(57)【要約】【課題】    新規の抗体ライブラリー及びこれを用いた抗体スクリーニング方法を提供する。【解決手段】本発明に係る抗体ライブラリーは、ヒト配列由来の特定ＶＨ又はＶＬ骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を持っているので、高い熱力学的安定性（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を持っており、高い可溶性発現（ｈｉｇｈ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が可能であるという長所の他、可逆的なフォールディング（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ）が可能であるという長所もある。また、本発明に係る抗体ライブラリーは、全ての抗原に対して高い特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び高い親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有するように合理的に調節された（ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）様々なＣＤＲを含んでいるので、目的とする抗原に対する適切な候補抗体を選別するのに有用である。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体又はその断片の集合であって、
前記抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域対（ｐａｉｒ）を含み、
前記重鎖可変領域は、ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）及びＶＨ１−６９（配列番号１１）からなる群から選ばれる重鎖可変領域に含まれているフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）と、
各重鎖可変領域別に異なる重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）の組合せとを含み、
前記軽鎖可変領域は、Ｖκ１−３９（配列番号１６）、Ｖκ３−２０（配列番号２１）、Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）及びＶλ１−５１（配列番号３１）からなる群から選ばれる軽鎖可変領域に含まれているフレームワーク領域と、
各軽鎖可変領域別に異なる軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）の組合せとを含むことを特徴とする、抗体又はその断片の集合。
【請求項２】
ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖκ１−３９（配列番号１６）、ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖκ３−２０（配列番号２１）、ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）、ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖλ１−５１（配列番号３１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖκ１−３９（配列番号１６）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖκ３−２０（配列番号２１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖλ１−５１（配列番号３１）、ＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖκ１−３９（配列番号１６）、ＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖκ３−２０（配列番号２１）、ＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）及びＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖλ１−５１（配列番号３１）からなる群から選ばれる重鎖及び軽鎖可変領域対に含まれているフレームワーク領域と、
各重鎖可変領域別に異なるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の組合せ及び各軽鎖可変領域別に異なるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の組合せとを含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその断片の集合。
【請求項３】
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）の配列を有する重鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号２）、ＦＲ２（配列番号３）、ＦＲ３（配列番号４）及びＦＲ４（配列番号５）を含み、
ＶＨ３−２３（配列番号６）の配列を有する重鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号７）、ＦＲ２（配列番号８）、ＦＲ３（配列番号９）及びＦＲ４（配列番号１０）を含み、
ＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号１２）、ＦＲ２（配列番号１３）、ＦＲ３（配列番号１４）及びＦＲ４（配列番号１５）を含み、
Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号１７）、ＦＲ２（配列番号１８）、ＦＲ３（配列番号１９）及びＦＲ４（配列番号２０）を含み、
Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号２２）、ＦＲ２（配列番号２３）、ＦＲ３（配列番号２４）及びＦＲ４（配列番号２５）を含み、
Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号２７）、ＦＲ２（配列番号２８）、ＦＲ３（配列番号２９）及びＦＲ４（配列番号３０）を含み、及び
Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号３２）、ＦＲ２（配列番号３３）、ＦＲ３（配列番号３４）及びＦＲ４（配列番号３５）を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体又はその断片の集合。
【請求項４】
前記抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域対（ｐａｉｒ）の各可変領域内に含まれた相補性決定領域（ＣＤＲ）が、潜在的な翻訳後修飾（ＰＴＭ：ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を発生可能なアミノ酸が変形されて翻訳後修飾が発生しないように設計されたことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその断片の集合。
【請求項５】
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表３の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表４の範囲を含み、
前記ＶＨ３−２３（配列番号６）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表３の範囲を含み、
前記ＶＨ３−２３（配列番号６）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表４の範囲を含み、
前記ＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表５の範囲を含み、
前記ＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表６の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が９個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表７の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１０個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表８の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１１個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表９の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１２個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表１０の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１３個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表１１の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１４個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表１２の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表１３の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表１４の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表１５の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表１６の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表１７の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表１８の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表１９の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表１７の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表１８の範囲を含み、
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表２０の範囲を含み、
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表２１の範囲を含み、及び
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表２２の範囲を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその断片の集合。
【請求項６】
前記抗体の断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、及びＦｖからなる群から選ばれる一つ以上の形態であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその断片の集合。
【請求項７】
次のｉ）〜ｉｖ）から選択された一つ以上の特性を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその断片の集合：
ｉ）１０％以下のリダンダンシー（反復配列の比率）
ｉｉ）ＣＤＲ構成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）のｐ値（ｐ−ｖａｌｕｅ）＞０．０５
ｉｉｉ）７０℃以上の熱安定性
ｉｖ）１０７以上の多様性（ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｉｚｅ）。
【請求項８】
前記抗体又はその断片の集合は、前記抗体又はその断片の集合をコードする核酸が導入されたファージ又は宿主細胞の表面で発現することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその断片の集合。
【請求項９】
前記宿主細胞は、大腸菌又は酵母であることを特徴とする、請求項８に記載の抗体又はその断片の集合。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその断片の集合をコードする核酸。
【請求項１１】
（ａ）抗原を、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその断片の集合と接触させる段階；及び（ｂ）前記抗原に結合する一つ以上の抗体又は抗体断片を選択する段階を含む、抗原に対して特異的な抗体又はその断片を同定する方法。
【請求項１２】
前記抗体又はその断片の集合は、前記抗体又はその断片の集合をコードする核酸が導入されたファージ又は宿主細胞の表面で発現することを特徴とする、請求項１１に記載の抗原に対して特異的な抗体又はその断片を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の抗体ライブラリー及びこれを用いた抗体スクリーニング方法に関し、本発明に係る抗体ライブラリーは、ヒト配列由来の特定ＶＨ又はＶＬ骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を有することにより、高い熱力学的安定性（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を有し、高い可溶性発現（ｈｉｇｈ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が可能であるという長所の他、可逆的なフォールディング（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ）が可能であるという長所もある。
