(57)【要約】  本発明は、主にＤ−プシコース３−エピメラーゼを産生するための、最適化されたベクターで形質転換された、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子が不活性化され、
−胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子の不活性化、及び／又は
−エリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットの不活性化
から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子不活性化を有する、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株。
【請求項２】
−受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５１で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された菌株；
−受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５２で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された菌株；及び
−受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５３で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された菌株；
から選択される、請求項１に記載の遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株。
【請求項３】
Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列、及び配列番号１又は配列番号２を含むか又はそれからなる配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４】
Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列が、配列番号３、配列番号４の核酸配列、又は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３をコードする核酸から選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６を含むか又はそれからなる、請求項３又は４に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項３又は４に記載の核酸、又は請求項５に記載の組換え発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞が、請求項１又は２に定義されるような遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が、
−配列番号１４を含むか又はそれからなる核酸を含む、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５１で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株；
−配列番号１５を含むか又はそれからなる核酸を含む、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５１で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株；
−配列番号１６を含むか又はそれからなる核酸を含む、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５１で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株；
−配列番号１４を含むか又はそれからなる核酸を含む、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５２で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株；
−配列番号１５を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５２で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株；
−配列番号１６を含むか又はそれからなる核酸を含む、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５２で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株；
−配列番号１４を含むか又はそれからなる核酸を含む、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５３で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株；
−配列番号１５を含むか又はそれからなる核酸を含む、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５３で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株；
−配列番号１６を含むか又はそれからなる核酸を含む、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５３で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株
から選択される、請求項６又は７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を培養すること、及び任意選択により得られた培養物から産生したＤ−プシコース３−エピメラーゼを回収することを含む、特に発酵プロセスによって、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼを産生する方法。
【請求項１０】
以下のステップ： 
−請求項６〜８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を、少なくとも６０ｇ／Ｌ、特に６０ｇ／Ｌの糖濃度を含む適切な培地で培養するステップ；
−及び任意選択により得られた培養物から産生したＤ−プシコース３−エピメラーゼを回収するステップ
を含む、請求項９に記載のＤ−プシコース３−エピメラーゼの産生方法。
【請求項１１】
前記組換え宿主細胞が、配列番号１６を含むか又はそれからなる核酸を含む、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５３で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である、請求項９又は１０に記載のＤ−プシコース３−エピメラーゼの産生方法。
【請求項１２】
−（ａ）請求項６〜８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を培養するステップ；
−（ｂ）得られた培養物から産生したＤ−プシコース３−エピメラーゼを回収するステップ；
−（ｃ）ステップ（ｂ）で取得したＤ−プシコース３−エピメラーゼをＤ−プシコース３−エピメラーゼ活性に適した条件でＤ−フルクトースと接触させるステップ；及び
−（ｄ）任意選択により、産生したＤ−プシコースを回収するステップ
を含む、Ｄ−プシコースの産生方法。
【請求項１３】
バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の変異誘発又は遺伝子形質転換を含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載の遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を取得する方法。
【請求項１４】
以下のステップ： 
−（ａ）請求項１３に記載の遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を取得するステップ；
−（ｂ）ステップ（ａ）で取得した前記遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列、及び配列番号１又は配列番号２を含むか又はそれからなる配列を含む核酸分子を含むベクターで形質転換するステップ
を含む、請求項６〜８に記載の組換え宿主細胞を取得する方法。
【請求項１５】
以下のステップ： 
−（ａ）好ましくはＣｒｅ／Ｌｏｘシステムによって、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子を欠失させるステップ；
−（ｂ）ステップ（ａ）で取得したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株のエリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットを、好ましくはＭａｚＦベースのシステムを使用することによって、欠失させるステップ
−（ｃ）ステップ（ｂ）で取得したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子を、好ましくはＭａｚＦベースのシステムを使用することによって、欠失させるステップ
−（ｄ）ステップ（ｃ）で取得したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、配列番号１６を含むか又はそれからなるベクターで形質転換するステップ
を含む、請求項１４に記載の組換え宿主細胞を取得する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主にＤ−プシコース３−エピメラーゼを産生するための、最適化されたベクターで形質転換された、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−プシコースは、Ｄ−アルロースとも呼ばれ、フルクトースの希少糖エピマーである。これは自然界に見られるが、食用キノコ、ジャックフルーツ、小麦、及びズイナ（Ｉｔｅａ）属植物などに非常に低濃度で見られる。
【０００３】
フルクトースとは反対に、ヒトにおけるプシコースの代謝は、一部は吸収されてエネルギーに代謝され、一部は変化せずに尿及び糞便中に排泄される。
【０００４】
Ｄ−プシコースは、ノンカロリーの性質、スクロースと同等の甘味、血糖反応の低下に対するプラスの効果、抗肥満効果などを有する。そして、これは糖尿病又は肥満などの生活習慣病の予防に特に有用である。
【０００５】
Ｄ−プシコースは化学的に合成することが非常に困難である。したがって、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼという酵素を使用したエピマー化によるＤ−フルクトースとＤ−プシコースの間の転換は、Ｄ−プシコース産生の魅力的な方法と考えられてきた。
【０００６】
その目的で、弱酸安定性、熱安定性であり、より高い触媒効率及び基質Ｄ−フルクトースの代謝回転を有する、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの改善されたバリアントが提供されている（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６８６２８）。この国際出願はまた、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの前記改善されたバリアントをコードする核酸を有する宿主細胞（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又はバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）を開示している。
【０００７】
別の戦略は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に中に、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）からのＤ−プシコース−３−エピメラーゼをクローニング及び発現させることであった（Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ−３−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ  Ｈ１０，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，５９，７７８５−７７９２，Ｗａｎｍｅｎｇ  Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０００８】
バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるクロストリジウム・シンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ３５７０４）からのＤ−プシコース−３−エピメラーゼのクローニング及び発現も開示されている。Ｄ−プシコース−３−エピメラーゼをコードする遺伝子を発現するプラスミドで形質転換されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の組換え株の選択は、Ｄ−アラニン欠損選択マーカー（ＣＮ１０４８９４０４７）に基づく。
【０００９】
しかしながら、本発明の発明者らは、特にバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌株における酵素発現系の活性が低いために、これらの戦略は産
業上の利用には適切ではなかったと考える。
【００１０】
したがって、Ｄ−プシコース−３−エピメラーゼの産生を改善する必要性、及びＤ−プシコースの産生を改善する必要性が依然として存在する。方法は、産業上の利用に適しており、費用対効果の高いものでなければならない。方法は、安全及び環境規制にも準拠していなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明は、産業上の利用に適しており、費用対効果が高く、安全及び環境規制に準拠した、Ｄ−プシコース−３−エピメラーゼの産生を改善する方法、及びＤ−プシコースの産生を改善する方法を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明は、Ｄ−プシコース−３−エピメラーゼ産生及びＤ−プシコース産生を改善するために、（ｉ）バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の最適化された株を開発するだけでなく、（ｉｉ）より高いＤ−プシコース−３−エピメラーゼ発現のために最適化されたベクターを開発することも必要であったことを示す発明者らの予想外の結果に依拠するものである。
【００１３】
本発明はまた、より高いＤ−プシコース−３−エピメラーゼ発現のために最適化された発酵培地と比較した、本発明者らの予想外の結果にも依拠するものである。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、最適化されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列を含む最適化された核酸分子、最適化された組換え発現ベクター、最適化された組換え宿主細胞、及びＤ−プシコース３−エピメラーゼの産生方法及びＤ−プシコースの産生方法におけるそれらの使用である。最適化された組換えバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を取得する方法、及び最適化された発酵培地も、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、第１の態様では、本発明は、アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子が不活性化され、胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子の不活性化、及び／又はエリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットの不活性化から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子不活性化を有する、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に関する。
【００１６】
本発明による「バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株」という用語は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びサブティリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種に属する細菌の任意の株を意味する。これらの生物の細胞は幅が１μｍ未満で、胞子嚢は肥大しておらず、胞子は楕円体である。バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｓｔ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ａｒｙａｌ  Ｓ．２０１６．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｉｎｆｏ．ｃｏｍ／ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ−ｔｅｓｔ−ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｏｆ−ｂａｃｉｌｌｕｓ−ｓｕｂｔｉｌｉｓ／に記載される方法などの、いくつかの方法によって同定できる。本発明の実施形態では、「バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株」は、単離及び／又は精製される。
【００１７】
本発明による「アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子」という用語は、Ｌ−アラニンから
Ｄ−アラニンへの化学反応を触媒する酵素Ｄ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を意味する。「ａｌｒＡ」遺伝子は「ｄａｌ」遺伝子とも呼ばれ、配列番号１７で表される。配列番号１７（１．１７ｋｂのＤＮＡ断片）は、ａｌｒＡ構造遺伝子全体（ＧｅｎＢａｎｋにおいて番号ＣＡＢ１２２７１．１で識別されるＤ−アラニンラセマーゼをコードする）及びその発現の制御シグナルを含有する。細菌の大部分において、Ｄ−アラニンは細胞壁を形成するためのグリカンサブユニット（ペプチドグリカンから構成される）の重要な構成要素である。アラニンは通常、Ｌ−立体異性体として自然界に存在し、細胞の成長に不可欠な細胞質のＤ−アラニンラセマーゼ（ａｌｒＡ）によるＤ−アラニンへの変換を行う。酵素の不足は、ペプチドグリカン生合成の初期ステップの失敗により、急速な細胞溶解を引き起こす。本発明によれば、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、Ｄ−アラニンラセマーゼ遺伝子が挿入されているベクターで形質転換されることが意図されている。したがって、ａｌｒＡ遺伝子が欠失している（バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が「Ｄ−アラニン欠損」であることを意味する）、及び前記ベクターでの形質転換に成功した、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、Ｄ−アラニンの補充なしで増殖することができる。この戦略の主な利点は、抗生物質を含まない複合培地で組換えバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の直接選択を提供することである。さらに、Ｄ−アラニンラセマーゼは細胞壁代謝に関与しているため、活性化の喪失は、細胞溶解を引き起こし、ベクターを失ったバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（細胞）集団の蓄積を防止する。本発明において、用語「ａｌｒＡ遺伝子」、「ｄａｌ遺伝子」、「アラニンラセマーゼ遺伝子」、アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子及び「Ｄ−アラニンラセマーゼ遺伝子」は、他の用語の代わりに使用することができる。
【００１８】
本発明による「胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子」という用語は、内生胞子成熟のステージＩＶの間に作用する遺伝子を意味する。この遺伝子の正確な機能は知られていないが、その不活性化／欠失は、完全な胞子形成の中断につながる。この「ｙｆｑＤ遺伝子」は、配列番号１８によって表される。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌は、休眠状態に入るための、特化された、非常に耐性があり、非生殖的な構造である、内生胞子を産生することが知られている。細菌の内生胞子は、好ましい条件が現れると、細胞が生細胞を回復するために必要な全ての物質を保持する。内生胞子は菌株の完璧な播種因子であり、環境及び健康汚染の深刻なリスクである。特に産業上の使用を目的としたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株では、内生胞子形成経路が中断された菌株を有することが重要である。したがって、胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子が欠失したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、安全及び環境規制に準拠している。菌株が胞子形成不全であるかどうかを判断するために、菌株に熱処理を適用することができる。菌株が明色の胞子を産生できる場合、菌株は胞子形成不全ではなく、菌株が明色の胞子を産生できない場合、菌株は胞子形成不全である。
【００１９】
「エリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセット」という用語は、ＥｍＲ遺伝子及びｃｏｍＫ遺伝子を含有するカセットを意味する。驚くべきことに、一部のバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株がエリスロマイシンに耐性であることが実際に本発明者らによって見出された。本発明のバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株では、ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットは不活性化され、特に除去される。そして、「エリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットの欠失」とは、「エリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットの除去」を意味する。上記カセットは、配列番号１９で表される。株がエリスロマイシンに耐性又は感受性であるかどうかを判断ために、次の試験を適用することができる。菌株を高濃度のエリスロマイシン（例えば、５μｇ／ｍＬ）と接触させ、菌株がまだ培養できる場合、菌株はエリスロマイシンに耐性であり、菌株が培養できない場合、菌株はエリスロマイシン
に感受性である。したがって、エリスロマイシン耐性遺伝子が欠失しているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、安全及び環境規制に準拠している。
【００２０】
したがって、一実施形態では、本発明は、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に関し、ここで、配列番号１７で表されるアラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子、又は配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を有する配列は不活性化されており、配列番号１８で表される胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子、又は配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有する配列の不活性化、及び／又は配列番号１９で表されるエリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセット、又は配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を有する配列の不活性化から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子不活性化を有する。２つの配列（Ａ）と（Ｂ）の間の同一性の割合は、アライメントされた同一のアミノ酸残基の総数を、配列（Ａ）と（Ｂ）の間の最長の配列に含有される残基の総数で割ることによって取得できる。配列の前記アライメントは、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈのグローバルアライメントのためのアルゴリズムを使用して、周知の方法によって実行することができる。「少なくとも８０％の同一性」という用語は、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び１００％、特に９０％、好ましくは９５％、さらにより好ましくは９９％の配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９との同一性を意味する。
