(57)【要約】本開示は、免疫応答を調節することができる治療キットを提供する。治療キットは、細胞破片から放出された抗原の免疫原性を高めるためにも使用することができる。治療キットを使用する方法も提供される。
2021509674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療キットであって、
細胞と物理的に会合することができる免疫アジュバント処方物と、
細胞からの抗原放出を誘導するための手段と、
を含む、治療キット。
【請求項２】
前記免疫アジュバント処方物は、
アジュバントを封入するポリマーナノ粒子を含み、前記ポリマーナノ粒子は、
水不透過性のポリマーシェルと、
同ポリマーシェルによって封入された１つ以上の水性コアと
を含む、請求項１に記載の治療キット。
【請求項３】
前記ポリマーシェルは、２５ｎｍ未満の厚さを有し、前記ポリマーナノ粒子は、３０〜６００ｎｍの外径を有する、請求項２に記載の治療キット。
【請求項４】
前記細胞からの抗原放出を誘導するための手段は、ポリマーナノ粒子に封入される、請求項２に記載の治療キット。
【請求項５】
前記免疫アジュバント処方物は、ＭＰＬＡ、ＣｐＧ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、または環状ジヌクレオチドの変異体を含む、請求項１に記載の治療キット。
【請求項６】
前記免疫アジュバント処方物は、細胞質パターン認識受容体に対するアゴニストまたはインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を含む、請求項１に記載の治療キット。
【請求項７】
前記アゴニストは、環状ｄｉ−ＧＭＰまたは環状ＧＡＭＰである、請求項６に記載の治療キット。
【請求項８】
前記免疫アジュバント処方物は、細胞表面上の部分を認識してそれに結合するために、小分子、ペプチド、抗体、アプタマー、糖部分、ポリマーまたはそれらの組み合わせにコンジュゲートされたアジュバントを含む、請求項１に記載の治療キット。
【請求項９】
前記抗体は、免疫グロブリン分子、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイボディ、ヒト化抗体、多特異的抗体、Ｆａｂ、二重特異的抗体、Ｆａｂ’フラグメント、二重特異的抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または単鎖抗体、である、請求項８に記載の治療キット。
【請求項１０】
前記免疫アジュバント処方物は、細胞膜に繋留することができる分子にコンジュゲートされている、請求項１に記載の治療キット。
【請求項１１】
前記分子が親油性または両親媒性である、請求項１０に記載の治療キット。
【請求項１２】
親油性分子は、脂肪酸鎖、コレステロール、またはリン脂質を含む、請求項１１に記載の治療キット。
【請求項１３】
両親媒性分子が脂質−ＰＥＧコンジュゲートを含む、請求項１１に記載の治療キット。
【請求項１４】
前記免疫アジュバント処方物は、細胞内送達のためにナノ粒子または細胞透過性ペプチドとコンジュゲートされたアジュバントを含む、請求項１に記載の治療キット。
【請求項１５】
細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴペプチド（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）、ペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）、ポリアルギニン（Ｒｎ）、またはトランスポータン（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ）を含む、請求項１４に記載の治療キット。
【請求項１６】
前記抗原放出を誘導するための手段は、化学薬剤、生物薬剤、放射線照射、光分解剤、機械的破壊、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の治療キット。
【請求項１７】
化学薬剤が細胞毒性剤を含む、請求項１６に記載の治療キット。
【請求項１８】
前記細胞毒性剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メルタンシン（ＤＭ１）、アントラサイクリン、ピロロベンゾジアゼピン、α−アマニチン、ツブリジン、ベンゾジアゼピン、エルロチニブ、ボルテゾミブ、フルベストラント、スニチニブ、レトロゾール、メシル酸イマチニブ、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、オキサリプラチン、ロイコボリン、ラパマイシン、ラパチニブ、ロナファルニブ（ＳＡＲＡＳＡＥ（登録商標）、ＳＣＨ６６３３６）、ソラフェニブ、ゲフィチニブ、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１、アルキル化剤；アルキルスルホン酸塩；アジリジン；エチレンイミン；メチルアメラミン；アセトゲニン；カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５；クリプトフィシン；ドラスタチン；デュオカルマイシン；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル；クロルナファジン；クロロフォスファミド；エストラムスチン；イホスファミド；メクロレタミン；メクロレタミンオキサイド塩酸塩；メルファラン；ノベンビチン；フェネステリン；プレドニムスチン；トロフォスファミド；ウラシルマスタード；カルムスチン；クロロゾトシン；ホテムスチン；ロムスチン；ニムスチン；ラニムスチン；カリケアミシン；ダイネマイシン；クロドロネート；エスペラマイシン；ネオカルジノスタチン発色団；アクラシノマイシン；アクチノマイシン；オートラマイシン；アザセリン；ブレオマイシン；カクチノマイシン；カラビシン；カミノマイシン；カルジノフィリン；クロモマイシン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；デトルビシン；６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン；ドキソルビシン；エピルビシン；エソルビシン；イダルビシン；マルセロマイシン；マイトマイシン；ミコフェノール酸；ノガラマイシン；オリボマイシン；ペプロマイシン；ポピロマイシン；ピューロマイシン；クエラマイシン；ロドルビシン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；デノプテリン；プテロプテリン；トリメトレキセート；フルダラビン；６−メルカプトプリン；チアミプリン；チオグアニン；アンシタビン；アザシチジン；６−アザウリジン；カーモーファー；シタラビン；ジデオキシウリジン；ドキシフルリジン；エノシタビン；フロクスウリジン；カルステロン；プロピオン酸ドロモスタノロン；エピチオスタノール；メピチオスタン；テストラクトン；アミノグルテチミド；ミトタン；トリロスタン；フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アンサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラクセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミジン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシッド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン；アンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プ���カルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド；パクリタキセル；ドセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン；カルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エデトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロン酸；トポイソメラーゼ阻害剤；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド；カペシタビン；またはその組み合わせ、を含む、請求項１７に記載の治療キット。
【請求項１９】
前記光分解剤は、フォトフリン、レーザーフィリン、アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、シリコンフタロシアニンＰｃ  ４、ｍ−テトラヒドロキシフェニルクロリン（ｍＴＨＰＣ）、クロリンｅ６（Ｃｅ６）、アルメラ、レブラン、フォスキャン、メトビクス、ヘクスビックス、フォトクロル、フォトセンス、フォトレックス、ルマカン、ビソナック、アンフィネックス、ベルテポルフィン、プリチン、ＡＴＭＰｎ、亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰｃ）、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）、ピロフェオホルビデア（ＰＰａ）、フェオホルビド  ａ（ＰｈＡ）、またはこれらの組み合わせ、を含む、請求項１６に記載の治療キット。
【請求項２０】
前記免疫アジュバント処方物および前記細胞からの抗原放出を誘導するための手段が単回用量で処方化される、請求項１に記載の治療キット。
【請求項２１】
疾患を治療する方法であって、同方法は、
それを必要とする対象に、細胞と物理的に会合することができる免疫アジュバント処方物を投与することと、
それを必要とする対象に細胞からの抗原放出を誘導するための手段を投与することと、
を含む、方法。
【請求項２２】
アジュバントをポリマーナノ粒子に封入することをさらに含み、前記ポリマーナノ粒子が、
水不透過性のポリマーシェルと、
ポリマーシェルによって囲まれた１つ以上の水性コアと
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗原放出を誘導するための手段は、免疫アジュバント処方物の投与前または投与後に、必要とする対象に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
抗原放出を誘導するための手段は、免疫アジュバント処方物と同時に、必要とする対象に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
免疫アジュバント処方物に細胞からの抗原放出を誘導するための手段を封入することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫アジュバント処方物は、ＭＰＬＡ、ＣｐＧ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、または環状ジヌクレオチドの変異体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記アジュバントは、細胞質パターン認識受容体に対するアゴニストまたはインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記アゴニストは、環状ｄｉ−ＧＭＰまたは環状ＧＡＭＰである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
細胞表面上の部分を認識してそれに結合するために、アジュバントを、小分子、ペプチド、抗体、アプタマー、糖部分、ポリマーまたはそれらの組み合わせとコンジュゲートして免疫アジュバント処方物を形成することを、さらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体は、免疫グロブリン分子、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイボディ、ヒト化抗体、多特異的抗体、Ｆａｂ、二重特異的抗体、Ｆａｂ’フラグメント、二重特異的抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または単鎖抗体、である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
細胞膜に繋留することができる分子とアジュバントとをコンジュゲートすることを、さらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記分子が親油性または両親媒性である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
親油性分子は、脂肪酸鎖、コレステロール、またはリン脂質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
両親媒性分子が脂質−ＰＥＧコンジュゲートを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
