(57)【要約】【課題】成熟ＭＳＬＮは、他の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と同様に、酵素的切断によって細胞表面から流出されることが知られている。【解決手段】本出願は、メソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する抗体分子に関する。この抗体分子は、癌などの疾患及び障害の治療及び診断に利用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する抗体分子であって、当該抗体分子の抗原結合部位が、抗体：
（ｉ）配列番号９８、７３、９９、２０、２１及び４４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−２７１；
（ｉｉ）配列番号１０、１１、４１、２０、２１及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５２；
（ｉｉｉ）配列番号９８、７３、９９、２０、２１及び３４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２１；
（ｉｖ）配列番号９８、７３、９９、２０、２１及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１２；
（ｖ）配列番号１０１、７３、１０３、２０、２１及び３４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２３；
（ｖｉ）配列番号９８、７３、９９、２０、２１及び４３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２４；
（ｖｉｉ）配列番号１０１、７３、１０３、２０、２１及び４３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２６；
（ｖｉｉｉ）配列番号９８、７３、９９、２０、２１及び４４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２７；
（ｉｘ）配列番号８５、７３、７５、２０、２１及び３４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００１；
（ｘ）配列番号８５、７３、７５、２０、２１及び４３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００５；
（ｘｉ）配列番号１１１、７３、１１３、２０、２１及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１４；
（ｘｉｉ）配列番号１０１、７３、１０３、２０、２１及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１８；
（ｘｉｉｉ）配列番号７１、７３、７５、２０、２１及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６；
（ｘｉｖ）配列番号１０、１１、３２、２０、２１及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５１；
（ｘｖ）配列番号１０、１１、５１、２０、２１及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５３；又は
（ｘｖｉ）配列番号１０、１１、１２、２０、２１及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４
の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜６を含み；
前記ＣＤＲ配列が、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従って定義される、抗体分子。
【請求項２】
抗体：
（ｉ）配列番号１８０及び５６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−２７１；
（ｉｉ）配列番号３９及び１８にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５２；
（ｉｉｉ）配列番号１０９及び９３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２１；
（ｉｖ）配列番号１０９及び７９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１２；
（ｖ）配列番号１２１及び９３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２３；
（ｖｉ）配列番号１０９及び５３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２４；
（ｖｉｉ）配列番号１２１及び５３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２６；
（ｖｉｉｉ）配列番号１０９及び５６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２７；
（ｉｘ）配列番号６３及び９３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００１；
（ｘ）配列番号６３及び５３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００５；
（ｘｉ）配列番号１１５及び７９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１４；
（ｘｉｉ）配列番号１２１及び７９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１８；
（ｘｉｉｉ）配列番号６９及び７９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６；
（ｘｉｖ）配列番号３０及び１８にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５１；
（ｘｖｖ）配列番号４９及び１８にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５３；又は
（ｘｖｉ）配列番号８及び１８にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４
のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３】
前記抗体分子の前記抗原結合部位が、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１のＣＤＲ１〜６及び／又はＶＨ及びＶＬドメインを含む、請求項１又は２に記載の抗体分子。
【請求項４】
前記抗体分子の前記抗原結合部位が、抗体ＦＳ２８−０２４−０５２のＣＤＲ１〜６及び／又はＶＨ及びＶＬドメインを含む、請求項１又は２に記載の抗体分子。
【請求項５】
多重特異的抗体分子であり、且つ第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項６】
前記第２の抗原結合部位が、前記抗体分子の定常ドメイン中に位置する、請求項５に記載の抗体分子。
【請求項７】
前記定常ドメインが、ＣＨ３ドメインである、請求項６に記載の抗体分子。
【請求項８】
前記第２の抗原結合部位が、免疫細胞抗原に結合する、請求項５から７のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項９】
前記免疫細胞抗原が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである、請求項８に記載の抗体分子。
【請求項１０】
前記ＴＮＦＲＳＦの前記メンバーが、ＣＤ１３７である、請求項９に記載の抗体分子。
【請求項１１】
前記第２の抗原結合部位が、第１の配列、第２の配列及び／又は第３の配列を含み、
前記第１の配列、第２の配列及び第３の配列が、それぞれ前記定常ドメインのＡＢ構造ループ、ＣＤ構造ループ及びＥＦ構造ループ中に位置する、請求項６から１０のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１２】
ＭＳＬＮの存在下で免疫細胞を活性化することが可能である、請求項８から１１のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１３】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞又は樹状細胞（ＤＣ）である、請求項１２に記載の抗体分子。
【請求項１４】
１つ以上のＦｃγ受容体への前記抗体分子のＣＨ２ドメインの結合を低減又は抑制するように修飾されている、請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１５】
１つ以上のＦｃγ受容体に結合しない、請求項１４に記載の抗体分子。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の抗体分子と、生物活性分子と、を含むコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の抗体分子をコードする１つ又は複数の核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む１つ又は複数のベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載の核酸分子又は請求項１８に記載のベクターを含む組み換え宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の抗体分子を産生する方法であって、前記抗体分子の産生のための条件下において、請求項１９に記載の組み換え宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項２１】
請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗体分子又はコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項２２】
個体における癌を治療する方法に使用するための、請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗体分子又はコンジュゲート。
【請求項２３】
個体における癌を検出又は診断する方法であって、請求項１から１５のいずれか１項に記載の抗体分子の使用を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、メソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する抗体分子に関する。この抗体分子は、癌などの疾患及び障害の治療及び診断に利用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＭＳＬＮは、健康な個体の胸膜、腹膜及び心膜の内側を覆っている中皮細胞において比較的低いレベルで発現される（Hassan et al., 2005）が、中皮腫、扁平上皮癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌及び卵巣癌を含むいくつかの様々な癌において高度に発現される。メソテリンの通常の生物学的機能は、不明である。癌に関して、ＭＳＬＮの高い発現レベルは、卵巣癌、胆管癌、肺腺癌及びトリプルネガティブ乳癌における予後不良と相関しているとされてきた。腫瘍細胞における高い発現と比べた正常細胞におけるＭＳＬＮの限られた発現のため、ＭＳＬＮは、モノクローナル抗体を用いた魅力的な治療標的である（Hassan et al., 2016）。
【０００３】
ＭＳＬＮは、６９−ｋＤａ前駆体タンパク質（６２８アミノ酸）として発現される。次に、前駆体タンパク質は、エンドプロテアーゼフリンによって切断されて、巨核球増強因子（ＭＰＦ）と呼ばれる分泌されるＮ末端領域を放出する一方、４０−ｋＤａタンパク質成熟ＭＳＬＮは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）リンカーを介して細胞膜に結合されたままである。ヒトＭＳＬＮは、ＭＳＬＮのマウス及びカニクイザルオルソログとそれぞれ６０％及び８７％のアミノ酸同一性を共有する。
【０００４】
膜結合型の成熟ＭＳＬＮは、膜アンカー配列を欠く変異体を生成することによる選択的スプライシング又は腫瘍壊死因子α変換酵素（ＴＡＣＥ）によるプロテアーゼ切断の結果として細胞から流出される（Sapede et al., 2008、Zhang et al., 2011）。可溶性の流出されるＭＳＬＮは、患者の血清中及び悪性中皮腫、卵巣癌又は高転移性癌を含む腫瘍の間質中に見られる。中皮腫患者の血液及び滲出液中の可溶性ＭＳＬＮレベルを測定することは、治療に対する患者の応答及び進行を監視するためにＵＳ  ＦＤＡによって認められている（Hollevoet et al., 2012、Creany et al., 2015）。
【０００５】
ＭＳＬＮを標的とするいくつかの抗体ベースの治療法が開発され、主に中皮腫、膵臓癌及び非小細胞肺癌における臨床試験において試験された（Hassan et al., 2016）。用いられる手法は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を有するアマツキシマブなどの抗ＭＳＬＮ抗体の使用並びに毒素にコンジュゲートされた抗体又は抗体断片を含む、ＳＳ１Ｐ−ＰＥ３８及びアネツマブ・ラブタンシンなどの抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の使用による直接の腫瘍細胞殺滅を含む。さらに、抗ＭＳＬＮ結合Ｆｖ断片は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法に使用されており、ＡＢＢＶ−４２８などの二重特異的抗体が前臨床試験から臨床試験に入っている。
【０００６】
アマツキシマブは、ＭＳＬＮ−ＭＵＣ１６相互作用をブロックし、且つＡＤＣＣ機能に依存して腫瘍細胞を取り除くマウスキメラＩｇＧ１  κ  ｍＡｂである。第Ｉ相試験は、良好な安全性プロフィールを示したが、化学療法（ゲムシタビン又はペメトレキセド／シスプラチン）と組み合わされる場合、臨床的有効性が限られ、悪性中皮腫における無増悪生存率の最小の改善を有するか／改善を有さず（ＮＣＴ００７３８５８２、Hassan et al., 2014）、膵臓癌において比較アームと比較して全奏効を有さなかった（ＮＣＴ００５７０７１３）。ＳＳ１−ＰＥ−３８は、タンパク質合成阻害剤ＰＥ３８に結合された、アマツキシマブ中に存在する抗ＭＳＬＮ  ｓｃＦｖを含有する組み換え免疫毒素である。第Ｉ相試験において観察される高い抗腫瘍活性（化学療法、ＮＣＴ０１４４５３９２と組み合わせた場合に７７％の部分奏効）にもかかわらず、ＳＳ１Ｐの臨床用途は、免疫原性及び用量制限血管漏出症候群によって制限される。インビトロでの低下した免疫原性を有するＳＳ１Ｐ−ＰＥ３８の最適化形態であるＬＭＢ−１００は、第Ｉ及びＩＩ相試験において、単独で及び化学療法（ＮＣＴ０２７９８５３６、ＮＣＴ０２８１０４１８）と組み合わせて現在試験中である。
【０００７】
抗ＭＳＬＮの標的化は、細胞傷害性薬物を腫瘍細胞に送達するのに使用されることが多い。抗有糸分裂剤ＤＭ４に共有結合される完全ヒトＩｇＧ１であるアネツマブ・ラブタンシンは、卵巣癌、原発性腹膜癌、卵管癌及び進行した類上皮型の腹膜優位の中皮腫（ＮＣＴ０１４３９１５２）に関する第Ｉ相試験において３１％の全奏効率（ＯＲＲ）を示した。中皮腫において、アネツマブ・ラブタンシンは、化学療法（ＮＣＴ０２６３９０９１）の標準的な投与と組み合わせて５０％のＯＲＲを示した。別のＡＤＣ抗体薬物、ＲＧ７６００と同様に、アネツマブ・ラブタンシンは、忍容可能な安全性プロフィールを示したが、用量制限毒性は、それぞれのＡＤＣ部分について報告されるものと一致してこれらの試験で観察された。これまで、ＢＭＳ８６１４８からの第Ｉ相データは、依然として入手可能でない。
【０００８】
要約すると、ＭＳＬＮを標的とする非コンジュゲート抗体は、有利な安全性プロフィールを示したが、それらの治療効果が限られている一方、ＡＤＣは、より強力な抗腫瘍活性を示したが、用量制限毒性を伴っていた。安全性に関して、ＡＤＣは、免疫毒素療法より広い治療域を有する可能性がある（Zhao et al., 2016）。いくつかのこれらの抗体ベースのＭＳＬＮ治療法では、治療法を化学療法又はＰＤ−１若しくはＰＤ−Ｌ１などの免疫チェックポイント阻害剤のいずれかと組み合わせた第ＩＩ相臨床試験が進行中である。ＭＳＬＮを標的とするＡＢＢＶ−４２８並びに共刺激タンパク質ＣＤ４０、ＭＳＬＮ−ＣＤ３二重特異的Ｔ細胞エンゲージャ（ＢＩＴＥ）及びＭＳＬＮ−ＣＤ４７二重特異的分子を含む、免疫系に関与することが意図されたいくつかの二重特異的分子も開発中である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の記述
上記に説明されるように、成熟ＭＳＬＮは、他の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と同様に、酵素的切断によって細胞表面から流出されることが知られている。次に、ＭＳＬＮの流出される／可溶性部分は、腫瘍部位から取り除かれる。流出される／可溶性部分は、治療薬のためのシンクとして機能し得、治療薬が腫瘍に結合する前に腫瘍部位から治療薬を取り除くため、これは、ＭＳＬＮを標的とする治療薬にとって課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、溶液中のＭＳＬＮより固定されたＭＳＬＮに高い親和性で結合する抗体分子を単離するために幅広い選択プログラムを行った。
【００１１】
本明細書において言及される「親和性」は、ＫＤによって測定される抗体分子とその同種抗原との間の結合相互作用の強さを指し得る。当業者に容易に明らかになるであろうように、抗体分子が抗原と複数の結合相互作用を形成することが可能である場合（例えば、抗体分子が抗原に２価的に結合することが可能である、任意選択的に抗原が二量体である場合）、ＫＤによって測定される親和性は、結合力によっても影響され得、それにより、結合力は、抗体−抗原複合体の全体的な強さを指す。
【００１２】
具体的には、本発明の抗体分子は、溶液中のＭＳＬＮに関する場合であると予想される、ＭＳＬＮがモノマー形態である場合より、抗原の複数のコピーが表面において固定される場合のように、抗体が２つのＭＳＬＮ分子に結合することが可能である場合、高い結合力でＭＳＬＮに結合し、したがってより強くＭＳＬＮに結合すると考えられる。したがって、理論に制約されることを望むものではないが、本発明の抗体分子は、モノマーＭＳＬＮに対する抗体の低い親和性のため、インビボで溶液中の流出されるＭＳＬＮに結合されたままにならないことから、腫瘍部位から急速に取り除かれず、したがって腫瘍細胞の表面にＭＳＬＮを結合することにより、それらの治療効果をより長く発揮することになると考えられる。膜結合ＭＳＬＮの優先的な標的化が以前に報告されているが、その分子は、本発明者らによって用いられるものと異なる手法を用いて単離された。具体的には、ＭＳＬＮの異なる領域を標的とする分子の単離による膜結合ＭＳＬＮの優先的な標的化が報告されている（Asgarov et al., 2017；Tang et al., 2013）。例えば、ＣＤＣ活性を促進するために、細胞膜に近いエピトープを標的とする、ヒトＦｃ、ＳＤ１−Ｆｃに融合された単一ドメイン（ＶＨドメインのみ）抗体が報告されている（Tang et al., 2013）。しかしながら、このようなエピトープが様々な癌の状況にどのように曝されるかは、不明である。さらに、ＭＳＬＮ−ＣＤ３二重特異的Ｔ細胞エンゲージャ（ＢＩＴＥ）は、細胞結合ＭＳＬＮに優先的に結合することも報告されている。しかしながら、これらの分子のいずれも、完全ＩｇＧ分子でなく、いずれも（ＳＤ１−Ｆｃ中のＶＨドメイン又はＢＩＴＥのｓｃＦｖを介した）標的への１価結合を有するため、ＭＳＬＮに２価的に結合することが可能でない。
【００１３】
本発明者らによって単離される抗体分子は、ＭＳＬＮにおける様々なエピトープ／領域に結合する。これは、抗体分子の一部がＭＳＬＮへのリガンドＭＵＣ１６の結合をブロックすることが可能である一方、他の抗体分子が可能でないことから明らかである。ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６をブロックすることは、ＭＵＣ１６発現癌細胞の、胸膜及び腹膜におけるＭＳＬＮ発現表面への転移を阻害するのに有利であると考えられる（Chen et al., 2013）。細胞膜により近い他の結合領域は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を促進する可能性がある。
【００１４】
本発明の抗ＭＳＬＮ抗体分子は、ＡＤＣＣ活性を有することが示されており、したがって癌治療に利用されると予想される。具体的には、抗体分子は、細胞表面にＭＳＬＮを含む腫瘍細胞を標的とし、ＡＤＣＣを介して腫瘍細胞の殺滅を媒介することが可能であることが示された。
【００１５】
本発明の抗体分子は、本発明の抗体分子及び毒素などの生物活性分子を含むＡＤＣを調製するのに有用でもあり得る。このような分子は、腫瘍細胞への生物活性分子の標的化された送達により、細胞表面にＭＳＬＮを含む癌の治療に利用されるとも予想される。
【００１６】
本発明者らは、本発明の抗ＭＳＬＮ抗体が、ＭＳＬＮに加えて第２の抗原に結合する多重特異的、例えば二重特異的分子を調製するのに使用され得ることを認識した。好ましくは、多重特異的分子は、第２の抗原に２価的に結合する。特に、本発明者らは、第２の抗原に２価的に結合することが可能である抗体分子のＣＨ３ドメインのそれぞれにさらなる抗原結合部位を含む抗ＭＳＬＮ抗体分子を調製した。
【００１７】
抗体分子によって結合される第２の抗原は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーなどの免疫細胞抗原であり得る。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体は、活性化のためにクラスター化を必要とする。具体的には、ＴＮＦ受容体リガンドのその受容体への最初のライゲーションは、ＴＮＦ受容体の三量体化、続いて受容体のクラスター化、ＮＦｋＢ細胞内シグナル伝達経路の活性化及びその後の免疫細胞活性化をもたらす一連の事象を開始させる。したがって、ＴＮＦＲ受容体を効率的に活性化する治療剤のために、いくつかのＴＮＦ受容体モノマーは、三量体リガンドを模倣する方法で一緒に架橋される必要がある。多くの抗ＴＮＦ受容体アゴニスト抗体は、それらのアゴニスト活性のためにＦｃγ受容体による架橋を必要とするか、又は架橋の非存在下でアゴニスト活性を示す。いずれの場合も、Ｆｃγ受容体は、ヒトの全身にわたって見られるため、抗体のアゴニスト活性は、特定の部位に限定されない。
【００１８】
免疫細胞抗原のための定常ドメイン結合部位を含む二重特異的抗ＭＳＬＮ抗体分子は、従来の抗体分子によって必要とされる例えばＦｃγ受容体媒介性架橋を必要とすることなく、ＭＳＬＮの存在下において、コンディショナルで免疫細胞抗原を活性化することが可能であると予想される。ＭＳＬＮへの抗体分子の結合がＭＳＬＮの部位における抗体分子の架橋を引き起こし、これは、したがって、免疫細胞表面における免疫細胞抗原のクラスター化及び活性化をもたらすと考えられる。したがって、抗体分子のアゴニスト活性は、存在している免疫細胞抗原及びＭＳＬＮの両方に依存していると予想される。換言すると、アゴニスト活性は、コンディショナルであると予想される。さらに、ＭＳＬＮの存在下における抗体の架橋は、抗体分子の定常ドメイン抗原結合部位を介して結合される免疫細胞抗原のクラスター化を促進すると考えられる。したがって、ＭＳＬＮが腫瘍抗原である際、抗体分子は、例えば、腫瘍微小環境中において、疾患に依存して免疫細胞を活性化することが可能であると予想される。免疫細胞のこの標的化された活性化は、オフターゲットの副作用を回避するのに有益であると予想される。本発明者らは、抗ＭＳＬＮ及び抗ＣＤ１３７結合部位を含む二重特異的抗体分子がマウス腫瘍モデルにおいてＦｃγ受容体結合の非存在下で腫瘍成長を阻害し、生存期間を延長することが可能であったことを示した。
【００１９】
抗ＭＳＬＮ  Ｆａｂ及び第２の抗原に特異的なＣＨ３ドメイン結合部位を含む抗体分子は、ＭＳＬＮ及び第２の抗原の両方に２価的に結合する。第２の抗原が免疫細胞抗原である場合、両方の標的の２価結合は、免疫細胞抗原を発現する免疫細胞とＭＳＬＮとの間の架橋をより安定させ、それにより免疫細胞が腫瘍微小環境などの特定の部位に限局され、疾患、例えば腫瘍に作用し得る時間を延長することが予想される。これは、ヘテロ二量体であり、１つのＦａｂアームを介して１価的に各標的抗原に結合する従来の二重特異的抗体フォーマットの大部分と異なる。このような１価相互作用は、より不安定であるだけでなく、多くの場合、第一にＴＮＦ受容体などの免疫細胞抗原のクラスター化を誘発するのに不十分であることが予想される。
【００２０】
第２の抗原に特異的なＣＨ３ドメイン結合部位を含む本発明の抗ＭＳＬＮ抗体分子のさらなる特徴は、ＭＳＬＮ及び第２の抗原のための２つの抗原結合部位が両方とも抗体構造自体の中に含まれることである。特に、抗体分子は、その標的の両方に２価的に結合する分子をもたらすために、他のタンパク質がリンカー又は他の手段を介して抗体分子に融合される必要がない。これは、多くの利点を有する。具体的には、抗体分子は、さらなる融合された部分を含まないため、標準的な抗体の産生に用いられるものと類似の方法を用いて産生され得る。リンカーが、時間とともに分解して、抗体分子の不均一な集団をもたらし得るため、この構造は、改善した抗体安定性をもたらすことも予測される。１つのみのタンパク質が融合された集団中のそれらの抗体は、２つの融合されたタンパク質を有するものと同程度に効率的に、ＴＮＦ受容体などの免疫細胞抗原のコンディショナルなアゴニズムを誘発できないことがあり得る。リンカーの切断又は分解は、患者への治療薬の投与前又は投与後に（例えば、酵素的切断又は患者のインビボｐＨによって）起こり、それにより患者の循環中でその有効性の低下をもたらし得る。抗体分子中にリンカーがない際、抗体分子は、投与前及び投与後の両方で同じ数の結合部位を保持することが予想される。さらに、融合されたタンパク質若しくはリンカー又はその両方の導入は、その分子が患者に投与されるときに免疫原性を誘発し、治療薬の有効性の低下をもたらし得るため、抗体分子の構造は、分子の免疫原性の観点からも好ましい。
【００２１】
したがって、本発明は、以下を提供する：
［１］メソテリン（ＭＳＬＮ）に結合する抗体分子であって、抗体分子の抗原結合部位は、抗体：
（ｉ）配列番号９８、７３、９９、２０、２１及び４４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−２７１；
（ｉｉ）配列番号１０、１１、４１、２０、２１及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５２；
（ｉｉｉ）配列番号９８、７３、９９、２０、２１及び３４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２１；
（ｉｖ）配列番号９８、７３、９９、２０、２１及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１２；
（ｖ）配列番号１０１、７３、１０３、２０、２１及び３４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２３；
（ｖｉ）配列番号９８、７３、９９、２０、２１及び４３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２４；
（ｖｉｉ）配列番号１０１、７３、１０３、２０、２１及び４３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２６；
（ｖｉｉｉ）配列番号９８、７３、９９、２０、２１及び４４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２７；
（ｉｘ）配列番号８５、７３、７５、２０、２１及び３４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００１；
（ｘ）配列番号８５、７３、７５、２０、２１及び４３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００５；
（ｘｉ）配列番号１１１、７３、１１３、２０、２１及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１４；
（ｘｉｉ）配列番号１０１、７３、１０３、２０、２１及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１８；
（ｘｉｉｉ）配列番号７１、７３、７５、２０、２１及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６；
（ｘｉｖ）配列番号１０、１１、３２、２０、２１及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５１；
（ｘｖ）配列番号１０、１１、５１、２０、２１及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５３；又は
（ｘｖｉ）配列番号１０、１１、１２、２０、２１及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４
の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜６を含み；
ここで、ＣＤＲ配列は、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従って定義される、抗体分子。
【００２２】
［２］ＭＳＬＮに結合する抗体分子であって、分子の抗原結合部位は、抗体：
（ｉ）配列番号９７、１８２、１００、２３、２４及び４４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−２７１；
（ｉｉ）配列番号１３、１４、４２、２３、２４及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５２；
（ｉｉｉ）配列番号９７、７４、１００、２３、２４及び３４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２１；
（ｉｖ）配列番号９７、７４、１００、２３、２４及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１２；
（ｖ）配列番号１０２、７４、１０４、２３、２４及び３４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２３；
（ｖｉ）配列番号９７、７４、１００、２３、２４及び４３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２４；
（ｖｉｉ）配列番号１０２、７４、１０４、２３、２４及び４３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２６；
（ｖｉｉｉ）配列番号９７、７４、１００、２３、２４及び４４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２７；
（ｉｘ）配列番号８６、７４、７６、２３、２４及び３４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００１；
（ｘ）配列番号８６、７４、７６、２３、２４及び４３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００５；
（ｘｉ）配列番号１１２、７４、１１４、２３、２４及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１４；
（ｘｉｉ）配列番号１０２、７４、１０４、２３、２４及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１８；
（ｘｉｉｉ）配列番号７２、７４、７６、２３、２４及び２５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６；
（ｘｉｖ）配列番号１３、１４、３３、２３、２４及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５１；
（ｘｉｖ）配列番号１３、１４、５２、２３、２４及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５３；又は
（ｘｖｉ）配列番号１３、１４、１５、２３、２４及び２２にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４
のＣＤＲ１〜６を含み；
ここで、ＣＤＲ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される、抗体分子。
【００２３】
［３］重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び／又は軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、好ましくはＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、［１］又は［２］に記載の抗体分子。
【００２４】
［４］免疫グロブリン重鎖及び／又は免疫グロブリン軽鎖、好ましくは免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含む、［１］から［３］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００２５】
［５］抗体：
（ｉ）配列番号１８０及び５６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−２７１；
（ｉｉ）配列番号３９及び１８にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５２；
（ｉｉｉ）配列番号１０９及び９３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２１；
（ｉｖ）配列番号１０９及び７９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１２；
（ｖ）配列番号１２１及び９３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２３；
（ｖｉ）配列番号１０９及び５３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２４；
（ｖｉｉ）配列番号１２１及び５３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２６；
（ｖｉｉｉ）配列番号１０９及び５６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２７；
（ｉｘ）配列番号６３及び９３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００１；
（ｘ）配列番号６３及び５３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００５；
（ｘｉ）配列番号１１５及び７９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１４；
（ｘｉｉ）配列番号１２１及び７９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１８；
（ｘｉｉｉ）配列番号６９及び７９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６；
（ｘｉｖ）配列番号３０及び１８にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５１；
（ｘｖ）配列番号４９及び１８にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５３；又は
（ｘｖｉ）配列番号８及び１８にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４
のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、好ましくはＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、［３］から［４］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００２６】
［６］抗体：
（ｉ）配列番号１７６及び９５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−２７１；
（ｉｉ）配列番号３５及び１６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５２；
（ｉｉｉ）配列番号１０５及び８３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２１；
（ｉｖ）配列番号１０５及び７７にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１２；
（ｖ）配列番号１２３及び８３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２３；
（ｖｉ）配列番号１０５及び９０にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２４；
（ｖｉｉ）配列番号１２３及び９０にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２６；
（ｖｉｉｉ）配列番号１０５及び９５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２７；
（ｉｘ）配列番号８１及び８３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００１；
（ｘ）配列番号８７及び９０にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００５；
（ｘｉ）配列番号１１７及び７７にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１４；
（ｘｉｉ）配列番号１２３及び７７にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１８；
（ｘｉｉｉ）配列番号６５及び７７にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６；
（ｘｉｖ）配列番号２６及び１６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５１；
（ｘｖ）配列番号４５及び１６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５３；又は
（ｘｖｉ）配列番号４及び１６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４
の重鎖［ＬＡＬＡを有さない］及び軽鎖を含む、［１］から［５］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００２７】
［７］抗体：
（ｉ）配列番号１７８及び９５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−２７１；
（ｉｉ）配列番号３７及び１６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５２；
（ｉｉｉ）配列番号１０７及び８３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２１；
（ｉｖ）配列番号１０７及び７７にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１２；
（ｖ）配列番号１２５及び８３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２３；
（ｖｉ）配列番号１０７及び９０にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２４；
（ｖｉｉ）配列番号１２５及び９０にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２６；
（ｖｉｉｉ）配列番号１０７及び９５にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２７；
（ｉｘ）配列番号８９及び８３にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００１；
（ｘ）配列番号８９及び９０にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００５；
（ｘｉ）配列番号１１９及び７７にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１４；
（ｘｉｉ）配列番号１２５及び７７にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１８；
（ｘｉｉｉ）配列番号６７及び７７にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６；
（ｘｉｖ）配列番号２８及び１６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５１；
（ｘｖ）配列番号４７及び１６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５３；又は
（ｘｖｉ）配列番号５及び１６にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４
