(57)【要約】  本発明は、ラクトバチルス・ガッセリー(Lactobacillus gasseri)KBL697株及びその使用に関する。本発明によるラクトバチルス・ガッセリーKBL697(受託番号KCTC 13520BP)株は、細胞のアレルギー反応を弱め、アトピー性皮膚炎の症状を著しく改善し、抗炎症効果、及び抗真菌効果、並びに過敏性腸症候群及び大腸炎等の腸疾患のための治療効果を示す。したがって、単一株のみで、アレルギー性疾患及び炎症性疾患を軽減する並びに腸の健康を改善する全ての目的を達成し、それによってプロバイオティクス物質としての有利な適用を見出すことができる。加えて、その抗真菌活性に基づいて、株は、真菌によって引き起こされる各種の皮膚疾患に対する皮膚局所剤において、並びに敏感肌を軽減するための化粧用組成物及び機能性パッチにおいて、有利に利用することができる。
2021524748.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号KCTC 13520BPを有するラクトバチルス・ガッセリー(Lactobacillus gasseri)KBL697株。
【請求項２】
配列番号1の16S rDNA配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の株。
【請求項３】
請求項1に記載の株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、食品組成物。
【請求項４】
アレルギー症状の軽減、炎症症状の軽減、腸の健康の改善、及び免疫調節からなる群から選択される少なくとも1つの効果を有する健康機能性食品組成物であることを特徴とする、請求項3に記載の食品組成物。
【請求項５】
前記アレルギー症状が、アトピー性皮膚炎、湿疹、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、及び食物アレルギーからなる群から選択され;前記腸の健康の軽減が、腹部膨満、腹部不快感、病原微生物によって引き起こされる感染性下痢、胃結腸炎、炎症性腸疾患、神経性腸炎症候群、過敏性腸症候群、小腸微生物の過剰増殖、及び腸の摂食性下痢からなる群から選択される少なくとも1つの軽減であることを特徴とする、請求項4に記載の食品組成物。
【請求項６】
請求項1に記載の株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、飼料組成物。
【請求項７】
請求項1に記載の株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、抗真菌組成物。
【請求項８】
マラセチア・フルフル(Malassezia furfur)に対する抗真菌活性を示すことを特徴とする、請求項7に記載の抗真菌組成物。
【請求項９】
請求項7に記載の抗真菌組成物を含む、皮膚外用製剤。
【請求項１０】
皮膚アレルギー、皮膚蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、乾癬、真菌感染症、又は湿疹を改善するための医療用パッチであって、請求項1に記載の株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、医療用パッチ。
【請求項１１】
アレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、若しくは自己免疫疾患の処置又は予防のための医薬組成物であって、請求項1に記載の株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
前記アレルギー性疾患が、湿疹、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、及び食品アレルギーからなる群から選択されることを特徴とする、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記炎症性疾患が、浮腫、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、慢性副鼻腔炎、咽頭喉頭炎、扁桃炎、気管支炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、大腸炎、痛風、湿疹、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、強直性脊椎炎、リウマチ熱、線維筋痛症、変形性関節症、乾癬性関節炎、関節リウマチ、肩の関節周囲炎、腱炎、腱鞘筋炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、シェーグレン症候群、重症筋無力症、敗血症、血管炎、滑液包炎、側頭動脈炎、及び多発性硬化症からなる群から選択されることを特徴とする、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記腸疾患が、腹部膨満、腹部不快感、病原微生物によって引き起こされる感染性下痢、胃結腸炎、炎症性腸疾患、神経性腸炎症候群、過敏性腸症候群、小腸微生物の過剰増殖、及び腸の摂食性下痢からなる群から選択されることを特徴とする、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記自己免疫疾患が、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、狼瘡、全身性強皮症、アトピー性皮膚炎、喘息、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、皮膚筋炎、多発性筋炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、結節性多発動脈炎、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、側頭動脈炎、若年性糖尿病、円形脱毛症、天疱瘡、アフタ性口内炎、自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症、シェーグレン症候群、アジソン病、クローン病、及びベーチェット病からなる群から選択されることを特徴とする、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記医薬組成物が、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、アブシキシマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エルツマキソマブ、エタネルセプト、エタラシズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ、イムシロマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、リツキシマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、タカツズマブテトラキセタン、テフィバズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、セクキヌマブ、ベドリズマブ、ビジリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、及びザノリムマブからなる群から選択される少なくとも1つの薬物と併用されることを特徴とする、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
アレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、若しくは自己免疫疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に請求項1に記載の株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを投与することを含む、方法。
【請求項１８】
アレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、若しくは自己免疫疾患のための予防薬又は治療薬を調製するための組成物の使用であって、請求項1に記載の株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、組成物の使用。
【請求項１９】
請求項1に記載の株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、化粧用組成物。
【請求項２０】
皮膚アレルギー、皮膚蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、乾癬、真菌感染症、又は湿疹を改善することを特徴とする、請求項19に記載の化粧用組成物。
【請求項２１】
化粧用パッチである、請求項19に記載の化粧用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス・ガッセリー(Lactobacillus gasseri)KBL697株及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、新規なラクトバチルス・ガッセリーKBL697のプロバイオティクス株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、アレルギー症状の軽減、炎症症状の軽減、腸の健康の改善、及び免疫調節からなる群から選択される少なくとも1つの効果を有する健康機能性食品組成物;抗真菌組成物;並びにアレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、及び自己免疫疾患からなる群から選択される少なくとも1つの疾患の処置のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクスは、腸内微生物のバランスを助ける抗微生物活性及び酵素活性を有する、微生物並びにそれらから得られる生成物を指す。加えて、プロバイオティクスは、乾燥細胞若しくは発酵産物の形態でヒト又は動物に提供される場合に、腸内フローラを改善する単一又は複数の株の形態の生細菌としても定義される。プロバイオティクスは、ヒトの腸に住みつかなければならず、非病原性及び非毒性でなければならず、かつそれらが腸に届くまで十分に長く生存していなければならない。更に、プロバイオティクスは、それらが送達される食品中で摂取されるまで生存能及び活性を維持しなければならず、感染を予防するために使用される抗生物質に対して感受性でなければならず、かつ抗生物質耐性プラスミドを有していてはならない。また、プロバイオティクスは、腸内環境において、酸、酵素及び胆汁に対して耐性でなければならない。
【０００３】
これらのプロバイオティクスとしては、例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、及びホスファターゼ等の消化酵素を産生する優れた能力を有するバチルス種(Bacillus sp.)、乳酸を産生するラクトバチルス種(Lactobacillus sp.)、並びに代謝プロセスにおいて家畜の糞便に残った悪臭原因物質(アンモニア、硫化水素、及びアミン等)を使用することによって悪臭を予防する光合成細菌が挙げられ得る。最近、プロバイオティクスは、腸の健康の改善を含む、各種の健康機能の改善効果を有することが報告されており、それにより、既存の化合物系治療剤に取って代わることができる主要な治療物質として注目を集めている。
【０００４】
