(57)【要約】本発明は、標的抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸を含むウイルスベクターで細胞を形質導入するための方法であって、細胞が、標的抗原を発現する細胞の亜集団および標的抗原を発現しない細胞の亜集団を含み、標的抗原を発現しない細胞の亜集団が標的抗原を発現する細胞の亜集団よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）で、細胞を形質導入するステップを含む、方法、を提供する。本発明は、かかる方法によって作製された細胞組成物ならびに疾患の処置および／または予防におけるそれらの使用もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸を含むウイルスベクターで細胞を形質導入するための方法であって、前記細胞が、前記標的抗原を発現する細胞の亜集団および前記標的抗原を発現しない細胞の亜集団を含み、
前記標的抗原を発現しない細胞の前記亜集団が前記標的抗原を発現する細胞の前記亜集団よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）で、前記細胞を形質導入するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記標的抗原を発現しない細胞の前記亜集団の少なくとも５％が形質導入され、前記標的抗原を発現する細胞の前記亜集団の１％未満が形質導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的抗原を発現しない細胞の前記亜集団の少なくとも１０％が形質導入され、前記標的抗原を発現する細胞の前記亜集団の１％未満が形質導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的抗原を発現しない細胞の前記亜集団の少なくとも１５％が形質導入され、前記標的抗原を発現する細胞の前記亜集団の１％未満が形質導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的抗原を発現しない細胞の前記亜集団の少なくとも２０％が形質導入され、前記標的抗原を発現する細胞の前記亜集団の１％未満が形質導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的抗原を発現しない細胞の前記亜集団の少なくとも３０％が形質導入され、前記標的抗原を発現する細胞の前記亜集団の１％未満が形質導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的抗原を発現しない細胞の前記亜集団の少なくとも２０％が形質導入され、前記標的抗原を発現する細胞の前記亜集団が有意には形質導入されない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＯＩが、前記標的抗原を発現しない細胞の前記亜集団の約１０〜５０％の形質導入を達成するために選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、０．２〜１．０の範囲のＭＯＩのＲＤ１１４シュードタイプ化ウイルスベクターで形質導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、１．０〜２．０の範囲のＭＯＩのＧＡＬＶシュードタイプ化ウイルスベクターで形質導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、５．０〜１０．０の範囲のＭＯＩのＶＳＶＧシュードタイプ化ウイルスベクターで形質導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的抗原が、ＴＣＲベータ定常領域１（ＴＲＢＣ１）である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的抗原が、ＴＣＲベータ定常領域２（ＴＲＢＣ２）である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）細胞の出発集団を提供するステップ；
（ｉｉ）前記標的抗原を発現する細胞の前記出発集団を枯渇させるステップ；および
（ｉｉｉ）前記標的抗原を発現しない細胞が前記標的抗原を発現する残りの細胞よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）の、前記ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するウイルスベクターで、前記標的抗原枯渇細胞を形質導入するステップ
を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子改変された前記細胞の１０％未満が、前記ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの前記標的抗原を発現する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子改変された前記細胞の５％未満が、前記ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの前記標的抗原を発現する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子改変された前記細胞の１％未満が、前記ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの前記標的抗原を発現する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
上記請求項のいずれか一項に記載の方法によって細胞を形質導入することによって作製された細胞組成物。
【請求項１９】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法によって形質導入された細胞を含む医薬組成物。
【請求項２０】
疾患を処置および／または予防する際の使用のための、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１８または１９に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法。
【請求項２２】
（ｉ）細胞の出発集団を含む試料を提供するステップ；
（ｉｉ）標的抗原を発現する細胞の上記出発集団を枯渇させるステップ；
（ｉｉｉ）前記標的抗原を発現しない細胞が前記標的抗原を発現する残りの細胞よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）の、前記ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するウイルスベクターで、前記標的抗原枯渇細胞を形質導入するステップ；および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）からの前記細胞を対象に投与するステップ
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患ががんである、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患が、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、請求項１８または１９に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、標的抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を含むウイルスベクターで細胞を形質導入する方法に関する。形質導入される細胞は、一定の割合の、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を含む。この方法は、標的抗原を発現しない細胞が標的抗原を発現する細胞よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）で、細胞を形質導入するステップを含む。本発明は、本発明の形質導入方法によって作製された細胞組成物ならびに疾患を処置および／または予防する際のそれらの使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
養子細胞治療（ＡＣＴ）は、特定の疾患関連抗原に対する活性を有する免疫細胞の、対象への投与が関与する、個別化治療である。天然に存在する腫瘍反応性リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を使用するＡＣＴは、黒色腫を有する患者において永続的な完全な退縮を媒介した。しかし、黒色腫は、特異的な抗腫瘍認識および反応性が可能なＴＩＬ培養物を再現性良く生じさせる唯一のがんのようである。
【０００３】
引き続くアプローチは、抗腫瘍受容体を発現するように細胞を遺伝子操作することによって、他の疾患およびがんを処置するためにＡＣＴをより広く適用することを求めてきた。例えば、ＴＣＲは、１つのα鎖および１つのβ鎖から構成される。これらの受容体は、プロセシングされ、ＭＨＣ分子によって提示された抗原を認識する。ＭＡＲＴ−１黒色腫−メラニン形成細胞抗原を認識したＴＣＲをコードするレトロウイルスで形質導入された正常な循環リンパ球は、腫瘍退縮を媒介することが示されている。
【０００４】
別のアプローチは、ＣＡＲを発現するように遺伝的に発現されたリンパ球の投与である。ＣＡＲは、抗体重鎖および軽鎖の可変領域を、細胞内シグナル伝達鎖単独または他のシグナル伝達部分と組み合わせた細胞内シグナル伝達鎖に連結させることによって構築され得る人工受容体である。ＣＡＲは、腫瘍細胞表面上に提示される抗原を認識するが、ＭＨＣ拘束される必要はない。例えば、Ｂ細胞抗原ＣＤ１９に対するＣＡＲは、進行Ｂ細胞リンパ腫の退縮を媒介することが示されている。
【０００５】
遺伝子改変された細胞治療の製造における必須の材料は、出発材料、即ち、遺伝子改変される細胞である。これらの細胞は、自家治療の場合には患者から、または同種治療の場合には異なるドナーから取得され得る。これらの細胞は、例えば、処置される患者（自家）または異なるドナー（同種）由来の、末梢血または白血球除去物（leukapheresate）から取得され得る。
【０００６】
ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、ウイルスベクターでＴ細胞含有細胞試料、例えば、白血球除去物を形質導入することによって作製され得る。ほとんどの研究プロトコールの目的は、最大の形質導入を達成することであるので、形質導入ステップにおいて飽和（または過剰）量のベクターを使用することが一般的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
再現性のある効率および／もしくは増強された安全性を提供する、ならびに／または患者への投与に不適切な細胞集団および／もしくは医薬組成物の製造を回避し、それによって引き続く処置の遅延を防止する、ウイルスベクターによる細胞の形質導入のための改善された方法が、いまだ必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の態様の概要
本発明者らは、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを含む遺伝子改変された細胞の集団を調製するための方法を提供する。
【０００９】
本発明者らは、そのうち一部がＣＡＲまたはＴＣＲの標的抗原を発現する細胞の集団を形質導入する場合に、標的抗原を発現しない細胞が標的抗原を発現する細胞よりも高い程度まで形質導入されるように感染多重度（ＭＯＩ）を調整することが可能であることを示している。
【００１０】
理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、これが、形質導入プロセスの間の受容体干渉に起因すると予測している。標的抗原を発現する細胞の亜集団(subpopulation)について、本発明者らは、ウイルスベクターが、ウイルスエンベロープタンパク質を介した細胞への結合の代わりに（またはそれと同様に）、標的抗原へのＣＡＲまたはＴＣＲ結合を介して細胞に結合すると予測している。低いＭＯＩでは、これは、標的抗原を発現しない細胞が優先的に形質導入されることを意味する。高いＭＯＩでは、受容体の全てが飽和されるので、この影響は克服される。
【００１１】
ほとんどのウイルス形質導入プロトコールの目的は、細胞の最大の形質導入を達成することである。従って、ほとんどの形質導入プロトコールは、過剰量のベクターを使用する。従って、既存のプロトコールの教示は、標的抗原を発現しない細胞が優先的に形質導入されるように低いＭＯＩを意図的に使用することが関与する本発明の方法とは反対の教示である。
【００１２】
従って、第１の態様では、本発明は、標的抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸を含むウイルスベクターで細胞を形質導入するための方法であって、細胞が、標的抗原を発現する細胞の亜集団および標的抗原を発現しない細胞の亜集団を含み、標的抗原を発現しない細胞の亜集団が標的抗原を発現する細胞の亜集団よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）で、細胞を形質導入するステップを含む方法、を提供する。
【００１３】
遺伝子改変された細胞の集団は、形質導入前の細胞の集団よりも、より高い比率の、標的抗原を発現しない細胞：標的抗原を発現する細胞を有する。
【００１４】
細胞の集団は、標的抗原を発現しない細胞が形質導入され、標的抗原を発現する細胞が形質導入されないようなＭＯＩのウイルスベクターで形質導入され得る。細胞の亜集団は、この亜集団中の形質導入された細胞がフローサイトメトリーによって検出不能である場合、「形質導入されていない」とみなされ得る。
【００１５】
本発明の方法では、標的抗原を発現しない細胞の亜集団の少なくとも５％、１０％、２０％または３０％が形質導入され得、標的抗原を発現する細胞の亜集団の１％未満が形質導入され得る。
【００１６】
本発明の方法では、標的抗原を発現しない細胞の亜集団の少なくとも２０％が形質導入され得、標的抗原を発現する細胞の亜集団は、有意には形質導入されない。細胞の亜集団は、この亜集団中の形質導入された細胞がフローサイトメトリーによって検出不能である場合、「形質導入されていない」または「有意には形質導入されていない」とみなされ得る。
【００１７】
ＭＯＩは、標的抗原を発現しない細胞の亜集団の約１０〜５０％の形質導入を達成するために選択され得る。
【００１８】
本発明の方法では、細胞は、０．２〜１．０の範囲のＭＯＩのＲＤ１１４シュードタイプ化ウイルスベクターで形質導入され得る。
【００１９】
本発明の方法では、細胞は、１．０〜２．０の範囲のＭＯＩのＧＡＬＶシュードタイプ化ウイルスベクターで形質導入され得る。
【００２０】
本発明の方法では、細胞は、５．０〜１０．０の範囲のＭＯＩのＶＳＶＧシュードタイプ化ウイルスベクターで形質導入され得る。
【００２１】
ＣＡＲまたはＴＣＲの標的抗原は、ＴＣＲベータ定常領域１（ＴＲＢＣ１）であり得る。
【００２２】
ＣＡＲまたはＴＣＲの標的抗原は、ＴＣＲベータ定常領域２（ＴＲＢＣ２）であり得る。
【００２３】
この方法は、
（ｉ）細胞の出発集団を提供するステップ；
（ｉｉ）標的抗原を発現する細胞の上記出発集団を枯渇させるステップ；および
（ｉｉｉ）標的抗原を発現しない細胞が標的抗原を発現する残りの細胞よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）の、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するウイルスベクターで、標的抗原枯渇細胞を形質導入するステップ
を含み得る。
【００２４】
遺伝子改変された細胞の１０％、５％または１％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現し得る。
【００２５】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に従う方法によって細胞を形質導入することによって作製された細胞組成物を提供する。
【００２６】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に従う方法によって形質導入された細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
第４の態様では、本発明は、疾患を処置および／または予防する際の使用のための、本発明の第２または第３の態様に従う組成物を提供する。
【００２８】
第５の態様では、本発明は、本発明の第２または第３の態様に従う組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。
【００２９】
この方法は、
（ｉ）細胞の出発集団を含む試料を提供するステップ；
（ｉｉ）標的抗原を発現する細胞の上記出発集団を枯渇させるステップ；
（ｉｉｉ）標的抗原を発現しない細胞が標的抗原を発現する残りの細胞よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）の、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するウイルスベクターで、標的抗原枯渇細胞を形質導入するステップ；および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）からの細胞を対象に投与するステップ
を含み得る。
【００３０】
疾患は、がん、例えば、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫であり得る。
【００３１】
第６の態様では、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、本発明の第３の態様に従う医薬組成物の使用が提供される。
【００３２】
本発明の方法は、いくつかの利点を提供する。低いまたは無視できる割合の、標的抗原を発現する形質導入された細胞を有する、細胞の形質導入された集団を有することは、兄弟殺しが低減され、細胞が分化する可能性が低いおよび／または疲弊する可能性が低いことを意味する。これは、細胞が、投与後に改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ存続性および／または投与後に改善された細胞溶解活性を有するはずであることを意味する。
【００３３】
