(57)【要約】  本開示の実施形態は概して、がん治療のための光免疫療法に関する。より詳細には、本開示は、対象に免疫原性組成物および感光性の生物学的色素を投与してがんを治療および／または予防するための、経皮マイクロニードルアレイを使用する光応答性皮膚アプリケータを提供する。本開示の光応答性皮膚アプリケータは、従来の手段よりも安全で侵襲性が低くがん性腫瘍を標的にする能力を提供する。【選択図】  図１Ａ
2021501148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光免疫療法で使用するための光応答性皮膚アプリケータであって、
各マイクロニードルが基部部分および先端部分を含む、複数のマイクロニードルを含む経皮マイクロニードルアレイと、
少なくとも１つの腫瘍抗原を含む免疫原性組成物と、
感光性の生物学的色素と
を含む皮膚アプリケータ。
【請求項２】
免疫原性組成物および生物学的色素が、グリコサミノグリカン、ポリ硫酸グリコサミノグリカン、グルコソグリカン、ポリ硫酸グルコソグリカン、グルコサミノグリカン、ムコ多糖、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリＬ−乳酸（ＰＬＡ）、マルトース、キトサン、アルギネート、ならびにその誘導体および組合せの少なくとも１つを含むポリマーマトリックスを使用して前記マイクロニードルアレイの中に封入されている、請求項１に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項３】
ポリマーマトリックスがヒアルロン酸を含む、請求項１に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項４】
少なくとも１つの腫瘍抗原が不活性化腫瘍溶解物または新生抗原に由来する、請求項１に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項５】
少なくとも１つの腫瘍抗原が、メラノーマ、白血病、乳がん、肺がん、膀胱がん、脳がん、子宮頸がん、卵巣がん、結腸直腸がんおよび任意の関連するがんに由来する、請求項１に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項６】
少なくとも１つの腫瘍抗原が、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ、ＢＲＡＦv600Eメラノーマまたは４Ｔ１乳房腫瘍に由来する、請求項１に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項７】
少なくとも１つの腫瘍抗原が対象からの免疫原性エピトープを含む、請求項１に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項８】
感光性の生物学的色素が、メラニン、カロテノイド、キサントフィル、ビリルビンまたはその組合せの少なくとも１つである、請求項１に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項９】
免疫原性組成物が免疫刺激剤をさらに含む、請求項１に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項１０】
免疫刺激剤が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣｐＧヌクレオチド、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−１５およびその組合せの少なくとも１つを含み、免疫刺激剤が免疫細胞を刺激することが可能である、請求項９に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項１１】
免疫刺激剤が少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項９に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項１２】
免疫原性組成物および感光性の生物学的色素が複数のマイクロニードルの基部部分の中に封入されており、免疫刺激剤が複数のマイクロニードルの先端部分の中に封入されており、前記先端部分は前記基部部分の遠位にある、請求項１に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項１３】
免疫刺激剤が、複数のマイクロニードルの先端部分の中にメタクリル化ヒアルロン酸を架橋することによって封入されている、請求項１２に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項１４】
対象における免疫応答を刺激するためにアプリケータに光エネルギーを送達するための手段をさらに含む、請求項１に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項１５】
光エネルギーが近赤外（ＮＩＲ）光を含む、請求項１４に記載の皮膚アプリケータ。
【請求項１６】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、
対象の皮膚の領域を請求項１に記載の光応答性皮膚アプリケータと接触させること、および皮膚アプリケータに光エネルギーを送達することを含み、
皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、対象において腫瘍に対する免疫応答を刺激する、方法。
【請求項１７】
皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、近赤外（ＮＩＲ）光、ＵＶ光、または約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長の光を送達することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、ＮＩＲ光を約５分〜約２０分の間送達することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、ＮＩＲ光を約１日から約７日連続で１日に少なくとも１回送達することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの腫瘍抗原が不活性化腫瘍溶解物または新生抗原に由来する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの腫瘍抗原が、メラノーマ、白血病、乳がん、肺がん、膀胱がん、脳がん、子宮頸がん、卵巣がん、結腸直腸がんおよび任意の関連するがんに由来する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
感光性の生物学的色素がメラニンを含み、皮膚アプリケータにＮＩＲ光を送達することが、メラニンが高体温微小環境を形成することを刺激する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
高体温微小環境の温度が約３５℃〜約４５℃である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
免疫原性組成物が免疫刺激剤をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
免疫刺激剤が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣｐＧヌクレオチド、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−１５およびその組合せの少なくとも１つを含み、免疫刺激剤が免疫細胞を刺激することが可能である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
免疫刺激剤が少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
対象において腫瘍形成を予防する方法であって、
対象の皮膚の領域を請求項１に記載の光応答性皮膚アプリケータと接触させること、および皮膚アプリケータに光エネルギーを送達することを含み、
皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、対象において腫瘍に対する免疫応答を刺激する、方法。
【請求項２８】
皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、近赤外（ＮＩＲ）光、ＵＶ光、または約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長の光を送達することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、ＮＩＲ光を約５分〜約２０分の間送達することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、ＮＩＲ光を約１日から約７日連続で１日に少なくとも１回送達することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの腫瘍抗原が不活性化腫瘍溶解物または新生抗原に由来する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１つの腫瘍抗原が、メラノーマ、白血病、乳がん、肺がん、膀胱がん、脳がん、子宮頸がん、卵巣がん、結腸直腸がんおよび任意の関連するがんに由来する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
感光性の生物学的色素がメラニンを含み、皮膚アプリケータにＮＩＲ光を送達することが、メラニンが高体温微小環境を形成することを刺激する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
高体温微小環境の温度が約３５℃〜約４５℃である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
免疫原性組成物が免疫刺激剤をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
免疫刺激剤が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣｐＧヌクレオチド、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−１５およびその組合せの少なくとも１つを含み、免疫刺激剤が免疫細胞を刺激することが可能である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
免疫刺激剤が少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、参照により完全に本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月２５日に出願の米国特許仮出願第６２／５７６，７７４号の利益を主張する。
政府資金提供
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって与えられた交付番号ＴＲ００１１１１の下での政府支援によってなされた。政府は、本発明にある特定の権利を有する。
本開示の実施形態は概して、がん治療のための光免疫療法に関する。より詳細には、本開示は、対象に免疫原性組成物および感光性の生物学的色素（photo-sensitive biological pigment）を投与してがんを治療および／または予防するための、経皮マイクロニードル（transdermal microneedle）（ＭＮ）アレイを使用する光応答性皮膚アプリケータ（photo-responsive dermal applicator）を提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法に関連した新興技術は、がん療法において大きな将来性を有する。様々な免疫モジュレーターを送達するために、マイクロもしくはナノ製剤、または改変された免疫細胞を使用することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕで免疫細胞を動員し活性化する免疫原性微小環境を形成するために、ヒドロゲルなどの足場も開発されている。さらに、抗体または治療薬を組み込むＴ細胞エンジニアリングは、免疫標的化および治療を促進する。それらの中で、樹状細胞（ＤＣ）ベースのワクチン接種は、免疫応答の効果を向上させるために抗原を効果的に捕捉することができ、がん療法のための強力なツールである。しかし、ＤＣエンジニアリングは、複雑で高価なｅｘ  ｖｉｖｏの操作をしばしば必要とする。さらに、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作されたＤＣの限られたリンパ節ホーミング能力は、少なくとも一部、限られた抗がん効能の原因である。全腫瘍抗原によるワクチン接種は、狭く規定される腫瘍抗原と比較して著しく強化された免疫応答を導き出す、腫瘍関連抗原の広い供給源を提供する。さらに、広域の免疫原性エピトープを提示することは、ＤＣ抗原取り込みおよびプロセシングによって媒介される免疫を増強するだけでなく、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）も直接的に活性化する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示の実施形態は、がん治療のための光免疫療法に一般的に関する。より詳細には、本開示は、がんを治療および／または予防するために対象に免疫原性組成物および感光性の生物学的色素を投与するために、経皮マイクロニードルアレイを使用する光応答性皮膚アプリケータを提供する。
本開示の実施形態は、光免疫療法で使用するための光応答性皮膚アプリケータを含む。これらの実施形態により、皮膚アプリケータは、各マイクロニードルが基部部分（base portion）および先端部分（tip portion）を有する、複数のマイクロニードルを含む経皮マイクロニードルアレイと、少なくとも１つの腫瘍抗原を含む免疫原性組成物と、感光性の生物学的色素とを含む。
一部の実施形態では、免疫原性組成物および生物学的色素は、ヒアルロン酸ベースのマトリックスなどのポリマーマトリックスを使用してマイクロニードルアレイの中に封入されている。免疫原性組成物は、不活性化腫瘍溶解物から誘導される、例えばメラノーマから誘導される、少なくとも１つの腫瘍抗原、または新生抗原などの合成抗原を含むことができ、感光性の生物学的色素はメラニンを含むことができる。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、免疫細胞を刺激することが可能である免疫刺激剤をさらに含むことができる。
【０００４】
本開示の実施形態は、腫瘍を有する対象を治療する、および／または対象における腫瘍形成を予防する方法を含む。これらの実施形態により、本方法は、対象の皮膚の領域を上記の光応答性皮膚アプリケータと接触させること、および皮膚アプリケータに光エネルギーを送達することを含み、ここで、光エネルギーの送達は局所の熱に転換され、対象において腫瘍に対する免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達は、近赤外（ＮＩＲ）光、ＵＶ光、または約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長の光を送達することを含む。皮膚アプリケータに光を送達することは、メラニンなどの感光性の生物学的色素を刺激して高体温微小環境（hyperthermic microenvironment）を形成し、腫瘍を治療するおよび／または腫瘍形成を予防する免疫応答を刺激することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１Ａ−１Ｅ】メラニン媒介がん免疫療法のための経皮ＭＮベースアプリケータの代表的な概略図および画像。（Ａ）ＭＮベース経皮ワクチン接種の概略図。ＴＨ細胞：ヘルパーＴ細胞、ＴＣ細胞：細胞傷害性Ｔ細胞。（Ｂ）メラニンなしおよびメラニンありの代表的ＭＮアプリケータの写真（スケールバー：４ｍｍ）。（Ｃ）ＭＮアプリケータの走査電子顕微鏡像（スケールバー：４００μｍ）。（Ｄ）代表的ＭＮの蛍光断面像。細胞の中のアクチンフィラメントはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ファロイジン（緑色）によって可視化し、細胞ＤＮＡ断片はＨｏｅｃｈｓｔ（青色）によって染色し、ヒアルロン酸ポリマーマトリックスはローダミン（赤色）によって染色した（スケールバー：２００μｍ）。（Ｅ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ファロイジン標識腫瘍溶解物およびローダミン標識ヒアルロン酸を含有した代表的ＭＮ−アレイアプリケータの蛍光イメージング（スケールバー：４００μｍ）。
【図２Ａ−２Ｇ】光応答性経皮ＭＮを特徴付ける図。（Ａ）赤外線サーマルカメラで特徴付けた、１．０Ｗ／ｃｍ2での連続８０８ｎｍ  ＮＩＲ照射による、腫瘍溶解物ありまたはなしのリアルタイムにおけるＭＮの表面温度変化（スケールバー：１ｍｍ）。（Ｂ）１．０Ｗ／ｃｍ２での連続ＮＩＲ照射による代表的ＭＮの定量的表面温度変化（ｎ＝３）。（Ｃ）レーザー出力フラックスの増加による代表的ＭＮ−アレイアプリケータの定量的温度変化（ｎ＝３）。（Ｄ）ＭＮ−アレイアプリケータからの腫瘍溶解物タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの集合的な放出（ｎ＝３）。（Ｅ）腫瘍溶解物およびＧＭ−ＣＳＦまたはＬＰＳを加え、異なる時間ＮＩＲ照射に曝露させたＭＮに応答したＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化（ｎ＝３）。（Ｆ）（ｉ）ブランクＭＮ、（ｉｉ）１０分間のＮＩＲ、（ｉｉｉ）ＭＮおよび（ｉｖ）ＭＮおよび１０分間のＮＩＲによる処置の後のＤＣの生／死アッセイ。（Ｇ）処置の後のＤＣ生存率の定量化。データポイントは、平均±標準偏差（ＳＤ）（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（ＮＳ．Ｐ＞０．０５；*Ｐ＜０．０５）によって計算した。
