(57)【要約】本発明は、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過するアプタマーに関し、このようなアプタマーを脳内に存在するターゲット物質に選択的に結合する物質と共に結合した複合体などへの応用に関し、本発明のアプタマー及びそのアプタマーと結合した複合体は、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）の放射線造影剤として使用して、アルツハイマー病やパーキンソン病などを早期に診断することができ、ＢＢＢを通過し、脳実質内にターゲット物質の分布をＰＥＴを使用して早期に造影できる放射線造影物質として使用することができ、退行性脳疾患治療剤として使用することができる。
2021534790.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１００に記載された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド群から選択される血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過するアプタマー。
【請求項２】
前記アプタマーは、配列番号１０１の塩基配列を共通に有することを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
脳内に存在するターゲット物質に選択的に結合する物質と、請求項１又は２に記載の血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過するアプタマーを一緒に結合した複合体。
【請求項４】
前記脳内に存在するターゲット物質に選択的に結合する物質は、脳実質内に送達が困難な薬物、化学物質、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ペプチド及びタンパク質で構成される群から選択される物質であることを特徴とする、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
前記脳内に存在するターゲット物質は、α−シヌクレイン、タウ（ｔａｕ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）１又はアミロイドβであることを特徴とする、請求項３に記載の複合体。
【請求項６】
前記脳内に存在するターゲット物質に選択的に結合する物質と、前記血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過するアプタマーとは、リンカーによって連結されることを特徴とする、請求項３に記載の複合体。
【請求項７】
前記脳内に存在するターゲット物質に選択的に結合する物質は、放射性同位元素が標識されていることを特徴とする、請求項３に記載の複合体。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか一項に記載の複合体を有効成分として含む陽電子断層撮影（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ＰＥＴ）用組成物。
【請求項９】
請求項３〜７のいずれか一項に記載の複合体を有効成分として含む退行性脳疾患診断用組成物。
【請求項１０】
前記退行性脳疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、又はハンチントン病であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項３〜７のいずれか一項に記載の複合体を有効成分として含む退行性脳疾患治療用組成物。
【請求項１２】
前記退行性脳疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、又はハンチントン病であることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液脳関門を通過するアプタマー及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病の場合、脳実質内の神経細胞間にアミロイドβとＴＤＰ−４３の凝集が見られ、パーキンソン病では、神経細胞内にレビー小体（Ｌｅｗｙ  Ｂｏｄｙ；ＬＢｓ）と呼ばれるタンパク質の凝集体が病理的所見で見られる。ＬＢの主成分は、α−シヌクレインと呼ばれるタンパク質として知られている。これらのターゲット物質の脳内での凝集は、各疾患の主要な症状が現れる前から起こることが知られており、このような異常に凝集したタンパク質は、神経細胞の細胞死滅を起こし、疾病を誘発することになる。
【０００３】
したがって、脳疾患に関連するターゲット物質の凝集を早期に確認し、凝集を防止すれば、脳疾患の発病率を画期的に低減できると考えられる。
【０００４】
アプタマーは、“ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ”とも呼ばれる一本鎖のＤＮＡやＲＮＡ（ｓｓＤＮＡあるいはｓｓＲＮＡ）であって、物質内の塩基の相補結合を介して様々な形状の三次構造を作り出して、タンパク質、ペプチドなどに選択的に結合する物質を指す。抗体と同様に、ターゲット物質に対する選択的特異性が高いが、サイズは１／１０程度と小さく、合成により製造可能であるので、抗体のような複雑な細胞培養及び精製過程を回避することができ、生化学的特性を均一に維持させることができるという大きな利点がある。また、ＤＮＡやＲＮＡは既に体内に存在する物質であって、毒性の問題を解決することができる。
【０００５】
アプタマーは、脳疾患ターゲット物質に特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に結合することができ、最近、α−ｓｙｎに特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に結合するアプタマーが、α−シヌクレイン（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）の凝集を防ぎ、分解を促進させることができることが報告されている（Ｙｕａｎ  Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ．ａｌ，（２０１８）Ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｉｔｓ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：２２８−２４２）。したがって、アプタマーを用いる場合、ターゲット物質に結合して早期診断に使用できるだけでなく、疾病を予防し、治療できるので、病気を診断すると同時に治療が可能なＴｈｅｒａｇｎｏｓｉｓ（ｔｈｅｒａｐｙ＋ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）技術への活用が期待される。