本発明の別の利点は、この方法によって産生された遺伝子改変された細胞が、より均一に遺伝子改変されることである。異なるドナー由来の細胞集団に対して実施される方法間ならびに細胞調製物および／または医薬組成物間に、変形形態はあまり存在しない。
【００３４】
有利には、本発明に従う方法は、より純粋であり、低いまたは検出不能なレベルの、標的抗原を発現する細胞を含む、遺伝子改変された細胞の集団を産生する。本発明に従う方法は、標的抗原を発現する細胞を遺伝子改変するリスクを最小化または排除する。これは、標的細胞（即ち、標的抗原を発現する細胞）ががん細胞である場合に、さらなる安全性の恩恵を提供し得る。
【００３５】
さらに、本発明に従う方法は、高い割合の、標的抗原を発現する細胞が、細胞の供給源、例えば、細胞の出発集団中に存在する場合の、形質導入またはトランスフェクションにおける失敗を低減させる。
【００３６】
さらなる態様
本発明のさらなる態様が、以下の番号付きの段落に示される：
１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む遺伝子改変された細胞の集団を調製する方法であって、
（ｉ）細胞の出発集団を提供するステップ；
（ｉｉ）標的抗原を発現する細胞の上記出発集団を枯渇させるステップ；および
（ｉｉｉ）枯渇された出発集団中の細胞中に、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列を導入するステップ
を含む、方法。
２．ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲが、細胞溶解性免疫細胞に導入される、段落１に記載の方法。
３．細胞の出発集団が、白血球除去物を含む、段落１に記載の方法。
４．細胞の出発集団が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含む、上記段落のいずれかに記載の方法。
５．枯渇された出発集団が、ＰＢＭＣを含む、上記段落のいずれかに記載の方法。
６．枯渇された出発集団が、細胞溶解性免疫細胞を含む、上記段落のいずれかに記載の方法。
７．枯渇された出発集団が、Ｔ細胞を含む、上記段落のいずれかに記載の方法。
８．標的抗原が、ＴＣＲベータ定常領域１（ＴＲＢＣ１）である、上記段落のいずれかに記載の方法。
９．標的抗原が、ＴＣＲベータ定常領域２（ＴＲＢＣ２）である、段落１から７のいずれか１つに記載の方法。
１０．ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲ標的抗原陽性細胞のパーセンテージが、出発集団よりも遺伝子改変された細胞の集団において低い、上記段落のいずれかに記載の方法。
１１．遺伝子改変された細胞の１０％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する、上記段落のいずれかに記載の方法。
１２．遺伝子改変された細胞の５％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する、上記段落のいずれかに記載の方法。
１３．遺伝子改変された細胞の１％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する、上記段落のいずれかに記載の方法。
１４．遺伝子改変された細胞が、医薬組成物として調製される、上記段落のいずれかに記載の方法。
１５．上記段落のいずれかによって取得可能な、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを含む遺伝子改変された細胞。
１６．段落１５に記載の遺伝子改変された細胞の集団。
１７．細胞が、細胞溶解性免疫細胞である、段落１６に記載の遺伝子改変された細胞の集団。
１８．細胞がＴ細胞である、段落１６または１７に記載の遺伝子改変された細胞の集団。
１９．遺伝子改変された細胞が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞よりも分化していない、段落１６から１８のいずれか１つに記載の遺伝子改変された細胞の集団。
２０．遺伝子改変された細胞が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞と比較して、ＣＤ２７および／またはＣＤ６２Ｌの増加した発現を有する、段落１６から１９のいずれか１つに記載の遺伝子改変された細胞の集団。
２１．遺伝子改変された細胞が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞よりもナイーブである、段落１６から２０のいずれか１つに記載の遺伝子改変された細胞の集団。
２２．上記遺伝子改変された細胞が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞と比較して、疲弊していない、段落１６から２１のいずれか１つに記載の遺伝子改変された細胞の集団。
２３．上記遺伝子改変された細胞が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞と比較して、１つまたは複数の疲弊マーカーの減少した発現を有する、段落１６から２２のいずれか１つに記載の遺伝子改変された細胞の集団。
２４．１つまたは複数の疲弊マーカーが、ＰＤ１、Ｌａｇ３およびＴｉｍ３からなる群から選択される、段落２３に記載の遺伝子改変された細胞の集団。
２５．段落１６から２４のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞の集団を含む医薬組成物。
２６．疾患を処置および／または予防する際の使用のための、段落２５に記載の医薬組成物。
２７．段落２５に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法。
２８．
（ｉ）細胞の出発集団を含む試料を提供するステップ；
（ｉｉ）標的抗原を発現する細胞の上記出発集団を枯渇させるステップ；
（ｉｉｉ）枯渇された出発集団中の細胞中に、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列を導入するステップ；および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）からの細胞を対象に投与するステップ
を含む、段落２７に記載の方法。
２９．細胞が自家である、段落２８に記載の方法。
３０．細胞が同種である、段落２８に記載の方法。
３１．疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、段落２５に記載の医薬組成物の使用。
３２．疾患ががんである、段落２６に記載の使用のための医薬組成物、段落２７から３０のいずれか１つに記載の方法、または段落３１に記載の使用。
３３．疾患が血液学的悪性疾患である、段落３１または段落３２に記載の使用のための医薬組成物、方法、または使用。
３４．疾患が白血病またはリンパ腫である、段落３２または段落３３に記載の使用のための医薬組成物、方法、または使用。
３５．
（ｉ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする第１の核酸配列；および
（ｉｉ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させるための手段
を含むキット。
３６．医薬組成物中の、標的抗原を発現し、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを発現する細胞の数を低減させる方法であって、
細胞の出発集団を提供するステップ；
標的抗原を発現する細胞の上記出発集団を枯渇させるステップ；
枯渇された出発集団中の細胞中に、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸を導入するステップ；および
細胞を医薬組成物中に取り込むステップ
を含む、方法。
３７．標的抗原を発現し、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを発現する細胞の数が、標的抗原を発現する細胞の出発集団を枯渇させることなしに産生された医薬組成物と比較して低減される、段落３６に記載の方法。
３８．細胞が、医薬組成物中への取込み前に拡大増殖される、段落３６または３７に記載の方法。
３９．細胞が、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸の導入前に活性化される、段落３６から３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．細胞の出発集団が、前もって凍結されており、標的抗原を発現する細胞の枯渇前に解凍される、段落３６から３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲが、形質導入によって細胞中に導入され、感染多重度が、標的抗原を発現しない細胞を形質導入するのに十分であり、標的抗原を発現する細胞を形質導入するのに不十分である、段落３６から４０のいずれか１つに記載の方法。
４０．標的抗原を発現する細胞のパーセンテージが、細胞の出発集団よりも医薬組成物において低い、段落３６から４１のいずれか１つに記載の方法。
４１．医薬組成物中の細胞の１０％未満が、標的抗原を発現する、段落３６から４０のうち１つに記載の方法。
４２．医薬組成物中の細胞の５％未満が、標的抗原を発現する、段落３６から４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．医薬組成物中の細胞の１％未満が、標的抗原を発現する、段落３６から４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．医薬組成物中の細胞の５％未満が、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲ、および標的抗原を発現する、段落３６から４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．医薬組成物中の細胞の１％未満が、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲ、および標的抗原を発現する、段落３６から４３のいずれか１つに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、ＴＲＢＣ１細胞枯渇を示す蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）プロットである。示されるように、非コンジュゲート抗体／抗Ｍｓ  ＩｇＧマイクロビーズまたはビオチン化抗体／抗ビオチンマイクロビーズを用いて実施した代表的枯渇。これらのプロットは、非枯渇インプット試料、２．１×１０７に対して実施した枯渇からのＴＲＢＣ１−アウトプット（枯渇されたカラムフロースルー）試料およびＴＲＢＣ１＋アウトプット（カラム捕捉された）試料中のＴＲＢＣ１＋細胞含量を示す。
【図２】図２は、ＴＲＢＣ１枯渇効率を示すグラフである。（Ａ）枯渇前（インプット）および枯渇後（ＴＲＢＣ１−アウトプット）のＴＲＢＣ１＋細胞含量の比較を示す平均データ。（Ｂ）枯渇から回復したインプット細胞サブセット（ＴＲＢＣ１−アウトプット）のパーセンテージ（ｎ＝１３）。
【図３】図３は、ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ形質導入の比較を示すグラフである。プロセスの終了時の、ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎを使用して達成された形質導入（マーカー＋／ＣＤ３＋細胞）のレベルを示すデータ（非枯渇  ｎ＝１５；枯渇  ｎ＝１１；８のマッチドペア。対応のあるｔ検定  ｎ＝８）。
【図４】図４は、形質導入効率  対  ＴＲＢＣ１＋細胞含量を示すグラフである。形質導入の時点における、非枯渇細胞における形質導入をＴＲＢＣ１＋細胞含量と相互に関連付けるデータ（ｎ＝１１）。失敗した形質導入についてのＴＲＢＣ１＋細胞含量が示される。
【図５】図５は、ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ形質導入プロセスの比較を示すグラフである。（Ａ）細胞生存度と共に最終ＣＤ３およびＴＲＢＣ１細胞含量を示すデータ（非枯渇  ｎ＝１２；枯渇  ｎ＝１５；１２のマッチドペア。対応のあるｔ検定  ｎ＝１２）。（Ｂ）形質導入後の培養物の拡大増殖（非枯渇  ｎ＝７；枯渇  ｎ＝５；４のマッチドペア。対応のあるｔ検定  ｎ＝４）。
【図６】図６は、形質導入された（マーカー＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおける疲弊表現型を示すグラフである。複数の疲弊マーカー（Ｌａｇ３、ＰＤ１およびＴｉｍ３）を発現する細胞のパーセンテージを示す平均データ（非枯渇  ｎ＝１２；枯渇  ｎ＝１５；１２のマッチドペア。対応のあるｔ検定  ｎ＝１２）。
【図７】図７は、形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるメモリー表現型を示すバーチャートおよびグラフである。ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ２７＋細胞を同定し未分化細胞をさらに識別するためのナイーブ細胞サブセット（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）の増強された表現型決定を示す平均データ（ｎ＝３）。
【図８】図８は、サイトカイン放出アッセイの結果を示すグラフである。培養物中に放出された（Ａ）グランザイムＢ、（Ｂ）ＩＬ−２、（Ｃ）ＩＦＮ−ｇおよび（Ｄ）ＴＮＦ−ａの濃度を示す、プロセスの終了時のデータ（非枯渇  ｎ＝５；枯渇  ｎ＝７；５のマッチドペア。対応のあるｔ検定  ｎ＝５）。
【図９】図９は、細胞傷害性アッセイ：標的細胞死滅の結果を示すグラフである。（Ａ）非形質導入対照細胞と比較した（非特異的死滅に対して標準化した）、（Ｂ）単独で培養したＴＲＢＣ１＋Ｒａｊｉ細胞と比較した（通常の細胞死に対して標準化した）、４８時間後の死滅したＴＲＢＣ１＋Ｒａｊｉ細胞のパーセンテージを示すデータ（非枯渇  ｎ＝５；枯渇  ｎ＝７）。
【図１０】図１０は、細胞傷害性：サイトカイン放出アッセイの結果を示すグラフである。４８時間後の放出された（Ａ）グランザイムＢ、（Ｂ）ＩＬ−２、（Ｃ）ＩＦＮ−ｇおよび（Ｄ）ＴＮＦ−ａの濃度を示すデータ（非枯渇  ｎ＝５；枯渇  ｎ＝７；５のマッチドペア。対応のあるｔ検定  ｎ＝５）。
【図１１】図１１は、ＴＲＢＣ１＋細胞形質導入を示すバーチャートである。（Ａ）ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ、（Ｂ）対照ＣＡＲによる、異なるＭＯＩにおける非枯渇細胞、ＴＲＢＣ１＋細胞および枯渇細胞の比較形質導入を示すデータ（ｎ＝１；２連のウェルの平均）。
【図１２】図１２は、ＣＤ１９＋細胞枯渇を示すＦＡＣＳプロットである。ＣＤ１９＋マイクロビーズおよびＭＡＣＳ選択カラムを使用して実施した代表的枯渇。これらのプロットは、非枯渇インプット、ＣＤ１９−（枯渇されたカラムフロースルー）およびＣＤ１９＋アウトプット（カラム捕捉）試料を示す。
【図１３】図１３は、製造プロセスの６日目（Ｄ６）における培養物中のＢ細胞（即ち、ＣＤ２０＋）のパーセンテージを示すグラフである。非枯渇培養物中においても、低い％（即ち、＜１％）の生ＣＤ２０＋細胞が、培養の終了時に検出された。Ｎ＝２。
【図１４】図１４は、７日目（Ｄ７）の培養期間の終了時の形質導入効率を示すグラフである。％ＣＡＲ＋細胞を、生きたＣＤ３＋細胞から測定した。非枯渇対照と比較してより高い形質導入が、ＣＤ１９枯渇細胞において観察された。Ｎ＝４。
【図１５】図１５は、培養培地中に放出されたサイトカインを示すグラフである。プロセスの終了時のこれらのデータは、培養物中に放出された（Ａ）グランザイムＢ、（Ｂ）ＩＦＮ−γ、（Ｃ）ＩＬ−２および（Ｄ）ＴＮＦ−αの濃度を示す。全てのサイトカインについて、最も低い濃度が、非枯渇と比較して、枯渇試料において観察された。Ｎ＝４。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な説明
本発明は、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックＴ細胞受容体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターで細胞を形質導入する方法を提供する。形質導入される細胞は、一定の割合の、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を含む。この方法は、標的抗原を発現しない細胞が標的抗原を発現する細胞よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）で、細胞を形質導入するステップを含む。得られた細胞組成物は、疾患を処置および／または予防するための方法において有用である。遺伝子改変された細胞を対象に投与することによって、遺伝子改変された細胞は、標的抗原を発現する細胞の枯渇を引き起こす。
【００３９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
古典的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原認識ドメイン（結合因子）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン（endodomain））に接続するキメラＩ型膜貫通タンパク質である。結合因子は、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づき得る。スペーサードメインが通常、膜から結合因子を隔絶し、それを適切な配向にするために必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。よりコンパクトなスペーサー、例えば、ＣＤ８α由来の柄およびさらにはＩｇＧ１ヒンジ単独のみが、抗原に依存して十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜中にタンパク質をアンカリングし、スペーサーをエンドドメインに接続する。
