(57)【要約】  本発明は、クロロキンゲル、その調製方法及び応用を開示する。本発明は、水溶性ナノスフェア担体、及びクロロキン又はクロロキン誘導体を含有するクロロキンナノスフェアをさらに提供し、クロロキン又はクロロキン誘導体と水溶性ナノスフェア担体の質量比が１：３以下である。本発明は、水溶性ナノスフェア担体とクロロキン又はクロロキン誘導体とを組み合わせてナノスフェアを調製することによって、クロロキンの副作用及び薬剤耐性の問題を効果的に解決し、治療部位での医薬品の滞留時間を延長させ、医薬品のバイオアベイラビリティと治療効果を向上させて、外性器感染症を効果的に治療でき、治療効果を大幅に高め、クロロキンの用途を広げて、その応用手段を増加するだけでなく、調製方法が簡便であり、合成しやすく、毒性及び副作用がなく、安全性が高く、新薬の工業化的応用が期待できる。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロキンナノスフェアであって、
水溶性ナノスフェア担体、及びクロロキン又はクロロキン誘導体を含有する、
ことを特徴とするクロロキンナノスフェア。
【請求項２】
その調製方法は、
前記水溶性ナノスフェア担体を溶解した後、クロロキン又はクロロキン誘導体と水溶性ナノスフェア担体の質量比が１／３以下となるようにクロロキン又はクロロキン誘導体を加え、均一に混合して撹拌して水相とするステップＳ１と、
油相基質に乳化剤を加えて油相とし、水相と油相の体積比が１：１〜６となるように水相を油相に加え、１００００〜２００００ｒ／ｍｉｎで１０〜３０ｍｉｎ乳化させ、ナノスフェアエマルジョンを得るステップＳ２と、
ナノスフェアエマルジョンに沈殿剤を加えて、均一に混合し、次に、２〜８ｍｉｎ静止した後脱水し、高速遠心処理して、洗浄して乾燥させ、前記クロロキンナノスフェアを得るステップＳ３と、を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のクロロキンナノスフェア。
【請求項３】
調製するときに前記クロロキン又はクロロキン誘導体と水溶性ナノスフェア担体の質量比が１：３〜１：５である、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のクロロキンナノスフェア。
【請求項４】
前記クロロキン誘導体は、ヒドロキシクロロキン、リン酸クロロキン又は硫酸クロロキンから選ばれる１種以上である、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のクロロキンナノスフェア。
【請求項５】
前記水溶性ナノスフェア担体は、水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉から選ばれる１種以上である、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のクロロキンナノスフェア。
【請求項６】
調製されたクロロキンナノスフェアにおけるクロロキン又はクロロキン誘導体の担持率が、３．０％〜２１．６％である、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のクロロキンナノスフェア。
【請求項７】
乳化剤と沈殿剤の体積比が、１〜１．５：３０〜５０である、
ことを特徴とする請求項２に記載のクロロキンナノスフェア。
【請求項８】
前記油相基質は、植物油であり、前記沈殿剤は、アルカリ性有機相である、
ことを特徴とする請求項２に記載のクロロキンナノスフェア。
【請求項９】
前記アルカリ性有機相は、水酸化ナトリウム−ｎ−プロパノール混合溶液であり、前記アルカリ性有機相のｐＨ値が８．５〜１０．０である、
ことを特徴とする請求項８に記載のクロロキンナノスフェア。
【請求項１０】
抗菌及び／又は抗ウイルス製品の調製における請求項１又は２に記載のクロロキンナノスフェアの応用。
【請求項１１】
外性器感染症及び／又はほかの皮膚イボを予防及び治療する製品の調製における請求項１又は２に記載のクロロキンナノスフェアの応用。
【請求項１２】
前記外性器感染症は、ウイルス性膣炎、尖形コンジローム、細菌性膣疾患、真菌感染性膣炎又はトリコモナス膣炎を含む、
ことを特徴とする請求項１１に記載の応用。
【請求項１３】
前記ほかの皮膚イボは、扁平イボ、非性器部位でのイボを含む、
ことを特徴とする請求項１１に記載の応用。
【請求項１４】
外性器感染症及び／又はほかの皮膚イボを予防及び治療する製品であって、クロロキン又はクロロキン誘導体を含み、さらに水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉のうちの１種以上を含む、
ことを特徴とする製品。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のクロロキンナノスフェアを含有する、
ことを特徴とする請求項１４に記載の製品。
【請求項１６】
前記クロロキンナノスフェアは、製品の全重量の１％〜６％を占める、
ことを特徴とする請求項１５に記載の製品。
【請求項１７】
前記製品の剤形は、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、発泡錠、膣錠、カプセル剤、フィルム剤又は座剤である、
ことを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬の技術分野に属し、より具体的には、外性器感染症及びほかの皮膚イボの治療に適用できるクロロキンゲル、その調製方法及び応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生殖感染症は、性感染症としても知られており、性的接触が主な感染方式である疾患のことである。性行為又は性行為に類似した行為によって引き起こされる２０種類以上の感染症が、国際的に生殖感染症のカテゴリーに含まれている。１９８０年代以来、流動する人口の数がますます増えて、性的観念が変わり、安全でない性行為が増えている。中国では生殖管感染症や性感染症が増加しており、沿岸部から内陸部、都市部から農村部に広がっており、状況は非常に厳しい。統計によると、現在、中国では、約４０万人のエイズ患者があり、ＨＩＶ感染が１,０００人に約１人あり、毎日約数百人が感染され、性的感染の割合が大きいこと、及びハイリスク集団から一般集団へ変わりつつあることを特徴とする。統計によると、中国では、近年、両性の外性器感染症の症例数が年々増加しており、多くの区域では、外性器感染症の発症率は、感染症のうち２位と３位にあり、既婚女性の下部生殖管感染症の発症率は５０％、７０％と高く、女性は、一生を通じて少なくとも１回外陰カンジダ症に罹患し、そのうち５％〜１０％の女性は、再発膣カンジダ症に罹患し、９０％の女性は、ヒトパピローマウイルスに感染されたことがある。両性の外性器感染症の発症率は前記のように急速に増加し且つ制御されにくいため、世界的に深刻な脅威となっている社会的及び公衆衛生上の問題となり、このため、両性の外性器感染症の効果的な予防及び治療は、現在、非常に深刻で緊急の課題となっている。
【０００３】
現代医学は、外性器感染症に対しては病原体をターゲットとして治療するのが一般的である。予防及び治療では、生殖管感染症を引き起こし得る病原微生物の多様性と、病原体の突然変異及び薬剤耐性の問題のため、生殖管感染症を予防するために抗生物質を使用することは非常に困難である。現在、臨床的実践では、外性器感染症の治療は、主に抗生物質又は消毒剤を投与することにより行われる。しかしながら、消毒剤は、局所粘膜への刺激性により膣内の環境を破壊するので使用が制限され、且つ、通常は局所治療にのみ適している。細菌性器感染症の場合は、抗生物質による治療は、しばしば薬剤耐性と副作用をもたらす。したがって、抗菌と抗ウイルスの二重作用を有する高性能の新規な外用医薬品の開発は、外性器感染症を効果的に予防及び治療するために非常に重要である。
【０００４】
従来から、クロロキンは、マラリア原虫感染を予防及び治療するための医薬品として使用されており、またトランスフェクション効率を向上させるために遺伝子トランスフェクション実験でもよく使用される。インビトロ研究では、高濃度のクロロキンは、インビトロでクリプトコッカス菌を阻害して殺滅する作用を有し、且つ、クリプトコッカス菌の２つのバリアントに対するクロロキンの作用にも差別はなく、また、クロロキンは、アンホテリシンBの抗クリプトコッカス菌能力を増強でき、アンホテリシンBとは相乗的な抗菌作用を有することが分かった。現在、多くの研究がＨＩＶに対するクロロキンの活性に焦点を合わせている。研究により、クロロキンには広いスペクトルの抗ＨＩＶ活性があり、クロロキンは、ＨＩＶ−１から進化された実験室株Ｂに対してだけでなく、ＨＩＶ−１から進化されたＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの一次分離株に対しても有効であることが示されている。クロロキンの抗ＨＩＶ作用の主なメカニズムは、ｇｐ１２０ウイルスエンベロープタンパク質のグリコシル化を阻害し、新たに生成するビリオンの感染性を大幅に低下させると考えられる。また、研究によれば、クロロキンは、二本鎖ＤＮＡに挿入されて巻き戻されることによりＤＮＡの二重らせん形態を変えることができるアミノキニン類の膜貫通剤であることが示唆されている。細菌学的研究によれば、クロロキンをアクリジンオレンジやエチジウムブロマイドなどのようなインターカレート剤として使用して、小さなプラスミドＤＮＡの共有結合を選択的に阻害し、ＤＮＡの超らせん密度を変えることで超らせんの閉鎖を変えることにより、細菌及びウイルス感染細胞の増殖を阻害できることが示唆されている。子宮頸がんを引き起こすヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＤＮＡは、このようなプラスミドであり、超らせんで組み立てられた複合物ＤＮＡであり、ＤＮＡ複製とＲＮＡ転写を行う。一方、クロロキンは、プラスミドＤＮＡのらせん密度を変えることにより、プラスミドＤＮＡを阻害しＤＮＡポリメラーゼ活性を妨害できることが証明されている。クロロキンは、弱アルカリ性であるため、たとえば、エンドソーム／リソソームの蓄積、ｐＨの変更、アポトーシスを引き起こし得ることなどのミトコンドリア機能障害を引き起こし得ることが証明されている。また、クロロキンは、不活性化されたｐ５３を再活性化させること（ＨＰＶはＰ５３を分解／不活性化する）、メラニン（メラニンの発生及びＨＰＶの複製は、皮膚の同一層すなわち表皮の基底層で起こる）に連結されること、鉄イオンの放出（鉄触媒／ＨＰＶ複製時に必要なエネルギー）を防ぐことが可能であることが証明されている。鉄は、ＤＮＡ複製に不可欠なものであり、また、酸素の輸送や貯蔵にも電子触媒として機能する。しかしながら、鉄は、病原体の生存とウイルス複製に不可欠な物質でもある。鉄粒子に対する阻害も、クロロキンがウイルス及びウイルス感染細胞を殺滅する重要なメカニズムである。
【０００５】
現在、クロロキンには、外用医薬品、特に刺激性が小さく治療効果がより後広範な外用製剤がない。臨床応用では、クロロキンは、主にマラリアの急性発作を治療し、マラリアの症状を制御するために使用される。また、肝性アメーバ症、肝吸虫症、肺吸虫症、結合組織病などの治療にも使用できる。さらに、日焼け紅斑などの光線過敏症の治療にも使用できる。錠剤と注射剤は、マラリアの治療に用いられる場合、投与量が大きく、治療時間が長く、胃腸管や皮膚に深刻な副作用をもたらす可能性があり、また、クロロキンは、皮膚に一定の刺激性があり、皮膚損傷やさまざまなタイプの発疹を引き起こす可能性がある。したがって、どうように剤形を変えることでクロロキンの刺激性及び副作用を低減させ、クロロキンの応用価値を高めるかは、現在の主要な課題となっている。
【０００６】
医薬品マイクロスフェアとは、高分子ポリマー基質に医薬品を分散又は吸着させることにより形成された微小球体を指す。マイクロスフェア製剤は、長期持続放出又はターゲティング作用があり、患者の使用の利便性、コンプライアンスを大幅に向上させることができ、臨床では既に明らかな優位性を示し、非常に有望な剤形といえる。また、マイクロスフェア製剤製品は、付加価値が大きく、市場での将来性が期待できるため、近年の医薬品開発の焦点となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、従来技術の上記欠点を克服するために、天然高分子化合物をマイクロスフェア担体として使用することにより、調製プロセスが簡単であり、製品の副作用が小さく、クロロキンとマイクロスフェア担体の相乗作用を十分に発揮させ、顕著な抗炎症、抗菌、抗ウイルスの作用があり、クロロキンによる皮膚の刺激を低減させ、創口の癒合を促進し、また薬物の放出速度を制御することができ、従来のマイクロスフェア担体の低抗菌性とクロロキンの高刺激性の欠陥を解消するクロロキンナノスフェアを提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、外性器及びほかの皮膚イボに適用できる上記クロロキンナノスフェアの調製方法を提供することである。
【０００９】
本発明のまた別の目的は、上記クロロキンナノスフェアの新用途を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、外性器感染症及び／又はほかの皮膚イボを予防及び治療する製品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の上記目的は、下記技術案によって実現される。
