(57)【要約】  本出願は、キメラ受容体（ＣＲ）、キメラ共受容体（ＣＣＯＲ）、および／または共受容体（ＣＯＲ）を含む免疫細胞（例えばＴ細胞）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変された免疫細胞であって、
ａ）キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体（ＣＲ）、ならびに
ｂ）キメラ共受容体（ＣＣＯＲ）であって、ｉ）ＣＣＯＲ標的抗原を特異的に認識するＣＣＯＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＣＯＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＣＯＲ共刺激ドメインを含むキメラ共受容体（ＣＣＯＲ）
を含み、
前記ＣＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４であり、前記ＣＣＯＲ標的抗原はＣＤ４であるか、または
前記ＣＲ標的抗原はＣＤ４であり、前記ＣＣＯＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４である、改変された免疫細胞。
【請求項２】
改変された免疫細胞であって、
キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体（ＣＲ）
を含み、
前記ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４からなる群から選択される、改変された免疫細胞。
【請求項３】
前記ＣＣＲ５、前記ＣＸＣＲ４または前記ＣＤ４が、広域中和抗体とタンデム化されている、請求項１または２に記載の改変された免疫細胞。
【請求項４】
前記広域中和抗体が、ＶＲＣ０１、ＰＧＴ１２１、３ＢＮＣ１１７または１０−１０７４である、請求項３に記載の改変された免疫細胞。
【請求項５】
１または複数の共受容体（「１または複数のＣＯＲ」）をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項６】
改変された免疫細胞であって、
ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする第１の核酸であって、前記ＣＲは、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、第１の核酸、ならびに
ｂ）キメラ共受容体（ＣＣＯＲ）をコードする第２の核酸であって、前記ＣＣＯＲは、ｉ）ＣＣＯＲ標的抗原を特異的に認識するＣＣＯＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＣＯＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＣＯＲ共刺激シグナル伝達ドメインを含む、第２の核酸
を含み、
前記ＣＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４であり、前記ＣＣＯＲ標的抗原はＣＤ４であるか、または
前記ＣＲ標的抗原はＣＤ４であり、前記ＣＣＯＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４である、改変された免疫細胞。
【請求項７】
改変された免疫細胞であって、
キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、前記ＣＲは、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸
を含み、
前記ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４からなる群から選択される、改変された免疫細胞。
【請求項８】
前記ＣＣＲ５、前記ＣＸＣＲ４または前記ＣＤ４が、広域中和抗体とタンデム化されている、請求項６または７に記載の改変された免疫細胞。
【請求項９】
前記広域中和抗体が、ＶＲＣ０１、ＰＧＴ１２１、３ＢＮＣ１１７または１０−１０７４である、請求項８に記載の改変された免疫細胞。
【請求項１０】
１または複数の共受容体（「１または複数のＣＯＲ」）をコードする１または複数の核酸をさらに含む、請求項６から９のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項１１】
前記ＣＲがキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項１２】
前記ＣＲ膜貫通ドメインがＣＤ８αに由来する、請求項１１に記載の改変された免疫細胞。
【請求項１３】
前記細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζに由来する、請求項１１に記載の改変された免疫細胞。
【請求項１４】
前記ＣＲがさらに細胞内ＣＲ共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項１５】
前記細胞内ＣＲ共刺激シグナル伝達ドメインが、４−１−ＢＢの細胞質ドメインを含む、請求項１４に記載の改変された免疫細胞。
【請求項１６】
前記ＣＲが細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含まない、請求項１から１０のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項１７】
前記ＣＲがキメラＴ細胞受容体（「ｃＴＣＲ」）である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項１８】
前記ＣＲ膜貫通ドメインが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３δからなる群から選択されるＴＣＲサブユニットの膜貫通ドメインに由来する、請求項１７に記載の改変された免疫細胞。
【請求項１９】
前記ＣＲ膜貫通ドメインが、前記ＣＤ３εの膜貫通ドメインに由来する、請求項１８に記載の改変された免疫細胞。
【請求項２０】
前記細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３δからなる群から選択されるＴＣＲサブユニットの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項２１】
前記細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインが、前記ＣＤ３εの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する、請求項２０に記載の改変された免疫細胞。
【請求項２２】
前記ＣＲ膜貫通ドメインおよび細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインが、同一または異なる前記ＴＣＲサブユニットに由来する、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項２３】
前記ＣＲがさらにＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインの一部を含む、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項２４】
前記ＣＲが、前記ＣＤ３εのＮ末端に融合した前記ＣＲ抗原結合ドメインを含む、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項２５】
前記ＣＲ標的抗原がＣＤ４である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項２６】
前記ＣＣＯＲ標的抗原がＣＤ４である、請求項１、請求項１に間接的に従属する請求項５、請求項６、請求項６に間接的に従属する請求項１０から２５のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項２７】
前記ＣＲ標的抗原がＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４であり、前記ＣＣＯＲ標的抗原がＣＤ４である、請求項１、請求項１に間接的に従属する請求項５、請求項６、請求項６に間接的に従属する請求項１０から２４および２６のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項２８】
前記ＣＲ標的抗原がＣＤ４であり、前記ＣＣＯＲ標的抗原がＣＣＲ５または前記ＣＸＣＲ４である、請求項１、請求項１に間接的に従属する請求項５、請求項６、請求項６に間接的に従属する請求項１０から２５のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項２９】
前記ＣＲ抗原結合ドメインまたは前記ＣＣＯＲ抗原結合ドメインが、ＣＤ４（ＣＤ４−Ｄ１）のドメイン１を特異的に認識する、請求項１または６に間接的に従属する請求項２５から２８のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項３０】
前記１または複数のＣＯＲが、ＣＸＣＲ５、α４β７およびＣＣＲ９からなる群から選択される、請求項５、請求項１０、請求項５または１０に間接的に従属する請求項１１から２９のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項３１】
前記１または複数のＣＯＲが、α４β７とＣＣＲ９の両方を含む、請求項３０に記載の改変された免疫細胞。
【請求項３２】
前記改変された免疫細胞が、前記細胞内のＣＣＲ５の発現を減少させるか、または排除するように改変されている、請求項１から３１のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項３３】
前記改変された免疫細胞が、抗ＨＩＶ抗体を発現するように改変されている、請求項１から３２のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項３４】
前記抗ＨＩＶ抗体が広域中和抗体である、請求項３３に記載の改変された免疫細胞。
【請求項３５】
前記広域中和抗体が、ＶＲＣ０１、ＰＧＴ１２１、３ＢＮＣ１１７または１０−１０７４である、請求項３４に記載の改変された免疫細胞。
【請求項３６】
前記ＣＲ抗原結合ドメインがｓｃＦｖまたはｓｄＡｂである、請求項１から３５のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項３７】
前記ＣＣＯＲ抗原結合ドメインがｓｃＦｖまたはｓｄＡｂである、請求項１、請求項１に間接的に従属する請求項３から５、請求項６、請求項６に間接的に従属する請求項８から３６のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項３８】
前記改変された免疫細胞が、細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、γδＴ細胞およびナチュラルキラーＴ細胞からなる群から選択される、請求項１から３７のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞。
【請求項３９】
請求項１から３７のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項４０】
前記医薬組成物が、請求項１から３８のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞の少なくとも２種類の異なるタイプを含む、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
請求項３９または４０に記載の医薬組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体の感染性疾患を治療する方法。
【請求項４２】
前記感染性疾患が、ＨＩＶおよびＨＴＬＶからなる群から選択されるウイルスによる感染性疾患である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記感染性疾患がＨＩＶである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
第２の抗感染剤を個体に投与する段階をさらに含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項３９または４０に記載の医薬組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体の癌を治療する方法。
【請求項４６】
前記癌がＴ細胞リンパ腫である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
第２の抗癌剤を個体に投与する段階をさらに含む、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記個体がヒトである、請求項４１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１から３８のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞を作製する方法であって、
ａ）免疫細胞の集団を提供する段階と、
ｂ）前記ＣＲをコードする第１の核酸を前記免疫細胞の集団に導入する段階と
を含む、方法。
【請求項５０】
ｃ）前記ＣＣＯＲをコードする第２の核酸を前記免疫細胞の集団に導入する段階
をさらに含む、請求項1に従属する請求項４９、請求項１に間接的に従属する請求項３から５に従属する請求項４９、請求項６に従属する請求項４９、請求項６に間接的に従属する請求項８から３８に従属する請求項４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
１または複数のＣＯＲをコードする１または複数の核酸を前記免疫細胞の集団に導入する段階をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１の核酸、前記第２の核酸、および／または前記ＣＯＲをコードする核酸を、ウイルスベクターを介して前記細胞に導入する、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはＨＩＶ融合阻害ペプチドをコードする核酸を前記免疫細胞の集団に導入する段階
をさらに含む、請求項４９から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞のＣＣＲ５遺伝子を不活化する段階
をさらに含む、請求項４９から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＣＣＲ５遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される方法を用いて不活化する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
個体の末梢血から前記免疫細胞の集団を得る段階
をさらに含む、請求項４９から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記免疫細胞の集団が、ＣＤ４＋細胞についてさらに富化されている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫細胞の集団が、ＣＤ８＋細胞についてさらに富化されている、請求項５６または５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、２０１８年７月１３日に出願されたＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０９５６５０、および２０１９年５月１６日に出願されたＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０８７２５９の優先権の利益を主張しており、各出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＨＩＶなどの感染性疾患の治療に有用な１または複数の改変された受容体を含む免疫細胞（例えばＴ細胞）に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞を媒介した免疫とは、抗原（Ａｇ）特異的なＴリンパ球を発達させて、ウイルス、細菌、寄生虫感染または悪性細胞を排除する適応プロセスである。
【０００４】
Ａｇに曝露されると、ナイーブＴ細胞は活性化されたエフェクターＴ細胞に成熟することになる。このプロセスは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面にＡｇが提示されることによって起こる。特に、Ａｇ（すなわち、ウイルス、細菌、寄生虫または悪性細胞）からの抗原性ペプチドは、ＡＰＣの表面に位置する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の一部としてＴ細胞に提示される。Ｔ細胞の表面に見られるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＭＨＣと結合し、結合したペプチドを認識する役割を担っている。このプロセスは、Ｔ細胞の活性化と下流の免疫応答をもたらすシグナル伝達を誘発する。
【０００５】
ＴＣＲに加えて、Ｔ細胞は、他の細胞表面受容体と、それらの機能解析に役割を果たすマーカーを保有している。例えば、ＣＤ８（ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞毒性またはキラーＴ細胞としても知られている）を示すＴ細胞は、悪性である細胞、ウイルスに感染している細胞、または他の損傷の徴候を示す細胞を標的とし、破壊する役割を担っている。ＣＤ４を示すＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞）は、一般的に他の免疫細胞の機能を助けることを特徴とする。ヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７を含むいくつかの更なるサブセットがある。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原応答およびＴ細胞を媒介した免疫において重要な役割を果たしているが、免疫系におけるＴ細胞だけではない。すなわち、他にも調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む様々なクラスがある。
【０００６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞はおそらく免疫系における最も重要な調整役を果たしており、Ｔ細胞を媒介した免疫とＢ細胞を媒介した免疫、つまり体液性免疫の両方で中心的な役割を果たしている。Ｔ細胞を媒介した免疫では、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化と成熟に役割を果たしている。Ｂ細胞を媒介した免疫では、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＢ細胞の増殖を刺激し、Ｂ細胞の抗体クラスの切り替えを誘導する役割を担っている。
【０００７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞が果たす中心的な役割はおそらくヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の結果に最もよく現れている。ウイルスはレトロウイルスであり、つまり、その遺伝情報をＲＮＡとして逆転写酵素と共に運び、これが宿主細胞に侵入したら、そのＲＮＡゲノムからＤＮＡの生成が可能になる。次いで、ＤＮＡは、感染した宿主細胞に取り込まれ得、その時点でウイルス遺伝子が転写され、より多くのウイルス粒子が生成され、感染した細胞によって放出される。
【０００８】
ＨＩＶはＣＤ４＋Ｔ細胞を優先的に標的としており、その結果、感染した患者の免疫系は、免疫系の主要な調整細胞の集団が減少するため、ますます悪化する。実際、ＨＩＶから後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）への進行は、患者のＣＤ４＋Ｔ細胞数によって示される。このウイルスによるＣＤ４＋Ｔ細胞の標的化は、日和見病原体を含む様々な病原体に対して、感染した患者が生産的な免疫応答を正常に行うことができない原因でもある。
【０００９】
ＨＩＶに対する最初の治療法であるジドブジン（ＺＤＶ）またはアジドチミジン（ＡＺＴ）は、１９８７年に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。この薬物は、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）に分類された。時が経つにつれて、ウイルスの突然変異により薬物が感染を抑制し続けることができなくなった結果、薬物の初期の成功率は低下した。その後、初期の抗ウイルス療法（ＡＲＴ）に代わって、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）が導入された。
【００１０】
１９９０年代半ばまでに、研究者や臨床家は、ＮＲＴＩとプロテアーゼ阻害剤の両方を含む併用治療の有用性を観察した。併用療法は今日も使用され続けており、患者が利用できる併用療法は多くある。一般に、併用療法は、２種のＮＲＴＩと、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＩＴ）、プロテアーゼ阻害剤またはインテグラーゼ阻害剤のいずれかとを組み合わせたものからなる。まとめると、現在、併用療法の一部として使用されている薬物は、侵入阻害剤、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤およびインテグラーゼ阻害剤の６つのクラスに分類されている。
【００１１】
様々な薬理学的クラスの薬物でウイルスを標的化することで、ウイルス抵抗性が妨げられ、感染した患者では有意な薬効が示されているが、完全な薬効を確保するためには患者の高いレベルのアドヒアランスが必要である。実際、ノンアドヒアランスの結果、薬物耐性株が出現する可能性があり、患者の疾患とそれに続く合併症の両方を効果的に管理し、治療することをさらに困難にする。
【００１２】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、特許出願および公開特許出願の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の概要
【００１３】
本出願は、一態様では、キメラ受容体（ＣＲ）であって、ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ＣＲ膜貫通ドメイン、および細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲ、ならびにキメラ共受容体（ＣＣＯＲ）であって、ＣＣＯＲ標的抗原を特異的に認識するＣＣＯＲ抗原結合ドメイン、ＣＣＯＲ膜貫通ドメイン、および細胞内ＣＣＯＲ共刺激ドメインを含む、ＣＣＯＲを含む、改変された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＲ標的抗原はＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＤ４である。いくつかの実施形態では、ＣＲ標的抗原はＣＤ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、１または複数の共受容体（ＣＯＲ）を含む。
【００１４】
一態様では、本発明は、ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ＣＲ膜貫通ドメイン、および細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むＣＲを含む改変された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ４からなる群から選択される。他の実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、１または複数のＣＯＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは、ＣＤ４結合部位、ＣＣＲ５結合部位、および抗ＨＩＶ抗体部位（例えば広域中和抗体（「ｂＮＡｂ」））のうちの少なくとも２つを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲは、ＣＤ４結合部位およびＣＣＲ５結合部位を含むタンデムＣＲである。いくつかの実施形態では、ＣＲは、ＣＤ４結合部位および抗ＨＩＶ抗体部位（例えばｂＮＡｂ部位）を含むタンデムＣＲである。いくつかの実施形態では、ＣＲは、ＣＣＲ５結合部位および抗ＨＩＶ抗体部位（例えばｂＮＡｂ部位）を含むタンデムＣＲである。ＣＤ４部位、ＣＣＲ５部位、および／またはｂＮＡｂ部位は、互いに直接連結されていてもよいし、リンカーを介して連結されていてもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＲをコードする第１の核酸、ならびにＣＣＯＲをコードする第２の核酸を含む改変された免疫細胞であって、ＣＲが、ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ＣＲ膜貫通ドメイン、および細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含み、ＣＣＯＲが、ＣＣＯＲ標的抗原を特異的に認識するＣＣＯＲ抗原結合ドメイン、ＣＣＯＲ膜貫通ドメイン、および細胞内ＣＣＯＲ共刺激シグナル伝達ドメインを含む、改変された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＲ標的抗原はＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＤ４である。いくつかの実施形態では、ＣＲ標的抗原はＣＤ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はさらに、１または複数のＣＯＲをコードする１または複数の核酸を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＲをコードする核酸を含む改変された免疫細胞であって、ＣＲが、ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ＣＲ膜貫通ドメイン、および細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、改変された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞はさらに、１または複数のＣＯＲをコードする１または複数の核酸を含む。
【００１７】
上記の実施形態のいくつかまたは複数に従ういくつかの実施形態では、ＣＲはさらに、細胞内ＣＲ共刺激ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＲは、細胞内共刺激ドメインを含まない。
【００１８】
上記の１または複数の任意の実施形態に従ういくつかの実施形態では、ＣＲをコードする核酸は、誘導性プロモーターの下にある。他の実施形態では、ＣＲをコードする核酸は、構成的に発現する。
【００１９】
上記の１または複数の任意の実施形態に従ういくつかの実施形態では、ＣＣＯＲおよび／またはＣＯＲをコードする核酸は、誘導性プロモーターの下にある。他の実施形態では、ＣＣＯＲおよび／またはＣＯＲをコードする核酸は、構成的に発現する。さらに他の実施形態では、ＣＣＯＲおよび／またはＣＯＲをコードする核酸は、免疫細胞の活性化時に誘導可能である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、同じベクター上にある。いくつかの実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、同じプロモーターの制御下にある。他の実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、異なるベクター上にある。
【００２１】
いくつかの実施形態では、１または複数のＣＯＲをコードする核酸は、第１の核酸と同じベクター上にある。いくつかの実施形態では、１または複数のＣＯＲをコードする核酸は、第２の核酸と同じベクター上にある。いくつかの実施形態では、１または複数のＣＯＲをコードする核酸と第１の核酸または第２の核酸とは、同じプロモーターの制御下にある。
【００２２】
上記の任意の実施形態に従ういくつかの実施形態では、ＣＲ標的抗原はＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＤ４である。他の実施形態では、ＣＲ標的抗原はＣＤ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４である。
【００２３】
上記の任意の実施形態に従ういくつかの実施形態では、１または複数のＣＯＲは、ＣＸＣＲ５、α４β７、およびＣＸＣＲ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１または複数のＣＯＲのうちの少なくとも１つは、ＣＸＣＲ５である。他の実施形態では、１または複数のＣＯＲのうちの少なくとも１つは、α４β７である。さらに他の実施形態では、１または複数のＣＯＲのうちの少なくとも１つは、ＣＣＲ９である。更なる実施形態では、１または複数のＣＯＲは、α４β７とＣＣＲ９の両方を含む。
【００２４】
上記の任意の実施形態に従ういくつかの実施形態では、免疫細胞は、細胞内のＣＣＲ５の発現を減少させるか、または排除するように修飾されている。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ  ＺＦＮ、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される方法を用いて不活化される。
【００２５】
上記の任意の実施形態に従ういくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、およびＣＲ標的抗原に特異的に結合するペプチドリガンドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインはｓｃＦｖまたはｓｄＡｂである。
【００２６】
上記の任意の実施形態に従ういくつかの実施形態では、ＣＣＯＲ抗原結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｃ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、およびＣＣＯＲ標的抗原に特異的に結合するペプチドリガンドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＣＯＲ抗原結合ドメインはｓｃＦｖまたはｓｄＡｂである。
【００２７】
上記の任意の実施形態に従ういくつかの実施形態では、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択される。
【００２８】
上記の１または複数の実施形態に従ういくつかの実施形態では、ＣＲまたはＣＣＯＲ共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ４０ＬＧ、ＩＴＧＢ２、ＫＬＲＣ２、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＡＶＣＲ１、ＬＧＡＬＳ９、ＣＤ８３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのうちの１または複数の共刺激ドメインからなる群から選択される。
【００２９】
上記の任意の実施形態に従ういくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、好酸球、マクロファージ、リンパ球細胞、およびマスト細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、およびナチュラルキラーＴ細胞から選択される。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の任意の実施形態の改変された免疫細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２種類の異なるタイプの改変された免疫細胞を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における感染性疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、感染性疾患は、ＨＩＶおよびＨＴＬＶからなる群から選択されるウイルスによる感染症である。いくつかの実施形態では、感染性疾患はＨＩＶである。
【００３２】
上記方法のいくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明はまた、免疫細胞の集団を提供する段階と、免疫細胞の集団にＣＲをコードする第１の核酸を導入する段階とを含む、改変された免疫細胞を作製する方法を提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＣＣＯＲをコードする第２の核酸は、免疫細胞の集団に導入される。いくつかの実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、細胞に同時に導入される。他の実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、細胞に順次導入される。いくつかの実施形態では、１または複数のＣＯＲをコードする１または複数の核酸は、免疫細胞の集団に導入される。いくつかの実施形態では、第１の核酸および第２の核酸ならびに／またはＣＯＲをコードする核酸は、ウイルスベクターを介して細胞に導入される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞を作製する方法はさらに、細胞のＣＣＲ５遺伝子を不活化する段階を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ  ＺＦＮ、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される方法を用いて不活化される。いくつかの実施形態では、免疫細胞の集団は、個体の末梢血から得られる。いくつかの実施形態では、免疫細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞がさらに富化されている。他の実施形態では、免疫細胞の集団は、ＣＤ８＋細胞がさらに富化されている。
【００３６】
特許出願および刊行物を含む、本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】抗ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４および抗ＣＤ４を含む、異なる抗原結合ドメインを有するいくつかの例示的な受容体分子の略図を示す。
【００３８】
【図２】例示的な一般抗原（図２のＢ）および特異性抗原（ＨＩＶ）（図２のＡ）を標的とするコンストラクト＋ＣＸＣＲ５発現の略図を示す。
【００３９】
【図３】例示的な一般抗原（図３のＢ）および特異性抗原（ＨＩＶ）（図３のＡ）を標的とするコンストラクト＋ＣＣＲ９およびα４β７の略図を示す。
【００４０】
【図４】例示的なＨＩＶを標的とするコンストラクト＋ＣＣＲ５遺伝子ノックアウトの略図を示す。
【００４１】
【図５】例示的なＨＩＶを標的とするコンストラクト＋ＣＣＲ９およびα４β７＋ＣＸＣＲ５＋ＣＣＲ５遺伝子ノックアウトの略図を示す。
【００４２】
【図６】抗ＣＤ４または抗ＣＣＲ５または抗ＣＸＣＲ４のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂ（図６のＡ）、または、タンデムに連結された抗ＣＤ４および抗ＣＣＲ５のｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ（図６のＢ）を含む例示的なＣＡＲコンストラクトの略図を示す。図６のＣは、ＨＩＶを認識する広域中和抗体にタンデムに連結された抗ＣＤ４または抗ＣＣＲ５のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂを含む例示的なＣＡＲコンストラクトの略図を示す。
【００４３】
【図７】異なるｓｃＦｖ配列を有するＣＡＲ−Ｔのインビトロスクリーニング結果を示す。図７のＡは、１４の抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔの相対的な標的殺傷効果を示す。図７のＢは、１６の抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔの相対的な標的殺傷効果を示す。図７のＣは、８の抗ＣＸＣＲ４細胞の相対的な標的殺傷効果を示す。
【００４４】
【図８】様々なコンストラクトのＣＡＲ発現を示す。図８のＡは、非形質導入Ｔ細胞と比較した抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３細胞におけるＣＡＲ発現を示し、図８のＢは、非形質導入Ｔ細胞と比較した抗ＣＣＲ５−ＣＡＲ−Ｔ  Ｎｏ．１３細胞におけるＣＡＲ発現を示し、図８のＣは、ＣＸＣＲ５を発現する抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現を示す。図８のＤは、ＣＸＣＲ５を発現する抗ＣＣＲ５−ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現を示し、図８のＥは、抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞、抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５タンデムＣＡＲ−ＣＸＣＲ５−Ｔ細胞、抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５タンデムＣＡＲ−ＣＸＣＲ５−Ｃ３４−Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現を示す。
【００４５】
【図９】抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３細胞のインビトロでの増殖を示す。５×１０５個の細胞を０日目にＣＡＲレンチウイルスで形質導入した。細胞を形質導入後４日目、６日目、および１０日目に計数した。
【００４６】
【図１０】図１０は、標的細胞に対する様々なＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性効果を示す。標的細胞としてＣＦＳＥ標識パンＴ細胞を使用した。図１０のＡは、抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３細胞を示し、図１０のＢは、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３細胞を示し、図１０のＣは、ＣＸＣＲ５を発現する抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞を示し、図１０のＤは、ＣＸＣＲ５を発現する抗ＣＣＲ５ＣＡＲ  Ｔ細胞を示し、図１０のＥは、抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５タンデムＣＡＲ  Ｔ細胞を示し、図１０のＦは、抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５タンデムＣＡＲ  Ｔ細胞と抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５タンデムＣＡＲ−ＣＸＣＲ５−Ｃ３４  Ｔ細胞との比較を示す。
【００４７】
【図１１】抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３細胞によるサイトカインの発現を示す。エフェクター抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３細胞を、標的細胞と２：１および０．５：１の比率で２４時間共培養した。細胞培養物から上清を回収し、上清中のサイトカインレベルをホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイで検出した。
【００４８】
【図１２】抗ＣＤ４もしくは抗ＣＣＲ５のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂ（図１２のＡ）、または、タンデムに連結された抗ＣＤ４および抗ＣＣＲ５のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂ（図１２のＢ）を含む例示的なｅＴＣＲの略図を示す。図１２のＣは、ＣＤ４  Ｎｏ．１３  ＣＡＲ−Ｔ、ＣＤ４−ｅＴＣＲ、ＣＤ４−ｅＴＣＲ  Ｎｏ．１１の相対的な標的細胞殺傷能力を示す。図１２のＤは、いくつかのＣＣＲ５−ｅＴＣＲ細胞の相対的な標的細胞殺傷能力を示す。
【００４９】
【図１３】ｅＴＣＲ  Ｔ細胞の特徴付けの結果を示す。図１３のＡは、抗ＣＤ４  ｅＴＣＲ−Ｔおよび抗ＣＣＲ５  ｅＴＣＲ−Ｔ細胞における形質導入された遺伝子発現の検出を示す。図１３のＢは、抗ＣＤ４  ｅＴＣＲ−Ｔ細胞によるサイトカインの発現を示す。エフェクター抗ＣＤ４  ｅＴＣＲ  Ｔ細胞を、標的細胞と２：１および０．５：１の比率で２４時間共培養する。細胞培養物から上清を回収し、上清中のサイトカインレベルをＨＴＲＦアッセイで検出した。図１３のＣは、インビトロでの抗ＣＤ４ｅＴＣＲ−Ｔ細胞の拡大増殖を示す。５×１０５個の細胞を０日目にｅＴＣＲレンチウイルスで形質導入した。細胞を形質導入後４日目、６日目、および１０日目に計数した。
【００５０】
【図１４】抗ＣＤ４および抗ＣＣＲ５  ｅＴＣＲ−Ｔ細胞の細胞毒性効果を示す。抗ＣＤ４  ｅＴＣＲ  Ｔ細胞、抗ＣＣＲ５−ｅＴＣＲ  Ｔ細胞、または対照ＵｎＴ細胞を、ＣＦＳＥ標識初代Ｔ細胞と２：１の比率で２４時間共培養する。ＣＦＳＥ＋細胞中のＣＤ４＋％（Ａ）またはＣＣＲ５＋％（Ｂ）をフローサイトメトリーで記録した。
【００５１】
【図１５】抗ＣＤ４もしくは抗ＣＣＲ５のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂ（図１５のＡおよび図１５のＣ）、または、タンデムに連結された抗ＣＤ４および抗ＣＣＲ５のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂ（図１５のＢおよび図１５のＤ）を含む例示的なＣＡＲまたはｅＴＣＲの略図を示す。ＣＡＲ  Ｔ細胞またはｅＴＣＲ  Ｔ細胞はさらに、ＣＸＣＲ５を発現する。
【００５２】
【図１６】ＣＤ４−ＣＡＲＴ−ＣＸＣＲ５細胞およびＣＣＲ５−ＣＡＲＴ−ＣＸＣＲ５細胞におけるＣＸＣＲ５の発現を示す。
【００５３】
【図１７】抗ＣＤ４もしくは抗ＣＣＲ５のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂ（図１７のＡおよび図１７のＣ）、または、タンデムに連結された抗ＣＤ４および抗ＣＣＲ５のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂ（図１７のＢおよび図１７のＤ）を含む例示的なＣＡＲまたはｅＴＣＲの略図を示す。ＣＡＲ  Ｔ細胞またはｅＴＣＲ  Ｔ細胞はさらに、ＣＸＣＲ５および広域中和抗体を発現する。
【００５４】
【図１８】ウイルス負荷を制御する抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ細胞の効果を示す。図１８のＡ：抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３細胞を、ウイルスを含まない標的細胞またはＨＩＶ偽ウイルス感染標的細胞と１：１の比率で２４時間共培養した。抗ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ（配列番号７７）細胞を対照ＣＡＲ−Ｔとして使用した。残量の標的細胞をリアルタイムＰＣＲで検出した。図１８のＢ：抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３細胞または非形質導入Ｔ細胞を、ＥＧＦＰ＋偽感染標的細胞と指示比率で２４時間共培養した。ＥＧＦＰ＋標的細胞をフローサイトメトリーで検出した。
【００５５】
【図１９】シミアン／ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）感染を制御するためのＣＡＲ−Ｔ効果を示す。アカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞をサル末梢血から精製し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで４日間活性化した後、ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３でチャレンジする。ＳＨＩＶ感染細胞を標的細胞として使用し、抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３、抗ＣＣＲ５−ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３、タンデム抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞と３日間共培養する。図１９のＡは、細胞内染色によるウイルスｐ２７抗原の存在を示す。図１９のＢは、細胞培養上清中のウイルスＲＮＡレベル、およびゲノムＤＮＡ中の統合ＤＮＡレベルを示す。
【００５６】
【図２０】抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３細胞がＴ細胞リンパ腫細胞株（ＳｕｐＴ１およびＨＨ）を用量依存的に死滅させたことを示す。
【００５７】
【図２１】抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３細胞のインビボ効力を示し、ＣＤＸマウスを３つの群に分け、群１のマウスにはＨＢＳＳ、群２のマウスには対照ｕｎＴ細胞、群３のマウスには抗ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３による治療を行った。図２１のＡは、腫瘍体積を示す。図２１のＢは、治療後のマウスの体重を示す。
【００５８】
【図２２】Ｔ細胞表面上でのスプリットシグナルＣＡＲコンストラクトの発現を示す。ｓｓＣＣＲ５ＣＤ４−ＣＡＲ−Ｔ細胞では、抗ＣＣＲ５部位がＨＡタグおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインに連結されており、抗ＣＤ４部位がＭｙｃタグおよび細胞内共刺激ドメインに連結されている。ｓｓＣＤ４ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞では、抗ＣＤ４部位がＨＡタグおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインに連結されており、抗ＣＣＲ５部位がＭｙｃタグおよび細胞内共刺激ドメインに連結されている。２つの部位はＰ２Ａで連結されている。ＵＮＴは非形質導入Ｔ細胞を表す。この図において、Ｍｙｃタグの発現は、スプリットシグナルＣＡＲ系の発現を代表するものとして示された。図２２のＢは、コンストラクトの細胞毒性効果を示す。ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＵＮＴ細胞を、ＣＦＳＥ標識標的細胞と０．５：１の比率で２４時間共培養した。