【００２１】
本発明による「不活性化された」及び「遺伝子不活性化」という用語は、遺伝子が１つ又はいくつかの変異によって欠失又は不活性化されることを意味する。変異誘発は、部位特異的及び／又は無作為であり得る。変異誘発は、１つ又はいくつかのヌクレオチドの挿入、欠失、置換であり得る。好ましい実施形態では、「不活性化された」及び「遺伝子不活性化」は、遺伝子が欠失していることを意味する。別の好ましい実施形態では、これは遺伝子座が欠失していることを意味する。好ましい実施形態では、遺伝子（単数又は複数）はノックアウトされる。遺伝子の欠失は、当業者に知られている任意の技術によって達成することができ、例えば、Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステム、他の部位特異的リコンビナーゼシステム（例えば、ＦＬＰ、Ｄｒｅ）、又はＭａｚＦベースのシステム（すなわち、ＭａｚＦカセットの使用による）などの類似の方法によって、遺伝子をノックアウトすることができる。
【００２２】
一実施形態では、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子及び胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子が、特に遺伝子の欠失により、不活性化された株である。そのようなバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５２で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された菌株である。この菌株は、本発明の実施例においてＢｓＲ４と呼ばれる。
【００２３】
別の実施形態では、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子及びエリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットが、特に遺伝子の欠失により、不活性化された株である。そのようなバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５１で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された菌株である。この菌株は、本発明の実施例においてＢｓＲ３と呼ばれる。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子、エリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセット、及び胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子が、特に遺伝子の欠失により、不活性化された株である。そのような菌株の一例は、受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５３で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された菌株である。この菌株は、本発明の実施例においてＢｓＲ５と呼ばれる。
【００２５】
上記の株ＢｓＲ３、ＢｓＲ４及びＢｓＲ５は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５，２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅにある、パスツール研究所のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されている。
【００２６】
第２の態様では、本発明は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の変異誘発又は遺伝子形質転換を含む、上記のような遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を取得する方法に関する。特に、そのような方法は、株ＢｓＲ３、ＢｓＲ４及びＢｓＲ５を取得することを可能にする。
【００２７】
本発明による「遺伝子形質転換」とは、特に遺伝子の欠失を意味する。
【００２８】
したがって、一実施形態では、本発明は、Ｄ−アラニン欠損（ａｌｒＡ−）且つエリスロマイシン感受性且つ／又は胞子形成不全であるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、好ましくはＤ−アラニン欠損（ａｌｒＡ−）且つエリスロマイシン感受性且つ胞子形成不全であるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を取得する方法に関する。
【００２９】
一実施形態では、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株、特に株ＢｓＲ４を取得する前記方法は、以下のステップ： 
−（ａ）Ｄ−アラニン欠損バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ａｌｒＡ−）を提供するために、好ましくはＣｒｅ／Ｌｏｘシステムによって、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子が欠失されるステップ；
−（ｂ）胞子形成不全、且つＤ−アラニン欠損（ａｌｒＡ−）バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を提供するために、好ましくはＭａｚＦベースのシステムを使用することによって、胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子が欠失されるステップ
を含む。
【００３０】
この実施形態において、ステップ（ｂ）は、好ましくは、ステップ（ａ）で取得したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に対して実施される。一実施形態では、ステップ（ｂ）で取得した菌株は、エリスロマイシン感受性又はエリスロマイシン耐性、好ましくはエリスロマイシン耐性である。
【００３１】
胞子形成不全、且つＤ−アラニン欠損（ａｌｒＡ−）であるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、例えば、実施例３．２．ａに記載されているように取得することができる。
【００３２】
別の実施形態では、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株、特に株ＢｓＲ３を取得する前記方法は、以下のステップ：
−（ａ）Ｄ−アラニン欠損バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ａｌｒＡ−）を提供するために、好ましくはＣｒｅ／Ｌｏｘシステムによって、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアラニンラセマーゼａ
ｌｒＡ遺伝子が欠失されるステップ；
−（ｂ）エリスロマイシン感受性且つＤ−アラニン欠損バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ａｌｒＡ−）を提供するために、好ましくはＭａｚＦベースのシステムを使用することによって、エリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットが除去／欠失されるステップ
を含む。
【００３３】
この実施形態において、ステップ（ｂ）は、好ましくは、ステップ（ａ）で取得したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に対して実施される。一実施形態では、ステップ（ｂ）で取得した菌株は、胞子形成不全又は胞子形成効率がよく、好ましくは胞子形成不全である。
【００３４】
エリスロマイシン感受性、且つＤ−アラニン欠損（ａｌｒＡ−）であるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、例えば、実施例３．１に記載されているように取得することができる。
【００３５】
好ましい別の実施形態では、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株、特に株ＢｓＲ５を取得する前記方法は、以下のステップ：
−（ａ）Ｄ−アラニン欠損バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ａｌｒＡ−）を提供するために、好ましくはＣｒｅ／Ｌｏｘシステムによって、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子が欠失されるステップ；
−（ｂ）エリスロマイシン感受性且つＤ−アラニン欠損バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ａｌｒＡ−）を提供するために、好ましくはＭａｚＦベースのシステムを使用することによって、エリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットが除去／欠失されるステップ；
−（ｃ）エリスロマイシン感受性、胞子形成不全、且つＤ−アラニン欠損（ａｌｒＡ−）バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を提供するために、好ましくはＭａｚＦベースのシステムを使用することによって、胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子が欠失されるステップ
を含む。
【００３６】
エリスロマイシン感受性、胞子形成不全、且つＤ−アラニン欠損（ａｌｒＡ−）であるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、例えば、実施例３．２．ｂに記載されているように取得することができる。
【００３７】
この実施形態において、ステップ（ｂ）は、好ましくは、ステップ（ａ）で取得したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に対して実施され、ステップ（ｃ）は、好ましくは、ステップ（ｂ）で取得したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に対して実施される。別の実施形態では、胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子の欠失は、エリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットの欠失の前に実施することができる。
【００３８】
第３の態様では、本発明は、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列、及び配列番号１又は配列番号２を含むか又はそれからなる配列を含む、単離された核酸分子に関する。
【００３９】
配列番号１及び配列番号２は、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ発現のために最適化された５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の配列に対応している。そのような配列は、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列の上流にある。好ましい実施形態では、配
