(57)【要約】  Ｆｉｍ３だけを産生する臨床的Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）分離株に対してマウスにおいて改良された防御を提供するために十分に安定性のｆｉｍ３発現を備えるＦｉｍ３産生ＢＰＺＥ１誘導体が開発された。ＢＰＺＥ１ｆ３におけるｆｉｍ３発現は、Ｆｉｍ２＋菌株に対する防御有効性を変化させず、更にＦｉｍ２若しくはＦｉｍ３のどちらも産生しない菌株に対する防御有効性も変化させなかった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬上許容される担体及びＦｉｍ３を安定的に産生するように組み換えられた生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株を含むワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、哺乳動物対象の肺にコロニー形成し、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）感染に対する防御免疫応答を誘導する能力を保持していることを特徴とするワクチン。
【請求項２】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、Ｆｉｍ２を安定的に産生することを特徴とするワクチン。
【請求項３】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的百日咳毒素（ＰＴＸ）、機能的皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）及び機能的気管細胞毒素（ＴＣＴ）から成る群から選択される少なくとも１種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項４】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも２種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項５】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴが欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項６】
請求項２に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも１種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項７】
請求項２に記載のワクチンにおいて、前記弱毒化生ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも２種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項８】
請求項２に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴが欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項９】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記ワクチンは、少なくとも１×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）の前記菌株を含む単回剤形で投与されることを特徴とするワクチン。
【請求項１０】
ＢＰＺＥ１ｆ３と指名されたボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株。
【請求項１１】
哺乳動物対象が百日咳を発生することから防御する方法において、前記哺乳動物対象に、医薬上許容される担体及びＦｉｍ３を安定的に産生するように組み換えられた生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株を含むワクチンを投与するステップを含み、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株が前記哺乳動物対象の肺にコロニー形成する、及びボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）感染に対する防御免疫応答を誘導する能力を保持していることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、Ｆｉｍ２を安定的に産生することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも１種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも２種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴが欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも１種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも２種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１２に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴが欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１１に記載の方法において、前記菌株は、ＢＰＺＥ１ｆ３であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５７４，０６８号明細書の優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されていて、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１８年１０月１０日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、７０５６−００９１＿ＳＬと指名されており、サイズは１，８３３バイトである。
【０００３】
連邦政府資金による研究開発に関する陳述
該当なし。
【０００４】
本発明は、一般に微生物学、免疫学、ワクチン学、血清疫学、生化学及び医学の分野に関する。より特別には、本発明は、血清型３線毛を発現するように改変された生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株及びワクチンにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ若しくはｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、特に年少乳児においては生命を脅かす可能性がある重篤な呼吸器疾患であり、ＷＨＯ（世界保健機関）によると、世界的ワクチン接種率が８５％を超えているにもかかわらず、数カ国ではその発生率が上昇中である。しかし百日咳は、青少年や成人にも影響を及ぼすが、この場合には症状が通例は非定型であるので、このためこれらの年齢群ではこの疾患は診断未確定のままとされることが多い。それでもなお、青少年や成人は、彼らが無症候性のままである場合でさえ、年少乳児が一連の最初のワクチン接種によって防御される前に原因病原菌であるボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を年少乳児に感染させ得る。実際に、臨床分離株の系統動態解析と結び付けた、米国や英国におけるＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）感染についての近年のウェーブレット解析は、無症候性伝染が近年の百日咳再燃の主因であることを証明した。更に、無症候性Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）感染は、疫学的エビデンスがＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）感染には自己免疫疾患、例えばセリアック病、多発性硬化症及びアルツハイマー病さえ関連している可能性があることを示唆しているので、安心できるものではない。
