(57)【要約】  本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体に関する。本発明は、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体に関する。本発明は、ＣＤ３及びＰＳＭＡに特異的に結合する抗体に関する。本発明は、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体に関する。本発明は、ＣＤ３３に特異的に結合する抗体に関する。本発明は、ＣＤ３及びＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体に関する。本発明は、ＣＤ３及びＣＤ３３に特異的に結合する抗体に関する。本発明は、ＴＭＥＦＦ２に特異的に結合する抗体に関する。本発明は、ＣＤ３及びＴＭＥＦＦ２に特異的に結合する抗体に関する。本発明は、当該抗体の断片、当該抗体又はその断片をコードしているポリヌクレオチド、並びにそれを作製及び使用する方法に関する。
2021524249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）配列番号６６２を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号６６３を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号６６４を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖、並びに配列番号６７１を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号６７３を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６９０を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖；
ｂ）配列番号６５２を含む重鎖可変領域及び配列番号６６１を含む軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号６４０を含む重鎖、及び配列番号６７６を含む軽鎖；
ｄ）配列番号６５７を含む重鎖可変領域及び配列番号６７８を含む軽鎖可変領域；又は
ｅ）配列番号６７５を含む重鎖、及び配列番号６７７を含む軽鎖を含む、単離組換え抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
約３００ｎＭ以下の結合親和性でカニクイザル（Macaca fascicularis）又はヒトのＣＤ３ｄ、又はＣＤ３ｅ、又はＣＤ３ｅ及びＣＤ３ｄに特異的に結合する、単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記結合親和性が約１００ｎＭ以下である、請求項２に記載の単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記結合親和性が、フローサイトメトリー又は＋２５℃におけるＰｒｏｔｅｏｎ表面プラズモン共鳴アッセイＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムによって測定される、請求項２又は３に記載の単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、又は４つを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片：
ａ）３００ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でヒト及びカニクイザルのＣＤ３＋Ｔリンパ球に結合し、３００ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でカニクイザルＣＤ３発現ＨＥＫ細胞に結合し、ＣＤ３＋Ｔリンパ球への結合とカニクイザルＣＤ３発現ＨＥＫ細胞への結合との間の計算ＥＣ５０の差は５倍未満であり、前記計算ＥＣ５０は、フローサイトメトリーを使用して０℃で全細胞結合アッセイで測定される；
ｂ）３００ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でヒト由来の組換えＣＤ３ｄ（配列番号６９１）に結合、又はヒト由来の組換えＣＤ３ｅ（配列番号６３６）に結合、又はカニクイザル由来の組換えＣＤ３ｄ（配列番号６９２）に結合、又はカニクイザル由来の組換えＣＤ３ｅ（配列番号６９３）に結合し、前記ＫＤは、＋２５℃でＰｒｏｔｅｏｎ表面プラズモン共鳴アッセイＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを使用して測定される；
ｃ）Ｘ線結晶解析により決定したとき、ＣＤ３ｅの残基１〜６に結合する；あるいは
ｄ）蛍光活性化細胞選別アッセイによって決定したとき、ｃＯＫＴ３又はＳＰ３４−２と同様の程度まで、Ｔ細胞を活性化するか又はＣＤ６９発現を誘導する。
【請求項６】
抗体定常ドメインに少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片であって、前記少なくとも１つの置換が、
ａ）重鎖置換Ｋ４０９Ｒ、Ｆ４０５Ｌ、又はＦ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋを含む、
ｂ）重鎖置換Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａを含む、
ｃ）重鎖置換Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含み、前記抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプである、又は
ｄ）重鎖置換Ｓ２２８Ｐを含み、前記抗体が、ＩｇＧ４アイソタイプであり、
残基の付番がＥＵインデックスに準拠する、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０の前記ＨＣＤＲ１、前記ＨＣＤＲ２、前記ＨＣＤＲ３、前記ＬＣＤＲ１、前記ＬＣＤＲ２、及び前記ＬＣＤＲ３を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
それぞれ配列番号６５２及び６６１の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
それぞれ配列番号６４０及び６７６の重鎖配列（ＨＣ）及び軽鎖配列（ＬＣ）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
それぞれ配列番号６５７及び６７８のＶＨ及びＶＬを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
それぞれ配列番号６７５及び６７７のＨＣ及びＬＣを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
それぞれ配列番号６５７及び６７８のＶＨ及びＶＬを含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
それぞれ配列番号６７５及び６７７のＨＣ及びＬＣを含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
前記抗体が、ヒトである又はヒト化されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
前記抗体が、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体のＦｃに１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の置換を含む、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号６３９のＨＣ及び配列番号６４６のＬＣを含む、抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）Ｄ４３Ｇ、Ｌ４９Ｍ、Ｌ５０Ｉ、Ｓ６２Ｎ、Ｑ８５Ｅの軽鎖置換、
ｂ）Ｄ４３Ｇ、Ｖ４８Ｌ、Ｌ４９Ｍ、Ｌ５０Ｉ、Ｓ６２Ｎ、Ｑ８５Ｅ、Ｈ８９Ｙの軽鎖置換、
ｃ）Ｒ１０Ｇ、Ｒ１３Ｋ、Ｖ７３Ｉ、Ｒ７０Ｋ、Ｔ８３Ｓ、Ｌ９６Ｖの重鎖置換、
ｄ）軽鎖置換Ｄ４３Ｇ、Ｖ４８Ｌ、Ｌ４９Ｍ、Ｌ５０Ｉ、Ｓ６２Ｎ、Ｑ８５Ｅ、又はＨ８９Ｙのいずれか１つ、又は
ｅ）重鎖置換Ｒ１０Ｇ、Ｒ１３Ｋ、Ｖ７３Ｉ、Ｒ７９Ｋ、Ｔ８３Ｓ、又はＬ９６Ｖのいずれか１つ、
を含む少なくとも１つの置換を含み、
残基の付番がＥＵインデックスに準拠する、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２１】
前記抗体が、二重特異性又は多重特異性である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン及び第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインを含む二重特異性抗体であって、前記第１のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、二重特異性抗体。
【請求項２３】
前記第１のドメイン及び第２のドメインがＩｇＧ４アイソタイプであり、前記第１又は第２のドメインが、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋの重鎖置換を含み、前記第１又は第２のドメインの他方のドメインが、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの重鎖置換を含み、残基の付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２４】
前記第１及び／又は第２のドメインが、Ｆ４０５Ｌ、又はＦ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換を含む、ＣＨ３定常ドメインにおける少なくとも１つの置換を含み、残基の付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２５】
前記第１又は第２のドメインの一方が、Ｆ４０５Ｌの重鎖置換を含み、前記第１又は第２のドメインの他方が、Ｋ４０９Ｒの重鎖置換を含み、残基の付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２６】
前記第１のドメイン及び第２のドメインが、ＩｇＧ４アイソタイプであり、前記第１又は第２のドメインの一方が、Ｓ２２８Ｐの重鎖置換を含み、前記第１又は第２のドメインの他方が、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋの重鎖置換を含み、残基の付番がＥＵインデックスに準拠する、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２７】
前記第１のドメインが、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含む、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２８】
前記第１のドメインが、それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含む、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項２９】
前記第１のドメインが、それぞれ配列番号６５７及び６７８のＶＨ及びＶＬを含む、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項３０】
前記第１のドメインが、それぞれ配列番号６７５及び６７７のＨＣ及びＬＣを含む、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項３１】
前記第２の抗原が、免疫エフェクター細胞以外の標的細胞上で発現する細胞表面抗原である、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
【請求項３２】
前記細胞表面抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項３１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３３】
前記第２の抗原が、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＰＳＭＡ、又はＴＭＥＦＦ２である、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体をコードしている、ポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項３５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３７】
請求項３６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３８】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、前記抗体が発現する条件で請求項３７に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することと、を含む、方法。
【請求項３９】
対象における癌を治療する方法であって、前記癌を治療するのに十分な時間にわたって、それを必要としている前記対象に、治療有効量の請求項１〜３４のいずれか一項に記載の単離抗体を投与することを含む、方法。
【請求項４０】
前記癌が、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記固形腫瘍が、前立腺癌、結腸直腸癌、胃癌、腎明細胞癌、膀胱癌、肺癌、扁平上皮癌、神経膠腫、乳癌、腎臓癌、血管新生障害、腎明細胞癌（ＣＣＲＣＣ）、膵臓癌、腎癌、尿路上皮癌、又は肝臓腺癌である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記前立腺癌が、難治性前立腺癌、前立腺上皮内腫瘍、アンドロゲン非依存性前立腺癌、又は悪性前立腺癌である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記血液悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
治療において使用するための、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４６】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体に結合する、抗イディオタイプ抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。２０１９年５月３日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＪＢＩ５１３５ＷＯＰＣＴ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔというファイル名で、サイズは５８８ＫＢである。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書に提供される開示は、ヒト及び非ヒトＣＤ３に特異的に結合することができる抗表面抗原分類３（ＣＤ３）抗体及びその抗原結合断片、具体的には、非ヒト哺乳類（例えば、カニクイザル）のＣＤ３と交差反応性である抗ＣＤ３抗体及び抗原結合断片；ヒト及び非ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合することができるＰＳＭＡ抗体及びその抗原結合断片；ヒト及び非ヒトＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合することができるＩＬ１ＲＡＰ抗体及びその抗原結合断片；ヒト及び非ヒトＣＤ３３に特異的に結合することができるＣＤ３３抗体及びその抗原結合断片；並びにＣＤ３、ＰＳＭＡ、ＩＬ１ＲＡＰ、ＣＤ３３、ＣＤ３及びＰＳＭＡ、ＣＤ３及びＩＬ１ＲＡＰ、又はＣＤ３及びＣＤ３３に特異的に結合することができる二重特異性抗体に関する。本開示はまた、癌、自己免疫性及び／又は炎症性疾患、並びに他の病態の治療における、このような抗体及び抗原結合断片の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
二重特異性抗体及び抗体断片は、腫瘍細胞を殺傷するために細胞溶解性Ｔ細胞を動員する手段として検討されてきた。しかしながら、多くのＴ細胞動員二重特異性抗体の臨床的使用は、好ましくない薬物動態、潜在的な免疫原性、及び製造上の問題を含む課題によって制限されている。したがって、低い毒性及び好ましい製造プロファイルを示す、腫瘍細胞を殺傷するために細胞溶解性Ｔ細胞を動員する二重特異性抗体が非常に必要とされている。
【０００４】
ヒトＣＤ３  Ｔ細胞抗原受容体タンパク質複合体は、６本の異なる鎖：ＣＤ３γ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０９６９３）、ＣＤ３δ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０４２３４）、２本のＣＤ３ε鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６）、及び１本のＣＤ３ζ鎖ホモダイマー（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐ２０９６３）（ε  γ：ε  δ：ζζ）で構成され、これは、Ｔ細胞受容体のα及びβ鎖に会合する。この複合体は、いくつかの細胞内シグナル伝達経路への抗原認識の連関において重要な役割を果たす。ＣＤ３複合体は、シグナル伝達を媒介し、その結果、Ｔ細胞が活性化され、増殖する。ＣＤ３は、免疫応答に必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
配列番号６６２を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号６６３を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号６６４を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖、並びに配列番号６７１を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号６７３を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６９０を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖；配列番号６５２を含む重鎖可変領域及び配列番号６６１を含む軽鎖可変領域；配列番号６４０を含む重鎖及び配列番号６７６を含む軽鎖を含むか；又は配列番号６６２を含むＨＣＤＲ１、配列番号６６３を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号６６４を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖、並びに配列番号７７３を含むＬＣＤＲ１、配列番号６７３を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６９０を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖；配列番号６５７を含む重鎖可変領域及び配列番号６７８を含む軽鎖可変領域；若しくは配列番号６７５を含む重鎖及び配列番号６７８を含む軽鎖を含む、単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、本明細書に提供される。
【０００６】
また、約３００ｎＭ以下の結合親和性でカニクイザル（Macaca fascicularis）又はヒトのＣＤ３ｄ、又はＣＤ３ｅ、又はＣＤ３ｅ及びＣＤ３ｄに特異的に結合する単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片も本明細書に提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、又は４つを有する：
・２０ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でヒト及びカニクイザルのＣＤ３＋Ｔリンパ球に結合し、４０ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でカニクイザルＣＤ３発現ＨＥＫ細胞に結合し、ＣＤ３＋Ｔリンパ球への結合とカニクイザルＣＤ３発現ＨＥＫ細胞への結合との間の計算ＥＣ５０の差は５倍未満であり、計算ＥＣ５０は、フローサイトメトリーを使用して０℃で全細胞結合アッセイで測定される；
・１２ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でヒト由来の組換えＣＤ３ｄ（配列番号６９１）に結合、又はヒト由来の組換えＣＤ３ｅ（配列番号６３６）若しくはカニクイザル由来の組換えＣＤ３ｄ（配列番号６９２）に結合し、ＫＤは、＋２５℃でＰｒｏｔｅｏｎ表面プラズモン共鳴アッセイＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを使用して測定される；
・Ｘ線結晶解析により決定したとき、ＣＤ３ｅの残基１〜６に結合する；あるいは
・蛍光活性化細胞選別アッセイによって決定したとき、ｃＯＫＴ３又はＳＰ３４−２と同様の程度まで、Ｔ細胞を活性化するか又はＣＤ６９発現を誘導する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬ；又はそれぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、７７３、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；それぞれ配列番号６５７及び６７８のＶＨ及びＶＬ；又はそれぞれ配列番号６７５及び６７７のＨＣ及びＬＣを含む。
【００１０】
更に、ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン及び第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインを含む二重特異性抗体であって、当該第１のドメインが本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、二重特異性抗体が本明細書に提供される。
【００１１】
本明細書に記載の二重特異性抗体は、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む第１のドメインと、それぞれ配列番号６９７、６８３、６９８、６９９、７９２、及び６８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む第２のドメインと、を含み得る；
【００１２】
本明細書に記載の二重特異性抗体は、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含む第１のドメインと、それぞれ配列番号６８１及び６８２のＶＨ及びＶＬを含む第２のドメインと、を含み得る。
【００１３】
本明細書に記載の二重特異性抗体は、それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含む第１のドメインと、それぞれ配列番号６７９及び６８０のＨＣ及びＬＣを含む第２のドメインと、を含み得る。
【００１４】
本明細書に記載の二重特異性抗体は、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む第１のドメインと、それぞれ配列番号７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、及び７０９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む第２のドメインと、を含み得る。
【００１５】
本明細書に記載の二重特異性抗体は、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含む第１のドメインと、それぞれ配列番号７０２及び７０３のＶＨ及びＶＬを含む第２のドメインと、を含み得る。
【００１６】
本明細書に記載の二重特異性抗体は、それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含む第１のドメインと、それぞれ配列番号７００及び７０１のＨＣ及びＬＣを含む第２のドメインと、を含み得る。
【００１７】
本開示は、更に、３００ｎＭ以下の親和性で組換えカニクイザル又はヒトＣＤ３ｄ又はＣＤ３ｅを発現する細胞に結合する第１のドメインであって、細胞への結合がフローサイトメトリーによって測定される第１のドメインと、ＰＳＭＡに特異的に結合する第２のドメインと、を含む単離二重特異性ＣＤ３×ＰＳＭＡ抗体を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＤ３×ＰＳＭＡ抗体は、以下の第１のドメインを含む：
・２０ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でヒト及びカニクイザルのＣＤ３＋Ｔリンパ球に結合し、４０ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でカニクイザルＣＤ３発現ＨＥＫ細胞に結合し、ＣＤ３＋Ｔリンパ球への結合とカニクイザルＣＤ３発現ＨＥＫ細胞への結合との間の計算ＥＣ５０の差は５倍未満であり、計算ＥＣ５０は、フローサイトメトリーを使用して０℃で全細胞結合アッセイで測定される；
・１２ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でヒト由来の組換えＣＤ３ｄ（配列番号６９１）に結合、又はヒト由来の組換えＣＤ３ｅ（配列番号６３６）に結合、又はカニクイザル由来の組換えＣＤ３ｄ（配列番号６９２）に結合、又はカニクイザル由来の組換えＣＤ３ｅ（配列番号６９３）に結合し、ＫＤは、＋２５℃でＰｒｏｔｅｏｎ表面プラズモン共鳴アッセイＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを使用して測定される；
・ペプチドマッピング分析により検出したとき、メチオニンの酸化もトリプトファンの酸化も示さない、又はアスパラギンの脱アミドを示さない、又はアスパラギンの異性化を示さない；
・Ｘ線結晶解析により決定したとき、ＣＤ３ｅの残基１〜６に結合する；あるいは
・蛍光活性化細胞選別アッセイによって決定したとき、ｃＯＫＴ３又はＳＰ３４−２と同様の程度まで、Ｔ細胞を活性化するか又はＣＤ６９発現を誘導する。
【００１９】
また、本明細書に記載の抗体と、薬学的に許容できる担体と、を含む医薬組成物も記載される。
【００２０】
本開示は、更に、抗体が発現する条件で本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を培養することと、当該宿主細胞によって産生された抗体を回収することと、を含む、本明細書に記載の抗体を産生する方法を提供する。二重特異性ＣＤ３×ＰＳＭＡ抗体を産生する方法は、２つの同一のＨＣ１及び２つの同一のＬＣ１を有する単一特異性二価ＣＤ３抗体を、２つの同一のＨＣ２及び２つの同一のＬＣ２を有する単一特異性二価ＰＳＭＡ抗体と、約１：１のモル比の混合物で合わせることと、当該混合物に還元剤を導入することと、当該混合物を約９０分間〜約６時間インキュベートすることと、当該還元剤を除去することと、当該ＨＣ１、当該ＬＣ１、当該ＨＣ２、及び当該ＬＣ２を含む二重特異性ＣＤ３×ＰＳＭＡ抗体を精製することと、を含み得る。
【００２１】
対象における癌を治療する方法であって、当該癌を治療するのに十分な時間にわたって、治療有効量の単離抗体を、それを必要としている当該対象に投与することを含む、方法が更に記載される。
【００２２】
本開示は、また、本明細書に記載の抗体を含む、キットを提供する。キットは、抗体を検出するための試薬及び使用説明書を更に含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
発明の概要、並びに以下の発明を実施するための形態は、添付の図面と併せて読むことで、更に理解される。開示される抗体及び方法を説明する目的で、当該抗体及び方法の例示的な実施形態を図面中に示す。但し、当該抗体及び方法は、開示される特定の実施形態に限定されるものではない。図面は、以下の通りである。
【図１Ａ】ＯｍｎｉＲａｔで産生された抗ＣＤ３抗体を示す。ＯｍｎｉＲａｔにおいて産生された活性抗ＣＤ３ｍＡｂのＶＨ（図１Ａ）及びＶＬ（図１Ｂ）配列を、ＩＭＧＴ由来のヒト生殖系列配列とアラインメントした。ＣＤＲ領域には下線を引いた。配列の相違を太字で示す。それぞれ全て記載順に、図１Ａは、配列番号６５１、６５１、６５３、６５６、６５５、２０、６５４及び７１７を開示し、図１Ｂは、配列番号６５８、６８８、６６０、６５９、６５９、６５９、６５９及び７１８を開示する。
【図１Ｂ】ＯｍｎｉＲａｔで産生された抗ＣＤ３抗体を示す。ＯｍｎｉＲａｔにおいて産生された活性抗ＣＤ３ｍＡｂのＶＨ（図１Ａ）及びＶＬ（図１Ｂ）配列を、ＩＭＧＴ由来のヒト生殖系列配列とアラインメントした。ＣＤＲ領域には下線を引いた。配列の相違を太字で示す。それぞれ全て記載順に、図１Ａは、配列番号６５１、６５１、６５３、６５６、６５５、２０、６５４及び７１７を開示し、図１Ｂは、配列番号６５８、６８８、６６０、６５９、６５９、６５９、６５９及び７１８を開示する。
【図２】ヒト精製ＣＤ３＋Ｔリンパ球に対する個々のラットハイブリドーマ上清の結合能力を評価するための細胞ベースの結合アッセイを示す。
【図３】カニクイザル精製ＣＤ３＋Ｔリンパ球に対する個々のラットハイブリドーマ上清の結合能力を評価するための細胞ベースの結合アッセイを示す。
【図４】既知のエピトープを有し、カニクイザルＣＤ３と交差反応性である市販の抗ヒトＣＤ３抗体ＳＰ３４−２と競合する能力について評価したハイブリドーマ上清の競合アッセイ結果を示す。
【図５】初代ヒトＴ細胞における抗ＣＤ３抗体の代表的な結合曲線を示す。
【図６】初代ヒトＴ細胞における抗ＣＤ３抗体のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲートＳＰ３４−２との代表的な競合結合曲線を示す。
【図７】軽鎖（ＬＣ）が遺伝子操作されたＢＬＷ−２Ｅ６ｍＡｂの初代ヒトＴ細胞への結合を示す。
【図８】重鎖（ＨＣ）が遺伝子操作されたＢＬＷ−２Ｅ６の初代ヒトＴ細胞への結合を示す。
【図９】ＦＡＣＳ分析によるヒトＴ細胞におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）（ＡＦ）４８８  ＣＤ３飽和を示す。得られた平均蛍光強度値を抗体分子濃度の関数としてプロットした。各ドナーについてＫｄ値を導出し、平均値を得た。ヒトＴ細胞についての飽和結合定数（ＫｄＴ）は、５．６±１．０ｎＭ（ｎ＝４）であると導出され、Ｋｄ結合親和性を求めるために本明細書で使用した。分析中に少なくとも６０％の生存率基準を満たさなかったことから、１人のヒトドナーを除外した。図の凡例における「ＬＳ」識別子は、個々のヒトＴ細胞ドナーを指す。
【図１０】ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８  ＳＰ−３４抗ＣＤ３抗体に対する結合についての競合について、二価抗ＣＤ３抗体、ＣＤ３Ｂ３７６、及びＣＤ３Ｂ４５０の阻害曲線を示す。ＩＣ５０値は、それぞれ２９及び６０ｎＭであると導出された。
【図１１】ｈＣＤ３ε（１−２７）−Ｔｎ２５に結合するＢＬＷ−２Ｅ６変異体のセンサグラムを示す。
【図１２Ａ】ＤＳＣによる抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６（図１２Ａ）、ＣＤ３Ｂ４５０（図１２Ｂ）、ＣＤ３Ｂ３８９（図１２Ｃ）、ＣＤ３Ｂ４６７（図１２Ｄ）の熱安定性、及び全ての候補のサーモグラムのオーバーレイ（図１２Ｅ）を示す。
【図１２Ｂ】ＤＳＣによる抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６（図１２Ａ）、ＣＤ３Ｂ４５０（図１２Ｂ）、ＣＤ３Ｂ３８９（図１２Ｃ）、ＣＤ３Ｂ４６７（図１２Ｄ）の熱安定性、及び全ての候補のサーモグラムのオーバーレイ（図１２Ｅ）を示す。
【図１２Ｃ】ＤＳＣによる抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６（図１２Ａ）、ＣＤ３Ｂ４５０（図１２Ｂ）、ＣＤ３Ｂ３８９（図１２Ｃ）、ＣＤ３Ｂ４６７（図１２Ｄ）の熱安定性、及び全ての候補のサーモグラムのオーバーレイ（図１２Ｅ）を示す。
【図１２Ｄ】ＤＳＣによる抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６（図１２Ａ）、ＣＤ３Ｂ４５０（図１２Ｂ）、ＣＤ３Ｂ３８９（図１２Ｃ）、ＣＤ３Ｂ４６７（図１２Ｄ）の熱安定性、及び全ての候補のサーモグラムのオーバーレイ（図１２Ｅ）を示す。
【図１２Ｅ】ＤＳＣによる抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６（図１２Ａ）、ＣＤ３Ｂ４５０（図１２Ｂ）、ＣＤ３Ｂ３８９（図１２Ｃ）、ＣＤ３Ｂ４６７（図１２Ｄ）の熱安定性、及び全ての候補のサーモグラムのオーバーレイ（図１２Ｅ）を示す。
【図１３Ａ】抗ＣＤ３抗体の熱安定性の比較を示す；ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ３８９のサーモグラムのオーバーレイ（図１３Ａ）；ＣＤ３Ｂ４５０及びＣＤ３Ｂ４６７のサーモグラムのオーバーレイ（図１３Ｂ）。
【図１３Ｂ】抗ＣＤ３抗体の熱安定性の比較を示す；ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ３８９のサーモグラムのオーバーレイ（図１３Ａ）；ＣＤ３Ｂ４５０及びＣＤ３Ｂ４６７のサーモグラムのオーバーレイ（図１３Ｂ）。
【図１４】親和性成熟ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のサブセットのＬＮＣＡＰ細胞結合を示す。
【図１５】親和性成熟ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のサブセットのＬＮＣＡＰ細胞結合を示す。
【図１６】親和性成熟ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のＰＳＭＡ陰性ＰＣ３細胞結合を示す。
【図１７】機能性細胞殺傷アッセイにおけるＰＳＭＡ×ＣＤ３親和性成熟二重特異性Ａｂの結果を示す。
【図１９】ＣＤ３Ｂ３３４：ＣＤ３複合体における抗体−抗原相互作用を示す。楕円形内はＣＤ３残基であり、ボックス内はＣＤ３Ｂ３３４残基である。
【図２０】ＣＤ６９活性化によって測定したときの、ハイブリドーマヒットのＴ細胞を活性化する能力を判定するために使用した初代ヒト及びカニクイザルＴ細胞ベースのアッセイを示す。
【図２１】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＬｎＣＡＰ  ＡＲ．ＴＢヒト前立腺異種移植片におけるＰＳ３Ｂ７９の抗腫瘍有効性を示す。皮下ＬｎＣＡＰ  ＡＲ．ＴＢ腫瘍を週２回測定し、その結果を、平均腫瘍体積として提示し、ｍｍ３±ＳＥＭで表した（＊、ｐ＜０．０００１）。
【図２２】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＬｎＣＡＰ  ＡＲ．ＴＢヒト前立腺異種移植片におけるＰＳ３Ｂ９０の抗腫瘍有効性を示す。皮下ＬｎＣＡＰ  ＡＲ．ＴＢ腫瘍を週２回測定し、その結果を、平均腫瘍体積として提示し、ｍｍ３±ＳＥＭで表した（＊、ｐ＜０．００１）。
【図２３Ａ】ヒトＬＮＣａＰ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。図２３Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２３Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２３Ｃは、Ｍ８５、Ｍ８７、及びＭ８１を示し；図２３Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２３Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧ５（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２３Ｂ】ヒトＬＮＣａＰ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。図２３Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２３Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２３Ｃは、Ｍ８５、Ｍ８７、及びＭ８１を示し；図２３Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２３Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧ５（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２３Ｃ】ヒトＬＮＣａＰ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。図２３Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２３Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２３Ｃは、Ｍ８５、Ｍ８７、及びＭ８１を示し；図２３Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２３Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧ５（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２３Ｄ】ヒトＬＮＣａＰ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。図２３Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２３Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２３Ｃは、Ｍ８５、Ｍ８７、及びＭ８１を示し；図２３Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２３Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧ５（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２４Ａ】チンパンジー−ＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫに対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの哺乳類Ｆａｂ上清滴定曲線）。図２４Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２４Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２４Ｃは、Ｍ８１、Ｍ５２、Ｍ８５、及びＭ８７を示し；図２４Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２４Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧ５（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２４Ｂ】チンパンジー−ＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫに対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの哺乳類Ｆａｂ上清滴定曲線）。図２４Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２４Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２４Ｃは、Ｍ８１、Ｍ５２、Ｍ８５、及びＭ８７を示し；図２４Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２４Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧ５（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２４Ｃ】チンパンジー−ＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫに対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの哺乳類Ｆａｂ上清滴定曲線）。図２４Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２４Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２４Ｃは、Ｍ８１、Ｍ５２、Ｍ８５、及びＭ８７を示し；図２４Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２４Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧ５（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２４Ｄ】チンパンジー−ＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫに対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの哺乳類Ｆａｂ上清滴定曲線）。図２４Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２４Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２４Ｃは、Ｍ８１、Ｍ５２、Ｍ８５、及びＭ８７を示し；図２４Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２４Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧ５（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２５Ａ】カニクイザルＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫに対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの哺乳類Ｆａｂ上清滴定曲線）。図２５Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２５Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２５Ｃは、Ｍ８１、Ｍ５２、Ｍ８５、及びＭ８７を示し；図２５Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２５Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧＳ（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２５Ｂ】カニクイザルＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫに対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの哺乳類Ｆａｂ上清滴定曲線）。図２５Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２５Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２５Ｃは、Ｍ８１、Ｍ５２、Ｍ８５、及びＭ８７を示し；図２５Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２５Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧＳ（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２５Ｃ】カニクイザルＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫに対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの哺乳類Ｆａｂ上清滴定曲線）。図２５Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２５Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２５Ｃは、Ｍ８１、Ｍ５２、Ｍ８５、及びＭ８７を示し；図２５Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２５Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧＳ（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２５Ｄ】カニクイザルＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞に対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの滴定曲線を示す。（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫに対する抗ＰＳＭＡファージパンニングヒットの哺乳類Ｆａｂ上清滴定曲線）。図２５Ａは、ヒットＧ９−ＰＳＭ  Ｍ１８、Ｍ２５、Ｍ５０、Ｍ５２、Ｍ５６、Ｍ５７、及びＭ５９の滴定曲線を示し；図２５Ｂは、Ｍ５２及びＭ１１０を示し；図２５Ｃは、Ｍ８１、Ｍ５２、Ｍ８５、及びＭ８７を示し；図２５Ｄは、Ｍ５２及びＭ８４を示す。図２５Ｄでは、哺乳類で発現した上清を、ｏｃｔｅｔを介してＦａｂ発現について正規化し、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＧＳ（カニクイザル−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）、又はＰＳＭＧ９（チンパンジー−ＰＳＭＡ  ＨＥＫ）細胞のいずれかに対して滴定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍを用いて、幾何平均蛍光強度（ＧｅｏＭＦＩ）をＦａｂ濃度に対してプロットした。
【図２６】ヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤホモダイマーに結合したＰＳＭＭ８４  Ｆａｂの全体構造を示す。
【図２７】ＰＳＭＢ８３軽鎖とのＰＳＭＡの主要な相互作用の近接図を示す。
【図２８】ＰＳＭＢ８３重鎖とのＰＳＭＡの主要な相互作用の近接図を示す。
【図２９】ヒト（配列番号７１９）、マウス（配列番号７２０）、及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）（配列番号７２１）のＰＳＭＡの配列内のＰＳＭＢ８３のエピトープ残基の比較を示す。影付きはエピトープ残基であり、配列の相違を下線によって示す。
【図３０】ＰＳＭＢ８３のパラトープ残基を示す。下線はＣＤＲであり、影付きはパラトープ残基である。図３０は、記載順にそれぞれ配列番号７２２〜７２７を開示する。
【図３１】ＰＳＭＡとＰＳＭＭ８４との間に形成された直接接触を含む相互作用マップを示す。ファンデルワールス相互作用を破線で示し、実線は水素結合であり、矢印は骨格原子を指し示す。
【図３２】親ＰＳＭＢ８３の発現と比較したときのＰＳＭＭ８４由来の抗ＰＳＭＡ  Ｆａｂクローンの発現レベルを示す。生の発光数を対数濃度に対してプロットした。
【図３３】親ＰＳＭＭ８４の結合と比較したときのＰＳＭＢ８３由来の抗ＰＳＭＡ  ＦａｂクローンのヒトＰＳＭＡに対する結合を示す。生の発光数を対数濃度に対してプロットした。
【図３４】親ＰＳＭＢ８３の結合と比較したときのＰＳＭＢ８３由来の抗ＰＳＭＡ  ＦａｂクローンのカニクイザルＰＳＭＡに対する結合を示す。生の発光数を対数濃度に対してプロットした。
【図３５】４８時間後の全血におけるＬＡＭＡ−８４  ２０細胞のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４エクスビボ媒介Ｔ細胞細胞傷害を示す。ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４の濃度を、図の下部の表に提供する。
【図３６】４８時間後の全血におけるＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４エクスビボ媒介Ｔ細胞活性化を示す。ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４の濃度を、図の下部の表に提供する。
【図３７Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１β放出（図３７Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図３７Ｂ）を示す。
【図３７Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１β放出（図３７Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図３７Ｂ）を示す。
【図３８Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１β放出（図３８Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図３８Ｂ）を示す。
【図３８Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１β放出（図３８Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図３８Ｂ）を示す。
【図３９Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−２放出（図３９Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図３９Ｂ）を示す。
【図３９Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−２放出（図３９Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図３９Ｂ）を示す。
【図４０Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−２放出（図４０Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図４０Ｂ）を示す。
【図４０Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−２放出（図４０Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図４０Ｂ）を示す。
【図４１Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−４放出（図４１Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図４１Ｂ）を示す。
【図４１Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−４放出（図４１Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図４１Ｂ）を示す。
【図４２】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−４放出を示す。
【図４３Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−６放出（図４３Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図４３Ｂ）を示す。
【図４３Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−６放出（図４３Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図４３Ｂ）を示す。
【図４４】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−６放出を示す。
【図４５】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−８放出を示す。
【図４６】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−８放出を示す。
【図４７Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１０放出（図４７Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図４７Ｂ）を示す。
【図４７Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１０放出（図４７Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図４７Ｂ）を示す。
【図４８Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１０放出（図４８Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図４８Ｂ）を示す。
【図４８Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１０放出（図４８Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図４８Ｂ）を示す。
【図４９】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１２ｐ７０放出を示す。
【図５０】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１２ｐ７０放出を示す。
【図５１】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１３放出を示す。
【図５２Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１３放出（図５２Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図５２Ｂ）を示す。
【図５２Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＬ−１３放出（図５２Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図５２Ｂ）を示す。
【図５３Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＦＮ−γ放出（図２５  ５３Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図５３Ｂ）を示す。
【図５３Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＦＮ−γ放出（図２５  ５３Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図５３Ｂ）を示す。
【図５４Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＦＮ−γ放出（図５４Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図５４Ｂ）を示す。
【図５４Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＩＦＮ−γ放出（図５４Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図５４Ｂ）を示す。