【００４０】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有した。結果として、これらの第１世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達し、これは、コグネート標的細胞のＴ細胞死滅を誘発するのに十分であったが、Ｔ細胞を完全に活性化して増殖および生存させることに失敗した。この制限を克服するために、複合エンドドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分の、ＣＤ３ζの細胞内部分への融合は、抗原認識後に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達できる第２世代受容体を生じる。最も一般に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、最も強力な共刺激シグナル、即ち、Ｔ細胞増殖を誘発する免疫学的シグナル２を供給する。ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む一部の受容体、例えば、生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢもまた記載されている。活性化、増殖および生存シグナルを伝達することが可能なエンドドメインを有するさらにいっそう強力な第３世代ＣＡＲが、現在記載されている。
【００４１】
ＣＡＲコード核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞に移入され得る。レンチウイルスベクターが使用され得る。この方法で、多数の抗原特異的細胞が、養子細胞移入のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原に結合すると、これは、標的抗原がその上に発現されるＴ細胞への活性化シグナルの伝達を生じる。従って、ＣＡＲは、標的化される抗原を発現する腫瘍細胞へと、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を指向させる。
【００４２】
従って、ＣＡＲは、典型的には以下を含む：（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインを含むまたはシグナル伝達ドメインと会合する細胞内ドメイン。
【００４３】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの部分である。
【００４４】
抗体、抗体模倣物およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものを含む多数の抗原結合ドメインが、当該分野で公知である。例えば、抗原結合ドメインは、以下を含み得る：モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対する十分な親和性を有するペプチド；単一ドメイン抗体；人工単一結合因子、例えば、Ｄａｒｐｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質（ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ））；またはＴ細胞受容体に由来する単鎖。
【００４５】
抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合部位に基づかないドメインを含み得る。例えば、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞表面受容体に対する可溶性リガンドであるタンパク質／ペプチド（例えば、可溶性ペプチド、例えば、サイトカインまたはケモカイン）に基づくドメイン；またはそれに対する結合対カウンターパートが腫瘍細胞上で発現される膜アンカリングされたリガンドもしくは受容体の細胞外ドメイン、を含み得る。
【００４６】
抗原結合ドメインは、抗原の天然リガンドに基づき得る。
【００４７】
抗原結合ドメインは、コンビナトリアルライブラリー由来の親和性ペプチドまたはｄｅ  ｎｏｖｏに設計された親和性タンパク質／ペプチドを含み得る。
【００４８】
スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離する、スペーサー配列を含み得る。可動性スペーサーは、抗原結合ドメインが異なる方向で配向して、結合を促進することを可能にする。
【００４９】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８柄もしくはマウスＣＤ８柄を含み得る。スペーサーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８柄と類似の長さおよび／またはドメイン間隔あけ特性を有する代替的リンカー配列を代替的に含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変更され得る。
【００５０】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜を貫通するＣＡＲの配列である。
【００５１】
膜貫通ドメインは、膜中で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、数個の疎水性残基から構成されるアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインが、本発明の膜貫通部分を供給するために使用され得る。
【００５２】
タンパク質の膜貫通ドメインの存在およびスパンは、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）などのバイオインフォマティクスツールを使用して、当業者によって予測され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造、即ち、膜を貫通するのに十分な長さの疎水性アルファヘリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列であることを考慮すると、人工的に設計されたＴＭドメインもまた使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７０５２９０６Ｂ１に記載されるとおり）。
【００５３】
膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来し得、良好な受容体安定性を提供する。
【００５４】
活性化エンドドメイン
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。これは、ＣＡＲの細胞内ドメインの一部であり得るまたはそれと会合し得る。抗原認識の後、受容体はクラスター化し、ネイティブＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。最も一般に使用されるエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータのエンドドメインである。これは、抗原が結合した後に、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３−ゼータは、完全にコンピテントな活性化シグナルを提供しない場合があり、さらなる共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０が、増殖／生存シグナルを伝達するためにＣＤ３−ゼータと共に使用され得る、即ち、３つ全てが一緒に使用され得る。
【００５５】
ＣＡＲが活性化エンドドメインを含む場合、これは、ＣＤ３−ゼータエンドドメイン単独、ＣＤ２８もしくはＯＸ４０のいずれかのエンドドメインと共にＣＤ３−ゼータエンドドメイン、またはＣＤ２８エンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得る。
【００５６】
ＩＴＡＭモチーフを含む任意のエンドドメインが、活性化エンドドメインとして作用できる。
【００５７】
トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、標的抗原の断片を主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして認識することを担う、Ｔ細胞の表面上で見出される分子である。
【００５８】
ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖から構成されるヘテロダイマーである。ヒトでは、Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲは、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖（それぞれ、ＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）からなり、Ｔ細胞の５％において、ＴＣＲは、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）からなる。
【００５９】
各々の鎖は、２つの細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域から構成される。定常領域は、細胞膜に対して近位であり、その後に膜貫通領域および短い細胞質テイルが続き、可変領域は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の各々の可変ドメインは、３つの超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識を担う主要なＣＤＲである。ＴＣＲの定常ドメインは、短い接続配列からなり、この配列中で、システイン残基が、２つの鎖の間に連結を形成するジスルフィド結合を形成する。
【００６０】
ＴＣＲが抗原性ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と結合すると、Ｔリンパ球は、シグナル伝達を介して活性化される。
【００６１】
従来の抗体指向性標的抗原とは対照的に、ＴＣＲによって認識される抗原は、潜在的細胞内タンパク質のアレイ全体を含み得、これらのタンパク質は、プロセシングされ、ペプチド／ＭＨＣ複合体として細胞表面に送達される。
【００６２】
ベクターを使用してＴＲＡおよびＴＲＢ遺伝子；またはＴＲＧおよびＴＲＤ遺伝子を細胞中に人工的に導入することによって、異種（即ち、非ネイティブ）ＴＣＲ分子を発現するように細胞を操作することが可能である。かかる「異種」ＴＣＲは、本明細書で「トランスジェニックＴＣＲ」とも呼ばれ得る。例えば、遺伝子改変されたＴＣＲの遺伝子は、Ｔ細胞養子治療のために、自家Ｔ細胞中に再導入され得、患者中に戻し移入され得る。
【００６３】
標的抗原
「標的抗原」は、本明細書で使用される場合、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲがそれに対する特異性を有する抗原、即ち、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの抗原結合ドメインがそれに対する特異性を有するように操作された抗原を指す。
【００６４】
標的抗原は、疾患関連抗原であり得る。
【００６５】
適切には、標的抗原は、慢性感染と関連し得る。
【００６６】
適切には、標的抗原は、自己免疫と関連し得る。
【００６７】
標的抗原は、腫瘍関連抗原、例えば、がん関連抗原であり得る。
【００６８】
以下の表に示されるとおり、種々の標的抗原が公知である。本発明において使用される抗原結合ドメインは、本明細書に示される抗原に結合することが可能なドメインであり得る。
【表２】
2021509287.tif 000002
【００６９】
細胞
本発明は、本発明の方法によって取得可能な（または取得された）、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを含む遺伝子改変された細胞にも関する。
【００７０】
「細胞の出発集団」は、本明細書で使用される場合、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを含む遺伝子改変された細胞を産生するために使用される細胞の試料を指す。
【００７１】
細胞の出発集団は、血球または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の任意の供給源から取得され得る。供給源細胞は、新鮮に提供され得る、または使用前に凍結保存され得る。細胞の出発集団は、いずれのさらなる操作もなしに使用され得、または単離もしくは富化ステップの後に使用され得る。白血球を単離または富化するための方法は、当該分野で公知である。例えば、白血球またはＰＢＭＣは、種々の方法、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配媒体などを使用する密度勾配分離；磁気ビーズ分離、例えば、ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｙｎｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８ビーズ；水簸または任意の他の方法によって、全血から取得され得る。細胞の分離または単離は、自動化され得る、または手動で実施され得る。
【００７２】
細胞の出発集団は、血液由来、例えば、末梢血試料由来または生検由来であり得る。細胞の出発集団は、末梢血単核球であり得る。細胞の出発集団は、白血球除去物であり得る。
【００７３】
適切には、細胞の出発集団は、対象（第１者）から取得され得る。適切には、細胞の出発集団は、ドナー（第２者）から取得され得る。適切には、細胞の出発集団は、無関係のドナーであるドナー（第３者）から取得され得る。
【００７４】
あるいは、細胞は、例えば、Ｔ細胞への、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ分化に由来し得る。あるいは、その溶解機能を保持し、治療薬として作用し得る不死化細胞系が、使用され得る。
【００７５】
適切には、出発集団は、対象から取得された全血であり得る。適切には、出発集団は、対象から取得されたＰＢＭＣであり得る。適切には、出発集団は、対象から取得された白血球除去物であり得る。
【００７６】
適切には、出発集団は、ドナーから取得された全血であり得る。適切には、出発集団は、ドナーから取得されたＰＢＭＣであり得る。適切には、出発集団は、ドナーから取得された白血球除去物であり得る。
【００７７】
「枯渇された出発集団」は、本明細書で使用される場合、標的抗原を発現する細胞が出発集団から枯渇された後に残存する細胞の集団を指す。言い換えると、この出発集団は、標的抗原を発現する細胞が枯渇されている、即ち、枯渇された出発集団は、標的抗原枯渇されている。
【００７８】
「枯渇された」は、本明細書で使用される場合、特定の型の細胞（例えば、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞）が、数において選択的に低減されている、または細胞の集団から排除されていることを意味する。
【００７９】
「形質導入された細胞」は、本明細書で使用される場合、形質導入プロセスを受けた細胞集団を指す。細胞のこの集団は、首尾よく遺伝子改変された細胞および首尾よく遺伝子改変されていない細胞の混合物を含み得る。
【００８０】
「遺伝子改変された細胞」は、本明細書で使用される場合、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを含むまたは発現するように改変された細胞を意味する。細胞を操作するための方法は、当該分野で公知であり、これには、形質導入、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス形質導入による細胞の遺伝子改変が含まれる。
【００８１】
適切には、遺伝子改変された細胞は、そのゲノムが形質導入によって改変された細胞である。適切には、遺伝子改変された細胞は、そのゲノムがレトロウイルス形質導入によって改変された細胞である。適切には、遺伝子改変された細胞は、そのゲノムがレンチウイルス形質導入によって改変された細胞である。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「導入された」は、例えば形質導入によって、外来ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞中に挿入するための方法を指す。形質導入は、ウイルスベクターを介して外来ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞中に導入するプロセスである。
【００８３】
本発明に従う遺伝子改変された細胞は、ウイルスベクターによる形質導入によって、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成され得る。
【００８４】
細胞は、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、または抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の両方による処置によって、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列の導入前に、活性化および／または拡大増殖され得る。
【００８５】
細胞は、細胞溶解性免疫細胞であり得る。
【００８６】
「細胞溶解性免疫細胞」は、本明細書で使用される場合、他の細胞を直接死滅させる細胞である。細胞溶解性細胞は、がん性細胞；ウイルス感染細胞または他の損傷細胞を死滅させ得る。細胞溶解性免疫細胞には、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。
【００８７】
細胞溶解性免疫細胞は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の型であるＴ細胞またはＴリンパ球であり得る。Ｔ細胞は、その細胞表面上のＴＣＲの存在によって、他のリンパ球、例えば、Ｂ細胞およびＮＫ細胞から識別され得る。以下に要約されるように、種々の型のＴ細胞が存在する。
【００８８】
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞およびメモリーＢ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫プロセスにおいて、他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、その表面上にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原がＴＨ細胞に提示された場合、活性化される。これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌して異なる型の免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９またはＴＦＨを含むいくつかのサブタイプのうち１つへと分化し得る。
