、工程と、
ｂ）工程ｂ）で得られた組換えバキュロウイルスゲノムを含む昆虫細胞において組換えバキュロウイルスを作製する工程と
を含む。
【００９５】
この実施形態では、第１の組換えは、細菌細胞において、（ａ’１）ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性である複製欠損バキュロウイルスゲノムと、（ａ’２）各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を各々含む１つまたは複数のヌクレオチド配列の間で起こる。
【００９６】
好ましくは、タンパク質成熟酵素をコードする導入遺伝子は各々、ウイルス複製に必須ではない遺伝子の遺伝子座で、好ましくは、ウイルス複製に必須の非機能性遺伝子に対して隣接していない、ウイルス複製に必須ではない遺伝子の遺伝子座で、組換えされる。ウイルス複製に必須ではない遺伝子は、ｐｔｐ（ＯＲＦ１）、ｃｔｘ（ＯＲＦ３）、ＯＲＦ４、ＯＲＦ７、ｏｄｖ−ｅ２６（ＯＲＦ１６）、ＯＲＦ１７、ＯＲＦ１８、ＯＲＦ１９、ＡＲＩＦ−１  ＯＲＦ２０−２１、ｐｉｆ２（ＯＲＦ２２）、タンパク質Ｆ（ＯＲＦ２３）、ｉａｐ１（ＯＲＦ２７）、ｌｅｆ６（ＯＲＦ２８）、ＯＲＦ２９、ＯＲＦ３０、ｓｏｄ（ＯＲＦ３１）、ｆｇｆ（ＯＲＦ３２）、ｇｔａ（ＯＲＦ４２）、ＯＲＦ４３、ＯＲＦ４４、ＯＲＦ４５、ｏｄｖ−ｅ６６（ＯＲＦ４６）、ＯＲＦ４７、ＯＲＦ５６、ＯＲＦ５７、ｃｈａＢ様（ＯＲＦ５８／５９）、ｃｈａＢ様（ＯＲＦ６０）、ｍｔａｓｅ（ＯＲＦ６９）、ｈｃｆ−１（ＯＲＦ７０）、ｉａｐ２（ＯＲＦ７１）、ＯＲＦ８６、ＯＲＦ８７、ＯＲＦ１１１、ＯＲＦ１１４、ｐｉｆ３（ＯＲＦ１１５）、ＯＲＦ１１６、ＯＲＦ１１７、ｐｉｆ（ＯＲＦ１１９）、ＯＲＦ１２０、ＯＲＦ１２１、ＯＲＦ１２２、ｐｋ２（ＯＲＦ１２３）、ＯＲＦ１２４、ｌｅｆ７（ＯＲＦ１２５）、キチナーゼ（ＯＲＦ１２６）、ｇｐ１６（ＯＲＦ１３０）、ｐ３５（ＯＲＦ１３５）、ｐ２６（ＯＲＦ１３６）、ｐ１０（ＯＲＦ１３７）、ｐ７４（ＯＲＦ１３８）、ＯＲＦ１４９、ＯＲＦ１５０、ｉｅ２（ＯＲＦ１５１）、ｐｅ３８（ＯＲＦ１５３）およびＯＲＦ１５４から選択されることが有利である。
【００９７】
この特定の実施形態では、細菌細胞は、ｍｉｎｉ−Ｆ複製起源を含有するバキュロウイルスゲノムの複製を支持する細菌である。細菌細胞は、好ましくは、大腸菌、とりわけ、ＤＨ１０ＢまたはＥＬ３５０である。
【００９８】
工程ｂ）
工程ｂ）は、工程ａ）で得られた組換えバキュロウイルスゲノムを含む昆虫細胞において、組換えバキュロウイルスを作製することからなる。例えば、工程ａ）の昆虫細胞であり得る。
【００９９】
昆虫細胞は、とりわけ、細胞の成長に適した培養培地において組換えバキュロウイルスを発現するような適した条件で培養されることが有利である。培養培地は、動物起源の血清を含有してもよく、血清を含まない培養培地であってもよい。
【０１００】
昆虫細胞は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５−ｂ１４、バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶに対して感受性の鱗翅目（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）細胞株、株Ｓｆ２１、「ハイファイブ」株から選択されることが有利であり、好ましくは、Ｓｆ９である。
【０１０１】
このように作製された組換えバキュロウイルスは、その他の昆虫細胞に感染させるために使用され得る。組換えバキュロウイルスに感染したこれらの昆虫細胞は、次いで、各々、導入遺伝子を産生し得る。したがって、この導入遺伝子各々の産生によって、タンパク質成熟酵素によって成熟したｎ個の対象のポリペプチドを得ることが可能になる。
【０１０２】
特定の実施形態では、組換えバキュロウイルスは、真核細胞に感染させるために使用され得る。実際、バキュロウイルスは、真核細胞に感染できることがわかっている。
【０１０３】
したがって、本発明による方法は、ゲノムが各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および各々別個の対象のポリペプチドをコードするｎ個の別個の導入遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを容易に、迅速に製造することを可能にする。
【０１０４】
組換えバキュロウイルス
本発明はまた、
ａ）各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子と、
ｂ）式（Ｉ）：
［対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子］−［スペーサーヌクレオチド配列］−［機能性ウイルス複製に必須の遺伝子］（Ｉ）
のｎ個のヌクレオチド配列と
を含み、
前記スペーサー核酸配列は、０〜６００ｐｂ、好ましくは、１〜６００塩基対から構成され、
前記の機能性ウイルス複製に必須の遺伝子は、１６２９（ＯＲＦ９）、Ｐｋ１（ＯＲＦ１０）、ｌｅｆ−１（ＯＲＦ１４）、ＯＲＦ３４、ｌｅｆ−１１（ＯＲＦ３７）、ｐ４７（ＯＲＦ４０）、ｌｅｆ８（ＯＲＦ５０）、ＤＮＡＪドメイン（ＯＲＦ５１）、ＯＲＦ５３、ｖｐ１０５４（ＯＲＦ５４）、Ｌｅｆ−９（ＯＲＦ６２）、ＤＮＡ  Ｐｏｌ（ＯＲＦ６５）、ｌｅｆ−３（ＯＲＦ６７）、ＯＲＦ７３、ＯＲＦ７５、ＯＲＦ８１、ｐ９５（ＯＲＦ８３）、ｖｐ３９（ＯＲＦ８９）、ｌｅｆ−４（ＯＲＦ９０）、ｐ３３（ＯＲＦ９２）、ヘリカーゼ（ＯＲＦ９５）、Ｖｐ８０（ＯＲＦ１０４）、ＯＲＦ１０６−１０７、ｏｄｖ−ｅｃ４３（ＯＲＦ１０９）、ｇｐ６４／６７（ＯＲＦ１２８）、ＯＲＦ１３２、ＯＲＦ１３３、ｏｄｖ−ｅｃ２７（ＯＲＦ１４４）、ＯＲＦ１４６、ｉｅ１（ＯＲＦ１４７）、ｌｅｆ−２（ＯＲＦ６）から選択され
ｎは、少なくとも２に等しい整数である、
組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノムを保護することを目的とする。
【０１０５】
本発明による組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノムは、細菌細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含まないことが有利である。実際、このような配列の不在が、このような配列を含む組換えバキュロウイルスと比較して組換えバキュロウイルスの安定性を増大することを可能にすることが実証されている（Piljmann et al. (2003) Journal of General Virology）。
【０１０６】
本発明による組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノムは、Ｐｈ（ＯＲＦ８）、ＯＲＦ１１、ＯＲＦ１３、ｅｇｔ（ＯＲＦ１５）、ｖ−ユビキチン（ＯＲＦ３５）、３９Ｋ（ＯＲＦ３６）、ＯＲＦ３８、ｐ４３（ＯＲＦ３９）、ｌｅｆ−１２（ＯＲＦ４１）、ｐｃｎａ（ＯＲＦ４９）、ＯＲＦ５２、ＯＲＦ５５、Ｆｐ（ＯＲＦ６１）、ＯＲＦ６３、ｇｐ３７（ＯＲＦ６４）、ＯＲＦ６８、ＯＲＦ７２、ＯＲＦ７４、ＯＲＦ８２、ｃｇ３０（ＯＲＦ８８）、ＯＲＦ９１、ｐｉｆ−４（ＯＲＦ９６）、ｈｅ６５（ＯＲＦ１０５）、ＯＲＦ１０８、ＯＲＦ１１０、カテプシン（ＯＲＦ１２７）、ｐ２４（ＯＲＦ１２９）、ｐｐ３４（ＯＲＦ１３１）、ＯＲＦ１３４、ＯＲＦ１４５、ｏｄｖ−ｅ５６（ＯＲＦ１４８）、ＯＲＦ５から選択されるウイルス複製に必須ではないｎ個の遺伝子を含まないことが有利である。カテプシンは、産生される対象のポリペプチドに対して有害な効果を有し得るので、組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノム中に含まれないウイルス複製に必須ではないｎ個の遺伝子のうち１つは、カテプシンをコードする遺伝子であることが有利である。
【０１０７】
本発明によれば、上記の節「組換えバキュロウイルスを調製する方法」に詳述されたように、ｎは、少なくとも２に等しい整数、例えば、２〜３０の範囲の、例えば、２〜１０の範囲の、より詳しくは、２、３または４に等しい整数である。
【０１０８】
本発明の特定の実施形態によれば、ｎは、３以上である。
【０１０９】
本発明はまた、
ａ）各々、タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子と、
ｂ）式（Ｉ）：
［対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子］−［スペーサーヌクレオチド配列］−［機能性ウイルス複製に必須の遺伝子］（Ｉ）
のｎ個のヌクレオチド配列と
を含み、
前記スペーサー核酸配列は、０〜６００ｐｂ、好ましくは、１〜６００塩基対から構成され、
前記機能性ウイルス複製に必須の遺伝子は、１６２９（ＯＲＦ９）、Ｐｋ１（ＯＲＦ１０）、ｌｅｆ−１（ＯＲＦ１４）、ＯＲＦ３４、ｌｅｆ−１１（ＯＲＦ３７）、ｐ４７（ＯＲＦ４０）、ｌｅｆ８（ＯＲＦ５０）、ＤＮＡＪドメイン（ＯＲＦ５１）、ＯＲＦ５３、ｖｐ１０５４（ＯＲＦ５４）、Ｌｅｆ−９（ＯＲＦ６２）、ＤＮＡ  Ｐｏｌ（ＯＲＦ６５）、ｌｅｆ−３（ＯＲＦ６７）、ＯＲＦ７３、ＯＲＦ７５、ＯＲＦ８１、ｐ９５（ＯＲＦ８３）、ｖｐ３９（ＯＲＦ８９）、ｌｅｆ−４（ＯＲＦ９０）、ｐ３３（ＯＲＦ９２）、ヘリカーゼ（ＯＲＦ９５）、Ｖｐ８０（ＯＲＦ１０４）、ＯＲＦ１０６−１０７、ｏｄｖ−ｅｃ４３（ＯＲＦ１０９）、ｇｐ６４／６７（ＯＲＦ１２８）、ＯＲＦ１３２、ＯＲＦ１３３、ｏｄｖ−ｅｃ２７（ＯＲＦ１４４）、ＯＲＦ１４６、ｉｅ１（ＯＲＦ１４７）、ｌｅｆ−２（ＯＲＦ６）から選択され、
ｎは、少なくとも２に等しい整数である、本発明による製造方法によって得られることが可能な組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノムを保護することを目的とする。
【０１１０】
式（Ｉ）のｎ個のヌクレオチド配列は、組換えバキュロウイルスのゲノム全体に広げられ、これが、その安定性を改善することを可能にすることが有利である。したがって、式（Ｉ）のｎ個のヌクレオチド配列は、バキュロウイルスのゲノム上で十分に離れて間隔がとられる。式（Ｉ）のｎ個のヌクレオチド配列の各々が、式（Ｉ）のｎ個のヌクレオチド配列の別のものに関して少なくとも５００ヌクレオチド離れて間隔がとられることが有利である。式（Ｉ）のｎ個のヌクレオチド配列が、ゲノム全体にわたって広がっている組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノムを得ることは、ゲノム上の分布は、選択される「必須である遺伝子／必須ではない遺伝子」対と関連付けられるので当業者にとって特定の困難は全く示さない。
【０１１１】
これは、本発明による調製方法の実施において固有であり、式（Ｉ）のｎ個のヌクレオチド配列は、組換えバキュロウイルスのゲノム上で重複されないので有利である。実際、配列がゲノム上で重複される場合（示されていないデータ）の組換えバキュロウイルスの安定性の低下は実証されている。
【０１１２】
相同組換えエレメントのセット
本発明はまた、
ａ）ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性であり、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む複製欠損バキュロウイルスゲノムと、
ｂ）ｉ）ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子のうち１つの機能を回復させることを可能にする核酸配列と、
ｉｉ）対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子と
を各々含むｎ個のトランスファーベクターとを含み、
ｎが少なくとも２に等しい整数である、相同組換えエレメントのセットを保護することを目的とする。
【０１１３】
上記の節「組換えバキュロウイルスを調製する方法」に記載されるように、ウイルス複製に必須の非機能性遺伝子は、ウイルス複製に必須ではない遺伝子に各々隣接することが有利である。
【０１１４】
