(57)【要約】核酸エンコーディングを利用して、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む、巨大分子を解析するためのキットおよびキットの使用方法が開示される。試料解析キットは、認識事象などの分子相互作用および／または反応（例えば、抗原と抗体間のもの、修飾された末端アミノ酸残基と標的間のもの、または小分子もしくはペプチド治療物質と標的間のものなど）の核酸エンコーディングおよび／または核酸記録を利用する。サイクル特異的バーコーディング（例えば、「クロッキング」）、コンパートメントバーコーディング、コンビナトリアルバーコーディング、空間的バーコーディングまたはこれらの任意の組合せのためのものなどのさらなるバーコーディング試薬をキットに含めることができる。
2021501577.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨大分子を解析するための方法であって、
（ａ）固体支持体に接合した巨大分子および付随する記録ポリマーを提供するステップと；
（ｂ）前記巨大分子を、前記巨大分子に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｃ）前記第１のコーディングポリマーの情報を前記記録ポリマーに移行させて、一次伸長記録ポリマーを生成するステップと；
（ｄ）前記巨大分子を、前記巨大分子に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｅ）前記第２のコーディングポリマーの情報を前記一次伸長記録ポリマーに移行させて、二次伸長記録ポリマーを生成するステップと；
（ｆ）前記二次伸長記録ポリマーを解析するステップと
を含む方法。
【請求項２】
接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を逐次的に実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を同時に実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、（ｘ）前記第２の結合性物質を、前記巨大分子に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、前記第３の（またはより高次の）結合性物質が、前記第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングポリマーを含む、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回または複数回繰り返すステップと；（ｙ）前記第３の（またはより高次の）コーディングポリマーの情報を前記第２の（またはより高次の）伸長記録ポリマーに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録ポリマーを生成するステップとをさらに含み、
ステップ（ｆ）において前記第３の（またはより高次の）伸長記録ポリマーを解析する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
巨大分子を解析するための方法であって、
（ａ）固体支持体に接合した巨大分子、付随する第１の記録ポリマーおよび付随する第２の記録ポリマーを提供するステップと；
（ｂ）前記巨大分子を、前記巨大分子に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｃ）前記第１のコーディングポリマーの情報を前記第１の記録ポリマーに移行させて、第１の伸長記録ポリマーを生成するステップと；
（ｄ）前記巨大分子を、前記巨大分子に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｅ）前記第２のコーディングポリマーの情報を前記第２の記録ポリマーに移行させて、第２の伸長記録ポリマーを生成するステップと；
（ｆ）前記第１および第２の伸長記録ポリマーを解析するステップと
を含む方法。
【請求項６】
接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を逐次的に実施する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を同時に実施する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）が、前記固体支持体に接合した付随する第３の（またはより高次の）記録ポリマーを提供するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、
（ｘ）前記第２の結合性物質を、前記巨大分子に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、前記第３の（またはより高次の）結合性物質が、前記第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｙ）前記第３の（またはより高次の）コーディングポリマーの情報を前記第３の（またはより高次の）記録ポリマーに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録ポリマーを生成するステップと
をさらに含み、
ステップ（ｆ）において前記第１、第２または第３の（またはより高次の）伸長記録ポリマーを解析する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のコーディングポリマー、第２のコーディングポリマー、および任意のより高次のコーディングポリマーが、結合サイクル特異的スペーサーポリマー配列を含む、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録ポリマーを提供するステップと；
（ｂ）前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学薬剤で修飾するステップと；
（ｃ）前記ペプチドを、修飾された前記ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｄ）前記第１のコーディングポリマーの情報を前記記録ポリマーに移行させて、伸長記録ポリマーを生成するステップと；
（ｅ）前記伸長記録ポリマーを解析するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）が、前記ペプチドを、第２の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第２の（またはより高次の）コーディングポリマーを含む第２の（またはより高次の）結合性物質と接触させることをさらに含み、第２の（またはより高次の）結合性物質が、ステップ（ｂ）の前記修飾されたＮＴＡＡ以外の修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触後に逐次的に行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触と同時に行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記化学薬剤が、イソチオシアネート誘導体、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、ダンシルクロリド、７−メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、またはチオベンジル化試薬である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録ポリマーを提供するステップと；
（ｂ）前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学薬剤で修飾して修飾ＮＴＡＡを得るステップと；
（ｃ）前記ペプチドを、前記修飾ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｄ）前記第１のコーディングポリマーの情報を前記記録ポリマーに移行させて、第１の伸長記録ポリマーを生成するステップと；
（ｅ）前記修飾ＮＴＡＡを除去して新しいＮＴＡＡを露出させるステップと；
（ｆ）前記ペプチドの前記新しいＮＴＡＡを化学薬剤で修飾して新しく修飾されたＮＴＡＡを得るステップと；
（ｇ）前記ペプチドを、前記新しく修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｈ）前記第２のコーディングポリマーの情報を前記第１の伸長記録ポリマーに移行させて、第２の伸長記録ポリマーを生成するステップと；
（ｉ）前記第２の伸長記録ポリマーを解析するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
ペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録ポリマーを提供するステップと；
（ｂ）前記ペプチドを、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｃ）前記第１のコーディングポリマーの情報を前記記録ポリマーに移行させて、伸長記録ポリマーを生成するステップと；
（ｄ）前記伸長記録ポリマーを解析するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）が、前記ペプチドを、第２の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第２の（またはより高次の）コーディングポリマーを含む第２の（またはより高次の）結合性物質と接触させることをさらに含み、前記第２の（またはより高次の）結合性物質が、前記ペプチドの前記ＮＴＡＡ以外のＮＴＡＡに結合することが可能である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触後に逐次的に行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触と同時に行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録ポリマーを提供するステップと；
（ｂ）前記ペプチドを、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｃ）前記第１のコーディングポリマーの情報を前記記録ポリマーに移行させて、第１の伸長記録ポリマーを生成するステップと；
（ｄ）前記ＮＴＡＡを除去して前記ペプチドの新しいＮＴＡＡを露出させるステップと；
（ｅ）前記ペプチドを、前記新しいＮＴＡＡに結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｈ）前記第２のコーディングポリマーの情報を前記第１の伸長記録ポリマーに移行させて、第２の伸長記録ポリマーを生成するステップと；
（ｉ）前記第２の伸長記録ポリマーを解析するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記巨大分子が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記巨大分子がペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することにより得られる、請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記巨大分子が、脂質、炭水化物、または大環状分子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記記録ポリマーが、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、非核酸の配列決定可能なポリマー、例えば、多糖、ポリペプチド、ペプチドもしくはポリアミド、またはこれらの組合せを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記記録ポリマーが、ユニバーサルプライミング部位を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記記録ポリマーが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項１〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記記録ポリマーが、バーコードを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記記録ポリマーが、その３’末端にスペーサーポリマーを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記巨大分子および前記付随する記録ポリマーが、前記固体支持体に共有結合により接合されている、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
複数の巨大分子および付随する記録ポリマーが、固体支持体に接合されている、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数の巨大分子の間に前記固体支持体上で平均距離＞５０ｎｍの間隔をあける、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記結合性物質が、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記結合性物質が、修飾アミノペプチダーゼ、修飾アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、修飾アンチカリン、または修飾ＣｌｐＳである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記結合性物質が、前記巨大分子に選択的に結合することが可能である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記コーディングポリマーが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、非核酸の配列決定可能なポリマー、例えば、多糖、ポリペプチド、ペプチドもしくはポリアミド、またはこれらの組合せを含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記コーディングポリマーが、エンコーダー配列を含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記コーディングポリマーが、スペーサーポリマー、結合サイクル特異的配列、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記結合性物質および前記コーディングポリマーが、リンカーによって接合されている、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記結合性物質と前記コーディングポリマーが、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対によって接合されている、請求項１〜４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記コーディングポリマーの情報の前記記録ポリマーへの移行が、ＤＮＡリガーゼによって媒介される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記コーディングポリマーの情報の前記記録ポリマーへの移行が、ＤＮＡポリメラーゼによって媒介される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記コーディングポリマーの情報の前記記録ポリマーへの移行が、化学的ライゲーションによって媒介される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記伸長記録ポリマーの解析が、核酸配列決定法を含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸配列決定法が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記伸長記録ポリマーが、解析前に増幅される、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記伸長記録ポリマーに含有されるコーディングポリマー情報の順序が、前記結合性物質による前記巨大分子への結合の順序に関する情報を提供する、請求項１〜５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記伸長記録ポリマーに含有される前記コーディングポリマー情報の頻度が、前記結合性物質による前記巨大分子への結合の頻度に関する情報を提供する、請求項１〜５２に記載の方法。
【請求項５４】
複数の巨大分子を表す複数の伸長記録ポリマーが、並行して解析される、請求項１〜５３に記載の方法。
【請求項５５】
複数の巨大分子を表す前記複数の伸長記録ポリマーが、多重化アッセイで解析される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記複数の伸長記録ポリマーが、解析前に標的濃縮アッセイされる、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記複数の伸長記録ポリマーが、解析前にサブトラクションアッセイされる、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記複数の伸長記録ポリマーが、極めて豊富な種を低減させるために解析前に正規化アッセイされる、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＮＴＡＡが、修飾アミノペプチダーゼ、修飾アミノ酸ｔＲＮＡ合成酵素、穏やかなエドマン分解、エドマナーゼ酵素、または無水ＴＦＡによって除去される、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも１つの結合性物質が、末端アミノ酸残基に結合する、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも１つの結合性物質が、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合する、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを含む試料由来の１つまたは複数のペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）前記試料中の前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するステップであって、各コンパートメントが、必要に応じて固体支持体に接合した複数のコンパートメントタグ（例えば、非核酸の配列決定可能なポリマーの形態のもの）を含み、前記複数のコンパートメントタグが、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；
（ｂ）前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、および／またはポリペプチドを複数のペプチドに断片化するステップと；
（ｃ）前記複数のペプチドと前記複数のコンパートメント内の前記複数のコンパートメントタグとのアニーリングまたは接合を可能にするのに十分な条件下で前記複数のペプチドを前記複数のコンパートメントタグと接触させることによって複数のコンパートメントタグ付きペプチドを生成するステップと；
（ｄ）前記コンパートメントタグ付きペプチドを前記複数のコンパートメントから収集するステップと；
（ｅ）１つまたは複数のコンパートメントタグ付きペプチドを、請求項１〜２１および２６〜６１のいずれか一項に記載の方法に従って解析するステップと
を含む方法。
【請求項６３】
前記コンパートメントが、マイクロ流体液滴である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記コンパートメントが、マイクロウェルである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記コンパートメントが、表面上の分離された領域である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
各コンパートメントが、平均して単一の細胞を含む、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを含む試料由来の１つまたは複数のペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のユニバーサルＤＮＡタグで標識するステップと；
（ｂ）前記試料中の前記複数の標識されたタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するステップであって、各コンパートメントが、複数のコンパートメントタグ（例えば、非核酸の配列決定可能なポリマーの形態のもの）を含み、前記複数のコンパートメントタグが、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；
（ｃ）前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドと前記複数のコンパートメント内の前記複数のコンパートメントタグとのアニーリングまたは接合を可能にするのに十分な条件下で前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを前記複数のコンパートメントタグと接触させることによって複数のコンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを生成するステップと；
（ｄ）前記コンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを前記複数のコンパートメントから収集するステップと；
（ｅ）必要に応じて前記コンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドをコンパートメントタグ付きペプチドに断片化するステップと；
（ｆ）１つまたは複数のコンパートメントタグ付きペプチドを、請求項１〜２１および２６〜６１のいずれか一項に記載の方法に従って解析するステップと
を含む方法。
【請求項６８】
コンパートメントタグ情報が、ペプチドに付随する記録ポリマーに、プライマー伸長またはライゲーションによって移行される、請求項６２〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記固体支持体が、ビーズを含む、請求項６２〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ビーズが、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記コンパートメントタグが、一本鎖または二本鎖核酸分子を含む、請求項６２〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記コンパートメントタグが、バーコードおよび必要に応じてＵＭＩを含む、請求項６２〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記固体支持体がビーズであり、前記コンパートメントタグがバーコードを含み、さらに、前記複数のコンパートメントタグが接合されているビーズが、スプリット・アンド・プール合成により形成される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記固体支持体がビーズであり、前記コンパートメントタグがバーコードを含み、さらに、複数のコンパートメントタグが接合されているビーズが、個々の合成または固定化により形成される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記コンパートメントタグが、記録ポリマーの成分であり、前記記録ポリマーが、必要に応じて、スペーサーポリマー、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、請求項６２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記コンパートメントタグが、前記複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドの内部アミノ酸またはＮ末端アミノ酸と反応することができる機能的部分をさらに含む、請求項６２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記機能的部分が、ＮＨＳ基である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記機能的部分が、アルデヒド基である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記複数のコンパートメントタグが、前記コンパートメントタグを前記コンパートメントに印刷、スポッティング、インク噴射すること、またはその組合せにより形成される、請求項６２〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記コンパートメントタグが、ペプチドをさらに含む、請求項６２〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記コンパートメントタグペプチドが、タンパク質リガーゼ認識配列を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記タンパク質リガーゼが、ブテラーゼＩまたはそのホモログである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記複数のポリペプチドが、プロテアーゼで断片化される、請求項６２〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記プロテアーゼが、メタロプロテアーゼである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記メタロプロテアーゼの活性が、金属カチオンの光活性化放出によりモジュレートされる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記複数のポリペプチドを前記複数のコンパートメントに分配する前に１つまたは複数の豊富なタンパク質を前記試料からサブトラクションすることをさらに含む、請求項６２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記複数のペプチドと前記コンパートメントタグを接合させる前に前記コンパートメントタグを前記固体支持体から遊離させることをさらに含む、請求項６２〜８６に記載の方法。
【請求項８８】
ステップ（ｄ）の後に、前記コンパートメントタグ付きペプチドを固体支持体に記録ポリマーを伴って接合させることをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項８９】
前記コンパートメントタグ付きペプチド上の前記コンパートメントタグの情報を前記付随する記録ポリマーに移行させることをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
ステップ（ｅ）の前に前記コンパートメントタグを前記コンパートメントタグ付きペプチドから除去することをさらに含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
解析されるペプチドが由来する前記単一の細胞の同一性を前記解析されるペプチドのコンパートメントタグ配列に基づいて決定することをさらに含む、請求項６２〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
解析されるペプチドが由来する前記タンパク質またはタンパク質複合体の同一性を前記解析されるペプチドのコンパートメントタグ配列に基づいて決定することをさらに含む、請求項６２〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
複数の巨大分子を解析するための方法であって、
（ａ）固体支持体に接合した複数の巨大分子および付随する記録ポリマーを提供するステップと；
（ｂ）前記複数の巨大分子を、前記複数の巨大分子に結合することが可能な複数の結合性物質と接触させるステップであって、各結合性物質が前記結合性物質に関する識別情報を有するコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｃ）（ｉ）前記巨大分子に付随する記録ポリマーの情報を、前記巨大分子に結合している前記結合性物質の前記コーディングポリマーに移行させて、伸長コーディングポリマーを生成するステップ；または（ｉｉ）巨大分子に付随する記録ポリマーおよび前記巨大分子に結合している前記結合性物質のコーディングポリマーの情報をジタグ構築物に移行するステップと；
（ｄ）前記伸長コーディングポリマーまたはジタグ構築物を収集するステップと；
（ｅ）必要に応じてステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回の結合サイクルにわたって繰り返すステップと；
（ｆ）伸長コーディングポリマーまたはジタグ構築物の収集物を解析するステップと
を含む方法。
【請求項９４】
前記巨大分子が、タンパク質である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記巨大分子が、ペプチドである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記ペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することにより得られる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記記録ポリマーが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ、分子、ＬＮＡ分子、γＰＮＡ分子、非核酸の配列決定可能なポリマー、例えば、多糖、ポリペプチド、ペプチドもしくはポリアミド、またはこれらの組合せを含む、請求項９３〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記記録ポリマーが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）（例えば、非核酸の配列決定可能なポリマーの形態のもの）を含む、請求項９３〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記記録ポリマーが、コンパートメントタグ（例えば、非核酸の配列決定可能なポリマーの形態のもの）を含む、請求項９３〜９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記記録ポリマーが、ユニバーサルプライミング部位（例えば、非核酸の配列決定可能なポリマーの形態のもの）を含む、請求項９３〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記記録ポリマーが、その３’末端にスペーサーポリマーを、例えば、非核酸の配列決定可能なポリマーの形態で含む、請求項９３〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記記録ポリマーの３’末端が、ポリメラーゼによる前記記録ポリマーの伸長を防止するためにブロッキングされ、巨大分子に付随する記録ポリマーおよび前記巨大分子に結合している前記結合性物質のコーディングポリマーの情報が、ジタグ構築物（例えば、非核酸の配列決定可能なポリマーの形態のもの）に移行される、請求項９３〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記コーディングポリマーが、エンコーダー配列を含む、請求項９３〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記コーディングポリマーが、ＵＭＩを含む、請求項９３〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記コーディングポリマーが、ユニバーサルプライミング部位を含む、請求項９３〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記コーディングポリマーが、その３’末端にスペーサーポリマーを含む、請求項９３〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記コーディングポリマーが、結合サイクル特異的配列を含む、請求項９３〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記結合性物質および前記コーディングポリマーが、リンカーによって接合されている、請求項９３〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記記録ポリマーの情報の前記コーディングポリマーへの移行が、プライマー伸長により果たされる、請求項９３〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記記録ポリマーの情報の前記コーディングポリマーへの移行が、ライゲーションによって果たされる、請求項９３〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ジタグ構築物が、ギャップ充填、プライマー伸長、またはその両方により生成される、請求項９３〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ジタグ分子が、前記記録ポリマーに由来するユニバーサルプライミング部位、前記記録ポリマーに由来するコンパートメントタグ、前記記録ポリマーに由来する一意の分子識別子、前記記録ポリマーに由来する必要に応じたスペーサーポリマー、前記コーディングポリマーに由来するエンコーダー配列、前記コーディングポリマーに由来する一意の分子識別子、前記コーディングポリマーに由来する必要に応じたスペーサーポリマー、および前記コーディングポリマーに由来するユニバーサルプライミング部位を含む、請求項９３〜９７、１０７、１０８および１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記巨大分子および前記付随する記録ポリマーが、前記固体支持体に共有結合により接合されている、請求項９３〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記結合性物質が、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項９３〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記結合性物質が、修飾アミノペプチダーゼ、修飾アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、修飾アンチカリン、または抗体もしくはその結合断片である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記結合性物質が、単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチドまたは前記ペプチドの翻訳後修飾に結合する、請求項９５〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記結合性物質が、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に結合する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記結合性物質が、Ｎ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、または内部ペプチドに結合する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記結合性物質が、前記Ｎ末端アミノ酸残基に結合し、前記Ｎ末端アミノ酸残基が、各結合サイクル後に切断される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２２】
前記結合性物質が、前記Ｃ末端アミノ酸残基に結合し、前記Ｃ末端アミノ酸残基が、各結合サイクル後に切断される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２３】
前記Ｎ末端アミノ酸残基が、エドマン分解によって切断される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記結合性物質が、アミノ酸または翻訳後修飾の部位特異的な共有結合性標識である、請求項９３に記載の方法。
【請求項１２５】
ステップ（ｂ）の後に、前記巨大分子と付随する結合性物質とを含む複合体が、前記固体支持体から解離され、液滴またはマイクロ流体液滴のエマルジョン中に分配される、請求項９３〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
各マイクロ流体液滴が、平均して、前記巨大分子と前記結合性物質とを含む複合体を１つ含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記記録ポリマーが、伸長コーディングポリマーまたはジタグ構築物の生成前に増幅される、請求項１２５または１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
エマルジョン融合ＰＣＲが、前記記録ポリマーの情報を前記コーディングポリマーに移行させるためにまたはジタグ構築物の集団を創出するために使用される、請求項１２５〜１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
伸長コーディングポリマーまたはジタグ構築物の収集物が、解析前に増幅される、請求項９３〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
伸長コーディングポリマーまたはジタグ構築物の前記収集物の解析が、核酸配列決定法を含む、請求項９３〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記核酸配列決定法が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
前記巨大分子の部分的組成が、一意のコンパートメントタグおよび必要に応じてＵＭＩを使用する複数の伸長コーディングポリマーまたはジタグ構築物の解析により決定される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３４】
前記解析ステップが、塩基当たりのエラー率が＞５％、＞１０％、＞１５％、＞２０％、＞２５％、または＞３０％である配列決定法を用いて実施される、請求項１〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
コーディングポリマー、記録ポリマー、またはその両方の識別成分が、エラー訂正コードを含む、請求項１〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記識別成分が、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記エラー訂正コードが、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される、請求項１３５または１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
コーディングポリマー、記録ポリマー、またはその両方の識別成分が、一意の電流またはイオンフラックスまたは光学的シグネチャを生成することができ、前記解析ステップが、前記識別成分を識別するための前記一意の電流またはイオンフラックスまたは光学的シグネチャの検出を含む、請求項１〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記識別成分が、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
複数の巨大分子を解析するための方法であって、
（ａ）固体支持体に接合した複数の巨大分子および付随する記録ポリマーを提供するステップと；
（ｂ）前記複数の巨大分子を、同類の巨大分子に結合することが可能な複数の結合性物質と接触させるステップであって、各結合性物質が前記結合性物質に関する識別情報を有するコーディングポリマーを含む、ステップと；
（ｃ）第１の結合性物質の第１のコーディングポリマーの情報を第１の巨大分子に付随する第１の記録ポリマーに移行させて、一次伸長記録ポリマーを生成するステップであって、前記第１の結合性物質が前記第１の巨大分子に結合するステップと；
（ｄ）前記複数の巨大分子を、同類の巨大分子に結合することが可能な前記複数の結合性物質と接触させるステップと；
（ｅ）第２の結合性物質の第２のコーディングポリマーの情報を前記一次伸長記録ポリマーに移行させて、二次伸長記録ポリマーを生成するステップであって、前記第２の結合性物質が前記第１の巨大分子に結合するステップと；
（ｆ）必要に応じてステップ（ｄ）〜（ｅ）を「ｎ」回の結合サイクルにわたって繰り返すステップであって、前記第１の巨大分子に結合する各結合性物質の各コーディングポリマーの情報を前の結合サイクルで生成した伸長記録ポリマーに移行させて、前記第１の巨大分子を表すｎ次伸長記録ポリマーを生成するステップと；
（ｇ）前記ｎ次伸長記録ポリマーを解析するステップと
を含む方法。
【請求項１４１】
複数の巨大分子を表す複数のｎ次伸長記録ポリマーが生成され、解析される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記巨大分子が、タンパク質である、請求項１４０または１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記巨大分子が、ペプチドである、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記ペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することにより得られる、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記複数の巨大分子が、多数のプールされた試料由来の巨大分子を含む、請求項１４０〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記記録ポリマーが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ、分子、ＬＮＡ分子、γＰＮＡ分子、非核酸の配列決定可能なポリマー、例えば、多糖、ポリペプチド、ペプチドもしくはポリアミド、またはこれらの組合せを含む、請求項１４０〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記記録ポリマーが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項１４０〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記記録ポリマーが、コンパートメントタグを含む、請求項１４０〜１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記記録ポリマーが、ユニバーサルプライミング部位を含む、請求項１４０〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記記録ポリマーが、その３’末端にスペーサーポリマーを含む、請求項１４０〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記コーディングポリマーが、エンコーダー配列を含む、請求項１４０〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記コーディングポリマーが、ＵＭＩを含む、請求項１４０〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記コーディングポリマーが、ユニバーサルプライミング部位を含む、請求項１４０〜１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記コーディングポリマーが、その３’末端にスペーサーポリマーを含む、請求項１４０〜１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記コーディングポリマーが、結合サイクル特異的配列を含む、請求項１４０〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記コーディングポリマーが、一意の分子識別子を含む、請求項１４０〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記結合性物質および前記コーディングポリマーが、リンカーによって接合されている、請求項１４０〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記記録ポリマーの情報の前記コーディングポリマーへの移行が、プライマー伸長によって媒介される、請求項１４０〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記記録ポリマーの情報の前記コーディングポリマーへの移行が、ライゲーションによって媒介される、請求項１４０〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記複数の巨大分子、前記付随する記録ポリマー、またはその両方が、前記固体支持体に共有結合により接合されている、請求項１４０〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、請求項１４０〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記結合性物質が、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項１４０〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記結合性物質が、修飾アミノペプチダーゼ、修飾アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、修飾アンチカリン、または抗体もしくはその結合断片である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記結合性物質が、単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチドまたは前記ペプチドの翻訳後修飾に結合する、請求項１４２〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記結合性物質が、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に結合する、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記結合性物質が、Ｎ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、または内部ペプチドに結合する、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６８】
前記結合性物質が、修飾されたＮ末端アミノ酸残基、修飾されたＣ末端アミノ酸残基または修飾された内部アミノ酸残基の化学標識に結合する、請求項１４２〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記結合性物質が、前記Ｎ末端アミノ酸残基、または前記修飾されたＮ末端アミノ酸残基の前記化学標識に結合し、前記Ｎ末端アミノ酸残基が、各結合サイクル後に切断される、請求項１６６または１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記結合性物質が、前記Ｃ末端アミノ酸残基、または前記修飾されたＣ末端アミノ酸残基の前記化学標識に結合し、前記Ｃ末端アミノ酸残基が、各結合サイクル後に切断される、請求項１６６または１６８に記載の方法。
【請求項１７１】
前記Ｎ末端アミノ酸残基が、エドマン分解、エドマナーゼ、修飾アミノペプチダーゼまたは修飾アシルペプチドヒドロラーゼによって切断される、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７２】
前記結合性物質が、アミノ酸または翻訳後修飾の部位特異的な共有結合性標識である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７３】
前記複数のｎ次伸長記録ポリマーが、解析前に増幅される、請求項１４０〜１７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記ｎ次伸長記録ポリマーの解析が、核酸配列決定法を含む、請求項１４０〜１７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
複数の巨大分子を表す複数のｎ次伸長記録ポリマーが、並行して解析される、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記核酸配列決定法が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、請求項１７４または１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
前記核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、請求項１７４または１７５に記載の方法。
【請求項１７８】
（ａ）分析物と直接または間接的に会合するように構成されている記録ポリマーと、
（ｂ）（ｉ）分析物に結合することが可能な結合性部分に関する識別情報を含み、前記結合性部分と直接もしくは間接的に会合して結合性物質を形成するように構成されている、コーディングポリマー、および／または（ｉｉ）標識
を含むキットであって、
前記記録ポリマーおよび前記コーディングポリマーが、前記結合性物質と前記分析物との結合時に前記記録ポリマーと前記コーディングポリマーの間での情報の移行を可能にするように構成されているキットであり、
必要に応じて、（ｃ）前記結合性部分
を含む、キット。
【請求項１７９】
少なくとも（ａ）（ｉ）解析されるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）または官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性部分および（ｉｉ）前記第１の結合性部分に関する識別情報を含む第１のコーディングポリマーを含む、第１の結合性物質と、
必要に応じて（ｂ）前記ポリペプチドと直接または間接的に会合するように構成されている記録ポリマーと、
さらに必要に応じて（ｃ）第１の官能化ＮＴＡＡを生成するために前記ポリペプチドの第１のＮＴＡＡを修飾することができる官能化試薬と
を含むキットであって、
前記記録ポリマーおよび前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質と前記ポリペプチドとの結合時に前記第１のコーディングポリマーと前記記録ポリマーの間の情報の移行を可能にするように構成されている、キット。
【請求項１８０】
少なくとも（ａ）（ｉ）解析されるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）もしくは官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な結合性部分と（ｉｉ）前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングポリマーとを各々が含む、１つもしくは複数の結合性物質、および／または
（ｂ）前記ポリペプチドと直接もしくは間接的に会合するように構成されている１つもしくは複数の記録ポリマー
を含むキットであって、
前記１つまたは複数の記録ポリマーおよび前記１つまたは複数の結合性物質が、各結合性物質と前記ポリペプチドとの結合時に前記コーディングポリマーと前記記録ポリマーの間の情報の移行を可能にするように構成され、
必要に応じて（ｃ）第１の官能化ＮＴＡＡを生成するために前記ポリペプチドの第１のＮＴＡＡを修飾することができる官能化試薬を含む、キット。
【請求項１８１】
（ａ）各タンパク質に記録ポリマーが直接または間接的に付随しているタンパク質のセットを薬剤のライブラリーと接触させるステップであって、各薬剤が（ｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマーなどの核酸アプタマー、もしくはペプチドアプタマー）、および（ｉｉ）前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖またはアプタマーに関する識別情報を含むコーディングポリマーを含み、
各タンパク質および／もしくはそれに付随する記録ポリマー、または各薬剤が、支持体に直接または間接的に固定化されている、ステップと；
（ｂ）（ｉ）１つまたは複数の薬剤の前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーと結合および／または反応する各タンパク質に付随する前記記録ポリマーと（ｉｉ）前記１つまたは複数の薬剤のコーディングポリマーとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録ポリマーおよび／または伸長コーディングポリマーを生成するステップと；
（ｃ）前記伸長記録ポリマーおよび／または前記伸長コーディングポリマーを解析するステップと
を含む方法。
【請求項１８２】
ポリペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）（ｉ）各断片に記録ポリマーが直接または間接的に付随しているポリペプチドの断片のセットを、（ｉｉ）各結合性物質が結合性部分および前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングポリマーを含む結合性物質のライブラリーと接触させるステップであって、
前記結合性部分が、前記断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することができ、または官能化試薬により修飾された前記１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することができ、
各断片および／もしくはそれに付随する記録ポリマー、または各結合性物質が、支持体に直接または間接的に固定化されている、ステップと；
（ｂ）（ｉ）各断片に付随する前記記録ポリマーと（ｉｉ）前記コーディングポリマーとの間の情報の移行を、前記結合性部分と前記断片の１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸との結合時に可能にして、伸長記録ポリマーおよび／または伸長コーディングポリマーを生成するステップと；
（ｃ）前記伸長記録ポリマーおよび／または前記伸長コーディングポリマーを解析するステップと
を含む方法。
【請求項１８３】
複数のポリペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）複数のポリペプチドの各分子を複数のユニバーサルタグで標識するステップと；
（ｂ）前記複数のポリペプチドと複数のコンパートメントタグ（例えば、非核酸の配列決定可能なポリマーの形態のもの）とを、前記複数のユニバーサルタグと前記複数のコンパートメントタグとのアニーリングまたは接合に好適な条件下で接触させることによって、前記複数のポリペプチドを複数のコンパートメント（例えば、ビーズ表面、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、または表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せ）に分配するステップであって、前記複数のコンパートメントタグが、各コンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；
（ｃ）各コンパートメント内の前記ポリペプチドを断片化することによって、少なくとも１つのユニバーサルポリヌクレオチドタグと少なくとも１つのコンパートメントタグとを含む記録ポリマーが各々に付随しているポリペプチド断片のセットを生成するステップと；
（ｄ）前記ポリペプチド断片のセットを支持体に直接または間接的に固定化するステップと；
（ｅ）固定化されたポリペプチド断片のセットを、各結合性物質が結合性部分および前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングポリマーを含む結合性物質のライブラリーと接触させるステップであって、
前記結合性部分が、前記断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬により修飾された前記１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、ステップと；
（ｆ）（ｉ）各断片に付随する前記記録ポリマーと（ｉｉ）前記コーディングポリマーとの間の情報の移行を、前記結合性部分と前記断片の１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸との結合時に可能にして、伸長記録ポリマーおよび／または伸長コーディングポリマーを生成するステップと；
（ｇ）前記伸長記録ポリマーおよび／または前記伸長コーディングポリマーを解析するステップと
を含む方法。
【請求項１８４】
複数のポリペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）各基板がコンパートメントタグを各々が含む複数の記録ポリマーを含み、必要に応じて各コンパートメントが、ビーズ、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、もしくは表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せである、複数の基板に複数のポリペプチドを固定化するステップと；
（ｂ）各基板上に固定化された前記ポリペプチドを（例えば、プロテアーゼ消化により）断片化することによって、前記基板に固定化されたポリペプチド断片のセットを生成するステップと；
（ｃ）前記固定化されたポリペプチド断片のセットを、各結合性物質が結合性部分および前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングポリマーを含む結合性物質のライブラリーと接触させるステップであって、
前記結合性部分が、前記断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬により修飾された前記１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、ステップと；
（ｄ）（ｉ）前記記録ポリマーと（ｉｉ）前記コーディングポリマーとの間の情報の移行を、前記結合性部分と各断片の前記１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸との結合時に可能にして、伸長記録ポリマーおよび／または伸長コーディングポリマーを生成するステップと；
（ｅ）前記伸長記録ポリマーおよび／または前記伸長コーディングポリマーを解析するステップと
を含む方法。
【請求項１８５】
（ａ）各薬剤が（ｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖および／またはアプタマーと（ｉｉ）前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖またはアプタマーに関する識別情報を含むコーディングポリマーとを含む、薬剤のライブラリーと；
必要に応じて（ｂ）各タンパク質に記録ポリマーが直接または間接的に付随しているタンパク質のセットと
を含むキットであって、
各タンパク質および／もしくはそれに付随する記録ポリマー、または各薬剤が、支持体に直接または間接的に固定化されており、
前記タンパク質のセット、前記記録ポリマーおよび前記薬剤のライブラリーが、（ｉ）１つまたは複数の薬剤の前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーと結合および／または反応する各タンパク質に付随する前記記録ポリマーと（ｉｉ）前記１つまたは複数の薬剤のコーディングポリマーとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録ポリマーおよび／または伸長コーディングポリマーを生成するように構成されている、キット。
【請求項１８６】
ポリペプチドを解析するためのキットであって、
（ａ）各結合性物質が、結合性部分、および前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングポリマーを含み、前記結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬により修飾された前記１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、結合物質のライブラリーと；
必要に応じて、（ｂ）各断片が記録ポリマーに直接もしくは間接的に付随しているポリペプチドの断片のセット、または（ｂ’）ポリペプチドを断片化するための手段、例えばプロテアーゼと
を含み、
各断片および／もしくはそれに付随する記録ポリマー、または各結合性物質が、支持体に直接または間接的に固定化されており、
前記ポリペプチドの断片のセット、前記記録ポリマー、および前記結合性物質のライブラリーが、（ｉ）各断片に付随する前記記録ポリマーと（ｉｉ）前記コーディングポリマーとの間の情報の移行を、前記結合性部分と前記断片の１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸との結合時に可能にして、伸長記録ポリマーおよび／または伸長コーディングポリマーを生成するように構成されている、キット。
【請求項１８７】
複数のポリペプチドを解析するキットであって、（ａ）各結合性物質が、結合性部分、および前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングポリマーを含み、前記結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬により修飾された前記１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと；（ｂ）複数のポリペプチドが必要に応じて固定化されている複数の基板であって、各基板が、コンパートメントタグ（例えば、非核酸の配列決定可能なポリマーの形態のもの）を各々が含む複数の記録ポリマーを含み、必要に応じて、各コンパートメントが、ビーズ、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、もしくは表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せであり、各基板上に固定化された前記ポリペプチドが、断片化されて（例えば、プロテアーゼ切断によって）前記基板に固定化されたポリペプチド断片のセットを生成するように構成されている、複数の基板とを含む、キットであり；前記複数のポリペプチド、前記記録ポリマー、および前記結合性物質のライブラリーが、（ｉ）前記記録ポリマーと（ｉｉ）前記コーディングポリマーとの間の情報の移行を、前記結合性部分と前記各断片の１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸との結合時に可能にして、伸長記録ポリマーおよび／または伸長コーディングポリマーを生成するように構成されている、キット。
【請求項１８８】
（ａ）分析物を、前記分析物に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディング部分を含み、前記分析物には支持体に接合した記録部分が付随しており、前記分析物および／または前記記録部分が支持体に固定化されている、ステップと；
（ｂ）前記第１のコーディング部分の情報を前記記録部分に移行させて、一次伸長記録部分を生成するステップと；
（ｃ）前記分析物を、前記分析物に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディング部分を含む、ステップと；
（ｄ）前記第２のコーディング部分の情報を前記一次伸長記録部分に移行させて、二次伸長記録部分を生成するステップと；
（ｅ）前記二次伸長記録部分を解析するステップと
を含む方法。
【請求項１８９】
（ａ）ポリペプチドを、前記ポリペプチドの１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディング部分を含み、前記ポリペプチドには支持体に接合した記録部分が付随しており、前記ポリペプチドおよび／または前記記録部分が支持体に固定化されている、ステップと；
（ｂ）前記第１のコーディング部分の情報を前記記録部分に移行させて、一次伸長記録部分を生成するステップと；
（ｃ）前記分析物を、前記ポリペプチドの異なる１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディング部分を含む、ステップと；
（ｄ）前記第２のコーディング部分の情報を前記一次伸長記録部分に移行させて、二次伸長記録部分を生成するステップと；
（ｅ）前記二次伸長記録部分を解析するステップと
を含む方法。
【請求項１９０】
（ａ）ポリペプチドを、前記ポリペプチドの１つまたは複数のＮ末端またはＣ末端アミノ酸に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディング部分を含み、前記ポリペプチドには支持体に接合した記録部分が付随しており、前記ポリペプチドおよび／または前記記録部分が支持体に固定化されている、ステップと；
（ｂ）前記第１のコーディング部分の情報を前記記録部分に移行させて、一次伸長記録部分を生成するステップと；
（ｃ）前記ポリペプチドの１つまたは複数のＮ末端またはＣ末端アミノ酸を消去して、前記ポリペプチドの異なる１つまたは複数のＮ末端またはＣ末端アミノ酸を露出させるステップと；
（ｄ）分析物を、前記ポリペプチドの異なる１つまたは複数のＮ末端またはＣ末端アミノ酸に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディング部分を含む、ステップと；
（ｅ）前記第２のコーディング部分の情報を前記一次伸長記録部分に移行させて、二次伸長記録部分を生成するステップと；
（ｆ）前記二次伸長記録部分を解析するステップと
を含む方法。
【請求項１９１】
請求項１９０に記載の方法で開示および／または使用される任意の分子、分子複合体もしくはコンジュゲート、試薬（例えば、化学的もしくは生物学的）、薬剤、構造（例えば、支持体、表面、粒子もしくはビーズ）、反応中間体、反応生成物、結合性複合体または任意の他の製造物品を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、発明の名称が「KITS FOR ANALYSIS USING NUCLEICACID ENCODING AND/OR LABEL」である２０１７年１０月３１日に出願した米国特許仮出願第６２／５７９，８４４号、発明の名称が「KITS FORANALYSIS USING NUCLEIC ACID ENCODING AND/OR LABEL」である２０１７年１１月６日に出願した米国特許仮出願第６２／５８２，３１２号、および発明の名称が「KITSFOR ANALYSIS USING NUCLEIC ACID ENCODING AND/OR LABEL」である２０１７年１１月８日に出願した米国特許仮出願第６２／５８３，４４８号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらの出願の各々の全内容は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。本願は、発明の名称が「MacromoleculeAnalysis Employing Nucleic Acid Encoding」である２０１６年５月２日に出願した米国特許仮出願第６２／３３０，８４１号；発明の名称が「MacromoleculeAnalysis Employing Nucleic Acid Encoding」である２０１６年５月１９日に出願した米国特許仮出願第６２／３３９，０７１号、発明の名称が「MacromoleculeAnalysis Employing Nucleic Acid Encoding」である２０１６年８月１８日に出願した米国特許仮出願第６２／３７６，８８６号；発明の名称が「MacromoleculeAnalysis Employing Nucleic Acid Encoding」である２０１７年５月２日に出願した国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０７０２号；発明の名称が「Kitsfor Analysis Using Nucleic Acid Encoding and/or Label」である２０１７年１０月３１日に出願した代理人整理番号７７６５３３０００５００を有する米国特許仮出願第６２／５７９，８４４号；発明の名称が「Methodsand Compositions for Polypeptide Analysis」である２０１７年１０月３１日に出願した代理人整理番号７７６５３３０００６００を有する米国特許仮出願第６２／５７９，８７０号；発明の名称が「Methodsand Kits Using Nucleic Acid Encoding and/or Label」である２０１７年１０月３１日に出願した代理人整理番号７７６５３３０００７００を有する米国特許仮出願第６２／５７９，８４０号；発明の名称が「Kitsfor Analysis Using Nucleic Acid Encoding and/or Label」である２０１７年１１月６日に出願した代理人整理番号７７６５３３０００５０１を有する米国特許仮出願第６２／５８２，３１２号；および発明の名称が「Methodsand Kits Using Nucleic Acid Encoding and/or Label」である２０１７年１１月７日に出願した代理人整理番号７７６５３３０００７０１を有する米国特許仮出願第６２／５８２，９１６号に関連するものであり、これらの出願の開示は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：４６１４−２０００５４０＿２０１８１０３１＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０１８年１０月３１日、サイズ：５２キロバイト）。
【０００３】
技術分野
本開示は、一般に、認識事象などの分子相互作用および／または反応の核酸エンコーディングおよび／または核酸記録を利用する試料解析キットに関する。一部の実施形態では、キットは、ハイスループット、多重化および／または自動化解析に使用することができ、プロテオームまたはそのサブセットの解析に好適である。
【背景技術】
【０００４】
タンパク質は、多くの異なる生物学的機能を実行および促進し、細胞生物学および生理学において不可欠な役割を果たす。異なるタンパク質分子のレパートリーは広範囲にわたり、翻訳後修飾（ＰＴＭ）によって導入される追加的な多様性に起因して、トランスクリプトームよりもはるかに複雑である。さらに、細胞内のタンパク質は、環境、生理的状況、および病態に応答して動的に変化する（発現レベルおよび修飾の状態）。したがって、タンパク質は、特にゲノム情報と比べて、莫大な量のほとんど明らかになっていない関連情報を含有する。一般に、プロテオミクス解析ではゲノミクス解析と比べて革新が遅れている。ゲノミクスの分野では、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により、数十億のＤＮＡ配列を単一の計器における実行で解析することが可能になることによって当該分野が変容しているが、一方で、タンパク質解析およびペプチド配列決定では、スループットが今でも限られている。
【０００５】
それにもかかわらず、このタンパク質情報は、健康および疾患におけるプロテオームダイナミクスをよりよく理解するために、ならびに高精度の医療を可能にするのを補助するために差し迫って必要とされている。しかるが故に、このプロテオミクス情報の収集を小型化および高度に並行化するための「次世代」ツールの開発に大きな関心が寄せられている。本開示は、これらおよび他の要求に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本概要は、請求項記載の主題の範囲を限定するために使用することを意図したものではない。請求項記載の主題の他の特徴、詳細、有用性および利点は、付属の図面および添付の特許請求の範囲において開示される態様を含む詳細な説明から明らかになる。
【０００７】
本明細書のこの概要における実施形態のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０００８】
一態様では、（ａ）分析物と直接または間接的に会合するように構成されている記録タグ、（ｂ）（ｉ）分析物に結合することが可能な結合性部分に関する識別情報を含み、前記結合性部分と直接もしくは間接的に会合そて結合性物質を形成するように構成されている、コーディングタグ、および／または（ｉｉ）標識を含む、キットであって、前記記録タグおよび前記コーディングタグが、前記結合性物質と前記分析物との結合時に前記記録タグと前記コーディングタグの間での情報の移行を可能にするように構成されているキットであり、必要に応じて（ｃ）前記結合性部分を含むキットが、本明細書で開示される。一実施形態では、記録タグおよび／または分析物は、支持体に直接または間接的に固定化されるように構成されている。さらなる実施形態では、記録タグは、支持体に固定化されるように構成されており、それにより、記録タグに付随する分析物が固定化される。別の実施形態では、分析物は、支持体に固定化されるように構成されており、それにより、分析物に付随する記録タグが固定化される。さらに別の実施形態では、記録タグおよび分析物の各々が、支持体に固定化されるように構成されている。さらに別の実施形態では、記録タグおよび分析物は、両方が支持体に固定化されたときに共局在するように構成されている。一部の実施形態では、（ｉ）分析物と（ｉｉ）記録タグ間の、前記記録タグと前記分析物に結合されている結合性物質のコーディングタグとの間の情報移行のための、距離は、約１０−６ｎｍ未満、約１０−６ｎｍ、約１０−５ｎｍ、約１０−４ｎｍ、約０．００１ｎｍ、約０．０１ｎｍ、約０．１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約５ｎｍであるか、または約５ｎｍより長いか、または前記範囲の間の任意の値の距離である。
【０００９】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ｉ）支持体に直接もしくは間接的に固定化されるようにおよび（ｉｉ）前記記録タグおよび／または分析物と直接または間接的に会合するように構成されている、固定化リンカーをさらに含むことができる。一実施形態では、固定化リンカーは、記録タグおよび分析物と会合するように構成されている。
【００１０】
前述の実施形態のいずれかでは、固定化リンカーを支持体に直接固定化されるように構成することができ、それにより、前記固定化リンカーに付随する前記記録タグおよび／または前記分析物が固定化される。
【００１１】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、支持体をさらに含むことができる。
【００１２】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、結合性物質と分析物との結合時にコーディングタグと記録タグの間で情報を移行させるための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。一実施形態では、１つまたは複数の試薬は、コーディングタグから記録タグに情報を移行させるように構成されており、それにより、伸長記録タグが生成される。別の実施形態では、１つまたは複数の試薬は、記録タグからコーディングタグに情報を移行させるように構成されており、それにより、伸長コーディングタグが生成される。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の試薬は、コーディングタグからの情報および記録タグからの情報を含むジタグ構築物を生成するように構成されている。
【００１３】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、少なくとも２つの記録タグを含むことができる。前述の実施形態のいずれかでは、キットは、前記コーディングタグのうちの少なくとも２つを含むことができ、各々がそれに付随する結合性部分に関する識別情報を含む。特定の実施形態では、各分析物は、その分析物に結合されている結合性物質が利用可能な複数（例えば、少なくとも約２、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約２０００、約５０００、またはそれより多く）の記録タグを有する。特定の実施形態では、キットは、複数の記録タグ、例えば、少なくとも約２、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約２０００、約５０００、またはそれより多くの記録タグを含む。
【００１４】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、前記結合性物質のうちの少なくとも２つを含むことができる。一実施形態では、キットは、（ｉ）第１の結合性物質と分析物との結合時に、前記第１の結合性物質の第１のコーディングタグから記録タグに情報を移行させて一次伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬、および／または（ｉｉ）第２の結合性物質と前記分析物との結合時に、前記第２の結合性物質の第２のコーディングタグから前記一次伸長記録タグに情報を移行させて二次伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬を含み、（ｉ）の１つまたは複数の試薬と（ｉｉ）の１つまたは複数の試薬が同じであってもよく、または異なっていてもよい。特定の実施形態では、各分析物は、分析物についての記録タグが利用可能な複数の結合性物質および／またはコーディングタグ、例えば、少なくとも約２、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約２０００、約５０００、またはそれより多くの結合性物質および／またはコーディングタグを有し、前記複数の結合性物質は、逐次的に付加されることもあり、または並行して付加されることもある。特定の実施形態では、キットは、複数の結合性物質および／またはコーディングタグ、例えば、少なくとも約２、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約２０００、約５０００、またはそれより多くの結合性物質および／またはコーディングタグを含む。
【００１５】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ｉｉｉ）第３の（またはより高次の）結合性物質と分析物との結合時に、第３の（またはより高次の）結合性物質の第３の（またはより高次の）コーディングタグから二次伸長記録タグに情報を移行させて三次（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。一実施形態では、キットは、（ｉ）第１の結合性物質と分析物との結合時に、前記第１の結合性物質の第１のコーディングタグから第１の記録タグに情報を移行させて第１の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬、（ｉｉ）第２の結合性物質と分析物との結合時に、前記第２の結合性物質の第２のコーディングタグから第２の記録タグに情報を移行させて第２の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬、および／または（ｉｉｉ）第３の（またはより高次の）結合性物質と分析物との結合時に、前記第３の（またはより高次の）結合性物質の第３の（またはより高次の）コーディングタグから第３の（またはより高次の）記録タグに情報を移行させて第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬を含み、（ｉ）、（ｉｉ）、および／または（ｉｉｉ）の１つまたは複数の試薬は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。
【００１６】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ｉｉｉ）第３の（またはより高次の）結合性物質と分析物との結合時に、第３の（またはより高次の）結合性物質の第３の（またはより高次の）コーディングタグから第３の（またはより高次の）記録タグに情報を移行させて第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。
【００１７】
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（もしくはより高次の）記録タグを、前記分析物と直接または間接的に会合するように構成することができる。
【００１８】
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（もしくはより高次の）記録タグを支持体上に固定化するように構成することができる。
【００１９】
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（もしくはより高次の）記録タグを、分析物と共局在するように、例えば、第１、第２または第３の（またはより高次の）結合性物質と分析物との結合時に、第１、第２または第３の（またはより高次の）コーディングタグと第１、第２または第３の（またはより高次の）記録タグとの間の情報の移行をそれぞれ可能にするように、構成することができる。
【００２０】
前述の実施形態のいずれかでは、第１のコーディングタグ、第２のコーディングタグ、および／または第３の（もしくはより高次の）コーディングタグの各々は、結合サイクル特異的バーコード、例えば、結合サイクル特異的スペーサー配列Ｃｎ、および／もしくはコーディングタグ特異的スペーサー配列Ｃｎ（ここで、ｎは整数であり、Ｃｎは、第ｎの結合性物質とポリペプチドとの結合を示す）を含むことができる。あるいは、結合サイクルタグＣｎは、外因的に付加されることがあり、例えば、前記結合サイクルタグＣｎは、前記コーディングタグにとって外来のものであり得る。
【００２１】
前述の実施形態のいずれかでは、分析物は、ポリペプチドを含むことができる。一実施形態では、キットの結合性部分は、ポリペプチドの１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することができ、または官能化試薬により修飾された前記１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である。
【００２２】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、前記官能化試薬のうちの１つまたは複数をさらに含むことができる。
【００２３】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、ポリペプチドの１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸を（例えば、化学的切断もしくは酵素的切断により）除去するための、または官能化されたＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸を除去するための、消去試薬をさらに含むことができ、必要に応じて、前記消去試薬は、カルボキシペプチダーゼもしくはアミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ヒドロラーゼまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；穏やかなエドマン分解試薬；エドマナーゼ酵素；無水ＴＦＡ、塩基；あるいはこれらの任意の組合せを含む。
【００２４】
前述の実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸は、（ｉ）Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）、（ｉｉ）Ｎ末端ジペプチド配列、（ｉｉｉ）Ｎ末端トリペプチド配列；（ｉｖ）内部アミノ酸配列；（ｖ）内部ジペプチド配列；（ｖｉ）内部トリペプチド配列；（ｖｉｉ）Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）；（ｖｉｉｉ）Ｃ末端ジペプチド配列；もしくは（ｉｘ）Ｃ末端トリペプチド配列、またはこれらの任意の組合せを含むことができ、必要に応じて、（ｉ）〜（ｉｘ）のアミノ酸残基の任意の１つまたは複数が修飾または官能化されている。
【００２５】
別の態様では、少なくとも（ａ）（ｉ）解析されるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）または官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性部分、および（ｉｉ）前記第１の結合性部分に関する識別情報を含む第１のコーディングタグを含む、第１の結合性物質と、必要に応じて（ｂ）前記ポリペプチドと直接または間接的に会合するように構成されている記録タグと、さらに必要に応じて（ｃ）第１の官能化ＮＴＡＡを生成するために前記ポリペプチドの第１のＮＴＡＡを修飾することができる官能化試薬とを含むキットであって、前記記録タグおよび前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質と前記ポリペプチドとの結合時に前記第１のコーディングタグと前記記録タグの間の情報の移行を可能にするように構成されている、キットが、本明細書で開示される。一実施形態では、キットは、第１のコーディングタグから記録タグに情報を移行させることによって一次伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含む。
【００２６】
前述の実施形態のいずれかでは、官能化試薬は、化学薬剤、酵素、および／または生物学的薬剤、例えば、イソチオシアネート誘導体、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（dinitrobenzenesulfonic）（ＤＮＢＳ）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、ダンシルクロリド、７−メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、またはチオベンジル化試薬を含むことができる。
【００２７】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、第１の官能化ＮＴＡＡを（例えば、化学的切断または酵素的切断により）除去して、直接隣接しているアミノ酸残基を第２のＮＴＡＡとして露出させるための消去試薬をさらに含むことができる。一実施形態では、第２のＮＴＡＡは、第１の官能化ＮＴＡＡと同じであってもよくまたは異なっていてもよい第２の官能化ＮＴＡＡを生成するように、同じまたは異なる官能化試薬により官能化され得る。別の実施形態では、キットは、（ｄ）（ｉ）第２の官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な第２の（またはより高次の）結合性部分と、（ｉｉ）第２の（またはより高次の）結合性部分に関する識別情報を含む第２の（またはより高次の）コーディングタグとを含む、第２の（またはより高次の）結合性物質をさらに含み、前記第１のコーディングタグと前記第２の（またはより高次の）コーディングタグは、同じであってもよく、または異なっていてもよい。さらに別の実施形態では、第１の官能化ＮＴＡＡおよび第２の官能化ＮＴＡＡは、官能化Ｎ末端アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）からなる群から、これらの任意の組合せで、互いに独立して選択される。
【００２８】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、第２の（またはより高次の）コーディングタグから一次伸長記録タグに情報を移行させることによって二次（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。
【００２９】
さらなる態様では、少なくとも（ａ）各々が（ｉ）解析されるポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）もしくは官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な結合性部分と、（ｉｉ）前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグとを含む、１つもしくは複数の結合性物質、および／または（ｂ）前記ポリペプチドと直接もしくは間接的に会合するように構成されている１つもしくは複数の記録タグを含む、キットであって、前記１つまたは複数の記録タグおよび前記１つまたは複数の結合性物質が、各結合性物質と前記ポリペプチドとの結合時に前記コーディングタグと前記記録タグの間の情報の移行を可能にするように構成されているキットであり、必要に応じて（ｃ）第１の官能化ＮＴＡＡを生成するために前記ポリペプチドの第１のＮＴＡＡを修飾することができる官能化試薬を含む、キットが、本明細書で開示される。一実施形態では、キットは、第１の官能化ＮＴＡＡを（例えば、化学的切断または酵素的切断により）除去して、直接隣接しているアミノ酸残基を第２のＮＴＡＡとして露出させるための消去試薬をさらに含む。別の実施形態では、第２のＮＴＡＡは、第１の官能化ＮＴＡＡと同じであってもよくまたは異なっていてもよい第２の官能化ＮＴＡＡを生成するように、同じまたは異なる官能化試薬により官能化され得る。さらに別の実施形態では、第１の官能化ＮＴＡＡおよび第２の官能化ＮＴＡＡは、官能化Ｎ末端アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）からなる群から、これらの任意の組合せで、互いに独立して選択される。
【００３０】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ｉ）第１の結合性物質と前記ポリペプチドとの結合時に、前記第１の結合性物質の第１のコーディングタグから第１の記録タグに情報を移行させて第１の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬、および／または（ｉｉ）第２の結合性物質と前記ポリペプチドとの結合時に、前記第２の結合性物質の第２のコーディングタグから第２の記録タグに情報を移行させて第２の伸長記録タグを生成するための１つもしくは複数の試薬を含むことができ、（ｉ）の１つまたは複数の試薬と（ｉｉ）の１つまたは複数の試薬は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。一態様では、キットは、（ｉｉｉ）第３の（またはより高次の）結合性物質と前記ポリペプチドとの結合時に、前記第３の（またはより高次の）結合性物質の第３の（またはより高次の）コーディングタグから第３の（またはより高次の）記録タグに情報を移行させて第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するための１つまたは複数の試薬をさらに含む。
【００３１】
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（もしくはより高次の）記録タグを、ポリペプチドと直接または間接的に会合するように構成することができる。
【００３２】
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（もしくはより高次の）記録タグを支持体上に固定化するように構成することができる。
【００３３】
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（もしくはより高次の）記録タグを、ポリペプチドと共局在するように、例えば、第１、第２または第３の（またはより高次の）結合性物質とポリペプチドとの結合時に、第１、第２または第３の（またはより高次の）コーディングタグと第１、第２または第３の（またはより高次の）記録タグとの間の情報の移行をそれぞれ可能にするように、構成することができる。
【００３４】
前述の実施形態のいずれかでは、第１の記録タグ、第２の記録タグ、および／または第３の（またはより高次の）記録タグのうちの２つのタグ間または３つ以上のタグ間の支持体上での距離は、約１０ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、約１５ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、約２０ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、約５０ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、約１００ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、約１５０ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、約２００ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、約２５０ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、約３００ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、約３５０ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、約４００ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、約４５０ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよく、または約５００ｎｍに等しくてももしくはそれより長くてもよいが、各記録タグおよびその対応する分析物は、両方が支持体に固定化されたときに共局在するように構成されるか、または各記録タグとその対応する分析物の間の距離は、約１０−６ｎｍ未満、約１０−６ｎｍ、約１０−５ｎｍ、約１０−４ｎｍ、約０．００１ｎｍ、約０．０１ｎｍ、約０．１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約５ｎｍであるか、もしくは約５ｎｍより長いか、もしくは前記範囲の間の任意の値の距離である。
【００３５】
前述の実施形態のいずれかでは、第１のコーディングタグ、第２のコーディングタグ、および／または第３の（もしくはより高次の）コーディングタグの各々は、結合サイクル特異的バーコード、例えば、結合サイクル特異的スペーサー配列Ｃｎ、および／もしくはコーディングタグ特異的スペーサー配列Ｃｎ（ここで、ｎは整数であり、Ｃｎは、第ｎの結合性物質とポリペプチドとの結合を示す）を含むことができる。あるいは、結合サイクルタグＣｎは、外因的に付加されることがあり、例えば、前記結合サイクルタグＣｎは、前記コーディングタグにとって外来のものであり得る。
【００３６】
前述の実施形態のいずれかでは、分析物またはポリペプチドは、タンパク質もしくはポリペプチド鎖またはその断片、脂質、炭水化物、あるいは大環状分子、あるいはこれらの組合せもしくは複合体を含むことができる。
【００３７】
前述の実施形態のいずれかでは、分析物またはポリペプチドは、巨大分子またはその複合体、例えばタンパク質複合体、またはそのサブユニットを含むことができる。
【００３８】
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、もう１つの保護された塩基を有するＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、あるいはこれらの組合せを含むことができる。
【００３９】
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位を含むことができる。
【００４０】
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグは、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含むことができ、例えば、ユニバーサルプライミング部位は、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む。
【００４１】
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグおよび／またはコーディングタグは、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含むことができる。
【００４２】
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグおよび／またはコーディングタグは、バーコードおよび／またはヌクレアーゼ部位、例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼ部位（例えば、ｄｓＤＮＡニッキングエンドヌクレアーゼ部位）を含むことができる。
【００４３】
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグおよび／またはコーディングタグは、その３’末端および／またはその５’末端にスペーサーを含み、例えば、記録タグは、その３’末端にスペーサーを含む。
【００４４】
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグおよび／またはコーディングタグは、１つまたは複数のヌクレアーゼ部位、例えば、エンドヌクレアーゼ部位、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位、制限酵素消化部位、ニッキングエンドヌクレアーゼ部位、またはこれらの組合せを含むことができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ部位を、コーディングタグに、例えば、スペーサー配列内に、またはスペーサー配列とエンコーダー配列の間に設けることができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ部位を、記録タグに、例えば、ユニバーサルプライマー配列と支持体の間に（例えば、支持体から記録タグを切断除去するために）設けることができる。
【００４５】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、固体支持体、例えば、剛性固体支持体、可撓性固体支持体、または軟質固体支持体を含むことができ、多孔質支持体または非多孔質支持体を含む。
【００４６】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子および／もしくは銀ナノ粒子などの、金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せを含む、支持体を含むことができる。一実施形態では、支持体は、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、もしくは制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む。
【００４７】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、支持体を含むことができ、および／または複数の分析物（例えば、ポリペプチド）を逐次反応で、並列反応で、もしくは逐次反応と並列反応の組合せで解析するためのものであり得る。一実施形態では、分析物の間に前記支持体上で平均距離約１０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１５ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、または約５００ｎｍに等しいもしくはそれより長い間隔をあける。
【００４８】
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分は、ポリペプチドまたはその断片、タンパク質もしくはポリペプチド鎖またはその断片、あるいはタンパク質複合体またはそのサブユニット、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含むことができる。
【００４９】
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分は、カルボキシペプチダーゼもしくはアミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アンチカリンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アミノ酸に結合する修飾小分子、すなわちバンコマイシンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾分子；あるいはこれらの任意の組合せを含むことができる；または各結合性物質中の、結合性部分は、小分子を含み、コーディングタグは、前記小分子を識別するポリヌクレオチドを含み、それによって、複数の前記結合性物質が、ＤＮＡにコードされた小分子のライブラリーなどの、コードされた小分子のライブラリーを形成する。
【００５０】
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分は、前記分析物または前記ポリペプチドに選択的におよび／または特異的に結合することが可能である。
【００５１】
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、１つもしくは複数の保護された塩基を有するＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはモルホリノ、あるいはこれらの組合せを含むことができる。
【００５２】
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、エンコーダー配列などのバーコード配列、例えば、前記結合性部分を識別するものを含むことができる。
【００５３】
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、スペーサー、結合サイクル特異的配列、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。一実施形態では、結合サイクル特異的配列は、各結合サイクル後に記録タグに付加される。
【００５４】
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分およびコーディングタグを、リンカーまたは結合対により接合させることができる。
【００５５】
前述の実施形態のいずれかでは、結合性部分と前記コーディングタグを、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（この場合、接合される２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅがＳｐｙＴａｇをＫＴａｇに接合させ、かくして２つの部分が接合される）、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、ＨａｌｏＴａｇ／ＨａｌｏＴａｇリガンド対、もしくはソルターゼ、例えばＬＰＸＴＧ  Ｔａｇ／Ｓｏｒｔａｓｅ（例えば、Ｓｏｒｔａｓｅ  Ａ５、ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、もしくは参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，２６７，１２７（Ｂ２）号において開示されているような）、またはこれらの任意の組合せにより接合させることができる。
【００５６】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、鋳型または非鋳型反応においてコーディングタグと記録タグの間で情報を移行させるための試薬をさらに含むことができ、必要に応じて、前記試薬は、（ｉ）化学的ライゲーション試薬もしくは生物学的ライゲーション試薬、例えば、一本鎖核酸もしくは二本鎖核酸をライゲーションするためのＤＮＡリガーゼもしくはＲＮＡリガーゼなどのリガーゼであるか、または（ｉｉ）一本鎖核酸もしくは二本鎖核酸のプライマー伸長のための試薬であり、必要に応じて、前記キットは、少なくとも２つのリガーゼもしくはそれらのバリアント（例えば、少なくとも２つのＤＮＡリガーゼ、もしくは少なくとも２つのＲＮＡリガーゼ、もしくは少なくとも１つのＤＮＡリガーゼおよび少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ）を含むライゲーション試薬であって、前記少なくとも２つのリガーゼもしくはそれらのバリアントが、アデニル化リガーゼおよび構成的にアデニル化されていないリガーゼを含む、ライゲーション試薬をさらに含み、または必要に応じて、前記キットは、ＤＮＡもしくはＲＮＡリガーゼおよびＤＮＡ／ＲＮＡデアデニレースを含むライゲーション試薬をさらに含む。
【００５７】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、コーディングタグと記録タグの間で情報を移行させるためのポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素をさらに含むことができる。
【００５８】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、核酸配列解析のための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。一実施形態では、前記核酸配列解析は、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、もしくは先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージング、またはこれらの任意の組合せを含む。
【００５９】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、核酸増幅のための、例えば、１つまたは複数の伸長記録タグを増幅するための、１つまたは複数の試薬をさらに含むことができ、必要に応じて、前記核酸増幅は、指数関数的増幅反応（例えば、鋳型乗り換えを低減もしくは消去するためのエマルジョンＰＣＲなどの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））および／または線形増幅反応（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写による等温増幅、もしくはキメラプライマーにより開始される核酸の等温増幅（Isothermal Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）（ＩＣＡＮ））を含む。例えば、Uemoriet al., (2007), "Investigation of the molecular mechanism of ICAN, a novelgene amplification method," J Biochem 142(2): 283-292；Mukai et al.,(2007), "Highly efficient isothermal DNA amplification system using threeelements of 5'-DNA-RNA-3' chimeric primers, RNaseH and strand-displacing DNApolymerase," J Biochem 142(2): 273-281；Ma et al., (2013), "Isothermalamplification method for next-generation sequencing," Proc Natl Acad Sci US A. 110(35): 14320-14323を参照されたく、これらの参考文献のすべては、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、コーディングタグ情報を記録タグに移行させて伸長記録タグを形成するための１つまたは複数の試薬を含むことができ、伸長記録タグ上のコーディングタグ情報の順序および／または頻度は、結合性物質が分析物またはポリペプチドに結合する順序および／または頻度を示す。
【００６１】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、標的濃縮、例えば、１つまたは複数の伸長記録タグの濃縮のための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。
【００６２】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、サブトラクション、例えば、１つまたは複数の伸長記録タグのサブトラクションのための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。
【００６３】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、例えば、１つまたは複数の分析物またはポリペプチドなどの極めて豊富な種を低減させるための、正規化のための、１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。
【００６４】
前述の実施形態のいずれかでは、キットの少なくとも１つの結合性物質は、末端アミノ酸残基、末端ジアミノ酸残基、または末端トリプルアミノ酸残基に結合することが可能である。
【００６５】
前述の実施形態のいずれかでは、キットの少なくとも１つの結合性物質は、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合することが可能である。
【００６６】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、試料中の複数の分析物またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するための１つまたは複数の試薬または手段をさらに含むことができ、各コンパートメントは、支持体（例えば、固体支持体）に必要に応じて接合されている複数のコンパートメントタグを含み、前記複数のコンパートメントタグは、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる。一実施形態では、キットは、複数の分析物またはポリペプチド（例えば、複数のタンパク質複合体、タンパク質および／またはポリペプチド）を複数のポリペプチド断片に断片化するための１つまたは複数の試薬または手段をさらに含む。
【００６７】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、複数のポリペプチド断片を、複数のコンパートメントの各々の中のコンパートメントタグとアニーリングまたは接合させることによって複数のコンパートメントタグ付きポリペプチド断片を生成するための、１つまたは複数の試薬または手段をさらに含むことができる。
【００６８】
前述の実施形態のいずれかでは、複数のコンパートメントは、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、もしくは表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。
【００６９】
前述の実施形態のいずれかでは、複数のコンパートメントの各々は、平均して単一の細胞を含むことができる。
【００７０】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、試料中の複数の分析物またはポリペプチドを標識するための１つまたは複数のユニバーサルＤＮＡタグをさらに含むことができる。
【００７１】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、試料中の複数の分析物またはポリペプチドを１つまたは複数のユニバーサルＤＮＡタグで標識するための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。
【００７２】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、プライマー伸長またはライゲーションのための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。
【００７３】
前述の実施形態のいずれかでは、支持体は、ビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、もしくは制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。
【００７４】
前述の実施形態のいずれかでは、コンパートメントタグは、一本鎖または二本鎖核酸分子を含むことができる。
【００７５】
前述の実施形態のいずれかでは、コンパートメントタグは、バーコードおよび必要に応じてＵＭＩを含むことができる。前述の実施形態のいずれかでは、支持体はビーズであることができ、コンパートメントタグは、バーコードを含むことができる。
【００７６】
前述の実施形態のいずれかでは、支持体は、ビーズを含むことができ、複数のコンパートメントタグが接合したビーズを、スプリット・アンド・プール（ｓｐｌｉｔ−ａｎｄ−ｐｏｏｌ）合成、個々の合成、もしくは固定化、またはこれらの任意の組合せにより形成することができる。
【００７７】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、スプリット・アンド・プール合成、個々の合成、もしくは固定化、またはこれらの任意の組合せのための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。
【００７８】
前述の実施形態のいずれかでは、コンパートメントタグは、記録タグ内の成分であることができ、前記記録タグは、必要に応じて、スペーサー、バーコード配列、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含むことができる。
【００７９】
前述の実施形態のいずれかでは、コンパートメントタグは、複数の分析物またはポリペプチド（例えば、タンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチド）の内部アミノ酸、ペプチド骨格またはＮ末端アミノ酸と反応することができる機能的部分をさらに含むことができる。一実施形態では、機能的部分は、アルデヒド、アジド／アルキン、マレイミド（malemide）／チオール、エポキシ／求核試薬、逆電子要請型ディールス−アルダー（ｉＥＤＤＡ）基、クリック試薬、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。
【００８０】
前述の実施形態のいずれかでは、コンパートメントタグは、タンパク質リガーゼ認識配列などのペプチドをさらに含むことができ、必要に応じて、前記タンパク質リガーゼは、ブテラーゼＩまたはそのホモログであることもある。
【００８１】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、複数の分析物またはポリペプチドを断片化するための化学的または生物学的試薬、例えば、酵素、例えばプロテアーゼ（例えば、メタロプロテアーゼ）をさらに含むことができる。
【００８２】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、コンパートメントタグを支持体から遊離させるための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。
【００８３】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、伸長コーディングタグまたはジタグ構築物を形成するための１つまたは複数の試薬をさらに含むことができる。一実施形態では、記録タグの３’末端は、ポリメラーゼによる記録タグの伸長を防止するためにブロッキングされる。前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、エンコーダー配列、ＵＭＩ、ユニバーサルプライミング部位、その３’末端にスペーサー、結合サイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。
【００８４】
前述の実施形態のいずれかでは、ジタグ構築物を、ギャップ充填、プライマー伸長、またはこれらの組合せにより生成することができる。
【００８５】
前述の実施形態のいずれかでは、ジタグ分子は、記録タグに由来するユニバーサルプライミング部位、記録タグに由来するコンパートメントタグ、記録タグに由来する一意の分子識別子、記録タグに由来する必要に応じたスペーサー、コーディングタグに由来するエンコーダー配列、コーディングタグに由来する一意の分子識別子、コーディングタグに由来する必要に応じたスペーサー、およびコーディングタグに由来するユニバーサルプライミング部位を含むことができる。
【００８６】
前述の実施形態のいずれかでは、結合性物質は、ポリペプチドまたはタンパク質であることができる。
【００８７】