【０００２】
また、本発明に係る抗体ライブラリーは、全ての抗原に対して高い特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）と高い親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有するように合理的に調節された（ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）様々なＣＤＲを含んでいるので、目的とする抗原に対する適切な候補抗体を選別するのに有用に利用可能である。
【背景技術】
【０００３】
抗体は、免疫系内の白血球のＢ細胞（Ｂリンパ球）において抗原の刺激によって作られるタンパク質であり、抗原に出会うと、細胞にある受容体を通じて抗原を認識し、受容体を通じて結合する。このような抗体は、疾病を治療するためのタンパク質新薬の候補物質とされており、目的とする機能的な抗体を見出すために様々な抗体ライブラリーを作製し、それからスクリーニングする。
【０００４】
このような抗体ライブラリーは、遺伝子組換え技術を用いるものであり、人体内に存在するＢ細胞から抗体タンパク質をコードする遺伝子を抽出して抗体遺伝子ライブラリーを作製し、このライブラリーから、所望の抗原結合特異性を持つ抗体を選別する。抗体ライブラリー技術はヒト抗体などの抗体の作製に一大革新をもたらした。抗体免疫反応の最も目立つ特徴は、外部からいかなる種類、或いは形状の抗原が体内に侵入しても、その抗原が体内の成分と同一でない外来物質であれば、その抗原と特異的に結合する抗体が１週内に作られるということである。
【０００５】
抗体は、Ｂリンパ球によって作られ、１つのＢリンパ球はただ１種類の抗体だけを生産する。実際に我々は、人体には数多くのＢリンパ球があり、それぞれのＢリンパ球は固有の独特の抗原結合特異性を持つ抗体を細胞膜に発現させているが、一般に、約１０８余種の抗原結合多様性が人体内に存在すると知られている。抗原が侵入する場合には、この抗原と特異的に結合する抗体を発現させているＢリンパ球だけが速く増殖しながら抗体を多量生産し、結果的に、血清内にこの特定抗体の濃度が急に上昇して、侵入した抗原の迅速な除去機能を果たす。したがって、人体内には数億種の抗体多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）が存在し、このような抗体の多様性を抗体レパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）と表現する。
【０００６】
したがって、人体から十分な数字のＢリンパ球を採血によって獲得し、この細胞からｍＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）方法で重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを得ると、比較的簡単な方法で人体内の抗体レパートリーを遺伝子の形態で試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）に確保可能になる。抗体ライブラリー技術の核心は、このようなヒト抗体遺伝子レパートリーをタンパク質として発現させる（或いは、ディスプレイと表現）と同時に、その抗体タンパク質をコードする遺伝子が、ある媒体を通じて連結される、いわゆる遺伝型−表現型連結（ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）であり、これによって抗体ライブラリーから特定抗原と結合する抗体を選別すると同時に、その特定抗体をコードする遺伝子を獲得することにある。
【０００７】
このとき、完璧な形態の免疫は必要でなく、抗原結合機能を持つ抗体のＦａｂ形態で発現したり、或いは重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨとＶＬ）が約１５アミノ酸の短いペプチド連結子（ｌｉｎｋｅｒ）で連結されている、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）と命名される抗体断片として発現する。このとき、このような抗体の遺伝型−表現型連結（ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）に使用される媒体をどのような媒体の表面に発現させるかによって、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイなどに区別され、抗原を投与するなどの免疫反応の誘導無しで所望の抗原結合性の抗体を得ることができる。
【０００８】
しかし、抗体ライブラリー作製及び抗体選別には多いノウハウが必要であり、高親和度の抗体が得難いことから、抗体選別後に親和度成熟などの抗体最適化過程を行う場合が多く、特に、１次選別時に、毒性などの問題から、哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ）において直ちに機能分析することができないという短所などがある。治療抗体は、単純に抗原との結合ではなく実際に治療機能を持つ抗体を選別しなければならないが、このような短所は治療用抗体開発に障壁とされてきた。
【０００９】
抗体ライブラリーにおいて現在最も使用されているものは、ファージディスプレイ抗体ライブラリーであり、実際に、現在商業化されているリウマチ関節炎治療剤であるヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ，ａｎｔｉ−ＴＮＦ−ａｌｐｈａヒト単クローン抗体）がファージディスプレイ技術によって作製された治療用抗体である。理想的な抗体ライブラリーは巨大な抗体多様性を含んでおり、所望の抗原結合特異性を持つ高親和度の抗体クローンをいつでも獲得できるライブラリーである。そのためには、約１０１０〜１０１１程度の抗体多様性を持つライブラリーを作製しなければならないが、抗体遺伝子クローニング作業によってこのようなサイズのライブラリーを作製することは非常に難しく、この点がファージディスプレイ抗体ライブラリー作製における最大の難題であるといえる。また、ファージ自体が毒性として働き、機能分析を直ちに行うことができないという短所がある。
【００１０】
リボソームディスプレイの最大の長所は無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）システムであるということであり、理論的に１０１３サイズのライブラリー作製が可能な程度に巨大なサイズのライブラリーを容易に作ることができ、高親和度抗体（ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の獲得に有利であり（一般に、抗体ライブラリーのサイズが大きいほどライブラリー内に高親和度の抗体が含まれている可能性が高い）、また、ＰＣＲ増幅過程があるので、エラープローンポリメラーゼ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）などを用いることができ、分子進化（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を人為的に誘導するための突然変異の導入が非常に容易であるが、これもまた、毒性問題及び種々の実験上の問題から、実際には、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）起源の抗体ライブラリーの作製には、ファージディスプレイ技術を主に用いている。
【００１１】
酵母ディスプレイ技術は、組換えベクターをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株に挿入する過程と酵母細胞の大きいサイズのため、１０９以上の多様性を持つ抗体ライブラリーを作るには多くの技術的制限があり、このため、選別過程における長所を活用して既に確保されている抗原−特異的抗体の突然変異ライブラリーを作製し、これから高親和度の抗体を選別するのに主に利用する。
【００１２】
このうち、ファージディスプレイは、バクテリオファージの表面に抗体断片を発現させて抗体をスクリーニングする技術であり、既存の抗体開発技術（ハイブリドーマを用いたキメラ／ヒト化抗体開発、遺伝子移植トランスジェニックマウスを用いた抗体開発）に比べて短時間で抗原特異的抗体を同定できるという長所がある。高い多様性のライブラリーが確保されないと効果的に抗体が同定できないという短所があるが、最近の遺伝子増幅技術及びクローニング技術の発達によってライブラリー確保は相当解決されている。
【００１３】
ヒト遺伝子ベースの自然的ライブラリーに比べて、抗体の相補性決定部位（ＣＤＲ）に無作為合成配列を入れて多様性を創造したものを合成抗体ライブラリー（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）という。しかし、合成抗体ライブラリーは、突然変異やフレームシフト（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ）などの影響から、正常に機能可能な抗体断片の比率が、自然的ヒトライブラリーに比べて低い。最近では新規標的抗原を同定するための抗体ライブラリー利用戦略が多様化しており、その代表として、腫瘍由来１次細胞（Ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）を用いたセルパンニング（Ｃｅｌｌ  ｐａｎｎｉｎｇ）によって新規抗原特異的抗体を同定した（Ｚｈｕ  Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０）。
【００１４】
このように、様々な接近戦略が可能であるため、持続した抗体候補物質の確保が可能であり、クローニングによって抗体を生産できる側面で、ファージディスプレイは効率的な接近戦略であるといえる。このようなファージディスプレイ技術を応用して同定された種々の癌を標的にする候補抗体医薬品が臨床に入っている。ファージディスプレイ技術の活用のために、目的とする抗体同定のためには抗体可変領域遺伝子のライブラリー化が必要であり、様々なライブラリー構築が必須であるといえよう。
【００１５】
現在、様々な抗体ライブラリーが開発されているが、依然として高い熱力学的安定性（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）及び高い可溶性発現（ｈｉｇｈ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が可能であり、且つ大きい多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を有する点から、様々な抗原に対する高い特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び高い親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する抗体を選別できる抗体ライブラリーに対する要求は続いている現状である。
【００１６】
このような技術的背景の下に、本発明者らは鋭意努力した結果、アジア及びコーカサス人種のｃＤＮＡから共通の配列を抽出し、これに基づき、特定ＶＨ及び／又はＶＬ骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の組合せを基盤とする抗体ライブラリーを用いる場合、選別された抗体が高い熱力学的安定性を有しており、高い可溶性発現が可能であり、且つ、可逆的なフォールディング（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ）が可能であるという点を明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１７】
さらに、本発明に係る抗体ライブラリーは、全ての抗原に対して高い特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び高い親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有するように合理的に調節され設計された（ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ）様々なＣＤＲを含んでいるので、自然上の抗体ライブラリーに比べて優れた多様性及び低い反復配列比率を示すだけでなく、目的とする抗原に対する適切な候補抗体を選別するのに有用である。本背景技術の部分に記載された前記情報は、単に本発明の背景に対する理解を向上させるためのもので、よって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に周知の先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
【００１８】
本発明の目的は、疾病の治療又は診断に効果的に使用可能なヒト抗体をスクリーニングするための抗体ライブラリー及びこれを用いて抗体をスクリーニングする方法を提供することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
前記目的を達成するために、本発明では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域対（ｐａｉｒ）を含み、前記重鎖可変領域は、ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）及びＶＨ１−６９（配列番号１１）からなる群から選ばれる重鎖可変領域に含まれているフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）と、各重鎖可変領域別に異なる重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）の組合せを含み、前記軽鎖可変領域は、Ｖκ１−３９（配列番号１６）、Ｖκ３−２０（配列番号２１）、Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）及びＶλ１−５１（配列番号３１）からなる群から選ばれる軽鎖可変領域に含まれているフレームワーク領域と、各軽鎖可変領域別に異なる軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）の組合せを含むことを特徴とする抗体又はその断片の集合を提供する。
