(57)【要約】  本発明は、ペプチド合成のための新たなビルディングブロックを提供し、これにより、ペプチド配列に続いて開裂可能なフラグメントを生成するために使用され得る開裂部位を導入する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造
【化１】
2021534107.tif 000015
［式中、２≦ｎ≦２４、ｍ＝２または３であり、
Ａは、酸に不安定な保護基であり、
Ｂは、タグまたは塩基に不安定な保護基である］を含む、ビルディングブロック。
【請求項２】
Ａが、Ｂｏｃであり、かつ／またはＢがＦｍｏｃである、請求項１に記載のビルディングブロック。
【請求項３】
構造
【化２】
2021534107.tif 000016
［式中、
２≦ｎ≦２４、ｍ＝２または３であり、
Ｘは、ペプチド、または固体支持体であり、
Ｙは、ペプチド、官能基、タグ、および官能基を含有するペプチドからなる群から選択される］を含む、化合物。
【請求項４】
Ｙが、溶解度増強タグまたは固定タグのいずれかである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｙが、ＰＥＧ、ポリ−リジン、ポリ−アルギニン、ポリ−グルタミン酸およびポリ−アスパラギン酸からなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｙが、ビオチン、ヒドラジン、アミノオキシ、アジド、アルキニル、アルケニル、アルデヒド、ピロロアラニン、カルボキシおよびチオールからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
方法であって、
ａ）  固体支持体上でペプチドを合成するステップであって、前記ペプチドが末端アミノ基を含むステップと、
ｂ）  請求項１または２記載のビルディングブロックを提供するステップと、
ｃ）  前記ビルディングブロックを前記ペプチドとカップリングするステップとを含む、方法。
【請求項８】
さらに、
ｄ）  保護基Ｂを除去するステップと、
ｅ）  少なくとも１つのアミノ酸ビルディングブロックを末端アミノ基とカップリングするステップとを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、
ｄ）  保護基Ｂを除去するステップと、
ｅ）  場合により少なくとも１つのアミノ酸ビルディングブロックを末端アミノ基とカップリングするステップと、
ｆ）  タグまたは官能基を末端アミノ基とカップリングするステップとを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記官能基またはタグが、ＰＥＧ、ポリ−リジン、ポリ−アルギニン、ポリ−グルタミン酸、ポリ−アスパラギン酸、ビオチン、ヒドラジン、アミノオキシ、アジド、アルキニル、アルケニル、アルデヒド、ピロロアラニン、カルボキシおよびチオールからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、
ｇ）  ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップとを含む、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
さらに、
ｄ）  生成されたペプチドをｐＨ≧８で開裂するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タグまたは官能基が、可溶化タグであり、さらに、
ｇ）  ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップと、
ｈ）  前記ペプチドを精製するステップと、
ｉ）  前記可溶化タグをｐＨ≧８で切断するステップとを含む、
請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記タグまたは官能基が、固定化タグであり、さらに、
ｇ）  ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップと、
ｈ）  固体支持体上の前記固定化タグを介して前記ペプチドを固定するステップと、
ｉ）  場合により前記ペプチドを追加の化学成分とコンジュゲートするステップと、
ｊ）  前記固定化タグをｐＨ≧８で切断するステップとを含む、
請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記化学成分が、核酸、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド、好ましくはヌクレオシド−六リン酸である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド合成の技術分野に関する。より正確には、本発明は、開裂可能なリンカーを化学的に合成されたペプチドに導入する新たな可能性を提供し、それにより、新たなペプチドコンジュゲートを作成する。
【背景技術】
【０００２】
開裂可能な結合を介して２つの官能基を接続する化学部分として定義される開裂可能なリンカーは、固相合成（ＳＰＳ）および化学生物学において重要なツールである。とりわけ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）において、これらのリンカーは、ペプチドの物理化学的特性、取り扱いおよび精製に関する問題の解決に役立つことができる：開裂可能なリンカーを介して、ペプチドを、機能性タグ（例えば、溶解度増強部分）で修飾することができ、リンカーの開裂後、リンカーの残基を伴ってまたは伴わずに、所望のペプチドが放出される。開裂可能なリンカーは、有機合成および固相合成において広く使用されている（例えば、Ｌｅｒｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２０，５７１−５８２；Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００６，２２５１−２２６８を参照）。開裂は、化学物質（求核試薬、塩基性試薬、求電子試薬、酸性試薬、還元試薬、酸化試薬、有機金属および金属触媒）によって、光化学的または酵素的手段によって実施されてもよい。ペプチド合成において、開裂可能なリンカーは、新生ペプチドを樹脂と連結するために主に使用され、これは、固相ペプチド合成の完了後に切断することができる（例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｅｒｃｋ；Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．），Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０４７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０１３を参照）。
【０００３】