【図５５Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＴＮＦ−α放出（図５５Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図５５Ｂ）を示す。
【図５５Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。２４時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＴＮＦ−α放出（図５５Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図５５Ｂ）を示す。
【図５６Ａ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＴＮＦ−α放出（図５６Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図５６Ｂ）を示す。
【図５６Ｂ】Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）の、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合を示す。上清を、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて評価した。統計的に有意な差異を太字のテキストで示す。４８時間後のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によって媒介されるＴ細胞ＴＮＦ−α放出（図５６Ａ）並びに対応する４ＰＬ回帰パラメータ推定（図５６Ｂ）を示す。
【図５７】ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４は、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞において標的特異的細胞傷害を誘導したが、ヌルアームを有する二重特異性抗体（ＩＡＰＢ５７×Ｂ２３Ｂ４９又はＢ２３Ｂ３９×ＣＤ３Ｂ２１９）は誘導しなかったことを示す。このアッセイでは、細胞傷害ＥＣ５Ｏは、ＩＣ３Ｂ１９とＩＣ３Ｂ３４との間で３倍異なり、それぞれ０．０１８及び０．０５７ｎＭの値である。
【図５８】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＨ１９７５ヒトＮＳＣＬＣ異種移植片におけるＩＡＰＢ５７×ＣＤ３Ｂ３７６の抗腫瘍有効性を示す。皮下Ｈ１９７５腫瘍を週２回測定し、その結果を、平均腫瘍体積として提示し、ｍｍ３±ＳＥＭで表した、＊ｐ＜０．０００１。
【図５９】様々な抗ＰＳＭＡコンストラクトの等電点の比較を示す。
【図６０】ＣＮＴ０５８２５対照分子と比較した波長の変化をプロットする。対照ＣＮＴ０６０７は、特徴的に強い自己相互作用を示す。エラーバーは、３回の測定からの標準偏差を表す。
【図６１】抗ＰＳＭＡ交差相互作用アッセイにおける、ＩｇＧ及び対照カラムの保持時間の比較を示す。
【図６２Ａ】新鮮ＡＭＬ患者全血における芽球の細胞傷害及びＴ細胞活性化についての抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９及びＣＤ３Ｂ３７６を使用したＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体のエクスビボ評価を示す。図２Ａは、ＣＤ３３二重特異性抗体又はＣＤ３×ヌル対照を使用したＡＭＬ細胞の全細胞傷害のパーセントを示す。図２Ｂは、ＣＤ３３二重特異性抗体又はＣＤ３×ヌル対照によって誘導されたＴ細胞活性化を示す。Ｆｃ遮断薬は添加しなかった。
【図６２Ｂ】新鮮ＡＭＬ患者全血における芽球の細胞傷害及びＴ細胞活性化についての抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９及びＣＤ３Ｂ３７６を使用したＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体のエクスビボ評価を示す。図２Ａは、ＣＤ３３二重特異性抗体又はＣＤ３×ヌル対照を使用したＡＭＬ細胞の全細胞傷害のパーセントを示す。図２Ｂは、ＣＤ３３二重特異性抗体又はＣＤ３×ヌル対照によって誘導されたＴ細胞活性化を示す。Ｆｃ遮断薬は添加しなかった。
【図６３Ａ】ＣＤ３３×ＣＤ３  Ｔ細胞媒介性細胞傷害アッセイを示す。抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９及び抗ＣＤ３Ｂ３７６を使用したＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒト汎Ｔ細胞、及びＣＤ３３  ＳＮＰｒｓ１２４５９４１９変異について野生型（ＫＧ１、図３Ａ）、ヘテロ接合型（ＳＨ２、図３Ｂ）、又はホモ接合型（ＯＣＩＡＭＬ３、図３Ｃ）のいずれかであるＡＭＬ細胞株と共にインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で４８時間後、フローサイトメトリーによって全腫瘍細胞傷害を測定した。
【図６３Ｂ】ＣＤ３３×ＣＤ３  Ｔ細胞媒介性細胞傷害アッセイを示す。抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９及び抗ＣＤ３Ｂ３７６を使用したＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒト汎Ｔ細胞、及びＣＤ３３  ＳＮＰｒｓ１２４５９４１９変異について野生型（ＫＧ１、図３Ａ）、ヘテロ接合型（ＳＨ２、図３Ｂ）、又はホモ接合型（ＯＣＩＡＭＬ３、図３Ｃ）のいずれかであるＡＭＬ細胞株と共にインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で４８時間後、フローサイトメトリーによって全腫瘍細胞傷害を測定した。
【図６３Ｃ】ＣＤ３３×ＣＤ３  Ｔ細胞媒介性細胞傷害アッセイを示す。抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９及び抗ＣＤ３Ｂ３７６を使用したＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒト汎Ｔ細胞、及びＣＤ３３  ＳＮＰｒｓ１２４５９４１９変異について野生型（ＫＧ１、図３Ａ）、ヘテロ接合型（ＳＨ２、図３Ｂ）、又はホモ接合型（ＯＣＩＡＭＬ３、図３Ｃ）のいずれかであるＡＭＬ細胞株と共にインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で４８時間後、フローサイトメトリーによって全腫瘍細胞傷害を測定した。
【図６４Ａ】正常健常ヒト全血（Ｎ＝６人のドナー）に外因的に添加されたＭＯＬＭ−１３細胞の細胞傷害に対する、ＣＤ３Ｂ２１９又はＣＤ３Ｂ３７６のいずれかと対形成したＣ３３Ｂ９０４抗体のエクスビボ評価：４８時間目における、ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体及びそれぞれのヌル×ＣＤ３対照を使用した、ＭＯＬＭ−１３細胞（図４Ａ）及びＣＤ３３＋ＣＤ１４＋単球（図４Ｂ）の細胞傷害のパーセントを示す。
【図６４Ｂ】正常健常ヒト全血（Ｎ＝６人のドナー）に外因的に添加されたＭＯＬＭ−１３細胞の細胞傷害に対する、ＣＤ３Ｂ２１９又はＣＤ３Ｂ３７６のいずれかと対形成したＣ３３Ｂ９０４抗体のエクスビボ評価：４８時間目における、ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体及びそれぞれのヌル×ＣＤ３対照を使用した、ＭＯＬＭ−１３細胞（図４Ａ）及びＣＤ３３＋ＣＤ１４＋単球（図４Ｂ）の細胞傷害のパーセントを示す。
【図６５Ａ】６頭の正常カニクイザルドナー由来の新鮮全血における単球の細胞傷害及びＴ細胞活性化に対する抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９及びＣＤ３Ｂ３７６を使用したＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体のエクスビボ評価を示す。図５Ａは、ＣＤ３３二重特異性抗体又はＣＤ３×ヌル対照を使用したＣＤ３３＋ＣＤ１４＋カニクイザル単球の全細胞傷害のパーセントを示す。図５Ｂは、ＣＤ３３二重特異性抗体又はそのＣＤ３×ヌル対照によって誘導されたＴ細胞活性化を示す。Ｆｃ遮断薬は添加しなかった。
【図６５Ｂ】６頭の正常カニクイザルドナー由来の新鮮全血における単球の細胞傷害及びＴ細胞活性化に対する抗ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９及びＣＤ３Ｂ３７６を使用したＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体のエクスビボ評価を示す。図５Ａは、ＣＤ３３二重特異性抗体又はＣＤ３×ヌル対照を使用したＣＤ３３＋ＣＤ１４＋カニクイザル単球の全細胞傷害のパーセントを示す。図５Ｂは、ＣＤ３３二重特異性抗体又はそのＣＤ３×ヌル対照によって誘導されたＴ細胞活性化を示す。Ｆｃ遮断薬は添加しなかった。
【図６６】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＣ３ＣＢ１８９の抗腫瘍有効性を示す。播種性ＭＯＬＭ−１３腫瘍を生物発光（ＢＬＩ）について週２回撮像し、その結果を、平均放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）±ＳＥＭ（ｎ＝８〜１０／群）として提示した。＊処理対対照についてｐ≦０．０００１、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を伴う二元配置分散分析により計算。
【図６７】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＣ３ＣＢ１８９で処理された動物の生存率を示す。ＭＯＬＭ−１３担持マウスの生存率を、カプラン・マイヤー曲線を使用してグラフで表し、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定によって評価する。＊処理群対対照群についてｐ≦０．０００１。
【図６８】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＣ３ＣＢ８８の抗腫瘍有効性を示す。播種性ＭＯＬＭ−１３腫瘍を生物発光（ＢＬＩ）について週２回撮像し、その結果を、平均放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）±ＳＥＭ（ｎ＝８〜１０／群）として提示した。＊処理対対照についてｐ≦０．０００１、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を伴う二元配置分散分析により計算。
【図６９】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＣ３ＣＢ８８で処理された動物の生存率を示す。ＭＯＬＭ−１３担持マウスの生存率を、カプラン・マイヤー曲線を使用してグラフで表し、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定によって評価する。＊処理群対対照群についてｐ≦０．０５。
【図７０】選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のアラインメントを示す。ＶＨ領域は、各行の先頭の配列番号によって特定される。
【図７１】選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）のアラインメントを示す。ＶＨ領域は、各行の先頭の配列番号によって特定される。
【図７２】雄ＮＧＳマウスにおけるエクスビボＬｎＣａＰ前立腺癌モデルにおける、０．５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ１３２で処理した各マウスの平均腫瘍体積の減少を示す。
【図７３】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおける樹立されたＬＮＣａＰ異種移植片における、ＴＭＥＢ７６２×ＣＤ３Ｂ３７６の有効性を示す。
【図７４】ＴＭＣＢ１３２の投与に応答した、ＬｎＣａＰ前立腺癌細胞におけるＴ細胞活性化を示す。
【図７５】ＴＭＣＢ１３２のＴ細胞媒介性細胞傷害を示す。
【図７６】Ｔ細胞ヒト化マウスにおけるＴＭＣＢ１３２の抗腫瘍有効性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（但しそれらに限定されない）全ての刊行物は、完全に記載されているかのように参照により、本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００２６】
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用することができるが、例示的な材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が使用される。
【００２７】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
【００２８】
「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「結合する」とは、抗体が抗原又はかかる抗原内部のエピトープに、他の抗原に対しより高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、約５×１０−８Ｍ以下、例えば約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１２Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原又は抗原内のエピトープに結合し、非特異性抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に関しては、典型的には、そのＫＤより少なくとも１００倍小さいＫＤで結合する。解離定数は標準的手法を用いて測定することができる。しかし、抗原又は抗原内のエピトープに特異的に結合する抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）又はＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合がある。単一特異性抗体は、１つの抗原又は１つのエピトープに特異的に結合するのに対し、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原又は２つの異なるエピトープに特異的に結合する。
【００２９】
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性又は多重特異性抗体、ダイマー、テトラマー又は多量体（マルチマー）抗体、単鎖抗体、ドメイン抗体、並びに必要とされる特異性の抗原結合部位を含む任意の他の改変された立体配置の免疫グロブリン分子を含む、免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体分子」は、ジスルフィド結合によって相互に接続されている２本の重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chain、ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）及び軽鎖定常領域（constant region、ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
【００３０】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原に結合する抗体の領域である。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２：２１１−５０）（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−１７）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５−７７）、及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６）Ｊ  Ｂｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６３：８００−１５）などの、様々な記述を使用して定義することができる。様々な記述と、可変領域の付番との対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５−７７；Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２００１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０９：６５７−７０；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース；ウェブソース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇを参照のこと）。ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを描写することができる。本明細書で使用する場合、用語「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」は、明細書で別途明示的に記載のない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
【００３１】
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
【００３２】
「抗原結合断片」とは、抗原に結合する免疫グロブリン分子の一部を意味する。抗原結合断片は合成ポリペプチド、酵素により入手可能なポリペプチド、又は遺伝子組換えされたポリペプチドであってよく、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）、サメ可変性ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４部分などの、抗体のＣＤＲを再現したアミノ酸残基からなる最小の認識単位、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３が挙げられる。ＶＨ及びＶＬドメインは互いに、合成リンカーを介して連結し、様々なタイプの一本鎖抗体設計を形成することができ、ＶＨ及びＶＬドメインが、別々の一本鎖抗体コンストラクトにより発現される場合では、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内、又は分子間で対形成し、一価の抗原結合部位、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又はディアボディを形成することができ、これらは、例えば国際公開第１９９８／４４００１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号、及び同第１９９２／０１０４７号に記載されている。
【００３３】
「モノクローナル抗体」とは、抗体分子の実質的に均質な母集団（即ち、母集団を含む個別の抗体が、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去する、又は、アミノ酸異性化若しくはアミド分解、メチオニン酸化若しくはアスパラギン若しくはグルタミンアミド分解などの翻訳後修飾といった、可能な周知の変更を除いて同一である）から入手される抗体を意味する。モノクローナル抗体は典型的には、１つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であってよく、又は、二重特異性などの多重特異性であってよく、一価、二価、又は多価であってよい。
【００３４】
「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体又は抗体断片を指す（例えば、ある抗原に特異的に結合する単離抗体は、当該抗原以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。二重特異性ＣＤ３抗体の場合、二重特異性抗体は、ＣＤ３及び第２の抗原の両方に特異的に結合する。「単離抗体」は、純度が８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の抗体など、高純度に単離された抗体を包含する。
【００３５】
「ヒト化抗体」とは、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を意味する。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
【００３６】
「ヒト抗体」とは、ヒト対象に投与されるときに、最小の免疫応答を有するように最適化された抗体を意味する。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、当該定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットを含む。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、又はこれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６に記載されているヒトフレームワーク配列分析から導かれたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５−９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載されている、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有していてもよい。
【００３７】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性パーセントが最大になるように、配列同一性の一部として保存的置換を全く考慮することなく、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを求める目的のためのアライメントは、当該技術分野における技能の範囲内で様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のために、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用してアミノ酸配列同一性％の値が生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）にユーザ文書と共に提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）から公的に入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルする必要がある。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２を使用する場合、所与のアミノ酸配列Ｂへの、との、に対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに、と、又はに対して同一である特定のアミノ酸配列％を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａとも言うことができる）は、以下のように計算される：
１００×割合Ｘ／Ｙ、
（式中、Ｘは、Ａ及びＢの配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によるアラインメントにおいてそのプログラムによって完全一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくはないことが理解されるであろう。特に明記しない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載の通り得られる。
【００３８】
抗原結合部位が非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
【００３９】
「組換え物」は、異なる供給源由来のセグメントが結合されて組換えＤＮＡ、抗体、又はタンパク質を産生するときに、組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されるＤＮＡ、抗体、及び他のタンパク質を指す。
【００４０】
「エピトープ」とは、抗体が特異的に結合する抗原の一部分を指す。エピトープは、典型的には、アミノ酸又は多糖側鎖などの部分の化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）表面基からなり、特定の三次元構造特性に加えて特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、配座上の空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続なアミノ酸によって構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分にあるアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。抗体「エピトープ」は、エピトープを識別するために使用する方法論によって異なる。
【００４１】
「パラトープ」は、抗原に特異的に結合する抗体の部分を指す。パラトープは、事実上線形であってもよく、又は線形の一連のアミノ酸ではなく、抗体の隣接していないアミノ酸同士の空間的な関係することによって形成される不連続なものであってもよい。「軽鎖パラトープ」及び「重鎖パラトープ」又は「軽鎖パラトープのアミノ酸残基」及び「重鎖パラトープのアミノ酸残基」はそれぞれ、抗原と接触する抗体の軽鎖残基及び重鎖残基を指し、あるいは概して「抗体パラトープ残基」は、抗原と接触するこれらの抗体アミノ酸を指す。
【００４２】
「二重特異性」は、２つの異なる抗原、又は同じ抗原中の２つの異なるエピトープと特異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（ｃｙｎｏ）又はチンパンジーなどの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得る、あるいは、２つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合し得る。
【００４３】
「多重特異性」とは、同じ抗原内の２つ以上の異なる抗原、又は２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する抗体を意味する。多重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（ｃｙｎｏ）又はチンパンジーなどの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得る、あるいは、２つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合し得る。
【００４４】
「変異体」は、１つ以上の改変、例えば、１つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
【００４５】
「ベクター」は、生体系内で複製可能な、又はそのような系間を移動することができる、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターを複製することができる生物学的要素を利用して細胞、ウイルス、動物、植物などの生体系及び再構成された生体系におけるこれらポリヌクレオチドの複製又は維持を促進する機能を有する、複製起点、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、及び選択マーカーなどの要素を含有する。ベクターポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又はこれらのハイブリッドであり得る。
【００４６】
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指令するために、生体系又は再構成された生体系において利用できるベクターを指す。
【００４７】
「ポリヌクレオチド」とは、糖−リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学によって共有結合しているヌクレオチド鎖を含む分子を指す。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。「ポリヌクレオチド」とは、糖−リン酸骨格により共有結合した、又は他の等価な共有結合性化学反応により結合したヌクレオチド鎖を含む合成分子を指し得、ｃＤＮＡは、例示的な合成ポリヌクレオチドである。
【００４８】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。
【００４９】
「フローサイトメトリー」は、流体が少なくとも１つのレーザーを通過する際に当該流体中の粒子の物理的及び化学的特性を分析するために使用される技術である。細胞成分を蛍光標識し、次いで、レーザーによって励起して、様々な波長で発光させる（Ａｄａｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１６）１５４９−７８０１）。
【００５０】
「抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体」は、抗体の抗原決定基（例えば、パラトープ又はＣＤＲ）を認識する抗体である。抗イディオタイプ抗体を産生又は調製するプロセスは、当該技術分野において概ね知られている。（Ｌａｔｈｅｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９８６  ５７（１）：２９−３５）。抗Ｉｄ抗体は、抗原をブロッキングするものであっても、しないものであってもよい。抗原をブロッキングする抗Ｉｄ抗体は、サンプル中の遊離抗体、例えばＣＤ３を検出するために使用することができる。ブロッキングしない抗Ｉｄ抗体は、サンプル中の全抗体（遊離しているもの、抗原に一部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの）を検出するために使用することができる。抗Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄ抗体が調製されている抗体で動物を免疫化することによって調製することができる。本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、抗イディオタイプ抗体は、サンプル中の治療抗体のレベルを検出するために使用される。
【００５１】
また、更に別の動物で免疫応答を誘導する免疫原として抗Ｉｄ抗体を使用して、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生することもできる。抗抗Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄ抗体を誘導した元のｍＡｂとエピトープが同一であり得る。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。抗Ｉｄ抗体は様々であってよく（それにより、抗Ｉｄ抗体変異体が産生される）、及び／又は抗ＣＤ３抗体に関して本明細書の他の箇所に記載されているものなどの任意の好適な技術によって誘導体化してもよい。
【００５２】
ＰＳＭＡは、前立腺特異性膜抗原を指す。Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー又はｃｈｉｍｐとも称される）ＰＳＭＡのアミノ酸配列を配列番号４９に示す。細胞外ドメインは、配列番号４９の残基４４〜７５０にまたがり、膜貫通ドメインは、残基２０〜４３にまたがり、細胞質ドメインは、残基１〜１９にまたがる。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、マカク、又はｃｙｎｏとも称される）ＰＳＭＡのアミノ酸配列を配列番号５０に示す。細胞外ドメインは、配列番号５０の残基４４〜７５０にまたがり、膜貫通ドメインは、残基２０〜４３にまたがり、細胞質ドメインは、残基１〜１９にまたがる。ヒトＰＳＭＡのアミノ酸配列を配列番号５１に示す。細胞外ドメインは、配列番号５１の残基４４〜７５０にまたがり、膜貫通ドメインは、残基２０〜４３にまたがり、細胞質ドメインは、残基１〜１９にまたがる。
【００５３】
本明細書全体を通して、「ＣＤ３特異的」又は「ＣＤ３に特異的に結合する」又は「抗ＣＤ３抗体」は、ＣＤ３−ε細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号６３６）に特異的に結合する抗体を含む、ＣＤ３−εポリペプチド（配列番号６３５）に特異的に結合する抗体を指す。ＣＤ３−εは、ＣＤ３−γ、−δ、及び−ζ、並びにＴ細胞受容体α／β及びγ／δヘテロダイマーと一緒に、Ｔ細胞受容体−ＣＤ３複合体を形成する。この複合体は、いくつかの細胞内シグナル伝達経路への抗原認識の連関において重要な役割を果たす。ＣＤ３複合体は、シグナル伝達を媒介し、その結果、Ｔ細胞が活性化され、増殖する。ＣＤ３は、免疫応答に必要である。
【００５４】
配列番号６３５（ヒトＣＤ３ε）
ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ
【００５５】
配列番号６３６（ヒトＣＤ３ε細胞外ドメイン）
ＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤ
【００５６】
本明細書で使用するとき、用語「インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質」、「ＩＬ１ＲＡＰ」、及び「ＩＬ１−ＲＡＰ」は、具体的には、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ８４０５９、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００２１７３．１、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ９ＮＰＨ３−１に記載されているような、ヒトＩＬ１ＲＡＰタンパク質を含む（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４（２４），１２８２９−１２８３２も参照）。ＩＬ１ＲＡＰはまた、科学文献においてＩＬ１  Ｒ３、Ｃ３ｏｒｆ１３、ＦＬＪ３７７８８、ＩＬ−１  ＲＡｃＰ及びＥＧ３５５６としても知られている。
【００５７】
「ＣＤ３３」は、表面抗原分類３３タンパク質を指す。ＣＤ３３は、６７キロダルトン（ｋＤ）の１回膜貫通糖タンパク質であり、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（シグレック）ファミリーのメンバーである。ＣＤ３３は、主に骨髄分化抗原であると考えられ、骨髄前駆細胞、好中球、及びマクロファージでは低発現し、循環単球及び樹状細胞では高発現する。ヒトＣＤ３３細胞外ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２０１３８）（配列番号６３６）及びカニクイザルＣＤ３３（ＸＰ＿００５５９０１３８．１）は、本開示によるＣＤ３３特異性抗体の生成に使用するためのタンパク質の例である。
【００５８】
「ＴＭＥＦＦ２」は、ＥＧＦ様ドメイン及びトモレグリン２とも呼ばれる２つのフォリスタチン様ドメイン２を含むヒト膜貫通タンパク質を指す。完全長ヒトＴＭＥＦＦ２のアミノ酸配列を配列番号７７に示す。ＴＭＥＦＦ２の細胞外ドメインを配列番号５７５に示し、完全長ＴＭＥＦＦ２の残基４０〜３７４にまたがる。ＴＭＥＦＦ２細胞外ドメインは、３つの異なるサブドメイン、Ｋａｚａｌ様１（残基８５〜１３７）、Ｋａｚａｌ様２（残基１７６〜２２９）、及びＥＧＦドメイン（残基２６１〜３０１）を保有する。ＴＭＥＦＦ２  ＥＧＦドメインを配列番号５７７に示す。ＴＭＥＦＦ２「膜近位領域」は、ＥＧＦドメイン及びＮ−Ｃ末端リンカー領域（例えば、配列番号７７の完全長ヒトＴＭＥＦＦ２の残基２３０〜３２０）を包含する、配列番号６２９のＴＭＥＦＦ２領域を指す。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片に対する全ての言及は、非ヒト種由来のものであると明示的に指定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質断片のヒトバージョンを指すことを意図する。したがって、「ＴＭＥＦＦ２」は、非ヒト種、例えば、「マウスＴＭＥＦＦ２」又は「サルＴＭＥＦＦ２」などの非ヒト種由来のものであると指定されない限り、ヒトＴＭＥＦＦ２を意味する。
【００５９】
配列番号７７（完全長ヒトＴＭＥＦＦ２）
ＭＶＬＷＥＳＰＲＱＣＳＳＷＴＬＣＥＧＦＣＷＬＬＬＬＰＶＭＬＬＩＶＡＲＰＶＫＬＡＡＦＰＴＳＬＳＤＣＱＴＰＴＧＷＮＣＳＧＹＤＤＲＥＮＤＬＦＬＣＤＴＮＴＣＫＦＤＧＥＣＬＲＩＧＤＴＶＴＣＶＣＱＦＫＣＮＮＤＹＶＰＶＣＧＳＮＧＥＳＹＱＮＥＣＹＬＲＱＡＡＣＫＱＱＳＥＩＬＶＶＳＥＧＳＣＡＴＤＡＧＳＧＳＧＤＧＶＨＥＧＳＧＥＴＳＱＫＥＴＳＴＣＤＩＣＱＦＧＡＥＣＤＥＤＡＥＤＶＷＣＶＣＮＩＤＣＳＱＴＮＦＮＰＬＣＡＳＤＧＫＳＹＤＮＡＣＱＩＫＥＡＳＣＱＫＱＥＫＩＥＶＭＳＬＧＲＣＱＤＮＴＴＴＴＴＫＳＥＤＧＨＹＡＲＴＤＹＡＥＮＡＮＫＬＥＥＳＡＲＥＨＨＩＰＣＰＥＨＹＮＧＦＣＭＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬＹＶＶＰＧＰＶＲＦＱＹＶＬＩＡＡＶＩＧＴＩＱＩＡＶＩＣＶＶＶＬＣＩＴＲＫＣＰＲＳＮＲＩＨＲＱＫＱＮＴＧＨＹＳＳＤＮＴＴＲＡＳＴＲＬＩ
【００６０】
配列番号５７５（ヒトＴＭＥＦＦ２の細胞外ドメイン）
ＦＰＴＳＬＳＤＣＱＴＰＴＧＷＮＣＳＧＹＤＤＲＥＮＤＬＦＬＣＤＴＮＴＣＫＦＤＧＥＣＬＲＩＧＤＴＶＴＣＶＣＱＦＫＣＮＮＤＹＶＰＶＣＧＳＮＧＥＳＹＱＮＥＣＹＬＲＱＡＡＣＫＱＱＳＥＩＬＶＶＳＥＧＳＣＡＴＤＡＧＳＧＳＧＤＧＶＨＥＧＳＧＥＴＳＱＫＥＴＳＴＣＤＩＣＱＦＧＡＥＣＤＥＤＡＥＤＶＷＣＶＣＮＩＤＣＳＱＴＮＦＮＰＬＣＡＳＤＧＫＳＹＤＮＡＣＱＩＫＥＡＳＣＱＫＱＥＫＩＥＶＭＳＬＧＲＣＱＤＮＴＴＴＴＴＫＳＥＤＧＨＹＡＲＴＤＹＡＥＮＡＮＫＬＥＥＳＡＲＥＨＨＩＰＣＰＥＨＹＮＧＦＣＭＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬＹＶＶＰＧＰＶＲＦＱＹＶＬＩＡＡＶＩＧＴＩＱＩＡＶＩＣＶＶＶＬＣＩＴＲＫＣＰＲＳＮＲＩＨＲＱＫＱＮＴＧＨＹＳＳＤＮＴＴＲＡＳＴＲＬＩ
【００６１】
ＴＭＥＦＦ２  ＥＧＦドメイン配列番号５７７
ＨＨＩＰＣＰＥＨＹＮＧＦＣＭＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥ
【００６２】
ＴＭＥＦＦ２膜近位領域配列番号６２９
ＮＴＴＴＴＴＫＳＥＤＧＨＹＡＲＴＤＹＡＥＮＡＮＫＬＥＥＳＡＲＥＨＨＩＰＣＰＥＨＹＮＧＦＣＭＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬＹＶＶＰＧＰＶＲＦＱＹＶ
【００６３】
「ＴＭＥＦＦ２陽性癌」は、測定可能なレベルのＴＭＥＦＦ２タンパク質を示す癌組織又は癌細胞を指す。ＴＭＥＦＦ２タンパク質のレベルは、生細胞又は溶解細胞に対して周知のアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、フローサイトメトリー、又はラジオイムノアッセイを使用して測定することができる。「過剰発現」、「過剰発現した」、及び「過剰発現している」は、互換的に、参照サンプルと比較したときに測定可能に高いレベルの腫瘍抗原を有する癌細胞、悪性細胞、又は癌組織などのサンプルを指す。過剰発現は、遺伝子増幅によって、又は転写若しくは翻訳の増加によって引き起こされ得る。サンプル中のタンパク質の発現及び過剰発現は、例えば、生細胞又は溶解細胞に対して周知のアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、フローサイトメトリー、又はラジオイムノアッセイを使用して測定することができる。サンプル中のポリヌクレオチドの発現及び過剰発現は、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、又はＰＣＲ技術を使用して測定することができる。サンプル中のタンパク質又はポリヌクレオチドのレベルが参照サンプルと比較したときに少なくとも１．５倍高いとき、タンパク質又はポリヌクレオチドは過剰発現している。参照サンプルの選択は周知である。
【００６４】
「サンプル」は、対象から単離された類似の流体、細胞、又は組織に加えて、対象の体内に存在する流体、細胞、又は組織の収集物を指す。例示的なサンプルは、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ液、尿、唾液、嚢胞液、涙液、糞便、喀痰などの体液、分泌組織及び器官の粘膜からの分泌液、膣分泌液、非固形腫瘍に関連するものなどの腹水、胸膜腔、心膜腔、腹膜腔、腹腔、及び他の体腔の流体、気管支洗浄によって回収された流体、対象又は生物供給源、例えば、細胞及び器官の培養培地（細胞又は器官の馴化培地を含む）、洗浄液などと接触した液体溶液、組織生検、穿刺吸引、又は外科的に切除された腫瘍組織である。
【００６５】
本明細書で使用するとき、「癌細胞」又は「腫瘍細胞」は、インビボ、エクスビボ、又は組織培養のいずれかにおいて、自然発生的な又は導入された表現型の変化を有する癌性、前癌性、又は形質転換細胞を指す。これらの変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の組み込み、又は外因性の核酸の取り込みにより生じ得るが、自然発生的に又は発癌物質に対する曝露後にも生じる場合があり、それによって内因性遺伝子が変異する。形質転換／癌は、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖の制御、病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベルの調節、侵襲性、ヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍増殖などによって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４年））。
【００６６】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）〜１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
【００６７】
「エフェクター抗原」は、細胞傷害、貪食作用、抗原提示、及び／又はサイトカイン放出を刺激又は誘発することができる免疫系の細胞からの抗原である。このようなエフェクター抗原は、例えば、限定するものではないが、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。エフェクター抗原の好適な特異性の例としては、Ｔ細胞についてはＣＤ３又はＣＤ３εなどのＣＤ３サブユニット、及びＮＫ細胞についてはＣＤ１６が挙げられるが、これらに限定されない。エフェクター細胞のこのような細胞表面分子は、細胞殺傷を媒介するのに好適である。エフェクター細胞は、細胞傷害、貪食作用、抗原提示、及び／又はサイトカイン放出を刺激又は誘発することができる免疫系の細胞である。このようなエフェクター細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び抗原提示細胞であるが、これらに限定されない。エフェクター細胞の好適な特異性の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｔ細胞についてはＣＤ２、ＣＤ３及びＣＤ３ｅなどのＣＤ３サブユニット、ＣＤ５、ＣＤ２８、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の他の構成要素；ＮＫ細胞についてはＣＤ１６、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＣＤ３３６、（ＮＫｐ４４）、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＮＫｐ８０、ＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ、ＮＣＲ；顆粒球についてはＣＤ１８、ＣＤ６４、及びＣＤ８９；単球及びマクロファージについてはＣＤ１８、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８９、及びマンノース受容体；樹状細胞についてはＣＤ６４及びマンノース受容体；並びにＣＤ３５。本発明の特定の実施形態では、エフェクター細胞の特異性、すなわち細胞表面分子は、二重特異性又は多重特異性分子のこのような細胞表面分子への結合時に細胞殺傷を媒介し、それによって、細胞溶解又はアポトーシスを誘導するのに好適である。
【００６８】
「二重特異性ＣＤ３抗体」は、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメイン及び第２の抗原に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む分子、例えば、ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン及び第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインを含む二重特異性抗体を指す。ＣＤ３及び第２の抗原に特異的に結合するドメインは、典型的にはＶＨ／ＶＬ対である。二重特異性ＣＤ３抗体は、ＣＤ３又は第２の抗原のいずれかへの結合に関して一価であってもよい。いくつかの実施形態では、第２の又は標的抗原は、免疫エフェクター細胞以外の標的細胞上で発現する細胞表面抗原である。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。例示的なＴＡＡは、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、及びＴＭＥＦＦ２である。
【００６９】
「二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体」、「ＰＳＭＡ／ＣＤ３抗体」、「二重特異性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体」、又は「抗ＰＳＭＡ／ＣＤ３抗体」などは、ＰＳＭＡに特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインとを含む分子を指す。ＰＳＭＡ及びＣＤ３に特異的に結合するドメインは、典型的にはＶＨ／ＶＬ対である。二重特異性抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体は、ＰＳＭＡ又はＣＤ３のいずれかへの結合に関して一価であってもよい。
【００７０】
「二重特異性ＣＤ３３×ＣＤ３抗体」、「ＣＤ３３／ＣＤ３抗体」、「二重特異性抗ＣＤ３３×ＣＤ３抗体」、又は「抗ＣＤ３３／ＣＤ３抗体」などは、ＣＤ３３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインとを含む分子を指す。ＣＤ３３及びＣＤ３に特異的に結合するドメインは、典型的にはＶＨ／ＶＬ対である。二重特異性抗ＣＤ３３×ＣＤ３抗体は、ＣＤ３３又はＣＤ３のいずれかへの結合に関して一価であってもよい。
【００７１】
「二重特異性ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体」、「ＩＬ１ＲＡＰ／ＣＤ３抗体」、「二重特異性抗ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体」、又は「抗ＩＬ１ＲＡＰ／ＣＤ３抗体」などは、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインと、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインとを含む分子を指す。ＩＬ１ＲＡＰ及びＣＤ３に特異的に結合するドメインは、典型的にはＶＨ／ＶＬ対である。二重特異性抗ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体は、ＩＬ１ＲＡＰ又はＣＤ３のいずれかへの結合に関して一価であってもよい。
【００７２】
「二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体」、ＴＭＥＦＦ２／ＣＤ３抗体、ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３抗体などは、ＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３に結合する抗体を指す。
【００７３】
「価数」とは、分子中の抗原に対して特異的な結合部位が明記された数で存在することを意味する。そのため、用語「１価」、「２価」、「４価」、及び「６価」はそれぞれ、抗原に対して特異的な結合部位が分子中に１個、２個、４個、及び６個存在することを指す。「多価」とは、分子中に抗原に対して特異的な結合部位が２つ以上存在することを指す。
【００７４】
「抗原特異的ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞」は、特定の抗原によって活性化されるＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞、又はその免疫刺激性エピトープを指す。
【００７５】
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」としては、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの全ての脊椎動物が挙げられる。注記されている場合を除き、「患者」及び「対象」という用語は、互換的に使用される。
【００７６】
本明細書全体を通して、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、特に明示的に指定しない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載されているＥＵインデックスに準拠する。
【００７７】
【表１】
2021524249.tif 000003
【００７８】
物質の組成
本発明は、抗ＣＤ３抗体及びその抗原結合断片、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片、ＣＤ３３に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片、ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン及び第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインを含む多重特異性抗体、並びにＣＤ３とＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、及びＴＭＥＦＦ２のうちの１つ以上とに特異的に結合する多重特異性抗体を提供する。本発明は、本発明の抗体又はその相補的核酸をコードしているポリペプチド及びポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びにこれらを作製する方法及び使用する方法を提供する。
【００７９】
本明細書に記載される抗体の全般的な態様
本明細書に記載の抗ＣＤ３特異性抗体又は抗原結合断片は、記載される抗ＣＤ３抗体又は抗原結合断片の生物学的特性（例えば、結合親和性又は免疫エフェクター活性）を保持している、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有する変異体を含む。本発明の文脈において、下記注釈は、別途記載のない限り、変異を説明するのに使用される。ｉ）所与の位置におけるアミノ酸の置換は、例えば、Ｋ４０９Ｒと記載される。Ｋ４０９Ｒは、４０９位におけるリジンのアルギニンによる置換を意味する。ｉｉ）特定の変異体について、特定の三文字又は一文字コードは、コードＸａａ及びＸを含めて、アミノ酸残基を示すのに使用される。このため、４０９位におけるリジンについてのアルギニンの置換は、Ｋ４０９Ｒと指定され、又は４０９位におけるリジンについての任意のアミノ酸残基の置換は、Ｋ４０９Ｘと指定される。４０９位におけるリジンの欠失の場合には、この欠失は、Ｋ４０９＊により示される。当業者であれば、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有する変異体を産生することができる。
【００８０】
これらの変異体としては、（ａ）１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸により置換されている変異体、（ｂ）１つ又は２つ以上のアミノ酸がポリペプチドに付加され、又は同ポリペプチドから欠失している変異体、（ｃ）１つ又は２つ以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、及び（ｄ）ポリペプチドが別のペプチド又はポリペプチド、例えば、融合パートナー、タンパク質タグ、又は他の化学部分と融合した変異体、を挙げることができる。これらは、ポリペプチドに有用な特性、例えば、抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分等を付与してもよい。本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントは、保存的又は非保存的位置のいずれかにおいてある種からのアミノ酸残基が別の種における対応する残基に置換されている変異体を含んでもよい。他の実施形態では、非保存的位置におけるアミノ酸残基は、保存的又は非保存的残基により置換される。これらの変異体を得るための手法は、遺伝的（欠失、変異等）、化学的、及び酵素的手法を含めて、当業者に既知である。
【００８１】
本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥアイソタイプであってよい。いくつかの実施形態では、抗体アイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。抗体又はその抗原結合断片の特異性は、ＣＤＲのアミノ酸配列及び配置によって部分的に決定される。したがって、あるアイソタイプのＣＤＲは、抗原特異性を変化させることなく、別のアイソタイプに導入することができる。したがって、このような抗体アイソタイプは、記載された抗体又は抗原結合フラグメントの範囲内にある。
【００８２】
ＩｇＧクラスは、ヒトにおいて、４つのアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分割される。これらのアイソタイプは、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域のアミノ酸配列において９５％超の相同性を共有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成及び構造においては大きな差異を示す。Ｆｃ領域は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。ＡＤＣＣでは、Ｆｃ領域が、免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージの表面上のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合して、標的細胞の溶解を引き起こす。ＣＤＣでは、抗体が、細胞表面における補体カスケードを誘発することにより標的細胞の殺傷を媒介する。ＡＤＣＰでは、抗体が、マクロファージ又は樹状細胞などの貪食細胞による内部移行により抗体被膜標的細胞の排除を媒介する。本明細書に記載の抗体としては、Ｆｃ領域が様々なエフェクター機能を調節するように改変されている改変バージョンを含む、ＩｇＧアイソタイプのいずれかと組み合わされて可変ドメインの記載された特徴を有する抗体が挙げられる。
【００８３】
