(57)【要約】  本発明は、生体物質を、流体サンプルから単離し、識別し、分析し、および定量化するための方法、デバイス、ならびにシステムを含む。様々な態様において、上記方法、デバイス、ならびにシステムは、最小限の量の物質を必要とし、および／または、血液、血清あるいは血漿などの複合流体から高純度の生体物質を結果としてもたらす、迅速な手順を可能にし得る。【選択図】図９
2021509265.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルを分析するための方法であって、前記方法は：
ａ）ＡＣ誘電泳動電界を生成するように構成された電極を使用して、生体サンプル中の複数の分析物を捕捉する工程であって、ここで、前記複数の分析物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、および細胞小胞からなる群から選択される少なくとも２つのタイプの分析物を含む、工程と；
ｂ）前記複数の分析物を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記生体サンプル中の前記複数の分析物を捕捉する工程は、誘電泳動低電界領域および誘電泳動高電界領域を生成するように構成された電極を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体サンプル中の前記複数の分析物を捕捉する工程は、第１の電極を使用して第１の分析物を、および第２の電極を使用して第２の分析物を優先的に捕捉することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体サンプル中の前記複数の分析物を捕捉する工程は、同じ電極上で１つを超える分析物を捕捉することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡは無細胞ＤＮＡを含む、請求項１−４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記検出する工程は、前記複数の分析物中の少なくとも２つのタイプの分析物を定量化することを含む、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記複数の分析物を検出する工程は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、あるいは細胞小胞の少なくとも２つの異なる種を検出することを含む、請求項１−６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも２つのタイプの分析物を定量化することは、１つのタイプの分析物のみを定量化する方法と比較して、方法の診断力または予測力あるいは精度を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％あるいはそれ以上増加させる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも２つのタイプの分析物を定量化することは、１のタイプの分析物のみを定量化する方法と比較して、偽陽性率を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％あるいはそれ以上減少させる、請求項６−８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも２つのタイプの分析物を定量化することは、１のタイプの分析物のみを定量化する方法と比較して、偽陰性率を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％あるいはそれ以上減少させる、請求項６−９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記方法の性能は、０．６０〜０．７０、０．７０〜０．７９、０．８０〜０．８９、あるいは０．９０〜１．００の範囲の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とする、請求項６−１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記生体サンプルは被験体から得られる、請求項１−１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
前記生体サンプルは、体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、あるいはこれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体サンプルは細胞を含み、前記方法は前記細胞を溶解する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体サンプル中で検出された前記少なくとも２つのタイプの分析物を使用して、被験体の疾患あるいは疾病を検出する工程をさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患あるいは疾病は癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
検出する工程は、癌のタイプ、癌の段階、初期の時点と比較した腫瘍量の増大、初期の時点と比較した腫瘍量の減少、初期の時点と比較して腫瘍量に変化がないこと、あるいは癌治療の有効性、または癌の不在を決定することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出する工程は、前記複数の分析物の１つの分析物を、分析物に特異的に結合する抗体と接触させることを含む、請求項１−１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
抗体は検出可能な標識を含む、請求項１−１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
前記検出可能な標識は蛍光部分を含む、請求項１−１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
前記複数の分析物の１つの分析物は、ＰＤ−Ｌ１、ＣＡ１９．９、ＣＡ１２５、ＧＰＣ−１、ＣＥＡ、ＣＡ  １５．３、プロラクチン、Ｋｉ−６７、エストロゲン受容体α、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ１０、αフェトプロテイン、サバイビン、前立腺特異抗原、ＡＺＵ１、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、およびＣＹＦＲＡ−２１からなる群から選択される、請求項１−２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
前記検出する工程は、前記複数の分析物の１つの分析物を、オリゴヌクレオチドと接触させることを含む、請求項１−２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
前記検出する工程は、前記複数の分析物の１つの分析物を、インターカレーティング色素、主溝に優先的に結合する色素、あるいは副溝に優先的に結合する色素に接触させることを含む、請求項１−２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の分析物は、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも１つを含み、ここで、前記方法は、ポリメラーゼ連鎖反応により、ＤＮＡあるいはＲＮＡの少なくとも１つを増幅する工程をさらに含む、請求項１−２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の分析物は、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも１つを含み、ここで、検出する工程は、前記ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも１つを配列決定することを含む、請求項１−２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
検出する工程は、定量的リアルタイムＰＣＲ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、直接ＳＹＢＲ  ｇｏｌｄアッセイ、直接ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ、マイクロサテライトマーカーアッセイのヘテロ結合性の喪失（ＬＯＨ）、電気泳動、メチル化分析、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＰＣＲ、およびデジタルＰＣＲからなる群の少なくとも１つを含む、請求項１−２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
前記生体サンプルは流体を含む、請求項１−２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
捕捉後に、前記分析物を前記電極から溶離する工程をさらに含む、請求項１−２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
前記誘電泳動低電界領域は、１〜４０ボルトのピーク−ピーク電圧；および／または、５Ｈｚ〜５，０００，０００Ｈｚの周期数を有する交流を使用して生成される、請求項２−２８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
前記誘電泳動高電界領域は、１〜４０ボルトのピーク−ピーク電圧；および／または、５Ｈｚ〜５，０００，０００Ｈｚの周期数を有する交流を使用して生成される、請求項２−２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
電極のアレイはヒドロゲルでコーティングされる、請求項１−３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒドロゲルは合成ポリマーの２つ以上の層を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒドロゲルは前記電極上でスピンコーティングされる、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヒドロゲルは、スピンコーティングの前に約０．５ｃＰ〜約５ｃＰの粘度を有する、請求項３１−３３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒドロゲルは、約０．０１ミクロン〜１ミクロンの厚さを有する、請求項３１−３４のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本特許出願は、２０１７年１２月１９日に出願された米国仮特許出願６２／６０７，８７３号の利益を主張するものであり、参照によってその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
多くの生物試験法が、研究用であるか診断用であるかにかかわらず、単一のタイプの生物学的に関連する分析物を分析することができる。現在の方法およびデバイスはしばしば、複合生体サンプルから標的分子を単離することにより、サンプルを分析し始める。様々なタイプの高分子を互いに分離する必要なく、複合サンプルの様々な高分子を一度に分析することができる新しい方法およびデバイスが必要とされる。そのような方法は、アッセイの精度の向上につながる可能性がある。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書に開示されるデバイス、方法、およびキットは、複合生体サンプルの分析の向上へのニーズを満たすものである。本明細書に記載される実施形態のいくつかは、被験体から得られたサンプルを含む生体サンプルで見られる様々な高分子または細胞の構成要素を、単離、検出、定量化、および／または分析することができる。そのような高分子および細胞の構成要素の例としては、無細胞ＤＮＡおよびＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、あるいは細胞小胞が挙げられる。本明細書に記載されるように、同じデバイスおよび方法を使用して、複数のタイプの高分子を検知する能力は、データを生成するプロセスを簡略化するか、縮小するか、同じサンプルから高分子を個別に単離および分析することにより導入されるバイアスを減少あるいは除去することができ、ならびに、同時に検出および分析することができる分子の数およびタイプを増加させることにより、サンプル分析力および精度を増大させることができる。その結果、本明細書に記載される実施形態は、生成される結果の精度、精密度、および信頼度を増大させることができる。これらの特性は、疾患または疾病を検出し、診断し、分類し、同定し、疾患または疾病を患う被験体の予後を判定し、あるいは癌を含む疾患または疾病を患う被験体のための処置レジメンの進展あるいは有効性を評価するために使用されるアッセイにおいて、非常に有益であり得る。
【０００４】
生体サンプルを分析するための方法が本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、上記方法は、ＡＣ誘電泳動電界を生成するように構成された電極を使用して、生体サンプル中の複数の分析物を捕捉する工程を含み、ここで、上記複数の分析物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、および細胞小胞からなる群から選択される少なくとも２つのタイプの分析物を含む、工程と；複数の分析物を検出する工程と、を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態において、生体サンプル中の複数の分析物を捕捉する工程は、誘電泳動低電界領域および誘電泳動高電界領域を生成するように構成された電極を使用することを含む。いくつかの実施形態において、生体サンプル中の複数の分析物を捕捉する工程は、第１の電極を使用して第１の分析物を、および第２の電極を使用して第２の分析物を優先的に捕捉すること含む。いくつかの実施形態において、生体サンプル中の複数の分析物を捕捉する工程は、同じ電極上で１つを超える分析物を捕捉することを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは無細胞ＤＮＡを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、検出する工程は、複数の分析物中の少なくとも２つのタイプの分析物を定量化することを含む。いくつかの実施形態において、複数の分析物を検出する工程は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、あるいは細胞小胞の少なくとも２つの異なる種を検出することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのタイプの分析物を定量化することは、１つのタイプの分析物のみを定量化する方法と比較して、方法の診断力または予測力あるいは精度を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％あるいはそれ以上増加させる。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのタイプの分析物を定量化することは、１のタイプの分析物のみを定量化する方法と比較して、偽陽性率を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％あるいはそれ以上減少させる。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのタイプの分析物を定量化することは、１のタイプの分析物のみを定量化する方法と比較して、偽陰性率を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％あるいはそれ以上減少させる。いくつかの実施形態において、方法の性能は、０．６０〜０．７０、０．７０〜０．７９、０．８０〜０．８９、あるいは０．９０〜１．００の範囲の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とする。
【０００８】
いくつかの実施形態において、生体サンプルは被験体から得られる。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、生体サンプルは細胞を含み、方法は上記細胞を溶解する工程をさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、方法は、生体サンプル中で検出された少なくとも２つのタイプの分析物を使用して、被験体の疾患または疾病を検出する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、疾患または疾病は癌である。いくつかの実施形態において、検出する工程は、癌のタイプ、癌の段階、初期の時点と比較した腫瘍量の増大、初期の時点と比較した腫瘍量の減少、初期の時点に比較して腫瘍量に変化がないこと、または癌治療の有効性、あるいは癌の不在を決定する工程をさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、検出する工程は、複数の分析物の１つ分析物を、分析物に特異的に結合する抗体と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、抗体は検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は蛍光部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の分析物の１つの分析物は、ＰＤ−Ｌ１、ＣＡ１９．９、ＣＡ１２５、ＧＰＣ−１、ＣＥＡ、ＣＡ  １５．３、プロラクチン、Ｋｉ−６７、エストロゲン受容体α、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ１０、αフェトプロテイン、サバイビン、前立腺特異抗原、ＡＺＵ１、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、およびＣＹＦＲＡ−２１からなる群から選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、検出する工程は、複数の分析物の１つの分析物をオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、検出する工程は、複数の分析物の１つの分析物を、インターカレーティング色素、主溝に優先的に結合する色素、あるいは副溝に優先的に結合する色素に接触させることを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、複数の分析物は、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも１つを含み、ここで、方法は、ポリメラーゼ連鎖反応により、ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つを増幅する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、複数の分析物は、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも１つを含み、ここで、検出する工程は、順番に並べること、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも１つを配列決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、検出する工程は、定量的リアルタイムＰＣＲ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、直接ＳＹＢＲ  ｇｏｌｄアッセイ、直接ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ、マイクロサテライトマーカーアッセイのヘテロ結合性の喪失（ＬＯＨ）、電気泳動、メチル化分析、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＰＣＲ、およびデジタルＰＣＲからなる群の少なくとも１つを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、生体サンプルは流体を含む。いくつかの実施形態において、方法は、捕捉後に、分析物を電極から溶離する工程をさらに含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、誘電泳動低電界領域は、１ボルト〜４０ボルトのピーク−ピーク電圧；および／または、５Ｈｚ〜５，０００，０００Ｈｚの周期数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、誘電泳動高電界領域は、１ボルト〜４０ボルトのピーク−ピーク電圧；および／または５Ｈｚ〜５，０００，０００Ｈｚの周期数を有する交流を使用して生成される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、電極のアレイはヒドロゲルでコーティングされる。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、合成ポリマーの２つ以上の層を含む。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは電極上でスピンコーティングされる。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、スピンコーティングの前に約０．５ｃＰ〜約５ｃＰの粘度を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．０１ミクロン〜１ミクロンの厚さを有する。
【００１６】
引用による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が引用によって組み込まれるよう具体的かつ個別に示されるかのように、同じ程度まで引用により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
特許または特許出願のファイルは、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を備えるこの特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な料金の支払い後に当該事務局によって提供される。
【００１８】
本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを参照することによって得られるであろう。
【００１９】
【図１】例示的なデバイスの上面図を示す。
【図２】様々な量のゲノムＤＮＡに関連した電極を示す。
【図３】核酸を細胞から単離するための例示的な方法を示す。
【図４】細胞を含む流体から、細胞外核酸を単離するための例示的な方法を示す。
【図５】微小電極アレイから溶離されたＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。
【図６】微小電極アレイから溶離されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を示す。
【図７】電極アレイ上で視覚化されるｃｆＤＮＡ（緑）とＰＤ−Ｌ１タンパク質染色（赤）の統合された画像を示す。サンプルは非小細胞肺癌の患者からのものである。
【図８】健康な対照および非小細胞肺癌を患う患者の一連のサンプル中で検出されたｃｆＤＮＡならびにＰＤ−Ｌ１タンパク質の量のチャートを示す。その量は、電極アレイ上で各サンプルを実行し、ｃｆＤＮＡおよびＰＤ−Ｌ１を染色し、結果として生じる染色された物質（ｍａｔｅｒｉａｌ）を画像化し、ならびに、ｃｆＤＮＡおよびＰＤ−Ｌ１の量を定量化することにより検出された。