の重鎖［ＬＡＬＡを有する］及び軽鎖を含む、［１］から［５］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００２８】
［８］抗体ＦＳ２８−２５６−２７１のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖を含む、［１］から［７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００２９】
［９］抗体ＦＳ２８−０２４−０５２のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖を含む、［１］から［７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３０】
［１０］ＭＳＬＮは、細胞表面に結合されたＭＳＬＮである、［１］から［９］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３１】
［１１］溶液中のＭＳＬＮより高い親和性で、固定されたＭＳＬＮに結合する、［１０］に記載の抗体分子。
【００３２】
［１２］８ｎＭの親和性（ｋＤ）又はより高い親和性で、固定されたＭＳＬＮに結合する、［１１］に記載の抗体分子。
【００３３】
［１３］１５ｎＭの親和性（ｋＤ）又はより低い親和性で溶液中のＭＳＬＮに結合する、［１１］又は［１２］に記載の抗体分子。
【００３４】
［１４］ＭＳＬＮは、ヒトＭＳＬＮである、［１］から［１３］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３５】
［１５］ＭＳＬＮは、配列番号１６９に記載される配列からなるか又はそれを含む、［１４］に記載の抗体分子。
【００３６】
［１６］ＭＳＬＮは、カニクイザルＭＳＬＮである、［１］から［１３］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３７】
［１７］ＭＳＬＮは、配列番号１７０に記載される配列からなるか又はそれを含む、［１６］に記載の抗体分子。
【００３８】
［１８］抗体ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−０２４−０５３又はＦＳ２８−０２４のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖を含み、抗体は、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックする、［１］から［１７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００３９】
［１９］抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６又はＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８又はＦＳ２８−２５６のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖を含み、抗体は、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックしない、［１］から［１７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４０】
［２０］ＭＵＣ１６は、ヒトＭＵＣ１６である、［１８］又は［１９］に記載の抗体分子。
【００４１】
［２１］多重特異的抗体分子であり、且つ第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を含む、［１］から［２０］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４２】
［２２］二重特異的、三重特異的又は四重特異的抗体分子である、［２１］に記載の抗体分子。
【００４３】
［２３］二重特異的分子である、［２２］に記載の抗体分子。
【００４４】
［２４］第２の抗原結合部位は、抗体分子の定常ドメイン中に位置する、［２１］から［２３］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４５】
［２５］第２の抗原は、免疫細胞抗原である、［２１］から［２４］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４６】
［２６］免疫細胞抗原は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである、［２５］に記載の抗体分子。
【００４７】
［２７］ＴＮＦＲＳＦのメンバーは、ＯＸ４０又はＣＤ１３７である、［２６］に記載の抗体分子。
【００４８】
［２８］第２の抗原結合部位は、第１の配列、第２の配列及び／又は第３の配列を含み、ここで、第１の配列、第２の配列及び第３の配列は、それぞれ定常ドメインのＡＢ構造ループ、ＣＤ構造ループ及びＥＦ構造ループ中に位置する、［２１］から［２７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００４９】
［２９］定常ドメインは、ＣＨ３ドメインである、［２４］から［２８］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００５０】
［３０］腫瘍細胞表面に結合されたＭＳＬＮの存在下で免疫細胞上のＴＮＦＲＳＦメンバーを活性化することが可能である、［２６］から［２９］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００５１】
［３１］ＴＮＦＲＳＦメンバー及び腫瘍細胞表面に結合されたＭＳＬＮへの抗体分子の結合は、免疫細胞表面におけるＴＮＦＲＳＦメンバーのクラスター化を引き起こす、［２６］から［３０］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００５２】
［３２］免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞又は樹状細胞（ＤＣ）である、［３０］又は［３１］に記載の抗体分子。
【００５３】
［３３］免疫細胞は、Ｔ細胞である、［３２］に記載の抗体分子。
【００５４】
［３４］抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有するか、又は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を引き起こすことが可能である、［１］から［３３］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００５５】
［３５］１つ以上のＦｃγ受容体への抗体分子のＣＨ２ドメインの結合を低減又は抑制するように修飾されている、［１］から［３３］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００５６】
［３６］Ｆｃγ受容体に結合しない、［１］から［３３］又は［３５］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００５７】
［３７］Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択される、［３５］又は［３６］に記載の抗体分子。
【００５８】
［３８］［１］から［３７］のいずれか１つに記載の抗体分子と、生物活性分子とを含むコンジュゲート。
【００５９】
［３９］［１］から［３７］のいずれか１つに記載の抗体分子と、検出可能な標識とを含むコンジュゲート。
【００６０】
［４０］［１］から［３７］のいずれか１つに記載の抗体分子をコードする１つ又は複数の核酸分子。
【００６１】
［４１］抗体：
（ｉ）配列番号１８１及び５７にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−２７１；
（ｉｉ）配列番号４０及び１９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５２；
（ｉｉｉ）配列番号１１０及び９４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２１；
（ｉｖ）配列番号１１０及び８０にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１２；
（ｖ）配列番号１２２及び９４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２３；
（ｖｉ）配列番号１１０及び５４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２４；
（ｖｉｉ）配列番号１２２及び５４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２６；
（ｖｉｉｉ）配列番号１１０及び５７にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０２７；
（ｉｘ）配列番号６４及び９４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００１；
（ｘ）配列番号６４及び５４にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−００５；
（ｘｉ）配列番号１１６及び８０にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１４；
（ｘｉｉ）配列番号１２２及び８０にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６−０１８；
（ｘｉｉｉｉ）配列番号７０及び８０にそれぞれ記載されるＦＳ２８−２５６；
（ｘｉｖ）配列番号３１及び１９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５１；
（ｘｖ）配列番号５０及び１９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４−０５３；又は
（ｘｖｉ）配列番号９及び１９にそれぞれ記載されるＦＳ２８−０２４
のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン核酸配列を含む、［４０］に記載の核酸分子。
【００６２】
［４２］
（ｉ）配列番号１７９若しくは１７７に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−２７１の重鎖核酸配列及び／又は配列番号９６に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−２７１の軽鎖核酸配列；
（ｉｉ）配列番号３８若しくは３６に記載される抗体ＦＳ２８−０２４−０５２の重鎖核酸配列及び／又は配列番号１７に記載される抗体ＦＳ２８−０２４−０５２の軽鎖核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１０８若しくは１０６に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０２１の重鎖核酸配列及び／又は配列番号９２に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０２１の軽鎖核酸配列；
（ｉｖ）配列番号１０８若しくは１０６に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０１２の重鎖核酸配列及び／又は配列番号７８に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０１２の軽鎖核酸配列；
（ｖ）配列番号１２６若しくは１２４に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０２３の重鎖核酸配列及び／又は配列番号９２に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０２３の軽鎖核酸配列；
（ｖｉ）配列番号１０８若しくは１０６に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０２４の重鎖核酸配列及び／又は配列番号９１に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０２４の軽鎖核酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号１２６若しくは１２４に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０２６の重鎖核酸配列及び／又は配列番号９１に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０２６の軽鎖核酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号１０８若しくは１０６に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０２７の重鎖核酸配列及び／又は配列番号９６に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０２７の軽鎖核酸配列；
（ｉｘ）配列番号８４若しくは８２に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−００１の重鎖核酸配列及び／又は配列番号９２に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−００１の軽鎖核酸配列；
（ｘ）配列番号８４若しくは８８に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−００５の重鎖核酸配列及び／又は配列番号９１に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−００５の軽鎖核酸配列；
（ｘｉ）配列番号１２０若しくは１１８に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０１４の重鎖核酸配列及び／又は配列番号７８に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０１４の軽鎖核酸配列；
（ｘｉｉ）配列番号１２６若しくは１２４に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０１８の重鎖核酸配列及び／又は配列番号７８に記載される抗体ＦＳ２８−２５６−０１８の軽鎖核酸配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号６８若しくは６６に記載される抗体ＦＳ２８−２５６の重鎖核酸配列及び／又は配列番号７８に記載される抗体ＦＳ２８−２５６の軽鎖核酸配列；
（ｘｉｖ）配列番号２９若しくは２７に記載される抗体ＦＳ２８−０２４−０５１の重鎖核酸配列及び／又は配列番号１７に記載される抗体ＦＳ２８−０２４−０５１の軽鎖核酸配列；
（ｘｖ）配列番号４８若しくは４６に記載される抗体ＦＳ２８−０２４−０５３の重鎖核酸配列及び／又は配列番号１７に記載される抗体ＦＳ２８−０２４−０５３の軽鎖核酸配列；又は
（ｘｖｉ）配列番号７若しくは６に記載される抗体ＦＳ２８−０２４の重鎖核酸配列及び／又は配列番号１７に記載される抗体ＦＳ２８−０２４の軽鎖核酸配列
を含む、［４０］又は［４１］に記載の核酸分子。
【００６３】
［４３］［４０］から［４２］のいずれか１つに記載の１つ又は複数の核酸分子を含む１つ又は複数のベクター。
【００６４】
［４４］［４０］から［４２］のいずれか１つに記載の核酸分子又は［４３］に記載のベクターを含む組み換え宿主細胞。
【００６５】
［４５］［１］から［３７］のいずれか１つに記載の抗体分子を産生する方法であって、抗体分子の産生のための条件下において、［４４］に記載の組み換え宿主細胞を培養することを含む方法。
【００６６】
［４６］抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含む、［４５］に記載の方法。
【００６７】
［４７］［１］から［３９］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【００６８】
［４８］個体における癌を治療する方法に使用するための、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲート。
【００６９】
［４９］個体における癌を治療する方法であって、治療有効量の、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲートを個体に投与することを含む方法。
【００７０】
［５０］癌の治療のための薬剤の調製における、［１］から［３９］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲートの使用。
【００７１】
［５１］癌の細胞は、それらの細胞表面においてＭＳＬＮを発現する、［４８］から［５０］のいずれか１つに記載の使用のための抗体分子又はコンジュゲート、方法又は使用。
【００７２】
［５２］癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌及び肺癌からなる群から選択される、［４８］から［５０］のいずれか１つに記載の使用のための抗体分子又はコンジュゲート、方法又は使用。
【００７３】
［５３］治療の方法は、抗体分子又はコンジュゲートを第２の治療薬と組み合わせて個体に投与することを含む、［４８］に記載の使用のための抗体分子又はコンジュゲート。
【００７４】
［５４］治療有効量の第２の治療薬を個体に投与することをさらに含む、［４９］に記載の方法。
【００７５】
［５５］個体における癌を検出するか、診断するか、予後診断するか又は癌の予後を監視する方法に使用するための、［１］から［３７］又は［３９］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲート。
【００７６】
［５６］個体における癌を検出するか、診断するか、予後診断するか又は癌の予後を監視する方法であって、［１］から［３７］又は［３９］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲートの使用を含む方法。
【００７７】
［５７］個体における癌を検出するか、診断するか、予後診断するか又は癌の予後を監視するための診断薬の製造における、［１］から［３７］又は［３９］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲートの使用。
【００７８】
［５８］個体における癌を検出するか、診断するか、予後診断するか又は癌の予後を監視する方法に使用するためのキットであって、［１］から［３７］又は［３９］のいずれか１つに記載の抗体分子又はコンジュゲートを含むキット。
【００７９】
［５９］癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌及び肺癌からなる群から選択される、［５５］から［５８］のいずれか１つに記載の使用のための抗体分子又はコンジュゲート、方法、使用又はキット。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
図面の簡単な説明
【図１】ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞への抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂの結合を示す。抗ヒトＭＳＬＮ  ｍＡｂ  ＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６、ＦＳ２８−０９１、ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６（全てＩｇＧ１  ＬＡＬＡフォーマットにおける）は、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞への用量依存性の結合を示した。ＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６及びＦＳ２８−０９１は、陽性対照抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂ  ＳＳ１と同様に、低いナノモルＥＣ５０値で細胞表面ＭＳＬＮへの高い親和性の結合を示した。ｍＡｂ  ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６は、３０ｎＭを超えるＥＣ５０値並びにＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６及びＦＳ２８−０９１と比較してより低いＥｍａｘ値で細胞表面ＭＳＬＮへのより弱い結合を示した。
【図２】抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂ2のＡＤＣＣ活性を示す。抗ヒトＭＳＬＮ  ｍＡｂ2  ＦＳ２８−０２４−０５２及びＦＳ２８−２５６−２７１並びに陽性対照抗体ＳＳ１をｈＩｇＧ１  ＬＡＬＡフォーマット（エフェクター機能なし）及びエフェクターコンピテント骨格ｈＩｇＧ１において試験した。ＦＳ２８−０２４−０５２は、試験された抗体の最も高いＡＤＣＣ活性を有しており、ＦＳ２８−２５６−２７１は、対照抗体と同等のＡＤＣＣ活性を有する。全ての場合、ＩｇＧ１骨格へのＬＡＬＡ突然変異の導入は、予想どおりＡＤＣＣ活性を完全に抑制した。
【図３】（Ａ）Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（ヒトＩｇＧ１対照）、（Ｂ）ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（ｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ）、（Ｃ）ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３とＧ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０との組合せ（抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂプラス抗マウスＭＳＬＮ  Ｆａｂ）、（Ｄ）ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（抗マウスＣＤ１３７／ＭＳＬＮ  ｍＡｂ２）（Ｅ）ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０（ｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ）、及び（Ｆ）Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（抗マウスＭＳＬＮ  Ｆａｂ）で処理されたＣＴ２６．Ｇ１０同系腫瘍モデルにおける個々の腫瘍体積測定を示す。ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０は、アイソタイプ対照並びに他の処理群と比較して低減された腫瘍成長を示した。
【図４】Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（ＩｇＧ対照）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（ｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０（ｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ）、Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（抗マウスＭＳＬＮ  Ｆａｂ）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３とＧ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０との組合せ（抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂプラス抗マウスＭＳＬＮ  Ｆａｂ）及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（抗マウスＣＤ１３７／ＭＳＬＮ  ｍＡｂ２）で処理されたＣＴ２６．Ｇ１０同系腫瘍モデルについてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。結果は、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０処理が、アイソタイプ対照で処理されたマウス又は他の処理群と比較して有意に改善された生存をもたらしたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
詳細な説明
本発明は、ＭＳＬＮに結合する抗体分子に関する。抗体分子は、好ましくは、ヒトＭＳＬＮ、より好ましくはヒト及びカニクイザルＭＳＬＮに結合する。本発明の抗体分子は、好ましくは、細胞の表面において発現されるＭＳＬＮに結合することが可能である。細胞は、好ましくは、腫瘍細胞である。
【００８２】
抗体分子は、好ましくは、ＭＳＬＮに特異的に結合する。「特異的」という用語は、抗体分子がその特異的結合パートナー（ここではＭＳＬＮ）以外の分子への顕著な結合を示さない状況を指し得る。「特異的」という用語は、抗体分子が、いくつかの抗原によって保有されるＭＳＬＮ上のエピトープなどの特定のエピトープに対して特異的である場合にも該当し、その場合、抗体分子は、エピトープを保有する様々な抗原に結合することが可能であろう。抗体分子は、好ましくは、結合しないか、又はＣＥＡＣＡＭ−５、Ｅ−カドヘリン、トロンボモジュリン及び／又はＥｐＣＡＭなど、細胞接着に関与する他の分子への顕著な結合を示さない。
【００８３】
上記の背景の項において説明されるように、成熟ＭＳＬＮは、腫瘍細胞から流出され、腫瘍部位から取り除かれる。この流出されるＭＳＬＮは、抗ＭＳＬＮ結合分子のシンクとして機能し得、その後、流出されるＭＳＬＮへの結合は、腫瘍部位からも取り除かれる。腫瘍細胞の表面に存在するＭＳＬＮに優先的に結合する分子を選択するために、本発明者らは、ＭＳＬＮに対する高い結合力を有する抗体分子を選択した。具体的には、本発明者らは、溶液中のＭＳＬＮより高い親和性で、固定されたＭＳＬＮに結合した抗体分子を選択した。高い結合力でＭＳＬＮに結合する抗体分子は、モノマー形態であると予想される、腫瘍細胞から流出されるメソテリンと対照的に、ＭＳＬＮの複数のコピーが存在し、抗体分子による２価結合に利用可能であると予想される、腫瘍細胞上に存在するＭＳＬＮに優先的に結合すると考えられる。したがって、理論に制約されることを望むものではないが、本発明の抗体分子は、腫瘍部位からゆっくりと取り除かれるため、それらの治療効果を発揮するより長い期間を有すると予想される。
【００８４】
抗体分子は、好ましくは、溶液中のＭＳＬＮより高い親和性で、固定されたＭＳＬＮに結合する。固定されたＭＳＬＮは、表面プラズモン共鳴において使用するためのチップなどの表面において固定されたＭＳＬＮであり得る。溶液中のＭＳＬＮは、本明細書において可溶性ＭＳＬＮとも呼ばれ、固定されていない。可溶性ＭＳＬＮは、好ましくは、モノマー形態であり、すなわちモノマーメソテリンである。
【００８５】
抗体のその同種抗原に対する親和性は、抗体が前記抗原に結合する平衡解離定数（ＫＤ）として表され得る。ＫＤ値が高くなるほど、抗原に対する抗体分子の親和性が低い。
【００８６】
抗体分子は、好ましくは、少なくとも９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ若しくは６ｎＭの親和性（ＫＤ）又はより高い親和性で、固定されたＭＳＬＮに結合する。好ましくは、抗体分子は、少なくとも７ｎＭ、６ｎＭの親和性（ＫＤ）又はより高い親和性で、固定されたＭＳＬＮに結合する。
【００８７】
抗体分子は、好ましくは、１５ｎＭの親和性（ＫＤ）又はより低い親和性で、固定されたＭＳＬＮに結合する。より好ましくは、抗体分子は、１６ｎＭ、１７ｎＭ若しくは１８ｎＭの親和性（ＫＤ）又はより低い親和性で、固定されたＭＳＬＮに結合する。
【００８８】
好ましい実施形態において、抗体分子は、６ｎＭの親和性（ＫＤ）又はより高い親和性で、固定されたＭＳＬＮに結合し、１８ｎＭの親和性（ＫＤ）又はより低い親和性で溶液中のＭＳＬＮに結合する。
【００８９】
表面に結合されたＭＳＬＮを含む細胞に対する抗体分子の結合親和性は、細胞への抗体分子の最大半量結合（ＥＣ５０）を達成するのに必要な抗体分子の濃度を決定することによって測定され得る。細胞への抗体分子の最大半量結合を達成するのに必要な抗体分子の濃度を決定するための好適な方法は、当技術分野において公知であり、本発明の実施例に開示されている（例えば、実施例４を参照されたい）。上記に説明されるように、表面に結合されたＭＳＬＮを含む腫瘍細胞への結合が可溶性メソテリンの存在の影響を受けないか又はあまり影響を受けない抗体分子は、腫瘍環境中で流出されるＭＳＬＮの存在を考慮して好ましい。したがって、好ましい実施形態において、可溶性ＭＳＬＮの存在下での、表面に結合されたＭＳＬＮを含む細胞（例えば、腫瘍細胞）への抗体の最大半量結合（ＥＣ５０）を達成するのに必要な抗体分子の濃度は、可溶性ＭＳＬＮの非存在下での、細胞への抗体の最大半量結合（ＥＣ５０）を達成するのに必要な抗体分子の濃度より２０倍未満、１５倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満又は３倍未満高い。
【００９０】
ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックしない抗体分子の、細胞結合ＭＳＬＮを含む細胞への結合は、可溶性ＭＳＬＮの存在によってあまり影響されないことが示されている。したがって、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックすることが可能でないか又はブロックしない抗体分子が好ましいことがある。
【００９１】
代わりに、抗体分子は、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックし得る。
【００９２】
固定されたＭＳＬＮは、配列番号１６９に記載される配列を有し得る。溶液中のＭＳＬＮは、配列番号１６９に記載される配列を有し得る。
【００９３】
本発明の抗体分子は、カニクイザルＭＳＬＮに結合することも示された。カニクイザルＭＳＬＮ並びにヒトＭＳＬＮへの結合は、カニクイザルにおける抗体分子の有効性及び毒性試験を行うのに有益であると考えられ、これは、ヒトにおける抗体分子の有効性及び毒性の予測であり得る。
【００９４】
抗体分子は、同様の親和性で、固定されたヒトＭＳＬＮ及び固定されたカニクイザルＭＳＬＮに結合し得る。さらに、抗体分子は、同様の親和性で溶液中のヒトＭＳＬＮ及び溶液中のカニクイザルＭＳＬＮに結合し得る。これは、カニクイザルにおいて抗体分子を用いて行われる有効性及び毒性試験がヒトにおける抗体分子の有効性及び毒性の予測であることを確実にするのに有益であると考えられる。
【００９５】
したがって、好ましい実施形態において、抗体分子は、抗体分子が固定されたヒトＭＳＬＮに結合する親和性より１０倍以下、好ましくは５倍以下、より好ましくは２倍以下低いか又は高い親和性で、固定されたカニクイザルＭＳＬＮに結合する。さらに、抗体分子は、好ましくは、抗体分子が溶液中のヒトＭＳＬＮに結合する親和性より１０倍以下、好ましくは５倍以下、より好ましくは２倍以下低いか又は高い親和性で溶液中のカニクイザルＭＳＬＮに結合する。
【００９６】
ヒト又はカニクイザルＭＳＬＮなどの同種抗原に対する抗体分子の結合親和性は、例えば、Biacoreなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定され得る。
【００９７】
抗体分子は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体分子であり得る。好ましくは、抗体分子は、ヒト抗体分子である。
【００９８】
抗体分子は、好ましくは、モノクローナルである。
【００９９】
抗体分子は、他のポリペプチド及び／又は血清成分に結合することが可能な抗体など、汚染物質を含まないという意味で単離され得る。
【０１００】
抗体分子は、天然であるか又は部分的に若しくは完全に合成的に産生され得る。例えば、抗体分子は、組み換え抗体分子であり得る。
【０１０１】
抗体分子は、ＭＳＬＮのための１つ以上のＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。
【０１０２】
抗体分子は、免疫グロブリン又はその抗原結合断片であり得る。例えば、抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ分子、好ましくはＩｇＧ分子、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子、より好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２分子、最も好ましくはＩｇＧ１分子又はその断片であり得る。好ましい実施形態において、抗体分子は、完全免疫グロブリン分子である。
【０１０３】
他の実施形態において、抗体分子は、ＭＳＬＮのためのＣＤＲベースの抗原結合部位を含む抗原結合断片であり得る。例えば、抗原結合断片は、断片抗原結合（Ｆａｂ）、ＩｇＧΔＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ジスルフィド安定化可変断片（ｄｓＦｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−ＣＨ３（ミニボディ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ジッパー、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又は単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、例えばＶＨＨドメイン又はナノボディであり得る。好ましい抗原結合断片は、ＭＳＬＮのための２つ以上のＣＤＲベースの抗原結合部位を含み、すなわち、それらは、多価であり得る。したがって、抗原結合断片は、好ましくは、ＩｇＧΔＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディであり得る（Brinkmann and Kontermann, (2017)及びPowers et al, (2012)）。
【０１０４】
抗体並びにそれらの構築及び使用のための方法は、当技術分野において周知であり、例えばHolliger and Hudson, 2005に記載されている。モノクローナル及び他の抗体を取り、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生するために組み換えＤＮＡ技術の技術を使用することが可能である。このような技術は、１つの抗体分子のＣＤＲ又は可変領域を異なる抗体分子中に導入することを含み得る（欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号、英国特許第２１８８６３８Ａ号及び欧州特許出願公開第Ａ−２３９４００号）。
【０１０５】
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域における抗原結合部位である。ＣＤＲベースの抗原結合部位は、３つのＣＤＲ、例えば３つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ又は３つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲによって形成され得る。好ましくは、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、６つのＣＤＲ、３つのＶＬ  ＣＤＲ及び３つのＶＨ  ＣＤＲによって形成される。抗原の結合への異なるＣＤＲの寄与は、異なる抗原結合部位において異なり得る。
【０１０６】
抗原結合部位の３つのＶＨドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＨドメイン内に位置し得、３つのＶＬドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＬドメイン内に位置し得る。例えば、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域中に位置し得る。
【０１０７】
抗体分子は、１つ又は好ましくは２つ以上、例えば２つの、ＭＳＬＮのためのＣＤＲベースの抗原結合部位を有する。したがって、抗体分子は、１つのＶＨ及び１つのＶＬドメインを含み得るが、好ましくは例えば天然のＩｇＧ分子の場合のように２つのＶＨ及び２つのＶＬドメイン、すなわち２つのＶＨ／ＶＬドメイン対を含む。
【０１０８】
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３又はＦＳ２８−０２４、好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１又はＦＳ２８−０２４−０５２、最も好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１の３つのＶＨ  ＣＤＲ又は３つのＶＬ  ＣＤＲ、好ましくは３つのＶＨ  ＣＤＲ及び３つのＶＬ  ＣＤＲを含み得る。
【０１０９】
ＣＤＲの配列は、日常的な技術を用いて、抗体分子のＶＨ及びＶＬドメイン配列から容易に決定され得る。抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３及びＦＳ２８−０２４のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、本明細書に記載され、したがって、前記抗体の３つのＶＨ及び３つのＶＬドメインＣＤＲは、前記配列から決定され得る。ＣＤＲ配列は、例えば、Kabat et al., 1991又は国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）（Lefranc et al., 2015）に従って決定され得る。
【０１１０】
ＩＭＧＴ番号付けに従う抗体分子のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれ抗体分子のＶＨドメインの２７〜３８、５６〜６５及び１０５〜１１７位に位置する配列であり得る。
【０１１１】
Kabat番号付けに従う抗体分子のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれＶＨドメインの３１〜３５、５０〜６５及び９５〜１０２位に位置する配列であり得る。
【０１１２】
ＩＭＧＴ番号付けに従う抗体分子のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれＶＬドメインの２７〜３８、５６〜６５及び１０５〜１１７位に位置する配列であり得る。
【０１１３】
Kabat番号付けに従う抗体分子のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれＶＬドメインの２４〜３４、５０〜５６及び８９〜９７位に位置する配列であり得る。
【０１１４】
例えば、
（ｉ）ＦＳ２８−２５６−２７１のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号９８、７３及び９９のそれぞれに記載され得；
（ｉｉ）ＦＳ２８−０２４−０５２のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１０、１１及び４１のそれぞれに記載され得；
（ｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２１のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号９８、７３及び９９のそれぞれに記載され得；
（ｉｖ）ＦＳ２８−２５６−０１２のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号９８、７３及び９９のそれぞれに記載され得；
（ｖ）ＦＳ２８−２５６−０２３のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１０１、７３及び１０３のそれぞれに記載され得；
（ｖｉ）ＦＳ２８−２５６−０２４のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号９８、７３及び９９のそれぞれに記載され得；
（ｖｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２６のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１０１、７３及び１０３のそれぞれに記載され得；
（ｖｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２７のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号９８、７３及び９９のそれぞれに記載され得；
（ｉｘ）ＦＳ２８−２５６−００１のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号８５、７３及び７５のそれぞれに記載され得；
（ｘ）ＦＳ２８−２５６−００５のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号８５、７３及び７５のそれぞれに記載され得；