列番号１又は配列番号２は、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列のＡＴＧコドンの直接上流にある。この実施形態では、配列番号１又は配列番号２の最後の塩基の後に、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列のＡＴＧコドンの最初の塩基が続く。配列番号１又は配列番号２を含むか又はそれからなる配列は、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。本発明による「作動可能に連結された」という用語は、配列番号１又は配列番号２を含むか又はそれからなる配列が、これらの配列番号１又は配列番号２を含むか又はそれからなる配列がＤ−プシコース３−エピメラーゼの発現を制御することを可能にするような方法で、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする配列に結合又は連結されていることを意味する。配列番号１又は配列番号２は、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列とは反対に、非コード配列である。より正確には、配列番号１又は配列番号２は、最適化されたリボソーム結合部位である。
【００４０】
本発明による「Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ」又は「ＤＰＥａｓｅ」という用語は、そのＤ−プシコースが最適な基質であるケトース３−エピメラーゼを指す。これは、Ｄ−フルクトースをＤ−プシコースに改変する能力を有する酵素を指す。
【００４１】
好ましい実施形態では、本発明は、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列、及び配列番号２を含むか又はそれからなる配列を含む、単離された核酸分子に関する。
【００４２】
一実施形態では、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列は、配列番号３、配列番号４の核酸配列、又は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３をコードする核酸から選択され、好ましくは、配列番号４である。配列番号５〜配列番号１３は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６８６２８に開示される最適化されたバリアント、すなわち２１１位にセリン残基を有する最適化されたバリアントをコードする核酸に対応する。
【００４３】
本発明による「核酸」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。「ＤＮＡ」という用語は、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ又は人工的に合成されたＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。好ましい実施形態では、本発明の核酸はＤＮＡである。遺伝子コードの縮重の結果として、多数のヌクレオチド配列が所定のタンパク質をコードし得ることが理解されよう。一実施形態では、前記核酸分子は人工的である。
【００４４】
本発明によれば、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸は、エピソーム配列として宿主細胞に存在することができるか、又はその染色体に組み込むことができる。Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸は、宿主細胞中に１つのコピー又はいくつかのコピーで存在することもできる。
【００４５】
本発明はまた、上記のような核酸分子の発現カセットに関する。その実施形態では、この発現カセットは、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの発現に必要な全ての要素、特に宿主細胞における転写及び翻訳に必要な全ての要素を含む。
【００４６】
第４の態様では、本発明は、上記のような核酸分子、又は上記のような核酸分子の発現カセットを含む、組換え発現ベクターに関する。別の実施形態では、前記組換え発現ベクターは、配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６を含むか又はそれからなる。
【００４７】
「組換え発現ベクター」という用語は、その発現に必要／不可欠な要素を含む、すなわち、宿主細胞においてＤ−プシコース３−エピメラーゼを発現することを可能にするベクターを意味する。好ましくは、ベクターは、自己複製可能なベクターである。特に、ベク
ター又は発現カセットはまた、プロモーター配列（例えば、プロモーターＰ４３）、ターミネーター配列及び任意選択によりエンハンサーを含む。
【００４８】
本発明による「ベクター」は、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、等であり得る。好ましい実施形態では、ベクターはプラスミドである。好ましい実施形態では、ベクターは、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする配列を宿主細胞の染色体に組み込むのに適した組み込みベクターである。より好ましくは、本発明の組換え発現ベクターは、配列番号１６を含むか又はそれからなる。
【００４９】
第５の態様では、本発明は、上記のような核酸、又は上記のような組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【００５０】
本発明による「宿主細胞」という用語は、原核生物又は真核生物の宿主細胞であり得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＧＲＡＳ（一般に安全と認められている）株、より好ましくはバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、上記で定義されるような遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。
【００５１】
一実施形態では、細胞は非ヒト及び非胚性である。
【００５２】
一実施形態では、宿主細胞は、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼが宿主細胞によって発現されるような条件下で培養される。好ましい実施形態では、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼは培養培地から回収される。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１６を含む又はそれからなる組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【００５４】
一実施形態では、宿主細胞は、配列番号１４を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５１で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。これは、ｐＲ１と呼ばれるプラスミドで形質転換されたＢｓＲ３と呼ばれる菌株を指す。
【００５５】
別の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１５を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５１で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。これは、ｐＲ２と呼ばれるプラスミドで形質転換されたＢｓＲ３と呼ばれる菌株を指す。
【００５６】
別の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１６を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５１で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。これは、ｐＲ３と呼ばれるプラスミドで形質転換されたＢｓＲ３と呼ばれる菌株を指す。
【００５７】
別の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１４を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５２で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。これは、ｐＲ１と呼ばれるプラスミドで形質転換されたＢｓＲ４と呼ばれる菌株を指す。
【００５８】
別の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１５を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５２で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。これは、ｐＲ２と呼ばれるプラスミドで形質転換されたＢｓＲ４と呼ばれる菌株を指す。
【００５９】
別の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１６を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５２で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。これは、ｐＲ３と呼ばれるプラスミドで形質転換されたＢｓＲ４と呼ばれる菌株を指す。
【００６０】
別の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１４を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５３で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。これは、ｐＲ１と呼ばれるプラスミドで形質転換されたＢｓＲ５と呼ばれる菌株を指す。
【００６１】
別の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１５を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５３で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。これは、ｐＲ２と呼ばれるプラスミドで形質転換されたＢｓＲ５と呼ばれる菌株を指す。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、配列番号１６を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５３で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。これは、ｐＲ３と呼ばれるプラスミドで形質転換されたＢｓＲ５と呼ばれる菌株を指す。
【００６３】
「遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株であり、核酸を含む宿主細胞」という用語は、前記遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株が、核酸又は核酸を含むベクターで形質転換されていることを意味する。本明細書中で使用される場合、「形質転換された」という用語は、「安定して形質転換された」を意味し得、ヌクレオチド配列が人の介入によって導入された細胞を指す。「形質転換する」又は「形質転換すること」又は「形質転換された」という用語は、「改変」又は「改変すること」又は「改変された」という意味によって理解することもできるが、使用されるベクターに応じて、「トランスフェクション」又は「トランスフェクトすること」又は「トランスフェクトされた」及び「形質導入」又は「形質導入すること」又は「形質導入された」をも意味する。
【００６４】
第６の態様では、本発明は、上記のように、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼを発現する組換えバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を取得する方法に関し、以下のステップ：
−（ａ）アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子が不活性化され、胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子の不活性化、及び／又はエリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットの不活性化から選択される少なくとも１つのさらなる遺伝子不活性化を有する、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を取得するステップ；