前述の実施形態のいずれかでは、結合性物質は、アミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アンチカリンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；あるいはアミノ酸に結合する修飾小分子、すなわちバンコマイシンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾分子（例えば、Ｄ−アラニル−Ｄアラニンに結合するバンコマイシン）；あるいは抗体またはその結合断片；あるいはこれらの任意の組合せを含むことができる。
【００８８】
前述の実施形態のいずれかでは、結合性物質は、単一のアミノ酸残基（例えば、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、もしくは内部アミノ酸残基）、ジペプチド（例えば、Ｎ末端ジペプチド、Ｃ末端ジペプチド、もしくは内部ジペプチド）、トリペプチド（例えば、Ｎ末端トリペプチド、Ｃ末端トリペプチド、もしくは内部トリペプチド）、または前記分析物もしくはポリペプチドの翻訳後修飾に結合することが可能である。
【００８９】
前述の実施形態のいずれかでは、結合性物質は、Ｎ末端ポリペプチド、Ｃ末端ポリペプチド、または内部ポリペプチドに結合することが可能である。
【００９０】
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグおよび／または記録タグは、１つもしくは複数のエラー訂正コード、１つもしくは複数のエンコーダー配列、１つもしくは複数のバーコード、１つもしくは複数のＵＭＩ、１つもしくは複数のコンパートメントタグ、１つもしくは複数のサイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、エラー訂正コードは、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される。
【００９１】
前述の実施形態のいずれかでは、コーディングタグおよび／または記録タグは、サイクル標識を含むことができる。
【００９２】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、コーディングタグおよび／または記録タグから独立しているサイクル標識をさらに含むことができる。
【００９３】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ａ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｂ）システインのアルキル化またはリシンのブロッキングなどによって、アミノ酸側鎖をブロッキングするための試薬；（ｃ）トリプシン、ＬｙｓＮ、またはＬｙｓＣなどの、プロテアーゼ；（ｄ）核酸標識ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ標識タンパク質）を支持体に固定化するための試薬；（ｅ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｆ）核酸配列決定のための試薬をさらに含むことができる。
【００９４】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ａ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｂ）システインのアルキル化またはリシンのブロッキングなどによって、アミノ酸側鎖をブロッキングするための試薬；（ｃ）トリプシン、ＬｙｓＮ、またはＬｙｓＣなどの、プロテアーゼ；（ｄ）固定化された記録タグを含む支持体にポリペプチド（例えば、タンパク質）を固定化するための試薬；（ｅ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｆ）核酸配列決定のための試薬を含むことができる。
【００９５】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ａ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｂ）変性試薬；（ｃ）システインのアルキル化またはリシンのブロッキングなどによって、アミノ酸側鎖をブロッキングするための試薬；（ｄ）ユニバーサルＤＮＡプライマー配列；（ｅ）ポリペプチドをユニバーサルＤＮＡプライマー配列で標識するための試薬；（ｆ）標識されたポリペプチドをプライマーによってアニーリングするためのバーコード付きビーズ；（ｇ）標識されたポリペプチドにビーズからのバーコードを書き込むためのポリメラーゼ伸長のための試薬；（ｈ）トリプシン、ＬｙｓＮ、またはＬｙｓＣなどの、プロテアーゼ；（ｉ）核酸標識ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ標識タンパク質）を支持体に固定化するための試薬；（ｊ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｋ）核酸配列決定のための試薬を含むことができる。
【００９６】
前述の実施形態のいずれかでは、キットは、（ａ）架橋試薬；（ｂ）細胞溶解物もしくはタンパク質試料を生成するための試薬；（ｃ）システインのアルキル化またはリシンのブロッキングなどによって、アミノ酸側鎖をブロッキングするための試薬；（ｄ）ユニバーサルＤＮＡプライマー配列；（ｅ）ポリペプチドをユニバーサルＤＮＡプライマー配列で標識するための試薬；（ｆ）標識されたポリペプチドをプライマーによってアニーリングするためのバーコード付きビーズ；（ｇ）標識されたポリペプチドにビーズからのバーコードを書き込むためのポリメラーゼ伸長のための試薬；（ｈ）トリプシン、ＬｙｓＮ、またはＬｙｓＣなどの、プロテアーゼ；（ｉ）核酸標識ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ標識タンパク質）を支持体に固定化するための試薬；（ｊ）分解に基づくポリペプチド配列決定のための試薬；および／または（ｋ）核酸配列決定のための試薬を含むことができる。
【００９７】
キットの前述の実施形態のいずれかでは、溶液中または支持体、例えば、固体支持体上の１つまたは複数の成分を提供することができる。
【００９８】
キット成分は、下記の例示的な方法および／または態様で開示および／または使用される、任意の分子、分子複合体もしくはコンジュゲート、試薬（例えば、化学的もしくは生物学的）、薬剤、構造（例えば、支持体、表面、粒子もしくはビーズ）、反応中間体、反応生成物、結合性複合体または任意の他の製造物品も含み得る。本キットは、任意の適切な分析物、例えば巨大分子またはポリペプチドの解析に使用することができる。一部の実施形態では、本キットは、高度に並行な、ハイスループットなデジタル解析（例えば、巨大分子解析）、特にポリペプチド解析に使用することができる。一部の実施形態では、本キットは、分析物、例えば巨大分子またはポリペプチドを解析するための下記の例示的な方法において使用することができる。
【００９９】
第１の例は、分析物、例えば、巨大分子またはポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合した分析物および付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記分析物を、前記分析物に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、一次伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）前記分析物を、前記分析物に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｅ）前記第２のコーディングタグの情報を前記一次伸長記録タグに移行させて、二次伸長記録タグを生成するステップと；（ｆ）前記二次伸長記録タグを解析するステップとを含む方法である。
【０１００】
第２の例は、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を逐次的に実施する、第１の例に記載の方法である。
【０１０１】
第３の例は、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を同時に実施する、第１の例に記載の方法である。
【０１０２】
第４の例は、ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、（ｘ）前記第２の結合性物質を、前記分析物に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、前記第３の（またはより高次の）結合性物質が、前記第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む、ステップと；（ｙ）前記第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を第２の（またはより高次の）伸長記録タグに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップとをさらに含み、ステップ（ｆ）において前記第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析する、第１の例に記載の方法である。
【０１０３】
第５の例は、分析物、例えば、巨大分子またはポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合した分析物、付随する第１の記録タグおよび付随する第２の記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記分析物を、前記分析物に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）前記第１のコーディングタグの情報を前記第１の記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）前記分析物を、前記分析物に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｅ）前記第２のコーディングタグの情報を前記第２の記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグを生成するステップと；（ｆ）前記第１および第２の伸長記録タグを解析するステップとを含む方法である。
【０１０４】
第６の例は、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を逐次的に実施する、第５の例に記載の方法である。
【０１０５】
第７の例は、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を同時に実施する、第５の例に記載の方法である。
【０１０６】
第８の例は、ステップ（ａ）が、前記固体支持体に接合した付随する第３の（またはより高次の）記録タグを提供するステップをさらに含む、第５の例に記載の方法である。
【０１０７】
第９の例は、ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、（ｘ）前記第２の結合性物質を、前記分析物に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、第３の（またはより高次の）結合性物質が、前記第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む、ステップと；（ｙ）前記第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を前記第３の（またはより高次の）記録タグに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップとをさらに含み、ステップ（ｆ）において前記第１、第２および第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析する、第８の例に記載の方法である。
【０１０８】
第１０の例は、前記第１のコーディングタグ、第２のコーディングタグ、および任意のより高次のコーディングタグが、結合サイクル特異的スペーサー配列を含む、第５〜第９の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１０９】
第１１の例は、ペプチドを解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学薬剤で修飾するステップと；（ｃ）前記ペプチドを、修飾された前記ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｄ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、伸長記録タグ生成するステップと；（ｅ）前記伸長記録タグを解析するステップとを含む方法である。
【０１１０】
第１２の例は、ステップ（ｃ）が、前記ペプチドを、第２の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第２の（またはより高次の）コーディングタグを含む第２の（またはより高次の）結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の（またはより高次の）結合性物質が、ステップ（ｂ）の修飾された前記ＮＴＡＡ以外の修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能である、ステップをさらに含む、第１１の例に記載の方法である。
【０１１１】
第１３の例は、前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触後に逐次的に行う、第１２の例に記載の方法である。
【０１１２】
第１４の例は、前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触と同時に行う、第１２の例に記載の方法である。
【０１１３】
第１５の例は、前記化学薬剤が、イソチオシアネート誘導体、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、ダンシルクロリド、７−メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、またはチオベンジル化試薬である、第１１〜第１４の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１１４】
第１６の例は、ペプチドを解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学薬剤で修飾して修飾されたＮＴＡＡを得るステップと；（ｃ）前記ペプチドを、修飾された前記ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｄ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；（ｅ）修飾された前記ＮＴＡＡを除去して新しいＮＴＡＡを露出させるステップ；（ｆ）前記ペプチドの新しいＮＴＡＡを化学薬剤で修飾して新しく修飾されたＮＴＡＡを得るステップと；（ｇ）前記ペプチドを、前記新しく修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｈ）前記第２のコーディングタグの情報を前記第１の伸長記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグ生成するステップと；（ｉ）前記第２の伸長記録タグを解析するステップとを含む方法である。
【０１１５】
第１７の例は、ペプチドを解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記ペプチドを、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）前記伸長記録タグを解析するステップとを含む方法である。
【０１１６】
第１８の例は、ステップ（ｂ）が、前記ペプチドを、第２の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第２の（またはより高次の）コーディングタグを含む第２の（またはより高次の）結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の（またはより高次の）結合性物質が、前記ペプチドの前記ＮＴＡＡ以外のＮＴＡＡに結合することが可能である、ステップをさらに含む、第１７の例に記載の方法である。
【０１１７】
第１９の例は、前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触後に逐次的に行う、第１８の例に記載の方法である。
【０１１８】
第２０の例は、前記ペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ペプチドの前記第１の結合性物質との接触と同時に行う、第１８の例に記載の方法である。
【０１１９】
第２１の例は、ペプチドを解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記ペプチドを、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）前記ＮＴＡＡを除去して前記ペプチドの新しいＮＴＡＡを露出させるステップと；（ｅ）前記ペプチドを、前記新しいＮＴＡＡに結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｆ）前記第２のコーディングタグの情報を前記第１の伸長記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグを生成するステップと；（ｇ）前記第２の伸長記録タグを解析するステップとを含む方法である。
【０１２０】
第２２の例は、前記分析物が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである、第１〜第１０の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２１】
第２３の例は、前記分析物が、ペプチドである、第１〜第１０の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２２】
第２４の例は、前記ペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することにより得られる、第１１〜第２３の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２３】
第２５の例は、前記分析物が、脂質、炭水化物、または大環状分子である、第１〜第１０の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２４】
第２６の例は、前記記録タグが、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せである、第１〜第２５の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２５】
第２７の例は、前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、第１〜第２６の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２６】
第２８の例は、前記ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、第２７の例に記載の方法である。
【０１２７】
第２９の例は、前記記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、第１〜第２８の例に記載の方法である。
【０１２８】
第３０の例は、前記記録タグが、バーコードを含む、第１〜第２９の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１２９】
第３１の例は、前記記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、第１〜第３０の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１３０】
第３２の例は、前記分析物および前記付随する記録タグが、前記固体支持体に共有結合により接合されている、第１〜第３１の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１３１】
第３３の例は、前記固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、第１〜第３２の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１３２】
第３４の例は、前記固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、第３３の例に記載の方法である。
【０１３３】
第３５の例は、複数の分析物（例えば、同じ分析物のまたは異なる分析物の分子）および付随する記録タグが、固体支持体に接合されている、第１〜第３４の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１３４】
第３６の例は、前記複数の分析物（例えば、同じ分析物のまたは異なる分析物の分子）の間に固体支持体上で平均距離＞５０ｎｍの間隔をあける、第３５の例に記載の方法である。
【０１３５】
第３７の例は、前記結合性物質が、ポリペプチドまたはタンパク質である、第１〜第３６の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１３６】
第３８の例は、前記結合性物質が、修飾アミノペプチダーゼ、修飾アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、修飾アンチカリン、または修飾ＣｌｐＳである、第３７の例に記載の方法である。
【０１３７】
第３９の例は、前記結合性物質が、前記分析物に選択的に結合することが可能である、第１〜第３８の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１３８】
第４０の例は、前記コーディングタグが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せである、第１〜第３９の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１３９】
第４１の例は、前記コーディングタグが、エンコーダー配列を含む、第１〜第４０の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４０】
第４２の例は、前記コーディングタグが、スペーサー、結合サイクル特異的配列、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、第１〜第４１の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４１】
第４３の例は、前記結合性物質および前記コーディングタグが、リンカーによって接合されている、第１〜第４２の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４２】
第４４の例は、前記結合性部分および前記コーディングタグが、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（この場合、接合される２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅがＳｐｙＴａｇをＫＴａｇに接合させ、かくして２つの部分が接合される）、ソルターゼ、またはＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対によって接合されている、第１〜第４２の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４３】
第４５の例は、前記コーディングタグの情報の前記記録タグへの移行が、ＤＮＡリガーゼによって媒介される、第１〜第４４の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４４】
第４６の例は、前記コーディングタグの情報の前記記録タグへの移行が、ＤＮＡポリメラーゼによって媒介される、第１〜第４４の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４５】
第４７の例は、前記コーディングタグの情報の前記記録タグへの移行が化学的ライゲーションによって媒介される、第１〜第４４の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４６】
第４８の例は、前記伸長記録タグの解析が、核酸配列決定法を含む、第１〜第４７の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１４７】
第４９の例は、前記核酸配列決定法が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、第４８の例に記載の方法である。
【０１４８】
第５０の例は、前記核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、第４８の例に記載の方法である。
【０１４９】
第５１の例は、前記伸長記録タグが、解析前に増幅される、第１〜第５０の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１５０】
第５２の例は、前記伸長記録タグに含有されるコーディングタグ情報の順序が、前記結合性物質による前記分析物への結合の順序に関する情報を提供する、第１〜第５１の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１５１】
第５３の例は、前記伸長記録タグに含有される前記コーディングタグ情報の頻度が、前記結合性物質による前記分析物への結合の頻度に関する情報を提供する、第１〜第５２の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１５２】
第５４の例は、複数の分析物（例えば、同じ分析物のまたは異なる分析物の分子）を表す複数の伸長記録タグが、並行して解析される、第１〜第５３の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１５３】
第５５の例は、複数の分析物（例えば、同じ分析物のまたは異なる分析物の分子）を表す前記複数の伸長記録タグが、多重化アッセイで解析される、第５４の例に記載の方法である。
【０１５４】
第５６の例は、前記複数の伸長記録タグが、解析前に標的濃縮アッセイされる、第１〜第５５の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１５５】
第５７の例は、前記複数の伸長記録タグが、解析前にサブトラクションアッセイされる、第１〜第５６の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１５６】
第５８の例は、前記複数の伸長記録タグが、極めて豊富な種を低減させるために解析前に正規化アッセイされる、第１〜第５７の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１５７】
第５９の例は、前記ＮＴＡＡが、修飾アミノペプチダーゼ、修飾アミノ酸ｔＲＮＡ合成酵素、穏やかなエドマン分解、エドマナーゼ酵素、または無水ＴＦＡによって除去される、第１〜第５８の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１５８】
第６０の例は、少なくとも１つの結合性物質が、末端アミノ酸残基に結合する、第１〜第５９の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１５９】
第６１の例は、少なくとも１つの結合性物質が、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合する、第１〜第６０の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１６０】
第６２の例は、複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを含む試料由来の１つまたは複数のペプチドを解析するための方法であって、（ａ）前記試料中の前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するステップであって、各コンパートメントが、固体支持体に必要に応じて接合されている複数のコンパートメントタグを含み、前記複数のコンパートメントタグが、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；（ｂ）前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、および／またはポリペプチドを複数のペプチドに断片化するステップと；（ｃ）前記複数のペプチドと前記複数のコンパートメント内の前記複数のコンパートメントタグとのアニーリングまたは接合を可能にするのに十分な条件下で前記複数のペプチドを前記複数のコンパートメントタグと接触させることによって複数のコンパートメントタグ付きペプチドを生成するステップと；（ｄ）前記コンパートメントタグ付きペプチドを前記複数のコンパートメントから収集するステップと；（ｅ）１つまたは複数のコンパートメントタグ付きペプチドを、第１〜第２１の例および第２６〜第６１の例のいずれか１つに記載の方法に従って解析するステップとを含む方法である。
【０１６１】
第６３の例は、前記コンパートメントが、マイクロ流体液滴である、第６２の例に記載の方法である。
【０１６２】
第６４の例は、前記コンパートメントが、マイクロウェルである、第６２の例に記載の方法である。
【０１６３】
第６５の例は、前記コンパートメントが、表面上の分離された領域である、第６２の例に記載の方法である。
【０１６４】
第６６の例は、各コンパートメントが、平均して単一の細胞を含む、第６２〜第６５の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１６５】
第６７の例は、複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを含む試料由来の１つまたは複数のペプチドを解析するための方法であって、（ａ）前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のユニバーサルＤＮＡタグで標識するステップと；（ｂ）前記試料中の複数の標識されたタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するステップであって、各コンパートメントが、複数のコンパートメントタグを含み、前記複数のコンパートメントタグが、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；（ｃ）前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドと前記複数のコンパートメント内の前記複数のコンパートメントタグとのアニーリングまたは接合を可能にするのに十分な条件下で前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを前記複数のコンパートメントタグと接触させることによって複数のコンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを生成するステップと；（ｄ）前記コンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを前記複数のコンパートメントから収集するステップと；（ｅ）必要に応じて前記コンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドをコンパートメントタグ付きペプチドに断片化するステップと；（ｆ）１つまたは複数のコンパートメントタグ付きペプチドを、第１〜第２１の例および第２６〜第６１の例のいずれか１つに記載の方法に従って解析するステップとを含む方法である。
【０１６６】
第６８の例は、コンパートメントタグ情報が、ペプチドに付随する記録タグに、プライマー伸長またはライゲーションによって移行される、第６２〜第６７の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１６７】
第６９の例は、前記固体支持体が、ビーズを含む、第６２〜第６８の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１６８】
第７０の例は、前記ビーズが、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、第６９の例に記載の方法である。
【０１６９】
第７１の例は、前記コンパートメントタグが、一本鎖または二本鎖核酸分子を含む、第６２〜第７０の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１７０】
第７２の例は、前記コンパートメントタグが、バーコードおよび必要に応じてＵＭＩを含む、第６２〜第７１の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１７１】
第７３の例は、前記固体支持体がビーズであり、前記コンパートメントタグがバーコードを含み、さらに、前記複数のコンパートメントタグが接合されているビーズが、スプリット・アンド・プール合成により形成される、第７２の例に記載の方法である。
【０１７２】
第７４の例は、前記固体支持体がビーズであり、前記コンパートメントタグがバーコードを含み、さらに、複数のコンパートメントタグが接合されているビーズが、個々の合成または固定化により形成される、第７２の例に記載の方法である。
【０１７３】
第７５の例は、前記コンパートメントタグが、記録タグ内の成分であり、前記記録タグが、必要に応じて、スペーサー、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、第６２〜第７４の例いずれか１つに記載の方法である。
【０１７４】
第７６の例は、前記コンパートメントタグが、前記複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドの内部アミノ酸またはＮ末端アミノ酸と反応することができる機能的部分をさらに含む、第６２〜第７５の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１７５】
第７７の例は、前記機能的部分が、ＮＨＳ基である、第７６の例に記載の方法である。
【０１７６】
第７８の例は、前記機能的部分が、アルデヒド基である、第７６の例に記載の方法である。
【０１７７】
第７９の例は、前記複数のコンパートメントタグが、前記コンパートメントタグを前記コンパートメントに印刷、スポッティング、インク噴射すること、またはその組合せにより形成される、第６２〜第７８の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１７８】
第８０の例は、前記コンパートメントタグが、ペプチドをさらに含む、第６２〜第７９の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１７９】
第８１の例は、前記コンパートメントタグペプチドが、タンパク質リガーゼ認識配列を含む、第８０の例に記載の方法である。
【０１８０】
第８２の例は、前記タンパク質リガーゼが、ブテラーゼＩまたはそのホモログである、第８１の例に記載の方法である。
【０１８１】
第８３の例は、前記複数のポリペプチドが、プロテアーゼで断片化される、第６２〜第８２の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１８２】
第８４の例は、前記プロテアーゼが、メタロプロテアーゼである、第８３の例に記載の方法である。
【０１８３】
第８５の例は、前記メタロプロテアーゼの活性が、金属カチオンの光活性化放出によりモジュレートされる、第８４の例に記載の方法である。
【０１８４】
第８６の例は、前記複数のポリペプチドを前記複数のコンパートメントに分配する前に１つまたは複数の豊富なタンパク質を前記試料からサブトラクションすることをさらに含む、第６２〜第８５の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１８５】
第８７の例は、前記複数のペプチドと前記コンパートメントタグを接合させる前に前記コンパートメントタグを前記固体支持体から遊離させることをさらに含む、第６２〜第８６の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１８６】
第８８の例は、ステップ（ｄ）の後に、前記コンパートメントタグ付きペプチドを固体支持体に記録タグを伴って接合させることをさらに含む、第６２の例に記載の方法である。
【０１８７】
第８９の例は、前記コンパートメントタグ付きペプチド上の前記コンパートメントタグの情報を前記付随する記録タグに移行させることをさらに含む、第８８の例に記載の方法である。
【０１８８】
第９０の例は、ステップ（ｅ）の前に前記コンパートメントタグを前記コンパートメントタグ付きペプチドから除去することをさらに含む、第８９の例に記載の方法である。
【０１８９】
第９１の例は、前記解析されるペプチドが由来する前記単一の細胞の同一性を、前記解析されるペプチドのコンパートメントタグ配列に基づいて決定することをさらに含む、第６２〜第９０の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９０】
第９２の例は、前記解析されるペプチドが由来する前記タンパク質またはタンパク質複合体の同一性を、前記解析されるペプチドのコンパートメントタグ配列に基づいて決定することをさらに含む、第６２〜第９０の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９１】
第９３の例は、複数の分析物（例えば、同じ分析物のまたは異なる分析物の分子）を解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合した複数の分析物および付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記複数の分析物を、前記複数の分析物に結合することが可能な複数の結合性物質と接触させるステップであって、各結合性物質が前記結合性物質に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）（ｉ）前記分析物に付随する記録タグの情報を、前記分析物に結合している前記結合性物質の前記コーディングタグに移行させて、伸長コーディングタグを生成するステップ；または（ｉｉ）分析物に付随する記録タグおよび前記分析物に結合している前記結合性物質のコーディングタグの情報をジタグ構築物に移行するステップと；（ｄ）前記伸長コーディングタグまたはジタグ構築物を収集するステップと；（ｅ）必要に応じてステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回の結合サイクルにわたって繰り返すステップと；（ｆ）伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物を解析するステップとを含む方法である。
【０１９２】
第９４の例は、前記分析物が、タンパク質である、第９３の例に記載の方法である。
【０１９３】
第９５の例は、前記分析物が、ペプチドである、第９３の例に記載の方法である。
【０１９４】
第９６の例は、前記ペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することにより得られる、第９５の例に記載の方法である。
【０１９５】
第９７の例は、前記記録タグが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せである、第９３〜第９６の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９６】
第９８の例は、前記記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、第９３〜第９７の例のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９７】
第９９の例は、前記記録タグが、コンパートメントタグを含む、例９３〜９８に記載の方法である。
【０１９８】
第１００の例は、前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、例９３〜９９のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９９】
第１０１の例は、前記記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、例９３〜１００のいずれか１つに記載の方法である。
【０２００】
第１０２の例は、前記記録タグの３’末端が、ポリメラーゼによる前記記録タグの伸長を防止するためにブロッキングされ、分析物に付随する記録タグおよび前記分析物に結合している結合性物質のコーディングタグの情報が、ジタグ構築物に移行される、例９３〜１０１のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０１】
第１０３の例は、前記コーディングタグが、エンコーダー配列を含む、例９３〜１０２のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０２】
第１０４の例は、前記コーディングタグが、ＵＭＩを含む、例９３〜１０３のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０３】
第１０５の例は、前記コーディングタグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、例９３〜１０４のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０４】
第１０６の例は、前記コーディングタグが、その３’末端にスペーサーを含む、例９３〜１０５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０５】
第１０７の例は、前記コーディングタグが、結合サイクル特異的配列を含む、例９３〜１０６のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０６】
第１０８の例は、前記結合性物質および前記コーディングタグが、リンカーによって接合されている、例９３〜１０７のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０７】
第１０９の例は、前記記録タグの情報の前記コーディングタグへの移行が、プライマー伸長により果たされる、例９３〜１０８のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０８】
第１１０の例は、前記記録タグの情報の前記コーディングタグへの移行が、ライゲーションによって果たされる、例９３〜１０８のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０９】
第１１１の例は、前記ジタグ構築物が、ギャップ充填、プライマー伸長、またはその両方により生成される、例９３〜１０８のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１０】
第１１２の例は、ジタグ分子が、記録タグに由来するユニバーサルプライミング部位、記録タグに由来するコンパートメントタグ、記録タグに由来する一意の分子識別子、記録タグに由来する必要に応じたスペーサー、コーディングタグに由来するエンコーダー配列、コーディングタグに由来する一意の分子識別子、コーディングタグに由来する必要に応じたスペーサー、およびコーディングタグに由来するユニバーサルプライミング部位を含む、例９３〜９７、１０７、１０８および１１１のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１１】
第１１３の例は、前記分析物および前記付随する記録タグが、前記固体支持体に共有結合により接合されている、例９３〜１１２のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１２】
第１１４の例は、前記固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、例１１３に記載の方法である。
【０２１３】
第１１５の例は、前記固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、例１１４に記載の方法である。
【０２１４】
第１１６の例は、前記結合性物質が、ポリペプチドまたはタンパク質である、例９３〜１１５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１５】
第１１７の例は、前記結合性物質が、修飾アミノペプチダーゼ、修飾アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、修飾アンチカリン、または抗体もしくはその結合断片である、例１１６に記載の方法である。
【０２１６】
第１１８の例は、前記結合性物質が、単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチドまたは前記ペプチドの翻訳後修飾に結合する、例９５〜１１７のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１７】
第１１９の例は、前記結合性物質が、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に結合する、例１１８に記載の方法である。
【０２１８】
第１２０の例は、前記結合性物質が、Ｎ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、または内部ペプチドに結合する、例１１８に記載の方法である。
【０２１９】
第１２１の例は、前記結合性物質が、Ｎ末端アミノ酸残基に結合し、Ｎ末端アミノ酸残基が、各結合サイクル後に切断される、例１１９に記載の方法である。
【０２２０】
第１２２の例は、前記結合性物質が、Ｃ末端アミノ酸残基に結合し、Ｃ末端アミノ酸残基が、各結合サイクル後に切断される、例１１９に記載の方法である。
【０２２１】
例１２３．前記Ｎ末端アミノ酸残基が、エドマン分解によって切断される、例１２１に記載の方法。
【０２２２】
例１２４．前記結合性物質が、アミノ酸または翻訳後修飾の部位特異的な共有結合性標識である、例９３に記載の方法。
【０２２３】
例１２５．ステップ（ｂ）の後に、前記分析物と付随する結合性物質とを含む複合体が、前記固体支持体から解離され、液滴またはマイクロ流体液滴のエマルジョン中に分配される、例９３〜１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２２４】
例１２６．各マイクロ流体液滴が、平均して、前記分析物と前記結合性物質とを含む複合体を１つ含む、例１２５に記載の方法。
【０２２５】
例１２７．前記記録タグが、伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の生成前に増幅される、例１２５または１２６に記載の方法。
【０２２６】
例１２８．エマルジョン融合ＰＣＲが、前記記録タグの情報を前記コーディングタグに移行させるためにまたはジタグ構築物の集団を創出するために使用される、例１２５〜１２７のいずれか１つに記載の方法。
【０２２７】
例１２９．伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物が、解析前に増幅される、例９３〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２２８】
例１３０．伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物の解析が、核酸配列決定法を含む、例９３〜１２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２２９】
例１３１．前記核酸配列決定法が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、例１３０に記載の方法。
【０２３０】
例１３２．前記核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、例１３０に記載の方法。
【０２３１】
例１３３．前記分析物の部分的組成が、一意のコンパートメントタグおよび必要に応じてＵＭＩを使用する複数の伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の解析により決定される、例１３０に記載の方法。
【０２３２】
例１３４．前記解析ステップが、塩基当たりのエラー率が＞５％、＞１０％、＞１５％、＞２０％、＞２５％、または＞３０％である配列決定法を用いて実施される、例１〜１３３のいずれか１つに記載の方法。
【０２３３】
例１３５．コーディングタグ、記録タグ、またはその両方の識別成分が、エラー訂正コードを含む、例１〜１３４のいずれか１つに記載の方法。
【０２３４】
例１３６．前記識別成分が、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せから選択される、例１３５に記載の方法。
【０２３５】
例１３７．前記エラー訂正コードが、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される、例１３５または１３６に記載の方法。
【０２３６】
例１３８．コーディングタグ、記録タグ、またはその両方の識別成分が、一意の電流またはイオンフラックスまたは光学的シグネチャを生成することができ、解析ステップが、識別成分を識別するための一意の電流またはイオンフラックスまたは光学的シグネチャの検出を含む、例１〜１３４のいずれか１つに記載の方法。
【０２３７】
例１３９．前記識別成分が、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列、またはこれらの任意の組合せから選択される、例１３８に記載の方法。
【０２３８】
例１４０．複数の分析物（例えば、同じ分析物のまたは異なる分析物の分子）を解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合した複数の分析物および付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記複数の分析物を、同類の分析物に結合することが可能な複数の結合性物質と接触させるステップであって、各結合性物質が前記結合性物質に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）第１の結合性物質の第１のコーディングタグの情報を第１の分析物に付随する第１の記録タグに移行させて、一次伸長記録タグを生成するステップであって、前記第１の結合性物質が前記第１の分析物に結合する、ステップと；（ｄ）前記複数の分析物を、同類の分析物に結合することが可能な前記複数の結合性物質と接触させるステップと；（ｅ）第２の結合性物質の第２のコーディングタグの情報を前記一次伸長記録タグに移行させて、二次伸長記録タグを生成するステップであって、前記第２の結合性物質が前記第１の分析物に結合する、ステップと；（ｆ）必要に応じてステップ（ｄ）〜（ｅ）を「ｎ」回の結合サイクルにわたって繰り返すステップであって、前記第１の分析物に結合する各結合性物質の各コーディングタグの情報を前の結合サイクルで生成した伸長記録タグに移行させて、前記第１の分析物を表すｎ次伸長記録タグを生成するステップと；（ｇ）前記ｎ次伸長記録タグを解析するステップとを含む方法。
【０２３９】
例１４１．複数の分析物を表す複数のｎ次伸長記録タグが生成され、解析される、例１４０に記載の方法。
【０２４０】
例１４２．前記分析物が、タンパク質である、例１４０または１４１に記載の方法。
【０２４１】
例１４３．前記分析物が、ペプチドである、例１４２に記載の方法。
【０２４２】
例１４４．前記ペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することにより得られる、例１４３に記載の方法。
【０２４３】
例１４５．前記複数の分析物が、多数のプールされた試料由来の分析物（例えば、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体などの、巨大分子）を含む、例１４０〜１４４のいずれか１つに記載の方法。
【０２４４】
例１４６．前記記録タグが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ、分子、ＬＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せである、例１４０〜１４５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４５】
例１４７．前記記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、例１４０〜１４６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４６】
例１４８．前記記録タグが、コンパートメントタグを含む、例１４０〜１４７に記載の方法。
【０２４７】
例１４９．前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、例１４０〜１４８のいずれか１つに記載の方法。
【０２４８】
例１５０．前記記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、例１４０〜１４９のいずれか１つに記載の方法。
【０２４９】
例１５１．前記コーディングタグが、エンコーダー配列を含む、例１４０〜１５０のいずれか１つに記載の方法。
【０２５０】
例１５２．前記コーディングタグが、ＵＭＩを含む、例１４０〜１５１のいずれか１つに記載の方法。
【０２５１】
例１５３．前記コーディングタグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、例１４０〜１５２のいずれか１つに記載の方法。
【０２５２】
例１５４．前記コーディングタグが、その３’末端にスペーサーを含む、例１４０〜１５３のいずれか１つに記載の方法。
【０２５３】
例１５５．前記コーディングタグが、結合サイクル特異的配列を含む、例１４０〜１５４のいずれか１つに記載の方法。
【０２５４】
例１５６．前記コーディングタグが、一意の分子識別子を含む、例１４０〜１５５のいずれか１つに記載の方法。
【０２５５】
例１５７．前記結合性物質および前記コーディングタグが、リンカーによって接合されている、例１４０〜１５６のいずれか１つに記載の方法。
【０２５６】
例１５８．前記記録タグの情報の前記コーディングタグへの移行が、プライマー伸長によって媒介される、例１４０〜１５７のいずれか１つに記載の方法。
【０２５７】
例１５９．前記記録タグの情報の前記コーディングタグへの移行が、ライゲーションによって媒介される、例１４０〜１５８のいずれか１つに記載の方法。
【０２５８】
例１６０．前記複数の分析物、前記付随する記録タグ、またはその両方が、前記固体支持体に共有結合により接合されている、例１４０〜１５９のいずれか１つに記載の方法。
【０２５９】
例１６１．前記固体支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、例１４０〜１６０のいずれか１つに記載の方法。
【０２６０】
例１６２．前記固体支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、例１６１に記載の方法。
【０２６１】
例１６３．前記結合性物質が、ポリペプチドまたはタンパク質である、例１４０〜１６２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６２】
例１６４．前記結合性物質が、修飾アミノペプチダーゼ、修飾アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、修飾アンチカリン、または抗体もしくはその結合断片である、例１６３に記載の方法。
【０２６３】
例１６５．前記結合性物質が、単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチドまたは前記ペプチドの翻訳後修飾に結合する、例１４２〜１６４のいずれか１つに記載の方法。
【０２６４】
例１６６．前記結合性物質が、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に結合する、例１６５に記載の方法。
【０２６５】
例１６７．前記結合性物質が、Ｎ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、または内部ペプチドに結合する、例１６５に記載の方法。
【０２６６】
例１６８．前記結合性物質が、修飾されたＮ末端アミノ酸残基、修飾されたＣ末端アミノ酸残基または修飾された内部アミノ酸残基の化学標識に結合する、例１４２〜１６４のいずれか１つに記載の方法。
【０２６７】
例１６９．前記結合性物質が、前記Ｎ末端アミノ酸残基、または前記修飾されたＮ末端アミノ酸残基の化学標識に結合し、前記Ｎ末端アミノ酸残基が、各結合サイクル後に切断される、例１６６または１６８に記載の方法。
【０２６８】
例１７０．前記結合性物質が、前記Ｃ末端アミノ酸残基、または前記修飾されたＣ末端アミノ酸残基の化学標識に結合し、前記Ｃ末端アミノ酸残基が、各結合サイクル後に切断される、例１６６または１６８に記載の方法。
【０２６９】
例１７１．前記Ｎ末端アミノ酸残基が、エドマン分解、エドマナーゼ、修飾アミノペプチダーゼまたは修飾アシルペプチドヒドロラーゼによって切断される、例１６９に記載の方法。
【０２７０】
例１７２．前記結合性物質が、アミノ酸または翻訳後修飾の部位特異的な共有結合性標識である、例１６３に記載の方法。
【０２７１】
例１７３．前記複数のｎ次伸長記録タグが、解析前に増幅される、例１４０〜１７２のいずれか１つに記載の方法。
【０２７２】
例１７４．前記ｎ次伸長記録タグの解析が、核酸配列決定法を含む、例１４０〜１７３のいずれか１つに記載の方法。
【０２７３】
例１７５．複数の分析物を表す複数のｎ次伸長記録タグが並行して解析される、例１７４に記載の方法。
【０２７４】
例１７６．前記核酸配列決定法が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、例１７４または１７５に記載の方法。
【０２７５】
例１７７．前記核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、例１７４または１７５に記載の方法。
【０２７６】
例１’．（ａ）各タンパク質に記録タグが直接または間接的に付随しているタンパク質のセットを薬剤のライブラリーと接触させるステップであって、各薬剤が（ｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマーなどの核酸アプタマー、もしくはペプチドアプタマー）、および（ｉｉ）前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖またはアプタマーに関する識別情報を含むコーディングタグを含み、各タンパク質および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各薬剤が、支持体に直接または間接的に固定化されている、ステップと；（ｂ）（ｉ）１つまたは複数の薬剤の前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーと結合および／または反応する各タンパク質に付随する前記記録タグと（ｉｉ）前記１つまたは複数の薬剤のコーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと；（ｃ）前記伸長記録タグおよび／または前記伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法。
【０２７７】
例２’．各タンパク質と他のタンパク質との間に前記支持体上で平均距離約２０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約６００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約６５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約７００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約７５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約８００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約８５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約９００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約９５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、または約１μｍに等しいもしくはそれより長い間隔をあける、例１’に記載の方法。
【０２７８】
例３’．各タンパク質およびそれに付随する記録タグと他のタンパク質およびそれらに付随する記録タグとの間に前記支持体上で平均距離約２０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約６００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約６５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約７００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約７５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約８００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約８５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約９００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約９５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、または約１μｍに等しいもしくはそれより長い間隔をあける、例１’または２’に記載の方法。
【０２７９】
例４’．前記タンパク質および／またはそれらに付随する記録タグの１つまたは複数が、前記支持体に（例えばリンカーを介して）共有結合により固定化されているか、または前記支持体に（例えば、結合対を介して）非共有結合により固定化されている、例１’〜３’のいずれか１つに記載の方法。
【０２８０】
例５’．前記タンパク質および／またはそれらに付随する記録タグのサブセットが、前記支持体に共有結合により固定化されており、その一方で前記タンパク質および／またはそれらに付随する記録タグの別サブセットが、前記支持体に非共有結合により固定化されている、例１’〜４’のいずれか１つに記載の方法。
【０２８１】
例６’．前記記録タグの１つまたは複数が、前記支持体に固定化されおり、それにより、前記付随するタンパク質が固定化されている、例１’〜５’のいずれか１つに記載の方法。
【０２８２】
例７’．前記タンパク質の１つまたは複数が、前記支持体に固定化されおり、それにより、前記付随する記録タグが固定化されている、例１’〜６’のいずれか１つに記載の方法。
【０２８３】
例８’．少なくとも１つのタンパク質が、それに付随する記録タグと共局在し、さらに、各々が独立して前記支持体に固定化されている、例１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０２８４】
例９’．少なくとも１つのタンパク質および／またはそれに付随する記録タグが、固定化リンカーと直接または間接的に会合し、前記固定化リンカーが、前記支持体に直接または間接的に固定化されており、それにより、前記少なくとも１つのタンパク質および／またはそれに付随する記録タグが前記支持体に固定化されている、例１’〜８’のいずれか１つに記載の方法。
【０２８５】
例１０’．固定化されている記録タグの密度が、固定化されているタンパク質の密度に等しいか、またはそれより高い、例１’〜９’のいずれか１つに記載の方法。
【０２８６】
例１１’．固定化されている記録タグの密度が、固定化されているタンパク質の密度の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍であるか、またはそれより高い、例１０’に記載の方法。
【０２８７】
例１２’．各薬剤と前記支持体上に固定化されている他の薬剤との間に平均距離約２０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約６００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約６５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約７００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約７５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約８００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約８５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約９００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約９５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、または約１μｍに等しいもしくはそれより長い間隔をあける、例１’に記載の方法。
【０２８８】
例１３’．前記薬剤の１つまたは複数が、前記支持体に（例えばリンカーを介して）共有結合により固定化されている、または前記支持体に（例えば、結合対を介して）非共有結合により固定化されている、例１２’に記載の方法。
【０２８９】
例１４’．前記薬剤のサブセットが、前記支持体に共有結合により固定化されており、その一方で前記薬剤の別サブセットが、前記支持体に非共有結合により固定化されている、例１２’または１３’に記載の方法。
【０２９０】
例１５’．前記薬剤の１つまたは複数について、前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーが、前記支持体に固定化されており、それにより、前記コーディングタグが固定化されている、例１２’〜１４’のいずれか１つに記載の方法。
【０２９１】
例１６’．前記薬剤の１つまたは複数について、前記コーディングタグが前記支持体に固定化されており、それにより、前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーが固定化されている、例１２’〜１５’のいずれか１つに記載の方法。
【０２９２】
例１７’．情報が、少なくとも１つのコーディングタグから少なくとも１つの記録タグに移行され、それにより、少なくとも１つの伸長記録タグが生成される、例１’〜１６’のいずれか１つに記載の方法。
【０２９３】
例１８’．情報が、少なくとも１つの記録タグから少なくとも１つのコーディングタグに移行され、それにより、少なくとも１つの伸長コーディングタグが生成される、例１’〜１７’のいずれか１つに記載の方法。
【０２９４】
例１９’．前記コーディングタグからの情報および前記記録タグからの情報を含む、少なくとも１つのジタグ構築物が生成される、例１’〜１８’のいずれか１つに記載の方法。
【０２９５】
例２０’．前記タンパク質の少なくとも１つが、２つまたはそれより多くの薬剤の前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーと結合および／または反応する、例１’〜１９’のいずれか１つに記載の方法。
【０２９６】
例２１’．前記伸長記録タグまたは前記伸長コーディングタグが、前記２つまたはそれより多くの薬剤の前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖またはアプタマーに関する識別情報を含む、例２０’に記載の方法。
【０２９７】
例２２’．前記タンパク質の少なくとも１つに２つまたはそれより多くの記録タグが付随しており、前記２つまたはそれより多くの記録タグが、同じであってもよく、または異なっていてもよい、例１’〜２１’のいずれか１つに記載の方法。
【０２９８】
例２３’．前記薬剤の少なくとも１つが、２つまたはそれより多くのコーディングタグを含み、前記２つまたはそれより多くのコーディングタグが、同じであってもよく、または異なっていてもよい、例１’〜２２’のいずれか１つに記載の方法。
【０２９９】
例２４’．前記情報の移行が、ライゲーション（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション、副子ライゲーション、粘着末端ライゲーション、ｓｓＤＮＡライゲーションなどの一本鎖（ｓｓ）ライゲーション、またはこれらの任意の組合せ）、ポリメラーゼ媒介反応（例えば、一本鎖核酸もしくは二本鎖核酸のプライマー伸長）、またはこれらの任意の組合せにより実現される、例１’〜２３’のいずれか１つに記載の方法。
【０３００】
例２５’．前記ライゲーションおよび／またはポリメラーゼ媒介反応が、前記タンパク質と前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖またはアプタマーとの結合の占有時間または反応時間と比較して速いカイネティクスを有し、必要に応じて、前記ライゲーションおよび／またはポリメラーゼ媒介反応のための試薬が、前記タンパク質と前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖またはアプタマーとの結合または反応と同じ反応体積で存在し、さらに必要に応じて、情報移行が、同時の結合／エンコーディングステップを使用することにより、および／または前記エンコーディングステップもしくは情報書き込みステップの、前記結合性物質の解離速度を緩徐化するために低下される温度を使用することにより、果たされる、例２４’に記載の方法。
【０３０１】
例２６’．各タンパク質が、個々の付着によってその記録タグと会合し、および／または各小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーが、個々の付着によってそのコーディングタグと会合する、例１’〜２５’のいずれか１つに記載の方法。
【０３０２】
例２７’．前記付着が、リボソームまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡディスプレイによって行われ、この場合、前記記録タグおよび／またはコーディングタグ配列情報がｍＲＮＡ配列に含有される、例２６’に記載の方法。
【０３０３】
例２８’．前記記録タグおよび／またはコーディングタグが、前記ｍＲＮＡ配列の３’末端におけるユニバーサルプライマー配列、バーコード、および／またはスペーサー配列を含む、例２７’に記載の方法。
【０３０４】
例２９’．前記記録タグおよび／またはコーディングタグが、その３’末端に、制限酵素消化部位をさらに含む、例２８’に記載の方法。
【０３０５】
例３０’．前記タンパク質のセットが、プロテオームまたはそのサブセットであり、必要に応じて、前記タンパク質のセットが、ゲノムもしくはそのサブセットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写、続いてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して産生される、またはトランスクリプトームもしくはそのサブセットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を使用して産生される、例１’〜２９’のいずれか１つに記載の方法。
【０３０６】
例３１’．前記プロテオームのサブセットが、キノーム；セクレトーム；レセプトーム（例えば、ＧＰＣＲｏｍｅ）；免疫プロテオーム；栄養プロテオーム；翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、酸化、脂質付加および／またはニトロシル化）により定義されるプロテオームサブセット、例えば、リン酸化プロテオーム（例えば、ホスホチロシン−プロテオーム、チロシン−キノーム、およびチロシン−ホスファトーム）、グライコプロテオームなど；組織もしくは臓器、発生期または生理もしくは病的状態に関連するプロテオームサブセット；細胞プロセス、例えば、細胞周期、分化（もしくは脱分化）、細胞死、老化、細胞遊走、形質転換、または転移に関連する、プロテオームサブセット；あるいはこれらの任意の組合せを含む、例３０’に記載の方法。
【０３０７】
例３２’．前記タンパク質のセットが、哺乳動物、例えばヒト、非ヒト動物、魚、無脊椎動物、節足動物、昆虫、または植物、例えば酵母、細菌、例えばＥ．Ｃｏｌｉ、ウイルス、例えばＨＩＶもしくはＨＣＶ、またはこれらの組合せに由来する、例１’〜３１’のいずれか１つに記載の方法。
【０３０８】
例３３’．前記タンパク質のセットが、タンパク質複合体またはそのサブユニットを含む、例１’〜３２’のいずれか１つに記載の方法。
【０３０９】
例３４’．前記記録タグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、もしくはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、例１’〜３３’のいずれか１つに記載の方法。
【０３１０】
例３５’．前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、例１’〜３４’のいずれか１つに記載の方法。
【０３１１】
例３６’．前記記録タグが、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含み、例えば、前記ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、例１’〜３５’のいずれか１つに記載の方法。
【０３１２】
例３７’．前記記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、例１’〜３６’のいずれか１つに記載の方法。
【０３１３】
例３８’．前記記録タグが、バーコードを含む、例１’〜３７’のいずれか１つに記載の方法。
【０３１４】
例３９’．前記記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、例１’〜３８’のいずれか１つに記載の方法。
【０３１５】
例４０’．前記支持体が、固体支持体、例えば、剛性固体支持体、可撓性固体支持体、または軟質固体支持体であり、多孔質支持体または非多孔質支持体を含む、例１’〜３９’のいずれか１つに記載の方法。
【０３１６】
例４１’．前記支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子および／もしくは銀ナノ粒子などの、金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せを含む、例１’〜４０’のいずれか１つに記載の方法。
【０３１７】
例４２’．前記支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、もしくは制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、例４１’に記載の方法。
【０３１８】
例４３’．小分子−タンパク質結合マトリックス、および／またはペプチド／ペプチドの模倣物−タンパク質結合マトリックス、および／またはペプチド模倣物−タンパク質結合マトリックス（例えば、ペプトイド−タンパク質結合マトリックス、β−ペプチド−タンパク質結合マトリックス、もしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物−タンパク質結合マトリックス）、および／または多糖−タンパク質結合マトリックス、および／またはアプタマー−タンパク質結合マトリックスを創出するために、前記タンパク質のセットと、小分子および／またはペプチドもしくはペプチドの模倣物および／またはペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）および／または多糖および／またはアプタマーのライブラリーとの間の相互作用を並列解析するための、例１’〜４２’のいずれか１つに記載の方法。
【０３１９】
例４４’．前記マトリックスのサイズが、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４のまたはそれより大きい、例えば、約２×１０１３のサイズである、例４３’に記載の方法。
【０３２０】
例４５’．前記コーディングタグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、もしくはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、例１’〜４４’のいずれか１つに記載の方法。
【０３２１】
例４６’．前記コーディングタグが、前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーを識別するエンコーダー配列を含む、例１’〜４５’のいずれか１つに記載の方法。
【０３２２】
例４７’．前記コーディングタグが、スペーサー、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含む、例１’〜４６’のいずれか１つに記載の方法。
【０３２３】
例４８’．前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーと、前記コーディングタグが、リンカーまたは結合対により接合されている、例１’〜４７’のいずれか１つに記載の方法。
【０３２４】
例４９’．前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーと、前記コーディングタグが、ＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（この場合、接合される２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅがＳｐｙＴａｇをＫＴａｇに接合させ、かくして２つの部分が接合される）、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、ソルターゼ、もしくはＨａｌｏＴａｇ／ＨａｌｏＴａｇリガンド対、またはこれらの任意の組合せによって接合されている、例１’〜４８’のいずれか１つに記載の方法。
【０３２５】
例５０’．ポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）（ｉ）各断片に記録タグが直接または間接的に付随しているポリペプチドの断片のセットを（ｉｉ）各結合性物質が結合性部分および前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含む結合性物質のライブラリーと接触させるステップであって、前記結合性部分が、前記断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することができ、または官能化試薬により修飾された前記１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することができ、各断片および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各結合性物質が、支持体に直接または間接的に固定化されている、ステップと；（ｂ）（ｉ）各断片に付随する前記記録タグと（ｉｉ）前記コーディングタグとの間の情報の移行を、前記結合性部分と前記断片の１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸との結合時に可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと、（ｃ）前記伸長記録タグおよび／または前記伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法。
【０３２６】
例５１’．前記１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸が、（ｉ）Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）、（ｉｉ）Ｎ末端ジペプチド配列、（ｉｉｉ）Ｎ末端トリペプチド配列；（ｉｖ）内部アミノ酸；（ｖ）内部ジペプチド配列；（ｖｉ）内部トリペプチド配列；（ｖｉｉ）Ｃ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）；（ｖｉｉｉ）Ｃ末端ジペプチド配列；もしくは（ｉｘ）Ｃ末端トリペプチド配列、またはこれらの任意の組合せを含み、必要に応じて、（ｉ）〜（ｉｘ）の前記アミノ酸残基の任意の１つまたは複数が、修飾または官能化されている、例５０’に記載の方法。
【０３２７】
例５２’．前記１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸が、各残基において独立して、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）からなる群から、これらの任意の組合せで、選択される、例５１’に記載の方法。
【０３２８】
例５３’．前記結合性部分が、ポリペプチドまたはその断片、タンパク質もしくはポリペプチド鎖またはその断片、あるいはタンパク質複合体またはそのサブユニット、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含む、例５０’〜５２’のいずれか１つに記載の方法。
【０３２９】
例５４’．前記結合性部分が、アンチカリンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アンチカリンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；あるいはアミノ酸に結合する修飾小分子、すなわちバンコマイシンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾分子；あるいはこれらの任意の組合せを含む、例５０’〜５３’のいずれか１つに記載の方法。
【０３３０】
例５５’．前記結合性部分が、官能化Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）、Ｎ末端ジペプチド配列、もしくはＮ末端トリペプチド配列、またはこれらの任意の組合せに選択的におよび／または特異的に結合することが可能である、例５０’〜５４’のいずれか１つに記載の方法。
【０３３１】
例５６’．複数のポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）複数のポリペプチドの各分子を複数のユニバーサルタグで標識するステップと；（ｂ）前記複数のポリペプチドと複数のコンパートメントタグとを、前記複数のユニバーサルタグと前記複数のコンパートメントタグとのアニーリングまたは接合に好適な条件下で接触させることによって、前記複数のポリペプチドを複数のコンパートメント（例えば、ビーズ表面、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、または表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せ）に分配するステップであって、前記複数のコンパートメントタグが、各コンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；（ｃ）各コンパートメント内の前記ポリペプチドを断片化することによって、少なくとも１つのユニバーサルポリヌクレオチドタグと少なくとも１つのコンパートメントタグとを含む記録タグが各々に付随しているポリペプチド断片のセットを生成するステップと；（ｄ）前記ポリペプチド断片のセットを支持体に直接または間接的に固定化するステップと；（ｅ）固定化されたポリペプチド断片のセットを、各結合性物質が結合性部分および前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含む結合性物質のライブラリーと接触させるステップであって、前記結合性部分が、前記断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬により修飾された前記１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、ステップと；（ｆ）（ｉ）各断片に付随する前記記録タグと（ｉｉ）前記コーディングタグとの間の情報の移行を、前記結合性部分と前記断片の１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸との結合時に可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと；（ｇ）前記伸長記録タグおよび／または前記伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法。
【０３３２】
例５７’．同じコンパートメントタグを有する前記複数のポリペプチドが、同じタンパク質に属する、例５６’に記載の方法。
【０３３３】
例５８’．前記同じコンパートメントタグを有する複数のポリペプチドが、異なるタンパク質、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのタンパク質に属する、例５６’に記載の方法。
【０３３４】
例５９’．前記複数のコンパートメントタグが、各基板がコンパートメントを規定している、複数の基板に固定化されている、例５６’〜５８’のいずれか１つに記載の方法。
【０３３５】
例６０’．前記複数の基板が、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子および／もしくは銀ナノ粒子などの、金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、例５９’に記載の方法。
【０３３６】
例６１’．前記複数の基板の各々が、バーコード付きビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、もしくは制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せなどの、バーコード付き粒子を含む、例５９’または６０’に記載の方法。
【０３３７】
例６２’．前記支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子および／もしくは銀ナノ粒子などの、金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、例５９’〜６１’のいずれか１つに記載の方法。
【０３３８】
例６３’．前記支持体が、シーケンシングビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、もしくは制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む、例６２’に記載の方法。
【０３３９】
例６４’．各断片およびそれに付随する記録タグと他の断片およびそれらに付随する記録タグとの間に前記支持体上で平均距離約２０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約６００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約６５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約７００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約７５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約８００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約８５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約９００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約９５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、または約１μｍに等しいもしくはそれより長い間隔をあける、例５６’〜６３’のいずれか１つに記載の方法。
【０３４０】
例６５’．複数のポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）各基板がコンパートメントタグを各々が含む複数の記録タグを含み、必要に応じて、各コンパートメントがビーズ、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、もしくは表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せである、複数の基板に複数のポリペプチドを固定化するステップと；
（ｂ）各基板上に固定化された前記ポリペプチドを（例えば、プロテアーゼ消化により）断片化することによって、基板に固定化されたポリペプチド断片のセットを生成するステップと；（ｃ）前記固定化されたポリペプチド断片のセットを、各結合性物質が結合性部分および前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含む結合性物質のライブラリーと接触させるステップであって、前記結合性部分が、前記断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬により修飾された前記１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、ステップと；（ｄ）（ｉ）前記記録タグと（ｉｉ）前記コーディングタグとの間の情報の移行を、前記結合性部分と各断片の１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸との結合時に可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するステップと；（ｅ）前記伸長記録タグおよび／または前記伸長コーディングタグを解析するステップとを含む方法。
【０３４１】
例６６’．同じコンパートメントタグを有する前記複数のポリペプチドが、同じタンパク質に属する、例６５’に記載の方法。
【０３４２】
例６７’．前記同じコンパートメントタグを有する複数のポリペプチドが、異なるタンパク質、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのタンパク質に属する、例６５’に記載の方法。
【０３４３】
例６８’．各基板が、コンパートメントを規定する、例６５’〜６７’のいずれか１つに記載の方法。
【０３４４】
例６９’．前記複数の基板が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、表面、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、スライド、フィルター、ナイロン、チップ、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、ウェル、マイクロタイターウェル、プレート、ＥＬＩＳＡプレート、ディスク、スピン干渉ディスク、膜、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）、金ナノ粒子および／もしくは銀ナノ粒子などの、金属を含む）、量子ドット、ナノシェル、ナノケージ、マイクロスフェア、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、例６５’〜６８’のいずれか１つに記載の方法。
【０３４５】
例７０’．前記複数の基板の各々が、バーコード付きビーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、もしくは制御ポアビーズ、またはこれらの任意の組合せなどの、バーコード付き粒子を含む、例６５’〜６９’のいずれか１つに記載の方法。
【０３４６】
例７１’．前記官能化試薬が、化学薬剤、酵素および／または生物学的薬剤、例えば、イソチオシアネート誘導体、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、ダンシルクロリド、７−メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、またはチオベンジル化試薬を含む、例５０’〜７０’のいずれか１つに記載の方法。
【０３４７】
例７２’．前記記録タグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、もしくはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、例５０’〜７１’のいずれか１つに記載の方法。
【０３４８】
例７３’．前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位；増幅、配列決定もしくはその両方のためのプライミング部位；必要に応じて、一意の分子識別子（ＵＭＩ）：バーコード；必要に応じて、その３’末端にスペーサー；またはこれらの組合せを含む、例５０’〜７２’のいずれか１つに記載の方法。
【０３４９】
例７４’．前記ポリペプチドまたは複数のポリペプチドの配列を決定するためのものである、例５０’〜７３’のいずれか１つに記載の方法。
【０３５０】
例７５’．前記コーディングタグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、もしくはモルホリノ、またはこれらの組合せを含む、例５０’〜７４’のいずれか１つに記載の方法。
【０３５１】
例７６’．前記コーディングタグが、エンコーダー配列、必要に応じたスペーサー、必要に応じた一意の分子識別子（ＵＭＩ）、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せを含む、例５０’〜７５’のいずれか１つに記載の方法。
【０３５２】
例７７’．前記結合性部分および前記コーディングタグが、リンカーまたは結合対によって接合されている、例５０’〜７６’のいずれか１つに記載の方法。
【０３５３】
例７８’．前記結合性部分と前記コーディングタグが、ＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（この場合、接合される２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅがＳｐｙＴａｇをＫＴａｇに接合させ、かくして２つの部分が接合される）、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、ソルターゼ、もしくはＨａｌｏＴａｇ／ＨａｌｏＴａｇリガンド対、またはこれらの任意の組合せによって接合されている、例５０’〜７７’のいずれか１つに記載の方法。
【０３５４】
例７９’．前記コーディングタグおよび／または前記記録タグが、１つもしくは複数のエラー訂正コード、１つもしくは複数のエンコーダー配列、１つもしくは複数のバーコード、１つもしくは複数のＵＭＩ、１つもしくは複数のコンパートメントタグ、またはこれらの任意の組合せを含む、例１’〜７８’のいずれか１つに記載の方法。
【０３５５】
例８０’．前記エラー訂正コードが、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される、例７９’に記載の方法。
【０３５６】
例８１’．前記伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグの解析が、核酸配列解析を含む、例１’〜８０’のいずれか１つに記載の方法。
【０３５７】
例８２’．前記核酸配列解析が、核酸配列決定法、例えば、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、もしくはパイロシーケンシング、またはこれらの任意の組合せを含む、例８１’に記載の方法。
【０３５８】
例８３’．前記核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、例８２’に記載の方法。
【０３５９】
例８４’．１または複数の洗浄ステップをさらに含む、例１’〜８３’のいずれか１つに記載の方法。
【０３６０】
例８５’．前記伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグが、解析前に増幅される、例１’〜８４’のいずれか１つに記載の方法。
【０３６１】
例８６’．前記伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグが、解析前に標的濃縮アッセイされる、例１’〜８５’のいずれか１つに記載の方法。
【０３６２】
例８７’．前記伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグが、解析前にサブトラクションアッセイされる、例１’〜８６’のいずれか１つに記載の方法。
【０３６３】
一態様では、（ａ）各薬剤が（ｉ）小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖および／またはアプタマーと（ｉｉ）前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖またはアプタマーに関する識別情報を含むコーディングタグとを含む、薬剤のライブラリーと；必要に応じて（ｂ）各タンパク質に記録タグが直接または間接的に付随している、タンパク質のセットとを含むキットであって、各タンパク質および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各薬剤が、支持体に直接または間接的に固定化されており、前記タンパク質のセット、前記記録タグ、および前記薬剤のライブラリーが、（ｉ）１つまたは複数の薬剤の前記小分子、ペプチドもしくはペプチドの模倣物、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド、β−ペプチドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物）、多糖、またはアプタマーと結合および／または反応する各タンパク質に付随する前記記録タグと（ｉｉ）前記１つまたは複数の薬剤のコーディングタグとの間の情報の移行を可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するように構成されている、キットが、本明細書で開示される。
【０３６４】
一態様では、ポリペプチドを解析するためのキットであって、（ａ）各結合性物質が、結合性部分、および前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、前記結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬により修飾された前記１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと；必要に応じて、（ｂ）各断片が記録タグに直接もしくは間接的に付随しているポリペプチドの断片のセット、または（ｂ’）ポリペプチドを断片化するための手段、例えばプロテアーゼとを含み、各断片および／もしくはそれに付随する記録タグ、または各結合性物質が、支持体に直接または間接的に固定化されており、前記ポリペプチドの断片のセット、前記記録タグ、および前記結合性物質のライブラリーが、（ｉ）各断片に付随する前記記録タグと（ｉｉ）前記コーディングタグとの間の情報の移行を、前記結合性部分と前記断片の１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸との結合時に可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するように構成されている、キットが、本明細書で開示される。
【０３６５】
一態様では、複数のポリペプチドを解析するためのキットであって、（ａ）各結合性物質が、結合性部分、および前記結合性部分に関する識別情報を含むコーディングタグを含み、前記結合性部分が、断片の１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、または官能化試薬により修飾された前記１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸に結合することが可能である、結合性物質のライブラリーと；（ｂ）複数のポリペプチドが必要に応じて固定化されている複数の基板であって、各基板が、コンパートメントタグを各々が含む複数の記録タグを含み、必要に応じて、各コンパートメントが、ビーズ、マイクロ流体液滴、マイクロウェル、もしくは表面上の分離された領域、またはこれらの任意の組合せであり、各基板上に固定化された前記ポリペプチドが、（例えば、プロテアーゼ切断により）断片化されて前記基板に固定化されたポリペプチド断片のセットを生成するように構成されている、複数の基板とを含む、キットであり；前記複数のポリペプチド、前記記録タグ、および前記結合性物質のライブラリーが、（ｉ）前記記録タグと（ｉｉ）前記コーディングタグとの間の情報の移行を、前記結合性部分と前記各断片の１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸との結合時に可能にして、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグを生成するように構成されている、キットが、本明細書で開示される。
【０３６６】
以下の態様は、本開示のさらなる実例を提供するものである。
【０３６７】
態様１．ポリペプチドを解析するための方法であって、（ａ）記録タグが必要に応じて直接または間接的に付随しているポリペプチドを提供するステップと；（ｂ）前記ポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学試薬で官能化するステップであって、前記化学試薬が、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2021501577.tif 000003
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化２】
2021501577.tif 000004
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の化合物：
【化３】
2021501577.tif 000005
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｖ）式（ＩＶ）の化合物：
【化４】
2021501577.tif 000006
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｖ）式（Ｖ）の化合物：
【化５】
2021501577.tif 000007
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）；
（ｖｉ）式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）；および
（ｖｉｉ）式（ＶＩＩ）の化合物：
【化６】
2021501577.tif 000008
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミンおよびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む、ステップと；
（ｃ）前記ポリペプチドを、前記官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性部分および
（ｃ１）前記第１の結合性部分に関する識別情報を有する第１のコーディングタグまたは
（ｃ２）第１の検出可能な標識
を含む第１の結合性物質と、接触させるステップと；
（ｄ）（ｄ１）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、伸長記録タグを生成し、前記伸長記録タグを解析するステップ、または
（ｄ２）前記第１の検出可能な標識を検出するステップと；
を含み；
ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の前に行われるか、ステップ（ｃ）後かつステップ（ｄ）の前に行われるか、またはステップ（ｄ）の後に行われる、方法。
【０３６８】
一部の実施形態では、この配列決定法は、「エドマン様」Ｎ末端アミノ酸分解プロセスを利用する。エドマン様分解は、２つの重要なステップ：１）前記ペプチドの前記ＮＴＡＡの□−アミンの官能化、および２）官能化されたＮＴＡＡの消去からなる。本明細書に記載の、標準的エドマン官能化化学、およびエドマン様官能化化学は、Ｎ末端プロリン残基のより不良な官能化および消去を示す。しかるが故に、Ｎ末端プロリンの存在は、周期的な配列決定反応の「ストール」につながることがある。それ故、本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、Ｎ末端プロリンだけを特異的に切断するプロリンアミノペプチダーゼ（プロリンイミノペプチダーゼ）に標的ポリペプチドを曝露することにより各エドマン様分解サイクルの開始時に一切のＮ末端プロリンを除去することが有益である。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法およびアッセイの各々は、分析されるポリペプチドをプロリンアミノペプチダーゼと接触させる追加のステップを必要に応じて含むことができる。同様に、これらの方法を実施するためのキットは、必要に応じて、少なくとも１つのプロリンアミノペプチダーゼを含むことができる。
【０３６９】
この目的に使用することができるいくつかのプロリンアミノペプチダーゼ（ＰＡＰ）が、文献で公知である。好ましい実施形態では、小さい単量体ＰＡＰ（約２５〜３５ｋＤａ）が、ＮＴＡＡプロリンの除去に利用される。本明細書に記載の方法およびキットでの使用に好適な単量体ＰＡＰは、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｔ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、およびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍからのファミリーメンバーを含む（ＭＥＲＯＰＳ  Ｓ３３．００１）（Nakajima, Ito et al. 2006）（Kitazono, Yoshimoto et al. 1992）。好適な多量体ＰＡＰも公知であり、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉからの酵素（Bolumar,Sanz et al. 2003）を含む。ネイティブなＰＡＰまたは操作されたＰＡＰのどちらかを利用することができる。プロリン残基を欠く本明細書における方法およびアッセイにより生成されるペプチド配列の有効なマッピングは、ペプチド読み取りデータを「プロリンマイナス」プロテオームにマッピングし戻すことにより実現することができる。バイオインフォマティクスレベルでは、本質的に、これは、２０ではなく１９アミノ酸残基で構成されているタンパク質に変わる。
【０３７０】
あるいは、プロリン情報を保持するために、プロリン除去前および除去後に２ステップの結合を利用してプロリン残基の検出を可能にすることができるが、これには、配列決定サイクルごとに余分な結合／エンコーディングサイクルの余分なコストがかかる。さらに、エドマン様化学をＲ基特異的アミノペプチダーゼと組み合わせるこの概念を使用して、ＮＴＦ／ＮＴＥが困難な任意のアミノ酸を除去することができるが、好ましい実施形態では、単一の困難なアミノ残基、典型的にはプロリン、のみが、アミノペプチダーゼにより除去される。多数の残基の除去は、除去される配列の組合せ激増につながる（すなわち、ＰおよびＷの除去は、Ｐの実行、Ｗの実行、およびＰとＷの実行での配列の除去につながる）。
【０３７１】
態様２．ステップ（ａ）が、支持体（例えば、固体支持体）に接合されている前記ポリペプチドおよび付随する記録タグを提供することを含む、態様１に記載の方法。
【０３７２】
態様３．ステップ（ａ）が、溶液中の付随する記録タグに接合されている前記ポリペプチドを提供することを含む、態様１に記載の方法。
【０３７３】
態様４．ステップ（ａ）が、記録タグが間接的に付随する前記ポリペプチドを提供することを含む、態様１に記載の方法。
【０３７４】
態様５．ステップ（ａ）では前記ポリペプチドに記録タグが付随していない、態様１に記載の方法。
【０３７５】
態様６．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の前に行われる、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３７６】
態様７．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の後かつステップ（ｄ）の前に行われる、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３７７】
態様８．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）の両方の後に行われる、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３７８】
態様９．ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ１）および（ｄ１）を逐次的に行う、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３７９】
態様１０．ステップ（ａ）、（ｃ１）、（ｂ）、および（ｄ１）を逐次的に行う、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３８０】
態様１１．ステップ（ａ）、（ｃ１）、（ｄ１）、および（ｂ）を逐次的に行う、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３８１】
態様１２．ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ２）および（ｄ２）を逐次的に行う、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３８２】
態様１３．ステップ（ａ）、（ｃ２）、（ｂ）、および（ｄ２）を逐次的に行う、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３８３】
態様１４．ステップ（ａ）、（ｃ２）、（ｄ２）、および（ｂ）を逐次的に行う、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３８４】
態様１５．ステップ（ｃ）が、前記ポリペプチドを、ステップ（ｂ）の官能化ＮＴＡＡ以外の官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な第２の（またはより高次の）結合性部分を含む第２の（またはより高次の）結合性物質、および前記第２の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有するコーディングタグと接触させることをさらに含む、態様１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【０３８５】
態様１６．前記ポリペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触が、前記ポリペプチドの前記第１の結合性物質との接触後に逐次的に行われる、態様１５に記載の方法。
【０３８６】
態様１７．前記ポリペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触が、前記ポリペプチドの前記第１の結合性物質との接触と同時に行われる、態様１５に記載の方法。
【０３８７】
態様１８．ポリペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）記録タグが必要に応じて直接または間接的に付随しているポリペプチドを提供するステップと；
（ｂ）前記ポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学試薬で官能化して官能化ＮＴＡＡを得るステップであって、前記化学試薬が、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物：
【化７】
2021501577.tif 000009
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化８】
2021501577.tif 000010
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の化合物：
【化９】
2021501577.tif 000011
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｖ）式（ＩＶ）の化合物：
【化１０】
2021501577.tif 000012
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｖ）式（Ｖ）の化合物：
【化１１】
2021501577.tif 000013
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）；
（ｖｉ）式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）；および
（ｖｉｉ）式（ＶＩＩ）の化合物：
【化１２】
2021501577.tif 000014
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミンおよびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む、ステップと；
（ｃ）前記ポリペプチドを、前記官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性部分および（ｃ１）第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグまたは（ｃ２）第１の検出可能な標識を含む前記第１の結合性物質と、接触させるステップと；
（ｄ）（ｄ１）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成し、前記伸長記録タグを解析するステップ、または
（ｄ２）前記第１の検出可能な標識を検出するステップと；
（ｅ）前記官能化ＮＴＡＡを消去して新しいＮＴＡＡを露出させるステップと
を含み；
ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の前に行われるか、ステップ（ｃ）の後かつステップ（ｄ）の前に行われるか、またはステップ（ｄ）の後に行われる、方法。
【０３８８】
本明細書で開示される方法およびキットのいずれかで使用するための式（Ｉ）の化合物の一部の実施形態では、Ｒ３は、単環式ヘテロアリール基である。式（Ｉ）の一部の実施形態では、Ｒ３は、５員または６員単環式ヘテロアリール基である。式（Ｉ）の一部の実施形態では、Ｒ３は、１つまたは複数のＮを含有する５員または６員単環式ヘテロアリール基である。好ましくは、Ｒ３は、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾールおよびテトラゾールから選択され、前記ピラゾール、イミダゾール、トリアゾールまたはテトラゾール環の窒素原子を介して式（Ｉ）のアミジンに連結されており、Ｒ３は、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、およびニトロから選択される基により、必要に応じて置換されている。一部の実施形態では、Ｒ３は、
【化１３】
2021501577.tif 000015
（式中、Ｇ１は、Ｎ、ＣＨ、またはＣＸであり、ここでのＸは、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、またはニトロである）
である。一部の実施形態では、Ｒ３は、
【化１４】
2021501577.tif 000016
であるか、またはここでのＸは、Ｍｅ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ３、もしくはＮＯ２である。一部の実施形態では、Ｒ３は、
【化１５】
2021501577.tif 000017
（式中、Ｇ１は、ＮまたはＣＨである）である。一部の実施形態では、Ｒ３は、
【化１６】
2021501577.tif 000018
である。一部の実施形態では、Ｒ３は、二環式ヘテロアリール基である。一部の実施形態では、Ｒ３は、９員または１０員二環式ヘテロアリール基である。一部の実施形態では、Ｒ３は、
【化１７】
2021501577.tif 000019
である。
【０３８９】
態様１９．ステップ（ａ）が、支持体（例えば、固体支持体）に接合されている前記ポリペプチドおよび付随する記録タグを提供することを含む、態様１８に記載の方法。
【０３９０】
態様２０．ステップ（ａ）が、溶液中の付随する記録タグに接合されている前記ポリペプチドを提供することを含む、態様１８に記載の方法。
【０３９１】
態様２１．ステップ（ａ）が、記録タグが間接的に付随する前記ポリペプチドを提供することを含む、態様１８に記載の方法。
【０３９２】
態様２２．ステップ（ａ）では前記ポリペプチドに記録タグが付随していない、態様１８に記載の方法。
【０３９３】
態様２３．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の前に行われる、態様１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０３９４】
態様２４．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の後かつステップ（ｄ）の前に行われる、態様１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０３９５】