【図３Ａ−３Ｇ】ＭＮアプリケータが保護的な先天性および適応性の免疫を付与することを実証する図。（Ａ）ＭＮがん免疫療法の概略図。（Ｂ）挿入後のＭＮの特徴付け。（ｉ）１つのＭＮアプリケータで経皮的に処置したマウス背側皮膚（赤線の中の領域）の写真、および（ｉｉ）Ｃｙ５．５標識ＭＮ−アレイアプリケータの経時的蛍光シグナル。（Ｃ）赤外線サーマルカメラで測定した皮膚へのＭＮ挿入後の個々の動物の表面温度変化。（Ｄ）Ｂ１６Ｆ１０ワクチン腫瘍モデルの概略図。（Ｅ）腫瘍チャレンジ後の処置マウスにおける平均腫瘍体積。（Ｆ）処置および対照マウスのためのカプランマイアー生存曲線。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定およびログランク検定によって計算した（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１）。（Ｇ）腫瘍チャレンジ後の異なる実験群および異なる時点のＢ１６Ｆ１０メラノーマのｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージング。処置群につき３匹の代表的マウスを示す。Ｅ、ＦおよびＧにおける腫瘍増殖は、腫瘍細胞接種の１０日後に測定した。
【図４Ａ−４Ｄ】ＮＩＲ増強ＭＮ媒介がん免疫療法の後の免疫細胞動員を実証する図。（Ａ）フローサイトメトリーによって調査した、処置の３日後の皮膚に浸潤したＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋、ＰＩＲ−Ａ／Ｂ＋）の代表的定量分析。示した試料を、ブランクＭＮ（ブランク）、ワクチンＭＮ（ＭＮ）、ＧＭ−ＣＳＦなしの腫瘍溶解物を加え、ＮＩＲで処置したＭＮ（ＮＩＲ）、ワクチンＭＮおよびＮＩＲ処置（ＭＮ＋ＮＩＲ）で処置した。（Ｂ）フローサイトメトリーによって調査した、経皮がん免疫療法の後の皮膚におけるＮＫ細胞（ＣＤ４９ｂ＋）の代表的な定量分析。（Ｃ）ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの免疫蛍光染色および定量分析（スケールバー：１００μｍ）、および（Ｄ）ＣＤ４９ｂ＋ＮＫ細胞（スケールバー：１００μｍ）。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１）によって計算した。アスタリスクは、ＭＮ＋ＮＩＲ群および全ての他の処置群の間の有意差を示す。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。
【図５Ａ−５Ｇ】ＭＮ媒介がん免疫療法の後の免疫性応答を実証する図。（Ａ）フローサイトメトリーによって分析した、処置腫瘍におけるＴ細胞（ＣＤ３＋Ｔ細胞の上にゲーティングされる）の代表的な定量分析。（Ｂ）フローサイトメトリーによって分析した、流入領域リンパ節における活性化ＤＣ（ＣＤ８６＋、ＣＤ８０＋）の代表的な定量分析。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。（Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を示す腫瘍の免疫蛍光染色（スケールバー：１００μｍ）。（Ｄ）１０日目に収集した血清におけるＩｇＧ１サブタイプの定量化。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。（Ｅ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＢ１６Ｆ１０細胞に対する脾細胞の細胞傷害性応答。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）を表す。（Ｆ）領域性皮膚におけるＨＳＰ７０（緑色）の免疫蛍光染色、アクチンフィラメントはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０−ファロイジン（赤色）によって可視化され、細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ（青色）によって染色される（スケールバー：１００μｍ）。（Ｇ）３日目の抽出されたアプリケータからのサイトカインのｉｎ  ｖｉｖｏ局所検出。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１）によって計算した。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。
【図６Ａ−６Ｋ】離れたＢ１６Ｆ１０腫瘍に対する局所がん免疫療法処置の抗腫瘍作用を実証する。（Ａ）Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルの概略図。（Ｂ）ＭＮ投与の前後のマウスの写真。赤色矢印は、両側の確立された腫瘍を示す。赤線は、ＭＮ注射部位を示す。（Ｃ）異なる実験群（ｎ＝３）における腫瘍質量。（Ｄ）異なる実験群（ｎ＝６）における処置後の腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｃ、Ｄのアスタリスクは、ブランクＭＮと他の群の間の統計的有意差を示す。（Ｅ）（Ｄ）の標識によって示される処置マウスから抽出された腫瘍の像。（Ｆ）処置後の異なる時点の処置Ｂ１６Ｆ１０メラノーマのｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージング。処置群ごとの１匹の代表的マウスを示した。（Ｇ）処置マウスにおける平均腫瘍体積。（Ｈ）処置マウス（ｎ＝６）の体重。（Ｉ）ＢＰ溶解物とメラニンを加えたＭＮおよびブランクＭＮで処置したマウス（ｎ＝８）における平均Ｂ１６Ｆ１０腫瘍体積。（Ｊ）８０日目にＢ１６Ｆ１０細胞またはＢＰ細胞で再チャレンジしたワクチン接種マウスにおける平均腫瘍体積。（Ｋ）再チャレンジマウスのためのカプランマイアー生存曲線。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定およびログランク検定によって計算した（ＮＳ．Ｐ＞０．０５；*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１）。
【図７Ａ−７Ｄ】様々な腫瘍モデルにおける局所がん免疫療法処置の抗腫瘍作用を実証する。（Ａ）ＢＰ腫瘍細胞チャレンジ後のワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの平均腫瘍増殖およびカプラン−マイヤー生存率。マウスを、ブランクＭＮ（ブランク）、ＢＰ腫瘍溶解物およびメラニンを加えたＭＮ（ＭＮ）、またはＮＩＲ照射と組み合わせた、添加ＭＮ（ＭＮ＋ＮＩＲ）で前処置した。（Ｂ）４Ｔ１腫瘍細胞チャレンジ後のワクチン接種ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの平均腫瘍増殖およびカプラン−マイヤー生存率。マウスを、ブランクＭＮ（ブランク）、４Ｔ１腫瘍溶解物およびメラニンを加えたＭＮ（ＭＮ）、またはＮＩＲ照射と組み合わせた、添加ＭＮ（ＭＮ＋ＮＩＲ）で前処置した。（Ｃ）確立されたＢＰ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの平均腫瘍増殖およびカプラン−マイヤー生存率。マウスを、ブランクＭＮ（ブランク）、ＢＰ腫瘍溶解物およびメラニンを加えたＭＮ（ＭＮ）、またはＮＩＲ照射と組み合わせた、添加ＭＮ（ＭＮ＋ＮＩＲ）で処置した。（Ｄ）確立された４Ｔ１腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃＪマウスの平均腫瘍増殖およびカプラン−マイヤー生存率。マウスを、ブランクＭＮ（ブランク）、４Ｔ１腫瘍溶解物およびメラニンを加えたＭＮ（ＭＮ）、またはＮＩＲ照射と組み合わせた、添加ＭＮ（ＭＮ＋ＮＩＲ）で処置した。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定およびログランク検定によって計算した（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１）。
【図８】経皮ＭＮベースアプリケータの機械的特性を実証する図。データポイントは、１つの代表的ＭＮを示す。実験は３回繰り返し、類似の結果が得られた。
【図９Ａ−９Ｂ】腫瘍溶解物溶液および合成メラニンを特徴付けるデータを含む図。（Ａ）Ｂ１６Ｆ１０全腫瘍溶解物溶液、合成メラニンおよびＰＢＳの吸収スペクトル。（Ｂ）１０分間の１．０Ｗ／ｃｍ2のＮＩＲ照射処置ありまたはなしのメラニンのフーリエ変換赤外分光法。
【図１０Ａ−１０Ｂ】反復ＮＩＲ照射によるＭＮ−アレイアプリケータの加熱行動を実証する図。（Ａ）ピンクゾーンはＮＩＲ光がオンの状態を示し、白色ゾーンはＮＩＲ光がオフの状態を示す。（Ｂ）１．０Ｗ／ｃｍ2のＮＩＲ光に曝露させた場合またはＮＩＲ光に曝露させなかった場合のＭＮアプリケータの表面温度変化。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】ＮＩＲ照射後の腫瘍溶解物の様々な添加量を有するＭＮ−アレイアプリケータの表面温度を実証する図。ＭＮ−アレイアプリケータは１．０Ｗ／ｃｍ２のＮＩＲ光に曝露させた。（Ａ）抽出した腫瘍溶解物タンパク質の異なる濃度を有するＭＮ−アレイアプリケータの表面温度変化。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。（Ｂ）異なる厚さのＭＮ裏張りを有するＭＮ−アレイアプリケータの表面温度変化。異なる裏張り厚さを有するＭＮ−アレイアプリケータを使用した：（１）１６９μｍ、（２）１７５μｍ、（３）１７９μｍ、（４）１８１μｍおよび（５）２０２μｍ。
【図１２Ａ−１２Ｄ】ＧＭ−ＣＳＦおよび腫瘍溶解物タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロファイルを実証する図。ＭＮ−アレイアプリケータからのＧＭ−ＣＳＦの経時的（Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ集合的放出および（Ｂ）生物活性のプロファイル。ＭＮ−アレイアプリケータの１０分間／日のＮＩＲ処置による緩衝溶液における経時的な（Ｃ）ＧＭ−ＣＳＦおよび（Ｄ）腫瘍溶解物タンパク質の集合的な放出。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（ＮＳ．Ｐ＞０．０５）によって計算した。
【図１３】１、２および３日目に調査したマウス皮膚への挿入後のＭＮ−アレイアプリケータの代表的な走査電子顕微鏡像（スケールバー：４００μｍ）。
【図１４Ａ−１４Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化の後のＤＣ機能を評価する図。（Ａ）生／死アッセイによって測定したＤＣ生存率。（Ｂ）細胞上清中のサイトカインインターロイキン１２（ＩＬ−１２）濃度。ＤＣを腫瘍溶解物またはリポ多糖（ＬＰＳ）およびＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＮで処置し、異なる時間のＮＩＲ照射に曝露させた。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（*Ｐ＜０．０５）によって計算した。
【図１５】ブランクＭＮの細胞傷害性研究を示す図。ＭＮ−アレイアプリケータを再溶解し、２４時間のインキュベーションの間、Ｂ１６Ｆ１０細胞に加えた。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝６）。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（ＮＳ．Ｐ＞０．０５）によって計算した。
【図１６Ａ−１６Ｂ】ＭＮ挿入後の皮膚を特徴付ける図。マウス皮膚へのＭＮの透過を示す（Ａ）トリパンブルーおよび（Ｂ）Ｈ＆Ｅ染色の像（スケールバー：２００μｍ）。ＭＮ挿入が起きた領域は、黒色の破線によって示す。
【図１７Ａ−１７Ｃ】メラニン添加ＭＮがｉｎ  ｖｉｖｏで防御免疫を付与することを実証する図。（Ａ）赤外線サーマルカメラで測定した、皮膚へのＭＮ挿入およびＮＩＲ（１．０Ｗ／ｃｍ2）照射の後の個々の動物のリアルタイム表面温度変化。（Ｂ）処置および対照マウスのための平均腫瘍体積。（Ｃ）処置および対照マウスのためのカプランマイアー生存曲線。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定およびログランク検定によって計算した（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１）。
【図１８Ａ−１８Ｂ】対照および処置マウスにおける腫瘍増殖を実証する図。腫瘍接種および示した処置の後のマウスの（Ａ）平均および（Ｂ）個々のＢ１６Ｆ１０腫瘍増殖曲線。腫瘍細胞接種の１０日後に、腫瘍増殖曲線をグラフ表示した。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定によって計算した（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１）。
【図１９】対照および処置マウスにおけるＢ１６Ｆ１０生物発光腫瘍シグナルを定量化するデータを示す図。エラーバーは、ＳＤを示す（ｎ＝３）。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（ＮＳ．Ｐ＞０．０５；*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１）によって計算した。
【図２０】対照および処置マウスにおける腫瘍質量のデータを示す図。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（**Ｐ＜０．０１）によって計算した。
【図２１Ａ−２１Ｂ】腫瘍断面の組織像およびアポトーシス分析を示す図。（Ａ）腫瘍断面におけるメラニン含有量のＨ＆Ｅ染色および定量分析。（Ｂ）示した各処置の後にマウスから収集した腫瘍のインサイチューのＴＵＮＥＬ陽性の核の蛍光像および定量分析。腫瘍断面をアポトーシスのためにフルオレセイン−ｄＵＴＰ（緑色）で、核のためにＤＡＰＩ（青色）で染色した（スケールバー：１００μｍ）。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定によって計算した（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１）。
【図２２】経皮がん免疫療法を受けたマウスの腫瘍増殖のデータを示す図。ＣＤ８  Ｔ細胞消失（ＣＤ８）、ＣＤ４  Ｔ細胞消失（ＣＤ４）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞消失（ＮＫ）およびＢ細胞消失（Ｂ）の条件下の腫瘍接種ならびにワクチンＭＮ処置およびＮＩＲ照射の後のマウスにおける平均腫瘍体積。対照は、ブランクＭＮ（ブランク）およびＮＩＲ照射を伴うワクチンＭＮ（ＭＮ＋ＮＩＲ）で処置したナイーブマウスである。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定によって計算した（ＮＳ．Ｐ＞０．０５；*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１）。
【図２３Ａ−２３Ｃ】マウスの局所微小循環性血液かん流の測定を示す図。データは、レーザードップラー血流計を使用して異なる条件の処置の直後に収集した。マウスは、以下で処置した：（Ａ）ブランクＭＮ、（Ｂ）ワクチンＭＮおよび（Ｃ）ワクチンＭＮとＮＩＲ照射。実験は３回繰り返し、定量分析は表２に要約する。
【図２４Ａ−２４Ｂ】経皮がん免疫療法の後の免疫性応答を実証する図。フローサイトメトリーによって分析した、処置マウスの腫瘍からのＣＤ８＋Ｔ細胞における四量体ＧＰ１００染色の（Ａ）代表的なプロットおよび（Ｂ）定量分析。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（*Ｐ＜０．０５）によって計算した。
【図２５】血清中のＩｇＧ１サブタイプの定量化を示す図。ブランク、ＭＮまたはＭＮ＋ＮＩＲによる処置の１５日後に血清を収集した。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１）によって計算した。
【図２６Ａ−２６Ｂ】腫瘍切片におけるフローサイトメトリーによる反応性酸素種（ＲＯＳ）検出を実証する図。（Ａ）異なる実験群から収集した腫瘍における正規化された平均ＲＯＳシグナル強度。（Ｂ）定量的平均ＲＯＳシグナル強度（ｎ＝６）。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（*Ｐ＜０．０５）によって計算した。
【図２７Ａ−２７Ｂ】経皮がん免疫療法の後のＨＳＰ９０発現を実証する図。（Ａ）示した処置の後に収集した皮膚におけるＨＳＰ９０の免疫蛍光染色（緑色）。アクチンフィラメントはファロイジン（赤色）によって可視化し、細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ（青色）によって染色した（スケールバー：１００μｍ）。（Ｂ）免疫蛍光染色像におけるＨＳＰ９０シグナル強度の定量分析。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（*Ｐ＜０．０５）によって計算した。
【図２８】経皮がん免疫療法の後のサイトカインカイネティクスを示す図。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルの抽出されたアプリケータおよび周囲組織において、サイトカイン濃度を示した時点で測定した。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１）によって計算した。