【０００６】
現在利用可能な全細胞若しくは無細胞ワクチンは、最初の３回のワクチン投与後における百日咳の発生率を低減させることには極めて効果的であった。しかし、Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）による以前の感染とは対照的に、近年確立されたヒヒモデルにおいて証明されたように、無症候性コロニー形成を低減させることにおいてははるかに有効性が低い。ワクチンが接種されたヒヒは、Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）による実験的感染後には百日咳疾患から防御されたが、回復期のヒヒとは対照的に、症状の非存在下においてさえ同腹子へ微生物を容易に感染及び伝染することができた。これらの観察所見は完全に、現在利用可能なワクチンの欠点を例示しており、疾患及び感染のどちらも防御する新規なワクチンが必要とされる。
【０００７】
Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のコロニー形成に対して防御するための最善の方法は以前の感染であるという観察に基づいて、疾患を惹起することなくできる限り自然感染を模倣するために、経鼻経路によって投与され得る生弱毒化ワクチンが開発されてきた。皮膚壊死毒素についての遺伝子コード化が欠如する、ＢＰＺＥ１と呼ばれるワクチン菌株は、遺伝的に解毒された百日咳毒素を産生し、Ｂ．ペルツシス（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ａｍｐＧ遺伝子と大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ａｍｐＧ遺伝子との置換によって気管細胞毒素産生が欠失している。ＢＰＺＥ１は、重度に免疫無防備状態のマウスを含む前臨床モデルでは安全であり、少なくとも１２カ月間に渡りｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの連続継代後に遺伝的に安定性であることが証明されている。ＢＰＺＥ１は、単回経鼻投与後のＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）チャレンジ投与から防御的ＣＤ４＋Ｔ細胞及び抗体の両方によってマウスを防御し、この防御は単回経鼻投与後にも永続することが証明された。ＢＰＺＥ１は更に近年、ヒヒにおけるＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）による鼻咽喉感染を非ワクチン接種ヒヒと比較して９９．９９２％まで低減させることもまた証明されている。ＢＰＺＥ１は現在、ファーストインマン第Ｉ相臨床試験を上首尾で完了し、ヒト成人において安全であり、ヒト上咽頭に一過性でコロニー形成することができ、全コロニー形成個人における全試験抗原に対する免疫応答を誘導することが見出された。
【０００８】
Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、主要な線毛サブユニットとしてのＦｉｍ２若しくはＦｉｍ３何れかから構成される２種の血清学的に別個の線毛を産生する。これらの線毛は、呼吸上皮細胞への細菌の付着に関係している。ＢＰＺＥ１はＦｉｍ２だけを産生するが、更に数百種の他の抗原（例えば、百日咳毒素、ＦＨＡ及びパータクチン）を産生する。従ってＢＰＺＥ１は、Ｆｉｍ３だけを産生するものを含む多種多様なＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）臨床分離株に対する有意な防御を誘導することが証明されている。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書に記載するのは、２０１７年１０月１１日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，ＦＲＡＮＣＥ）に登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２４７を付して寄託された、血清型２線毛（Ｆｉｍ２）及び血清型３線毛（Ｆｉｍ３）の両方を産生するＢＰＺＥ１に由来するＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）菌株であるＢＰＺＥ１ｆ３の開発である。ＢＰＺＥ１が免疫応答の標的とされ得るであろう数百種の非線毛抗原を産生することを前提にすると、単一の新規抗原を加えることが細菌の防御作用に大きな作用を及ぼすとは予期されなかった。従って、驚くべきことに、ＢＰＺＥ１ｆ３によるワクチン接種が、Ｆｉｍ３を産生するがＦｉｍ２を産生しない所定の臨床分離株に対する防御作用を有意に改善することが見出された。
【００１０】
下記の実施例のセクションにおいて記載した試験では、鼻腔内マウスチャレンジ投与モデルを使用して、様々な血清型の臨床分離株に対して防御するためのＦｉｍ２産生ＢＰＺＥ１及びＦｉｍ２産生、Ｆｉｍ３産生ＢＰＺＥ１ｆ３の防御潜在力を試験した。どちらのワクチン菌株も試験した全臨床分離株に対して有意な防御を誘導すると思われた。しかし、ＢＰＺＥ１ｆ３は、Ｆｉｍ３だけを産生する臨床分離株に対してＢＰＺＥ１よりも有意に良好な防御を提供したので、所定の程度までの血清特異的防御を確証した。
【００１１】
多数のＦｉｍ２及びＦｉｍ３サブタイプが同定されている。これらには、単一アミノ酸相違によって相互に異なる２種のＦｉｍ２のサブタイプであるＦｉｍ２−１、Ｆｉｍ２−２が含まれる。Ｆｉｍ２−１は１７４位でアルギニンを有するが、他方これはＦｉｍ２−２ではリシンに変化している。Ｆｉｍ３のサブタイプは、６個の異なる対立遺伝子によってコードされる。Ｆｉｍ３−２は、Ｆｉｍ３−１とは８７位での単一アミノ酸置換：Ｆｉｍ３−１及びＦｉｍ３−２について各々アラニン及びグルタミン酸塩によって異なる。Ｆｉｍ３−３は、８７位でのグルタミン酸塩置換に加えて、Ｆｉｍ３−１でのトレオニンからＦｉｍ３−３でのアラニンへの変化を有する。ｆｉｍ３−４対立遺伝子は、ｆｉｍ３−１とは単一サイレントヌクレオチド多型のみによって異なるが、他の５個の対立遺伝子は、各々が主要線毛サブユニットにおける１つのアミノ酸変化をもたらす３個のコドンによって異なる。様々なサブタイプ間のわずかな配列相違を前提とすると、ＢＰＺＥ１ｆ３はそれらの全部に対して防御的である可能性が高い。
【００１２】
線毛抗原に対する免疫応答を誘導するために、これらの抗原の産生は、生Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ワクチン菌株において十分に安定性でなければならない。Ｆｉｍ２及びＦｉｍ３産生の安定性は、１つの血清型から他の血清型への特に感染中の相変異については記載されており、ワクチン圧によって駆動され得るので、特別の注目に値する。高から低線毛産生へのこの相転移は、ｆｉｍプロモーター領域内のＣストリング中に存在するシトシンの数に左右される。Ｃストリング内のシトシンの数は、ｆｉｍプロモーターの−１０ボックスとｆｉｍ及び他のＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ビルレンス遺伝子の発現のために必要とされる転写活性化因子であるＢｖｇＡの結合部部位との間の距離に影響を及ぼす可能性がある。長年に渡り、大部分はＣストリング内に反復塩基対配列を備えるＤＮＡ領域は、特に単一塩基の付加若しくは欠失が生じる傾向があることは公知であった。ＢＰＺＥ１ｆ３は、ｆｉｍ３発現を可能にするためにプロモーター領域内での１３Ｃのストレッチにおける単一Ｃ：Ｇ塩基対の付加によって構築されたので、ｆｉｍ３発現は不安定になるであろうと考えられた。しかし予想外にも、マウスを通してのＢＰＺＥ１ｆ３の数継代後に、第１継代後に回収された細菌の１００％がＦｉｍ３＋並びにＦｉｍ２＋のままであった。その後の（３継代までの）継代中、細菌の９０％近くは依然としてｆｉｍ３及びｆｉｍ２の両方を発現し、これは、Ｆｉｍ３だけを産生する臨床分離株に対するＢＰＺＥ１ｆ３の防御作用によって確証されたように、血清型特異的免疫を誘導するために十分に安定性であることを示した。
【００１３】