ペプチド配列への内部組み込みのために、開裂可能なリンカービルディングブロックも記述されている。ペプチド合成のためのα，γ−ジアミノ−β−ヒドロキシブタン酸およびγ−アミノ−α，β−ジヒドロキシブタン酸ベースのリンカービルディングブロックは、Ａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１３，１４，１２３−１３１によって記述されている。これらのリンカーは、酸化的手段によって、すなわち、過ヨウ素酸ナトリウムを使用して、開裂することができる。システインまたはメチオニン残基のようなペプチド内の酸化感受性成分の酸化が不利点となり得る。
【０００４】
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｌｅｔｔ  ２０１３，２４，７３３−７３６によって記述されているペプチド合成のための光開裂可能なリンカービルディングブロックがもう１つの例である。光照射の不利点は、ラジカル反応から生じる不完全なリンカー開裂および副反応であり得る。［２−（アミノメチル）フェニル］酢酸をベースとするアルコールのための周期的に開裂可能なリンカーが、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１，３７９−３８２によって記述されている。このリンカーは、固体支持体を使用するアルコールの合成および放出にのみ適用されてきた。ペプチド合成における内部組み込みに使用され得る誘導体については、記述されていない。異なる化学および開裂条件を使用し、開裂可能な可溶化タグを適用するペプチド合成が記述されている（例えば、Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＳ  ２０１６，１３８，１１７７７−１１７８２；国際公開第２０１６０４７７９４号パンフレットを参照）。
【０００５】
異なる化学および開裂条件を使用し、開裂可能な精製タグを適用するペプチド合成が記述されている（例えば、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９９１，８８，６９８１−６９８５；Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３，６３８，２１−２７；Ｃａｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９７，３８，３３６１−３３６４；Ｖｉｚｚａｖｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００２，４３，８６９３−８６９６；Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１５，３６９−３７６；Ａｕｃａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１２，５１，１１３２０−１１３２４；Ｒｅｉｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１５，５４，３０６−３１０；Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６，１５，３７９−３８２；Ｐａｔｅｎｔｓ：Ａｕｃａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１１０５８１８８号パンフレット、Ｚｉｔｔｅｒｂａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１７１２９８１８  Ａ１号パンフレットを参照）。このアプローチにおいて、リンカーは、通常、ＳＰＰＳの最後のサイクルで成長中のペプチド鎖のＮ末端に結合され、所望の全長ペプチドの固体支持体上への選択的固定を可能にする。副生成物は、固体支持体を洗浄することによって除去され、最終的には、標的ペプチドはリンカーの開裂によって放出される。ペプチドの非クロマトグラフ的精製に使用される開裂可能なリンカーは、通常、強塩基性条件を必要とする。これらの条件下では、望ましくない副反応、例えばラセミ化が起こるかもしれない。頻繁に使用されるスルホネート排除リンカーの主な問題は、高度に反応性の求電子試薬であり、これは、開裂反応中に生成される。これらの中間体は、求核性側鎖基（例えば、アルギニン、システイン）と迅速に反応し、その結果として、スルホネートベースの開裂可能なリンカーの適用を限定する。Ｖｉｚｚａｖｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００２，４３，８６９３−８６９６）による酸化的に開裂可能な精製リンカーの非常に希少な例は、前述の問題を回避しているが、メチオニンまたはシステイン含有ペプチドと適合しない可能性が最も高い。
【０００６】
イソアシルジペプチドは、Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳにおいて合成効率を増強するためのツールである（Ｙ．Ｓｏｈｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４，１２４−１２５）。イソアシルジペプチドは、β−ヒドロキシル基がＦｍｏｃ保護アミノ酸によってアシル化されている、Ｂｏｃ保護セリンまたはトレオニン誘導体からなる。ペプチドの配列内へのイソアシルジペプチドビルディングブロックの組み込み後、ペプチドの二次構造が変化し、より効率的な合成が可能になる。さらに、開裂および脱保護後、ペプチドのイソアシル形態をＨＰＬＣによって精製することができる。ｐＨ７．４において、Ｏ→Ｎ分子内アシル移動が行われて、規則的にアミド連結されたペプチドを生成する。これらのイソアシルジペプチドビルディングブロックを適用すると、開裂反応を実施することができない。
【０００７】
ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、治療および診断用途のための新興クラスである。しかしながら、これらのコンジュゲートの合成は、依然として大きな課題のままである（例えば、Ｎ．Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００６，１０６，３７１２−３７６１およびＫ．Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０，２１，１８７−２０２の総説を参照）。率直なアプローチは、固相ベースの合成を活用して、ポリマー支持体上に所望のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを構築することであろう。残念なことに、固相オリゴヌクレオチドおよびペプチド合成の確立された方法は、完全に適合するわけではない。ペプチドの固相合成は、強酸の使用を必要とし、それにより、酸性条件下でのオリゴヌクレオチドの不安定性によるペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成を防止する。これは、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの段階的合成が、通常最初にペプチドを構築すること、続いて、同じ固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成によって進むからである。この戦略は、非常に単純なペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成に首尾よく適用されてきたにもかかわらず、方法は、アミノ酸側鎖の困難な化学に対処するための適合性の保護基の全領域を依然として欠いている。