【００５９】
【図２３】ＣＡＲ−Ｔ療法のインビボ効果を示す。図２３のＡは、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ  Ｔ  Ｎｏ．１３細胞で治療したＨＩＳマウスにおける異なる時点でのＣＣＲ５＋細胞のパーセンテージを示す。図２３のＢは、タンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞で治療したＨＩＳマウスにおけるＣＣＲ５＋細胞のパーセンテージを示す。図２３のＣは、タンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞で治療したＨＩＳマウスにおけるＣＤ４＋細胞のパーセンテージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本出願は、ＣＣＲ５（またはＣＸＣＲ４）およびＣＤ４のうちのいずれか１つから選択されるＣＲ標的抗原を特異的に認識するキメラ受容体（「ＣＲ」）、ならびに免疫細胞を活性化することができる細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを発現する免疫細胞（例えばＴ細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＲが共刺激ドメインを含まない場合、ＣＲは、ＣＣＯＲ共刺激ドメインを含み、ＣＣＲ５（もしくはＣＸＣＲ４）またはＣＤ４（ＣＣＯＲ標的抗原）のうちの他方を特異的に認識するキメラ共受容体（「ＣＣＯＲ」）と共発現させることができる。このように、ＣＣＯＲは、ＣＣＯＲ標的抗原の結合時に必要な共刺激を提供することで、ＣＲ標的抗原とＣＣＯＲ標的抗原の両方が存在し、免疫細胞に認識された場合にのみ免疫細胞が活性化されるようにする。免疫細胞はさらに、１または複数の共受容体（「ＣＯＲ」）、例えば、濾胞（ＣＸＣＲ５受容体）および腸管（α４β７受容体またはＣＣＲ９受容体）などの所望の位置への免疫細胞の遊走を容易にする共受容体をさらに発現することができる。加えて、免疫細胞をさらに改変して、ＣＣＲ５受容体の発現を減少させるか、またはノックアウトすることで、免疫細胞（例えばＣＤ４＋免疫細胞）のウイルス感染に対する抵抗性を高めることができる。
【００６１】
したがって、本発明の一態様では、ＣＲおよびＣＣＯＲを含む免疫細胞が提供される。別の態様では、ＣＲおよびＣＯＲを含む免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＲ、ＣＣＯＲ、および１または複数のＣＯＲを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞をさらに修飾して、ＣＣＲ５の発現が減少されるか、またはノックアウトされる。
【００６２】
また、免疫細胞におけるＣＲ、ＣＣＯＲ、および／またはＣＯＲを発現する核酸系も提供される。
【００６３】
また、治療目的のための改変された免疫細胞の作製方法および使用方法、ならびにそのような方法に有用なキットおよび製造物品も提供される。
定義
【００６４】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限りにおいて抗体フラグメントを対象に含める。
【００６５】
本明細書では、「ネイティブ型抗体」、「完全長抗体」、「インタクト抗体」および「全抗体」という用語は、以下に定義されるような抗体フラグメントではなく、実質的にインタクトな形態の抗体を指すために互換的に使用される。これらの用語は、特に、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。ネイティブ型抗体は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１個のジスルフィド共有結合によって重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖と軽鎖はまた、規則的な間隔で鎖内ジスルフィド橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続けて複数の定常ドメインがある。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有し、すなわち、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並んでおり、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界面を形成していると考えられている。
【００６６】
「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含む免疫グロブリンの他の部分である可変ドメインと比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（総称してＣＨ）と、軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインとを含む。
【００６７】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼ばれることがある。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼ばれることがある。これらのドメインは、一般的に抗体の最も可変的な部分であり、抗原結合部位を含む。
【００６８】
「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列が広範囲に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性に使用されているという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方で高頻度可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブ型の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主にβシート配置をとり、３つのＨＶＲによって接続された４つのＦＲ領域を含み、当該４つのＦＲ領域はβシート構造を接続、場合によっては一部を形成するループを形成している。各鎖におけるＨＶＲは、ＦＲ領域によって他の鎖からのＨＶＲと共に極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
【００６９】
任意の哺乳動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）およびラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに分類することができる。
【００７０】
本明細書で使用される用語ＩｇＧ「アイソタイプ」または「サブクラス」は、それらの定常領域の化学的および抗原性特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。
【００７１】
抗体（免疫グロブリン）は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのクラスいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に区別することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、γ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知であり、一般的には、例えば、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，２０００）に記載されている。抗体は、抗体と１つもしくは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成される、より大きな融合分子の一部であってもよい。
【００７２】
本明細書では、「完全長抗体」、「インタクト抗体」および「全抗体」という用語は、以下に定義されるような抗体フラグメントではなく、実質的にインタクトな形態の抗体を指すために互換的に使用される。これらの用語は、特に、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００７３】
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部を含み、好ましくは、その抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体フラグメントは、抗原結合フラグメントである。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００７４】
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Ｆｃ」フラグメントとが生成される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋することができるＦ（ａｂ'）２フラグメントが生じる。
【００７５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。一実施形態では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合性会合で１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種のものと類似した「二量体」構造で会合することができるように、柔軟性のあるペプチドリンカーによって共有結合され得る。この配置では、各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定する。集合的に、６つのＨＶＲは抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりもアフィニティーは低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００７６】
Ｆａｂフラグメントは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含むほか、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ'フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１または複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端の数個の残基が付加されているという点でＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ'−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ'についての本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ'）２抗体フラグメントは、元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ'フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
【００７７】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、１本鎖ポリペプチド中に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドはさらに、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９４．２６９−３１５を参照されたい。
【００７８】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと強制的に対形成して、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディは、二価または二重特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第１９９３／１０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されている。トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【００７９】
「重鎖のみの抗体」または「ＨＣＡｂ」という用語は、重鎖を含むが、通常であれば抗体に見られる軽鎖を欠いた機能性抗体を指す。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、またはアルパカ）は、ＨＣＡｂを生成することが知られている。
【００８０】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントを指す。場合によっては、単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物のＨＣＡｂから改変され、そのようなｓｄＡｂは、本明細書では「ナノボディ」または「ＶＨＨｓ」と呼ばれる。ラクダ科動物のｓｄＡｂは、既知の最小の抗原結合抗体フラグメントのうちの１つである（例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８−７３（１９９５）；Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ−Ｇｈａｓｓａｂｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），８：１０１３−２６（２０１３）を参照されたい）。
【００８１】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在する可能性のある突然変異、例えば、自然発生の突然変異を除いて同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の性質が別々の抗体の混合物ではないことを示す。特定の実施形態では、そのようなモノクローナル抗体としては、典型的には、標的を結合するポリペプチド配列を含む抗体が挙げられ、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られる。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなど、複数のクローンの中からユニークなクローンを選択することであり得る。選択された標的結合配列はさらに、例えば、標的に対するアフィニティーを向上させるため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養での生産を向上させるため、インビボでの免疫原性を低下させるため、多重特異性抗体を作製するためなどに改変させることができ、改変された標的結合配列を含む抗体は、本発明のモノクローナル抗体であることも理解されるべきである。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して指向された異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向されている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には、他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。
【００８２】
「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の性質を示しており、抗体を任意の特定の方法で生産しなければならないと解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、様々な技術、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １４（３）：２５３−２６０（１９９５），Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版  １９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）を参照されたい）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９ー３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）を参照されたい）、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部もしくは全部を有する動物においてヒト抗体またはヒト様抗体を産生するための技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；国際公開第１９９６／３４０９６号；国際公開第１９９６／３３７３５号；国際公開第１９９１／１０７４１号；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；および同第５，６６１，０１６号明細書；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照された）をはじめとする技術によって作製することができる。
【００８３】
本明細書でのモノクローナル抗体としては、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖の残りの部分が、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物学的活性を示す限りにおいて、そのような抗体のフラグメントが挙げられる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照されたい）。キメラ抗体としては、抗体の抗原結合領域が、例えば、目的の抗原でマカクザルを免疫することによって産生された抗体に由来する、ＰＲＩＭＡＴＴＺＥＤ（登録商標）抗体が挙げられる。
【００８４】
「非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲからの残基が、所望の特異性、アフィニティー、および／またはキャパシティを有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲからの残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに向上させるために行うことができる。一般に、ヒト化抗体は、高頻度可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。更なる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。例えば、ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）；ならびに米国特許第６，９８２，３２１号明細書および同第７，０８７，４０９号明細書も参照されたい。
【００８５】
「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生された抗体のものに対応し、かつ／または本明細書に開示されているようなヒト抗体を作製するための任意の技術を使用して作製されアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義では、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は除外されている。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野で知られている様々な技術を用いて産生することができる。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）。ヒトモノクローナル抗体の調製のために、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載されている方法も利用可能である。ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば免疫されたキセノマウスに抗原を投与することによって調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号明細書および同第６，１５０，５８４号明細書を参照されたい）。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体に関するＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：３５５７−３５６２（２００６）も参照されたい。
【００８６】
本明細書で使用される「結合する」、「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、生体分子を含む分子の異種集団の存在下での標的の存在を決定づける、標的と抗体との間の結合などの測定可能で再現可能な相互作用を指す。例えば、ある標的（エピトープであってもよい）に結合する、または特異的に結合する抗体は、他の標的に結合する抗体よりも、より高いアフィニティー、アビディティーで、より容易に、かつ／または、より長い期間で、この標的に結合する抗体である。一実施形態では、無関係な標的への抗体の結合の程度は、例えば、放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって測定して、標的への抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、標的に特異的に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施形態では、抗体は、異なる種のタンパク質間で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、特異的結合には、排他的結合が含まれ得るが、必須ではない。
【００８７】
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、Ｔ細胞などの細胞上に１または複数の抗原特異性をグラフトする遺伝子改変された受容体を指す。ＣＡＲは、「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」としても知られている。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原に特異的な抗体の細胞外可変ドメイン、およびＴ細胞または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば１または複数の共刺激ドメインを含む。「ＣＡＲ−Ｔ」とは、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指す。
【００８８】
本明細書で使用される「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」とは、ＭＨＣ分子に結合した特異的抗原性ペプチドに結合する細胞外抗原結合ドメインを含む内因性または組換えＴ細胞受容体を指す。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲαポリペプチド鎖およびＴＣＲβポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは腫瘍抗原を特異的に結合する。
【００８９】
「組換え」という用語は、（１）その自然発生の環境から除外されているか、（２）その遺伝子が自然界で見出されるポリヌクレオチドの全部もしくは一部と関連していないか、（３）自然界において連結されていないポリヌクレオチドに作用可能に連結されているか、または（４）自然界に存在しない、生体分子、例えば遺伝子またはタンパク質を指す。「組換え」という用語は、クローン化されたＤＮＡ分離株、化学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、ならびにそのような核酸によってコードされたタンパク質および／またはｍＲＮＡに関連して使用することができる。
【００９０】
「発現する」という用語は、核酸をタンパク質に翻訳することを指す。タンパク質は、発現して細胞内にとどまったり、細胞表面膜の構成要素となったり、または細胞外マトリックスもしくは培地に分泌されたりすることがある。
【００９１】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターの複製または発現をサポートすることができる細胞を指す。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞であってもよいし、酵母、昆虫細胞、両生類細胞、または哺乳動物細胞などの真核細胞であってもよい。
【００９２】
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入れるかまたは導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞とは、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞をいう。
【００９３】
「インビボで（ｉｎ  ｖｉｖｏ）」という用語は、細胞が得られる生物の体内を指す。「エクスビボで（Ｅｘ  ｖｉｖｏ）」または「インビトロで（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」とは、細胞が得られる生物の体外であることを意味する。
【００９４】
「細胞」という用語には、初代対象細胞とその子孫が含まれる。
【００９５】
ＣＤ３を発現する細胞に関連して本明細書で使用される「活性化」とは、細胞増殖およびサイトカイン産生を含むがこれらに限定されないＣＤ３シグナル伝達経路の下流エフェクター機能の検出可能な増加を誘導するために十分に刺激された細胞の状態を指す。
【００９６】
タンパク質の一部を指す場合の「ドメイン」という用語は、タンパク質を構成する１つもしくは複数のポリペプチドの構造的および／または機能的に関連する部分を含むことを意味する。例えば、二量体受容体の膜貫通ドメインは、膜全体に広がる受容体の各ポリペプチド鎖の部分を指してもよい。ドメインはまた、１本鎖ポリペプチドの関連部分を指してもよい。例えば、単量体受容体の膜貫通ドメインは、膜全体に広がる受容体の１本鎖ポリペプチドの部分を指してもよい。ドメインはまた、ポリペプチドの単一部分のみを含んでいてもよい。
【００９７】
本明細書で使用される「単離された核酸」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成由来の核酸、またはそれらのいくつかの組み合わせた核酸を意味することが意図されており、その由来によって、「単離された核酸」は、（１）その「単離された核酸」が自然界で見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と関連していないか、（２）自然界において連結されていないポリヌクレオチドに作用可能に連結されているか、または（３）より大きな配列の一部として自然界に存在していない、ということである。
【００９８】
特に定めのない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮重したタイプのものである、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはＲＮＡをコードするフレーズヌクレオチド配列はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのタイプでイントロンを含むことができる範囲でイントロンを含んでいてもよい。
【００９９】
「作用可能に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結が後者の発現をもたらすことを指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関連して配置されている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作用可能に連結されている。例として、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、コード配列に作用可能に連結されている。一般的に、作用可能に連結されたＤＮＡ配列は、連続しており、必要に応じて、同じリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域をつなぐ。
【０１００】
「誘導性プロモーター」という用語は、１または複数の特定のシグナルの付加または除去によって活性を調節することができるプロモーターを指す。例えば、誘導性プロモーターは、作用可能に連結された核酸の転写を特定の一連の条件下で、例えば、誘発剤の存在下で、またはプロモーターを活性化し、かつ／もしくはプロモーターの抑制を緩和する条件の下で活性化してもよい。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」は、臨床結果を含む有益な結果または所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、以下のうちの１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない：疾患に起因する１つもしくは複数の症状の緩和、疾患の程度の低下、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の防止もしくは遅延）、疾患の広がり（例えば、転移）の防止もしくは遅延、疾患の再発の防止もしくは遅延、疾患の進行の遅延もしくは減速、疾患の寛解（部分的または全体的）の提供、病態の改善、疾患の寛解（部分的もしくは全体的）の提供、疾患の治療に必要な１つもしくは複数の他の薬剤の用量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質を増加もしくは改善、体重増加の増大、および／または生存期間の延長。また、疾患の病理学的帰結（例えば、癌の腫瘍体積など）の減少も「治療」に包含される。本発明の方法は、治療のこれらの態様のうちのいずれか１つまたは複数を企図する。
【０１０２】
「治療上有効な量」という用語は、本明細書に開示されているように、個体の疾患または障害を「治療する」のに有効な組成物の量を指す。感染性疾患の場合には、患者の状態を改善することができる組成物を含む組成物の治療上有効な量である。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」または「薬理学的に適合性がある」とは、生物学的または他の点で望ましくないわけではない材料を意味し、例えば、その材料は、いかなる重大な望ましくない生物学的作用も引き起こしたりせず、またはそれが含まれる組成物の他の成分のいずれとも有害に相互作用したりせずに、患者に投与される医薬組成物に組み込まれてもよい。薬学的に許容される担体または医薬品添加剤は、好ましくは、毒性試験および製造試験の要求される基準を満たしており、かつ／または米国食品医薬品局によって作成された不活性成分ガイドに含まれている。
【０１０４】
治療の目的のための「対象」または「個体」とは、哺乳動物に分類される任意の動物であって、ヒト、家畜および有用動物、動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む動物を指す。
【０１０５】
本明細書に記載される本発明の実施形態は、「〜からなる」および／または「本質的に〜からなる」実施形態を含むことが理解される。
【０１０６】
本明細書での「約」の付いた値またはパラメーターのへの言及は、その値またはパラメーター自体に向けられた変動を含み（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」に言及した説明には、「Ｘ」についての説明が含まれている。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、値またはパラメーター「でない」という言及は、一般的に、値またはパラメーター「以外」を意味し、記載する。例えば、方法がＸ型の癌を治療するために使用されないということは、この方法がＸ型以外の癌を治療するために使用されることを意味する。
【０１０８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ｏｒ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明記されていない限り、複数の指示対象を含む。
共受容体システム
【０１０９】
本発明は、いくつかの実施形態では、キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲを含む、改変された免疫細胞が提供され、ここで、ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体（「ＣＲ」）であって、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体（「ＣＲ」）をコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供され、ここで、ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ４からなる群から選択される。
【０１１０】
いくつかの状況下では、ＣＲシグナル伝達ドメインを介して生成されたシグナルだけでは免疫細胞の完全な活性化には不十分であり、二次的または共刺激性のシグナルも必要とされる。したがって、いくつかの実施形態では、免疫細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞内シグナル伝達配列、すなわち、ＣＲ（例えば細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインのシグナル伝達配列）を介して抗原依存性の初代活性化を開始するものと、二次的または共刺激性のシグナル（本明細書では「共刺激シグナル伝達配列」と呼ばれる）を提供するものとによって媒介される。共刺激シグナル伝達配列は、ＣＲに存在し得る。言い換えれば、ＣＲはさらに、ＣＲ共刺激ドメインを含み得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達配列は、共受容体によって提供される。特に、いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲ、ならびにｂ）キメラ共受容体（ＣＣＯＲ）であって、ｉ）ＣＣＯＲ標的抗原を特異的に認識するＣＣＯＲ標的抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＣＯＲ共刺激ドメインを含む、ＣＣＯＲを含む、改変された免疫細胞が提供され、ここで、ＣＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＤ４であるか、またはＣＲ標的抗原はＣＤ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４である。いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする第１の核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、第１の核酸、ならびにｂ）キメラ共受容体（ＣＣＯＲ）をコードする第２の核酸であって、ＣＣＯＲは、ｉ）ＣＣＯＲ標的抗原を特異的に認識するＣＣＯＲ標的抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＣＯＲ共刺激ドメインを含む、第２の核酸を含む、改変された免疫細胞が提供され、ここで、ＣＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＤ４であるか、またはＣＲ標的抗原はＣＤ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４である。いくつかの実施形態では、ＣＲおよびＣＣＯＲは、核酸から発現され、免疫細胞表面に局在する。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＲは共刺激ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞のＣＣＲ５の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の内因性ＴＣＲサブユニットの１つもしくは両方の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。遺伝子発現をかく乱するための細胞の修飾としては、例えば、ＲＮＡ干渉（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−またはＴＡＬＥＮベースの遺伝子ノックアウト）などを含む、当該技術分野で知られている任意のそのような技術が挙げられる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、１または複数の共受容体をさらに含むように改変されている。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲ、ならびにｂ）ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される共受容体（ＣＯＲ）を含む、改変された免疫細胞が提供され、ここで、ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）細胞内ＣＲ共刺激ドメイン、およびｉｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲ、ならびにｂ）ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される共受容体（ＣＯＲ）を含む、改変された免疫細胞が提供され、ここで、ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、α４β７とＣＣＲ９の両方を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＸＣＲ５、α４β７、およびＣＣＲ９のすべてを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞のＣＣＲ５の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の内因性ＴＣＲサブユニットの１つもしくは両方の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸、ならびにｂ）共受容体（ＣＯＲ）をコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供され、ここで、ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ４からなる群から選択され、ＣＯＲは、ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）細胞内ＣＲ共刺激ドメイン、およびｉｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸、ならびにｂ）共受容体（ＣＯＲ）をコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供され、ここで、ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ４からなる群から選択され、ＣＯＲは、ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、α４β７をコードする核酸およびＣＣＲ９をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＸＣＲ５をコードする核酸、α４β７をコードする核酸、およびＣＣＲ９をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲおよびＣＯＲは、核酸から発現され、免疫細胞表面に局在する。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞のＣＣＲ５の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の内因性ＴＣＲサブユニットの１つもしくは両方の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸、ならびにｂ）共受容体（ＣＯＲ）をコードする核酸であって、ＣＯＲは、ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）細胞内ＣＲ共刺激ドメイン、およびｉｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸、ならびにｂ）共受容体（ＣＯＲ）をコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供され、ここで、ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ４からなる群から選択され、ＣＯＲは、ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位とＣＣＲ５結合部位とはタンデムに連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、抗ＣＣＲ５部位のＮ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、抗ＣＣＲ５部位のＣ末端側にある。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、α４β７をコードする核酸およびＣＣＲ９をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＸＣＲ５をコードする核酸、α４β７をコードする核酸、およびＣＣＲ９をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲおよびＣＯＲは、核酸から発現され、免疫細胞表面に局在する。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞のＣＣＲ５の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の内因性ＴＣＲサブユニットの１つもしくは両方の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）および広域中和抗体（「ｂＮＡｂ」）部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸、ならびにｂ）共受容体（ＣＯＲ）をコードする核酸であって、ＣＯＲは、ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）および広域中和抗体（「ｂＮＡｂ」）部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲ共刺激ドメイン、およびｉｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸、ならびにｂ）共受容体（ＣＯＲ）をコードする核酸であって、ＣＯＲは、ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位とｂＮＡｂ部位とはタンデムに連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ｂＮＡｂ部位のＮ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ｂＮＡｂ部位のＣ末端側にある。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、α４β７をコードする核酸およびＣＣＲ９をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＸＣＲ５をコードする核酸、α４β７をコードする核酸、およびＣＣＲ９をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲおよびＣＯＲは、核酸から発現され、免疫細胞表面に局在する。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞のＣＣＲ５の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の内因性ＴＣＲサブユニットの１つもしくは両方の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）および広域中和抗体（「ｂＮＡｂ」）部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸、ならびにｂ）共受容体（ＣＯＲ）をコードする核酸であって、ＣＯＲは、ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）および広域中和抗体（「ｂＮＡｂ」）部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲ共刺激ドメイン、およびｉｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸、ならびにｂ）共受容体（ＣＯＲ）をコードする核酸であって、ＣＯＲは、ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５結合部位とｂＮＡｂ部位とはタンデムに連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５結合部位は、ｂＮＡｂ部位のＮ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５結合部位は、ｂＮＡｂ部位のＣ末端側にある。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、α４β７をコードする核酸およびＣＣＲ９をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＸＣＲ５をコードする核酸、α４β７をコードする核酸、およびＣＣＲ９をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲおよびＣＯＲは、核酸から発現され、免疫細胞表面に局在する。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞のＣＣＲ５の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の内因性ＴＣＲサブユニットの１つもしくは両方の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載される１または複数のＣＲ、ＣＣＯＲ、およびＣＯＲを発現するように改変されている。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲ、ｂ）キメラ共受容体（ＣＣＯＲ）であって、ｉ）ＣＣＯＲ標的抗原を特異的に認識するＣＣＯＲ標的抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＣＯＲ共刺激ドメインを含む、ＣＣＯＲ、ならびにｃ）共受容体（ＣＯＲ）を含む、改変された免疫細胞が提供され、ここで、ＣＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＤ４であるか、またはＣＲ標的抗原はＣＤ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４である。いくつかの実施形態では、ＣＯＲは、ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、α４β７とＣＣＲ９の両方を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＸＣＲ５、α４β７、およびＣＣＲ９のすべてを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲは、ＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞のＣＣＲ５の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の内因性ＴＣＲサブユニットの１つもしくは両方の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする第１の核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、第１の核酸、ｂ）キメラ共受容体（ＣＣＯＲ）をコードする第２の核酸であって、ＣＣＯＲは、ｉ）ＣＣＯＲ標的抗原を特異的に認識するＣＣＯＲ標的抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＣＯＲ共刺激ドメインを含む、第２の核酸、ならびにｃ）共受容体（ＣＯＲ）をコードする第３の核酸を含む、改変された免疫細胞が提供され、ここで、ＣＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＤ４であるか、またはＣＲ標的抗原はＣＤ４であり、ＣＣＯＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４である。いくつかの実施形態では、ＣＯＲは、ＣＸＣＲ５、α４β７、ＣＣＲ９、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、α４β７をコードする核酸およびＣＣＲ９をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＸＣＲ５をコードする核酸、α４β７をコードする核酸、およびＣＣＲ９をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲ、ＣＣＯＲ、およびＣＯＲは、核酸から発現され、免疫細胞表面に局在する。いくつかの実施形態では、ＣＲは、ＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞のＣＣＲ５の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の内因性ＴＣＲサブユニットの１つもしくは両方の発現をブロックするか、または減少させるように修飾されている。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＣＲをコードする核酸配列、ＣＣＯＲをコードする核酸配列、および／またはＣＯＲをコードする核酸配列を含む核酸が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＲ、ＣＣＯＲ、およびＣＯＲ核酸配列は、それぞれ異なるベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、核酸配列の一部または全部が同じベクターに含まれる。ベクターは、例えば、哺乳動物発現ベクターおよびウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスに由来するもの）からなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、１または複数のベクターは、免疫細胞の宿主ゲノムに組み込まれている。いくつかの実施形態では、ＣＲ、ＣＣＯＲ、および／またはＣＯＲ核酸配列は、それぞれ異なるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、プロモーターは同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、プロモーターは異なる配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列の一部または全部が単一のプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、プロモーターの一部または全部が誘導可能である。例えば、ＣＣＯＲおよびＣＯＲ核酸は、免疫細胞の活性化時に誘導可能なプロモーターの制御下にあることができる。いくつかの実施形態では、プロモーターの一部または全部が構成的である。