その一方で、アレルギーは、外来物質(抗原、アレルゲン)に対する固有の応答変化を示す生化学的現象である。症状を引き起こす外来物質は、アレルゲンと呼ばれる一方、これらの症状に由来する疾患は、アレルギー性疾患と呼ばれる。アレルギーは、抗原-抗体反応から生じる生体内の病理過程である。一般に、反応を引き起こす期間、及び補体の関与に応じて、4種類のアレルギーがある。これらの中で、1型は、標的器官が、主に、消化器官、皮膚、及び肺であるアナフィラキシー型(即時型)であり、一般的な症状としては、消化管アレルギー、蕁麻疹、萎縮性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、及び気管支喘息等が挙げられる。1型の病理学的機構は、以下の通り公知である:抗原が、肥満細胞及び好塩基球の表面に付着したIgE抗体に接触すると、標的細胞が活性化されて、ヒスタミン、ロイコトリエン、及びPAF等の化学伝達物質を分泌し、次いで、血管及び平滑筋が収縮する。このような機構は、多くの場合、4型(遅延型)と組み合わされ得る。言い換えれば、このようなアナフィラキシー及びアレルギー反応は、肥満細胞等における様々な変化に起因して生じ得る。脱顆粒をもたらす肥満細胞の活性化は、抗原、抗IgE、レクチン等のFc受容体への結合、アナフィラトキシン等、又はカルシウムイオノフォア、化合物48/80、コデイン、及び合成副腎皮質刺激ホルモン等の他の薬物の刺激によって引き起こされる。
【０００５】
血液中の肥満細胞及び好塩基球は、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、喘息、食品アレルギー、及びアナフィラキシーショック等の多くのアレルギー性疾患を引き起こす、身体中の主な細胞として公知である。これらの細胞は、アレルギーを引き起こす抗体であるIgEに対するそれらの表面上の受容体(FcRI)を有し、細胞は、アレルギー原因物質(抗原、アレルゲン)によって刺激されて、細胞外に、それら自身の各種のアレルギー原因物質を分泌する(Kim Kら、Eur J Pharmacol、581巻:191〜203頁、2008年)。
【０００６】
アレルギー性皮膚炎の中で、アトピー性皮膚炎は、一般に広く知られているように、新生児又は小児に影響を与える慢性の再発性皮膚疾患であり、成人になるまで持続する場合がある。喘息又はアレルギー性鼻炎のように、アトピー性皮膚炎は、IL-4及びIL-5を産生するTリンパ球の局所浸潤と関連する炎症性皮膚疾患である。IL-4は、一般によく知られているように、ヘルパーT2(Th2)表現型の発達を制御し、免疫グロブリン(Ig)の過剰産生及び好酸球増加、並びに血清IgEレベルの増加をもたらす。食品及び吸入アレルゲンに関する皮膚試験に対して陽性の対象のうちの80〜90%は、アトピー性皮膚炎を有することが分かった。
【０００７】
アレルギー性疾患及びアトピー性皮膚炎を処置又は予防するための種々の処置があるが、有効な処置は、まだ見出されていない。いくつかの薬物に基づく処置が知られているが、処置のための薬物の短期投与でさえ耐性を発達させ、長期投与は重篤な副作用を引き起こすことがあり、したがって、アレルギー性疾患及びアトピー性皮膚炎のそのような薬物に基づく処置は、最近、回避されている。この状況下、任意の絶対的な明白な効果を有する処置がなければ、アレルギーに加えて、皮膚のそう痒及び発赤等の刺激性症状は、多くの場合、改善されない。
【０００８】
その一方で、過敏性腸症候群(IBS)は、症状が、解剖学的又は生化学的な異常で説明できないような、腸の運動若しくは排便習慣の変化と関連する腹部の痛み及び/又は過敏によって特徴付けられる症状である。IBSの一般的な症状としては、尿意切迫、腹部膨満、及び不完全な腸運動の感覚も挙げられる。したがって、IBSは、機能性腹部膨満、非心臓性胸痛、非潰瘍性胃腸症、及び慢性の便秘又は下痢等の状態を含む機能性胃腸障害として分類され得る。特に、IBSの場合において、関連する症状が、患者の幸福及び正常機能の態様の両方に影響を与えるので、この疾患は、腹部の痛み及び不快感を超えて、病的状態及びクオリティオブライフに対する莫大な影響を有する。
【０００９】
炎症性腸疾患(IBD)は、限定されないが、クローン病、潰瘍性大腸炎、又はベーチェット病等の全ての腸の炎症性疾患を含む、腸における異常な慢性炎症が、改善及び再発を繰り返す状態である。多くの研究が、IBS及びIBDを処置するための薬物開発の分野で実施されている。これに関して、各種の抗うつ薬は、臨床試験におけるそれらの有効性が中程度であり、その臨床的有用性が重大な副作用に起因して制限されているにもかかわらず、一般に使用されている。セロトニン作動性の医薬も、全体的なIBSの症状に対する有効性を有することが判明している。しかしながら、これらの医薬の適用は、最近の重篤な安全性の問題に起因して、各種の方法で制限されている。したがって、IBSのための新たな治療剤の開発における関心が高まっている。
【００１０】
国際公開第96/29083号及び欧州特許出願公開第554418号は、腸でコロニーを形成する2種類のラクトバチルス属(Lactobacillus)株、即ち、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)299v(DSM 6595)及びラクトバチルス・カゼイ亜種ラムノースス(Lactobacillus casei ssp. rhamnosus)271(DSM 6594)等を開示している。欧州特許出願公開第415941号は、栄養組成物を調製するための方法であって、オート麦粥を酵素で処理した後、それを乳酸菌(lactobacilli)と混合することを含む方法を開示している。米国特許第7195906号は、炎症性疾患、特に、IBD及びIBS等の胃腸の炎症活動の処置のための、切除され、洗浄されたヒト消化管から単離されたビフィズス菌(Bifidobacterium)株を開示している。
【００１１】
しかしながら、腸の健康の改善、例えば、IBD及びIBSの処置に対する優れた効果を有する株は、まだ見出されておらず、そのような効果を有する株を見出すために、多くの研究機関が開発に取り組んでいる。
【００１２】
この状況下、本発明者らは、プロバイオティクスの研究に専心して、満足な処置がないアトピー性皮膚炎を含むアレルギー性疾患のための薬物に基づく処置に代わる方法を見出した。したがって、本発明は、ラクトバチルス・ガッセリーの新規株が、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患に対して優れた治療効果を示したことを確認することによって、更に、前記株が、抗真菌活性、腸の健康、免疫調節、及び炎症の阻害に対する優位な効果も示したことを確認することによって、完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第96/29083号
【特許文献２】欧州特許出願公開第554418号
【特許文献３】欧州特許出願公開第415941号
【特許文献４】米国特許第7195906号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Kim Kら、Eur J Pharmacol、581巻:191〜203頁、2008年
【非特許文献２】Slyter,L.L.、J. Animal Sci.、1976年、43巻、910〜926頁
【非特許文献３】Johnson, D. Eら、J.Anim.Sci.、1983年、56巻、735〜739頁
【非特許文献４】Williams, P. E. V.ら、1990年、211頁
【非特許文献５】L. Lachmanら、The Theory and Practice of Industrial Pharmacy、第3版、1986年、365〜373頁
【非特許文献６】H. Suckerら、Pharmazeutische Technologie、Thieme、1991年、355〜359頁
【非特許文献７】Hagers Handbuchder pharmazeutischen Praxis、第4版、7巻、739〜742頁、及び766〜778頁、(SpringerVerlag、1971年)
【非特許文献８】Remington's Pharmaceutical Sciences、第13版、1689〜1691頁(Mack Publ., Co.、1970年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、アトピー性皮膚炎等のアレルギー症状の軽減、炎症症状の軽減、抗真菌活性、腸の健康の改善、及び免疫調節に対する優れた効果を示す新規株、並びに様々なその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この目的を達成するために、本発明は、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株(受託番号KCTC13520BP)を提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、食品組成物又は食品添加物組成物を提供する。
【００１８】
本発明は、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、飼料組成物又は飼料添加物組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、抗ふけ組成物等の抗真菌組成物も提供する。
【００２０】
本発明は、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、及び/又は自己免疫疾患の処置のための医薬組成物であって、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、医薬組成物も提供する。
【００２１】
本発明は、アトピー性皮膚炎を含むアレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、及び/又は自己免疫疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを投与することを含む、方法も提供する。
【００２２】
本発明は、アトピー性皮膚炎を含むアレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、及び/若しくは自己免疫疾患の予防又は処置する使用のための、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む組成物も提供する。
【００２３】
本発明は、アトピー性皮膚炎を含むアレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、若しくは自己免疫疾患のための予防薬又は治療薬を調製するための組成物の使用であって、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、組成物の使用も提供する。
【００２４】
本発明は、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、化粧用組成物も提供する。
【００２５】
本発明は、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、化粧用パッチ又は医療用パッチも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図1は、EL4細胞株においてアレルギー反応を誘導した後、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株を含む各種のラクトバチルス属株によるIL-4発現の阻害効果を確認する結果を図示する。
【図２】図2は、EL4細胞株においてアレルギー反応を誘導した後、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株を含む各種のラクトバチルス属株によるIL-5発現の阻害効果を確認する結果を図示する。
【図３】図3は、RBL 2H3細胞株において抗原-抗体反応によりヒスタミン産生を誘導した後、各種のラクトバチルス・ガッセリー株及び抗ヒスタミン剤のケトチフェンの処置によるヒスタミン分泌の阻害効果を確認する結果を図示する。
【図４】図4は、RAW 264.7細胞株において炎症反応を誘導した後、ラクトバチルス・ガッセリー株で処置した場合に、KBL697株の処置による抗炎症性の免疫調節性のサイトカインであるIL-10の分泌の量を増加させる顕著な効果の観察の結果を図示する。
【図５】図5は、RAW 264.7細胞株において炎症反応を誘導した後、ラクトバチルス・ガッセリー株で処置した場合に、KBL697株の処置による顕著な免疫調節効果及び抗炎症効果、並びにIL-10/TNF-α値を確認する結果を図示する。
【図６】図6は、RAW 264.7細胞株において炎症応答を誘導した後、ラクトバチルス・ガッセリー株で処置した場合に、KBL697株の処置による顕著な免疫調節効果及び抗炎症効果、並びにIL-10/IL-6値を確認する結果を図示する。