【００１２】
クロロキンナノスフェアであって、水溶性ナノスフェア担体、及びクロロキン又はクロロキン誘導体を含有する。
【００１３】
本発明者は、驚くことに、水溶性ナノスフェア担体とクロロキン又はクロロキン誘導体を組み合わせて調製されるナノスフェアが、作用時間が長く、粘膜に対する粘着性、局所滞留性及び自己分解性を有し、且つクロロキンの刺激性を低減させ、外性器には刺激性がなく、従来の外性器感染症の治療方法の大きな副作用及び使用の不便さの欠陥を同時に解決し、クロロキンの副作用及び薬剤耐性を効果的に解決できることを見出した。本発明のナノスフェアは、外性器感染症及びほかの皮膚イボ性疾患、たとえば膣炎、扁平イボなどを効果的に予防又は治療でき、さらに顕著な相乗効果を果たし、クロロキンの用途、その応用範囲を広げるだけでなく、従来の抗菌医薬品の乱用による薬剤耐性を解決できる。
【００１４】
本発明は、さらに上記クロロキンナノスフェアの調製方法に関し、
前記水溶性ナノスフェア担体を溶解した後、クロロキン又はクロロキン誘導体と水溶性ナノスフェア担体の質量比が１／３以下となるようにクロロキン又はクロロキン誘導体を加え、均一に混合して撹拌して水相とするステップＳ１と、
油相基質に乳化剤を加えて油相とし、水相と油相の体積比が１：１〜６となるように水相を油相に加え、１００００〜２００００ｒ／ｍｉｎで１０〜３０ｍｉｎ乳化させ、ナノスフェアエマルジョンを得るステップＳ２と、
ナノスフェアエマルジョンに沈殿剤を加えて、均一に混合し、次に、２〜８ｍｉｎ静止した後脱水し、高速遠心処理して、洗浄して乾燥させ、前記クロロキンナノスフェアを得るステップＳ３と、を含む。
【００１５】
好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体と水溶性ナノスフェア担体の質量比が１：３〜１：５である。
【００１６】
より好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体と水溶性ナノスフェア担体の質量比が１：３である。
【００１７】
好ましくは、前記クロロキン誘導体は、ヒドロキシクロロキン、リン酸クロロキン又は硫酸クロロキンから選ばれる１種以上である。
【００１８】
好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体の担持率が、３．０％〜２１．６％である。
【００１９】
より好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体の担持率が、１２．５％である。
【００２０】
好ましくは、前記水溶性ナノスフェア担体は、水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉から選ばれる１種以上である。
【００２１】
好ましくは、前記水溶性ナノスフェア担体は、水溶性キトサンである。
【００２２】
より好ましくは、前記水溶性キトサンは、脱アセチル化度が８０％〜９５％、粘度平均分子量が３０００〜５０００である。
【００２３】
好ましくは、ステップＳ２において、前記水相と油相の体積比が、１：３である。
【００２４】
好ましくは、ステップＳ３において、前記高速遠心処理の条件は、１５００〜２０００ｒ／ｍｉｎで５〜１０ｍｉｎ遠心処理することである。
【００２５】
より好ましくは、ステップＳ３において、前記高速遠心処理の条件は、１５００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心処理することである。
【００２６】
好ましくは、ステップＳ３において、１ｓあたり１〜５滴の速度でナノスフェアエマルジョンに沈殿剤を滴下する。
【００２７】
好ましくは、前記乳化剤と沈殿剤の体積比が、１〜１．５：３０〜５０である。
【００２８】
より好ましくは、前記乳化剤と沈殿剤の体積比が、１：５０である。
【００２９】
好ましくは、前記油相基質は、植物油であり、前記沈殿剤は、アルカリ性有機相である。
【００３０】
より好ましくは、前記アルカリ性有機相は、水酸化ナトリウム−ｎ−プロパノール混合溶液である。
【００３１】
より好ましくは、前記アルカリ性有機相のｐＨ値が８．５〜１０．０である。
【００３２】
さらに好ましくは、前記アルカリ性有機相のｐＨ値が９．０である。
【００３３】
好ましくは、前記植物油は、コーン油、オリーブオイル、落花生油、大豆油、菜種油などの植物油から選ばれる１種以上である。
【００３４】
好ましくは、前記乳化剤は、ツイン−２０、ツイン−８０、Ｓｐａｎ  ８０から選ばれる１種以上である。
【００３５】
抗菌及び／又は抗ウイルス製品の調製における上記クロロキンナノスフェアの応用、及び外性器感染症及び／又はほかの皮膚イボを予防及び治療する製品の調製における上記クロロキンナノスフェアの応用も、本発明の保護範囲に含まれる。
【００３６】
上記クロロキンナノスフェアを含有する製品は、クロロキンによる皮膚への刺激性を大幅に低減させ、創口の癒合を促進し、徐放効果を果たし、また、その生物学的活性を向上させ、外性器感染症及びほかの皮膚イボの治療に適用できる。
【００３７】
好ましくは、前記外性器感染症は、ウイルス性膣炎、尖形コンジローム、細菌性膣疾患、真菌感染性膣炎又はトリコモナス膣炎を含む。
【００３８】
好ましくは、前記其他皮膚イボは、扁平イボ、ＨＰＶ感染により引き起こされる非性器部位でのイボを含む。
【００３９】
前記クロロキンナノスフェアは、ウイルス性膣炎、尖形コンジローム、細菌性膣疾患、真菌感染性膣炎又はトリコモナス膣炎などの外性器感染症、及び扁平イボ、ＨＰＶ感染により引き起こされる非性器部位でのイボなどのほかの皮膚イボのいずれにも良好な治療効果を有する。
【００４０】
本発明は、クロロキン又はクロロキン誘導体を含み、さらに水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉のうちの１種以上を含む、外性器感染症及び／又はほかの皮膚イボを予防及び治療する製品をさらに提供する。
【００４１】
好ましくは、クロロキン又はクロロキン誘導体と、水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉との質量比が、１／３以下である。
【００４２】
より好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体と、水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉との質量比が、１：３〜１：５である。
【００４３】
さらに好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体と、水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉との質量比が、１：３である。
【００４４】
さらに、本発明の好適実施例では、前記外性器感染症及び／又はほかの皮膚イボを予防及び治療する製品は、上記クロロキンナノスフェアを含有する。
【００４５】
より好ましくは、前記クロロキンナノスフェアは、製品の全重量の１％〜６％を占める。
【００４６】
さらに、本発明の好適実施例では、前記製品は、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、発泡錠、膣錠、カプセル剤、フィルム剤又は座剤である。
【００４７】
本発明の前記製品は、ゲル剤、クリーム剤などの半固体製剤、又は、錠剤、発泡錠などの固体製剤として調製でき、本発明の前記製品は、クロロキン自体の苦味、皮膚への刺激性を顕著に改善し、創口の癒合を促進し、徐放効果を果たし、また、その生物学的活性を向上させる。
【００４８】
また、さらに、本発明の好適実施例では、前記製品は、ゲル剤である。
【発明の効果】
【００４９】
従来技術に比べて、本発明の有益な効果は、以下のとおりである。
【００５０】
（１）本発明では、水溶性ナノスフェア担体とクロロキンを組み合わせて、殺菌と抗ウイルスを兼ね備える外用製剤を調製し、顕著な相乗効果を発揮させ、複数種の細菌やウイルスに対して一定のクリーニングや殺滅作用を果たし、男性及び女性を問わず外性器に対してクリーニングやケアの作用を有し、外性器の炎症反応を低減させ、且つ、クロロキンによる皮膚への刺激性を改善し、膣粘膜、ペニスには刺激がなく、粘膜に対する粘着性、局所滞留性及び自己分解性を有し、細菌やウイルスの感染を予防できるとともに、微小創口の癒合を促進することができ、外性器感染症やイボを効果的に治療でき、特にセックスの前後の外性器のヘルスケアに対しては、効果が顕著であり、かつ涼しく快適に使用できる。
【００５１】
（２）本発明は、主に水溶性ナノスフェア担体と相乗剤であるクロロキンを主成分とするものであり、処方が安定的であり、医薬品は、マイクロスフェアの形態として存在し、治療部位での医薬品の滞留時間を延長させ、作用時間を延長させ、医薬品のバイオアベイラビリティ及び治療効果を高め、その調製方法が簡便であり、合成されやすく、且つ毒性や副作用がなく、安全性が高く、新薬の産業的応用に適用でき、抗菌、抗ウイルス活性を有する医薬品の開発及び応用のために新しい選択を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】クロロキンキトサンナノスフェアである。
【図２】高速液体検出によるクロロキンの検量線である。
【図３】高速液体検出によるクロロキンキトサンマイクロスフェアのクロロキン含有量である。
【図４】クロロキンキトサンナノスフェアとクロロキンマイクロスフェアの放出状況である。
【図５】滑らかなガラス面で観察された各割合のゲル製品である（ゲル製品１〜４では、リン酸クロロキン：キトサンの質量比は、それぞれ１：５、１：３、１：１、１：０．５であり、ゲル製品５は、純粋なキトサンのゲル製品である）。
【図６】各割合のゲル製品の１ｍｉｎ内の滑らかなガラス面での流動の状況である（ゲル製品１〜４では、リン酸クロロキン：キトサンの質量比は、それぞれ１：５、１：３、１：１、１：０．５であり、ゲル製品５は、純水なキトサンのゲル製品である）。
【図７】損傷皮膚刺激性試験のＨ−Ｅ染色結果である。Ａ群：対照群、空白ゲル基質、図Ａ１（被験物側）、図Ａ２（陰性対照側）；Ｂ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１、図Ｂ１（被験物側）、図Ｂ２（陰性対照側）；Ｃ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２、図Ｃ１（被験物側）、図Ｃ２（陰性対照側）；Ｄ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群３、図Ｄ１（被験物側）、図Ｄ２（陰性対照側）；Ｅ群：リン酸クロロキンゲル群、図Ｅ１（被験物側）、図Ｅ２（陰性対照側）。
【図８】ヘルペスウイルス膣炎動物試験のＨ−Ｅ染色結果である。図Ａ：空白対照群；図Ｂ：モデル対照群；図Ｃ：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１；図Ｄ：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２；図Ｅ：リン酸クロロキンゲル群。
【図９】ＨＰＶ尖形コンジローム動物実験のＨ−Ｅ染色結果である。図Ａ：モデル対照群；図Ｂ：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１；図Ｃ：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２；図Ｄ：リン酸クロロキンゲル群。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、特定の実施形態にて本発明をさらに説明するが、実施例は、本発明を何ら制限するものではない。本発明の主旨及び実質から脱逸せずに本発明の方法、ステップ又は条件について実施される簡単な修正又は置換は、すべて本発明の範囲に属し、特に断らない限り、実施例に使用されている技術手段は、当業者が公知する一般的な手段である。
【００５４】
特に断らない限り、以下の実施例に使用される試薬及び材料は、すべて市販品である。
【００５５】
実施例１    クロロキンキトサンナノスフェアの調製
１、調製方法
Ｓ１．脱アセチル化度８０％、粘度平均分子量５０００の水溶性キトサン３ｇを秤量して、水１００ｍＬに溶解した後、リン酸クロロキン１．０ｇを加え、均一に混合して撹拌して水相とする。
Ｓ２．コーン油３００ｍＬを秤量して油相基質とし、油相基質に乳化剤としてのツイン−２０１ｍＬを加えて油相とし、水相と油相の体積比が１：３となるように水相を油相に加え、１５０００ｒ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ乳化させ、ナノスフェアエマルジョンを得る。
Ｓ３．水酸化ナトリウム−ｎ−プロパノール混合溶液を沈殿剤とし、まず、ｎ−プロパノール１０ｍＬに数滴の飽和水酸化ナトリウム溶液を滴下してｐＨ＝９に調整し、均一に混合した後、乳化剤と沈殿剤の体積比が１：５０となるように、１ｓあたり１〜５滴の速度でナノスフェアエマルジョンに滴下し、５ｍｉｎ静止し、適量のｎ−プロパノールを加えて脱水し、１５００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心処理し、洗浄して乾燥させ、前記クロロキンキトサンナノスフェアを得る。
【００５６】