【０１２０】
上記の任意の実施形態に従ういくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、好酸球、マクロファージ、リンパ球細胞、およびマスト細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、およびナチュラルキラーＴ細胞から選択される。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＤ４発現のために富化されている。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＤ８発現のために富化されている。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、初代免疫細胞に由来する。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、免疫活性を有するように人工的に誘導された細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）に由来する。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＤ４＋免疫細胞（またはＣＤ４発現のために富化された免疫細胞）に由来する。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＤ８＋免疫細胞（またはＣＤ８発現のために富化された免疫細胞）に由来する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ＣＲ、ＣＣＯＲ、およびＣＯＲをコードする２つ以上の核酸が単一のプロモーターの制御下にある場合には、核酸は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および２Ａ自己切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ）をコードする核酸からなる群から選択されるリンカーを介して連結することができる。
キメラ受容体（ＣＲ）コンストラクト
【０１２３】
本明細書に記載されるＣＲは、ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ＣＲ膜貫通ドメイン、および細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは、ＣＲ膜貫通ドメインに直接または間接的に融合されている。例えば、ＣＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＲ抗原結合ドメイン、ＣＲ膜貫通ドメイン、およびＣＲ細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一のポリペプチドであり得る。ＣＲ抗原結合ドメイン、ＣＲ膜貫通ドメイン、およびＣＲ細胞内ドメインは、互いに直接融合していてもよいし、リンカー配列を介して間接的に融合していてもよい。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは、ＣＲ膜貫通ドメインを含むポリペプチドに非共有結合的に結合している。これは、例えば、結合対の２つのメンバーを使用することによって達成することができ、一方のドメインはＣＲ抗原結合ドメインに融合（例えば、ＣＲ抗体結合ドメインのＣ末端に融合）しており、他方のドメインはＣＲ膜貫通ドメインに融合（例えば、ＣＲ膜貫通ドメインのＮ末端に融合）している。この２つの構成要素は、結合対の２つのメンバーの相互作用によって一つにされる。例えば、ＣＲは、ｉ）ＣＲ抗原結合ドメインおよび結合対の第１のメンバーを含む第１のポリペプチド、ならびにｉｉ）結合対の第２のメンバーを含む第２のポリペプチドを含む、細胞外ドメインを含むことができ、ここで、第１のメンバーと第２のメンバーとは互いに非共有結合的に結合している。結合対の第１のメンバーは、ＣＲ抗原結合ドメインに直接または間接的に融合され得る。類似して、結合対の第２のメンバーは、ＣＲ膜貫通ドメインに直接または間接的に融合され得る。適切な結合対としては、ロイシンジッパー、ビオチン／ストレプトアビジン、ＭＩＣリガンド／ｉＮＫＧ２Ｄなどが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｅｌｌ  １７３，１４２６−１４３８，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１８；７（１）：ｅ１３６８６０４，米国特許第１０２５９８５８Ｂ２号明細書を参照されたい。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは２つ以上の抗原結合ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは、タンデムに連結されたＣＤ４結合部位とＣＣＲ５結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは、タンデムに連結されたＣＤ４結合部位とｂＮＡｂ部位とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは、タンデムに連結されたＣＣＲ５結合部位とｂＮＡｂ部位とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位、ＣＣＲ５結合部位、および／またはｂＮＡｂ部位は、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂからなる群から選択される。
【０１２７】
いくつかの実施形態における細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインは、機能的な初代免疫細胞シグナル伝達配列を含み、これには、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるタンパク質中に見出されるものが含まれるが、これらに限定されない。「機能的な」初代免疫細胞シグナル伝達配列は、適切な受容体に作用可能に結合された場合に、免疫細胞活性化シグナルを変換することができる配列である。「非機能的な」初代免疫細胞シグナル伝達配列は、一次免疫細胞シグナル伝達配列のフラグメントまたは変異体を含んでいてもよく、免疫細胞活性化シグナルを変換することができない。本明細書に記載されるＣＣＯＲは、機能的な初代免疫細胞シグナル伝達配列を欠いている。いくつかの実施形態では、ＣＣＯＲは、任意の初代免疫細胞シグナル伝達配列を欠いている。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、ＣＲ膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来する１または複数の膜貫通ドメインを含む。
【０１２９】
ＣＲ抗原結合ドメインは、抗体部位であってもよいし、またはＣＲ標的抗原を特異的に認識するリガンドであってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは、ａ）他の分子に対するその結合アフィニティーの少なくとも約１０倍（例えば、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００倍以上のいずれかを含む）のアフィニティー、またはｂ）他の分子との結合に対するそのＫｄのわずか約１／１０倍（例えば、わずか約１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／７５、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００、１／５００、１／７５０、１／１０００倍以下のいずれか）のＫｄで標的抗原に特異的に結合する。結合アフィニティーは、ＥＬＩＳＡ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）解析、または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）などの当該技術分野で知られている方法によって決定することができる。Ｋｄは、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を利用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、または例えば、Ｓａｐｉｄｙｎｅ機器を利用した結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）などの当該技術分野で知られている方法によって決定することができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、およびＣＲ標的抗原に特異的に結合するペプチドリガンドからなる群から選択される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは抗体部位である。いくつかの実施形態では、抗体部位は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体部位は多重特異性である。いくつかの実施形態では、抗体部位は二重特異性である。いくつかの実施形態では、抗体部位は、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Ｄｂ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ｄｕａｌ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＡＲＴ）抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体、化学的に架橋された抗体、ヘテロ多量体抗体、またはヘテロコンジュゲート抗体である。いくつかの実施形態では、抗体部位はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗体部位は単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態では、抗体部位は、完全ヒトであるか、ヒト抗体フレームワーク領域と半合成であるか、またはヒト化されている。
【０１３２】
いくつかの実施形態における抗体部位は、１つもしくは複数の抗体部位（例えばモノクローナル抗体）に由来する特異的ＣＤＲ配列、または１つもしくは複数のアミノ酸置換を含むそのような配列の特定の変異体を含む。いくつかの実施形態では、変異体配列におけるアミノ酸置換は、標的抗原を結合する抗原結合ドメインの能力を実質的に低下させない。標的抗原結合アフィニティーを実質的に改善するか、または特異性および／もしくは標的抗原の関連変異体との交差反応性などの他の一部特性に影響を与える改変も企図される。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは、約０．１ｐＭ〜約５００ｎＭ（例えば、約０．１ｐＭ、１．０ｐＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または５００ｎＭのいずれかであって、これらの値の間の任意の範囲を含む）のＫｄでＣＲ標的抗原を結合する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、例えば、単独で発現されるか、またはＣＣＯＲを伴わずにＣＯＲと共発現される場合、ＣＲはさらに、細胞内ＣＲ共刺激ドメインを含んでいてもよい。細胞内ＣＲ共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ４０ＬＧ、ＩＴＧＢ２、ＫＬＲＣ２、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＡＶＣＲ１、ＬＧＡＬＳ９、ＣＤ８３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む共刺激分子の細胞内ドメインの一部であり得る。いくつかの実施形態では、細胞内ＣＲ共刺激ドメインは、４−１ＢＢのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ＣＣＯＲ共刺激ドメインは、ＣＤ２８のフラグメントおよび４−１ＢＢのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、例えばＣＣＯＲと共発現される場合、ＣＲは機能的な共刺激ドメインを含まない。
【０１３５】
したがって、例えば、いくつかの実施形態では、キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＤ４を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲが提供される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＤ４を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＤ４を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、１つもしくは複数のＣＯＲ（例えばＣＸＣＲ５）または１つもしくは複数のＣＯＲ（例えばＣＸＣＲ５）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＣＲ５を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲが提供される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＣＲ５を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＣＲ５を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、１つもしくは複数のＣＯＲ（例えばＣＸＣＲ５）または１つもしくは複数のＣＯＲ（例えばＣＸＣＲ５）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲが提供される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、ＣＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、ＣＲは、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位とＣＣＲ５結合部位とはタンデムに連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ＣＣＲ５部位のＮ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ＣＣＲ５部位のＣ末端側にある。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、１つもしくは複数のＣＯＲ（例えばＣＸＣＲ５）または１つもしくは複数のＣＯＲ（例えばＣＸＣＲ５）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＲは、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）である。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４  ＣＡＲであって、ｉ）ＣＤ４を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ４抗体部位、例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む抗ＣＤ４  ＣＡＲが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４  ＣＡＲであって、ｉ）ＣＤ４を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ４抗体部位、例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む抗ＣＤ４  ＣＡＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４  ＣＡＲをコードする核酸であって、ｉ）ＣＤ４を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ４抗体部位、例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む抗ＣＤ４  ＣＡＲをコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原ドメインは、ドメイン１を特異的に認識する。例えば、ＣＲ抗原ドメインは、ＣＤ４のドメイン１を特異的に認識する抗ＣＤ４抗体（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）であり得る。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲであって、ｉ）ＣＣＲ５を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＣＲ５抗体部位、例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む抗ＣＣＲ５−ＣＡＲが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲであって、ｉ）ＣＣＲ５を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＣＲ５抗体部位、例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む抗ＣＣＲ５−ＣＡＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲをコードする核酸であって、ｉ）ＣＣＲ５を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＣＲ５抗体部位、例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む抗ＣＣＲ５−ＣＡＲをコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５  ＣＡＲであって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含むタンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５−ＣＡＲが提供される。いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５  ＣＡＲであって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含むタンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５−ＣＡＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５  ＣＡＲをコードする核酸であって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含むタンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５−ＣＡＲをコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位とＣＣＲ５結合部位とはタンデムに連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ＣＣＲ５結合部位のＮ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ＣＣＲ５結合部位のＣ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原ドメインは、ドメイン１を特異的に認識する。例えば、ＣＲ抗原ドメインは、ＣＤ４のドメイン１を特異的に認識する抗ＣＤ４抗体（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含み得る。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ＣＡＲであって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含むタンデム抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ＣＡＲが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ＣＡＲであって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ＣＡＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ＣＡＲをコードする核酸であって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ＣＡＲをコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位とｂＮＡｂ部位とはタンデムに連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ｂＮＡｂ部位のＮ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ｂＮＡｂ部位のＣ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原ドメインは、ドメイン１を特異的に認識する。例えば、ＣＲ抗原ドメインは、ＣＤ４のドメイン１を特異的に認識する抗ＣＤ４抗体（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含み得る。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含み、例えば、ＶＲＣ０１、ＰＧＴ１２１、３ＢＮＣ１１７、１０−１０７４、Ｎ６、ＶＲＣ０７、ＶＲＣ０７−５２３、ｅＣＤ４−ＩＧ、１０Ｅ８、１０Ｅ８ｖ４、ＰＧ９、ＰＧＤＭ１４００、ＰＧＴ１５１、ＣＡＰ２５６．２５、３５Ｏ２２、８ＡＮＣ１９５などが挙げられる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＣＲ５抗ｂＮＡｂ  ＣＡＲであって、ｉ）ＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含むタンデム抗ＣＣＲ５抗ｂＮＡｂ  ＣＡＲが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ５抗ｂＮＡｂ  ＣＡＲであって、ｉ）ＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む抗ＣＣＲ５抗ｂＮＡｂ  ＣＡＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ５抗ｂＮＡｂ  ＣＡＲをコードする核酸であって、ｉ）ＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどのＣＣＲ５抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のヒンジ配列（例えばＣＤ８に由来するヒンジ配列）、ｉｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８膜貫通ドメイン）、ｉｖ）細胞内共刺激ドメイン（例えば４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン）、およびｖ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む抗ＣＣＲ５抗ｂＮＡｂ  ＣＡＲをコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５結合部位とｂＮＡｂ部位とはタンデムに連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５結合部位は、ｂＮＡｂ部位のＮ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５結合部位は、ｂＮＡｂ部位のＣ末端側にある。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含み、例えば、ＶＲＣ０１、ＰＧＴ１２１、３ＢＮＣ１１７、１０−１０７４、Ｎ６、ＶＲＣ０７、ＶＲＣ０７−５２３、ｅＣＤ４−ＩＧ、１０Ｅ８、１０Ｅ８ｖ４、ＰＧ９、ＰＧＤＭ１４００、ＰＧＴ１５１、ＣＡＰ２５６．２５、３５Ｏ２２、８ＡＮＣ１９５などが挙げられる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＲは、キメラＴＣＲ受容体（「ｃＴＣＲ」）である。ｃＴＣＲは、典型的には、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３δなどのＴＣＲサブユニットの全長または一部に（直接または間接的に）融合したＣＲ抗原結合ドメインを含む。融合ポリペプチドは、他のＴＣＲサブユニットと共に機能的なＴＣＲ複合体に組み込むことができ、ＴＣＲ複合体に抗原特異性を付与する。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインは、ＣＤ３εサブユニット（「ｅＴＣＲ」と呼ばれる）の全長または一部に融合されている。ｃＴＣＲの細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲサブユニットの細胞内シグナル伝達ドメインに由来し得る。ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン。いくつかの実施形態では、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインとＣＲ膜貫通ドメインとは、同じＴＣＲサブユニットに由来する。いくつかの実施形態では、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインとＣＲ膜貫通ドメインとは、ＣＤ３εに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原結合ドメインとＴＣＲサブユニット（またはその一部）とは、リンカー（例えばＧＳリンカー）を介して融合され得る。いくつかの実施形態では、ｃＴＣＲはさらに、ＴＣＲサブユニットまたはその一部の細胞外ドメインを含み、これは、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインおよび／またはＣＲ膜貫通ドメインが由来するＴＣＲユニットと同じであっても異なっていてもよい。
【０１４４】
したがって、例えば、いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４  ｃＴＣＲであって、ｉ）ＣＤ４を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む抗ＣＤ４−ｃＴＣＲが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４−ｃＴＣＲであって、ｉ）ＣＤ４を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む抗ＣＤ４−ｃＴＣＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４−ｃＴＣＲをコードする核酸であって、ｉ）ＣＤ４を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む抗ＣＤ４−ｃＴＣＲをコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原ドメインは、ドメイン１を特異的に認識する。例えば、ＣＲ抗原ドメインは、ＣＤ４のドメイン１を特異的に認識する抗ＣＤ４抗体（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３γ、ＣＤ３εからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットまたはその一部のＣＲ膜貫通ドメイン、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン、および任意の細胞外ドメインは、同じＴＣＲサブユニットに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットまたはその一部のＣＲ膜貫通ドメイン、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン、および任意の細胞外ドメインは、ＣＤ３εに由来する。いくつかの実施形態では、ｃＴＣＲは、全長ＣＤ３εのＮ末端に融合したＣＲ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲであって、ｉ）ＣＣＲ５を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲであって、ｉ）ＣＣＲ５を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲをコードする核酸であって、ｉ）ＣＣＲ５を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲをコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３γ、ＣＤ３εからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットまたはその一部のＣＲ膜貫通ドメイン、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン、および任意の細胞外ドメインは、同じＴＣＲサブユニットに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットまたはその一部のＣＲ膜貫通ドメイン、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン、および任意の細胞外ドメインは、ＣＤ３εに由来する。いくつかの実施形態では、ｃＴＣＲは、全長ＣＤ３εのＮ末端に融合したＣＲ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲであって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むタンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲが提供される。いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲであって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むタンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲをコードする核酸であって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むタンデム抗ＣＤ４抗ＣＣＲ５−ｃＴＣＲをコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原ドメインは、ドメイン１を特異的に認識する。例えば、ＣＲ抗原ドメインは、ＣＤ４のドメイン１を特異的に認識する抗ＣＤ４抗体（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３γ、ＣＤ３εからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットまたはその一部のＣＲ膜貫通ドメイン、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン、および任意の細胞外ドメインは、同じＴＣＲサブユニットに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットまたはその一部のＣＲ膜貫通ドメイン、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン、および任意の細胞外ドメインは、ＣＤ３εに由来する。いくつかの実施形態では、ｃＴＣＲは、全長ＣＤ３εのＮ末端に融合したＣＲ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位とＣＣＲ５結合部位とはタンデムに連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ＣＣＲ５部位のＮ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ＣＣＲ５部位のＣ末端側にある。いくつかの実施形態では、改変された免疫細��はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲであって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むタンデム抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲが提供される。いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲであって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むタンデム抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン。いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲをコードする核酸であって、ｉ）ＣＤ４結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＤ４抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むタンデム抗ＣＤ４−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲをコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＲ抗原ドメインは、ドメイン１を特異的に認識する。例えば、ＣＲ抗原ドメインは、ＣＤ４のドメイン１を特異的に認識する抗ＣＤ４抗体（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３γ、ＣＤ３εからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットまたはその一部のＣＲ膜貫通ドメイン、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン、および任意の細胞外ドメインは、同じＴＣＲサブユニットに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットまたはその一部のＣＲ膜貫通ドメイン、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン、および任意の細胞外ドメインは、ＣＤ３εに由来する。いくつかの実施形態では、ｃＴＣＲは、全長ＣＤ３εのＮ末端に融合したＣＲ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位とｂＮＡｂ部位とはタンデムに連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ｂＮ��ｂ部位のＮ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＤ４結合部位は、ｂＮＡｂ部位のＣ末端側にある。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含み、例えば、ＶＲＣ０１、ＰＧＴ１２１、３ＢＮＣ１１７、１０−１０７４、Ｎ６、ＶＲＣ０７、ＶＲＣ０７−５２３、ｅＣＤ４−ＩＧ、１０Ｅ８、１０Ｅ８ｖ４、ＰＧ９、ＰＧＤＭ１４００、ＰＧＴ１５１、ＣＡＰ２５６．２５、３５Ｏ２２、８ＡＮＣ１９５などが挙げられる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＣＲ５−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲであって、ｉ）ＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むタンデム抗ＣＣＲ５−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲが提供される。いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＣＲ５−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲであって、ｉ）ＣＣＲ５結合部位（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むタンデム抗ＣＣＲ５−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲを含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、タンデム抗ＣＣＲ５−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲをコードする核酸であって、ｉ）ＣＣＲ５結合部位ン（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂなどの抗ＣＣＲ５抗体部位）およびｂＮＡｂ部位（例えばｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ）を含むＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）任意のリンカー（例えばＧＳリンカー）、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットまたはその一部の任意の細胞外ドメイン、ｉｉｉ）ＴＣＲサブユニットに由来するＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｖ）ＴＣＲサブユニットに由来する細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むタンデム抗ＣＣＲ５−ｂＮＡｂ  ｃＴＣＲをコードする核酸を含む、改変された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３γ、ＣＤ３εからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットまたはその一部のＣＲ膜貫通ドメイン、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン、および任意の細胞外ドメインは、同じＴＣＲサブユニットに由来する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットまたはその一部のＣＲ膜貫通ドメイン、細胞内ＣＲシグナル伝達ドメイン、および任意の細胞外ドメインは、ＣＤ３εに由来する。いくつかの実施形態では、ｃＴＣＲは、全長ＣＤ３εのＮ末端に融合したＣＲ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５結合部位とｂＮＡｂ部位とはタンデムに連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５結合部位は、ｂＮＡｂ部位のＮ末端側にある。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５結合部位は、ｂＮＡｂ部位のＣ末端側にある。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはｂＮＡｂをコードする核酸を含み、例えば、ＶＲＣ０１、ＰＧＴ１２１、３ＢＮＣ１１７、１０−１０７４、Ｎ６、ＶＲＣ０７、ＶＲＣ０７−５２３、ｅＣＤ４−ＩＧ、１０Ｅ８、１０Ｅ８ｖ４、ＰＧ９、ＰＧＤＭ１４００、ＰＧＴ１５１、ＣＡ��２５６．２５、３５Ｏ２２、８ＡＮＣ１９５などが挙げられる。
キメラ共刺激受容体（ＣＣＯＲ）
【０１４９】
本明細書に記載されるキメラ共刺激受容体（ＣＣＯＲ）は、ＣＣＯＲ標的抗原に特異的に結合し、標的結合時に機能的に発現される表面上の免疫細胞を刺激することを可能にする。ＣＣＯＲは、標的結合特異性を提供するＣＣＯＲ抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫細胞を刺激することを可能にするＣＣＯＲ共刺激ドメインを含む。ＣＣＯＲは、機能的な初代免疫細胞シグナル伝達配列を欠いている。いくつかの実施形態では、ＣＣＯＲは、すべての初代免疫細胞シグナル伝達配列を欠いている。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞におけるＣＣＯＲの発現は誘導可能である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞の発現は、ＣＲを介したシグナル伝達時に誘導可能である。
【０１５０】
本発明のＣＣＯＲにおいて使用するための共刺激免疫細胞シグナル伝達ドメインの例としては、ＣＲ会合に続くシグナル伝達を開始するためにＣＲと協働して作用し得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体および同様の機能的な能力を有する任意の合成配列が挙げられる。
【０１５１】
