(57)【要約】  修飾ヌクレオチドの特有なパターンを有する、強力で最適化されたβカテニン核酸阻害剤分子を、本明細書で提供する。βカテニン発現を低減するための方法及び組成物、ならびにがんを治療するための方法及び組成物も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２６のヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖、ならびに前記センス鎖と前記アンチセンス鎖の間の相補性領域を含む、核酸阻害剤分子であって、
前記センス鎖が、配列番号１１の核酸配列を含み；
前記アンチセンス鎖が、その３’末端に２の一本鎖ヌクレオチド、及びその５’末端に１０の一本鎖ヌクレオチドを含む、前記核酸阻害剤分子。
【請求項２】
前記センス鎖が、配列番号１１の核酸からなる、請求項１に記載の核酸阻害剤分子。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖が、配列番号１２の核酸からなる、請求項１に記載の核酸阻害剤分子。
【請求項４】
前記センス鎖が配列番号１１の核酸からなり、前記アンチセンス鎖が配列番号１２の核酸からなる、請求項１に記載の核酸阻害剤分子。
【請求項５】
配列番号１１及び配列番号１２の２’−Ｆ及び２’−ＯＣＨ3修飾以外で、前記核酸阻害剤分子が、任意の追加の修飾を含有しない、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸阻害剤分子。
【請求項６】
センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、二本鎖核酸阻害剤分子であって、
前記センス鎖が、配列番号１３の核酸配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１４の核酸配列を含み、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、２６の塩基対の二本鎖領域を一緒に形成し、前記アンチセンス鎖が、その３’末端に２の一本鎖ヌクレオチド、及びその５’末端に１０の一本鎖ヌクレオチドを含み；
配列番号１３のヌクレオチド１、３、７、９〜１１、１３、１５、１９及び２０のそれぞれの糖部位が、２’−Ｆで修飾されており、配列番号１３のヌクレオチド２、４〜６、８、１２、１４、１６〜１８及び２４のそれぞれの糖部位が、２’−ＯＣＨ3で修飾されており、配列番号１３のヌクレオチド２５及び２６が、デオキシリボヌクレオチドであり、配列番号１３のヌクレオチド２１〜２３が、リボヌクレオチドであり；
配列番号１４のヌクレオチド２、６、１９、２１、２３、２５、３０、３１、３３及び３５のそれぞれの糖部位が、２’−Ｆで修飾されており、配列番号１４のヌクレオチド１、３〜５、７〜９、１１〜１５、２０、２２、２４、２６、３２、３４及び３６〜３８のそれぞれの糖部位が、２’−ＯＣＨ3で修飾されており、配列番号１４のヌクレオチド１０が、デオキシリボヌクレオチドであり、配列番号１４のヌクレオチド１６〜１８及び２７〜２９が、リボヌクレオチドである、前記二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項７】
前記センス鎖及び／または前記アンチセンス鎖の５’末端で、５’−リン酸模倣体を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸阻害剤分子。
【請求項８】
前記修飾βカテニン核酸阻害剤分子が、ナノ粒子で調製される、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸阻害剤分子。
【請求項９】
前記脂質ナノ粒子が、コア脂質及びエンベロープ脂質を含み、前記コア脂質が、第１カチオン性脂質及び第１ペグ化脂質を含み、前記エンベロープ脂質が、第２カチオン性脂質、中性脂質、ステロール及び第２ペグ化脂質を含む、請求項８に記載の核酸阻害剤分子。
【請求項１０】
前記第１カチオン性脂質がＤＬ−０４８であり、前記第１ペグ化脂質がＤＳＧ−ＭＰＥＧであり、前記第２カチオン性脂質がＤＬ−１０３であり、前記中性脂質がＤＳＰＣであり、前記ステロールがコレステロールであり、前記第２ペグ化脂質がＤＳＰＥ−ＭＰＥＧである、請求項９に記載の核酸阻害剤分子。
【請求項１１】
先行請求項のいずれか一項に記載の治療上有効な量の前記核酸阻害剤分子、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
βカテニン遺伝子の発現を低減するのに十分な量で、先行請求項のいずれか一項に記載の前記核酸阻害剤分子または前記医薬組成物を必要とする対象に、先行請求項のいずれか一項に記載の前記核酸阻害剤分子または前記医薬組成物を投与することを含む、前記対象の前記βカテニン遺伝子の発現を低減する方法。
【請求項１３】
前記投与が静脈内、筋肉内または皮下投与である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象がヒトである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象のβカテニン関連疾患を治療する方法であって、前記方法が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の治療上有効な量の前記核酸阻害剤分子または前記医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記投与が静脈内、筋肉内または皮下投与である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象がヒトである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記βカテニン関連疾患ががんである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記がんが結腸直腸癌、肝細胞癌または黒色腫である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
βカテニン関連がんの治療で使用するために、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の前記核酸阻害剤分子を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月１８日出願の米国仮特許出願第６２／５７３，９９９号、表題「ＢＥＴＡ  ＣＡＴＥＮＩＮ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ  ＭＯＬＥＣＵＬＥ」、及び２０１８年１月５日出願の米国仮特許出願第６２／６１４，２０６号、表題「ＲＥＤＵＣＩＮＧ  ＢＥＴＡ−ＣＡＴＥＮＩＮ  ＡＮＤ  ＩＤＯ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＯ  ＰＯＴＥＮＴＩＡＴＥ  ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ」に対する優先権を主張し、その内容全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１８年１０月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０２４３＿０００８−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１９，２１９バイトのサイズである。
【０００３】
がん遺伝子βカテニンは、細胞内のＷｎｔシグナル伝達の重要なメディエータである。βカテニンは、形質膜（βカテニンは細胞間接着複合体の安定化に寄与する）、細胞質（βカテニン濃度が調整される）、及び核（βカテニンは転写調節及びクロマチン相互作用に関与する）を含む細胞位置で、いくつかの細胞機能を果たす。
【０００４】
βカテニン（ヒトでＣＴＮＮＢ１遺伝子によりコードされる）中の突然変異は、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、肝芽細胞腫、腎臓癌（ウィルムス腫瘍）、髄芽細胞腫、黒色腫、卵巣癌（類子宮内膜癌）、膵臓癌、石灰化上皮種、前立腺癌、甲状腺（未分化）癌及び子宮（子宮内膜）癌と特異的に関連している（Ｐｏｌａｋｉｓ  Ｐ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：１８３７−５１；Ｓａｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１４４２−４；Ｉｗａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１０２１−６；Ｍｉｒａｂｅｌｌｉ−Ｐｒｉｍｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：３３４６−５１；Ｓｈｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈ．５２：６９５−６；Ｔｅｊｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１８：６６１５−２０；Ｋｉｔａｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４４７８−８１；Ｓｐａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１１３０−４；Ｍｉｙａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４５０６−９；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４２５７−６０；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１５５：１７９５−８０１；Ｎｈｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１５５：７０３−１０；Ｌｅｇｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１８：４０４４−６；Ｊｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１５２：４５−５１；Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：２６９−７３；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９：４９８−５０４；Ｋｏｅｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：３８８０−２；Ｍａｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６２８８−９２；Ｚｕｒａｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：８９６−９；Ｇａｍａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１５５：５２７−３６；Ｐａｌａｃｉｏｓ  ａｎｄ  Ｇａｍａｌｌｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１３４４−７；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ８２：６２５−９；Ｇｅｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ６０：５４４−８；Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２１：４１０−３；Ｖｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２５２０−３；Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１８１１−５；Ｆｕｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：３５２６−８）。
【０００５】
βカテニン／Ｗｎｔ経路は、８０％を超える結腸直腸癌で一貫して活性化される。βカテニン／Ｗｎｔ経路は、５０％を超える肝細胞癌（ＨＣＣ）患者でも一貫して活性化される。活性化Ｗｎｔシグナル伝達及び核内βカテニンは、疾患の再発及び予後不良と相関している（Ｔａｋｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；９（１１）：１０１３−２４）。
【０００６】
βカテニン遺伝子中の突然変異は、βカテニンのＮ末端の一部の欠損をもたらす切断、またはβカテニンのリン酸化を媒介して、プロテアソームによるその分解を標的とする細胞質分解複合体（例えば、ＧＳＫ３α／βまたはＣＫＩα）の構成成分によって標的化されるセリン及びスレオニン残基に影響を及ぼす、点突然変異を含む。これらの突然変異βカテニンタンパク質は、リン酸化に対して反応せず、したがってプロテオソーム分解を回避する。したがって、βカテニンは罹患細胞内に蓄積する。安定的及び核局所的βカテニンは、結腸癌のほとんどすべての症例の特徴である（Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．，２００６，Ｃｅｌｌ１２７：４６９−４８０）。Ｍｏｒｉｎらは、リン酸化部位を改変するβカテニンの突然変異により、細胞がβカテニンのＡＰＣに媒介されるダウンレギュレーションの影響を受けなくなることと、この機構の崩壊が結腸直腸腫瘍形成にとって重要であることと、を証明した（Ｍｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７５：１７８７−１７９０）。
【０００７】
βカテニンがどのようにして細胞内のＷｎｔシグナル伝達の重要なメディエータとして機能しているか、そしてβカテニンの突然変異及び／またはその発現の変化が腫瘍形成にどのような役割を果たし得るかの理解が進んでいるにもかかわらず、依然としてＣＴＮＮＢ１発現と関連する疾患（例えば、がん）を治療し得る組成物が求められている。
【発明の概要】
【０００８】
本出願は、分子中の大多数のヌクレオチドの糖部位の２’−炭素で２’−フルオロ（「２’−Ｆ」）及び２’−Ｏ−メチル（「２’−ＯＭｅ」または「２’−ＯＣＨ3」）修飾の特有なパターンを含む、修飾ヌクレオチドの特有なパターンを有する、強力で最適化された二本鎖βカテニン核酸阻害剤分子を提供する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、ヌクレオチド修飾の特有なパターンが、改善した特性（例えば、低減した免疫原性、βカテニンｍＲＮＡ発現の改善した低減、改善したＡｇｏ２結合または腫瘍増殖の改善した抑制のうちの１つ以上）をβカテニン核酸阻害剤分子に提供すると思われる。
【０００９】
一実施形態にて、最適化したβ−カテニン核酸阻害剤分子は、配列番号１１の核酸を含むもしくはそれからなるセンス（または、パッセンジャー）鎖、及び配列番号１２の核酸を含むもしくはそれからなるアンチセンス（または、ガイド）鎖、ならびに２６のヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖の間の相補性領域を含む。アンチセンス鎖は、その３’末端に２の一本鎖ヌクレオチド、及びその５’末端に１０の一本鎖ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、センス鎖は、配列番号１１の核酸からなり、アンチセンス鎖は、配列番号１２の核酸からなる。
【００１０】
一実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸阻害剤分子であり、
