(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−６Ｒ抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。本発明のＩＬ−６Ｒ抗体は、アルパカ由来抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体である。本発明は、ＩＬ−６関連疾患処置用医薬の製造における本発明の抗体の使用をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントにおいて、
ＣＤＲ１の配列は、配列番号１５の配列、および配列番号１５の配列と３、２または１個のアミノ酸が異なるバリアント配列からなる群から選択され；
ＣＤＲ２の配列は、配列番号１６の配列、および配列番号１６の配列と３、２または１個のアミノ酸が異なるバリアント配列からなる群から選択され；
ＣＤＲ３の配列は、配列番号１７の配列、および配列番号１７の配列と３、２または１個のアミノ酸が異なるバリアント配列からなる群から選択され；
該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ−６Ｒに結合する、
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ＣＤＲ１配列が配列番号１５の配列であり；
ＣＤＲ２配列が配列番号１６の配列であり；
ＣＤＲ３配列が配列番号１７の配列である、
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
該モノクローナル抗体が、組換え抗体、好ましくはアルパカ由来抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される組換え抗体であり；
好ましくは、該モノクローナル抗体は配列番号１４のＶＨＨを含む、
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
該ヒト化抗体が、配列番号１４のＶＨＨのバリアントを含む、請求項３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
該ＶＨＨのバリアントが、配列番号１４のＶＨＨのＦＲ領域において１〜１５個のアミノ酸のヒト化変異を有し；好ましくは該アミノ酸変異は、配列番号１４のＶＨＨにおけるＡ１４Ｐ、Ｅ２３Ａ、Ｑ４４Ｇ、Ｖ７８Ｌ、Ｋ８６Ｒ、Ｎ９６Ａ、Ａ９７Ｆ、Ｑ１１６Ｌまたはそれらの組み合わせからなる群から選択され；最も好ましくは該バリアントのアミノ酸配列は配列番号２０〜２８からなる群から選択される、請求項４に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
該抗体がヒト抗体Ｆｃ領域をさらに含み、好ましくは配列番号１９のヒト抗体Ｆｃ領域を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
該抗原結合フラグメントが、シングルドメイン抗体、または３つのＣＤＲを含むペプチドである、請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＩＬ−６Ｒへの結合を競合し、ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
処置有効量の、請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、および
１つまたはそれ以上の薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤
を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項１１】
配列番号１３の核酸分子との相同性が少なくとも８０％であるポリヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞において、該宿主細胞は原核生物細胞および真核生物細胞であり、好ましくは該宿主細胞は真核生物細胞であり、より好ましくは該宿主細胞は哺乳動物細胞または酵母細胞である、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法において、該方法は、
請求項１３に記載の宿主細胞を培養するステップ；
該培養において請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生成し蓄積するステップ；および
該培養から該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを回収するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
ヒトＩＬ−６Ｒを検出または測定する方法において、該方法は、請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをサンプルと接触させるステップを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、ヒトＩＬ−６Ｒを検出または測定するための試薬。
【請求項１７】
ヒトＩＬ−６Ｒが関与する疾患の治療または予防用医薬の製造における、請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項９に記載の医薬組成物、または請求項１０もしくは１１に記載の核酸分子の使用。
【請求項１８】
敗血症、多発性骨髄腫、腎細胞癌、形質細胞白血病、リンパ腫、Ｂリンパ組織過形成、前立腺癌、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、エイズ関連リンパ腫、関節リウマチ、全身的に発症する若年性特発性関節炎、高γグロブリン血症、限局性腸炎、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭγグロブリン疾患、心臓粘液腫、喘息、自己免疫性インスリン依存性糖尿病および炎症性貧血からなる群から選択される１つまたはそれ以上の疾患の治療または予防用医薬の製造における、請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項９に記載の医薬組成物、または請求項１０もしくは１１に記載の核酸分子、またはそれらの組み合わせの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＩＬ−６Ｒ抗体およびその抗原結合フラグメントに関する。本開示は、該ＩＬ−６Ｒ抗体のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体およびヒト化抗体にも関する。本開示はさらに、該ＩＬ−６Ｒ抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびにＩＬ−６ＲまたはＩＬ−６が関与する疾患の診断および処置剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン６（ＩＬ−６）は、細胞の増殖および分化を調節する多面的な炎症性サイトカインで、炎症反応および免疫反応の仲介において重要な役割を担う。インターロイキン−６およびその受容体（ＩＬ−６Ｒ）の産生は、多発性骨髄腫、自己免疫疾患および前立腺癌といったさまざまな疾患の原因に関連する。
【０００３】
ＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６ＲαおよびＩＬ−６Ｒβを含む、ＣＤ１２６としても知られる、造血サイトカイン受容体スーパーファミリーの最初に発見されたメンバーで、シグナル伝達タンパク質ｇｐ１３０はＩＬ−６ファミリーメンバーに共通する。ＩＬ−６はＩＬ−６Ｒαに結合してＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒα複合体を形成し、これがｇｐ１３０に結合して高親和性複合体を形成する（Journal of Immunology, 2006, 25(5): 475-479）。
【０００４】
ＩＬ−６Ｒαは主に、肝細胞、好中球、マクロファージおよびいくつかのリンパ球の表面で発現され、ｇｐ１３０はすべての細胞の表面で発現される（Rheumatology (Oxford, England), 2010, 49(1): 15-24）。さらに、可溶性形態のＩＬ−６Ｒ（すなわち、ｓＩＬ−６Ｒ）が存在する。ｓＩＬ−６Ｒは、体液中を輸送され、したがって、ＩＬ−６と反応する細胞種を増加させる。例えば、内皮細胞および滑膜細胞はｇｐ１３０を発現するが、ＩＬ−６Ｒを発現しない。これらの細胞は、ｓＩＬ−６Ｒ存在下においてのみ、ＩＬ−６と反応することができる（Rheumatology (Oxford, England), 2010, 49(1): 15-24）。さらに、ｇｐ１３０の細胞外ドメインからなる可溶性フラグメント（ｓｇｐ１３０）が存在し、これはＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒの複合体と結合することができ、ＩＬ−６の生物学的活性に対しアンタゴニスト作用を示す。
【０００５】
さまざまな疾患、例えば多発性骨髄腫、肝臓癌およびほぼすべてのタイプの骨髄性白血病において、ＩＬ−６Ｒが高度に発現されることが、研究により示されている（Journal of Experimental Hematology 2001: 9 (2) 184-187）。免疫療法の標的として、２００９年に世界初のＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体トシリズマブの上市が承認された。また、２番目のＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体サリルマブの上市が、２０１７年１月にカナダで初めて承認された。ＩＬ−６Ｒ抗原は、古くから開示されている。現在、例えばWO1996011020A1、WO2009052454、WO2016089886、WO2005061000、US8753634、US20100215664、US7582298、US5795965、US8034344、WO2016062766およびCN101454345Bにおいて、患者におけるＩＬ−６Ｒに対する抗体が報告されている。肝臓癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症、慢性関節リウマチおよび血管炎のような患者の多くがＩＬ−６Ｒ抗体の適用に関連付けられる。
【０００６】
しかしながら、ＩＬ−６仲介疾患等の処置における上記薬物の改良が依然必要とされている。したがって、選択性が高く、効果が高く、副作用の少ない抗体を開発し、ＩＬ−６Ｒが関与する疾患の処置のための抗ＩＬ−６Ｒを用いるより良い処置法を提供することが依然必要である。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、ＩＬ−６Ｒ細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。さらに、本開示は、前記モノクローナル抗体またはその抗体フラグメントと競合する、高活性および高安定性の抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体を提供する。
【０００８】
本開示はさらに、本開示の抗体のクローン、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および該ベクターの導入により得られる形質転換体を作製する方法を提供する。本開示はまた、該クローンまたは該形質転換体を用いて、抗体またはその抗体フラグメントを生産する方法を提供する。本開示はまた、本開示の抗体またはその抗体フラグメントを活性成分として含む診断または処置剤を提供する。