細胞内ＣＣＯＲ共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ４０ＬＧ、ＩＴＧＢ２、ＫＬＲＣ２、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＡＶＣＲ１、ＬＧＡＬＳ９、ＣＤ８３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む共刺激分子の細胞内ドメインの一部であり得る。いくつかの実施形態では、細胞内ＣＣＯＲ共刺激ドメインは、４−１ＢＢのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ＣＣＯＲ共刺激ドメインは、ＣＤ２８のフラグメントおよび４−１ＢＢのフラグメントを含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＣＣＯＲ膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来する１または複数の膜貫通ドメインを含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態におけるＣＣＯＲ抗原結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、およびＣＣＯＲ標的抗原に特異的に結合するペプチドリガンドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＣＯＲ抗原結合ドメインは、ａ）他の分子に対するその結合アフィニティーの少なくとも約１０倍（例えば、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００倍以上のいずれかを含む）のアフィニティー、またはｂ）他の分子との結合に対するそのＫｄのわずか約１／１０倍（例えば、わずか約１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／７５、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００、１／５００、１／７５０、１／１０００倍以下のいずれか）のＫｄでＣＣＯＲ標的抗原に特異的に結合する。結合アフィニティーは、ＥＬＩＳＡ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析、または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）などの当該技術分野で知られている方法によって決定することができる。Ｋｄは、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を利用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、または例えば、Ｓａｐｉｄｙｎｅ機器を利用した結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）などの当該技術分野で知られている方法によって決定することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＣＣＯＲ抗原結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、およびＣＲ標的抗原に特異的に結合するペプチドリガンドからなる群から選択される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＣＣＯＲ抗原結合ドメインは抗体部位である。いくつかの実施形態では、抗体部位は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体部位は多重特異性である。いくつかの実施形態では、抗体部位は二重特異性である。いくつかの実施形態では、抗体部位は、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Ｄｂ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ｄｕａｌ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＡＲＴ）抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体、化学的に架橋された抗体、ヘテロ多量体抗体、またはヘテロコンジュゲート抗体である。いくつかの実施形態では、抗体部位はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗体部位は単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態では、抗体部位は、完全ヒトであるか、ヒト抗体フレームワーク領域と半合成であるか、またはヒト化されている。
【０１５６】
いくつかの実施形態における抗体部位は、１つもしくは複数の抗体部位（例えばモノクローナル抗体）に由来する特定のＣＤＲ配列、または１つもしくは複数のアミノ酸置換を含むそのような配列の特定の変異体を含む。いくつかの実施形態では、変異体配列におけるアミノ酸置換は、標的抗原を結合する抗原結合ドメインの能力を実質的に低下させない。標的抗原の結合アフィニティーを実質的に改善するか、または特異性および／もしくは標的抗原の関連変異体との交差反応性などの他の一部特性に影響を与える改変も企図される。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＣＣＯＲ抗原結合ドメインは、約０．１ｐＭ〜約５００ｎＭ（例えば、約０．１ｐＭ、１．０ｐＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または５００ｎＭのいずれかであって、これらの値の間の任意の範囲を含む）のＫｄでＣＣＯＲ標的抗原を結合する。
ＣＲおよびＣＣＯＲ抗原結合ドメイン
【０１５８】
本明細書に記載されるＣＲおよびＣＣＯＲは、ＣＤ４、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４からなる群から選択される標的抗原を特異的に認識する。上述したように、ＣＲがＣＤ４を特異的に認識する場合、ＣＣＯＲはＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４を特異的に認識するであろう。あるいは、ＣＲがＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４を特異的に認識する場合、ＣＣＯＲはＣＤ４を特異的に認識するであろう。標的抗原および抗原結合ドメインは、以下のセクションでより詳細に議論され、これらは、ＣＲ抗原結合ドメイン（およびＣＲ標的抗原）ならびにＣＣＯＲ抗原結合ドメイン（およびＣＣＯＲ標的抗原）の両方に一般的に適用可能である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＣＲ５である。ＣＣＲ５は、７つの膜貫通ドメインを持ち、膜内在性タンパク質のβケモカイン受容体ファミリーに属しているＧタンパク質共役型受容体である。ＣＣＲ５は３５２個のアミノ酸から構成されており、約４１キロダルトン（ｋＤａ）である。
【０１６０】
ＣＣＲ５は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好酸球を含む免疫系の細胞に主に発現されるが、内皮、上皮、血管平滑筋、線維芽細胞にも発現される。さらに、中枢神経系に見られるミクログリア、ニューロン、およびアストロサイトにも発現される。（Ｂａｒｍａｎｉａ，Ｆ．  ａｎｄ  Ｐｅｐｐｅｒ，ＭＳ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ＆  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０１３）２（２０１３）：３−１６．を参照されたい）。
【０１６１】
ＣＣＲ５はほとんどのＨＩＶ−１初代分離株に発現され、感染の確立と維持に非常に重要である。初期疾患のＨＩＶ−１分離株は、ＣＤ４＋Ｔ細胞内に侵入するためのＣＤ４との共受容体としてＣＣＲ５を使用する傾向がある。ＣＣＲ５は、非感染対照と比較して、ＨＩＶ感染個体のＣＤ４＋Ｔ細胞上でアップレギュレーションされていることが示されている（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６１（６）：３１９５−３２０１を参照されたい）。個体間でＣＣＲ５表面発現の変動の測定可能な量がある。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＣＲ５の細胞外ドメイン変異体である。他の実施形態では、標的抗原は、ＣＣＲ５の膜貫通ドメイン変異体である。さらに他の実施形態では、標的抗原は、ＣＣＲ５の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの変異体である（いくつかのＣＣＲ５変異体の解析とその結果としてのＨＩＶ感染性の解析については、Ｚａｃｋ  Ｈｏｗａｒｄ，ＯＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４（２３）：１６２２８−１６２３４を参照されたい）。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＣＲ５を認識するリガンド、ＣＣＲ５を認識することができるそのフラグメントである。ＣＣＲ５を認識するリガンドとしては、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＭＩＰ−１αであり、ＣＣＬ３としても知られている。ＭＩＰ−１αは、急性炎症時の多形核白血球のリクルートメントと活性化に関与するサイトカインである。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＭＩＰ−１βであり、ＣＣＬ４としても知られている。ＭＩＰ−１βは、ナチュラルキラー細胞および単球を含む多くの免疫細胞の化学誘引物質である。ＭＩＰ−１βは、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞を含む免疫系の様々な細胞によって産生されるほか、線維芽細胞および内皮細胞および上皮細胞によっても産生される。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、リガンドがＲＡＮＴＥＳであり、ＣＣＬ５としても知られている。ＲＡＮＴＥＳは、白血球を炎症部位にリクルートし、Ｔ細胞、好塩基球、および好酸球を含む免疫系の様々な細胞の化学誘引物質として作用する。さらに他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＣＲ５に結合する別のリガンドである。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＣＲ５を認識する抗体部位、例えば、本明細書に記載される抗体部位のいずれかである。例示的な抗ＣＣＲ５抗体は、国際公開第２００６１０３１００号に見出すことができ、これは参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＸＣＲ４である。ＣＸＣＲ４は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４型としても知られているα−ケモカイン受容体であり、リガンドであるＳＤＦ−１と結合し、いくつかの異なる経路を介して細胞内シグナルを伝達することで、カルシウムの増加および／またはｃＡＭＰレベルの低下をもたらす。それは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む免疫細胞に主に発現されるが、中枢神経系の細胞にも発現される。ＣＸＣＲ４は、７つの膜貫通らせんを持つＧタンパク質共役型受容体であり、３５２個のアミノ酸から構成されている。
【０１６６】
ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶ分離株がＣＤ４＋Ｔ細胞に感染するために使用することができるいくつかのケモカイン受容体のうちの１つである。ＨＩＶのＴ細胞指向性分離株は、その表面にＣＸＣＲ４を発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞に感染することができる。ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶがＴ細胞内に侵入するための共受容体であり、特定のマウス抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＨＩＶ分離株のＴ細胞への侵入を抑制できることが実証されている（Ｈｏｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１８０−１８８；Ｃａｒｎｅｃ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１９３０−１９３８を参照されたい）。ＣＸＣＲ４は、ウイルスが細胞内に侵入するための受容体として使用することができ、ＣＸＣＲ４を受容体として使用するウイルスの細胞内侵入を抑制するために、ＣＸＣＲ４に対する抗体が使用されてきた。国際公開第２００８０６０３６７号および国際公開第２０１１０９８７６２号を参照されたい。
【０１６７】
ＣＸＣＲ４は、非感染対照と比較して、ＨＩＶ感染個体のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにＣＤ１４＋単球上でダウンレギュレートされている（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６１（６）：３１９５−３２０１を参照されたい）。ＨＩＶ−１分離株は、ＣＸＣＲ４を共受容体としてＣＤ４と共に使用し、疾患の進行に伴って細胞に侵入するが、ＣＸＣＲ４は、ＣＣＲ５の場合のように感染の初期には共受容体として使用されない。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＸＣＲ４リガンド、例えば間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１、もしくはＣＸＣＬ１２）、またはＣＸＣＲ４を認識するそのフラグメントである。ＳＤＦ−１は、リンパ球に対して強い走化性を示し、胸腺、脾臓、および骨髄を含む多くの組織で発現されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＳＤＦ−１の７つのアイソフォームのうちの１つである。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＭＩＦ、ユビキチン、またはそのフラグメントである。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＸＣＲ４を認識する抗体部位、例えば本明細書に記載される抗体部位のいずれかである。例示的な抗ＣＸＣＲ４抗体は、国際公開第２００８０６０３６７号および国際公開第２０１１０９８７６２号に見出すことができ、これらは参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ４であり、分化抗原群４としても知られている。ＣＤ４は、免疫細胞、特にＣＤ４＋、またはヘルパーＴ細胞の表面に見られる糖タンパク質である。ＣＤ４は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４は、４つの細胞外免疫グロブリンドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）で構成されている。Ｄ１およびＤ３は、免疫グロブリン可変ドメインとの類似性を示し、Ｄ２およびＤ４は、免疫グロブリン定常ドメインとの類似性を示す。
【０１７１】
ＣＤ４は、ＨＩＶ−１の侵入および感染に必要な重要な細胞表面分子である。ＨＩＶ−１の侵入は、ウイルスエンベロープ（Ｅｎｖ）糖タンパク質ｇｐ１２０とＴ細胞受容体ＣＤ４のドメイン１（Ｄ１）との相互作用によって引き起こされる。ＨＩＶ感染が進行すると、より多くのＣＤ４＋Ｔ細胞が標的化され、ウイルスによって破壊され、その結果、免疫系がますます損なわれる。そのため、ＣＤ４＋Ｔ細胞数は、個体のＨＩＶ／ＡＩＤＳの進行度と病期の代用として使用される。さらに、ＨＩＶ感染時のＣＤ４のダウンレギュレーションには、ＨＩＶ遺伝子産物Ｅｎｖ、Ｖｐｕ、およびＮｅｆが関与している（Ｔａｎａｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００３）３１１（２）：３１６−３２５を参照されたい）。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ａ）他の分子に対するその結合アフィニティーの少なくとも約１０倍（例えば、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００倍以上のいずれかを含む）のアフィニティー、またはｂ）他の分子との結合に対するそのＫｄのわずか約１／１０倍（例えば、わずか約１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／７５、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００、１／５００、１／７５０、１／１０００倍以下のいずれか）のＫｄでＣＤ４−Ｄ１またはＣＤ４−Ｄ２／Ｄ３に特異的に結合する。結合アフィニティーは、ＥＬＩＳＡ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析、または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）などの当該技術分野で知られている方法によって決定することができる。Ｋｄは、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を利用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、または例えば、Ｓａｐｉｄｙｎｅ機器を利用した結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）などの当該技術分野で知られている方法によって決定することができる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、およびＣＤ４に特異的に結合するペプチドリガンドからなる群から選択される。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは抗体部位である。いくつかの実施形態では、抗体部位は単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗体部位は多重特異性である。いくつかの実施形態では、抗体部位は二重特異性である。いくつかの実施形態では、抗体部位は、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Ｄｂ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ｄｕａｌ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＡＲＴ）抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体、化学的に架橋された抗体、ヘテロ多量体抗体、またはヘテロコンジュゲート抗体である。いくつかの実施形態では、抗体部位はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗体部位は単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態では、抗体部位は、完全ヒトであるか、ヒト抗体フレームワーク領域と半合成であるか、またはヒト化されている。
【０１７５】
いくつかの実施形態における抗体部位は、１つもしくは複数の抗体部位（例えば本明細書に開示される特異性抗体のいずれか）に由来する特異的ＣＤＲ配列、または１つもしくは複数のアミノ酸置換を含むそのような配列の特定の変異体を含む。いくつかの実施形態では、変異体配列におけるアミノ酸置換は、標的抗原を結合する抗原結合ドメインの能力を実質的に低下させない。標的抗原の結合アフィニティーを実質的に改善するか、または特異性および／もしくは標的抗原の関連変異体との交差反応性などの他の一部特性に影響を与えるような改変もまた企図される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、約０．１ｐＭ〜約５００ｎＭ（例えば、約０．１ｐＭ、１．０ｐＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または５００ｎＭのいずれかであって、これらの値の間の任意の範囲を含む）のＫｄでＣＤ４−Ｄ１またはＤ２／３に結合する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＤ４のＤ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、以下の領域のいずれか１つまたは複数に該当するエピトープに結合する：ＣＤ４のアミノ酸２６〜１２５、２６〜４６、４６〜６６、６６〜８６、８６〜１０６、１０６〜１２５であって、アミノ酸のナンバリングは配列番号１に従う。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、以下の領域のいずれか１つまたは複数に該当するエピトープに結合する：配列番号１のアミノ酸２６〜１２５、２６〜４６、４６〜６６、６６〜８６、８６〜１０６、１０６〜１２５。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、約０．１ｐＭ〜約５００ｎＭ（例えば、約０．１ｐＭ、１．０ｐＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または５００ｎＭのいずれかであって、これらの値の間の任意の範囲を含む）でＣＤ４のＤ１に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４はヒトＣＤ４である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、例えば国際公開第１９９７０１３８５２号に開示されているように、ザノリムマブに由来する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ザノリムマブに対する結合のために競合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ザノリムマブのエピトープと同じまたは重複するエピトープに結合する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＤ４のＤ２またはＤ３のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、以下の領域のいずれか１つまたは複数に該当するエピトープに結合する：ＣＤ４のアミノ酸１２６〜３１７、１２６〜２０３、２０４〜３１７、１２６〜１４６、１４６〜１６６、１６６〜１８６、１８６〜２０６、２０６〜２２６、２２６〜２４６、２４６〜２６６、２６６〜２８６、２８６〜３０６、および３０６〜３１７であって、アミノ酸のナンバリングは配列番号１に従う。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、以下の領域のいずれか１つまたは複数に該当するエピトープに結合する：配列番号１のアミノ酸１２６〜３１７、１２６〜２０３、２０４〜３１７、１２６〜１４６、１４６〜１６６、１６６〜１８６、１８６〜２０６、２０６〜２２６、２２６〜２４６、２４６〜２６６、２６６〜２８６、２８６〜３０６、および３０６〜３１７。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、約０．１ｐＭ〜約５００ｎＭ（例えば、約０．１ｐＭ、１．０ｐＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または５００ｎＭのいずれかであって、これらの値の間の任意の範囲を含む）のＫｄでＣＤ４のＤ２またはＤ３に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４はヒトＣＤ４である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、例えば米国特許出願公開第２０１３０１９５８８１号明細書および国際公開第２００４０８３２４７号に開示されているように、イバリズマブまたはトレガリズマブに由来する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、イバリズマブまたはトレガリズマブに対する結合のために競合する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、イバリズマブまたはトレガリズマブのエピトープと同じまたは重複するエピトープに結合する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＤ４のリガンド、またはＣＤ４を結合することができるそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４のリガンドは、Ｔ細胞の活性化を調節し、ＨＩＶの複製を阻害する多多機能性サイトカインであるＩＬ−１６である。他の実施形態では、ＣＤ４のリガンドは、クラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣクラスＩＩ）である。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、典型的には、Ｂ細胞、樹状細胞、抗原提示細胞、単核貧食細胞、胸腺上皮細胞を含む免疫系の抗原提示細胞に見られる。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩリガンドは、免疫系への後続提示のためのＣＤ４に提示される病原性ペプチドを提示する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０またはそのフラグメントである。ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子にコードされるネイティブ型ｇｐ１２０は、ＨＩＶウイルスエンベロープに見られる１２０ｋＤａの糖タンパク質で、ＨＩＶの標的細胞への接着に重要な役割を果たしている。ｇｐ１２０は、標的細胞のＣＤ４およびＣＣＲ５を含むケモカイン受容体ファミリーのメンバーに結合し、標的細胞のＨＩＶ感染を効率的に行うことができる。ｇｐ１２０とＣＤ４との複合体がＣＣＲ５と特異的に相互作用し、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βのようなナチュラルＣＣＲ５リガンドの結合を阻害することが示されている（Ｗｕ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：１７９−１８３）。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインがｇｐ１２０である場合には、改変された免疫細胞はＣＣＯＲを含まない。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞におけるＣＲは、ＣＲ共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＤ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４のうちの１つまたは複数に結合しない修飾ｇｐ１２０である。例えば、いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＤ４に結合するが、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４には結合しない修飾ｇｐ１２０である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＣＲ５に結合するが、ＣＤ４またはＣＸＣＲ４には結合しない修飾ｇｐ１２０である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＸＣＲ４に結合するが、ＣＣＲ５またはＣＤ４には結合しない修飾ｇｐ１２０である。
共受容体（「ＣＯＲ」）
【０１８３】
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はさらに、１または複数の共受容体（「ＣＯＲ」）を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ＣＯＲは、濾胞への免疫細胞の遊走を容易にする。いくつかの実施形態では、ＣＯＲは、腸管への免疫細胞の遊走を容易にする。いくつかの実施形態では、ＣＯＲは、皮膚への免疫細胞の遊走を容易にする。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ＣＯＲはＣＸＣＲ５である。いくつかの実施形態では、ＣＯＲはＣＣＲ９である。いくつかの実施形態では、ＣＯＲはα４β７（インテグリンα４β７とも呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＸＣＲ５、α４β７、およびＣＣＲ９からなる群から選択される２つ以上の受容体を含む。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、α４β７とＣＣＲ９の両方を含む。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＸＣＲ５、α４β７、およびＣＣＲ９を含む。
【０１８６】
ＣＣＲ９は、Ｃ−Ｃケモカイン受容体９型（ＣＣＲ９）としても知られており、βケモカイン受容体ファミリーのメンバーであり、その結合リガンドであるＣＣＬ２５に応答して走化性を媒介する。ＣＣＲ９は、Ｇタンパク質共役型受容体と構造が類似した７つの膜貫通ドメインタンパク質であると予測されている。ＣＣＲ９は、胸腺および小腸のＴ細胞に発現され、Ｔリンパ球の発生および遊走を調節する役割を果たしている（Ｕｅｈａｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８（６）：２８１１−２８１９）。ＣＣＲ９／ＣＣＬ２５は、免疫細胞を小腸に誘導することが示されている（Ｐａｂｓｔ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９（３）：４１１）。このように、免疫細胞にＣＣＲ９を共発現させることで、改変された免疫細胞を腸管に誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ９のスプライシング変異体が使用される。
【０１８７】
α４β７（リンパ球パイエル板接着分子（ＬＰＡＭ））は、リンパ球に発現されるインテグリンであり、腸管関連リンパ組織へのＴ細胞ホーミングの役割を担っている（Ｐｅｔｒｏｖｉｃ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３（４）：１５４２−１５４７）。α４β７は、ＣＤ４９ｄ（α４インテグリンサブユニットをコードする遺伝子であるＩＴＧＡ４のタンパク質産物）とＩＴＧＢ７（β７インテグリンサブユニットをコードする遺伝子であるＩＴＧＢ４のタンパク質産物）とから構成されるヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、α４のスプライシング変異体がα４β７ヘテロ二量体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、β７のスプライシング変異体がα４β７ヘテロ二量体に組み込まれている。他の実施形態では、α４のスプライシング変異体およびβ７のスプライシング変異体がヘテロ二量体に組み込まれている。α４β７の共発現は、単独でまたはＣＣＲ９との組み合わせで、改変された免疫細胞を腸管に誘導することができる。
【０１８８】
α４β７とＣＣＲ９の両方は腸管へのホーミングに機能しているが、必ずしも共調節されているわけではない。ビタミンＡの代謝物であるレチノイン酸は、ＣＣＲ９とα４β７の両方の発現誘導に役割を果たしている。しかしながら、α４β７の発現は他の手段によって誘導することができ、ＣＣＲ９の発現にはレチノイン酸が必要である。さらに、大腸指向性Ｔ細胞はα４β７のみを発現し、ＣＣＲ９は発現しないことから、２つの受容体が常に共発現または共調節されているわけではないことが示される。（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０）１８５（９）：５２８９−５２９９を参照されたい）。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ９およびα４β７は、腸管に標的化するためのＣＯＲとして機能する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体５型としても知られているＣＸＣＲ５を発現する。ＣＸＣＲ５は、ＣＸＣケモカイン受容体ファミリーに属する７つの膜貫通ドメインを含むＧタンパク質共役型受容体である。ＣＸＣＲ５とそのリガンドであるケモカインＣＸＣＬ１３は、リンパ節および脾臓を含む二次リンパ組織内の濾胞へのリンパ球の輸送に中心的な役割を果たしている。（Ｂｕｅｒｋｌｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １１０：３３１６−３３２５）。特に、ＣＸＣＲ５は、ＣＸＣＬ１３に応答してＴ細胞がリンパ節Ｂ細胞ゾーンに遊走することを可能にする（Ｓｃｈａｅｒｌｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（１１）：１５５３−１５６２）。免疫細胞において発現される場合、ＣＸＣＲ５は、改変された免疫細胞を濾胞に標的化するためのＣＯＲとして機能することができる。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ５のスプライシング変異体が使用される。
【０１９１】
一般に、上述のＣＯＲのいずれかの非自然発生の変異体を、改変された免疫細胞において構成／発現させることができる。これらの変異体は、例えば、１または複数の突然変異を含み得るが、それにもかかわらず、対応するネイティブ型受容体のいくつかまたは複数の機能を維持する。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＯＲは、自然発生のＣＣＲ９、α４β、またはＣＸＣＲ５の変異体であって、この変異体は、ネイティブ型のＣＣＲ９、α４β、またはＣＸＣＲ５と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちのいずれかと同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＯＲは、自然発生のＣＣＲ９、α４β、またはＣＸＣＲ５の変異体であって、この変異体は、ネイティブ型のＣＣＲ９、α４β、またはＣＸＣＲ５のものと比較して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下のうちのいずれかのアミノ酸置換を含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、ＣＯＲはケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、ＣＯＲはインテグリンである。いくつかの実施形態では、ＣＯＲは、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲ１、ＸＣＲ１、ＡＣＫＲ１、ＡＣＫＲ２、ＡＣＫＲ３、ＡＣＫＲ４、ＣＣＲＬ２からなる群から選択される。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、ＣＯＲは通常、改変された免疫細胞が由来する免疫細胞において発現されない。いくつかの実施形態では、ＣＯＲは、改変された免疫細胞が由来する免疫細胞において低レベルで発現される。
抗ＨＩＶ抗体
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変された免疫細胞はさらに、広域中和抗体（「ｂＮＡｂ」）などの抗ＨＩＶ抗体をさらに発現（および分泌）する。いくつかの実施形態では、ＣＲがタンデムＣＲである場合、ＣＲ抗原結合ドメインは、抗ＨＩＶ抗体部位（例えばｂＮＡｂ部位）を含んでいてもよい。ｂＮＡｂはＨＩＶエンベロープタンパク質に結合し、ウイルスが宿主細胞の受容体に結合するのをブロックする。本明細書に記載されるｂＮＡｂ部位とは、広域中和抗体活性および／または結合特異性を保持する抗体またはそのフラグメントを指す。いくつかの実施形態では、ｂＮＡｂ部位はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ｂＮＡｂ部位はｓｄＡｂである。
【０１９５】
ｂＮＡｂは、ＨＩＶに感染したものの、抗レトロウイルス薬を服用しなくてもウイルス感染を自然に制御することができるエリートコントローラーにおいて初めて発見された。ｂＮＡｂは、複数のＨＩＶウイルス株を中和する中和抗体である。ｂＮＡｂは、ウイルスが突然変異を受けた場合でも、ウイルスの保存されたエピトープを標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変された免疫細胞は、新規宿主細胞のＨＩＶ感染をブロックするための広域中和抗体を分泌することができる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ｂＮＡｂは、ｇｐ４１のＭＰＥＲ、Ｖ１Ｖ２グリカン、グリカンのｏｕｔｅｒｄｏｍａｉｎ、Ｖ３グリカン、またはＣＤ４結合部位のウイルスエピトープを特異的に認識する。ｂＮＡｂは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質とＣＤ４との相互作用をブロックする。ＭａｓｃｏｌａおよびＨａｙｎｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０１３  Ｊｕｌｙ；２５４（１）：２２５−４４。適切なｂＮＡｂとしては、ＶＲＣ０１、ＰＧＴ−１２１、３ＢＮＣ１１７、１０−１０７４、Ｎ６、ＶＲＣ０７、ＶＲＣ０７−５２３、ｅＣＤ４−ＩＧ、１０Ｅ８、１０Ｅ８ｖ４、ＰＧ９、ＰＧＤＭ  １４００、ＰＧＴ１５１、ＣＡＰ２５６．２５、３５Ｏ２２、８ＡＮＣ１９５が挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２３  Ｄｅｃ  ２０１５：Ｖｏｌ．７，Ｉｓｓｕｅ  ３１９，ｐｐ．３１９ｒａ２０６；ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２０１３；９（５）：ｅ１００３３４２；Ｎａｔｕｒｅ．２０１５  Ｊｕｎ  ２５；５２２（７５５７）：４８７−９１；Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１７  Ｆｅｂ；２３（２）：１８５−１９１；Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｖｏｌｕｍｅ  １９，ｐｐ．１１７９−１１８８（２０１８）。他の適切な広域中和抗体は、例えば、次の刊行物に見出すことができる：Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．ＨＩＶ  ＡＩＤＳ，２０１８  Ｊｕｌ；１３（４）：３６６−３７３；ＭａｓｃｏｌａおよびＨａｙｎｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０１３  Ｊｕｌｙ；２５４（１）：２２５−４４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ。
【０１９７】
また、本明細書に記載されるＣＲ、ＣＣＯＲおよび／またはＣＯＲをコードする核酸（または核酸のセット）、ならびにその核酸を含むベクターも本明細書に提供される。
【０１９８】
ＣＲ、ＣＣＯＲおよび／またはＣＯＲの発現は、核酸が、例えば、プロモーター（例えば、リンパ球特異的プロモーター）および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む５'ならびに／または３'調節エレメントに作用可能に連結されるように、適切な発現ベクターに核酸を挿入することによって達成され得る。ベクターは、宿主細胞内での複製および統合に適したものとすることができる。典型的なクローニングおよび発現ベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、および所望の核酸配列の発現調節に有用なプロモーターを含む。
【０１９９】
核酸は、多くのタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、配列決定ベクターが挙げられる。
【０２００】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知である。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製の起源、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１または複数の選択可能なマーカーを含む。
【０２０１】
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスベースのシステムが開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該技術分野で知られている技術を用いて、ベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスは単離され、インビボまたはエクスビボのいずれかの対象の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルスシステムが当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子を長期的、安定的に取り込んで娘細胞内で増殖させることができるため、長期的な遺伝子導入を達成するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターに比べて、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できるという更なる利点がある。それらはまた、免疫原性が低いという更なる利点もある。
【０２０２】
更なるプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の上流３０〜１１０ｂｐの領域に位置しているが、最近では多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能的なエレメントを含むことが示されている。多くの場合、プロモーターエレメント間の間隔は柔軟性であり、そのため、エレメントが互いに反転したり移動したりしたときにプロモーターの機能が維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐ間隔まで広げることができる。
【０２０３】
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、作用可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列を使用してもよく、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えばアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
ポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染されることが求められる細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含むことができる。他の態様では、選択可能なマーカーは、ＤＮＡの別個のピースに担持され、共トランスフェクション手順で使用されてもよい。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞内での発現を可能にするために、適切な調節配列でフランキングされてもよい。有用な選択可能なマーカーとしては、例えば、Ｎｅｏなどの薬剤耐性遺伝子が挙げられる。
【０２０５】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定したり、調節配列の機能性を評価したりするために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織に存在しないか、またはレシピエント生物もしくは組織によって発現されず、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって発現が明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後、適切な時期にアッセイされる。適切なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を挙げることができる。適切な発現系は周知であり、公知の技術を用いて調製してもよいし、商業的に入手してもよい。一般に、レポーター遺伝子の最大レベルの発現を示す最小の５'フランキング領域を有するコンストラクトがプロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結されていてもよく、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用される。
【０２０６】
哺乳動物細胞における異種核酸の存在を確認するための例示的な方法としては、例えば、当業者には周知である分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的方法（例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）による、特定のペプチドの存在または非存在の検出などが挙げられる。
【０２０７】
哺乳動物細胞における異種核酸の存在を確認するための例示的な方法としては、例えば、当業者には周知である分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的方法（例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）による、特定のペプチドの存在または非存在の検出などが挙げられる。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、１または複数の核酸配列の各々は、別個のベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、核酸配列の少なくとも一部が同じベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、核酸配列の全部が同じベクターに含まれる。ベクターは、例えば、哺乳動物発現ベクターおよびウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスに由来するもの）からなる群から選択されてもよい。
【０２０９】