細胞内送達のためにナノ粒子または細胞透過性ペプチドとともにアジュバントを処方化することを、さらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴペプチド（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）、ペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）、ポリアルギニン（Ｒｎ）、またはトランスポータン（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ）を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗原放出を誘導するための手段は、化学薬剤、生物薬剤、放射線照射、光分解剤、機械的破壊、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
化学薬剤が細胞毒性剤を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞毒性剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メルタンシン（ＤＭ１）、アントラサイクリン、ピロロベンゾジアゼピン、α−アマニチン、ツブリジン、ベンゾジアゼピン、エルロチニブ、ボルテゾミブ、フルベストラント、スニチニブ、レトロゾール、メシル酸イマチニブ、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、オキサリプラチン、ロイコボリン、ラパマイシン、ラパチニブ、ロナファルニブ（ＳＡＲＡＳＡＥ（登録商標）、ＳＣＨ６６３３６）、ソラフェニブ、ゲフィチニブ、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１、アルキル化剤；アルキルスルホン酸塩；アジリジン；エチレンイミン；メチルアメラミン；アセトゲニン；カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５；クリプトフィシン；ドラスタチン；デュオカルマイシン；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル；クロルナファジン；クロロフォスファミド；エストラムスチン；イホスファミド；メクロレタミン；メクロレタミンオキサイド塩酸塩；メルファラン；ノベンビチン；フェネステリン；プレドニムスチン；トロフォスファミド；ウラシルマスタード；カルムスチン；クロロゾトシン；ホテムスチン；ロムスチン；ニムスチン；ラニムスチン；カリケアミシン；ダイネマイシン；クロドロネート；エスペラマイシン；ネオカルジノスタチン発色団；アクラシノマイシン；アクチノマイシン；オートラマイシン；アザセリン；ブレオマイシン；カクチノマイシン；カラビシン；カミノマイシン；カルジノフィリン；クロモマイシン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；デトルビシン；６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン；ドキソルビシン；エピルビシン；エソルビシン；イダルビシン；マルセロマイシン；マイトマイシン；ミコフェノール酸；ノガラマイシン；オリボマイシン；ペプロマイシン；ポピロマイシン；ピューロマイシン；クエラマイシン；ロドルビシン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；デノプテリン；プテロプテリン；トリメトレキセート；フルダラビン；６−メルカプトプリン；チアミプリン；チオグアニン；アンシタビン；アザシチジン；６−アザウリジン；カーモーファー；シタラビン；ジデオキシウリジン；ドキシフルリジン；エノシタビン；フロクスウリジン；カルステロン；プロピオン酸ドロモスタノロン；エピチオスタノール；メピチオスタン；テストラクトン；アミノグルテチミド；ミトタン；トリロスタン；フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アンサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラクセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミジン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシッド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン；アンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プ���カルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド；パクリタキセル；ドセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン；カルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エデトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロン酸；トポイソメラーゼ阻害剤；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド；カペシタビン；またはその組み合わせ、を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記光分解剤は、フォトフリン、レーザーフィリン、アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、シリコンフタロシアニンＰｃ  ４、ｍ−テトラヒドロキシフェニルクロリン（ｍＴＨＰＣ）、クロリンｅ６（Ｃｅ６）、アルメラ、レブラン、フォスキャン、メトビクス、ヘクスビックス、フォトクロル、フォトセンス、フォトレックス、ルマカン、ビソナック、アンフィネックス、ベルテポルフィン、プリチン、ＡＴＭＰｎ、亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰｃ）、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）、ピロフェオホルビデア（ＰＰａ）、フェオホルビド  ａ（ＰｈＡ）、またはこれらの組み合わせ、を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
対象に投与することは、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内、皮内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、経鼻、および経皮、からなる群より選択される少なくとも１つの様式によるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患が心血管疾患、癌、自己免疫疾患、または感染症である、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、治療キットおよび治療キットを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原標的に対する効果的な免疫増強は、抗原と免疫刺激シグナルとの協調的な提示に左右される。病原体認識受容体のアゴニストを介した自然免疫シグナルの活性化は、特定のサイトカイン環境の分泌を誘発し、それが次に抗原標的に対する適応免疫を形成する。ワクチン抗原は、免疫増強を強化するために免疫アジュバントと共に製剤化されることが多いため、このメカニズムは、ワクチン設計でしばしば利用される。一旦免疫系が外来抗原に対して予備刺激を受けると、適応免疫細胞は同じ抗原の記憶を保持しながら、同様に疑わしい細胞を認識して排除するように働き、感染の再発に対してより迅速かつ強力な攻撃をすることができる［１］。
【０００３】
細胞傷害性Ｔリンパ球のような免疫細胞はこれらの細胞標的の根絶を促進することができるので、悪性細胞、すなわちがんとの戦いにおいて適応免疫の役割がますます認識されている。腫瘍細胞は、腫瘍関連抗原を頻繁に発現し、同抗原はワクチン開発の標的としての機能を果たす。最近の研究では、腫瘍関連抗原を免疫アジュバントと処方化することにより、得られたワクチン製剤が腫瘍特異的免疫を増強し、より優れたがん治療の結果を促進できることが示されている［２］。これらのがんワクチン製剤は、特異的ペプチド配列の同定のために腫瘍試料のゲノム分析を必要とし、次いで、ワクチン開発のために合成することができる。
【０００４】
あるいは、全細胞ベースの腫瘍ワクチンは、患者のがん細胞サンプルを抽出することによって、または同種異系のがん細胞を使用することによっても開発されてきた。これらのアプローチにおいて、腫瘍細胞由来の派生物は、投与前に外因的にアジュバントと共に処方される。次に、アジュバント混合物は、腫瘍細胞由来の派生物において腫瘍関連抗原の免疫原性を増加させることができる。一例では、死んだがん細胞をアジュバントナノ粒子でエクスビボで機能化し、皮下腫瘍に対してワクチン接種した［３］。プラットフォーム自体の効率は３０％であり、それは、免疫チェックポイント遮断薬療法と併用すると７８％まで高めることができる。別の例では、同種異系性がん細胞を、ワクチン製剤として、エクスビボでＳＴＩＮＧアゴニストと共に製剤化した。ＳＴＩＮＧ−ＷＡＸとして知られているこの製剤は、動物モデルに投与すると抗腫瘍免疫を誘発することができた。
【０００５】
内因性免疫刺激分子の誘導もまた、がん治療の成功の背後にある重要な要素として同定されている。いくつかのタイプの化学療法、放射線および腫瘍溶解性ウイルスを含むいくつかのがん治療は、がん細胞に細胞ストレスを誘発し、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を引き起こすことが示されている。このタイプの細胞死は、死に向かっている細胞由来のペプチド、タンパク質、または核酸の組み合わせで構成される危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の内因性放出に関連している［５］。死に向かっている細胞からの抗原性物質とともに、これらの内因性の危険シグナルは、抗原特異的な適応免疫を促進する。多くの証拠から、共表示抗原と免疫刺激分子のこの先天的なメカニズムが、大量の新生物に冒された患者の疾患進行を抑制するのに重要であることが示唆されている［６］。したがって、このようなメカニズムは、がん細胞の死後に放出された腫瘍抗原に対する免疫応答をさらに増幅し得る外因性アジュバントの助けを借りて増強され得ると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願では、細胞と関連付けることができる（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌｓ）免疫アジュバントを開発し、治療中に細胞から放出された抗原の免疫原性を増強するためのその使用を実証する。図１に示すように、外因性免疫アジュバントを、例えば細胞内在化（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）、膜会合（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、または表面リガンド結合の手段を介して、がん細胞と会合し得る機能性と関連付けることによって、同アジュバントは、免疫増強のために細胞標的を標識することができる。したがって、細胞破片（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｂｒｉｓ）、小胞、抗原の放出を誘導するその後の治療は、治療自体が内因性の危険シグナルを誘発するかどうかにかかわらず、免疫応答を誘発する。したがって、本出願は、免疫アジュバントの機能化および機能化されたアジュバントに関連する治療法（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ）の両方に関する。請求項の発明は、がん以外の任意の病原性細胞に適用することができる。具体的には、免疫アジュバントは、細胞内手段（細胞内在化）または細胞外手段（膜繋留（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）または表面リガンド結合）のいずれかを介して、悪性細胞と会合するように設計される。次に、機能化されたアジュバントで処理された悪性細胞は、細胞破片、小胞（ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、および抗原を放出するように誘導される。抗原放出の誘導は、当技術分野で知られている任意の刺激によって誘発され得る。例えば、刺激は少なくとも化学薬剤（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ）、生物薬剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ）、光、または機械的刺激を含み得る。
【０００７】
本発明の範囲において、病原性細胞に対する治療法が提供され、ここでは、罹患した細胞（ｄｉｓｅａｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ）がまず外因性アジュバントとともに投与される。外因性アジュバントは、次のように細胞と関連付けることができる（ｂｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）：（１）例えばナノ粒子、エキソソーム、操作された細胞浸透性ペプチドのような所望のアジュバントの細胞内送達を可能にするアジュバント処方物；（２）例えば親油性リンカーを含むアジュバント、両親媒性アジュバントのような、細胞膜に分配することができるアジュバント処方物；および（３）例えば、抗体と結合したアジュバント、アプタマーと結合したアジュバント、アジュバント糖処方物のような細胞表面部分に結合親和性を有し、細胞膜部分と物理的に会合する（ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ）ことができるアジュバント処方物。