センス鎖は、配列番号１３の核酸配列を含むまたはそれからなり、アンチセンス鎖は、配列番号１４の核酸配列を含むまたはそれからなり、センス鎖及びアンチセンス鎖は、２６塩基対の二本鎖領域を一緒に形成し、アンチセンス鎖は、その３’末端に２の一本鎖ヌクレオチド、及びその５’末端に１０の一本鎖ヌクレオチドを含み；
配列番号１３のヌクレオチド１、３、７、９〜１１、１３、１５、１９及び２０のそれぞれの糖部位は、２’−Ｆで修飾されており、配列番号１３のヌクレオチド２、４〜６、８、１２、１４、１６〜１８及び２４のそれぞれの糖部位は、２’−ＯＣＨ3で修飾されており、配列番号１３のヌクレオチド２５及び２６は、デオキシリボヌクレオチドであり、配列番号１３のヌクレオチド２１〜２３は、リボヌクレオチドであり；
配列番号１４のヌクレオチド２、６、１９、２１、２３、２５、３０、３１、３３及び３５のそれぞれの糖部位は、２’−Ｆで修飾されており、配列番号１４のヌクレオチド１、３〜５、７〜９、１１〜１５、２０、２２、２４、２６、３２、３４及び３６〜３８のそれぞれの糖部位は、２’−ＯＣＨ3で修飾されており、配列番号１４のヌクレオチド１０は、デオキシリボヌクレオチであり、配列番号１４のヌクレオチド１６〜１８及び２７〜２９は、リボヌクレオチドである。
【００１１】
一態様は、本明細書に記載されているように、最適化されたβカテニン核酸阻害剤分子の治療上有効な量を対象に投与することを含む、対象のがんを治療する方法に関する。特定の実施形態で、方法は、免疫治療薬の治療上有効な量を投与することを更に含む。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００１２】
別の態様は、本明細書に記載されているように、最適化されたβカテニン核酸阻害剤分子を含む医薬組成物に関する。特定の実施形態では、最適化されたβカテニン核酸阻害剤分子を含む医薬組成物は、がんの治療で使用するためである。特定の実施形態では、医薬組成物は、免疫治療薬（例えば、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体、または抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体及び抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の組み合わせ）と組み合わせて投与される。
【００１３】
方法または医薬組成物の特定の実施形態で、がんは非Ｗｎｔ活性化がんである。他の実施形態にて、がんはＷｎｔ活性化がんである。方法または医薬組成物の特定の実施形態で、非Ｗｎｔ活性化がんは、黒色腫、神経芽細胞腫または腎臓癌である。
【００１４】
方法または組成物の特定の実施形態で、最適化されたβカテニン核酸阻害剤分子は、本明細書に記載されているように、脂質ナノ粒子により調製される。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、コア脂質及びエンベロープ脂質を含み、コア脂質は、第１カチオン性脂質及び第１ペグ化脂質を含み、エンベロープ脂質は、第２カチオン性脂質、中性脂質、ステロール及び第２ペグ化脂質を含む。特定の実施形態では、第１カチオン性脂質はＤＬ−０４８であり、第１ペグ化脂質はＤＳＧ−ＭＰＥＧであり、第２カチオン性脂質はＤＬ−１０３であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、第２ペグ化脂質はＤＳＰＥ−ＭＰＥＧである。
【００１５】
本明細書に組み込まれ、その一部をなす添付の図面は、特定の実施形態を例示し、本明細書と共に本明細書で開示された組成物及び方法の特定の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、βカテニン遺伝子を標的として、異なるヌクレオチド修飾パターンを有する、３つの代表的な非伸長の二本鎖核酸阻害剤分子、ＮｏｎＥｘｔｅｎｄｅｄ  Ｍ１（ＮＥＸ  Ｍ１）、ＮｏｎＥｘｔｅｎｄｅｄ  Ｍ２（ＮＥＸ  Ｍ２）及びＮｏｎＥｘｔｅｎｄｅｄ  Ｍ３（ＮＥＸ  Ｍ３）の構造を概略的に示す。この概略図で、陰影のないヌクレオチドはリボヌクレオチドを表し、斜線のヌクレオチドは２’−ＯＭｅ修飾を含み、陰影のある塩基は２’−Ｆ修飾を含み、黒い枠で示されるヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドを表す。ＮＥＸ  Ｍ１のパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、それぞれ配列番号１及び配列番号２に対応する。ＮＥＸ  Ｍ２のパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、それぞれ配列番号３及び配列番号４に対応する。ＮＥＸ  Ｍ３のパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、それぞれ配列番号５及び配列番号６に対応する。３つの分子のＩＣ５０値（ｐＭ）も示される。図１Ｂは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異なる非伸長二本鎖核酸阻害剤分子のインターフェロン反応（ＩＦＩＴ１誘導で測定）を示す。ＮＥＸ  Ｍ２が中程度の上昇を示すと共に、ＮＥＸ  Ｍ１はＩＦ１Ｔ１の著しい上昇を誘導した。一方でＮＥＸ  Ｍ３は、ＩＦＩＴ１の最小の上昇だけを示した。
【図２】図２Ａは、β−カテニン遺伝子を標的として、異なるヌクレオチド修飾パターンを有する、３つの代表的な伸長した二本鎖核酸阻害剤分子、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｍ１（ＥＸ  Ｍ１）、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｍ２（ＥＸ  Ｍ２）及びＥｘｔｅｎｄｅｄ  Ｍ３（ＥＸ  Ｍ３）の構造を概略的に示す。この概略図で、陰影のないヌクレオチドはリボ核酸塩基を表し、斜線のヌクレオチドは２’−ＯＭｅ修飾塩基を表し、陰影のある塩基は２’−Ｆ修飾塩基を表し、黒い枠で示されるヌクレオチドはデオキシリボ核酸塩基を表す。ＥＸ  Ｍ１のパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、それぞれ配列番号７及び配列番号８に対応する。ＥＸ  Ｍ２のパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、それぞれ配列番号９及び配列番号１０に対応する。ＥＸ  Ｍ３のパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に対応する。３つの分子のＩＣ５０値（ｐＭ）も示される。図２Ｂは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異なる伸長した二本鎖核酸阻害剤分子のインターフェロン反応（ＩＦＩＴ１誘導で測定）を示す。ＥＸ  Ｍ２が中程度の上昇を示すと共に、ＥＸ  Ｍ１はＩＦ１Ｔ１の著しい上昇を誘導した。一方でＮＥＸ  Ｍ３は、本質的にＩＦＩＴ１の上昇を示さなかった。
【図３】図３Ａは、４人の異なるドナーからのヒトＰＢＭＣと混合したとき、ＮＥＸ  Ｍ１、ＮＥＸ  Ｍ３及びＥＸ  Ｍ３のインターフェロン濃度への影響を測定することにより、相対的免疫原性を評価したアッセイからの結果を示す。ＮＥＸ  Ｍ３及びＥＸ  Ｍ３は、全４人のドナーでほとんどまたはまったくインターフェロン反応を示さなかったが、ＮＥＸ  Ｍ１は、ドナー１、２及び４で中程度のインターフェロン反応及びドナー３で相当なインターフェロン反応（過敏性）を示した。図３Ｂは、ＮＥＸ  Ｍ１、ＮＥＸ  Ｍ３及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスから得た異なる時点（処置後の２４時間及び１２０時間）で、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍のβカテニンｍＲＮＡノックダウンの量（「効力」）を示す。２４時間で、ＥＸ  Ｍ３は、ＥＸ  Ｍ２及びＮＥＸ  Ｍ３と比較したとき、わずかにより良好な効力を示し、ＮＥＸ  Ｍ１と比較して類似の効力を示した。処置の１２０時間後に、ＥＸ  Ｍ３は、ＮＥＸ  Ｍ１と比較して改善した効力を示した。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｄは、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３構築物を比較する、種々のアッセイからの結果のグラフまたは画像を示す。図４Ａは、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、投与後３日目に、ＥＸ  Ｍ３がはるかに高いレベルで腫瘍組織に存在したことを示す。図４Ｂは、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、投与後３日目に、ＥＸ  Ｍ３が、腫瘍組織のアルゴノート（Ａｇｏ）２結合／ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）負荷効率の増加を呈示したことを示す。図４Ｃは、ＳＷ４０３腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、ＮＥＸ  Ｍ１が、ビヒクル処置した動物と比べて腫瘍の増殖を約５５％阻害したことを示し、一方でＥＸ  Ｍ３は腫瘍の増殖を８０％超で阻害した。ｘ軸は、（ＳＷ４０３腫瘍の）移植後の日数を記載し、矢印は、ＮＥＸ  Ｍ１、ＥＸ  Ｍ３または対照が投与された（３ｍｇ／ｋｇの投与量で）日数を示す。図４Ｄは、図４Ｃで示した試験終了後に得られたＳＷ４０３腫瘍のβカテニンタンパク質濃度で相当な減少があったことを、免疫組織化学によって示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｄは、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３構築物を比較する、種々のアッセイからの結果のグラフまたは画像を示す。図４Ａは、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、投与後３日目に、ＥＸ  Ｍ３がはるかに高いレベルで腫瘍組織に存在したことを示す。図４Ｂは、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、投与後３日目に、ＥＸ  Ｍ３が、腫瘍組織のアルゴノート（Ａｇｏ）２結合／ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）負荷効率の増加を呈示したことを示す。図４Ｃは、ＳＷ４０３腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、ＮＥＸ  Ｍ１が、ビヒクル処置した動物と比べて腫瘍の増殖を約５５％阻害したことを示し、一方でＥＸ  Ｍ３は腫瘍の増殖を８０％超で阻害した。ｘ軸は、（ＳＷ４０３腫瘍の）移植後の日数を記載し、矢印は、ＮＥＸ  Ｍ１、ＥＸ  Ｍ３または対照が投与された（３ｍｇ／ｋｇの投与量で）日数を示す。図４Ｄは、図４Ｃで示した試験終了後に得られたＳＷ４０３腫瘍のβカテニンタンパク質濃度で相当な減少があったことを、免疫組織化学によって示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｄは、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３構築物を比較する、種々のアッセイからの結果のグラフまたは画像を示す。図４Ａは、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、投与後３日目に、ＥＸ  Ｍ３がはるかに高いレベルで腫瘍組織に存在したことを示す。図４Ｂは、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、投与後３日目に、ＥＸ  Ｍ３が、腫瘍組織のアルゴノート（Ａｇｏ）２結合／ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）負荷効率の増加を呈示したことを示す。図４Ｃは、ＳＷ４０３腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、ＮＥＸ  Ｍ１が、ビヒクル処置した動物と比べて腫瘍の増殖を約５５％阻害したことを示し、一方でＥＸ  Ｍ３は腫瘍の増殖を８０％超で阻害した。ｘ軸は、（ＳＷ４０３腫瘍の）移植後の日数を記載し、矢印は、ＮＥＸ  Ｍ１、ＥＸ  Ｍ３または対照が投与された（３ｍｇ／ｋｇの投与量で）日数を示す。図４Ｄは、図４Ｃで示した試験終了後に得られたＳＷ４０３腫瘍のβカテニンタンパク質濃度で相当な減少があったことを、免疫組織化学によって示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜図４Ｄは、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３構築物を比較する、種々のアッセイからの結果のグラフまたは画像を示す。図４Ａは、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、投与後３日目に、ＥＸ  Ｍ３がはるかに高いレベルで腫瘍組織に存在したことを示す。図４Ｂは、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、投与後３日目に、ＥＸ  Ｍ３が、腫瘍組織のアルゴノート（Ａｇｏ）２結合／ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）負荷効率の増加を呈示したことを示す。図４Ｃは、ＳＷ４０３腫瘍を保有して、ＮＥＸ  Ｍ１及びＥＸ  Ｍ３で処置したマウスで、ＮＥＸ  Ｍ１が、ビヒクル処置した動物と比べて腫瘍の増殖を約５５％阻害したことを示し、一方でＥＸ  Ｍ３は腫瘍の増殖を８０％超で阻害した。ｘ軸は、（ＳＷ４０３腫瘍の）移植後の日数を記載し、矢印は、ＮＥＸ  Ｍ１、ＥＸ  Ｍ３または対照が投与された（３ｍｇ／ｋｇの投与量で）日数を示す。図４Ｄは、図４Ｃで示した試験終了後に得られたＳＷ４０３腫瘍のβカテニンタンパク質濃度で相当な減少があったことを、免疫組織化学によって示す。
【図５】βカテニン核酸阻害剤分子を調製するために使用できる、脂質ナノ粒子の１つの非限定的な実施形態を示す。ＬＮＰは、以下のコア脂質：ＤＬ−０４８（カチオン性脂質）及びＤＳＧ−ＭＰＥＧ（ペグ化脂質）、ならびに以下のエンベロープ脂質：ＤＬ−１０３（カチオン性脂質）、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＭＰＥＧ（ペグ化脂質）を含む。
【図６】Ｗｎｔシグナル伝達経路の簡略図を示す。左側は、Ｗｎｔリガンドがその表面受容体に結合されておらず、βカテニンが分解複合体中に隔絶され、ユビキチン化及び分解のため標的化されており、標的遺伝子が抑圧されている細胞を示す。右側は、Ｗｎｔリガンドがその表面受容体に結合した後の細胞を示しており、分解複合体がばらばらになり、安定化したβカテニンが放出され、それが核に移動し、そして標的遺伝子が活性化される。
【図７】図７Ａは、実施例５で記載するように、Ｗｎｔ活性化４Ｔ１腫瘍を移植して、プラセボまたはＥＸ  Ｍ３で処置したＢａｌｂ／Ｃマウスの処置スケジュールを示す。図７Ｂは、ＥＸ  Ｍ３処置がβカテニン濃度を低下させて、ＣＤ８  Ｔ細胞浸潤を増加させるが、４Ｔ１腫瘍のＩＤＯ１濃度を著しくは低下させないことを、免疫組織化学によって示す。図７Ｃは、２サイクルのＥＸ  Ｍ３処置が、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに移植された４Ｔ１腫瘍のプラセボと比較して、腫瘍増殖を阻害することを示す。