従って、本明細書で記載するのは、Ｆｉｍ３を安定的に産生するように組み換えられた生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株において、哺乳動物対象の肺にコロニー形成し、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）感染（例えば、ＢＰＺＥ１ｆ３と指名されたボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株）に対する防御免疫応答を誘導する能力を保持している生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株である。生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、Ｆｉｍ２をも安定的に産生する菌株であり得る。本明細書で記載した生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、更に次のビルレンス因子：機能的百日咳毒素（ＰＴＸ）、機能的皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）及び機能的気管細胞毒素（ＴＣＴ）の少なくとも１つ（１、２若しくは３つ）が欠失させられ得る。
【００１４】
更に、本明細書で記載するのは、本明細書で言及したＦｉｍ３を安定的に産生するように組み換えられた生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株及び医薬上許容される担体を含むワクチンである。このワクチンは、少なくとも１×１０６（例えば、少なくとも１×１０６、５×１０６若しくは１×１０７）のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の菌株を含む単回剤形で提供され得る。
【００１５】
更に本明細書で記載するのは、哺乳動物対象（例えば、ヒト）が百日咳を発生することから防御する方法において、哺乳動物対象に医薬上許容される担体及びＦｉｍ３を安定的に産生するように組み換えられた生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株を含むワクチンを投与するステップを含み、その生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株が哺乳動物対象の肺にコロニー形成する、及びボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）感染に対する防御免疫応答を誘導する能力を保持している方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本明細書で使用する、抗原を「安定的に産生する」細菌菌株とは、その抗原の発現の５０％超（又は６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８若しくは９９％）を失うことなく宿主動物を通して少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５回以上）継代され得る抗原である。例えば、Ｆｉｍ３を安定的に産生するように組み換えられている分離されたボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）細菌菌株は、Ｆｉｍ３を発現するように遺伝子改変されており、例えば、下記の実施例のセクションにおいて記載した方法によって１匹のマウスを通して継代された後に、Ｆｉｍ−３の発現の少なくとも５０％（例えば、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８若しくは９９％）を維持する菌株である。
【００１７】
「機能的」ビルレンス因子との言及は、ある細菌菌株が、そのビルレンス因子の野生型バージョンと比較して、そのビルレンス因子の少なくとも５０％の酵素活性を有することを意味する。「少なくとも１種のビルレンス因子が欠失させられている」細菌菌株は、それに由来する親菌株と比較して、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％未満のビルレンス因子の酵素活性若しくは機能的活性を発現するように組み換えられた菌株である。
【００１８】
他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様若しくは同等の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用できるが、好適な方法及び材料については以下に記載する。本明細書で言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。不一致が生じた場合は用語の定義を含めて本明細書が優先されることになる。更に、下記で考察する特定の実施形態は例示に過ぎず、限定的であることは意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａは、ＢＰＺＥ１（ダイヤモンド形）及びＢＰＺＥ１ｆ３（四角形）によるＦｉｍ２の産生を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＢＰＺＥ１（ダイヤモンド形）及びＢＰＺＥ１ｆ３（四角形）によるＦｉｍ３の産生を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、改変Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ培地中でのＢＰＺＥ１（ダイヤモンド形）及びＢＰＺＥ１ｆ３（四角形）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、完全合成Ｔｈｉｊｓ培地中でのＢＰＺＥ１（ダイヤモンド形）及びＢＰＺＥ１ｆ３（四角形）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を示すグラフである。
【図３】図３は、１０６ＣＦＵのＢＰＺＥ１（黒色）若しくはＢＰＺＥ１ｆ３（灰色）が経鼻接種されたマウスの肺コロニー形成を示しているグラフであり、肺内の細菌量は指示した時点で測定された。
【図４】図４は、臨床的Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）分離株に対するＢＰＺＥ１誘導性防御及びＢＰＺＥ１ｆ３誘導性防御を示している一連のグラフ（４Ａ〜４Ｅ）であり、マウスは１０５ＣＦＵのＢＰＺＥ１（黒色バー）若しくはＢＰＺＥ１ｆ３（灰色バー）の何れかを経鼻的に受容した、又は未治療で放置された（白色バー）。ワクチン接種の４週間後、マウスには１０６ＣＦＵの１６１７ｐＦ１（Ａ）、４０３ｐＦ１（Ｂ）、Ｐ１３４（Ｃ）、１４１２ｐＦ１（Ｄ）若しくは４０３ｐＦ３（Ｅ）がチャレンジ投与された。チャレンジ投与の３時間後（パネルの左側の部分、Ｄ０）又は７日後（パネルの右側の部分、Ｄ７）、肺内の細菌量を測定し、ＣＦＵの平均値及び標準偏差として提示した。１群当たりマウス（Ｄ０に対して）３匹又は（Ｄ７に対して）５匹が使用された。＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図５】図５は、Ｂ．パラペルツシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対するＢＰＺＥ１誘導性防御及びＢＰＺＥ１ｆ３誘導性防御を比較しているグラフであり、マウスは１０６ＣＦＵのＢＰＺＥ１（黒色バー）若しくはＢＰＺＥ１ｆ３（灰色バー）の何れかを経鼻的に受容した、又は未治療で放置された（白色バー）。ワクチン接種の２カ月後、マウスには１０６ＣＦＵのＢ．パラペルツシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）がチャレンジ投与された。チャレンジ投与の３時間後（パネルの左側の部分、Ｄ０）又は７日後（パネルの右側の部分、Ｄ７）、肺内の細菌量を測定し、ＣＦＵの平均値及び標準偏差として提示した。１群当たりマウス（Ｄ０に対して）３匹又は（Ｄ７に対して）５匹が使用された。＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図６】図６は、ＢＰＺＥ１ｆ３によるＦｉｍ２及びＦｉｍ３の産生の安定性を示しているグラフであり、ＢＰＺＥ１ｆ３はマウスにおいて３回継代され、各継代（Ｐ１〜Ｐ３）では、抗Ｆｉｍ２及び抗Ｆｉｍ３モノクローナル抗体を使用して９４コロニーがＦｉｍ２（白色バー）及びＦｉｍ３（黒色バー）の存在について全細胞ＥＬＩＳＡによって解析された。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書では、マウスにおいてＦｉｍ３だけを産生する臨床的Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）分離株に対して改良された防御を提供するために十分に安定性のｆｉｍ３発現を備えるＦｉｍ３産生ＢＰＺＥ１誘導体について記載する。ＢＰＺＥ１ｆ３におけるｆｉｍ３発現は、Ｆｉｍ２＋菌株に対する防御有効性を変化させず、更にＦｉｍ２若しくはＦｉｍ３のどちらも産生しない菌株に対しても防御有効性を変化させなかった。下記に記載する実施形態は、これらの方法の代表的な実施例を例示している。それでもなお、これらの実施形態の説明から、下記に提供した説明に基づいて本発明の他の態様を作成する、及び／又は実施することができる。