【図９】本明細書に記載されるデバイスを用いて単離された、腺癌、扁平上皮癌、および卵巣癌を患う患者、ならびに健康な対照からの血漿サンプルの結果を示す。
【図１０】５２人の健康な患者および５３人の癌患者（肺癌、乳房癌、卵巣癌、および膵臓癌）についてのｃｆＤＮＡ濃度の比較を示す。
【図１１Ａ】癌の処置を受ける際の２人の患者のｃｆＤＮＡの濃度を示す。この図は、Ｙ軸上にｃｄＤＮＡの濃度をｎｇ／ｍＬとして示し、Ｘ軸上に時間を表す。
【図１１Ｂ】癌の処置を受ける際の２人の患者のｃｆＤＮＡの濃度を示す。この図は、Ｙ軸上にｃｄＤＮＡの濃度をｎｇ／ｍＬとして示し、Ｘ軸上に時間を表す。
【図１２Ａ】ＡＳＰＣ−１膵臓癌細胞株に由来する微小電極デバイス上で単離されたＲＮＡを示す。
【図１２Ｂ】非小細胞肺癌を患う患者あるいは健康な患者から得られた血漿サンプルから単離されたＲＮＡを示す。
【図１３】腺癌を患う患者から得られた血漿から単離された癌胎児抗原（ＣＥＡ）を示す。いくつかのサンプルは、２μｇ／ｍＬの裸のＣＥＡタンパク質（ｎａｋｅｄ  ＣＥＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を人為的に添加された。染色は、エキソソーム結合ＣＥＡにおいて最も顕著である。
【図１４】敗血症を患っているか、あるいは患っていない患者から得られた血漿から単離された無細胞ＤＮＡを示す。
【図１５】健康な患者と２人の敗血症患者それぞれについてのｃｆＤＮＡ濃度の比較を示す。結果は、健康な対照と比較して、敗血症患者における３００ｂｐ以上のサイズの断片に対するｃｆＤＮＡ濃度の増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
流体組成物から細胞の構成要素あるいは分子を単離または分離するのに適した方法、デバイス、およびシステムが本明細書に記載されている。そのような成分および分子の例としては、無細胞ＤＮＡおよびＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、あるいは細胞小胞が挙げられる。
【００２１】
特定の実施形態では、流体組成物から単離された成分および分子を検出および定量化する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、１つを超えるタイプの成分あるいは分子が、流体組成物から単離、検出、あるいは定量化される。多くのアッセイは、伝統的に、特定のタイプのみの分析物の検出および定量化に向けられている。例えば、ＱＰＣＲは、タンパク質ではなく核酸を検出および定量化することができる。対照的に、ＥＬＩＳＡは、核酸ではなくタンパク質を検出および定量化することができる。その結果として、様々なタイプの分析物からのデータに依拠する研究あるいは試験は、一連の別々の試験としてしばしば行なわれる。本明細書に記載される方法、デバイス、およびシステムの１つの例示的な利点では、いくつかの異なるタイプの分析物を一度に単離、検出、および定量化することができる。例えば、このことにより、所望の粒子は、無細胞ＤＮＡとＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、無細胞ＲＮＡを含むＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、（エンドソームの表面上で発現されたタンパク質を含む）タンパク質、タンパク質断片、細胞膜断片、ミトコンドリア、細胞小胞、およびエンドソーム起源の小胞を、同じアッセイの一部として検出ならびに定量化することができる。いくつかの実施形態において、様々な分析物を、ともに処理し、ともに染色し、および、ともに視覚化することができる。その結果として、様々な分析物を検出するために必要なワークフローを、大幅に簡略化することができる。
【００２２】
別の例示的な利点では、いくつかのアッセイは、複数の変数の使用および複数のバイオマーカーの検出から利益を得る。癌において、例えば、癌の存在を示すことができる様々なバイオマーカーがある。サンプルの中に存在する特定のサイズの無細胞ＤＮＡ断片の量は、癌の存在の可能性を示し得る。同様に、ＰＤ−Ｌ１あるいはＣＡ１２５を含む特定のタンパク質の存在も、癌の存在の可能性を示し得る。他の疾患あるいは症状も企図される。例えば、これらは、感染性の疾患または疾病、敗血症、移植合併症または拒絶反応に関連するものを含む、同種免疫性および自己免疫性疾患または疾病、炎症性の疾患または疾病、あるいは心臓の疾患または心臓の疾病を含む。
【００２３】
本発明者らは、これらの試験が単離で行われた場合、時々決定的でないことがあることを発見した。正常な無細胞ＤＮＡプロファイルを有する患者は、ＰＤ−Ｌ１発現が高い可能性がある。このことは、試験が、癌あるいは非癌のいずれかとして分類される寸前の（ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｄｇｅ）の結果をもたらす場合、時々当てはまることがある。本発明者らは、驚くべきことに、タンパク質、核酸、あるいは他の細胞の構成要素の１つのみを検出することができる試験よりも、１つより多い分析物を同時に検出することができる試験の方がより正確、より精密、より選択的、より特異的、およびより包括的であり得るということを発見した。本明細書に提示された驚くべき結果は、複数のタイプの分析物の分析が従来の試験によって正常であると分類されるかもしれない患者の疾患あるいは疾病をより良く診断および検出することができる可能性があることを示す。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法の性能は、０．６０〜０．６９、０．７０〜０．７９、０．８０〜０．８９、あるいは、０．９０〜１．００の範囲の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とする。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、患者の疾患あるいは疾病を検出、診断、あるいは分析に使用される他の試験、例えば、病理学、ＥＬＩＳＡ、ＱＰＣＲ、あるいはＤＮＡ配列決定よりも、１０％、２０％、３０％、５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、あるいは１０００％を超えて正確、選択的、精密、特異的、包括的であり得る。
【００２４】
粒子または分子を流体組成物から単離あるいは分離するための方法、デバイス、およびシステムが本明細書のある実施形態で提供され、上記方法、デバイス、およびシステムは、電極のアレイを含み、および（例えば、電極のアレイに通電される際に）ＡＣ動電学的力を生成することができるデバイスに流体を適用する工程を含む。いくつかの実施形態では、誘電泳動電界は、ＡＣ動電学的力効果の成分である。他の実施形態において、ＡＣ動電学的力効果の成分は、ＡＣ電気浸透効果またはＡＣ電熱効果である。いくつかの実施形態において、誘電泳動電界を含むＡＣ動電学的力は、高電界領域（正のＤＥＰ、すなわち、不均一電界により電界線の強い集中が存在する区域）、および／または低電界領域（負のＤＥＰ、すなわち、不均一電界により電界線の弱い集中が存在する区域）を含む。
【００２５】
特定の例では、粒子、細胞成分、あるいは分子（例えば、核酸）は、誘電泳動電界の電界領域（例えば、高電界領域）で単離される（例えば、細胞から単離または分離される）。いくつかの実施形態において、粒子、細胞の構成要素、あるいは分子は、体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、あるいはこれらの組み合わせから単離される。いくつかの実施形態において、粒子、細胞の構成要素、あるいは分子は、無細胞である流体または流体の一部から単離される。いくつかの実施形態において、粒子、細胞の構成要素、あるいは分子は、無細胞ＤＮＡを含むＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、あるいは細胞小胞、ならびに、上記のいずれかの断片あるいは一部であるか、これらを含む。
【００２６】
いかなる分析物も、本明細書に記載される方法を使用して検出され得ることが理解される。いくつかの例では、分析物は、タンパク質マーカーであり得る生物学的マーカーを含む。いくつかの例では、マーカーは、ウイルスまたは細胞をさらに含む。いくつかの実施形態において、分析物は、抗体を使用して検出される。いくつかの実施形態において、抗体は、検出可能なマーカーで標識化される。いくつかの実施形態において、検出可能なマーカーは、蛍光マーカーである。
【００２７】
本明細書に記載される方法で使用される蛍光タグあるいは発光タグは、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびタンパク質を標識するために使用される任意の適切な蛍光タンパク質あるいは発光タンパク質であり得、それは、限定されないが、ローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５  Ａｌｅｘａフルオロフォア、ルシフェリン、ｆｕｒａ−２色素、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質、ならびに黄色蛍光タンパク質を含む、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アクリジン色素、シアニン色素、フルオロン色素、オキサジン色素、フェナントリジン色素およびローダミン色素を含む。本明細書に開示される抗体は、様々な蛍光タグおよびフルオロフォアでカスタム合成され得る。
【００２８】
本明細書に記載される方法で利用される、結合した第一抗体および二次抗体を含む一次抗体および二次抗体が検出される分析物、あるいは検出される分析物に結合する抗体に、特異的に結合することが理解される。用語「特異的に結合する」とは、抗体が無関係なアミノ酸配列に結合するよりも大きな親和性でエピトープに結合することを意味する。１つの態様において、そのような親和性は、関連しないアミノ酸配列のための抗体の親和性よりも、少なくとも１倍大きい、少なくとも２倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、あるいは、少なくとも１０００倍大きい。
【００２９】
「エピトープ」とは、抗体の可変領域結合ポケットとの結合相互作用を形成することができる、抗原あるいは他の高分子の一部を指す。
【００３０】
重鎖の不変領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なる種類に割り当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、ならびに、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに相当する、重鎖不変ドメイン（Ｆｃ）は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造は周知である。
【００３１】
任意の脊椎動物種の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、不変ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパまたは（「κ」あるいは「Ｋ」）およびラムダまたは（「λ」）と呼ばれる、２つの明らかに異なるタイプの１つに割り当てることができる。
【００３２】
用語「抗体の抗原結合部分」、「抗原結合性断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗体断片」、または「抗体の機能性断片」は、本明細書で互換的に使用され、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片に言及する。そのような用語に含まれる抗体断片の限定しない例としては、限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１のドメインからなる一価断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂ断片を含有する二価断片）；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１のドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨのドメインを含有するＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインを含有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４  ５４６）；ならびに、（ｖｉ）単離されたＣＤＲを含む。加えて、この定義において、単一の重鎖および単一の軽鎖を含む「半分の」抗体が含まれる。二重特異性抗体などの単鎖抗体の他の形態も本明細書に包含される。
【００３３】
本明細書に記載される方法で使用される対照抗体は、検出される分析物に特異的に結合しない。
【００３４】
本明細書に記載される免疫学的アッセイは、本明細書に記載されるデバイスで実施され得る。
【００３５】
この評価に利用され得る他のアッセイとしては、限定されないが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）が挙げられる。
【００３６】
本明細書に記載される方法におけるＡＣ動電学的電界の適用は、誘電泳動を含む。ＡＣ動電学的電界の適用は、誘電泳動低電界領域および誘電泳動高電界領域を作る。この適用は、結合した分析物をサイズによって分け、結合された分析物を検出することができ、いくつかの例では、当技術分野において既知の方法を使用して定量化することができる。
【００３７】
ある例では、キャリブレーターは、単離されたタンパク質マーカーを直接定量化するために、対象のサンプルと共に実行することができる。キャリブレーターは、制御された緩衝液において一定濃度でスパイクされた対象のタンパク質であり得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、検出可能なマーカーは、蛍光顕微鏡によって検出される。
【００３９】
マーカーの非限定的な例は、例えば、癌マーカーおよび炎症のマーカーを含む。癌マーカーおよび炎症のマーカーは本明細書に例証されているが、記載される方法が開示されるマーカーに限定されないことが理解されよう。本明細書に開示される免疫学的アッセイは、限定されないが、腫瘍マーカー、心臓マーカー、貧血症マーカー、代謝性マーカー、腎臓マーカー、糖尿病マーカー、甲状腺ホルモンマーカー、生殖ホルモンマーカー、およびそれらの組み合わせを含む、他のマーカーと共に使用することができる。
【００４０】
本明細書に記載される方法を使用して検出されるタンパク質マーカーとしては、限定されないが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、ＣＡ２７．２９、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９．９、プロラクチン、Ｋｉ−６７、エストロゲン受容体α、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ１０、生存、ＡＺＵ１、α−フェトプロテイン（αＦＰ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、（βＨＣＧ）、グリピカン−１（ＧＰＣ−１）、ＣＹＦＲＡ−２１、ＲＮＡベースのマーカー、および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられる。
【００４１】
本明細書に記載される方法を使用して検出され得るさらなる癌マーカーとしては、限定されないが、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤ２０、カルシトニン、カルレチニン、ＣＤ３４、ＣＤ９９ＭＩＣ  ２、ＣＤ１１７、クロモグラニン、サイトケラチン（様々な型）、デスミン、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、第ＶＩＩＩ因子、ＣＤ３１  ＦＬ１、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、総嚢胞性疾患流体タンパク質（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＭＢ−４５、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インヒビン、ケラチン（様々な型）、リンパ球マーカー、ＭＡＲＴ−１（Ｍｅｌａｎ−Ａ）、メソテリン、Ｍｙｏ  Ｄ１、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、リンパ球共通抗原（ＣＤ４５）、Ｓ１００タンパク質、シナプトフィジン、チログロブリン、甲状腺転写因子１、腫瘍Ｍ２−ＰＫ、およびビメンチンが挙げられる。
【００４２】
本明細書に記載される方法を使用して検出され得る炎症のさらなるマーカーとしては、限定されないが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、血漿α−フェトプロテイン（αＦＰ）、βヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、リソソーム粒状体、ヒスタミン、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）−８、ロイコトリエンＢ４、一酸化窒素、プロスタグランジン、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１が挙げられる。
【００４３】
心臓マーカーはクレアチンキナーゼ（ＣＫＭＢ）、ミオグロビン、およびトロポニン１を含む。貧血症のためのマーカーはフェリチンを含む。代謝マーカーはコルチゾール（ＣＯＲＴ）およびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）を含む。腎臓マーカーはシスタチンＣ（ＣｙｓＣ）、β２ミクログロブリン（ＢＭＧ）、無傷の副甲状腺ホルモン（ｉＰＴＨ）を含む。糖尿病マーカーはＣペプチド、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、およびインスリン（ＩＲＩ）を含む。甲状腺ホルモンマーカーは甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含み、その一方で、生殖ホルモンマーカーはβＨＣＧ、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモンＩＩ（ＬＨＩＩ）、およびプロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔａｔｉｎ）（ＰＲＬ）を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、方法、デバイス、あるいはシステムは、以下の工程の１つ以上を含む：第１の誘電泳動電界領域（例えば、高電界ＤＥＰ領域）中の対象の細胞を集中させる工程、上記第１の誘電泳動電界領域中の細胞を溶解する工程、および／または、第１あるいは第２の誘電泳動電界領域中の核酸を集中させる工程。他の実施形態において、方法、デバイス、あるいはシステムは、以下の工程の１つ以上を含む：第１の誘電泳動電界領域（例えば、低電界ＤＥＰ領域）中の細胞を集中させる工程、第２の誘電泳動電界領域（例えば、高電界ＤＥＰ領域）中の核酸を集中させる工程、および、細胞と残留物質を洗い流す工程。方法はさらに、以下の工程の１つ以上を実施することができる、デバイスおよび／またはシステムを随意に含む：核酸から残留物質（例えば、細胞）を洗浄するか、そうでなければ、除去する工程（例えば、核酸をアレイの高電界ＤＥＰ領域内に集中および維持しながら、水または緩衝液でアレイをすすぐ工程）、残留タンパク質を分解する工程（例えば、溶解細胞および／または他の供給源からの残留タンパク質、そのような分解は、熱、プロテアーゼ、あるいは化学物質などでの任意の適切なメカニズムに従って生じる）、分解タンパク質を核酸から洗い流す工程、および核酸を収集する工程。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイスの操作、システムの操作の結果は、随意にＤＮＡ配列決定に適切な量および純度の単離された核酸である。
【００４５】
いくつかの例では、本明細書に記載される方法は短時間で実施され、デバイスは短時間で操作され、および、システムは短時間で操作されることが有利である。いくつかの実施形態では、期間は、デバイスへの流体の添加から単離された核酸の入手までの時間から測定される「手順時間」に関して短い。いくつかの実施形態では、手順時間は、３時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分未満、２０分未満、１０分、または５分未満である。
【００４６】
別の態様では、期間は、デバイスへの流体の添加から単離された核酸の入手までの時間から、手順に人が参加しなければならない累積的な時間として測定される「実地時間（ｈａｎｄｓ−ｏｎ  ｔｉｍｅ）」に関して短い。いくつかの実施形態では、実地時間は、４０分未満、２０分未満、１０分未満、５分未満、１分未満、または３０秒未満である。
【００４７】
いくつかの例では、本明細書に記載されるデバイスは単一の容器を含み、本明細書に記載されるシステムは単一の容器を含むデバイスを含み、本明細書に記載される方法は、単一の容器、例えば、本明細書に記載されているような誘電泳動デバイスにおいて実施可能であるということは有利である。いくつかの態様では、そのような単一の容器の実施形態は、流体を取り扱う工程の回数を最小限に抑え、および／または、短時間で実施される。いくつかの例では、本方法、デバイス、およびシステムは、１つ以上の遠心分離工程および／または培地交換を使用する方法、デバイス、およびシステムと対比される。いくつかの例では、遠心分離は、核酸を単離するために必要とされる実地時間を増加させる。他の態様では、単一の容器の手順またはデバイスは、最小限の量の消費可能な試薬を使用して、核酸を単離する。
【００４８】
デバイスおよびシステム