【０００６】
しかし、脳実質内に存在するターゲット物質に結合して効能を示すためには、血液を介して投与されたアプタマーがＢＢＢを通過しなければならない。ＢＢＢを通過して脳実質に物質を送達する最も効果的な方法は、受容体結合を介するトランスサイトーシス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）である。トランスサイトーシスを介して脳実質に物質を送達することが知られている受容体には、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インスリン受容体（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、低密度リポタンパク質受容体（Ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などがあり、特にトランスフェリン受容体をターゲットとして脳実質に薬物を送達しようとする研究が多く行われている。その例として、トランスフェリン受容体に結合する抗体がＢＢＢを効果的に通過できることが報告されている（Ｂｅｌｌ  ＲＤ，Ｅｈｌｅｒｓ  ＭＤ（２０１４）  Ｂｒｅａｃｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎｅｕｒｏｎ８１：１−３）。また、トランスフェリン受容体の細胞外側部分（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ，ＥＣＤ）に結合するアプタマーを介してリソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ）酵素を細胞内に効果的に送達できることが報告されている（Ｃｈｅｎ  ＣＨ，ｅｔ．ａｌ，（２００８）Ａｐｔａｍｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：１５９０８−１５９１３）。
【０００７】
ところが、このような受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は脳血管にのみ存在するものではないため、受容体をターゲットとして脳実質に送達される薬物は、必然的に、肝臓、心臓、肺、腎臓などのような組織にかなりの量が送達され、予期せぬ副作用をもたらす可能性がある。このような問題点を解決するために、脳血管のみを特異的に通過する物質を見つける研究が行われている。その例として、一本鎖抗体ライブラリーを用いたスクリーニングによってＢＢＢのみを選択的に通過する抗体が報告されている（Ａｎｇｅｌａ，ｅｔ．ａｌ，（２０１４）  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  ９（５）：６６４−７４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】大韓民国公開特許第１０−２０１４−００１９０９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記の必要性によって案出されたものであって、本発明の目的は、血液脳関門を通過するアプタマーを提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの早期診断のための新規なＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）放射線造影剤を提供することである。
【００１１】
本発明の更に他の目的は、新規なアルツハイマー病やパーキンソン病などに対する治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号１〜１００に記載された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド群から選択される血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過するアプタマーを提供する。
【００１３】
本発明の一実施例において、前記アプタマーは、配列番号１０１の塩基配列を共通に有することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１４】
また、本発明は、脳内に存在するターゲット物質に選択的に結合する物質と、前記本発明の血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過するアプタマーを一緒に結合した複合体を提供する。
【００１５】
本発明の一実施例において、前記脳内に存在するターゲット物質に選択的に結合する物質は、脳実質内に送達が困難な薬物、化学物質、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ペプチド及びタンパク質で構成される群から選択される物質であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１６】
本発明の他の実施例において、前記脳内に存在するターゲット物質に選択的に結合する物質と、前記本発明の血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過するアプタマーとは、リンカーによって連結されることが好ましいが、これに限定されない。
【００１７】
本発明の更に他の実施例において、前記脳内に存在するターゲット物質に選択的に結合する物質は、放射性同位元素が標識されていることが好ましいが、これに限定されない。
【００１８】
また、本発明は、前記本発明の複合体を有効成分として含む陽電子断層撮影（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ＰＥＴ）用組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明は、前記本発明の複合体を有効成分として含む退行性脳疾患診断用組成物を提供する。
【００２０】
また、本発明は、前記本発明の複合体を有効成分として含む退行性脳疾患治療用組成物を提供する。
【００２１】
本発明の一実施例において、前記退行性脳疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、又はハンチントン病であることが好ましいが、これに限定されない。
【００２２】
以下、本発明を説明する。
【００２３】
本発明は、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過するアプタマーと、脳内に存在するターゲット物質に選択的に結合する物質を一緒に結合した複合体（例えば、Ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｒ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ）アプタマー）を製造し、これを陽電子断層撮影（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ＰＥＴ）の放射線造影剤（Ａｐｔａｍｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｒａｄｉｏｔｒａｃｅｒ）として使用することで、ターゲット物質の凝集を防止してアルツハイマー病やパーキンソン病などを早期に診断し、予防及び治療するものである。