２、製品のキャラクタリゼーション
（１）調製されたクロロキンキトサンナノスフェアは、図１に示されるように、粒子径が１００〜８００ｎｍである。
（２）図２及び図３に示されるように、高速液体検出をしたところ、クロロキンキトサンマイクロスフェアにおけるクロロキンの担持率は、１２．５％である。
【００５７】
実施例２    クロロキンキトサンナノスフェアの調製
１、調製方法
Ｓ１．脱アセチル化度９０％、粘度平均分子量３０００の水溶性キトサンを水で溶解した後、ヒドロキシクロロキンと水溶性キトサンの質量比が１：５となるようにヒドロキシクロロキンを加え、均一に混合して撹拌して水相とする。
Ｓ２．コーン油３００ｍＬを秤量して油相基質とし、油相基質に乳化剤としてのツイン−２０  １ｍＬを加えて油相とし、水相と油相の体積比が１：１となるように水相を油相に加え、１００００ｒ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ乳化させ、ナノスフェアエマルジョンを得る。
Ｓ３．  水酸化ナトリウム−ｎ−プロパノール混合溶液を沈殿剤とし、ｎ−プロパノール１０ｍＬに数滴の飽和水酸化ナトリウム溶液を滴下してｐＨ＝８．５に調整し、均一に混合した後、乳化剤と沈殿剤の体積比が１．５：５０となるようにナノスフェアエマルジョンに緩慢に加え、２ｍｉｎ静止し、適量のｎ−プロパノールを加えて脱水し、２０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、洗浄して乾燥させ、粒子径２００〜８００ｎｍ、クロロキンの担持率１０．３％の前記クロロキンカラギーナンナノスフェアを得る。
【００５８】
実施例３    クロロキンキトサンナノスフェアの調製
１、調製方法
Ｓ１．脱アセチル化度９０％、粘度平均分子量４０００の水溶性キトサンを水で溶解した後、硫酸クロロキンと水溶性キトサンの質量比が１：７となるように硫酸クロロキンを加えて、均一に混合して撹拌して水相とする。
Ｓ２．オリーブオイルを油相基質とし、油相基質に乳化剤としてのツイン−８０を加えて油相とし、水相と油相の体積比が１：６となるように水相を油相に加え、２００００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ乳化させ、ナノスフェアエマルジョンを得る。
Ｓ３．水酸化ナトリウム−ｎ−プロパノール混合溶液を沈殿剤とし、まず、ｎ−プロパノールに数滴の飽和水酸化ナトリウム溶液を滴下してｐＨ＝１０に調整し、均一に混合した後、乳化剤と沈殿剤の体積比が１．５：３０となるようにナノスフェアエマルジョンに緩慢に加え、８ｍｉｎ静止し、適量のｎ−プロパノールを加えて脱水し、１５００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、洗浄して乾燥させ、平均粒子径４００ｎｍ、クロロキンの担持率８．６％の前記クロロキン澱粉ナノスフェアを得る。
【００５９】
実施例４    クロロキンキトサンナノスフェアゲルの調製
１、ゲルの処方
【表１】
2021509681.tif 000003
【００６０】
２、調製方法は、
実施例１のクロロキンキトサンナノスフェアの調製ステップと同様にマイクロスフェアを調製するステップ（１）と、
カルボキシメチルセルロース２０ｇに処方量のグリセリン３００ｇ、エチルパラベン２ｇを加えて、均一に撹拌し、十分に膨潤してゲル基質とし、クロロキンキトサンナノスフェア１０ｇを水１００ｍＬに溶解し、ゲル基質にバッチ式で加えて撹拌し、ハッカ油１ｍｌを加えて、水を１０００ｍＬまで加えて、外性器の抗菌、抗ウイルスに適しているクロロキンキトサンナノスフェアゲルを得るステップ（２）と、を含む。
【００６１】
３、同様な方法によって、純粋なクロロキンゲルを調製し、クロロキンキトサンナノスフェアゲルとクロロキンゲルにおけるクロロキンの放出率を比較した。
【００６２】
図４に示されるように、クロロキンキトサンナノスフェアゲルは、クロロキンを緩慢で安定的に放出できた。本発明で調製されたクロロキンキトサンナノスフェアゲルは、初期ではバースト放出がなく、放出速度も媒体による影響をほぼ受けず、良好な徐放効果を示し、外用投与後の医薬品の持続的放出に有利であった。
【００６３】
実施例５    クロロキンキトサンナノスフェアゲルの調製
１、ゲルの処方
【表２】
2021509681.tif 000004
【００６４】
２、調製方法は、
実施例１のクロロキンキトサンナノスフェアの調製ステップと同様に、マイクロスフェアを調製するステップ（１）と、
カルボキシメチルセルロースに処方量のグリセリンを加えて、水８００ｍＬを加え、均一に撹拌し、十分に膨潤してゲル基質とし、クロロキンキトサンナノスフェアを水１００ｍＬに溶解し、ゲル基質にバッチ式で加えて撹拌し、８０〜８５℃の熱湯５０ｍＬでエチルパラベンを溶解し、温度が４０℃以下に下がると、ゲル基質に加えて、均一に撹拌し、ハッカ油を加えて、水を１０００ｍＬまで加えて、外性器の抗菌、抗ウイルスに適しているクロロキンキトサンナノスフェアゲルを得るステップ（２）と、を含む。
【００６５】
３、リン酸クロロキンとキトサンの質量比を変える以外、残りのプロセスの条件を上記ステップと同様にして、ゲル１、２、３、４をそれぞれ調製し、同時に、クロロキン又はその誘導体を加えず、純粋なキトサンを主活性成分とする以外、残りのプロセス条件を上記実施例の調製ステップと同様にして、ゲル５を調製し、下記表に示した。
【００６６】
【表３】
2021509681.tif 000005
【００６７】
そのうち、図５は、滑らかなガラス面で観察された各割合のゲル製品の形状を示す図である（ゲル製品１〜４では、リン酸クロロキン：キトサンの割合は、それぞれ１：５、１：３、１：１、１：０．５であり、ゲル製品５は、純粋なキトサン製品である）。各割合のゲル製品の１ｍｉｎ内の滑らかなガラス面での流動の状況は、図６に示される。
【００６８】
実験した結果、リン酸クロロキンとキトサンの割合が１：１又は１：０．５である場合、調製されたゲルは、テクスチャが不均一であり、小顆粒を含有し、流動性が不十分であった。リン酸クロロキンとキトサンの割合が１：５又は１：３である場合、調製されたゲルは、テクスチャが均一であり、ｐＨが膣及び皮膚への投与に適しており、粘度が適切であり、色も匂いもさまざまな消費者のニーズに応えられ、クロロキン含有量が安定的な製品であった。一方、リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：５である場合、クロロキン含有量が低く、効能がある程度制限され、総合的に考慮すると、リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３である場合、製品の性能は、より好ましかった。
【００６９】
実施例６    クロロキンキトサンナノスフェアゲルによる損傷皮膚への刺激性試験
【００７０】
１、実験方法
（１）ニュージーランドウサギを実験対象とし、自体左右側皮膚比較法を用いて、それぞれ左右側の投与部位の皮膚に「井」字（面積約３．０ｃｍ×３．０ｃｍ）をカットし、左側に被験物１．０ｇを９ｃｍ２／匹の投与量で投与し、毎回の貼り付け面積を３．０ｃｍ×３．０ｃｍとし、右側に白いワセリン１．０ｇを陰性対照側として投与した。各群の動物に１日に１回投与し、２８日間持続した。
【００７１】
被験物群は、それぞれ以下のとおりである。
【００７２】
Ａ群：対照群、空白ゲル基質、
Ｂ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１、
Ｃ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２、
Ｄ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群３、
Ｅ群：リン酸クロロキンゲル群。
【００７３】
塗布前及び医薬品を取り除いてから１時間後、２８日目の最終回に医薬品を取り除いてから１時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後及び１４日間後のそれぞれの時点に、上記各群の動物について、それぞれ投与部位の紅斑及び水腫の状況を観察して記録し、紅斑及び水腫をスコア化し、また、投与部位の色素沈着、出血点の有無、皮膚の荒さ又は皮膚の薄さを観察し、発生及び解消時間を記録した。
【００７４】
（２）上記５群の動物について、すべて最終回に医薬品を取り除いてから１４日間後に、それぞれ各群の動物の投与部位の左右側の皮膚に対して病理組織学的検査を行った。
【００７５】
２、結果
（１）各群の皮膚の観察結果
試験結果：
陰性対照側（右側）では、各被験物群の動物の投与部位の皮膚において、各観察時点に明らかな刺激性反応が認められず、このため、白いワセリンである陰性対照品の結果が陰性であると判断できた。
【００７６】
Ａ群：各観察時点に明らかな刺激性反応が認められず、このため、空白ゲル基質は、皮膚に対して刺激性がないと判断できた。
【００７７】
Ｂ群：６／６例の動物の被験物側（左側）の投与部位の皮膚において、１日目から１２日までの間に裸眼で観察する時点には、僅かな紅斑又は水腫が現れ、１２日目から剖検までに、各例の動物の投与部位には明らかな異常が観察できず、且つ、最終回から７２時間後及び１４日間後の病理組織学的検査結果から、６／６例の動物の被験物側の投与部位の皮膚のうち、２例は軽度の水腫が見られ、残りには明らかな異常な変化がなかったことが分かった。このため、上記刺激については、皮膚が損傷された後、医薬品により機械的刺激がわずかに深刻化したと考えられた。
【００７８】
Ｃ群：６／６例の動物の被験物側（左側）の投与部位の皮膚において、１日目から１２日目までの間に、肉眼で観察する時点に軽度の紅斑又は水腫が現れ、１２日目から剖検までに、各例の動物の投与部位には明らかな異常が観察できず、且つ、最終回から７２時間後及び１４日間後の病理組織学的検査結果から、６／６例の動物の被験物側の投与部位の皮膚のいずれにも、明らかな異常な変化が見られなかったことが分かった。したがって、上記軽度の刺激については、皮膚損傷後の機械的刺激であると考えられた。
【００７９】
Ｄ群：６／６例の動物の被験物側（左側）の投与部位のうち、４／６例の動物は、１２日目から投与部位に明らかな紅斑又は水腫が現れ、投与するときに痂皮が脱落し、脱落したときに皮膚の表面が完全に癒合されず、最終回に薬品を取り除いてから７２時間後、傷口が明らかに癒合した。
【００８０】
Ｅ群：６／６例の動物の被験物側（左側）の投与部位のうち、４／６例の動物は、１１日目から損傷部位が割れて、外へ広げる傾向があり、投与部位には初期よりも明らかな紅斑又は水腫が現れ、痂皮が絶えずに再生して脱落し、脱落したときに皮膚の表面が完全に癒合できず、自体右側の陰性対照側に比べて有意差が見られ、最終回で薬品を取り除いてから７２時間及び１４日間後の病理組織学的検査の結果から、６／６例の動物の被験物側の投与部位の皮膚のいずれにも明らかな異常が認められ、その中でも、７２時間後に剖検した３例の動物には一定の程度の損傷が見られ、表皮が明らかに厚くなり、表皮の下の結合組織の配列が不規則であり、線維組織が過形成し、炎症性細胞が浸潤し、表皮に痂皮ができて、一部の表皮が窪んで、構造が不明瞭になるなどし、最終回から１４日後に剖検した３例の動物では、局所の表皮が厚くなり、表皮の下の結合組織の配列が不規則であり、線維組織が過形成し、炎症性細胞炎浸潤が伴うことが分かった。
【００８１】
上記実験結果から分かるように、ニュージーランドウサギの損傷皮膚に複数回投与した結果、リン酸クロロキンキトサンナノスフェアゲルは、損傷皮膚への刺激性がリン酸クロロキンゲル（一般外用製剤）よりも明らかに低下し、リン酸クロロキンキトサンナノスフェアゲルでは、クロロキン／ナノスフェア担体の割合が低いほど、皮膚に対する刺激性反応が小さく、投与終了後、損傷皮膚の修復効果が良好であった。それに対して、クロロキンゲルは、損傷皮膚の損傷を深刻化させ、陰性対照側が完全に修復したが、クロロキンゲル側の皮膚が正常に修復できず、投与停止後の１４日目に、クロロキンゲル側の皮膚で一定の程度の回復が見られ、有意的な差異があった。クロロキンが損傷皮膚に対して刺激作用を有し、クロロキンキトサンマイクロスフェアがこのような刺激作用を顕著に低減できることが示されており、それは、キトサン自体が抗菌、消炎及び傷口癒合促進の作用を有することにつながると考えられる。
【００８２】
（２）病理学的検査の結果
Ａ群：図７におけるＡ１（空白基質側）、図Ａ２（陰性対照側）に示されるように、皮膚の表皮、真皮及び付属器の構造が完全であり、炎症性細胞浸潤及び小血管拡張が認められなかった。
【００８３】
Ｂ群：図７における図Ｂ１（クロロキンキトサンナノスフェアゲル）、図Ｂ２（陰性対照側）に示される。図Ｂ２に示されるように、皮膚の表皮、真皮及び付属器の構造が完全であり、炎症性細胞浸潤及び小血管拡張が認められなかった。陰性対照側に比べて、図Ｂ１に示されるように、該群の皮膚の小限局性表皮がわずかに厚くなり、少量の炎症性細胞浸潤が認められた。
【００８４】
Ｃ群：図７における図Ｃ１（クロロキンキトサンナノスフェアゲル側）、図Ｃ２（陰性対照側）に示される。図Ｃ２に示されるように、皮膚の表皮、真皮及び付属器の構造が完全であり、炎症性細胞浸潤及び小血管拡張が認められなかった。図Ｃ１に示されるように、該群の皮膚の局所の表皮がわずかに厚くなり、細胞の層数が明らかに増加し且つ真皮層へ拡張して成長し、皮の下の結合組織の配列が不規則的であり、一定の炎症性細胞浸潤が伴った。
【００８５】
