(57)【要約】  ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ１６及びＩＬ２を発現するＮＫ−９２（登録商標）細胞の組成物、並びにそれらの細胞を使用して患者における癌を治療する方法が本明細書に提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１９  ＣＡＲ及びＦｃ受容体を発現するＮＫ−９２細胞であって、マルチシストロン性ＤＮＡ構築物を含み、前記マルチシストロン性構築物は、前記ＣＤ１９  ＣＡＲ及び前記Ｆｃ受容体をコードし、前記マルチシストロン性構築物は、ＩＬ−２若しくはそのバリアント又はＩＬ−１５若しくはそのバリアントをコードする配列をさらに含むＮＫ−９２細胞。
【請求項２】
前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６である、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項３】
前記Ｆｃ受容体は、配列番号２を含む、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項４】
前記ＩＬ−２バリアントは、ｅｒＩＬ−２であり、又は前記ＩＬ−１５バリアントは、ｅｒＩＬ−１５である、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項５】
前記ＣＤ１９  ＣＡＲ、前記Ｆｃ受容体、前記ｅｒＩＬ−１５又はｅｒＩＬ−２の１つ以上の前記コード配列は、ヒト系中での発現のためにコドン最適化されている、請求項４に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項６】
ＣＤ１９発現細胞を殺傷し得る、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項７】
前記ＣＤ１９発現細胞は、腫瘍細胞である、請求項６に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項８】
前記腫瘍細胞は、ＳＵＰ−Ｂ１５細胞である、請求項７に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項９】
前記ＣＤ１９  ＣＡＲは、ｓｃＦｖ抗体断片を含む、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１０】
前記ｓｃＦｖ抗体断片は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１１】
前記マルチシストロン性構築物は、配列番号９の配列を含み、前記配列は、前記ｓｃＦｖ抗体断片をコードする、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１２】
自己開裂ペプチドをコードする配列を含み、前記配列は、前記ＣＤ１９  ＣＡＲとＣＤ１６との間に位置し、前記配列は、前記ＣＤ１９  ＣＡＲ及び前記ＦｃＲの等モル発現を可能とする、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１３】
ＣＤ１６をコードする配列と、ＩＬ−２若しくはそのバリアントをコードする配列又はＩＬ−１５若しくはそのバリアントをコードする配列との間の内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１４】
ＣＤ１９発現細胞に対する前記ＮＫ−９２細胞の直接細胞毒性は、エフェクターと標的との比が１０である場合、７０〜１００％である、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１５】
前記ＮＫ−９２細胞のＡＤＣＣ活性は、エフェクターと標的との比が１０である場合、３０〜９０％である、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１６】
前記ＣＤ１９  ＣＡＲは、配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を共有する配列を含む、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１７】
前記ＣＤ１９  ＣＡＲは、細胞質シグナリングドメインを含む、請求項１に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１８】
前記細胞質シグナリングドメインは、Ｆｃイプシロン受容体ガンマ（ＦｃεＲＩγ）である、請求項１７に記載のＮＫ−９２細胞。
【請求項１９】
請求項１に記載のＮＫ−９２細胞を含む医薬組成物を含むキット。
【請求項２０】
ＮＫ−９２細胞を生成する方法であって、
ＣＤ１９  ＣＡＲ、及びＣＤ１６、並びにＩＬ−２又はＩＬ−１５をコードするマルチシストロン性ベクターを提供すること、並びに
前記ベクターを前記ＮＫ−９２細胞中に導入して前記ＮＫ−９２細胞を生成すること
を含む方法。
【請求項２１】
前記ベクターは、自己開裂ペプチドをコードする配列を含み、前記配列は、ＣＡＲとＣＤ１６との間に位置し、前記配列は、ＣＡＲ及びＣＤ１６の等モル発現を可能とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクターは、前記ＣＤ１６コード配列と前記ＩＬ−２又はＩＬ−１５コード配列との間の内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
対象における癌を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の組成物を前記対象に投与することを含み、前記組成物は、請求項１に記載の複数のＮＫ−９２細胞を含む方法。
【請求項２４】
前記対象の体表面積１ｍ２当たり約１×１０８〜約１×１０１１個の改変細胞を、前記対象に投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌は、白血病又はリンパ腫である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍、ＨＳＣＴ後のＢ細胞悪性腫瘍、ＣＬＬ、Ｂ−ＡＬＬ、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ＵＣＢＴ後のＢ細胞系統リンパ悪性腫瘍、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ−非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）、ＨＳＣＴ後のＡＬＬ；リンパ腫、難治性濾胞性リンパ腫、又はリンパ芽球性白血病の１つ以上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍は、マントル細胞リンパ腫である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数のＮＫ−９２細胞を、静脈内投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数のＮＫ−９２細胞を、腫瘍内投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
ＮＫ細胞を個体に投与する方法であって、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＮＫ細胞を含む第１の組成物及び初代ＮＫ細胞を含む第２の組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年１０月３１日に出願された、本発明者らの同時係属中の米国仮特許出願第６２／７５３，７１９号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
３８ｋｂサイズの１０４０７７．０００８ＰＣＴ  Ｓｅｑ＿ＳＴ２５という名称の配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、２０１９年７月１５日に作成され、本出願とともにＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されており、参照により全体として組み込まれる。
【０００３】
本発明の分野は、癌治療法に関する遺伝子操作細胞である。
【背景技術】
【０００４】
背景技術の記載は、本発明の理解において有用であり得る情報を含む。本明細書に提供される情報のいずれも、先行技術であること又は目下特許請求される発明に関連することも、具体的又は暗示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることも許容するものではない。
【０００５】
本明細書における全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が具体的且つ個別的に参照により組み込まれることが示されるのと同程度で参照により組み込まれる。組み込まれる参照文献中の用語の定義又は使用が本明細書に提供されるその用語の定義と矛盾又は反する場合、本明細書に提供されるその用語の定義が適用され、その参照文献中のその用語の定義は適用されない。
【０００６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の主成分を構成する細胞毒性リンパ球である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、一般に、循環リンパ球の約１０〜１５％を占め、抗原に関して非特異的に且つ事前の免疫感作なしで標的細胞、例として、ウイルス感染細胞及び多くの悪性腫瘍細胞に結合し、それを殺傷する。Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４：２４（１９８１）。標的細胞の殺傷は、細胞溶解の誘導により生じる。自己ＮＫ細胞移植に使用されるＮＫ細胞は、対象からの血液の末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）画分から単離し、細胞培養物中で拡大して十分数の細胞を得、次いで対象中に再注入する。このような自己ＮＫ細胞は、インビボ治療においていくらかの有効性を示している。しかしながら、このような治療法はオートロガスの状況に制限され、全てのＮＫ細胞が細胞溶解性ではないという事実によりさらに複雑になる。
【０００７】
ＮＫ−９２（登録商標）は、非ホジキンリンパ腫を罹患する対象の血液中で発見され、次いでインビトロで不死化された細胞溶解癌細胞系である。ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＮＫ細胞に由来するが、正常ＮＫ細胞によりディスプレイされる主要阻害受容体を欠く一方、活性化受容体の大多数を保持する。しかしながら、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、正常細胞を攻撃することもなく、それらはヒトにおいて許容不可能な免疫拒絶応答を誘発することもない。ＮＫ−９２（登録商標）細胞系の特徴付けは、国際公開第１９９８／０４９２６８号パンフレット及び米国特許出願公開第２００２−００６８０４４号明細書に開示されている。ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ある癌の治療における治療剤として評価されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一部の実施形態において、本開示は、ＣＤ１９  ＣＡＲ及びＦｃ受容体を発現するＮＫ−９２（登録商標）細胞を提供する。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＣＤ１９  ＣＡＲ及びＦｃ受容体をコードするマルチシストロン性構築物を含む。一部の実施形態において、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６である。一部の実施形態において、Ｆｃ受容体は、配列番号２を含む。一部の実施形態において、マルチシストロン性導入遺伝子は、ＩＬ−２又はそのバリアントをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態において、ＩＬ−２バリアントは、ｅｒＩＬ−２である。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、又はｅｒＩＬ−２の１つ以上のコード配列は、ヒト系中での発現のためにコドン最適化されている。
【０００９】
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＣＤ１９発現細胞、例えば、腫瘍細胞を殺傷し得る。一部の実施形態において、腫瘍細胞は、ＳＵＰ−Ｂ１５細胞である。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、ｓｃＦｖ抗体断片を含む。一部の実施形態において、ｓｃＦｖ抗体断片は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、マルチシストロン性構築物は、配列番号９の配列を含み、その配列は、ｓｃＦｖ抗体断片をコードする。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、自己開裂ペプチドをコードする配列を含み、その配列は、ＣＤ１９  ＣＡＲとＣＤ１６との間に位置し、その配列は、ＣＤ１９  ＣＡＲ及びＦｃＲの等モル発現を可能とする。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＣＤ１６をコードする配列と、ＩＬ−２又はそのバリアントをコードする配列との間の内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）を含む。
【００１０】
一部の実施形態において、ＣＤ１９発現細胞に対するＮＫ−９２（登録商標）細胞の直接細胞毒性は、エフェクターと標的との比が１０である場合、７０〜１００％である。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞のＡＤＣＣ活性は、エフェクターと標的との比が１０である場合、３０％〜９０％である。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を共有する配列を含む。
【００１１】
一部の実施形態において、本開示は、本開示のＮＫ−９２（登録商標）細胞を含む医薬組成物を含むキットを提供する。
【００１２】
一部の実施形態において、本開示は、ＮＫ−９２（登録商標）細胞を生成する方法であって、ＣＤ１９  ＣＡＲ及びＣＤ１６をコードするベクターを提供すること、並びにベクターをＮＫ−９２（登録商標）細胞中に導入してＮＫ−９２（登録商標）細胞を生成することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ベクターは、ＩＬ−２をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態において、ベクターは、自己開裂ペプチドをコードする配列を含み、その配列は、ＣＡＲとＣＤ１６との間に位置し、その配列は、ＣＡＲ及びＣＤ１６の等モル発現を可能とする。一部の実施形態において、ベクターは、ＣＤ１６コード配列と、ＩＬ−２コード配列との間の内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）を含む。
【００１３】
一部の実施形態において、本開示は、対象における癌を治療する方法であって、対象に、治療有効量の組成物を対象に投与することを含み、組成物は、請求項エラー！参照元が見つかりません〜エラー！参照元が見つかりませんのいずれかの複数のＮＫ−９２（登録商標）細胞を含む方法を提供する。一部の実施形態において、対象の体表面積１ｍ２当たり約１×１０８〜約１×１０１１個の改変細胞を、対象に投与する。
【００１４】
一部の実施形態において、癌は、白血病又はリンパ腫である。
【００１５】
一部の実施形態において、癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍、ＨＳＣＴ後のＢ細胞悪性腫瘍、ＣＬＬ、Ｂ−ＡＬＬ、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ＵＣＢＴ後のＢ細胞系統リンパ悪性腫瘍、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ−非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）、ＨＳＣＴ後のＡＬＬ；リンパ腫、難治性濾胞性リンパ腫、又はリンパ芽球性白血病の１つ以上である。一部の実施形態において、Ｂ細胞悪性腫瘍は、マントル細胞リンパ腫である。一部の実施形態において、複数のＮＫ−９２（登録商標）細胞は、静脈内投与される。一部の実施形態において、複数のＮＫ−９２（登録商標）細胞は、腫瘍内投与される。
【００１６】
上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明は、例示的及び説明的なものであり、本開示のさらなる説明を提供するものとする。他の目的、利点及び新規特徴部は、当業者に容易に明らかである。
【００１７】
目的、特徴部及び利点は、添付の図面とともに考慮される場合、以下の開示の参照時により容易に認識される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】第１、第２、及び第３世代のＣＡＲの構造ドメインの模式的表示である。
【図２】ＣＡＲコード配列、Ｐ２Ａ配列、ＣＤ１６コード配列、及びｅｒＩＬ−２コード配列を含むトリシストロン性プラスミドの構成成分を示す。