（ｘｉ）ＦＳ２８−２５６−０１４のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１１１、７３及び１１３のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０１８のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１０１、７３及び１０３のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号７１、７３及び７５のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｖ）ＦＳ２８−０２４−０５１のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１０、１１及び３２のそれぞれに記載され得；
（ｘｖ）ＦＳ２８−０２４−０５３のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１０、１１及び５１のそれぞれに記載され得；
（ｘｖｉ）ＦＳ２８−０２４のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１０、１１及び１２のそれぞれに記載され得；
ここで、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
【０１１５】
（ｉ）ＦＳ２８−２５６−２７１のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び４４のそれぞれに記載され得；
（ｉｉ）ＦＳ２８−０２４−０５２のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び２２のそれぞれに記載され得；
（ｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２１のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び３４のそれぞれに記載され得；
（ｉｖ）ＦＳ２８−２５６−０１２のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び２５のそれぞれに記載され得；
（ｖ）ＦＳ２８−２５６−０２３のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び３４のそれぞれに記載され得；
（ｖｉ）ＦＳ２８−２５６−０２４のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び４３のそれぞれに記載され得；
（ｖｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２６のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び４３のそれぞれに記載され得；
（ｖｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２７のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び４４のそれぞれに記載され得；
（ｉｘ）ＦＳ２８−２５６−００１のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び３４のそれぞれに記載され得；
（ｘ）ＦＳ２８−２５６−００５のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び４３のそれぞれに記載され得；
（ｘｉ）ＦＳ２８−２５６−０１４のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び２５のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０１８のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び２５のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び２５のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｖ）ＦＳ２８−０２４−０５１のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び２２のそれぞれに記載され得；
（ｘｖ）ＦＳ２８−０２４−０５３のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び２２のそれぞれに記載され得；
（ｘｖｉ）ＦＳ２８−０２４のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２０、２１及び２２のそれぞれに記載され得；
ここで、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
【０１１６】
例えば、
（ｉ）ＦＳ２８−２５６−２７１のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号９７、１８２及び１００のそれぞれに記載され得；
（ｉｉ）ＦＳ２８−０２４−０５２のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１３、１４及び４２のそれぞれに記載され得；
（ｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２１のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号９７、７４及び１００のそれぞれに記載され得；
（ｉｖ）ＦＳ２８−２５６−０１２のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号９７、７４及び１００のそれぞれに記載され得；
（ｖ）ＦＳ２８−２５６−０２３のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１０２、７４及び１０４のそれぞれに記載され得；
（ｖｉ）ＦＳ２８−２５６−０２４のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号９７、７４及び１００のそれぞれに記載され得；
（ｖｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２６のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１０２、７４及び１０４のそれぞれに記載され得；
（ｖｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２７のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号９７、７４及び１００のそれぞれに記載され得；
（ｉｘ）ＦＳ２８−２５６−００１のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号８６、７４及び７６のそれぞれに記載され得；
（ｘ）ＦＳ２８−２５６−００５のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号８６、７４及び７６のそれぞれに記載され得；
（ｘｉ）ＦＳ２８−２５６−０１４のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１１２、７４及び１１４のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０１８のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１０２、７４及び１０４のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号７２、７４及び７６のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｖ）ＦＳ２８−０２４−０５１のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１３、１４及び３３のそれぞれに記載され得；
（ｘｖ）ＦＳ２８−０２４−０５３のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１３、１４及び５２のそれぞれに記載され得；
（ｘｖｉ）ＦＳ２８−０２４のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号１３、１４及び１５のそれぞれに記載され得；
ここで、ＣＤＲ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。
【０１１７】
（ｉ）ＦＳ２８−２５６−２７１のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び４４のそれぞれに記載され得；
（ｉｉ）ＦＳ２８−０２４−０５２のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び２２のそれぞれに記載され得；
（ｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２１のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び３４のそれぞれに記載され得；
（ｉｖ）ＦＳ２８−２５６−０１２のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び２５のそれぞれに記載され得；
（ｖ）ＦＳ２８−２５６−０２３のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び３４のそれぞれに記載され得；
（ｖｉ）ＦＳ２８−２５６−０２４のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び４３のそれぞれに記載され得；
（ｖｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２６のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び４３のそれぞれに記載され得；
（ｖｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０２７のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び４４のそれぞれに記載され得；
（ｉｘ）ＦＳ２８−２５６−００１のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び３４のそれぞれに記載され得；
（ｘ）ＦＳ２８−２５６−００５のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び４３のそれぞれに記載され得；
（ｘｉ）ＦＳ２８−２５６−０１４のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び２５のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｉ）ＦＳ２８−２５６−０１８のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び２５のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｉｉ）ＦＳ２８−２５６のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び２５のそれぞれに記載され得；
（ｘｉｖ）ＦＳ２８−０２４−０５１のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び２２のそれぞれに記載され得；
（ｘｖ）ＦＳ２８−０２４−０５３のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び２２のそれぞれに記載され得；
（ｘｖｉ）ＦＳ２８−０２４のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、配列番号２３、２４及び２２のそれぞれに記載され得；
ここで、ＣＤＲ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。
【０１１８】
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３又はＦＳ２８−０２４、好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１又はＦＳ２８−０２４−０５２、最も好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１のＶＨ又はＶＬドメイン、好ましくはＶＨ及びＶＬドメインを含み得る。
【０１１９】
抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３及びＦＳ２８−０２４のＶＨドメインは、配列番号１８０、３９、１０９、１０９、１２１、１０９、１２１、１０９、６３、６３、１１５、１２１、６９、３０、４９及び８にそれぞれ記載される配列を有し得る。
【０１２０】
抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３及びＦＳ２８−０２４のＶＬドメインは、配列番号５６、１８、９３、７９、９３、５３、５３、５６、９３、５３、７９、７９、７９、１８、１８及び１８にそれぞれ記載される配列を有し得る。
【０１２１】
抗体分子は、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３又はＦＳ２８−０２４、好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１又はＦＳ２８−０２４−０５２、最も好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１の重鎖又は軽鎖、好ましくは重鎖及び軽鎖を含み得る。
【０１２２】
抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３及びＦＳ２８−０２４の重鎖（ＬＡＬＡ突然変異を有する）は、配列番号１７８、３７、１０７、１０７、１２５、１０７、１２５、１０７、８９、８９、１１９、１２５、６７、２８、４７、５にそれぞれ記載される配列を有し得る。
【０１２３】
抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３及びＦＳ２８−０２４の重鎖（ＬＡＬＡ突然変異を有さない）は、配列番号１７６、３５、１０５、１０５、１２３、１０５、１２３、１０５、８１、８７、１１７、１２３、６５、２６、４５及び４にそれぞれ記載される配列を有し得る。
【０１２４】
抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３及びＦＳ２８−０２４の軽鎖は、配列番号９５、１６、８３、７７、８３、９０、９０、９５、８３、９０、７７、７７、７７、１６、１６及び１６にそれぞれ記載される配列を有し得る。
【０１２５】
抗体分子は、本明細書に開示されるＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖又は軽鎖配列の変異体も含み得る。好適な変異体は、配列変異又は突然変異及びスクリーニングの方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、１つ以上のこのような変異体配列を含む抗体分子は、ＭＳＬＮ、好ましくはヒト及び／又はカニクイザルＭＳＬＮに対する結合特異性及び／又は結合親和性など、親抗体分子の機能特性の１つ以上を保持する。例えば、１つ以上の変異体配列を含む抗体分子は、好ましくは、（親）抗体分子と同じ親和性又は（親）抗体分子より高い親和性でＭＳＬＮに結合する。親抗体分子は、変異体抗体分子に組み込まれたアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を含まない抗体分子である。
【０１２６】
抗体ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８又はＦＳ２８−２５６のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン及び／又は重鎖を含む抗体分子は、ＶＨドメインの５５又は５７位にアミノ酸置換を含み得、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１２７】
例えば、抗体分子は、抗体ＦＳ２８−２５６−０２７のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン及び／又は重鎖を含み得、ここで、抗体分子は、ＶＨドメインの５５位にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１２８】
本発明の抗体分子は、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３又はＦＳ２８−０２４、好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１又はＦＳ２８−０２４−０５２、最も好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１のＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖又は軽鎖に対する少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖又は軽鎖を含み得る。
【０１２９】
配列同一性は、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCG package, Accelerys Inc, San Diego USA）に関連して一般的に定義される。ＧＡＰは、Needleman and Wunschアルゴリズムを使用して、一致の数を最大にし、且つギャップの数を最小にする、２つの完全な配列をアラインする。一般に、１２に等しいギャップ作成ペナルティ及び４に等しいギャップ伸長ペナルティを伴うデフォルトパラメータが使用される。ＧＡＰの使用が好ましいことがあるが、他のアルゴリズム、例えば一般にデフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴ（Altschul et al., 1990の方法を使用する、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, 1988の方法を使用する）、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981）、又は上記のAltschul et al., 1990のＴＢＬＡＳＴＮプログラムが使用され得る。特に、psi-Blastアルゴリズム（Altschul et al., 1997）が使用され得る。
【０１３０】
抗体分子は、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３又はＦＳ２８−０２４、好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１又はＦＳ２８−０２４−０５２、最も好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及び／又はＶＬ  ＣＤＲ３と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは３つ以下の変異、２つ以下の変異又は１つの変異を有するＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及び／又はＶＬ  ＣＤＲ３を含み得る。
【０１３１】
抗体分子は、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３又はＦＳ２８−０２４、好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１又はＦＳ２８−０２４−０５２、最も好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１のＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖又は軽鎖と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは２０以下の変異、１５以下の変異、１０以下の変異、５つ以下の変異、４つ以下の変異、３つ以下の変異、２つ以下の変異又は１つの変異を有するＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖又は軽鎖を含み得る。特に、アミノ酸配列変異は、抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖の１つ以上のフレームワーク領域など、抗体分子の１つ以上のフレームワーク領域中に位置し得る。
【０１３２】
１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換される好ましい実施形態において、置換は、例えば、以下の表で表される保存的置換であり得る。ある実施形態において、真ん中の列における同じカテゴリーのアミノ酸が互いに置換され、すなわち非極性アミノ酸が例えば別の非極性アミノ酸で置換される。ある実施形態において、最も右側の列における同じ行のアミノ酸が互いに置換される。
【０１３３】
【表１】
2021524278.tif 000002
【０１３４】
ある実施形態において、置換は、機能的に保存的であり得る。すなわち、ある実施形態において、置換は、同等の非置換の抗体分子と比較して、置換を含む抗体分子の１つ以上の機能特性（例えば、結合親和性）に影響を与えることはない（又は実質的に影響を与えることはない）。
【０１３５】
抗体分子の重鎖は、重鎖ＣＨ３ドメイン配列の直近のＣ末端にさらなるリジン残基（Ｋ）を任意選択的に含み得る。
【０１３６】
ＣＨ２ドメインは、Ｆｃγ受容体及び補体に結合することが知られている。ＣＨ２ドメインのＦｃγ受容体への結合は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に必要とされる一方、補体への結合は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に必要とされる。抗体分子が癌の治療に使用され、ＡＤＣの形態でない場合、ＡＤＣＣ活性は、癌細胞の殺滅をもたらすと予想され、したがって好ましくは保持されるべきである。しかしながら、抗体分子がＡＤＣの形態であり、生物活性分子にコンジュゲートされる場合、ＡＤＣＣ活性を低減又は抑制する突然変異は、生物活性分子が細胞に送達される前に、ＡＤＣＣを介した標的癌細胞の殺滅を回避するのに有益であると予想される。さらに、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を低減又は抑制する突然変異は、抗体分子が、本明細書に記載される免疫細胞抗原のための第２の抗原結合部位を含む場合に有益であると予想され、その場合、抗体分子によって結合された免疫細胞のＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ媒介性の殺滅は、回避されるべきである。
【０１３７】
したがって、抗体分子のＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲｌｌａ、ＦｃγＲｌｌｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどの１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体への結合を低減又は抑制する１つ以上の突然変異を含み得る。本発明者らは、Ｆｃγ受容体への結合を低減又は抑制することが、抗体分子によって媒介されるＡＤＣＣを低減するか又はなくすと仮定している。同様に、補体への結合を低減又は抑制することは、抗体分子によって媒介されるＣＤＣを低減するか又はなくすと予想される。ＣＨ２ドメインの、１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体への結合を低減又は抑制する突然変異は、当技術分野において公知である（Wang et al., 2018）。これらの突然変異は、Bruhns et al., 2009及びHezareh et al., 2001に記載される「ＬＡＬＡ突然変異」を含み、これは、アラニン（Ｌ１．３Ａ及びＬ１．２Ａ）によるＣＨ２ドメインの位置１．３及び１．２におけるロイシン残基の置換を含む。代わりに、ＣＨ２ドメインの位置８４．４におけるアスパラギン（Ｎ）をアラニン、グリシン又はグルタミン（Ｎ８４．４Ａ、Ｎ８４．４Ｇ又はＮ８４．４Ｑ）に突然変異させることによる、保存されたＮ−結合型グリコシル化部位の突然変異を介したａ−グリコシル抗体の産生は、ＩｇＧ１エフェクター機能を低下させることも知られている（Wang et al., 2018）。さらなる代替例として、補体活性化（Ｃ１ｑ結合）及びＡＤＣＣは、ＣＨ２ドメインの位置１１４におけるプロリンのアラニン又はグリシン（Ｐ１１４Ａ又はＰ１１４Ｇ）への突然変異によって低下されることが知られている（Idusogie et al., 2000；Klein et al., 2016）。これらの突然変異は、さらなる低下されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性を有するか又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性を有さない抗体分子を産生するためにも組み合わされ得る。
【０１３８】
したがって、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み得、ここで、ＣＨ２ドメインは、好ましくは、
（ｉ）１．３及び１．２位におけるアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位におけるアラニン若しくはグリシン；及び／又は
（ｉｉｉ）８４．４位におけるアラニン、グルタミン若しくはグリシン
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１３９】
好ましい実施形態において、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位におけるアラニン残基；及び
（ｉｉ）１．２位におけるアラニン残基
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１４０】
例えば、ＣＨ２ドメインは、ＬＡＬＡ突然変異を含み、且つ配列番号１７３に記載される配列を有し得る。
【０１４１】
別の好ましい実施形態において、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位におけるアラニン残基；
（ｉｉ）１．２位におけるアラニン残基；及び
（ｉｉｉ）１１４位におけるアラニン
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１４２】
例えば、ＣＨ２ドメインは、ＬＡＬＡ−ＰＡ突然変異を含み、且つ配列番号１７４に記載される配列を有し得る。
【０１４３】
ＭＳＬＮのためのＣＤＲベースの抗原結合部位を含み、且つ本明細書に記載される抗体分子と競合するか、又はＭＳＬＮにおける、本明細書に記載される抗体分子と同じエピトープに結合する抗体分子も考えられる。２つの抗体による抗原を巡る競合を決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、２つの抗体による抗原への結合の競合は、例えば、Biacore機器を用いて、表面プラズモン共鳴によって決定され得る。抗体によって結合されたエピトープをマッピングするための方法が同様に公知である。
【０１４４】
ＭＳＬＮのＮ末端領域は、ＭＵＣ１６と相互作用することが報告されている。この相互作用は、癌細胞接着に役割を果たし得ることが報告されている。
【０１４５】
抗体分子は、リガンド結合に対するある範囲の活性を有することが示された。例えば、抗体分子は、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックすることが可能であり得るか、又はＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックすることが可能であることはない。代わりに、抗体分子は、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合を促進することが可能であり得る。例えば、抗体分子は、抗体ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−０２４−０５３若しくはＦＳ２８−０２４又はその変異体のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖及び／又は軽鎖を含み得、ここで、抗体分子は、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックする。
【０１４６】
好ましい実施形態において、抗体分子は、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックしない。例えば、抗体分子は、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６又はその変異体のＣＤＲ１〜６、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖及び／又は軽鎖を含み得、ここで、抗体分子は、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックしない。
【０１４７】
ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックする抗体分子の能力を決定するのに好適な方法は、当技術分野において公知であり、ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースのアッセイ、例えば抗体が、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞など、ＭＳＬＮを発現する細胞への結合を巡ってＭＵＣ１６と結合を競合するアッセイを含む。
【０１４８】
好ましい実施形態において、抗体分子は、ＭＳＬＮのためのＣＤＲベースの抗原結合部位に加えて、１つ以上のさらなる抗原に結合する１つ以上のさらなる抗原結合部位を含み得る。１つ以上のさらなる抗原結合部位は、好ましくは、それらの同種抗原に特異的に結合する。
【０１４９】
１つ以上のさらなる抗原結合部位は、好ましくは、ＭＳＬＮに結合しない。したがって、抗体分子は、多重特異的、例えば二重特異的、三重特異的又は四重特異的分子、好ましくは二重特異的分子であり得る。好ましい実施形態において、抗体分子は、ＭＳＬＮ及び１つ以上のさらなる抗原に同時に結合することが可能である。
【０１５０】
抗体分子は、多重特異的、例えば二重特異的、三重特異的又は四重特異的抗体フォーマットを形成するために複数の異なる方法で組み合わされ得る個別のドメインを含むモジュール構造を有することが知られている。例示的な多重特異的抗体フォーマットは、例えば、Spiess et al. (2015)及びKontermann (2012)に記載されている。本発明の抗体分子は、このような多重特異的フォーマットで用いられ得る。
【０１５１】
例えば、本発明の抗体分子は、ヘテロ二量体抗体分子、例えばヘテロ二量体完全免疫グロブリン分子又はその断片であり得る。この場合、抗体分子の一部は、本明細書に記載される１つ又は複数の配列を有するであろう。例えば、本発明の抗体分子が二重特異的ヘテロ二量体抗体分子である場合、抗体分子は、ＭＳＬＮ以外の抗原に結合するか、又はＭＳＬＮ上の別のエピトープにさらに結合する、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをそれぞれ含む重鎖及び軽鎖と対合される本明細書に記載される重鎖及び軽鎖を含み得る。ヘテロ二量体抗体を調製するための技術は、当技術分野において公知であり、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）技術を含み、これは、鎖のヘテロ二量体化を促進するために「ノブ」又は「ホール」のいずれかを形成するように抗体分子のＣＨ３ドメインを操作することを含む。代わりに、ヘテロ二量体抗体は、静電反発力によってＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避し、静電引力によってヘテロ二量体化を指向するための、抗体分子中への電荷対の導入によって調製され得る。ヘテロ二量体抗体フォーマットの例としては、CrossMab、ｍＡｂ−Ｆｖ、ＳＥＥＤ−ボディ及びｋｉｈ  ＩｇＧが挙げられる。
【０１５２】
代わりに、多重特異的抗体分子は、完全免疫グロブリン分子又はその断片及び１つ若しくは複数のさらなる抗原結合部分を含み得る。抗原結合部分は、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体であり得、完全免疫グロブリン分子又はその断片に融合され得る。完全免疫グロブリン分子に融合されたさらなる抗原結合部分を含む多重特異的抗体分子の例としては、ＤＶＤ−ＩｇＧ、ＤＶＩ−ＩｇＧ、ｓｃＦｖ４−ＩｇＧ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ−ＩｇＧ分子が挙げられる（Spiess et al., 2015；図１）。免疫グロブリン断片に融合されたさらなる抗原結合部分を含む多重特異的抗体分子の例としては、例えば、ＢｉＴＥ分子、二重特異性抗体及びＤＡＲＴ分子が挙げられる（Spiess et al., 2015；図１）。他の好適なフォーマットは、当業者に容易に明らかになるであろう。
【０１５３】
好ましい実施形態において、抗体分子は、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を含み、第２の抗原結合部位は、抗体分子の定常ドメイン中に位置する。例えば、抗体分子は、ｍＡｂ２（ＴＭ）二重特異的抗体であり得る。本明細書において言及されるｍＡｂ２二重特異的抗体は、その可変領域のそれぞれにおけるＣＤＲベースの抗原結合部位及び抗体分子の定常ドメイン中の少なくとも１つの抗原結合部位を含むＩｇＧ免疫グロブリンである。
【０１５４】
好ましい実施形態において、抗体は、ＭＳＬＮ及び第２の抗原に結合する抗体分子であり、抗体分子は、
（ｉ）免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによってそれぞれ形成される、ＭＳＬＮのための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｉｉ）抗体分子の２つのＣＨ３ドメイン中に位置する第２の抗原に結合する２つの抗原結合部位
を含む。
【０１５５】
より好ましい実施形態において、抗体は、完全免疫グロブリン分子、例えばＭＳＬＮ及び第２の抗原に結合する完全ＩｇＧ１分子であり、抗体分子は、
（ｉ）免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによってそれぞれ形成される、ＭＳＬＮのための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｉｉ）抗体分子の２つのＣＨ３ドメイン中に位置する第２の抗原に結合する２つの抗原結合部位
を含み；
ここで、免疫グロブリン分子は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＬドメインをさらに含む。
【０１５６】
第２の抗原のための抗原結合部位は、抗体分子の任意の定常ドメイン中に位置し得る。例えば、第２の抗原のための抗原結合部位は、ＣＨ４、ＣＨ３、ＣＨ２、ＣＨ１又はＣＬドメインの１つ以上、好ましくはＣＨ３又はＣＨ２ドメイン、最も好ましくはＣＨ３ドメインに位置し得る。
【０１５７】
抗原結合部位は、１つ以上、例えば１つ、２つ、３つ又はそれを超える、抗体分子の定常ドメインの構造ループから構成され得る。
【０１５８】
抗体定常ドメインの構造ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ及びＦＧ構造ループを含む。抗原結合部位は、定常ドメインのＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ及びＦＧ構造ループの２つ以上、好ましくはＡＢ及びＥＦ構造ループ又はＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループを含み得る。
【０１５９】
抗体定常ドメインにおける構造ループの位置は、当技術分野において周知である。例えば、ＣＨ３ドメインの構造ループは、ＣＨ３ドメインの１０及び１９位間（ＡＢループ）、２８及び３９位間（ＢＣループ）、４２及び７９位間（ＣＤループ）、８２及び８５位間（ＤＥループ）、９１及び１０２位間（ＥＦループ）並びに１０６及び１１７位間（ＦＧループ）に位置し、ここで、残基は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って番号付けされる。他の定常ドメインにおける構造ループ位置の場所は、容易に決定され得る。
【０１６０】
定常ドメインの構造ループは、第２の抗原のための抗原結合部位を形成するために１つ以上のアミノ酸修飾を含み得る。１つ以上のアミノ酸修飾は、アミノ酸置換、付加又は欠失を含み得る。標的抗原のための抗原結合部位を形成するための抗体定常ドメインの構造ループ領域中へのアミノ酸修飾の導入は、当技術分野において周知であり、例えばWozniak-Knopp G et al., 2010、国際公開第２００６／０７２６２０号及び国際公開第２００９／１３２８７６号に記載されている。定常ドメイン結合部位の例が以下に示される。
【０１６１】
好ましい実施形態において、抗体分子は、ＡＢ、ＣＤ及び／又はＥＦ構造ループ、好ましくはＡＢ及びＥＦ構造ループ又はＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ中の１つ以上のアミノ酸修飾（置換、付加及び／又は欠失）を含む。例えば、抗体分子は、本明細書に記載される第２の抗原のための抗原結合部位を提供するために、ＣＨ３ドメインの１１〜１８、４３〜７８及び／又は９２〜１０１位、好ましくはＣＨ３ドメインの１１〜１８及び９２〜１０１又は１１〜１８、４３〜７８及び９２〜１０１位に１つ以上のアミノ酸修飾（置換、付加及び／又は欠失）を含み得る。より好ましくは、抗体分子は、本明細書に記載される第２の抗原のための抗原結合部位を提供するために、ＣＨ３ドメインの１２〜１８、４５．１から７８、９２から９４及び／又は９７〜９８位、より好ましくは１２〜１８、９２から９４及び９７〜９８位又はＣＨ３ドメインの１２〜１８、４５．１から７８、９２から９４及び９７〜９８位に１つ以上のアミノ酸修飾（置換、付加及び／又は欠失）を含む。非修飾ＣＨ３ドメインは、好ましくは、配列番号１７２に記載される配列を含むか又はそれからなる。残基番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１６２】
抗体分子の第２の抗原結合部位によって結合される第２の抗原は、免疫細胞抗原、好ましくは腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり得る。ＴＮＦＲＳＦ受容体は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）の１つ以上のリガンドに結合する細胞外システインリッチドメインを含む膜結合サイトカイン受容体である。
【０１６３】
ＴＮＦＲＳＦ受容体は、好ましくは、免疫細胞、例えばＴ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ＮＫ細胞及び／又はＢ細胞、好ましくはＴ細胞の表面に位置する。ＴＮＦＲＳＦリガンドの結合時、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、免疫細胞を活性化する免疫細胞表面上にクラスターを形成する。例えば、リガンド結合ＴＮＦＲＳＦ受容体は、三量体などの多量体又は多量体のクラスターを形成し得る。リガンド−結合ＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスターの存在は、免疫細胞を活性化する細胞内シグナル伝達経路を刺激する。
【０１６４】
理論に制約されることを望むものではないが、腫瘍細胞表面上のＭＳＬＮ及び免疫細胞表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体の両方を嵌合することにより、抗体分子は、ＭＳＬＮへの結合によって架橋され、それによりＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化及び活性化、したがって免疫細胞の活性化を引き起こすと考えられる。換言すると、抗体分子は、両方の標的が結合されるとき、ＴＮＦＲＳＦ受容体アゴニストとしての役割を果たす。次に、活性化された免疫細胞は、細胞表面に結合されたＭＳＬＮを発現する癌に対する免疫応答を開始させるか、促進するか又はそれに関与し得る。免疫系が癌細胞を認識及び根絶する際に果たす役割の概説は、Chen and Mellman (2013)によって提供される。
【０１６５】
抗体分子は、Ｆｃγ受容体への結合によって架橋され得るが、これは、非効率的であり、Ｆｃγ受容体発現細胞がヒト身体全体に存在する際、特定の位置、例えば疾患の部位に標的化することができない。したがって、好ましい実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ受容体のための第２の抗原結合部位を含む抗体分子は、本明細書に記載される１つ以上のＦｃγ受容体への結合を低減又は抑制する１つ又は突然変異を含む。
【０１６６】
本発明者らは、ＭＳＬＮ及びＴＮＦＲＳＦ受容体の両方のための結合部位を含む二重特異的分子、特にＴＮＦＲＳＦ受容体のための２つの定常ドメイン結合部位及びＭＳＬＮのための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位を含むｍＡｂ２分子を用いて、ＭＳＬＮ及びＴＮＦＲＳＦ受容体の両方への抗体分子の結合がＴ細胞活性化を誘発するか又は促進することを示した。
【０１６７】