【図８Ａ】実施例５で記載するように、Ｗｎｔ活性化４Ｔ１腫瘍を移植して、ＰＢＳまたはＥＸ  Ｍ３で処置したＢａｌｂ／Ｃマウスの処置スケジュールを示す。
【図８Ｂ−１】４Ｔ１腫瘍のＥＸ  Ｍ３処置がＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させて、複数のチェックポイント分子（ＰＤ−１、ＬＡＧ−３＋及びＴｉｍ−３＋）を増加させて、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増加させるが、腫瘍微小環境の骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数を著しく変えないことを、フローサイトメトリー分析によって示す。
【図８Ｂ−２】４Ｔ１腫瘍のＥＸ  Ｍ３処置がＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させて、複数のチェックポイント分子（ＰＤ−１、ＬＡＧ−３＋及びＴｉｍ−３＋）を増加させて、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増加させるが、腫瘍微小環境の骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数を著しく変えないことを、フローサイトメトリー分析によって示す。
【図９】図９Ａは、実施例６で記載するように、４Ｔ１腫瘍を移植して、ビヒクルまたはエパカドスタットと呼ばれるＩＤＯ阻害剤（ＩＤＯｉ）で処置したＢａｌｂ／Ｃマウスの処置スケジュールを示す。図９Ｂは、ＩＤＯｉ処置がβカテニン濃度を低下させて、ＣＤ８  Ｔ細胞浸潤を増加させ、４Ｔ１腫瘍のＩＤＯ１濃度を低下させることを、免疫組織化学によって示す。図９Ｃは、２サイクルのＩＤＯｉ処置が、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに移植された４Ｔ１腫瘍のプラセボと比較して、腫瘍増殖を阻害することを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｃは、実施例７で記載するように、腫瘍退縮を示す３つの薬剤すべての組み合わせによる、４Ｔ１腫瘍を移植したＢａｌｂ／Ｃマウスでの、１つの薬剤として投与されるＩＤＯｉ（エパカドスタット）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ−１）及びＥＸ  Ｍ３（図１０Ａ）、２つの薬剤の組み合わせ（図１０Ｂ）、３つの薬剤の組み合わせ（図１０Ｃ）の有効性を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｃは、実施例７で記載するように、腫瘍退縮を示す３つの薬剤すべての組み合わせによる、４Ｔ１腫瘍を移植したＢａｌｂ／Ｃマウスでの、１つの薬剤として投与されるＩＤＯｉ（エパカドスタット）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ−１）及びＥＸ  Ｍ３（図１０Ａ）、２つの薬剤の組み合わせ（図１０Ｂ）、３つの薬剤の組み合わせ（図１０Ｃ）の有効性を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜図１０Ｃは、実施例７で記載するように、腫瘍退縮を示す３つの薬剤すべての組み合わせによる、４Ｔ１腫瘍を移植したＢａｌｂ／Ｃマウスでの、１つの薬剤として投与されるＩＤＯｉ（エパカドスタット）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ−１）及びＥＸ  Ｍ３（図１０Ａ）、２つの薬剤の組み合わせ（図１０Ｂ）、３つの薬剤の組み合わせ（図１０Ｃ）の有効性を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ及び図１１Ｂは、ＩＤＯｉ、抗ＰＤ−１抗体及び／またはＥＸ  Ｍ３で処置した４Ｔ１腫瘍のＣＤ８（図１１Ａ）及びＦｏｘｐ３（図１１Ｂ）のｍＲＮＡ濃度を示し、３つのすべての薬剤組み合わせだけがＣＤ８  ｍＲＮＡ濃度を著しく増加させ、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡ濃度を著しく減少させたことを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ及び図１１Ｂは、ＩＤＯｉ、抗ＰＤ−１抗体及び／またはＥＸ  Ｍ３で処置した４Ｔ１腫瘍のＣＤ８（図１１Ａ）及びＦｏｘｐ３（図１１Ｂ）のｍＲＮＡ濃度を示し、３つのすべての薬剤組み合わせだけがＣＤ８  ｍＲＮＡ濃度を著しく増加させ、Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡ濃度を著しく減少させたことを示す。
【００１７】
定義
本開示をより容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語及び他の用語の追加の定義は、本明細書を通して記載され得る。以下に示される用語の定義が、参照により組み込まれる出願または特許の定義と一致していない場合には、本出願に示される定義を使用して、その用語の意味を理解するべきである。
【００１８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により明確に別段の指示がなされない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば「方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及には、１つ以上の方法、及び／または本明細書に記載される及び／または本開示を読むことで当業者に明らかになるタイプの工程などが含まれる。
【００１９】
投与する：本明細書で使用する場合に、組成物を対象に「投与する」ことは、対象に組成物を与える、適用する、または対象を組成物と接触させることを意味する。投与は、例えば局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内及び皮内を含む、多数の経路のいずれかによって達成することができる。
【００２０】
抗体：本明細書で使用する場合「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを意味する。用語は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多特異性、非特異性、ヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組換え型、複合型、変異型、移植、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成された抗体を含むが、これらに限定されない。抗体は、定常領域またはその一部（例えば、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常域遺伝子）を含むことができる。例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＭ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＤ、及びＩｇＥを含む、種々のアイソタイプの重鎖定常領域を使用できる。例えば、軽鎖定常領域はκまたはλであり得る。
【００２１】
抗原結合ドメイン：本明細書で使用する場合「抗原結合ドメイン」という用語は、抗体と抗原の間の特異的結合の原因であるアミノ酸を含む、抗体分子の一部を意味する。特定の抗原で、抗原結合ドメインは、抗原の一部と結合できるだけである。抗体によって特異的に認識されかつ結合される抗原の一部は「エピトープ」または「抗原決定基」と呼ばれる。抗原結合ドメインは、Ｆａｂ（抗原結合性断片）、Ｆ（ａｂ’）2断片（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのＦａｂ断片を有する２価の断片）、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照）、２つのＶH及びＣH１ドメインを有するＦｄ断片、ｄＡｂ（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）、ならびに抗原結合機能を保持する他の抗体断片を含む。Ｆａｂ断片は、定常領域の間にジスルフィド結合によって共有結合されるＶH−ＣH１及びＶL−ＣLドメインを有する。Ｆｖ断片は小さく、非共有結合されるＶH及びＶLドメインを有する。非共有結合されるドメインの分離する傾向を解決するために、ｓｃＦｖが構築され得る。ｓｃＦｖは、（１）ＶHのＣ末端をＶLのＮ末端にまたは（２）ＶLのＣ末端をＶＨのＮ末端に結合する、可撓性ポリペプチドを含む１５ｍｅｒ（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3ペプチドはリンカーとして使用できるが、他のリンカーも当技術分野において周知である。これらの抗体断片は、当業者に周知の従来技術を使用して得られて、断片は、完全抗体であると同様に機能に関して評価される。
【００２２】
アンチセンス鎖：二本鎖核酸阻害剤分子は、２つのオリゴヌクレオチド鎖、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。アンチセンス鎖もしくはその領域は、部分的に、実質的にまたは完全に標的核酸の対応する領域と相補的である。更に二本鎖核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖またはその領域は、部分的に、実質的にもしくは完全に二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖またはその領域と相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、標的核酸配列に非相補的であるヌクレオチドも含むことができる。非相補的ヌクレオチドは、相補的な配列の片側にあり得る、または相補的な配列の両側にあり得る。特定の実施形態で、アンチセンス鎖もしくはその領域は、部分的にまたは実質的にセンス鎖もしくはその領域と相補的であり、非相補的ヌクレオチドは、１つ以上の相補的領域（例えば、１つ以上のミスマッチ）の間に位置できる。二本鎖核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖は、ガイド鎖とも呼ばれる。
【００２３】
およそ：本明細書で使用する場合、１つ以上の目的とする値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記載された参照値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記しない限りまたは文脈から明白でない限り、記載された参照値のいずれかの方向（超または未満）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に入る値の範囲を指す（このような数値が可能性のある値の１００％を超える場合を除く）。
【００２４】
βカテニン：本明細書で使用する場合「βカテニン」とは、ポリペプチド、またはそのようなβカテニンタンパク質をコードする核酸配列のいずれかを指す。ポリペプチドを意味する場合、「βカテニン」とは、βカテニン遺伝子／転写物（ＣＴＮＮＢ１）（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１９０４．３（ヒトβカテニン転写変異体１）、ＮＭ＿００１０９８２０９．１（ヒトβカテニン転写変異体２）、ＮＭ＿００１０９８２１０．１（ヒトβカテニン転写変異体３）、ならびにＮＭ＿００７６１４．２及びＮＭ＿００７６１４．３（マウスβカテニン））のポリペプチド遺伝子産物を指す。
【００２５】
相補的：本明細書で使用する場合「相補的」という用語は、２つのヌクレオチドが塩基対を互いに形成できる２つのヌクレオチドの間の構造的関係（例えば、２つの対向する核酸にまたは１つの核酸鎖の対抗する領域に）を指す。例えば、対向する核酸のピリミジンヌクレオチドと相補的である１つの核酸のプリンヌクレオチドは、水素結合を互いに形成することによって塩基対を一緒に形成できる。いくつかの実施形態では、相補的なヌクレオチドは、ワトソン・クリック型、または安定的二重鎖の形成を可能にする他の任意の型で塩基対を形成できる。「完全に相補的」または「１００％の相補性」とは、第１オリゴヌクレオチド鎖のまたは第１オリゴヌクレオチド鎖のセグメントの各ヌクレオチドモノマーが、第２オリゴヌクレオチド鎖のまたは第２オリゴヌクレオチド鎖のセグメントの各ヌクレオチドモノマーと共に塩基対を形成できる状況を意味する。１００％未満の相補性とは、いくらかだがすべてではない２つのオリゴヌクレオチド鎖（または、２つのオリゴヌクレオチド鎖の２つのセグメント）のヌクレオチドモノマーが互いに塩基対を形成できる状況を意味する。「実質的な相補性」とは、互いに９０％以上の相補性を示す２つのオリゴヌクレオチド鎖（または、２つのオリゴヌクレオチド鎖のセグメント）を意味する。「十分な相補性」とは、標的ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の量を低減する、標的ｍＲＮＡと核酸阻害剤分子の間の相補性を意味する。
【００２６】
相補鎖：本明細書で使用する場合「相補鎖」という用語は、部分的に、実質的にまたは完全に他の鎖と相補的である二本鎖核酸阻害剤分子の鎖を意味する。
【００２７】
デオキシリボフラノシル：本明細書で使用する場合「デオキシリボフラノシル」という用語は、天然に存在するＤＮＡで見つかり、下に示すように２’−炭素で水素基を有する、フラノシルを指す。
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【００２８】
デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用する場合「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、糖部位の２’位で水素基を有する、天然ヌクレオチド（本明細書で定義される）または修飾ヌクレオチド（本明細書で定義される）を意味する。
【００２９】
ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子：本明細書で使用する場合「ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子」という用語は、センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有する二本鎖核酸阻害剤分子を指し、アンチセンス鎖またはアンチセンス鎖の一部が、標的ｍＲＮＡの開裂のアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼによって使用される。
【００３０】
二本鎖：核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関して、本明細書で使用する場合「二本鎖」という用語は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的な塩基対により形成される構造を指す。
【００３１】
賦形剤：本明細書で使用する場合「賦形剤」という用語は、例えば、所望の整合性もしくは安定化効果をもたらす、またはそれに寄与する、組成物中に含まれ得る非治療薬を指す。
【００３２】
フラノシル：本明細書で使用する場合「フラノシル」という用語は、４つの炭素原子及び１つの酸素原子を備える五員環を含む構造を意味する。
【００３３】