【図３Ａ−Ｂ】ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の表面上でのＣＤ１６及びＣＤ１９−ＣＡＲの発現を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。それぞれのプロットの右側のピークは、ＣＤ１６又はＣＤ１９を発現する細胞の集団を表す。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａは、Ｋ５６２細胞に対するＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の細胞毒性効果を示す。１６Ｂ１及び１８Ｂ１は、２つの異なる日に実施された２つのエレクトロポレーションイベントから得られた２つのＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）集団である。図４Ｂは、細胞毒性アッセイにおける、Ｋ５６２に対する選択されたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンの細胞毒性効果を示す。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａは、ＳＵＰ−Ｂ１５細胞に対するＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の細胞毒性効果を示す。１６Ｂ１及び１８Ｂ１は、２つの異なる日に実施された２つのエレクトロポレーションイベントから得られた２つのＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）集団である。図５Ｂは、細胞毒性アッセイにおける、ＳＵＰ−Ｂ１５に対する選択されたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンの細胞毒性効果を示す。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（抗Ｈｅｒ２抗体）と組み合わせた場合の、ＳＫＢｒ３細胞に対するＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞のＡＤＣＣ活性を示す。抗ＣＤ２０抗体Ｒｉｔｕｘａｎを対照として使用した。図６Ｂは、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブと組み合わせた場合の、ＣＤ１９ＫＯ／ＣＤ２０＋であるＳＵＰ−Ｂ１５細胞に対する選択されたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンのＡＤＣＣ活性を示す。
【図７】選択されたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンのその倍化時間を示す。
【図８】培養条件における、選択されたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンからのＩＬ−２放出を示す。
【図９】ＩＶ  Ｒａｊｉ腫瘍担持動物の生存曲線を示す。統計的分析をログランク（マンテルコックス）検定により行った、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図１０】ＩＶ  Ｒａｊｉ腫瘍モデルにおける動物体重変化を示す。データは、平均±ＳＥＭである。ＳＥＭは、標準偏差をＮの平方根により割ったものとして計算した。
【図１１】ＳＣ  Ｒａｊｉモデルについての腫瘍成長曲線を示す。データは、平均±ＳＥＭである。統計的分析を、２元ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキー検定による多重比較を使用して行った；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図１２】ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）が、ＳＣ  Ｒａｊｉ腫瘍担持マウスの肝臓中の転移性疾患負荷を低減させたことを示す。（ａ）示される処理群からの動物の１３日目の全肝画像。黄色矢印は、転移性病変を示す。肝臓を写真撮影前に１０％のホルマリン中で少なくとも２４時間固定した。（ｂ）示される日の肝臓中の腫瘍細胞の進展割合の定量（ＨＥ染色により評価）。１３日目：対応のない両側ｔ検定により＊、Ｐ＝０．０２５７。１１及び１５日目についての統計的分析は、限定された試料サイズに起因して実施することができなかった。未加工データについては表４を参照されたい。
【図１３】ＳＣ  Ｒａｊｉ腫瘍モデルにおける動物体重変化を示す。データは、平均±ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
概要
本開示は、ＣＤ１９  ＣＡＲ及びＦｃ受容体を発現するＮＫ−９２（登録商標）細胞を提供する。一部の実施形態において、細胞は、ＩＬ−２をさらに発現する。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＣＤ１９  ＣＡＲ及びＦｃ、並びにＩＬ２をコードする核酸配列を含むトリシストロン性構築物を含む。
【００２０】
用語
別途規定のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００２１】
本明細書において、及び以下の特許請求の範囲において、以下の意味を有することが定義される多数の用語が参照される。
【００２２】
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものであるにすぎず、限定的なものではない。本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示しない限り、複数形も含むものとする。したがって、例えば、「ナチュラルキラー細胞」の言及には、複数のナチュラルキラー細胞が含まれる。
【００２３】
全ての数値指定、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、量、及び分子量は、範囲を含め、適宜０．１又は１．０刻みだけ（＋）又は（−）に変動する近似値である。常に明示されるわけではないが、全ての数値指定の前に、用語「約」が先行し得ることを理解すべきである。
【００２４】
本明細書において使用される「＋」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、その細胞マーカーが蛍光活性化細胞選別においてアイソタイプ対照に対して検出可能に存在し；又は定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいてバックグラウンドを超えて検出可能であることを意味する。
【００２５】
本明細書において使用される「−」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用される場合、その細胞マーカーが蛍光活性化細胞選別においてアイソタイプ対照に対して検出可能に存在せず；又は定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいてバックグラウンドを超えて検出可能でないことを意味する。
【００２６】
当業者により理解されるとおり、任意の及び全ての目的のため、特に書面による説明の提供に関して、本明細書に開示される全ての範囲は、任意の及び全ての考えられる下位範囲及びその下位範囲の組合せも包含する。任意の列記範囲は、同一の範囲が少なくとも等しい２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分割されることを十分に説明し、それを可能とすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書に開示されるそれぞれの範囲は、下位３分の１、中位３分の１及び上位３分の１などに容易に分けることができる。同様に当業者により理解されるとおり、全ての言語、例えば、「最大」、「少なくとも」、「よりも大きい」、「未満」などは、引用される数を含み、続いて上記の下位範囲に分けることができる範囲を指す。最後に、当業者により理解されるとおり、範囲は、それぞれの個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１、２、又は３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、又は５個の細胞を有する群を指し、以下同様である。
【００２７】
本明細書において使用される用語「実質的に同一」は、用語「同等」、又は「実質的に類似」と互換的に使用され、ＮＫ−９２（登録商標）細胞のある定量可能な特性、例えば、細胞毒性、生存率又は細胞倍化時間などを指す場合、それらの特性の２つの計測値が互いに１５％以下異なり、１０％以下、８％以下、又は５％以下異なることを指す。
【００２８】
常に明示されるわけではないが、本明細書に記載の試薬は単に例示であること及びそのようなものの等価物が当該技術分野において公知であることも理解すべきである。
【００２９】
本発明の目的のため、及び別途示されない限り、用語「ＮＫ−９２（登録商標）（商標）」は、元のＮＫ−９２（登録商標）細胞系並びにＮＫ−９２（登録商標）細胞系、ＮＫ−９２（登録商標）細胞のクローン、及び（例えば、外因性遺伝子の導入により）改変されたＮＫ−９２（登録商標）細胞を指すものとする。ＮＫ−９２（登録商標）細胞並びに例示的及びその非限定的な改変は、全てが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，６１８，８１７号明細書；同第８，０３４，３３２号明細書；同第８，３１３，９４３号明細書；同第９，１８１，３２２号明細書；同第９，１５０，６３６号明細書；及び米国特許出願公開第１０／００８，９５５号明細書に記載されており、それとしては、野生型ＮＫ−９２（登録商標）、ＮＫ−９２（登録商標）−ＣＤ１６、ＮＫ−９２（登録商標）−ＣＤ１６−γ、ＮＫ−９２（登録商標）−ＣＤ１６−ζ、ＮＫ−９２（登録商標）−ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖ）、ＮＫ−９２（登録商標）ＭＩ、及びＮＫ−９２（登録商標）ＣＩが挙げられる。ＮＫ−９２（登録商標）細胞は当業者に公知であり、そのような細胞はＮａｎｔＫｗｅｓｔ（登録商標），Ｉｎｃ．から容易に入手可能である。
【００３０】
本明細書において使用される用語「ＮＫ−９２（登録商標）細胞」は、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））に記載の高度に強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔ（登録商標）により保有される（以下、「ＮＫ−９２（登録商標）細胞」）。
【００３１】
本明細書において使用される用語「ａＮＫ細胞」は、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））に記載の高度に強力なユニーク細胞系に由来する未改変ナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔ（登録商標）により保有される（以下、「ａＮＫ細胞」）。
【００３２】
本明細書において使用される用語「ｈａＮＫ細胞」は、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））に記載の高度に強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔ（登録商標）により保有され、細胞表面上でＣＤ１６を発現するように改変されている（以下、「ＣＤ１６＋ＮＫ−９２（登録商標）細胞」又は「ｈａＮＫ細胞」）。
【００３３】
本明細書において使用される用語「ｔａＮＫ細胞（登録商標）」は、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））に記載の高度に強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔ（登録商標）により保有され、キメラ抗原受容体を発現するように改変されている（以下、「ＣＡＲ改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞」又は「ｔａＮＫ細胞（登録商標）」）。
【００３４】
本明細書において使用される用語「ｔ−ｈａＮＫ（商標）」細胞は、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））に記載の高度に強力なユニーク細胞系に由来するナチュラルキラー細胞を指し、それはＮａｎｔｋＷｅｓｔ（登録商標）により保有され、細胞表面上でＣＤ１６を発現し、キメラ抗原受容体を発現するように改変されている（以下、「ＣＡＲ改変ＣＤ１６＋ＮＫ−９２（登録商標）細胞」又は「ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞」）。一部の実施形態において、腫瘍特異的抗原はＣＤ１９であり、それらのＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＣＤ−１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞と称される。
【００３５】
本明細書において使用される用語「マルチシストロン性構築物」は、単一ｍＲＮＡ分子に転写され得る組換えＤＮＡ構築物を指し、単一ｍＲＮＡ分子は、２つ以上の導入遺伝子をコードする。マルチシストロン性構築物は、それが２つの導入遺伝子をコードする場合はバイシストロン性構築物と称され、それが３つの遺伝子をコードする場合はトリシストロン性構築物と称され、それが４つの遺伝子をコードする場合はクアドロシストロン性構築物と称され、以下同様である。
【００３６】
本明細書において使用される用語「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、細胞内シグナリングドメインと融合している細胞外抗原結合ドメインを指す。ＣＡＲは、Ｔ細胞又はＮＫ細胞中で発現させて細胞毒性を増加させることができる。一般に、細胞外抗原結合ドメインは、目的細胞上に見出される抗原に特異的なｓｃＦｖである。ＣＡＲ発現ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ｓｃＦｖドメインの特異性に基づき、ある抗原を細胞表面上で発現する細胞に標的化される。ｓｃＦｖドメインは、任意の抗原、例として、腫瘍特異的抗原及びウイルス特異的抗原を認識するように遺伝子操作することができる。例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲは、一部の癌により発現される細胞表面マーカーのＣＤ１９を認識する。
【００３７】
本明細書において使用される用語「腫瘍特異的抗原」は、癌又は新生物細胞上に存在するが、癌細胞と同一の組織又は系統に由来する正常細胞上では検出可能でない抗原を指す。本明細書において使用される腫瘍特異的抗原は、腫瘍関連抗原、すなわち、癌細胞と同一の組織又は系統に由来する正常細胞と比較して高いレベルにおいて癌細胞上で発現される抗原も指す。
【００３８】
本明細書において使用される用語「標的」は、腫瘍の標的化を指す場合、腫瘍細胞（すなわち、標的細胞）を認識し、殺傷するＮＫ−９２（登録商標）細胞の能力を指す。この文脈における用語「標的化される」は、例えば、腫瘍により発現される細胞表面抗原を認識し、それに結合するＮＫ−９２（登録商標）細胞により発現されるＣＡＲの能力を指す。
【００３９】
用語「抗体」は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン、又は標的抗原への特異的結合についてインタクト抗体と競合し得るその断片を指し、それとしては、キメラ、ヒト化、完全ヒト、及び二重特異的抗体が挙げられる。インタクト抗体は、一般に、少なくとも２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含むが、一部の例において、より少ない鎖を含み得、例えば、ラクダにおいて天然に発生する抗体は、重鎖のみを含み得る。抗体は、もっぱら単一資源に由来し得、又は抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来するような「キメラ」であり得る。抗原結合タンパク質、抗体、又は結合断片は、ハイブリドーマ中で組換えＤＮＡ技術により、又はインタクト抗体の酵素的若しくは化学的開裂により産生することができる。別途示されない限り、用語「抗体」は、２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含む抗体に加え、それらの誘導体、バリアント、断片、及びムテインを含む。さらに、明示的に排除されない限り、抗体としては、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書において「抗体模倣物」と称されることがある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書において「抗体コンジュゲート」と称されることがある）、及びそれらの断片がそれぞれ挙げられる。一部の実施形態において、この用語は、ペプチボディも含む。
【００４０】
用語「対象」は、非ヒト動物、例として、哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、及びヤギ、並びにヒトを指す。対象という用語は、本明細書に記載の疾患のための治療が必要とされる患者も指す。
【００４１】
「任意選択」又は「場合により」は、続いて記載されるイベント又は状況が生じても生じなくてもよいこと、並びに記載がイベント又は状況が生じる例及び生じない例を含むことを意味する。