【０００９】
一側面において、本開示はモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲ１の配列は、配列番号１５および配列番号１５のバリアント配列からなる群から選択される。特定の一態様において、配列番号１５のバリアント配列は、配列番号１５の配列と１、２または３アミノ酸が相異する。特定の一態様において、配列番号１５のバリアント配列は、抗体親和性成熟試験によって得られる。ＣＤＲ２の配列は、配列番号１６および配列番号１６のバリアント配列からなる群から選択される。特定の一態様において、配列番号１６のバリアント配列は、配列番号１６の配列と１、２または３アミノ酸が相異する。特定の一態様において、配列番号１６のバリアント配列は、抗体親和性成熟試験によって得られる。ＣＤＲ３の配列は、配列番号１７および配列番号１７のバリアント配列からなる群から選択される。特定の一態様において、配列番号１７のバリアント配列は、配列番号１７の配列と１、２または３アミノ酸が相異する。特定の一態様において、配列番号１７のバリアント配列は、抗体親和性成熟試験によって得られる。該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ−６Ｒを認識し、それに結合する。
【００１０】
いくつかの態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントにおいて、ＣＤＲ１配列は配列番号１５のものであり、ＣＤＲ２配列は配列番号１６のものであり、ＣＤＲ３配列は配列番号１７のものである。
【００１１】
いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、組換え抗体である。
【００１２】
いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、アルパカ由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびその抗原結合フラグメントからなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの態様において、ヒト化抗体の可変領域のＦＲ領域の配列は、ヒト生殖細胞系列の重鎖またはその変異配列に由来する。
【００１４】
いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、配列番号１４のＶＨＨまたはそのバリアントを含み、該バリアントは、配列番号１４のＶＨＨ配列において１〜１５のアミノ酸の変異を有する。より具体的には、ＶＨＨのバリアントは、配列番号１４のＶＨＨ配列のＦＲ領域において１〜１５のアミノ酸の変異を有する。より具体的には、ＶＨＨのバリアントは、配列番号１４のＶＨＨ配列において、Ａ１４Ｐ、Ｅ２３Ａ、Ｑ４４Ｇ、Ｖ７８Ｌ、Ｋ８６Ｒ、Ｎ９６Ａ、Ａ９７Ｆ、Ｑ１１６Ｌおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される変異を有する。
【００１５】
いくつかの態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体Ｆｃ領域をさらに含み、好ましくは配列番号１９のヒト抗体Ｆｃ領域を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、抗原結合フラグメントは、シングルドメイン抗体およびＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含むペプチドからなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの態様において、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、上記に限定したモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＩＬ−６Ｒへの結合を競合し、ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害する。
【００１８】
他の一側面において、本開示は、処置有効量の前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、および１つまたはそれ以上の薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
他の一側面において、本開示は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を提供する。
【００２０】
いくつかの態様において、該核酸分子は、前記ＣＤＲ領域をコードする。いくつかの態様において、該核酸分子は、配列番号１３との相同性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％であるポリヌクレオチドを含む。
【００２１】
他の一側面において、本開示は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
【００２２】
他の一側面において、本開示は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、原核生物細胞および真核生物細胞、好ましくは真核生物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞または酵母細胞からなる群から選択される。哺乳動物細胞は、好ましくはＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞である。哺乳動物細胞は個体へと成長しない。
【００２３】
他の一側面において、本開示は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法を提供する。該方法は、
前記宿主細胞を培養するステップ；
該培養において前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生成し蓄積するステップ；および
該培養から該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを回収するステップ
を含む。
【００２４】
他の一側面において、本開示は、ヒトＩＬ−６Ｒを検出または測定する方法を提供する。該方法は、サンプル中のＩＬ−６Ｒを、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントによって検出するステップを含む。
【００２５】
他の一側面において、本開示は、ヒトＩＬ−６Ｒを検出または測定するための試薬を提供する。該試薬は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００２６】
他の一側面において、本開示は、ヒトＩＬ−６Ｒが関与する疾患を処置する方法を提供する。該方法は、ヒトＩＬ−６が関与する疾患を処置するために、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与すること、または前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を対象に投与すること、または前記核酸分子を対象に投与することを含む。
【００２７】
他の一側面において、本開示は、ＩＬ−６が関与する疾患の処置用の処置剤を製造するための、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。本開示はまた、ＩＬ−６が関与する疾患の処置用の処置剤を製造するための、前記医薬組成物の使用を提供する。本開示はまた、ＩＬ−６が関与する疾患の処置用の処置剤を製造するための、前記核酸分子の使用を提供する。
【００２８】
本開示はさらに、ＩＬ−６Ｒ陽性細胞に関連付けられる疾患を処置するための薬剤を包含する。該薬剤は、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを活性成分として含む。
【００２９】
本開示の抗体、抗原結合フラグメントおよび組成物は、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６および／またはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（場合により、ｇｐ１３０がさらに結合した複合体）に関連付けられる、および／またはＩＬ−６および／またはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（場合により、ｇｐ１３０がさらに結合した複合体）が関与するシグナル伝達経路および／または生物学的機能および反応に関連付けられる疾患および状態を予防および治療するために使用することができる。特に、本開示の抗体、抗原結合フラグメントおよび組成物は、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６および／またはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（場合により、ｇｐ１３０がさらに結合した複合体）に関連付けられ、および／またはＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６および／またはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（場合により、ｇｐ１３０がさらに結合した複合体）が関与するシグナル伝達経路および／または生物学的機能および反応に関連付けられる疾患および状態を予防および治療するために使用することができ、ここで、該疾患および状態は、ＩＬ−６ＲによるかまたはＩＬ−６Ｒが関与する経路によって仲介される過剰なおよび／または望ましくないシグナル伝達によって特徴付けられる。本開示にしたがって、当業者は、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６および／またはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に関連付けられ、および／またはＩＬ−６および／またはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与するシグナル伝達経路および／または生物学的機能および反応に関連付けられる疾患および状態の例を明確に理解しうる。該疾患および該状態は本書において、「ＩＬ−６に関連付けられる状態」または「ＩＬ−６Ｒに関連付けられる疾患」ともいう。
【００３０】
他の一側面において、本開示は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、前記医薬組成物、前記核酸分子、またはそれらの組み合わせの、下記のものからなる群から選択される疾患または状態の予防または処置用医薬を製造するための使用を提供する：敗血症（Starnes et al, 1999）およびさまざまな癌、例えば多発性骨髄腫（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞白血病（Klein et al, 1991）、リンパ腫、Ｂリンパ組織過形成疾患（ＢＬＰＤ）および前立腺癌。過剰なＩＬ−６産生またはシグナル伝達によって引き起こされる他の疾患の例は、骨吸収（骨粗鬆症）（Roodman et al, 1992; Jilka et al, 1992）、悪液質（Strassman et al, 1992）、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、エイズ関連リンパ腫（Emilie et al, 1994）；炎症性疾患および状態、例えば関節リウマチ、全身的に発症する若年性特発性関節炎、高γグロブリン血症（Grau et al., 1990）；限局性腸炎、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭγグロブリン疾患、心臓粘液腫、喘息（特にアレルギー性喘息）、炎症性貧血、および自己免疫性インスリン依存性糖尿病（Campbell et al, 1991）を包含するが、それに限定されない。