ヌクレオチド間連結基：本明細書で使用する場合「ヌクレオチド間連結基」または「ヌクレオチド間結合」という用語は、２つのヌクレオシド部分を共有結合できる化学基を意味する。通常、化学基は、リン酸基または亜リン酸基を含むリン含有連結基である。リン連結基は、ホスホジエステル結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、ホスホロアミダイト結合、ホスホネート結合及び／またはボラノホスフェート結合を含むことを意味する。多くのリン含有結合は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，１９４，５９９号；同第５，５６５，５５５号；同第５，５２７，８９９号；同第５，７２１，２１８号；同第５，６７２，６９７号及び同第５，６２５，０５０号に開示されるように公知技術である。他の実施形態にて、オリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；ならびにアミド主鎖；を有するものを含む、亜リン原子を含まない１つ以上のヌクレオチド間連結基（例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオチド間結合）を含む。非亜リン酸含有結合は、例えば米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；同第５，７９２，６０８号；同第５，６４６，２６９号及び同第５，６７７，４３９号に開示されるように、公知技術である。
【００３４】
免疫チェックポイント分子：本明細書で使用する場合「免疫チェックポイント分子」という用語は、免疫系が外来病原体に反応するとき、自己免疫寛容の維持（または、自己免疫の防止）、ならびに宿主細胞及び組織の保護の通常の生理的条件下で重要である、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）上の分子を指す。特定の免疫チェックポイント分子が、抗原へのＴ細胞反応に関与するシグナルを低減する阻害剤分子（例えば、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１）である一方で、特定の免疫チェックポイント分子は、抗原へのＴ細胞反応に関与するシグナルを増幅する共刺激分子である。
【００３５】
修飾核酸塩基：本明細書で使用する場合「修飾核酸塩基」という用語は、天然核酸塩基または汎用核酸塩基でない、任意の核酸塩基を意味する。好適な修飾核酸塩基は、ジアミノプリン及びその誘導体、アルキル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、チオラート化プリンまたはピリミジンなどを含む。他の好適な修飾核酸塩基は、プリン及びピリミジンの類似体を含む。好適な類似体は、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ν，Ν−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２‐チオウラシル、５−メチル−２‐チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、１−メチルシュードウラシル、キュエオシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、ニトロピロールイル、ニトロインドリル及びジフルオロトリル、６−チオプリン及び２，６−ジアミノプリンニトロピロールイル、ニトロインドリル及びジフルオロトリルを含むが、これらに限定されない。通常、核酸塩基は、窒素塩基を含む。特定の実施形態では、核酸塩基は、窒素原子を含まない。例えば、公開した米国特許出願第２００８０２７４４６２号を参照。
【００３６】
修飾ヌクレオシド：本明細書で使用する場合「修飾ヌクレオシド」という用語は、リン酸基または修飾リン酸基（本明細書で定義される）に結合されておらず、修飾核酸塩基（本明細書で定義される）、汎用核酸塩基（本明細書で定義される）または修飾糖部位（本明細書で定義される）のうちの１つ以上を含む、糖（例えば、デオキシリボースもしくはリボースまたはその類似体）とのＮ−グリコシド結合中の複素環窒素塩基を指す。修飾または汎用核酸塩基（本明細書で塩基類似体とも称される）は通常、ヌクレオシドの糖部位の１’位に配置され、１’位のアデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシル以外の核酸塩基を指す。特定の実施形態では、修飾または汎用核酸塩基は、窒素塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない。例えば、公開した米国特許出願第２００８０２７４４６２号を参照。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（非塩基性）。本開示との関係で好適な修飾もしくは汎用核酸塩基、または修飾糖は、本明細書に記載されている。
【００３７】
修飾ヌクレオチド：本明細書で使用する場合「修飾ヌクレオチド」という用語は、リン酸基または修飾リン酸基（本明細書で定義される）に結合しており、修飾核酸塩基（本明細書で定義される）、汎用核酸塩基（本明細書で定義される）または修飾糖部位（本明細書で定義される）のうちの１つ以上を含む、糖（例えば、リボースもしくはデオキシリボースまたはその類似体）とのＮ−グリコシド結合中の複素環窒素塩基を指す。修飾または汎用核酸塩基（本明細書で塩基類似体とも称される）は通常、ヌクレオシドの糖部位の１’位に配置され、１’位のアデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシル以外の核酸塩基を指す。特定の実施形態では、修飾または汎用核酸塩基は、窒素塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない。例えば、公開した米国特許出願第２００８０２７４４６２号を参照。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（非塩基性）。本開示との関係で好適な修飾もしくは汎用核酸塩基、修飾糖部位、または修飾リン酸基は、本明細書に記載されている。
【００３８】
修飾リン酸基：本明細書で使用する場合「修飾リン酸基」という用語は、天然ヌクレオチドで生じないリン酸基の修飾を指し、亜リン原子及びリン酸塩（例えば、酢酸塩）を含まないアニオンリン酸模倣体を含む、リン酸模倣体を含む、本明細書に記載の天然に存在しないリン酸模倣体を含む。修飾リン酸基は、本明細書に記載のように、例えばホスホロチオエートを含む亜リン酸含有ヌクレオチド間連結基、及び非亜リン酸含有連結基の両方を含む、天然に存在しないヌクレオチド間連結基も含む。
【００３９】
修飾糖部位：本明細書で使用する場合「修飾糖部位」とは、置換糖部位（本明細書で定義される）または糖の類似体（本明細書で定義される）を意味する。
【００４０】
天然ヌクレオシド：本明細書で使用する場合「天然ヌクレオシド」という用語は、糖（例えば、デオキシリボースまたはリボースまたはその類似体）とのＮ−グリコシド結合中の複素環窒素塩基を指す。天然の複素環窒素塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル及びチミンを含む。
【００４１】
天然ヌクレオチド：本明細書で使用する場合「天然ヌクレオチド」という用語は、リン酸基に結合される糖（例えば、リボースまたはデオキシリボースまたはその類似体）とのＮ−グリコシド結合中の複素環窒素塩基を指す。天然の複素環窒素塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル及びチミンを含む。
【００４２】
天然核酸塩基：本明細書で使用する場合「天然核酸塩基」という用語は、５つの主要な天然に存在するＲＮＡ及びＤＮＡの複素環核酸塩基、すなわち、プリン塩基：アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基：チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を指す。
【００４３】
天然ヌクレオシド：本明細書で使用する場合「天然ヌクレオシド」という用語は、リン酸基に結合しない天然糖部位（本明細書で定義される）とのＮ−グリコシド結合中の天然核酸塩基（本明細書で定義される）を意味する。
【００４４】
天然ヌクレオチド：本明細書で使用する場合「天然ヌクレオチド」という用語は、リン酸基に結合する天然糖部位（本明細書で定義される）とのＮ−グリコシド結合中の天然核酸塩基（本明細書で定義される）を意味する。
【００４５】
天然糖部位：本明細書で使用する場合「天然糖部位」という用語は、リボフラノシル（本明細書で定義される）またはデオキシリボフラノシル（本明細書で定義される）を意味する。
【００４６】
非Ｔ細胞炎症表現型：本明細書で使用する場合「非Ｔ細胞炎症表現型」とは、腫瘍微小環境へ浸潤するＣＤ８＋Ｔ細胞の蓄積がほとんどまたはまったくないことにより証明されるように、腫瘍に対して既存のＴ細胞反応のない腫瘍微小環境を指す。通常、非Ｔ細胞炎症表現型は、腫瘍微小環境へのＣＤ８＋Ｔ細胞の漸増及び蓄積を促進しない限られたケモカインプロファイル及び／または最小またはまったくないＩ型ＩＦＮ遺伝子シグネチャーも特徴とする。
【００４７】
非Ｗｎｔ活性化疾患または障害：本明細書で使用する場合「非Ｗｎｔ活性化疾患または障害」とは、Ｗｎｔ／βカテニン経路の活性化と関連しない疾患または障害を意味する。「非Ｗｎｔ活性化」疾患または障害は、特定の結腸直腸癌、類線維腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、肝芽腫、腎臓癌（ウィルムス腫瘍）、髄芽細胞腫、黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣癌（類子宮内膜癌）、膵臓癌、石灰化上皮種、前立腺癌、甲状腺（未分化）癌及び子宮（子宮内膜）癌を含む、特定の癌及び／または増殖性疾患、状態または障害を含む。一実施形態にて、「非Ｗｎｔ活性化」疾患または障害は、結腸直腸癌、肝細胞癌または黒色腫である。一実施形態にて、「非Ｗｎｔ活性化」疾患または障害は、神経芽細胞腫、腎臓癌または黒色腫である。上述のがん及び／または増殖性疾患を含む疾患または障害が、疾患または障害の非Ｗｎｔ活性化サブタイプ、及び以下で提供するＷｎｔ活性化疾患または障害の定義と一致する、疾患または障害のＷｎｔ活性化サブタイプの両方を含み得ることは理解されよう。
【００４８】
核酸阻害剤分子：本明細書で使用する場合「核酸阻害剤分子」という用語は、標的遺伝子ｍＲＮＡの配列を特異的に標的とする領域を、オリゴヌクレオチド分子が含む、標的遺伝子の発現を低減するまたは除去する、オリゴヌクレオチド分子を意味する。通常、核酸阻害剤分子の標的領域は、特定した標的遺伝子に核酸阻害剤分子の効果を向けるために、標的遺伝子ｍＲＮＡ上の配列と十分に相補的である配列を含む。核酸阻害剤分子には、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチドが含まれ得る。
【００４９】
核酸塩基：本明細書で使用する場合「核酸塩基」という用語は、天然核酸塩基（本明細書で定義される）、修飾核酸塩基（本明細書で定義される）または汎用核酸塩基（本明細書で定義される）を意味する。
【００５０】
ヌクレオシド：本明細書で使用する場合「ヌクレオシド」という用語は、天然ヌクレオシド（本明細書で定義される）または修飾ヌクレオシド（本明細書で定義される）を意味する。
【００５１】
ヌクレオチド：本明細書で使用する場合「ヌクレオチド」という用語は、天然ヌクレオチド（本明細書で定義される）または修飾ヌクレオチド（本明細書で定義される）を意味する。
【００５２】
突出：本明細書で使用する場合「突出」という用語は、二本鎖核酸阻害剤分子のいずれかの鎖のいずれかの端の末端非塩基対ヌクレオチド（複数可）を意味する。特定の実施形態では、突出は、第１鎖または領域が二本鎖を形成する、相補鎖の末端を越えて伸びている１つの鎖または領域から生じる。塩基対の水素結合により二本鎖を形成できる２つのオリゴヌクレオチド領域の一方または両方は、２つのポリヌクレオチドまたは領域により共有される、相補的３’端及び／または５’端を越えて伸びる、５’端及び／または３’端を有することができる。二本鎖の３’端及び／または５’端を越えて伸びる一本鎖領域は、突出と呼ばれる。
【００５３】
医薬組成物：本明細書で使用する場合「医薬組成物」という用語は、薬理学的に有効な量のβカテニン核酸阻害剤分子または抗体などの免疫治療薬（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体のうちの１つ以上を含む）及び薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００５４】
薬学的に許容される賦形剤：本明細書で使用する場合「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、賦形剤が、妥当な利益／危険率に相応する過度に有害な副作用（例えば、毒性、炎症及びアレルギー反応）がなく、ヒト及び／または動物での使用に適しているものであることを意味する。
【００５５】
リン酸模倣体：本明細書で使用する場合「リン酸模倣体」という用語は、リン酸基の静電特性及び立体特性を模倣するオリゴヌクレオチドの５’末端の化学部位を意味する。オリゴヌクレオチドの５’端に結合されることができる、多くのリン酸模倣体が開発されてきた（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号（Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５，４３（６）：２９９３−３０１１）を参照）。通常、これらの５’リン酸模倣体は、ホスファターゼ耐性結合を含む。好適なリン酸模倣体は、国際特許公開第ＷＯ２０１８／０４５３１７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、５’ホスホン酸塩（例えば、５’メチレンホスホネート（５’ＭＰ）及び５’−（Ｅ）−ビニルホスホネート（５’ＶＰ））、ならびにオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドの糖部位（例えば、リボースもしくはデオキシリボース、またはその類似体）の４’炭素に結合する４’リン酸類似体（例えば、４’−オキシメチルホスホネート、４’−チオメチルホスホネートまたは４’−アミノメチルホスホネート）を含む。特定の実施形態では、４’−オキシメチルホスホネートは、式−Ｏ−ＣＨ2−ＰＯ（ＯＨ）2または−Ｏ−ＣＨ2−ＰＯ（ＯＲ）2で表され、式中Ｒは、Ｈ、ＣＨ3、アルキル基または保護基からそれぞれ選択される。特定の実施形態では、アルキル基はＣＨ2ＣＨ3である。更に一般的に、Ｒは、Ｈ、ＣＨ3またはＣＨ2ＣＨ3からそれぞれ選択される。オリゴヌクレオチドの５’末端における他の修飾が開発されてきた（例えば、国際特許第ＷＯ２０１１／１３３８７１号を参照）。
【００５６】
増強する：本明細書で使用する場合「強化する」または「強化すること」という用語は、別の治療薬（例えば、免疫抑制チェックポイント分子（例えば、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１）の拮抗薬または共刺激チェックポイント分子の刺激薬）の治療効果を増大させるまたは強化する、１つの治療薬（例えば、β−カテニン核酸阻害剤分子）の能力を指す。
【００５７】
保護基：本明細書で使用する場合「保護基」という用語は、所望の反応の特定の条件下で官能基を可逆的に非反応性にする基として、従来の化学的意味で使用される。所望の反応の後、保護基は、保護した官能基を脱保護するために除去されることができる。すべての保護基は、かなり大きな割合の合成されている分子を分解しない条件の下で、除去可能でなければならない。
【００５８】