【図２９Ａ−２９Ｂ】経皮がん免疫療法の後の組織学分析を示す図。（Ａ）組合せ処置の後のマウスおよび肺転移のある対照マウスならびに健康なマウスから収集した臓器のＨ＆Ｅ染色。濃青色矢印は、肺における転移性腫瘍を示す。（Ｂ）異なる処置を受けたマウスからの収集した肺の写真（スケールバー：１００μｍ）および肺小結節の定量化。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（***Ｐ＜０．００１）によって計算した。
【図３０Ａ−３０Ｂ】異なる腫瘍モデルへの経皮がん免疫療法の抗腫瘍作用を実証する図。示した処置を受けたマウスの（Ａ）平均ならびに（Ｂ）個々のＢ１６Ｆ１０およびＢＰ腫瘍増殖曲線。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（***Ｐ＜０．００１）によって計算した。
【図３１】メラニン添加ＭＮの表面温度変化を実証する図。マウス皮膚への挿入および１．０Ｗ／ｃｍ2のＮＩＲ照射の後に、像を赤外線サーマルカメラによりリアルタイムで測定した。ＭＮには、メラノーマＢＰ溶解物または乳がん４Ｔ１溶解物をメラニンと一緒に加えた。
【図３２Ａ−３２Ｄ】経皮がん免疫療法の抗腫瘍作用を実証する図。（Ａ）ＢＰ腫瘍細胞チャレンジ後のワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腫瘍増殖。マウスを、ブランクＭＮ（ブランク）、ＢＰ腫瘍溶解物およびメラニンを加えたＭＮ（ＭＮ）、またはＮＩＲ照射と組み合わせた添加ＭＮ（ＭＮ＋ＮＩＲ）で前処置した。（Ｂ）ブランクＭＮ（ブランク）、ＢＰ腫瘍溶解物およびメラニンを加えたＭＮ（ＭＮ）、またはＮＩＲ照射と組み合わせた添加ＭＮ（ＭＮ＋ＮＩＲ）による治療処置の前に確立されたＢＰ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腫瘍増殖。（Ｃ）４Ｔ１腫瘍細胞チャレンジ後のワクチン接種ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの腫瘍増殖。マウスを、ブランクＭＮ（ブランク）、４Ｔ１腫瘍溶解物およびメラニンを加えたＭＮ（ＭＮ）、またはＮＩＲ照射と組み合わせた添加ＭＮ（ＭＮ＋ＮＩＲ）で前処置した。（Ｄ）ブランクＭＮ（ブランク）、４Ｔ１腫瘍溶解物およびメラニンを加えたＭＮ（ＭＮ）、またはＮＩＲ照射と組み合わせた添加ＭＮ（ＭＮ＋ＮＩＲ）による治療処置の前に確立された４Ｔ１腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃＪマウスの腫瘍増殖。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定によって計算した（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１）。アスタリスクは、ＭＮ＋ＮＩＲ群および全ての他の処置群の間の統計的有意差を示す。
【図３３Ａ−３３Ｂ】経皮がん免疫療法の後のＨＳＰ７０発現を実証する図。（Ａ）ＢＰおよび４Ｔ１腫瘍モデルのそれぞれにおける、領域性皮膚におけるＨＳＰ７０（緑色）の免疫蛍光染色、アクチンフィラメントはファロイジン（赤色）によって可視化され、細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ（青色）によって染色された（スケールバー：１００μｍ）。（Ｂ）領域性皮膚試料におけるＨＳＰ７０の定量的強度。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１）によって計算した。
【図３４Ａ−３４Ｂ】ＤＣ活性化の代表的な定量分析を示す図。（Ａ）ＢＰおよび（Ｂ）４Ｔ１腫瘍モデルの流入領域リンパ節において、活性化ＤＣ（ＣＤ８６＋、ＣＤ８０＋）を収集した。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（*Ｐ＜０．０５）によって計算した。
【図３５Ａ−３５Ｂ】異なる腫瘍モデルにおける経皮がん免疫療法の後のサイトカインカイネティクスを示す図。（Ａ）ＢＰおよび（Ｂ）４Ｔ１腫瘍モデルにおいて抽出されたアプリケータおよび周囲組織でサイトカイン濃度を測定した。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。統計的有意性は、スチューデントｔ検定（*Ｐ＜０．０５）によって計算した。
【図３６Ａ−３６Ｄ】対照および処置マウスにおける経皮がん免疫療法の後のマウスの平均重量を示す図。（Ａ）ＢＰ腫瘍細胞チャレンジ後のワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの平均重量。（Ｂ）治療処置前に確立されたＢＰ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの平均重量。（Ｃ）４Ｔ１腫瘍細胞チャレンジ後のワクチン接種ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの平均重量。（Ｄ）治療処置の前に確立された４Ｔ１腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃＪマウスの平均重量。データポイントは、平均±ＳＤ（ｎ＝８）を表す。
【図３７】ワクチン接種後の、（Ａ）ＢＰ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび（Ｂ）４Ｔ１腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける、経皮がん免疫療法の後に収集した臓器の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す図（スケールバー：１００μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、当分野の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。相反する場合には、定義を含めた本文書が支配する。好ましい方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載されるそれらに類似するか同等である方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができる。本明細書で指摘される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法および例は例示されるだけであり、限定するものではない。
【０００７】
本明細書で使用される用語「含む（comprise）」、「含む（include）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「できる（can）」、「含有する（contain）」およびその変形は、さらなる行為または構造の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語または単語を指す。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別途指示しない限り複数形を含む。明示的であろうがなかろうが、本開示は、本明細書で提供される実施形態または要素を「含む」、「からなる」および「から本質的になる」他の実施形態も企図する。
【０００８】
量に関連して使用される修飾語「約」は、明記される値を包含し、文脈によって指示される意味を有する（例えば、それは少なくとも特定の量の測定に関連した誤差の程度を含む）。修飾語「約」は、２つのエンドポイントの絶対値によって規定される範囲を開示するものと考えるべきでもある。例えば、表現「約２〜約４」は、「２〜４」の範囲も開示する。用語「約」は、示された数のプラスマイナス１０％を指すことができる。例えば、「約１０％」は９％〜１１％の範囲を示すことができ、「約１」は０．９〜１．１を意味することができる。「約」の他の意味は、四捨五入のように文脈から明らかになることがあり、したがって、例えば「約１」は０．５〜１．４を意味することもできる。
【０００９】
本明細書で特記されない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、本発明の記載との関連で（特に以下の請求項との関連で）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および「少なくとも１つ」および類似の指示語の使用は、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈するべきである。本明細書で別途指示がない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、用語「少なくとも１つ」とそれに続く１つまたは複数のアイテムのリスト（例えば、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」）の使用は、掲載されるアイテムから選択される１つのアイテム（ＡまたはＢ）または掲載されるアイテムの２つ以上の任意の組合せ（ＡおよびＢ）を意味するものと解釈するべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」および「含有する（containing）」は、特に指摘されない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「限定されずに含む」ことを意味する）と解釈するべきである。本明細書で特に明記しない限り、本明細書中での値の範囲の列挙は、単にその範囲に入る各別個の値に個々に言及する簡略な方法の役割をするものであり、各別個の値は、それが本明細書に個々に挙げられているかのように本明細書に組み込まれている。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に明記しない限り、さもなければ文脈によって明らかに否定されない限り、任意の適する順序で実行することができる。本明細書で提供される任意および全ての例、または例示を示す言語（例えば、「など」）の使用は、特に主張されない限り、本発明を単により良好に示すことが目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。明細書の中のいかなる言語も、請求されていないいかなる要素も本発明の実施に必須であることを示すと解釈するべきでない。
【００１０】
用語「投与する」は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮、経真皮、筋肉内、関節内、非経口、細動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入または植え込まれたレザバーを通した投与を指す。投与することは、経皮マイクロニードル−アレイパッチを使用して実行することができる。用語「非経口」には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、クモ膜下、肝内、病巣内および頭蓋内の注射または注入技術が含まれる。「生体適合性」は、レシピエントに一般的に無毒であり、対象にいかなる重大な有害作用も引き起こさない材料およびその任意の代謝産物または分解生成物を一般的に指す。
【００１１】
用語「担体」または「薬学的に許容される担体」は、一般的に安全および無毒である医薬または治療組成物の調製で有益である担体または賦形剤を意味し、獣医学および／またはヒトの医薬または治療的使用のために許容される担体が含まれる。本明細書で使用されるように、用語「担体」または「薬学的に許容される担体」は、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳濁液（例えば、油／水または水／油乳濁液）、および／または各種の湿潤剤を含むことができる。本明細書で使用されるように、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または医薬製剤で使用するための当技術分野で周知である、および下でさらに記載される、他の材料を包含する。
本明細書で使用されるように、用語「薬学的に許容される」は、生物学的にも、その他の点でも望ましくなくはない構成成分を指すことができる。例えば、いかなる重大な望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、またはそれが含有される製剤の他の構成成分のいずれとも有害な相互作用をすることなく、その構成成分を本明細書に記載されるように本発明の医薬製剤に組み込むことができ、対象に投与することができる。用語「薬学的に許容される」が賦形剤を指すために使用される場合、その構成成分が毒性学および製造試験の要求基準を満たしていること、または米国食品医薬品局によって作成されたＩｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅにそれが含まれることを一般的に暗示する。
【００１２】
用語「免疫チェックポイント阻害剤」または「免疫療法」は、１つまたは複数のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減するか、阻害するか、干渉するか、またはモジュレートする分子を指す。チェックポイントタンパク質は、免疫細胞の活性化または機能を調節する。多数のチェックポイントタンパク質が公知である、例えばＣＴＬＡ−４とそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６；ならびにＰＤ１とそのリガンドＰＤＬ１およびＰＤＬ２（例えば、Pardoli, Nature Reviews Cancer 12: 252-264, 2012、を参照）。これらのタンパク質は、免疫細胞応答の共刺激性または阻害性相互作用の役割を担う。免疫チェックポイントタンパク質は、生理的免疫応答の自己寛容ならびに持続期間および振幅を調節し、維持する。免疫チェックポイント阻害剤は抗体を含むか、抗体から誘導される。
【００１３】
本明細書で使用されるように、用語「ポリマー」は、連結してより大きなポリマーマトリックスを形成することができる、反復する小さい単位、単量体（例えば、ポリエチレン、ゴム、セルロース）によってその構造を表すことができる、天然または合成の比較的高い分子量の有機化合物を指す。合成ポリマーは、単量体の付加または縮合重合によって一般的に形成される。本明細書で使用されるように、用語「コポリマー」は、２つ以上の異なる反復単位（単量体残基）から形成されるポリマーを指す。例として、限定されずに、コポリマーは、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマーまたはグラフトコポリマーであってもよい。ある特定の態様では、ブロックコポリマーの様々なブロックセグメントは、コポリマーをそれ自身含むことができることも考えられる。
本明細書で使用される「予防」、「予防する」および／または「予防すること」（および、その任意の派生語）は、転移の過程または進行および後発転移を阻止、停止および／または阻害することを含む、腫瘍の増殖または発達を阻止、停止および／または阻害することを指す。
本明細書で使用される「対象」および「患者」は、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジー等）およびヒト）を限定されずに含む、任意の脊椎動物を互換的に指す。一部の実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒトであってもよい。対象または患者は、他の形態の処置を受けていてもよい。
【００１４】
本明細書で使用されるように、治療剤の「治療的有効量」は、所望の治療結果を達成するのに有効である量を指し、治療剤の「予防的有効量」は、望ましくない生理的状態を予防するのに有効である量を指す。所与の治療剤の治療的有効および予防的有効量は、処置する障害または疾患のタイプおよび重症度、ならびに対象の年齢、性および重量などの因子に関して一般的に異なる。用語「治療的有効量」は、所望の治療効果を促進するのに有効である治療剤の量または治療剤の送達速度（例えば、経時的な量）を指すこともできる。正確な所望の治療効果は、処置する状態、対象の耐性、投与される薬物および／または薬物製剤（例えば、治療剤（薬物）の効力、製剤中の薬物の濃度など）、ならびに当業者によって評価される様々な他の因子によって異なる。
【００１５】
本明細書で使用されるように、「処置する」、「処置された」または「処置すること」は、その目的が望ましくない生理的状態、障害もしくは疾患を鈍化する（少なくする）こと、または有益なもしくは所望の臨床結果を得ることである治療方法を指す。本開示の一部の態様では、有益なまたは所望の臨床結果には、限定されずに、症状の緩和；状態、障害または疾患の程度の減少；病状、障害または疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）；状態、障害または疾患の開始の遅れまたは進行の鈍化；病状、障害または疾患の状態の改善；および、検出可能であるかもしくは検出不能である寛解（部分的または完全な）、または状態、障害もしくは疾患の向上もしくは改善が含まれる。処置には、処置を受けない場合の予想生存期間と比較して、生存期間を延長することも含まれる。
【００１６】
ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持する。変異体は、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味することもできる。アミノ酸の保存的な置換、すなわち、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸によってアミノ酸を置き換えることは、軽微な変化を一般的に含むと当技術分野で認識されている。これらの軽微な変化は、当技術分野で理解されるように、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって一部同定することができる。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づく。類似の疎水性親水性指標のアミノ酸を置換しても、なおタンパク質機能を保持することができることは、当技術分野で公知である。一態様では、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすだろう置換を明らかにするために、アミノ酸の親水性を使用することもできる。ペプチドとの関連におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大の局所の平均親水性の計算を可能にする。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で実行することができる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察と一貫して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズおよび他の特性によって明らかにされる、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存すると理解される。