【図７】図7は、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の抗真菌活性を確認するスポットアッセイの結果を図示する。
【図８】図8は、アトピー性皮膚炎が誘導されたマウスモデルに対する、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の経口投与による皮膚炎スコアの低減効果を確認する結果を図示する。
【図９】図9は、アトピー性皮膚炎が誘導されたマウスモデルに対する、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株のマウスへの経口投与によるそう痒軽減効果を確認する結果を図示する。
【図１０】図10は、アトピー性皮膚炎が誘導されたマウスモデルに対する、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の経口投与による耳の厚さの低下効果を確認する結果を図示する。
【図１１】図11は、アトピー性皮膚炎が誘導されたマウスモデルに対する、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の経口投与による皮膚の厚さの低下効果を確認する結果を図示する。
【図１２】図12は、アトピー性皮膚炎が誘導されたマウスモデルに対する、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の経口投与によるIgEの血液中濃度の低下効果を確認する結果を図示する。
【図１３】図13は、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株によるタイトジャンクションを強化する効果を確認するTEERアッセイの結果を図示する。
【図１４】図14は、大腸炎が誘導されたマウスモデルに対する、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の1×109CFUでの経口投与による体重の回復効果の観察の結果を図示する。
【図１５】図15は、大腸炎が誘導されたマウスモデルに対する、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の経口投与による大腸の長さの回復効果の観察の結果を図示する。
【図１６】図16は、乾癬が誘導されたマウスモデルにおける、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株によるPASI(乾癬の面積及び重症度指数)及び浮腫の症状の軽減効果の観察の結果を図示する。
【図１７】図17は、乾癬が誘導されたマウスモデルにおける、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株による炎症性サイトカイン(TNF-α、IFN-γ、IL-17)を低下させる効果の決定結果を図示する。
【図１８】図18は、大腸炎が誘導されたマウスモデルにおける、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株及びインフリキシマブによる体重及び大腸の長さを回復させる効果を比較する結果を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明を実施するための最良の形態
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、科学用語は、当技術分野における通常の技能を有する者(「当業者」)によって理解されるものと同じものを意味する。一般に、本明細書で使用される命名法は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されている。
【００２８】
本発明は、ヒト身体に由来する微生物の抗アレルギー効果を見出し、優れたアレルギー阻害効果を有するラクトバチルス・ガッセリーKBL697株(受託番号KCTC13520BP)を選択した。前記株の16S rDNAの分析は、前記株が、これまで一般に知られていなかった新規株であることを実証する。
【００２９】
本発明の1つの実施形態によれば、本発明は、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697(受託番号KCTC13520BP)の新規なプロバイオティクス株に関し、前記株は、配列番号1の16S rDNA配列を含むことによって特徴付けられる。
【００３０】
<配列番号1>ラクトバチルス・ガッセリーKBL697(受託番号KCTC13520BP)株の16S rDNA配列
GGCAAGTGGGCGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGAGCTTGCCTAGATGAATTTGGTGCTTGCACCAAATGAAACTAGATACAAGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAGAGACTGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGGATAACAACACTAGACGCATGTCTAGAGTTTAAAAGATGGTTCTGCTATCACTCTTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGCAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTAGTGAAGAAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATTACTTAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGGAGAATTGCATCAGAAACTGTTGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCAGTGCAAACCTAAGAGATTAGGAGTTCCCTTCGGGGACGCTGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGAAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGAAGCGAACCTGCGAAGGCAAGCGGATCTCTGAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTCTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGATAACCTTTATAGGAGTCAGCCGTCTAAGTAGACAGATGTTA
【００３１】
次いで、本発明は、前記株の有効性に関する実験を実施し、それにより、前記株が、アトピー性皮膚炎等のアレルギーに対する優れた阻害効果を有し、炎症反応を軽減し、かつ抗真菌活性、免疫調節性、及び腸疾患に対する治療効果を有することを検証した。更に、本発明者らは、前記効果が、生細菌の状態においてだけではなく、低温殺菌又は高温殺菌下においても、提供されたことを確認した。
【００３２】
したがって、本発明の別の実施形態において、本発明は、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株(受託番号KCTC13520BP)、前記株の細胞成分、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、食品組成物又は食品添加物組成物に関する。
【００３３】
組成物は、アトピー性皮膚炎等のアレルギー症状の軽減、炎症症状の軽減、腸の健康の改善、及び免疫調節からなる群から選択される少なくとも1つの効果を有する健康機能性食品組成物であることを特徴とし得る。
【００３４】
前記食品組成物又は食品添加物組成物は、限定されないが、例えば、食品、食品添加物、健康機能性食品組成物若しくは機能性飲料の主成分又は副成分として、アトピー性皮膚炎等のアレルギー症状の軽減、炎症症状の軽減、腸の健康の改善、及び/又は免疫調節のため、並びにそれらの予防のために有効な食品として容易に利用することができる。
【００３５】
「食品組成物」という用語は、少なくとも1つの栄養分を含む天然製品又は人工製品を指し、より好ましくは、ある特定の処理によって食用になる製品を指し、通常、食品、食品添加物、健康機能性食品、及び機能性飲料の全てを包含する。
【００３６】
本発明による前記食品組成物を添加物として含み得る食品としては、例えば、色々な種類の食品、飲料、チューインガム、茶、複合ビタミン剤、又は機能性食品が挙げられ得る。加えて、本発明の食品としては、特別栄養食品(例えば、調製乳、幼児/乳児用食品)、加工肉製品、魚肉製品、豆腐、ムク、麺(例えば、ラーメン、アジアンヌードル)、ベーカリー製品、健康補助食品、調味料製品(例えば、醤油、大豆ペースト、赤唐辛子ペースト、混合ペースト)、ソース、菓子(例えば、スナック食品)、キャンディー、チョコレート、チューインガム、アイスクリーム、乳製品(例えば、発酵乳、チーズ)、他の加工食品、キムチ、塩漬け食品(例えば、色々な種類のキムチ、漬物)、飲料(例えば、フルーツジュース、野菜ジュース、豆乳、発酵飲料)、及び天然調味料(例えば、ラーメン用のブロス粉末)が挙げられるが、これらに限定されない。前記食品、飲料又は食品添加物は、従来の方法で調製することができる。
【００３７】
「健康機能性食品」という用語は、物理的、生化学的、若しくは生物工学的手法を使用することによって、その機能が所定の目的のために発揮及び発現されるように価値が付与された食品、又は予防におけるリズム調整、疾患の予防、及び疾患からの回復等の関連する食品組成物の機能のインビボの調整機能が十分に発現されるように設計された加工食品の群である。このような機能性食品は、食品化学的に許容される食品補助添加物を含んでいてよく、その製造において一般に使用される適切な担体、賦形剤、及び希釈剤を追加で含んでいてよい。
【００３８】
「機能性飲料」という用語は、本発明において使用される場合、口渇を緩和するため、又は味を味わうための飲料製品をまとめて指す。示された比率の必須成分として、アトピー性皮膚炎等のアレルギー症状の軽減、炎症症状の軽減、腸の健康の改善、及び/又は免疫調節、並びにそれらの予防のための組成物が飲料中に含まれていなければならないことを除いて、特に制限されず、各種の香味剤又は天然炭水化物が、一般的な飲料におけるように、追加の成分としてその中に含有されてよい。
【００３９】
上記に加えて、本発明による食品組成物又は食品添加物組成物を含む食品は、各種の栄養分、ビタミン、ミネラル(電解質)、合成香味剤及び天然香味剤等の香味剤、着色剤及びフィラー(チーズ、チョコレート等)、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、pH調整剤、安定剤、保存剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料において使用される炭酸化剤等を含有していてよく、上記成分のそれぞれは、単独で、又は互いに組み合わせて使用されてよい。
【００４０】
本発明による食品組成物を含む食品において、本発明の組成物は、食品の総質量に対して、0.001質量%〜100質量%、好ましくは、1質量%〜99質量%の量で含まれていてよく、飲料の場合において、100mlに対して、0.001g〜10g、好ましくは、0.01g〜1gの量で含まれていてよい。しかしながら、健康及び衛生状態の目的、又は健康管理の目的のための長期間にわたる摂取のために、この量は、上記で言及した範囲を下回っていてよく、有効成分は、安全性プロファイルの観点で問題がないので、それらは、範囲を上回る量で使用することができ、それらは、上記で言及した量の範囲に限定されない。
【００４１】