最終的に、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの段階的固相ベースの合成のための信頼性が高くかつ一般的な適用可能な方法は、利用不可能である。したがって、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成は、通常、収束戦略を用いることによって進む。ここで、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドフラグメントは、通常用いられるビルディングブロックおよび固相合成のプロトコールを使用することによって、別個に合成される。精製後、２つのフラグメントをコンジュゲートし、追加の精製ステップ後に、所望のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを単離する。低い全収率、時間消費の増大および高いコストがこの戦略の主な不利点であり、これらは、前述の多数の精製ステップおよび中間体凍結乾燥手順によって生じる。その上、ＨＰＬＣベースの精製ステップおよび中間体凍結乾燥は、自動化を活用してペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのハイスループット合成を達成する可能性を妨げる。これらの欠点は、例えば、公知のアンチセンスオリゴヌクレオチド上の好適なトランスフェクションペプチドをスクリーニングするために必要とされる、多数のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成する必要がある場合には特に厄介になる。完全な方法は、あらゆるＨＰＬＣベースの精製の必要性を無視しながら、確立された固相合成および合成後コンジュゲーションの容易さを組み合わせるものであろう。
【０００８】
しかしながら、ペプチド合成に開裂可能なリンカーを適用するための上記で開示した方法はすべて、非効率的な組み込みもしくは開裂、過酷な、損傷を与える開裂条件、複雑な試薬合成または使用制限のような、いくつかの不利点を有する。
【発明の概要】
【０００９】
したがって、本発明は、構造
【化１】
2021534107.tif 000002
［式中、２≦ｎ≦２４、ｍ＝２または３であり、ＡおよびＢは、保護基である］を含むビルディングブロック（building block：構成要素）を提供する。通常、ＡおよびＢは、異なる条件下で開裂される直交保護基である。一実施形態では、Ａは、酸に不安定な保護基であり、
Ｂは、タグまたは塩基に不安定な保護基である。１つの特定の実施形態では、Ａは、Ｂｏｃであり、かつ／またはＢは、Ｆｍｏｃである。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、構造
【化２】
2021534107.tif 000003
［式中、２≦ｎ≦２４、ｍ＝２または３であり、Ｘは、ペプチドまたは固体支持体であり、Ｙは、ペプチド、官能基、タグ、および官能基またはタグを含有するペプチドからなる群から選択される］を含む化合物を提供する。
【００１１】
一実施形態では、Ｙは、溶解度増強タグ、固定タグまたは固相のいずれかである。例えば、Ｙは、ＰＥＧ、ポリ−リジン、ポリ−アルギニン、ポリ−グルタミン酸およびポリ−アスパラギン酸からなる群から選択されてよい。Ｙは、ビオチン、ヒドラジン、アミノオキシ、アジド、アルキニル、アルケニル、アルデヒド、ケトン、ピロロアラニン、カルボキシおよびチオールからなる群から選択されてもよい。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、
固体支持体上でペプチドを合成するステップであって、前記ペプチドが末端アミノ基を含むステップと、
上記で開示した通りのビルディングブロックを提供するステップと、
前記ビルディングブロックを前記ペプチドとカップリングするステップとを含む、方法を提供する。
【００１３】
前記方法は、
保護基Ｂを除去するステップと、
少なくとも１つのアミノ酸ビルディングブロックを末端アミノ基とカップリングするステップとをさらに含んでよい。
【００１４】
代替として、前記方法は、
保護基Ｂを除去するステップと、
場合により少なくとも１つのアミノ酸ビルディングブロックを末端アミノ基とカップリングするステップと、
タグまたは官能基を末端アミノ基とカップリングするステップとをさらに含んでよい。
【００１５】
前記官能基またはタグは、ＰＥＧ、ポリ−リジン、ポリ−アルギニン、ポリ−グルタミン酸、ポリ−アスパラギン酸、ビオチン、ヒドラジン、アミノオキシ、アジド、アルキニル、アルケニル、アルデヒド、ピロロアラニン、カルボキシおよびチオールからなる群から選択されてよい。
【００１６】
加えて、上記で開示した方法は、
ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、ｐＨ≧８で起こり得る、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップとをさらに含んでよい。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、
ａ）  固体支持体上でペプチドを合成するステップであって、前記ペプチドが末端アミノ基を含むステップと、
ｂ）  上記で開示した通りのビルディングブロックを提供するステップと、
ｃ）  前記ビルディングブロックを前記ペプチドとカップリングするステップとを含む、方法を提供する。
ｄ）  保護基Ｂを除去するステップと、
ｅ）  場合により少なくとも１つのアミノ酸ビルディングブロックを末端アミノ基とカップリングするステップと、
ｆ）  可溶化または固定化タグを末端アミノ基とカップリングするステップとを含み、
さらに、
ｇ）  ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップと、
ｈ）  前記ペプチドを精製するステップと、
ｉ）  前記可溶化タグをｐＨ≧８で切断するステップ、または、
ｊ）  ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップと、
ｋ）  固体支持体上の前記固定化タグを介して前記ペプチドを固定するステップと、
ｌ）  場合により前記ペプチドを追加の化学実体とコンジュゲートするステップと、
ｍ）  前記可溶化タグをｐＨ≧８で切断するステップとを含む、方法を提供する。
【００１８】
前記化学実体は、炭水化物、タンパク質、ペプチド、染料、ハプテン等であってよい。特に、前記化学実体は、核酸、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド含有化合物、好ましくはヌクレオシド−六リン酸であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】実施例３に従うリンカー１の導入を含むペプチド合成  ペプチド合成
【図１Ｂ】０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ＝８．２）中の溶媒和、環化をトリガーする