【００１７】
本明細書で、「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を記載するために使用される。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、それは、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる、環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞の中で自律的に複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。宿主細胞への導入の後に他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を宿主細胞のゲノムに組み入れることができ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことが可能である。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または、単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用である発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。プラスミドは最も一般的に使用される形のベクターであるので、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用することができる。しかし、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを使用することができる。この点に関して、ＲＮＡバージョンのベクター（ＲＮＡウイルスベクターを含む）を、本開示との関連で使用することもできる。
【００１８】
本開示のいかなる実施形態も詳細に説明する前に、本開示は、その適用が以下の記載に示されるかまたは付随図に図示される構成成分の構築および配置の詳細に限定されないことを理解すべきである。本開示は、他の実施形態、および様々な方法で実施または実行することが可能である。
本発明の他の態様は、詳細な記載および付随図を考慮して明らかになる。
本開示の実施形態は、がん治療のための光免疫療法に一般的に関する。より詳細には、本開示は、がんを治療および／または予防するために対象に免疫原性組成物および感光性の生物学的色素を投与するために、経皮マイクロニードルアレイを使用する光応答性皮膚アプリケータを提供する。
【００１９】
メラニンは吸収した太陽エネルギーの９９．９％を熱に変換して、皮膚がんのリスクを低減することが可能である。本開示の実施形態は、経皮マイクロニードル−アレイアプリケータ（「アプリケータパッチ」または「パッチ」とも呼ばれる）による、メラニン媒介がん免疫療法戦略を含む。これらの実施形態により、例えば、メラニンを含有するＢ１６Ｆ１０全腫瘍溶解物を、皮膚への挿入の後の溶解物の持続的放出を可能にするポリマーマイクロニードルに加えることができる。近赤外光照射などの光エネルギーと組み合わせて、アプリケータの中のメラニンは熱の発生を媒介し、それは樹状細胞による腫瘍抗原の取り込みをさらに促進し、強化された抗腫瘍処置およびワクチン接種に導く。いかなる特定の理論にも縛られることなく、空間時間的光応答性免疫療法は、極性化Ｔ細胞の浸潤および局所のサイトカイン放出を増加させる。例えば、これらの免疫作用は腫瘍チャレンジ後のマウスの生存、ならびに確立された原発性腫瘍および離れた腫瘍に対して導き出される抗腫瘍作用を増加させる。総合的に、メラニンは局所熱を発生させ、経皮ワクチンによるＴ細胞活性を増強し、抗腫瘍免疫応答を促進する。
【００２０】
本開示に基づいて当業者が認識するだろうように、本開示の光応答性ＭＮアプリケータで使用される免疫原性組成物は、がん性腫瘍形成を治療および予防／阻害するために使用することができる。一般的に、がんワクチンは、生体応答調節剤として知られる物質のクラスに属する。生体応答調節剤は、感染症および疾患と闘う免疫系の能力を刺激または回復することによって働く。２つの広いタイプのがんワクチンがある：健康な人々においてがんが発生することを予防することを目的とする防止的（または、予防的）ワクチン；および、がんに対する体の天然の免疫応答を強化することによって既存のがんを治療することを目的とする治療（または、治療的）ワクチン。治療ワクチンは、免疫療法の形態である。防止的（例えば、予防的処置）および治療（例えば、診断後の処置）ワクチン機能は、本明細書に記載される。
【００２１】
本開示の光応答性皮膚アプリケータは、メラニンなどの光応答性生物学的色素と組み合わせた腫瘍溶解物の経皮送達を通して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を直接的に標的にする全腫瘍溶解物を含む免疫原性組成物を含むことができる（図１Ａ）。この免疫原性組成物は、皮膚に挿入される皮内マイクロニードル（ＭＮ）アレイアプリケータによって徐々に放出される不活性の腫瘍溶解物の封入を含む。腫瘍溶解物は完全または部分的な腫瘍溶解物であってもよく、一部の場合には、不活性化された完全または部分的な腫瘍溶解物（例えば、熱不活性化された）であってもよい。ＭＮはＤＣによる抗原の取り込みおよび提示を促進し、次に、真皮におけるリンパ管の広範なネットワークを通して免疫活性化を促進する。同時に、腫瘍溶解物の中に天然の生物学的色素として存在してもよいかまたは存在しなくてもよいメラニンの存在は、遠隔制御可能な近赤外（ＮＩＲ）光放出を通した熱の局所放出を可能にする。局所の熱は、免疫細胞を誘引する炎症性サイトカインの放出を引き起こすことができる；細胞外熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、反応性酸素種（ＲＯＳ）、抗原アジュバントおよび一部の他の危険シグナルなどの免疫原性基質の生成は、免疫系を活性化することができる。間質組織の局所温度の軽度の増加は、ＡＰＣおよびＴ細胞の遊走を促進する血液およびリンパ流の増加に寄与し、こうして腫瘍抗原特異的免疫応答を開始することもできる。血流の増加は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの他の細胞サブセットの動員を可能にすることもできる。一部の実施形態では、光応答性皮膚アプリケータの投与は、頑強な先天性および適応性の免疫応答を生成することができ、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマモデルにおいて腫瘍退行を提供した。さらに、ＮＩＲによって強化された経皮ワクチン接種は、離れた腫瘍の増殖を遅延させ、長期生存を向上させ、臨床試験でこの戦略を探究するための強力な理論的根拠を敷いた。
【００２２】
これらの実施形態により、本開示は、Ｂ１６Ｆ１０全腫瘍溶解物および免疫刺激剤（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））を経皮ＭＮアプリケータに組み入れることは、免疫原性組成物の送達を持続させ、表皮の免疫細胞集団を標的にすることができることを実証した。メラニンの組込みは、ＤＣおよび他の免疫細胞の動員を通して、近赤外（ＮＩＲ）照射後の局所免疫活性化を促進する。他の光感作剤と比較して、メラニンは、高い生体適合性および広い吸収スペクトルを有する天然色素である。メラニンによって媒介される効率的な光から熱への変換は、約４２℃までの皮膚温度の急上昇に寄与する。
【００２３】
本明細書に記載される免疫原性組成物の実施形態は、対象における腫瘍形成を治療および／または予防するために処置レジメンの一部として使用することができる。これらの実施形態により、光応答性皮膚アプリケータによって対象を処置することは、生存を増加させ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊワクチン接種マウスの８７％において腫瘍排除を導くことができる。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞で再チャレンジしたマウスにおいて、完全な腫瘍防御がさらに実証された。ＮＩＲ処置の後、上昇した局所の微小循環血液かん流は、局所のＤＣおよびＮＫ細胞の遊走と相関した。Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＴ細胞の消失はワクチン接種マウスにおける治療効果を減弱させ、腫瘍発達における免疫制御の関連性を強調した。さらに、危険シグナルおよび炎症誘発性サイトカインの生成は、周囲組織におけるＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０発現の増加ならびにＲＯＳレベルの増加を含む免疫活性化を誘発する。この作用は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の局所の富化とも関連していた。
【００２４】
本開示の実施形態は、光照射ＭＮアプリケータパッチに全腫瘍溶解物およびメラニンを含有する光応答性皮膚アプリケータが、ワクチン接種部位で免疫細胞を効果的に動員して活性化する、高体温模倣微小環境を形成することを実証する。その結果、メラニン媒介アプリケータは、予防モデルにおける腫瘍移植を予防し、担がんマウスにおける持続的腫瘍退行を引き起こす。さらに、感光性の生物学的色素の使用は、メラニンに加えて、天然および合成のカロテノイド、キサントフィル、ビリルビンおよび／またはこれらの生物学的色素の組合せおよび誘導体などの、他の生物学的色素に拡張することができる。さらに、本明細書に記載される方法は、深部組織の光音響イメージング、生物学的標識にも適応でき、光／熱に応答して様々な疾患を標的にするために使用することができる。
【００２５】
本開示の実施形態は、光免疫療法で使用するための光応答性皮膚アプリケータを含む。皮膚アプリケータは、複数のマイクロニードル（または、ＭＮ）を含む経皮マイクロニードルアレイを含み、各マイクロニードルは、基部部分および先端部分を含む。マイクロニードルは、生物学的障壁に挿入される間、数日間所定の位置に留まる間、および除去される間、インタクトなままであるように機械的強度を有するべきである。一部の実施形態では、マイクロニードルは、少なくともその意図された目的（例えば、免疫原性組成物の送達）を果たすのに十分長く、インタクトなままでなければならない。マイクロニードルは、直線状または先細のシャフトを有することができる。一実施形態では、マイクロニードルの直径はマイクロニードルの基部末端で最大であり、基部から離れた末端の先まで先細りする。マイクロニードルは、直線（先細りしていない）部分および先細の部分を含むシャフトを有するように製作することもできる。針は先細の末端をまったく有さなくてもよく、すなわち、それらは単に鈍いかまたは扁平な先端を有する円柱であってもよい。マイクロニードルは、基板に対して直角であるかまたは斜めであってもよい。一実施形態では、マイクロニードルは基板に対して直角であり、そのため、基板の単位面積につきより大きな密度のマイクロニードルを提供することができる。マイクロニードルのアレイは、マイクロニードルの方向、高さまたは他のパラメータの混合を含むことができる。マイクロニードルは、直角の円形断面を有するシャフトで形成することができるか、または断面は非円形であってもよい。例えば、マイクロニードルの断面は、多角形（例えば、星状、四角、三角）、長方形または別の形状であってもよい。断面寸法は約１μｍ〜約１０００μｍであってもよく、そのため、基部は約１００〜約５００μｍであってもよく、先端は約１μｍ〜約２０μｍであってもよい。一実施形態では、マイクロニードルは基部が概ね３００μｍ、および先端が概ね５μｍであってもよい。マイクロニードルの長さは、約４００μｍ〜１ｍｍを含め、一般的に約１０μｍ〜約１ｍｍである。一実施形態では、マイクロニードルの長さ（または、高さ）は、約８００μｍである。長さは、挿入されるおよび挿入されない部分を考慮して、特定の適用のために選択される。マイクロニードルのアレイは、例えば、様々な長さ、外径、内径、断面形状およびマイクロニードルの間の間隔を有する、マイクロニードルの混合を含むことができる。一実施形態では、マイクロニードルは、先端から先端への間隔が６００μｍである１５×１５アレイで配置される。
【００２６】
本開示の実施形態は、少なくとも１つの腫瘍抗原を含む免疫原性組成物も含む。腫瘍抗原は、対象におけるがん性腫瘍の発生または発達に伴う、合成のまたは天然に存在する任意の抗原または新生抗原を含むことができる。腫瘍抗原の上の抗原エピトープは、公知であるかまたは未同定であってもよい。本開示の免疫原性組成物の中の腫瘍抗原は、新生抗原などの合成腫瘍抗原であってもよいか、または任意のがん、例えば、限定されずに、とりわけ固形腫瘍、例えば、メラノーマ、肺がん（肺腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、大細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、気管支癌、非小細胞癌、小細胞癌、中皮腫を含む）；乳がん（腺管癌、小葉癌、炎症性乳がん、明細胞癌、粘液癌、漿膜窩洞乳癌を含む）；結腸直腸がん（結腸がん、直腸がん、結腸直腸腺癌）；肛門がん；膵臓がん（膵臓の腺癌、島細胞癌、神経内分泌腫瘍を含む）；前立腺がん；前立腺癌；卵巣癌（卵巣の上皮癌または表面の上皮−間質性腫瘍、例えば、漿液腫瘍、子宮内膜性腫瘍および粘液性嚢胞腺癌、性索間質性腫瘍）；肝臓および胆管癌（肝細胞癌、胆管癌、血管腫を含む）；食道癌（食道腺癌および扁平上皮癌を含む）；経口および口咽頭扁平上皮癌；唾液腺腺様嚢胞癌；膀胱がん；膀胱癌；子宮癌（子宮内膜腺癌、眼、子宮乳頭漿液癌、子宮明細胞癌、子宮肉腫、平滑筋肉腫、混合ミュラー腫瘍を含む）；神経膠腫、神経膠芽腫、髄芽細胞腫および脳の他の腫瘍；腎臓がん（腎細胞癌、明細胞癌、ウィルムの腫瘍を含む）；頭頸部がん（扁平上皮細胞癌を含む）；胃がん（胃がん、胃腺癌、消化管間質腫瘍）；精巣がん；胚細胞腫瘍；神経内分泌腫瘍；子宮頸がん；胃腸管、乳房および他の臓器のカルチノイド；印環細胞癌；間葉性腫瘍、例えば、肉腫、線維肉腫、血管腫、血管腫症、血管周囲細胞腫、偽血管腫間質性過形成、筋線維芽細胞腫、線維腫症、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、脂肪腫、血管脂肪腫、顆粒細胞腫瘍、神経線維腫、シュワン細胞腫、血管肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、皮膚、例えば、メラノーマ、頸部、網膜芽細胞腫、頭頸部がん、膵臓、脳、甲状腺、精巣、腎臓、膀胱、軟組織、副腎腺、尿道、ペニスのがん、粘液肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、悪性線維組織球腫、リンパ管肉腫、中皮腫、扁平上皮癌；類表皮癌、悪性皮膚付属器腫瘍、腺癌、肝癌、肝細胞癌、腎細胞癌、副腎腫、胆管癌、移行細胞癌、絨毛癌、精上皮腫、胚的細胞癌、未分化神経膠腫；多形性神経膠芽腫、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、悪性髄膜腫、悪性シュワン細胞腫、神経線維肉腫、副甲状腺癌、甲状腺髄様癌、気管支カルチノイド、褐色細胞腫、島細胞癌、悪性カルチノイド、悪性パラガングリオーマ、メラノーマ、メルケル細胞新生物、葉状嚢肉腫、唾液がん、胸腺癌および膣がんの腫瘍溶解物（または、その任意の抗原成分）に由来してもよい。メラノーマの場合、腫瘍抗原はＢ１６Ｆ１０メラノーマまたはＢＲＡＦｖ６００Ｅメラノーマに由来してもよい。他の場合には、腫瘍抗原は、４Ｔ１乳房腫瘍に由来してもよい。
【００２７】
本開示の実施形態は、感光性の生物学的色素を含む免疫原性組成物を含むこともできる。色素は、特異な色を有する化学物質である。生物学的色素は、対象の体の毎日の活動において不可欠な役割を演ずる。例えば、メラニンは、光エネルギーを吸収してそれを熱として消散させることによって日焼けによる損傷から保護するのを助ける、皮膚の中の黄色から黒色の色素である。メラニンは、ほとんどの生物体において見出される一群の天然色素のための広い用語である。メラニンは、アミノ酸チロシンの酸化と、続く重合によって生成される。メラニン色素は、メラノサイトとして知られる専門化した細胞群において生成される。３種類の基本的なメラニンがある：ユーメラニン、フェオメラニンおよび神経メラニン。最も一般的なタイプはユーメラニンであり、褐色のユーメラニンおよび黒色のユーメラニンの２つのタイプがある。フェオメラニンは、他の色素の間でも赤毛の主な原因であるベンゾチアジン単位の赤色ポリマーを含有するシステインである。神経メラニンは脳において見出されるが、その機能は不明のままである。ヒト皮膚では、メラニン形成は、皮膚を褐色にするＵＶ照射への曝露によって開始される。メラニンは、光の有効な吸収材である；この色素は、吸収したＵＶ照射の９９．９％以上を消散させることができる。この特性のために、メラニンは、皮膚細胞をＵＶＢ照射損傷から保護し、がんのリスクを低減すると考えられ、ＵＶ照射への曝露は悪性メラノーマ、メラノサイト細胞のがんのリスクの増加と関連すると考えられている。
【００２８】