本発明による食品組成物は、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株を、単独で、若しくは許容される担体と組み合わせて含んでいてよく、又はヒト若しくは動物による食物摂取に適切な組成物の形態で調製されていてよい。即ち、組成物は、プロバイオティクス細菌を含まないか、又は2〜3のプロバイオティクス細菌を含む、食品に添加されてよい。例えば、本発明の食品の調製において、本発明による株と組み合わせて使用することができる微生物は、ヒト又は動物による食物摂取に適切でなければならず、かつ病原体、有害細菌を阻害するか、又は取り込みの際に哺乳動物の腸管中の微生物のバランスを改善する、プロバイオティクス活性を有していなければならないが、これらに限定されない。このようなプロバイオティクス微生物としては、例えば、サッカロミセス属(Saccharomyces)、カンジダ属(Candida)、ピキア属(Pichia)、又はトルロプシス属(Torulopsis)等の酵母、アスペルギルス属(Aspergillus)、リゾプス属(Rhizopus)、ムコール属(Mucor)、又はペニシリウム属(Penicillium)等の真菌、及びラクトバチルス属(Lactobacillus)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、ロイコノストック属(Leuconostoc)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、バチルス属(Bacillus)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、又はペディオコッカス属(Pediococcus)の属に属する細菌が挙げられ得る。適切なプロバイオティクス微生物としては、具体的には、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・アリメンタリウス(Lactobacillus alimentarius)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・カルバタス(Lactobacillus curvatus)、ラクトバチルス・デルブルッキィ(Lactobacillus delbruckii)、ラクトバチルス・ジョンソニイ(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス・ファルシミナス(Lactobacillus farciminus)、ラクトバチルス・ガッセリー、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、又はペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)が挙げられ得る。好ましくは、本発明による食品組成物は、その効果を更に増強するために、優れたプロバイオティクス活性、並びに抗アレルギー、抗炎症、免疫調節、及び/又は腸の健康の改善の優位な活性を有するプロバイオティクス微生物混合物を更に含んでいてもよい。本発明の食品組成物に含まれ得る担体としては、例えば、増量剤、高繊維添加物、カプセル化剤、及び脂質が挙げられ得、これらは当技術分野において広く周知である。本発明におけるラクトバチルス・ガッセリーKBL697株���、凍結乾燥形態若しくはカプセル化形態、又は培養懸濁液若しくは乾燥粉末の形態であり得る。
【００４２】
本発明の組成物は、前記株を含む飼料添加物、又はこれを含む飼料の形態で提供することもできる。
【００４３】
本発明の飼料添加物は、乾燥製剤又は液体製剤の形態であってよく、前記ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株に加えて、他の非病原微生物を更に含んでいてよい。飼料添加物に添加することができる微生物としては、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、及び糖変換酵素を産生し得るバチルス・サブティリス、ウシの胃におけるような嫌気性条件下で生理学的活性及び有機化合物の分解性を有するラクトバチルス属株、動物の体重増加、乳量、及び飼料の消化性に対する効果を示すアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)(Slyter,L.L.、J. Animal Sci.、1976年、43巻、910〜926頁)、並びにサッカロミセス・セレビシエ等の酵母(Johnson, D. Eら、J.Anim.Sci.、1983年、56巻、735〜739頁;Williams ,P .E .V.ら、1990年、211頁)が挙げられ得る。
【００４４】
本発明の飼料添加物は、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697の前記株に加えて、少なくとも1つの酵素剤を追加で含んでいてよい。追加の酵素剤は、乾燥形態又は液体形態であり得、例えば、リパーゼ等の脂肪分解酵素、フィチン酸を分解することによってホスフェート及びイノシトールホスフェートを産生するフィターゼ、アミラーゼ、即ち、例えば、デンプン及びグリコーゲンに含まれるα-1,4-グリコシド結合を加水分解する酵素、ホスファターゼ、即ち、有機リン酸エステルを加水分解する酵素、セルロースを分解するカルボキシメチルセルラーゼ、キシロースを分解するキシラーゼ、マルトースを2つのグルコース分子に加水分解するマルターゼ、並びにショ糖を加水分解することによってグルコース-フルクトース混合物を産生するインベルターゼ等の糖生成酵素が挙げられ得る。
【００４５】
飼料添加物としての本発明のラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の使用において、各種の穀物及び大豆タンパク質を含む、ピーナッツ、エンドウ、ビート、果肉、穀物副産物、動物の腸の粉末、及び魚粉末等の飼料のための原材料を使用することができる。これらは、加工されていてよく、又は加工されていなくてよく、限定されずに使用することができる。加工としては、限定されないが、飼料の原材料が投入され、所与の出口に対して圧力下で圧縮され得るようなプロセスを挙げることができ、タンパク質については、好ましくは、タンパク質が変性されて利用能を増加させる押出を使用することができる。押出は、熱処理によりタンパク質を変性させて、抗酵素因子を破壊し、有利である。更に、大豆タンパク質については、その消化性は、大豆中に存在するプロテアーゼの阻害剤の1つであるチロシン阻害剤等の反栄養素を不活性化する押出によって改善することができる。更に、押出は、プロテアーゼによる消化性の改善を促進することができ、大豆タンパク質の栄養価を増強する。
【００４６】
本発明の別の実施形態によれば、本発明は、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、抗真菌組成物に関する。
【００４７】
組成物は、限定されないが、マラセチア・フルフル(Malassezia furfur)、マラセチア・グロボーサ(Malassezia globos)、及びマラセチア・レストリクタからなる群から選択される1つに対する抗真菌活性を示すことによって特徴付けることができる。
【００４８】
組成物は、脂漏性皮膚炎若しくはふけを、予防、軽減又は処置するための組成物であり得、前記脂漏性皮膚炎は、頭皮におけるものであり得る。
【００４９】
更に、前記組成物は、真菌感染に起因する、蕁麻疹、発疹、体部白癬、股部白癬、又は足白癬を、予防、軽減又は処置するための組成物であり得る。
【００５０】
前記株、並びに前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物は、組成物の総質量に対して、0.1質量%〜50質量%の量で含まれ得る。
【００５１】
前記抗真菌組成物は、医薬組成物、化粧用組成物又は健康食品組成物であり得、これは、皮膚外用製剤でもあり得る。
【００５２】
前記化粧用組成物は、局所適用のために適切な全ての剤形、例えば、液体、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、懸濁液、固体、ゲル、粉末、ペースト、フォーム又はエアロゾルの形態で提供することができる。上記剤形の前記組成物は、当技術分野において使用される従来の方法で調製することができる。
【００５３】
上記成分に加えて、前記組成物は、主たる効果を害しない量で、好ましくは、主たる効果に対して相乗効果を提供する量で、他の成分を含んでいてよい。本発明による組成物は、ビタミン、ポリペプチド、多糖類、及びスフィンゴ脂質からなる群から選択される物質を含んでいてよい。更に、本発明の化粧用組成物は、保湿剤、皮膚軟化剤、界面活性剤、UV吸収剤、保存剤、殺菌剤、抗酸化剤、pH調整剤、有機及び無機顔料、香味剤、冷却剤、又は制汗剤を含んでいてもよい。前記成分を合わせたパーセンテージは、本発明の目的及び効果を妨げない範囲内で、当業者によって選択することができ、組成物の総質量に対して、0.01質量%〜5質量%、特に、0.01質量%〜3質量%の範囲であり得る。
【００５４】
上記の実施形態によれば、本発明の抗真菌組成物は、クリーム、軟膏、シャンプー、又はトリートメント等の皮膚外用製剤であり得る。
【００５５】
本発明の別の実施形態によれば、本発明は、アトピー性皮膚炎を含むアレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、及び/若しくは自己免疫疾患の処置又は予防のための医薬組成物であって、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の細胞成分、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む組成物に関する。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、生細菌の細胞成分、乾燥株、前記株の培養物、前記株の溶解物、又は薬学的に許容される担体若しくは媒体と組み合わせた組成物の形態で提供することができる。本明細書において使用することができる担体又は媒体としては、溶媒、分散剤、コーティング、エンハンサー、徐放性製剤(即ち、持続放出製剤)、又はデンプン、ポリオール、顆粒、極細セルロース、Celphere等の微結晶性セルロース、Celphereビーズ、希釈剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤を含む少なくとも1つの不活性賦形剤が挙げられ得る。上記組成物の錠剤は、必要に応じて、標準的な水性又は非水性の手法によってコーティングされてよい。薬学的に許容される不活性担体及び前記追加の成分としての使用のための薬学的に許容される担体及び賦形剤の例としては、例えば、結合剤、フィラー、崩壊剤、滑沢剤、抗菌剤、及びコーティング剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００５７】
更に、本発明の医薬組成物は、軟膏、クリーム、ペースト、皮膚適用のための液体及び溶液、グリセロゼラチン、リニメント剤、皮膚適用のための粉末、エアロゾル、並びにパップ剤からなる群から選択される剤形を含む外用製剤として、使用することができる。
【００５８】
本発明において、前記アレルギー性疾患は、IL-4又はIL-5発現と関連する状態を指し、例えば、湿疹、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、蕁麻疹、又はアナフィラキシーが挙げられ得る。好ましくは、本発明は、疾患が、限定されないが、乳児湿疹、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、及び食品アレルギーからなる群から選択されることを特徴とし得る。
【００５９】
本発明は、前記腸疾患が、腹部膨満、腹部不快感、病原微生物によって引き起こされる感染性下痢、胃結腸炎、炎症性腸疾患、神経性腸炎症候群、過敏性腸症候群、小腸微生物の過剰増殖、及び腸の摂食性下痢からなる群から選択されることを特徴とし得、疾患は、腸のバリア機能の損傷によって引き起こされるものも含む。
【００６０】
炎症性腸疾患(IBD)としては、クローン病、ベーチェット病に付随する腸の病変、潰瘍性大腸炎、出血性直腸潰瘍、及び嚢炎が挙げられ得、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む疾患の群を指す。潰瘍性大腸炎は、大腸にのみ影響を与える。潰瘍性大腸炎の炎症及び潰瘍は、大腸の4つの層のうちの2つの最も内側の層である粘膜及び粘膜下層に限定される。クローン病の炎症及び潰瘍は、小腸及び大腸両方の腸壁の全ての層にわたって広がり得る。
【００６１】