【００２０】
前記抗体又はその断片の集合に含まれる個別的な抗体又はその断片をコードする核酸は、個別的に別個のファージ（ｐｈａｇｅ）又は宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）に含まれ、前記抗体又はその断片はそれぞれ、ファージ又は宿主細胞の表面に発現する形態を有することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２１】
本発明はまた、前記抗体又はその断片の集合をコードする核酸を提供する。前記抗体又はその断片の集合をコードする核酸は、個別的に別個のファージ（ｐｈａｇｅ）又は宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）に含まれることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２２】
本発明はまた、（ａ）抗原を前記抗体の集合と接触させる段階；及び（ｂ）前記抗原に結合する一つ以上の抗体又は抗体断片を選択する段階を含む、抗原に対して特異的な抗体又はその断片を同定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明に係るライブラリーベクターを構築する過程を示す模式図である。
【図２】本発明の一実施例で構築したライブラリーの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ３）の位置別アミノ酸分布を確認したグラフである。
【図３】本発明の一実施例で構築したライブラリー配列の反復される配列の比率を分析したグラフである。
【図４】本発明の一実施例で構築したライブラリーの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ３）の長さ分布を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
特に定義しない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。
【００２５】
本発明では、フレームワーク領域の安定性が高いＶＨ、ＶＬクローンを確保し、翻訳後修飾（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＰＴＭ）を最小化しながら、免疫原性を最小化するアミノ酸だけを正確に合成するためにトライマーコドン（ｔｒｉｍｅｒ  ｃｏｄｏｎ）を用いて抗体ライブラリーを構築する場合、高い多様性及び安定性を有する抗体ライブラリーを構築できるということを確認した
【００２６】
すなわち、本発明の一実施例では、アジア人（Ａｓｉａｎ）及びコーカサス人（Ｃａｕｃａｓｉａｎ）のｃＤＮＡから、ヒト可変領域のうち、重鎖可変領域はＶＨ１、ＶＨ３、軽鎖可変領域はＶκ１、Ｖκ３、Ｖλ１遺伝子を確保した後、ヒト抗体可変領域に含まれた相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸組合せを分析したが、特に、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）は９個〜１４個の長さ別にそれぞれを分析した。分析後、確保したアジア人とコーカサス人との可変領域のアミノ酸の組合せは、有意差なく類似性を示し、確保されたアジア人とコーカサス人との組合せの平均値を求めてライブラリープライマーデザインに反映した。そして、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）の場合、分析された組合せからＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔアミノ酸によって５％のＮ−グリコシル化部位（Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）の発生可能性を発見し、このＰＴＭによって将来に抗体結合力及び安定性に阻害を与える可能性を排除するために、Ｎ−グリコシル化部位の発生可能性を１％以下に調節した。前記方法によって、高い多様性を有するライブラリー構築用プライマーを設計した。前記プライマーに基づいてＦａｂライブラリーを構築した結果、１．５４Ｘ１０１１の多様性を有するライブラリーを構築した（図１）。
【００２７】
したがって、本発明は、一観点において、抗体又はその断片の集合であって、前記抗体又はその断片は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域対（ｐａｉｒ）を含み、前記重鎖可変領域は、ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）及びＶＨ１−６９（配列番号１１）からなる群から選ばれる重鎖可変領域に含まれているフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）と、各重鎖可変領域別に異なる重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）の組合せを含み、前記軽鎖可変領域は、Ｖκ１−３９（配列番号１６）、Ｖκ３−２０（配列番号２１）、Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）及びＶλ１−５１（配列番号３１）からなる群から選ばれる軽鎖可変領域に含まれているフレームワーク領域と、各軽鎖可変領域別に異なる軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）の組合せを含むことを特徴とする抗体又はその断片の集合に関する。
【００２８】
好ましくは、本発明に係る抗体又はその断片の集合は、
ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖκ１−３９（配列番号１６）、ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖκ３−２０（配列番号２１）、ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）、ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖλ１−５１（配列番号３１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖκ１−３９（配列番号１６）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖκ３−２０（配列番号２１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖλ１−５１（配列番号３１）、ＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖκ１−３９（配列番号１６）、ＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖκ３−２０（配列番号２１）、ＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）及びＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖλ１−５１（配列番号３１）からなる群から選ばれる重鎖及び軽鎖可変領域対に含まれているフレームワーク領域と、
各重鎖可変領域別に異なるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の組合せ及び各軽鎖可変領域別に異なるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の組合せを含むことを特徴とする。
【００２９】
また、本発明に係る抗体又はその断片の集合は、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）の配列を有する重鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号２）、ＦＲ２（配列番号３）、ＦＲ３（配列番号４）及びＦＲ４（配列番号５）を含み、
ＶＨ３−２３（配列番号６）の配列を有する重鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号７）、ＦＲ２（配列番号８）、ＦＲ３（配列番号９）及びＦＲ４（配列番号１０）を含み、
ＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号１２）、ＦＲ２（配列番号１３）、ＦＲ３（配列番号１４）及びＦＲ４（配列番号１５）を含み、
Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号１７）、ＦＲ２（配列番号１８）、ＦＲ３（配列番号１９）及びＦＲ４（配列番号２０）を含み、
Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号２２）、ＦＲ２（配列番号２３）、ＦＲ３（配列番号２４）及びＦＲ４（配列番号２５）を含み、
Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号２７）、ＦＲ２（配列番号２８）、ＦＲ３（配列番号２９）及びＦＲ４（配列番号３０）を含み、及び
Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号３２）、ＦＲ２（配列番号３３）、ＦＲ３（配列番号３４）及びＦＲ４（配列番号３５）を含むことができる。
【００３０】
前記抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域対（ｐａｉｒ）の各可変領域内に含まれた相補性決定領域（ＣＤＲ）が、潜在的な翻訳後修飾（ＰＴＭ：ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が起き得るアミノ酸が変形されて翻訳後修飾が発生しないように設計されたことを特徴とし得る。
【００３１】
特に、本発明に係る抗体又はその断片の集合に含まれるＣＤＲ配列は、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表３の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表４の範囲を含み、
前記ＶＨ３−２３（配列番号６）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表３の範囲を含み、
前記ＶＨ３−２３（配列番号６）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表４の範囲を含み、
前記ＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表５の範囲を含み、
前記ＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表６の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が９個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表７の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１０個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表８の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１１個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表９の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１２個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表１０の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１３個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表１１の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１４個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表１２の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表１３の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表１４の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表１５の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表１６の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表１７の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表１８の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表１９の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表１７の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表１８の範囲を含み、
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表２０の範囲を含み、
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表２１の範囲を含み、及び