【００３１】
さらに、本開示は、ＩＬ−６Ｒの免疫検出または免疫アッセイ法；ＩＬ−６Ｒの免疫検出または免疫アッセイ用の試薬；ＩＬ−６Ｒ発現細胞の免疫検出または免疫アッセイ；およびヒトＩＬ−６Ｒを特異的に認識し、その細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合する本開示のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを活性成分として含む、ＩＬ−６に関連付けられる疾患の診断用の診断剤に関する。
【００３２】
本開示において、ＩＬ−６Ｒの量を検出または測定する方法は、当分野で知られる任意の方法でありうる。例えば、それには免疫検出または免疫アッセイが包含される。
【００３３】
免疫検出または免疫アッセイは、抗体または抗原の量を、標識した抗原または抗体を用いて検出または測定する方法である。免疫検出または免疫アッセイの例は、放射性物質標識免疫学的抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ、ウエスタンブロッティング、物理化学的アッセイ等を包含する。
【００３４】
前記ＩＬ−６関連疾患は、発現されたＩＬ−６を本開示のモノクローナル抗体または抗体フラグメントで検出または測定することによって診断することができる。
【００３５】
該ポリペプチドを発現する細胞を検出するために、既知の免疫アッセイ、好ましくは免疫沈降、蛍光細胞染色、免疫組織化学染色等を使用することができる。FMAT8100HTSシステム（Applied Biosystem）による蛍光抗体染色法等を用いることもできる。
【００３６】
本開示において、ＩＬ−６Ｒｄを検出または測定する生体サンプルには、それがＩＬ−６Ｒ発現細胞、例えば組織細胞を含む可能性がある限り、特に制限はなく、血液（全血、血漿または血清）、膵液、尿、便、組織液または培養培地を用いることができる。
【００３７】
本開示のモノクローナル抗体またはその抗体フラグメントを含む診断剤は、所望の診断方法に応じて、抗原−抗体反応を実施するための試薬、または該反応を検出するための試薬をさらに含みうる。抗原−抗体反応を実施するための試薬は、例えば緩衝剤および塩を包含する。該反応を検出するための試薬は、免疫検出または免疫アッセイにおいて通常用いられる試薬、例えば、該モノクローナル抗体、その抗体フラグメントまたはそのコンジュゲートを認識する標識された二次抗体、および該標識に対応する基質を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃは、１７６４およびそのヒト化抗体によってＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの間の結合を阻害するアッセイを示す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、１７６４およびそのヒト化抗体によってｇｐ１３０とＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒの間の結合を阻害するアッセイを示す。
【図３】図３は、１７６４およびＵ２６６Ｂ１細胞の結合アッセイを示す。
【図４】図４は、１７６４抗体によるＩＬ−６誘導ＴＦ−１増殖抑制アッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
１．用語
本開示をより容易に理解するために、いくつかの技術用語および科学用語を定義する。本書において用いられる他の技術用語および科学用語はいずれも、本書において異なる定義が明らかになされない限り、本開示が属する技術分野における通常の技術を有する者に通常理解される意味を有する。
【００４０】
本開示において用いられるアミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、J. biol. chem, 243, p3558 (1968)に記載されるとおりである。
【００４１】
通常の免疫グロブリンは、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる四量体であり、全体の分子量は約１５０ｋＤａである。ラクダ科のメンバーの血清抗体の多くは、分子量約８０ｋＤａのホモ二量体ＩｇＧである（Hamers-Casterman et al. 1993 Nature, 363, 446-448）。そのような重鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）は、３つのドメインを有し、その可変領域はＶＨＨ（重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン）と称される。組換えＶＨＨ（約１２〜１４ｋＤａ）は、抗原結合ドメイン全体を構成し、広範な抗原結合プロファイルを示す。その超可変領域の拡大によりユニークな性質が示され、例えば、３〜４個の疎水性フレームワーク残基（通常の抗体ＶＬと相互作用する）が、より親水性のアミノ酸に置換される。拡大されたＣＤＲを安定化するために、通常のジスルフィド結合に加えて、ＶＨＨは、ヒトコブラクダの場合はＣＤＲ１とＣＤＲ３の間に、ラマの場合はＣＤＲ２とＣＤＲ３の間に、さらなるジスルフィド結合を有しうる（Harmsen and De Haard 2007 Appl Microbiol Biotechnol., 77, 13-22; Muyldermans 2001 J Biotechnol., 74, 277-302）。拡大されたＣＤＲ３のループは凸型のコンフォメーションをとり、通常のパラトープは凹型または平面状の構造に限られる（Muyldermans 2001 J Biotechnol., 74, 277-302）。これらの特徴によってＶＨＨは、通常の抗体と比較した場合、免疫原性がより低いユニークなエピトープを認識する（Lafaye et al. 2009 Mol Immuno., 46, 695-704; Wernery 2001 J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health., 48, 561-568）。ＶＨＨは１価抗体として定義されるが、親和性効果はデフォルトで除外され、生物学的活性はインビトロＩＣ５０として測定され、これは通常の２価抗体分子のものと同等である（Thys et al. 2010 Antiviral Res., 87: 257-264）。
【００４２】
用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に相同である抗体の集団から得られる抗体をさし、すなわち、該集団に含まれる各抗体は、（わずかな量で存在する可能性のある天然の変異を除き）同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対して高度に特異的である。さらに、抗原上の異なる抗原決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を通常含む通常のポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の抗原決定基またはエピトープのみを標的とする。
【００４３】
いくつかの態様において、本開示は、キメラ ラクダ科／ヒト抗体、特に、ＶＨおよび／またはＶＬドメインの全体がラクダ科配列（例えばラマまたはアルパカ）であり、残部が完全にヒト配列からなるキメラ抗体に関する。さらに、いくつかの好ましい態様において、本開示は、ＶＨおよび／またはＶＬドメインが、能動免疫により得られるラクダ科ＶＨおよび／またはＶＬドメインと比較して、フレームワーク領域における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、「ヒト化」または「生殖細胞系列化」ラクダ科抗体およびキメラ ラクダ科／ヒト抗体に関する。ヒト生殖細胞系列ＶＨまたはＶＬドメインに対する配列同一性パーセントは、そのような「ヒト化」プロセス、すなわち、元のラクダ科ＶＨまたはＶＬドメイン中に存在するミスマッチアミノ酸残基の、ヒト生殖細胞系列ＶＨまたはＶＬドメイン中の対応する残基による置換、によって高められる。
【００４４】
本開示は、天然、組換えＶＨＨまたはＶＨを包含する。
【００４５】
「組換え」は、遺伝子工学的方法（クローン化、増幅）によるＶＨＨまたはＶＨの生産を伴う。
【００４６】
本開示によるＶＨＨは、単量体またはホモ重合体、例えばホモ二量体もしくはホモ三量体の形態でありうる。
【００４７】
抗体重鎖および軽鎖のＮ末端に隣接する約１１０アミノ酸の配列は、高度に可変であり、可変領域（Ｆｖ領域）と呼ばれる。残部のＣ末端に近いアミノ酸配列は、比較的保存的であり、定常領域と呼ばれる。可変領域は３つの超可変領域（ＨＶＲ）および４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。抗体の特異性を決定する該３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域からなり、その並びは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、次のとおりである：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と称され、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と称される。本開示において抗体または抗原結合フラグメントのＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域中のＣＤＲアミノ酸残基の数および位置は、知られているKabatナンバリング基準にしたがう（ＬＣＶＲ１〜３、ＨＣＤＲ１〜３）。
【００４８】
本開示の抗体は、アルパカ由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、好ましくはヒト化抗体を包含する。
【００４９】
用語「アルパカ由来抗体」とは、ヒトＩＬ−６Ｒに対するアルパカ由来モノクローナル抗体のことで、当分野の知識および技術にしたがって調製しうる。そのような抗体の調製のために、ＩＬ−６Ｒ抗原を対象に注射し、その後、所望の配列または機能性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離するか、またはファージディスプレイ技術によって、免疫学的ライブラリーを樹立して所望の機能を有する抗体を単離する。本開示の特定の一態様において、アルパカ由来ＩＬ−６Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、アルパカ重鎖Ｆｃ領域をさらに含みうる。
【００５０】