いくつかの実施形態において、流体から細胞物質を集めるためのデバイスが本明細書に記載される。一態様では、細胞を含む流体から、流体の無細胞部分から、あるいは他の粒子物質から細胞物質を集めるためのデバイスが本明細書に記載される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、細胞物質を単離するためのデバイスが本明細書に開示され、上記デバイスは：ａ．ハウジング；ｂ．タンパク質分解剤を含むヒーターあるいは熱源および／またはリザーバー；ならびに、ｃ．上記ハウジング内の複数の交流（ＡＣ）電極を備え、上記ＡＣ電極は、ＡＣ動電学的高電界領域およびＡＣ動電学的低電界領域を確立するために選択的に電圧を印加するように構成され、それにより、ＡＣ動電学的効果が、デバイスの低電界領域における細胞の集中をもたらす。いくつかの実施形態では、複数の電極は、誘電泳動高電界領域および誘電泳動低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成される。いくつかの実施形態では、タンパク質分解剤はプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質分解剤はプロテイナーゼＫである。いくつかの実施形態では、デバイスは、溶離剤を含む第２のリザーバーをさらに含む。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本明細書にはデバイスが開示され、上記デバイスは：ａ．複数の交流（ＡＣ）電極であって、上記ＡＣ電極は、ＡＣ動電学的高電界領域およびＡＣ動電学的低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成される、ＡＣ電極；ならびに、ｂ．サーモサイクリング、および、ＰＣＲあるいは他の酵素反応を行うことができるモジュールを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本明細書にはデバイスが開示され、上記デバイスは：ａ．複数の交流（ＡＣ）電極であって、ＡＣ動電学的高電界領域およびＡＣ動電学的低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成される、ＡＣ電極；および、ｂ．ＡＣ電極によって捕捉あるいは単離された物質を画像化することができるモジュールを含む。いくつかの実施形態はさらに、捕捉された物質の視覚化を可能にする、試薬を追加および除去するためのチャンバおよびフルイディックスを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、複数の電極は、誘電泳動高電界領域および誘電泳動低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成される。いくつかの実施形態において、デバイスは、流体を含む生体サンプルから、無細胞ＤＮＡとＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、および細胞小胞を単離することができる。いくつかの実施形態において、デバイスは、生体サンプル中の細胞からこれらの物質を単離することができる。いくつかの実施形態において、デバイスは、ＰＣＲ増幅あるいは他の酵素反応を実施することができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは単離され、ＰＣＲあるいは他の酵素反応が１つのチャンバにおいて実施される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは単離され、ＰＣＲあるいは他の酵素反応は１つのチャンバの複数の領域において実施される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは単離され、ＰＣＲあるいは他の酵素反応は複数のチャンバにおいて実施される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、デバイスはさらに、ＰＣＲ増幅あるいは他の酵素反応を実施するために、溶出管、チャンバ、およびリザーバーの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ増幅あるいは他の酵素反応は、複数の温度帯を含む曲がりくねったマイクロチャネルにおいて実施される。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ増幅あるいは他の酵素反応は、不混和性流体中に捕捉された水滴中で実施される（つまり、デジタルＰＣＲ）。いくつかの実施形態では、サーモサイクリングは対流を含む。いくつかの実施形態において、デバイスは、電極に接触するか、あるいは電極の近位にある表面を備え、ここで、上記表面は、生体分子を選択的に捕捉することができる生体リガンドで機能化される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、生体サンプルから細胞物質を単離するためのシステムが本明細書で開示され、上記システムは：ａ．複数の交流（ＡＣ）電極を含むデバイスであって、上記ＡＣ電極は、ＡＣ動電学的高電界領域およびＡＣ動電学的低電界領域を確立するために、選択的に電圧を印加するように構成され、それにより、ＡＣ動電学的効果は、デバイスの高電界領域における細胞の集中をもたらす、デバイス；およびｂ．シーケンサー、サーモサイクラー、あるいは、単離または収集された核酸上で酵素反応を実施するための他のデバイスを含む。いくつかの実施形態では、複数の電極は、誘電泳動高電界領域および誘電泳動低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成される。
【００５５】
様々な実施形態において、ＤＥＰ電界は、本明細書に記載されるように電極のアレイに電圧が選択的に印加されることによって作られるか、あるいは作られ得る。電極は随意に、貴金属（例えば、プラチナ、プラチナイリジウム合金、パラジウム、金など）などの金属を含む腐食に耐性を示す任意の適切な材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）で作られる。様々な実施形態において、電極は、適切なＤＥＰおよび／または他の動電学的電界が生成されるように、任意の適切なサイズであり、任意の適切な配向であり、任意の適切な間隔であり、任意の適切な手法で電圧が印加されるか、あるいは電圧が印加され得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムが本明細書に記載され、電極は別々のチャンバに入れられ、正のＤＥＰ領域と負のＤＥＰ領域は、細孔または穴構造を介したＡＣ  ＤＥＰ電界の通過により、内部チャンバ内に作成される。細胞、微粒子、ナノ粒子、および核酸の分離を行うための所望の正のＤＥＰ（高電界）領域およびＤＥＰの負の（低電界）領域を形成するために、様々な幾可学的形状が使用される。いくつかの実施形態において、細孔または穴構造は、多孔質物質（ヒドロゲル）を含み（あるいは充填され）、または多孔質膜構造で覆われている。いくつかの実施形態において、別々のチャンバへ電極を分離することによって、そのような細孔／穴構造ＤＥＰデバイスは、ＤＥＰプロセスの間に、内部の分離チャンバ内で生じる電気化学効果、加熱、あるいは無秩序な流体の運動を減らす。
【００５７】
一態様では、電極を含むデバイスが本明細書に記載され、ここで、電極は、別々のチャンバに入れられ、および、ＤＥＰ電界は、細孔構造を通過することよって、内部チャンバ内に作られる。例示的なデバイスは、ハウジング内に複数の電極と、電極を含むチャンバとを含んでいる。デバイスのコントローラーは、開示のために本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００９／１４６１４３Ａ２にさらに記載されるように、電極を独立して制御する。
【００５８】
いくつかの実施形態において、チャンバ付きのデバイスは、様々な細孔および／または穴構造（ナノスケール、マイクロスケール、さらにはマクロスケール）を伴って作られ、ならびに、細胞、ナノ粒子、あるいは他の実体が内部チャンバに分散するか、運ばれるのを制御、制限、あるいは抑制する膜、ゲル、あるいは濾過物質を含むが、ＡＣ／ＤＣ電界、溶質分子、緩衝液、および他の小分子はチャンバを通過することができる。
【００５９】
様々な実施形態において、デバイスの様々な構成が可能である。例えば、デバイスは、例えば、ＡＣ動電学を可能にするために反復する不均一電界を作るように構成された正方形または長方形のパターンの電極のより大きなアレイを含む。例示目的のためだけに、適切な電極アレイは、限定されないが、１０ｘ１０電極構成、５０ｘ５０電極構成、１０ｘ１００電極構成、２０ｘ１００電極構成、あるいは２０ｘ８０電極構成を含み得る。
【００６０】
そのようなデバイスは、限定されないが、多重化電極およびチャンバ付きのデバイス、再構成可能な電界パターンを作ることができるデバイス、ＤＣ電気泳動プロセスと流体プロセスを組み合わせるデバイス；サンプル調製デバイス、サンプル調製、単離された核酸分子の酵素学的な操作、および、その後の検出および分析を含む診断デバイス、ラボオンチップデバイス、ポイントオブケア、ならびに他の臨床診断システムあるいはバージョンを含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、平面の白金電極アレイデバイスは、サンプル流体が流れるハウジングを含む。いくつかの実施形態では、流体は入口端部から出口端部へと流れ、随意に側方の分析物出口を含む。例示的なデバイスは複数のＡＣ電極を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、ミクロンサイズの実体あるいは細胞、より大きなナノ粒子、およびより小さなナノ粒子または生体分子の組み合わせからなる。いくつかの例では、より大きなナノ粒子はサンプル中に分散した細胞残屑である。いくつかの実施形態において、より小さなナノ粒子は、タンパク質、より小さなＤＮＡ、ＲＮＡ、および細胞断片である。いくつかの実施形態において、平面電極アレイデバイスは、個別に制御することができるが同時に作動させることができる３つの２０ｘ２０アレイへ随意に区分される６０ｘ２０電極アレイである。随意の補助のＤＣ電極は正電荷へ切り替え可能であり、その一方で、随意のＤＣ電極は電気泳動のために負電荷へ切り替えられる。いくつかの例では、制御されたＡＣおよびＤＣシステムの各々は、様々な実施形態において、連続的および／またはパルス化手法の両方で使用される（例えば、各々は、比較的短時間の間隔でパルス化をオンおよびオフすることができる）。サンプルの流れの側面に沿った随意の平面電極アレイは、ナノ多孔性材料（例えば、合成ポリマーのヒドロゲル）で覆われる場合、ＡＣ  ＤＥＰと同様に、ＤＣ電気泳動力を生成するために随意に使用される。加えて、マイクロ電気泳動分離プロセスは、ｘ−ｙ−ｚ次元でアレイの平面電極および／または補助電極を使用して、ナノポア層内で随意に実行される。
【００６２】
様々な実施形態において、これらの方法、デバイス、およびシステムは、１，０００Ｈｚ〜１００ＭＨｚの範囲のＡＣ周波数範囲、ならびに、およそ１ボルト〜２０００ボルトのピークトゥピークの範囲の電圧で；１ボルト〜１０００ボルトのＤＣ電圧で、毎分１０マイクロリットル〜毎分１０ミリリットルの流量で、１°Ｃ〜１２０°Ｃの温度範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、約３〜約１５ｋＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、５〜２５ボルトのピーク−ピーク電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、約１〜約５０ボルト／ｃｍの電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、約１〜約５ボルトのＤＣ電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、毎分約１０マイクロリットル〜毎分約５００マイクロリットルまでの流量で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、約２０°Ｃ〜約６０°Ｃの温度範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１０００Ｈｚ〜１０ＭＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１０００Ｈｚ〜１ＭＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１０００Ｈｚ〜１００ｋＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１０００Ｈｚ〜１０ｋＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１０ｋＨｚ〜１００ｋＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１００ｋＨｚ〜１ＭＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜１５００ボルトのピーク−ピーク電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜１５００ボルトのピーク−ピーク電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜１０００ボルトのピーク−ピーク電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜５００ボルトのピーク−ピーク電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜２５０ボルトのピーク−ピーク電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜１００ボルトのピーク−ピーク電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜５０ボルトのピーク−ピーク電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１ボルト〜１０００ボルトのＤＣ電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１ボルト〜５００ボルトのＤＣ電���で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１ボルト〜２５０ボルトのＤＣ電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１ボルト〜１００ボルトのＤＣ電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１ボルト〜５０ボルトのＤＣ電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、毎分１０マイクロリットル〜毎分１ｍｌの流量で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、毎分０．１マイクロリットル〜毎分５００マイクロリットルの流量で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、毎分０．１マイクロリットル〜毎分２５０マイクロリットルの流量で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、毎分０．１マイクロリットル〜毎分１００マイクロリットルの流量で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１°Ｃ〜１００°Ｃの温度範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、２０°Ｃ〜９５°Ｃの温度範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、２５°Ｃ〜１００°Ｃの温度範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは室温で作動する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、コントローラーは、電極の各々を独立して制御する。いくつかの実施形態において、コントローラーは、ソケットおよびプラグ接続によるなどしてデバイスに外部接続されるか、あるいはデバイスハウジングと一体化される。
【００６４】
さらに、堅牢な電極のスケールされた断面（ｘ−ｙ次元）アレイと、ＤＥＰ、電気泳動、および流体力を組み合わせる補助電極の戦略的に置かれた（ｘ−ｙ−ｚ次元）配置、ならびにそれらの使用が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、臨床的に関連する量の血液、血清、血漿、あるいは他のサンプルは、より高いイオン強度および／または伝導条件下でより直接的に分析される。電極上または電極の近くで生じ得るあらゆる電気化学（電気分解）反応、加熱、および無秩序な流体の運動の効果を弱めるために、ならびに、細胞、細菌、ウイルス、ナノ粒子、ＤＮＡ、および他の生体分子の有効な分離を実行することができるようにするために、材料（天然または合成の多孔性ヒドロゲル、膜、制御されたナノポア材料、および薄い誘電体層状材料）の１つ以上の多孔層で堅牢な電極構造（例えば、白金、パラジウム、金など）を覆うことが本明細書で記載されている。いくつかの実施形態において、高分解能分離を達成するためにＡＣ周波数交差点を使用することに加えて、オンデバイス（オンアレイ）ＤＣ微量電気泳動法は二次的な分離に使用される。例えば、ＤＮＡナノ粒子（２０−５０ｋｂ）、高分子量ＤＮＡ（５−２０ｋｂ）、中間分子量ＤＮＡ（１−５ｋｂ）、および低分子量ＤＮＡ（０．１−１ｋｂ）断片の分離は、アレイ上のＤＣ微量電気泳動法によって遂行され得る。いくつかの実施形態において、デバイスは、様々な血液細胞、細菌、およびウイルスの同時分離、ならびに、そのようなデバイス上で同時に実行されるＤＮＡの様々な目的のために随意に細分化される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、デバイスは、ハウジング、および、ヒーターまたは熱源、および／または、タンパク質分解剤を含むリザーバーを含んでいる。いくつかの実施形態において、ヒーターまたは熱源は、流体の温度を所望の温度（例えば、タンパク質を分解するのに適切な温度、約３０°Ｃ、４０°Ｃ、５０°Ｃ、６０°Ｃ、７０°Ｃなど）に増加させることができる。いくつかの実施形態において、ヒーターまたは熱源は、ＰＣＲサーモサイクラーとしての作用に適している。他の実施形態では、ヒーターまたは熱源は、一定の温度（等温条件）を維持するために使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質分解剤はプロテアーゼである。他の実施形態では、タンパク質分解剤は、プロテイナーゼＫであり、ヒーターまたは熱源はタンパク質分解剤を不活性化するために使用される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、デバイスは、ハウジング内の複数の交流（ＡＣ）電極をさらに含み、上記ＡＣ電極は、誘電泳動（ＤＥＰ）高電界領域および誘電泳動（ＤＥＰ）低電界領域を確立するために、選択的に電圧を印加するように構成することができ、それにより、ＡＣ動電学的効果は、デバイスの低電界領域中における細胞の集中をもたらす。いくつかの実施形態において、電極は、第１のＡＣ動電学的電界領域を提供するために選択的に電圧が印加され、および、第２のＡＣ動電学的電界領域を提供するために、その後、あるいは、継続的に、選択的に電圧が印加される。例えば、電極、およびＤＥＰ電界における細胞の集中のさらなる説明は、開示のために本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開ＷＯ２００９／１４６１４３号Ａ２において見られる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、デバイスは溶離剤を含む第２のリザーバーを含む。溶離剤は、デバイスから単離された細胞物質を溶離するのに適した任意の流体である。いくつかの例では、溶離剤は水または緩衝液である。いくつかの例では、溶離剤はＤＮＡ配列決定方法に必要とされる試薬を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態において、デバイスは複数のリザーバーを含み、各リザーバーは、デバイス中の単離された細胞物質の染色および洗浄に役立つ試薬を含んでいる。例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、プローブ、および色素、緩衝液、洗浄液、水、界面活性剤、ならびに溶剤が挙げられる。
【００６９】
複数の交流（ＡＣ）電極を含むシステムおよびデバイスが本明細書でさらに提供され、上記ＡＣ電極は、誘電泳動（ＤＥＰ）高電界領域ならびに誘電泳動（ＤＥＰ）低電界領域を確立するために、選択的に電圧を印加するように構成される。いくつかの例では、ＡＣの動電学的効果は、ＤＥＰ電界の低電界領域における細胞の集中、および／または高電界領域における分子（例えば、核酸などの高分子）の集中（あるいは、収集または単離）をもたらす。
【００７０】
さらに、複数の直流（ＤＣ）電極を含むシステムおよびデバイスが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、複数のＤＣ電極は、アレイ全体にわたって広がっている少なくとも２つの長方形の電極を含む。いくつかの実施形態において、電極はアレイの縁に位置する。いくつかの実施形態では、ＤＣ電極はＡＣ電極間に点在する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、核酸を操作するための手段を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、酵素反応を実施する手段を含む。他の実施形態では、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅、ライゲーション反応、制限分析、核酸クローニング、転写あるいは翻訳アッセイ、または他の酵素ベースの分子生物学的アッセイを実施する手段を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、核酸シーケンサーを含む。シーケンサーは随意に、限定されないが、サンガーシーケンサー、パイロシーケンサー、イオン半導体シーケンサー、ポロニーシーケンサー、ライゲーションデバイスによるシーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシングデバイス、あるいは単一分子配列決定デバイスを含む、任意の適切なＤＮＡシーケンシングデバイスである。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、一定の温度を維持することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、アレイまたはチャンバを冷却することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、アレイまたはチャンバを加熱することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、サーモサイクラーを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるデバイスは、局所的な温度制御要素を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるデバイスは、温度の感知および制御の両方を行うことができる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、デバイスは加熱素子あるいは熱素子をさらに含む。いくつかの実施形態において、加熱素子あるいは熱素子は電極の真下に位置する。いくつかの実施形態において、加熱素子あるいは熱素子は金属を含む。いくつかの実施形態において、加熱素子あるいは熱素子は、タンタル、アルミニウム、タングステン、あるいはこれらの組み合わせを含む。通常、加熱素子あるいは熱素子によって達成される温度は、それを流れる電流に比例する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスは、局所的な冷却素子を含む。いくつかの実施形態において、熱抵抗性の素子は、露出した電極アレイの下に直接置かれる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスは、約２０°Ｃ〜約１２０°Ｃの間の温度を達成および維持することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスは、約３０°Ｃ〜約１００°Ｃの間の温度を達成および維持することができる。他の実施形態では、本明細書で開示されるデバイスは、約２０°Ｃ〜約９５°Ｃの間の温度を達成および維持することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスは、約２５°Ｃ〜９０°Ｃ、約２５°Ｃ〜約８５°Ｃ、約２５°Ｃ〜約７５°Ｃ、約２５°Ｃ〜約６５°Ｃ、あるいは約２５°Ｃ〜約５５°Ｃの間の温度を達成および維持することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスは、約２０°Ｃ、約３０°Ｃ、約４０°Ｃ、約５０°Ｃ、約６０°Ｃ、約７０°Ｃ、約８０°Ｃ、約９０°Ｃ、約１００°Ｃ、約１１０°Ｃ、あるいは約１２０°Ｃの温度を達成および維持することができる。
【００７５】
電極