低減する：本明細書で使用する場合「低減する」という用語は、当技術分野で一般に受け入れられている、その意味を指す。核酸阻害剤分子に関して、前記用語は、核酸阻害剤分子の不存在下で観察されるものを下回る、遺伝子の発現の低減、またはＲＮＡ分子または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードする同等なＲＮＡ分子の濃度の低減、または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性の低減を一般的に意味する。
【００５９】
耐性：免疫治療に関して使用する場合「耐性」または「抵抗性」という用語は、免疫治療への医学的に顕著な反応を示さないがん及び／または増殖性疾患、状態または障害を指す。本明細書で開示するように、免疫治療に対する耐性は、βカテニン発現を低減させることにより逆転できる。
【００６０】
リボフラノシル：本明細書で使用する場合「リボフラノシル」という用語は、天然に存在するＲＮＡで見つかり、下に示すように２’炭素で水素基を有するフラノシルを指す。
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【００６１】
リボヌクレオチド：本明細書で使用する場合「リボヌクレオチド」という用語は、糖部位の２’位で水酸基を有する、天然ヌクレオチド（本明細書で定義される）または修飾ヌクレオチド（本明細書で定義される）を意味する。
【００６２】
センス鎖：二本鎖核酸阻害剤分子は、２つのオリゴヌクレオチド鎖、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。センス鎖またはその領域は、部分的に、実質的にもしくは完全に二本鎖核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖またはその領域と相補的である。特定の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖に非相補的であるヌクレオチドも含むことができる。非相補的ヌクレオチドは、相補的な配列の片側にあり得る、または相補的な配列の両側にあり得る。特定の実施形態で、センス鎖またはその領域は、部分的にもしくは実質的にアンチセンス鎖またはその領域と相補的であり、非相補的ヌクレオチドは、１つ以上の相補的領域（例えば、１つ以上のミスマッチ）の間に位置できる。センス鎖は、パッセンジャー鎖とも呼ばれている。
【００６３】
対象：本明細書で使用される場合「対象」という用語は、マウス、ウサギ及びヒトを含む、任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象はヒトである。「個体」または「患者」という用語は、「対象」と置き換え可能であると意図される。
【００６４】
置換基または置換：本明細書で使用する場合「置換基」または「置換」という用語は、置換基のラジカルで所与の構造の水素ラジカルを置換することを意味する。任意の所与の構造の２つ以上の位置が２つ以上の置換基で置換されることができるとき、置換基は、特に指示がない限り、あらゆる位置で同じでも異なってもよい。本明細書で使用する場合「置換」という用語は、有機化合物に適合するすべての許容される置換基を含むと想到される。許容される置換基は、非環式及び環式、分枝状及び非枝状、炭素環式及び複素環式、芳香族及び非芳香族の有機化合物の置換基を含む。本開示は、有機化合物の許容される置換基によるいかなる方法にも制限されることを意図しない。
【００６５】
置換糖部位：本明細書で使用する場合「置換糖部位」とは、１つ以上の修飾を含むフラノシルを含む。通常、修飾は、糖の２’、３’、４’または５’炭素位置で生じる。
【００６６】
糖の類似体：本明細書で使用する場合「糖の類似体」という用語は、フラノシルを含まず、ヌクレオチドの天然の糖部位を置き換えることができる構造を意味し、その結果、得られるヌクレオチドは（１）オリゴヌクレオチドへの組み込み及び（２）相補的ヌクレオチドへのハイブリッド形成ができる。このような構造は通常、フラノシルへの比較的単純な変化（例えば、異なる数の原子を含む環（例えば、四員、六員または七員環）；非酸素原子（例えば、炭素、硫黄または窒素）とフラノシルの酸素の置換；または原子の数の変化及び酸素の置換の両方）を含む。このような構造は、置換糖部位について記載するものに対応する置換も含むことができる。糖の類似体は、より複雑な糖置換（例えば、ペプチド核酸の非環式）も含む。糖の類似体は、モルホリノ、シクロヘキセニル及びシクロヘキシトールを含むが、これらに限定されない。
【００６７】
糖部位：本明細書で使用する場合「糖部位」という用語は、天然の糖部位またはヌクレオチドもしくはヌクレオシドの修飾糖部位を意味する。
【００６８】
標的部位：本明細書で使用する場合「標的部位」「標的配列」「標的核酸」「標的領域」「標的遺伝子」という用語は区別なく使用されて、例えば部分的に、実質的にもしくは完全に、または十分にその標的配列に相補的である、そのガイド／アンチセンス領域内に配列を含有する、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子により媒介される開裂について「標的化される」ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を意味する。
【００６９】
Ｔ細胞炎症表現型：本明細書で使用する場合「Ｔ細胞炎症表現型」とは、腫瘍微小環境へ浸潤するＣＤ８＋Ｔ細胞の蓄積により証明されるように、腫瘍に対して既存のＴ細胞反応がある腫瘍微小環境を指す。通常、Ｔ細胞炎症表現型は、腫瘍微小環境へＣＤ８＋Ｔ細胞を動員することができる広範なケモカインプロファイル（ＣＸＣＬ９及び／またはＣＸＣＬ１０を含む）及び／またはＩ型ＩＦＮ遺伝子シグネチャーも特徴とする。
【００７０】
治療上有効な量：本明細書で使用する場合「治療上有効な量」または「薬理学的に有効な量」とは、意図する薬理学的、治療的または予防的結果をもたらすのに効果的なβ−カテニン核酸阻害剤分子または抗体などの免疫治療薬（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体のうちの１つ以上を含む）の量を指す。
【００７１】
汎用核酸塩基：本明細書で使用する場合「汎用核酸塩基」とは、天然に存在する核酸で通常見つかる塩基の２つ以上と対になることができ、したがって二本鎖中のこのような天然に存在する塩基と置換することができる、塩基を意味する。塩基は、天然塩基のそれぞれと対になることができる必要はない。例えば、特定の塩基は、プリンとだけもしくはそれと選択的に、またはピリミジンとだけもしくはそれと選択的に対になる。汎用核酸塩基は、ワトソン・クリックまたは非ワトソン・クリック相互作用（例えば、フーグスティーン相互作用）を介して水素結合を形成することにより、塩基対を形成できる。代表的な汎用核酸塩基は、イノシン及びその誘導体を含む。
【００７２】
Ｗｎｔ活性化疾患または障害：本明細書で使用する場合「Ｗｎｔ活性化疾患または障害」とは、活性化Ｗｎｔ／βカテニン経路と関連する疾患または障害を意味する。「Ｗｎｔ関連」疾患または障害は、結腸直腸癌、類線維腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、肝芽腫、腎臓癌（ウィルムス腫瘍）、髄芽細胞腫、黒色腫、卵巣癌（類子宮内膜癌）、膵臓癌、石灰化上皮種、甲状腺（未分化）癌及び子宮（子宮内膜）癌を含む、がん及び／または増殖性疾患、状態または障害を含む。一実施形態にて、「Ｗｎｔ活性化」疾患または障害は、結腸直腸癌、肝細胞癌または黒色腫である。上述のがん及び／または増殖性疾患を含む疾患または障害が、上述した非Ｗｎｔ活性化疾患または障害の定義と一致する、Ｗｎｔ活性化型の疾患または障害及び非Ｗｎｔ活性化型の疾患または障害の両方を含み得ることは理解されよう。
【００７３】
Ｗｎｔ／βカテニン経路本明細書で使用する場合「Ｗｎｔ／βカテニン経路」とは、Ｗｎｔリガンド、受容体及び共受容体の組み合わせにより伝達される、細胞の分子シグナル伝達経路を意味し、それはβカテニンを伴う下流シグナル伝達経路を開始する（例えば、図６を参照）。Ｗｎｔシグナル伝達がない状態で、βカテニンは、細胞質のユビキチン化を介する分解のため標的化される。Ｗｎｔリガンド及びＷｎｔシグナル伝達がある場合、βカテニンは安定化され、転写因子（例えば、Ｔ細胞転写因子（ＴＣＦ）及びリンパ系増強転写因子（ＬＥＦ））と相互作用することができ、かつ遺伝子転写を作動させることができる、細胞核に移動する。Ｗｎｔ／βカテニン経路の調節解除及び活性化は、βカテニン遺伝子、またはβカテニン機能を負に調整する腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）をコードする遺伝子の突然変異によって多くの場合生じるが、Ｗｎｔ／βカテニン経路の他の構成成分（例えば、アキシン、ＬＥＦ及びＩＣＡＴ）をコードする遺伝子の突然変異によっても生じる。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本出願は、修飾ヌクレオチドの特有なパターンを有する、強力で最適化された二本鎖βカテニン核酸阻害剤分子を提供する。例に示すように、二本鎖核酸分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの修飾パターンを変えることは、センス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド配列が同一のときでも、低減した免疫原性及び腫瘍細胞中のβカテニンｍＲＮＡ発現の改善した低減を含む、改善した特性をもたらすことができる。βカテニン遺伝子の濃度または発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで低減するために、同じものを含む、最適化した二本鎖βカテニン核酸阻害剤分子及び組成物を使用する方法も提供され、それは、免疫治療（例えば、免疫チェックポイント分子の遮断）に応答しないがんを含むがんを治療する方法及び組成物を含む。
【００７５】
最適化したβカテニン核酸阻害剤分子
本明細書に記載の二本鎖βカテニン核酸阻害剤分子は、ヌクレオチド修飾の特有なパターンを含み、ヌクレオチド修飾の同じパターンを共有しないβカテニン核酸阻害剤分子と比べて改善した特性を有する。特定の実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子のセンス鎖は、配列番号１１の核酸を含む。特定の実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子のセンス鎖は、配列番号１１の核酸からなる。特定の実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖は、配列番号１２の核酸を含む。特定の実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖は、配列番号１２の核酸からなる。一実施形態では、センス鎖は配列番号１１の核酸からなり、アンチセンス鎖は配列番号１２の核酸からなる。一実施形態では、センス鎖は配列番号１１の核酸を含み、アンチセンス鎖は配列番号１２の核酸を含む。
【００７６】
特定の実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸阻害剤分子であり、センス鎖は、配列番号１１の核酸を含むまたはそれからなり、アンチセンス鎖は、配列番号１２の核酸を含むまたはそれからなり、センス鎖及びアンチセンス鎖は、２６塩基対の二本鎖領域を一緒に形成し、アンチセンス鎖は、その３’末端に２の一本鎖ヌクレオチド、及びその５’末端に１０の一本鎖ヌクレオチドを含む。
【００７７】
この最適化したβカテニン核酸阻害剤分子の概略図が図２Ａに示されており（「ＥＸ  Ｍ３」）、それは、センス鎖及びアンチセンス鎖の配列、センス鎖とアンチセンス鎖の間の相補性領域、及び修飾ヌクレオチドの特有なパターンを示す。
【００７８】
修飾ヌクレオチドの特有なパターンは、配列番号１１及び配列番号１２でも示される。配列番号１１及び配列番号１２で示すように、修飾βカテニン核酸阻害剤分子の大部分のヌクレオチドの糖部位は、２’−Ｆまたは２’−ＯＣＨ3で修飾される。具体的には、図２Ａで示すように、センス鎖（配列番号１１）において、ヌクレオチド１、３、７、９〜１１、１３、１５、１９及び２０のそれぞれの糖部位は２’−Ｆで修飾され、ヌクレオチド２、４〜６、８、１２、１４、１６〜１８及び２４のそれぞれの糖部位は２’−ＯＣＨ3で修飾される。図２で示すように、アンチセンス鎖（配列番号１２）において、ヌクレオチド２、６、１９、２１、２３、２５、３０、３１、３３及び３５のそれぞれの糖部位は２’−Ｆで修飾され、ヌクレオチド１、３〜５、７〜９、１１〜１５、２０、２２、２４、２６、３２、３４及び３６〜３８のそれぞれの糖部位は２’−ＯＣＨ3で修飾される。最適化したβカテニン核酸阻害剤分子の残りのヌクレオチドは、２’−Ｆまたは２’−ＯＣＨ3で修飾されない。更に具体的には、センス鎖（配列番号１１）において、ヌクレオチド２５及び２６はデオキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオチド２１〜２３はリボヌクレオチドである。通常、ヌクレオチド２５及び２６は天然デオキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオチド２１〜２３は天然リボヌクレオチドである。アンチセンス鎖（配列番号１２）において、ヌクレオチド１０はデオキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオチド１６〜１８及び２７〜２９はリボヌクレオチドである。通常、ヌクレオチド１０は天然デオキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオチド１６〜１８及び２７〜２９は天然リボヌクレオチドである。
【００７９】
一実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸阻害剤分子であり、
センス鎖は、配列番号１３の核酸配列（ａｇａａｕａｃａａａｕｇａｕｇｕａｇａａａｃａｇｃｃ）を含むまたはそれからなり、アンチセンス鎖は、配列番号１４の核酸配列（ｕａｇｃｕａｕｃｇｔｇｇｃｕｇｕｕｕｃｕａｃａｕｃａｕｕｕｇｕａｕｕｃｕｇｃ）を含むまたはそれからなり、センス鎖及びアンチセンス鎖は、２６塩基対の二本鎖領域を一緒に形成し、アンチセンス鎖は、その３’末端に２の一本鎖ヌクレオチド、及びその５’末端に１０の一本鎖ヌクレオチドを含み；
配列番号１３のヌクレオチド１、３、７、９〜１１、１３、１５、１９及び２０のそれぞれの糖部位は、２’−Ｆで修飾されており、配列番号１３のヌクレオチド２、４〜６、８、１２、１４、１６〜１８及び２４のそれぞれの糖部位は、２’−ＯＣＨ3で修飾されており、配列番号１３のヌクレオチド２５及び２６は、天然デオキシリボヌクレオチドであり、配列番号１３のヌクレオチド２１〜２３は、天然リボヌクレオチドであり；
配列番号１４のヌクレオチド２、６、１９、２１、２３、２５、３０、３１、３３及び３５のそれぞれの糖部位は、２’−Ｆで修飾されており、配列番号１４のヌクレオチド１、３〜５、７〜９、１１〜１５、２０、２２、２４、２６、３２、３４及び３６〜３８のそれぞれの糖部位は、２’−ＯＣＨ3で修飾されており、配列番号１４のヌクレオチド１０は、天然デオキシリボヌクレオチドであり、配列番号１４のヌクレオチド１６〜１８及び２７〜２９は、天然リボヌクレオチドである。
【００８０】
関連態様は、配列番号１１の核酸を含むまたはそれからなる、オリゴヌクレオチドに関する。別の態様は、配列番号１２の核酸を含むまたはそれからなる、オリゴヌクレオチドに関する。
【００８１】
配列番号１３の核酸を含むまたはそれからなるオリゴヌクレオチドも提供されてり、ヌクレオチド１、３、７、９〜１１、１３、１５、１９及び２０のそれぞれの糖部位は、２’−Ｆで修飾されており、ヌクレオチド２、４〜６、８、１２、１４、１６〜１８及び２４のそれぞれの糖部位は、２’−ＯＣＨ3で修飾されており、ヌクレオチド２５及び２６は、デオキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオチド２１〜２３は、リボヌクレオチドである。通常、ヌクレオチド２５及び２６は、天然デオキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオチド２１〜２３は、天然リボヌクレオチドである。