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表２２の範囲を含むことを特徴とし得る。
【００３２】
特に、本発明に係る抗体又は又はその断片の集合は、
次のｉ）〜ｉｖ）から選択された一つ以上の特性を有することを特徴とし得る。
ｉ）１０％以下のリダンダンシー（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）（反復配列の比率）
ｉｉ）ＣＤＲ構成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）のｐ値（ｐ−ｖａｌｕｅ）＞０．０５
ｉｉｉ）７０℃以上の熱安定性
ｉｖ）１０７以上の多様性（ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｉｚｅ）。
【００３３】
本発明で使われる用語“抗体”は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＹ及びＩｇＧからなる群から選ばれる免疫グロブリンであり、目標抗原に特異的に結合できる。軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）及び重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）がそれぞれ２個ずつ集まってなり、それぞれの鎖は、アミノ酸配列が可変的な可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）と一定の配列を有する定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）とからなっている。可変領域の３次元構造末端に抗原の結合する部位が位置し、この部位は、軽鎖と重鎖にそれぞれ３個ずつ存在する相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）が集まって形成される。相補性決定部位は、可変領域の中でもアミノ酸配列の可変性が特に高い部分であり、このような高い可変性によって様々な抗原に対して特異的抗体が見つけられ得る。本発明の範囲には、完全な抗体形態の他、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。
【００３４】
完全な抗体は、２本の全長の軽鎖及び２本の全長の重鎖を有する構造であり、各軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖の定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）のタイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のタイプを有する。
【００３５】
本発明に係る“抗原結合断片”は、特定抗原と結合できる機能を保有している抗体の断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、及びＦｖなどを含む概念であり、本明細書では“抗体断片”と同じ意味で使われる。
【００３６】
抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域及び重鎖の最初の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを持つ最小の抗体断片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９号、ＷＯ８８／１０６６３０号、ＷＯ８８／０７０８５号、ＷＯ８８／０７０８６号及びＷＯ８８／０９３４４号に開示されている。二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ，ｓｃＦｖ）は、一般にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されたり又はＣ−末端で直接連結され、二本鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、遺伝子組換え技術を用いて作製してもよい。
【００３７】
本発明で使われる用語“ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ、一本鎖断片抗体又は抗体断片）”は、軽鎖及び重鎖の可変領域を連結した抗体である。場合によって、１５個前後のアミノ酸が連結されたペプチド鎖からなるリンカー（ｌｉｎｋｅｒ、連結部位）を含むことができ、このとき、ＳｃＦｖは、軽鎖可変領域−連結部位−重鎖可変領域、又は重鎖可変領域−連結部位−軽鎖可変領域の構造を有することができ、親抗体と同一或いは類似の抗原特異性を有する。
【００３８】
本発明で使われる用語“抗体ライブラリー”は、異なる配列を有する様々な抗体の組合せを意味し、本発明における特定重鎖可変領域及び軽鎖可変領域対の組合せからなる集合を意味する。
【００３９】
前記抗体ライブラリーに含まれる個別の抗体又はその断片をコードする核酸はそれぞれ、別個のファージ（ｐｈａｇｅ）又は宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）に含まれ、前記抗体又はその断片はそれぞれ、ファージ又は宿主細胞の表面に発現する形態（ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）を有することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４０】
本発明に係る抗体又はその断片が表面に発現する形態において用いられる宿主細胞としては、大腸菌、サッカロマイセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母などのようなヒトとネズミのＢ細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
ファージ又は宿主細胞の表面に発現する抗体又はその断片の形態によって、本発明に係るライブラリーは、Ｆａｂライブラリー又はｓｃＦｖライブラリーのように命名できる。
【００４２】
また、本発明における“抗体ライブラリー”とは、タンパク質レベルにおける特定重鎖可変領域及び軽鎖可変領域対の組合せだけでなく、各特定重鎖可変領域及び軽鎖可変領域対をコードする遺伝子レベルにおける組合せも含む意味で使われる。
【００４３】
抗体ライブラリーから任意の抗原に対して特異的抗体を分離するためには非常に高い多様性が要求され、それぞれ異なる抗体クローンからなるライブラリーが構築されて用いられる。このような抗体ライブラリーをなす抗体遺伝子は、例えば、ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクターにクローニングされ、形質転換体（大腸菌などの宿主細胞）に形質転換され得る。
【００４４】
本発明で使われる用語“核酸”は、遺伝子又はヌクレオチドと同じ意味で使われてもよく、例えば、天然／合成ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、天然／合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡからなる群から選ばれ得るが、これに制限されるものではない。
【００４５】
本発明で使われる用語“ファージミド”ベクターは、ファージディスプレイに用いられ、ファージ複製起点（ｐｈａｇｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を有するプラスミドＤＮＡであり、通常、抗生剤耐性遺伝子を選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ）として持っている。ファージディスプレイに用いられるファージミドベクターの場合、Ｍ１３ファージのｇＩＩＩ遺伝子又はその一部が含まれており、ＳｃＦｖ遺伝子はｇＩＩＩ遺伝子の５’末端にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）され、形質転換体を通じて発現する。
【００４６】
本発明で使われる用語“ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）”は、ファージミドがファージ粒子に組み立てられるように必要な遺伝情報を提供するファージである。ファージミドにはファージ遺伝子中のｇＩＩＩ或いはその一部だけが存在するので、ファージミドで形質転換された宿主細胞（形質転換体）をヘルパーファージで感染させて残りのファージ遺伝子を供給する。Ｍ１３Ｋ０７或いはＶＣＳＭ１３などの種類があり、たいてい、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）などの抗生剤耐性遺伝子を含み、ヘルパーファージに感染された形質転換体を選択できるようにしている。また、組立信号（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）に欠陥があるので、ヘルパーファージ遺伝子よりはファージミド遺伝子が選別的にファージ粒子中に組み立てられる。
【００４７】
本発明で使われる用語“信号配列”は、遺伝子の５’末端部分に位置し、遺伝子からコードされたタンパク質が外部に分泌される時に必要な信号として機能する塩基配列或いはそれに相応するアミノ酸配列である。
【００４８】
本発明で使われる用語“ファージディスプレイ”は、変異体ポリペプチドを、ファージ、例えば、繊維状ファージ粒子の表面上に外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速且つ効率的に分類できるということにある。ペプチド及びタンパク質ライブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を持つポリペプチドを調べるために数百万個のポリペプチドをスクリーニングする上で用いられてきた。
【００４９】
ファージディスプレイ技術は、特定リガンド（例：抗原）と結合する新規タンパク質を生成及び選別するための強力な道具を提供した。ファージディスプレイ技術を用いて、タンパク質変異体の大きいライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速に分類できる。変異体ポリペプチドをコードする核酸を、ウイルス性外皮タンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸配列と融合させる。タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列を遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部をコードする核酸配列と融合させた１価ファージディスプレイシステムが開発された。１価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルに発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現して粒子感染性が維持される。
【００５０】
繊維状ファージ表面上におけるペプチドの発現と宿主細胞の周辺細胞質における機能性抗体断片の発現を立証することが、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発する上で重要である。抗体又は抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、多数の方式、例えば、無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法又は関連遺伝子系列をクローニングする方法で作製した。ライブラリーを対象にして、目的とする特徴を伴う抗体又は抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングすることができる。
【００５１】
ファージディスプレイ技術は、目的とする特徴を持つ抗体を作製するための通常のハイブリドーマ及び組換え方法に比べていくつかの利点がある。このような技術によれば、動物を使用しなくても短時間で様々な配列を持つ大きい抗体ライブラリーを生成させることができる。ハイブリドーマの作製やヒト化抗体の作製には数ヵ月の作製期間がかかることがある。また、免疫が全く要求されないので、ファージ抗体ライブラリーは、毒性であるか抗原性の低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。さらに、ファージ抗体ライブラリーを用いて新規の治療的抗体を生成及び確認することができる。
【００５２】
ファージディスプレイライブラリーを用いてヒト生殖細胞系組織又は美感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）からヒト抗体を生成させる技術を用いることができる。各種のリンパ系組織を用いて、美感作又は非免疫抗原結合性ライブラリーを作製できる。
【００５３】
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認及び分離できる技術は、治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーのサイズ、細菌性細胞中における生産効率及びライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーのサイズは、抗体又は抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディングと停止コドンの存在による非効率的生産によって減少する。細菌性細胞における発現は、抗体又は抗原結合性ドメインが適切にフォルディングされない場合には抑制され得る。発現は、可変／定常界面の表面や選別されたＣＤＲ残基における残基を交互に突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞において抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一つの要素である。
【００５４】