【００８９】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関与する。ＣＴＬは、その表面上にＣＤ８を発現する。ＣＴＬは、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知であり得る。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩと会合した抗原への結合によって、それらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態へと不活性化され得、これが、自己免疫性疾患、例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎を予防する。
【００９０】
メモリーＴ細胞は、感染が解決した後長期にわたって存続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。これらは、そのコグネート抗原への再曝露の際に多数のエフェクターＴ細胞へと迅速に拡大増殖し、こうして、免疫系に、過去の感染に対する「記憶（メモリー）」を提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプを含む：セントラルメモリー（central  memory）Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２つの型のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【００９１】
以前はサプレッサーＴ細胞として公知の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫学的寛容の維持に重要である。それらの主要な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫を免疫反応の終了に向けてシャットダウンすること、および胸腺における陰性選択のプロセスを逃避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【００９２】
２つの主要なクラスのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が記載されている  −  天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応または誘導性Ｔｒｅｇ細胞。
【００９３】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺において生じ、発生中のＴ細胞と、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって、他のＴ細胞から識別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞の発生を防止し、致死的な自己免疫性疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。
【００９４】
本明細書で使用される場合、用語「天然Ｔｒｅｇ」は、胸腺由来のＴｒｅｇを意味する。天然Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋ニューロピリン１＋である。ｉＴｒｅｇと比較して、ｎＴｒｅｇは、ＰＤ−１（プログラム細胞死−１、ｐｄｃｄ１）、ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）、Ｈｅｌｉｏｓ（Ｉｋｚｆ２）およびＣＤ７３の増加した発現を有する。ｎＴｒｅｇは、Ｈｅｌｉｏｓタンパク質またはニューロピリン１（Ｎｒｐ１）の発現に個々に基づいて、ｉＴｒｅｇから識別され得る。
【００９５】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、正常な免疫応答の間に生じ得る。
【００９６】
末梢で生成されたＴｒｅｇは、誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞と呼ばれ得る。
【００９７】
本明細書で使用される場合、用語「誘導性調節性Ｔ細胞」（ｉＴｒｅｇ）は、胸腺の外側で、成熟したＣＤ４＋の従来のＴ細胞から発生する、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ−ニューロピリン１−Ｔ細胞を意味する。例えば、ｉＴｒｅｇは、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの存在下で、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦＯＸＰ３−細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導され得る。
【００９８】
細胞は、Ｔ細胞、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞または調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり得る。
【００９９】
細胞は、自然免疫系の一部を形成する細胞溶解性細胞の１つの型であるナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的様式で、ウイルス感染細胞からの自然シグナルに対する迅速な応答を提供する。
【０１００】
ＮＫ細胞（自然リンパ系細胞の群に属する）は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、ＢおよびＴリンパ球を生成する共通のリンパ系前駆体から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺および胸腺において分化および成熟することが公知であり、次いでこの場所で、循環に入る。
【０１０１】
細胞は、幹細胞または前駆細胞であり得る。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、同じ型のより多くの幹細胞を無制限に生じることが可能な未分化細胞を意味し、これから、他の特殊化した細胞が、分化によって生じ得る。幹細胞は、多分化能性である。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞または成体幹細胞であり得る。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、用語「前駆細胞」は、１つまたは複数の型の細胞を形成するように分化することができるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの自己再生が限定された細胞を意味する。
【０１０４】
適切には、細胞は、細胞溶解性免疫細胞へと分化することが可能な任意の細胞であり得る。
【０１０５】
適切には、細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞へと分化することが可能であり得る。
【０１０６】
適切には、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）であり得る。適切には、細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞であり得る。適切には、細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。適切には、細胞は、臍帯血から取得され得る。適切には、細胞は、成体末梢血から取得され得る。
【０１０７】
一部の態様では、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、臍帯血から取得され得る。臍帯血は、当該分野で公知の技術に従って回収され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１４７，６２６号および同第７，１３１，９５８号）。
【０１０８】
一態様では、ＨＳＰＣは、多能性幹細胞供給源、例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）から取得され得る。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、用語「造血幹細胞および前駆細胞」または「ＨＳＰＣ」は、抗原性マーカーＣＤ３４を発現する細胞（ＣＤ３４＋）およびかかる細胞の集団を指す。特定の実施形態では、用語「ＨＳＰＣ」は、抗原性マーカーＣＤ３４の存在（ＣＤ３４＋）および系譜（ｌｉｎ）マーカーの非存在によって同定される細胞を指す。ＣＤ３４＋および／またはＬｉｎ（−）細胞を含む細胞の集団には、造血幹細胞および造血前駆細胞が含まれる。
【０１１０】
ＨＳＰＣは、大腿骨、寛骨、肋骨、胸骨および他の骨を含む成体の骨髄から取得または単離され得る。ＨＳＰＣを含む骨髄吸引物は、針およびシリンジを使用して、臀部から直接取得または単離され得る。ＨＳＰＣの他の供給源には、臍帯血、胎盤血、動員末梢血、ワルトン膠様質、胎盤、胎仔血液、胎仔肝臓または胎仔脾臓が含まれる。特定の実施形態では、治療適用における使用に十分な量のＨＳＰＣを回収することは、対象において幹細胞および前駆細胞を動員することを必要とし得る。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、用語「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」は、多能性状態へとリプログラムされた非多能性細胞を指す。対象の細胞が多能性状態へとリプログラムされると、細胞は次いで、所望の細胞型、例えば、造血幹細胞または前駆細胞（それぞれＨＳＣおよびＨＰＣ）へとプログラムされ得る。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、用語「リプログラムする」は、あまり分化していない状態へと細胞の潜在力を増加させる方法を指す。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「プログラムする」は、より分化した状態へと細胞の潜在力を減少させるまたは細胞を分化させる方法を指す。
【０１１４】
本発明は、標的抗原を発現しない細胞の亜集団が標的抗原を発現する細胞の亜集団よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）のウイルスベクターで、細胞の出発集団（これは、標的抗原を発現する細胞の亜集団および標的抗原を発現しない細胞の亜集団を含む）を形質導入することによって作製された細胞の組成物を提供する。
【０１１５】
本発明はまた、
（ｉ）細胞の出発集団を提供するステップ；
（ｉｉ）標的抗原を発現する細胞の上記出発集団を枯渇させるステップ；および
標的抗原を発現しない細胞が標的抗原を発現する残りの細胞よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）の、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するウイルスベクターで、標的抗原枯渇細胞を形質導入するステップ
によって作製された細胞の組成物を提供する。
【０１１６】
細胞の集団は、形質導入ステップの前に活性化されていてもいなくてもよい。
【０１１７】
一実施形態では、（ｉｉｉ）枯渇された出発集団中の細胞中に、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列を導入するステップは、（ｉｉ）標的抗原を発現する細胞の上記出発集団を枯渇させるステップと連続して実施される。
【０１１８】
一実施形態では、（ｉｉｉ）枯渇された出発集団中の細胞中に、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列を導入するステップは、（ｉｉ）標的抗原を発現する細胞の上記出発集団を枯渇させるステップの後に実施される。
【０１１９】
必要に応じて、この方法は、（ｉｉ）（標的抗原を発現する細胞の下記出発集団を枯渇させるステップ）の前に、（ｉｉｉ）（枯渇された出発集団中の細胞中に、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列を導入するステップ）を実施することを含み得る、即ち、標的抗原に対するＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列は、細胞から標的抗原を発現する細胞が枯渇される前に、細胞中に導入され得る。
【０１２０】
必要に応じて、この方法は、対象由来の試料を含む細胞を単離するステップをさらに含み得る。試料を含むこの細胞は、細胞の出発集団として使用され得る。
【０１２１】
必要に応じて、本発明における使用のための細胞は、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列の導入前に、活性化および／または拡大増殖され得る。
【０１２２】
細胞を活性化および／または拡大増殖するための当該分野で公知の任意の方法が、本発明の方法において使用され得る。例えば、本発明における使用のための細胞、例えば、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、または抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の両方による処置によって、活性化および／または拡大増殖され得る。
【０１２３】
適切には、インターロイキン７（ＩＬ−７）および／またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５）が、細胞、例えば、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖させるために使用され得る。適切には、インターロイキン２（ＩＬ−２）が、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの拡大増殖のために使用され得る。
【０１２４】
本発明における使用のためのＮＫ細胞は、サイトカイン、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）および／またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５）による処置によって、活性化および／または拡大増殖され得る。アクセサリー細胞、例えば、単球、Ｂリンパ芽球様細胞、または刺激分子を発現する細胞系とのインキュベーションが、ＮＫ細胞の拡大増殖のためのさらなるシグナルを提供するために使用され得る。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「活性化された」は、細胞が刺激されて、細胞の増殖、分化またはエフェクター機能の開始を引き起こすことを意味する。
【０１２６】
細胞活性化を測定するための方法は、当該分野で公知であり、これには、例えば、フローサイトメトリーによって活性化マーカーの発現、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ３８もしくはＨＬＡ−ＤＲの発現を測定すること、または細胞内サイトカインを測定することが含まれる。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「拡大増殖された」は、細胞または細胞の集団が、増殖するように誘導されたことを意味する。
【０１２８】
細胞の集団の拡大増殖は、例えば、集団中に存在する細胞の数を計数することによって測定され得る。細胞の表現型は、当該分野で公知の方法、例えば、フローサイトメトリーによって決定され得る。
【０１２９】
一態様では、本発明に従う方法は、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックＴ細胞受容体を含む操作された細胞（例えば、遺伝子改変された細胞）の集団を産生する。
【０１３０】
適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞または遺伝子改変された細胞の集団は、本発明に従う方法によって作製され得る。
【０１３１】
一態様では、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（例えば、取得された）遺伝子改変された細胞の集団は、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞よりも、分化していない。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「分化した」は、その細胞型の分化の直線的な進行の範囲内の特定の細胞の発生の段階を指す。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、それらの分化状態に基づいて、別個のメモリーサブセットへとカテゴライズされ得る。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞からセントラルメモリーおよびエフェクターメモリー細胞集団への分化の進行性の経路に従う。ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化状態は、増殖し存続するそれらの能力と逆相関している。
【０１３３】
前臨床研究は、遺伝子改変されたＴ細胞が分化の初期段階（例えば、ナイーブまたはセントラルメモリー細胞）にある場合に、改善された抗腫瘍応答が達成されることを示唆している。セントラルメモリー細胞は、エフェクターメモリー細胞と比較して、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ存続性を有する。
【０１３４】
一態様では、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な遺伝子改変された細胞の集団は、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞よりも、ナイーブである。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「ナイーブ」は、完全には分化していない細胞を意味する。ナイーブＴ細胞は、抗原に遭遇していない可能性がある。
【０１３６】