特定の実施形態では、トランスファーベクターは、導入遺伝子の発現カセットのいずれかの側に、複製欠損バキュロウイルスゲノムに対して相同なフランキング配列を含む。トランスファーベクターの各々のフランキング配列は、前記のウイルス複製に必須の非機能性遺伝子のすべてまたは一部に対して、ならびに前記のウイルス複製に必須ではない遺伝子のすべてまたは一部に対して相同であることが有利である。有利である。フランキング配列は、１０ｐｂ（すなわち、１０塩基対）〜１０ｋｂ（すなわち、１０，０００塩基対）の範囲であり得る、有利には、１００ｐｂ〜６ｋｂの範囲の、好ましくは、２００ｐｂ〜６ｋｂの範囲の、完全に好ましい方法では、４００ｐｂ〜６ｋｂの範囲の長さを有する。フランキング配列は、上記の節「組換えバキュロウイルスを調製する方法」に詳細に記載される。
【０１１５】
上記の節「組換えバキュロウイルスを調製する方法」に詳述されるように、ｎは、２〜３１の範囲の、例えば、２〜１０の範囲の整数であることが有利である。
【０１１６】
細胞
本発明はまた、本発明による組換えバキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスゲノムを含む細胞または本発明による相同組換えエレメントのセットを含む細胞を保護することを目的とする。
【０１１７】
特定の実施形態では、上記の節「組換えバキュロウイルスを調製する方法」により詳細に記載されるように、細胞は、好ましくは、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５−ｂ１４、バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶに対して感受性の鱗翅目（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）細胞株、株Ｓｆ２１から選択される昆虫細胞、好ましくは、Ｓｆ９である。
【０１１８】
使用
本発明はまた、各々対象のポリペプチドをコードするｎ個の導入遺伝子の製造のための、本発明による組換えバキュロウイルスもしくは組換えバキュロウイルスゲノムまたは本発明による細胞の使用を標的とする。
【０１１９】
バキュロウイルスからの組換え対象のポリペプチドの製造は、先行技術に十分に記載されており、当業者に周知の技術によって容易に実施され得る。
【０１２０】
「単一組換え体（Mono-recombinant）」バキュロウイルス
特定の実施形態では、本発明の方法は、「単一組換え体」バキュロウイルス、すなわち、対象のポリペプチドをコードする単一導入遺伝子を含むバキュロウイルスを製造するために使用され得る。
【０１２１】
この特定の実施形態では、組換えバキュロウイルスを製造する方法であって、組換えバキュロウイルスのゲノムが、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子を含み、本方法は、
ａ）ａ１）ウイルス複製に必須のｎ個の遺伝子が非機能性であり、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含む複製欠損バキュロウイルスゲノム、および
ａ２）ウイルス複製に必須のｎ個の非機能性遺伝子のうち１つの機能を回復させることを可能にするヌクレオチド配列（ｉ）を各々含むｎ個のトランスファーベクター間の相同組換えによって、昆虫細胞において、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子および対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む、複製可能な組換えバキュロウイルスゲノムを調製する工程であって、
ｎ個のベクターのうち１つが、対象のポリペプチドをコードする導入遺伝子を含み、
ｎ個のトランスファーベクターのヌクレオチド配列（ｉ）のセットが、複製欠損バキュロウイルスゲノムの複製を回復可能であり、
ｎが、少なくとも２に等しい整数である、工程と、
ｂ）工程ａ）で得られた組換えバキュロウイルスゲノムを含む昆虫細胞において組換えバキュロウイルスを生成する工程と
を含む。
【実施例】
【０１２２】
実施例１〜３は、複製欠損バキュロウイルスの構築に関連し、１、２または３つの遺伝子がそれぞれ、非機能性である。
【０１２３】
実施例４および５は、それぞれ、２または３つの導入遺伝子が組み込まれている組換えバキュロウイルスの作製を記載する。
【０１２４】
実施例６〜８は、対象のタンパク質の製造のための、２または３つの導入遺伝子が組み込まれているこれらの組換えバキュロウイルスの使用に関連する。
【０１２５】
実施例９〜１５は、タンパク質成熟酵素をコードする導入遺伝子を含む組換えバキュロウイルスの構築を記載する。
【０１２６】
実施例１６〜１９は、満足な成熟および／またはグリコシル化を有する実施例９〜１５のバキュロウイルスのおかげで産生された対象のタンパク質を実証する。
【０１２７】
実施例１：ウイルス複製に必須の１つの遺伝子が非機能性である複製欠損バキュロウイルスゲノム（ＢａｃＭｉｄ１）の構築
ＢａｃＭｉｄ１は、ウイルス複製に必須の遺伝子、遺伝子１６２９の欠失を有する。
１．バキュロウイルスのゲノムにおける細菌複製の起源の組込み
この操作は、昆虫細胞において実施される。
細菌複製の起源Ｍｉｎｉ−Ｆを、昆虫Ｓｆ９細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）における相同組換えによってバキュロウイルスゲノムＡｃＭＮＰＶのポリヘドリン遺伝子座中に導入した。そうするために、細胞を（ｉ）遺伝子ｐｈの配列が、Ｍｉｎｉ−Ｆ＋カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）を付与する細菌発現カセットを有するＤＮＡの断片によって置換されたトランスファーベクターＰＨ（ｐＶＴ／Ｍｉｎｉ−Ｆ−ＫａｎＲ）および（ｉｉ）バキュロウイルスゲノムＡｃＭＮＰＶ（鱗翅目オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）から単離されたバキュロウイルス）を用いてトランスフェクトした。作製されたバキュロウイルスを、ファージプラークアッセイ技術によって精製し、次いで、それらが実際に組み込まれたＭｉｎｉ−Ｆおよび発現カセットＫａｎＲを有していたことを確認するために特性決定した。バキュロウイルスを選択し、次に、細菌大腸菌ＥＬ３５０に移し、第１のバクミド（ＢａｃＭｉｄ０、昆虫細胞におけるウイルス複製について欠損がない）をこのように作製した。
【０１２８】
１．必須である遺伝子１６２９の欠失
アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）を付与し、５’および３’に制限部位ＭａｕＢＩ−バキュロウイルスゲノムＡｃＭＮＰＶにはない部位−を有する細菌発現カセットを、細菌大腸菌ＥＬ３５０において相同組換えによって細菌発現カセットＫａｎＲの下流に組み込んだ。この組換えの過程で、タンパク質１６２９の２７個のＣ末端アミノ酸をコードするＤＮＡの断片が欠失され、これが、タンパク質１６２９を非機能性にした（ＢａｃＭｉｄ０／ａｍｐＲ）。ＭａｕＢＩによる消化、次いで、再ライゲーション後にアンピシリン耐性遺伝子が次に排除され、ＢａｃＭｉｄ１をこのように作製した。次いで、ウイルス複製に必須の遺伝子（すなわち、タンパク質１６２９をコードする遺伝子）が非機能性であるので、バキュロウイルスのゲノム（すなわち、ＢａｃＭｉｄ１）は昆虫細胞における複製について欠損している。ＢａｃＭｉｄ１を含有する細菌は、この後「細菌大腸菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ１」と呼ばれる。
【０１２９】
図１は、ＢａｃＭｉｄ１の調製の工程を例示する。
【０１３０】
実施例２：ウイルス複製に必須の２つの遺伝子が非機能性である複製欠損バキュロウイルスゲノム（ＢａｃＭｉｄ２）の構築
ＢａｃＭｉｄ２は、ウイルス複製に必須の２つの遺伝子、遺伝子１６２９およびウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（ＤＮＡＰｏｌ）の欠失を示す。ＢａｃＭｉｄ１からの、遺伝子ＤＮＡＰｏｌの欠失は、ｇｐ３７をコードする遺伝子の部分（２５２個のアミノ酸）およびＤＮＡＰｏｌをコードする遺伝子の部分（４６６個のＣ末端アミノ酸）が欠失され、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼの産生を可能にする細菌発現カセット（ＨｙｇｒｏＲ）によって置換された４２２２ｂｐの組換え断片のエレクトロポレーション後に、細菌大腸菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ１において実施し、ハイグロマイシン耐性（ＨｙｇｒｏＲ）をこのように付与した。ＨｙｇｒｏＲ遺伝子を、細菌プロモーターＥＭ７（市販のベクターｐＳｅｌｅｃｔ−Ｈｙｇｒｏ−ｍｃｓに由来する、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の制御下に配置し、ターミネーターｇｌｍｓは、ＨｙｇｒｏＲ遺伝子の下流に導入した（Gay N.J. et al. Biochem J., 1986, 234, 111-117）。ＢａｃＭｉｄ２を含有する細菌（大腸菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２）を、そのハイグロマイシン耐性について選択した。２つのウイルス複製に必須の遺伝子（すなわち、タンパク質１６２９をコードする遺伝子およびＤＮＡＰｏｌをコードする遺伝子）が非機能性であるので、バキュロウイルスゲノム（すなわち、ＢａｃＭｉｄ２）は、昆虫細胞における複製について欠損している。
【０１３１】
図２は、ＢａｃＭｉｄ２を調製するための、遺伝子ＤＮＡＰｏｌの一部の欠失の工程を例示する図である。
【０１３２】
注記：ＢａｃＭｉｄ２を使用して、単一タンパク質を製造することが可能である（実施例４を参照のこと）。２つのトランスファーベクター、導入遺伝子および欠失された必須である遺伝子１のすべてまたは一部を提供する１つならびに欠失された必須である遺伝子２に対応する野生遺伝子を提供するもう１つを有するのに十分である。２つの欠失された遺伝子は、相同組換えの際に修復される。
【０１３３】
実施例３：ウイルス複製に必須の３つの遺伝子が非機能性である複製欠損バキュロウイルスゲノム（ＢａｃＭｉｄ３）の構築
ＢａｃＭｉｄ３は、３つの必須である遺伝子、１６２９、ＤＮＡＰｏｌおよびｇｐ６４の欠失を有する。
ＢａｃＭｉｄ２からの、遺伝子ｇｐ６４の欠失は、カテプシンの遺伝子およびキチナーゼの２５９個のアミノ酸をコードする配列の７７９ｂｐおよびｇｐ６４の遺伝子の一部、１８８個のアミノ酸をコードする５６６ｂｐの欠失の全体が、ゼオシン耐性を付与する細菌発現カセット（ＺｅｏＲ）によって置換された３２６０ｐｂの組換え断片のエレクトロポレーション後に細菌大腸菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２において実施した（Drocourt et al., Nucleic Acids Research, vol.18 n°13, 1990）。市販のプラスミドｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＺｅｏＲ遺伝子を、ファージＴ５に由来する細菌プロモーターＴ５Ｎ２５（Gentz and Bujard, J. Bacteriology, vol.164 n1, 1985）の制御下に配置し、転写ターミネーターｒｒｎＢＴ１（大腸菌リボソームＲＮＡオペロンＴ１ターミネーター）（Kwon et al., J Biol. Chem., vol 274 n°41, 1999）が続いた。ＢａｃＭｉｄ３を含有する細菌（大腸菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ３）をそのゼオシン耐性について選択した。３つのウイルス複製に必須の遺伝子（すなわち、タンパク質１６２９をコードする遺伝子およびＤＮＡＰｏｌをコードする遺伝子およびｇｐ６４をコードする遺伝子）が非機能性であるので、バキュロウイルスゲノム（すなわち、ＢａｃＭｉｄ３）は、昆虫細胞における複製について欠損している。