【００２４】
例えば、本発明は、α−シヌクレイン（ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、アミロイドβ（ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ）、タウ（ｔａｕ）、ＳＯＤ１、ＴＤＰ−４３などの退行性脳疾患において凝集が増加する様々な物質に選択的に結合して凝集を抑制するアプタマーと、前記本発明のＢＢＢを通過するアプタマーとを連結して具現したＢｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃアプタマーを用いることで、ＢＢＢを通過し、脳実質内にターゲット物質の分布をＰＥＴを使用して早期に造影することができ、ターゲット物質の凝集を防止するセラグノーシス（Ｔｈｅｒａｇｎｏｓｉｓ）技術に活用可能な物質を開発することに関する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明を通じて分かるように、本発明のアプタマーは血液脳関門を通過することができ、このようなアプタマーを含む複合体は、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）の放射線造影剤として使用して、アルツハイマー病やパーキンソン病などを早期に診断することができ、ＢＢＢを通過し、脳実質内にターゲット物質の分布をＰＥＴを使用して早期に造影できる放射線造影物質として使用することができる。また、ターゲット物質の凝集を防止して治療剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ヒト血液脳血管細胞株（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）のＺＯ−１の発現を確認した図である。
【図２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを作成し、人工ＢＢＢモデルを通過するアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を発掘することを示す図である。
【図３】ＳＥＬＥＸを使用したＢＢＢ−透過アプタマーの方法及び結果を確認した図である。
【図４】ＢＢＢ−透過アプタマーのＮＧＳの結果を示す図である。
【図５】ＢＢＢ−透過アプタマー候補の透過率テストの結果を示す図である。
【図６】本発明の応用の一例であって、本発明のアプタマーをＢＢＢを通過して脳実質に存在するターゲット物質に結合できるアプタマーと結合した二重特異的なアプタマーを介するセラグノーシス（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｉｓ）技術の活用戦略を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を非限定的な実施例によりさらに詳細に説明する。但し、以下の実施例は、本発明を例示するために記載したものであって、本発明の範囲は、以下の実施例によって制限されるものと解釈されない。
【００２８】
実施例１：アプタマーが細胞内に発現させたα−シヌクレイン（ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）の凝集を防止するか、又は分解を促進するかを確認する
ヒト神経母細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にα−シヌクレインをレンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）を用いて過剰発現させた後、α−シヌクレインのモノマー／オリゴマー（ｍｏｎｏｍｅｒ／ｏｌｉｇｏｍｅｒ）に特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）するアプタマーを処理する。その後、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）によって、α−シヌクレインの凝集及び分解の程度を確認した。
【００２９】
実施例２：ヒト血液脳血管細胞株（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３）のＺＯ−１の発現
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血液脳関門モデルを作成するのに使用したｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞株は、ヒト脳血管細胞に由来する細胞株であって、血液脳関門の研究に最も多く使用される細胞株であり、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞株を単一層で培養しながら、血液脳関門の重要な表現型であるタイトジャンクションが形成されるかを、タイトジャンクションタンパク質の指標の一つであるＺＯ−１（緑色）を免疫蛍光染色して確認した。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ（青色）を用いて染色した。その結果、培養期間が長くなるほど、細胞が互いに接触しながらタイトジャンクションがよく形成されることを確認した（図１）。
【００３０】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  人工ＢＢＢモデルを作成してアプタマーを選択（ａｐｔａｍｅｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）して、脳血管のみを特異的に通過するアプタマーを発掘し、特性を研究する