用語「キメラ抗体」とは、アルパカ由来抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域（またはＦｃ領域）との融合によって形成される抗体のことであり、キメラ抗体では、アルパカ由来抗体によって誘導される免疫反応が減弱される。キメラ抗体を作製するために、まず、特定のアルパカ由来モノクローナル抗体をつくるハイブリドーマまたは抗体ライブラリーを構築し、次いで、アルパカ由来可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子（またはＦｃ領域）と連結してキメラ遺伝子を作製し、これを発現ベクターに挿入し、最後に原核生物または真核生物系においてキメラ抗体分子を発現させる。本開示の好ましい一態様において、ＩＬ−６Ｒキメラ抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域（またはＦｃ領域）またはそのバリアント、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域（またはＦｃ領域）またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域（またはＦｃ領域）のアミノ酸変異（例えばＹＴＥ変異または復帰変異）を含むバリアントをさらに含む。
【００５１】
用語「ヒト化抗体」とは、アルパカＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域フレームワークの中に挿入することによって作製される抗体、すなわち、異なるタイプのヒト生殖細胞系列抗体フレームワークから作製される抗体をさす。ヒト化抗体は、多量のアルパカタンパク質成分を含むキメラ抗体によって誘発される異種反応の欠点を克服する。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列をカバーする公のＤＮＡデータベース、または刊行物から得ることができる。例えば、生殖細胞系列のヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のＤＮＡ配列は、“VBase”ヒト生殖細胞系列配列データベース（ウェブでwww.mrccpe.com.ac.uk/vbaseにて利用可能）に含まれ、また、Kabat, E A, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.に記載されている。免疫原性低下によって起こる活性低下を回避するために、ヒト抗体可変領域のフレームワーク配列は、活性維持のために、最小限の復帰変異に付される。本開示のヒト化抗体は、ＣＤＲ親和性成熟がファージディスプレイによって行われたヒト化抗体をも包含する。免疫原性低下によって起こる活性低下を回避するために、１７６４の配列に基づいて、ヒト配列への段階的な変異が行われ、すなわち、活性維持のために、１７６４のＦＲ領域に存在するアルパカ由来残基がヒト由来残基で段階的に置換される。
【００５２】
用語「ＶＨＨ」とは、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ等）の重鎖抗体に由来する可変抗原結合ドメインに関する（Nguyen et al. 2000 EMBO J., 19, 921-930; Muyldermans 2001 J Biotechnol., 74, 277-302、およびVanlandschoot et al. 2011 Antiviral Res. 92, 389-407参照）。
【００５３】
一般に、ナノボディとは、下記（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
を有するアミノ酸配列として定義され得、ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜４をさし、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜３をさすす。
【００５４】
本書において用いられる用語「抗体フレーム領域」または「抗体フレームワーク領域」とは、可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）の足場の役割を有する可変ドメイン（ＶＨ）部分をさす。これは本質的に、ＣＤＲ以外の可変ドメインをさす。
【００５５】
抗体の「抗原結合フラグメント」または「機能的フラグメント」なる用語は、抗原（例えばＩＬ−６Ｒ）への特異的結合能力を維持する１つまたはそれ以上の抗体フラグメントをさす。抗体の抗原結合機能は、完全抗体のフラグメントによって達成されうることが示されている。抗体の「抗原結合フラグメント」なる用語に含まれる結合性フラグメントの例には、以下のものが含まれる：
（ｉ） Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価フラグメント；
（ii） Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち、ヒンジ領域に存在するジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメント；
（iii）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；
（iv） 抗体の１つのアームのＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖフラグメント；
（ｖ） ＶＨＨドメインからなる、シングルドメインまたはｄＡｂフラグメント（Ward et al, (1989) Nature 341:544-546）；
（vi） 単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；または
（vii）場合により合成リンカーで連結された、２つまたはそれ以上の別個のＣＤＲの組み合わせ；
（viii）ＶＨＨおよびＦｃによって形成された融合タンパク質；
（ix） ＶＨＨおよび抗体重鎖定常領域によって形成された融合タンパク質。
【００５６】
さらに、「抗原結合フラグメント」は、ＩＬ−６Ｒに結合することができるＶＨＨドメインの３つのＣＤＲを含む他の抗原結合形態をも包含する。
【００５７】
本開示はさらに、ＶＨＨドメインの超可変ループまたはＣＤＲがラクダ科に由来するが、ラクダ科に由来する超可変ループまたはＣＤＲの少なくとも１つが、ラクダ科由来コーディング配列と比較して１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含むように組換えられている、抗原結合ポリペプチドを包含する。そのような変更は、超可変ループ／ＣＤＲの「ヒト化」を包含する。そのように組換えられたラクダ科由来ＨＶ／ＣＤＲは、ラクダ科によってコードされるＨＶ／ＣＤＲのものと「実質的に同一」のアミノ酸配列を依然示すことができる。ここで、「実質的に同一」とは、ラクダ科によりコードされるＨＶ／ＣＤＲと比較したときの１つ以下、または２つ以下、または３つ以下のアミノ酸配列ミスマッチを許容しうる。
【００５８】
本開示の抗体は、任意のアイソタイプのものでありうる。ヒト処置用の抗体のタイプは、典型的には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭである。通常、抗体はＩｇＧ型抗体であり、その場合、それは４つのサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のいずれのものであってもよい。これらサブタイプにおいて、Ｆｃ部分における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入または欠失が許容されるか、または他の構造改変、例えばＦｃ依存性機能の向上もしくは低下のための構造改変が許容される。
【００５９】
本開示のディアボディは、下記ステップで生産することができる：ヒトＩＬ−６Ｒを特異的に認識し細胞外領域（アミノ酸配列またはその立体構造）に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨＨをコードするｃＤＮＡを得るステップ；ペプチドリンカーが８個またはそれ以下のアミノ酸残基の長さとなるように該ＶＨＨをコードするＤＮＡを構築するステップ；該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ；そしてその後、ディアボディを発現するように、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入するステップ。
【００６０】
ＶＨＨを構成する１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域によって、ＣＤＲ含有ペプチドを構築する。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接に、または適当なペプチドリンカーを介して、連結されうる。
【００６１】
本開示のＣＤＲ含有ペプチドは、以下のステップによって生産することができる：ヒトＩＬ−６Ｒを特異的に認識し細胞外領域（アミノ酸配列またはその立体構造）に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨＨのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築するステップ；該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ；そしてその後、該ペプチドを発現するように、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入するステップ。ＣＤＲ含有ペプチドは、化学合成方法、例えばＦｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法によって生産することもできる。
【００６２】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位（例えばＩＬ−６Ｒ分子上の特定の部位）をさす。エピトープは典型的には、特定の三次構造をとる少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続するかまたは連続しないアミノ酸を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris ed. (1996)を参照されたい。
【００６３】
「特異的な結合」、「選択的な結合」、「…に選択的に結合する」および「…に特異的に結合する」なる表現は、抗体が、抗原上の予め決定されたエピトープに結合することをいう。典型的には、抗体は、約１０−７Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満の、またはより小さい親和性（ＫＤ）で結合する。
【００６４】
記号「ＫＤ」または「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。典型的には、本開示の抗体はＩＬ−６Ｒに、例えばＢＩＡＣＯＲＥ装置を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による測定で、約１０−７Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満の、またはより小さい平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。
【００６５】