【０１３４】
図３は、ＢａｃＭｉｄ３の調製のための、ｇｐ６４の欠失の工程を例示する図である。
【０１３５】
実施例４：ＢａｃＭｉｄ２の使用
２つの導入遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスを作製できるようにトランスファーベクターｐＶＴ／ｇｐ３７を構築した。そうするために、遺伝子ｇｐ３７および遺伝子ＤＮＡＰｏｌを含有するバキュロウイルスゲノムＡｃＭＮＰＶの断片ＥｃｏＲＩ  Ｆを、細菌プラスミドｐＵＣにクローニングし、このようにｐＵＣ／ｇｐ３７を作製した。
【０１３６】
このプラスミドを次いで、以下の方法で修飾した：ｇｐ３７をコードする遺伝子の大きな部分を欠失させ（７２４ｐｂ）、ＡＴＧイニシエーターを突然変異させ、２つの独特の制限部位ＸｂａＩおよびＡｖｒＩＩによって置換し、ｇｐ３７の天然プロモーターの制御下に導入遺伝子の組込みを可能にした。これらの修飾は、トランスファーベクターｐＶＴ／ｇｐ３７が得られることにこのようにつながった。
【０１３７】
Ｓｆ９細胞を、導入遺伝子およびＢａｃＭｉｄ２のＤＮＡを負荷したトランスファーベクターｐＶＴ／ＰＨおよびｐＶＴ／ｇｐ３７を用いるリポフェクションによってトランスフェクトした。相同組換え後に作製されたウイルスを、ファージプラークアッセイ法によってクローニングした。組換えタンパク質の製造は、適した方法（例えば、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、酵素アッセイ）によって確認した。組換えウイルスのゲノムは、サザンブロットにより確認し、ウイルスゲノムに組み込まれた導入遺伝子の配列は、ＰＣＲ増幅後にシーケンシングすることによって確認した。
【０１３８】
図４は、遺伝子Ｘ（ここで、Ｘは、抗体の重鎖をコードする遺伝子とは異なる遺伝子である）の発現のための、トランスファーベクターｐＶＴ／ｇｐ３７を例示する図である。
【０１３９】
ＢａｃＭｉｄ２とトランスファーベクター間の相同組換え後に生成した組換えバキュロウイルスのゲノムは、もはやｇｐ３７（ウイルス複製に必須ではないタンパク質）を発現しない。
【０１４０】
ウイルスＤＮＡが、ＢａｃＭｉｄ２の２つの遺伝子座において修復されるために、第２の組換えが、導入遺伝子を負荷した、または負荷していないトランスファーベクターＰＨを用いて起こらなくてはならない。すべての場合において、バキュロウイルスゲノムのＤＮＡは、修復され、その結果感染性となる。
【０１４１】
ポリヘドリンの製造につながる、野生配列を含有する、すなわち、野生発現カセット（非修飾）を含有するｐＶＴ／ＰＨを使用することも可能となる。ｐＶＴ／ＰＨはまた、「空」すなわち、導入遺伝子またはポリヘドリン遺伝子を含有しない場合もある。
【０１４２】
同様に、導入遺伝子を遺伝子座ＰＨに組み込むことが可能となる。この場合には、図４に記載されるものなど、欠失されていないｐＶＴ／ｇｐ３７（機能性の必須ではない遺伝子）または完全にもしくは部分的に欠失されたｐＶＴ／ｇｐ３７を使用して、遺伝子座ｇｐ３７／ＤＮＡｐｏｌを修復する。本明細書において以下に説明されるように、図４に記載されるｐＶＴ／ｇｐ３７中に存在する遺伝子ｇｐ３７の配列が修飾され、ＡＴＧイニシエーター（ＡＴＧｉ）が突然変異され、遺伝子ｇｐ３７が２４０個のアミノ酸から欠失されたことは留意されなければならない：
【０１４３】
【化１】
2021500052.tif 000004
キャプション：
太字の遺伝子の配列
下線が引かれたＡＴＧイニシエーター
四角で囲まれたセクション中のポリリンカーＸｂａＩ／ＡｖｒＩＩ／ＢａｍＨＩ
上記で例示される核酸配列は、配列の配列番号１６である。
【０１４４】
図５は、導入遺伝子Ｘ（ここで、Ｘは、抗体の軽鎖をコードする遺伝子とは異なる導入遺伝子である）の発現のための、トランスファーベクターＰＨ  ｐＶＴ／ＰＨの構築および使用を例示する図である。
【０１４５】
抗体の重鎖の発現
特定のｐＶＴ／ｇｐ３７、ｐＶＴ／ｇｐ３７−Ｃγ１の構築
このトランスファーベクターは、以下の発現カセットを含有する：
−  野生ウイルスプロモーターＰ１０（配列番号１）
−  ヒト免疫グロブリンのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列（分泌配列）
−  抗体の可変領域（ＶＨ）（抗体の特異性をもたらす領域）の同相でのクローニングのための２つの独特な制限部位
−  イプシロン、ミューまたはアルファヒトＩｇＧ（γ１〜４）の定常領域をコードするＤＮＡ配列。
【０１４６】
図６は、抗体の重鎖の発現のための、トランスファーベクターｐＶＴ／ｇｐ３７Ｃγ１の構築および使用を例示する図である。
【０１４７】
抗体の軽鎖の発現
特定のｐＶＴ／ＰＨ、ｐＶＴ／ＰＨ−ＣＬの構築
このトランスファーベクターは、以下の発現カセットを含有する：
−  ウイルスプロモーターＰ１０  Ｐ１０Ｓ１Ｂ（配列番号３）
−  ヒト免疫グロブリンのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列（分泌配列）
−  抗体の可変領域（ＶＬ）（抗体の特異性をもたらす領域）の同相でのクローニングのための２つの独特な制限部位。
−  ヒトＩｇＧの軽鎖（ＣＬ）カッパ（κ）またはラムダ（λ）の定常領域をコードするＤＮＡ配列。
【０１４８】
図７は、抗体の軽鎖の発現のための、トランスファーベクターｐＶＴ／ＰＨＣの構築および使用を例示する図である。
【０１４９】
実施例５：ＢａｃＭｉｄ３の使用。
３つの導入遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスのゲノムを作製できるようにトランスファーベクター、ｐＶＴ／Ｃｈｉｔ−Ｃａｔｈを構築した。
バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶの領域ＥｃｏＲＩ  ＥおよびＨに由来する断片ＢｓｔＸＩ−ＸｂａＩを、プラスミドｐＵＣにクローニングした。欠失１１７５ｐｂのＥｃｏＮＩ−ＥｃｏＲＩが、必須ではないキチナーゼをコードする、同様に必須ではないカテプシンをコードする遺伝子を不活性にすることを可能にする。部位ＥｃｏＮＩおよびＥｃｏＲＩ間の部位ＸｂａＩの付加が、導入遺伝子が組み込まれることを可能にする。これらの修飾が、トランスファーベクターｐＶＴ／Ｃｈｉｔ−Ｃａｔｈが得られることにこのようにつながった。
【０１５０】
Ｓｆ９細胞を、導入遺伝子およびＢａｃＭｉｄ３のＤＮＡを負荷したトランスファーベクターｐＶＴ／ＰＨ、ｐＶＴ／ｇｐ３７およびｐＶＴ／ｃｈｉｔＣａｔｈを用いるリポフェクションによってトランスフェクトした。相同組換えの際に作製されたウイルスを、ファージプラークアッセイ法によってクローニングした。組換えタンパク質の製造は、適した方法、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、酵素アッセイなどによって管理され、組換えウイルスのゲノムは、サザンブロットによって制御され、導入遺伝子の配列は、ＰＣＲ増幅後に管理された。
【０１５１】
図８は、ベクターｐＶＴ／Ｃｈｉｔ−Ｃａｔｈの構築およびそのＢａｃＭｉｄ３との相同組換えを例示する図である。
【０１５２】
実施例６：ＢａｃＭｉｄ２を使用するモノクローナル抗体抗ＣＤ４（１３Ｂ８ＩＩ）の製造
抗体の領域ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡｃをそれぞれ、トランスファーベクターｐＶＴ／ＰＨ−ＣおよびｐＶＴ／ｇｐ３７−Ｃγ１に組み込んだ。２つのｐＶＴと実施例４のＢａｃＭｉｄ２のＤＮＡの間の相同組換え後に組換えバキュロウイルスが作製された。
【０１５３】
抗体の領域ＶＬをコードするＤＮＡｃをｐＶＴＰＨ／Ｃｋに導入し、これが、ＢａｃＭｉｄ２の領域ＰＨ／１６２９と組換えされた。
【０１５４】
抗体の領域ＶＨをコードするＤＮＡｃをｐＶＴ／ｇｐ３７−Ｃγ１にクローニングし、これがＢａｃＭｉｄ２の領域ｇｐ３７と組換えされた。
【０１５５】
Ｓｆ９細胞を、ＢａｃＭｉｄ２および実施例４で得られた２つのトランスファーベクターを用いるリポフェクションによってトランスフェクトし、次いで、２８℃で４日間インキュベートした。培養上清を回収し、作製され、培養培地中に分泌された組換えバキュロウイルスを、ファージプラークアッセイ技術によってクローニングした。
【０１５６】
組換えバキュロウイルスのゲノム組織化は、サザンブロットによって管理され（図９Ａを参照のこと）、組み込まれた導入遺伝子（すなわち、ＶＬおよびＶＨ）は、ＰＣＲ増幅、クローニング、次いで、シーケンシング後に確認された。培養培地中に分泌された組換え抗体を、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、次いで、ポリアクリルアミドゲルにおける泳動および銀染色後に解析した（図９Ｂ）。
【０１５７】
実施例７：ＶＬＰ（ウイルス様粒子）の製造のためのＢａｃＭｉｄ３の使用
ｆｌｕ  ＶＬＰの製造
これらのＶＬＰを製造するために、ｆｌｕウイルス、Ｍ、ＨＡおよびＮＡの３つの遺伝子が同時発現された。
【０１５８】
これらの３つの遺伝子を、実施例５のＢａｃＭｉｄ３と組換えされることが必要な３つのトランスファーベクターに組み込んだ：
【０１５９】
遺伝子Ｍを、図５に記載されるようにトランスファーベクターｐＶＴ／ＰＨに導入した。
【０１６０】
遺伝子ＨＡを、図４に記載されるようにトランスファーベクターｐＶＴ／ｇｐ３７に導入した。
【０１６１】
遺伝子ＮＡを、図８に記載されるようにトランスファーベクターｐＶＴ／Ｃｈｉｔ／Ｃａｔｈに導入した。
【０１６２】
Ｓｆ９細胞を、ＢａｃＭｉｄ３および上記で得られた３つのトランスファーベクターを用いるリポフェクションによってトランスフェクトし、次いで２８℃で４日間インキュベートした。作製され、次いで、培養上清中に分泌された組換えバキュロウイルスをファージプラークアッセイ法によってクローニングした。
【０１６３】
組換えバキュロウイルスのゲノム組織化は、サザンブロットによって管理され（図１０を参照のこと）、組み込まれた遺伝子は、ＰＣＲ増幅、クローニング、次いで、シーケンシング後に確認された。サザンブロットは、ｆｌｕウイルスの３つのタンパク質ＨＡ、ＮＡおよびＭを発現する組換えウイルスのゲノムＤＮＡで実施した。これら３つの遺伝子に対して特異的なプローブを用いて実施したこの実験が、組換えバキュロウイルスゲノムにおいて３つのタンパク質をコードするＤＮＡの存在を検出することを可能にする。
【０１６４】
実施例８：二重特異性抗体の製造のためのＢａｃＭｉｄ３の使用
国際出願ＷＯ２０１３／００５１９４に従って構築された二重特異性抗体は、抗体１のドメインＶＨ＋ＣＨ１＋ＣＨ２＋ＣＨ３、抗体２のドメインＶＨ＋ＣＨ１に融合されたＮ末端から構成される重鎖から構成される。抗体１の領域ＣＬおよびＣＨ１の界面に導入された突然変異は、別個に製造される軽鎖Ｌ１およびＬ２のドメインＶＬ１およびＶＬ２と、対応するドメインＶＨ１およびＶＨ２間の正しい対形成を支持する。この抗体の製造は、３つの鎖、融合された重鎖、軽鎖Ｌ１および軽鎖Ｌ２の等量での同時製造を必要とする。
【０１６５】
図５に記載されるように、軽鎖Ｌ１をコードするＤＮＡｃをトランスファーベクターｐＶＴ／ＰＨに導入した。
【０１６６】
図４に記載されるように、軽鎖Ｌ２をコードするＤＮＡｃを、トランスファーベクターｐＶＴ／ｇｐ３７に導入した。
【０１６７】
図８に記載されるように、融合された重鎖をコードするＤＮＡｃを、トランスファーベクターｐＶＴ／Ｃｈｉｔ−Ｃａｔｈに導入した。
【０１６８】
図１１は、Ａにおいて、二重特異性抗体の構造を、Ｂにおいて、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製された二重特異性抗体のポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動による解析を例示する図である。
【０１６９】
実施例９：成熟したマンノシル化タンパク質を正確に発現する組換えバキュロウイルスの作製を可能にするＢａｃＭｉｄ２−Ｆｕｒの構築