Ｄ群：図７における図Ｄ１（クロロキンキトサンナノスフェアゲル側）、図Ｄ２（陰性対照側）に示される。図Ｄ２に示されるように、皮膚の表皮、真皮及び付属器の構造が完全であり、炎症性細胞浸潤及び小血管拡張が認められなかった。陰性対照側に比べて、図Ｄ１に示されるように、該群の局所の表皮がわずかに厚くなり、細胞の層数が増加し、少量の炎症性細胞浸潤が伴った。
【００８６】
Ｅ群：図７における図Ｅ１（クロロキンゲル側）、図Ｅ２（陰性対照側）に示される。陰性対照側では、皮膚の表皮、真皮及び付属器の構造が完全であり、炎症性細胞浸潤及び小血管拡張が認められなかったのに対して、クロロキンゲル側では、皮膚の局所の表皮に痂皮ができて、表皮が明らかに厚くなり、痂皮の一部が皮下組織に緊密につながり、表皮が窪んで、構造が不明瞭になり、大量の炎症性細胞が浸潤するとともに線維組織が過形成し、真皮層の毛包の数が有意に減少したが、筋肉層及び皮下組織には明らかな異常が見られなかった。
【００８７】
上記病理学的検査結果から、クロロキンキトサンマイクロスフェア群のゲルは、クロロキンゲルに比べて、刺激性、及び投与停止後の癒合のいずれの点でも明らかな優位性を有することが示されている。各クロロキンキトサンマイクロスフェア群では、クロロキンナノスフェア担体の割合が低いほど、皮膚に対する刺激性反応が低下した。
【００８８】
皮膚の観察結果及び病理学的検査の結果の組み合わせから明らかなように、クロロキンキトサンナノスフェアゲルによる皮膚への刺激性反応がクロロキンゲルよりも明らかに低く、それは、クロロキンキトサンナノスフェアがクロロキンによる皮膚への刺激性の副作用を大幅に低減させるとともに、ある程度で傷口の癒合を促進することが示されている。クロロキンとキトサンの質量比が１：３以下である場合、刺激作用が小さく、薬品含有量が最高であった。
【００８９】
実施例７    ヘルペスウイルス膣炎についての動物試験
１、実験方法
実施例２で得られたクロロキンキトサンナノスフェアをゲルに調製して、ヘルペスウイルス膣炎についての動物試験を行った。
【００９０】
実験方法は、具体的には、適応性を観察したところ合格したＨａｒｔｌｅｙモルモットを複数匹用い、１０匹の動物をランダムに選択して空白対照群（Ａ）とし、残りの動物について、膣感染ヘルペスウイルスを用いてモデリングし、モデリングした動物を５個の群にランダムに分け、すべての群は、以下のとおりである。
【００９１】
Ａ群：空白対照群、
Ｂ群：モデル群、
Ｃ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１、
Ｄ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２、
Ｅ群：リン酸クロロキンゲル群。
【００９２】
１群１０匹とし、すべて膣投与を行った。空白対照群、モデル対照群には、０．９％塩化ナトリウム注射液を投与し、Ｃ群、Ｄ群、及びＥ群には、対応する試験医薬品を投与し、１日に１回投与し、各群について連続して２週間投与した。１４日間投与した後、翌日に膣粘膜組織を取り、固定、パラフィン包埋をして、連続した４μｍの切片を切り、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）で染色した後、顕微鏡下で膣粘膜組織の病理学的状況を観察した。
【００９３】
２、結果
（１）病理学的検査
Ａ群：空白対照群の結果は、図８におけるＡ図に示されるように、空白対照群の膣粘膜の上皮細胞の構造が完全であり、固有層には、血管拡張及び炎性細胞浸潤がなかった。
【００９４】
Ｂ群：モデル対照群の結果は、図８におけるＢ図に示されるように、モデル対照群の膣粘膜の下の固有層に大量の炎性細胞浸潤が見られ、疎性結合組織の配列が不規則的であり、水腫が明らかであった。
【００９５】
Ｃ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１の結果は、図８におけるＣ図に示されるように、該群の漿膜層の結合組織が増えて、配列が不規則であり、水腫が明らかであり、少量の炎症性細胞浸潤が伴った。
【００９６】
Ｄ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２の結果は、図８におけるＤ図に示されるように、該群の粘膜の下の固有層に明らかな水腫があり、漿膜層の結合組織が増えて、配列が不規則であり、水腫が明らかであり、炎症性細胞浸潤が認められた。
【００９７】
Ｅ群：リン酸クロロキンゲル群の結果は、図８におけるＥ図に示されるように、クロロキンゲル群の膣粘膜の局所の上皮細胞が変形して壊死し、粘膜の下の固有層における疎性結合組織の配列がわずかに不規則的であるが、水腫が明らかなであり、且つ炎症性細胞浸潤が伴った。
【００９８】
（２）試験動物の組織学的検査による病変程度の結果
【表４】
2021509681.tif 000006
【００９９】
注：「−」は、組織構造には明らかな異常が認められないことを示し、「±」は、極めて軽度の損傷を示し、「＋」は、軽度の損傷を示し、「＋＋」は、中度の損傷を示し、「＋＋＋」は、重度の損傷を示す。
【０１００】
上記研究結果から明らかなように、クロロキンゲルに比べて、クロロキンキトサンナノスフェアゲルは、ヘルペスウイルスにより引き起こされる膣炎を明らかな改善できた。各群の炎症程度を比較すると、モデル対照群＞リン酸クロロキンＥ群＞クロロキンキトサンナノスフェアゲルＤ群＞クロロキンキトサンナノスフェアゲルＣ群＞空白対照群であった。さらに、クロロキンとキトサンを併用することにより膣の水腫を顕著に改善でき、且つ、結果は、炎症の程度と類似した。それは、クロロキンとキトサンマイクロスフェアを併用することにより顕著な相乗的な治療効果を奏することを示した。
【０１０１】
実施例８    ＨＰＶにより引き起こされる尖形コンジロームの治療
１、実験方法
適応性を観察したところ合格した複数匹のヌードマウスを用い、雌雄それぞれを半分とし、無菌手術の原則に厳密に従っている手順で、ＨＰＶに感染したイボ組織構造をそのままヌードマウスの皮下に接種した。イボを接種してから５〜６日間後、接種部位が良好なヌードマウスを選択して、体重及び性別別に、以下の４群に均一にランダムに分けた。
【０１０２】
Ａ群：モデル対照群、
Ｂ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１、
Ｃ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２、
Ｄ群：リン酸クロロキンゲル群
１群６匹とし、雌性それぞれを半分とした。そのうち、モデル対照群には、白いワセリンを投与し、残りの各群には、対応するゲルを投与し、各群について皮膚へ塗布して投与し、動物の投与部位における投与領域の約（２ｃｍ×２ｃｍ）へ塗布した。１日に１回塗布し、１回に６時間接触させ、６時間接触させた後、薬品を取り除き、連続的に１４日間投与した。陽性対照群の場合は、１週間に３回投与し、１回に６時間接触させ、６時間接触させた後、薬品を取り除き、１４日間投与した。１４日間投与した後、翌日にイボ組織構造を切り取り、固定、パラフィン包埋をして、連続した４μｍの切片を切り、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）で染色した後、顕微鏡下でイボ組織構造の病理学的状況を観察した。
【０１０３】
２、結果
病理学的検査結果から分かるように、
（１）Ａ群イボ結果から明らかなように、各例の動物には、イボ組織構造が見られ、イボ組織構造は、上皮細胞の構造が完全であり、局所には空胞細胞が認められた。
【０１０４】
図９におけるＡ図に示されるように、イボにおいて、局所の上皮細胞の細胞核の周辺に明らかな空胞があり、細胞核の核小体が明らかであった。（Ｈ−Ｅ染色×２００）
（２）Ｂ群のイボ結果から明らかなように、６例の動物には、イボ組織構造が見られた。そのうち、２例の動物（０３、０４；２／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の局所が変性して壊死し、且つ少量の空胞細胞が認められ、４例の動物（０１、０２、０５、０６；４／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の構造が完全であり、局所には空胞細胞が認められた。
【０１０５】
図９におけるＢ図に示されるように、イボにおいて、局所の上皮細胞の細胞核の周辺に明らかな空胞があり、細胞核の核小体が明らかであった。（Ｈ−Ｅ染色×２００）
【０１０６】
（３）Ｃ群のイボ結果から明らかなように、６例の動物には、イボ組織構造が見られた。そのうち、３例の動物（０３、０４、０５；３／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の局所が変性して壊死し、且つ少量の空胞細胞が認められ、３例の動物（０１、０２、０６；３／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の構造が完全であり、局所には空胞細胞が認められた。
【０１０７】
図９におけるＣ図に示されるように、イボにおいて、局所の上皮細胞の細胞核の周辺に明らかな空胞があり、細胞核の核小体が明らかであった。（Ｈ−Ｅ染色×２００）
【０１０８】
（４）Ｄ群のイボ結果から明らかなように、６例の動物には、イボ組織構造が見られた。そのうち、４例の動物（０１、０２、０３、０４；４／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の局所が変性して壊死し、且つ少量の空胞細胞が認められ、２例の動物（０５、０６；２／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の構造が完全であり、局所には空胞細胞が認められた。
【０１０９】
図９におけるＤ図に示されるように、イボにおいて、イボの表皮細胞が過度に角質化し、表皮の下に扁平上皮が見られ、局所の上皮細胞が変性して壊死し、局所には、少量の空胞細胞が認められた。
【０１１０】
上記研究結果から明らかなように、クロロキンは、ＨＰＶにより引き起こされるイボに対して感染細胞ウイルスを取り除く作用を果たし、且つ、クロロキン含有量の増大に伴い、ＨＰＶに感染した空胞細胞が減少した。クロロキンゲル群（Ｄ群）は、感染細胞を明らかに除去できるが、組織構造の局所の変性壊死を引き起こした。クロロキンキトサンゲルは、純粋なクロロキンゲルに比べて、感染細胞を減少させるとともに、皮膚に対して保護作用を有する。
【０１１１】
実施例９    膣における複数種の病原微生物に対する殺滅又は阻害作用
実施例６におけるクロロキンキトサンナノスフェアゲル群（Ｂ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が３：１のクロロキンキトサンナノスフェアゲル）について、インビトロ抗菌活性試験を行った。ゲル製品２０ｇをｐＨ７．０の緩衝液１００ｍＬ（陰性対照には試験品を添加しない）に加えて、十分に溶解させた。試験品を添加したｐＨ７．０緩衝液１ｍＬ、０．５ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．１２５ｍＬを、対応する菌種に対応する培地に加えて、平皿に入れて培養した。緑膿菌、カンジダ・アルビカンス、大腸菌、黄色ブドウ球菌を回復して希釈し、菌濃度が１００ｃｆｕ／ｍＬになるとき、接種ループで各培地に接種して、５〜７日間培養した後、観察し始めた。
【０１１２】
インビトロ抗菌活性試験の結果は、以下のとおりである。キトサンクロロキンナノスフェアゲルは、濃度にかかわらず、緑膿菌、カンジダ・アルビカンス、大腸菌、黄色ブドウ球菌に対して成長阻害作用を示し、濃度が高いほど、菌体に対する阻害率が高かった。その中でも、カンジダ・アルビカンス及び黄色ブドウ球菌の感度がより高かった。
【０１１３】
結果から、クロロキンキトサンナノスフェアゲルは、複数種の細菌に対して優れた阻害作用を有するが、感度には差異があることが示されている。
【０１１４】
本発明では、クロロキンとキトサンを併用することによって、膣における複数種の病原微生物に対して相乗阻害作用を果たす。本発明の医薬品は、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）、緑膿菌（ＥＣ）、β溶血性レンサ球菌（ＳＴ）、カンジダ・アルビカンス（ＣＡ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ｕｕ）、膣トリコモナス及びバクテロイデス・フラジリス、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）など、膣における複数種の病原微生物を殺滅又は阻害する作用を有する。また、本発明の医薬品は、病原体と宿主の膣の上皮細胞との粘着を抑制し、複数種の膣炎、たとえばカンジダ・アルビカンス膣炎、トリコモナス膣炎、細菌性膣疾患、性器ヘルペスウイルスなどの複数種の外性器感染症を予防治療できる。
【０１１５】
実施例１０    予備臨床研究結果
本発明のクロロキンキトサンナノスフェアをカンジダ感染により引き起こされる膣炎に罹った女性１０例に適用した結果、治療過程において副作用や不良反応を報告した患者がなく、６ヵ月のフォローアップにも、副作用や不良反応が発見せず、且つ、クロロキンキトサンナノスフェア治療群の全有効率が、クロロキン単独治療群の全有効率よりも３０％と高く向上したことを見出した。
【０１１６】