【００４２】
用語「含む」は、組成物及び方法が記載された要素を含むが、他の要素を排除するものでないことを意味するものとする。「から本質的になる」は、組成物及び方法を定義するために使用される場合、その組合せに対して任意の本質的に重要な他の要素を排除することを意味するものとする。例えば、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求の範囲の基本的且つ新規の特徴に実質的に影響を与えない他の要素を排除しない。「からなる」は、微量を上回る量の他の成分及び実質的な方法ステップを排除することを意味する。これらの移行語のそれぞれにより定義される実施態様は、本開示の範囲内である。
【００４３】
本明細書において使用される用語「細胞毒性」及び「細胞溶解性」は、エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性を記載するために使用される場合、同義であるものとする。一般に、細胞毒性活性は、種々の生物学的、生化学的、又は生物物理学的機序のいずれかによる標的細胞の殺傷に関する。細胞溶解は、より具体的には、エフェクターが標的細胞の原形質膜を溶解し、それによりその物理的統合性を破壊する活性を指す。これは、標的細胞の殺傷をもたらす。理論による拘束を望むものではないが、ＮＫ細胞の細胞毒性効果は細胞溶解に起因すると考えられる。
【００４４】
細胞／細胞集団に関する用語「殺傷する」は、その細胞／細胞集団の死滅をもたらす任意のタイプの操作を含むものとする。
【００４５】
用語「サイトカイン」は、免疫系の細胞に影響を与える生物分子の一般的クラスを指す。例示的なサイトカインとしては、限定されるものではないが、ＦＬＴ３リガンド、インターフェロン及びインターロイキン（ＩＬ）、特にＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１が挙げられる。
【００４６】
用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書では互換的に用いられ、本明細書に記載の方法に適する任意の動物、又はインビトロ若しくはインサイチューにかかわらずその細胞を指す。ある非限定的な実施形態において、患者、対象、又は個体はヒトである。
【００４７】
用語「治療する」又は「治療」は、対象、例えば、ヒトにおける本明細書に記載の疾患又は障害の治療を包含し、（ｉ）疾患若しくは障害を阻害すること、すなわち、その発生を停止させること；（ｉｉ）疾患若しくは障害を緩和すること、すなわち、障害の退縮を引き起こすこと；（ｉｉｉ）障害の進行を減速させること；及び／又は（ｉｖ）疾患若しくは障害の１つ以上の症状を阻害し、緩和し、若しくはその進行を減速させることを含む。対象にモノクローナル抗体又はナチュラルキラー細胞を「投与する」又は対象へのそれらの「投与」という用語は、目的の機能を果たすために抗体又は細胞を導入又は送達する任意の経路を含む。投与は、細胞又はモノクローナル抗体の送達に好適な任意の経路により実施することができる。したがって、送達経路としては、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下送達を挙げることができる。一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、例えば腫瘍中への注射により腫瘍に直接投与する。一部の実施形態において、本明細書に記載の改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、例えば、注射、注入又は移植（皮下、静脈内、筋肉内、小胞内、腫瘍内又は腹腔内）により非経口投与する。
【００４８】
用語「発現」は、遺伝子産物の産生を指す。
【００４９】
本明細書において使用される用語「細胞毒性」は、エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性を記載するために使用される場合、種々の生物学的、生化学的、又は生物物理学的機序のいずれかによる標的細胞の殺傷に関する。
【００５０】
用語「減少させる」、「低減された」、「低減」及び「減少」は全て、参照レベルと比較して少なくとも１０％だけの減少、例えば、少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％だけの減少若しくは１００％を含む最大１００％の減少（すなわち、参照サンプルと比較して不存在のレベル）、又は参照レベルと比較して１０〜１００％の任意の減少を指すために本明細書において使用される。
【００５１】
用語「癌」は、哺乳動物中に見出される全てのタイプの癌、新生物、又は悪性腫瘍、例として、白血病、癌腫及び肉腫を指す。例示的な癌としては、脳、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、肝臓、腎臓、肺、非小細胞肺、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃、子宮及び髄芽腫の癌が挙げられる。追加の例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽腫、食道癌、泌尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮内膜癌、副腎皮質癌、膵内分泌部及び膵外分泌部の新生物、並びに前立腺癌が挙げられる。
【００５２】
用語「治療有効量」又は「有効量」は、非治療患者に対して疾患の症状を改善するために要求される量を指す。疾患の治療的処置のために本開示を実施するために使用される有効量の活性化合物は、投与方式、対象の年齢、体重、及び全身健康状態に応じて変動する。最終的には、主治医又は獣医師は、適切量及び投与量レジメンを決定する。このような量は、「有効」量と称される。
【００５３】
表題又は副題は読者の簡便性のために本明細書において使用することができ、それらは本開示の範囲に影響を与えるものではない。さらに、本明細書において使用される一部の用語は以下により具体的に定義される。
【００５４】
ＮＫ−９２（登録商標）細胞
ＮＫ−９２（登録商標）は、非ホジキンリンパ腫を罹患する対象の血液中で発見され、次いでインビトロで不死化された細胞溶解癌細胞系である。ＮＫ−９２（登録商標）細胞はＮＫ細胞に由来するが、正常ＮＫ細胞によりディスプレイされる主要な阻害受容体を欠く一方、活性化受容体の大多数を保持する。しかしながら、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は正常細胞を攻撃することもなく、それらはヒトにおいて許容不可能な免疫拒絶応答を誘発することもない。ＮＫ−９２（登録商標）細胞系の特徴付けは、国際公開第１９９８／０４９２６８号パンフレット及び米国特許出願公開第２００２−００６８０４４号明細書に開示されている。ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ある癌の治療における治療剤として評価されている。
【００５５】
ベクター
本明細書に記載の改変細胞を産生するために細胞を形質移入するためのベクターが、本明細書に記載される。一実施形態において、本明細書に記載のベクターは、一過的発現ベクターである。このようなベクターを使用して導入される外因性導入遺伝子は細胞の核ゲノム中にインテグレートされず；したがって、ベクター複製の不存在下で外来導入遺伝子は分解され、又は経時的に希釈される。
【００５６】
一実施形態において、本明細書に記載のベクターは、細胞の安定的形質移入を可能とする。一実施形態において、ベクターは、細胞のゲノム中への導入遺伝子の取り込みを可能とする。一実施形態において、ベクターは、陽性選択マーカーを有する。陽性選択マーカーとしては、任意の遺伝子を発現しない細胞を殺傷する条件下で細胞が成長するのを可能とする任意の遺伝子が挙げられる。非限定的な例としては、抗生物質耐性、例えば、ジェネティシン（Ｔｎ５からのＮｅｏ遺伝子）が挙げられる。
【００５７】
一実施形態において、ベクターは、プラスミドベクターである。一実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。当業者により理解されるとおり、任意の好適なベクターを使用することができる。好適なベクターは、当該技術分野において周知である。
【００５８】
一部の実施形態において、細胞は、目的タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードするｍＲＮＡにより形質移入される。ｍＲＮＡの形質移入は、タンパク質の一過的発現をもたらす。一実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞中へのｍＲＮＡの形質移入は、細胞の投与直前に実施される。一実施形態において、細胞の投与「直前」は、投与の約１５分〜約４８時間前を指す。好ましくは、ｍＲＮＡ形質移入は、投与の約５時間〜約２４時間前に実施される。
【００５９】
ＣＤ１９
ＣＤ１９は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通糖タンパク質である。これは、単一膜貫通ドメイン、細胞質Ｃ末端、及び細胞外Ｎ末端を有する。ＣＤ１９は、正常及び新生物Ｂ細胞、並びに濾胞性樹状細胞についてのバイオマーカーであり、Ｂ細胞受容体依存性及び非依存性シグナリングの両方のモジュレートを介する内因性Ｂ細胞シグナリング閾値の樹立に決定的に関与する。
【００６０】
ＣＤ１９は、ほとんどの急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及びＢ細胞リンパ腫において発現される。Ｂ細胞悪性腫瘍の大多数は、ＣＤ１９を正常〜高レベルにおいて発現する（ＡＬＬの８０％、Ｂ細胞リンパ腫の８８％、及びＢ細胞白血病の１００％）。ＣＤ１９はＢ細胞のホールマークであるが、骨髄悪性腫瘍の症例、例として、ＡＭＬ症例の２％においても観察されている。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｎｏｖ．２９，２０１２；１：３６。ＣＤ１９と関連する悪性腫瘍の非限定的な例を、表１に示す。
【００６１】
【表１】
2021524732.tif 000003
【００６２】
ＣＡＲ
腫瘍細胞をその同一組織に由来する正常細胞から区別する表現型変化は、特異的遺伝子産物の発現の１つ以上の変化、例として、正常細胞表面構成成分の損失又は他の細胞表面構成成分（すなわち、対応する正常、非癌性組織中で検出可能でない抗原）の獲得と関連することが多い。新生物若しくは腫瘍細胞中で発現されるが、正常細胞中では発現されない抗原、又は正常細胞中で見出されるレベルを実質的に上回るレベルにおいて新生物細胞中で発現される抗原は、「腫瘍特異的抗原」又は「腫瘍関連抗原」と称されている。腫瘍特異的抗原は、癌免疫療法のための標的として使用されている。１つのこのような治療法は、免疫細胞、例として、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表面上で発現されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を利用して癌細胞に対する細胞毒性を改善する。ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内シグナリングドメインに結合している単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、標的細胞（例えば、癌細胞）上の抗原を認識し、それに結合し、エフェクター細胞活性化をトリガーする。シグナリングドメインは、受容体による細胞内シグナリングに重要である免疫受容体チロシンベース活性化ドメイン（ＩＴＡＭ）を含有する。
【００６３】
本開示は、細胞表面上で少なくともキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されたＮＫ−９２（登録商標）細胞を提供する。ＣＡＲは、細胞外抗原認識部分（通常、特異的抗体の可変ドメインに由来する、と、特異的抗原が認識されると細胞溶解応答をトリガーし得る細胞内シグナリングドメイン（単一又は追加の共刺激エレメントを有する）とを組み合わせる。複数のタイプのＣＡＲが存在し、それら全てを本出願において使用することができる。第１世代のＣＡＲは、１つの細胞質シグナリングドメインを含有する。シグナリングドメインは、例えば、１つのＩＴＡＭを含有するＦｃイプシロン受容体ガンマ（ＦｃεＲＩγ）に、又は３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３ζに由来し得る。ＣＤ３ζ  ＣＡＲは、腫瘍根絶においてＦｃεＲＩγ  ＣＡＲよりも効率的であることが考えられる。例えば、Ｈａｙｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６６：１８２−１８７；Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．２０１０，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９５６３０４を参照されたい。第２及び第３世代ＣＡＲは、複数のシグナリングドメイン、例えば、ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメイン及び共刺激シグナリングドメイン、例えば、ＣＤ２８／ＣＤ１３４／ＣＤ１３７／ＩＣＯＳ及びＣＤ２８／ＣＤ１３４と、単一ＣＡＲとを組み合わせてＮＫ−９２（登録商標）細胞の活性化及び増殖を促進する。したがって、一部の実施形態において、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞により発現されるＣＤ１９  ＣＡＲは、ＣＤ８からのヒンジ領域、及び／又はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、ＦｃεＲＩγの細胞質シグナリングドメインを含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメインを含む。ヒンジ領域、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン及びＦｃεＲＩγ又はＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメインの例は、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／６７４，９３６号明細書に開示されている。
【００６４】
従来の刊行物、例えば、Ｈａｙｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６６：１８２−１８７及びＣａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．２０１０，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９５６３０４は、ＣＤ３ζ  ＣＡＲが腫瘍根絶においてＦｃεＲＩγ  ＣＡＲよりも有効であり得ることを開示している一方、本件で、本発明者らは、驚くべきことに、且つ予想外に、そのようなものは、本明細書に開示の細胞、組成物、及び方法について当てはまらないことを見出した。実際、本発明者らは、本明細書に開示のＮＫ−９２（登録商標）細胞がＦｃεＲＩγ  ＣＡＲドメインを有する場合、それは、ＣＤ３ζ  ＣＡＲを有する場合と同程度に有効であり、又は一部の実施形態において、それよりもさらに有効であることを見出した。
【００６５】
場合により、ＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的である。一部の実施形態において、ＣＤ１９は、ヒトＣＤ１９である。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は、配列番号１０をコードする配列番号９の核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は、配列番号１２をコードする配列番号１１の核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は、配列番号１３のトリシストロン性構築物を含む。
【００６６】
一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を共有する配列を含む。一部の実施形態において、エピトープタグペプチド、例えば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ポリヒスチジン、又はＶ５をポリペプチドのアミノ末端ドメインに付加して抗エピトープタグペプチドモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用による細胞表面検出を支援することができる。
【００６７】
例において、当該技術分野において公知の方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を使用してバリアントポリペプチドを作製する。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ，１９８６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８７）、カセット突然変異誘発、制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）又は他の公知の技術をクローニングされたＤＮＡに対して実施してＣＤ１６バリアントを産生する（Ａｕｓｕｂｅｌ，２００２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１）。
【００６８】