バクミド中に、タンパク質の翻訳後修飾を最適化することを可能にする遺伝子（ＢａｃＭｉｄ２／ＭＰＴ（ＭＰＴ：翻訳後修飾）を導入するために使用された一般的原理は、図１４に記載され、実施例１０において詳述される。いくつかの遺伝子が必要である場合には、それらは、ウイルスの複製に必須ではない領域または遺伝子中に反復して組み込まれる。以下の表２には、構築された種々のバクミドにおける、組込み部位および組み込まれた遺伝子の性質が記載される。
【０１７０】
【表２】
2021500052.tif 000005
【０１７１】
表２のキャプション：翻訳後修飾（例：グリコシル化、細胞内タンパク質分解による切断）の精緻化に関与する遺伝子を、バクミドの必須ではない遺伝子／領域に挿入した。強力な後期プロモーターＰ１０Ｓ１の制御下で産生される細胞性フューリンの過剰発現の場合を除いて、これらの遺伝子の発現を制御するために使用されるプロモーターは、後期プロモーターの制御下で発現される対象のタンパク質の生合成の前にこれらの酵素を産生するために、初期である。
【０１７２】
ＢａｃＭｉｄ２−Ｆｕｒは、実施例２において得られたＢａｃＭｉｄ２から構築した。鱗翅目細胞Ｓｆ９のフューリンをコードする遺伝子（ｆｕｒ）を、以下の配列の合成後期プロモーターＰ１０Ｓ１の下流にクローニングした：
５’−ＡＴＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＣＧＴＴＴＧＴＡＴＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＣＴＡＴＡＣＴＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＣＧＧＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＣＣＧＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＧＧＣＧＴＡＣＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１７）。
【０１７３】
遺伝子ｆｕｒを、キチナーゼ−カテプシン遺伝子座に組み込んだ。構築が実施例５に記載されるトランスファーベクター、ｐＶＴ／Ｃｈｉｔ−Ｃａｔｈを使用した。合成プロモーターＰ１０Ｓ１の制御下に遺伝子ｆｕｒを含む発現カセットを、ｐＶＴ／Ｃｈｉｔ−Ｃａｔｈ独特の部位ＸｂａＩ（バキュロウイルスのゲノム中の位置１０６１６０）に導入して、プラスミドｐＶＴ／Ｃｈｉｔ−Ｃａｔｈ−Ｆｕｒを得た。遺伝子ｆｕｒを、不活性化されたカテプシン遺伝子と同一方向にクローニングした。
【０１７４】
以下のとおりに構成される細菌発現カセット「ゼオシン耐性（ＺｅｏＲ）」：いずれかの側に部位Ｂｓｕ３６Ｉを含有する［細菌プロモーターＴ５Ｎ２５−ＺｅｏＲ−ターミネーターｒｒｎＢＴ１］を、ｐＶＴ／Ｃｈｉｔ−Ｃａｔｈ−Ｆｕｒの部位ＥｃｏＲＩにクローニングして、プラスミドｐＶＴ／Ｃｈｉｔ−Ｃａｔｈ−Ｆｕｒ−ＺｅｏＲを得た。この第２のカセットは、遺伝子ＺｅｏＲの発現を可能にし、したがって、このプラスミドを有する細菌にゼオシン耐性を与える。
【０１７５】
ＢｇｌＩＩによるプラスミドｐＶＴ／Ｃｈｉｔ−Ｃａｔｈ−Ｆｕｒ−ＺｅｏＲの消化後に、５９２７ｐｂの組換え断片が調製され、断片のいずれかの側に６５２ｐｂおよび７０４ｐｂの相同組換えのためのフランキング領域をこのように作製した。細菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２におけるエレクトロポレーション後、細菌をゼオシン上で選択した。図１４に記載されるように、細菌発現カセットＺｅｏＲを、消化Ｂｓｕ３６Ｉ、修復、次いで、ライゲーションによって排除した。
【０１７６】
ＢａｃＭｉｄ２／Ｆｕｒをこのように得た。これらの新規ＢａｃＭｉｄのゲノムはサザンによって（図１５）、次いで、組み込まれた遺伝子ｆｕｒのシーケンシングによって管理された。
【０１７７】
実施例１０：ガラクトシル化タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの作製を可能にするＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌの構築
ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌは、実施例２において得られたＢａｃＭｉｄ２から構築した。鱗翅目細胞において失われており、ガラクトシル化グリカン、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧＮＴ−ＩＩ）（ＥＣ２．４．１．１４３、受託番号ＮＭ＿００２４０８．３）およびウシβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（β１，４ＧａｌＴ）（ＥＣ２．４．１．３８、受託番号ＮＭ＿１７７５１２．２）の生合成に必要な２つのグリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡｃを、相同組換えによって、必須ではない遺伝子またはＢａｃＭｉｄ２の領域に導入した。β１，４ＧａｌＴおよびＧＮＴ−ＩＩの酵素活性が、対象のポリペプチドをコードする対象の導入遺伝子の合成の前に発現されるために、ＧＮＴ−ＩＩおよびβ１，４ＧａｌＴをコードする導入遺伝子を、表２に記載されるようなものなどの初期ウイルスプロモーターの下流にクローニングした。
【０１７８】
図１４は、各々タンパク質成熟酵素をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含むバクミドＢａｃＭｉｄ２／ＭＰＴの構築に必要な種々の工程を一般的に例示する。特に、図１４では、タンパク質成熟酵素をコードする導入遺伝子は、ＧＮＴＩＩをコードする遺伝子（遺伝子ＧＮＴＩＩ）である。
【０１７９】
それぞれ、ＧＮＴ−ＩＩおよびβ１，４ＧａｌＴをコードする導入遺伝子の付加を、ＢａｃＭｉｄ２において反復して実施した。
【０１８０】
−  導入遺伝子ＧＮＴ−ＩＩの挿入
この導入遺伝子を、遺伝子間領域ＩＧ３５／３６と呼ばれるｏｒｆ３５（ｖ−ｕｂｉ）とｏｒｆ３６（３９ｋ）間の相同組換えによってウイルスゲノムの位置２９２２６に導入した。ＢａｃＭｉｄのゲノム中に発現カセットを挿入できるために、クローニングのための独特の部位ＸｂａＩ（イタリック体）およびＢｓｕ３６Ｉ（下線が引かれた）を、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって領域ＩＧ３５／３６中に組み込んだ：
アンチセンスｉｇ３５／３６
５’−ＣＣＴＧＧＴＡＡＴＴＴＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧ−３’（ウイルスゲノム中の位置２８８０６）（配列番号７）
および
【化２】
2021500052.tif 000006
次いで
【化３】
2021500052.tif 000007
および
センスｉｇ３５／３６
５’−ＣＧＣＡＧＣＡＡＴＴＣＣＡＧＣＧＡＧＣ−３’（ウイルスゲノム中の位置２９６５７）（配列番号４）
【０１８１】
８６１ｂｐの得られたＰＣＲ断片を、プラスミドｐＧＥＭ（登録商標）Ｔｅａｓｙ中にクローニングし、シーケンシングによって管理して、プラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ３５／３６を得た。
【０１８２】
２つの発現カセットを、上記のプラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ３５／３６中に導入した。
【０１８３】
以下のとおりに構成されるウイルス発現カセット［デンソウイルス−ＪｃＮＤＶのプロモーターＰ９−ＧＮＴＩＩをコードする導入遺伝子−停止ＴｋｐＡ］を、部位ＸｂａＩのレベルで挿入して、プラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ３５／３６−ＧＮＴＩＩを得た。デンソウイルスＪｃＮＤＶのプロモーターＰ９は、Shirk PD, Bossin H, Furlong RB, Gillett JL. Regulation of Junonia coenia densovirus P9 promoter expression. Insect Mol Biol. 2007 Oct;16(5):623-33. Epub 2007 Aug 22に記載されている。
【０１８４】
以下のとおりに構成される細菌発現カセット「ゼオシン耐性」（ＺｅｏＲ）（市販のプラスミドｐＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから得られた）：［細菌プロモーターＴ５Ｎ２５−ＺｅｏＲ−ターミネーターｒｒｎＢＴ１］を、部位Ｂｓｕ３６Ｉのレベルでクローニングした。この第２のカセットは、ＺｅｏＲ遺伝子の発現を可能にし、したがって、それを有する細菌にゼオシン耐性を与えて、プラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ３５／３６−ＧＮＴＩＩ−ＺｅｏＲが得られる。細菌プロモーターＴ５Ｎ２５は、Gentz R, Bujard H. Promoters recognized by Escherichia coli RNA polymerase selected by function: highly efficient promoters from bacteriophage T5. J Bacteriol. 1985 Oct;164(1):70-7に記載されている。転写ターミネーターｒｒｎＢＴ１は、Kwon YS, Kang C. Bipartite modular structure of intrinsic, RNA hairpin-independent termination signal for phage RNA polymerases. J Biol Chem. 1999 Oct 8;274(41):29149-55に記載されている。
【０１８５】
細菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２中の、上記で作製されたプラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ３５／３６−ＧＮＴＩＩ−ＺｅｏＲのＥｃｏＲＩによる消化後に得られ、組換え断片のいずれかの側に４２０ｂｐおよび４２８ｐｂの相同組換えのためのフランキング領域を有する３４９３ｂｐの組換え断片＜ＩＧ３５／３６−ＧＮＴＩＩ−ＺｅｏＲ＞を、電気泳動した。ＢａｃＭｉｄ２／ＧＮＴＩＩ−ＺｅｏＲを含有する細菌（大腸菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２／ＧＮＴＩＩ−ＺｅｏＲ）を、そのカナマイシン、ハイグロマイシンおよびゼオシン耐性について選択した。選択されたＢａｃｍｉｄ２／ＧＮＴＩＩ−ＺｅｏＲの３つのクローンのＤＮＡを抽出し、次いで、領域ＩＧ３５／３６に挿入されたＧＮＴ−ＩＩおよびＺｅｏＲ遺伝子を、ＰＣＲ、次いで、シーケンシングによって管理した。
【０１８６】
次いで、部位Ｂｓｕ３６Ｉのいずれかの側に隣接する細菌発現カセットを、Ｂｓｕ３６Ｉによる簡単な消化、クレノウのＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡの末端の修復、次いで、それ自体でのプラスミドのライゲーションによって排除した。「修復された」配列Ｂｓｕ３６Ｉ［５’ＣＣＴＮＡＴＮＡＧＧ３’］は、プラスミドのライゲーション後にこのように作製されたＢａｃｍｉｄ２／ＧＮＴＩＩ中に保存されたことは留意されなければならない。この配列は、したがって、組換えバキュロウイルス中に存在し、特異的なシグネチャーを構成し得る。
【０１８７】
ＧＮＴＩＩをコードする導入遺伝子を、遺伝子３９Ｋと同一方向にクローニングした。
【０１８８】
ＢａｃＭｉｄ２／ＧＮＴＩＩをこのように得、次いで、上記のように管理し、その後、β１，４ＧａｌＴをコードする遺伝子の挿入のために使用した。
【０１８９】
遺伝子β１，４ＧａｌＴの挿入