【００２１】
一般的方法論
本明細書では、従来型の微生物学、免疫学、分子生物学及び医学技術を包含する方法について記載する。微生物学的方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（３ｄ  Ｅｄ），Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。免疫学的方法は、一般に当分野において公知であり、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ等の方法論の論文に記載されている。分子生物学の技術は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなどの論文の中で詳細に記載されている。内科療法の一般的方法については、ＭｃＰｈｅｅ  ａｎｄ  Ｐａｐａｄａｋｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ２０１０，４９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ，２０１０；及びＦａｕｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，２００８に記載されている。
【００２２】
Ｆｉｍ３産生ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株
Ｆｉｍ３発現が欠如するボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）種（例えば、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・パラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及びボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ））は、Ｆｉｍ３（例えば、Ｆｉｍ３−１、Ｆｉｍ３−２、Ｆｉｍ３−３若しくはＦｉｍ３−４）を産生するように遺伝子組換えすることができる、及びさもなければ下記に記載するように弱毒化することができる。これらのＦｉｍ３産生細菌は、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）種によって惹起される症候性若しくは無症候性呼吸器感染症、並びにＢＰＺＥＩが有効であることが証明された他の状況（例えば、アレルギー及び喘息）を治療及び／又は予防するために使用され得る。Ｆｉｍ３を産生するように組み換えられたボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株もまた、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）感染の伝染を予防するために使用され得る。弱毒化されたＦｉｍ２／Ｆｉｍ３産生ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、ヒト対象において使用するために好ましい。Ｆｉｍ３産生細菌の作成に使用するためのボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、自然源（例えば、コロニー形成対象）から分離できる、又は様々な培養コレクションから入手できる。Ｆｉｍ３を産生するように組み換えられているボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、下記に記載する方法によって作成することができる。
【００２３】
ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）の病原性菌株の不十分な弱毒化は対象における病理学的感染を誘発し得るので、Ｆｉｍ３を産生するように組み換えられたボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株が低レベルの他のビルレンス因子を有するのが好ましい。他方、Ｆｉｍ３産生ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株が対象にコロニー形成することができ、呼吸器炎症に防御作用を発揮できることを保証するためには、その菌株は、過度に弱毒化されてはならない。弱毒化は、その菌株を以下の：百日咳毒素（ＰＴＸ）、皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）、気管細胞毒素（ＴＣＴ）、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチン又は何れかのｂｖｇ調節成分の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５つ以上）の産生を低減させるために突然変異させることによって達成され得る。そのような突然変異体を作成するための方法は、本明細書及び米国特許第９，１１９，８０４号明細書及び米国特許出願第１５／４７２，４３６号明細書に記載されている。下記に提示した実験では、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、ＤＮＴ及びＴＣＴ内で欠失するように組み換えられており、遺伝的に不活性のＰＴＸを産生するＦｉｍ３を産生した。その菌株は、対象の気道にコロニー形成し、対象における防御免疫応答を誘導することもできた。
【００２４】
調製物／用量／投与
Ｆｉｍ３を産生するように組み換えられたボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、対象に投与するためのワクチンとして調製することができる。好適な数の生細菌は、例えばリン酸緩衝生理食塩液、蒸留水等の医薬上好適な賦形剤若しくは担体、例えば水中油型エマルション等のエマルション、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液等と混合される。一部の場合には、ワクチンは凍結乾燥し、次に投与前に再構成することができる。気道にコロニー形成させるためには、粘膜（特に鼻腔、気管支若しくは肺）投与と適合する医薬上好適な賦形剤若しくは担体の使用が好ましい。この分野及びＵＳＰ／ＮＦ（米国薬局方／国民医薬品集）における標準的な教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい。
【００２５】
粘膜投与のために調製された場合、ワクチンの各用量は、それを摂取する哺乳動物の体重及び年齢に依存して、気道のコロニー形成を生じさせるために十分な数、例えば細菌およそ（即ち、±５０％の）５×１０３〜５×１０９個の生ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）細菌を含むことができる。ヒト対象に投与するためには、用量はおよそ１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９若しくは１×１０１０の生Ｆｉｍ３産生ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）細菌を含むことができる。用量は、１回又は複数回（２、３、４、５、６、７、８回以上）の機会に１、２、３、４、５若しくは６日間又は１、２、３、４、５若しくは６週間又は１、２、３、４、５、６若しくは１２カ月間の間隔を空けて投与され得る。一般に、コロニー形成及び防御的応答を生じさせるために十分な量のワクチンが投与される。誘導された防御的応答が減弱した後には、追加量が投与される。