【００８２】
配列番号１４の核酸を含むまたはそれからなるオリゴヌクレオチドも提供されてり、ヌクレオチド２、６、１９、２１、２３、２５、３０、３１、３３及び３５のそれぞれの糖部位は、２’−Ｆで修飾されており、ヌクレオチド１、３〜５、７〜９、１１〜１５、２０、２２、２４、２６、３２、３４及び３６〜３８のそれぞれの糖部位は、２’−ＯＣＨ3で修飾されており、ヌクレオチド１０は、デオキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオチド１６〜１８及び２７〜２９は、リボヌクレオチドである。通常、ヌクレオチド１０は、天然デオキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオチド１６〜１８及び２７〜２９は、天然リボヌクレオチドである。
【００８３】
他の修飾
本明細書に記載の最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、配列番号１１及び配列番号１２で示したように、特定のヌクレオチドの糖部位の２’−炭素で、２’−Ｆ及び２’−ＯＭｅ修飾の特有なパターンを含む、ヌクレオチド修飾の特有なパターンを含む。
【００８４】
特定の実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子のヌクレオチドは、核酸塩基、リン酸基または糖部位の他の部分を含む、ヌクレオチドの他の部分で生じる１つ以上の追加修飾を含む。
【００８５】
例えば、特定の実施形態で、糖部位の環構造は修飾されることができ、それは、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４，３６０７−３６３０を参照）；架橋型核酸（「ＢＮＡ」）（例えば、米国特許第４２７，６７２号及びＭｉｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７（４）：１２２５−３８を参照）；及びアンロックド核酸（「ＵＮＡ」）  （例えば、Ｓｎｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２，ｅ１０３（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１３．３６）を参照）中に存在する修飾環構造を含むが、これらに限定されない。更なる修飾は、本明細書に記載のヌクレオチドの糖部位の他の部分（例えば、５’−炭素）でも生じ得る。
【００８６】
特定の実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、当技術分野で既知のように、１’位でアデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシル以外の１つ以上の修飾核酸塩基も含むことができる。特定の実施形態では、修飾または汎用核酸塩基は、窒素塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない。例えば、公開した米国特許出願第２００８０２７４４６２号を参照。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（非塩基性）。修飾核酸塩基の代表例は、５’−メチルシトシンである。
【００８７】
特定の実施形態では、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、１つ以上の修飾リン酸基も含むことができる。「修飾リン酸基」という用語は、天然ヌクレオチドで生じないリン酸基の修飾を指し、亜リン原子及びリン酸塩（例えば、酢酸塩）を含まないアニオンリン酸模倣体を含む、リン酸模倣体を含む、本明細書に記載の天然に存在しないリン酸模倣体を含む。修飾リン酸基は、本明細書に記載のように、亜リン酸含有ヌクレオチド間連結基、及び非亜リン酸含有連結基の両方を含む、天然に存在しないヌクレオチド間連結基も含む。通常、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、本明細書に記載のように、１つ以上の亜リン酸含有ヌクレオチド間連結基を含む。他の実施形態にて、核酸阻害剤分子のヌクレオチド間連結基のうちの１つ以上は、非亜リン酸含有結合である。特定の実施形態では、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、本明細書に記載のように、１つ以上の亜リン酸含有ヌクレオチド間連結基及び１つ以上の非亜リン酸含有ヌクレオチド間連結基を含む。
【００８８】
核酸阻害剤分子の５’末端は、天然置換基（例えば、水酸基またはリン酸基）を含むことができる。特定の実施形態では、水酸基は、核酸阻害剤分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端に結合する。特定の実施形態では、リン酸基は、核酸阻害剤分子の５’末端に結合する。通常、リン酸塩は、オリゴヌクレオチド合成の前にモノマーに加えられる。他の実施形態にて、核酸阻害剤分子が、例えば細胞質Ｃｌｐ１キナーゼにより細胞質内に導入された後、５’−リン酸化は自然に達成される。いくつかの実施形態では、５’末端リン酸塩は、リン酸基（例えば、５’−モノリン酸［（ΗＯ）2（Ｏ）Ρ−Ｏ−５’］、５’−二リン酸［（ΗＯ）2（Ｏ）Ρ−Ｏ−Ρ（ΗＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’］または５’−三リン酸［（ＨＯ）2（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’］）である。
【００８９】
特定の実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子の１または２のヌクレオチドは、グルタチオン感受性部位で可逆的に修飾される。通常、グルタチオン感受性部位は、糖部位の２’−炭素に位置して、ジスルフィド架橋またはスルホニル基を含む。特定の実施形態で、グルタチオン感受性部位は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４８２３９号に記載されているように（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）、ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成法に適合する。特定の実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子の３つ以上のヌクレオチドは、グルタチオン感受性部位で可逆的に修飾される。特定の実施形態では、ヌクレオチドの大部分は、グルタチオン感受性部位で可逆的に修飾される。特定の実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子のすべてまたはほぼすべてのヌクレオチドは、グルタチオン感受性部位で可逆的に修飾される。
【００９０】
少なくとも１つのグルタチオン感受性部位は、二本鎖核酸阻害剤分子のパッセンジャー鎖またはガイド鎖の５’または３’末端ヌクレオチドに通常位置する。しかし、少なくとも１つのグルタチオン感受性部位は、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子の目的の任意のヌクレオチドに位置できる。
【００９１】
βカテニン発現を低減する方法
最適化した核酸阻害剤分子は、本明細書に記載のように、βカテニンｍＲＮＡ発現を低減する方法で使用できる。通常、βカテニンｍＲＮＡ発現を低減する方法は、本明細書に記載のように、βカテニン遺伝子の発現を低減するのに十分な量で、試料にまたはそれを必要とする対象に、最適化した核酸阻害剤分子を投与することを含む。前記方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施され得る。
【００９２】
βカテニンＲＮＡの濃度または活性は、当技術分野で現在知られるまたは後に開発される、適切な方法によって測定することができる。標的ＲＮＡ及び／または標的遺伝子の「発現」の測定のために使用される方法が、標的遺伝子及びそのコードされるＲＮＡの性質に依存し得ることは理解されるであろう。例えば、標的βカテニンＲＮＡ配列がタンパク質をコードする場合、「発現」という用語は、βカテニン遺伝子に由来するタンパク質またはβカテニンＲＮＡ／転写物を指すことができる（ゲノムまたは外因性起源）。そのような場合に、標的βカテニンＲＮＡの発現は、βカテニンＲＮＡ／転写物を直接計測することにより、またはβカテニンタンパク質の量を計測することにより測定することができる。タンパク質は、タンパク質アッセイにて、例えば染色もしくは免疫ブロットにより、またはタンパク質が計測可能な反応を触媒する場合には反応速度を計測することにより測定することができる。すべてのそのような方法は、当技術分野で既知であり、使用することができる。標的βカテニンＲＮＡ濃度が測定される場合、ＲＮＡ濃度を検出する当技術分野で承認されている方法を使用できる（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなど）。βカテニンＲＮＡを標的化する際に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで、細胞の対象、組織もしくは細胞抽出物のβカテニンＲＮＡまたはタンパク質の濃度を低下させる際の核酸阻害剤分子の有効性の測定は、例えば国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２２５１０号に開示されるように、βカテニン関連の表現型（例えば、疾患または障害（例えば、がんまたは腫瘍形成、増殖、転移、拡散など））の低減の範囲を判定するためにも使用できる。上述の測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物、または他の適切な起源の材料に対して行われ得る。
【００９３】
医薬組成物
本開示は、本明細書に記載の最適化したβカテニン核酸阻害剤分子の治療上有効な量、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００９４】
これらの医薬組成物は、従来の滅菌技術により滅菌され得る、または無菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装され得る、または凍結乾燥され得て、凍結乾燥された調剤は、投与前に滅菌水性賦形剤と混合される。調剤のｐＨは通常、３と１１の間、より好ましくは５と９の間、または６と８の間であり、最も好ましくは７と８の間（例えば、７〜７．５）である。
【００９５】
本開示の医薬組成物は、治療用途のために投与される。したがって、本開示の一態様は医薬組成物を提供し、それは、対象に本開示の医薬組成物の治療上有効な量を投与することにより、これに限定されないが、疾患または状態を患っているヒトを含む、前記対象を治療するために使用できる。通常、疾患または状態とは、本明細書に記載されているようにがんである。
【００９６】
特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象の治療のための薬剤を製造するために、本明細書に記載の医薬組成物の治療上有効な量の使用を特徴とする。通常、対象は、本明細書に記載されているように、がんがある。
【００９７】
薬学的に許容される賦形剤
本開示で有用な薬学的に許容される賦形剤は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９７５）は、１つ以上の治療用組成物の薬物送達に適した組成物及び製剤を記載する。薬学的に許容される賦形剤として機能できる材料のいくつかの例としては、糖（例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース）；デンプン（例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン）；セルロース及びその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース）；麦芽；ゼラチン；賦形剤（例えば、カカオバター及び坐薬ワックス）；油（例えば、落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油）；緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム）；（等張生理食塩水；リンゲル液）；エチルアルコール；ｐＨ緩衝溶液；ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）ならびに医薬組成物で使用される他の非中毒性適合性物質が挙げられる。
【００９８】
投与剤形
医薬組成物は、任意の意図された投与経路用に従来の賦形剤で調製されることができ、それは、通常の治療に従って選択され得る。
【００９９】
一実施形態にて、医薬組成物は、本明細書に記載されているように最適化したβカテニン核酸阻害剤分子を含み、非経口投与に適している。医薬組成物は所望により、免疫治療薬（例えば、免疫抑制チェックポイント分子の拮抗薬（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体のうちの１つ以上）または共刺激チェックポイント分子の刺激薬）を含有する。通常、オリゴヌクレオチドを含有する本開示の医薬組成物は、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による非経口投与のための液体状態で調製される。
【０１００】
非経口投与に適した剤形は通常、例えば、滅菌水溶液、生理食塩水、低分子量のアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、植物油、ゼラチン、脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル）などを含む、非経口投与用の１つ以上の好適なビヒクルを含む。非経口製剤は、糖、アルコール、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、配合物を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁化もしくは濃稠化剤を含有できる。適切な流動性は、例えば界面活性剤を用いて維持され得る。液体配合物は、滅菌注射用溶液で元に戻すことによる後の使用のために、凍結乾燥され、保存されることができる。
【０１０１】
医薬組成物は、周知の技術を使用して、局所もしくは経皮投与、直腸もしくは経膣投与、眼投与、経鼻投与、頬側投与または舌下投与を含む、他の投与経路のためにも調製され得る。
【０１０２】
送達剤
本明細書に記載されているように、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、例えばリポソーム及び脂質（例えば、米国特許第６，８１５，４３２号、同第６，５８６，４１０号、同第６，８５８，２２５号、同第７，８１１，６０２号、同第７，２４４，４４８号及び同第８、１５８，６０１号に開示されるもの）；ポリマー材料（例えば、米国特許第６，８３５，３９３号、同第７，３７４，７７８号、同第７，７３７，１０８号、同第７，７１８，１９３号、同第８，１３７，６９５号ならびに公開された米国特許出願第２０１１／０１４３４３４号、同第２０１１／０１２９９２１号、同第２０１１／０１２３６３６号、同第２０１１／０１４３４３５号、同第２０１１／０１４２９５１号、同第２０１２／００２１５１４号、同第２０１１／０２８１９３４号、同第２０１１／０２８６９５７号及び同第２００８／０１５２６６１号に開示されるもの）；カプシド、カプソイド、もしくは摂取、分配もしくは吸収を補助するための受容体標的化分子を含む、化合物の他の分子、分子構造もしくは混合物と混合される、カプセル化される、結合されるまたは会合されることができる。