一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを突然変異させてＣＡＲの機能を変更せずにＣＡＲをコードするアミノ酸配列を変更する。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすポリヌクレオチド置換を、配列番号９又は配列番号１１中で作製することができる。
【００６９】
１つのクラスのアミノ酸を同一クラスの別のアミノ酸により置き換える配列番号１０又は１２中の保存的置換は、その置換がポリペプチドの活性を実質的に変更しない限り、開示されるバリアントの範囲内に収まる。保存的置換は、当業者に周知である。（１）ポリペプチド骨格の構造、例えば、β−シート又はα−ヘリカル立体構造、（２）電荷、（３）疎水性、又は（４）標的部位の側鎖のかさ高さに影響を与える非保存的置換は、ポリペプチド機能又は免疫学的アイデンティティを改変し得る。非保存的置換は、それらのクラスの１つのメンバーと、別のクラスとの交換を伴う。置換は、保存的置換部位又はより好ましくは、非保存部位中に導入することができる。
【００７０】
例において、当該技術分野において公知の方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を使用してバリアントポリペプチドを産生する。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ，１９８６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８７）、カセット突然変異誘発、制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）又は他の公知の技術をクローニングされたＤＮＡに対して実施してバリアントを産生することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，２００２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１）。
【００７１】
場合により、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ細胞（商標）を使用して癌、特に、ＣＤ１９を発現する癌を治療することができる。場合により、癌は、白血病（例として、急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（例として、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病））及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、例として、限定されるものではないが、肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫からなる群から選択される。
【００７２】
Ｆｃ受容体
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、少なくとも１つのＦｃ受容体を発現するように改変されており、その結果、少なくとも１つのＦｃ受容体は、ＮＫ−９２（登録商標）細胞の細胞表面上でディスプレイされる。Ｆｃ受容体は、抗体のＦｃ部分に結合する。いくつかのＦｃ受容体は公知であり、それらの好ましいリガンド、親和性、発現、及び抗体への結合後の効果により異なる。
【００７３】
【表２】
2021524732.tif 000004
【００７４】
【表３】
2021524732.tif 000005
【００７５】
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、細胞表面上でＦｃ受容体タンパク質を発現するように改変されている。
【００７６】
一部の実施形態において、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６である。本開示の目的のため、ＣＤ１６の特異的アミノ酸残基は、配列番号２、又は配列番号１に対して１つの位置において異なる配列番号１を参照して指定される。したがって、ＣＤ１６ポリペプチドの「１５８位における」アミノ酸残基は、ＣＤ１６ポリペプチド及び配列番号２が最大でアラインされる場合、配列番号２（又は配列番号１）の１５８位に対応するアミノ酸残基である。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、タンパク質の成熟形態、例えば、配列番号１の１５８位におけるフェニルアラニンを有するヒトＣＤ１６を発現するように改変されている。典型的な実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、タンパク質の成熟形態、例えば、配列番号２の１５８位におけるバリンを有するヒトＣＤ１６の高親和性形態を発現するように改変されている。成熟タンパク質の１５８位は、天然シグナルペプチドを含むＣＤ１６配列の１７６位に対応する。一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドは、配列番号３又は配列番号４の前駆体（すなわち、天然シグナルペプチドを有する）ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドによりコードされる。したがって、一実施形態において、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩ−Ａ（ＣＤ１６）を含む。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、配列番号１（ＦｃγＲＩＩＩ−Ａ又は１５８位におけるフェニルアラニン（Ｆ−１５８）を有するＣＤ１６と少なくとも９０％の配列同一性；又は配列番号２（１５８位におけるバリン（Ｆ１５８Ｖ）を有するＣＤ１６、より高親和性の形態）と少なくとも９０％の同一性を有するＦｃ受容体コードポリペプチドを発現するように遺伝子改変されている。
【００７７】
一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、全長ＣＤ１６の１７６位（成熟ＣＤ１６タンパク質の１５８位に対応する）におけるフェニルアラニンを有するシグナルペプチドを含む全長天然発生ＣＤ１６をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する。一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１７６位（成熟タンパク質の１５８位に対応する）におけるバリンを有するシグナルペプチドを含む全長天然発生ＣＤ１６をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する。一部の実施形態において、ＣＤ１６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有し、シグナルペプチドを含む全長ＣＤ１６ポリペプチドの１７６位をコードするポリヌクレオチドの位置におけるバリンをコードするコドンを含む。一部の実施形態において、ＣＤ１６をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３を含むが、全長ＣＤ１６の１７６位におけるバリンをコードするコドンを有する。
【００７８】
一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有するポリペプチドをコードし、配列番号２を参照して決定される１５８位におけるバリンを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２をコードする。一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリヌクレオチドは、シグナル配列を有し若しくは有さないＣＤ１６の細胞外ドメイン、又は全長ＣＤ１６の任意の他の断片、又は別のタンパク質のアミノ酸配列に融合しているＣＤ１６の少なくとも部分配列を包含するキメラ受容体をコードする。他の実施形態において、エピトープタグペプチド、例えば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ポリヒスチジン、又はＶ５を成熟ポリペプチドのアミノ末端ドメインに付加して抗エピトープタグペプチドモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用による細胞表面検出を支援することができる。
【００７９】
一部の実施形態において、相同性ＣＤ１６ポリヌクレオチドは、約１５０〜約７００、約７５０、又は約８００個のポリヌクレオチド長さであり得るが、７００〜８００個超のポリヌクレオチドを有するＣＤ１６バリアントは本開示の範囲内である。
【００８０】
相同性ポリヌクレオチド配列としては、ＣＤ１６のバリアントをコードするポリペプチド配列をコードするものが挙げられる。相同性ポリヌクレオチド配列としては、配列番号１に関する天然発生アレルバリエーションも挙げられる。配列番号１若しくは配列番号２のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、その天然発生バリアント、又は配列番号１若しくは配列番号２と少なくとも７０％同一、若しくは少なくとも８０％、９０％、若しくは９５％同一である配列をコードする任意のポリヌクレオチドによるＮＫ−９２（登録商標）細胞の形質移入は、本開示の範囲内である。一部の実施形態において、相同性ポリヌクレオチド配列は、配列番号１又は配列番号２中の保存的アミノ酸置換をコードする。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、天然ポリヌクレオチド配列と異なるが、同一のポリペプチドをコードする縮重相同性ＣＤ１６ポリヌクレオチド配列を使用して形質移入される。
【００８１】
他の例において、ＣＤ１６アミノ酸配列を変化させる多型を有するｃＤＮＡ配列、例えば、ＣＤ１６遺伝子中の遺伝子多型を示す個体間のアレルバリエーションなどを使用して、ＮＫ−９２（登録商標）細胞を改変する。他の例において、配列番号１の配列と異なるポリヌクレオチド配列を有する他の種からのＣＤ１６遺伝子を使用してＮＫ−９２（登録商標）細胞を改変する。
【００８２】
バリアントポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を使用して作製することができる。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ，１９８６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８７）、カセット突然変異誘発、制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）又は他の公知の技術をクローニングされたＤＮＡに対して実施してＣＤ１６バリアントを産生することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，２００２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１）。
【００８３】
一部の実施形態において、ＣＤ１６をコードするポリヌクレオチドを突然変異させてＣＤ１６の機能を変更せずにＣＤ１６をコードするアミノ酸配列を変更する。例えば、例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすポリヌクレオチド置換を、配列番号１又は配列番号２中で作製することができる。
【００８４】
１つのクラスのアミノ酸を同一クラスの別のアミノ酸により置き換える配列番号１又は配列番号２中の保存的置換は、その置換がポリペプチドの活性を実質的に変更しない限り、開示されるＣＤ１６バリアントの範囲内に収まる。保存的置換は、当業者に周知である。（１）ポリペプチド骨格の構造、例えば、β−シート又はα−ヘリカル立体構造、（２）電荷、（３）疎水性、又は（４）標的部位の側鎖のかさ高さに影響を与える非保存的置換は、ＣＤ１６ポリペプチド機能又は免疫学的アイデンティティを改変し得る。非保存的置換は、それらのクラスの１つのメンバーと、別のクラスとの交換を伴う。置換は、保存的置換部位又はより好ましくは、非保存部位中に導入することができる。
【００８５】
一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドバリアントは、少なくとも２００個のアミノ酸長さであり、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドバリアントは、少なくとも２２５個のアミノ酸長さであり、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドバリアントは、配列番号２を参照して決定される１５８位におけるバリンを有する。
【００８６】
一部の実施形態において、ＣＤ１６ポリペプチドをコードする核酸は、ＣＤ１６融合タンパク質をコードし得る。ＣＤ１６融合ポリペプチドとしては、非ＣＤ１６ポリペプチドと融合しているＣＤ１６の任意の部分又はＣＤ１６全体が挙げられる。融合ポリペプチドは、組換え方法を使用して簡便に作出される。例えば、ＣＤ１６ポリペプチド、例えば、配列番号１又は配列番号２をコードするポリヌクレオチドは、非ＣＤ１６コードポリヌクレオチド（例えば、異種タンパク質のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）とインフレームで融合される。一部の実施形態において、異種ポリペプチド配列がＣＤ１６のＣ末端に融合しており、又はＣＤ１６中に内部的に位置する融合ポリペプチドを作出することができる。典型的には、ＣＤ１６細胞質ドメインの最大約３０％を置き換えることができる。このような改変は、発現を向上させ、又は細胞毒性（例えば、ＡＤＣＣ応答性）を向上させ得る。他の例において、キメラタンパク質、例えば、他のリンパ球活性化受容体、例として、限定されるものではないが、Ｉｇ−ａ、Ｉｇ−Ｂ、ＣＤ３−ｅ、ＣＤ３−ｄ、ＤＡＰ−１２及びＤＡＰ−１０からのドメインが、ＣＤ１６細胞質ドメインの一部と置き換わる。
【００８７】
融合遺伝子は、慣用の技術、例として、自動化ＤＮＡ合成装置及び２つの連続する遺伝子断片（続いてこれをアニールし、再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成することができる）間の相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用するＰＣＲ増幅により合成することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，２００２）。融合部分へのインフレームでのＣＤ１６のサブクローニングを容易にする多くのベクターが市販されている。
【００８８】
サイトカイン
ＮＫ−９２（登録商標）細胞の細胞毒性は、サイトカイン（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２））の存在に依存的である。市販スケール培養でＮＫ−９２細胞を維持し、拡大するために必要とされる外因的に添加されるＩＬ−２を使用するコストは、かなりのものである。ＮＫ９２（登録商標）細胞の活性化を継続するために十分な量のＩＬ−２のヒト対象への投与は、有害副作用を引き起こす。
【００８９】
一実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、少なくとも１つのサイトカインを発現するように改変されている。特に、少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ−２（配列番号６）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、又はそのバリアントである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、又はそのバリアントである。ある実施形態において、ＩＬ−２は、小胞体に標的化されるバリアントであり、ＩＬ−１５は、小胞体に標的化されるバリアントである。
【００９０】
一実施形態において、ＩＬ−２は、ＩＬ−２を小胞体に指向するシグナル配列とともにクローニング及び発現される（ｅｒＩＬ−２）（配列番号７）。これは、ＩＬ−２を細胞外に放出させずにオートクリン活性化に十分なレベルにおけるＩＬ−２の発現を可能とする。Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＩＬ−２  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｏｎｆｉｎｅｓ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＮＫ−９２（Ｒ）ｃｅｌｌｓ”Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００５  Ｆｅｂ；３３（２）：１５９−６４を参照されたい。ＦｃＲ発現ＮＫ−９２（登録商標）細胞の継続的活性化は、例えば、自殺遺伝子の存在により防止することができる。
【００９１】
自殺遺伝子
用語「自殺遺伝子」は、自殺遺伝子を発現する細胞の陰性選択を可能とする導入遺伝子を指す。自殺遺伝子は、その遺伝子を発現する細胞を選択剤の導入により殺傷することができる安全系として使用される。これは、組換え遺伝子が制御不能な細胞成長をもたらす突然変異を引き起こす場合、又は細胞自体がそのような成長をし得る場合に望ましい。多数の自殺遺伝子系、例として、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｐｔ遺伝子、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｄｅｏ遺伝子が同定されている。典型的には、自殺遺伝子は、細胞に対する悪影響を有さないが、規定の化合物の存在下でその細胞を殺傷するタンパク質をコードする。したがって、自殺遺伝子は、典型的には、系の一部である。