【００２６】
百日咳から防御するための免疫応答を誘導する方法
本明細書に記載したワクチンは、哺乳動物対象（例えば、ヒト、ヒトの小児若しくは新生児、ヒト成人、百日咳からの合併症を発生する高リスク状態にあるヒト、肺疾患を有するヒト及び免疫が抑制されている、又は免疫が抑制されるようになるヒト）へワクチン内の細菌を気道内に堆積させる任意の好適な方法によって投与され得る。例えば、ワクチンは、吸入若しくは鼻腔内導入によって、例えば吸入器、シリンジ、注入器、スプレー装置等によって投与することができる。１×１０４〜１×１０７（例えば、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６若しくは１×１０７±１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０％）の生細菌の単回用量の投与は、例えば百日咳などのボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）感染を発生することに対して防御免疫を誘導するために典型的には十分であるが、十分に防御免疫応答が発生するまで、４日間以上（例えば、４、５、６若しくは７日間；又は１、２、３、４、５、６、７若しくは８週間）の間隔を空けて１回以上（１、２、３、４回以上）の追加の用量が投与されてよい。防御免疫応答の発生は、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）特異的抗体力価を定量するステップ及びボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）抗原特異的Ｔ細胞応答（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用する）を測定するステップ等の当分野において公知の方法によって評価することができる。ワクチン誘導性防御免疫応答が（例えば、最終ワクチン接種から１、２、３、４、５、１０年以上後に）減弱化されている場合には、対象には抗ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）免疫応答をブーストするためにワクチンが再び投与され得る。
【実施例】
【００２７】
材料及び方法
培養条件
全Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）菌株は、（Ｉｍａｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９８３；４１：１１３８−４３）において記載されたように、攪拌下の改変Ｓｔａｉｎｅｒ  Ｓｃｈｏｌｔｅ（ＳＳ）培地中、又は完全合成Ｔｈｉｊｓ培地（Ｔｈａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９９；７５：１４７−５９）中において、１０％（ｖ／ｖ）のヒツジ血を含むＢｏｒｄｅｔ  Ｇｅｎｇｏｕ（ＢＧ）寒天上で増殖させた。培地には、適切な抗生物質（ｐＦＵＳ２  ＢｃｔＡ１を有する菌株のために１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン若しくは１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン）を補給した。
【００２８】
細菌菌株
本試験で使用したＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）であるＢＰＳＭ及びＢＰＺＥ１並びにボルデテラ・パラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）については、以前に記載されている（Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２００６；２：ｅ６５；Ｍｅｎｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９４；６２：７６９−７８）。Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）菌株であるＢ０４０３、Ｂ１４１２、Ｂ１６１７及びＢ０００５（菌株１３４  Ｐｉｌｌｍｅｒ）は、ＲＩＶＭコレクション（Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。対抗選択のために、臨床分離菌株の一部は、Ａｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００５；３５１：７９９−８０９）に記載されたゲンタマイシン耐性を獲得するためにｐＦＵＳ２  ＢｃｔＡ１自滅プラスミドを用いてエレクトロポレーションにかけた。エレクトロポレーション後のゲンタマイシン耐性誘導体は、染色体ＤＮＡ内へのｐＦＵＳ２  ＢｃｔＡ１ベクターの挿入部位を検証するためにＰＣＲによってチェックし、及び下記に説明するように表面曝露したＦｉｍ２及び／又はＦｉｍ３のレベルをＥＬＩＳＡによってチェックした。菌株Ｐ１３４Ｓは、Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）Ｂ０００５のストレプトマイシン誘導体を選択することによって入手した。菌株Ｐ１３４Ｓは、ｒｐｓｌ遺伝子内の突然変異によって媒介されたストレプトマイシン耐性に加えて、線毛産生の消失をもたらすｆｉｍＣ遺伝子内の突然変異を有する。Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）内への様々なプラスミド構築体のコンジュゲーションのために、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＳＭ１０を使用した（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８３；１：７８４−９１）。
【００２９】
Ｆｉｍ３陽性ＢＰＺＥ１誘導体ＢＰＺＥ１ｆ３の構築
ＢＰＺＥ１ｆ３を構築するために、ｆｉｍ３  ＡＴＧコドンの７５ｂｐ上流であるＢＰＺＥ１のｆｉｍ３遺伝子のプロモーター領域内に局在する１３Ｃストレッチは、ｆｉｍ３の転写を誘発するために１４Ｃストレッチと置換された。プロモーター領域を含有する全ｆｉｍ３遺伝子座は、親菌株内で最初に欠失させられ、その後１４Ｃストレッチを備えるｆｉｍ３遺伝子座によって置換された。この遺伝子座を包含する２２６５ｂｐのＰＣＲ断片は、以下のオリゴヌクレオチド（ＳＰｆｉｍ３ＵＰ２：ＧＡＧＣＴＣＴＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧ及びＡＳＰｆｉｍ３ＬＯ２：ＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧ）を使用することによって増幅させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）のＳａｃＩ及びＢａｍＨＩ制限部位内にクローン化した。結果として生じたプラスミドから、全遺伝子座を含有する９０４ｂｐ断片は、ｐＳＫｆｉｍ３ＵＰＬＯを得るためにＳｐｈＩ制限によって除去した。ｐＳＫｆｉｍ３ＵＰＬＯの１３５１ｂｐのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片は、ｐＪＱ２００ｍｐ１８ｒｐｓＬのＳａｃＩ及びＢａｍＨＩ部位内に挿入された（Ａｎｔｏｉｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５）３５１，７９９−８０９）。組換えプラスミドは、次に以前に記載されたように（Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２００６；２：ｅ６５）、コンジュゲーションを使用するＢＰＺＥ１内での二重相同組換えのために使用した。接合完了体は、オリゴヌクレオチドであるＳＰｆｉｍ３ＵＰ２及びＡＳＰｆｉｍ３ＬＯ２を使用するＰＣＲによって全ｆｉｍ３遺伝子座の欠失についてチェックした。プロモーター内への１４Ｃストレッチを備える全ｆｉｍ３遺伝子座の再導入は、以下の通りに実施した。１４Ｃストレッチを備える全遺伝子座を包含する９１１ｂｐの合成遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）によって合成した。合成断片の先端にあるＳｐｈＩ部位を使用してそれをｐＳＫｆｉｍ３ＵＰＬＯのＳｐｈＩ部位内に挿入すると、ｐＳＫｆｉｍ３＋が生じた。挿入物の正確な方向は、制限によってチェックした。このプラスミドの２２５６ｂｐのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片は、ｐＪＱ２００ｍｐ１８ｒｐｓＬの同一制限部位内に運ばれ、ｐＪＱｆｉｍ３＋をもたらした。このプラスミドを使用して、ＢＰＺＥ１ｆ３を得るために二重相同組換えを実施した。この組換え菌株は、オリゴヌクレオチドであるＳＰｆｉｍ３ＵＰ２及びＡＳＰｆｉｍ３ＬＯ２を使用するＰＣＲによって検証した。