治療抗体の多くの用途では、細胞枯渇による安全上のリスクを生じる可能性が潜在的にあるため、Ｆｃ媒介エフェクター機能は望ましくない。エフェクター機能の改変は、Ｆｃ領域を遺伝子操作してＦｃγＲ又は補体因子への結合を低減することにより達成され得る。活性化（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂ）及び阻害性（ＦｃγＲＩＩｂ）ＦｃγＲ又は補体第１成分（Ｃ１ｑ）へのＩｇＧの結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４に変異を導入して、Ｆｃ媒介エフェクター機能を低下又はサイレンシングさせることができる。本明細書に記載された抗体は、これらの改変を含んでもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、及び／又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、以下の特性のうちの１つ以上を有する遺伝子操作されたＦｃ領域を含む：（ａ）親Ｆｃと比較してエフェクター機能が低下している；（ｂ）ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、及び／若しくはＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性が低下している、（ｃ）ＦｃγＲＩに対する親和性が低下している、（ｄ）ＦｃγＲＩＩａに対する親和性が低下している、（ｅ）ＦｃγＲＩＩＩｂに対する親和性が低下している、又は（ｆ）ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性が低下している。
【００８５】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、及び／又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。抗体がＩｇＧ４アイソタイプを有するいくつかの実施形態では、抗体は、野生型ＩｇＧ４アイソタイプと比較して、そのＦｃ領域中にＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を含有する。抗体がＩｇＧ１アイソタイプを有するいくつかの実施形態では、抗体は、そのＦｃ領域中にＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を含有する。本明細書に記載された抗体は、これらの改変を含んでもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、及び／又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、任意選択で重鎖置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４アイソタイプである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、及び／又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、野生型ＩｇＧ１と比較して、任意選択で重鎖置換Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含むＩｇＧ１アイソタイプである。
【００８８】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、及び／又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、野生型ＩｇＧ２と比較して、任意選択で重鎖置換Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含むＩｇＧ２アイソタイプである。
【００８９】
野生型ＩｇＧ４
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号６０２）
【００９０】
野生型ＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６０１）
【００９１】
野生型ＩｇＧ２
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７１１）
【００９２】
特定の実施形態では、標識された抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、及び／又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体が提供される。例示的な直接検出される標識又は部分（例えば、蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、及び放射性標識）並びに（例えば、酵素反応又は分子間相互作用を通して）間接的に検出される標識及び部分（例えば、酵素又はリガンド）。例示的な標識としては、放射性標識（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１１１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ）、蛍光標識（ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６４９など）、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、又は酵素が挙げられる。より詳細には、記載された標識としては、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、ポリヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料などが挙げられる。
【００９３】
記載される抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、及び／又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、並びに抗原結合断片に加えて、記載される抗体及び抗原結合断片をコード可能なポリヌクレオチド配列も提供される。記載されるポリヌクレオチドを含むベクターも提供され、同様に、本明細書に提供される抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、及び／若しくは抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、又は抗原結合断片を発現している細胞も提供される。また、開示されたベクターを発現可能な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞（例えば、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ７細胞）、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞（例えば、大腸菌）であってもよい。記載された抗体はまた、ハイブリドーマ細胞により産生することができる。
【００９４】
単一特異性抗体の生成
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、抗ＴＭＥＦＦ２、及び／又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体はヒトである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、抗ＴＭＥＦＦ２、及び／又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体はヒト化されている。
【００９６】
本明細書に記載の本発明の単一特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、抗ＴＭＥＦＦ２、及び／又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体）は、様々な技術を使用して生成され得る。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５のハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を生成することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えばハムスター、ラット、又はニワトリを、ヒト、チンパンジー、又はマカクのＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＭＥＦＦ２、若しくはＣＤ３、又はＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＭＥＦＦ２、若しくはＣＤ３の断片、例えば、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＭＥＦＦ２、若しくはＣＤ３の細胞外ドメインで免疫化し、続いて、標準的な方法を使用して、免疫化した動物由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から発生したコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、及び抗原親和性などの所望の特性を有する抗体の産生についてスクリーニングする。
【００９７】
様々な宿主動物を使用して、本明細書に記載の本発明の抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、ＴＭＥＦＦ２、及び／又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を産生することができる。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、マウス抗ヒトＰＳＭＡ抗体を生成することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウス及び他のヒト以外の動物において作製された抗体を、よりヒトに近い配列を生成するための様々な技術を使用してヒト化することもできる。
【００９８】
ヒトアクセプターフレームワークの選択を含む例示的なヒト化技術は公知であり、ＣＤＲグラフト化（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲグラフト化（米国特許第６，８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：４８９−４９９）、特異性決定残基のリサーフェシング（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適応（米国特許第８，７４８，３５６）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）を含む。これらの方法では、ＣＤＲの長さの類似性若しくはカノニカル構造の同一性、又はこれらの組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づき選択され得るヒトフレームワークに親抗体のＣＤＲを導入する。
【００９９】
ヒト化抗体は、国際公開第１０９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号に記載されているものなどの技術によって、結合親和性を保存するように変化させたフレームワーク支持残基を組み込むことによって（復帰変異）、又はＣＤＲのいずれかに変動を導入して、例えば抗体の親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択性又は親和性を改善するように更に最適化させてもよい。
【０１００】
自身のゲノムにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を有する、マウス又はラットなどのトランスジェニック動物を使用して、標的タンパク質に対するヒト抗体を生成することができ、これらは例えば、以下に記載されている：米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第９９／４５９６２号、同第２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８号、及び同第１９９０／０４０３６号、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−９；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１；Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５−９３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３−  １３２６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：１２３６−１２４３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ（１９９７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：４５５−４５８。このような動物の内在的な免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組換えを使用して、導入染色体（transchromosome）を使用して、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を使用して、選択抗原を標的としたヒト抗体を提供するべく取り組んでいる場合がある。
【０１０１】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリから選択することができ、この場合、ファージは、ヒト免疫グロブリン又はその一部、例えば、Ｆａｂ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は不対若しくは対合抗体の可変領域を発現するように遺伝子操作されている（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２５４：６７−８４；Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４；Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）ＰＩＴＡＳ（ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１）。本発明の抗体は、例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５−９６及び国際公開第０９／０８５４６２号）に記載の通り、バクテリオファージｐＩＸコートタンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現しているファージディスプレイライブラリから単離され得る。ライブラリを、ヒト及び／又はカニクイザルのＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＭＥＦＦ２、又はＣＤ３のファージ結合についてスクリーニングし、得られた陽性クローンを更に特性評価し、Ｆａｂをクローンの溶解物から単離し、完全長のＩｇＧとして発現させることができる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、及び同第６，５９３，０８１号に記載されている。
【０１０２】
免疫原性抗原の調製及びモノクローナル抗体の産生は、組換えタンパク質産生などの任意の好適な技術を使用して実施することができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あるいは全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、抗原は、当該抗原又はその一部をコードしている核酸から動物の体内でデノボ形成されてもよい。
【０１０３】
二重特異性及び多重特異性ＣＤ３抗体の生成及び使用
本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと、第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性及び多重特異性抗体を提供する。第２の抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は病原性細胞上の抗原であってよい。
【０１０４】
ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体及び多重特異性抗体を遺伝子操作するために使用することができる例示的な抗ＣＤ３抗体としては、それぞれ表７Ａ及び７Ｂに示されるＶＨ／ＶＬ配列及び重鎖／軽鎖ＣＤＲを含むＣＤ３抗体、並びに表１０及び表１１及び添付のテキストに記載されているその遺伝子操作された変異体が挙げられる。例えば、本明細書に記載のＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３１２、ＣＤ３Ｂ３１３、ＣＤ３Ｂ３１４、ＣＤ３Ｂ３１５、ＣＤ３Ｂ３１６、ＣＤ３Ｂ３１７、ＣＤ３Ｂ３３７、ＣＤ３Ｂ３７３、ＣＤ３Ｂ３７６、ＣＤ３Ｂ３８９、ＣＤ３Ｂ４５０、及びＣＤ３Ｂ４６７のＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬドメインを使用して、ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性及び多重特異性抗体を生成することができる。
【０１０５】
本明細書に記載の抗ＣＤ３抗体のＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬドメインを、ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体に組み込むことができる。
【０１０６】
本明細書に記載の抗ＣＤ３抗体のＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬドメインを、本明細書及び表２３に記載のＰＳＭＡ結合ＶＨ／ＶＬドメインを含む二重特異性抗体に組み込むことができる。本明細書に記載の抗ＣＤ３抗体及び／又はＶＨ／ＶＬドメインを、本明細書及び表３０に記載のＩＬ１ＲＡＰ結合ＶＨ／ＶＬドメインを含む二重特異性抗体に組み込むことができる。本明細書に記載の抗ＣＤ３抗体のＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬドメインを、本明細書及び表３８に記載のＣＤ３３結合ＶＨ／ＶＬドメインを含む二重特異性抗体に組み込むことができる。例えば、本明細書に記載のＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１１９、ＰＳＭＢ１２０、ＰＳＭＢ１２１、ＰＳＭＢ１２２、ＰＳＭＢ１２３、ＰＳＭＢ８７、ＰＳＭＢ１２６、ＰＳＭＢ１２７、ＰＳＭＢ１２８、ＰＳＭＢ１２９、ＰＳＭＢ１３０、ＰＳＭＢ１２０、ＰＳＭＢ１２１、ＰＳＭＢ１２２、ＰＳＭＢ１２３、ＰＳＭＢ１２７、ＰＳＭＢ１２８、ＰＳＭＢ１３０、ＰＳＭＢ３４４、ＰＳＭＢ３４５、ＰＳＭＢ３４６、ＰＳＭＢ３４７、ＰＳＭＢ３４９、ＰＳＭＢ３５８、ＰＳＭＢ３５９、ＰＳＭＢ３６０、ＰＳＭＢ３６１、ＰＳＭＢ３６２、ＰＳＭＢ３６３、及びＰＳＭＢ３６５のＶＨ／ＶＬドメインを使用して、二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗体を生成することができる。
【０１０７】
例示的なＴＡＡは、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＴＭＥＦＦ２、及びＩＬ１ＲＡＰである。本明細書に提供される例示的な多重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３、ＣＤ３３×ＣＤ３、ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３、及びＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＴＭＥＦＦ２、又はＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する第２のドメインとを有する。二重特異性ＰＳＭＡ×ＣＤ３分子を遺伝子操作するために使用することができる例示的な抗ＰＳＭＡ抗体は、本明細書に記載されているものであり、これは、表２３に列挙する重鎖及び軽鎖配列を含むがこれらに限定されない重鎖及び軽鎖配列を含み得る。二重特異性ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３分子を遺伝子操作するために使用することができる例示的な抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体は、本明細書に記載されているものであり、これは、表３５に提供される重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むがこれらに限定されない重鎖及び軽鎖可変領域配列を含み得る。二重特異性ＣＤ３３×ＣＤ３分子を遺伝子操作するために使用することができる例示的な抗ＣＤ３３抗体は、本明細書に記載されているものであり、これは、表４３に提供される重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むがこれらに限定されない重鎖及び軽鎖可変領域配列を含み得る。二重特異性ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３分子を遺伝子操作するために使用することができる例示的な抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、本明細書に記載されているものであり、これは、表５９、表６６〜６８に提供される重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むがこれらに限定されない重鎖及び軽鎖可変領域配列を含み得る。
【０１０８】
生成された二重特異性抗体は、ＣＤ３及び／若しくは第２の抗原への結合について、並びに／又は第２の抗原を発現する細胞のＴ細胞媒介性殺傷などの所望の機能特性について試験することができる。
【０１０９】
本明細書に提供される二重特異性抗体は、完全長抗体構造を有する抗体を含む。
【０１１０】
「Ｆａｂアーム」又は「半分子」とは、抗原に特異的に結合する１つの重鎖−軽鎖対を意味する。
【０１１１】
本明細書に記載の完全長二重特異性抗体は、例えば、インビトロにおける無細胞環境において又は共発現を使用してＮのいずれかで異なる特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロダイマーを形成するのに好都合になるように、各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することによって、２つの単一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して生成され得る。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離−会合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少する。親単一特異性抗体のうちの１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離−会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモダイマー化よりヘテロダイマー化に好都合になるように改変されてもよい。得られる生成物は、各々が異なるエピトープ、すなわち、ＣＤ３上のエピトープ及び第２の抗原上のエピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
【０１１２】
「ホモダイマー化」とは、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。「ホモダイマー」とは、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【０１１３】
「ヘテロダイマー化」とは、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。「ヘテロダイマー」とは、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂ−ｉｎ−Ｈｏｌｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、及び静電的一致（Ｃｈｕｇａｉ，Ａｍｇｅｎ，ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｏｎｃｏｍｅｄ）、ＬＵＺ−Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｔｒａｎｄ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）、並びにＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｅｎｍａｂ  Ａ／Ｓ）などの設計を含む。
【０１１５】
Ｔｒｉｏｍａｂ  ｑｕａｄｒｏｍａ技術を使用して、本発明の抗ＣＤ３抗体のＶＨ及びＶＬが組み込まれた完全長二重特異性抗体を生成することができる。Ｔｒｉｏｍａｂ技術は、２つの親キメラ抗体、ＩｇＧ２ａを有する１つの親ｍＡｂと、ラットＩｇＧ２ｂ定常領域を有する第２の親ｍＡｂとの間のＦａｂアーム交換を促進し、キメラ二重特異性抗体をもたらす。
【０１１６】
「ノブ−イン−ホール」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照されたい）を使用して、完全長二重特異性抗体を生成することができる。簡潔に述べると、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロダイマー形成を促進するために、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロダイマーが、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換ペアは、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）。
【０１１７】
ＣｒｏｓｓＭＡｂ技術を使用して、完全長二重特異性抗体を生成することができる。ＣｒｏｓｓＭＡｂは、「ノブ−イン−ホール」戦略を利用してＦａｂアーム交換を促進することに加えて、半アームのうちの１つに、得られる二重特異性抗体の正しい軽鎖対形成を保証するために交換されたＣＨ１及びＣＬドメインを有する（例えば、米国特許第８，２４２，２４７号を参照されたい）。
【０１１８】
他の交差戦略を使用して、一方のアーム又は両方のアームのいずれかにおける、重鎖と軽鎖との間若しくは二重特異性抗体の重鎖内の、可変領域若しくは定常領域、又は両方の領域を交換することによって、完全長二重特異性抗体を生成することができる。これらの交換としては、例えば、国際公開第２００９／０８０２５４号、同第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０１８３８６号、及び同第２００９／０８０２５２号に記載されるＶＨ−ＣＨ１とＶＬ−ＣＬ、ＶＨとＶＬ、ＣＨ３とＣＬ、及びＣＨ３とＣＨ１が挙げられる。
【０１１９】
他の戦略、例えば、あるＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロダイマー化の促進は、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されるように使用することができる。他の戦略では、ヘテロダイマー化は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されるように、下記置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ  Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）により促進されてもよい。
【０１２０】
ＬＵＺ−Ｙ技術を利用して、二重特異性抗体を生成することができる。この技術では、Ｗｒａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７（５２）：４２２２１−９に記載の通り、ロイシンジッパーをＣＨ３ドメインのＣ末端に付加して、精製後に除去される親ｍＡｂからのヘテロダイマーアセンブリを駆動する。
【０１２１】
ＳＥＥＤｂｏｄｙ技術を利用して、二重特異性抗体を生成することができる。ＳＥＥＤｂｏｄｙは、それらの定常ドメインにおいて、米国特許出願公開第２００７／０２８７１７０号に記載されるように、ヘテロダイマー化を促進するためにＩｇＡ残基で置換された選択ＩｇＧ残基を有する。
【０１２２】
本明細書に記載の二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号）に記載の方法に従って、２つの単一特異性ホモダイマー抗体のＣＨ３領域に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下で、２つの親単一特異性ホモダイマー抗体から二重特異性ヘテロダイマー抗体を形成することによって、無細胞環境においてインビトロで生成され得る。この方法では、第１の単一特異性二価抗体（すなわち、第２の抗原に特異的に結合する抗体、例えば、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、抗ＴＭＥＦＦ２、又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体）及び第２の単一特異性二価抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）を、ヘテロダイマーの安定性を促進するＣＨ３ドメインにおける特定の置換を有するように遺伝子操作し；これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるのに十分な還元条件下において共にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、非還元条件に戻される。使用され得る例示的な還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、及びβ−メルカプトエタノールである。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
【０１２３】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体は、抗体のＣＨ３定常ドメインに少なくとも１つの置換を含む。
【０１２４】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、抗体のＣＨ３定常ドメインにおける少なくとも１つの置換は、Ｋ４０９Ｒ、Ｆ４０５Ｌ、又はＦ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換であり、残基の付番はＥＵインデックスに準拠する。
【０１２５】
抗体ドメイン及び付番は、周知である。「非対称」とは、抗体内の２本の別の重鎖の２つのＣＨ３ドメインにおける、同一でない置換を意味する。ＩｇＧ１  ＣＨ３領域は通常、ＩｇＧ１上の残基３４１〜４４６（残基付番はＥＵインデックスに従う）からなる。
【０１２６】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、抗体の第１の重鎖（ＨＣ１）におけるＦ４０５Ｌ置換及び抗体の第２の重鎖（ＨＣ２）におけるＫ４０９Ｒ置換を含む。
【０１２７】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比較して、抗体の第１の重鎖（ＨＣ１）におけるＫ４０９Ｒ置換及び抗体の第２の重鎖（ＨＣ２）におけるＦ４０５Ｌ置換を含む。
【０１２８】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、ＨＣ１におけるＳ２２８Ｐ置換並びにＨＣ２におけるＳ２２８Ｐ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を含む。
【０１２９】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、ＨＣ１におけるＳ２２８Ｐ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換、並びにＨＣ２におけるＳ２２８Ｐ置換を含む。
【０１３０】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、ＨＣ１におけるＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換、並びにＨＣ２におけるＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を含む。
【０１３１】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比較して、ＨＣ１におけるＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換、並びにＨＣ２におけるＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を含む。
【０１３２】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、残基位置３５０、３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、４０７、又は４０９においてＨＣ１及びＨＣ２における少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つの非対称置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに準拠する。
【０１３３】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、残基位置３５０、３７０、４０５、又は４０９においてＨＣ１及びＨＣ２における少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの非対称置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに準拠する。
【０１３４】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、残基位置４０５又は４０９においてＨＣ１及びＨＣ２における少なくとも１つの非対称置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに準拠する。
【０１３５】
置換は、典型的には、標準方法を使用して抗体の定常ドメインなどの分子に対してＤＮＡレベルで行われる。
【０１３６】
本発明の抗体は、様々な周知の抗体形態に改変されてもよい。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、クロスボディである。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体としては、組換えＩｇＧ様二重標的分子（分子の２つの側が各々、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂ断片又はＦａｂ断片の一部を含有する）、ＩｇＧ融合分子（完全長ＩｇＧ抗体が、余分のＦａｂ断片又はＦａｂ断片の一部に融合される）、Ｆｃ融合分子（一本鎖Ｆｖ分子又は安定化された二重特異性抗体が、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、又はその一部に融合される）、Ｆａｂ融合分子（異なるＦａｂ断片が１つに融合される）、ＳｃＦｖ及びディアボディに基づく抗体及び重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）（異なる一本鎖Ｆｖ分子又は異なる二重特異性抗体又は異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が、互いに融合するか、又は別のタンパク質若しくは担体分子に融合する）が挙げられる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、組換えＩｇＧ様二重標的化分子としては、Ｄｕａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）−Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びｍＡｂ２（Ｆ−Ｓｔａｒ）が挙げられる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ融合分子としては、Ｄｕａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ（ＤＶＤ）−Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、並びにＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合分子としては、ＳｃＦｖ／Ｆｃ  Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、及びＤｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ−ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）が挙げられる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ融合二重特異性抗体としては、Ｆ（ａｂ）２（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ−Ａｃｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｂｉｓ−Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ−ａｎｄ−Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）、及びＦａｂ−Ｆｖ（ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ−、ディアボディに基づく抗体及びドメイン抗体としては、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢＩＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、Ｔａｎｄｅｍ  Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｄｉａｂｏｄｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ−ｌｉｋｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＩＴ，ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＳｃＦｖ  Ｆｕｓｉｏｎ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的ナノボディ（dual targeting nanobody）（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的重鎖のみのドメイン抗体（dual targeting heavy chain only domain antibody）が挙げられる。様々なフォーマットの二重特異性抗体が、例えば、Ｃｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｔｙ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｖ  １２：２７６及びＮｕｎｅｚ−Ｐｒａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０（５）：５８８−５９４に記載されている。
【０１４３】
表２は、本発明の二重特異性抗体を生成するために使用することができる、本明細書に記載の例示的なモノクローナル抗体をまとめたものである。
【０１４４】
【表２】
2021524249.tif 000004
【０１４５】
二重特異性ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３分子を遺伝子操作するために使用することができる例示的な抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、本明細書に記載されているものであり、これは、表５９、表６６〜６８に提供される重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むがこれらに限定されない重鎖及び軽鎖可変領域配列を含み得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、多重特異性抗体、例えば、ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、第２の又は標的抗原は、免疫エフェクター細胞以外の標的細胞上で発現する細胞表面抗原である。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＴＡＡである。例示的なＴＡＡは、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＴＭＥＦＦ２、及びＩＬ１ＲＡＰである。
【０１４７】
本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと、第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体を提供する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、第１のドメインは、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、それぞれ配列番号６５７及び６７８のＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、それぞれ配列番号６７５及び６７７のＨＣ及びＬＣを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、第１のドメインは、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、７７３、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、それぞれ配列番号６５７及び６７８のＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、それぞれ配列番号６７５及び６７７のＨＣ及びＬＣを含む。
【０１５０】
本発明は、また、治療において使用するための、本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１５１】
本発明は、また、細胞増殖性障害の治療において使用するための、本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１５２】
本発明は、また、癌の治療において使用するための、本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１５３】
本発明は、また、自己免疫疾患の治療において使用するための、本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１５４】
本発明は、また、癌を治療するための医薬の製造において使用するための、本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１５５】
本発明は、また、自己免疫障害を治療するための医薬の製造において使用するための、本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む、二重特異性抗体を提供する。
【０１５６】
本発明の更なる態様は、それを必要としている対象における細胞増殖性疾患又は自己免疫疾患を治療する方法であって、治療有効量の本発明の抗ＣＤ３抗体を当該対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体、又は本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの投与量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体、又は本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの投与量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体、又は本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体は、約１ｍｇ／ｋｇの投与量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体、又は本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体は、皮下に、静脈内に、筋肉内に、局所的に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植によって、吸入によって、髄腔内に、脳室内に、又は鼻腔内に投与される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体、又は本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体は、皮下投与される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体、又は本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体は、静脈内投与される。
【０１５７】
前述の使用又は方法のいずれかにおいて、細胞増殖性疾患は癌である。いくつかの実施形態では、癌は、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、乳癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、神経膠芽腫、胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、小リンパ性白血病（ＳＬＬ）、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、中枢神経系リンパ腫（ＣＮＳＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、Ｂ細胞性リンパ性白血病、脾臓辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、脾臓リンパ腫／白血病・分類不能型、脾臓びまん性赤色髄小細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病変異体、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織の節外性辺縁帯リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯リンパ腫、小児節性辺縁帯リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＣＮＳの原発性ＤＬＢＣＬ、原発性皮膚ＤＬＢＣＬ・下肢型、高齢者のＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、慢性炎症に関連するＤＬＢＣＬ、リンパ腫様肉芽腫症、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病において生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫：びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫との中間の特徴を有する分類不能Ｂ細胞リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫、及び軽鎖アミロイドーシスからなる群から選択される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、癌は、食道癌である。いくつかの実施形態では、癌は、腺癌、例えば、転移性腺癌（例えば、結腸直腸腺癌、胃腺癌、又は膵臓腺癌）である。
【０１５９】
前述の使用又は方法のいずれかにおいて、自己免疫障害は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫班症（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少紫斑症（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発ニューロパシー、重症筋無力症、血管炎、真性糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、糸球体腎炎、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、及びＩｇＧニューロパシーからなる群から選択され得る。
【０１６０】
別の態様では、本発明は、（ａ）本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン及び第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインを含む、前述の抗ＣＤ３抗体又は二重特異性抗体のいずれか１つを含む組成物と、（ｂ）細胞増殖性障害を治療又は進行を遅延させるために対象に当該組成物を投与するための指示書を含む添付文書と、を含むキットを特徴とする。用語「添付文書」は、このような治療用製品の適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌、及び／又は使用に関する警告に関する情報を含む、治療用製品の市販のパッケージに通常的に含まれている指示書を指すために使用される。
【０１６１】
前述の使用又は方法のいずれかにおいて、対象はヒトであってよい。
【０１６２】
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
また、本発明の抗ＣＤ３抗体、又は本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメインと第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインとを含む二重特異性抗体をコードしている、単離ポリヌクレオチドも開示される。本明細書で提供される可変ドメインをコード可能な単離ポリヌクレオチドは、本発明の抗体又は抗原結合断片を産生するために同一の又は異なるベクターに含まれ得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、リーダー配列をコードしているポリヌクレオチドを含む。当技術分野において既知の任意のリーダー配列を利用することができる。リーダー配列をコードしているポリヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位又は翻訳開始部位を含み得る。
【０１６４】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。ベクターは、発現ベクターであり得る。発現ベクターは、１つ以上の追加配列を含有してもよい。この追加配列には、例えば、制御配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）、選択マーカー、及びポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。広い各種の宿主細胞を形質転換するためのベクターは公知であり、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、並びに、他の細菌、酵母、及びウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
本明細書の範囲内にある組換え発現ベクターは、好適な制御エレメントに操作可能に連結することができる少なくとも１つの組換えタンパク質をコードしている合成又はｃＤＮＡ由来の核酸断片を含む。このような調節エレメントとしては、転写プロモータ、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクター、特に、哺乳類の発現ベクターはまた、１つ以上の非転写エレメント、例えば、複製の起点、発現される遺伝子に連結された好適なプロモータ及びエンハンサー、他の５’又は３’フランキング非転写配列、５’又は３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、又は転写終了配列を含んでもよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた包含されてもよい。
【０１６６】
脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳制御配列は、ウイルス資源により提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，３  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）に記載されたように構築されてもよい。Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントのコード配列は、強力な構成的プロモータ、例えば、下記遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン等のためのプロモータの制御下に置かれる。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で恒常的に機能し、記載された実施形態での使用に適している。このようなウイルスプロモータとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＰＳＭＡ特異性抗体又はその抗原結合断片のコード配列は、誘導性プロモータ、例えば、メタロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、ドキシサイクリン誘導性プロモータ、１つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）、例えば、プロテインキナーゼＲ２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素、Ｍｘ遺伝子、ＡＤＡＲ１などを含有するプロモータの制御下に置かれる。
【０１６８】
本明細書に記載されたベクターは、１つ以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列の融合ベクター内への包含は、一部のタンパク質の発現を増強させるのに有益であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含むこととなる。この部位は、前述の核酸配列のうちのいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターの成分は、近接して連結されてもよく、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（すなわち、ＯＲＦ間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよく、若しくは別の方法で位置付けられてもよい。調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフはまた、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
【０１６９】