【図１Ｃ】ＬＣ−ＭＳは、ペプチドＡＢの、ＡおよびＢへの開裂を経時的に示す
【図２Ａ】実施例４に従う疎水性ペプチドの合成  不溶性ペプチド１２からのポリ−リジンタグの開裂。
【図２Ｂ】Ｈ−ＫＫＫＫＫ１ＡｈａＧＩＳＦＳＩＲＦＡＩＷＩＲＦＧ−ＮＨ２（１０）のＬＣ−ＭＳ
【図２Ｃ】不溶性ペプチド１２のＭＳ（ＥＳＩ）
【図３Ａ】実施例５に従う親和性精製  ＳＰＰＳおよび樹脂からの開裂後の粗ペプチド混合物
【図３Ｂ】３０分後の上清
【図３Ｃ】０．０２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ＝８．８）とともに３０分間にわたってインキュベーション後の上清
【図４】スキーム：実施例７に従うヌクレオシド−ペプチドコンジュゲートの迅速合成ａ）  固体支持コンジュゲーションおよび非クロマトグラフ的精製によるペプチドおよびヌクレオシド−ペプチドコンジュゲートの合成
【図５Ａ】実施例７において得られたコンジュゲートのＨＰＬＣ分析
【図５Ｂ】実施例７において得られたコンジュゲートのＨＰＬＣ分析
【図５Ｃ】実施例７において得られたコンジュゲートのＨＰＬＣ分析
【図５Ｄ】実施例７において得られたコンジュゲートのＨＰＬＣ分析
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義および略語のリスト：
Ｆｍｏｃ：フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成
ＳＰＳ：固相合成
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＡＢ：ジアミノ酪酸
ＥＤＣ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド
ＤＭＡＰＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン
ＨＡＴＵ：１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＴＨＰＴＡ：トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン
Ｐｒａ：プロパルギルグリシン
Ａｈａ：アジドホモアラニン
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
【００２１】
定義：
タグ：本発明の文脈では、タグは、分子の化学的もしくは物理的特性を改変し、かつ／または分子を認識可能にする、化学部分である。例えば、精製タグは、分子の精製を容易にし得る。タグは、固定タグ、すなわち、固体支持体に結合し得る化学部分であってよい。タグは、存在する場合、ある特定の分子の溶解度を増大させる化学基を意味する、溶解度増強タグであってもよい。
【００２２】
官能基：官能基は、それらの分子の特徴的な化学反応を司る、分子内の原子または結合の特異的な化学基（部分）である。官能基は、それらの分子の特徴的な化学反応を司る、分子内の特異的な置換基または部分である。同じ官能基は、それがその一部である分子のサイズにかかわらず、同じまたは同様の化学反応を受けることになる。これは、化学反応および化学化合物の挙動の体系的予測ならびに化学合成の設計を可能にする。さらに、官能基の反応性は、近隣の他の官能基によって修飾することができる。有機合成において、官能基相互変換は、転換の基本型の１つである。官能基は、それらが何に結合していようとも、独特の化学的特性の１個または複数の原子の基である。官能基の原子は、共有結合によって、互いにおよび分子の残りと連結している。ポリマーの繰り返し単位について、官能基は、それらの炭素原子の非極性コアに結合しており、故に、炭素鎖に化学的特徴を付加する。官能基は、荷電されることもできる。
【００２３】
保護基：用語「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）」またはその同義語「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）」は、化学反応が、合成化学において慣用的に関連する意味において、別の保護されていない反応部位で選択的に行われ得るように、多官能性化合物中の反応部位を選択的にブロックする基を意味する。保護基は、適切なポイントで削除することができる。保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基、またはヒドロキシ保護基である。保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）または保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）またはブロッキング基は、官能基の化学修飾によって分子に導入されて、その後の化学反応において化学選択性を得る。保護基は、官能基の反応性をブロックするまたは少なくとも低減させるために導入される。脱保護は、保護基の除去の化学的ステップである。ペプチド合成の分野における関連する保護基は、塩基に不安定な保護基および酸に不安定な保護基である。塩基に不安定な保護基は、７．５から１２の間のｐＨであるが、好ましくは８．０から１０の間のｐＨで切断される。酸に不安定な保護基は、６．５から３の間のｐＨであるが、好ましくは６．０から５の間のｐＨで切断される。本発明では、アミノ保護基が特に重要である。アミノ保護基は、アミノ基を保護するように意図されている基であり、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（カルボベンジルオキシ、ＣＢＺ）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）およびトリフルオロアセチルを含む。これらの基の例は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９１，ｃｈａｐｔｅｒ  ５；Ｅ．Ｈａｓｌａｍ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｊ．Ｇ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９７３，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，およびＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８１，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５において見られる。
【００２４】
ペプチド：ペプチドは、２から１２０残基の長さを持つアミド結合を介して連結しているアミノ酸ビルディングブロックの鎖である。
【００２５】
ペプチド合成のための新規開裂可能なリンカーが開発された。開裂は、弱塩基性条件下で起こる。リンカーは、４−アミノブタノエートコアをベースとし、これがｐＨ≧８で分子内ラクタム化を受けて、２つのフラグメント、Ｎ末端アルコールおよびＣ末端ラクタムを放出することにより、エステル結合を開裂する（スキーム１ａ）。Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎγ−Ｂｏｃ保護ビルディングブロック（スキーム１ｂ）として、このアミノブタノエート開裂可能なリンカーを、固相ペプチド合成において用いることができる。アミノブタノエートリンカー１は、従来のペプチド合成中、および驚いたことに、連続アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護中に安定であることが判明し、６員ジケトピペラジンおよび対応する崩壊ペプチドへの環化は観察されなかった。