その一方で、過敏性腸症候群は、腹部膨満等の持続的な再発性の腹部不快感及び痛みだけでなく、下痢及び便秘等の排便習慣の変化に付随する慢性の状態である。症状は、心理学的要因、又はストレスが多い社会環境によって悪化し得る。
【００６２】
本発明において、炎症性疾患は、主要病変として炎症を有する状態をまとめて指し、例えば、浮腫、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、慢性副鼻腔炎、咽頭喉頭炎、扁桃炎、気管支炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、大腸炎、痛風、湿疹、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、強直性脊椎炎、リウマチ熱、線維筋痛症、変形性関節症、乾癬性関節炎、関節リウマチ、肩の関節周囲炎、腱炎、腱鞘筋炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、シェーグレン症候群、重症筋無力症、敗血症、血管炎、滑液包炎、側頭動脈炎、及び多発性硬化症が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明において、免疫調節性効果によって軽減することができる自己免疫疾患及び症状は、例えば、関節リウマチ、狼瘡、全身性強皮症、アトピー性皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、喘息、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、皮膚筋炎、多発性筋炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、結節性多発動脈炎、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、側頭動脈炎、若年性糖尿病、円形脱毛症、天疱瘡、アフタ性口内炎、自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症、シェーグレン症候群、アジソン病、クローン病、及びベーチェット病が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明は、免疫調節、或いは自己免疫疾患若しくは炎症性疾患を軽減、予防又は予防するための本発明の株から得られる効果が、炎症及び免疫調節の阻害と関連するサイトカインの増加並びに減少、特に、TNF-α、TFN-γ、及びIL-17分泌の減少、並びにIL-10分泌の増加から選択される少なくとも1つの機構によって誘導され得る。
【００６５】
TNF-α(腫瘍壊死因子-α)は、マクロファージ、並びに細菌感染及び腫瘍学的疾患に対する宿主免疫反応の間に活性化される各種の他の細胞によって産生される17kDaのペプチドである。このサイトカインは、免疫及び炎症反応の重要なメディエーターとしても公知であり、関節リウマチ(RA)、乾癬性関節炎、クローン病、乾癬、及び強直性脊椎炎(AS)等の自己免疫疾患並びに炎症性疾患において重要な役割を果たす炎症性サイトカインとしても公知である。
【００６６】
他方で、CD4+T細胞は、特定のサイトカイン及び転写因子の発現に応じて、Th1(ヘルパーT1型)、Th2(ヘルパーT2型)、CD4+ CD25+炎症性T細胞、及びTh17細胞(ヘルパーT17細胞)等のサブタイプに分類することができる。これらの中で、Th17細胞によって産生されるIL-17は、自己免疫疾患、アレルギー反応、又は細菌若しくは真菌の感染に対する宿主防御に主に関与するとして公知である。
【００６７】
更に、IL-10は、ヘルパーT細胞、B細胞、単球及び他の細胞によって産生される35〜40kDaのペプチドであり、免疫抑制性及び抗炎症性、例えば、TNF-α及びTNF-γを含むサイトカインの産生の阻害を有する。
【００６８】
「処置する」という用語は、特に言及しない限り、前記用語と共に使用される疾患若しくは状態、又はその1つ若しくは複数の症状を反転又は軽減すること、その進行を阻害すること、或いはそれを予防することを指す。本発明において使用される「処置」という用語は、上記に定義する「処置する」の行為を指す。したがって、哺乳動物における疾患の処置又は治療レジメンは、以下のうちの1つ又は複数を含み得る。
(1)疾患の発展を阻害する、即ち、その発達を阻害する
(2)疾患の広がりを予防する
(3)疾患を軽減する
(4)疾患の再発を予防する、及び
(5)疾患の症状を緩和する
【００６９】
アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、及び/若しくは自己免疫疾患を予防又は処置するための本発明の組成物は、薬学的有効量のラクトバチルス・ガッセリーKBL697株を、単独で、又は薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは希釈剤の少なくとも1つと組み合わせて、含み得る。
【００７０】
本発明において、「有効量」という用語は、所望の効果を提供するのに十分に高いが、医学的判断下で重篤な副作用を予防するのに十分に低い、量を意味する。本発明の組成物によって身体に投与される微生物の量は、投与経路及び投与標的を考慮して、適切に調整することができる。
【００７１】
本発明の組成物は、1日あたり1回又は複数回、対象に投与することができる。単位投薬量は、ヒト対象及び他の哺乳動物への単位投与のために適切な物理的な不連続単位を意味し、それぞれの単位は、適切な薬学的担体、及び治療効果を提供する所定量の本発明のラクトバチルス・ガッセリーKBL697株を含む。成人患者に対する経口投与のための投薬量単位は、好ましくは、0.001g以上の本発明の微生物を含有し、本発明の組成物の経口投薬量は、1用量あたり、0.001〜10g、好ましくは、0.01g〜5gである。本発明の微生物の薬学的有効量は、0.01g〜10g/日である。しかしながら、投薬量は、患者の疾患の重症度、並びに一緒に使用される微生物及び補助有効成分に応じて変わる。加えて、1日の総投薬量は、数回に分けることができ、必要により連続的に投与することができる。したがって、上記投薬量範囲は、本発明の範囲を決して限定するものではない。
【００７２】
更に、上記で使用される「薬学的に許容される」という用語は、ヒトに投与された場合に、生理学的に許容され、胃腸障害若しくは眩暈等のアレルギー反応、又は同様の反応を引き起こさない、組成物を指す。
【００７３】
本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の即時放出、持続放出、又は遅延放出を提供することができるように、当技術分野において公知の方法を使用して製剤化することができる。剤形は、散剤、顆粒剤、錠剤、乳剤、シロップ剤、エアロゾル、軟若しくは硬ゼラチンカプセル剤、滅菌注射液、又は滅菌粉末であり得る。更に、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、及び/若しくは自己免疫疾患を予防又は処置するための本発明の組成物は、経口、経皮、皮下、静脈内、又は筋肉内投与を含む、いくつかの経路を介して投与することができる。活性成分の投薬量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重、及び患者の重症度等の各種の要因に応じて、適切に選択することができる。アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、及び/又は自己免疫疾患を処置するための本発明の組成物は、関連する症状を、予防、軽減、又は処置する効果を有する公知化合物と組み合わせて投与することができる。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、特に、腸溶コーティング製剤の経口単位剤形で提供することができる。「腸溶コーティング」という用語は、本明細書で使用される場合、胃酸によって分解されることなく、胃中に留まることができ、かつ腸管中で十分に崩壊して、そこで活性成分を放出することができる、任意の公知の薬学的に許容されるコーティングを含む。本発明の「腸溶コーティング」は、pH1のHCl溶液等の人工胃液を36℃〜38℃で接触させた場合に、2時間又はそれよりも長く維持され得、その後、pH6.8のKH2PO4緩衝液等の人工腸液中で、好ましくは、30分内に崩壊し得る、コーティングを指す。
【００７５】
本発明の腸溶コーティングは、1つのコア上に、約16mg〜30mg、好ましくは、16mg〜20mg、又は25mg以下の量でコーティングされる。本発明の腸溶コーティングの厚さが、5μm〜100μm、好ましくは、20μm〜80μmである場合、満足のいく結果を、腸溶コーティングとして得ることができる。腸溶コーティングの材料は、公知のポリマー材料から適切に選択することができる。適切なポリマー材料は、多くの公知文献[L. Lachmanら、The Theory and Practice of Industrial Pharmacy、第3版、1986年、365〜373頁;H. Suckerら、Pharmazeutische Technologie、Thieme、1991年、355〜359頁;Hagers Handbuchder pharmazeutischen Praxis、第4版、7巻、739〜742頁、及び766〜778頁、(SpringerVerlag、1971年);並びにRemington's Pharmaceutical Sciences、第13版、1689〜1691頁(Mack Publ., Co.、1970年)]に列挙されており、セルロースエステル誘導体、セルロースエーテル、アクリル樹脂及びメタクリレートのコポリマー、並びにマレイン酸及びフタル酸誘導体のコポリマーが、そこに含まれ得る。
【００７６】
本発明の腸溶コーティングは、腸溶コーティング液がコア上に噴霧される、従来の腸溶コーティング法を使用して、調製することができる。腸溶コーティングプロセスのために使用される適切な溶媒は、エタノール等のアルコール、アセトン等のケトン、ジクロロメタン(CH2Cl2)等のハロゲン化炭化水素溶媒、及びこれらの溶媒の混合溶媒である。フタル酸ジ-n-ブチル又はトリアセチン等の軟化剤は、1:約0.05〜約0.3(コーティング材料:軟化剤)の比で、コーティング液に添加される。噴霧プロセスを連続的に行うことが適切であり、コーティングの条件を考慮して、噴霧量を調整することが可能である。噴霧手順は、各種調整することができ、満足のいく結果は、一般に、約1bar〜約1.5barの噴霧圧力を用いて得ることができる。
【００７７】
その一方で、本発明の医薬組成物は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、及び/若しくは自己免疫疾患に対する予防効果又は処置効果を有することが公知の従来の薬物と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明の医薬組成物と組み合わせて投与することができる薬物としては、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、アブシキシマブ、アレムツズマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エルツマキソマブ、エタネルセプト、エタラシズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ、イムシロマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、リツキシマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、タカツズマブテトラキセタン、テフィバズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、セクキヌマブ、ベドリズマブ、ビジリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、及びザノリムマブ等の、炎症性疾患、腸疾患、又は自己免疫疾患を処置するために使用される抗体医薬が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００７８】