複数の交流電極は、本明細書に記載される分離プロセスに適した任意の手法で随意に構成される。例えば、電極、および／またはＤＥＰ電界における細胞の集中を含むシステムまたはデバイスのさらなる説明が、開示のために本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開ＷＯ２００９／１４６１４３号において見られる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される電極は、任意の適切な金属を含むことができる。いくつかの実施形態では、電極は限定されないが、以下を含むことができる：アルミニウム、銅、炭素、鉄、銀、金、パラジウム、白金、イリジウム、白金イリジウム合金、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、タンタル、チタン、タングステン、ポリシリコン、および酸化インジウム錫、あるいはこれらの組み合わせ、ならびに、白金シリサイド、チタンシリサイド、金シリサイド、あるいはタングステンシリサイドなどのシリサイド材料。いくつかの実施形態において、電極は、スクリーン印刷することができる導電性インクを含み得る。
【００７７】
いくつかの実施形態において、電極の端から端（Ｅ２Ｅ）対内外径比は、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍである。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ｅ対内外径比は、約１ｍｍ〜約４ｍｍである。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ｅ対内外径比は、約１ｍｍ〜約３ｍｍである。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ｅ対内外径比は、約１ｍｍ〜約２ｍｍである。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ｅ対内外径比は、約２ｍｍ〜約５ｍｍである。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ｅ対内外径比は、約１ｍｍである。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ｅ対内外径比は、約２ｍｍである。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ｅ対内外径比は、約３ｍｍである。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ｅ対内外径比は、約４ｍｍである。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ｅ対内外径比は、約５ｍｍである。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される電極はドライエッチングされる。いくつかの実施形態において、電極はウェットエッチングされる。いくつかの実施形態において、電極は、ドライエッチングとウェットエッチングの組み合わせを受ける。
【００７９】
いくつかの実施形態において、それぞれの電極は個々に部位制御される。
【００８０】
いくつかの実施形態において、電極のアレイはユニットとして制御される。
【００８１】
いくつかの実施形態において、パッシベーション層が使用される。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、当該技術分野において知られている任意の適切な材料から形成することができる。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は窒化ケイ素を含む。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は二酸化ケイ素を含むことができる。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、約２．０〜約８．０の相対的な誘電率を有する。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、約３．０〜約８．０、約４．０〜約８．０、あるいは約５．０〜約８．０の相対的な誘電率を有する。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、約２．０〜約４．０の相対的な誘電率を有する。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、約２．０〜約３．０の相対的な誘電率を有する。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、あるいは約４．０の相対的な誘電率を有する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、約０．１ミクロン〜約１０ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約０．５ミクロン〜８ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約１．０ミクロン〜５ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約１．０ミクロン〜４ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約１．０ミクロン〜３ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約０．２５ミクロン〜２ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約０．２５ミクロン〜１ミクロンの間の厚さである。
【００８３】
いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、限定されないが、窒化ケイ素または二酸化ケイ素を含む、任意の適切な絶縁性の低ｋ誘電材料で構成される。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、ポリアミド、炭素、ドープ窒化ケイ素、炭素ドープ二酸化ケイ素、フッ素ドープ窒化ケイ素、フッ素ドープ二酸化ケイ素、多孔性の二酸化ケイ素、あるいはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、スクリーン印刷することができる誘電性インクを含み得る。
【００８４】
電極の幾可学的形状
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される電極は、本明細書で開示される方法を実行するのに適切な任意の手法で配置され得る。
【００８５】
いくつかの実施形態において、電極はドット構成であり、例えば、電極は通常円形または丸い構成を含む。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約２５°〜約６０°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約３０°〜約５５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約３０°〜約５０°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約３５°〜約４５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約２５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約３０°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約３５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約４０°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約４５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約５０°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約５５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約６０°である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、電極は実質的に細長い構成である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、電極は波線または非線形線に似た構成である。いくつかの実施形態において、電極のアレイは波線または非線形線の構成であり、ここで、上記構成は、リンカーによって接続される１対のドットの形状を含む反復単位を含み、ここで、上記ドットおよびリンカーは電極の境界を画定し、ここで、上記リンカーは、１対のドット間の中間点の方へと、あるいはその中間点で内側に先細りになり、ここで、上記ドットの直径は、上記反復単位の長さに沿った最も幅広い点であり、ここで、反復単位の並列セット間の端から端までの距離は等距離であるか、だいたい等距離である。いくつかの実施形態において、図８に示されるように、電極は波線に似たストリップである。いくつかの実施形態において、電極間の端から端までの距離は、波線構成全体にわたって等距離であるか、だいたい等距離である。いくつかの実施形態において、波線の電極の使用は、本明細書で開示されるように、ＤＥＰ電界勾配の増強をもたらす。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される電極は、平面構成である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される電極は非平面構成である。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスは、その表面上で生体分子を選択的に捕捉する。例えば、本明細書に開示されるデバイスは、例えば、ａ．核酸ハイブリダイゼーション；ｂ．抗体−抗原相互作用；ｃ．ビオチン−アビジン相互作用；ｄ．イオンまたは静電相互作用；あるいは、ｅ．これらの任意の組み合わせによって、核酸などの生体分子を捕捉することができる。したがって、本明細書に開示されるデバイスは、機能化された表面を組み込むことがあり、これは、相補的な核酸プローブなどの捕捉分子、抗体あるいは生体分子（核酸など）を捕捉することができる他のタンパク質捕捉物、ビオチンあるいはアビジンなどの他の相補的な標的分子を捕捉することができる他の固定捕捉物、イオン相互作用または静電相互作用によって生体分子を捕捉することができる捕捉分子、あるいはこれらの組み合わせを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、表面は、ａ．ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールＰＥＧ）；ｂ．イオンまたは静電相互作用；ｃ．界面活性剤；あるいは、ｄ．それらの任意の組み合わせによって、非特異的な結合相互作用を最小限に抑え、および／または阻害するように機能化される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、そのような相互作用に干渉することによって非特異的な結合相互作用を減らす添加剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０など、ウシ血清アルブミン、非特異的な免疫グロブリンなどの使用を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、デバイスは、（ａ）横に並んで、（ｂ）垂直に面して、あるいは（ｃ）水平に面して配向された複数の微小電極デバイスを含む。他の実施形態では、電極は、サンドイッチされた構成であり、例えば、垂直フォーマットで互いに上に積み重ねられる。
【００９２】
ヒドロゲル
材料の１つ以上の層で電極構造を覆うことは、限定されないが、電極上あるいはその電極の近くで生じ得る電気分解反応、加熱、および無秩序な流体の運動を含む、有害な電気化学効果を弱めることができ、依然として、細胞、細菌、ウイルス、ナノ粒子、ＤＮＡ、および他の生体分子の有効な分離を行うことができる。いくつかの実施形態において、電極構造上で層状になっている材料は１つ以上の多孔層であり得る。他の実施形態では、１つ以上の多孔層はポリマー層である。他の実施形態では、１つ以上の多孔層はヒドロゲルである。
【００９３】
一般的に、ヒドロゲルは、構成解除（ｄｉｓｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）または分解することなく、電極表面で電気化学的効果に耐えることができるように、十分な機械的強さを備えていなければならず、かつ、比較的、化学的に不活性でなければならない。一般的に、ヒドロゲルは、小さな水性のイオンに対して十分に透過性であるが、生体分子を電極表面から遠ざける。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは１つの層またはコーティングである。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは多孔性の勾配を含み、ここで、ヒドロゲル層の底部はヒドロゲル層の上部よりも大きな多孔性を有する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは複数の層またはコーティングを含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは２つのコートを含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは３つのコートを含む。いくつかの実施形態において、底部（第１の）コーティングは、その後のコーティングよりも大きな多孔性を有する。いくつかの実施形態において、上部コートは、第１のコーティングよりも少ない多孔性を有する。いくつかの実施形態において、上部コートは、直径で１００ピコメートルよりも大きな粒子に対するサイズカットオフとして機能する、平均的な細孔直径を有する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．００１Ｓ／ｍ〜約１０Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．０１Ｓ／ｍ〜約１０Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約１０Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約１．０Ｓ／ｍ〜約１０Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．０１Ｓ／ｍ〜約５Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．０１Ｓ／ｍ〜約４Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．０１Ｓ／ｍ〜約３Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．０１Ｓ／ｍ〜約２Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約５Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約４Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約３Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約２Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約１．５Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約１．０Ｓ／ｍの導電率を有する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは約０．１Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．２Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．３Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．４Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．５Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．６Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．７Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．８Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．９Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約１．０Ｓ／ｍの導電率を有する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜約１０ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜約５ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜約４ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜約３ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜約２ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約１ミクロン〜約５ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約１ミクロン〜約４ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約１ミクロン〜約３ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約１ミクロン〜約２ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．５ミクロン〜約１ミクロンの厚さを有する。
【０１００】
いくつかの実施形態において、スピンコーティング前のヒドロゲル溶液の粘度は、約０．５ｃＰ〜約５ｃＰの範囲である。いくつかの実施形態において、ヒドロゲル溶液の１回のコーティングは、スピンコーティングの前で約０．７５ｃＰおよび５ｃＰの粘度を有する。いくつかの実施形態において、複数のコートヒドロゲルでは、第１のヒドロゲル溶液はスピンコーティングの前に約０．５ｃＰ〜約１．５ｃＰの粘度を有する。いくつかの実施形態において、第２のヒドロゲル溶液は、約１ｃＰ〜約３ｃＰの粘度を有する。ヒドロゲル溶液の粘度は、溶媒中のポリマー濃度（０．１％−１０％）とポリマー分子量（１０，０００〜３００，０００）、および、溶媒の開始粘度に基づく。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、第１のヒドロゲルコーティングは、約０．５ミクロン〜１ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第１のヒドロゲルコーティングは、約０．５ミクロン〜０．７５ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第１のヒドロゲルコーティングは、約０．７５〜１ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第２のヒドロゲルコーティングは、約０．２ミクロン〜０．５ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第２のヒドロゲルコーティングは、約０．２〜０．４ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第２のヒドロゲルコーティングは、約０．２〜０．３ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第２のヒドロゲルコーティングは、約０．３〜０．４ミクロンの厚さを有する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、ヒドロゲルを形成する任意の適切な合成ポリマーを含む。一般的に、任意の十分に親水性および重合化可能な分子は、本明細書で開示されるように使用される合成ポリマーヒドロゲルの生成において利用され得る。単量体中の重合可能な部分は、限定されないが、置換または非置換のα，β，不飽和カルボニル（二重結合は炭素に直接結合し、その炭素は、酸素に二重結合し、かつ別の酸素、窒素、硫黄、ハロゲン、あるいは炭素に単結合する）；ビニル（二重結合は酸素、窒素、ハロゲン、リン、あるいは硫黄に単結合する）；アリル（二重結合は、酸素、窒素、ハロゲン、リン、あるいは硫黄に結合する炭素に単結合する）；ホモアリル（二重結合は炭素に単結合し、その炭素は別の炭素に単結合し、その別の炭素は、酸素、窒素、ハロゲン、リン、あるいは硫黄に単結合する）；アルキニル部分（２つの炭素原子間に三重結合が存在する）を含む、アルケニル部分を含み得る。いくつかの実施形態において、アクリロイルまたはアクリルアミドの単量体、例えば、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミドなどは、本明細書に開示されるようにヒドロゲルの形成に役立つ。多くの好ましいアクリルアミド単量体は、アクリルアミド、Ｎ−置換アクリルアミド、Ｎ−置換メタクリルアミド、およびメタクリルアミドを含む。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、ポリマー、例えば、エポキシドベースのポリマー、ビニルベースのポリマー、アリルベースのポリマー、ホモアリルベースのポリマー、環状無水物ベースのポリマー、エステルベースのポリマー、エーテルベースのポリマー、アルキレングリコールベースのポリマー（例えば、ポリプロピレングリコール）などを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、あるいは任意の適切なアクリルアミド、あるいはビニルベースのポリマー、またはその誘導体を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは蒸着によって塗布される。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）によって重合される。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは可逆的な追加−断片化連鎖移動反応（ＲＡＦＴ）重合によって重合される。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、添加剤は、ゲルの導電率を増大させるためにヒドロゲルに加えられる。いくつかの実施形態において、ヒドロゲル添加剤は、導電性ポリマー（例えば、ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳ）、塩（例えば、塩化銅）、金属（例えば、金）、可塑剤（例えば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、あるいはＰＥＧ６００）、または共溶媒である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルはさらに、限定されないが、ヒスチジン、ヒスチジンペプチド、ポリヒスチジン、リジン、リジンペプチド、および他のカチオン性化合物または材料を含む、ＤＮＡハイブリッドの安定性を維持するのを助ける化合物あるいは材料を含む。
【０１０９】