例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、ＣＲポリペプチド鎖をコードする第１の核酸配列、任意にＣＣＯＲポリペプチド鎖をコードする第２の核酸、任意にＣＯＲポリペプチド鎖をコードする第３の核酸、および任意にｂＮＡｂポリペプチドをコードする第４の核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第１のベクターに含まれ、第２の核酸配列は第２のベクターに含まれ、第３の核酸配列は第３のベクターに含まれ、および／または第４の核酸配列は第４のベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、第１および第２の核酸配列は第１のベクターに含まれ、第３の核酸配列および／または第４の核酸配列は第２のベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、第１および第３の核酸配列は第１のベクターに含まれ、第２の核酸配列および／または第４の核酸配列は第２のベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、第２および第３の核酸配列は第１のベクターに含まれ、第１の核酸配列および／または第４の核酸配列は第２のベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および任意に第４の核酸配列は、同じベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および任意に第４の核酸は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および２Ａ自己切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ）をコードする核酸からなる群から選択されるリンカーを介して互いに連結することができる。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は第１のプロモーターの制御下にあり、第２の核酸配列は第２のプロモーターの制御下にあり、第３の核酸配列は第３のプロモーターの制御下にあり、および／または第４の核酸配列は第４のプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および／または第４のプロモーターの一部または全部が同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および任意に第４のプロモーターの一部または全部が異なる配列を有する。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および任意に第４の核酸配列の一部または全部が、多重シストロンベクターにおいて単一のプロモーターの制御下で単一の転写物として発現される。いくつかの実施形態では、１または複数のプロモーターは誘導可能である。いくつかの実施形態では、第３および／または第４の核酸配列は、誘導性プロモーターに作用可能に連結されている。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および任意に第４の核酸配列の一部または全部が免疫細胞（例えばＴ細胞）において類似の（例えば実質的にまたはほぼ同じ）発現レベルを有する。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および任意に第４の核酸配列のいくつかは、少なくとも約２倍（例えば、少なくとも約２、３、４、５倍以上のいずれか）の差がある免疫細胞（例えばＴ細胞）における発現レベルを有する。発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで決定することができる。ｍＲＮＡの発現レベルは、核酸から転写されたｍＲＮＡの量を、ノーザンブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ解析法などを含む様々な周知の方法を用いて測定することによって決定することができる。タンパク質の発現レベルは、免疫細胞化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット解析、発光アッセイ、質量分析、高速液体クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析を含む公知の方法で測定することができる。
【０２１２】
細胞（例えば免疫細胞）に遺伝子を導入して発現させる方法は、当該技術分野で知られている。発現ベクターの文脈では、ベクターは、当該技術分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。
【０２１３】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、パーティクル・ガン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を生成するための方法は、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション法によって行われる。
【０２１４】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒトの細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。
【０２１５】
宿主細胞（例えば免疫細胞）にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに油中水型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質系が挙げられる。インビボおよびインビトロで送達賦形剤として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜ベシクル）である。
【０２１６】
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達賦形剤はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）のために企図されている。別の態様では、核酸は脂質と会合されてもよい。脂質と会合された核酸は、リポソームの水性内部に封入されてもよく、リポソームの脂質二重層内に混在されてもよく、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合された連結分子を介してリポソームに付着されてもよく、リポソームに捕捉されてもよく、リポソームと複合体を形成してもよく、脂質を含む溶液に分散されてもよく、脂質と混合されてもよくし、脂質と組み合わせられてもよく、脂質に懸濁液として含まれてもよく、ミセルに含まれるかまたはミセルと複合体を形成してもよく、または他の方法で脂質と会合されてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター会合組成物は、溶解状態で任意の特定の構造に限定されない。例えば、脂質は、二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在してもよい。脂質はまた、単に溶液中に混在されていることもあり、サイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成している可能性がある。脂質とは、自然発生の脂質であっても合成脂質であってもよい脂肪性物質のことである。例えば、脂質としては、細胞質に自然に存在する脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含む化合物のクラスも挙げられる。
【０２１７】
宿主細胞に外因性核酸を導入するか、または他の方法で細胞を本発明の阻害剤に曝露するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施してもよい。例えば、そのようなアッセイとしては、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えばサザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲなどの、；「生化学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）または本明細書に記載されるアッセイによる、特定のペプチドの存在または非存在の検出などを行って本発明の範囲に該当する薬剤を同定することが挙げられる。
抗体部位
【０２１８】
本明細書に記載される様々なコンストラクト（例えばＣＲ抗原結合ドメインまたはＣＣＯＲ抗原結合ドメインなど）は抗体部位を含む。いくつかの実施形態では、抗体部位は、モノクローナル抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、抗体部位はさらに、モノクローナル抗体のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメイン、またはその変異体を含む。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）ならびにＳｅｒｇｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１７（１６）：４２６２−４２７２に記載される方法などを用いて調製することができる。
【０２１９】
ハイブリドーマ法では、ハムスター、マウス、または他の適切な宿主動物が、典型的には、免疫剤で免疫されて、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫剤は、目的のタンパク質のポリペプチドもしくは融合タンパク質、またはペプチドとＭＨＣタンパク質とを含む複合体などの、少なくとも２分子を含む複合体を含むことができる。一般的に、ヒト由来の細胞が所望される場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用されるか、または非ヒト哺乳動物源が所望される場合には脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。次いで、このリンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシ、およびヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する１または複数の物質を含む適切な培地で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、これがＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である。いくつかの実施形態では、不死化細胞株は、例として、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）およびｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国バージニア州マナサス）から入手することができるマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫およびマウスーヒト異種骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている。Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）ｐｐ．５１−６３。
【０２２１】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養された培地は、ポリペプチドに対して指向されたモノクローナル抗体の存在をアッセイすることができる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によって、または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって決定することができる。そのような技術およびアッセイは、当該技術分野で知られている。モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスカチャード分析によって決定することができる。
【０２２２】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンは、限界希釈手順でサブクローン化され、標準的な方法で増殖させることができる。Ｇｏｄｉｎｇ（上記を参照されたい）。この目的のために適した培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腹水でインビボ増殖させることができる。
【０２２３】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地または腹水から単離もしくは精製することができる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、抗体部位は、抗体部位ライブラリー（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを提示するファージライブラリー）から選択されたクローンからの配列を含む。クローンは、所望の活性または複数の活性を有する抗体フラグメントのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体のそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ'Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００１）に概説されており、さらに、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；ならびにＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に記載されている。
【０２２５】
特定のファージディスプレイ方法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングされ、ファージライブラリー中で無作為に組み換えられ、これは、次いで、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）．に記載されているように、抗原結合ファージのためにスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかとして、抗体フラグメントをディスプレイする。免疫源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、高アフィニティー抗体を免疫原に提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されているように、ナイーブレパートリーは、クローニングされ（例えば、ヒトから）、いかなる免疫化も伴わずに、幅広い非自己抗原と、それに自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されているように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、無作為配列を含むＰＣＲプライマーを使用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配置を達成することによって、合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載した特許公報として、例えば、以下のものが挙げられる：米国特許第５，７５０，３７３号明細書、米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号明細書、同第２００５／０１１９４５５号明細書、同第２００５／０２６６０００号明細書、同第２００７／０１１７１２６号明細書、同第２００７／０１６０５９８号明細書、同第２００７／０２３７７６４号明細書、同第２００７／０２９２９３６号明細書および同第２００９／０００２３６０号明細書。
【０２２６】
抗体部位は、ファージディスプレイを用いて、標的抗原に特異的な抗体（例えば、ＣＤ４、ＣＣＲ５、またはＣＸＣＲ４ポリペプチド）のためのライブラリーをスクリーニングするために調製することができる。ライブラリーは、少なくとも１つの×１０９（例えば、少なくとも約１×１０９、２．５×１０９、５×１０９、７．５×１０９、１×１０１０、２．５×１０１０、５×１０１０、７．５×１０１０、または１×１０１１のうちのいずれか）のユニークなヒト抗体フラグメントの多様性を有するヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーであり得る。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、健康なドナーからのヒトＰＭＢＣおよび脾臓から抽出されたＤＮＡから構築されたナイーブなヒトライブラリーであり、すべてのヒト重鎖および軽鎖サブファミリーを包含する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、自己免疫疾患患者、癌患者、および感染性疾患患者などの様々な疾患を有する患者から単離されたＰＢＭＣから抽出されたＤＮＡから構築されたナイーブヒトライブラリーである。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、半合成ヒトライブラリーであり、ここで、重鎖ＣＤＲ３は、完全に無作為化され、すべてのアミノ酸（システインを除く）は、任意の所与の位置において等しく存在する可能性がある（例えば、Ｈｏｅｔ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：３４４−３４８，２００５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、半合成ヒトライブラリーの重鎖ＣＤＲ３は、約５〜約２４（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のいずれか）アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、完全合成ファージディスプレイライブラリーである。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、非ヒトファージディスプレイライブラリーである。
【０２２７】
高アフィニティーで標的抗原に結合するファージクローンは、固体支持体（例えば、溶液パニングについてはビーズまたは細胞パニングについては哺乳動物細胞など）に結合する標的抗原にファージを反復的に結合させ、その後、非結合ファージを除去し、特異的に結合したファージを溶出させることによって選択することができる。溶液パニングの例では、標的抗原は、固体支持体への固定化のためにビオチン化することができる。ビオチン化された標的抗原をファージライブラリーおよび固体支持体、例えばストレプトアビジン共役Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０と混合し、次いで標的抗原−ファージービーズ複合体を単離する。結合したファージクローンを溶出し、適切な宿主細胞、例えば発現および精製のための大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを感染させるために使用する。細胞パニングの例では、ＣＤ４、ＣＣＲ５、またはＣＸＣＲ４を発現する細胞をファージライブラリーと混合し、その後、細胞を回収し、結合したクローンを溶出し、発現および精製のために適切な宿主細胞に感染させるために使用する。パニングは、標的抗原に特異的に結合するファージクローンを富化するために、溶液パニング、細胞パニング、またはその両方の組み合わせのいずれかを用いて、複数回（例えば、約２、３、４、５、６回またはそれより多い回数のいずれか）ラウンドで実施することができる。富化されたファージクローンは、例えばＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳを含む、当該技術分野で知られている任意の方法によって、標的抗原への特異的結合について試験することができる。
ヒトおよびヒト化された抗体部位
【０２２８】
本明細書に記載される抗体部位は、ヒトまたはヒト化されたものであってもよい。非ヒト（例えば、マウス）抗体部位のヒト化された形態は、典型的には非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ、または抗体の他の抗原結合部分配列）である。ヒト化抗体部位としては、ヒト免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（レシピエント抗体）が含まれ、レシピエントのＣＤＲの残基が、所望の特異性、アフィニティー、およびキャパシティを有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲの残基（ドナー抗体）で置換されている。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置換されている。ヒト化された抗体部位はまた、レシピエント抗体部位にも、インポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体部位は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み得る。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【０２２９】
一般的に、ヒト化抗体部位は、非ヒトである供給源からそれに導入された１または複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、これは典型的には「インポート」可変ドメインから取られている。いくつかの実施形態によれば、ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）に従って、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体部位の対応する配列の代わりに用いることによって本質的に実施され得る。したがって、そのような「ヒト化」抗体部位は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ない量のヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置換された抗体部位である（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。実際には、ヒト化抗体部位は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および場合によってはいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似の部位からの残基で置換されたヒト抗体部位である。
【０２３０】
ヒト化に代わるものとして、ヒト抗体部位を生成することができる。例えば、免疫の際に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが現在可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失により、内因性抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖系列変異体マウス中へのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入により、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生が生じる。Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，５９１，６６９号明細書；同第５，５４５，８０７号明細書および国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。あるいは、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されたトランスジェニック動物、例えば、マウス中にヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作製することができる。チャレンジの際に、遺伝子再構成、アセンブリおよび抗体レパートリーを含むあらゆる点において、ヒトにおいて見られたものと密接に類似したヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書、ならびにＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６−８５９（１９９４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０２３１】
ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞（米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書を参照されたい）によって、またはファージディスプレイライブラリーを含む当該技術分野で知られている様々な技術を使用して生成することもできる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術は、ヒトモノクローナル抗体を調製するためにも利用可能である。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．  ７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６ー９５（１９９１）。
更なる変異体
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗原結合ドメインのアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗原結合ドメインの結合アフィニティーおよび／または他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合がある。抗原結合ドメインのアミノ酸配列変異体は、抗原結合ドメインをコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによるか、またはペプチド合成により調製することができる。そのような修飾は、例えば、抗原結合ドメインのアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終的なコンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有することを条件として、最終的なコンストラクトに到達するために行うことができる。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、１または複数のアミノ酸置換を有する抗原結合ドメイン変異体が提供される。置換突然変異誘発の目的の部位には、抗体部位のＨＶＲおよびＦＲが含まれる。アミノ酸置換は、目的の抗原結合ドメインに導入することができ、産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善または免疫原性の低下についてスクリーニングされる。
【０２３４】
保存的置換は、以下の表４に示すとおりである。本明細書で議論される変異体ＣＯＲはまた、そのような保存的置換を含むことができる。
表１．保存的置換
【表１】
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【０２３５】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に応じて異なるクラスにグループ化されていてもよい：
ａ．疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
ｂ．中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
ｅ．鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
ｆ．芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２３６】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０２３７】
例示的な置換変異体は、例えば、ファージディスプレイベースのアフィニティー成熟技術を使用して、便利に生成され得るアフィニティー成熟抗体部位である。簡単に言えば、１または複数のＣＤＲ残基が変異され、変異体抗体部位がファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合アフィニティー）のためにスクリーニングされる。改変（例えば、置換）は、例えば、抗体部位アフィニティーを改善するために、ＨＶＲにおいて行われてもよい。そのような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照されたい）、および／または特異性決定残基（ＳＤＲ）で行われてもよく、結果として得られる変異体ＶＨまたはＶＬは、結合アフィニティーについて試験される。二次ライブラリーからの構築および再選択によるアフィニティー成熟化は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ'Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。
【０２３８】
アフィニティー成熟のいくつかの実施形態では、多様性は、様々な方法（例えば、エラーを起こしやすいＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指示突然変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望のアフィニティーを有する任意の抗体部位の変異体を同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６個の残基）が無作為化されるＨＶＲ指向的アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。特にＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３は標的化されることが多い。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、そのような改変が抗原を結合する抗体部位の能力を実質的に低下させない限り、置換、挿入、または欠失が、１または複数のＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合アフィニティーを実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）をＨＶＲに行ってもよい。そのような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」外またはＳＤＲ外にあり得る。上記で提供される変異体ＶＨおよびＶＬ配列のいくつかの実施形態では、各ＨＶＲは、改変されていないか、または１つ、２つもしくは３つ以下のアミノ酸置換を含む。
【０２４０】
突然変異誘発の標的とすることができる抗原結合ドメインの残基または領域を同定するための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ  （１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基群（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、それを中性アミノ酸または負荷電アミノ酸（例えばアラニンまたはポリアラニン）で置き換えて、抗原結合ドメインと抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に更なる置換を導入することもできる。これに代えて、またはこれに加えて、抗原−抗原結合ドメイン複合体の結晶構造を決定して、抗原結合ドメインと抗原どの間の接触点を同定することができる。そのような接触残基および近接残基は、置換候補として標的にするか、または除外することができる。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を有しているかどうかを決定することができる。
【０２４１】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００残基またはそれ以上を含むポリペプチドまでの長さのアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗原結合ドメインが挙げられる。抗原結合ドメインの他の挿入変種としては、抗原結合ドメインのＮ末端またはＣ末端と酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）または抗原結合ドメインの血清中半減期を増加させるポリペプチドとの融合が挙げられる。
核酸の発現
【０２４２】
本明細書に記載される異種核酸は、免疫細胞に一時的にまたは安定的に組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態では、異種核酸は、改変された免疫細胞において一過性に発現する。例えば、異種核酸は、異種遺伝子発現カセットを含む染色体外アレイにおいて、改変された免疫細胞の核内に存在していてもよい。異種核酸は、ウイルス法または非ウイルス法を含む、当該技術分野で知られている任意のトランスフェクション法または形質導入法を用いて、改変された哺乳動物に導入することができる。例示的な非ウイルストランスフェクション法には、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム、またはカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミン）を使用するなどの化学ベースのトランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞圧搾、ソノポレーション、光トランスフェクション、インペルフェクション、プロトプラスト融合、流体力学的送達、またはトランスポゾンなどの非化学的方法；遺伝子銃、マグネクストフェクションまたはマグネットアシストトランスフェクション、パーティクル・ガン法を使用するなどの粒子ベースの方法；およびヌクレオフェクションなどのハイブリッド法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、異種核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、異種核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、異種核酸は線状である。いくつかの実施形態では、異種核酸は環状である。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、異種核酸は、改変された免疫細胞のゲノム中に存在する。例えば、異種核酸は、ウイルス媒介インテグレーション、無作為インテグレーション、相同組換え法、ならびに部位特異的リコンビナーゼまたはインテグラーゼ、トランスポザーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するなどの部位特異的インテグレーション法を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の方法によって免疫細胞のゲノムに組み込まれてもよい。いくつかの実施形態では、異種核酸は、改変された免疫細胞のゲノムの特異的に設計された遺伝子座に組み込まれている。いくつかの実施形態では、異種核酸は、改変された免疫細胞のゲノムの統合ホットスポットに組み込まれている。いくつかの実施形態では、異種核酸は、改変された免疫細胞のゲノムの無作為な遺伝子座に組み込まれている。異種核酸の多重コピーが単一の改変された免疫細胞に存在する場合、異種核酸は、改変された免疫細胞のゲノムの複数の遺伝子座に組み込まれていてもよい。
【０２４４】
本明細書に記載される異種核酸（例えば、ＣＲ、ＣＣＯＲ、およびＣＯＲをコードする核酸）は、プロモーターに作用可能に連結することができる。いくつかの実施形態では、プロモーターは内因性プロモーターである。例えば、核酸（例えば、ＣＲ、ＣＣＯＲ、またはＣＯＲをコードする核酸）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法などの当該技術分野で知られている任意の方法を用いて、内因性プロモーターの下流にある改変された免疫細胞のゲノムにノックインされてもよい。いくつかの実施形態では、内因性プロモーターは、βーアクチンなどの豊富なタンパク質のプロモーターである。いくつかの実施形態では、内因性プロモーターは、誘導性プロモーターであり、例えば、改変された免疫細胞の内因性活性化シグナルによって誘導可能である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞がＴ細胞である場合、プロモーターは、Ｔ細胞活性化依存性プロモーター（例えば、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター）である。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、プロモーターは異種プロモーターである。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、異種核酸（例えば、ＣＲ、ＣＣＯＲ、またはＣＯＲをコードする核酸）は、構成的プロモーターに作用可能に連結されている。いくつかの実施形態では、異種核酸（例えば、ＣＲ、ＣＣＯＲ、またはＣＯＲをコードする核酸）は、誘導性プロモーターに作用可能に連結されている。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、ＣＲをコードする核酸に作用可能に連結されており、誘導性プロモーターは、ＣＣＯＲまたはＣＯＲをコードする核酸に作用可能に連結されている。いくつかの実施形態では、第１の誘導性プロモーターは、ＣＲをコードする核酸に作用可能に連結されており、第２の誘導性プロモーターは、ＣＣＯＲをコードする核酸に作用可能に連結されており、またはその逆である。いくつかの実施形態では、第１の誘導性プロモーターは、ＣＲをコードする核酸に作用可能に連結されており、第２の誘導性プロモーターは、ＣＯＲをコードする核酸に作用可能に連結されており、またはその逆である。いくつかの実施形態では、第１の誘導性プロモーターは、ＣＣＯＲをコードする核酸に作用可能に連結されており、第２の誘導性プロモーターは、ＣＯＲをコードする核酸に作用可能に連結されており、またはその逆である。いくつかの実施形態では、第１の誘導性プロモーターは第１の誘導条件によって誘導可能であり、第２の誘導性プロモーターは第２の誘導条件によって誘導可能である。いくつかの実施形態では、第１の誘導条件は、第２の誘導条件と同じである。いくつかの実施形態では、第１の誘導性プロモーターと第２の誘導性プロモーターとは同時に誘導される。いくつかの実施形態では、第１の誘導性プロモーターと第２の誘導性プロモーターとは、順次誘導され、例えば、第１の誘導性プロモーターは、第２の誘導性プロモーターよりも先に誘導され、または第１の誘導性プロモーターは、第２の誘導性プロモーターの後に誘導される。
【０２４７】
構成的プロモーターは、異種遺伝子（導入遺伝子とも呼ばれる）を宿主細胞内で構成的に発現させる。本明細書で企図される例示的な構成的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長因子−１α（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、およびＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＡＧＧ）とカップリングされたしたニワトリβーアクチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。そのような構成的プロモーターが導入遺伝子の発現を駆動する効率は、膨大な数の研究で広く比較されている。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅらは、初代ヒトＴ細胞におけるキメラ抗原受容体発現を駆動するためのＣＭＶ、ｈＥＦ１α、ＵｂｉＣおよびＰＧＫの効率を比較し、ｈＥＦ１αプロモーターが、最も高いレベルの導入遺伝子発現を誘導するだけでなく、それにＣＤ４およびＣＤ８ヒトＴ細胞中で最適に維持されたという結論を下した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３−１４６４（２００９））。いくつかの実施形態では、異種核酸中のプロモーターは、ｈＥＦ１αプロモーターである。
【０２４８】