ベクターは、当技術分野において既知の選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーとしては、陽性及び陰性選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子（例えば、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、テトラサイクリン抵抗性遺伝子、ペニシリン抵抗性遺伝子）、グルタミン酸合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ−ＴＫ、ＨＳＶ−ＴＫ誘導体、又は６−メチルプリン選択用の細菌のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（Ｇａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，７  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７３８−１７４３（２０００））が挙げられる。（余白）選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
【０１７０】
本明細書に記載されたベクターを使用して、記載された抗体又は抗原結合フラグメントをコードする遺伝子により種々の細胞を形質転換することができる。例えば、ベクターは、抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、抗ＴＭＥＦＦ２、若しくは抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、又は抗原結合断片を産生する細胞を生成するために使用され得る。したがって、本発明は、本発明のベクターを含む、宿主細胞も提供する。
【０１７１】
外来遺伝子を細胞内に導入するための数多くの手法が、当技術分野において既知であり、本明細書に記載され例示された種々の実施形態に従って、記載された方法を行う目的で組換え細胞を作成するのに使用することができる。使用される手法は、異種遺伝子配列が細胞の子孫により遺伝及び発現可能であり、かつレシピエント細胞に必須の成育及び生理学的機能を損なうことのないよう、異種遺伝子配列を宿主細胞に安定して導入するものである必要がある。使用することができる手法としては、染色体導入法（例えば、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロ細胞媒介性遺伝子導入）、物理的方法（例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム担体）、ウイルスベクター導入（例えば、組換えＤＮＡウイルス、組換えＲＮＡウイルス）等が挙げられる（Ｃｌｉｎｅ，２９  Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６９−９２（１９８５）に記載）が、これらに限定されない。Ｔｈｅｒ．６９−９２（１９８５））。哺乳類細胞による細菌プロトプラストのリン酸カルシウム沈殿及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導融合を使用してもまた、細胞を形質転換することができる。
【０１７２】
本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片の発現に使用するのに好適な細胞は、好ましくは、真核細胞、より好ましくは、植物、げっ歯類、又はヒト起源の細胞であり、例えば、特にＮＳＯ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ｐｅｒＣ．６、Ｔｋ−ｔｓ１３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７、Ｔ９８Ｇ、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＳ１、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞、及びＢＨＫ細胞株であるが、これらに限定されない。加えて、抗体の発現は、ハイブリドーマ細胞を使用して達成されてもよい。ハイブリドーマを生成するための方法は、当該技術分野において十分確立されている。
【０１７３】
本発明の発現ベクターで形質転換された細胞を、本発明の抗体又は抗原結合断片の組換え発現について選択又はスクリーニングしてよい。組換え陽性細胞は、タンパク質改変又は変化させた翻訳後修飾により、所望の表現型、例えば、高レベルの発現、向上した増殖特性、又は所望の生化学的特性を有するタンパク質を生成する能力を示すサブクローンについて、増殖され、スクリーニングされる。これらの表現型は、所与のサブクローンの本来の特性又は変異によるものであり得る。変異は、化学薬品、ＵＶ波長光、照射、ウイルス、挿入変異源、ＤＮＡミスマッチ修復の阻害、又はこのような方法の組み合わせにより生じ得る。
【０１７４】
医薬組成物／投与
本発明は、本発明の抗体と、薬学的に許容できる担体と、を含む、医薬組成物も提供する。治療用途では、本発明の抗体は、薬学的に許容できる担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」は、本発明の抗体と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いてよい。これらの溶液は滅菌され、概して粒子状物質を含まない。これらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容できる補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有し得る。このような医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ６９１−１０９２に記載されており、特にｐｐ．９５８−９８９を参照されたい。
【０１７５】
本発明の抗体を治療的に使用するための投与方法は、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、ゲル、粒子の、注射器、埋め込み式装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに入れられた製剤を使用する非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下、肺内、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）投与；又は当該技術分野において周知の、当業者によって認識される他の手段であり得る。部位特異的投与は、例えば、腫瘍内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、腟内、直腸内、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。
【０１７６】
本発明の抗体は、任意の好適な経路によって、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注入若しくはボーラス注射によって非経口的に、筋肉内に、又は皮下に、又は腹腔内に、対象に投与してよい。ｉ．ｖ．注入は、例えば、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０若しくは２４０分間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２時間にわたって投与され得る。
【０１７７】
対象に与えられる用量は、治療される疾患を緩和するか又は少なくとも部分的に停止させるのに十分（「治療有効量」）であり、時には、０．００５ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０５ｍｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、若しくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、又は約４ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、若しくは約２４ｍｇ／ｋｇ、又は、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｍｇ／ｋｇであってよいが、更により高い量、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０１７８】
例えば、５０、１００、２００、５００、若しくは１０００ｍｇの一定の単位用量を与えてもよく、又は用量は、患者の表面積に基づいて、例えば、５００、４００、３００、２５０、２００、若しくは１００ｍｇ／ｍ２であってもよい。通常、１〜８用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８）が患者を治療するために投与されるが、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれよりも多い用量を与えてもよい。
【０１７９】
本発明の抗体の投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月後に、又はそれ以上後に繰り返すことができる。治療過程を繰り返してもよく、長期にわたる投与も同様に可能である。繰り返し投与は、同一用量であっても異なる用量であってもよい。例えば、本明細書に記載される本発明の抗体は、静脈内注入によって、８週間にわたって１週間間隔で８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与し、続いて、更に１６週間にわたって２週間ごとに８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与し、続いて、４週間ごとに８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与してよい。
【０１８０】
例えば、本明細書に記載の方法における抗体は、単回投与、又は２４、１２、８、６、４若しくは２時間ごとの分割投与、又はこれらの任意の組み合わせを使用して、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日あたり０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇの量の１日投薬量として、治療開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０日目のうちの少なくとも１日に、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週目のうちの少なくとも１週に、あるいはこれらの任意の組み合わせで提供され得る。
【０１８１】
また、本明細書に記載の方法における抗体は、癌の発現リスクを低下させる、癌の進行における事象の発生の開始を遅延させる、及び／又は癌が寛解したときの再発リスクを低下させるために予防的に投与されてもよい。
【０１８２】
本明細書に提供される抗体を、保存のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体で再構成してもよい。この技術は、従来のタンパク質調製物に関して効果的であることが示されており、周知の凍結乾燥及び再構成技術を用いることができる。
【０１８３】
ＣＤ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＭＥＦＦ２、又は標的抗原及びＣＤ３を検出する方法
サンプル中のＣＤ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＴＭＥＦＦ２、又はＩＬ１ＲＡＰを検出する方法であって、サンプルを得ることと、当該サンプルを本発明の抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、抗ＴＭＥＦＦ２、又は抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体と接触させることと、当該サンプル中のＣＤ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＴＭＥＦＦ２、又はＩＬ１ＲＡＰに結合した抗体を検出することと、を含む、方法が本明細書に提供される。
【０１８４】
更に、サンプル中のＣＤ３及び第２の抗原（例えば、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＴＭＥＦＦ２、又はＩＬ１ＲＡＰ）を検出する方法であって、サンプルを得ることと、当該サンプルを、ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン及び第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインを含む二重特異性抗体と接触させることと、当該サンプル中のＣＤ３及び当該第２の抗原に結合した抗体を検出することと、を含む、方法が提供される。
【０１８５】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科的に切除された腫瘍組織、穿刺吸引を含む生検）、組織学的調製物などに由来していてよい。
【０１８６】
本発明の抗体は、既知の方法を使用して検出することができる。例示的な方法としては、蛍光若しくは化学発光標識、又は放射線標識を使用して抗体を直接標識すること、あるいは本発明の抗体に、ビオチン、酵素、又はエピトープタグなどの容易に検出可能な部分を結合させることが挙げられる。例示的な標識及び部分は、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びベータガラクトシダーゼ、ポリ−ヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料である。
【０１８７】
本明細書で提供される抗体は、サンプル中のＣＤ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＭＥＦＦ２、又はＣＤ３、及び第２の抗原を検出するために、様々なアッセイで使用することができる。例示的なアッセイは、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、又はＥＬＩＳＡアッセイである。
【０１８８】
抗体キット
本発明はまた、抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、抗ＴＭＥＦＦ２、若しくは抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、又は本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン及び第２の抗原若しくはその抗原結合断片に特異的に結合する第２のドメインを含む二重特異性抗体、又はこれらの抗原結合断片のうちの１つ以上を含む、キットも提供する。記載されるキットは、抗ＣＤ３、抗ＰＳＭＡ、抗ＣＤ３３、抗ＴＭＥＦＦ２、若しくは抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体、又は本発明のＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン及び第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインを含む二重特異性抗体を使用する方法、あるいは当業者に公知の他の方法を実行するために使用することができる。いくつかの実施形態では、記載されるキットは、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片と、生体サンプル中のＣＤ３、又はＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＭＥＦＦ２などの第２の抗原の存在の検出において使用するための試薬とを含んでいてよい。したがって、記載されるキットは、本明細書に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、及び使用していないときに抗体若しくは断片を収容しておくための容器、抗体若しくは断片の使用説明書、固体支持体に固定された抗体若しくは断片、及び／又は本明細書に記載の抗体若しくは断片の検出可能に標識された形態のうちの１つ以上を含んでいてよい。
【０１８９】
本発明は、また、ＰＳＭＡに特異的に結合する本明細書に記載の抗体を含む、キットも提供する。本発明は、また、ＣＤ３３に特異的に結合する本明細書に記載の抗体を含む、キットも提供する。本発明は、また、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する本明細書に記載の抗体を含む、キットも提供する。本発明は、また、ＴＭＥＦＦ２に特異的に結合する本明細書に記載の抗体を含む、キットも提供する。
【０１９０】
キットは、治療的使用のために、及び診断キットとして使用することができる。
【０１９１】
キットは、生体サンプル中のＣＤ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＭＥＦＦ２、及び／又は第２の抗原の存在を検出するために使用され得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の本発明の抗体と、当該抗体を検出するための試薬とを含む。キットは、使用説明書；他の試薬、例えば、標識、治療薬、又はキレート化若しくは別の方法のカップリングに有用な剤、標識若しくは治療薬に対する抗体、又は放射線防護組成物；投与するために当該抗体を調製するための装置又は他の材料；薬学的に許容できる担体、及び対象に投与するためのデバイス又は他の材料を含む、１つ以上の他の構成要素を含み得る。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、キットは、容器内の本発明の抗体と、キットの使用説明書とを含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、キットにおける抗体は標識されている。
【０１９５】
ＣＤ３特異性抗体
単離抗ＣＤ３抗体が本明細書に記載される。本発明の抗ＣＤ３抗体は、ヒトＣＤ３及び任意選択でカニクイザルＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体及びその断片は、互いの５倍以内の親和性でヒト及びカニクイザルＣＤ３に結合する。換言すれば、抗体結合の差は、５倍未満である。この場合、本発明の抗ＣＤ３抗体は、霊長類におけるＣＤ３の安全性、活性、及び／又は薬物動態プロファイルの前臨床評価のため、並びに、ヒトにおいて薬物として使用することができる。換言すれば、同じＣＤ３特異性分子を、前臨床動物試験並びにヒトにおける臨床試験において使用することができる。このヒト／カニクイザル交差反応性は、種特異的な代替分子と比較して高度に同等の結果及び動物試験の予測力の大きな増大をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体及びその断片は、ＣＤ３ｅ／ｄサブユニットによって形成されるエピトープに結合する。ＣＤ３特異性抗体は、ヒトであっても、ヒト化されていても、又はキメラであってもよい。また、ＯｍｎｉＲａｔ（Ｏｐｅｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（「ＯＭＴ」）、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ，ｏｍｎｉａｂ．ｃｏｍ）で生成されたヒト抗体も本明細書に例示される。
【０１９６】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体又はその断片は、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを有する：
ａ）２０ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でヒト及びカニクイザルのＣＤ３＋Ｔリンパ球に結合し、４０ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でカニクイザルＣＤ３発現ＨＥＫ細胞に結合し、ＣＤ３＋Ｔリンパ球への結合とカニクイザルＣＤ３発現ＨＥＫ細胞への結合との間の計算ＥＣ５０の差は５倍未満であり、計算ＥＣ５０は、フローサイトメトリーを使用して０℃で全細胞結合アッセイで測定される；
ｂ）１２ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でヒト由来の組換えＣＤ３ｄ（配列番号６９１）に結合、又はヒト由来の組換えＣＤ３ｅ（配列番号６３６）に結合、又はカニクイザル由来の組換えＣＤ３ｅ（配列番号６９３）に結合し、ＫＤは、＋２５℃でＰｒｏｔｅｏｎ表面プラズモン共鳴アッセイＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを使用して測定される；
ｃ）ペプチドマッピング分析により検出したとき、メチオニンの酸化もトリプトファンの酸化も示さない、又はアスパラギンの脱アミドを示さない、又はアスパラギンの異性化を示さない；
ｄ）Ｘ線結晶解析により決定したとき、ＣＤ３ｅの残基１〜６に結合する；又は
ｅ）蛍光活性化細胞選別アッセイによって決定したとき、ｃＯＫＴ３又はＳＰ３４−２と同様の程度まで、Ｔ細胞を活性化するか又はＣＤ６９発現を誘導する。
【０１９７】
本発明の抗ＣＤ３抗体及びその断片は、フローサイトメトリーによって決定したとき、約５ｎＭ〜約１０００ｎＭ、好ましくは約５ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３００ｎＭ〜約４００ｎＭ、約４００ｎＭ〜約５００ｎＭ、約５００ｎＭ〜約６００ｎＭ、約６００ｎＭ〜約７００ｎＭ、約７００ｎＭ〜約８００ｎＭ、約８００ｎＭ〜約９００ｎＭ、及び約９００ｎＭ〜約１０００ｎＭ、より好ましくは約５ｎＭ〜約３００ｎＭである、ヒトＣＤ３を発現しているヒトＴ細胞に対するインビトロ結合親和性（Ｋｄ）を有する。
【０１９８】
いくつかの態様では、本発明の抗ＣＤ３抗体及びその断片は、フローサイトメトリーによって決定したとき、約５ｎＭ〜約１０００ｎＭ、好ましくは約５ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３００ｎＭ〜約４００ｎＭ、約４００ｎＭ〜約５００ｎＭ、約５００ｎＭ〜約６００ｎＭ、約６００ｎＭ〜約７００ｎＭ、約７００ｎＭ〜約８００ｎＭ、約８００ｎＭ〜約９００ｎＭ、及び約９００ｎＭ〜約１０００ｎＭ、より好ましくは約５ｎＭ〜約３００ｎＭ、最も好ましくは約１００ｎＭである、ヒトＣＤ３を発現しているヒトＴ細胞に対するインビトロ結合親和性（Ｋｄ）を有する二価抗体である。
【０１９９】
いくつかの態様では、本発明の抗ＣＤ３抗体及びその断片は、フローサイトメトリーによって決定したとき、約５ｎＭ〜約１０００ｎＭ、好ましくは約５ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３００ｎＭ〜約４００ｎＭ、約４００ｎＭ〜約５００ｎＭ、約５００ｎＭ〜約６００ｎＭ、約６００ｎＭ〜約７００ｎＭ、約７００ｎＭ〜約８００ｎＭ、約８００ｎＭ〜約９００ｎＭ、及び約９００ｎＭ〜約１０００ｎＭ、より好ましくは約１００ｎＭ〜約２５０ｎＭ、最も好ましくは約２５０ｎＭである、ヒトＣＤ３を発現しているヒトＴ細胞に対するインビトロ結合親和性（Ｋｄ）を有する一価コンストラクトである。
【０２００】
一態様では、本明細書に記載の抗ＣＤ３抗体及びその断片は、フローサイトメトリーを使用して測定された初代ヒトＴ細胞に対してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲートＳＰ３４−２抗体を使用する競合結合アッセイによって決定したとき、ＣＤ３の結合について市販のＣＤ３抗体ＳＰ３４−２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５１９１６）と競合する。
【０２０１】
一態様では、抗ＣＤ３抗体及びその断片は、ペプチドマッピングによって決定したとき、翻訳後修飾を示さず、例えば、酸化を示さず、脱アミドを示さず、及びアスパラギン酸の異性化を示さない。
【０２０２】
一態様では、抗ＣＤ３抗体及びその断片は、フローサイトメトリーを用いたＴ細胞ベースのアッセイによって決定したとき、ヒト及びカニクイザルＴ細胞におけるＳＰ３４−２並びにヒトＴ細胞におけるｃＯＫＴ３と同様の程度までＴ細胞を活性化し、ＣＤ６９発現を誘導するのに効果的である。
【０２０３】
一態様では、本明細書に記載の抗ＣＤ３抗体及びその断片は、約４００ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約４１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約４２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約４３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約４４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約４５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約４６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約４７０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約４８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約４９０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約５００ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約５１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約５２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約５３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、約５４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上、又は約５５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上のアンフォールディングの全エンタルピーを有する。特定の態様では、本発明の抗ＣＤ３抗体及びその断片は、約４１８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、５４５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約４０２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は約４０６ｋｃａｌ／ｍｏｌのアンフォールディングの全エンタルピーを有し、抗ＣＤ３抗体は、それぞれ、ＣＤ３Ｂ３７６（ＩｇＧ４  ＰＡＡ）、ＣＤ３Ｂ４５０（ＩｇＧ４  ＰＡＡ）、ＣＤ３Ｂ３８９（ＩｇＧ１σ）、及びＣＤ３Ｂ４６７（ＩｇＧ１σ）分子である。
【０２０４】
例示的なこのような抗体としては、ＣＤ３Ｂ３１１、ＣＤ３Ｂ３１２、ＣＤ３Ｂ３１３、ＣＤ３Ｂ３１４、ＣＤ３Ｂ３１５、ＣＤ３Ｂ３１６、ＣＤ３Ｂ３１７、ＣＤ３Ｂ３３４、ＣＤ３Ｂ３７６、ＣＤ３Ｂ３８９、ＣＤ３Ｂ４５０、並びに一価フォーマットに遺伝子操作されたＣＤ３Ｂ４６７及びＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０が挙げられる。
【０２０５】
本発明の抗ＣＤ３抗体又は抗原結合断片は、様々な形態で存在することができるが、表７Ａに示されている抗体可変ドメインセグメント又はＣＤＲ、及びその遺伝子操作された変異体、例えば、表９及び表１０、並びにそれに付随する説明に示されているか又は記載されているもののうちの１つ以上を含む。
【０２０６】
本発明は、また、表７Ｂに記載の抗体のいずれか１つのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖を含む、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。本発明は、また、表７Ｂに記載の抗体のいずれか１つのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖と、表７Ｂに記載の抗体のいずれか１つのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含む、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、表７Ｂに記載の抗体のいずれか１つのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖と、表７Ｂに記載の抗体のいずれか１つのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含む抗体又はその抗原結合断片と、ＣＤ３に対する結合について競合する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６８７、又は６５６の重鎖可変領域（ＶＨ）に含有されているＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、当該ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３は、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ、又はＩＭＧＴによって定義される。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６５８、６５９、６９４、６６０、６８８、又は６６１の軽鎖可変領域（ＶＬ）に含有されているＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ、又はＩＭＧＴによって定義される。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、以下を含む：
配列番号６６２、６６５、又は６６６のＨＣＤＲ１；
配列番号６６３、６８９、又は６９５のＨＣＤＲ２；
配列番号６６４のＨＣＤＲ３。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、以下を含む：
配列番号７７３、７１０、６７４又は６７１のＬＣＤＲ１；
配列番号６６９又は６７３のＬＣＤＲ２；
配列番号６７０のＬＣＤＲ３。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、以下を含む：
配列番号６６２、６６５、又は６６６のＨＣＤＲ１；
配列番号６６３、６８９、又は６９５のＨＣＤＲ２；
配列番号６６４のＨＣＤＲ３；
配列番号７７３、７１０、６７４又は６７１のＬＣＤＲ１；
配列番号６６９又は６７３のＬＣＤＲ２；
配列番号６７０のＬＣＤＲ３。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む：
それぞれ、配列番号６６２、６６３、及び６６４；
それぞれ、配列番号６６２、６９５、及び６６４；
それぞれ、配列番号６６５、６６３、及び６６４；
それぞれ、配列番号６６５、６９５、及び６６４；
それぞれ、配列番号６６２、６８９、及び６６４；
それぞれ、配列番号６６６、６６３、及び６６４；
それぞれ、配列番号６６６、６９５、及び６６４；
それぞれ、配列番号６６５、６８９、及び６６４；又は
それぞれ、配列番号６６６、６８９、及び６６４。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、以下のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む：
それぞれ、配列番号７７３、６６９、及び６７０；
それぞれ、配列番号７７３、６７３、及び６７０；
それぞれ、配列番号７１０、６７３、及び６７０；
それぞれ、配列番号６７４、６７３、及び６７０；
それぞれ、配列番号６７１、６７３、及び６９０；
それぞれ、配列番号７７３、６７３、及び６９０；
それぞれ、配列番号６７１、６６９、及び６７０；又は
それぞれ、配列番号７７６、６７３、及び６７０。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、７７３、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、７７３、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６９５、６６４、７７３、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６９５、６６４、７７３、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６９５、６６４、６７１、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６９５、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６５、６６３、６６４、７７３、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６５、６６３、６６４、７７３、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６５、６６３、６６４、６７１、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６５、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６５、６９５、６６４、７７３、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６５、６９５、６６４、７７３、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６５、６９５、６６４、７７６、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６５、６９５、６６４、７７６、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６６、６６３、６６４、７７３、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６６、６６３、６６４、７７３、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６６、６６３、６６４、７７６、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６６、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６６、６９５、６６４、７７３、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６６、６９５、６６４、７７３、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６６、６９５、６６４、６７１、６６９、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６６、６９５、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６８９、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、７１０、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、７７３、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合断片の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７０９、６４０、６４１、６４２、６４３、６７５、若しくは６４４の重鎖（ＨＣ）配列、及び／又は配列番号６４５、７１６、６４９、６７６、６７７、若しくは６５０の軽鎖（ＬＣ）配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合断片の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７０９、６４０、６４１、６４２、６４３、６７５、又は６４４と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有するＨＣ、及び配列番号６４５、７１６、６４９、６７６、６７７、又は６５０と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有するＬＣを含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合断片の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７０９、６４０、６４１、６４２、６４３、６７５、又は６４４と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有するＨＣ、及び配列番号６４５、７１６、６４９、６７６、６７７、又は６５０と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有するＬＣを含み、ＣＤＲ領域に配列の変動は存在しない。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合断片の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６５１、６５２、６５７、６５３、６５４、６５５、６８７、若しくは６５６の重鎖可変領域（ＶＨ）配列、及び／又は配列番号６５８、６５９、６９４、６６０、６８８、６７８、若しくは６６１の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合断片の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６５１、６５２、６５７、６５３、６５４、６５５、６８７、又は６５６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号６５８、６５９、６９４、６６０、６８８、６７８、又は６６１と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有するＶＬを含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合断片の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６５１、６５２、６５７、６５３、６５４、６５５、６８７、又は６５６と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号６５８、６５９、６９４、６６０、６８８、６７８、又は６６１と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のポリペプチド配列を有するＶＬを含み、ＣＤＲ領域に配列の変動は存在しない。
【０２４４】
ＰＳＭＡ特異性抗体
ＰＳＭＡに結合する抗体及びその断片は、チンパンジー標的抗原に結合する。一実施形態では、抗体及びその断片は、互いの５倍以内の親和性でヒト及びマカクＰＳＭＡ標的抗原に結合する。換言すれば、抗体結合の差は、５倍未満である。この場合、同一抗体分子は、霊長類におけるＰＳＭＡの安全性、活性、及び／又は薬物動態プロファイルの前臨床評価のため、並びに、ヒトにおいて薬物として使用することができる。換言すれば、同じＰＳＭＡ特異性分子を、前臨床動物試験並びにヒトにおける臨床試験において使用することができる。これは、種特異的な代替分子と比較して高度に同等の結果及び動物試験の予測力の大きな増大をもたらす。ＰＳＭＡドメインは、種間特異的、すなわち、ヒト及びマカク抗原と反応性であるため、本発明の抗体又はその断片は、霊長類におけるこれらの結合ドメインの安全性、活性、及び／又は薬物動態プロファイルの前臨床評価のため、そして、同一形態で、ヒトにおいて薬物として使用することができる。
【０２４５】
本発明は、また、ＰＳＭＡに特異的に結合する多重特異性抗体を提供する。本発明によれば、二重特異性、すなわち二機能性抗体を使用して、２つの異なる治療標的を会合させるか、又は２つの異なる機能を発揮させることができる。このような抗体を使用して、免疫エフェクター細胞、例えばＴ−又はＮＫ−細胞を特定の標的細胞に向かって動員することができる。様々な抗体断片に基づく分子は、公知であり、例えば癌治療のために研究中である。
【０２４６】
本発明は、また、ＰＳＭＡ×「エフェクター抗原」二重特異性抗体も提供する。一実施形態では、ＰＳＭＡ×「エフェクター抗原」二重特異性抗体のエフェクター抗原は、ＣＤ３である。同一分子を、前臨床動物試験、並びに臨床試験、更にはヒトにおける治療において使用することができる、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を生成することが可能であることが本発明で見出された。これは、それぞれヒトＰＳＭＡ及びヒトＣＤ３への結合に加えて、チンパンジー及びマカクの抗原のホモログにも結合する、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の同定による。本発明のＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、癌を含むがこれらに限定されない様々な疾患に対する治療剤として使用することができる。上記に鑑みて、系統学的に（ヒトから）遠い種において試験するための代替標的ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を構築する必要がなくなる。結果として、同一分子を、臨床試験においてヒトに投与することを意図しているような動物の前臨床試験において使用することができることに加えて、続いての市場承認及び治療薬の投与で使用することもできる。
【０２４７】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＰＳＭＡに特異的に結合する単離抗体又はその抗体断片は、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを有する：
ａ．２５ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でチンパンジーＰＳＭＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合し、ＫＤは、＋２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを使用して測定される、
ｂ．２０ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でＬＮＣａＰ細胞に結合し、４０ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でカニクイザルＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞に結合し、ＬＮＣａＰ細胞への結合とカニクイザルＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞への結合との間の計算ＥＣ５０の差は５倍未満であり、計算ＥＣ５０は、フローサイトメトリーを使用して０℃で全細胞結合アッセイにおいて測定される、
ｃ．１２ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でヒト（配列番号５５）、チンパンジー（配列番号５２）、及びカニクイザル（配列番号５３）由来の組換えＰＳＭＡ  ＥＣＤに結合し、ＫＤは、＋２５℃でＰｒｏｔｅｏｎ表面プラズモン共鳴アッセイＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを使用して測定される、
ｄ．抗ＣＤ３抗体と二重特異性抗体において対になったときに、ＬＮＣａＰ細胞、Ｃ４２細胞、ヒトＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞、若しくはカニクイザルＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞のＴ細胞媒介性殺傷を示し、当該Ｔ細胞媒介性殺傷は、クロム−５１若しくはカスパーゼ３／７活性化アッセイによって測定される、又は
ｅ．配座エピトープを認識し、当該エピトープは、ヒトＰＳＭＡ（配列番号５１）の残基Ｉ１３８、Ｆ２３５、Ｐ２３７、Ｇ２３８、Ｄ２４４、Ｙ２９９、Ｙ３００、Ｑ３０３、Ｋ３０４、Ｅ３０７、及びＫ３２４−Ｐ３２６で構成される
【０２４８】
例示的なこのような抗体又はその断片は、本明細書に記載のＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１１９、ＰＳＭＢ１２０、ＰＳＭＢ１２１、ＰＳＭＢ１２２、ＰＳＭＢ１２３、ＰＳＭＢ８７、ＰＳＭＢ１２６、ＰＳＭＢ１２７、ＰＳＭＢ１２８、ＰＳＭＢ１２９、ＰＳＭＢ１３０、ＰＳＭＢ１２０、ＰＳＭＢ１２１、ＰＳＭＢ１２２、ＰＳＭＢ１２３、ＰＳＭＢ１２７、ＰＳＭＢ１２８、ＰＳＭＢ１３０、ＰＳＭＢ３４４、ＰＳＭＢ３４５、ＰＳＭＢ３４６、ＰＳＭＢ３４７、ＰＳＭＢ３４９、ＰＳＭＢ３５８、ＰＳＭＢ３５９、ＰＳＭＢ３６０、ＰＳＭＢ３６１、ＰＳＭＢ３６２、ＰＳＭＢ３６３、及びＰＳＭＢ３６５である。
【０２４９】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号５６、５７、５８、５９、６０、及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２５０】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号６２、６３、６４、６５、６０、及び６６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２５１】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号６７、６８、６９、７０、７１、及び７２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２５２】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７３、７４、７５、７６、６０、及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２５３】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、７９、８０、８１、８２、及び８３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２５４】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号８４、８５、８６、８７、６０、及び８８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２５５】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号８９、９０、９１、９２、９３、及び９４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２５６】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号９５、９６、９７、６５、６０、及び６６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２５７】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号８４、９８、９９、１００、８２、及び１０１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２５８】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号８９、９０、１０２、１０３、１０４、及び１０５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２５９】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号８９、９０、１０６、１０３、１０４、及び１０５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２６０】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号１０７、１０８、１０９、７６、６０、及び８８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２６１】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、１、８０、８１、８２、及び８３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２６２】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、１、８０、８１、８２、及び８３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２６３】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、１、８０、４、８２、及び６８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２６４】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、１、８０、８１、７９２、及び６８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２６５】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、２、８０、８１、８２、及び８３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２６６】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、３、８０、８１、８２、及び５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２６７】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、３、８０、８１、８２、及び８３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２６８】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、３、８０、４、８２、及び６８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２６９】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、３、８０、８１、７９２、及び６８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２７０】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、２、８１、８１、８２、及び５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２７１】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、２、８０、４、７９２、及び６８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２７２】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、２、８０、４、７９２、及び６８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２７３】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、それぞれ配列番号７８、６８３、８０、８１、７９２、及び６８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
【０２７４】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、配列番号６、７、８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２１、１２３、１２５、１２６、１２８、１３０、又は６８１の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、配列番号９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２２、１２４、１２７、１２９、１３１、又は６８２の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２７５】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、配列番号１２、１３、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４１、１４３、１４５、１４６、１４８、１５０、１５１、又は６７９の重鎖配列を含む。
【０２７６】
本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＰＳＭＡに特異的に結合する抗体は、配列場号１４、１５、７５、１３３、１３５、１３７、１３９、１４２、１４４、１４７、１４９、又は６８０の軽鎖配列を含む。
【０２７７】
ＣＤ３３特異性抗体
本発明のＣＤ３３特異性抗体は、ＣＤ３３及び／又はＣＤ３に対する高親和性結合、ＣＤ３３及び／又はＣＤ３に対する高い特異性、並びに単独で又は他の抗癌療法と組み合わせて投与されたときに癌を治療又は予防する能力を含むがこれらに限定されない、１つ以上の望ましい機能特性を有する。
【０２７８】
特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ３３のＣ２ドメインに結合する。特定の実施形態では、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ３３のＶドメインに結合する。完全長ヒトＣＤ３３は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２０１３８（配列番号２４４）によって提供される。
【０２７９】
本明細書で使用するとき、「ＣＤ３３に特異的に結合する」抗体とは、ＣＤ３３、好ましくはヒトＣＤ３３、好ましくはＣＤ３３のＣ２ドメインに対し、１×１０−７Ｍ以下、好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０−９Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、又は１×１０−１０Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を指す。
【０２８０】
本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片は、様々な形態で存在し得るが、表３９及び４０に示される抗体ＣＤＲのうちの１つ以上を含む。
【０２８１】
ＣＤ３３に特異的に結合する組換え抗体及び抗原結合断片が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３特異性抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ又はその誘導体である。本明細書に例示されるＣＤ３３特異性抗体又は抗原結合断片は、ヒトであるが、例示される抗体又は抗原結合断片は、キメラ化されていてもよい。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、表３９に記載の抗体のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖を含む、ＣＤ３３特異性抗体又はその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態では、表３９に記載の抗体のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖と、表４０に記載の抗体のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含む、ＣＤ３３特異性抗体又はその抗原結合断片が提供される。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、表３８に示される重鎖可変領域を含むＣＤ３３特異性抗体又はその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態では、表３８に示される軽鎖可変領域を含むＣＤ３３特異性抗体又はその抗原結合断片が提供される。