【００９２】
一実施形態において、自殺遺伝子は、ＮＫ−９２（登録商標）細胞中で活性である。一実施形態において、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である。ＴＫ遺伝子は、野生型又は突然変異ＴＫ遺伝子（例えば、ｔｋ３０、ｔｋ７５、ｓｒ３９ｔｋ）であり得る。ＴＫタンパク質を発現する細胞は、ガンシクロビルを使用して殺傷することができる。
【００９３】
別の実施形態において、自殺遺伝子は、５−フルオロシトシンの存在下で細胞に毒性であるシトシンデアミナーゼである。Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｄｕｃｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  １  ｍｉｌｌｉｏｎ−ｆｏｌｄ  ｗｈｅｎ  ｔｈｅｙ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｕｒｇｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”Ｂｌｏｏｄ．１９９８  Ｊｕｌ  １５；９２（２）：６７２−８２。
【００９４】
別の実施形態において、自殺遺伝子は、イホスファミド又はシクロホスファミドの存在下で毒性であるシトクロムＰ４５０である。例えば、Ｔｏｕａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．“Ａ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．”Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１４；１４（３）：２３６−４６を参照されたい。
【００９５】
別の実施形態において、自殺遺伝子は、ｉＣａｓｐ９である。Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ，（２０１１）“Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｓａｆｅｔｙ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：１６７３−１６８３。Ｍｏｒｇａｎ，“Ｌｉｖｅ  ａｎｄ  Ｌｅｔ  Ｄｉｅ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｏｖｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）；２０：１１−１３も参照されたい。ｉＣａｓｐ９は、低分子ＡＰ１９０３の存在下でアポトーシスを誘導する。ＡＰ１９０３は生物学的に不活性な低分子であり、臨床試験において良好に忍容性であることが示されており、養子細胞療法の状況において使用されている。
【００９６】
コドン最適化
一部の実施形態において、ａＮＫ細胞を形質転換するために使用される構築物の配列は、ヒト系中でのＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ１６、及び／又はｅｒＩＬ−２の発現効率を最大化するようにコドン最適化されている。コドン最適化は、典型的には、天然配列のコドンの少なくとも１つ、２つ以上、又はかなりの数を、発現系の遺伝子においてより高頻度に又は最も高頻度に使用されるコドンにより置き換えることにより核酸配列を改変することにより実施される。コドン最適化を翻訳速度に使用し、又はそれを使用して所望の特性、例えば、非最適化配列を使用して産生される転写産物と比較して長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写産物を産生することができる。コドン最適化の方法は容易に利用可能であり、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からのＧｅｎｅＡｒｔ（商標）；ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲにおいて無料でアクセス可能なＯｐｔｉｍｉｚｅｒ、及びＤＮＡ  ２．０（Ｎｅｗａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのＧｅｎｅＧＰＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙである。特定の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲのコード配列はコドン最適化されており、配列番号９に記載の配列を含む。
【００９７】
導入遺伝子発現
導入遺伝子は、当業者に公知の任意の機序により発現ベクター中に遺伝子操作することができる。複数の導入遺伝子を細胞中に挿入すべき場合、導入遺伝子は、同一の発現ベクター又は異なる発現ベクター中に遺伝子操作することができる。
【００９８】
一部の実施形態において、細胞は、発現させるべきトランスジェニックタンパク質をコードするｍＲＮＡにより形質移入される。
【００９９】
導入遺伝子及びｍＲＮＡは、当該技術分野において公知の任意の形質移入法、例として、非限定的な例として、感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、又は「遺伝子銃」を使用してＮＫ−９２（登録商標）細胞中に導入することができる。
【０１００】
ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＮＫ−９２（登録商標）細胞
本開示は、ＣＤ１９  ＣＡＲ及びＦｃＲを発現する改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞を提供する。場合により、改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＩＬ−２をさらに発現する。
【０１０１】
一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、マルチシストロン性導入遺伝子を含み、マルチシストロン性導入遺伝子は、キメラ抗原受容体及びＦｃ受容体、並びに場合によりＩＬ−２をコードする。
【０１０２】
一部の実施形態において、ＦｃＲは、ＣＤ１６である。一部の実施形態において、ＣＤ１６は、配列番号２を含み、又はそれからなる高親和性ＣＤ１６である。一部の実施形態において、ＩＬ−２は、配列番号７を含み、又はそれからなるｅｒＩＬ−２である。
【０１０３】
一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲコード配列及びＣＤ１６コード配列は、同一のｍＲＮＡからコードされるＣＤ１９  ＣＡＲ及びＣＤ１６の等モル発現を産生するための自己開裂ペプチドをコードする配列により離隔している。自己開裂ペプチド及びそのコード配列は周知であり、例えば、関連の開示が参照により本明細書に組み込まれるＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  １６２７３（２０１５）に開示されている。自己開裂ペプチドの非限定的な例としては、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、トセア・アシグナ（ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａ（Ｅ２Ａ）、カイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）の細胞質多角体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ  ２Ａ）、及び軟化病ウイルス（ＢｍＩＦＶ  ２Ａ）が挙げられる。一部の実施形態において、自己開裂ペプチドは、配列番号８：ｇｇａａｇｃｇｇａｇｃｔａｃｔａａｃｔｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇａａｇｃａｇｇｃｔｇｇａｇａｃｇｔｇｇａｇｇａｇａａｃｃｃｔｇｇａｃｃｔによりコードされるＰ２Ａペプチドである。
【０１０４】
一部の実施形態において、ＣＤ１６コード配列及びｅｒＩＬ−２コード配列は、核酸配列から転写されるｍＲＮＡの内部領域からの翻訳の開始を可能とする内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）により離隔している。
【０１０５】
一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、単一ｍＲＮＡからＣＡＲ、高親和性ＣＤ１６、及びｅｒＩＬ−２を発現するトリシストロン性構築物を含む。一部の実施形態において、トリシストロン性構築物は、配列番号１１に記載の配列を含む。ＣＡＲのインテグレーションは、エフェクター細胞が、ＣＡＲにより認識される標的を発現する標的細胞に特異的にエンゲージし、それを殺傷するのを可能とし；ＣＤ１６のインテグレーションは、治療モノクローナル抗体と組み合わせた場合にＡＤＣＣを可能とし；ｅｒＩＬ２は外因性ＩＬ−２の不存在下で細胞拡大を可能とし、導入遺伝子発現についての選択圧を維持する。１つの実例的なトリシストロン性構築物を図２に示す。
【０１０６】
ＣＡＲ及びＣＤ１６（例えば、高親和性ＣＤ１６）、並びにｅｒＩＬ−２を発現する改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞を産生するため、マルチシストロン性プラスミドを、例えば、エレクトロポレーションによりａＮＫ細胞中に導入する。形質転換ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＩＬ−２を有さない培地中で成長させ、個々のクローンを形質転換ＮＫ−９２（登録商標）細胞から、限定希釈クローニングにより選択し、基準、例として、例えば、高レベルのＣＡＲ及びＣＤ１６発現、細胞毒性、ＡＤＣＣ、成長速度、及び／又はＩＬ−２分泌に基づき特徴付けすることができる。好適なクローンは、表面マーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／又はＮＫｐ３０も、ａＮＫ細胞のものと実質的に類似するレベルにおいて発現し得る。場合により、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を実施して導入遺伝子インテグレーション部位を決定する。これらの基準の１つ以上を満たすクローンをさらなる開発のために選択し、それを使用して診療所において患者を治療することができる。
【０１０７】
発現
ＩＬ−２の発現は、ＩＬ−２不含条件における改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞の能力により確認することができる。ＣＡＲ及びＣＤ１６の発現は、フローサイトメトリーにより計測することができる。ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ１６、及びＩＬ−２（例えば、ｅｒＩＬ−２）のコード配列を含むトリシストロン性構築物により形質転換されたＮＫ−９２（登録商標）細胞について、典型的には、ＩＬ−２不含条件で成長し得る形質転換細胞の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％が、ＣＡＲ及びＣＤ１６の両方の高い発現レベルも示す。
【０１０８】
場合により、形質転換ＮＫ−９２（登録商標）細胞のＩＬ−２分泌レベルは、種々の時点において当該技術分野において周知の方法を使用して、例えば、ＥＬＩＳＡにより計測することができる。
【０１０９】
一部の実施形態において、培養上清中のＩＬ−２レベルを計測して細胞培養培地に放出されるＩＬ−２のレベルを決定する。一部の実施形態において、細胞ペレット中のＩＬ−２レベルを計測してＩＬ−２の総細胞内レベルを評価する。一部の実施形態において、上清中のＩＬ−２量及び細胞ペレット中のＩＬ−２量の両方を計測して形質転換ＮＫ−９２（登録商標）細胞により産生されるＩＬ−２の総量を決定する。
【０１１０】
場合により、形質転換ＮＫ−９２（登録商標）細胞の他の表面マーカーは、フローサイトメトリーにより計測することができる。これらのマーカーとしては、限定されるものではないが、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、及びＣＤ３が挙げられる。好適なクローンは、同一の成長条件下でａＮＫ細胞とそれらのマーカーの実質的に類似する発現レベルを実証したものである。
【０１１１】
細胞毒性
場合により、トリシストロン性プラスミドにより形質転換されたＮＫ−９２（登録商標）細胞の細胞毒性は、フローベース細胞毒性アッセイを使用して評価することができる。エフェクター細胞（ＮＫ−９２（登録商標）細胞）及びフルオロフォア標識標的細胞、例えば、腫瘍細胞を、異なるエフェクターと標的との比において混合する。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を細胞に添加することができ、試料をフローサイトメーターにより分析した。好ましくは、標的細胞を標識するために使用されるフルオロフォアは、フローサイトメーターによりＰＩから区別することができる。一部の実施形態において、フルオロフォアは、ＣＦＳＥである。一部の実施形態において、フルオロフォアは、ＰＫＨＧＬ６７である。細胞毒性は、フルオロフォア陽性標的集団内のＰＩ陽性細胞の％により決定することができる。
【０１１２】
場合により、トリシストロン性プラスミドにより形質転換されたＮＫ−９２（登録商標）細胞の細胞毒性は、当分野において周知の方法を使用して試験することもできる。ＮＫ−９２（登録商標）細胞の細胞毒性は、それらの直接細胞毒性又はＡＤＣＣ活性により反映することができる。産生されたＮＫ−９２（登録商標）細胞の直接細胞毒性、異常細胞、例えば、腫瘍細胞を標的化し、殺傷する能力は、当該技術分野において周知の方法、例えば、Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３３：３９５−３９７（１９９１））により記載された手順を使用する５１Ｃｒ放出アッセイ（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｐｒ；８（４）：６５２−８（１９９４））により評価することができる。一部の実施形態において、標的細胞は、ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の表面上で発現されるＣＡＲにより認識され得る抗原を発現する。簡潔に述べると、５１Ｃｒ標識標的細胞をＮＫ−９２（登録商標）細胞と混合し、溶解させる。特異的細胞毒性の割合は、放出される５１Ｃｒの量に基づき計算することができる。米国特許出願公開第２００２００６８０４４号明細書を参照されたい。
【０１１３】
或いは、産生されるＮＫ−９２（登録商標）細胞の直接細胞毒性は、カルセイン放出アッセイを使用して評価することもできる。例えば、ＮＫ−９２（登録商標）細胞（アッセイにおいてエフェクターと称される）をカルセイン負荷標的細胞（アッセイにおいて標的と称される）と、ある比において混合することができる。一定時間のインキュベーション後、標的細胞から放出されたカルセインを、例えば、蛍光プレートリーダーにより評価することができる。
【０１１４】
各アッセイにおいて使用されるエフェクターと標的との比は変動し得、場合により、エフェクター：標的比は、２０：１、１５：１、１０：１、８：１、又は５：１であり得；好ましくは、エフェクター：標的比は、１０：１である。標的細胞は、ＮＫ−９２（登録商標）細胞（ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞）上のＣＡＲにより認識され得る抗原分子を発現する任意の細胞であり得る。例えば、ＳＵＰ−Ｂ１５細胞はＣＤ１９  ＣＡＲにより認識され得、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞についての標的細胞である。ＮＫ−９２（登録商標）細胞の細胞毒性の値は、使用される標的細胞のタイプ及びエフェクター：標的比に応じて変動し得る。一般に、本明細書に記載の方法を使用して産生されるＮＫ−９２（登録商標）細胞は、６０〜１００％、例えば、７０〜１００％又は８０〜１００％の細胞毒性を有し得る。一部の場合、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、カルセイン放出アッセイにより１：１０のエフェクター：標的比を使用した場合、８０〜１００％、例えば、８２〜１００％、８５〜１００％、８７〜１００％、８８〜１００％、又は８９〜１００％の細胞毒性を有し得る。
【０１１５】
場合により、評価されるＮＫ−９２（登録商標）細胞、例えば、ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の細胞毒性は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）である。ＮＫ−９２（登録商標）細胞のＡＤＣＣ活性を計測する方法は、標的細胞を認識し得る抗体も添加することを除き上記の直接細胞毒性を計測する方法と類似する。ＮＫ細胞のＦｃ受容体は細胞結合抗体を認識し、細胞溶解反応をトリガーし、標的細胞を殺傷する。１つの実例的な例において、ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（抗Ｈｅｒ２抗体）及びＳＫＢｒ３（標的細胞）とインキュベートすることができ、ＳＫＢｒ３細胞の殺傷は、上記の標的細胞の内部構成成分、例えば、５１Ｃｒ若しくはカルセインの放出により、又は標的細胞のＰＩ染色により計測することができる。