高親和性抗体分離において抗体又は抗原結合性タンパク質の様々なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、それらがしばしば抗原結合に参加することが明らかにされた。重鎖上のＣＤＲ３領域は、サイズ、配列及び構造的立体形態の面において非常に多様であり、これを用いて様々なライブラリーを作製することができる。
【００５５】
また、各位置において２０個のアミノ酸を全て使用して可変重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって、多様性を発生させることができる。２０個の全てのアミノ酸を使用すれば、多様性の大きい変異体抗体配列が生成され、新規の抗体を確認する機会が増加し得る。
【００５６】
本発明で使われる用語“抗体可変領域”は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及びフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分のことを指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインのことを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインのことを指す。
【００５７】
“相補性決定領域”（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基のことを指す。各可変ドメインは典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。
【００５８】
“フレームワーク領域”（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。
【００５９】
本発明において、前記抗体又はその断片の集合は、ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖκ１−３９（配列番号１６）、ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖκ３−２０（配列番号２１）、ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）、ＶＨ３−１５（配列番号１）／Ｖλ１−５１（配列番号３１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖκ１−３９（配列番号１６）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖκ３−２０（配列番号２１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）、ＶＨ３−２３（配列番号６）／Ｖλ１−５１（配列番号３１）、ＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖκ１−３９（配列番号１６）、ＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖκ３−２０（配列番号２１）、ＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）及びＶＨ１−６９（配列番号１１）／Ｖλ１−５１（配列番号３１）からなる群から選ばれる重鎖及び軽鎖可変領域対に含まれているフレームワーク領域と、各重鎖可変領域別に異なるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の組合せ及び各軽鎖可変領域別に異なるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の組合せを含むことを特徴とし得る。
【００６０】
本発明において、前記ＶＨ３−１５（配列番号１）の配列を有する重鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号２）、ＦＲ２（配列番号３）、ＦＲ３（配列番号４）及びＦＲ４（配列番号５）を含み、
ＶＨ３−２３（配列番号６）の配列を有する重鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号７）、ＦＲ２（配列番号８）、ＦＲ３（配列番号９）及びＦＲ４（配列番号１０）を含み、
ＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号１２）、ＦＲ２（配列番号１３）、ＦＲ３（配列番号１４）及びＦＲ４（配列番号１５）を含み、
Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号１７）、ＦＲ２（配列番号１８）、ＦＲ３（配列番号１９）及びＦＲ４（配列番号２０）を含み、
Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号２２）、ＦＲ２（配列番号２３）、ＦＲ３（配列番号２４）及びＦＲ４（配列番号２５）を含み、
Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号２７）、ＦＲ２（配列番号２８）、ＦＲ３（配列番号２９）及びＦＲ４（配列番号３０）を含み、及び
Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域内のフレームワーク領域は、ＦＲ１（配列番号３２）、ＦＲ２（配列番号３３）、ＦＲ３（配列番号３４）及びＦＲ４（配列番号３５）を含むことを特徴とし得る。
【００６１】
本発明の重鎖可変領域、軽鎖可変領域及び各可変領域内のフレームワーク領域の配列を整理すると、下記の通りである：
【表１】
2021524752.tif 000002
2021524752.tif 000003
【００６２】
【表２】
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2021524752.tif 000005
2021524752.tif 000006
【００６３】
本発明において、前記抗体又はその断片は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域対（ｐａｉｒ）の各可変領域内に含まれた相補性決定領域（ＣＤＲ）は、潜在的な翻訳後修飾（ＰＴＭ：ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が生じ得るアミノ酸が変形されて翻訳後修飾が発生しないように設計されたことを特徴とし得る。
【００６４】
本発明において、前記ＶＨ３−１５（配列番号１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表３の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表４の範囲を含み、
前記ＶＨ３−２３（配列番号６）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表３の範囲を含み、
前記ＶＨ３−２３（配列番号６）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表４の範囲を含み、
前記ＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表５の範囲を含み、
前記ＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表６の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が９個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表７の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１０個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表８の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１１個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表９の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１２個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表１０の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１３個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表１１の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１４個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表１２の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表１３の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表１４の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表１５の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表１６の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表１７の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表１８の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表１９の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表１７の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表１８の範囲を含み、
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表２０の範囲を含み、
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表２１の範囲を含み、及び
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表２２の範囲を含むことを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
【００６５】
【表３】
2021524752.tif 000007
【００６６】
【表４】
2021524752.tif 000008
【００６７】
【表５】
2021524752.tif 000009
【００６８】
【表６】
2021524752.tif 000010
【００６９】
【表７】
2021524752.tif 000011
【００７０】
【表８】
2021524752.tif 000012
【００７１】
【表９】
2021524752.tif 000013
【００７２】
【表１０】
2021524752.tif 000014
【００７３】
【表１１】
2021524752.tif 000015
【００７４】
【表１２】
2021524752.tif 000016
【００７５】
【表１３】
2021524752.tif 000017
【００７６】
【表１４】
2021524752.tif 000018
【００７７】
【表１５】
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【００７８】
【表１６】
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【００７９】
【表１７】
2021524752.tif 000021
【００８０】
【表１８】
2021524752.tif 000022
【００８１】
【表１９】
2021524752.tif 000023
【００８２】
【表２０】
2021524752.tif 000024
【００８３】
【表２１】
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【００８４】
【表２２】
2021524752.tif 000026
【００８５】
本発明において、前記ＶＨ３−１５（配列番号１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表２３の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表２４の範囲を含み、
前記ＶＨ３−２３（配列番号６）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表２３の範囲を含み、
前記ＶＨ３−２３（配列番号６）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表２４の範囲を含み、
前記ＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）内の位置別アミノ酸比率は、表２５の範囲を含み、
前記ＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）内の位置別アミノ酸比率は、表２６の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が９個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表２７の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１０個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表２８の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１１個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表２９の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１２個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表３０の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１３個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表３１の範囲を含み、