スキーム１
【化３】
2021534107.tif 000004
【００２６】
ａ）  リンカーの周期的開裂（ｎ＞１）。
ｂ）  保護された開裂可能なリンカーの一般式（ｎ＞１）。
【００２７】
固相ペプチド合成中、Ｎγ−Ｂｏｃ保護アミノ基は非反応性であり、アミノブタノエートリンカーはインタクトなままである。固体支持体からのペプチドの開裂および酸性条件下での保護基の脱保護は、アミノブタノエートリンカーのＮγ−Ｂｏｃ保護基の除去につながる。アミノ基は、酸性開裂および脱保護条件下でプロトン化されることから、ラクタム化反応は完全に抑制され、アミノブタノエートリンカーはインタクトなままである。したがって、インタクトなアミノブタノエートリンカーを含有するペプチドは、酸性条件（すなわち、水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸溶離液）下で精製されることもできる。弱塩基性条件下、アミノブタノエートリンカーの開裂は、分子内環化反応を活用して進み、２つのペプチドを、一方はＮ−アルコールとして、および他方はＣ末端ラクタムとして放出する。アミノブタノエートリンカー（ｎ＞１）を用いる固相ペプチド合成および２つのペプチドフラグメントの放出を伴う最終開裂を示すスキーム２において、一般概念を示す。
スキーム２
【化４】
2021534107.tif 000005
【００２８】
ｎ＝１を持つ開裂可能なリンカーは、固相ペプチド合成中に副反応（すなわち、エステル開裂）を起こしたことから適していないことが分かっている。しかしながら、ｎ＝２およびｎ＝３を持つ開裂可能なリンカーは、固相ペプチド合成に適合し、所望のリンカー含有ペプチドを産出し、これは、弱アルカリ性条件下で開裂することができた。したがって、上記で言及したビルディングブロックを使用して、様々な官能基をペプチドのＮ末端に付加することができ、これは、後のプロセスステップで除去することができる。
【００２９】
開裂可能な官能基を付加する１つの用途は、そのような疎水性ペプチドの精製（すなわちＨＰＬＣによる）を可能にするために、疎水性ペプチドのＮ末端に親水性タグを導入することである。精製後、精製された疎水性標的ペプチドを放出するために、可溶化タグを弱塩基性条件下で切断することができる。
【００３０】
方法は、オリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートの改善された合成に適用することもできる。これは、ペプチドが多くの疎水性残基を含有する場合、特に興味深い。例えば、アジドホモアラニン等、オリゴヌクレオチドの結合のためのコンジュゲーション部位を含有する疎水性ペプチドが最初に合成され得る。次いで、開裂可能なアミノブタノエートリンカーがカップリングされ、続いて、可溶化タグ配列が導入される。開裂および脱保護後、ペプチドをＨＰＬＣによって精製し、最後に、コンジュゲーション部位で官能基化されたオリゴヌクレオチドとコンジュゲートすることができる。前記コンジュゲーション部位は、例えば、アルキン基であってよい。その後、コンジュゲートを精製することができ、可溶化タグを弱アルカリ性条件下で切断することができる。
【００３１】
別の用途は、ペプチドのＮ末端に導入され得る精製タグの導入である。ビオチンは、そのような精製タグの顕著な例である。最初に、各カップリング後にキャッピングステップを含むＳＰＰＳを介して、ペプチドを合成する。その後、開裂可能なリンカーをペプチドのＮ末端とカップリングし、最後にビオチンを開裂可能なリンカーとカップリングする。酸性条件下での開裂および脱保護後、ビオチン標識されたペプチドを、好ましくは磁性ビーズであるストレプトアビジンコーティングされたビーズと結合させることができる。ＳＰＰＳの非ビオチン化副産物（すなわち、失敗配列、欠失）は、洗浄によって除去することができる。その後、弱アルカリ処理下でリンカーを開裂することによって、精製されたペプチドをストレプトアビジンビーズから放出することができる。
【００３２】
ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの収束合成のための現代的方法は、複数の精製ステップを必要とする。したがって、多数のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのスクリーニングは、時間とコストのかかる努力である。本発明の方法は、ペプチド−（オリゴ）ヌクレオチドコンジュゲートの迅速合成を可能にする。本発明の開裂可能なリンカービルディングブロックを使用する本発明の方法は、化学選択的反応性単位および開裂可能な精製タグの組合せにより冗長なＨＰＬＣ−精製ステップの必要性を回避し、関心対象の分子の穏やかな開裂を可能にする。この非クロマトグラフ的精製アプローチは、多数のコンジュゲートの並列合成を良好な収率および純度で可能にする。
【００３３】
実施例内で示す通り、本発明の開裂可能なリンカーは、合成し易く、わずかにアルカリ性の非破壊的な条件下で、ペプチドへの効率的な組み込みおよび穏やかな開裂を可能にする。
【実施例】
【００３４】
実施例１：リンカー１（ｍ＝２、ｎ＝３）の合成
スキーム３
【化５】
2021534107.tif 000006
【００３５】
化合物２の合成：  ４‐ヒドロキシ酪酸アリル
【化６】
2021534107.tif 000007
【００３６】
ＤＭＦ（１７ｍｌ）中のγ−ブチロラクトン（５．００ｇ、５８．１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２Ｏ（１３．６ｇ、１３．６ｍｌ、７５５ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（８．８５ｇ、８．６７ｍｌ、５８．１ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１時間撹拌した後、臭化アリル（１０．５ｇ、７．５３ｍｌ、８７．２ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。１時間後、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３０ｍｌ）の添加によって反応物をクエンチし、水性相を酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。ＳｉＯ２上でのカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１）により、所望生成物（５．９０ｇ、４０．９ｍｍｏｌ、７１％）を無色油として生じさせた。