誘電泳動電界
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイス、およびシステムは、流体物質（随意に他の物質（汚染物質、残留細胞物質など）を含む）から、細胞、粒子、および／または分子（核酸など）を収集、分離、および／または単離するためのメカニズムを提供する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ＡＣ動電学的電界は、核酸などの生体分子を収集、分離、または単離するために生成される。いくつかの実施形態において、ＡＣ動電学的電界は誘電泳動電界である。これに応じて、いくつかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）は、本明細書に記載される方法の様々な工程で利用される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるデバイスおよびシステムはＤＥＰ電界などを生成することができる。特定の実施形態では、ＤＥＰは、（例えば、同時にあるいは異なるときに）細胞および／または核酸を集中させるために使用される。ある実施形態では、本明細書で記載される方法は、第１、第２、および任意のさらなる随意のＤＥＰ電界を作るために、電極のアレイに電圧を印加する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるデバイスおよびシステムは、第１、第２、および任意のさらなる随意のＤＥＰ電界を作るために、電圧が印加され得る。
【０１１２】
ＤＥＰは、不均一電界にさらされるとき、誘電体粒子上に力が加えられる現象である。本明細書に記載される方法の工程、明細書に記載されるデバイスとシステムの態様などに応じて、様々な実施形態にける誘電体粒子は、生体細胞および／または分子、例えば、核酸分子である。本明細書に記載される方法の様々な工程、あるいは、本明細書に記載されるデバイスまたはシステムの態様は、様々な構成要素、例えば、無傷細胞あるいは他の特定の物質を単離および分離するために利用され得；さらに、ＤＥＰ電界の様々な電界領域は、本明細書に記載される方法の様々な工程、あるいはデバイスとシステムの態様で使用され得る。この誘電泳動力は、粒子を帯電することを必要としない。いくつかの例では、力の強さは、媒体、および特定の粒子の電気特性、粒子の形状および大きさ、ならびに電界の周波数に依存する。いくつかの例では、特定の周波数の電界は、粒子を選択的に操作する。本明細書に記載される特定の態様において、これらのプロセスは、（例えば、流体媒体中の）他の成分からの、あるいは互いの、細胞および／または小さな粒子（核酸分子を含む分子など）の分離を可能にする。
【０１１３】
本明細書で提供される様々な実施形態では、本明細書に記載される方法またはデバイスは、複数のＤＥＰ電界領域を生成することを含む。例えば、方法またはデバイスは、アレイを用いて第１のＤＥＰ電界領域および第２のＤＥＰ電界領域を生成することを含む。本明細書で提供される様々な実施形態において、本明細書に記載されるデバイスまたはシステムは、アレイを用いて、第１のＤＥＰ電界領域および第２のＤＥＰ電界領域を生成することができる。いくつかの例では、第１と第２の電界領域は、１つの電界の一部である（例えば、第１と第２の領域は同時に存在するが、デバイス内および／またはアレイ上の異なる位置で見られる）。いくつかの実施形態において、第１と第２の電界領域は異なる電界である（例えば、第１の領域は第１の時間に電極を電圧で印加することにより作られ、第２の領域は第２の時間に電極を電圧で印加することにより作られる）。特定の態様では、第１のＤＥＰ電界領域は、細胞を（例えば、低電界ＤＥＰ領域へと）集中させるか単離するのに適切である。いくつかの実施形態において、第２のＤＥＰ電界領域は、例えば、高電界ＤＥＰ領域へと、分子（例えば、核酸、無細胞の核酸）などのより小さな粒子を集中させるのに適している。いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、第１あるいは第２のＤＥＰ電界領域のいずれかの使用を随意に除外する。
【０１１４】
いくつかの例において、以下に記載されるように、第１のＤＥＰ電界は、あるサイズ以上、あるサイズ以下、あるいはサイズのある範囲内の無細胞の核酸を含む、核酸を集中させるか、または単離するのに適切である。いくつかの例では、第２のＤＥＰ電界は、あるサイズ以上、あるサイズ以下、あるいはサイズのある範囲内の無細胞の核酸を含む、核酸を集中させるか、あるいは単離するのに適している。第１および第２のＤＥＰ電界は、同じまたは異なるサイズの核酸を集中させるか、あるいは単離するように構成することができる。したがって、本明細書に開示される方法およびデバイスは、様々な異なるサイズの核酸を評価するために使用することができる。
【０１１５】
３つ以上のＤＥＰ電界領域を含む実施形態がさらに本明細書に記載され、ここで、電界領域の各々は、少なくとも１つの他の電界領域と同じまたは異なる数で作動するように構成することができる。したがって、上記実施形態は、様々な特性に基づいて、生体サンプル中の様々な物質を集中させるか、あるいは単離することができる。例えば、第１のＤＥＰ電界領域は細胞を単離するように構成することができ、第２のＤＥＰ電界領域は、５００ｂｐ以上の無細胞ＤＮＡを単離するか、あるいは集中させるように構成することができ、第３のＤＥＰ電界領域は、３００ｂｐ〜５００ｂｐの間の無細胞ＤＮＡを単離するか、あるいは集中させるように構成することができ、第４のＤＥＰ電界領域は、３００ｂｐ以下の無細胞ＤＮＡを単離するか、あるいは集中させるように構成することができる。そのような実施形態のいくつかは、各電界領域内で単離あるいは集中されたＤＮＡの量を定量化することを含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、本明細書に開示されるデバイスの第２のＤＥＰ電界領域と同じチャンバ内にある。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域と第２のＤＥＰ電界領域は、電極のアレイの同じ領域を占める。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、本明細書に開示されるデバイスまたは完全に別のデバイスの第２のＤＥＰ電界領域とは別のチャンバ内にある。
【０１１８】
第１のＤＥＰ電界領域
いくつかの態様、例えば、高伝導度緩衝液（＞１００ｍＳ／ｍ）において、本明細書に記載される方法は、電極のアレイを含むデバイスに細胞あるいは他の特定の粒子を含む流体を適用する工程と、それによって、第１のＤＥＰ電界領域に上記細胞を集中させる工程とを含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されるデバイスおよびシステムは、細胞あるいは他の粒子物質を含む流体を、電極のアレイを含むデバイスに適用し、それにより、第１のＤＥＰ電界領域において細胞を集中させることができる。その後あるいは同時に、第２、あるいは任意の第３および第４のＤＥＰ領域は、核酸などの生体分子を含む他の流体成分を収集あるいは単離することができる。
【０１１９】
第１のＤＥＰ電界領域は、流体から細胞を集中させるのに適した任意の電界領域であり得る。この用途について、その細胞は通常、電極のアレイの近くに集中する。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は誘電泳動低電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は誘電泳動高電界領域である。いくつかの態様、例えば、低伝導度緩衝液（＜１００ｍＳ／ｍ）において、本明細書に記載される方法は、電極のアレイを含むデバイスに細胞を含む流体を適用する工程と、それによって、第１のＤＥＰ電界領域に上記細胞あるいは他の粒子物質を集中させる工程とを含む。
【０１２０】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるデバイスおよびシステムは、電極のアレイを含むデバイスに細胞あるいは他の粒子物質を含む流体を適用する工程と、第１のＤＥＰ電界領域において細胞を集中させる工程とを含む。様々な実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、流体から細胞を集中させるのに適切な任意の電界領域であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は電極のアレイに上で集中される。いくつかの実施形態において、細胞は誘電泳動高電界領域において捕捉される。いくつかの実施形態において、細胞は誘電泳動低電界領域において捕捉される。高電界対低電界の捕捉は通常、流体の導電率に依拠し、ここで、通常、交差点は約３００−５００ｍＳ／ｍの間である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約３００ｍＳ／ｍよりも大きな流体導電率で実施された誘電泳動低電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約３００ｍＳ／ｍよりも小さな流体導電率で実施された誘電泳動低電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約３００ｍＳ／ｍよりも大きな流体導電率で実施された誘電泳動高電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約３００ｍＳ／ｍよりも小さな流体導電率で実施された誘電泳動高電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約５００ｍＳ／ｍよりも大きな流体導電率で実施された誘電泳動低電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約５００ｍＳ／ｍよりも小さな流体導電率で実施された誘電泳動低電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約５００ｍＳ／ｍよりも大きな流体導電率で実施された誘電泳動高電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約５００ｍＳ／ｍよりも小さな流体導電率で実施された誘電泳動高電界領域である。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、第１の誘電泳動電界領域は交流によって作られる。交流は、細胞を集中させるのに適切な、任意の電流量、電圧、周波数などを有する。いくつかの実施形態では、第１の誘電泳動電界領域は、０．１マイクロアンペア〜１０アンペアのアンペア数、１−５０ボルトのピーク−ピーク電圧；および／または、１〜１０，０００，０００Ｈｚの周期数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、５〜２５ボルトのピーク−ピーク電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、３〜１５ｋＨｚの周波数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、１ミリアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、０．１マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１００マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、５００マイクロアンペア〜５００ミリアンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１〜２５ボルトのピーク−ピーク電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１〜１０ボルトのピーク−ピーク電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、２５〜５０ボルトのピーク−ピーク電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１０〜１，０００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１０〜１００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１００〜１０，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１０，０００〜１００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１００，０００〜１，０００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、第１の誘電泳動電界領域は直流によって作られる。直流は、細胞を集中させるのに適切な、任意のアンペア数、電圧、周波数などを有する。いくつかの実施形態では、第１の誘電泳動電界領域は、０．１マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数；１０ミリボルト〜１０ボルトの電圧；および／または、１ミリ秒〜１０００秒のパルス幅、および０．００１〜１０００Ｈｚのパルス周波数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１００マイクロアンペア〜５００ミリアンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１ミリアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１マイクロアンペア〜１ミリアンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、５００ミリ秒〜５００秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、５００ミリ秒〜１００秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１秒〜１０００秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、５００ミリ秒〜１秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、０．０１〜１０００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、０．１〜１００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１〜１００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１００〜１０００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、流体は細胞型の混合物を含む。例えば、血液は、赤血球および白血球を含む。環境サンプルは、広い濃度範囲の、多くの型の細胞および他の粒子物質を含む。いくつかの実施形態において、１つの細胞型（あるいは、サンプルを含む細胞型の総数より少ない任意の数の細胞型）は、第１のＤＥＰ電界において優先的に集中される。限定されないが、この実施形態は、糞便性大腸菌などの特定の環境汚染物に核酸単離手順を集中させるために有益であり、それによって、ＤＮＡ配列決定を使用して、汚染物質のソースを特定することができる。他の非限定的な実施形態では、第１のＤＥＰ電界は、細胞ではなくウイルスを特異的に集中させる（例えば、３００ｍＳ／ｍを超える導電率の流体において、ウイルスはＤＥＰ高電界領域に集中するが、より大きい細胞は、ＤＥＰ低電界領域に集中する）ように操作される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイス、あるいはシステムは、特異的な細胞型を単離あるいは分離するのに適している。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、あるいはシステムのＤＥＰ電界は、特定の細胞型のＤＥＰ電界の電界領域への分離あるいは集中を可能にするように特別に調整される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイス、あるいはシステムは、１つを超える電界領域を提供し、ここで、１つを超える型の細胞が単離あるいは集中される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイス、あるいはシステムは、様々な型の細胞の、そのＤＥＰ電界領域内への単離あるいは集中を可能にするように調整可能である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、ＤＥＰ電界を調整する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるデバイスまたはシステムは、ＤＥＰ電界を調整することができる。いくつかの例では、そのような調整は、所望の目的に特に適したＤＥＰを提供する際のものであり得る。例えば、アレイ、エネルギー、あるいは別のパラメータの修正は、ＤＥＰ電界を調整するために随意に利用される。より微細な分解能のための調整パラメータは、電極の直径、電極間の端から端までの距離、電圧、周期数、流体導電率、およびヒドロゲル組成物を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、電極のアレイの全体を含む。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、電極のアレイの一部を含む。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、電極のアレイの約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２５％、約２０％、あるいは約１０％を含む。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は電極のアレイの約三分の一を含む。
【０１２６】
第２のＤＥＰ電界領域
第２のＤＥＰ電界領域は、第１のＤＥＰ電界領域と同じまたは異なるように構成することができる。上記のように、第２のＤＥＰ電界領域は、第１のＤＥＰ電界領域と同じまたは異なる高分子および細胞の構成要素を単離するか、あるいは集中させるように構成することができる。これらは、無細胞ＤＮＡおよびＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、あるいは細胞小胞を含む、高分子および細胞の構成要素を含む。
【０１２７】
いくつかの態様では、第１のＤＥＰ電界領域および第２のＤＥＰ電界領域は、同じ型の高分子あるいは細胞の構成要素の異なるサブセットを単離するか、集中させるように構成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、第１のサイズまたはサイズの第１の範囲の第１の高分子または第１の細胞の構成要素を単離するか、あるいは集中させるように構成することができ、ならびに、第２のＤＥＰ電界領域は、第１のサイズまたはサイズの第２の範囲の第１の高分子あるいは第１の細胞の構成要素を単離するか、あるいは集中させるように構成することができる。一実施例では、第１のＤＥＰ電界領域は、３００−５００ｂｐの間の無細胞ＤＮＡを単離するか、あるいは集中させるように構成することができる、ならびに、第２のＤＥＰ電界領域は、３００ｂｐ未満の無細胞ＤＮＡを単離するか、あるいは集中させるように構成することができる。したがって、複数の電界領域を使用して、同じ型の高分子または細胞の構成要素のサブセット間を区別することができる。例示的な利点では、複数の電界領域の使用は、同じ型の高分子または細胞の構成要素の１つ以上のサブセットの定量化を可能にすることもできる。
【０１２８】
一態様では、（以下に提供される）細胞の溶解後、本明細書に記載される方法は、第２のＤＥＰ電界領域において核酸を集中させる工程を含む。他の態様では、本明細書に記載されるデバイスおよびシステムは、第２のＤＥＰ電界領域において核酸を集中させることができる。いくつかの実施形態において、第２のＤＥＰ電界領域は、核酸を集中させるのに適した任意の電界領域である。いくつかの実施形態において、核酸は電極のアレイ上に集中される。いくつかの実施形態において、第２のＤＥＰ電界領域は誘電泳動高電界領域である。第２のＤＥＰ電界領域は、随意に、第１のＤＥＰ電界領域と同じである。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、第２の誘電泳動電界領域は交流によって作られる。いくつかの実施形態において、交流は、核酸を集中させるのに適した、任意の電流量、電圧、周波数などを有する。いくつかの実施形態では、第２の誘電泳動電界領域は、０．１マイクロアンペア〜１０アンペアのアンペア数、１−５０ボルトのピーク−ピーク電圧；および／または、１〜１０，０００，０００Ｈｚの周期数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、０．１マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１００マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、５００マイクロアンペア〜５００ミリアンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１〜２５ボルトのピーク−ピーク電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１〜１０ボルトのピーク−ピーク電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、２５〜５０ボルトのピーク−ピーク電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１０〜１，０００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１０〜１００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１００〜１０，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１０，０００〜１００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１００，０００〜１，０００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、第２の誘電泳動電界領域は直流によって作られる。直流は、核酸を集中させるのに適した任意のアンペア数、電圧、周波数などを有する。いくつかの実施形態では、第２の誘電泳動電界領域は、０．１マイクロアンペア〜１アンペアの電流量；１０ミリボルト〜１０ボルトの電圧；および／または、１ミリ秒〜１０００秒のパルス幅、および０．００１〜１０００Ｈｚのパルス周波数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、５〜２５ボルトのピーク−ピーク電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、３〜１５ｋＨｚの周波数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、２ミリアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１００マイクロアンペア〜５００ミリアンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１ミリアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１マイクロアンペア〜１ミリアンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、５００ミリ秒〜５００秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、５００ミリ秒〜１００秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１秒〜１０００秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、５００ミリ秒〜１秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、０．０１〜１０００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、０．１〜１００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１〜１００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第２のＤＥＰ電界領域は、１００〜１０００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、第２のＤＥＰ電界領域は、電極のアレイの全体を含む。いくつかの実施形態において、第２のＤＥＰ電界領域は、電極のアレイの一部を含む。いくつかの実施形態において、第２のＤＥＰ電界領域は、電極のアレイの約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２５％、約２０％、あるいは約１０％を含む。いくつかの実施形態において、第２のＤＥＰ電界領域は電極のアレイの約三分の一を含む。