ナイーブＴ細胞は、Ｌセレクチン（selection）（ＣＤ６２Ｌ）の表面発現、活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ４４またはＣＤ６９の非存在、およびメモリーＣＤ４５ＲＯアイソフォームの非存在によって特徴付けられ得る、例えば、ナイーブＴ細胞は、ＣＤ６２ＬＨｉＣＤ２５ＬｏＣＤ４４ＬｏＣＤ６９Ｌｏであり得る。ナイーブＴ細胞は、サブユニットＩＬ−７受容体−α、ＣＤ１２７、および共通のγ鎖であるＣＤ１３２からなる機能的ＩＬ−７受容体もまた発現する。
【０１３７】
一態様では、ナイーブ細胞サブセットは、ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋細胞として定義され得る。適切には、ナイーブ細胞サブセットは、ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ２７＋細胞としてさらに定義され得る。
【０１３８】
適切には、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（例えば、取得された）遺伝子改変された細胞は、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、高いＭＯＩのウイルスベクターを用いて調製されたおよび／またはＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞と比較して、ＣＤ２７および／またはＣＤ６２Ｌの増加した発現を有し得る。
【０１３９】
理論に束縛されることは望まないが、よりナイーブなまたは未成熟な遺伝子改変された細胞集団は、治療における使用のために有利であるが、それは、ナイーブ細胞が、より分化した表現型を有する細胞と比較した場合に、増強されたｉｎ  ｖｉｖｏ存続性および増強された細胞溶解活性を示すからである。
【０１４０】
適切には、本発明に従う方法は、高いＭＯＩを使用するおよび／またはＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させない方法よりも多くのナイーブなまたはセントラルメモリー細胞を産生し得る。適切には、遺伝子改変された細胞の少なくとも７５％が、ナイーブまたはセントラルメモリー細胞であり得る。適切には、遺伝子改変された細胞の少なくとも８０％が、ナイーブまたはセントラルメモリー細胞であり得る。適切には、遺伝子改変された細胞の少なくとも８５％が、ナイーブまたはセントラルメモリー細胞であり得る。
【０１４１】
適切には、本発明に従う方法は、高いＭＯＩを使用するおよび／またはＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させない方法よりも少ないエフェクターおよびエフェクターメモリー細胞を産生し得る。適切には、遺伝子改変された細胞の２５％未満が、エフェクターまたはエフェクターメモリー細胞であり得る。適切には、遺伝子改変された細胞の２０％未満が、エフェクターまたはエフェクターメモリー細胞であり得る。適切には、遺伝子改変された細胞の１５％未満が、エフェクターまたはエフェクターメモリー細胞であり得る。
【０１４２】
一態様では、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（または取得された）遺伝子改変された細胞の集団は、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、高いＭＯＩのウイルスベクターを用いて調製されたおよび／またはＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞と比較して、疲弊していない。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「疲弊」または「疲弊した」は、細胞が、減少したエフェクター機能および／または変更された表現型を示すことを意味する。免疫細胞疲弊は、通常は腫瘍または慢性感染の状況下にある免疫細胞の機能不全の状態を記述する。疲弊には、表現型変化、エピジェネティック改変および転写プロファイルにおける変更が伴い得る。
【０１４４】
エフェクター機能には、エフェクターサイトカインの産生および直接的細胞傷害活性が含まれ得る。
【０１４５】
適切には、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（または取得された）遺伝子改変された細胞の集団は、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、高いＭＯＩのウイルスベクターを用いて調製されたおよび／またはＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞と比較して、１つまたは複数の疲弊マーカーの減少した発現を有し得る。
【０１４６】
例えば、ＮＫ細胞の文脈では、エフェクター機能には、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生が含まれ得る。ＮＫ細胞の他のエフェクター機能には、直接的細胞傷害活性、例えば、パーフォリンおよびグランザイムに依存する活性、または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）による標的細胞アポトーシスの誘導が含まれる。
【０１４７】
適切には、疲弊したＮＫ細胞は、非疲弊ＮＫ細胞と比較して、減少した量のエフェクターサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γを産生し得る。適切には、疲弊したＮＫ細胞は、非疲弊ＮＫ細胞と比較して、減少した細胞溶解活性を有し得、例えば、減少した量のＣＤ１０７ａおよび／またはグランザイムＢおよび／またはパーフォリンを産生し得る。
【０１４８】
適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢおよびパーフォリンからなる群から選択され得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢおよびパーフォリンからなる群から選択され得、ここで、遺伝子改変された細胞は、ＮＫ細胞である。
【０１４９】
適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、減少したＩＦＮ−γ産生を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、減少したＴＮＦ−α産生を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＦＡＳＬの減少した発現を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＴＲＡＩＬの減少した発現を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＣＤ１０７ａの減少した発現を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、グランザイムＢの減少した産生を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、パーフォリンの減少した産生を含み得る。
【０１５０】
例えば、Ｔ細胞の文脈では、疲弊は、機能的なエフェクターまたはメモリーＴ細胞のものとは異なる、不十分なエフェクター機能、阻害性受容体の持続性の発現および／または転写状態によって定義され得る。例えば、疲弊したＴ細胞は、高レベルのＰＤ１、Ｔｉｍ３、Ｌａｇ３、ＣＤ４３（１Ｂ１１）、ＣＤ６９および阻害性受容体を発現し得るが、低レベルのＣＤ６２ＬおよびＣＤ１２７を発現し得、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を減少させ得る。
【０１５１】
適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＰＤ１の増加した（例えば、高い）発現を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、Ｔｉｍ３の増加した（例えば、高い）発現を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、Ｌａｇ３の増加した（例えば、高い）発現を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＣＤ４３（１Ｂ１１）の増加した（例えば、高い）発現を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＣＤ６９の増加した（例えば、高い）発現を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、阻害性受容体の増加した（例えば、高い）発現を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＣＤ６２Ｌの減少した（例えば、低い）発現を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＣＤ１２７の減少した（例えば、低い）発現を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、標的が遭遇した際の、減少した（例えば、低い）ＩＬ−２産生を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、標的が遭遇した際の、減少した（例えば、低い）ＴＮＦ−α産生を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、標的が遭遇した際の、減少した（例えば、低い）ＩＦＮ−γ産生を含み得る。
【０１５２】
適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＰＤ１、Ｌａｇ３およびＴｉｍ３からなる群から選択され得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＰＤ１を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、Ｌａｇ３を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、Ｔｉｍ３を含み得る。適切には、１つまたは複数の疲弊マーカーは、ＰＤ１、Ｌａｇ３およびＴｉｍ３からなる群から選択され得、ここで、遺伝子改変された細胞は、Ｔ細胞である。
【０１５３】
一態様では、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（または取得された）遺伝子改変された細胞の集団の１０％よりも多く、１５％よりも多く、２０％よりも多く、２５％よりも多く、３０％よりも多くまたは３５％よりも多くが、ナイーブ（ＣＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）およびＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ２７＋であり得る。適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞の１０％よりも多くが、ナイーブ（ＣＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）およびＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ２７＋であり得る。適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞の１５％よりも多くが、ナイーブ（ＣＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）およびＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ２７＋であり得る。適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞の２０％よりも多くが、ナイーブ（ＣＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）およびＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ２７＋であり得る。適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞の３０％よりも多くが、ナイーブ（ＣＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）およびＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ２７＋であり得る。適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞の４０％よりも多くが、ナイーブ（ＣＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）およびＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ２７＋であり得る。
【０１５４】
適切には、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット中のナイーブ細胞の割合が測定され得る。
【０１５５】
一態様では、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（または取得された）遺伝子改変された細胞の集団の３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満が、複数の疲弊マーカーを発現し得る。適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞の３０％未満が、複数の疲弊マーカーを示し得る。適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞の２５％未満が、複数の疲弊マーカーを示し得る。適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞の２０％未満が、複数の疲弊マーカーを示し得る。適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞の１５％未満が、複数の疲弊マーカーを示し得る。
【０１５６】
適切には、複数の疲弊マーカーは、ＰＤ１、Ｔｉｍ３、Ｌａｇ３、ＣＤ４３（１Ｂ１１）、ＣＤ６９および阻害性受容体の増加した発現（例えば、高いレベル）ならびにＣＤ６２ＬおよびＣＤ１２７の減少した発現（例えば、低いレベル）ならびに減少した（例えば、低い）インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生から選択され得る。適切には、複数の疲弊マーカーは、Ｌａｇ３、ＰＤ１およびＴｉｍ３の増加した発現（例えば、高いレベル）から選択され得る。
【０１５７】
一態様では、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（または取得された）遺伝子改変された細胞の集団は、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、高いＭＯＩのウイルスベクターを用いて調製されたおよび／またはＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞と比較して、増加したレベルのＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲ形質導入効率を有する。
【０１５８】
適切には、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（または取得された）遺伝子改変された細胞の集団における形質導入効率のレベルは、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、高いＭＯＩのウイルスベクターを用いて調製されたおよび／またはＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞の形質導入効率よりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高くてもよい。
【０１５９】
適切には、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（または取得された）遺伝子改変された細胞の集団における形質導入効率のレベルは、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、高いＭＯＩのウイルスベクターを用いて調製されたおよび／またはＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞の形質導入効率よりも、少なくとも５０％高くてもよい。適切には、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（または取得された）遺伝子改変された細胞の集団における形質導入効率のレベルは、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、高いＭＯＩのウイルスベクターを用いて調製されたおよび／またはＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞の形質導入効率よりも、少なくとも６０％高くてもよい。適切には、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（または取得された）遺伝子改変された細胞の集団における形質導入効率のレベルは、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、高いＭＯＩのウイルスベクターを用いて調製されたおよび／またはＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞の形質導入効率よりも、少なくとも７０％高くてもよい。適切には、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（または取得された）遺伝子改変された細胞の集団における形質導入効率のレベルは、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、高いＭＯＩのウイルスベクターを用いて調製されたおよび／またはＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞の形質導入効率よりも、少なくとも８０％高くてもよい。適切には、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な（または取得された）遺伝子改変された細胞の集団における形質導入効率のレベルは、本発明の方法に従って調製されなかった、即ち、高いＭＯＩのウイルスベクターを用いて調製されたおよび／またはＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させることなしに調製された遺伝子改変された細胞の形質導入効率よりも、少なくとも９０％高くてもよい。