β１，４ＧａｌＴをコードする導入遺伝子を、上記の一般的な原理に従って、ＢａｃＭｉｄ２／ＧＮＴＩＩの必須ではない遺伝子ｅｇｔ（エクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼ、ＯＲＦ１５、ウイルスゲノムＡｃＭＮＰＶのゲノム位置１１４２６〜１２９４６の位置）の遺伝子座に組み込んだ。遺伝子ｅｇｔを含有する５１１０ｂｐの断片ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ（ＡｃＭＮＰＶのウイルスゲノム中の位置９９９９〜１５１１０）を、プラスミドｐＵＣに事前にクローニングし、プラスミドｐＵＣ−ＥＧＴを得た。次いで、ＯｐＭＮＰＶのプロモーターｇｐ６７の制御下にウシβ１，４ＧａｌＴをコードするＤＮＡｃを含むウイルス発現カセットを、遺伝子ｅｇｔをコードする配列中に存在する独特の部位ＸｂａＩ（バキュロウイルスのゲノム中の位置１２７８２）で挿入によって遺伝子ｅｇｔ中に導入して（挿入による遺伝子の不活性化）、プラスミドｐＵＣ−ＥＧＴ−ＧａｌＴを得た。β１，４ＧＴをコードする導入遺伝子を、遺伝子ｅｇｔと同一方向でクローニングした。
【０１９０】
次いで、遺伝子β１，４ＧａｌＴの下流に位置する部位ＮｓｉＩに、アダプターＮｓｉＩ−Ｂｓｕ３６Ｉ−ＮｓｉＩを挿入し、これによって、Ｂｓｕ３６Ｉにおける細菌発現カセットＺｅｏＲの導入が可能になり、プラスミドｐＵＣ−ＥＧＴ−ＧａｌＴ−ＺｅｏＲを作製した。
【０１９１】
３１２８ｂｐの組換え断片が、ＳｎａＢＩ−ＮｒｕＩによる上記のプラスミドｐＵＣ−ＥＧＴ−ＧａｌＴ−ＺｅｏＲの消化後に調製され、断片のいずれかの側に４７４ｂｐおよび８６６ｐｂの相同組換えのためのフランキング領域をこのように作製した。細菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩにおけるエレクトロポレーション後、細菌をゼオシン上で選択した。これまでのように、細菌発現カセットＺｅｏＲを、消化Ｂｓｕ３６Ｉ、修復、次いでライゲーションによって排除した。
【０１９２】
ＢａｃＭｉｄ２／ＧＮＴＩＩ／β１，４ＧａｌＴ（ＢａｃＭｉｄ２−ＧａｌまたはＢａｃＧａｌとも呼ばれる）をこのように得た。ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌのゲノムを、サザン、次いで、すべての組み込まれた遺伝子のシーケンシングによって管理した。
【０１９３】
実施例１１：成熟したガラクトシル化タンパク質を正確に発現する組換えバキュロウイルスの作製を可能にするＢａｃＭｉｄ２Ｇａｌ−Ｆｕｒの構築
ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌ−Ｆｕｒを、ＢａｃＭｉｄ２−Ｆｕｒについて記載されたように（実施例９）構築した。
【０１９４】
細菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌを、実施例９に記載される５９２７ｐｂの組換え断片を用いて電気泳動し、次いで、ゼオシン上で選択した。これまでのように、細菌発現カセットＺｅｏＲを、消化Ｂｓｕ３６Ｉ、修復、次いで、ライゲーションによって排除した。ＢａｃＭｉｄ２Ｇａｌ−Ｆｕｒをこのように得た。バクミドのゲノムを、サザンによって（図１５）、次いで、新規に組み込まれた遺伝子のシーケンシングによって管理した。
【０１９５】
実施例１２：ＢａｃＭｉｄ−Ｓｉａ３（またはＢａｃＳｉａ３）の構築
ヒトＣＭＰＮｅｕＡｃシンターゼ（ＣＭＰＮｅｕＡｃシンターゼまたはＣＭＰＮｅｕＡｃＳ）（ＥＣ２．７．７．４３、受託番号ＮＭ＿０１８６８６．５）、ヒトＮｅｕＡｃシンターゼ（ＮｅｕＡｃシンターゼまたはＮｅｕＡｃＳ）（ＥＣ２．５．１．５６、受託番号ＡＦ２５７４６６）およびヒトα２，３シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３）、ＳＴ３ＧａｌＩＶ（ＥＣ２．４．９９．４、受託番号Ｘ７４５７０）をコードする導入遺伝子を、図１４に記載される一般的原理に従ってＢａｃＭｉｄ２／ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ中に反復して挿入した。
【０１９６】
・それぞれ、ＮｅｕＡｃシンターゼおよびＣＭＰ  ＮｅｕＡｃシンターゼをコードする２つの導入遺伝子の、ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌの遺伝子座ｉａｐ２へのクローニング
本出願人は、これらの２つの酵素を、遺伝子ＣＭＰ  ＮｅｕＡｃシンターゼの発現の制御のために、超初期プロモーター、コリストレウラ・フミフェラナ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｒｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）のバキュロウイルスのプロモーターＩＥ１（最初期１）の、および遺伝子ＮｅｕＡｃシンターゼの発現の制御のためにリマントリア・ディスパル（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ）のバキュロウイルスのものの制御下に、ヘッドトゥーテイルでクローニングするために選択した（表２を参照のこと）。
【０１９７】
バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶの遺伝子ｉａｐ２（ＯＲＦ７１）を含む領域（ゲノム中の位置６１０１６〜６１７６５）を、以下のプライマーを用いる二重ＰＣＲによって事前に増幅した：
センスｉａｐ２  ５’−ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＴＧＣＴＣＡＡＴＧＴＣ−３’（ウイルスゲノム中の位置６０７３６）（配列番号８）
【化４】
2021500052.tif 000008
次いで
【化５】
2021500052.tif 000009
アンチセンスｉａｐ２  ５‘−ＣＧＡＴＣＡＣＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＧＴＣＴＴＣ−３’（ウイルスゲノム中の位置６１９５１）（配列番号１１）
【０１９８】
これらの連続ＰＣＲはまた、独特な部位Ｂｓｕ３６Ｉ（上記で下線が引かれている）およびＸｂａＩ（上記で二重下線が引かれている）を組み込むことおよび（ｉｉ）ｉａｐ２をコードする配列の大部分、３３５ｂｐ／１１２アミノ酸の欠失を可能にした。８９６ｂｐの増幅された断片を、プラスミドｐＧＥＭ（登録商標）Ｔｅａｓｙにクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−ＩＡＰ２を得た。
【０１９９】
以下のとおりに構成されるウイルス発現カセット［停止ＳＶ４０−ＣＭＰＮｅｕＡｃシンターゼ−プロモーターＩＥ１Ｃｆ−プロモーターＩＥ１Ｌｄ−ＮｅｕＡｃシンターゼ］を、ｐＧＥＭ−ＩＡＰ２の部位ＸｂａＩで挿入して、プラスミドｐＧＥＭ−ｉａｐ２−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳを得た。
【０２００】
以下のとおりに構成される細菌発現カセット「ゼオシン耐性」（ＺｅｏＲ）：［細菌プロモーターＴ５Ｎ２５−ＺｅｏＲ−ターミネーターｒｒｎＢＴ１］を、ｐＧＥＭ−ｉａｐ２−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳの部位Ｂｓｕ３６Ｉでクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−ｉａｐ２−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳ−ＺｅｏＲを得た。この第２のカセットは、ＺｅｏＲ遺伝子の発現を可能にし、したがって、このプラスミドを有する細菌にゼオシン耐性を与える。
【０２０１】
４５４８ｐｂの組換え断片［ＣＭＰＮｅｕＡｃ−ＮｅｕＡｃＳ−ＺｅｏＲ］を、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩによるプラスミドｐＧＥＭ−ｉａｐ２−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳ−ＺｅｏＲの消化後に調製し、これによって、断片のいずれかの側に４８６ｂｐおよび３９６ｐｂの相同組換えのためのフランキング領域を作製した。細菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴを、組換え断片を用いて電気泳動し、ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳ−ＺｅｏＲをこのように作製した。これまでのように、ゼオシン耐性カセットを、Ｂｓｕ３６Ｉによる消化、修復、次いで、再ライゲーション後に排除した。ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳをこのように得た。
【０２０２】
・ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳのｏｒｆ５１およびｏｒｆ５２の間（ＩＧ５１／５２）に含まれる遺伝子間領域における導入遺伝子α２，３−シアリルトランスフェラーゼＩＶ（ＳＴ３ＧａｌＩＶ）のクローニング
バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶの断片ＥｃｏＲＩ  Ｎ中に位置するこの領域を、以下のプライマーを用いる二重ＰＣＲによる増幅後に単離した：
センスＩＧ５１／５２  ５’−ＧＧＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴＣＣＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣ（ウイルスゲノム中の位置４３８１４）（配列番号１２）および
【化６】
2021500052.tif 000010
次いで
【化７】
2021500052.tif 000011
および
アンチセンスＩＧ５１／５２  ５’−ＧＧＴＧＣＡＧＡＡＣＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＣ（ウイルスゲノム中の位置４４７２３）（配列番号１５）
【０２０３】
これらの連続ＰＣＲの際に、ウイルスゲノム中の位置４４２９８における部位ＸｂａＩでの発現カセットＳＴ３の組込みを可能にする遺伝子間領域ＯＲＦ５１／ＯＲＦ５２において２つの独特な部位Ｂｓｕ３６Ｉ（上記で下線が引かれている）およびＸｂａＩ（上記で二重下線が引かれている）の付加がある。９２２ｂｐの得られた断片を、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ  ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、プラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２を得た。
【０２０４】
その他の酵素についてと同様に、ＳＴ３ＧａｌＩＶは、対象の糖タンパク質が発現される前に細胞中に存在しなくてはならない。本発明者らは、「最初期」型の機能性細胞プロモーターＳｆ９であると同定されたエビウイルスＷＳＳＶ（白点症候群ウイルス）のプロモーターＩＥ１を選択した（表２を参照のこと）（Liu et al., Virology, 2005; Liu et al. J of virology, 2007; Gao et al., J. Biotechnology, 2007）。
【０２０５】
以下のとおりに構成されるウイルス発現カセット［プロモーターＷＳＳＶ−ＳＴ３］を、ｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２の部位ＸｂａＩに挿入して、プラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２−ＳＴ３を得た。ＳＴ３ＧａｌＩＶを、ｏｒｆ５１の反対方向にクローニングした。
【０２０６】