態様２５．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）の両方の後に行われる、態様１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０３９６】
態様２６．ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ１）および（ｄ１）を逐次的に行う、態様１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０３９７】
態様２７．ステップ（ａ）、（ｃ１）、（ｂ）、および（ｄ１）を逐次的に行う、態様１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０３９８】
態様２８．ステップ（ａ）、（ｃ１）、（ｄ１）、および（ｂ）を逐次的に行う、態様１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０３９９】
態様２９．ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ２）および（ｄ２）を逐次的に行う、態様１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０４００】
態様３０．ステップ（ａ）、（ｃ２）、（ｂ）、および（ｄ２）を逐次的に行う、態様１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０４０１】
態様３１．ステップ（ａ）、（ｃ２）、（ｄ２）、および（ｂ）を逐次的に行う、態様１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０４０２】
態様３２．（ｆ）前記ポリペプチドの新しいＮＴＡＡを化学試薬で官能化して新しく官能化されたＮＴＡＡを得るステップと；
（ｇ）前記ポリペプチドを、前記新しく官能化されたＮＴＡＡに結合することが可能な第２の（またはより高次の）結合性部分と（ｇ１）前記第２の（もしくはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグまたは（ｇ２）第２の検出可能な標識とを含む第２の（またはより高次の）結合性物質と、接触させるステップと；
（ｈ）（ｈ１）前記第２のコーディングタグの情報を前記第１の伸長記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグを生成し、前記第２の伸長記録タグを解析するステップ、または
（ｈ２）前記第２の検出可能な標識を検出するステップと；
（ｉ）前記官能化ＮＴＡＡを消去して新しいＮＴＡＡを露出させるステップと
をさらに含み；
ステップ（ｆ）が、ステップ（ｇ）の前に行われるか、ステップ（ｇ）後かつステップ（ｈ）の前に行われるか、またはステップ（ｈ）の後に行われる、態様１８〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０４０３】
態様１〜３２のいずれかでは、方法は、前記ポリペプチドとプロリンアミノペプチダーゼとを、存在する一切のＮ末端プロリンを切断するのに好適な条件下で、通常は列挙されている方法ステップの前に、接触させるステップを、必要に応じてさらに含む。
【０４０４】
態様３３．前記化学試薬が、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物：
【化１８】
2021501577.tif 000020
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化１９】
2021501577.tif 000021
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の化合物：
【化２０】
2021501577.tif 000022
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｖ）式（ＩＶ）の化合物：
【化２１】
2021501577.tif 000023
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリル（heterocycl）であり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；および
（ｖ）式（Ｖ）の化合物：
【化２２】
2021501577.tif 000024
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）；および
（ｖｉ）式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）；および
（ｖｉｉ）式（ＶＩＩ）の化合物：
【化２３】
2021501577.tif 000025
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む、態様３２に記載の方法。
【０４０５】
態様３４．ステップ（ｆ）をステップ（ｇ）の前に行う、態様３２または態様３３に記載の方法。
【０４０６】
態様３５．ステップ（ｆ）をステップ（ｇ）の後かつステップ（ｈ）の前に行う、態様３２または態様３３に記載の方法。
【０４０７】
態様３６．ステップ（ｆ）をステップ（ｇ）とステップ（ｈ）の両方の後に行う、態様３２または態様３３に記載の方法。
【０４０８】
態様３７．ステップ（ｆ）、（ｇ１）および（ｈ１）を逐次的に行う、態様３２または態様３３に記載の方法。
【０４０９】
態様３８．ステップ（ｇ１）、（ｆ）、および（ｈ１）を逐次的に行う、態様３２または態様３３に記載の方法。
【０４１０】
態様３９．ステップ（ｇ１）、（ｈ１）、および（ｆ）を逐次的に行う、態様３２または態様３３に記載の方法。
【０４１１】
態様４０．ステップ（ｆ）、（ｇ２）および（ｈ２）を逐次的に行う、態様３２または態様３３に記載の方法。
【０４１２】
態様４１．ステップ（ｇ２）、（ｆ）、および（ｈ２）を逐次的に行う、態様３２または態様３３に記載の方法。
【０４１３】
態様４２．ステップ（ｇ２）、（ｈ２）および（ｆ）を逐次的に行う、態様３２または態様３３に記載の方法。
【０４１４】
態様４３．前記ポリペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ポリペプチドの前記第１の結合性物質との接触後に逐次的に行う、態様３２〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０４１５】
態様４４．前記ポリペプチドの前記第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、前記ポリペプチドの前記第１の結合性物質との接触と同時に行う、態様３２〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０４１６】
態様４５．前記ポリペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することにより得られる、態様１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【０４１７】
態様４６．前記記録タグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、保護された塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、もしくはモルホリノＤＮＡ、またはこれらの組合せを含む、態様１〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０４１８】
態様４７．前記ＤＮＡ分子が、骨格修飾、糖修飾、または核酸塩基修飾されている、態様４６に記載の方法。
【０４１９】
態様４８．前記ＤＮＡ分子が、Ａｌｌｏｃなどの核酸塩基保護基、チイラン（thiarane）などの電子吸引性保護基、アセチル保護基、ニトロベンジル保護基、スルホン酸保護基、またはＵｌｔｒａｍｉｌｄ試薬を含む旧来の塩基不安定性保護基を有する、態様４６に記載の方法。
【０４２０】
態様４９．前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、態様１〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【０４２１】
態様５０．前記ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、態様４９に記載の方法。
【０４２２】
態様５１．前記記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、態様１〜５０に記載の方法。
【０４２３】
態様５２．前記記録タグが、バーコードを含む、態様１〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【０４２４】
態様５３．前記記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、態様１〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【０４２５】
態様５４．前記ポリペプチドおよび前記付随する記録タグが、前記支持体に共有結合により接合されている、態様１〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【０４２６】
態様５５．前記支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、態様１〜５４のいずれか１つに記載の方法。
【０４２７】
態様５６．前記支持体が、金、銀、半導体または量子ドットを含む、態様５５に記載の方法。
【０４２８】
態様５７．前記ナノ粒子が、金、銀、または量子ドットを含む、態様５５に記載の方法。
【０４２９】
態様５８．前記支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、態様５５に記載の方法。
【０４３０】
態様５９．複数のポリペプチドおよび付随する記録タグが、支持体に接合されている、態様１〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【０４３１】
態様６０．前記複数のポリペプチドの間に支持体上で間隔をあけ、前記ポリペプチド間の平均距離が、約≧２０ｎｍである、態様５９に記載の方法。
【０４３２】
態様６１．前記結合性物質の前記結合性部分が、ペプチドまたはタンパク質を含む、態様１〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３３】
態様６２．前記結合性物質の前記結合性部分が、アミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アンチカリンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳ（例えば、ＣｌｐＳ２）またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；あるいはアミノ酸に結合する修飾小分子、すなわちバンコマイシンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾分子；あるいは抗体またはその結合断片；あるいはこれらの任意の組合せを含む、態様１〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【０４３４】
態様６３．前記結合性物質が、単一のアミノ酸残基（例えば、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、もしくは内部アミノ酸残基）、ジペプチド（例えば、Ｎ末端ジペプチド、Ｃ末端ジペプチド、もしくは内部ジペプチド）、トリペプチド（例えば、Ｎ末端トリペプチド、Ｃ末端トリペプチド、もしくは内部トリペプチド）、または前記ポリペプチドの翻訳後修飾に結合する、態様１〜６２のいずれか１つに記載の方法。
【０４３５】
態様６４．前記結合性物質が、ＮＴＡＡ官能化単一アミノ酸残基、ＮＴＡＡ官能化ジペプチド、ＮＴＡＡ官能化トリペプチド、またはＮＴＡＡ官能化ポリペプチドに結合する、態様１〜６２のいずれか１つに記載の方法。
【０４３６】
態様６５．前記結合性物質の前記結合性部分が、前記ポリペプチドに選択的に結合することが可能である、態様１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０４３７】
態様６６．前記コーディングタグが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せである、態様１〜６５のいずれか１つに記載の方法。
【０４３８】
態様６７．前記コーディングタグが、エンコーダーまたはバーコード配列を含む、態様１〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【０４３９】
態様６８．前記コーディングタグが、スペーサー、結合サイクル特異的配列、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、態様１〜６７のいずれか１つに記載の方法。
【０４４０】
態様６９．前記結合性部分および前記コーディングタグが、リンカーにより接合されている、態様１〜６８のいずれか１つに記載の方法。
【０４４１】
態様７０．前記結合性部分および前記コーディングタグが、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、またはＨａｌｏＴａｇ／ＨａｌｏＴａｇリガンド対によって接合されている、態様１〜６９に記載の方法。
【０４４２】
態様７１．前記コーディングタグの情報の前記記録タグへの移行が、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼによって媒介される、態様１〜７０のいずれか１つに記載の方法。
【０４４３】
態様７２．前記コーディングタグの情報の前記記録タグへの移行が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素によって媒介される、態様１〜７０のいずれか１つに記載の方法。
【０４４４】
態様７３．前記コーディングタグの情報の前記記録タグへの移行が、化学的ライゲーションによって媒介される、態様１〜７０のいずれか１つに記載の方法。
【０４４５】
態様７４．前記化学的ライゲーションが、一本鎖ＤＮＡを使用して実施される、態様７３に記載の方法。
【０４４６】
７５．前記化学的ライゲーションが、二本鎖ＤＮＡを使用して実施される、態様７４に記載の方法。
【０４４７】
７６．前記伸長記録タグの解析が、核酸配列決定法を含む、態様１〜７２のいずれか１つに記載の方法。
【０４４８】
７７．前記核酸配列決定法が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、態様７６に記載の方法。
【０４４９】
７８．前記核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、態様７６に記載の方法。
【０４５０】
７９．前記伸長記録タグが、解析前に増幅される、態様１〜７８のいずれか１つに記載の方法。
【０４５１】
８０．サイクル標識を付加するステップをさらに含む、態様１〜７９のいずれか１つに記載の方法。
【０４５２】
８１．前記サイクル標識が、前記結合性物質による前記ポリペプチドへの結合の順序に関する情報を提供する、態様８０に記載の方法。
【０４５３】
８２．前記サイクル標識が、前記コーディングタグに付加される、態様８０または態様８１に記載の方法。
【０４５４】
８３．前記サイクル標識が、前記記録タグに付加される、態様８０または態様８１に記載の方法。
【０４５５】
８４．前記サイクル標識が、前記結合性物質に付加される、態様８０または態様８１に記載の方法。
【０４５６】
８５．前記サイクル標識が、前記コーディングタグ、記録タグ（recording tab）および結合性物質とは独立に付加される、態様８０または態様８１に記載の方法。
【０４５７】
８６．前記伸長記録タグに含有されるコーディングタグ情報の順序が、前記結合性物質による前記ポリペプチドへの結合の順序に関する情報を提供する、態様１〜８５のいずれか１つに記載の方法。
【０４５８】
８７．前記伸長記録タグに含有されるコーディングタグ情報の頻度が、前記結合性物質による前記ポリペプチドへの結合の頻度に関する情報を提供する、態様１〜８６のいずれか１つに記載の方法。
【０４５９】
８８．複数のポリペプチドを表す複数の伸長記録タグが、並行して解析される、態様１〜８７のいずれか１つに記載の方法。
【０４６０】
８９．複数のポリペプチドを表す前記複数の伸長記録タグが、多重化アッセイで解析される、態様８８に記載の方法。
【０４６１】
９０．前記複数の伸長記録タグが、解析前に標的濃縮アッセイされる、態様８８または８９に記載の方法。
【０４６２】
９１．前記複数の伸長記録タグが、解析前にサブトラクションアッセイされる、態様８８〜９０のいずれか１つに記載の方法。
【０４６３】
９２．前記複数の伸長記録タグが、極めて豊富な種を低減させるために解析前に正規化アッセイされる、態様８８〜９１のいずれか１つに記載の方法。
【０４６４】
９３．前記ＮＴＡＡが、化学的切断または酵素的切断により前記ポリペプチドから消去される、態様１〜９２のいずれか１つに記載の方法。
【０４６５】
９４．前記ＮＴＡＡが、カルボキシペプチダーゼもしくはアミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは修飾タンパク質；ヒドロラーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは修飾タンパク質；穏やかなエドマン分解；エドマナーゼ酵素；ＴＦＡ、塩基；あるいはこれらの任意の組合せにより消去される、態様９３に記載の方法。
【０４６６】
９５．前記穏やかなエドマン分解が、ジクロロまたはモノクロロ酸を使用する、態様９４に記載の方法。
【０４６７】
９６．前記穏やかなエドマン分解が、ＴＦＡ、ＴＣＡ、またはＤＣＡを使用する、態様９４に記載の方法。
【０４６８】
９７．前記穏やかなエドマン分解が、酢酸トリエチルアンモニウム（Ｅｔ３ＮＨＯＡｃ）を使用する、態様９４に記載の方法。
【０４６９】
９８．前記塩基が、水酸化物、アルキル化アミン、環状アミン、炭酸緩衝剤、または金属塩である、態様９４に記載の方法。
【０４７０】
９９．前記水酸化物が、水酸化ナトリウムである、態様９８に記載の方法。
【０４７１】
１００．前記アルキル化アミンが、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、アニリン、ジフェニルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、およびリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）から選択される、態様９８に記載の方法。
【０４７２】
１０１．前記環状アミンが、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、ピロール、インドール、ピペリジン、ピロリジン（prolidine）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、および１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン（ＤＢＮ）から選択される、態様９８に記載の方法。
【０４７３】
１０２．前記炭酸緩衝剤が、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、または炭酸水素カルシウムを含む、態様９８に記載の方法。
【０４７４】
１０３．前記金属塩が、銀を含む、態様９８に記載の方法。
【０４７５】
１０４．前記金属塩が、ＡｇＣｌＯ４である、態様１０３に記載の方法。
【０４７６】
１０５．少なくとも１つの結合性物質が、末端アミノ酸残基、末端ジアミノ酸残基、または末端トリアミノ酸残基に結合する、態様１〜１０４のいずれか１つに記載の方法。
【０４７７】
１０６．少なくとも１つの結合性物質が、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合する、態様１〜１０５のいずれか１つに記載の方法。
【０４７８】
１０７．前記化学試薬が、式（Ｉ）の化合物：
【化２４】
2021501577.tif 000026
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、およびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化２５】
2021501577.tif 000027
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）
からなる群から選択される化合物を含む、態様１〜１０６のいずれか１つに記載の方法。
【０４７９】
１０８．Ｒ１が、
【化２６】
2021501577.tif 000028
である、態様１０７に記載の方法。
【０４８０】
１０９．Ｒ２が、
【化２７】
2021501577.tif 000029
である、態様１０７または１０８に記載の方法。
【０４８１】
１１０．Ｒ１またはＲ２が、
【化２８】
2021501577.tif 000030
である、態様１０７〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
【０４８２】
１１１．Ｒ３が、
【化２９】
2021501577.tif 000031
（式中、Ｇ１は、ＮまたはＣＨである）
である、態様１０７〜１１０のいずれか１つに記載の方法。
【０４８３】
１１２．Ｒ３が、
【化３０】
2021501577.tif 000032
【化３１】
2021501577.tif 000033
である、態様１０７〜１１０のいずれか１つに記載の方法。
【０４８４】
１１３．前記式（Ｉ）の化合物が、
【化３２】
2021501577.tif 000034
【化３３】
2021501577.tif 000035
からなる群であって、必要に応じて、以下のものから選択される化合物：
【化３４】
2021501577.tif 000036
（Ｎ−Ｂｏｃ，Ｎ’−トリフルオロアセチル−ピラゾールカルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’−ビスアセチル−ピラゾールカルボキサミジン、Ｎ−メチル−ピラゾールカルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’−ビスアセチル−Ｎ−メチル−ピラゾールカルボキサミジン、Ｎ，Ｎ’−ビスアセチル−Ｎ−メチル−４−ニトロ−ピラゾールカルボキサミジン、およびＮ，Ｎ’−ビスアセチル−Ｎ−メチル−４−トリフルオロメチル−ピラゾールカルボキサミジン）、またはその塩もしくはコンジュゲート
をさらに含む群から選択される、態様１０７に記載の方法。
【０４８５】
１１４．前記化学試薬が、向山試薬（ヨウ化２−クロロ−１−メチルピリジニウム）をさらに含む、態様１０７〜１１３のいずれか１つに記載の方法。
【０４８６】
１１５．前記化学試薬が、式（ＩＩ）の化合物：
【化３５】
2021501577.tif 000037
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）
からなる群から選択される化合物を含む、態様１〜１０６のいずれか１つに記載の方法。
【０４８７】
１１６．Ｒ４が、カルボキシベンジルである、態様１１５に記載の方法。
【０４８８】
１１７．Ｒ４が、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇであり、Ｒｇが、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルで必要に応じて置換されている、Ｃ２〜６アルケニルである、態様１１５に記載の方法。
【０４８９】
１１８．前記化合物が、
【化３６】
2021501577.tif 000038
、またはその塩もしくはコンジュゲート、からなる群から選択される、態様１１５に記載の方法。
【０４９０】
１１９．前記化学試薬が、ＴＭＳ−Ｃｌ、Ｓｃ（ＯＴｆ）２、Ｚｎ（ＯＴｆ）２、またはランタニド含有試薬をさらに含む、態様１１５〜１１８のいずれか１つに記載の方法。
【０４９１】
１２０．前記化学試薬が、式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、およびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）
からなる群から選択される化合物を含む、態様１〜１０６のいずれか１つに記載の方法。
【０４９２】
１２１．Ｒ５が、置換フェニルである、態様１２０に記載の方法。
【０４９３】
１２２．Ｒ５が、ハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、およびヘテロシクリルからなる群から選択される１つまたは複数の基で置換されている、フェニルである、態様１２０または態様１２１に記載の方法。
【０４９４】
１２３．前記式（ＩＩＩ）の化合物が、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳＩＴＣ）またはペンタフルオロフェニルイソチオシアネート（ＰＦＰＩＴＣ）である、態様１２０に記載の方法。
【０４９５】
１２４．前記化学試薬が、カルボジイミド化合物をさらに含む、態様１２０〜１２３のいずれか１つに記載の方法。
【０４９６】
１２５．前記ＮＴＡＡが、トリフルオロ酢酸または塩酸を使用して消去される、態様１２０〜１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０４９７】
１２６．前記ＮＴＡＡが、穏やかなエドマン分解を使用して消去される、態様１２０〜１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０４９８】
１２７．前記ＮＴＡＡが、エドマナーゼまたは操作されたヒドロラーゼ、アミノペプチダーゼもしくはカルボキシペプチダーゼを使用して消去される、態様１２０〜１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０４９９】
１２８．前記化学試薬が、式（ＩＶ）の化合物：
【化３７】
2021501577.tif 000039
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）
からなる群から選択される化合物を含む、態様１〜１０６のいずれか１つに記載の方法。
【０５００】
１２９．Ｒ６およびＲ７が、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキルまたはシクロアルキルである、態様１２８に記載の方法。
【０５０１】
１３０．前記化合物が、
【化３８】
2021501577.tif 000040
【化３９】
2021501577.tif 000041
、またはその塩もしくはコンジュゲート、からなる群から選択される、態様１２８に記載の方法。
【０５０２】
１３１．前記式（ＩＶ）の化合物が、対応するチオ尿素の脱硫により調製される、態様１２８〜１３０のいずれか１つに記載の方法。
【０５０３】
１３２．前記化学試薬が、向山試薬（ヨウ化２−クロロ−１−メチルピリジニウム）をさらに含む、態様１２８〜１３１のいずれか１つに記載の方法。
【０５０４】
１３３．前記化学試薬が、ルイス酸をさらに含む、態様１２８〜１３１のいずれか１つに記載の方法。
【０５０５】
１３４．前記ルイス酸が、Ｎ−（（アリール）イミノ−アセナフテノン（acenapthenone））ＺｎＣｌ２、Ｚｎ（ＯＴｆ）２、ＺｎＣｌ２、ＰｄＣｌ２、ＣｕＣｌ、およびＣｕＣｌ２から選択される、態様１３３に記載の方法。
【０５０６】
１３５．前記化学試薬が、式（Ｖ）の化合物：
【化４０】
2021501577.tif 000042
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）
からなる群から選択される化合物を含む、態様１〜１０６のいずれか１つに記載の方法。
【０５０７】
１３６．Ｒ８が、クロロである、態様１３５に記載の方法。
【０５０８】
１３７．Ｒ９が、水素またはブロモである、態様１３５または態様１３６に記載の方法。
【０５０９】
１３８．前記化学試薬が、ペプチドカップリング試薬をさらに含む、態様１３５〜１３７のいずれか１つに記載の方法。
【０５１０】
１３９．前記ペプチドカップリング試薬が、カルボジイミド化合物である、態様１３８に記載の方法。
【０５１１】
１４０．前記カルボジイミド化合物が、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）である、態様１３９に記載の方法。
【０５１２】
１４１．前記ＮＴＡＡが、アシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）を使用して消去される、態様１３５〜１４０のいずれか１つに記載の方法。
【０５１３】
１４２．前記化学試薬が、式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）
を含む、態様１〜１０６のいずれか１つに記載の方法。
【０５１４】
１４３．Ｍが、Ｃｏである、態様１４２に記載の方法。
【０５１５】
１４４．前記化学試薬が、シス−β−ヒドロキシアクオ（トリエチレンテトラミン）コバルト（ＩＩＩ）錯体を含む、態様１４２または態様１４３に記載の方法。
【０５１６】
１４５．前記化学試薬が、β−［Ｃｏ（ｔｒｉｅｎ）（ＯＨ）（ＯＨ２）］２＋を含む、態様１４２に記載の方法。
【０５１７】
１４６．前記化学試薬が、式（ＶＩＩ）の化合物：
【化４１】
2021501577.tif 000043
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む、態様１〜１０６のいずれか１つに記載の方法。
【０５１８】
１４７．Ｇ１がＣＨ２であり、Ｇ２がＣＨであるか、またはＧ１がＮＨであり、Ｇ２がＮである、態様１４６に記載の方法。
【０５１９】
１４８．Ｒ１２が、Ｈである、態様１４６または１４７に記載の方法。
【０５２０】
１４９．Ｒ１０およびＲ１１が、各々、Ｈである、態様１４６〜１４８のいずれか１つに記載の方法。
【０５２１】
１５０．前記式（ＶＩＩ）の化合物が、
【化４２】
2021501577.tif 000044
【化４３】
2021501577.tif 000045
、またはその塩もしくはコンジュゲート、からなる群から選択される、態様１４６に記載の方法。
【０５２２】
１５１．前記ＮＴＡＡが、塩基を使用して消去される、態様１０７〜１５０のいずれか１つに記載の方法。
【０５２３】
１５２．前記塩基が、水酸化物、アルキル化アミン、環状アミン、炭酸緩衝剤、または金属塩である、態様１５１に記載の方法。
【０５２４】
１５３．前記水酸化物が、水酸化ナトリウムである、態様１５２に記載の方法。
【０５２５】
１５４．前記アルキル化アミンが、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、アニリン、ジフェニルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、およびリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）から選択される、態様１５２に記載の方法。
【０５２６】
１５５．前記環状アミンが、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、ピロール、インドール、ピペリジン、ピロリジン（proolidine）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、および１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン（ＤＢＮ）から選択される、態様１５２に記載の方法。
【０５２７】
１５６．前記炭酸緩衝剤が、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、または炭酸水素カルシウムを含む、態様１５２に記載の方法。
【０５２８】
１５７．前記金属塩が、銀を含む、態様１５２に記載の方法。
【０５２９】
１５８．前記金属塩が、ＡｇＣｌＯ４である、態様１５２に記載の方法。
【０５３０】
１５９．前記化学試薬が、
【化４４】
2021501577.tif 000046
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、態様１において式（Ｉ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化４５】
2021501577.tif 000047
（式中、Ｒ４は、態様１において式（ＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化４６】
2021501577.tif 000048
（式中、Ｒ５は、態様１において式（ＩＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化４７】
2021501577.tif 000049
（式中、Ｒ６およびＲ７は、態様１において式（ＩＶ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化４８】
2021501577.tif 000050
（式中、Ｒ８およびＲ９は、態様１において式（Ｖ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
（ＭＬｎ）−Ｑ    式（ＶＩ）−Ｑ
（式中、Ｍ、Ｌ、およびｎは、態様１において式（ＶＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化４９】
2021501577.tif 000051
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｇ１、Ｇ２、およびｐは、態様１において式（ＶＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）
からなる群から選択されるコンジュゲートを含む、態様１〜１５８のいずれか１つに記載の方法。
【０５３１】
１６０．前記Ｑが、−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ２〜６アルケニル、−Ｃ２〜６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒｎ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ、−−ＳＲｐまたは−Ｓ（Ｏ）２Ｒｑからなる群から選択され、ここで、−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ２〜６アルケニル、−Ｃ２〜６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルが、各々、非置換であるか、置換されており、ならびにＲｎ、Ｒｏ、Ｒｐ、およびＲｑが、各々独立して、−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ１〜６ハロアルキル、−Ｃ２〜６アルケニル、−Ｃ２〜６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルからなる群から選択される、態様１５９に記載の方法。
【０５３２】
１６１．前記Ｑが、
【化５０】
2021501577.tif 000052
からなる群から選択される、態様１５９に記載の方法。
【０５３３】
１６２．Ｑが、フルオロフォアである、態様１５９に記載の方法。
【０５３４】
１６３．態様１または態様５のステップ（ｂ）が、前記ＮＴＡＡの二官能化を含む、態様１〜１６２のいずれか１つに記載の方法。
【０５３５】
１６４．態様１または態様５のステップ（ｂ）が、前記ＮＴＡＡを、（１）式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）および（ＶＩＩ）の化合物、またはその塩もしくはコンジュゲート、からなる群から選択される化合物を含む第１の化学試薬、および（２）第２の化学試薬で、二官能化することを含む、態様１６３に記載の方法。
【０５３６】
１６５．前記第２の化学試薬が、式（ＶＩＩＩａ）または（ＶＩＩＩｂ）の化合物：
【化５１】
2021501577.tif 000053
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；または
Ｒ１３−Ｘ    （ＶＩＩＩｂ）
（式中、
Ｒ１３は、Ｃ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、これらの各々は、非置換であるか、または置換されており、
Ｘは、ハロゲンである）
を含む、態様１６４に記載の方法。
【０５３７】
１６６．態様１または態様５のステップ（ｂ）が、前記ＮＴＡＡを、前記第１の化学試薬で官能化する前に、前記第２の化学試薬で官能化することを含む、１６４または１６５に記載の方法。
【０５３８】
１６７．態様１または態様５のステップ（ｂ）が、前記ＮＴＡＡを、前記第２の化学試薬で官能化する前に、前記第１の化学試薬で官能化することを含む、１６４または１６５に記載の方法。
【０５３９】
１６８．態様６のステップ（ｆ）が、前記ＮＴＡＡの二官能化を含む、態様３２〜１６７のいずれか１つに記載の方法。
【０５４０】
１６９．態様６のステップ（ｆ）が、前記ＮＴＡＡを、（１）式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）および（ＶＩＩ）の化合物からなる群から選択される化合物を含む第１の化学試薬、および（２）第２の化学試薬で、二官能化することを含む、態様１６８に記載の方法。
【０５４１】
１７０．前記第２の化学試薬が、式（ＶＩＩＩａ）または（ＶＩＩＩｂ）の化合物：
【化５２】
2021501577.tif 000054
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；または
Ｒ１３−Ｘ    （ＶＩＩＩｂ）
（式中、
Ｒ１３は、Ｃ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、これらの各々は、非置換であるか、または置換されており、
Ｘは、ハロゲンである）
を含む、態様１６９に記載の方法。
【０５４２】
１７１．態様１または態様５のステップ（ｂ）が、前記ＮＴＡＡを、前記第１の化学試薬で官能化する前に、前記第２の化学試薬で官能化することを含む、１６９または１７０に記載の方法。
【０５４３】
１７２．態様１または態様５のステップ（ｂ）が、前記ＮＴＡＡを、前記第２の化学試薬で官能化する前に、前記第１の化学試薬で官能化することを含む、１６９または１７０に記載の方法。
【０５４４】
１７３．前記式（ＶＩＩＩａ）の化合物が、ホルムアルデヒドである、態様１６５〜１６７および１７０〜１７２のいずれか１つに記載の方法。
【０５４５】
１７４．前記式（ＶＩＩＩｂ）の化合物が、ヨウ化メチルである、態様１６５〜１６７および１７０〜１７２のいずれか１つに記載の方法。
【０５４６】
１７５．複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを含む試料由来の１つまたは複数のポリペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）前記試料中の前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するステップであって、各コンパートメントが、支持体（例えば、固体支持体）に必要に応じて接合されている複数のコンパートメントタグを含み、前記複数のコンパートメントタグが、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；
（ｂ）前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、および／またはポリペプチドを複数のポリペプチドに断片化するステップと；
（ｃ）前記複数のポリペプチドと前記複数のコンパートメント内の前記複数のコンパートメントタグとのアニーリングまたは接合を可能にするのに十分な条件下で前記複数のポリペプチドを前記複数のコンパートメントタグと接触させることによって複数のコンパートメントタグ付きポリペプチドを生成するステップと；
（ｄ）前記コンパートメントタグ付きポリペプチドを前記複数のコンパートメントから収集するステップと；
（ｅ）１つまたは複数のコンパートメントタグ付きポリペプチドを、態様１〜１７４のいずれか１つに記載の方法に従って解析するステップと
を含む方法。
【０５４７】
１７６．前記コンパートメントが、マイクロ流体液滴である、態様１７５に記載の方法。
【０５４８】
１７７．前記コンパートメントが、マイクロウェルである、態様１７５に記載の方法。
【０５４９】
１７８．前記コンパートメントが、表面上の分離された領域である、態様１７５に記載の方法。
【０５５０】
１７９．各コンパートメントが、平均して単一の細胞を含む、態様１７５〜１７８のいずれか１つに記載の方法。
【０５５１】
１８０．複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを含む試料由来の１つまたは複数のポリペプチドを解析するための方法であって、
（ａ）前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のユニバーサルＤＮＡタグで標識するステップと；
（ｂ）前記試料中の前記複数の標識されたタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するステップであって、各コンパートメントが、複数のコンパートメントタグを含み、前記複数のコンパートメントタグが、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、ステップと；
（ｃ）前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドと前記複数のコンパートメント内の前記複数のコンパートメントタグとのアニーリングまたは接合を可能にするのに十分な条件下で前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを前記複数のコンパートメントタグと接触させることによって複数のコンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを生成するステップと；
（ｄ）前記コンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを前記複数のコンパートメントから収集するステップと；
（ｅ）必要に応じて前記コンパートメントタグ付きタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドをコンパートメントタグ付きポリペプチドに断片化するステップと；
（ｆ）１つまたは複数のコンパートメントタグ付きポリペプチドを、態様１〜１７４のいずれか１つに記載の方法に従って解析するステップと
を含む方法。
【０５５２】
１８１．コンパートメントタグ情報が、ポリペプチドに付随する記録タグに、プライマー伸長またはライゲーションによって移行される、態様１７５〜１８０のいずれか１つに記載の方法。
【０５５３】
１８２．前記支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、態様１７５〜１８１のいずれか１つに記載の方法。
【０５５４】
１８３．前記支持体が、ビーズを含む、態様１７５〜１８１のいずれか１つに記載の方法。
【０５５５】
１８４．前記ビーズが、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、態様１８３に記載の方法。
【０５５６】
１８５．前記コンパートメントタグが、一本鎖または二本鎖核酸分子を含む、態様１７５〜１８４のいずれか１つに記載の方法。
【０５５７】
１８６．前記コンパートメントタグが、バーコードおよび必要に応じてＵＭＩを含む、態様１７５〜１８５のいずれか１つに記載の方法。
【０５５８】
１８７．前記支持体がビーズであり、前記コンパートメントタグがバーコードを含み、さらに、前記複数のコンパートメントタグが接合されているビーズが、スプリット・アンド・プール合成により形成される、態様１８６に記載の方法。
【０５５９】
１８８．前記支持体がビーズであり、前記コンパートメントタグがバーコードを含み、さらに、複数のコンパートメントタグが接合されているビーズが、個々の合成または固定化により形成される、態様１８６に記載の方法。
【０５６０】
１８９．前記コンパートメントタグが、記録タグ内の成分であり、前記記録タグが、必要に応じて、スペーサー、バーコード配列、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、態様１７５〜１８８のいずれか１つに記載の方法。
【０５６１】
１９０．前記コンパートメントタグが、前記複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドの内部アミノ酸、ペプチド骨格、またはＮ末端アミノ酸と反応することができる機能的部分をさらに含む、態様１７５〜１８９のいずれか１つに記載の方法。
【０５６２】
１９１．前記機能的部分が、アルデヒド、アジド／アルキン、またはマレイミド／チオール、またはエポキシド／求核試薬、または逆電子要請型ディールス−アルダー（ｉＥＤＤＡ）基である、態様１９０に記載の方法。
【０５６３】
１９２．前記機能的部分が、アルデヒド基である、態様１９０に記載の方法。
【０５６４】
１９３．前記複数のコンパートメントタグが、前記コンパートメントタグを前記コンパートメントに印刷、スポッティング、インク噴射すること、またはその組合せにより形成される、態様１７５〜１９２のいずれか１つに記載の方法。
【０５６５】
１９４．前記コンパートメントタグが、ポリペプチドをさらに含む、態様１７５〜１９３のいずれか１つに記載の方法。
【０５６６】
１９５．前記コンパートメントタグポリペプチドが、タンパク質リガーゼ認識配列を含む、態様１９４に記載の方法。
【０５６７】
１９６．前記タンパク質リガーゼが、ブテラーゼＩまたはそのホモログである、態様１９５に記載の方法。
【０５６８】
１９７．前記複数のポリペプチドが、プロテアーゼで断片化される、態様１７５〜１９６のいずれか１つに記載の方法。
【０５６９】
１９８．前記プロテアーゼが、メタロプロテアーゼである、態様１９７に記載の方法。
【０５７０】
１９９．前記メタロプロテアーゼの活性が、金属カチオンの光活性化放出によりモジュレートされる、態様１９８に記載の方法。
【０５７１】
２００．前記複数のポリペプチドを前記複数のコンパートメントに分配する前に１つまたは複数の豊富なタンパク質を前記試料からサブトラクションすることをさらに含む、態様１７５〜１９９のいずれか１つに記載の方法。
【０５７２】
２０１．前記複数のポリペプチドと前記コンパートメントタグを接合させる前に前記コンパートメントタグを前記支持体から遊離させることをさらに含む、態様１７５〜２００に記載の方法。
【０５７３】
２０２．ステップ（ｄ）の後に、前記コンパートメントタグ付きポリペプチドを支持体に記録タグを伴って接合させることをさらに含む、態様１７５に記載の方法。
【０５７４】
２０３．前記コンパートメントタグ付きポリペプチド上の前記コンパートメントタグの情報を前記付随する記録タグに移行させることをさらに含む、態様２０２に記載の方法。
【０５７５】
２０４．ステップ（ｅ）の前に前記コンパートメントタグを前記コンパートメントタグ付きポリペプチドから除去することをさらに含む、態様２０３に記載の方法。
【０５７６】
２０５．解析されるポリペプチドが由来する前記単一の細胞の同一性を、前記解析されるポリペプチドのコンパートメントタグ配列に基づいて決定することをさらに含む、態様１７５〜２０４のいずれか１つに記載の方法。
【０５７７】
２０６．解析されるポリペプチドが由来する前記タンパク質またはタンパク質複合体の同一性を、前記解析されるポリペプチドのコンパートメントタグ配列に基づいて決定することをさらに含む、態様１７５〜２０４のいずれか１つに記載の方法。
【０５７８】
２０７．ステップ（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、および（ｉ）が、多数のアミノ酸を用いて繰り返される、態様３２〜２０６のいずれか１つに記載の方法。
【０５７９】
２０８．ステップ（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、および（ｉ）が、２つまたはそれより多くのアミノ酸を用いて繰り返される、態様２０７に記載の方法。
【０５８０】
２０９．ステップ（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）が、最大約１００のアミノ酸を用いて繰り返される、態様２０７に記載の方法。
【０５８１】
２１０．ポリペプチドを解析するためのキットであって、
（ａ）記録タグが必要に応じて直接または間接的に付随しているポリペプチドをもたらすための試薬と；
（ｂ）前記ポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を官能化するための試薬であって、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物：
【化５３】
2021501577.tif 000055
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化５４】
2021501577.tif 000056
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の化合物：
【化５５】
2021501577.tif 000057
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｖ）式（ＩＶ）の化合物：
【化５６】
2021501577.tif 000058
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｖ）式（Ｖ）の化合物：
【化５７】
2021501577.tif 000059
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）；
（ｖｉ）式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）；および
（ｖｉｉ）式（ＶＩＩ）の化合物：
【化５８】
2021501577.tif 000060
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む試薬と；
（ｃ）前記官能化ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性部分と（ｃ１）前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグまたは（ｃ２）第１の検出可能な標識とを含む第１の結合性物質と；
（ｄ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて伸長記録タグを生成するための試薬と；必要に応じて
（ｅ）前記伸長記録タグを解析するための試薬、または前記第１の検出可能な標識を検出するための試薬と
を含むキット。
【０５８２】
２１１．（ａ）の前記試薬が、支持体（例えば、固体支持体）に接合されている前記ポリペプチドおよび付随する記録タグをもたらすように構成されている、態様２１０に記載のキット。
【０５８３】
２１２．（ａ）の前記試薬が、溶液中の記録タグが直接付随しているポリペプチドをもたらすように構成されている、態様２１０に記載のキット。
【０５８４】
２１３．（ａ）の前記試薬が、記録タグが間接的に付随しているポリペプチドをもたらすように構成されている、態様２１０に記載のキット。
【０５８５】
２１４．（ａ）の前記試薬が、記録タグが付随していないポリペプチドをもたらすように構成されている、態様２１０に記載のキット。
【０５８６】
２１５．前記ポリペプチドのＮＴＡＡを官能化するための２つまたはそれより多くの異なる試薬を含む、態様２１０〜２１４のいずれか１つに記載のキット。
【０５８７】
２１６．態様１２５に記載の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）および（ＶＩＩ）の化合物、またはその塩もしくはコンジュゲート、からなる群から選択される化合物を含む第１の試薬と、第２の試薬とを含む、態様２１５に記載のキット。
【０５８８】
２１７．前記第２の試薬が、式（ＶＩＩＩａ）または（ＶＩＩＩｂ）の化合物：
【化５９】
2021501577.tif 000061
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；または
Ｒ１３−Ｘ    （ＶＩＩＩｂ）
（式中、
Ｒ１３は、Ｃ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、これらの各々は、非置換であるか、または置換されており、
Ｘは、ハロゲンである）
を含む、態様２１６に記載のキット。
【０５８９】
２１８．前記式（ＶＩＩＩａ）の化合物が、ホルムアルデヒドである、態様２１７に記載のキット。
【０５９０】
２１９．前記式（ＶＩＩＩｂ）の化合物が、ヨウ化メチルである、態様２１７に記載のキット。
【０５９１】
２２０．２つまたはそれより多くの異なる結合性物質を含む、態様２１０〜２１９のいずれか１つに記載のキット。
【０５９２】
２２１．前記官能化ＮＴＡＡを消去して新しいＮＴＡＡを露出させるための試薬をさらに含む、態様２１０〜２２０のいずれか１つに記載のキット。
【０５９３】
２２２．前記官能化ＮＴＡＡを消去するための２つまたはそれより多くの異なる試薬を含む、態様２１１〜２２１のいずれか１つに記載のキット。
【０５９４】
２２３．前記官能化ＮＴＡＡを消去するための試薬が、化学的切断試薬または酵素的切断試薬を含む、態様２２１または態様２２２に記載のキット。
【０５９５】
２２４．前記官能化ＮＴＡＡを消去するための試薬が、カルボキシペプチダーゼもしくはアミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは修飾タンパク質；ヒドロラーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは修飾タンパク質；穏やかなエドマン分解試薬；エドマナーゼ酵素；ＴＦＡ；塩基；あるいはこれらの任意の組合せを含む、態様２２１または態様２２２に記載のキット。
【０５９６】
２２５．前記化学試薬が、式（Ｉ）の化合物：
【化６０】
2021501577.tif 000062
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、およびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化６１】
2021501577.tif 000063
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）
からなる群から選択される化合物を含む、態様２１０〜２２４のいずれか１つに記載のキット。
【０５９７】
２２６．Ｒ１が、
【化６２】
2021501577.tif 000064
である、態様２２５に記載のキット。
【０５９８】
２２７．Ｒ２が、
【化６３】
2021501577.tif 000065
である、態様２２５または態様２２６に記載のキット。
【０５９９】
２２８．Ｒ１またはＲ２が、
【化６４】
2021501577.tif 000066
である、態様２２５〜２２７のいずれか１つに記載のキット。
【０６００】
２２９．Ｒ３が、
【化６５】
2021501577.tif 000067
（式中、Ｇ１は、ＮまたはＣＨである）
である、態様２２５〜２２８のいずれか１つに記載のキット。
【０６０１】
２３０．Ｒ３が、
【化６６】
2021501577.tif 000068
【化６７】
2021501577.tif 000069
である、態様２２５〜２２８のいずれか１つに記載のキット。
【０６０２】
２３１．前記式（Ｉ）の化合物が、
【化６８】
2021501577.tif 000070
【化６９】
2021501577.tif 000071
、またはその塩もしくはコンジュゲート、からなる群から選択される、態様２２５に記載のキット。
【０６０３】
２３２．前記化学試薬が、向山試薬（ヨウ化２−クロロ−１−メチルピリジニウム）をさらに含む、態様２２５〜２３１のいずれか１つに記載のキット。
【０６０４】
２３３．前記化学試薬が、式（ＩＩ）の化合物：
【化７０】
2021501577.tif 000072
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）
からなる群から選択される化合物を含む、態様２１０〜２２４のいずれか１つに記載のキット。
【０６０５】
２３４．Ｒ４が、カルボキシベンジルである、態様１４２に記載のキット。
【０６０６】
２３５．Ｒ４が、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇであり、Ｒｇが、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルで必要に応じて置換されている、Ｃ２〜６アルケニルである、態様１４２に記載のキット。
【０６０７】
２３６．前記化合物が、
【化７１】
2021501577.tif 000073
、またはその塩もしくはコンジュゲート、からなる群から選択される、態様１４２に記載のキット。
【０６０８】
２３７．前記化学試薬が、ＴＭＳ−Ｃｌ、Ｓｃ（ＯＴｆ）２、Ｚｎ（ＯＴｆ）２、またはランタニド含有試薬をさらに含む、態様１４２〜１４５のいずれか１つに記載のキット。
【０６０９】
２３８．前記化学試薬が、式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、およびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）
からなる群から選択される化合物を含む、態様２１０〜２２４のいずれか１つに記載のキット。
【０６１０】
２３９．Ｒ５が、置換フェニルである、態様２３８に記載のキット。
【０６１１】
２４０．Ｒ５が、ハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、およびヘテロシクリルからなる群から選択される１つまたは複数の基で置換されている、フェニルである、態様２３８または態様２３９に記載のキット。
【０６１２】
２４１．前記式（ＩＩＩ）の化合物が、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳＩＴＣ）またはペンタフルオロフェニルイソチオシアネート（ＰＦＰＩＴＣ）である、態様２３８に記載のキット。
【０６１３】
２４２．前記化学試薬が、カルボジイミド化合物をさらに含む、態様２３８〜２４０のいずれか１つに記載のキット。
【０６１４】
２４３．前記官能化ＮＴＡＡを消去するための試薬が、トリフルオロ酢酸または塩酸を含む、態様２３８〜２４２のいずれか１つに記載のキット。
【０６１５】
２４４．前記官能化ＮＴＡＡを消去するための試薬が、穏やかなエドマン分解試薬を含む、態様２３８〜２４３のいずれか１つに記載のキット。
【０６１６】
２４５．前記官能化ＮＴＡＡを消去するための試薬が、エドマナーゼまたは操作されたヒドロラーゼ、アミノペプチダーゼもしくはカルボキシペプチダーゼを含む、態様２３８〜２４３のいずれか１つに記載のキット。
【０６１７】
２４６．前記化学試薬が、式（ＩＶ）の化合物：
【化７２】
2021501577.tif 000074
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）
からなる群から選択される化合物を含む、態様２１０〜２２４のいずれか１つに記載のキット。
【０６１８】
２４７．Ｒ６およびＲ７が、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキルまたはシクロアルキルである、態様２４６に記載のキット。
【０６１９】
２４８．前記化合物が、
【化７３】
2021501577.tif 000075
【化７４】
2021501577.tif 000076
、またはその塩もしくはコンジュゲート、からなる群から選択される、態様２４６に記載のキット。
【０６２０】
２４９．前記式（ＩＶ）の化合物が、対応するチオ尿素の脱硫により調製される、態様２４６〜２４８のいずれか１つに記載のキット。
【０６２１】
２５０．前記化学試薬が、向山試薬（ヨウ化２−クロロ−１−メチルピリジニウム）をさらに含む、態様２４６〜２４９のいずれか１つに記載のキット。
【０６２２】
２５１．前記化学試薬が、ルイス酸をさらに含む、態様２４６〜２４９のいずれか１つに記載のキット。
【０６２３】
２５２．前記ルイス酸が、Ｎ−（（アリール）イミノ−アセナフテノン）ＺｎＣｌ２、Ｚｎ（ＯＴｆ）２、ＺｎＣｌ２、ＰｄＣｌ２、ＣｕＣｌ、およびＣｕＣｌ２から選択される、態様２５１に記載のキット。
【０６２４】
２５３．前記化学試薬が、式（Ｖ）の化合物：
【化７５】
2021501577.tif 000077
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）
からなる群から選択される化合物を含む、態様２１０〜２２４のいずれか１つに記載のキット。
【０６２５】
２５４．Ｒ８が、クロロである、態様２５３に記載のキット。
【０６２６】
２５５．Ｒ９が、水素またはブロモである、態様２５３または態様２５４に記載のキット。
【０６２７】
２５６．前記化学試薬が、ペプチドカップリング試薬をさらに含む、態様２５３〜２５５のいずれか１つに記載のキット。
【０６２８】
２５７．前記ペプチドカップリング試薬が、カルボジイミド化合物である、態様２５６に記載のキット。
【０６２９】
２５８．前記カルボジイミド化合物が、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）である、態様２５７に記載のキット。
【０６３０】
２５９．前記官能化ＮＴＡＡを消去するための試薬が、アシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）を含む、態様２５３〜２５８のいずれか１つに記載のキット。
【０６３１】
２６０．前記化学試薬が、式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）
を含む、態様２１０〜２２４のいずれか１つに記載のキット。
【０６３２】
２６１．Ｍが、Ｃｏである、態様２６０に記載のキット。
【０６３３】
２６２．前記化学試薬が、シス−β−ヒドロキシアクオ（トリエチレンテトラミン）コバルト（ＩＩＩ）錯体を含む、態様２６０または２６１に記載のキット。
【０６３４】
２６３．前記化学試薬が、β−［Ｃｏ（ｔｒｉｅｎ）（ＯＨ）（ＯＨ２）］２＋を含む、態様２６０または２６１に記載のキット。
【０６３５】
２６４．前記化学試薬が、式（ＶＩＩ）の化合物：
【化７６】
2021501577.tif 000078
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む、態様２１０〜２２４のいずれか１つに記載のキット。
【０６３６】
２６５．Ｇ１がＣＨ２であり、Ｇ２がＣＨであるか、またはＧ１がＮＨであり、Ｇ２がＮである、態様２６４に記載のキット。
【０６３７】
２６６．Ｒ１２が、Ｈである、態様２６４または２６５に記載のキット。
【０６３８】
２６７．Ｒ１０およびＲ１１が、各々、Ｈである、態様２６４〜２６６のいずれか１つに記載のキット。
【０６３９】
２６８．前記式（ＶＩＩ）の化合物が、
【化７７】
2021501577.tif 000079
【化７８】
2021501577.tif 000080
、またはその塩もしくはコンジュゲート、からなる群から選択される、態様２６４に記載のキット。
【０６４０】
２６９．前記官能化ＮＴＡＡを消去するための試薬が、塩基を含む、態様２２５〜２６８のいずれか１つに記載のキット。
【０６４１】
２７０．前記塩基が、水酸化物、アルキル化アミン、環状アミン、炭酸緩衝剤、または金属塩である、態様２６９に記載のキット。
【０６４２】
２７１．前記水酸化物が、水酸化ナトリウムである、態様２７０に記載のキット。
【０６４３】
２７２．前記アルキル化アミンが、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、アニリン、ジフェニルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、およびリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）から選択される、態様２７０に記載のキット。
【０６４４】
２７３．前記環状アミンが、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、ピロール、インドール、ピペリジン、ピロリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、および１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン（ＤＢＮ）から選択される、態様２７０に記載のキット。
【０６４５】
２７４．前記炭酸緩衝剤が、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、または炭酸水素カルシウムを含む、態様２７０に記載のキット。
【０６４６】
２７５．前記金属塩が、銀を含む、態様２７０に記載のキット。
【０６４７】
２７６．前記金属塩が、ＡｇＣｌＯ４である、態様２７０に記載のキット。
【０６４８】
２７７．前記化学試薬が、
【化７９】
2021501577.tif 000081
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、態様１において式（Ｉ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化８０】
2021501577.tif 000082
（式中、Ｒ４は、態様１において式（ＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化８１】
2021501577.tif 000083
（式中、Ｒ５は、態様１において式（ＩＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化８２】
2021501577.tif 000084
（式中、Ｒ６およびＲ７は、態様１において式（ＩＶ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化８３】
2021501577.tif 000085
（式中、Ｒ８およびＲ９は、態様１において式（Ｖ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
（ＭＬｎ）−Ｑ    式（ＶＩ）−Ｑ
（式中、Ｍ、Ｌ、およびｎは、態様１において式（ＶＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化８４】
2021501577.tif 000086
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｇ１、Ｇ２、およびｐは、態様１において式（ＶＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）
からなる群から選択されるコンジュゲートを含む、態様２１０〜２７６のいずれか１つに記載のキット。
【０６４９】
２７８．前記Ｑが、−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ２〜６アルケニル、−Ｃ２〜６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒｎ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｏ、−−ＳＲｐまたは−Ｓ（Ｏ）２Ｒｑからなる群から選択され、ここで、−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ２〜６アルケニル、−Ｃ２〜６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルが、各々、非置換であるか、置換されており、ならびにＲｎ、Ｒｏ、Ｒｐ、およびＲｑが、各々独立して、−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ１〜６ハロアルキル、−Ｃ２〜６アルケニル、−Ｃ２〜６アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルからなる群から選択される、態様２７７に記載のキット。
【０６５０】
２７９．前記Ｑが、
【化８５】
2021501577.tif 000087
からなる群から選択される、態様２７７に記載のキット。
【０６５１】
２８０．Ｑが、フルオロフォアである、態様２７７に記載のキット。
【０６５２】
２８１．前記結合性物質が、末端アミノ酸残基、末端ジアミノ酸残基、または末端トリアミノ酸残基に結合する、態様２１０〜２８０のいずれか１つに記載のキット。
【０６５３】
２８２．前記結合性物質が、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合する、態様２１０〜２８０のいずれか１つに記載のキット。
【０６５４】
２８３．前記記録タグが、核酸、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、偽相補的塩基を有するＤＮＡ、保護された塩基を有するＤＮＡ、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、もしくはモルホリノＤＮＡ、またはこれらの組合せを含む、態様２１０〜２８２のいずれか１つに記載のキット。
【０６５５】
２８４．前記ＤＮＡ分子が、骨格修飾、糖修飾、または核酸塩基修飾されている、態様２８３に記載のキット。
【０６５６】
２８５．前記ＤＮＡ分子が、Ａｌｌｏｃなどの核酸塩基保護基、チイラン（thirane）などの電子吸引性保護基、アセチル保護基、ニトロベンジル保護基、スルホン酸保護基、またはＵｌｔｒａｍｉｌｄ試薬を含む旧来の塩基不安定性保護基を有する、態様２８３に記載のキット。
【０６５７】
２８６．前記記録タグが、ユニバーサルプライミング部位を含む、態様２１０〜２８５のいずれか１つに記載のキット。
【０６５８】
２８７．前記ユニバーサルプライミング部位が、増幅、配列決定、またはその両方のためのプライミング部位を含む、態様２８６に記載のキット。
【０６５９】
２８８．前記記録タグが、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む、態様２１０〜２８７のいずれか１つに記載のキット。
【０６６０】
２８９．前記記録タグが、バーコードを含む、態様２１０〜２８８のいずれか１つに記載のキット。
【０６６１】
２９０．前記記録タグが、その３’末端にスペーサーを含む、態様２１０〜２８８のいずれか１つに記載のキット。
【０６６２】
２９１．支持体に接合されている前記ポリペプチドおよび付随する記録タグをもたらすための前記試薬が、前記支持体上の前記ポリペプチドと前記付随する記録タグの共有結合性連結をもたらす、態様２１０〜２９０のいずれか１つに記載のキット。
【０６６３】
２９２．前記支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、態様２１０〜２９１のいずれか１つに記載のキット。
【０６６４】
２９３．前記支持体が、金、銀、半導体または量子ドットを含む、態様２９２に記載のキット。
【０６６５】
２９４．前記ナノ粒子が、金、銀、または量子ドットを含む、態様２９２に記載のキット。
【０６６６】
２９５．前記支持体が、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、態様２９２に記載のキット。
【０６６７】
２９６．支持体に接合されている前記ポリペプチドおよび付随する記録タグをもたらすための前記試薬が、前記支持体に連結されている複数のポリペプチドおよび付随する記録タグをもたらす、態様２１０〜２９５のいずれか１つに記載のキット。
【０６６８】
２９７．前記複数のポリペプチドの間に支持体上で間隔をあけ、前記ポリペプチド間の平均距離が、約≧２０ｎｍである、態様２９６に記載のキット。
【０６６９】
２９８．前記結合性物質が、ペプチドまたはタンパク質である、態様２１０〜２９７のいずれか１つに記載のキット。
【０６７０】
２９９．前記結合性物質が、アミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アンチカリンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；あるいはアミノ酸に結合する修飾小分子、すなわちバンコマイシンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾分子；あるいは抗体またはその結合断片；あるいはこれらの任意の組合せを含む、態様２１０〜２９８のいずれか１つに記載のキット。
【０６７１】
３００．前記結合性物質が、単一のアミノ酸残基（例えば、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、もしくは内部アミノ酸残基）、ジペプチド（例えば、Ｎ末端ジペプチド、Ｃ末端ジペプチド、もしくは内部ジペプチド）、トリペプチド（例えば、Ｎ末端トリペプチド、Ｃ末端トリペプチド、もしくは内部トリペプチド）、または前記分析物もしくはポリペプチドの翻訳後修飾に結合する、態様２１０〜２９９のいずれか１つに記載のキット。
【０６７２】
３０１．前記結合性物質が、ＮＴＡＡ官能化単一アミノ酸残基、ＮＴＡＡ官能化ジペプチド、ＮＴＡＡ官能化トリペプチド、またはＮＴＡＡ官能化ポリペプチドに結合する、態様２１０〜３００のいずれか１つに記載のキット。
【０６７３】
３０２．前記結合性物質が、前記ポリペプチドに選択的に結合することが可能である、態様２１０〜３０１のいずれか１つに記載のキット。
【０６７４】
３０３．前記コーディングタグが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せである、態様２１０〜３０２のいずれか１つに記載のキット。
【０６７５】
３０４．前記コーディングタグが、エンコーダーまたはバーコード配列を含む、態様２１０〜３０３のいずれか１つに記載のキット。
【０６７６】
３０５．前記コーディングタグが、スペーサー、結合サイクル特異的配列、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、態様２１０〜３０４のいずれか１つに記載のキット。
【０６７７】
３０６．前記結合性物質中の前記結合性部分および前記コーディングタグが、リンカーにより接合されている、態様２１０〜３０５のいずれか１つに記載のキット。
【０６７８】
３０７．前記結合性部分および前記コーディングタグが、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対、またはＨａｌｏＴａｇ／ＨａｌｏＴａｇリガンド対によって接合されている、態様２１０〜３０５のいずれか１つに記載のキット。
【０６７９】
３０８．前記コーディングタグの情報を前記記録タグに移行させるための試薬が、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼを含む、態様２１０〜３０７のいずれか１つに記載のキット。
【０６８０】
３０９．前記コーディングタグの情報を前記記録タグに移行させるための試薬が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素を含む、態様２１０〜３０７のいずれか１つに記載のキット。
【０６８１】
３１０．前記コーディングタグの情報を前記記録タグに移行させるための試薬が、化学的ライゲーション試薬を含む、態様２１０〜３０７のいずれか１つに記載のキット。
【０６８２】
３１１．前記化学的ライゲーション試薬が、一本鎖ＤＮＡに関して使用するためのものである、態様３１０に記載のキット。
【０６８３】
３１２．前記化学的ライゲーション試薬が、二本鎖ＤＮＡに関して使用するためのものである、態様３１０に記載のキット。
【０６８４】
３１３．２つのＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼバリアント、アデニル化バリアントおよび構成的にアデニル化されていないバリアントで構成されている、ライゲーション試薬をさらに含む、態様２１０〜３１２のいずれか１つに記載のキット。
【０６８５】
３１４．ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼおよびＤＮＡ／ＲＮＡデアデニレースで構成されている、ライゲーション試薬をさらに含む、態様２１０〜３１２のいずれか１つに記載のキット。
【０６８６】
３１５．核酸配列決定法のための試薬をさらに含む、態様２１０〜３１４のいずれか１つに記載のキット。
【０６８７】
３１６．前記核酸配列決定法が、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである、態様３１５に記載のキット。
【０６８８】
３１７．前記核酸配列決定法が、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである、態様３１５に記載のキット。
【０６８９】
３１８．前記伸長記録タグを増幅するための試薬をさらに含む、態様２１０〜３１７のいずれか１つに記載のキット。
【０６９０】
３１９．サイクル標識を付加するための試薬をさらに含む、態様２１０〜３１８のいずれか１つに記載のキット。
【０６９１】
３２０．前記サイクル標識が、前記結合性物質による前記ポリペプチドへの結合の順序に関する情報を提供する、態様３１９に記載のキット。
【０６９２】
３２１．前記サイクル標識を前記コーディングタグに付加することができる、態様３１９または態様３２０に記載のキット。
【０６９３】
３２２．前記サイクル標識を前記記録タグに付加することができる、態様３１９または態様３２０に記載のキット。
【０６９４】
３２３．前記サイクル標識を前記結合性物質に付加することができる、態様３１９または態様３２０に記載のキット。
【０６９５】
３２４．前記サイクル標識を、前記コーディングタグ、記録タグ（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｔａｂ）および結合性物質とは独立に付加することができる、態様３１９または態様３２０に記載のキット。
【０６９６】
３２５．前記伸長記録タグに含有されるコーディングタグ情報の順序が、前記結合性物質による前記ポリペプチドへの結合の順序に関する情報を提供する、態様２１０〜３２４のいずれか１つに記載のキット。
【０６９７】
３２６．前記伸長記録タグに含有されるコーディングタグ情報の頻度が、前記結合性物質による前記ポリペプチドへの結合の頻度に関する情報を提供する、態様２１０〜３２５のいずれか１つに記載のキット。
【０６９８】
３２７．複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドを含む試料由来の１つまたは複数のポリペプチドを解析するために構成される、態様２１０〜３２６のいずれか１つに記載のキット。
【０６９９】
３２８．前記試料中の前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のコンパートメントに分配するための手段であって、各コンパートメントが、支持体（例えば、固体支持体）に必要に応じて接合されている複数のコンパートメントタグを含み、前記複数のコンパートメントタグが、個々のコンパートメント内では同じであり、他のコンパートメントのコンパートメントタグとは異なる、手段をさらに含む、態様３２７に記載のキット。
【０７００】
３２９．前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、および／またはポリペプチドを複数のポリペプチドに断片化するための試薬をさらに含む、態様３２７または態様３２８に記載のキット。
【０７０１】
３３０．前記コンパートメントが、マイクロ流体液滴である、態様３２８に記載のキット。
【０７０２】
３３１．前記コンパートメントが、マイクロウェルである、態様３２８に記載のキット。
【０７０３】
３３２．前記コンパートメントが、表面上の分離された領域である、態様３２８に記載のキット。
【０７０４】
３３３．各コンパートメントが、平均して単一の細胞を含む、態様３２８〜３３２のいずれか１つに記載のキット。
【０７０５】
３３４．前記複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチドを複数のユニバーサルＤＮＡタグで標識するための試薬をさらに含む、態様３２７〜３３３のいずれか１つに記載のキット。
【０７０６】
３３５．前記コンパートメントタグ情報を、ポリペプチドに付随する前記記録タグに移行させるための試薬が、プライマー伸長またはライゲーション試薬を含む、態様３２８〜３３４のいずれか１つに記載のキット。
【０７０７】
３３６．前記支持体が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、態様３２８〜３３５のいずれか１つに記載のキット。
【０７０８】
３３７．前記支持体が、ビーズを含む、態様３２８〜３３５のいずれか１つに記載のキット。
【０７０９】
３３８．前記ビーズが、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである、態様３３７に記載のキット。
【０７１０】
３３９．前記コンパートメントタグが、一本鎖または二本鎖核酸分子を含む、態様３２８〜３３８のいずれか１つに記載のキット。
【０７１１】
３４０．前記コンパートメントタグが、バーコードおよび必要に応じてＵＭＩを含む、態様３２８〜３３９のいずれか１つに記載のキット。
【０７１２】
３４１．前記支持体がビーズであり、前記コンパートメントタグがバーコードを含み、さらに、前記複数のコンパートメントタグが接合されているビーズが、スプリット・アンド・プール合成により形成される、態様３４０に記載のキット。
【０７１３】
３４２．前記支持体がビーズであり、前記コンパートメントタグがバーコードを含み、さらに、複数のコンパートメントタグが接合されているビーズが、個々の合成または固定化により形成される、態様３４０に記載のキット。
【０７１４】
３４３．前記コンパートメントタグが、記録タグ内の成分であり、前記記録タグが、必要に応じて、スペーサー、バーコード配列、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、態様３２８〜３４２のいずれか１つに記載のキット。
【０７１５】
３４４．前記コンパートメントタグが、前記複数のタンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチドの内部アミノ酸、ペプチド骨格、またはＮ末端アミノ酸と反応することができる機能的部分をさらに含む、態様３２８〜３４３のいずれか１つに記載のキット。
【０７１６】
３４５．機能的部分が、アルデヒド、アジド／アルキン、またはマレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）／チオール、またはエポキシド／求核試薬、または逆電子要請型（inverse electron demain）ディールス−アルダー（ｉＥＤＤＡ）基である、態様３４４に記載のキット。
【０７１７】
３４６．前記機能的部分が、アルデヒド基である、態様３４４に記載のキット。
【０７１８】
３４７．前記複数のコンパートメントタグが、前記コンパートメントタグを前記コンパートメントに印刷、スポッティング、インク噴射すること、またはその組合せにより形成される、態様３２８〜３４６のいずれか１つに記載のキット。
【０７１９】
３４８．前記コンパートメントタグが、ポリペプチドをさらに含む、態様３２８〜３４７のいずれか１つに記載のキット。
【０７２０】
３４９．前記コンパートメントタグポリペプチドが、タンパク質リガーゼ認識配列を含む、態様３４８に記載のキット。
【０７２１】
３５０．前記タンパク質リガーゼが、ブテラーゼＩまたはそのホモログである、態様３４９に記載のキット。
【０７２２】
３５１．前記複数のポリペプチドを断片化するための試薬が、プロテアーゼを含む、態様３２８〜３５０のいずれか１つに記載のキット。
【０７２３】
３５２．前記プロテアーゼが、メタロプロテアーゼである、態様３５１に記載のキット。
【０７２４】
３５３．前記メタロプロテアーゼの活性をモジュレートするための試薬、例えば、メタロプロテアーゼの金属カチオンの光活性化放出のための試薬をさらに含む、態様３５２に記載のキット。
【０７２５】
３５４．前記複数のポリペプチドを前記複数のコンパートメントに分配する前に１つまたは複数の豊富なタンパク質を前記試料からサブトラクションするための試薬をさらに含む、態様３２８〜３５３のいずれか１つに記載のキット。
【０７２６】
３５５．前記複数のポリペプチドと前記コンパートメントタグを接合させる前に前記コンパートメントタグを前記支持体から遊離させるための試薬をさらに含む、態様３２８〜３５４のいずれか１つに記載のキット。
【０７２７】
３５６．前記コンパートメントタグ付きポリペプチドを支持体に記録タグを伴って接合させるための試薬をさらに含む、態様３２８に記載のキット。
【０７２８】
３５７．ポリペプチド官能化試薬、アミノ酸消去試薬および／または反応条件についてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ポリヌクレオチドとポリペプチド官能化試薬および／またはアミノ酸消去試薬とを反応条件下で接触させるステップと；
（ｂ）前記ポリヌクレオチドに対するステップ（ａ）の効果を、必要に応じて、前記ポリヌクレオチドに対して全くまたはほとんど効果がないポリペプチド官能化試薬、アミノ酸消去試薬および／または反応条件を同定するために、評価するステップと
を含む方法。
【０７２９】
３５８．前記ポリヌクレオチドが、少なくとも約４つのヌクレオチドを含む、態様３５７に記載の方法。
【０７３０】
３５９．前記ポリヌクレオチドが、最大で約１０ｋｂのヌクレオチドを含む、態様３５７に記載の方法。
【０７３１】
３６０．前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡポリヌクレオチドである、態様３５７〜３５９のいずれか１つに記載の方法。
【０７３２】
３６１．前記ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡであるか、前記方法が、ゲノムＤＮＡの存在下で行われる、態様３５７〜３６０のいずれか１つに記載の方法。
【０７３３】
３６２．前記ポリヌクレオチドが、単離されたポリヌクレオチドである、態様３５７〜３６０のいずれか１つに記載の方法。
【０７３４】
３６３．前記ポリヌクレオチドが、前記ポリペプチドの結合性物質の一部である、態様３５７〜３６０のいずれか１つに記載の方法。
【０７３５】
３６４．前記ポリヌクレオチドと前記ポリペプチド官能化試薬および／または前記アミノ酸消去試薬とを反応条件下、前記ポリペプチドの非存在下で接触させる、態様３５７〜３６３のいずれか１つに記載の方法。
【０７３６】
３６５．前記ポリヌクレオチドと前記ポリペプチド官能化試薬および／または前記アミノ酸消去試薬とを反応条件下、前記ポリペプチドの存在下で接触させる、態様３５７〜３６３のいずれか１つに記載の方法。
【０７３７】
３６６．前記ポリヌクレオチドが、前記ポリペプチドの結合性物質の一部である、態様３６５に記載の方法。
【０７３８】
３６７．  前記ポリペプチド官能化試薬が、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物：
【化８６】
2021501577.tif 000088
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化８７】
2021501577.tif 000089
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の化合物：
【化８８】
2021501577.tif 000090
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｖ）式（ＩＶ）の化合物：
【化８９】
2021501577.tif 000091
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｖ）式（Ｖ）の化合物：
【化９０】
2021501577.tif 000092
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）；
（ｖｉ）式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）；および
（ｖｉｉ）式（ＶＩＩ）の化合物：
【化９１】
2021501577.tif 000093
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む、態様３５７〜３６６のいずれか１つに記載の方法。
【０７３９】
３６８．前記アミノ酸消去試薬が、化学的切断試薬または酵素的切断試薬である、態様３５７〜３６７のいずれか１つに記載の方法。
【０７４０】
３６９．前記アミノ酸消去試薬が、カルボキシペプチダーゼもしくはアミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは修飾タンパク質；ヒドロラーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは修飾タンパク質；穏やかなエドマン分解試薬；エドマナーゼ酵素；ＴＦＡ、塩基；あるいはこれらの任意の組合せである、態様３６８に記載の方法。
【０７４１】
３７０．前記反応条件が、反応時間、反応温度、反応ｐＨ、溶媒のタイプ、共溶媒、触媒、およびイオン液体、および電気化学的ポテンシャルを含む、態様３５７〜３６９のいずれか１つに記載の方法。
【０７４２】
３７１．ステップ（ａ）が、溶液中で行われる、態様３５７〜３７０のいずれか１つに記載の方法。
【０７４３】
３７２．ステップ（ａ）が、固相で行われる、態様３５７〜３７０のいずれか１つに記載の方法。
【０７４４】
３７３．前記ポリヌクレオチドに対するステップ（ａ）の効果が、前記ポリペプチド官能化試薬、前記アミノ酸消去試薬および／または前記反応条件による前記ポリヌクレオチドの修飾の存在、非存在または量を評価することにより評価される、態様３５７〜３７２のいずれか１つに記載の方法。
【０７４５】
３７４．前記ポリヌクレオチドについての、反応条件下でポリペプチド官能化試薬および／またはアミノ酸消去試薬と接触させていない対応するポリヌクレオチドと比較して５０％未満の修飾によって、前記ポリヌクレオチドに対して全くまたはほとんど効果がない前記ポリペプチド官能化試薬、前記アミノ酸消去試薬および／または前記反応条件が同定される、態様３５７〜３７３のいずれか１つに記載の方法。
【０７４６】
３７５．ポリペプチド官能化試薬、アミノ酸消去試薬および／または反応条件についてスクリーニングするためのキットであって、（ａ）ポリヌクレオチドと；（ｂ）ポリペプチド官能化試薬および／またはアミノ酸消去試薬と；（ｃ）前記ポリペプチド官能化試薬、前記アミノ酸消去試薬および／またはポリペプチド官能化もしくは消去のための反応条件の前記ポリヌクレオチドに対する効果を評価するための手段とを含むキット。
【０７４７】
３７６．  前記ポリペプチド官能化試薬が、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物：
【化９２】
2021501577.tif 000094
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化９３】
2021501577.tif 000095
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の化合物：
【化９４】
2021501577.tif 000096
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｖ）式（ＩＶ）の化合物：
【化９５】
2021501577.tif 000097
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｖ）式（Ｖ）の化合物：
【化９６】
2021501577.tif 000098
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）；
（ｖｉ）式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）；および
（ｖｉｉ）式（ＶＩＩ）の化合物：
【化９７】
2021501577.tif 000099
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む、態様３７５に記載のキット。
【０７４８】
３７７．ポリペプチド官能化試薬およびアミノ酸消去試薬を含む、態様３７５または態様３７６に記載のキット。
【０７４９】
３７８．ポリペプチドを配列決定する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを支持体もしくは基板に取り付ける、または溶液中の前記ポリペプチドを提供するステップと；
（ｂ）前記ポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学試薬で官能化するステップであって、前記化学試薬が、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物：
【化９８】
2021501577.tif 000100
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化９９】
2021501577.tif 000101
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の化合物：
【化１００】
2021501577.tif 000102
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｖ）式（ＩＶ）の化合物：
【化１０１】
2021501577.tif 000103
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｖ）式（Ｖ）の化合物：
【化１０２】
2021501577.tif 000104
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）；
（ｖｉ）式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）；および
（ｖｉｉ）式（ＶＩＩ）の化合物：
【化１０３】
2021501577.tif 000105
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む、ステップと；
（ｃ）前記ポリペプチドを、官能化されたＮＴＡＡおよび検出可能な標識に結合することが可能な結合性部分を各々が含む複数の結合性物質と、接触させるステップと；
（ｄ）前記ポリペプチドに結合した前記結合性物質の前記検出可能な標識を検出することによって、前記ポリペプチドのＮ末端アミノ酸を識別するステップと；
（ｅ）前記官能化されたＮＴＡＡを消去して新しいＮＴＡＡを露出させるステップと；
（ｆ）ステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して、前記ポリペプチドの少なくとも一部分の配列を決定するステップと
を含む方法。
【０７５０】
３７９．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の前に行われる、態様３７８に記載の方法。
【０７５１】
３８０．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の後かつステップ（ｄ）の前に行われる、態様３７８に記載の方法。
【０７５２】
３８１．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）の両方の後に行われる、態様３７８に記載の方法。
【０７５３】
３８２．前記ポリペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することにより得られる、態様３７８〜３８１のいずれか１つに記載の方法。
【０７５４】
３８３．前記支持体または基材が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、態様３７８〜３８２のいずれか１つに記載の方法。
【０７５５】
３８４．前記ＮＴＡＡが、化学的切断または酵素的切断により前記ポリペプチドから消去される、態様３７８〜３８３のいずれか１つに記載の方法。
【０７５６】
３８５．前記ＮＴＡＡが、カルボキシペプチダーゼもしくはアミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは修飾タンパク質；ヒドロラーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは修飾タンパク質；穏やかなエドマン分解；エドマナーゼ酵素；ＴＦＡ、塩基；あるいはこれらの任意の組合せにより消去される、態様３７８〜３８４のいずれか１つに記載の方法。
【０７５７】
３８６．前記ポリペプチドが、前記支持体または基板に共有結合により取り付けられる、態様３７８〜３８５のいずれか１つに記載の方法。
【０７５８】
３８７．前記支持体または基板が、光学的に透明である、態様３７８〜３８６のいずれか１つに記載の方法。
【０７５９】
３８８．前記支持体または基板が、複数の空間分解された付着点を含み、ステップａ）が、空間分解された付着点に前記ポリペプチドを取り付けることを含む、態様３７８〜３８７のいずれか１つに記載の方法。
【０７６０】
３８９．前記結合性物質の前記結合性部分が、ペプチドまたはタンパク質を含む、態様３７８〜３８８のいずれか１つに記載の方法。
【０７６１】
３９０．前記結合性物質の前記結合性部分が、アミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アンチカリンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳ（例えば、ＣｌｐＳ２）またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；あるいはアミノ酸に結合する修飾小分子、すなわちバンコマイシンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾分子；あるいは抗体またはその結合断片；あるいはこれらの任意の組合せを含む、態様３７８〜３８９のいずれか１つに記載の方法。
【０７６２】
３９１．前記化学試薬が、
【化１０４】
2021501577.tif 000106
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、態様１において式（Ｉ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化１０５】
2021501577.tif 000107
（式中、Ｒ４は、態様１において式（ＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化１０６】
2021501577.tif 000108
（式中、Ｒ５は、態様１において式（ＩＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化１０７】
2021501577.tif 000109
（式中、Ｒ６およびＲ７は、態様１において式（ＩＶ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化１０８】
2021501577.tif 000110
（式中、Ｒ８およびＲ９は、態様１において式（Ｖ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
（ＭＬｎ）−Ｑ    式（ＶＩ）−Ｑ
（式中、Ｍ、Ｌ、およびｎは、態様１において式（ＶＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化１０９】
2021501577.tif 000111
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｇ１、Ｇ２、およびｐは、態様１において式（ＶＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）
からなる群から選択されるコンジュゲートを含む、態様３７８〜３９０のいずれか１つに記載の方法。
【０７６３】
３９２．ステップ（ｂ）が、前記ＮＴＡＡを、式（ＶＩＩＩａ）および（ＶＩＩＩｂ）：
【化１１０】
2021501577.tif 000112
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；および
Ｒ１３−Ｘ    （ＶＩＩＩｂ）
（式中、
Ｒ１３は、Ｃ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、これらの各々は、非置換であるか、または置換されており、
Ｘは、ハロゲンである）
から選択される第２の化学試薬で官能化することを含む、態様３７８〜３９１のいずれか１つに記載の方法。
【０７６４】
３９３．前記ポリペプチドが、部分的にまたは完全に消化されたタンパク質である、態様３７８〜３９２のいずれか１つに記載の方法。
【０７６５】
３９４．試料中の複数のポリペプチド分子を配列決定する方法であって、
（ａ）前記試料中の前記ポリペプチド分子を支持体または基板上の複数の空間分解された付着点に取り付けるステップと；
（ｂ）前記ポリペプチド分子のＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学試薬で官能化するステップであって、前記化学試薬が、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物：
【化１１１】
2021501577.tif 000113
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化１１２】
2021501577.tif 000114
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の化合物：
【化１１３】
2021501577.tif 000115
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｖ）式（ＩＶ）の化合物：
【化１１４】
2021501577.tif 000116
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｖ）式（Ｖ）の化合物：
【化１１５】
2021501577.tif 000117
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）；
（ｖｉ）式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）；および
（ｖｉｉ）式（ＶＩＩ）の化合物：
【化１１６】
2021501577.tif 000118
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む、ステップと；
（ｃ）前記ポリペプチドを、官能化されたＮＴＡＡおよび検出可能な標識に結合することが可能な結合性部分を各々が含む複数の結合性物質と、接触させるステップと；
（ｄ）空間分解されて前記支持体または基板に取り付けられている複数のポリペプチド分子について、必要に応じて、各ポリペプチドに結合しているプローブの蛍光レベルを光学的に検出するステップと；
（ｅ）前記ポリペプチドの各々の前記官能化されたＮＴＡＡを消去するステップと；
（ｆ）ステップｂ）〜ｄ）を繰り返して、空間分解されて前記支持体または基板に取り付けられている前記複数のポリペプチド分子のうちの１つまたは複数についての少なくとも一部分の配列を決定するステップと
を含む方法。
【０７６６】
３９５．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の前に行われる、態様３９４に記載の方法。
【０７６７】
３９６．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の後かつステップ（ｄ）の前に行われる、態様３９４に記載の方法。
【０７６８】
３９７．ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）の両方の後に行われる、態様３９４に記載の方法。
【０７６９】
３９８．前記試料が、生体液、細胞抽出物または組織抽出物を含む、態様３９４〜３９７のいずれか１つに記載の方法。
【０７７０】
３９９．ステップｅ）において決定された少なくとも１つのポリペプチド分子の配列を参照タンパク質配列データベースと比較するステップをさらに含む、態様３９４〜３９８のいずれか１つに記載の方法。
【０７７１】
４００．ステップｅ）において決定された各ポリペプチドの配列を比較するステップ、類似のポリペプチド配列を群分けするステップ、および類似のポリペプチド配列各々のインスタンス数を計数するステップをさらに含む、態様３９４〜３９９のいずれか１つに記載の方法。
【０７７２】
４０１．前記蛍光標識が、蛍光部分、色分けされたナノ粒子、または量子ドットである、態様３９４〜４００のいずれか１つに記載の方法。
【０７７３】
４０２．ポリペプチドを配列決定するためのキットであって、
（ａ）前記ポリペプチドを支持体もしくは基板に取り付けるための試薬、または溶液中の前記ポリペプチドをもたらすための試薬；
（ｂ）前記ポリペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を官能化するための試薬であって、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物：
【化１１７】
2021501577.tif 000119
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化１１８】
2021501577.tif 000120
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の化合物：
【化１１９】
2021501577.tif 000121
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｖ）式（ＩＶ）の化合物：
【化１２０】
2021501577.tif 000122
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｖ）式（Ｖ）の化合物：
【化１２１】
2021501577.tif 000123
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）；
（ｖｉ）式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）；および
（ｖｉｉ）式（ＶＩＩ）の化合物：
【化１２２】
2021501577.tif 000124
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む試薬と；
（ｃ）前記官能化されたＮＴＡＡおよび検出可能な標識に結合することが可能な結合性部分を含む結合性物質と
を含むキット。
【０７７４】
４０３．前記官能化されたＮＴＡＡを消去して新しいＮＴＡＡを露出させるための試薬をさらに含む、態様４０２に記載のキット。
【０７７５】
４０４．前記ポリペプチドが、生体試料由来のタンパク質を断片化することにより得られる、態様４０２または態様４０３に記載のキット。
【０７７６】
４０５．前記支持体または基材が、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアである、態様４０２〜４０４のいずれか１つに記載のキット。
【０７７７】
４０６．前記官能化されたＮＴＡＡを消去するための試薬が、カルボキシペプチダーゼもしくはアミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは修飾タンパク質；ヒドロラーゼまたはそのバリアント、変異体、もしくは修飾タンパク質；穏やかなエドマン分解；エドマナーゼ酵素；ＴＦＡ；塩基；あるいはこれらの任意の組合せである、態様４０３〜４０５のいずれか１つに記載のキット。
【０７７８】
４０７．前記ポリペプチドが、前記支持体または基板に共有結合により取り付けられる、態様４０２〜４０６のいずれか１つに記載のキット。
【０７７９】
４０８．前記支持体または基板が、光学的に透明である、態様４０２〜４０７のいずれか１つに記載のキット。
【０７８０】
４０９．前記支持体または基板が、複数の空間分解された付着点を含み、ステップａ）が、空間分解された付着点に前記ポリペプチドを取り付けることを含む、態様４０２〜４０８のいずれか１つに記載のキット。
【０７８１】
４１０．前記結合性物質の前記結合性部分が、ペプチドまたはタンパク質を含む、態様４０２〜４０９のいずれか１つに記載のキット。
【０７８２】
４１１．前記結合性物質の前記結合性部分が、アミノペプチダーゼまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；アンチカリンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＣｌｐＳ（例えば、ＣｌｐＳ２）またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；ＵＢＲボックスタンパク質またはそのバリアント、変異体もしくは修飾タンパク質；あるいはアミノ酸に結合する修飾小分子、すなわちバンコマイシンまたはそのバリアント、変異体もしくは修飾分子；あるいは抗体またはその結合断片；あるいはこれらの任意の組合せを含む、態様４０２〜４１０のいずれか１つに記載のキット。
【０７８３】
４１２．前記化学試薬が、
【化１２３】
2021501577.tif 000125
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、態様１において式（Ｉ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化１２４】
2021501577.tif 000126
（式中、Ｒ４は、態様１において式（ＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化１２５】
2021501577.tif 000127
（式中、Ｒ５は、態様１において式（ＩＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化１２６】
2021501577.tif 000128
（式中、Ｒ６およびＲ７は、態様１において式（ＩＶ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化１２７】
2021501577.tif 000129
（式中、Ｒ８およびＲ９は、態様１において式（Ｖ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
（ＭＬｎ）−Ｑ    式（ＶＩ）−Ｑ
（式中、Ｍ、Ｌ、およびｎは、態様１において式（ＶＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）；
【化１２８】
2021501577.tif 000130
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｇ１、Ｇ２、およびｐは、態様１において式（ＶＩＩ）について定義されているとおりであり、Ｑは、配位子である）
からなる群から選択されるコンジュゲートを含む、態様４０２〜４１１のいずれか１つに記載のキット。
【０７８４】
態様４１３．式（ＶＩＩＩａ）および（ＶＩＩＩｂ）：
【化１２９】
2021501577.tif 000131
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；および
Ｒ１３−Ｘ    （ＶＩＩＩｂ）
（式中、
Ｒ１３は、Ｃ１〜６アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり、これらの各々は、非置換であるか、または置換されており、
Ｘは、ハロゲンである）
から選択される第２の化学試薬を含む、態様４０２〜４１２のいずれか１つに記載のキット。
【０７８５】
４１４．前記ポリペプチドが、部分的にまたは完全に消化されたタンパク質である、態様４０２〜４１３のいずれか１つに記載の方法。
【０７８６】
４１５．試料中の複数のポリペプチド分子を配列決定するためのキットであって、
（ａ）前記試料中の前記ポリペプチド分子を支持体または基板上の複数の空間分解された付着点に取り付けるための試薬と；
（ｂ）前記ポリペプチド分子のＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を官能化するための試薬であって、
（ｉ）式（Ｉ）の化合物：
【化１３０】
2021501577.tif 000132
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒｃであり；
Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒ３は、ヘテロアリール、−ＮＲｄＣ（Ｏ）ＯＲｅ、または−ＳＲｆであり、ここでのヘテロアリールは、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、各々独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；ならびに
必要に応じて、Ｒ３が
【化１３１】
2021501577.tif 000133
であるときにはＲ１およびＲ２は両方ともＨでない）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の化合物：
【化１３２】
2021501577.tif 000134
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｇ、または−Ｃ（Ｏ）ＯＲｇであり；
Ｒｇは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、またはアリールアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜６ハロアルキル、およびアリールアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ５−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （ＩＩＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；
ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、各々、非置換であるか、またはハロ、−ＮＲｈＲｉ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｊ、もしくはヘテロシクリルからなる群から選択される１つもしくは複数の基で置換されており；
Ｒｈ、Ｒｉ、およびＲｊは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、アリールアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｉｖ）式（ＩＶ）の化合物：
【化１３３】
2021501577.tif 000135
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、またはシクロアルキルであり、ここでのＣ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｃ１〜４アルキル、−ＯＲｋ、アリール、およびシクロアルキルは、各々、非置換であるか、または置換されており；
Ｒｋは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり、ここでのＣ１〜６アルキルおよびヘテロシクリルは、各々、非置換であるか、または置換されている）；
（ｖ）式（Ｖ）の化合物：
【化１３４】
2021501577.tif 000136
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｒ８は、ハロまたは−ＯＲｍであり；
Ｒｍは、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、またはヘテロシクリルであり；
Ｒ９は、水素、ハロ、またはＣ１〜６ハロアルキルである）；
（ｖｉ）式（ＶＩ）の金属錯体：
ＭＬｎ    （ＶＩ）
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｍは、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｚｎ、およびＮｉからなる群から選択される金属であり；
Ｌは、−ＯＨ、−ＯＨ２、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ）、１，５ジチアシクロオクタン（ｄｔｃｏ）、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン（ｄｐｐｅ）、エチレンジアミン（ｅｎ）、およびトリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｎ）からなる群から選択される配位子であり；
ｎは、１および８を含む、１〜８の整数であり；
各Ｌは、同じであってもよく、または異なっていてもよい）；および
（ｖｉｉ）式（ＶＩＩ）の化合物：
【化１３５】
2021501577.tif 000137
またはその塩もしくはコンジュゲート
（式中、
Ｇ１は、Ｎ、ＮＲ１３、またはＣＲ１３Ｒ１４であり；
Ｇ２は、ＮまたはＣＨであり；
ｐは、０または１であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンからなる群から選択され、ここでのＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ハロアルキル、Ｃ１〜６アルキルアミン、およびＣ１〜６アルキルヒドロキシルアミンは、各々、非置換であるか、または置換されており、ならびにＲ１０およびＲ１１は、必要に応じて、一緒になって環を形成していることもあり；