【０２８４】
この項で論じられ、表３８に示される抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、二重特異性コンストラクトに含めるのに好適である。例えば、ＣＤ３３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、エフェクターアームはＣＤ３アームである。ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含む。ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含む。
【０２８５】
ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、７７３、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６５７及び６７８のＶＨ及びＶＬを含む。ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６７５及び６７７のＨＣ及びＬＣを含む含む。
【０２８６】
特定の実施形態では、抗ＣＤ３３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２６７、２６０、２７５、２７０、２６２、２５８、２５７、２８１、２９２、２９１、２６１、２６９、２８０、２５９、２６３、２６４、２６５、２６６、２７２、２７７、２７９、２８４、若しくは２８５と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号２８７、３１４、３０９、３０１、２９８、２９７、２９０、３３２、３３１、３０２、３１０、３２０、３００、３０４、３０５、３０６、３０７、３１７、３１９、３２４、若しくは３２５と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含み、当該抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号２５７若しくは２５８と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号２９８若しくは２９９と少なくとも９５％同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【０２８７】
ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体
本明細書で使用するとき、用語「インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質」、「ＩＬ１ＲＡＰ」、及び「ＩＬ１−ＲＡＰ」は、具体的には、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ８４０５９、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００２１７３．１、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ９ＮＰＨ３−１に記載されているような、ヒトＩＬ１ＲＡＰタンパク質（配列番号５７６）を含む（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４（２４），１２８２９−１２８３２も参照）。ＩＬ１ＲＡＰはまた、科学文献においてＩＬ１  Ｒ３、Ｃ３ｏｒｆ１３、ＦＬＪ３７７８８、ＩＬ−１  ＲＡｃＰ及びＥＧ３５５６としても知られている。
【０２８８】
本明細書に記載された抗体又は抗原結合断片は、様々な形態で存在し得るが、表２９に示される抗体ＣＤＲのうちの１つ以上を含む。
【０２８９】
本明細書において、ＩＬ１ＲＡＰに特異的に結合する、組換え抗体及び抗原結合フラグメントが記載されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ又はその誘導体である。本明細書に例示されるＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又は抗原結合断片は、ヒトであるが、例示される抗体又は抗原結合断片は、キメラ化されていてもよい。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、表２９に記載の抗体のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖を含む、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態では、表２９に記載の抗体のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖と、表２９に記載の抗体のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含む、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合断片が提供される。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、表３０に示される抗体のいずれか１つの重鎖可変領域を含む、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態では、表３０に示される抗体のいずれか１つの軽鎖可変領域を含む、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態では、表３０に示される抗体のいずれか１つの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、ＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体又はその抗原結合断片が提供される。
【０２９２】
この項で論じられ、表３０に示される抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、標的アームが抗ＩＬ１ＲＡＰアームである二重特異性コンストラクトに含めるのに好適である。例えば、ＩＬ１ＲＡＰ二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、エフェクターアームはＣＤ３アームである。ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含む。ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含む。
【０２９３】
ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、７７３、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６５７及び６７８のＶＨ及びＶＬを含む。ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３アームは、それぞれ配列番号６７５及び６７７のＨＣ及びＬＣを含む。
【０２９４】
ＴＭＥＦＦ２特異性抗体
本発明は、ＴＭＥＦＦ２の配列番号６２９の膜近位領域に結合する、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、細胞によって内部移行しない。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、内部移行しない抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、内部移行する抗ＴＭＥＦＦ２抗体と比較したとき、ＴＭＥＦＦ２の内部移行及び分解の欠如から生じる抗体エフェクター機能によって媒介される発癌作用が改善されていると予想することができる。
【０２９５】
「膜近位領域に結合する」とは、水素／重水素交換（Ｈ／Ｄ交換）を用いて同定された抗体エピトープ残基の９０％が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域内に存在することを意味する。エピトープ残基は、Ｈ／Ｄ交換による重水素化レベルの少なくとも５％の差によって、試験抗体により保護されるものである。例示的なこのような抗体は、本明細書に記載のＴＭＥＢ６７５、ＴＭＥＢ５７０、ＴＭＥＢ６７４、ＴＭＥＢ５６５、ＴＭＥＢ７６２、及びＴＭＥＢ７５７である。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５９２）又はＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号６００）内でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する。残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５９２）内で結合する例示的な抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ＴＭＥＢ５７０である。残基ＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号６００）内で結合する例示的な抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ＴＭＥＢ６７５である。ＴＮＥＢ６７５変異体ＴＭＥＢ７６２及びＴＭＥＢ７５７も、残基ＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号６００）内でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合すると予想される。
【０２９７】
Ｈ／Ｄ交換アッセイでは、組換え的に発現させたＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤを、抗体の存在又は非存在下、重水素化水中で所定の時間にわたってインキュベートし、その結果、抗体によって保護されていない交換可能な水素原子での重水素が組み込まれ、続いて、タンパク質のプロテアーゼ消化及びＬＣ−ＭＳを使用するペプチド断片の分析を行う。Ｈ／Ｄ交換アッセイは、公知のプロトコルを使用して行うことができる。例示的なプロトコルを実施例５に記載する。
【０２９８】
本発明は、また、配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号５８９のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、配列番号５８９のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、配列番号６０４のＶＨ及び配列番号６０７のＶＬ、又は配列番号６１２のＶＨ及び配列番号６１３のＶＬを含む参照抗体と、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合について競合する、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２９９】
ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への試験抗体の結合についての参照抗体との競合は、周知の方法を用いてインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識抗体の存在下におけるＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏタグ（商標）ＮＨＳ−エステル標識試験抗体の、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合は、ＥＬＩＳＡ法によって評価することができるか、又はＢｉａｃｏｒｅ分析法若しくはフローサイトメトリーを用いて競合を実証することもできる。試験抗体がＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への参照抗体の結合を８５％以上、例えば、９０％以上、又は９５％以上阻害するとき、試験抗体はＴＭＥＦＦ２への結合に関して参照抗体と競合している。
【０３００】
本発明は、また、以下の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する：
それぞれ、配列番号５８２、５８４、５８７、１８、５８８、及び２２、
それぞれ、配列番号５８３、５８５、１６、１９、２１、及び２３、
それぞれ、配列番号５８２、５８６、１７、１８、５８８、及び２４、
それぞれ、配列番号５８３、５８５、１６、１８、５８８、及び２２、又は
それぞれ、配列番号５８２、５８４、５８７、１８、５８８、及び６０３。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、本発明の単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、約０．４×１０−９Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合し、ＫＤは、室温においてｐＨ４．５〜５．０の酢酸バッファ中で表面プラズモン共鳴を使用して測定される。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、約０．１×１０−１０Ｍ〜約０．４×１０−９ＭのＫＤでＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する。
【０３０３】
ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に対する抗体の親和性は、任意の好適な方法を用いて実験により決定することができる。例示的な方法は、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００又はＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ、若しくは当業者に既知の競合的結合アッセイを利用する。抗体のＴＭＥＦＦ２に対する親和性の測定値は、異なる条件（例えば、オスモル濃度、ｐＨ）下で測定した場合に異なり得る。したがって、親和性及び他の結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、典型的には、標準化された条件及び本明細書に記載のバッファなどの標準化されたバッファを用いて行われる。例えばＢｉａｃｏｒｅ  ３０００又はＰｒｏｔｅＯｎを使用した親和性測定での内部エラー（標準偏差（ＳＤ）として測定されるもの）は典型的に、典型的な検出範囲内で測定した場合、５〜３３％の範囲内であり得ることが当業者には分かるであろう。したがって、「約」という用語は、ＫＤ値に言及する場合、アッセイにおける典型的な標準偏差を反映する。例えば、ＫＤが１×１０−９Ｍの場合の典型的なＳＤは、最大±０．３３×１０−９Ｍである。
【０３０４】
本発明は、また、ＶＨ３＿３−２３（配列番号５３）又はＶＨ１＿１−６９（配列番号５４）に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）フレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３０５】
本発明は、また、ＶＫＩ＿Ｌ１１（配列番号５５）又はＶＫＩＩＩＩ＿Ａ２７（配列番号５９１）に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）フレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３０６】
本発明は、また、それぞれ配列番号５３のＶＨ３＿３−２３又は配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１に由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３０７】
本発明は、また、それぞれ配列番号５４のＶＨ１＿１−６９及び配列番号５９１のＶＫＩＩＩ＿Ａ２７に由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３０８】
本発明は、また、それぞれ配列番号５４のＶＨ１＿１−６９及び配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１に由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３０９】
特定のフレームワーク又は生殖系列配列「に由来する」重鎖又は軽鎖可変領域を含む抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から、例えば、本明細書で論じるトランスジェニックマウス、ラット、若しくはニワトリ、又はファージディスプレイライブラリなどから得られる抗体を指す。生殖細胞系列配列に由来する特定のフレームワークを含有する抗体は、例えば自然発生する体細胞変異又は意図的な置換が原因で、その由来となった配列と比較したときにアミノ酸の違いを含み得る。
【０３１０】
本発明は、また、それぞれ配列番号５８２、５８４、５８７、１８、５８８、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のポリヌクレオチドによってコードされており、ＶＬは、配列番号４２のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３２のＨＣ及び配列番号３５のＬＣを含む。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４６のポリヌクレオチドによってコードされており、ＶＬは、配列番号４９のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３１５】
本発明は、また、それぞれ配列番号５８３、５８５、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５８９のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０のポリヌクレオチドによってコードされており、ＶＬは、配列番号４３のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３３のＨＣ及び配列番号３６のＬＣを含む。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４７のポリヌクレオチドによってコードされており、ＬＣは、配列番号５０のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３２０】
本発明は、また、それぞれ配列番号５８２、５８６、１７、１８、５８８、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４１のポリヌクレオチドによってコードされており、ＶＬは、配列番号４４のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３４のＨＣ及び配列番号３７のＬＣを含む。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４８のポリヌクレオチドによってコードされており、ＬＣは、配列番号５１のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３２５】
本発明は、また、それぞれ配列番号５８３、５８５、１６、１８、５８８、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５８９のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含む。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０のポリヌクレオチドによってコードされており、ＶＬは、配列番号４５のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３３のＨＣ及び配列番号３８のＬＣを含む。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４７のポリヌクレオチドによってコードされており、ＬＣは、配列番号５９０のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３３０】
本発明は、また、それぞれ配列番号５８２、５８４、５８７、１８、５８８、及び６０３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６０４のＶＨ及び配列番号６０７のＶＬを含む。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号６１８のポリヌクレオチドによってコードされており、ＶＬは、配列番号６１９のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６１４のＨＣ及び配列番号６１５のＬＣを含む。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号６２０のポリヌクレオチドによってコードされており、ＬＣは、配列番号６２１のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３３５】
本発明は、また、それぞれ配列番号５８２、５８４、５８７、１８、５８８、及び６０３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６１２のＶＨ及び配列番号６１３のＶＬを含む。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号６２２のポリヌクレオチドによってコードされており、ＶＬは、配列番号６２３のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６１６のＨＣ及び配列番号６１７のＬＣを含む。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号６２４のポリヌクレオチドによってコードされており、ＬＣは、配列番号６２５のポリヌクレオチドによってコードされている。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、多重特異性抗体である。
【０３４１】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性抗体である。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、Ｔ細胞抗原に結合する。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ３に結合する。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、単離抗ＴＭＥＦＦ２二重特異性抗体又はその抗原−結合断片は、ＣＤ３εに結合する。
【０３４５】
本発明の例示的な抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＶＨ、ＶＬ、ＨＣＤＲ、ＬＣＤＲ、ＨＣ、及びＬＣ配列を、表６０〜６７に示す。
【０３４６】
実施例で説明する実施形態は、一方が重鎖に由来し、一方が軽鎖に由来する可変ドメインの対を含むが、当業者であれば、代替的な実施形態が単一の重鎖又は軽鎖可変ドメインを含み得ることを認識するであろう。単一の可変ドメインを用いて、ＴＭＥＦＦ２に結合することができる２ドメイン特異性抗原結合断片を形成することができる可変ドメインについてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、国際公開第１９９２／０１０４７号に開示されている階層的二重コンビナトリアルアプローチ（hierarchical dual combinatorial approach）を用いたファージディスプレイスクリーニング法によって行うことができる。このアプローチでは、ＶＨ鎖又はＶＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて、他方の鎖（ＶＬ又はＶＨ）をコードしているクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた二本鎖特異性抗原結合ドメインを公知の方法及び本明細書に記載されるものを用いてファージディスプレイ技術に従って選択する。したがって、個別のＶＨ及びＶＬポリペプチド鎖は、国際公開第１９９２／０１０４７号に開示されている方法を用いて、追加の抗ＴＭＥＦＦ２抗体を同定するのに有用である。
【０３４７】
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体
本発明は、また、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメイン及びＣＤ３に結合する第２のドメインを含む、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、抗体が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供する。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する二重特異性抗体は、腫瘍細胞のＴ細胞媒介性殺傷の媒介においてより効率的であり得る。
【０３４８】
本発明は、また、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメイン及びＣＤ３に結合する第２のドメインを含む単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、抗体が、配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号５８９のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、配列番号５８９のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、配列番号６０４のＶＨ及び配列番号６０７のＶＬ、又は配列番号６１２のＶＨ及び配列番号６１３のＶＬを含む参照抗体と、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合について競合する、単離二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３４９】
いくつかの実施形態では、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、約０．４×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合し、ＫＤは、室温においてｐＨ４．５〜５．０の酢酸バッファ中で表面プラズモン共鳴を使用して測定される。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、約０．１×１０−１０Ｍ〜約０．４×１０−９ＭのＫＤでＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する。
【０３５１】
本発明は、また、第１のドメインが、以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する：
それぞれ、配列番号５８２、５８４、５８７、１８、５８８、及び２２、
それぞれ、配列番号５８３、５８５、１６、１９、２１、及び２３、
それぞれ、配列番号５８２、５８６、１７、１８、５８８、及び２４、ｏ
それぞれ、配列番号５８３、５８５、１６、１８、５８８、及び２２、又は
それぞれ、配列番号５８２、５８４、５８７、１８、５８８、及び６０３。
【０３５２】
本発明は、また、第２のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３５３】
本発明は、また、第１のドメインが、以下を含む、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する：
配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
配列番号５８９のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
配列番号５８９のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
配列番号６０４のＶＨ及び配列番号６０７のＶＬ、又は
配列番号６１２のＶＨ及び配列番号６１３のＶＬ。
【０３５４】
本発明は、また、第２のドメインが、以下を含む、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する：
配列番号６５２のＶＨ及び配列番号６６１のＶＬ。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、第２のドメインは、配列番号６５７のＶＨ及び配列番号６５８のＶＬを含む。
【０３５６】
本発明は、また、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメイン及びＣＤ３に結合する第２のドメインを含む、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
当該第１のドメインが、それぞれ配列番号５８２、５８４、５８７、１８、５８８、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む；
当該第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５２のＶＨ及び配列番号６６１のＶＬを含む；
当該第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５７のＶＨ及び配列番号６７８のＶＬを含む；
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号３２のＨＣ１、配列番号３５のＬＣ１、配列番号６４０のＨＣ２、及び配列番号６７６のＬＣ２を含む；並びに／又は
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号３２のＨＣ１、配列番号３５のＬＣ１、配列番号６７５のＨＣ２、及び配列番号６７７のＬＣ２を含む、単離二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３５７】
本発明は、また、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメイン及びＣＤ３に結合する第２のドメインを含む、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
当該第１のドメインが、それぞれ配列番号５８３、５８５、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む；
当該第１のドメインが、配列番号５８９のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５２のＶＨ及び配列番号６６１のＶＬを含む；
当該第１のドメインが、配列番号５８９のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５７のＶＨ及び配列番号６７８のＶＬを含む；並びに／又は
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号６４０のＨＣ２、及び配列番号６７６のＬＣ２を含む；
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号６７５のＨＣ２、及び配列番号６７７のＬＣ２を含む、単離二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３５８】
本発明は、また、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメイン及びＣＤ３に結合する第２のドメインを含む、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
当該第１のドメインが、それぞれ配列番号５８２、５８６、１７、１８、５８８、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む；
当該第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５２のＶＨ及び配列番号６６１のＶＬを含む；
当該第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５７のＶＨ及び配列番号６７８のＶＬを含む；並びに／又は
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号６４０のＨＣ２、及び配列番号６７６のＬＣ２を含む；
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号６７５のＨＣ２、及び配列番号６７７のＬＣ２を含む、単離二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３５９】
本発明は、また、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメイン及びＣＤ３に結合する第２のドメインを含む、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
当該第１のドメインが、それぞれ配列番号５８３、５８５、１６、１８、５８８、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む；
当該第１のドメインが、配列番号５８９のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５２のＶＨ及び配列番号６６１のＶＬを含む；
当該第１のドメインが、配列番号５８９のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５７のＶＨ及び配列番号６７８のＶＬを含む；並びに／又は
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号６４０のＨＣ２、及び配列番号６７６のＬＣ２を含む；
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号６７５のＨＣ２、及び配列番号６７７のＬＣ２を含む、単離二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６０】
本発明は、また、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメイン及びＣＤ３に結合する第２のドメインを含む、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
当該第１のドメインが、それぞれ配列番号５８２、５８４、５８７、１８、５８８、及び６０３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む；
当該第１のドメインが、配列番号６０４のＶＨ及び配列番号６０７のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５２のＶＨ及び配列番号６６１のＶＬを含む；
当該第１のドメインが、配列番号６０４のＶＨ及び配列番号６０７のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５７のＶＨ及び配列番号６７８のＶＬを含む；並びに／又は
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号６１４のＨＣ１、配列番号６１５のＬＣ１、配列番号６４０のＨＣ２、及び配列番号６７６のＬＣ２を含む；
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号６１４のＨＣ１、配列番号６１５のＬＣ１、配列番号６７５のＨＣ２、及び配列番号６７７のＬＣ２を含む、単離二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６１】
本発明は、また、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメイン及びＣＤ３に結合する第２のドメインを含む、単離二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
当該第１のドメインが、それぞれ配列番号５８２、５８４、５８７、１８、５８８、及び６０３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む；
当該第１のドメインが、配列番号６１２のＶＨ及び配列番号６１３のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５２のＶＨ及び配列番号６６１のＶＬを含む；
当該第１のドメインが、配列番号６１２のＶＨ及び配列番号６１３のＶＬを含み、当該第２のドメインが、配列番号６５７のＶＨ及び配列番号６７８のＶＬを含む；並びに／又は
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号６１６のＨＣ１、配列番号６１７のＬＣ１、配列番号６４０のＨＣ２、及び配列番号６７６のＬＣ２を含む；
当該二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号６１６のＨＣ１、配列番号６１７のＬＣ１、配列番号６７５のＨＣ２、及び配列番号６７７のＬＣ２を含む、単離二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６２】
実施形態：
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
１．単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）配列番号６６２を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号６６３を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号６６４を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖、並びに配列番号６７１を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号６７３を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６９０を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖；
ｂ）配列番号６５２を含む重鎖可変領域及び配列番号６６１を含む軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号６４０を含む重鎖、及び配列番号６７６を含む軽鎖；
ｄ）配列番号６６２を含むＨＣＤＲ１、配列番号６６３を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号６６４を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖、並びに配列番号７７３を含むＬＣＤＲ１、配列番号６７３を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６９０を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖；
ｅ）配列番号６５７を含む重鎖可変領域及び配列番号６７８を含む軽鎖可変領域；あるいは
ｆ）配列番号６７５を含む重鎖及び配列番号６７８を含む軽鎖を含む、単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
２．約３００ｎＭ以下の結合親和性でカニクイザル（Macaca fascicularis）又はヒトのＣＤ３ｄ、又はＣＤ３ｅ、又はＣＤ３ｅ及びＣＤ３ｄに特異的に結合する、単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
３．当該結合親和性が約１００ｎＭ以下である、実施形態２に記載の単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
４．当該結合親和性が、フローサイトメトリー又は＋２５℃におけるＰｒｏｔｅｏｎ表面プラズモン共鳴アッセイＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムによって測定される、実施形態２又は３に記載の単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
５．以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、又は４つを有する、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の単離組換え抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片：
ａ）３００ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でヒト及びカニクイザルのＣＤ３＋Ｔリンパ球に結合し、３００ｎＭ以下の計算ＥＣ５０でカニクイザルＣＤ３発現ＨＥＫ細胞に結合し、ＣＤ３＋Ｔリンパ球への結合とカニクイザルＣＤ３発現ＨＥＫ細胞への結合との間の計算ＥＣ５０の差は５倍未満であり、計算ＥＣ５０は、フローサイトメトリーを使用して０℃で全細胞結合アッセイで測定される；
ｂ）３００ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でヒト由来の組換えＣＤ３ｄ（配列番号６９１）に結合、又はヒト由来の組換えＣＤ３ｅ（配列番号６３６）に結合、又はカニクイザル由来の組換えＣＤ３ｄ（配列番号６９２）に結合、又はカニクイザル由来の組換えＣＤ３ｅ（配列番号６９３）に結合し、ＫＤは、＋２５℃でＰｒｏｔｅｏｎ表面プラズモン共鳴アッセイＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システムを使用して測定される；
ｃ）Ｘ線結晶解析により決定したとき、ＣＤ３ｅの残基１〜６に結合する；又は
ｄ）蛍光活性化細胞選別アッセイによって決定したとき、ｃＯＫＴ３又はＳＰ３４−２と同様の程度まで、Ｔ細胞を活性化するか又はＣＤ６９発現を誘導する。
６．抗体定常ドメインに少なくとも１つの置換を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片であって、当該少なくとも１つの置換が、
ａ）重鎖置換Ｋ４０９Ｒ、Ｆ４０５Ｌ、又はＦ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋを含む、
ｂ）重鎖置換Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａを含む、
ｃ）重鎖置換Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含み、当該抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプである、又は
ｄ）重鎖置換Ｓ２２８Ｐを含み、当該抗体が、ＩｇＧ４アイソタイプであり、
残基の付番がＥＵインデックスに準拠する、抗体又はその抗原結合断片。
７．それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
８．それぞれ配列番号６５２及び６６１の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
９．それぞれ配列番号６４０及び６７６の重鎖配列（ＨＣ）及び軽鎖配列（ＬＣ）を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
１０．それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、７７３、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
１１．それぞれ配列番号６５７及び６７８のＶＨ及びＶＬを含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
１２．それぞれ配列番号６７５及び６７７のＨＣ及びＬＣを含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
１３．それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、抗体又はその抗原結合断片。
１４．それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含む、抗体又はその抗原結合断片。
１５．それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含む、抗体又はその抗原結合断片。
１６．それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、７７３、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、抗体又はその抗原結合断片。
１７．それぞれ配列番号６５７及び６７８のＶＨ及びＶＬを含む、抗体又はその抗原結合断片。
１８．それぞれ配列番号６７５及び６７７のＨＣ及びＬＣを含む、抗体又はその抗原結合断片。
１９．当該抗体が、ヒトである又はヒト化されている、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合断片。
２０．当該抗体が、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１アイソタイプである、実施形態１９に記載の抗体。
２１．当該抗体のＦｃに１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の置換を含む、実施形態２０に記載の抗体。
２２．実施形態１８に記載の抗体であって、
ａ）Ｄ４３Ｇ、Ｌ４９Ｍ、Ｌ５０Ｉ、Ｓ６２Ｎ、Ｑ８５Ｅの軽鎖置換、
ｂ）Ｄ４３Ｇ、Ｖ４８Ｌ、Ｌ４９Ｍ、Ｌ５０Ｉ、Ｓ６２Ｎ、Ｑ８５Ｅ、Ｈ８９Ｙの軽鎖置換、
ｃ）Ｒ１０Ｇ、Ｒ１３Ｋ、Ｖ７３Ｉ、Ｒ７０Ｋ、Ｔ８３Ｓ、Ｌ９６Ｖの重鎖置換、
ｄ）軽鎖置換Ｄ４３Ｇ、Ｖ４８Ｌ、Ｌ４９Ｍ、Ｌ５０Ｉ、Ｓ６２Ｎ、Ｑ８５Ｅ、又はＨ８９Ｙのいずれか１つ、又は
ｅ）重鎖置換Ｒ１０Ｇ、Ｒ１３Ｋ、Ｖ７３Ｉ、Ｒ７９Ｋ、Ｔ８３Ｓ、又はＬ９６Ｖのいずれか１つ、
を含み、
軽鎖置換の残基付番は、配列番号６６１に準拠し、重鎖置換については、配列番号６５２に準拠する、抗体。
２３．当該抗体が、二重特異性又は多重特異性である、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の抗体。
２４．ＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン及び第２の抗原に特異的に結合する第２のドメインを含む二重特異性抗体であって、当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、二重特異性抗体。
２５．当該第１のドメイン及び第２のドメインがＩｇＧ４アイソタイプであり、当該第１又は第２のドメインが、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋの重鎖置換を含み、当該第１又は第２のドメインの他方のドメインが、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの重鎖置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う、実施形態２４に記載の二重特異性抗体。
２６．当該第１及び／又は第２のドメインが、Ｆ４０５Ｌ、又はＦ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換を含む、ＣＨ３定常ドメインにおける少なくとも１つの置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに準拠する、実施形態２４に記載の二重特異性抗体。
２７．当該第１又は第２のドメインの一方が、Ｆ４０５Ｌの重鎖置換を含み、当該第１又は第２のドメインの他方が、Ｋ４０９Ｒの重鎖置換を含み、残基の付番がＥＵインデックスに準拠する、実施形態２４に記載の二重特異性抗体。
２８．当該第１のドメイン及び第２のドメインが、ＩｇＧ４アイソタイプであり、当該第１又は第２のドメインの一方が、Ｓ２２８Ｐの重鎖置換を含み、当該第１又は第２のドメインの他方が、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋの重鎖置換を含み、残基の付番がＥＵインデックスに準拠する、実施形態２４に記載の二重特異性抗体。
２９．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含む、請求項２４に記載の二重特異性抗体。
３０．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含む、請求項２４に記載の二重特異性抗体。
３１．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６５７及び６７８のＶＨ及びＶＬを含む、請求項２４に記載の二重特異性抗体。
３２．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６７５及び６７７のＨＣ及びＬＣを含む、請求項２４に記載の二重特異性抗体。
３３．当該第２の抗原が、免疫エフェクター細胞以外の標的細胞上で発現する細胞表面抗原である、請求項２４に記載の二重特異性抗体。
３４．当該細胞表面抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項３３に記載の二重特異性抗体。
３５．当該第２の抗原が、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＰＳＭＡ、又はＴＭＥＦＦ２である、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
３６．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号７８、６８３、８０、８１、７９２、及び６８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態３５に記載の二重特異性抗体。
３７．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号６８１及び６８２のＶＨ及びＶＬを含む、実施形態３３に記載の二重特異性抗体。
３８．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号６７９及び６８０のＨＣ及びＬＣを含む、実施形態３３に記載の二重特異性抗体。
３９．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号７８、３、８０、８１、７９２、及び６８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態３３に記載の二重特異性抗体。
４０．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号８及び６８２のＶＨ及びＶＬを含む、実施形態３３に記載の二重特異性抗体。（余白）。
４１．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号１３及び６８０のＨＣ及びＬＣを含む、実施形態３３に記載の二重特異性抗体。
４２．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号７８、７９、８０、８１、８２、及び８３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態３３に記載の二重特異性抗体。
４３．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号１１６及び１１７のＶＨ及びＶＬを含む、実施形態３３に記載の二重特異性抗体。
４４．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６４０及び６７６のＨＣ及びＬＣを含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号１３８及び１３９のＨＣ及びＬＣを含む、実施形態３３に記載の二重特異性抗体。
４５．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、及び１６９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態３１に記載の二重特異性抗体。
４６．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号２１５及び２１６のＶＨ及びＶＬを含む、実施形態３１に記載の二重特異性抗体。
４７．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号３４９、３９０、３４１、４７１、５１３、及び５５５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態３１に記載の二重特異性抗体。
４８．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号２６７及び３０６のＶＨ及びＶＬを含む、実施形態３１に記載の二重特異性抗体。
４９．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６６２、６６３、６６４、６７１、６７３、及び６７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号３６３、４０４、４４５、４８５、５２７、及び５６９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態３１に記載の二重特異性抗体。
５０．当該第１のドメインが、それぞれ配列番号６５２及び６６１のＶＨ及びＶＬを含み、当該第２のドメインが、それぞれ配列番号２８１及び３２０のＶＨ及びＶＬを含む、実施形態３１に記載の二重特異性抗体。
５１．実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物。
５２．実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の抗体をコードしている、ポリヌクレオチド。
５３．実施形態５２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
５４．実施形態５３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
５５．実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の抗体を産生する方法であって、当該抗体が発現する条件で実施形態５２に記載の宿主細胞を培養することと、当該宿主細胞によって産生された当該抗体を回収することと、を含む、方法。
５６．対象における癌を治療する方法であって、当該癌を治療するのに十分な時間にわたって、それを必要としている当該対象に、治療有効量の実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の単離抗体を投与することを含む、方法。
５７．当該癌が、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である、実施形態５６に記載の方法。
５８．当該固形腫瘍が、前立腺癌、結腸直腸癌、胃癌、腎明細胞癌、膀胱癌、肺癌、扁平上皮癌、神経膠腫、乳癌、腎臓癌、血管新生障害、腎明細胞癌（ＣＣＲＣＣ）、膵臓癌、腎癌、尿路上皮癌、又は肝臓腺癌である、実施形態５７に記載の方法。