【０００８】
アジュバントが感染した細胞と会合されると、同細胞は、化学療法薬、生物薬剤、放射線照射、光分解剤、機械的破壊などを含むがこれらに限定されない小胞形成性の抗原放出刺激で処理される。このレジメンは、インビボでの外因性アジュバントとの共局在抗原の産生を促進する。原則として、細胞と会合する（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）免疫原性アジュバントは、病原性細胞の根絶を目的とする既存または新規の治療法を補完するために適用できる。
【０００９】
一態様において、本明細書で提供されるのは治療キットであり、同治療キットは、細胞と物理的に会合することができる免疫アジュバント処方物と、細胞からの抗原放出を誘導するための手段と、を含む。
【００１０】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、疾患を治療する方法であって、同方法は、それを必要とする対象に、細胞と物理的に会合することができる免疫アジュバント処方物を投与することと、それを必要とする対象に細胞からの抗原放出を誘導するための手段を投与することと、を含む。
【００１１】
好ましくは、免疫アジュバント処方物は、アジュバントを封入するポリマーナノ粒子を含み得、そしてポリマーナノ粒子は、水不透過性のポリマーシェルと、同ポリマーシェルによって封入された１つ以上の水性コアとをさらに含み得る。
【００１２】
好ましくは、ポリマーシェルは、２５ｎｍ未満の厚さを有し得、そしてポリマーナノ粒子は、３０〜６００ｎｍの外径を有する。
好ましくは、細胞からの抗原放出を誘導するための手段は、ポリマーナノ粒子に封入され得る。
【００１３】
好ましくは、免疫アジュバント処方物は、ＭＰＬＡ、ＣｐＧ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、または環状ジヌクレオチドの変異体を含み得る。
好ましくは、免疫アジュバント処方物は、細胞質パターン認識受容体に対するアゴニストまたはインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を含み得る。
【００１４】
好ましくは、アゴニストは、環状ｄｉ−ＧＭＰまたは環状ＧＡＭＰであり得る。
好ましくは、免疫アジュバント処方物は、細胞表面上の部分を認識してそれに結合するために、小分子、ペプチド、抗体、アプタマー、糖部分、ポリマーまたはそれらの組み合わせにコンジュゲートされたアジュバントを含み得る。
【００１５】
好ましくは、抗体は、免疫グロブリン分子、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイボディ、ヒト化抗体、多特異的抗体、Ｆａｂ、二重特異的抗体、Ｆａｂ’フラグメント、二重特異的抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または単鎖抗体、であり得る。
【００１６】
好ましくは、免疫アジュバント処方物は、細胞膜に繋留する（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）ことができる分子にコンジュゲートしたアジュバントを含むことができる。
好ましくは、分子は親油性または両親媒性であり得る。
【００１７】
好ましくは、親油性の分子は、脂肪酸鎖、コレステロール、またはリン脂質を含み得る。
好ましくは、両親媒性の分子は脂質−ＰＥＧコンジュゲートを含み得る。
【００１８】
好ましくは、免疫アジュバント処方物は、細胞内送達のためにナノ粒子または細胞透過性ペプチドと処方化されたアジュバントを含み得る。
好ましくは、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴペプチド（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）、ペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）、ポリアルギニン（Ｒｎ）、またはトランスポータン（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ）を含み得る。
【００１９】
好ましくは、抗原放出を誘導するための手段は、化学薬剤、生物薬剤、放射線照射、光分解剤、機械的破壊、またはそれらの組み合わせを含み得る。
好ましくは、化学薬剤は細胞毒性剤を含み得る。
【００２０】
好ましくは、細胞毒性剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メルタンシン（ＤＭ１）、アントラサイクリン、ピロロベンゾジアゼピン、α−アマニチン、ツブリジン、ベンゾジアゼピン、エルロチニブ、ボルテゾミブ、フルベストラント、スニチニブ、レトロゾール、メシル酸イマチニブ、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、オキサリプラチン、ロイコボリン、ラパマイシン、ラパチニブ、ロナファルニブ（ＳＡＲＡＳＡＥ（登録商標）、ＳＣＨ６６３３６）、ソラフェニブ、ゲフィチニブ、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１、アルキル化剤；アルキルスルホン酸塩；アジリジン；エチレンイミン；メチルアメラミン；アセトゲニン；カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５；クリプトフィシン；ドラスタチン；デュオカルマイシン；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル；クロルナファジン；クロロフォスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；エストラムスチン；イホスファミド；メクロレタミン；メクロレタミンオキサイド塩酸塩；メルファラン；ノベンビチン；フェネステリン；プレドニムスチン；トロフォスファミド；ウラシルマスタード；カルムスチン；クロロゾトシン；ホテムスチン；ロムスチン；ニムスチン；ラニムスチン；カリケアミシン；ダイネマイシン；クロドロネート；エスペラマイシン；ネオカルジノスタチン発色団；アクラシノマイシン；アクチノマイシン；オートラマイシン；アザセリン；ブレオマイシン；カクチノマイシン；カラビシン；カミノマイシン；カルジノフィリン；クロモマイシン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；デトルビシン；６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン；ドキソルビシン；エピルビシン；エソルビシン；イダルビシン；マルセロマイシン；マイトマイシン；ミコフェノール酸；ノガラマイシン；オリボマイシン；ペプロマイシン；ポピロマイシン；ピューロマイシン；クエラマイシン；ロドルビシン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；デノプテリン；プテロプテリン；トリメトレキセート；フルダラビン；６−メルカプトプリン；チアミプリン；チオグアニン；アンシタビン；アザシチジン；６−アザウリジン；カーモーファー；シタラビン；ジデオキシウリジン；ドキシフルリジン；エノシタビン；フロクスウリジン；カルステロン；プロピオン酸ドロモスタノロン；エピチオスタノール；メピチオスタン；テストラクトン；アミノグルテチミド；ミトタン；トリロスタン；フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アンサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラクセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミジン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシッド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン；アンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロ���；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド；パクリタキセル；ドセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン；カルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エデトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロン酸；トポイソメラーゼ阻害剤；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド；カペシタビン；またはその組み合わせ、を含み得る。
【００２１】
好ましくは、光分解剤は、フォトフリン、レーザーフィリン、アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、シリコンフタロシアニンＰｃ  ４、ｍ−テトラヒドロキシフェニルクロリン（ｍＴＨＰＣ）、クロリンｅ６（Ｃｅ６）、アルメラ、レブラン、フォスキャン、メトビクス、ヘクスビックス、フォトクロル、フォトセンス、フォトレックス、ルマカン、ビソナック、アンフィネックス、ベルテポルフィン、プリチン、ＡＴＭＰｎ、亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰｃ）、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）、ピロフェオホルビデア（ＰＰａ）、フェオホルビド  ａ（ＰｈＡ）、またはこれらの組み合わせ、を含み得る。
【００２２】
好ましくは、方法は、ポリマーナノ粒子にアジュバントを封入することをさらに含み得る。ポリマーナノ粒子は、水不透過性のポリマーシェルと、ポリマーシェルによって囲まれた１つ以上の水性コアとを含むことができる。
【００２３】
好ましくは、抗原放出を誘導するための手段は、免疫アジュバント処方物の投与の前または投与の後に、必要とする対象に投与され得る。
好ましくは、抗原放出を誘導するための手段は、免疫アジュバント処方物の投与と同時に、必要とする対象に投与され得る。
【００２４】
好ましくは、方法は、免疫アジュバント処方物に細胞からの抗原放出を誘導するための手段を封入することをさらに含み得る。
好ましくは、方法は、細胞表面上の部分を認識してそれに結合するために、アジュバントを、小分子、ペプチド、抗体、アプタマー、糖部分、ポリマーまたはそれらの組み合わせとコンジュゲートして免疫アジュバント処方物を形成することを、さらに含み得る。
【００２５】
好ましくは、方法はさらに、細胞膜に繋留することができる分子とアジュバントとをコンジュゲートすることを、さらに含み得る。
好ましくは、方法は、細胞内送達のためにナノ粒子または細胞透過性ペプチドとともにアジュバントを処方化することを、さらに含み得る。
【００２６】
好ましくは、対象に投与するステップは、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、皮内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸管内（ｉｎｔｒａｃｅｖｉｃａｌ）、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、経鼻、および経皮、なる群より選択される少なくとも１つの様式によるものであり得る。
【００２７】
好ましくは、疾患は、心血管疾患、がん、自己免疫疾患、または感染症であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】病原細胞と会合する（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）免疫アジュバントおよびその後の治療を増強する際のそれらの機能を示す。免疫アジュバントは、細胞内送達、膜繋留、および表面結合などのさまざまな手段を通じて病原細胞と会合するように機能化される。得られた細胞は、その後、アジュバント会合細胞破片の生成を誘導する処理に供され、調整された抗原およびアジュバント輸送を介して適応免疫を促進することができる。
【図２】核酸およびタンパク質に対するポリマーナノ粒子の封入化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）の効率を示す。Ａ：超遠心分離によるペレット化の後の、空のナノ粒子（左）、色素標識されたＤＮＡ負荷（ｌｏａｄｅｄ  ｗｉｔｈ）ナノ粒子（中央）、および色素標識されたウシ血清アルブミン（右）負荷ナノ粒子の観察。特徴的な色のペレットは、ＤＮＡおよびＢＳＡタンパク質の封入化が成功したことを示す。Ｂ：ｃｒｙｏＥＭ（低温電子顕微鏡法）で可視化された空のナノ粒子。Ｃ：ｃｒｙｏＥＭで可視化されたＤＮＡ負荷ナノ粒子。Ｄ：ｃｒｙｏＥＭで可視化されたＢＳＡタンパク質負荷ナノ粒子。効果的なＤＮＡおよびタンパク質負荷は、ナノ粒子内部の非常に粒状の組織を通して観察できた。