【０１６０】
一態様では、形質導入またはトランスフェクトされた細胞の集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％または少なくとも６０％が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを含む。適切には、形質導入またはトランスフェクトされた細胞の集団の少なくとも４０％が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを含む。適切には、形質導入またはトランスフェクトされた細胞の集団の少なくとも５０％が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを含む。適切には、形質導入またはトランスフェクトされた細胞の集団の少なくとも６０％が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを含む。
【０１６１】
適切には、標的抗原を発現する、ＣＡＲまたはトランスジェニックＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされた細胞のパーセンテージは、５％未満である。適切には、標的抗原を発現する、ＣＡＲまたはトランスジェニックＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされた細胞のパーセンテージは、３％未満である。適切には、標的抗原を発現する、ＣＡＲまたはトランスジェニックＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされた細胞のパーセンテージは、２％未満である。適切には、標的抗原を発現する、ＣＡＲまたはトランスジェニックＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされた細胞のパーセンテージは、１％未満である。適切には、標的抗原を発現する、ＣＡＲまたはトランスジェニックＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされた細胞のパーセンテージは、検出不能である。
【０１６２】
ウイルスベクター
レトロウイルスおよびレンチウイルスは、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）または複数のＮＯＩの、標的細胞への移入のためのベクターまたは送達系として使用され得る。移入は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行われ得る。この様式で使用される場合、ウイルスは、典型的には、ウイルスベクターと呼ばれる。
【０１６３】
ガンマ−レトロウイルスベクターは、１９９０年に遺伝子治療の臨床試験において使用された最初の第１のウイルスベクターであり、今も一般的に使用されている。より最近では、複雑なレトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来するレンチウイルスベクターへの興味が、非分裂細胞を形質導入するその能力に起因して高まっている。遺伝子移入ツールとしてのレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターの最も魅力的な特色には、大きい遺伝子ペイロード（最大で９ｋｂ）の収容能力、最小の患者免疫応答、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの高い形質導入効率、ならびに標的細胞の遺伝子内容を恒久的に改変して、送達された遺伝子の長期発現を持続させる能力が含まれる。
【０１６４】
本発明の方法における使用のためのレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは、遺伝情報を真核生物細胞に送達することができる任意の適切なレトロウイルスまたはレンチウイルスに基づき得る。例えば、レトロウイルスベクターは、アルファレトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクターまたはスプーマレトロウイルスベクターであり得る。レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または非霊長類レンチウイルス、例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づき得る。
【０１６５】
ウイルスベクターは、シュードタイプ化ウイルスベクターを生じる異種ウイルスエンベロープ糖タンパク質を含み得る。例えば、ウイルスエンベロープ糖タンパク質は、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）に由来し得る。
【０１６６】
方法
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を含むウイルスベクターで細胞を形質導入するための方法が提供される。
【０１６７】
細胞治療のための遺伝子改変された細胞の集団を調製する方法は、当該分野で一般に公知である。細胞治療のための遺伝子改変された細胞を調製する方法は、以下のステップのうち一部または全てを含み得る：
【０１６８】
出発材料は、最初に凍結され得る、例えば、細胞の出発集団は、ドナー、例えば、細胞の供給源から取得されると、凍結され得る。凍結された材料が使用される場合、解凍および必要に応じた休止期間が、次のステップに進行する前に行われ得る。あるいは、新鮮な出発材料が使用され得る。出発材料は、Ｔ細胞からの白血球の最初の精製／富化（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ勾配）を受け得る。
【０１６９】
次いで、出発材料は、活性化され得る、例えば、Ｔ細胞は、活性化され得る。これは、当該分野で公知の任意の方法によって、例えば、可溶性ＣＤ３／ＣＤ２８抗体またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）またはＣＤ３／２８ナノマトリックス（例えば、ＴｒａｎｓＡｃｔ）を使用して、実施され得る。当該分野で理解されるように、活性化ステップの長さは、例えば、次のステップに進行する前の１時間未満から７２時間を超えるまでにわたり、変動され得る。
【０１７０】
次いで、活性化された細胞は、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス）で形質導入され得る。これは、形質導入エンハンサー（例えば、ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎまたはポリブレン）の存在下で、またはスピノキュレーション（spinoculation）によって、または単純なインキュベーションによって、実施され得る。非ウイルスベクターもまた、遺伝子改変ステップ（例えば、ＲＮＡ電気穿孔、またはＤＮＡを使用する転位を使用する）のために使用され得る。
【０１７１】
次いで、細胞は、必要とされる細胞の最終用量に依存して、数時間から数日間まで持続し得る拡大増殖ステップを受け得る。一般に、必要とされる細胞が多いほど、拡大増殖ステップは長くなる。
【０１７２】
製造プロセスの終了時の細胞は、新鮮に使用され得、または好ましくは、使用前に凍結され得る。
【０１７３】
従って、プロセス全体は、２〜１８日間かかり得る。典型的には、プロセス全体は、６〜１０日間かかる。
【０１７４】
プロセスの間に、細胞は、さらなる補充物を含み得る細胞成長培地中で培養され得る。かかる補充物は、ヒト血清、胎仔ウシ血清、ヒト血清アルブミンおよび／またはサイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ７および／またはＩＬ１５、ＩＬ２１）であり得る。
【０１７５】
「ＭＯＩ」／「感染多重度」は、本明細書で使用される場合、形質導入において使用される細胞１つ当たりの感染性ベクター粒子の数を示す。例えば、１のＭＯＩは、１０４個の細胞への１０４個の感染性ベクター粒子の添加を意味する。感染性粒子の数は、許容状態の細胞系に対するウイルスベクターの滴定によって取得される。
【０１７６】
適切には、形質導入された細胞型は、滴定に使用されたものと同じ細胞型であり得る。この場合、１のＭＯＩは、定量的ＰＣＲまたは他の適切な方法によって推定される、細胞１つ当たりのベクター組込みの平均数１を生じるはずである。
【０１７７】
細胞は、低い感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入され得る。例えば、標的抗原陽性細胞を枯渇させない方法によって調製された細胞を形質導入するために必要とされるＭＯＩと比較して低いＭＯＩが、特定のレベルの細胞形質導入を達成するために、本発明の方法において使用され得る。
【０１７８】
有利には、より低いＭＯＩで細胞の集団を形質導入することは、標的抗原を発現しない細胞の形質導入を可能にしつつ、標的抗原を発現する細胞の形質導入を防止する。
【０１７９】
適切には、ＭＯＩは、標的抗原を発現しない細胞が形質導入され、標的抗原を発現する細胞が形質導入されないように選択される。適切には、ＭＯＩは、標的抗原を発現しない細胞が標的抗原を発現する細胞よりも高い程度まで形質導入されるように選択される。遺伝子改変された細胞の集団は、形質導入前の細胞よりも、より高い比率の、標的抗原を発現しない細胞：標的抗原を発現する細胞を有し得る。
【０１８０】
適切には、ＭＯＩは、標的抗原を発現しない細胞の少なくとも５％が形質導入され、標的抗原を発現する細胞が形質導入されないように選択される。
【０１８１】
適切には、ＭＯＩは、標的抗原を発現しない細胞の少なくとも１０％が形質導入され、標的抗原を発現する細胞が形質導入されないように選択される。適切には、ＭＯＩは、標的抗原を発現しない細胞の少なくとも１５％が形質導入され、標的抗原を発現する細胞が形質導入されないように選択される。
【０１８２】
適切には、ＭＯＩは、標的抗原を発現しない細胞の少なくとも２０％が形質導入され、標的抗原を発現する細胞が形質導入されないように選択される。
【０１８３】
標的抗原を発現する細胞は、かかる細胞が検出不能である、または最小のもしくは非常に低いレベル、例えば、１％もしくはそれよりも低いレベルで形質導入されているという点で、「形質導入されていない」場合がある。
【０１８４】
適切には、本発明の方法は、有利には、形質導入のための低いＭＯＩの使用を可能にし得る。適切には、標的抗原陰性細胞の２０〜３０％の形質導入を達成するために必要とされるＭＯＩは、本発明の方法では、標的抗原陽性細胞を枯渇させない対応する方法よりも低くてもよい。
【０１８５】
理論に束縛されることは望まないが、本発明の方法は、より低いＭＯＩが形質導入のために必要とされるので、遺伝子改変された細胞の製造に安全性の恩恵を提供し得る。有利には、標的抗原を発現する細胞は、本発明の方法によって形質導入されなくてもよいまたは最小の／非常に低いレベルで形質導入され得る。
【０１８６】
適切には、ＭＯＩは、標的抗原を発現しない細胞の約１０〜５０％の形質導入を達成するために選択され得る。適切には、ＭＯＩは、標的抗原を発現しない細胞の約１５〜４０％の形質導入を達成するために選択され得る。適切には、ＭＯＩは、標的抗原を発現しない細胞の約２０〜３０％の形質導入を達成するために選択され得る。
【０１８７】
標的抗原を発現しない細胞の形質導入を可能にしつつ標的抗原を発現する細胞の形質導入を防止するＭＯＩ範囲は、ウイルスベクターのエンベロープタンパク質に依存する。
【０１８８】
ＲＤ１１４エンベロープタンパク質によってシュードタイプ化されたウイルスベクターについて、適切には、ＭＯＩは、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１または約１．２であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約０．１〜１．２であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約０．２〜１．０であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約０．３〜０．８であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約０．４〜０．６であり得る。
【０１８９】
ＲＤ１１４エンベロープタンパク質によってシュードタイプ化されたウイルスベクターについて、適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩは、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１または約１．２であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約０．１〜１．２であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約０．２〜１．０であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約０．３〜０．８であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約０．４〜０．６であり得る。
【０１９０】
ＧＡＬＶエンベロープタンパク質によってシュードタイプ化されたウイルスベクターについて、適切には、ＭＯＩは、約０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５または約２であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約０．５〜２であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約０．８〜１．８であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約１〜２であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約１．４〜１．６であり得る。
【０１９１】
ＧＡＬＶエンベロープタンパク質によってシュードタイプ化されたウイルスベクターについて、適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩは、約０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５または約２であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約０．５〜２であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約０．８〜１．８であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約１〜２であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約１．４〜１．６であり得る。
【０１９２】
ＶＳＶ−Ｇによってシュードタイプ化されたウイルスベクターについて、適切には、ＭＯＩは、約３、４、５、６、７、８、９または約１０であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約３〜１０であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約４〜１０であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約５〜１０であり得る。適切には、ＭＯＩ範囲は、約６〜８であり得る。
【０１９３】
ＶＳＶ−Ｇによってシュードタイプ化されたウイルスベクターについて、適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩは、約３、４、５、６、７、８、９または約１０であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約３〜１０であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約４〜１０であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約５〜１０であり得る。適切には、約２０〜３０％の形質導入を達成するためのＭＯＩ範囲は、約６〜８であり得る。
【０１９４】
適切には、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲ標的抗原陽性細胞のパーセンテージは、出発集団よりも、枯渇された出発集団または遺伝子改変された細胞の集団において低い場合がある。
【０１９５】
適切には、標的抗原陽性細胞のパーセンテージは、出発集団中の標的抗原陽性細胞のパーセンテージと比較した場合、枯渇された出発集団または遺伝子改変された細胞の集団において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％低減され得る。適切には、標的抗原陽性細胞のパーセンテージは、少なくとも９０％低減され得る。適切には、標的抗原陽性細胞のパーセンテージは、少なくとも９５％低減され得る。適切には、抗原陽性細胞のパーセンテージは、少なくとも９８％低減され得る。適切には、抗原陽性細胞のパーセンテージは、出発集団中の標的抗原陽性細胞のパーセンテージと比較した場合、枯渇された出発集団または遺伝子改変された細胞の集団において、少なくとも９９％低減され得る。
【０１９６】
適切には、枯渇された出発集団の４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現し得る。
【０１９７】
適切には、枯渇された出発集団の１０％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現し得る。