加えて、本発明の医薬組成物は、湿疹、及びアトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患の処置のために、抗ヒスタミン剤、ステロイド、サリチル酸、尿素、タクロリムス、シクロホスホリン(cyclophosphorine)、光線療法等と組み合わせて使用することができ、炎症性腸疾患等の腸疾患の処置のために、スルファサラジン、アザチオプリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、TNF遮断剤(アダリムマブ、エタネルセプト等)、又はインテグリン抗体(ベドリズマブ、ナタリズマブ等)と組み合わせて使用することができる。
【００７９】
本発明の別の実施形態において、本発明は、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、及び/若しくは自己免疫疾患を予防若しくは処置するための前記株又は前記組成物の使用、並びに上記疾患のための治療剤を調製するための前記株又は前記組成物の使用を提供する。
【００８０】
特に、本発明は、アトピー性皮膚炎を含むアレルギー性疾患、炎症性疾患、大腸炎等の腸疾患、及び/若しくは乾癬等の自己免疫疾患の予防又は処置する使用のための、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む組成物に関する。
【００８１】
本発明は、アトピー性皮膚炎を含むアレルギー性疾患、炎症性疾患、大腸炎等の腸疾患、及び/若しくは乾癬等の自己免疫疾患のための予防薬又は治療薬を調製するための組成物の使用であって、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、組成物の使用にも関する。
【００８２】
「予防」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患を低減するために、疾患を防ぐこと、遅延させること、妨げること又は邪魔することと関連する。
【００８３】
「処置」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患の症状を、寛解、治癒若しくは低減するため、又は疾患の進行を低減若しくは停止するために、疾患に罹患した対象について世話することと関連する。
【００８４】
本発明の別の実施形態において、本発明は、アトピー性皮膚炎を含むアレルギー性疾患、炎症性疾患、腸疾患、及び/若しくは自己免疫疾患を予防又は処置するための方法であって、薬学的有効量の株又は前記組成物を、前記疾患の予防若しくは処置を必要とする対象、又は腸の健康、アレルギー反応、炎症反応、若しくは自己免疫反応の軽減を必要とする対象に、投与することを含む、方法を提供する。
【００８５】
特に、本発明は、アトピー性皮膚炎を含むアレルギー性疾患、炎症性疾患、大腸炎等の腸疾患、及び/又は乾癬等の自己免疫疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の、前記株、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを投与することを含む、方法も提供する。
【００８６】
前記疾患を予防又は処置するための方法、その投与方法のために使用される医薬組成物は、上記に記載しているので、組成物及び方法の間で重複する内容は、本明細書の必要以上の複雑さを避けるために、本明細書において省略する。
【００８７】
その一方で、前記疾患を予防又は処置するための組成物を投与することができる前記対象としては、ヒトを含む全ての動物が挙げられる。例えば、対象は、イヌ、ネコ、又はマウス等の動物であり得る。
【００８８】
本発明の別の実施形態によれば、本発明は、薬学的有効量の、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の細胞成分、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、化粧用組成物に関する。
【００８９】
化粧用組成物は、限定されないが、皮膚アレルギー、皮膚蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、乾癬、真菌感染症、及び湿疹からなる群から選択される少なくとも1つの敏感肌状態を軽減するその機能によって特徴付けられ得る。
【００９０】
「化粧用組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の細胞成分、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む組成物を指し、任意の種類の剤形を取り得る。例えば、前記化粧用組成物を使用することによって調製される化粧品としては、クリーム、パック、ローション、エッセンス、化粧液、ファンデーション、及び化粧下地が挙げられ得、限定されないが、本発明の目的を達成するために、上記に列挙された任意の剤形で商業化され得る。本発明の化粧用組成物に含まれる成分としては、上記の成分に加えて、化粧用組成物において通常使用される成分、例えば、抗酸化剤、安定剤、可溶化剤、ビタミン、顔料及び香料、並びに担体等の従来の補助剤が挙げられる。
【００９１】
本発明の別の実施形態において、本発明は、ラクトバチルス・ガッセリーKBL697株の細胞成分、前記株の培養物、前記株の溶解物、及び前記株の抽出物からなる群から選択される少なくとも1つを含む、機能性パッチに関し、前記機能性パッチは、化粧用又は医療用の目的のために使用され得る。
【００９２】
パッチは、限定されないが、皮膚アレルギー、皮膚蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、乾癬、真菌感染症、及び湿疹からなる群から選択される少なくとも1つの敏感肌状態を軽減するその機能によって特徴付けられ得る。
【００９３】
本発明において、パッチは、典型的には、送達される物質を含有する小さな粘着包帯であり、包帯は、様々な形態を取ることができる。最も単純な形態は、支持体上に置かれた送達される物質を含有するリザーバーを含む単一の接着体である。リザーバーは、典型的には、化粧的又は薬学的に許容される感圧接着剤から形成されるが、一部の場合では、皮膚接触表面に適切な薄い接着層を備えた非接着物質から形成されてもよい。送達される物質がパッチからパッチを着けた対象に投与される速度は、送達される物質に対する皮膚の透過性が、通常、個体及び皮膚の場所に依存するので、変化させることができ、これは、当業者によって容易に選択することができる。
【００９４】
本明細書の以下において、本発明を、実施例を通してより詳細に記載する。これらの実施例は、本発明を説明するのみのためであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されると解釈されるべきではないことは当業者に明らかであろう。
【実施例１】
【００９５】
T細胞におけるTh2型サイトカインの阻害から生じるアレルギー反応に対するKBL697による軽減及び治療効果
IL-4及びIL-5等の2型ヘルパーT細胞(Th2)関連サイトカインは、Th2関連免疫反応を増加させること、及びIgE産生を増加させることによって、慢性アレルギー反応に寄与することが報告されている(Passante E、Inflamm. Res.、2009年)。各種のラクトバチルス属株によるIL-4及びIL-5分泌を阻害する効果を検証することによって、本発明は、慢性アレルギー性疾患を含む各種のアレルギー性疾患のために治療剤として使用することができるプロバイオティクス株のスクリーニングを試みた。この目的で、IL-4及びIL-5の分泌を阻害する効果を、マウスT細胞株であるEL4細胞株を使用して、以下の通り試験した。
【００９６】
1-1.EL-4細胞株のインキュベーション
EL4(ATCC番号TIB-39)細胞を、10%のFBS(ウシ胎仔血清)、ペニシリン(100μg/mL)及びストレプトマイシン(100μg/mL)で補充されたDMEM培地中、5%のCO2下、37℃で培養し、次いで、3日ごとに1回継代した。EL4細胞を、4×105個細胞/ウェルの濃度で24ウェルプレートに播種し、次いで、16〜20時間培養して、アレルギー反応を誘導し、株で処置した。
【００９７】
1-2.株のインキュベーション及び回収
使用するラクトバチルス・ガッセリー株を、0.5%のシステインで補充されたMRS培地中で培養し、18時間間隔で合計で2回の継代により活性化し、次いで、実験に使用した。得られた培養液を15,000×gで3分間遠心分離し、ペレットをPBS緩衝液で洗浄した。株を、フローサイトメトリーのためのLIVE/DEAD(商標)BacLight(商標)細菌生存率及び計数キット(Thermo Fisher Scientific社、米国)を使用することによって、SYTO9及びPIで、15分間染色した。次いで、含有されているビーズを添加し、染色された生細菌の数を、フローサイトメトリーアッセイを使用することによって、計数した。
【００９８】
1-3.株の処置、及びアレルギー反応を誘導した後のIL-4及びIL-5の量の測定
24ウェルプレートに以前に播種されたEL4細胞においてアレルギー反応を誘導するために、各ウェルを100μLのPMA(20ng/mL)及びイオノマイシン(1μg/mL)で処置した。次いで、300μLの以前に調製された株を、1:10の細胞の株に対する比で処置した。5%のCO2インキュベーター中、37℃で24時間のインキュベーション後、上清を収集し、マウスIL-4 ELISAセット(カタログ番号555232、BD OptEIA(商標))及びマウスIL-5 ELISAセット(カタログ番号555236、BD OptEIA(商標))を使用して、製造者の方法に従って、分泌されたIL-4及びIL-5の量を測定した。
【００９９】
結果として、図1及び2に示すように、KBL697が、IL-4及びIL-5両方の分泌を効果的に阻害したことが確認され、アレルギーに対するその治療及び予防効果を、アレルギー反応を媒介するTh2型サイトカインの分泌の阻害により提供することができた。
【実施例２】
【０１００】
好塩基球におけるヒスタミン分泌の阻害から生じるアレルギー反応に対するKBL697による軽減及び処置効果
アレルギー反応において、ヒスタミンは、組織中で発現し、炎症反応を引き起こし、ヒスタミン分泌を抑制すると、ヒスタミンによる反応を遮断することによってアレルギー症状の軽減をもたらすことが報告されている。本発明において、KBL697によるヒスタミン分泌の阻害による、アレルギー反応の軽減、及びそれに対する治療効果を更に確認した。更に、実施例1において特定された慢性アレルギーを処置及び予防するための効果が、ラクトバチルス・ガッセリーの固有の特性であるか否か、又はラクトバチルス・ガッセリーの中で特にKBL697において顕著な効果であるか否かを確認するために、ヒスタミン分泌を抑制する能力を、KBL697に加えて、9つの追加のラクトバチルス・ガッセリー株についても評価した。RBL-2H3細胞株を培養後に脱顆粒を誘導した後、ヒスタミン分泌を抑制する能力を、基質との比色分析反応を使用して、ヒスタミンと共に共分泌されるβ-ヘキソサミニダーゼの活性を測定することによって、試験した。
【０１０１】
2-1.RBL-2H3細胞株のインキュベーション
RBL-2H3(ATCC番号CRL-2256)細胞を、10%のFBS、ペニシリン(100μg/mL)及びストレプトマイシン(100μg/mL)で補充されたDMEM培地中、5%のCO2下、37℃で培養し、次いで、3日ごとに1回継代した。RBL-2H3細胞を、1×106個細胞/ウェルの濃度で6ウェルプレートに播種し、次いで、3時間培養し、次いで、IgE(0.5μg/mL)で処置して、16〜20時間インキュベートした。
【０１０２】
2-2.株のインキュベーション及び培養液の調製
使用するラクトバチルス・ガッセリー株を、0.5%のシステインで補充されたMRS培地中で培養し、18時間間隔で合計で2回の継代により活性化し、次いで、実験に使用した。得られた培養液を15,000×gで3分間遠心分離して、上清を収集した。
【０１０３】
2-3.株の処置後の脱顆粒の誘導