用語「競合」とは、同じエピトープを競合する複数の抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）に関して用いられるとき、抗原結合タンパク質間で競合が起こることを意味し、これは下記アッセイによって決定される：試験する抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメント）は、参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）と共通の抗原（例えば、ＩＬ−６Ｒ抗原またはそのフラグメント）との間の特異的結合を、抑制または阻害（例えば低減）する。抗原結合タンパク質どうしが競合するかを決定するために、多くの種類の競合結合アッセイが利用可能である。そのようなアッセイは、例えば、直接的または間接的な固相放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）；直接的または間接的な固相酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）；サンドイッチ競合アッセイ（例えばStahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253参照）；直接的な固相標識アッセイ；直接的な固相標識サンドイッチアッセイ（例えばHarlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press参照）；Ｉ−１２５標識を用いる直接的な固相標識ＲＩＡ（例えばMorel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15参照）；直接的な固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えばCheung, et al, 1990, Virology 176: 546-552参照）；および直接的な標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82）である。アッセイは典型的には、試験される標識されていない抗原結合タンパク質と、標識された参照抗原結合タンパク質との両方に結合可能な、（固体表面上または細胞表面上の）精製された抗原の使用を伴う。試験する抗原結合タンパク質の存在下に固体表面または細胞に結合された標識の量を測定することによって、競合阻害が調べられる。試験する抗原結合タンパク質は通常、過剰に存在する。（抗原結合タンパク質と競合する）競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質は、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質；および参照抗原結合タンパク質が結合するエピトープの十分近くのエピトープ（ここで、該２つのエピトープは、結合を妨害するよう、立体障害し合う）に結合する抗原結合タンパク質を包含する。競合的結合を調べる方法についてのさらなる詳細は、本書の実施例に記載される。典型的には、競合する抗原結合タンパク質は、それが過剰に存在する場合、参照抗原結合タンパク質と共通の抗原との間の特異的結合を少なくとも４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％または７５％もしくはそれ以上阻害しうる。いくつかの態様において、結合は少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％または９７％もしくはそれ以上阻害される。
【００６６】
本書において、用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子をさす。核酸分子は、一本鎖または二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖のＤＮＡである。核酸は、別の核酸配列との機能的関連性をもって配置されるとき、「作動可能に連結」されているものと考える。例えば、プロモーターまたはエンハンサーはコーディング配列に、該配列の転写に影響を及ぼす場合、作動可能に連結される。
【００６７】
用語「ベクター」とは、それが連結する別の核酸を輸送することのできる核酸分子をさす。一態様において、ベクターは「プラスミド」であり、「プラスミド」とは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲートされていてもよい、環状二本鎖ＤＮＡループをさす。他の一態様において、ベクターはウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが該ウイルスゲノムにライゲートされていてもよい。本開示のベクターは、それが導入された宿主細胞内で自己複製可能であるか（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）、または宿主細胞への導入後に宿主細胞ゲノムと一体化され得、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される（例えば、エピソーマルでない哺乳動物ベクター）。
【００６８】
抗体および抗原結合フラグメントを生産および精製する方法は当分野において知られており、例えば、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, chapters 5-8 and 15を参照することができる。当分野で知られる方法によって、例えば、マウスをヒトＩＬ−６Ｒまたはそのフラグメントで免疫し、その後、生じた抗体を変性、精製およびアミノ酸配列決定することができる。抗原結合フラグメントも、従来の方法で調製することができる。本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒト抗体由来ＣＤＲの中に１つまたはそれ以上のヒトフレームワーク領域を導入するように組換えられる。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ヒト抗体可変生殖細胞系列遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアとを利用して得ることができ、ImMunoGeneTics (IMGT) ウェブサイトhttp://imgt.cines.fr、またはThe Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351から利用可能である。
【００６９】
用語「宿主細胞」とは、発現ベクターが導入されている細胞をさす。宿主細胞は、微生物（例えば細菌）、植物または動物の細胞を包含しうる。形質転換を受けることのできる細菌は、下記のものを包含する：腸内細菌科のメンバー、例えば大腸菌またはサルモネラ属の株；バシラス科のメンバー、例えば枯草菌；肺炎球菌；レンサ球菌およびインフルエンザ菌。適当な微生物は、出芽酵母およびピキア酵母を包含する。適当な動物宿主細胞株は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＥＫ細胞（例としてＨＥＫ２９３Ｅ細胞が挙げられるが、それに限定されない）、およびＮＳ０細胞等を包含するが、それに限定されない。
【００７０】
本開示の組換え抗体または抗原結合フラグメントは、既知の方法を用いて調製および精製しうる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列を、ＧＳ発現ベクター中にクローン化および組換えしうる。次いで、組換え免疫グロブリン発現ベクターを、ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトしうる。当分野で知られるより推奨される方法として、哺乳動物発現系によって、グリコシル化、典型的には、Ｆｃ領域の高度に保存されたＮ末端部位におけるグリコシル化をもたらしうる。適当なクローンは、ヒトＩＬ−６Ｒに特異的に結合する抗体の発現について確認されうる。抗体生産のために、陽性クローンを、バイオリアクター内で血清不含有培養培地中で増殖させうる。抗体が分泌された培養培地を、従来の方法で精製しうる。精製のために、例えば、調整緩衝液で平衡化したプロテインＡまたはＧのSepharose FFカラムを使用しうる。カラムを洗って非特異的結合成分を除去し、次いで、結合した抗体をｐＨ勾配によって溶出し、抗体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し、収集する。抗体を、一般的な方法で濾過および濃縮しうる。可溶性の凝集物および重合体を、一般的な方法、例えばサイズ排除またはイオン交換によって、効果的に除去しうる。その後、得られた産物を直ちに冷凍、例えば−７０℃で冷凍するか、または凍結乾燥しうる。
【００７１】
動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に対しての、「投与」、「投与する」または「処置（処理）」とは、外来の薬剤、処置剤、診断剤または組成物を、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体と接触させることをさす。「投与」、「投与する」または「処置（処理）」とは、例えば、治療、薬物動態学、診断、研究および実験の方法をさすことができる。細胞の処理は、試薬を細胞と接触させること、および試薬を、細胞と接触した状態にある流体と接触させることを包含する。「投与」、「投与する」または「処置（処理）」とは、インビトロおよびエクスビボの処置（処理）、例えば、細胞の、試薬、診断剤、結合組成物または他の細胞による処理をも意味する。ヒト、動物または研究対象に対する「処置（処理）」とは、治療的処置、予防または防止の手段、研究および診断のための適用をさす。
【００７２】
「処置（処理）」とは、処置剤、例えば本開示の任意の抗体またはそのフラグメントを含む組成物を、それが処置活性を示すことがわかっている１つまたはそれ以上の疾患症状を有する患者に、内用または外用で投与することを意味する。典型的には、該剤は、処置される患者または集団の１つまたはそれ以上の疾患症状を、臨床的に測定可能な程度の該症状の改善の誘導または該症状の進行の防止によって、軽減するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患症状の軽減に有効な処置剤の量（「処置有効量」ともいう）は、患者の疾患状態、年齢および体重、ならびに患者において所望の反応を誘導する薬物の能力といった因子によって異なりうる。疾患状態が軽減されたかは、該症状の重篤度または進行状況を評価するために医師または他のヘルスケア提供の専門家により通常用いられる任意の臨床的測定方法によって評価することができる。本開示のある一つの態様（例えば処置方法または製造物品）は、すべての患者における標的疾患症状軽減に有効でないことがあるが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン-ホイットニーのＵ検定、クラスカル-ウォリス検定（Ｈ−検定）、ヨンクヒール-タプストラ検定、およびウィルコクソン検定といった当分野で知られる任意の統計学的検定法によって決定される統計学的に有意な数の患者において標的疾患症状を軽減しうる。
【００７３】
「保存的改変」または「保存的置換」とは、変化をしばしば、タンパク質の生物学的活性を変えることなくもたらすことができるように、タンパク質中のアミノ酸を、同様の性質（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、バックボーンのコンフォメーション、および硬さ等）を有する他のアミノ酸に置き換えることをさす。当業者は、ポリペプチドの本質的でない領域における単一のアミノ酸置換は一般的に、実質的に生物学的活性を変化しないことを認識する（Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)参照）。さらに、構造的または機能的に類似するアミノ酸による置換は、生物学的活性を変化させる可能性が低い。