【０１３２】
核酸の単離
一態様では、流体から核酸を単離するための方法が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、核酸は無細胞の核酸である。いくつかの実施形態において、流体から無細胞の核酸を単離するための方法が本明細書に開示され、上記方法は：ａ．電極のアレイを含むデバイスに流体を適用する工程；ｂ．第１のＡＣ動電学的（例えば、誘電泳動）電界領域において複数の細胞物質を集中させる工程；ｃ．第２のＡＣ動電学的（例えば、誘電泳動）電界領域において核酸を単離する工程；および、ｄ．細胞物質を洗い流す工程を含む。いくつかの例では、残留細胞物質は低電界領域の近くに集中させられる。いくつかの実施形態において、残留物質はデバイスから洗い流され、および／または核酸から洗い流される。いくつかの実施形態において、核酸は第２のＡＣ動電学的電界領域に集中させられる。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、核酸は、最初は細胞内にある。図３に見られるように、方法は、いくつかの例において、高電界領域の近くに細胞を集中させる工程を含む。いくつかの実施形態において、細胞を含む流体から核酸を単離するための方法が本明細書で開示され、上記方法は：ａ．電極のアレイを含むデバイスに流体を適用する工程；ｂ．第１のＡＣ動電学的（例えば、誘電泳動）電界領域において複数の細胞を集中させる工程；ｃ．第２のＡＣ動電学的（例えば、誘電泳動）電界領域で核酸を単離する工程；および、ｄ．細胞を洗い流す工程を含む。いくつかの例では、細胞は高電界領域において溶解される。溶解後、核酸は高電界領域内に残り、および／または高電界領域において集中させられる。いくつかの例では、残留細胞物質は低電界領域の近くに集中させられる。いくつかの実施形態において、残留物質はデバイスから洗い流され、および／または核酸から洗い流される。いくつかの実施形態において、核酸は第２のＡＣ動電学的電界領域に集中させられる。
【０１３４】
一態様では、細胞または他の粒子物質を含む流体から核酸を単離するための方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、核酸は細胞（例えば、流体中の無細胞ＤＮＡ）内にはない。いくつかの実施形態において、細胞または他の粒子物質を含む流体から核酸を単離するための方法が本明細書で開示され、上記方法は：ａ．電極のアレイを含むデバイスに流体を適用する工程；ｂ．第１のＡＣ動電学的（例えば、誘電泳動）電界領域において複数の細胞を集中させる工程；ｃ．第２のＡＣ動電学的（例えば、誘電泳動）電界領域で核酸を単離する工程；および、ｄ．細胞を洗い流す工程を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、細胞を洗い流した後に、残留タンパク質を分解する工程をさらに含む。図４は、細胞を含む流体から細胞外核酸を単離するための例示的な方法を示す。いくつかの実施形態において、細胞は低電界領域上あるいはその近くに集中し、ならびに、核酸は、高電界領域上あるいはその近くに集中する。いくつかの例では、細胞はデバイスから洗い流され、および／または核酸から洗い流される。
【０１３５】
一態様では、本明細書に記載される方法、システム、およびデバイスは、細胞または他の粒子物質を含む流体から核酸を単離する。一態様では、誘電泳動は細胞を集中させるために使用される。いくつかの実施形態では、流体は、液体、随意に水もしくは水溶液、または分散液である。いくつかの実施形態において、流体は体液を含む任意の適切な流体である。典型的な体液は、血液、血清、血漿、胆汁、乳汁、脳脊髄液、胃液、射精液、粘液、腹水、唾液、汗、涙、尿などを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、医学的な治療または診断の手順、デバイス、またはシステムの一部として、本明細書に記載される方法、システム、またはデバイスを使用して、体液から単離される。いくつかの実施形態では、流体は、流体中に可溶化および／または分散した、組織および／または細胞である。例えば、組織は、核酸が本明細書に記載される方法、デバイス、またはシステムを使用して単離することができる癌腫瘍であり得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、流体は水である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、流体は他の粒子物質をさらに含み得る。そのような粒子物質は、例えば、封入体（例えば、セロイドまたはマロリー体）、細胞円柱（例えば、顆粒円柱、硝子円柱、細胞円柱、蝋様円柱、および偽円柱）、ピック体、レーヴィ体、神経原線維変化、筋原繊維形成、細胞残屑、および他の粒子物質であってもよい。いくつかの実施形態では、粒子物質は凝集タンパク質（例えば、ベータアミロイド）である。
【０１３８】
流体は、高いまたは低い導電率を含む任意の導電率を有し得る。いくつかの実施形態では、導電率は、約１μＳ／ｍ〜約１０ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は、約１０μＳ／ｍ〜約１０ｍＳ／ｍである。他の実施形態では、導電率は、約５０μＳ／ｍ〜約１０ｍＳ／ｍである。さらに他の実施形態では、導電率は、約１００μＳ／ｍ〜約１０ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約８ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約６ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約５ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約４ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約３ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約２ｍＳ／ｍ、および約１００μＳ／ｍ〜約１ｍＳ／ｍである。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、導電率は約１μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約１０μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約１００μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約１ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約２ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約３ｍＳ／ｍである。さらに他の実施形態では、導電率は約４ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約５ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約１０ｍＳ／ｍである。さらに別の実施形態では、導電率は約１００ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約１Ｓ／ｍである。他の実施形態において、導電率は約１０Ｓ／ｍである。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、導電率は少なくとも１μＳ／ｍである。まだ他の実施形態では、導電率は少なくとも１０μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は少なくとも１００μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は少なくとも１ｍＳ／ｍである。さらなる実施形態では、導電率は少なくとも１０ｍＳ／ｍである。まだ他の実施形態では、導電率は少なくとも１００ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は少なくとも１Ｓ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は少なくとも１０Ｓ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１０μＳ／ｍである。他の実施形態では、導電率は最大で１００μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１０ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１００ｍＳ／ｍである。さらに他の実施形態では、導電率は最大で１Ｓ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１０Ｓ／ｍである。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、流体は、１０ｍｌ未満を含む小量の液体である。いくつかの実施形態において、流体は８ｍｌ未満である。いくつかの実施形態において、流体は５ｍｌ未満である。いくつかの実施形態において、流体は２ｍｌ未満である。いくつかの実施形態において、流体は１ｍｌ未満である。いくつかの実施形態において、流体は５００μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は２００μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は１００μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は５０μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は１０μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は５μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は１μｌ未満である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、デバイスに適用される、または方法において使用される、流体の量は、約１００，０００，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は、約１０，０００，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は、約１，０００，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は、約１００，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は、約１０，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は、約１，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は無細胞である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるデバイス、システム、および方法を用いる、細胞または他の粒子物質を含む流体からの核酸の単離は、約３０分未満、約２０分未満、約１５分未満、約１０分未満、約５分未満、または約１分未満の時間を要する。他の実施形態において、本明細書に記載されたデバイス、システム、および方法を用いる、細胞または他の粒子物質を含む流体からの核酸の単離は、３０分以下、約２０分以下、約１５分以下、約１０分以下、約５分以下、約２分以下、または約１分以下の時間を要する。さらなる実施形態では、本明細書に記載されたデバイス、システム、および方法を用いる、細胞または他の粒子物質を含む流体からの核酸の単離は、約１５分未満、好ましくは約１０分未満、または約５分未満の時間を要する。
【０１４４】
いくつかの例では、細胞外ＤＮＡ、無細胞ＤＮＡ断片、あるいは他の核酸（外部の細胞）は、細胞または他の粒子物質を含む流体から単離される。いくつかの実施形態では、流体は細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は細胞を含まない。
【０１４５】
細胞溶解
一態様では、第１の電泳動電界領域中の細胞を集中させた後、方法は、細胞から核酸を遊離する方法を含む。他の態様では、本明細書に記載されるデバイスおよびシステムは、細胞から核酸を遊離することができる。いくつかの実施形態において、核酸は、第１のＤＥＰ電界領域の細胞から遊離される。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、細胞を溶解することにより、複数の細胞から核酸を遊離する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるデバイスおよびシステムは、細胞を溶解することにより複数の細胞から核酸を遊離することができる。細胞溶解の１つの方法は、アレイ上の細胞の単離後に細胞に直流を印加する工程を含む。直流は、細胞を溶解するのに適した、任意の適切なアンペア数、電圧などを有する。いくつかの実施形態では、電流は、約１ボルト〜約５００ボルトの電圧を有する。いくつかの実施形態では、電流は、約１０ボルト〜約５００ボルトの電圧を有する。いくつかの実施形態では、電流は、約１０ボルト〜約２５０ボルトの電圧を有する。さらに他の実施形態では、電流は、約５０ボルト〜約１５０ボルトの電圧を有する。高電界は膜の完全性を損なうため、電圧は一般に、細胞溶解のドライバーである。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、溶解に使用される直流は、細胞を溶解するのに適した任意の持続時間、周期数などを有する１つ以上のパルスを含む。いくつかの実施形態において、約１００ボルトの電圧は、細胞を溶解するために約１ミリ秒間印加される。いくつかの実施形態において、約１００ボルトの電圧は、第２のソース上に２あるいは３回印加される。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、直流の周期数は、ボルト／ｃｍ、パルス幅、および流体導電率に依存する。いくつかの実施形態において、パルスは、約０．００１〜約１０００Ｈｚの周波数を有する。いくつかの実施形態において、パルスは、約１０〜約２００Ｈｚの周波数を有する。他の実施形態において、パルスは、約．０１Ｈｚ〜１０００Ｈｚの周期数を有する。さらに他の実施形態において、パルスは、約０．１Ｈｚ〜１０００Ｈｚ、約１Ｈｚ〜１０００Ｈｚ、約１Ｈｚ〜５００Ｈｚ、約１Ｈｚ〜４００Ｈｚ、約１Ｈｚ〜３００Ｈｚ、あるいは約１Ｈｚ〜約２５０Ｈｚの周期数を有する。いくつかの実施形態では、パルスは、約０．１Ｈｚの周波数を有する。いくつかの実施形態では、パルスは、約１Ｈｚの周波数を有する。さらに他の実施形態では、パルスは、約５Ｈｚ、約１０Ｈｚ、約５０Ｈｚ、約１００Ｈｚ、約２００Ｈｚ、約３００Ｈｚ、約４００Ｈｚ、約５００Ｈｚ、約６００Ｈｚ、約７００Ｈｚ、約８００Ｈｚ、約９００Ｈｚ、あるいは約１０００Ｈｚの周波数を有する。
【０１４９】
他の実施形態では、パルスは、約１ミリ秒（ｍｓ）〜１０００秒（ｓ）の持続時間を有する。いくつかの実施形態において、パルスは、約１０ｍｓ〜１０００ｓの持続時間を有する。さらに他の実施形態では、パルスは、約１００ｍｓ〜１０００ｓ、約１ｓ〜１０００ｓ、約１ｓ〜５００ｓ、約１ｓ〜２５０ｓ、あるいは１ｓ〜１５０ｓの持続時間を有する。いくつかの実施形態において、パルスは、約１ｍｓ、約１０ｍｓ、約１００ｍｓ、約１ｓ、約２ｓ、約３ｓ、約４ｓ、約５ｓ、約６ｓ、約７ｓ、約８ｓ、約９ｓ、約１０ｓ、約２０ｓ、約５０ｓ、約１００ｓ、約２００ｓ、約３００ｓ、約５００ｓ、あるいは約１０００ｓの存続時間を有する。いくつかの実施形態において、パルスは、１０〜５０％のデューティサイクルを有する０．２〜２００Ｈｚの周波数を有する。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、直流は、１回のパルスあるいは複数のパルスとして印加される。約１〜２０のパルスを含む、任意の適切な数のパルスが適用され得る。約１ミリ秒〜１０００秒を含む、パルス間の任意の適切な時間がある。いくつかの実施形態では、パルスの持続期間は、．０１〜１０秒である。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、細胞は、単離細胞に印加された直流と組み合わせた他の方法を使用して溶解される。さらに他の実施形態では、細胞は直流を使用せずに溶解される。様々な態様では、デバイスおよびシステムは、他の手段と組み合わせた直流を用いて細胞を溶解することができるか、あるいは、直流を使用せず細胞を溶解することができる場合がある。限定されないが、化学溶解剤（例えば、酸）、酵素溶解剤、熱、圧力、剪断力、音響エネルギー、浸透圧ショック、あるいはそれらの組み合わせの適用を含む、当業者に既知の細胞溶解の任意の方法が適切であり得る。リゾチームは酵素溶解剤の一例である。
【０１５２】
残留物質の除去
いくつかの実施形態において、第２のＤＥＰ電界領域で標的とされた細胞物質を集中させた後、方法は、標的とされた細胞物質から残留物質を随意に洗い流す工程を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるデバイスまたはシステムは、標的とされた細胞物質から残留物質を洗い流すのに適している流体を含むリザーバーを随意に含むことができる。いくつかの実施形態において、標的とされた細胞物質は、電極に電圧を印加し続けることにより、第２のＤＥＰ電界領域などの電極のアレイの近くで保持される。「残留物質」とは、流体中に元々存在するもの、細胞中に元々存在するもの、手順の間に添加されるもの、限定されないが、細胞（つまり、残留細胞物質）の溶解を含むプロセスの任意の工程を通じて作成されたものなどである。例えば、残留物質は、非溶解細胞、細胞壁断片、タンパク質、脂質、炭水化物、無機質、塩、緩衝液、血漿、および望ましくない核酸を含む。いくつかの実施形態において、溶解した細胞物質は、溶解時に複数の細胞から遊離された残留タンパク質を含む。標的とされた細胞物質のすべてが第２のＤＥＰ電界に集中するとは限らない場合がある。いくつかの実施形態では、一定量の標的とされた細胞物質は、残留物質を用いて洗い流される。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、残留物質は、任意の適切な流体、例えば、水、ＴＢＥ緩衝液などで洗い流される。いくつかの実施形態では、残留物質は、任意の適切な量の流体で洗い流されるか、任意の適切な時間洗い流されるか、１を超える流体を用いて洗い流されるか、または他の任意のバリエーションである。いくつかの実施形態では、残留物質を洗い流す方法は、標的とされた細胞物質の単離の望ましいレベルに関し、高純度の標的とされた細胞物質は、より厳重な洗い流しおよび／または洗浄を必要とする。他の実施形態において、残留物質を洗い流す方法は、特定の出発物質およびその組成物に関する。いくつかの例では、脂質が多い出発物質は、脂質を可溶化するのに適した疎水性流体を伴う、洗い流し手順を必要とする。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、方法は、残留タンパク質を含む残留物質を分解する工程を含む。いくつかの実施形態では、デバイスまたはシステムは、残留タンパク質を含む残留物質を分解することができる。例えば、タンパク質は、１つ以上の化学分解（例えば、酸加水分解）および酵素分解により分解される。いくつかの実施形態では、酵素分解剤はプロテアーゼである。他の実施形態において、タンパク質分解剤はプロテイナーゼＫである。残留物質の分解の随意の工程は、任意の適切な時間、温度などで実施される。いくつかの実施形態では、分解された残留物質（分解タンパク質を含む）は、核酸から洗い流される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、残留物質を分解するために使用される薬剤は、不活性化または分解される。いくつかの実施形態では、デバイスまたはシステムは、残留物質を分解するために使用される薬剤を分解または不活性化することができる。いくつかの実施形態では、残留物質を分解するために使用される酵素は、熱（例えば、５０〜９５°Ｃで５〜１５分間）により不活性化される。例えば、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を含む酵素は、熱（一般的には、１５分、７０°Ｃ）を使用して分解および／または不活性化される。残留タンパク質が酵素により分解されるいくつかの実施形態では、方法は、タンパク質の分解後に、分解酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）を不活性化する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、熱は、デバイス中の加熱モジュールにより提供される（例えば、３０〜９５℃の温度範囲）。
【０１５６】
方法の特定の工程の順序および／または組み合わせは、変更可能である。いくつかの実施形態では、デバイスまたは方法は、任意の順序または組み合わせで、特定の工程を実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、残留物質および分解タンパク質は、別の工程または同時の工程で洗い流される。すなわち、残留物質が洗い流され、その後、残留タンパク質が分解され、次に、核酸から分解されたタンパク質が洗い流される。いくつかの実施形態において、最初に残留タンパク質を分解し、その後、組み合わされた工程で核酸から残留物質と分解タンパク質の両方を洗い流す。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、標的とされた細胞物質はデバイス中で保持され、ＰＣＲ、あるいは、核酸を操作または増幅する他の手順などのさらなる手順で随意に使用される。いくつかの実施形態において、デバイスおよびシステムは、ＰＣＲあるいは他の任意の手順を実施することができる。他の実施形態において、標的とされた細胞物質は、デバイスから収集および／または溶離される。いくつかの実施形態において、デバイスならびにシステムは、デバイスまたはシステムから標的とされた細胞物質を採取および／または溶離することができる。いくつかの実施形態において、単離された細胞物質は、（ｉ）第２の誘電泳動電界領域をオフにすること；および、（ｉｉ）溶離剤中のアレイから物質を溶離することにより収集される。典型的な溶離剤は、水、ＴＥ、ＴＢＥ、およびＬ−ヒスチジン緩衝液を含む。