前記ＶＨ３−１５（配列番号１）、ＶＨ３−２３（配列番号６）又はＶＨ１−６９（配列番号１１）の配列を有する重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）が１４個のアミノ酸である場合、前記ＣＤＲＨ３内の位置別アミノ酸比率は、表３２の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表３３の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表３４の範囲を含み、
前記Ｖκ１−３９（配列番号１６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表３５の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表３６の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表３７の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０（配列番号２１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表３８の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表３９の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表３７の範囲を含み、
前記Ｖκ３−２０−２（配列番号２６）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表３８の範囲を含み、
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）内の位置別アミノ酸比率は、表４０の範囲を含み、
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）内の位置別アミノ酸比率は、表４１の範囲を含み、及び
前記Ｖλ１−５１（配列番号３１）の配列を有する軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）内の位置別アミノ酸比率は、表４２の範囲を含むことを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
【００８６】
【表２３】
2021524752.tif 000027
【００８７】
【表２４】
2021524752.tif 000028
【００８８】
【表２５】
2021524752.tif 000029
【００８９】
【表２６】
2021524752.tif 000030
【００９０】
【表２７】
2021524752.tif 000031
【００９１】
【表２８】
2021524752.tif 000032
【００９２】
【表２９】
2021524752.tif 000033
【００９３】
【表３０】
2021524752.tif 000034
【００９４】
【表３１】
2021524752.tif 000035
【００９５】
【表３２】
2021524752.tif 000036
【００９６】
【表３３】
2021524752.tif 000037
【００９７】
【表３４】
2021524752.tif 000038
【００９８】
【表３５】
2021524752.tif 000039
【００９９】
【表３６】
2021524752.tif 000040
【０１００】
【表３７】
2021524752.tif 000041
【０１０１】
【表３８】
2021524752.tif 000042
【０１０２】
【表３９】
2021524752.tif 000043
【０１０３】
【表４０】
2021524752.tif 000044
【０１０４】
【表４１】
2021524752.tif 000045
【０１０５】
【表４２】
2021524752.tif 000046
【０１０６】
本発明において、前記抗体の断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ及びｓｃＦｖからなる群から選ばれる一つ以上の形態であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
【０１０７】
本発明において、前記抗体又はその断片は、ｉ）１０％以下のリダンダンシー（反復配列の比率）；ｉｉ）ＣＤＲ構成のｐ値＞０．０５；ｉｉｉ）７０℃以上の熱安定性；及びｉｖ）１０７以上の多様性（ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｉｚｅ）からなる群から選ばれる一つ以上の特性を有することを特徴とし得る。
【０１０８】
本発明は、他の観点において、前記抗体又はその断片の集合をコードする核酸に関する。
【０１０９】
本発明は、さらに他の観点において、（ａ）抗原を前記抗体の集合と接触させる段階；及び（ｂ）前記抗原に結合する一つ以上の抗体又は抗体断片を選択する段階を含む、抗原に対して特異的な抗体又はその断片を同定する方法に関する。
【０１１０】
本発明において、前記抗体の集合は、前記抗体の集合をコードする核酸が導入された形質転換体に含まれたファージ表面で発現することを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
【０１１１】
本発明において、前記同定方法は、ライブラリーの形質転換体とファージを培養してファージ表面に発現した抗体を抗原と結合させ、所望の抗体を発現する形質転換体をスクリーニングし、選別する過程を含むことができる。このようなスクリーニング及び選別段階は、当業界に公知の様々な技術を用いて行うことができる。
【０１１２】
例えば、前記ライブラリーから、パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）方法によって、特定抗原に結合する抗体を分離して作製できる。前記パンニングは、特定抗原（ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎ）にファージを結合させ、結合しなかったファージを除去した後、結合したファージを回収して宿主細胞に感染させることによってファージ数を増幅し、この過程を２〜４回反復することができる。
【０１１３】
実施例
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【０１１４】
実施例１）アジア人及びコーカサス人のヒト可変領域ｃＤＮＡ確保
【０１１５】
アジア人及びコーカサス人のヒト抗体可変領域ＣＤＲのアミノ酸組合せを分析するために、まず、アジア人ヒトメッセンジャーＲＮＡは、研究所内の研究員の血液供与（ＩＲＢ実施前）を用いたＰＢＭＣからＢ細胞を分化して獲得し、コーカサス人ヒトメッセンジャーＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のヒト脾臓全RNA（ｈｕｍａｎ  ｓｐｌｅｅｎ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）（ＣＡＴ  Ｎｏ．６３６５２５、Ｌｏｔ  Ｎｏ．１１０７１７１Ａ）を購買した。確保されたアジア人、コーカサス人メッセンジャーＲＮＡは、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ逆転写システム（ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣＡＴ  Ｎｏ．Ａ３８０２）を用いてｃＤＮＡにそれぞれ変換した。確保したｃＤＮＡからヒト可変領域遺伝子を確保するために、アジア人、コーカサス人のｃＤＮＡをそれぞれ鋳型とし、ＶＨ１タイプは順方向プライマー（表４３：配列番号７１）、逆方向プライマー（表４３：配列番号７２）を添加し、ＶＨ３タイプは順方向プライマー（表４３：配列番号７３）、逆方向プライマー（表４３：配列番号７２）を添加し、Ｖｋ１タイプは順方向プライマー（表４３：配列番号７４）、逆方向プライマー（表４３：配列番号７５）を添加し、Ｖｋ３タイプは順方向プライマー（表４３：配列番号７６）、逆方向プライマー（表４３：配列番号７５）を添加し、Ｖλ１タイプは順方向プライマー（表４３：配列番号７７）、逆方向プライマー（表４３：配列番号７８）を添加した後、それぞれのｃＤＮＡ、プライマー混合物をプラチナ混合ポリメラーゼ（ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｍｉｘ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡＴ  Ｎｏ．１１３０６）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で３分間露出後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分間露出を２５回反復した後、７２℃で１０分間反応した。前記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想サイズのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル摘出キットを用いてそれぞれ分離した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．Ｎｏ．２８７０６）。
【０１１６】
【表４３】
2021524752.tif 000047
【０１１７】
実施例２）高性能シーケンシング（Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）用のアジア人及びコーカサス人のヒト抗体可変領域ライブラリー作製
【０１１８】
実施例１で確保したアジア人及びコーカサス人のｃＤＮＡを、高性能シーケンシングを行うために各タイプを分別するためのバーコード（ｂａｒｃｏｄｅ）を連結するＰＣＲを行った。まず、アジア人は、Ａｓｉａｎ  ＶＨ１  ｃＤＮＡを鋳型にして順方向プライマー（表４４：配列番号７９）、逆方向プライマー（表４４：配列番号８９）を添加し、ＶＨ３タイプは順方向プライマー（表４４：配列番号８０）、逆方向プライマー（表４４：配列番号８９）を添加し、Ｖｋ１タイプは順方向プライマー（表４４：配列番号８１）、逆方向プライマー（表４４：配列番号９０）を添加し、Ｖｋ３タイプは順方向プライマー（表４４：配列番号８２）、逆方向プライマー（表４４：配列番号９０）を添加し、Ｖλ１タイプは順方向プライマー（表４４：配列番号８３）、逆方向プライマー（表４４：配列番号９１）を添加した後、それぞれの鋳型、プライマー混合物をＰｒｉｍｅ  ｓｔａｒ  ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ，ＣＡＴ  Ｎｏ．Ｒ０４０Ｂ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間露出後、９４℃で１５分、５５℃で１５分、７２℃で３０分露出を１０回反復した後、７２℃で５分間反応した。前記増幅された遺伝子を、１％アガロースゲルで予想サイズのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル摘出キットを用いてそれぞれ分離した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．Ｎｏ．２８７０６）。コーカサス人は、Ｃａｕｃａｓｉａｎ  ＶＨ１  ｃＤＮＡを鋳型にして順方向プライマー（表４４：配列番号８４）、逆方向プライマー（表４４：配列番号８９）を添加し、ＶＨ３タイプは順方向プライマー（表４４：配列番号８５）、逆方向プライマー（表４４：配列番号８９）を添加し、Ｖｋ１タイプは順方向プライマー（表４４：配列番号８６）、逆方向プライマー（表４４：配列番号９０）を添加し、Ｖｋ３タイプは順方向プライマー（表４４：配列番号８７）、逆方向プライマー（表４４：配列番号９０）を添加し、Ｖλ１タイプは順方向プライマー（表４４：配列番号８８）、逆方向プライマー（表４４：配列番号９１）を添加した後、それぞれの鋳型、プライマー混合物をＰｒｉｍｅ  ｓｔａｒ  ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ，ＣＡＴ  Ｎｏ．Ｒ０４０Ｂ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間露出後、９４℃で１５分、５５℃で１５分、７２℃で３０分露出を１０回反復した後、７２℃で５分間反応した。前記増幅された遺伝子を、１％アガロースゲルで予想サイズのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル摘出キットを用いてそれぞれ分離した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．Ｎｏ．２８７０６）。
【０１１９】
確保したアジア人、コーカサス人別遺伝子をマクロジェン（韓国ソウル、グロ−ク）に依頼して４５４シーケンシング（ＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ，Ｒｏｃｈｅ）手法で、表４５に示す個数だけシーケンシングを行った。表４６に表記のアミノ酸を基準に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に対してシーケンシングされた配列のＣＤＲアミノ酸構成比率を分析した。
【０１２０】
【表４４】
2021524752.tif 000048
【０１２１】
実施例３）高性能シーケンシングデータ分析及びこれに基づくプライマーデザイン
【０１２２】