【０１９８】
適切には、枯渇された出発集団の５％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現し得る。
【０１９９】
適切には、枯渇された出発集団の３％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現し得る。
【０２００】
適切には、枯渇された出発集団の２％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現し得る。
【０２０１】
適切には、枯渇された出発集団の１％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現し得る。
【０２０２】
適切には、遺伝子改変された細胞の１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現し得る。
【０２０３】
適切には、遺伝子改変された細胞の１０％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現し得る。
【０２０４】
適切には、遺伝子改変された細胞の５％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現し得る。
【０２０５】
適切には、遺伝子改変された細胞の１％未満が、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現し得る。
【０２０６】
医薬組成物
本発明は、本発明の遺伝子改変された細胞または本発明に従う遺伝子改変された細胞の集団を含む医薬組成物にも関する。
【０２０７】
一態様では、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な遺伝子改変された細胞の集団を含む医薬組成物が提供される。
【０２０８】
適切には、医薬組成物は、本発明に従うまたは本発明に従う方法によって取得可能な、凍結保存された遺伝子改変された細胞を含み得る。
【０２０９】
医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。医薬組成物は、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を必要に応じて含み得る。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。
【０２１０】
適切には、細胞の出発集団は、前もって凍結されていてもよい。凍結された細胞が使用される場合、細胞は、解凍され得、必要に応じて、処理される前に培養物中で回復させられ得る。
【０２１１】
この方法は、白血球について出発集団を富化するステップをさらに含み得る。白血球を単離または富化するための当該分野で公知の任意の方法が使用され得る。例えば、白血球またはＰＢＭＣは、種々の方法、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配媒体などを使用する密度勾配分離；磁気ビーズ分離、例えば、ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｙｎｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８ビーズ；水簸または任意の他の方法によって、全血から取得され得る。細胞の分離または単離は、自動化され得る、または手動で実施され得る。
【０２１２】
処置の方法
本発明の遺伝子改変された細胞は、標的細胞、例えば、がん細胞、ウイルス感染細胞または他の損傷細胞を死滅させることが可能であり得る。
【０２１３】
本発明の遺伝子改変された細胞は、治療において使用され得る。本発明の遺伝子改変された細胞は、疾患の処置および／または予防のために使用され得る。適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞を含む医薬組成物は、治療において使用され得る。適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞を含む医薬組成物は、疾患の処置および／または予防のために使用され得る。
【０２１４】
ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原は、必要とされる治療に基づいて選択されることが理解される。例えば、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲががんを処置するためのものである場合、このＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原は、がんに関連する抗原であり得る。
【０２１５】
本発明の遺伝子改変された細胞は、感染、例えば、ウイルス感染の処置のために使用され得る。
【０２１６】
本発明の遺伝子改変された細胞は、例えば、自己免疫性疾患、アレルギーおよび移植片対宿主拒絶において、病原性免疫応答の制御のためにも使用され得る。
【０２１７】
本発明は、本発明の方法によって作製された細胞組成物を対象に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。
【０２１８】
本発明は、本発明の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。
【０２１９】
本発明は、疾患を処置および／または予防する際の使用のための、本発明の方法によって作製された細胞組成物もまた提供する。
【０２２０】
本発明は、疾患を処置および／または予防する際の使用のための、本発明の医薬組成物もまた提供する。
【０２２１】
本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における、本発明に従う遺伝子改変された細胞または細胞組成物の使用にも関する。
【０２２２】
適切には、本発明の処置の方法は、本発明の医薬組成物の、対象への投与に関し得る。
【０２２３】
適切には、本発明は、
（ｉ）細胞の出発集団を含む試料を提供するステップ；
（ｉｉ）標的抗原を発現する細胞の上記出発集団を枯渇させるステップ；
（ｉｉｉ）標的抗原を発現しない細胞が標的抗原を発現する残りの細胞よりも高い程度まで形質導入されるような感染多重度（ＭＯＩ）の、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するウイルスベクターで、標的抗原枯渇細胞を形質導入するステップ；および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）からの細胞を対象に投与するステップ
を含む、処置の方法を提供する。
【０２２４】
適切には、この方法は、患者への投与の前に、細胞の拡大増殖ステップをさらに含み得る、例えば、細胞は、患者への投与の前に培養され得る。
【０２２５】
本発明の遺伝子改変された細胞または医薬組成物は、がん性疾患、例えば、血液学的悪性疾患、膀胱がん、乳房がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞）、肺がん、黒色腫、膵臓がん、前立腺がんおよび甲状腺がん、舌、口および咽頭のがんを含む、口腔および咽頭のがん；食道、胃および結腸直腸がんを含む、消化器系のがん；肝細胞癌および胆管細胞癌を含む、肝臓および胆樹のがん；気管支原性がんおよび喉頭のがんを含む、呼吸器系のがん；骨肉腫を含む、骨および関節のがん；黒色腫を含む皮膚のがん；乳房がん；女性における子宮、卵巣および子宮頚がん、男性における前立腺および精巣がんを含む、生殖器のがん；腎細胞癌および尿道（utterers）または膀胱の移行上皮癌を含む、泌尿器（renal  tract）のがん；神経膠腫、多形神経膠芽腫および髄芽腫（medullobastoma）を含む脳がん；甲状腺がん、副腎癌、および多発性内分泌腫瘍症候群に関連するがんを含む、内分泌系のがん；ならびに神経芽細胞腫を含む、他のおよび不特定の部位のがんの、処置および／または予防のために使用され得る。
【０２２６】
適切には、本発明の遺伝子改変された細胞または医薬組成物は、血液学的悪性疾患の処置および／または予防のために使用され得る。
【０２２７】
本明細書で使用される場合、「血液学的悪性疾患」は、血液およびリンパ系を侵すがんを指し、これには、白血病、リンパ腫、骨髄腫および関連の血液障害が含まれる。
【０２２８】
適切には、本発明の遺伝子改変された細胞または医薬組成物は、血液学的悪性疾患の処置および／または予防のために使用され得る。
【０２２９】
適切には、本発明の遺伝子改変された細胞または医薬組成物は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（acute  premyelocytic  leukaemia）（ＡＰＬ）およびＢまたはＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（acute  lympoblastic  leukaemia）（それぞれ、Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）および大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬＬ）；ホジキンリンパ腫、ならびに低悪性度ＮＨＬおよび高悪性度ＮＨＬの両方の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む、リンパ腫；くすぶり型または無症候性骨髄腫および症候性骨髄腫を含む骨髄腫（多発性骨髄腫（ＭＭ））、ならびに血液がんと関連する他の状態、例えば、意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、骨髄異形成症候群（myelodysplastic  sydrome）（ＭＤＳ）、孤立性形質細胞腫、ならびに本態性血小板血症（ＥＴ）、骨髄線維症（ＭＦ）および真性赤血球増加症（ＰＶ）を含む骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）を含む、急性および慢性の両方の、骨髄性またはリンパ系の白血病の処置および／または予防において使用され得る。
【０２３０】
適切には、本発明の遺伝子改変された細胞または医薬組成物は、Ｔ細胞リンパ腫の処置および／または予防において使用され得る。適切には、本発明の遺伝子改変された細胞または医薬組成物は、Ｔ細胞白血病の処置および／または予防において使用され得る。
【０２３１】
Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を処置するための方法は、本発明の遺伝子改変された細胞の治療的使用に関する。遺伝子改変された細胞は、疾患に関連する少なくとも１つの症状を低下、低減もしくは改善させるため、および／または疾患の進行を減速、低減もしくは遮断するために、Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病の既存の疾患を有する対象に投与され得る。
【０２３２】
適切には、本発明の方法は、β定常領域を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞のクローン性拡大増殖に関連する任意のリンパ腫および／または白血病の処置のために使用され得る。このように、本発明は、ＴＲＢＣ、例えば、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を含むＴＣＲを発現する悪性Ｔ細胞が関与する疾患を処置するための方法に関し得る。
【０２３３】
適切には、本発明の方法は、悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣを含むＴＣＲを発現するＴ細胞リンパ腫を処置するために使用され得る。「リンパ腫」は、リンパ節において典型的には発症するが、脾臓、骨髄、血液および他の臓器もまた侵し得るがんを指すために、その標準的な意味に従って本明細書で使用される。リンパ腫は、典型的には、リンパ系細胞の固形腫瘍として存在する。リンパ腫に関連する主要な症状は、リンパ節腫大であるが、続発性（Ｂ）症状には、発熱、寝汗、体重減少、食欲低下、疲労、呼吸促迫およびそう痒感が含まれ得る。
【０２３４】
本発明の方法は、悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣを含むＴＣＲを発現するＴ細胞白血病を処置するために使用され得る。「白血病」は、血液または骨髄のがんを指すために、その標準的な意味に従って本明細書で使用される。
【０２３５】
以下は、本発明の方法によって処置され得る疾患の包括的でない例示的なリストである。
【０２３６】
適切には、Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型（peripheral  T-cell  lymphoma,  not  otherwise  specified）（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）であり得る。適切には、Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）であり得る。適切には、Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）であり得る。適切には、Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）であり得る。適切には、Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）であり得る。適切には、Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型であり得る。適切には、Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）であり得る。適切には、Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、原発性皮膚（ＡＬＣＬ）であり得る。適切には、Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病であり得る。適切には、Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病であり得る。
【０２３７】
本発明の遺伝子改変された細胞または本発明に従う医薬組成物による処置は、標準的なアプローチで生じる場合が多い腫瘍細胞の逃避または解放を予防することを助け得る。
【０２３８】
用語「処置する（treat）／処置／処置する（treating）」は、疾患に関連する少なくとも１つの症状を低下、低減もしくは改善させるため、および／または疾患の進行を減速、低減もしくは遮断するために、本発明に従う遺伝子改変された細胞、遺伝子改変された細胞の集団または医薬組成物を、既存の疾患または状態を有する対象に投与することを指す。
【０２３９】
「予防（prevention）」／「予防する（preventing）」（または予防（prophylaxis））に対する言及は、本明細書で使用される場合、疾患の症状の開始を遅延させるまたは予防することを指す。予防は、（疾患が生じないように）絶対的であり得、または一部の個体においてのみもしくは限定的な量の時間にわたってのみ有効であり得る。
【０２４０】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかの対象は、哺乳動物、好ましくは、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットである。好ましくは、対象はヒトである。
【０２４１】
投与
医薬組成物の投与は、医薬組成物中に含まれる遺伝子改変された細胞を、対象にとって生体利用可能なものにする種々の経路のいずれかを使用して達成され得る。例えば、組成物は、経口および非経口経路によって、腹腔内で、静脈内で、皮下で、経皮で、筋肉内で、例えばカテーテルまたはステントによる局所送達を介して、投与され得る。
【０２４２】
適切には、本発明に従う遺伝子改変された細胞または本発明に従う医薬組成物は、静脈内投与される。
【０２４３】
当業者は、例えば、送達の経路（例えば、経口  対  静脈内  対  皮下など）が用量に影響を与え得ること、および／または必要とされる用量が送達の経路に影響を与え得ることを理解する。例えば、特定の部位または場所内の薬剤の特に高い濃度が目的とされる場合、集中的な送達が所望され得るおよび／または有用であり得る。所与の治療レジメンのために経路および／または投薬スケジュールを最適化する場合に考慮すべき他の因子には、例えば、処置されている疾患（例えば、型またはステージなど）、対象の臨床的条件（例えば、年齢、全体的健康など）、併用療法の存在または非存在、および医師にとって公知の他の因子が含まれ得る。
【０２４４】
投薬量は、疾患の症状を安定化または改善するのに十分な投薬量である。
【０２４５】
典型的には、医師は、個々の対象に最も適切な実際の投薬量を決定し、これは、特定の患者の年齢、体重および応答によって変動する。投薬量は、標的抗原を発現する細胞の数を低減または枯渇させるのに十分な投薬量である。
【０２４６】
使用
本発明は、疾患を処置する際の使用のための、本発明に従う医薬組成物または遺伝子改変された細胞の集団もまた提供する。医薬組成物または遺伝子改変された細胞の集団は、上で定義した任意のものであり得る。
【０２４７】
本発明は、疾患の処置のための医薬の製造における、上で定義した本発明の遺伝子改変された細胞の集団の使用にも関する。
【０２４８】
キット
本発明は、
（ｉ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列を含むウイルスベクター；および
（ｉｉ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲの標的抗原を発現する細胞を枯渇させるための手段
を含むキットもまた提供する。
【０２４９】
本明細書で使用される場合、「標的抗原を発現する細胞を枯渇させるための手段」は、細胞の混合集団から特定の細胞を除去または分離するために適切な、当該分野で公知の任意の製品を指す。
【０２５０】
適切には、キットは、標的抗原に対して特異的な抗体を含み得る。
【０２５１】
適切には、キットは、枯渇抗体を含み得る。「枯渇抗体」は、標的細胞上に存在する抗原に結合し、標的細胞の死を媒介する抗体である。従って、細胞の集団への枯渇抗体の投与は、集団中の、標的抗原を発現する細胞の数における低減／減少を生じる。
【０２５２】
適切には、キットは、抗体コーティングされた固体マトリックスを含み得る。標的抗原を発現する細胞は、抗体コーティングされた固体マトリックスへの吸着によって枯渇され得る。