誘導性プロモーターは、例えば、物理的条件、改変された免疫細胞の微小環境、または改変された免疫細胞の生理学的状態、誘導因子（すなわち、誘発剤）、またはそれらの組み合わせなどの１または複数の条件によって誘導され得る。いくつかの実施形態では、誘導条件は、改変された免疫細胞および／または医薬組成物を受ける対象における内因性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態では、誘導条件は、改変された免疫細胞の誘導因子、照射（例えば電離放射線、光）、温度（例えば熱）、酸化還元状態、腫瘍環境、および活性化状態からなる群から選択される。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導因子によって誘導可能である。いくつかの実施形態では、誘導因子は、化合物などの低分子である。いくつかの実施形態では、低分子は、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、アルコール、金属、またはステロイドからなる群から選択される。化学的に誘導されたプロモーターが最も広く研究されてきた。そのようなプロモーターとしては、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、アルコール、ステロイド、金属および他の化合物などの低分子化学物質の存在または非存在によって転写活性が制御されているプロモーターが含まれる。逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）とテトラサイクリン応答性エレメントプロモーター（ＴＲＥ）を用いたドキシサイクリン誘導システムが、現在のところ最も成熟したシステムである。国際公開第９４２９４４２号には、テトラサイクリン応答性プロモーターによる真核細胞における遺伝子発現の厳格な制御が記載されている。国際公開第９６０１３１３号には、テトラサイクリンで制御された転写調節因子が開示されている。さらに、Ｔｅｔ−ｏｎシステムなどのＴｅｔ技術が、例えば、ＴｅｔＳｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍのウェブサイトに記載されている。本出願の治療用タンパク質の発現を駆動するために、既知の化学的に制御されたプロモーターのいずれかを使用することができる。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、誘導因子は、成長因子、ホルモン、または細胞表面受容体に対するリガンド、例えば腫瘍抗原を特異的に結合するポリペプチドなどのポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、改変された免疫細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、異種核酸中の核酸によってコードされる。多くのポリペプチド誘導因子も当該技術分野で知られており、それらは本発明での使用に適している場合がある。例えば、エクジゾン受容体系の遺伝子スイッチ、プロゲステロン受容体系の遺伝子スイッチ、およびエストロゲン受容体系の遺伝子スイッチは、ステロイド受容体由来のトランスアクチベーターを用いた遺伝子スイッチに属する（国際公開第９６３７６０９号、国際公開第９７３８１１７号など）。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、誘導因子は、低分子成分と１または複数のポリペプチドの両方を含む。例えば、ポリペプチドの二量体化に依存する誘導性プロモーターは当該技術分野で知られており、本発明での使用に適している場合がある。１９９３年に開発された最初の低分子ＣＩＤシステムは、薬物ＦＫ５０６の誘導体であるＦＫ１０１２を用いてＦＫＢＰのホモ二量体化を誘導した。同様の戦略を採用することにより、Ｗｕらは、Ｒａｐａｌｏｇ／ＦＫＰＢ−ＦＲＢ＊およびＧｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｅ／ＧＩＤ１−ＧＡＩ二量体化依存性遺伝子スイッチを用いて、オンスイッチでＣＡＲ−Ｔ細胞を滴定可能にすることに成功した（Ｃ．−Ｙ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５０，ａａｂ４０７７（２０１５））。他の二量体化依存性スイッチ系としては、Ｃｏｕｍｅｒｍｙｃｉｎ／ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢ（Ｎａｔｕｒｅ  ３８３（６５９６）：１７８−８１）、およびＨａＸＳ／Ｓｎａｐ−ｔａｇ−ＨａｌｏＴａｇ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０  （４）：５４９−５７）が挙げられる。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、プロモーターは光誘導性プロモーターであり、その誘導条件は光である。哺乳動物細胞における遺伝子発現を制御するための光誘導性プロモーターも当該技術分野で周知である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３２，１５６５−１５６８（２０１１）；Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，２６６−２６９（２０１２）；Ｎａｔｕｒｅ  ５００：４７２−４７６（２０１３）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８：１２０２−１２１２（２０１５））を参照されたい。そのような遺伝子制御系は、（１）ＤＮＡ結合、または（２）転写活性化ドメインのＤＮＡ結合タンパク質へのリクルートメントの調整に基づいて２つに大きく分類され得る。例として、青色光（４８０ｎｍ）に応答して細胞内カルシウムの増加を誘発し、カルシニューリン媒介のＮＦＡＴの動員を結果もたらすメラノプシンをベースとした合成哺乳動物青色光制御転写系を開発し、哺乳動物細胞において試験を行った。さらに最近では、ＭｏｔｔＡ−Ｍｅｎａらは、ヒト細胞株およびゼブラフィッシュ胚において、高レベルの青色光感受性の転写開始制御を付与する自然発生のＥＬ２２２転写因子から開発された新しい誘導性遺伝子発現系を説明している（Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０（３）：１９６−２０２（２０１４））。さらに、シロイヌナズナの光受容体フィトクロムＢ（ＰｈｙＢ）とフィトクロム相互作用因子６（ＰＩＦ６）の赤色光誘起相互作用を利用して、赤色光をトリガーとした遺伝子発現制御を行った。さらに、紫外線Ｂ（ＵＶＢ）誘導性遺伝子発現系も開発され、哺乳動物細胞における標的遺伝子の転写に効率的であることが判明した（Ｃｈａｐｔｅｒ  ２５  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｊａｎ．２０ｔｈ，２０１５）。本明細書に記載される光誘導性プロモーターのいずれかを、本発明の治療用タンパク質の発現を駆動するために使用することができる。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、光誘導性分子と光との組み合わせによって誘導される光誘導性プロモーターである。例えば、化学的誘導因子上の光開裂可能な光ケージ基は、光照射または他の手段により光ケージ基が除去されない限り、誘導因子を不活性に保つ。そのような光誘導性分子としては、低分子化合物、オリゴヌクレオチド、タンパク質などが挙げられる。例えば、ケージドエクジゾン、ｌａｃオペロンと共に使用するためのケージドＩＰＴＧ、リボザイム媒介性遺伝子発現のためのケージドトヨカマイシン、Ｔｅｔ−ｏｎシステムで使用するためのケージドドキシサイクリン、および光媒介性ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化のためのケージドＲａｐａｌｏｇが開発されている（例えば、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１６（３−４）：２９２−２９９（２０１２）を参照されたい）。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、プロモーターは放射線誘導性プロモーターであり、誘導条件は放射線、例えば電離放射線である。放射線誘導性プロモーターによる導入遺伝子発現の制御も当該技術分野で公知である。細胞に照射すると遺伝子発現の改変が起こる。例えば、「前初期遺伝子」として知られる一群の遺伝子は、電離放射の際に即座に反応することができる。例示的な前初期遺伝子としては、Ｅｒｇ−１、ｐ２１／ＷＡＦ−１、ＧＡＤＤ４５α、ｔ−ＰＡ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＮＦ−κＢ、およびＡＰ１が挙げられるが、これらに限定されない。これらの前初期遺伝子は、それらのプロモーター領域に放射線応答性配列を有する。Ｅｒｇ−１プロモーターにはコンセンサス配列ＣＣ（Ａ／Ｔ）６ＧＧが見出されており、血清応答エレメントと呼ばれるか、またはＣＡｒＧエレメントとして知られている。放射線誘導性プロモーターと導入遺伝子との組み合わせは広く研究されており、治療上の利益を有効にもたらすことが判明している。例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．６（７）：１００５−１２（２００７）およびＣｈａｐｔｅｒ  ２５  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｊａｎ．２０ｔｈ，２０１５を参照されたい。任意の前初期遺伝子プロモーター、または血清応答エレメントを含む任意のプロモーターが、本発明の治療用タンパク質の発現を駆動する放射線誘導性プロモーターとして有用な可能性がある。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、プロモーターは熱誘導性プロモーターであり、誘導条件は熱である。導入遺伝子の発現を駆動する熱誘導性プロモーターも、当該技術分野において広く研究されてきた。Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ４０、およびＨｓｐ１０などを含む、熱ショックまたはストレスタンパク質（ＨＳＰ）は、熱または他の物理的および化学的ストレスのもとで細胞を保護する重要な役割を果たしている。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター、ならびに増殖停止およびＤＮＡ損傷（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ）（ＧＡＤＤ）１５３プロモーターを含む、いくつかの熱誘導性プロモーターが前臨床試験において試みられてきた。１９８５年に初めて記載されたヒトｈｓｐ７０Ｂ遺伝子のプロモーターは、最も高効率な熱誘導性プロモーターの１つであると考えられている。Ｈｕａｎｇらは、ｈｓｐ７０Ｂ−ＥＧＦＰ、ｈｓｐ７０Ｂ−ＴＮＦα、およびｈｓｐ７０Ｂ−ＩＬ１２のコード配列の導入後、腫瘍細胞が、熱処理された際に極めて高い導入遺伝子発現を発現した一方で、熱処理が行われなかった場合、導入遺伝子の発現は検出されなかったことを報告した。そして、インビボにおいて、マウスのＩＬ１２導入遺伝子＋熱処理群で腫瘍増殖が有意に遅延した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３４３５（２０００））。別のグループの科学者たちは、ＨＳＶーｔｋ自殺遺伝子をｈｓｐ７０Ｂプロモーターに連結し、マウス乳癌を有するヌードマウスでこの系を試験した。ｈｓｐ７０Ｂ−ＨＳＶｔｋコード配列を腫瘍に投与し、熱処理したマウスは、熱処理を行わなかった対照と比較して、腫瘍の退縮と有意な生存率の向上を示した（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：２４５３（２０００））。当該技術分野で知られている更なる熱誘導性プロモーターは、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２５  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｊａｎ．２０ｔｈ，２０１５に見出すことができる。本明細書に議論される熱誘導性プロモーターのいずれかを、本発明の治療用タンパク質の発現を駆動するために使用することができる。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、プロモーターは酸化還元状態によって誘導可能である。酸化還元状態によって誘導可能な例示的なプロモーターとしては、誘導性プロモーターおよび低酸素誘導性プロモーターが挙げられる。例として、Ｐｏｓｔ  ＤＥらは、ＨＩＦ活性腫瘍細胞における導入遺伝子の発現を特異的かつ強力に誘導する低酸素誘導因子（ＨＩＦ）応答性プロモーターを開発した（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１８０１−１８０７（２００１）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７：６８７２−６８８１（２００７））。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、改変された免疫細胞の内因性活性化シグナルなどの生理学的状態によって誘導可能である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞がＴ細胞である場合、プロモーターは、改変されたＴ細胞の内因性活性化シグナルによって誘導可能なＴ細胞活性化依存性プロモーターである。いくつかの実施形態では、改変されたＴ細胞は、ＰＭＡ、イオノマイシン、またはフィトヘマグルチニンなどの誘導因子によって活性化される。いくつかの実施形態では、改変されたＴ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体または改変された受容体（例えば組換えＴＣＲもしくはＣＡＲ）を介した腫瘍細胞上の腫瘍抗原の認識によって活性化される。いくつかの実施形態では、改変されたＴ細胞は、免疫チェックポイントの遮断により、例えば、改変されたＴ細胞または第２の改変された免疫細胞によって発現される免疫調節剤により活性化される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化依存性プロモーターはＩＬ−２プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化依存性プロモーターはＮＦＡＴプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化依存性プロモーターは、ＮＦκＢプロモーターである。
【０２５８】
いかなる理論または仮説にも拘束されるものではないが、ＩＬ−２プロモーターからの遺伝子転写によって開始されるＩＬ−２の発現は、Ｔ細胞活性化の主要な活動である。ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ）、またはイオノマイシン、またはフィトヘマグルチニンによるヒトＴ細胞の非特異的刺激の結果、刺激されたＴ細胞からのＩＬ−２分泌が起こる。ＩＬ−２プロモーターは、遺伝子改変されたＴ細胞における活性化誘導性導入遺伝子発現のために研究された（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：９７（２００６））。ヒトＴ細胞株において、ＩＬ−２プロモーターがＰＭＡ／ＰＨＡ−Ｐ活性化の存在下でレポーター遺伝子の発現を開始するのに効率的であることを見出した。Ｔ細胞受容体刺激は細胞内反応のカスケードを開始し、細胞質カルシウム濃度を上昇させ、その結果、ＮＦＡＴとＮＦκＢの両方の核内翻訳をもたらす。活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）のメンバーは、Ｔリンパ球の免疫応答を媒介するＣａ２＋依存性転写因子である。ＮＦＡＴは、活性化Ｔ細胞における誘導性インターロイキンー２（ＩＬ−２）発現に重要であることが示されている（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５（１１）：６２９９−３１０（１９９５）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：４７２−４８４（２００５））。本願発明者らは、ヒトＴ細胞株において、ＮＦＡＴプロモーターがＰＭＡ／ＰＨＡ−Ｐ活性化の存在下でレポーター遺伝子の発現を開始するのに有効であることを見出した。核内因子κＢ（ＮＦκＢ）を含む他の経路も、Ｔ細胞の活性化を介して導入遺伝子の発現を制御するために用いることができる。
免疫細胞
【０２５９】
本発明に有用な例示的な免疫細胞としては、樹状細胞（未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞を含む）、Ｔリンパ球（例えばナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、細胞毒性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。免疫細胞の下位集団は、当該技術分野で知られている１または複数の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３３など）の存在または非存在によって定義することができる。医薬組成物が複数の改変された哺乳動物免疫細胞を含む場合、改変された哺乳動物免疫細胞は、免疫細胞型の特定の下位集団、免疫細胞型の下位集団の組み合わせ、または２つ以上の免疫細胞型の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、均質な細胞集団に存在する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞において増強された異種細胞集団に存在する。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はリンパ球ではない。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、養子免疫療法に適している。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＰＢＭＣに由来する免疫細胞である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はＮＫ細胞である。
改変された免疫細胞の調製
【０２６０】
本明細書に記載される様々なコンストラクト（例えば、ＣＲ、ＣＣＯＲ、および／またはＣＯＲ）を発現する免疫細胞は、ＣＲ、ＣＣＯＲ、および／またはＣＯＲをコードする核酸などの１または複数の核酸（例えば、レンチウイルスベクターを含む）を免疫細胞に導入することによって生成することができる。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクター技術は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、および他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。
【０２６１】
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスベースのシステムが開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。異種核酸は、当該技術分野で知られている技術を用いて、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。組換えウイルスは、次に、単離され、インビトロまたはエクスビボで改変された免疫細胞に送達され得る。多くのレトロウイルスシステムが当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態では、自己不活化レンチウイルスベクターが使用される。例えば、免疫調節剤（例えば免疫チェックポイント阻害剤）をコードする配列を有する自己不活化レンチウイルスベクターおよび／またはキメラ抗原受容体を有する自己不活化レンチウイルスベクターは、当該技術分野で知られているプロトコルを用いてパッケージングすることができる。得られたレンチウイルスベクターは、当該技術分野で知られている方法を用いて、哺乳動物細胞（例えば、初代ヒトＴ細胞など）を形質導入するために使用することができる。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、異種核酸の導入後、エクスビボで増殖される。いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、または１４日のうちのいずれかの期間だけ増殖するように培養される。いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、または１４日以下のうちのいずれかの期間だけ培養される。いくつかの実施形態では、形質導入またはトランスフェクトされた哺乳動物細胞をさらに評価またはスクリーニングして、改変された免疫細胞を選択する。
【０２６３】
免疫細胞への１または複数の核酸の導入は、当該技術分野で知られている技術を用いて達成することができる。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞（改変されたＴ細胞など）は、インビボで複製することができ、その結果、標的抗原の発現に関連する疾患（例えばウイルス感染）の持続的な制御につながり得る長期持続性が得られる。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＩＶなどの感染性疾患を有するか、または発症の危険性がある患者の治療のために、本明細書に記載される改変された免疫細胞を投与することに関する。いくつかの実施形態では、自己リンパ球注入が治療に使用される。自家ＰＢＭＣは、治療を必要とする患者から採取され、Ｔ細胞は、本明細書に記載される方法および当該技術分野で知られている方法を用いて活性化および拡大増殖され、次いで、患者に再び注入される。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、ＨＩＶの治療に使用するために、本明細書に記載される改変された免疫細胞が提供される。この細胞は、インビボでロバストな拡大増殖を受けることができ、血液および骨髄において長期間高レベルで持続する標的抗原特異的なメモリー細胞を確立することができる。いくつかの実施形態では、患者に注入された改変された免疫細胞は、ウイルス感染した細胞を除去することができる。いくつかの実施形態では、患者に注入された改変された免疫細胞は、ウイルス感染した細胞を除去することができる。
【０２６６】
免疫細胞の拡大増殖および遺伝子修飾に先立って、対象から免疫細胞源が得られる。免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多くの供給源から得ることができる。本発明のいくつかの実施形態では、当該技術分野で利用可能ないくつもの数の免疫細胞株を使用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、免疫細胞は、当業者に知られているいくつもの技術、例えばＦＩＣＯＬＬ（商標）分離を使用して、対象から採取された血液の単位から得ることができる。いくつかの実施形態では、個体の循環血からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核化白血球、赤血球および血小板を含む。いくつかの実施形態では、アフェレーシスによって採取された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、それに続く処理ステップのために適切な緩衝剤または培地中に細胞を配置してもよい。いくつかの実施形態では、細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠いていてもよく、またはすべてではないものの、多くの二価のカチオンを欠いていてもよい。当業者が容易に理解するように、洗浄ステップは、当業者に公知の方法によって、例えば、製造元の指示に従って、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅまたはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を使用することによって達成され得る。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝剤、例えば、無Ｃａ２＋、無Ｍｇ２＋ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、または緩衝剤の有無にかかわらず他の食塩水溶液中に再懸濁させてもよい。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を直接培地中に再懸濁させてもよい。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えばＴ細胞）は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離によって、またはカウンターフロー遠心分離溶出によって単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞、例えばＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の特異的下位集団は、ポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な期間にわたって、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）共役ビーズ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔとインキュベートすることによって単離される。いくつかの実施形態では、期間は約３０分である。いくつかの実施形態では、期間は、３０分〜３６時間以上の範囲（これらの値の間のすべての範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、期間は、少なくとも１、２、３、４、５または６時間である。いくつかの実施形態では、期間は、１０〜２４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は２４時間である。他の細胞型に比べてＴ細胞が少ない任意の状況では、Ｔ細胞の分離のために、より長いインキュベーション時間が使用される可能性がある。さらに、より長いインキュベーション時間を使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を高めることができる。このように、間を単に短縮もしくは延長することによって、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合するようになり、および／またはビーズ対Ｔ細胞の比率を増減させることによって、Ｔ細胞の下位集団を、培養開始の時点で、もしくはプロセス中の他の時点で、有利にまたは不利に優先的に選択することができる。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増減させることにより、Ｔ細胞の下位集団を、培養開始時または他の所望の時点で優先的に選択することができる。当業者は、本発明の文脈において、複数ラウンドの選択も使用され得ることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、活性化および拡大増殖プロセスにおいて、選択手順を実施し、「選択されていない」細胞を使用することが望まれ得る。「選択されていない」細胞をまた、更なるラウンドの選択に供することができる。
【０２６８】
ネガティブ選択によるＴ細胞集団の富化は、ネガティブ選択された細胞に独自の表面マーカーに指向された抗体の組み合わせを用いて達成することができる。１つの方法は、ネガティブ選択を受けた細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向されたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを介した細胞分取および／または選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。いくつかの実施形態では、典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を富化またはポジティブ選択することが望まれ得る。あるいは、いくつかの実施形態では、Ｔ調節細胞は、抗ＣＤ２５共役ビーズまたは他の類似の選択方法によって枯渇される。
【０２６９】
ポジティブまたはネガティブ選択による細胞の所望の集団の単離のために、細胞の濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変えてもよい。いくつかの実施形態では、細胞とビーズとの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞が一緒に混合される体積を大幅に減少させること（すなわち、細胞の濃度を増加させること）が望まれ得る。例えば、いくつかの実施形態では、約２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。いくつかの実施形態では、約１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。いくつかの実施形態では、約１億個／ｍｌ超の細胞が使用される。いくつかの実施形態では、約１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、または５０００万個／ｍｌの細胞のうちのいずれのかの個数の細胞の濃度が使用される。いくつかの実施形態では、約７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個／ｍｌの細胞うちのいずれかの個数の細胞の濃度が使用される。いくつかの実施形態では、約１億２５０００万個または約１億５００００万個／ｍｌの細胞の濃度が使用される。高濃度を使用すると、細胞の収率の増加、細胞の活性化、および細胞の拡大増殖がもたらされ得る。さらに、高濃度の細胞を使用することで、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞、または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（すなわち、白血病の血液、腫瘍組織など）から、より効率的に捕捉することが可能になる。そのような細胞の集団は、治療的価値を有し得、取得することが望ましい。例えば、高濃度の細胞を使用することで、通常はＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞をより効率的に選択できるようになる。
【０２７０】
核酸（望ましい核酸ＣＲ、ＣＣＯＲおよび／またはＣＯＲなど）を発現させるための免疫細胞の遺伝子修飾の前または後のいずれであっても、免疫細胞を活性化して拡大増殖させることができる。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される免疫細胞（例えばＴ細胞）は、それに結合したＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを有する表面との接触によって拡大増殖される。特に、Ｔ細胞集団は、例えば、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＣＤ２抗体との接触によって、あるいはカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、刺激されてもよい。Ｔ細胞の表面上のアクセサリ分子の共刺激のために、アクセサリ分子を結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体が使用される。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，ブサンゾン、フランス国）が挙げられ、当該技術分野で一般的に知られている他の方法と同様に用いることができる（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
遺伝子修飾
【０２７２】
いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＣＲ５の発現をブロックするか、または減少させるように修飾された免疫細胞（例えばＴ細胞）である。遺伝子発現をかく乱するための細胞の修飾としては、例えば、ＲＮＡ干渉（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−またはＴＡＬＥＮベースの遺伝子ノックアウト）などを含む、当該技術分野で知られている任意のそのような技術が挙げられる。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５の発現が低下した改変された免疫細胞（例えばＴ細胞）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて生成される。遺伝子編集のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの概説については、例えば、Ｊｉａｎ  Ｗ  ＆  Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ＬＡ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９，２０１５；Ｈｓｕ  ＰＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５７（６）：１２６２−１２７８，２０１４；およびＯ'Ｃｏｎｎｅｌｌ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５１６：２６３‐２６６，２０１４を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の内因性ＴＣＲ鎖の１つまたは両方の発現が低下した改変された免疫細胞（例えば、改変されたＴ細胞）は、ＴＡＬＥＮベースのゲノム編集を用いて生成される。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５遺伝子（またはＴＣＲ遺伝子）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を用いて不活化される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、２つの主な特徴：短いガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼまたはＣａｓタンパク質を含む。Ｃａｓタンパク質はｇＲＮＡに結合することができ、このｇＲＮＡには、目的の遺伝子を直接標的化し、それに続けてノックアウトを可能にする改変されたスペーサーが含まれている。一度標的化されると、Ｃａｓタンパク質はＤＮＡ標的配列を切断し、その結果、遺伝子をノックアウトする。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５遺伝子（またはＴＣＲ遺伝子）は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（商標））ベースのゲノム編集を用いて不活化される。ＴＡＬＥＮ（商標）ベースのゲノム編集には、ＤＮＡの特定の領域を標的化するように改変することができる制限酵素の使用が含まれる。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）のＤＮＡ結合ドメインが、ＤＮＡ切断ドメインに融合されている。ＴＡＬＥは、目的の配列にヌクレアーゼを標的化する役割を担い、切断ドメイン（ヌクレアーゼ）はＤＮＡを切断する役割を担い、その結果、ＤＮＡのそのセグメントが除去され、それに続けて遺伝子がノックアウトされる。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ゲノム編集法を用いて、ＣＣＲ５遺伝子（またはＴＣＲ遺伝子）が不活化される。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインとから構成される人工制限酵素である。ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡの特定の領域を標的化するように改変することができる。ＤＮＡ切断ドメインは、目的のＤＮＡ配列を切断する役割を担い、その結果、ＤＮＡのそのセグメントが除去され、それに続けて遺伝子がノックアウトされる。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５遺伝子（またはＴＣＲ遺伝子）の発現は、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて低下される。ｓｉＲＮＡ分子は、目的の遺伝子からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に相補的な２０〜２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド二本鎖である。ｓｉＲＮＡは、これらのｍＲＮＡを標的化して破壊する。標的化により、ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡ転写物が翻訳されるのを防ぎ、それによって細胞がタンパク質を産生するのを防ぐ。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５遺伝子（またはＴＣＲ遺伝子）の発現は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して低下される。ｍＲＮＡを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に当該技術分野で知られており、遺伝子発現をダウンレギュレートするために日常的に使用されている。Ｗａｔｔｓ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，Ｄ（２０１２）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２２６（２）：３６５−３７９．）Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓを参照されたい。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変された免疫細胞のいずれかに従う改変された免疫細胞の異種細胞集団を富化する方法が提供される。
【０２８０】
標的抗原および標的リガンドに特異的に結合する改変された免疫細胞（例えば改変されたＴ細胞）の特異的下位集団を、ポジティブ選択技術によって富化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞（例えば改変されたＴ細胞）は、所望の改変された免疫細胞のポジティブ選択に十分な期間にわたって、標的抗原共役ビーズおよび／または標的リガンド共役ビーズとインキュベートすることによって富化される。いくつかの実施形態では、期間は約３０分である。いくつかの実施形態では、期間は、３０分〜３６時間以上の範囲（これらの値の間のすべての範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、期間は、少なくとも１、２、３、４、５または６時間である。いくつかの実施形態では、期間は１０〜２４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間は２４時間である。異種細胞集団の中に低レベルで存在する改変された免疫細胞を分離するためには、２４時間などの長いインキュベーション時間を使用することで、細胞の収率を高めることができる。他の細胞型に比べて改変された免疫細胞が少ない任意の状況では、改変された免疫細胞の単離のために、より長いインキュベーション時間が使用される可能性がある。当業者は、本発明の文脈において、複数ラウンドの選択も使用され得ることを認識するであろう。
【０２８１】
ポジティブ選択による改変された免疫細胞の所望の集団の単離のために、細胞の濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変えてもよい。いくつかの実施形態では、細胞とビーズとの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞が一緒に混合される体積を大幅に減少させること（すなわち、細胞の濃度を増加させること）が望まれ得る。例えば、いくつかの実施形態では、約２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。いくつかの実施形態では、約１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。いくつかの実施形態では、約１億個／ｍｌ超の細胞が使用される。いくつかの実施形態では、約１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、または５０００万個／ｍｌの細胞のうちのいずれかの個数の細胞の濃度が使用される。いくつかの実施形態では、約７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個／ｍｌの細胞のうちのいずれかの個数の細胞の濃度が使用される。いくつかの実施形態では、約１億２５０００万個または約１億５００００万個／ｍｌの細胞の濃度が使用される。高濃度を使用すると、細胞の収率の増加、細胞の活性化、および細胞の拡大増殖がもたらされ得る。さらに、高濃度の細胞を使用することで、ＣＲ、ＣＣＯＲ、および／またはＣＯＲを弱く発現し得る改変された免疫細胞をより効率的に捕捉することが可能になる。
【０２８２】
本明細書に記載される任意のそのような実施形態のいくつかでは、富化の結果、改変された免疫細胞の枯渇は最小限に抑えられるか、または実質的に枯渇しなくなる。例えば、いくつかの実施形態では、富化の結果、改変された免疫細胞の約５０％未満（例えば、約４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５％未満のうちのいずれか）が枯渇することになる。免疫細胞の枯渇は、本明細書に記載されている任意の手段を含む、当該技術分野で知られている任意の手段によって決定することができる。
【０２８３】
本明細書に記載される任意のそのような実施形態のいくつかでは、富化の結果、改変された免疫細胞の末端分化は最小限に抑えられるか、または実質的に起こらなくなる。例えば、いくつかの実施形態では、富化の結果、改変された免疫細胞の約５０％未満（例えば、約４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５％未満のうちのいずれか）が末端分化する。免疫細胞の分化は、本明細書に記載されている任意の手段を含む、当該技術分野で知られている任意の手段によって決定することができる。
【０２８４】
本明細書に記載される任意のそのような実施形態のいくつかでは、富化の結果、改変された免疫細胞上でのＣＲ、ＣＣＯＲ、および／またはＣＯＲの内在化が最小限に抑えられるか、または実質的に起こらなくなる。例えば、いくつかの実施形態では、富化の結果、改変された免疫細胞上で約５０％未満（例えば、約４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５％未満のうちのいずれか）のＣＲ、ＣＣＯＲ、および／またはＣＯＲが内在化される。改変された免疫細胞上でのＣＲ、ＣＣＯＲ、またはＣＯＲの内在化は、本明細書に記載されている任意の手段を含む、当該技術分野で知られている任意の手段によって決定することができる。
【０２８５】
本明細書に記載される任意のそのような実施形態のいくつかでは、富化の結果、改変された免疫細胞の増殖が増加することになる。例えば、いくつかの実施形態では、富化の結果、富化後の改変された免疫細胞の数は少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００％以上のうちのいずれか）増加する。
【０２８６】
このように、いくつかの実施形態では、ＣＲ標的抗原に特異的に結合するＣＲおよび／またはＣＣＯＲ標的リガンドに特異的に結合するＣＣＯＲを発現する改変された免疫細胞の異種細胞集団を富化する方法であって、ａ）標的抗原またはそれに含まれる１または複数のエピトープを含む第１の分子および／または標的リガンドまたはそれに含まれる１または複数のエピトープを含む第２分子を異種細胞集団に接触させて、第１の分子に結合した改変された免疫細胞を含む複合体および／または第２の分子に結合した改変された免疫細胞を含む複合体を形成するステップ、ならびにｂ）複合体を異種細胞集団から分離し、それによって改変された免疫細胞が富化された細胞集団を生成する段階を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の分子は、固体支持体に個々に固定化されている。いくつかの実施形態では、固体支持体は微粒子（例えばビーズ）である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面（例えばウェルの底）である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の分子は、個々にタグで標識されている。いくつかの実施形態では、タグは、蛍光分子、アフィニティータグ、または磁気タグである。いくつかの実施形態では、方法はさらに、第１および／または第２の分子から改変された免疫細胞を溶出し、溶出液を回収する段階を含む。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、免疫細胞または改変された免疫細胞は、例えば、ネガティブ富化の使用により、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞が富化され、それによって、細胞混合物は、物理的（カラム）および磁気的（ＭＡＣＳ磁気ビーズ）精製ステップの両方を含む２段階の精製方法を使用して精製される（Ｇｕｎｚｅｒ，Ｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５８（１−２）：５５−６３）。他の実施形態では、細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞の富化のために特異的に設計されたＴ細胞富化カラムの使用により、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞を富化することができる。さらに他の実施形態では、細胞集団は、市販のキットを使用することにより、ＣＤ４＋細胞を富化することができる。いくつかの実施形態では、市販のキットは、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））である。他の実施形態では、市販のキットは、ＭａｇｎｉＳｏｒｔ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。さらに他の実施形態では、市販の富化キットは、当業者に知られているものである。
医薬組成物
【０２８８】
また、本明細書に記載される改変された免疫細胞（例えばＴ細胞）を含む改変された免疫細胞組成物（例えば医薬組成物、本明細書では製剤とも呼ばれる）も本明細書に提供される。
【０２８９】
組成物は、同じ細胞型で、同じＣＲおよび／またはＣＣＯＲを発現する改変された免疫細胞を含む同種細胞集団、または異なる細胞型で、異なるＣＲ、異なるＣＣＯＲ、および／または異なるＣＯＲを発現する改変された免疫細胞を含む複数の改変された免疫細胞集団を含む異種細胞集団であってもよい。組成物はさらに、改変された免疫細胞ではない細胞を含んでいてもよい。
【０２９０】
このように、いくつかの実施形態では、同じ細胞型で、同じＣＲ、ＣＣＯＲ、および／またはＣＯＲを発現する改変された免疫細胞（例えば改変されたＴ細胞）の同種細胞集団を含む改変された免疫細胞組成物が提供される。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、およびサプレッサ−Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞組成物は医薬組成物である。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、または異なる細胞型で、異なるＣＲ、異なるＣＣＯＲ、および／または異なるＣＯＲを発現する改変された免疫細胞を含む複数の改変された免疫細胞集団を含む異種細胞集団を含む改変された免疫細胞組成物が提供される。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体、例えばヒト個体に投与するのに適している。いくつかの実施形態では、医薬組成物は注射に適している。いくつかの実施形態では、医薬組成物は注入に適している。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、細胞培地を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、エンドトキシンまたはアレルゲン性タンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、「実質的に含まない」とは、医薬組成物の総体積または総重量の約１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％未満、１ｐｐｍ未満のいずれかである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、マイコプラズマ、微生物剤、および／または伝染性疾患剤を含まない。
【０２９３】
本出願人の医薬組成物は、任意の数の改変された免疫細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、改変された免疫細胞の単一コピーを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、改変された免疫細胞の少なくとも約１、１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８以上のいずれかのコピーを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単一のタイプの改変された免疫細胞からなる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２種類の改変された免疫細胞を含み、ここで、異なる種類の改変された免疫細胞は、その細胞源、細胞タイプ、発現された治療用タンパク質、免疫調節剤、および／またはプロモーターなどによって異なる。
【０２９４】
組成物の調製中の様々な時点で、細胞を凍結保存することが必要であるか、または有益であり得る。「冷凍／凍結」と「冷凍保存／凍結保存」という用語は、互換的に使用することができる。凍結には凍結乾燥が含まれる。
【０２９５】
特定の実施形態では、細胞は、培地から採取され、洗浄され、治療上有効な量で担体に濃縮され得る。例示的な担体としては、食塩水、緩衝食塩水、生理食塩水、水、ハンクス溶液、リンゲル溶液、ＮｏｎｎｏｓｏＬ−Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ）、ＰｌａｓｍＡ−Ｌｙｔｅ  Ａ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｍｏｒｔｏｎ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２９６】
特定の実施形態では、担体に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または他のヒト血清成分またはウシ胎児血清を加えることができる。特定の実施形態では、注入用の担体としては、５％ＨＳＡまたはデキストロースを含む緩衝食塩水が挙げられる。更なる等張化剤としては、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、またはマンニトールなどの三価以上の糖アルコールを含む多価糖アルコールが挙げられる。
【０２９７】
担体としては、緩衝剤、例えばクエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フマル酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、シュウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、および／またはトリメチルアミン塩を挙げることができる。
【０２９８】
安定剤は、増量剤から容器壁への細胞の付着を防止するのに役立つ添加剤にまで及ぶ機能を持つことができる医薬品添加剤の幅広いカテゴリーを指す。典型的な安定剤としては、多価糖アルコール；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、およびトレオニン；有機糖または糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール、およびシクリトール、例えばイノシトール；ＰＥＧ；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（すなわち、＜１０個の残基）；タンパク質、例えばＨＳＡ、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；単糖類、例えばキシロース、マンノース、フルクトースおよびグルコース；二糖類、例えばラクトース、マルトースおよびスクロース；三糖類、例えばラフィノース、および多糖類、例えばデキストランを挙げることができる。