ＭＳＬＮ及びＴＮＦＲＳＦ受容体への結合時にのみＴ細胞などの免疫細胞を活性化するか、又はその免疫細胞活性化活性がＭＳＬＮ及びＴＮＦＲＳＦ受容体への結合時に促進される、ＴＮＦＲＳＦ受容体のための第２の抗原結合部位を含む抗体分子は、コンディショナルなアゴニストとも呼ばれる。この免疫細胞活性化活性は、抗体分子の、Ｆｃγ受容体及び／又は外部の架橋剤、例えばプロテインＡ又はＧ又は二次抗体への結合とは無関係であり、したがって抗体分子のコンディショナルなアゴニスト活性が、ＭＳＬＮ及びＴＮＦＲＳＦの両方が存在する部位に標的化されることを可能にする。ＭＳＬＮが腫瘍抗原である場合、抗体分子は、腫瘍の部位で選択的にＴ細胞などの免疫細胞を活性化し得、個体における他の箇所で活性化しない。
【０１６８】
ＭＳＬＮ及びＴＮＦＲＳＦ受容体への結合時にのみＴ細胞などの免疫細胞を活性化する抗体分子は、外部の架橋剤などの他の機構による架橋又はＦｃγ受容体相互作用による架橋に依存する抗体分子と比較して増加した免疫細胞活性化活性を有し得る。ＴＮＦＲＳＦ受容体の活性化がより効率的であるため、免疫細胞活性化は、他の抗ＴＮＦＲＳＦ抗体分子と比べてより低い濃度の本明細書に記載される抗体分子で達成され得る。
【０１６９】
本発明の抗体分子が、Ｔ細胞上に存在するＴＮＦＲＳＦ受容体のための第２の抗原結合部位を含む場合、抗体分子は、抗体分子が架橋されていない場合より、抗体分子が例えばＭＳＬＮへの結合によって架橋される場合に好ましくはＴ細胞などの免疫細胞の増加した活性化を誘発する。
【０１７０】
Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、Ｔ細胞活性化アッセイを用いて測定され得る。Ｔ細胞は、活性化時にＩＬ−２を放出する。したがって、Ｔ細胞活性化アッセイは、抗体分子によって誘発されるＴ細胞活性化のレベルを決定するためにＩＬ−２放出を測定し得る。
【０１７１】
例えば、Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、抗体分子が架橋される場合、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によるＩＬ−２の最大半量放出を達成するのに必要な抗体分子の濃度を測定することによって決定され得る。これは、抗体分子のＥＣ５０とも呼ばれる。より低いＥＣ５０は、より低い濃度の抗体分子が、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によるＩＬ−２の最大半量放出を達成するのに必要とされること及びしたがって抗体分子がより高いＴ細胞活性化活性を有することを示す。抗体分子は、例えば、抗ＣＨ２抗体を用いて架橋され得る。
【０１７２】
加えて又は代わりに、Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、抗体分子の存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度を測定することによって決定され得、ここで、抗体分子は、架橋されている。
【０１７３】
好ましい実施形態において、抗体分子（例えば、Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００３を含むｍＡｂ２フォーマットにおける）は、例えば、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞への結合によって架橋される場合、同じアッセイにおけるＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＦＳ２８−２５６−２７１のＥＣ５０の５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１０倍又は５倍以内であるＴ細胞活性化アッセイにおけるＥＣ５０を有し、ここで、ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＦＳ２８−２５６−２７１は、配列番号１８７の重鎖及び配列番号１８８の軽鎖からなる。
【０１７４】
例えば、架橋される場合の抗体分子は、架橋される場合、３０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１４ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１．５ｎＭ、１ｎＭ又は０．５ｎＭ以下、好ましくは１．５ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ、最も好ましくは０．５ｎＭ以下の、初代Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＥＣ５０を有し得る。
【０１７５】
加えて又は代わりに、Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、架橋された抗体分子の存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度を測定することによって決定され得る。
【０１７６】
好ましい実施形態において、例えばＮＣＩ−Ｈ２２６細胞への結合によって架橋される場合、抗体分子（例えば、Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００３を含むｍＡｂ２フォーマットにおける）の存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度は、同じアッセイにおいてＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＦＳ２８−２５６−２７１の存在下でＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度の２０％又は１０％以内であり、ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＦＳ２８−２５６−２７１は、配列番号１８７の重鎖及び配列番号１８８の軽鎖からなる。
【０１７７】
例えば、Ｔ細胞アッセイは、第２の抗原結合部位によって結合されるＴＮＦＲＳＦ受容体に応じてｐａｎ−Ｔ細胞活性化アッセイ又はＣＤ８＋  Ｔ活性化細胞アッセイであり得る。例えば、ＴＮＦＲＳＦ受容体がＯＸ４０である場合、ｐａｎ−Ｔ細胞アッセイが好適である一方、ＴＮＦＲＳＦ受容体がＣＤ１３７である場合、ＣＤ８＋  Ｔ細胞アッセイが好適である。
【０１７８】
例えば、ｐａｎ−Ｔ細胞活性化アッセイは、白血球除去錐体細胞からヒトＰＢＭＣを単離することを含み得る。ＰＢＭＣを単離するための方法は、当技術分野において公知である。次に、Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから単離され得る。ＰＢＭＣからＴ細胞を単離するための方法も当技術分野において公知である。
【０１７９】
Ｔ細胞活性化アッセイは、例えば、Ｔ細胞培地などの好適な培地中で必要数のＴ細胞を調製することを含み得る。必要数のＴ細胞は、１．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で調製され得る。次に、Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化に必要とされるシグナルを提供する好適なＴ細胞活性化試薬を用いて刺激され得る。例えば、Ｔ細胞活性化試薬は、ＣＤ３及びＣＤ２８を含むビーズなど、ＣＤ３及びＣＤ２８を含む試薬であり得る。単離されたＴ細胞は、Ｔ細胞を活性化するためにＴ細胞活性化試薬とともに一晩インキュベートされ得る。この後、活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化試薬からＴ細胞を分離するために洗浄され、２．０×１０６個の細胞／ｍｌなどの好適な濃度においてＴ細胞培地中で再懸濁され得る。次に、活性化Ｔ細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体で被覆されたプレートに加えられ得る。
【０１８０】
各試験抗体分子の好適な希釈物が調製され、ウェルに加えられ得る。次に、Ｔ細胞は、試験抗体とともに２４時間にわたって３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートされ得る。上清が収集され、上清中のＩＬ−２の濃度を決定するためにアッセイされ得る。溶液中のＩＬ−２の濃度を決定するため方法は、当技術分野において公知であり、本発明の実施例に記載されている。ヒトＩＬ−２の濃度は、抗体分子のlog濃度に対してプロットされ得る。得られた曲線は、log（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングされ得る。
【０１８１】
例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化アッセイは、白血球除去錐体細胞からヒトＰＢＭＣを単離することを含み得る。ＰＢＭＣを単離するための方法は、当技術分野において公知である。次に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから単離され得る。ＰＢＭＣからＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離するための方法も当技術分野において公知である。
【０１８２】
次に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体で被覆された多層プレートに加えられ得る。各試験抗体分子の好適な希釈物が調製され、ウェルに加えられ得る。次に、Ｔ細胞は、試験抗体とともに２４時間にわたって３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートされ得る。上清が収集され、上清中のＩＬ−２の濃度を決定するためにアッセイされ得る。溶液中のＩＬ−２の濃度を決定するための方法は、当技術分野において公知であり、本発明の実施例に記載されている。ヒトＩＬ−２の濃度は、抗体分子のlog濃度に対してプロットされ得る。得られた曲線は、log（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングされ得る。
【０１８３】
ＴＮＦＲＳＦ受容体としては、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＥＤＡ２Ｒ、ＥＤＡＲ、ＦＡＳ、ＬＴＢＲ、ＲＥＬＴ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９（ＣＤ１３７）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ−１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２１及びＴＮＦＲＳＦ２５が挙げられる。
【０１８４】
好ましい実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０）である。
【０１８５】
別の好ましい実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、ＴＮＦＲＳＦ９（ＣＤ１３７）である。
【０１８６】
ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７：遺伝子ＩＤ  ９３９）は、ＮＰ＿００１２３３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２４２．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５：遺伝子ＩＤ  ９５８）は、ＮＰ＿００１２４１．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２５０．５の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥＤＡ２Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ２７：遺伝子ＩＤ  ６０４０１）は、ＮＰ＿００１１８６６１６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１１９９６８７．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥＤＡＲ（遺伝子ＩＤ  １０９１３）は、ＮＰ＿０７１７３１．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０２２３３６、３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＦＡＳ（ＴＮＦＲＳＦ６：遺伝子ＩＤ  ３５５）は、ＮＰ＿００００３４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００００４３．５の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＬＴＢＲ（ＴＮＦＲＳＦ３：遺伝子ＩＤ  ４０５５）は、ＮＰ＿００１２５７９１６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２７０９８７．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＲＥＬＴ（ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ：遺伝子ＩＤ  ８４９５７）は、ＮＰ＿１１６２６０．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０３２８７１．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（遺伝子ＩＤ  ７１３２）は、ＮＰ＿００１０５６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０６５．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（遺伝子ＩＤ  ７１３３）は、ＮＰ＿００１０５７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０６６．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ４（遺伝子ＩＤ  ７２９３）は、ＮＰ＿００３３１８の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３３２７の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。）ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（遺伝子ＩＤ  ８７７１）は、ＮＰ＿００３８１４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８２３．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ８（遺伝子ＩＤ  ９４３）は、ＮＰ＿００１２３４．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２４３．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ９（遺伝子ＩＤ  ３６０４）は、ＮＰ＿００１５５２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ００１５６１）の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（遺伝子ＩＤ  ８７９７）は、ＮＰ＿００３８３５．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４４．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（遺伝子ＩＤ  ８７９５）は、ＮＰ＿００３８３３．４の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４２．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（遺伝子ＩＤ  ８７９４）は、ＮＰ＿００３８３２．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４１．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（遺伝子ＩＤ  ８７９３）は、ＮＰ＿００３８３１．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４０．４の基準ヌク��オチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（遺伝子ＩＤ  ８７９２）は、ＸＰ＿０１１５２４５４７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＸＭ＿１１５２６２４５．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（遺伝子ＩＤ  ４９８２）は、ＮＰ＿００２５３７．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００２５４６．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（遺伝子ＩＤ  ５１３３０）は、ＮＰ＿０５７７２３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１６６３９．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（遺伝子ＩＤ  ２３４９５）は、ＮＰ＿００３６５８４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１２４５２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（遺伝子ＩＤ  １１５６５０）は、ＮＰ＿４４３１７７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０５２９４５．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１４（遺伝子ＩＤ  ８７６４）は、ＮＰ＿００１２８４５３４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２９７６０５．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１７（遺伝子ＩＤ  ６０８）は、ＮＰ＿００１１８３．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１１９２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１８（遺伝子ＩＤ  ８７８４）は、ＮＰ＿００４１９５．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００４１８６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１９（遺伝子ＩＤ  ５５５０４）は、ＮＰ＿００１１９１３８７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２０４４５８．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＮＦＲＳＦ２１（遺伝子ＩＤ  ２７２４２）は、ＮＰ＿０５５２６７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１４４５２．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３：遺伝子ＩＤ  ８７１８）は、リガンドＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ）に結合し、ＮＰ＿００１０３４７５３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０３９６６４．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１８７】
ある実施形態において、抗体分子は、抗体分子の定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメイン中に抗原結合部位を含むことはない。例えば、抗体分子は、抗体分子のＣＨ３ドメインなどの定常ドメイン中にＣＤ１３７に結合する抗原結合部位を含むことはない。特に、抗体分子は、抗体分子の定常ドメイン中にＣＤ１３７抗原結合部位を含むことはなく、ここで、抗原結合部位は、定常ドメインの１つ以上の構造ループ中の修飾、例えば定常ドメインのＡＢ、ＣＤ及び／又はＥＦ構造ループ中の１つ以上の修飾を含む。特定の実施形態において、抗体分子は、ＣＨ３ドメインのＡＢ及びＥＦ構造ループのそれぞれに位置する第１の配列及び第２の配列を含む抗体分子のＣＨ３ドメイン中に位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含むことはなく、ここで、第１及び第２の配列は、配列番号１９８及び１９９［ＦＳ２２−１７２−００３］にそれぞれ記載される配列を有する。例えば、抗体分子は、配列番号２００及び２０１［ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＦＳ２８−２５６−２７１］に記載される軽鎖及び重鎖配列を含むことはない。
【０１８８】
抗体分子は、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。この場合、抗体分子は、コンジュゲートと呼ばれ得る。このようなコンジュゲートは、本明細書に記載される疾患の治療及び／又は診断に利用される。
【０１８９】
例えば、生物活性分子は、サイトカイン、好ましくはヒトサイトカインなどの免疫系調節剤であり得る。例えば、サイトカインは、Ｔ細胞活性化及び／又は増殖を刺激するサイトカインであり得る。抗体分子へのコンジュゲーションのためのサイトカインの例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γが挙げられる。
【０１９０】
代わりに、生物活性分子は、サイトカインのリガンドトラップ、例えばＴＧＦ−β又はＩＬ−６のリガンドトラップなどのリガンドトラップであり得る。
【０１９１】
さらなる代替例として、生物活性分子は、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ又はＧＩＴＲＬなどのリガンドであり得る。
【０１９２】
さらなる代替例として、生物活性分子は、チューブリン重合の阻害剤（例えば、アウリスタチン）、チューブリン脱重合剤（例えば、マイタンシン）、ＤＮＡ鎖切断誘導剤（例えば、カリケアミシン）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、デュオカルマイシン）又はＲＮＡポリメラーゼ阻害剤（α−アマニチンなど）などの薬物であり得る。
【０１９３】
さらに他の代替例として、生物活性分子は、治療用放射性同位体であり得る。
【０１９４】
放射免疫療法は、例えば、癌治療に使用される。放射免疫療法に好適な治療用放射性同位体は、当技術分野において公知であり、イットリウム−９０、ヨウ素−１３１、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、ルテチウム１７７、レニウム−１８８、銅−６７、アクチニウム−２２５、ヨウ素−１２５が挙げられる。
【０１９５】
抗体分子にコンジュゲートされ得る好適な検出可能な標識は、当技術分野において公知であり、放射性同位体、例えばヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、インジウム−１１１及びテクネチウム−９９；蛍光色素、例えばフルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、Texas Red及びシアニン色素誘導体、例えばCy7及びAlexa750；発色性色素、例えばジアミノベンジジン；ラテックスビーズ；酵素標識、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ；スペクトル的に分離された吸収若しくは発光特性を有する蛍光又はレーザー色素；及び特定の同種検出可能部分、例えば標識されたアビジンへの結合を介して検出され得る、ビオチンなどの化学部分が挙げられる。
【０１９６】
抗体分子は、任意の好適な共有結合又は非共有結合、例えばジスルフィド又はペプチド結合により、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。生物活性分子がサイトカインである場合、サイトカインは、ペプチドリンカーによって抗体分子に結合され得る。好適なペプチドリンカーは、当技術分野において公知であり、５から２５、５から２０、５から１５、１０から２５、１０から２０又は１０から１５アミノ酸長であり得る。
【０１９７】
ある実施形態において、生物活性分子は、切断可能なリンカーによって抗体分子にコンジュゲートされ得る。リンカーは、治療の部位における抗体分子からの生物活性分子の放出を可能にし得る。リンカーは、アミド結合（例えば、ペプチドリンカー）、ジスルフィド結合又はヒドラゾンを含み得る。ペプチドリンカーは、例えば、部位特異的プロテアーゼによって切断され得、ジスルフィド結合は、サイトゾルの還元環境によって切断され得、ヒドラゾンは、酸媒介性加水分解によって切断され得る。
【０１９８】
コンジュゲートは、抗体分子及び生物活性分子を含む融合タンパク質であり得る。この場合、生物活性分子は、ペプチドリンカー又はペプチド結合によって抗体分子にコンジュゲートされ得る。抗体分子が多連鎖分子である場合、例えば抗体分子がＦｃａｂであるか若しくはそれを含むか又はｍＡｂ２である場合、生物活性分子は、抗体分子の１つ以上の鎖にコンジュゲートされ得る。例えば、生物活性分子は、ｍＡｂ２分子の重鎖の一方又は両方にコンジュゲートされ得る。融合タンパク質は、産生及び精製するのが容易であるという利点を有し、臨床グレードの材料の製造を容易にする。
【０１９９】
本発明は、本発明の抗体分子をコードする１つ又は複数の単離された核酸分子も提供する。当業者には、当技術分野において周知の方法を用いて、このような核酸分子を調製するのに何らの困難もない。
【０２００】
１つ又は複数の核酸分子は、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３又はＦＳ２８−０２４、好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１又はＦＳ２８−０２４−０５２、最も好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、好ましくはＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードし得る。
【０２０１】
例えば、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３及びＦＳ２８−０２４のＶＨドメインをコードする核酸分子は、配列番号１８１、４０、１１０、１１０、１２２、１１０、１２２、１１０、６４、６４、１１６、１２２、７０、３１、５０及び９にそれぞれ記載される。
【０２０２】
抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３及びＦＳ２８−０２４のＶＬドメインをコードする核酸分子は、配列番号５７、１９、９４、８０、９４、５４、５４、５７、９４、５４、８０、８０、８０、１９、１９及び１９にそれぞれ記載される。
【０２０３】
好ましい実施形態において、核酸分子は、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３又はＦＳ２８−０２４、好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１又はＦＳ２８−０２４−０５２、最も好ましくは抗体ＦＳ２８−２５６−２７１の重鎖及び／又は軽鎖、好ましくは重鎖及び軽鎖をコードする。
【０２０４】
例えば、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３及びＦＳ２８−０２４の重鎖（ＬＡＬＡ突然変異を有する）をコードする核酸分子は、配列番号１７９、３８、１０８、１０８、１２６、１０８、１２６、１０８、８４、８４、１２０、１２６、６８、２９、４８及び７にそれぞれ記載される。
【０２０５】
例えば、抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３及びＦＳ２８−０２４の重鎖（ＬＡＬＡ突然変異を有さない）をコードする核酸分子は、配列番号１７７、３６、１０６、１０６、１２４、１０６、１２４、１０６、８２、８８、１１８、１２４、６６、２７、４６及び６にそれぞれ記載される。
【０２０６】
抗体ＦＳ２８−２５６−２７１、ＦＳ２８−０２４−０５２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６、ＦＳ２８−２５６−０２７、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６、ＦＳ２８−０２４−０５１、ＦＳ２８−０２４−０５３及びＦＳ２８−０２４の軽鎖をコードする核酸分子は、配列番号９６、１７、９２、７８、９２、９１、９１、９６、９２、９１、７８、７８、７８、１７、１７及び１７にそれぞれ記載される。
【０２０７】
核酸が、本発明の抗体分子のＶＨ及びＶＬドメイン又は重鎖及び軽鎖をコードする場合、２つのドメイン又は鎖は、２つの別個の核酸分子上でコードされ得る。
【０２０８】
単離された核酸分子は、本発明の抗体分子を発現させるのに使用され得る。核酸は、一般に、発現のために組み換えベクターの形態で提供される。したがって、本発明の別の態様は、上述される核酸を含むベクターを提供する。必要に応じて、プロモータ配列、ターミネータ断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む適切な制御配列を含有する好適なベクターが選択又は構築され得る。好ましくは、ベクターは、宿主細胞内の核酸の発現を引き起こすために適切な制御配列を含有する。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えばファージ又はファージミドであり得る。
【０２０９】
本明細書に記載される核酸分子又はベクターは、宿主細胞中に導入され得る。宿主細胞中への核酸又はベクターの導入のための技術は、当技術分野において十分に確立されており、任意の好適な技術が用いられ得る。組み換え抗体分子の産生に好適な様々な宿主細胞が当技術分野において公知であり、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物宿主細胞を含む。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳ０又はＨＥＫ細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞である。
【０２１０】
本発明の別の態様は、本発明の抗体分子を産生する方法であって、宿主細胞内で抗体分子をコードする核酸を発現させること及び任意選択的にこのように産生された抗体分子を単離及び／又は精製することを含む方法を提供する。宿主細胞を培養するための方法は、当技術分野において周知である。本方法は、抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含み得る。組み換え抗体分子の精製のための技術は、当技術分野において周知であり、例えばプロテインＡ又はプロテインＬを用いた、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又はアフィニティークロマトグラフィーを含む。ある実施形態において、精製は、抗体分子上でアフィニティータグを用いて行われ得る。本方法は、任意選択的に、薬学的に許容される賦形剤又は後述される他の物質を用いて、抗体分子を医薬組成物に製剤化することも含み得る。
【０２１１】
上記に説明されるように、ＭＳＬＮは、腫瘍細胞の表面において発現され、高い発現レベルの可溶性ＭＳＬＮは、いくつかの癌における予後不良と相関しているとされてきた。抗ＭＳＬＮ抗体は、抗癌治療剤として研究されている。これらの抗ＭＳＬＮ抗体は、それらのＡＤＣＣ活性によって直接の細胞殺滅を誘導するか又はＡＤＣの形態で使用される。
【０２１２】
したがって、本明細書に記載される抗体分子は、癌の治療に利用されると予想される。したがって、本発明の関連する態様は、以下を提供する：
（ｉ）個体における癌を治療する方法に使用するための、本明細書に記載される抗体分子、
（ｉｉ）個体における癌の治療に使用するための薬剤の製造における、本明細書に記載される抗体分子の使用；及び
（ｉｖ）個体における癌を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載される抗体分子を個体に投与することを含む方法。
【０２１３】
個体は、患者、好ましくはヒト患者であり得る。
【０２１４】
本発明の抗体分子は、可溶性ＭＳＬＮと比較して、癌細胞の表面に存在するＭＳＬＮに優先的に結合することが示されている。したがって、本発明の抗体分子を用いて治療される癌は、好ましくは、ＭＳＬＮを発現するか又はそれを発現することが分かっている。より好ましくは、治療される癌の細胞は、それらの細胞表面にＭＳＬＮを含むか又はそれを含むことが分かっており、すなわち細胞表面に結合されたＭＳＬＮを含むことが分かっている。
【０２１５】
抗体分子が例えば抗体分子の定常ドメイン中のＴＮＦＲＳＦメンバーなどの免疫細胞抗原のための第２の抗原結合部位を含む場合、癌は、好ましくは、ＴＮＦＲＳＦメンバーを発現する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含むか又はそれを含むことが分かっている。具体的には、ＴＩＬは、好ましくは、それらの細胞表面にＴＮＦＲＳＦメンバーを含むか又はそれを含むことが分かっている。
【０２１６】
細胞表面における抗原の存在を決定するための方法は、当技術分野において公知であり、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。
【０２１７】
癌は、原発性癌又は二次癌であり得る。したがって、本明細書に記載される抗体分子は、個体における癌を治療する方法に使用するためのものであり得、ここで、癌は、原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である。
【０２１８】
本発明の抗体分子を用いて治療される癌は、固形癌であり得る。
【０２１９】
癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌、肺癌（小細胞肺癌及び非小細胞肺癌など）、食道癌、乳癌、胃癌、胆管癌、結腸癌、胸腺癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肉腫（二相型滑液肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫若しくは軟部組織肉腫）、線維形成性小細胞腫瘍、白血病（急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、有毛細胞白血病若しくは骨髄性白血病など）、副腎皮質癌、膀胱癌、脳腫瘍、子宮頸癌、子宮頸部過形成、精巣絨毛癌、本態性血小板血症、泌尿生殖器癌、神経膠腫、膠芽細胞腫、リンパ腫（ホジキン病若しくは非ホジキンリンパ腫など）、悪性カルチノイド癌腫、悪性高カルシウム血症、黒色腫（悪性黒色腫とも呼ばれる）、悪性膵インスリノーマ、甲状腺髄様癌、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、神経芽細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、原発性マクログロブリン血症、前立腺癌、腎細胞癌、皮膚癌、扁平上皮細胞癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌及びウィルムス腫瘍からなる群から選択され得る。
【０２２０】
好ましくは、癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、胆管癌、結腸癌、胸腺癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、二相型滑液肉腫及び線維形成性小細胞腫瘍からなる群から選択される。
【０２２１】
より好ましくは、癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌及び肺癌からなる群から選択される。
【０２２２】
癌は、悪性癌細胞の異常増殖によって特徴付けられる。乳癌などの特定のタイプの癌が言及される場合、これは、乳房組織などの関連する組織の悪性細胞の異常増殖を指す。乳房に位置するが、卵巣組織などの別の組織の悪性細胞の異常増殖の結果である二次癌は、本明細書において言及される際、乳癌ではなく、卵巣癌である。
【０２２３】
癌に関して、治療は、完全な癌の寛解を含む、癌成長を阻害すること及び／又は癌転移を阻害すること並びに癌の再発を阻害することを含み得る。癌成長は、一般に、より発達した形態への癌内の変化を示すいくつかの指標のいずれか１つを指す。したがって、癌成長の阻害を測定するための指標としては、癌細胞生存の減少、腫瘍体積若しくは形態の減少（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査若しくは他のイメージング方法を用いて決定される際）、遅延した腫瘍成長、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏症皮膚試験の改善した成績、抗癌免疫細胞若しくは他の抗癌免疫応答の活性の増加及び腫瘍特異的抗原のレベルの低下が挙げられる。個体における癌性腫瘍に対する免疫応答を活性化又は促進することは、癌成長、特に対象中に既に存在する癌の成長に抵抗し、及び／又は個体における癌成長の傾向を低下させる個体の能力を向上させ得る。
【０２２４】
抗体分子は、単独で投与され得るが、抗体分子は、通常、抗体分子に加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与されるであろう。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載される抗体分子を含む医薬組成物を提供する。抗体分子を医薬組成物に製剤化することを含む方法も提供される。
【０２２５】
医薬組成物は、抗体分子に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。本明細書において使用される際の「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、妥当なリスク・ベネフィット比に見合う、対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物及び／又は剤形に関する。各担体、賦形剤などは、製剤の他の成分と適合するという意味でも「許容され」なければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、投与経路は、後述されるように、注入、注射又は任意の他の好適な経路によるものであり得る。
【０２２６】
例えば、注射による、非経口、例えば皮下又は静脈内投与のため、抗体分子を含む医薬組成物は、パイロジェンフリーであり、且つ好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口で許容される水溶液の形態であり得る。当業者は、例えば、等張ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、ラクトリンゲル注射液を用いて好適な溶液を調製することが十分にできる。緩衝液、例えばリン酸、クエン酸及び他の有機酸；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジン；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の糖質；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤及び／又は他の添加剤が必要に応じて用いられ得る。
【０２２７】
ある実施形態において、抗体分子は、投与前に再構成のために凍結乾燥形態で提供され得る。例えば、凍結乾燥された抗体分子は、滅菌水で再構成され、個体への投与前に生理食塩水と混合され得る。
【０２２８】
投与は、「治療有効量」であり得、これは、個体への利益を示すのに十分なものである。投与される実際の量並びに投与の速度及び時間的経過は、治療されるものの性質及び重症度、治療される特定の個体、個体の臨床症状、障害の原因、組成物の送達の部位、抗体分子のタイプ、投与の方法、投与のスケジューリング及び医師に公知の他の要因に依存する。治療の処方、例えば投与量に関する決定などは、一般医師及び他の医師の責任に含まれ、症状の重症度及び／又は治療される疾患の進行に依存し得る。抗体分子の適切な用量は、当技術分野において周知である（Ledermann et al., 1991；Bagshawe et al., 1991）。本明細書又は投与される抗体分子について適切な場合、the Physician’s Desk Reference (2003)に示される特定の投与量が使用され得る。抗体分子の治療有効量又は好適な用量は、動物モデルにおけるインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定され得る。マウス及び他の試験動物における有効な投与量をヒトに当てはめるための方法は、公知である。正確な用量は、治療される部位のサイズ及び位置がどうであるか並びに抗体分子の正確な性質を含むいくつかの要因に依存する。
【０２２９】