【００７４】
「有効量」とは、医学的状態の症状または徴候を改善または防止するのに十分な量を包含する。有効量とは、診断を可能にするかまたは促進するのに十分な量をも意味する。特定の患者または動物対象に対する有効量は、処置する状態、患者の全身的健康状態、投与経路および投与量、ならびに副作用の重篤度といった因子によって異なりうる。有効量は、顕著な副作用または毒性作用を回避する最大の用量または投与プロトコルでありうる。
【００７５】
「外因（外来）」とは、文脈により生物、細胞または人体の外部で生産される物質のことをさす。「内因（内生）」とは、文脈により生物、細胞または人体の内部で生産される物質のことをさす。
【００７６】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間、または２つのポリペプチド配列間の配列類似性をさす。比較される２つの配列の両方において、ある位置を同じ塩基またはアミノ酸単量体サブユニットが占める場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおいて、ある位置をアデニンが占める場合、それら分子は該位置において相同である。２つの配列間の相同性パーセントは、２つの配列の間でマッチするかまたは相同である位置の数を、比較される位置の数で除し、１００を掛けた関数である。例えば、配列が最適にアラインされたとき、２つの配列間で１０個の位置のうちの６個がマッチするかまたは相同である場合、２つの配列の相同性は６０％であり、２つの配列間で１００個の位置のうちの９５個がマッチするかまたは相同である場合、２つの配列の相同性は９５％である。一般に、比較は、２つの配列が相同性パーセントが最大となるようにアラインされたときに行われる。
【００７７】
本書において「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」なる表現は、互換的に用いられ、いずれもその子孫を包含する。したがって、用語「形質転換体」および「形質転換細胞」は、初代の対象細胞、および継代数に関わらず、それから誘導された培養物を包含する。意図されるかまたなされない変異のために、子孫はＤＮＡの中身において完全に同一ではない可能性があることも理解すべきである。元の形質転換細胞と同じ機能または生物学的活性を有するスクリーニングされた変異子孫が包含される。異なる意味が意図される場合、それは、その文脈から明らかに理解されうる。
【００７８】
本書において「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の部分を増幅する手順または技術をさし、例えば米国特許第４６８３１９５号に記載されている。通常、関心の領域または関心の領域を越える領域の各末端の配列情報が、オリゴヌクレオチドプライマーの設計を可能とするために必要である。そのようなプライマーは、その配列が、増幅するテンプレートの相対する鎖と同一または同様でありうる。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅対象の末端に対応する。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミドの配列を増幅するために使用することができる。Mlis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)を参照されたい。本開示において用いられるＰＣＲ試験は、核酸試験サンプルをポリメラーゼ反応により増幅する方法の１例であって、それが唯一の方法ではないと解釈される。該方法は、特定の核酸部分を増幅または生産するための、プライマーとしての既知の核酸、および核酸ポリメラーゼの使用を含む。
【００７９】
「任意の」または「任意に（場合により）」とは、そのように記載される事象または状況が必ずしも起こらないことを意味し、記載は、事象または状況が起こるかまたは起こらない例を含む。例えば、「場合により１〜３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在することができるが、その存在は必須ではないことを意味する。
【００８０】
「医薬組成物」とは、本開示の１つまたはそれ以上の化合物、またはその生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、および他の化学的成分、例えば生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤を含む混合物をさす。医薬組成物は、生体への投与の促進、活性成分の吸収の促進、およびそれによる生物学的効果の発揮を目的とするものである。
【実施例】
【００８１】
２．実施例および試験例
下記実施例により本発明をさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００８２】
本開示の実施例または試験例において特定の条件を示していない実験方法は全般に、従来の条件にしたがって、または製造者の推奨する条件にしたがって行われる。Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Contemporary Molecular Biology Methods, Ausubel et al., Greene Publishing Association, Wiley Interscience, NYを参照されたい。入手元を特定していない試薬は、市販される試薬である。
【００８３】
実施例
実施例１：抗原、関連のタンパク質および抗体といった試薬の調製
Ｆｃ、ＨｉｓおよびＢＰ１５タグ（細胞内部位指向ビオチン化のために用いられる）を有するヒトインターロイキン６受容体（それぞれ、ｈＩＬ−６Ｒ．Ｆｃ、ｈＩＬ−６Ｒ．Ｈｉｓ、ｈＩＬ−６Ｒ．ＢＰ１５）をコードする配列、Ｆｌａｇ．Ｈｉｓタグを有するカニクイザルＩＬ−６Ｒ（ｃＩＬ−６Ｒ．ＦＨ）をコードする配列、ＦｃまたはＨｉｓタグを有するヒトＩＬ−６（ＩＬ−６．Ｆｃ、ＩＬ−６．ｈｉｓ）をコードする配列、ならびにＦｃタグを有するｇｐ１３０をコードする配列を、哺乳動物細胞における一過性発現のために、分子クローニング法によって発現ベクター中に構築した。
【００８４】
すべての抗原および関連タンパク質のアミノ酸配列は次のとおりである：
ｈＩＬ−６Ｒ．Ｈｉｓ（配列番号１）：
【化１】
2021500856.tif 000002
【００８５】
ｈＩＬ−６Ｒ．ＢＰ１５（配列番号２）：
【化２】
2021500856.tif 000003
【００８６】
ｈＩＬ−６Ｒ．Ｆｃ（配列番号３）：
【化３】
2021500856.tif 000004
【００８７】
ｃＩＬ−６Ｒ．ＦＨ（ｃＩＬ−６Ｒ．ＦｌａｇＨｉｓ、配列番号４）：
【化４】
2021500856.tif 000005
【００８８】
ＩＬ−６．Ｆｃ（配列番号５）：
【化５】
2021500856.tif 000006
【００８９】
ＩＬ−６．ｈｉｓ（配列番号６）：
【化６】
2021500856.tif 000007
【００９０】
ｇｐ１３０．Ｆｃ（配列番号７）：
【化７】
2021500856.tif 000008
【００９１】
陽性抗体は次のものである：Roche/Chugaiから入手可能な抗ＩＬ−６Ｒヒト化ｍＡｂトシリズマブ（その配列はＷＯ１９９６０１１０２０Ａ１に記載されている）；抗ＩＬ−６Ｒシングルドメイン抗体２０Ａ１１およびＦｃにより形成される融合タンパク質（Ablynx）；Regeneronから入手可能なサリルマブ（その配列はＣＮ１０１４５４３４５Ｂに記載されている）。それらのアミノ酸配列は次のとおりである：
【００９２】
トシリズマブ（Ｔｏｃｉ）：
トシリズマブ重鎖（配列番号８）：
【化８】
2021500856.tif 000009
トシリズマブ軽鎖（配列番号９）：
【化９】
2021500856.tif 000010
【００９３】
２０Ａ１１−Ｆｃ融合タンパク質（２０Ａ１１のＶＨＨ配列はボバリリズマブに由来する）（配列番号１０）：
【化１０】
2021500856.tif 000011
【００９４】
サリルマブ（Ｓａｒｉ）
重鎖（配列番号１１）：
【化１１】
2021500856.tif 000012
軽鎖（配列番号１２）：
【化１２】
2021500856.tif 000013
【００９５】
タンパク質の発現のために、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞（すなわち２９３Ｅ細胞）をＰＥＩを用いて一過性にトランスフェクトした。その後、タグまたは融合タンパク質に応じて、次のように精製法を選択した：
【００９６】
１．ニッケルカラム精製（Ｈｉｓタグ付きタンパク質の単離）：発現産物を含む上清を高速遠心分離して、不純物を除去した。ニッケルカラムをＰＢＳ緩衝液で平衡化し、２〜５カラム体積で洗った。上清サンプルをNi Sepharose Excel Column（GE Healthcare, Cat #17-3712-01）に、ある流速で適用した。カラムをＰＢＳ緩衝液で、Ａ２８０の測定値がベースラインに低下するまで洗い、次いで、ＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールで洗って、望ましくない非特異的結合タンパク質を除去し、流出液を収集した。最後に、標的タンパク質を、３００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液で溶出し、溶出ピークを収集した。
【００９７】
２．排除クロマトグラフィー精製：ＳＥＣカラム（superdex75）をＰＢＳで予め平衡化した。サンプルを適用し（適用体積はカラム体積の３％以下とすべきである）、次いでＰＢＳを移動相として溶出した。各溶出ピークを収集し、標的タンパク質含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した。
【００９８】
３．Ｆｌａｇアフィニティークロマトグラフィー（Ｆｌａｇ含有タンパク質の単離）：Ｆｌａｇ親和性の充填材を０．５×ＰＢＳで平衡化し、２〜５カラム体積で洗った。精製するサンプルを充填材と共に、室温で２時間インキュベートした。充填材を５カラム体積の０．５×ＰＢＳで洗い、標的タンパク質を、１００μｇ／ｍｌの３×Ｆｌａｇポリペプチドを含むＴＢＳ緩衝液で溶出し、収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した。
【００９９】
４．キメラ抗体のアフィニティークロマトグラフィー（Ｆｃ含有タンパク質の単離）：発現産物を含む上清を高速遠心分離して不純物を除去し、発現組換え抗体を含む上清をプロテインＡカラムを用いて精製した。カラムをＰＢＳで、Ａ２８０測定値がベースラインまで低下するまで洗った。標的タンパク質を、１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。溶出サンプルを適当に濃縮し、ＰＢＳで予め平衡化したゲルクロマトグラフィーSuperdex 200（GE）によってさらに精製した。解重合産物のピークを収集し、使用のためにアリコートに分けた。
【０１００】
実施例２：ラマの免疫、ファージディスプレイライブラリーの構築およびスクリーニング
免疫原として用いたＩＬ−６Ｒ．ＦｃまたはＩＬ−６Ｒ．Ｈｉｓを、完全フロイントアジュバントもしくは不完全フロイントアジュバントまたはＰＢＳと混合し、アルパカに６回注射した。４回目、５回目および６回目の免疫の前と後に、力価測定のために末梢血サンプルを採った。最後の回の免疫の後、脾臓細胞を抽出した。
【０１０１】