５９．当該前立腺癌が、難治性前立腺癌、前立腺上皮内腫瘍、アンドロゲン非依存性前立腺癌、又は悪性前立腺癌である、実施形態５８に記載の方法。
６０．当該血液悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＤＰＤＣＮ）である、実施形態５７に記載の方法。
６１．当該抗体が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、実施形態５６〜６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．治療において使用するための、実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の抗体。
６３．実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の抗体に結合する抗イディオタイプ抗体。
【実施例】
【０３６３】
１  抗ＣＤ３ｍＡｂのデノボ生成及び機能特性評価
１−１  ＣＤ３モノクローナル抗体を生成するためのＣＤ３抗原によるＯｍｎｉＲａｔｓ（登録商標）の免疫化
ＯｍｎｉＲａｔｓ（登録商標）を、ヒトＣＤ３ｅ及びヒトＣＤ３ｄ；カニクイザルＣＤ３ｅ及びカニクイザルＣＤ３ｄをコードしている特許品ベクター（Ａｌｄｅｖｒｏｎ，Ｆａｒｇｏ，Ｎｏｒｔｈ  Ｄａｋｏｔａ，ＵＳＡ）で免疫化した。動物を、ヒト及びカニクイザルＤＮＡで交互にブーストした。６回目の適用から、動物に同じインサートを有する最適化されたベクターを投与した。リンパ節由来の細胞を、Ａｇ８骨髄腫細胞株と融合させた。融合ＢＬＷ由来の細胞４０００万個を、ＩｇＭ枯渇後、３枚の９６ウェルプレートに置いた。融合ＢＬＸ由来の細胞１３３００万個を、ＩｇＭを枯渇させていない、９枚の９６ウェルプレートに置いた。
【０３６４】
ａ）スクリーニングベクター：ｐＯＰＴ−ＣＤ３ｅ−ｈｕｍ−ｅｐｓｉｌｏｎ−ＴＣＥ．ＯＭＴ＋ｐＯＰＴ−ＣＤ３ｄ−ｈｕｍ−ｄｅｌｔａ．ＯＭＴ、１：１（ｐＯＰＴ−ＣＤ３ｅ／ｄ−ｈｕｍ−ｍｉｘ）、及びｐｃＤＮＡ３．１−ＣＤ３ｅ−ｃｙｎ−ｄｅｌｔａ＋ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＤ３ｄ−ｃｙｎ−ｄｅｌｔａ、１：１（ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＤ３ｅ／ｄ−ｃｙｎ−ｍｉｘ）にクローニングしたヒト及びカニクイザルｃＤＮＡを一過的にトランスフェクトした細胞で、細胞ベースのＥＬＩＳＡ（ＣＥＬＩＳＡ）により、融合ＢＬＷ（リンパ球の磁気ビーズ枯渇あり）及びＢＬＸ（リンパ球の磁気ビーズ枯渇なし）からのハイブリドーマ上清を分析した。ヒト及びカニクイザルｃＤＮＡ配列（及び対応するアミノ酸配列）を表４に提供する。ＣＥＬＩＳＡ陰性対照については、トランスフェクトされていない哺乳類細胞をハイブリドーマ上清と共にインキュベートし、二次Ｂｅｔｈｙｌ抗体で検出した。ＣＥＬＩＳＡトランスフェクション対照については、上記のコンストラクトでトランスフェクトした哺乳類細胞を、抗タグ抗体で検出した。
【０３６５】
ハイブリドーマ上清を、ＣＤ３陽性及びＣＤ３陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞：Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ３＋（Ｅ６−１）及びＪｕｒｋａｔ  ＣＤ３−（Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５）においてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により更に分析した。ＦＡＣＳ陰性対照については、ＣＤ３陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５）を希釈バッファと共にインキュベートし、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ抗ラットＩｇＨＲＰ及びＢｅｔｈｙｌ抗ラットＩｇＧ１、２ａ、２ｂ、２ｃ−ＨＲＰ二次抗体で検出した。
【０３６６】
一過的にトランスフェクトされた細胞に提示されたヒト及びカニクイザルＣＤ３ｅ／ｄ複合体について、又はヒトＣＤ３ｅ／ｄ複合体の場合、Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ３＋（Ｅ６−１）細胞において、融合ＢＬＷ及び融合ＢＬＸ由来のハイブリドーマのハイブリドーマ上清中の抗体の特異性は、一過的にトランスフェクトされた細胞に対するＣＥＬＩＳＡによって、並びにＪｕｒｋａｔ細胞株に対してＦＡＣＳで試験した場合に証明された（表３）。陰性対照として機能する実験サンプル中のいずれのサンプルについても有意なシグナルは検出されなかった。
【０３６７】
【表３】
2021524249.tif 000005
【０３６８】
【表４】
2021524249.tif 000006
【０３６９】
１−２  クローニング抗ＣＤ３抗体
ＯｍｎｉＲａｔｓ（ＯＭＴ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で抗ヒトＣＤ３抗体を生成した。これらのクローンの可変領域（「Ｖ領域」）配列をゲノム配列から抽出し、解析した。得られた全ての配列は、ヒトＩｇＧ重鎖又はλ軽鎖のいずれかであり、配列、特にＬＣが高い相同性を示した。配列を生殖細胞系列にアラインメントすると、フレームワークにおいていくつかの変異が示された（図１）。Ｖ領域ＤＮＡ配列を合成し、哺乳類発現ベクターに、重鎖配列をヒトＩｇＧ１ベクターに、軽鎖配列をヒトλベクターにクローニングした。配列を表６及び７に示す。７つのｍＡｂにタンパク質識別子を割り当てた（表５Ａ）。
【０３７０】
ＣＤ３Ｂ３１２を最も代表的なクローンとして選択し、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を有し、表５Ｂに示すようにタンパク質識別子を割り当てた、ヒトＩｇＧ１σ及びＩｇＧ４ＰＡＡに、重鎖配列をクローニングした。これらを使用して二重特異性抗体を生成し、細胞傷害を通してＴ細胞リダイレクション機能を実証した。
【０３７１】
【表５】
2021524249.tif 000007
【０３７２】
【表６】
2021524249.tif 000008
【０３７３】
【表７−１】
2021524249.tif 000009
【０３７４】
【表７−２】
2021524249.tif 000010
【０３７５】
【表７−３】
2021524249.tif 000011
【０３７６】
【表８】
2021524249.tif 000012
【０３７７】
【表９】
2021524249.tif 000013
【０３７８】
１−３  ヒト及びカニクイザル精製Ｔ細胞への結合についてのハイブリドーマのスクリーニング
ヒト（図２）及びカニクイザル（図３）の精製ＣＤ３＋Ｔリンパ球に対する個々のラットハイブリドーマ上清の結合能力を評価するために、細胞ベースの結合アッセイを設計した。Ｔ細胞を計数し、１×１０＾６細胞／ｍＬに希釈し、０．５μＬ／ｍＬのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌ−２３０１）と共にインキュベートした。次に、細胞を、１００μＬ／ウェル（１×１０＾５細胞／ウェル）でＵ底（Ｆａｌｃｏｎ  ３５３０７７）プレートに分注した。プレートを３００ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去した。プレートを短時間ボルテックスして、細胞を再懸濁させた。ハイブリドーマ上清をＦＡＣＳ染色バッファ（ＢＳＡ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５４６５７）で４．５μｇ／ｍＬに希釈し、次いで、最低濃度が０．００６μｇ／ｍＬになるように１：３希釈度で６回連続希釈した。マウス抗ヒトＣＤ３の陽性対照（ＳＰ３４−２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５１９１６）及び陰性アイソタイプ対照（マウスＩｇＧ１  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５６６４８）も４．５μｇ／ｍＬに希釈した。５０μＬの各サンプルをＴ細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。細胞を、染色バッファで１回洗浄し、二次ＡＦ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ２１２３５）又はＡＦ６４７ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ２１２４７）を、適切な種（ハイブリドーマサンプルについては抗ラット、対照抗体については抗マウス）に従って、５０μＬ中１０μｇ／ｍＬで添加した。プレートを４℃で４５分間インキュベートし、染色バッファで２回洗浄した。細胞を、２５μＬのランニングバッファ（染色バッファ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９２６０Ｇ）＋０．１％プルロニックＦ−６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２４０４０−０３２））に再懸濁させ、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔシステム（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  Ｃｏｒｐ．）で読み取った。結果を図２及び３に示す。
【０３７９】
他の実験では、精製ヒトＴ細胞を、Ｕ底プレートに１．１×１０＾５細胞／ウェルでプレーティングした。プレートを３００ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去した。プレートを短時間ボルテックスして、細胞を再懸濁させた。ハイブリドーマ上清をＦＡＣＳ染色バッファ（ＢＳＡ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５４６５７）で３０μｇ／ｍＬに希釈し、次いで、最低濃度が０．０００１７μｇ／ｍＬになるように１：３希釈度で１１回連続希釈した。５０μＬの各サンプルをＴ細胞に添加し、４Ｃで１時間インキュベートした。細胞を染色バッファで１回洗浄し、二次Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６５０ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ１１０−２３９Ｄ５）を５０μＬ中１０μｇ／ｍＬで添加した。プレートを４Ｃで１時間インキュベートし、染色バッファで２回洗浄した。細胞を３０μＬのＦＡＣＳバッファに再懸濁させ、Ｈｙｐｅｒｃｙｔｅフローサイトメータ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  Ｃｏｒｐ．）で読み取った。初代ヒトＴ細胞に結合する抗ＣＤ３クローンの代表的な用量応答曲線を図５に示す。
【０３８０】
ＳＰ３４−２（既知のエピトープを有し、カニクイザルＣＤ３と交差反応性である市販の抗ヒトＣＤ３抗体）との代表的な競合結合曲線を図６に示す。初期スクリーニング結果を表８にまとめる。クローンのうちの６つは陽性結合を示し、また、初代ヒトＴ細胞への結合についてＳＰ３４−２と競合する。
【０３８１】
１−４  ＳＰ３４−２市販ＣＤ３抗体との競合アッセイ
また、既知のエピトープを有し、カニクイザルＣＤ３と交差反応性である、市販の抗ヒトＣＤ３抗体ＳＰ３４−２と競合する能力について、ハイブリドーマ上清を評価した。最初に、ＡＦ４８８蛍光標識ＳＰ３４−２（ＢＤ、５５７７０５）の濃度滴定曲線で実施して、以下の競合アッセイのためにＳＰ３４−２の固定濃度を決定した。簡潔に述べると、ヒト精製Ｔ細胞を、ＰＢＳで１×１０＾６細胞／ｍＬに希釈した。Ｆｃブロック（Ｈｕｍａｎ  ＴｒｕＳｔａｉｎ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，４２２３０２）を５μＬ／１００μＬ細胞で添加し、１００μＬ／ウェルでＵ底プレートにプレーティングした。ＡＦ４８８  ＳＰ３４−２及びＡＦ４８８標識されたアイソタイプ対照（ＡＦ４８８マウスＩｇＧ１、ＢＤ、４００１２９）を、１：２希釈スキームで５０μｇ／ｍＬから０．０４９μｇ／ｍＬに連続希釈した。プレートを３００×ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去した。プレートを穏やかにボルテックスして、細胞を再懸濁させた。５０μＬの各ＡＦ４８８  ＳＰ３４−２希釈液を細胞に添加し、４Ｃで１時間インキュベートした。プレートを染色バッファで２回、ランニングバッファ（染色バッファ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９２６０Ｇ）＋０．１％プルロニックＦ−６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２４０４０−０３２））で１回洗浄した。細胞を、２５μＬのランニングバッファに再懸濁させ、ＨＴＦＣスクリーニングシステム（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で読み取った。用量応答曲線に基づいて、競合アッセイのために、２μｇ／ｍＬのＳＰ３４−２の固定濃度を選択した。
【０３８２】
精製Ｔ細胞への結合が実証された７つのハイブリドーマを、ヒトＴ細胞に結合するＳＰ３４−２との競合についてアッセイした（図４）。対照抗体を競合アッセイに含めた。非標識マウス抗ヒトＣＤ３、ＳＰ３４−２抗体及びマウス抗ヒトＣＤ３、ＵＣＨＴ１抗体を陽性対照として使用し、ラットＩｇＧ及びマウスアイソタイプを、ＡＦ４８８標識ＳＰ３４−２の陰性対照として使用した。精製ヒトＴ細胞を、ＰＢＳで１×１０＾６細胞／ｍＬの濃度に希釈した。細胞１００μＬあたり５μＬのＦｃブロック（Ｈｕｍａｎ  ＴｒｕＳｔａｉｎ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２２３０２）及び細胞１ｍＬあたり０．５μＬのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌ１０１２０）を細胞に添加し、４℃で１５分間インキュベートした。次に、１ウェルあたり１０５個の細胞（１×１０＾５細胞／ウェル）を９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３５３０７７）に分注した。プレートを３００×ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去した。プレートを穏やかにボルテックスして、細胞を再懸濁させた。ハイブリドーマ上清及び対照抗体を、ＦＡＣＳ染色バッファ（ＢＳＡ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５４６５７）で所望の最終濃度の２倍に希釈した。３５μＬの２×ハイブリドーマ上清及び対照抗体を３５μＬの２×ＡＦ４８８  ＳＰ３４−２（４μｇ／ｍＬ）と混合して、所望の１×濃度のハイブリドーマ上清、１×濃度の対照抗体、及び２μｇ／ｍＬのＡＦ４８８  ＳＰ３４−２を得た。ハイブリドーマ上清及び対照抗体を、ある濃度範囲で７点滴定を用いてアッセイした。ハイブリドーマ上清は２００μｇ／ｍＬから０．０８μｇ／ｍＬまでアッセイし、対照抗体は１００μｇ／ｍＬから０．０４μｇ／ｍＬまでアッセイした。２μｇ／ｍＬのＡＦ４８８  ＳＰ３４−２を含む１×ハイブリドーマ上清又は１×対照抗体５０μＬをＴ細胞に添加し、４℃で２時間インキュベートした。プレートを染色バッファで２回、ランニングバッファ（染色バッファ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９２６０Ｇ）＋０．１％プルロニックＦ−６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２４０４０−０３２））で１回洗浄した。細胞を、２５μＬのランニングバッファに再懸濁させ、ＨＴＦＣスクリーニングシステム（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で読み取った。ＳＰ３４−２（既知のエピトープを有し、カニクイザルＣＤ３と交差反応性である、市販の抗ヒトＣＤ３抗体）との代表的な競合結合曲線を図４及び６に示す。初期スクリーニング結果を表８にまとめる。クローンのうちの６つは陽性結合を示し、また、初代ヒトＴ細胞への結合についてＳＰ３４−２と競合した。
【０３８３】
図４に示すように、７つの抗体は、同様の曲線でＳＰ３４−２と競合した。対照ＳＰ３４−２に対する曲線の右側シフトは、弱くなる結合親和性を示す。アイソタイプ対照ラットＩｇＧは、予想どおり、ＳＰ３４−２と競合しなかった。
【０３８４】
【表１０】
2021524249.tif 000014
【０３８５】
１−５  ＣＤ６９のアップレギュレーションにより測定したときのＴ細胞活性化についてのハイブリドーマヒットのスクリーニング
初代ヒト及びカニクイザルＴ細胞ベースのアッセイを使用して、ハイブリドーマヒットのＴ細胞を活性化する能力を判定した。これは、ＴＣＲ活性化の交差連結効果を再現するために、抗体をプレートにコーティングすることによって達成された。活性化の際、Ｔ細胞は、タンパク質、ＣＤ６９の表面発現をアップレギュレートすることが知られている。未知のサンプル又は対照（陽性対照：インハウス、Ｏｋｔ−３  ＢＩＳＢ２６４．００２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＳＰ−３４−２  ＃５５１９１６；陰性対照：抗ＣＤ２０、インハウス、ＢＩＳＢ２６６．００４）を含む１０μｇ／ｍＬの抗体調製物５０μＬを９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３３６１）にコーティングすることによって、実験を実施した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳで２回洗浄した。冷凍した初代Ｔ細胞（ヒトはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ又はＨｅｍａｃａｒｅから供給され；カニクイザルはＷｏｒｌｄＷｉｄｅ  Ｐｒｉｍａｔｅｓから供給された）を解凍し、生存数について計数し、ＲＰＭＩ  １６４０培地（１０％  ＨＩ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１００６２）を含むＧｉｂｃｏ  ＃１１８７５）中に２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。１００μＬの細胞をプレートに添加し、３７Ｃ、５％ＣＯ２で一晩（約１６時間）インキュベートした。翌日、プレートを１３００ｒｐｍで３分間回転させて細胞をペレット化し、上清を廃棄した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、既に述べた通り回転させた。ＰＢＳ中Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｄｙｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ｌ２３１０１）の２．５％溶液１０μＬを各ウェルに添加し、室温及び暗所で１０分間インキュベートした。次に、ＦＡＣＳバッファ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃５５４６５７）中抗ＣＤ６９  ＡＦ４８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３１０９１６ロット＃Ｂ１２５２７１）の１％溶液５０μＬを添加し、プレートを４℃で４５分間インキュベートした。既に述べた通り細胞をペレット化し、上清を廃棄し１５０μＬのＦＡＣＳバッファに再懸濁させることによって、プレートを２回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳバッファに再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏで読み取った。図２０にみられるように、抗ＣＤ６９染色の測定された平均蛍光強度によって示されるように、陽性対照ｃＯｋｔ３及びＳＰ３４−２は、ヒトＴ細胞におけるＣＤ６９のアップレギュレーションを誘導した。ＳＰ３４−２のみがカニクイザルＴ細胞でＣＤ６９発現を誘導したが、これは、サルからヒトまで保存されているＣＤ３配列の領域に結合するためである。ＯＫＴ３抗ＣＤ３クローンは、カニクイザルＣＤ３に結合せず、ＣＤ６９のアップレギュレーションを誘導しなかった。ヒト及びカニクイザルＴ細胞の両方における陰性対照は、Ｔ細胞で発現しない抗ＣＤ２０であった。Ｔ細胞活性化について試験したハイブリドーマクローンのうちのいくつかは、陽性対照と同様の程度まで、すなわち２Ｂ４、２Ｅ６、３Ｂ４、１Ｆ８、２Ｅ９、３Ｆ４、３Ｇ８、４Ｅ５、５Ｈ７、８Ｂ４、８Ｇ８、及び１Ｆ１と同様の程度までＣＤ６９発現を誘導した。また、５Ｈ７、８Ｂ４、及び８Ｇ��を除いて、ほとんどは、カニクイザルＴ細胞に結合し、活性化した。
【０３８６】
１−６  ＢＬＷ−２Ｅ６のフレームワーク遺伝子操作
クローンは、ヒト免疫グロブリン生殖細胞系列の配列と比較して高い相同性を示し、フレームワーク変異を有していた（図１Ａ及び１Ｂ）。クローン２Ｅ６を選択して、標準的なフレームワーク配列を適合させた。ＨＣにおける６つの変異及びＬＣにおける７つの変異全てを個々に又は組み合わせてヒト生殖系列配列に復帰変異させた（表９）。変異したＶ領域ＤＮＡ配列を合成し、その親コンストラクトと同じ哺乳類発現ベクターにクローニングした。ＨＣ及びＬＣコンストラクトをマトリックスフォーマットを介して対にして、個々の又は組み合わせの変異を有するタンパク質を生成し、タンパク質活性を試験した。ＬＣにおけるＶ４８は、生殖細胞系列に変更し戻すことができなかった。他の全ての復帰変異は、重大なものではなかったが、ある程度まで活性を低下させた。
【０３８７】
【表１１】
2021524249.tif 000015
【０３８８】
１つのハイブリドーマクローン、ＢＬＷ−２Ｅ６に対してフレームワーク変異で遺伝子操作した結果、８０個の変異体クローンが得られ、そのうちのいくつかを表１０に示す。８０個の変異体クローンを、初代ヒトＴ細胞への結合についてアッセイした（図７及び８）。Ｔ細胞を計数し、１×１０＾６細胞／ｍＬに希釈し、細胞１００μＬあたり５μＬのＦｃブロック（Ｈｕｍａｎ  ＴｒｕＳｔａｉｎ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２２３０２）及び細胞１００μＬあたり０．５μ／ｍＬのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌ−２３０１）と共にインキュベートした。次に、細胞を、１００μＬ／ウェル（１×１０＾５細胞／ウェル）で９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３５３０７７）に分注した。プレートを３００×ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去した。プレートを穏やかに短時間ボルテックスして、細胞を再懸濁させた。ハイブリドーマ上清をＦＡＣＳ染色バッファ（ＢＳＡ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５４６５７）で７．５μｇ／ｍＬ、１．５ｕｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、及び０．０６μｇ／ｍＬに希釈した。５０μＬの各サンプルをＴ細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。細胞を染色バッファで１回洗浄し、５μｇ／ｍＬの二次ＡＦ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ１０９−６０５−０９７）５０μＬを細胞に添加した。プレートを４℃で４５分間インキュベートし、染色バッファで２回、ランニングバッファ（染色バッファ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ９２６０Ｇ）＋０．１％プルロニックＦ−６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２４０４０−０３２））で１回洗浄した。細胞を、２５μＬのランニングバッファに再懸濁させ、ＨＴＦＣスクリーニングシステム（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で読み取った。結果は、位置４８におけるＬＣの変化が結合を無効にし、その結果、変異が持ち越されなかったことを示す。全ての位置が生殖系列に戻ったＨＣ（ＣＤ３Ｈ２３１）では、結合のわずかな減少がみられた。
【０３８９】
１−７  ＢＬＷ−２Ｅ６  ＬＣのＣ９１スキャニング
クローン２Ｅ６及びその誘導体は、発現が乏しく、タンパク質の凝集が観察された。軽鎖の１つの残基、Ｃ９１は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）リスクを有すると予測され、タンパク質の安定性を改善するために他の全ての可能なアミノ酸を変異させた（表１０）。変異したＶ領域ＤＮＡ配列を合成し、その親コンストラクトと同じヒトλ発現ベクターにクローニングした。ＳＰＲ結果は、位置９１におけるバリン又はロイシンに対する変化が、結合親和性を劇的には変化させないことを示した。この変化は野生型配列にも組み込まれ、上記フレームワーク適応の結果、抗体ＣＤ３Ｂ３７６（ＣＤ３Ｈ２１９／ＣＤ３Ｌ１５０）及びＣＤ３Ｂ４５０（ＣＤ３Ｈ２３１／ＣＤ３Ｌ１９７）が得られた。ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０をＩｇＧ４ＰＡＡとしてクローニングした（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ４）。
【０３９０】
ＣＤ３Ｂ３７６の配列情報を以下に提供する：
ＣＤ３Ｈ２１９  ＨＣアミノ酸配列（配列番号６４０）：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＲＬＶＲＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＦＮＮＮＡＡＷＳＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＬＹＤＹＡＶＳＶＫＳＲＩＴＶＮＰＤＴＳＲＮＱＦＴＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＧＹＳＳＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０３９１】
ＣＤ３Ｈ２１９  ＨＣ核酸配列（配列番号７１２）
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇｃａｇｔｃｔｇｇｃｃｃｔａｇａｃｔｃｇｔｇｃｇｇｃｃｔｔｃｃｃａｇａｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇａｃｃｔｇｔｇｃｃａｔｃｔｃｃｇｇｃｇａｃｔｃｃｇｔｇｔｔｃａａｃａａｃａａｃｇｃｃｇｃｃｔｇｇｔｃｃｔｇｇａｔｃｃｇｇｃａｇａｇｃｃｃｔｔｃｔａｇａｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇｃｔｇｇｇｃｃｇｇａｃｃｔａｃｔａｃｃｇｇｔｃｃａａｇｔｇｇｃｔｇｔａｃｇａｃｔａｃｇｃｃｇｔｇｔｃｃｇｔｇａａｇｔｃｃｃｇｇａｔｃａｃｃｇｔｇａａｃｃｃｔｇａｃａｃｃｔｃｃｃｇｇａａｃｃａｇｔｔｃａｃｃｃｔｇｃａｇｃｔｇａａｃｔｃｃｇｔｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｃｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇａｇｇｃｔａｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｃｇａｃｔａｔｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｃｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｃｔｃｔ
【０３９２】
ＣＤ３Ｌ１５０  ＬＣアミノ酸配列（配列番号６７６）：
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＮＩＧＴＹＫＦＶＳＷＹＱＱＨＰＤＫＡＰＫＶＬＬＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＳＳＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＱＡＤＹＨＣＶＳＹＡＧＳＧＴＬＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
【０３９３】
ＣＤ３Ｌ１５０  ＬＣ核酸配列（配列番号７１３）
ｃａｇｔｃｔｇｃｔｃｔｇａｃｃｃａｇｃｃｔｇｃｃｔｃｃｇｔｇｔｃｔｇｇｃｔｃｔｃｃｃｇｇｃｃａｇｔｃｃａｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｔｇｔａｃｃｇｇｃａｃｃｔｃｃｔｃｃａａｃａｔｃｇｇｃａｃｃｔａｃａａｇｔｔｃｇｔｇｔｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｃｇａｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａａｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃｇａｇｇｔｇｔｃｃａａｇｃｇｇｃｃｃｔｃｔｇｇｃｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａｔｔｃｔｃｃｇｇｃｔｃｃａａｇｔｃｔｇｇｃａａｃａｃｃｇｃｃｔｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃａｇｃｇｇａｃｔｇｃａｇｇｃｔｇａｇｇａｃｃａｇｇｃｃｇａｃｔａｃｃａｃｔｇｔｇｔｇｔｃｃｔａｃｇｃｔｇｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｃｃｔｇｃｔｇｔｔｔｇｇｃｇｇａｇｇｃａｃｃａａｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｔｇ
【０３９４】
ＣＤ３Ｈ２１９のＶＨアミノ酸配列（配列番号６５２）：
ｑｖｑｌｑｑｓｇｐｒｌｖｒｐｓｑｔｌｓｌｔｃａｉｓｇｄｓｖｆｎｎｎａａｗｓｗｉｒｑｓｐｓｒｇｌｅｗｌｇｒｔｙｙｒｓｋｗｌｙｄｙａｖｓｖｋｓｒｉｔｖｎｐｄｔｓｒｎｑｆｔｌｑｌｎｓｖｔｐｅｄｔａｌｙｙｃａｒｇｙｓｓｓｆｄｙｗｇｑｇｔｌｖｔｖｓｓ
【０３９５】
ＣＤ３Ｌ１５０のＶＬアミノ酸配列（配列番号６６１）：
ｑｓａｌｔｑｐａｓｖｓｇｓｐｇｑｓｉｔｉｓｃｔｇｔｓｓｎｉｇｔｙｋｆｖｓｗｙｑｑｈｐｄｋａｐｋｖｌｌｙｅｖｓｋｒｐｓｇｖｓｓｒｆｓｇｓｋｓｇｎｔａｓｌｔｉｓｇｌｑａｅｄｑａｄｙｈｃＶｓｙａｇｓｇｔｌｌｆｇｇｇｔｋｌｔｖｌ
【０３９６】
ＣＤ３Ｈ２１９のＨＣＤＲ１（配列番号６６２）：ＮＮＮＡＡＷＳ
【０３９７】
ＣＤ３Ｈ２１９のＨＣＤＲ２（配列番号６６３）：ＲＴＹＹＲＳＫＷＬＹＤＹＡＶＳＶＫＳ
【０３９８】
ＣＤ３Ｈ２１９のＨＣＤＲ３（配列番号６６４）：ＧＹＳＳＳＦＤＹ
【０３９９】
ＣＤ３Ｌ１５０のＬＣＤＲ１（配列番号６７１）：ＴＧＴＳＳＮＩＧＴＹＫＦＶＳ
【０４００】
ＣＤ３Ｌ１５０のＬＣＤＲ２（配列番号６７３）：ＥＶＳＫＲＰＳ
【０４０１】
ＣＤ３Ｌ１５０のＬＣＤＲ３（配列番号６９０）：ＶＳＹＡＧＳＧＴＬＬ
【０４０２】
ＣＤ３Ｂ４５０の配列情報を以下に提供する：
ＣＤ３Ｈ２３１  ＨＣアミノ酸配列（配列番号６７５）：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＦＮＮＮＡＡＷＳＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＬＹＤＹＡＶＳＶＫＳＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＳＳＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０４０３】
ＣＤ３Ｈ２３１  ＨＣ核酸配列（配列番号７１４）：
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇｃａｇａｇｃｇｇｃｃｃｃｇｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｃｃｃａｇｃｃａｇａｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｇｃｃａｔｃａｇｃｇｇｃｇａｃａｇｃｇｔｇｔｔｃａａｃａａｃａａｃｇｃｃｇｃｃｔｇｇｔｃｃｔｇｇａｔｃｃｇｃｃａｇａｇｃｃｃｃａｇｃｃｇｃｇｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇｃｔｇｇｇｃｃｇｃａｃｃｔａｃｔａｃｃｇｃａｇｃａａｇｔｇｇｃｔｇｔａｃｇａｃｔａｃｇｃｃｇｔｇｔｃｃｇｔｇａａｇｔｃｃｃｇｃａｔｃａｃｃａｔｃａａｃｃｃｃｇａｃａｃｃａｇｃａａｇａａｃｃａｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｃａｇｃｔｇａａｃａｇｃｇｔｇａｃｃｃｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃｃｇｃｇｇｃｔａｃａｇｃａｇｃａｇｃｔｔｃｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｇｔｃｃａｇｃ
【０４０４】
ＣＤ３Ｌ１９７  ＬＣアミノ酸配列（配列番号６７７）：
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＮＩＧＴＹＫＦＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＶＭＩＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＶＳＹＡＧＳＧＴＬＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
【０４０５】
ＣＤ３Ｌ１９７  ＬＣ核酸配列（配列番号７１５）：
Ｃａｇｔｃｔｇｃｔｃｔｇａｃｃｃａｇｃｃｔｇｃｃｔｃｃｇｔｇｔｃｔｇｇｃｔｃｔｃｃｃｇｇｃｃａｇｔｃｃａｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｔｇｔａｃｃｇｇｃａｃｃｔｃｃｔｃｃａａｃａｔｃｇｇｃａｃｃｔａｃａａｇｔｔｃｇｔｇｔｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｃｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａａｇｔｇａｔｇａｔｃｔａｃｇａｇｇｔｇｔｃｃａａｇｃｇｇｃｃｃｔｃｃｇｇｃｇｔｇｔｃｃａａｃａｇａｔｔｃｔｃｃｇｇｃｔｃｃａａｇｔｃｃｇｇｃａａｃａｃｃｇｃｃｔｃｃｃｔｇａｃａａｔｃａｇｃｇｇａｃｔｇｃａｇｇｃｃｇａｇｇａｃｇａｇｇｃｃｇａｃｔａｃｔａｃｔｇｔｇｔｇｔｃｃｔａｃｇｃｃｇｇｃｔｃｔｇｇｃａｃｃｃｔｇｃｔｇｔｔｔｇｇｃｇｇｃｇｇａａｃａａａｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｔｇ
【０４０６】
ＣＤ３Ｈ２３１のＶＨアミノ酸配列（配列番号６５７）：ｑｖｑｌｑｑｓｇｐｇｌｖｋｐｓｑｔｌｓｌｔｃａｉｓｇｄｓｖｆｎｎｎａａｗｓｗｉｒｑｓｐｓｒｇｌｅｗｌｇｒｔｙｙｒｓｋｗｌｙｄｙａｖｓｖｋｓｒｉｔｉｎｐｄｔｓｋｎｑｆｓｌｑｌｎｓｖｔｐｅｄｔａｖｙｙｃａｒｇｙｓｓｓｆｄｙｗｇｑｇｔｌｖｔｖｓｓ
【０４０７】
ＣＤ３Ｌ１９７のＶＬアミノ酸配列（配列番号６７８）：
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＮＩＧＴＹＫＦＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＶＭＩＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＶＳＹＡＧＳＧＴＬＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【０４０８】
ＣＤ３Ｈ２３１のＨＣＤＲ１（配列番号６６２）：ＮＮＮＡＡＷＳ
【０４０９】
ＣＤ３Ｈ２３１のＨＣＤＲ２（配列番号６６３）：ＲＴＹＹＲＳＫＷＬＹＤＹＡＶＳＶＫＳ
【０４１０】
ＣＤ３Ｈ２３１のＨＣＤＲ３（配列番号６６４）：ＧＹＳＳＳＦＤＹ
【０４１１】
ＣＤ３Ｌ１９７のＬＣＤＲ１（配列番号６７１）：ＴＧＴＳＳＮＩＧＴＹＫＦＶＳ
【０４１２】
ＣＤ３Ｌ１９７のＬＣＤＲ２（配列番号６７３）：ＥＶＳＫＲＰＳ
【０４１３】
ＣＤ３Ｌ１９７のＬＣＤＲ３（配列番号６９０）：ＶＳＹＡＧＳＧＴＬＬ
【０４１４】
【表１２】
2021524249.tif 000016
【０４１５】
１−８  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＳＰＲによるｈＣＤ３εコンストラクトに対するＢＬＷ−２Ｅ６  ＣＤ３ｍＡｂの結合
Ｃ末端Ｔｅｎｃｏｎ２５融合体を含む組換えヒトＣＤ３ε（１−２７）（Ｊａｎｓｓｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、ｈＣＤ３ε（１−２７）−Ｔｎ２５と称される）に対する、軽鎖及び／又は重鎖に点変異を有するＢＬＷ−２Ｅ６抗ＣＤ３ｍＡｂの結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＳＰＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により測定した。０．００５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中流量３０μＬ／分で、ＧＬＣ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１７６−５０１１）に垂直に配向された６つのリガンドチャネル全てにおいて、酢酸バッファ、ｐＨ５．０中３０μｇ／ｍＬでのアミンカップリングを介して、ヤギ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００５−０９８）を直接固定化した。固定化密度は、平均で約６０００応答単位（ＲＵ）であり、異なるチャネル間の変動は５％未満であった。垂直リガンド配向で１．５μｇ／ｍＬ（１０００〜１２５０ＲＵ）において抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ表面に５つの異なるｍＡｂを捕捉し、６番目のリガンドチャネルは、リガンドなし表面対照であった。５つの濃度の３倍希釈系列中１μＭ濃度のｈＣＤ３ε（１−２７）−Ｔｎ２５をアナライトとして流して、捕捉されたｍＡｂに水平配向で結合させた。また、捕捉されたｍＡｂの解離及びベースラインでの安定性をモニタリングするために、６番目のバッファサンプルを注入した。ｈＣＤ３ε（１−２７）−Ｔｎ２５の全濃度について、１００μＬ／分の流量で３０分間解離相をモニタリングした。抗原及び結合ｍＡｂを除去するために１８秒パルスの０．８％リン酸を用いて、次の相互作用サイクルのために結合表面を再生した。応答データから次の２セットの基準データを減算することによって生データを処理した：１）Ａｇと空のチップ表面との間での非特異的相互作用を補正するためのスポット間シグナル；２）経時的な捕捉されたｍＡｂ表面の解離に起因するベースラインの揺れを補正するためのバッファチャネルシグナル。各ｍＡｂについて全濃度において処理したデータを１：１の単純なラングミュア結合モデルにグローバルフィットさせて、反応速度定数（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ）及び親和性（ＫＤ）定数の推定値を抽出した。結果を表１１に与える。
【０４１６】
【表１３】
2021524249.tif 000017
Ｎ／Ａ＝該当なし
【０４１７】
１−９  ヒトＴ細胞に対する抗ＣＤ３モノクローナル抗体の結合
ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０のヒトＴ細胞に対するインビトロ結合親和性を、抗原特異的標的アームとの交差後にフローサイトメトリーによって判定した。抗ＣＤ３トレーサー分子（ＫｄＴ）の飽和結合定数を求めるために、ヒトＴ細胞に対して予備試験を実施した。次いで、滴定された濃度の試験ｍＡｂを用いる競合結合アッセイにおいて、固定濃度のトレーサー（［Ｔ］）を使用した。試験分子のＩＣ５０（５０％阻害が達成される濃度）値を使用して、以下の式：Ｋｄ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ｔ］／ＫｄＴ））を使用して結合親和性（Ｋｄ）を求めた。５人のヒトドナーを使用して、トレーサー、市販のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８  ＳＰ３４−２抗ＣＤ３（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ＃５５７７０５）の飽和結合定数（ＫｄＴ）を求めた（データは示さず）。
【０４１８】
トレーサーの飽和結合定数（ＫｄＴ）の決定
方法：ヒト汎Ｔ細胞を、使用するまで窒素タンク内で低温保存した。Ｔ細胞を解凍し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ染色バッファに再懸濁させ、計数し（生存率に留意して）、０．５×１０＾６細胞／ｍＬで再懸濁させた。Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＫＡ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｌ３４９７４）（バイアルに５０μＬのＤＭＳＯ）を１×１０＾６細胞あたり１μＬで添加し；ＦｃＲブロッカー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０５９−９０１）（０．５×１０＾６あたり１：２０希釈液１ｍＬ）をそれぞれ１０分間にわたって細胞に添加した。細胞を５０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、洗浄した。漸増濃度のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８  ＳＰ−３４抗ＣＤ３を４℃で２時間にわたってＴ細胞に添加した。細胞を洗浄して非結合抗体を除去し、１５分間固定し、洗浄し、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＦＡＣＳ染色バッファ中に再懸濁させた。
【０４１９】
ｉＱｕｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して結合を測定した。Ｔ細胞集団、続いて細胞個片、続いて生細胞（ＦＬ４）について細胞をゲーティングした。各ウェルについて、染色の幾何平均（ＦＬ１）を求めた。
【０４２０】
得られた平均蛍光強度値を抗体分子濃度の関数としてプロットし、一部位結合分析（全結合）においてＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した（図９）。ソフトウェアは、質量作用の法則に従う受容体（ヒト汎Ｔ細胞上のＣＤ３）への抗体分子の結合を説明する、対応するＫｄ値を計算する。式は以下の通りである：Ｙ＝（Ｂｍａｘ×Ｘ）／（Ｋｄ＋Ｘ）；（式中、Ｂｍａｘは最大結合であり、Ｋｄは、最大半量結合に達するのに必要なリガンドの濃度である）。
【０４２１】
結果：各ドナーについてＫｄ値を導出し、平均値を得た。ヒトＴ細胞についての飽和結合定数（ＫｄＴ）は、５．６±１．０ｎＭ（ｎ＝４）であると導出され、Ｋｄ結合親和性を求めるために既に述べた式で使用した。
【０４２２】
競合アッセイによる抗ＣＤ３ｍＡｂの結合親和性の決定
方法：ＣＤ３に対する二価抗体を用いて競合結合試験を行った。
・抗ＣＤ３二価：ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０（図１０）
ヒト汎Ｔ細胞を使用して、試験ｍＡｂの結合親和性を求めた。使用したトレーサーは、市販のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８  ＳＰ−３４抗ＣＤ３（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ＃５５７７０５）であり、このトレーサーの飽和結合定数は上記の通りである。
【０４２３】
Ｔ細胞を、使用するまで窒素タンク内で低温保存した。Ｔ細胞を解凍し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ染色バッファに再懸濁させ、生存率に留意して計数し、０．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＫＡ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃  Ｌ３４９７４）（バイアルに５０μＬのＤＭＳＯ）を１×１０＾６細胞あたり１μＬで添加し；ＦｃＲブロッカー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０５９−９０１）（０．５×１０＾６あたり１：２０希釈液１ｍＬ）をそれぞれ１０分間にわたって細胞に添加した。細胞を５０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、洗浄した。
【０４２４】
ｍＡｂ（及びアイソタイプ対照）を、出発濃度１０００又は２００μｇ／ｍＬ（２×）から１：２連続希釈し、固定濃度（５μｇ／ｍＬ；２×）のトレーサーを一緒に混合して、１×濃度を得た。したがって、トレーサーの最終濃度（１×）は、２．５μｇ／ｍＬ＝１６．６ｎＭであった。混合物を４℃で２時間にわたってＴ細胞に添加した。次いで、細胞を洗浄して非結合抗体を除去し、１５分間固定し、洗浄し、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＦＡＣＳ染色バッファ中に再懸濁させた。
【０４２５】
ｉＱｕｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して結合を測定した。Ｔ細胞集団、続いて細胞個片、続いて生細胞（ＦＬ４）について細胞をゲーティングした。各ウェルについて、染色の幾何平均（ＦＬ１）を求めた。取得した平均蛍光強度値をｌｏｇ抗体分子濃度（ｎＭに変換）の関数としてプロットし、それからＥＣ５０／ＩＣ５０値（ｎＭ）が導出されるシグモイド用量応答（可変勾配）においてＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。以下の式：Ｋｄ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ｔ］／ＫｄＴ））を用いて結合親和性（Ｋｄ）を導出した。式中、Ｋｄは、競合相手（非標識分子）の親和性であり、試験化合物のＩＣ５０はｎＭ単位であり、［Ｔ］は、トレーサーの濃度（１６．６ｎＭ）であり、ＫｄＴは、飽和結合によって決定されるトレーサーのＫｄである（ヒトについては５．６ｎＭ）。
【０４２６】
モノクローナル及び二重特異性抗体の産生
本発明の二重特異性ＣＤ３抗体は、Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１１０（１３）：５１４５−５１５０；国際公開第２０１１／１３１７４６号；又はＬａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ，９（１０）：２４５０−６３に記載の通り、制御されたＦａｂアーム交換（ＦＡＥ）によって生成され得る。簡潔に述べると、このインビトロ法では、２つの完全長親二価抗体が提供され、各々がヘテロダイマー形成に好都合な抗体ＣＨ３領域における変異を含み、その結果、各々の親抗体由来の半アームを含有する二重特異性抗体が得られる。ヘテロダイマー形成に好都合になるように使用され得る変異は、ＩｇＧ１抗体の場合、一方の親抗体ではＦ４０５Ｌ、他方の親抗体ではＲ４０９Ｋであるか、又はＩｇＧ４抗体の場合、野生型ＣＨ３を保持しながら、一方の親抗体でＦ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒである。
【０４２７】
単一特異性抗体を、ＣＭＶプロモータ下においてＨＥＫ細胞株中で発現させた。
【０４２８】
親抗体を、１００ｍＭ  ＮａＡｃ  ｐＨ３．５の溶出バッファ、並びに２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５及び１５０ｍＭのＮａＣｌの中和バッファを用いたプロテインＡカラムを使用して精製した。ＰＤ１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５Ｍ）カラムを用いてｍａｂを脱塩し、Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．２バッファに透析した。
【０４２９】
精製後、親抗体を、７５ｍＭシステアミン−ＨＣｌ中の還元条件下で混合し、３１℃で４時間インキュベートした。組換え反応はモル濃度比に基づいており、設定量の標的親（例えば、１０ｍｇ又は約７１．８ナノモル）をＣＤ３抗体（例えば、約６７．８ナノモル）と組み合わせ、標的親抗体をＣＤ３抗体の６％過剰で添加した。その後、組換え物をＰＢＳに対して透析して、還元剤を除去した。組換え後に残存する未反応のＣＤ３親抗体の量を最小化するために、過剰な標的親抗体（比）を用いて二重特異性抗体反応を行った。親ｍＡｂの部分的な減少に続いて、ＰＢＳ中に一晩透析することによって還元剤を除去した。
【０４３０】
結果：図１０は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８  ＳＰ−３４抗ＣＤ３トレーサー抗体に対する結合についての競合について、二価及び一価抗ＣＤ３コンストラクト、ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０の阻害曲線を示す。漸増濃度の試験抗ＣＤ３抗体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８トレーサー抗体の結合を減少させ、したがって、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を減少させる。ＩＣ５０値を生成し、前述の式を使用して、Ｋｄ親和性を計算し、表１３にまとめた。
【０４３１】
ＣＤ３Ｂ３７６結合部位は、二価及び一価の両方の形態でＣＤ３Ｂ４５０よりも強固であった。
【０４３２】
【表１４】
2021524249.tif 000018
【０４３３】
１−１０  抗ＣＤ３モノクローナル抗体の配座安定性
抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６、ＣＤ３Ｂ３８９（ＣＤ３Ｂ３７６のＩｇＧ１σバージョン；重鎖は配列番号７２９であり；軽鎖は配列番号６７６である）、ＣＤ３Ｂ４５０、及びＣＤ３Ｂ４６７（ＣＤ３Ｂ４５０のＩｇＧ１σバージョン；重鎖は配列番号７２８であり；軽鎖は配列番号６７７である）の配座安定性を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって判定した。熱転移の中点Ｔｍを、Ａｂ候補のそれぞれの熱変性プロファイルから決定した。図１２Ａ〜図１２Ｅは、ＰＢＳ中の抗ＣＤ３抗体の熱変性プロファイルを示す。表１４は、ＤＳＣによって決定したときの抗ＣＤ３抗体の熱的アンフォールディングについてのＴｍ及びエンタルピー値（ΔＨ）のまとめを含む。
【０４３４】
ＤＳＣ結果は、全ての抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６、ＣＤ３Ｂ３８９、ＣＤ３Ｂ４５０、及びＣＤ３Ｂ４６７が折り畳まれたドメインを有することを示す。アンフォールディングの開始に基づいて、各抗体の相対的安定性は以下の通りであった：ＣＤ３Ｂ３８９＜ＣＤ３Ｂ４６７＜ＣＤ３Ｂ３７６＜ＣＤ３Ｂ４５０。ＤＳＣによって試験した抗ＣＤ３分子は、その熱安定性においてある程度の差を示した。ＣＤ３Ｂ３７６（ＩｇＧ４  ＰＡＡ）分子は、５９．７、６２．４、及び６９．２℃で３つの部分的に未分解転移を示し、アンフォールディングの全エンタルピーは４１７．６ｋｃａｌ／モルであったが、ＣＤ３Ｂ４５０（ＩｇＧ４  ＰＡＡ）分子は、６２．５及び６６．３℃で２つの未分解転移を示し、アンフォールディングの全エンタルピーは５４５．１ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。ＣＤ３Ｂ３８９（ＩｇＧ１σ）分子は、５４．６、５８．２、７３．１、及び７７．１℃で４つの転移を示し、アンフォールディングの全エンタルピーは４０１．７ｋｃａｌ／ｍｏｌであったが、ＣＤ３Ｂ４６７（ＩｇＧ１σ）分子は、５６．３、５９．６、６６．５、及び７５．６℃で４つの転移を示し、アンフォールディングの全エンタルピーは４０６．２ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。
【０４３５】
【表１５】
2021524249.tif 000019
【０４３６】
２つのＩｇＧ１抗体は、対応するＩｇＧ４  ＰＡＡ抗体と比較（同じ可変ドメインを有する分子を比較）してより低い安定性を示し、第１の転移のＴｍは５〜６℃低い（図１３Ａ及び図１３Ｂ及び表１４）。
【０４３７】
１−１１  ＣＤ３ｅのＮ末端ペプチドとの複合体におけるＣＤ３Ｂ３３４  Ｆａｂの結晶構造
抗ＣＤ３  ｍＡｂ  ＣＤ３Ｂ３３４（ＣＤ３Ｈ２３１／ＣＤ３Ｌ１３７）を改変して、抗体中の多数のフレームワーク残基をヒト生殖系列残基で置き換えることによって、「ヒト度」指数を増加させた。この手順により、以下の変異を有する抗体ＣＤ３Ｂ３３４が得られた：親ＶＬ  ＣＤ３Ｌ１２４と比較したとき、ＶＬにおいてＤ４３Ｇ／Ｌ４９Ｍ／Ｌ５０Ｉ／Ｓ６２Ｎ／Ｑ８５Ｅ／Ｈ８９Ｙ、親ＶＨ  ＣＤ３Ｈ２１９と比較したとき、ＶＨにおいてＲ１０Ｇ／Ｒ１３ｋ／Ｖ７３Ｉ／Ｒ７９Ｋ／Ｔ８３Ｓ／Ｌ９６Ｖ。ＣＤ３Ｂ３３４のＨｉｓタグ付きＦａｂ断片を、ＨＥＫ２９３  Ｅｘｐｉ細胞において発現させ、アフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。ヒトＣＤ３ｅのＮ末端の９ｍｅｒペプチドを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（ロットＶ１１０８−１９／２１）で合成し、モル比１０：１（ペプチド過剰）でＦａｂと混合した。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５中４Ｍギ酸ナトリウムを含有する溶液から蒸気拡散法により複合体を結晶化させた。結晶は、６６．５×６９．４×１００．４Åの単位格子寸法及び非対称ユニット内の１つの複合分子を有する斜方晶空間群Ｐ２１２１２１に属する。検索モデルとしてＦａｂの結晶構造を使用して、分子置換法により１．８Åの分解能でこの複合体の構造を決定した。
【０４３８】
ＣＤ３Ｂ３３４は、ＣＤ３ｅの残基１〜６に結合した。ペプチドのＮ末端Ｇｌｎは、ピログルタミン酸塩形態であり、疎水性環境では、ＨＣＤＲ３のＦ１０７とＬＣＤＲ３のＬ９９との間にあった（図１８）。ＨＣＤＲ２からの２つのアルギニン残基Ｒ５２及びＲ５６を、ＣＤ３の酸性残基と静電相互作用で会合させた。合計で、１６残基がＣＤ３Ｂ３３４パラトープを形成した。ＬＣＤＲ２を除く全てのＣＤＲからの残基が、ＣＤ３ペプチドと直接接触していた（４Å以内の距離）（図１９を参照）。
【０４３９】
２  ＰＳＭＡ抗体
２−１  ＰＳＭＡ細胞株の生成
標準的な分子生物学技術を使用して、ＣＭＶプロモータを含むインハウス発現ベクターを使用して、抗ＰＳＭＡリードを評価するためのスクリーニングツールとして使用するために、完全長チンパンジーＰＳＭＡ（Ｈ２Ｑ３Ｋ５＿ＰＡＮＴＲ、配列番号４９）又は完全長カニクイザルＰＳＭＡ（ＥＨＨ５６６４６．１、配列番号５０）を提示する発現ベクターを生成した。標準的な方法を使用して、ベクターを懸濁液中のＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過的にトランスフェクションした。トランスフェクトされた２９３Ｆ懸濁細胞を、増殖培地＋血清中にプレーティングしたところ、接着性になり、安定したプラスミドの組み込みについて選択した。単一細胞集団を連続希釈により選択し、（アイソタイプ対照としてのＲ−ＰＥ抗ウサギ二次抗体（カタログ番号＃１１１−１１６−１４４，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）及びウサギポリクローナルＩｇＧ（カタログ番号ＳＣ−５３２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に、一次抗体としてＰＳＭＡＬ抗体（Ｃｅｎｔｅｒ）親和性精製ウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ＯＡＡＢ０２４８３、Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）を使用して、ＰＳＭＡ表面受容体の発現をＦＡＣＳにより定量した。