【０１５８】
核酸およびその収率
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイス、あるいはシステムは、そのような方法、デバイス、あるいはシステムから得られ得るあらゆる所望の核酸を入手、単離、または分離するために随意に利用される。本明細書に記載される方法、デバイス、およびシステムにより単離された核酸は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、およびこれらの組み合わせを含む。ＤＮＡは無細胞ＤＮＡとＤＮＡ断片を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、配列決定に適した形態、または増幅、ライゲーション、あるいはクローニングを含む核酸のさらなる操作に適切な形態で単離される。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、単離、分離、または捕捉された核酸は、そのサイズに基づいて選択的あるいは優先的に単離、分離、または捕捉されるＤＮＡ断片を含む。いくつかの実施形態において、選択的あるいは優先的に単離、分離、または捕捉されるＤＮＡ断片は、２５０−６００ｂｐ、２５０−２７５ｂｐ、２７５−３００ｂｐ、３００−３２５ｂｐ、３２５−３５０ｂｐ、３５０−３７５ｂｐ、３７５−４００ｂｐ、４００−４２５ｂｐ、４２５−４５０ｂｐ、４５０−４７５ｂｐ、４７５−５００ｂｐ、５００−５２５ｂｐ、５２５−５５０ｂｐ、５５０−５７５ｂｐ、５７５−６００ｂｐ、３００−４００ｂｐ、４００−５００ｂｐ、および／または３００−５００ｂｐ長さである。いくつかの実施形態において、選択的あるいは優先的に単離、分離、または捕捉されるＤＮＡ断片は、６００−７００ｂｐ、７００−８００ｂｐ、８００−９００ｂｐ、９００−１０００ｂｐ、１−２ｋｂｐ、２−３ｋｂｐ、３−４ｋｂｐ、４−５ｋｂｐ、５−６ｋｂｐ、６−７ｋｂｐ、７−８ｋｂｐ、８−９ｋｂｐ、または９−１０ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、選択的あるいは優先的に単離、分離、または捕捉されるＤＮＡ断片は、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、あるいは１０００ｂｐサイズよりも大きい。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ断片は無細胞ＤＮＡ断片である。
【０１６１】
様々な実施形態において、単離あるいは分離された核酸は、少なくとも９９質量％の他の物質を含まず、少なくとも９９質量％の残留細胞物質（例えば、核酸が得られる溶解された細胞からの）を含まず、少なくとも９８質量％の他の物質を含まず、少なくとも９８質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも９５質量％の他の物質を含まず、少なくとも９５質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも９０質量％の他の物質を含まず、少なくとも９０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも８０質量％の他の物質を含まず、少なくとも８０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも７０質量％の他の物質を含まず、少なくとも７０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも６０質量％の他の物質を含まず、少なくとも６０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも５０質量％の他の物質を含まず、少なくとも５０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも３０質量％の他の物質を含まず、少なくとも３０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも１０質量％の他の物質を含まず、少なくとも１０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも５質量％の他の物質を含まず、少なくとも５質量％の残留細胞物質を含まない、核酸を含む組成物である。
【０１６２】
様々な実施形態において、核酸は任意の適切な純度を有する。例えば、ＤＮＡ配列決定の手順が約２０％の残留細胞物質を有する核酸サンプルで機能し得る場合、８０％までの核酸の単離が適切である。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、約８０質量％未満、約７０質量％未満、約６０質量％未満、約５０質量％未満、約４０質量％未満、約３０質量％未満、約２０質量％未満、約１０質量％未満、約５質量％未満、あるいは約２質量％未満の非核酸細胞物質および／またはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、約９９質量％を超える、約９８質量％を超える、約９５質量％を超える、約９０質量％を超える、約８０質量％を超える、約７０質量％を超える、約６０質量％を超える、約５０質量％を超える、約４０質量％を超える、約３０質量％を超える、約２０質量％を超える、または約１０質量％を超える核酸を含む。
【０１６３】
核酸は、未修飾の形態、誘導体化された形態、断片化された形態、断片化されていない形態などの任意の適切な形態で単離される。いくつかの実施形態では、核酸は配列決定に適切な形態で収集される。いくつかの実施形態では、核酸は、ショットガン・シークエンシング法、増幅、または他の操作に適切な断片化された形態で収集される。核酸は、例えば、合成方法による配列決定で使用されるようなヌクレオチドなどの、ＤＮＡ配列決定手順で使用される試薬を含む溶液において、デバイスから収集されてもよい。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、出発サンプルの核酸のほぼ典型である単離された核酸を結果としてもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるデバイスおよびシステムは、出発サンプルの核酸のほぼ典型であるサンプルから核酸を単離することができる。すなわち、方法により収集される、あるいは、デバイスまたはシステムにより収集することができる核酸の集団は、流体中の細胞に存在する核酸の集団に実質的に比例する。いくつかの実施形態では、本態様は、流体が、多くの細胞型の複合混合物であり、開業医が、様々な細胞型の関連する集団を判定するための核酸に基づく手順を望む用途において効果的である。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法を使用して単離された、あるいは、本明細書に記載されるデバイスによって単離され得る核酸は高品質であり、および／または、ＤＮＡ配列決定などの下流の手順、ＰＣＲなどの核酸増幅、あるいはライゲーション、クローニング、またはさらなる翻訳または形質転換アッセイなどの他の核酸操作で直接使用するのに適している。いくつかの実施形態では、収集された核酸は、最大で０．０１％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、収集された核酸は、最大で０．５％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、収集された核酸は、最大で０．１％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、収集された核酸は、最大で１％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、収集された核酸は、最大で２％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、収集された核酸は、最大で３％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、収集された核酸は、最大で４％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、収集された核酸は、最大で５％のタンパク質を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって単離された、あるいは、本明細書に記載されるデバイスによって単離され得る核酸は、少なくとも０．５ｎｇ／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって単離された、あるいは、本明細書に記載されるデバイスによって単離され得る核酸は、少なくとも１ｎｇ／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって単離された、あるいは、本明細書に記載されるデバイスによって単離され得る核酸は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって単離された、あるいは、本明細書に記載されるデバイスによって単離され得る核酸は、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度を有する。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、約５０ピコグラムの核酸は、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスを使用して、約５，０００の細胞から単離される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも１０ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも２０ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも５０ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも７５ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも１００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも２００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも３００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも４００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも５００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも１，０００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも１０，０００ピコグラムの核酸を生じさせる。
【０１６８】
アッセイおよびアプリケーション
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離された核酸を随意に増幅する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ反応は、電極のアレイ上あるいはそのアレイの近くで、あるいはデバイス内で行われる。いくつかの実施形態において、デバイスまたはシステムは、サーモサイクリングに適切なヒーターおよび／または温度制御機構を含む。
【０１６９】
ＰＣＲは、２つの効率的な熱伝導性要素（例えば、アルミニウムまたは銀）の間に反応化学分析物を配置すること、および、ＴＥＣを使用して反応温度を調節することにより、従来のサーモサイクリングを使用して随意に行われる。さらなる設計は、ガラスまたは熱ポリマーのような透過性材料を介する赤外線加熱を随意に使用する。いくつかの例では、設計は、基板を介して網状に繋げられた導電配線を含むスマートポリマーまたはスマートガラスを使用する。この導電配線は、材料の迅速な熱伝導を可能にし、および、（適切なＤＣ電圧を印加することにより）効率的なＰＣＲ反応を持続させるために必要とされる温度変化と温度勾配をもたらす。ある例では、加熱は、抵抗性チップヒーター、および温度を急速に、かつ通過する電流の量に比例して変化させる他の抵抗素子を使用して適用される。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、従来の蛍光光度法（ｃｃｄ、ｐｍｔ、他の光学検出器、および光学フィルター）と共に使用され、増幅倍数（ｆｏｌｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）はリアルタイムで、あるいは時間間隔をおいてモニタリングされる。ある例では、最終的な増幅倍数の定量化は、ＡＦＵ（倍化を分析するための相互に関連する任意の蛍光単位）に変換される光学的検出を介して報告されるか、あるいは、インピーダンス測定または他の電気化学的感知を介して電気信号に変換される。
【０１７１】
微小電極アレイの小さなサイズを考慮すると、これらの要素は微小電極アレイの周囲に随意に追加され、ＰＣＲ反応は主なサンプル処理チャンバ（ＤＥＰアレイ上）で実施され、あるいは、増幅される分析物は、流体カートリッジ内の別のチャンバへとフルイディックスによって随意に運ばれて、オンカートリッジを可能にする。
【０１７２】
ラボオンチップ手順
いくつかの例では、光送達スキームは、光の励起および／または発光、および／または、増幅倍数の検出を提供するために利用される。特定の実施形態では、これは、外部の構成要素を使用する必要をなくすための光導波管として、フローセル材料（アクリル（ＰＭＭＡ）環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等のような熱のポリマー）を使用することを含む。加えて、いくつかの例では、光源−発光ダイオード−ＬＥＤ、垂直共振器面発光レーザ−ＶＣＳＥＬ、および他の照明スキームは、フローセルの内部で直接統合され、または微小電極アレイ表面上に直接構築されて、内部制御され動力が供給された光源を有する。小型のＰＭＴ、ＣＣＤ、またはＣＭＯＳ検出器もフローセルへと組み込むことができる。この最小化および小型化は、類似する従来のデバイス（すなわち、標準的なベンチトップＰＣＲ／ＱＰＣＲ／蛍光測定器）のフットプリントを低減させつつ、迅速な信号送達および検出が可能なコンパクトなデバイスを可能にする。
【０１７３】
オンチップ増幅
いくつかの例では、シリコン微小電極アレイは、ＰＣＲに必要な熱サイクルに耐えることができる。いくつかの適用では、少量の標的核酸が移行工程中に失われる可能性があるので、オンチップＰＣＲは有利である。本明細書に記載されるデバイス、システム、またはプロセスの特定の実施形態では、複数のＰＣＲ技術の任意の１つ以上が随意に使用され、そのような技術は、以下のいずれか１つ以上を随意に含む：フローセルにおける直接的な熱サイクリング；様々な温度帯を有するマイクロチャネルを通って物質を移動させること；および、システム上で増幅され得るか、ＰＣＲ機械に移され得るＰＣＲ管へ量を移動させること。いくつかの例では、出口が不混和性流体を含むＴ字路と界面安定化剤（界面活性剤など）を含む場合に、液滴ＰＣＲが実施される。ある実施形態では、液滴は任意の適切な方法によって熱サイクルされる。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、増幅は、等温反応、例えば、転写増幅法、核酸配列ベース増幅、ＲＮＡ技術のシグナル媒介性増幅、ＳＤＡ法（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ローリングサークル増幅、ＤＮＡのＬＡＭＰ法、等温ＭＤＡ法（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ヘリカーゼ依存性増幅、単一プライマー等温増幅、あるいは環状ヘリカーゼ依存増幅（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用して実施される。
【０１７５】
様々な実施形態において、増幅は、均質溶液で、あるいはアンカードプライマー（ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）を有する不均一系（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ）として実施される。後者のいくつかの実施形態において、結果として生じるアンプリコンは、より高い多重度のために表面に直接連結される。いくつかの実施形態において、アンプリコンを変性することで、電極上あるいはその電極の近くに単鎖産物を与える。その後、ハイブリダイゼーション反応は、一塩基多型（ＳＮＰ）、短いタンデム反復（ＳＴＲ）、突然変異、挿入／欠失、メチル化などの、遺伝子情報調べるために任意に実施される。メチル化は並行分析によって随意に決定され、ここで、１つのＤＮＡサンプルはバイサルファイト処理され、１つはバイサルファイト処理されていない。バイサルファイトは、未修飾のＣを脱プリン化してＵにする。メチル化Ｃは、いくつかの例において影響を受けない。いくつかの実施形態において、対立遺伝子特異的塩基伸長が、対象の塩基を報告するために使用された。
【０１７６】
特定の相互作用ではなく、表面は、捕捉のための非特異的部分で随意に修飾される。例えば、表面は、ポリカチオン（つまり、ポリリシン）で修飾され、逆バイアス（‐Ｖ）によって遊離することができるＤＮＡ分子を捕捉することができる。いくつかの実施形態において、表面への修飾は、表面にわたって均一であるか、あるいは電極領域または非電極領域を機能化するために特異的にパターン化される。ある実施形態では、これは、フォトリソグラフィー、電気化学的活性化、スポッティングなどを用いて遂行される。
【０１７７】
いくつかの用途では、チップは複数の領域を含む場合があり、各領域は、特定のサイズあるいは異なるサイズのＤＮＡ断片を捕捉するように構成される。チップ領域は、選択的に様々な領域の様々なサイズの断片を捕捉するために、電圧、アンペア数、周期数、ピッチ、電極の直径、ウェルの深さ、あるいは他の要因に対して時々変化することがある。いくつかの実施形態において、各領域は複数の電極のアレイを含む。
【０１７８】
様々な実施形態において、デバイスまたは領域は、順次にあるいは平行に実行される。いくつかの実施形態において、複数のチップ設計を使用して、収集された物質のサイズ範囲を狭くし、バンドパスフィルターを作る。いくつかの例では、現在のチップの幾可学的形状（例えば、２００ｕｍの中心間のピッチの直径８０ｕｍの電極（８０／２００））は５００ｂｐの遮断フィルターとして機能する（例えば、約１０Ｖｐｐおよび１０ｋＨｚの電圧および周波数の条件を使用して）。そのような例では、５００ｂｐを越える核酸が捕捉され、５００ｂｐ未満の核酸は捕捉されない。代替の電極直径およびピッチの幾可学的形状は、チップの組み合わせが所望の断片サイズを提供するように、異なる遮断サイズを有する。いくつかの例では、１００ｕｍの中心間ピッチの直径４０ｕｍの電極（４０／１００）はより低い遮断閾値を有するが、４００ｕｍの中心間ピッチ上の直径１６０ｕｍの電極（１６０／４００）は、同様の条件下で、８０／２００の幾可学的形状に対してより高い遮断閾値を有する。様々な実施形態において、シングルチップまたは複数のチップ上の幾可学的形状は、特定のサイズの断片または粒子を選択するために組み合わせられる。例えば、６００ｂｐの遮断チップは、溶液中に６００ｂｐ未満の核酸を残し、その後、その物質は、５００ｂｐの遮断チップ（６００ｂｐのチップに対向している）で随意に再捕捉される。これにより、５００−６００ｂｐからなる核酸集団が溶液中に残る。その後、この集団は、同じチャンバ、サイドチャンバー、あるいは他の構成で随意に増幅される。いくつかの実施形態において、サイズ選択は、単一の電極形状を使用して遂行され、ここで、＞５００ｂｐの核酸は電極上で単離され、その後、洗浄され、その後、＜６００ｂｐの核酸を遊離するために、ＡＣＥＫ高電界の強度（電圧、周期数、導電率の変化）を低減することにより、５００−６００ｂｐの上清核酸集団を結果としてもたらす。いくつかの実施形態において、デバイスは、２５０−６００ｂｐ、２５０−２７５ｂｐ、２７５−３００ｂｐ、３００−３２５ｂｐ、３２５−３５０ｂｐ、３５０−３７５ｂｐ、３７５−４００ｂｐ、４００−４２５ｂｐ、４２５−４５０ｂｐ、４５０−４７５ｂｐ、４７５−５００ｂｐ、５００−５２５ｂｐ、５２５−５５０ｂｐ、５５０−５７５ｂｐ、５７５−６００ｂｐ、３００−４００ｂｐ、４００−５００ｂｐ、および／または３００−５００ｂｐ長さの核酸断片を選択的に捕捉するように構成される。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、チップデバイスは、温度勾配カラムを作る下端でヒーターと垂直に配向される。ある例では、底部は変性温度であり、中部はアニーリング温度であり、上部は伸長温度である。いくつかの例では、対流が断続的にプロセスを駆動する。いくつかの実施形態において、電熱による流動（ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ｆｌｏｗｓ）およびプロセスの加速を特にもたらす電極設計を含む、方法またはシステムが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、そのような設計が、同じデバイス上、あるいは適切に配置された別々のデバイス上に随意にある。いくつかの例では、上部での能動冷却あるいは受動冷却は、フィンまたはファン（ｆｉｎｓ  ｏｒ  ｆａｎｓ）などによって急な温度勾配をもたらす。いくつかの例では、本明細書に記載されるデバイスまたはシステムは、デバイス上の、あるいは反応チャンバのモニター温度中の温度センサを備えるか、または本明細書に記載された方法は上記センサを使用し、そのようなセンサは、フィードバック方式で温度を調節するために任意に使用される。いくつかの例では、そのようなセンサは、様々な熱転写特性を有する材料と結合され、連続的および／または不連続的勾配プロファイルを作成する。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、増幅は一定温度で進行する（つまり、等温増幅）。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるような単離された核酸を配列決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、核酸はサンガーシーケンシングあるいは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって配列決定される。いくつかの実施形態において、次世代シーケンシング方法は、限定されないが、パイロシークエンシング、イオン半導体シーケンシング、ポロニー配列決定、ライゲーションシーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、ライゲーションシーケンシング、あるいは一分子シーケンシングを含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される単離された核酸は、サンガーシーケンシングにおいて使用される。いくつかの実施形態において、サンガーシーケンシングは、核酸単離（ラボオンチップ（Ｌａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ））と同じデバイス内で行われる。サンプルの準備のためのラボオンチップのワークフローおよびサンガーシーケンシングの結果は、以下の工程を組み込む：ａ）ＡＣＥチップを使用するサンプル抽出；ｂ）標的配列のオンチップ増幅の実施；ｃ）ＡＣＥによるＰＣＲ産物の捕捉；ｄ）標的鎖を濃縮するためのサイクルシークエンスの実施；ｅ）濃縮された標的鎖の捕捉；ｆ）サンガー連鎖停止反応の実施；オンチップ多色蛍光検出を用いるキャピラリー電気泳動による、標的配列の電気泳動分離の実施。必要に応じて、核酸の洗浄、試薬の添加、および電圧を切ることが実施される。反応は、複数の捕捉ゾーンを有するシングルチップ上で、別々のチップおよび／または反応チャンバ上で実施することができる。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、核酸上で反応を実施する（例えば、ＤＮＡあるいはＲＮＡの断片化、制限分解、ライゲーション）工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるように、反応は、アレイ上あるいはその近くで、またはデバイス内で生じる。