Ｒ１５は、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択される化合物を含む試薬と；
（ｃ）前記官能化されたＮＴＡＡおよび検出可能な標識に結合することが可能な結合性部分を含む結合性物質と
を含むキット。
【０７８７】
４１６．前記官能化されたＮＴＡＡを消去して新しいＮＴＡＡを露出させるための試薬をさらに含む、態様４１５に記載のキット。
【０７８８】
態様４１７．前記試料が、生体液、細胞抽出物または組織抽出物を含む、態様４１５または４１６に記載のキット。
【０７８９】
態様４１８．前記蛍光標識が、蛍光部分、色分けされたナノ粒子、または量子ドットである、態様４１５〜４１７のいずれか１つに記載のキット。
【０７９０】
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグおよび／またはコーディングタグは、小分子であることもあり、またはポリヌクレオチドもしくは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの配列決定可能なポリマーのサブユニット、単量体、残基もしくは構成要素であることもある。
【０７９１】
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグおよび／またはコーディングタグは、ポリヌクレオチドまたは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーであることがある。
【０７９２】
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグおよび／またはコーディングタグは、小分子を含むこともあり、またはポリヌクレオチドもしくは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの配列決定可能なポリマーのサブユニット、単量体、残基もしくは構成要素を含むこともある。
【０７９３】
前述の実施形態のいずれかでは、記録タグが、配列決定可能なポリマーである一方で、コーディングタグは、小分子であることもあり、またはポリヌクレオチドもしくは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの配列決定可能なポリマーのサブユニット、単量体、残基もしくは構成要素であることもある。一部の実施形態では、コーディングタグ（小分子、サブユニットまたは単量体など）を記録タグに付加させて、糸（例えば、伸長記録タグ）に通したビーズ（例えば、様々なコーディングタグ）のようなものである配列決定可能なポリマーを形成することができる。
【０７９４】
前述の実施形態のいずれかでは、伸長記録タグおよび／または伸長コーディングタグは、ポリヌクレオチドまたは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーであることがある。
【０７９５】
一態様では、（ａ）分析物を、前記分析物に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディング部分を含み、前記分析物には支持体に接合した記録部分が付随しており、前記分析物および／または前記記録部分が支持体に固定化されている、ステップと；（ｂ）前記第１のコーディング部分の情報を前記記録部分に移行させて、一次伸長記録部分を生成するステップと；（ｃ）前記分析物を、前記分析物に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディング部分を含む、ステップと；（ｄ）前記第２のコーディング部分の情報を前記一次伸長記録部分に移行させて、二次伸長記録部分を生成するステップと；（ｅ）前記二次伸長記録部分を解析するステップとを含む方法が、本明細書で開示される。一実施形態では、この方法は、ステップ（ｄ）と（ｅ）の間に、（ｘ）前記第２の結合性物質を、前記分析物に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｃ）および（ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、第３の（またはより高次の）結合性物質が、前記第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディング部分を含む、ステップと；（ｙ）前記第３の（またはより高次の）コーディング部分の情報を第２の（またはより高次の）伸長記録部分に移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録部分を生成するステップとをさらに含み、ステップ（ｅ）において前記第３の（またはより高次の）伸長記録部分を解析する。
【０７９６】
前述の実施形態のいずれかでは、記録部分は、小分子であることもあり、またはポリヌクレオチドもしくは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの配列決定可能なポリマーのサブユニット、単量体、残基もしくは構成要素であることもある。
【０７９７】
前述の実施形態のいずれかでは、記録部分は、ポリヌクレオチドまたは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーであることがある。一部の実施形態では、第１、第２、第３、および／またはより高次のコーディング部分は、小分子、および／またはポリヌクレオチドもしくは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの配列決定可能なポリマーのサブユニット、単量体、残基もしくは構成要素を含む。
【０７９８】
前述の実施形態のいずれかでは、第１、第２、第３、および／またはより高次のコーディング部分は、小分子であることもあり、またはポリヌクレオチドもしくは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの配列決定可能なポリマーのサブユニット、単量体、残基もしくは構成要素であることもある。
【０７９９】
前述の実施形態のいずれかでは、一次伸長記録部分、二次伸長記録部分、三次伸長記録部分、および／またはより高次の伸長記録部分は、ポリヌクレオチドまたは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーであることがある。
【０８００】
別の態様では、（ａ）ポリペプチドを前記ポリペプチドの１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディング部分を含み、前記ポリペプチドには支持体に接合した記録部分が付随しており、前記ポリペプチドおよび／または前記記録部分が支持体に固定化されている、ステップと；（ｂ）前記第１のコーディング部分の情報を前記記録部分に移行させて、一次伸長記録部分を生成するステップと；（ｃ）前記分析物を、前記ポリペプチドの異なる１つまたは複数のＮ末端、内部またはＣ末端アミノ酸に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディング部分を含む、ステップと；（ｄ）前記第２のコーディング部分の情報を前記一次伸長記録部分に移行させて、二次伸長記録部分を生成するステップと；（ｅ）前記二次伸長記録部分を解析するステップとを含む方法が、本明細書で開示される。一実施形態では、前記ポリペプチドの１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸および／または異なる１つもしくは複数のＮ末端、内部もしくはＣ末端アミノ酸は、修飾されたＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）などの、修飾されたアミノ酸である。
【０８０１】
別の態様では、（ａ）ポリペプチドを前記ポリペプチドの１つまたは複数のＮ末端またはＣ末端アミノ酸に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディング部分を含み、前記ポリペプチドには支持体に接合した記録部分が付随しており、前記ポリペプチドおよび／または前記記録部分が支持体に固定化されている、ステップと；（ｂ）前記第１のコーディング部分の情報を前記記録部分に移行させて、一次伸長記録部分を生成するステップと；（ｃ）前記ポリペプチドの１つまたは複数のＮ末端またはＣ末端アミノ酸を消失させて、前記ポリペプチドの異なる１つまたは複数のＮ末端またはＣ末端アミノ酸を露出させるステップと；（ｄ）前記分析物を、前記ポリペプチドの異なる１つまたは複数のＮ末端またはＣ末端アミノ酸に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディング部分を含む、ステップと；（ｅ）前記第２のコーディング部分の情報を前記一次伸長記録部分に移行させて、二次伸長記録部分を生成するステップと；（ｆ）前記二次伸長記録部分を解析するステップとを含む方法が、本明細書で開示される。一実施形態では、前記ポリペプチドの１つもしくは複数のＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸および／または異なる１つもしくは複数のＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸は、修飾されたＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）などの、修飾されたアミノ酸である。
【０８０２】
前述の実施形態のいずれかでは、ステップ（ａ）の記録部分は、小分子であることもあり、またはポリヌクレオチドもしくは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの配列決定可能なポリマーのサブユニット、単量体、残基もしくは構成要素であることもある。
【０８０３】
前述の実施形態のいずれかでは、ステップ（ａ）の記録部分は、ポリヌクレオチドまたは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーであることがある。一部の実施形態では、一次または二次コーディング部分は、小分子、および／またはポリヌクレオチドもしくは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの配列決定可能なポリマーのサブユニット、単量体、残基もしくは構成要素を含む。
【０８０４】
前述の実施形態のいずれかでは、一次または二次コーディング部分は、小分子であることもあり、またはポリヌクレオチドもしくは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの配列決定可能なポリマーのサブユニット、単量体、残基もしくは構成要素であることもある。
【０８０５】
前述の実施形態のいずれかでは、一次伸長記録部分または二次伸長記録部分は、ポリヌクレオチドまたは非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーであることがある。
【０８０６】
前述の実施形態のいずれかでは、配列決定可能なポリマーは、１つまたは複数の遮断基を含むことができる。一実施形態では、１つまたは複数の遮断基は、配列決定可能なポリマーがナノポアを通過するときにシグネチャ電流遮断シグナルを生成することができる。
【０８０７】
前述の実施形態のいずれかでは、配列決定可能なポリマーは、ナノポアを通過するときに前記配列決定可能なポリマーをストールする結合性物質に結合することが可能な１つまたは複数の結合性部分を含むことができる。
【０８０８】
前述の実施形態のいずれかでは、配列決定可能なポリマーは、ナノポアを通過するときに配列決定可能なポリマーをストールすることができる１つまたは複数の構造を含むことができる。一実施形態では、前記１つまたは複数の構造は、固有の準安定性二次構造などの、二次構造を含む。
【０８０９】
前述の実施形態のいずれかでは、配列決定可能なポリマーは、ホスホロアミダイト化学構造、またはペプトイドポリマー、またはこれらの組合せを使用して構築されたポリマーを含むことができる。
【０８１０】
別の態様では、前述の実施形態のいずれかに記載の方法で開示および／または使用される、任意の分子、分子複合体もしくはコンジュゲート、試薬（例えば、化学的もしくは生物学的）、薬剤、構造（例えば、支持体、表面、粒子もしくはビーズ）、反応中間体、反応生成物、結合性複合体または任意の他の製造物品あるいはこれらの任意の組合せを含むキットが、本明細書で開示される。
【０８１１】
上述のいずれのキット成分も、ならびに例示的キットおよび方法で開示および／または使用される、任意の分子、分子複合体もしくはコンジュゲート、試薬（例えば、化学的もしくは生物学的試薬）、薬剤、構造（例えば、支持体、表面、粒子もしくはビーズ）、反応中間体、反応生成物、結合性複合体または任意の他の製造物品を、キットを形成するために、別々にまたは任意の好適な組合せで提供することができる。キットは、例えば、高度に並行な、ハイスループットなデジタル解析（例えば、巨大分子解析）、特に、ポリペプチド解析に使用するための説明書を、必要に応じて含むことができる。
【０８１２】
本開示の非限定的実施形態は、添付の図面に関連して例として説明されることになるが、これらの図は、概略図であり、正確な縮尺率で描かれるように意図されたものではない。この説明では、必ずしもすべての図中のすべての構成要素に表示が付けられておらず、説明しなくても当業者が本開示を理解できる場合は必ずしも本発明の各実施形態のすべての構成要素が示されていない。
【図面の簡単な説明】
【０８１３】
【図１−１】図１Ａは、図面に示されている機能的エレメントの凡例を示す。したがって、一実施形態では、１つもしくは複数のユニバーサルプライマー配列（または１つもしくは複数の対のユニバーサルプライマー配列、例えば、記録タグもしくは伸長記録タグの５’末端における対の一方のユニバーサルプライマー（prime）と３’末端における対の他方のもの）、複数の記録タグもしくは伸長記録タグの中からその記録タグもしくは伸長記録タグを識別することができる１つもしくは複数のバーコード配列、１つもしくは複数のＵＭＩ配列、１つもしくは複数のスペーサー配列、および／または１つもしくは複数のエンコーダー配列（コード配列、例えばコーディングタグのコード配列、とも呼ばれる）を含む、記録タグまたは伸長記録タグが本明細書で提示される。ある特定の実施形態では、伸長記録タグは、（ｉ）１つのユニバーサルプライマー配列、１つのバーコード配列、１つのＵＭＩ配列、および１つのスペーサー（すべてが非伸長記録タグからのもの）と、（ｉｉ）各カセットが、結合性物質のエンコーダー配列と、ＵＭＩ配列と、スペーサーとを含み、かつ各カセットが、コーディングタグからの配列情報を含む、タンデムに配列された１つまたは複数の「カセット」と、（ｉｉｉ）ｎ回の結合サイクル（ここで、ｎは、アッセイ読み取りが所望される結合サイクル数を表す整数である）でコーディング物質のコーディングタグにより提供され得る別のユニバーサルプライマー配列とを含む。一実施形態では、ユニバーサルプライマー配列が伸長再コーディングタグに導入された後、結合サイクルは、継続することができ、伸長記録タグをさらに伸長することができ、１つまたは複数のさらなるユニバーサルプライマー配列を導入することができる。その場合、伸長記録タグの増幅および／または配列決定を、ユニバーサルプライマー配列の任意の組合せを使用して行うことができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８１４】
【図１−２】図１Ｂは、複数のタンパク質またはポリペプチドが複数のペプチドに断片化され、次いで、それらが、複数のペプチドを表わす伸長記録タグのライブラリーに変換される、タンパク質コードの核酸（例えば、ＤＮＡ）コードへの転換または変換の全般的な概観を示す。伸長記録タグは、ペプチド配列を表すＤＮＡにコードされるライブラリー（ＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ）（ＤＥＬ）を構成する。ライブラリーを適切に修飾して、任意の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プラットフォームで配列決定することができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８１５】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｄは、単一のもしくは複数の記録タグと共局在しているまたは単一のもしくは複数の記録タグで共標識されている固定化タンパク質と相互作用するコーディングタグを含む結合性物質（例えば、抗体、アンチカリン、Ｎ−レコグニンタンパク質（Ｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｎｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ＣｌｐＳ、またはＵＢＲボックスタンパク質など）、およびそれらのバリアント／ホモログ、ならびにアプタマーなど）の複数のサイクルを使用する、本明細書で開示されている方法によるポリペプチド（例えば、タンパク質）解析の例を示す。この例では、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位、バーコード（例えば、分配バーコード、コンパートメントバーコードおよび／または画分バーコード）、必要に応じた一意の分子識別子（ＵＭＩ）配列、および必要に応じて、コーディングタグと記録タグ（または伸長記録タグ）間の情報移行に使用されるスペーサー配列（Ｓｐ）を含む。スペーサー配列（Ｓｐ）は、すべての結合サイクルにわたって一定であることもあり、結合性物質特異的であることもあり、および／または結合サイクル数特異的（例えば、結合サイクルの「クロッキング」に使用される）であることもある。この例では、コーディングタグは、結合性物質（または結合性物質のクラス、例えば、図３に示されているような修飾Ｎ末端Ｑなどの末端アミノ酸にすべてが特異的に結合する、結合物質のクラス）の識別情報を提供するエンコーダー配列、必要に応じたＵＭＩ、および記録タグの相補的スペーサー配列にハイブリダイズし、コーディングタグ情報の記録タグへの移行を（例えば、本明細書ではポリメラーゼ伸長とも呼ばれる、プライマー伸長によって）容易にするスペーサー配列を含む。配列情報を移行するためにライゲーションが使用されることもあり、その場合、スペーサー配列が使用されることがあるが、必須ではない。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。図２Ａは、同種結合性物質の分析物（例えば、タンパク質、またはタンパク質複合体）へのサイクル結合、およびその結合性物質のコーディングタグから分析物の記録タグへの対応する情報の移行によって、伸長記録タグを創出するプロセスを示す。一連の連続的な結合およびコーディングタグ情報移行ステップの後、結合性物質（例えば、抗体１（Ａｂ１）、抗体２（Ａｂ２）、抗体３（Ａｂ３）、．．．抗体「ｎ」（Ａｂｎ））の識別情報を提供する、「ｎ」結合サイクルからのエンコーダー配列を含む結合性物質コーディングタグ情報と、記録タグに由来するバーコード／必要に応じたＵＭＩ配列と、結合性物質のコーディングタグに由来する必要に応じたＵＭＩ配列と、デジタル次世代シーケンシングによる増幅および／ま���は解析を容易にするための、ライブラリー構築物の各末端にある隣接ユニバーサルプライミング配列とを含有する、最終伸長記録タグが生成される。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８１６】
【図２−２】図２Ｂは、ＤＮＡバーコード付き記録タグでタンパク質を標識するためのスキームの例を示す。上段パネルでは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、アミン反応性カップリング剤であり、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）は、固形基材の表面への「クリック」カップリングに有用な歪みアルキンである。このスキームでは、記録タグは、タンパク質のリシン（Ｋ）残基（および任意選択でＮ末端アミノ酸）のεアミンに、ＮＨＳ部分を介してカップリングされる。下段パネルでは、ヘテロ二機能性リンカーであるＮＨＳアルキンを使用して、リシン（Ｋ）残基のεアミンを標識し、アルキン「クリック」部分を創出する。その後、アジド標識ＤＮＡ記録タグを、標準的クリック化学によりこれら反応性アルキン基に容易に付着させることができる。さらに、ＤＮＡ記録タグは、逆電子要請型ディールス−アルダー（ｉＥＤＤＡ）反応によりｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）誘導体化配列決定基材に下流でカップリングするための直交性メチルテトラジン（ｍＴｅｔ）部分を用いて設計することができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８１７】
【図２−３】図２Ｃは、記録タグを使用するタンパク質分析方法の２つの例を示す。上段パネルでは、タンパク質巨大分子などの分析物は、捕捉剤により固体支持体に固定化され、必要に応じて架橋される。タンパク質または捕捉剤のどちらかを、記録タグと共局在させることまたは記録タグで標識することができる。下段パネルでは、付随する記録タグを有するタンパク質は、固体支持体に直接固定化される。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８１８】
【図２−４】図２Ｄは、同種結合物質のＤＮＡエンコーディング、および得られた伸長記録タグの配列決定を使用する単純なタンパク質イムノアッセイの全体的なワークフローの例を示す。タンパク質を記録タグにより試料バーコード化（すなわち、インデックス化）し、サイクル結合解析前にプールすることができ、その結果、試料スループットが大幅に増加され、結合試薬が節約される。事実上、この手法は、逆相タンパク質アッセイ（ＲＰＰＡ）を実施するためのデジタル式のより単純でより大規模化可能な手法であって、多数の生体試料におけるタンパク質レベル（例えば、発現レベル）を定量的方法で同時に測定することを可能にする手法である。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８１９】
【図３】図３Ａ〜Ｄは、ポリペプチド配列を表わす伸長記録タグ（例えば、ＤＮＡ配列）の構築による、分解に基づくポリペプチド配列決定アッセイのプロセスを示す。これは、サイクルプロセス、例えば、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）結合、ポリペプチドに付着している記録タグへのコーディングタグ情報の移行、末端アミノ酸切断（例えば、ＮＴＡＡ切断）を使用し、このプロセスをサイクル様式で、例えばすべて固体支持体上で、繰り返す、エドマン分解様手法によって達成される。ペプチドのＮ末端分解に由来する伸長記録タグの例示的な構築の概観が提供されている：（Ａ）ペプチドのＮ末端アミノ酸を（例えば、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、スルホニルニトロフェニル（ＳＮＰ）、アセチル、またはグアニジンジル（ｇｕａｎｉｄｉｎｄｙｌ）部分で）標識する；（Ｂ）は、標識ＮＴＡＡに結合された結合性物質および付随するコーディングタグを示す；（Ｃ）は、固体支持体（例えば、ビーズ）に結合しており、記録タグに（例えば、三機能性リンカーを介して）付随しているポリペプチドであって、結合性物質がポリペプチドのＮＴＡＡに結合すると、コーディングタグの情報が記録タグに（例えば、プライマー伸長によって、または一本鎖ライゲーションまたは二本鎖ライゲーションまたは平滑末端ライゲーションもしくは粘着末端ライゲーションを含む、ライゲーションによって）移行されて伸長記録タグが生成する、ポリペプチドを示す；（Ｄ）標識ＮＴＡＡを化学的または生物学的（例えば、酵素的）手段によって切断して新しいＮＴＡＡを露出させる。矢印により示されているように、このサイクルを「ｎ」回繰り返して、最終伸長記録タグを生成する。最終伸長記録タグは、必要に応じて、下流の増幅および／またはＤＮＡ配列決定を容易にするためのユニバーサルプライミング部位と隣接している。フォワードユニバーサルプライミング部位（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰ５−Ｓ１配列）は、元の記録タグ設計の一部であることができ、リバースユニバーサルプライミング部位（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰ７−Ｓ２’配列）を、記録タグの伸長の最終ステップとして付加させることができる。この最終ステップを結合性物質とは独立して行うことができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８２０】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｂは、本明細書で開示されている方法による例示的なタンパク質配列決定ワークフローを示す。図４Ａは、例示的なワークフローを示し、代替モードが明灰色の破線で概説されており、四角の中に示されている特定の実施形態が矢印で関連付けられている。ワークフローの各ステップの代替モードが、矢印下方の四角の中に示されている。図４Ｂは、サイクル結合およびコーディングタグ情報移行ステップを実施する際の、情報移行の効率を向上させるための選択肢を示す。１分子当たり複数の記録タグを用いることができる。さらに、所与の結合事象毎に、コーディングタグ情報の記録タグへの移行を複数回実施してもよく、またはその代わりに表面増幅ステップを用いて、伸長記録タグライブラリーなどのコピーを創出してもよい。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８２１】
【図４−２】図４Ａ〜４Ｂは、本明細書で開示されている方法による例示的なタンパク質配列決定ワークフローを示す。図４Ａは、例示的なワークフローを示し、代替モードが明灰色の破線で概説されており、四角の中に示されている特定の実施形態が矢印で関連付けられている。ワークフローの各ステップの代替モードが、矢印下方の四角の中に示されている。図４Ｂは、サイクル結合およびコーディングタグ情報移行ステップを実施する際の、情報移行の効率を向上させるための選択肢を示す。１分子当たり複数の記録タグを用いることができる。さらに、所与の結合事象毎に、コーディングタグ情報の記録タグへの移行を複数回実施してもよく、またはその代わりに表面増幅ステップを用いて、伸長記録タグライブラリーなどのコピーを創出してもよい。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８２２】
【図５】図５Ａ〜Ｂは、プライマー伸長を使用して、結合性物質のコーディングタグの識別情報を巨大分子（例えば、ポリペプチド）などの分析物に付随する記録タグに移行して伸長記録タグを生成する、伸長記録タグの例示的な構築の概観を示す。結合性物質に関する識別情報を有する一意のエンコーダー配列を含むコーディングタグは、必要に応じて、各末端が共通スペーサー配列（Ｓｐ’）と隣接している。図５Ａは、記録タグで標識されており、ビーズに連結されている、ポリペプチドのＮＴＡＡに結合するコーディングタグを含むＮＴＡＡ結合性物質を示す。記録タグは、相補的スペーサー配列を介してコーディングタグにアニーリングし（ＳｐがＳｐ’にアニーリングし）、プライマー伸長反応は、スペーサー（Ｓｐ）をプライミング部位として使用するコーディングタグ情報の記録タグへの移行を媒介する。コーディングタグは、結合性物質に対して遠位側の末端に一本鎖スペーサー（Ｓｐ’）配列を有する二本鎖として示されている。この構成は、記録タグの内部部位とのコーディングタグのハイブリダイゼーションを最小限に抑え、記録タグの末端スペーサー（Ｓｐ）配列と、コーディングタグの一本鎖スペーサー突出（Ｓｐ’）とのハイブリダイゼーションに有利に働く。さらに、伸長記録タグを１つまたは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、エンコーダーおよび／またはスペーサー配列に相補的な）と事前にアニーリングして、コーディングタグと内部記録タグ配列エレメントとのハイブリダイゼーションを阻止することができる。図５Ｂは、結合、およびコーディングタグ情報の移行、およびユニバーサルプライミング部位の３’末端への付加の、「ｎ」回のサイクルの後に生成された最終伸長記録タグを示す（「＊＊＊」は、伸長記録タグに示されていない介在結合サイクルを表わす）。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８２３】
【図６】図６は、酵素的ライゲーションによって伸長記録タグに移行されるコーディングタグ情報を示す。それぞれの記録タグを有し、記録タグ伸長が並行して進行する、２つの異なる分析物が示されている。記録タグ上の相補的スペーサー（Ｓｐ）とアニーリングする「粘着末端」突出を一方の鎖にスペーサー配列（Ｓｐ’）が有するように二本鎖コーディングタグを設計することにより、ライゲーションを容易にすることができる。この「粘着末端」（「付着末端」としても公知）は、長さ０〜８塩基、例えば、およそ２〜４塩基であり得る。二本鎖コーディングタグの相補鎖は、記録タグへのライゲーション後、情報を記録タグに移行する。相補鎖は、別のスペーサー配列を含むこともあり、このスペーサー配列は、ライゲーション前の記録タグのＳｐと同じであることもあり、またはそれと異なることもある。ライゲーションを使用して記録タグを伸長させる場合、伸長の方向は、示されているように、５’から３’へであることもあり、または必要に応じて３’から５’へであることもある。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８２４】
【図７】図７は、スペーサー配列を伸長記録タグに挿入せずに、記録タグまたは伸長記録タグの３’ヌクレオチドを、コーディングタグ（またはその相補体）の５’ヌクレオチドと連結させる化学的ライゲーションにより、コーディングタグ情報を記録タグへと移行させる、「無スペーサー」手法を示す。また、伸長記録タグおよびコーディングタグの向きを逆にして、記録タグの５’末端が、コーディングタグ（または相補体）の３’末端にライゲーションされるようにしてもよい。示されている例では、記録タグの相補的「ヘルパー」オリゴヌクレオチド配列（「記録ヘルパー」）とコーディングタグとのハイブリダイゼーションを使用して、複合体を安定させ、記録タグのコーディングタグ相補鎖への特異的な化学的ライゲーションを可能にさせる。得られた伸長記録タグは、スペーサー配列を欠いている。また、ＤＮＡ、ＰＮＡ、または類似の核酸ポリマーを用いることができる「クリック化学」型の化学的ライゲーション（例えば、アジドおよびアルキン部分（３本線記号として示されている）が使用される）が示されている。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８２５】
【図８】図８Ａ〜Ｂは、Ｎ末端アミノ酸分解の前に、ポリペプチドの翻訳後修飾（ＰＴＭ）情報を伸長記録タグに書き込むための例示的な方法を示す。図８Ａ：結合性物質に関する識別情報を有するコーディングタグを含む結合性物質（例えば、ホスホチロシン抗体の識別情報を有するコーディングタグを含むホスホチロシン抗体）を、ポリペプチドに結合させることが可能である。ホスホチロシンが、図示されているように記録タグ標識ポリペプチドに存在する場合、ホスホチロシン抗体がホスホチロシンに結合すると、コーディングタグおよび記録タグが、相補的スペーサー配列を介してアニーリングし、コーディングタグ情報が、記録タグに移行されて、伸長記録タグを生成する。図８Ｂ：伸長記録タグは、一次アミノ酸配列（例えば、「ａａ１」、「ａａ２」、「ａａ３」、．．．、「ａａＮ」）とペプチドの翻訳後修飾（例えば、「ＰＴＭ１」、「ＰＴＭ２」）の両方のコーディングタグ情報を含むこともある。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８２６】
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、結合性物質を分析物（例えば、ポリペプチドなどの巨大分子）に結合させ、結合性物質に付着しているコーディングタグの情報を、例えば、固体支持体（例えば、ビーズ）に付着している単一の分析物の部位に共局在している、複数の記録タグ中の個々の記録タグへと移行させ、それにより、分析物情報（例えば、試料中の存在もしくは非存在、レベルもしくは量、結合物質のライブラリーへの結合プロファイル、活性もしくは反応性、アミノ酸配列、翻訳後修飾、起源試料、またはそれらの任意の組合せ）を集合的に表す複数の伸長記録タグを生成する、複数サイクルのプロセスを示す。この図では、例示のために過ぎないが、分析物は、ポリペプチドであり、各サイクルは、結合性物質を、Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合させること、コーディングタグ情報を記録タグに移行させることにより結合事象を記録すること、その後、そのＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させることを含む。図９Ａは、分析物に結合されている結合性物質が利用することができる複数の記録タグ（例えば、ユニバーサルフォワードプライミング配列およびＵＭＩを含む）を固体支持体上に示す。個々の記録タグは、伸長反応をプライミングしてコーディングタグ情報を記録タグへと移行させるために使用することができる、結合性物質のコーディングタグ内の共通スペーサー配列に相補的な共通スペーサー配列（Ｓｐ）を有する。例えば、複数の記録タグが支持体上に分析物と共局在している可能性があり、それらの記録タグの一部は、他のものより分析物に近い可能性がある。一態様では、支持体上の分析物密度に対する記録タグ密度を、統計的に、各分析物が、その分析物に結合されている結合性物質が利用可能な複数（例えば、少なくとも約２、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約２０００、約５０００、またはそれより多く）の記録タグを有することになるように、制御することができる。この方法は、試料中の豊富さが低いタンパク質またはポリペプチドの分析に特に有用であり得る。図９Ａは、異なる記録タグが、サイクル１〜３の各々において伸長される（例えば、結合性物質中のサイクル特異的バーコード、または各結合／反応サイクルにおいて別々に付加されるサイクル特異的バーコードを使用して、結合／反応を「クロッキング」することができる）ことを示すが、伸長記録タグは、後続の結合サイクルのいずれか１または複数サイクルにおいてさらに伸長され得ること、および得られる伸長記録タグプールは、１回だけ、２回、３回、またはそれより多い回数、伸長されている記録タグのミックスであり得ることが予想される。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。図９Ｂは、連続的な結合サイクル各々に使用されるサイクル特異的ＮＴＡＡ結合性物質についての異なるプールであって、サイクル特異的スペーサー配列などの、サイクル特異的配列を各々が有するプールを示す。あるいは、サイクル特異的配列は、結合性物質とは別の試薬で提供されることもある。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８２７】
【図１０】図１０Ａ〜Ｃは、結合性物質に付着しているコーディングタグの情報を、固体支持体（例えば、ビーズ）に付着している単一の分析物（例えば、ポリペプチドなどの巨大分子）の部位に共局在している複数の記録タグのうちの１つの記録タグに移行させ、それにより分析物を集合的に表す複数の伸長記録タグを生成する、複数のサイクルを含む例示的な方法を示す。この図では、例示のために過ぎないが、分析物は、ポリペプチドであり、各々の処理ラウンドは、ＮＴＡＡと結合させること、結合事象を記録すること、その後、そのＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させることを含む。図１０Ａは、固体支持体上の分析物、例えば１ビーズ当たり単一分子、に対して複数の記録タグ（例えば、ユニバーサルフォワードプライミング配列およびＵＭＩを含む）を示す。個々の記録タグは、異なる「サイクル特異的」配列（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、．．．Ｃｎ）を有する異なるスペーサー配列をそれらの３’末端に有する。例えば、各ビーズ上の記録タグは、同じコンパートメントバーコードおよび／またはＵＭＩ配列を共有する。第１の結合サイクル（サイクル１）では、複数のＮＴＡＡ結合性物質を分析物と接触させる。サイクル１で使用される結合性物質は、記録タグのサイクル１Ｃ１スペーサー配列に相補的である共通５’スペーサー配列（Ｃ’１）を有する。サイクル１で使用される結合性物質は、サイクル２スペーサーＣ２に相補的である３’スペーサー配列（Ｃ’２）も有する。結合サイクル１中に、第１のＮＴＡＡ結合性物質は、分析物の遊離Ｎ末端に結合し、第１のコーディングタグの情報が、相補的Ｃ’１スペーサー配列とハイブリダイズしているＣ１配列から、プライマー伸長により、同種記録タグに移行される。ＮＴＡＡを除去して新しいＮＴＡＡを露出させた後、結合サイクル２は、サイクル１結合性物質の３’スペーサー配列と同一であるサイクル２  ５’スペーサー配列（Ｃ’２）および共通のサイクル３  ３’スペーサー配列（Ｃ’３）を有する複数のＮＴＡＡ結合性物質を、分析物と接触させる。第２のＮＴＡＡ結合性物質は、分析物のＮＴＡＡに結合し、第２のコーディングタグの情報が、プライマー伸長により、相補的なＣ２およびＣ’２スペーサー配列から同種記録タグに移行される。これらのサイクルを、最大「ｎ」結合サイクル繰り返し、最後の伸長記録タグを、ユニバーサルリバースプライミング配列でキャッピングし、単一の分析物と共局在している複数の伸長記録タグを生成し、前記伸長記録タグの各々は、１結合サイクルに由来するコーディングタグ情報を有する。連続的な結合サイクル各々で使用される結合性物質の各々のセットは、コーディングタグ中にサイクル特異的スペーサー配列を有するため、結合サイクル情報を、得られる伸長記録タグの結合性物質情報と関連付けることができる。図１０Ｂは、連続的な結合サイクル各々に使用されるサイクル特異的結合性物質についての異なるプールであって、サイクル特異的スペーサー配列を各々が有するプールを示す。図１０Ｃは、サイクル特異的スペーサー配列を使用して伸長記録タグのＰＣＲアセンブリに基づいて伸長記録タグ（例えば、分析物の部位に共局在しているもの）の収集物を逐次的��アセンブリし、それにより巨大分子などの分析物の順序付けられた配列を提供することができる方法を示す。好ましい方法は、連鎖の前に、増幅によって各伸長記録タグの複数のコピーを生成する。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８２８】
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、記録タグからコーディングタグまたはジタグ構築物への情報移行を示す。結合情報を記録するための２つの方法が（Ａ）および（Ｂ）に示されている。結合性物質は、本明細書に記載のいずれのタイプの結合性物質であってもよく、単に便宜上、抗ホスホチロシン結合性物質が示されている。伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の場合、結合情報をコーディングタグから記録タグに移行させるのではなく、情報を記録タグからコーディングタグに移行させて伸長コーディングタグを生成する（図１１Ａ）か、または情報を記録タグとコーディングタグの両方から第３のジタグ形成構築物に移行させる（図１１Ｂ）かのどちらかである。ジタグおよび伸長コーディングタグは、記録タグ（バーコード、必要に応じたＵＭＩ配列、および必要に応じたコンパートメントタグ（ＣＴ）配列を含有する（図示せず））およびコーディングタグの情報を含む。ジタグおよび伸長コーディングタグを記録タグから溶出し、収集し、必要に応じて増幅し、次世代シーケンサーで読み取ることができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８２９】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＰＮＡコンビナトリアルバーコード／ＵＭＩ記録タグの設計、および結合事象のジタグ検出を示す。図１２Ａには、化学的ライゲーションによる、４つの基本ＰＮＡワード配列（Ａ、Ａ’−Ｂ、Ｂ’−Ｃ、およびＣ’）のコンビナトリアルＰＮＡバーコード／ＵＭＩの構築が示されている。ＤＮＡアームのハイブリダイズは、ＰＮＡバーコード／ＵＭＩのコンビナトリアルアセンブリの無スペーサーコンビナトリアル鋳型を創出するために含まれている。化学的ライゲーションは、アニーリングされたＰＮＡ「ワード」を縫い合わせるために使用される。図１２Ｂは、記録タグのＰＮＡ情報をＤＮＡ中間体へと移行させるための方法示す。ＤＮＡ中間体は、情報をコーディングタグへと移行させることが可能である。すなわち、相補的ＤＮＡワード配列を、ＰＮＡにアニーリングさせ、化学的にライゲーションする（任意選択で、ＰＮＡ鋳型を使用するリガーゼが発見された場合は、酵素的にライゲーションする）。図１２Ｃでは、ＤＮＡ中間体は、スペーサー配列Ｓｐを介して、コーディングタグと相互作用するように設計されている。鎖置換プライマー伸長ステップは、ライゲーションされたＤＮＡを置換し、記録タグ情報をＤＮＡ中間体からコーディングタグへと移行させ、伸長コーディングタグを生成する。ターミネーターヌクレオチドを、ＤＮＡ中間体の末端に組み込んで、プライマー伸長によるコーディングタグ情報のＤＮＡ中間体への移行を防止してもよい。図１２Ｄ：あるいは、情報を、コーディングタグからＤＮＡ中間体へと移行させて、ジタグ構築物を生成してもよい。ターミネーターヌクレオチドを、コーディングタグの末端に組み込んで、ＤＮＡ中間体からコーディングタグへの記録タグ情報の移行を防止してもよい。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８３０】
【図１３】図１３Ａ〜Ｅは、ポリペプチド配列組成を表わすエレメントのライブラリーを生成するための、コンパートメントバーコード付きビーズへのプロテオーム分配、その後のエマルジョン融合ＰＣＲによるジタグアセンブリを示す。その後、ポリペプチドのアミノ酸の内容を、Ｎ末端配列決定法によって、またはその代わりに、アミノ酸特異的化学的標識のもしくはコーディングタグに付随する結合性物質の付着（共有結合性または非共有結合性）によって、特徴付けることができる。コーディングタグは、ユニバーサルプライミング配列、ならびにアミノ酸同一性のエンコーダー配列、コンパートメントタグ、およびアミノ酸ＵＭＩを含む。情報移行の後、ジタグを記録タグＵＭＩによって元の分子にマッピングし戻す。図１３Ａでは、プロテオームを、バーコード付きビーズを有する液滴にコンパートメント化する。付随する記録タグ（コンパートメントバーコード情報を含む）を有するペプチドをビーズ表面に付着させる。液滴エマルジョンを破壊して、ペプチドが分配されているバーコード付きビーズを放出させる。図１３Ｂでは、ペプチドの特定のアミノ酸残基を、部位特異的標識部分とコンジュゲートされているＤＮＡコーディングタグで化学的に標識する。ＤＮＡコーディングタグは、アミノ酸バーコード情報および必要に応じてアミノ酸ＵＭＩを含む。図１３Ｃ：標識ペプチド−記録タグ複合体をビーズから放出させる。図１３Ｄ：標識ペプチド−記録タグ複合体を乳化させて、１コンパートメント当たり平均で１未満のペプチド−記録タグ複合体が存在するようなナノエマルジョンまたはマイクロエマルジョンにする。図１３Ｅ：エマルジョン融合ＰＣＲは、記録タグ情報（例えば、コンパートメントバーコード）を、アミノ酸残基に付着しているＤＮＡコーディングタグのすべてに移行させる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８３１】
【図１４】図１４は、乳化されたペプチド記録タグ−コーディングタグ複合体からの伸長コーディングタグの生成を示す。図１３Ｃのペプチド複合体を、１液滴当たり平均で単一のペプチド複合体となるように、ＰＣＲ試薬と共に液滴内へと共乳化する。３プライマー融合ＰＣＲ（ｔｈｒｅｅ−ｐｒｉｍｅｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ）手法を使用して、ペプチドに付随されている記録タグを増幅し、増幅した記録タグを、複数の結合性物質コーディングタグまたは共有結合で標識されたアミノ酸のコーディングタグと融合し、プライマー伸長によりコーディングタグを伸長させて、ペプチドＵＭＩおよびコンパートメントタグ情報を、記録タグからコーディングタグへと移行させ、得られた伸長コーディングタグを増幅する。１液滴当たり複数の伸長コーディングタグ種が存在し、存在する各アミノ酸エンコーダー配列−ＵＭＩコーディングタグ毎に種が異なる。このようにして、ペプチド内のアミノ酸の同一性および計数を両方とも決定することができる。Ｕ１ユニバーサルプライマーおよびＳｐプライマーは、Ｕ２ｔｒユニバーサルプライマーよりも高い融解Ｔｍを有するように設計される。これにより、２段階ＰＣＲが可能になり、２段階ＰＣＲでは、最初の少数回のサイクルをより高いアニーリング温度で実施して記録タグを増幅し、その後、ＰＣＲ中に記録タグおよびコーディングタグが互いにプライミングして伸長コーディングタグが産生されるように、より低いＴｍの段階へと進み、Ｕ１およびＵ２ｔｒユニバーサルプライマーを使用して、得られた伸長コーディングタグ産物の増幅にプライミングする。ある特定の実施形態では、Ｕ２ｔｒプライマーからの時期尚早ポリメラーゼ伸長は、光不安定性３’ブロッキング基を使用することにより防止することができる（Ｙｏｕｎｇら、２００８年、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  （Ｃａｍｂ）４巻：４６２〜４６４頁）。記録タグを増幅する第１のラウンドのＰＣＲ、およびコーディングタグＳｐｔｒが、記録タグの増幅されたＳｐ’配列のコーディングタグの伸長にプライミングする第２のラウンドの融合ＰＣＲステップの後、Ｕ２ｔｒの３’ブロッキング基を除去し、Ｕ１およびＵ２ｔｒプライマーを有する伸長コーディングタグを増幅するために、より高い温度でのＰＣＲを開始させる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８３２】
【図１５】図１５は、タンパク質のマッピング可能性およびフェージングの増強を容易にするプロテオーム分配およびバーコード付与の使用を示す。ポリペプチド配列決定では、典型的には、タンパク質を消化してペプチドにする。このプロセスでは、親タンパク質分子に由来する個々のポリペプチド間の関係性および親タンパク質分子に対するそれらの関係性に関する情報が失われる。この情報を再構築するために、個々のペプチド配列を、それらが由来する可能性のあるタンパク質配列の収集物にマッピングし戻す。そのようなセット内に一意の一致を見出すタスクは、短いおよび／または部分的なペプチド配列では、収集物のサイズおよび複雑性（例えば、プロテオーム配列複雑性）が増加するにつれて、より困難となる。バーコード付き（例えば、コンパートメントタグ付き）コンパートメントまたは区分へとプロテオームを分配し、その後、タンパク質をペプチドへと消化し、コンパートメントタグをペプチドに接合することにより、ペプチド配列をマッピングする必要のある「タンパク質」空間が低減され、複雑なタンパク質試料の場合のタスクが大幅に単純化される。ペプチドへと消化する前に、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を有するタンパク質を標識することにより、ペプチドを元のタンパク質分子にマッピングし戻すことが容易になり、同じタンパク質分子に由来する翻訳後修飾（ＰＴＭ）バリアント間のフェージング情報の注釈、および個々のプロテオフォームの識別が可能になる。図１５Ａは、コンパートメントまたは分配バーコードを含む記録タグでタンパク質を標識し、その後、記録タグ標識ペプチドへと断片化することを含む、プロテオーム分配の例を示す。図１５Ｂ：部分ペプチド配列情報またはさらには組成情報のみの場合、このマッピングは、高度に縮重性である。しかしながら、同じタンパク質に由来する複数のペプチドからの情報と結び付けられた部分ペプチド配列または組成情報は、元のタンパク質分子の一意の識別を可能にする。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８３３】
【図１６】図１６は、コンパートメントタグ付きビーズ配列設計の例示的なモードを示す。コンパートメントタグは、個々のコンパートメントを識別するためのＸ５〜２０のバーコード、およびコンパートメントタグが接合されているペプチドを識別するためのＮ５〜１０の一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含み、ＸおよびＮは、縮重した核酸塩基または核酸塩基ワードを表わす。コンパートメントタグは、一本鎖であってもよく（上段に図示）、または二本鎖であってもよい（下段に図示）。任意選択で、コンパートメントタグは、目的のペプチドと接合するためのタンパク質リガーゼ（例えば、ブテラーゼＩ（ｂｕｔｅｌａｓｅ  Ｉ））の認識配列を有するペプチド配列を含むキメラ分子であってもよい（左側に図示）。あるいは、目的のペプチドとのカップリングのために、化学的部分が、コンパートメントタグに含まれていてもよい（例えば、右側の図に示されるようなアジド）。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８３４】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｂは、（Ａ）複数のペプチドを表す複数の伸長記録タグおよび（Ｂ）標準的ハイブリッド捕捉技法による標的ペプチド濃縮の例示的な方法を示す。例えば、ハイブリッド捕捉濃縮では、ペプチドのライブラリーを表わす伸長記録タグのライブラリーから、１つまたは複数の目的のペプチド（「標的ペプチド」）を表わす伸長記録タグとハイブリダイズする１つまたは複数のビオチン化「ベイト」オリゴヌクレオチドを使用してもよい。ベイトオリゴヌクレオチド：標的とする伸長記録タグハイブリダイゼーション対を、ハイブリダイゼーション後にビオチンタグにより溶液からプルダウンして、１つまたは複数の目的のペプチドを表わす伸長記録タグの濃縮画分を生成する。伸長記録タグの分離（「プルダウン」）は、例えば、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して達成することができる。ビオチン部分を、ビーズのストレプトアビジンと結合させ、磁石を使用してビーズを局在化させ、溶液を除去または交換することにより分離を達成する。望ましくないかまたは過剰に豊富なペプチドを表わす伸長記録タグに競合的にハイブリダイズする非ビオチン化競合物質濃縮オリゴヌクレオチドを、任意選択で、ハイブリッド捕捉アッセイのハイブリダイゼーションステップに含めて、濃縮された標的ペプチドの量をモジュレートしてもよい。非ビオチン化競合オリゴヌクレオチドは、標的ペプチドとのハイブリダイゼーションを競合するが、ハイブリダイゼーション二本鎖は、ビオチン部分が存在しないため捕捉ステップ中に捕捉されない。したがって、競合オリゴヌクレオチドのビオチン化「ベイト」オリゴヌクレオチドに対する比を調整することにより、濃縮された伸長記録タグ画分を、広いダイナミックレンジにわたってモジュレートすることができる。このステップは、試料内のタンパク質存在量のダイナミックレンジ問題に対処するために重要になるであろう。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８３５】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂは、単一細胞およびバルクプロテオームを個々の液滴内に分配するための例示的な方法を示し、各液滴は、ペプチドをそれらの元のタンパク質複合体と、または単一の細胞に由来するタンパク質と相関させるために、複数のコンパートメントタグが付着しているビーズを含む。コンパートメントタグは、バーコードを含む。液滴形成後の液滴構成成分の操作：（Ａ）単一細胞を個々の液滴内に分配し、その後細胞溶解して細胞プロテオームを放出させ、タンパク質分解により細胞プロテオームをペプチドへと消化し、十分なタンパク質分解後にプロテアーゼを不活化する；（Ｂ）バルクプロテオームを、複数の液滴内に分配し、個々の液滴は、タンパク質複合体を含み、その後タンパク質分解によりタンパク質複合体をペプチドへと消化し、十分なタンパク質分解後にプロテアーゼを不活化する。熱不安定性メタロ−プロテアーゼを使用し、光ケージ化２価カチオンを光放出させてプロテアーゼを活性化した後、封入されているタンパク質をペプチドへと消化することができる。プロテアーゼは、十分なタンパク質分解後に加熱不活化してもよく、または２価カチオンをキレートしてもよい。液滴は、ペプチドのＮ−またはＣ−末端アミノ酸のいずれかにライゲートすることが可能な核酸バーコード（記録タグとは別の）を含む、ハイブリダイズされたまたは放出可能なコンパートメントタグを含む。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８３６】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂは、単一細胞およびバルクプロテオームを個々の液滴内に分配するための例示的な方法を示し、各液滴は、ペプチドをそれらの元のタンパク質またはタンパク質複合体と、またはタンパク質を元の単一細胞と相関させるために、コンパートメントタグが付着している複数の二機能性記録タグを有するビーズを含む。液滴形成後の液滴構成成分の操作：（Ａ）単一細胞を個々の液滴内に分配し、その後細胞溶解して細胞プロテオームを放出させ、タンパク質分解により細胞プロテオームをペプチドへと消化し、十分なタンパク質分解後にプロテアーゼを不活化する；（Ｂ）バルクプロテオームを、複数の液滴内に分配し、個々の液滴は、タンパク質複合体を含み、その後タンパク質分解によりタンパク質複合体をペプチドへと消化し、十分なタンパク質分解後にプロテアーゼを不活化する。熱不安定性メタロ−プロテアーゼを使用し、光ケージ化２価カチオン（例えば、Ｚｎ２＋）を光放出させた後、封入されているタンパク質をペプチドへと消化することができる。プロテアーゼは、十分なタンパク質分解後に加熱不活化してもよく、または２価カチオンをキレートしてもよい。液滴は、ペプチドのＮ−またはＣ−末端アミノ酸のいずれかにライゲートすることが可能な核酸バーコード（記録タグとは別の）を含む、ハイブリダイズされたまたは放出可能なコンパートメントタグを含む。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８３７】
【図２０−１】図２０Ａ〜Ｌは、ペプチドに付着したコンパートメントバーコード付き記録タグの生成を示す。コンパートメントバーコード付与技術（例えば、マイクロ流体液滴中のバーコード付きビーズなど）を使用して、コンパートメント特異的バーコードを、特定のコンパートメント内に封入されている分子内容物に移行させることができる。（Ａ）特定の実施形態では、タンパク質分子を変性させ、リシン残基（Ｋ）のε−アミン基を、活性化されたユニバーサルＤＮＡタグ分子（５’末端にＮＨＳ部分を有することが示されているユニバーサルプライミング配列（Ｕ１）を含むが、任意の他のバイオコンジュゲーション部分も利用することができる）と化学的にコンジュゲートさせる。ユニバーサルＤＮＡタグをポリペプチドにコンジュゲーションした後、過剰なユニバーサルＤＮＡタグを除去する。（Ｂ）ユニバーサルＤＮＡタグ付きポリペプチドを、ビーズに結合されている核酸分子とハイブリダイズさせ、個々のビーズに結合されている前記核酸分子は、コンパートメントタグ（バーコード）配列の一意の集団を含む。コンパートメント化は、液滴などの異なる物理的コンパートメント（破線楕円により示されている）内に試料を分離することによって行うことができる。あるいは、コンパートメント化は、例えば、ポリペプチドのユニバーサルＤＮＡタグを、ビーズのコンパートメントＤＮＡタグにアニーリングさせることによって、標識ポリペプチドをビーズ表面に固定化することにより、追加の物理的分離を必要とせずに、直接的に達成することができる。単一のポリペプチド分子は、単一のビーズとのみ相互作用する（例えば、単一のポリペプチドは、複数のビーズにまたがっていない）。しかしながら、複数のポリペプチドが、同じビーズと相互作用することもある。コンパートメントバーコード配列（ＢＣ）に加えて、ビーズに結合されている核酸分子は、共通Ｓｐ（スペーサー）配列、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、およびポリペプチドＤＮＡタグＵ１’に相補的な配列で構成されることもある。（Ｃ）ユニバーサルＤＮＡタグ付きポリペプチドを、ビーズに結合されているコンパートメントタグとアニーリングさせた後、付着リンカーを切断することによってコンパートメントタグをビーズから放出させる。（Ｄ）アニーリングしたＵ１  ＤＮＡタグプライマーを、ビーズに由来するコンパートメントタグ核酸分子を鋳型として使用する、ポリメラーゼに基づくプライマー伸長によって、伸長させる。プライマー伸長ステップを、（Ｃ）に示されているようにコンパートメントタグをビーズから放出させた後に行ってもよく、または必要に応じてコンパートメントタグが依然としてビーズに付着している間に行ってもよい（図示せず）。これにより、ビーズのコンパートメントタグに由来するバーコード配列が、ポリペプチドのＵ１  ＤＮＡタグ配列に効果的に書き込まれる。この新しい配列が、記録タグを構成する。プライマー伸長後、プロテアーゼ、例えば、Ｌｙｓ−Ｃ（リシン残基のＣ末端側を切断する）、Ｇｌｕ−Ｃ（グルタミン酸残基のＣ末端側を、および程度は低いがグルタミン酸残基を切断する）、またはプロテイナーゼＫなどのランダムプロテアーゼを使用して、ポリペプチドを切断してペプチド断片にする。（Ｅ）各ペプチド断片は、本明細書で開示されているように下流ペプチド配列決定のために、そのＣ末端リシンを、記録タグを構成する伸長ＤＮＡタグ配列で標識する。（Ｆ）記録タグ付きペプチドを、歪みアルキン標識であるＤＢＣＯを介してアジドビーズにカップリングする。アジドビーズは、必要に応じて、ＤＢＣＯ−アジド固定化の効率を促進するために、記録タグに相補的な捕捉配列も含有する。元のビーズからペプチドを除去し、新しい固体支持体（例えば、ビーズ）に再固定化することにより、ペプチド間の最適な分子間間隔が可能になり、本明細書で開示されているペプチド配列決定法が容易になることが留意されるべきである。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【図２０−２】図２０Ａ〜Ｌは、ペプチドに付着したコンパートメントバーコード付き記録タグの生成を示す。コンパートメントバーコード付与技術（例えば、マイクロ流体液滴中のバーコード付きビーズなど）を使用して、コンパートメント特異的バーコードを、特定のコンパートメント内に封入されている分子内容物に移行させることができる。（Ａ）特定の実施形態では、タンパク質分子を変性させ、リシン残基（Ｋ）のε−アミン基を、活性化されたユニバーサルＤＮＡタグ分子（５’末端にＮＨＳ部分を有することが示されているユニバーサルプライミング配列（Ｕ１）を含むが、任意の他のバイオコンジュゲーション部分も利用することができる）と化学的にコンジュゲートさせる。ユニバーサルＤＮＡタグをポリペプチドにコンジュゲーションした後、過剰なユニバーサルＤＮＡタグを除去する。（Ｂ）ユニバーサルＤＮＡタグ付きポリペプチドを、ビーズに結合されている核酸分子とハイブリダイズさせ、個々のビーズに結合されている前記核酸分子は、コンパートメントタグ（バーコード）配列の一意の集団を含む。コンパートメント化は、液滴などの異なる物理的コンパートメント（破線楕円により示されている）内に試料を分離することによって行うことができる。あるいは、コンパートメント化は、例えば、ポリペプチドのユニバーサルＤＮＡタグを、ビーズのコンパートメントＤＮＡタグにアニーリングさせることによって、標識ポリペプチドをビーズ表面に固定化することにより、追加の物理的分離を必要とせずに、直接的に達成することができる。単一のポリペプチド分子は、単一のビーズとのみ相互作用する（例えば、単一のポリペプチドは、複数のビーズにまたがっていない）。しかしながら、複数のポリペプチドが、同じビーズと相互作用することもある。コンパートメントバーコード配列（ＢＣ）に加えて、ビーズに結合されている核酸分子は、共通Ｓｐ（スペーサー）配列、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、およびポリペプチドＤＮＡタグＵ１’に相補的な配列で構成されることもある。（Ｃ）ユニバーサルＤＮＡタグ付きポリペプチドを、ビーズに結合されているコンパートメントタグとアニーリングさせた後、付着リンカーを切断することによってコンパートメントタグをビーズから放出させる。（Ｄ）アニーリングしたＵ１  ＤＮＡタグプライマーを、ビーズに由来するコンパートメントタグ核酸分子を鋳型として使用する、ポリメラーゼに基づくプライマー伸長によって、伸長させる。プライマー伸長ステップを、（Ｃ）に示されているようにコンパートメントタグをビーズから放出させた後に行ってもよく、または必要に応じてコンパートメントタグが依然としてビーズに付着している間に行ってもよい（図示せず）。これにより、ビーズのコンパートメントタグに由来するバーコード配列が、ポリペプチドのＵ１  ＤＮＡタグ配列に効果的に書き込まれる。この新しい配列が、記録タグを構成する。プライマー伸長後、プロテアーゼ、例えば、Ｌｙｓ−Ｃ（リシン残基のＣ末端側を切断する）、Ｇｌｕ−Ｃ（グルタミン酸残基のＣ末端側を、および程度は低いがグルタミン酸残基を切断する）、またはプロテイナーゼＫなどのランダムプロテアーゼを使用して、ポリペプチドを切断してペプチド断片にする。（Ｅ）各ペプチド断片は、本明細書で開示されているように下流ペプチド配列決定のために、そのＣ末端リシンを、記録タグを構成する伸長ＤＮＡタグ配列で標識する。（Ｆ）記録タグ付きペプチドを、歪みアルキン標識であるＤＢＣＯを介してアジドビーズにカップリングする。アジドビーズは、必要に応じて、ＤＢＣＯ−アジド固定化の効率を促進するために、記録タグに相補的な捕捉配列も含有する。元のビーズからペプチドを除去し、新しい固体支持体（例えば、ビーズ）に再固定化することにより、ペプチド間の最適な分子間間隔が可能になり、本明細書で開示されているペプチド配列決定法が容易になることが留意されるべきである。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８３８】
【図２０−３】図２０Ｇ〜Ｌは、アルキンで予め標識したポリペプチド（図２Ｂに記載のような）へのＤＮＡタグのクリック化学コンジュゲーションを使用すること以外は、図２０Ａ〜Ｆに示されているものと同様の概念を示す。アジドおよびｍＴｅｔ化学は、直交性であり、ＤＮＡタグへのクリックコンジュゲーション、および配列決定基材へのクリックｉＥＤＤＡコンジュゲーション（ｍＴｅｔおよびＴＣＯ）を可能にする。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【図２０−４】図２０Ｇ〜Ｌは、アルキンで予め標識したポリペプチド（図２Ｂに記載のような）へのＤＮＡタグのクリック化学コンジュゲーションを使用すること以外は、図２０Ａ〜Ｆに示されているものと同様の概念を示す。アジドおよびｍＴｅｔ化学は、直交性であり、ＤＮＡタグへのクリックコンジュゲーション、および配列決定基材へのクリックｉＥＤＤＡコンジュゲーション（ｍＴｅｔおよびＴＣＯ）を可能にする。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８３９】
【図２１】図２１は、流動フォーカスＴ字路を使用して、単一細胞を、コンパートメントタグ付き（例えば、バーコード）ビーズにコンパートメント化するための例示的な方法を示す。２つの水流を用いると、液滴形成時に、細胞溶解およびプロテアーゼ活性化（Ｚｎ２＋混合）を容易に開始することができる。
【０８４０】
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｂは、例示的なタグ化詳細を示す。（Ａ）コンパートメントタグ（ＤＮＡ−ペプチドキメラ）を、ブテラーゼＩによるペプチドライゲーションを使用して、ペプチドに付着させる。（Ｂ）ペプチド配列決定の開始前に、コンパートメントタグ情報を、付随する記録タグへと移行させる。任意選択で、アスパラギン酸残基のＮ末端でペプチド結合を選択的に切断するエンドペプチダーゼＡｓｐＮを使用して、記録タグへの情報移行後、コンパートメントタグを切断することができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８４１】
【図２３】図２３Ａ〜Ｃ：組織スライスの空間的プロテオミクスに基づく解析のためのアレイに基づくバーコード。（Ａ）空間的にコードされたＤＮＡバーコードのアレイ（ＢＣｉｊと表記されている特徴バーコード）を、組織スライス（ＦＦＰＥまたは凍結されたもの）と組み合わせる。一実施形態では、組織スライスは、固定され、透過処理されている。好ましい実施形態では、アレイ特徴サイズは、細胞サイズ（ヒト細胞については約１０μｍ）よりも小さい。（Ｂ）アレイにマウントした組織スライスを試薬で処理して架橋を元に戻し（例えば、シトラコン酸無水物での抗原賦活化プロトコール（Namimatsu, Ghazizadeh et al. 2005）、次いで、その中のタンパク質を、タンパク質分子すべてをＤＮＡ記録タグで効果的に標識する部位反応性ＤＮＡ標識で標識する（例えば、抗原賦活化後に遊離される、リシン標識）。標識および洗浄後、アレイに結合されているＤＮＡバーコード配列を切断し、マウントした組織スライスへの拡散を可能にし、その中にあるタンパク質に付着したＤＮＡ記録タグとハイブリダイズさせる。（Ｃ）アレイにマウントした組織を、次にポリメラーゼ伸長に供して、ハイブリダイズされたバーコードの情報を、タンパク質を標識しているＤＮＡ記録タグへと移行させる。バーコード情報の移行後、アレイにマウントした組織を、スライドからこすり落とし、必要に応じてプロテアーゼにより消化し、タンパク質またはペプチドを溶液に抽出する。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８４２】
【図２４−１】図２４Ａ〜Ｂは、ビーズに固定化されており、コーディングタグに付着している結合性物質によってアッセイされる、２つの異なる例示的なＤＮＡ標的分析物（ＡＢおよびＣＤ）を示す。このモデル系は、結合されている物質から近位レポートタグへのコーディングタグ移行についての単一分子挙動を説明するのに役立つ。好ましい実施形態では、コーディングタグは、プライマー伸長によって伸長再コーディングタグに組み込まれる。図２４Ａは、ＡＢ巨大分子が、Ａ特異的結合性物質（「Ａ’」、ＡＢ巨大分子の「Ａ’」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長によって記録タグに移行され、Ｂ特異的結合性物質（「Ｂ’」、ＡＢ巨大分子の「Ｂ’」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長によって再コーディングタグへと移行されることを示す。コーディングタグＡおよびＢは配列が異なり、この図では、容易に識別することができるように長さも異なっている。長さが異なることにより、ゲル電気泳動法によるコーディングタグ移行の解析が容易になるが、次世代シーケンシングによる解析では長さが異なる必要はない。Ａ’およびＢ’結合性物質の結合は、単一結合サイクルの代替的な可能性として示されている。第２のサイクルが追加されれば、伸長記録タグはさらに伸長されることになる。第１および第２のサイクルにおいてＡ’またはＢ’結合性物質のどちらが付加されるのかに依存して、伸長記録タグは、形態ＡＡ、ＡＢ、ＢＡおよびＢＢのコーディングタグ情報を含有することができる。したがって、伸長記録タグは、結合物質の同一性だけでなく、結合事象の順序に関する情報も含有する。同様に、図２４Ｂは、ＣＤ巨大分子が、Ｃ特異的結合性物質（「Ｃ’」、ＣＤ巨大分子の「Ｃ’」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長によって記録タグへと移行され、Ｄ特異的結合性物質（「Ｄ’」、ＣＤ巨大分子の「Ｄ’」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長によって記録タグに移行されることを示す。コーディングタグＣおよびＤは配列が異なり、この図では、容易に識別することができるように長さも異なっている。長さが異なることにより、ゲル電気泳動法によるコーディングタグ移行の解析が容易になるが、次世代シーケンシングによる解析では長さが異なる必要はない。Ｃ’およびＤ’結合性物質の結合は、単一結合サイクルの代替的な可能性として示されている。第２のサイクルが追加されれば、伸長記録タグはさらに伸長されることになる。第１および第２のサイクルにおいてＣ’またはＤ’結合性物質のどちらが付加されるのかに依存して、伸長記録タグは、形態ＣＣ、ＣＤ、ＤＣおよびＤＤのコーディングタグ情報を含有することができる。コーディングタグは、必要に応じてＵＭＩを含むこともある。コーディングタグにＵＭＩを含めることにより、結合事象に関する追加情報を記録することが可能になり、それにより、結合事象を個々の結合性物質のレベルで区別することが可能になる。これは、個々の結合性物質が、１つより多くの結合事象に関与し得る（例えば、その結合親和性が、１つより多くの事象に関与するのに十分な頻度で遊離および再結合できるような結合親和性である）場合、有用であり得る。それは、エラー訂正にも有用であり得る。例えば、いくつかの状況下では、コーディングタグは、同じ結合サイクルで２回またはそれよりも多くの頻度で情報を記録タグに移行させることがある。ＵＭＩの使用によって、これらが、すべて単一結合事象に関連付けられる繰り返し情報移行事象である可能性が高いことが明らかになる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８４３】
【図２４−２】図２４Ａ〜Ｂは、ビーズに固定化されており、コーディングタグに付着している結合性物質によってアッセイされる、２つの異なる例示的なＤＮＡ標的分析物（ＡＢおよびＣＤ）を示す。このモデル系は、結合されている物質から近位レポートタグへのコーディングタグ移行についての単一分子挙動を説明するのに役立つ。好ましい実施形態では、コーディングタグは、プライマー伸長によって伸長再コーディングタグに組み込まれる。図２４Ａは、ＡＢ巨大分子が、Ａ特異的結合性物質（「Ａ’」、ＡＢ巨大分子の「Ａ’」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長によって記録タグに移行され、Ｂ特異的結合性物質（「Ｂ’」、ＡＢ巨大分子の「Ｂ’」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長によって再コーディングタグへと移行されることを示す。コーディングタグＡおよびＢは配列が異なり、この図では、容易に識別することができるように長さも異なっている。長さが異なることにより、ゲル電気泳動法によるコーディングタグ移行の解析が容易になるが、次世代シーケンシングによる解析では長さが異なる必要はない。Ａ’およびＢ’結合性物質の結合は、単一結合サイクルの代替的な可能性として示されている。第２のサイクルが追加されれば、伸長記録タグはさらに伸長されることになる。第１および第２のサイクルにおいてＡ’またはＢ’結合性物質のどちらが付加されるのかに依存して、伸長記録タグは、形態ＡＡ、ＡＢ、ＢＡおよびＢＢのコーディングタグ情報を含有することができる。したがって、伸長記録タグは、結合物質の同一性だけでなく、結合事象の順序に関する情報も含有する。同様に、図２４Ｂは、ＣＤ巨大分子が、Ｃ特異的結合性物質（「Ｃ’」、ＣＤ巨大分子の「Ｃ’」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長によって記録タグへと移行され、Ｄ特異的結合性物質（「Ｄ’」、ＣＤ巨大分子の「Ｄ’」成分に相補的なオリゴヌクレオチド配列）と相互作用して、付随するコーディングタグの情報がプライマー伸長によって記録タグに移行されることを示す。コーディングタグＣおよびＤは配列が異なり、この図では、容易に識別することができるように長さも異なっている。長さが異なることにより、ゲル電気泳動法によるコーディングタグ移行の解析が容易になるが、次世代シーケンシングによる解析では長さが異なる必要はない。Ｃ’およびＤ’結合性物質の結合は、単一結合サイクルの代替的な可能性として示されている。第２のサイクルが追加されれば、伸長記録タグはさらに伸長されることになる。第１および第２のサイクルにおいてＣ’またはＤ’結合性物質のどちらが付加されるのかに依存して、伸長記録タグは、形態ＣＣ、ＣＤ、ＤＣおよびＤＤのコーディングタグ情報を含有することができる。コーディングタグは、必要に応じてＵＭＩを含むこともある。コーディングタグにＵＭＩを含めることにより、結合事象に関する追加情報を記録することが可能になり、それにより、結合事象を個々の結合性物質のレベルで区別することが可能になる。これは、個々の結合性物質が、１つより多くの結合事象に関与し得る（例えば、その結合親和性が、１つより多くの事象に関与するのに十分な頻度で遊離および再結合できるような結合親和性である）場合、有用であり得る。それは、エラー訂正にも有用であり得る。例えば、いくつかの状況下では、コーディングタグは、同じ結合サイクルで２回またはそれよりも多くの頻度で情報を記録タグに移行させることがある。ＵＭＩの使用によって、これらが、すべて単一結合事象に関連付けられる繰り返し情報移行事象である可能性が高いことが明らかになる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８４４】
【図２５】図２５は、ビーズに固定化されており、コーディングタグに付着した結合性物質によりアッセイされる例示的なＤＮＡ標的巨大分子（ＡＢ）を示す。Ａ特異的結合性物質（「Ａ’」、ＡＢ巨大分子のＡ成分に相補的なオリゴヌクレオチド）は、ＡＢ巨大分子と相互作用し、付随するコーディングタグの情報が、ライゲーションにより記録タグへと移行される。Ｂ特異的結合性物質（「Ｂ’」、ＡＢ巨大分子のＢ成分に相補的なオリゴヌクレオチド）は、ＡＢ巨大分子と相互作用し、付随するコーディングタグの情報が、ライゲーションにより記録タグへと移行される。コーディングタグＡおよびＢは配列が異なり、この図では、容易に識別することができるように長さも異なっている。長さが異なることにより、ゲル電気泳動法によるコーディングタグ移行の解析が容易になるが、次世代シーケンシングによる解析には長さが異なる必要はない。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８４５】
【図２６】図２６Ａ〜Ｂは、プライマー伸長による結合／コーディングタグ移行の例示的なＤＮＡ−ペプチド分析物（例えば、巨大分子）を示す。図２６Ａは、ビーズに固定化されている例示的なオリゴヌクレオチド−ペプチド標的巨大分子（「Ａ」オリゴヌクレオチド−ｃＭｙｃペプチド）を示す。ｃＭｙｃ特異的結合性物質（例えば、抗体）は、巨大分子のｃＭｙｃペプチド部分と相互作用し、付随するコーディングタグの情報が記録タグに移行される。ｃＭｙｃコーディングタグの情報の記録タグへの移行をゲル電気泳動法により解析することができる。図２６Ｂは、ビーズに固定化されている例示的なオリゴヌクレオチド−ペプチド標的巨大分子（「Ｃ」オリゴヌクレオチド−赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチド）を示す。ＨＡ特異的結合性物質（例えば、抗体）は、巨大分子のＨＡペプチド部分と相互作用し、付随するコーディングタグの情報が記録タグに移行される。コーディングタグの情報の記録タグへの移行をゲル電気泳動法により解析することができる。ｃＭｙｃ抗体−コーディングタグおよびＨＡ抗体−コーディングタグの結合が、単一結合サイクルの代替的な可能性として示されている。第２の結合サイクルが実施されれば、伸長記録タグはさらに伸長されることになる。第１および第２の結合サイクルにおいてｃＭｙｃ抗体−コーディングタグまたはＨＡ抗体−コーディングタグのどちらが付加されるのかに依存して、伸長記録タグは、形態ｃＭｙｃ−ＨＡ、ＨＡ−ｃＭｙｃ、ｃＭｙｃ−ｃＭｙｃ、およびＨＡ−ＨＡのコーディングタグ情報を含有することができる。図示されていないが、追加の結合性物質を導入して、巨大分子のＡおよびＣオリゴヌクレオチド成分の検出を可能にすることもできる。したがって、情報を記録タグへと移行させ、結合性物質の同一性だけでなく結合事象の順序に関する情報も含有する伸長記録タグを読み出すことによって、異なるタイプの骨格を含むハイブリッド巨大分子を解析することができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８４６】
【図２７Ａ】図２７Ａ〜Ｄは、エラー訂正バーコードの生成の例を示す。（Ａ）６５個のエラー訂正バーコード（配列番号１〜６５）のサブセットを、Ｒソフトウェアパッケージ「ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ」（https://bioconductor.riken.jp/packages/3.3/bioc/manuals/DNABarcodes/man/DNABarcodes.pdf）から、コマンドパラメーター［ｃｒｅａｔｅ．ｄｎａｂａｒｃｏｄｅｓ（ｎ＝１５、ｄｉｓｔ＝１０）］を使用して導出した７７個のバーコードのセットから選択した。このアルゴリズムは、４個の置換の距離まで置換エラーを訂正することができ、９個の置換までエラーを検出することができる、１５ｍｅｒ「Ｈａｍｍｉｎｇ」バーコードを生成する。フィルターをかけて、様々なナノポア電流レベル（ナノポアに基づく配列決定の場合）を示さなかったバーコードまたはこのセットの他のメンバーとも相関していたバーコードを除去することにより、６５個のバーコードのサブセットを生成した。（Ｂ）ポアを通り抜ける１５ｍｅｒバーコードの予測ナノポア電流レベルのプロット。これらの予測電流は、各々の１５ｍｅｒバーコードワードを、１１個のオーバーラップしている５ｍｅｒワードの複合セットに分割し、５ｍｅｒ  Ｒ９ナノポア電流レベル索引表（https://github.com/jts/nanopolish/tree/master/etc/r9-modelsで入手可能な、ｔｅｍｐｌａｔｅ＿ｍｅｄｉａｎ６８ｐＡ．５ｍｅｒｓ．ｍｏｄｅｌ）を使用して、バーコードがナノポアを一度に一塩基ずつ通り抜ける際の対応する電流レベルを予測することによって計算した。（Ｂ）から理解することができるように、６５個のバーコードのこのセットは、そのメンバーの各々について一意の電流シグネチャを示す。（Ｃ）ＤＴＲおよびＤＴＲプライマーのオーバーラップセットを使用する、ナノポアシーケンシング用のモデル伸長記録タグとしてのＰＣＲ産物の生成が示されている。次いで、ＰＣＲアンプリコンをライゲーションして、連鎖状の伸長記録タグモデルを形成する。（Ｄ）図２７Ｃに示されているように生成された、例示的な「伸長記録タグ」モデルのナノポアシーケンシングリード（リード長７３４塩基）。ＭｉｎＩｏｎ  Ｒ９．４リードは、７．２（リード品質不良）の品質スコアを有する。しかしながら、低いリード品質（Ｑｓｃｏｒｅ＝７．２）であっても、ｌａｌｉｇｎを使用してバーコード配列を容易に識別することができる。１５ｍｅｒスペーサーエレメントには下線が引かれている。バーコードは、ＢＣまたはＢＣ’表示により示されるフォワード方向またはリバース方向のどちらかでアラインメントすることができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【図２７Ｂ】図２７Ａ〜Ｄは、エラー訂正バーコードの生成の例を示す。（Ａ）６５個のエラー訂正バーコード（配列番号１〜６５）のサブセットを、Ｒソフトウェアパッケージ「ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ」（https://bioconductor.riken.jp/packages/3.3/bioc/manuals/DNABarcodes/man/DNABarcodes.pdf）から、コマンドパラメーター［ｃｒｅａｔｅ．ｄｎａｂａｒｃｏｄｅｓ（ｎ＝１５、ｄｉｓｔ＝１０）］を使用して導出した７７個のバーコードのセットから選択した。このアルゴリズムは、４個の置換の距離まで置換エラーを訂正することができ、９個の置換までエラーを検出することができる、１５ｍｅｒ「Ｈａｍｍｉｎｇ」バーコードを生成する。フィルターをかけて、様々なナノポア電流レベル（ナノポアに基づく配列決定の場合）を示さなかったバーコードまたはこのセットの他のメンバーとも相関していたバーコードを除去することにより、６５個のバーコードのサブセットを生成した。（Ｂ）ポアを通り抜ける１５ｍｅｒバーコードの予測ナノポア電流レベルのプロット。これらの予測電流は、各々の１５ｍｅｒバーコードワードを、１１個のオーバーラップしている５ｍｅｒワードの複合セットに分割し、５ｍｅｒ  Ｒ９ナノポア電流レベル索引表（https://github.com/jts/nanopolish/tree/master/etc/r9-modelsで入手可能な、ｔｅｍｐｌａｔｅ＿ｍｅｄｉａｎ６８ｐＡ．５ｍｅｒｓ．ｍｏｄｅｌ）を使用して、バーコードがナノポアを一度に一塩基ずつ通り抜ける際の対応する電流レベルを予測することによって計算した。（Ｂ）から理解することができるように、６５個のバーコードのこのセットは、そのメンバーの各々について一意の電流シグネチャを示す。（Ｃ）ＤＴＲおよびＤＴＲプライマーのオーバーラップセットを使用する、ナノポアシーケンシング用のモデル伸長記録タグとしてのＰＣＲ産物の生成が示されている。次いで、ＰＣＲアンプリコンをライゲーションして、連鎖状の伸長記録タグモデルを形成する。（Ｄ）図２７Ｃに示されているように生成された、例示的な「伸長記録タグ」モデルのナノポアシーケンシングリード（リード長７３４塩基）。ＭｉｎＩｏｎ  Ｒ９．４リードは、７．２（リード品質不良）の品質スコアを有する。しかしながら、低いリード品質（Ｑｓｃｏｒｅ＝７．２）であっても、ｌａｌｉｇｎを使用してバーコード配列を容易に識別することができる。１５ｍｅｒスペーサーエレメントには下線が引かれている。バーコードは、ＢＣまたはＢＣ’表示により示されるフォワード方向またはリバース方向のどちらかでアラインメントすることができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【図２７Ｃ】図２７Ａ〜Ｄは、エラー訂正バーコードの生成の例を示す。（Ａ）６５個のエラー訂正バーコード（配列番号１〜６５）のサブセットを、Ｒソフトウェアパッケージ「ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ」（https://bioconductor.riken.jp/packages/3.3/bioc/manuals/DNABarcodes/man/DNABarcodes.pdf）から、コマンドパラメーター［ｃｒｅａｔｅ．ｄｎａｂａｒｃｏｄｅｓ（ｎ＝１５、ｄｉｓｔ＝１０）］を使用して導出した７７個のバーコードのセットから選択した。このアルゴリズムは、４個の置換の距離まで置換エラーを訂正することができ、９個の置換までエラーを検出することができる、１５ｍｅｒ「Ｈａｍｍｉｎｇ」バーコードを生成する。フィルターをかけて、様々なナノポア電流レベル（ナノポアに基づく配列決定の場合）を示さなかったバーコードまたはこのセットの他のメンバーとも相関していたバーコードを除去することにより、６５個のバーコードのサブセットを生成した。（Ｂ）ポアを通り抜ける１５ｍｅｒバーコードの予測ナノポア電流レベルのプロット。これらの予測電流は、各々の１５ｍｅｒバーコードワードを、１１個のオーバーラップしている５ｍｅｒワードの複合セットに分割し、５ｍｅｒ  Ｒ９ナノポア電流レベル索引表（https://github.com/jts/nanopolish/tree/master/etc/r9-modelsで入手可能な、ｔｅｍｐｌａｔｅ＿ｍｅｄｉａｎ６８ｐＡ．５ｍｅｒｓ．ｍｏｄｅｌ）を使用して、バーコードがナノポアを一度に一塩基ずつ通り抜ける際の対応する電流レベルを予測することによって計算した。（Ｂ）から理解することができるように、６５個のバーコードのこのセットは、そのメンバーの各々について一意の電流シグネチャを示す。（Ｃ）ＤＴＲおよびＤＴＲプライマーのオーバーラップセットを使用する、ナノポアシーケンシング用のモデル伸長記録タグとしてのＰＣＲ産物の生成が示されている。次いで、ＰＣＲアンプリコンをライゲーションして、連鎖状の伸長記録タグモデルを形成する。（Ｄ）図２７Ｃに示されているように生成された、例示的な「伸長記録タグ」モデルのナノポアシーケンシングリード（リード長７３４塩基）。ＭｉｎＩｏｎ  Ｒ９．４リードは、７．２（リード品質不良）の品質スコアを有する。しかしながら、低いリード品質（Ｑｓｃｏｒｅ＝７．２）であっても、ｌａｌｉｇｎを使用してバーコード配列を容易に識別することができる。１５ｍｅｒスペーサーエレメントには下線が引かれている。バーコードは、ＢＣまたはＢＣ’表示により示されるフォワード方向またはリバース方向のどちらかでアラインメントすることができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【図２７Ｄ】図２７Ａ〜Ｄは、エラー訂正バーコードの生成の例を示す。（Ａ）６５個のエラー訂正バーコード（配列番号１〜６５）のサブセットを、Ｒソフトウェアパッケージ「ＤＮＡＢａｒｃｏｄｅｓ」（https://bioconductor.riken.jp/packages/3.3/bioc/manuals/DNABarcodes/man/DNABarcodes.pdf）から、コマンドパラメーター［ｃｒｅａｔｅ．ｄｎａｂａｒｃｏｄｅｓ（ｎ＝１５、ｄｉｓｔ＝１０）］を使用して導出した７７個のバーコードのセットから選択した。このアルゴリズムは、４個の置換の距離まで置換エラーを訂正することができ、９個の置換までエラーを検出することができる、１５ｍｅｒ「Ｈａｍｍｉｎｇ」バーコードを生成する。フィルターをかけて、様々なナノポア電流レベル（ナノポアに基づく配列決定の場合）を示さなかったバーコードまたはこのセットの他のメンバーとも相関していたバーコードを除去することにより、６５個のバーコードのサブセットを生成した。（Ｂ）ポアを通り抜ける１５ｍｅｒバーコードの予測ナノポア電流レベルのプロット。これらの予測電流は、各々の１５ｍｅｒバーコードワードを、１１個のオーバーラップしている５ｍｅｒワードの複合セットに分割し、５ｍｅｒ  Ｒ９ナノポア電流レベル索引表（https://github.com/jts/nanopolish/tree/master/etc/r9-modelsで入手可能な、ｔｅｍｐｌａｔｅ＿ｍｅｄｉａｎ６８ｐＡ．５ｍｅｒｓ．ｍｏｄｅｌ）を使用して、バーコードがナノポアを一度に一塩基ずつ通り抜ける際の対応する電流レベルを予測することによって計算した。（Ｂ）から理解することができるように、６５個のバーコードのこのセットは、そのメンバーの各々について一意の電流シグネチャを示す。（Ｃ）ＤＴＲおよびＤＴＲプライマーのオーバーラップセットを使用する、ナノポアシーケンシング用のモデル伸長記録タグとしてのＰＣＲ産物の生成が示されている。次いで、ＰＣＲアンプリコンをライゲーションして、連鎖状の伸長記録タグモデルを形成する。（Ｄ）図２７Ｃに示されているように生成された、例示的な「伸長記録タグ」モデルのナノポアシーケンシングリード（リード長７３４塩基）。ＭｉｎＩｏｎ  Ｒ９．４リードは、７．２（リード品質不良）の品質スコアを有する。しかしながら、低いリード品質（Ｑｓｃｏｒｅ＝７．２）であっても、ｌａｌｉｇｎを使用してバーコード配列を容易に識別することができる。１５ｍｅｒスペーサーエレメントには下線が引かれている。バーコードは、ＢＣまたはＢＣ’表示により示されるフォワード方向またはリバース方向のどちらかでアラインメントすることができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８４７】
【図２８】図２８Ａ〜Ｄは、記録タグによるタンパク質の分析物特異的標識の例を示す。（Ａ）そのネイティブなコンフォメーションをとっている目的のタンパク質分析物を標的とする結合性物質は、分析物特異的バーコード（ＢＣＡ’）を含み、これがＤＮＡ記録タグ上の相補的な分析物特異的バーコード（ＢＣＡ）とハイブリダイズする。あるいは、切断可能なリンカーを介してＤＮＡ記録タグを結合性物質に付着させることができ、そのＤＮＡ記録タグを直接タンパク質に「クリック」し、その後、結合性物質から（切断可能なリンカーによって）切断する。ＤＮＡ記録タグは、反応性カップリング部分（例えば、目的のタンパク質にカップリングするためのクリック化学試薬（例えば、アジド、ｍＴｅｔなど）、および他の機能性成分（例えば、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）、試料バーコード（ＢＣＳ）、分析物特異的バーコード（ＢＣＡ）、およびスペーサー配列（Ｓｐ））を含む。試料バーコード（ＢＣＳ）を使用して、異なる試料に由来するタンパク質を標識および区別することもできる。ＤＮＡ記録タグはまた、後続の基材表面へのカップリングのための直交性カップリング部分（例えば、ｍＴｅｔ）を含むこともある。目的のタンパク質に記録タグをクリック化学カップリングする場合、タンパク質を、ＤＮＡ記録タグのクリック化学カップリング部分と同種のクリック化学カップリング部分で予め標識する（例えば、タンパク質のアルキン部分は、ＤＮＡ記録タグのアジド部分と同種である）。クリック化学カップリング用のカップリング部分でＤＮＡ記録タグを標識するための試薬の例としては、リシン標識用のアルキン−ＮＨＳ試薬、光親和性標識用のアルキン−ベンゾフェノン試薬などが挙げられる。（Ｂ）結合性物質が近位標的タンパク質に結合した後、記録タグの反応性カップリング部分（例えば、アジド）は、近位タンパク質の同種クリック化学カップリング部分（３本線記号として示されている）に共有結合により付着する。（Ｃ）標的タンパク質分析物を記録タグで標識した後、ウラシル特異的切除試薬（例えば、ＵＳＥＲ（商標））を使用してウラシル（Ｕ）を消化することにより、付着している結合性物質を除去する。したがって、本請求項記載のキットは、ニッキングエンドヌクレアーゼなどのニッキング試薬も含み得る。（Ｄ）ＤＮＡ記録タグで標識した標的タンパク質分析物を、クリック化学（アルキン−アジド結合対、メチルテトラジン（ｍＴＥＴ）−ｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）結合対など）のような好適なバイオコンジュゲート化学反応を使用して、基材表面に固定化する。ある特定の実施形態では、標的タンパク質−記録タグ標識アッセイ全体を、結合性物質のプールおよび記録タグのプールを使用して、多数の異なる標的タンパク質分析物を含む単一チューブの中で実施する。試料バーコード（ＢＣＳ）を含む記録タグで試料中のタンパク質分析物を標的標識した後、複数のタンパク質分析物試料を、（Ｄ）の固定化ステップの前にプールすることができる。したがって、ある特定の実施形態では、数百個の試料にわたって最大数千個のタンパク質分析物を、単一チューブ次世代タンパク質アッセイ（ＮＧＰＡ）で標識および固定化することができ、その結果、高価な親和性試薬（例えば、抗体）が大幅に節約される。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８４８】
【図２９】図２９Ａ〜Ｄは、ＤＮＡ記録タグとポリペプチドとのコンジュゲーションの例を示す。（Ａ）変性ポリペプチドを、アルキン−ＮＨＳエステル（アセチレン−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル）試薬またはアルキン−ベンゾフェノンなどの二機能性クリック化学試薬で標識して、アルキン標識（３本線記号）ポリペプチドを生成する。アルキンはまた、歪みアルキン、例えば、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）などを含むシクロオクチンなどである場合もある。（Ｂ）アルキン標識ポリペプチドに化学的にカップリングされるＤＮＡ記録タグ設計の例が示されている。記録タグは、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）、バーコード（ＢＣ）、およびスペーサー配列（Ｓｐ）を含む。記録タグを、基材表面にカップリングするためのｍＴｅｔ部分、および標識ポリペプチドのアルキン部分とカップリングするためのアジド部分で標識する。（Ｃ）アルキンで標識された変性タンパク質またはポリペプチドを、アルキンおよびアジド部分を介して記録タグで標識する。必要に応じて、記録タグ標識ポリペプチドを、コンパートメントバーコードで、例えば、コンパートメントビーズに付着している相補配列とのアニーリングおよびプライマー伸長（ポリメラーゼ伸長とも呼ばれる）によって、または図２０Ｈ〜Ｊに示されているように、さらに標識することができる。（Ｄ）記録タグ標識ポリペプチドをプロテアーゼ消化することにより、記録タグ標識ペプチドの集団が創出される。一部の実施形態では、一部のペプチドは、いかなる記録タグでも標識されないことになる。他の実施形態では、一部のペプチドには、１つまたは複数の記録タグが付着していることもある。（Ｅ）記録タグ標識ペプチドを、ＴＣＯ基で機能化された基材表面とペプチドに付着している記録タグのｍＴｅｔ部分との間の逆電子要請型ディールス−アルダー（ｉＥＤＤＡ）クリック化学反応を使用して、基材表面に固定化する。ある特定の実施形態では、示されている異なる段階間で、クリーンアップステップを用いることもある。直交性クリック化学（例えば、アジド−アルキンおよびｍＴｅｔ−ＴＣＯ）を使用することによって、記録タグでのポリペプチドのクリック化学標識と、記録タグ標識ペプチドの基材表面へのクリック化学固定化との両方が可能になる（その全体が参照により組み込まれる、McKay et al., 2014, Chem. Biol. 21:1075-1101を参照されたい）。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８４９】
【図３０】図３０Ａ〜Ｅは、ポリペプチドの最初のＤＮＡ標識後に記録タグに試料バーコードを書き込むための例示的なプロセスを示す。（Ａ）変性ポリペプチドを、アルキン−ＮＨＳ試薬またはアルキン−ベンゾフェノンなどの二機能性クリック化学試薬で標識して、アルキン標識ポリペプチドを生成する。（Ｂ）ポリペプチドのアルキン（またはその代わりにクリック化学部分）標識後、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）を含み、アジド部分およびｍＴｅｔ部分で標識されているＤＮＡタグを、アジド−アルキン相互作用によってポリペプチドにカップリングする。他のクリック化学相互作用を用いてもよいことは理解される。（Ｃ）試料バーコード情報（ＢＣＳ’）および他の記録タグ機能性成分（例えば、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１’）、スペーサー配列（Ｓｐ’））を含む記録タグＤＮＡ構築物は、相補的ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１−Ｐ１’）を介してＤＮＡタグ標識ポリペプチドとアニーリングする。記録タグ情報は、ポリメラーゼ伸長によりＤＮＡタグに移行される。（Ｄ）記録タグ標識ポリペプチドをプロテアーゼ消化することにより、記録タグ標識ペプチドの集団が創出される。（Ｅ）記録タグ標識ペプチドを、ＴＣＯ基で機能化された表面とペプチドに付着している記録タグのｍＴｅｔ部分との間の逆電子要請型ディールス−アルダー（ｉＥＤＤＡ）クリック化学反応を使用して、基材表面に固定化する。ある特定の実施形態では、示されている異なる段階間で、クリーンアップステップを用いることもある。直交性クリック化学（例えば、アジド−アルキンおよびｍＴｅｔ−ＴＣＯ）を使用することによって、記録タグでのポリペプチドのクリック化学標識と、記録タグ標識ポリペプチドの基材表面へのクリック化学固定化との両方が可能になる（その全体が参照により組み込まれる、McKay et al., 2014, Chem. Biol. 21:1075-1101を参照されたい）。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８５０】
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｄは、ポリペプチドにバーコードを付与するためのビーズコンパートメント化の例を示す。（Ａ）ポリペプチドを、標準的バイオコンジュゲーションまたは光親和性標識技法を使用して、ヘテロ二機能性クリック化学試薬を用いて、溶液中で標識する。可能性のある標識部位としては、リシン残基のε−アミン（例えば、示されているようなＮＨＳ−アルキンで）またはペプチドの炭素骨格（例えば、ベンゾフェノン−アルキンで）が挙げられる。（Ｂ）ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）を含むアジド標識ＤＮＡタグを、標識ポリペプチドのアルキン部分にカップリングする。（Ｃ）ＤＮＡタグ標識ポリペプチドを、ＤＮＡ記録タグ標識ビーズに、相補的ＤＮＡ配列（Ｐ１およびＰ１’）を介してアニーリングさせる。ビーズのＤＮＡ記録タグは、スペーサー配列（Ｓｐ’）、コンパートメントバーコード配列（ＢＣＰ’）、必要に応じた一意の分子識別子（ＵＭＩ）、およびユニバーサル配列（Ｐ１’）を含む。ＤＮＡ記録タグ情報は、ポリメラーゼ伸長によって（あるいは、ライゲーションを用いてもよい）、ポリペプチドのＤＮＡタグに移行した。情報移行後、得られたポリペプチドは、コンパートメントバーコードを含むいくつかの機能的エレメントを含有する複数の記録タグを含む。（Ｄ）記録タグ標識ポリペプチドをプロテアーゼ消化することにより、記録タグ標識ペプチドの集団が創出される。記録タグ標識ペプチドをビーズから解離させ、（Ｅ）配列決定基材に（例えば、示されているようなｍＴｅｔ部分とＴＣＯ部分との間のｉＥＤＤＡクリック化学を使用して）再固定化する。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８５１】
【図３２−１】図３２Ａ〜Ｈは、次世代タンパク質アッセイ（ＮＧＰＡ）のワークフローの例を示す。タンパク質試料を、いくつかの機能性単位、例えば、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）、バーコード配列（ＢＣ）、必要に応じたＵＭＩ配列、およびスペーサー配列（Ｓｐ）（結合性物質コーディングタグとの情報移行を可能にする）で構成されているＤＮＡ記録タグで標識する。（Ａ）標識タンパク質を基材（例えば、ビーズ、多孔質ビーズ、または多孔質マトリックス）に（受動的に、または共有結合で）固定化する。（Ｂ）基材をタンパク質でブロッキングし、必要に応じて、スペーサー配列に相補的な競合オリゴヌクレオチド（Ｓｐ’）を添加して分析物記録タグ配列の非特異的相互作用を最小限に抑える。（Ｃ）分析物特異的抗体（付随するコーディングタグを有する）を、基質に結合されたタンパク質と共にインキュベートする。コーディングタグは、後続のウラシル特異的切断のためのウラシル塩基を含むこともある。（Ｄ）抗体結合後、添加した場合には過剰な競合オリゴヌクレオチド（Ｓｐ’）を洗い流す。コーディングタグが相補的スペーサー配列を介して記録タグと一時的にアニーリングし、コーディングタグ情報がプライマー伸長反応で記録タグへと移行されて伸長記録タグが生成される。固定化されたタンパク質が変性される場合、結合されている抗体およびアニーリングされたコーディングタグを０．１Ｎ  ＮａＯＨなどのアルカリ洗浄条件下で除去することができる。固定化されたタンパク質が、ネイティブなコンフォメーションをとっている場合には、結合されている抗体およびコーディングタグをより穏やかな条件で除去する必要があり得る。より穏やかな抗体除去条件の例は、パネルＥ〜Ｈに概説されている。（Ｅ）コーディングタグから記録タグへの情報移行後、ウラシル特異的切除試薬（例えば、ＵＳＥＲ（商標））酵素ミックスを使用して、コーディングタグをそのウラシル部位でニッキングする（切断する）。（Ｆ）結合されている抗体を、高塩濃度、低／高ｐＨの洗浄液を使用してタンパク質から除去する。抗体に付着したままの切り詰められたＤＮＡコーディングタグは、短いため溶出も迅速である。より長いＤＮＡコーディングタグ断片は、記録タグにアニーリングされたままであることもあり、またはアニーリングされたままでないこともある。（Ｇ）第２の結合サイクルが、ステップ（Ｂ）〜（Ｄ）と同様に開始し、第２のプライマー伸長ステップが、プライマー伸長によってコーディングタグ情報を第２の抗体から伸長記録タグに移行させる。（Ｈ）２つの結合サイクルの結果は、記録タグに付着している第１の抗体および第２の抗体からの結合情報の連鎖体である。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換え���ことができる。
【図３２−２】図３２Ａ〜Ｈは、次世代タンパク質アッセイ（ＮＧＰＡ）のワークフローの例を示す。タンパク質試料を、いくつかの機能性単位、例えば、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）、バーコード配列（ＢＣ）、必要に応じたＵＭＩ配列、およびスペーサー配列（Ｓｐ）（結合性物質コーディングタグとの情報移行を可能にする）で構成されているＤＮＡ記録タグで標識する。（Ａ）標識タンパク質を基材（例えば、ビーズ、多孔質ビーズ、または多孔質マトリックス）に（受動的に、または共有結合で）固定化する。（Ｂ）基材をタンパク質でブロッキングし、必要に応じて、スペーサー配列に相補的な競合オリゴヌクレオチド（Ｓｐ’）を添加して分析物記録タグ配列の非特異的相互作用を最小限に抑える。（Ｃ）分析物特異的抗体（付随するコーディングタグを有する）を、基質に結合されたタンパク質と共にインキュベートする。コーディングタグは、後続のウラシル特異的切断のためのウラシル塩基を含むこともある。（Ｄ）抗体結合後、添加した場合には過剰な競合オリゴヌクレオチド（Ｓｐ’）を洗い流す。コーディングタグが相補的スペーサー配列を介して記録タグと一時的にアニーリングし、コーディングタグ情報がプライマー伸長反応で記録タグへと移行されて伸長記録タグが生成される。固定化されたタンパク質が変性される場合、結合されている抗体およびアニーリングされたコーディングタグを０．１Ｎ  ＮａＯＨなどのアルカリ洗浄条件下で除去することができる。固定化されたタンパク質が、ネイティブなコンフォメーションをとっている場合には、結合されている抗体およびコーディングタグをより穏やかな条件で除去する必要があり得る。より穏やかな抗体除去条件の例は、パネルＥ〜Ｈに概説されている。（Ｅ）コーディングタグから記録タグへの情報移行後、ウラシル特異的切除試薬（例えば、ＵＳＥＲ（商標））酵素ミックスを使用して、コーディングタグをそのウラシル部位でニッキングする（切断する）。（Ｆ）結合されている抗体を、高塩濃度、低／高ｐＨの洗浄液を使用してタンパク質から除去する。抗体に付着したままの切り詰められたＤＮＡコーディングタグは、短いため溶出も迅速である。より長いＤＮＡコーディングタグ断片は、記録タグにアニーリングされたままであることもあり、またはアニーリングされたままでないこともある。（Ｇ）第２の結合サイクルが、ステップ（Ｂ）〜（Ｄ）と同様に開始し、第２のプライマー伸長ステップが、プライマー伸長によってコーディングタグ情報を第２の抗体から伸長記録タグに移行させる。（Ｈ）２つの結合サイクルの結果は、記録タグに付着している第１の抗体および第２の抗体からの結合情報の連鎖体である。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換え���ことができる。
【０８５２】
【図３３】図３３Ａ〜Ｄは、複数の結合性物質および酵素媒介性連続情報移行を使用する１ステップ次世代タンパク質アッセイ（ＮＧＰＡ）の例を示す。２つの同種結合性物質（例えば、抗体）が同時に結合している固定化タンパク質分子でのＮＧＰＡアッセイ。複数の同種抗体結合事象の後、プライマー伸長とＤＮＡニッキングの組合せステップを使用して、結合されている抗体のコーディングタグから記録タグに情報を移行させる。コーディングタグのキャレット記号（＾）は、二本鎖ＤＮＡニッキングエンドヌクレアーゼ部位を表わす。図３３Ａでは、タンパク質のエピトープ１（Ｅｐｉ＃１）に結合されている抗体のコーディングタグは、相補的スペーサー配列のハイブリダイゼーション後のプライマー伸長ステップにおいて、コーディングタグ情報（例えば、エンコーダー配列）を記録タグに移行させる。図３３Ｂでは、伸長記録タグとコーディングタグの間に二本鎖ＤＮＡが形成されたら、３７℃で活性である、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩなどの、二本鎖ＤＮＡ基質の一方のＤＮＡ鎖のみを切断するニッキングエンドヌクレアーゼを使用して、コーディングタグを切断する。ニッキングステップ後、切り詰められたコーディングタグ結合性物質と伸長記録タグとで形成された二本鎖は、熱力学的に不安定になり、解離する。より長いコーディングタグ断片は、記録タグにアニーリングされたままであることもあり、またはアニーリングされたままでないこともある。図３３Ｃでは、これにより、タンパク質のエピトープ＃２（Ｅｐｉ＃２）に結合されている抗体からのコーディングタグが、相補的スペーサー配列を介して伸長記録タグにアニーリングすることが可能になり、プライマー伸長によってＥｐｉ＃２抗体のコーディングタグから伸長記録タグに情報を移行させることにより伸長記録タグをさらに伸長させることが可能になる。図３３Ｄでは、この場合も、伸長記録タグとＥｐｉ＃２抗体のコーディングタグとの間に二本鎖ＤＮＡが形成された後、Ｎｂ．ＢｓｓＳＩなどのニッキングエンドヌクレアーゼによりコーディングタグをニッキングする。ある特定の実施形態では、プライマー伸長（ポリメラーゼ伸長とも呼ばれる）中は非鎖置換ポリメラーゼの使用が好ましい。非鎖置換ポリメラーゼは、単一塩基より多くの塩基によって記録タグにアニーリングされたままである切断されたコーディングタグ残部の伸長を防止する。図３３Ａ〜Ｄのプロセスは、近位の結合されている結合性物質のコーディングタグすべてが、ハイブリダイゼーションステップ、伸長記録タグへの情報移行ステップおよびニッキングステップにより「消費」されるまで、自発的に繰り返すことができる。コーディングタグは、所与の分析物（例えば、同種タンパク質）に特異的なすべての結合性物質（例えば、抗体）について同一であるエンコーダー配列を含むことができ、エピトープ特異的エンコーダー配列を含むことができ、または異なる分子事象を区別するための一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含むことができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８５３】
【図３４】図３４Ａ〜Ｃは、基材表面の反応性部分のタイトレーションを使用する記録タグ−ペプチド固定化の密度制御の例を示す。図３４Ａでは、基材表面のペプチド密度は、基材の表面の機能性カップリング部分の密度を制御することによりタイトレーションすることができる。これは、活性カップリング分子の「ダミー」カップリング分子に対する適切な比で基質の表面を誘導体化することにより達成することができる。示されている例では、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＴＣＯ試薬（活性カップリング分子）とＮＨＳ−ｍＰＥＧ（ダミー分子）とを規定されている比で組み合わせて、アミン表面をＴＣＯで誘導体化する。機能化ＰＥＧは、３００から４０，０００を超える種々の分子量のものが入手可能である。図３４Ｂでは、二機能性５’アミンＤＮＡ記録タグ（ｍＴｅｔは他方の機能的部分である）を、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１（ＳＭＣＣ）二機能性架橋剤を使用して、ペプチドのＮ末端Ｃｙｓ残基にカップリングする。記録タグの内部ｍＴｅｔ−ｄＴ基を、ｍテトラジン−アジドを使用してアジド−ｄＴ基から創出する。図３４Ｃでは、記録タグ標識ペプチドを、ｍＴｅｔとＴＣＯとのｉＥＤＤＡクリック化学反応を使用して図３４Ａからの活性化基材表面に固定化する。ｍＴｅｔ−ＴＣＯ  ｉＥＤＤＡカップリング反応は、非常に迅速であり、効率的であり、安定している（ｍＴｅｔ−ＴＣＯは、Ｔｅｔ−ＴＣＯよりも安定している）。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８５４】
【図３５】図３５Ａ〜Ｃは、次世代タンパク質シーケンシング（ＮＧＰＳ）結合サイクル特異的コーディングタグの例を示す。（Ａ）サイクル特異的Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）結合性物質コーディングタグを用いるＮＧＰＳアッセイ（ＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅとも呼ばれる）の設計。ＮＴＡＡ結合性物質（例えば、Ｎ末端ＤＮＰ標識チロシンに特異的な抗体）は、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）と、バーコード（ＢＣ）と、スペーサー配列（Ｓｐ）とを含む記録タグに付随するペプチドのＤＮＰ標識ＮＴＡＡに結合する。結合性物質がペプチドの同種ＮＴＡＡに結合すると、ＮＴＡＡ結合性物質に付随するコーディングタグは、記録タグに接近し、相補的スペーサー配列を介して記録タグにアニーリングする。コーディングタグ情報は、プライマー伸長により記録タグに移行される。コーディングタグがどの結合サイクルを表わすのかを記録するために、コーディングタグは、サイクル特異的バーコードを含むことができる。ある特定の実施形態では、分析物に結合する結合性物質のコーディングタグは、一意の結合サイクル特異的バーコードと組み合わせられている、サイクル数に依存しない同じエンコーダーバーコードを有する。他の実施形態では、分析物に対する結合性物質のコーディングタグは、分析物−結合サイクルの組合せ情報についての一意のエンコーダーバーコードを含む。どちらの手法においても、共通スペーサー配列を、各結合サイクルで結合性物質のコーディングタグに使用することができる。（Ｂ）この例では、各結合サイクルからの結合性物質は、結合サイクルを識別するための短い結合サイクル特異的バーコードを有し、これが、結合性物質を識別するエンコーダーバーコードと一緒に、特定の結合性物質−結合サイクルの組合せを識別する一意の組合せバーコードを提供する。（Ｃ）結合サイクルの完了後、伸長記録タグを、キャッピングサイクルステップを使用して増幅可能なライブラリーに変換することができ、このキャッピングサイクルステップでは、例えば、ユニバーサルプライミング配列Ｐ２とスペーサー配列Ｓｐ’とに連結されたユニバーサルプライミング配列Ｐ１’を含むキャップが、まず相補的Ｐ１およびＰ１’配列を介して伸長記録タグとアニーリングして、キャップを伸長記録タグに接近させる。伸長記録タグおよびキャップにおける相補的ＳｐおよびＳｐ’配列がアニーリングし、プライマー伸長により、第２のユニバーサルプライマー配列（Ｐ２）が伸長記録タグに付加される。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８５５】
【図３６−１】図３６Ａ〜Ｅは、コーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するためのＤＮＡに基づくモデル系の例を示す。例示的な結合および分子内書き込みを、オリゴヌクレオチドモデル系により実証した。コーディングタグにおける標的化物質Ａ’およびＢ’を、記録タグの標的結合領域ＡおよびＢとハイブリダイズするように設計した。ｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２（Ａ標的）およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２（Ｂ標的）という２つの再コーディングタグを等濃度でプールすることにより、記録タグ（ＲＴ）ミックスを調製した。記録タグは、５’末端がビオチン化されており、一意の標的結合領域と、ユニバーサルフォワードプライマー配列と、一意のＤＮＡバーコードと、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）とを含有する。コーディングタグは、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）と隣接している一意のエンコーダーバーコード塩基を含有し、８塩基共通スペーサー配列の１つは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＡまたはＢ標的物質と共有結合により連結されている。図３６Ａでは、ビオチン化記録タグオリゴヌクレオチド（ｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２）を、ビオチン化ダミーＴ１０オリゴヌクレオチドと共に、ストレプトアビジンビーズに固定化した。ＡまたはＢ捕捉配列（同種結合性物質−Ａ’およびＢ’により、それぞれ認識される）と、結合標的を識別するための対応するバーコード（ｒｔＡ＿ＢＣおよびｒｔＢ＿ＢＣ）とを用いて、記録タグを設計した。このモデル系のすべてのバーコードは、６５個の１５ｍｅｒバーコード（配列番号１〜６５）のセットから選択した。一部の場合には、ゲル解析を容易にするために、１５ｍｅｒバーコードを組み合わせてより長いバーコードを構成した。詳細には、ｒｔＡ＿ＢＣ＝ＢＣ＿１＋ＢＣ＿２；ｒｔＢ＿ＢＣ＝ＢＣ＿３。記録タグのＡおよびＢ配列と同種の結合性物質の２つのコーディングタグ、つまり、ＣＴ＿Ａ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５）およびＣＴ＿Ｂ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５＋ＢＣ＿６）も合成した。必要に応じて、ビーズに固定化された記録タグとのコーディングタグのアニーリング前に、コーディングタグ配列の一部分に相補的なブロッキングオリゴ（ＤｕｐＣＴ＿Ａ’ＢＣおよびＤｕｐＣＴ＿ＡＢ’ＢＣ）を（一本鎖Ｓｐ’配列を残して）、コーディングタグに前以てアニーリングした。鎖置換ポリメラーゼは、ポリメラーゼ伸長中にブロッキングオリゴを除去する。バーコード凡例（挿入図）は、記録タグおよびコーディングタグの機能性バーコードへの１５ｍｅｒバーコードの割り当てを示す。図３６Ｂでの、記録タグバーコード設計およびコーディングタグエンコーダーバーコード設計は、記録タグとコーディングタグ間の「分子内」対「分子間」相互作用の容易なゲル解析を提供する。この設計では、望ましくない「分子間」相互作用（Ａ記録タグとＢ’コーディングタグとの、およびＢ記録タグとＡ’コーディングタグとの）が、所望の「分子内」（Ａ記録タグとＡ’コーディングタグとの；Ｂ記録タグとＢ’コーディングタグとの）相互作用産物よりも１５塩基長いかまたは短い、どちらか（wither）である、ゲル産物を生成する。プライマー伸長ステップは、Ａ’およびＢ’コーディングタグバーコード（ｃｔＡ’＿ＢＣ、ｃｔＢ’＿ＢＣ）をリバース相補的バーコード（reversecomplement barcode）（ｃｔＡ＿ＢＣおよびｃｔＢ＿ＢＣ）に変更する。図３６Ｃでは、プライマー伸長アッセイは、コーディングタグから記録タグへの情報移行、およびＰＣＲ解析のためのアニーリングされたＥｎｄＣａｐオリゴに対するプライマー伸長によるアダプター配列の付加を実証した。図３６Ｄは、ダミーＴ２０オリゴを使用する記録タグの表面密度のタイトレーションによる「分子内」情報移行の最適化を示す。ビオチン化記録タグオリゴを、１：０から、１：１０、下は１：１００００に至るまでの様々な比で、ビオチン化ダミーＴ２０オリゴと混合した。低下した記録タグ密度（１：１０３および１：１０４）では、「分子内」相互作用が、「分子間」相互作用よりも優勢である。図３６Ｅには、ＤＮＡモデル系の単純な伸長として、Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド−ストレプトアビジン結合対を含む単純なタンパク質結合系が示されている（ＫＤ  約４ｎＭ）（Perbandtet al., 2007, Proteins 67:1147-1153）が、任意の数のペプチド−結合性物質モデル系を用いることができる。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド配列は、（ｆＭ）ＤＶＥＡＷＬＧＡＲＶＰＬＶＥＴ（配列番号１３１）（ｆＭ＝ホルミル−Ｍｅｔ）である。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチドは、ＤＮＡ記録タグにカップリングするための短い柔軟性リンカーペプチド（ＧＧＧＧＳ）およびシステイン残基をさらに含む。他の例示的なペプチドタグ−同種結合性物質対としては、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）−カルモジュリン（ＫＤ  約２ｐＭ）（Mukherjeeet al., 2015, J. Mol. Biol. 427: 2707-2725）、アミロイドベータ（Ａβ１６〜２７）ペプチド−ＵＳ７／Ｌｃｎ２アンチカリン（０．２ｎＭ）（Rauthet al., 2016, Biochem. J. 473: 1563-1578）、ＰＡタグ／ＮＺ−１抗体（ＫＤ  約４００ｐＭ）、ＦＬＡＧ−Ｍ２  Ａｂ（２８ｎＭ）、ＨＡ−４Ｂ２  Ａｂ（１．６ｎＭ）、およびＭｙｃ−９Ｅ１０  Ａｂ（２．２ｎＭ）（Fujiiet al., 2014, Protein Expr. Purif. 95:240-247）が挙げられる。プライマー伸長による結合性物質のコーディングタグから記録タグへの分子内情報移行の試験として、相補的ＤＮＡ配列「Ａ」に結合するオリゴヌクレオチド「結合性物質」を、試験および開発に使用することができる。このハイブリダイゼーション事象は、本質的にｆＭ親和性よりも大きい親和性を有する。ストレプトアビジンを、Ｎａｎｏ−ｔａｇ１５ペプチドエピトープの試験結合性物質として使用することができる。ペプチドタグ−結合性物質相互作用は、高親和性であるが、酸性および／または高塩濃度の洗浄液を用いてこの相互作用を容易に妨げることができる（Perbandtet al.、上掲）。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマー���置き換えることができる。