本発明をＨＰＶ感染によるイボ３０例の治療に適用した場合、２〜３週間治療したところ、３０例の患者のイボは、自然に落ちて、且ついずれの不良反応もなかった。
【０１１７】
本発明のクロロキンナノスフェアは、ウイルス性膣炎、尖形コンジローム、細菌性膣疾患、真菌感染性膣炎又はトリコモナス膣炎などの外性器感染症、及び扁平イボ、ＨＰＶ感染により引き起こされる非性器部位でのイボなどのほかの皮膚イボに対して良好な治療効果を有する。
【０１１８】
勿論、本発明の上記実施例は、あくまで本発明を明瞭に説明するための例示に過ぎず、本発明の実施形態を限定するものではない。当業者であれば、上記の内容に基づいてほかの形態に対して変化又は変更を実施できる。ここで、すべての実施形態を挙げる必要がなく、またそれは不可能なことである。本発明の主旨及び原則から逸脱せずに行われるすべての修正、同等置換や改良などは、本発明の特許請求の範囲の保護範囲に属すべきである。
【図１】
2021509681.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月9日(2020.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬の技術分野に属し、より具体的には、外性器感染症及びほかの皮膚イボの治療に適用できるクロロキンゲル、その調製方法及び応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生殖感染症は、性感染症としても知られており、性的接触が主な感染方式である疾患のことである。性行為又は性行為に類似した行為によって引き起こされる２０種類以上の感染症が、国際的に生殖感染症のカテゴリーに含まれている。１９８０年代以来、流動する人口の数がますます増えて、性的観念が変わり、安全でない性行為が増えている。中国では生殖管感染症や性感染症が増加しており、沿岸部から内陸部、都市部から農村部に広がっており、状況は非常に厳しい。統計によると、現在、中国では、約４０万人のエイズ患者があり、ＨＩＶ感染が１,０００人に約１人あり、毎日約数百人が感染され、性的感染の割合が大きいこと、及びハイリスク集団から一般集団へ変わりつつあることを特徴とする。統計によると、中国では、近年、両性の外性器感染症の症例数が年々増加しており、多くの区域では、外性器感染症の発症率は、感染症のうち２位と３位にあり、既婚女性の下部生殖管感染症の発症率は５０％、７０％と高く、女性は、一生を通じて少なくとも１回外陰カンジダ症に罹患し、そのうち５％〜１０％の女性は、再発膣カンジダ症に罹患し、９０％の女性は、ヒトパピローマウイルスに感染されたことがある。両性の外性器感染症の発症率は前記のように急速に増加し且つ制御されにくいため、世界的に深刻な脅威となっている社会的及び公衆衛生上の問題となり、このため、両性の外性器感染症の効果的な予防及び治療は、現在、非常に深刻で緊急の課題となっている。
【０００３】
現代医学は、外性器感染症に対しては病原体をターゲットとして治療するのが一般的である。予防及び治療では、生殖管感染症を引き起こし得る病原微生物の多様性と、病原体の突然変異及び薬剤耐性の問題のため、生殖管感染症を予防するために抗生物質を使用することは非常に困難である。現在、臨床的実践では、外性器感染症の治療は、主に抗生物質又は消毒剤を投与することにより行われる。しかしながら、消毒剤は、局所粘膜への刺激性により膣内の環境を破壊するので使用が制限され、且つ、通常は局所治療にのみ適している。細菌性器感染症の場合は、抗生物質による治療は、しばしば薬剤耐性と副作用をもたらす。したがって、抗菌と抗ウイルスの二重作用を有する高性能の新規な外用医薬品の開発は、外性器感染症を効果的に予防及び治療するために非常に重要である。
【０００４】
従来から、クロロキンは、マラリア原虫感染を予防及び治療するための医薬品として使用されており、またトランスフェクション効率を向上させるために遺伝子トランスフェクション実験でもよく使用される。インビトロ研究では、高濃度のクロロキンは、インビトロでクリプトコッカス菌を阻害して殺滅する作用を有し、且つ、クリプトコッカス菌の２つのバリアントに対するクロロキンの作用にも差別はなく、また、クロロキンは、アンホテリシンBの抗クリプトコッカス菌能力を増強でき、アンホテリシンBとは相乗的な抗菌作用を有することが分かった。現在、多くの研究がＨＩＶに対するクロロキンの活性に焦点を合わせている。研究により、クロロキンには広いスペクトルの抗ＨＩＶ活性があり、クロロキンは、ＨＩＶ−１から進化された実験室株Ｂに対してだけでなく、ＨＩＶ−１から進化されたＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの一次分離株に対しても有効であることが示されている。クロロキンの抗ＨＩＶ作用の主なメカニズムは、ｇｐ１２０ウイルスエンベロープタンパク質のグリコシル化を阻害し、新たに生成するビリオンの感染性を大幅に低下させると考えられる。また、研究によれば、クロロキンは、二本鎖ＤＮＡに挿入されて巻き戻されることによりＤＮＡの二重らせん形態を変えることができるアミノキニン類の膜貫通剤であることが示唆されている。細菌学的研究によれば、クロロキンをアクリジンオレンジやエチジウムブロマイドなどのようなインターカレート剤として使用して、小さなプラスミドＤＮＡの共有結合を選択的に阻害し、ＤＮＡの超らせん密度を変えることで超らせんの閉鎖を変えることにより、細菌及びウイルス感染細胞の増殖を阻害できることが示唆されている。子宮頸がんを引き起こすヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＤＮＡは、このようなプラスミドであり、超らせんで組み立てられた複合物ＤＮＡであり、ＤＮＡ複製とＲＮＡ転写を行う。一方、クロロキンは、プラスミドＤＮＡのらせん密度を変えることにより、プラスミドＤＮＡを阻害しＤＮＡポリメラーゼ活性を妨害できることが証明されている。クロロキンは、弱アルカリ性であるため、たとえば、エンドソーム／リソソームの蓄積、ｐＨの変更、アポトーシスを引き起こし得ることなどのミトコンドリア機能障害を引き起こし得ることが証明されている。また、クロロキンは、不活性化されたｐ５３を再活性化させること（ＨＰＶはＰ５３を分解／不活性化する）、メラニン（メラニンの発生及びＨＰＶの複製は、皮膚の同一層すなわち表皮の基底層で起こる）に連結されること、鉄イオンの放出（鉄触媒／ＨＰＶ複製時に必要なエネルギー）を防ぐことが可能であることが証明されている。鉄は、ＤＮＡ複製に不可欠なものであり、また、酸素の輸送や貯蔵にも電子触媒として機能する。しかしながら、鉄は、病原体の生存とウイルス複製に不可欠な物質でもある。鉄粒子に対する阻害も、クロロキンがウイルス及びウイルス感染細胞を殺滅する重要なメカニズムである。
【０００５】
現在、クロロキンには、外用医薬品、特に刺激性が小さく治療効果がより後広範な外用製剤がない。臨床応用では、クロロキンは、主にマラリアの急性発作を治療し、マラリアの症状を制御するために使用される。また、肝性アメーバ症、肝吸虫症、肺吸虫症、結合組織病などの治療にも使用できる。さらに、日焼け紅斑などの光線過敏症の治療にも使用できる。錠剤と注射剤は、マラリアの治療に用いられる場合、投与量が大きく、治療時間が長く、胃腸管や皮膚に深刻な副作用をもたらす可能性があり、また、クロロキンは、皮膚に一定の刺激性があり、皮膚損傷やさまざまなタイプの発疹を引き起こす可能性がある。したがって、どうように剤形を変えることでクロロキンの刺激性及び副作用を低減させ、クロロキンの応用価値を高めるかは、現在の主要な課題となっている。
【０００６】
医薬品マイクロスフェアとは、高分子ポリマー基質に医薬品を分散又は吸着させることにより形成された微小球体を指す。マイクロスフェア製剤は、長期持続放出又はターゲティング作用があり、患者の使用の利便性、コンプライアンスを大幅に向上させることができ、臨床では既に明らかな優位性を示し、非常に有望な剤形といえる。また、マイクロスフェア製剤製品は、付加価値が大きく、市場での将来性が期待できるため、近年の医薬品開発の焦点となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、従来技術の上記欠点を克服するために、天然高分子化合物をマイクロスフェア担体として使用することにより、調製プロセスが簡単であり、製品の副作用が小さく、クロロキンとマイクロスフェア担体の相乗作用を十分に発揮させ、顕著な抗炎症、抗菌、抗ウイルスの作用があり、クロロキンによる皮膚の刺激を低減させ、創口の癒合を促進し、また薬物の放出速度を制御することができ、従来のマイクロスフェア担体の低抗菌性とクロロキンの高刺激性の欠陥を解消するクロロキンナノスフェアを提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、外性器及びほかの皮膚イボに適用できる上記クロロキンナノスフェアの調製方法を提供することである。
【０００９】
本発明のまた別の目的は、上記クロロキンナノスフェアの新用途を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、外性器感染症及び／又はほかの皮膚イボを予防及び治療する製品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の上記目的は、下記技術案によって実現される。
【００１２】
クロロキンナノスフェアであって、水溶性ナノスフェア担体、及びクロロキン又はクロロキン誘導体を含有する。
【００１３】
本発明者は、驚くことに、水溶性ナノスフェア担体とクロロキン又はクロロキン誘導体を組み合わせて調製されるナノスフェアが、作用時間が長く、粘膜に対する粘着性、局所滞留性及び自己分解性を有し、且つクロロキンの刺激性を低減させ、外性器には刺激性がなく、従来の外性器感染症の治療方法の大きな副作用及び使用の不便さの欠陥を同時に解決し、クロロキンの副作用及び薬剤耐性を効果的に解決できることを見出した。本発明のナノスフェアは、外性器感染症及びほかの皮膚イボ性疾患、たとえば膣炎、扁平イボなどを効果的に予防又は治療でき、さらに顕著な相乗効果を果たし、クロロキンの用途、その応用範囲を広げるだけでなく、従来の抗菌医薬品の乱用による薬剤耐性を解決できる。
【００１４】
本発明は、さらに上記クロロキンナノスフェアの調製方法に関し、
前記水溶性ナノスフェア担体を溶解した後、クロロキン又はクロロキン誘導体と水溶性ナノスフェア担体の質量比が１／３以下となるようにクロロキン又はクロロキン誘導体を加え、均一に混合して撹拌して水相とするステップＳ１と、
油相基質に乳化剤を加えて油相とし、水相と油相の体積比が１：１〜６となるように水相を油相に加え、１００００〜２００００ｒ／ｍｉｎで１０〜３０ｍｉｎ乳化させ、ナノスフェアエマルジョンを得るステップＳ２と、
ナノスフェアエマルジョンに沈殿剤を加えて、均一に混合し、次に、２〜８ｍｉｎ静止した後脱水し、高速遠心処理して、洗浄して乾燥させ、前記クロロキンナノスフェアを得るステップＳ３と、を含む。
【００１５】
好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体と水溶性ナノスフェア担体の質量比が１：３〜１：５である。
【００１６】
より好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体と水溶性ナノスフェア担体の質量比が１：３である。
【００１７】
好ましくは、前記クロロキン誘導体は、ヒドロキシクロロキン、リン酸クロロキン又は硫酸クロロキンから選ばれる１種以上である。
【００１８】
好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体の担持率が、３．０％〜２１．６％である。
【００１９】
より好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体の担持率が、１２．５％である。
【００２０】
好ましくは、前記水溶性ナノスフェア担体は、水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉から選ばれる１種以上である。
【００２１】
好ましくは、前記水溶性ナノスフェア担体は、水溶性キトサンである。
【００２２】
より好ましくは、前記水溶性キトサンは、脱アセチル化度が８０％〜９５％、粘度平均分子量が３０００〜５０００である。
【００２３】
好ましくは、ステップＳ２において、前記水相と油相の体積比が、１：３である。
【００２４】
好ましくは、ステップＳ３において、前記高速遠心処理の条件は、１５００〜２０００ｒ／ｍｉｎで５〜１０ｍｉｎ遠心処理することである。
【００２５】
より好ましくは、ステップＳ３において、前記高速遠心処理の条件は、１５００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心処理することである。
【００２６】
好ましくは、ステップＳ３において、１ｓあたり１〜５滴の速度でナノスフェアエマルジョンに沈殿剤を滴下する。
【００２７】
好ましくは、前記乳化剤と沈殿剤の体積比が、１〜１．５：３０〜５０である。
【００２８】
より好ましくは、前記乳化剤と沈殿剤の体積比が、１：５０である。
【００２９】
好ましくは、前記油相基質は、植物油であり、前記沈殿剤は、アルカリ性有機相である。
【００３０】
より好ましくは、前記アルカリ性有機相は、水酸化ナトリウム−ｎ−プロパノール混合溶液である。
【００３１】
より好ましくは、前記アルカリ性有機相のｐＨ値が８．５〜１０．０である。