−（ｂ）ステップ（ａ）で取得した前記遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列、及び配列番号１又は配列番号２を含むか又はそれからなる配列を含む核酸分子を含むベクターで形質転換するステップ
を含む。
【００６５】
一実施形態では、上記のように、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼを発現する組換えバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を取得する方法は、以下のステップ：
−（ａ）アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子及び胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子が不活性化された、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を取得するステップ；
−（ｂ）ステップ（ａ）で取得した前記遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列、及び配列番号１又は配列番号２を含むか又はそれからなる配列を含む核酸分子を含むベクターで形質転換するステップ
を含む。
【００６６】
一実施形態では、上記のように、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼを発現する組換えバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を取得する方法は、以下のステップ：
−（ａ）アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子及びエリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットが不活性化された、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を取得するステップ；
−（ｂ）ステップ（ａ）で取得した前記遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列、及び配列番号１又は配列番号２を含むか又はそれからなる配列を含む核酸分子を含むベクターで形質転換するステップ
を含む。
【００６７】
好ましい一実施形態では、上記のように、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼを発現する組換えバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を取得する方法は、以下のステップ：
−（ａ）アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子、エリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセット、及び胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子が不活性化された、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を取得するステップ；
−（ｂ）ステップ（ａ）で取得した前記遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼをコードする核酸配列、及び配列番号１又は配列番号２を含むか又はそれからなる配列を含む核酸分子を含むベクターで形質転換するステップ
を含む。
【００６８】
好ましい一実施形態では、上記のように、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼを発現する組換えバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を取得する方法は、以下のステップ：
−（ａ）アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子、エリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセット、及び胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子が不活性化された、遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を取得するステップ；
−（ｂ）ステップ（ａ）で取得した前記遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、配列番号１６を含むか又はそれからなるベクターで形質
転換するステップ
を含む。
【００６９】
好ましい一実施形態では、上記のように、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼを発現する組換えバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を取得する方法は、以下のステップ：
−（ａ）Ｄ−アラニン欠損バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ａｌｒＡ−）を提供するために、好ましくはＣｒｅ／Ｌｏｘシステムによって、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子を欠失させるステップ；
−（ｂ）エリスロマイシン感受性且つＤ−アラニン欠損バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ａｌｒＡ−）を提供するために、好ましくはＭａｚＦベースのシステムを使用することによって、ステップ（ａ）で取得したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株のエリスロマイシン耐性ＥｍＲ−ｃｏｍＫ遺伝子カセットを欠失させるステップ；
−（ｃ）エリスロマイシン感受性、胞子形成不全、且つＤ−アラニン欠損（ａｌｒＡ−）バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を提供するために、好ましくはＭａｚＦベースのシステムを使用することによって、ステップ（ｂ）で取得したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の胞子形成ｙｆｑＤ遺伝子を欠失させるステップ；
−（ｄ）ステップ（ｃ）で取得した前記遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、配列番号１６を含むか又はそれからなるベクターで形質転換するステップ
を含む。
【００７０】
第７の態様では、本発明は、特に発酵プロセスによって、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼを産生する方法に関し、これは、上記のような組換え宿主細胞を培養すること、及び任意選択により得られた培養物から産生したＤ−プシコース３−エピメラーゼを回収することを含む。
【００７１】
本発明はまた、本発明によるＤ−プシコース３−エピメラーゼを産生するための、上記のような核酸、発現カセット、発現ベクター、又は宿主細胞の使用に関する。
【００７２】
一実施形態では、そのようなＤ−プシコース３−エピメラーゼの産生方法は、以下のステップ：
−上記のような組換え宿主細胞を、少なくとも６０ｇ／Ｌ、特に６０ｇ／Ｌの糖濃度を含む適切な培地で培養するステップ；
−及び任意選択により得られた培養物から産生したＤ−プシコース３−エピメラーゼを回収するステップ
を含む。
【００７３】
一実施形態では、適切な培養培地は、適切な発酵培地である。
【００７４】
好ましい実施形態では、糖はグルコースである。本発明の発明者らはまた、驚くべきことに、約６０ｇ／Ｌのグルコース濃度の使用が、本発明によるＤ−プシコース３−エピメラーゼの産生のために最適化された濃度であることを見出した。この量は特に２０Ｌのバッチに適合し、必要に応じて他のバッチに適合する。適切な培地の他の成分は、当業者にとって明らかであろう。例えば、適切な培地は、酵母、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、２Ｈ２Ｏ、ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ、等も含み得る。有利には、培養培地は、炭素源（グルコースなど）、窒素源（酵母、酵母エキス（単数又は複数）又はアミノ酸など）、塩（硫酸アン
モニウムなど）、微量栄養素（鉄及びマグネシウム塩など）、及び必要に応じて有機ビタミンを含有する。温度、ｐＨなどの他の特定の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に使用されるものであってよく、当業者にとって明らかであろう。例えば、温度は３０℃を超えていてもよく（特に３６．５〜３７．５℃）、ｐＨは約６であってもよい。
【００７５】
好ましい実施形態では、培養はバッチ培養で行われる。
【００７６】
好ましい一実施形態では、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの産生方法において使用される宿主細胞は、配列番号１６を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５３で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株（すなわち、ｐＲ３と呼ばれるプラスミドで形質転換されたＢｓＲ５と呼ばれる菌株）である。
【００７７】
第８の態様では、本発明は、Ｄ−プシコースを産生するための、本発明に従って取得したＤ−プシコース３−エピメラーゼの使用に関する。
【００７８】
一実施形態では、本発明は、
−（ａ）上記で定義されるような組換え宿主細胞を培養するステップ；
−（ｂ）得られた培養物から産生したＤ−プシコース３−エピメラーゼを回収するステップ；
−（ｃ）ステップ（ｂ）で取得したＤ−プシコース３−エピメラーゼをＤ−プシコース３−エピメラーゼ活性に適した条件でＤ−フルクトースと接触させるステップ；及び
−（ｄ）任意選択により、産生したＤ−プシコースを回収するステップ
を含む、Ｄ−プシコースを産生するための方法に関する。
【００７９】
好ましい一実施形態では、Ｄ−プシコースの産生方法において使用される組換え宿主細胞は、配列番号１６を含むか又はそれからなる核酸を含む、番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５２５３で２０１７年１０月１８日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された遺伝子改変バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株（すなわち、ｐＲ３と呼ばれるプラスミドで形質転換されたＢｓＲ５と呼ばれる菌株）である。
【００８０】
Ｄ−プシコースを産生するための適切な条件は、当業者によって定義され得る。
【００８１】
以下の表１は、本発明で使用される配列について言及する。
【００８２】
【表１】
2021501595.tif 000002
【００８３】
【表２】
2021501595.tif 000003
【００８４】
【表３】
2021501595.tif 000004
【００８５】
【表４】
2021501595.tif 000005
【００８６】
【表５】
2021501595.tif 000006
【００８７】
【表６】
2021501595.tif 000007
【００８８】
【表７】
2021501595.tif 000008
【００８９】
【表８】
2021501595.tif 000009
【００９０】
【表９】
2021501595.tif 000010
【００９１】
【表１０】
2021501595.tif 000011
【００９２】
【表１１】
2021501595.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ａｌｒＡ構造遺伝子の欠損の戦略の実施例を表す。
【図２】ベクター／プラスミドｐＲ１とも呼ばれるプラスミドｐＵＢ−Ｐ４３−ＤＰＥａｓｅ−ａｌｒＡの構築を表す。
【図３】ベクター／プラスミドｐＲ１／ｐＲ２／ｐＲ３の概要を表す。ｐＲ２／ｐＲ３の翻訳効率に関して改変された配列領域は、黒色の四角で略示される。
【図４】β−ガラクトシダーゼゲノム遺伝子座（ｇａｎＡ１／ｇａｎＡ２；野生型産物：２．１Ｋｂ）のＰＣＲ分析を表す。ＤＮＡは、ＢｓＲの３つの独立したコロニー、バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ７５１及びタイプ１６８株としての２つの収集株、Ｍ１遺伝子定規１００ｂｐ；Ｍ２、遺伝子定規１Ｋｂラダーから適用した。