【００３０】
Ｆｉｍ２及びＦｉｍ３産生の解析
Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）菌株は、最初に３０分間に渡り５６℃で加熱することによって不活化した。熱不活化菌株は、次に９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ，）内で０．０７５の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）でコーティングし、ウエルが乾燥するまで３７℃で一晩インキュベートした。ウエルは次に、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１００μＬのＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ０．１％（ＰＢＳＴ）を用いてブロックした。Ｆｉｍ２及びＦｉｍ３モノクローナル抗体（ＮＩＢＳＣ、各々０４／１５４及び０４／１５６）は、ＰＢＳＴ中の１／５０〜１／３６４５０（ｖ／ｖ）の連続希釈率で添加した。３回の洗浄後、プレートをＰＢＳＴ中の１００μＬのホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。５回の洗浄後、プレートは、室温で３０分間に渡り、１００μＬのＨＲＰ基質ＴＭＢ溶液（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）を用いてインキュベートした。反応は、５０μＬの１ＭのＨ３ＰＯ４の添加によって停止させた。ＯＤは、ＢｉｏｋｉｎｅｔｉｃリーダーＥＬ／３４０マイクロプレートを用いて４５０ｎｍで測定した。
【００３１】
ＤＮＡシーケンシング
染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）又はＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の取扱説明書に従って使用して実施した。ＰＣＲ断片は、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、増幅のために使用したプライマーを用いてシーケンシングした。ｐｔｘＰのＰＣＲ増幅のために使用したプライマーｐｔｘＰ  Ｕｐ及びｐｔｘＰ  Ｌｏｗについては、以前に記載されている（Ｍｏｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００９；１５：１２０６−１３）。ｐｒｎの部分的ＰＣＲ増幅のために使用したプライマーｐｒｎ  ＡＦ及びｐｒｎ  ＡＲについては、以前に記載されている（Ｍｏｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  １９９８；６６：６７０−５）。プライマーｆｉｍ２  Ｕｐ  ５’−ＡＧＣＴＡＧＧＧＧＴＡＧＡＣＣＡＣＧＧＡ−３’及びｆｉｍ２  Ｌｏｗ  ５’−ＡＴＡＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＣＧＣＣＡＡＧ−３’は、ｆｉｍ２の増幅及びシーケンシングのために使用した。プライマーｆｉｍ３  Ｕｐ  ５’−ＣＡＴＧＡＣＧＧＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＴＡ−３’及びｆｉｍ３  Ｌｏｗ  ５’−ＴＴＣＡＣＧＴＡＣＧＡＧＧＣＧＡＧＡＴＡ−３’は、ｆｉｍ３の増幅及びシーケンシングのために使用した。
【００３２】
マウスの感染実験
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（ｌ’Ａｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手し、ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ｄｅ  Ｌｉｌｌｅの動物飼育施設内で特異的無菌条件下で飼育した。６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスは、以前に記載されたように（Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２００６；２：ｅ６５）、麻酔カクテル（ケタミン＋アトロピン＋バリウム）を含む腹腔内注射によって軽度に鎮静し、その後に１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）であるＢＰＺＥ１若しくはＢＰＺＥ１ｆ３を含有する２０μＬのＰＢＳによる鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与を実施した。１群当たり３匹のマウスをｉ．ｎ．投与後の選択した時点に安楽死させ、マウスの肺を摘出し、ＰＢＳ中でホモジナイズし、連続希釈液中でＢＧ血寒天上でプレーティングし、３〜４日間に渡り３７℃でインキュベーションした後にＣＦＵを計数した。
【００３３】
マウスの防御実験
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスには、上述したように１０５ＣＦＵのＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）であるＢＰＺＥ１若しくはＢＰＺＥ１ｆ３をｉ．ｎ．ワクチン接種した。４週間後、ナイーブ及びワクチン接種マウスには２０μＬのＰＢＳ中の１０６ＣＦＵのＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）であるＢＰＳＭ、指示した臨床的Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）分離株若しくはＢ．パラペルツシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）をチャレンジ投与した。肺コロニー形成は、１群当たり各々３匹及び５匹のマウスを用いて３時間後及び７日後に決定した。
【００３４】
Ｆｉｍ３及びＦｉｍ２産生の安定性
２０μＬのＰＢＳ中の１０６ＣＦＵのＢＰＺＥ１ｆ３を鎮静したマウスに投与した。１４日後、肺を摘出し、ホモジナイズし、ＢＧ寒天上にプレーティングした。３〜４日後、９４個の個別コロニーは、１００μＬのＰＢＳ／ウエルを含有する９６ウエルプレート内に接種した。コントロールウエルは、陰性コントロールとしてのＢＰＺＥ１及び陽性コントロールとしてのＢＰＺＥ１ｆ３を含有していた。各ウエル内に存在する細菌の量は、６３０ｎｍでのＯＤ測定によって決定した。乾燥させた後、Ｆｉｍ３及びＦｉｍ２の存在は、上述したように全細胞ＥＬＩＳＡによって評価した。１％のＢＳＡを含有する１００μＬのＰＢＳＴを用いたブロッキングステップ後、１時間中に、細菌は１／１３５０の希釈率で１００μＬのＰＢＳＴ中の抗Ｆｉｍ３モノクローナル抗体０４／１５６又は抗Ｆｉｍ２モノクローナル抗体０４／１５４と共にインキュベートした。ＰＢＳＴ中の１００μＬのホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた洗浄及びインキュベーション後、Ｆｉｍ３又はＦｉｍ２の存在を１００μＬのＨＲＰ基質ＴＭＢ溶液（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）曝露を用いて評価した。反応は、５０μＬの１ＭのＨ３ＰＯ４の添加によって停止させた。ＯＤは、ＢｉｏｋｉｎｅｔｉｃリーダーＥＬ／３４０マイクロプレートを用いて４５０ｎｍで測定した。