本開示に基づいて当業者が認めるように、メラニンと一緒に、またはその代用として、他の生物学的色素を本開示の免疫原性組成物で使用することもできる。これらの生物学的色素には、限定されずに、ヘム／ポルフィリンベースの色素、例えば、葉緑素、ビリルビン、ヘモシアニン、ヘモグロビン、ミオグロビン；発光色素、例えばルシフェリン；カロテノイド；ヘマトクロム、例えば藻類の色素、カロテノイドおよびそれらの誘導体のミックス；カロテン、例えばアルファおよびベータカロテン、リコペン、ロドプシン；キサントフィル、例えばカンタキサンチン、ゼアキサンチン、ルテイン；タンパク性色素、例えばフィトクローム、フィコビリンタンパク質；ポリエンエノラート；ウロクローム；およびフラボノイドが含まれる。一部の実施形態では、感光性の生物学的色素は、メラニン、カロテノイド、キサントフィル、ビリルビンまたはその組合せの少なくとも１つである。感光性の生物学的色素は、合成、天然またはその組合せであってもよい。
【００２９】
免疫原性組成物に含まれてもよい生物学的色素の量または濃度は、処置する腫瘍の性質、対象の特徴等を非限定的に含む、様々な因子によって異なることができる。一部の場合には、生物学的色素の量は、約０．０１質量％〜約１０質量％であってもよい。一部の場合には、生物学的色素の量は、約０．１質量％〜約１０質量％であってもよい。一部の場合には、生物学的色素の量は、約１質量％〜約１０質量％であってもよい。一部の場合には、生物学的色素の量は、約５．０質量％〜約１０質量％であってもよい。一部の場合には、生物学的色素の量は、約０．１質量％〜約５質量％であってもよい。一部の場合には、生物学的色素の量は、約０．１質量％〜約２．５質量％であってもよい。生物学的色素の保存溶液を調製し、その後希釈してから免疫原性組成物に加えることもできる。一部の場合には、生物学的色素保存溶液は、約２００ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬまたは約５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。これらの保存溶液は、約１：１０００、１：５００、１：２５０、１：１００、１：１０の範囲内の比、および本開示に基づいて当業者によって決定される任意の他の比で希釈することができる。
【００３０】
本開示の実施形態は、免疫刺激剤を含む免疫原性組成物を含むこともできる。免疫刺激剤は、免疫系を刺激する物質である。ワクチンなどの特異的免疫刺激剤は、特異的抗原性タイプへの免疫応答を刺激する。非特異的免疫刺激剤は抗原特異性を有さず、慢性感染症、免疫不全、自己免疫性および新生物疾患において広く使用されている。一部の免疫原性組成物では、アジュバントは、免疫系に抗原を提示し、増幅された抗原特異的免疫応答を導き出す重要な任務を有する免疫刺激剤であると考えることができる。一部の実施形態では、免疫刺激剤には、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣｐＧヌクレオチド、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−１５およびその組合せが含まれる。これらの実施形態により、免疫刺激剤は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージなどを含む様々な免疫細胞を刺激することができる。
【００３１】
一部の実施形態では、免疫刺激剤は、免疫チェックポイント阻害剤を含むことができる。免疫チェックポイントタンパク質を阻害することが知られているいくつかの免疫療法剤がある（免疫チェックポイント阻害剤）。公知の免疫チェックポイントタンパク質には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２、さらにＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭＳ、ＫＩＲが含まれる。ＬＡＧＳ、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ΤΓΜ3およびＫＩＲを含む経路は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１依存性経路と類似の免疫チェックポイント経路を構成すると当技術分野で認識されている（例えば、Pardoll, 2012. Nature Rev Cancer 12:252-264を参照）。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害する任意の化合物である。阻害は、機能の低減および／または完全な遮断を含む。一実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、ヒト免疫チェックポイントタンパク質である。したがって、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ヒト免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤であってもよい。免疫チェックポイントタンパク質は、当技術分野で記載されている（例えば、Pardoll, 2012. Nature Rev. Cancer 12: 252-264を参照）。免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質を特異的に認識する抗体を含むことができる。いくつかのＰＤ１、ＰＤＬ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＴＥＶＩ３およびＫＩＲ阻害剤が公知であり、これらの公知の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤と同様に、本明細書に開示される装置および方法を使用して代替の免疫チェックポイント阻害剤を投与することができる。ＰＤ−１阻害剤の例には、ペムブロリズマブ（旧称ラムブロリズマブ）またはピジリズマブなどのヒトＰＤ−１をブロックするヒト化抗体、ならびにニボルマブ（以前、ＭＤＸ−１１０６またはＢＭＳ−９３６５５８として知られる）などの完全ヒト抗体が限定されずに含まれる。イピリムマブは、Ｙｅｒｖｏｙ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の名称で現在市販されている、完全ヒトＣＴＬＡ−４ブロッキング抗体である。第２のＣＴＬＡ−４阻害剤は、トレメリムマブである。一実施形態では、免疫療法はニボルマブである。さらに、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１をブロックするヒト化または完全ヒト抗体、例えば、ＭＥＤ  １−４７３６、ＭＰＤＬ３２８  ＯＡおよびＭＩＨ１、ならびに他のＰＤ−Ｌ１阻害剤を限定されずに含むことができる。ＰＤ−Ｌ１に対するさらなる抗体には、アテゾリズマブおよびデュルバルマブが含まれる。
【００３２】
本開示の実施形態は、ポリマーマトリックスを使用してマイクロニードルアレイの中に封入されている免疫原性組成物および生物学的色素を含むこともできる。一部の実施形態では、ポリマーマトリックスは、グリコサミノグリカン、ポリ硫酸グリコサミノグリカン、グルコソグリカン、ポリ硫酸グルコソグリカン、グルコサミノグリカン、ムコ多糖、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリＬ−乳酸（ＰＬＡ）、マルトース、キトサン、アルギネート、ならびにその誘導体および組合せの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、ポリマーマトリックスは、ヒアルロン酸を含む。これらの実施形態により、免疫原性組成物および感光性の生物学的色素は複数のマイクロニードルの基部部分の中に封入されていてもよく、免疫刺激剤は複数のマイクロニードルの先端部分の中に封入されており、先端部分は基部部分の遠位にある（図１）。一部の実施形態では、免疫刺激剤は、複数のマイクロニードルの先端部分の中にメタクリル化ヒアルロン酸を架橋することによって封入されている。
【００３３】
本明細書に開示されるＭＮ皮膚アプリケータの一部として、免疫原性組成物は、担体または薬学的に許容される担体を含むこともでき、それには、限定されずに、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳濁液（油／水または水／油乳濁液など）および／または各種の湿潤剤、および／または界面活性剤、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または医薬製剤で使用するための当技術分野で周知である、および本明細書に記載される他の材料を含めることができる。
本開示の実施形態は、対象における免疫応答を刺激するために、光応答性ＭＮ皮膚アプリケータに光エネルギーを送達するための手段も含む。生物学的色素としてのメラニンの使用は、本明細書に記載されるように、ＭＮアプリケータの周囲の微小環境の温度を、例えば約３５℃から約４５℃に、または約３８℃から約４２℃に上昇させるための（高体温）、様々な量の時間および曝露のレジメンのための近赤外（ＮＩＲ）光エネルギーの使用を可能にする。この温度上昇は免疫刺激剤として作用することができ、対象におけるがんの治療および／または予防を促進するためにアプリケータの部位に様々な免疫細胞を動員することができる。
【００３４】
一部の実施形態では、がんの治療および／または予防の方法は、皮膚アプリケータにＮＩＲ光、ＵＶ光、または約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長の光を送達することを含む。一部の場合には、皮膚アプリケータに約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍの光が送達される。一部の場合には、皮膚アプリケータに約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍの光が送達される。一部の場合には、皮膚アプリケータに約３００ｎｍ〜約１０００ｎｍの光が送達される。一部の場合には、皮膚アプリケータに約４００ｎｍ〜約１０００ｎｍの光が送達される。一部の場合には、皮膚アプリケータに約５００ｎｍ〜約１０００ｎｍの光が送達される。一部の場合には、皮膚アプリケータに約８００ｎｍ〜約９００ｎｍの光が送達される。一部の場合には、ＮＩＲ光は、約８０８ｎｍで皮膚アプリケータに送達される。特定の処置レジメンは、例えば、対象の必要性、腫瘍のタイプ等に基づいて異なるが、皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達は、ＮＩＲ光を約５分〜約２０分の間送達することを含むことができる。一部の実施形態では、皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達は、ＮＩＲ光を約１日から約５日連続で１日に少なくとも１回送達することを含む。他の実施形態では、がんの治療および／または予防の方法は、約１日から約５日連続で光エネルギーを１日に複数回送達することを含む。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例は、開示される方法の例示である。本開示に照らして、当業者は、これらの実施例の変形体および開示される方法の他の実施例が過度の実験なしで可能であろうことを認める。
【００３６】
（実施例１）
光免疫療法で使用するための光応答性皮膚アプリケータの調製および特徴付け
１番目に、腫瘍溶解物を経皮ＭＮアプリケータに詰めてそこから持続的に放出することができるかどうかについて調査した。全腫瘍溶解物（メラニンと一緒に）および免疫刺激剤、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を封入するヒアルロン酸ベースのＭＮを形成するために、ＭＮアプリケータをマイクロモールドの中で製作した。腫瘍溶解物ありまたはなしのアプリケータを、それぞれ軸方向および横方向の観点から示す（図１Ｂ）。１５×１５ＭＮのアレイは、中心から中心の間隔が６００μｍの９×９ｍｍ2アプリケータパッチの上にアセンブルされた。ＭＮの詳細な寸法は、走査電子顕微鏡法によって可視化した（図１Ｃ）。各ＭＮは、基部の直径が３００μｍ、高さが８００μｍ、および半径５μｍの湾曲に先細りする鋭い先端を有する円錐構造を有していた。腫瘍溶解物を詰めた後、アプリケータパッチの中のメラニンの存在のために、ＭＮの外観はブランクのヒアルロン酸ＭＮよりかなり暗色であった。メラニンの量は、アプリケータパッチにつきおよそ５０μｇであったが、それは、単一投与の安全な投薬量範囲内である。代表的なＭＮは、腫瘍溶解物を封入するローダミン標識ヒアルロン酸で構築され、アクチンフィラメントおよびＤＮＡはそれぞれファロイジンおよびＨｏｅｃｈｓｔで染色された（図１Ｄ）。アレイの蛍光像は、腫瘍溶解物の均一な添加およびＭＮの整列をさらに示した（図１Ｅ）。ＭＮは、その高さの四分の一に圧縮される０．３９Ｎの歪み試験の失敗に耐え（図８）、湾曲なしで可能な皮膚挿入のために十分な強度を実証した。
【００３７】
次に、メラニン誘導発熱に及ぼすＮＩＲレーザー照射の影響を評価した。赤外線サーマルカメラを使用して、ＭＮの温度変動をリアルタイムで記録した（図２Ａ）。透明なヒアルロン酸ＭＮと比較して、腫瘍溶解物を添加したＭＮの表面温度は、メラニンによって誘導された光から熱への変換のために１分以内に劇的に増加した（図２Ｂ）。メラニンの吸収スペクトルによって実証される通り、腫瘍溶解物に含有されるメラニンによって８０８ｎｍのＮＩＲ照射を吸収することができた（図９Ａ）。腫瘍溶解物中のメラニン含量の吸収係数も、合成メラニンのそれと同等だった（図９Ａおよび表１）。温度上昇にもかかわらず、ＭＮの形態は不変に保たれ、メラニンの輻射熱特性は処置の間安定したままだった（図９Ｂ）。反復ＮＩＲ光曝露を実行したときも、ＭＮアプリケータの加熱行動が維持された（図１０）。さらに、アプリケータの表面温度の定常状態は、溶解物濃度およびＮＩＲ光強度に依存性であったが、ＭＮ裏張りの厚さの影響は最小限であった（図１１および図２Ｃ）。腫瘍抗原および他の生体分子の潜在的な熱誘導変性を最小にするために、アプリケータの表面温度は高体温（４２℃）の下に容易に制御することができた。
【表１】
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【００３８】
（実施例２）
ＭＮワクチンに応答したＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化
ＤＣ動員および活性化のための強力なサイトカインの役目をするＧＭ−ＣＳＦは、紫外線照射の後にメタクリル化ヒアルロン酸を架橋することによってＭＮの先端に物理的に封入された。生体活性ＧＭ−ＣＳＦの６０％が４８時間以内にＭＮから放出されるが（図１２Ａ−１２Ｂ）、腫瘍溶解物タンパク質の持続的放出は５日以上観察されることが判明した（図２Ｄ）。ＮＩＲ処置の組込みは、ＧＭ−ＣＳＦおよび腫瘍溶解物の放出プロファイルを変化させなかった（図１２Ｃ−１２Ｄ）。ワクチンＭＮの走査電子顕微鏡法像は、経時的な先端の段階的解離を示した（図１３）。
【００３９】
ＭＮ中のＧＭ−ＣＳＦがＤＣ成熟を効率的に促進することができるシグナル伝達合図を提供したかどうか評価するために、骨髄由来のＤＣをＭＮ懸濁液に曝露させた。腫瘍溶解物およびＧＭ−ＣＳＦ添加ＭＮと１０分間のＮＩＲレーザー照射による処置の後に、成熟ＤＣ（ＣＤ８０＋ＣＤ８６＋）の百分率は３６．７±２．３％から４８．９±３．１％に実質的に増加した（図２Ｅ）。ＤＣの活性化に及ぼす様々なＮＩＲレーザー照射時間の影響も測定した。１０分間のＮＩＲ照射は、５分または１５分間で処置した試料と比較して、最適なＤＣ活性化を可能にした（図２Ｅ）。２０分間のＮＩＲ曝露だけが、ＤＣの生存率および機能をわずかに損ねた（図１４）。ＭＮ懸濁液または１０分間のＮＩＲ照射の全ての他の実験条件におけるＤＣは、高い生存率を示した（図２Ｆ−２Ｇおよび図１５）。
【００４０】
（実施例３）
ＮＩＲの後のＭＮ媒介免疫化のｉｎ  ｖｉｖｏ効能
ＭＮベースの免疫化のｉｎｖｉｖｏ効能を特徴付けるために、１．５ｍｇの抽出タンパク質を含有するＢ１６Ｆ１０全腫瘍溶解物を加えた光応答性ＭＮアプリケータで、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを経皮的に処置した。ＮＩＲ照射および以降の腫瘍チャレンジの後に、免疫応答の大きさおよび持続期間を測定した（図３Ａ）。ＭＮアプリケータを尾部背側領域のマウス皮膚に概ね１０分間適用し、Ｓｋｉｎ  Ａｆｆｉｘ外科用接着剤を使用してさらに固定した。トリパンブルーおよびヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）による染色は、切除した皮膚におけるＭＮの良好な透過を示した（図１６）。経皮アプリケータは、少なくとも５日間、皮膚に停留した（図３Ｂ）。次に、５日間、ＭＮ領域に局所ＮＩＲ照射を１日に１０分間送達した（ＭＮ＋ＮＩＲ）。対照マウスは、ＮＩＲ照射なしのＭＮアプリケータ（ＭＮ）、メラニンだけを加えたＭＮアプリケータ（メラニン）またはＮＩＲ照射とヒアルロン酸だけを含有するＭＮ（ブランク）によって処置した。
【００４１】
ワクチンＭＮの挿入の後の領域性皮膚表面の温度変化を、赤外線サーマルカメラを使用してリアルタイムで記録した。ＮＩＲ照射の後の光から熱への変換は、ワクチンＭＮで処置したマウスで観察される局所の加熱作用を引き起こした（図３Ｃ）。アプリケータの中のメラニンは、３０秒以内に３８℃〜４２℃の温度の経皮加熱を媒介した。合成メラニン添加ＭＮで処置したマウスにおいて、局所の処置部位で軽度の高体温が同様に観察された（図１７Ａ）。対照的に、ブランクＭＮおよびＮＩＲで処置したマウス、ならびに添加ＭＮを植え込んだがＮＩＲなしのマウスは、３３〜３６℃の正常範囲内の皮膚表面温度の限定的な変動を示した（図３Ｃ）。
【００４２】