単離したリンパ球を、ＲＮＡ抽出、その後のｃＤＮＡへの逆転写に付した。ライブラリーの構築のために２ステップＰＣＲを用いた：第１のステップにおいて、ＰＣＲ反応のために、ＦＲ１領域に対して設計された３つのフォワードプライマー、およびＣＨ２領域に対して設計された３つのリバースプライマーを等しい比で混合した。小フラグメントをアガロースゲルから回収した。第２のステップでは、フォワードおよびリバースプライマーの両方にｓｆｉＩ制限酵素部位および保護塩基を組み込んだ。ｓｆｉＩ制限酵素部位および保護塩基以外のフォワードプライマー配列は、１回目のＰＣＲに用いたフォワードプライマーと同一であった。リバースプライマーはＦＲ４領域に対して設計された。第２ステップのＰＣＲ産物を回収し、ファージミドベクター中にクローン化し、ＳＳ３２０コンピテント細胞に電気的導入した。最終的に、キャパシティー１．７４Ｅ９のファージディスプレイライブラリーを得た。
【０１０２】
構築したライブラリーにヘルパーファージをパッケージして、ファージを形成した。ファージディスプレイライブラリーを、ＩＬ−６Ｒ結合についてパニングおよびスクリーニングした。所望のクローンをＥＬＩＳＡによって同定した。パニングは、液相および固相法の両方で行った：液相法においては、ビオチン化ＩＬ−６Ｒ．ＢＰ１５抗原を液相中でファージ粒子に結合させ、次いでストレプトアビジン磁気ビーズで捕捉した；固相法においては、ＥＬＩＳＡプレートをＩＬ−６Ｒ．Ｆｃでコートし、ファージ粒子を結合させた。パニングを２回行った後、モノクローナルパックされたファージを収集した。結合活性ならびにＩＬ−６およびｇｐ１３０ブロック活性をＥＬＩＳＡによって調べた。ＥＬＩＳＡの方法は次のとおりである：
【０１０３】
ＩＬ−６Ｒ結合ＥＬＩＳＡ：プレートを、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン２ｎｇ／μｌで、４℃で一晩コートし、２％ＭＰＢＳＣａＭｇで、３７℃で１時間ブロックした。その後、プレートを洗い、ＩＬ−６Ｒ．ＢＰ１５  １ｎｇ／μｌと共に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗った後、５０μｌ／ウェルの２％ＭＰＢＳＣａＭｇおよび５０μｌ／ウェルのファージ上清を加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗い、次いで、１：５０００希釈で１００μｌの抗Ｍ１３  ＨＲＰを加えた。３７℃で１時間インキュベートし、洗った後、プレートの発色のために１００μｌ／ウェルのＴＭＢを加えた。１００μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を停止した。ＯＤ４５０によってシグナルを測定した。
【０１０４】
ＩＬ−６ブロックＥＬＩＳＡ：プレートを、１００μｌ／ウェルのＩＬ−６．Ｆｃ  ２ｎｇ／μｌでコートした。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを２％ＭＰＢＳＣａＭｇ（２％ミルク、０．９０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ２、１×ＰＢＳ）で、３７℃で１時間ブロックした。プレートを洗った後、１００μｌのＩＬ−６Ｒ．ｈｉｓ（１ｎｇ／μｌ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗った後、１００μｌＩＬ−６Ｒ．ｈｉｓと共に、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗い、５０μｌ／ウェルのファージ上清＋５０μｌ／ウェルの２％ＭＰＢＳＣａＭｇブロッキング液共に、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗った後、１：５０００希釈で１００μｌの抗Ｍ１３  ＨＲＰ（GE healthcare, Cat# 27-9421-01）と共に、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄およびＴＭＢインキュベーションの後、１００μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を停止した。ＯＤ４５０のシグナルを測定した。
【０１０５】
ｇｐ１３０ブロックＥＬＩＳＡ：プレートを、１００μｌ／ウェルのｇｐ１３０  ２ｎｇ／μｌで４℃で一晩コートし、２％ＭＰＢＳＣａＭｇで、３７℃で１時間ブロックした。次いで、プレートを洗い、１００μｌのＩＬ−６Ｒ．ｈｉｓ  １ｎｇ／μｌ＋ＩＬ−６Ｒ．ｈｉｓ  １ｎｇ／μｌと共に３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、５０μｌ／ウェルのファージ上清＋５０μｌ／ウェルの２％ＭＰＢＳＣａＭｇブロッキング液を加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗い、１：５０００希釈で１００μｌの抗Ｍ１３  ＨＲＰを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢでプレートを発色させた。１００μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を停止した。ＯＤ４５０のシグナルを測定した。
【０１０６】
例えば次のような予め選択された基準に合うクローンを、シーケンシングのために選択した：陽性のＩＬ−６Ｒ結合結果、ＯＤ４５０（ＩＬ−６Ｒ結合ＥＬＩＳＡ）／ＯＤ４５０（ＩＬ−６ブロックＥＬＩＳＡ）（ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６）の値が４またはそれ以上；およびＯＤ４５０（ＩＬ−６ブロックＥＬＩＳＡ）／ＯＤ４５０（ＩＬ−６ブロックＥＬＩＳＡ）（ＩＬ−６／ｇｐ１３０）の値が３またはそれ以上。
【０１０７】
配列を解析し、独特の配列を有するクローンのパネルを同定した。
【０１０８】
実施例３：Ｆｃ融合タンパク質の構築および特徴付け
選択されたクローンを分子および細胞レベルでさらに特徴付けるために、同定されたＶＨＨをＦｃのＮ末端に融合し、哺乳動物発現ベクター中にクローン化し、２９３Ｅ細胞中で一過性に発現させた。タンパク質Ａ精製後、ＶＨＨ−ｈＦｃ融合タンパク質を下記試験に付した。
【０１０９】
ＩＬ−６Ｒブロックアッセイ（試験例１）、ｇｐ１３０結合阻害アッセイ（試験例２）、Ｕ２６６Ｂ１細胞結合活性（試験例３）、およびＩＬ−６刺激ＴＦ−１増殖抑制アッセイ（試験例４）。あらゆる面で最も良好な性質を有するＩＬ−６Ｒシングルドメイン抗体１７６４を選択した。そのヌクレオチド配列は次のとおりである：
【化１３】
2021500856.tif 000014
【０１１０】
コードされるアミノ酸の配列は次のとおりである：
【化１４】
2021500856.tif 000015
ここで、シングルドメイン抗体１７６４のＣＤＲ１〜３は下線で示され、それらの配列は次のとおりである：
【化１５】
2021500856.tif 000016
【０１１１】
上記シングルドメイン抗体ＶＨＨを、融合タンパク質形成のために下記のＦｃフラグメントと融合させた。
【０１１２】
ヒトＦｃフラグメントをコードするヌクレオチド配列は次のとおりである：
【化１６】
2021500856.tif 000017
【０１１３】
ヒトＦｃフラグメント：
【化１７】
2021500856.tif 000018
【０１１４】
実施例４：１７６４のヒト化
処置用抗体の抗薬剤反応を回避するために、本開示においてラマ由来分子１７６４を、その免疫原性を低下するようヒト化した。ヒト化は、１７６４の配列に基づき、ヒト配列への段階的変異の様式で行い、１７６４のＦＲ領域におけるラマ由来アミノ酸残基を、ヒト由来残基で段階的に置換した。設計された配列は次のとおりである：
【表１】
2021500856.tif 000019
注釈：例えば、Ａ１４Ｐは、１７６４の位置１４におけるアミノ酸残基ＡがＰで置換されたことを示す。本表におけるアミノ酸残基の番号付けは、配列番号１４に示される天然の位置番号にしたがう。
【０１１５】
＞１７６４−ｍｕ１（配列番号２０）
【化１８】
2021500856.tif 000020
【０１１６】
＞１７６４−ｍｕ２（配列番号２１）
【化１９】
2021500856.tif 000021
【０１１７】
＞１７６４−ｍｕ３（配列番号２２）
【化２０】
2021500856.tif 000022
【０１１８】
＞１７６４−ｍｕ４（配列番号２３）
【化２１】
2021500856.tif 000023
【０１１９】
＞１７６４−ｍｕ５（配列番号２４）
【化２２】
2021500856.tif 000024
【０１２０】
＞１７６４−ｍｕ６（配列番号２５）
【化２３】
2021500856.tif 000025
【０１２１】
＞１７６４−ｍｕ７（配列番号２６）
【化２４】
2021500856.tif 000026
【０１２２】
＞１７６４−ｍｕ８（配列番号２７）
【化２５】
2021500856.tif 000027
【０１２３】
＞１７６４−ｍｕ９（配列番号２８）
【化２６】
2021500856.tif 000028
【０１２４】
設計された９つのクローンをＦｃ（アミノ酸配列を配列番号１９に示した）に融合させ、哺乳動物一過性発現ベクター中に構築し、２９３Ｅ細胞において一過性に発現させた。アフィニティー精製によって、ＶＨＨ−ｈＦｃ融合タンパク質を得た。
【０１２５】
精製したＩＬ−６Ｒ抗体融合タンパク質（Ｆｃフラグメントを含み、以下、ＩＬ−６Ｒ抗体とも称する）を、下記試験に付した。
【０１２６】
試験例１：ＩＬ−６Ｒ抗体によるＩＬ−６Ｒブロックアッセイ
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体の形成は、ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６Ｒ抗体の結合によって阻害され得、したがって、細胞膜上におけるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体形成阻害によって、下流細胞シグナル伝達が遮断されうる。発現され精製されたすべての抗体を、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの間の結合を阻害するその能力について、ＥＬＩＳＡによって試験した。手順は次のとおりであった：
【０１２７】
プレートを１００μｌのＩＬ−６．Ｆｃ  ２ｎｇ／μｌで、４℃で一晩コートし、２％スキムミルクで３７℃で１時間ブロックした。次いで、プレートを洗い、１００μｌの試験サンプル段階希釈物、およびＩＬ−６Ｒ．ＢＰ１５  １ｎｇ／μｌと共にインキュベートした。３７℃で１時間のインキュベーション後、プレートを洗い、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（Jackson, 016-030-084）を１：４０００希釈でプレートに加えてインキュベートした。洗浄し、１００μｌのＴＭＢで室温で５分間発色させた後、１００μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止した。ＯＤ４５０値を測定した。結果を図１Ａ〜１Ｃに示す。
【０１２８】
試験例２：ＩＬ−６Ｒ抗体によるｇｐ１３０結合阻害アッセイ
ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの複合体はｇｐ１３０に結合することができる。本アッセイは、選択された抗体がＩＬ−６Ｒへの結合によってＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０複合体の形成を阻害することができるかを評価しうる。
【０１２９】