6ウェルプレートに以前に播種されたRBL-2H3細胞の培地を除去した後、細胞を1mlのSiraganian緩衝液(pH7.2)で2回洗浄した。その後、細胞を、ウェルあたり120μLの以前に調製された細菌培養液又は陽性対照群のケトチフェン(20μg/mL)で処置し、5%のCO2インキュベーター中、37℃で20分間インキュベートし、続いて、60μLの抗原(DNP-HAS、1μg/mL)で処置して、抗原-抗体反応による脱顆粒を誘導した。陰性対照として、脱顆粒を、120μLのSiraganian緩衝液で処置した後、誘導した。反応を、5%のCO2インキュベーター中、37℃で20分間行い、次いで、上清を収集した。
【０１０４】
2-4.呈色反応の特定
β-ヘキソサミニダーゼの活性を特定するために、実施例2-3で収集された上清の25μLを、96ウェルプレートの各ウェルに移し、次いで、25μLの基質(p-ニトロフェニルN-アセチル-D-グルコサミニダーゼ)をそれぞれに添加し、続いて、反応を、5%のCO2インキュベーター中、37℃で90分間行った。次いで、200μLの停止溶液(Na2CO3/NaHCO3)を添加して、反応を停止し、次いで、吸光度を405nmで測定した。それぞれの種類のラクトバチルス・ガッセリーで処置した場合の吸光度を陰性対照群と比較し、パーセンテージに変換して、脱顆粒の阻害のレベルを示した。
【０１０５】
結果として、図3及びTable 1(表1)において見ることができるように、KBL697は、他のラクトバチルス・ガッセリー株と比較して、最大で4倍低い量のβ-ヘキソサミニダーゼ分泌を示し、これが、陽性対照の市販の抗ヒスタミン剤であるケトチフェンのものよりも低いことを確認した。結果として、KBL697が、ヒスタミンの過剰分泌によって引き起こされるアレルギー症状を効果的に軽減する、優れた脱顆粒予防活性を示したことが分かった。
【０１０６】
【表１】
2021524748.tif 000003
【実施例３】
【０１０７】
KBL697の免疫調節及び炎症阻害効果の分析
KBL697の免疫調節及び炎症阻害効果も、その抗アレルギー有効性に加えて、検証した。この目的で、免疫調節機能を有する代表的なサイトカインであるIL-10、炎症反応の主要な指標としてのサイトカインであるTNF-α及びIL-6の間の比(IL-10/TNF-α、IL-10/IL-6)を、炎症反応において重要な役割を果たすマクロファージを使用することによって測定した。
【０１０８】
3-1.RAW264.7細胞株のインキュベーション
RAW264.7(ATCC番号TIB-71)細胞を、10%のFBS、ペニシリン(100μg/mL)及びストレプトマイシン(100μg/mL)で補充されたDMEM培地中、5%のCO2下、37℃で培養し、次いで、3日ごとに1回継代した。RAW264.7細胞を、1×105個細胞/ウェルの濃度で24ウェルプレートに播種し、次いで、16〜20時間培養し、次いで、実施例3-3のために使用した。
【０１０９】
3-2.株のインキュベーション及び試料の調製
同数の生細菌を有する培養液を収集し、次いで、3つの試料:生細菌、低温殺菌及び熱死滅として、調製した。生細菌、低温殺菌及び熱死滅のための試料を、実施例1-2の方法と同じ方法により、調製した。次いで、低温殺菌のための試料を70℃で30分間反応させ、同じ遠心分離プロセスにより調製した。熱死滅の試料を121℃で15分間滅菌し、同じプロセスにより調製した。陰性対照群として、0.5%のシステインで補充されたMRS培地を使用した。
【０１１０】
3-3.株の処置、及び炎症反応を誘導した後に分泌された炎症性サイトカインの量の測定
24ウェルプレートに以前に播種されたRAW264.7細胞において炎症反応を誘導するために、各ウェルを500μLのLPS(20ng/mL)で処置した。次いで、300μLの以前に調製された株を、1:10の細胞の株に対する比で処置し、5%のCO2インキュベーター中、37℃で24時間インキュベートした。培養された細胞株混合物中の上清を収集し、マウスTNF ELISAセットII(カタログ番号558534、BD OptEIA(商標))、マウスIL-6 ELISAセット(カタログ番号555240、BD OptEIA(商標))、及びマウスIL-10 ELISAセット(カタログ番号555252、BD OptEIA(商標))を使用して、製造者の方法に従って、各サイトカインの量を測定した。
【０１１１】
結果として、図4に示すように、ラクトバチルス・ガッセリー株の中で、特にKBL697が、IL-10分泌を誘導し、したがって、免疫調節及び炎症反応の抑制の観点で優れた効果を示したことを確認した。図5及び図6に示すように、炎症促進性サイトカインのTNF-α及びIL-6で正されたIL-10を分泌する能力から、KBL697処置群が、対照群と比較してはるかに増強された、炎症阻害効果及び免疫調節能力を示したことを確認した。したがって、KBL697が、IL-10分泌による免疫調節及び炎症阻害活性を有することが分かった。加えて、これらの効果は、生細菌においてだけでなく、低温殺菌又は熱死滅した死体においても同様に確認され(Table 2(表2)及びTable(表3)を参照のこと)、KBL697を、死細菌等の各種の形態で炎症反応を抑制するために使用することができることを示す。
【０１１２】
【表２】
2021524748.tif 000004
【０１１３】
【表３】
2021524748.tif 000005
【実施例４】
【０１１４】
KBL697の抗真菌効果の分析
KBL697の抗真菌効果を、スポットアッセイ法によって確認した。約1%のKBL697を、MRS液体培地上に接種し、次いで、静置培養のために、嫌気性条件下、37℃のインキュベーター中で約24時間インキュベートした。細胞がインキュベートされた培養液を、嫌気性条件下で調製されたMRS個体培地に、各回で10μLの量でスポットし、次いで、嫌気性条件下、37℃で約24時間インキュベートした。真菌微生物であるマラセチア・フルフルKCTC 7545を、好気性条件下で調製されたmYPG液体培地に、1%の割合で接種することによって調製し、続いて、37℃のインキュベーター中、約24〜48時間インキュベートした。抗真菌有効性の評価のために使用するmYPGソフト培地を、Table 4(表4)に示される成分を用いて調製し、2.5mLの調製した培養培地に、500μLのM.フルフル(M.furfur)をインキュベートした培養液を接種した。M.フルフルを接種した2.5mLのmYPGソフト培地を、KBL697でスポットされたMRS培地に注ぎ、1時間乾燥させた。乾燥培地を、好気性条件下、37℃のインキュベーター中、約24〜48時間インキュベートした。透明ゾーンが培養培地中で特定された時に、抗真菌活性を、スポットされた乳酸菌の外側から透明ゾーンまでの長さを測定することによって、決定した。透明ゾーンは、真菌の成長が阻害された部分であり、乳酸菌によって引き起こされる抗真菌活性を、透明ゾーンまでの長さにより決定した。
【０１１５】
3回の繰り返し実験の結果として、透明ゾーンを、KBL697でスポットされた部分と約6.00mmの間隔で特定し(図7)、これは、KBL697が真菌微生物の成長を効果的に抑制することができることを示す。
【０１１６】
【表４】
2021524748.tif 000006
【実施例５】
【０１１７】
アトピー状態の軽減に対するKBL697の効果
KBL697のアレルギー改善効果の中でアトピーの軽減に対する効果を検証するために、アトピー性皮膚疾患の動物モデルであるNC/Ngaマウスモデルを使用した。
【０１１８】
NC/Ngaマウスを5頭のマウスの群に分けた後、各マウスの背を耳の下側から尾の上側まで脱毛し、マウスを24時間放置した。次いで、200μLの1%のDNCB(ジニトロクロロベンゼン)溶液(アセトン:オリーブ油=3:1)を、脱毛された部分に、週に2回適用して、アトピー性皮膚炎を誘導した。皮膚炎の誘導の3週目から、200μLのPBSのみを対照群のマウスに毎日投与し;培養されたKBL697株を遠心分離し、PBSでの希釈により洗浄し、回収し、次いで、少なくとも2×109(KBL697-9)/2×108(KBL697-8)/2×107 (KBL697-7)CFUが200μLのPBSに添加されるように調製し、これを、試験群のマウスに、200μL/日で経口投与した。その一方で、200μLのデキサメタゾン(60μg/mL)を、陽性対照群のマウスに投与した。次いで、細菌の投与の3週間の間、対照群及び試験群のマウスの皮膚炎スコアを毎週測定し、細菌の投与の3週間後に、マウスの引っ掻き時間及び皮膚の厚さ、並びにマウスの剖検を実施した後にIgEの血液中濃度を測定した。
【０１１９】
5-1.皮膚炎スコアの評価
DNCB誘導皮膚病変を評価するために、皮膚炎スコアを以下の方法によって測定した。皮膚の状態を、株を投与してから3週目から、1週間の間隔で3週間、写真を撮ることによってモニターした。乾燥、浮腫、紅斑/出血の4つの指標、及び皮膚のびらん/剥脱をチェックした。そして、病変がない状態を0ポイント、軽度の状態を1ポイント、中度の状態を2ポイント、及び重度の状態を3ポイントとして、スコア化し、総スコアを評価した。
【０１２０】
結果として、図8に示すように、DNCBによって誘導された皮膚炎スコアは、アトピー性皮膚炎が誘導された対照群(陰性)と比較して、KBL697投与群において顕著に低減され、特に、KBL697が2×109CFUで投与された試験群(KBL697-9)は、デキサメタゾン投与の陽性対照よりも更に低い皮膚炎スコアを示した。結果として、KBL697の投与によるアトピー性皮膚炎を処置する効果を検証した。
【０１２１】
5-2.そう痒緩和効果
DNCBによって誘導されたアトピー性皮膚炎を患うマウスモデルにおけるKBL697の投与によるそう痒を軽減する効果を検証するために、引っ掻き時間を、株の投与の3週間後に10分間、マウスモデルのビデオを撮影することによって測定した。
【０１２２】
結果として、図9において見ることができるように、引っ掻き時間は、PBS投与群と比較して、KBL697を投与された全ての試験群において顕著に低減されたと思われ、これは、アトピー性皮膚炎のそう痒症状が、KBL697の投与によって非常に軽減されたことを確認した。
【０１２３】
5-3.皮膚の厚さの減少
DNCBによって誘導されたアトピー性皮膚炎を患うマウスモデルに対するKBL697の投与後のそう痒を軽減する効果を検証するために、マウスの耳の厚さ及び背面の皮膚の厚さを、株が投与された3週間後にキャリパーで測定し、アトピー性皮膚炎に起因する浮腫の症状の緩和を観察した。
【０１２４】
結果として、図10及び11において見ることができるように、KBL697が投与された試験群及び陽性対照群において、耳及び背面の皮膚の厚さが顕著に低減されたことが観察された。
【０１２５】
5-4.IgEの血液中濃度の減少
アトピー性皮膚炎を有する患者におけるIgEの濃度が、大抵は、アトピー性皮膚炎の臨床的重症度の増加と共に増加していることが見出された(Matsumoto M、J. Immunol.、1999年)。したがって、アトピー性皮膚炎が生じた時に現れる代表的な血液学的因子であるIgEの濃度を、株を投与した3週間後に血液を収集すること、血液から血清を分離すること、及びマウスIgE ELISAセット(カタログ番号555248、BD OptEIA(商標))を使用することによって、測定した。
【０１２６】
結果として、図12に示すように、IgEの血液中の濃度が、KBL697を経口投与された試験群において顕著に減少したことが分かり、これは、KBL697の投与後の抗アレルギー効果を示した。
【実施例６】
【０１２７】
腸間膜のタイトジャンクションの強化に対するKBL697の効果
大腸炎の患者の場合において、エンテロサイトのタイトジャンクションに関与するタンパク質の発現が減少し、より高い細胞透過性をもたらし、これが、より重度の炎症反応をもたらす(J. Landy、World J. Gastroenterol.、2016年)。これに関して、本発明は、KBL697が、代表的な腸上皮細胞モデルであるCaco-2細胞株においてタイトジャンクションを増強することができるか否かの確認を試みた。
【０１２８】
6-1.Caco-2細胞株のインキュベーション
Caco-2(ATCC番号HTB-37)細胞を、2日ごとに1回培地を交換しながら、10%のFBS、ペニシリン(100μg/mL)及びストレプトマイシン(100μg/mL)で補充されたMEM培地中、5%のCO2下、37℃でインキュベートし、次いで、4日ごとに1回継代した。
【０１２９】