【図３】免疫刺激のためのＳＴＩＮＧアゴニストの封入化および制御放出に対するポリマーナノ粒子の効果を示す。Ａ：アジュバントを装填した薄いシェルの中空ナノ粒子の調製。Ｂ：ナノ粒子追跡分析によって測定されたナノ粒子のサイズ。Ｃ：グラジエントＨＰＬＣにより確認された環状−ｄｉ−ＧＭＰの封入化。Ｄ：薄いシェルの中空ナノ粒子のｃｒｙｏＥＭでの可視化。Ｅ：カーゴ放出試験（Ｃａｒｇｏ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｔｕｄｙ）は、ナノ粒子のｐＨ感受性誘発放出プロファイルを明らかにした。
【図４】全身性サイトカインを最小にしながらリンパ性サイトカインを増強するＳＴＩＮＧアゴニスト負荷ナノ粒子を示す。Ａ：ｃｄ−ＧＭＰナノ粒子および遊離ｃｄ−ＧＭＰとのインキュベーション後のマウス樹状細胞株におけるＴＮＦ−αの誘導。Ｂ：同じマウス樹状細胞株におけるＩＬ−６の誘導。Ｃ：マウス樹状細胞株におけるＩＦＮ−βの誘導。Ｄ：遊離分子形態およびナノ粒子処方物中の等用量のｃｄ−ＧＭＰとのインキュベーション時のＪＡＷＳＩＩの活性化。Ｅ：遊離ｃｄ−ＧＭＰ又はナノ粒子ｃｄ−ＧＭＰの足蹠注射（ｆｏｏｔｐａｄ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）４８時間後のリンパ節ＩＦＮ−βの定量。Ｆ：遊離ｃｄ−ＧＭＰおよびナノ粒子ｃｄ−ＧＭＰの足蹠注射後の全身ＴＮＦ−αのレベル。
【図５】腫瘍細胞と会合する免疫アジュバント（ｃＧＡＭＰ負荷ナノ粒子）に基づく治療法を示す。ナノ粒子の取り込み後、外因性アジュバントを含有する細胞を処理して、死滅細胞破片を生成する。外因性アジュバントを含有する細胞破片は、その後、適応免疫を誘発して治療結果を改善する。
【図６】（ａ）蛍光標識されたｃＧＡＭＰ負荷ナノ粒子のｃｒｙｏＥＭでの可視化；（ｂ）共焦点分析；を示し、（ｃ）フローサイトメトリー分析は、ｃＧＡＭＰ負荷ナノ粒子による処理後のｃＧＡＭＰと死滅した細胞および破片との会合を示す。
【図７】ｃＧＡＭＰナノ粒子とインキュベートされたＨｅＬａ細胞によって生成された細胞破片が、遊離ｃＧＡＭＰとインキュベートされたものよりも免疫原性が高かったことを示す。ＨｅＬａ細胞と会合するｃＧＡＭＰナノ粒子（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｃＧＡＭＰ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、ＣＤ８０（ａ）、ＣＤ８６（ｂ）のＤＣでの発現の増加およびＴＮＦ−α（ｃ）およびＩＦＮ−β（ｄ）のＤＣでの分泌の上昇を生じた。
【図８】腫瘍およびがん細胞のアジュバント保持を、色素標識ＳＴＩＮＧアゴニスト（赤色）の、その遊離型（遊離アジュバント）およびナノ粒子形態（アジュバントナノ粒子）での腫瘍内注射にて試験したことを示す。アジュバント投与の２４時間後に、腫瘍および抽出したがん細胞を（ａ）全身イメージング、（ｂ）フローサイトメトリー分析、および（ｃ）蛍光顕微鏡検査によって調べた。試験は、ナノ粒子投与時に腫瘍内およびがん細胞内でのアジュバントの有意な保持を示す。
【図９】プラセボ、シスプラチンのみ（ＣＴＴＰのみ）、ｃＧＡＭＰ負荷ナノ粒子のみ（ＮＰのみ）、遊離ｃＧＡＭＰとその後のシスプラチン（ｃＧＡＭＰ＋ＣＴＴＰ）、およびｃＧＡＭＰ負荷ナノ粒子とその後のシスプラチン（ＮＰ＋ＣＴＴＰ）を含む、種々のアジュバントおよび化学薬物の組み合わせによる腫瘍処理の有効性を示す。（ａ）Ｂ１６−ＯＶＡマウスメラノーマ皮下モデルに対する腫瘍移植と処理のレジメン。（ｂ）６０日間にわたる全処理群の腫瘍進行。（ｃ）異なる処理群（ｎ＝９〜１１）の生存分析曲線。（ｃ）ＮＰ＋ＣＴＴＰ群（ｎ＝４）からの腫瘍のない生存動物での腫瘍再チャレンジ実験における平均腫瘍体積の比較。腫瘍の成長を、同じ数の腫瘍細胞を接種した未処理対照動物（ｎ＝１）と比較した。
【図１０】抗体−コンジュゲートＣｐＧ−ＯＤＮの調製を示す。
【図１１】（Ａ）遊離ＣｐＧ−ＦＡＭ（中央）および抗体コンジュゲートＣｐＧ−ＦＡＭ（αＣＤ４４−ＣｐＧ−ＦＡＭ；右）との３時間のインキュベーションに続くＨｅＬａ細胞単層の蛍光顕微鏡観察を示す。抗体−コンジュゲートＣｐＧ−ＦＡＭによるＣｐＧ会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の増強は、より多数の蛍光点で観察された。（Ｂ）ＣｐＧ−ＦＡＭでの細胞のフローサイトメトリー分析。（Ｃ）ＣｐＧ−ＦＡＭと会合する細胞の定量化。抗ＣＤ４４コンジュゲート（αＣＤ４４）は、遊離ＣｐＧ−ＦＡＭ（遊離）よりもＨｅＬａ細胞上でより高いＣｐＧ−ＦＡＭ会合を生じた。
【図１２】遊離ＣｐＧ（遊離）または抗ＣＤ４４コンジュゲートＣｐＧ（αＣＤ４４）で処理されたＨｅＬａ細胞破片とのインキュベーションに続くＪＡＷＳＩＩ細胞による成熟マーカー（Ａ）ＣＤ８０および（Ｂ）ＣＤ８６の発現を示す。
【図１３】（Ａ）ナノ粒子封入化（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）ＣｐＧの略図；（Ｂ）ナノ粒子封入化ＣｐＧのｃｒｙｏＥＭ可視化、を示す。
【図１４】（Ａ）遊離ＣｐＧ−ＦＡＭ（中央）およびナノ粒子封入化ＣｐＧ（ＣｐＧ−ＦＡＭ  ＮＰ；右）との２４時間のインキュベーションに続く、ＨｅＬａ細胞単層の蛍光顕微鏡観察を示す。ＣｐＧ会合の増強は、より多数の蛍光点で観察された。（Ｂ）ＣｐＧ−ＦＡＭでの細胞のフローサイトメトリー分析。（Ｃ）ＣｐＧ−ＦＡＭと会合する細胞の定量化。抗ＣＤ４４コンジュゲート（αＣＤ４４）は、遊離ＣｐＧ−ＦＡＭ（遊離）よりもＨｅＬａ細胞上でより高いＣｐＧ−ＦＡＭ会合を生じた。
【図１５】遊離ＣｐＧ（遊離）またはナノ粒子封入化ＣｐＧ（ＮＰ）で処理されたＨｅＬａ細胞破片とのインキュベーションに続くＪＡＷＳＩＩ細胞による成熟マーカー（Ａ）ＣＤ８０および（Ｂ）ＣＤ８６の発現を示す。
【図１６】（Ａ）化学療法薬（ダウノルビシン）およびアジュバント（ｃｄ−ＧＭＰ）を共に封入するナノ粒子の略図；（Ｂ）ダウノルビシンとｃｄ−ＧＭＰを共に封入するナノ粒子のｃｒｙｏＥＭでの可視化、を示す。
【図１７】ダウノルビシンおよびｃｄ−ＧＭＰを共に封入するナノ粒子（（ｃｄＧＭＰ＋ＤＲ）ＮＰ）、遊離ｃｄ−ＧＭＰおよびダウノルビシンのナノ粒子（ｃｄＧＭＰ＋ＤＲ  ＮＰ）またはダウノルビシンのナノ粒子のみ（ＤＲ  ＮＰ）で処理されたＣＴ２６細胞破片とのインキュベーション後のＪＡＷＳＩＩ細胞による成熟マーカー（Ａ、Ｂ）ＣＤ８６および（Ｃ、Ｄ）ＣＤ８０の発現を示す。
【図１８】ダウノルビシンおよびｃｄ−ＧＭＰ（（ｃｄＧＭＰ＋ＤＲ）ＮＰ）を共に封入するナノ粒子、遊離ｃｄ−ＧＭＰおよびダウノルビシンのナノ粒子、またはダウノルビシンのナノ粒子のみ（ＤＲ  ＮＰ）で処理したＣＴ２６細胞破片とのインキュベーション後のＪＡＷＳＩＩ細胞によるＩＦＮ−βの分泌を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示の前述のおよび他の態様は、以下において、本明細書で説明される他の実施形態に関してより詳細に説明される。本発明は異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載された実施形態に限定されると解釈されるべきではないことを理解されたい。むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。
【００３０】
本明細書において本発明の説明で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形も含むことを意図する。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「によって特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」、またはそれらの任意の他の変形は、明示的に示された任意の制限に従うことを条件として、非排他的な包含をカバーすることを意図している。たとえば、要素のリストを含むプロセス、方法、システム、組成物、キット、または装置は、必ずしもそれらの要素に限定されるものではなく、明示的にリストされていない他の要素、またはそのようなプロセス、方法、システム、組成物、キット、または装置に固有の他の要素を含む場合がある。
【００３２】
「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という移行句は、特定されていない任意の要素、ステップ、または成分を含まない。それが請求項に記載されている場合、通常それに付随する不純物を除いて、請求項に記載されている材料以外の材料を含めることはできない。「〜からなる」という句が、前提部分の直後ではなく、請求項の本文の条項に現れる場合、それは、その条項に記載されている要素のみを限定し、その他の要素はクレーム全体から除外されない。
【００３３】
「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という移行句は、文字通りに開示されたものに加えて、材料、ステップ、特徴、成分、または要素を含む組成物、方法を定義するために使用される。ただし、これらの追加の材料、ステップ、特徴、成分、または要素が、クレームされた発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないことを条件とする。「本質的に〜からなる」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」との間の中間点を占める。
【００３４】
出願人が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの制限のない用語で発明またはその一部を定義している場合、（特に明記されない限り）説明は「本質的に〜からなる」又は「〜からなる」という用語を用いてそのような発明も記載していると解釈されるべきであることは容易に理解されるべきである。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、値が、例えば、測定装置に対する誤差の固有の変動、値を決定するために使用される方法、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、この用語は、状況に応じて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％未満の変動を含むことを意味する。
【００３６】
特許請求の範囲における用語「または（ｏｒ）」の使用は、代替物のみを参照するように明示的に示されていない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するために使用され、又は代替物は相互に排他的であるが、とはいえ、本開示は、代替物のみ及び「および／または」を参照する定義を支持する。
【００３７】
「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書では、障害、障害の症状、障害に続発する病態、または障害に対する素因を、治癒、緩和、軽減、治療、予防、または改善する目的で、治療組成物を対象に投与することを指す。
【００３８】
本明細書で使用される「対象」は、心血管疾患、がん、自己免疫疾患、または感染症などの疾患を有するか、または発症していると診断された、または疑われる哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、類人猿、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類および治療から利益を得ることができる疾患を有する他の哺乳動物であり得る。
【００３９】
「投与する（Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」または「投与（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、本明細書では、本出願の治療キットを対象に提供することを指す。限定ではなく例として、投与は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内、皮内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、頬、舌下、経鼻、および経皮を介して行われ得る。例えば、注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって行われ得る。１つまたは複数のそのような経路を使用することができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射によるか、または時間をかけて徐々に灌流することによることであってもよい。あるいは、または同時に、投与は経口経路によるものであり得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「免疫アジュバント処方物（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」は、対象に投与された場合に、対象において免疫応答を誘導することができる処方物を意味する。抗原と組み合わせて投与すると、「免疫アジュバント処方物」は抗原特異的免疫応答を引き出すことができる。「免疫アジュバント処方物」は、対象によって投与された後、細胞内在化、膜会合、および／または表面リガンド結合を介して細胞と関連付けられるであろう。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「細胞内在化（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）」は、所望のアジュバントの細胞内送達を可能にするアジュバント処方物を意味する。例えば、所望のアジュバントの「細胞内在化」は、少なくともナノ粒子、エキソソーム、操作された細胞透過性ペプチドなどによって達成され得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「膜会合（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」は、細胞膜に分配され得るアジュバント処方物を意味する。例えば、所望のアジュバントの「膜会合」は、少なくとも親油性リンカー、両親媒性アジュバントなどによって達成され得る。