【０１１６】
倍化時間
ＮＫ−９２（登録商標）細胞、例えば、ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の成長速度は、細胞倍化時間、すなわち、細胞が初期の細胞数の２倍に到達するまで増殖するのに要する時間を使用して評価することができる。倍化時間は、ＮＫ−９２（登録商標）細胞の成長速度と反比例し；倍化時間が長いほど、成長速度は遅い。
【０１１７】
ＷＧＳ
場合により、形質転換ＮＫ−９２（登録商標）細胞の全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を実施してマルチシストロン性構築物の挿入部位を同定する。
【０１１８】
治療用途
本開示はまた、疾患の任意の病期における対象における任意のタイプの癌を治療する方法を提供する。好適な癌の非限定的な例としては、癌腫、黒色腫、又は肉腫が挙げられる。一部の実施形態において、本発明を使用して造血系由来の癌、例えば、白血病又はリンパ腫を治療する。一部の実施形態において、癌は、固形腫瘍である。
【０１１９】
一部の実施形態において、対象における任意のタイプの癌を治療する方法は、患者に治療有効量の上記のＮＫ−９２（登録商標）細胞を投与し、それにより癌を治療することを含む。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、Ｆｃ受容体、例えば、配列番号２に記載の配列を有する高親和性Ｆｃ受容体を発現する。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＣＤ１９  ＣＡＲ、Ｆｃ受容体及びＩＬ−２を発現する。一部の実施形態において、改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、マルチシストロン性構築物を含み、マルチシストロン性構築物は、キメラ抗原受容体及びＦｃ受容体をコードする。
【０１２０】
治療が必要とされる対象を、本明細書に記載の改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞により治療する方法も提供される。一部の実施形態において、対象又は患者は、癌又は感染性疾患、例えば、ウイルス感染を罹患する。
【０１２１】
改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、個体に絶対数の細胞だけ投与することができ、例えば、前記個体に、約１０００個の細胞／注射〜最大約１００億個の細胞／注射、例えば、１注射当たり約、少なくとも約、又は多くとも約１×１０８、１×１０７、５×１０７、１×１０６、５×１０６、１×１０５、５×１０５、１×１０４、５×１０４、１×１０３、５×１０３個（など）のＮＫ−９２（登録商標）細胞、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）を投与することができる。したがって、本開示はまた、複数のＮＫ−９２（登録商標）細胞を含む組成物であって、細胞の数は、１×１０８、１×１０７、５×１０７、１×１０６、５×１０６、１×１０５、５×１０５、１×１０４、５×１０４、１×１０３、又は５×１０３個（など）である組成物を提供する。
【０１２２】
他の実施形態において、前記個体に、約１０００個の細胞／注射／ｍ２〜最大約１００億個の細胞／注射／ｍ２、例えば、１注射当たり約、少なくとも約、又は多くとも約１×１０８個／ｍ２、１×１０７個／ｍ２、５×１０７個／ｍ２、１×１０６個／ｍ２、５×１０６個／ｍ２、１×１０５個／ｍ２、５×１０５個／ｍ２、１×１０４個／ｍ２、５×１０４個／ｍ２、１×１０３個／ｍ２、５×１０３個／ｍ２（など）のＮＫ−９２（登録商標）細胞、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）を投与することができる。
【０１２３】
他の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、そのような個体に相対数の細胞だけ投与することができ、例えば、前記個体に、個体１キログラム当たり約１０００個の細胞〜最大約１００億個の細胞、例えば、個体１キログラム当たり約、少なくとも約、又は多くても約１×１０８、１×１０７、５×１０７、１×１０６、５×１０６、１×１０５、５×１０５、１×１０４、５×１０４、１×１０３、又は５×１０３個（など）のＮＫ−９２（登録商標）細胞、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）を投与することができる。
【０１２４】
他の実施形態において、総用量は体表面積のｍ２により算出することができ、それとしては、１ｍ２当たり約１×１０１１、１×１０１０、１×１０９、１×１０８、１×１０７個、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）が挙げられる。平均的な人間は、約１．６ｍ２〜約１．８ｍ２である。好ましい実施形態において、約１０億〜約３０億個のＮＫ−９２（登録商標）細胞が患者に投与される。他の実施形態において、１用量当たり注射されるＮＫ−９２（登録商標）細胞の量は体表面積のｍ２により算出することができ、それとしては、１ｍ２当たり１×１０１１、１×１０１０、１×１０９、１×１０８、１×１０７個が挙げられる。人間についての平均体表面積は１．６〜１．８ｍ２である。
【０１２５】
他の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、そのような個体に相対数の細胞だけ投与することができ、例えば、前記個体に、個体１キログラム当たり約１０００個の細胞〜最大約１００億個の細胞、例えば、約、少なくとも約、又は多くとも約１×１０８、１×１０７、５×１０７、１×１０６、５×１０６、１×１０５、５×１０５、１×１０４、５×１０４、１×１０３、又は５×１０３個（など）のＮＫ−９２（登録商標）細胞、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）を投与することができる。
【０１２６】
ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、癌を有する患者に１回投与することができ、又はそれらは複数回、例えば、治療の間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３時間ごとに１回、又は１、２、３、４、５、６若しくは７日ごとに１回、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週若しくはそれを超える週ごとに１回、又はいずれか２つの数字間の任意の範囲（端点を含む）ごとに１回、投与することができる。
【０１２７】
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＮＫ−９２（登録商標）細胞及び媒体、例えばヒト血清又はその同等物を含む組成物中で投与される。一部の実施形態において、媒体はヒト血清アルブミンを含む。一部の実施形態において、媒体はヒト血漿を含む。一部の実施形態において、媒体は、約１％〜約１５％のヒト血清又はヒト血清同等物を含む。一部の実施形態において、媒体は、約１％〜約１０％のヒト血清又はヒト血清同等物を含む。一部の実施形態において、媒体は、約１％〜約５％のヒト血清又はヒト血清同等物を含む。好ましい実施態様において、媒体は、約２．５％のヒト血清又はヒト血清同等物を含む。一部の実施形態において、血清は、ヒトＡＢ血清である。一部の実施形態において、ヒト治療における使用に許容可能な血清代用物がヒト血清の代わりに使用される。このような血清代用物は、当該技術分野において公知であり、又は今後開発され得る。１５％を超える濃度のヒト血清を使用することができるが、約５％を上回る濃度は費用が高すぎることが企図される。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＮＫ−９２（登録商標）細胞と細胞生存を支持する等張液とを含む組成物中で投与される。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、凍結保存試料から再構成させた組成物中で投与される。
【０１２８】
ＮＫ−９２（登録商標）細胞を含む薬学的に許容可能な組成物は、種々の担体及び賦形剤を含み得る。種々の水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に不所望な物質を有さない。好適な担体及び賦形剤並びにそれらの配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。薬学的に許容可能な担体は、生物学的にもその他でも不所望でない材料を意味し、すなわち、その材料は、不所望な生物学的効果を引き起こすこともなく、それが含有される医薬組成物の他の構成成分と有害な形で相互作用することもなく、対象に投与される。対象に投与される場合、担体は、場合により、活性成分の分解を最小化するように、及び対象における有害副作用を最小化するように選択される。本明細書において使用される、薬学的に許容可能という用語は、生理学的に許容可能及び薬理学的に許容可能と同義的に使用される。医薬組成物は一般に、緩衝及び貯蔵時の保存性のための薬剤を含み、投与経路に応じた適切な送達のための緩衝剤及び担体を含み得る。
【０１２９】
インビボ又はインビトロでの使用のためのこれらの組成物は、細胞に用いられる滅菌技術により滅菌することができる。組成物は、適切な生理学的状態に要求される許容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、並びに毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの配合物中の細胞及び／又は他の薬剤の濃度は変動し得、主に、選択される特定の投与方式及び対象の要求に従って液体量、粘性、及び体重など基づき選択される。
【０１３０】
一実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、治療される癌のための１つ以上の他の治療又は薬剤と併用して患者に投与される。一部の実施形態において、治療される癌のための１つ以上の他の治療としては、例えば、抗体、放射線照射、化学療法、幹細胞移植、又はホルモン療法が挙げられる。
【０１３１】
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞及び他の癌薬剤／治療は、同時に又はほぼ同時に（例えば、互いに約１、５、１０、１５、２０、又は３０分以内）投与される。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞及び他の癌薬剤／治療は、連続的に投与される。一部の実施形態において、他の癌治療／薬剤は、ＮＫ−９２（登録商標）細胞の投与の１、２、又は３日後に投与される。
【０１３２】
一実施形態において、他の癌薬剤は、抗体である。一実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、疾患細胞を標的化する抗体と併用して投与される。一実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞及び抗体は、患者に一緒に投与され、例えば、同一の配合物中で；別個に、例えば、別個の配合物中で、併用して；又は別個に、例えば、異なる投与スケジュールで若しくはその日の異なる時間に投与することができる。別個に投与される場合、抗体は、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は腫瘍内注射を介して投与することができる。
【０１３３】
一部の実施形態において、本開示のＮＫ−９２（登録商標）細胞は、治療抗体及び／又は他の抗癌剤との組合せで使用される。治療抗体を使用して癌関連又は腫瘍関連マーカーを発現する細胞を標的化することができる。癌治療モノクローナル抗体の例を、表４に示す。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、Ｆｃ受容体、例えば、配列番号２に記載の配列を有する高親和性Ｆｃ受容体を発現する。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ｈａＮＫ（登録商標）細胞である。一実施形態において、治療抗体は、アベルマブである。
【０１３４】
【表４】
2021524732.tif 000006
【０１３５】
【表５】
2021524732.tif 000007
【０１３６】
このようなＮＫ−９２（登録商標）細胞の投与は、モノクローナル抗体の投与と同時に、又は連続様式で実施することができる。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、対象がモノクローナル抗体により治療された後に対象に投与される。或いは、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、同時に、例えば、モノクローナル抗体の２４時間以内に投与することができる。
【０１３７】
一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、静脈内投与される。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、骨髄中に直接注入される。
【０１３８】
したがって、本開示は、癌又はウイルス感染の治療が必要とされる患者における癌又はウイルス感染を治療する方法であって、患者に治療有効量の本明細書に開示のＮＫ−９２（登録商標）細胞を投与し、それにより癌を治療することを含む方法を提供する。
【０１３９】
キット
本明細書に記載の複数のＮＫ−９２（登録商標）細胞を含む組成物を使用する癌又は感染性疾患の治療のためのキットも開示される。一部の実施形態において、本開示のキットは、少なくとも１つのモノクローナル抗体も含み得る。キット中に含まれるＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＣＡＲ及びＦｃ受容体を発現する。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、ＩＬ−２、例えば、ｅｒＩＬ−２、又はＩＬ−１５、例えば、ｅｒＩＬ−１５をさらに発現する。一部の実施形態において、ＮＫ−９２（登録商標）細胞は、マルチシストロン性構築物を含み、マルチシストロン性構築物は、キメラ抗原受容体、Ｆｃ受容体、及び場合によりＩＬ−２又はＩＬ−１５をコードする。
【０１４０】
ある実施形態において、キットは、ＮＫ−９２（登録商標）細胞の投与前、投与と同時、又は投与後に投与すべき追加の化合物、例えば、治療有効化合物又は薬物を含有し得る。このような化合物の例としては、抗体、ビタミン、ミネラル、フルドロコルチゾン、イブプロフェン、リドカイン、キニジン、化学療法薬などが挙げられる。
【０１４１】
種々の実施形態において、キットの使用説明書は、癌又は感染性疾患の治療においてキット構成成分を使用するための指示を含む。説明書は、ＮＫ−９２（登録商標）細胞の取扱方法に関する情報（例えば、解凍及び／又は培養）をさらに含有し得る。説明書は、投与量及び投与頻度に関する指針をさらに含み得る。
【０１４２】
ある実施形態において、キットは、本明細書に記載の１つ以上の組成物、例えば、本明細書に記載のＮＫ−９２（登録商標）細胞を含む組成物が充填された１つ以上の容器をさらに含む。場合により、キットが癌、例えば、本明細書に記載のものを治療するためのものであることを示すラベルが、このような容器に伴うことがある。場合により、ラベルは、医薬又は生物製品の製造、使用又は販売を規制する当局により処方される形態の通知も含み、その通知は、ヒト投与についての製造、使用又は販売の当局による承認を反映する。
【０１４３】
本開示の方法及び組成物に使用することができ、それらと併用して使用することができ、それらの調製において使用することができ、又はそれらの産物である材料、組成物、及び構成成分が開示される。これら及び他の材料は本明細書において開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、グループなどが記載される場合、これらの化合物のそれぞれの種々の個々の及び集合的な組合せ及び順列の具体的な言及が明示されていないことがあるが、それぞれが本明細書において具体的に企図及び記載されることが理解される。例えば、方法が開示及び考察され、その方法を含む多数の分子に対して行うことができる多数の改変が考察される場合、方法のそれぞれの及びあらゆる組合せ及び順列、並びに考えられる改変は、そうでないことが具体的に示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意のサブセット又は組合せも具体的に企図及び開示される。この概念は、本開示の全ての態様、例として、限定されるものではないが、開示の組成物を使用する方法におけるステップに適用される。したがって、実施することができる種々の追加のステップが存在する場合、それらの追加のステップのそれぞれを、任意の規定の方法ステップ又は開示の方法の方法ステップの組合せにより実施することができること、及びそれぞれのそのような組合せ又は組合せのサブセットが具体的に企図され、開示されているとみなすべきことが理解される。
【実施例】
【０１４４】
以下の実施例は、実例的な目的のためのものにすぎず、限定として解釈すべきではない。以下の実施例を良好に実施することを同様に可能とする、当業者が利用可能な種々の代替技術及び手順が存在する。
【０１４５】
実施例１：ＰＤ−１  ＣＡＲ改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞の産生