典型的な抗体用量は、全身適用では１００μｇから１ｇの範囲であり、局所適用では１μｇから１ｍｇの範囲である。初期のより多い負荷用量、その後、１回以上のより少ない用量が投与され得る。これは、成人個体の単回の治療のための用量であり、これは、小児及び幼児のために比例的に調整され得、また分子量に比例して他の抗体フォーマットのために調整され得る。
【０２３０】
治療は、医師の判断で、毎日、週に２回、１週間又は１か月間隔で繰り返され得る。個体のための治療スケジュールは、抗体組成物の薬物動態及び薬力学的特性、投与経路及び治療される病態の性質に依存し得る。
【０２３１】
治療は、定期的であり得、投与間の期間は、約２週間以上、例えば約３週間以上、約４週間以上、１か月以上で約１回、約５週間以上又は約６週間以上であり得る。例えば、治療は、２から４週間毎又は４から８週間毎であり得る。好適な製剤及び投与の経路は、上述されている。
【０２３２】
癌治療に関して、本明細書に記載される抗体分子は、癌の治療のために好適であることが示されているか、又は好適であると予想される抗癌治療法又は治療剤などの別の抗癌治療法又は治療剤と組み合わせて個体に投与され得る。例えば、抗体分子は、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法（養子ＮＫ細胞療法など又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）若しくはγ／δ  Ｔ細胞を用いた治療法又はホルモン療法のための薬剤と組み合わせて個体に投与され得る。
【０２３３】
理論に制約されることを望むものではないが、ＴＮＦＲＳＦ受容体などの免疫細胞抗原のための第２の抗原結合部位を含む、本明細書に記載される抗体分子は、抗癌治療法において補助剤としての役割を果たし得ると考えられる。具体的には、化学療法及び／又は放射線療法と組み合わせた又は抗腫瘍ワクチンと組み合わせた個体への抗体分子の投与は、例えば、化学療法及び／又は放射線療法で、又は抗腫瘍ワクチン単独で達成されるより大きい、癌に対する免疫応答を引き起こすと考えられる。
【０２３４】
本明細書に記載される抗体分子と組み合わせた投与のための１つ以上の化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、アルキル化剤、白金類似体、ヌクレオシド類似体、抗葉酸剤、サリドマイド誘導体、抗腫瘍性化学療法剤及びその他からなる群から選択され得る。タキサンとしては、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ−パクリタキセルが挙げられ；細胞傷害性抗生物質としては、アクチノマイシン、ブレオマイシン及びアントラサイクリン、例えばドキソルビシン、ミトキサントロン及びバルルビシンが挙げられ；チロシンキナーゼ阻害剤としては、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コビメチニブ及びトラメチニブが挙げられ；ＰＡＲＰ阻害剤としては、ニラパリブが挙げられ；Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤としては、ベムラフェニブ及びダブラフェニブが挙げられ；アルキル化剤としては、ダカルバジン、シクロホスファミド及びテモゾロミドが挙げられ；白金類似体としては、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンが挙げられ；ヌクレオシド類似体としては、アザシチジン、カペシタビン、フルダラビン、フルオロウラシル及びゲムシタビンが挙げられ；抗葉酸剤としては、メトトレキサート及びペメトレキセドが挙げられる。本発明において使用するのに好適な他の化学療法剤としては、デファクチニブ、エンチノスタット、エリブリン、イリノテカン及びビンブラスチンが挙げられる。
【０２３５】
本明細書に記載される抗体分子とともに投与するための好ましい治療剤は、ペントスタチン、シクロホスファミド、シスプラチン、ペメトレキセド、パクリタキセル、カルボプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビノレルビン、ドセタキセル又はエトポシドである。
【０２３６】
本明細書に記載される抗体分子とともに投与するための放射線療法は、外照射放射線療法（強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）、画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）、術中放射線療法（ＩＯＲＴ）、電子療法若しくは電子線療法（ＥＢＴ）、表在放射線療法（ＳＲＴ）など）又は内部放射線療法（近接照射療法、放射性同位体若しくは放射性核種療法、ＳＩＲＴなどであり得る。好ましくは、放射線療法は、従来の外照射放射線療法、外照射放射線療法（ＥＢＲＴ）、定位放射線療法又は近接照射療法である。
【０２３７】
本明細書に記載される抗体分子と組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子、核酸、サイトカイン又はサイトカインベースの治療法であり得る。例えば、治療用抗体分子は、免疫調節分子、例えば阻害性チェックポイント分子若しくは免疫共刺激分子、自然免疫系の受容体又は腫瘍抗原、例えば細胞表面腫瘍抗原若しくは可溶性腫瘍抗原に結合し得る。治療用抗体分子が結合し得る免疫調節分子の例としては、阻害性チェックポイント分子、例えばＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１若しくはＫＩＲ、免疫共刺激分子、例えばＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７若しくはＩＣＯＳ、他の免疫調節分子、例えばＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＨＶＥＭ、ＴＧＦＢ若しくはＣＳＦ−１が挙げられる。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（例えば、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ−５）及びＳＴＩＮＧが挙げられる。
【０２３８】
本明細書に記載される抗体分子と組み合わせた投与のための核酸は、ｓｉＲＮＡであり得る。
【０２３９】
サイトカイン又はサイトカインベースの治療法は、ＩＬ−２、コンジュゲートされたＩＬ−２のプロドラッグ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１及びＩ型インターフェロンからなる群から選択され得る。
【０２４０】
癌の治療のための抗腫瘍ワクチンは、臨床において実現されており、且つ科学文献（Rosenberg, S. 2000など）中で詳細に説明されている。これは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とともに又はそれを伴わずに、ワクチン接種法として自己又は同種異系癌細胞を使用することにより、それらの細胞によって発現される様々な細胞マーカーに応答するように免疫系を促す手法を主に必要とする。ＧＭ−ＣＳＦは、前記手法により用いられるとき、抗原提示において強い応答を引き起こし、特によく機能する。
【０２４１】
化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法又はホルモン療法のための薬剤は、好ましくは、癌のための化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法又はホルモン療法のための薬剤、すなわち癌の治療に有効であることが示されている、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法又はホルモン療法のための薬剤である。癌に有効であることが示されている好適な化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法又はホルモン療法のための薬剤の選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２４２】
本発明の抗体分子は、ＭＳＬＮの検出、特に細胞表面に結合されたＭＳＬＮなどの固定されたＭＳＬＮの検出に有用であり得る。抗体分子は、本明細書の他の箇所に記載されるように検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。
【０２４３】
したがって、本発明は、試料における、固定されたＭＳＬＮの存在、好ましくは細胞表面にＭＳＬＮを含む細胞の存在を検出するための抗体分子の使用に関する。
【０２４４】
ＭＳＬＮを検出するインビトロ方法も提供され、この方法は、抗体分子を、対象とする試料とともにインキュベートすること及び試料への抗体分子の結合を検出することを含み、ここで、試料への抗体の結合は、固定されたＭＳＬＮの存在を示す。試料への抗体分子の結合は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて検出され得る。
【０２４５】
好ましい実施形態において、本発明は、細胞表面にＭＳＬＮを含む細胞を検出するインビトロ方法に関し、この方法は、抗体分子を、対象とする細胞試料とともにインキュベートすること及び試料中に存在する細胞への抗体分子の結合を決定することを含み、ここで、試料中に存在する細胞への抗体の結合は、細胞表面にＭＳＬＮを含む細胞の存在を示す。細胞への抗体分子の結合を検出するための方法は、当技術分野において公知であり、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーを含む。
【０２４６】
本発明の抗体分子は、癌の検出、診断及び／又は予後診断に利用され得る。癌は、本明細書に記載される本発明の抗体分子で治療され得る癌であり得る。
【０２４７】
したがって、本発明の関連する態様は、以下を提供する；
（ｉ）個体における癌を検出するか、癌を診断するか、癌の予後を決定するか又は癌の予後を監視する方法に使用するための、本明細書に記載される抗体分子；
（ｉｉ）癌を検出するか、癌を診断するか、癌の予後を決定するか又は癌の予後を監視するのに使用するための診断薬の製造における、本明細書に記載される抗体分子の使用；
（ｉｉｉ）本明細書に記載される抗体分子を用いて、個体における癌を検出するか、癌を診断するか、癌の予後を決定するか又は癌の予後を監視する方法；及び
（ｉｖ）個体における癌を検出するか、診断するか、予後診断するか又は癌の予後を監視する方法に使用するためのキットであって、本明細書に記載される抗体分子を含むキット。
【０２４８】
本方法は、本発明の抗体分子を個体に投与すること及び個体の身体の部位における抗体分子の存在を決定することを含み得、ここで、身体の部位における抗体分子の存在は、腫瘍の存在、特に細胞表面においてＭＳＬＮを発現する細胞を含む腫瘍の存在を示す。
【０２４９】
好ましい実施形態において、本方法は、個体から得られた試料における、細胞表面においてＭＳＬＮを発現する細胞の存在を決定することを含み、ここで、細胞表面においてＭＳＬＮを発現する細胞の存在は、個体が癌を有することを示す。
【０２５０】
別の好ましい実施形態において、本方法は、個体から得られた腫瘍試料における、細胞表面においてＭＳＬＮを発現する腫瘍細胞の存在を決定することを含み、ここで、細胞表面においてＭＳＬＮを発現する腫瘍細胞の存在は、個体が、細胞表面においてＭＳＬＮを発現する細胞を含まない同じ癌を有する個体より予後が悪い（例えば、癌転移のより高いリスクを有する）ことを示す。
【０２５１】
癌は、本明細書において言及される癌であり得る。好ましくは、癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、胆管癌、結腸癌、胸腺癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、二相型滑液肉腫及び線維形成性小細胞腫瘍からなる群から選択される。より好ましくは、癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌及び肺癌からなる群から選択される。
【０２５２】
本開示が以下の実験の例示を含むことを考えると、本発明のさらなる態様及び実施形態が当業者に明らかであろう。
【０２５３】
本明細書において言及される全ての文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０２５４】
本明細書において使用される際の「及び／又は」は、他のものを伴うか又は伴わない、２つの規定の特徴又は成分のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが本明細書に個々に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。
【０２５５】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、上記に記載される特徴の説明及び定義は、本発明のいずれかの特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
【０２５６】
本発明の他の態様及び実施形態は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「からなる」又は「から本質的になる」という用語によって置き換えられる「を含む」という用語を用いて上述される態様及び実施形態を提供する。
【０２５７】
本発明の特定の態様及び実施形態は、例として及び上述される図を参照して例示される。
【実施例】
【０２５８】
実施例
実施例１：抗ヒトＭＳＬＮ抗体の単離：抗原、選択及びスクリーニング
メソテリンは、６９ｋＤａの前駆体として合成され、タンパク質分解により３０ｋＤａのＮＨ２末端分泌型（巨核球増強因子又はＭＰＦと呼ばれる）及び４０ｋＤａの膜結合メソテリン（ＭＳＬＮ）にプロセシングされたグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型糖タンパク質である。腫瘍細胞表面から流出され、膜結合ＭＳＬＮの選択的スプライシング又は腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）によって生成される可溶型のＭＳＬＮは、患者血清中に見られる。この腫瘍で流出される抗原は、治療用抗体のデコイとしての役割を果たし得る「シンク」を形成することが知られており（Lee et al, 2018）、そのため、これは、抗体が腫瘍上のＭＳＬＮに結合することを可能にするために克服されなければならない。このシンク効果を回避するために、本発明者らは、これが可溶性ＭＳＬＮより膜結合ＭＳＬＮへの優先的な結合につながることを意図して、可溶性ＭＳＬＮと比較して、固定されたＭＳＬＮに優先的に結合した新規な抗メソテリン抗体を単離することに着手した。この目的のために、異なる形態のＭＳＬＮ抗原がファージ選択及びその後のスクリーニング作業に用いられた。
【０２５９】
１．１  ヒト、カニクイザル及びマウスメソテリン抗原の産生
Ｃ末端の１８アミノ酸を欠く、「ｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ  Ａｃｒｏ」と示される組み換えビオチン化ヒトＭＳＬＮ−Ｈｉｓ抗原をAcrobiosystems（カタログ番号ＭＳＮ−Ｈ８２２３）から入手した。抗原全体にわたって選択される結合剤の多様性を最大にするために、完全長モノマーヒトＭＳＬＮ抗原を生成し、ファージ選択のために社内でビオチン化した。カニクイザル及びマウスＭＳＬＮを、ヒト並びにカニクイザルＭＳＬＮに結合することが可能であった結合剤の単離を可能にするため及びさらにマウスＭＳＬＮ結合剤の単離のためにそれぞれ産生した。
【０２６０】
簡潔に述べると、ヒト（配列番号１６９）（ｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ）、カニクイザル（配列番号１７０）（ｃＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ）又はマウス（配列番号１７１）（ｍＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ）ＭＳＬＮをコードするＤＮＡを、６つのＣ末端ヒスチジン残基及びＡｖｉ配列とともに、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＢａｍＨＩ−ＨＦ制限酵素を用いて、修飾されたｐＦＵＳＥベクター（Invivogenカタログ番号ｐｆｕｓｅ−ｍｇ２ａｆｃ２）にクローニングすることにより、ＭＳＬＮ抗原を産生した。ベクターをＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（National Research Council of Canada）にトランスフェクトし、発現されたＭＳＬＮを、HisTrap（商標）エクセルニッケルカラム（GE LifeSciences、２９０４８５８６）を用いて精製した。抗原のそれぞれを、BirAビオチン−ビオチンタンパク質リガーゼ反応キット（Avidity LLC、BirA500）を用いてビオチン化して、単一のビオチン分子で標識されたモノマーＭＳＬＮ抗原を産生した。具体的には、５から１０ｍｇの抗原を、１：５０の酵素対基質のモル比になるまでBirA酵素ミックスと混合した。次に、添加剤を製造業者の推奨に従って加え、室温で一晩インキュベートし、続いて組み換えヒト、カニクイザル又はマウスＭＳＬＮを、HisTrap（商標）エクセルニッケルカラム（GE LifeSciences、２９０４８５８６）を用いて精製して、過剰な遊離ビオチンを除去した。
【０２６１】
各抗原の生物物理学的特性を、集合体が存在するかどうかを決定するためにＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析及び分子のサイズを確認するためにＰＡＧＥによって特徴付けした。これらの抗原のＳＥＣ−ＨＰＬＣは、１０％未満の集合を示し、ＰＡＧＥは、抗原がモノマーであることを確認した。ＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、ビオチン化ＭＳＬＮ抗原がＭＳＬＮ特異的陽性対照抗体によって結合され得ることを確認した（ＳＳ１、第１．３項；Hassan et al 2002を参照されたく、及びＭＯＲ６６２６、第７．１項、特許公開番号国際公開第２００９／０６８２０４  Ａ１号を参照されたい）。このデータに基づいて、全ての抗原は、ナイーブな選択に好適であると考えられた。
【０２６２】
１．２  ファージミドライブラリー選択
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３中のランダム化アミノ酸を有する生殖細胞系列のヒトＦａｂドメインを示す合成ナイーブファージミドライブラリー（MSM Technologies）を、第１．１項に記載されるＭＳＬＮ抗原を用いた選択に使用した。
【０２６３】
ストレプトアビジンDynabeads（Thermo Fisher、１１２０５Ｄ）、Dynabeadsに結合されたニュートラアビジン結合タンパク質（Thermo Fisher、３１０００）又は抗Ｈｉｓ  Dynabeads（Thermo Fisher、１０１０３Ｄ）を用いて、それぞれ３又は４回の複数の作業において、Ｆａｂライブラリーを最初に選択して、ビオチン化ヒト、カニクイザル又はマウスＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ又はｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ  Ａｃｒｏに結合されたファージを単離した。また、選択作業を、社内で産生された完全長ＭＳＬＮ抗原を用いて行い、ここで、ヒト及びカニクイザル交差反応性クローンを単離する目的でヒトＭＳＬＮ選択回をカニクイザルＭＳＬＮ抗原と交互に行った。マウスＭＳＬＮへの結合剤（R&D mMSLN-His 8604-MS）のための選択も行った。標準的なファージ選択及びファージ回収手順を使用した。
【０２６４】
ＭＳＬＮ抗原の様々な領域に結合するクローンを得るために、エピトープマスキング手法を、上述される初期の選択作業からの抗ＭＳＬＮ抗体を用いて採用した。簡潔に述べると、ナイーブＦａｂライブラリーの１回目の選択を、５００ｎＭでビオチン化ヒトＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉを用いて行った。２回目及び３回目において、５００ｎＭ（２回目）又は１００ｎＭ（３回目）におけるビオチン化カニクイザルＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉのファージ結合を、初期の選択作業から単離されたナイーブ抗メソテリンｍＡｂタンパク質の混合物（ＦＳ２８−００４、ＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６、ＦＳ２８−０９１及びＦＳ２８−９７、５００ｎＭの各ｍＡｂ）の存在下で試験した。これらのエピトープマスキング選択は、出力力価を低下させ、これは、より少ない結合剤が同定された際、選択手法が機能していたことを示す。これは、前の選択作業からのクローンと比較して、ＭＳＬＮのさらなる領域を標的とするクローン（ＦＳ２８−２４３、ＦＳ２８−２５５及びＦＳ２８−２５６、第２．１．３項を参照されたい）の同定をもたらした。
【０２６５】
１．３  抗ＭＳＬＮ抗体を同定するためのスクリーニング
全ての選択のうちの３及び４回目の出力からの約２０００個のクローンを、選択の回に使用される抗原と一致する、２５ｎＭの固定されたビオチン化ｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ  Ａｃｒｏ、完全長ビオチン化ヒト又はカニクイザルＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉへの結合についてファージＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ストレプトアビジンプレート又は非関連ビオチン化Ｈｉｓタグ化抗原で固定されたプレートが陰性対照として含まれていた。陰性対照へのシグナルより少なくとも４倍高いＭＳＬＮ結合シグナルを有するクローンを選択し、それらの可変領域をシーケンシングして、１５６の固有のＶＨ／ＶＬ配列の組合せを同定し、続いて、これは、可溶性発現のために選択された。クローンを、エピトープマスキング選択を含む全ての選択作業から選択した。各クローンについて、ＶＨ及びＶＬを、ＣＨ１、ＣＨ２（ＣＨ２ドメイン中にＬＡＬＡ突然変異を有する（Bruhns et al., 2009；Hezareh et al., 2001）及びＣＨ３ドメイン又はＣＬドメインのいずれかをそれぞれ含有するｐＴＴ５発現ベクター（National Research Council of Canada）に個別にクローニングした。ＬＡＬＡ突然変異（ＡＡ）を有する得られたｐＴＴ５−ＦＳ２８  ＶＨ及びｐＴＴ５−ＦＳ２８  ＶＬベクターをＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に一過性に共トランスフェクトし、クローンを完全なＩｇＧ１分子として産生した。抗体を上清中に保持するか、又はmAb Select SuReプロテインＡカラムによって精製し、後述されるようにさらなる試験に供した。同じ方法を用いて、ＳＳ１及び抗ニワトリ卵白リゾチーム抗体ＨｅｌＤ１．３のＶＨ及びＶＬ領域をクローニングし、ＩｇＧ１  ＬＡＬＡフォーマットにおいて発現させ、Ｇ１−ＡＡ／ＳＳ１（配列番号１６７及び１６８）及びＧ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（配列番号１６５及び１６６）を得て、それをそれぞれ陽性対照及び陰性対照として用いた。
【０２６６】
実施例２：一連のナイーブ抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂの同定
抗メソテリンｍＡｂは、中でも特に、ＡＤＣＣを誘発することが可能な治療薬として、免疫毒素、ＡＤＣの送達のための腫瘍標的化アームとして及び二重特異的抗体の生成のためのそれらの使用を含む広範な潜在的な用途を有する。抗メソテリンｍＡｂの所望の特性は、用途に依存し、したがって、本発明者らは、様々な親和性で膜結合ヒト及びカニクイザルＭＳＬＮに結合し、且つＭＳＬＮの様々な領域を標的化することが可能であった一連のｍＡｂを同定することに着手した。この目的のために、ＥＬＩＳＡ、Biacoreブロッキングアッセイ及び細胞結合を含む一連のスクリーニングアッセイ並びにＭＳＬＮへの結合領域を比較するアッセイを行った。
【０２６７】
２．１  組み換えＭＳＬＮへの結合についてのスクリーニング
２．１．１  結合ＥＬＩＳＡ
可溶性抗ＭＳＬＮ結合クローン又は精製されたクローンを含有するＨＥＫ２９３−６Ｅ上清を、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＭＳＬＮ−Ｈｉｓ  Ａｃｒｏ、ｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ及び一部の作業についてｃＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉへの結合についてスクリーニングした。簡潔に述べると、ｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ  Ａｃｒｏ、ｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ、ｃＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ又は非関連Ｈｉｓタグ化抗原を４℃で一晩、２５ｎＭでmaxisorpプレート上にコートした。翌日、プレートを、０．０５％のTween20及び２％のMarvel乳（Marvel粉乳）を含有する３００μｌのＰＢＳでブロックした。上清又は精製されたタンパク質を含有する抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂを室温で１時間インキュベートし、それらの結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされたマウス抗ヒトＦｃ−ＩｇＧ抗体を用いて検出した。非関連抗原への結合を示したか又はヒト及びカニクイザル抗原の両方と交差反応性でなかったクローンを廃棄した。さらに、完全長抗原がＭＳＬＮ発現細胞の細胞表面における抗原立体構造のより代表的なものであり得ることが予想されるため、切断型ＭＳＬＮ抗原、ｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ  Ａｃｒｏに結合したが、完全長ＭＳＬＮ抗原、ＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉに結合しなかったクローンもさらに進めなかった。
【０２６８】
メソテリンは、糖タンパク質であり、そのグリコシル化パターンは、種及び組織に応じて様々であり得る。抗体がＭＳＬＮへの結合について特異性を有することを確実にするために、抗ＭＳＬＮ結合クローンもグリコシル化及び脱グリコシル化ＭＳＬＮへの異なる結合について試験した。ビオチン化ｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉを、３７℃で２４時間にわたってＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素（ＮＥＢ、Ｐ０７０４Ｌ）を用いて脱グリコシル化し、Amicon ultra遠心分離フィルタ（Millipore、ＵＦＣ９０１０２４）を用いて精製し、２５ｎＭでmaxisorpプレート上にコートした。ＭＳＬＮへの固有の抗メソテリンｍＡｂのＥＬＩＳＡ結合を、マウス抗ヒトＦｃ−ＩｇＧ−ＨＲＰ（Sigma、Ａ０１７０）を用いて検出した。グリコシル化ＭＳＬＮ抗原と比較して、脱グリコシル化ＭＳＬＮ抗原への結合シグナルの２倍を超える低下を示したクローンを一連のナイーブ抗ＭＳＬＮ結合ｍＡｂから除外した。
【０２６９】
２．１．２  BIAcoreスクリーニング
ヒトＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉを、約２００応答単位（ＲＵ）になるまで、アミンカップリングキット（GE Healthcare、ＢＲ１００５０）を用いてCM5 Series S BIAcoreセンサーチップ（GE Healthcare、ＢＲ１００５３０）においてフローセル２上に固定した。フローセル１は、減算のためにブランクのままにしておいた。ＨＥＫ２９３−６Ｅ上清又は精製されたタンパク質を、ＨＢＳ−ＥＰ＋（GE Healthcare）を用いて、１試料当たり約５０ｎＭの抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂに調整した。試料を３０μｌ／分で２．５分間にわたってフローセル１及び２上に注入し、次に２．５分間にわたってＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で解離させた。３０μｌ／分の速度で３０秒間にわたって１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５（GE Healthcare、ＢＲ１００３５４）を注入することによって再生を行った。減算されたデータ（フローセル２−フローセル１）を、BIAevaluation 3.2 Software（GE Healthcare）を用いて分析した。結合ＥＬＩＳＡからこのアッセイにおいて試験された８６個のクローンのうちの３９個のクローンは、５０ｎＭで１０ＲＵを超える結合応答を示し、したがって再発現、精製及びさらなるスクリーニングのために選択した。
【０２７０】
２．１．３  ＭＳＬＮが結合された領域に基づく抗体のビニング
ＥＬＩＳＡ及びBiacoreスクリーニングデータに基づいて、次にクローンをビニングアッセイにおいて試験し、ここで、ヒトＭＳＬＮへのｍＡｂの結合をOctet（ForteBio）においてバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって別のｍＡｂの存在下で試験した。
【０２７１】
簡潔に述べると、ビオチン化ｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ（５μｇ／ｍｌ）を５分間にわたってストレプトアビジンチップ（ForteBio、１８−５０２０）に結合させた。Ｇ１−ＡＡ／ＳＳ１を１×キネティックバッファー（ForteBIO、１８−１０９２）中で２００ｎＭになるまで希釈し、５分間にわたってｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉに結合させた。次に、２００ｎＭの試験ｍＡｂ及び２００ｎＭのＧ１−ＡＡ／ＳＳ１を含有する混合物の結合を５分間評価した。これを、結合されたＧ１−ＡＡ／ＳＳ１の非存在下において、ｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉへの試験ｍＡｂの結合と比較して、ＳＳ１の非存在下（すなわち結合を巡る競合がなかった場合）における可能な結合の最大の程度を決定した。両方の抗体がＭＳＬＮの同じ領域への結合を巡って競合した場合、試験抗体は、結合することができないであろう。
【０２７２】
Ｇ１−ＡＡ／ＳＳ１を用いたこれらのビニング実験は、試験されるＦＳ２８−系統抗体の大部分（２３個のうちの１９個）は、Ｇ１−ＡＡ／ＳＳ１の存在下でＭＳＬＮに結合することができず、したがってＧ１−ＡＡ／ＳＳ１と同様の領域に結合することに起因し得ることを示した。ＦａｂフォーマットにおけるＳＳ１抗体のためのＭＳＬＮ結合部位は、報告されており（Ma et al., 2012）、ＭＵＣ１６結合にも関与するアミノ酸７から６４を含むＮ末端領域として定義される。単離されたほとんどの抗ＭＳＬＮ結合剤がこの又は同様の領域に結合したことは、これらのアミノ酸が組み換え抗原において十分に曝されることを示唆する。ＭＳＬＮへの結合を巡ってＧ１−ＡＡ／ＳＳ１との部分的な競合を示すか又は競合を示さなかった４つの他のクローン、ＦＳ２８−１８５、ＦＳ２８−２４３、ＦＳ２８−２５５及びＦＳ２８−２５６を同定した。互いに対するこれらのクローンのビニングは、これらのクローンが２つのさらなる独立したビンを示したこと、すなわちＭＳＬＮのさらなる２つの異なる領域に結合することが可能であったことを示した。ＦＳ２８−１８５、ＦＳ２８−２４３及びＦＳ２８−２５５を１つのビン（「ビン２」）に割り当てた一方、ＦＳ２８−２５６を別のビン（「ビン３」）に割り当てた。これらの結果は、ＭＳＬＮの複数の領域に結合した抗体が同定された際、第１．２項におけるエピトープマスキング選択が成功したことを示した。
【０２７３】
２．１．４  親和性
２．１．３に記載される各ビンについて、ヒト又はカニクイザルＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉを５０又は１００ＲＵで固定したことを除いて、第２．１．２項に記載されるのと同じ方法を用いて結合速度を決定した。クローンを３倍希釈物中において８１ｎＭから０．３３ｎＭの濃度範囲で試験した。結合剤をランク付けし、各ビンからの最良のものを選択した：全てビン１からのＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６及びＦＳ２８−０９１、ビン２からのＦＳ２８−１８５並びにビン３からのＦＳ２８−２５６。これらのクローンの全ては、カニクイザル交差反応性であることが示されたが、親和性は、これらの試験条件下で計算されなかった。選択された抗体の親和性が表１に示され、これは、固定されたＭＳＬＮの５０ＲＵで得られた親和性が、固定されたＭＳＬＮ抗原の１００ＲＵにおける親和性より低かったことを示し、これは、より高いレベルのＭＳＬＮでの増加した結合を示す。
【０２７４】
【表２】
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【０２７５】
２．２  ＭＵＣ１６−ＭＳＬＮブロッキングアッセイ
ＭＳＬＮ（アミノ酸２９６〜３５９）のＮ末端領域は、糖タンパク質ＭＵＣ１６と相互作用することが報告されており、この相互作用は、癌細胞接着に役割を果たし得る（Kaneko et al., 2009）。ＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６、ＦＳ２８−０９１、ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６を、ブロッキングアッセイにおいてメソテリンへのＭＵＣ１６の結合をブロックするそれらの能力について試験した。ＳＳ１は、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックすることが文献から知られている（Ma et al., 2012）。上述されるように、本発明者らは、これがＭＵＣ１６の結合をブロックするその能力に影響を与えないことを予想して、これをＧ１−ＡＡ／ＳＳ１フォーマットに変換した。Ｇ１−ＡＡ／ＳＳ１及び対照ＩｇＧ１抗体（Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）は、それぞれ陽性対照及び陰性対照として含まれていた。
【０２７６】
簡潔に述べると、組み換えヒトＭＵＣ１６（R&D Systems、５８０９−ＭＵ−０５０）を４℃で一晩、１×ＰＢＳ中０．６５μｇ／ｍｌでmaxisorpプレート上にコートした。プレートを１×ＰＢＳで３回洗浄し、２％のTween20及び２％のMarvel Milkを含有する３００μｌのＰＢＳでブロックした。ある濃度の抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂ（０．２３ｎＭから５００ｎＭ、３倍希釈物）を室温で１時間にわたり、１００μｌの体積中でビオチン化ｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ抗原（最終濃度２μｇ／ｍｌ）と予め混合した。ブロッキング溶液の除去後、ｍＡｂ／ＭＳＬＮ混合物をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ及び０．０５％のTween20）で３回洗浄し、室温で１時間にわたってストレプトアビジン−ＨＲＰ（Thermo Scientific、２１１２６、１×ＰＢＳ中１：１０００の希釈物）とともにインキュベートした。最後に、プレートをＰＢＳＴで３回及びＰＢＳで３回洗浄した。ＭＵＣ１６に結合されたＭＳＬＮを、１５分間にわたって１００μｌのＴＭＢ、続いて１００μｌの１Ｍの硫酸溶液を加えることによって視覚化した。吸光度を４５０〜６３０ｎｍで読み取った（Gen5 software、BioTek）。
【０２７７】
【表３】
2021524278.tif 000004
【０２７８】
ビン１クローンＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６及びＦＳ２８−０９１は、それぞれ２．９ｎＭ、５．２ｎＭ及び４．４ｎＭのＩＣ５０でＭＵＣ１６−ＭＳＬＮ相互作用の用量依存性ブロッキングを示した（表２）。観察されたブロッキング活性は、Ｇ１−ＡＡ／ＳＳ１のブロッキング活性と同様であった。ＦＳ２８−２５６は、陰性対照Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３と同様に、ブロッキング活性を示さなかった。一方、ＦＳ２８−１８５は、ＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合を促進した。この現象は、報告されている（米国特許第８，９１１，７３２  Ｂ２号）。これらの結果は、ＭＳＬＮの３つの異なる領域に結合したクローンがリガンドブロッキングアッセイにおいて３つの異なる挙動を示したという、第２．１．３項におけるビニングデータと一致していた。
【０２７９】
結論として、結果は、ＭＳＬＮの３つの異なる領域（ビン）に結合する一連のクローンが選択され；ＭＳＬＮの１つの領域に結合する抗体がＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックする一方、他の２つの領域に結合する抗体がそうではないことを示す。
【０２８０】
２．３  特異性
一連の抗体によって結合されるＭＳＬＮの様々な領域を考慮して、ＭＳＬＮへの結合に対するそれらの特異性を試験した。ＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６、ＦＳ２８−０９１、ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６の特異性を、ＭＳＬＮへの結合を、細胞接着に関与する他の分子、例えばＣＥＡＣＡＭ−５、Ｅ−カドヘリン、トロンボモジュリン及びＥｐＣＡＭへの結合と比較することにより、ＥＬＩＳＡによって試験した。
【０２８１】
同様のプロトコルが第１．２．１項に記載されるように使用され、ここで、maxisorpプレートを１μｇ／ｍｌの組み換えヒトＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ、ヒトＣＥＡＣＡＭ−５−Ｈｉｓ−Ｆｃ（Sino Biological、１０７７−Ｈ０３Ｈ）、ヒトＥ−カドヘリン（R&D systems、８５０５−ＥＣ）、ヒトトロンボモジュリン（Peprotech、１００−５８）又はヒトＥｐＣＡＭ−ｈＦｃ（社内で産生）にコートした。０．０２から１０００ｎＭの濃度範囲（３倍希釈物）で試験される抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂの結合を、抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰ（Sigma、Ａ０２９３）を用いて検出した。それぞれの分子のための陽性対照は、ヒトＥｐＣＡＭ抗体（米国特許第８２３６３０８  Ｂ２号からのクローン２Ｇ８）、ＣＥＡＣＡＭ−５抗体（米国特許第８７７１６９０  Ｂ２号からのクローンｈＭＮ１５）、ヒトＥ−カドヘリン抗体、マウスＩｇＧ２ｂクローン１８０２１５（R&D systems、ＭＡＢ１８３８）、ヒトトロンボモジュリン抗体、マウスＩｇＧ１、クローン５０１７３３（R&D systems、ＭＡＢ３９４７）を含んでいた。後者の２つは、二次ｍＡｂとしてヤギ抗マウスＦｃ−ＨＲＰ（Sigma、Ａ９３０９）を用いて検出した。
【０２８２】
ＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６、ＦＳ２８−０９１及びＦＳ２８−１８５は、ヒトＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉに結合したが（約０．５ｎＭのＥＣ５０及び３の最大結合シグナル）、１０００ｎＭまで試験された細胞接着分子のいずれに対する結合も観察されなかった。陽性対照抗体は、予想どおり、それらのそれぞれの標的に結合した。したがって、抗ＭＳＬＮ抗体は、高いレベルの特異性を示した。
【０２８３】
２．４  細胞結合
一連の５つの選択された抗メソテリンｍＡｂをヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２６における内因性の細胞表面ＭＳＬＮへの結合について分析した。
【０２８４】
簡潔に述べると、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞（ATCC CRL-5826）を、StemPro Accutase（Gibco、Ａ１１１０５−０１）を用いて、Ｔ１７５細胞培養フラスコから収集した。細胞を３分間にわたって１２００ｒｐｍで遠心分離し、２×１０６個の細胞／ｍｌ及び１ウェル当たり５０μｌでＤＰＢＳ（Life Technologies、１４１９０１６９）及び１％のＢＳＡ（Sigma-Aldrich、Ａ７９０６）から構成される氷冷したＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させ、９６ウェルＶ底プレート（Costar、３８９４）に播種した。試験される全てのｍＡｂを０．０１〜２００ｎＭの濃度範囲（４倍希釈物）において１２０μｌ中のＦＡＣＳ緩衝液中で希釈した。次に、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を遠心分離し、上清を除去し、細胞を１００μｌの各ｍＡｂ希釈物中で再懸濁させ、４℃で４５分間インキュベートした。細胞を、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を用いた遠心分離によって２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１０００に希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ−鎖特異的）Ｆ（ａｂ’）２断片−Ｒ−フィコエリトリン抗体（Sigma、Ｐ８０４７）を含有する１００μｌ中で再懸濁させ、４℃で４５分間インキュベートした。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液及び次に１５０μｌのＤＰＢＳで１回洗浄し、１：１０，０００でＤＡＰＩ（Biotium、４００４３）を含有する１５０μｌのＤＰＢＳ中で再懸濁させ、BDCantoII又はiQue（Intellicyt）において読み取った。データを、FlowJo v10を用いて分析して、各ウェル中の生細胞についてのＰＥのシグナル幾何平均を決定した。