【００４３】
本明細書で使用される「表面リガンド結合（ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、細胞表面部分に対する結合親和性を有し、細胞膜部分と物理的に会合することができるアジュバント処方物を意味する。例えば、所望のアジュバントの「表面リガンド結合」は、少なくとも抗体、アプタマー、糖処方物などによって達成され得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「細胞からの抗原放出を誘導するための手段」は、化学的または物理的アプローチを使用して、免疫応答を引き起こす細胞破片、小胞、および／または抗原を放出するように処理された細胞を誘導することを意味する。例えば、同手段は、化学薬剤、生物薬剤、放射線照射、光分解剤、機械的破壊、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００４５】
特に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのものと同じ意味を有する。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参考文献が提示されている文および／または段落に関連する教示について、参照によりその全体が組み込まれる。
【００４６】
一実施形態において、細胞から放出された抗原の免疫原性を増強するための治療キットが開示される。治療キットは、細胞と物理的に会合することができる免疫アジュバント処方物と、細胞からの抗原放出を誘導するための手段と、を含む。
【００４７】
好ましい実施形態において、免疫アジュバント処方物は、アジュバントを封入するポリマーナノ粒子を含み得、そしてポリマーナノ粒子は、水不透過性のポリマーシェルと、同ポリマーシェルによって封入された１つ以上の水性コアとを含み得る。
【００４８】
ポリマーシェルは、２５ｎｍ未満の厚さを有することができ、そしてポリマーナノ粒子は、３０〜６００ｎｍの外径を有する。好ましくは、厚さは、２４ｎｍ、２３ｎｍ、２２ｎｍ、２１ｎｍ、２０ｎｍ、１８ｎｍ、１６ｎｍ、１４ｎｍ、１２ｎｍ、または１０ｎｍ未満である。外径は、好ましくは３０〜５５０ｎｍ、３０〜５００ｎｍ、３０〜４５０ｎｍ、３０〜４００ｎｍ、３０〜３５０ｎｍ、３０〜３００ｎｍ、３０〜２５０ｎｍ、３０〜２００ｎｍ、３０〜１５０ｎｍ、３０〜１００ｎｍ、３５〜５５０ｎｍ、３５〜５００ｎｍ、３５〜４５０ｎｍ、３５〜４００ｎｍ、３５〜３５０ｎｍ、３５〜３００ｎｍ、３５〜２５０ｎｍ、３５〜２００ｎｍ、３５〜１５０ｎｍ、３５〜１００ｎｍ、４０〜５５０ｎｍ、４０〜５００ｎｍ、４０〜４５０ｎｍ、４０〜４００ｎｍ、４０〜３５０ｎｍ、４０〜３００ｎｍ、４０〜２５０ｎｍ、４０〜２００ｎｍ、４０〜１５０ｎｍ、４０〜１００ｎｍ、４５〜５５０ｎｍ、４５〜５００ｎｍ、４５〜４５０ｎｍ、４５〜４００ｎｍ、４５〜３５０ｎｍ、４５〜３００ｎｍ、４５〜２５０ｎｍ、４５〜２００ｎｍ、４５〜１５０ｎｍ、４５〜１００ｎｍ、５０〜５５０ｎｍ、５０〜５００ｎｍ、５０〜４５０ｎｍ、５０〜４００ｎｍ、５０〜３５０ｎｍ、５０〜３００ｎｍ、５０〜２５０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、５０〜１５０ｎｍ、または５０〜１００ｎｍ、の範囲にある。
【００４９】
一実施形態において、ポリマーシェルは、非極性セグメントおよび極性末端基を含む両親媒性ポリマーで形成される。非極性セグメントの例としては、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、およびポリウレタンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＰＬＧＡの乳酸対グリコール酸のモル比は、１：９９〜９９：１、１０：９０〜９０：１０、１５：８５〜８５：１５、２０：８０〜８０：２０、２５：７５〜７５：２５、３０：７０〜７０：３０で変化する。好ましくは、ＰＬＧＡの乳酸対グリコール酸のモル比は、５０：５０または７５：２５である。極性末端基は、負に帯電した基、正に帯電した基、両性イオン基、または中性基であり得る。負に帯電した基の例としては、カルボン酸、コハク酸、スルホン酸が含まれる。正に帯電した基の例としては、アミンおよびアミジンが含まれる。両性イオン基の例としては、カルボキシベタインおよびスルホベタインが含まれる。中性基の例は糖類である。
【００５０】
例示的なポリマーシェルは、非極性セグメントとしてのポリ（乳酸−コ−グリコール酸）および極性末端基としてのカルボン酸を含むポリマーから形成される。
本明細書に記載されるポリマーナノ粒子は、２５ｎｍ以下の厚さを有する欠陥のない（ｄｅｆｅｃｔ−ｆｒｅｅ）ポリマーシェルを有するポリマー中空ナノ粒子プラットフォームであり得る。中空ポリマーナノ粒子は、典型的には３０〜６００ｎｍの外径を有する。
【００５１】
シェルの厚さを最小にすることにより、カーゴ負荷（ｃａｒｇｏ  ｌｏａｄｉｎｇ）を最大にすることができる大きな内部水性空間を備えたポリマーナノ粒子を形成できる。外径が１００ｎｍを超える粒子の場合、内部の水性空間は、粒子の外径の少なくとも８０％の直径を有するか、または大きな集合体積を有する複数の区画であり得る。相補的結合分子の非存在下での薄いシェル中空ナノ粒子による親水性染料及び核酸の高効率封入化を実証した。薄いシェルのナノ粒子は浸透圧ストレスに耐性があることが実証されており、これは水を透過しない完全で欠陥のない高分子シェルに起因する特徴である。本願のポリマーナノ粒子は、薬物送達およびワクチン開発を含む様々な分野で生物活性剤を送達するために使用することができる。
【００５２】
ポリマーナノ粒子、特にポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）のような生分解性および生体適合性ポリマーからなるものは、生体適合性、生分解性および合成上の柔軟性を含むポリマーの多くの特徴のため、ナノ医療研究においてかなりの注目を集めている。しかしながら、ポリマー固有の疎水性のために、ＰＬＧＡベースのナノ粒子は、臨床における水不溶性化合物の送達に制限されてきた。ポリマーは、親水性および高分子量のカーゴ、例えばｓｉＲＮＡを担持するための水性コア空間をほとんどまたは全く有しない固体ナノスフェアを形成する傾向があるので、ポリマーナノ粒子への親水性および高分子量のカーゴの封入（Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）は依然として課題である。
【００５３】
高分子の封入がウイルスの形の天然ナノ粒子で一般的であることを考慮すると、理想的なナノキャリアは生物活性分子のパッケージのための大きな水性体積を囲む薄いシェルを持つべきである。薄いシェルはまた、好ましくは、欠陥がなく、水不透過性であり、確実なカーゴの封入を可能にする。
【００５４】
一実施形態において、疾患を治療する方法が提供される。同方法は、細胞と物理的に会合することができる免疫アジュバント処方物を、それを必要とする対象に投与することと、それを必要とする対象に、細胞からの抗原放出を誘導するための手段を投与することと、を含む。疾患の例としては、限定されるものではないが、心血管疾患、がん、自己免疫疾患、または感染症が含まれる。
【００５５】
本明細書においてさらに詳細に開示されるのは、上述のポリマーナノ粒子を調製する方法である。
一般に、薄いシェルの中空ナノ粒子は、末端に高い極性のコントラストを有する両親媒性ポリマーを用いる二重エマルションプロセスに基づいて調製される。より具体的には、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のカルボキシル末端ＰＬＧＡの溶液を最初に使用して、音波分散下でカーゴを含有する水相を乳化して、エマルションを形成する。このようにして形成されたエマルションは、その後、流体分散液を使用して外水相に乳化される。
【００５６】
ポリマーの濃度および分散力を調節することによって、または二重エマルションプロセスにおいて規定された長さおよび鋭い極性を有するポリマーを使用することによって、上記の調製方法は、外径が３０ｎｍ〜６００ｎｍ、例えば、３０〜４０ｎｍおよび１００〜６００ｎｍの中空ポリマーナノ粒子を提供することができる。
【００５７】
ナノ粒子は、溶媒系に溶解したポリマーを最初に水相を乳化するために使用する水−油−水二重エマルションプロセスに基づいて調製される。エマルションはその後、二次水相によって乳化される。内水相および外水相は、任意の極性溶液、例えば、水、酢酸、およびエタノールであり得る。水相には、溶液の酸性度および粘度を調整するために可溶化された分子が含まれており、これにはリン酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムが含まれる。一実施形態において、ナノ粒子調製のための抗溶媒として水が使用される。
【００５８】
本願のポリマーナノ粒子を調製するための上記水−油−水二重エマルション法は、２つの重要な特徴を有する：すなわち、（ｉ）異なる相間のエマルションは、界面活性剤、例えば、ビタミンＥ−Ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコールコハク酸塩およびポリ（ビニルアルコール）を使用するよりもむしろ、極性において本質的に高いコントラストを有するポリマー（カルボキシル末端基を有するＰＬＧＡ）を介して達成され、これは、界面活性剤材料を使用することなく、ポリマーシェルの厚さを最小にする乳化能力を高め、より高い商品価値を有すること；および（ｉｉ）油相の均質化と内水相中の封入されたカーゴの保持とのバランスを保つために、第２のエマルションプロセスに対してマイクロフルイダイザーまたは超音波処理のいずれかを用いる、制御された流体分散であること。
【００５９】
上述の方法によって調製されたポリマーナノ粒子は、薬物送達、セラノスティックス、およびワクチン開発用途のためのプラットフォーム技術として役立つ。それは、小分子、ペプチド、核酸、およびタンパク質を含む大きなクラスの生物活性剤の送達を促進して、それらの治療効力を高めることができる。薄いシェルのポリマー中空ナノ粒子は、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸、イメージング剤、無機ナノ粒子、有機ナノ粒子、およびこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない生物活性剤を封入するために使用することができる。プラットフォームの表面は、必要に応じて、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸、イメージング剤、ナノ粒子を含む機能的部分で修飾して、長期の循環薬物送達、標的化薬物送達、および抗原送達などの異なる用途に供することができる。
【００６０】
さらに詳細に説明することなく、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法においても、本開示の残りの部分を制限するものではない。本明細書に引用される全ての刊行物は、参照により援用される。
【実施例】
【００６１】
ポリマーナノ粒子の調製
薄いシェルのポリマーナノ粒子を、以下の工程を含むプロトコルに従って製造した：
１．ＤＣＭ中で１０ｍｇ／ｍＬのカルボキシ末端ＰＬＧＡポリマーを調製する。
【００６２】
２．５０μＬの内水相を５００μＬのＰＬＧＡ／ＤＣＭ溶液中に乳化して、第１のエマルションを形成する。音波処理振幅５０％で３０秒間連続的に超音波処理する。
３．第１のエマルションを５ｍＬの水溶液中で乳化し、マイクロフルイダイザーを用いて制御された流体剪断下で混合物を分散させて第２のエマルションを形成する。
【００６３】
４．第２のエマルションにさらなる３０ｍＬの水溶液を加え、３５℃で溶媒を蒸発させる。
５．ＤＣＭをヒュームフード中で３時間蒸発させて溶液を得る。
【００６４】
６．２２ｋＧで３５分間の超遠心分離によって溶液から粒子を単離する。
７．所望の溶液中に粒子を再分散させる。
ポリマーナノ粒子のキャラクタリゼーションおよび封入
上記の工程を用いて、平均直径１１０．９ｎｍの中空ポリマーナノ粒子を調製した。粒子のシェル厚の統計的平均は、ナノ粒子追跡分析によって得られたパラメータに基づいて導出された。総ポリマー重量、ＰＬＧＡ密度、および得られたナノ粒子の数に基づいて、ナノ粒子はシェル厚さにおいて統計的平均１６．５ｎｍを有すると計算された。予想外に、ある種のポリマーナノ粒子は、４０ｎｍ未満の直径を有していた。
【００６５】