【０４４０】
完全長ヒトＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１＿ＨＵＭＡＮ、配列番号５１）及びＰＳＭＡ陽性細胞を選択するためのピューロマイシンを含有するレンチウイルス（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ、カタログ番号ＥＸ−Ｇ００５０−Ｌｖ１０５−１０）を使用して、ヒトＰＳＭＡ発現細胞株を生成した。ＰＳＭＡについて陰性であるＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＡＴＣＣ）に、レンチウイルス粒子を形質導入して、ヒトＰＳＭＡを過剰発現させた。形質導入後、プールされた細胞を処理することによって、ＰＳＭＡ及び耐性マーカーを陽性発現している細胞を選択し、ＤＭＥＭ＋１０％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させ、様々な濃度のピューロマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補給した。
【０４４１】
ＨＥＫ生成細胞株に加えて、いくつかの市販の細胞株を、ファージパニング及び結合及び細胞傷害アッセイに使用した。ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１７４０）は、市販のヒト前立腺癌細胞株である。Ｃ４−２Ｂ細胞は、元々ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎで開発されたものであり、インビボで増殖させ、骨髄に転移したＬＮＣａＰ  ＦＧＣに由来する（Ｔｈａｌｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ  １９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４，２５７７−８１）。
【０４４２】
２−２  可溶性ＰＳＭＡ  ＥＣＤタンパク質の生成
組換えチンパンジーＰＳＭＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質（Ｃｈｉｍｐ  ＰＳＭＡ  ＥＣＤ、配列番号５２）をパニングのために生成し、標準的な分子生物学的技術を使用し、ＣＭＶプロモータを含むインハウス発現ベクターを使用して抗ＰＳＭＡリードを評価した。Ｎ末端シグナル配列（配列番号５９４）、Ｎ末端Ａｖｉタグ（配列番号５９５）、及び６−Ｈｉｓタグ（配列番号５９６）を含むチンパンジーＰＳＭＡ  ＥＣＤ遺伝子断片（配列番号４９のアミノ酸４４〜７５０）を、標準的な分子生物学的技術を使用し、ＣＭＶプロモータを含むインハウス発現ベクターを使用してクローニングし、２９３Ｅｘｐｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一過的に発現させた。遺伝子合成技術を使用してｃＤＮＡを調製した（米国特許第６，６７０，１２７号、米国特許第６，５２１，４２７号）。上清を回収し、遠心分離して清澄化した。タンパク質を、１）ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＩＭＡＣ精製、及び２）サイズ排除精製（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、Ｇｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の２段階精製プロセスを用いて精製し、ここでの溶出バッファは、ＰＳＭＡのダイマー化を安定させるために０．５ｍＭ  ＺｎＣｌ２を含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、カルシウム、マグネシウム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃１４０４０）である。対象とするタンパク質を含む画分をプールし、タンパク質濃度をＡ２８０によって測定した。この材料を、結合及び親和性の測定のために使用し、ＰＳＭＧ８と称する。
【０４４３】
チンパンジーＰＳＭＡ  ＥＣＤもパニングのためにビオチン化した。Ａｖｉタグを含有するタンパク質をビオチン化するために哺乳類細胞にコトランスフェクトするＢｉｒＡプラスミドを、インハウスで作製した。ＢｉｒＡコード領域（配列番号５９７）を、マウスＩｇＧ重鎖（配列番号５９８）由来のシグナルペプチドに融合させ、ＥＲ保持シグナル（ＫＤＥＬ（配列番号７１６））をＣ末端に付加して、ＢｉｒＡプラスミド（配列番号５９９）を作製した。構築した遺伝子を、ＣＭＶプロモータの制御下にある発現ベクターにクローニングした。ビオチン化ＰＳＭＡ抗原を産生するために、ＰＳＭＡプラスミドＤＮＡを、ＢｉｒＡプラスミドに対して４倍過剰（ｗ／ｗ）でトランスフェクションミックスに添加した。
【０４４４】
ＢｉｒＡ発現コンストラクトのコトランスフェクションによりＡｖｉタグを介してチンパンジーＰＳＭＡ  ＥＣＤタンパク質のビオチン化を実施し、得られた分泌タンパク質を、１）ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＩＭＡＣ精製、及び２）サイズ排除精製（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、Ｇｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の２段階精製プロセスを用いて精製し、ここでの溶出バッファは、ＰＳＭＡのダイマー化を安定させるために０．５ｍＭ  ＺｎＣｌ２を含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、カルシウム、マグネシウム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，＃１４０４０）である。このタンパク質を、ファージパニング試験で使用する前に内毒素について試験した。
【０４４５】
Ｎ末端シグナル（配列番号５９４）、Ｎ末端Ａｖｉ−（配列番号５９５）及び６Ｈｉｓ−（配列番号５９６）タグを含む配列番号５０のアミノ酸４４〜７５０に対応する組換えカニクイザルＰＳＭＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質（カニクイザルＰＳＭＡ  ＥＣＤ、配列番号５３）をクローニングし、チンパンジーＰＳＭＡ  ＥＣＤについて前述したように発現させた。ＢｉｒＡ発現コンストラクトのコトランスフェクションによりＡｖｉタグを介してカニクイザルＰＳＭＡ  ＥＣＤタンパク質のビオチン化を実施し、得られた分泌タンパク質を、ＩＭＡＣ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＭｏｎｏＡｖｉｄｉｎカラムを用いて２段階精製することによって精製した。このタンパク質を、ファージパニング試験で使用する前に内毒素について試験した。この材料を、結合及び親和性の測定のためにも使用し、ＰＳＭＧ１と称する。
【０４４６】
ＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号５９３）を含む第２の組換えカニクイザルＰＳＭＡ  ＥＣＤタンパク質（カニクイザルＰＳＭＡ  Ｆｃ、配列番号５４）をクローニングし、標準的な分子生物学的技術を用いてＣＭＶプロモータを含むインハウス発現ベクターを用いて発現させた。Ｃｙｎｏ  ＰＳＭＡ  Ｆｃタンパク質を、２９３ＨＥＫ−ｅｘｐｉ細胞で一過的に発現させた。ＨＥＫ２９３  Ｅｘｐｉ細胞におけるＰＳＭＧ３の一過的トランスフェクション物を、トランスフェクションの５日後に収集し、遠心分離（３０分、６０００ｒｐｍ）により清澄化し、濾過した（０．２μＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。標準曲線を作成するために使用済み培地（spent medium）にスパイクされた精製既知ＩｇＧ（同じアイソタイプ）を使用し、Ｏｃｔｅｔ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でＩｇＧの相対量を求めた。
【０４４７】
清澄化されたカニクイザルＰＳＭＡ  Ｆｃ上清を、平衡化された（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、レジン１ｍＬあたり約３０ｍｇのタンパク質の相対濃度でロードした。ローディング後、カラムをｄＰＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄し、１０カラム体積の０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５で溶出した。ピーク画分をプールし、２Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７で中和し、濾過した（０．２μ）。中和したタンパク質サンプルを、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、及び０．５ｍＭ  ＺｎＣｌ２、ｐＨ７．２を含有するｄＰＢＳの３つの改変物に対して、４℃で一晩透析した。翌日、サンプルを透析から取り出し、濾過し（０．２μ）、ＢｉｏＴｅｋ  ＳｙｎｅｒｇｙＨＴＴＭ分光光度計で２８０ｎｍの吸光度によってタンパク質濃度を求めた。精製したタンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び解析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステム）によって評価した。ＬＡＬアッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ−Ｔ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ）を用いて内毒素レベルを測定した。精製したタンパク質を４℃で保存した。
【０４４８】
Ｎ末端Ａｖｉ−及び６Ｈｉｓタグ（配列番号５９６）を含む配列番号５１のアミノ酸４４〜７５０に対応する組換えヒトＰＳＭＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質（ヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤ、配列番号５５）をクローニングし、チンパンジー及びカニクイザルのＰＳＭＡ  ＥＣＤタンパク質について前述したように、発現させ、精製した。
【０４４９】
２−３  抗チンパンジー及び抗ヒトＰＳＭＡ  Ｆａｂの同定
組換えタンパク質を用いたパニング
４つのヒトＶＬ生殖系列遺伝子（Ａ２７、Ｂ３、Ｌ６、Ｏ１２）ライブラリと対になったＶＨ１−６９、３−２３、及び５−５１重鎖ライブラリからなるデノボヒトＦａｂ−ｐＩＸライブラリ［Ｓｈｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０１０．３９７（２）：ｐ．３８５−３９６．国際公開第２００９／０８５４６２号］の第１の溶液パニングを、製造元のプロトコルに従ってビオチン化チンパンジーＰＳＭＡ  ＥＣＤでコーティングされたストレプトアビジンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１２．０５Ｄ、ロット番号６２９９２９２０）にファージを捕捉し、続いて、製造元のプロトコルに従ってカニクイザルＰＳＭＡ−ＦｃでコーティングされたＰｒｏｔＧビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０００３Ｄ）にファージを捕捉し、続いて、製造元のプロトコルに従ってビオチン化チンパンジーＰＳＭＡ  ＥＣＤでコーティングされたＳｅｒａ−ｍａｇ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｐｅｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号７８１５−２１０４−０１１１５０）にファージを捕捉する１ラウンドを含む交互パニングアプローチを使用して実施した。このパニングから、２つのヒット：ＰＳＭＭ１８及びＰＳＭＭ２５を得た。
【０４５０】
抗ＰＳＭＡＦａｂの全細胞パニング
インプットとしての上記のチンパンジーＥＣＤパニング実験又は新たなデノボファージライブラリからの、ラウンド＃１アウトプットを使用して、全細胞に対して追加のパニング実験を行った。簡潔に述べると、ヘルパーファージ感染によってファージを産生し、当該技術分野において公知の標準的なプロトコルに従ってＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿により濃縮した。静かに揺動させながら、４℃で一晩、トランスフェクトされていない親ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上でファージライブラリを予め排除した（pre-cleared）。ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿後、予め排除したライブラリを、チンパンジーＰＳＭＡを発現しているＨＥＫ２９３細胞又はＬＮＣＡＰ細胞と共に、４℃で２時間、静かに揺動させながらインキュベートした。未結合のファージの除去及びファージに結合している細胞の回収をＦｉｃｏｌｌ勾配により行い、数回の洗浄段階後、結合ファージを保有する細胞を、揺動させることなく、３７℃で３０分間、１ｍＬのＴＧ−１大腸菌培養物と共にインキュベートした。得られた混合物をＬＢ−カルベニシリン−１％グルコースプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。次いで、その後のパニングラウンドのためにプロセスを繰り返した。
【０４５１】
大腸菌上清を生成するためのファージＦａｂ−ｐＩＸのＦａｂ−Ｈｉｓへの変換
得られたファージＦａｂ−ｐＩＸヒットを標準的な手順を用いてＦａｂ−Ｈｉｓに変換した。プラスミドＤＮＡをファージパニングした大腸菌（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１２９６３）から単離し、ＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ制限酵素消化に供した。得られた５４００及び１００ｂｐの断片を０．８％アガロースゲルで分離し、５４００ｂｐの断片をゲル精製した（ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット、Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２８００６）。精製した５４００ｂｐのバンドを、Ｔ４リガーゼを使用してセルフライゲーションさせ、得られた生成物（Ｆａｂ−ｈｉｓ融合体をコードしている）を、ＴＧ−１大腸菌株に形質転換し戻し、クローン的に単離した。１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む培養物を一晩誘導することによって、クローンからＦａｂ−Ｈｉｓ上清を生成した。一晩培養物を遠心分離した後、清澄化した上清は下流アッセイで使用する準備が整った。様々なＦａｂ−ｈｉｓ上清の相対発現レベルを求めるために、連続希釈した上清に対する抗カッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０６１−０５）ＥＬＩＳＡを実施した。試験した全てのクローンが、同様のＦａｂ−ｈｉｓ発現を示した（データは示さず）。
【０４５２】
大腸菌由来のＦａｂ−ｈｉｓ融合体の細胞結合
大腸菌上清由来の個々のＦａｂ−ｈｉｓ融合体のＰＳＭＡ発現細胞への結合能力を評価するために、細胞ベースの結合アッセイを設計した。ｐＩＸ切除後の全てのパニング実験のラウンド３のアウトプットから個々のＦａｂクローンを単離した。Ｆａｂクローンを、チンパンジー及びカニクイザルのＰＳＭＡ発現ＨＥＫ細胞、並びにＬＮＣａＰ細胞におけるヒトＰＳＭＡへの結合について試験した。簡潔に述べると、ＰＳＭＡ発現細胞を、１ウェルあたり２００，０００の密度でＶ底プレート（ＣｏＳｔａｒ  ３３５７）に分注し、氷上で１時間、Ｆａｂ断片を発現している（１００μＬ）上清と共にインキュベートした。２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで細胞を２回洗浄し、氷上で１時間、マウス抗ヒトカッパ−ＲＰＥ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＭＨ１０５１４）で染色した。２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで細胞を２回洗浄し、１００Ｌμの同じ洗浄バッファ中に再懸濁させた。ＢＤ  ＦＡＣＳアレイフローサイトメーターでプレートを読み取った。前方散乱及び側方散乱を使用して細胞の健常集団をライブゲーティングし、次いで、ＰＥ染色のためにこのゲート内の細胞を分析することによって、ＦＡＣＳデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにエクスポートした。３種全てのＰＳＭＡ（カニクイザル、チンパンジー、及びヒト）に対してバックグラウンドの≧３倍の結合を示し、ＨＥＫ２９３細胞株への結合は示さなかったＦａｂクローンを、「予備陽性」とラベル付けした。Ｆａｂを配列決定し、再スクリーニングのために哺乳類発現ベクターにクローニングするために持ち越した。哺乳類細胞で発現したＦａｂ上清のＰＳＭＡ発現細胞株への結合から、真の陽性を選択した。
【０４５３】
哺乳類Ｆａｂの調製
大腸菌Ｆａｂを哺乳類発現Ｆａｂに変換するために、製造元のプロトコルに従って、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローニング（ＣｌｏｎＴｅｃｈカタログ番号６３８９１８）を使用した。簡潔に述べると、一次スクリーニングを通過し、哺乳類Ｆａｂフォーマットに移されるクローンのヌクレオチド配列を、「ＩｎＦｕ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｉｎｄｅｒ  ｖ１．２．３」プログラム（インハウスで開発したソフトウェア）にロードし、これによって、ｈｕＫａｐｐａ＿ｍｕＩｇＧＳＰ及びｈｕＧ１  Ｆａｂ発現ベクターへのＩｎ−ＦｕｓｉｏｎクローニングのためのＰＣＲ断片を生成するために使用されるアイソタイプ特異的ＰＣＲプライマーのリストを生成する。これらのベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１に基づかないＣＭＶプロモータを有するインハウスベクターである。Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎプロセスに続いて、大腸菌クローンを単離し、配列を確認し、標準的なプロトコルを用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。５日後にトランスフェクションから２０ｍＬの上清を収集することにより、ＰＳＭＡ発現細胞株への結合を確認するための哺乳類ＰＳＭＡ  Ｆａｂを調製した。
【０４５４】
哺乳類ｓｕｐフォーマットにおける全細胞パニングからのヒットの再スクリーニング
既に記載した全細胞結合アッセイを用いて、哺乳類で発現したＦａｂ上清の確認を行った。ヒトＰＳＭＡ（ＬＮＣａＰ）、チンパンジー、及びカニクイザル細胞へのＦａｂの結合を試験することに加えて、親ＨＥＫ細胞株に結合しないことについてのカウンタースクリーニングを行った。表１９は、ＰＳＭＡ発現細胞に結合する哺乳類Ｆａｂ上清のヒットプロファイルを示す。大腸菌の上清からのヒットの多くは、哺乳類で発現したタンパク質では確認されなかった。ＰＳＭＭ４８は、カニクイザルＰＳＭＡ発現細胞への高い結合、及びチンパンジーＰＳＭＡ発現細胞へのいくらかの結合を示したが、ヒトＰＳＭＡを発現するＬＮＣａＰ細胞へは結合しなかった。ＰＳＭＭ５６は同様のプロファイルを示したが、ＬＮＣａＰ細胞にいくらか結合した。ＰＳＭＭ６９〜８０は、ＬＮＣａＰ細胞に結合したが、チンパンジーＰＳＭＡ発現細胞にもカニクイザルＰＳＭＡ発現細胞にも結合しなかった。哺乳類Ｆａｂ  ｓｕｐ  ＰＳＭＭ５２、Ｍ５６、及びＭ５７は、３つ全ての細胞株に結合した。ＰＳＭＭ５０、Ｍ５１、及びＭ５４は、より多くのチンパンジー又はカニクイザルへの結合を示す。Ｍ５８は、わずかなチンパンジー及びカニクイザルへの結合を示した。
【０４５５】
【表１６−１】
2021524249.tif 000020
【０４５６】
【表１６−２】
2021524249.tif 000021
【０４５７】
【表１６−３】
2021524249.tif 000022
【０４５８】
【表１６−４】
2021524249.tif 000023
【０４５９】
哺乳類で発現したＦａｂの用量応答曲線
哺乳類で発現したＦａｂクローンが、未希釈Ｆａｂ上清としてＰＳＭＡ発現細胞株への陽性結合について確認されてから、上清をＯｃｔｅｔ又はタンパク質ゲルによりタンパク質濃度に対して正規化し、用量応答曲線を完成させて、前述のプロトコルを用いてＰＳＭＡ結合を確認した。図２３〜図２５は、３つのＰＳＭＡ発現細胞の全てに対する結合が実証されたヒットの滴定曲線を示す。図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、及び２３Ｄは、抗ＰＳＭＡパニングヒット対ＬＮＣａＰ細胞の滴定曲線を示す。図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、及び２４Ｄは、抗ＰＳＭＡパニングヒット対チンパンジーＰＳＭＡ  ＨＥＫ細胞の滴定曲線を示す。図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄは、抗ＰＳＭＡパニングヒット対カニクイザルＰＳＭＡ  ＨＥＫ細胞の滴定曲線を示す。ヒット間の結合プロファイルを、異なる種のＰＳＭＡを発現する細胞株にわたって比較した。ＰＳＭＭ５２上清を、実験にわたって陽性対照として使用した。ＣＤＲにおけるＮ−結合型グリコシル化部位、ＰＳＭＡ陰性親ＨＥＫ細胞株への結合、又はＰＳＭＡ陽性細胞株への結合の欠如から、いくつかのヒットを優先から外した。１１個のＦａｂヒットが残っており、１０個のヒットをヒトＩｇＧ４−ＰＡＡ重鎖コンストラクトにクローニングし、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を生成するために使用した。これらのヒットは、互いの３倍以内の種間結合を示し、ＰＳＭＡ陽性標的のＴ細胞リダイレクション殺傷について試験される二重特異性抗体フォーマットに移した。各ヒットについてのパニング抗原を表２０に示す。
【０４６０】
【表１７】
2021524249.tif 000024
【０４６１】
抗ＰＳＭＡｍＡｂの調製
３つ全てのＰＳＭＡ発現細胞への結合が実証された合計１２個のクローンを、最終的には、制限クローニングによってＦｃ置換Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ（ＰＡＡ）アイソタイプを有するｍＡｂ  ＩｇＧ４に変換した。簡潔に述べると、初期スクリーニングを通過したＦａｂクローンに対応するコンストラクトをＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩで消化した。ゲル精製した断片を、完全ｍＡｂ発現のためにＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｖＤＲ０００２１５、ヒトＩｇＧ４−ＰＡＡ  Ｆｃを含有するＣＭＶ駆動発現ベクターを含む、発現ベクターにライゲーションした。これにより、二重特異性抗体の迅速生成が可能になった。既に記載した発現ベクターを使用して、各ＰＳＭＡ  ｍａｂの重鎖及び軽鎖を発現させ、両方のベクターをｍＡｂの発現のために２９３Ｅｘｐｉ又はＣＨＯ細胞株に一過的にコトランスフェクトした。ファージパニングから生成された種間陽性ＰＳＭＡ  ＦａｂのＣＤＲ配列を以下の表２１に示す。選択されたＦａｂのＶＨ及びＶＬ配列を以下の表２２に示す。Ｆａｂから生成されたｍＡｂの重鎖及び軽鎖配列を表２３に示す。
【０４６２】
【表１８】
2021524249.tif 000025
【０４６３】
【表１９−１】
2021524249.tif 000026
【０４６４】
【表１９−２】
2021524249.tif 000027
【０４６５】
【表２０−１】
2021524249.tif 000028
【０４６６】
【表２０−２】
2021524249.tif 000029
【０４６７】
【表２０−３】
2021524249.tif 000030
【０４６８】
【表２０−４】
2021524249.tif 000031
【０４６９】
配列番号１３０のＶＨ及び配列番号１３１のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１１９を生成した。配列番号１２８のＶＨ及び配列番号１２９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１２０を生成した。配列番号１２６のＶＨ及び配列番号１２７のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１２１を生成した。配列番号１２５のＶＨ及び配列番号１１１のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１２２を生成した。配列番号１２３のＶＨ及び配列番号１２４のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１２３を生成した。配列番号１２１のＶＨ及び配列番号１２２のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１２４を生成した。配列番号１１８のＶＨ及び配列番号１１９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１２６を生成した。配列番号１１６のＶＨ及び配列番号１１７のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１２７を生成した。配列番号１１４のＶＨ及び配列番号１１５のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１２８を生成した。配列番号１１０のＶＨ及び配列番号１１１のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１２９を生成した。配列番号１１２のＶＨ及び配列番号１１３のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単一特異性抗ＰＳＭＡ抗体ＰＳＭＢ１３０を生成した。
【０４７０】
２−５  抗ＰＳＭＡ  Ｆａｂ  ＰＳＭＢ８３（別名ＰＳＭＭ８４）に結合したヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤの結晶構造
ＰＳＭＡは、細胞表面上で発現するホモダイマータンパク質である。ＰＳＭＡは、ペプチダーゼ活性を有する大きなＥＣＤドメイン（７０５残基）、１回貫通ＴＭドメイン、及び短い１９残基の細胞内ドメインで構成される、１モノマーあたり７５０残基のＩＩ型内在性糖タンパク質である。ＰＳＭＡと抗体との間の結合部位についてより深く理解するために、二重特異性抗体ＰＳ３Ｂ２７の抗ＰＳＭＡ  Ｆａｂアームに結合したヒトＰＳＭＡの細胞外領域（ＥＣＤ）の結晶構造を３．１５Åの分解能で決定した。
【０４７１】
ヒトＰＳＭＡ（残基４４〜７５０）の細胞外領域を、Ｎ末端ｇｐ６７シグナルペプチド、続いて、切断可能なヘキサヒスチジンタグ（配列番号５９６）を含むＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）昆虫細胞で発現させた。最初のＮｉ２＋−ＮＴＡ親和性捕捉、ＴＥＶに媒介されるヒスチジンタグの切断、続いて、逆アフィニティクロマトグラフィー段階、及び最後のサイズ排除クロマトグラフィー段階を含む３段階手順により、上清から分泌タンパク質を精製した。精製されたＰＳＭＡ−ＥＣＤを液体窒素中で急速冷凍し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２中において−８０℃で保存した。
【０４７２】
二重特異性抗体ＰＳ３Ｂ２７における親抗ＰＳＭＡ  ＦａｂアームであるＰＳＭＢ８３（別名ＰＳＭＭ８４）のＦａｂを、ヘキサヒスチジンタグ（配列番号５９６）を含むＨＥＫ２９３  Ｅｘｐｉ細胞で発現させ、アフィニティクロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−３００、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｙａｒｒａ）を用いて精製した。Ｆａｂを、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４中において４℃で保存した。
【０４７３】
３段階手順によってヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤ／ＰＳＭＢ８３  Ｆａｂ複合体を調製した。最初に、Ｆａｂを２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌにバッファ交換した。次いで、Ｆａｂ及びＰＳＭＡを混合し（ＰＳＭＡモノマーに対して１．５モル過剰のＦａｂ）、２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０に透析しながら、４℃で一晩インキュベートした。最後に、複合体を２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０中でｍｏｎｏＳ  ５／５０カラムに結合させ、ＮａＣｌ勾配で溶出した。
【０４７４】
２０℃におけるシッティングドロップ蒸気拡散法及びＭｏｓｑｕｉｔｏ  ＬＣＰロボット（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて、Ｘ線回折に好適な結晶を得た。マイクロシード及び最初は７．３ｍｇ／ｍＬのＰＳＭＡ／Ｆａｂ複合体を用いて、１８％  ＰＥＧ  ３ｋＤａ、０．２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５から、ヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤに結合したＰＳＭＢ８３  Ｆａｂの結晶を成長させた。最初は８．８ｍｇ／ｍＬのＦａｂを用いて、２５％  ＰＥＧ  ３ｋＤａ、０．２Ｍ  ＬｉＣｌ、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ４．５から遊離ＰＳＭＢ８３  Ｆａｂの結晶を得た。
【０４７５】
Ｐｈａｓｅｒ（Ｐｈａｓｅｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）による分子置換（ＭＲ）によって構造を解析した。ＰＳＭＢ８３（別名ＰＳＭＭ８４）Ｆａｂ構造のＭＲ検索モデルは、ＰＤＢコード４Ｍ６Ｏであった。ＭＲ検索モデルとしてＰＳＭＡ（ＰＤＢコード：２Ｃ６Ｇ）及びＰＳＭＢ８３  Ｆａｂ（１．９３Å分解能の構造、データは示さない）の結晶構造を使用して、ＰＳＭＡ／Ｆａｂ複合体構造を解析した。ＰＨＥＮＩＸにより構造を精密化し（Ａｄａｍｓ，ｅｔ  ａｌ，２００４）、ＣＯＯＴを用いてモデル調整を行った（Ｅｍｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃｏｗｔａｎ，２００４）。他の全ての結晶学的計算をＣＣＰ４プログラムスイートで行った（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４，１９９４）。ＰｙＭｏｌ（ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４．１，Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）で全ての分子グラフィクスを作成し、相補性決定領域（ＣＤＲ）をＫａｂａｔの定義を用いて決定した。
【０４７６】
ＰＳＭＡ／Ｆａｂ構造は、Ｆａｂ軽鎖残基１〜２１１、Ｆａｂ重鎖残基１〜２２４（無秩序である残基１３８〜１４６を除く）、及びＰＳＭＡ残基５６〜７５０を含み、これは、プロテアーゼ（残基５６〜１１６及び３５２〜５９０）、アピカル（残基１１７〜３５１）及びヘリカル（残基５９１〜７５０）ドメイン、並びにＰＳＭＡダイマーサブユニットあたり１０個の可能なＮ−結合型グリカンのうちの７個（Ａｓｎ−７６、−１２１、−１４０、−１９５、−４５９、−４７６、及び−６３８）に対応する。ＰＳＭＡ活性部位は、３つのドメイン間の界面に位置し、ヒスチジン（Ｈ３７７及びＨ５５３）及びグルタミン酸／アスパラギン酸（Ｄ３８７、触媒活性を有するＥ４２４、Ｅ４２５、及びＤ４５３）の残基、並びに水分子が配位している２個の亜鉛原子を含有している。結晶非対称単位は、ＰＳＭＢ８３  Ｆａｂと同様に結合した各サブユニットを有する１つのＰＳＭＡダイマーを含有する。Ｆａｂ／ＰＳＭＡの結合部位は、結合残基の信頼できる位置決めを可能にする電子密度マップによってよく定義される。Ｆａｂ及びＰＳＭＡ分子は、図２６〜図３１で逐次付番される。
【０４７７】
ＰＳＭＢ８３エピトープ、パラトープ、及び相互作用。二重特異性抗体ＰＳ３Ｂ２７における親抗ＰＳＭＡ  ＦａｂアームであるＰＳＭＢ８３は、ＰＳＭＡのアピカルドメインにおける配座エピトープ及び不連続エピトープを認識する（図２６）。Ｆａｂに埋もれているＰＳＭＡ表面積は、約７００Å２である。具体的には、ＰＳＭＢ８３エピトープ残基は、Ｉ１３８、Ｆ２３５、Ｐ２３７、Ｇ２３８、Ｄ２４４、Ｙ２９９、Ｙ３００、Ｑ３０３、Ｋ３０４、Ｅ３０７、及びＫ３２４〜Ｐ３２６である。ヘリックスα７（残基Ｙ２９９〜Ｅ３０７）はエピトープの優勢領域であり、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖ＣＤＲにわたって結合する。ヘリックスの一端において、Ｙ２９９及びＹ３００は、Ｆａｂ残基Ｙ５７Ｈ、Ｗ９４Ｌ、並びにＰＳＭＡ残基Ｆ２３５及びＰ２３７と芳香族クラスタを形成し、一方、他のヘリックス末端におけるＥ３０７は、Ｒ９１Ｌとの塩架橋及び水素結合Ｙ３２Ｌを形成する。図２７及び図２８は、ＰＳＭＢ８３軽鎖及び重鎖とのＰＳＭＡの主な相互作用を示す。ＰＳＭＢ８３エピトープ残基は、ヒトとカニクイザルとの間で保存されており（図２９）、二重特異性抗体ＰＳ３Ｂ２７は、ヒト及びカニクイザルＰＳＭＡと同様の親和性で結合することが実証された。対照的に、ヒトの、マウスＧ２３８Ａ及び特にＹ３００Ｄのエピトープへの変異は、ヒトと比較してマウスＰＳＭＡに対するＰＳＭＢ８３結合親和性が低いと予想される。Ｙ３００Ｄ変異は、Ｎ５９Ｈとの水素結合接触及びＷ９４Ｌとのπスタッキング相互作用を妨害する。
【０４７８】
ＰＳＭＢ８３パラトープは、ＣＤＲ−Ｌ２及び−ＣＤＲ−Ｈ１を除く全てのＣＤＲ由来の残基で構成されている（図３０）。具体的には、パラトープ残基は、軽鎖Ｓ３０Ｌ、Ｙ３２Ｌ、Ｒ９１Ｌ、Ｓ９２Ｌ、Ｗ９４Ｌ、並びに重鎖Ｇ５６Ｈ〜Ｎ５９Ｈ、Ｋ６５Ｈ、Ｇ６６Ｈ、Ｙ１０１Ｈ、Ｖ１０７Ｈ、及びＤ１０９Ｈである。図３１は、ＰＳＭＡとＰＳＭＢ８３との間の相互作用接触を示す。エピトープのアクセス可能な位置は、ＰＳ３Ｂ２７二重特異性抗体におけるＰＳＭＢ８３  Ｆａｂアームの膜結合ＰＳＭＡへの結合を促進し、一方、他のＦａｂアームは、Ｔ細胞膜におけるＣＤ３に依然として結合している。ＰＳＭＢ８３は、抗体が活性部位から離れて結合し、酵素機能に影響を及ぼす可能性があるＰＳＭＡにおける何らかの大きな構造変化、例えば、活性部位を閉鎖するループ移動又は触媒残基の置換（Ｆａｂに結合している及び結合していない（Ｂａｒｉｎｋａ  Ｅｔ  ａｌ，２００７）構造におけるＰＳＭＡ分子のＣα重ね合わせについては０．３ÅのＲＭＳＤ）を引き起こさないので、ＰＳＭＡ酵素活性を阻害しないと予想される。
【０４７９】
２−６  抗ＰＳＭＡ親和性成熟
親ＰＳＭＢ１２７（ｆａｂ  ＩＤ＝ＰＳＭＢ８３、別名ＰＳＭＭ８４）と比較して結合親和性が増加した抗体を同定するために、２つのＰＳＭＡ親和性成熟ライブラリからの抗ＰＳＭＡ  Ｆａｂファージクローンに対して親和性成熟を行った。ＰＳＭＢ１２７の親和性成熟のために２つのライブラリを生成した）。第１のライブラリにおいて、重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２を表２４（ＰＨ９Ｈ９Ｌ１）の設計に従ってランダム化した。Ｈ−ＣＤＲ３断片をｐＤＲ００００２４０３２からＰＣＲで増幅させ、ＳａｃＩＩ＋ＸｈｏＩで消化した。この断片をＰＨ９Ｈ９Ｌ１／ＰＨ９Ｌ３ライブラリにクローニングした。これを大腸菌ＭＣ１０６１Ｆ’細胞に形質転換し、このＦａｂライブラリをディスプレイするファージを生成した。第２のライブラリにおいて、軽鎖ＣＤＲを表２５（ＰＨ９Ｌ３Ｌ３）の設計に従ってランダム化した。ＰＳＭＢ８３（ＰＳＭＨ３６０）からの重鎖をＰＣＲで増幅し、ＮｃｏＩ＋ＸｈｏＩで消化した。この断片をＰＨ９Ｌ３Ｌ３ライブラリＤＮＡ（ＥＬＮ：デノボ２０１０ファージライブラリＳＲＩ−０２１）にクローニングした。これを大腸菌ＭＣ１０６１Ｆ’細胞に形質転換し、このＦａｂライブラリをディスプレイするファージを生成した。
【０４８０】
【表２１】
2021524249.tif 000032
【０４８１】
【表２２】
2021524249.tif 000033
【０４８２】
ＰＳＭＡ親和性成熟Ｆａｂ−ｐＩＸライブラリの溶液パニングを、３ラウンドにわたってビオチン化ヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤに対して行った。ファージに結合した抗原を、製造元のプロトコルに従ってニュートラアビジンビーズ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号７８１５２１０４０１１１５０）に捕捉し、続いて、１×ＰＢＳＴ（ｔｗｅｅｎ２０中０．０５％）で広範に洗浄し、５００倍モル過剰のビオチン化抗原中非標識ＰＳＭＡ  ＥＣＤと共に１時間インキュベートした。このパニングにより、クローン、ＰＳＭＸＰ４６Ｒ３＿５９Ｈ０９、ＰＳＭＸＰ４６Ｒ３＿５９Ｈ０６、ＰＳＭＸＰ４６Ｒ３＿５９Ｅ０３、ＰＳＭＸＰ４６Ｒ３＿５９Ｃ０９，ＰＳＭＸＰ４６Ｒ３＿５９Ｈ０１、ＰＳＭＸＰ４６Ｒ３＿５９Ｆ１１、及びＰＳＭＸＰ４６Ｒ３＿５９Ｆ０７が得られた。
【０４８３】
抗ＰＳＭＡ  ｆａｂクローンの発現レベルを決定するために、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂプレートを、４℃で一晩抗ヒトＦｄ  ＩｇＧでコーティングし、洗浄し、３％ミルク−ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで１時間ブロッキングした。最後のウェルブランクを用いて、１１個の希釈液についてファージ上清サンプルをブロッキングバッファで２倍連続希釈した。１００μＬのこれらの溶液を、コーティングされたプレート上に１時間にわたって捕捉した。プレートを洗浄し、１００μＬの抗Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ抗体を１時間にわたって添加した。プレートを洗浄し、１００μＬのペルオキシダーゼ試薬で発色させ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎで発光を読み取った（図３２）。
【０４８４】
抗ＰＳＭＡ  ｆａｂクローンのヒト及びカニクイザル組換えタンパク質への結合を決定するために、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂプレートを、４℃で一晩、５μｇ／ｍＬのニュートラアビジン１００μＬでコーティングした。プレートを洗浄し、３％ミルク−ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで１時間ブロッキングした。組換えビオチン化ヒト及びカニクイザルＰＳＭＡタンパク質を、室温で１時間にわたって、２．５μｇ／ｍＬで捕捉した。プレートを洗浄し、２倍連続希釈したｆａｂ上清１００μＬを、ＲＴで１時間にわたって捕捉した。プレートを洗浄し、次いで、ＰＢＳＴ中０．３％ミルク２００μＬと共に２．５時間インキュベートして、親和性の弱いｆａｂの一部を洗い流した。次いで、新たなＰＢＳＴ中の０．３％ミルク２００μＬと共に更に３０分間インキュベートして、親和性の弱いｆａｂを更に除去した。プレートを洗浄し、１００μＬの抗Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ抗体を１時間にわたって添加した。プレートを洗浄し、１００μＬのペルオキシダーゼ試薬で発色させ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎで発光を読み取った（図３３及び３４）。
【０４８５】
図３２は、親Ｆａｂ及び親和性成熟Ｆａｂのタンパク質発現が類似していることを示す。ｙ軸の値は、希釈曲線にわたってｆａｂタンパク質の存在量に等しい検出試薬の発光を表し、発光の読み取り値が高いほど、連続的な２倍希釈で減少させたウェル内のタンパク質がより多い。親和性成熟ｆａｂを有するウェルにはより多くのタンパク質が存在していたが、ＥＣ５０値（最大応答の半分を与えるタンパク質の濃度である）によって示されるように、親に対する増加は最大で５倍である。これらのデータは、図３３におけるＰＳＭＡ結合プロファイルの差を示しており、図３４は、Ｆａｂ濃度の差によるものではない。
【０４８６】
図３３は、親和性成熟Ｆａｂのヒト組換え抗原に対する結合が親抗ＰＳＭＡ  Ｆａｂ（ＰＳＭＢ８３）よりも改善されたことを示す。ここでもまた、グラフのｙ軸は、発光値を表す。この場合、値が大きいほど、ヒトＰＳＭＡタンパク質に結合したＦａｂがより多いことを意味する。これは、（ｘ軸に沿って）Ｆａｂの濃度を増加させるにつれて高い発光値が生じる、結合の尺度である。高濃度であってもシグナルが存在しないことによって実証されるように、これらの条件下での親Ｆａｂの結合はごくわずかであった（ｘ軸に沿った白丸）。親和性成熟ｆａｂの結合は、試験された濃度にわたって観察され、これは、ヒトＰＳＭＡタンパク質に対する結合能がより強いことと等しい。ヒトＰＳＭＡタンパク質に対する親Ｆａｂ結合がゼロであることに鑑みて、ＥＣ５０を生成することはできなかった。
【０４８７】
図３４は、親和性成熟Ｆａｂのカニクイザル組換え抗原に対する結合が親抗ＰＳＭＡ  Ｆａｂ（ＰＳＭＢ８３）よりも改善されたことを示す。ここでもまた、グラフのｙ軸は、発光値を表す。この場合、値が大きいほど、カニクイザルＰＳＭＡタンパク質に結合したＦａｂがより多いことを意味する。これは、（ｘ軸に沿って）Ｆａｂの濃度を増加させるにつれて高い発光値が生じる、結合の尺度である。高濃度であってもシグナルが存在しないことによって実証されるように、これらの条件下での親Ｆａｂの結合はごくわずかであった（ｘ軸に沿った白丸）。親和性成熟Ｆａｂの結合は、試験された濃度にわたって観察され、これは、ヒトＰＳＭＡタンパク質に対する結合能がより強いことと等しい。ヒトＰＳＭＡタンパク質に対する親Ｆａｂ結合がゼロであることに鑑みて、直接比較するためのＥＣ５０を生成することはできなかった。
【０４８８】
全体として、ファージのＦａｂ結合プロファイルは、ヒト及びカニクイザル組換え抗原に対する結合が親抗ＰＳＭＡ  ｍＡｂ（ＰＳＭＢ１２７）よりも改善されたことを示す。この改善は、Ｆａｂ発現レベルに対して正規化された親和性成熟Ｆａｂの結合を示す図３４及び図３５によって実証されるように、Ｆａｂ発現プロファイルの違いの結果ではない。ＥＬＩＳＡスクリーニングから同定された上位５つのＦａｂ候補を、ＩｇＧ４  ＰＡＡにおいてモノクローナル抗体フォーマットで産生した。表２６は、後続のＭａｂ識別子を列挙し、表２７及び表２８は、それぞれ、その可変領域の配列並びに重鎖及び軽鎖の配列を示す。
【０４８９】
【表２３】
2021524249.tif 000034
【０４９０】
【表２４】
2021524249.tif 000035
【０４９１】
【表２５−１】
2021524249.tif 000036
【０４９２】
【表２５−２】
2021524249.tif 000037
【０４９３】
３つの異なるＨＣ及び４つの異なるＬＣをマトリックス形式で組み合わせて、ヒットの相違を拡大した（表２９）。ＰＳＭＨ８６０のＣＤＲ２におけるメチオニンが翻訳後リスクであることに鑑みて、Ｍ６４Ｌを有する新たな配列が生成され、ＰＳＭＨ８６５として同定した。ＰＳＭ８６５はＰＳＭＬ１６０と対になって、Ｍａｂ  ＰＳＭＢ３６５を生成した。
【０４９４】
【表２６】
2021524249.tif 000038
【０４９５】
表３０及び３１は、それぞれ、マトリックスで組換えた可変領域の配列並びに重鎖及び軽鎖の配列を示す。
【０４９６】
【表２７】
2021524249.tif 000039
【０４９７】
【表２８−１】
2021524249.tif 000040
【０４９８】
【表２８−２】
2021524249.tif 000041
【０４９９】
【表２８−３】
2021524249.tif 000042
【０５００】
表３２は、全ての親和性成熟ＰＳＭＡヒットについてのＣＤＲ配列を示す。
【０５０１】
【表２９】
2021524249.tif 000043
【０５０２】
３  ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の調製及び機能評価
３−１  ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の生成
２種類の親和性成熟ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を生成した：高親和性ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ３７６（ＶＨ配列番号６５２、ＶＬ配列番号６６１、ＨＣ配列番号６４０、ＬＣ配列番号６７６）ＣＤ３アーム又は低親和性ＣＤ３Ｂ４５０（ＶＨ配列番号６５７、ＶＬ配列番号６７８、ＨＣ配列番号６７５、ＬＣ配列番号６７７）アームで組換えされた標的アーム（例えば、親和性成熟抗ＰＳＭＡ）に特異的なものである。
【０５０３】
これらの親ｍＡｂは、ターゲティング親（ＰＳＭＡ）が４０９ＲＧｅｎＭａｂ変異（ＩｇＧ４のネイティブアミノ酸）を含有し、一方、殺傷親（ＣＤ３）はＦ４０５ＬＧｅｎＭａｂ変異及びＲ４０９Ｋ変異を含有する、ＧｅｎＭａｂフォーマット（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）である。単一特異性抗ＣＤ３抗体を、そのＦｃ領域にＦｃ置換Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ（ＣＤ３アーム）（ＥＵインデックスに従って付番）を有するＩｇＧ４として発現させた。ターゲティング親（ＰＳＭＡ）は、Ｆｃ置換Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ４上にある。単一特異性抗体を、ＣＭＶプロモータ下においてＨＥＫ細胞株中で発現させた。
【０５０４】
親ＰＳＭＡ及びＣＤ３抗体を、１００ｍＭ  ＮａＡｃ  ｐＨ３．５の溶出バッファ及び２．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．２の中和バッファを用いたプロテインＡカラムを使用して精製した。中和された親ｍＡを使用して、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を作製した。親ｍａｂの一部を、更に、分析測定及びアッセイのために、Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．２バッファにバッファ交換した。
【０５０５】
精製後、制御されたＦａｂアーム交換を行い、二重特異性抗体を作製した。親ＰＳＭＡ抗体を、７５ｍＭ  −２−ＭＥＡ（２−メルカプトエチルアミン）中の還元条件下で所望の親ＣＤ３抗体と混合し、３１℃で４時間又は室温で一晩インキュベートした。組換え反応は、モル比に基づくものであり、ここでは、組換え後に残存するＣＤ３親ｍＡｂを最小化するために６％過剰のＰＳＭＡ親ｍＡを使用した。その後、組換え物を１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して透析して、還元剤を除去した。
【０５０６】
組換え反応で使用した親ｍＡｂ（すなわち、ＰＳＭＡ、ＣＤ３、又はヌル）と共に、産生された最終二重特異性抗体を表３３に列挙する。
【０５０７】
選択されたＰＳＭＡヒットを非殺傷アーム（ヌル）と対にして、試験目的のための陰性対照を作製した。対照二重特異性抗体の場合、Ｂ２Ｍ１、ＩｇＧ４  ＰＡＡフォーマット（ＶＨ配列番号６１０、ＶＬ配列番号６１１）におけるＲＳＶ抗体を生成し、精製し、それぞれ、ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９−Ｆ４０５Ｌ、Ｒ４０９Ｋのいずれかと組み合わせてＣＤ３Ｂ２８８（ＣＤ３×ヌル）を、又はＰＳＭＡアームＰＳＭＢ１２２、ＰＳＭＢ１２６、ＰＳＭＢ１３０のいずれかと組み合わせてＰＳ３Ｂ３７、ＰＳ３Ｂ３９及びＰＳ３Ｂ４０（ＰＳＭＡ×ヌル）を生成した。これらのＰＳＭＡ特異的親和性成熟Ｍａｂを（上記の方法のように）ＣＤ３Ｂ２１９及びＣＤ３Ｂ３７６と交差させて、表３２に示す二重特異性抗体を生成した。
【０５０８】
【表３０】
2021524249.tif 000044
【０５０９】
３−２  ＬＮＣＡＰ細胞結合におけるＰＳＭＡ×ＣＤ３親和性成熟二重特異性Ａｂの評価
ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体を、ＰＳＭＡ陽性細胞株、ＬＮＣＡＰ、ＰＳＭＡ陰性細胞株、ＰＣ３への結合について試験した。ＰＳＭＡ二重特異性抗体の結合能を評価するために、（既に記載した通りの）細胞結合アッセイを利用した。二重特異性抗体をタンパク質濃度について正規化した後、ヒト又はカニクイザルＰＳＭＡのいずれかを発現している同じ数の細胞と共にインキュベートした。各濃度のＭＦＩをフローサイトメトリーによって収集し、濃度の関数としてプロットした。データをｌｏｇ１０を介して変換し、次いでプロットした。結合曲線の非線形回帰を行って、ＥＣ５０を求めた。
【０５１０】
これらの相対値を、標的細胞に対するＰＳＭＡ結合をランク付けするために使用した。図１４〜１６は、調製した全ての二重特異性抗体のＬＮＣＡＰ結合を示す。図１６では、コンストラクトのいずれもＰＳＭＡ陰性細胞株への結合を示さなかった。図１４及び図１５では、親和性成熟ヒットは全て、親Ｍａｂ、ＰＳ２Ｂ２７と比較して、曲線の左側へのシフト及びｃＭａｘの増加を通して結合親和性の増加を示した。
【０５１１】
組換えカニクイザルＰＳＭＡ  ＥＣＤとヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤとの親和性成熟二重特異性抗体の相互作用を、組換えチンパンジーＰＳＭＡ  ＥＣＤについて既に記載した通り、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験した。二重特異性抗体の全てが、実質的に同じ親和性で両標的に結合し、ＫＤは、ヒトＰＳＭＡ  ＥＣＤについては０．０５ｎＭ〜０．２７ｎＭの範囲であり、カニクイザルＰＳＭＡ  ＥＣＤについては０．０５ｎＭ〜０．２３ｎＭの範囲である。
【０５１２】
３−３  機能性細胞殺傷アッセイにおけるＰＳＭＡ×ＣＤ３親和性成熟二重特異性Ａｂの評価
上記データ、親和性測定値、及び配列同一性に基づいて、ＣＤ３Ｂ２１９又はＣＤ３Ｂ３７６のいずれかとの二重特異性物として、３つのＰＳＭＡ抗体、ＰＳＭＢ３４７、ＰＳＭＢ３６０、及びＰＳＭＢ３６５を、ＰＳＭＡ特異的なリダイレクトされたＴ細胞の細胞傷害を媒介する能力について更に特性評価した。活性カスパーゼ３／７による蛍光基質の切断を介して細胞殺傷を間接的に測定するカスパーゼ細胞傷害アッセイを用いて、Ｔ細胞媒介性殺傷を測定した。基質の切断により蛍光ＤＮＡ色素が得られ、蛍光は細胞核に制限される。同じ座標でウェルを正確に撮像することができる電動式１０倍対物レンズを使用して、アッセイの全過程を通して各ウェルにおいて繰り返し蛍光測定を行う。規定のサイズ制限に基づいて及び／又は二次標識の使用を通して、標的細胞集団を特定する。冷凍した汎ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡから購入）を、正常健常ドナーから陰性選択によって単離した。ＰＳＭＡを発現している前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ、Ｃ４２）を、１０％  ＨＩ  ＦＢＳ＋補給物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）を含むＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。
【０５１３】
Ｔ細胞及び標的細胞を、選択試薬なしで、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ＋１０％  ＦＢＳ及び補給物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で合わせ、製造元ガイドラインに従って細胞各１ｍＬに対して０．６μＬのＮｕｃＶｉｅｗカスパーゼ試薬（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した。総体積０．１ｍＬの細胞を、透明な９６ウェル平底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）の適切なウェルに添加した。ＰＳ３Ｂ２７（ＣＤ３×ＰＳＭＡ）、ＣＤ３Ｂ２８８（ＣＤ３×ヌル）、又はＰＳ３Ｂ４６（ＰＳＭＡ×ヌル）二重特異性抗体を、上記のように調製したフェノールレッド不含ＲＰＭＩ中２×最終濃度で調製し、０．１ｍＬの化合物を各ウェルに添加した。ウェルの縁部における細胞凝集を最小化するために室温で３０分間インキュベートした後、プレートをＺｏｏｍ  Ｉｎｃｕｃｙｔｅ機器（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に移した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ機器は、３７℃、５％ＣＯ２に設定された加湿インキュベータ内に存在する。
【０５１４】
Ｉｎｃｕｃｙｔｅにおける処理の解像度は、製造ガイドラインに従って、試験される各細胞株に対して設計した。カスパーゼシグナルにおいてプラトーが観察され、続いて、最高濃度の試験化合物を含有するウェルにおける最大シグナルから３回以上の連続的な減少が観察されるまで、６時間ごとに測定を行った。図１７のデータが示すように、ＰＳ３Ｂ８０、ＰＳ３Ｂ７９、ＰＳ３Ｂ８９、ＰＳ３Ｂ９０、ＰＳ３Ｂ６３、及びＰＳ３Ｂ７２の曲線は左にシフトし、これはＰＳ３Ｂ２７に対する効力の増加を示す。ヌルアーム対照は、予想どおり細胞死を誘導しなかった。
【０５１５】
３−４  ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＬｎＣａＰ異種移植片の腫瘍形成予防における抗腫瘍有効性
ヒトＴ細胞で腹腔内（ｉｐ）ヒト化された雄ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスにおける、樹立された３Ｄ  ＬｎＣａＰ  ＡＲ．ＴＢヒト前立腺癌異種移植片において、ＰＳ３Ｂ７９及びＰＳ３Ｂ９０の有効性を評価した。２．５若しくは５ｍｇ／ｋｇのＰＳ３Ｂ７９及びＰＳ３Ｂ９０、又はヌル×ＣＤ３Ｂ３７６抗体対照を、合計８回、３６、３９、４３、４７、５０、５３、５６、６０、及び６３日目にｑ３ｄ〜ｑ４ｄで投与した。１群あたり９頭の動物が残っていた試験の最後の日である腫瘍移植後５３日目に、腫瘍増殖抑制（％ＴＧＩ）を計算した。ヌル×ＣＤ３対照と比較して統計的に有意な腫瘍増殖阻害は、ＰＳ３Ｂ７９については５ｍｇ／ｋｇで４２％  ＴＧＩ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を伴う二元配置分散分析、＊ｐ≦０．０００１、図２１）、並びにＰＳ３Ｂ９０については２．５及び５ｍｇ／ｋｇでそれぞれ５３％及び３３％  ＴＧＩ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を伴う二元配置分散分析、＊ｐ≦０．００１、図２２）が観察された。したがって、ＣＤ３Ｂ３７６は、インビボでＴ細胞活性化及び細胞傷害を誘導することができ、その結果、高親和性ＰＳＭＡ結合アーム、ＰＳＭＢ３６０及びＰＳＭＢ３６５を有する二重特異性フォーマットにおける腫瘍増殖阻害をもたらすことができる。