【０２８５】
細胞結合データ（表３）は、ＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６及びＦＳ２８−０９１の全てが、陽性対照Ｇ１−ＡＡ／ＳＳ１と同様に、０．６２から１．２２ｎＭの範囲のＥＣ５０でＮＣＩ−Ｈ２２６における細胞表面細胞表面ＭＳＬＮに結合したことを示す。比較すると、ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６は、３０ｎＭを超えるＥＣ５０及び低い最大結合シグナル（Ｅｍａｘ）で弱い結合を示した。代表的な結合アッセイが図１に示される。
【０２８６】
【表４】
2021524278.tif 000005
【０２８７】
２．５  ナイーブなスクリーニング手順の概要
ナイーブファージライブラリーの最初のスクリーンによって同定された１５６のｍＡｂから、５つの抗ヒトＭＳＬＮ  ｍＡｂクローン（ＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６、ＦＳ２８−０９１、ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６）を一連のスクリーニングアッセイに基づいて選択し、このスクリーニングアッセイは、まず、完全長、脱グリコシル化組み換えＭＳＬＮへの結合並びにカニクイザルＭＳＬＮに結合する能力を確認した。第２に、クローンを、それらが結合したＭＳＬＮの領域（ビン）の多様性及びＭＵＣ１６ブロッキング活性に基づいて分類し、これらの群から最も高い親和性の結合剤を選択した。得られた一連のｍＡｂクローンＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６、ＦＳ２８−０９１、ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６は、ＭＳＬＮの３つの異なる領域に結合し、そのうちの１つ（ＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６及びＦＳ２８−０９１を含むビン１）がインビトロでＭＳＬＮへのＭＵＣ１６の結合をブロックする。一連の５つの抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂは、ＭＳＬＮへの特異的結合、組み換え及び細胞表面ＭＳＬＮに対する異なる親和性を示し、以下の実施例３及び４に記載されるように、さらなる特徴付け及び／又は最適化のために選択した。
【０２８８】
実施例３：ナイーブ抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂの親和性成熟及び配列最適化
３．１  ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６の親和性成熟
ＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６及びＦＳ２８−０９１と比較して、ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６は、組み換え及び細胞表面ＭＳＬＮの両方に対するより弱い親和性を有し、したがって親和性成熟に供した。
【０２８９】
３．１．１  ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６の親和性成熟及びスクリーニング
ＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲ３領域を、ＮＮＫプライマーを用いて、５から６つのアミノ酸の重複カセットをランダム化することにより、ｓｃＦｖフォーマットにおいて並行して親和性成熟させた。ＦＳ２８−１８５についてランダム化した領域は、ＶＨ  Ｇ９５−Ｍ１００Ｆ及びＶＬ  Ｓ９１−Ａ９５であり、ＦＳ２８−２５６について、それらは、ＶＨ  Ｙ９５−Ｌ１００Ｂ及びＶＬ  Ｓ９１−Ｉ９６（Kabat番号付け）であった。ライブラリー生成前に節約的な突然変異誘発をＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域（ＦＳ２８−２５６  ＶＬ  ＣＤＲ３ライブラリーを除いて）における潜在的なメチオニン酸化及び脱アミド化部位において行った。ファージミドライブラリーを独立して生成し、各クローンについて１つのＶＨ  ＣＤＲ３及び１つのＶＬ  ＣＤＲ３ライブラリーを生成するためにプールした。１回目に２０ｎＭのビオチン化ヒトＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉを用いて及び２回目に２０若しくは２ｎＭのカニクイザルＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉを用いて、２回の選択を、ナイーブな作業について記載されるように行った。次に、可溶性ｓｃＦｖ（単一点濃度）を卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３（ATCC（登録商標）HTB-161（商標））への結合について試験した。ＯＶＣＡＲ−３細胞を、StemPro Accutase（Gibco、Ａ１１１０５−０１）を用いて収集し、３分間にわたって１２００ｒｐｍで遠心分離し、２×１０６個の細胞／ｍｌにおいてＦＡＣＳ緩衝液（２％のＢＳＡを含有するＤＰＢＳ）中で再懸濁させた。１００μｌのＯＶＣＡＲ−３細胞を９６ウェルＶ底プレートに加えた。プレートを３分間にわたって１２００ｒｐｍで遠心分離し、緩衝液を廃棄した。１５０μｌのｓｃＦｖを細胞に加え、４℃で１時間にわたってインキュベートした。親クローンＦＳ２８−１８５及び２５６のＳｃＦｖが対照として含まれていた。洗浄した後、細胞を１００μｌのPenta His Alexa-Fluor 647（Qiagen、１０９−５４６−０９８）中で再懸濁させ、洗浄してから、Sytox Green Nucleic Acid Stain（Invitrogen S7020、１：１００００希釈物）を含有する１００μｌのＤＰＢＳ中で再懸濁させた。試料をiQue（Intellicyt Corporation、IQue Plus）において実行し、ＡＰＣの幾何平均を記録した。
【０２９０】
両方のＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６について、ＯＶＣＡＲ−３細胞への改善した結合を有する親和性成熟したクローンを同定した。細胞結合（８５０を超えるＭＦＩ）及び配列多様性に基づいて、１０個のクローンをＦＳ２８−２５６  ＶＨ  ＣＤＲ３から選択し、９個をＶＬ  ＣＤＲ３選択から選択した。このアッセイにおいて試験された３８個のＦＳ２８−１８５親和性成熟したクローンのうちの１４個をＶＨ  ＣＤＲ３選択から選択し、１つをＶＬ  ＣＤＲ３選択から選択した。選択されたクローンをｍＡｂ２二重特異的抗体フォーマットにおいてさらに特徴付けした。
【０２９１】
３．１．２  ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６ベースのｍＡｂ２の生成
抗ＭＳＬＮ結合剤のさらなる特徴付けについて、ＦＳ２８−１８５又はＦＳ２８−２５６並びに親クローンの親和性成熟したＶＨ又はＶＬ領域をｍＡｂ２フォーマットにおいて産生した。得られたｍＡｂ２は、ＦＳ２８−１８５若しくはＦＳ２８−２５６クローンのいずれか又はそれらから得られる親和性成熟した変異体のＣＤＲ、ＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異及びＣＨ３ドメイン中のヒトＣＤ１３７受容体−結合部位を含むＩｇＧ１抗体である。これらのｍＡｂ２分子は、ＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／ＦＳ２８−１８５（配列番号１５４及び１９５）及びＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／ＦＳ２８−２５６（配列番号１５６及び７７）及び親和性成熟した子孫についてＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／ＦＳ２８−２５６−ｘと示された。ｍＡｂ２をＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞における一過性発現によって産生し、示される場合、mAb Select SuReプロテインＡカラムを用いて精製した。
【０２９２】
３．１．３  固定されたＭＳＬＮに対するＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６親和性成熟クローンの親和性スクリーニング
次に、親和性成熟したＣＤＲ領域を含有するｍＡｂ２の結合を、Biacoreにより、固定されたヒト及びカニクイザルＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉへの結合についてスクリーニングした。ＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／ＦＳ２８−２５６親和性成熟クローンを含有するＨＥＫ２９３−６Ｅ上清を、第２．１．２項に記載されるように、２００ＲＵで固定されたＭＳＬＮへの結合について分析した。２つの濃度、すなわち５０及び１００ｎＭのｍＡｂ２を試験し、結合を同様にｍＡｂ２フォーマットにおける親抗体の結合と比較した。結合剤をランク付けし、各系統の上位６つのカニクイザル交差反応性結合剤を再度発現させ、精製し、以下の第３．１．４項に記載されるように、細胞結合アッセイにおいて試験した。次に、ＦＳ２８−２５６系統について、改善したＶＨ  ＣＤＲ３を有するクローンを、改善したＶＬ  ＣＤＲ３を有するクローンとシャッフルして、さらなる９つのＶＨ／ＶＬ対合を形成し、これをｍＡｂ２として産生し、これも試験した。
【０２９３】
３．１．４  可溶性ＭＳＬＮの存在下での細胞結合
第１項に上述されるように、可溶性ＭＳＬＮは、任意の抗ＭＳＬＮ抗体の結合のデコイとしての役割を果たし得る。したがって、親和性成熟したクローンを可溶性ヒトＭＳＬＮの存在下及び非存在下で組み換え及び細胞表面ＭＳＬＮへの結合についてスクリーニングした。可溶性の流出されるＭＳＬＮは、７又は１３個のＣ末端残基のいずれかを欠くため（Zhang et al., 2011）、１８個のＣ末端アミノ酸を欠く市販のヒトＭＳＬＮ抗原、ＭＳＬＮ−Ｈｉｓ  Ａｃｒｏを模倣体として使用した。この抗原を２０ｎＭの濃度で使用し、これは、悪性中皮腫及び肺癌患者をＭＳＬＮ陽性であると定義する診断値を有することが分かった可溶性ＭＳＬＮのレベルの約１０〜２０倍である（Cui et al., 2014）。
【０２９４】
ＯＶＣＡＲ−３細胞を用いた細胞結合アッセイを、第２．４項に記載されるアッセイと同様に行った。可溶性ＭＳＬＮの存在の影響を、可溶性ＭＳＬＮの存在下又は非存在下で抗体をプレインキュベートしてから、細胞と混合し、プレインキュベーションが細胞表面におけるＭＳＬＮへの結合に影響を与えたかどうかを決定することによって試験した。親和性成熟したクローン及び親分子（上述されるように全てｍＡｂ２フォーマットにおける）をＦＡＣＳ緩衝液中で希釈して、９６ウェルＶ底プレートにおいて２×最終濃度を得た。次に、各ウェルからの６０μｌを、ＦＡＣＳ緩衝液単独又は６０μｌの４０ｎＭの組み換えｈＭＳＬＮ（R&D systems、３２６５−ＭＳ−０５０）を含有するＦＡＣＳ緩衝液のいずれかに（２０ｎＭのｈＭＳＬＮの最終濃度を得るために）加え、室温で１時間にわたってプレインキュベートしてから１００μｌを細胞に加えた。結合された抗体を、ヤギ抗ヒト抗Fcγ Alexa-Fluor 488（Jackson Immunoresearch、１０９−５４６−０９８）を用いて検出した。
【０２９５】
ＦＳ２８−１８５系統について、全ての親和性成熟したクローンは、親クローンによる結合と比較してＯＶＣＡＲ−３への改善した細胞結合（ＥＣ５０で約７倍）を示した。しかしながら、この結合は、２０ｎＭの可溶性ＭＳＬＮの存在下で低減され、３から７倍高いＥＣ５０（１．６〜１．８ｎＭから約５〜７．８ｎＭ）が得られた。ＦＳ２８−２５６系統について、５つのクローンをその系統の代表的なものとして選択し、これらは、全て０．９から８．６ｎＭで変化する範囲のＥＣ５０を有していた。最も重要なことに、結合親和性は、保持され、２０ｎＭの可溶性ＭＳＬＮの存在下で結合する際、それが存在しない場合と比較して２倍未満の変化があった。このデータから、さらなる試験のために選択されたクローンは、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０２３及びＦＳ２８−２５６−０２４を含んでいた。
【０２９６】
３．２  ＮＮＫウォーク法を用いたクローンＦＳ２８−０２４の親和性成熟
ＦＳ２８−０２４がサブナノモルの親和性でヒトＭＳＬＮに結合した一方、カニクイザルＭＳＬＮに対するその親和性は、約５倍低かった（実施例４、表４を参照されたい）。カニクイザルＭＳＬＮへの結合を改善するために、ＶＨ  ＣＤＲ３領域における５つの残基においてＮＮＫウォーク法を使用した。ＦＳ２８−０２４  ＶＨ及びＶＬの配列を、第３．１．２項に記載されるのと同じｍＡｂ２フォーマットで最適化した。節約的な突然変異誘発ライブラリーを、ＶＨ  ＣＤＲ３においてＲＡＴＬＦ残基（kabat番号付け９５〜９９）のときに１つのアミノ酸残基を多様化することによって生成して、合計で５つの個別のライブラリーをもたらした。対象とする位置において全ての可能なアミノ酸を表すために、低冗長性ＮＮＫコドンを用いてライブラリーを作成した。フォワード及びリバースプライマーをQuickchange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent、２００５１８）のガイドラインに従って設計し、これを用いてライブラリーを作成した。各突然変異体をＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中において小規模で発現させ、上清を、ヒト及びカニクイザルＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉへの保持された又は改善した結合についてBIAcoreによってスクリーニングした。スクリーニングされる８４個のクローンのうち、結合を保持していたものは、わずかであり、それらのほとんどは、Ｔ９８残基の置換があった。４つのクローン、ＦＳ２８−０２４−５１、ＦＳ２８−０２４−５２、ＦＳ２８−０２４−５３及びＦＳ２８−０２４−０６０を再度発現させ、精製し、ヒト及びカニクイザルＭＳＬＮに対するそれらの親和性を決定した。１つのみのクローン、ＦＳ２８−０２４−５３は、単一のＴ９８Ｖ突然変異（Kabat番号付け、表４、実施例４を参照されたい）によって達成されたカニクイザル交差反応性の改善を示した。４つ全てのクローンを、それらが用途に応じて別の配列及び特性を提供し得るため、さらに進めた。
【０２９７】
３．３  親和性成熟の概要
全体的に、ＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６系統のための親和性成熟及び配列最適化手法は、抗ＭＳＬＮ  ｍＡｂのパネル及び多様性をさらに拡大することによって成功した。
【０２９８】
実施例４：抗ＭＳＬＮクローンの特徴付け
４．１  親和性
ｍＡｂ２フォーマットにおける選択された抗ＭＳＬＮクローンの組み換えヒト及びカニクイザルＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ抗原への結合を、Biacore T200プロセシングユニット（GE Healthcare）を用いてＳＰＲによって測定した。上述されるように、可溶性抗原より固定された抗原により強く結合することが望ましかった。クローンの結合特性を評価するために、固定されたＭＳＬＮ抗原への結合速度を、第２．１．２項に記載されるように決定し、溶液中のＭＳＬＮ抗原が、捕捉されたクローンに結合した場合に得られる速度と比較した。
【０２９９】
捕捉実験について、ｍＡｂ２フォーマットにおけるクローンを、BIAcoreセンサーシリーズＳチッププロテインＧ（GE Healthcare、２９１７９３１５）を用いて捕捉した。１μｇ／ｍｌで９００ｍＭのＮａＣｌ２を含有するＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（GE Healthcare、ＢＲ１００１８８）中で希釈されたｍＡｂ２を３０μｌ／分でフローセル２、３及び４において個別に注入して、約１００ＲＵの応答を達成した。Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３をフローセル１において捕捉した。９００ｍＭのＮａＣｌ２を含有するＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で希釈された組み換えヒト及びカニクイザルＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ（第１．１項）を、７０μｌ／分で５分間にわたり、３倍希釈物で必要に応じて１０００ｎＭから０．０５１ｎＭの濃度範囲においてフローセル１、２、３又は４上に注入し、次に５分間にわたって緩衝液中で解離させた。３０μｌ／分の速度で２０秒間にわたって１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５（GE Healthcare、ＢＲ１００３５４）及び界面活性剤Ｐ２０（GE Healthcare、ＢＲ−１０００−５４）を注入することによって再生を行った。減算されたデータ（フローセル２−フローセル１、フローセル３−フローセル１又はフローセル４−フローセル１）を、BIAevaluation 3.2 Software（GE Healthcare）を用いて分析して、モデル１：１結合、ローカル（local）のＲｍａｘ及び屈折率（ＲＩ）定数０を用いて結合を同定した。
【０３００】
【表５】
2021524278.tif 000006
【０３０１】
動力学的データは、ＦＳ２８−０２４−０６０を除いて、試験された全てのクローンが、ヒトＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉに対する親和性の５倍以内のカニクイザル抗原に対する親和性を有して、カニクイザルＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉと交差反応性であったことを示した。
【０３０２】
さらに、異なるＭＳＬＮ結合領域に結合したクローンの各群について、固定されたヒトＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉに低いナノモル親和性で結合したクローンを同定した。ＦＳ２８−２５６の子孫クローンは、それらのそれぞれの親抗体よりより高い親和性を有しており、これらのクローンの親和性成熟が成功していたことが確認された。興味深いことに、全てのクローンは、溶液中のヒトＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉに対するより固定されたＭＳＬＮに対してより高い親和性を有しており、これは、固定されたＫＤと比べた溶液中のＫＤの倍数差を計算することによって定量された特徴である（表４を参照されたい）。したがって、可溶性ＭＳＬＮへの結合に対する低い親和性によって観察されるように、抗ＭＳＬＮ抗体は、標的に高い親和性で結合しておらず、固定された抗原との促進された結合力相互作用のため、固定されたＭＳＬＮにより強く結合していると考えられると仮説が立てられ得る。結合力は、抗体特異的であるようである。
【０３０３】
４．２  可溶性ＭＳＬＮの存在下でのＮＣＩ−Ｈ２２６への細胞結合
次に、他のシャッフルされていないＦＳ２８−２５６親和性成熟クローン（表５を参照されたい）を補充した全ての選択されたクローンを、２０ｎＭのＭＳＬＮの非存在下及び存在下において、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞における細胞表面ＭＳＬＮへの結合について試験した。使用される方法は、まさに第３．１．４項に記載されるとおりであった。ＥＣ５０及びＥｍａｘ値の両方が決定された（表５）。
【０３０４】
【表６】
2021524278.tif 000007
【０３０５】
データは、試験されるｍＡｂ２の抗ＭＳＬＮ結合Ｆａｂアームが、０．７８から１６ｎＭ超の範囲のＮＣＩ−Ｈ２２６細胞に対する可変の親和性で結合し、クローンの大部分が低いナノモルの細胞結合親和性を示すことを示し、これは、固定された組み換えＭＳＬＮについて報告された親和性と一致していた。ナイーブなＦＳ２８−０２４、ＦＳ２８−０２６、ＦＳ２８−０９１、ＦＳ２８−１８５及びＦＳ２８−２５６の細胞結合親和性のランク付けも、ｍＡｂフォーマットにおいて取得されたランク付けデータと一致していた（表３、第２．４項）。興味深いことに、細胞結合親和性に対する２０ｎＭの組み換えＭＳＬＮの影響は、ほとんどのクローンについて観察されたＥＣ５０の最小（２．５倍未満）の増加を伴い、低かった。特に、ＦＳ２８−２５６由来のクローン、例えばＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４及びＦＳ２８−２５６−０２６の細胞結合親和性は、可溶性ＭＳＬＮの存在によって影響されなかった。これは、過剰な可溶性ＭＳＬＮの存在下でさえ、ほとんどのクローンが膜結合型のＭＳＬＮに優先的に結合したことを示した。
【０３０６】
ＦＳ２８−０２４に由来するクローンについて、可溶性ＭＳＬＮのより可変の影響が３．４から１７．６倍の範囲のＥＣ５０の増加を伴って観察された。
【０３０７】
組み換え可溶性ＭＳＬＮに対する最も高い親和性を有する２つのクローン（表４を参照されたい）、すなわちＦＳ２８−０２４−０６０及びＦＳ２８−２５６−０２７（両方とも溶液中のＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉに対する１桁のｎＭのＫＤを有する）は、可溶性ＭＳＬＮの存在下で細胞に結合するときに最も影響され、これは、より高い親和性の結合剤が、流出されるＭＳＬＮによって影響される可能性がより高いことを示している。結果として、可溶性ＭＳＬＮの存在下でのＥＣ５０の増加は、あまり好ましくなく、その理由は、患者におけるこれらの腫瘍細胞に対するｍＡｂの親和性を最も反映すると考えられるのが、可溶性ＭＳＬＮの存在下での最終的なＥＣ５０であるためである。抗ＭＳＬＮ抗体の実際の必要な親和性は、用途に依存する。
【０３０８】
実施例５：ＦＳ２８−２５６親和性成熟クローンの配列最適化
５．１  ＦＳ２８−２５６親和性成熟クローンの配列最適化
全てのＦＳ２８−２５６系統クローンは、ＶＨ  ＣＤＲ２（ＩＭＧＴ番号付けＮ５５−Ｘ−Ｓ５７、ここで、Ｘは、任意の残基である）中に潜在的なＮ−結合型グリコシル化部位を含有していた。さらに、ＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−０２１及びＦＳ２８−２５６−０２３は、Ｎ１１６−Ｔ１１７位（ＩＭＧＴ番号付け）においてＶＬ  ＣＤＲ３領域中に潜在的な脱アミド化部位を有していた。第３．２項に記載される手順と同様に、ＮＮＫウォーク法を用いて、これらの潜在的なグリコシル化及び脱アミド化部位を除去し得るクローンＦＳ２８−２５６−０２１におけるアミノ酸置換を同定した。最初に、ＶＨ  ＣＤＲ２残基Ｎ５５及びＶＬ  ＣＤＲ３  Ｎ１１６残基をそれぞれのクローンにおいて突然変異させ、突然変異体を、ヒト及びカニクイザルＭＳＬＮへの最適化された結合の保持についてスクリーニングした。ＦＳ２８−２５６−０２１について、ＶＬ  ＣＤＲ３  Ｎ１１６残基への変化が抗原結合の喪失をもたらした。Ｎ５５におけるＶＨ  ＣＤＲ２の変化のうち、４つのみの突然変異体（Ｎ５５Ａ、Ｎ５５Ｈ、Ｎ５５Ｓ及びＮ５５Ｔ）がヒトＭＳＬＮへの結合を保持していたが、それらの結合は、親クローンと比較して弱かった。
【０３０９】
配列を突然変異させることによってＶＬ  ＣＤＲ３中の潜在的な脱アミド化部位を除去することができなかったため、別の手法を採用した。ＦＳ２８−２５６に由来する他の親和性成熟したクローンの一部は、ＦＳ２８−２５６−０２１と同じ重鎖配列を共有していたが、異なる軽鎖配列を有していたため、これらの他のクローンをさらに調べた。具体的には、ＦＳ２８−２５６−０２７を試験のために選択した。上述されるように、ＦＳ２８−２５６−０２７は、ＦＳ２８−２５６−０２１（６．０ｎＭ、表４）より可溶性ＭＳＬＮに対するより高い親和性を有しており、可溶性ＭＳＬＮ（表５）の存在下において、細胞表面で発現されるＭＳＬＮへの減少した結合をもたらし、そのため、その時点で好ましいクローンとして選択されなかった。このクローンが、細胞表面で発現されるＭＳＬＮへの結合について最適化され得るかどうかを調べるために、ＦＳ２８−２５６−０２１クローンについて同定されたＮ５５Ａ、Ｎ５５Ｈ、Ｎ５５Ｓ又はＮ５５Ｔ突然変異をＦＳ２８−２５６−０２７の重鎖中に導入し、４つの得られたクローンの結合を、固定された及び溶液中のＭＳＬＮへの結合について、１００の代わりに約４０のＲＵを用いる以外には実施例４．１において使用されるプロトコルと同様にＳＰＲによって測定した。結果は、表６に示される。ＦＳ２８−２５６−０２７中への突然変異Ｎ５５Ｔの導入により、クローン、ＦＳ２８−２５６−２７４が得られ、これは、他のクローンより固定されたＭＳＬＮに対するはるかに弱い親和性を有していたため、さらに進めなかった。ＦＳ２８−２５６−０２７中への突然変異Ｎ５５Ｈ及びＮ５５Ｓの導入により、それぞれクローンＦＳ２８−２５６−２７２及びＦＳ２８−２５６−２７３が得られ、これは、固定されたＭＳＬＮに対するより高い又は同等の親和性で可溶性ＭＳＬＮに結合した。そのため、細胞表面で発現されるＭＳＬＮへのこれらのクローンの両方の結合が可溶性ＭＳＬＮの存在によって悪影響を受ける可能性が高いと考えられた。対照的に、ＦＳ２８−２５６−０２７中への突然変異Ｎ５５Ａの導入により、クローン、ＦＳ２８−２５６−２７１が得られ、これは、試験される４つのクローンのうち、固定されたＭＳＬＮに対する最も高い親和性及び可溶性ＭＳＬＮへのより弱い結合を示した。これらの結果は、意外なことに、親クローンＦＳ２８−２５６−０２７のＶＨ  ＣＤＲ２におけるＮ５５Ａ突然変異が、ＦＳ２８−２５８−２７１が可溶性ＭＳＬＮより固定されたＭＳＬＮを優先的に標的とするように、固定された及び可溶性ＭＳＬＮの両方への結合の親和性を低下させたことを示した。１０ｎＭ以下のＫＤで固定されたＭＳＬＮに、且つ１０ｎＭ以上のＫＤで可溶性ＭＳＬＮに結合したＦＳ２８−２５６−０２１などの他のクローンと一致して、細胞表面におけるＭＳＬＮへのＦＳ２８−２５８−２７１の結合が可溶性ＭＳＬＮの存在によってあまり影響されないと予想される。
【０３１０】
【表７】
2021524278.tif 000008
【０３１１】
ｍＡｂ2  ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＦＳ２８−２５６−２７１について、カニクイザル交差反応性を、定常状態動力学分析を用いてＳＰＲによって決定した。ＣＭ５チップ（GE Healthcare  ＢＲ−１００５−３０）を製造業者の説明書に従って約５０ＲＵにおいてｈＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ又はｃＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉで被覆した。ｍＡｂ2を１０μｌ／分の流量において、２４３ｎＭから開始する３倍希釈系列である範囲の濃度において注入した。会合時間は、定常状態まで１０００秒であり、解離時間は、３０秒であった。泳動用緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ（GE Healthcare  ＢＲ１００１８８）であった。３０秒間にわたって３０μｌ／分の流量でグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．５を注入することによってフローセルを再生した。意図的にブランクのままにした（抗原コーティングなし）フローセルに対して二重参照することによってデータを分析した。定常状態親和性モデルを用いて、BiaEvaluationソフトウェアバージョン３．２を用いて動力学的データを分析した。カニクイザルＭＳＬＮへの結合は、ヒトＭＳＬＮへの結合の３倍以内であった。
【０３１２】
５．２  抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性
ＭＬＳＮ  ｍＡｂのエフェクター機能を評価するために、分子をＡＤＣＣインビトロアッセイにおいて試験した。この目的のために、ＦＳ２８−２５６−２７１及びＦＳ２８−０２４−０５２抗体を、ＬＡＬＡ突然変異を有するか又は有さない（それぞれＬＡＬＡ又はＧ１）ヒトＩｇＧ１フォーマットで産生した。
【０３１３】
ヒトＭＳＬＮを発現するRaji細胞（Raji.hMSLN細胞）を、Lenti-X HTX Packaging system（Takara、カタログ番号６３１２５３）を用いて、レンチウイルス形質導入によって生成した。ヒトＭＬＳＮをコードするｃＤＮＡを含有するLenti-X発現ベクター（pLVX）（Takara、カタログ番号６３１２５３）をLenti-X HTX Packaging MixとともにLenti-X 293T細胞株（Takara、カタログ番号６３２１８０）に共トランスフェクトして、ウイルスを生成した。次に、Raji細胞株（ATCC（登録商標）CCL-86（商標））にこれらのレンチウイルスベクターを形質導入した。これらの細胞におけるヒトＭＬＳＮの発現を１時間にわたってＧ１／ＳＳ１陽性対照抗体の結合によって確認し、次に蛍光標識された抗ヒトＦｃ検出抗体（Stratech Scientific Ltd、カタログ番号１０９−５４６−０９８−ＪＩＲ）を用いて細胞結合を検出した。
【０３１４】
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイキット（Promega、カタログ番号Ｇ７０１０）を製造業者のプロトコルに従って使用した。ＡＤＣＣキットからのエフェクター細胞をRaji.hMSLN細胞と２０：１の比率で混合した。ｍＡｂ2又は対照抗体ＳＳ１を９６ウェルプレート上で滴定し、６時間にわたって３７℃  ５％のＣＯ２でインキュベートした。製造業者の説明書に従い、Bio-Gloアッセイシステムキット（Promega、カタログ番号Ｇ７９４１）からのルシフェラーゼ基質を加えることによってＡＤＣＣ活性を測定した。発光シグナルを抗体のlog濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてlog（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。結果は、図２に示され、ＦＳ２８−２５６−２７１及びＦＳ２８−０２４−０５２の両方がヒトＩｇＧ１フォーマットである場合にＡＤＣＣ活性を引き起こすことが可能であったことを示す。予想どおり、ＡＤＣＣ活性は、ＬＡＬＡ突然変異がこれらの抗体のｈＩｇＧ１骨格中に導入された場合に喪失された。このデータは、本明細書に記載されるＭＳＬＮ抗体を用いて、エフェクター機能を引き起こして、免疫応答を調節することができることを実証する。
【０３１５】
５．３  初代Ｔ細胞アッセイにおけるＦＳ２８−２５６−２７１の効力
５．３．１  初代Ｔ細胞アッセイにおけるインビトロでのＯＸ４０  ｍＡｂ2フォーマットのＦＳ２８−２５６−２７１の効力
Ｐａｎ  Ｔ細胞を、血小板成分献血の副産物である白血球除去錐体細胞から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。簡潔に述べると、白血球錐体細胞の内容物をＰＢＳでフラッシュし、Ficoll勾配（GE Lifesciencesカタログ番号１７１４４００２）上に重ね合わせた。ＰＢＭＣを、遠心分離及びFicoll勾配を通過しなかった細胞の回収によって単離した。ＰＢＭＣをＰＢＳでさらに洗浄し、残っている赤血球を、製造業者の説明書に従い、１０ｍｌの赤血球溶解緩衝液（eBioscience）の添加によって溶解させた。ＰＢＭＣを計数し、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）、１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies）、ピルビン酸ナトリウム（Gibco）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Gibco）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Gibco）を含むＴ細胞培地（ＲＰＭＩ培地（Life Technologies）中で２．０×１０６個の細胞／ｍｌになるまで再懸濁させた。
【０３１６】
次に、Ｔ細胞を、製造業者の説明書に従い、Ｐａｎ  Ｔ細胞単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec Ltd）を用いてＰＢＭＣから単離した。ヒトT-Activator CD3/CD28 Dynabeads（Invitrogen  １１１．３２Ｄ）をボルテックスによって再懸濁させた。ビーズを、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）、１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies）、ピルビン酸ナトリウム（Gibco）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Gibco）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Gibco）を含むＴ細胞培地（ＲＰＭＩ培地（Life Technologies）で２回洗浄した。Ｔ細胞培地中の１．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度のＴ細胞をＴ−２５フラスコ（Sigma）中で２：１の細胞対ビーズ比率において、洗浄されたヒトT-Activator CD3/CD28 Dynabeadsで刺激し、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートして、Ｔ細胞を活性化した。活性化Ｔ細胞をDynabeadsで洗浄し、２．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度においてＴ細胞培地中で再懸濁させた。９６ウェル平底プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で２時間にわたってＰＢＳ中で希釈された２．５μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体（R&D systemsクローンＵＨＣＴ１）とのインキュベーションによって抗ヒトＣＤ３抗体で被覆し、次にＰＢＳで２回洗浄した。活性化Ｔ細胞を６×１０５個の細胞／ウェルでプレートに加えた。メソテリン発現細胞、ＮＣＩ−Ｈ２２６を２０，０００個の細胞／ウェルで加えた。抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂ並びに抗ＭＳＬＮ  Ｆａｂ  ＦＳ２８−２５６−２７１を含むｍＡｂ2を対照抗体と一緒にこのアッセイにおいて試験した。アッセイプレートを７２時間にわたって３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。上清を収集し、ＩＬ−２放出をヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ（Life Technologies、８８−７０２５−８８）によって測定した。ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の濃度を抗体のlog濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてlog（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。結果は、表７に示され、ＯＸ４０結合部位がＯＸ４０に結合し、それを活性化することができるように、ｍＡｂ２フォーマットにおけるＦＳ２８−２５６−２７１が、細胞表面において発現されるＭＳＬＮに結合し、抗体を架橋することが可能であることを実証する。
【０３１７】
５．３．２  インビトロ初代Ｔ細胞アッセイにおけるＣＤ１３７  ｍＡｂ2フォーマットのＦＳ２８−２５６−２７１の効力
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を５．２に記載されるように得た。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、製造業者の説明書に従い、ＣＤ８＋  Ｔ細胞単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec Ltd、１３０−０９６−４９５）を用いて単離した。９６ウェル平底組織培養プレートを４℃で一晩、ＰＢＳ中の８μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Clone UCHT1、R&D systems、ＭＡＢ１００−ＳＰ）で被覆した。次に、プレートを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）、１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies、１５１４０１２２）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco、１１３６０−０７０）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Sigma-Aldrich、Ｈ０８８７）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma-Aldrich、Ｇ７５１３）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Gibco、Ｍ６２５０））を含む１００μｌのＴ細胞培養培地（ＲＰＭＩ培地（Life Technologies、６１８７０−０４４））中、抗ＣＤ３抗体で被覆された（８μｇ／ｍｌ）９６ウェル平底プレート上において、１ウェル当たり２×１０４個の細胞で平板培養した。細胞が４時間のインキュベーション後に接着した後、全てのＴ細胞培養培地を除去し、４．０×１０５個の細胞／ｍｌの濃度でＴ細胞を含有する５０μｌのＴ細胞培養培地と交換して、２．０×１０４個の細胞／ウェルを得た。対照抗体又はＣＤ１３７  Ｆｃａｂ及びＭＳＬＮ  Ｆａｂ  ＦＳ２８−２５６−２７１を含むｍＡｂ2を、６０ｎＭから開始する４×最終濃度においてＴ細胞培地中で希釈し、１：３又は１：７連続希釈を行った。５０μｌの抗体滴定を２００μｌの総アッセイ体積及び１×濃度の抗体のために細胞に加えた。アッセイを７２時間にわたって３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。上清を収集し、製造業者の説明書に従い、Meso Scale Discovery（Ｋ１５１ＱＱＤ−４）からのＶ−ＰＬＥＸ  ＩＬ−２キットを用いてアッセイした。ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の濃度を抗体のlog濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてlog（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。結果は、表７に示され、ＣＤ１３７結合部位がＣＤ１３７に結合し、それを活性化することができるように、ｍＡｂ２フォーマットにおけるＦＳ２８−２５６−２７１が細胞表面におけるＭＳＬＮに結合し、抗体を架橋することが可能であることを実証する。
【０３１８】
５．３．３  配列最適化されたＭＳＬＮクローンＦＳ２８−２５６−２７１及びＴＮＦＲＳＦメンバーのアゴニズムを駆動するためのその使用の概要
表７は、５．３．１及び５．３．２に記載されるＴ細胞アッセイの結果を示し、これは、Ｔ細胞におけるアゴニズムを誘発するために、ＯＸ４０−又はＣＤ１３７などの異なるＴＮＦＳＦＲを架橋及び活性化するｍＡｂ２フォーマットにおけるＦＳ２８−２５６−２７１などの抗ＭＳＬＮ  Ｆａｂの能力を実証する。
【０３１９】
【表８】
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【０３２０】
抗ヒトメソテリンｍＡｂの単離の概要（実施例１から５）
ファージ選択及び抗体スクリーニング手法は、細胞表面ＭＳＬＮに結合する抗ヒトＭＳＬＮ抗体を単離することを目的としており、ある範囲の親和性、ＭＵＣ１６−ＭＳＬＮブロッキング活性、ＭＳＬＮ領域結合ビン及び細胞結合特性を有する一連の特異的抗メソテリン結合抗体の同定をもたらした。行われるスクリーニングカスケードのため、ほとんどの抗ＭＳＬＮ結合Ｆａｂは、ｍＡｂ又はｍＡｂ２フォーマットのいずれで試験されるかにかかわらず、細胞表面ＭＳＬＮに優先的に結合した。
【０３２１】
実施例６：抗マウスＭＳＬＮ抗体の選択及び特徴付け
６．１  抗マウスＭＳＬＮ  ｍＡｂのナイーブな選択
マウス及びヒトＭＳＬＮの間のアミノ酸同一性は、低い（６０％）。マウスにおけるインビボでの概念実証（ＰｏＣ）試験を可能にするために、本発明者らは、実施例１から５に記載される抗ヒトＭＳＬＮ  ｍＡｂと同様の特性を有する抗マウスＭＳＬＮ  ｍＡｂを単離することに着手した。