薄いシェルの中空ナノ粒子は、水不透過性ポリマーシェルにより浸透抵抗性であることが分かった。ある試験では、親水性の赤い食用着色剤を封入した１００ｎｍの中空ナノ粒子を、水から３Ｘ  ＰＢＳに至るまでの範囲の溶液に懸濁させたが、浸透圧の差（０〜８５０Ｏｓｍｏ／ｋｇ）は、中空ナノ粒子がそれらのカーゴを放出する原因とはならなかった。それぞれの溶液中で１０分間インキュベートした後、ナノ粒子を３０，０００ｇで５分間遠心分離下でペレット化し、得られたペレットは、粒子内に親水性色素が保持されていることを示す同様の赤みを帯びた色を示した。吸光度法に基づいて放出された染料の上清を検出したところ、検出可能なシグナルは認められなかった。この試験は、２０ｎｍ以下の薄いポリマーシェルを有するにもかかわらず、中空ナノ粒子が浸透応力に抵抗する欠陥のないシェルを有することを示した。
【００６６】
薄いシェルの中空ナノ粒子のシェルが流体ではなく固体であることをさらに実証するために、中空ナノ粒子に機械的応力を加えてシェルを破壊した。ｃｒｙｏ−ＥＭでの可視化において、破壊した中空ナノ粒子を観察した。破壊された中空ナノ粒子の観察画像は、機械的摂動により小胞再編成を起こす高分子ベシクル（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）とは対照的に、固体シェルを有する中空の球体であることを示していた。固体ポリマーシェルは、既知の中空ナノ構造では観察されなかった水の不透過性と浸透圧抵抗性をもたらした。
【００６７】
薄いシェルのポリマーナノ粒子プラットフォームの際立った特徴は、その広い内部水性空間により大量の親水性カーゴを封入できる能力にある。薄いシェルの中空ナノ粒子は、ｓｉＲＮＡと免疫アジュバント環状ｄｉ−ＧＭＰを含むいくつかの生物活性剤を封入するために使用した。予想外に、小分子（例えば、スルホ−ｃｙ５、環状ｄｉ−ＧＭＰ、環状ｃＧＡＭＰ）、ペプチド（例えば、オボアルブミンペプチドＯＴＩ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）またはＯＴＩＩ（ＡＡＨＡＥＩＮＥＡ））、核酸（例えば、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド、２０−ｍｅｒ単鎖ＤＮＡ、および２０−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ）およびタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）を含む種々の長さスケールの親水性含量に対して高い封入効率を達成し、化合物の溶解限度内で３０％以上の効率で封入することに成功した。例えば、ｓｉＲＮＡは、ナノ粒子１ｍｇ当たり約１ｎｍｏｌの最終負荷収量で５０％の効率で封入化され、環状ｄｉ−ＧＭＰは３７％の負荷効率で封入化された。ＧＦＰ発現ＨｅＬａ細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子のサイレンシングを、ｓｉＲＮＡを担持した薄いシェルの中空ナノ粒子を用いて観察した。
【００６８】
親水性高分子によるポリマーナノ粒子の封入。
アッセイを行い、２つの親水性高分子、すなわち核酸（色素標識２０−ｍｅｒ一本鎖ＤＮＡ）とタンパク質（色素標識ＢＳＡ）に対する高分子ナノ粒子の封入効率を評価した。
【００６９】
核酸およびタンパク質に対するポリマーナノ粒子の封入効率の描写については、図２を参照されたい。この実施例において、核酸およびタンパク質の効果的な封入は、色素標識された２０−ｍｅｒ一本鎖ＤＮＡ（Ａ；中央）および色素標識されたＢＳＡ（Ａ；右）を用いて実証された。ナノ粒子をペレット化すると、粒子ペレットは空のナノ粒子の白色ペレット（Ａ；左）とは対照的に黄色（黄色がかったＦＡＭ色素標識を示す）であることが明らかとなった。蛍光の定量化により、ナノ粒子が予想外に核酸とタンパク質に対してそれぞれ４２％と３５％の封入効率を示すことが判明した。
【００７０】
核酸およびタンパク質の効果的な封入はまた、ｃｒｙｏＥＭを使用して視覚化した。空の粒子はその水性コア（図２Ｂ）の中では、プレーンで均一なテクスチャ（ｔｅｘｔｕｒｅ）を示したが、ＤＮＡ負荷粒子（図２Ｃ）およびＢＳＡ負荷粒子（図２Ｄ）は、ｃｒｙｏＥＭ下で濃縮された生物学的内容物の特徴である非常に粒状のテクスチャを示した。本実施形態の８ｍＭのＤＮＡおよび５０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの負荷濃度に基づくと、ＤＮＡ負荷ナノ粒子は約３５００のＤＮＡ分子を、ＢＳＡ負荷ナノ粒子は約２６０のタンパク質を含んでいた。重要なことは、核酸およびタンパク質のこのような高負荷は、これまで達成されていなかったということである。実際、既知のＰＬＧＡベースのナノ処方物は、一貫して核酸の封入化が非常に悪く、負荷を増強するために核酸上の負電荷を中和するためにポリカチオン性ポリマーを使用しなければならなかった。例えば、Ｓｈｉ他、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ、２０１１、５０（３１）：７０２７−３１およびＷｏｏｄｒｏｗ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００９、８（６）：５２６−５３３、を参照されたい。
【００７１】
上述したこれらの結果は、本願の薄いシェルのポリマーナノ粒子が、それらの本来の可溶性状態の親水性高分子に対して予想外に高い封入効率、すなわち高い負荷効率を示し、薄いシェル中空ナノ粒子の利点および独自性を強調していることが分かる。
【００７２】
リンパ節における免疫刺激のためのインターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの封入化および放出制御におけるポリマーナノ粒子の効果
リンパ節における免疫刺激に対するＳＴＩＮＧアゴニストの封入化および放出制御におけるポリマーナノ粒子の効果を評価するためにアッセイを行った。
【００７３】
図３は、免疫刺激のためのＳＴＩＮＧアゴニストの封入化および制御放出に対するポリマーナノ粒子の効果を示す。この例では、本プラットフォームをワクチン開発に適用した。ナノ粒子ワクチンを調製する際の主要な技術的課題は、ナノスケール基質上で抗原とアジュバントを確実に会合させる（ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）ことにある。例えば、Ｂｒａｎｎｏｎ−Ｐｅｐｐａｓ他、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００４、５６（１１）：１６４９−５９、およびＬｉｍａ−Ｔｅｎｏｒｉｏ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ、２０１５、４９３（１−２）：３１３−２７、を参照されたい。この技術的課題を克服するために、薄いシェルのポリマー中空ナノ粒子を用いて、生分解性ポリマー、すなわちＰＬＧＡを用いて機能性カーゴを高密度にパッケージ化した。
【００７４】
より具体的には、直径が１００〜２００ｎｍの間の中空粒子を、二重エマルションプロセスを使用して調製した（図３Ａおよび３Ｂ）。それらは、約４０％の効率（図３Ｃ）で、ＳＴＩＮＧアゴニストアジュバントの環状ｄｉ−ＧＭＰ（ｃｄ−ＧＭＰ）を効率的に封入したが、これは、核酸および親水性カーゴをナノ粒子プラットフォームに封入することは非常に困難であることが知られていることから注目に値する。高い封入効率により、ナノ粒子当たり約２，０００のＳＴＩＮＧアゴニスト分子を得た。ポリマーナノ粒子に基づくＳＴＩＮＧアゴニストのナノ処方物は報告されていない。ｃｒｙｏＥＭによる試験は、これら中空ナノ粒子の大きな内部コアを明らかにし、これはｃｄ−ＧＭＰ（図３Ｄ）の高い負荷効率の原因であった。細胞内送達に際して、中空ナノ粒子の薄いポリマーシェルは酸性ｐＨによってトリガーされ、内部含有物を迅速に放出した（図３Ｅ）。
【００７５】
これらの結果は、薄いシェルのポリマーナノ粒子が合成ワクチンの効果的な調製を可能にしたことを示す。
全身性サイトカインを最小にしながらリンパ性サイトカインを増強するＳＴＩＮＧアゴニスト負荷ナノ粒子の評価
全身性サイトカインを最小にしながらリンパ性サイトカインを増強するＳＴＩＮＧアゴニスト負荷ナノ粒子を評価するためのアッセイを実施した。
【００７６】
図４は、全身性サイトカインを最小にしながらリンパ性サイトカインを増強するＳＴＩＮＧアゴニスト負荷ナノ粒子を示す。最初に、ｃｄ−ＧＭＰ負荷ナノ粒子による免疫活性化を、マウス樹状細胞株ＪＡＷＳＩＩを用いてインビトロで検討した。遊離のＣＤ−ＧＭＰまたはｃｄ−ＧＭＰナノ粒子と２４時間インキュベートした後、培養上清をＥＬＩＳＡ分析のために回収し、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＦＮ−βのレベルを定量した。遊離ｃｄ−ＧＭＰ処方物と比較して、ナノ粒子処方物はＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＦＮ−βの産生をより効果的に誘発した（図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃ）。細胞上のＣＤ８０発現も、遊離ｃｄ−ＧＭＰの等価用量（図４Ｄ）と比較して、ナノ粒子処方物とインキュベートした場合に増強された。ナノ粒子は、ナノキャリアによる細胞内送達の増加に起因して、ＳＴＩＮＧアゴニストのアジュバント性を約３０倍増強することが観察された。遊離の環状−ｄｉ−ヌクレオチドは膜透過性が低く、細胞質の標的に容易に接近できないと推測される。ナノ粒子封入により、細胞取り込みは粒子エンドサイトーシスを介して増強され、続いて細胞内放出がｃｄ−ＧＭＰのサイトゾル侵入を促進し、それによりその免疫増強効果を増強する。
【００７７】
さらに、ｃｄ−ＧＭＰナノ粒子による免疫増強を、マウスにおいてインビボで遊離ｃｄ−ＧＭＰと比較した。足蹠注射の４８時間後に、流出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）膝窩リンパ節をＩＦＮ−β定量のために採取した。ナノ粒子処方物はリンパ節において有意に高いレベルのＩＦＮ−βを誘導し（図４Ｅ）、これは適切なＴ細胞成熟に重要であることが観察された。加えて、反応原性のインジケーターである、ＴＮＦ−αの全身レベルも、遊離ｃｄ−ＧＭＰおよびｃｄ−ＧＭＰナノ粒子の足蹠投与後にモニターした。ナノ粒子は、リンパ系におけるナノ粒子の分布を反映するＴＮＦ−αの有意に低い血清レベルをもたらすことが観察された。一方、遊離ｃｄ−ＧＭＰは血清中のＴＮＦ−αレベルを上昇させ、これらの小分子は血流中に自由に拡散している（図４Ｆ）。
【００７８】
これらの結果は、ＳＴＩＮＧアゴニスト負荷ナノ粒子が、リンパ節を標的とした免疫増強のためにリンパ性サイトカインを効果的に増強したことを示す。
細胞と会合する免疫アジュバント（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ａｄｊｕｖａｎｔ）に基づく治療法
一実施形態において、本明細書に記載される治療キットおよび方法は、疾患、例えば、心血管疾患、がん、自己免疫疾患、または感染症を治療するために使用され得る。一実施形態において、本明細書に記載の治療キットおよび方法は、口腔および咽頭のがん（口唇、舌、唾液腺、口腔底、歯肉および他の口腔、鼻咽頭、扁桃、中咽頭、下咽頭、他の口腔／咽頭）；消化器系のがん（食道；胃；小腸；結腸および直腸；肛門、肛門管、肛門直腸；肝臓；肝内胆管；胆嚢；他の胆道；膵臓；後腹膜腔；腹膜、大網、腸間膜；他の消化器）；呼吸器系のがん（鼻腔、中耳、および副鼻腔；喉頭；肺および気管支；胸膜；気管、縦隔、およびその他の呼吸器）；中皮腫；骨および関節；ならびに心臓を含む軟組織のがん；黒色腫および他の非上皮性皮膚がんを含む皮膚がん；カポジ肉腫および乳がん；女性生殖器系のがん（子宮頚部；子宮体部；子宮、卵巣；膣；外陰部；他の女性生殖器）；男性生殖器系のがん（前立腺；睾丸；陰茎；他の男性生殖器）；泌尿器系のがん（膀胱；腎臓および腎骨盤；尿管；その他の泌尿器）；眼および眼窩のがん；脳および神経系のがん（脳；その他の神経系）；内分泌系のがん（甲状腺および胸腺を含む他の内分泌）；リンパ腫（ホジキン病および非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、ならびに白血病（リンパ球性白血病；骨髄性白血病；単球性白血病；その他の白血病）、のようながんに対して使用されてもよい。
【００７９】
一実施形態において、免疫アジュバント処方物は、アジュバントを封入するポリマーナノ粒子を含み得、そしてポリマーナノ粒子は、水不透過性のポリマーシェルと、同ポリマーシェルによって封入された１つ以上の水性コアとをさらに含み得る。好ましい実施形態において、アジュバントは、ＭＰＬＡ、ＣｐＧ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、環状ジヌクレオチドの変異体、細胞質パターン認識受容体に対するアゴニスト（例えば、環状ｄｉ−ＧＭＰまたは環状ＧＡＭＰ）、またはインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を含む。
【００８０】