【００３５】
結果
ＢＰＺＥ１ｆ３の構築。
Ｆｉｍ３を産生するＢＰＺＥ１誘導体を構築するために、最初にｆｉｍ３遺伝子をＢＰＺＥ１から欠失させた。ｆｉｍ３の上流及び下流隣接領域は、鋳型としてのＢＰＺＥ１染色体ＤＮＡを使用するＰＣＲによって増幅させ、非複製ベクターｐＪＱ２００ｍｐ  １８ｒｐｓＬ内で一緒にスプライスした（Ａｎｔｏｉｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５）３５１，７９９−８０９）。ＢＰＺＥ１のｆｉｍ３遺伝子は、次に組換えプラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＭ１０とのコンジュゲーション後の対立遺伝子交換によって欠失させた。結果として生じた菌株ＢＰＺＥ１&#8710;ｆｉｍ３を使用してｆｉｍ３遺伝子を機能的プロモーターと一緒に元のｆｉｍ３遺伝子座内に再統合させた。元のプロモーターの１３Ｃストレッチは、ｆｉｍ３発現を可能にする１４Ｃストレッチと置換し、ｆｉｍ３オープンリーディングフレームと一緒にｐＳＫｆｉｍ３ＵＰＬＯ内に挿入した。生じたプラスミドｐＪＱＦｉｍ３＋は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＭ１０：ｐＪＱＦｉｍ３＋とのコンジュゲーションによってＢＰＺＥ１&#8710;ｆｉｍ３内にコンジュゲート化した。これはＢＰＺＥ１ｆ３を生じさせた。
【００３６】
ＢＰＺＥ１ｆ３におけるＦｉｍ２及びＦｉｍ３の産生は、各々Ｆｉｍ２特異的及びＦｉｍ３特異的モノクローナル抗体を使用して全細胞ＥＬＩＳＡによって解析した。図１Ａに示したように、ＢＰＺＥ１及びＢＰＺＥ１ｆ３はどちらも同等量のＦｉｍ２を産生した。対照的に、Ｆｉｍ３はＢＰＺＥ１ｆ３によってのみ産生され、全ＢＰＺＥ１抽出物上でＦｉｍ３特異的抗体を用いた場合はバックグラウンド吸光度しか検出されなかった（図１Ｂ）。どちらの菌株もＳｔａｉｎｅｒ  Ｓｃｈｏｌｔｅ培地中及び完全合成Ｔｈｉｊｓ培地中で同等に良好に増殖し（図２）、これはＦｉｍ３の産生がＢＰＺＥ１ｆ３の増殖特性に影響を及ぼさないことを示していた。
【００３７】
ＢＰＺＥ１ｆ３によるマウスコロニー形成。
マウス気道におけるコロニー形成においてＢＰＺＥ１ｆ３によるＦｉｍ３産生が果たす潜在的役割を評価するため、成体マウスを１０６ＣＦＵのＢＰＺＥ１若しくはＢＰＺＥ１ｆ３の何れかで感染させ、１群当たり３匹のマウスを安楽死させて感染後第３、７、１４、２１及び２８日後に彼らの肺内の細菌量を定量した。図３に示したように、マウス肺にコロニー形成する能力は解析した全時点において２種の菌株間で同一であったが、これはＦｉｍ３の産生がＢＰＺＥ１がマウス気道にコロニー形成する能力を増強も妨害もしないことを示していた。
【００３８】
臨床的Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）分離株に対するＢＰＺＥ１媒介性及びＢＰＺＥ１ｆ３媒介性防御。
Ｆｉｍ２及びＦｉｍ３のそれらの産生に関して相違する臨床分離株に対するＢＰＺＥ１及びＢＰＺＥ１ｆ３の相対的防御作用を試験するために、本発明者らは、マウスを１０５ＣＦＵのワクチン菌株を用いて鼻腔内免疫し、１０６ＣＦＵのチャレンジ菌株を用いて１カ月後に感染させる準最適免疫化プロトコールを使用した。このプロトコールを使用したのは、１０６ＣＦＵのワクチン菌株を使用し、２カ月後に１０６ＣＦＵのチャレンジ菌株を用いた感染が続く標準ワクチン接種プロトコールは、通常は抗原投与７日後に総クリアランスを生じさせるので、このプロトコールがワクチンロット間の潜在的差を検出するために最も適合するためであった。
【００３９】
２種のワクチン菌株の効力をＲＩＶＭのＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）培養コレクション（Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）由来の４種の異なる臨床分離株に対して試験した。５種の菌株は、Ｆｉｍ２及びＦｉｍ３産生に関して下記の：１６１７Ｆ１（Ｆｉｍ２＋Ｆｉｍ３−）、４０３ｐＦ１（Ｆｉｍ２＋Ｆｉｍ３−）、Ｐ１３４（Ｆｉｍ２−Ｆｉｍ３−）、１４１２ｐＦ１（Ｆｉｍ２−Ｆｉｍ３＋）及び４０３ｐＦ３（Ｆｉｍ２＋Ｆｉｍ３＋）の特徴を有していた。これらの菌株の遺伝的に重要な特徴は、下記の表Ｉに提示した。ワクチン接種及びチャレンジ感染後、チャレンジ菌株の細菌量は感染３時間後及び７日後に肺内で測定された。
【表１】
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【００４０】
ＢＰＺＥ１及びＢＰＺＥ１ｆ３は、１６１７ｐＦ１、４０３ｐＦ１、Ｐ１３４及び４０３ｐＦ３に対して同等に良好に防御し、非ワクチン接種マウスにおける細菌量と比較して、各場合において細菌量を感染７日後に４〜５ｌｏｇ減少させた（図４）。ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスとＢＰＺＥ１ｆ３ワクチン接種マウスとの間で統計的有意差は見られなかった。しかし、マウスに１４１２ｐＦ１をチャレンジ投与すると、Ｆｉｍ３だけを産生してＦｉｍ２を産生しない菌株であるＢＰＺＥ１ｆ３は、ＢＰＺＥ１より有意に良好に防御すると思われた（図４Ｄ）。ＢＰＺＥ１ワクチン接種は非ワクチン接種マウスと比較して、細菌量において４ｌｏｇの差を生じさせたが、ＢＰＺＥ１ｆ３はこの防御を５ｌｏｇの差へ増加させた。チャレンジ感染の３時間後にＣＦＵを測定した場合に、ワクチン接種マウスと非ワクチン接種マウスとの間の細菌量の統計的有意な減少は観察されなかったが、これは、予想通りに、全マウスが同一チャレンジ用量を摂取していたことを示していた。これらの結果は、Ｆｉｍ３だけを産生する菌株に対してＢＰＺＥ１に比してＢＰＺＥ１ｆ３の改良された効力を示しているが、他方Ｆｉｍ３と共に、又はＦｉｍ３を伴わずにＦｉｍ２を産生する菌株又は線毛を産生しない菌株に対する防御の改善は見られなかった。
【００４１】
ボルデテラ・パラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対するＢＰＺＥ１媒介性及びＢＰＺＥ１ｆ３媒介性防御。
Ｂ．パラペルツシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対するＢＰＺＥ１ｆ３の効力についても試験した。この場合には、１０６ＣＦＵのワクチン菌株を使用し、その後にワクチン接種の２カ月後に１０６ＣＦＵのＢ．パラペルツシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）によりチャレンジ投与した。以前に、このプロトコールは強力な防御をもたらすが、チャレンジ感染の７日後に総クリアランスは生じないことが証明されている（Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２００６；２：ｅ６５）。Ｂ．パラペルツシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）感染の７日後、ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスとＢＰＺＥ１ｆ３ワクチン接種マウスはどちらも、非ワクチン接種マウスと比較して、肺内の細菌量の強度の減少（４〜５ｌｏｇの間）を示した（図５）。ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスとＢＰＺＥ１ｆ３ワクチン接種マウスとの間で統計的差は見られず、これはＦｉｍ３の産生が利点を提供しないが、Ｂ．パラペルツシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）感染に対する防御にとって有害ではないことも示している。
【００４２】
ＢＰＺＥ１ｆ３によるＦｉｍ３産生の安定性。