【図３６−２】図３６Ａ〜Ｅは、コーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するためのＤＮＡに基づくモデル系の例を示す。例示的な結合および分子内書き込みを、オリゴヌクレオチドモデル系により実証した。コーディングタグにおける標的化物質Ａ’およびＢ’を、記録タグの標的結合領域ＡおよびＢとハイブリダイズするように設計した。ｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２（Ａ標的）およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２（Ｂ標的）という２つの再コーディングタグを等濃度でプールすることにより、記録タグ（ＲＴ）ミックスを調製した。記録タグは、５’末端がビオチン化されており、一意の標的結合領域と、ユニバーサルフォワードプライマー配列と、一意のＤＮＡバーコードと、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）とを含有する。コーディングタグは、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）と隣接している一意のエンコーダーバーコード塩基を含有し、８塩基共通スペーサー配列の１つは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＡまたはＢ標的物質と共有結合により連結されている。図３６Ａでは、ビオチン化記録タグオリゴヌクレオチド（ｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２）を、ビオチン化ダミーＴ１０オリゴヌクレオチドと共に、ストレプトアビジンビーズに固定化した。ＡまたはＢ捕捉配列（同種結合性物質−Ａ’およびＢ’により、それぞれ認識される）と、結合標的を識別するための対応するバーコード（ｒｔＡ＿ＢＣおよびｒｔＢ＿ＢＣ）とを用いて、記録タグを設計した。このモデル系のすべてのバーコードは、６５個の１５ｍｅｒバーコード（配列番号１〜６５）のセットから選択した。一部の場合には、ゲル解析を容易にするために、１５ｍｅｒバーコードを組み合わせてより長いバーコードを構成した。詳細には、ｒｔＡ＿ＢＣ＝ＢＣ＿１＋ＢＣ＿２；ｒｔＢ＿ＢＣ＝ＢＣ＿３。記録タグのＡおよびＢ配列と同種の結合性物質の２つのコーディングタグ、つまり、ＣＴ＿Ａ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５）およびＣＴ＿Ｂ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５＋ＢＣ＿６）も合成した。必要に応じて、ビーズに固定化された記録タグとのコーディングタグのアニーリング前に、コーディングタグ配列の一部分に相補的なブロッキングオリゴ（ＤｕｐＣＴ＿Ａ’ＢＣおよびＤｕｐＣＴ＿ＡＢ’ＢＣ）を（一本鎖Ｓｐ’配列を残して）、コーディングタグに前以てアニーリングした。鎖置換ポリメラーゼは、ポリメラーゼ伸長中にブロッキングオリゴを除去する。バーコード凡例（挿入図）は、記録タグおよびコーディングタグの機能性バーコードへの１５ｍｅｒバーコードの割り当てを示す。図３６Ｂでの、記録タグバーコード設計およびコーディングタグエンコーダーバーコード設計は、記録タグとコーディングタグ間の「分子内」対「分子間」相互作用の容易なゲル解析を提供する。この設計では、望ましくない「分子間」相互作用（Ａ記録タグとＢ’コーディングタグとの、およびＢ記録タグとＡ’コーディングタグとの）が、所望の「分子内」（Ａ記録タグとＡ’コーディングタグとの；Ｂ記録タグとＢ’コーディングタグとの）相互作用産物よりも１５塩基長いかまたは短い、どちらか（wither）である、ゲル産物を生成する。プライマー伸長ステップは、Ａ’およびＢ’コーディングタグバーコード（ｃｔＡ’＿ＢＣ、ｃｔＢ’＿ＢＣ）をリバース相補的バーコード（reversecomplement barcode）（ｃｔＡ＿ＢＣおよびｃｔＢ＿ＢＣ）に変更する。図３６Ｃでは、プライマー伸長アッセイは、コーディングタグから記録タグへの情報移行、およびＰＣＲ解析のためのアニーリングされたＥｎｄＣａｐオリゴに対するプライマー伸長によるアダプター配列の付加を実証した。図３６Ｄは、ダミーＴ２０オリゴを使用する記録タグの表面密度のタイトレーションによる「分子内」情報移行の最適化を示す。ビオチン化記録タグオリゴを、１：０から、１：１０、下は１：１００００に至るまでの様々な比で、ビオチン化ダミーＴ２０オリゴと混合した。低下した記録タグ密度（１：１０３および１：１０４）では、「分子内」相互作用が、「分子間」相互作用よりも優勢である。図３６Ｅには、ＤＮＡモデル系の単純な伸長として、Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド−ストレプトアビジン結合対を含む単純なタンパク質結合系が示されている（ＫＤ  約４ｎＭ）（Perbandtet al., 2007, Proteins 67:1147-1153）が、任意の数のペプチド−結合性物質モデル系を用いることができる。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド配列は、（ｆＭ）ＤＶＥＡＷＬＧＡＲＶＰＬＶＥＴ（配列番号１３１）（ｆＭ＝ホルミル−Ｍｅｔ）である。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチドは、ＤＮＡ記録タグにカップリングするための短い柔軟性リンカーペプチド（ＧＧＧＧＳ）およびシステイン残基をさらに含む。他の例示的なペプチドタグ−同種結合性物質対としては、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）−カルモジュリン（ＫＤ  約２ｐＭ）（Mukherjeeet al., 2015, J. Mol. Biol. 427: 2707-2725）、アミロイドベータ（Ａβ１６〜２７）ペプチド−ＵＳ７／Ｌｃｎ２アンチカリン（０．２ｎＭ）（Rauthet al., 2016, Biochem. J. 473: 1563-1578）、ＰＡタグ／ＮＺ−１抗体（ＫＤ  約４００ｐＭ）、ＦＬＡＧ−Ｍ２  Ａｂ（２８ｎＭ）、ＨＡ−４Ｂ２  Ａｂ（１．６ｎＭ）、およびＭｙｃ−９Ｅ１０  Ａｂ（２．２ｎＭ）（Fujiiet al., 2014, Protein Expr. Purif. 95:240-247）が挙げられる。プライマー伸長による結合性物質のコーディングタグから記録タグへの分子内情報移行の試験として、相補的ＤＮＡ配列「Ａ」に結合するオリゴヌクレオチド「結合性物質」を、試験および開発に使用することができる。このハイブリダイゼーション事象は、本質的にｆＭ親和性よりも大きい親和性を有する。ストレプトアビジンを、Ｎａｎｏ−ｔａｇ１５ペプチドエピトープの試験結合性物質として使用することができる。ペプチドタグ−結合性物質相互作用は、高親和性であるが、酸性および／または高塩濃度の洗浄液を用いてこの相互作用を容易に妨げることができる（Perbandtet al.、上掲）。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマー���置き換えることができる。
【図３６−３】図３６Ａ〜Ｅは、コーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するためのＤＮＡに基づくモデル系の例を示す。例示的な結合および分子内書き込みを、オリゴヌクレオチドモデル系により実証した。コーディングタグにおける標的化物質Ａ’およびＢ’を、記録タグの標的結合領域ＡおよびＢとハイブリダイズするように設計した。ｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２（Ａ標的）およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２（Ｂ標的）という２つの再コーディングタグを等濃度でプールすることにより、記録タグ（ＲＴ）ミックスを調製した。記録タグは、５’末端がビオチン化されており、一意の標的結合領域と、ユニバーサルフォワードプライマー配列と、一意のＤＮＡバーコードと、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）とを含有する。コーディングタグは、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）と隣接している一意のエンコーダーバーコード塩基を含有し、８塩基共通スペーサー配列の１つは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＡまたはＢ標的物質と共有結合により連結されている。図３６Ａでは、ビオチン化記録タグオリゴヌクレオチド（ｓａＲＴ＿Ａｂｃ＿ｖ２およびｓａＲＴ＿Ｂｂｃ＿Ｖ２）を、ビオチン化ダミーＴ１０オリゴヌクレオチドと共に、ストレプトアビジンビーズに固定化した。ＡまたはＢ捕捉配列（同種結合性物質−Ａ’およびＢ’により、それぞれ認識される）と、結合標的を識別するための対応するバーコード（ｒｔＡ＿ＢＣおよびｒｔＢ＿ＢＣ）とを用いて、記録タグを設計した。このモデル系のすべてのバーコードは、６５個の１５ｍｅｒバーコード（配列番号１〜６５）のセットから選択した。一部の場合には、ゲル解析を容易にするために、１５ｍｅｒバーコードを組み合わせてより長いバーコードを構成した。詳細には、ｒｔＡ＿ＢＣ＝ＢＣ＿１＋ＢＣ＿２；ｒｔＢ＿ＢＣ＝ＢＣ＿３。記録タグのＡおよびＢ配列と同種の結合性物質の２つのコーディングタグ、つまり、ＣＴ＿Ａ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５）およびＣＴ＿Ｂ’−ｂｃ（エンコーダーバーコード＝ＢＣ＿５＋ＢＣ＿６）も合成した。必要に応じて、ビーズに固定化された記録タグとのコーディングタグのアニーリング前に、コーディングタグ配列の一部分に相補的なブロッキングオリゴ（ＤｕｐＣＴ＿Ａ’ＢＣおよびＤｕｐＣＴ＿ＡＢ’ＢＣ）を（一本鎖Ｓｐ’配列を残して）、コーディングタグに前以てアニーリングした。鎖置換ポリメラーゼは、ポリメラーゼ伸長中にブロッキングオリゴを除去する。バーコード凡例（挿入図）は、記録タグおよびコーディングタグの機能性バーコードへの１５ｍｅｒバーコードの割り当てを示す。図３６Ｂでの、記録タグバーコード設計およびコーディングタグエンコーダーバーコード設計は、記録タグとコーディングタグ間の「分子内」対「分子間」相互作用の容易なゲル解析を提供する。この設計では、望ましくない「分子間」相互作用（Ａ記録タグとＢ’コーディングタグとの、およびＢ記録タグとＡ’コーディングタグとの）が、所望の「分子内」（Ａ記録タグとＡ’コーディングタグとの；Ｂ記録タグとＢ’コーディングタグとの）相互作用産物よりも１５塩基長いかまたは短い、どちらか（wither）である、ゲル産物を生成する。プライマー伸長ステップは、Ａ’およびＢ’コーディングタグバーコード（ｃｔＡ’＿ＢＣ、ｃｔＢ’＿ＢＣ）をリバース相補的バーコード（reversecomplement barcode）（ｃｔＡ＿ＢＣおよびｃｔＢ＿ＢＣ）に変更する。図３６Ｃでは、プライマー伸長アッセイは、コーディングタグから記録タグへの情報移行、およびＰＣＲ解析のためのアニーリングされたＥｎｄＣａｐオリゴに対するプライマー伸長によるアダプター配列の付加を実証した。図３６Ｄは、ダミーＴ２０オリゴを使用する記録タグの表面密度のタイトレーションによる「分子内」情報移行の最適化を示す。ビオチン化記録タグオリゴを、１：０から、１：１０、下は１：１００００に至るまでの様々な比で、ビオチン化ダミーＴ２０オリゴと混合した。低下した記録タグ密度（１：１０３および１：１０４）では、「分子内」相互作用が、「分子間」相互作用よりも優勢である。図３６Ｅには、ＤＮＡモデル系の単純な伸長として、Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド−ストレプトアビジン結合対を含む単純なタンパク質結合系が示されている（ＫＤ  約４ｎＭ）（Perbandtet al., 2007, Proteins 67:1147-1153）が、任意の数のペプチド−結合性物質モデル系を用いることができる。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチド配列は、（ｆＭ）ＤＶＥＡＷＬＧＡＲＶＰＬＶＥＴ（配列番号１３１）（ｆＭ＝ホルミル−Ｍｅｔ）である。Ｎａｎｏ−Ｔａｇ１５ペプチドは、ＤＮＡ記録タグにカップリングするための短い柔軟性リンカーペプチド（ＧＧＧＧＳ）およびシステイン残基をさらに含む。他の例示的なペプチドタグ−同種結合性物質対としては、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）−カルモジュリン（ＫＤ  約２ｐＭ）（Mukherjeeet al., 2015, J. Mol. Biol. 427: 2707-2725）、アミロイドベータ（Ａβ１６〜２７）ペプチド−ＵＳ７／Ｌｃｎ２アンチカリン（０．２ｎＭ）（Rauthet al., 2016, Biochem. J. 473: 1563-1578）、ＰＡタグ／ＮＺ−１抗体（ＫＤ  約４００ｐＭ）、ＦＬＡＧ−Ｍ２  Ａｂ（２８ｎＭ）、ＨＡ−４Ｂ２  Ａｂ（１．６ｎＭ）、およびＭｙｃ−９Ｅ１０  Ａｂ（２．２ｎＭ）（Fujiiet al., 2014, Protein Expr. Purif. 95:240-247）が挙げられる。プライマー伸長による結合性物質のコーディングタグから記録タグへの分子内情報移行の試験として、相補的ＤＮＡ配列「Ａ」に結合するオリゴヌクレオチド「結合性物質」を、試験および開発に使用することができる。このハイブリダイゼーション事象は、本質的にｆＭ親和性よりも大きい親和性を有する。ストレプトアビジンを、Ｎａｎｏ−ｔａｇ１５ペプチドエピトープの試験結合性物質として使用することができる。ペプチドタグ−結合性物質相互作用は、高親和性であるが、酸性および／または高塩濃度の洗浄液を用いてこの相互作用を容易に妨げることができる（Perbandtet al.、上掲）。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマー���置き換えることができる。
【０８５６】
【図３７】図３７Ａ〜Ｂは、ポリペプチドのＵＭＩ標識ＮまたはＣ末端からＤＮＡタグ標識体に情報を移行させるための、ナノ−またはマイクロ−エマルジョンＰＣＲの使用の例を示す。図３７Ａでは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端を、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む核酸分子で標識する。このＵＭＩは、後続のＰＣＲをプライミングするために使用される配列と隣接していることもある。次いで、ポリペプチドの内部部位を、ＵＭＩに隣接するプライミング配列に相補的な配列を含む別々のＤＮＡタグで「本体標識」する。図３７Ｂでは、得られた標識ポリペプチドを乳化し、エマルジョンＰＣＲ（ｅＰＣＲ）（あるいは、エマルジョンｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写−ＲＴ−ＰＣＲ（ＩＶＴ−ＲＴ−ＰＣＲ）反応または他の好適な増幅反応を実施することができる）を実施して、Ｎ末端ＵＭＩまたはＣ末端ＵＭＩを増幅する。マイクロエマルジョンまたはナノエマルジョンは、平均液滴直径が５０〜１０００ｎｍであるように、かつ１液滴当たり平均で１つ未満のポリペプチドが存在するように、形成される。ＰＣＲ前およびＰＣＲ後の液滴内容物のスナップショットが、左パネルおよび右パネルにそれぞれ示されている。ＵＭＩアンプリコンを、相補的プライミング配列を介して内部ポリペプチド本体ＤＮＡタグとハイブリダイズさせ、ＵＭＩ情報をプライマー伸長によってアンプリコンから内部ポリペプチド本体ＤＮＡタグに移行させる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８５７】
【図３８】図３８は、単一細胞プロテオミクスの例を示す。細胞を、ポリマー形成サブユニット（例えば、アクリルアミド）を含有する液滴に封入し、溶解する。ポリマー形成サブユニットを重合し（例えば、ポリアクリルアミド）、タンパク質をポリマーマトリックスに架橋する。エマルジョン液滴を破壊し、透過性ポリマーマトリックスに付着した単一細胞タンパク質ライセートを含有する重合ゲルビーズを放出させる。タンパク質を、それらのネイティブなコンフォメーションで、または溶解および封入緩衝液中に尿素などの変性剤を含めることにより変性状態で、どちらかで、ポリマーマトリックスに架橋する。コンパートメントバーコードおよび他の記録タグ成分（例えば、ユニバーサルプライミング配列（Ｐ１）、スペーサー配列（Ｓｐ）、必要に応じた一意の分子識別子（ＵＭＩ））を含む記録タグを、バーコード付きビーズとの乳化、またはコンビナトリアルインデックス化を含む、当技術分野で公知のおよび本明細書に開示の多数の方法を使用して、タンパク質に付着させる。単一細胞タンパク質を含有する重合ゲルビーズを、記録タグの付加後にプロテイナーゼ消化に供して、ペプチド配列決定に好適な記録タグ標識ペプチドを生成することもできる。ある特定の実施形態では、ポリマーマトリックスを、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤に曝露されると破壊するジスルフィド架橋ポリマーなどの適切な添加剤に溶解するように、設計することができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８５８】
【図３９】図３９Ａ〜Ｅは、二機能性Ｎ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）修飾因子およびキメラ切断試薬を使用する、アミノ酸切断反応の増強の例を示す。（Ａ）および（Ｂ）固相基材に付着しているペプチドを、ビオチン−フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）などの二機能性ＮＴＡＡ修飾因子で修飾する。（Ｃ）低親和性エドマナーゼ（＞μＭ  Ｋｄ）を、ストレプトアビジン−エドマナーゼキメラタンパク質を使用してビオチン−ＰＩＴＣ標識ＮＴＡＡに動員する。（Ｄ）エドマナーゼ切断の効率は、ビオチン−ストレプトアビジン（strepavidin）相互作用の結果として有効局所濃度が増加するため、大幅に向上する。（Ｅ）切断されたビオチン−ＰＩＴＣ標識ＮＴＡＡおよび付随するストレプトアビジン−エドマナーゼキメラタンパク質は、切断後に遠方に拡散する。多数の他のバイオコンジュゲーション動員戦略を用いることもできる。アジド修飾ＰＩＴＣは、市販されており（４−アジドフェニルイソチオシアネート、Ｓｉｇｍａ）、アルキン−ビオチンとのクリック化学反応によって、ビオチン−ＰＩＴＣなどのＰＩＴＣの他のバイオコンジュゲートへのアジド−ＰＩＴＣの多数の単純な変換を可能にする。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８５９】
【図４０−１】図４０Ａ〜Ｉは、タンパク質ライセート（ゲルビーズに封入されていることもある）からのＣ末端記録タグ標識ペプチドの生成の例を示す。（Ａ）変性ポリペプチドを酸無水物と反応させて、リシン残基を標識する。一実施形態では、アルキン（ｍＴｅｔ）置換シトラコン酸無水物＋プロピオン酸無水物のミックスを使用して、リシンをｍＴｅｔ（縞模様の長方形として示されている）で標識する。（Ｂ）その結果、リシンの何分の一かがプロピオン基（ポリペプチド鎖上に正方形として示されている）でブロッキングされている、アルキン（ｍＴｅｔ）標識ポリペプチドとなる。アルキン（ｍＴｅｔ）部分は、クリック化学に基づくＤＮＡ標識に有用である。（Ｃ）ＤＮＡタグ（黒抜き長方形として示されている）を、アルキンまたはｍＴｅｔ部分に対してそれぞれアジドまたはｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）標識を使用してクリック化学により付着させる。（Ｄ）バーコードならびに機能的エレメント、例えばスペーサー（Ｓｐ）配列およびユニバーサルプライミング配列を、図３１に示されているようなプライマー伸長ステップを使用してＤＮＡタグに追加して、記録タグ標識ポリペプチドを生成する。バーコードは、試料バーコード、分配バーコード、コンパートメントバーコード、空間位置バーコードなど、またはそれらの任意の組合せであり得る。（Ｅ）得られた記録タグ標識ポリペプチドを、プロテアーゼでまたは化学的に記録タグ標識ペプチドに断片化する。（Ｆ）説明のために、２つの記録タグで標識されたペプチド断片が示されている。（Ｇ）記録タグのユニバーサルプライミング配列に相補的であるユニバーサルプライミング配列を含むＤＮＡタグを、ペプチドのＣ末端にライゲーションする。Ｃ末端ＤＮＡタグは、ペプチドを表面にコンジュゲートするための部分も含む。（Ｈ）Ｃ末端ＤＮＡタグの相補的ユニバーサルプライミング配列と確率的に選択された記録タグとがアニーリングする。分子内プライマー伸長反応を使用して、記録タグからＣ末端ＤＮＡタグに情報を移行させる。（Ｉ）ペプチド上の内部記録タグを、無水マレイン酸を介してリシン残基にカップリングする。このカップリングは酸性ｐＨで可逆的である。内部記録タグは、酸性ｐＨでペプチドのリシン残基から切断され、その結果、Ｃ末端記録タグが残る。新たに露出したリシン残基を、プロピオン酸無水物などの非加水分解性無水物で、必要に応じて、ブロッキングすることができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【図４０−２】図４０Ａ〜Ｉは、タンパク質ライセート（ゲルビーズに封入されていることもある）からのＣ末端記録タグ標識ペプチドの生成の例を示す。（Ａ）変性ポリペプチドを酸無水物と反応させて、リシン残基を標識する。一実施形態では、アルキン（ｍＴｅｔ）置換シトラコン酸無水物＋プロピオン酸無水物のミックスを使用して、リシンをｍＴｅｔ（縞模様の長方形として示されている）で標識する。（Ｂ）その結果、リシンの何分の一かがプロピオン基（ポリペプチド鎖上に正方形として示されている）でブロッキングされている、アルキン（ｍＴｅｔ）標識ポリペプチドとなる。アルキン（ｍＴｅｔ）部分は、クリック化学に基づくＤＮＡ標識に有用である。（Ｃ）ＤＮＡタグ（黒抜き長方形として示されている）を、アルキンまたはｍＴｅｔ部分に対してそれぞれアジドまたはｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）標識を使用してクリック化学により付着させる。（Ｄ）バーコードならびに機能的エレメント、例えばスペーサー（Ｓｐ）配列およびユニバーサルプライミング配列を、図３１に示されているようなプライマー伸長ステップを使用してＤＮＡタグに追加して、記録タグ標識ポリペプチドを生成する。バーコードは、試料バーコード、分配バーコード、コンパートメントバーコード、空間位置バーコードなど、またはそれらの任意の組合せであり得る。（Ｅ）得られた記録タグ標識ポリペプチドを、プロテアーゼでまたは化学的に記録タグ標識ペプチドに断片化する。（Ｆ）説明のために、２つの記録タグで標識されたペプチド断片が示されている。（Ｇ）記録タグのユニバーサルプライミング配列に相補的であるユニバーサルプライミング配列を含むＤＮＡタグを、ペプチドのＣ末端にライゲーションする。Ｃ末端ＤＮＡタグは、ペプチドを表面にコンジュゲートするための部分も含む。（Ｈ）Ｃ末端ＤＮＡタグの相補的ユニバーサルプライミング配列と確率的に選択された記録タグとがアニーリングする。分子内プライマー伸長反応を使用して、記録タグからＣ末端ＤＮＡタグに情報を移行させる。（Ｉ）ペプチド上の内部記録タグを、無水マレイン酸を介してリシン残基にカップリングする。このカップリングは酸性ｐＨで可逆的である。内部記録タグは、酸性ｐＨでペプチドのリシン残基から切断され、その結果、Ｃ末端記録タグが残る。新たに露出したリシン残基を、プロピオン酸無水物などの非加水分解性無水物で、必要に応じて、ブロッキングすることができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８６０】
【図４１】図４１は、ＮＧＰＳアッセイの実施形態の例示的なワークフローを示す。
【０８６１】
【図４２】図４２Ａ〜Ｄは、ＮＧＰＳシーケンシングアッセイの例示的なステップを示す。記録タグで標識された、表面に結合されているペプチドに関するＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）アセチル化またはアミジン化ステップは、ＮＴＡＡ結合性物質が、アセチル化ＮＴＡＡに結合するように操作されているのか、またはネイティブなＮＴＡＡに結合するように操作されているのかに依存して、ＮＴＡＡ結合性物質による結合の前または後で行うことができる。第１の場合には、（Ａ）最初に、無水酢酸を使用する化学的手段によって、またはＮ末端アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）を用いて酵素的に、ペプチドのＮＴＡＡをアセチル化する。（Ｂ）ＮＴＡＡは、ＮＴＡＡ結合性物質、例えば、操作されたアンチカリン、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）、ＣｌｐＳなどにより、認識される。ＤＮＡコーディングタグは、結合性物質に付着しており、特定のＮＴＡＡ結合性物質を識別するバーコードエンコーダー配列を含む。（Ｃ）アセチル化ＮＴＡＡにＮＴＡＡ結合性物質が結合した後、ＤＮＡコーディングタグは、相補配列を介して記録タグと一時的にアニーリングし、コーディングタグ情報がポリメラーゼ伸長によって記録タグに移行される。代替的な実施形態では、記録タグ情報は、ポリメラーゼ伸長によってコーディングタグに移行される。（Ｄ）アセチル化ＮＴＡＡは、アセチル化ペプチドの末端アセチル化アミノ酸の加水分解を触媒する操作されたアシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）により、ペプチドから切断される。アセチル化ＮＴＡＡの切断後、このサイクルは、新たに露出したＮＴＡＡのアセチル化で開始して自発的に繰り返される。Ｎ末端アセチル化がＮＴＡＡ修飾／切断の例示的な方法として使用されているが、グアニル部分などの他のＮ末端部分を、その代わりに使用することができ、それに付随して切断の化学的性質が変わる。グアニジニル化を用いる場合、０．５〜２％ＮａＯＨ溶液を使用して穏やかな条件下でグアニル化ＮＴＡＡを切断することができる（その全体が参照により組み込まれる、Hamada, 2016を参照されたい）。ＡＰＨは、ブロッキングされたペプチドのＮα−アセチル化アミノ酸の除去を触媒することができるセリンペプチダーゼであり、プロリルオリゴペプチダーゼ（ＰＯＰ）ファミリー（Ｃｌａｎ  ＳＣ、ファミリーＳ９）に属する。ＡＰＨは、真核生物細胞、細菌細胞および古細菌細胞のＮ−末端アセチル化タンパク質の重要な調節因子である。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８６２】
【図４３】図４３Ａ〜Ｂは、例示的な記録タグ−コーディングタグ設計特徴を示す。（Ａ）例示的な記録タグ付随タンパク質（またはペプチド）のおよび付随するコーディングタグを有する結合されている結合性物質（例えば、アンチカリン）の構造。プライマー伸長反応での確率的な非鋳型３’末端アデノシン（Ａ）付加に適応するために、チミジン（Ｔ）塩基がコーディングタグのスペーサー（Ｓｐ’）とバーコード（ＢＣ’）配列との間に挿入されている。（Ｂ）ＤＮＡコーディングタグは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＳｐｙＴａｇタンパク質−ペプチド相互作用によって結合性物質（例えば、アンチカリン）に付着している。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８６３】
【図４４】図４４Ａ〜Ｅは、記録タグと切断剤のハイブリダイゼーションを使用するＮＴＡＡ切断反応の増強の例を示す。図４４Ａ〜Ｂでは、固相基材（例えば、ビーズ）に付着している記録タグ標識ペプチドのＮＴＡＡを、例えば、ＰＩＴＣ、ＤＮＰ、ＳＮＰ、アセチル修飾因子、グアニジニル化などで、修飾または標識する（Ｍｏｄ）。図４４Ｃでは、切断酵素（例えば、アシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）、アミノペプチダーゼ（ＡＰ）、エドマナーゼなど）を、記録タグのユニバーサルプライミング配列に相補的なユニバーサルプライミング配列を含むＤＮＡタグに付着させる。切断酵素は、切断酵素のＤＮＡタグおよび記録タグの相補的ユニバーサルプライミング配列のハイブリダイゼーションによって修飾ＮＴＡＡに動員される。図４４Ｄでは、ハイブリダイゼーションステップは、ＮＴＡＡに対する切断酵素の有効親和性を大幅に向上させる。図４４Ｅでは、切断されたＮＴＡＡは遠方に拡散し、付随する切断酵素は、ハイブリダイズされたＤＮＡタグの剥離によって除去することができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８６４】
【図４５】図４５は、ペプチドリガーゼ＋プロテアーゼ＋ジアミノペプチダーゼを使用する、例示的なサイクル分解ペプチド配列決定を示す。ブテラーゼＩは、ＴＥＶ−ブテラーゼＩペプチド基質（ＴＥＮＬＹＦＱＮＨＶ、配列番号１３２）をクエリペプチドのＮＴＡＡにライゲーションする。ブテラーゼは、ペプチド基質のＣ末端にＮＨＶモチーフを必要とする。ライゲーション後、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼを使用してグルタミン（Ｑ）残基の後でキメラペプチド基質を切断し、その結果、クエリペプチドのＮ末端にアスパラギン（Ｎ）残基が付着したキメラペプチドが得られる。２つのアミノ酸残基をＮ末端から切断するジアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）またはジペプチジルペプチダーゼは、Ｎに付加されたクエリペプチドを、クエリペプチドのそのアスパラギン残基（Ｎ）および元々のＮＴＡＡの効果的な除去により、アミノ酸２個分短縮する。新たに露出したＮＴＡＡを、本明細書で提示されるような結合性物質を使用して読み取り、次いで、サイクル全体を「ｎ」回繰り返して、「ｎ」個のアミノ酸を配列決定する。ストレプトアビジン−ＤＡＰ金属酵素キメラタンパク質を使用することおよびビオチン部分をＮ末端アスパラギン残基に係留することにより、ＤＡＰ処理能力の制御を可能にすることができる。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８６５】
【図４６−１】図４６Ａ〜Ｃは、一本鎖ＤＮＡ記録タグへの一本鎖ＤＮＡコーディングタグのライゲーションによる例示的な「無スペーサー」コーディングタグ移行を示す。一本鎖ＤＮＡコーディングタグを、記録タグにそのコーディングタグをライゲーションすることによって直接移行させて、伸長記録タグを生成する。（Ａ）一本鎖ＤＮＡライゲーションによるＤＮＡに基づくモデル系の概観。コーディングタグとコンジュゲートされている標的化物質Ｂ’配列を、記録タグにおけるＢ  ＤＮＡ標的を検出するために設計した。ｓｓＤＮＡ記録タグ、ｓａＲＴ＿Ｂｂｃａ＿ｓｓＬｉｇは、５’リン酸化および３’ビオチン化されており、６塩基ＤＮＡバーコードＢＣａ、ユニバーサルフォワードプライマー配列、および標的ＤＮＡ  Ｂ配列で構成される。コーディングタグ、ＣＴ＿Ｂ’ｂｃｂ＿ｓｓＬｉｇは、ユニバーサルリバースプライマー配列、ウラシル塩基、および一意の６塩基エンコーダーバーコードＢＣｂを含有する。コーディングタグは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＢ’ＤＮＡ配列に共有結合により連結されている。コーディングタグに付着しているＢ’配列の記録タグに付着しているＢ配列とのハイブリダイゼーションは、記録タグの５’リン酸基とコーディングタグの３’ヒドロキシル基を固体表面で極めて近接させ、その結果、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩなどのリガーゼとの一本鎖ＤＮＡのライゲーションによって情報移行が生じる。（Ｂ）一本鎖ＤＮＡライゲーションを確認するためのゲル解析。一本鎖ＤＮＡライゲーションアッセイは、コーディングタグから記録タグへの結合情報移行を実証した。４７塩基記録タグと４９塩基コーディングタグのライゲーション産物のサイズは、９６塩基である。同種ｓａＲＴ＿Ｂｂｃａ＿ｓｓＬｉｇ記録タグの存在下でライゲーション産物バンドが観察されたが、非同種ｓａＲＴ＿Ａｂｃｂ＿ｓｓＬｉｇ記録タグの存在下で産物バンドが観察されなかったということから、特異性が実証される。（Ｃ）コーディングタグの複数サイクル情報移行。第１のサイクルのライゲーション産物をＵＳＥＲ酵素で処理して、第２の情報移行サイクルで使用するための遊離５’リン酸化末端を生成した。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【図４６−２】図４６Ａ〜Ｃは、一本鎖ＤＮＡ記録タグへの一本鎖ＤＮＡコーディングタグのライゲーションによる例示的な「無スペーサー」コーディングタグ移行を示す。一本鎖ＤＮＡコーディングタグを、記録タグにそのコーディングタグをライゲーションすることによって直接移行させて、伸長記録タグを生成する。（Ａ）一本鎖ＤＮＡライゲーションによるＤＮＡに基づくモデル系の概観。コーディングタグとコンジュゲートされている標的化物質Ｂ’配列を、記録タグにおけるＢ  ＤＮＡ標的を検出するために設計した。ｓｓＤＮＡ記録タグ、ｓａＲＴ＿Ｂｂｃａ＿ｓｓＬｉｇは、５’リン酸化および３’ビオチン化されており、６塩基ＤＮＡバーコードＢＣａ、ユニバーサルフォワードプライマー配列、および標的ＤＮＡ  Ｂ配列で構成される。コーディングタグ、ＣＴ＿Ｂ’ｂｃｂ＿ｓｓＬｉｇは、ユニバーサルリバースプライマー配列、ウラシル塩基、および一意の６塩基エンコーダーバーコードＢＣｂを含有する。コーディングタグは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＢ’ＤＮＡ配列に共有結合により連結されている。コーディングタグに付着しているＢ’配列の記録タグに付着しているＢ配列とのハイブリダイゼーションは、記録タグの５’リン酸基とコーディングタグの３’ヒドロキシル基を固体表面で極めて近接させ、その結果、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩなどのリガーゼとの一本鎖ＤＮＡのライゲーションによって情報移行が生じる。（Ｂ）一本鎖ＤＮＡライゲーションを確認するためのゲル解析。一本鎖ＤＮＡライゲーションアッセイは、コーディングタグから記録タグへの結合情報移行を実証した。４７塩基記録タグと４９塩基コーディングタグのライゲーション産物のサイズは、９６塩基である。同種ｓａＲＴ＿Ｂｂｃａ＿ｓｓＬｉｇ記録タグの存在下でライゲーション産物バンドが観察されたが、非同種ｓａＲＴ＿Ａｂｃｂ＿ｓｓＬｉｇ記録タグの存在下で産物バンドが観察されなかったということから、特異性が実証される。（Ｃ）コーディングタグの複数サイクル情報移行。第１のサイクルのライゲーション産物をＵＳＥＲ酵素で処理して、第２の情報移行サイクルで使用するための遊離５’リン酸化末端を生成した。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８６６】
【図４７−１】図４７Ａ〜Ｂは、二本鎖ＤＮＡ記録タグへの二本鎖ＤＮＡコーディングタグのライゲーションによる例示的なコーディングタグ移行を示す。二本鎖ＤＮＡライゲーションによるコーディングタグの複数の情報移行を、ＤＮＡに基づくモデル系により実証した。（Ａ）二本鎖ＤＮＡライゲーションによるＤＮＡに基づくモデル系の概観。コーディングタグとコンジュゲートされている標的化物質Ａ’配列を、記録タグにおける標的結合性物質Ａを検出するために調製した。記録タグとコーディングタグの両方は、４塩基突出を有する２本の鎖で構成されている。コーディングタグの標的化物質Ａ’を固体表面に固定化された記録タグの標的結合性物質Ａにハイブリダイズすると、両方のタグの近接突出末端がハイブリダイズし、その結果、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼによる二本鎖ＤＮＡライゲーションによって情報移行が生じる。（Ｂ）二本鎖ＤＮＡライゲーションを確認するためのゲル解析。二本鎖ＤＮＡライゲーションアッセイは、コーディングタグから記録タグへのＡ／Ａ’結合情報移行を実証した。７６および５４塩基記録タグと二本鎖コーディングタグのライゲーション産物のサイズは、それぞれ、１１６および１１１塩基である。第１のサイクルのライゲーション産物をＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）により消化し、第２のサイクルのアッセイに使用した。第２のサイクルのライゲーション産物バンドは、およそ１５０塩基で観察された。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【図４７−２】図４７Ａ〜Ｂは、二本鎖ＤＮＡ記録タグへの二本鎖ＤＮＡコーディングタグのライゲーションによる例示的なコーディングタグ移行を示す。二本鎖ＤＮＡライゲーションによるコーディングタグの複数の情報移行を、ＤＮＡに基づくモデル系により実証した。（Ａ）二本鎖ＤＮＡライゲーションによるＤＮＡに基づくモデル系の概観。コーディングタグとコンジュゲートされている標的化物質Ａ’配列を、記録タグにおける標的結合性物質Ａを検出するために調製した。記録タグとコーディングタグの両方は、４塩基突出を有する２本の鎖で構成されている。コーディングタグの標的化物質Ａ’を固体表面に固定化された記録タグの標的結合性物質Ａにハイブリダイズすると、両方のタグの近接突出末端がハイブリダイズし、その結果、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼによる二本鎖ＤＮＡライゲーションによって情報移行が生じる。（Ｂ）二本鎖ＤＮＡライゲーションを確認するためのゲル解析。二本鎖ＤＮＡライゲーションアッセイは、コーディングタグから記録タグへのＡ／Ａ’結合情報移行を実証した。７６および５４塩基記録タグと二本鎖コーディングタグのライゲーション産物のサイズは、それぞれ、１１６および１１１塩基である。第１のサイクルのライゲーション産物をＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）により消化し、第２のサイクルのアッセイに使用した。第２のサイクルのライゲーション産物バンドは、およそ１５０塩基で観察された。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８６７】
【図４８−１】図４８Ａ〜Ｅは、複数のサイクルを用いるコーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するための、例示的なペプチドに基づくおよびＤＮＡに基づくモデル系を示す。複数の情報移行が、逐次的ペプチドおよびＤＮＡモデル系により実証された。（Ａ）ペプチドに基づくモデル系における第１のサイクルの概観。コーディングタグとコンジュゲートされている標的化物質抗ＰＡ抗体を、第１のサイクルの情報移行で記録タグのＰＡ−ペプチドタグを検出するために調製した。加えて、Ｎａｎｏｔａｇペプチドまたはアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドを使用して、ペプチド−記録タグ複合体陰性対照も生成した。Ａ配列標的物質と、ポリ−ｄＴと、ユニバーサルフォワードプライマー配列と、一意のＤＮＡバーコードＢＣ１およびＢＣ２と、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）とを含有するａｍＲＴ＿Ａｂｃである記録タグを、５’末端のアミン基および内部のアルキン基によってペプチドおよび固体支持体にそれぞれ共有結合により付着させる。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）と隣接している一意のエンコーダーバーコードＢＣ５’を含有するａｍＣＴ＿ｂｃ５であるコーディングタグの５’末端および３’末端を抗体およびＣ３リンカーにそれぞれ共有結合により連結させる。抗ＰＡ抗体がＰＡ−タグペプチド−記録タグ（ＲＴ）複合体に結合すると、ポリメラーゼ伸長によってコーディングタグから記録タグへの情報移行が果たされる。（Ｂ）ＤＮＡに基づくモデルアッセイにおける第２のサイクルの概観。コーディングタグに連結されている標的化物質Ａ’配列を、記録タグにおけるＡ配列標的物質を検出するために調製した。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）と、一意のエンコーダーバーコードＢＣ１３’と、ユニバーサルリバースプライマー配列とを含有するＣＴ＿Ａ’＿ｂｃ１３である、コーディングタグ。Ａ’配列がＡ配列とハイブリダイズするとポリメラーゼ伸長によりコーディングタグから記録タグへの情報移行が果たされる。（Ｃ）ＰＣＲ解析のための記録タグ増幅。固定化記録タグを、Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ２プライマーセットを使用して１８サイクルＰＣＲにより増幅した。記録タグ密度依存性ＰＣＲ産物がおよそ５６ｂｐで観察された。（Ｄ）第１のサイクルの伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。第１のサイクルの伸長記録タグを、Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ５プライマーセットを使用して２１サイクルのＰＣＲにより増幅した。第１のサイクルの伸長産物からのＰＣＲ産物の強いバンドが、複合体の異なる密度タイトレーション全体にわたってＰＡ−ペプチドＲＴ複合体についておよそ８０ｂｐで観察された。小さいバックグラウンドバンドが、ＮａｎｏおよびＡβペプチド複合体についても最高複合体密度で観察され、これは、表面上、非特異的結合に起因する。（Ｅ）第２のサイクルの伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。第２の伸長記録タグを、Ｐ１＿Ｆ２およびＰ２＿Ｒ１プライマーセットを使用して２１サイクルのＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物の相対的に強いバンドが、すべてのペプチド固定化ビーズについて１１７塩基対で観察された。これらは、元の記録タグ（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ１３）に関する第２のサイクルの伸長��物のみに対応する。第１のサイクルの伸長記録タグ（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ５＋ＢＣ１３）に関する第２のサイクルの伸長産物に対応するバンドが、ＰＡ−タグ固定化ビーズをアッセイに使用したときにのみ９３塩基対で観察された。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【図４８−２】図４８Ａ〜Ｅは、複数のサイクルを用いるコーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するための、例示的なペプチドに基づくおよびＤＮＡに基づくモデル系を示す。複数の情報移行が、逐次的ペプチドおよびＤＮＡモデル系により実証された。（Ａ）ペプチドに基づくモデル系における第１のサイクルの概観。コーディングタグとコンジュゲートされている標的化物質抗ＰＡ抗体を、第１のサイクルの情報移行で記録タグのＰＡ−ペプチドタグを検出するために調製した。加えて、Ｎａｎｏｔａｇペプチドまたはアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドを使用して、ペプチド−記録タグ複合体陰性対照も生成した。Ａ配列標的物質と、ポリ−ｄＴと、ユニバーサルフォワードプライマー配列と、一意のＤＮＡバーコードＢＣ１およびＢＣ２と、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）とを含有するａｍＲＴ＿Ａｂｃである記録タグを、５’末端のアミン基および内部のアルキン基によってペプチドおよび固体支持体にそれぞれ共有結合により付着させる。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）と隣接している一意のエンコーダーバーコードＢＣ５’を含有するａｍＣＴ＿ｂｃ５であるコーディングタグの５’末端および３’末端を抗体およびＣ３リンカーにそれぞれ共有結合により連結させる。抗ＰＡ抗体がＰＡ−タグペプチド−記録タグ（ＲＴ）複合体に結合すると、ポリメラーゼ伸長によってコーディングタグから記録タグへの情報移行が果たされる。（Ｂ）ＤＮＡに基づくモデルアッセイにおける第２のサイクルの概観。コーディングタグに連結されている標的化物質Ａ’配列を、記録タグにおけるＡ配列標的物質を検出するために調製した。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）と、一意のエンコーダーバーコードＢＣ１３’と、ユニバーサルリバースプライマー配列とを含有するＣＴ＿Ａ’＿ｂｃ１３である、コーディングタグ。Ａ’配列がＡ配列とハイブリダイズするとポリメラーゼ伸長によりコーディングタグから記録タグへの情報移行が果たされる。（Ｃ）ＰＣＲ解析のための記録タグ増幅。固定化記録タグを、Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ２プライマーセットを使用して１８サイクルＰＣＲにより増幅した。記録タグ密度依存性ＰＣＲ産物がおよそ５６ｂｐで観察された。（Ｄ）第１のサイクルの伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。第１のサイクルの伸長記録タグを、Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ５プライマーセットを使用して２１サイクルのＰＣＲにより増幅した。第１のサイクルの伸長産物からのＰＣＲ産物の強いバンドが、複合体の異なる密度タイトレーション全体にわたってＰＡ−ペプチドＲＴ複合体についておよそ８０ｂｐで観察された。小さいバックグラウンドバンドが、ＮａｎｏおよびＡβペプチド複合体についても最高複合体密度で観察され、これは、表面上、非特異的結合に起因する。（Ｅ）第２のサイクルの伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。第２の伸長記録タグを、Ｐ１＿Ｆ２およびＰ２＿Ｒ１プライマーセットを使用して２１サイクルのＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物の相対的に強いバンドが、すべてのペプチド固定化ビーズについて１１７塩基対で観察された。これらは、元の記録タグ（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ１３）に関する第２のサイクルの伸長��物のみに対応する。第１のサイクルの伸長記録タグ（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ５＋ＢＣ１３）に関する第２のサイクルの伸長産物に対応するバンドが、ＰＡ−タグ固定化ビーズをアッセイに使用したときにのみ９３塩基対で観察された。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【図４８−３】図４８Ａ〜Ｅは、複数のサイクルを用いるコーディングタグから記録タグへの情報移行を実証するための、例示的なペプチドに基づくおよびＤＮＡに基づくモデル系を示す。複数の情報移行が、逐次的ペプチドおよびＤＮＡモデル系により実証された。（Ａ）ペプチドに基づくモデル系における第１のサイクルの概観。コーディングタグとコンジュゲートされている標的化物質抗ＰＡ抗体を、第１のサイクルの情報移行で記録タグのＰＡ−ペプチドタグを検出するために調製した。加えて、Ｎａｎｏｔａｇペプチドまたはアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドを使用して、ペプチド−記録タグ複合体陰性対照も生成した。Ａ配列標的物質と、ポリ−ｄＴと、ユニバーサルフォワードプライマー配列と、一意のＤＮＡバーコードＢＣ１およびＢＣ２と、８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ）とを含有するａｍＲＴ＿Ａｂｃである記録タグを、５’末端のアミン基および内部のアルキン基によってペプチドおよび固体支持体にそれぞれ共有結合により付着させる。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）と隣接している一意のエンコーダーバーコードＢＣ５’を含有するａｍＣＴ＿ｂｃ５であるコーディングタグの５’末端および３’末端を抗体およびＣ３リンカーにそれぞれ共有結合により連結させる。抗ＰＡ抗体がＰＡ−タグペプチド−記録タグ（ＲＴ）複合体に結合すると、ポリメラーゼ伸長によってコーディングタグから記録タグへの情報移行が果たされる。（Ｂ）ＤＮＡに基づくモデルアッセイにおける第２のサイクルの概観。コーディングタグに連結されている標的化物質Ａ’配列を、記録タグにおけるＡ配列標的物質を検出するために調製した。８塩基共通スペーサー配列（Ｓｐ’）と、一意のエンコーダーバーコードＢＣ１３’と、ユニバーサルリバースプライマー配列とを含有するＣＴ＿Ａ’＿ｂｃ１３である、コーディングタグ。Ａ’配列がＡ配列とハイブリダイズするとポリメラーゼ伸長によりコーディングタグから記録タグへの情報移行が果たされる。（Ｃ）ＰＣＲ解析のための記録タグ増幅。固定化記録タグを、Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ２プライマーセットを使用して１８サイクルＰＣＲにより増幅した。記録タグ密度依存性ＰＣＲ産物がおよそ５６ｂｐで観察された。（Ｄ）第１のサイクルの伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。第１のサイクルの伸長記録タグを、Ｐ１＿Ｆ２およびＳｐ／ＢＣ５プライマーセットを使用して２１サイクルのＰＣＲにより増幅した。第１のサイクルの伸長産物からのＰＣＲ産物の強いバンドが、複合体の異なる密度タイトレーション全体にわたってＰＡ−ペプチドＲＴ複合体についておよそ８０ｂｐで観察された。小さいバックグラウンドバンドが、ＮａｎｏおよびＡβペプチド複合体についても最高複合体密度で観察され、これは、表面上、非特異的結合に起因する。（Ｅ）第２のサイクルの伸長アッセイを確認するためのＰＣＲ解析。第２の伸長記録タグを、Ｐ１＿Ｆ２およびＰ２＿Ｒ１プライマーセットを使用して２１サイクルのＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物の相対的に強いバンドが、すべてのペプチド固定化ビーズについて１１７塩基対で観察された。これらは、元の記録タグ（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ１３）に関する第２のサイクルの伸長��物のみに対応する。第１のサイクルの伸長記録タグ（ＢＣ１＋ＢＣ２＋ＢＣ５＋ＢＣ１３）に関する第２のサイクルの伸長産物に対応するバンドが、ＰＡ−タグ固定化ビーズをアッセイに使用したときにのみ９３塩基対で観察された。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８６８】
【図４９−１】図４９Ａ〜Ｂは、シーケンシングリード、例えば、単一分子手法を使用して得たもの、のプロテオフォームの重要性およびロバストなマッピング可能性を説明するための例として、ｐ５３タンパク質配列決定を使用する。図４９Ａの左パネルは、インタクトなプロテオフォームを断片に消化することができることを示し、これらの断片の各々は、１つもしくは複数のメチル化アミノ酸を含むこともあり、１つもしくは複数のリン酸化アミノ酸を含むこともあり、または翻訳後修飾を含まないこともある。翻訳後修飾情報をシーケンシングリードと一緒に分析することができる。右パネルは、タンパク質に沿って様々な翻訳後修飾を示す。図４９Ｂは、分配を使用するリードのマッピングを示し、例えば、全ヒトプロテオームに対してＢＬＡＳＴを実行した後、リード「ＣＰＸＱＸＷＸＤＸＴ」（配列番号１７０、ここで、Ｘ＝任意のアミノ酸）は、一意にｐ５３（ＣＰＶＱＬＷＶＤＳＴ配列、配列番号１６９における）位置にマッピングして戻る。シーケンシングリードは、長い必要はない−例えば、約１０〜１５アミノ酸配列によって、プロテオーム内のタンパク質を識別するのに十分な情報を得ることができる。シーケンシングリードは、オーバーラップすることがあり、オーバーラップ配列における配列情報の重複性を使用して、全ポリペプチド配列を推定および／または検証することができる。
【図４９−２】図４９Ａ〜Ｂは、シーケンシングリード、例えば、単一分子手法を使用して得たもの、のプロテオフォームの重要性およびロバストなマッピング可能性を説明するための例として、ｐ５３タンパク質配列決定を使用する。図４９Ａの左パネルは、インタクトなプロテオフォームを断片に消化することができることを示し、これらの断片の各々は、１つもしくは複数のメチル化アミノ酸を含むこともあり、１つもしくは複数のリン酸化アミノ酸を含むこともあり、または翻訳後修飾を含まないこともある。翻訳後修飾情報をシーケンシングリードと一緒に分析することができる。右パネルは、タンパク質に沿って様々な翻訳後修飾を示す。図４９Ｂは、分配を使用するリードのマッピングを示し、例えば、全ヒトプロテオームに対してＢＬＡＳＴを実行した後、リード「ＣＰＸＱＸＷＸＤＸＴ」（配列番号１７０、ここで、Ｘ＝任意のアミノ酸）は、一意にｐ５３（ＣＰＶＱＬＷＶＤＳＴ配列、配列番号１６９における）位置にマッピングして戻る。シーケンシングリードは、長い必要はない−例えば、約１０〜１５アミノ酸配列によって、プロテオーム内のタンパク質を識別するのに十分な情報を得ることができる。シーケンシングリードは、オーバーラップすることがあり、オーバーラップ配列における配列情報の重複性を使用して、全ポリペプチド配列を推定および／または検証することができる。
【０８６９】
【図５０】図５０Ａ〜Ｃは、ｍＲＮＡディスプレイを使用するＤＮＡ記録タグでのタンパク質またはペプチドの標識を示す。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８７０】
【図５１】図５１Ａ〜Ｅは、バーコード標識ペプチドを分配するためのＮ末端ジペプチド結合による単一サイクルタンパク質識別を示す。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８７１】
【図５２】図５２Ａ〜Ｅは、ペプチドに固定化された分配バーコード付きビーズに対するＮ末端ジペプチド結合物質による単一サイクルタンパク質識別を示す。この図で示される例のいずれにおいても、エンコーディングタグおよび／もしくは記録タグ（および／もしくは、利用可能な場合は、ジタグ、コンパートメントタグもしくは分配タグ）、またはそれらの任意の部分（例えば、ユニバーサルプライマー、スペーサー、ＵＭＩ、記録タグバーコード、エンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコードなど）は、非核酸の配列決定可能なポリマーなどの、配列決定可能なポリマーを含むことができ、またはそれらを配列決定可能なポリマーで置き換えることができる。
【０８７２】
【図５３】図５３Ａ〜Ｂは、異なる細菌種にわたってのＣｌｐＳホモログ／バリアント、ならびに本開示での使用のための例示的なＣｌｐＳタンパク質、例えば、受託番号４ＹＪＭ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ：ＭＳＤＳＰＶＤＬＫＰＫＰＫＶＫＰＫＬＥＲＰＫＬＹＫＶＭＬＬＮＤＤＹＴＰＲＥＦＶＴＶＶＬＫＡＶＦＲＭＳＥＤＴＧＲＲＶＭＭＴＡＨＲＦＧＳＡＶＶＶＶＣＥＲＤＩＡＥＴＫＡＫＥＡＴＤＬＧＫＥＡＧＦＰＬＭＦＴＴＥＰＥＥ（配列番号１９８）からのＣｌｐＳ２；受託番号２Ｗ９Ｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＭＧＫＴＮＤＷＬＤＦＤＱＬＡＥＥＫＶＲＤＡＬＫＰＰＳＭＹＫＶＩＬＶＮＤＤＹＴＰＭＥＦＶＩＤＶＬＱＫＦＦＳＹＤＶＥＲＡＴＱＬＭＬＡＶＨＹＱＧＫＡＩＣＧＶＦＴＡＥＶＡＥＴＫＶＡＭＶＮＫＹＡＲＥＮＥＨＰＬＬＣＴＬＥＫＡＧＡ（配列番号１９９）からのＣｌｐＳ；および受託番号３ＤＮＪ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ：ＴＱＫＰＳＬＹＲＶＬＩＬＮＤＤＹＴＰＭＥＦＶＶＹＶＬＥＲＦＦＮＫＳＲＥＤＡＴＲＩＭＬＨＶＨＱＮＧＶＧＶＣＧＶＹＴＹＥＶＡＥＴＫＶＡＱＶＩＤＳＡＲＲＨＱＨＰＬＱＣＴＭＥＫＤ（配列番号２００）からのＣｌｐＳを示す。図５３Ａは、９９％同一性までクラスタリングした６１２の異なる細菌種からのＣｌｐＳアミノ酸配列についての階層的クラスタリングの樹状図を示す。図５３Ｂは、図５３Ａにおける３つの種からのＣｌｐＳ間のアミノ酸配列同一性の表である。Ａ．ｔｕｍｆａｃｉｅｎｓ  ＣｌｐＳ２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣｌｐＳと３５％未満の配列同一性、およびＣ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣｌｐＳと４０％未満の配列同一性を有する。
【０８７３】
【図５４】図５４は、一本鎖ＤＮＡ／ポリマーキメラ記録タグへの一本鎖ＤＮＡ／ポリマーキメラコーディングタグのライゲーションによるポリマーコーディングタグ移行の例を示す。一本鎖ポリマーコーディングタグを、ＤＮＡスペーサーを介して記録タグにそのコーディングタグをライゲーションすることによって直接移行させて、伸長記録タグを生成する。（Ａ）一本鎖ＤＮＡスペーサーライゲーションによるＮＴＡＡ検出系の概観。コーディングタグとコンジュゲートされているＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）結合物質を、記録タグのペプチドのＮＴＡＡを検出するために設計する。一本鎖ＤＮＡ／ポリマーキメラ記録タグは、５’リン酸化されており、ＤＮＡスペーサー、ポリマーバーコード（例えば、保護されたＤＮＡ、ＰＮＡ、ペプトイドなど）、ナノポアシーケンシング用ユニバーサルポリマーアダプター（例えば、コレステロール、ビオチン、テザーＤＮＡ配列など）で構成されている。スペーサーの長さは、酵素的ライゲーションを開始させるために１〜６塩基であり得る。ＤＮＡ／ポリマーキメラコーディングタグは、ユニバーサルポリマーアダプター、ポリマーバーコード（例えば、保護されたＤＮＡ、ＰＮＡ、ペプトイドなど）、およびＤＮＡスペーサーを含有する。コーディングタグは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＮＴＡＡ結合物質に共有結合により連結されている。コーディングタグに付着しているＮＴＡＡ結合物質の記録タグに付着しているペプチドのＮＴＡＡへの結合は、記録タグの５’リン酸基とコーディングタグの３’ヒドロキシル基を固体表面で極めて近接させ、その結果、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩとの一本鎖ＤＮＡのライゲーションによって情報移行が生じる。（Ｂ）二本鎖ＤＮＡスペーサーライゲーションによるＮＴＡＡ検出系の概観。ＤＮＡ／ポリマーキメラコーディングタグとコンジュゲートされているＮＴＡＡ結合物質を、記録タグのペプチドのＮＴＡＡを検出するために調製する。一本鎖ＤＮＡ／ポリマーキメラ記録タグは、５’リン酸化されており、ＤＮＡスペーサー、ポリマーバーコード（例えば、保護されたＤＮＡ、ＰＮＡ、ペプトイドなど）、ナノポアシーケンシング用ユニバーサルポリマーアダプター（例えば、コレステロール、ビオチン、テザーＤＮＡ配列など）で構成されている。スペーサーの長さは、酵素的ライゲーションを開始させるために５〜２０塩基であり得る。ＤＮＡ／ポリマーキメラコーディングタグは、ユニバーサルポリマーアダプター、ポリマーバーコード（例えば、保護されたＤＮＡ、ＰＮＡ、ペプトイドなど）、およびＤＮＡスペーサーを含有する。コーディングタグは、ポリエチレングリコールリンカーを介してＮＴＡＡ結合物質に共有結合により連結されている。コーディングタグに付着しているＮＴＡＡ結合物質の、記録タグに付着しているペプチドのＮＴＡＡへの結合は、記録タグの５’リン酸基とコーディングタグの３’ヒドロキシル基を固体表面で極めて近接させ、その結果、スプリットＤＮＡハイブリダイゼーション、続いてのＴ４  ＤＮＡリガーゼとの二本鎖ＤＮＡのライゲーションによって情報移行が生じる。
【０８７４】
【図５５】図５５は、単一分子電子シーケンシングの例示的な方法を示す。（Ａ）イオン電流遮断、（Ｂ）トンネル電流、（Ｃ）ＮＰ／ナノリボンに関する面内相互コンダクタンス、（Ｄ）ナノリボンに関する面内相互コンダクタンス。電流遮断部分は、電子的読み取り方法に依存して、イオン電流を遮断することができ、またはトンネル電流を媒介することができ、または相互コンダクタンスをモジュレートすることができる（Heerema et al., 2016, Nat Nanotechnol, 11(2): 127-136）。
【０８７５】
【図５６】図５６は、ナノポア／ナノギャップ解析のためのコードされたポリマー配列の例示的な設計を示す。（Ａ）コードされたポリマーは、コードを含むコンビナトリアル電流遮断基（陰付き多角形により示されている）で構成されている。電流遮断基がナノポアを通過すると、電流遮断基はシグネチャ電流遮断シグナルを生成し、このシグナルを、多数のコンピュータおよび機械学習手法を使用してポリマーコードに関連付けることができる。「ビオチン」の丸は、結合性物質が結合することが可能な結合性部分を構成し、この結合性物質がＤＮＡをナノポア内で「ストール」し、それによって、下流のポリマー遮断基についてのより正確な読み取りが可能になる。転位置をストールするこの特徴部がなければ、ポリマーは、ポアを速く通過し過ぎる可能性がある。示されている例では、ビオチンに、ストレプトアビジン（ＳＡ）、単量体ストレプトアビジン（ｍＳＡ２）、アビジンなどが結合することが可能である。結合物質および結合条件は、結合が準安定性であり、結合物質が、結合してから数ミリ秒以内に解離することになるか、あるいは膜貫通電圧の増加に伴って除去され得るように、選択するべきである。（Ｂ）ポアを通っての転位置を「ストール」するための外因性結合性物質の代案として、ポリマーの固有の準安定性二次構造を使用して、ポリマーによるポアの通過をストールすることができる。この場合もやはり、二次構造のエネルギー論は、ストール時間がミリ秒オーダーになるように選択するべきである。（Ｃ）ナノポアを読み取る電子機器が十分高速であり、ノイズが十分に低い場合、ポアを通る転位置によってポリマーを直接読み取ることができる。
【０８７６】
【図５７】図５７は、ナノポア技術を使用するポリマー読み取りの例を示す。（Ａ）シス膜電圧に対して＋１００ｍＶトランスで保持された脂質二重層膜にアルファ溶血素（ａＨｌｙ）ポアが挿入されている基本ナノポア構成の説明図。この膜電圧の極性が、シスからトランス側に負荷電ポリマーを転位置させる。正荷電ポリマーについては膜電圧を逆転させることができる。（Ｂ）単一遮断部分の典型遮断電流シグネチャ。（Ｃ）異なるナノポアタイプについての比較構造：生物学的ナノポアであるＭｓｐＡおよびａＨｌｙ、合成ナノポアであるグラフェンおよびＳｉＮ２。遮断電流をあらゆるポアタイプに関して測定することができるが、ただし、ブロッキング基（陰付き多角形）の次元はポア直径のオーダーであるべきである。（Laszlo et al., 2014, Nature Biotech.,32, 829-833；Ying et al., 2014,The Analyst, 139, 3826-3835）。
【０８７７】
【図５８】図５８は、結合特徴部で通過をストールすることによりポリマーによるナノポアの通過を制御する例示的な方法を示す。（Ａ）この例での配列決定可能なポリマーは、ポリマーによるポアの通過を一過性にストールして正確な電流遮断（ＩＢ）測定を行うのに十分な時間をもたらす結合要素または固有の二次構造要素であるポリマー「キャッチ」（例えば、ビオチン（ｂ）に結合している単量体ストレプトアビジン（ｍＳＡ２））が散在している電流遮断部分（ＩＢ部分）を有するように設計されている。（Ｂ）ポアに当接している結合性物質であるｍＳＡ２は、膜電位（すなわち、１８０ｍＶ）のもとで最終的に解離する。理想的には、準安定性結合は、ミリ秒の時間規模で解離する。
【０８７８】
【図５９】図５９Ａ〜Ｂ。３サイクル結合／エンコーディングおよびＮＧＳ読み取り。（Ａ）３ステップの逐次的エンコーディングステップを示す。記録タグ（ＤＮＡ  ＲＴ）とコンジュゲートされ、磁気ビーズに固定化されたペプチドが示されている。ペプチドは、ＰＡエピトープを含有する。３つの異なるサイクル特異的バーコード（ＢＣ４、ＢＣ５、ＢＣ１３）で標識された抗ＰＡ抗体を使用して、逐次的な３サイクルのアッセイを行い、各バーコードを異なるサイクル（それぞれ第１、第２および第３のサイクル）に使用した。各サイクルの結果、それぞれのサイクルバーコードで伸長された記録タグが生じる。（Ｂ）各サイクル後の伸長記録タグのＰＣＲ産物についての解析を示すアガロースゲル。レーン１  ＝  サイズ標準、レーン２〜４は、第１、第２および第３のサイクルの産物にそれぞれ対応する。ゲルは、高収率エンコーディングを明確に示す。ＰＣＲは、ＫＯＤポリメラーゼと２４サイクルの増幅を用いた。（Ｃ）ゲル解析に加えて、最終「３サイクル」産物（ゲルの第３のレーン）をＮＧＳシーケンシングにより解析した。ゲルの最大バンドに対応する主産物（産物の７８％を超える）は、３つのバーコードすべてを有するライブラリーエレメントからなった。単一および二重バーコード産物も低い比率で（２つのＢＣについては２０．７％で、および１つのＢＣについては１．１％で）観察された。
【０８７９】
【図６０】図６０Ａ〜Ｂ。プライマー伸長エンコーディングアッセイにおけるブロッキングオリゴヌクレオチドの使用。いくつかのタイプのブロッキングオリゴヌクレオチドをプライマー伸長に基づくエンコーディングアッセイで試験した。（Ａ）ＤＮＡ「結合物質」モデル系、およびエンコーディングアッセイの成分をブロッキングするために使用した３タイプのブロッキングオリゴヌクレオチド：ＲＴブロッカー、ＣＴブロッカーおよびＳｐ’ブロッカー、の設計を示す。各サイクルのコーディングタグバーコードは、サイクル特異的であるように、およびサイクル間で直交性（非相互作用性）であるように設計した。（Ｂ）３サイクルのエンコーディングおよびＰＣＲ増幅後のエンコーディング結果のゲル解析。示されている例では、各サイクルの入力コーディングタグと同種のＣＴブロッカー（＊印の付いているレーン）が、矢印により示されている上方のバンドが示す通り、最高エンコーディング効率を提供した。
【０８８０】
【図６１】図６１Ａ〜Ｂ。ＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅライブラリー増幅中の鋳型乗り換えの最小化。（Ａ）好熱性ポリメラーゼをＰＣＲ中の鋳型乗り換えの傾向についてスクリーニングした。共有バーコード（ＢＣ３、ＢＣ４、ＢＣ５およびＢＣ１３）とスペーサー（Ｓｐ）配列とを含有する、異なる長さの２つの合成擬似鋳型（ＴＳ＿Ｃｔｒｌ１およびＴＳ＿Ｃｔｒｌ４）が示されている。ＰＣＲによる共増幅後、２つの元の鋳型バンドに加えてＰＡＧＥによるバンドの存在が鋳型乗り換えを示す。（Ｂ）ＰＣＲ産物をＰＡＧＥにより解析した。鋳型乗り換えは、ＰＣＲ条件およびポリメラーゼのタイプの関数であった。Ｔａｑポリメラーゼ（レーン２〜５；レーン１＝サイズマーカー）は、特に６０℃アニーリングでＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−（レーン６〜９）よりはるかに少ない鋳型乗り換えを示した。
【０８８１】
【図６２】図６２。単一サイクルＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅアッセイ。２つの異なるビーズタイプ（一方はアミノＡ末端ペプチド（ＡＦＡ−ペプチド）を有し、他方は、アミノＦ末端ペプチド（ＦＡ−ペプチド）を有する）をアッセイで使用した。１サイクルのＮＴＦ／ＮＴＥ化学作用サイクルと、操作されたフェニルアラニン（Ｆ）結合物質を用いる化学作用前および後エンコーディングステップで構成されている２サイクルのエンコーディングサイクルとからなる、フルサイクルＰｒｏｔｅｏＣｏｄｅアッセイにおいて、ＡＦＡ−ペプチドおよびＦＡ−ペプチドビーズを使用した。化学作用後エンコーディングアッセイに対して化学作用前エンコーディングアッセイではＦ−結合物質に異なるバーコードを使用した。２サイクルのエンコーディング（前および後）の後、伸長記録タグを、ＰＣＲおよびＮＧＳライブラリー調製、続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ装置でのＮＧＳシーケンシング読み取りに供した。「前」および「後」バーコード付きコーディングタグを含有するＡＦＡおよびＦＡ記録タグの正規化されたリード数が示されている。Ｆ−結合物質とともにインキュベートしたＦＡペプチドについて、化学作用後サイクルタグと比較して高い「化学作用前」コーディングタグリードカウントが観察された。これは、Ｆ残基の除去成功を示す。逆に、Ｆ−結合物質とともにインキュベートしたＡＦＡペプチドについて、化学作用後サイクルタグと比較して低い化学作用前サイクルタグリードカウントが観察された。これは、Ａ残基の除去成功を示す。
【０８８２】
【図６３】図６３Ａ〜Ｂ。ペプチドキメラ表面密度の関数としての分子間クロストーク。異なる表面キメラ密度で同じビーズ上に固定化されている４−ｐｌｅｘペプチド−記録タグキメラ（ＡＡ−ペプチド、ＡＦ−ペプチド、ＦＡ−ペプチド、およびペプチドなし）に関するＦ−結合物質アッセイクロストーク測定。（Ａ）ＰＡ抗体結合／エンコーディングにより評価した４つのキメラタイプにわたってのキメラ固定化の均一性。各キメラ（配列決定または記録タグにより測定したとき）は、全キメラのおよそ２０〜３０％に相当した。（Ｂ）４つのキメラタイプにわたってのＦ−結合物質に関する単一の結合およびエンコーディングサイクルのエンコーディング効率。１：１０，０００および１：１００，０００のキメラ表面希釈度で、ＦＡ−ペプチドの分子内エンコーディング効率は、オフターゲットのペプチドキメラ（ＡＦ、ＡＡ、およびペプチドなし）の分子間エンコーディングよりはるかに高い。
【０８８３】
【図６４】図６４Ａ〜Ｂ。ｓｓＤＮＡリガーゼを使用する塩基保護ＤＮＡに関するＤＮＡエンコーディング。（Ａ）ｓｓＤＮＡライゲーションアッセイのための塩基保護記録タグ（ＲＴ）およびコーディングタグ（ＣＴ）の設計。用いた塩基保護基は、オリゴヌクレオチド合成で使用される標準的なホスホロアミダイト保護基：Ｂｚ−ｄＡ、ｉｂｕ−ｄＧ、Ａｃ−ｄＣであった。合成後、これらの保護基を所定の位置に残した。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩを使用して、ＲＴオリゴの５’リン酸化末端をＣＴオリゴの３’ＯＨとライゲーションした。（Ｂ）ｓｓＤＮＡリガーゼライゲーション反応成分および産物のＰＡＧＥゲル解析。レーン１  ＝  ＲＴ完全長オリゴ；レーン２  ＝  ５’Ｕで構成されるＲＴ完全長からリン酸化ＲＴ配列を生成するためのＵＳＥＲ酵素処理後；レーン３  ＝  ビーズに固定化されたＲＴオリゴへのＣＴオリゴのアニーリング後；レーン４  ＝  ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩを使用する、Ｂ−Ｂ’相互作用によるＲＴの５’末端へのＣＴの３’末端のライゲーション後。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩを使用したレーン５から分かるように、「塩基保護」ＤＮＡのライゲーションは、より高分子量のライゲーション産物の形成によって示される通り相対的に効率がよい。
【０８８４】
【図６５】図６５Ａ〜Ｅ。ＤＮＡビーズへのハイブリダイゼーションおよびライゲーションを使用するＤＮＡタグ付きペプチドの固定化。（Ａ）ＤＮＡヘアピンの５’突出を使用してＤＮＡ−ペプチドキメラを捕捉する、ＤＮＡヘアピンビーズの設計。（Ｂ）ビーズ上のヘアピンとハイブリダイズされているＤＮＡ−ペプチドキメラ。（Ｃ）ＤＮＡリガーゼを使用して、ペプチドのリン酸化ＤＮＡタグの５’末端をヘアピンに共有結合により接合させる。ペプチドのＤＮＡタグを、ペプチドが内部ヌクレオチドに化学的にコンジュゲートされるように設計する。ペプチドのＤＮＡタグは、コーディングタグからの情報が移行され得る遊離３’末端を有する記録タグを構成する。（Ｄ）ビーズへのＤＮＡタグ付きペプチドの固定化の効率を評価するためのｑＰＣＲプライマーの設計。（Ｅ）ヘアピン（突出）およびＤＮＡタグ付きペプチド固定化（キメラおよびライゲーション産物）を評価するための３つの異なるプライマーセットを使用するｑＰＣＲ定量化。Ｃｑ値が低いほど、示す増幅産物の豊富さが高い。
【発明を実施するための形態】
【０８８５】
本明細書において具体的に定義されない用語には、本開示および文脈を踏まえて当業者により与えられるであろう意味が与えられるべきである。しかしながら、本明細書で使用される場合、相反する指定がなければ、用語は示される意味を有する。
【０８８６】
本出願で言及される、特許文献、科学論文およびデータベースを含む全ての公表文献は、個々の公表文献の各々が参照により個々に組み込まれた場合と同程度に、あらゆる目的でそれら全体が参照により組み込まれる。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願および他の公表文献で述べられている定義と相容れないまたは別様に矛盾する場合、本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれる定義より優先する。
【０８８７】
本明細書で使用される節の見出しは、構成を目的としたものに過ぎず、記載される主題を限定すると見なすべきでない。
Ｉ．序論および概観
【０８８８】
ポリペプチド（例えば、タンパク質）の巨大分子の高度に並行した特徴付けおよび認識は、いくつかの理由で困難である。親和性に基づくアッセイの使用は、いくつかの重要な課題に起因して難しいことが多い。１つの有意な課題は、親和性作用物質の集合の読み取りデータを同類の巨大分子の集合に多重化することであり；もう１つの課題は、親和性作用物質とオフターゲットの巨大分子との交差反応性を最小限に抑えることであり；第３の課題は、効率的なハイスループットの読み取りプラットフォームを開発することである。この問題の例は、試料中のタンパク質の大部分または全てを識別および定量化することが１つの目標であるプロテオミクスにおいて生じる。加えて、タンパク質の様々な翻訳後修飾（ＰＴＭ）を単一分子レベルで特徴付けることが望ましい。現在、これは、ハイスループット方式で果たされるべき非常に厄介な仕事である。
【０８８９】
タンパク質またはポリペプチド分析物の分子認識および特徴付けは、一般には、イムノアッセイを使用して実施される。ＥＬＩＳＡ、マルチプレックスＥＬＩＳＡ（例えば、スポッテッド抗体アレイ、液体粒子ＥＬＩＳＡアレイ）、デジタルＥＬＩＳＡ（例えば、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ）、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）、および多くの他のものを含む、多くの異なるイムノアッセイ形式が存在する。これらの異なるイムノアッセイプラットフォームは全て、高親和性かつ高特異的（または選択的）抗体（結合性物質）の開発、試料レベルにおいても分析物レベルにおいても多重化能力が限られていること、感度およびダイナミックレンジが限られていること、ならびに交差反応性およびバックグラウンドシグナルを含む、同様の課題に直面する。ペプチド配列決定（エドマン分解または質量分析）による直接的なタンパク質特徴付けなどの、結合性物質にとらわれない手法は、有用な代替的手法をもたらす。しかしながら、これらの手法はいずれも、然程並行したものでも、ハイスループットなものでもない。
【０８９０】
エドマン分解に基づくペプチド配列決定は、１９５０年にPehr Edmanによって最初に提唱されたものであり、言い換えれば、ペプチドのＮ末端アミノ酸についての一連の化学修飾による段階的分解および下流のＨＰＬＣ分析（後に質量分析による解析に取って代わられた）である。第１のステップでは、Ｎ末端アミノ酸を穏やかな塩基性条件下（ＮＭＰ／メタノール／Ｈ２Ｏ）で、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）で修飾して、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）誘導体を形成する。第２のステップでは、ＰＴＣ修飾アミノ基を酸（無水トリフルオロ酢酸、ＴＦＡ）で処理して、切断された環状ＡＴＺ（２−アニリノ−５（４）−チアゾリノン（thiozolinone））修飾アミノ酸を創出し、その結果、新たなＮ末端がペプチドに残る。切断された環状ＡＴＺアミノ酸をフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸誘導体に変換し、逆相ＨＰＬＣによって分析する。このプロセスを、ペプチド配列を構成するアミノ酸の全てまたは部分的な数がＮ末端から除去され識別され終わるまで、反復的に継続する。一般に、当技術分野のエドマン分解ペプチド配列決定法は、緩徐であり、１日にほんの数ペプチドという限られたスループットを有する。
【０８９１】
ここ１０〜１５年で、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレー質量分析（ＭＳ）、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用するペプチド解析が大きくエドマン分解に取って代わっている。ＭＳ器械使用（Riley et al., 2016, Cell Syst 2:142-143）の最近の進歩にもかかわらず、ＭＳにはなお、高額な計器費用、洗練された使用者の必要性、不十分な定量能力、およびプロテオームの全ダイナミックレンジにわたって測定を行う能力が限られていることを含む、いくつかの欠点がある。例えば、タンパク質は異なる効率レベルでイオン化するので、試料間の絶対定量化およびさらには相対的定量化が困難である。質量タグのインプリメンテーションが相対的定量化の改善に役立ってきたが、プロテオームを標識する必要がある。試料中のタンパク質の濃度が非常に大きな範囲にわたって（血漿に関しては１０桁にわたって）変動し得るダイナミックレンジが、さらなる複雑化要因である。一般には、ＭＳではより豊富な種のみが分析され、そのため豊富さが低いタンパク質の特徴付けは困難になる。最後に、試料スループットは、一般には、実行１回当たり数千ペプチドに限られ、データ非依存性解析（ＤＩＡ）の場合、このスループットは、真のボトムアップ式のハイスループットなプロテオーム解析には不十分である。さらに、各試料について記録された何千もの複雑なＭＳスペクトルをデコンボリューションするために著しいコンピュータ処理が要求される。
【０８９２】
したがって、タンパク質配列決定および／または解析に適用される巨大分子配列決定および／または解析に関する、ならびにそれを実現するための製品、方法およびキットに関する改善された技法が、当技術分野において依然として必要とされている。高度に並行化されており、正確であり、高感度であり、ハイスループットである、プロテオミクス技術が、必要とされている。本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明を参照すれば明らかになろう。この目的のために、ある特定のバックグラウンド情報、手順、化合物および／または組成物がより詳細に記載されている様々な参考文献が本明細書に記載され、各々が、これによりそれら全体が参照により組み込まれる。
【０８９３】
本開示は、一部において、タンパク質およびペプチドの特徴付けおよび配列決定に直接適用される、高度に並行な、ハイスループットなデジタル巨大分子特徴付けおよび定量化方法を提供する（例えば、図１Ｂ、図２Ａを参照されたい）。本明細書に記載の方法では、核酸分子または配列決定可能なポリマーの形態の識別情報を有するコーディングタグを含む結合性物質であって、目的の巨大分子と相互作用する結合性物質を使用する。多数の連続的な結合サイクルを実施し、各サイクルは、固体支持体上に固定化された複数の巨大分子（これは、例えば、プールされた試料を意味する）を複数の結合性物質に曝露することを含む。各結合サイクル中、巨大分子に結合する各結合性物質の同一性、および必要に応じて結合サイクル数を、結合性物質コーディングタグから巨大分子と共局在している記録タグに情報を移行させることによって記録する。代替の実施形態では、付随する巨大分子に関する識別情報を含む記録タグからの情報を、結合した結合性物質のコーディングタグに（例えば、伸長コーディングタグを形成するために）または第３の「ジタグ」構築物に移行させることができる。多数サイクルの結合事象により、巨大分子と共局在している記録タグに関する歴史的な結合情報が構築され、それにより、多数のコーディングタグを含む伸長記録タグが、所与の巨大分子についての時間的な結合履歴を表す共直線的な順序で生じる。さらに、サイクル特異的コーディングタグを用いて各サイクルからの情報を追跡することができ、したがって、あるサイクルが何らかの理由でスキップされた場合に、伸長記録タグがその後のサイクルで情報を収集し続け、情報が欠けているサイクルを識別することができる。
【０８９４】
あるいは、コーディングタグから記録タグに情報を書き込むまたは移行させる代わりに、付随する巨大分子に関する識別情報を含む記録タグから、伸長コーディングタグを形成するコーディングタグまたは第３のジタグ構築物に情報を移行させることができる。得られた伸長コーディングタグまたはジタグを、その後の配列解析のために各結合サイクル後に収集することができる。バーコード（例えば、分配タグ、コンパートメントタグ、試料タグ、画分タグ、ＵＭＩ、またはそれらの任意の組合せ）を含む記録タグ上の識別情報を使用して、伸長コーディングタグまたはジタグ配列読み取りを元の巨大分子にマッピングし戻すことができる。このように、巨大分子の結合履歴の核酸コードライブラリー表示を生成する。この核酸コードライブラリーを、非常にハイスループットの次世代デジタルシーケンシング法を使用して増幅させ、解析し、それにより、実行当たり数百万〜数十億の分子を解析することができる。結合情報に関する核酸コードライブラリーの創出は、ハイブリダイゼーションを使用するＤＮＡに基づく技法による濃縮、サブトラクション、および正規化が可能になるという点で、別のように有用である。これらのＤＮＡに基づく方法は、容易におよび迅速に大規模化可能かつカスタマイズ可能であり、タンパク質ライブラリーなどの他の種類の巨大分子ライブラリーの直接操作のために利用可能なものよりも費用効果が大きい。したがって、結合情報に関する核酸コードライブラリーを配列決定前に１つまたは複数の技法によって処理して、配列の表示を濃縮および／またはサブトラクションおよび／または正規化することができる。これにより、最大の目的の情報が、個々のメンバーの豊富さが多数の桁にわたって最初に変動し得る非常に大きなライブラリーから、はるかに効率的に、迅速に、かつ大きな費用効果で抽出される。重要なことに、ライブラリー表示を操作するためのこれらの核酸に基づく技法は、より慣習的な方法と直交性のものであり、それらと組み合わせて使用することができる。例えば、アルブミンなどの、一般的な、極めて豊富なタンパク質を、望ましくないタンパク質の全てではないが大多数を除去することができるタンパク質に基づく方法を使用してサブトラクションすることができる。その後、伸長記録タグライブラリーのアルブミン特異的メンバーもサブトラクションし、したがって、より徹底的な全体的サブトラクションを実現することができる。
【０８９５】
一態様では、本開示は、ＤＮＡ記録タグで標識されたペプチドの大きな集団（例えば、数百万〜数十億）からの配列決定を可能にする、エドマン様分解手法を使用した、ペプチド配列決定のための高度に並行化された手法を提供する。これらの記録タグで標識されたペプチドは、タンパク質試料のタンパク質分解による消化または限定された加水分解に由来するものであり、記録タグで標識されたペプチドは、配列決定基板（例えば、多孔質ビーズ）に、基板上の適切な分子間間隔でランダムに固定化される。ＮＴＡＡ切断反応を触媒するまたは動員する、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、スルホニルニトロフェノール（ＳＮＰ）、ダンシル、７−メトキシクマリン、アセチル、またはグアニジニルなどの小さな化学的部分を用いたペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）残基の修飾により、エドマン様分解プロセスの周期的制御が可能になる。修飾用化学的部分により、同類のＮＴＡＡ結合性物質に対する結合親和性の増強をもたらすこともできる。各固定化ペプチドの修飾されたＮＴＡＡを、コーディングタグを含む同類のＮＴＡＡ結合性物質の結合、および、コーディングタグ情報（例えば、結合性物質に関する識別情報をもたらすエンコーダー配列）のコーディングタグからペプチドの記録タグへの移行（例えば、プライマー伸長またはライゲーション）によって識別する。その後、修飾されたＮＴＡＡを化学的方法または酵素的手段によって除去する。ある特定の実施形態では、修飾されたＮＴＡＡの除去を触媒させるために酵素（例えば、エドマナーゼ）を操作する。他の実施形態では、アミノペプチダーゼまたはアシルペプチドヒドロラーゼなどの天然に存在するエキソペプチダーゼを、適切な化学修飾の存在下でのみ末端アミノ酸を切断するように操作することができる。必要に応じて、方法は、各ＮＴＡＡ除去ステップの前および／または後にポリペプチドをプロリンアミノペプチダーゼと接触させるステップを含む。これらのステップは、そうしなければ末端プロリンを切断することができないからである。
ＩＩ．定義
【０８９６】
以下の説明では、種々の実施形態の詳細な理解をもたらすために、ある特定の具体的詳細を記載する。しかし、これらの詳細を伴わずに本化合物を作製および使用できることが当業者には理解されよう。他の場合では、実施形態の説明が不必要に不明瞭になるのを回避するために、周知の構造は詳細に示されていないまたは記載されていない。文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書およびそれが従う特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、制限のない、包括的な意味で、すなわち、「含むが、これだけに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるべきである。さらに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語（および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの関連する用語）は、他のある特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載の任意の組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｔｅｒ）、組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）、方法、またはプロセスなどのある実施形態が、記載されている特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」ものであり得ることを排除するものではない。本明細書で提示される表題は単に便宜上のものであり、特許請求された実施形態の範囲または意味とは解釈されない。
【０８９７】
本明細書全体を通して、「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、当該実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して各所での「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているのではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、任意の適切な様式で組み合わせて１つまたは複数の実施形態にすることができる。
【０８９８】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「１つのペプチド（ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１つもしくは複数のペプチド、またはペプチドの混合物を含む。また、特に明記されていないまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「または（ｏｒ）」という用語は、包括的であり、「または（ｏｒ）」と「および（ａｎｄ）」の両方を包含するものと理解される。
【０８９９】
本明細書で使用される場合、「巨大分子」という用語は、より小さなサブユニットで構成される大きな分子を包含する。巨大分子の例としては、これだけに限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、大環状分子が挙げられる。巨大分子は、共有結合により連結した２つまたはそれよりも多くの型の巨大分子の組合せで構成されるキメラ巨大分子（例えば、核酸と連結したペプチド）も含む。巨大分子は、２つまたはそれよりも多くの巨大分子の非共有結合性の複合体で構成される「巨大分子集合体」も含み得る。巨大分子集合体は、同じ型の巨大分子で構成されるもの（例えば、タンパク質−タンパク質）であってもよく、２つまたはそれよりも多くの異なる型の巨大分子で構成されるもの（例えば、タンパク質−ＤＮＡ）であってもよい。
【０９００】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチドおよびタンパク質を包含し、ペプチド結合によって接合されている２つまたはそれよりも多くのアミノ酸の鎖を含む分子を指す。一部の実施形態では、ポリペプチドは、２〜５０個のアミノ酸を含み、例えば、２０〜３０個より多くのアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、二次、テリトリー、またはより高次の構造を含まない。一部の実施形態では、タンパク質は、３０個またはそれよりも多くのアミノ酸を含み、例えば、５０個よりも多くのアミノ酸を含む。一部の実施形態では、一次構造に加えて、タンパク質は、二次、テリトリー、またはより高次の構造を含む。ポリペプチドのアミノ酸は、最も典型的にはＬ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、またはそれらの任意の組合せであってもよい。ポリペプチドは、天然に存在するものであってもよく、合成的に産生されたものであってもよく、組換え発現されたものであってもよい。ポリペプチドはまた、アミノ酸鎖を修飾する追加の基、例えば、翻訳後修飾によって付加された官能基を含んでいてもよい。ポリマーは、直鎖状であってもよく、または分岐していてもよく、ポリマーは、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、ポリマーに非アミノ酸が割り込んでいてもよい。この用語は、天然にまたは介入により、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
【０９０１】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、ペプチドの単量体サブユニットとして機能する、アミン基、カルボン酸基、および各アミノ酸に特異的な側鎖を有する有機化合物を指す。アミノ酸は、２０種の標準の天然に存在するまたは正規のアミノ酸ならびに非標準アミノ酸を含む。標準の天然に存在するアミノ酸としては、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）が挙げられる。アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であってもＤ−アミノ酸であってもよい。非標準アミノ酸は、天然に存在するまたは化学的に合成された修飾されたアミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、非標準タンパク質新生性アミノ酸、または非タンパク質新生性アミノ酸であり得る。非標準アミノ酸の例としては、これだけに限定されないが、セレノシステイン、ピロリジン、およびＮ−ホルミルメチオニン、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖コアアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸が挙げられる。
【０９０２】
本明細書で使用される場合、「翻訳後修飾」という用語は、リボソームによるペプチドの翻訳が完了した後に当該ペプチド上で生じる修飾を指す。翻訳後修飾は、共有結合性修飾または酵素的修飾であり得る。翻訳後修飾の例としては、これだけに限定されないが、アシル化、アセチル化、アルキル化（メチル化を含む）、ビオチン化、ブチリル化、カルバミル化、カルボニル化、脱アミド化、脱イミノ化、ジフタミド形成、ジスルフィド架橋形成、エリミニル化、フラビン付着、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）、ヘムＣ付着、ヒドロキシル化、ハイプシン形成、ヨウ素化、イソプレニル化、脂質付加、リポイル化、マロニル化、メチル化、ミリストイル化、酸化、パルミトイル化、ペグ化、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、プレニル化、プロピオニル化、レチニリデンシッフ塩基形成、Ｓ−グルタチオン化、Ｓ−ニトロシル化、Ｓ−スルフェニル化、セレン化、サクシニル化、スルフィン化、ユビキチン化、およびＣ末端アミド化が挙げられる。翻訳後修飾は、ペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端の修飾を含む。末端アミノ基の修飾としては、これだけに限定されないが、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ低級アルキル、およびＮ−アシル修飾が挙げられる。末端カルボキシ基の修飾としては、これだけに限定されないが、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾（例えば、低級アルキルはＣ１〜Ｃ４アルキルである）が挙げられる。翻訳後修飾は、例えば、これだけに限定されないが、アミノ末端とカルボキシ末端の間にあるアミノ酸の、上記のものなどの修飾も含む。翻訳後修飾という用語は、１つまたは複数の検出可能な標識を含むペプチド修飾も含み得る。
【０９０３】
本明細書で使用される場合、「結合性物質」という用語は、分析物、例えば、巨大分子または巨大分子の成分もしくは特徴部に結合する、会合する、それと一体化する、それを認識する、またはそれと化合する核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、または小分子を指す。結合性物質は、分析物、例えば、巨大分子または巨大分子の成分もしくは特徴部と共有結合性の会合または非共有結合性の会合を形成し得る。結合性物質はまた、２つまたはそれよりも多くのタイプの分子で構成されるキメラ結合性物質、例えば、核酸分子−ペプチドキメラ結合性物質、または炭水化物−ペプチドキメラ結合性物質であってもよい。結合性物質は、天然に存在するものであってもよく、合成的に産生されたものであってもよく、組換え発現された分子であってもよい。結合性物質は、巨大分子の単一の単量体またはサブユニット（例えば、ペプチドの単一のアミノ酸）に結合することもあり、または巨大分子の複数の連結したサブユニット（例えば、より長いペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質分子の、ジ−ペプチド、トリ−ペプチド、もしくはより高次のペプチド）に結合することもある。結合性物質は、直鎖状分子に結合することもあり、または三次元構造（コンフォメーションとも称される）を有する分子に結合することもある。例えば、抗体結合性物質は、直鎖状ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に結合することもあり、またはコンフォメーションペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に結合することもある。結合性物質は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質分子の、Ｎ末端ペプチドに結合することもあり、Ｃ末端ペプチドに結合することもあり、または介在するペプチドに結合することもある。結合性物質は、ペプチド分子の、Ｎ末端アミノ酸に結合することもあり、Ｃ末端アミノ酸に結合することもあり、または介在するアミノ酸に結合することもある。結合性物質は、例えば、化学修飾されたまたは標識されたアミノ酸に、修飾されていないアミノ酸または非標識アミノ酸よりも優先的に結合することもある。例えば、結合性物質は、例えば、アセチル部分、グアニル部分、ダンシル部分、ＰＴＣ部分、ＤＮＰ部分、ＳＮＰ部分などで修飾されたアミノ酸に、前記部分を有さないアミノ酸よりも優先的に結合することもある。結合性物質は、ポリペプチド分子の翻訳後修飾に結合することもある。結合性物質は、巨大分子などの分析物の成分もしくは特徴部への選択的結合を示すこともある（例えば、結合性物質は、可能性のある２０の天然のアミノ酸残基のうちの１つに選択的に結合し、他の１９の天然のアミノ酸残基には非常に低い親和性で結合するかまたは全く結合しないこともある）。結合性物質は、より低い選択的結合を示すこともあり、その場合、結合性物質は、巨大分子などの分析物の複数の成分もしくは特徴部に結合し得る（例えば、結合性物質は、２つまたはそれよりも多くの異なるアミノ酸残基に同様の親和性で結合することもある）。結合性物質は、コーディングタグを含み、このコーディングタグは、リンカーによって結合性物質に接合されていることもある。
【０９０４】
一部の実施形態では、「物質」および「試薬」という用語は、同義で使用される。例えば、結合性物質は、物質と称されるが、そのコーディングタグは、情報を移行させるために記録タグのスペーサー配列または反応性末端と反応するための反応性部分、例えば、スペーサー配列または反応性末端を有することができる。前記反応は、ライゲーションおよび／またはアニーリング、その後のプライマー伸長を含み得る。
【０９０５】
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つの分子を接合するために使用される、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、または非ヌクレオチド化学的部分の１つまたは複数を指す。リンカーは、結合性物質とコーディングタグを接合するため、記録タグと巨大分子（例えば、ペプチド）を接合するため、巨大分子と固体支持体を接合するため、記録タグと固体支持体などを接合するために使用することができる。ある特定の実施形態では、リンカーにより、２つの分子が酵素反応または化学反応（例えば、クリックケミストリー）を介して接合される。
【０９０６】
本明細書で使用される場合、「プロテオミクス」という用語は、プロテオーム、例えば、細胞、組織および体液中のプロテオーム、ならびに細胞内および組織内のプロテオームの対応する空間的分布の分析（例えば、定量的分析）を指す。さらに、プロテオミクス研究は、生態および定義された生物学的または化学的刺激の関数として継続的に時間変動するプロテオームの動的状態を含む。
【０９０７】
本明細書で使用される場合、「プロテオーム」という用語は、標的、例えば、任意の生物のゲノム、細胞、組織、またはある特定の時期の生物によって発現される、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（それらのコンジュゲートまたは複合体を含む）の全セットを含むことができる。一態様では、プロテオームは、所与のタイプの細胞または生物において所与の時期に、定義された条件下で発現されるタンパク質のセットである。プロテオミクスは、プロテオームの研究である。例えば、「細胞プロテオーム」は、ホルモン刺激への曝露などの、環境条件の特定のセットのもとで特定の細胞型に見られるタンパク質の一群を含むことがある。生物の完全なプロテオームは、様々な細胞プロテオームの全てからのタンパク質の完全なセットを含み得る。プロテオームはまた、ある特定の細胞内生物システム内のタンパク質の一群を含むこともある。例えば、ウイルスのタンパク質の全てをウイルスプロテオームと呼ぶことができる。本明細書で使用される場合、「プロテオーム」という用語は、これだけに限定されないが、キノーム；セクレトーム；レセプトーム（例えば、ＧＰＣＲｏｍｅ）；免疫プロテオーム；栄養プロテオーム；翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、酸化、脂質付加および／またはニトロシル化）により定義されるプロテオームサブセット、例えば、リン酸化プロテオーム（例えば、ホスホチロシン−プロテオーム、チロシン−キノーム、およびチロシン−ホスファトーム）、グライコプロテオームなど；組織もしくは臓器、発生期、または生理もしくは病的状態に関連するプロテオームサブセット；細胞プロセス、例えば、細胞周期、分化（もしくは脱分化）、細胞死、老化、細胞遊走、形質転換、または転移に関連する、プロテオームサブセット；あるいはこれらの任意の組合せを含む、プロテオームのサブセットを含む。
【０９０８】
本明細書で使用される場合、「非同類結合性物質」という用語は、特定の結合サイクル反応において調査される巨大分子の特徴、成分、またはサブユニットに、対応する巨大分子の特徴、成分、またはサブユニットに高親和性で結合する「同類結合性物質」と比較して、結合することができないまたは低親和性で結合する結合性物質を指す。例えば、ペプチド分子のチロシン残基を結合反応において調査する場合、非同類結合性物質は、チロシン残基に低親和性で結合するまたは全く結合しないものであり、したがって、非同類結合性物質では、コーディングタグ情報を同類結合性物質から記録タグに移行させるために適した条件下でコーディングタグ情報が記録タグに効率的に移行されない。あるいは、ペプチド分子のチロシン残基を結合反応において調査する場合、非同類結合性物質は、チロシン残基に低親和性で結合するまたは全く結合しないものであり、したがって、伸長記録タグではなく伸長コーディングタグを伴う実施形態に適した条件下で、記録タグ情報はコーディングタグに効率的に移行されない。
【０９０９】
本明細書で使用される場合、「プロリンアミノペプチダーゼ」という用語は、ポリペプチドからＮ末端プロリンを特異的に切断することができる酵素を指す。この活性を有する酵素は当技術分野において周知であり、プロリンイミノペプチダーゼまたはＰＡＰと称されることもある。公知の単量体ＰＡＰには、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｔ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍからのファミリーメンバーが含まれる（ＭＥＲＯＰＳ  Ｓ３３．００１）（Nakajima, Ito et al. 2006）（Kitazono, Yoshimoto et al. 1992）。公知の多量体ＰＡＰには、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ（Bolumar,Sanz et al. 2003）が含まれる。ネイティブなＰＡＰまたは操作されたＰＡＰのどちらかを用いることができる。
【０９１０】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、結合物質、例えば、抗体、ＣｌｐＳタンパク質、またはアンチカリンについての、それがポリペプチド抗原などの標的に優先的に結合するような、特異性を指す。結合パートナー、例えば、タンパク質、核酸、抗体または他の親和性捕捉物質などに言及する場合、「特異的結合」は、指定アッセイ条件下で選択的ハイブリダイゼーションを確実にする高い親和性および／または相補性を有する２つまたはそれより多くの結合パートナーの結合反応を含むことができる。通常は、特異的結合は、バックグラウンドシグナルの標準偏差の少なくとも３倍であろう。したがって、指定条件下で、結合パートナーは、その特定の標的分子に結合し、試料中に存在する他の分子には有意な量で結合しない。他の潜在的干渉物質の存在下での結合物質または抗体による特定の標的の認識は、そのような結合の１つの特徴である。例えば、標的に特異的であるまたは特異的に結合する結合物質、抗体または抗体断片は、他の非標的物質への結合より高い親和性で標的と結合する。例えば、標的に特異的であるまたは特異的に結合する結合物質、抗体または抗体断片は、非標的物質、例えば、試験する試料中に存在する非標的物質の有意なパーセンテージへの結合を回避する。一部の実施形態では、本開示の結合物質、抗体または抗体断片は、非標的物質の約９０％より高いパーセンテージへの結合を回避するが、より高いパーセンテージが明らかに考えられ、好ましい。例えば、本開示の結合物質、抗体または抗体断片は、非標的物質の約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、および約９９％またはそれより高いパーセンテージへの結合を回避する。他の実施形態では、本開示の結合物質、抗体または抗体断片は、非標的物質の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％より高いパーセンテージ、または約７５％より高いパーセンテージ、または約８０％より高いパーセンテージ、または約８５％より高いパーセンテージへの結合を回避する。
【０９１１】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドバリアント、変異体、ホモログ、または修飾バージョンは、参照ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドとの核酸またはアミノ酸配列同一性、例えば、約１０％配列同一性、約１５％配列同一性、約２０％配列同一性、約２５％配列同一性、約３０％配列同一性、約３５％配列同一性、約４０％配列同一性、約４５％配列同一性、約５０％配列同一性、約５５％配列同一性、約６０％配列同一性、約６５％配列同一性、約７０％配列同一性、約７５％配列同一性、約８０％配列同一性、約８５％配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％配列同一性、または約１００％配列同一性を共有する、タンパク質またはポリペプチドを含む。
【０９１２】
参照ポリヌクレオチド配列に対する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない、参照ポリヌクレオチド配列中の核酸残基と同一である候補配列中の核酸残基のパーセンテージと定義される。参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントおよび／または核酸配列パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。
【０９１３】
例えば、本明細書に開示されているＣｌｐＳタンパク質またはポリペプチドは、参照ＣｌｐＳタンパク質またはポリペプチド、例えば、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣｌｐＳ２（例えば、配列番号１９８）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣｌｐＳ（例えば、配列番号１９９）、および／またはＣ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣｌｐＳ（例えば、配列番号２００）と配列同一性を、約１０％配列同一性、約１５％配列同一性、約２０％配列同一性、約２５％配列同一性、約３０％配列同一性、約３５％配列同一性、約４０％配列同一性、約４５％配列同一性、約５０％配列同一性、約５５％配列同一性、約６０％配列同一性、約６５％配列同一性、約７０％配列同一性、約７５％配列同一性、約８０％配列同一性、約８５％配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％配列同一性、または約１００％配列同一性で共有する、バリアント、変異体、ホモログまたは修飾バージョンを含む。
【０９１４】
遊離アミノ基を有するペプチド鎖の一方の末端における末端アミノ酸は、本明細書では「Ｎ末端アミノ酸」（ＮＴＡＡ）と称される。遊離カルボキシル基を有する鎖の他方の末端における末端アミノ酸は、本明細書では「Ｃ末端アミノ酸」（ＣＴＡＡ）と称される。長さ「ｎ」のアミノ酸であるペプチドに関して、ペプチドを構成するアミノ酸に、順番に番号を付すことができる。本明細書で使用される場合、ＮＴＡＡは、ｎ番目のアミノ酸と考えられる（本明細書では「ｎ番目のＮＴＡＡ」とも称される）。この命名法を使用すると、Ｎ末端からＣ末端へとペプチドの長さを下って、次のアミノ酸は（ｎ−１）番目のアミノ酸、次いで（ｎ−２）番目のアミノ酸などとなる。ある特定の実施形態では、ＮＴＡＡ、ＣＴＡＡ、または両方は、化学的部分で修飾または標識されていることもある。
【０９１５】
本明細書で使用される場合、「バーコード」という用語は、巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド）、結合性物質、結合サイクルからの結合性物質のセット、試料巨大分子、試料のセット、コンパートメント（例えば、液滴、ビーズ、または分離された位置）内の巨大分子、コンパートメントのセット内の巨大分子、巨大分子の画分、巨大分子画分のセット、空間的領域または空間的領域のセット、巨大分子のライブラリー、または結合性物質のライブラリーについての一意の識別子タグまたは起源情報をもたらす約２〜約３０塩基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基）の核酸分子を指す。バーコードは、人工的な配列であっても天然に存在する配列であってもよい。ある特定の実施形態では、バーコードの集団内の各バーコードは異なるものである。他の実施形態では、バーコードの集団のバーコードの一部が異なる、例えば、バーコードの集団のバーコードの少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が異なる。バーコードの集団は、ランダムに生成することもでき、非ランダムに生成することもできる。ある特定の実施形態では、バーコードの集団は、エラー訂正バーコードである。バーコードは、多重化された配列決定データをコンピュータによりデコンボリューションし、個々の巨大分子、試料、ライブラリーなどに由来する配列読み取りを識別するために使用することができる。バーコードはまた、マッピングを増強するための小さなコンパートメント中に分布させた巨大分子の集合のデコンボリューションのために使用することもできる。例えば、ペプチドをプロテオームにマッピングし戻すのではなく、ペプチドをその起源であるタンパク質分子またはタンパク質複合体にマッピングし戻す。
【０９１６】
「試料バーコード」は、「試料タグ」とも称され、巨大分子がいずれの試料に由来するかを識別するものである。
【０９１７】
「空間バーコード」は、巨大分子が２Ｄまたは３Ｄ組織切片のいずれの領域に由来するかを識別するものである。空間バーコードは、組織切片に関する分子病理学のために使用することができる。空間バーコードにより、組織切片（複数可）由来の複数の試料またはライブラリーのマルチプレックス配列決定が可能になる。
【０９１８】
本明細書で使用される場合、「コーディングタグ」という用語は、それに付随する結合性物質に関する識別情報を含む任意の好適な長さを有するポリヌクレオチド、例えば、約２塩基〜約１００塩基の、２および１００ならびにその間のあらゆる整数を含む、核酸分子を指す。「コーディングタグ」はまた、「配列決定可能なポリマー」で作られたものであってよい（例えば、Niu et al., 2013, Nat. Chem. 5:282-292；Roy et al., 2015, Nat.Commun. 6:7237；Lutz, 2015, Macromolecules 48:4759-4767を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）。コーディングタグは、必要に応じて片側が１つのスペーサーと隣接しているまたは両側がスペーサーと隣接している、エンコーダー配列（例えば、バーコード識別子）を含んでいてもよい。コーディングタグはまた、必要に応じたＵＭＩおよび／または必要に応じた結合サイクル特異的バーコードで構成されていてもよい。コーディングタグは、一本鎖状であってもよく、または二本鎖状であってもよい。二本鎖コーディングタグは、平滑末端、突出末端、またはその両方を含んでいてもよい。コーディングタグは、結合性物質に直接付着しているコーディングタグを指すこともあり、結合性物質に直接付着しているコーディングタグとハイブリダイズした相補配列（例えば、二本鎖コーディングタグに関して）を指すこともあり、または伸長記録タグに存在するコーディングタグ情報を指すこともある。ある特定の実施形態では、コーディングタグは、結合サイクル特異的スペーサーもしくはバーコード、一意の分子識別子、ユニバーサルプライミング部位、またはそれらの任意の組合せをさらに含むこともある。
【０９１９】
本明細書で使用される場合、「エンコーダー配列」または「エンコーダーバーコード」という用語は、それが付随する結合性物質に関する識別情報をもたらす、約２塩基〜約３０塩基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基）の長さの核酸分子を指す。エンコーダー配列は、それが付随する結合性物質を一意的に識別することができるものである。ある特定の実施形態では、エンコーダー配列により、それが付随する結合性物質および結合性物質が使用される結合サイクルに関する識別情報がもたらされる。他の実施形態では、エンコーダー配列をコーディングタグ内の別の結合サイクル特異的バーコードと組み合わせる。あるいは、エンコーダー配列により、それに付随する結合性物質を２種またはそれよりも多くの異なる結合性物質のセットのメンバーに属するものと識別することができる。一部の実施形態では、解析のためにはこの識別のレベルで十分である。例えば、アミノ酸に結合する結合性物質を伴う一部の実施形態では、ペプチドの特定の位置におけるアミノ酸残基を決定的に識別するのではなく、ペプチドがその位置において２つの可能性のあるアミノ酸のうちの１つを含むことを知ることで十分であり得る。別の例では、タンパク質標的の１種よりも多くのエピトープを認識し、様々な特異性を有する抗体の混合物を含むポリクローナル抗体に共通のエンコーダー配列を使用する。他の実施形態では、エンコーダー配列により可能性のある結合性物質のセットを識別する場合、逐次的な脱コーディング手法を使用して、各結合性物質の一意の識別をもたらすことができる。これは、繰り返される結合のサイクルにおいて所与の結合性物質に対するエンコーダー配列を変動させるによって実現される（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、２００４年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１４巻：８７０〜７頁を参照されたい）。各結合サイクルからのコーディングタグ情報を部分的に識別することにより、他のサイクルからのコーディング情報と組み合わせると、結合性物質について一意の識別子がもたらされ、例えば、個々のコーディングタグ（またはエンコーダー配列）ではなく、コーディングタグの特定の組合せにより、結合性物質に関する一意的識別情報がもたらされる。例えば、結合性物質のライブラリー内のエンコーダー配列は同じまたは同様の数の塩基を有する。
【０９２０】
本明細書で使用される場合、「結合サイクル特異的タグ」、「結合サイクル特異的バーコード」、または「結合サイクル特異的配列」という用語は、特定の結合サイクル内で使用される結合性物質のライブラリーを識別するために使用される一意の配列を指す。結合サイクル特異的タグは、約２塩基〜約８塩基（例えば、２、３、４、５、６、７、または８塩基）の長さを含み得る。結合サイクル特異的タグは、結合性物質のコーディングタグ内に、スペーサー配列の一部として、エンコーダー配列の一部として、ＵＭＩの一部として、またはコーディングタグ内の別の成分として組み入れることができる。
【０９２１】
本明細書で使用される場合、「スペーサー」（Ｓｐ）という用語は、記録タグまたはコーディングタグの末端に存在する長さ約０塩基〜約２０塩基（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０塩基）の核酸分子を指す。スペーサーが０塩基である場合、アッセイは、例えば図７および図４６に示されているような、「無スペーサー」形式のアッセイと称されることもある。ある特定の実施形態では、スペーサー配列は、一方の末端または両方の末端がコーディングタグのエンコーダー配列に隣接している。結合性物質の巨大分子への結合後、それらにそれぞれ付随するコーディングタグおよび記録タグの相補的なスペーサー配列間のアニーリングにより、結合情報は、プライマー伸長反応またはライゲーションによって記録タグ、コーディングタグ、またはジタグ構築物に移行することができる。Ｓｐ’は、Ｓｐに相補的なスペーサー配列を指す。例えば、結合性物質のライブラリー内のスペーサー配列は、同数の塩基を有する。共通する（共有されるまたは同一の）スペーサーを結合性物質のライブラリーにおいて使用することができる。スペーサー配列は、特定の結合サイクルで使用される結合性物質を追跡するために、「サイクル特異的」配列を有していてもよい。スペーサー配列（Ｓｐ）は、全結合サイクルにわたって一定であることもあり、巨大分子の特定のクラスに特異的であることもあり、または結合サイクル数特異的であることもある。巨大分子クラス特異的スペーサーは、完了した結合／伸長サイクルからの伸長記録タグに存在する同類結合性物質のコーディングタグ情報の、後続の結合サイクルにおける巨大分子の同じクラスを認識する別の結合性物質のコーディングタグへの、クラス特異的スペーサーを介したアニーリングを可能にする。正確な同類の対の逐次的な結合によってのみ、相互作用するスペーサーエレメントおよび有効なプライマー伸長がもたらされる。スペーサー配列は、記録タグ内の相補的なスペーサー配列とアニーリングしてプライマー伸長（ポリメラーゼ伸長とも称される）反応を開始させるのに十分な数の塩基を含むこともあり、またはライゲーション反応のための「副子」を提供するのに十分な数の塩基を含むこともあり、または「粘着末端」ライゲーション反応を媒介するのに十分な数の塩基を含むこともある。スペーサー配列は、コーディングタグ内のエンコーダー配列よりも少ない数の塩基を含むこともある。
【０９２２】
本明細書で使用される場合、「記録タグ」という用語は、部分、例えば、化学カップリング部分、核酸部分、または配列決定可能なポリマー部分（例えば、Niu et al., 2013, Nat. Chem. 5:282-292；Roy et al., 2015, Nat.Commun. 6:7237；Lutz, 2015, Macromolecules 48:4759-4767を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）であって、そこにコーディングタグの識別情報を移行することができる部分、またはそこから記録タグが付随する巨大分子に関する識別情報（例えば、ＵＭＩ情報）をコーディングタグに移行させることができる部分を指す。識別情報は、分子を特徴付ける任意の情報、例えば、試料、画分、分配、空間位置、相互作用する近隣の分子、サイクル数などに関する情報を含むことができる。さらに、ＵＭＩ情報の存在を識別情報として分類することもできる。ある特定の実施形態では、結合性物質がポリペプチドに結合した後、結合性物質に連結されているコーディングタグからの情報を、結合性物質がポリペプチドに結合されている間にポリペプチドに付随する記録タグに移行させることができる。他の実施形態では、結合性物質がポリペプチドに結合した後、ポリペプチドに付随する記録タグからの情報を、結合性物質がポリペプチドに結合されている間に、結合性物質に連結されているコーディングタグに移行させることができる。再コーディングタグは、ポリペプチドに直接連結されていてもよく、ポリペプチドに多機能性リンカーを介して連結されていてもよく、または固体支持体上でのその近接（または共局在）によってポリペプチドに付随していてもよい。記録タグは、その５’末端もしくは３’末端を介して連結されていてもよく、またはその内部の部位に連結されていてもよいが、ただし、その連結が、コーディングタグ情報を記録タグに移行させるために使用される方法または逆に記録タグの情報をコーディングタグに移行させるために使用される方法に適合することを条件とする。記録タグは、他の機能的成分、例えば、ユニバーサルプライミング部位、一意の分子識別子、バーコード（例えば、試料バーコード、画分バーコード、空間バーコード、コンパートメントタグなど）、コーディングタグのスペーサー配列と相補的であるスペーサー配列、またはそれらの任意の組合せをさらに含んでいてもよい。記録タグのスペーサー配列は、コーディングタグ情報を記録タグに移行させるためにポリメラーゼ伸長が使用される実施形態では、記録タグの３’末端にあるのが好ましい。