高性能シーケンシングによって各人種及びタイプ別に１００００個以上のヒト可変領域配列を確保した（表４５）。確保したヒト可変領域配列のうち、ＣＤＲ領域のアミノ酸組合せを確認するために、ＶＨ１タイプのＣＤＲ１は、セリン−システイン（Ｋａｂａｔナンバー２２、２３番）とトリプトファン−バリン（Ｋａｂａｔナンバー３６、３７番）との間、ＣＤＲ２は、グルタミン酸−トリプトファン（Ｋａｂａｔナンバー４７、４８番）とアルギニン−ランダム−トレオニン（ｋａｂａｔナンバー６７、６８、６９番）との間、ＣＤＲ３は、チロシン−チロシン−システイン（ｋａｂａｔナンバー９０、９１、９２番）とグリシン−トレオニン−ロイシン（ｋａｂａｔナンバー１０３、１０４、１０５番）との間を分析した。ＶＨ３タイプのＣＤＲ１は、セリン−システイン（Ｋａｂａｔナンバー２２、２３番）とトリプトファン−バリン（Ｋａｂａｔナンバー３６、３７番）との間、ＣＤＲ２は、グルタミン酸−トリプトファン（Ｋａｂａｔナンバー４７、４８番）とリシン−グリシン−アルギニン（ｋａｂａｔナンバー６７、６８、６９番）との間、ＣＤＲ３は、チロシン−チロシン−システイン（ｋａｂａｔナンバー９０、９１、９２番）とグリシン−トレオニン−ロイシン（ｋａｂａｔナンバー１０３、１０４、１０５番）との間を分析した。Ｖｋ１のＣＤＲ１は、イソロイシン−ランダム−システイン（Ｋａｂａｔナンバー２１、２２、２３番）とトリプトファン−チロシン（Ｋａｂａｔナンバー３５、３６番）との間、ＣＤＲ２は、イソロイシン−チロシン（Ｋａｂａｔナンバー４８、４９番）とグリシン−バリン（ｋａｂａｔナンバー５７、５８番）との間、ＣＤＲ３は、チロシン−チロシン−システイン（ｋａｂａｔナンバー８６、８７、８８）とグリシン−トレオニン−リシン（ｋａｂａｔナンバー１０１、１０２、１０３番）との間を分析した。Ｖｋ３のＣＤＲ１はセリン−システイン（Ｋａｂａｔナンバー２２、２３番）とトリプトファン−チロシン（Ｋａｂａｔナンバー３５、３６番）との間、ＣＤＲ２はロイシン−イソロイシン（Ｋａｂａｔナンバー４７、４８番）とイソロイシン−プロリン（ｋａｂａｔナンバー５８、５９番）との間、ＣＤＲ３は、チロシン−チロシン−システイン（ｋａｂａｔナンバー８６、８７、８８番）とグリシン−トレオニン−リシン（ｋａｂａｔナンバー１０１、１０２、１０３番）との間を分析した。Ｖλ１のＣＤＲ１は、セリン−システイン（Ｋａｂａｔナンバー２２、２３番）とトリプトファン−チロシン（Ｋａｂａｔナンバー３５、３６番）との間、ＣＤＲ２はロイシン−イソロイシン（Ｋａｂａｔナンバー４７、４８番）とセリン−グリシン（ｋａｂａｔナンバー５６、５７番）との間、ＣＤＲ３は、チロシン−チロシン−システイン（ｋａｂａｔナンバー８６、８７、８８）とグリシン−トレオニン−リシン（ｋａｂａｔナンバー１０１、１０２、１０３番）との間を分析した（表４６）。ＶＨ１とＶＨ３タイプの場合、ＣＤＲ３の長さが様々なので、既存文献を用いて合成ライブラリー作製時に最も効率的に抗体を選別できる長さであるアミノ酸９〜１４個別に分けてそれぞれ分析した後、アミノ酸組合せを確認した。
【０１２３】
分析の結果、アジア人とコーカサス人のＣＤＲアミノ酸組合せ間の有意の差異点が発見できず、相当類似していることを確認した。ＶＨのＣＤＲ１、２の場合、様々なアミノ酸の組合せを有しているが、ＣＤＲ３に比べて高い割合で保存されているアミノ酸が存在していた。これは、Ｖ遺伝子（Ｖ−ｇｅｎｅ）領域であるので、Ｖ−Ｄ−Ｊ連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）が起きず、ＣＤＲ３に比べて突然変異導入の可能性が低く、構造的安定性に影響を与える剰余数（ｒｅｓｉｄｕｅ  ｎｕｍｂｅｒ）があることから、保存されるべきアミノ酸が存在するためである。ＶＨ１とＶＨ３のＣＤＲ３間にも有意の差異点が発見されず、類似のアミノ酸組合せを有することを確認した。これは、ＶＨ１、ＶＨ３のＶ遺伝子末端がチロシン−チロシン−システイン−アラニン−アルギニン／リシンとして共通に保存されており、Ｖ−Ｄ−Ｊ連結時にＤ遺伝子、Ｊ遺伝子は共通して同一遺伝子が適用されるためである。
【０１２４】
分析の結果に従ってアジア人とコーカサス人のＣＤＲアミノ酸の組合せの平均値を求めてプライマーコドンデザインに反映した。また、ＶＨ１とＶＨ３のＣＤＲ３が類似していることから、ＣＤＲ３を構成するプライマーを共有した。さらに、ＶＨ１のＣＤＲ２のｋａｂａｔナンバー５２−５２ａ−５３、ＶＨ３のＣＤＲ２においてｋａｂａｔナンバー５２ａ−５３−５４のアミノ酸Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔの比率が５％程度になり、Ｎ−グリコシル化による抗体力価減少の恐れがあるため、ＶＨ１の５２、ＶＨ３の５２ａのアスパラギンの比率を０％に下げ、Ｎ−グリコシル化の可能性を除去した。
【０１２５】
【表４５】
2021524752.tif 000049
【０１２６】
【表４６】
2021524752.tif 000050
【０１２７】
実施例４）Ｆａｂライブラリー構築
４−１）軽鎖可変領域ライブラリー構築
【０１２８】
１）ＶＬフレームシーケンス合成（ＶＬ  Ｆｒａｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）：ヒトＶＬκ１−３９、ＶＬκ３−２０、ＶＬλ１−５１のフレーム１〜３の配列（表４７）をバイオニア社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｎｅｅｒ．ｃｏ．ｋｒ）に合成を依頼して確保した。
【０１２９】
【表４７】
2021524752.tif 000051
【０１３０】
２）一番目のＰＣＲ増幅（Ｐｒｉｍａｒｙ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＰＣＲ）：各フレーム配列を鋳型（５ｎｇ／ｒｅａｃｔｉｏｎ）としてＶＬ  ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３断片（Ｆｒａｇｍｅｎｔ１〜３）をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲに用いられるプライマー配列は、表４８の通りである。前記配列においてＸ数字は３個の塩基を意味し、配列目録ファイルではＮＮＮと表記した。ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  Ｐｆｕ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋ−２０２５）を用いて３０サイクル（９５℃で３０秒、５０〜５８℃で３０秒、７２℃で１分）で反応させる。それぞれのＰＣＲ産物は、電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．ＮＯ．２８７０６）を用いて精製した。
【０１３１】
【表４８】
2021524752.tif 000052
2021524752.tif 000053
【０１３２】
配列番号９３（Ｖｋ１−３９−Ｆ１）、配列番号９８（Ｖｋ３−２０−Ｆ１）及び配列番号１０３（Ｖｋ３−２０−２−Ｆ１）のＮ１〜Ｎ８は、下記の表４９のような塩基の比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１３３】
【表４９】
2021524752.tif 000054
【０１３４】
配列番号９３（Ｖｋ１−３９−Ｆ１）、配列番号９８（Ｖｋ３−２０−Ｆ１）及び配列番号１０３（Ｖｋ３−２０−２−Ｆ１）のＸ１〜Ｘ１６は、下記の表５０のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１３５】
【表５０】
2021524752.tif 000055
【０１３６】
配列番号９５（Ｖｋ１−３９−Ｆ２）のＮは、下記の表５１のような塩基の比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１３７】
【表５１】
2021524752.tif 000056
【０１３８】
配列番号９５（Ｖｋ１−３９−Ｆ２）のＸは、下記の表５２のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１３９】
【表５２】
2021524752.tif 000057
【０１４０】
配列番号１００（Ｖｋ３−２０−Ｆ２）のＮは、下記の表５３のような塩基の比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１４１】
【表５３】
2021524752.tif 000058
【０１４２】
配列番号１００（Ｖｋ３−２０−Ｆ２）のＸは、下記の表５４のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１４３】
【表５４】
2021524752.tif 000059
【０１４４】
配列番号９７（ＶＬκ１−３９＿Ｆ３）及び配列番号１０２（ＶＬκ３−２０＿Ｆ３）のＮは、下記の表５５のような塩基の比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１４５】
【表５５】
2021524752.tif 000060
【０１４６】
配列番号９７（ＶＬκ１−３９＿Ｆ３）及び配列番号１０２（ＶＬκ３−２０＿Ｆ３）のＸは、下記の表５６のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１４７】
【表５６】
2021524752.tif 000061
【０１４８】
配列番号１０４（ＶＬλ１−５１＿Ｆ１）のＮは、下記の表５７のような塩基の比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１４９】
【表５７】
2021524752.tif 000062
【０１５０】
配列番号１０４（ＶＬλ１−５１＿Ｆ１）のＸは、下記の表５８のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１５１】
【表５８】
2021524752.tif 000063
【０１５２】
配列番号１０６（ＶＬλ１−５１＿Ｆ２）のＸは、下記の表５９のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１５３】
【表５９】
2021524752.tif 000064
【０１５４】
配列番号１０８（ＶＬλ１−５１＿Ｆ３）のＸは、下記の表６０のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１５５】
【表６０】
2021524752.tif 000065
【０１５６】
３）二番目のＰＣＲ増幅（一番目の重複ＰＣＲ（１ｓｔ  Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲ））：一番目のＰＣＲ産物（断片１〜３）を鋳型（各断片当たり２０ｎｇ／ｒｅａｃｔｉｏｎ）に添加し、１６サイクル（９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分）で反応させた。ＰＣＲに用いられるプライマー配列は、表６１の通りである。それぞれのＰＣＲ産物（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ）は、電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．ＮＯ．２８７０６）を用いて精製した。
【０１５７】
【表６１】
2021524752.tif 000066
【０１５８】
４）三番目のＰＣＲ増幅（二番目の重複ＰＣＲ）：精製した一番目の重複ＰＣＲ産物を定量し、ＶＬκ１−３９、ＶＬκ３−２０、ＶＬκ３−２０−２の場合はＣＬκ（断片ＰＣＲ産物）を、ＶＬλ１−５１の場合はＣＬλ（断片ＰＣＲ産物）を共に鋳型（各ｐｒｏｄｕｃｔ党１０ｎｇ／  ｒｅａｃｔｉｏｎ）として用いて１５サイクル（９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分）で反応させた。ＰＣＲに用いられるプライマー配列は、表６２の通りである。それぞれのＰＣＲ産物は、電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．ＮＯ．２８７０６）を用いて精製した。
【０１５９】
【表６２】
2021524752.tif 000067
【０１６０】
５）ＶＬライブラリー形質転換（ＶＬ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
【０１６１】
５−ａ）ライゲーション：可変軽鎖（ＶＬ）と定常軽鎖（ＣＬ）領域の重複ＰＣＲ産物にＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ，ＣＡＴ．ＮＯ．Ｒ０１０１Ｌ）を添加して３７℃で一晩（Ｏ／Ｎ）反応させた後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．ＮＯ．２８１０６）を用いて精製した。ここに、ＸｂａＩ（ＮＥＢ．ＣＡＴ．ＮＯ．Ｒ０１４５Ｌ）を添加して３７℃で一晩（Ｏ／Ｎ）反応させた後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．ＮＯ．２８１０６）を用いて精製した。ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切ったインサートＤＮＡ断片（ｉｎｓｅｒｔ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）２０μｇと線形化ｐＣｏｍｂ３ＸＴＴベクター（ＥｃｏＲＩ，ＸｂａＩ  ｃｕｔｔｅｄ）４０μｇにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ，ＣＡＴ．ＮＯ．Ｍ０２０３Ｓ）を添加し、２５℃で一晩（Ｏ／Ｎ）反応させた。
【０１６２】