ヒト脳血管細胞株であるｈＣＭＥＣ／Ｄ３を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でＢＢＢモデルを作成（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞はミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社から購入した。培養液は、ＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ）に５％ＦＢＳ（ｇｉｂｃｏ）、１．４μＭヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）（ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ）（ｓｉｇｍａ）、１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｇｉｂｃｏ）、１ｘ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ（ｇｉｂｃｏ）、Ｐ／Ｓ（ｇｉｂｃｏ）を追加して使用した。培養液の交換は２〜３日サイクルで行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上でＢＢＢモデルを作成するために、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３の細胞をトランスウェル（１２ウェルインサート、ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ：０．４μｍ、ｃｏｒｎｉｎｇ）の内部に２．２×１０５の細胞をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）して６〜１０日間培養した。このように作成されたＢＢＢモデルを用いて、ＤＮＡアプタマーライブラリー（ＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ  ｌｉｂｒａｒｙ）を人工モデルの血管に該当する箇所に処理した後、ＤＮＡプール（ＤＮＡ  ｐｏｏｌ）を選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）した。各ラウンド（Ｒｏｕｎｄ）当たり１個のＢＢＢモデルを使用した。）した後、ＤＮＡアプタマーライブラリーを人工モデルにおいて血管に該当する箇所に処理して、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を通過したＤＮＡプールを選択した。
【００３１】
簡略に記載すると、図２に示したように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  血液脳関門モデルを通過するアプタマーを発掘するために、ＳＥＬＥＸを行った。このとき使用したランダムＤＮＡライブラリーは合計６０−ｍｅｒであり、中央に３０−ｍｅｒのランダム配列と、両端に増幅のための１５−ｍｅｒの固定されたプライマー配列とで構成される（５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＣ−Ｎ３０−ＧＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣ−３’；配列番号１０３）。最初のラウンドでは、１ｎｍｏｌのランダムＤＮＡライブラリーを血液脳関門モデルに処理し、３７℃で６０分間反応させた後、通過したアプタマーを選別した。
【００３２】
ＳＥＬＥＸ技術は、ｓｓＤＮＡを９５℃で１０分間処理し、５分間常温で放置してフォールディング（Ｆｏｌｄｉｎｇ）させて準備する。細胞は、ＰＢＳで洗浄（ｗａｓｈ）した後、サケ精子（ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳで１０〜１５分間培養してブロッキング過程を経る。その後、準備したｓｓＤＮＡをブロッキングされた細胞に処理して、透過したｓｓＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ；ＰＣＩ）抽出法を用いてｓｓＤＮＡを選別した。次のラウンドのためのＤＮＡ試料を得るために、選別したアプタマーをＰＣＲで増幅した。
【００３３】
ＰＣＲ増幅は、２つのステップを経る。このとき、順方向プライマーは５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＣ−３’（配列番号１０４）配列を使用し、逆方向プライマーは５’−ＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＣ−３’（配列番号１０５）配列にビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を付着させて使用した。第１ステップは、対称（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）ＰＣＲを用いて、選別されたｓｓＤＮＡプール（ｐｏｏｌ）をｄｓＤＮＡにする。
【００３４】
前記ＰＣＲ条件：ステップ１、９５℃  ３分、ステップ２、９５℃  １０秒、５９℃  １０秒、７２℃  １０秒  １１〜１５サイクル、ステップ３、７２℃  １分であった。
【００３５】
このステップは、作成されたｄｓＤＮＡをテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用し、順方向プライマーと逆方向プライマーとの比率を２５：１として非対称（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）ＰＣＲを行う。
【００３６】
前記ＰＣＲ条件：ステップ１、９５℃  ３分、ステップ２、９５℃  １０秒、５９℃  １０秒、７２℃  １０秒  ３０サイクル、ステップ３、７２℃  １分。
【００３７】
順方向プライマーの比率が高いため、ｄｓＤＮＡよりもｓｓＤＮＡがさらに多く作成されるようになる。このとき、ｄｓＤＮＡには、逆方向プライマーに付着しているビオチンが含まれるようになる。ＳＥＬＥＸに使用するｓｓＤＮＡを分離するために、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）が付着しているマグネチックビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ）を用いてｄｓＤＮＡを除去した。
【００３８】
２ラウンドでは、処理するＤＮＡ試料の量を２００ｐｍｏｌに減らした。ラウンドを進めるほど、処理するＤＮＡ試料の量及び反応時間を各５０ｐｍｏｌ及び２０分に減らした。ＳＥＬＥＸが適するか否かを判断するために４ラウンド及び９ラウンドでモニタリングした。
【００３９】
ＰＣＲ方式を用いて電気泳動方法によりＤＮＡバンド（ｂａｎｄ）の強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定する方法で確認した。
【００４０】
４ラウンドを行うときに、１００ｐｍｏｌのランダムＤＮＡライブラリー、及び３ラウンドで選別して増幅させたＤＮＡ試料を、それぞれの血液脳関門モデルに処理し、通過したＤＮＡの量を対称（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）ＰＣＲによって確認した（ＰＣＲ増幅の第１ステップの条件と同一）。その結果、３ラウンドで選別して増幅させたＤＮＡ試料よりも、ランダムＤＮＡライブラリーを処理した群においてＰＣＲ産物が相対的に少ないことを確認した。９ラウンドを行うときは、３ラウンド及び８ラウンドで選別されて増幅されたＤＮＡ試料を、それぞれの血液脳関門モデルに処理した。通過したＤＮＡの量をＰＣＲで確認したとき、８ラウンドで選別されたＤＮＡ試料がさらによく通過することを確認した。これにより、ラウンドが進むほど、血液脳関門モデルをより一層よく通過するアプタマーが選別されることを確認した（図３）。９回のラウンドで得られたＤＮＡ試料は、ＮＧＳ分析を行った（ＮＧＳ分析は、マクロジェンでｉｌｌｕｍｉｎａ  ｐｌａｔｆｏｒｍタイプのシーケンサー（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を実施する）。