以下のとおりに構成される細菌発現カセット「ゼオシン耐性（ＺｅｏＲ）」：［細菌プロモーターＴ５Ｎ２５−ＺｅｏＲ−ターミネーターｒｒｎＢＴ１］を、ｐＧＥＭ−ＯＲＦ５１−ＳＴ３の部位Ｂｓｕ３６Ｉでクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２−ＳＴ３−ＺｅｏＲを得た。この第２のカセットは、ＺｅｏＲ遺伝子の発現を可能にし、したがって、このプラスミドを有する細菌にゼオシン耐性を与える。
【０２０７】
２５８９ｐｂの組換え断片［ＳＴ３ＧａｌＩＶ−ＺｅｏＲ］を、ｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２−ＳＴ３−ＺｅｏＲから制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩによる消化によって作製した。この消化は、発現カセットのいずれかの側に４９８ｂｐおよび４１１ｐｂの相同組換えのためのフランキング領域を作製した。相同組換えを、細菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳにおいて実施し、ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳ−ＳＴ３（またはＢａｃＳｉａ３）を作製した。ＢａｃＳｉａ３のゲノムは、サザン、次いで、すべての組み込まれた遺伝子のシーケンシングによって管理した。
【０２０８】
実施例１３：ＢａｃＭｉｄ−Ｓｉａ６（またはＢａｃＳｉａ６）の構築
・ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳの遺伝子間領域ｏｒｆ５１／ｏｒｆ５２（ＩＧ５１／５２）における導入遺伝子α２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ＳＴ６ＧａｌＩ）のクローニング
ヒトα２，６シアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ６ＧａｌＩ（ＥＣ２．４．９９．１、受託番号Ｘ１７２４７）をコードする遺伝子をクローニングする方法は、以下のとおりに要約される、ＳＴ３ＧａｌＩＶをコードする導入遺伝子について実施例１２において記載されたものと同様である：
−  以下のとおりに構成されるウイルス発現カセット［プロモーターＷＳＳＶ−ＳＴ６］を、ｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２の部位ＸｂａＩで挿入して、プラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２−ＳＴ６を得た。ＳＴ６ＧａｌＩは、ｏｒｆ５１に対して反対方向にクローニングする。
−  以下のとおりに構成される細菌発現カセット「ゼオシン耐性」（ＺｅｏＲ）：［細菌プロモーターＴ５Ｎ２５−ＺｅｏＲ−ターミネーターｒｒｎＢＴ１］を、ｐＧＥＭ−ＯＲＦ５１−ＳＴ６の部位Ｂｓｕ３６Ｉでクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２−ＳＴ６−ＺｅｏＲを作製した。この第２のカセットは、ＺｅｏＲ遺伝子の発現を可能にし、したがって、このプラスミドを有する細菌にゼオシン耐性を与える。
−  ２８２５ｐｂの組換え断片［ＳＴ６ＧａｌＩ−ＺｅｏＲ］を、ｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２−ＳＴ６−ＺｅｏＲから制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩによる消化によって作製した。この消化は、発現カセットのいずれかの側に４９８ｂｐおよび４１１ｐｂの相同組換えのためのフランキング領域を作製した。相同組換えを、細菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳにおいて実施し、ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳ−ＳＴ６（またはＢａｃＳｉａ６）を作製した。ＢａｃＳｉａ６のゲノムは、サザン、次いで、すべての組み込まれた遺伝子のシーケンシングによって管理した。
【０２０９】
実施例１４：ＢａｃＭｉｄ−Ｓｉａ６ＩＩ（またはＢａｃＳｉａ６−ＩＩ）の構築
ａ．ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳのＯＲＦ１１９（ＰＩＦ１）における導入遺伝子α２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ＳＴ６ＧａｌＩ）のクローニング
ＰＩＦ１、ウイルス複製に必須ではないタンパク質をコードするＯＲＦ１１９（ゲノム中の位置１００６９９〜１０２２９１）は、バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶの断片ＥｃｏＲＩ  Ｅ中に位置する。以下のプライマーを用いる二重ＰＣＲによる増幅後に、遺伝子のいずれかの側の断片を得た：
センスｐｉｆ１  ５’−ＧＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＣＡＣＡＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡＧＴＡＣＡＡＣ−３’（ウイルスゲノム中の位置１００２４７）（配列番号１８）および
【化８】
2021500052.tif 000012
次いで
【化９】
2021500052.tif 000013
および
ＲｅｖＰｉｆ１  ５’−ＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＣＡＴＴＴＴＧＡＣＣＡＴＣ−３’（ウイルスゲノム中の位置１０２８２５）（配列番号２１）
【０２１０】
これらの連続ＰＣＲは、ＯＲＦ１１９の全体を排除すること、独特な部位Ｂｓｕ３６Ｉ（上記で下線が引かれている）およびＸｂａＩ（上記で二重下線が引かれている）を組み込むことを可能にした。部位ＸｂａＩは、ウイルスゲノム中の位置１００６９７における発現カセットＳＴ６の組込みを可能にする。９９８ｂｐの得られた断片を、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）においてクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−ＰＩＦ１を得た。
【０２１１】
実施例１２において記載されたウイルス発現カセット［プロモーターＷＳＳＶ−ＳＴ６］を、ｐＧＥＭ−ＰＩＦ１の部位ＸｂａＩで挿入して、プラスミドｐＧＥＭ−ＰＩＦ１−ＳＴ６を得た。ＳＴ６ＧａｌＩを、ｐｉｆ１の方向でクローニングした。
【０２１２】
以下のとおりに構成される細菌発現カセット「ゼオシン耐性（ＺｅｏＲ）」：［細菌プロモーターＴ５Ｎ２５−ＺｅｏＲ−ターミネーターｒｒｎＢＴ１］を、ｐＧＥＭ−ＰＩＦ１−ＳＴ６の部位Ｂｓｕ３６Ｉでクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−ＰＩＦ１−ＳＴ６−ＺｅｏＲを得た。この第２のカセットは、ＺｅｏＲ遺伝子の発現を可能にし、したがって、このプラスミドを有する細菌にゼオシン耐性を与える。
【０２１３】
２９０３ｐｂの組換え断片［ＳＴ６ＧａｌＩ−ＺｅｏＲ］を、ｐＧＥＭ−ＰＩＦ１−ＳＴ６−ＺｅｏＲから制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩによる消化によって作製した。この消化は、発現カセットのいずれかの側に４９８ｂｐおよび４１１ｐｂの相同組換えのためのフランキング領域を作製した。相同組換えを、細菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳにおいて実施し、ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳ−ＳＴ６−ＩＩ（またはＢａｃＳｉａ６−ＩＩ）を作製した。ＢａｃＳｉａ６−ＩＩのゲノムは、サザン（図１９Ｂ）、次いで、すべての組み込まれた遺伝子のシーケンシングによって管理した。
【０２１４】
実施例１５：ＢａｃＭｉｄ−Ｓｉａ３／６またはＢａｃＳｉａ３／６の構築
・ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳ中の遺伝子間領域ｏｒｆ５１／ｏｒｆ５２（ＩＧ５１／５２）における導入遺伝子ＳＴ６ＧａｌＩおよびＳＴ３ＧａｌＩＶのヘッドトゥーテイルクローニング
クローニング法は、以下のとおりに要約される、ＳＴ３ＧａｌＩＶをコードする導入遺伝子およびＳＴ６ＧａｌＩをコードする導入遺伝子について実施例１２および１３において記載されたものと同様である：
−  以下のとおりに構成される、ＳＴ６ＧａｌＩをコードする導入遺伝子およびＳＴ３ＧａｌＩＶをコードする導入遺伝子を含むウイルス発現カセット［ＳＴ６−プロモーターＷＳＳＶ−アクチンプロモーター３  Ｂ．モリ−ＳＴ３−停止アクチン３］を、ｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２の部位ＸｂａＩで挿入して、プラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２−ＳＴ３／ＳＴ６を得た。
−  以下のとおりに構成される細菌発現カセット「ゼオシン耐性」（ＺｅｏＲ）：［細菌プロモーターＴ５Ｎ２５−ＺｅｏＲ−ターミネーターｒｒｎＢＴ１］を、ｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２−ＳＴ３／ＳＴ６の部位Ｂｓｕ３６Ｉでクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２−ＳＴ３／ＳＴ６−ＺｅｏＲを得た。この第２のカセットは、ＺｅｏＲ遺伝子の発現を可能にし、したがって、このプラスミドを有する細菌にゼオシン耐性を与える。
【０２１５】
５００８ｐｂの組換え断片［ＳＴ３／ＳＴ６−ＺｅｏＲ］を、ｐＧＥＭ−ＩＧ５１／５２−ＳＴ３／ＳＴ６−ＺｅｏＲから制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩによる消化によって作製した。この消化は、発現カセットのいずれかの側に４９０ｂｐおよび４２６ｐｂの相同組換えのためのフランキング領域を作製した。相同組換えを、細菌ＥＬ３５０／ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳにおいて実施し、ＢａｃＭｉｄ２−ＧＮＴＩＩ−β１，４ＧＴ−ＣＭＰＮｅｕＡｃＳ−ＮｅｕＡｃＳ−ＳＴ３／ＳＴ６（またはＢａｃＳｉａ３／６）を得た。ＢａｃＳｉａ３／６のゲノムは、サザン、次いで、すべての組み込まれた遺伝子のシーケンシングによって管理した。
【０２１６】
実施例１６：成熟したＨＩＶ１糖タンパク質ｇｐ１６０の製造のためのＢａｃＭｉｄ２−Ｆｕｒの使用
ＨＩＶ１  ｇｐ１６０は、ウイルスが感染性であり、ウイルスの表面糖タンパク質が三量体に組織化されるために、成熟の工程を受けなければならない。これらの構造は、今日、ＨＩＶ−１に対するワクチンの精緻化にとって必要である対象のエピトープの形成にとって必須であると考えられている。この成熟は、ｇｐ１６０をｇｐ１２０＋ｇｐ４１に切断しようとする細胞性フューリンによって実施される。組換え型のｇｐ１６０の産生は、一般に部分的に成熟した形態につながり、発現系が何であれそのようになされる。
【０２１７】
完全に成熟したｇｐ１６０を得るために、本発明者らは、Ｓｆ９細胞のフューリンをコードする遺伝子を、ウイルスゲノム中、極めて活性なプロモーター、プロモーターＰ１０様、Ｐ１０Ｓ１と呼ばれるものの制御下で組み込み、ＢａｃＭｉｄ２−Ｆｕｒ（実施例９）を構築した。
【０２１８】