【００３２】
さらに好ましくは、前記アルカリ性有機相のｐＨ値が９．０である。
【００３３】
好ましくは、前記植物油は、コーン油、オリーブオイル、落花生油、大豆油、菜種油などの植物油から選ばれる１種以上である。
【００３４】
好ましくは、前記乳化剤は、ツイン−２０、ツイン−８０、Ｓｐａｎ  ８０から選ばれる１種以上である。
【００３５】
抗菌及び／又は抗ウイルス製品の調製における上記クロロキンナノスフェアの応用、及び外性器感染症及び／又はほかの皮膚イボを予防及び治療する製品の調製における上記クロロキンナノスフェアの応用も、本発明の保護範囲に含まれる。
【００３６】
上記クロロキンナノスフェアを含有する製品は、クロロキンによる皮膚への刺激性を大幅に低減させ、創口の癒合を促進し、徐放効果を果たし、また、その生物学的活性を向上させ、外性器感染症及びほかの皮膚イボの治療に適用できる。
【００３７】
好ましくは、前記外性器感染症は、ウイルス性膣炎、尖形コンジローム、細菌性膣疾患、真菌感染性膣炎又はトリコモナス膣炎を含む。
【００３８】
好ましくは、前記其他皮膚イボは、扁平イボ、ＨＰＶ感染により引き起こされる非性器部位でのイボを含む。
【００３９】
前記クロロキンナノスフェアは、ウイルス性膣炎、尖形コンジローム、細菌性膣疾患、真菌感染性膣炎又はトリコモナス膣炎などの外性器感染症、及び扁平イボ、ＨＰＶ感染により引き起こされる非性器部位でのイボなどのほかの皮膚イボのいずれにも良好な治療効果を有する。
【００４０】
本発明は、クロロキン又はクロロキン誘導体を含み、さらに水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉のうちの１種以上を含む、外性器感染症及び／又はほかの皮膚イボを予防及び治療する製品をさらに提供する。
【００４１】
好ましくは、クロロキン又はクロロキン誘導体と、水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉との質量比が、１／３以下である。
【００４２】
より好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体と、水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉との質量比が、１：３〜１：５である。
【００４３】
さらに好ましくは、前記クロロキン又はクロロキン誘導体と、水溶性キトサン、水溶性カラギーナン又は水溶性澱粉との質量比が、１：３である。
【００４４】
さらに、本発明の好適実施例では、前記外性器感染症及び／又はほかの皮膚イボを予防及び治療する製品は、上記クロロキンナノスフェアを含有する。
【００４５】
より好ましくは、前記クロロキンナノスフェアは、製品の全重量の１％〜６％を占める。
【００４６】
さらに、本発明の好適実施例では、前記製品は、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、発泡錠、膣錠、カプセル剤、フィルム剤又は座剤である。
【００４７】
本発明の前記製品は、ゲル剤、クリーム剤などの半固体製剤、又は、錠剤、発泡錠などの固体製剤として調製でき、本発明の前記製品は、クロロキン自体の苦味、皮膚への刺激性を顕著に改善し、創口の癒合を促進し、徐放効果を果たし、また、その生物学的活性を向上させる。
【００４８】
また、さらに、本発明の好適実施例では、前記製品は、ゲル剤である。
【発明の効果】
【００４９】
従来技術に比べて、本発明の有益な効果は、以下のとおりである。
【００５０】
（１）本発明では、水溶性ナノスフェア担体とクロロキンを組み合わせて、殺菌と抗ウイルスを兼ね備える外用製剤を調製し、顕著な相乗効果を発揮させ、複数種の細菌やウイルスに対して一定のクリーニングや殺滅作用を果たし、男性及び女性を問わず外性器に対してクリーニングやケアの作用を有し、外性器の炎症反応を低減させ、且つ、クロロキンによる皮膚への刺激性を改善し、膣粘膜、ペニスには刺激がなく、粘膜に対する粘着性、局所滞留性及び自己分解性を有し、細菌やウイルスの感染を予防できるとともに、微小創口の癒合を促進することができ、外性器感染症やイボを効果的に治療でき、特にセックスの前後の外性器のヘルスケアに対しては、効果が顕著であり、かつ涼しく快適に使用できる。
【００５１】
（２）本発明は、主に水溶性ナノスフェア担体と相乗剤であるクロロキンを主成分とするものであり、処方が安定的であり、医薬品は、マイクロスフェアの形態として存在し、治療部位での医薬品の滞留時間を延長させ、作用時間を延長させ、医薬品のバイオアベイラビリティ及び治療効果を高め、その調製方法が簡便であり、合成されやすく、且つ毒性や副作用がなく、安全性が高く、新薬の産業的応用に適用でき、抗菌、抗ウイルス活性を有する医薬品の開発及び応用のために新しい選択を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】クロロキンキトサンナノスフェアである。
【図２】高速液体検出によるクロロキンの検量線である。
【図３】高速液体検出によるクロロキンキトサンマイクロスフェアのクロロキン含有量である。
【図４】クロロキンキトサンナノスフェアとクロロキンマイクロスフェアの放出状況である。
【図５】滑らかなガラス面で観察された各割合のゲル製品である（ゲル製品１〜４では、リン酸クロロキン：キトサンの質量比は、それぞれ１：５、１：３、１：１、１：０．５であり、ゲル製品５は、純粋なキトサンのゲル製品である）。
【図６】各割合のゲル製品の１ｍｉｎ内の滑らかなガラス面での流動の状況である（ゲル製品１〜４では、リン酸クロロキン：キトサンの質量比は、それぞれ１：５、１：３、１：１、１：０．５であり、ゲル製品５は、純水なキトサンのゲル製品である）。
【図７】損傷皮膚刺激性試験のＨ−Ｅ染色結果である。Ａ群：対照群、空白ゲル基質、図Ａ１（被験物側）、図Ａ２（陰性対照側）；Ｂ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１、図Ｂ１（被験物側）、図Ｂ２（陰性対照側）；Ｃ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２、図Ｃ１（被験物側）、図Ｃ２（陰性対照側）；Ｄ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群３、図Ｄ１（被験物側）、図Ｄ２（陰性対照側）；Ｅ群：リン酸クロロキンゲル群、図Ｅ１（被験物側）、図Ｅ２（陰性対照側）。
【図８】ヘルペスウイルス膣炎動物試験のＨ−Ｅ染色結果である。図Ａ：空白対照群；図Ｂ：モデル対照群；図Ｃ：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１；図Ｄ：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２；図Ｅ：リン酸クロロキンゲル群。
【図９】ＨＰＶ尖形コンジローム動物実験のＨ−Ｅ染色結果である。図Ａ：モデル対照群；図Ｂ：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１；図Ｃ：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２；図Ｄ：リン酸クロロキンゲル群。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、特定の実施形態にて本発明をさらに説明するが、実施例は、本発明を何ら制限するものではない。本発明の主旨及び実質から脱逸せずに本発明の方法、ステップ又は条件について実施される簡単な修正又は置換は、すべて本発明の範囲に属し、特に断らない限り、実施例に使用されている技術手段は、当業者が公知する一般的な手段である。
【００５４】
特に断らない限り、以下の実施例に使用される試薬及び材料は、すべて市販品である。
【００５５】
実施例１    クロロキンキトサンナノスフェアの調製
１、調製方法
Ｓ１．脱アセチル化度８０％、粘度平均分子量５０００の水溶性キトサン３ｇを秤量して、水１００ｍＬに溶解した後、リン酸クロロキン１．０ｇを加え、均一に混合して撹拌して水相とする。
Ｓ２．コーン油３００ｍＬを秤量して油相基質とし、油相基質に乳化剤としてのツイン−２０１ｍＬを加えて油相とし、水相と油相の体積比が１：３となるように水相を油相に加え、１５０００ｒ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ乳化させ、ナノスフェアエマルジョンを得る。
Ｓ３．水酸化ナトリウム−ｎ−プロパノール混合溶液を沈殿剤とし、まず、ｎ−プロパノール１０ｍＬに数滴の飽和水酸化ナトリウム溶液を滴下してｐＨ＝９に調整し、均一に混合した後、乳化剤と沈殿剤の体積比が１：５０となるように、１ｓあたり１〜５滴の速度でナノスフェアエマルジョンに滴下し、５ｍｉｎ静止し、適量のｎ−プロパノールを加えて脱水し、１５００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心処理し、洗浄して乾燥させ、前記クロロキンキトサンナノスフェアを得る。
【００５６】
２、製品のキャラクタリゼーション
（１）調製されたクロロキンキトサンナノスフェアは、図１に示されるように、粒子径が１００〜８００ｎｍである。
（２）図２及び図３に示されるように、高速液体検出をしたところ、クロロキンキトサンマイクロスフェアにおけるクロロキンの担持率は、１２．５％である。
【００５７】
実施例２    クロロキンキトサンナノスフェアの調製
１、調製方法
Ｓ１．脱アセチル化度９０％、粘度平均分子量３０００の水溶性キトサンを水で溶解した後、ヒドロキシクロロキンと水溶性キトサンの質量比が１：５となるようにヒドロキシクロロキンを加え、均一に混合して撹拌して水相とする。
Ｓ２．コーン油３００ｍＬを秤量して油相基質とし、油相基質に乳化剤としてのツイン−２０  １ｍＬを加えて油相とし、水相と油相の体積比が１：１となるように水相を油相に加え、１００００ｒ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ乳化させ、ナノスフェアエマルジョンを得る。
Ｓ３．  水酸化ナトリウム−ｎ−プロパノール混合溶液を沈殿剤とし、ｎ−プロパノール１０ｍＬに数滴の飽和水酸化ナトリウム溶液を滴下してｐＨ＝８．５に調整し、均一に混合した後、乳化剤と沈殿剤の体積比が１．５：５０となるようにナノスフェアエマルジョンに緩慢に加え、２ｍｉｎ静止し、適量のｎ−プロパノールを加えて脱水し、２０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、洗浄して乾燥させ、粒子径２００〜８００ｎｍ、クロロキンの担持率１０．３％の前記クロロキンキトサンナノスフェアを得る。
【００５８】
実施例３    クロロキンキトサンナノスフェアの調製
１、調製方法
Ｓ１．脱アセチル化度９０％、粘度平均分子量４０００の水溶性キトサンを水で溶解した後、硫酸クロロキンと水溶性キトサンの質量比が１：７となるように硫酸クロロキンを加えて、均一に混合して撹拌して水相とする。
Ｓ２．オリーブオイルを油相基質とし、油相基質に乳化剤としてのツイン−８０を加えて油相とし、水相と油相の体積比が１：６となるように水相を油相に加え、２００００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ乳化させ、ナノスフェアエマルジョンを得る。
Ｓ３．水酸化ナトリウム−ｎ−プロパノール混合溶液を沈殿剤とし、まず、ｎ−プロパノールに数滴の飽和水酸化ナトリウム溶液を滴下してｐＨ＝１０に調整し、均一に混合した後、乳化剤と沈殿剤の体積比が１．５：３０となるようにナノスフェアエマルジョンに緩慢に加え、８ｍｉｎ静止し、適量のｎ−プロパノールを加えて脱水し、１５００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、洗浄して乾燥させ、平均粒子径４００ｎｍ、クロロキンの担持率８．６％の前記クロロキンキトサンナノスフェアを得る。
【００５９】
実施例４    クロロキンキトサンナノスフェアゲルの調製
１、ゲルの処方
【表１】
2021509681.tif 000016
【００６０】
２、調製方法は、
実施例１のクロロキンキトサンナノスフェアの調製ステップと同様にマイクロスフェアを調製するステップ（１）と、
カルボキシメチルセルロース２０ｇに処方量のグリセリン３００ｇ、エチルパラベン２ｇを加えて、均一に撹拌し、十分に膨潤してゲル基質とし、クロロキンキトサンナノスフェア１０ｇを水１００ｍＬに溶解し、ゲル基質にバッチ式で加えて撹拌し、ハッカ油１ｍｌを加えて、水を１０００ｍＬまで加えて、外性器の抗菌、抗ウイルスに適しているクロロキンキトサンナノスフェアゲルを得るステップ（２）と、を含む。
【００６１】
３、同様な方法によって、純粋なクロロキンゲルを調製し、クロロキンキトサンナノスフェアゲルとクロロキンゲルにおけるクロロキンの放出率を比較した。
【００６２】
図４に示されるように、クロロキンキトサンナノスフェアゲルは、クロロキンを緩慢で安定的に放出できた。本発明で調製されたクロロキンキトサンナノスフェアゲルは、初期ではバースト放出がなく、放出速度も媒体による影響をほぼ受けず、良好な徐放効果を示し、外用投与後の医薬品の持続的放出に有利であった。
【００６３】
実施例５    クロロキンキトサンナノスフェアゲルの調製
１、ゲルの処方
【表２】
2021509681.tif 000017
【００６４】