予防的マウスモデルでは、ワクチン接種の１０日後にＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞をマウスに植え込んだ（図３Ｄ）。ブランクＭＮで処置した全てのマウスは腫瘍細胞接種から１５日以内にかなりの腫瘍増殖を有し、２５日目までに安楽死が必要であった。メラニンを加え、ＮＩＲ照射で処置したＭＮは、マウスの生存をわずかに向上させ、一部のマウスは２５日目まで生き延びた（図１７Ｂ−１７Ｃ）。同様に、腫瘍溶解物およびメラニンを加えたが、ＮＩＲ照射なしのＭＮは、３０日目までマウスの１３％において腫瘍防御をもたらした（図３Ｅ−３Ｆ）。極めて対照的に、組み合わせたもの（腫瘍溶解物およびＧＭ−ＣＳＦおよびＮＩＲ照射を付加したＭＮ）を受けたマウスは長期生存を示し、処置マウスの８７％において完全な腫瘍排除があった（図３Ｅ−３Ｆおよび図１８）。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマを有するマウスの生物発光イメージングは、腫瘍増殖のかなりの阻害を確認した（図３Ｇおよび図１９）。これは、腫瘍質量の測定（図２０）および組織学的分析（図２１Ａ）によってさらに立証された。
【００４３】
組み合わせた免疫組成物ベースの処置によって観察された抗腫瘍作用のための免疫細胞の必要条件も、調査した。ジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）マウスにおけるＣＤ１１ｃ＋ＤＣの消失は、ＭＮ免疫組成物の抗腫瘍作用を抑止するのに十分だった（図３Ｅ−３Ｆ）。ＴおよびＢ細胞が欠損したＲａｇ１−／−マウスにおけるデータは、組み合わせたワクチン接種による処置の間、腫瘍増殖抑制のかなりの減少を示した（図１８）。組合せＭＮワクチン接種の前のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の選択的消失も、研究した。ＣＤ８＋Ｔリンパ球の排除は、ブランク対照と比較して有意な腫瘍退行を示さなかった（図２２）。抗ＣＤ４抗体をマウスに与えたとき、対照と比較して腫瘍サイズの減少（Ｐ＜０．０１）があり、抗腫瘍応答に関してＣＤ８  Ｔ細胞より少ない程度でＣＤ４  Ｔ細胞の有益性を示唆した（図２２）。Ｂ細胞およびＮＫ細胞の消失も、免疫応答に有害な影響を及ぼしたが、腫瘍チャレンジに対するワクチン接種効果を低減しなかった（図２２）。全体として、これらの結果は、ＭＮワクチン接種がＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞などの他の免疫細胞と関連することを示した。
【００４４】
ＭＮにおけるＧＭ−ＣＳＦの添加は、ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋、活性化（ＰＩＲ）−Ａ／Ｂ＋の対形成Ｉｇ様受容体）の局所動員において重要な役割を演じた（図４Ａ−４Ｃ）。組合せワクチン接種の３日後に、ブランクＭＮで処置したマウスと比較して、蓄積されたＤＣの５．９倍の増加が皮膚断面で観察された。ＮＩＲは、ＤＣの動員に対するＧＭ−ＣＳＦ添加ＭＮの作用をさらに増強した（図４Ｃ）。ＮＫ細胞の局在化の増加も、観察された（図４Ｂ−４Ｄ）。さらに、ＮＩＲおよびＭＮ処置の後に観察された局所の微小循環血液かん流の増加は、免疫細胞の遊走の増強に寄与することができた（表２および図２３）。処置後のＴ細胞による腫瘍浸潤は、腫瘍接種の１５日目にフローサイトメトリーによって分析した。対照マウスと比較して組合せワクチン接種を受けたマウスにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞の概ね９．８倍の増加が観察されたが、ＭＮだけの群は５．８倍の増加を示した（図５Ａ）。さらに、Ｈ−２Ｄｂ  ｇｐ１００四量体による染色は、処置マウスの腫瘍においてＢ１６Ｆ１０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を同定した。四量体陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、免疫化を欠いている対照マウスと比較してＭＮ処置マウスにおいてより大きいことが見出された（図２４）。組合せ処置またはＭＮのみの処置によるマウスは、対照マウスと比較して領域性皮膚における活性化ＤＣ（ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋）のそれぞれ１．５倍および１．３倍の増加を示した（図５Ｂ）。免疫蛍光染色およびｉｎ  ｓｉｔｕ細胞アポトーシスは、フローサイトメトリーで得られた結果を確認した（図５Ｃおよび図２１Ｂ）。局所の免疫活性化は、全身性免疫応答と関連していた。ブランク対照で処置したマウスと比較して、免疫化マウスの血清においてＩｇＧ力価の８倍の増加が測定された（図５Ｄ）。対照群と比較して、ＮＩＲ処置は１５日目までにＩｇＧ力価のさらなる増加、および長期にわたる免疫応答を促進した（図２５）。脾細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は、組合せワクチン接種を受けたマウスにおける、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍溶解物に応答するＴ細胞の１０倍より高い頻度を明らかにした（図５Ｅ）。
【００４５】
【表２】
2021501148.tif 000004
【００４６】
光から熱への変換が危険シグナルおよび炎症誘発性サイトカインの生成を誘導したことを調べるために、我々はＭＮ処置周囲組織におけるＲＯＳの局所レベルをフローサイトメトリーによって先ず測定した。組合せ処置を受けたマウスからの試料は、未処置の群と比較してＲＯＳレベルの概ね４倍の増加を示したが、ＭＮ対照と比較してＮＩＲ照射の後に１．５倍の増加が観察された（図２６）。危険シグナルの誘発と並んで、組合せワクチン接種は、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０の発現を引き起こした（図５Ｆおよび図２７）。局所組織からの危険シグナルおよび抗原性分子は、炎症誘発性サイトカインの生成を促進する。この作用と一貫して、ＭＮ対照と比較して組合せワクチン接種で処置したマウスにおいて、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）の局所の増加が見出された（図５Ｇおよび図２８）。
【００４７】
（実施例４）
離れた腫瘍における光応答性ＭＮアプリケータの効能
局所ワクチン接種がＮＩＲおよびＭＮ処置部位から離れている二次性の腫瘍に対する防御を付与するかどうかについてさらに分析した（図６Ａ）。両側性の腫瘍を有するＢ１６Ｆ１０マウスの左側の腫瘍だけで、局所ＮＩＲ照射およびＭＮ処置を実行した。右側の腫瘍は注射されず、遮光された（図６Ｂ）。組合せワクチン接種を有したマウスの両側で、腫瘍サイズおよび生物発光シグナルが有意に低下することが観察された（図６Ｃ−６Ｇ）。一方、領域性リンパ節における活性化ＤＣの著しい増加（図５Ｂ）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける脾細胞のＢ１６Ｆ１０細胞への強化された細胞傷害性応答（図５Ｅ）は、経皮免疫療法によって全身性抗腫瘍作用を達成することができることを全て示した。この作用は、対照と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の５倍の増加と並行し、それは、抗腫瘍効能のための免疫細胞の役割と一貫していた（図６Ｄ）。組合せ処置のマウスの肺で、遠隔転移は観察されなかった（図２９）。体重測定は、処置マウスが正常範囲の中で体重が増加したことを示した（図６Ｈ）。マウスを異なるメラノーマ細胞型（ＢＲＡＦＶ６００ＥＰＴＥＮ−／−Ｄｕｋｅ−クローン６細胞系（ＢＰ））の腫瘍溶解物でワクチン接種をしたとき、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍増殖の最小限の変化が観察され（図６Ｉ）、免疫学的記憶の特異性を示した。同様に、ワクチン接種マウスをＢ１６Ｆ１０細胞またはＢＰ細胞で再チャレンジしたとき、Ｂ１６Ｆ１０でチャレンジしたマウスだけで腫瘍防御が観察された（図６Ｊ−６Ｋおよび図３０）。
【００４８】
（実施例５）
他の腫瘍モデルにおける光応答性ＭＮアプリケータの効能
提案されるワクチン接種の効力が、メラニン形成の上方制御があるＢ１６メラノーマモデルに限定されていないことを実証するために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異ＢＰメラノーマ、およびＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおける三重陰性乳がん４Ｔ１癌腫腫瘍を利用した。合成メラニン（吸光分光分析によって定量化したのと同じ量の色素；表１）および腫瘍溶解物を加えたＭＮの研究は類似の高体温作用を示し、組合せワクチン接種による免疫応答を有意に強化した（図３１）。腫瘍退行および長期生存も、達成された。重要なことに、組合せアプローチによるワクチン接種は、マウスの７５％および８７％をそれぞれＢＰおよび４Ｔ１移植に抵抗性にした（図７Ａ−７Ｂおよび図３２）。担がんマウスでは、ＢＰおよび４Ｔ１細胞をそれぞれ移植したマウスの８７％および３７％において、ＭＮおよびＮＩＲ処置は完全寛解を誘導した（図７Ｃ−７Ｄおよび図３２）。ＭＮ単独と比較して組合せワクチン接種の後、局所のＨＳＰ７０発現の分析は、ＢＰにおける２．５倍の増加および４Ｔ１モデルにおける４倍の増加を示した（図３３）。炎症誘発性サイトカインの生成も組合せ処置によって誘導され、強化されたＤＣ活性化をもたらした（図３４および図３５）。処置は良好な耐容性を示し、体重減少も遠隔転移の臨床徴候も引き起こさなかった（図３６および図３７）。
【００４９】
材料および方法
試験計画。本開示は、がんワクチンベースの免疫療法に及ぼすメラニン媒介経皮アプリケータパッチの作用を調査した。メラニンを含有するＢ１６Ｆ１０全腫瘍溶解物を、がんワクチンの制御放出を可能にするマイクロニードルアプリケータパッチに組み入れた。アプリケータパッチへのＮＩＲ光照射の後、免疫応答の増強に及ぼす局所加熱の影響を評価した。マウス対象をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）から購入し、計量し、異なる実験群にランダムに分けた。サンプリングおよび実験の反復数は、各図の説明に含まれた。
【００５０】
ＭＮの調製および特徴付け。全てのＭＮはシリコーン型を使用して調製し、円錐形の穴のアレイはレーザーアブレーション（Ｂｌｕｅａｃｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）によって加工した。各ＭＮは、８００μｍの高さに先細りしておよそ５μｍの先端半径を有する、３００μｍ×３００μｍの丸い基部を有していた。ＭＮは、中心から中心への間隔が６００μｍである１５×１５アレイで配置された。各シリコーン製のマイクロモールド表面にＧＭ−ＣＳＦ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、最終体積１０μＬ）をピペットで置き、続いて５分間の真空（６００ｍｍＨｇ）条件によって溶液を窩洞に流れ込ませることによって直接沈着させた。その後、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（２．０質量％）および光重合開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９；０．０５質量％）と混合した０．２ｍＬの４．０質量％のメタクリル化ヒアルロン酸溶液を各シリコーン製のマイクロモールド表面にピペットで置き、続いて５分間の真空（６００ｍｍＨｇ）条件によって直接沈着させた。ＧＭ−ＣＳＦ層は１０秒間の紫外線照射（波長：３６５ｎｍ）を通して架橋され、４ｃｍ×９ｃｍの銀接着テープを２ｃｍ×２ｃｍのマイクロモールド底板の周囲に張った。４．０質量％の混合メタクリル化ヒアルロン酸溶液中の３ｍＬの均質化Ｂ１６Ｆ１０腫瘍溶解物（１．５ｍｇの抽出された腫瘍溶解物タンパク質を含有する）を、調製したマイクロモールドレザバーに加えた。ヒアルロン酸溶液は、腫瘍タンパク質の約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲内の異なる濃度と一緒に使用した。タンパク質濃度は、ＭＮ製作前にＴ−ＰＥＲ抽出試薬およびブラッドフォードアッセイを使用して、腫瘍溶解物上清中の抽出されたタンパク含有量を測定することによって定量化した。ＢＰまたは４Ｔ１腫瘍溶解物添加ＭＮのために、ＭＮマトリックスを製作するために、腫瘍溶解物を有する４．０質量％の混合メタクリル化ヒアルロン酸溶液（１．５ｍｇの抽出腫瘍溶解物タンパク質を含有する、最終体積３．０ｍＬ）に、５０μｇのメラニンを溶解した。腫瘍溶解物のないブランクＭＮのために、混合メタクリル化ヒアルロン酸を腫瘍溶解物なしで使用した。メラニン添加ＭＮのために、ＭＮマトリックスを製作するために、４．０質量％の混合メタクリル化ヒアルロン酸溶液に５０μｇのメラニンを溶解した。１．０Ｍ水酸化ナトリウムにメラニンを溶解し、９９℃に１０分間加熱することによって、保存用１００ｍｇ／ｍＬメラニン溶液を調製した。最終製剤は、減圧デシケーターの中で２５℃で一晩乾燥させた。乾燥が完了した後、針アレイをシリコーン型から注意深く分離し、紫外線照射を通して架橋させた。針基部は、四角形に仕立てた。蛍光性ＭＮは、ファロイジン標識腫瘍溶解物およびローダミンＢまたはＣｙ５．５標識ヒアルロン酸で製作した。ＭＮの形態は、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、金／パラジウムによるスパッタコーティングの後に２０ｋＶで作動するＦＥＩ  Ｖｅｒｉｏｓ  ４６０Ｌ電界放出走査電子顕微鏡で特徴付けた。ＭＮの横断切片は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＨＮ５２５ＮＸクリオスタットを使用して５μｍのスライドを切断して得られ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８または６６０−ファロイジンおよびＨｏｅｃｈｓｔによって染色した。ＭＮの蛍光像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０多重パラメータ蛍光顕微鏡によって撮影した。
【００５１】
ＭＮのＮＩＲ応答特性。ＮＩＲ光照射に応答した光応答性ＭＮアプリケータの特性を評価するために、試料を８０８ｎｍのＮＩＲレーザー光で照射した。ダイオード赤外線レーザーモジュール（Ｏｐｔｏ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＬＬＣ、ＭＤＬ−Ｎ−８０８）は、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＣ州）Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃｅｎｔｅｒのレーザー安全性職員に承認された。ＭＮアプリケータは、針先端を下向きにして白色の紙の上に置いた。支持棒およびクランプを備えたプレートスタンドを使用して、レーザーワイヤを所定の位置に固定した。アプリケータとスポット光の間の距離は１０ｃｍに固定し、スポットサイズは約１ｃｍ2であった。ダイオード赤外線レーザーモジュールの出力エネルギーは１．０Ｗ以内に調整し、１．０ワット／ｃｍ2（８０８ｎｍ）（Ｗ／ｃｍ2）の単位面積あたりの強度（Ｅ＝Ｉ／ｄ2）に導いた。ＮＩＲ光は、必要に応じて連続的にまたは断続的に照射した。熱撮影装置（ＦＬＩＲ  Ｅ４）および非接触赤外線温度計ガン（Ｌｅｅｇｏａｌ）を使用してＭＮアプリケータの裏張りの表面温度変化を記録し、最高温度を４２℃未満にリアルタイムで制御した。断続的な照射のために、ＭＮを１．０Ｗ／ｃｍ2のレーザーに繰り返し曝露させ、局所温度は１分の間概ね４２℃に到達した。その後、レーザーを１分間オフにした。反復ＮＩＲ照射の下でのＭＮアレイアプリケータの応答性行動を調査するために、このサイクルを４回繰り返した。連続照射のために、異なるパラメータの試料を試験した。異なるタンパク質濃度の腫瘍溶解物を加えたＭＮまたはヒアルロン酸を有するブランクＭＮで、光応答性行動に及ぼすメラニン含有量の影響を試験した。１．０Ｗ／ｃｍ2での連続ＮＩＲ照射の下で、代表的ＭＮの定量的な表面温度変化を記録した。別個の実験では、レーザー出力フラックスを制御した。２分間の連続的ＮＩＲ曝露の間、ＭＮ表面の最高温度を記録し、プロットした。１．０Ｗ／ｃｍ2の連続的ＮＩＲ照射により、光応答性行動に及ぼすＭＮ裏張り厚さの影響をＭＮで試験した。ＭＮアプリケータの厚さはディジマチック指示計（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  Ｃｏｒｐ．ＩＤ−Ｃ１１２Ｅシリーズ５４３）を使用して測定し、平均値は１８１μｍ、標準偏差は１２．５μｍであった。異なる裏張り厚さのＭＮアプリケータ試料を使用した：１６９μｍ、１７５μｍ、１７９μｍ、１８１μｍおよび２０２μｍ。
【００５２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＣ活性化。１０％ウシ胎児増殖血清を含有する完全ＲＰＭＩ  １６４０培地によって大腿骨および脛骨を洗い流すことによって、骨髄を収集した。赤血球の溶解後（溶解溶液、Ｃｗｂｉｏｔｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよび５０μＭのベータメルカプトエタノール（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含有する３．０ｍＬの培地によって、６ウェル培養皿に１×１０6個の骨髄細胞を播種した。３日目に、ＧＭ−ＣＳＦを有する同じ培地のさらなる４．０ｍＬをプレートに加えた。６日目に、培養上清の半分を収集し、遠心分離した。細胞をＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、元のプレートに戻した。７日目に、非接着細胞を収集し、さらなる研究使用のための骨髄由来ＤＣとして使用した。別のマウスＤＣ細胞系ＪＡＷＳ  ＩＩ細胞を、５ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを補充した最少必須培地イーグルアルファ改変（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）で培養した。ＤＣは刺激しなかったか、または１００μｇ／ｍＬのブランクＭＮもしくは腫瘍溶解物添加ＭＮ放出培地もしくは１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）によって１２時間刺激した。刺激の後、細胞をそれぞれ０、５、１０、１５、２０分間、１０ｃｍの距離で１．０Ｗ／ｃｍ2のＮＩＲ照射に曝露させた。４時間の細胞インキュベーションの後、上清を収集し、ＩＬ−１２  ｐ７０マウスＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ＭＣ０１２１）によって測定した。細胞を洗浄し、生死アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｌ３２２４）、ＣＤ８０＋およびＣＤ８６＋成熟マーカー特異的抗体で染色し、その後、共焦点顕微鏡検査およびフローサイトメーターによって分析した。ＤＣ活性化の特徴付けのために、骨髄由来ＤＣ細胞およびＪＡＷＳ  ＩＩ細胞系を使用した。生／死アッセイイメージングデータは、ＪＡＷＳ  ＩＩ細胞系から得られた。