【０１０３】
特定の実施形態で、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で調製される。脂質−核酸ナノ粒子は一般的に、脂質と核酸を混合して複合体を形成することで自然に形成する。所望の粒径分布に応じて、得られたナノ粒子混合物は、所望によりポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍのカットオフ）を通じて、例えばサーモバレル押出機（例えば、ＬＩＰＥＸ（登録商標）押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ））を使用して押し出され得る。治療用途の脂質ナノ粒子を調製するために、ナノ粒子の形成で使用する溶媒（例えば、エタノール）及び／または交換緩衝液を除去することが望ましい場合があり、それは、例えば透析または接線流濾過によって達成され得る。核酸干渉分子を含む脂質ナノ粒子の製造方法は、例えば、公開された米国特許出願第２０１５／０３７４８４２号及び同第２０１４／０１０７１７８号に開示されているように、当技術分野で周知である。
【０１０４】
特定の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性リポソーム及びペグ化脂質を含む、コア脂質成分を含む。ＬＮＰは、１つ以上のエンベロープ脂質（例えば、カチオン性脂質、構造脂質もしくは中性脂質、ステロール、ペグ化脂質、またはそれらの混合物）を更に含み得る。
【０１０５】
ＬＮＰで使用するカチオン性脂質は、例えば、公開された米国特許出願第２０１５／０３７４８４２号及び同第２０１４／０１０７１７８号で論じられているように、当技術分野で周知である。通常、カチオン性脂質は、生理的ｐＨで正味の正電荷を有する脂質である。特定の実施形態にて、カチオン性リポソームは、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＬ−０４８またはＤＬ−１０３である。特定の実施形態にて、構造脂質または中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣまたはＤＯＰＣである。特定の実施形態にて、ステロールはコレステロールである。特定の実施形態にて、ペグ化脂質は、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＧ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ、ＤＳＧ−ＰＥＧ２ＫまたはＤＳＧ−ＭＰＥＧである。一実施形態にて、カチオン性脂質はＤＬ−０４８であり、ペグ化脂質はＤＳＧ−ＭＰＥＧであり、１つ以上のエンベロープ脂質は、ＤＬ−１０３、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＭＰＥＧである。例えば、βカテニン核酸阻害剤分子を調製するために使用できる、脂質ナノ粒子の１つの非限定的な実施形態を示す、図５を参照のこと。
【０１０６】
特定の実施形態では、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、目的の組織にオリゴヌクレオチドを送達することに向かうリガンドに、共有結合的に接合される。多くのそのようなリガンドは、調査されてきた。例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）：７９１−８０９（２０１３）を参照のこと。例えば、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、オリゴヌクレオチドの肝臓内への直接取り込みのため、１つ以上の糖リガンド部位（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））に接合され得る。例えば、米国特許第５，９９４，５１７号、米国特許第５，５７４，１４２号、国際特許第ＷＯ２０１６／１００４０１号を参照のこと。通常、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、３つまたは４つの糖リガンド部位に接合される。使用できる他のリガンドは、マンノース−６−リン酸塩、コレステロール、葉酸塩、トランスフェリン及びガラクトースを含むが、これらに限定されない（他の特定の代表的なリガンドについては、国際特許第ＷＯ２０１２／０８９３５２号を参照のこと）。
【０１０７】
投与／治療方法
一実施形態は、本明細書に記載のように、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子の治療上有効な量を含む、医薬組成物を対象に投与することを含む、βカテニン関連疾患の治療方法に関する。特定の実施の形態にて、βカテニン関連疾患はがんである。
【０１０８】
このようながんの非限定的な例としては、胆道癌、膀胱癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、脳癌、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、化生癌、子宮頸癌、子宮頸部扁平上皮癌、直腸癌、結腸直腸癌、結腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道癌、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼内黒色腫、ブドウ膜黒色腫、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、ウィルムス腫瘍、白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝臓癌、肝癌、肝細胞腫、肝細胞癌、胆管細胞腫、肝芽腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌（ＮＰＣ）、神経芽細胞腫、中咽頭癌、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵管腺癌、偽乳頭腫瘍、腺房細胞癌、前立腺癌、前立腺腺癌、皮膚癌、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、小腸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮癌、または子宮肉腫が挙げられる。特定の実施形態では、本開示は、肝臓癌、肝癌、肝細胞腫、肝細胞癌、胆管細胞癌及び肝芽腫を治療する方法を特徴とする。治療方法の特定の実施形態で、がんは、結腸直腸癌、肝細胞癌または黒色腫である。治療方法の特定の実施形態で、がんは、黒色腫、神経芽細胞腫または腎臓癌である。
【０１０９】
特定の実施形態で、本明細書に開示される医薬組成物は、Ｗｎｔ活性化疾患または障害（例えば、がん）に関連する症状の治療または予防のために有用であり得る。他の実施形態にて、本明細書に開示される医薬組成物は、非Ｗｎｔ活性化疾患または障害（例えば、がん）に関連する症状の治療または予防のために有用であり得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態にて、がんは、活性化Ｗｎｔ／βカテニン経路と関連する。他の実施形態にて、がんは、非Ｗｎｔ活性化がんである。特定の実施形態で、対象は、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子を投与する前に、非Ｗｎｔ活性化がんであると確認されている。対象は、当業者が利用可能な任意の方法を使用して、非Ｗｎｔ活性化がんであると確認され得る。しかし、通常、対象からの試料は、対象に非Ｗｎｔ活性化がんがあるかを判定するために分析される。特定の実施形態では、試料は、組織、細胞、血液または尿を含む。特定の実施形態では、試料は、活性化Ｗｎｔ／βカテニン経路、不活性化Ｗｎｔ／βカテニン経路及び／または非Ｔ細胞炎症表現型に関連する１つ以上のバイオマーカーについて分析される。任意の好適なアッセイまたは技術を使用して、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）、タンパク質及びペプチドを含む、任意の好適はバイオマーカーを分析することができるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、バイオマーカーは、活性化Ｗｎｔ／βカテニン経路と関連する遺伝子の突然変異（例えば、βカテニンもしくはＡＰＣ、またはＷｎｔ／βカテニン経路に関連する１つ以上の他の構成成分（例えば、アキシン、ＬＥＦ及びＩＣＡＴ）をコードする遺伝子の突然変異）である。
【０１１１】
特定の実施形態で、がんの治療方法は、免疫治療薬の治療上有効な量を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、免疫治療薬は、免疫抑制チェックポイント分子の拮抗薬、または共刺激チェックポイント分子の刺激薬としてある。特定の実施形態では、免疫抑制チェックポイント分子の拮抗薬は、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはそれらの組み合わせである。
【０１１２】
特定の実施形態では、がんは、免疫治療に対する耐性があるが、免疫治療に対する耐性は、βカテニン核酸阻害剤分子（例えば、本明細書に記載の最適化したβカテニン核酸阻害剤分子）と組み合わせて免疫治療を行うことによって逆転できる。通常、免疫治療に反応しないがんは、非Ｔ細胞炎症表現型（冷たいまたは非炎症型腫瘍としても知られる）を特徴とし、腫瘍微小環境へ浸潤するＣＤ８＋Ｔ細胞がほとんどまたはまったくない。βカテニン発現を低減することは、冷たいまたは非炎症型腫瘍を熱いまたは炎症型腫瘍に変えることができ、活性化Ｗｎｔ／βカテニン経路を有しない腫瘍でも免疫治療の効果を強化できる。換言すれば、βカテニン阻害剤を免疫治療と組み合わせることによって、普通なら免疫治療に反応しない、冷たいまたは非炎症型腫瘍を治療することができる。この併用療法は、例えば、米国仮特許出願第６２／４７７，７８３号に記載されているように（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）、活性化Ｗｎｔ／βカテニン経路を備える及びそれを備えないがんを含む、多様ながんにわたって強力に腫瘍増殖をｉｎ  ｖｉｖｏ阻害することを示している。特定の実施形態にて、がんは、非Ｗｎｔ活性化がんである。特定の実施形態にて、がんは、Ｗｎｔ活性化がんである。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、がんに対する免疫治療の治療効果を増強する、またはがんが免疫治療に影響されやすくなるのに十分な量で、本明細書に記載されているように、がんを有する対象に最適化したβカテニン核酸阻害剤分子を投与することを含む、がんに対するｉｎ  ｖｉｖｏ免疫反応を増強する方法を提供する。通常、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子を投与する前に、がんは、免疫治療に対する耐性がある非Ｔ細胞炎症表現型に関連しており、修飾βカテニン核酸阻害剤分子を投与することは、非Ｔ細胞炎症表現型をＴ細胞炎症表現型に変えて、その結果、がんは免疫治療に反応するようになる。特定の実施形態では、免疫治療に耐性のあるがんは、Ｗｎｔ活性化がんである。他の実施形態にて、免疫治療に耐性のあるがんは、非Ｗｎｔ活性化がんである。
【０１１４】
投与及びスケジュール
通常、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与を介して）に投与される。他の実施形態にて、医薬組成物は、局所投与または全身投与を介して送達される。しかし、本明細書に開示される医薬組成物は、例えば頬側、舌下、直腸、経膣、尿道内、局所、眼内、鼻内及び／または耳介内を含む、当技術分野で既知の任意の方法でも投与され得て、その投与には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、水性懸濁液剤、ゲル剤、スプレー剤、坐剤、膏剤、軟膏剤などが含まれ得る。
【０１１５】
特定の実施形態では、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、２０μｇ〜１０ｍｇ／レシピエントの体重１ｋｇ／１日、１００μｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ〜５．０ｍｇ／ｋｇ、０．５〜３．０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。通常、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、約０．２５〜２．０ｍｇ／レシピエントの体重１ｋｇ／１日の投与量で投与される。
【０１１６】
本開示の医薬組成物は、毎日または断続的に投与されることができる。例えば、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子の断続的な投与は、１週間当たり１〜６日、１か月当たり１〜６日、１週間に１回、１週間おきに１回、１か月に１回、１か月おきに１回、もしくは１年当たり１〜２回、または１年間、１か月、１週間もしくは１日用量を複数に分けて投与され得る。通常、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、毎週または２週毎に投与される。いくつかの実施形態では、断続的な投与は、最初の最適化したβカテニン核酸阻害剤分子または免疫治療薬の後に、最高１週間、最高１か月、最高２か月、最高３か月もしくは最高６か月間の投与のない休薬期間が続くサイクルの投与を意味できる、またはそれは隔日、隔週、隔月または隔年の投与を意味できる。
【０１１７】
免疫治療薬と組み合わせるとき、βカテニン核酸阻害剤分子は通常、免疫治療薬とは別に、及びそれとは異なるスケジュールで投与される。免疫治療薬を含有する医薬組成物は通常、静脈内に投与される。例えば、１つの薬剤として使用するとき、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４抗体）は、合計４回の投与のために３週毎に３ｍｇ／ｋｇの推奨用量にて９０分かけて静脈内に投与される。同様に、１つの薬剤として使用するとき、ニボルマブ（抗ＰＤ−１抗体）は、２週毎に６０分かけて２４０ｍｇ（または３ｍｇ／ｋｇ）の推奨用量にて静脈内に投与される。ニボルマブをイピリムマブと併用して投与するとき、ニボルマブの推奨用量は６０分かけて静脈内に投与される１ｍｇ／ｋｇであり、それから同じ日に合計４回の投与のために３週毎に３ｍｇ／ｋｇの推奨用量でイピリムマブ、次に２週毎に２４０ｍｇの推奨用量のニボルマブが続く。
【０１１８】
特定の実施形態では、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、免疫治療薬の前に投与される。特定の実施形態では、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子は、免疫治療薬の後に投与される。特定の実施形態では、患者は、最適化したβカテニン核酸阻害剤分子による治療を開始する前に、以前治療薬で治療されていた。最適化したβカテニン核酸阻害剤分子または免疫治療薬の治療上有効な量は、投与経路及び患者の身体的な特徴（例えば、対象の大きさ及び体重、疾患の進行または浸透の範囲、対象の年齢、健康及び性別）に依存することができ、これら及び他の要因に応じて必要に応じて調整されることができる。
【実施例】
【０１１９】
実施例１：修飾βカテニン（ＢＣＡＴ）核酸阻害剤分子