【０２５３】
適切には、キットは、標的抗原に対して特異的な蛍光抗体を含み得る。標的抗原を含む細胞は、フローサイトメトリーによって単離され得る。
【０２５４】
適切には、キットは、免疫磁気製品、即ち、磁気ナノ粒子またはビーズに結合された標的抗原に対して特異的な抗体を含み得る。
【０２５５】
本発明は、本発明を実施するにあたり当業者を補助するように機能することを意図した、本発明の範囲を限定することを決して意図しない実施例によって、ここでさらに記載される。
【実施例】
【０２５６】
（実施例１）
Ｔ細胞リンパ腫の処置のための遺伝子改変された自家細胞遺伝子治療薬物製品の製造
【０２５７】
標準的なＣＡＲ−Ｔ細胞製造プロセスは、以下の５つの段階によって要約され得る。活性化ステップの前にＴＲＢＣ１＋細胞枯渇ステップを導入することを評価した。
１．製造プロセスのための出発材料を提供するための、白血球除去物からのＰＢＭＣの単離。
２．サイトカインの存在下で抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を使用する、患者由来Ｔ細胞の活性化。
３．レトロウイルス上清による患者由来Ｔ細胞の形質導入。
４．サイトカインを使用する、形質導入されたＴ細胞の拡大増殖（原薬［ＤＳ］）。
５．細胞の製剤化、ならびにバッグおよび凍結保存への細胞の充填（ＤＰ）。
【０２５８】
抗ＴＲＢＣ１抗体で標識したＴＲＢＣ１＋細胞を捕捉するためにＭＡＣＳマイクロビーズおよびカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を利用する原理証明（ＰｏＰ）開発実験により、ＴＲＢＣ１＋細胞およびＴＲＢＣ１−細胞の効率的な選別ならびに製造の実現可能性が実証された。さらなる驚くべき成果は、ＴＲＢＣ１＋細胞が、使用した低い感染多重度（ＭＯＩ）における形質導入に対して抵抗性であると証明されたことであった（ビリオンは、ＲＤ１１４受容体ではなくＴＣＲを介して細胞に結合し得るので、おそらくは受容体干渉に起因する）。要約すると、枯渇ステップを取り込むことで、増強された安全性（ＤＳ／ＤＰにおける最小の／検出不能なレベルの形質導入されたＴＲＢＣ１＋Ｔ細胞）を有する、よりロバストなプロセス（より再現性のある形質導入効率およびＤＰにおける残りのＴＲＢＣ１＋Ｔ細胞レベル）が生じた。
【０２５９】
実験アプローチ
最適なＴＲＢＣ１＋細胞標識および枯渇／選別条件を、ＭＡＣＳマイクロビーズ（抗Ｍｓおよび抗ビオチン）およびカラムと併せて、Ｍｓ（マウス）抗ＴＲＢＣ１（ＪＯＶＩ−１）抗体（非コンジュゲートおよびビオチン化）を使用して確立した（この報告では議論しないが、図１に例示される）。異なる規模で健康なドナーの白血球除去物に対して実施した一連のＰｏＰ開発実験を続けて、ＧＭＰコンプライアンスのための自動化されたＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＣＡＲ−Ｔ細胞製造プロトコールへの適応を含め、ＣＡＲ−Ｔ細胞製造プロセス中に枯渇ステップを取り込むことを評価した。データを収集して、枯渇の効率を決定し、プロセスの終了時の形質導入効率、細胞の成長および生存度、ならびにメモリーおよび疲弊表現型を評価した。さらに、培養培地に対して実施したサイトカイン分析は、Ｔ細胞の活性化および細胞傷害性に関連するＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびグランザイムＢの放出についての情報を提供した。最後に、細胞傷害性／サイトカイン放出アッセイが、産生されたＣＡＲ−Ｔ細胞の機能的評価を可能にした。これには、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＴＲＢＣ１腫瘍抗原を発現するように形質導入したリンパ芽球様腫瘍細胞系であるＴＲＢＣ１＋Ｒａｊｉ細胞と共に共培養することが関与した。４８時間後の標的細胞死滅を決定するためのＦＡＣＳ、およびサイトカイン放出分析は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性および潜在力の尺度を提供した。
【０２６０】
プロトコールの概要
小規模および大規模実験が、１．５×１０７〜７×１０８個の細胞からＴＲＢＣ１＋細胞を枯渇させ、０．３×１０６〜１．４×１０８個のＴ細胞を形質導入した。さらに、一部の大規模実験は、０日目から、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ上で自動化した。全ての実験は、同じ基本プロトコールに従った。−１日目に、凍結させたドナー白血球除去試料を解凍し、血清を補充した細胞培養培地中で一晩インキュベートして回復させた。
【０２６１】
０日目に、ＴＲＢＣ１＋細胞を、１０６細胞当たり０．１２５μｇの抗ＴＲＢＣ１抗体（非コンジュゲートまたはビオチン化）で標識し、次いで１０７細胞当たり１０μｌのＭＡＣＳマイクロビーズ（抗Ｍｓまたは抗ビオチン）で標識した後に、ＭＡＣＳ  ＬＳカラム上で枯渇／選別した。枯渇／選別の前および後の試料中のＴＲＢＣ１＋細胞含量を決定するためのＦＡＣＳは、選別効率の評価を提供した。選別されたサブセットおよび選別されていないサブセットからの細胞を、血清およびＩＬ−７およびＩＬ−１５を補充した細胞培養培地中１×１０６細胞／ｍｌで播種し、ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を添加してＴ細胞を活性化した。
【０２６２】
標的抗原を発現する細胞の枯渇
図１中のプロットは、非枯渇インプット試料、２．１×１０７細胞に対して実施した枯渇からのＴＲＢＣ１−アウトプット（枯渇されたカラムフロースルー）試料およびＴＲＢＣ１＋アウトプット（カラム捕捉された）試料中のＴＲＢＣ１＋細胞含量を示す。図２に示されるデータは、枯渇後のＴ細胞集団において測定した、＜１．２％のＴＲＢＣ１＋細胞、および＞６０％の回復したＴＲＢＣ１−Ｔ細胞インプット（ＴＲＢＣ１−／ＣＤ３＋細胞）で、最初の枯渇ステップの有効性を実証している。
【０２６３】
ＣＡＲ形質導入
２日目（活性化の４８時間後）に、細胞を、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ）またはＶｅｃｔｏｆｕｓｉｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）形質導入エンハンサーのいずれかを使用して、特定のＭＯＩの抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲベクター、対照ＣＡＲ１ベクターまたは対照ＣＡＲ２ベクターで形質導入した。細胞を一晩形質導入し、その後洗浄し、血清およびＩＬ−７およびＩＬ−１５を補充した新鮮な細胞培養培地中に再播種し、次いで、６〜１０日目まで培養した。
【０２６４】
予期せぬことに、ＣＡＲ−Ｔ細胞産生のために枯渇細胞を使用することで、非枯渇細胞と比較して、抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ形質導入のレベルにおける有意な改善が生じた（２４．５％対３９．８％）（図３）。非枯渇細胞を使用した３回の実験は、枯渇細胞または対照ＣＡＲを使用した首尾よい並行形質導入にもかかわらず、抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲによって形質導入することに事実上失敗した（表１）。興味深いことに、３回全てにおいて、出発材料中のＴＲＢＣ１＋細胞のパーセンテージは高く（＞４０％）、これは、枯渇を実施することのさらなる予想外の利点を示唆している。非枯渇試料についてＴＲＢＣ１含量に対して形質導入効率をプロットすると、弱い相関が、形質導入効率と形質導入の時点でのＴＲＢＣ１＋細胞含量との間で実際に観察される（図４）。
【０２６５】
【表１】
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【０２６６】
細胞純度
製造プロセスの終了時に実施した分析は、ＣＤ３＋およびＣＤ８＋細胞サブセットにおける疲弊（ＰＤ１、Ｌａｇ３およびＴｉｍ３発現）およびメモリー表現型（ＣＤ４５ＲＡ発現に対するＣＣＲ７）と共に、ＴＲＢＣ１＋細胞含量および％形質導入効率を決定するためのＦＡＣＳからなった。ＳｉｍｐｌｅＰｌｅｘアッセイを使用して、培養培地中のＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびグランザイムＢ放出もまた測定した。培養物の拡大増殖を評価するための細胞計数もまた実施した。
【０２６７】
産生プロセスの終了時の細胞純度はあまり可変性でなく、枯渇細胞を使用した場合、非枯渇と比較して有意に改善された（９４．５％対８７．４％のＣＤ３＋）（図５Ａ）。この時点で、培養物の拡大増殖および生存度は、枯渇細胞および非枯渇細胞の両方について同等であったが、枯渇細胞を使用する拡大増殖は、これもあまり可変性ではなかった（それぞれ、図５Ｂおよび５Ａ）。非枯渇細胞を使用した場合、プロセスの終了時のＴＲＢＣ１＋細胞含量はそのままであり、平均して、枯渇細胞と比較して有意に高かった（＞１２％対＜１％）（図５Ａ）。これは驚くべきことであり、抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ＋細胞からの死滅は、ＴＲＢＣ１＋細胞を効率的に枯渇させることが予測され、このデータは、最初の枯渇が実施されない場合の最終薬物製品における形質導入された悪性細胞の潜在的リスクを強調する。
【０２６８】
表現型分析
表現型分析もまた、非枯渇細胞を使用した場合の、形質導入されたＴ細胞におけるＰＤ１、Ｌａｇ３およびＴｉｍ３疲弊マーカーの有意に高い共発現を同定した（図６）。ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７およびＣＤ６２Ｌ発現に基づく対応するメモリー表現型は、非枯渇細胞を使用した場合の、より分化した表現型を示した（図７）。
【０２６９】
さらに、ＣＡＲ−Ｔ細胞産生の間の最終培養物に対するサイトカイン分析は、枯渇細胞で一貫して低いレベルのＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびグランザイムＢを明らかにしたが、非枯渇細胞では高度に可変性であり、平均して、グランザイムＢおよびＩＬ−２について有意に高いことを証明した（図８）。細胞傷害性データ（細胞死滅およびサイトカイン放出）データは、枯渇細胞に由来するＣＡＲ−Ｔ細胞が、平均してより一貫していることもまた示唆し、全体的な傾向ならびにＩＬ−２およびＴＮＦ−ａの放出における統計的に有意な差異によって支持されるように、改善された細胞死滅能を実証している（図９および１０）。
【０２７０】
枯渇プロセスから保持されたＴＲＢＣ１＋選択された細胞の形質導入および拡大増殖もまた研究した。驚くべきことに、本発明者らのＣＡＲ−Ｔ細胞製造に使用した低いＭＯＩで形質導入した場合、ＴＲＢＣ１＋細胞は、抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲで首尾よく形質導入することができず（＜２％）、ＴＲＢＣ１もＴ細胞も通常標的化しない対照ＣＡＲによるこれらの細胞の効率的な形質導入（＞３０％）により、ＣＡＲ特異的であることが示された（図１１に示される）。この現象に具体的に取り組んだところ、１つの小規模実験により、抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ形質導入が、枯渇細胞に対して比較的低い効率（２７．７％対７０％）ではあるが、ＭＯＩを劇的に増加（＞１０倍）させることによって、これらの細胞において達成され得ることが示された（図１１）。ビリオンは、ＴＣＲだけでなくＲＤ１１４受容体を介して細胞に結合し得るので、受容体干渉は、可能性がある原因であり得、高いＭＯＩは、受容体の全てを飽和させることによってこれを克服している。
【０２７１】
要約および結論
本研究は、培養物中の枯渇細胞を活性化、形質導入および拡大増殖する能力を損なうことなしに、遺伝子改変された細胞の製造プロセスの一部として、標的抗原を発現する細胞を枯渇させることの実現可能性を確立している。
【０２７２】
その代わり、本明細書に記載される分析は、ＴＲＢＣ１＋細胞を枯渇させることが、抗ＴＲＢＣ１特異的ＣＡＲを発現するようにレトロウイルスで形質導入されたＴ細胞を含む細胞遺伝子治療薬物製品の産生に明確な利点を提供することを示している；非枯渇細胞から産生されたものよりも潜在的に分化していない、あまり疲弊していないＣＡＲ−Ｔ細胞と共に、改善された形質導入および細胞純度。
【０２７３】
さらに、機能的分析は、枯渇細胞から産生された場合の、抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性における改善された一貫性および潜在力を示唆している。
【０２７４】
驚くべきことに、細胞遺伝子治療薬物製品の製造のための追加の安全性の恩恵は、ＴＲＢＣ１＋細胞が、形質導入のために低いＭＯＩを使用した場合に抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲによって形質導入することに失敗したという観察から来ている。白血球除去物中に存在している場合であっても、ＴＲＢＣ１＋腫瘍細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞製造のために最適化されたＭＯＩの抗ＴＲＢＣ１  ＣＡＲレトロウイルスでは効率的に形質導入されないことが予測される。
【０２７５】
（実施例２）
Ｂ細胞悪性疾患の処置のための遺伝子改変された細胞遺伝子治療薬物製品の製造
【０２７６】
健康なドナーでは通常、小さいパーセンテージのＢ細胞が、出発白血球除去物材料において観察され、この集団は通常、形質導入後、ＣＡＲ  Ｔ細胞製造プロセスの終了に向かって消失する。
【０２７７】
一連の実験を、４人の健康なドナーを使用して実施した。各ドナーについて、Ｂ細胞を、ＣＤ１９＋マイクロビーズおよびＭＡＣＳ選択カラムを使用して枯渇させた。次いで、ＣＤ１９−（枯渇）白血球除去物を、以下に記載される標準的な製造プロセスに従って培養した。各ドナーについて、非枯渇条件を対照として使用した。
【０２７８】
Ｂ細胞枯渇の一例は、図１２に示される。Ｂ細胞を、ＰＥコンジュゲートＣＤ２０抗体で染色した。ＣＤ１９マイクロビーズによる選択後にＣＤ１９結合部位の遮断が観察されたので、ＣＤ１９抗体による染色は実行不能であった。
【０２７９】
データを、製造プロセスの終了時に収集して、形質導入効率を評価した。さらに、培養培地に対して実施したサイトカイン分析は、Ｔ細胞の活性化および細胞傷害性に関連するＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびグランザイムＢの放出についての情報を提供した。
【０２８０】
プロトコールの概要
実験を、２４ウェルプレートにおいて実施した。−１日目に、凍結させたドナー白血球除去物試料を解凍し、血清を補充した細胞培養培地中で一晩インキュベートして回復させた。０日目に、ＣＤ１９＋細胞を、抗ＣＤ１９マイクロビーズで標識した後に、ＭＡＣＳ  ＬＳカラム上で枯渇させた。実験の１つでは、Ｂ細胞を、実験の開始の１週間前に枯渇させ、ＣＤ１９枯渇および非枯渇白血球除去物試料を凍結させ、液体窒素中で維持し、その後実験のために解凍した。抗ＣＤ２０抗体を使用してＦＡＣＳを実施して、枯渇／選別の前および後の試料中のＢ細胞含量を決定した。両方の条件からの細胞を、血清およびＩＬ−７およびＩＬ−１５を補充した細胞培養培地中１×１０６細胞／ｍｌで播種し、ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を添加してＴ細胞を活性化した。
【０２８１】
次いで、２日目に、全ての条件における細胞を、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ）形質導入エンハンサーを使用して、０．２のＭＯＩの抗ＣＤ１９／２２  ＣＡＲ（ＣＤ１９／２２  ＣＡＲとも呼ばれる）で形質導入した（０．３×１０６細胞／ウェル）。細胞を一晩形質導入し、その後洗浄し、血清およびＩＬ−７およびＩＬ−１５を補充した新鮮な細胞培養培地中に再播種し、次いで、７日目まで培養した。
【０２８２】
結果
形質導入効率を、培養の最終日（７日目）に、枯渇培養物および非枯渇培養物の両方について測定した。図１４に示されるように、Ｂ細胞枯渇ステップを製造プロセスの開始時に実施した場合、より高い形質導入が観察された。
【０２８３】
培養物中での７日間の終了時に、各条件について上清を回収し、サイトカインの存在について分析した。図１５に示されるように、低い濃度のＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびグランザイムＢが、枯渇培養物において観察されたが、値は、非枯渇培養物ではより可変性であり一貫してより高いことが見出され、これは、製造プロセスの間にＢ細胞死滅が生じたことを示唆している。
【０２８４】
要約および結論
Ｂ細胞を標的化する細胞治療の出発材料中のＢ細胞の存在は、製造プロセスの間の形質導入効率に負の影響を与え得る。さらに、培養物上清中のより高い濃度のサイトカインが非枯渇試料において観察され、これは、Ｂ細胞が存在する場合、製造プロセスの間に死滅が生じたことを示唆している。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで注入された場合のＣＡＲ  Ｔ細胞の性能および存続性に潜在的に影響を与え得る。
【０２８５】
従って、製造プロセスの開始時におけるＢ細胞枯渇ステップの追加は、最終産物の品質およびプロセスのロバストさを顕著に改善できるだけでなく、患者が血液学的悪性疾患に罹患している場合の悪性Ｂ細胞の形質導入のリスクを安全に最小化することを確実にする。
【０２８６】
上記本明細書で言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法および系の種々の改変および変形形態は、本発明の範囲および精神から逸脱することなしに、当業者に明らかである。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、特許請求された発明がかかる具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野における当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である意図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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