５−ｂ）形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）：ライゲーションした反応物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．ＮＯ．２８１０６）を用いて精製した。軽鎖の各サブタイプ当たりに１ｍＬのＭＣ１０６１Ｆ’（ＳＳ３２０）コンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ，ＣＡＴ．ＮＯ．６０５１２−１）に、１０個のキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）（１００μｌ／ｃｕｖｅｔｔｅ）に分けて電気穿孔した。ＳＢ液体培地を添加して全体積（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）を５００ｍＬに合わせた後、１時間、３７℃２００ｒｐｍで振盪培養（ｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、培養懸濁液（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐ．）１００μＬを段階希釈（ｓｅｒｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を通じてＬＢアガーｌｏｐプレート（ＬＢ  ａｇａｒ  ｌｏｐ  ｐｌａｔｅ）＋カルベニシリン（ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ，ＣＡＴ．ＮＯ．ＬＮ００４ＣＡ）にスプレッドした後、３７℃で一晩培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）し、ｐＣｏｍｂ３ＸＴＴ−合成ＶＬライブラリーサイズを確認した。５００ｍＬ培地体積当たりにカルベニシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）５００μＬを入れ、３７℃で一晩培養（２００ｒｐｍ）した。
【０１６３】
４−２）重鎖可変領域ライブラリー構築
【０１６４】
１）ＶＨフレームシーケンス合成：ヒトＶＨ１−６９、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２３のフレーム１〜３の配列（表６３）を、バイオニア社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｎｅｅｒ．ｃｏ．ｋｒ）に合成を依頼して確保した。
【０１６５】
【表６３】
2021524752.tif 000068
【０１６６】
２）一番目のＰＣＲ増幅（断片ＰＣＲ）：各フレーム配列を鋳型（５ｎｇ／ｒｅａｃｔｉｏｎ）としてＶＬ  ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３断片（断片１〜３）をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲに用いられるプライマー配列は、表６４の通りである。ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  Ｐｆｕ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋ−２０２５）を用いて３０サイクル（９５℃で３０秒、５０〜５５℃で３０秒、７２℃で１分）で反応させた。それぞれのＰＣＲ産物は、電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．ＮＯ．２８７０６）を用いて精製した。
【０１６７】
【表６４】
2021524752.tif 000069
2021524752.tif 000070
2021524752.tif 000071
【０１６８】
配列番号１１６（ＶＨ１−６９＿Ｆ１）及び配列番号１２６（ＶＨ３−１５＿Ｆ）のＮは、下記の表６５のような塩基の比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１６９】
【表６５】
2021524752.tif 000072
【０１７０】
配列番号１１６（ＶＨ１−６９＿Ｆ１）及び配列番号１２６（ＶＨ３−１５＿Ｆ）のＸは、下記の表６６のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１７１】
【表６６】
2021524752.tif 000073
【０１７２】
配列番号１１８（ＶＨ１−６９＿Ｆ２）のＸは、下記の表６７のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１７３】
【表６７】
2021524752.tif 000074
【０１７４】
配列番号１２８（ＶＨ３−１５＿Ｆ２）のＮは、下記の表６８のような塩基の比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１７５】
【表６８】
2021524752.tif 000075
【０１７６】
配列番号１２８（ＶＨ３−１５＿Ｆ２）のＸは、下記の表６９のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１７７】
【表６９】
2021524752.tif 000076
【０１７８】
配列番号１３０（ＶＨ３−２３＿Ｆ２）のＮは下記の表７０のような塩基の比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１７９】
【表７０】
2021524752.tif 000077
【０１８０】
配列番号１３０（ＶＨ３−２３＿Ｆ２）のＸは、下記の表７１のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１８１】
【表７１】
2021524752.tif 000078
【０１８２】
配列番号１２０（ＶＨ１−６９＿Ｆ３＿ＣＤＲ９、ＶＨ３−１５＿Ｆ３＿ＣＤＲ９、ＶＨ３−２３＿Ｆ３＿ＣＤＲ９）のＸは、下記の表７２のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１８３】
【表７２】
2021524752.tif 000079
【０１８４】
配列番号１２１（ＶＨ１−６９＿Ｆ３＿ＣＤＲ１０、ＶＨ３−１５＿Ｆ３＿ＣＤＲ１０、ＶＨ３−２３＿Ｆ３＿ＣＤＲ１０）、配列番号１２２（ＶＨ１−６９＿Ｆ３＿ＣＤＲ１１、ＶＨ３−１５＿Ｆ３＿ＣＤＲ１１、ＶＨ３−２３＿Ｆ３＿ＣＤＲ１１）、配列番号１２３（ＶＨ１−６９＿Ｆ３＿ＣＤＲ１２、ＶＨ３−１５＿Ｆ３＿ＣＤＲ１２、ＶＨ３−２３＿Ｆ３＿ＣＤＲ１２）、配列番号１２４（ＶＨ１−６９＿Ｆ３＿ＣＤＲ１３、ＶＨ３−１５＿Ｆ３＿ＣＤＲ１３、ＶＨ３−２３＿Ｆ３＿ＣＤＲ１３）及び配列番号１２５（ＶＨ１−６９＿Ｆ３＿ＣＤＲ１４、ＶＨ３−１５＿Ｆ３＿ＣＤＲ１４、ＶＨ３−２３＿Ｆ３＿ＣＤＲ１４）のＸは、下記の表７３のようなコドン比率を有するように設計してＰＣＲを行った。
【０１８５】
【表７３】
2021524752.tif 000080
【０１８６】
３）二番目のＰＣＲ増幅（一番目の重複ＰＣＲ）：一番目のＰＣＲ産物（断片１〜３）を鋳型（各断片当たり４０ｎｇ／ｒｅａｃｔｉｏｎ）に添加して１６サイクル（９５℃で３０秒、５０〜５５℃で３０秒、７２℃で１分）で反応させた。ＰＣＲに用いられるプライマー配列は、表７４の通りである。それぞれのＰＣＲ産物（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎｓ）は、電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．ＮＯ．２８７０６）を用いて精製した。
【０１８７】
【表７４】
2021524752.tif 000081
【０１８８】
４）Ｆａｂライブラリー形質転換
【０１８９】
４−ａ）ライゲーション：可変重鎖（ＶＨ）のＰＣＲ産物にＸｂａＩ（ＮＥＢ．ＣＡＴ．ＮＯ．Ｒ０１４５Ｌ）を添加して３７℃で６時間反応させた後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．ＮＯ．２８１０６）を用いて精製した。ここにＡｐａＩ（ＮＥＢ．ＣＡＴ．ＮＯ．Ｒ０１１４Ｌ）を添加して２５℃で６時間反応させた後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．ＮＯ．２８１０６）を用いて精製した。ＸｂａＩとａｐａＩで切ったインサートＤＮＡ断片１０μｇと線形化ｐＣｏｍｂ３ＸＴＴベクター（ＥｃｏＲＩ，ＸｂａＩ  ｃｕｔｔｅｄ）４０μｇにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ，ＣＡＴ．ＮＯ．Ｍ０２０３Ｓ）を添加し、２５℃で一晩（Ｏ／Ｎ）反応させた。この時、ＣＤＲ３の長さによって全ＤＮＡ量の比率においてＣＤＲ３＿９ＡＡ（アミノ酸）長は１２％、ＣＤＲ３＿１０ＡＡ長は１４％、ＣＤＲ３＿１１ＡＡ長は１７％、ＣＤＲ３＿１２ＡＡ長は２２％、ＣＤＲ３＿１３ＡＡ長は１９％、ＣＤＲ３＿１４ＡＡ長は１６％となるように調整した。
【０１９０】
４−ｂ）形質転換：ライゲーションした反応物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡＴ．ＮＯ．２８１０６）を用いて精製する。重鎖の各サブタイプ当たりに１ｍＬのＸＬ１−ブルー電気穿孔−コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡＴ．ＮＯ．２００２２８）に、１０個のキュベット（１００μｌ／ｃｕｖｅｔｔｅ）に分けて電気穿孔した。ＳＢ液体培地を添加して全体積を５００ｍＬにした後、１時間、３７℃、２００ｒｐｍで振盪培養した。培養懸濁液１００μＬを段階希釈を通じてＬＢアガーｌｏｐプレート＋カルベニシリン（ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ，ＣＡＴ．ＮＯ．ＬＮ００４ＣＡ）にスプレッドした後、３７℃で一晩培養し、ｐＣｏｍｂ３ＸＴＴ−合成ＶＬライブラリーサイズを確認した。５００ｍＬ培地体積当たりにカルベニシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）５００μＬを入れ、３７℃で一晩培養（２００ｒｐｍ）した。
【０１９１】
実施例５）Ｆａｂライブラリー性能確認
５−１）ライブラリーサイズ確認
【０１９２】
Ｆａｂライブラリーは、３個のＶＨタイプ、４個のＶＬタイプを用いて、総１２個のライブラリーをそれぞれ１０１０サイズ以上に構築して総１．５２×１０１１サイズのＦａｂライブラリーを構築したことを確認し、ｓｃＦｖライブラリーは、２個のＶＨタイプ、４個のＶＬタイプを用いて、総８個のライブラリーをそれぞれ１０１１サイズ以上に構築して総１．２７ｘ１０１２サイズのｓｃＦｖライブラリーを構築したことを確認した。
【０１９３】
【表７５】
2021524752.tif 000082
【０１９４】
５−２）ライブラリーＣＤＲアミノ酸分布確認
【０１９５】
ＨＴ−シーケンシングを用いて得たヒトジャームラインＣＤＲ配列と実際に構築されたライブラリーのＣＤＲ配列とを比較し、再現レベルを分析した。
【０１９６】
その結果、図２に示すように、設計した分だけのアミノ酸多様性を確保したことが確認できた。
【０１９７】
これを定量的に分析するために、対応のあるt検定（ｐａｉｒｅｄ−Ｔ  ｔｅｓｔ）を用いて分析した。
【０１９８】
その結果、全てのライブラリー導入部位（ｓｉｔｅ）の有意水準が５％以下であることを確認し、ヒトジャームラインＣＤＲに基づくデザインと実ライブラリーの突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）配列が同等であることが確認できた。
【０１９９】
【表７６】
2021524752.tif 000083
【０２００】
５−３）反復配列（リダンダンシー，ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）分布確認
【０２０１】
ＨＴ−シーケンシングを用いて各ライブラリー配列を約１００００個ずつ分析し、反復される配列の比率を導出した。
【０２０２】
その結果、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２３タイプは１０％以下、ＶＨ１−６９は１３〜２１％の反復配列を保有した。全体平均で１０．５％の反復配列比率を保有することを確認し（表７７）、図３に開示のように、反復配列の大部分が２回反復であるため、ライブラリー品質を下げる影響がわずかであることを確認した。
【０２０３】
【表７７】
2021524752.tif 000084
【０２０４】
５−４）ＣＤＲ長の分析
【０２０５】
ヒトジャームラインＶＨ  ＣＤＲ３配列を、ＨＴ−シーケンシングを通じて長さ別の分布を確認し、これをライブラリーに再現後、ＨＴ−シーケンシングを通じて比較分析した。
【０２０６】
その結果、図４に開示のように、ヒトジャームライン配列の長さ別分布とライブラリーのＣＤＲ長が類似していることが確認できた。
【０２０７】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態であるだけで、これに本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【産業上の利用可能性】
【０２０８】
本発明に係る抗体ライブラリーは、高い熱力学的安定性（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を有しており、高い可溶性発現（ｈｉｇｈ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が可能であるという長所の他、可逆的なフォールディング（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ）が可能であるという長所もある。
【０２０９】
さらに、本発明に係る抗体ライブラリーは、全ての抗原に対して高い特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）と高い親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有するように合理的に調節された（ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）様々なＣＤＲを含んでおり、高いレベルの多様性を有するので、目的とする抗原に対する適切な候補抗体を選別するのに有用である。
【０２１０】
また、本発明に係る抗体ライブラリーは、ヒト抗体配列に基づくライブラリーという特性から、人体内に投与時に、免疫原性が最小化した抗体をスクリーニングでき、疾患の治療又は診断に効果的に利用できる抗体の開発を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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