Ｒｆ（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１）＝０．３３（ＫＭｎＯ４）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝６．０６−５．８６（ｍ，１Ｈ），５．４２−５．０４（ｍ，２Ｈ），４．５９（ｔｄ，Ｊ＝１．４，５．７  Ｈｚ，１Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝７．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．２５−４．０６（ｍ，１Ｈ），３．７３−３．６７（ｍ，１Ｈ），２．５５−２．４１（ｍ，２Ｈ），２．３４−２．１６（ｍ，１Ｈ），１．９９−１．８３（ｍ，１Ｈ），１．６２（ｓ，１Ｈ）．
【００３７】
化合物３の合成：
４−（アリルオキシ）−４−オキソブチル２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブタノエート
【化７】
2021534107.tif 000008
【００３８】
市販のＦｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１．００ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）および化合物２（３６０ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（７．５  ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。ＥＤＣ−ＨＣｌ（４７９ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２８ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。室温で１時間撹拌した後、飽和ＮａＣｌ水溶液（２５ｍｌ）を反応混合物に添加し、次いでこれを、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して、所望生成物（１．２７ｇ、２．２４ｍｍｏｌ、９９％）を無色の樹脂として生じさせた。
Ｒｆ（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１）＝０．６３
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８０−７．７２（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．５６（ｍ，２Ｈ），７．４４−７．３６（ｍ，２Ｈ），７．３５−７．２８（ｍ，２Ｈ），５．９５−５．８４（ｍ，１Ｈ），５．６８−５．５７（ｍ，１Ｈ），５．３４−５．２０（ｍ，２Ｈ），５．１０−４．９８（ｍ，１Ｈ），４．６１−４．５５（ｍ，２Ｈ），４．４６−４．３２（ｍ，３Ｈ），４．２６−４．１５（ｍ，３Ｈ），３．４７−３．３０（ｍ，１Ｈ），３．０２−２．９３（ｍ，Ｊ＝５．３，５．３，８．３，１４．０  Ｈｚ，１Ｈ），２．４６−２．３７（ｍ，２Ｈ），２．１２−１．９４（ｍ，３Ｈ），１．８２−１．７２（ｍ，１Ｈ），１．５１−１．３５（ｍ，９Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値５６７．３［Ｍ＋Ｈ］＋，４６７．３［Ｍ＋Ｈ−Ｂｏｃ］＋，計算値５６７．３［Ｍ＋Ｈ］＋  
リンカー１：の合成
４−（（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブタノイル）オキシ）ブタン酸
【化８】
2021534107.tif 000009
【００３９】
ＣＨ２Ｃｌ２／酢酸エチル２：１（７５ｍｌ）中の４−（アリルオキシ）−４−オキソブチル２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブタノエート３（４．５ｇ、８７．９４ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２７５ｍｇ、０．２３８ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１０４ｍｇ、０．３９５ｍｍｏｌ）および２−エチルヘキサン酸ナトリウム（１．９７ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を、室温で３時間撹拌した。次いで、１Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍｌ）を添加した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３×１５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。ＳｉＯ２上でのカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル＋１％メタノール）により、所望生成物１を無色固体として生じさせた。
Ｒｆ（酢酸エチル）＝０．３８
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７９−７．７３（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４４−７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３５−７．２８（ｍ，２Ｈ），５．７０−５．５４（ｍ，１Ｈ），５．１８−５．０２（ｍ，１Ｈ），４．４７−４．３３（ｍ，３Ｈ），４．２８−４．１６（ｍ，３Ｈ），３．４３−３．３２（ｍ，１Ｈ），３．０４−２．９４（ｍ，１Ｈ），２．５５−２．２５（ｍ，３Ｈ），２．１５−１．９８（ｍ，３Ｈ），１．４８−１．３８（ｍ，９Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値５２７．３［Ｍ＋Ｈ］＋，４２７．２［Ｍ＋Ｈ−Ｂｏｃ］＋，計算値５２７．２［Ｍ＋Ｈ］＋
【００４０】
実施例２：リンカー４（ｍ＝２、ｎ＝２）の合成
スキーム
【化９】
2021534107.tif 000010
【００４１】
化合物５の合成：
３−（ベンジルオキシ）−３−オキソプロピル２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブタノエート
【化１０】
2021534107.tif 000011
【００４２】