【０２９９】
必要な場合または有益な場合には、組成物は、注射部位での疼痛を和らげるために、リドカインなどの局所麻酔薬を含むことができる。
【０３００】
例示的な防腐剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、および３−ペンタノールが挙げられる。
【０３０１】
組成物内の細胞の治療上有効な量は、１０２個の細胞より多い、１０３個の細胞より多い、１０４個の細胞より多い、１０５個の細胞より多い、１０６個の細胞より多い、１０７個の細胞より多い、１０８個の細胞より多い、１０９個の細胞より多い、１０１０個の細胞より多い、または１０１１個の細胞より多くあり得る。
【０３０２】
本明細書に開示される組成物および製剤では、細胞は、一般的に、１リットル以下、５００ｍｌ以下、２５０ｍｌ以下、または１００ｍｌ以下の体積である。したがって、投与される細胞の密度は、典型的には、１０４個の細胞／ｍｌ、１０７個の細胞／ｍｌ、または１０８個の細胞／ｍｌより大きい。
【０３０３】
また、本明細書に記載されるＣＲ、ＣＣＯＲおよび／またはＣＯＲをコードする核酸のいずれかを含む核酸組成物（例えば医薬組成物、本明細書では製剤とも呼ばれる）も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、核酸組成物は医薬組成物である。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、等張化剤、医薬品添加剤、希釈剤、増粘剤、安定剤、緩衝剤、および／または防腐剤；および／または水性賦形剤、例えば精製水、砂糖水溶液、緩衝液、生理食塩水、ポリマー水溶液、またはＲＮａｓｅ遊離水なのいずれかをさらに含み得る。そのような添加剤や水性賦形剤の添加量は、核酸組成物の使用形態に応じて適宜選択することができる。
【０３０４】
本明細書に開示される組成物および製剤は、例えば、注射、注入、灌流、または洗浄による投与のために調製することができる。組成物および製剤はさらに、骨髄注射、静脈内注射、皮内注射、動脈内注射、鼻腔内注射、リンパ管内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、膀胱内注射、膣内注射、直腸内注射、局所注射、髄腔内注射、筋肉内注射、濾胞内注射、および／または皮下注射のために、さらに製剤化することができる。
【０３０５】
インビボ投与に使用する製剤は滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌ろ過膜を介したろ過によって容易に達成される。
医薬品添加剤
【０３０６】
本発明の医薬組成物は、治療目的に有用である。このように、免疫調節剤または他の治療用タンパク質を発現する生産細胞などの改変された免疫細胞を含む他の組成物とは異なり、本発明の医薬組成物は、個体への投与に適した薬学的に許容される医薬品添加剤を含む。
【０３０７】
適切な薬学的に許容される医薬品添加剤は、緩衝剤、例えば中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリジン；酸化防止剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される医薬品添加剤は自己血清を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される医薬品添加剤はヒト血清を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される医薬品添加剤は、非毒性、生体適合性、非免疫原性、生分解性であり、宿主の防御機構による認識を回避することができる。医薬品添加剤はまた、保存安定剤、湿潤剤、乳化剤などのアジュバントを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される医薬品添加剤は、改変された免疫細胞、免疫調節剤またはその分泌された他の治療用タンパク質の安定性を高める。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される医薬品添加剤は、免疫調節剤または、改変された免疫細胞によって分泌される他の治療用タンパク質の凝集を減少させる。最終形態は、滅菌であってもよく、また、中空針のなどの注入デバイスを容易に通過させることができるものであってよい。適切な粘度は、医薬品添加剤の適切な選択によって達成および維持され得る。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約４．５〜約９．０の範囲のｐＨ（例えば、約５．０〜約８．０、約６．５〜約７．５、または約６．５〜約７．０のうちのいずれか１つのｐＨ範囲を含む）を有するように製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物はまた、グリセロールなどの適切な等張化剤の添加によって血液と等張性にすることができる。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの投与に適している。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口投与によるヒトへの投与に適している。非経口投与に適した製剤としては、水性および非水性の等張性滅菌注射液（これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されたレシピエントの血液に適合させる溶質を含むことができる）、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液（懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができるが含まれる）が挙げられる。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単回用量または多回用量の密封容器に提示することができ、使用直前に、本明細書に記載される滅菌液体医薬品添加剤の処理方法、投与方法、および注射のための投与レジメン（すなわち、水）の添加のみを必要とする状態で保存することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回使用のバイアル、例えば単回使用の密封バイアルに含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物はマルチユースバイアルに含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物はバルクで容器内に含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は凍結保存される。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮下投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腫瘍部位への局所投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体腔内注射用に製剤化される。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体への投与のための一定の基準を満たさなければならない。例えば、米国食品医薬品局は、２１ＣＦＲ  ６１０および２１ＣＦＲ  ６１０．１３を含む、細胞ベースの免疫療法製品の基準を設定する規制ガイドラインを発行している。医薬組成物の外観、同一性、純度、安全性、および／または効力を評価する方法が当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アレルギー作用を生じる可能性のある外因性タンパク質、例えば、改変された哺乳動物免疫細胞以外の細胞培養に使用される動物源のタンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、「実質的に含まない」とは、医薬組成物の総体積または総重量の約１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、１ｐｐｍ未満のいずれかである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＧＭＰレベルのワークショップで調製される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口投与のためのエンドトキシン約５ＥＵ／ｋｇ（体重）／ｈ未満を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の改変された免疫細胞の少なくとも約７０％は、静脈内投与のために生存している。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、米国薬局方（ＵＳＰ）に記載されているような１４日間の直接接種試験法を用いて評価した場合、「増殖なし」の結果を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物を投与する前に、改変された免疫細胞と薬学的に許容される医薬品添加剤の両方を含むサンプルを、最終収穫の約４８〜７２時間前（または培養物の最後の再給餌と同時）に、滅菌性試験のために採取することが望ましい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、マイコプラズマ汚染を含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、検出可能な微生物剤を含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＨＩＶ  Ｉ型、ＨＩＶ  ＩＩ型、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ヒトＴリンパ球性ウイルスＩ型；およびヒトＴリンパ球性ウイルスＩＩ型などの伝染性疾患剤を含まない。
改変された免疫細胞を用いた治療方法
【０３１２】
本出願はさらに、感染性疾患、ＥＢＶ陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害、Ｔ細胞前駆細胞性白血病、ＥＢＶ陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、原発性皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性疾患、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（他に特定されない）、血管性免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、および未分化大細胞リンパ腫、および自己免疫疾患を含むがこれらに限定されない疾患を治療するために、改変された免疫細胞を投与する方法を提供する。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、自己リンパ球注入が治療に使用される。自家ＰＢＭＣは、治療を必要とする患者から採取され、Ｔ細胞は、本明細書に記載される方法および当該技術分野で知られている方法を用いて活性化および拡大増殖され、次いで、患者に再び注入される。
【０３１４】
この細胞は、インビボでロバストな拡大増殖を受けることができ、血液および骨髄において長期間高レベルで持続するＣＤ４特異的メモリー細胞を確立することができる。いくつかの実施形態では、患者に注入された改変された免疫細胞は、癌またはウイルス感染細胞を枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、患者に注入された改変された免疫細胞は、癌またはウイルス感染細胞を除去することができる。ウイルス感染治療は、例えば、ウイルス負荷、生存期間、生活の質、タンパク質発現および／または活性によって評価することができる。
【０３１５】
いくつかの実施形態における本発明の改変された免疫細胞は、癌、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ腫またはＴ細胞白血病を治療するために、個体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本出願は、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つに従う改変された免疫細胞を含む組成物（例えば、医薬組成物）の有効量を個体に投与することを含む、個体の癌を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌はＴ細胞リンパ腫である。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される癌を治療する方法はさらに、第２の抗癌剤を個体に投与することをさらに含む。適切な抗癌剤としては、ＣＤ７０標的化剤、ＴＲＢＣ１、ＣＤ３０標的化剤、ＣＤ３７標的化剤、ＣＣＲ４標的化剤、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＥＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシドおよびプレドニゾン）、ＥＰＯＣＨ（エトポシド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミドおよびプレドニゾン）、Ｈｙｐｅｒ−ＣＶＡＤ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびデキサメタゾン）、ＨＤＡＣ阻害剤、ＣＤ５２抗体ベリノスタット、ベンダムスチン、ＢＬ−８０４０、ボルテゾミブ、ＣＰＩ−６１３、モガムリズマブ、ネララビン、ニボルマブ、ロミデプシンならびにルキソリチニブが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）である。いくつかの実施形態では、第２の抗癌剤は、改変された免疫細胞と同時に投与される。いくつかの実施形態では、第２の抗癌剤は、改変された免疫細胞の投与と共に（例えば、改変された免疫細胞の投与に先立ってまたは後に）順次投与される。いくつかの実施形態では、本発明の改変された免疫細胞組成物は、標的抗原の発現が関与する疾患または障害を治療するために、第２の薬剤、第３の薬剤剤または第４の薬剤（例えば、抗悪性腫瘍剤、増殖抑制剤、細胞毒性剤、または化学療法剤を含む）と組み合わせて投与される。
【０３１７】
本発明の改変された免疫細胞はまた、感染性疾患、例えばＨＩＶを治療するために、個体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することもできる。したがって、いくつかの実施形態では、本出願は、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つに従う改変された免疫細胞を含む組成物（例えば、医薬組成物）の有効量を個体に投与することを含む、個体の感染性疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、例えば、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）およびＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）から選択されるウイルスによって引き起こされる。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、ＨＩＶを治療する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載される改変された免疫細胞のいずれかを投与することを含む。ＨＩＶには、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の２つのサブタイプがある。ＨＩＶ−１は世界的なパンデミックの原因となるウイルスで、高病原性と高い感染力を併せ持ったウイルスである。しかしながら、ＨＩＶ−２は西アフリカでのみ流行しており、ＨＩＶ−１ほどの病原性も感染力もない。ＨＩＶ−１感染症とＨＩＶ−２感染症との間のウイルス性と感染性の違いは、ＨＩＶ−２感染症のウイルス性タンパク質に対して備わったより強力な免疫応答に根ざしている可能性があり、感染した個体における制御がより効率的なものとなる（Ｌｅｌｉｇｄｏｗｉｃｚ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７（１０）：３０６７−３０７４）。これもまた、ＨＩＶ−１の世界的な広がりとＨＩＶ−２の限られた地理的な有病率の主たる理由になっている可能性がある。
【０３１９】
ＨＩＶ−２感染症はＨＩＶ−１感染症よりも制御されているが、ＨＩＶ−２感染した個体は依然として治療の恩恵を受けている。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＨＩＶ−１感染症を治療するために使用される。他の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＨＩＶ−２感染症を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、改変された免疫細胞は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２感染症を治療するために使用される。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される感染性疾患を治療する方法はさらに、第２の抗感染剤を個体に投与することを含む。適切な抗感染剤としては、抗レトロウイルス剤、広域中和抗体、トール様受容体アゴニスト、潜伏再活性化剤、ＣＣＲ５アンタゴニスト、免疫刺激剤（例えば、ＴＬＲリガンド）、ワクチン、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、および融合阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第２の抗感染剤は、改変された免疫細胞と同時に投与される。いくつかの実施形態では、第２の抗感染剤は、改変された免疫細胞の投与と共に（例えば、改変された免疫細胞の投与に先立ってまたは後に）順次投与される。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、個体は哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）である。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、臨床患者、臨床試験ボランティア、実験動物などである。いくつかの実施形態では、個体は、約６０歳未満（例えば、約５０歳、４０歳、３０歳、２５歳、２０歳、１５歳、または１０歳のうちのいずれかの年齢未満であることを含む）。いくつかの実施形態では、個体は、約６０歳を超える（例えば、約７０歳、８０歳、９０歳、または１００歳のうちのいずれかの年齢を超えることを含む）。いくつかの実施形態では、個体は、本明細書に記載される疾患または障害（例えば、癌またはウイルス感染）の１または複数の疾患または障害を有するか、または環境的もしくは遺伝的に起こりやすいと診断されている。いくつかの実施形態では、個体は、本明細書に記載される１または複数の疾患または障害に関連する１または複数の危険因子を有する。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９個の細胞のうちのいずれかの投与量で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり約１０４〜約１０５、約１０５〜約１０６、約１０６〜約１０７、約１０７〜約１０８、約１０８〜約１０９、約１０４〜約１０９、約１０４〜約１０６、約１０６〜約１０８、または約１０５〜約１０７個の細胞のいずれかの投与量で投与される。
【０３２３】
２つ以上のタイプの改変された免疫細胞が投与されるいくつかの実施形態では、異なるタイプの改変された免疫細胞は、単一の組成物のように、同時に、または任意の適切な順序で順次、個体に投与されてもよい。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、多回（例えば、２、３、４、５、６回以上のうちのいずれか）投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、または１年に１回投与される。いくつかの実施形態では、投与間の間隔は、約１週間〜２週間、２週間〜１ヶ月、２週間〜２ヶ月、１ヶ月〜２ヶ月、１ヶ月〜３ヶ月、３ヶ月〜６ヶ月、または６ヶ月〜１年のうちのいずれか１つである。特定の患者のための最適な投与量および治療レジームは、疾患の徴候のために患者を監視し、それに応じて治療を調整することによって、医学分野の当業者によって容易に決定することができる。
製造物品およびキット
【０３２５】
本発明のいくつかの実施形態では、ウイルス感染（例えばＨＩＶによる感染）などの感染性疾患の治療に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器上または容器に関連付けられたラベルまたは添付文書を含むことができる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料で形成されていてもよい。一般的に、容器は、本明細書に記載される疾患または障害の治療に有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポート（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穴をあけることができるストッパーを有するバイアルであってもよい）を有していてもよい。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明のＣＲおよびＣＣＯＲをその表面に提示する免疫細胞である。ラベルまたは添付文書は、組成物が特定の状態を治療するために使用されるものであることを示す。ラベルまたは添付文書はさらに、改変された免疫細胞組成物を患者に投与するための指示を含む。本明細書に記載される併用療法を含む製造物品およびキットも企図される。
【０３２６】
添付文書とは、市販の治療用製品のパッケージに習慣的に含まれる、そのような治療用製品の使用にかかわる適応症、使用法、投与量、投与、禁忌および／または警告についての情報を含有する指示を指す。他の実施形態では、添付文書は、組成物が、標的抗原陽性ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶによる感染症）を治療するために使用されるものであることを示す。
【０３２７】
さらに、製造物品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝剤を含む第２の容器をさらに含み得る。製造物品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０３２８】
任意に製造物品と組み合わせた、様々な目的のために、例えば、本明細書に記載される標的抗原陽性疾患または障害の治療のために有用なキットも提供される。本発明のキットは、改変された免疫細胞組成物（または単位剤形および／もしくは製造物品）を含む１または複数の容器を含み、いくつかの実施形態では、別の薬剤（例えば、本明細書に記載される薬剤）および／または本明細書に記載される方法のいずれかに従い使用するための指示をさらに含む。キットはさらに、治療に適した個体の選択についての記載を含み得る。本発明のキット中に供給される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）上に書かれた指示であるが、機械により読み取り可能な指示（例えば、磁気または光学的なメモリーディスクに保持された指示）も許容される。
例示的な実施形態
【０３２９】
実施形態１改変された免疫細胞であって、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体（ＣＲ）、ならびにｂ）キメラ共受容体（ＣＣＯＲ）であって、ｉ）ＣＣＯＲ標的抗原を特異的に認識するＣＣＯＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＣＯＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＣＯＲ共刺激ドメインを含む、ＣＣＯＲを含み、上記ＣＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４であり、上記ＣＣＯＲ標的抗原はＣＤ４であるか、または上記ＣＲ標的抗原はＣＤ４であり、上記ＣＣＯＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４である、改変された免疫細胞。
【０３３０】
実施形態２改変された免疫細胞であって、キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体（ＣＲ）を含み、上記ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４からなる群から選択される、改変された免疫細胞。
【０３３１】
実施形態３改変された免疫細胞であって、キメラ受容体（ＣＲ）であって、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体（ＣＲ）を含み、上記ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４からなる群から選択され、上記ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４またはＣＤ４は、広域中和抗体とタンデム化されている、改変された免疫細胞。
【０３３２】
実施形態４上記広域中和抗体が、ＶＲＣ０１、ＰＧＴ１２１、３ＢＮＣ１１７または１０−１０７４である、実施形態３に記載の改変された免疫細胞。
【０３３３】
実施形態５１または複数の共受容体（「ＣＯＲ」）をさらに含む、実施形態１から４いずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３３４】
実施形態６改変された免疫細胞であって、ａ）キメラ受容体（ＣＲ）をコードする第１の核酸であって、上記ＣＲは、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含む、第１の核酸、ならびにｂ）キメラ共受容体（ＣＣＯＲ）をコードする第２の核酸であって、上記ＣＣＯＲは、ｉ）ＣＣＯＲ標的抗原を特異的に認識するＣＣＯＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＣＯＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＣＯＲ共刺激シグナル伝達ドメインを含む、第２の核酸を含み、上記ＣＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４であり、上記ＣＣＯＲ標的抗原はＣＤ４であるか、または上記ＣＲ標的抗原はＣＤ４であり、上記ＣＣＯＲ標的抗原はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４である、改変された免疫細胞。
【０３３５】
実施形態７改変された免疫細胞であって、キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、上記ＣＲは、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸を含み、上記ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４からなる群から選択される、改変された免疫細胞。
【０３３６】
実施形態８改変された免疫細胞であって、キメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸であって、上記ＣＲは、ｉ）ＣＲ標的抗原を特異的に認識するＣＲ抗原結合ドメイン、ｉｉ）ＣＲ膜貫通ドメイン、およびｉｉｉ）細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体（ＣＲ）をコードする核酸を含み、上記ＣＲ標的抗原は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４およびＣＤ４からなる群から選択され、上記ＣＣＲ５、上記ＣＸＣＲ４または上記ＣＤ４は、広域中和抗体とタンデム化されている、改変された免疫細胞。
【０３３７】
実施形態９上記広域中和抗体が、ＶＲＣ０１、ＰＧＴ１２１、３ＢＮＣ１１７または１０−１０７４である、実施形態８に記載の改変された免疫細胞。
【０３３８】
実施形態１０１または複数の共受容体（「ＣＯＲ」）をコードする１または複数の核酸をさらに含む、実施形態６から９のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３３９】
実施形態１１上記ＣＲがキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）である、実施形態１から１０のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３４０】
実施形態１２上記ＣＲ膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２およびＰＤ１からなる群から選択される分子に由来する、実施形態１１に記載の改変された免疫細胞。
【０３４１】
実施形態１３上記ＣＲ膜貫通ドメインがＣＤ８αに由来する、実施形態１２に記載の改変された免疫細胞。
【０３４２】
実施形態１４上記細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄに由来する、実施形態１１に記載の改変された免疫細胞。
【０３４３】
実施形態１５上記細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζに由来する、実施形態１４に記載の改変された免疫細胞。
【０３４４】
実施形態１６上記ＣＲがさらに細胞内ＣＲ共刺激ドメインを含む、実施形態１１から１５のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３４５】
実施形態１７上記細胞内ＣＲ共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＬＦＡ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ４０ＬＧ、ＩＴＧＢ２、ＫＬＲＣ２、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＡＶＣＲ１、ＬＧＡＬＳ９、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ８３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する、実施形態１６に記載の改変された免疫細胞。
【０３４６】
実施形態１８上記細胞内ＣＲ共刺激シグナル伝達ドメインが、４−１−ＢＢの細胞質ドメインを含む、実施形態１７に記載の改変された免疫細胞。
【０３４７】
実施形態１９上記ＣＲ抗原結合ドメインのＣ末端と上記ＣＲ膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するＣＲヒンジドメインをさらに含む、実施形態１１から１８のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３４８】
実施形態２０上記ＣＲヒンジドメインがＣＤ８αに由来する、実施形態１９に記載の改変された免疫細胞。
【０３４９】
実施形態２１上記ＣＲが細胞内共刺激ドメインを含まない、実施形態１から１０のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３５０】
実施形態２２上記ＣＲがキメラＴ細胞受容体（「ｃＴＣＲ」）である、実施形態１から１０のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３５１】
実施形態２３上記細胞内ＣＲ膜貫通ドメインが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３δからなる群から選択されるＴＣＲサブユニットの膜貫通ドメインに由来する、実施形態２２に記載の改変された免疫細胞。
【０３５２】
実施形態２４上記ＣＲ膜貫通ドメインが、上記ＣＤ３εの膜貫通ドメインに由来する、実施形態２３に記載の改変された免疫細胞。
【０３５３】
実施形態２５上記細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３δからなる群から選択されるＴＣＲサブユニットの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する、実施形態２２から２４のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３５４】
実施形態２６上記細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインが、上記ＣＤ３εの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する、実施形態２５に記載の改変された免疫細胞。
【０３５５】
実施形態２７上記ＣＲ膜貫通ドメインおよび細胞内ＣＲシグナル伝達ドメインが、同一または異なる上記ＴＣＲサブユニットに由来する、実施形態２２から２６のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３５６】
実施形態２８上記ＣＲがさらにＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインの一部を含む、実施形態２２から２７のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３５７】
実施形態２９  上記ＣＲが、上記ＣＤ３εのＮ末端に融合した上記ＣＲ抗原結合ドメインを含む、実施形態２２から２８のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３５８】
実施形態３０上記ＣＲをコードする核酸が誘導性プロモーターの下にある、実施形態６から２９のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３５９】
実施形態３１上記ＣＲをコードする核酸が構成的に発現している、実施形態６から２９のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３６０】
実施形態３２上記ＣＣＯＲおよび／またはＣＯＲをコードする核酸が誘導性プロモーターの下にある、実施形態６から３１のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３６１】
実施形態３３上記ＣＣＯＲおよび／またはＣＯＲをコードする核酸が構成的に発現している、実施形態６から３１のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３６２】
実施形態３４上記ＣＣＯＲおよび／またはＣＯＲをコードする核酸が、上記免疫細胞の活性化時に誘導可能である、実施形態３２に記載の改変された免疫細胞。
【０３６３】
実施形態３５上記第１の核酸および上記第２の核酸が同じベクター上にある、実施形態６から３４のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３６４】
実施形態３６上記第１の核酸および上記第２の核酸が同じプロモーターの制御下にある、実施形態３５に記載の改変された免疫細胞。
【０３６５】
実施形態３７上記第１の核酸および上記第２の核酸が異なるベクター上にある、実施形態６から３１のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３６６】
実施形態３８１または複数のＣＯＲをコードする核酸が、上記第１の核酸と同じベクター上にある、実施形態１０から３７のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３６７】
実施形態３９１または複数のＣＯＲをコードする核酸が、上記第２の核酸と同じベクター上にある、実施形態１０から３８のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３６８】
実施形態４０上記１または複数のＣＯＲをコードする核酸と上記第１の核酸または上記第２の核酸とが同じプロモーターの制御下にある、実施形態３８または３９に記載の改変された免疫細胞。
【０３６９】
実施形態４１上記ＣＲ標的抗原がＣＤ４である、実施形態１から４０のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３７０】
実施形態４２上記ＣＣＯＲ標的抗原がＣＤ４である、実施形態１、５、６および１０から４０のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３７１】
実施形態４３上記ＣＲ標的抗原がＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４であり、上記ＣＣＯＲ標的抗原がＣＤ４である、実施形態１、５、６ならびに１０から４０および４２のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３７２】
実施形態４４上記ＣＲ標的抗原がＣＤ４であり、上記ＣＣＯＲ標的抗原がＣＣＲ５または上記ＣＸＣＲ４である、実施形態１、５、６および１０から４１のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３７３】
実施形態４５上記ＣＲ抗原結合ドメインまたは上記ＣＣＯＲ抗原結合ドメインが、ＣＤ４（ＣＤ４−Ｄ１）のドメイン１を特異的に認識する、実施形態４１から４４のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３７４】
実施形態４６上記１または複数のＣＯＲが、ＣＸＣＲ５、α４β７およびＣＣＲ９からなる群から選択される、実施形態５および１０から４５のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３７５】
実施形態４７上記１または複数のＣＯＲがＣＸＣＲ５である、実施形態４６に記載の改変された免疫細胞。
【０３７６】
実施形態４８上記１または複数のＣＯＲがα４β７である、実施形態４６または４７に記載の改変された免疫細胞。
【０３７７】
実施形態４９上記１または複数のＣＯＲがＣＣＲ９である、実施形態４６から４８のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３７８】
実施形態５０上記１または複数のＣＯＲが、α４β７とＣＣＲ９の両方を含む、実施形態４６から４９のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３７９】
実施形態５１上記改変された免疫細胞が、上記細胞内のＣＣＲ５の発現を減少させるか、または排除するように改変されている、実施形態１から５０のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３８０】
実施形態５２上記改変された免疫細胞が、抗ＨＩＶ抗体を発現するように改変されている、実施形態１から５１のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３８１】
実施形態５３上記抗ＨＩＶ抗体が広域中和抗体である、実施形態５２に記載の改変された免疫細胞。
【０３８２】
実施形態５４上記広域中和抗体が、ＶＲＣ０１、ＰＧＴ１２１、３ＢＮＣ１１７または１０−１０７４である、実施形態５３に記載の改変された免疫細胞。
【０３８３】
実施形態５５上記ＣＲ抗原結合ドメインが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、および上記ＣＲ標的抗原に特異的に結合するペプチドリガンドからなる群から選択される、実施形態１から５４のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３８４】
実施形態５６上記ＣＲ抗原結合ドメインがｓｃＦｖまたはｓｄＡｂである、実施形態５５に記載の改変された免疫細胞。
【０３８５】
実施形態５７上記ＣＣＯＲ抗原結合ドメインが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、および上記ＣＣＯＲ標的抗原に特異的に結合するペプチドリガンドからなる群から選択される、実施形態１、５、６および１０から５６のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３８６】
実施形態５８上記ＣＣＯＲ抗原結合ドメインがｓｃＦｖまたはｓｄＡｂである、実施形態５７に記載の改変された免疫細胞。
【０３８７】
実施形態５９上記ＣＣＯＲ共刺激ドメインが、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ４０ＬＧ、ＩＴＧＢ２、ＫＬＲＣ２、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＡＶＣＲ１、ＬＧＡＬＳ９、ＣＤ８３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのうちの１または複数の共刺激ドメインからなる群から選択される、実施形態１から５８のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３８８】
実施形態６０上記改変された免疫細胞が、細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、γδＴ細胞およびナチュラルキラーＴ細胞からなる群から選択される、実施形態１から５９のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞。
【０３８９】
実施形態６１上記改変された免疫細胞が細胞毒性Ｔ細胞である、実施形態６０に記載の改変された免疫細胞。
【０３９０】
実施形態６２実施形態１から６１のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【０３９１】
実施形態６３上記医薬組成物が、実施形態１から６１のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞の少なくとも２種類の異なるタイプを含む、実施形態６２に記載の医薬組成物。
【０３９２】
実施形態６４実施形態６２または６３に記載の医薬組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体の感染性疾患を治療する方法。
【０３９３】
実施形態６５上記感染症が、ＨＩＶおよびＨＴＬＶからなる群から選択されるウイルスによる感染性疾患である、実施形態６４に記載の方法。
【０３９４】
実施形態６６上記感染性疾患がＨＩＶである、実施形態６５に記載の方法。
【０３９５】
実施形態６７第２の抗感染剤を個体に投与する段階をさらに含む、実施形態６４から６６のいずれか一つに記載の方法。
【０３９６】
実施形態６８上記抗感染剤が、抗レトロウイルス薬、広域中和抗体、トール様受容体アゴニスト、潜伏再活性化剤、ＣＣＲ５アンタゴニスト、免疫刺激剤、およびワクチンからなる群から選択される、実施形態６７に記載の方法。
【０３９７】
実施形態６９実施形態６２または６３に記載の医薬組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体の癌を治療する方法。
【０３９８】
実施形態７０上記癌がＴ細胞リンパ腫である、実施形態６９に記載の方法。
【０３９９】
実施形態７１  第２の抗癌剤を個体に投与する段階をさらに含む、実施形態６９または７０に記載の方法。
【０４００】
実施形態７２上記第２の抗癌剤が、ＣＤ７０標的化剤、ＴＲＢＣ１、ＣＤ３０標的化剤、ＣＤ３７標的化剤およびＣＣＲ４標的化剤からなる群から選択される、実施形態７１に記載の方法。
【０４０１】
実施形態７３上記個体がヒトである、実施形態６４から７２のいずれか一つに記載の方法。
【０４０２】
実施形態７４実施形態１から６１のいずれか一つに記載の改変された免疫細胞を作製する方法であって、ａ）免疫細胞の集団を提供する段階と、ｂ）上記ＣＲをコードする第１の核酸を上記免疫細胞の集団に導入する段階とを含む、方法。
【０４０３】
実施形態７５ｃ）上記ＣＣＯＲをコードする第２の核酸を上記免疫細胞の集団に導入する段階をさらに含む、実施形態７４に記載の方法。
【０４０４】
実施形態７６上記第１の核酸および上記第２の核酸を同時に上記細胞に導入する、実施形態７５に記載の方法。
【０４０５】
実施形態７７上記第１の核酸および上記第２の核酸を上記細胞に順次導入する、実施形態７５に記載の方法。
【０４０６】
実施形態７８１または複数のＣＯＲをコードする１または複数の核酸を上記免疫細胞の集団に導入する段階をさらに含む、実施形態７４から７７のいずれか一つに記載の方法。
【０４０７】
実施形態７９上記第１の核酸、上記第２の核酸、および／または上記ＣＯＲをコードする核酸を、ウイルスベクターを介して上記細胞に導入する、実施形態７４から７８までのいずれか一つに記載の方法。
【０４０８】
実施形態８０広域中和抗体（ｂＮＡｂ）またはＨＩＶ融合阻害ペプチドをコードする核酸を上記免疫細胞の集団に導入する段階をさらに含む、実施形態７４から７９のいずれか一つに記載の方法。
【０４０９】
実施形態８１上記細胞のＣＣＲ５遺伝子を不活化する段階をさらに含む、実施形態７４から８０のいずれか一つに記載の方法。
【０４１０】
実施形態８２上記ＣＣＲ５遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される方法を用いて不活化する、実施形態８１に記載の方法。
【０４１１】
実施形態８３個体の末梢血から上記免疫細胞の集団を得る段階をさらに含む、実施形態７４から８２のいずれか一つに記載の方法。
【０４１２】
実施形態８４上記免疫細胞の集団が、ＣＤ４＋細胞についてさらに富化されている、実施形態８３に記載の方法。
【０４１３】
実施形態８５上記免疫細胞の集団が、ＣＤ８＋細胞についてさらに富化されている、実施形態８３または８４に記載の方法。
【０４１４】
当業者は、いくつかの実施形態が本発明の範囲および精神の範囲内で可能であることを認識するであろう。これから、以下の非限定的な実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。以下の実施例は、本発明をさらに分かりやすく説明するものであるが、本発明の範囲を制限するものとして当然解釈されるべきではない。
【０４１５】
実施例
【０４１６】
実施例１：初代Ｔ細胞および他の哺乳動物細胞におけるＣＲおよびＣＣＯＲの発現
【０４１７】
構成的プロモーターｈＥＦ１α、ドキシサイクリン誘導性プロモーター（例えばＴｅｔＯｎ）、ＮＦＡＴ依存性誘導性プロモーター、または熱誘導性プロモーター（例えばヒト熱ショックタンパク質７０プロモーター、ＨＳＰ７０ｐ）によって駆動されるＣＲ、ＣＣＯＲ、および任意にＣＯＲをコードする核酸を担持するレンチウイルスベクターを設計し、調製する。ヒト初代末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なドナーから末梢血を密度勾配遠心分離することにより調製する。ヒト初代Ｔ細胞は、磁気ビーズ単離を用いてＰＢＭＣから精製する。ヒトＴ細胞をレンチウイルスベクターで形質導入し、数日間エクスビボで拡大増殖させる。受容体の発現は、当該技術分野で知られている方法を用いて検出することができる。形質導入されたＴ細胞の生物活性は、インビトロ標的細胞致死試験および他のインビトロアッセイおよびインビボ動物モデルを介して評価することができる。