２、調製方法は、
実施例１のクロロキンキトサンナノスフェアの調製ステップと同様に、マイクロスフェアを調製するステップ（１）と、
カルボキシメチルセルロースに処方量のグリセリンを加えて、水８００ｍＬを加え、均一に撹拌し、十分に膨潤してゲル基質とし、クロロキンキトサンナノスフェアを水１００ｍＬに溶解し、ゲル基質にバッチ式で加えて撹拌し、８０〜８５℃の熱湯５０ｍＬでエチルパラベンを溶解し、温度が４０℃以下に下がると、ゲル基質に加えて、均一に撹拌し、ハッカ油を加えて、水を１０００ｍＬまで加えて、外性器の抗菌、抗ウイルスに適しているクロロキンキトサンナノスフェアゲルを得るステップ（２）と、を含む。
【００６５】
３、リン酸クロロキンとキトサンの質量比を変える以外、残りのプロセスの条件を上記ステップと同様にして、ゲル１、２、３、４をそれぞれ調製し、同時に、クロロキン又はその誘導体を加えず、純粋なキトサンを主活性成分とする以外、残りのプロセス条件を上記実施例の調製ステップと同様にして、ゲル５を調製し、下記表に示した。
【００６６】
【表３】
2021509681.tif 000018
【００６７】
そのうち、図５は、滑らかなガラス面で観察された各割合のゲル製品の形状を示す図である（ゲル製品１〜４では、リン酸クロロキン：キトサンの割合は、それぞれ１：５、１：３、１：１、１：０．５であり、ゲル製品５は、純粋なキトサン製品である）。各割合のゲル製品の１ｍｉｎ内の滑らかなガラス面での流動の状況は、図６に示される。
【００６８】
実験した結果、リン酸クロロキンとキトサンの割合が１：１又は１：０．５である場合、調製されたゲルは、テクスチャが不均一であり、小顆粒を含有し、流動性が不十分であった。リン酸クロロキンとキトサンの割合が１：５又は１：３である場合、調製されたゲルは、テクスチャが均一であり、ｐＨが膣及び皮膚への投与に適しており、粘度が適切であり、色も匂いもさまざまな消費者のニーズに応えられ、クロロキン含有量が安定的な製品であった。一方、リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：５である場合、クロロキン含有量が低く、効能がある程度制限され、総合的に考慮すると、リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３である場合、製品の性能は、より好ましかった。
【００６９】
実施例６    クロロキンキトサンナノスフェアゲルによる損傷皮膚への刺激性試験
【００７０】
１、実験方法
（１）ニュージーランドウサギを実験対象とし、自体左右側皮膚比較法を用いて、それぞれ左右側の投与部位の皮膚に「井」字（面積約３．０ｃｍ×３．０ｃｍ）をカットし、左側に被験物１．０ｇを９ｃｍ２／匹の投与量で投与し、毎回の貼り付け面積を３．０ｃｍ×３．０ｃｍとし、右側に白いワセリン１．０ｇを陰性対照側として投与した。各群の動物に１日に１回投与し、２８日間持続した。
【００７１】
被験物群は、それぞれ以下のとおりである。
【００７２】
Ａ群：対照群、空白ゲル基質、
Ｂ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１、
Ｃ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２、
Ｄ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群３、
Ｅ群：リン酸クロロキンゲル群。
【００７３】
塗布前及び医薬品を取り除いてから１時間後、２８日目の最終回に医薬品を取り除いてから１時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後及び１４日間後のそれぞれの時点に、上記各群の動物について、それぞれ投与部位の紅斑及び水腫の状況を観察して記録し、紅斑及び水腫をスコア化し、また、投与部位の色素沈着、出血点の有無、皮膚の荒さ又は皮膚の薄さを観察し、発生及び解消時間を記録した。
【００７４】
（２）上記５群の動物について、すべて最終回に医薬品を取り除いてから１４日間後に、それぞれ各群の動物の投与部位の左右側の皮膚に対して病理組織学的検査を行った。
【００７５】
２、結果
（１）各群の皮膚の観察結果
試験結果：
陰性対照側（右側）では、各被験物群の動物の投与部位の皮膚において、各観察時点に明らかな刺激性反応が認められず、このため、白いワセリンである陰性対照品の結果が陰性であると判断できた。
【００７６】
Ａ群：各観察時点に明らかな刺激性反応が認められず、このため、空白ゲル基質は、皮膚に対して刺激性がないと判断できた。
【００７７】
Ｂ群：６／６例の動物の被験物側（左側）の投与部位の皮膚において、１日目から１２日までの間に裸眼で観察する時点には、僅かな紅斑又は水腫が現れ、１２日目から剖検までに、各例の動物の投与部位には明らかな異常が観察できず、且つ、最終回から７２時間後及び１４日間後の病理組織学的検査結果から、６／６例の動物の被験物側の投与部位の皮膚のうち、２例は軽度の水腫が見られ、残りには明らかな異常な変化がなかったことが分かった。このため、上記刺激については、皮膚が損傷された後、医薬品により機械的刺激がわずかに深刻化したと考えられた。
【００７８】
Ｃ群：６／６例の動物の被験物側（左側）の投与部位の皮膚において、１日目から１２日目までの間に、肉眼で観察する時点に軽度の紅斑又は水腫が現れ、１２日目から剖検までに、各例の動物の投与部位には明らかな異常が観察できず、且つ、最終回から７２時間後及び１４日間後の病理組織学的検査結果から、６／６例の動物の被験物側の投与部位の皮膚のいずれにも、明らかな異常な変化が見られなかったことが分かった。したがって、上記軽度の刺激については、皮膚損傷後の機械的刺激であると考えられた。
【００７９】
Ｄ群：６／６例の動物の被験物側（左側）の投与部位のうち、４／６例の動物は、１２日目から投与部位に明らかな紅斑又は水腫が現れ、投与するときに痂皮が脱落し、脱落したときに皮膚の表面が完全に癒合されず、最終回に薬品を取り除いてから７２時間後、傷口が明らかに癒合した。
【００８０】
Ｅ群：６／６例の動物の被験物側（左側）の投与部位のうち、４／６例の動物は、１１日目から損傷部位が割れて、外へ広げる傾向があり、投与部位には初期よりも明らかな紅斑又は水腫が現れ、痂皮が絶えずに再生して脱落し、脱落したときに皮膚の表面が完全に癒合できず、自体右側の陰性対照側に比べて有意差が見られ、最終回で薬品を取り除いてから７２時間及び１４日間後の病理組織学的検査の結果から、６／６例の動物の被験物側の投与部位の皮膚のいずれにも明らかな異常が認められ、その中でも、７２時間後に剖検した３例の動物には一定の程度の損傷が見られ、表皮が明らかに厚くなり、表皮の下の結合組織の配列が不規則であり、線維組織が過形成し、炎症性細胞が浸潤し、表皮に痂皮ができて、一部の表皮が窪んで、構造が不明瞭になるなどし、最終回から１４日後に剖検した３例の動物では、局所の表皮が厚くなり、表皮の下の結合組織の配列が不規則であり、線維組織が過形成し、炎症性細胞炎浸潤が伴うことが分かった。
【００８１】
上記実験結果から分かるように、ニュージーランドウサギの損傷皮膚に複数回投与した結果、リン酸クロロキンキトサンナノスフェアゲルは、損傷皮膚への刺激性がリン酸クロロキンゲル（一般外用製剤）よりも明らかに低下し、リン酸クロロキンキトサンナノスフェアゲルでは、クロロキン／ナノスフェア担体の割合が低いほど、皮膚に対する刺激性反応が小さく、投与終了後、損傷皮膚の修復効果が良好であった。それに対して、クロロキンゲルは、損傷皮膚の損傷を深刻化させ、陰性対照側が完全に修復したが、クロロキンゲル側の皮膚が正常に修復できず、投与停止後の１４日目に、クロロキンゲル側の皮膚で一定の程度の回復が見られ、有意的な差異があった。クロロキンが損傷皮膚に対して刺激作用を有し、クロロキンキトサンマイクロスフェアがこのような刺激作用を顕著に低減できることが示されており、それは、キトサン自体が抗菌、消炎及び傷口癒合促進の作用を有することにつながると考えられる。
【００８２】
（２）病理学的検査の結果
Ａ群：図７におけるＡ１（空白基質側）、図Ａ２（陰性対照側）に示されるように、皮膚の表皮、真皮及び付属器の構造が完全であり、炎症性細胞浸潤及び小血管拡張が認められなかった。
【００８３】
Ｂ群：図７における図Ｂ１（クロロキンキトサンナノスフェアゲル）、図Ｂ２（陰性対照側）に示される。図Ｂ２に示されるように、皮膚の表皮、真皮及び付属器の構造が完全であり、炎症性細胞浸潤及び小血管拡張が認められなかった。陰性対照側に比べて、図Ｂ１に示されるように、該群の皮膚の小限局性表皮がわずかに厚くなり、少量の炎症性細胞浸潤が認められた。
【００８４】
Ｃ群：図７における図Ｃ１（クロロキンキトサンナノスフェアゲル側）、図Ｃ２（陰性対照側）に示される。図Ｃ２に示されるように、皮膚の表皮、真皮及び付属器の構造が完全であり、炎症性細胞浸潤及び小血管拡張が認められなかった。図Ｃ１に示されるように、該群の皮膚の局所の表皮がわずかに厚くなり、細胞の層数が明らかに増加し且つ真皮層へ拡張して成長し、皮の下の結合組織の配列が不規則的であり、一定の炎症性細胞浸潤が伴った。
【００８５】
Ｄ群：図７における図Ｄ１（クロロキンキトサンナノスフェアゲル側）、図Ｄ２（陰性対照側）に示される。図Ｄ２に示されるように、皮膚の表皮、真皮及び付属器の構造が完全であり、炎症性細胞浸潤及び小血管拡張が認められなかった。陰性対照側に比べて、図Ｄ１に示されるように、該群の局所の表皮がわずかに厚くなり、細胞の層数が増加し、少量の炎症性細胞浸潤が伴った。
【００８６】
Ｅ群：図７における図Ｅ１（クロロキンゲル側）、図Ｅ２（陰性対照側）に示される。陰性対照側では、皮膚の表皮、真皮及び付属器の構造が完全であり、炎症性細胞浸潤及び小血管拡張が認められなかったのに対して、クロロキンゲル側では、皮膚の局所の表皮に痂皮ができて、表皮が明らかに厚くなり、痂皮の一部が皮下組織に緊密につながり、表皮が窪んで、構造が不明瞭になり、大量の炎症性細胞が浸潤するとともに線維組織が過形成し、真皮層の毛包の数が有意に減少したが、筋肉層及び皮下組織には明らかな異常が見られなかった。
【００８７】
上記病理学的検査結果から、クロロキンキトサンマイクロスフェア群のゲルは、クロロキンゲルに比べて、刺激性、及び投与停止後の癒合のいずれの点でも明らかな優位性を有することが示されている。各クロロキンキトサンマイクロスフェア群では、クロロキンナノスフェア担体の割合が低いほど、皮膚に対する刺激性反応が低下した。
【００８８】
皮膚の観察結果及び病理学的検査の結果の組み合わせから明らかなように、クロロキンキトサンナノスフェアゲルによる皮膚への刺激性反応がクロロキンゲルよりも明らかに低く、それは、クロロキンキトサンナノスフェアがクロロキンによる皮膚への刺激性の副作用を大幅に低減させるとともに、ある程度で傷口の癒合を促進することが示されている。クロロキンとキトサンの質量比が１：３以下である場合、刺激作用が小さく、薬品含有量が最高であった。
【００８９】
実施例７    ヘルペスウイルス膣炎についての動物試験
１、実験方法
実施例１で得られたクロロキンキトサンナノスフェアをゲルに調製して、ヘルペスウイルス膣炎についての動物試験を行った。
【００９０】
実験方法は、具体的には、適応性を観察したところ合格したＨａｒｔｌｅｙモルモットを複数匹用い、１０匹の動物をランダムに選択して空白対照群（Ａ）とし、残りの動物について、膣感染ヘルペスウイルスを用いてモデリングし、モデリングした動物を５個の群にランダムに分け、すべての群は、以下のとおりである。
【００９１】
Ａ群：空白対照群、
Ｂ群：モデル群、
Ｃ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１、
Ｄ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２、
Ｅ群：リン酸クロロキンゲル群。
【００９２】
１群１０匹とし、すべて膣投与を行った。空白対照群、モデル対照群には、０．９％塩化ナトリウム注射液を投与し、Ｃ群、Ｄ群、及びＥ群には、対応する試験医薬品を投与し、１日に１回投与し、各群について連続して２週間投与した。１４日間投与した後、翌日に膣粘膜組織を取り、固定、パラフィン包埋をして、連続した４μｍの切片を切り、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）で染色した後、顕微鏡下で膣粘膜組織の病理学的状況を観察した。
【００９３】
２、結果
（１）病理学的検査
Ａ群：空白対照群の結果は、図８におけるＡ図に示されるように、空白対照群の膣粘膜の上皮細胞の構造が完全であり、固有層には、血管拡張及び炎性細胞浸潤がなかった。
【００９４】
Ｂ群：モデル対照群の結果は、図８におけるＢ図に示されるように、モデル対照群の膣粘膜の下の固有層に大量の炎性細胞浸潤が見られ、疎性結合組織の配列が不規則的であり、水腫が明らかであった。
【００９５】
Ｃ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１の結果は、図８におけるＣ図に示されるように、該群の漿膜層の結合組織が増えて、配列が不規則であり、水腫が明らかであり、少量の炎症性細胞浸潤が伴った。
【００９６】
Ｄ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２の結果は、図８におけるＤ図に示されるように、該群の粘膜の下の固有層に明らかな水腫があり、漿膜層の結合組織が増えて、配列が不規則であり、水腫が明らかであり、炎症性細胞浸潤が認められた。