本発明者らは、このバクミドから、ＨＩＶ１の２つのタンパク質、ポリタンパク質Ｐｒ５５Ｇａｇおよびｇｐ１６０を発現する二重組換えウイルスを構築した。これら２つのタンパク質の産生は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の培養培地における分泌につながる。この実験では、本発明者らは、分泌されたＶＬＰを、「Ｒｅｔｒｏ  Ｃｏｎｃｅｎｔｉｎ（商標）Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ」（ＳＢＩ、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＶ１００Ａ−１）の溶液を用いて濃縮した（Ｃと、濃縮されていないものについてはＮＣと注記した）。野生ウイルスＢＡＣＷＴまたはｇｐ１６０およびＰｒ５５Ｇａｇを発現する多重組換えウイルス（ＢＡＣ／ｇｐ１６０／Ｇａｇ）、ｇｐ１６０およびＰｒ５５Ｇａｇおよびフューリンを発現する多重組換えウイルス（ＢＡＣ／ｇｐ１６０／Ｇａｇ）または唯一可溶性ｇｐ１２０を発現するウイルスＢＡＣ  ｇｐ１２０および唯一ポリタンパク質Ｐｒ５５Ｇａｇを発現するウイルスＢＡＣＧａｇ（ＢＡＣＧａｇ）のような単一組換えウイルスを用いた感染後に得られた種々のサンプルを、抗体抗ｇｐ１２０、パネルＡ（ＨＩＶ１のｇｐ１２０に対するヤギポリクローナル抗体、参照Ａｂ２１１７９、Ａｂｃａｍ）または抗体抗Ｇａｇ、パネルＢ（抗ｐ５５＋ｐ２４＋ｐ１７、参照Ａｂ６３９１７、Ａｂｃａｍ）を用いるウエスタンブロットによって解析した。
【０２１９】
図１５Ｃに示されるように、細胞性フューリンの活性は、産生されるｇｐ１６０の全体を成熟させるには十分ではない（ウェルＢＡＣｇｐ１６０／Ｇａｇ）。逆に、この酵素の過剰発現がある場合には、ｇｐ１６０のｇｐ１２０への完全な成熟がある（ウェルＢＡＣｇｐ１６０／Ｇａｇ／ｆｕｒ）。
【０２２０】
実施例１７：ガラクトシル化抗体の製造のためのＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌの使用
末端Ｎ−ガラクトシル化は、ＩｇＧの定常ドメイン中に位置するＡｓｎ２９７のグリコシル化の特徴であり（図１２および１３）、以下に記載した実施例は、組換え抗体の製造に関する。
【０２２１】
二重組換えバキュロウイルスの単一工程における作製のために（図１６および１７）、これまでに記載したＢａｃＭｉｄ２のように（実施例４および６）、ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌを使用した。ＢａｃＭｉｄ２についてと同様に、ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌを用いる同時トランスフェクションは、組換えウイルスの１００％に迫る、極めて高い含量につながった（図９Ａ）。
【０２２２】
抗体の重鎖および軽鎖をコードする導入遺伝子の挿入
１．組換えバキュロウイルスの作製の原理
対象の抗体の可変領域ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡｃを、抗体の重鎖および軽鎖の特定のバキュロウイルストランスファーベクター（ｐＶＴ）、ｐＶＴ／ｇｐ３７−Ｈ（重鎖の可変領域をクローニングするため）（図６）およびｐＶＴ／ＰＨ−Ｌ（軽鎖の可変領域をクローニングするため）（図７）中に挿入した。これらのベクターは、論文（Juliant et al., 2013）に記載されている。次いで、Ｓｆ９細胞を、２つの負荷されたｐＶＴおよびＢａｃＭｉｄ２−ＧａｌのＤＮＡを用いてトランスフェクトした。次いで、抗体の重鎖および軽鎖を同時発現する二重組換えウイルスを単一工程で製造した（図１７）。
【０２２３】
２．ガラクトシル化抗体を発現する組換えウイルスの構築
同一抗体を発現する組換えウイルスを、ＢａｃＭｉｄ２およびＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌから製造した。Ｓｆ９細胞の、ＢａｃＭｉｄ２由来の組換えウイルスでの感染後に産生された抗体は、それらが、「昆虫」グリコシル化、すなわち、パウチマンノシド型の、より低い割合でオリゴマンノシド型のグリカンモチーフを有するので対照として働く（図１２）。
【０２２４】
・トランスファーベクターにおけるクローニング
対象の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡｃの断片を、それぞれのトランスファーベクター（ｐＶＴ／ｇｐ３７−ＨおよびｐＶＴ／ＰＨ−Ｌ）にクローニングした。このクローニングの過程で、抗体の２つの鎖をコードする完全遺伝子が再構成される（図６および７）。
・組換えバキュロウイルスの作製およびクローニング
Ｓｆ９細胞を、負荷されたｐＶＴ／ｇｐ３７−ＨおよびｐＶＴ／ＰＨ−ＬおよびＢａｃｍｉｄ２−ＧａｌまたはＢａｃＭｉｄ２のＤＮＡを用いるリポフェクションによってトランスフェクトした（図１７）。２８℃で感染の７日後、培養上清中の分泌されたバキュロウイルスを、ファージプラークアッセイ技術によってクローニングした。
・組換えウイルスのゲノム組織化の管理
いくつかのバキュロウイルスクローンを選択し、増幅し、そのゲノムを抽出して、サザンブロットによって解析した。バキュロウイルスゲノム中に挿入された重鎖および軽鎖をコードする遺伝子もまた、ＰＣＲによって増幅し、次いで、シーケンシングした。
・組換え抗体の製造および精製
血清不含培地における成長に適したＳｆ９細胞を、３ＰＦＵ／細胞のレベルで感染させた。感染の３日後、培養上清を回収し、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に載せた。ポリアクリルアミドゲルにおける泳動および銀染色後に、抗体の量を確認した。
・レクチンブロットによるグリコシル化の解析
レクチンブロットの原理：レクチンは、グリカンモチーフ上にそれ自体が特異的に付着する分子である。したがって、ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動、ニトロセルロースメンブレン上への移動およびメンブレンのビオチンがコンジュゲートしたレクチン（例としてビオチン化レクチンＲＣＡ１２０、参照Ｂ１０８５、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともの、またはジゴキシゲニンとともの（例として、「ＤＩＧ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎキット」のレクチン、参照１１２１０２３８００１、Ｒｏｃｈｅ）インキュベーション後にタンパク質に結合された特定のグリカンの存在を実証することは極めて簡単である。次いで、レクチンの存在は、ペルオキシダーゼがコンジュゲートした、またはアルカリホスファターゼをともなうビオチンまたはジゴキシゲニン自体に対する抗体のおかげで間接的に検出される。次いで、これらの酵素の存在は、ペルオキシダーゼについては茶褐色の沈殿物またはアルカリホスファターゼについては青色の着色のいずれかを生成する、その酵素活性のおかげで検出される。
・実験
抗体の製造は、ウエスタンブロットによって管理した。タンパク質を、ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールの存在下での１０％のポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離し、次いで、ニトロセルロースメンブレン（Ｐｒｏｔｒａｎ（商標）０．４５μｍ  ＮＣ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。タンパク質の移動は、ポンソーレッド染色後に確認した。メンブレンを、（図１８Ａ）ヒトＩｇＧに対するヒツジポリクローナル抗体およびコンジュゲートされたペルオキシダーゼ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＮＡ９３３Ｖ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともに、または（図１８Ｂ）マウスＩｇＧに対するヒツジポリクローナル抗体およびコンジュゲートされたペルオキシダーゼ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＮＡ９３１Ｖ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とともにインキュベートした。ペルオキシダーゼは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（参照：３４０７７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる化学発光によって明らかにされた。
【０２２５】
レクチンブロットによる解析（図１８Ｃ）。この実施例では、本発明者らは、ベータ−ガラクトシル残基上に特異的にそれ自体が付着するビオチン化レクチンＲＣＡ１２０（トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）凝集素）を使用した。タンパク質を、上記のようにポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離し、ウエスタンブロットのために、Ｐｒｏｔｒａｎ（商標）０．４５μｍ  ＮＣメンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移し、次いで、ビオチン化ＲＣＡ１２０の存在下でインキュベートした。レクチンは、メンブレンの、抗ビオチン抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート型（ヤギ抗体、参照Ａ４５４１、Ｓｉｇｍａ）ととものインキュベーション後に間接的に明らかにされた。顕色は、化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下で実施した。
【０２２６】
３．結果
ヒト（図１８Ａ）およびマウス（図１８Ｂ）組換え抗体を製造し、プロテインＡセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、次いで、ウエスタンブロットによって（図１８ＡおよびＢ）およびレクチンブロットによって（図１８Ｃ）解析した。図１８ＡおよびＢは、実際、ヒトおよびマウス組換え抗体の存在を確認する、ウェル２および３：ウェル４および５。図１８Ｃは、ＢａｃＭｉｄ２−Ｇａｌから作製された組換えバキュロウイルスに感染した細胞によって産生された抗体−ヒトまたはマウス−のみが、ＲＣＡ１２０によって認識されることを示す（ウェル３および５）。ＢａｃＭｉｄ２に由来する組換えウイルスによる感染の際に産生された抗体は、レクチンによって認識されない、ウェル２および４。
【０２２７】
これらの実験は、ＢａｃＧａｌウイルスは、Ｓｆ９細胞を、ガラクトシル化糖タンパク質を産生できるように補完可能であることを明確に実証する。
【０２２８】
実施例１８：ＢａｃＭｉｄ−Ｓｉａ３の使用
１．そのアルファ２，３シアリル化糖タンパク質エンベロープｇｐ６４を発現する組換えバキュロウイルスの構築
ＢａｃＳｉａ３の活性を、モデルタンパク質として、ウイルスの表面糖タンパク質、ｇｐ６４を使用して管理した。糖タンパク質ｇｐ６４は、バキュロウイルスの主要な糖タンパク質であり、感染のすべての第１の工程に関与する。ウイルスの表面に位置する。この糖タンパク質は、ガラクトシル化およびシアリル化されることが可能であるということがわかっている（Jarvis et al. 1995）。そうするために、ＢａｃＭｉｄＳｉａ３と空のトランスファーベクターｐＶＴＰＨおよびｐＶＴ／ｇｐ３７の間の相同組換えによって、組換えウイルスを得た。α２，３シアリルモチーフの存在は、論文（Ribeiro et al., 2016）に記載されるレクチンジ−ＣＢＭ４０を用いて実施したレクチンブロットのおかげで実証された。
【０２２９】
・組換えバキュロウイルスの作製およびクローニング
Ｓｆ９細胞を、図１９Ａの原理に従って、空のｐＶＴＰＨおよびｐＶＴ／ｇｐ３７およびＢａｃｍｉｄ２（対照）または実施例１２において得られたＢａｃＭｉｄ−Ｓｉａ３のＤＮＡを用いるリポフェクションによってトランスフェクトした。２８℃で感染の７日後、培養上清中の分泌されたウイルスを、ファージプラークアッセイ技術によってクローニングした。４つのウイルスクローンを選択し、増幅し、そのゲノムを抽出して、サザンブロットによって解析した。ウイルスゲノム中に挿入された遺伝子を、ＰＣＲによって増幅し、次いで、シーケンシングした。
【０２３０】