6-2.タイトジャンクションの測定
200μLのCaco-2細胞を、3×105個細胞/mLの濃度で24Transwellプレート(Corning社、米国)の上層部分に播種し、次いで、7日間インキュベートした。翌日、FBSなしでMEMのみを有する培地に交換した後、細胞を終夜インキュベートし、チョップスティック型電極セットをそこに挿入して、EVOM上皮組織ボルトオームメーター(World Precision Instruments社、フロリダ、米国)を使用することによって、TEER(経上皮電気抵抗率)を測定した(0時間TEER)。次いで、株を、細胞の株に対する比が1:100になるように処置し、24時間インキュベートし、次いで、TEERを測定した(24時間TEER)。
【０１３０】
式:
TEER(Ω・cm2)=(抵抗(Ω)-バックグラウンド抵抗(Ω))×膜面積(cm2)
によって計算した後、以下の式:
TEER変化(%)=24時間TEER(Ω・cm2)/0時間TEER(Ω・cm2)×100
を適用した。
【０１３１】
結果として、図13に示すように、KBL697で処置されたCaco-2細胞株は、対照群と比較して、タイトジャンクションが20%増加したことを示し、KBL697が、大腸炎に起因するエンテロサイトの間の弱まった細胞間ジャンクションを回復させる効果を有することを示す。他方で、このような効果は、他のラクトバチルス・ガッセリー株であるKBL342及びKBL381において見られなかった。
【実施例７】
【０１３２】
大腸炎の処置及び予防に対するKBL697の効果
大腸炎に対するKBL697の治療効果を検証するために、大腸炎が誘導されたマウスモデルを使用した。マウスモデルを5頭のC57BL/6マウスの群に分け、次いで、3%のDSSが溶解された水道水を5日間与え、それによって大腸炎を誘導した。その後、陽性対照群のマウスに、1mg/kg/日に従って、200μLのPBS中のステロイド系薬物であるプレドニゾロンを経口投与し、試験群のマウスに、実施例5と同様の方法で調製し、次いで、それぞれ、5×109CFU/mL、5×108CFU/mL、及び5×107CFU/mLに希釈した、200μLのKBL697株を、毎日、経口投与により与えた。対照群のマウスに、200μLのPBSを、毎日、経口投与した。この実施例例において使用されたPBSは、システインが一部の細胞において抗炎症と関連するという報告に従って(Hasegawa, Sら、Clin Exp Immunol.、2012年、167巻、269〜27号)、株培養液の組成物に含まれ、洗浄後でさえそのままである少量のシステインの効果を除外するために、0.05%のシステインを添加して、調製した。DSSの消費が始まった日から21日目まで、対照群及び試験群のマウスの体重変化を毎日測定し、DSSが供給されてから21日後に、マウスを剖検に付して、結腸の長さを測定した。
【０１３３】
結果として、図14に示すように、1×109CFUのKBL697が投与された大腸炎誘導マウスにおいて、対照群のマウスと同様に、体重は、10日目まで急速に減少し、次いで、徐々に回復して、21日目には、正常レベルに戻ったことが分かった。特に、図15に示すように、1×109CFUのKBL697(KBL697×10^9)を経口投与されたマウスにおいて、結腸の長さがネイティブ群の90%のレベルに回復し、結腸の長さを短くする症状は、陰性対照群の80%未満と比較して、顕著に軽減されたことが分かった。結果として、KBL697が大腸炎疾患を改善する効果を示したことが分かった。
【実施例８】
【０１３４】
乾癬の処置及び予防に対するKBL697の効果
乾癬の軽減に対するKBL697の効果を検証するために、Balb/cマウスモデルを使用した。
【０１３５】
Balb/cマウスを5頭のマウスの群に分けた後、対照群のマウスに、200μLのPBSを、毎日、10日間経口投与し、一方、試験群のマウスに、200μLの少なくとも1×109CFU/0.2mLでPBS中に希釈された各試験株を、毎日、経口投与した。株及び対照群を、実施例7と同様の方法で調製した。細菌の投与の2週間後に、各マウスの背を耳の下側の端から背中の中央まで脱毛し、マウスを24時間放置した。次いで、62.5mgの5%イミキモドクリームを、脱毛された部分に1日1回適用して、乾癬を引き起こした。乾癬を誘導した後、陽性対照群のマウスに、200μLのデキサメタゾン(0.25mg/mL)を毎日投与した。同量のKBL697を、乾癬が誘導されている間でさえ、毎日投与した。乾癬が誘導された10日間、対照群及び処置群のマウスの乾癬の面積及び重症度指数(PASI)を、2日間隔で測定し、乾癬が誘導されてから10日目に、各マウスの皮膚の厚さを測定し、次いで、マウスを剖検に付して、皮膚組織及び血液中のサイトカインの濃度を決定した。
【０１３６】
8-1.PASI測定及び皮膚の厚さの変化
イミキモドで誘導された皮膚乾癬病変を評価するために、PASIスコアを以下の方法によって測定した。紅斑、鱗屑及び皮膚の厚さの3つの指標をチェックした。そして、病変がない状態を0ポイント、軽度の状態を1ポイント、中度の状態を2ポイント、重度の状態を3ポイント、非常に重度の状態を4ポイントとして、スコア化し、総スコアを評価した。
【０１３７】
結果として、図16(A)に示すように、PASIは、乾癬が誘導された対照群(NC)と比較して、デキサメタゾン(DXM)を投与された陽性対照群と同様に、KBL697を投与されたイミキモドで誘導された乾癬群において、顕著に低減された。加えて、キャリパーを使用してマウスの耳及び背面の皮膚の厚さを測定した結果、及び乾癬に起因する浮腫症状の緩和に対する効果の観察の結果として、図16(B)に示すように、耳及び背面の皮膚の厚さは、陽性対照群と同様に、KBL697を投与された試験群において、顕著に低減されたことが分かった。
【０１３８】
8-2.サイトカイン測定
乾癬の場合において、IFN-γ及びTNF-α等のTh1サイトカインの反応、並びにTh17応答、代表的にはIL-17は、症状の進行及び悪化において重要な役割を果たすことが知られている(Brembilla NC、Front Immunol.、2018年)。イミキモドによって誘導された乾癬を有するマウスを剖検に付して、皮膚組織及び血液中のサイトカインの濃度を決定した。サイトカインの濃度を、皮膚組織から得たタンパク質試料、並びにマウスTNF-α  ELISAセット(カタログ番号555138、BD OptEIA(商標))、マウスIFN-γ  ELISAセット(カタログ番号558534、BD OptEIA(商標))、マウスIgE ELISAセット(カタログ番号555248、BD OptEIA(商標))、及びマウスIL-17 DuoSet ELISA(カタログ番号DY421-05、R&D SYSTEMS社)キットをそれぞれ使用することによって、実施例5-4と同様の方法で血液から調製した血清試料を用いて決定した。
【０１３９】
図17において見ることができるように、乾癬誘導マウスにおいて増加した皮膚組織中のTNF-α及びIFN-γ等の炎症性サイトカインが、KBL697によって低減されたことを確認した。加えて、Th17に特異的なIL-17も、乾癬誘導皮膚組織及び血清中で増加したが、KBL697投与によって減少したことを確認した。結果として、KBL697の投与が、乾癬が発病した時に特異的に増加する炎症性サイトカインを低減することができ、低減効果による疾患の処置又は予防に対する効果を示すことを確認した。
【実施例９】
【０１４０】
大腸炎を処置するための抗体及びKBL697の併用投与の際の大腸炎の処置及び予防に対する効果
インフリキシマブ(製品名レミケード)は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、成人におけるクローン病、小児におけるクローン病、乾癬及び乾癬性関節炎等の自己免疫疾患のための注射剤として使用される治療用組換え抗体薬である。この研究の目的は、KBL697及びインフリキシマブの併用投与の場合において、インビボで腸疾患の症状を改善する効果を確認することであった。
【０１４１】
C57BL/6マウスを8頭のマウスの群に分けた後、マウスに2%のDSSが溶解された水道水を8日間与え(D0〜D7)、大腸炎を誘導した。同時に、200μLのPBSを、毎日、14日間、対照群のマウスに経口投与し(D0〜D13)、一方、200μLの1×1010CFU/mLでPBSに希釈されたKBL697株を、1日投与量が2×109CFUに設定されるように、KBL697投与群のマウスに経口投与した。治療用抗体投与群において、インフリキシマブ抗体を、マウスあたり5mg/kgの用量で3日ごとに1回投与し、200μLのPBSを、KBL697株が投与された期間の間、毎日経口投与した。併用投与についての試験群において、200μLの1×1010CFU/mLでPBSに希釈されたKBL697株を毎日投与し、3日目に、インフリキシマブ抗体をマウスあたり5mg/kgの用量で静脈内注射した。インフリキシマブ抗体投与なしの試験群に、同体積のPBSを静脈内注射した。大腸炎がDSSによって誘導された14日の間、対照群及び各試験群のマウスの体重変化を毎日測定し、DSSが供給されてから14日後に(D14)、マウスを剖検に付して、結腸の長さを測定した。
【０１４２】
結果として、図18(A)に示すように、結腸の長さの変化に関して、結腸の長さの減少幅は、対照群(DSS+PBS)のマウスと比較して、KBL697を単独で投与した群(DSS+KBL697)及びインフリキシマブを単独で投与した群(DSS+IFX)において、顕著に改善された。インフリキシマブ及びKBL697が併用投与された群(DSS+併用)において、インフリキシマブ又はKBL697が単独で投与された群と比較して、結腸の長さの顕著な改善があったことを確認した。
【０１４３】
体重の変化に関して、図18(B)に示すように、投与後14日が経過した時に、体重減少に対する効果は、処置なしの対照群のマウスと比較して、KBL697を単独で投与した群(DSS+KBL697)及びインフリキシマブを単独で投与した群(DSS+IFX)において、顕著に改善された。投与後3日が経過した時に、DSSが投与された全ての試験群と比較して、インフリキシマブ及びKBL697が併用投与された群(DSS+併用)において、高体重が維持されたことを確認し、大腸炎の誘導に起因する体重減少の症状を軽減する効果を検証した。したがって、過敏性腸症候群の処置のための前記株の使用に関して、株が市販の治療用抗体と組み合わせて投与された場合に、より強い治療効果が予測されるであろうことを確認した。
【０１４４】
本発明の特定の態様を上記に詳細に記載し、これらの特定の態様が、好ましい実施形態のみであって、本発明の範囲がそれらによって限定されないことは当業者には自明である。したがって、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲と特許請求の範囲の均等物によって実質的に定義される。
【受託番号】
【０１４５】
寄託機関の名称:韓国生命工学研究院
受託番号:KCTC13520BP
受託日:2018年4月27日
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明によるラクトバチルス・ガッセリーKBL697(受託番号KCTC13520BP)株は、細胞のアレルギー反応を弱め、アトピー性皮膚炎の症状を著しく改善し、抗炎症効果、免疫調節効果及び抗真菌効果、並びに過敏性腸症候群及び大腸炎等の腸疾患に対する治療効果を示す。したがって、単一株のみで、アレルギー性疾患及び炎症性疾患を軽減する目的、腸の健康を改善する目的、及び免疫調節の目的、それによってプロバイオティクス物質としての有利な適用を見出す目的の全てを達成することができる。加えて、その抗真菌活性に基づいて、真菌によって引き起こされる各種の皮膚疾患に対する皮膚外用製剤において、並びに敏感肌を軽減するための化粧用組成物及び機能性パッチにおいて、有利に利用することができる。
[寄託証]
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【配列表フリーテキスト】
【０１４７】
添付された配列表の電子ファイル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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