【０３２２】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（MSM Technologies）におけるランダム化を伴うヒトＩｇＧ１生殖細胞系列のＦａｂドメインを示す合成ナイーブファージミドライブラリーを用いたファージ選択を、第１．２項に記載されるようにビオチン化マウスＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ（配列番号１７１、第１．１項を参照されたい）とともに選択に使用した。４回の選択を、減少する濃度のビオチン化ｍＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉを用いて及び抗ヒトＭＳＬＮ選択と同様に行い、エピトープマスキング手法を、その後の作業において行った。さらに、組み換え抗原を用いた１回目の後、ＨＥＫ２９３−ｍＭＳＬＮ細胞を生成し、２、３及び４回目に使用した。
【０３２３】
簡潔に述べると、マウスＭＳＬＮ配列をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯベクター（Life Technologies、Ｖ６５２０２０）にサブクローニングし、次にＦｌｐレコンビナーゼ発現プラスミド、ｐＯＧ４４（Life Technologies、Ｖ６００５２０）とともにＦｌｐ−Ｉｎ  ＴＲＥｘ  ２９３細胞株（Life Technologies、Ｒ７８００７）に共トランスフェクトした。細胞を、安定に形質転換された細胞のコロニーが形成されるまで３〜４週間にわたり、１０％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Ｚ２４７５）及び１５μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、Ｂ１１０５）を含有するＤＭＥＭ中で成長させた。これらのコロニーを１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Sigma Aldrich、Ｄ９８９１）の存在下で増幅させ、抗マウスＭＳＬＮ（LS Bio、ＬＳ−Ｃ１７９４８４）を用いて、ＭＳＬＮの発現について試験した。
【０３２４】
富化された集団からの合計で４７の個々のｍＡｂを抗原結合についてスクリーニングし、４５の固有の陽性結合剤をサブクローニングし、実施例１．３において上述されるように、ＩｇＧ１  ＬＡＬＡフォーマットにおける可溶性ｍＡｂとして発現させた。ｍＡｂを、ＥＬＩＳＡによって固定されたｍＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉへの特異的結合について特徴付けし、Biacore分析を用いた動力学実験において、約５０又は２００ＲＵの固定されたｍＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉに対する親和性に基づいてランク付けした。これは、１から２５ｎＭの範囲の親和性を有するＦＳ２８ｍ−１９４、ＦＳ２８ｍ−２０１、ＦＳ２８ｍ−２０９、ＦＳ２８ｍ−２１６、ＦＳ２８ｍ−２２８、ＦＳ２８ｍ−２６１及びＦＳ２８ｍ−２６５を含む一連のｍＡｂを同定した。さらに、ＭＳＬＮの異なる領域への結合を、第２．１．３項に記載されるように試験した。ＭＯＲ６６２６クローン（特許公開番号国際公開第２００９／０６８２０４  Ａ１号）のＶＨ及びＶＬをクローニングすることによって生成されたマウス交差反応性ｍＡｂ  Ｇ１−ＡＡ／ＭＯＲ６６２６を陽性対照として使用した。ほとんどのクローンは、その中でも特にＦＳ２８ｍ−２２８は、ＭＯＲ６６２６に既に結合したＭＳＬＮに結合することができなかった一方、ＦＳ２８−１９４又はＦＳ２８−０２６のような他のクローンは、それぞれ部分的な又は完全な結合を示した。したがって、異なる領域（ビン）に結合するクローンを単離した。ＭＯＲ６６２６の抗ＭＳＬＮ結合領域は、インビボＰｏＣ試験に使用されている（特許公開番号米国特許出願公開第２０１７／０３４２１６９  Ａ１号）。得られたデータに基づいて、ＦＳ２８ｍ−２２８は、ＭＳＬＮにおける、ＭＯＲ６６２６と同様の領域に結合する可能性がある。
【０３２５】
６．２  抗マウスＭＳＬＮ  ｍＡｂの親和性成熟
ＦＳ２８ｍ−２２８のＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲ３領域を、実施例３．１．１に記載されるように、ＮＮＫプライマーを用いて、５つのアミノ酸の重複カセットをランダム化することにより、ｓｃＦｖフォーマットにおいて並行して最適化した。２回の選択を、１回目に５０ｎＭのビオチン化ｍＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉを用いて及び２回目に０．２ｎＭのｍＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉを用いて行った。２回目について、１０００倍過剰（２００ｎＭ）のｍＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ（非ビオチン化）を加え、室温で２．５時間にわたって抗原／ファージ混合物をインキュベートすることによってオフレートの選択圧も加えた。次に、可溶性ｓｃＦｖ（単一点濃度）を、Octetを用いて、ｍＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉへの結合について試験した。簡潔に述べると、ストレプトアビジンセンサー（ForteBio、１８−５０１９）を５分間にわたってｍＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ（１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。１０×キネティックバッファーを用いて、１×緩衝液（ForteBio、１８−１０９２）の最終濃度に希釈された可溶性ｓｃＦｖの、ｍＭＳＬＮへの会合を５分間にわたって分析した後、５分間の解離工程を行った。親ＦＳ２８ｍ−２２８  ｓｃＦｖと比較して、試験される８５個のクローンのうちの約６６個は、改善した結合を示した。９つのクローンをｍＡｂ２フォーマットにおける発現に進め、記載されるのと同じクローニング及び発現方法（第３．１．２項）を用いて、Ｆａｂアームを、マウスＣＤ１３７に結合するＦｃａｂ（ＦＳ２２−０６３−ＡＡと呼ばれる）と組み合わせた。示される得られたｍＡｂ２をそれらのＭＳＬＮ結合親和性について試験した。
【０３２６】
６．３  固定された及び可溶性マウスＭＳＬＮに対する抗マウスＭＳＬＮ  ｍＡｂ２の結合親和性
抗ヒトＭＳＬＮ結合剤と同様に、ＦＳ２８ｍ−２２８に由来する親和性成熟した変異体を、Biacoreを用いて、固定された及び可溶性ＭＳＬＮへの結合について試験した。固定されたＭＳＬＮに結合するための手順は、５０ＲＵで固定されたｍＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉについて第２．１．４項に記載される方法と同様であった。可溶性ＭＳＬＮに対する親和性を決定するために、ｍＡｂ２を、抗ヒトＦｃを介して捕捉した。簡潔に述べると、２５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（GE Healthcare、Human Antibody Capture Kit、ＢＲ１００８３９）をBiacore sensor chip CM5（GE Healthcare、ＢＲ１００５３０）のフローセル１、２、３及び４上に被覆し、約７５０ＲＵの最終的な応答を達成した。５０ｎＭで、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（GE Healthcare、ＢＲ１００１８８）中で希釈されたｍＡｂ２クローンを３０μｌ／分でフローセル２、３及び４において個別に注入して、約１００ＲＵの応答を達成した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で希釈された組み換えｍＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ抗原を、７０μｌ／分で５分間にわたり、３倍希釈物で必要に応じて２４３ｎＭから０．１１ｎＭの範囲の濃度でフローセル１、２、３又は４上に注入し、次に５分間にわたって緩衝液中で解離させた。３０μｌ／分の速度で３０秒間にわたって３Ｍの塩化マグネシウム（GE Healthcare、Human Antibody Capture Kit、ＢＲ１００８３９）を注入することによって再生を行った。
【０３２７】
固定された及び溶液中の親和性の両方の動力学的データ（表８）は、親ＦＳ２８ｍ−２２８  Ｆａｂアームと比較して、親和性成熟したクローンがマウスＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ抗原への改善した結合を示したことを示した。さらに、全てのクローンは、可変の比率において、可溶性ＭＳＬＮに対するより高い、固定されたＭＳＬＮに対する親和性で結合速度を示した。第４．１及び５．１項に記載されるヒトクローンと同様に、これらのクローンは、促進された強力な結合相互作用のため、可溶性の流出されるＭＳＬＮより膜結合型のＭＳＬＮへのより強い結合を有し得ると考えられた。したがって、ＦＳ２８ｍ−２２８の親和性成熟は、マウスＭＳＬＮに対する増加した親和性を有する一連の親和性成熟したクローンをもたらし、これらは、全て可溶性ＭＳＬＮより固定されたＭＳＬＮにより強く結合した。クローンＦＳ２８ｍ−２２８−０１０は、固定されたマウスＭＳＬＮに対する最も高い親和性及び溶液中のマウスＭＳＬＮに対する低い親和性を有していたため、好ましいクローンとして選択された。
【０３２８】
【表９】
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【０３２９】
６．４  抗マウスメソテリンｍＡｂの単離の概要
ファージ選択及び抗体スクリーニング手法は、ある範囲の親和性を有し、ｍＭＳＬＮの異なる領域に結合する一連の抗マウスメソテリン結合クローンの同定をもたらした。抗ヒトＭＳＬＮ結合剤と同様に、クローンは、可溶性ｍＭＳＬＮより固定されたｍＭＳＬＮへの結合に有利に作用する結合特性を示したため、マウスインビボＰｏＣ試験において試験するのに好適な分子になる。
【０３３０】
６．５  抗マウスＭＳＬＮ  ｍＡｂ  ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０を含有するｍＡｂ2のインビボ有効性
ｈＩｇＧ１アイソタイプの抗ＭＬＳＮ  ｍＡｂがＡＤＣＣ活性を引き起こすことが可能であることを示したため、抗ＭＬＳＮ  ｍＡｂがＣＤ１３７  ｍＡｂ2フォーマットにおいてインビボでのＭＬＳＮ依存性架橋を引き起こすことが可能であることを実証することが望ましかった。
【０３３１】
マウスＭＳＬＮを発現する同種マウス腫瘍モデルを構築した。完全長マウスメソテリン（配列番号１７１）を発現するＣＴ２６結腸癌細胞（ATCC、CRL-2638）を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（＋）（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号Ｖ７９０２０）を用いて、リポフェクション（Lipofectamine 3000、Thermo Fisher Scientific、カタログ番号Ｌ３０００００８）によって産生した。製造業者のプロトコルに従い、ＣＴ２６細胞を、マウスＭＳＬＮ  ｃＤＮＡを含有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターでトランスフェクトした。安定したトランスフェクションを、完全培地（ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ）中で選択抗生物質（６００μｇ／ｍｌで）としてジェネティシンを用いて行った。ＣＴ２６細胞におけるマウスＭＳＬＮの発現を、陽性対照抗体ＭＯＲ６６２６（国際公開第２００９／０６８２０４  Ａ１号）を使用することにより、フローサイトメトリーによって確認した。具体的には、細胞を１時間にわたって陽性対照抗体とともにインキュベートし、次に蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ検出抗体（Stratech Scientific Ltd、カタログ番号１０９−５４６−０９８−ＪＩＲ）を用いて、細胞結合を検出した。クローン集団を増殖させ、その後、同じフローサイトメトリー手順を用いて相対的発現レベルを決定するために分析し、その後、１つのクローンを選択し、ＣＴ２６．Ｇ１０と命名した。
【０３３２】
ＣＴ２６．Ｇ１０腫瘍成長をインビボで確認した。８〜１０週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウス（Charles River）にマイクロチップを埋め込み、固有の識別子を与えた。各コホートは、１７匹のマウスを有し、各動物に、１００μｌの無血清培地中において、背部左脇腹に皮下注射される１×１０５個の細胞を与えた。腫瘍体積測定を、キャリパーを用いて週に３回行って、腫瘍の最長軸及び最短軸の最長軸及び最短軸を決定した。以下の式を用いて、腫瘍体積を計算した：
体積＝Ｌ×Ｓ２２
（式中、Ｌ＝最長軸であり；Ｓ＝最短軸である）。
【０３３３】
英国動物（科学的処置）法（United Kingdom Animal (Scientific Procedures) Act）及びＥＵ指令EU86/609に従い、腫瘍体積が人道的エンドポイントに達したときに試験を停止した。腫瘍組織を、試験の終了時に採取し、膜結合メソテリンの発現を以下のようにホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織中での免疫組織化学的染色によって確認した：４μｍのＦＦＰＥ組織切片を脱パラフィンし、抗原を、９７℃で低いｐＨ６．１を用いて回収し（Dako PT Link）、続いてペルオキシダーゼブロック及びタンパク質ブロックを行ってから、１μｇ／ｍｌの濃度で一次抗メソテリン抗体（LifeSpan Biosciences、カタログ番号ＬＳ−Ｃ４０７８８３）とのインキュベーションを行った。抗メソテリン抗体を、標識されたポリマー−ＨＲＰ抗ウサギ二次試薬及びＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）比色エンドポイント（chromogenic endpoint）（Dako EnVision+ System）を用いて検出した。
【０３３４】
抗体ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０を評価するために、以下の分子又は組合せをインビボで試験した：ＬＡＬＡ突然変異を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦＳ２８ｍ−２２８−０１０抗体（Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０）、２つの「モック」ＣＤ１３７  ｍＡｂ２（ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０）、ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０抗体と、ＬＡＬＡ突然変異を有するモックＣＤ１３７  ｍＡｂ２との組合せ（Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０＋ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）、ヒトアイソタイプ対照抗体（Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）及び最後にＬＡＬＡ突然変異を有するＣＤ１３７／ＭＳＬＮ  ｍＡｂ2（ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０）（配列番号１９６及び１９７）。
【０３３５】
８〜１０週齢であり、且つそれぞれ重量２０〜２５ｇのＢａｌｂ／ｃ雌マウス（Charles River）を試験開始前の１週間にわたって順化させた。全ての動物にマイクロチップを埋め込み、固有の識別子を与えた。ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０（ｎ＝１０匹のマウス）を除いて、各コホートは、２０匹のマウスを含んでいた。ＣＴ２６．Ｇ１０結腸癌細胞株を増殖させ、細胞バンクを生成した。各動物に、１００μｌの無血清培地中において、左脇腹に皮下注射される１×１０５個の細胞を与えた。腫瘍細胞接種の１２日後に腫瘍を有さなかったマウスを試験から外した。
【０３３６】
２００μｇの用量の各抗体（約１０ｍｇ／ｋｇ）を調製し、マウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。さらに、Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０＋ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３の両方は、併用群のために１回の投与当たり２００μｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）でそれぞれ調製した。２００μｌの用量を腫瘍接種の１２、１４及び１６日後に（隔日（ｑ２ｄ）×３）マウスに投与した。腫瘍体積測定を、キャリパーを用いて週に３回行い、マウスを厳密に監視した。試験エンドポイントをマウスの腫瘍体積及び状態に基づいて人道的エンドポイントによって決定した。
【０３３７】
図３に示されるように、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０  ｍＡｂ２は、Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３アイソタイプ対照と比較して、腫瘍成長を有意に阻害した。表９は、全ての群をＧ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３アイソタイプ対照と比較する、混合モデル分析を用いた試験の全過程にわたる全ての処理群についての腫瘍成長速度のペアワイズ比較を示す。
【０３３８】
試験終了時に６２．５ｍｍ３以下の腫瘍を有する全ての動物を十分に奏功した動物として計数した（表１０を参照されたい）。抗ＣＤ１３７／ＭＳＬＮ  ｍＡｂ２で処理された動物の３５％は、Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３アイソタイプ対照、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３及びＧ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０併用群における０％と比較して、試験終了時に治療に対する完全奏功を示した。
【０３３９】
生存分析（図４及び表１１）は、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０  ｍＡｂ２がＧ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３抗体と比較して有意な生存利益を誘発した一方、Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０）が生存利益を示さなかったことを示した。さらに、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０  ｍＡｂ２は、Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（２９日）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（３０日）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０（２９日）、Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（３０日）及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３とＧ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０との組合せ（２９日）と比較して４２．５日の生存期間中央値の改善をもたらした。
【０３４０】
これらのデータは、ＭＳＬＮを介したｍＡｂ２の架橋が、腫瘍におけるＣＤ１３７アゴニズム；ＣＤ１３７及び／又はＭＳＬＮ単独（及び組合せでも）を標的とするより優れた二重特異的抗体の作用を引き起こすことが可能であり、担腫瘍マウスの有意に改善された生存をもたらすことを示唆する。ＬＡＬＡ突然変異を有するｍＡｂ（Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０）は、それ自体でこの試験において固有の活性を示さなかった。理論に制約されることを望むものではないが、抗体ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（ＬＡＬＡ突然変異を除く）のエフェクターコンピテント形態は、第５．２項において観察されるインビトロでの結果と一致して、ＡＤＣＣ活性及び抗腫瘍有効性を示すと予想される。
【０３４１】
【表１０】
2021524278.tif 000011
【０３４２】
【表１１】
2021524278.tif 000012
【０３４３】
【表１２】
2021524278.tif 000013
【０３４４】
６．６  抗マウスＭＬＳＮ  ｍＡｂ  ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０を含有する抗マウスＣＤ１３７／ＭＳＬＮ  ｍＡｂ２の作用機序
抗マウスＭＳＬＮ  ｍＡｂ  ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０を含有するＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０で観察された抗腫瘍応答の薬理学をさらに理解するために、ＭＳＬＮ陽性同系腫瘍モデルにおけるＣＤ１３７／ＭＳＬＮ  ｍＡｂ２の作用機序を調べた。
【０３４５】
マウスを、実施例６．５に記載されるように準備し、ＣＴ２６．Ｇ１０結腸癌細胞株を接種した。各コホートは、２０匹のマウスからなっていた。ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８−２２８−０１０（ＣＤ１３７／ＭＳＬＮ）ｍＡｂ２、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｇ１−ＡＡ／４４２０）及び抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体（クローン３Ｈ３；Ｇ１／３Ｈ３；Rickert et al., 2016）も比較のために含まれていた。３つ全ての抗体をＤＰＢＳ＋１ｍＭのアルギニン＋０．０５％のTween 80中で１回の投与当たり１３４μｇ（２０ｇのマウスで約６．７ｍｇ／ｋｇ）で調製し、マウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。各マウスに、腫瘍接種後２０日目に１３４μｇの一定用量で１回の２００μｌの腹腔内注射によって抗体を投与した。腫瘍体積測定を、実施例６．５に記載されるようにキャリパーを用いて週に３回行い、マウスを厳密に監視した。
【０３４６】
１群当たり６匹のマウスを、腫瘍接種後２０日目に、投与の２４、７２、１４４及び１９２時間後に解剖した。脾臓、血液及び腫瘍組織を、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８−２２８−０１０、Ｇ１−ＡＡ／４４２０又はＧ１／３Ｈ３のいずれかで処理されたＣＴ２６．Ｇ１０担腫瘍マウスから分析のために採取した。Ｔ細胞活性化及び増殖マーカーは、ＣＤ１３７アゴニズムの下流の影響であることが知られているため（Fisher et al., 2012）、全ての試料をフローサイトメトリーによってＴ細胞存在量及び増殖について調べた。さらに、血液からの血清も可溶性ＭＳＬＮ発現の検出及び定量のために採取した。脾臓及び腫瘍組織を標準的な機械的及び酵素的方法によって単一の細胞懸濁液に分解し、赤血球を赤血球溶解緩衝液中で１回溶解させた（Miltenyi Biotec Ltd.、１３０−０９４−１８３）。血液を末端の心臓の出血（terminal cardiac bleed）によって収集し、半分をフローサイトメトリーによる単一細胞分析のためにＥＤＴＡを含む管中に収集し、血液の半分を可溶性ＭＳＬＮの分析のために凝固活性化因子／血清管中に収集した。ＥＤＴＡを含む管中に収集された全血を製造業者の説明書に従って赤血球溶解緩衝液（Miltenyi Biotec Ltd.、１３０−０９４−１８３）中で３回溶解させた。血清管中に収集された血液を遠心分離によって分画し、血清を可溶性ＭＳＬＮの分析のために取り出した。
【０３４７】
次に、脾臓、腫瘍及び血液からの単一細胞を同様に処理し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、試料を固定可能な生存性色素（eBioscience、６５−０８６５−１４）で染色した。その後、細胞を４℃で４５分間にわたってＦｃブロック（eBioscience、１：２５で１６−０１６１−８５）の存在下において、表１２に示される抗体染色パネル（細胞内マーカー、Ｋｉ６７及びＦｏｘＰ３を除く）を用いて細胞表面マーカーのために染色した。次に、細胞を固定し、製造業者の説明書に従ってeBioscience FoxP3染色キット（eBioscience、００−５５２３−００）で透過処理した。細胞を細胞内マーカーＫｉ６７及びＦｏｘＰ３抗体とともに１００μｌの透過処理緩衝液中で再懸濁させ、暗所で４℃において一晩インキュベートした。BD Fortessaフローサイトメーターにおける取得前に細胞を透過処理緩衝液で１回洗浄し、０．５％のＢＳＡを含有する１２０μｌのＰＢＳ中で再懸濁させた。データを、BD FACS Divaソフトウェアを用いて取得し、FlowJo（Ｖ１０）及びMicrosoft Excelを用いて分析した。データは、親集団におけるパーセンテージとして、投与の１４４時間後の時点でのＣＤ８＋  Ｔ細胞の存在量及び増殖を示す。
【０３４８】
【表１３】
2021524278.tif 000014
【０３４９】
表１３に示されるように、腫瘍中のＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージの増加は、対照処理群（Ｇ１−ＡＡ／４４２０）と比較して、Ｇ１／３Ｈ３及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８−２２８−０１０  ｍＡｂ２の投与の１４４時間後に観察された。腫瘍中のＣＤ８＋  Ｔ細胞の平均パーセンテージは、投与の１４４時間後の時点でＧ１／３Ｈ３では３２．１％（Ｇ１−ＡＡ／４４２０）から５６．１％に増加し、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０では５８．４％に増加した。
【０３５０】
さらに、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の存在量の増加は、血液及び脾臓中でも観察されたが、ＩｇＧ１対照と比較してＧ１／３Ｈ３でのみであった。投与の１４４時間後の時点で血液中において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の平均パーセンテージは、２２．６％（Ｇ１−ＡＡ／４４２０）から５７．０％（Ｇ１／３Ｈ３）に増加したが、この増加は、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（２５．８％）で観察されなかった。同様に、脾臓中において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の平均パーセンテージは、Ｇ１／３Ｈ３では２８．８％（Ｇ１−ＡＡ／４４２０）から３８．０％に増加したが、この増加は、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（２９％）で観察されなかった。
【０３５１】
これは、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０  ｍＡｂ２が、ＭＳＬＮが発現される場合、腫瘍において特異的にＣＤ８＋  Ｔ細胞を増加させることを示唆する一方、ＣＤ１３７標的化抗体、Ｇ１／３Ｈ３も、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の末梢（血液及び脾臓）における増加を示す。
【０３５２】
投与後にＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖の差があったかどうかを確認するために、増殖マーカー、Ｋｉ６７を腫瘍、血液及び脾臓中のＣＤ８＋  Ｔ細胞において分析した。表１４に示されるように、高い割合のＣＤ８＋  Ｔ細胞が対照群においてＫｉ６７＋を発現し（７５．１％の平均発現）、これは、ＣＴ２６．Ｇ１０モデルにおいて腫瘍中の高いレベルの増殖するＣＤ８＋  Ｔ細胞を示唆している。これは、腫瘍中の投与群間のＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＫｉ６７発現の不明確な差につながり得る。
【０３５３】
比較すると、血液及び脾臓中のＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＫｉ６７＋発現の明らかな増加がＩｇＧ１対照と比較してＧ１／３Ｈ３の投与の１４４時間後に観察された。血液中において、アイソタイプ対照処理マウスは、１０．４％の、ＣＤ８＋  Ｔ細胞における平均Ｋｉ６７＋発現を示す一方、Ｇ１／３Ｈ３の投与後のＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＫｉ６７の平均発現は、投与の１４４時間後の時点で８６．３％であることが示される。比較すると、この増加は、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０で観察されず、ここで、ＣＤ８＋  Ｔ細胞における平均Ｋｉ６７＋発現は、血液中でｍＡｂ２の投与後に１３．１％で観察された。同様に、脾臓中において、平均Ｋｉ６７＋発現は、アイソタイプ対照で投与後に観察された８．１％及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０で観察された１１．４％と比較して、Ｇ１／３Ｈ３の投与後にＣＤ８＋  Ｔ細胞の３６．１％で観察された。
【０３５４】
【表１４】
2021524278.tif 000015
【０３５５】
【表１５】
2021524278.tif 000016
【０３５６】
総合すると、これらのデータは、抗マウスＭＬＳＮ  ｍＡｂ  ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０を含有するｍＡｂ2が腫瘍中の細胞傷害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の腫瘍特異的増加を媒介することを示す。これは、Ｇ１／３Ｈ３でも観察されるが、このＣＤ１３７標的化アゴニストは、血液及び脾臓中のＣＤ８＋  Ｔ細胞の末梢の増加も促進する。さらに、これらのＣＤ８＋  Ｔ細胞は、Ｇ１／３Ｈ３の投与後に増加した増殖も示す。
【０３５７】
配列表
親クローン及び親和性成熟したクローンＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−００５、ＦＳ２８−２５６−０１２、ＦＳ２８−２５６−０１４、ＦＳ２８−２５６−０１８、ＦＳ２８−２５６−０２１、ＦＳ２８−２５６−０２３、ＦＳ２８−２５６−０２４、ＦＳ２８−２５６−０２６及びＦＳ２８−２５６−０２７に適用可能な「マスター」ＣＤＲ２配列を示す親クローンＦＳ２８−２５６の重鎖アミノ酸配列。二重下線が引かれた「Ｘ」は、可能なＮ−結合型グリコシル化を除去するための全ての潜在的な置換を表す。得られたクローンは、１つ若しくは他の置換又はその両方のいずれかを含有し得る。
配列番号１  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１】
2021524278.tif 000017
配列番号２  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２】
2021524278.tif 000018
【０３５８】
クローンＦＳ２８−２５６−００１、ＦＳ２８−２５６−０２１及びＦＳ２８−２５６−０２３に適用可能なマスター軽鎖アミノ酸配列。二重下線が引かれた「Ｘ」は、可能な脱アミド化部位を除去するための全ての潜在的な置換を表す。得られたクローンは、１つ若しくは他の置換又はその両方のいずれかを含有し得る。
配列番号３  軽鎖
【化３】
2021524278.tif 000019
【０３５９】
ＦＳ２８−０２４  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号４  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化４】
2021524278.tif 000020
配列番号６  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化５】
2021524278.tif 000021
配列番号５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化６】
2021524278.tif 000022
配列番号７  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化７】
2021524278.tif 000023
配列番号８  可変ドメインＡＡ
【化８】
2021524278.tif 000024
配列番号９  可変ドメインＤＮＡ
【化９】
2021524278.tif 000025
【化１０】
2021524278.tif 000026
【０３６０】
ＦＳ２８−０２４  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１６  軽鎖ＡＡ
【化１１】
2021524278.tif 000027
配列番号１７  軽鎖ＤＮＡ
【化１２】
2021524278.tif 000028
配列番号１８  可変ドメインＡＡ
【化１３】
2021524278.tif 000029
配列番号１９  可変ドメインＤＮＡ
【化１４】
2021524278.tif 000030
【化１５】
2021524278.tif 000031
【０３６１】
ＦＳ２８−０２４−０５１  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号２６  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１６】
2021524278.tif 000032
配列番号２７  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１７】
2021524278.tif 000033
配列番号２８  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１８】
2021524278.tif 000034
配列番号２９  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１９】
2021524278.tif 000035
配列番号３０  可変ドメインＡＡ
【化２０】
2021524278.tif 000036
配列番号３１  可変ドメインＤＮＡ
【化２１】
2021524278.tif 000037
【化２２】
2021524278.tif 000038
【０３６２】
ＦＳ２８−０２４−０５１  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１６  軽鎖ＡＡ
【化２３】
2021524278.tif 000039
配列番号１７  軽鎖ＤＮＡ
【化２４】
2021524278.tif 000040
配列番号１８  可変ドメインＡＡ
【化２５】
2021524278.tif 000041
配列番号１９  可変ドメインＤＮＡ
【化２６】
2021524278.tif 000042
【化２７】
2021524278.tif 000043
【０３６３】
ＦＳ２８−０２４−０５２  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号３５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２８】
2021524278.tif 000044
配列番号３６  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２９】
2021524278.tif 000045
配列番号３７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化３０】
2021524278.tif 000046
配列番号３８  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化３１】
2021524278.tif 000047
配列番号３９  可変ドメインＡＡ
【化３２】
2021524278.tif 000048
配列番号４０  可変ドメインＤＮＡ
【化３３】
2021524278.tif 000049
【化３４】
2021524278.tif 000050
【０３６４】
ＦＳ２８−０２４−０５２  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１６  軽鎖ＡＡ
【化３５】
2021524278.tif 000051
配列番号１７  軽鎖ＤＮＡ
【化３６】
2021524278.tif 000052
配列番号１８  可変ドメインＡＡ
【化３７】
2021524278.tif 000053
配列番号１９  可変ドメインＤＮＡ
【化３８】
2021524278.tif 000054
【化３９】
2021524278.tif 000055
【０３６５】
ＦＳ２８−０２４−０５３  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号４５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化４０】
2021524278.tif 000056
配列番号４６  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化４１】
2021524278.tif 000057
配列番号４７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化４２】
2021524278.tif 000058
配列番号４８  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化４３】
2021524278.tif 000059
配列番号４９  可変ドメインＡＡ
【化４４】
2021524278.tif 000060
配列番号５０  可変ドメインＤＮＡ
【化４５】
2021524278.tif 000061
【化４６】
2021524278.tif 000062
【０３６６】
ＦＳ２８−０２４−０５３  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１６  軽鎖ＡＡ
【化４７】
2021524278.tif 000063
配列番号１７  軽鎖ＤＮＡ
【化４８】
2021524278.tif 000064
配列番号１８  可変ドメインＡＡ
【化４９】
2021524278.tif 000065
配列番号１９  可変ドメインＤＮＡ
【化５０】
2021524278.tif 000066
【化５１】
2021524278.tif 000067
【０３６７】
ＦＳ２８−０２４−０６０  ｍＡｂ（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号５５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化５２】
2021524278.tif 000068
配列番号１６  軽鎖ＡＡ
【化５３】
2021524278.tif 000069
【０３６８】
ＦＳ２８−０２６  ｍＡｂ（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号５８  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化５４】
2021524278.tif 000070
配列番号５９  軽鎖ＡＡ
【化５５】
2021524278.tif 000071
【０３６９】
ＦＳ２８−０９１  ｍＡｂ（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号６０  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化５６】
2021524278.tif 000072
配列番号６１  軽鎖ＡＡ
【化５７】
2021524278.tif 000073
【０３７０】
ＦＳ２８−１８５  ｍＡｂ（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号６２  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化５８】
2021524278.tif 000074
配列番号１９５  軽鎖ＡＡ
【化５９】
2021524278.tif 000075
【０３７１】
ＦＳ２８−２５６  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号６５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化６０】