市販のＦｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２．５ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）および３−ヒドロキシプロパン酸ベンジル（１．１２ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。この溶液に、ＥＤＣ−ＨＣｌ（１．２０ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７０．０ｍｇ、０．５６８ｍｍｏｌ）を添加した。１時間後、飽和ＮａＣｌ水溶液（２５ｍｌ）を添加し、有機相を分離し、水性相をＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。ＳｉＯ２上でのカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ６：４）により、所望生成物（２．８４ｇ、４．７１ｍｍｏｌ、８３％）を無色樹脂として生じさせた。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．７８−７．７４（ｍ，２Ｈ），７．６５−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．３５（ｓ，９Ｈ），５．７７−５．６６（ｍ，１Ｈ），５．１７−５．１４（ｍ，２Ｈ），５．１３−５．０４（ｍ，１Ｈ），４．５４−４．４６（ｍ，１Ｈ），４．４５−４．３０（ｍ，４Ｈ），４．２６−４．２０（ｍ，１Ｈ），３．９１−３．８７（ｍ，１Ｈ），３．４６−３．３３（ｍ，１Ｈ），２．９７−２．８８（ｍ，１Ｈ），２．７７−２．７０（ｍ，２Ｈ），２．０５−２．０３（ｍ，１Ｈ），２．０１−１．９２（ｍ，１Ｈ），１．７９−１．７０（ｍ，１Ｈ），１．４７−１．４２（ｍ，９Ｈ）．
【００４３】
化合物４の合成：
３−（（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブタノイル）オキシ）プロパン酸
【化１１】
2021534107.tif 000012
【００４４】
化合物４（２．８ｇ、４．６５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５０ｍｌ）に溶解した。パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ１０％、７４２ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、Ｈ２を反応混合物に通して発泡させた。１時間後、反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、シリカプラグでフィルタにかけた。溶媒を減圧下で除去して、所望生成物（０．６ｇ、１．１７ｍｍｏｌ、２５％）を無色固体として生じさせた。
ＭＳ（ＥＳＩ）：５１３．０［Ｍ＋Ｈ］，計算値５１３．２［Ｍ＋Ｈ］＋．
【００４５】
実施例３：リンカー１を適用するペプチド合成：
配列Ｈ−ＫＡＴＳＧ−（リンカー１）−ＧＬＦ−ＮＨ２（７）（配列番号１）を持つペプチドを、固相ペプチド合成によって合成し、分取ＨＰＬＣによって精製した。リンカー１は、ペプチド合成中、および驚いたことに、連続アミノ酸（５位のＧｌｙ）のピペリジンによるＦｍｏｃ脱保護中も、安定であった。６員ジケトピペラジンおよび対応する崩壊ペプチドへの環化は観察されなかった（図１ａ）。次いで、精製されたペプチド（図１ｂ中のＡＢ）を０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液（ｐＨ＝８．２）に溶解し、これにより、分子内環化反応をトリガーして、２つのフラグメント８および９（ＡおよびＢ、図１ｂ）を放出し、ＬＣ−ＭＳによって同定した（図１ｃ）。
【００４６】
実施例４：疎水性ペプチドの合成：
Ｈ−ＡｈａＧＩＳＦＳＩＲＦＡＩＷＩＲＦＧ−ＮＨ２（Ａｈａ＝アジドホモアラニン）（配列番号２）は、極めて疎水性のペプチドであり、これは、水に不溶性であり、合成後の取り扱いおよびＨＰＬＣ精製を事実上不可能にする。このペプチドの溶解度を増強するために、ペプチド配列および開裂可能なリンカー１組み込みの後に開裂可能なＮ末端ポリ−リジンタグが合成された、バリアントを調製した：Ｈ−ＫＫＫＫＫ−（リンカー１）ＡｈａＧＩＳＦＳＩＲＦＡＩＷＩＲＦＧ−ＮＨ２（１０）（配列番号３）。この修飾ペプチドの合成および精製は、実施例３に従って順調に進んだ（図２ｂ）。純粋なペプチド１０を０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３水溶液に溶解し、室温で２時間振とうした。（図２ａ）。開裂反応は、２つのペプチド１１および１２を放出した：ポリ−リジンタグ１１は水溶性であるが、ペプチド１２は反応条件下で沈殿し、遠心分離によって高純度で簡単に単離され得る。
図２ｂ）：Ｈ−ＫＫＫＫＫ（リンカー１）−ＡｈａＧＩＳＦＳＩＲＦＡＩＷＩＲＦＧ−ＮＨ２（１０）のＬＣ−ＭＳ、ＭＳ（ＥＳＩ）：５４５．４［Ｍ＋５Ｈ］５＋，６８１．６［Ｍ＋４Ｈ］４＋，９０８．３［Ｍ＋３Ｈ］３＋，１３６２．０［Ｍ＋２Ｈ］２＋．
図２ｃ）：不溶性ペプチド１２のＭＳ（ＥＳＩ）（ＭＳ（ＥＳＩ）：６６１．５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，９９１．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋，１３２２．０［３Ｍ＋２Ｈ］２＋，１９８３．１［Ｍ＋Ｈ］＋）．
【００４７】
実施例５：ビオチン／ストレプトアビジン相互作用を介する親和性精製
各カップリングステップ後にキャッピングを適用するペプチド合成方法と組み合わせたＮ末端親和性標識の導入は、全長生成物の親和性精製を可能にする。全長ペプチドがストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズ上で捕捉され、副産物（より短い配列）がフィルタにかけることによって除去され、純粋な全長ペプチドが放出される。
【００４８】
標的ペプチドのＳＰＰＳ後、最初にリンカー１、次いでＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ビオチニル−ＰＥＧ）−ＯＨを、ペプチドのＮ末端とカップリングした。これは、Ｈ−ＧｌｕビオチニルＰＥＧ−１−ＩＩＫＫＳＴＡＬＬ−ＮＨ２（１３）（配列番号４）をもたらした。ペプチド配列は、いくつかの立体的にかさ高いアミノ酸を含有するため、樹脂からの開裂後に、全長ペプチドおよびアセチル化されたより短いフラグメントの複雑な混合物が得られた。粗生成物をｐＨ＝６．２のリン酸緩衝液に溶解し、ストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズとともに３０分間インキュベートした。上清をＬＣ−ＭＳによって分析すると、混合物からのビオチン化ペプチドの完全な除去を指し示した。副産物含有緩衝溶液を除去し、ビーズをリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２）で数回洗浄した。その後、揮発性開裂緩衝液（ＮＨ４ＨＣＯ３、０．０２Ｍ、ｐＨ＝８．８）をビーズに添加し、３０分間のインキュベーション後、所望のペプチド１４がビーズから放出された。
スキーム５
【化１２】
2021534107.tif 000013
【００４９】
結果を図３に示す。図３ａは、ＳＰＰＳおよび樹脂からの開裂後に得られた粗ペプチド混合物を示す。図３ｂは、ｐＨ＝６．２のリン酸緩衝液中のストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズ上での粗ペプチド混合物の３０分間のインキュベーション後の上清を示す。Ｎ末端でビオチンタグ含有ペプチド１３は、ストレプトアビジンによって完全に捕捉される。ｃ）アセチル化されたペプチド副産物を洗い流し、磁性ストレプトアビジンビーズをｐＨ８．８のＮＨ４ＨＣＯ３とともに３０分間インキュベートした後、所望のペプチドＨＯ（ＣＨ２）３ＣＯ−ＩＩＫＫＳＴＡＬＬ−ＮＨ２（１４）（配列番号４）を放出する