【００９７】
Ｅ群：リン酸クロロキンゲル群の結果は、図８におけるＥ図に示されるように、クロロキンゲル群の膣粘膜の局所の上皮細胞が変形して壊死し、粘膜の下の固有層における疎性結合組織の配列がわずかに不規則的であるが、水腫が明らかなであり、且つ炎症性細胞浸潤が伴った。
【００９８】
（２）試験動物の組織学的検査による病変程度の結果
【表４】
2021509681.tif 000019
【００９９】
注：「−」は、組織構造には明らかな異常が認められないことを示し、「±」は、極めて軽度の損傷を示し、「＋」は、軽度の損傷を示し、「＋＋」は、中度の損傷を示し、「＋＋＋」は、重度の損傷を示す。
【０１００】
上記研究結果から明らかなように、クロロキンゲルに比べて、クロロキンキトサンナノスフェアゲルは、ヘルペスウイルスにより引き起こされる膣炎を明らかな改善できた。各群の炎症程度を比較すると、モデル対照群＞リン酸クロロキンＥ群＞クロロキンキトサンナノスフェアゲルＤ群＞クロロキンキトサンナノスフェアゲルＣ群＞空白対照群であった。さらに、クロロキンとキトサンを併用することにより膣の水腫を顕著に改善でき、且つ、結果は、炎症の程度と類似した。それは、クロロキンとキトサンマイクロスフェアを併用することにより顕著な相乗的な治療効果を奏することを示した。
【０１０１】
実施例８    ＨＰＶにより引き起こされる尖形コンジロームの治療
１、実験方法
適応性を観察したところ合格した複数匹のヌードマウスを用い、雌雄それぞれを半分とし、無菌手術の原則に厳密に従っている手順で、ＨＰＶに感染したイボ組織構造をそのままヌードマウスの皮下に接種した。イボを接種してから５〜６日間後、接種部位が良好なヌードマウスを選択して、体重及び性別別に、以下の４群に均一にランダムに分けた。
【０１０２】
Ａ群：モデル対照群、
Ｂ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：３のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群１、
Ｃ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が１：０．５のクロロキンキトサンナノスフェアゲル群２、
Ｄ群：リン酸クロロキンゲル群
１群６匹とし、雌性それぞれを半分とした。そのうち、モデル対照群には、白いワセリンを投与し、残りの各群には、対応するゲルを投与し、各群について皮膚へ塗布して投与し、動物の投与部位における投与領域の約（２ｃｍ×２ｃｍ）へ塗布した。１日に１回塗布し、１回に６時間接触させ、６時間接触させた後、薬品を取り除き、連続的に１４日間投与した。１４日間投与した後、翌日にイボ組織構造を切り取り、固定、パラフィン包埋をして、連続した４μｍの切片を切り、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）で染色した後、顕微鏡下でイボ組織構造の病理学的状況を観察した。
【０１０３】
２、結果
病理学的検査結果から分かるように、
（１）Ａ群イボ結果から明らかなように、各例の動物には、イボ組織構造が見られ、イボ組織構造は、上皮細胞の構造が完全であり、局所には空胞細胞が認められた。
【０１０４】
図９におけるＡ図に示されるように、イボにおいて、局所の上皮細胞の細胞核の周辺に明らかな空胞があり、細胞核の核小体が明らかであった。（Ｈ−Ｅ染色×２００）
（２）Ｂ群のイボ結果から明らかなように、６例の動物には、イボ組織構造が見られた。そのうち、２例の動物（０３、０４；２／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の局所が変性して壊死し、且つ少量の空胞細胞が認められ、４例の動物（０１、０２、０５、０６；４／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の構造が完全であり、局所には空胞細胞が認められた。
【０１０５】
図９におけるＢ図に示されるように、イボにおいて、局所の上皮細胞の細胞核の周辺に明らかな空胞があり、細胞核の核小体が明らかであった。（Ｈ−Ｅ染色×２００）
【０１０６】
（３）Ｃ群のイボ結果から明らかなように、６例の動物には、イボ組織構造が見られた。そのうち、３例の動物（０３、０４、０５；３／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の局所が変性して壊死し、且つ少量の空胞細胞が認められ、３例の動物（０１、０２、０６；３／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の構造が完全であり、局所には空胞細胞が認められた。
【０１０７】
図９におけるＣ図に示されるように、イボにおいて、局所の上皮細胞の細胞核の周辺に明らかな空胞があり、細胞核の核小体が明らかであった。（Ｈ−Ｅ染色×２００）
【０１０８】
（４）Ｄ群のイボ結果から明らかなように、６例の動物には、イボ組織構造が見られた。そのうち、４例の動物（０１、０２、０３、０４；４／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の局所が変性して壊死し、且つ少量の空胞細胞が認められ、２例の動物（０５、０６；２／６）のイボ組織構造は、上皮細胞の構造が完全であり、局所には空胞細胞が認められた。
【０１０９】
図９におけるＤ図に示されるように、イボにおいて、イボの表皮細胞が過度に角質化し、表皮の下に扁平上皮が見られ、局所の上皮細胞が変性して壊死し、局所には、少量の空胞細胞が認められた。
【０１１０】
上記研究結果から明らかなように、クロロキンは、ＨＰＶにより引き起こされるイボに対して感染細胞ウイルスを取り除く作用を果たし、且つ、クロロキン含有量の増大に伴い、ＨＰＶに感染した空胞細胞が減少した。クロロキンゲル群（Ｄ群）は、感染細胞を明らかに除去できるが、組織構造の局所の変性壊死を引き起こした。クロロキンキトサンゲルは、純粋なクロロキンゲルに比べて、感染細胞を減少させるとともに、皮膚に対して保護作用を有する。
【０１１１】
実施例９    膣における複数種の病原微生物に対する殺滅又は阻害作用
実施例６におけるクロロキンキトサンナノスフェアゲル群（Ｂ群：リン酸クロロキンとキトサンの質量比が３：１のクロロキンキトサンナノスフェアゲル）について、インビトロ抗菌活性試験を行った。ゲル製品２０ｇをｐＨ７．０の緩衝液１００ｍＬ（陰性対照には試験品を添加しない）に加えて、十分に溶解させた。試験品を添加したｐＨ７．０緩衝液１ｍＬ、０．５ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．１２５ｍＬを、対応する菌種に対応する培地に加えて、平皿に入れて培養した。緑膿菌、カンジダ・アルビカンス、大腸菌、黄色ブドウ球菌を回復して希釈し、菌濃度が１００ｃｆｕ／ｍＬになるとき、接種ループで各培地に接種して、５〜７日間培養した後、観察し始めた。
【０１１２】
インビトロ抗菌活性試験の結果は、以下のとおりである。キトサンクロロキンナノスフェアゲルは、濃度にかかわらず、緑膿菌、カンジダ・アルビカンス、大腸菌、黄色ブドウ球菌に対して成長阻害作用を示し、濃度が高いほど、菌体に対する阻害率が高かった。その中でも、カンジダ・アルビカンス及び黄色ブドウ球菌の感度がより高かった。
【０１１３】
結果から、クロロキンキトサンナノスフェアゲルは、複数種の細菌に対して優れた阻害作用を有するが、感度には差異があることが示されている。
【０１１４】
本発明では、クロロキンとキトサンを併用することによって、膣における複数種の病原微生物に対して相乗阻害作用を果たす。本発明の医薬品は、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）、緑膿菌、β溶血性レンサ球菌（ＳＴ）、カンジダ・アルビカンス（ＣＡ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ｕｕ）、膣トリコモナス及びバクテロイデス・フラジリス、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）など、膣における複数種の病原微生物を殺滅又は阻害する作用を有する。また、本発明の医薬品は、病原体と宿主の膣の上皮細胞との粘着を抑制し、複数種の膣炎、たとえばカンジダ・アルビカンス膣炎、トリコモナス膣炎、細菌性膣疾患、性器ヘルペスウイルスなどの複数種の外性器感染症を予防治療できる。
【０１１５】
実施例１０    予備臨床研究結果
本発明のクロロキンキトサンナノスフェアをカンジダ感染により引き起こされる膣炎に罹った女性１０例に適用した結果、治療過程において副作用や不良反応を報告した患者がなく、６ヵ月のフォローアップにも、副作用や不良反応が発見せず、且つ、クロロキンキトサンナノスフェア治療群の全有効率が、クロロキン単独治療群の全有効率よりも３０％と高く向上したことを見出した。
【０１１６】
本発明をＨＰＶ感染によるイボ３０例の治療に適用した場合、２〜３週間治療したところ、３０例の患者のイボは、自然に落ちて、且ついずれの不良反応もなかった。
【０１１７】
本発明のクロロキンナノスフェアは、ウイルス性膣炎、尖形コンジローム、細菌性膣疾患、真菌感染性膣炎又はトリコモナス膣炎などの外性器感染症、及び扁平イボ、ＨＰＶ感染により引き起こされる非性器部位でのイボなどのほかの皮膚イボに対して良好な治療効果を有する。
【０１１８】
勿論、本発明の上記実施例は、あくまで本発明を明瞭に説明するための例示に過ぎず、本発明の実施形態を限定するものではない。当業者であれば、上記の内容に基づいてほかの形態に対して変化又は変更を実施できる。ここで、すべての実施形態を挙げる必要がなく、またそれは不可能なことである。本発明の主旨及び原則から逸脱せずに行われるすべての修正、同等置換や改良などは、本発明の特許請求の範囲の保護範囲に属すべきである。
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月14日(2020.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロキンナノスフェアであって、
水溶性ナノスフェア担体、及びクロロキン又はクロロキン誘導体を含有し、
調製するときに前記クロロキン又はクロロキン誘導体と水溶性ナノスフェア担体の質量比が１：３〜１：５であり、
調製されたクロロキンナノスフェアにおけるクロロキン又はクロロキン誘導体の担持率が、３．０％〜２１．６％であり、
前記水溶性ナノスフェア担体は、水溶性キトサンであって、
前記水溶性キトサンの脱アセチル化度は、８０％〜９５％であって、
前記水溶性キトサンの粘度平均分子量は、３０００〜５０００であって、
前記クロロキン誘導体は、ヒドロキシクロロキン、リン酸クロロキン又は硫酸クロロキンから選ばれる１種以上である、
ことを特徴とするクロロキンナノスフェア。
【請求項２】
前記クロロキンナノスフェアの調製方法は、
前記水溶性ナノスフェア担体を溶解した後、クロロキン又はクロロキン誘導体を加え、均一に混合して撹拌して水相とするステップＳ１と、
油相基質に乳化剤を加えて油相とし、水相と油相の体積比が１：１〜６となるように水相を油相に加え、１００００〜２００００ｒ／ｍｉｎで１０〜３０ｍｉｎ乳化させ、ナノスフェアエマルジョンを得るステップＳ２と、
ナノスフェアエマルジョンに沈殿剤を加えて、均一に混合し、次に、２〜８ｍｉｎ静止した後脱水し、高速遠心処理して、洗浄して乾燥させ、前記クロロキンナノスフェアを得るステップＳ３と、を含み、
前記高速遠心処理は、１５００〜２０００ｒ／ｍｉｎで５〜１０ｍｉｎ遠心処理することであり、
前記油相基質は、コーン油、オリーブオイル、落花生油、大豆油及び菜種油から選ばれる１種以上であり、
前記乳化剤は、ツイン−２０、ツイン−８０、Ｓｐａｎ  ８０から選ばれる１種以上であり、
前記沈殿剤は、水酸化ナトリウム−ｎ−プロパノール混合溶液である、
ことを特徴とする請求項１に記載のクロロキンナノスフェア。
【請求項３】
乳化剤と沈殿剤の体積比が、１〜１．５：３０〜５０である、
ことを特徴とする請求項２に記載のクロロキンナノスフェア。
【請求項４】
前記沈殿剤のｐＨ値が８．５〜１０．０である、
ことを特徴とする請求項２に記載のクロロキンナノスフェア。
【請求項５】
抗菌及び／又は抗ウイルス製品の調製において、
前記クロロキンナノスフェアは、使用のためにゲルに調整される、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のクロロキンナノスフェアの応用。
【請求項６】
外性器感染症及び／又は扁平イボを予防及び治療する製品の調製における請求項１又は２に記載のクロロキンナノスフェアの応用。
【請求項７】
前記外性器感染症は、ウイルス性膣炎、尖形コンジローム、細菌性膣疾患、真菌感染性膣炎又はトリコモナス膣炎を含む、
ことを特徴とする請求項６に記載の応用。
【請求項８】
外性器感染症及び／又は扁平イボを予防及び治療する製品であって、
請求項１〜４のいずれか１項に記載のクロロキンナノスフェアを含有する、
ことを特徴とする製品。
【請求項９】
前記クロロキンナノスフェアは、製品の全重量の１％〜６％を占める、
ことを特徴とする請求項８に記載の製品。
【請求項１０】
前記製品の剤形は、ゲル剤である、
ことを特徴とする請求項８又は９に記載の製品。
【国際調査報告】
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