【００５３】
マウスおよびｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍モデル。雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＢＡＬＢ／ｃＪマウス、ＣＤ１１ｃジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）トランスジェニックマウス（Ｂ６．ＦＶＢ−Ｔｇ（Ｉｔｇａｘ−ＤＴＲ／ＥＧＦＰ）５７Ｌａｎ／Ｊ；保存液番号００４５０９）、Ｒａｇ１−／−ノックアウトマウス（Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ／Ｊ；保存液番号００２２１６）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂから購入した。マウスを計量し、異なる群にランダムに分けた。０日目に、腫瘍溶解物およびＧＭ−ＣＳＦを加えたＭＮ、腫瘍溶解物なしで合成メラニンを加えたブランクＭＮ、またはヒアルロン酸だけを含有するブランクＭＮ（ブランク）で、健康なマウスを処置した。ＭＮアプリケータを尾部背側領域の皮膚に概ね１０分間適用し、Ｓｋｉｎ  Ａｆｆｉｘ外科用接着剤（Ｍｅｄｌｉｎｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してさらに固定した。ＭＮの注射の後、免疫化の後に５日連続で毎日１０分間、ＮＩＲ照射を局所的なＭＮ領域で実行した（ＭＮ＋ＮＩＲ）。８０８ｎｍのダイオード赤外線レーザーモジュール（Ｏｐｔｏ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＬＬＣ、ＭＤＬ−Ｎ−８０８）は、ＮＣ州Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃｅｎｔｅｒのレーザー安全性職員に承認された。対照群のマウスは、ＮＩＲ照射なしのワクチンＭＮ（ＭＮ）、腫瘍溶解物なしのＮＩＲ照射ありの合成メラニンを加えたブランクＭＮ（メラニン）、またはＮＩＲ照射ありのヒアルロン酸だけを含有するブランクＭＮ（ブランク）によって処置した。熱撮影装置（ＦＬＩＲ  Ｅ４）および非接触赤外線温度計ガン（Ｌｅｅｇｏａｌ）を使用して領域性皮膚の表面温度変化を記録し、４２℃未満にリアルタイムで制御した。１０日目に、２５μＬのＰＢＳ中の１×１０6個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞系を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＣＤ１１ｃ−ＤＴＲトランスジェニックマウスおよびＲａｇ１−／−ノックアウトマウスの脇腹に皮下移植した。最初の腫瘍接種の８０日後に、腫瘍なしのマウスを２５μＬのＰＢＳ中の１×１０6個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞で再チャレンジした。消失抗体研究のために、マウスモデルにおいて特異的Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞集団を消失させた。２００μＬのＰＢＳに溶解させた、マウス胸腺または脾臓から精製された抗体の２００μｇを、マウスに腹腔内投与した。ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＬＥＡＦ  １００４３５）およびＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＬＥＡＦ  １００７３５）、ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＬＥＡＦ  １５２４０２）およびＮＫ−１．１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＬＥＡＦ  １０８７１２）に対する抗体を、腫瘍接種の１週前に開始して３週にわたって週２回投与した。消失は、脾臓懸濁液のフローサイトメトリーによって確認された。別のメラノーマモデルのために、２５μＬのＰＢＳ中の１×１０6個のＢＰ腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脇腹に皮下移植した。癌腫腫瘍モデルのために、２５μＬのＰＢＳ中の１×１０6個の４Ｔ１腫瘍細胞を、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの脇腹に皮下移植した。実験的な転移モデルのために、１×１０5個の腫瘍細胞を、尾静脈を通してマウスに静脈内注入した。別のセットの実験では、０日目に腫瘍細胞をマウスの脇腹に皮下移植した。腫瘍体積が３日目におよそ５０ｍｍ3に到達したときに、担がんマウスを計量し、ランダムに４群に分けた。その後、腫瘍溶解物およびＧＭ−ＣＳＦを加えた無菌のＭＮ（ＭＮ）またはヒアルロン酸だけを含有するブランクＭＮ（ブランク）を、マウスの腫瘍周囲に投与した。その後、３日目から７日目までの続く５日間の間、ＮＩＲ光をＭＮアプリケータの上に１０分間照射した。腫瘍増殖はデジタル式ノギスによって測定したか、またはルシフェラーゼ標識細胞の生物発光シグナルによってモニタリングした。腫瘍体積（ｍｍ3）は、１／２×長径×（短径）2で計算した。
【００５４】
潜在的毒性を調査するために、マウスを体重減少について毎日モニタリングした。標準手順（ＮＣ州のＣｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＨｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に従って、マウスから収集した臓器でＨ＆Ｅ染色を実行した。肺を切除し、肉眼的に可視的な転移を数えた。切除した原発性腫瘍を免疫蛍光染色のために−２０℃で保存したか、または以降の分析のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【００５５】
ＤＣサブセット、Ｔ細胞およびサイトカインの同定。使用した抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＢｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．から購入した。ＣＤ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１８６４４）、ＣＤ４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１８６６７）、ＣＤ８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１８６０９）、ＣＤ１１ｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１１７３０９）、ＣＤ４９ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０８９０９）、ＣＤ８０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０４７０７）、ＣＤ８６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０５００７）、ＰＩＲ−Ａ／Ｂ（ｇｐ９１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１４４１０３）、四量体（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｈ−２Ｄｂ  ｇｐ１００  ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ−Ｐ）および蛍光発生ＣｅｌｌＲＯＸ（商標）深紅試薬（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃ１０４２２）を含む染色抗体をＦＡＣＳのために使用し、製造業者の説明書に従って分析した。臓器（皮膚、腫瘍、リンパ節、脾臓）を採収し、ハサミまたはメスの刃を使用して２〜４ｍｍの小片に刻んだ。細胞染色緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４２０２０１）の中で、単一細胞懸濁液を調製した。所定の最適な濃度のＣｅｌｌＲＯＸ試薬を細胞に加え、ＲＯＳ検出のために暗所で２０〜３０分間、氷上でインキュベートした。関連する四量体ＰＥを暗所で３０分間、室温で染色し、その後、適切にコンジュゲートした蛍光抗体によってさらに染色した。染色された細胞は、Ｃａｌｉｂｕｒ  ＦＡＣＳ機器（ＢＤ）で分析し、ｆｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。ＭＮワクチン部位で異なるサイトカインの濃度を判定するために、アプリケータおよび隣接組織を切除し、組織タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で消化した。抽出されたアプリケータの中のサイトカイン濃度は、製造業者の説明書に従って、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）ビーズベース免疫測定で分析した。
【００５６】
統計分析。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（６．０）を使用して評価した。統計分析は、対応のあるスチューデントｔ検定およびＡＮＯＶＡで実行した。カプラン−マイアー曲線のためのＰ値は、ログランク検定で計算した。０．０５以下のＰ値は、有意であると考えられた。
研究の承認。全てのマウス研究は、Ｃｈａｐｅｌ  ＨｉｌｌのＮｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  ＣａｒｏｌｉｎａのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された動物プロトコールに従って実行された。
【００５７】
細胞培養。マウスメラノーマ細胞系Ｂ１６Ｆ１０およびマウス乳癌細胞系４Ｔ１は、アメリカ基準株保存機構から購入した。Ｂ１６Ｆ１０−ｌｕｃおよびＢＲＡＦＶ６００ＥＰＴＥＮ−／−（ＢＰ）（ＤｕｋｅのＢｒｅｎｔ  Ａ．Ｈａｎｋｓ博士のラボによって作製された）細胞は、Ｃｈａｐｅｌ  ＨｉｌｌのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  ＣａｒｏｌｉｎａのＬｅａｆ  Ｈｕａｎｇ博士から得られた。Ｂ１６Ｆ１０細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持した。４Ｔ１およびＢＰ細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持した。細胞は、５％ＣＯ2および９０％相対湿度の環境下で３７℃のインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中で培養し、０．２５質量％トリプシンを１：３の分割比で使用して、８０％の集密度で概ね３日おきに継代培養した。
【００５８】
腫瘍溶解物のタンパク質およびメラニンの定量化。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマを有するマウスから、原発腫瘍を収集した。腫瘍溶解物タンパク質の定量化のために、３ｍＬのＴ−ＰＥＲ組織タンパク質抽出試薬を１．５ｇの腫瘍組織に加え、超音波処理を使用してホモジナイズした。氷上で２時間のインキュベーションの後、溶解物を４℃の１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して組織デブリをペレット化し、結果として生じた上清のタンパク質濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（商標）（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイキットを使用して判定した。メラニンの定量化のために、ホモジナイズした腫瘍組織を１Ｍ水酸化ナトリウムに再懸濁させ、９９℃に１０分間加熱した。メラニン濃度は、４７５ｎｍで吸光度を測定し、標準曲線に基づいて計算することによって決定した。マイクロニードル（ＭＮ）の調製のために、３ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）培地緩衝液を１．５ｇの腫瘍組織に加え、超音波処理によってホモジナイズした。
【００５９】
機械的強度試験。応力歪ゲージによるマイクロニードルの機械的強度は、ＭＴＳ  ３０Ｇ引張試験機の上でＭＮに対してステンレス鋼板をプレスすることによって判定した。初期ゲージは、ＭＮの先端とプレートの間で２．００ｍｍであり、ロードセルキャパシティーは１０．００Ｎであった。ＭＮに接近するプレートの速度は、０．１ｍｍ／秒に設定した。ＭＮの破綻力は、針が曲がり始めるときの力として記録した。
皮膚透過試験。ＭＮの皮膚透過能力を評価するために、それらをマウスの皮膚に１０分間挿入した。マウスを安楽死させ、皮膚試料を１０分間トリパンブルーで染色してから、光学式顕微鏡検査（Ｌｅｉｃａ  ＥＺ４  Ｄ立体顕微鏡）によってイメージングした。別個の実験では、皮膚試料をヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した（ＮＣ州Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＨｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【００６０】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）放出プロファイル。ＭＮから放出されるＧＭ−ＣＳＦの量は、製造業者のプロトコールに従ってＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅマウスＧＭ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡキット）によって検出した。中程度の振盪下で３７℃のＰＢＳ培地緩衝液にＭＮの先端を浸漬することによって、ＭＮからのＧＭ−ＣＳＦの放出をモニタリングした。近赤外（ＮＩＲ）照射は、３日間にわたって１日につき１０分間、ＭＮに対して実行された。所定の時点で、培地の１００μＬを分析のために収集し、さらなる１００μＬの新鮮な培地を加えた。マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯ、Ｔｅｃａｎ）によって、ＧＭ−ＣＳＦの吸収強度を４５０ｎｍで判定した。腫瘍溶解物タンパク質の濃度も、ブラッドフォードアッセイによって同時に分析した。生物活性ＧＭ−ＣＳＦの百分率はｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性アッセイによって調査し、ＧＭ−ＣＳＦ生物活性の量をＥＬＩＳＡによって検出されるＧＭ−ＣＳＦタンパク質の量に正規化することによって計算した。生物活性アッセイは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌、６〜８週齢；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から単離された骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）を利用した。１０ｖ／ｖ％のＡｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬を各細胞培養ウェルに加え、３７℃で４時間のインキュベーションの後、プレートを４９０ｎｍの吸光度で読み取った。全ての標準および試料をブランク対照に正規化し、実験試料の生物活性を標準曲線に対して判定した。
【００６１】
細胞傷害性研究。Ｂ１６Ｆ１０細胞を使用して、様々な溶解濃度のブランクＭＮ製剤に向けた細胞傷害性研究を実行した。１ウェルにつき５×１０3個の細胞密度で細胞を９６ウェルプレートに播種し、５００ｍＬ培地につき１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）、１×Ｌ−グルタミンおよび２．５μＬのベータメルカプトエタノールを有する１００μＬのＤＭＥＭ（２５ｍＭグルコース）で培養した。プレートを次に３７℃の５％ＣＯ2の中で１２時間インキュベートして７０〜８０％集密度に到達させた後、ＭＮ溶液とインキュベートした放出された培地の段階希釈を加えた。試料との２４時間のインキュベーションの後、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄し、１００μＬの新鮮なＦＢＳなしのＤＭＥＭおよび２０μＬの新たに調製した３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド溶液（ＭＴＴ溶液、５．０ｍｇ／ｍＬ）とインキュベートした。プレートは、暗所の３７℃でさらに４時間インキュベートした。その後、溶液を注意深く取り出し、１００μＬのジメチルスルホキシドを加えた。１０分以内にマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して、プレートの吸光度を５９０ｎｍおよび６３０ｎｍの参照波長で読み取った。