【００５０】
実施例６：ペプチド上で開裂可能な可溶化タグを用いるＤＮＡ−ペプチドコンジュゲートの合成
スキーム６
【化１３】
2021534107.tif 000014
【００５１】
配列Ｈ−ＰＥＧ１０（リンカー１）Ａｈａ  ＡＦＤＹＬＡＱＹＨＧＧ−ＮＨ２（１５）（配列番号５）を持つペプチドを、ＳＰＰＳ（Ａｈａ＝アジドホモアラニン）によって合成した。ヘキシニル修飾核酸とのコンジュゲーションを、クリックケミストリーによって実施した。アジド修飾ペプチド１５の溶液（ＤＭＳＯ／ｔＢｕＯＨ  ３：１中４ｍＭ、５０μｌ）を、標準的な固相ホスホルアミダイトアプローチに従って合成した５’−ヘキシニル−ｄＴ２０−３’の溶液（Ｈ２Ｏ中０．５５ｍＭ、１８０μｌ）と混合した。ＣｕＢｒ（ＤＭＳＯ／ｔＢｕＯＨ  ３：１中１００ｍＭ、１０μｌ）およびＴＨＰＴＡ（Ｈ２Ｏ中１００ｍＭ、２０μｌ）を別個に混合し、あらかじめ形成された複合体をオリゴヌクレオチド−ペプチド溶液に添加した。３７℃で１時間振とうした後、クリック反応は完了した。可溶化ＰＥＧリンカーの開裂は、ＮａＨＣＯ３（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍ、３ｍｌ）を添加して得られた。この溶液の透析（ＭＷＣＯ１０００透析膜）により、所望生成物１６が生じた。
５’−ヘキサ−Ｔ２０−３’：ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値１５４４．３［Ｍ−４Ｈ］４−，計算値１５４４．５［Ｍ−４Ｈ］４−．
ペプチドＸ−５’−ヘキサ−Ｔ２０−３’：ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値１６４７．７［Ｍ−５Ｈ］５−，計算値１６４８．０［Ｍ−５Ｈ］５−．
生成物１６：ペプチドＸ−５’−ヘキサ−Ｔ２０−３’（脱ペグ化）：ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値１５２５．６［Ｍ−５Ｈ］−５，計算値１５２５．９［Ｍ−５Ｈ］−５．
【００５２】
実施例７：開裂可能な固定リンカーを使用する、固体支持コンジュゲーションおよび非クロマトグラフ的精製によるペプチドおよびヌクレオシド−ペプチドコンジュゲートの迅速合成
この実施例で開示される反応スキームは、図４に例証され、２つの代替経路ＡおよびＢを含む。
【００５３】
ペプチドＷＷＷＷＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＥＥＥＥ（配列番号６）は、自動Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳを使用してリンクアミド樹脂上で合成した。次に、Ｆｍｏｃ−Ｐｒａ−ＯＨ（Ｎ−アルファ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｌ−プロパルギルグリシン）、Ｆｍｏｃ保護開裂可能なリンカー１、Ｆｍｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−ＯＨ（８−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−アミノ）−３，６−ジオキサオクタン酸）およびＴｒｉ−Ｂｏｃ−ヒドラジン酢酸を、ＳＰＰＳを活用して樹脂結合ペプチドと段階的にカップリングして、所望のペプチド１７を産出した。
【００５４】
ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９５／２．５／２．５）の混合物を用いて、ペプチドを樹脂から開裂した。２時間後、溶液を濃縮し、冷エーテルの溶液に添加した。沈殿したペプチドを上清から分離し、Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ（１／１）の混合物に溶解し、フリーズドライした。粗材料を、０．２５Ｍ  ＮａＯＡｃ水溶液／ＡｃＯＨ緩衝液（ｐＨ４．２）およびアセトニトリル（２０体積％）の混合物に溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、溶液をアルデヒドアガロース樹脂上に移した。懸濁液を室温でかき混ぜ、固定反応の進行をＨＰＬＣによってモニターした（図５Ａ、Ｂを参照）。固定（約１時間）後、樹脂を、０．２５Ｍ  ＮａＯＡｃ水溶液／ＡｃＯＨ緩衝液（ｐＨ４．２）、Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ（２／１）および水の混合物で洗浄した。樹脂結合プロパルギルグリシン含有ペプチド１８を、アジド修飾チミジン六リン酸（Ｆｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２０１６，１１３（１９），ｐ．５２３３−４２３８）と、ＣｕＳＯ４，ＴＨＰＴＡ、アスコルビン酸およびアミノグアニジンの存在下、２０体積％ＤＭＳＯを含有する０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液水溶液（ｐＨ６．５）の混合物中で反応させた（図４、経路Ａを参照）。懸濁液を３７℃で１６時間かき混ぜた。樹脂を、０．２Ｍ  ＮａＨＰＯ４緩衝液水溶液（ｐＨ６．５）およびＨ２Ｏ／ＡＣＮ（２／１）の混合物で洗浄した。所望のヌクレオシド−ペプチドコンジュゲート２０は、樹脂の、０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液水溶液（ｐＨ８．５）による、室温で１６時間にわたる処理によって、高純度で放出された。
（ＨＯ（ＣＨ２）３ＣＯＮＨ−Ｐｒａ（Ｎ３（ＣＨ２）１１Ｏ（ＰＯ２）６ｄＴ）
ＷＷＷＷＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＥＥＥＥ−ＮＨ２：
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値１１０１．３［Ｍ−６Ｈ］６−，計算値１１０１．２［Ｍ−６Ｈ］６−；実測値９４４．０［Ｍ−７Ｈ］７−，計算値９４３．８［Ｍ−７Ｈ］７−．
代替として、樹脂結合ペプチド１８を、ヌクレオシド−コンジュゲーションステップの前であっても、弱塩基性条件（０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液、ｐＨ８．５、室温、１６時間）下、アガロース樹脂から放出することもできる（図４、経路Ｂを参照）。これらの条件下、未修飾ペプチド１９
【００５５】
ＨＯ（ＣＨ２）３ＣＯＮＨ−Ｐｒａ  
ＷＷＷＷＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＥＥＥＥ−ＮＨ２が高純度で単離された。
【００５６】
生成物発生をＨＰＬＣ分析によってモニターした。図５は、粗ＳＰＰＳ生成物のＨＰＬＣ分析（５Ａ）、固定後の上清（５Ｂ）、経路Ｂに従って生成された精製ペプチド１９（５Ｄ）およびヌクレオシド−ペプチドコンジュゲート２０（５Ｃ）を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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