【図５】ＭａｚＦカセットを使用したカセットＥｍＲ−ＣｏｍＫ除去の系統図を表す。Ｘは、乗換事象を示す。
【図６】ｇａｎ遺伝子座特異的プライマーを用いたＢｓＲクローンにおけるＥｍＲ−ＣｏｍＫカセットのＰＣＲ分析を表す。１：ＢｓＲ原株、２−５：Ｅｍ感受性クローン、Ｍ：遺伝子定規１ｋｂラダー。
【図７】図７Ａは特異的ｙｑｆＤ領域プライマーを使用したＤ−アラニン栄養要求性ｙｑｆＤ（ＢｓＲ４）変異候補クローンのＰＣＲ分析を表す。図７Ｂは分析プライマーの欠損及び位置の前後の胞子形成遺伝子座ｙｑｆＤの遺伝的構成を表す。１−５  ＢｓＲ４．＃１−５（１．７ｋｂ産物は、ｙｑｆＤの欠損を示す）；６：ｙｑｆＤ野生型に予想されるＢｓＲ原株）；Ｍ：Ｇ遺伝子定規１ｋｂラダー。
【図８】ＬＢ＋Ｄ−アラニン補充におけるΔｙｑｆＤ（ＢｓＲ４）の表現型分析を表す。図８ＡはＢｓＲ４株を表し、図８ＢはＢｓＲ株を表す。各図とも、左側が熱処理前、右側が熱処理後である。
【図９】Ｄ−アラニン原栄養性の喪失を介したＢｓＲ５変異候補の表現型スクリーニングを表す。組み込まれた変異誘発カセットの切除に成功したクローンは、もはやＬＢ上では成長せず（図９Ｂ）、Ｄ−アラニンを補充した培地に厳密に依存する（図９Ａ）。
【図１０】適用された菌株プラットフォーム派生と遺伝的事象の概略図を表す。
【図１１】ワーキングセルバンクの調製の概要を表す。
【図１２】Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ及びその安定化ステップを提供する菌株培養の概要を表す。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態及び側面を実証及びさらに例示するために提供され、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９５】
実施例１：クロストリジウム・セルロリティカムＨ１０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ  Ｈ１０）株からＤ−プシコースエピメラーゼを産生する組換え型バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の構築
細菌の大部分において、Ｄ−アラニンは細胞壁を形成するためのグリカンサブユニット（ペプチドグリカン）の重要な構成要素である。
【００９６】
アラニンは通常、Ｌ−立体異性体として自然界に存在し、細胞の成長に不可欠な細胞質のＤ−アラニンラセマーゼ（ａｌｒＡ）によるＤ−アラニンへの変換を行う。
【００９７】
酵素の不足は、ペプチドグリカン生合成の初期ステップの失敗により、急速な細胞溶解を引き起こす。
【００９８】
ａｌｒＡ構造遺伝子全体（ＧｅｎＢａｎｋ、番号ＣＡＢ１２２７１．１）及びその発現の制御シグナルは、１．１７ｋｂＤＮＡ断片（配列番号１７）内に含有されていた。
【００９９】
１．ＢｓＲと呼ばれるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主の構築
ＰＣＲによる抗生物質耐性マーカーカセットと隣接する相同性領域の融合は、Ｓｈｅｖｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｉｋｏｌａｉ  Ａ．Ｓｈｅｖｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４（３２）：ｅ１９）に記載されている。簡潔には、次のように行われた。
【０１００】
ｌｏｘ７１−ｓｐｃ−ｌｏｘ６６カセットは、Ｐ１／Ｐ２プライマー対を使用してベクターｐ７Ｓ６から増幅された。２つの追加のプライマー対（Ｐ３／Ｐ４及びＰ５／Ｐ６）を使用して、Ｄ−アラニンラセマーゼ領域に隣接する約９００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、そのフロントエンド及びバックエンドを削除した。
【０１０１】
増幅されたマーカーカセットの５’及び３’末端に相補的な３２ヌクレオチド（ｎｔ）の伸長が、フロント及びバック隣接領域のリバース及びフォワードプライマーの５’末端にそれぞれ追加された。最後に、２つの隣接する相同性領域及びｌｏｘ７１−ｓｐｃ−ｌｏｘ６６カセットをＰＣＲで融合した。
【０１０２】
ＰＣＲ産物をバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主に直接、形質転換した（ＰＣＲ産物は２つの隣接する相同性断片のためにバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体と組み換えられている）。
【０１０３】
形質転換体クローンは、スペクチノマイシン（Ｓｐｃ）（１００μｇ／ｍＬ）及びＤ−アラニン（２００μｇ／ｍＬ）の両方で濃縮されたＬＢ寒天上で選択された。
【０１０４】
表現型を提供する陽性クローン［ａｌｒＡ−；ＳｐｃＲ］は、さらなる変更のために選択された。
【０１０５】
次に、抗生物質耐性遺伝子スペクチノマイシン（Ｓｐｃ）は、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステムにより欠損させた。
【０１０６】
最後に、アラニンラセマーゼａｌｒＡ遺伝子が削除されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主［ａｌｒＡ−］が取得される（図１）。このバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、ＢｓＲと呼ばれる。
【０１０７】
２．組換えプラスミド及び抗生物質を含まないバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＰＥａｓｅプロデューサーの構築
バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）内因性プロモーターＰ４３は、周知の菌株であるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８染色体からプライマー対Ｐ７／Ｐ８を使用して増幅された。遺伝子座タグＹＰ＿００２５０５２８４を含むタンパク質をコードするクロストリジウム・セルロリティカムＨ１０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ  Ｈ１０）（ＡＴＣＣ３５３１９）のＤ−プシコース３−エピメラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ  ＣＰ００１３４８．１）（配列ＩＩ）は、１）５’及び３’末端のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位の統合（さらなる遺伝子クローニングステップのため）、及び２）ＮｄｅＩ制限部位を中和するためのヌクレオチド置換Ｔ５５８Ｃ（配列番号４）により新規に合成された。
【０１０８】
Ｐ４３プロモーター及びＤ−プシコース３−エピメラーゼ遺伝子は、Ｐ７及びＰ１０プライマーを使用したＳＯＥ−ＰＣＲ（スプライシングオーバーラップ伸長ＰＣＲ）を介して発現カセットとして融合された。次に、ＰＣＲで生成されたｐ４３−ＤＰＥａｓｅカセットをｐＭＤ−１９Ｔベクターにクローニングした。
【０１０９】
発現を改善するために、ｐＵＢ１１０プラスミドを元のＨｐａＩＩプロモーターと共に使用した。
【０１１０】
プラスミド抗生物質耐性遺伝子フリーは、シンプルクローニング（Ｃｈｕｎ  Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２，７８（５）：１５９３−１５９５）と呼ばれる方法を参照して構築された。これは、制限及びライゲーション酵素を必要としない配列非依存性の方法である。
【０１１１】
プロトコルは３つのステップで構成される。
（１）直鎖状ＤＮＡ（Ｐ４３−ＤＰＥａｓｅ発現カセット及び直鎖状ｐＵＢ１１０ベクター骨格の適切なゾーン（Ｍｏｂ遺伝子領域外の断片））は、それぞれプライマーＰ１１／Ｐ１２及びＰ１３／Ｐ１４（Ｐ１１／Ｐ１２は、Ｐ１３／Ｐ１４の４０−５０ｂｐの重複する末端を含有する）を用いたＰＣＲにより別々に増幅された。
（２）これらのＤＮＡテンプレート（標的遺伝子及び対応するベクター）に基づいて、プライマーなしでＰＯＥ−ＰＣＲ（延長したオーバーラップ伸長ＰＣＲ）によりＤＮＡ多量体が生成され、
（３）ＰＯＥ−ＰＣＲ産物（ｐＵＢ−Ｐ４３−ＤＰＥａｓｅ）は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）コンピテント細胞に形質転換された。ヒット形質転換体は、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを添加することによりＬＢ寒天上で回収された。同じ方法を使用して、カナマイシン（Ｋｍ）及びブレオマイシン（Ｂｌｍ）の抗生物質耐性遺伝子領域の置換するためにＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子を挿入した。
【０１１２】
Ｄ−アラニンラセマーゼ遺伝子及びベクター骨格は、それぞれＰ１５／Ｐ１６及びＰ１７／Ｐ１８プライマーを用いたＰＣＲにより増幅された。
【０１１３】
ＤＮＡ多量体は、Ｄ−アラニン代謝産物の生合成が不全であるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）［ａｌｒＡ−］コンピテント細胞内で形質転換された。
【０１１４】
最後に、プラスミドｐＵＢ−Ｐ４３−ＤＰＥａｓｅ−ａｌｒＡ（配列番号１４）（図２）を、Ｄ−アラニンを添加せずにＬＢ寒天上で選択した。
【０１１５】
この戦略の主な利点は、抗生物質を含まない複合培地でプラスミドの直接選択を提供することである。
【０１１６】
Ｄ−アラニンラセマーゼが細胞壁代謝に関与するため、活性化の喪失は、細胞溶解を引き起こし、プラスミドを失った細胞集団の蓄積を防止する。
【０１１７】
実施例２：より高いＤＰＥａｓｅ発現のためのプラスミド最適化
実験的戦略は、上記で取得したＤＰＥａｓｅ発現宿主（ＢｓＲ）としてのバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の発現の可能性及び本質的制限を明らかにすることを目的としている。
【０１１８】
翻訳効率（ｐＲ２、ｐＲ３）によって親プラスミドｐＵＢ−Ｐ４３−ＤＰＥａｓｅ−ａｌｒＡ（ｐＲ１）標的に導入された改変。
【０１１９】
これは、ｐＲ２／ｐＲ３の場合、ある特定の時点で、ある既定の細胞で遺伝子発現が「オン」の場合、この時点でより多くのタンパク質が伝達されると予想されるべきであることを意味する。
【０１２０】
１．リボソーム結合部位（ｐＲ２）のプラスミド最適化
最適化されたＤＰＥａｓｅ発現構築物を生成するためのテンプレートとして、プラスミドｐＵＢ−Ｐ４３−ＤＰＥａｓｅ−ａｌｒＡ（又はｐＲ１）を標準ＬＢ培地で一晩培養して分離し、プラスミドフリー株を次のステップのために保持した。
【０１２１】
これらのプラスミド調製物は、バリアントリボソーム結合部位及び隣接領域のＰＣＲを介した挿入のテンプレートとして機能した（図３）。変異誘発ＰＣＲが成功した後、新しいプラスミドをバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｌｒＡ欠損プラスミドフリー株（ＢｓＲ）に戻した。
【０１２２】
形質転換に成功したクローンを標準ＬＢ培地で培養し、一次活性スクリーニングフェーズ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃１）を通過させた。
【０１２３】
次に、電気泳動及びリボソーム結合部位のゾーン変化の配列検証のために、プラスミドＤＮＡを一晩培養して調製した。
【０１２４】
下流のＤＰＥａｓｅオープンリーディングフレームとの併用で最もよく機能するｐＲ２クローンで識別された上流の配列を以下に示す。
【０１２５】
ｐＲ１（１）及びｐＲ２（２）のＤＰＥａｓｅ上流の５’非翻訳領域のヌクレオチド配列。以下の表１において、ＤＰＥａｓｅ遺伝子のＡＴＧコドンに下線が付され、ＲＢＳ改変領域は斜体太字で示される。
【０１２６】
【表１２】
2021501595.tif 000013
【０１２７】
配列番号１５のプラスミドｐＲ２は、配列番号１又は配列番号３９の最適化された配列を含有する。
【０１２８】
プロトコル＃１：ＤＰＥａｓｅ活性の酵素的検出
ＤＰＥａｓｅスクリーニングサンプルの分析は、メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅｓ）のフルクトース／グルコースアッセイキット（Ｋ−ＦＲＵＧＬ）を適用して行った。
【０１２９】
初期評価では、プシコースはいかなるシグナルも生じさせないことが明らかになり、したがって、反応におけるフルクトース含有量の減少を追跡することにより、ＤＰＥａｓｅ活性を測定できる。簡潔には、サンプルは反応前に新たに１：１０００に希釈した。