【００６２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光およびイメージング。生物発光像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍで収集した。ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中のＤ−ルシフェリン（Ｐｉｅｒｃｅ）（１５ｍｇ／ｍＬ）の動物への腹腔内注射（体重１ｇあたり１０μＬ）の１０分後にデータを得るために、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用した。
【００６３】
共焦点顕微鏡検査。領域性皮膚および腫瘍を切開し、４℃の４％パラホルムアルデヒドで固定し、次に、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ）に包埋し、ドライアイスの上のイソペンタン浴の中で急速冷凍した。凍結試料を切片（厚さ５μｍ）にし、顕微鏡スライドにマウントし、−２０℃で保存した。免疫蛍光法によるＣＤ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１８６４４）、ＣＤ４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１８６６７）、ＣＤ８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＡ１８６０９）、ＣＤ１１ｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１１７３０９）、ＣＤ４９ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０８９０９）、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）（Ａｂｃａｍ、ａｂ２７８７）およびＨＳＰ９０（Ａｂｃａｍ、ａｂ１４２９）の染色のために、スライドを２回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００溶液を使用して３０分間透過性にし、その後１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を使用して１時間ブロックした。ブロッキングの後、１／２００希釈の一次モノクローナル抗体を４℃で一晩適用し、その後洗浄および１／４００希釈の二次抗体とのインキュベーションが続いた。ヤギ抗ラットＩｇＧ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ａ１８８６６）、ウサギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１８９２０）を含む二次抗体を、一部の試料に加えた。スライドを３回洗浄し、細胞核を染色するためにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２または４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩化水素化物（ＤＡＰＩ）を適用し、カバーグラスでカバーした。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アポトーシス染色のために、固定された腫瘍切片を、製造業者のプロトコールに従ってＩｎ  Ｓｉｔｕ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）によって染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を、核染色のために使用した。試料は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０多重パラメータ蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用してイメージングした。像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して処理した。
【００６４】
腫瘍浸潤性細胞およびリンパ組織細胞の単離。ＲＰＭＩの中で４０μｍナイロン細胞ストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通して腫瘍を磨砕することによって、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞試料を単離した。ＢＰおよび４Ｔ１腫瘍試料をハサミで刻んでから、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％／０．１％）と２０分間インキュベーションした。ＲＰＭＩの中で反復ピペット操作によって腫瘍細胞をホモジナイズし、４０μｍ細胞ストレーナーを通して濾過し、単一細胞懸濁液を作製した。完全ＲＰＭＩで、細胞懸濁液を１回洗浄した。記載される通り、マウス皮膚からリンパ組織細胞を単一細胞懸濁液に単離した。試験前に、全ての試料を蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）緩衝液（ＰＢＳ／０．５％アルブミン）に再懸濁させた。
【００６５】
細胞傷害性Ｔ細胞活性。マウスから採収した脾細胞を、腫瘍溶解物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した。細胞はストレーナーを通して過剰なＰＢＳで３回洗浄し、次に、９６ウェル培養プレートの中で、５００：１の有効標的細胞比でＢ１６Ｆ１０標的細胞と一緒に培養した。２４時間後に、非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）漏出レベルを検出するために、上清を収集し、それは有効細胞による標的細胞の比溶解のレベルを示した。比溶解の百分率は、比溶解％＝（（実験のＬＤＨ放出−有効細胞ＬＤＨ放出）／（最大ＬＤＨ放出−自発的ＬＤＨ放出））×１００％により計算した。
前述の詳細な説明および付随する実施例は、例示的なものにすぎず、添付の請求項およびそれらの均等物だけによって規定される本発明の範囲を制限するものと解釈すべきでないことが理解される。
開示される実施形態に対する様々な変更および改変は、当業者にとって明らかであろう。そのような変更および改変は、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または本発明の使用方法に関するものを限定することなく含め、その精神および範囲を逸脱しない範囲で加えることができる。
【００６６】
完全性のために、本発明の様々な態様は、以下の番号付けした項（clause）で、ならびに以下の請求項で提示される：
項１。光免疫療法で使用するための光応答性皮膚アプリケータであって、各マイクロニードルが基部部分および先端部分を含む、複数のマイクロニードルを含む経皮マイクロニードルアレイと、少なくとも１つの腫瘍抗原を含む免疫原性組成物と、感光性の生物学的色素とを含む皮膚アプリケータ。
項２。免疫原性組成物および生物学的色素が、グリコサミノグリカン、ポリ硫酸グリコサミノグリカン、グルコソグリカン、ポリ硫酸グルコソグリカン、グルコサミノグリカン、ムコ多糖、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリＬ−乳酸（ＰＬＡ）、マルトース、キトサン、アルギネート、ならびにその誘導体および組合せの少なくとも１つを含むポリマーマトリックスを使用してマイクロニードルアレイの中に封入されている、項１の皮膚アプリケータ。
項３。ポリマーマトリックスがヒアルロン酸を含む、項１または２の皮膚アプリケータ。
項４。少なくとも１つの腫瘍抗原が不活性化腫瘍溶解物または新生抗原に由来する、項１〜３の皮膚アプリケータ。
項５。少なくとも１つの腫瘍抗原が、メラノーマ、白血病、乳がん、肺がん、膀胱がん、脳がん、子宮頸がん、卵巣がん、結腸直腸がんおよび任意の関連するがんに由来する、項１〜４の皮膚アプリケータ。
【００６７】
項６。少なくとも１つの腫瘍抗原が、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ、ＢＲＡＦv600Eメラノーマまたは４Ｔ１乳房腫瘍に由来する、項１〜４の皮膚アプリケータ。
項７。少なくとも１つの腫瘍抗原が対象からの免疫原性エピトープを含む、項１〜５の皮膚アプリケータ。
項８。感光性の生物学的色素が、メラニン、カロテノイド、キサントフィル、ビリルビンまたはその組合せの少なくとも１つである、項１〜７の皮膚アプリケータ。
項９。免疫原性組成物が免疫刺激剤をさらに含む、項１〜８の皮膚アプリケータ。
項１０。免疫刺激剤が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣｐＧヌクレオチド、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−１５およびその組合せの少なくとも１つを含み、免疫刺激剤が免疫細胞を刺激することが可能である、項９の皮膚アプリケータ。
【００６８】
項１１。免疫刺激剤が少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む、項９の皮膚アプリケータ。
項１２。免疫原性組成物および感光性の生物学的色素が複数のマイクロニードルの基部部分の中に封入されており、免疫刺激剤が複数のマイクロニードルの先端部分の中に封入されており、先端部分は基部部分の遠位にある、項１〜１１の皮膚アプリケータ。
項１３。免疫刺激剤が、複数のマイクロニードルの先端部分の中にメタクリル化ヒアルロン酸を架橋することによって封入されている、項１２の皮膚アプリケータ。
項１４。対象における免疫応答を刺激するためにアプリケータに光エネルギーを送達するための手段をさらに含む、項１〜１３の皮膚アプリケータ。
項１５。光エネルギーが近赤外（ＮＩＲ）光を含む、項１４の皮膚アプリケータ。
【００６９】
項１６。腫瘍を有する対象を治療する方法であって、対象の皮膚の領域を項１の光応答性皮膚アプリケータと接触させること、および皮膚アプリケータに光エネルギーを送達することを含み、光エネルギーは熱に変換し、対象において腫瘍に対する免疫応答をさらに刺激する、方法。
項１７。皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、近赤外（ＮＩＲ）光、ＵＶ光、または１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長の光を送達することを含む、項１６の方法。
項１８。皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、ＮＩＲ光を約５分〜約２０分の間送達することを含む、項１６または１７の方法。
項１９。皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、ＮＩＲ光を約１日から約７日連続で１日に少なくとも１回送達することを含む、項１６〜１８の方法。
項２０。少なくとも１つの腫瘍抗原が不活性化腫瘍溶解物または新生抗原に由来する、項１６〜１９の方法。
【００７０】
項２１。少なくとも１つの腫瘍抗原が、メラノーマ、白血病、乳がん、肺がん、膀胱がん、脳がん、子宮頸がん、卵巣がん、結腸直腸がんおよび任意の関連するがんに由来する、項１６〜１９の方法。
項２２。感光性の生物学的色素がメラニンを含み、皮膚アプリケータにＮＩＲ光を送達することが、メラニンが高体温微小環境を形成することを刺激する、項１６〜２１の方法。
項２３。高体温微小環境の温度が約３５℃〜約４５℃である、項２２の方法。
項２４。免疫原性組成物が免疫刺激剤をさらに含む、項１６〜２３の方法。
項２５。免疫刺激剤が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣｐＧヌクレオチド、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−１５およびその組合せの少なくとも１つを含み、免疫刺激剤が免疫細胞を刺激することが可能である、項２４の方法。
【００７１】
項２６。免疫刺激剤が少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む、項２４の方法。
項２７。対象において腫瘍形成を阻害する方法であって、対象の皮膚の領域を項１の光応答性皮膚アプリケータと接触させること、および皮膚アプリケータに光エネルギーを送達することを含み、皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、対象において腫瘍に対する免疫応答を刺激する、方法。
項２８。皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、近赤外（ＮＩＲ）光、ＵＶ光、または約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長の光を送達することを含む、項２７の方法。
項２９。皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、ＮＩＲ光を約５分〜約２０分の間送達することを含む、項２７または２８の方法。
項３０。皮膚アプリケータへの光エネルギーの送達が、ＮＩＲ光を約１日から約７日連続で１日に少なくとも１回送達することを含む、項２７〜２９の方法。
【００７２】
項３１。少なくとも１つの腫瘍抗原が不活性化腫瘍溶解物または新生抗原に由来する、項２７〜３０の方法。
項３２。少なくとも１つの腫瘍抗原が、メラノーマ、白血病、乳がん、肺がん、膀胱がん、脳がん、子宮頸がん、卵巣がん、結腸直腸がんおよび任意の関連するがんに由来する、項２７〜３１の方法。
項３３。感光性の生物学的色素がメラニンを含み、皮膚アプリケータにＮＩＲ光を送達することが、メラニンが高体温微小環境を形成することを刺激する、項２７〜３２の方法。
項３４。高体温微小環境の温度が約３５℃〜約４５℃である、項３３の方法。
項３５。免疫原性組成物が免疫刺激剤をさらに含む、項２７〜３４の方法。
【００７３】
項３６。免疫刺激剤が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣｐＧヌクレオチド、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−１５およびその組合せの少なくとも１つを含み、免疫刺激剤が免疫細胞を刺激することが可能である、項３５の方法。
項３７。免疫刺激剤が少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤を含む、項３６の方法。
【図１Ａ−１Ｅ】
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【図２Ａ−２Ｇ】
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【図３Ａ−３Ｇ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図５Ａ−５Ｇ】
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【図６Ａ−６Ｋ】
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【図７Ａ−７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１２Ａ−１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ−１６Ｂ】
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【図１７Ａ−１７Ｃ】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ−２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ−２３Ｃ】
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【図２４Ａ−２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ−２６Ｂ】
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【図２７Ａ−２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ−２９Ｂ】
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【図３０Ａ−３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ−３２Ｄ】
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【図３３Ａ−３３Ｂ】
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【図３４Ａ−３４Ｂ】
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【図３５Ａ−３５Ｂ】
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【図３６Ａ−３６Ｄ】
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【図３７】
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【国際調査報告】
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