ＣＤ１９  ＣＡＲを、ＣＤ１６及びｅｒＩＬ−２導入遺伝子も含有するトリシストロン性プラスミドｐＮＥＵＫｖ１  ＦｃＲ＿ＩＬ−２ベクター中にクローニングした。トリシストロン性プラスミドを、ａＮＫ細胞中にエレクトロポレーションした。ＩＬ−２依存的である未形質転換ａＮＫ細胞はＩＬ−２枯渇培地中で生存し得なかったため、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現ＮＫ−９２（登録商標）細胞をＩＬ−２枯渇培地により選択した。
【０１４６】
限定希釈クローニング
ポリクローナルＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）プール培養物のアリコートを、ＩＬ−２補給なしの成長培地中で３個の細胞／ｍｌの密度に希釈した。この細胞懸濁液を９６ウェルプレート中でウェル当たり２００μｌの容量においてアリコート化し、それはウェル当たり平均０．６個の細胞に対応した。プレートを３７℃において１０日間インキュベートし、次いで細胞成長について目視により確認した。目下、クローンと命名される合計２０個の培養物をピックし、大型容器に移し、それらの初期成長速度に従って番号付与し、クローン＃１〜１０を最初に継代することができた。
【０１４７】
実施例２：生物学的分析法
細胞培養：
ポリクローナル及びクローナルＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は、５％の熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＣＭＶ陰性試験ドナー由来）が補給され、ＩＬ−２を有さない成長培地中で培養した。
【０１４８】
ａＮＫ細胞は、５％の熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＣＭＶ陰性試験ドナー由来）及び５００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２が補給された成長培地中で培養した。
【０１４９】
ｈａＮＫ細胞は、５％の熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＣＭＶ陰性試験ドナー由来）が補給され、ＩＬ−２を有さない成長培地中で培養した。
【０１５０】
Ｋ５６２細胞は、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清及び抗生物質／抗真菌薬のカクテルが補給されたＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。Ｋ５６２細胞は、２〜５日間ごと、又は培養培地が黄色を呈するごとに継代した。
【０１５１】
ＳＵＰ−Ｂ１５及びＳＵＰ−Ｂ１５ＣＤ１９ＫＯ／ＣＤ２０＋細胞は、２０％の熱不活性化ウシ胎児血清、５５ｕＭのベータ−メルカプトエタノール、及び抗生物質／抗真菌薬のカクテルが補給されたＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。それ以外では、細胞を上記のＫ５６２細胞と同様に継代した。
【０１５２】
フローサイトメトリー分析のための抗体染色：
細胞を遠心分離により回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（１×Ｄ−ＰＢＳ中５％のＦＢＳ）中で２回洗浄し、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させた。表面タンパク質の直接的なフルオロフォアコンジュゲート抗体染色のため、細胞を適切なコンジュゲート抗体（又はアイソタイプ対照）と４℃において暗所で２０分間インキュベートし、次いでＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄した。ＣＡＲタンパク質の検出のため、細胞をビオチン化抗Ｆ（ａｂ’）２断片抗体とインキュベートし、次いでストレプトアビジン−ＡＰＣ抗体とインキュベートした。試料をＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター上で分析した。
【０１５３】
成長アッセイ：
５％の熱不活性化ヒトＡＢ血清が補給された成長培地中で再懸濁させた１×１０５個の細胞／ｍＬの初期濃度（１日目）から、培養物を３日目、５日目、及び７日目に自動細胞計数装置により計数した。成長速度を以下の式：
倍化時間（時間）＝
［持続時間（時間）×ｌｏｇ（２）］／［ｌｏｇ（最終細胞密度）−ｌｏｇ（初期細胞密度）］
により計算した。
【０１５４】
細胞毒性：
懸濁液−成長細胞系を、細胞培養物の上下のピペッティングにより再懸濁させた。細胞生存率を自動計数（トリパンブルー排除法）により決定した。標的細胞をＣＦＳＥ色素により標識し、要求される細胞濃度への標的及びエフェクター細胞の希釈を、１０％の熱不活性化ＦＢＳ及び抗生物質／抗真菌薬が補給されたＲＰＭＩ−１６４０中で行った。エフェクター及び標的細胞を異なるエフェクターと標的との比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、０．６２：１、０．３１：１、及び０．１５：１のＥ：Ｔ）において９６ウェルプレート中で混合し、５％のＣＯ２雰囲気の３７℃のインキュベーター中で４時間同時培養した。次いで、死細胞の蛍光標識のためにＰＩを添加し、アッセイをＭＡＣＳｑｕａｎｔフローサイトメトリー装置上で分析した。
【０１５５】
ＡＤＣＣ：
懸濁液−成長細胞系を、細胞培養物の上下のピペッティングにより再懸濁させた。細胞生存率を自動計数（トリパンブルー排除法）により決定した。標的細胞をＰＫＨ６７−ＧＬ色素により標識し、要求される細胞濃度への標的及びエフェクター細胞の希釈を、１０％の熱不活性化ＦＢＳ及び抗生物質／抗真菌薬が補給されたＲＰＭＩ−１６４０中で行った。標的細胞をモノクローナル抗体のトラスツズマブ、リツキシマブと、又は抗体なしで室温において３０分間プレインキュベートした。次いで、抗体標識標的細胞（及び無抗体対照）をエフェクター細胞と異なるエフェクターと標的との比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、０．６２：１、０．３１：１、及び０．１５：１のＥ：Ｔ）において９６ウェルプレート中で混合し、５％のＣＯ２雰囲気の３７℃のインキュベーター中で４時間同時培養した。次いで、死細胞の蛍光標識のためにＰＩを添加し、アッセイをＭＡＣＳｑｕａｎｔフローサイトメトリー装置上で分析した。
【０１５６】
ＩＬ−２の定量
分析用細胞をＤ−ＰＢＳ１×中で洗浄して残りの培地を除去し、新鮮成長培地中で再懸濁させ、２つの９６ウェルプレート中でそれぞれ１０５個の細胞／ウェル（＝２００μｌ／ウェル）の密度において３つ組でアリコート化し、プレートを３７℃において５％のＣＯ２加湿インキュベーター中でインキュベートした。プレートの一方のセットを２４時間のインキュベーション後に分析のために取り出し、他方を４８時間後に取り出した。分析用試料上清を、細胞を除去するための５００×ｇにおける５分間の第１の遠心分離ステップとそれに続く細胞残屑を除去するための２０００×ｇにおける５分間の第２の遠心分離により調製した。試料上清を分析まで−８０℃において冷凍した。５００×ｇの遠心分離ステップからの細胞ペレットを再懸濁させ、３つ組をプールし、細胞密度を記録した。試料上清中のＩＬ−２の濃度を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手可能なヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ検出キットを製造業者の説明書に従って使用して計測し、提供されるスタンダードと比較した。ＩＬ−２濃度を２４及び４８時間における細胞数に正規化し、ｐｇ／ｍｌ／１０５個の細胞として表現した。
【０１５７】
実施例３：改変ＮＫ−９２（登録商標）細胞の表現型
ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞中でのＣＤ１９  ＣＡＲの発現をフローサイトメトリーにより計測し、結果は、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞がＩＬ−２の不存在下で成長し得、細胞の８０％超が高レベルの両方のＣＤ１６（図３Ａ）及びＣＡＲ（図３Ｂ）を発現することを示した。
【０１５８】
別個の実験において、２０個の選択クローンを、ＣＤ１９ＣＡＲ（ビオチン化Ｆ（ａｂ’）２断片特異的一次抗体及びストレプトアビジン−ＡＰＣ二次抗体により検出）及びＣＤ１６（３Ｇ８モノクローナル抗体により検出）の表面発現についてフローサイトメトリーによりスクリーニングした。複数の陽性集団、ＣＤ１６についての低い染色強度、又は高いバックグラウンドを示したクローンを廃棄した。
【０１５９】
【表６】
2021524732.tif 000008
【０１６０】
選択されたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンにおける６つのＮＫ細胞マーカーの発現プロファイルを抗体染色及びフローサイトメトリーにより決定し、ａＮＫと比較した。全てのクローン及びａＮＫはＣＤ３発現について陰性であった一方、ａＮＫのみがＣＤ１６発現について陰性であった。全てのクローンはＣＤ５４、ＣＤ５６、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄの発現について陽性であり、それらの発現レベルはａＮＫ対照と類似であった。
【０１６１】
【表７】
2021524732.tif 000009
【０１６２】
実施例４：標的細胞系に対するＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の細胞毒性
ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の細胞毒性を、標的細胞のＫ５６２細胞、ＳＵＰ−Ｂ１５細胞、及びＳＫＢｒ細胞とインキュベートすることにより分析した。図４Ａは、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞がＫ５６２細胞（標的細胞）の殺傷において親ａＮＫ細胞と同等の細胞毒性を維持したことを示す。１６Ｂ１及び１８Ｂ１は、異なる日に実施された２つのエレクトロポレーションイベントから得られた２つのＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）集団である。
【０１６３】
別個の実験において、選択されたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンを、Ｋ５６２標的細胞系（ＣＤ１９−、ＮＫ感受性）に対するフローサイトメトリーベースインビトロ細胞毒性アッセイにおけるエフェクターとして使用した。全てのクローンは、４時間の細胞毒性アッセイにおいてＫ５６２に対する効率的な細胞溶解活性を示した。ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンについての平均最大殺傷効率は、１０：１の比においてａＮＫ対照についての８４．１±２．４％と比較して７０．９±１０．１％〜８４．４±０．６％であった（ｎ＝２〜５）。図４Ｂを参照されたい。
【０１６４】
図５Ａは、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞が、ａＮＫ（商標）耐性、ＣＤ１９陽性ＳＵＰ−Ｂ１５細胞系の向上した特異的殺傷を実証し、１０のエフェクターと標的との比において細胞の約１０〜２０％のみがａＮＫ細胞により殺傷されたのに対して、細胞の約８０〜９０％がＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞により殺傷されたことを示す。
【０１６５】
別個の実験において、選択されたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンを、ＳＵＰ−Ｂ１５標的細胞系（ＣＤ１９＋、ＮＫ耐性）に対するフローサイトメトリーベースインビトロ細胞毒性アッセイにおけるエフェクターとして使用した。全てのクローンは、４時間の細胞毒性アッセイにおいて耐性ＳＵＰ−Ｂ１５を効率的に標的化し、殺傷し得た。ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンについての平均最大殺傷効率は、１０：１の比においてａＮＫ対照についての１０．８±７．４％と比較して８５．７±０．１％〜９２．２±１．２％であった（ｎ＝２〜５）。図５Ｂを参照されたい。
【０１６６】
図６Ａは、ＳＫＢｒ３細胞（ＣＤ１９−、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ＋）に対するＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞のＡＤＣＣ活性が、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎと組み合わせた場合、ＣＤ１６（１５８Ｖ）受容体のみを発現するｈａＮＫ（登録商標）細胞のものと同等であったことを示す。
【０１６７】
別の実験において、選択されたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンを、改変ＳＵＰ−Ｂ１５標的細胞系（ＣＤ１９−、ＣＤ２０＋、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ−、ＮＫ耐性）に対するフローサイトメトリーベースインビトロＡＤＣＣアッセイにおけるエフェクターとして、抗ＣＤ２０リツキシマブモノクローナル抗体との、又は抗Ｈｅｒ２−ｎｅｕトラスツズマブモノクローナル抗体との組合せで使用した。４時間の細胞毒性アッセイにおいて、全てのクローンは、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブと組み合わせた場合、耐性ＳＵＰ−Ｂ１５ＣＤ１９ＫＯ／ＣＤ２０＋を効率的に標的化し、殺傷し得た。ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンについての最大殺傷効率は、１０：１の比においてｈａＮＫ（登録商標）対照についての６７．１％と比較して６３．７％〜７７．８％であった（ｎ＝１〜２）。ｈａＮＫ（登録商標）も、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンも、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ対照抗体トラスツズマブと組み合わせた場合、標的ＳＵＰ−Ｂ１５ＣＤ１９ＫＯ／ＣＤ２０＋細胞を殺傷し得なかった（ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンについての最大殺傷効率は、１０：１の比において７．７％〜２１．９％であり、ｈａＮＫ（登録商標）については４．１％であった）。ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンについてのＡＤＣＣ媒介殺傷は、１０：１の比においてｈａＮＫ（登録商標）対照についての６２．７％と比較して４６．４％〜６５．２％であった。図６Ｂを参照されたい。
【０１６８】
実施例５：ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の他の特性
選択されたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンの集団倍化時間を培地交換なしの７日間にわたる細胞成長アッセイにより決定し、平均倍化時間を計算した。全てのクローンは、ａＮＫ対照についての３４．５時間と比較して３３．１〜５４．５時間の範囲の集団倍化時間を有した。図７を参照されたい。
【０１６９】
ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンを６ウェルプレート中の培養物中に１０ｅ５個の細胞／ｍｌの密度においてＩＬ−２なしで配置し、培養物上清を２４及び４８時間後に回収した。上清をＥＬＩＳＡにより分析してＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞によるＥＲＩＬ−２の潜在的放出を検出し、計測した。培養物中で２４時間後、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）クローンは１６．１〜１２７８．５ｐｇ／ｍｌ／１０５個の細胞を放出した。図８を参照されたい。
【０１７０】
実施例６：ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）：ＮＳＧマウスにおけるＲａｊｉヒトバーキットリンパ腫の静脈内及び皮下モデルにおけるＣＤ１９標的化ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の抗腫瘍活性の評価
ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）は、ＣＤ１９に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現してＢ細胞系統の血液癌を治療するナチュラルキラー細胞である。本試験において、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）の反復静脈内（ＩＶ）投与の抗腫瘍効果を、ＮＳＧマウスにおけるＩＶ及び皮下（ＳＣ）Ｒａｊｉゼノグラフトモデルの両方において評価した。両方のモデルにおいて、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は有意な治療効力を実証した。具体的には、ＩＶ腫瘍モデルにおいて、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は、ビヒクル対照と比較して動物生存期間を有意に改善した。ＳＣ腫瘍モデルにおいて、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）は、腫瘍成長を有意に抑制し、動物罹病／死亡イベントの数を低減させ、肝臓中の転移性疾患負荷を顕著に減少させ得た。