【０１３０】
較正用グルコース／フルクトース標準とフルクトース／ＰＢＳミックスは常に含まれて
いた。糖は、０−１００ｍｇ／Ｌの線形範囲で検出できた。
【０１３１】
１００μＬのサンプルをアッセイプレート（９６ウェルＭＴＰ、平底）に移した。
【０１３２】
９０μＬの反応混合物１＋２（１＆２の各溶液１０μＬ、＋７０μＬミリＱ（ｍＱ）水）を添加し、室温（ＲＴ）で数分間インキュベートした。
【０１３３】
２０μＬ反応混合物３（２μＬ溶液３＋１８μＬｍＱ水）を添加し、５分後に、ＯＤ３４０を「ブランク」として読み取り、２０μＬ反応混合物４（２μＬ溶液４＋１８μＬｍＱ水）を添加し、５分後にＯＤ３４０を残留フルクトースとして読み取った。
【０１３４】
残留フルクトースは、較正基準を使用し計算され、未処理のフルクトースサンプルと比較して変換されたプシコースを推定した。
【０１３５】
２．カスタマイズされた翻訳開始（ｐＲ３）によるベクターの確立
図３に示した以前のｐＲ２バリアントは、翻訳開始領域（スペーサー）をさらに最適化するための親プラスミドとして機能した。
【０１３６】
この目的のために、ＤＰＥａｓｅオープンリーディングフレームの上流の近位４ヌクレオチドは、ＰＣＲ変異誘発を介して無作為化された。
【０１３７】
結果として得られたプラスミドバリアントをバチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｌｒＡ欠損プラスミドフリー株（ＢｓＲ）に戻し、標準的なＬＢ寒天プレートで培養した。
【０１３８】
可能な４ヌクレオチドの全ての組み合わせをカバーするために、２０００クローンを超える変異体バンクを無作為に選び、９６ディープウェルプレートで培養した（ＤＷＰ及び一次活性スクリーニングフェーズ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃１）でＤＰＥａｓｅ発現を評価した）。
【０１３９】
ｐＲ３プラスミドを内包した最良のクローンが配列決定された（下記）。
【０１４０】
ｐＲ１（１）及びｐＲ２（２）とｐＲ３（３）のＤＰＥａｓｅ上流の５’非翻訳領域のヌクレオチド配列を以下の表２に示す。ＤＰＥａｓｅ遺伝子のＡＴＧコドンに下線が付され、ＲＢＳ改変領域が斜体太字で示され、翻訳開始領域は四角で囲まれている。
【０１４１】
【表１３】
2021501595.tif 000014
【０１４２】
配列番号１６のプラスミドｐＲ３は、配列番号２又は配列番号４０の最適化された配列を含有する。
【０１４３】
３．発現スクリーニングと酵素アッセイ
二次活性スクリーニングフェーズは、より代表的なＤＰＥａｓｅの産生のために行われた。再評価のために、より大きな容量で培養するために最良クローンを選択した。
【０１４４】
したがって、以前にｐＲ１及びｐＲ２とｐＲ３プラスミドで形質転換されたＢｓＲ株を振盪フラスコで培養した（表３）。
【０１４５】
最終点（１６時間）にサンプルを採取し、６０００ｇで１５分間遠心分離することにより細胞を収集し、上清を廃棄した。
【０１４６】
凍結乾燥により調製したクロストリジウム・セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＤＰＥａｓｅを内包した細胞ペレットを真空凍結乾燥し、粉砕して酵素粉末として直接使用した。
【０１４７】
次に、生成された各酵素粉末のＤＰＥａｓｅ活性を行った（以下に記載された方法に従う）。
【０１４８】
【表１４】
2021501595.tif 000015
【０１４９】
インキュベーション時間は、プレートでは一晩、最初の種培養では１６時間、２番目の種培養では最大Ａｂｓ６００ｎｍ、産生は１６時間であった。
【０１５０】
方法：ＤＰＥａｓｅ酵素アッセイの説明
全細胞反応を使用して生成されたＤ−プシコースの量を決定することにより、ＤＰＥａ
ｓｅ活性を測定した。
【０１５１】
１ミリリットルの反応混合物には、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７、５にＤ−フルクトース（８０ｇ／Ｌ）及び２００μＬの酵素溶液が含有されていた。細胞は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解されていた。
【０１５２】
反応を６０℃で正確に１０分間インキュベートし、１００℃で正確に１０分間煮沸することにより終了した。混合物中に生成されたＤ−プシコースは、寸法２５０ｘ４ｍｍ、＃１２５―００９４及び屈折率検出器（ｗａｔｅｒｓ  ４１０）のアミネックスＨＰＸ−８７Ｃａ２＋カラム（Ｂｉｏｒａｄ製）を取り付けたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣで検出された。
【０１５３】
カラムを８５℃で流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで、純水で溶出した。ＤＰＥａｓｅ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのＤ−プシコースの産生を触媒する酵素の量として定義された。
【０１５４】
４．ＤＰＥａｓｅのパフォーマンス結果
最高のＤＰＥａｓｅ酵素パフォーマンスを次の表４にまとめた。
【０１５５】
【表１５】
2021501595.tif 000016
【０１５６】
構築されたｐＵＢ−Ｐ４３−ＤＰＥａｓｅ−ａｌｒＡベクター（ｐＲ１）を内包するＤ−アラニンラセマーゼ欠損の初期株（ＢｓＲ）は、約１０．５７のＤＰＥａｓｅ酵素活性を示した。
【０１５７】
２ステップのプラスミド最適化では、ＲＢＳ領域の変更（ｐＲ２）及び翻訳開始スペーサーの最適化（ｐＲ３）で、それぞれ約２６．８５Ｕ／ｍＬと３８．８５Ｕ／ｍＬと高めのＤＰＥａｓｅ活性が示された。プラスミドｐＲ３は最も有望なプラスミドである。
【０１５８】
実施例３：ＤＰＥａｓｅ酵素発現増強のためのバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢｓＲの改善
プラスミドの最適化と並行して、特に規制と安全の目的のために、株ＢｓＲ自体が最適化された。
【０１５９】
ＢｓＲの抗生物質感受性は、エリスロマイシンを５μｇ／ｍＬで添加したときに菌株が増殖できることを示した。この知見は、この菌株がエリスロマイシン耐性（ＥｍＲ）であることを明確に示している。この耐性は除去されなければならない。バチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属細菌は、休眠状態に入るための、特化された、非常に耐性があり、非生殖的な構造である、内生胞子を産生することが知られている。
【０１６０】
細菌の内生胞子は、好ましい条件が現れると、細胞が生細胞を回復するために必要な全ての物質を保持する。
【０１６１】
内生胞子は菌株の完璧な播種因子であり、環境及び健康汚染の深刻なリスクである。内生胞子形成ＢｓＲの産業的用途では、内生胞子形成経路を中断することが重要である。
【０１６２】
１．ＥｍＲ−ｃｏｍＫカセットの除去：ＢｓＲ３の生成
分子生物学ツールによって酵素産生株を開発することを目指して、バチルス・サブティリス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢｓＲは、いくつかのプラスミドでの遺伝子発現の誘導因子として使用される可能性が高い異なる抗生物質（テトラサイクリン、エリスロマイシン、カナマイシン）と糖（キシロース及びマンニトール）の適用性について試験された。
【０１６３】
驚くべきことに、ＢｓＲは高コピープラスミド（５μｇ／ｍＬ）の選択圧に適用される濃度でもエリスロマイシンで培養でき、菌株はバチルス・サブティリス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（野生型）と比較してキシロースでの培養が明らかに遅れていた。
【０１６４】
バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）β−ガラクトシダーゼ遺伝子ｌａｃＡ（ｇａｎＡとも呼ばれる）は、異種発現カセットの統合部位として、及び／又はプロモーター誘導効率をテストするレポーター遺伝子として機能できるため、Ｘ−ｇａｌ寒天プレートでその機能を試験した。
【０１６５】
Ｘ―ｇａｌ（５−ブロモ―４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｃ１４Ｈ１５ＢｒＣｌＮＯ６））は、β−ガラクトシダーゼに対するラクトース感受性の類似体（酵素は、Ｄ−ラクトースのβ−グリコシド結合を切断する）は切断され、ガラクトース及び５−ブロモ―４−クロロ−３−ヒドロキシインドールは放出される。
【０１６６】
後者は、自発的に二量体化し、５，５’−ジブロモ−４，４’−ジクロロ―インディゴ（不溶性青色）に酸化される。
【０１６７】
確かに、発色性基質Ｘ−ｇａｌを含有する寒天で細胞を成長させることによりネイティブｌａｃＡ遺伝子は青色のコロニーを持ち、ｌａｃＡ遺伝子が活性であることを示す。ＢｓＲ株では、Ｘ−ｇａｌプレート上に青いコロニーは見られなかった。
【０１６８】
したがって、ｌａｃＡＰＣＲ分析は、バチルス・サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株（野生型）と比較して行われた。
【０１６９】
野生型ｌａｃＡ遺伝子が存在する場合は、２．１ｋｂの産物を提供する必要がある。ＰＣＲ分析により、約５ｋｂのより大きな増幅バンドが明らかに示され、ｌａｃＡ遺伝子座に挿入断片が含有されていることが示された（図４）。
【０１７０】
この増幅された断片を増幅し破壊して、ＥｍＲ遺伝子及びキシロース誘導プロモーターＰｘｙｌＡによって制御されたｃｏｍＫ遺伝子を含有するカセットの存在を明らかにした。
【０１７１】
ＥｍＲ−ｃｏｍＫカセット（６．２ｋｂのＰＣＲ断片）を削除するために、カウンター
セレクションマーカーとして大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）毒素遺伝子ＭａｚＦを使用した。
【０１７２】
ＭａｚＦ遺伝子は、イソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）−誘導性発現系の制御下に置かれ、ａｌｒＡ遺伝子と関連し、３つの標的配列が隣接するＭａｚＦカセットを形成した。
【０１７３】
送達ベクター及び染色体間の二重乗換事象により、標的とされたＥｍＲ−ｃｏｍＫカセットの前にＭａｚＦカセットが統合され、Ｄ−アラニンラセマーゼを含むＩＰＴＧ感受性株が生成された。２つのｇａｎＡ配列間の別の単一乗換事象により、ＭａｚＦカセットの切除が引き起こされた（図５）。
【０１７４】
次に、成功した変異体の望ましい表現型に関して、クローンを評価した。ａ）エリスロマイシン選択で増殖しない。ｂ）Ｄ−アラニンの欠乏した培地では増殖しない。
【０１７５】
後者のクローンは、２．３ｋＢの増幅断片を使用して、目的のＥｍＲ−ｃｏｍＫカセット除去遺伝子型についてＰＣＲ分析を介し正常に確認された（図６）。
【０１７６】
これらのエリスロマイシン感受性（Ｅｍｓ）及びＤ−アラニン栄養要求性クローンを、その後ＤＰＥａｓｅ発現プラスミドｐＲ３で形質転換した。
【０１７７】
外部のＤ−アラニン補充なしで、得られたクローンは、ＬＢ上で増殖することができた。
【０１７８】
２．胞子の不活性化：ＢｓＲ４及びＢｓＲ５の生成
以前に、エリスロマイシン感受性及び胞子形成不全（二重変異体ＥｍＳＳｐｏ−）のＢｓＲ５株バージョンを生成するために、内生胞子の不活性化の影響が株ＢｓＲ（ＥｍＲ−ｃｏｍＫカセットを含有する）で評価され、ＢｓＲ４、ＥｍＲ  ｓｐｏ−遺伝子型という名の単一変異体をもたらした。
【０１７９】
胞子代謝カスケードを破壊するための戦略は、胞子形成を中断するために、内生胞子成熟のステージＩＶ（胞子形成プロセス後期の一つ）の間に作用するｙｑｆＤ必須遺伝子を削除することである。
【０１８０】
ａ−単一変異株ＢｓＲ４の生成
胞子形成遺伝子ｙｑｆＤを削除するためのＤ−アラニンラセマーゼ選択可能な変異誘発カセットの確立が生成され、ＤＰＥａｓｅに内包したプラスミドがないＢｓＲに導入された。
【０１８１】
ａｌｒＡカセットは、ＥｍＲ−ＣｏｍＫカセットの除去に使用されたものと同様に、ｙｄｆＤ遺伝子欠損に特異的配列を使用して行われた。
【０１８２】
形質転換体は、Ｄ−アラニンを含まない培地で増殖する能力により首尾よく選択された。
【０１８３】
これらの候補は、変異誘発カセットとｙｑｆＤ胞子形成遺伝子（ΔｙｑｆＤ）のないクローンを導くＩＰＴＧ誘導カウンター選択に適用された。
【０１８４】
単一の変異体は、Ｄ−アラニン栄養要求性及びｙｑｆＤ遺伝子座のＰＣＲ分析により同定された（図７）。
【０１８５】
ＢｓＲ４株の胞子形成表現型を評価するために、変異体クローンをＬＢ＋Ｄ−アラニン培地で一晩培養させた。
【０１８６】