腫瘍細胞と会合する免疫アジュバント（ｃＧＡＭＰ負荷ナノ粒子）に基づく治療法の説明については、図５を参照されたい。本願の一実施形態において、２’３’−ｃＧＡＭＰは、ポリマー中空ナノ粒子内に封入されて、エンドサイトーシスを介した細胞内包化（ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増強する。ｃＧＡＭＰは細胞質パターン認識受容体に対するアゴニストであり、ＴＢＫ１／インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）／１型インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達を活性化するインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）である。細胞とのｃＧＡＭＰ会合を促進することにより、アジュバント処方物は免疫プロセッシングのために抗原を活性化する（ｐｒｉｍｅ）。抗原放出を誘発する手段により細胞死を誘発する処理に際して、細胞破片は、次いで、アジュバント処方物から外因的に送達されたアジュバントと共に処理され、細胞殺傷のために強化された適応免疫を可能にする（図５）。
【００８１】
一実施形態において、抗原放出を誘導するための手段は、化学薬剤、生物薬剤、放射線照射、光分解剤、機械的破壊、またはそれらの組み合わせを含み得る。
好ましい実施形態では、化学薬剤は、当技術分野で知られている任意の細胞毒性剤を含む。例えば、細胞毒性剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メルタンシン（ＤＭ１）、アントラサイクリン、ピロロベンゾジアゼピン、α−アマニチン、ツブリジン、ベンゾジアゼピン、エルロチニブ、ボルテゾミブ、フルベストラント、スニチニブ、レトロゾール、メシル酸イマチニブ、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、オキサリプラチン、ロイコボリン、ラパマイシン、ラパチニブ、ロナファルニブ（ＳＡＲＡＳＡＥ（登録商標）、ＳＣＨ６６３３６）、ソラフェニブ、ゲフィチニブ、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１、アルキル化剤；アルキルスルホン酸塩；アジリジン；エチレンイミン；メチルアメラミン；アセトゲニン；カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５；クリプトフィシン；ドラスタチン；デュオカルマイシン；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル；クロルナファジン；クロロフォスファミド（ｃｈｏｌｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；エストラムスチン；イホスファミド；メクロレタミン；メクロレタミンオキサイド塩酸塩；メルファラン；ノベンビチン；フェネステリン；プレドニムスチン；トロフォスファミド；ウラシルマスタード；カルムスチン；クロロゾトシン；ホテムスチン；ロムスチン；ニムスチン；ラニムスチン；カリケアミシン；ダイネマイシン；クロドロネート；エスペラマイシン；ネオカルジノスタチン発色団；アクラシノマイシン；アクチノマイシン；オートラマイシン；アザセリン；ブレオマイシン；カクチノマイシン；カラビシン；カミノマイシン；カルジノフィリン；クロモマイシン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；デトルビシン；６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン；ドキソルビシン；エピルビシン；エソルビシン；イダルビシン；マルセロマイシン；マイトマイシン；ミコフェノール酸；ノガラマイシン；オリボマイシン；ペプロマイシン；ポピロマイシン；ピューロマイシン；クエラマイシン；ロドルビシン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；デノプテリン；プテロプテリン；トリメトレキセート；フルダラビン；６−メルカプトプリン；チアミプリン；チオグアニン；アンシタビン；アザシチジン；６−アザウリジン；カーモーファー；シタラビン；ジデオキシウリジン；ドキシフルリジン；エノシタビン；フロクスウリジン；カルステロン；プロピオン酸ドロモスタノロン；エピチオスタノール；メピチオスタン；テストラクトン；アミノグルテチミド；ミトタン；トリロスタン；フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アンサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラクセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミジン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシッド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン；アンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；���トラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド；パクリタキセル；ドセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン；カルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エデトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロン酸；トポイソメラーゼ阻害剤；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド；カペシタビン；またはその組み合わせ、を含む。
【００８２】
好ましい実施形態において、一般に光線力学療法に用いたれる光増感剤である光分解剤は、フォトフリン、レーザーフィリン、アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、シリコンフタロシアニンＰｃ  ４、ｍ−テトラヒドロキシフェニルクロリン（ｍＴＨＰＣ）、クロリンｅ６（Ｃｅ６）、アルメラ、レブラン、フォスキャン、メトビクス、ヘクスビックス、フォトクロル、フォトセンス、フォトレックス、ルマカン、ビソナック、アンフィネックス、ベルテポルフィン、プリチン、ＡＴＭＰｎ、亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰｃ）、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）、ピロフェオホルビデア（ＰＰａ）、フェオホルビド  ａ（ＰｈＡ）、またはこれらの組み合わせ、を含む。
【００８３】
抗原放出を誘導するための手段は、免疫アジュバント処方物の投与の前または投与の後に、必要とする対象に投与され得る。この一連の治療において、抗原放出を誘導するための手段および免疫アジュバント処方物は、異なる時期に投与されるための２つの異なる用量として処方化される。
【００８４】
あるいは、抗原放出を誘導するための手段は、免疫アジュバント処方物の投与と同時に、必要とする対象に投与され得る。この一連の治療において、細胞からの抗原放出を誘導するための手段は、免疫アジュバント処方物において、同時に投与するための単一用量または２つの異なる用量として処方するか、またはカプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）することができる。例えば、アジュバントおよび細胞毒性剤は、１つのナノ粒子中に処方され得るか、または１つの抗体にコンジュゲートされ得る。
【００８５】
治療法を示すために、ＨｅＬａ細胞を、蛍光標識したｃＡＭＰ負荷ナノ粒子とともにインキュベートした（図６（ａ））。２４時間のインキュベーション後のナノ粒子の細胞内取り込みに際して、図５に示すように、化学療法薬シスプラチンの処理下で、細胞を小胞化し、細胞破片を生成した。アジュバントナノ粒子と癌細胞小胞との会合を示すために、回収した細胞破片を共焦点顕微鏡で分析し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）で定量化した。結果は、細胞破片がかなりの量のアジュバント負荷ナノ粒子を含んでいたことを示す（図６（ｂ）、（ｃ））。
【００８６】
次に、がん細胞の破片を回収し、ＪＡＷＳＩＩマウス樹状細胞（ＤＣ）株とインキュベートして、それらの免疫原性を調べた。遊離ｃＧＡＭＰまたはｃＧＡＭＰ負荷ナノ粒子のいずれかと２４時間インキュベートしたＨｅＬａ細胞をシスプラチンで処理し、得られた細胞破片を回収してＤＣを刺激した。ＤＣは２４時間のインキュベーション後に回収し、ＤＣ活性化マーカーＣＤ８６およびＣＤ８０について試験した。免疫原性細胞破片によるＤＣのインビトロ活性化は、ＦＡＣＳ分析によって実証した。活性化されたＤＣのサイトカインプロファイルは、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βのＥＬＩＳＡ分析によって推定した。結果は、細胞と会合する能力がほとんどない遊離ｃＧＡＭＰと比較して、ｃＧＡＭＰ負荷ナノ粒子とのインキュベーションがＣＤ８０とＣＤ８６のレベルを有意に増加させ、ＤＣによるＴＮＦ−αとＩＦＮ−βの分泌を上昇させることを示す（図７）。特に、適応細胞免疫を形成する重要な因子として認識されているＩ型ＩＦＮであるＩＦＮ−β［７］は、アジュバント処方物によって１００倍以上増強される。
【００８７】
ナノ粒子アジュバント処方物の細胞会合効果を検証するために、Ｂ６マウスにＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を皮下接種した。Ｂ１６細胞によるナノ粒子を介したアジュバントの保持は、全身イメージング、フローサイトメトリー分析、および蛍光顕微鏡を用いて検証した。色素標識ＳＴＩＮＧアゴニスト（２’−［ＤＹ−５４７］−ＡＨＣ−ｃ−ｄｉＧＭＰ）をその遊離型およびナノ粒子型で腫瘍内に投与し、２４時間後に調べた。ＳＴＩＮＧアゴニストのナノ粒子処方物が腫瘍内部に十分に保持されていることが観察された（図８（ａ））。切除した腫瘍からがん細胞を抽出すると、がん細胞内での有意なＳＴＩＮＧアゴニストの会合がフローサイトメトリーと共焦点顕微鏡（図８（ｂ）、（ｃ））からも確認された。対照的に、腫瘍内またはがん細胞内部のいずれかのアジュバント保持は、遊離アジュバントの投与時にほとんど観察されなかった。
【００８８】
治療法のインビボ効率を試験するために、Ｂ６マウスにＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を皮下接種した。腫瘍が触知可能に見えた場合、シスプラチン（ＣＴＴＰ）による化学療法の前に、それらを遊離ｃＧＡＭＰまたはｃＧＡＭＰ負荷ナノ粒子で前処理した。腫瘍内アジュバント投与の２４時間後に、細胞死（図９（ａ））を誘導するために、マウスに腫瘍内シスプラチン注射を行った。これらの２つのグループは、それぞれ、遊離ｃＧＡＭＰおよびｃＧＡＭＰ負荷ナノ粒子の使用を区別するために、それぞれｃＧＡＭＰ＋ＣＴＴＰおよびＮＰ＋ＣＴＴＰと命名した。対照として、未処理（プラセボ）、シスプラチンのみ（ＣＴＴＰのみ）およびｃＧＡＭＰ負荷ナノ粒子のみ（ＮＰのみ）を受けた腫瘍担持マウスも調製した。ｃＧＡＭＰ投与のために、５０μＬの溶液中に２．５μｇのアジュバントを投与した。シスプラチン投与については、２３５μｇの化学薬剤を１００μＬの溶液中に投与した。異なる処理の後、腫瘍体積を経時的に監視した。ＮＰ＋ＣＴＴＰ群では、動物の５０％（１０匹のうち５匹）が完全な腫瘍退縮を示した。対照的に、他の群では完全退縮した腫瘍はなかった（図９（ｂ）、（ｃ））。特に、ＣＴＴＰのみまたはＮＰのみの処理は腫瘍退縮を誘導せず、それらの併用により相乗効果が誘導されることを示した。加えて、どのｃＧＡＭＰ＋ＣＴＴＰ動物も完全な腫瘍退縮を示さなかったことから、ＮＰ＋ＣＴＴＰ群における相乗効果はがん細胞内のアジュバント保持の増強に起因することが示された。ＮＰ＋ＣＴＴＰ群からの腫瘍のない生存マウスでは、それらのうちの４匹を、６０日目にＢ１６−ＯＶＡ細胞で再チャレンジし、以前に腫瘍チャレンジおよび処理を受けていない動物と比較した。ＮＰ＋ＣＴＴＰ群の生存動物の間で腫瘍増殖が有意に減少したことが観察され、このことは、これらの動物が適応抗がん免疫を獲得していること（図９（ｄ））を示している。これらの結果は、がん細胞と会合する免疫アジュバントを適用することにより、適応免疫が促進され、その後の抗がん治療の効果が大幅に向上することを検証するものである。
【００８９】
本願の一実施形態において、免疫アジュバント処方物は、細胞表面上の部分を認識してそれに結合するために、小分子、ペプチド、抗体、アプタマー、糖部分、ポリマーまたはそれらの組み合わせにコンジュゲートされたアジュバントを含む。好ましくは、抗体は、免疫グロブリン分子、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイボディ、ヒト化抗体、多特異的抗体、Ｆａｂ、二重特異的抗体、Ｆａｂ’フラグメント、二重特異的抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または単鎖抗体、を含む。
【００９０】