プレートを、１μｇ／ｍｌのｇｐ１３０（ＰＢＳで希釈）で、４℃で一晩コートした。コーティング液を廃棄し、プレートをＰＢＳ中の５％スキムミルクで３７℃で２〜３時間ブロックした。ブロッキング後、プレートを洗浄用緩衝液ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗った。
【０１３０】
ＩＬ−６．ｈｉｓおよびＩＬ−６Ｒ．ＢＰ１５を、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで希釈して０．０６μｇ／ｍｌの濃度とした。ＩＬ−６Ｒ抗体を、５０μｇ／ｍｌから始めて希釈緩衝液で連続１：３希釈し、試験抗体サンプルおよびＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の両方をプレートに入れ、３７℃で１時間インキュベートした。その後、プレートを、洗浄用緩衝液ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗った。
【０１３１】
１：２０００希釈した二次抗体ＨＲＰストレプトアビジン（Jackson, 016-030-084）をプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションおよび洗浄の後、ＴＭＢを用いて発色させた。ＯＤ４５０値を測定した。結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。
【０１３２】
試験例３：ＩＬ−６Ｒ抗体のＵ２６６Ｂ１細胞結合活性
細胞表面ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６Ｒ抗体の結合能力を試験するために、ＩＬ−６Ｒ発現Ｕ２６６Ｂ１細胞においてＩＬ−６Ｒ抗体の結合アッセイを行った。Ｕ２６６Ｂ１細胞（ATCC（登録商標）TIB-196（商標））を収集し、４℃で５分間、４００ｇで遠心分離した。終濃度１０％のＦＢＳを含む予め冷却したＤＰＢＳを用いて細胞ペレットを再懸濁した後、４℃で５分間、４００ｇで遠心分離した。２回洗浄後、細胞を１０Ｅ５／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。各ウェルに５０μｌのサンプルを加え、４℃で４５〜６０分間インキュベートし、次いで終濃度１０％のＦＢＳを含む予め冷却したＤＰＢＳ  ２５０μｌを加えた。２回洗浄後、５０μｌの二次抗体Alexa Fluor@488ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Lifetechologies, A11013）（１：２００希釈）を加え、暗所にて４℃で４５分間インキュベートした。その後、プレートを、終濃度１０％のＦＢＳを含む予め冷却したＤＰＢＳ ２５０μｌ／ウェルで２回洗った。細胞の再懸濁のために、各ウェルに、１００μｌ／ウェルの予め冷却したＤＰＢＳを加えた。機器（BD, FACSverse）上で検出を行った。結果をflowjoで解析し、図３に示した。
【０１３３】
試験例４：ＩＬ−６Ｒ抗体によるＩＬ−６刺激ＴＦ−１増殖抑制
ＩＬ−６は、膜型ＩＬ−６Ｒに結合することによって、下流シグナル伝達を開始し、ＴＦ−１細胞の増殖を誘導することができる。ＩＬ−６Ｒ抗体は、ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害することができ、それによってＴＦ−１細胞の増殖を抑制することができる。
【０１３４】
ＴＦ−１細胞培養：ＴＦ−１白血病細胞（ATCC, CRL-2003）を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０（２ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）（GE, Catalog No. SH30809.01）中で培養し、１Ｅ６細胞／ｍｌ以下の細胞密度で、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に置いた。
【０１３５】
ＩＬ−６刺激ＴＦ−１増殖阻害アッセイの手順：対数増殖期の細胞をＰＢＳで３回洗い、８００ｒｐｍで３分間遠心分離し、細胞密度をＲＰＭＩ１６４０（ＦＢＳ２％、組換えヒトＩＬ−６  ５ｎｇ／ｍｌ）で２００００細胞／ウェル／１８０μｌに調節した。２０μｌの試験抗体連続希釈物を９６ウェルプレートに加え、３日間インキュベートした（連続希釈物の抗体濃度４９０ｎＭで開始し、４．９×１０−７ｎＭまで１０倍連続希釈）。検出のために、１００μｌの細胞懸濁液を１００μｌのCell Titer（Promega, Catalog No. G7573）と混合した。結合を表２に示す。
【０１３６】
【表２】
2021500856.tif 000029
【０１３７】
試験例５：ＩＬ−６Ｒ抗体はＩＬ−６誘導ヘプシジン発現を抑制する
ヘプシジンの高発現は、炎症性貧血の主な原因である。ＩＬ−６は、下流シグナル伝達経路を活性化するＩＬ−６Ｒとの結合によって、ヘプシジン発現をアップレギュレートしうる。したがって、ＩＬ−６Ｒ抗体は、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの間の結合を阻害することにより、ＩＬ−６誘導ヘプシジン発現を抑制しうる。実験デザインは次のとおりである：
群１：ブランク対照；
群２：ＩＬ−６のみで処理する陽性対照；
群３：１７６４−ｍｕ３およびＩＬ−６で処理；
群４：トシリズマブおよびＩＬ−６で処理。
【０１３８】
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（Chinese Academy of Sciences, TCHu106）を、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥ培地（Gibco, 11095098）中で培養し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内でインキュベートした。２〜３日毎に細胞を継代した。対数増殖期のＨｅｐ３Ｂ細胞を、２０００００細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養した。翌日、細胞が８０％〜９０％のコンフルエンシーに達したら、ＩＬ−６Ｒ抗体１７６４−ｍｕ３およびトシリズマブをそれぞれ群３および群４の各ウェルに終濃度５ｎＭで加えた。３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で３０分間インキュベートした後、ブランク対照を除く各ウェルにＩＬ−６タンパク質を終濃度１０ｎｇ／ｍｌで加えた。細胞をさらに２４時間培養し、次いで細胞を収集し、全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。ヘプシジンのｍＲＮＡレベルを検出するために、ｃＤＮＡを鋳型として用いて蛍光定量ＰＣＲを行った。ミクログロブリンｍＲＮＡの発現レベルを内部標準とした。結果を表３および図４に示す。
【０１３９】
【表３】
2021500856.tif 000030
【０１４０】
試験例６：抗体のＢＩＡｃｏｒｅアフィニティー（ＫＤ）アッセイ
Human Anti-Capture Kit（Cat. #BR-1008-39, GE）を用いてBiacore装置（Biacore T200, GE）においてバイオセンサーチップＣＭ５（Cat.# BR-1000-12, GE）にヒト抗体キャプチャー抗体を製造者のプロトコルにしたがって共有結合カップリングさせ、それによって、ある量の試験する抗体を捕捉した。次いで、抗原（ｈＩＬ−６Ｒ．ｈｉｓおよびｃＩＬ−６Ｒ．ＦＨ）を一連の濃度勾配でチップ表面に流した。Biacore装置（Biacore T200, GE）を用いて反応シグナルをリアルタイムで検出して結合および解離曲線を得た。
【０１４１】
各解離サイクルの後に、バイオチップを洗い、Human Anti-Capture Kitに提供される再生液で再生した。本試験において使用したアミノカップリングキットは、ＧＥから購入し（Cat. #BR-1000-50, GE）、緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ＋１０×緩衝液（Cat.#BR-1006-69, GE）を脱イオン水で１×希釈したものであった（ｐＨ７．４）。
【０１４２】
試験データにBIAevaluationバージョン４．１およびＧＥソフトウェア（１：１）Langmuirモデルをフィットさせて、アフィニティー値を得た。結果を表４に示す。
【表４】
2021500856.tif 000031
【０１４３】
試験例７：ラットにおける薬物動態試験
ラットにおいて抗体融合タンパク質の薬物動態試験を行った。ラットへの投与スケジュールは次のとおりであった：
【表５】
2021500856.tif 000032
【０１４４】
１２匹のＳＤラット（Sipper-Beikai Experimental Animal Co., Ltd.）（雌雄同数）を６匹ずつの２群に分けた。薬物を静脈内注射した。処置群において、投与前と、投与の１５分後、８時間後、１日後、２日後、４日後、７日後、１０日後、１４日後、２１日後、および２８日後に、全血サンプル０．２ｍｌを抗凝固剤の添加なしに採った。血液サンプルを４℃で３０分間置き、１０００ｇで１５分間遠心分離し、上清（血清）をＥＰ管に入れ、−８０℃で保存した。標的の濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、試験薬物の薬物動態パラメーターをWinnolinソフトウェアで計算した。試験結果を表６に示す。
【０１４５】
【表６】
2021500856.tif 000033
【０１４６】
１７６４−ｍｕ３および１７６４−ｍｕ４は、それぞれ半減期が７．７日および６．２日の一本鎖抗体である。
【０１４７】
試験例８：加速安定性試験
いくつかの抗体について、抗体の安定性を観察するために加速試験を行った。１ｍｇ／ｍｌの抗体融合タンパク質を４０℃に３日間置いた後、沈殿物の存否を観察し、ＳＥＣ検出に付した。試験結果を表７に示す。
【０１４８】
【表７】
2021500856.tif 000034
【０１４９】
上記本発明を、明確な理解のために、添付の図面および実施例を参照して詳細に説明した。しかしながら、説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。すべての図面の数値の単位は、横座標に示す単位と同じである。本書において引用される特許および科学文献はいずれも、引用によってその全体を本書の一部とする。
【図１Ａ】
2021500856.tif 000035
【図１Ｂ】
2021500856.tif 000036
【図１Ｃ】
2021500856.tif 000037
【図２Ａ】
2021500856.tif 000038
【図２Ｂ】
2021500856.tif 000039
【図３】
2021500856.tif 000040
【図４】
2021500856.tif 000041
【配列表】
2021500856000001.app
【国際調査報告】
2021500856.tif 000042
2021500856.tif 000043
2021500856.tif 000044
2021500856.tif 000045
2021500856.tif 000046
2021500856.tif 000047
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2021500856.tif 000049
2021500856.tif 000050
2021500856.tif 000051
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2021500856.tif 000054