【０９２３】
本明細書で使用される場合、「プライマー伸長」という用語は「ポリメラーゼ伸長」とも称され、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって触媒される反応であって、相補鎖とアニーリングする核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー、スペーサー配列）を、相補鎖を鋳型として使用してポリメラーゼによって伸長させる反応を指す。
【０９２４】
本明細書で使用される場合、「一意の分子識別子」または「ＵＭＩ」という用語は、ＵＭＩが連結された各巨大分子（例えば、ペプチド）または結合性物質についての一意の識別子タグをもたらす、約３〜約４０塩基（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０塩基の長さの核酸分子を指す。巨大分子ＵＭＩは、複数の伸長記録タグからの配列決定データをコンピュータによりデコンボリューションして個々の巨大分子を起源とする伸長記録タグを識別するために使用することができる。結合性物質ＵＭＩは、特定の巨大分子に結合する個々の結合性物質それぞれを識別するために使用することができる。例えば、ＵＭＩを使用して、特定のペプチド分子に存在する単一のアミノ酸に特異的な結合性物質についての個々の結合事象の数を識別することができる。結合性物質または巨大分子に関してＵＭＩおよびバーコードの両方に言及される場合、バーコードは、個々の結合性物質または巨大分子についてのＵＭＩ以外の識別情報（例えば、試料バーコード、コンパートメントバーコード、結合サイクルバーコード）を指すことが理解される。
【０９２５】
本明細書で使用される場合、「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」または「ユニバーサルプライミング配列」という用語は、ライブラリー増幅のためおよび／または配列決定反応のために使用することができる核酸分子を指す。ユニバーサルプライミング部位としては、これだけに限定されないが、ＰＣＲ増幅のためのプライミング部位（プライマー配列）、一部の次世代シーケンシングプラットフォームにおいてブリッジ増幅を可能にする、フローセル表面上の相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングするフローセルアダプター配列、配列決定プライミング部位、またはこれらの組合せを挙げることができる。ユニバーサルプライミング部位は、次世代デジタルシーケンシングと併せて一般に使用されるものを含めた他の型の増幅のために使用することができる。例えば、伸長記録タグ分子を環状化し、ローリングサークル増幅にユニバーサルプライミング部位を使用して、配列決定鋳型として使用することができるＤＮＡナノボールを形成することができる（Ｄｒｍａｎａｃら、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７巻：７８〜８１頁）。あるいは、記録タグ分子を環状化し、ユニバーサルプライミング部位からのポリメラーゼ伸長によって直接配列決定することができる（Ｋｏｒｌａｃｈら、２００８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、１０５巻：１１７６〜１１８１頁）。「フォワード」という用語は、「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」に関連して使用される場合、「５’」または「センス」と称される場合もある。「リバース」という用語は、ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」に関連して使用される場合は、「３’」または「アンチセンス」と称される場合もある。
【０９２６】
本明細書で使用される場合、「伸長記録タグ」という用語は、結合性物質が分析物、例えば巨大分子、に結合した後に少なくとも１つの結合性物質のコーディングタグ（またはその相補配列）の情報が移行された記録タグを指す。コーディングタグの情報は、記録タグに直接移行されること（例えば、ライゲーション）もあり、または間接的に移行されること（例えば、プライマー伸長）もある。コーディングタグの情報は、記録タグに酵素的に移行されることもあり、または化学的に移行されることもある。伸長記録タグは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００またはそれよりも多くのコーディングタグの結合性物質情報を含むことができる。伸長記録タグの塩基配列は、コーディングタグによって識別される結合性物質の結合の時間的および逐次的順序を反映することもあり、コーディングタグによって識別される結合性物質の結合の部分的な逐次的順序を反映することもあり、またはコーディングタグによって識別される結合性物質の結合のいかなる順序も反映しないこともある。ある特定の実施形態では、伸長記録タグ中に存在するコーディングタグ情報は、解析される巨大分子配列を少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性で表す。伸長記録タグが、解析される巨大分子配列を１００％の同一性で表さない、ある特定の実施形態では、エラーは、結合性物質によるオフターゲットの結合に起因することもあり、または「飛ばされた」結合サイクル（例えば、結合サイクル中に結合性物質が巨大分子に結合できないことが原因で、プライマー伸長反応の不成功が原因で）に起因することもあり、またはその両方に起因することもある。
【０９２７】
本明細書で使用される場合、「伸長コーディングタグ」という用語は、コーディングタグが接合している結合性物質の、記録タグが付随している巨大分子への結合後に少なくとも１つの記録タグ（またはその相補配列）の情報が移行されたコーディングタグを指す。記録タグの情報は、コーディングタグに直接移行させることもでき（例えば、ライゲーション）、間接的に移行させることもできる（例えば、プライマー伸長）。記録タグの情報は、酵素的に移行させることもでき、化学的に移行させることもできる。ある特定の実施形態では、伸長コーディングタグは、１つの結合事象を反映する１つの記録タグの情報を含む。本明細書で使用される場合、「ジタグ」または「ジタグ構築物」または「ジタグ分子」という用語は、コーディングタグが接合している結合性物質の、記録タグが付随する巨大分子への結合後に少なくとも１つの記録タグ（またはその相補配列）の情報および少なくとも１つのコーディングタグ（またはその相補配列）が移行された核酸分子を指す（例えば図１１Ｂを参照されたい）。記録タグの情報およびコーディングタグは、ジタグに間接的に移行させることができる（例えば、プライマー伸長）。記録タグの情報は、酵素的に移行させることもでき、化学的に移行させることもできる。ある特定の実施形態では、ジタグは、記録タグのＵＭＩ、記録タグのコンパートメントタグ、記録タグのユニバーサルプライミング部位、コーディングタグのＵＭＩ、コーディングタグのエンコーダー配列、結合サイクル特異的バーコード、コーディングタグのユニバーサルプライミング部位、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０９２８】
本明細書で使用される場合、「固体支持体」、「固体表面」、または「固体基板」または「基板」という用語は、共有結合性相互作用および非共有結合性相互作用またはそれらの任意の組合せを含む当技術分野において公知の任意の手段によって巨大分子（例えば、ペプチド）と直接または間接的に会合することができる、多孔質材料および非多孔質材料を含む任意の固体材料を指す。固体支持体は、２次元（例えば、平面）であってもよく、または３次元（例えば、ゲルマトリックスもしくはビーズ）であってもよい。固体支持体は、これだけに限定されないが、ビーズ、マイクロビーズ、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、フローセル、信号変換電子機器を含むバイオチップ、チャネル、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ポリマーマトリックス、ナノ粒子、またはマイクロスフェアを含む、任意の支持体表面であってよい。固体支持体用の材料としては、これだけに限定されないが、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、石英、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸（polyactic acid）、ポリオルトエステル、官能化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリアミノ酸、デキストラン、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。固体支持体は、薄膜、膜、ビン、ディッシュ、繊維、織られた繊維、チューブなどの成形ポリマー、粒子、ビーズ、マイクロスフェア、微小粒子、またはそれらの任意の組合せをさらに含む。例えば、固体表面がビーズである場合、ビーズは、これだけに限定されないが、セラミックビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、メチルスチレンビーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズを含み得る。ビーズは、球状であってもよく、または不規則な形状であってもよい。ビーズのサイズは、ナノメートル、例えば１００ｎｍから、ミリメートル、例えば１ｍｍまでにわたり得る。ある特定の実施形態では、ビーズのサイズは、約０．２ミクロンから約２００ミクロンまで、または約０．５ミクロンから約５ミクロンまでにわたる。一部の実施形態では、ビーズは、直径約１、１．５、２、２．５、２．８、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１５または２０μｍであり得る。ある特定の実施形態では、「ビーズ」固体支持体は、個々のビーズを指すこともあり、または複数のビーズを指すこともある。本明細書で使用される場合、「基板」という用語は、機械的機能性か、生物学的機能性か、光学的機能性か、化学的機能性か、他の機能性かを問わず、機能性を提供するように材料をその上に配置することができ��、機械的支持体を含む。基板は、パターン形成されていないこともあり、またはパターン形成されていることもあり、仕切られていることもあり、または仕切られていないこともある。基板上の分子は、特徴部内に配置されることもあり、または基板表面に均一に配置されることもある。
【０９２９】
本明細書で使用される場合、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、３’−５’リン酸ジエステル結合で連結されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有する一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチド類似体を指す。核酸分子としては、これだけに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡが挙げられる。ポリヌクレオチド類似体は、天然のポリヌクレオチドにおいて見出される標準のリン酸ジエステル連結以外の骨格、および任意選択で、修飾された糖部分またはリボースもしくはデオキシリボース以外の部分を有し得る。ポリヌクレオチド類似体は、標準のポリヌクレオチド塩基とワトソン・クリック塩基対合によって水素結合することが可能な塩基を含有し、ここで、類似体骨格は、当該塩基を、そのような水素結合がオリゴヌクレオチド類似体分子と標準のポリヌクレオチド内の塩基との間で配列特異的に可能になるように提示する。ポリヌクレオチド類似体の例としては、これだけに限定されないが、異種核酸（ｘｅｎｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＸＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、γＰＮＡ、モルホリノポリヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルリボシル置換ポリヌクレオチド、ホスホロチオエートポリヌクレオチド、およびボロノホスフェートポリヌクレオチドが挙げられる。ポリヌクレオチド類似体は、例えば、７−デアザプリン類似体、８−ハロプリン類似体、５−ハロピリミジン類似体、または、ヒポキサンチン、ニトロアゾール、イソカルボスチリル類似体、アゾールカルボキサミド、および芳香族トリアゾール類似体を含めた、任意の塩基と対合することができるユニバーサル塩基類似体、または、親和性結合のためのビオチン部分などの追加的な機能性を有する塩基類似体を含めたプリンまたはピリミジン類似体を有し得る。
【０９３０】
本明細書で使用される場合、「核酸配列決定」とは、核酸分子内または核酸分子の試料中のヌクレオチドの順序を決定することを意味する。
【０９３１】
本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング」は、数百万〜数十億の分子を並行して配列決定することを可能にするハイスループットな配列決定法を指す。次世代シーケンシング法の例としては、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、およびパイロシーケンシングが挙げられる。プライマーを固体基板および核酸分子に対する相補配列に付着させることにより、核酸分子を固体基板にプライマーを介してハイブリダイズさせることができ、次いで、固体基板上の別個の領域においてポリメラーゼを使用することによって多数のコピーを生成させて、増幅させることができる（これらの群分けは、時にはポリメラーゼコロニーまたはポロニーと称される）。したがって、配列決定プロセス中、特定の位置にあるヌクレオチドについて多数回配列決定することができる（例えば、数百回または数千回）−このカバレッジの深さは、「ディープシーケンシング」と称される。ハイスループットな核酸配列決定技術の例としては、Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１１巻：１５４４〜１５４６頁、２００６年）によって概説されている通り、並行ビーズアレイ、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、キャピラリー電気泳動、電子マイクロチップ、「バイオチップ」、マイクロアレイ、並行マイクロチップ、および単一分子アレイなどの形式を含めた、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＢＧＩ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、およびＲｏｃｈｅにより提供されるプラットフォームが挙げられる。
【０９３２】
本明細書で使用される場合、「単一分子シーケンシング」または「第３世代シーケンシング」とは、単一分子シーケンシング装置からの読み取りがＤＮＡの単一分子の配列決定によって生成される次世代シーケンシング法を指す。段階的な手法で配列決定するために増幅に依拠して多くのＤＮＡ分子を並行してクローニングする次世代シーケンシング法とは異なり、単一分子シーケンシングでは、ＤＮＡの単一分子を調査し、増幅または同期化の必要はない。単一分子シーケンシングは、各塩基の組み入れ後に配列決定反応を休止する（「ｗａｓｈ−ａｎｄ−ｓｃａｎ」サイクル）必要のある方法、および読み取りステップ間の停止を必要としない方法を含む。単一分子シーケンシング法の例としては、単一分子リアルタイムシーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ナノポアに基づく配列決定（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ）、ＤＩ（ｄｕｐｌｅｘ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）ナノポアシーケンシング、および先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングが挙げられる。
【０９３３】
本明細書で使用される場合、分析物、例えば、巨大分子の「解析」とは、分析物または巨大分子の成分の全部または一部を定量化すること、特徴付けること、区別すること、またはこれらの組合せを意味する。例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の解析は、ペプチドのアミノ酸配列（連続したまたは連続していない）の全部または一部を決定することを含む。巨大分子の解析は、巨大分子の成分の部分的な識別も含む。例えば、巨大分子タンパク質配列内のアミノ酸の部分的な識別により、タンパク質のアミノ酸を、可能性のあるアミノ酸のサブセットに属するものとして識別することができる。解析は、一般には、ｎ番目のＮＴＡＡの解析で開始され、次いで、ペプチドの次のアミノ酸（すなわち、ｎ−１、ｎ−２、ｎ−３など）へと進行する。これは、ｎ番目のＮＴＡＡが切断され、それにより、ペプチドの（ｎ−１）番目のアミノ酸がＮ末端アミノ酸（本明細書では、「（ｎ−１）番目のＮＴＡＡ」と称される）に変わることによって実現される。ペプチドの解析はまた、ペプチド上の翻訳後修飾の存在および頻度を決定することを含むことがあり、これは、ペプチド上の翻訳後修飾の逐次的順序に関する情報を含むこともあり、含まないこともある。ペプチドの解析はまた、ペプチド内のエピトープの存在および頻度を決定することを含むことがあり、これは、ペプチド内のエピトープの逐次的順序または位置に関する情報を含むこともあり、含まないこともある。ペプチドの解析は、異なる型の解析を組み合わせること、例えば、エピトープ情報、アミノ酸配列情報、翻訳後修飾情報、またはそれらの任意の組合せを得ることを含むこともある。
【０９３４】
本明細書で使用される場合、「コンパートメント」という用語は、巨大分子のサブセットを巨大分子の試料から分離または隔離する物理的な領域または容積を指す。例えば、コンパートメントにより、個々の細胞を他の細胞から分離すること、または試料のプロテオームのサブセットを試料の残りのプロテオームから分離することができる。コンパートメントは、水性コンパートメント（例えば、マイクロ流体液滴）、固体コンパートメント（例えば、プレート上のピコタイターウェルまたはマイクロタイターウェル、チューブ、バイアル、ゲルビーズ）、または表面上の分離された領域であってよい。コンパートメントは、巨大分子を固定化することができる１つまたは複数のビーズを含んでよい。
【０９３５】
本明細書で使用される場合、「コンパートメントタグ」または「コンパートメントバーコード」という用語は、１つまたは複数のコンパートメント（例えば、マイクロ流体液滴）内の、構成物（例えば、単一の細胞のプロテオーム）に関する識別情報を含む、約４塩基〜約１００塩基（４塩基、１００塩基、およびその間の任意の整数を含む）の一本鎖または二本鎖核酸分子を指す。コンパートメントバーコードにより、試料中の巨大分子のサブセット、例えば、複数（例えば、数百万〜数十億）のコンパートメントから同じ物理的コンパートメントまたはコンパートメントの群に分離されたタンパク質試料のサブセットが識別される。したがって、コンパートメントタグを使用して、同じコンパートメントタグを有する１つまたは複数のコンパートメントに由来する構成物と、異なるコンパートメントタグを有する別のコンパートメント内の構成物を、これらの構成物が一緒にプールされた後であっても区別することができる。各コンパートメント内または２つもしくはそれよりも多くのコンパートメントの群内のタンパク質および／またはペプチドを一意のコンパートメントタグで標識することにより、個々のコンパートメントまたはコンパートメントの群内の同じタンパク質、タンパク質複合体、または細胞に由来するペプチドを識別することができる。コンパートメントタグは、任意選択で片側またはその両側にスペーサー配列が隣接するバーコード、および任意選択のユニバーサルプライマーを含む。スペーサー配列は、記録タグのスペーサー配列に相補的なものであってよく、それにより、コンパートメントタグ情報の記録タグへの移行が可能になる。コンパートメントタグは、特に、コンパートメントタグが、本明細書に記載の下流のペプチド解析方法に使用される記録タグを含む実施形態に関しては、ユニバーサルプライミング部位、一意の分子識別子（それに付着したペプチドに関する識別情報をもたらす）、またはその両方も含んでよい。コンパートメントタグは、ペプチドとのカップリングのための機能的部分（例えば、アルデヒド、ＮＨＳ、ｍＴｅｔ、アルキンなど）を含んでよい。あるいは、コンパートメントタグは、コンパートメントタグと目的のペプチドのライゲーションを可能にするためのタンパク質リガーゼの認識配列を含むペプチドを含んでよい。コンパートメントは、単一のコンパートメントタグ、任意選択のＵＭＩ配列を保存する複数の同一のコンパートメントタグ、または２種またはそれよりも多くの異なるコンパートメントタグを含んでよい。ある特定の実施形態では、各コンパートメントは、一意のコンパートメントタグを含む（１対１のマッピング）。他の実施形態では、より大きなコンパートメントの集団からの多数のコンパートメントは、同じコンパートメントタグを含む（多対１のマッピング）。コンパートメントタグは、コンパートメント内の固体支持体（例えば、ビーズ）に接合していてもよく、コンパートメント自体の表面（例えば、ピコタイターウェルの表面）に接合していてもよい。あるいは、コンパートメントタグは、コンパートメント内の溶液中に遊離していてよい。
【０９３６】
本明細書で使用される場合、「分配」という用語は、試料内の巨大分子の集団に由来する巨大分子の亜集団への一意のバーコードのランダムな割り当てを指す。ある特定の実施形態では、分配は、巨大分子をコンパートメントに区分することによって実現することができる。分配は、単一のコンパートメント内の巨大分子で構成されるものであってもよく、コンパートメントの集団に由来する多数のコンパートメント内の巨大分子で構成されるものであってもよい。
【０９３７】
本明細書で使用される場合、「分配タグ」または「分配バーコード」とは、分配に関する識別情報を含む、約４塩基〜約１００塩基（４塩基、１００塩基、およびその間の任意の整数を含む）の一本鎖または二本鎖核酸分子を指す。ある特定の実施形態では、巨大分子に関する分配タグは、巨大分子を同じバーコードで標識されたコンパートメント（複数可）に分配することにより生じる同一のコンパートメントタグを指す。
【０９３８】
本明細書で使用される場合、「画分」という用語は、サイズ、疎水性、等電点、親和性などによる分画などの物理的または化学的分離方法を使用して残りの試料または細胞小器官から選別された試料内の巨大分子のサブセット（例えば、タンパク質）を指す。分離方法としては、ＨＰＬＣ分離、ゲル分離、アフィニティー分離、細胞分画、細胞小器官分画、組織分画などが挙げられる。流体の流れ、磁性、電流、質量、密度などの物理特性も分離のために使用することができる。
【０９３９】
本明細書で使用される場合、「画分バーコード」という用語は、画分内の巨大分子に関する識別情報を含む、約４塩基〜約１００塩基（４塩基、１００塩基、およびその間の任意の整数を含む）の一本鎖または二本鎖核酸分子を指す。
【０９４０】
本明細書で使用される場合、本明細書での「多重化」または「マルチプレックスアッセイ」という用語は、少なくとも１つの異なる検出特性、例えば、蛍光特性（例えば、励起波長、発光波長、発光強度、ＦＷＨＭ（半値全幅のピーク高さ）もしくは蛍光寿命）または一意の核酸もしくはタンパク質配列特性を各々が有する１つより多くの捕捉用プローブコンジュゲートを使用することにより、複数の標的、例えば複数の核酸配列、の存在および／または量を同時にアッセイすることができる、アッセイまたは他の解析方法を含み得る。
ＩＩＩ．巨大分子を含む分析物を解析するためのキット
Ａ．製造物品およびキットの概観
【０９４１】
本明細書に記載されるキットおよびキット成分は、分析物、例えば巨大分子、を解析するための高度に並行化された手法をもたらす。高度に多重化された分析物巨大分子結合アッセイは、次世代シーケンシングによる読み取りのために核酸分子ライブラリーに変換される。本明細書において提示されるキットおよびキット成分は、タンパク質またはペプチド配列決定に特に有用である。
【０９４２】
好ましい実施形態では、タンパク質試料を、バーコード（例えば、試料バーコード、コンパートメントバーコード）および任意選択の一意の分子識別子を含む少なくとも１つの核酸記録タグを用いて単一分子レベルで標識する。タンパク質試料にタンパク質分解による消化を行って記録タグで標識されたペプチドの集団（例えば、数百万〜数十億）を生成する。これらの記録タグで標識されたペプチドをプールし、固体支持体（例えば、多孔質ビーズ）上にランダムに固定化する。プールされ、固定化された、記録タグで標識されたペプチドを多数の連続的な結合サイクルに供し、各結合サイクルは、付随する結合性物質を識別するエンコーダー配列を含むコーディングタグで標識された複数の結合性物質（例えば、天然に存在するアミノ酸２０種全てに対する結合性物質）に曝露することを含む。各結合サイクル中、結合性物質のペプチドへの結合に関する情報を、結合性物質のコーディングタグ情報を記録タグに移行させること（または記録タグ情報をコーディングタグに移行させることもしくは記録タグ情報およびコーディングタグ情報の両方を別のジタグ構築物に移行させること）によって捕捉する。結合サイクルが完了したら、アッセイされたペプチドの結合履歴を表す伸長記録タグ（または伸長コーディングタグまたはジタグ構築物）のライブラリーを生成し、これを、非常にハイスループットの次世代デジタルシーケンシング法を使用して解析することができる。記録タグに核酸バーコードを使用することにより、例えば、ペプチド配列の起源である試料、細胞、プロテオームのサブセット、またはタンパク質を識別するために、大量のペプチド配列決定データをデコンボリューションすることが可能になる。
【０９４３】
一態様では、巨大分子を解析するための方法において使用するためのキットおよびキット成分であって、前記方法が、（ａ）固体支持体に接合した大分子および付随するまたは共局在する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記巨大分子を、前記巨大分子に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、一次伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）前記巨大分子を、前記巨大分子に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｅ）前記第２のコーディングタグの情報を前記一次伸長記録タグに移行させて、二次伸長記録タグを生成するステップと；（ｆ）前記二次伸長タグを解析するステップとを含む（例えば、図２Ａ〜Ｄを参照されたい）、キットおよびキット成分が、本明細書で提示される。
【０９４４】
ある特定の実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を逐次的に実施する、例えば、第１の結合性物質と第２の結合性物質を、別々の結合サイクル反応で巨大分子と接触させる。他の実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を同時に、例えば、第１の結合性物質、第２の結合性物質、および任意選択で追加的な結合性物質を含む単一の結合サイクル反応などで実施する。好ましい実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）は、それぞれ、巨大分子を複数の結合性物質と接触させることを含む。キット成分は、これらのステップを実施するために提供される。
【０９４５】
ある特定の実施形態では、方法は、ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、（ｘ）第２の結合性物質を巨大分子に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、前記第３の（またはより高次の）結合性物質が、第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む、ステップと；（ｙ）第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を第２の（またはより高次の）伸長記録タグに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップと；（ｚ）第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析するステップとをさらに含む。キット成分は、これらのステップを実施するために提供される。
【０９４６】
第３の（またはより高次の）結合性物質を、第１の結合性物質および第２の結合性物質とは別の結合サイクル反応で巨大分子と接触させることができる。一実施形態では、第ｎの結合性物質を第ｎの結合サイクルで分析物（例えば、巨大分子）と接触させ、情報を、第ｎのコーディングタグ（第ｎの結合性物質の）から第（ｎ−１）の結合サイクルにおいて形成された伸長記録タグに移行させて、さらなる伸長記録タグ（第ｎの伸長記録タグ）を形成し、ここでのｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または約５０、約１００、約１５０、約２００、またはそれより大きい整数である。同様に、第（ｎ＋１）の結合性物質を第（ｎ＋１）の結合サイクルで分析物と接触させる、等々。
【０９４７】
あるいは、第３の（またはより高次の）結合性物質を第１の結合性物質および第２の結合性物質と一緒に単一の結合サイクル反応で巨大分子と接触させることができる。この場合、結合サイクル特異的コーディングタグなどの結合サイクル特異的配列を使用することができる。例えば、コーディングタグは、結合サイクル特異的スペーサー配列を含むことができ、したがって、情報が第ｎのコーディングタグから第（ｎ−１）の伸長記録タグに移行されて第ｎの伸長記録タグが形成された後のみに、第（ｎ＋１）の結合性物質（これは、分析物に既に結合していることもあり、していないこともある）は、第（ｎ＋１）の結合性タグの情報を第ｎの伸長記録タグに移行させることができることになる。
【０９４８】
第２の態様では、（ａ）固体支持体に接合した巨大分子、付随する第１の記録タグおよび付随する第２の記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記巨大分子を、前記巨大分子に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）前記第１のコーディングタグの情報を前記第１の記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）前記巨大分子を、前記巨大分子に結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｅ）前記第２のコーディングタグの情報を前記第２の記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグ生成するステップと；（ｆ）前記第１および第２の伸長記録タグを解析するステップとを含む方法において使用するためのキットおよびキット成分が、本明細書で提示される。
【０９４９】
ある特定の実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を逐次的に実施する、例えば、第１の結合性物質および第２の結合性物質を別々の結合サイクル反応で巨大分子と接触させる。他の実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｄ）を同時に、例えば、第１の結合性物質、第２の結合性物質、および任意選択で追加的な結合性物質を含む単一の結合サイクル反応などで実施する。キット成分は、これらのステップを実施するために提供される。
【０９５０】
ある特定の実施形態では、ステップ（ａ）は、固体支持体に接合した付随する第３の（またはより高次の）記録タグを提供するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、方法は、ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、（ｘ）第２の結合性物質を巨大分子に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）および（ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、前記第３の（またはより高次の）結合性物質が、第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む、ステップと；（ｙ）第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を第３の（またはより高次の）記録タグに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップと；（ｚ）第１の伸長記録タグ、第２の伸長記録タグおよび第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析するステップとをさらに含む。キット成分は、これらのステップを実施するために提供される。
【０９５１】
第３の（またはより高次の）結合性物質を第１の結合性物質および第２の結合性物質とは別の結合サイクル反応で巨大分子と接触させることができる。あるいは、第３の（またはより高次の）結合性物質を第１の結合性物質、および第２の結合性物質と一緒に単一の結合サイクル反応で巨大分子と接触させることができる。
【０９５２】
キットについてのある特定の実施形態では、第１のコーディングタグ、第２のコーディングタグ、および任意のより高次のコーディングタグは、各々、結合サイクル特異的配列を有する。
【０９５３】
第３の態様では、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学的部分で修飾して修飾ＮＴＡＡを産生するステップと；（ｃ）前記ペプチドを、前記修飾ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｄ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、伸長記録タグを生成するステップと；（ｅ）前記伸長記録タグを解析するステップとを含む方法（例えば、図３を参照されたい）において使用するためのキットおよびキット成分が、本明細書で提示される。
【０９５４】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｃ）が、前記ペプチドを、前記第２の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第２の（またはより高次の）コーディングタグを含む第２の（またはより高次の）結合性物質と接触させるであって、前記第２の（またはより高次の）結合性物質が、ステップ（ｂ）の前記修飾されたＮＴＡＡ以外の修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能である、ステップをさらに含む。さらなる実施形態では、ペプチドの第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、ペプチドの第１の結合性物質との接触後に逐次的に行う、例えば、第１の結合性物質および第２の（またはより高次の）結合性物質を別々の結合サイクル反応でペプチドと接触させる。他の実施形態では、ペプチドの第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、ペプチドの第１の結合性物質との接触と同時に、例えば、第１の結合性物質および第２の（またはより高次の）結合性物質）を含む単一の結合サイクル反応などで行う。キット成分は、これらのステップを実施するために提供される。
【０９５５】
ある特定の実施形態では、化学的部分を化学反応または酵素的反応によってＮＴＡＡに付加させる。
【０９５６】
ある特定の実施形態では、ＮＴＡＡを修飾するために使用される化学的部分は、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）部分；スルホニルオキシニトロフェニル（ＳＮＰ）部分、ダンシル部分；７−メトキシクマリン部分；チオアシル部分；チオアセチル部分；アセチル部分；グアニジニル部分；またはチオベンジル部分である。
【０９５７】
化学的部分は、化学薬剤を使用してＮＴＡＡに付加させることができる。ある特定の実施形態では、ＮＴＡＡをＰＴＣ部分で修飾するための化学薬剤は、フェニルイソチオシアネートまたはその誘導体であり；ＮＴＡＡをＤＮＰ部分で修飾するための化学薬剤は、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）、またはハロゲン化アリール、例えば１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＦＢ）であり；ＮＴＡＡをスルホニルオキシニトロフェニル（ＳＮＰ）部分で修飾するための化学薬剤は、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）であり；ＮＴＡＡをダンシル基で修飾するための化学薬剤は、ダンシルクロリドなどのスルホニルクロリドであり；ＮＴＡＡを７−メトキシクマリン部分で修飾するための化学薬剤は、７−メトキシクマリン酢酸（ＭＣＡ）であり；ＮＴＡＡをチオアシル部分で修飾するための化学薬剤は、チオアシル化試薬であり；ＮＴＡＡをチオアセチル部分で修飾するための化学薬剤は、チオアセチル化試薬であり；ＮＴＡＡをアセチル部分で修飾するための化学薬剤は、アセチル化試薬（例えば、無水酢酸）であり；ＮＴＡＡをグアニジニル（アミジニル）部分で修飾するための化学薬剤は、グアニジニル化試薬であり、またはＮＴＡＡをチオベンジル部分で修飾するための化学薬剤は、チオベンジル化試薬である。これらの化学的部分および化学試薬のいずれかが、本明細書に開示されているキットの成分として提供され得る。
【０９５８】
第４の態様では、本開示は、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を化学的部分で修飾して修飾ＮＴＡＡを産生するステップと；（ｃ）前記ペプチドを、前記修飾ＮＴＡＡに結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｄ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；（ｅ）前記修飾ＮＴＡＡを除去して新しいＮＴＡＡを露出させるステップと；（ｆ）前記ペプチドの新しいＮＴＡＡを化学的部分で修飾して新しく修飾されたＮＴＡＡを産生するステップと；（ｇ）前記ペプチドを、前記新しく修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｈ）前記第２のコーディングタグの情報を前記第１の伸長記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグを生成するステップと；（ｉ）前記第２の伸長記録タグを解析するステップとを含む方法において使用するためのキットおよびキット成分を提供する。
【０９５９】
ある特定の実施形態では、接触させるステップ（ｃ）および（ｇ）を逐次的に実施する、例えば、第１の結合性物質および第２の結合性物質を別々の結合サイクル反応でペプチドと接触させる。キット成分は、これらのステップを実施するために提供される。
【０９６０】
ある特定の実施形態では、方法は、ステップ（ｈ）と（ｉ）の間に、（ｘ）第２の結合性物質を修飾されたＮＴＡＡに結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）を１回または複数回繰り返すステップであって、前記第３の（またはより高次の）結合性物質が、第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む、ステップと；（ｙ）第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を第２の（またはより高次の）伸長記録タグに移行させて、第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップと；（ｚ）第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析するステップとをさらに含む。キット成分は、これらのステップを実施するために提供される。
【０９６１】
ある特定の実施形態では、化学的部分を化学反応または酵素的反応によってＮＴＡＡに付加させる。
【０９６２】
ある特定の実施形態では、化学的部分は、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）部分；スルホニルオキシニトロフェニル（ＳＮＰ）部分、ダンシル部分；７−メトキシクマリン部分；チオアシル部分；チオアセチル部分；アセチル部分；グアニル部分；またはチオベンジル部分である。
【０９６３】
化学的部分は、化学薬剤を使用してＮＴＡＡに付加することができる。ある特定の実施形態では、ＮＴＡＡをＰＴＣ部分で修飾するための化学薬剤は、フェニルイソチオシアネートまたはその誘導体である；ＮＴＡＡをＤＮＰ部分で修飾するための化学薬剤は、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）または１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＦＢ）などのハロゲン化アリールである；ＮＴＡＡをスルホニルオキシニトロフェニル（ＳＮＰ）部分で修飾するための化学薬剤は、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）である；ＮＴＡＡをダンシル基で修飾するための化学薬剤は、ダンシルクロリドなどのスルホニルクロリドである；ＮＴＡＡを７−メトキシクマリン部分で修飾するための化学試薬は、７−メトキシクマリン酢酸（ＭＣＡ）である；ＮＴＡＡをチオアシル部分で修飾するための化学薬剤は、チオアシル化試薬である；ＮＴＡＡをチオアセチル部分で修飾するための化学薬剤は、チオアセチル化試薬である；ＮＴＡＡをアセチル部分で修飾するための化学薬剤は、アセチル化剤（例えば、無水酢酸）である；ＮＴＡＡをグアニル部分で修飾するための化学薬剤は、グアニジニル化試薬である、またはＮＴＡＡをチオベンジル部分で修飾するための化学薬剤は、チオベンジル化試薬である。これらの化学的部分および化学薬剤のいずれかが、本明細書に開示されているキットの成分として提供され得る。
【０９６４】
第５の態様では、ポリペプチドを解析するための方法において使用するためのキットおよびキット成分であって、前記方法が、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記ペプチドを、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）前記伸長記録タグを解析するステップとを含む、キットおよびキット成分が提供される。
【０９６５】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）が、前記ペプチドを、前記第２の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第２の（またはより高次の）コーディングタグを含む第２の（またはより高次の）結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の（またはより高次の）結合性物質が、前記ペプチドの前記ＮＴＡＡ以外のＮＴＡＡに結合することが可能である、ステップをさらに含む。さらなる実施形態では、ペプチドの第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、ペプチドの第１の結合性物質との接触後に逐次的に行う、例えば、第１の結合性物質および第２の（またはより高次の）結合性物質を別々の結合サイクル反応でペプチドと接触させる。他の実施形態では、ペプチドの第２の（またはより高次の）結合性物質との接触を、ペプチドを第１の結合性物質と接触させるのと同時に、例えば、第１の結合性物質および第２の（またはより高次の）結合性物質を含む単一の結合サイクル反応などで行う。
【０９６６】
第６の態様では、（ａ）固体支持体に接合したペプチドおよび付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）前記ペプチドを、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に結合することが可能な第１の結合性物質と接触させるステップであって、前記第１の結合性物質が、前記第１の結合性物質に関する識別情報を有する第１のコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）前記第１のコーディングタグの情報を前記記録タグに移行させて、第１の伸長記録タグを生成するステップと；（ｄ）前記ＮＴＡＡを除去して前記ペプチドの新しいＮＴＡＡを露出させるステップと；（ｅ）前記ペプチドを、前記新しいＮＴＡＡに結合することが可能な第２の結合性物質と接触させるステップであって、前記第２の結合性物質が、前記第２の結合性物質に関する識別情報を有する第２のコーディングタグを含む、ステップと；（ｆ）前記第２のコーディングタグの情報を前記第１の伸長記録タグに移行させて、第２の伸長記録タグを生成するステップと；（ｇ）前記第２の伸長記録タグを解析するステップとを含む方法において使用するためのキットおよびキット成分が提供される。
【０９６７】
ある特定の実施形態では、方法は、ステップ（ｆ）と（ｇ）の間に、（ｘ）第２の結合性物質を巨大分子に結合することが可能な第３の（またはより高次の）結合性物質に置き換えることにより、ステップ（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を１回または複数回繰り返すステップであって、前記第３の（またはより高次の）結合性物質が、第３の（またはより高次の）結合性物質に関する識別情報を有する第３の（またはより高次の）コーディングタグを含む、ステップと；（ｙ）第３の（またはより高次の）コーディングタグの情報を第２の（またはより高次の）伸長記録タグに移行させて第３の（またはより高次の）伸長記録タグを生成するステップとをさらに含み、ステップ（ｇ）において第３の（またはより高次の）伸長記録タグを解析する。キット成分は、これらのステップを実施するために提供される。
【０９６８】
ある特定の実施形態では、接触させるステップ（ｂ）および（ｅ）を逐次的に実施する、例えば、第１の結合性物質および第２の結合性物質を別々の結合サイクル反応でペプチドと接触させる。
【０９６９】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、方法は、複数の巨大分子を並行して解析することを含む。好ましい実施形態では、方法は、複数のペプチドを並行して解析することを含む。
【０９７０】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、巨大分子（またはペプチド）を結合性物質と接触させるステップは、巨大分子（またはペプチド）を複数の結合性物質と接触させることを含む。
【０９７１】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、巨大分子は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドであってよい。さらなる実施形態では、ペプチドは、生体試料に由来するタンパク質またはポリペプチドを断片化することによって得ることができる。
【０９７２】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、巨大分子は、炭水化物、脂質、核酸、もしくは大環状分子であり得るか、またはそれを含み得る。
【０９７３】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、記録タグは、ＤＮＡ分子、修飾塩基を有するＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子（Ｄｒａｇｕｌｅｓｃｕ−Ａｎｄｒａｓｉら、２００６年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２８巻：１０２５８〜１０２６７頁）、ＧＮＡ分子、またはそれらの任意の組合せであってよい。
【０９７４】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位を含んでよい。さらなる実施形態では、ユニバーサルプライミング部位は、増幅、ライゲーション、配列決定、またはこれらの組合せのためのプライミング部位を含む。
【０９７５】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、記録タグは、一意の分子識別子、コンパートメントタグ、分配バーコード、試料バーコード、画分バーコード、スペーサー配列、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。
【０９７６】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、一意の分子識別子（ＵＭＩ）、エンコーダー配列、結合サイクル特異的配列、スペーサー配列、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。
【０９７７】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、コーディングタグ内の結合サイクル特異的配列は、結合サイクル特異的スペーサー配列であってよい。
【０９７８】
ある特定の実施形態では、結合サイクル特異的配列は、エンコーダー配列とは別のバーコードとしてコードされる。他の実施形態では、エンコーダー配列および結合サイクル特異的配列は、結合性物質に対しておよび各結合サイクルに対して一意である単一のバーコードに記載される。
【０９７９】
ある特定の実施形態では、スペーサー配列は、多数の結合サイクルからの結合性物質の間で共有される共通の結合サイクル配列を含む。他の実施形態では、スペーサー配列は、同じ結合サイクルからの結合性物質の間で共有される一意の結合サイクル配列を含む。
【０９８０】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、記録タグは、バーコードを含んでよい。
【０９８１】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、巨大分子および付随する記録タグ（複数可）は、固体支持体に共有結合により接合していてよい。
【０９８２】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、固体支持体は、ビーズ、多孔質ビーズ、多孔質マトリックス、拡張可能なゲルビーズまたはマトリックス、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアであってよい。
【０９８３】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、固体支持体は、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズであってよい。
【０９８４】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の巨大分子および付随する記録タグを固体支持体に接合させることができる。さらなる実施形態では、複数の分析物（例えば、巨大分子）の間に固体支持体上で平均距離＞５０ｎｍ、＞１００ｎｍ、または＞２００ｎｍの間隔をあける。
【０９８５】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、結合性物質は、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。さらなる実施形態では、結合性物質は、改変もしくはバリアントアミノペプチダーゼ、改変もしくはバリアントアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、改変もしくはバリアントアンチカリン、または改変もしくはバリアントＣｌｐＳである。
【０９８６】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、結合性物質は、巨大分子に選択的に結合することが可能なものであってよい。
【０９８７】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、コーディングタグは、ＤＮＡ分子、修飾塩基を有するＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、ＧＮＡ分子、ＰＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せであってよい。
【０９８８】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、結合性物質とコーディングタグは、リンカーによって接合されていてよい。
【０９８９】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、結合性物質とコーディングタグを、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇ−ＫＴａｇ／ＳｐｙＬｉｇａｓｅ（この場合、接合される２つの部分がＳｐｙＴａｇ／ＫＴａｇ対を有し、ＳｐｙＬｉｇａｓｅがＳｐｙＴａｇをＫＴａｇに接合させ、かくして２つの部分が接合される）、ソルターゼ、および／またはＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質対（Zakeri, et al., 2012, Proc Natl Acad Sci U S A 109(12): E690-697；Veggianiet al., 2016, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113:1202-1207、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）によって接合させることができる。
【０９９０】
ＳｐｙＬｉｇａｓｅは、不可逆的ペプチド間相互作用を生じさせるように２つのペプチドタグを互いにライゲーションするタンパク質ドメインである。その全体が参照により組み込まれる、Fierer et al., (2014), "SpyLigase peptide-peptide ligationpolymerizes affibodies to enhance magnetic cancer cell capture," PNAS111(13): E1176-E1181。
【０９９１】
ソルターゼを使用して、結合性物質とコーディングタグを接合させることもできる。例えば、ソルターゼは、ＬＰＸＴＧ  Ｔａｇ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）をＧＧＧなどのポリＧ部分に選択的に接合させることができる。例えば、ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏからの、または米国特許第９，２６７，１２７（Ｂ２）号において開示されているような、ソルターゼＡ５を使用することができる。別の例では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＡのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むソルターゼを使用することができる。
【０９９２】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、コーディングタグの情報の記録タグへの移行は、ＤＮＡリガーゼ、例えば一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼなどの、リガーゼにより媒介される。一態様では、ライゲーションされる２つの一本鎖ポリヌクレオチドのうちの一方の５’末端をブロッキングしてその５’末端におけるライゲーションを防止する。前述の実施形態のいずれかでは、ｓｓＤＮＡリガーゼは、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例えば、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））またはそのバリアント、ホモログ、変異体もしくは修飾バージョン、あるいは古細菌ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１またはそのバリアント、ホモログ、変異体もしくは修飾バージョンであり得る。他の態様では、ｓｓＤＮＡリガーゼは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱ、またはＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑなどの、ＲＮＡリガーゼである。一態様では、ＰＥＧ４０００などのクラウディング剤を使用することにより、ライゲーション反応を最適化することができる。ライゲーションされるＤＮＡ末端を、相補的ＤＮＡ配列上で互いに隣接してアニーリングする場合、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）ＤＮＡリガーゼも使用することができる。
【０９９３】
あるいは、コーディングタグの情報の記録タグへの移行は、ＤＮＡポリメラーゼまたは化学的ライゲーションにより媒介される。一部の実施形態では、化学的ライゲーションは、チオール−マレイミドカップリングなどのマイケル付加を含む。一部の実施形態では、化学的ライゲーションは、銅により触媒されるアジド−アルキン付加環化を含む。一部の実施形態では、化学的ライゲーションは、アミド結合形成を含む。一部の実施形態では、アミド結合形成は、ペプチドカップリング剤の存在下、ＮＨＳエステルとアミン間またはカルボン酸とアミン間で進行する。一部の実施形態では、化学的ライゲーションは、アミンおよびアルデヒドによるイミン形成、続いてのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用する還元を含む。一部の実施形態では、化学的ライゲーションは、チオレンカップリングを含む。一部の実施形態では、化学的ライゲーションは、ネイティブな化学的ライゲーション（例えば、チオエステル（チオールエステル）とシステイン）を含む。一部の実施形態では、化学的ライゲーションのための試薬は、歪みアルキン（例えば、シクロオクチン）およびアジドを含む。一部の実施形態では、化学的ライゲーションは、無痕跡型および非無痕跡型シュタウディンガーライゲーションを含む。
【０９９４】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、伸長記録タグを解析するステップは、核酸配列決定を含んでよい。さらなる実施形態では、核酸配列決定は、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシングである。他の実施形態では、核酸配列決定は、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、ナノギャップトンネリングシーケンシング、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングである。
【０９９５】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、伸長記録タグを解析前に増幅させることができる。
【０９９６】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、伸長記録タグに含有されるコーディングタグ情報の順序が、結合性物質による巨大分子への結合の順序に関する情報、したがって、結合性物質によって検出される分析物の配列を提供することができる。
【０９９７】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、伸長記録タグに含有される特定のコーディングタグ情報（例えば、エンコーダー配列）の頻度は、特定の結合性物質による巨大分子への結合の頻度、したがって、結合性物質によって検出される巨大分子内の分析物の頻度に関する情報を提供することができる。
【０９９８】
本明細書に開示されている実施形態のいずれかでは、多数の巨大分子（例えば、タンパク質）試料であって、各試料内の巨大分子の集団が試料特異的バーコードを含む記録タグで標識されている試料をプールすることができる。そのような巨大分子試料のプールを単一の反応チューブ内での結合サイクルに供することができる。
【０９９９】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の巨大分子を表す複数の伸長記録タグを並行して解析することができる。
【１０００】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の巨大分子を表す複数の伸長記録タグを多重化アッセイで解析することができる。
【１００１】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の伸長記録タグに対して、解析前に標的濃縮アッセイを行うことができる。
【１００２】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の伸長記録タグに対して、解析前にサブトラクションアッセイを行うことができる。
【１００３】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、複数の伸長記録タグに対して、極めて豊富な種を減少させるために解析前に正規化アッセイを行うことができる。
【１００４】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、ＮＴＡＡを、改変アミノペプチダーゼ、改変アミノ酸ｔＲＮＡ合成酵素、穏やかなエドマン分解、エドマナーゼ（Ｅｄｍａｎａｓｅ）酵素、または無水ＴＦＡによって除去することができる。
【１００５】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、少なくとも１つの結合性物質は、末端アミノ酸残基に結合し得る。ある特定の実施形態では、末端アミノ酸残基は、Ｎ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸である。
【１００６】
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、少なくとも１つの結合性物質は、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合し得る。
【１００７】
一部の実施形態では、小分子−タンパク質結合マトリックスが本明細書において提示される。一部の実施形態では、これは、１０９の多様性の小分子ライブラリーを固定化ヒトプロテオーム全体（２×１０４）とインキュベートする場合であっても、かなり大きいマトリックスであり得る。マトリックスサイズは、２×１０１３の異なる測定で、１０９×２×１０４である。一部の実施形態では、洗浄ステップ後であっても、高親和性結合相互作用（＜低ｎＭ）を上記の手法で容易に記録することができるが、中等度〜低親和性相互作用は、失われる可能性が高いであろう。一部の実施形態では、低親和性相互作用（約μＭ）を記録するには、結合および同時情報移行が起こる均一反応が望ましい。一部の実施形態では、このことにより、重合またはライゲーションステップが、結合の占有時間と比較して速いカイネティクスを有する必要があることが求められる。重合の時間尺度は、秒のオーダーであり、μＭ濃度での結合の占有時間（約１０〜１００秒）に適合する。ライゲーションの時間尺度も秒のオーダーであり得る（例えば、速い化学的ライゲーションについて、例えば、Abe et al., (2008), "Rapid DNA chemical ligation foramplification of RNA and DNA signal," Bioconjug Chem 19(1): 327-333を参照されたい）。一部の実施形態では、特に、低親和性相互作用を解析または検出するために、リガーゼまたはポリメラーゼを１つまたは複数の結合物質とともに反応ミックスに含めることができる。あるいは、リガーゼまたはポリメラーゼを物質部位に、記録タグ内の部位とのＤＮＡタグ相互作用によるハイブリダイゼーションを使用して、共局在させることができる。結合ステップと「書き込む」（すなわち、情報移行）ステップを組み合わせることを行うことにより、低親和性相互作用を「記録する」ことがより容易になる。
【１００８】
一実施形態では、タンパク質標的またはペプチドもしくは小分子リガンド（またはペプチド模倣物リガンド、例えば、ペプトイドリガンド、β−ペプチドリガンドもしくはＤ−ペプチドペプチド模倣物リガンド、または多糖リガンド）のいずれかへのＤＮＡタグの付着は、個別に産生されたタンパク質標的または個別に産生された小分子／ペプチド標的へのバーコード付きＤＮＡタグの個別の付着によって果たすことができる。別の実施形態では、タンパク質へのＤＮＡタグの付着は、ＤＮＡバーコードがｍＲＮＡ配列に含有されている場合、リボソームまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡディスプレイによって行われる。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡディスプレイの過程で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応を使用してｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される。ｍＲＮＡは、リンカーを介してｍＲＮＡの３’末端に付着しているピューロマイシン分子を有するように構成される（例えば、Liu et al., (2000), "Optimized synthesis of RNA-protein fusionsfor in vitro protein selection," In Methods in Enzymology, Academic Press,318:268-293を参照されたい）。チロシル−ｔＲＮＡの類似体であるピューロマイシンは、ｍＲＮＡ転写物の３’末端に係留され、リボソームが３’末端に接近すると成長ポリペプチド鎖に組み込まれ、翻訳を停止させ、ＲＮＡ／ＤＮＡ転写物および付随するバーコードをその対応する翻訳タンパク質に連結させることにより有効にｍＲＮＡ−タンパク質融合体を創出する（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２５８８７１（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１７／０１０７５６６（Ａ１）号、またはKozlovet al., (2012), PLoS One 7(6): e37441において開示されている通りであり、これらの参考文献の全てが参照により本明細書に組み込まれる）。
【１００９】
一実施形態では、下流の情報移行のためにバーコード配列および付随するＤＮＡ記録タグ機能的エレメント、例えば、ユニバーサルプライマー部位およびスペーサー配列を操作して、ｍＲＮＡ転写物の３’末端にする。一実施形態では、一意の制限部位も、ＤＮＡバーコードおよびＤＮＡ記録タグ機能的エレメントのすぐ５’に含める。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳およびｍＲＮＡ−タンパク質融合体の創出後、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆翻訳する。ｃＤＮＡを外因性オリゴのアニーリングおよび制限酵素とのインキュベーションによってバーコードの５’側で切断する。これにより、後続のアッセイのために記録タグとして役立つＤＮＡタグが遊離される（例えば、図５０を参照されたい）。
【１０１０】
別の態様では、単一サイクルでの次世代タンパク質アッセイが本明細書において開示される。一部の実施形態では、アッセイは、ＮＴＡＡ結合物質（例えば、Ｎ末端におけるモノ−、ジ−またはトリ−アミノ酸）などのアミノ酸結合物質を使用する。
【１０１１】
ボトムアップ質量分析（ＭＳ）による典型的なタンパク質識別は、各タンパク質からペプチド（約２０〜４０ペプチド）のセットを生成するために、トリプシン消化などのプロテアーゼ消化ステップを使用する。単一ペプチド種をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで解析して、全タンパク質種の識別をもたらすことができる。参照により本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１５／０４２５０６もまた、単一分子レベルでのタンパク質識別方法を開示している。ＷＯ／２０１５／０４２５０６の試薬および方法ステップを本開示と組み合わせることができる。
【１０１２】
単一分子レベルでのタンパク質識別のための代替手法は、タンパク質分子を数百万〜数十億の区分（例えば、コンパートメントバーコードを含む区分）に分配し、分配バーコードを有する試料中の全ての分子にバーコードを付与する手法である。一態様では、所与のコンパートメント（例えば、個々のビーズ表面）について、そのコンパートメント内の全ての分子を同じバーコードで標識する。別の態様では、区分は、同じバーコードを共有する全てのコンパートメントを含む。例えば、１０８個のビーズ上に１０６のバーコードがある場合、ビーズの一部は、同じバーコードを有することになる。この例では、個々のビーズ各々がコンパートメントであり得、同じバーコードを共有するコンパートメントは、バーコードの差異に基づいて他の区分と区別することができる区分を形成する。好ましい実施形態では、タンパク質を先ず変性させ、アルキル化し、次いで、ポリペプチド全体にわたって「クリック」ケミストリーハンドルで標識する。「クリック」ハンドルの付着後、クリックケミストリーを使用してユニバーサルＤＮＡプライマーを「クリック」ハンドルに付着させる。このＤＮＡプライマーは、ＤＮＡ記録タグの最初の部分となる。ポリペプチドを過剰なＤＮＡプライマーから精製する。ポリペプチドをＤＮＡプライマーで標識した後、コンパートメントバーコードとポリペプチド上のものに相補的なユニバーサルプライマーとを有するＤＮＡバーコード付きビーズの集団にポリペプチドを曝露する（例えば、図５１を参照されたい）。個々のポリペプチド分子は、特定のビーズと相互作用し、基本的には、ユニバーサルプライマー配列によるハイブリダイゼーションによってビーズ上で「ジッパーを閉じる」。１つより多くの分子を任意の所与のビーズに付随させることができるが、理想的には、分子の数を最小に保つ。ポリペプチドをビーズ上に「ジッパー留めした」ら、プライマー伸長またはライゲーション反応を使用して、ビーズのバーコード情報を、ポリペプチドに付着している多数のユニバーサルプライマーに移行させる。このようにして、ポリペプチドは、今や、バーコードが付与された「コンパートメント」であり、これがプロテオームの分配の基礎をなす。ポリペプチド分子上の伸長ＤＮＡタグは、アッセイにおける後続のステップのための記録タグとなる。次に、ビーズ上のポリペプチド（最初に除去され得る）を、プロテアーゼ消化ステップ（例えば、トリプシン消化）を使用して断片化する。消化後、記録タグ標識ペプチドをビーズから溶出させる。標識ペプチドを基板に単一分子密度で固定化する（例えば、ペプチド間の距離は、固定化されたペプチド間の平均距離が主として分子内結合事象のみに情報移行を制限するような距離である）。間隔をあける例示的な距離は、約２０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約１５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約２５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約３５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約４５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約５５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約６００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約６５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約７００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約７５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約８００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約８５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約９００ｎｍに等しいもしくはそれより長い、約９５０ｎｍに等しいもしくはそれより長い、または約１μｍに等しいもしくはそれより長いこともある。
【１０１３】
一実施形態では、ペプチドは、トリプシン消化から生じる。ヒトプロテオームについては、１タンパク質当たり約２０〜３０トリプシンペプチドで、およそ５００，０００の異なるトリプシンペプチドがある。試料中のタンパク質分子を定量化し、特徴付けるために、タンパク質を、分配バーコード付き記録タグで標識されたペプチドのセットに変換する。所与の分子に由来するトリプシンペプチドへの結合からの全ての情報を分配バーコードにより分子（または分子の小サブセット）にマッピングし戻すことができる。好ましい実施形態では、結合物質を識別するバーコード情報で構成されるＤＮＡコーディングタグで標識された、Ｎ末端ジペプチドおよび／またはトリペプチド（Ｎ末端ジアミノ／トリアミノ酸とも称される）結合性物質を、固定化されたペプチドと共にインキュベートする（その結果、Ｎ末端が遊離する）。結合時または結合後、ポリメラーゼ伸長またはライゲーションによってコーディングタグから記録タグへ（または逆に記録タグからコーディングタグへ）情報を移行させる。このプロセスを複数サイクル繰り返して、交差反応性結合事象からのエラーを低減させることができる。Ｎ末端ジペプチド結合物質の完全なセットは、異なる識別バーコードで各々が標識されている４００の異なる結合物質のセットに相当する。単一の結合サイクルで、この分配概念を使用してヒトプロテオーム全体を識別するには十分過ぎるはずである。例えば、所与のタンパク質分子からの１セット２０個のペプチドのうちの５個のトリプシンペプチドしか検出されない場合であっても、トリプシン消化情報と組み合わせたＮ末端ジアミノ酸情報で、そのタンパク質を一意に識別するには十分過ぎる。
【１０１４】
最初に分配バーコード付きビーズにポリペプチドを固定化し、分析物基板に再固定化する代わりに、変性ペプチドを共有結合性または非共有結合性相互作用によってＤＮＡバーコード付きビーズに直接固定化することができ、この場合、全ビーズを同一のバーコード付き記録タグの集団で被覆する（例えば、図５２を参照されたい）。ポリペプチドは、ビーズ上で消化されてトリプシン消化物などの断片になる。プロテアーゼ消化後に続いて、バーコード付きビーズ上のポリペプチドの露出したＮ末端へのＮ末端ジペプチド結合物質の結合が起こる。情報移行が、ジペプチド結合物質上のコーディングタグと、ビーズに付着している記録タグのいずれかとの間で起こる。以前の「間隔の遠い」ペプチドモデル（例えば、図５１を参照されたい）とは異なり、ペプチド複合体の間隔を、結合サイクルを１回しか実施しないのであれば、以前の実施形態でのように離す必要はない。結合および情報移行後、得られた伸長記録タグを、線形増幅またはＰＣＲを使用してビーズ表面から直接溶液に増幅させることができる。
【１０１５】
一部の実施形態では、上文にて開示のアッセイは、コーディングタグと記録タグの間の情報の周期的移行を必要としない。したがって、これらのアッセイを単一結合サイクルで行うことができる。
【１０１６】
上述の実施形態の特徴を以下の節でさらに詳細に提示する。
Ｂ．巨大分子
【１０１７】
一態様では、本開示は、巨大分子の解析に関する。巨大分子は、より小さなサブユニットで構成される大きな分子である。ある特定の実施形態では、巨大分子は、タンパク質、タンパク質複合体、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、炭水化物、脂質、大環状分子、またはキメラ巨大分子である。
【１０１８】
本明細書に開示されているキットおよび方法に従って解析される巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド）は、これだけに限定されないが、細胞（初代細胞および培養細胞株の両方）、細胞溶解物または抽出物、エキソソームを含む細胞小器官または小胞、組織および組織抽出物などの生体試料；生検材料；糞便物質；事実上あらゆる生物体の体液（例えば、血液、全血、血清、血漿、尿、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、眼房水または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門および膣分泌物、汗および精液、漏出液、滲出液（例えば、膿瘍もしくは任意の他の感染もしくは炎症の部位から得られる流体）または関節（正常な関節もしくは関節リウマチ、変形性関節症、痛風もしくは化膿性関節炎などの疾患に罹患している関節）から得られる流体）（マイクロバイオームを含有する試料を含む、哺乳動物由来試料であることが好ましく、マイクロバイオームを含有する試料を含む、ヒト由来試料であることが特に好ましい）；環境試料（例えば、空気、農業、水および土壌試料など）；微生物バイオフィルムおよび／または微生物群、ならびに微生物の胞子に由来する試料を含む、微生物試料；細胞外液、細胞培養物からの細胞外上清、細菌内の封入体、ミトコンドリア区画を含む細胞区画、および細胞ペリプラズムを含む、研究試料を含む、適切な供給源または試料から得ることができる。
【１０１９】
ある特定の実施形態では、巨大分子は、タンパク質、タンパク質複合体、ポリペプチド、またはペプチドである。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のアミノ酸配列情報および翻訳後修飾を、次世代シーケンシング法によって解析することができる核酸コードライブラリーに変換する。ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはその両方を含んでよい。ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体は、標準の、天然に存在するアミノ酸、修飾されたアミノ酸（例えば、翻訳後修飾）、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。一部の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、天然に存在するもの、合成的に作製されたもの、または組換えによって発現させたものである。上述のペプチド実施形態のいずれかでは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体は、翻訳後修飾をさらに含んでよい。
【１０２０】
標準の、天然に存在するアミノ酸としては、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）が挙げられる。非標準アミノ酸としては、セレノシステイン、ピロリジン、およびＮ−ホルミルメチオニン、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖コアアミノ酸、およびＮ−メチルアミノ酸が挙げられる。
【１０２１】
ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、共有結合性修飾であっても酵素的修飾であってもよい。翻訳後修飾の例としては、これだけに限定されないが、アシル化、アセチル化、アルキル化（メチル化を含む）、ビオチン化、ブチリル化、カルバミル化、カルボニル化、脱アミド化、脱イミノ化、ジフタミド形成、ジスルフィド架橋形成、エリミニル化、フラビン付着、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化（例えば、Ｎ結合、Ｏ結合、Ｃ結合、ホスホグリコシル化）、グリコシルホスファチジルイノシトール付加（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）、ヘムＣ付着、ヒドロキシル化、ハイプシン形成、ヨウ素化、イソプレニル化、脂質付加、リポイル化、マロニル化、メチル化、ミリストイル化、酸化、パルミトイル化、ペグ化、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、プレニル化、プロピオニル化、レチニリデンシッフ塩基形成、Ｓ−グルタチオン化、Ｓ−ニトロシル化、Ｓ−スルフェニル化、セレン化、サクシニル化、スルフィン化、ユビキチン化、およびＣ末端アミド化が挙げられる。翻訳後修飾は、ペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端、ポリペプチド、またはタンパク質の修飾を含む。末端アミノ基の修飾としては、これだけに限定されないが、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、およびＮ−アシル修飾が挙げられる。末端カルボキシ基の修飾としては、これだけに限定されないが、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾（例えば、低級アルキルは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである）が挙げられる。翻訳後修飾は、例えば、これだけに限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のアミノ末端とカルボキシ末端の間にあるアミノ酸の、上記のものなどの修飾も含む。翻訳後修飾により、細胞内のタンパク質の「生物学的性質」、例えば、その活性、構造、安定性、または局在を調節することができる。リン酸化は最も一般的な翻訳後修飾であり、タンパク質の調節、特に細胞シグナル伝達において重要な役割を果たす（Ｐｒａｂａｋａｒａｎら、２０１２年、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ、４巻：５６５〜５８３頁）。グリコシル化などの、タンパク質への糖の付加により、タンパク質のフォールディングが促進されること、安定性が改善されること、および調節機能が修飾されることが示されている。タンパク質に脂質を付着させるにより、細胞膜へのターゲティングが可能になる。翻訳後修飾は、１つまたは複数の検出可能な標識を含めるための、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の修飾も含み得る。
【１０２２】
ある特定の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を断片化することができる。例えば、生体試料などの試料に由来するタンパク質を断片化することにより、断片化されたペプチドを得ることができる。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を、プロテアーゼまたはエンドペプチダーゼによる断片化を含めた当技術分野で公知の任意の手段によって断片化することができる。一部の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の断片化を、特異的なプロテアーゼまたはエンドペプチダーゼを使用することによって標的化する。特異的なプロテアーゼまたはエンドペプチダーゼは、特異的なコンセンサス配列に結合し、そこで切断する（例えば、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓコンセンサス配列に対して特異的なＴＥＶプロテアーゼ）。他の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の断片化を、非特異的プロテアーゼまたはエンドペプチダーゼを使用することにより、標的化しないまたはランダムなものにする。非特異的プロテアーゼは、コンセンサス配列ではなく特定のアミノ酸残基に結合し、そこで切断することができる（例えば、プロテイナーゼＫは、非特異的セリンプロテアーゼである）。プロテイナーゼおよびエンドペプチダーゼは当技術分野で周知であり、タンパク質またはポリペプチドを切断してより小さなペプチド断片にするために使用することができるものの例としては、プロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、トロンビン、第Ｘａ因子、フューリン、エンドペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、スブチリシン、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（商標）Ｉ、エンドプロテアーゼＬｙｓＣ、エンドプロテアーゼＡｓｐＮ、エンドプロテアーゼＧｌｕＣなどが挙げられる（Ｇｒａｎｖｏｇｌら、２００７年、Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、３８９巻：９９１〜１００２頁）。ある特定の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を、プロテイナーゼＫによって、または、任意選択で、迅速な不活化を可能にするために熱不安定性型のプロテイナーゼＫによって、断片化する。プロテイナーゼＫは、尿素およびＳＤＳなどの変性試薬中で非常に安定であり、それにより、完全に変性したタンパク質を消化することが可能になる。タンパク質およびポリペプチドのペプチドへの断片化は、ＤＮＡタグまたはＤＮＡ記録タグを付着させる前に実施することもでき、その後に実施することもできる。
【１０２３】
化学試薬を使用してタンパク質をペプチド断片に消化することもできる。化学試薬により、特定のアミノ酸残基において切断することができる（例えば、臭化シアンにより、メチオニン残基のＣ末端においてペプチド結合が加水分解される）。ポリペプチドまたはタンパク質をより小さなペプチドに断片化するための化学試薬としては、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ギ酸、ＢＮＰＳ−スカトール［２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチルインドール］、ヨードソ安息香酸、・ＮＴＣＢ＋Ｎｉ（２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸）などが挙げられる。
【１０２４】
ある特定の実施形態では、酵素的切断または化学的切断の後、得られるペプチド断片は、ほぼ同じ所望の長さ、例えば、約１０アミノ酸から約７０アミノ酸まで、約１０アミノ酸から約６０アミノ酸まで、約１０アミノ酸から約５０アミノ酸まで、約１０アミノ酸から約４０アミノ酸まで、約１０アミノ酸から約３０アミノ酸まで、約２０アミノ酸から約７０アミノ酸まで、約２０アミノ酸から約６０アミノ酸まで、約２０アミノ酸から約５０アミノ酸まで、約２０アミノ酸から約４０アミノ酸まで、約２０アミノ酸から約３０アミノ酸まで、約３０アミノ酸から約７０アミノ酸まで、約３０アミノ酸から約６０アミノ酸まで、約３０アミノ酸から約５０アミノ酸まで、または約３０アミノ酸から約４０アミノ酸までである。切断反応は、タンパク質またはポリペプチド試料に、プロテイナーゼまたはエンドペプチダーゼ切断部位を含有するペプチド配列を含む短い試験ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）ペプチドをスパイクすることにより、例えばリアルタイムで、モニターすることができる。インタクトなＦＲＥＴペプチドでは、蛍光基およびクエンチャー基が切断部位を含有するペプチド配列のいずれかの末端に付着しており、クエンチャーとフルオロフォアの間の蛍光共鳴エネルギー移動により、低い蛍光が生じる。試験ペプチドがプロテアーゼまたはエンドペプチダーゼによって切断されると、クエンチャーおよびフルオロフォアが分離し、それにより、蛍光の大きな増大がもたらされる。切断反応は、ある特定の蛍光強度が実現された時に停止させることができ、これにより、再現性のある切断エンドポイントを実現することが可能になる。
【１０２５】
巨大分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質）の試料に対して、固体支持体に付着させる前にタンパク質分画法を行うことができ、ここで、タンパク質またはペプチドを細胞内の位置、分子量、疎水性、もしくは等電点などの１つもしくは複数の性質、またはタンパク質濃縮法によって分離する。その代わりにまたはそれに加えて、特定のタンパク質またはペプチドを選択するため（例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｗｈｉｔｅａｋｅｒら、２００７年、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３６２巻：４４〜５４頁を参照されたい）または特定の翻訳後修飾を選択するため（例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｈｕａｎｇら、２０１４年、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ、１３７２巻：１〜１７頁を参照されたい）に、タンパク質濃縮法を使用することができる。あるいは、免疫グロブリンなどの特定のクラス（複数可）のタンパク質、またはＩｇＧなどの免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプを、解析のために親和性により濃縮または選択することができる。免疫グロブリン分子の場合では、親和性結合に関与する超可変配列の配列および豊富さまたは頻度を解析することが特に興味深く、これは、特に、これらが疾患の進行に応答して変動するまたは健康、免疫、および／もしくは疾患表現型と相関するからである。過度に豊富なタンパク質を、標準の免疫親和性方法を使用して試料からからサブトラクションすることもできる。豊富なタンパク質の枯渇は、タンパク質構成物の８０％よりも多くがアルブミンおよび免疫グロブリンである血漿試料に関して有用であり得る。例えばＰＲＯＴＩＡおよびＰＲＯＴ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）など、血漿試料の過度に豊富なタンパク質の枯渇のために、いくつかの市販品が入手可能である。
【１０２６】
ある特定の実施形態では、巨大分子は、タンパク質またはポリペプチドで構成される。一実施形態では、タンパク質またはポリペプチドを標準のアミンカップリング化学によってＤＮＡ記録タグで標識する（例えば、図２Ｂ、２Ｃ、２８、２９、３１、４０）を参照されたい。ε−アミノ基（例えばリシン残基の）およびＮ末端アミノ基は、反応のｐＨに応じて、アミン反応性カップリング剤で特に標識しやすい（ＭｅｎｄｏｚａおよびＶａｃｈｅｔ、２００９年）。特定の実施形態では（例えば、図２Ｂおよび図２９を参照されたい）、記録タグは、反応性部分（例えば、固体表面、多機能性リンカー、または巨大分子へのコンジュゲーションのための部分）、リンカー、ユニバーサルプライミング配列、バーコード（例えば、コンパートメントタグ、分配バーコード、試料バーコード、画分バーコード、またはそれらの任意の組合せ）、任意選択のＵＭＩ、およびコーディングタグへの／からの情報移行を容易にするためのスペーサー（Ｓｐ）配列で構成される。別の実施形態では、タンパク質を、まず、ユニバーサルＤＮＡタグで標識し、その後で、酵素的または化学的カップリングステップによってバーコード−Ｓｐ配列（試料、コンパートメント、スライド上の物理的位置を表すなど）をタンパク質に付着させることができる（例えば、図２０、３０、３１、４０を参照されたい）。ユニバーサルＤＮＡタグは、タンパク質またはポリペプチド巨大分子を標識するために使用され、バーコード（例えば、コンパートメントタグ、記録タグなど）の付着点として使用することができるヌクレオチドの短い配列を含む。例えば、記録タグは、その末端に、ユニバーサルＤＮＡタグと相補的な配列を含んでよい。ある特定の実施形態では、ユニバーサルＤＮＡタグは、ユニバーサルプライミング配列である。標識されたタンパク質上のユニバーサルＤＮＡタグが記録タグ（例えば、ビーズに結合させたもの）内の相補配列とハイブリダイズしたら、アニーリングされたユニバーサルＤＮＡタグをプライマー伸長によって伸長させ、それにより、ＤＮＡタグが付されたタンパク質に記録タグ情報を移行させることができる。特定の実施形態では、タンパク質を、プロテイナーゼにより消化してペプチドにする前に、ユニバーサルＤＮＡタグで標識する。次いで、消化物に由来する標識されたペプチド上のユニバーサルＤＮＡタグを、情報価値があり、有効な記録タグに変換することができる。
【１０２７】
ある特定の実施形態では、タンパク質巨大分子を親和性捕捉試薬によって固体支持体に固定化すること（および任意選択で共有結合により架橋結合させること）ができ、ここで、記録タグは、親和性捕捉試薬に直接付随している、あるいは、タンパク質を固体支持体に記録タグと共に直接固定化することができる（例えば、図２Ｃを参照されたい）。
Ｃ．固体支持体などの支持体
【１０２８】
本開示の巨大分子を固体支持体の表面（「基板表面」とも称される）に接合する。固体支持体は、これだけに限定されないが、ビーズ、マイクロビーズ、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フローセル、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアを含めた任意の多孔質または非多孔質支持体表面であってよい。固体支持体用の材料としては、これだけに限定されないが、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、石英、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリアミノ酸、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。固体支持体は、薄膜、膜、ビン、ディッシュ、繊維、織られた繊維、チューブなどの成形ポリマー、粒子、ビーズ、微小粒子、またはそれらの任意の組合せをさらに含む。例えば、固体表面がビーズである場合、ビーズとしては、これだけに限定されないが、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズを挙げることができる。
【１０２９】
ある特定の実施形態では、固体支持体は、フローセルである。フローセルの形態は、異なる次世代シーケンシングプラットフォームの間で変動し得る。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルは、その表面に一連のオリゴヌクレオチドアンカーが結合した、顕微鏡スライドと同様の平面の光学的に透明な表面である。鋳型ＤＮＡは、末端にフローセル表面上のオリゴヌクレオチドと相補的なアダプターがライゲーションしている。アダプター付加した一本鎖ＤＮＡをフローセルに結合させ、固相「ブリッジ」ＰＣＲによって増幅した後、配列決定する。４５４フローセル（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、７５ピコリットルのウェルを約１６０万個有する光ファイバースライドである「ピコタイター」プレートを支持するものである。せん断された鋳型ＤＮＡの個々の分子をそれぞれ別々のビーズに捕捉し、各ビーズを油エマルジョン中の水性ＰＣＲ反応混合物の個々の液滴中に区画化する。鋳型をビーズ表面上でＰＣＲによってクローン的に増幅し、次いで、鋳型がローディングされたビーズを配列決定反応のためにピコタイタープレートのウェル中に、理想的には１ウェル当たり１個またはそれ未満のビーズに分布させる。Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＳＯＬｉＤ（Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）計器では、４５４システムと同様に、鋳型分子をエマルジョンＰＣＲによって増幅する。増幅した鋳型を含有しないビーズを選別するステップの後、ビーズに結合した鋳型がフローセル上に蓄積する。フローセルは、ＴＷＩＳＴ（商標）ＤＮＡ合成カラム（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などの単純なフィルターフリットであってもよい。
【１０３０】
ある特定の実施形態では、固体支持体はビーズであり、これは、個々のビーズを指す場合もあり複数のビーズを指す場合もある。一部の実施形態では、ビーズは、下流の解析のために使用される選択された次世代シーケンシングプラットフォーム（例えば、ＳＯＬｉＤまたは４５４）に適合するものである。一部の実施形態では、固体支持体は、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズである。さらなる実施形態では、ビーズは、巨大分子への結合を容易にするために、結合機能性（例えば、アミン基、ビオチン標識された巨大分子、抗体との結合用のストレプトアビジンなどの親和性リガンド）でコーティングすることができる。
【１０３１】
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、固体支持体に、直接または間接的に、共有結合性の相互作用および非共有結合性の相互作用またはそれらの任意の組合せを含めた当技術分野で公知の任意の手段によって接合させることができる（例えば、それぞれ、これによってその全体が参照により組み込まれる、Ｃｈａｎら、２００７年、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２巻：ｅ１１６４頁；Ｃａｚａｌｉｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．、１５巻：１００５〜１００９頁；Ｓｏｅｌｌｎｅｒら、２００３年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２５巻：１１７９０〜１１７９１頁；Ｓｕｎら、２００６年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．、１７巻、５２〜５７頁；Ｄｅｃｒｅａｕら、２００７年、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、７２巻：２７９４〜２８０２頁；Ｃａｍａｒｅｒｏら、２００４年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２６巻：１４７３０〜１４７３１頁；Ｇｉｒｉｓｈら、２００５年、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．、１５巻：２４４７〜２４５１頁；Ｋａｌｉａら、２００７年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．、１８巻：１０６４〜１０６９頁；Ｗａｔｚｋｅら、２００６年、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、４５巻：１４０８〜１４１２頁；Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙら、２００７年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１８巻：４６９〜４７６頁；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｇ．  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０１３年）を参照されたい）。例えば、ペプチドを固体支持体にライゲーション反応によって接合させることができる。あるいは、固体支持体は、直接または間接的にペプチドを固体支持体に接合することを容易にするための作用物質またはコーティングを含んでよい。タンパク質、核酸、炭水化物および小分子を含めた任意の適切な分子または材料をこの目的のために使用することができる。例えば、一実施形態では、作用物質は、親和性分子である。別の例では、作用物質は、別の分子のアルキニル基と反応して固体支持体と他の分子の間の会合または結合を容易にすることができる、アジド基である。
【１０３２】
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、固体支持体に、「クリックケミストリー」と称される方法を使用して接合させることができる。この目的のために、迅速かつ実質的に不可逆的である任意の反応を使用してタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを固体支持体に付着させることができる。例示的な反応としては、トリアゾールが形成される、アジドとアルキンの銅により触媒される反応（ヒュスゲン１，３−双極子付加環化）、歪み促進型アジド−アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）、ジエンと求ジエン体の反応（ディールス・アルダー）、歪み促進型アルキン−ニトロン付加環化、歪アルケンとアジド、テトラジンまたはテトラゾールの反応、アルケン−アジド［３＋２］付加環化、アルケン−テトラジン逆電子要請型ディールス・アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応（例えば、ｍ−テトラジン（ｍＴｅｔ）−ｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ））、アルケン−テトラゾール光化学反応、アジド−ホスフィンのシュタウディンガーライゲーション、ならびに、求電子原子に対する求核攻撃による脱離基の置換（Ｈｏｒｉｓａｗａ  ２０１４年、Ｋｎａｌｌ、Ｈｏｌｌａｕｆら、２０１４年）などの種々の置換反応が挙げられる。例示的な置換反応としては、アミンと活性化エステルの反応；アミンとＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの反応；アミンとイソシアネートの反応；アミンとイソチオシアネートの反応などが挙げられる。
【１０３３】
一部の実施形態では、巨大分子および固体支持体を、２つの相補的な反応性基の反応によって形成することができる官能基、例えば、前述の「クリック」反応のうちの１つの生成物である官能基によって接合する。種々の実施形態では、官能基は、アルデヒド、オキシム、ヒドラゾン、ヒドラジド、アルキン、アミン、アジド、アシルアジド、ハロゲン化アシル、ニトリル、ニトロン、スルフヒドリル、ジスルフィド、ハロゲン化スルホニル、イソチオシアネート、イミドエステル、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンチン酸ＳＴＰエステル）、ケトン、α，β−不飽和カルボニル、アルケン、マレイミド、α−ハロイミド、エポキシド、アジリジン、テトラジン、テトラゾール、ホスフィン、ビオチンまたはチイラン官能基と、相補的な反応性基との反応によって形成することができる。例示的な反応は、アミン（例えば、第一級アミン）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはイソチオシアネートの反応である。
【１０３４】
さらに他の実施形態では、官能基は、アルケン、エステル、アミド、チオエステル、ジスルフィド、炭素環式、複素環式またはヘテロアリール基を含む。さらなる実施形態では、官能基は、アルケン、エステル、アミド、チオエステル、チオ尿素、ジスルフィド、炭素環式、複素環式またはヘテロアリール基を含む。他の実施形態では、官能基は、アミドまたはチオ尿素を含む。一部のより具体的な実施形態では、官能基は、トリアゾリル官能基、アミド、またはチオ尿素官能基である。
【１０３５】
好ましい実施形態では、迅速かつ低インプット濃度で高収率がもたらされるので、ｉＥＤＤＡクリックケミストリーを巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド）を固体支持体に固定化するために使用する。別の好ましい実施形態では、テトラジンではなくｍ−テトラジンをｉＥＤＤＡクリックケミストリー反応に使用し、これは、ｍ−テトラジンが改善された結合安定性を有するからである。
【１０３６】
好ましい実施形態では、基板表面をＴＣＯで官能化し、記録タグで標識したタンパク質、ポリペプチド、ペプチドを、ＴＣＯでコーティングした基板表面に、付着したｍ−テトラジン部分を介して固定化する（例えば図３４を参照されたい）。
【１０３７】
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、そのＣ末端、Ｎ末端、または内部アミノ酸により、例えば、アミン基、カルボキシル基、またはスルフィドリル基を介して、固体支持体の表面に固定化することができる。アミン基へのカップリングに使用される標準の活性化された支持体としては、ＣＮＢｒで活性化された支持体、ＮＨＳで活性化された支持体、アルデヒドで活性化された支持体、アズラクトンで活性化された支持体、およびＣＤＩで活性化された支持体が挙げられる。カルボキシルカップリングに使用される標準の活性化された支持体としては、アミン支持体にカップリングするカルボジイミドで活性化されたカルボキシル部分が挙げられる。システインカップリングでは、マレイミド、ヨードアセチル、およびピリジルジスルフィドで活性化された支持体を使用することができる。ペプチドカルボキシ末端固定化の代替方式では、Ｃ末端にリシンまたはアルギニン残基を含有するペプチドに、それらを切断することなく結合する、触媒として不活性なトリプシンの誘導体であるアンヒドロトリプシンを使用する。
【１０３８】
ある特定の実施形態では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを固体支持体に、固体表面に結合させたリンカーをタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのリシン基に共有結合により付着させることによって固定化する。
【１０３９】
固体支持体への固定化前または固定化後に、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに記録タグを付着させることができる。例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、まず記録タグで標識し、次いで、カップリングのための２つの機能的部分を含む記録タグを介して固体表面に固定化することができる（例えば図２８を参照されたい）。記録タグの一方の機能的部分をタンパク質とカップリングさせ、他方の機能的部分により、記録タグで標識したタンパク質を固体支持体に固定化する。
【１０４０】
あるいは、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを記録タグで標識する前に、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを固体支持体に固定化する。例えば、タンパク質をまずクリックケミストリー部分などの反応性基で誘導体化することができる。次いで、活性化されたタンパク質分子を適切な固体支持体に付着させ、次いで、相補的なクリックケミストリー部分を使用して記録タグで標識することができる。例として、アルキンおよびｍＴｅｔ部分で誘導体化したタンパク質を、アジドおよびＴＣＯで誘導体化したビーズに固定化し、アジドおよびＴＣＯで標識された記録タグに付着させることができる。
【１０４１】
巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）を固体支持体に付着させるための本明細書において提示される方法はまた、記録タグを固体支持体に付着させるまたは記録タグを巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）に付着させるためにも使用することができることが理解される。
【１０４２】
ある特定の実施形態では、結合性物質への非特異的吸収を最小限にするために、固体支持体の表面を不動態化（ブロッキング）する。「不動態化」された表面とは、結合性物質の非特異的結合を最小限にするために材料の外層で処理された表面を指す。表面を不動態化する方法としては、表面を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｐａｎら、２０１５年、Ｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｌ．、１２巻：０４５００６頁）、ポリシロキサン（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７）、星型ポリマー（例えば、星型ＰＥＧ）（Ｇｒｏｌｌら、２０１０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４７２巻：１〜１８頁）、疎水性ジクロロジメチルシラン（ＤＤＳ）＋自己組織化Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｈｕａら、２０１４年、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１１巻：１２３３〜１２３６頁）、およびダイヤモンド様炭素（ＤＬＣ）、ＤＬＣ＋ＰＥＧ（Ｓｔａｖｉｓら、２０１１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０８巻：９８３〜９８８頁）のようなポリマーで不動態化することを含めた、蛍光単一分子解析の文献からの標準の方法が挙げられる。共有結合性の表面修飾に加えて、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０のような界面活性物質、溶液中ポリシロキサン（Ｐｌｕｒｏｎｉｃシリーズ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ならびにＢＳＡおよびカゼインのようなタンパク質を含めたいくつもの不動態化剤を同様に使用することができる。あるいは、固体基板の表面上または容積内のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの密度を、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを固体基板に固定化する際に競合剤または「ダミー」反応性分子をスパイクすることによって調整することができる（例えば図３６Ａを参照されたい）。
【１０４３】
ある特定の実施形態では、多数の巨大分子を同じ固体支持体上に固定化する場合、例えば、結合性物質が第１の巨大分子に結合し、そのコーディングタグ情報が第１の巨大分子に付随する記録タグではなく近隣の巨大分子に付随する記録タグに移行する交差結合または分子間事象の発生を低減するまたはそれを防止するために、巨大分子の間に適切に間隔をあけることができる。固体支持体上の巨大分子の間隔（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの間隔）を制御するために、基板表面上の機能的カップリング基（例えば、ＴＣＯ）の密度を調整することができる（例えば図３４を参照されたい）。一部の実施形態では、固体支持体（例えば、多孔質支持体）の表面上または容積内で多数の巨大分子の間に約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約４００ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約１００ｎｍの距離で間隔をあける。一部の実施形態では、固体支持体の表面上で多数の巨大分子の間に少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、または少なくとも５００ｎｍの平均距離で間隔をあける。一部の実施形態では、固体支持体の表面上で多数の巨大分子の間に少なくとも５０ｎｍの平均距離で間隔をあける。一部の実施形態では、固体支持体の表面上または容積内で巨大分子の間に、経験的に分子内事象に対する分子間事象の相対的な頻度が＜１：１０；＜１：１００；＜１：１，０００；または＜１：１０，０００になるように間隔をあける。適切な間隔頻度は、機能アッセイを使用して経験的に決定することができ（例えば実施例２３を参照されたい）、希釈によっておよび／または基板表面上の部位への付着について競合する「ダミー」スペーサー分子をスパイクすることによって実現することができる。
【１０４４】
例えば、図３４に示されている通り、ＰＥＧ−５０００（ＭＷ  約５０００）を使用して、基板表面（例えば、ビーズ表面）上のペプチド間の間隙の空間をブロッキングする。さらに、ペプチドを同じくＰＥＧ−５０００分子に付着させた機能的部分とカップリングさせる。好ましい実施形態では、これは、ＮＨＳ−ＰＥＧ−５０００−ＴＣＯ＋ＮＨＳ−ＰＥＧ−５０００−メチルの混合物をアミン誘導体化ビーズにカップリングさせることによって実現される（例えば、図３４を参照されたい）。２つのＰＥＧ間（ＴＣＯ対メチル）の化学量論比をタイトレーションして、基板表面上の機能的カップリング部分（ＴＣＯ基）の適切な密度を生じさせる；メチル−ＰＥＧはカップリングに対して不活性である。ＴＣＯ基間の有効な間隔は、表面上のＴＣＯ基の密度を測定することによって算出することができる。ある特定の実施形態では、固体表面上のカップリング部分（例えば、ＴＣＯ）間の平均間隔は、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、または少なくとも５００ｎｍである。ビーズをＰＥＧ５０００−ＴＣＯ／メチルで誘導体化した後、表面上の過剰なＮＨ２基を反応性無水物（例えば、無水酢酸または無水コハク酸）阻害剤でクエンチする。
【１０４５】
特定の実施形態では、分析物分子および／または記録タグを、基板または支持体に、（ｉ）第１の分析物に結合しているコーディング物質（特に、その結合しているコーディング物質中のコーディングタグ）と（ｉｉ）第２の分析物および／もしくはその記録タグとの間の相互作用が低減される、最小限に抑えられる、または完全に消去されるような密度で、固定化する。したがって、「分子間」会合の結果として生じる偽陽性アッセイシグナルを低減させること、最小限に抑えること、または消去することができる。
【１０４６】
ある特定の実施形態では、基板上の分析物分子および／または記録タグの密度を分析物の各タイプについて決定する。例えば、変性ポリペプチド鎖が長いほど、「分子間」相互作用を防止するために存在すべき密度は低い。ある特定の態様では、分析物分子および／または記録タグ間の間隔の増大（すなわち、密度の低下）は、本開示のアッセイのシグナル対バックグラウンド比を増大させる。
【１０４７】
一部の実施形態では、分析物分子および／または記録タグを、約０．０００１分子／μｍ２、０．００１分子／μｍ２、０．０１分子／μｍ２、０．１分子／μｍ２、１分子／μｍ２、約２分子／μｍ２、約３分子／μｍ２、約４分子／μｍ２、約５分子／μｍ２、約６分子／μｍ２、約７分子／μｍ２、約８分子／μｍ２、約９分子／μｍ２、または約１０分子／μｍ２の平均密度で、基板上に堆積または固定化させる。他の実施形態では、分析物分子および／または記録タグを、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００、または約２００分子／μｍ２の平均密度で基板上に堆積または固定化する。他の実施形態では、分析物分子および／または記録タグを、約１分子／ｍｍ２、約１０分子／ｍｍ２、約５０分子／ｍｍ２、約１００分子／ｍｍ２、約１５０分子／ｍｍ２、約２００分子／ｍｍ２、約２５０分子／ｍｍ２、約３００分子／ｍｍ２、約３５０分子／ｍｍ２、４００分子／ｍｍ２、約４５０分子／ｍｍ２、約５００分子／ｍｍ２、約５５０分子／ｍｍ２、約６００分子／ｍｍ２、約６５０分子／ｍｍ２、約７００分子／ｍｍ２、約７５０分子／ｍｍ２、約８００分子／ｍｍ２、約８５０分子／ｍｍ２、約９００分子／ｍｍ２、約９５０分子／ｍｍ２、または約１０００分子／ｍｍ２の平均密度で堆積または固定化する。さらに他の実施形態では、分析物分子および／または記録タグを、約１×１０３〜約０．５×１０４分子／ｍｍ２の間、約０．５×１０４〜約１×１０４分子／ｍｍ２の間、約１×１０４〜約０．５×１０５分子／ｍｍ２の間、約０．５×１０５〜約１×１０５分子／ｍｍ２の間、約１×１０５〜約０．５×１０６分子／ｍｍ２の間、または約０．５×１０６〜約１×１０６分子／ｍｍ２の間の平均密度で、基板上に堆積または固定化する。他の実施形態では、基板上に堆積または固定化される分析物分子および／または記録タグの平均密度は、例えば、約１分子／ｃｍ２〜約５分子／ｃｍ２の間、約５〜約１０分子／ｃｍ２の間、約１０〜約５０分子／ｃｍ２の間、約５０〜約１００分子／ｃｍ２の間、約１００〜約０．５×１０３分子／ｃｍ２の間、約０．５×１０３〜約１×１０３分子／ｃｍ２の間、１×１０３および約０．５×１０４分子／ｃｍ２、約０．５×１０４〜約１×１０４分子／ｃｍ２の間、約１×１０４〜約０．５×１０５分子／ｃｍ２の間、約０．５×１０５〜約１×１０５分子／ｃｍ２の間、約１×１０５〜約０．５×１０６分子／ｃｍ２の間、または約０．５×１０６〜約１×１０６分子／ｃｍ２の間であり得る。
【１０４８】
ある特定の実施形態では、溶液中の結合性物質の濃度を、アッセイのバックグラウンドおよび／または偽陽性結果を低減させるように制御する。
【１０４９】