【０１８４】
他のアッセイ
本明細書に開示される単離された核酸は、様々なアッセイフォーマットで利用され得る。例えば、核酸プローブまたはアンプリコンと共に扱われるデバイスは、ドットブロット分析または逆ドットブロット分析、塩基スタッキング一塩基多型（ＳＮＰ）分析、電子的なストリンジェンシー（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を用いる分析において、またはＳＴＲ分析において利用されてもよい。加えて、本明細書に開示されるそのようなデバイスは、例えば、酵素的な報告を用いる遺伝子発現解析、固定された核酸増幅などの酵素的な核酸修飾、あるいはタンパク質−核酸相互作用のためのフォーマット、または、制限エンドヌクレアーゼ切断、ｅｎｄｏ−ヌクレアーゼまたはｅｘｏ−ヌクレアーゼ切断、小溝結合タンパク質アッセイ、ターミナルトランスフェラーゼ反応、ポリヌクレオチドキナーゼもしくはホスファターゼ反応、リガーゼ反応、トポイソメラーゼ反応、および他の核酸の結合もしくは修飾タンパク質反応を含む、固相フォーマットに適した他の核酸修飾などのためのフォーマットで利用されてもよい。
【０１８５】
加えて、本明細書で開示されるデバイスは、免疫学的アッセイに有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、デバイスの位置は、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、あるいは他のフォーマットにより体液サンプル中の抗体を分析するために、抗原（例えば、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、プロテオグリカン、糖タンパク質など）と関連付けられる場合がある。代替的に、デバイスの位置は、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、または他のアッセイフォーマットにより、サンプル中の抗原を検出するために、抗体と共に扱われることもある。実験法あるいはｐＨ／電荷の計算によって抗体およびタンパク質の等電点を極めて容易に決定することができるので、デバイスの電子アドレッシング（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ）と電子濃度の利点は、電子アドレッシングされた種あるいは分析種（ａｎａｌｙｔｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ）が帯電するように、緩衝液のｐＨを単に調節することによって利用することができる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、単離された核酸は、免疫学的アッセイ型のアレイまたは核酸アレイにおける使用に有用である。
【０１８７】
定義および略語
冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は非限定的である。例えば、「方法」は、句の意味の最も広い定義を含み、１つを超える方法であり得る。
【０１８８】
「Ｖｐ−ｐ」はピーク−ピーク電圧である。
【０１８９】
「ＴＢＥ」は、トリス塩基（Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ）、ホウ酸、およびＥＤＴＡの混合物を含む緩衝溶液である。
【０１９０】
「ＴＥ」は、トリス塩基およびＥＤＴＡの混合物を含む緩衝溶液である。
【０１９１】
「Ｌ−ヒスチジン緩衝液」は、Ｌ−ヒスチジンを含む溶液である。
【０１９２】
「ＤＥＰ」は誘電泳動の略語である。
【実施例】
【０１９３】
実施例１：チップ構造
【０１９４】
２００ｕｍの中心間のピッチの、４５ｘ２０カスタム８０μｍ直径の環状白金微小電極アレイは、前の結果（下記の文献１−３を参照）に基づいて作られた。９００の微小電極すべてがともに活性化され、交流バイアスされて、市松模様の電界の幾何学的形状（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ  ｆｉｅｌｄ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を形成する。正のＤＥＰ領域が、微小電極上に直接生じ、負の低電界領域が微小電極間に生じる。アレイは２００ｎｍ−５００ｎｍの厚さの多孔性のポリ−Ｈｅｍａヒドロゲル層でオーバーコーティングされ（手順：ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．から購入したエタノール原液中の１２％のｐＨｅｍａを、エタノールを使用して５％に希釈する。スピンコーターを使用して、７０ｕＬの５％の溶液を上記チップ上で６Ｋ  ＲＰＭの回転速度で回転させる。その後、チップ＋ヒドロゲル層を６０°Ｃのオーブンに４５分間入れる。）、ならびにマイクロ流体カートリッジ内に封入され、アクリル窓でコーティングされた５０μＬのサンプルチャンバを形成する。微小電極への電気接続部は、フローセルにおけるＰＣＢボードのＭｏｌｅｘコネクタからアクセスされる。ファンクションジェネレーター（ＨＰ  ３２４５Ａ）は、溶液導電率に応じて、１０ＫＨｚおよび１０−１４ボルトのピーク−ピーク電圧で正弦電気信号を提供する。画像は、螢光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）およびＥＧＦＰキューブ（４８５ｎｍの発光バンドパスフィルターおよび５２５ｎｍの励起バンドパスフィルター）で捕捉した。励起源は、ＰｈｏｔｏＦｌｕｏｒ  ＩＩ  ２００ＷのＨｇアーク灯であった。
【０１９５】
［１］Ｒ．  Ｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｂ．Ｄ．  Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｒ．Ｌ．  Ｍｉｆｆｌｉｎ，  Ｓ．Ｃ．  Ｅｓｅｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．  Ｈｅｌｌｅｒ，  “Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．”Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ｖｏｌ．  ２９，  ｐａｇｅｓ  １７６５−１７７４，  ２００８．
【０１９６】
［２］Ｒ．  Ｋｒｉｓｈｎａｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．  Ｈｅｌｌｅｒ，  “Ａｎ  ＡＣ  ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．”Ｊ．  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，  ｖｏｌ．  ２，  ｐａｇｅｓ  ２５３−２６１，  ２００９．
【０１９７】
［３］Ｒ．  Ｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｄ．Ａ．  Ｄｅｈｌｉｎｇｅｒ，  Ｇ．Ｊ．  Ｇｅｍｍｅｎ，  Ｒ．Ｌ．  Ｍｉｆｆｌｉｎ，  Ｓ．Ｃ．  Ｅｓｅｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．  Ｈｅｌｌｅｒ，  “Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ＤＥＰ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｕｎｄｅｒ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ”  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，  ｖｏｌ．  １１，  ｐａｇｅｓ  １６６１−１６６６，  ２００９． 
【０１９８】
実施例２：ヒトゲノムＤＮＡの単離
ヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入し、それは、２０−４０ｋｂｐの大きさであった。（サイジングゲルは示さず）。ｇＤＮＡを脱イオン水において以下の濃度へと希釈した：５０ナノグラム、５ナノグラム、１ナノグラム、および５０ピコグラム。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した１ｘＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの緑色蛍光二本鎖ＤＮＡ色素を使用して、ｇＤＮＡを染色した。その後、この混合物を微小電極アレイに挿入し、１０ｋＨｚの正弦波で１分間、１４ボルトのピーク−ピーク電圧（Ｖｐｐ）で実行した。１分の終わりに、ｇＤＮＡを視覚化できるように、緑色蛍光フィルター（ＦＩＴＣ）を使用して、顕微鏡上で、１０倍対物レンズを備えるＣＣＤカメラを用いて微小電極パッドの写真を撮影した（図２）。チップは、５０μＬの水中の５０ｐｇのｇＤＮＡ（つまり、１ｎｇ／ｍＬの濃度）まで同定することができた。さらに、５０のピコグラムでは、アレイ上に９００の微小電極があるので、各微小電極は、平均して〜６０フェムトグラムのＤＮＡを有していた。ＡＣＥデバイスの低レベルの濃縮能力は、血漿および血清中のＣｆｃ−ＤＮＡバイオマーカーを同定するために必要とされる、１−１０ｎｇ／ｍＬの範囲内である（下記の文献４−６を参照）。
【０１９９】
［４］Ｔ．Ｌ．  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ：  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｒａｎｇｅ．”  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．，  ｖｏｌ．  ２１，  ｐａｇｅｓ  ７７−８７，  ２００２．
【０２００】
［５］Ｒ．  Ｅ．  Ｂｏａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  “ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｕｒ  ＤＮＡ  ａｓ  ａ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ”，  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，  ｖｏｌ．  ２，  ｐａｇｅｓ  ３０７−３１９，  ２００７．
【０２０１】
［６］Ｏ．  Ｇａｕｔｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｓ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，  ｖｏｌ．  ２２，  ｐａｇｅｓ  ４１５７−４１６４，  ２００４． 
【０２０２】
実施例３：ＧＶＤを用いたヒドロゲルの形成
ＧＶＤ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ｍＡ）（ｗｗｗ．ｇｖｄｃｏｒｐ．ｃｏｍを参照）によって開発された独自のアッセイシステムを使用して、ポリヒドロキシエチルメタクリラート（ｐＨＥＭＡ）などをヒドロゲル蒸着によってチップ表面上に積層することもできた。ｐＨＥＭＡなどのヒドロゲルを、様々な厚さ（１００、２００、３００、４００ｎｍ）で堆積させ、電極チップ上で密度の架橋（５、２５、および４０％）を、ＧＶＤ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発された技術を使用して実施した。標準ＡＣＥプロトコル（前処置なし、７Ｖｐ−ｐ、１０ＫＨｚ、２分、０．５ＸＰＢＳ、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  １で標識された５００ｎｇ／ｍｌのｇＤＮＡ）を使用して、ヒドロゲルフィルムを試験した。電極上の蛍光を画像化によってキャプチャした。シラン誘導体などの接着促進剤を用いて、微小電極アレイの表面（つまり、パッシベーション層および露出電極）への堆積速度または固着増加（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ）を変更することにより、プロセスを最適化することもできる。
【０２０３】
実施例４：開示されたデバイスおよび方法対従来の方法の性能
メーカーのプロトコルに従ってＱＩＡＧＥＮ（登録商標）循環核酸精製キット（ｃａｔ＃５５１１４）を使用して、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者から１ｍｌの血漿を精製した。簡潔に言えば、プロテイナーゼＫ溶液で１ｍｌの血漿のインキュベーションを６０°Ｃで３０分間実施した。その反応物を氷上でクエンチし、全量を真空に接続されたＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉカラムに適用した。液体をカラムに通し、３つの異なる緩衝液（それぞれ６００−７５０ｕｌ）で洗浄した。カラムを、２０，０００ｘｇで３分間遠心分離機にかけ、１０分間５６°Ｃで焼いて（ｂａｋｅｄ）、余分な液体を取り除いた。サンプルを、２０，０００ｘｇでの１分間の遠心分離によって、５５μｌの溶離用緩衝液において溶離した。処理時間の合計は〜２．５時間であった。
【０２０４】
チップダイ（ｃｈｉｐ  ｄｉｅ）のサイズは１０×１２ｍｍであり、６０〜８０μｍｍの直径のＰｔ電極が、１８０〜２００μｍの中心間のピッチでそれぞれ存在する。アレイを、５％のｐＨＥＭＡヒドロゲル層（エタノール溶液からのスパンキャスト（ｓｐｕｎ  ｃａｓｔ）６０００ｒｐｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓの１２％のｐＨＥＭＡストック）でオーバーコーティングした。０．５ｘＰＢＳを使用して、２Ｖ  ｒｍｓ、５Ｈｚ、１５秒間、チップを前処理した。緩衝液を除去し、２５μｌのＣＬＬ患者の血漿を加えた。電源を入れて、ＤＮＡを、１１Ｖｐ−ｐ、１０Ｋｈｚで３分間単離し、その後、１００μｌ／分の流量で５００μｌのＴＥ緩衝液で洗浄した。電圧を切り、フローセル量をマイクロ遠心チューブに溶離した。処理時間の合計は〜１０分であった。
【０２０５】
同じプロセスを変更することなく、新鮮な全血に適用することができる。全体の希釈されていない血液のＤＮＡを抽出および精製する能力は、本明細書に開示されるチップ技術によって独自に可能になる。
【０２０６】
メーカーのプロトコルに従ってＰｉｃｏＧｒｅｅｎを使用して、ＤＮＡ定量化をＱｉａｇｅｎおよびチップの溶離液上で実施した。
【０２０７】
後のゲル電気泳動、ＰＣＲおよびサンガーシーケンシング反応は、両方の抽出技術で同様の性能を示し、チップは、血漿と同様に全血も処理することができる。マン・ホイットニーのＵ検定のノンパラメトリック統計的検定も、Ｑｉａｇｅｎおよびチップ技術を使用して、血漿から単離されたＤＮＡ量の間で実行した。ＤＮＡ精製のいずれの方法を使用しても、統計的差異はなかった（ｐ＜０．０５、両側）。
【０２０８】
【表１】
2021509265.tif 000003
【０２０９】
実施例５：複数のバイオマーカーの検出
標準的な手法を使用して、一連の患者の全血サンプルから血漿を単離した。患者のうち数人は健康な対照であり、他の患者は非小細胞肺癌を患っていることがわかっていた。
【０２１０】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した１ｘＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの緑色蛍光二本鎖ＤＮＡ色素を使用して、各サンプル中の無細胞ＤＮＡ断片を染色した。その後、各混合物を微小電極アレイに挿入し、１０ｋＨｚの正弦波で１分間、１４ボルトのピーク−ピーク電圧（Ｖｐｐ）で実行した。その後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に結合したウサギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１（２８−８）抗体でサンプルを染色した。
【０２１１】
ｃｆＤＮＡを視覚化することができるように青／緑色蛍光フィルター（ＦＩＴＣ）を使用し、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４を画像化するために緑／オレンジ色の蛍光フィルター（ＴＲＩＴＣ）を使用して、顕微鏡上で、４倍対物レンズを備えるＣＭＯＳカメラを用いて、微小電極パッドの写真を撮影した。各サンプルについてｃｆＤＮＡおよびＰＤ−Ｌ１の量を決定し、画像を統合した（図７）。各サンプル中のｃｆＤＮＡおよびＰＤ−Ｌ１の量を、ＸＹ散布図上にプロットした（図８）。その結果は、健康な対照のサンプルが、低量のｃｆＤＮＡおよびＰＤ−Ｌ１を含有していたことを示す。これに対して、癌患者のサンプルのほとんどは、ｃｆＤＮＡおよびＰＤ−Ｌ１の両方が高かった。驚くべきことに、いくつかのサンプルでは、２つのマーカーのうちの１つのみがレベルの上昇を示した。例えば、１つのサンプルはＰＤ−Ｌ１染色が特に高かったが、比較的正常なレベルのｃｆＤＮＡを有していた。（プロットの右下に菱形で示されたドット）。ｃｆＤＮＡとＰＤ−Ｌ１のレベルの両方を同時に検出する能力により、このサンプルが癌患者のものであることを正確に判定することができた。
【０２１２】
実施例６：健康な患者および癌患者から得られた血漿からの無細胞ＤＮＡの単離および定量化
５２人の健康な患者および５３人の癌患者から血漿サンプルを得た。実施例１に記載されるような本明細書に開示されるデバイス上で、３００ｂｐより大きいサイズの無細胞ＤＮＡ断片を血漿から単離した。ＤＮＡをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染色を使用して標識し、４倍対物レンズに取り付けられたＣＭＯＳセンサを用いて定量化した。その後、無細胞ＤＮＡの量を、血漿の１マイクロリットル当たりのピクトグラムで各サンプルについて定量化した。
【０２１３】
図９は、腺癌、扁平上皮癌、および卵巣癌を患う患者、ならびに健康な対照からのサンプルの結果を示す。図１０は、５２人の健康な患者および５３人の癌患者（肺癌、乳癌、卵巣癌、および膵臓癌）についてのｃｆＤＮＡ濃度の比較を示す。結果は、健康な対照と比較して、癌患者におけるサイズが３００ｂｐ以上の断片のｃｆＤＮＡ濃度の増加を示す。
【０２１４】
実施例７：無細胞ＤＮＡ定量化を用いた治療効果のトラッキング
ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）治療を受けているＩＶ期の腺癌を患う２人の患者の処置の過程で、血漿サンプルを得た。上記サンプルを、実施例２に記載されるように処理および分析した。結果は、図１１Ａおよび図１１Ｂに示される。図１１Ａにおける患者は、ニボルマブ処置に応答せず（これは、処置の後に、一定のレベルの検出されたｃｆＤＮＡによって示される）、その後、疾患の進行の兆候を示し始めた。その後、患者にアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）を投与し、それに応答した。上記応答は、ｃｆＤＮＡ濃度の減少によって示される。その結果は、患者が治療に応答するにつれて、３００ｂｐより大きなｃｆＤＮＡの濃度が減少し、疾患が進行するにつれて、３００ｂｐより大きなｃｆＤＮＡの濃度が増加することを示す。上記図は、Ｙ軸上にｎｇ／ｍＬとしてｃｄＤＮＡの濃度を示し、Ｘ軸上に時間を表す。
【０２１５】
実施例８：ＲＮＡの単離および検出
ＡＳＰＣ−１膵癌細胞株培養液の上清を超遠心分離機にかけ、ＳＹＴＯ  ＲＮＡＳｅｌｅｃｔを使用して、インサイチュで染色した。結果として生じる生成物をプールし、様々な濃度（０倍、１倍、および１０倍）でＬｉＨｅｐ血漿サンプルにスパイクした。その後、上記サンプルを微小電極アレイによって捕捉した。図１２Ａに示されるように、結果を画像化した。
【０２１６】
微小電極を使用して、非小細胞肺癌および健康な患者から得られた血漿からＲＮＡも単離した。結果として生じるＲＮＡを、ＳＹＴＯ  ＲＮＡＳｅｌｅｃｔで染色した。その結果を図１２Ｂに示す。
【０２１７】
実施例９：癌胎児抗原（ＣＥＡ）の単離および検出
腺癌を患う患者から血漿を得た。その後、微小電極アレイによってサンプルを分析した。ヒトＣＥＡに対する標識抗体を使用して、電極によって収集された、結果として生じる物質を染色した。いくつかのサンプルを、２μｇ／ｍＬの裸のＣＥＡタンパク質で人工的にスパイクした。結果は、裸のＣＥＡではなく、エキソソーム結合ＣＥＡが抗体によって染色されたことを示す（図１３）。したがって、その結果は、エキソソーム結合ＣＥＡが微小電極によって保持されたことを示す。
【０２１８】
実施例１０：敗血症患者から得られた血漿からの無細胞ＤＮＡの単離および定量化
血漿サンプルを、敗血症に苦しむ患者および健康な患者から得た。実施例１に記載されるような本明細書に開示される微小電極デバイス上で、３００ｂｐより大きいサイズの無細胞ＤＮＡ断片を血漿から単離した。ＤＮＡをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染色を使用して標識し、４倍対物レンズに取り付けられたＣＭＯＳセンサを用いて定量化した。その後、無細胞ＤＮＡの量を、血漿の１マイクロリットル当たりのピクトグラムで各サンプルについて定量化した。
【０２１９】
図１４は、敗血症患者および健康な対照からのサンプルの結果を示す。図１５は、健康な患者と２人の敗血症患者のそれぞれのｃｆＤＮＡ濃度の比較を示す。結果は、健康な対照と比較して、敗血症患者におけるサイズが３００ｂｐ以上の断片に対するｃｆＤＮＡ濃度の増加を示す。
【０２２０】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されてきたが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。当業者であれば、多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく思いつくだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法、および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。
【図１】
2021509265.tif 000004
【図２】
2021509265.tif 000005
【図３】
2021509265.tif 000006
【図４】
2021509265.tif 000007
【図５】
2021509265.tif 000008
【図６】
2021509265.tif 000009
【図７】
2021509265.tif 000010
【図８】
2021509265.tif 000011
【図９】
2021509265.tif 000012
【図１０】
2021509265.tif 000013
【図１１Ａ】
2021509265.tif 000014
【図１１Ｂ】
2021509265.tif 000015
【図１２Ａ】
2021509265.tif 000016
【図１２Ｂ】
2021509265.tif 000017
【図１３】
2021509265.tif 000018
【図１４】
2021509265.tif 000019
【図１５】
2021509265.tif 000020
【国際調査報告】
2021509265.tif 000021
2021509265.tif 000022
2021509265.tif 000023