βカテニン遺伝子を標的とする複数の核酸阻害剤分子は、異なる修飾パターンで作成されて、修飾パターンがどのように分子の異なる特性（例えば、免疫原性、βカテニンｍＲＮＡ発現の調節及び／またはＡｇｏ２結合）に影響を及ぼし得るかを評価した。このために、図１Ａに示すような初期世代の生成分子の右側に（すなわち、パッセンジャー鎖の３’末端及びガイド鎖の５’末端に）平滑末端を有する「非伸長の」分子と、図２Ａに示すような次世代のその５’末端で１０のヌクレオチドの一本鎖伸長を備えるガイド鎖を有する「伸長」分子と、を含む別の種類の構造の二本鎖核酸阻害剤分子を試験した。図１Ａ及び図２Ａにて、陰影のないヌクレオチドはリボースを含み、明るい陰影のヌクレオチドは２’−ＯＭｅ修飾を備えるリボースを含み、暗い陰影のヌクレオチドは２’−Ｆ修飾を備えるリボースを含み、黒枠で囲まれているヌクレオチドはデオキシリボースを含む。
【０１２０】
非伸長の核酸阻害剤分子
３つの非伸長の核酸阻害剤分子、ＮｏｎＥｘｔｅｎｄ  Ｍ１（ＮＥＸ  Ｍ１）、ＮｏｎＥｘｔｅｎｄ  Ｍ２（ＮＥＸ  Ｍ２）及びＮｏｎＥｘｔｅｎｄ  Ｍ３（ＮＥＸ  Ｍ３）が構築された。ＮＥＸ  Ｍ１は、それぞれ２５及び２７の塩基対からなるパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有する。お互いにパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、２塩基対の一本鎖で、ガイド鎖の３’末端の突出を備える、２５塩基対からなる二本鎖領域を形成する。多くの２’−ＯＭｅ修飾（明るい陰影の囲み）は、ＮＥＸ  Ｍ１のパッセンジャー鎖及びガイド鎖内に組み込まれる。パッセンジャー鎖の３’末端の最後の２つのヌクレオチドは、デオキシリボースを含む。図１Ａ。
【０１２１】
いくつかの２’−Ｆ修飾（暗い陰影の塩基）は、ＮＥＸ  Ｍ１に導入されて、ＮＥＸ  Ｍ２を生成した。塩基の修飾パターンの変化を除いて、ＮＥＸ  Ｍ２のパッセンジャー鎖及びガイド鎖のヌクレオチド配列は、ＮＥＸ  Ｍ１のそれと同じである。図１Ａ。次に、ＮｏｎＥｘｔｅｎｄ  Ｍ３（ＮＥＸ  Ｍ３）は、４つの追加の２’−Ｆ修飾をＮＥＸ  Ｍ２に加えることによって生成された。ＮＥＸ  Ｍ２及びＮＥＸ  Ｍ３のパッセンジャー鎖及びガイド鎖は、ＮＥＸ  Ｍ１と同じヌクレオチド配列、２５の塩基対の二本鎖領域及び３’突出を有し、唯一異なるのは２’−Ｆ修飾パターンである。
【０１２２】
ＮＥＸ  Ｍ１をＮＥＸ  Ｍ２またはＮＥＸ  Ｍ３構造に変えることは、図１Ａに示すように、細胞のそれらの構築物のＩＣ５０値（それぞれ０．９ｐＭ、０．８ｐＭ及び０．８ｐＭ）により示される、固有の効力に影響を及ぼさなかった。これらの配列の修飾パターンが二本鎖核酸構築物の免疫原性に影響を及ぼすかどうか決定するために、インターフェロン反応は、ヒトＰＢＭＣをＮＥＸ  Ｍ１、ＮＥＸ  Ｍ２及びＮＥＸ  Ｍ３で処理した後に測定された。ＰＢＭＣは、フィコール−Ｈｉｓｔｏｐｈａｑｕｅを使用する勾配遠心分離により、異なるドナーからのヒト血液試料から分離された。分離したＰＢＭＣは、異なる期間、ＤＯＴＡＰ（リポソーム型トランスフェクション試薬及び免疫アジュバント）を混合した二本鎖核酸構築物で処理されて、ＩＦ１Ｔ１誘導（インターフェロン誘導遺伝子）は、固相ｃＤＮＡ合成により、その後定量的ＰＣＲで監視した。Ｂｃｌ２遺伝子を標的とする非修飾二本鎖核酸阻害剤分子（２１のヌクレオチドの長さ）が、ＤＯＴＡＰ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）と混合されて、この実験の参照として使用された。ＮＥＸ  Ｍ２が中程度の上昇を示すと共に、ＮＥＸ  Ｍ１はＩＦ１Ｔ１の有意な上昇を示した。一方でＮＥＸ  Ｍ３は、ＮＥＸ  Ｍ１及びＮＥＸ  Ｍ２と比較してまったく動きがなく、ＮＥＸ  Ｍ３の２’−ＯＭｅ及び２’−Ｆ修飾の特定の組み合わせが、ヒトＰＢＭＣのＮＥＸ  Ｍ３により誘発されるインターフェロン反応を実質的に低減させたことを示唆した（図１Ｂ）。
【０１２３】
伸長した核酸阻害剤分子
次世代の伸長した二本鎖核酸構築物は、ガイド鎖の５’末端に１０の塩基対一本鎖突出を加えることにより生成された。この１０の塩基対一本鎖突出は、２’−ＯＭｅ及び２’−Ｆ修飾も含む。余分なＣ／Ｇ塩基対も、図２Ａに示すように、１０の塩基対一本鎖突出の前に、二本鎖の右側に組み込まれた。余分なＣ／Ｇ塩基対及び１０の塩基対の伸長のＮＥＸ  Ｍ１、ＮＥＸ  Ｍ２及びＮＥＸ  Ｍ３構築物への取り込みは、図２Ａに示すように、それぞれＥＸ  Ｍ１、ＥＸ  Ｍ２及びＥＸ  Ｍ３構築物を生成した。
【０１２４】
ＥＸ  Ｍ１の固有の効力はわずかに影響を受けたが、取り込みは、図２ＡのＩＣ５０値で示すように、ＥＸ  Ｍ２及びＥＸ  Ｍ３の効力に実質的に影響を及ぼさなかった。ヒトＰＢＭＣのＥＸ  Ｍ１、ＥＸ  Ｍ２及びＥＸ  Ｍ３のインターフェロン反応は、実施例２で上述したとおりに測定された。非伸長構築物で観察される傾向と同様に、免疫刺激が低減する傾向は、ＥＸ  Ｍ１からＥＸ  Ｍ２、ＥＸ  Ｍ３まで観察され（図２Ｂ）、それは、伸長二本鎖核酸構築物への２’−ＯＭｅ及び２’−Ｆ修飾の特定の組み合わせがインターフェロン反応を低減することを示唆した。
【０１２５】
実施例２：選択したＢＣＡＴ構築部の更なる評価
４人のドナーからのヒトＰＢＭＣのインターフェロン反応（上述したようにＩＦ１Ｔ１誘導で測定）に関して、最小のインターフェロン反応（ＮＥＸ  Ｍ３）を有する非伸長構築物を、最小のインターフェロン反応（ＥＸ  Ｍ３）を有する伸長構築物と比較した。ＮＥＸ  Ｍ１も比較に含まれた。
【０１２６】
ＮＥＸ  Ｍ３及びＥＸ  Ｍ３は、４つのすべてのドナーＰＢＭＣで基本的にインターフェロン反応を示さなかったが、一方で、ＮＥＸ  Ｍ１は、ドナー１、ドナー２及びドナー４からのＰＭＢＣで処理したとき、中程度のインターフェロン反応を示し、過敏性ドナー３からのＰＭＢＣで処理したとき、かなりのインターフェロン反応を示した（図３Ａ）。したがって、ＮＥＸ  Ｍ３及びＥＸ  Ｍ３の２’−ＯＭｅならびに２’−Ｆ修飾の特定の組み合わせは、ヒトＰＢＭＣのこれらの核酸構築物によって生じるインターフェロン反応をうまく減少させた。
【０１２７】
実施例３：腫瘍のβカテニン（ＣＴＮＮＢ１）ｍＲＮＡノックダウン
修飾パターンがどのように腫瘍の標的結合に影響するか見るために、ＮＥＸ  Ｍ１、ＮＥＸ  Ｍ３及びＥＸ  Ｍ３構築物は、ＥｎＣｏｒｅ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で調製されて、活性について試験した。ＬＮＰ中に調製された核酸は、腫瘍を保有するマウスの異なる時点で評価された。腫瘍を生成するために、生後６〜８週間のＨｓｄ：胸腺欠損ヌードマウス−Ｆｏｘｎ１nuマウスに、右肩下にＬＳ４１１Ｎ（５×１０6細胞）を皮下注射した。腫瘍容積は、腫瘍増殖を監視するために、２〜３日毎に測定した。腫瘍が２００〜２５０ｍｍ3に到達したとき、動物は無作為に選ばれて、異なるコホートに割り当てられて、図３Ｂに列挙されるように、異なる二本鎖核酸阻害剤分子構築物を有するＬＮＰを注射された。ＬＮＰは、総量１０ｍｌ／ｋｇで側尾静脈を介して静脈内に投与された。腫瘍試料は、投与の２４時間及び１２０時間後に収集されて、ｍＲＮＡ分析を受けた。ＥＸ  Ｍ３は、ＮＥＸ  Ｍ３と比較したとき、わずかに良好な効力を示したが、投与の２４時間後に、ＮＥＸ  Ｍ１と類似の効力を有した（図３Ｂ）。しかし、ＥＸ  Ｍ３は、ＮＥＸ  Ｍ１と比較して投与の１２０時間後に改善した効力を示したが、ＮＥＸ  Ｍ３と類似の効力を有した。インターフェロン反応及び効力及び期間効果に基づいて、ＥＸ  Ｍ３は、更なる特性決定のために選択された。
【０１２８】
実施例４：ＮＥＸ  Ｍ１をＥＸ  Ｍ３と比較する
ＥＸ  Ｍ３の特性は、それを初期世代ＮＥＸ  Ｍ１と比較することによって、更に評価した。この増加した効力に関して可能性がある機構を検討するために、腫瘍ホモジネートの各構築物の曝露レベル及びＡｇｏ２結合（ＲＩＳＣ取り込み）レベルも比較した。ＥＸ  Ｍ３（アンチセンス鎖）は、３日間（腫瘍移植の１４日、１５日及び１６日後）、３ｍｇ／ｋｇでＬＳ４１１Ｎ腫瘍保有マウスを処置した後、ＮＥＸ  Ｍ１より約５〜１００倍高いレベルで腫瘍移植の１６日後の腫瘍組織で検出された（図４Ａ）。更にＥＸ  Ｍ３（アンチセンス鎖）は、３日間（腫瘍移植後の１４日目、１５日目及び１６日目）、３ｍｇ／ｋｇでＬＳ４１１Ｎ腫瘍保有マウスを処置した後、腫瘍移植後の１６日目に、ＮＥＸ  Ｍ１より約５〜１０倍高いＡｇｏ２結合／ＲＩＳＣ負荷を示し（図４Ｂ）、ＥＸ  Ｍ３が初期世代ＮＥＸ  Ｍ１より安定して活性であるらしいことを示した。
【０１２９】
ＥＸ  Ｍ３の改善した特性が抗腫瘍効力に転換されたかどうか見るために、ＳＷ４０３腫瘍保有マウスは、１日１回×３、３ｍｇ／ｋｇ投与量（２サイクル）で、プレセボ及びＰＢＳと共にＬＮＰ調製したＮＥＸ  Ｍ１またはＥＸ  Ｍ３で処置した。週２回の投与サイクル（１日１回×３、３ｍｇ／ｋｇ）の後、ＮＥＸ  Ｍ１は、ビヒクル処置した動物と比べて約５５％の腫瘍増殖の抑制を誘導したが、ＥＸ  Ｍ３は８０％以上の増殖の抑制を誘導した（図４Ｃ）。試験終了後、腫瘍は更に、βカテニンタンパク質を染色した。図４Ｄに示すように、ＮＥＸ  Ｍ１処置した腫瘍と比較して、ＥＸ  Ｍ３処置した腫瘍からβカテニンタンパク質濃度に相当な減少があり、ＥＸ  Ｍ３構築物により生じる改善した効力及び期間が、ＥＸ  Ｍ３処置した腫瘍の増加した抗腫瘍効力をもたらすことを示唆した。
【０１３０】
実施例５：Ｗｎｔ活性化４Ｔ１腫瘍のβカテニンを阻害する
Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、４Ｔ１腫瘍を移植した。平均腫瘍サイズ１５０〜２００ｍｍ3の４Ｔ１腫瘍細胞移植の６日後に、マウスは、図７Ａに示すように、２つの群に選別されて、移植後６日目及び７日目及び１２日目及び１３日目に３ｍｇ／ｋｇでプラセボまたはＥＸ  Ｍ３で処置した。最終投与の４８時間後に、腫瘍は採取されて、βカテニン、ＣＤ８及びＩＤＯ１タンパク質濃度に関して免疫組織化学によりアッセイされた。図７Ｂに示すように、ＥＸ  Ｍ３処置はβカテニン濃度を低下させて、ＣＤ８濃度を上昇させたが、処置の２巡後、ＩＤＯ１レベルを著しくは低下させなかった。
【０１３１】
別の試験で、４Ｔ１腫瘍細胞がＢａｌｂ／Ｃマウスに移植され、移植の４日後にマウスは２つの群に無作為に組み込まれて、プラセボまたはＥＸ  Ｍ３で処置した。マウスは、図７Ｃに示すように、４日目及び５日目に、３ｍｇ／ｋｇのプラセボまたはＥＸ  Ｍ３の２つの投与を施された。それからこの組み合わせ投与サイクルは、９日目及び１０日目に繰り返された。腫瘍増殖は、処置期間にわたって腫瘍サイズを測定することによって監視された。ＥＸ  Ｍ３だけでマウスを処理することは、約４０％の腫瘍増殖の抑制になった。図７Ｃ。
【０１３２】
別の類似の試験で、４Ｔ１腫瘍保有マウスは、図８Ａに示すように、移植後６日目及び７日目及び１２日目及び１３日目に３ｍｇ／ｋｇでＰＢＳまたはＥＸ  Ｍ３で処置した。腫瘍は、最終投与の２４時間後に採取されて、フローサイトメトリーを受けて、抽出した腫瘍から調製される単細胞懸濁液の表面マーカーを測定した。ＰＢＳ対照では腫瘍免疫微小環境に著しい効果はなかったが、ＥＸ  Ｍ３処置は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８）及び複数のチェックポイント（ＰＤ−１、ＬＡＧ−３及びＴｉｍ−３）の著しい増加をもたらした。図８Ｂ。Ｍ３処置は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を著しく増加させて、それは、免疫系の他の細胞を調整するまたは抑制する際に重要な役割を果たす。図８Ｂ。免疫抑制ＭＤＳＣ細胞で、効果は観察されなかった。図８Ｂ。
【０１３３】
実施例６：Ｗｎｔ活性化４Ｔ１腫瘍のＩＤＯ１を阻害する
別の有効性試験は、ＩＤＯ１阻害剤（エパカドスタット（ＩＤＯｉ））で、４Ｔ１腫瘍に実施された。４Ｔ１腫瘍保有マウスは、図９Ａに示すように、２つの群に無作為に組み込まれて、移植後６日目及び８日目に、１投与量当たり１００ｍｇ／ｋｇで、経口でビヒクルまたはＩＤＯｉを１日２回処置した。腫瘍は、最終投与の４８時間後に採取されて、免疫組織化学下に置かれて、βカテニン、ＣＤ８及びＩＤＯ１濃度を調べた。１００ｍｇ／ｋｇのＩＤＯｉは、ほぼ完全にＩＤＯ１濃度を低下させた。図９Ｂ。βカテニン濃度はやや低下して、ＣＤ８濃度はわずかに増加した。図９Ｂ。関連試験で、４Ｔ１腫瘍保有マウスは、図９Ｃに示すように、移植後６日目及び８日目に、１日当たり１００ｍｇ／ｋｇのプラセボまたはＩＤＯｉを１日２回投与した。腫瘍増殖は、処置期間にわたって腫瘍サイズを測定することによって監視された。ＩＤＯｉだけで処置したマウスは腫瘍増殖の抑制になり、βカテニンに加えて、４Ｔ１腫瘍が腫瘍増殖に関してＩＤＯ１にも依存することを示唆した。図９Ｃ。
【０１３４】
実施例７：βカテニン阻害及び／またはチェックポイント阻害剤と組み合わせてＷｎｔ活性化４Ｔ１腫瘍のＩＤＯ１を抑制する
次に、ＥＸ  Ｍ３及びＩＤＯｉ、またはＥＸ  Ｍ３及びチェックポイント阻害剤（抗ＰＤ−１抗体）による４Ｔ１腫瘍の併用療法、またはＥＸ  Ｍ３、ＩＤＯ１及び抗ＰＤ−１抗体による３つの併用療法を、評価した。４Ｔ１腫瘍保有マウスは８つの群に選別されれて（ｎ＝５）、図１０Ｃで示すように、移植後４日目及び６日目にＩＤＯｉ（１投与当たり１００ｍｇ／ｋｇを経口で）で、移植後５日目及び６日目にＥＸ  Ｍ３またはプラセボ（１投与当たり３ｍｇ／ｋｇを静脈内に）で、それから移植後７日目及び８日目に抗ＰＤ−１抗体（１投与当たり５ｍｇ／ｋｇを腹腔内に）で、１日２回前処理された。マウスは更に、１つの薬剤（図１０Ａ）及び２つの薬剤の組み合わせとして、ＥＸ  Ｍ３、ＩＤＯｉ及びＰＤ−１抗体を受けた単剤治療としてＥＸ  Ｍ３、ＩＤＯｉまたは抗ＰＤ１抗体を受けたマウスは、中程度の抗腫瘍効力を示した。図１０Ａ。ＥＸ  Ｍ３及び抗ＰＤ−１抗体、またはＥＸ  Ｍ３及びＩＤＯｉによる併用療法を受けたマウスは、腫瘍の増殖停止を示し、腫瘍増殖の速度が低下した。図１０Ｂ。注目すべきことに、３つのすべての薬剤（ＥＸ  Ｍ３、ＩＤＯｉ及び抗ＰＤ−１抗体）で処置したマウスは、図１０Ｃに示すように腫瘍退縮を示し、３つのすべての薬剤の投与後、腫瘍容積の著しい低減が始まる。特に、図１０Ｃに示すように、ＥＸ  Ｍ３、エパカドスタット（ＩＤＯｉ）及び抗ＰＤ−１抗体の３つの組み合わせの抗腫瘍効果は、エパカドスタット（ＩＤＯｉ）及び抗ＰＤ−１の２つの組み合わせによって観察される効果より著しく優れており、それは現在、第ＩＩＩ相試験で評価されている。
【０１３５】
試験の終了時（最後の抗ＰＤ−１抗体処置の７２時間後）に、腫瘍は採取されて、定量的ＰＣＲを受けて、特定のＴ細胞マーカーを分析した。他の群と比較して、３つの併用療法を受けたマウスで観察されるＣＤ８  ｍＲＮＡでかなりの増加があった。図１１Ａ。ＦｏｘＰ３は、Ｔｒｅｇと呼ばれている免疫抑制性Ｔ細胞のマーカーである。Ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡ濃度は、抗ＰＤ−１抗体がプラセボまたはＥＸ  Ｍ３処置に加えられるとき、増加した。図１１Ｂ。これらの濃度は、ＩＤＯｉの追加でバックグラウンド濃度に戻った。図１１Ｂ。いかなる理論にも束縛されるものではないが、これらのｍＲＮＡデータは、ＥＸ  Ｍ３、ＩＤＯｉ及び抗ＰＤ−１抗体の３つの組み合わせが、ＣＤ８  Ｔ細胞のかなりの増加及び免疫抑制Ｔｒｅｇの濃度の低減をもたらし、４Ｔ１腫瘍微小環境中のＴ細胞群のこれらの変化が、観察された腫瘍退縮に関与している可能性が高いことを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−１】
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【図８Ｂ−２】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021500026.tif 000024