次に、培養物は、胞子形成寒天プレート（Ｄ−アラニン補充）にスポットし、大きなコロニーを形成した。
【０１８７】
胞子形成プレートを３７℃で３日間インキュベートし、顕微鏡で評価した。ＢｓＲ原株は位相差顕微鏡下で明色の（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）胞子を生成したが、ΔｙｑｆＤ変異体クローンは胞子形成の欠陥を示す位相差顕微鏡下で明色の胞子を生成しなかった（変異体が生成する胞子は明色でなく暗色であり、これは、成熟に進むことができないことを示す）。
【０１８８】
変異クローンが成熟した（生存可能な）内生胞子を生成できなかったことを確認するために、ＬＢ＋Ｄ−アラニンで一晩培養を３７℃で行った。
【０１８９】
翌日、２ｘ０．５ｍＬを無菌チューブに無菌サンプリングした。
【０１９０】
最初のチューブは、２番目のチューブが８０℃で３０分間インキュベートされたときに、ＬＢ＋Ｄ−アラニン培地に直接スポットされた。
【０１９１】
熱処理は、栄養細胞を殺すことを目的とし、成熟内生胞子だけが生き延びることができる。
【０１９２】
熱処理後、ブロスを前述のプレートにスポットした（前の未熱処理スポットのすぐ隣）。
【０１９３】
次に、プレートを３７℃で一晩インキュベートして増殖させた。予想通り、ＢｓＲ野生型クローンのみが熱処理に生き延びた。
【０１９４】
ＢｓＲ４クローンの熱処理後、細胞細片のみがスポットに見えた（図８）。
【０１９５】
ｂ−二重変異株ＢｓＲ５の生成
単一変異株ＢｓＲ４を生成するためにすでに首尾よく適用されている胞子形成遺伝子座ｙｑｆＤを標的とする変異誘発カセットは、エリスロマイシン感受性株ＢｓＲ３に導入された。
【０１９６】
ゲノム統合が成功した後、ゲノムから変異誘発カセットが切除されたクローンを同定するための変異スクリーニングが開始され、ｙｑｆＤ遺伝子の完全な削除が行われた。
【０１９７】
ＢｓＲ４株について行われたように、クローンは、成熟した内生胞子を産生することができないために選択された。一晩培養した後、熱処理の前後でサンプルはＬＢ＋Ｄ−アラニンプレートにスポットされ、その後さらに一晩３７℃でインキュベートされた。
【０１９８】
Ｄ−アラニン原栄養性の喪失につき、熱処理後に成長しなかったヒット候補を採取し、ＬＢ培地プレートにスポットし、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１９９】
ヒット候補は成長を示したものであった（図９）。
【０２００】
最後に、産業株プラットフォームであるＢｓＲ５は、環境と安全性の規制を尊重するた
めに、エリスロマイシン感受性及び胞子形成ネガティブの二重変異体として取得された（図１０）。
【０２０１】
３．ＤＰＥａｓｅ酵素産生のパフォーマンスの結果
取得した全ての菌株（ＢｓＲ３、ＢｓＲ４及びＢｓＲ５）は、ヒットプラスミドｐＲ３で形質転換された。それらは以下のプロトコル（図１１及び１２）に関して培養された。
【０２０２】
ワーキングセルバンク構築：
ワーキングセルバンクとは、２ｍＬのＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）バイアルに入った−８０℃の凍結ストックを指す。
【０２０３】
このプロセスは、３７℃、１６時間のＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５、１０Ｎソーダで調整）でのペトリ皿培養を含有する。５又は１０ｍＬの液体ＬＢ＋０．１ｍＭマンガン（ＭｎＣｌ２、４Ｈ２Ｏ  ［１３４４６−３４−９］）培地で細胞懸濁液を調製し、≒１０Ｏ．Ｄ．６００ｎｍの調製物を取得する。５０ｍＬの液体ＬＢ＋０．１ｍＭマンガンを含有する２つの側面バッフルを備えた５００ｍＬの振とうフラスコを１２１℃で２１分間滅菌する。後者の培地は、新鮮な中間懸濁液を０．１Ｏ．Ｄ．６００ｎｍに接種される。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍ（軌道＝５ｃｍ）でインキュベートし、増殖をＯ．Ｄ．６００ｎｍ測定で毎時間監視する。培養がＯ．Ｄ．６００ｎｍＭＡＸ／２に達すると、手順が１ステップ進む。次に、最終培養の正確な量を測定し、同量の凍結保護物質（３０％ｖ／ｖ）グリセロール［５６−８１−５］）をゆっくりと添加し、よく均質化するまで混合する。その後、後者の懸濁液を１．８ｍＬずつ２ｍＬバイアルに等分する。新たに満たされたバイアルは、−８０℃の冷凍庫に迅速に保管され、さらに使用するためにワーキングセルバンクを意図している。
【０２０４】
ＤＰＥａｓｅ酵素産生のための菌株培養
種培養として、バッフルなし３００ｍＬの振とうフラスコにマンガンを添加した３０ｍＬのＬＢ培地で満たし、１２１℃で２０分間加熱滅菌した。ワーキングセルバンクチューブ１．８ｍＬを接種に使用した。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍ（軌道＝５ｃｍ）で４時間インキュベートした。
【０２０５】
産生培養として、０．９ｍＬの以前の種培養を使用して、滅菌した３つの側面バッフル付３００ｍＬ振とうフラスコ及び５０ｍＬの改良ＬＢ−ＲＯＱ培地（デキストロース一水和物１５ｇ／Ｌ、酵母エキス１５／Ｌ、ＮａＣｌ［７６４７−１４−５］８ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４［７７５８−１１−４］７ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４［７７７８−７７−０］１．３ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ［１００３４−９９−８］５０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ［１００３４−９６−５］０．４ｍｇ／Ｌ、及びＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ［１３４４６−３４−９］１９ｍｇ／Ｌ）に接種した。ｐＨは中性に近い必要がある。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍ（軌道＝５ｃｍ）で１６時間インキュベートした。ＤＰＥａｓｅ酵素の評価は、実施例２で詳細に行われた。
【０２０６】
最高のＤＰＥａｓｅ酵素のパフォーマンスを以下の表５にまとめ、性能の平均値及び実行した試行回数を示す。
【０２０７】
【表１６】
2021501595.tif 000017
【０２０８】
プラスミドｐＲ３（ｐｕＢ−Ｐ４３−ＤＰＥａｓｅ−ａｌｒＡベクター）で形質転換した場合、異なる構築株プラットフォーム、ＢｓＲ３（単一変異体ＥｍＳ）、ＢｓＲ４（単一変異体ΔｙｑｆＤ）及びＢｓＲ５（二重変異体ＥｍＳ、ΔｙｑｆＤ）による連続ＤＰＥａｓｅ酵素の産生パフォーマンスを徐々に向上させることにつながった。
【０２０９】
中間的な単一変異株（ＢｓＲ３及びＢｓＲ４）は、遺伝子組み換えの影響を追跡するために、ＤＰＥａｓｅ産生について評価された。これらの２つの菌株では、パフォーマンスは影響を受けなかった。
【０２１０】
プラスミドｐＲ３で形質転換された最終株ＢｓＲ５は、環境及び安全性が最適化されており、酵素ＤＰＥａｓｅ発現の向上につながった。
【０２１１】
この菌株は、エリスロマイシン耐性手段及び内生胞子完全成熟加工装置を産生する代わりにＤＰＥａｓｅを発現する資源を節約する可能性がある。
【０２１２】
実施例４：ＤＰＥａｓｅ酵素発現増強のための発酵培地の最適化
材料及び方法
プラスミドｐＲ３で形質転換されたＢｓＲ５株で使用された株。
【０２１３】
１．１バイオマスの産生
バイオマスの産生は前培養ステップから始まる。グルコース（１５ｇ／Ｌ）、酵母エキス（１５ｇ／Ｌ）、及びＮａＣｌ（１５ｇ／Ｌ）をｐＨが調整されていない脱塩水（ＱＳ
１Ｌ）に溶解する。培地をバッフル付き三角フラスコ（２０００ｍＬ）に入れ、次に三角フラスコを１２１℃で２０分間オートクレーブし、次に１つのクライオチューブを滅菌条件で接種し、３７℃で４時間、１１０ＲＰＭでインキュベートする。
【０２１４】
前培養は、０．５Ｌの培地を含有する２Ｌ三角フラスコで行われる。光学密度が０．５から１、又はＤＣＷ（乾燥細胞重量）が０．０７から０．１８ｇ／Ｌとなるよう、三角フラスコを３７℃で３時間、１１０ＲＰＭでインキュベートする。
【０２１５】
産生ステップは、グルコース、酵母エキス及び塩をベースとする混合培地で行われる「バッチ」タイプの発酵で構成されている。培地はマイクロエアレーションされているため、ｐＯ２の管理は特殊であり、ＯＵＲ（酸素消費量）は約７ｍｍｏｌ／ｌ／ｈに維持されている。これを行うために、攪拌及びエアレーションは弱く固定されている（２００ＲＰＭで９Ｌ／ｍｉｎ。これにより、産生の３／４の間、ｐＯ２がゼロとなる。発酵中、培地
の添加（フィード）はない。ｐＨ６の調整は、アンモニア２０％（ｗ／ｗ）で設定される。
【０２１６】
１．２バイオマスの調製−粉砕
グルコースが完全に消費されたときにバイオマスが収集される。この時点で、酵素活性は最大になる。次にバイオマスを遠心分離し（１００００ｇ／５分）、５０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液ｐＨ８で洗浄する。次に、細胞をボールミルで粉砕する（３０分／２ｇビーズ／１ｇ洗浄済みマスト）。取得した混合物を、細片を除去するために、０．４５μｍフィルターを通し濾過する。取得した溶液は４℃で７日間安定である。
【０２１７】
１．３活性の測定
酵素分析は以下の条件下で行われる：８００μｌの基質（５０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ８中フルクトース４００ｇ／Ｌ）を５５℃で５分間プレインキュベートする。反応を開始するために必要な量の酵素溶液を加える。全体を５５°で１０分間インキュベートする。次に、１００℃で１０分間通過させることにより反応を停止させる。生成されたプシコースの測定は、プシコースの％面積の測定によるＨＰＬＣ（Ｃａ２＋カラム、６５℃、Ｈ２Ｏ  ０．３ｍｌ／ｍｉｎ、及び屈折率検出）によって行われる。活性は、酵素１ｍｌあたり及び反応１分あたり（Ｕ／ｍｌ）の形成されたプシコースのμｍｏｌで表される。
【０２１８】
いくつかの発酵培地を試験し、それらの組成を以下の表６に詳述する。
【０２１９】
【表１７】
2021501595.tif 000018
【０２２０】
【表１８】
2021501595.tif 000019
【０２２１】
したがって、６０ｇ／Ｌを含む発酵培地（「Ｆ２  １６０９１９」と呼ばれる培地）は、約１３９．９Ｕ／ｍＬのＤＰＥａｓｅ活性をもたらすが、１５ｇ／Ｌを含む発酵培地（
「Ｆ１  １６０８１１」と呼ばれる培地）は、約４０．０Ｕ／ｍＬのＤＰＥａｓｅ活性をもたらす。
【０２２２】
これらの結果は、少なくとも６０ｇ／Ｌの糖、特にグルコースを含む発酵培地を使用することの関心を証明している。
【０２２３】
実施例５：５’ＵＴＲのいくつかの変異ヌクレオチド配列の比較
ＤＰＥａｓｅ遺伝子のＡＴＧコドンの上流にある５’非翻訳領域のヌクレオチド配列に変異が導入されている。
【０２２４】
標準手順書（ＳＯＰ）に従って試験されたＤＰＥａｓｅ活性の結果を、以下の表７に詳述する。
【０２２５】
【表１９】
2021501595.tif 000020
【０２２６】
クローンＩＩ６及びＩＩ７は、ＳＯＰに従って分析した後、最高のＤＰＥａｓｅ活性を提供する。ただし、最適な発酵条件（実施例４を参照）でのアッセイでは、Ｉ７クローンの変異が最高のＤＰＥａｓｅ活性をもたらすことが示された。
【０２２７】
したがって、Ｉ７クローンの変異は、プラスミドｐＲ３に存在する変異である。
【受託番号】
【０２２８】
ＣＮＣＭ Ｉ−５２５１
【０２２９】
ＣＮＣＭ Ｉ−５２５２
【０２３０】
ＣＮＣＭ Ｉ−５２５３
【図１】
2021501595.tif 000021
【図２】
2021501595.tif 000022
【図３】
2021501595.tif 000023
【図４】
2021501595.tif 000024
【図５】
2021501595.tif 000025
【図６】
2021501595.tif 000026
【図７】
2021501595.tif 000027
【図８】
2021501595.tif 000028
【図９】
2021501595.tif 000029
【図１０】
2021501595.tif 000030
【図１１】
2021501595.tif 000031
【図１２】
2021501595.tif 000032
【配列表】
2021501595000001.app
【国際調査報告】
2021501595.tif 000033
2021501595.tif 000034
2021501595.tif 000035
2021501595.tif 000036
2021501595.tif 000037
2021501595.tif 000038