【００４１】
ＮＧＳ分析を行った結果、上位にある配列のほとんどが１０−ｍｅｒの長さの共通の配列（ＧＡＧＣＡＣＧＧＧＧ；配列番号１０１）を含んでいることを確認し、表１に記載した上位の１００個の配列のうち２４個の配列が、前記の１０−ｍｅｒの配列を含んでいた（図４）。上位４個の配列を用いて実験を行った。
【００４２】
実施例４：ＢＢＢ−透過アプタマーの透過率テスト
配列番号２〜５のＮＧＳ配列においてリード（ｒｅａｄ）された数が高い配列（その配列が多く存在するので、その分多くリードされる）の４つのアプタマー配列（ＢＢＢ−１、２、３、４）の３’部分に蛍光物質であるＦＡＭを付着させて、それぞれの血液脳関門モデルに処理し、１時間後、通過したアプタマーの蛍光強度を測定した。
【００４３】
このとき使用したＢＢＢモデルは、ＳＥＬＥＸに使用したＢＢＢモデルよりも小さいモデルを使用した。２４ｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔ  ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ：０．４μｍ、ｃｏｒｎｉｇ）に８×１０４の細胞を７日間培養して、モデルを作成した。モデルの血管部分に該当する部分に、それぞれのＦＡＭが付着したアプタマーを５０ｐｍｏｌずつ処理し、１時間培養した。その後、通過したアプタマーの蛍光強度及び入れた全アプタマー（ｔｏｔａｌ  ａｐｔａｍｅｒ）の蛍光強度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１（Ｂｉｏｔｅｃｋ）を用いて、ｅｍｉｓｓｉｏｎ波長４９０ｎｍ、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ波長５２０ｎｍで測定した後、通過率を計算した。（通過率＝通過したアプタマーの蛍光強度／入れたアプタマーの蛍光強度×１００）。陰性対照群（５’−ＣＧＣＧＣＧＴＣＡＧＧＣＡＴＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧ−３’；配列番号１０２）と比較したとき、実験群全体において透過率が増加し、特に、ＢＢＢ−２及び４は、その増加幅が大きく、その中でＢＢＢ−２の通過率が最も高いことを確認した。
【００４４】
実施例５：ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｒ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ）アプタマーの開発
本発明のＢＢＢ通過アプタマーと、α−シヌクレインやアミロイドβなどのターゲット物質に対するアプタマーを、ポリチミジンリンカー（ｐｏｌｙ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｌｉｎｋｅｒ）（Ｔ１０〜Ｔ２０）などを介してｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋで連結して、Ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃアプタマーを作る。このとき、リンカーにｒｉｂｏｓｙＵｒｉｄｉｎｅなどを中間に入れて、トランスサイトーシス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）が起こった後、容易に切断されてターゲット物質に対するアプタマーを放出するようにデザインすることができる。
【００４５】
リンカーにより連結する場合、通常、アプタマーの結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）が低下する。したがって、それぞれのアプタマーの機能が連結の前と同一に維持されるように、ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃアプタマーを最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）しなければならない。
【００４６】
ＢＢＢ通過アプタマーのシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を固定させてＤＮＡライブラリーを作成した後、α−シヌクレインやアミロイドβなどのターゲット物質に対するＳＥＬＥＸを行う。
【００４７】
α−シヌクレインやアミロイドβなどのターゲット物質に結合するアプタマーのシーケンスを固定させてＤＮＡライブラリーを作成した後、人工ＢＢＢモデルを透過するアプタマーを選択(ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ)する。
【００４８】
実施例６：ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃアプタマーが人工ＢＢＢモデルを通過した後、ターゲット物質に結合できるかを確認する
人工ＢＢＢモデルにおいて脳実質部分に該当する側にα−シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）を過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）させたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を培養させる。蛍光物質で標識したｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃアプタマーを血管に該当する側に処理した後、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞質に蛍光が見えるかを確認する。また、α−シヌクレインを蛍光染色して、アプタマーとどれくらい共局在化（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｔｉｏｎ）されているかを確認する。
【００４９】
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表１は、ＢＢＢを透過するアプタマー配列の表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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