１つの好ましい実施形態において、ＣｐＧ−ＦＡＭは、病原性細胞会合のための抗体にコンジュゲートされた。ＨｅＬａ細胞で高度に発現するＣＤ４４を標的とする抗ＣＤ４４を、アジュバントコンジュゲーションに採用した。１ｍｇの抗体を最初に１ＸＰＢＳ中１：２０のモル比で２４時間スルホＳＭＣＣと混合した。インキュベーションに続いて、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）３０ｋＤａの遠心フィルターを用いて、機能化抗体を精製した。次に、抗体を、末端システイン基を含むＣｐＧ−ＯＤＮと混合した。可視化のためにＦＡＭ色素をＣｐＧ−ＯＤＮに取り付けた（図１０）。２４時間のインキュベーションに続いて、３０ｋＤａのＭＷＣＯを有する遠心フィルターを用いて、ＣｐＧコンジュゲート抗体を回収した。
【００９１】
次に、遊離ＣｐＧ−ＦＡＭおよび抗ＣＤ４４コンジュゲートＣｐＧ−ＦＡＭをＨｅＬａ細胞と３時間インキュベートすることにより、ＨｅＬａ細胞へのＣｐＧ会合を評価した。インキュベーションに続いて、細胞を洗浄し、ＣｐＧ会合をＦＡＭ蛍光に基づいて評価した。蛍光顕微鏡下で、抗ＣＤ４４ＣｐＧコンジュゲートがＨｅＬａ細胞単層に対してより高い蛍光保持をもたらすことを観察した（図１１Ａ）。フローサイトメトリー分析のために細胞を分離すると、ＣｐＧ／がん細胞会合の増強も抗ＣＤ４４コンジュゲートで観察され、病原性細胞へのアジュバントの標的化が成功したことが示された（図１１Ｂ，Ｃ）。
【００９２】
アジュバント会合に続いて、ＨｅＬａ細胞を細胞毒性薬であるドキソルビシンで処理して、細胞死を誘発し、細胞破片を生成した。２０時間のドキソルビシン処理に続いて、細胞破片を回収し、ＪＡＷＳＩＩマウス樹状細胞に与えた。次に、ＪＡＷＳＩＩ細胞を、細胞破片との２０時間のインキュベーション後に、ＣＤ８０およびＣＤ８６のような活性化マーカーについて評価した。抗ＣＤ４４コンジュゲートＣｐＧで処理したＨｅＬａ細胞の破片が最高レベルの成熟マーカーを誘発することが観察された（図１２）。
【００９３】
本願の別の実施形態において、ＣｐＧ−ＦＡＭは、腫瘍細胞の取り込みを増強するためにポリマーナノ粒子に封入された。ＣｐＧ−ＦＡＭ負荷ナノ粒子を調製するために二重エマルションプロセスを採用した。２０ｍｇ／ｍＬのＣｐＧを最初に５０μＬの１００ｍＭリン酸塩緩衝液に溶解し、次いで５０ｍｇ／ｍＬのＰＬＧＡ（１０，０００Ｄａ、カルボキシル末端、５０：５０ラクチド：グリコリド）を含有する５００μＬの酢酸エチル中で乳化した。次に、得られた油中水型エマルションを５ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液で乳化した。インキュベーションの後、水中油中水型エマルションを、次いで１０ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液に注ぎ入れ、酢酸エチルを窒素衝撃下で蒸発させた。１時間の溶媒蒸発後、ナノ粒子−封入化ＣｐＧを、３０ｋＤａのＭＷＣＯを有する遠心フィルターを用いて回収した。ＣｐＧを含有する１００ｎｍ以下（ｓｕｂ−１００ｎｍ）のナノ粒子の調製の成功をｃｒｙｏＥＭ（図１３）を用いて検証した。
【００９４】
次に、遊離ＣｐＧ−ＦＡＭおよびナノ粒子封入化ＣｐＧ−ＦＡＭをＨｅＬａ細胞と２４時間インキュベートすることによる、ＨｅＬａ細胞へのＣｐＧ会合を評価した。インキュベーションに続いて、細胞を洗浄し、ＣｐＧ会合をＦＡＭ蛍光に基づいて評価した。蛍光顕微鏡下で、ナノ粒子封入化ＣｐＧがＨｅＬａ細胞単層に対してより高い蛍光保持をもたらすことを観察した（図１４Ａ）。フローサイトメトリー分析のために細胞を分離すると、ＣｐＧ／がん細胞会合の増強もナノ粒子封入化ＣｐＧで観察され、細胞へのアジュバントの標的化が成功したことが示された（図１４Ｂ，Ｃ）。
【００９５】
アジュバント会合に続いて、ＨｅＬａ細胞を細胞毒性薬であるドキソルビシンで処理して、細胞死を誘発し、細胞破片を生成した。２０時間のドキソルビシン処理に続いて、細胞破片を回収し、ＪＡＷＳＩＩマウス樹状細胞に与えた。次に、ＪＡＷＳＩＩ細胞を、細胞破片との２０時間のインキュベーション後に、ＣＤ８０およびＣＤ８６のような活性化マーカーについて評価した。ナノ粒子封入化ＣｐＧで処理したＨｅＬａ細胞の破片が最高レベルの成熟マーカーを誘発することが観察された（図１５）。
【００９６】
本願の別の実施形態において、抗原放出を誘導するための手段は、免疫アジュバント処方物の投与と同時に、必要とする対象に投与され得る。あるいは、抗原放出を誘導するための手段は、免疫アジュバント処方物の投与前または投与後に、必要とする対象に投与され得る。
【００９７】
一実施形態において、ダウノルビシンをｃｄ−ＧＭＰ  ＳＴＩＮＧアゴニストと共にナノ粒子に封入し、細胞死を誘発しながら同時に細胞内アジュバント送達を可能にした。ダウノルビシンおよびｃｄ−ＧＭＰを共に封入するナノ粒子を調製するために二重エマルションプロセスを採用した。１０ｍｇ／ｍＬのダウノルビシンおよび１０ｍｇ／ｍＬのｃｄ−ＧＭＰを含有する溶液を、最初に１００ｍＭリン酸塩緩衝液で調製し、その溶液の５０μＬを、５０ｍｇ／ｍＬのＰＬＧＡを含有する５００μＬの酢酸エチル中で乳化した（１０，０００Ｄａ、カルボキシル末端、５０：５０ラクチド：グリコリド）。次に、得られた油中水型エマルションを５ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液で乳化した。インキュベーションの後、水中油中水型エマルションを、次いで１０ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液に注ぎ入れ、酢酸エチルを窒素衝撃下で蒸発させた。１時間の溶媒蒸発後、ダウノルビシン／ｃｄ−ＧＭＰナノ粒子を、３０ｋＤａのＭＷＣＯを有する遠心フィルターを用いて回収した。対照として、ｃｄ−ＧＭＰの非存在下でダウノルビシンを封入するナノ粒子を、内水相（ｉｎｎｅｒ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）として２０ｍｇ／ｍＬのダウノルビシンを用いて調製した。ダウノルビシンおよびｃｄ−ＧＭＰを含有する１００ｎｍ以下のナノ粒子の調製の成功をｃｒｙｏＥＭを用いて検証した（図１６）。
【００９８】
次に、ＣＴ２６結腸がん細胞を３つの異なる処方物で処理した：１）ダウノルビシンのナノ粒子のみ（ＤＲ  ＮＰ）；２）遊離ｃｄ−ＧＭＰおよびダウノルビシンのナノ粒子（ｃｄ−ＧＭＰ＋ＤＲ  ＮＰ）；および３）ダウノルビシンおよびｃｄ−ＧＭＰを共に封入するナノ粒子（（ｃｄ−ＧＭＰ＋ＤＲ）ＮＰ）。ＣＴ２６培養物２ｍＬにダウノルビシン１０μｇおよびｃｄ−ＧＭＰ１０μｇを与えた。３時間の処理に続いて、細胞破片を回収し、ＪＡＷＳＩＩマウス樹状細胞に与えた。次に、ＪＡＷＳＩＩ細胞を、細胞破片との２４時間のインキュベーション後に、ＣＤ８０およびＣＤ８６などの活性化マーカーについて評価した。ダウノルビシンおよびｃｄ−ＧＭＰを共に封入したナノ粒子で処理したＣＴ２６細胞の破片は、ＣＤ８０およびＣＤ８６のような最高レベルの成熟マーカーを誘発することが観察された（図１７）。
【００９９】
ＪＡＷＳＩＩ細胞の上清も、Ｔ細胞活性化および増殖のための主要なリンパ球活性化シグナルであるＩＦＮ−βについて評価した。ダウノルビシンおよびｃｄ−ＧＭＰを共に封入したナノ粒子で処理したＣＴ２６細胞の破片は、ＪＡＷＳＩＩ細胞において最高レベルのＩＦＮ−β産生を誘導することが観察された（図１８）。これらの結果は、細胞毒性剤と免疫アジュバントを細胞に同時送達するアジュバント処方物が、有意な免疫原性を備えた細胞破片を誘導できることを示している。
【０１００】
要約すると、上記の説明は、免疫アジュバント処方物を含む治療キットが、免疫応答標的特異的細胞を促進することができることを示している。疾患細胞に対する適応免疫を増強することができる細胞会合免疫アジュバントに基づく新しい治療法も示した。本方法および治療キットは、限定されるものではないが、化学療法、放射線療法、光熱療法、免疫療法、および外科的介入を含む、細胞破片および抗原の放出を誘導する任意の既存の治療に適用可能である。限定されるものではないが、細胞内侵入、膜繋留、および免疫アジュバントの表面結合を容易にする方法を含む、病原性細胞に免疫アジュバントを会合させるための他のアプローチもまた企図される。免疫アジュバントとしては、限定されるものではないが、ＭＰＬＡ、ＣｐＧ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、環状ジヌクレオチドの変異体、および他の免疫刺激分子も挙げられる。細胞会合のために、免疫アジュバント処方物および抗原放出を誘導するための手段（例えば、ｃＧＡＭＰおよび化学療法剤の両方を含有するナノ粒子）の両方を含む治療キットも考えられる。
【０１０１】
開示された実施形態に対して様々な修正および変更を行うことができることは、当業者には明らかであろう。本明細書および実施例は例示としてのみ考慮されることが意図され、本開示の真の範囲は、以下の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって示される。
【０１０２】
参考文献
以下に列挙され、本明細書で参照される参考文献は、本明細書が別段の定めがない限り、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
１．バックマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ），Ｍ．Ｆ．およびＧ．Ｔ．ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ａ  ｍａｔｔｅｒ  ｏｆ  ｓｉｚｅ，ｇｅｏｍｅｔｒｙ，ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ．（ワクチン送達:サイズ、幾何学的形状、動力学および分子パターンの問題）、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０、１０（１１）：ｐ．７８７−９６。
【０１０４】
２．オット（Ｏｔｔ），Ｐ．Ａ．他、Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｌａｎｏｍａ．（黒色腫患者に対する免疫原性個人用新抗原ワクチン）、Ｎａｔｕｒｅ、２０１７、５４７（７６６２）：ｐ．２１７−＋。
【０１０５】
３．ファン（Ｆａｎ），Ｙ．他、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｂｙ  Ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（免疫原性細胞死は、癌免疫療法のための共存アジュバント送達によって増幅された）、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ，２０１７。
【０１０６】
４．フ（Ｆｕ），Ｊ．他、ＳＴＩＮＧ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｃａｎ  ｃｕｒｅ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ＰＤ−１  ｂｌｏｃｋａｄｅ（ＳＴＩＮＧアゴニスト処方癌ワクチンは、ＰＤ−１遮断に抵抗性の確立された腫瘍を治癒することができる）、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１５、７（２８３）：ｐ．２８３ｒａ５２。
【０１０７】
５．ガルージ（Ｇａｌｌｕｚｚｉ），Ｌ．他、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ（がんおよび感染症における免疫原性細胞死）、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１７、１７（２）：ｐ．９７−１１１。
【０１０８】
６．フリッドマン（Ｆｒｉｄｍａｎ），Ｗ．Ｈ．他、Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｎｔｅｘｔｕｒｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒｓ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ（ヒト腫瘍における免疫機構：臨床転帰への影響）、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１２、１２（４）：ｐ．２９８−３０６。
【０１０９】
７．ヘルツゾッグ（Ｈｅｒｔｚｏｇ），Ｐ．Ｊ．、Ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ａｓ  ｐｒｉｍｅｒｓ，ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ（概要：自然免疫応答および適応免疫応答のプライマー、活性化因子および阻害因子としてのＩ型インターフェロン）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１２、９０（５）：ｐ．４７１−４７３。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３（Ａ）】
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【図１３（Ｂ）】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６（Ａ）】
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【図１６（Ｂ）】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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