ＢＰＺＥ１とＢＰＺＥ１ｆ３との間の唯一の遺伝的相違は、ｆｉｍ３プロモーターのＣストリング内のＣ（ＢＰＺＥ１内の１３Ｃ及びＢＰＺＥ１ｆ３内の１４Ｃ）の量であり、及びＣストリングはＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）内で位相変動を生じさせる傾向があるので（Ｗｉｌｌｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９０；９：２８０３−９）、ＢＰＺＥ１ｆ３によるＦｉｍ３及びＦｉｍ２両方の産生の安定性をマウスにおけるワクチン菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ継代後に評価した。マウスを１０６ＣＦＵのＢＰＺＥ１ｆ３により感染させ、感染１４日後の肺内に存在する細菌を採取し、ＢＧ寒天上でプレーティングした。増殖後、９４個の個別コロニーを９６ウエルプレート内に接種した。残留しているコロニーを採取し、第２継代のためにマウスに投与し、更に２週間後に第３継代を実施した。各継代時に、９４個の個別コロニーは、１００μＬのＰＢＳ／ウエルを含有する９６ウエルプレート内に接種した。コントロールウエルは、陰性コントロールとしてのＢＰＺＥ１及び陽性コントロールとしてのＢＰＺＥ１ｆ３を含有していた。各ウエル内に存在する細菌の量は、６３０ｎｍでのＯＤ測定によって決定した。乾燥させた後、Ｆｉｍ３及びＦｉｍ２の存在を全細胞ＥＬＩＳＡによって評価した。クローン９４個中９４個が第１継代後にＦｉｍ３及びＦｉｍ２の両方を産生することが見出された。第２継代後、９７．９％のコロニーはＦｉｍ２を産生し、９６．８％はＦｉｍ３を産生し、第３継代後の数はＦｉｍ３及びＦｉｍ２について各々８７．２３％及び９７．９％であったが（図６）、３回のｉｎ  ｖｉｖｏ継代後に１２．７７％の損失しか示さなかったので、これは相当に安定性のｆｉｍ３発現を示した。
【００４３】
その他の実施形態
本発明をその詳細な説明と結び付けて記載してきたが、上記の説明は具体的に説明することを意図するものであり、添付の請求項の範囲によって規定される本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解されたい。他の態様、利点及び修飾は、以下の請求項の範囲内に含まれる。
【図１】
2021500325.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2021500325000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月24日(2019.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬上許容される担体及びＦｉｍ３を安定的に産生するように組み換えられた生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株を含むワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、哺乳動物対象の肺にコロニー形成し、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）感染に対する防御免疫応答を誘導する能力を保持していることを特徴とするワクチン。
【請求項２】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、Ｆｉｍ２を安定的に産生することを特徴とするワクチン。
【請求項３】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的百日咳毒素（ＰＴＸ）、機能的皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）及び機能的気管細胞毒素（ＴＣＴ）から成る群から選択される少なくとも１種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項４】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも２種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項５】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴが欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項６】
請求項２に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも１種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項７】
請求項２に記載のワクチンにおいて、前記弱毒化生ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも２種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項８】
請求項２に記載のワクチンにおいて、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴが欠失させられていることを特徴とするワクチン。
【請求項９】
請求項１に記載のワクチンにおいて、前記ワクチンは、少なくとも１×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）の前記菌株を含む単回剤形で投与されることを特徴とするワクチン。
【請求項１０】
登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２４７を付してｔｈｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託されたＢＰＺＥ１ｆ３と指名されたボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株。
【請求項１１】
哺乳動物対象が百日咳を発生することから防御する方法において、前記哺乳動物対象に、医薬上許容される担体及びＦｉｍ３を安定的に産生するように組み換えられた生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株を含むワクチンを投与するステップを含み、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株が前記哺乳動物対象の肺にコロニー形成する、及びボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）感染に対する防御免疫応答を誘導する能力を保持していることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、Ｆｉｍ２を安定的に産生することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも１種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも２種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴが欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも１種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴから成る群から選択される少なくとも２種のビルレンス因子が欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１２に記載の方法において、前記生弱毒化ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌株は、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ及び機能的ＴＣＴが欠失させられていることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１１に記載の方法において、前記菌株は、登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２４７を付してｔｈｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託されたＢＰＺＥ１ｆ３であることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2021500325.tif 000009
2021500325.tif 000010