【０１７１】
ＣＤ１９に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する標的化ａＮＫ細胞はＲａｊｉ腫瘍担持ＮＳＧマウスにおける効力を示しており、これはＣＡＲ発現細胞における標的特異的細胞毒性に起因する可能性が最も高いことが既に示されている（例えば、Ｏｅｌｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１７を参照されたい）。この試験において、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の効力を、Ｒａｊｉゼノグラフトモデルの２つの異なるバリエーション：１）静脈内（ＩＶ）接種Ｒａｊｉ細胞；及び２）皮下（ＳＣ）接種Ｒａｊｉ腫瘍において評価し、両方のモデルは、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の反復ＩＶ投与を受容した。追加の動物群（Ｂ及びＥ群）も元の試験プロトコルに含めてこのモデルにおいて評価したが、それらはＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）効力決定と無関連であったため、この報告には含まれないことに留意されたい（簡略的な実験設計についての表６を参照されたい）。
【０１７２】
実施例７：ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）試験のための材料
ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞（クローン１９．６）：ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞を５％の熱不活性化ヒトＡＢ血清が補給された成長培地中で培養し、次いでＰｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＮａｎｔＫｗｅｓｔ（登録商標），Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓにより提供されるプロトコルを行った。
【０１７３】
試験動物：使用された試験動物は、試験開始時（隔離飼育後）に９〜１０週齢及び試験開始時に２０〜２７グラムの体重を有する雌ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスであった。２０匹の動物をＩＶ腫瘍モデル用とした一方、１２匹をＳＣ腫瘍モデル用とした。動物の供給業者は、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（６１０  Ｍａｉｎ  Ｓｔｒｅｅｔ  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ  ０４６０９  ＵＳ）であった。無菌ステンレス鋼の耳標を、識別のために携帯型装着器によりそれぞれのマウスに適用した。さらに、それぞれのケージは、試験番号及び動物番号情報を含有するケージカードを有した。
【０１７４】
Ｒａｊｉ癌細胞系：Ｒａｊｉ細胞を最初にＡＴＣＣ（カタログ＃ＣＣＬ−８６（商標）；ロット＃６１７２３８７１）から購入し、次いでＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＮａｎｔＫｗｅｓｔ（登録商標），Ｉｎｃにより拡大し、調製した。細胞は、２０１８年３月１８日にＩＤＥＸＸにより認証された（認証レポートについての付録２を参照されたい）。細胞培養培地は、１０％のウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）が補給されたＡＴＣＣ配合ＲＰＭＩ−１６４０培地であった。指数増殖期のＲａｊｉ細胞（第１２継代）を、遠心分離により回収した。細胞を洗浄し、ＩＶ接種のために５×１０５個の生細胞／ｍＬの濃度において無血清培地中で、及びＳＣ移植のために２．５×１０６個の生細胞／ｍＬの濃度において培地／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１  ｖ／ｖ）中で再懸濁させた。細胞を動物注射前に氷上で貯蔵した。インビボ試験において使用された細胞は、９６％は生存率を有した。
【０１７５】
Ｒａｊｉ  ＩＶモデル：２０匹の動物に、外側尾静脈を介して０．２ｍＬのＲａｊｉ細胞懸濁液を２７ゲージ針によりＩＶ注射した（１×１０５個の細胞の接種材料）。
【０１７６】
Ｒａｊｉ  ＳＣモデル：１２匹の動物に、両脇腹上に０．１ｍＬのＲａｊｉ細胞懸濁液を２５ゲージ針によりＳＣ移植した（２．５×１０５個の細胞の接種材料）。
【０１７７】
実施例８：ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）試験についての実験手順
ＩＶ  Ｒａｊｉモデル：１日目と定義された癌細胞接種後２４時間以内に、２０匹の動物を体重に従って１０匹の２つの群に偽無作為化して群間の類似の平均体重を達成した。２、５、８、１０、１２、及び１７日目、指数増殖期の成長させたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞を遠心分離により回収し、２００μＬの注射容量によるマウス当たり１×１０７個の細胞の用量におけるＩＶ投与のために５×１０７個の細胞／ｍＬの濃度において成長培地中で配合した。表６に示されるとおり、Ａ群の動物はビヒクル対照を受容した一方、Ｃ群の動物はＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞を受容した。
【０１７８】
動物を腫瘍細胞注射前及び週２回秤量した。動物を死亡／罹病（Ｇ０〜Ｇ４）及び毒性の臨床的徴候（Ｔ１〜Ｔ１２；表６を参照されたい）について毎日観察した。麻痺又は瀕死動物を安楽死させた。動物をＣＯ２吸入により安楽死させ、次いで頸椎脱臼を行った。死亡イベント（安楽死又は自然死）を死亡記録（Ｄｅａｔｈ  Ｌｏｇ）において記録し、集計して生存曲線を計算した。
【０１７９】
ＳＣ  Ｒａｊｉモデル：ＳＣ腫瘍移植後、動物を腫瘍樹立について少なくとも週２回試験した。腫瘍が触診可能になった時、腫瘍容積（ＴＶ）をデジタル携帯型測径器により週１回〜２回計測し、この式：ＴＶ＝長さ×幅２／２［長さは腫瘍の最大直径であり、幅は最短直径である］を使用して計算した。平均腫瘍容積が注射可能なサイズに達した時（この症例において１９５ｍｍ３；移植の２４日後）、１２匹の腫瘍担持動物を６匹の２つの群に偽無作為化して群間の類似の腫瘍容積を達成した。これを０日目と定義した。１、４、７、９、１１、及び１３日目、指数増殖期の成長させたＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞を遠心分離により回収し、１０００ｃＧｙガンマ線照射に供し、２００μＬの注射容量によるマウス当たり１×１０７個の細胞の用量におけるＩＶ投与のために５×１０７個の細胞／ｍＬの濃度において成長培地中で配合した。表６に示されるとおり、Ｄ群の動物はビヒクル溶液を受容した一方、Ｆ群の動物はＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞を受容した。動物を腫瘍細胞注射前及び次いで週２回秤量した。
【０１８０】
動物を、死亡／罹病（Ｇ０〜Ｇ４）及び毒性の臨床的徴候（Ｔ１〜Ｔ１２）について毎日観察した。麻痺又は瀕死動物を安楽死させた。瀕死動物をそれらが罹病を示したらすぐに安楽死させた一方、生存動物を組織回収のために予定安楽死に供した。具体的には、生存動物の半数（最大３匹のマウス／群）を、１３日目に試験品投与の最後の投与の６時間後において安楽死させた。残りの動物を１５日目に最後の投与の４８時間後において安楽死させた。安楽死は、最終心臓内出血後に動物を深麻酔下に置きながら頸椎脱臼により実施した。血液／血清試料は、この試験の部分において分析せず、したがってこの報告には含めなかった。
【０１８１】
終了時、解剖を実施し、可視の肉眼的病変を有する器官を摘出し、１０％のホルマリン中で固定し、腫瘍／転移性疾患負荷の組織学的評価のために提携病理学実験室（Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｗａｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に提出した。
【０１８２】
【表８】
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【０１８３】
実施例９：ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）試験についてのデータ分析
以下の式：腫瘍容積＝長さ×幅２／２（長さ及び幅は、それぞれ腫瘍の最長及び最短直径である）を使用して腫瘍容積を計算した。
【０１８４】
腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）計算を以下のとおり行った：ＴＧＩ＝（ＴＣ−Ｔｔ）／ΔＴＣ×１００％（式中、Ｔｃ及びＴｔは、それぞれ試験終了時の対照及び処理群についての平均腫瘍容積であり、ΔＴｃは、対照群における平均腫瘍容積の変化である）。
【０１８５】
腫瘍成長曲線を、２元ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキー検定による多重比較により分析した。生存曲線を、ログランク（マンテルコックス）検定により分析した。個々の日の肝転移性疾患負荷の差を、対応のない両側ｔ検定により分析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなす。全ての統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７を使用して実施した。
【０１８６】
実施例１０：ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）試験についてのＩＶ  Ｒａｊｉモデル結果
ＩＶ腫瘍モデルにおける主なリードアウトは、動物生存期間であった。動物の死亡と見出された場合又は疾患関連罹病及び／若しくは麻痺に起因して動物を安楽性させた場合、死亡イベントを計数した。図９に示されるとおり、ビヒクル対照と比較して、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞処理は、動物の生存率を有意に改善し得、ビヒクル対照群における２１．５日間に対して２７日間の中央生存期間をもたらした（Ｐ＜０．０００１）。動物体重変化も試験全体にわたりモニタリングした。図１０に示されるとおり、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）処理動物は、処理を最初に開始した場合に中程度（１０％未満）及び短期の体重損失を実証し、これはＩＶ  ＮＫ注入を受容した動物における希少な現象でなく、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞に特異的でない。これらの体重は、疾患進行に起因して再び減少する前に処理の第１週後に回復し得た。
【０１８７】
実施例１１：ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）試験についてのＳＣ  Ｒａｊｉモデル結果
ＳＣ腫瘍モデルにおける主なリードアウトは、腫瘍成長であった。図１１に示されるとおり、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は、ビヒクル対照群と比較して７日目以降に明らかな且つ統計的に有意な腫瘍成長阻害を実証し、試験終了時（１３日目）のＴＧＩは４９％であった。
【０１８８】
さらに、Ｒａｊｉは侵襲性リンパ腫モデルであるため、ＳＣ接種した場合であっても、癌細胞は播種し得、複数の転移部位を発症し得、それは最終的に動物罹病及び／又は死亡をもたらした。ビヒクル群において、１１日目〜１３日目に瀕死で、したがって安楽死させた合計３匹の動物（５０％）が存在した。対照的に、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞群において予定外の死亡イベントは存在しなかった（表７）。
【０１８９】
さらに、肝転移の定性的低減が、解剖の間にＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）処理動物において観察された（図１２ａ）。疾患負荷の半定量的推定を、代表的にサンプリングされたＨＥ染色肝切片について提携病理学研究室（Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｗａｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により実施した。図１２ｂ及び表８にまとめられるとおり、試験が進行するにつれて疾患負荷の増加の明確な傾向が存在した。ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）処理動物の肝臓は、ビヒクル対照と比較して顕著に低い割合の癌浸潤面積を示した。少ない試料数及び対照群における予定外の早期の死亡に起因して、統計的分析を１３日目のデータに対してのみ実施することができた。この分析は、疾患負荷の有意差を示し、対照群における浸潤が３０％であるのに対してＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）処理動物における浸潤は平均１０％であった。体重変化を試験全体にわたりモニタリングし、ＩＶ  Ｒａｊｉモデルと同様に、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）処理動物は、中程度（１０％未満）及び一過的な体重損失を治療レジメンの最初において実証した（図１３）。
【０１９０】
【表９】
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【０１９１】
【表１０】
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【０１９２】
実施例１２：ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）試験の結論
反復ＩＶ投与レジメンにおけるＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞の抗腫瘍効力を評価するため、それぞれＩＶ及びＳＣ腫瘍接種を用いるＲａｊｉゼノグラフトモデルの２つのバリエーションをこの試験において利用した。ＩＶ腫瘍モデルにおいて、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は、動物生存期間を有意に改善し得、ビヒクル対照群と比較して中央生存期間を５．５日間だけ延長させた（２６％の増加）。ＳＣ腫瘍モデルにおいて、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は、腫瘍成長を有意に抑制し得、試験終了時に４９％のＴＧＩをもたらした。さらに、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）処理は、動物の罹病／死亡イベントの数を低減させ得（対照群における３匹／６匹に対してＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）処理動物における０匹／６匹）、ＳＣ  Ｒａｊｉ腫瘍担持動物の肝臓中の転移性疾患負荷を顕著に減少させ得た。まとめると、ＣＤ１９  ｔ−ｈａＮＫ（商標）細胞は、Ｒａｊｉゼノグラフトモデルの両方のバリエーションにおいてビヒクル対照と比較して有意な治療効力を示した。
【０１９３】
本明細書における本発明の概念から逸脱することなく、既に記載のものに加えてさらに多くの改変が可能であることが当業者には明らかであるはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲以外では限定されるべきではない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の両方の解釈にあたり、全ての用語は、文脈に一致して最も広く考えられる様式で解釈されるべきである。特に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、要素、構成成分、又はステップを非排他的に指すものとして解釈されるべきであり、参照される要素、構成成分、又はステップが存在し得、又はそれらを利用することができ、又は明示的に参照されていない他の要素、構成成分、若しくはステップと組み合わせることができることを示す。本明細書、特許請求の範囲がＡ、Ｂ、Ｃ．．．及びＮからなる群から選択されるものの少なくとも１つを指す場合、その文章は、ＡとＮでも、ＢとＮなどでもなく、その群からの１つのみの要素を必要とするものとして解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021524732.tif 000025
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月11日(2020.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021524732000001.app
【国際調査報告】
2021524732.tif 000029
2021524732.tif 000030
2021524732.tif 000031