一部の実施形態では、結合性物質の濃度は、約０．０００１ｎＭ、約０．００１ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．１ｎＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約２００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１０００ｎＭである。他の実施形態では、アッセイに使用される可溶性コンジュゲートの濃度は、約０．０００１ｎＭ〜約０．００１ｎＭの間、約０．００１ｎＭ〜約０．０１ｎＭの間、約０．０１ｎＭ〜約０．１ｎＭの間、約０．１ｎＭ〜約１ｎＭの間、約１ｎＭ〜約２ｎＭの間、約２ｎＭ〜約５ｎＭの間、約５ｎＭ〜約１０ｎＭの間、約１０ｎＭ〜約２０ｎＭの間、約２０ｎＭ〜約５０ｎＭの間、約５０ｎＭ〜約１００ｎＭの間、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭの間、約２００ｎＭ〜約５００ｎＭの間、約５００ｎＭ〜約１０００ｎＭの間であるか、または約１０００ｎＭより高い。
【１０５０】
一部の実施形態では、可溶性結合性物質分子と固定化された分析物分子および／または記録タグとの間の比は、約０．００００１：１、約０．０００１：１、約０．００１：１、約０．０１：１、約０．１：１、約１：１、約２：１、約５：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約５５：１、約６０：１、約６５：１、約７０：１、約７５：１、約８０：１、約８５：１、約９０：１、約９５：１、約１００：１、約１０４：１、約１０５：１、約１０６：１であるか、もしくはそれより高いか、または上掲の比の間の任意の比である。可溶性結合性物質分子と固定化された分析物分子および／または記録タグとの間のより高い比を使用して、結合および／またはコーディングタグ／再コーディングタグ情報移行を完了に至らせることができる。これは、試料中の豊富さが低いタンパク質分析物の検出および／または解析に特に有用であり得る。
Ｄ．記録タグ
【１０５１】
一部の実施形態では、少なくとも１つの記録タグを巨大分子と直接または間接的に付随または共局在させ、固体支持体に接合させる（例えば、図５を参照されたい）。記録タグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、γＰＮＡ、ＧＮＡ、ＢＮＡ、ＸＮＡ、ＴＮＡ、保護されたＤＮＡもしくはＲＮＡ塩基、ポリヌクレオチド類似体、またはこれらの組合せを含み得る。記録タグは、一本鎖状であってもよく、または部分的にもしくは完全に二本鎖状であってもよい。記録タグは、平滑末端を有してもよく、または突出末端を有してもよい。ある特定の実施形態では、結合性物質が巨大分子に結合すると、結合性物質のコーディングタグの識別情報が記録タグに移行されて、伸長記録タグを生成する。伸長記録タグに対するさらなる伸長を後続の結合サイクルで生じさせることができる。
【１０５２】
記録タグは、固体支持体に、共有結合性の相互作用および非共有結合性の相互作用、またはそれらの任意の組合せを含めた当技術分野で公知の任意の手段によって直接または間接的に（例えば、リンカーを介して）接合させることができる。例えば、記録タグを固体支持体にライゲーション反応によって接合させることができる。あるいは、固体支持体は、記録タグを固体支持体に直接または間接的に接合させることを容易にするための作用物質またはコーティングを含んでよい。核酸分子を固体支持体（例えば、ビーズ）に固定化するための戦略は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９００，４８１号；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら（２００４年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、７３巻：５９７〜６０５頁）；Ｌｕｎｄら、１９８８年（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻：１０８６１〜１０８８０頁）；およびＳｔｅｉｎｂｅｒｇら（２００４年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、７３巻：５９７〜６０５頁）に記載されている。
【１０５３】
ある特定の実施形態では、巨大分子（例えば、ペプチド）と付随する記録タグの共局在は、巨大分子および記録タグを、固体支持体表面に直接付着させた二機能性リンカーとコンジュゲートすることによって実現される。Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら（２００４年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、７３巻：５９７〜６０５頁）。さらなる実施形態では、三機能性部分を使用して固体支持体（例えば、ビーズ）を誘導体化し、得られた二機能性部分を巨大分子および記録タグの両方とカップリングさせる。
【１０５４】
巨大分子および固体支持体の付着に関して記載されているものなどの方法および試薬（例えば、クリックケミストリー試薬および光親和性標識試薬）を記録タグの付着にも使用することができる。
【１０５５】
特定の実施形態では、単一の記録タグを巨大分子（例えば、ペプチド）に、例えば脱ブロッキングしたＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸に付着させることによって付着させる。別の実施形態では、多数の記録タグを巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）に、例えばリシン残基またはペプチド骨格に付着させる。一部の実施形態では、多数の記録タグで標識した巨大分子（例えば、タンパク質またはポリペプチド）を、それぞれが平均して１つの記録タグで標識された、より小さなペプチドに断片化または消化する。
【１０５６】
ある特定の実施形態では、記録タグは、任意選択の、ＵＭＩが付随する各巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド）についての一意の識別子タグをもたらす一意の分子識別子（ＵＭＩ）を含む。ＵＭＩは、約３〜約４０塩基、約３〜約３０塩基、約３〜約２０塩基、または約３〜約１０塩基、または約３〜約８塩基であってよい。一部の実施形態では、ＵＭＩは、約３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、または４０塩基の長さである。ＵＭＩを使用して、複数の伸長記録タグからの配列決定データをデコンボリューションして個々の巨大分子からの配列読み取りを識別することができる。一部の実施形態では、巨大分子のライブラリー内で、各巨大分子に単一の記録タグを付随させ、各記録タグが一意のＵＭＩを含む。他の実施形態では、記録タグの多数のコピーを単一の巨大分子に付随させ、記録タグの各コピーは同じＵＭＩを含む。一部の実施形態では、ＵＭＩは、結合性物質のコーディングタグ内のスペーサーまたはエンコーダー配列と、これらの成分を配列解析中に区別することを容易にするために、異なる塩基配列を有する。
【１０５７】
ある特定の実施形態では、記録タグは、例えば、存在する場合、ＵＭＩ以外のバーコードを含む。バーコードは、約３〜約３０塩基、約３〜約２５塩基、約３〜約２０塩基、約３〜約１０塩基、約３〜約１０塩基、約３〜約８塩基の長さの核酸分子である。一部の実施形態では、バーコードは、約３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、または３０塩基の長さである。一実施形態では、バーコードにより、複数の試料またはライブラリーのマルチプレックス配列決定が可能になる。バーコードを使用して、分配、画分、コンパートメント、試料、空間的位置、または巨大分子（例えば、ペプチド）が由来するライブラリーを識別することができる。バーコードを使用して、多重化された配列データをデコンボリューションし、個々の試料またはライブラリーからの配列読み取りを識別する。例えば、バーコードが付されたビーズは、試料のエマルジョンおよび分配を伴う方法に、例えば、プロテオームを分配するために、有用である。
【１０５８】
バーコードは、例えば液滴、マイクロウェル、固体支持体上の物理的領域などのコンパートメントに一意のバーコードが割り当てられたコンパートメントタグを表し得る。コンパートメントと特異的なバーコードの会合は、例えば、単一のバーコードが付されたビーズをコンパートメントに封入することによって、例えば、バーコードが付された液滴をコンパートメントに直接混合させるまたは添加することによって、バーコード試薬をコンパートメントに直接プリントまたは注射することによってなどの任意の数のやり方で実現することができる。コンパートメント内のバーコード試薬を使用して、コンパートメント特異的バーコードをコンパートメント内の巨大分子またはその断片に付加する。コンパートメント内へのタンパク質の分配に適用すると、バーコードを使用して、解析されるペプチドをコンパートメント内のそれらの起源であるタンパク質分子にマッピングし戻すことができる。これにより、タンパク質識別が著しく容易になる。コンパートメントバーコードを使用してタンパク質複合体を識別することもできる。
【１０５９】
他の実施形態では、コンパートメントの集団のサブセットを表す多数のコンパートメントにそのサブセットを表す一意のバーコードを割り当てることができる。
【１０６０】
あるいは、バーコードは、試料識別バーコードであってよい。試料バーコードは、単一反応容器中のまたは単一の固体基板または固体基板の集合（例えば、平面スライド、単一のチューブまたは容器などに含有されるビーズの集団）に固定化された試料のセットの多重化解析に有用である。多くの異なる試料由来の巨大分子を、試料特異的バーコードを有する記録タグで標識することができ、次いで、全ての試料を、固体支持体への固定化、周期的結合、および記録タグ解析の前に一緒にプールすることができる。あるいは、ＤＮＡによりコードされるライブラリー作成後まで試料を別々に保持し、ＤＮＡによりコードされるライブラリーのＰＣＲ増幅中に試料バーコードを付着させ、次いで、配列決定前に混合することができる。この手法は、豊富さのクラスが異なる分析物（例えば、タンパク質）をアッセイする場合に有用であり得る。例えば、試料を分割し、バーコードを付し、一方の部分を豊富さが低い分析物に対する結合性物質を使用して処理し、他方の部分を豊富さがより高い分析物に対する結合性物質を使用して処理することができる。特定の実施形態では、この手法は、特定のタンパク質分析物アッセイのダイナミックレンジをタンパク質分析物の標準の発現レベルの「スイートスポット」に入るように調整するのに役立つ。
【１０６１】
ある特定の実施形態では、多数の異なる試料に由来するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を、試料特異的バーコードを含有する記録タグで標識する。多試料バーコードが付されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を周期的結合反応前に混合することができる。このように、デジタル逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）に対する高度に多重化された代替物が有効に創出される（Ｇｕｏ、Ｌｉｕら、２０１２年、Ａｓｓａｄｉ、Ｌａｍｅｒｚら、２０１３年、Ａｋｂａｎｉ、Ｂｅｃｋｅｒら、２０１４年、ＣｒｅｉｇｈｔｏｎおよびＨｕａｎｇ、２０１５年）。デジタルＲＰＰＡ様アッセイの創出には、翻訳研究、バイオマーカー検証、薬物発見、臨床、および高精度の医療における多数の適用がある。
【１０６２】
ある特定の実施形態では、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位、例えば、フォワードまたは５’ユニバーサルプライミング部位を含む。ユニバーサルプライミング部位は、ライブラリー増幅反応をプライミングするためおよび／または配列決定のために使用することができる核酸配列である。ユニバーサルプライミング部位としては、これだけに限定されないが、ＰＣＲ増幅のためのプライミング部位、フローセル表面上の相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングするフローセルアダプター配列（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシング）、配列決定プライミング部位、またはこれらの組合せを挙げることができる。ユニバーサルプライミング部位は、約１０塩基〜約６０塩基であってよい。一部の実施形態では、ユニバーサルプライミング部位は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ５プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ−３’−配列番号１３３）またはＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ７プライマー（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−３’−配列番号１３４）を含む。
【１０６３】
ある特定の実施形態では、記録タグは、その末端、例えば３’末端にスペーサーを含む。本明細書で使用される場合、記録タグに関してスペーサー配列への言及は、その同類結合性物質に付随するスペーサー配列、またはその同類結合性物質に付随するスペーサー配列と相補的なスペーサー配列と同一のスペーサー配列を含む。記録タグ上の末端、例えば３’スペーサーにより、第１の結合サイクル中に同類結合性物質の識別情報をそのコーディングタグから記録タグに移行させることが可能になる（例えば、プライマー伸長または粘着末端ライゲーションのための相補的なスペーサー配列のアニーリングによって）。
【１０６４】
一実施形態では、スペーサー配列は、約１〜２０塩基の長さ、約２〜１２塩基の長さ、または５〜１０塩基の長さである。スペーサーの長さは、コーディングタグ情報を記録タグに移行させるためのプライマー伸長反応の温度および反応条件などの因子に依存し得る。
【１０６５】
好ましい実施形態では、記録タグ内のスペーサー配列を、記録タグ内の他の領域に対して最小の相補性を有するように設計する；同様に、コーディングタグ内のスペーサー配列はコーディングタグ内の他の領域に対して最小の相補性を有するべきである。言い換えれば、記録タグおよびコーディングタグのスペーサー配列は、記録タグまたはコーディングタグ内に存在する一意の分子識別子、バーコード（例えば、コンパートメント、分配、試料、空間的位置）、ユニバーサルプライマー配列、エンコーダー配列、サイクル特異的配列などの成分に対して最小の配列相補性を有するべきである。
【１０６６】
結合性物質スペーサーについて記載されている通り、一部の実施形態では、巨大分子のライブラリーに付随する記録タグは、共通のスペーサー配列を共有する。他の実施形態では、巨大分子のライブラリーに付随する記録タグは、それらの同類結合性物質の結合サイクル特異的スペーサー配列と相補的な結合サイクル特異的スペーサー配列を有し、これは、非連鎖状伸長記録タグを使用する場合に有用であり得る（図１０を参照されたい）。
【１０６７】
伸長記録タグの収集物は、事後に連鎖状にすることができる（例えば、図１０を参照されたい）。結合サイクルが完了した後、ビーズ固体支持体であって、各ビーズが平均してビーズ当たり１つまたは１つ未満の巨大分子を有し、各巨大分子が巨大分子の部位に共局在する伸長記録タグの収集物を有するビーズ固体支持体をエマルジョン中に入れる。エマルジョンは、各液滴が平均して最大で１ビーズによって占められるように形成する。任意選択のアセンブリＰＣＲ反応をエマルジョン中で実施してビーズ上の巨大分子と共局在する伸長記録タグを増幅し、それらを別の伸長記録タグの異なるサイクル特異的配列間のプライミングによって共直線的な順序でアセンブルさせる（Ｘｉｏｎｇ、Ｐｅｎｇら、２００８年）。その後、エマルジョンを破壊し、アセンブルした伸長記録タグを配列決定する。
【１０６８】
別の実施形態では、ＤＮＡ記録タグは、第１の結合サイクルに特異的なユニバーサルプライミング配列（Ｕ１）、１つまたは複数のバーコード配列（ＢＣｓ）、およびスペーサー配列（Ｓｐ１）で構成される。第１の結合サイクルでは、結合性物質はＳｐ１相補的スペーサー、エンコーダーバーコード、および任意選択のサイクルバーコード、および第２のスペーサーエレメント（Ｓｐ２）で構成されるＤＮＡコーディングタグを使用する。少なくとも２つの異なるスペーサーエレメントを使用することの有用性は、第１の結合サイクルにより潜在的に複数のＤＮＡ記録タグのうちの１つが選択され、単一のＤＮＡ記録タグが伸長し、その結果、伸長ＤＮＡ記録タグの最後に新しいＳｐ２スペーサーエレメントがもたらされることである。第２の結合サイクルおよびその後の結合サイクルでは、結合性物質は、Ｓｐ１’ではなくＳｐ２’スペーサーだけを含有する。このように、第１のサイクルからの単一の伸長記録タグのみがその後のサイクルで伸長する。別の実施形態では、第２のサイクルおよびその後のサイクルに結合性物質特異的スペーサーを使用することができる。
【１０６９】
一部の実施形態では、記録タグは、５’から３’の方向に、ユニバーサルフォワード（または５’）プライミング配列、ＵＭＩ、およびスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、記録タグは、５’から３’の方向に、ユニバーサルフォワード（または５’）プライミング配列、任意選択のＵＭＩ、バーコード（例えば、試料バーコード、分配バーコード、コンパートメントバーコード、空間バーコード、またはそれらの任意の組合せ）、およびスペーサー配列を含む。一部の他の実施形態では、記録タグは、５’から３’の方向に、ユニバーサルフォワード（または５’）プライミング配列、バーコード（例えば、試料バーコード、分配バーコード、コンパートメントバーコード、空間バーコード、またはそれらの任意の組合せ）、任意選択のＵＭＩ、およびスペーサー配列を含む。
【１０７０】
改変ＤＮＡおよびＰＮＡからＵＭＩを生成するためにコンビナトリアル手法を使用することができる。一実施例では、ＵＭＩは、互いに直交性になるように設計された短いワード配列（４〜１５ｍｅｒ）のセットの「化学的ライゲーション」によって構築することができる（ＳｐｉｒｏｐｕｌｏｓおよびＨｅｅｍｓｔｒａ、２０１２年）。「ワード」ポリマーの化学的ライゲーションを導くためにＤＮＡ鋳型を使用する。ＤＮＡ鋳型は、単に溶液中で副成分を一緒に混合することによってコンビナトリアル鋳型構造をアセンブルすることを可能にするハイブリダイズアームを用いて構築する（例えば図１２Ｃを参照されたい）。ある特定の実施形態では、この設計には「スペーサー」配列は存在しない。ワードスペースのサイズは、１０ワードから１０，０００またはそれよりも多くのワードまで変動し得る。ある特定の実施形態では、ワードは、交差ハイブリダイズはしないように互いとは異なるが、それでも比較的均一なハイブリダイゼーション条件が保たれるように選択する。一実施形態では、ワードの長さは、およそ１０塩基であり、サブセット内に約１０００ワードを有する（これは、全１０ｍｅｒワードスペースのたった０．１％である、約４１０＝百万ワード）。これらのワードのセット（サブセット内に１０００）を連鎖状にして、複雑さ＝１０００ｎパワーの最終的なコンビナトリアルＵＭＩを生成することができる。連鎖状にした４つのワードに関しては、これにより、１０１２種の異なるエレメントのＵＭＩ多様性が生じる。これらのＵＭＩ配列を巨大分子（ペプチド、タンパク質など）に単一分子レベルで付加する。一実施形態では、ＵＭＩの多様性は、ＵＭＩを付着させる巨大分子の分子数を超える。このように、ＵＭＩにより、目的の巨大分子が一意的に識別される。コンビナトリアルワードＵＭＩの使用により、多数塩基長のワードを読み取るために一塩基分解能は必要ないので、エラー率が高いシーケンサー（例えば、ナノポアシーケンサー、ナノギャップトンネリングシーケンシングなど）での読み取りが容易になる。コンビナトリアルワード手法は、コンパートメントタグ、分配バーコード、空間バーコード、試料バーコード、エンコーダー配列、サイクル特異的配列、およびバーコードなどの、他の同一性に関する情報価値のある記録タグまたはコーディングタグの成分を生成するためにも使用することができる。ナノポアシーケンシングに関する方法およびエラー許容性ワード（コード）を有する情報をコードするＤＮＡは、当技術分野で公知である（例えば、それぞれ、その全体が参照により組み込まれる、Ｋｉａｈら、２０１５年、Ｃｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ．  ＩＥＥＥ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｏｒｙ  （ＩＳＩＴ）；Ｇａｂｒｙｓら、２０１５年、Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｌｅｅ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｃｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｏｒａｇｅ．  ＩＥＥＥ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｏｒｙ  （ＩＳＩＴ）；Ｌａｕｒｅら、２０１６年、Ｃｏｄｉｎｇ  ｉｎ  ２Ｄ：  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｔｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ��ｏ  Ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｃｏｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｂａｒｃｏｄｅｓ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１６０５２７９；Ｙａｚｄｉら、２０１５年、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｃａｌｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１巻：２３０〜２４８頁；およびＹａｚｄｉら、２０１５年、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ、５巻：１４１３８頁を参照されたい）。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかにおける伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグ構築物は、エラー訂正コードである識別成分（例えば、ＵＭＩ、エンコーダー配列、バーコード、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列など）で構成される。一部の実施形態では、エラー訂正コードは、Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｌｅｅ距離コード、非対称Ｌｅｅ距離コード、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎコード、およびＬｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓコードから選択される。ナノポアシーケンシングに関しては、電流またはイオンフラックスプロファイルおよび非対称の塩基呼び出しエラーは使用されるナノポアの型および生化学的性質に内因するものであり、上述のエラー訂正手法を使用してよりロバストなＤＮＡコードを設計するためにこの情報を使用することができる。ロバストなＤＮＡナノポアシーケンシングバーコードの使用に対する代替として、バーコード配列の電流またはイオンフラックスシグネチャを直接使用し（その全体が参照により組み込まれる、米国特許第７，０６０，５０７号）、それによりＤＮＡ塩基呼び出しを完全に回避し、バーコード配列を、Ｌａｓｚｌｏら（２０１４年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２巻：８２９〜８３３頁、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている通り、予測される電流／フラックスシグネチャにマッピングし戻すことによってすぐに識別することができる。この論文において、Ｌａｓｚｌｏらは、生物学的ナノポア、ＭｓｐＡから、異なるワードのつながりをナノポアを通過させた時に生じる電流シグネチャ、ならびに、得られた電流シグネチャを配列のユニバースからの可能性のある電流シグネチャのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測にマッピングし戻すことによってＤＮＡ鎖をマッピングおよび識別する能力について記載している（２０１４年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２巻：８２９〜８３３頁）。同様の概念を、ＤＮＡコードおよびナノギャップトンネル電流に基づくＤＮＡ配列決定によって生じる電気信号に適用することができる（Ｏｈｓｈｉｒｏら、２０１２年、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ、２巻：５０１頁）。
【１０７１】
したがって、ある特定の実施形態では、コーディングタグ、記録タグ、またはその両方の識別成分は、一意の電流またはイオンフラックスまたは光学的シグネチャを生成することが可能であり、本明細書において提示される方法のいずれかの解析ステップは、識別成分を識別するために一意の電流またはイオンフラックスまたは光学的シグネチャを検出することを含む。一部の実施形態では、識別成分は、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列、またはそれらの任意の組合せから選択される。
【１０７２】
ある特定の実施形態では、試料中の巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）の全量または実質的な量（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）を記録タグで標識する。巨大分子の標識は、巨大分子を固体支持体に固定化する前に行うこともでき、その後に行うこともできる。
【１０７３】
他の実施形態では、試料中の巨大分子のサブセット（例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）を記録タグで標識する。特定の実施形態では、試料由来の巨大分子のサブセットに記録タグを用いて標的化（分析物特異的）標識を行う。タンパク質の標的化記録タグ標識は、相補的な標的特異的ベイト配列、例えば記録タグ内の分析物特異的バーコードとアニーリングする短い標的特異的ＤＮＡ捕捉用プローブ、例えば分析物特異的バーコードと連結した標的タンパク質特異的結合性物質（例えば、抗体、アプタマーなど）を使用して実現することができる（例えば図２８Ａを参照されたい）。記録タグは、標的タンパク質上に存在する同類の反応性部分（例えば、クリックケミストリー標識、光親和性標識）に対する反応性部分を含む。例えば、記録タグは、アルキンで誘導体化されたタンパク質と相互作用させるためのアジド部分を含んでよい、または、記録タグは、ネイティブなタンパク質で相互作用させるためのベンゾフェノンを含んでよい、などである（例えば図２８Ａ〜Ｂを参照されたい）。標的タンパク質に標的タンパク質特異的結合性物質を結合させたら、記録タグおよび標的タンパク質をそれらの対応する反応性部分を介してカップリングさせる（例えば図２８Ｂ〜Ｃを参照されたい）。標的タンパク質を記録タグで標識した後、標的タンパク質特異的結合性物質を、標的タンパク質特異的結合性物質に連結したＤＮＡ捕捉用プローブの消化によって除去することができる。例えば、ＤＮＡ捕捉用プローブをウラシル塩基が含有されるように設計することができ、次いでこれを、ウラシル特異的切除試薬（例えば、ＵＳＥＲ（商標））を用いた消化の標的とし、標的タンパク質特異的結合性物質を標的タンパク質から解離させることができる。
【１０７４】
一実施例では、標的タンパク質のセットに特異的な抗体を、相補的なベイト配列（例えば、図２８の分析物バーコードＢＣＡの）を用いて設計した記録タグとハイブリダイズするＤＮＡ捕捉用プローブ（例えば、図２８の分析物バーコードＢＣＡ）で標識することができる。タンパク質の試料特異的標識は、試料特異的バーコードを含む記録タグ上の相補的なベイト配列とハイブリダイズするＤＮＡ捕捉用プローブで標識された抗体を使用することによって実現することができる。
【１０７５】
別の例では、標的タンパク質特異的アプタマーを試料中のタンパク質のサブセットの標的化記録タグ標識のために使用する。標的特異的アプタマーを、記録タグ内の相補的なベイト配列とアニーリングするＤＮＡ捕捉用プローブに連結する。記録タグは、対応する反応性部分を有する標的タンパク質とカップリングするための反応性化学プローブまたは光反応性化学プローブ（例えば、ベンゾフェノン（ＢＰ））を含む。アプタマーがその標的タンパク質分子に結合し、記録タグが標的タンパク質の極めて近傍になり、その結果、記録タグと標的タンパク質がカップリングする。
【１０７６】
小分子タンパク質親和性リガンドに付着させた光反応性化学プローブを使用した光親和性（ＰＡ）タンパク質標識は以前記載されている（Ｐａｒｋ，  Ｋｏｈら、２０１６年）。典型的な光反応性化学プローブとしては、以前に記載されている照射波長の下で活性化されたベンゾフェノンに基づくプローブ（反応性ジラジカル、３６５ｎｍ）、フェニルジアジリンに基づくプローブ（反応性炭素、３６５ｎｍ）、およびアジ化フェニルに基づくプローブ（反応性ニトレンフリーラジカル、２６０ｎｍ）が挙げられる（ＳｍｉｔｈおよびＣｏｌｌｉｎｓ、２０１５年）。好ましい実施形態では、タンパク質試料中の標的タンパク質を、Ｌｉらにより開示された、ベンゾフェノンで標識した記録タグ内のベイト配列を同類結合性物質（例えば、核酸アプタマー（例えば図２８を参照されたい））に付着させたＤＮＡ捕捉用プローブとハイブリダイズさせる方法（Ｌｉ、Ｌｉｕら、２０１３年）を使用して試料バーコードを含む記録タグで標識する。光親和性標識されたタンパク質標的に関しては、光親和性部分により標的タンパク質ではなく抗体が自己標識される可能性があるので、抗体よりもＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーを標的タンパク質特異的結合性物質として使用することが好ましい。対照的に、光親和性標識は、核酸に対してはタンパク質よりも効率が低く、それにより、ＤＮＡ指向性化学標識または光標識についてはアプタマーがより良好なビヒクルになる。光親和性標識と同様に、Ｒｏｓｅｎら（Ｒｏｓｅｎ、Ｋｏｄａｌら、２０１４年、Ｋｏｄａｌ、Ｒｏｓｅｎら、２０１６年）記載されているものと同様に、アプタマー結合性部位の近傍にある反応性リシン（または他の部分）のＤＮＡ指向性化学標識を使用することもできる。
【１０７７】
上述の実施形態では、標的特異的結合性物質と記録タグを連結するために、ハイブリダイゼーションに加えて他の型の連結を使用することができる（例えば図２８Ａを参照されたい）。例えば、図２８Ｂに示されている通り、２つの部分を、捕捉された標的タンパク質（または他の巨大分子）が記録タグと共有結合したら、切断され、結合性物質を放出するように設計されたリンカーを使用して共有結合により連結することができる。適切なリンカーを記録タグの様々な位置、例えば、３’末端、または記録タグの５’末端に付着させたリンカー内などに付着させることができる。
Ｅ．結合性物質およびコーディングタグ
【１０７８】
一態様では、本明細書に記載のキットは、分析物、例えば巨大分子、に結合することが可能な結合性物質を含む。結合性物質は、巨大分子の成分もしくは特徴部に結合することが可能な任意の分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子など）であってよい。結合性物質は、天然に存在するものであってもよく、合成的に産生されたものであってもよく、組換え発現された分子であってもよい。結合性物質は、巨大分子の単一の単量体またはサブユニット（例えば、ペプチドの単一のアミノ酸）に結合することもあり、または巨大分子の多数の連結したサブユニット（例えば、より長いペプチド分子のジペプチド、トリペプチド、またはより高次のペプチド）に結合することもある。
【１０７９】
ある特定の実施形態では、結合性物質を、共有結合により結合するように設計することができる。共有結合は、正確な部分への結合が条件付けられるまたはそれが有利になるように設計することができる。例えば、ＮＴＡＡおよびその同類のＮＴＡＡ特異的結合性物質はそれぞれ、ＮＴＡＡ特異的結合性物質が同類のＮＴＡＡに結合したらカップリング反応が行われてこれら２つの間に共有結合性の連結が生じるように、反応性基を用いて修飾することができる。同類の反応性基を欠く他の位置への結合性物質の非特異的結合では共有結合による付着はもたらされない。結合性物質とその標的の間の共有結合により、非特異的に結合した結合性物質を除去するためによりストリンジェントな洗浄を使用することが可能になり、したがって、アッセイの特異度が増大する。
【１０８０】
ある特定の実施形態では、結合性物質は、選択的結合性物質であってよい。本明細書で使用される場合、選択的結合とは、結合性物質が、特異的なリガンド（例えば、アミノ酸またはアミノ酸のクラス）に、異なるリガンド（例えば、アミノ酸またはアミノ酸のクラス）への結合と比べて優先的に結合できることを指す。選択性は、一般に、結合性物質との複合体において１つのリガンドが別のリガンドで置換される反応についての平衡定数とされる。一般には、そのような選択性は、リガンドの空間的な幾何学的形状ならびに／またはリガンドが結合性物質に結合する様式および程度、例えば、水素結合またはファンデルワールス力（非共有結合性の相互作用）によるもしくは可逆的または非可逆的な共有結合による、結合性物質への付着などに関連付けられる。選択性は、絶対的なものとは対照的に相対的なものであってよいこと、および、リガンド濃度を含めた種々の因子が選択性に影響を及ぼし得ることも理解されるべきである。したがって、一実施例では、結合性物質は、２０種の標準のアミノ酸のうちの１種に選択的に結合する。非選択的結合の例では、結合性物質は、２０種の標準のアミノ酸のうちの２種またはそれよりも多くに結合し得る。
【１０８１】
本明細書に開示されているキットおよび方法の実施において、巨大分子の特徴部または成分に選択的に結合する結合性物質の能力は、結合性物質のコーディングタグ情報の巨大分子に付随する記録タグへの移行、記録タグ情報のコーディングタグへの移行、またはコーディングタグ情報および記録タグ情報のジタグ分子への移行を可能にするために十分なものでありさえすればよい。したがって、選択的にとは、巨大分子が暴露される他の結合性物質と比較してそうでありさえすればよい。結合性物質の選択性が、特定のアミノ酸に対して絶対的なものである必要はなく、非極性側鎖もしくは極性でない側鎖を有するアミノ酸、または電気的に（正にもしくは負に）荷電した側鎖を有するアミノ酸、または芳香族側鎖を有するアミノ酸などのアミノ酸のクラスに、あるいは側鎖の何らかの特異的なクラスまたはサイズなどに選択的なものであってよいことも理解されるべきである。
【１０８２】
特定の実施形態では、結合性物質は、目的の巨大分子に対して高い親和性および高い選択性を有する。特に、低い解離速度を伴う高い結合親和性がコーディングタグと記録タグの間の情報移行に効果的である。ある特定の実施形態では、結合性物質は、約５０ｎＭのもしくはそれ未満の、約１０ｎＭのもしくはそれ未満の、約５ｎＭのもしくはそれ未満の、約１ｎＭのもしくはそれ未満の、約０．５ｎＭのもしくはそれ未満の、または約０．１ｎＭのもしくはそれ未満のＫｄを有する。ある特定の実施形態では、結合性物質をそのＫｄの＞１０×、＞１００×、または＞１０００×の濃度で巨大分子に添加して結合を完了に至らせる。単一のタンパク質分子への抗体の結合カイネティクスに関する詳細な考察は、Changら（Chang, Rissin et al. 2012）に記載されている。
【１０８３】
結合性物質の、ペプチドの小さなＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）に対する親和性を増大させるために、ＮＴＡＡを、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）などの「免疫原性」ハプテンで修飾することができる。これは、ＤＮＰ基をＮＴＡＡのアミン基に付着させるサンガー試薬であるジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を使用して周期的な配列決定手法で実行することができる。商業的な抗ＤＮＰ抗体は、低ｎＭ範囲（約８ｎＭ、ＬＯ−ＤＮＰ−２）で親和性を有する（Ｂｉｌｇｉｃｅｒ，  Ｔｈｏｍａｓら、２００９年）；そのように、ＤＮＰで（ＤＮＦＢを介して）修飾されたいくつものＮＴＡＡに対して親和性が高いＮＴＡＡ結合性物質を操作し、同時に特定のＮＴＡＡに対する良好な結合選択性を実現することが可能であるはずなのは当然である。別の例では、ＮＴＡＡを、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）を使用してスルホニルニトロフェノール（ＳＮＰ）で修飾することができる。アセチル基またはアミジニル（グアニジニル）基などの代替的なＮＴＡＡ修飾因子を用いて同様の親和性の増強を実現することもできる。
【１０８４】
ある特定の実施形態では、結合性物質は、ペプチド分子のＮＴＡＡ、ＣＴＡＡ、介在するアミノ酸、ジペプチド（２つのアミノ酸の配列）、トリペプチド（３つのアミノ酸の配列）、またはより高次のペプチドに結合し得る。一部の実施形態では、結合性物質のライブラリー内の各結合性物質は、特定のアミノ酸、例えば、２０種の標準の天然に存在するアミノ酸のうちの１種に選択的に結合する。標準の、天然に存在するアミノ酸としては、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）が挙げられる。
【１０８５】
ある特定の実施形態では、結合性物質は、アミノ酸の翻訳後修飾に結合し得る。一部の実施形態では、ペプチドは、１つまたは複数の翻訳後修飾を含み、これは、同じものであっても異なるものであってもよい。ペプチドのＮＴＡＡ、ＣＴＡＡ、介在するアミノ酸、またはこれらの組合せを翻訳後に修飾することができる。アミノ酸に対する翻訳後修飾としては、アシル化、アセチル化、アルキル化（メチル化を含む）、ビオチン化、ブチリル化、カルバミル化、カルボニル化、脱アミド化、脱イミノ化、ジフタミド形成、ジスルフィド架橋形成、エリミニル化、フラビン付着、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）、ヘムＣ付着、ヒドロキシル化、ハイプシン形成、ヨウ素化、イソプレニル化、脂質付加、リポイル化、マロニル化、メチル化、ミリストイル化、酸化、パルミトイル化、ペグ化、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、プレニル化、プロピオニル化、レチニリデンシッフ塩基形成、Ｓ−グルタチオン化、Ｓ−ニトロシル化、Ｓ−スルフェニル化、セレン化、サクシニル化、スルフィン化、ユビキチン化、およびＣ末端アミド化が挙げられる（ＳｅｏおよびＬｅｅ、２００４年、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３７巻：３５〜４４頁も参照されたい）。
【１０８６】
ある特定の実施形態では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのグリコシル化の状態を検出するための結合性物質としてレクチンを使用する。レクチンは、遊離の炭水化物または糖タンパク質のグリカンエピトープを選択的に認識することができる炭水化物−結合性タンパク質である。種々のグリコシル化の状態（例えば、コア−フコース、シアル酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ラクトサミン、マンノース、Ｎ−アセチル−グルコサミン）を認識するレクチンの一覧は、Ａ、ＡＡＡ、ＡＡＬ、ＡＢＡ、ＡＣＡ、ＡＣＧ、ＡＣＬ、ＡＯＬ、ＡＳＡ、ＢａｎＬｅｃ、ＢＣ２Ｌ−Ａ、ＢＣ２ＬＣＮ、ＢＰＡ、ＢＰＬ、Ｃａｌｓｅｐａ、ＣＧＬ２、ＣＮＬ、Ｃｏｎ、ＣｏｎＡ、ＤＢＡ、Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ、ＤＳＡ、ＥＣＡ、ＥＥＬ、Ｆ１７ＡＧ、Ｇａｌ１、Ｇａｌ１−Ｓ、Ｇａｌ２、Ｇａｌ３、Ｇａｌ３Ｃ−Ｓ、Ｇａｌ７−Ｓ、Ｇａｌ９、ＧＮＡ、ＧＲＦＴ、ＧＳ−Ｉ、ＧＳ−ＩＩ、ＧＳＬ−Ｉ、ＧＳＬ−ＩＩ、ＨＨＬ、ＨＩＨＡ、ＨＰＡ、Ｉ、ＩＩ、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＢＡ、ＬＣＡ、ＬＥＡ、ＬＥＬ、Ｌｅｎｔｉｌ、Ｌｏｔｕｓ、ＬＳＬ−Ｎ、ＬＴＬ、ＭＡＡ、ＭＡＨ、ＭＡＬ＿Ｉ、Ｍａｌｅｃｔｉｎ、ＭＯＡ、ＭＰＡ、ＭＰＬ、ＮＰＡ、Ｏｒｙｓａｔａ、ＰＡ−ＩＩＬ、ＰＡ−ＩＬ、ＰＡＬａ、ＰＨＡ−Ｅ、ＰＨＡ−Ｌ、ＰＨＡ−Ｐ、ＰＨＡＥ、ＰＨＡＬ、ＰＮＡ、ＰＰＬ、ＰＳＡ、ＰＳＬ１ａ、ＰＴＬ、ＰＴＬ−Ｉ、ＰＷＭ、ＲＣＡ１２０、ＲＳ−Ｆｕｃ、ＳＡＭＢ、ＳＢＡ、ＳＪＡ、ＳＮＡ、ＳＮＡ−Ｉ、ＳＮＡ−ＩＩ、ＳＳＡ、ＳＴＬ、ＴＪＡ−Ｉ、ＴＪＡ−ＩＩ、ＴｘＬＣＩ、ＵＤＡ、ＵＥＡ−Ｉ、ＵＥＡ−ＩＩ、ＶＦＡ、ＶＶＡ、ＷＦＡ、ＷＧＡを含む（Ｚｈａｎｇら、２０１６年、ＭＡＢＳ、８巻：５２４〜５３５頁を参照されたい）。
【１０８７】
ある特定の実施形態では、結合性物質は、修飾または標識されたＮＴＡＡに結合し得る。修飾または標識されたＮＴＡＡは、ＰＩＴＣ、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ−Ｃｌ、もしくは１−ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニルクロリド）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、アセチル化試薬、グアニジニル化試薬、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、またはチオベンジル化試薬で標識されているものであり得る。
【１０８８】
ある特定の実施形態では、結合性物質は、アプタマー（例えば、ペプチドアプタマー、ＤＮＡアプタマー、またはＲＮＡアプタマー）、抗体、アンチカリン、ＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼアダプタータンパク質（ＣｌｐＳ）、抗体結合性断片、抗体模倣物、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、またはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、γＰＮＡ、架橋核酸（ＢＮＡ）、異種核酸（ＸＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、またはトレオース核酸（ＴＮＡ）、またはそのバリアント）であってよい。
【１０８９】
本明細書で使用される場合、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）および抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）という用語は、広範な意味で使用され、インタクトな抗体分子、例えば、これだけに限定されないが、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、および免疫グロブリンＭだけでなく、少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する抗体分子の任意の免疫反応性成分（複数可）も含む。抗体は、天然に存在するものであってもよく、合成的に作製されたものであってもよく、組換えによって発現させたものであってもよい。抗体は、融合タンパク質であってよい。抗体は、抗体模倣物であってよい。抗体の例としては、これだけに限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）、ミニボディ（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、架橋結合した抗体断片、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）、ナノボディ、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ分子、アルファボディ、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）、サイクロチド、分子などが挙げられる。抗体工学またはタンパク質工学技法を使用して得られる免疫反応性産物もまた、明白に抗体という用語の意味の範囲内に入る。関連するプロトコールを含めた抗体および／またはタンパク質工学の詳細な説明は、他の場所の中でも、Ｊ．  ＭａｙｎａｒｄおよびＧ．  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ、２０００年、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．、２巻：３３９〜７６頁；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｒ．  ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳ．  Ｄｕｂｅｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２００１年）；米国特許第５，８３１，０１２号；およびＳ．  Ｐａｕｌ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）において見いだすことができる。
【１０９０】
抗体と同様に、ペプチドを特異的に認識する核酸およびペプチドアプタマーは、公知の方法を使用して作製することができる。アプタマーは、標的分子に、高度に特異的な、コンフォメーション依存性様式で結合し、一般には、非常に高い親和性を有するが、より低い結合親和性を有するアプタマーも所望であれば選択することができる。アプタマーは、標的間を、メチル基またはヒドロキシル基が存在するかしないかなどの非常に小さな構造的差異に基づいて区別することが示されており、また、ある特定のアプタマーは、Ｄ−鏡像異性体とＬ−鏡像異性体を区別することができる。薬物、金属イオン、および有機色素、ペプチド、ビオチン、ならびに、これだけに限定されないが、ストレプトアビジン、ＶＥＧＦ、およびウイルスタンパク質を含めたタンパク質を含めた小分子標的に結合するアプタマーが得られている。アプタマーは、ビオチン化の後、フルオレセイン標識の後、ならびにガラス表面およびマイクロスフェアに付着した際に機能活性を保持することが示されている（Ｊａｙａｓｅｎａ、１９９９年、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４５巻：１６２８〜５０頁；Ｋｕｓｓｅｒ、２０００年、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４巻：２７〜３９頁；Ｃｏｌａｓ、２０００年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、４巻：５４〜９頁を参照されたい）。アルギニンおよびＡＭＰに特異的に結合するアプタマーも記載されている（ＰａｔｅｌおよびＳｕｒｉ、２０００年、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７４巻：３９〜６０頁を参照されたい）。特定のアミノ酸に結合するオリゴヌクレオチドアプタマーがＧｏｌｄら（１９９５年、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４巻：７６３〜９７頁）に開示されている。アミノ酸に結合するＲＮＡアプタマーも記載されている（ＡｍｅｓおよびＢｒｅａｋｅｒ、２０１１年、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．、８巻；８２〜８９頁；Ｍａｎｎｉｒｏｎｉら、２０００年、ＲＮＡ、６巻：５２０〜２７頁；Ｆａｍｕｌｏｋ、１９９４年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１１６巻：１６９８〜１７０６頁）。
【１０９１】
結合性物質は、天然に存在するまたは合成的に産生されたタンパク質を、アミノ酸配列内に１つまたは複数の変異が導入されるように遺伝子工学によって操作することにより修飾して、巨大分子の特定の成分もしくは特徴部（例えば、ＮＴＡＡ、ＣＴＡＡ、または翻訳後修飾されたアミノ酸またはペプチド）に結合する操作されたタンパク質を生じさせることによって、作製することができる。例えば、エキソペプチダーゼ（例えば、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ）、エキソプロテアーゼ、変異エキソプロテアーゼ、変異アンチカリン、変異ＣｌｐＳ、抗体、またはｔＲＮＡ合成酵素を修飾して、特定のＮＴＡＡに選択的に結合する結合性物質を創出することができる。別の例では、カルボキシペプチダーゼを修飾して、特定のＣＴＡＡに選択的に結合する結合性物質を創出することができる。結合性物質を、修飾されたＮＴＡＡまたは修飾されたＣＴＡＡ、例えば、翻訳後修飾（例えば、リン酸化ＮＴＡＡまたはリン酸化ＣＴＡＡ）を有するもの、または標識（例えば、ＰＴＣ、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢを使用して）で、ダンシルクロリドで（ＤＮＳ−Ｃｌ、もしくは１−ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニルクロリドを使用して）、またはチオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、アセチル化試薬、アミジン化（グアニジニル化）試薬もしくはチオベンジル化試薬を使用して修飾されたものに特異的に結合するように設計または修飾し、利用することもできる。タンパク質の定向進化のための戦略は、当技術分野で公知であり（例えば、Yuan et al., 2005, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69:373-392によって概説されている）、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＣＩＳディスプレイ、ＣＡＤディスプレイ、エマルジョン、細胞表面ディスプレイ法、酵母表面ディスプレイ、細菌表面ディスプレイなどを含む。
【１０９２】
一部の実施形態では、修飾されたＮＴＡＡに選択的に結合する結合性物質を利用することができる。例えば、ＮＴＡＡをフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）と反応させてフェニルチオカルバモイル−ＮＴＡＡ誘導体を形成することができる。このように、結合性物質をフェニルチオカルバモイル部分のフェニル基ならびにＮＴＡＡのアルファ炭素Ｒ基のどちらにも選択的に結合するように適合させることができる。このように、ＰＩＴＣを使用することにより、以下に考察する通り、その後の、ＮＴＡＡのエドマン分解による切断が可能になる。別の実施形態では、ＮＴＡＡをサンガー試薬（ＤＮＦＢ）と反応させて、ＤＮＰで標識されたＮＴＡＡを生成することができる（例えば図３を参照されたい）。任意選択で、ＤＮＦＢを、ＤＮＦＢが高度に可溶性である１−エチル−３−メチルイミダゾリウムビス［（トリフルオロメチル）スルホニル］イミド（［エミン］［Ｔｆ２Ｎ］）などのイオン性液体と共に使用する。このように、結合性物質を、ＤＮＰとＮＴＡＡのＲ基の組合せに選択的に結合するように操作することができる。ＤＮＰ部分の付加により、結合性物質とＮＴＡＡの相互作用に対するより大きな「ハンドル」がもたらされ、より高い親和性相互作用が導かれるはずである。さらに別の実施形態では、結合性物質は、ＤＮＰで標識されたＮＴＡＡを認識し、それによりペプチドのアミノペプチダーゼ分解の周期的制御がもたらされるように操作されたアミノペプチダーゼであってよい。ＤＮＰで標識されたＮＴＡＡが切断されたら、新しく露出したＮＴＡＡへの結合およびその切断のためにＤＮＦＢ誘導体化の別のサイクルを実施する。好ましい特定の実施形態では、アミノペプチダーゼは、単量体メタロ−プロテアーゼであり、そのようなアミノペプチダーゼは亜鉛によって活性化される（ＣａｌｃａｇｎｏおよびＫｌｅｉｎ、２０１６年）。別の例では、結合性物質は、例えば４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）を使用することによってスルホニルニトロフェノール（ＳＮＰ）で修飾されたＮＴＡＡに選択的に結合し得る。さらに別の実施形態では、結合性物質は、アセチル化されたまたはアミジン化されたＮＴＡＡに選択的に結合し得る。
【１０９３】
ＮＴＡＡを修飾するために使用することができる他の試薬としては、トリフルオロエチルイソチオシアネート、イソチオシアン酸アリル、およびジメチルアミノアゾベンゼンイソチオシアネートが挙げられる。
【１０９４】
結合性物質を、修飾されたＮＴＡＡに対する高い親和性、修飾されたＮＴＡＡに対する高い特異性、またはその両方のために操作することができる。一部の実施形態では、結合性物質を、ファージディスプレイを使用して有望な親和性足場の定向進化によって開発することができる。中等度からより低い親和性の結合性物質については、同時の結合／エンコーディングステップを使用することにより効率的な情報移行を果たすことができ、または代替的に、エンコーディングもしくは情報書き込みステップの温度を低下させて、結合性物質の解離速度を緩徐化することができる。一部の実施形態では、同時の結合／エンコーディングステップを、エンコーディングもしくは情報書き込みステップの温度低下と組み合わせることができる。一部の実施形態では、分析物への結合性部分の最初の結合後、結合性物質の結合性部分を、例えば架橋剤により、分析物に（直接または間接的に）共有結合させて、結合性物質の解離速度を緩徐化することができる。これは、中等度からより低い親和性の結合性物質に有用であり得る。
【１０９５】
個々のまたは小さな群の標識（ビオチン化）されたＮＴＡＡに結合し、それを切断する操作されたアミノペプチダーゼ変異体が記載されている（その全体が参照により組み込まれる、例えばＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０６５３２２号を参照されたい）。アミノペプチダーゼは、タンパク質またはペプチドのＮ末端からアミノ酸を切断する酵素である。天然のアミノペプチダーゼは、非常に限られた特異性を有し、一般的に、Ｎ末端アミノ酸を前進的に切断し、アミノ酸を次々に切断する（Ｋｉｓｈｏｒら、２０１５年、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４８８巻：６〜８頁）。しかし、残基特異的アミノペプチダーゼが同定されている（Ｅｒｉｑｕｅｚら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８０年、１２巻：６６７〜７１頁；Ｗｉｌｃｅら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９５巻：３４７２〜３４７７頁；Ｌｉａｏら、２００４年、Ｐｒｏｔ．  Ｓｃｉ．、１３巻：１８０２〜１０頁）。アミノペプチダーゼを、特定の部分（例えば、ＰＴＣ、ＤＮＰ、ＳＮＰなど）で標識された、標準のアミノ酸を表す２０種の異なるＮＴＡＡに特異的に結合するように操作することができる。ペプチドのＮ末端の段階的分解の制御は、標識の存在下でのみ活性な（例えば、結合活性または触媒活性）、操作されたアミノペプチダーゼを使用することによって実現される。別の例では、Ｈａｖｒａｎａｋら（米国特許公開第２０１４／０２７３００４号）が、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）を特異的なＮＴＡＡ結合物質として操作することに関して記載している。ａａＲＳのアミノ酸結合ポケットは、同類のアミノ酸に結合する内因性の能力を有するが、一般に、不十分な結合親和性および特異性を示す。さらに、これらの天然のアミノ酸結合物質はＮ末端標識を認識しない。ａａＲＳ足場の定向進化を使用して、Ｎ末端標識に関してＮ末端アミノ酸を認識する、親和性がより高く、特異性がより高い結合性物質を生成することができる。
【１０９６】
別の例では、高度に選択的な操作されたＣｌｐＳも文献に記載されている。Emiliらは、ＮＴＡＡにアスパラギン酸、アルギニン、トリプトファンおよびロイシン残基に対して選択的に結合する能力を有する４つの異なるバリアントが得られる結果となる、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣｌｐＳタンパク質のファージディスプレイによる定向進化を記載している（その全体が参照により組み込まれる、米国特許第９，５６６，３３５号）。一実施形態では、結合性物質の結合性部分は、天然のＮ末端タンパク質認識および結合に関与するアダプタータンパク質の進化的に保存されるＣｌｐＳファミリーのメンバーまたはそのバリアントを含む。細菌におけるアダプタータンパク質のＣｌｐＳファミリーは、Schuenemannet al., (2009), "Structural basis of N-end rule substrate recognition inEscherichia coli by the ClpAP adaptor protein ClpS," EMBO Reports 10(5)、およびRoman-Hernandezet al., (2009), "Molecular basis of substrate selection by the N-end ruleadaptor protein ClpS," PNAS 106(22):8888-93に記載されている。Guo et al., (2002),JBC 277(48): 46753-62、およびWang et al., (2008), "The molecular basis ofN-end rule recognition," Molecular Cell 32: 406-414も参照されたい。一部の実施形態では、Schuenemannet al.に規定されているＣｌｐＳ疎水性結合ポケットに対応するアミノ酸残基を、所望の選択性を有する結合性部分を生成するように修飾する。ＣｌｐＳファミリーメンバーは、ＣｌｐＳ１  ＲＰＡ１２０３、ＣｌｐＳ２  ｂｌｌ５１５４、ＣｌｐＳ２  ＲＰＡ３１４８、ＣｌｐＳ  ＢＡＶ２０９１、ＣｌｐＳ  ＢＰ２７５６、ＣｌｐＳ  ＥＣＰ＿０８９６、ＣｌｐＳ  ＥＣＳＥ＿０９３９、ＣｌｐＳ  ＳＧ１１０１、ＣｌｐＳ  ＳＣＯ２９１６、ＳＣＥ１９Ａ．１６ｃ、ＣｌｐＳ  Ｓｐｕｔｗ３１８１＿１７８１、ＣｌｐＳ  ＶＣ＿１１４３、ＣｌｐＳ  ＷＳ０３３６、ＣｌｐＳ  ＸＣＣ１９６６、ＣｌｐＳ  Ｔｃｒ＿１１１１、ＣｌｐＳ  ＴＤＥ＿２１２３、ＣｌｐＳ  ＺＭＯ１７２５、ＣｌｐＳ１  ｂｌｌ２６３６、ＣｌｐＳ  ＢＣＡＮ＿Ａ１１８８、ＣｌｐＳ  ＢａｍＭＣ４０６＿２４３７、ＣｌｐＳ  Ｂａｍｂ＿２５６７、ＣｌｐＳ  ＢＭＡ１０２４７＿２１５７、ＣｌｐＳ  ＢＭＡＳＡＶＰ１＿Ａ０５７５、ＣｌｐＳ  ＢＵＲＰＳ１１０６Ａ＿０９６３、ＣｌｐＳ  Ｂｃｅｐ１８０８＿２５９７、ＣｌｐＳ  ＣＣＮＡ＿０２５５２、およびその断片、バリアント、変異体、ホモログまたは修飾バージョンを含むが、これらに限定されない。
【１０９７】
一実施形態では、結合性物質の結合性部分は、Stein et al., (2016),"Structural Basis of an N-Degron Adaptor with More StringentSpecificity," Structure 24(2): 232-242において開示されているものなどの、ＣｌｐＳ２タンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されているＣｌｐＳタンパク質またはポリペプチドは、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣｌｐＳ２（例えば、配列番号１９８）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣｌｐＳ（例えば、配列番号１９９）および／またはＣ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣｌｐＳ（例えば、配列番号２００）などの参照ＣｌｐＳタンパク質またはポリペプチドと配列同一性を共有する、バリアント、変異体、ホモログまたは修飾バージョンを含む。一態様では、結合性物質の結合性部分は、配列番号１９８と、配列番号１９９と、および／または配列番号２００と約１０％配列同一性、約１５％配列同一性、約２０％配列同一性、約２５％配列同一性、約３０％配列同一性、約３５％配列同一性、約４０％配列同一性、約４５％配列同一性、約５０％配列同一性、約５５％配列同一性、約６０％配列同一性、約６５％配列同一性、約７０％配列同一性、約７５％配列同一性、約８０％配列同一性、約８５％配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％配列同一性、または約１００％配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【１０９８】
一実施形態では、結合性部分は、ＵＢＲボックス認識配列ファミリーのメンバー、またはＵＢＲボックス認識配列ファミリーのバリアントを含む。ＵＢＲ認識ボックスは、Tasaki et al., (2009), JBC 284(3): 1884-95に記載されている。例えば、結合性部分は、ＵＢＲ１、ＵＢＲ２、またはその変異体、バリアントもしくはホモログを含み得る。
【１０９９】
ある特定の実施形態では、結合性物質は、結合性部分に加えて、蛍光標識などの１つまたは複数の検出可能な標識をさらに含む。一部の実施形態では、結合性物質は、コーディングタグなどのポリヌクレオチドを含まない。必要に応じて、結合性物質は、合成または天然抗体を含む。一部の実施形態では、結合性物質は、アプタマーを含む。一実施形態では、結合性物質は、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＣｌｐＳ結合性ポリペプチドのバリアントなどの、アダプタータンパク質のＣｌｐＳファミリーの修飾されたメンバーなどの、ポリペプチドと、検出可能な標識とを含む。一実施形態では、検出可能な標識は、光学的に検出可能である。一部の実施形態では、検出可能な標識は、蛍光部分、色分けされたナノ粒子、量子ドットまたはこれらの任意の組合せを含む。一実施形態では、標識は、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ（商標）、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ、フルオレセイン、ローダミン、誘導体化ローダミン色素、例えばＴＡＭＲＡ、リン光体、ポリメタジン色素、蛍光ホスホロアミダイト、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ、緑色蛍光タンパク質、アクリジン、シアニン、シアニン５色素、シアニン３色素、５−（２’−アミノエチル）−アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、ＢＯＤＩＰＹ、１２０  ＡＬＥＸＡまたは前述のもののいずれかについての誘導体もしくは修飾体などの、コア色素分子を包含するポリスチレン色素を含む。一実施形態では、検出可能な標識は、光退色に対して耐性である上に、高いシグナル対ノイズ比で、一意の、容易に検出可能な波長で、沢山のシグナル（例えば、光子）を生じさせる。
【１１００】
特定の実施形態では、アンチカリンを、標識されたＮＴＡＡ（例えば、ＤＮＰ、ＳＮＰ、アセチル化など）に対する高い親和性および高い特異性の両方について操作する。アンチカリン足場のある特定の変形は、ベータバレル構造に起因して、単一のアミノ酸への結合に適した形状を有する。Ｎ末端アミノ酸（修飾を伴うまたは伴わない）は、この「ベータバレル」バケットに潜在的に適合し、認識され得る。操作された新規の結合活性を有する親和性が高いアンチカリンが記載されている（Ｓｋｅｒｒａ、２００８年、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２７５巻：２６７７〜２６８３頁によって概説されている）。例えば、フルオレセインおよびジゴキシゲニンに対して親和性が高い結合性（低ｎＭ）を有するアンチカリンが操作されている（ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ、２０１２年）。新しい結合機能のために代替的足場を操作することについては、Ｂａｎｔａら（２０１３年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．、１５巻：９３〜１１３頁）によっても概説されている。
【１１０１】
所与の一価の結合性物質の機能的親和性（結合活性）を、一価の結合性物質の二価またはより高次の多量体を使用することによって少なくとも１桁分だけ増大させることができる（ＶａｕｑｕｅｌｉｎおよびＣｈａｒｌｔｏｎ、２０１３年）。結合活性とは、多数の同時に存在する非共有結合性の相互作用の蓄積された強度を指す。個々の結合相互作用は容易に解離し得る。しかし、多数の結合相互作用が同時に存在する場合、単一の結合相互作用の一過性の解離では結合性タンパク質は発散せず、結合相互作用は回復する可能性がある。結合性物質の結合活性を増大させるための代替的方法は、結合性物質に付着させるコーディングタグと巨大分子に付随させる記録タグに相補配列を含めることである。
【１１０２】
一部の実施形態では、修飾されたＣ末端アミノ酸（ＣＴＡＡ）に選択的に結合する結合性物質を利用することができる。カルボキシペプチダーゼは、遊離のカルボキシル基を含有する末端アミノ酸を切断するプロテアーゼである。いくつものカルボキシペプチダーゼがアミノ酸の優先性を示し、例えば、カルボキシペプチダーゼＢは、アルギニンおよびリシンなどの塩基性アミノ酸において優先的に切断する。カルボキシペプチダーゼを改変して、特定のアミノ酸に選択的に結合する結合性物質を創出することができる。一部の実施形態では、カルボキシペプチダーゼを、修飾部分ならびにＣＴＡＡのアルファ炭素Ｒ基のどちらにも選択的に結合するように操作することができる。したがって、操作されたカルボキシペプチダーゼは、Ｃ末端標識に関連して標準のアミノ酸を表す２０種の異なるＣＴＡＡを特異的に認識し得る。ペプチドのＣ末端からの段階的分解の制御は、標識の存在下でのみ活性な（例えば、結合活性または触媒活性）操作されたカルボキシペプチダーゼを使用することによって実現される。一実施例では、ＣＴＡＡをパラ−ニトロアニリド基または７−アミノ−４−メチルクマリニル基によって修飾することができる。
【１１０３】
本明細書に記載の方法において使用するための結合物質を生成するために操作することができる他の潜在的な足場としては、アンチカリン、アミノ酸ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）、ＣｌｐＳ、Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、Ｔ細胞受容体、ジンクフィンガータンパク質、チオレドキシン、ＧＳＴ  Ａ１−１、ＤＡＲＰｉｎ、アフィマー、アフィチン、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＨＰＳＴＩ、細胞内抗体、リポカリン、ＰＨＤ−フィンガー、Ｖ（ＮＡＲ）ＬＤＴＩ、エビボディ（ｅｖｉｂｏｄｙ）、Ｉｇ（ＮＡＲ）、ノッチン、マキシボティ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ネオカルジノスタチン、ｐＶＩＩＩ、テンダミスタット、ＶＬＲ、プロテインＡ足場、ＭＴＩ−ＩＩ、エコチン、ＧＣＮ４、Ｉｍ９、クニッツドメイン、ミクロボディ、ＰＢＰ、トランスボディ（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）、テトラネクチン（ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）、ＷＷドメイン、ＣＢＭ４−２、ＤＸ−８８、ＧＦＰ、ｉＭａｂ、Ｌｄｌ受容体ドメインＡ、Ｍｉｎ−２３、ＰＤＺ−ドメイン、トリ膵臓ポリペプチド、カリブドトキシン／１０Ｆｎ３、ドメイン抗体（Ｄａｂ）、ａ２ｐ８アンキリンリピート、昆虫防御Ａペプチド、設計されたＡＲタンパク質、Ｃ型レクチンドメイン、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Ｓｒｃ相同性ドメイン３（ＳＨ３）、またはＳｒｃ相同性ドメイン２（ＳＨ２）が挙げられる。
【１１０４】
結合性物質を、より高い温度および穏やかな変性条件（例えば、尿素、グアニジンチオシアネート、イオン溶液の存在など）に耐えるように操作することができる。変性剤の使用は、結合性物質の直鎖ペプチドエピトープへの結合に干渉する可能性がある、表面に結合したペプチドの二次構造、例えば、α−ヘリックス構造、β−ヘアピン、β−鎖、および他のこのような構造などを低減するのに役立つ。一実施形態では、結合サイクル中にペプチド二次構造を低減するために１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（［ＥＭＩＭ］＋［ＡＣＥ］）などのイオン性液体を使用する（Ｌｅｓｃｈ、Ｈｅｕｅｒら、２０１５年）。
【１１０５】
記載されている任意の結合性物質はまた、結合性物質に関する識別情報を含有するコーディングタグも含む。コーディングタグは、それが付随する結合性物質に関する一意の識別情報をもたらす約３塩基〜約１００塩基の核酸分子である。コーディングタグは、約３〜約９０塩基、約３〜約８０塩基、約３〜約７０塩基、約３〜約６０塩基、約３塩基〜約５０塩基、約３塩基〜約４０塩基、約３塩基〜約３０塩基、約３塩基〜約２０塩基、約３塩基〜約１０塩基、または約３塩基〜約８塩基を含み得る。一部の実施形態では、コーディングタグは、約３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、５５塩基、６０塩基、６５塩基、７０塩基、７５塩基、８０塩基、８５塩基、９０塩基、９５塩基、または１００塩基の長さである。コーディングタグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド類似体、またはこれらの組合せで構成されるものであってよい。ポリヌクレオチド類似体は、ＰＮＡ、ガンマＰＮＡ、ＢＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノポリヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、アルキルリボシル置換ポリヌクレオチド、ホスホロチオエートポリヌクレオチド、および７−デアザプリン類似体を含む。
【１１０６】
コーディングタグは、付随する結合性物質に関する識別情報をもたらすエンコーダー配列を含む。エンコーダー配列は、約３塩基〜約３０塩基、約３塩基〜約２０塩基、約３塩基〜約１０塩基、または約３塩基〜約８塩基である。一部の実施形態では、エンコーダー配列は、約３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、または３０塩基の長さである。エンコーダー配列の長さにより、生成され得る一意のエンコーダー配列の数が決定される。コード配列が短いほど、生成される一意のコード配列の数が少なくなり、これは、少数の結合性物質を使用する場合に有用であり得る。巨大分子の集団を解析する場合にはより長いエンコーダー配列が望ましい可能性がある。例えば、５塩基のエンコーダー配列は式５’−ＮＮＮＮＮ−３’（配列番号１３５）（式中、Ｎは任意の天然に存在するヌクレオチドまたは類似体であってよい）を有する。４種の天然に存在するヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧを使用すると、５塩基の長さを有する一意のエンコーダー配列の総数は１，０２４になる。一部の実施形態では、例えば、塩基が全て同一であるか、少なくとも３つの連続した塩基が同一であるか、またはその両方であるエンコーダー配列を除くことにより、一意のエンコーダー配列の総数を減らすことができる。特定の実施形態では、≧５０種の一意のエンコーダー配列のセットを結合性物質ライブラリーに使用する。
【１１０７】
一部の実施形態では、コーディングタグまたは記録タグの識別成分、例えば、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、分配バーコード、試料バーコード、空間的領域バーコード、サイクル特異的配列またはそれらの任意の組合せを、Ｈａｍｍｉｎｇ距離、Ｌｅｅ距離、非対称Ｌｅｅ距離、Ｒｅｅｄ−Ｓｏｌｏｍｏｎ、Ｌｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ−Ｔｅｎｅｎｇｏｌｔｓ、または同様のエラー訂正方法に供する。Ｈａｍｍｉｎｇ距離は、長さが等しい２つのつながりの間の異なる位置の数を指す。Ｈａｍｍｉｎｇ距離により、１つのつながりを他のつながりに変えるために必要な置換の最小数が測定される。Ｈａｍｍｉｎｇ距離は、妥当な距離があいたエンコーダー配列を選択することによってエラーを訂正するために使用することができる。したがって、エンコーダー配列が５塩基である例では、使用できるエンコーダー配列の数は２５６種の一意のエンコーダー配列に減少する（１→４４エンコーダー配列のＨａｍｍｉｎｇ距離＝２５６種のエンコーダー配列）。別の実施形態では、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、サイクル特異的配列、またはそれらの任意の組合せを、周期的な脱コーディングプロセスによって容易に読み取られるように設計する（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ、２００４年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１４巻：８７０〜７頁）。別の実施形態では、エンコーダー配列、バーコード、ＵＭＩ、コンパートメントタグ、分配バーコード、空間バーコード、試料バーコード、サイクル特異的配列、またはそれらの任意の組合せを、一塩基分解能が必要なのではなく、多数の塩基のワード（約５〜２０塩基の長さ）を読み取る必要があるので、正確度の低いナノポアシーケンシングによって読み取られるように設計する。本開示の方法において使用することができる１５ｍｅｒのエラー訂正Ｈａｍｍｉｎｇバーコードのサブセットは配列番号１〜６５に記載されており、それらの対応する逆相補的な配列は配列番号６６〜１３０に記載されている。
【１１０８】
一部の実施形態では、結合性物質のライブラリー内の一意の結合性物質のそれぞれが一意のエンコーダー配列を有する。例えば、２０種の一意のエンコーダー配列を２０種の標準のアミノ酸に結合する２０種の結合性物質のライブラリーに使用することができる。修飾されたアミノ酸（例えば、翻訳後修飾されたアミノ酸）を識別するために追加的なコーディングタグ配列を使用することができる。別の例では、３０種の一意のエンコーダー配列を２０種の標準のアミノ酸および１０種の翻訳後修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、メチル化アミノ酸）に結合する３０種の結合性物質のライブラリーに使用することができる。他の実施形態では、２種またはそれよりも多くの異なる結合性物質が同じエンコーダー配列を共有してよい。例えば、それぞれが異なる標準のアミノ酸に結合する２種の結合性物質が同じエンコーダー配列を共有してよい。
【１１０９】
ある特定の実施形態では、コーディングタグは、一方の末端または両方の末端にスペーサー配列をさらに含む。スペーサー配列は、約１塩基〜約２０塩基、約１塩基〜約１０塩基、約５塩基〜約９塩基、または約４塩基〜約８塩基である。一部の実施形態では、スペーサーは、約１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基または２０塩基の長さである。一部の実施形態では、コーディングタグ内のスペーサーは、エンコーダー配列よりも短い、例えば、エンコーダー配列よりも少なくとも１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６、塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、２０塩基、または２５塩基短い。他の実施形態では、コーディングタグ内のスペーサーは、エンコーダー配列と同じ長さである。ある特定の実施形態では、スペーサーは、結合性物質特異的であり、したがって、前の結合サイクルからのスペーサーは現行の結合サイクルにおいて適切な結合性物質からのスペーサーとのみ相互作用する。例は、両方の抗体が巨大分子に逐次的に結合する場合にのみ情報移行を可能にするスペーサー配列を含有する同類の抗体の対である。スペーサー配列は、プライマー伸長反応のためのプライマーアニーリング部位、またはライゲーション反応における副子もしくは粘着末端として使用することができる。コーディングタグ上の５’スペーサー（例えば図５Ａ、「＊Ｓｐ’」を参照されたい）は、Ｔｍを上昇させるために、記録タグ上の３’スペーサーに対する偽性相補的塩基を任意選択で含有してよい（Ｌｅｈｏｕｄら、２００８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３６巻：３４０９〜３４１９頁）。
【１１１０】
一部の実施形態では、結合性物質の集合内のコーディングタグは、アッセイに使用される共通のスペーサー配列を共有する（例えば、多数の結合サイクル方法に使用される結合性物質のライブラリー全体がそれらのコーディングタグに共通のスペーサーを有する）。別の実施形態では、コーディングタグは、特定の結合サイクルを識別する結合サイクルタグで構成される。他の実施形態では、結合性物質のライブラリー内のコーディングタグは、結合サイクル特異的スペーサー配列を有する。一部の実施形態では、コーディングタグは、結合サイクル特異的スペーサー配列を１つ含む。例えば、第１の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル１」特異的スペーサー配列を含み、第２の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル２」特異的スペーサー配列を含み、「ｎ」回の結合サイクルまで同様である。さらなる実施形態では、第１の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル１」特異的スペーサー配列および「サイクル２」特異的スペーサー配列を含み、第２の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル２」特異的スペーサー配列および「サイクル３」特異的スペーサー配列を含み、「ｎ」回の結合サイクルまで同様である。この実施形態は、結合サイクルが完了した後の非連鎖状伸長記録タグのＰＣＲアセンブリに有用である（例えば図１０を参照されたい）。一部の実施形態では、スペーサー配列は、プライマー伸長反応または粘着末端ライゲーション反応を開始するために記録タグまたは伸長記録タグ内の相補的なスペーサー配列とアニーリングするのに十分な数の塩基を含む。
【１１１１】
記録タグの集団が巨大分子に付随する場合、サイクル特異的スペーサー配列を使用してコーディングタグの情報を単一の記録タグ上に連鎖状にすることもできる。第１の結合サイクルでコーディングタグからランダムに選択された記録タグに情報を移行させ、その後の結合サイクルではサイクル依存性スペーサー配列を使用して伸長記録タグのみをプライミングすることができる。より詳細には、第１の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル１」特異的スペーサー配列および「サイクル２」特異的スペーサー配列を含み、第２の結合サイクルで使用される結合性物質に対するコーディングタグは「サイクル２」特異的スペーサー配列および「サイクル３」特異的スペーサー配列を含み、「ｎ」回の結合サイクルまで同様である。第１の結合サイクルからの結合性物質のコーディングタグは、相補的なサイクル１特異的スペーサー配列を介して記録タグとアニーリングすることが可能である。コーディングタグ情報が記録タグに移行したら、結合サイクル１の最後に、サイクル２特異的スペーサー配列が伸長記録タグの３’末端に位置する。第２の結合サイクルからの結合性物質のコーディングタグは、相補的なサイクル２特異的スペーサー配列を介して伸長記録タグとアニーリングすることが可能である。コーディングタグ情報が伸長記録タグに移行したら、結合サイクル２の最後に、サイクル３特異的スペーサー配列が伸長記録タグの３’末端に位置し、「ｎ」回の結合サイクルまで同様である。この実施形態は、多数の結合サイクルの中で特定の結合サイクルにおける結合情報の移行が前の結合サイクルを経た（伸長）記録タグ上でのみ起こるものとする。しかし、時には、結合性物質は同類の巨大分子に結合し損ねる。「追跡」ステップとして各結合サイクル後に結合サイクル特異的スペーサーを含むオリゴヌクレオチドを使用して、結合サイクルの事象が失敗したとしても結合サイクルを同期させたままにすることができる。例えば、同類結合性物質が結合サイクル１の間に巨大分子に結合し損ねた場合、結合サイクル１後に、サイクル１特異的スペーサー、サイクル２特異的スペーサーの両方、および「ヌル」エンコーダー配列を含むオリゴヌクレオチドを使用する追跡ステップを追加する。「ヌル」エンコーダー配列は、エンコーダー配列、または、例えば、「ヌル」結合サイクルを正に識別する特異的なバーコードが存在しないことであってよい。「ヌル」オリゴヌクレオチドは、記録タグとサイクル１特異的スペーサーを介してアニーリングすることが可能であり、サイクル２特異的スペーサーが記録タグに移行される。したがって、結合サイクル１事象の失敗にもかかわらず、結合サイクル２からの結合性物質が伸長記録タグとサイクル２特異的スペーサーを介してアニーリングすることが可能である。「ヌル」オリゴヌクレオチドにより、伸長記録タグ内で結合サイクル１に結合事象失敗の印が付けられる。
【１１１２】
好ましい実施形態では、結合サイクル特異的エンコーダー配列をコーディングタグに使用する。結合サイクル特異的エンコーダー配列は、完全に一意の分析物（例えば、ＮＴＡＡ）−結合サイクルエンコーダーバーコードを使用することによって、または分析物（例えば、ＮＴＡＡ）エンコーダー配列とサイクル特異的バーコードを接合させた組合せ使用によってのいずれかで実現することができる（例えば図３５を参照されたい）。組合せ手法を使用することの有利な点は、設計する必要がある総バーコードがより少なくなることである。１０サイクルにわたって使用する２０種の分析物結合性物質のセットに対しては、２０種の分析物エンコーダー配列バーコードおよび１０種の結合サイクル特異的バーコードのみを設計する必要がある。対照的に、結合サイクルが結合性物質エンコーダー配列に直接埋め込まれる場合には、合計２００種の独立したエンコーダーバーコードを設計する必要があり得る。結合サイクル情報をエンコーダー配列に直接埋め込むことの利点は、ナノポア読み取りにエラー訂正バーコードを使用する場合にコーディングタグの全長を最小化することができることである。エラー耐性バーコードの使用により、配列決定プラットフォームおよびよりエラーが生じやすい手法を使用して高度に正確なバーコード識別が可能になるが、迅速な解析スピード、低費用、および／またはよりポータブルな器械使用などの他の利点がある。そのような例の１つは、ナノポアに基づく配列決定読み取りである。
【１１１３】
一部の実施形態では、コーディングタグは、結合性物質の近位にある第２の（３’）スペーサー配列内の切断可能なまたはニッキング可能なＤＮＡ鎖を含む（例えば図３２を参照されたい）。例えば、３’スペーサーは、ウラシル特異的切除試薬（ＵＳＥＲ）によってニッキングすることができる１つまたは複数のウラシル塩基を有してよい。ＵＳＥＲにより、ウラシルの位置に一ヌクレオチドギャップが生成される。別の例では、３’スペーサーは、２重鎖の一方の鎖のみを加水分解するニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列を含んでよい。例えば、３’スペーサー配列を切断またはニッキングするために使用する酵素は、一方のＤＮＡ鎖のみ（コーディングタグの３’スペーサー）に作用し、したがって、（伸長）記録タグに属する２重鎖内の他方の鎖はインタクトなまま残される。これらの実施形態は、プライマー伸長が起こった後に結合性物質を（伸長）記録タグから変性によらずに除去し、その後の結合サイクルに利用可能な一本鎖ＤＮＡスペーサー配列を伸長記録タグ上に残すことが可能になるので、タンパク質をそれらのネイティブなコンフォメーションで解析するアッセイにおいて特に有用である。
【１１１４】
コーディングタグは、パリンドローム配列を含有するように設計することもできる。コーディングタグにパリンドローム配列を含めることにより、新生の成長している伸長記録タグが、コーディングタグ情報が移行するに従ってそれ自体でフォールディングすることが可能になる。伸長記録タグはより緻密な構造にフォールディングし、望ましくない分子間結合およびプライマー伸長事象が有効に減少する。
【１１１５】
一部の実施形態では、コーディングタグは、同じ分析物を認識する結合性物質を用いて以前に伸長した記録タグ上でのみプライミング伸長することが可能な分析物特異的スペーサーを含む。伸長記録タグは、分析物特異的スペーサーおよびエンコーダー配列を含むコーディングタグを使用して一連の結合事象から組み立てることができる。一実施形態では、第１の結合事象では、一般的な３’スペーサープライマー配列および次の結合サイクルで使用するための５’末端の分析物特異的スペーサー配列で構成されるコーディングタグを伴う結合性物質を使用する；次いで、その後の結合サイクルでは、コードされる分析物特異的３’スペーサー配列を伴う結合性物質を使用する。この設計により、正確な一連の同類結合事象のみから創出される増幅可能なライブラリーエレメントがもたらされる。オフターゲットのおよび交差反応性結合相互作用により、増幅可能でない伸長記録タグが導かれる。一実施例では、同類結合性物質と特定の巨大分子分析物の対を２つの結合サイクルに使用して分析物を識別する。第１の同類結合性物質は、一般的な記録タグのスペーサー配列上でのプライミング伸長のための一般的なスペーサー３’配列および次の結合サイクルで使用される５’末端のコードされる分析物特異的スペーサーで構成されるコーディングタグを含有する。対応する同類結合性物質対に関しては、第２の結合性物質の３’分析物特異的スペーサーと第１の結合性物質の５’分析物特異的スペーサーを対応させる。このように、結合性物質の同類の対の正確な結合によってのみ、増幅可能な伸長記録タグがもたらされる。交差反応性結合性物質は記録タグ上でプライミング伸長することができず、増幅可能な伸長記録タグ産物は生成しない。この手法では、本明細書に開示されている方法の特異性が著しく増強される。同じ原理を、３つの結合サイクルを使用するトリプレット結合性物質セットに適用することができる。第１の結合サイクルでは、記録タグ上の一般的な３’Ｓｐ配列と結合性物質コーディングタグ上の一般的なスペーサーを相互作用させる。プライマー伸長により、分析物特異的５’スペーサーを含めたコーディングタグ情報を記録タグに移行させる。その後の結合サイクルでは、結合性物質のコーディングタグ上の分析物特異的スペーサーを使用する。
【１１１６】
ある特定の実施形態では、コーディングタグは、コーディングタグが連結した結合性物質についての一意の分子識別子をさらに含んでよい。結合性物質についてのＵＭＩは、配列決定読み取りのために伸長コーディングタグまたはジタグ分子を利用し、エンコーダー配列と組み合わせて、結合性物質の同一性および巨大分子に対する一意の結合事象の数に関する情報をもたらす実施形態において有用であり得る。
【１１１７】
別の実施形態では、コーディングタグは、ランダム化配列（Ｎのセット、ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔからのランダムな選択、またはワードのセットからのランダムな選択である）を含む。一連の「ｎ」回の結合サイクルおよびコーディングタグ情報の（伸長）記録タグへの移行の後、最終的な伸長記録タグ産物は、一連のこれらのランダム化配列で構成され、これは、最終的な伸長記録タグについての「複合性の」一意の分子識別子（ＵＭＩ）を集合的に形成する。例えば、各コーディングタグが（ＮＮ）配列（４＊４＝１６の可能性のある配列）を含有する場合、１０回の配列決定サイクル後に、分布した２ｍｅｒの組合せセットが１０種形成され、可能性のある伸長記録タグ産物についての複合性のＵＭＩ配列１６１０〜１０１２種という総多様性が創出される。ペプチド配列決定実験で約１０９個の分子を使用するとすれば、この多様性は、配列決定実験のための有効なＵＭＩのセットを創出するために十分すぎるほどである。多様性の増大は、単にコーディングタグ内により長いランダム化領域（ＮＮＮ、ＮＮＮＮなど）を使用することによって実現することができる。
【１１１８】
コーディングタグは、３’スペーサー配列の３’末端に組み入れられたターミネーターヌクレオチドを含んでよい。結合性物質が巨大分子およびそれらの対応するコーディングタグに結合し、記録タグが相補的なスペーサー配列を介してアニーリングした後、情報をコーディングタグから記録タグに移行させるため、または情報を記録タグからコーディングタグに移行させるためにプライマー伸長することが可能になる。コーディングタグの３’末端にターミネーターヌクレオチドを付加することにより、記録タグ情報のコーディングタグへの移行が防止される。伸長コーディングタグの生成を伴う本明細書に記載の実施形態に関しては、例えば、コーディングタグ情報の記録タグへの移行を防止するために、記録タグの３’末端にターミネーターヌクレオチドを含める場合があることが理解される。
【１１１９】
コーディングタグは、一本鎖分子であってもよく、二本鎖分子であってもよく、部分的に二本鎖であってもよい。コーディングタグは、平滑末端、突出末端、またはその一方を含んでよい。一部の実施形態では、コーディングタグは、部分的に二本鎖であり、それにより、コーディングタグが成長している伸長記録タグの内部のエンコーダーおよびスペーサー配列にアニーリングすることが防止される。
【１１２０】
コーディングタグは、結合性物質に、共有結合性の相互作用および非共有結合性の相互作用を含めた当技術分野で公知の任意の手段を使用して直接または間接的に接合される。一部の実施形態では、コーディングタグを結合性物質に酵素的にまたは化学的に接合することができる。一部の実施形態では、コーディングタグを結合性物質にライゲーションによって接合することができる。他の実施形態では、コーディングタグを結合性物質に親和性結合対（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン）を介して接合する。
【１１２１】
一部の実施形態では、結合性物質をコーディングタグにＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＳｐｙＴａｇ相互作用によって接合させる（例えば、図４３Ｂを参照されたい）。ＳｐｙＴａｇペプチドは、自発的なイソペプチド連結によってＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質と不可逆的共有結合を形成し、それにより、力および厳しい条件に対して抵抗性であるペプチド相互作用を創出するための遺伝子によりコードされたやり方がもたらされる（Zakeri et al., 2012, Proc.Natl.Acad.Sci.109:E690-697；Li et al.,2014, J. Mol.Biol.426:309- 317）。結合性物質を、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を含む融合タンパク質として発現させることができる。一部の実施形態では、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質またはそのバリアント（例えば、ＳｐｙＴａｇ００２またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００２バリアント、例えば、Keebleet al, "Evolving accelerated amidation by SpyTag/SpyCatcher to analyzemembrane dynamics," Angew.Chem.Int.Ed.10.1002/anie.201707623において開示されているもの）を、結合性物質のＮ末端またはＣ末端に付加する。標準的なコンジュゲーション化学（BioconjugateTechniques, G. T. Hermanson, Academic Press (2013)）を使用して、ＳｐｙＴａｇペプチドをコーディングタグとカップリングすることができる。
【１１２２】
他の実施形態では、結合性物質とコーディングタグをＳｎｏｏｐＴａｇ−ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒペプチド−タンパク質相互作用によって接合する。ＳｎｏｏｐＴａｇペプチドは、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質とイソペプチド結合を形成する（Ｖｅｇｇｉａｎｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、２０１６年、１１３巻：１２０２〜１２０７頁）。結合性物質を、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質を含む融合タンパク質として発現させることができる。一部の実施形態では、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質を結合性物質のＮ末端またはＣ末端に付加する。ＳｎｏｏｐＴａｇペプチドとコーディングタグを標準のコンジュゲーション化学を使用してカップリングすることができる。
【１１２３】
さらに他の実施形態では、結合性物質とコーディングタグをＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質融合タグとその化学的リガンドによって接合する。ＨａｌｏＴａｇは、合成リガンド（ＨａｌｏＴａｇリガンド）と共有結合するように設計された改変ハロアルカンデハロゲナーゼである（Ｌｏｓら、２００８年、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、３巻：３７３〜３８２頁）。合成リガンドは、種々の有用な分子に付着したクロロアルカンリンカーを含む。ＨａｌｏＴａｇとクロロアルカンリンカーの間に、高度に特異的であり、生理的条件下で迅速に起こり、基本的に不可逆的である共有結合が形成される。
【１１２４】
ある特定の実施形態では、巨大分子を非同類結合性物質とも接触させる。本明細書で使用される場合、非同類結合性物質は、考慮される特定の巨大分子とは異なる巨大分子特徴部または成分に対して選択的である結合性物質を指す。例えば、ｎ  ＮＴＡＡがフェニルアラニンであり、ペプチドを、フェニルアラニン、チロシン、およびアスパラギンに対して選択的な３つの結合性物質とそれぞれ接触させる場合、フェニルアラニンに対して選択的な結合性物質は、ｎ番目のＮＴＡＡ（すなわち、フェニルアラニン）に選択的に結合することが可能な第１の結合性物質ということになり、一方、他の２つの結合性物質は、そのペプチドに対する非同類結合性物質ということになる（それらはフェニルアラニン以外のＮＴＡＡに対して選択的であるので）。しかし、チロシン結合性物質およびアスパラギン結合性物質は、試料中の他のペプチドに対する同類結合性物質であることもある。したがって、ｎ番目のＮＴＡＡ（フェニルアラニン）をペプチドから切断することによってペプチドの（ｎ−１）番目のアミノ酸を（ｎ−１）番目のＮＴＡＡ（例えば、チロシン）に変換し、次いで、ペプチドを同じ３つの結合性物質と接触させた場合、チロシンに対して選択的な結合性物質が、（ｎ−１）番目のＮＴＡＡ（すなわち、チロシン）に選択的に結合することが可能な第２の結合性物質ということになり、一方、他の２つの結合性物質は、非同類結合性物質ということになる（それらは、チロシン以外のＮＴＡＡに対して選択的であるので）。
【１１２５】
したがって、作用物質が結合性物質であるか非同類結合性物質であるかは、結合のために現在利用可能な特定の巨大分子の特徴または成分の性質に依存することが理解されるべきである。また、多数の巨大分子を多重化反応において解析する場合、１つの巨大分子に対する結合性物質は別の巨大分子に対しては非同類結合性物質であり得、逆もまた同じである。したがって、結合性物質に関する以下の説明は本明細書に記載されているあらゆる型の結合性物質（すなわち、同類結合性物質および非同類結合性物質のどちらにも）に適用可能であることが理解されるべきである。
Ｆ．コーディングタグ情報の記録タグへの周期的移行のためのキットおよびキット成分
【１１２６】
本明細書に記載のキットおよび方法では、結合性物質が巨大分子に結合すると、その連結されているコーディングタグの識別情報が、巨大分子に付随する記録タグに移行されることによって、「伸長記録タグ」が生成される。伸長記録タグは、実施される各結合サイクルを表す、結合性物質のコーディングタグからの情報を含み得る。しかし、伸長記録タグは、例えば、結合性物質が巨大分子に結合し損ねたことが原因で、コーディングタグが見落とされた、損傷を受けた、または欠陥があることが原因で、プライマー伸長反応が失敗したことが原因で、「飛ばされた」結合サイクルを経る可能性もある。結合事象が起こったとしても、コーディングタグから記録タグへの情報の移行は、不完全または１００％未満の正確さになる可能性がある（例えば、コーディングタグが損傷を受けたまたは欠陥があることが原因で、プライマー伸長反応にエラーが導入されたことが原因で）。したがって、伸長記録タグは、その付随する巨大分子で起こった結合事象の１００％、または最大で９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、６５％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％を表す可能性がある。さらに、伸長記録タグ中に存在するコーディングタグ情報は、対応するコーディングタグに対して少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有する可能性がある。
【１１２７】
ある特定の実施形態では、伸長記録タグは、多数の連続的な結合事象を表す、多数のコーディングタグからの情報を含む可能性がある。これらの実施形態では、単一の連鎖状の伸長記録タグは単一の巨大分子を表す可能性がある（例えば図２Ａを参照されたい）。本明細書で言及される通り、コーディングタグ情報の記録タグへの移行は、多数の連続的な結合事象を伴う方法において起こると思われる伸長記録タグへの移行も含む。
【１１２８】
ある特定の実施形態では、結合事象情報をコーディングタグから記録タグに周期的に移行させる（例えば図２Ａおよび２Ｃを参照されたい）。交差反応性結合事象を、配列決定後に、少なくとも２つの異なるコーディングタグを要求し、２つまたはそれよりも多くの独立した結合事象を識別し、同じ結合性物質のクラス（特定のタンパク質と同類）にマッピングすることにより、情報科学的にフィルターにかけて除去することができる。任意選択の試料バーコードまたはコンパートメントバーコードを記録タグに含めることができ、同じく任意選択のＵＭＩ配列も含めることができる。コーディングタグは、任意選択のＵＭＩ配列をエンコーダーおよびスペーサー配列と一緒に含有してもよい。ユニバーサルプライミング配列（Ｕ１およびＵ２）も増幅およびＮＧＳ配列決定のために伸長記録タグに含めることもできる（例えば図２Ａを参照されたい）。
【１１２９】
特定の結合性物質に付随するコーディングタグ情報を記録タグに種々の方法を使用して移行させることができる。ある特定の実施形態では、コーディングタグの情報を記録タグに、プライマー伸長によって移行させる（Ｃｈａｎ、ＭｃＧｒｅｇｏｒら、２０１５年）。記録タグまたは伸長記録タグの３’末端のスペーサー配列をコーディングタグの３’末端の相補的なスペーサー配列とアニーリングさせ、ポリメラーゼ（例えば、鎖置換ポリメラーゼ）により、アニーリングしたコーディングタグを鋳型として使用して記録タグ配列を伸長させる（例えば図５〜７を参照されたい）。一部の実施形態では、コーディングタグと伸長記録タグに存在する内部のエンコーダーおよびスペーサー配列のハイブリダイゼーションを防止するために、コーディングタグエンコーダー配列および５’スペーサーと相補的なオリゴヌクレオチドをコーディングタグとプレアニーリングさせることができる。一本鎖のままのコーディングタグ上の３’末端スペーサーを、例えば、記録タグ上の末端３’スペーサーと結合させる。他の実施形態では、コーディングタグと内部の部位とのアニーリングを防止するために、新生記録タグを一本鎖結合性タンパク質でコーティングすることができる。あるいは、完全に二本鎖のコーディングタグへの３’末端の侵入を容易にするために、新生記録タグをＲｅｃＡ（またはｕｖｓＸなどの関連する相同体）でコーティングすることもできる（Ｂｅｌｌら、２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ、４９１巻：２７４〜２７８頁）。この形態により、二本鎖のコーディングタグが内部の記録タグエレメントと相互作用することが防止されるが、それでも、伸長記録タグのＲｅｃＡコーティングされた３’尾部による鎖の侵入は起こりやすい（Ｂｅｌｌら、２０１５年、Ｅｌｉｆｅ、４巻：ｅ０８６４６頁）。一本鎖結合性タンパク質が存在することにより、鎖置換反応が容易になり得る。
【１１３０】
好ましい実施形態では、プライマー伸長のために使用されるＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有し、３’−５エキソヌクレアーゼ活性が限られているまたはそれを欠く。そのようなポリメラーゼの多数の例のいくつかとして、クレノウｅｘｏ−（ＤＮＡ  Ｐｏｌ  １のクレノウ断片）、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼｅｘｏ−、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼｅｘｏ（シーケナーゼ２．０）、Ｐｆｕ  ｅｘｏ−、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ大断片ｅｘｏ−、Ｂｃａ  Ｐｏｌ、９°Ｎ  Ｐｏｌ、およびＰｈｉ２９  Ｐｏｌ  ｅｘｏ−が挙げられる。好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、室温および最大４５℃までで活性である。別の実施形態では、「ウォームスタート」バージョンの好熱性ポリメラーゼを使用し、したがって、ポリメラーゼを約４０℃〜５０℃で活性化し、使用する。例示的なウォームスタートポリメラーゼは、Ｂｓｔ  ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）である。
【１１３１】
鎖置換複製に有用な添加剤としては、Ｅ．ｃｏｌｉのＳＳＢタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２産物、ファージＴ７遺伝子２．５タンパク質、ファージＰｆ３  ＳＳＢ、複製タンパク質Ａ  ＲＰＡ３２およびＲＰＡ１４サブユニット（Ｗｏｌｄ、１９９７年）などの、細菌起源、ウイルス起源、または真核生物起源のいくつもの一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質（ＳＳＢタンパク質）のいずれか；アデノウイルスＤＮＡ結合性タンパク質、単純ヘルペスタンパク質ＩＣＰ８、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット、ヘルペスウイルスＵＬ２９  ＳＳＢ様タンパク質などの他のＤＮＡ結合性タンパク質；ファージＴ７ヘリカーゼ／プライマーゼ、ファージＴ４遺伝子４１ヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｅｐヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｅｃＢＣＤヘリカーゼ、ｒｅｃＡ、Ｅ．ｃｏｌｉおよび真核生物トポイソメラーゼ（Ｃｈａｍｐｏｕｘ、２００１年）などの、ＤＮＡ複製に関与することが公知のいくつもの複製複合体タンパク質のいずれかが挙げられる。
【１１３２】
記録タグの末端スペーサー配列により伸長自己伸長がプライミングされる場合などのミスプライミングまたは自己プライミング事象は、一本鎖結合性タンパク質（Ｔ４遺伝子３２、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢなど）、ＤＭＳＯ（１〜１０％）、ホルムアミド（１〜１０％）、ＢＳＡ（１０〜１００μｇ／ｍｌ）、ＴＭＡＣｌ（１〜５ｍＭ）、硫酸アンモニウム（１０〜５０ｍＭ）、ベタイン（１〜３Ｍ）、グリセロール（５〜４０％）、またはエチレングリコール（５〜４０％）をプライマー伸長反応に含めることによって最小化することができる。
【１１３３】
大多数のＡ型ポリメラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き（内因的または操作的除去）、例えば、クレノウｅｘｏ−、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼｅｘｏ−（シーケナーゼ２．０）、およびＴａｑポリメラーゼは、２重鎖増幅産物の３’平滑末端へのヌクレオチド、例えばアデノシン塩基（より低い程度でＧ塩基、配列の状況に依存する）の非鋳型付加を触媒する。Ｔａｑポリメラーゼに関しては、３’ピリミジン（Ｃ＞Ｔ）により、非鋳型アデノシン付加が最小限になり、一方、３’プリンヌクレオチド（Ｇ＞Ａ）では非鋳型アデノシン付加が有利になる。プライマー伸長のためにＴａｑポリメラーゼを使用する実施形態では、コーディングタグにおいて、結合性物質から遠位のスペーサー配列と隣接するバーコード配列（例えば、エンコーダー配列またはサイクル特異的配列）との間にチミジン塩基を置くことにより、記録タグのスペーサー配列の３’末端上の非鋳型アデノシンヌクレオチドの散在的包含に適応させる（例えば図４３Ａを参照されたい）。このように、伸長記録タグ（非鋳型アデノシン塩基を有するまたは有さない）は、コーディングタグとアニーリングし、プライマー伸長を受けることが可能である。
【１１３４】
あるいは、特にＯ−へリックス領域における１つまたは複数の点変異によって非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を著しく低下させた変異ポリメラーゼ（中温性または好熱性）を使用することにより、非鋳型塩基の付加を減少させることができる（例えば米国特許第７，５０１，２３７号を参照されたい）（Ｙａｎｇ、Ａｓｔａｔｋｅら、２００２年）。３’エキソヌクレアーゼが欠損しており、鎖置換能を有するＰｆｕ  ｅｘｏ−も非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を有さない。
【１１３５】
別の実施形態では、最適なポリメラーゼ伸長緩衝液は、４０〜１２０ｍＭの、例えばＴｒｉｓ−酢酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳなどの緩衝剤、ｐＨ６〜９で構成される。
【１１３６】
伸長記録タグの末端スペーサー配列と伸長記録タグの内部の領域の自己アニーリングによって開始される自己プライミング／ミスプライミング事象は、記録／伸長記録タグに偽相補的塩基を含めることによって最小化することができる（Ｌａｈｏｕｄ、Ｔｉｍｏｓｈｃｈｕｋら、２００８年）、（Ｈｏｓｈｉｋａ、Ｃｈｅｎら、２０１０年）。偽相補的塩基は、化学修飾が存在することに起因する互いとの２重鎖の形成に対する有意に低下したハイブリダイゼーション親和性を示す。しかし、多くの偽相補的修飾塩基は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ配列と強い塩基対を形成し得る。ある特定の実施形態では、コーディングタグスペーサー配列は、多数のＡ塩基およびＴ塩基で構成され、ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成を使用して市販の偽相補的塩基２−アミノアデニンおよび２−チオチミンを記録タグに組み入れる。追加的な偽相補的塩基を、プライマー伸長中に、偽相補的ヌクレオチドを反応に添加することによって伸長記録タグに組み入れることができる（Ｇａｍｐｅｒ、Ａｒａｒら、２００６年）。
【１１３７】
溶液中のコーディングタグで標識された結合性物質と固定化されたタンパク質の記録タグとの非特異的な相互作用を最小限にするために、記録タグスペーサー配列と相補的な競合剤オリゴヌクレオチド（遮断オリゴヌクレオチドとも称される）を結合反応に添加して、非特異的な相互作用を最小限にする（例えば図３２Ａ〜Ｄを参照されたい）。遮断オリゴヌクレオチドは、比較的短いものである。プライマー伸長前に過剰な競合オリゴヌクレオチドを結合反応から洗い流し、これにより、特にわずかな温度の上昇（例えば、３０〜５０℃）に曝露させると、アニーリングした競合オリゴヌクレオチドが記録タグから有効に解離する。遮断オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長を防止するために３’末端にターミネーターヌクレオチドを含んでよい。
【１１３８】
ある特定の実施形態では、記録タグ上のスペーサー配列とコーディングタグ上の相補的なスペーサー配列のアニーリングは、プライマー伸長反応条件下（すなわち、アニーリングＴｍが反応温度と同様である）で準安定である。これにより、コーディングタグのスペーサー配列で記録タグのスペーサー配列とアニーリングした任意の遮断オリゴヌクレオチドを置き換えることが可能になる。
【１１３９】
特定の結合性物質に付随するコーディングタグ情報をライゲーションによって記録タグに移行させることもできる（例えば、図６および図７を参照されたい）。ライゲーションは、平滑末端ライゲーションであってもよく、または粘着末端ライゲーションであってもよい。ライゲーションは、酵素的ライゲーション反応であってもよい。リガーゼの例としては、これだけに限定されないが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼ、Ｅｌｅｃｔｒｏｌｉｇａｓｅ（登録商標）が挙げられる。あるいは、ライゲーションは、化学的ライゲーション反応であってよい（例えば、図７を参照されたい）。説明図では、無スペーサーライゲーションは、「記録ヘルパー」配列とコーディングタグ上のアームのハイブリダイゼーションを使用することにより実現される。アニーリングした相補配列を、標準の化学的ライゲーションまたは「クリックケミストリー」を使用して化学的にライゲーションする（Gunderson, Huang et al. 1998、Peng, Li et al. 2010、El-Sagheer, Cheonget al. 2011、El-Sagheer, Sanzone et al. 2011、Sharma, Kent et al. 2012、Roloff andSeitz 2013、Litovchick, Clark et al. 2014、Roloff, Ficht et al. 2014）。一態様では、「無スペーサー」ライゲーションを、例えば図４６に示されているような、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩまたはＩＩ（例えば、Ｌｕｃｉｇｅｎからの）などの、ｓｓＤＮＡリガーゼを使用して実現することもできる。「無スペーサー」ライゲーションの使用は、大幅に、ライブラリーエレメントの全長を短縮させる場合および／またはライブラリー増幅中の鋳型乗り換えを低減させるもしくは最小限に抑える場合に有利である。
【１１４０】
一実施形態では、キットは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを含む。ｓｓＤＮＡリガーゼは、相補配列の非存在下でｓｓＤＮＡの末端をライゲーションすることができる。例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼおよびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ  ｓｓＤＮＡリガーゼは両方とも、５’−リン酸基と３’ヒドロキシル基とを有するｓｓＤＮＡ鋳型の分子内ライゲーション（すなわち、環状化）を触媒するために典型的に使用される熱安定性リガーゼである。相補的ＤＮＡ配列上で互いに隣接してアニーリングされているＤＮＡ末端をライゲーションする、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）ＤＮＡリガーゼとは対照的に、ｓｓＤＮＡリガーゼは、相補配列の非存在下でｓｓＤＮＡの末端をライゲーションする。したがって、この酵素は、直鎖状ｓｓＤＮＡから環状ｓｓＤＮＡ分子を作製するのに有用である。環状ｓｓＤＮＡ分子は、ローリングサークル複製またはローリングサークル転写の基質として使用することができる。ｓｓＤＮＡに対するその活性に加えて、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ酵素は、３’−ヒドロキシルリボヌクレオチドと５’−リン酸化リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドとを有する一本鎖核酸のライゲーションにおける活性も有する。
【１１４１】
ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ  ｓｓＤＮＡリガーゼのどちらかを本開示において使用することができる。これら２つの酵素は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  Ｉが、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩよりもはるかにアデニル化度が低く、最高の活性のためにＡＴＰを必要とする点で異なる。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  Ｉは、ＡＴＰの存在下でｓｓＤＮＡを再環状化する。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩは、ほぼ１００％アデニル化され、したがって、ＡＴＰを反応緩衝液に添加する必要がない。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩは、化学量論的反応の場合に作用し、そこでこの酵素は、酵素活性部位がアデニル化されているオリゴの５’末端に結合してそのオリゴをライゲーションし、停止する。この反応は、ＡＴＰを含まないので、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩは、１：１の酵素：オリゴのコンフィグレーションで作用する。特定の実施形態では、本明細書におけるキットは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＲＮＡリガーゼ、例えばバクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））、または古細菌ＲＮＡリガーゼ、例えばＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１を含む。前述の実施形態のいずれかでは、キットは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱ、またはＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７ＱなどのＲＮＡリガーゼを含むことができる。
【１１４２】
別の実施形態では、ＰＮＡの移行は、公開された技法を使用した化学的ライゲーションで実現することができる。ＰＮＡの構造は、５’Ｎ末端アミン基および非反応性３’Ｃ末端アミドを有するようなものである。ＰＮＡの化学的ライゲーションには、末端を化学的に活性になるように修飾することが必要である。これは、一般には、５’Ｎ末端をシステイニル部分で誘導体化し、３’Ｃ末端をチオエステル部分で誘導体化することによってなされる。そのような修飾されたＰＮＡは、標準のネイティブな化学的ライゲーション条件を使用することで容易にカップリングする（Ｒｏｌｏｆｆら、２０１３年、Ｂｉｏｏｒｇａｎ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、２１巻：３４５８〜３４６４頁）。
【１１４３】
一部の実施形態では、コーディングタグ情報を、トポイソメラーゼを使用して移行させることができる。トポイソメラーゼを使用して、記録タグ上のトポ荷電３’リン酸とコーディングタグまたはその相補物の５’末端とライゲーションすることができる（Ｓｈｕｍａｎら、１９９４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３２６７８〜３２６８４頁）。
【１１４４】
本明細書に記載の通り、結合性物質は、翻訳後修飾されたアミノ酸に結合し得る。したがって、ペプチド巨大分子を伴うある特定の実施形態では、伸長記録タグは、アミノ酸配列および翻訳後修飾に関するコーディングタグ情報を含む。一部の実施形態では、内部の翻訳後修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化、グリコシル化、サクシニル化、ユビキチン化、Ｓ−ニトロシル化、メチル化、Ｎ−アセチル化、脂質付加など）の検出は、末端アミノ酸（例えば、ＮＴＡＡまたはＣＴＡＡ）の検出および切断の前に実現される。一実施例では、ペプチドをＰＴＭ修飾のために結合性物質と接触させ、付随するコーディングタグ情報を上記の通り記録タグに移行する（例えば図８Ａを参照されたい）。アミノ酸修飾に関するコーディングタグ情報の検出および移行が完了したら、一次アミノ酸配列に関するコーディングタグ情報の検出および移行の前に、Ｎ末端またはＣ末端分解法を使用してＰＴＭ修飾基を除去することができる。したがって、得られた伸長記録タグにより、ペプチド配列における翻訳後修飾の存在が、逐次的順序ではないが、一次アミノ酸配列情報と併せて示される（例えば図８Ｂを参照されたい）。
【１１４５】
一部の実施形態では、内部の翻訳後修飾されたアミノ酸の検出は、一次アミノ酸配列の検出と並行して行うことができる。一実施例では、ＮＴＡＡ（またはＣＴＡＡ）を、単独でまたは結合性物質のライブラリー（例えば、２０種の標準のアミノ酸および選択された翻訳後修飾されたアミノ酸に対する結合性物質で構成されるライブラリー）の一部としての、翻訳後修飾されたアミノ酸に対して特異的な結合性物質と接触させる。末端アミノ酸切断および結合性物質（または結合性物質のライブラリー）との接触の連続的なサイクルを後に続ける。したがって、得られた伸長記録タグにより、一次アミノ酸配列に関して、翻訳後修飾の存在および順序が示される。
【１１４６】
ある特定の実施形態では、コーディングタグ情報移行の全体的な頑強性および効率を改善するために、巨大分子ごとに記録タグのアンサンブルを使用することができる（例えば、図９を参照されたい）。単一の記録タグではなく、所与の巨大分子に付随する記録タグのアンサンブルを使用することにより、コーディングタグと記録タグのカップリング収率が潜在的に高いこと、およびライブラリーの全収率が高いことに起因して、ライブラリー構築の効率が改善される。単一の連鎖状の伸長記録タグの収率は、連鎖の段階的収率に直接依存し、一方、コーディングタグ情報を受容することが可能な多数の記録タグの使用では、指数関数的な連鎖の喪失を受けない。