・レクチンブロットによるグリコシル化の解析
この実施例において使用されたレクチンは、ビオチン化ジ−ＣＢＭ４０であった。使用されたプロトコールは、実施例１７において記載されるものと同様である。飽和後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで１／２００希釈した（５．７μｇ／ｍｌ）ジＣＢＭ４０−ビオチン化レクチンとともに、またはＴＢＳ−Ｔで１／１０００希釈したＳＮＡ−Ｄｉｇレクチン（Ｒｏｃｈｅ、キット  ＤＩＧ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎキット）とともにインキュベートした。メンブランの顕色は実施例１７に記載のとおりに実施した。ｇｐ６４の存在は、抗ｇｐ６４抗体（モノクローナルマウス抗体ＡｃＶ５参照ＳＣ６５４９９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下でウエスタンブロットによって管理した。
【０２３１】
２．結果
図２０Ａに示されるように、ｇｐ６４は、研究されたすべてのサンプルにおいて検出される。パネルＢでは、ＳＴ６を同時発現するウイルス（実施例１９を参照のこと）を用いて産生される場合に独特にｇｐ６４に結合されるα２，６結合されたシアル酸を極めて特異的に認識するＳＮＡレクチンは、ＳＴ３を同時発現するウイルスによる感染の際に産生されるｇｐ６４と結合しない。
【０２３２】
他方、図２０Ｃは、レクチンジ−ＣＢＭ４０が実際、ＳＴ３を産生するウイルスによる感染の際に産生されたｇｐ６４を認識することを示す。細胞が野生ウイルスに感染している場合に産生されるマンノシル化ｇｐ６４のマーキングはない。しかし、α２，６結合されたシアル酸を有するｇｐ６４の、より弱いが、明確なマーキングは留意されよう。
【０２３３】
これらの実験は、ウイルスＢＡＣＳｉａ３は、Ｓｆ９細胞を、α２，３シアリル化糖タンパク質を産生できるように補完可能であることを明確に実証する。
【０２３４】
実施例１９：ＢａｃＭｉｄ−Ｓｉａ６の使用
１．組換えアルファ２，６シアリル化タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの構築
ＢａｃＳｉａ６の活性を、モデルタンパク質として、糖タンパク質Ｇ水泡性口内炎ウイルス、ＶＳＶｇ、タンパク質Ｘおよびバキュロウイルスの糖タンパク質ｇｐ６４を使用して管理した。
【０２３５】
・組換えバキュロウイルスの作製およびクローニング
対象のタンパク質をコードするＤＮＡｃ断片を、図１９Ａに記載される一般的原理に従って、ｐＶＴＰＨにクローニングした。Ｓｆ９細胞を、負荷されたｐＶＴＰＨ、修飾されたｐＶＴ／ｇｐ３７およびＢａｃｍｉｄ２（対照）または実施例１３において得られたＢａｃＭｉｄ−Ｓｉａ６のＤＮＡを用いるリポフェクションによってトランスフェクトした。２８℃で感染の７日後、培養上清中の分泌されたウイルスを、ファージプラークアッセイ技術によってクローニングした。４つのウイルスクローンを選択し、増幅し、そのゲノムを抽出して、サザンブロットによって解析した。ウイルスゲノム中に挿入された遺伝子を、ＰＣＲによって増幅し、次いで、シーケンシングした。
【０２３６】
・組換えタンパク質の製造
タンパク質を、実施例１８に記載されるように製造した。
【０２３７】
・レクチンブロットによるグリコシル化の解析
組換えタンパク質の存在は、ウエスタンブロットによって管理した。タンパク質の移動後、ニトロセルロースメンブランを、種々の特異的抗体、抗ＶＳＶｇ（マウスモノクローナル抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート型、参照Ａ５９７７、Ｓｉｇｍａ）、抗ｇｐ６４（マウスモノクローナル抗体ＡｃＶ５参照ＳＣ６５４９９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下でインキュベートした。顕色は、抗体が直接的にペルオキシダーゼによってコンジュゲートされる場合には実施例１６に記載されるように直接的に、または二次抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート型（ウサギ抗マウスＩｇＧ血清ペルオキシダーゼコンジュゲート型、参照Ａ９０４４）ととものインキュベーション後に実施した。ペルオキシダーゼは、ＥＣＬ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ系（参照３４０７７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる化学発光によって明らかにされた。
【０２３８】
この実施例において使用されたレクチンは、α２，６結合されたシアル酸を認識するＳＮＡ（セイヨウニワトコ（Sambuscus nigra）凝集素）であった。ＳＮＡは、実施例１７に記載されたとおりに明らかにされた。
【０２３９】
２．結果
ａ．ＢａｃＳｉａ６から作製された組換えバキュロウイルスによって発現されたタンパク質Ｘのグリコシル化
ウエスタンブロット、図２１Ａによって示されるように、タンパク質Ｘが、ＢａｃＭｉｄ２に由来する組換えウイルスを用いて産生される場合、そのサイズは、哺乳類細胞、ここではＣＨＯ細胞によって産生された市販のタンパク質のものよりも明確に小さい（比較ウェル１および３）。逆に、ＢａｃＳｉａ６に由来する組換えバキュロウイルスを用いて産生された場合、タンパク質Ｘは、ＣＨＯ細胞において産生されたものに匹敵するサイズを有していた（比較ウェル２およびウェル３）。
【０２４０】
レクチンブロット、図２１Ｂによる解析によって、ＢａｃＳｉａ６に由来する組換えバキュロウイルスを用いて産生された場合に、このタンパク質でα２，６結合されたシアル酸の存在が確認された（ウェル２）。タンパク質Ｘは実際、ＳＮＡ（実施例１７に記載された顕色プロトコール）によって認識され、したがって、タンパク質Ｘの分子量の増大が説明された。この実験はまた、ＣＨＯ細胞において産生された市販のタンパク質でのこのようなモチーフの不在を示し（ウェル３）、実際に、ＣＨＯ株は、α２，３シアリルトランスフェラーゼを独特に発現する。したがって、図２１Ｃに示されるように、ＣＨＯにおいて発現されたタンパク質Ｘ（ウェル３）は、α２，３結合されたシアル酸に対して特異的であるＭＡＡ（実施例１７に記載された顕色プロトコール）によって認識され、これは、ｔＢａｃＳｉａ６に由来する組換えバキュロウイルスを用いて発現されたタンパク質には当てはまらない（ウェル２）。
【０２４１】
ｂ．ＢａｃＳｉａ６から作製された組換えバキュロウイルスによって発現されたＶＳＶｇのグリコシル化
ＶＳＶｇは、膜タンパク質であり、本発明者らは、感染細胞のペレットを解析した。図２２Ａ（ウェル２および３）に示されるように、タンパク質ＶＳＶｇは、Ｓｆ９細胞の、ＢａｃＭｉｄ２に由来するか、ＢａｃＳｉａ６に由来するかの２つの組換えウイルスによる感染後に産生された。
【０２４２】
逆に、ＳＮＡ（実施例１７に記載の顕色プロトコール）を用いるレクチンブロットによる解析によって、ＢａｃＳｉａ６由来のバキュロウイルスから発現された場合にタンパク質ＶＳＶｇの強いマーキングが独特に示された（図２２Ｂ、ウェル２）。ＢａｃＭｉｄ２由来のバキュロウイルスによる感染後に産生されたタンパク質ＶＳＶｇを用いた場合、非特異的マーキング（図２２Ｂ、ウェル３）のみが留意された。グリカン分化キット（Ｄｉｇ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎキット）によって供給された「陽性対照」タンパク質、フェチュインは、ＳＮＡによって極めて良好にマークされた（図２２Ｂ、ウェル１）。
【０２４３】
ｃ．ＢａｃＳｉａ６から作製された組換えバキュロウイルスのｇｐ６４のグリコシル化
本発明者らはまた、シアリル化ＶＳＶｇを発現する組換えウイルス（上記を参照のこと）もまた、シアリル化ｇｐ６４を有していることを確認した。そうするために、培養上清中に分泌されたバキュロウイルスを沈降させ（３５，０００ｒｐｍで６０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  ＬＥ−８０Ｋ遠心機、ＴＩ−７０−１ローター）、次いで、溶解バッファーによって取り入れ、ウエスタンブロット、次いで、レクチンブロットによって解析した。これまでのように、フェチュインを、ＳＮＡの陽性マーカーとして使用した（図２２Ｃおよび図２２Ｄ、ウェル１）。
【０２４４】
図２２Ｃは、ウェル２および３におけるｇｐ６４の存在を明確に示す。ＶＳＶｇを用いて本発明者らが観察したことと同様に、ＢａｃＳｉａ６に由来するウイルスによる感染後に産生されたｇｐ６４（ウェル２）は、ＳＮＡ（実施例１７に記載された顕色プロトコール）によって認識される唯一のものであり（図２２Ｄ）、したがって、ｇｐ６４は、α２，６シアリル化されていると確認される。ウェル２および３における非特異的マーキングの存在（両ウェルにおいて同一のマーキング）も留意されよう。
【０２４５】
これらの実験は、ＢａｃＳｉａ６ウイルスは、Ｓｆ９細胞を、α２，６シアリル化糖タンパク質を産生できるように補完可能であることを明確に実証する。
【０２４６】
実施例２０：ＢａｃＭｉｄ  Ｓｉａ６−ＩＩウイルス
本発明者らは、ＢａｃＭｉｄＳｉａ６ＩＩのゲノムを、そのゲノム組織化を管理するためにサザンブロットによって解析した。
【０２４７】
図１９Ｂに示されるように、制限プロフィールおよびハイブリダイゼーションプロフィールは、予測される結果に準拠している。ＳＴ６の遺伝子はしたがって、遺伝子座ｐｉｆ１中に十分に組み込まれる。
【０２４８】
実施例２１：ＢａｃＭｉｄ  Ｓｉａ３／６の使用
１．組換えアルファ２，３およびアルファ２，６シアリル化タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの構築
ＢａｃＳｉａ３−６の活性を、モデルタンパク質として、ウイルスの表面糖タンパク質、ｇｐ６４を使用して管理した。そうするために、組換えウイルスを、ＢａｃＭｉｄＳｉａ３／６および空のトランスファーベクターｐＶＴＰＨおよびｐＶＴ／ｇｐ３７の間の相同組換えによって得た。α２，３シアリル−およびα２，６シアリル−モチーフの存在を、α２，３シアル酸を認識し、より低い程度に、α２，６結合されたシアル酸を認識するレクチンジ−ＣＢＭ４０およびα２，６結合されたシアル酸のみを認識し、α２，３結合されているものは認識しないＳＮＡの存在下で実施されるレクチンブロットによって解析した。
【０２４９】
・組換えバキュロウイルスの作製およびクローニング
Ｓｆ９細胞を、空のｐＶＴＰＨおよびｐＶＴ／ｇｐ３７およびＢａｃｍｉｄ２（対照）または実施例１５において得られたＢａｃＭｉｄ−Ｓｉａ３／６のＤＮＡを用いるリポフェクションによってトランスフェクトした。２８℃で感染の７日後、培養上清中の分泌されたウイルスを、ファージプラークアッセイ技術によってクローニングした。４つのウイルスクローンを選択し、増幅し、そのゲノムを抽出して、サザンブロットによって解析した。ウイルスゲノム中に挿入された遺伝子を、ＰＣＲによって増幅し、次いで、シーケンシングした。
【０２５０】
・組換えタンパク質の製造
タンパク質を、実施例１７に記載のとおりに製造した。
【０２５１】
・レクチンブロットによるグリコシル化の解析
解析プロトコールは、実施例２０、２１および２２において記載されたものと同一であった。
【０２５２】
２．結果
ＧａｌＳｉａ３−６ウイルスによって製造されたｇｐ６４は、ＳＮＡによって（図２０Ｂ）およびジ−ＣＢＭ４０（図２０Ｃ）によって両方によって認識される唯一のものであり、これは、２種類のシアル酸がｇｐ６４に結合されていることを明確に実証する。
【０２５３】
これらの実験は、ＢａｃＳｉａ３−６ウイルスは、Ｓｆ９細胞を、α２，３およびα２，６シアリル化糖タンパク質を産生できるように補完可能であることを明確に実証する。
【０２５４】
参考文献
特許文献
ＷＯ０１／１２８２９
ＷＯ２０１３／００５１９４
引用・参考文献リスト
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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