2021524278.tif 000076
配列番号６６  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化６１】
2021524278.tif 000077
配列番号６７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化６２】
2021524278.tif 000078
配列番号６８  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化６３】
2021524278.tif 000079
配列番号６９  可変ドメインＡＡ
【化６４】
2021524278.tif 000080
配列番号７０  可変ドメインＤＮＡ
【化６５】
2021524278.tif 000081
【化６６】
2021524278.tif 000082
【０３７２】
ＦＳ２８−２５６  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号７７  軽鎖ＡＡ
【化６７】
2021524278.tif 000083
配列番号７８  軽鎖ＤＮＡ
【化６８】
2021524278.tif 000084
配列番号７９  可変ドメインＡＡ
【化６９】
2021524278.tif 000085
配列番号８０  可変ドメインＤＮＡ
【化７０】
2021524278.tif 000086
【化７１】
2021524278.tif 000087
【０３７３】
ＦＳ２８−２５６−００１  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号８１  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化７２】
2021524278.tif 000088
配列番号８２  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化７３】
2021524278.tif 000089
配列番号８９  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化７４】
2021524278.tif 000090
配列番号８４  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化７５】
2021524278.tif 000091
配列番号６３  可変ドメインＡＡ
【化７６】
2021524278.tif 000092
配列番号６４  可変ドメインＤＮＡ
【化７７】
2021524278.tif 000093
【化７８】
2021524278.tif 000094
【０３７４】
ＦＳ２８−２５６−００１  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号８３  軽鎖ＡＡ
【化７９】
2021524278.tif 000095
配列番号９２  軽鎖ＤＮＡ
【化８０】
2021524278.tif 000096
配列番号９３  可変ドメインＡＡ
【化８１】
2021524278.tif 000097
配列番号９４  可変ドメインＤＮＡ
【化８２】
2021524278.tif 000098
【化８３】
2021524278.tif 000099
【０３７５】
ＦＳ２８−２５６−００５  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号８７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化８４】
2021524278.tif 000100
配列番号８８  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化８５】
2021524278.tif 000101
配列番号８９  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化８６】
2021524278.tif 000102
配列番号８４  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化８７】
2021524278.tif 000103
配列番号６３  可変ドメインＡＡ
【化８８】
2021524278.tif 000104
配列番号６４  可変ドメインＤＮＡ
【化８９】
2021524278.tif 000105
【化９０】
2021524278.tif 000106
【０３７６】
ＦＳ２８−２５６−００５  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列）
配列番号９０  軽鎖ＡＡ
【化９１】
2021524278.tif 000107
配列番号９１  軽鎖ＤＮＡ
【化９２】
2021524278.tif 000108
配列番号５３  可変ドメインＡＡ
【化９３】
2021524278.tif 000109
配列番号５４  可変ドメインＤＮＡ
【化９４】
2021524278.tif 000110
【化９５】
2021524278.tif 000111
【０３７７】
ＦＳ２８−２５６−０１２  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１０５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化９６】
2021524278.tif 000112
配列番号１０６  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化９７】
2021524278.tif 000113
配列番号１０７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化９８】
2021524278.tif 000114
配列番号１０８  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化９９】
2021524278.tif 000115
配列番号１０９  可変ドメインＡＡ
【化１００】
2021524278.tif 000116
配列番号１１０  可変ドメインＤＮＡ
【化１０１】
2021524278.tif 000117
【化１０２】
2021524278.tif 000118
【０３７８】
ＦＳ２８−２５６−０１２  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号７７  軽鎖ＡＡ
【化１０３】
2021524278.tif 000119
配列番号７８  軽鎖ＤＮＡ
【化１０４】
2021524278.tif 000120
配列番号７９  可変ドメインＡＡ
【化１０５】
2021524278.tif 000121
配列番号８０  可変ドメインＤＮＡ
【化１０６】
2021524278.tif 000122
【化１０７】
2021524278.tif 000123
【０３７９】
ＦＳ２８−２５６−０１４  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１１７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１０８】
2021524278.tif 000124
配列番号１１８  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１０９】
2021524278.tif 000125
配列番号１１９  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１１０】
2021524278.tif 000126
配列番号１２０  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１１１】
2021524278.tif 000127
配列番号１１５  可変ドメインＡＡ
【化１１２】
2021524278.tif 000128
配列番号１１６  可変ドメインＤＮＡ
【化１１３】
2021524278.tif 000129
【化１１４】
2021524278.tif 000130
【０３８０】
ＦＳ２８−２５６−０１４  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号７７  軽鎖ＡＡ
【化１１５】
2021524278.tif 000131
配列番号７８  軽鎖ＤＮＡ
【化１１６】
2021524278.tif 000132
配列番号７９  可変ドメインＡＡ
【化１１７】
2021524278.tif 000133
配列番号８０  可変ドメインＤＮＡ
【化１１８】
2021524278.tif 000134
【化１１９】
2021524278.tif 000135
【０３８１】
ＦＳ２８−２５６−０１８  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１２３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１２０】
2021524278.tif 000136
配列番号１２４  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１２１】
2021524278.tif 000137
配列番号１２５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１２２】
2021524278.tif 000138
配列番号１２６  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１２３】
2021524278.tif 000139
配列番号１２１  可変ドメインＡＡ
【化１２４】
2021524278.tif 000140
配列番号１２２  可変ドメインＤＮＡ
【化１２５】
2021524278.tif 000141
【化１２６】
2021524278.tif 000142
【０３８２】
ＦＳ２８−２５６−０１８  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号７７  軽鎖ＡＡ
【化１２７】
2021524278.tif 000143
配列番号７８  軽鎖ＤＮＡ
【化１２８】
2021524278.tif 000144
配列番号７９  可変ドメインＡＡ
【化１２９】
2021524278.tif 000145
配列番号８０  可変ドメインＤＮＡ
【化１３０】
2021524278.tif 000146
【化１３１】
2021524278.tif 000147
【０３８３】
ＦＳ２８−２５６−０２１  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１０５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１３２】
2021524278.tif 000148
配列番号１０６  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１３３】
2021524278.tif 000149
配列番号１０７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１３４】
2021524278.tif 000150
配列番号１０８  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１３５】
2021524278.tif 000151
配列番号１０９  可変ドメインＡＡ
【化１３６】
2021524278.tif 000152
配列番号１１０  可変ドメインＤＮＡ
【化１３７】
2021524278.tif 000153
【化１３８】
2021524278.tif 000154
【０３８４】
ＦＳ２８−２５６−０２１  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号８３  軽鎖ＡＡ
【化１３９】
2021524278.tif 000155
配列番号９２  軽鎖ＤＮＡ
【化１４０】
2021524278.tif 000156
配列番号９３  可変ドメインＡＡ
【化１４１】
2021524278.tif 000157
配列番号９４  可変ドメインＤＮＡ
【化１４２】
2021524278.tif 000158
【化１４３】
2021524278.tif 000159
【０３８５】
ＦＳ２８−２５６−０２３  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１２３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１４４】
2021524278.tif 000160
配列番号１２４  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１４５】
2021524278.tif 000161
配列番号１２５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１４６】
2021524278.tif 000162
配列番号１２６  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１４７】
2021524278.tif 000163
配列番号１２１  可変ドメインＡＡ
【化１４８】
2021524278.tif 000164
配列番号１２２  可変ドメインＤＮＡ
【化１４９】
2021524278.tif 000165
【化１５０】
2021524278.tif 000166
【０３８６】
ＦＳ２８−２５６−０２６  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１２３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１５１】
2021524278.tif 000167
配列番号１２４  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１５２】
2021524278.tif 000168
配列番号１２５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１５３】
2021524278.tif 000169
配列番号１２６  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１５４】
2021524278.tif 000170
配列番号１２１  可変ドメインＡＡ
【化１５５】
2021524278.tif 000171
配列番号１２２  可変ドメインＤＮＡ
【化１５６】
2021524278.tif 000172
【化１５７】
2021524278.tif 000173
【０３８７】
ＦＳ２８−２５６−０２３  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号８３  軽鎖ＡＡ
【化１５８】
2021524278.tif 000174
配列番号９２  軽鎖ＤＮＡ
【化１５９】
2021524278.tif 000175
配列番号９３  可変ドメインＡＡ
【化１６０】
2021524278.tif 000176
配列番号９４  可変ドメインＤＮＡ
【化１６１】
2021524278.tif 000177
【化１６２】
2021524278.tif 000178
【０３８８】
ＦＳ２８−２５６−０２４  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１０５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１６３】
2021524278.tif 000179
配列番号１０６  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１６４】
2021524278.tif 000180
配列番号１０７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１６５】
2021524278.tif 000181
配列番号１０８  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１６６】
2021524278.tif 000182
配列番号１０９  可変ドメインＡＡ
【化１６７】
2021524278.tif 000183
配列番号１１０  可変ドメインＤＮＡ
【化１６８】
2021524278.tif 000184
【化１６９】
2021524278.tif 000185
【０３８９】
ＦＳ２８−２５６−０２４  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号９０  軽鎖ＡＡ
【化１７０】
2021524278.tif 000186
配列番号９１  軽鎖ＤＮＡ
【化１７１】
2021524278.tif 000187
配列番号５３  可変ドメインＡＡ
【化１７２】
2021524278.tif 000188
配列番号５４  可変ドメインＤＮＡ
【化１７３】
2021524278.tif 000189
【化１７４】
2021524278.tif 000190
【０３９０】
ＦＳ２８−２５６−０２６  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号９０  軽鎖ＡＡ
【化１７５】
2021524278.tif 000191
配列番号９１  軽鎖ＤＮＡ
【化１７６】
2021524278.tif 000192
配列番号５３  可変ドメインＡＡ
【化１７７】
2021524278.tif 000193
配列番号５４  可変ドメインＤＮＡ
【化１７８】
2021524278.tif 000194
【化１７９】
2021524278.tif 000195
【０３９１】
ＦＳ２８−２５６−０２７  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１０５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１８０】
2021524278.tif 000196
配列番号１０６  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１８１】
2021524278.tif 000197
配列番号１０７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１８２】
2021524278.tif 000198
配列番号１０８  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１８３】
2021524278.tif 000199
配列番号１０９  可変ドメインＡＡ
【化１８４】
2021524278.tif 000200
配列番号１１０  可変ドメインＤＮＡ
【化１８５】
2021524278.tif 000201
【化１８６】
2021524278.tif 000202
【０３９２】
ＦＳ２８−２５６−０２７  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号９５  軽鎖ＡＡ
【化１８７】
2021524278.tif 000203
配列番号９６  軽鎖ＤＮＡ
【化１８８】
2021524278.tif 000204
配列番号５６  可変ドメインＡＡ
【化１８９】
2021524278.tif 000205
配列番号５７  可変ドメインＤＮＡ
【化１９０】
2021524278.tif 000206
【化１９１】
2021524278.tif 000207
配列番号１７５  ヒトＭＳＬＮプレタンパク質
【化１９２】
2021524278.tif 000208
【０３９３】
ＦＳ２８−２５６−２７１  ｍＡｂの重鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号１７６  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１９３】
2021524278.tif 000209
配列番号１７７  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化１９４】
2021524278.tif 000210
配列番号１７８  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１９５】
2021524278.tif 000211
配列番号１７９  重鎖ＤＮＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化１９６】
2021524278.tif 000212
配列番号１８０  可変ドメインＡＡ
【化１９７】
2021524278.tif 000213
配列番号１８１  可変ドメインＤＮＡ
【化１９８】
2021524278.tif 000214
【化１９９】
2021524278.tif 000215
【０３９４】
ＦＳ２８−２５６−２７１  ｍＡｂの軽鎖及びその可変ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列並びにＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号９５  軽鎖ＡＡ
【化２００】
2021524278.tif 000216
配列番号９６  軽鎖ＤＮＡ
【化２０１】
2021524278.tif 000217
配列番号５６  可変ドメインＡＡ
【化２０２】
2021524278.tif 000218
配列番号５７  可変ドメインＤＮＡ
【化２０３】
2021524278.tif 000219
【化２０４】
2021524278.tif 000220
【０３９５】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−０２４  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１４３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２０５】
2021524278.tif 000221
配列番号１４４  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２０６】
2021524278.tif 000222
配列番号１６  軽鎖ＡＡ
【化２０７】
2021524278.tif 000223
【０３９６】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−０２４−０５１  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１４５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２０８】
2021524278.tif 000224
配列番号１４６  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２０９】
2021524278.tif 000225
配列番号１６  軽鎖ＡＡ
【化２１０】
2021524278.tif 000226
【０３９７】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−０２４−０５２  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１４７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２１１】
2021524278.tif 000227
配列番号１４８  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２１２】
2021524278.tif 000228
配列番号１６  軽鎖ＡＡ
【化２１３】
2021524278.tif 000229
【０３９８】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−０２４−０５３  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１４９  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２１４】
2021524278.tif 000230
配列番号ＢＯ：１５０  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２１５】
2021524278.tif 000231
配列番号１６  軽鎖ＡＡ
【化２１６】
2021524278.tif 000232
【０３９９】
ＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／ＦＳ２８−０２４−０６０  ｍＡｂ２（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１５１  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２１７】
2021524278.tif 000233
配列番号１６  軽鎖ＡＡ
【化２１８】
2021524278.tif 000234
【０４００】
ＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／ＦＳ２８−０２６  ｍＡｂ２（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１５２  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２１９】
2021524278.tif 000235
配列番号５９  軽鎖ＡＡ
【化２２０】
2021524278.tif 000236
【０４０１】
ＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／ＦＳ２８−０９１  ｍＡｂ２（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１５３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２２１】
2021524278.tif 000237
配列番号６１  軽鎖ＡＡ
【化２２２】
2021524278.tif 000238
【０４０２】
ＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／ＦＳ２８−１８５  ｍＡｂ２（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１５４  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２２３】
2021524278.tif 000239
配列番号１９５  軽鎖ＡＡ
【化２２４】
2021524278.tif 000240
【０４０３】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−２５６  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１５５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２２５】
2021524278.tif 000241
配列番号１５６  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２２６】
2021524278.tif 000242
配列番号７７  軽鎖ＡＡ
【化２２７】
2021524278.tif 000243
【０４０４】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−２５６−００１  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列
配列番号１５７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２２８】
2021524278.tif 000244
配列番号１５８  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２２９】
2021524278.tif 000245
配列番号８３  軽鎖ＡＡ
【化２３０】
2021524278.tif 000246
【０４０５】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−２５６−００５  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列
配列番号１５９  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２３１】
2021524278.tif 000247
配列番号１６０  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２３２】
2021524278.tif 000248
配列番号９０  軽鎖ＡＡ
【化２３３】
2021524278.tif 000249
【０４０６】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−２５６−０１２  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列
配列番号１２７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２３４】
2021524278.tif 000250
配列番号１２８  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２３５】
2021524278.tif 000251
配列番号７７  軽鎖ＡＡ
【化２３６】
2021524278.tif 000252
【０４０７】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−２５６−０１４  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列
配列番号１２９  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２３７】
2021524278.tif 000253
配列番号１３０  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２３８】
2021524278.tif 000254
配列番号７７  軽鎖ＡＡ
【化２３９】
2021524278.tif 000255
【０４０８】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−２５６−０１８  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列
配列番号１３１  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２４０】
2021524278.tif 000256
配列番号１３２  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２４１】
2021524278.tif 000257
配列番号７７  軽鎖ＡＡ
【化２４２】
2021524278.tif 000258
【０４０９】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−２５６−０２１  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列
配列番号１３３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２４３】
2021524278.tif 000259
配列番号１３４  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２４４】
2021524278.tif 000260
配列番号８３  軽鎖ＡＡ
【化２４５】
2021524278.tif 000261
【０４１０】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−２５６−０２３  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列
配列番号１３５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２４６】
2021524278.tif 000262
配列番号１３６  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２４７】
2021524278.tif 000263
配列番号８３  軽鎖ＡＡ
【化２４８】
2021524278.tif 000264
【０４１１】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−２５６−０２４  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列
配列番号１３７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２４９】
2021524278.tif 000265
配列番号１３８  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２５０】
2021524278.tif 000266
配列番号９０  軽鎖ＡＡ
【化２５１】
2021524278.tif 000267
【０４１２】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−２５６−０２６の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１３９  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２５２】
2021524278.tif 000268
配列番号１４０  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２５３】
2021524278.tif 000269
配列番号９０  軽鎖ＡＡ
【化２５４】
2021524278.tif 000270
【０４１３】
ＦＳ２２−０５３−００８／ＦＳ２８−２５６−０２７  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１４１  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有さない）
【化２５５】
2021524278.tif 000271
配列番号１４２  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２５６】
2021524278.tif 000272
配列番号９５  軽鎖ＡＡ
【化２５７】
2021524278.tif 000273
【０４１４】
ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＦＳ２８−２５６−２７１  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖配列のアミノ酸配列
配列番号１８７  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２５８】
2021524278.tif 000274
配列番号１８８  軽鎖ＡＡ
【化２５９】
2021524278.tif 000275
【０４１５】
ＯＸ４０（ＦＳ２０−０２２−０４９）／ＦＳ２８−２５６−２７１  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖配列のアミノ酸配列
配列番号１８９  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２６０】
2021524278.tif 000276
配列番号１９０  軽鎖ＡＡ
【化２６１】
2021524278.tif 000277
【０４１６】
ＦＳ２８ｍ−２２８  ｍＡｂ（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１６１  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２６２】
2021524278.tif 000278
配列番号１６２  軽鎖ＡＡ
【化２６３】
2021524278.tif 000279
【０４１７】
ＬＡＬＡを有する）ＦＳ２２−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１６３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２６４】
2021524278.tif 000280
配列番号１６４  軽鎖ＡＡ
【化２６５】
2021524278.tif 000281
【０４１８】
ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０  ｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１９６  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２６６】
2021524278.tif 000282
配列番号１９７  軽鎖ＡＡ
【化２６７】
2021524278.tif 000283
【０４１９】
ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂ２（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１９１  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２６８】
2021524278.tif 000284
配列番号１９２  軽鎖ＡＡ
【化２６９】
2021524278.tif 000285
【０４２０】
ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０  ｍＡｂ２（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１９３  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２７０】
2021524278.tif 000286
配列番号１９４  軽鎖ＡＡ
【化２７１】
2021524278.tif 000287
【０４２１】
Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂ（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１６５  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２７２】
2021524278.tif 000288
配列番号１６６  軽鎖ＡＡ
【化２７３】
2021524278.tif 000289
【０４２２】
Ｇ１−ＡＡ／ＳＳ１  ｍＡｂ（ＬＡＬＡを有する）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１６７  重鎖（ＬＡＬＡを有する）
【化２７４】
2021524278.tif 000290
配列番号１６８  軽鎖
【化２７５】
2021524278.tif 000291
【０４２３】
ＭＳＬＮ−Ｈｉｓ−Ａｖｉ
メソテリン（ＭＰＦ及びＣ末端を有さない）（示される）
Ｈｉｓ及びＡｖｉタグ（示されていない）
配列番号１６９  ヒト
【化２７６】
2021524278.tif 000292
配列番号１７０  カニクイザル
【化２７７】
2021524278.tif 000293
配列番号１７１  マウス
【化２７８】
2021524278.tif 000294
【０４２４】
野生型ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列
配列番号１７２
【化２７９】
2021524278.tif 000295
【０４２５】
ＬＡＬＡ突然変異を含むＣＨ２ドメインのアミノ酸配列
（ＬＡＬＡ突然変異が太字及び下線で示される）
配列番号１７３
【化２８０】
2021524278.tif 000296
【０４２６】
ＬＡＬＡ−ＰＡ突然変異を含むＣＨ２ドメインのアミノ酸配列
（ＬＡＬＡ−ＰＡ突然変異が太字及び下線で示される）
配列番号１７４
【化２８１】
2021524278.tif 000297
【０４２７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００３  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−１７２−００３  第１の配列−ＰＹＩＩＰＰＹ（配列番号１９８）
ＦＳ２２−１７２−００３  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１９９）
【０４２８】
ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＦＳ２８−２５６−２７１の軽鎖のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列
配列番号２００  軽鎖
【化２８２】
2021524278.tif 000298
配列番号２０１  重鎖ＡＡ（ＬＡＬＡを有する）
【化２８３】
2021524278.tif 000299
【０４２９】
参照文献
本明細書において言及される全ての文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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