【１１４７】
そのような実施形態の例が図９および図１０に示されている。図９Ａおよび１０Ａでは、固体支持体上で単一の巨大分子に多数の記録タグが付随している（空間的共局在または単一の巨大分子の単一のビーズへの限局によって）。結合性物質を固体支持体に周期的に曝露させ、各サイクルにおいて、それらの対応するコーディングタグにより、共局在する多数の記録タグのうちの１つに情報が移行される。図９Ａに示されている例では、結合サイクル情報は、コーディングタグ上に存在するスペーサーにコードされている。各結合サイクルについて、結合性物質のセットに設計されたサイクル特異的スペーサー配列で印をつける（例えば図９Ａおよび９Ｂを参照されたい）。例えば、ＮＴＡＡ結合性物質の場合では、同じアミノ酸残基に対する結合性物質を異なるコーディングタグで標識する、またはサイクル特異的情報をスペーサー配列に含めて、両方の結合性物質の同一性およびサイクル数を示す。
【１１４８】
図９Ａにおいて例示されている通り、第１の結合サイクル（サイクル１）において、複数のＮＴＡＡ結合性物質を巨大分子と接触させる。サイクル１で使用する結合性物質は、記録タグのスペーサー配列と相補的な共通のスペーサー配列を有する。サイクル１で使用する結合性物質は、サイクル１特異的配列を含む３’−スペーサー配列も有する。結合サイクル１の間に、第１のＮＴＡＡ結合性物質が巨大分子の遊離末端に結合し、第１のコーディングタグおよび記録タグ内の共通のスペーサー配列の相補配列がアニーリングし、第１のコーディングタグの情報が同類の記録タグに共通のスペーサー配列からのプライマー伸長を介して移行する。ＮＴＡＡを除去して、新しいＮＴＡＡを露出させた後、結合サイクル２により、記録タグのスペーサー配列と相補的な共通のスペーサー配列を有する複数のＮＴＡＡ結合性物質を接触させる。サイクル２で使用する結合性物質は、サイクル２特異的配列を含む３’−スペーサー配列も有する。第２のＮＴＡＡ結合性物質が巨大分子のＮＴＡＡに結合し、第２のコーディングタグの情報が記録タグにプライマー伸長を介して移行する。これらのサイクルを最大「ｎ」回の結合サイクルまで繰り返し、単一の巨大分子と共局在する複数の伸長記録タグを生成し、ここで、各伸長記録タグは、１つの結合サイクルからのコーディングタグ情報を有する。連続的な結合サイクルのそれぞれで使用される結合性物質の各セットは、コーディングタグ内のサイクル特異的スペーサー配列を有するので、結合サイクル情報を、得られた伸長記録タグ内の結合性物質情報と関連づけることができる。
【１１４９】
代替の実施形態では、図９Ａと同様に、固体支持体（例えば、ビーズ）上で単一の巨大分子に多数の記録タグが付随しているが、この場合、特定の結合サイクルで使用される結合性物質は、今の結合サイクルに対するサイクル特異的スペーサーおよび次の結合サイクルに対するサイクル特異的スペーサーが隣接するコーディングタグを有する（例えば図１０Ａおよび１０Ｂを参照されたい）。この設計は、伸長記録タグの集団を単一の共直線性の伸長記録タグに変換するための最終的なアセンブリＰＣＲステップを支持するためのものである（例えば図１０Ｃを参照されたい）。単一の共直線性の伸長記録タグのライブラリーを配列決定前に濃縮、サブトラクションおよび／または正規化方法に供すことができる。第１の結合サイクル（サイクル１）では、第１の結合性物質が結合すると、サイクル１特異的スペーサー（Ｃ’１）を含むコーディングタグの情報が、末端に相補的なサイクル１特異的スペーサー（Ｃ１）を含む記録タグに移行する。第２の結合サイクル（サイクル２）では、第２の結合性物質が結合すると、サイクル２特異的スペーサー（Ｃ’２）を含むコーディングタグの情報が、末端に相補的なサイクル２特異的スペーサー（Ｃ２）を含む異なる記録タグに移行する。このプロセスを第ｎの結合サイクルまで続ける。一部の実施形態では、伸長記録タグ内の第ｎのコーディングタグにユニバーサルリバースプライミング配列を用いてキャップ形成する、例えば、ユニバーサルリバースプライミング配列を第ｎのコーディングタグ設計の一部として組み入れることもでき、ユニバーサルリバースプライミング配列を第ｎの結合サイクルの後に続く反応、例えば尾部を有するプライマーを使用した増幅反応などに添加することもできる。一部の実施形態では、各結合サイクル時に、巨大分子を、それらの対応する結合性物質に関する識別情報および結合サイクル情報を含むコーディングタグと接合した結合性物質の集合に曝露させる（例えば図９および図１０を参照されたい）。特定の実施形態では、第ｎの結合サイクルが完了した後、伸長記録タグでコーティングしたビーズ基板を油乳剤に平均して液滴当たり１ビーズ未満またはそれとほぼ同等になるように入れる。次いで、アセンブリＰＣＲを使用して、伸長記録タグをビーズから増幅し、多数の別々の記録タグを、別々の伸長記録タグ内のサイクル特異的スペーサー配列を介してプライミングすることによって共直線的な順序でアセンブルさせる（例えば図１０Ｃを参照されたい）（Ｘｉｏｎｇら、２００８年、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．、３２巻：５２２〜５４０頁）。あるいは、結合性物質のコーディングタグを有するサイクル特異的スペーサーを使用する代わりに、各結合サイクル中または各結合サイクル後に、サイクル特異的スペーサーを別々に伸長記録タグに付加することができる。単一の巨大分子を集合的に表すものである伸長記録タグの集団を使用することの、単一の巨大分子を表すものである単一の連鎖状の伸長記録タグに対する１つの利点は、より高濃度の記録タグにより、コーディングタグ情報の移行の効率が上昇し得ることである。さらに、結合サイクルを数回繰り返して同類結合事象の完了を確実にすることができる��さらに、伸長記録タグの表面増幅により、情報移行の重複性をもたらすことができる（例えば図４Ｂを参照されたい）。コーディングタグ情報が必ずしも移行されない場合、ほとんどの場合、それでも、コーディングタグ情報の不完全な集合を、タンパク質などの、情報含有量が非常に高い巨大分子を識別するために使用することが可能であるはずである。短いペプチドであっても、非常に多数の可能性のあるタンパク質配列を具体化し得る。例えば、１０ｍｅｒのペプチドは、２０１０種の可能性のある配列を有する。したがって、欠失および／または多義性を含有する可能性がある部分的または不完全な配列を、それでも、多くの場合、一意的にマッピングすることができる。
【１１５０】
タンパク質のネイティブなコンフォメーションが照会される一部の実施形態では、結合性物質の近位のスペーサーエレメント内の切断可能なまたはニッキング可能なＤＮＡ鎖で構成されるコーディングタグを有する結合性物質を用いて周期的結合アッセイを実施する（例えば図３２を参照されたい）。例えば、結合性物質の近位のスペーサーは、ウラシル特異的切除試薬（ＵＳＥＲ）によってニッキングすることができる１つまたは複数のウラシル塩基を有してよい。別の例では、結合性物質の近位のスペーサーは、２重鎖の一方の鎖のみを加水分解するニッキングエンドヌクレアーゼの認識配列を含んでよい。この設計により、結合性物質を伸長記録タグから変性によらずに除去し、その後のイムノアッセイサイクルのための遊離の一本鎖ＤＮＡスペーサーエレメントを創出することが可能になる。好ましい実施形態では、プライマー伸長ステップ後の結合性物質の酵素的ＵＳＥＲ除去を可能にするために、コーディングタグにウラシル塩基を組み入れる（例えば図３２Ｅ〜Ｆを参照されたい）。ウラシルによるＵＳＥＲ切除後、結合性物質および切り詰められたコーディングタグを、タンパク質−結合性物質相互作用を破壊するための、高塩濃度（４ＭのＮａＣｌ、２５％ホルムアミド）および穏やかな熱を含めた種々の穏やかな条件下で除去することができる。記録タグとアニーリングしたままの他の切り詰められたコーディングタグＤＮＡの残り（例えば図３２Ｆを参照されたい）は、わずかに温度を上昇させると容易に解離する。
【１１５１】
結合性物質の近位のスペーサーエレメント内の切断可能なまたはニッキング可能なＤＮＡ鎖で構成されるコーディングタグにより、多数の結合した結合性物質からコーディングタグ情報を移行させるための単一の均一なアッセイも可能になる（例えば図３３を参照されたい）。好ましい実施形態では、結合性物質の近位のコーディングタグはニッキングエンドヌクレアーゼ配列モチーフを含み、これは、ｄｓＤＮＡに関して規定された配列モチーフにおいてニッキングエンドヌクレアーゼにより認識され、ニッキングされる。多数の結合性物質の結合後、複合ポリメラーゼ伸長（鎖置換活性を欠く）＋ニッキングエンドヌクレアーゼ試薬混合物を使用して、コーディングタグの近位の記録タグまたは伸長記録タグへの反復移行を生じさせる。各移行ステップ後、得られた伸長記録タグ−コーディングタグ２重鎖をニッキングエンドヌクレアーゼによってニッキングし、それにより、結合性物質に付着した切り詰められたスペーサーを放出させ、追加的な近位の結合した結合性物質のコーディングタグとアニーリングすることが可能な伸長記録タグ３’スペーサー配列に曝露させる（例えば図３３Ｂ〜Ｄを参照されたい）。コーディングタグスペーサー配列内へのニッキングモチーフの配置は、切断されていないコーディングタグスペーサー配列と容易に交換することができる、準安定ハイブリッドが創出されるように設計する。このように、２種またはそれよりも多くの結合性物質が同じタンパク質分子に同時に結合する場合、多重に結合した結合性物質からのコーディングタグ情報の記録タグ上への連鎖による結合情報は、単一反応混合物において、いかなる周期的な試薬交換も伴わずに生じる（例えば図３３Ｃ〜Ｄを参照されたい）。この実施形態は、次世代タンパク質アッセイ（ＮＧＰＡ）、特に、タンパク質上の多価エピトープに対するポリクローナル抗体（またはモノクローナル抗体の混合集団）を用いるものに特に有用である。
【１１５２】
変性したタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの解析を伴う実施形態に関しては、結合した結合性物質およびアニーリングしたコーディングタグを、プライマー伸長後に、高度変性条件（例えば、０．１〜０．２ＮのＮａＯＨ、６Ｍの尿素、２．４Ｍのグアニジニウムイソチオシアネート、９５％ホルムアミドなど）を使用することによって除去することができる。
Ｇ．コーディングタグまたはジタグ構築物への記録タグ情報の周期的移行のためのキットおよびキット成分
【１１５３】
別の態様では、結合性物質が巨大分子に結合した後にコーディングタグから記録タグに情報を書き込むのではなく、任意選択のＵＭＩ配列（例えば、特定のペプチドまたはタンパク質分子を識別する）および少なくとも１つのバーコード（例えば、コンパートメントタグ、分配バーコード、試料バーコード、空間的位置バーコードなど）を含む記録タグからコーディングタグに情報を移行させ、それにより、伸長コーディングタグを生成することができる（例えば図１１Ａを参照されたい）。ある特定の実施形態では、結合性物質および付随する伸長コーディングタグを、各結合サイクル後、および任意選択でエドマン分解化学ステップの前に収集する。ある特定の実施形態では、コーディングタグは、結合サイクル特異的タグを含む。周期的なエドマン分解におけるＮＴＡＡの検出などの全ての結合サイクルが完了した後、伸長コーディングタグの完全な収集物を増幅し、配列決定し、ペプチド上の情報を、ＵＭＩ（ペプチド同一性）、エンコーダー配列（ＮＴＡＡ結合性物質）、コンパートメントタグ（単一の細胞またはプロテオームのサブセット）、結合サイクル特異的配列（サイクル数）、またはそれらの任意の組合せの間の関連性から決定することができる。同じコンパートメントタグ／ＵＭＩ配列を有するライブラリーエレメントを同じ細胞、プロテオームのサブセット、分子などにマッピングし戻し、ペプチド配列を再構築することができる。この実施形態は、記録タグがエドマン分解プロセス中に過度の損傷を保持する場合に有用であり得る。
【１１５４】
複数の巨大分子を解析するための方法であって、（ａ）固体支持体に接合した複数の巨大分子および付随する記録タグを提供するステップと；（ｂ）複数の巨大分子を複数の巨大分子に結合することが可能な複数の結合性物質と接触させるステップであって、各結合性物質が結合性物質に関する識別情報を有するコーディングタグを含む、ステップと；（ｃ）（ｉ）巨大分子に付随する記録タグの情報を巨大分子に結合した結合性物質のコーディングタグに移行させて、伸長コーディングタグを生成するステップ（例えば図１１Ａを参照されたい）；または（ｉｉ）巨大分子に付随する記録タグおよび巨大分子に結合した結合性物質のコーディングタグの情報をジタグ構築物に移行するステップと（例えば図１１Ｂを参照されたい）；（ｄ）伸長コーディングタグまたはジタグ構築物を収集するステップと；（ｅ）任意選択でステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回の結合サイクルにわたって繰り返すステップと；（ｆ）伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物を解析するステップとを含む方法が本明細書において提示される。
【１１５５】
ある特定の実施形態では、記録タグからコーディングタグへの情報移行は、記録タグのプライマー伸長を防止するために記録タグの３’末端を任意選択でブロッキングする（例えば、図１１Ａを参照されたい）プライマー伸長ステップを使用して実現することができる。得られた伸長コーディングタグおよび付随する結合性物質を各結合事象の後および情報移行の完了後に収集することができる。図１１Ｂに例示されている例では、記録タグは、ユニバーサルプライミング部位（Ｕ２’）、バーコード（例えば、コンパートメントタグ「ＣＴ」）、任意選択のＵＭＩ配列、および共通のスペーサー配列（Ｓｐ１）で構成される。ある特定の実施形態では、バーコードは、個々のコンパートメントを表すコンパートメントタグであり、また、ＵＭＩを使用して、配列読み取りを照会されている特定のタンパク質またはペプチド分子にマッピングし戻すことができる。図１１Ｂの例において例示されている通り、コーディングタグは、共通のスペーサー配列（Ｓｐ２’）、結合性物質エンコーダー配列、およびユニバーサルプライミング部位（Ｕ３）で構成される。コーディングタグで標識した結合性物質の導入前に、記録タグのＵ２’ユニバーサルプライミング部位と相補的であり、ユニバーサルプライミング配列Ｕ１およびサイクル特異的タグを含むオリゴヌクレオチド（Ｕ２）を記録タグＵ２’とアニーリングさせる。さらに、アダプター配列Ｓｐ１’−Ｓｐ２を記録タグＳｐ１とアニーリングさせる。このアダプター配列は、コーディングタグ上のＳｐ２’配列とも相互作用することができ、それにより、記録タグとコーディングタグが互いと近傍になる。結合事象の前または後のいずれかにギャップ充填伸長ライゲーションアッセイを実施する。ギャップ充填を結合サイクルの前に実施する場合、結合サイクル後のプライマー伸長ステップを使用してジタグ形成を完了させる。いくつもの結合サイクルにわたってジタグを収集した後、ジタグの収集物を配列決定し、ＵＭＩ配列を介して元のペプチド分子にマッピングし戻す。有効性を最大にするために、ＵＭＩ配列の多様性はＵＭＩでタグが付された単一分子の数の多様性を超えるものでなければならないことが理解される。
【１１５６】
ある特定の実施形態では、巨大分子は、タンパク質またはペプチドである。ペプチドは生体試料由来のタンパク質を断片化することによって得ることができる。
【１１５７】
記録タグは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ＢＮＡ分子、ＸＮＡ分子、ＬＮＡ分子、γＰＮＡ分子、またはこれらの組合せであってよい。記録タグは、それが付随する巨大分子（例えば、ペプチド）を識別するＵＭＩを含む。ある特定の実施形態では、記録タグは、コンパートメントタグをさらに含む。記録タグは、ユニバーサルプライミング部位も含んでよく、これを下流の増幅に使用することができる。ある特定の実施形態では、記録タグは、３’末端にスペーサーを含む。スペーサーは、コーディングタグ内のスペーサーと相補的であってよい。記録タグの３’末端をブロッキングして（例えば、光不安定性３’ブロッキング基）ポリメラーゼによる記録タグの伸長を防止し、それにより、巨大分子に付随する記録タグの情報のコーディングタグへの移行または巨大分子に付随する記録タグおよびコーディングタグの情報のジタグ構築物への移行を容易にすることができる。
【１１５８】
コーディングタグは、コーディング物質が連結した結合性物質を識別するエンコーダー配列を含む。ある特定の実施形態では、コーディングタグは、コーディングタグが連結した各結合性物質に対する一意の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含む。コーディングタグは、下流の増幅のために使用することができるユニバーサルプライミング部位を含んでよい。コーディングタグは、３’末端にスペーサーを含んでよい。スペーサーは、記録タグ内のスペーサーに相補的であってよく、記録タグ情報をコーディングタグに移行させるためのプライマー伸長反応を開始するために使用することができる。コーディングタグは、伸長コーディングタグまたはジタグの起源である結合サイクルを識別するための結合サイクル特異的配列も含んでよい。
【１１５９】
記録タグの情報のコーディングタグへの移行は、プライマー伸長またはライゲーションによってもたらすことができる。記録タグおよびコーディングタグの情報のジタグ構築物への移行は、ギャップ充填反応、プライマー伸長反応、またはその両方で生じさせることができる。
【１１６０】
ジタグ分子は、伸長記録タグのものと同様の機能的成分を含む。ジタグ分子は、記録タグに由来するユニバーサルプライミング部位、記録タグに由来するバーコード（例えば、コンパートメントタグ）、記録タグに由来する任意選択の一意の分子識別子（ＵＭＩ）、記録タグに由来する任意選択のスペーサー、コーディングタグに由来するエンコーダー配列、コーディングタグに由来する任意選択の一意の分子識別子、結合サイクル特異的配列、コーディングタグに由来する任意選択のスペーサー、およびコーディングタグに由来するユニバーサルプライミング部位を含んでよい。
【１１６１】
ある特定の実施形態では、記録タグを、バーコードのコンビナトリアル連鎖をコードするワードを使用して生成することができる。コンビナトリアルをコードするワードの使用により、アニーリングおよび化学的ライゲーションを使用して情報をＰＮＡ記録タグからコーディングタグまたはジタグ構築物に移行させることができる方法がもたらされる（例えば、図１２Ａ〜Ｄを参照されたい）。本明細書に開示されているペプチドを解析する方法がエドマン分解による末端アミノ酸の切断を伴うある特定の実施形態では、ＰＮＡなどの、エドマン分解の厳しい条件に対して抵抗性の記録タグを使用することが望ましい可能性がある。エドマン分解プロトコールにおける１つの厳しいステップは、Ｎ末端アミノ酸を切断するための無水ＴＦＡ処理である。このステップにより、一般には、ＤＮＡが破壊される。ＰＮＡは、ＤＮＡとは対照的に、酸加水分解に対して高度に抵抗性である。ＰＮＡでの問題は、情報移行の酵素的方法がより難しくなる、すなわち、好ましい様式が化学的ライゲーションによる情報移行になることである。図１１Ｂにおいて、記録タグおよびコーディングタグ情報は酵素的ギャップ充填伸長ライゲーションステップによって書き込まれるが、これは、現在、ＰＮＡ鋳型を用いると、ＰＮＡを使用するポリメラーゼが開発されなければ、都合がよくない。化学的ライゲーションが必要であり、その産物は容易には増幅されないので、ＰＮＡ記録タグからコーディングタグへのバーコードおよびＵＭＩの書き込みには問題がある。化学的ライゲーションの方法は、文献に広範囲にわたって記載されている（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、１９９８年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、８巻：１１４２〜１１５３頁；Ｐｅｎｇら、２０１０年、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、４１９４〜４１９７頁；Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら、２０１１年、Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、９巻：２３２〜２３５頁；Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら、２０１１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０８巻：１１３３８〜１１３４３頁；Ｌｉｔｏｖｃｈｉｃｋら、２０１４年、Ａｒｔｉｆ．  ＤＮＡ  ＰＮＡ  ＸＮＡ、５巻：ｅ２７８９６頁；Ｒｏｌｏｆｆら、２０１４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１０５０巻：１３１〜１４１頁）。
【１１６２】
コンビナトリアルＰＮＡバーコードおよびＵＭＩ配列を創出するために、ｎ−ｍｅｒのライブラリーからのＰＮＡワードのセットをコンビナトリアルにライゲーションすることができる。各ＰＮＡワードが１，０００ワードの空間に由来する場合、４つの組合せ配列により、１，０００４＝１０１２コードのコーディング空間が生じる。このように、４，０００種の異なるＤＮＡ鋳型配列の出発セットから、１０１２を超えるＰＮＡコードを生成することができる（例えば図１２Ａを参照されたい）。連鎖状のワードの数を調整すること、または基本のワードの数を調整することにより、より小さなまたはより大きなコーディング空間を生成することができる。そのように、ＰＮＡ記録タグとハイブリダイズさせたＤＮＡ配列を使用した情報移行は、ＤＮＡワードアセンブリハイブリダイゼーションおよび化学的ライゲーションを使用して完了させることができる（例えば図１２Ｂを参照されたい）。ＰＮＡ鋳型上のＤＮＡワードのアセンブリおよびＤＮＡワードの化学的ライゲーションの後、得られた中間体を使用して、情報をコーディングタグに／から移行させることができる（例えば図１２Ｃおよび図１２Ｄを参照されたい）。
【１１６３】
ある特定の実施形態では、巨大分子および付随する記録タグは、固体支持体に共有結合により接合している。固体支持体は、ビーズ、アレイ、ガラス表面、シリコン表面、プラスチック表面、フィルター、膜、ナイロン、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、信号変換電子機器を含むバイオチップ、マイクロタイターウェル、ＥＬＩＳＡプレート、スピン干渉ディスク、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースに基づくポリマー表面、ナノ粒子、またはマイクロスフェアであってよい。固体支持体は、ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔質ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、または制御ポアビーズであってよい。
【１１６４】
ある特定の実施形態では、結合性物質は、タンパク質またはポリペプチドである。一部の実施形態では、結合性物質は、改変またはバリアントアミノペプチダーゼ、改変またはバリアントアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、改変またはバリアントアンチカリン、改変またはバリアントＣｌｐＳ、または改変またはバリアント抗体またはその結合性断片である。ある特定の実施形態では、結合性物質は、単一のアミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチド、またはペプチドの翻訳後修飾に結合する。一部の実施形態では、結合性物質は、Ｎ末端アミノ酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基、または内部アミノ酸残基に結合する。一部の実施形態では、結合性物質は、Ｎ末端ペプチド、Ｃ末端ペプチド、または内部ペプチドに結合する。一部の実施形態では、結合性物質は、ペプチドの翻訳後修飾のアミノ酸の部位特異的な共有結合性標識である。
【１１６５】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）において複数の巨大分子を複数の結合性物質と接触させた後、巨大分子および付随する結合性物質を含む複合体を固体支持体から解離させ、液滴またはマイクロ流体液滴のエマルジョン中に分配する。一部の実施形態では、各マイクロ流体液滴は、巨大分子および結合性物質を含む複合体を最大で１つ含む。
【１１６６】
ある特定の実施形態では、伸長コーディングタグまたはジタグ構築物を生成する前に前記記録タグを増幅する。巨大分子および付随する結合性物質を含む複合体を液滴またはマイクロ流体液滴に液滴当たりの複合体が最大で１つになるように分配する実施形態では、記録タグの増幅により、情報をコーディングタグまたはジタグ構築物に移行させるための鋳型として追加的な記録タグがもたらされる（例えば図１３および図１４を参照されたい）。エマルジョン融合ＰＣＲを使用して、記録タグ情報をコーディングタグに移行させるか、またはジタグ構築物の集団を創出することができる。
【１１６７】
生成された伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物を解析前に増幅させることができる。伸長コーディングタグまたはジタグ構築物の収集物の解析は、核酸配列決定法を含んでよい。合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、またはパイロシーケンシング。核酸配列決定法は、単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、または先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングであってよい。
【１１６８】
エドマン分解、およびＰＩＴＣ、サンガー薬剤（ＤＮＦＢ）、ＳＮＦＢ、アセチル化試薬、アミジン化（グアニジニル化）試薬などのＮ末端アミンを化学的に標識する方法により、標準の核酸またはＰＮＡ塩基の内部アミノ酸および環外アミン、例えば、アデニン、グアニン、およびシトシンを修飾することもできる。ある特定の実施形態では、ペプチドのリシン残基のε−アミンを、配列決定の前に酸無水物、グアニジン化剤、または同様のブロッキング試薬でブロッキングする。ＤＮＡ塩基の環外アミンはペプチドのＮ末端第一級アミンよりもはるかに反応性が低いが、ＤＮＡ塩基の内部アミノ酸および環外アミンに対する非標的活性を低下させる、アミン反応性作用物質のＮ末端アミンに対する反応性の制御が、配列決定アッセイにとって重要である。修飾反応の選択性は、ｐＨ、溶媒（水性対有機、非プロトン性、非極性、極性非プロトン性、イオン性液体など）、塩基および触媒、共溶媒、温度、および時間などの、反応条件を調整することによって、モジュレートすることができる。さらに、ＤＮＡ塩基の環外アミンの反応性は、ＤＮＡがｓｓＤＮＡの形態であるかｄｓＤＮＡの形態であるかによってモジュレートされる。修飾を最小限にするために、ＮＴＡＡ化学修飾の前に、記録タグを相補的ＤＮＡプローブ：Ｐ１’、｛試料ＢＣ｝’、｛Ｓｐ−ＢＣ｝’などとハイブリダイズさせることができる。別の実施形態では、保護された環外アミンを有する核酸の使用も使用することもできる（Ohkubo, Kasuya et al. 2008）。さらに別の実施形態では、ＳＮＦＢなどの「反応性が低い」アミン標識化合物により、ＤＮＡの内部アミノ酸および環外アミンに対するオフターゲットの標識が軽減される（Cartyand Hirs 1968）。パラスルホニル基のほうがパラニトロ基よりも電子求引性であり、したがって、ＳＮＦＢでのほうがＤＮＦＢよりもフッ素置換の活性が低くなるという事実のため、ＳＮＦＢのほうがＤＮＦＢよりも反応性が低い。
【１１６９】
ＮＴＡＡ  α−アミン修飾を最適化し、オフターゲットのアミノ酸修飾またはＤＮＡ修飾を最小限にするためのカップリング条件およびカップリング試薬の調整は、化学および反応条件（濃度、温度、時間、ｐＨ、溶媒の型など）を慎重に選択することによって可能である。例えば、ＤＮＦＢは、二級アミンと、水中よりもアセトニトリルなどの非プロトン性溶媒中の方が容易に反応することが公知である。環外アミンが軽度に修飾されてもなお相補的なプローブが配列とハイブリダイズすることが可能になるが、ポリメラーゼに基づくプライマー伸長を妨害する可能性がある。環外アミンを保護しながら、それでも水素結合を可能にすることも可能である。これは、保護された塩基がなお目的の標的とハイブリダイズすることが可能であるという最近の刊行物に記載された（Ｏｈｋｕｂｏ、Ｋａｓｕｙａら、２００８年）。一実施形態では、操作されたポリメラーゼを使用して、ＤＮＡコーディングタグ鋳型上の記録タグの伸長中に、保護された塩基を有するヌクレオチドを組み入れる。別の実施形態では、操作されたポリメラーゼを使用して、ＰＮＡ記録タグ鋳型上のコーディングタグの伸長中に記録タグＰＮＡ鋳型（ｗ／またはｗ／ｏ保護された塩基）上のヌクレオチドを組み入れる。別の実施形態では、情報を、外因性オリゴヌクレオチドをＰＮＡ記録タグとアニーリングさせることによって記録タグからコーディングタグに移行させることができる。ハイブリダイゼーションの特異性は、ｎ−ｍｅｒのワードのアセンブリに基づく設計などの配列空間が別個であるＵＭＩを選択することによって容易にすることができる（Ｇｅｒｒｙ、Ｗｉｔｏｗｓｋｉら、１９９９年）。
【１１７０】
エドマン様Ｎ末端ペプチド分解配列決定を使用してペプチドの直鎖状アミノ酸配列を決定することができるが、代替的な実施形態を使用して、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、およびジタグを利用する方法を用いたペプチドの部分的な組成分析を実施することができる。結合性物質または化学標識を使用してペプチド上のＮ末端および内部の両方のアミノ酸またはアミノ酸修飾を識別することができる。化学薬剤により、アミノ酸（例えば、標識）を部位特異的に共有結合により修飾することができる（ＳｌｅｔｔｅｎおよびＢｅｒｔｏｚｚｉ、２００９年、Ｂａｓｌｅ、Ｊｏｕｂｅｒｔら、２０１０年）（ＳｐｉｃｅｒおよびＤａｖｉｓ、２０１４年）。部位特異的に標識されたアミノ酸のコーディングおよびその後の識別を容易にするために、単一のアミノ酸を標的とする化学標識剤にコーディングタグを付着させることができる（例えば図１３を参照されたい）。
【１１７１】
ペプチド組成分析にはペプチドの環状分解は必要なく、したがって、ＤＮＡを含有するタグを厳しいエドマン化学に曝露することの問題が回避される。環状結合様式では、組成情報（アミノ酸またはジペプチド／トリペプチド情報）、ＰＴＭ情報、および一次アミノ酸配列をもたらすために伸長コーディングタグまたはジタグを使用することもできる。一実施形態では、この組成情報は、本明細書に記載の伸長コーディングタグまたはジタグ手法を使用して読み取ることができる。ＵＭＩおよびコンパートメントタグ情報と組み合わせると、伸長コーディングタグまたはジタグの収集物により、ペプチドおよびそれらの起源であるコンパートメントのタンパク質（複数可）に関する組成情報がもたらされる。同じコンパートメントタグ（および表面上起源であるタンパク質分子）にマッピングし戻された伸長コーディングタグまたはジタグの収集物は、部分的な組成情報を有するペプチドをマッピングするための強力なツールである。プロテオーム全体にマッピングし戻すのではなく、コンパートメントタグ付きペプチドの集合を限られたタンパク質分子のサブセットにマッピングし戻し、これにより、マッピングの一意性が著しく増大する。
【１１７２】
本明細書で使用される結合性物質は、単一のアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、またはさらに長いペプチド配列モチーフを認識し得る。Ｔｅｓｓｌｅｒ（２０１１年、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｐｈ．Ｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）は、荷電したジペプチドエピトープのサブセットに対して比較的選択的なジペプチド抗体を生成することができることを実証した（Ｔｅｓｓｌｅｒ、２０１１年）。代替のタンパク質足場（例えば、ａａＲＳ、アンチカリン、ＣｌｐＳなど）およびアプタマーへの定向進化の適用を使用して、ジペプチド／トリペプチド結合性物質のセットを増大させることができる。単一のタンパク質分子にマッピングし戻すことと併せたジペプチド／トリペプチド組成分析からの情報は、各タンパク質分子を一意的に識別し、定量化するために十分なものであり得る。最大で、合計４００種の可能性のあるジペプチドの組合せがある。しかし、最も頻度が高く、かつ最も抗原性が高い（荷電、親水性、疎水性）ジペプチドのサブセットが、結合性物質を生成するために十分なものであるはずである。この数は、４０〜１００種の異なる結合性物質のセットを構成し得る。４０種の異なる結合性物質のセットに関して、平均１０ｍｅｒのペプチドに少なくとも１種の結合性物質が結合する見込みは約８０％である。この情報を同じタンパク質分子に由来する全てのペプチドと組み合わせることにより、タンパク質分子の識別が可能になり得る。ペプチドおよびその起源であるタンパク質に関するこの情報全てを組み合わせて、より正確かつ的確なタンパク質配列特徴付けをもたらすことができる。
【１１７３】
部分的なペプチド配列情報を使用する最近のデジタルタンパク質特徴付けアッセイが提唱された（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎら、２０１５年、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．、１１巻：ｅ１００４０８０頁）（Ｙａｏ、Ｄｏｃｔｅｒら、２０１５年）。すなわち、当該手法では、システイン、リシン、アルギニン、チロシン、アスパラギン酸／グルタミン酸などの、標準の化学を使用して容易に標識されるアミノ酸の蛍光標識を使用する（Ｂａｓｌｅ、Ｊｏｕｂｅｒｔら、２０１０年）。部分的なペプチド配列情報を用いることの問題は、プロテオームにマッピングし戻すことが一対多数の関連であり、一意のタンパク質が識別されないことである。この一対多数のマッピング問題は、プロテオーム全体空間を、ペプチドがマッピングし戻される限られたタンパク質分子のサブセットに減少させることによって解決することができる。本質的に、単一の部分的なペプチド配列を１００種または１０００種の異なるタンパク質配列にマッピングし戻すことができるが、いくつかのペプチド（例えば、単一のタンパク質分子の消化に由来する１０ペプチド）のセットを全て、コンパートメント内のタンパク質分子のサブセットに含有される単一のタンパク質分子にマッピングし戻した場合、タンパク質分子の同一性を推定することが容易であることが公知である。例えば、同じ分子に由来する全てのペプチドに関するペプチドプロテオームマップの交差により、可能性のあるタンパク質同一性のセットが著しく制限される（例えば図１５を参照されたい）。
【１１７４】
特に、部分的なペプチド配列または組成のマッピング可能性は、コンパートメントのタグおよびＵＭＩの革新的使用を行うことによって有意に増強される。すなわち、プロテオームをバーコードが付されたコンパートメントに最初に分配し、ここでのコンパートメントバーコードは、ＵＭＩ配列にも付着している。コンパートメントバーコードは、コンパートメントに一意の配列であり、ＵＭＩは、コンパートメント内のバーコードが付された分子それぞれに一意の配列である（例えば、図１６を参照されたい）。一実施形態では、この分配は、その全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０６１５１７に開示されているものと同様の方法を使用して、ビーズに付着しているＤＮＡコンパートメントバーコードとのハイブリダイゼーションによる、ＤＮＡタグで標識されたポリペプチドとビーズの表面との直接相互作用によって、実現される（例えば、図３１を参照されたい）。プライマー伸長ステップにより、ビーズに連結されたコンパートメントバーコードからポリペプチド上のＤＮＡタグに情報を移行させる（例えば、図２０を参照されたい）。別の実施形態では、この分配は、ＵＭＩを含有する、バーコードが付されたビーズおよびタンパク質分子をエマルジョンの液滴中に共封入することによって実現される。さらに、液滴は、タンパク質をペプチドに消化するプロテアーゼを必要に応じて含有する。いくつものプロテアーゼを、レポータータグが付されたポリペプチドを消化するために使用することができる（Switzar, Giera et al. 2013）。ブテラーゼＩなどの酵素的リガーゼとプロテアーゼの共封入では、酵素をプロテアーゼ消化に対して抵抗性にするために、ペグ化などの酵素の修飾が必要になり得る（Frokjaerand Otzen 2005, Kang, Wang et al. 2010）。消化後、ペプチドをバーコード−ＵＭＩタグとライゲーションする。好ましい実施形態では、下流の生化学的操作を容易にするために、バーコード−ＵＭＩタグをビーズ上に保持する（例えば、図１３を参照されたい）。
【１１７５】
バーコード−ＵＭＩとペプチドのライゲーション後、エマルジョンを破壊し、ビーズを回収する。バーコードが付されたペプチドを、それらの一次アミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸組成によって特徴付けることができる。ペプチドに関するどちらの型の情報も、プロテオームのサブセットにマッピングし戻すために使用することができる。一般に、配列情報は、組成情報よりもはるかに小さいプロテオームのサブセットにマッピングし戻される。それにもかかわらず、多数のペプチド（配列または組成）からの情報を同じコンパートメントバーコードと組み合わせることにより、ペプチドの起源であるタンパク質（複数可）を一意的に識別することが可能である。このように、プロテオーム全体を特徴付け、定量化することができる。ペプチド上の一次配列情報は、ペプチド配列を表すＤＮＡにコードされるライブラリー（ＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ）（ＤＥＬ）の伸長記録タグ創出を伴うペプチド配列決定反応を実施することによって引き出すことができる。好ましい実施形態では、記録タグは、コンパートメントバーコードおよびＵＭＩ配列で構成される。この情報を、コーディングタグから移行された一次またはＰＴＭアミノ酸情報と共に使用して、最終的なマッピングされたペプチド情報を生成する。
【１１７６】
ペプチド配列情報に対する代替は、コンパートメントバーコードおよびＵＭＩと連結したペプチドアミノ酸またはジペプチド／トリペプチド組成情報を生成することである。これは、ＵＭＩ−バーコードが付されたペプチドを伴うビーズを、各ペプチド上の選択されたアミノ酸（内部）をアミノ酸コード情報および別のアミノ酸ＵＭＩ（ＡＡ  ＵＭＩ）を含むＤＮＡタグで部位特異的に標識するアミノ酸標識ステップに供することによって実現される（例えば図１３を参照されたい）。最も化学標識しやすいアミノ酸（ＡＡ）は、リシン、アルギニン、システイン、チロシン、トリプトファン、およびアスパラギン酸／グルタミン酸であるが、他のＡＡに対する標識スキームを同様に展開することも実行可能であり得る（ＭｅｎｄｏｚａおよびＶａｃｈｅｔ、２００９年）。所与のペプチドは、同じ型のＡＡをいくつか含有し得る。同じ型の多数のアミノ酸の存在は、付着したＡＡ  ＵＭＩ標識によって区別することができる。各標識分子は、ＤＮＡタグ内に異なるＵＭＩを有し、それによりアミノ酸の計数が可能になる。化学標識に対する代替は、ＡＡを結合性物質で「標識」することである。例えば、ＡＡコード情報およびＡＡ  ＵＭＩを含むコーディングタグで標識されたチロシン特異的抗体を使用して、ペプチドの全てのチロシンに印を付けることができる。この手法に伴う注意事項は、大きなかさのある抗体では立体的な障害が生じることであり、この目的のためには、より小さなｓｃＦｖ、アンチカリン、またはＣｌｐＳバリアントを使用することが理想的である。
【１１７７】
一実施形態では、ＡＡへのタグ付け後、情報を、記録タグと、ペプチド上の結合したまたは共有結合によりカップリングした結合性物質に付随する多数のコーディングタグとの間で、液滴当たり単一のペプチドが含有されるようにペプチド複合体を区画化し、エマルジョン融合ＰＣＲを実施して、区画化されたペプチドのアミノ酸組成を特徴付ける伸長コーディングタグまたはジタグのセットを構築することによって移行させる。ジタグの配列決定後、同じバーコードを有するペプチド上の情報を単一のタンパク質分子にマッピングし戻すことができる。
【１１７８】
特定の実施形態では、タグが付されたペプチド複合体をビーズから解離させ（例えば図１３を参照されたい）、小さなミニコンパートメント（例えば、マイクロエマルジョン）に、平均して単一の標識された／結合した結合性物質ペプチド複合体のみが所与のコンパートメント内に存在するように分配する。特定の実施形態では、この区画化は、マイクロエマルジョン液滴の生成によって実現される（Ｓｈｉｍ、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅら、２０１３年、Ｓｈｅｍｂｅｋａｒ、Ｃｈａｉｐａｎら、２０１６年）。ペプチド複合体に加えて、ＰＣＲ試薬も、液滴中に３種のプライマー（Ｕ１、Ｓｐ、およびＵ２ｔｒ）と共封入することができる。液滴形成後、Ｕ１およびＳｐのみがアニーリングし、記録タグ産物が増幅するように、高いアニーリング温度でエマルジョンＰＣＲを数サイクル実施する（約５〜１０サイクル）（例えば図１３を参照されたい）。この最初の５〜１０サイクルのＰＣＲの後、アミノ酸コードタグ上のＵ２ｔｒおよびＳｐｔｒが増幅に加わるようにアニーリング温度を低下させ、さらに約１０ラウンドを実施する。３プライマーエマルジョンＰＣＲにより、ペプチドＵＭＩ−バーコードとＡＡコードタグの全てが有効に組み合わされ、それにより、ペプチドおよびそのアミノ酸組成のジタグライブラリー表示が生成する。３プライマーＰＣＲおよびタグの連鎖を実施する他のモダリティを使用することもできる。別の実施形態は、光デブロッキング、または不安定なブロッキングされた３’ヌクレオチドの３’デブロッキングを開始するための油可溶性還元体の添加によって活性化される、３’ブロッキングされたＵ２プライマーの使用である。エマルジョンＰＣＲ後、ＮＧＳ配列決定のためのライブラリーエレメントをフォーマットするための一般的なプライマーを用いて別のラウンドのＰＣＲを実施することができる。
【１１７９】
このように、ライブラリーエレメントの異なる配列成分を計数および分類のために使用する。所与のペプチド（コンパートメントバーコード−ＵＭＩの組合せによって識別される）について、多くのライブラリーエレメントが存在し、それぞれが識別用ＡＡコードタグおよびＡＡ  ＵＭＩを有する（例えば図１３を参照されたい）。ＡＡコードおよび付随するＵＭＩを使用して、所与のペプチド内の所与のアミノ酸型の存在を計数する。したがって、ペプチド（おそらくＧｌｕＣ、ＬｙｓＣ、またはＥｎｄｏ  ＡｓｎＮ消化物）を、そのアミノ酸組成（例えば、Ｃｙｓが２つ、Ｌｙｓが１つ、Ａｒｇが１つ、Ｔｙｒが２つなど）によって、空間的順序は考慮せず、特徴付ける。それにもかかわらず、これにより、ペプチドをプロテオームのサブセットにマッピングするため、また、同じタンパク質分子に由来する他のペプチドと組み合わせて使用した場合には、タンパク質を一意的に識別および定量化するための、十分なシグネチャがもたらされる。
Ｈ．末端アミノ酸（ＴＡＡ）標識のためのキットおよびキット成分
【１１８０】
ある特定の実施形態では、ペプチドの末端アミノ酸（例えば、ＮＴＡＡまたはＣＴＡＡ）を、本明細書に記載の方法でペプチドを結合性物質と接触させる前に、修飾または標識する。そのような修飾および／または標識のためのキットおよびキット成分を本明細書で説明する。
【１１８１】
一部の実施形態では、ＮＴＡＡをフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）と反応させて、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）−ＮＴＡＡ誘導体を生成する。エドマン分解では、一般には、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）を使用してＮ末端を標識する。ＰＩＴＣは、本明細書に開示されている方法に十分に適する２つの性質を有する：（１）ＰＩＴＣはＮ末端アミン基を高い効率で標識する；および（２）得られるＰＴＣ誘導体化ＮＴＡＡは、酸処理されると自己異性化を受け、それにより当該アミノ酸が残りのペプチドから切断される。
【１１８２】
ＮＴＡＡを標識するために使用することができる他の試薬としては、４−スルホフェニルイソチオシアネート、３−ピリジルイソチオシアネート（isothiocyante）（ＰＹＩＴＣ）、２−ピペリジノエチルイソチオシアネート（ＰＥＩＴＣ）、３−（４−モルホリノ）プロピルイソチオシアネート（ＭＰＩＴＣ）、３−（ジエチルアミノ）プロピルイソチオシアネート（ＤＥＰＴＩＣ）（Wanget al., 2009, Anal Chem 81: 1893-1900）、（１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（サンガー試薬、ＤＮＦＢ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ−Ｃｌ、または１−ジメチルアミノナフタレン−５−スルホニルクロリド）、４−スルホニル−２−ニトロフルオロベンゼン（ＳＮＦＢ）、アセチル化試薬、アミジン化（グアニジニル化）試薬、２−カルボキシ−４，６−ジニトロクロロベンゼン、７−メトキシクマリン酢酸、チオアシル化試薬、チオアセチル化試薬、およびチオベンジル化試薬が挙げられる。ＮＴＡＡを標識のためにブロッキングする場合、例えば、Ｎ−アセチルブロッキングをアシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）で除去することなど、末端をアンブロッキングするための手法がいくつも存在する（Farries,Harris et al., 1991, Eur. J. Biochem. 196:679- 685）。ペプチドのＮ末端をアンブロッキングする方法は、当技術分野で公知である（例えば、Krishnaet al., 1991, Anal.Biochem.199:45-50；Leone et al., 2011, Curr. Protoc. ProteinSci., Chapter 11:Unit11.7；Fowler et al., 2001, Curr.Protoc.Protein Sci.,Chapter 11: Unit 11.7を参照されたく、これらの参考文献の各々は、これによりその全体が参照により組み込まれる）。
【１１８３】
ダンシルクロリドは、ペプチドの遊離のアミン基と反応して、ＮＴＡＡのダンシル誘導体をもたらす。ＤＮＦＢおよびＳＮＦＢは、ペプチドのε−アミン基と反応して、それぞれＤＮＰ−ＮＴＡＡ、およびＳＮＰ−ＮＴＡＡを生成する。さらに、ＤＮＦＢおよびＳＮＦＢはどちらも、リシン残基のε−アミンとも反応する。ＤＮＦＢは、チロシンおよびヒスチジンアミノ酸残基とも反応する。ＳＮＦＢは、アミン基に対してＤＮＦＢよりも良好な選択性を有し、ＮＴＡＡ修飾に好ましい（Carty and Hirs 1968）。ある特定の実施形態では、ポリペプチドをプロテアーゼ消化してペプチドにする前に、リシンε−アミンを有機無水物でプレブロッキングする。
【１１８４】
別の有用なＮＴＡＡ修飾因子はアセチル基であり、その理由は、アセチル化ＮＴＡＡを除去する公知の酵素、すなわち、Ｎ末端アセチル化アミノ酸を切断し、それによりペプチドを単一アミノ酸だけ有効に短縮するアシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）が存在するからである｛Chang, 2015 #373; Friedmann, 2013 #374｝。ＮＴＡＡは、無水酢酸を用いて化学的にアセチル化することもでき、またはＮ末端アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）を用いて酵素的にアセチル化することもできる｛Chang,2015 #373; Friedmann, 2013 #374｝。さらに別の有用なＮＴＡＡ修飾因子は、アミジニル（グアニジニル）部分であり、その理由は、アミジン化ＮＴＡＡの証明された切断化学、すなわち、Ｎ末端アミジン化ペプチドを０．５〜２％ＮａＯＨと一緒に穏やかにインキュベートすることにより、Ｎ末端アミノ酸の切断がもたらされることが文献で公知であるからである｛Hamada,2016 #383｝。これにより、穏やかなエドマン様化学的Ｎ末端分解ペプチド配列決定プロセスが有効にもたらされる。さらに、ある特定のアミジン化（グアニジニル化）試薬および下流のＮａＯＨ切断は、ＤＮＡエンコーディングに非常に適合性である。
【１１８５】
ＮＴＡＡにＤＮＰ／ＳＮＰ基、アセチル基、またはアミジニル（グアニジニル）基が存在することにより、操作された結合性物質との相互作用のより良好な取り扱いがもたらされ得る。低ｎＭの親和性を有する商業的なＤＮＰ抗体がいくつも存在する。他のＮＴＡＡ標識方法としては、トリプリガーゼ（ｔｒｙｐｌｉｇａｓｅ）を用いた標識（Ｌｉｅｂｓｃｈｅｒら、２０１４年、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ、５３巻：３０２４〜３０２８頁）、およびアミノアシルトランスフェラーゼを用いた標識（Ｗａｇｎｅｒら、２０１１年、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１３３巻：１５１３９〜１５１４７頁）が挙げられる。
【１１８６】
イソチオシアネートは、イオン性液体の存在下では、第一級アミンに対して増強された反応性を有することが示されている。イオン性液体は、有機化学反応における優れた溶媒であり（また、触媒として作用する）、チオ尿素を形成する、イソチオシアネートとアミンの反応を増強することができる。例は、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）による芳香族および脂肪族アミンの迅速かつ効率的な標識のためにイオン性液体１−ブチル−３−メチル−イミダゾリウムテトラフルオロボレート［Ｂｍｉｍ］［ＢＦ４］を使用することである（Ｌｅ、Ｃｈｅｎら、２００５年）。エドマン分解は、ＰＩＴＣなどのイソチオシアネートとペプチドのアミノＮ末端の反応を伴う。そのように、一実施形態では、より穏やかな標識および分解条件をもたらすことによってエドマン分解プロセスの効率を改善するためにイオン性液体を使用する。例えば、イオン性液体［Ｂｍｉｍ］［ＢＦ４］中５％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）ＰＩＴＣを２５℃で１０分間使用することは、ピリジン、エタノール、およびｄｄＨ２Ｏを含有する溶液（１：１：１  ｖｏｌ．／ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）中５％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）ＰＩＴＣを５５℃で６０分間使用する標準のエドマンＰＩＴＣ誘導体化条件下で標識することよりも効率的である（Ｗａｎｇ、Ｆａｎｇら、２００９年）。好ましい実施形態では、ポリペプチドの内部のリシン、チロシン、ヒスチジン、およびシステインアミノ酸を、ペプチドへの断片化の前にブロッキングする。このように、ペプチド配列決定反応中、ペプチドＮＴＡＡのα−アミン基のみが修飾に利用可能になるようにする。これは、特に、ＤＮＦＢ（サンガー試薬）およびダンシルクロリドを使用する場合に適切である。
【１１８７】
ある特定の実施形態では、ＮＴＡＡは、ＮＴＡＡ標識ステップの前にブロッキングされている（特にタンパク質の元のＮ末端）。その場合、例えば、Ｎ−アセチルブロッキングをアシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）で除去することなど、Ｎ末端をアンブロッキングするための手法がいくつも存在する（Ｆａｒｒｉｅｓ、Ｈａｒｒｉｓら、１９９１年）。ペプチドのＮ末端をアンブロッキングする他の方法がいくつも当技術分野で公知である（例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｒｉｓｈｎａら、１９９１年、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９巻：４５〜５０頁；Ｌｅｏｎｅら、２０１１年、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、第１１章：ユニット１１．７；Ｆｏｗｌｅｒら、２００１年、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、第１１章：ユニット１１．７を参照されたい）。
【１１８８】
ＣＴＡＡは、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、２０１３年）に記載されている通り、いくつもの異なるカルボキシル反応性試薬を用いて修飾することができる。別の例では、ＣＴＡＡを混合無水物およびイソチオシアネートで修飾して、チオヒダントインを生成する（（ＬｉｕおよびＬｉａｎｇ、２００１年）および米国特許第５，０４９，５０７号）。チオヒダントインで修飾されたペプチドは、基剤中上昇した温度で切断されて、最後から２番目のＣＴＡＡが露出し、それにより、Ｃ末端に基づくペプチド分解配列決定手法を有効に生成することができる（ＬｉｕおよびＬｉａｎｇ、２００１年）。ＣＴＡＡに対して行うことができる他の修飾としては、パラ−ニトロアニリド基の付加および７−アミノ−４−メチルクマリニル基の付加が挙げられる。
Ｉ．末端アミノ酸切断のためのキットおよびキット成分
【１１８９】
ペプチドの解析に関するある特定の実施形態では、末端アミノ酸（Ｎ末端またはＣ末端）への結合性物質の結合、およびコーディングタグ情報の記録タグへの移行、記録タグ情報のコーディングタグへの移行、記録タグ情報およびコーディングタグ情報のジタグ構築物への移行の後、末端アミノ酸をペプチドから除去または切断して、新しい末端アミノ酸を露出させる。一部の実施形態では、末端アミノ酸は、ＮＴＡＡである。他の実施形態では、末端アミノ酸は、ＣＴＡＡである。
【１１９０】
末端アミノ酸の切断は、化学的切断および酵素的切断を含めた、任意の数の公知の技法によって実現することができる。化学的切断の例は、エドマン分解である。ペプチドのエドマン分解中、ｎ  ＮＴＡＡをフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）と弱アルカリ性条件下で反応させて、フェニルチオカルバモイル−ＮＴＡＡ誘導体を形成する。次に、酸性条件下で、フェニルチオカルバモイル−ＮＴＡＡ誘導体を切断し、それにより、遊離のチアゾリノン誘導体を生成し、それにより、ペプチドの（ｎ−１）番目のアミノ酸をＮ末端アミノ酸（（ｎ−１）番目のＮＴＡＡ）に変換する。このプロセスのステップを下で例示する。
【１１９１】
典型的なエドマン分解では、上記の通り、長いインキュベーション時間にわたって厳しい高温の化学的条件（例えば、無水ＴＦＡ）の発生が必要になる。これらの条件は、一般に、巨大分子の核酸エンコーディングには適合しない。
【１１９２】
化学的エドマン分解を核酸エンコーディングに好都合の手法に変換するために、厳しい化学的ステップを穏やかな化学的分解または効率的な酵素的ステップで置き換える。一実施形態では、化学的エドマン分解を、元々記載された条件よりも穏やかな条件を使用して利用することができる。アセトニトリル中無水ＴＦＡを酢酸トリエチルアミンで置き換えること（例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｂａｒｒｅｔｔ、１９８５年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２６巻：４３７５〜４３７８頁を参照されたい）を含め、エドマン分解のための穏やかな切断条件がいくつか文献に記載されている。ＮＴＡＡの切断は、エドマン分解と比較して穏やかな切断条件を使用するチオアシル化分解を使用することによって実現することもできる（米国特許第４，８６３，８７０号を参照されたい）。
【１１９３】
別の実施形態では、無水ＴＦＡによる切断を、穏やかな条件下で切れやすいペプチド結合のカルボニル基のチオ尿素硫黄原子の求核攻撃によるＰＩＴＣ誘導体化Ｎ末端アミノ酸の除去を触媒する、操作された酵素である「エドマナーゼ（Ｅｄｍａｎａｓｅ）」で置き換えることができる（その全体が参照により組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１４／０２７３００４号を参照されたい）。エドマナーゼは、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉに由来するシステインプロテアーゼであるクルザイン（ｃｒｕｚａｉｎ）を改変することによって作出された（Ｂｏｒｇｏ、２０１４年）。Ｃ２５Ｇ変異により触媒性システイン残基が除去されたと同時に、エドマン試薬（ＰＩＴＣ）のフェニル部分との立体的な適合を創出するための３つの変異（Ｇ６５Ｓ、Ａ１３８Ｃ、Ｌ１６０Ｙ）が選択された。
【１１９４】
ＮＴＡＡの酵素的切断は、アミノペプチダーゼによって実現することもできる。アミノペプチダーゼは、単量体酵素および多量体酵素として天然に存在し、金属またはＡＴＰ依存性であり得る。天然のアミノペプチダーゼは、非常に限られた特異性を有し、一般的に、Ｎ末端アミノ酸を前進的に切断し、それにより、アミノ酸を次々に切断する。本明細書に記載の方法に関しては、アミノペプチダーゼを、ＮＴＡＡに対して、Ｎ末端標識で修飾されている場合にのみ特異的な結合活性または触媒活性を有するように操作することができる。例えば、アミノペプチダーゼを、Ｎ末端アミノ酸がＤＮＰ／ＳＮＰ、ＰＴＣ、ダンシルクロリド、アセチル、アミジニルなどの基によって修飾されている場合にＮ末端アミノ酸のみを切断するように操作することができる。このように、アミノペプチダーゼは、一度にＮ末端から単一のアミノ酸だけ切断し、分解サイクルの制御を可能にする。一部の実施形態では、改変アミノペプチダーゼは、アミノ酸残基同一性に関しては非選択的である一方で、Ｎ末端標識に関しては選択的である。他の実施形態では、改変アミノペプチダーゼは、アミノ酸残基同一性とＮ末端標識の両方に関して選択的である。酵素的ＮＴＡＡ分解の修飾特異性のモデルの例は、ＢｏｒｇｏおよびＨａｖｒａｎｅｋにより例示されており、そこでは、構造−機能補助設計を通じて、メチオニンアミノペプチダーゼがロイシンアミノペプチダーゼに変換された（ＢｏｒｇｏおよびＨａｖｒａｎｅｋ、２０１４年）。ＤＮＰ／ＳＮＰで修飾されたＮＴＡＡなどの修飾されたＮＴＡＡに同様の手法をとることができ、ここで、アミノペプチダーゼを、ＤＮＰ／ＳＮＰ基が存在するＮ末端アミノ酸のみを切断するように操作する（構造−機能に基づく設計および定向進化の両方を使用する）。個々のまたは小さな群の標識した（ビオチン化した）ＮＴＡＡに結合し、それを切断する操作されたアミノペプチダーゼ変異体が記載されている（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０６５３２２号を参照されたい）。
【１１９５】
ある特定の実施形態では、緻密な単量体金属酵素的アミノペプチダーゼを、ＤＮＰで標識されたＮＴＡＡを認識し、切断するように操作する。単量体メタロ−アミノペプチダーゼの使用には、重要な利点が２つある：１）緻密な単量体タンパク質は、ファージディスプレイを使用してディスプレイおよびスクリーニングするのがはるかに容易である；２）メタロ−アミノペプチダーゼは、適切な金属カチオンを添加または除去することによってその活性をオン／オフにすることができるという点で、独特の利点を有する。例示的なアミノペプチダーゼとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＫＫ５０６（ＳＫＡＰ）（Ｙｏｏ、Ａｈｎら、２０１０年）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（ＳＧＡＰ）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＶＰＡＰ）、（ＳｐｕｎｇｉｎおよびＢｌｕｍｂｅｒｇ、１９８９年、Ｂｅｎ−Ｍｅｉｒ、Ｓｐｕｎｇｉｎら、１９９３年）などの、アミノペプチダーゼのＭ２８ファミリーが挙げられる。これらの酵素は、室温およびｐＨ８．０で安定であり、ロバストであり、かつ活性であり、したがって、ペプチド解析に好ましい穏やかな条件に適合する。
【１１９６】
別の実施形態では、アミノペプチダーゼを、Ｎ末端アミノ酸標識の存在下でのみ活性になるように操作することにより、周期的切断が達成される。さらに、アミノペプチダーゼを、非特異的になるように、したがって、１つの特定のアミノ酸を別のアミノ酸に対して選択的に認識するのではなく、単に標識されたＮ末端を認識するように、操作することができる。好ましい実施形態では、メタロペプチダーゼ単量体アミノペプチダーゼ（例えば、Ｖｉｂｒｏロイシンアミノペプチダーゼ）（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ、Ｖｉｌｌａｓｅｎｏｒら、２０１４年）を、修飾されたＮＴＡＡ（例えば、ＰＴＣ、ＤＮＰ、ＳＮＰ、アセチル化された、アシル化されたなど）のみを切断するように操作する。
【１１９７】
さらに別の実施形態では、アセチル化ＮＴＡＡを切断するように操作されたアシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ）を使用することによって周期的切断を達成する。ＡＰＨは、ブロッキングされたペプチドからのＮα−アセチル化アミノ酸の除去を触媒することができるセリンペプチダーゼであり、真核細胞、細菌細胞および古細菌細胞において、Ｎ末端がアセチル化されたタンパク質の重要な調節因子である。ある特定の実施形態では、ＡＰＨは、二量体であり、エキソペプチダーゼ活性のみを有する（Ｇｏｇｌｉｅｔｔｉｎｏ、Ｂａｌｅｓｔｒｉｅｒｉら、２０１２年、Ｇｏｇｌｉｅｔｔｉｎｏ、Ｒｉｃｃｉｏら、２０１４年）。操作されたＡＰＨは、内因性または野生型ＡＰＨよりも高い親和性および低い選択性を有し得る。
【１１９８】
さらに別の実施形態では、ＮＴＡＡのアミジン化（グアニジニル化）を使用して、標識されたＮＴＡＡのＮａＯＨを使用した穏やかな切断を可能にする（Ｈａｍａｄａ、２０１６年、その全体が参照により組み込まれる）。Ｓ−メチルイソチオ尿素、３，５−ジメチルピラゾール−１−カルボキサミジン、Ｓ−エチルチオウロニウムブロミド、Ｓ−エチルチオウロニウムクロリド、Ｏ−メチルイソ尿素、Ｏ−メチルイソウロニウム硫酸塩、Ｏ−メチルイソ尿素硫化水素塩、２−メチル−１−ニトロイソ尿素、アミノイミノメタンスルホン酸、シアナミド、シアノグアニド、ジシアンジアミド、３，５−ジメチル−１−グアニルピラゾール硝酸塩および３，５−ジメチルピラゾール、Ｎ，Ｎ’−ビス（オルト−クロロ−Ｃｂｚ）−Ｓ−メチルイソチオ尿素およびＮ，Ｎ’−ビス（オルト−ブロモ−Ｃｂｚ）−Ｓ−メチルイソチオ尿素を含めたいくつものアミジン化（グアニジニル化）試薬が当技術分野で公知である（Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ、２００５年、その全体が参照により組み込まれる）。
【１１９９】
ＮＴＡＡの標識、結合、および分解ワークフローの例は以下の通りである（例えば図４１および図４２を参照されたい）：タンパク質分解による消化に由来する、記録タグで標識されたペプチドの大きな集団（例えば、５千万〜１０億）を単一分子シーケンシング基板（例えば、多孔質ビーズ）に適切な分子内間隔でランダムに固定化する。周期的に、各ペプチドのＮ末端アミノ酸（ＮＴＡＡ）を小さな化学的部分（例えば、ＤＮＰ、ＳＮＰ、アセチル）で修飾して、ＮＴＡＡ分解プロセスの周期的制御をもたらし、同類結合性物質による結合親和性を増強する。各固定化ペプチドの修飾されたＮ末端アミノ酸（例えば、ＤＮＰ−ＮＴＡＡ、ＳＮＰ−ＮＴＡＡ、アセチル−ＮＴＡＡ）に同類のＮＴＡＡ結合性物質を結合させ、結合したＮＴＡＡ結合性物質に付随するコーディングタグからの情報を固定化されたペプチドに付随する記録タグに移行させる。ＮＴＡＡの認識、結合、およびコーディングタグ情報の記録タグへの移行の後、標識されたＮＴＡＡを、標識の存在下でのみＮＴＡＡを切断することができる操作されたアミノペプチダーゼ（例えば、ＤＮＰ−ＮＴＡＡもしくはＳＮＰ−ＮＴＡＡに対して）または操作されたＡＰＨ（例えば、アセチル−ＮＴＡＡに対して）に曝露させることによって除去する。他のＮＴＡＡ標識（例えば、ＰＩＴＣ）も、適切に操作されたアミノペプチダーゼとともに使用することもできる。特定の実施形態では、単一の操作されたアミノペプチダーゼまたはＡＰＨは、Ｎ末端アミノ酸標識を有する全ての可能性のあるＮＴＡＡ（翻訳後修飾バリアントを含む）を普遍的に切断する。別の特定の実施形態では、２種、３種、４種、またはそれよりも多くの操作されたアミノペプチダーゼまたはＡＰＨを使用して、標識されたＮＴＡＡのレパートリーを切断する。
【１２００】
ＤＮＰまたはＳＮＰで標識されたＮＴＡＡに対する活性を有するアミノペプチダーゼは、ベンジルペニシリンに対するメタロ−ベータ−ラクタマーゼ酵素の操作におけるＰｏｎｓａｒｄらにより記載されている手法（Ｐｏｎｓａｒｄ、Ｇａｌｌｅｎｉら、２００１年、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇａｃｉｏ、Ｕｇｕｅｎら、２００３年）のような、アポ酵素（金属補助因子の不在下では不活性）に対する密接結合の選択、その後の機能的触媒の選択ステップを組み合わせるスクリーニングを使用して選択することができる。この二段階選択は、Ｚｎ２＋イオンの添加によって活性化されたメタロ−ＡＰの使用を伴う。固定化されたペプチド基板への密接結合選択の後、Ｚｎ２＋を導入し、ＤＮＰまたはＳＮＰで標識されたＮＴＡＡを加水分解することが可能な、触媒として活性なファージにより、結合したファージの上清中への放出が導かれる。ＤＮＰまたはＳＮＰで標識されたＮＴＡＡを切断するための活性なＡＰを濃縮するために、選択ラウンドを繰り返し実施する。
【１２０１】
本明細書において提示される実施形態のいずれかでは、ＮＴＡＡの切断試薬のＮＴＡＡへの動員は、キメラ切断酵素およびキメラＮＴＡＡ修飾因子によって増強することができ、ここで、キメラ切断酵素およびキメラＮＴＡＡ修飾因子は、それぞれ、互いと密接結合反応することが可能な部分を含む（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）（例えば図３９を参照されたい）。例えば、ＮＴＡＡをビオチン−ＰＩＴＣで修飾し、キメラ切断酵素（ストレプトアビジン−エドマナーゼ）を修飾されたＮＴＡＡにストレプトアビジン−ビオチン相互作用によって動員し、それにより切断酵素の親和性および効率を改善することができる。修飾されたＮＴＡＡが切断され、付随する切断酵素と共にペプチドから発散する。キメラエドマナーゼの例では、この手法により、親和性ＫＤがμＭからサブピコモルまで有効に増大する。記録タグと相互作用する切断剤上のＤＮＡタグを使用した係留により、同様の切断の増強も実現することができる（例えば図４４を参照されたい）。
【１２０２】
ＮＴＡＡの切断のための代替として、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）を使用して、最後の２つのＮ末端アミノ酸をペプチドから切断することができる。ある特定の実施形態では、単一のＮＴＡＡを切断することができる（例えば、図４５を参照されたい）。図４５は、ブテラーゼＩペプチド基質のＮ末端ライゲーションによりＴＥＶエンドペプチダーゼ基質をペプチドのＮ末端に付着させる、Ｎ末端分解のための手法を示す。付着後、ＴＥＶエンドペプチダーゼにより、新しくライゲーションされたペプチドがクエリペプチド（配列決定されるペプチド）から切断され、ＮＴＡＡに付着した単一のアスパラギン（Ｎ）が残る。Ｎ末端から２つのアミノ酸を切断するＤＡＰと一緒にインキュベートすることにより、元のＮＴＡＡが最終的に除去されることになる。このプロセス全体をＮ末端分解プロセスとして周期的に繰り返すことができる。
【１２０３】
ＣＴＡＡ結合性物質に関する実施形態に関しては、ＣＴＡＡをペプチドから切断する方法も当技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，０４６，０５３号には、ペプチドまたはタンパク質をアルキル酸無水物と反応させて、カルボキシ末端をオキサゾロンに変換させ、酸およびアルコールまたはエステルを用いた反応によってＣ末端アミノ酸を遊離させる方法が開示されている。ＣＴＡＡの酵素的切断はまた、カルボキシペプチダーゼによっても実現することができる。いくつかのカルボキシペプチダーゼは、アミノ酸の優先性を示し、例えば、カルボキシペプチダーゼＢは、アルギニンおよびリシンなどの塩基性アミノ酸において優先的に切断する。上記の通り、カルボキシペプチダーゼをアミノペプチダーゼと同じように改変して、Ｃ末端標識を有するＣＴＡＡに特異的に結合するカルボキシペプチダーゼを操作して作製することもできる。このように、カルボキシペプチダーゼは、Ｃ末端から一度に単一のアミノ酸のみを切断し、分解サイクルの制御を可能にする。一部の実施形態では、改変カルボキシペプチダーゼは、アミノ酸残基同一性に関しては非選択的であるが、Ｃ末端標識については選択的である。他の実施形態では、改変カルボキシペプチダーゼは、アミノ酸残基同一性およびＣ末端標識の両方に関して選択的である。
Ｊ．伸長記録タグ、伸長コーディングタグまたはジタグの処理および解析のためのキットおよびキット成分
【１２０４】
目的の巨大分子（複数可）を表す伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、およびジタグライブラリーを、種々の核酸配列決定法を使用して処理および解析することができる。配列決定法の例としては、これだけに限定されないが、連鎖停止配列決定（サンガー配列決定）；合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、およびパイロシーケンシングなどの次世代シーケンシング法；および単一分子リアルタイムシーケンシング、ナノポアに基づく配列決定、ＤＩ（ｄｕｐｌｅｘ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）シーケンシング、および先端顕微鏡を使用したＤＮＡのダイレクトイメージングなどの第３世代シーケンシング法が挙げられる。
【１２０５】
伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーを様々なやり方で増幅することができる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーに、例えば、ＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲによって、指数関数的な増幅を行うことができる。エマルジョンＰＣＲにより、より均一な増幅がもたらされることが公知である（Hori, Fukano et al. 2007）。一部の実施形態では、反復バーコードまたはスペーサー配列を有する配列については、ＰＣＲ鋳型乗り換えのリスクが高く、エマルジョンＰＣＲまたは線形増幅を使用してそのリスクを低下させることができる。例えば、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５９３，３７５（Ｂ２）号において開示されているようなエマルジョンＰＣＲを使用することができる。
【１２０６】
あるいは、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーに、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびｃＤＮＡにコピーし戻すための逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼを使用する鋳型ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって、線形増幅を行うことができる。一態様では、線形増幅も鋳型乗り換えを低減または消去する。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、それに含有されるユニバーサルフォワードプライミング部位およびユニバーサルリバースプライミング部位に適合するプライマーを使用して増幅することができる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーは、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグの５’末端、３’末端または両末端のいずれかに配列を付加するための尾部を有するプライマーを使用して増幅することもできる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグの末端に付加することができる配列としては、単一の配列決定の実行で多数のライブラリーを多重化することを可能にするライブラリー特異的インデックス配列、アダプター配列、読み取りプライマー配列、または、配列決定プラットフォームに適合する、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、もしくはジタグのライブラリーを作出するための任意の他の配列が挙げられる。次世代シーケンシングのための調製におけるライブラリー増幅の例は以下の通りである：ビーズ（約１０ｎｇ）約１ｍｇから溶出した伸長記録タグライブラリー、２００ｕＭのｄＮＴＰ、１μＭの各フォワードおよびリバース増幅プライマー、０．５μｌ（１Ｕ）のＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してＰＣＲ反応体積２０μｌをセットアップし、以下のサイクル条件に供す：９８℃で３０秒、その後、９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を２０サイクル、その後、７２℃で７分、次いで、４℃で保持。
【１２０７】
ある特定の実施形態では、増幅前、増幅中または増幅後のいずれかにおいて、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーに標的濃縮を行うことができる。標的濃縮は、配列決定前に、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーから、目的の巨大分子を表す伸長記録タグを選択的に捕捉または増幅するために使用することができる。タンパク質配列に対する標的濃縮は、費用が高く、また、標的タンパク質に対して高度に特異的な結合性物質を作製することが難しいので、困難である。抗体は、非特異的であり、何千ものタンパク質にわたる規模生産が難しいことが周知である。本開示の方法では、タンパク質コードを核酸コードに変換し、次いで、ＤＮＡライブラリーに利用可能な広範囲の標的化ＤＮＡ濃縮戦略を使用することによってこの問題を回避する。目的のペプチドを、それらの対応する伸長記録タグを濃縮することによって試料中で濃縮することができる。標的化濃縮の方法が当技術分野で公知であり、それらとして、ハイブリッド捕捉アッセイ、ＰＣＲに基づくアッセイ、例えば、ＴｒｕＳｅｑ  ｃｕｓｔｏｍ  Ａｍｐｌｉｃｏｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ｐａｄｌｏｃｋプローブ（分子反転プローブとも称される）などが挙げられる（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｍａｎｏｖａら、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７巻：１１１〜１１８頁；Ｂｏｄｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｔｅｃｈ．、２０１３年、２４巻：７３〜８６頁；Ｂａｌｌｅｓｔｅｒら、２０１６年、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、３５７〜３７２頁；Ｍｅｒｔｅｓら、２０１１年、Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１０巻：３７４〜３８６頁；Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５巻：２０８５〜８頁を参照されたい）。
【１２０８】
一実施形態では、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーをハイブリッド捕捉に基づくアッセイによって濃縮する（例えば、図１７Ａおよび図１７Ｂを参照されたい）。ハイブリッド−捕捉に基づくアッセイでは、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーを、アフィニティータグ（例えば、ビオチン）で標識した標的特異的オリゴヌクレオチドまたは「ベイトオリゴヌクレオチド」とハイブリダイズさせる。標的特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを、親和性リガンド（例えば、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズ）を使用してそれらの親和性タグを介して「プルダウン」し、バックグラウンド（非特異的な）伸長記録タグを洗い流す（例えば、図１７を参照されたい）。次いで、濃縮された伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを正の濃縮のために得る（例えば、ビーズから溶出する）。
【１２０９】
アレイに基づく「ｉｎ  ｓｉｔｕ」オリゴヌクレオチド合成およびその後のオリゴヌクレオチドプールの増幅によって合成されたベイトオリゴヌクレオチドに関しては、所与のオリゴヌクレオチドアレイ内でユニバーサルプライマーのいくつかのセットを使用することにより、競合するベイトを操作してプールにすることができる。それぞれの型のユニバーサルプライマーについて、ビオチン化プライマーと非ビオチン化プライマーの比により、濃縮比を制御する。いくつかのプライマー型の使用により、いくつかの濃縮比を設計して最終的なオリゴヌクレオチドベイトプールにすることができる。
【１２１０】
ベイトオリゴヌクレオチドを目的の巨大分子を表す伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグと相補的になるように設計することができる。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグ内のスペーサー配列に対するベイトオリゴヌクレオチドの相補性の程度は、０％から１００％まで、およびその間の任意の整数にすることができる。このパラメーターは、少しの濃縮実験によって容易に最適化することができる。一部の実施形態では、コーディングタグ設計においてエンコーダー配列に対するスペーサーの長さを最小化する、または、スペーサーを、ベイト配列とのハイブリダイゼーションに利用できないように設計する。１つの手法は、補助因子の存在下で二次構造を形成するスペーサーを使用することである。そのような二次構造の例は、互いの上に積み重なった２つまたはそれよりも多くのグアニンカルテットによって形成される構造である、Ｇ−４重鎖である（Ｂｏｃｈｍａｎ、Ｐａｅｓｃｈｋｅら、２０１２年）。グアニンカルテットは、フーグスティーン水素結合によって結びついた４つのグアニン塩基によって形成される平面正方形構造である。Ｇ−４重鎖構造は、カチオン、例えば、Ｋ＋イオン対Ｌｉ＋イオンの存在下で安定化される。
【１２１１】
使用するベイトオリゴヌクレオチドの数を最小限にするために、各タンパク質に由来する比較的一意のペプチドのセットをバイオインフォマティクスにより識別することができ、目的のペプチドの対応する伸長記録タグライブラリー表示と相補的なベイトオリゴヌクレオチドのみをハイブリッド捕捉アッセイに使用する。同じまたは異なるベイトセットを用いて逐次的なラウンドまたは濃縮を行うこともできる。
【１２１２】
その断片（例えば、ペプチド）を表す伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリー中の巨大分子（例えば、タンパク質またはポリペプチド）の全長を濃縮するために、「タイルド」ベイトオリゴヌクレオチドをタンパク質の核酸表示全体にわたって設計することができる。
【１２１３】
別の実施形態では、プライマー伸長およびライゲーションに基づき媒介される増幅濃縮（ＡｍｐｌｉＳｅｑ、ＰＣＲ、ＴｒｕＳｅｑ  ＴＳＣＡなど）を使用して、巨大分子のサブセットを表すライブラリーエレメントを選択し、モジュール画分を濃縮することができる。競合するオリゴを使用して、プライマー伸長、ライゲーション、または増幅の程度を調整することもできる。最も単純な実行では、これは、ユニバーサルプライマー尾部を含む標的特異的プライマーと５’ユニバーサルプライマー尾部を欠く競合プライマーの混合物によって実現することができる。最初のプライマー伸長の後、５’ユニバーサルプライマー配列を有するプライマーのみを増幅することができる。ユニバーサルプライマー配列を有するプライマーとユニバーサルプライマー配列を有さないプライマーの比により、増幅する標的の分率を制御する。他の実施形態では、ハイブリダイズするが伸長しないプライマーを含めることを使用して、プライマー伸長、ライゲーション、または増幅を受けるライブラリーエレメントの分率をモジュレートすることができる。
【１２１４】
配列決定前に伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグをライブラリーから選択的に除去するために標的化濃縮法を負の選択形式で使用することもできる。したがって、ビオチン化ベイトオリゴヌクレオチドおよびストレプトアビジンでコーティングしたビーズを使用する上記の例において、上清を配列決定のために保持する一方で、ビーズに結合したベイト−オリゴヌクレオチド：伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグハイブリッドは解析しない。除去することができる望ましくない伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグの例は、豊富な巨大分子種、例えば、タンパク質、アルブミン、免疫グロブリンなどを表すものである。
【１２１５】
標的とハイブリダイズするがビオチン部分を欠く競合オリゴヌクレオチドベイトをハイブリッド捕捉ステップに使用して、濃縮しようとする任意の特定の遺伝子座の分率をモジュレートすることもできる。競合オリゴヌクレオチドベイトは、標的とのハイブリダイゼーションについて、濃縮中の標的プルダウンの分率を有効にモジュレートする標準のビオチン化ベイトと競合する（例えば図１７を参照されたい）。特にアルブミンなどの過度に豊富な種に関して、この競合的な抑制手法を使用することで１０桁のタンパク質発現のダイナミックレンジを何桁か圧縮することができる。したがって、所与の遺伝子座に関して、標準のハイブリッド捕捉に対する捕捉されるライブラリーエレメントの分率を１００％から０％濃縮までモジュレートすることができる。
【１２１６】
さらに、ライブラリー正規化技法を使用して、過度に豊富な種を伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグライブラリーから除去することができる。この手法は、トリプシン、ＬｙｓＣ、ＧｌｕＣなどの部位特異的プロテアーゼ消化によって生成されたペプチドを起源とする定義された長さのライブラリーに対して最良に機能する。一実施例では、正規化は、二本鎖ライブラリーを変性させ、ライブラリーエレメントを再アニーリングさせることによって実現することができる。豊富なライブラリーエレメントは、２分子ハイブリダイゼーションカイネティクスの二次速度定数に起因して、豊富さがより低いエレメントよりも迅速に再アニーリングする（Ｂｏｃｈｍａｎ、Ｐａｅｓｃｈｋｅら、２０１２年）。ヒドロキシアパタイトカラムでのクロマトグラフィー（ＶａｎｄｅｒＮｏｏｔら、２０１２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５３巻：３７３〜３８０頁）またはライブラリーを、ｄｓＤＮＡライブラリーエレメントを破壊するタラバガニ由来の２重鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）で処理すること（Ｓｈａｇｉｎら、２００２年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１２巻：１９３５〜４２頁）などの当技術分野で公知の方法を使用して、ｓｓＤＮＡライブラリーエレメントを豊富なｄｓＤＮＡライブラリーエレメントから分離することができる。
【１２１７】
固体支持体に付着させる前の巨大分子および／または得られた伸長記録タグライブラリーの分画、濃縮、およびサブトラクション方法の任意の組合せにより、配列決定読み取りを節約し、豊富さが低い種の測定を改善することができる。
【１２１８】
一部の実施形態では、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグのライブラリーをライゲーションまたは末端相補的ＰＣＲによって連鎖状にして、それぞれ多数の異なる伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを含む長いＤＮＡ分子を創出する（それぞれ、その全体が参照により組み込まれる、Ｄｕら、２００３年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３５巻：６６〜７２頁；Ｍｕｅｃｋｅら、２００８年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１６巻：８３７〜８４１頁；米国特許第５，８３４，２５２号）。この実施形態は、例えば、長鎖のＤＮＡをナノポアシーケンシングデバイスによって解析するナノポアシーケンシングである。
【１２１９】
一部の実施形態では、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグに対して直接単一分子解析を実施する（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、２００８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０巻：１０６〜１０９頁を参照されたい）。伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを、フローセル表面（任意選択でマイクロセルパターン）へのローディングに適合するフローセルまたはビーズなどの固体支持体上で直接解析することができ、ここで、フローセルまたはビーズは、単一分子シーケンサーまたは単一分子脱コーディング計器に組み込むことができる。単一分子脱コーディングに関しては、プールした蛍光標識した脱コーディングオリゴヌクレオチドの数ラウンドのハイブリダイゼーション（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、２００４年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１４巻：９７０〜７頁）を使用して、伸長記録タグ内のコーディングタグの同一性および順序の両方を確認することができる。コーディングタグの結合の順序をデコンボリューションするために、結合性物質を上記のサイクル特異的コーディングタグで標識することができる（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、２００４年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１４巻：９７０〜７頁も参照されたい）。サイクル特異的コーディングタグは、単一の巨大分子を表す単一の連鎖状の伸長記録タグ、または単一の巨大分子を表す伸長記録タグの集合のどちらに対しても機能する。
【１２２０】
伸長レポータータグ、伸長コーディングタグ、またはジタグライブラリーの配列決定後、得られた配列をそれらのＵＭＩにより崩壊させ、次いで、それらの対応する巨大分子（例えば、ペプチド、タンパク質、タンパク質複合体）に付随させ、細胞内の巨大分子型全体（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質巨大分子についてのプロテオーム）とアラインメントすることができる。得られた配列をそれらのコンパートメントタグにより崩壊させ、特定の実施形態では、単一のタンパク質分子のみまたは非常に限られた数のタンパク質分子を含有する、それらの対応するコンパートメントのプロテオームに付随させることもできる。タンパク質の識別および数量化はどちらも、このデジタルペプチド情報から容易に引き出すことができる。
【１２２１】
一部の実施形態では、コーディングタグ配列を特定の配列決定解析プラットフォームに対して最適化することができる。特定の実施形態では、配列決定プラットフォームは、ナノポアシーケンシングである。一部の実施形態では、配列決定プラットフォームの塩基当たりのエラー率は、＞５％、＞１０％、＞１５％、＞２０％、＞２５％、または＞３０％である。例えば、ナノポアシーケンシング装置を使用して伸長記録タグを解析する場合、バーコード配列（例えば、エンコーダー配列）を、ナノポアを通過時に最適に電気的に区別可能になるように設計することができる。本明細書に記載の方法に従ったペプチド配列決定は、ナノポアシーケンシングの一塩基正確度はまだ幾分低いが（７５％〜８５％）、「エンコーダー配列」の決定は、はるかにより正確であるはずである（＞９９％）ことを考慮すると、ナノポアシーケンシングによく適し得る。さらに、ＤＩ（ｄｕｐｌｅｘ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）ナノポアシーケンシングと称される技法を、システム設計を著しく単純化する分子モーターを必要とせずに、ナノポア鎖シーケンシングと共に使用することができる（Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｂｕｔｌｅｒら、２０１０年）。ＤＩナノポアシーケンシングによる伸長記録タグの読み取りには、連鎖状の伸長記録タグライブラリー内のスペーサーエレメントを相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングする必要がある。本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドは、得られる２重鎖の有効なＴｍを上昇させるために、ＬＮＡ、または他の改変された核酸または類似体を含んでよい。これらの２重鎖スペーサー領域で装飾された一本鎖伸長記録タグがポアを通過するに従い、２本鎖領域が狭窄域で一過性にストールし、それにより、２重鎖領域に隣接する約３塩基の電流読み取りが可能になる。特定の実施形態では、ＤＩナノポアシーケンシングのために、エンコーダー配列を、スペーサーエレメントに隣接する３塩基により最大限に電気的に区別可能なナノポアシグナルが生じるように設計する（Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、２０１０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０７巻：１６０６０〜５頁）。モーターフリーＤＩシーケンシングの代替として、スペーサーエレメントを、ナノポアを通過するに従い、伸長記録タグ、伸長コーディングタグ、またはジタグを一過性にストールし、それにより、隣接するエンコーダー配列の読み取りを可能にするＧ−カルテットなどの二次構造をとるように設計することができる（Ｓｈｉｍ、Ｔａｎら、２００９年、Ｚｈａｎｇ、Ｚｈａｎｇら、２０１６年）。ストールを過ぎて進んだ後、次のスペーサーにより一過性のストールが創出され、それにより、次のエンコーダー配列の読み取りが可能になる、などである。
【１２２２】
本明細書に開示されている方法は、複数の巨大分子（例えば、ペプチド）の同時（多重化）検出、定量化および／または配列決定を含めた解析のために使用することができる。多重化とは、本明細書で使用される場合、複数の巨大分子を同じアッセイで解析することを指す。複数の巨大分子は、同じ試料に由来するものであってもよく、異なる試料に由来するものであってもよい。複数の巨大分子は、同じ対象に由来するものであってもよく、異なる対象に由来するものであってもよい。解析される複数の巨大分子は、異なる巨大分子（例えば、ペプチド）であってもよく、異なる試料に由来する同じ巨大分子（例えば、ペプチド）であってもよい。複数の巨大分子は、２またはそれよりも多くの巨大分子、５またはそれよりも多くの巨大分子、１０またはそれよりも多くの巨大分子、５０またはそれよりも多くの巨大分子、１００またはそれよりも多くの巨大分子、５００またはそれよりも多くの巨大分子、１０００またはそれよりも多くの巨大分子、５，０００またはそれよりも多くの巨大分子、１０，０００またはそれよりも多くの巨大分子、５０，０００またはそれよりも多くの巨大分子、１００，０００またはそれよりも多くの巨大分子、５００，０００またはそれよりも多くの巨大分子、または１，０００，０００またはそれよりも多くの巨大分子を含む。
【１２２３】
試料多重化は、記録タグで標識された巨大分子試料を予めバーコーディングすることによって実現することができる。各バーコードは異なる試料を表し、試料を周期的結合アッセイまたは配列解析前にプールすることができる。このように、多くのバーコードで標識した試料を単一のチューブ内で同時に処理することができる。この手法は、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）で実施するイムノアッセイに対する有意な改善である（Ａｋｂａｎｉ、Ｂｅｃｋｅｒら、２０１４年、ＣｒｅｉｇｈｔｏｎおよびＨｕａｎｇ、２０１５年、ＮｉｓｈｉｚｕｋａおよびＭｉｌｌｓ、２０１６年）。このように、本開示は、基本的に、単純なワークフローを用いるＲＰＰＡアッセイの代わりに、多重化された高度にデジタルの試料および分析物を提供する。
Ｋ．ＮＴＡＡ認識、記録タグ伸長およびＮＴＡＡ切断の周期的ラウンドによる巨大分子特徴付けのためのキットおよびキット成分
【１２２４】
ある特定の実施形態では、本開示において提示される巨大分子を解析するための本キットを使用する方法は、多数の結合サイクルを有し、ここで、巨大分子を複数の結合性物質と接触させ、連続的な結合性物質の結合により、核酸に基づくコーディングタグの形態の履歴的な結合情報が、巨大分子に付随する少なくとも１つの記録タグに移行する。このようにして、多数の結合事象に関する情報を含有する履歴的記録を核酸形式で生成する。
【１２２５】
Ｎ末端分解に基づく手法を使用してペプチド巨大分子を解析するための方法に関する実施形態（例えば、図３、図４、図４１および図４２を参照されたい）では、第１の結合性物質をｎアミノ酸のペプチドのｎ番目ＮＴＡＡに接触させて結合させ、第１の結合性物質のコーディングタグ情報をペプチドに付随する記録タグに移行させ、それにより一次伸長記録タグを生成した後、ｎ番目のＮＴＡＡを本明細書に記載の通り切断する。ｎ番目のＮＴＡＡの切断により、ペプチドの（ｎ−１）番目のアミノ酸がＮ末端アミノ酸に変わり、これは、本明細書では（ｎ−１）番目のＮＴＡＡと称される。本明細書に記載の通り、ｎ番目のＮＴＡＡを必要に応じて部分（例えば、ＰＴＣ、ＤＮＰ、ＳＮＰ、アセチル、アミジニルなど）で標識することができ、これは、標識された形態のＮＴＡＡに結合するように操作される切断酵素と併せて特に有用である。ｎ番目のＮＴＡＡを標識したら、次いで、（ｎ−１）番目のＮＴＡＡも同じ部分を用いて標識する。第２の結合性物質をペプチドと接触させ、（ｎ−１）番目のＮＴＡＡに結合させ、第２の結合性物質のコーディングタグ情報を、一次伸長記録タグに移行させ、それによって二次伸長記録タグ（例えば、ペプチドを表す連鎖状のｎ次伸長記録タグを生成するため）を生成するか、または異なる記録タグ（例えば、ペプチドを集合的に表す多数の伸長記録タグを生成するため）に移行させる。（ｎ−１）番目のＮＴＡＡの切断により、ペプチドの（ｎ−２）番目のアミノ酸がＮ末端アミノ酸に変わり、これは、本明細書では（ｎ−２）番目のＮＴＡＡと称される。追加的な結合、移行、切断、および必要に応じてＮＴＡＡ標識を、上記の通り、最大ｎアミノ酸まで行って、ペプチドを集合的に表す、ｎ次伸長記録タグまたはｎ個の別々の伸長記録タグを生成することができる。本明細書で使用される場合、結合性物質、コーディングタグ、または伸長記録タグに関して使用されるときのｎ「次」は、結合性物質およびそれに付随するコーディングタグを使用する第ｎの結合サイクル、または、伸長記録タグを創出するｎ回の結合サイクルを指す。
【１２２６】
一部の実施形態では、第１の結合性物質および第２の結合性物質、ならびに任意選択で任意のさらなる結合性物質（例えば、第３の結合性物質、第４の結合性物質、第５の結合性物質など）の巨大分子への接触を同時に実施する。例えば、第１の結合性物質および第２の結合性物質、ならびに任意選択で任意のさらなる次数の結合性物質を、例えば結合性物質のライブラリーを形成するために、一緒にプールすることができる。別の例では、第１の結合性物質および第２の結合性物質、ならびに任意選択で任意のさらなる次数の結合性物質を、一緒にプールするのではなく、巨大分子に同時に添加する。一実施形態では、結合性物質のライブラリーは、２０種の標準の天然に存在するアミノ酸に選択的に結合する少なくとも２０種の結合性物質を含む。
【１２２７】
他の実施形態では、第１の結合性物質および第２の結合性物質、ならびに任意選択で任意のさらなる次数の結合性物質をそれぞれ別々の結合サイクルで巨大分子をと接触させ、逐次的に添加する。ある特定の実施形態では、多数の結合性物質を同時に使用することが好ましく、その理由は、並行手法により時間が節約されるから、および、結合性物質が競合状態になり、それにより、同類結合性物質が結合する部位への非同類結合性物質による非特異的結合が低減するからである。
【１２２８】
本明細書に記載の方法によって生成される最終的な伸長記録タグの長さは、コーディングタグ（例えば、エンコーダー配列およびスペーサー）の長さ、記録タグ（例えば、一意の分子識別子、スペーサー、ユニバーサルプライミング部位、バーコード）の長さ、実施される結合サイクルの数、および各結合サイクルからのコーディングタグが同じ伸長記録タグに移行されるか多数の伸長記録タグに移行されるかを含めた多数の因子に依存する。ペプチドを表し、エドマン分解様切断方法によって作製される連鎖状の伸長記録タグの例では、コーディングタグが、両側に５塩基のスペーサーが隣接する５塩基のエンコーダー配列を有する場合、ペプチドの結合性物質履歴を示す最終的な伸長記録タグ上のコーディングタグ情報は、１０塩基×エドマン分解サイクルの数になる。２０サイクルの実行に関しては、伸長記録は、少なくとも２００塩基である（最初の記録タグ配列は含めない）。この長さは、標準の次世代シーケンシング計器に適合する。
【１２２９】
最終的な結合サイクルおよび最終的な結合性物質のコーディングタグ情報の伸長記録タグへの移行の後、記録タグに、ユニバーサルリバースプライミング部位をライゲーション、プライマー伸長または当技術分野で公知の他の方法によって付加することによってキャップ形成することができる。一部の実施形態では、記録タグ内のユニバーサルフォワードプライミング部位は最終的な伸長記録タグに付属するユニバーサルリバースプライミング部位に適合する。一部の実施形態では、ユニバーサルリバースプライミング部位は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ７プライマー（５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ−３’−配列番号１３４）またはＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ５プライマー（５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ−３’−配列番号１３３）である。記録タグの鎖のセンスに応じてセンスまたはアンチセンスＰ７を付属させることができる。伸長記録タグライブラリーを固体支持体（例えば、ビーズ）からから直接切断または増幅し、従来の次世代シーケンシングアッセイおよびプロトコールに使用することができる。
【１２３０】
一部の実施形態では、プライマー伸長反応を一本鎖伸長記録タグのライブラリーに対して実施して、その相補鎖をコピーする。
【１２３１】
ＮＧＰＳペプチドシーケンシングアッセイは、いくつかの化学的ステップおよび酵素的ステップを周期的進行で含む。ＮＧＰＳシーケンシングは単一分子であるという事実により、いくつかの重要な利点がプロセスに付与される。単一分子アッセイの第１の重要な利点は、種々の周期的化学的／酵素的ステップにおける非能率に対する頑強性である。これは、コーディングタグ配列内に存在するサイクル特異的バーコードを使用することによって可能になる。
【１２３２】
サイクル特異的コーディングタグを使用して、各サイクルからの情報を追跡する。これは単一分子シーケンシング手法であるので、配列決定プロセスの各結合／移行サイクルにおける７０％の効率でさえ、マッピング可能な配列情報を生成するために十分すぎるほどである。例として、１０塩基ペプチド配列「ＣＰＶＱＬＷＶＤＳＴ」（配列番号１６９）は、我々の配列プラットフォームでは「ＣＰＸＱＸＷＸＤＸＴ」（配列番号１７０）と読み取られる可能性がある（Ｘ＝任意のアミノ酸；アミノ酸の存在はサイクル数追跡によって推定される）。この部分的なアミノ酸配列読み取りは、ＢＬＡＳＴＰを使用してそれをヒトｐ５３タンパク質に一意的にマッピングし戻すために十分すぎるほどである。そのように、我々のプロセスはいずれも完全にロバストにする必要はない。さらに、サイクル特異的バーコードを我々の分配概念と組み合わせれば、どのペプチドのセットが元のタンパク質分子にマッピングされるかが（コンパートメントバーコードによって）わかるので、１０カ所の位置のうちの数アミノ酸を識別するだけでタンパク質の絶対的な識別を実現することができる。
【１２３３】
分画、区画化、および結合能が限定された樹脂によるタンパク質正規化。
【１２３４】
プロテオミクス解析の重要な課題の１つは、試料中のタンパク質の豊富さの大きなダイナミックレンジに取り組むことである。タンパク質は、血漿中で１０桁を超えるダイナミックレンジにわたる（「上位２０種」が枯渇した血漿でさえ）。ある特定の実施形態では、解析前に、試料からのある特定のタンパク質種（例えば、極めて豊富なタンパク質）のサブトラクションを実施する。これは、例えば、上位２０種の血漿タンパク質を枯渇させるＳｉｇｍａのＰＲＯＴ２０免疫枯渇キットなどの市販のタンパク質枯渇試薬を使用して実現することができる。さらに、ダイナミックレンジを大きく低下させる、さらにもっと言えば扱いやすい３〜４桁まで低下させる手法をとることが、有用であると思われる。ある特定の実施形態では、タンパク質試料のダイナミックレンジは、電気泳動および液体クロマトグラフィーを含む標準的分画法を使用してタンパク質試料を分画すること（Zhou, Ning et al. 2012）、または限られた能力のタンパク質結合性ビーズ／樹脂（例えば、ヒドロキシル化シリカ粒子）をローディングしたコンパートメント（例えば、液滴）に画分を分配し（McCormick1989）、結合したタンパク質を溶出することによって、モジュレートすることができる。各区画化された画分中の過剰なタンパク質を洗い流す。
【１２３５】
電気泳動による方法の例としては、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、フリーフロー電気泳動、ゲル溶出分画液相封入電気泳動（ＧＥＬＦｒＥＥ）が挙げられる。液体クロマトグラフィータンパク質の分離方法の例としては、逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥ）、サイズ排除（ＳＥ）、親水性相互作用などが挙げられる。コンパートメント分配の例としては、エマルジョン、液滴、マイクロウェル、平らな基板上の物理的に分離された領域などが挙げられる。例示的なタンパク質結合性ビーズ／樹脂としては、フェノール基またはヒドロキシル基で誘導体化されたシリカナノ粒子（例えば、ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ  Ｒｅｓｉｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、ＲａｐｉｄＣｌｅａｎ（ＬａｂＴｅｃｈ製）など）が挙げられる。ビーズ／樹脂の結合能を限定することにより、所与の画分中に溶出する高度に豊富なタンパク質は部分的にビーズに結合するだけになり、過剰なタンパク質は除去される。
Ｌ．単一細胞のプロテオームの分配または分子サブサンプリングのためのキットおよびキット成分
【１２３６】
別の態様では、本開示は、バーコーディングおよび分配技法を使用して試料中のタンパク質を大規模並列解析するためのキットおよび方法を提供する。タンパク質解析の現行の手法は、タンパク質巨大分子をペプチド配列決定に適したより短いペプチド分子に断片化することを伴う。したがって、そのような手法を使用して得られる情報は、断片化ステップによって限定され、例えば、翻訳後修飾、各試料中に存在するタンパク質間相互作用、試料中に存在するタンパク質集団の組成、または特定の細胞もしくは細胞の集団に由来するなどのタンパク質巨大分子の起源を含む、タンパク質の広範な連続した情報は排除される。タンパク質分子内の翻訳後修飾に関する広範な情報（例えば、プロテオフォーム特徴付け）により、より完全的な生物学的像が得られ、どのペプチドがどのタンパク質分子に属するかに関する広範な情報により、基礎をなすタンパク質配列へのペプチド配列がよりロバストにマッピングされる（例えば、図１５Ａを参照されたい）。これは、ペプチド配列決定技術によってたった５つのアミノ酸型からの情報などの不完全なアミノ酸配列情報しか得られない場合に特に意義がある。本明細書に開示されている分配方法を使用することにより、同じタンパク質分子に由来するいくつものペプチドからの情報と組み合わせて、タンパク質分子の同一性（例えば、プロテオフォーム）をより正確に評価することができる。コンパートメントタグを同じコンパートメントに由来するタンパク質およびペプチドに付随させることにより、分子および細胞情報の再構成が容易になる。典型的なプロテオーム解析では、細胞が溶解され、タンパク質が短いペプチドに消化され、その結果、どのタンパク質がどの細胞または細胞型に由来するか、およびどのペプチドがどのタンパク質またはタンパク質複合体に由来するかに関する全体的な情報が破壊される。この全体的な情報は、細胞および組織内の生物学および生化学を理解するために重要である。
【１２３７】
分配とは、試料内の巨大分子の集団に由来する巨大分子の亜集団への一意のバーコードのランダムな割り当てを指す。分配は、巨大分子をコンパートメントに区分することによって実現することができる。分配は、単一のコンパートメント内の巨大分子で構成されるものであってもよく、コンパートメントの集団に由来する多数のコンパートメント内の巨大分子で構成されるものであってもよい。
【１２３８】
複数（例えば、数百万〜数十億）のコンパートメントから同じ物理的コンパートメントまたはコンパートメントの群に、またはそれにおいて分離された巨大分子のサブセットまたはタンパク質試料のサブセットを一意のコンパートメントタグによって識別する。したがって、コンパートメントタグを使用して、同じコンパートメントタグを有する１つまたは複数のコンパートメントに由来する構成物と、異なるコンパートメントタグを有する別のコンパートメント（またはコンパートメントの群）内の構成物を、これらの構成物が一緒にプールされた後であっても区別することができる。
【１２３９】
本開示は、複雑なプロテオーム試料（例えば、複数のタンパク質複合体、タンパク質、またはポリペプチド）または複雑な細胞試料を複数のコンパートメントに分配することによってタンパク質解析を増強する方法であって、各コンパートメントが、個々のコ菣醃菣袃菣뎃菣薆臣꾁郥颁臣芁苣袼믤辄臩麊臣떼볯ꦼ藩鞈臣꒙臣ꚁ볯膀믤꺁苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃臣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣ꢁ臣낕臣讂ꓨ낕臣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣銂郥肂胣릖돦銂迦鮾臣讂볯设臣낁鯥醼볯鲀볯邼苣芏藧閁苣龁臣覼胣뎂菣醃菣袃菣뎃菣꾁胣뮻蓦뢁諦ꞁ胣螤闦꺁苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂臣ꖎ郥鞁臣몛뷤꾔賦鎽볯设臣낁胣鎃菣몂볯銂郥肂胣螤闦꺁苣뎃菣꾂돨螤郥鎽胣뾂菣醃苣ꪳ胣뺁臣꾁菣ꪃ菣鞃菣覃苣螤闦꺁菣鞃菣覃臣궖觧隌臣膀곦蒁臣膀臣貂苣螤闦꺁苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂臣膀ꓨ낕臣뎂菣醃菣袃菣뎃菣薆臣螤闦꺁菣鞃菣覃臣螤闦꺁苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂臣꺁苣讃菣ꪃ菣낂臣龁臣ꖎ郥銂迥붃臣馁苣꺁臣膍裥ꪁ鷦뚻룤ꞁ軦ꚧ臣鮁胣鶁苣ꮁ苣誂胣螤闦꺁苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂믤趁菣鞃菣覃苣龔裦馁苣芀臣讂臣꾁胣螤闦꺁苣뎃菣꾂돨螤郥鎽胣뾂菣醃苣ꪳ胣뺁臣꾁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀ꓨ낕臣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣銂胣螤闦꺁苣뎃菣꾂돨螤郥鎽胣뾂菣醃苣ꪳ臣龁臣鶃菣骃菣膃菣ꢁꓨ낕臣뎂菣醃菣袃菣뎃菣薆臣螤闦꺁苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂臣ꊂ菣벃菣뎃苣뺁臣꾁軦袐苣꾏菨ꮁ臣讂臣膂臣膍裥ꪁ鷦뚻룤ꞁ軦袐臣膀臣貂臣袂苣膀ꓨ낕臣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣颻臣뾂菣醃苣ꪳꓨ袐뷤膀苣뎃菣꾂돨膀菣ꪃ菣鞃菣覃苣龔裦馁苣芀곦蒁臣膀苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂믤趁苣뎃菣꾂돨螤郥鎽胣뾂菣醃苣ꪳ胣뺁臣꾁菣ꪃ菣鞃菣覃苣螤闦꺁苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃臣覂迥蚛臣膀믤辄臩麊臣螤闦꺁苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂믤趁菣鞃菣覃臣궖觧隌臣讂胣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣颻臣骃菣膃菣銂鳦躘듧뢛臣風볨꺁雦閳臣蒁臣貂臣ꮁ뻥ꎁ臣ꎧ黦馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 芁苣릉껥꺁껥붖뷥讅臣꾁胣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣薃ꃥ銂럥Ꞥ裥邭볯设臣낁胣鶃菣骃菣膃菣覼臣ꦁ臣蚈黦ꦉ臣颻髩馁苣風賩뾂苣ꮁ菣ꦃ苣麃菣뢼闩袼뻤袁臣膀鯥閼臣袂臣뎛볯颼苣芏藧閁苣龁臣覼臣龁臣ꦃ苣늂菣랂菣뎃볯设臣낁胣뎛볯膀鯥钼볯誁苣뎁鯥钼볯銂迥ꞅ臣貂臣蒁볯ꮁ苣ꎁ臣뮧ꇨ閁臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†룤ꢃ臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂臣膀苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃蛥ꞁ뫦늶룤ꮁ臩ꊛ臣ꚁ臣讂胣隻臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂苣뎂菣醃菣袃菣뎃菣꺁ꇨꊝ볯设臣낁胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣节臣辁臣钃苣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣꺁苣Ꞃ菣꺁뫥覼臣龁臣鎃菣몂苣鞁臣꾁苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃蛥꺁菣벃苣ꮁ鯧ꖎ軦袐臣鮁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 뎂菣醃菣袃菣뎃菣꾁胣뒰胦뎂菣醃菣袃菣뎃菣袼뻤袁臣膀菣ꒂ苣궃뗦鎽뛦뒻볯ꞁ臣ꎁ臣节鯥鎽苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃臣芁臣ꚁ苣袂臣芀鯥鎽苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃臣鞁臣꾁胣设臣낁胣誃菣銲귥膀菣ꒂ苣궃苣閃苣ꊂ胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣Ꚃ苣ꮃ苣鞁臣꾁菣뎂苣ꒂ苣벃苣Ꞃ菣膀臣龁臣ꊂ菣ꒂ胣겂菣릂ꇨꊝ胣랂菣뎂菣ꢡ鷩膀菣ꦃ苣膃菣꾂ꇨꊝ胣閃苣ꮃ苣벃胣鲆胣誃苣궃菣膀苣ꪃ苣뎃苣Ꞃ菣较菣莃菣膀菣궃菣뮂菣膀菣궃菣릂菣벃菣莃菣膀뿤랏ꓥ鮏鯩邭ꧦꢙ苣ꮐ苣邃苣ꪂ菣莃菣膀볯겼볯뎼볯鞃菣벃菣膀苣钃菣늹룦螃苣릂苣膀菣袃菣뮂菣궃菣릂蛨膀苣鞁臣꾁菣袃菣뮂菣궃菣릂臣몟臣辁菣ꪃ菣벃ꇨꊝ룤꺁裥ꊛ臣貂臣颠鿥貁賦銁苣貂苣芀臣讂觧骮臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀郥뎂菣醃菣袃菣뎃菣꾁胣뎹鷥鞁臣膀跥肸臣내菨銂郥覜臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†鯥鎽铦膌뷤꾁胣鎁苣ꂁ臣ꮁ駩骮臣貂臣蒁臣膀菣벃苣膀菣ꒂ苣궃菣벃苣膀苣것苣膀苣ꦃ苣ꢡ鷩膀苣ꪃ苣뎃ꇨꊝ胣鞃菣릂菣莃苣ꢡ鷩膀菣ꎂ菣뾂菣膀蛨膀菣ꒂ菣뎃胣랂菣뎂菣Ꚃ苣벃菣膃菣鞃胣閃菣벃苣ꮃ胣閃菣벃苣ꮃ菣膃菣鞃胣ꆿ迥覤迦뮛귥龩駥銂郥肂菣ꒂ苣膃菣鞃胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣Ꚃ苣ꮃ胣ꖼ볯ꦼ볯ꆼ菣것菣袃胣릂菣뎃맥覸菣ꎂ苣꾂胣讃菣궃苣ꮃ菣벃苣鲆胣讃菣궃苣ꮃ菣벃苣ꮁ鿥ꖁ臣鶃菣麃菣ꢡ鷩膀菣躃닧邭胣뺁臣꾁菣ꒂ苣궃苣閃苣ꊂ苣ꮐ苣龁믤辄臣꾔賦鎽ꇨꊝ臣芁臣ꚁ苣蒁胣몛뷤꾔賦鎽铧꺁鷦首臣鞁臣꾁胣鎁苣ꂁ臣ꮁ駩骮臣貂臣蒁臣膀苣꾂菣ꮃ苣龃菣膀苣겂菣벃苣膀苣ꮃ菣벃苣膀菣袃菣뮂菣궃菣릂胣겂菣릂胣醇胣뎟诨膀菣ꪃ苣膃菣뎃胣鶃菣ꢂ菣것菣ꊅ藩鎃菣ꮃ胣鶃菣鞃菣钃菣뎃胣鶃菣ꆃ苣꾂菣것菣袃胣鶃菣ꢂ菣것菣膀菣ꪃ苣膃菣뎃苣궂苣覃胣鶃菣랂菣놂菣袃胣鶃菣ꮂ菣鲃菣벃菣膀菣閃菣뎃볯뮙賩蚕꣦覼胣閃菣ꪂ菣ꮂ菣鲃菣膀菣ꒂ菣뎃胣랂菣뎂菣뒂菣膀菣ꪃ藩ꆄ냦ꦉ胣鶃菣낂菣뎂菣ꮃ藩膀菣ꪃ매뢅胣鶃菣ꪂ菣袃苣릂菣ꮃ胣颮菨隌苣ꦃ菣膀菣ꪃ菣궃菣ꮃ菣ꆃ菣벃菣膀苣ꦃ菣늂菣膀苣ꪃ苣떂菣躃苣ꪃ苣뎃胣鶃菣ꊂ菣躃藩膀臣龁臣鶁苣覂臣뮻蓦꺁뗧袐臣貁賦銁苣貂苣芀臣讂觧骮臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀鯥鎽铦膌뷤꾁胣鎃菣몂胣设臣낁胣鶃菣릂菣것菣鎃菣몂胣鶃菣麃菣鎃菣몂胣ꊂ苣궃菣릂菣벃苣膀苣꾂菣ꮃ苣龃菣鎃菣몂胣몛뷤뎂苣鎃菣몂胣骤귥ꪳ菣벃苣膀룥膣胦鎃菣몂胣겂菣릂菣벃苣膀臣龁臣뚈뻥鶃苣鎃菣몂臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣銂믤醁臣鎃菣몂苣뒼臣뎂菣醃菣袃菣뎃菣ꮁꧨ首苣蚈藩馁苣꺨胣꺁雦閳臣膀볯袽뷯趽뷯薽뷯膽뷯覂臣袂苣芦ꫨ閁苣ꚁ臣讂볯뎼뷯薽뷯芽뷯讽뷯銽胣ꎼ뷯膽뷯邽뷯躽苣膀볯邼볯隼맥覼胣肸껥붖뻤ꞁ臣膀菣궃菣ꪂ菣ꂃ苣ꢂ菣ꮃ苣ꞃ菣ꮁ苣誂뛦뒻룤ꮁ裥超臣ꚁ胣뾂菣醃苣ꪳ裥邭臣袂臣뾂菣醃苣ꪳꓨ袐뷤ꮁ雩馁苣ꢅ뷤蒚臣薃ꃥ銂鳦躘듧뢛臣讖ꓧ閁苣ꚁ臣讂雦閳苣뾽铧鞁臣風賩馁苣鎁臣銂迥붃臣馁苣袼뻤袁臣膀鯥醼볯誁苣뎁鯥醼볯銂迥ꞅ臣貂臣蒁볯芀臣讂觧骮臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀菣궃菣ꪂ菣ꂃ苣뎂菣醃菣袃菣뎃菣袼뻤袁臣膀뛦뒻볯ꮁ胣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣銂믤醁臣鎃菣몂胣뮴胦隌迥붃臣鞃菣蚃苣벃苣袼鯧ꖎ臣龁臣鎖軦蒚臣놆胣覅臣ꦁ臣袂臣ꚁ볯膀臣袂臣鞃菣蚃苣벃苣떊諦Ꞁ臣ꪁ苣袂臣ꮁ鏦鲽臣貂臣袼뻤袁臣膀뿤뺣菣랂菣膀菣낂賥ꪁ臣覼菣鞃菣覃菣겂菣벂臣肸럧ꮁ裥超臣讂胣芁苣릉껥꺁껥붖뷥讅臣꾁胣鞃菣蚃苣벃菣銂ꓥꞀ觥ꞁ蟥蚐臣ꚁ胣뾂菣醃苣ꪳ臣龁臣鶃菣骃菣膃菣꺁菣鞃菣覃꟦邈觧銂ꧨꆾ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ臣趃苣蚃苣隃臣뚊藦ꮁ雩馁苣薃ꃥ貁鳦뺁苣讂ꃥ袐胣뢛뫤鲽铧馁苣뾂菣醃苣ꪳꓨ袐뷤銂胣鶁苣ꮁ铧ꖝ臣讂菣鞃菣覃臣鶁臣貾臣蚈黦꺁臣膂臣뎂菣醃菣袃菣뎃菣ꮁ裥超臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂臣膀믤辄臩麊臣螉臥뺁臣꾁룤뒁臣릂菣벃苣벃臣龁臣ꚃ菣邃菣떂菣鞃菣ꒂ菣벃藩鞈臣ꎚ軦馁苣邃菣뎂菣覃苣ꮐ苣芀菣ꦃ苣麃菣超裥꾁胣風賩뾂苣꺁볯馀藩鞈臣뺯臣ꚁ鯧鲣髧ꞁ臣ꎁ臣袂臣膀臣貂臣袂苣膀菣ꦃ苣麃菣뢼闩趏뿥ꮁ苣讂苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂菦놠臣風賩뾂苣뢁臣뮧ꇨ貁迥붃臣ꪁ苣袼뻤袁臣뎛볯銼볯鲀볯銂迥ꞅ臣貂臣蒁볯芀菣벃苣벃菣꾁胣몛뷤꾔賦鎽苣鞁臣꾁苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃臣颻鷧鞁臣肸鳦階ꃦ뢅裥邭臣龁臣몛뷤꾔賦鎽苣鞁臣꾁苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃臣较苣隃菣肃苣몂臣龁臣꺁鯧鲣藩鞈胣뺁臣꾁룤릖臣階臣讧裦閁苣讂苣꺁臣芁臣ꚁ苣蒁볯设臣낁胣뎛볯隼苣芏藧閁苣龁臣覼胣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣꾁胣骃菣膃菣ꢁ臣ꮂ菣鞃菣뎃苣꺁臣膂臣膀뻤袁臣릂菣벃苣벃臣颻鷧鞁臣膀ꧦ붃髧ꢃ裥銂郥鎂臣袂臣芀룤龮雦设臣꾁胣龩菨蒚菩蚈볯设臣낁胣ꊂ菣螃菣覃볯꾁胣螤闦꺁菣鞃菣覃룤꺁볯ꮜꯧꊂ菣躃藩议鿥ꢁ迥鲿臣讂臣ꢁ臣꾏菨ꞁ臣讂胣ꖈ臣设臣꾁胣龩菨蒚菩蚈臣膀ꓨ낕臣骃菣膃菣誸臣薆菩ꊂ菣躃藩议鿥袼뻤袁臣膀菣랂菣뺁臣꾁胣꾂菣莃苣趀迥鲿胦ꢃ裥ꞁ꣦颭臣貂臣ꪃ苣뎃볯ꢁ迥鲿臣讂臣ꢁ臣꾏菨ꞁ臣讂胣ꖈ臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀ꧦ붃髧ꢃ裥꾁胣颍臣膀볯꺼볯뾂苣ꞁ꣦颭臣貂臣뾂菣醃苣ꪳ臣较苣隃菣肃苣몂臣讂臣ꢁ臣꾏菨ꪁ鯧鲣볯꺼볯超裥ꞁ臣ꎁ臣袂臣芀臣讂臣꾁胣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣꾁胣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣꺁鯧蒚臣骃菣膃菣뢁臣ꦃ苣늂菣랂菣뎃苣꾏菨ꮁ臣讂臣膂臣膀苣뎃菣꾂돨ꪃ苣벃苣袼뻤袁臣膀菣蚃菣벃苣ꦼ臣龁臣鶁臣鮃菣궃苣覼臣趪귨超裥銂郥肂菣鞃菣覃苣閁苣ꮁ郥肂苣ꆃ菣蚈귥ꞁ臣ꎁ臣袂臣袼뻤袁臣뎛볯銼볯銂迥ꞅ臣貂臣蒁볯芀苣뎃菣벃菣ꆃ菣袃苣낂臣膀苣誂ꓥ趁臣뢠藩蚈귥薆臣邈裥ꞁ臣ꎁ臣袂臣膀뷥늩ꃦ뢅裥邭臣膀臣貂臣ꖎ郥鞁臣骃菣膃菣ꮁ雩馁苣颭裥薃ꃥ銂苣龁苣馁臣膂臣肸蓦꺁裥邭귨ꖈ귥膀苣骃菣떂菣超裥膀菣讃菣벃苣ꮃ菣ꦃ苣龃菣낂菩趽胣뺁臣꾁臣貂苣꺁믤辄臣蒵郥鮁苣뮻蓦뢁諦ꞁ臣覂臣ꮐ苣芀臣꺁볯궼볯超裥꾁胣肸裨ꮁ胣뎂菣醃菣袃菣뎃菣薆臣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣꺁鯩ꎛ臣鎖臣낕臣讂胣芁苣릉껥꺁껥붖뷥讅臣꾁胣뎂菣醃菣袃菣뎃菣뾂苣꾁胣風賩뾂苣薆臣邈裥ꞁ臣誂胣鞁臣貁臣ꚁ胣讀胣꺁苣뎃菣벃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