実施例２．材料および方法
【０４１８】
細胞．２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で維持した。凍結保存されたヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をＨｅｍａｃａｒｅ社から購入した。Ｔ細胞をＰＢＭＣからＴ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）で単離し、Ｔ細胞活性化／拡大増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）で活性化した。Ｔ細胞をＡＩＭ−Ｖ培地＋５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２中で維持した。
【０４１９】
プラスミドおよびレンチウイルスの産生
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子またはｅＴＣＲ遺伝子をｐＬＶＸベクター中のＥＦ１プロモーターによって制御した。遺伝子を合成し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔでベクターにクローニングした。２９３Ｔ細胞を、ＣＡＲまたはｅＴＣＲトランスファープラスミド、第２世代レンチウイルスパッケージングプラスミドおよびＶＳＶ−Ｇエンベロープコードプラスミドでトランスフェクトした。プラスミドを、１０％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）試薬により２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ウイルス上清をトランスフェクション後４８時間および７２時間で採取した。上清を０．４５μｍの滅菌フィルターで濾過し、細胞残屑を除去した。ウイルスをＰＥＧ法で濃縮し、アリコートし、−８０℃で保存した。
【０４２０】
ＣＡＲ−Ｔ構築
パンＴ細胞をＰＢＭＣからパンＴ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で富化し、Ｔ細胞活性化／拡大増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で４８時間活性化した。活性化されたＴ細胞を８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下でレンチウイルスとインキュベートし、室温にて１０００ｇで１時間遠心した。細胞をＡＩＭ−Ｖ培地＋５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋３００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２中で拡大増殖させた。形質導入効率はフローサイトメトリーにより、形質導入後４日目のＣＡＲ＋またはｅＴＣＲ＋の割合として決定した。
【０４２１】
細胞毒性アッセイ
標的細胞をＰＢＳ中の２．５μＭ  ＣＦＳＥで５分間室温にて標識した後、１／１０体積のＦＢＳを添加して反応を停止させた。細胞を２回洗浄し、培地に再懸濁した。エフェクター細胞と標的細胞を所望のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ比）で２４時間共培養した。ＣＦＳＥ標識された標的細胞の死滅をフローサイトメトリーで調べた。
【０４２２】
ＳＨＩＶ感染アッセイ
ＣＤ４−Ｔ細胞を４日間インビトロで精製し、活性化した後、ＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３ウイルスに感染させた。この細胞を、感染後１２日目に標的細胞として使用した。エフェクター細胞として、ＵＮＴ細胞、抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞、タンデム抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５細胞を使用した。エフェクター細胞と標的細胞を０．５：１および２：１の比率で７２時間共培養した。ウイルス陽性細胞率をｐ２７細胞内染色により検出した。
【０４２３】
フローサイトメトリー
抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ５およびｐ２７モノクローナル抗体をＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社およびＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）２ポリクローナル抗体をＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社から購入した。細胞をＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁し、フロー染色を行った。データをＢＤ  ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターで収集し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で解析した。
【０４２４】
ＨＴＲＦアッセイ
標的細胞をエフェクター細胞と２４時間共培養した。細胞培地を採取し、ＨＴＲＦアッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ社製）によりＩＦＮγ濃度を検出した。アッセイを製造元のプロトコルに従って実施した。簡単に言えば、１６μｌのサンプルを、アッセイプレート中で予め混合された４μｌの抗ＩＦＮγ抗体と混合した。プレートを室温にて一晩暗所でインキュベートした。シグナルをＰｈｅｒａＳｔａｒマイクロプレートリーダーにより検出した。
【０４２５】
ｑＰＣＲアッセイ
標的Ｔ細胞を、同じく強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現するＨＩＶ偽ウイルスに感染させた。標的細胞とエフェクター細胞を１：１の比で２４時間共培養した。細胞を採取し、ｑＰＣＲのためにゲノムＤＮＡを回収した。統合されたＤＮＡコピー数を、細胞ゲノムＤＮＡ中のＥＧＦＰコピー数を検出することにより検出した。
【０４２６】
リンパ腫マウスモデルでのＣＡＲ−Ｔ処理
ＮＣＧマウスにＨＨ皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞を皮下注射で移植した。腫瘍の大きさが１２０ｍｍ３に達した時点で、マウスを３つの群に分けて処理を行った。対照のＵＮＴ細胞とＣＡＲ−Ｔ細胞をＨＢＳＳ緩衝剤に再懸濁した。細胞を尾静脈注射によりマウスに接種した。１群のマウスには対照として４００μｌのＨＢＳＳを投与した。もう１群のマウスには２５００万個のＵＮＴ細胞を投与し、最後の群のマウスには５００万個のＣＡＲ＋抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与した。マウスを観察し、腫瘍の大きさと体重を実験終了まで記録した。腫瘍の大きさが２０００ｍｍ３に達した時点でマウスを犠牲にした。
【０４２７】
ヒト化マウスモデルでのＣＡＲ−Ｔインビボ試験
新生ＮＣＧマウスにヒト造血幹細胞を移植して、マウスをヒト免疫細胞で再構成し、ＨＩＳマウスと命名した。ＨＩＳマウスを、抗ＣＤ４、抗ＣＣＲ５またはタンデム抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理した。同時にＣＤ４＋／ＣＣＲ５＋細胞の存在を実験中に試験した。
実施例３．ＣＡＲ−Ｔ細胞の評価
【０４２８】
本実施例では、本出願で例示されている様々なＣＡＲコンストラクトの評価について説明する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現ベクターの構築
【０４２９】
図６は、抗ＣＤ４または抗ＣＣＲ５または抗ＣＸＣＲ４のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂ（図６のＡ）、またはタンデムに連結された抗ＣＤ４および抗ＣＣＲ５のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂ（図６のＢ）を含むＣＡＲコンストラクトの略図を示す。ＣＡＲは、抗原認識ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン４−１ＢＢ、ＣＤ３ζ細胞内ドメインから構成されている。抗原認識ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、リンカーによって連結された２つのタンデムｓｃＦｖ、またはリンカーによって連結された２つのタンデムｓｄＡｂであり得る。ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂは、ヒトＣＤ４またはヒトＣＣＲ５またはヒトＣＸＣＲ４のいずれかを認識することができる。リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎとすることができ、ここで、ｎは２〜５までの任意の数であり得る。ここに表示されているヒンジは、ヒトＣＤ８（配列番号２）の細胞外ドメインの一部である。膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８膜貫通ドメイン（配列番号３）由来である。細胞内ドメインは、ヒト４−１ＢＢ細胞内領域（配列番号４）およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（配列番号５）に由来する。本実施例で使用したＣＡＲコンストラクトは、以下の配列を有する。
【０４３０】
抗ＣＤ４−ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８−ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（抗ＣＤ４  ＣＡＲ）：配列番号１１、４９〜６４。
【０４３１】
抗ＣＣＲ５−ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８−ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ）：配列番号１２、３５〜４８。
【０４３２】
抗ＣＸＣＲ４−ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８  ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（抗ＣＸＣＲ４−ＣＡＲ）：配列番号６５〜７２。
【０４３３】
抗ＣＤ４−ｓｃＦｖ−抗ＣＣＲ５−ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８−ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（タンデム抗ＣＤ４−抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ）：配列番号１３。
【０４３４】
抗ＣＤ４−ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８−ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−Ｐ２Ａ−ＣＸＣＲ５（ＣＸＣＲ５を有する抗ＣＤ４  ＣＡＲ）：配列番号１４。
【０４３５】
抗ＣＣＲ５−ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８−ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−Ｐ２Ａ−ＣＸＣＲ５（ＣＸＣＲ５を有する抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ）：配列番号１５。
【０４３６】
抗ＣＤ４−ｓｃＦｖ−抗ＣＣＲ５−ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８−ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−Ｐ２Ａ−ＣＸＣＲ５（ＣＸＣＲ５を有するタンデム抗ＣＤ４−抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ）：配列番号１６。
【０４３７】
抗ＣＤ４−ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８−ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−Ｐ２Ａ−ＣＸＣＲ５−Ｐ２Ａ−ＶＲＣ０１（ＣＸＣＲ５およびＶＲＣ０１を有する抗ＣＤ４  ＣＡＲ）：配列番号１７。
【０４３８】
抗ＣＣＲ５−ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８−ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−Ｐ２Ａ−ＣＸＣＲ５−Ｐ２Ａ−ＶＲＣ０１（ＣＸＣＲ５およびＶＲＣ０１を有する抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ）：配列番号１８。
【０４３９】
抗ＣＤ４−ｓｃＦｖ−抗ＣＣＲ５−ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８−ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−Ｐ２Ａ−ＣＸＣＲ５−Ｐ２Ａ−ＶＲＣ０１（ＣＸＣＲ５およびＶＲＣ０１を有するタンデム抗ＣＤ４−抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ）：配列番号１９。
ＣＡＲ細胞の構築と表現型
ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離したＴ細胞から生成した。ＰＢＭＣからのＴ細胞をインビトロで富化し、活性化した後、ＣＡＲ遺伝子をコードするレンチウイルスで形質導入した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化すると細胞毒性因子であるパーフォリンおよびグランザイムＢを分泌して標的細胞を殺傷する機能を有している。ＣＤ８  Ｔ細胞の細胞毒性機能は、感染した細胞を排除し、内在する異常な細胞形質変換を監視するための適応免疫系にとって非常に重要である。また、人為的に改変されたＣＡＲ−Ｔ細胞の最も重要な機能は、標的細胞の殺傷機能である。改変されたＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性機能を調べるために、ＣＡＲ−Ｔ細胞をパンＴ細胞と所望の比率で共培養した。その中でＣＡＲ−Ｔ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）と命名し、パンＴ細胞を標的細胞（Ｔ）と命名した。エフェクター細胞と区別するために、標的細胞をＣＦＳＥで標識した。標的細胞とエフェクター細胞を２４時間共培養した後、フローサイトメトリーのために採取した。細胞毒性効果を反映するために、ＣＦＳＥ標識された標的細胞の割合を記録した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の陰性対照として、非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）を用いた。ＣＡＲ−Ｔ形質導入後１週間で、それらの重要な機能、すなわち標的細胞の殺傷能力を最初のスクリーニング中に試験した。図７は、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗ＣＸＣＲ４−ＣＡＲ−Ｔ細胞の定量的なスクリーニング結果を示す。１４の抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔの中で、１３番目のものが最も標的殺傷効果が高かった。１６の抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔの中で、最も効率が良かったのは１３番目であった。８の抗ＣＸＣＲ４−ＣＡＲ−Ｔの中で、５番目が最も標的殺傷効果が高い。抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ  Ｎｏ．１３は、ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ（配列番号１１）と改名し、ｓｃＦｖ配列を、以下のすべての抗ＣＤ４設計において使用した。抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ  Ｎｏ．１３を抗ＣＣＲ５−ＣＡＲ−Ｔ（配列番号１２）と改名し、そのｓｃＦｖ配列を複合体設計に使用した。
【０４４０】
ＣＡＲの構造は互いに類似しているが、すべてのキメラ抗原受容体をＴ細胞に等しく形質導入できるわけではなかった。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）２抗体を用いて、フローサイトメトリーによるＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合を検出した。図８のＡ〜図８のＥは、形質導入後４日目のＣＡＲ＋％細胞を示す。
【０４４１】
ＣＡＲ−Ｔ細胞をＡＩＭ−Ｖ培地＋５％ＦＢＳ＋３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２中で培養した。コンフルエントな場合、細胞をより大きなウェルに移した。細胞の拡大増殖をサポートするために、新鮮な完全培地を供給した。細胞数および生存率を、形質導入後０日目、４日目、６日目および１０日目に記録した。抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ  ＮＯ．１３の拡大増殖を図９に示す。
【０４４２】
ＣＡＲ−Ｔ細胞毒性アッセイ
【０４４３】
図１０のＡ、図１０のＢおよび図１０のＥは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性効果のフローサイトメトリー結果を示す。図１０のＡに示すように、対照のＵＮＴ細胞と共培養した標的細胞中には５８％のＣＤ４＋Ｔ細胞が存在していたが、標的細胞を抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ  Ｎｏ．１３細胞と共培養した場合には、ＣＤ４＋集団は０％に減少し、標的に対する抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ  Ｎｏ．１３の強い殺傷効果が示唆された。図１０のＢでは、標的細胞をＵＮＴと共培養した場合、ＣＣＲ５＋集団は約１５％であったが、標的細胞を抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ  Ｎｏ．１３細胞と共培養した場合には、集団は１％未満に減少し、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ  Ｎｏ．１３細胞が非常に有効であることが示唆された。図１０のＥは、タンデム抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５  ＣＡＲＴの効果を示す。タンデムＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ４単独陽性細胞とＣＣＲ５単独陽性細胞を除去するだけでなく、ＣＤ４／ＣＣＲ５二重陽性集団を効率的に除去することもできた。
ＣＡＲ−Ｔサイトカインプロファイル解析
【０４４４】
ペルフォリンおよびグランザイムＢの他に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化時にサイトカインであるＩＦＮγおよびＴＮＦαも分泌する。これらのプロ炎症性サイトカインは、重要なＣＤ８＋Ｔ細胞機能指標であるが、養子Ｔ細胞療法の副作用であるサイトカイン放出症候群にも役割を果たしている可能性がある。ＩＦＮγの産生は、インビトロでのＨＴＲＦアッセイによって検出した。形質導入後６日目に上清を採取し、サイトカインレベルを測定した。図１１は、抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ  Ｎｏ．１３細胞によるこれらのサイトカインの産生を示す。
実施例４．ｅＴＣＲ  Ｔ細胞の評価
【０４４５】
本実施例では、本出願で例示した様々なキメラＴＣＲコンストラクトの評価について説明する。抗ＣＤ４−ｅＴＣＲおよび抗ＣＣＲ５−ｅＴＣＲ発現ベクターの構築Ｔ細胞受容体αおよびβ鎖は、ＣＤ３ε／δ／γ／ζ鎖と複合体を形成する。ＴＣＲは、ＭＨＣによって提示された抗原を認識し、ＣＤ３ζ鎖のリン酸化とそれに続く細胞内の下流経路へのシグナル伝達を導き、Ｔ細胞を活性化させる。天然型Ｔ細胞の活性化はＴＣＲ−ＭＨＣ相互作用に依存しており、したがってＭＨＣ依存性である。本明細書に記載されるこのキメラＴＣＲは、ＴＣＲ複合体を修飾し、ＭＨＣに依存せずにＴ細胞を活性化する。この修飾はＣＤ３ε上にあり、その完全な名称は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ε鎖（配列番号６）である。ＣＤ３εの配列は、ＵｎｉｐｒｏｔおよびＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅｂａｎｋなどの公開データベースから入手可能である。配列番号６に記載された配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０７７６６からのものである。このキメラＴＣＲを、ここでｅＴＣＲと命名する。
【０４４６】
ｅＴＣＲ遺伝子はレンチウイルスベクターで発現し、ＥＦ１αプロモーターで制御されている。ＣＤ３εシグナルペプチド配列（配列番号７）の後に抗原認識配列が続く。抗原認識配列とＣＤ３ε配列との間にリンカー（Ｇ４Ｓ）３配列を付加した（配列番号８）。ＤＮＡ配列を最適化し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔでデノボ合成し、Ｇａｔｅｗａｙ  ＣｌｏｎｉｎｇでｐＬＶＸレンチウイルスベクターにクローニングした。本実施例で使用したｅＴＣＲコンストラクトは、以下の配列を有する。
【０４４７】
抗ＣＤ４−ＣＤ３ε（抗ＣＤ４  ｅＴＣＲ）：配列番号２０、７３。
【０４４８】
抗ＣＣＲ５−ＣＤ３ε（抗ＣＣＲ５  ｅＴＣＲ）：配列番号２１、７４〜７６。
【０４４９】
抗ＣＤ４−ＣＤ３ε−Ｐ２Ａ−ＣＸＣＲ５（ＣＸＣＲ５有する抗ＣＤ４  ｅＴＣＲ）：配列番号２２。
【０４５０】
抗ＣＣＲ５−ＣＤ３ε−Ｐ２Ａ−ＣＸＣＲ５（ＣＸＣＲ５を有する抗ＣＣＲ５  ｅＴＣＲ）：配列番号２３。
【０４５１】
抗ＣＤ４−抗ＣＣＲ５−ＣＤ３ε−Ｐ２Ａ−ＣＸＣＲ５（ＣＸＣＲ５を有するタンデム抗ＣＤ４−抗ＣＣＲ５  ｅＴＣＲ）：配列番号２４。
【０４５２】
抗ＣＤ４−抗ＣＣＲ５−ＣＤ３ε−Ｐ２Ａ−ＣＸＣＲ５−Ｐ２Ａ−ＶＲＣ０１（ＣＸＣＲ５およびＶＲＣ０１を有するタンデム抗ＣＤ４−抗ＣＣＲ５  ｅＴＣＲ）：配列番号２５。
【０４５３】
図１２のＡおよび図１２のＢは、抗ＣＤ４または抗ＣＣＲ５のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂ（図１２のＡ）、またはタンデムに連結された抗ＣＤ４および抗ＣＣＲ５のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂ（図１２のＢ）を含む例示的なｅＴＣＲの略図を示す。ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、２つのタンデムｓｃＦｖまたは２つのタンデムｓｄＡｂｓは、（Ｇ４Ｓ）３リンカーによってＣＤ３ε鎖に連結されている。
【０４５４】
標的細胞の殺傷効果は、ｅＴＣＲ設計をさらに開発するかどうかの重要な決定要因として評価された。改変されたｅＴＣＲ−Ｔ細胞の標的細胞殺傷効果を調べるために、ｅＴＣＲ−Ｔ細胞をパンＴ細胞と所望の比率で共培養した。その中でｅＴＣＲ−Ｔ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）と命名し、パンＴ細胞を標的細胞（Ｔ）と命名した。エフェクター細胞と区別するために、標的細胞をＣＦＳＥで標識した。標的細胞とエフェクター細胞を２４時間共培養した後、フローサイトメトリーのために採取した。細胞毒性効果を反映するために、ＣＦＳＥ標識された標的細胞の割合を記録した。ｅＴＣＲ−Ｔ細胞の陰性対照として、非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）細胞を用いた。図１２のＣは、ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ  Ｎｏ．１３、ＣＤ４  ｅＴＣＲ、ＣＤ４  ｅＴＣＲ  Ｎｏ．１１の標的細胞殺傷効果を定量的に比較したものである。ＣＤ４  ｅＴＣＲ  Ｎｏ．１１は、イバリズマブ抗体配列からの抗原結合領域を有する。ＣＤ４  ｅＴＣＲ  Ｎｏ．１１の標的細胞殺傷能力は、ＣＤ４  ｅＴＣＲよりも最適ではない。
【０４５５】
図１２のＤは、３つのスクリーニングされた抗ＣＣＲ５  ｅＴＣＲコンストラクトの結果を示した。３つの抗ＣＣＲ５コンストラクトのうち、ＣＣＲ５  ｅＴＣＲが最も優れた標的細胞殺傷効果を有しており、さらに研究を進めた。
ｅＴＣＲ−Ｔ細胞の表現型
【０４５６】
ＣＡＲ−Ｔ細胞と同様に、ｅＴＣＲ細胞を、ｅＴＣＲをコードするレンチウイルスで活性化されたＴ細胞を形質導入することによって生成した。すべてのＴ細胞が同じ効率で形質導入できるわけではない。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）２抗体を用いて、フローサイトメトリーによるｅＴＣＲ＋Ｔ細胞の割合を検出した。図１３のＡは、形質導入後４日目のｅＴＣＲ＋％細胞を示す。
ｅＴＣＲ−Ｔ細胞の拡大増殖
【０４５７】
ｅＴＣＲ−Ｔ細胞をＡＩＭ−Ｖ培地＋５％ＦＢＳ＋３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２中で培養した。コンフルエントな場合には、細胞をより大きなウェルに拡大増殖し、細胞が常に理想的な培養条件にあることを確認するために、新鮮な完全培地を供給した。細胞数および生存率を、形質導入後０日目、４日目、６日目および１０日目に記録した。ｅＴＣＲ−Ｔ細胞の拡大増殖が、図１３のＣに示される。
ｅＴＣＲ−Ｔ細胞毒性
【０４５８】
図１４は、ｅＴＣＲ−Ｔを媒介した標的細胞殺傷力のフローサイトメトリーの代表的な結果を示す。図１４のＡは、抗ＣＤ４  ｅＴＣＲ  Ｔ細胞が標的細胞のＣＤ４＋集団を完全に枯渇させることができるという抗ＣＤ４  ｅＴＣＲ−Ｔ細胞の細胞毒性効果のフローサイトメトリーの結果を示している。抗ＣＣＲ５  ｅＴＣＲ−Ｔ細胞もまた、図１４のＢに示すように、ＣＣＲ５＋集団の大部分を死滅させた。
ｅＴＣＲ−Ｔサイトカインプロファイル解析
【０４５９】
ＩＦＮγの産生は、インビトロでのＨＴＲＦアッセイによって検出した。ｅＴＣＲ−Ｔ細胞を標的パンＴ細胞と２：１および０．５：１の比率で２４時間共培養し、上清を回収した。図１３のＢは、抗ＣＤ４  ｅＴＣＲ−Ｔ細胞によるＩＦＮγサイトカインの産生を示す。ＵＮＴ細胞を対照として使用した。ｅＴＣＲ−Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＮγサイトカインは、ＵＮＴ対照細胞に比べてわずかに高かった。
実施例５．ＣＸＣＲ５発現Ｔ細胞
【０４６０】
リンパ節は重要な二次リンパ器官である。Ｂ細胞は末梢血中を循環し、成熟のためにリンパ節Ｂ細胞濾胞に入り、胚中心樹状細胞および濾胞Ｔヘルパー細胞の助けを借りて、アイソタイプの切り替えおよびアフィニティー成熟過程を経る。Ｂ細胞、樹状細胞、濾胞Ｔ細胞は、ＣＸＣＬ１３の受容体であるＣＸＣＲ５を発現する。ＣＸＣＬ１３は胚中心で高レベルに存在し、胚中心の間質細胞および樹状細胞で産生される。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、通常、Ｂ細胞濾胞では非常に稀である。免疫組織学的染色では、濾胞内に隠れているＨＩＶウイルスが高レベルであることが示され、胚中心が主要なＨＩＶリザーバーであることが示唆された。エリートＨＩＶコントローラーの胚中心でＣＤ８＋Ｔ細胞が増加していたことが報告されている。これらのＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＸＣＲ５を共発現し、高レベルの細胞毒性エフェクター因子を発現し、ウイルス制御に寄与している。本出願の特定の実施形態は、ＣＡＲ−Ｔ細胞またはｅＴＣＲ−Ｔ細胞にＣＸＣＲ５を共発現させることを含む。
【０４６１】
図１５は、ＣＡＲまたはｅＴＣＲを有する改変されたＴ細胞のほか、ＣＸＣＲ５の発現を示す。ＣＸＣＲ５は、Ｐ２ＡリンカーによってＣＡＲまたはｅＴＣＲ遺伝子に連結されていた。抗原認識領域は、抗ＣＤ４、抗ＣＣＲ５、またはタンデム抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５のいずれかであり得る。ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂのいずれかであり得る。抗ＣＸＣＲ５抗体を用いてＣＸＣＲ５の発現を検出した。
【０４６２】
この実験で使用したＣＡＲおよびｅＴＣＲコンストラクトは、上記と同様である。ＣＸＣＲ５は、次の配列を有する：配列番号９。図１６のＡは、形質導入された抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ細胞上のＣＸＣＲ５の発現を示し、図１６のＢは、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞上のＣＸＣＲ５の発現を示す。図に示すように、ＣＡＲ＋細胞の９０％超もＣＸＣＲ５を高レベルで発現している。
【０４６３】
ＣＸＣＲ５を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、図１０のＣおよび図１０のＤに示すように、ＣＸＣＲ５を発現しないＣＡＲ−Ｔ細胞と同様に効率的に標的細胞を排除することができた。エフェクター細胞としてＣＡＲ−Ｔ共発現ＣＸＣＲ５細胞を用い、ＣＦＳＥ標識パンＴ細胞を用いて２４時間培養した。図１０のＣでは、標的細胞をＵＮＴ対照細胞で培養した場合のＣＤ４＋Ｔ細胞数が６３．８％であり、ＣＸＣＲ５を共発現する抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ細胞と標的細胞を共培養した場合の集団は１．４６％に低下した。ＵＮＴサンプルでは、ＣＣＲ５＋％は２１．２％であったが、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−ＣＸＣＲ５サンプルでは、図１０のＤに示すように、パーセンテージは０．６０９％に減少した。
【０４６４】
図１０のＦは、抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５タンデムＣＡＲ−ＣＸＣＲ５−Ｃ３４Ｔ細胞の細胞毒性効果を説明する。抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５タンデムＣＡＲ−ＣＸＣＲ５−Ｃ３４  Ｔ細胞は、ＣＤ４／ＣＣＲ５二重陽性集団を効率的に除去し、ＣＤ４またはＣＣＲ５の単独陽性集団の一部を残し、疾患状況によっては安全性が向上する。
実施例６  広域中和抗体を発現するＴ細胞
【０４６５】
ＨＩＶ感染集団の中でも、抗レトロウイルス薬を服用せずに自然にウイルス感染を制御できる人はごく一部である。研究の結果、ウイルス感染に対するロバストな抗体応答を起こすことができることがわかった。これらの抗体は、ＨＩＶ糖タンパク質ＧＰ１６０の比較的保存された領域を認識し、ＨＩＶの様々なサブタイプを中和することができることから、広域中和抗体であった。広域中和抗体は、ＳＨＩＶに感染したアカゲザルで試験されており、２１週間の中央値でウイルス負荷を制御することができる。本出願の特定の実施形態は、ＣＡＲ−Ｔ細胞またはｅＴＣＲ−Ｔ細胞において広域中和抗体を共発現させることを含む。ＣＡＲ−Ｔ細胞およびｅＴＣＲ−Ｔ細胞は、広域中和抗体を分泌して、新しい宿主細胞のＨＩＶ感染をブロックすることができる。
【０４６６】
図１７は、抗ＣＤ４または抗ＣＣＲ５またはタンデム抗ＣＤ４／抗ＣＣＲ５  ＣＡＲまたはｅＴＣＲ、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ５のほか、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）を発現する改変されたＴ細胞を示す。そのコード配列をｐＬＶＸレンチウイルスベクターにクローニングした。キメラ遺伝子の転写はＥＦ１αプロモーターによって制御されていた。ＣＡＲまたはｅＴＣＲ配列の後にＰ２Ａ配列を付加した。ヒトＣＸＣＲ５配列をＰ２Ａ配列の後ろに付加した。ヒトＩＬ２シグナルペプチド（配列番号３４）を有するｂＮＡｂは、別のＰ２ＡによってＣＸＣＲ５に連結された。
【０４６７】
この実験で使用したＣＸＣＲ５と同様に、ＣＡＲおよびｅＴＣＲコンストラクトも、上記と同じである。ＶＲＣ０１は、次の配列を有する：配列番号１０。Ｔ細胞を、Ｈｉｓタグを標識したＶＲＣ０１（ＶＲＣ０１−６Ｈｉｓ）をコードするＣＡＲ−Ｔレンチウイルスで形質導入した。培養上清を、形質導入後８日目に採取した。上清中のＶＲＣ０１濃度は、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたＥＬＩＳＡにより検出した。検出された濃度は、上清中で約４０ｎｇ／ｍｌであった。
実施例７
ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能的応用
【０４６８】
抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＩＶ感染の主要な宿主細胞であるＣＤ４＋Ｔ細胞を死滅させる。これらの細胞がウイルスを排除できるかどうかを説明するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞をインビトロでＨＩＶ偽ウイルスに感染させた。ＣＡＲ−Ｔ細胞を感染細胞と共培養した。図１８のＡに示すように、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９（配列番号７７）を標的とする対照ＣＡＲ−Ｔと比較して、ウイルス負荷を大幅に減少させた。検出対照としては、ウイルス感染していない細胞を用いた。図１８のＢでは、Ｔ細胞は、ＨＩＶシュードウイルスをコードするＥＧＦＰを感染させ、その偽ウイルスに正常に感染した任意の細胞はＥＧＦＰ＋になった。これらの細胞を標的細胞として使用し、抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ  Ｎｏ．１３細胞またはＵＮＴ細胞と共培養した。異なるＥ：Ｔ比を使用した。細胞を２４時間共培養し、フローサイトメトリーによるＥＧＦＰ割合の検出のために細胞を採取した。Ｅ：Ｔ比の増加に伴い、ＥＧＦＰ＋割合が低下した。Ｅ：Ｔ比が１：１以上に達すると、偽ウイルス＋細胞の割合は０付近まで低下した。図１９のＡでは、ＣＡＲ−Ｔコンストラクトを、ＳＨＩＶ感染ＣＤ４＋標的細胞とインキュベートした。細胞内染色によりウイルスタンパク質ｐ２７を検出した。エフェクターと標的の比率は、０．５：１と２：１の２つの異なるものを使用した。ｐ２７陽性率によって示されるように、ＳＨＩＶ感染に成功した細胞は１．３％〜１．６％であった。ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理したすべてのサンプルにおいて、ｐ２７陽性率は０．２０７％以下に低下し、これはフロー染色アイソタイプ対照に近いか、またはそれより低い。図１９のＢは、ウイルスＲＮＡおよび統合ＤＮＡの減少を示す。細胞培養上清中では、ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理したサンプルでは、ＵＮＴ細胞で処理したサンプルに比べてウイルス力価が劇的に低下した。統合されたＤＮＡレベルは、ＰＣＲプロセスによるバックグラウンドノイズがいくらか存在する検出不能なレベルにまで低下した。これらのデータはすべて、我々のＣＡＲ−ＴがインビトロでＳＨＩＶ感染を非常に効率的にクリアすることを示した。
【０４６９】
本明細書に記載のＣＡＲコンストラクトのインビボでの有効性を試験するために、ヒト免疫系を有するマウスを使用した。以下、このマウスをＨＩＳマウスと呼ぶ。ＨＩＳマウスは、重度の免疫不全でＴ細胞およびＢ細胞の形成が欠損しているＮＯＤ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｐｒｋｄｃ  ＩＬ２Ｒγマウス（ＮＣＧマウス）から作製した。新生ＮＣＧマウスにヒト造血幹細胞を移植し、ＨＩＳマウスと改名した。ヒト造血細胞はマウスでＴ細胞およびＢ細胞に発達し、マウスの免疫ニッチを満たす。これらのＨＩＳマウスを、ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ試験モデルに使った。２つのＣＡＲ−Ｔ細胞を、インビボモデルで試験した：ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ（抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ）（図２３のＡ）ならびにタンデムＣＤ４ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ（抗ＣＤ４−抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ）（図２３のＢおよび図２３のＣ）。ＵＮＴ細胞を、対照としてレシピエントマウスの別個の群に注入した。図２３のＡに示すように、ＵＮＴ細胞処理マウスでは、マウスにＵＮＴ細胞を接種した後、ＣＣＲ５＋細胞が増加したが、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ処理マウスでは、観察期間中、ＣＣＲ５＋％が連続的に減少した。観察期間終了時には、生細胞集団中のＣＣＲ５＋％は０に近くなっていた。ＨＩＳマウスの別の群を、図２３のＢおよび図２３のＣに示すように、タンデムＣＤ４ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔで処理した。ＣＡＲ−Ｔ細胞処理後のマウス末梢血中のＣＣＲ５＋集団は劇的に減少した。ＣＣＲ５＋集団は、末梢生細胞集団からほぼ完全に欠失した。また、ＣＤ４＋集団もタンデムＣＤ４ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ群では元の集団の半分に減少した。生細胞中のＣＤ４＋集団の割合は、ＣＡＲ−Ｔ処理前は約３％であったが、観察期間終了時には１％まで減少した。これらのデータは、抗ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔが末梢血からＣＣＲ５＋細胞を除去するのに非常にインビボで効率的であることを示した。ＣＤ４＋集団は半分に減少し、まだ減少していることから、ＣＣＲ５＋細胞を排除する上で効率が高い他に、タンデムＣＤ４ＣＣＲ５  ＣＡＲ−ＴはＣＤ４＋集団を減少させることにも有効であることが示唆された。
【０４７０】
抗ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ細胞のもう一つの応用は、ＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ腫／白血病治療であろう。図２０に示すように、異なる用量のＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＣＤ４＋であるＳｕｐ−Ｔ１およびＨＨ  Ｔリンパ芽細胞と共培養した。ＣＡＲ−Ｔ細胞はこれらの腫瘍細胞に対して大きな細胞毒性を示したが、ＵＮＴ対照細胞は腫瘍細胞の生存率に影響を与えなかった。ＨＨ細胞をＮＣＧマウスに皮下移植し、細胞由来のキセノグラフト（ＣＤＸ）マウスモデルを作製した。ＨＨ  ＣＤＸマウスへのＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ接種は、図２１に示すように、ＣＡＲ−Ｔ細胞がマウスの腫瘍負担を有意に減少させることを示した。ＣＡＲ−Ｔ療法を受けたマウスは、ＣＡＲ−Ｔ接種後１２日目に腫瘍がなくなっていた。図２１のＡに示すように、腫瘍は、犠牲化基準を満たす前に、対照ハンクスのバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）緩衝剤またはＵＮＴ細胞で処理したマウスにおいて連続的に成長した。ＣＡＲ−Ｔ処理したマウスの腫瘍は処理後すぐに縮小し、マウスは全観察期間中生存した。図２１のＢにおいて、ＣＡＲ−Ｔ処理マウスの体重は、ＨＢＳＳまたはＵＮＴ処理マウスよりもわずかに低いが、これはおそらく腫瘍負担が少ないためであろう。ＨＢＳＳおよびＵＮＴで処理したマウスは２０日目頃に疾患の進行により犠牲になったため、その後の体重記録はなかった。
実施例８．スプリットＣＡＲシステム
【０４７１】
スプリットＣＡＲ−Ｔ細胞の構築
【０４７２】
本明細書に記載されるスプリットＣＡＲシステムは２つの構成要素を含む。一方のタンパク質は、細胞外抗原認識ドメイン、ヒンジ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内共刺激ドメインから構成されている。スプリットシグナルＣＡＲの他方のタンパク質は、第２の抗原認識ドメイン、ヒンジ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、細胞内ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインから構成されている。細胞外抗原認識ドメインは、一方の構成要素については抗ＣＤ４  ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂであり得、他方の構成要素については抗ＣＣＲ５または抗ＣＸＣＲ４のｓｃＦｖもしくはｓｄＡｂであり得る（図１）。本実施例では、２つのタンパク質のコード配列は、中間のＰ２Ａ配列で連結されていた。全コード配列は、ｐＬＶＸレンチウイルスプラスミド中のＥＦ１αプロモーターの制御下にあった。ＣＡＲコンストラクトを形質導入されたＴ細胞は、両タンパク質を相乗的に発現させる。また、Ｔ細胞はホーミング受容体を発現することもできた。ホーミング受容体の１つは、ＣＸＣＬ１３ケモカインと相互作用し、二次リンパ器官のＢ細胞濾胞への細胞ホーミングに重要な役割を果たすＣＸＣＲ５（図２）であり得る。ホーミング受容体はまた、細胞が腸にホーミングするのを助けるアップレギュレーションされたα４β７であり得る（図３）。
【０４７３】
スプリットシグナルＣＡＲのインビトロ効果
【０４７４】
図２２は、例示的なスプリットシグナルＣＡＲ−Ｔのインビトロ効果を示す。この実験では、４つの設計を使用した。ｓｓＣＤ４ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔでは、抗ＣＤ４がＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに接続され、抗ＣＣＲ５が共刺激ドメインに接続されているのに対し、ｓｓＣＣＲ５ＣＤ４では、抗ＣＣＲ５の部分がＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、抗ＣＤ４が共刺激ドメインに接続されている。
【０４７５】
コンストラクトは以下の配列を有する。
【０４７６】
ｓｓＣＤ４ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ：配列番号２６。
【０４７７】
抗ＣＤ４−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８  ＴＭ−ＣＤ３ζ：配列番号２７。
【０４７８】
抗ＣＣＲ５−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８  ＴＭ−４−１−ＢＢ：配列番号２８。
【０４７９】
ｓｓＣＣＲ５ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔ：配列番号２９。
【０４８０】
抗ＣＣＲ５−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８  ＴＭ−ＣＤ３ζ：配列番号３０。
【０４８１】
抗ＣＤ４−ＣＤ８ヒンジＣＤ８  ＴＭ−４−１−ＢＢ：配列番号３１。
【０４８２】
ｓｓＣＤ４ＣＣＲ５−ＣＸＣＲ５：配列番号７８。
【０４８３】
ｓｓＣＣＲ５ＣＤ４−ＣＸＣＲ５：配列番号７９。
【０４８４】
２つの部位間はＰ２Ａで連結されており、第１の部位はＭｙｃタグを有していた。Ｍｙｃの発現は、スプリットシグナルＣＡＲの発現を表すために、図２２のＡに示すように、フローサイトメトリーによって検出された。それらの機能を試験するために、ＣＦＳＥ標識パンＴ細胞を標的細胞として使用し、ＣＡＲ−Ｔ細胞とＥ：Ｔ＝０．５：１で共インキュベートした。フローサイトメトリーの結果を図２３のＢに示す。対照のＵＮＴサンプルでは、ＣＤ４＋集団は４２．２％、ＣＣＲ５＋集団は９．２９％、ＣＤ４＋ＣＣＲ５＋集団は６．６４％であった。ＳｓＣＤ４ＣＣＲ５  ＣＡＲ−ＴおよびｓｓＣＣＲ５ＣＤ４  ＣＡＲ−ＴはＣＤ４＋ＣＣＲ５＋二重陽性集団の大部分を死滅させ、残ったＣＤ４＋ＣＣＲ５＋集団は１％未満であった。ｓｓＣＣＲ５ＣＤ４  ＣＡＲ−Ｔサンプルでは、ＣＤ４単独陽性細胞が１０．４％、ＣＣＲ５単独陽性細胞が６．７７％残っていた。ｓｓＣＤ４ＣＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔサンプルでは、残りのＣＣＲ５＋細胞は７．８９％であった。ｓｓＣＣＲ５ＣＤ４  ＣＡＲおよびｓｓＣＤ４ＣＣＲ５  ＣＡＲにＣＸＣＲ５を添加したことで、ＣＣＲ５＋細胞の大部分が保たれ、ＣＡＲ−Ｔ細胞との共培養後も約半分のＣＤ４＋単独陽性細胞が生き続けていた。これらのデータは、ＣＤ４とＣＣＲ５の両方が同じ細胞上に存在する場合に、スプリットＣＡＲが最も効果的に機能することを示唆している。ＳｓＣＣＲ５ＣＤ４、ｓｓＣＣＲ５ＣＤ４−ＣＸＣＲ５およびｓｓＣＤ４ＣＣＲ５−ＣＸＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、それらの単独陽性細胞の多くを残しておくことができるＣＤ４単独陽性細胞またはＣＣＲ５単独陽性細胞を死滅させるのに効率的ではなかった。ＣＣＲ５指向性ＨＩＶ感染は、同一細胞上でＣＤ４とＣＣＲ５の両方の発現を必要とする。スプリットＣＡＲはＨＩＶ標的細胞を除去することができるが、ＨＩＶ感染に対して感受性がより少ないＣＤ４またはＣＣＲ５の単独陽性細胞の一部を残しておくことができた。
【０４８５】
本発明の実施形態に従う例示的なコンストラクトの配列：
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【０４８６】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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