【０５１６】
４  ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体の調製及び機能評価
本開示の二重特異性抗体に使用され、使用するのに好適なＩＬ１ＲＡＰモノクローナル抗体は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７０１２１４２０（Ａ１）号に記載されている。１５個の単一特異性ＩＬ１ＲＡＰ抗体（米国特許出願公開第２０１７０１２１４２０（Ａ１）号の表６を参照されたい）は、Ｆｃ置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａを有するＩｇＧ４として発現した。ＣＤ３親ｍＡｂは、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋを有するＩｇＧ４として発現した（ＥＵインデックスに従って付番）。配列番号９２のＶＨ及び配列番号９３のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域と、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を有するＩｇＧ４定常領域とを含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ２２０も生成した。
【０５１７】
プロテインＡカラムを用い、標準的な方法を用いて単一特異性抗体を精製した。溶出後、プールをｐＨ７に中和し、１×Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．２に透析した。
【０５１８】
（国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載の通り）制御されたＦａｂアーム交換を通して単一特異性ＣＤ３  ｍＡｂ（ＣＤ３Ｂ３７６：配列番号６５２のＶＨ及び配列番号６６１のＶＬ又はＣＤ３Ｂ４５０：配列番号６５７のＶＨ及び配列番号６７８のＶＬ）及び単一特異性ＩＬ１ＲＡＰ  ｍＡｂと組み合わせることにより、二重特異性ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３抗体を生成した。簡潔に述べると、ＤＰＢＳ、ｐＨ７〜７．４中約１〜２０ｍｇ／ｍＬの、モル比１．０８：１の抗ＩＬ１ＲＡＰ／抗ＣＤ３抗体を７５ｍＭの２−メルカプトエタノールアミン（２−ＭＥＡ）と混合し、２５〜３７℃において２〜６時間インキュベートし、続いて、透析、ダイアフィルトレーション、接線流濾過により２−ＭＥＡを除去して、還元剤を除去し、二重特異性抗体の形成を可能にした。
【０５１９】
ＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖を以下の表３４に示す。
【０５２０】
【表３１】
2021524249.tif 000045
【０５２１】
１５個のＩＬ１ＲＡＰ  ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ配列を以下の表３５に示す。
【０５２２】
【表３２−１】
2021524249.tif 000046
【０５２３】
【表３２−２】
2021524249.tif 000047
【０５２４】
【表３２−３】
2021524249.tif 000048
【０５２５】
【表３２−４】
2021524249.tif 000049
【０５２６】
【表３２−５】
2021524249.tif 000050
【０５２７】
【表３２−６】
2021524249.tif 000051
【０５２８】
【表３２−７】
2021524249.tif 000052
【０５２９】
【表３２−８】
2021524249.tif 000053
【０５３０】
４−１  全血Ｔ細胞傷害アッセイにおけるＩＬ１ＲＡＰ二重特異性抗体の評価
方法：腫瘍細胞株ＬＡＭＡ−８４をＤＰＢＳで洗浄した後、１０×１０６細胞／ｍＬ（ＣＦＳＥ）で、室温で８分間、ＣＦＳＥ（１５０μＬ  ＤＭＳＯに再懸濁し、１：１０，０００希釈）と共にインキュベートした。染色をＨＩ  ＦＢＳでクエンチし、培地で洗浄した後、２×１０５細胞／ｍＬで完全培地に再懸濁させた。等体積の全血及びＣＦＳＥ染色腫瘍細胞を９６ウェルプレートの各ウェルにおいて合わせた。それぞれのウェルに抗体（１０μＬのＤＰＢＳ中に再懸濁）を添加した後、全てのプレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。未希釈のＣＤ２５−ＰＥを全血の各ウェルに直接添加し、室温で３０分間インキュベートし、光から保護した。次いで、細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、２００μＬの複数種赤血球溶解バッファで溶解し、更に４回繰り返した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｎｅａｒ−ＩＲ（ＤＰＢＳで希釈）で１５分間染色した（表３６）。各ウェルを洗浄し、ＦＡＣＳバッファ中に再懸濁させた後、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩで細胞を取得した。
【０５３１】
【表３３】
2021524249.tif 000054
＊ＮＡ＝該当なし
【０５３２】
ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）での細胞取得は、１×１０４腫瘍細胞に限定された。細胞集団を特定するためのＦＳＣ及びＳＳＣ、次いで、ＣＦＳＥ陽性腫瘍事象、最後に、腫瘍細胞傷害を評価するためのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｎｅａｒ−ＩＲでゲーティングすることによって、腫瘍細胞死を評価した。細胞集団を特定するためのＦＳＣ及びＳＳＣ、ＣＦＳＥ陰性事象、生細胞を評価するためのＮｅａｒ−ＩＲ陰性事象、次いで、ＣＤ２５陽性細胞でゲーティングすることによって、Ｔ細胞活性化を評価した。死腫瘍細胞又はＣＤ２５陽性細胞のいずれかの百分率を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いてグラフ化し、非線形曲線フィットで分析した。非線形混合効果モデルを使用して集団ＥＣ５０値を求めるために、プログラム「Ｒ」において追加の統計分析を評価した。
【０５３３】
結果：ｓＩＬ１ＲＡＰを含有する生理学的末梢全血状態を再現するために、ＩＣ３Ｂ１９（ＩＡＰＢ５７×ＣＤ３Ｂ２１９）及びＩＣ３Ｂ３４（ＩＡＰＢ５７×ＣＤ３Ｂ３７６）を、全血を利用するエクスビボＴ細胞リダイレクションアッセイにおいて評価した。外因的に添加したＩＬ１ＲＡＰ＋ＬＡＭＡ−８４細胞株（２×１０４細胞／ウェル）を、４８時間かけてＩＣ３Ｂ１９、ＩＣ３Ｂ３４、及びヌルアーム対照二重特異性抗体と共に健常対照ヒト末梢全血（ｎ＝１５ドナーサンプル）に添加した。図５３に示す通り、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４は、４８時間後にエクスビボにおいてＩＬ１ＲＡＰ＋ＬＡＭＡ−８４細胞株の同様のＴ細胞媒介細胞傷害を誘導した。図５３に提示されるＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４細胞傷害のＥＣ５０値は、それぞれ２．０９７及び２．７６２であった（表３７）。同様に、図５４によって表されるＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４によるＴ細胞活性化（ＣＤ２５）のＥＣ５０値は、それぞれ４．２３７及び７．８２５ｎＭであった（表３８）。ヌルアーム対照二重特異性抗体は全て、図５３及び図５４に示すように、検出可能なレベルの細胞傷害もＴ細胞活性化も誘導しなかった。細胞傷害及びＴ細胞活性化の概ねのレベルは、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４の両方の間で類似していた。
【０５３４】
【表３４】
2021524249.tif 000055
【０５３５】
【表３５】
2021524249.tif 000056
【０５３６】
４−２  ２４及び４８時間における全血Ｔ細胞細胞傷害アッセイにおけるＩＬ１ＲＡＰ×ＣＤ３二重特異性Ａｂによるサイトカイン放出の評価
方法：実施例４−１の２４時間及び４８時間のサンプルからの凍結上清を、氷上で解凍した。使用前に、プレートを４℃で５分間５００ｇで遠心分離し、次いで、氷上に戻した。ＥＬＩＳＡのために１：２、１：２５、及び１：１０００の希釈比のＭＳＤ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ２を使用して、Ｕ底９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）において連続希釈液を調製した。
【０５３７】
上清を遠心分離している間、ＭＳＤアッセイプレート（ＰｒｏＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ  Ｖ−  Ｐｌｅｘ、カタログ番号Ｋ１５０４９Ｇ−４、ロット番号Ｋ００８５７２）を製造元のプロトコルに従って予め洗浄した。提供された較正物質を１．０ｍＬのＭＳＤ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ２で再構成することにより、標準曲線を作成した。５０マイクロリットルの各サンプル又は標準を、予め洗浄したＭＳＤプレートに直接添加した。その後のインキュベート及び洗浄は、全て製造元のプロトコルに従って実施した。ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒでアッセイプレートを読み取った。
【０５３８】
ＩＣ３Ｂ１９とＩＣ３Ｂ３４との間で応答を比較するために、２つの方法を使用した。
【０５３９】
混合効果を有する線形回帰
この方法では、対になったドナーを考慮した用量相互作用及びランダム効果による化合物、用量、及び化合物について固定効果を有する線形回帰モデルを構築した。次いで、各濃度でＩＣ３Ｂ１９とＩＣ３Ｂ３４との間の事後比較を行い、多重比較のためにｐ値を適切に調整した。
【０５４０】
混合効果を有する非線形（４パラメータ）回帰
それぞれの化合物の最小、最大、ｌｏｇＥＣ５０、及び傾きについての固定効果パラメータと、対にしたドナー効果を考慮するランダム効果項とを有する非線形回帰モデルを用いて、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４を一緒にモデル化した。点推定値及びその信頼区間を抽出し、これらの別個のモデルから目視比較のためにプロットした。対象となるパラメータの合同推定値を使用したモデルを構築し、次いで、そのモデルを対数尤度検定を使用して元のモデルと比較することによって、各パラメータについて有意差を検定した。精巧にするために、ＩＣ３Ｂ１９の最小、ＩＣ３Ｂ１９の最大、ＩＣ３Ｂ１９のｌｏｇＥＣ５０、ＩＣ３Ｂ１９の傾き、ＩＣ３Ｂ３４の最小、ＩＣ３Ｂ３４の最大、ＩＣ３Ｂ３４のｌｏｇＥＣ５０、及びＩＣ３Ｂ３４の傾きのパラメータを用いたモデルが存在する。最小値が有意に異なるかどうかをチェックするために、最小について単一の共有パラメータが存在することを除いて、全て同じパラメータを有する第２のモデルを構築する。第１のモデルの対数尤度（モデルがどのくらい良好にデータにフィッティングするかの全体的な尺度）を、第２のモデルの対数尤度と比較する。それらが互いに有意には異なっていない場合、最小が互いに有意には異なっていないと結論付けることができる。同様に、対数尤度が互いに有意に異なる場合、最小が有意に異なると結論付けるであろう。
【０５４１】
多くの場合、２つの理由のうちの１つから、モデル又はパラメータ比較を計算できなかった：１．４パラメータロジスティック回帰自体を計算するにはデータが扱いにくかった、又は２．パラメータ推定間の差が大きすぎて、合同モデルが失敗した。第１の場合、結果は報告せず、まとめの表には「ＮＡ」と示す。第２の場合も結果は報告しないが、有意の省略表現として「Ｓｉｇ」とまとめの表に示す。これらのパラメータの周囲の９５％信頼区間は個別に推定可能であり、重なり合わないため、これらは有意に異なるが、正確なｐ値は未知であると考えることができる。
【０５４２】
差は、０．０５以下のｐ値で統計的に有意であると考えられる。全ての分析をＲ、バージョン３．３．２．で実施した。
【０５４３】
結果：Ｔ細胞及びＩＬ１ＲＡＰ＋標的細胞株ＬＡＭＡ−８４（内因的及び外因的に添加された腫瘍細胞）のＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４媒介会合の結果、Ｔ細胞サイトカイン放出が生じた。ＩＣ３Ｂ１９とＩＣ３Ｂ３４との間のサイトカイン放出の差を求めるために、実施例１のセクションで論じた通り、外因性ＬＡＭＡ−８４  ＩＬ１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を添加した、全血（ｎ＝１５ドナー）細胞傷害及びＴ細胞活性化アッセイから１０個の炎症促進性サイトカインについて上清を評価した。評価した１０個のサイトカインのうち、ＩＬ−８及びＩＬ−１２ｐ７０を除いて、ほとんどのサイトカインは、ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４の両方に応答して測定可能な用量依存性放出をもたらした。表３９に示すように、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、及びＩＮＦ−γが、最も強力なＥＣ５０（ｎＭ）放出をもたらした。加えて、サイトカインの大部分及び両時点で、ＩＣ３Ｂ３４分子はＥＣ５０（ｎＭ）の効力を低下させ、これは統計的に有意であった。例外は、ＩＬ−４（２４時間）、ＩＬ−６（２４及び４８時間）、ＩＬ−８（２４及び４８時間）、ＩＬ−１２ｐ７０（２４時間及び４８時間）、ＩＬ−１３（２４時間）、ＩＮＦ−γ（２４時間及び４８時間）、及びＴＮＦ−α（２４時間）であり、ＩＣ３Ｂ１９とＩＣ３Ｂ３４との間でＥＣ５０（ｎＭ）値には統計的に有意な差がなかった。
【０５４４】
【表３６】
2021524249.tif 000057
【０５４５】
４−３  カスパーゼ細胞傷害アッセイにおけるＩＬ１ＲＡＰ二重特異性抗体の評価
ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４のＴ細胞媒介性殺傷を、第２の種類の細胞傷害アッセイを用いて測定した。カスパーゼ細胞傷害アッセイは、活性カスパーゼ３／７による蛍光基質の切断を介して細胞殺傷を間接的に測定する。基質の切断により蛍光ＤＮＡ色素が得られ、蛍光は細胞核に制限される。同じ座標でウェルを正確に撮像することができる電動式１０倍対物レンズを使用して、アッセイの全過程を通して各ウェルにおいて繰り返し蛍光測定を行う。規定のサイズ制限に基づいて、標的細胞集団を特定する。
【０５４６】
冷凍した汎ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡから購入）を、正常健常ドナーから陰性選択によって単離した。標的細胞（ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞、ＩＬ１ＲＡＰを発現しているヒト肺腺癌細胞株）を、１０％熱不活化ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補給したＲＰＭＩ１６４０／Ｇｌｕｔａｍａｘ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ）培地中で培養した。
【０５４７】
標的細胞を、実験開始の１６時間前に、補給物を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地５０μＬ中２０，０００細胞／ウェルで、組織培養処理された透明な平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）にプレーティングした。細胞を室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートして、ウェル内で細胞を均一に分布させ、次いで、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０５４８】
実験日に、Ｔ細胞を計数し、補給物を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地中１．０×１０＾６細胞／ｍＬに希釈し、１０μＭの作用濃度についてはＮｕｃ−Ｖｉｅｗ  ＴＭ４８８カスパーゼ−３／７基質（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と組み合わせた。組み合わせたＴ細胞及びカスパーゼ−３７基質１００μＬを、カスパーゼ−３／７基質の最終濃度５μＭで各ウェルに添加した。
【０５４９】
ＩＣ３Ｂ１９（ＩＡＰＢ５７×ＣＤ３Ｂ２１９）、ＩＣ３Ｂ３４（ＩＡＰＢ５７×ＣＤ３Ｂ３７６）、ＣＤ３Ｂ２８８（ヌル×ＣＤ３Ｂ２１９）、及びＩＡＰＢ５７×ヌル（ＩＡＰＢ１０１）二重特異性抗体を、補給物を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地中４×最終濃度で調製し、各ウェルに５０μＬの抗体を添加した。室温で２０分間インキュベートしてウェル内の分布を均一にした後、プレートをＺｏｏｍ  Ｉｎｃｕｃｙｔｅ機器（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に移した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ機器は、３７℃、５％ＣＯ２に設定された加湿インキュベータ内に存在する。
【０５５０】
ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞について、Ｉｎｃｕｃｙｔｅにおける処理の解像度を設計した。この処理の解像度は、Ｔ細胞をサイズによって除外しながら、標的細胞のカスパーゼ活性を明確に特定する。測定は、Ｔ０及び１２０時間まで６時間ごとに行った。最大シグナルは、処理後７２時間であると判定され、その時点でデータを分析した。
【０５５１】
アッセイが完了した後、ＮＣＣＩ  Ｈ１９７５の処理解像度を用いて各プレートを分析した。蛍光生データをＩｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍソフトウェアからエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にペーストした。ＧｒａｐｈＰａｄにおいて各ウェルの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって、カスパーゼ３／７活性を求めた。Ｌｏｇ１０ｎＭ抗体濃度の関数としてＡＵＣ値をプロットした。各濃度応答曲線のＥＣ５０（ナノモル（ｎＭ））を、非線形回帰（シグモイド用量応答、−可変の傾き）に従って報告した。各アッセイは、２つの技術的複製物を含んでおり、各技術的複製物を４回測定した。
【０５５２】
ＩＣ３Ｂ１９及びＩＣ３Ｂ３４はいずれも、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞において標的特異的細胞傷害を誘導したが、ヌルアームを有する二重特異性抗体（ＩＡＰＢ５７×Ｂ２３Ｂ４９又はＢ２３Ｂ３９×ＣＤ３Ｂ２１９）は誘導しなかった（図５７）。このアッセイでは、細胞傷害ＥＣ５０は、ＩＣ３Ｂ１９とＩＣ３Ｂ３４との間で３倍異なり、それぞれ０．０１８及び０．０５７ｎＭの値である。
【０５５３】
４−４  Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスのＨ１９７５ヒトＮＳＣＬＣ異種移植片におけるＩＡＰＢ５７×ＣＤ３Ｂ３７６の有効性
ＩＡＰＢ５７×ＣＤ３Ｂ３７６二重特異性抗体ＩＣ３Ｂ３４の有効性を、ヒトＴ細胞でヒト化された雌ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスにおける樹立されたＨ１９７５ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植片において評価した。０．１、０．３５、若しくは１ｍｇ／ｋｇのＩＡＰＢ５７×ＣＤ３Ｂ３７６、又はヌル×ＣＤ３抗体対照を、合計４回１４、１８、２１、及び２５日目に投与した。１群あたり１０頭の動物が残っていた試験の最後の日である腫瘍移植後２９日目に、腫瘍増殖抑制（％ＴＧＩ）を計算した。ヌル×ＣＤ３対照と比較して統計的に有意な腫瘍増殖阻害は、０．３５及び１ｍｇ／ｋｇのＩＡＰＢ５７×ＣＤ３Ｂ３７６で観察され、それぞれ６３％及び８９％  ＴＧＩであった（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を伴う二元配置分散分析、ｐ＜０．０００１、図５８）。
【０５５４】
５  ＣＤ３３抗体
５−１  抗原の生成
免疫化及びアッセイのためにＣ末端で融合させたＣ５８Ｓ変異を有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の変異型モノマー形態、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２７６８を有する又は有しない、ヒト及びカニクイザルのＣＤ３３タンパク質を産生した。６−ヒスチジンタグ（配列番号５９６）を含むＣＤ３３タンパク質抗原をコードしているｃＤＮＡを合成的に合成し、標準的な分子生物学的技術を用いて、アクチンプロモーターの下にある哺乳類分泌発現ベクターにクローニングした。
【０５５５】
Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２０１３８（配列番号２３５）由来の完全長ヒトＣＤ３３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ヒトＣＤ３３  ＥＣＤ）を、Ｎ末端でＨＳＡの有り無しでシグナル配列と融合させ、続いて、Ｃ末端で６ヒスチジンタグ（配列番号５９６）と融合させた（ＨＳＡを含むｈＣＤ３３  ＥＣＤ及びｈＣＤ３３  ＥＣＤのみ）。製造元のプロトコルに従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、ＨＥＫ２９３由来細胞、Ｅｘｐｉ２９３（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）にヒトＣＤ３３  ＥＣＤ発現コンストラクトを一過的にトランスフェクトした。軌道振盪器において８％ＣＯ２で３７℃において５日間細胞をインキュベートした後、収集した。発現した細胞を遠心分離により除去し、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｒｅｓｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用する固定化金属アフィニティクロマトグラフィー、続いて、ダルッベッコリン酸生理食塩水バッファｐＨ７．２（１×ＤＰＢＳ）中におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、可溶性ＣＤ３３を培地から精製した。ジスルフィド凝集体を全て除くＳＥＣ溶出画分を合わせ、滅菌濾過して、免疫化及びＣＤ３３アッセイのための最終タンパク質を得た。Ａ２８０によってタンパク質濃度を求め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び分析ＳＥＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）によって精製タンパク質の品質を評価した。ＥｎｄｏＳａｆｅ−ＰＴＳ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、発色性ＬＡＬアッセイ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ；Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、内毒素測定を実施した。
【０５５６】
ヒトＣＤ３３  ＥＣＤサブドメインタンパク質、ｈＣＤ３３  Ｖ−ドメイン−ＨＳＡ、ｈＣＤ３３  Ｖ−ドメイン−ｈｉｓ、ｈＣＤ３３  Ｃ２ドメイン−ＨＳＡ、及びｈＣＤ３３  Ｃ２ドメイン−Ｈｉｓを同様に構築し、発現させ、完全長ヒトＣＤ３３  ＥＣＤとして精製した。
【０５５７】
Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＸＰ＿００５５９０１３８．１に基づいて、免疫化及び交差選択性アッセイのためのカニクイザルＣＤ３３コンストラクト、カニクイザルＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ、カニクイザルＣＤ３３−Ｈｉｓも生成した。カニクイザルＣＤ３３タンパク質の発現及び精製は、ヒトＣＤ３３タンパク質と同様であった。
【０５５８】
製造元の条件に従ってＳｕｒｅＬｉｎｋ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎｉｃ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（ＳｅｒａＣａｒｅ  ＫＰＬ）を使用して、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．２中でスクリーニングのためのＣＤ３３抗原をビオチン化した。簡潔に述べると、ビオチンのタンパク質に対するモル比４：１で２５ｍＭのビオチン原液をＣＤ３３タンパク質に添加し、穏やかに回転させながら室温で３０分間インキュベートし、次いで、４℃に切り替えて更に２時間インキュベートした。１×ＤＰＢＳへのバッファ交換によって、組み込まれていないビオチンを除去した。ＮａｎｏＤｒｏｐを使用してＡ２８０ｎｍ及びＡ３５４ｎｍで測定することによって、タンパク質濃度及びビオチンの組み込みを求めた。上記抗原のそれぞれの配列については表４０を参照されたい。
【０５５９】
【表３７】
2021524249.tif 000058
【０５６０】
５−２  ＣＤ３３発現同質遺伝子細胞株の生成
完全長のヒトＣＤ３３又はカニクイザルＣＤ３３とＣＤ３３陽性細胞を選択するためのピューロマイシンとを含有するレンチウイルス（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、ヒト及びカニクイザルのＣＤ３３発現細胞株を生成した。ＣＤ３３について陰性であるＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＡＴＣＣ）に、レンチウイルス粒子を形質導入して、ヒトＣＤ３３及びカニクイザルＣＤ３３を過剰発現させた。形質導入後、プールされた細胞を処理することによって、ＣＤ３３及び耐性マーカーを陽性発現している細胞を選択し、ＤＭＥＭ＋１０％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で増殖させ、様々な濃度のピューロマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補給した。
【０５６１】
ＨＥＫ生成細胞株に加えて、いくつかの市販の細胞株を、結合及び細胞傷害アッセイに使用した。これらはＭＯＬＭ１３、ＫＧ１、ＳＨ２、ＯＣＩＡＭＬ３、及びＭＶ４１１を含んでおり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又はＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎのいずれかから入手し、１０％  ＦＢＳを含む完全ＲＰＭＩ培養培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【０５６２】
５−３  免疫化キャンペーン
ＯｍｎｉＲａｔ
ヒト免疫グロブリントランスジェニックラット系統（ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）；Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ヒトＣＤ３３モノクローナル抗体発現ハイブリドーマ細胞を開発した。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座（ラットＣＨ遺伝子座に連結された天然立体構造の２２のヒトＶＨ、全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む）を完全にヒトのＩｇＬ遺伝子座（Ｊκ−Ｃκに連結された１２のＶκ及びＪλ−Ｃλに連結された１６のＶλ）と共に含有する（例えば、Ｏｓｂｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０（４）：１４８１−１４９０を参照）。したがって、このラットは、ラット免疫グロブリンの発現減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチ及び体細胞変異を受けて、完全にヒトの可変領域を有する高親和性キメラヒト／ラットＩｇＧモノクローナル抗体が生成される。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用、並びにこのようなラットが有するゲノム改変は、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎらの国際公開第２０１４／０９３９０８号に記載されている。
【０５６３】
組換えヒト及びカニクイザルＣＤ３３（それぞれ、ｈｕＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ及びカニクイザルＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ）で免疫化したとき、このトランスジェニックラットは、ヒトＣＤ３３に対するキメラヒト−ラットＩｇＧ抗体を産生し、そのうちのいくつかはカニクイザルＣＤ３３にも結合する。
【０５６４】
８頭のＯｍｎｉＲａｔを、ｈｕＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ及びカニクイザルＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡのどちらかで免疫化した。４６日間の免疫化レジメン後、８頭のＯｍｎｉＲａｔ全てからリンパ節を摘出し、ハイブリドーマを生成するために使用した。８１枚の９６ウェルプレートのハイブリドーマ上清を、標準的な技術を用いて結合ＥＬＩＳＡ及びＡｌｐｈａＬＩＳＡを介してスクリーニングし、そのうち１２８個のハイブリドーマ上清を、ｈｕＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ及びカニクイザルＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡへの特異的結合について選択した。１２８個の上清の大部分が、ｈｕＣＤ３３又はｃｙＣＤ３３を過剰発現している細胞への結合についても陽性であった。
【０５６５】
６頭の追加のＯｍｎｉＲａｔをｒｈｕＣＤ３３のみで免疫化した。３１日間の免疫化レジメン後、６頭のＯｍｎｉＲａｔ全てからリンパ節を摘出し、ハイブリドーマを生成するために使用した。３０枚の９６ウェルプレートのハイブリドーマ上清を、標準的な技術を用いて結合ＥＬＩＳＡを介してスクリーニングし、そのうち９４個のハイブリドーマ上清を、ｈｕＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ及びカニクイザルＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡへの特異的結合について選択した。陽性クローンからハイブリドーマ溶解物を調製し、下記ｖ領域クローニングに進めた。
【０５６６】
ＯｍｎｉＭｏｕｓｅ
ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウス系統（ＯｍｎｉＭｏｕｓｅ（登録商標）；Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用して、ヒトＣＤ３３モノクローナル抗体発現ハイブリドーマ細胞を開発した。ＯｍｎｉＭｏｕｓｅ（登録商標）は、完全ヒトＩｇＬ遺伝子座と一緒にキメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座を含有する。このマウスは、マウス免疫グロブリンの発現減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチ及び体細胞変異を受けて、完全にヒトの可変領域を有する高親和性キメラヒト／ラットＩｇＧモノクローナル抗体が生成される。
【０５６７】
組換えヒト及びカニクイザルＣＤ３３（それぞれ、ｈｕＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ及びカニクイザルＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＡＳ）で免疫化したとき、このトランスジェニックマウスは、ヒトＣＤ３３に対するキメラヒト／ラットＩｇＧ抗体を産生し、そのうちのいくつかはカニクイザルＣＤ３３にも結合する。
【０５６８】
４頭のＯｍｎｉＭｏｕｓｅを、ｈｕＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ及びカニクイザルＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡのどちらかで免疫化した。５３日間の免疫化レジメン後、４頭のＯｍｎｉＭｏｕｓｅ全てから脾臓及びリンパ節を摘出し、ハイブリドーマを生成するために使用した。４８枚の９６ウェルプレートのハイブリドーマ上清を、結合ＥＬＩＳＡ及びＡｌｐｈａＬＩＳＡを介してスクリーニングし、そのうち８個のハイブリドーマ上清を、ｈｕＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ及びカニクイザルＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡへの特異的結合について選択した。陽性クローンからハイブリドーマ溶解物を調製し、下記ｖ領域クローニングに進めた。
【０５６９】
Ｖ領域クローニング
ハイブリドーマ細胞溶解物からの全ＲＮＡを、製造元のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ  ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製し、得られたＲＮＡをＤｒｏｐ  Ｓｅｎｓｅを使用して定量化し、−８０℃で保存した、又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してｃＤＮＡを合成した。それぞれ重鎖、κ鎖、及びλ鎖の定常領域にアニーリングされた遺伝子特異的プライマーを使用して、第１の鎖のｃＤＮＡ合成を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物は、最高３μｇの精製ＲＮＡ、遺伝子特異的プライマー、ｄＮＴＰミックス、反応バッファ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）（４０Ｕ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１８０８０−０５１）で構成されており、５０℃で５０分間及び８５℃で５分間インキュベートされる。得られた一本鎖ｃＤＮＡを−２０℃で保存した、又は一本鎖ＤＮＡをＰＣＲ増幅させた。ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ反応を行った。最適化されたＰＣＲ条件を使用して、それぞれ、リーダー配列並びに重鎖、κ及びλ鎖の定常領域に、フォワード及びリバースプライマーをアニーリングさせることによって、ｖ領域断片を増幅させた。得られたＰＣＲ断片をゲルに流し、予め設計しておいたプライマーを使用して配列決定して、ｖ領域配列を得た。得られたｖ領域配列の．ａｂｉファイルを収集し、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙで作成されたＳａｎｇｅｒ  ｖ領域配列解析プログラムによって分析した。回収されたｖ領域のＡＡ配列を内部データベースに登録し、コドンを最適化し、所望のヒト抗体アイソタイプの適切な定常領域：ＩｇＧ１  Ｆ４０５Ｌ及びＩｇＧ４  ＰＡＡを保有するｐＵｎｄｅｒベースの発現ベクターにクローニングした。合計７６個のＯＭＮＩＲａｔ抗体及び８個のＯＭＮＩＭｏｕｓｅ抗体のクローニングに成功し、更なる特性評価に進めた。以下の表は、ＯＭＮＩＲａｔキャンペーンで同定された上位３２（表４１を参照されたい）及びＯＭＮＩＭｏｕｓｅキャンペーンで同定された８（表４２を参照されたい）由来の配列をまとめたものであり、ＯＭＮＩＲａｔ抗体のうちのいくつかをＩｇＧ１及びＩｇＧ４  ＰＡＡにクローニングし、ＯＭＮＩＭｏｕｓｅキャンペーンからは全てをＩｇＧ１及びＩｇＧ４  ＰＡＡの両方にクローニングした。
【０５７０】
【表３８】
2021524249.tif 000059
ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖
【０５７１】
【表３９】
2021524249.tif 000060
ＨＣ：重鎖、ＬＣ：軽鎖
【０５７２】
５−４  Ｅｘｐｉ２９３小規模トランスフェクション及び精製
免疫化キャンペーン及びその後の（ＩｇＧ１  Ｆ４０５Ｌ及びＩｇＧ４  ＰＡＡへの）ｖ領域クローニングで同定された抗体を発現させ、小さな２ｍＬスケールを介して精製した。Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地に１．２５×１０５〜２．２５×１０５生存細胞／ｍＬの密度で播種し、３７℃、７％ＣＯ２のシェーカーインキュベータ（ＩＮＦＯＲＳ  ＨＴ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ  Ｐｒｏ）においてポリカーボネート製、使い捨て、滅菌、排気、バッフルなしの三角振盪フラスコ内で培養した。１２５ｍＬ〜２Ｌの振盪フラスコにおける通常的な細胞増殖の場合、振盪直径１９ｍｍの振盪器については振盪速度を１３０ｒｐｍに設定した。細胞を継代培養し、この場合、生存率９８〜９９％で、密度が３×１０６〜５×１０６生存細胞／ｍＬで対数増殖に達した。
【０５７３】
トランスフェクションの日に、生存細胞密度及び生存率を求めた。細胞を、３×１０６生存細胞／ｍＬの密度でトランスフェクトした。最適なトランスフェクションのために、ＴＥバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の滅菌重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡを使用する。
【０５７４】
製造元のトランスフェクションプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＭＡＮ０００７８１４）に従って、Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞をトランスフェクトした。２４ウェルディープウェルプレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてトランスフェクションを行った。簡潔に述べると、プラスミドＤＮＡを、以下の比で０．１ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ（商標）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈した：０．２５０μｇの重鎖ＤＮＡ：０．７５０μｇの軽鎖ＤＮＡ：０．５μｇのｐＡｄｖａｎｔａｇｅ。５μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクション試薬を希釈し、９５μＬのＯｐｔｉＭＥＭ（商標）培地と穏やかに混合し、１分間インキュベートした。希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬を希釈したＤＮＡに添加し、穏やかに混合し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３／プラスミドＤＮＡ複合体を室温で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、３７℃、７％ＣＯ２のシェーカーインキュベータにおいて一晩インキュベートした複合体に、１．８ｍＬのＥｘｐｉ２９３（商標）細胞を添加した。
【０５７５】
トランスフェクション後１日目に、１０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ１及び１００μＬのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３（商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２を添加し、プレートを更に５日間インキュベータに戻した。トランスフェクション後６日目に８５０×Ｇで１５分間遠心分離することによって培養物を収集した後、精製した。
【０５７６】
上記で調製した１．７ｍＬの清澄化した発現上清を、新たな２ｍＬ９６ディープウェルプレートに移した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＤＰＢＳ−／−スラリーの１：４混合物８００μＬを、９６ウェルＡｃｒｏｐｒｅｐ  Ａｄｖａｎｃｅ  １μｍガラスフィルタープレート（Ｐａｌｌ）の全てのウェルにピペッティングすることによって、精製プレートを調製した。２００ｍｂａｒの減圧をプレートに加えて過剰なＰＢＳを除去し、その後、８００μＬの新鮮ＰＢＳで洗浄した。２００ｍｂａｒの減圧を加えて、洗浄バッファを除去した。次いで、ＰＢＳで洗浄したレジンに清澄化した上清を移し、穏やかに混合し、１５分間インキュベートした。インキュベーション後、２００ｍｂａｒの減圧を加えて上清を除去した。洗浄と洗浄との間に２００ｍｂａｒの真空圧力を加えながら、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅをＰＢＳで３回洗浄し、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５（ＴＥＫＮＯＶＡ；Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）で１回洗浄して、過剰のバッファを除去した。０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５を使用してレジンに結合しているｍＡｂを溶出し、効果的に解離させるために１０分間インキュベートした。フィルタープレートを９６ディープウェルプレートの上に置き、１０００ｇで２分間遠心分離することを介して溶出したｍＡｂをボトムプレートに回収した。８０μＬの２．５Ｍトリス酢酸塩、ｐＨ７．２を添加してｍＡｂを中和した。ｍＡｂを、９６ウェルＤｉｓｐｏＤＩＡＬＹＺＥＲプレート（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ；Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）においてＰＢＳに一晩透析し、９６ディープウェルプレートの上に配置された９６ウェルＡｃｒｏｐｒｅｐ  Ａｄｖａｎｃｅ  ０．２μｍ  Ｓｕｐｏｒフィルタープレート（Ｐａｌｌ；Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）に移し、デスクトップ遠心分離において１，５００ｇで１５分間遠心分離することを介してタンパク質溶液を濾過した。ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、濾液に対するＡ２８０測定により、タンパク質濃度を求めた。
【０５７７】
【表４０−１】
2021524249.tif 000061
【０５７８】
【表４０−２】
2021524249.tif 000062
【０５７９】
【表４０−３】
2021524249.tif 000063
【０５８０】
【表４０−４】
2021524249.tif 000064
【０５８１】
【表４０−５】
2021524249.tif 000065
【０５８２】
【表４１】
2021524249.tif 000066
【０５８３】
【表４２】
2021524249.tif 000067
【０５８４】
５−５  抗ＣＤ３３  ｍＡｂの特性評価
免疫化を介して同定し、ｖ領域クローニングし、続いて、発現及び精製したＯＭＮＩＲａｔ抗体を、ＣＤ３３発現細胞への結合及び組換え抗原への結合について更に特性評価した。精製抗体を、ヒトＣＤ３３又はカニクイザルＣＤ３３（上記の通り生成）を発現している安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞への結合について、陰性対照としての親ＨＥＫ２９３Ｆと共に評価した。非酵素的解離バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、細胞を組織培養フラスコから収集した。フラスコをＰＢＳで２回すすぎ、解離バッファをフラスコに添加し、細胞が非接着性になるまでフラスコを３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、染色バッファ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に１．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。５０，０００細胞／ウェルの各細胞型を、丸底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）における染色バッファ５０μＬにプレーティングした。２×濃度の試験ｍＡｂ又はアイソタイプ対照５０μＬを３つの希釈濃度及びゼロ（１２０ｎＭ、１２ｎＭ、及び１．２ｎＭ、並びに０ｎＭ）で添加し、得られた溶液を４℃で３０分インキュベートした。各プレートの全てのウェルに１００μＬの染色バッファを添加し、プレートを３００ｇで５分間回転させ、バッファを除去し、各プレートの全てのウェルに２００μＬの染色バッファを添加し、プレートを３００ｇで５分間回転させ、バッファを除去した。５０μＬの２μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＦｃ  ＡＦ６４７二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）をプレートの全てのウェルに添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。プレートの全てのウェルに１００μＬの染色バッファを添加し、プレートを３００ｇで５分間回転させ、バッファを除去した。２００μＬのランニングバッファ（ランニングバッファは、染色バッファ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％プルロニック酸である）をプレートの全てのウェルに添加し、プレートを３００ｇで５分間回転させ、バッファを除去した。Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ  ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有するランニングバッファ３０μＬを細胞の入った全てのウェルに添加し、プレートをｉＱｕｅ  ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔフローサイトメータで読み取った。細胞を前方対側方散乱でゲーティングして細胞片を除去し、次いで、個片、次いで、Ｓｙｔｏｘ染色を除外した生細胞でゲーティングした。ＡＦ６４７チャネルにおける平均蛍光強度によって抗体結合を評価した。
【０５８５】
精製ｍＡｂの生物物理的結合特性の評価を開始するために、オフレートスクリーニングを実施した。７６個のＯＭＮＩＲａｔ抗ＣＤ３３ｍＡｂを、組換えヒトＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ（Ｃ３３Ｗ２）及びカニクイザルＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ（Ｃ３３Ｗ１）タンパク質（Ｊａｎｓｓｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）への結合について試験し、ＩＢＩＳ  ＭＸ９６  ＳＰＲｉアレイプラットフォーム（Ｃａｒｔｅｒｒａ；Ｎｅｗｔｏｎ，ＰＡ）によってオフレートを測定した。ＩＢＩＳ機器において１０分間の会合時間で、ＣＭＤ５０ｍセンサチップ（Ｘａｎｔｅｃ、ロットＣＭＤ５０ｍ０４１５．ａ）を使用し、酢酸バッファｐＨ４．５中１００μｇ／ｍＬのアミンカップリングを介して、ヤギ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００５−０９８）を直接固定化した。約９０００Ｒｕｓの平均ＧＡＨ−Ｆｃ固定化レベルが達成された。センサチップをＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｌｏｗ  Ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｅｒ（ＣＦＭ）ユニットに移して、１０分間１０μｇ／ｍＬで各抗ＣＤ３３ｍＡｂを捕捉した。再生なしの単一サイクルの反応速度論により、結合をＩＢＩＳ  ＳＰＲｉで測定した。各抗原濃度系列（３倍希釈系列で３μＭ）を低濃度（０．４６ｎＭ）から高濃度（３μＭ）まで逐次注入して、ランニングバッファとしてＰＢＳＴ（０．００５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）を使用して、５分間の会合時間及び１５分間の解離時間で、捕捉されたｍＡｂに結合させた。生の結合データ（．ｔｒｉｘファイルフォーマット）を参照し、ＳｐｒｉｎｔＸソフトウェア（Ｗａｓａｔｃｈ、バージョン１．９．３．２）を使用して整列させた後、１：１結合反応速度分析（Ｗａｓａｔｃｈ、バージョン２．０．０．３３）のためにＳｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア（バージョン２．０）にエクスポート（．ｉｂｍｘファイルフォーマット）して、ｋｏｆｆ結果を抽出した。
【０５８６】
以下の表４６は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３３発現細胞株への結合、並びに組換え抗原に対する結合（抗原のうちの１つについて少なくとも＞１０ｅ−３のオフレート）によって評価したときの上位３２のクローンをまとめたものである。これらの３２個のうち、４個を除いた全てが、ヒト又はカニクイザル発現細胞のいずれかへの認識可能な結合を示した。３２個全てを、エピトープビニング及び全反応速度分析を介した更なる特性評価に進めた。
【０５８７】
【表４３】
2021524249.tif 000068
【０５８８】
【表４４】
2021524249.tif 000069
【０５８９】
次いで、ｍＡｂのパネルを、完全親和性分析及びエピトープビニングについて更に特性評価した。抗ＣＤ３３ｍＡｂの組換えヒトＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ（Ｃ３３Ｗ２）及びカニクイザルＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ（Ｃ３３Ｗ１）への結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＳＰＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定した。０．００５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中流量３０μＬ／分で、ＧＬＣ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１７６−５０１１）に垂直に配向された６つのリガンドチャネル全てにおける酢酸バッファｐＨ５．０中３０μｇ／ｍＬでのアミンカップリングを介して、ヤギ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００５−０９８）を直接固定化した。固定化密度は、平均で約５０００応答単位（ＲＵ）であり、異なるチャネル間の変動は５％未満であった。垂直リガンド配向で０．２５又は０．５μｇ／ｍＬ（１６０〜３００ＲＵ）において抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ表面に異なるｍＡｂを捕捉し、６番目のリガンドチャネルは、リガンドなし表面対照であった。５つの濃度の３倍希釈系列中０．３μＭ濃度のヒト及びカニクイザルＣＤ３３−ＨＳＡタンパク質をアナライトとし流して、捕捉されたｍＡｂに水平配向で結合させた。また、捕捉されたｍＡｂの解離及びベースラインでの安定性をモニタリングするために、６番目のチャネルにバッファサンプルを注入した。ヒト及びカニクイザルＣＤ３３−ＨＳＡの全ての濃度の解離相を、Ｃ３３Ｂ７８２への結合については１５分間、Ｃ３３Ｂ９１２（ｈＩｇＧ４を有するＣ３３Ｂ９０４と同一）への結合については６０分間、流量１００μＬ／分でモニタリングした後、０．８５％リン酸の１８秒間パルスを使用して再生して、抗原及び結合したｍＡｂを除去した。以下から応答データを減じた後に二重参照することによって生データを処理した：１）Ａｇと空のチップ表面との間で非特異的相互作用を補正するためのインタースポット；２）経時的な捕捉されたｍＡｂ表面の解離に起因するベースラインの揺れを補正するためのバッファチャネル。各ｍＡｂについて全抗原濃度において処理したデータを１：１の単純なラングミュア結合モデルにグローバルフィットさせて、反応速度（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ）及び親和性（Ｋｄ）定数の推定値を抽出した。
【０５９０】
ｍＡｂのパネルが全て１つの個別のエピトープに結合するか、又は広いエピトープをカバーするかを判定するために、エピトープビニング実験を行った。ＣＭＤ−２００Ｍセンサプリズムチップを使用して、ＩＢＩＳ  ＳＰＲｉ機器（Ｃａｒｔｅｒｒａ）において、ＣＤ３３ｍＡｂの競合的エピトープビニングを行った。別々のＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｌｏｗ  Ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｅｒ（ＣＦＭ）を使用して、酢酸バッファ（ｐＨ４．５）中１０μｇ／ｍＬで、アミンカップリングを介してチップに各抗ＣＤ３３抗体を直接固定化した。次いで、プリントされたセンサチップを、Ｃｌａｓｓｉｃａｌ又は「Ｓａｎｄｗｉｃｈ」ビニングフォーマットを使用してビニング分析のためにＩＢＩＳ機器に移した。５０ｎＭのヒトＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ（Ｃ３３Ｗ２）を逐次注入し、続いて、１３３ｎＭの溶液で競合アナライトとして抗ＣＤ３３  ｍＡｂを１回注入して、抗原及び抗体の各逐次注入サイクル後に表面再生を伴って固定化された抗ＣＤ３３ｍＡに結合させることによって、ビニングを行った。
【０５９１】
再生前及び再生後の固定化されたｍＡｂの活性をモニタリングするために、実験の開始時及び終了時に、競合ｍＡｂを全く含まないバッファ注入を行って、抗原のみの結合活性を測定した。バッファ（抗原のみ）結合に対する競合ｍＡｂ結合の応答は、溶液中の抗体が固定化されたｍＡｂへの抗原結合をブロック又はサンドイッチするかどうかの指標である。生のビニングデータ（．ｔｒｉｘファイルフォーマット）を参照し、ＳｐｒｉｎｔＸソフトウェア（Ｗａｓａｔｃｈ、バージョン１．９．３．２）を使用してゼロにした後、分析のためにビニングソフトウェアＨｔＴｏｏｌｓ．ｅｘｅ（Ｗａｓａｔｃｈ、バージョン２．０．０．３３）にエクスポート（．ｉｂｍｘファイルフォーマット）した。２０ＲＵ未満の抗原応答を有する抗体及び自己ブロックしなかった抗体を除去することにより、データを精選した。競合ｍＡｂ応答を、抗原のみの結合応答に対して正規化した。正規化された応答が＜０．２５である抗体はブロッカーを意味し、正規化された応答が≧０．２５である抗体は、非ブロッカー／サンドイッチャーを意味した。組み合わされたデンドログラムプロットにおいて高さ２．５におけるカットを使用して、異なるビンを予測した。
【０５９２】
以下の表は、３２個の選択ｍＡｂの全反応速度分析及びエピトープビニングをまとめたものである。ヒト及びカニクイザルＣＤ３３の両方に対してナノモル濃度以下の親和性を有する抗ＣＤ３３ｍＡｂは合計８個存在し、これらのｍＡｂは３つの別個のエピトープビンに対応し、一方、より大きなパネルは、様々な親和性及び７個の別個のエピトープビンを有する。
【０５９３】
【表４５】
2021524249.tif 000070
【０５９４】
【表４６】
2021524249.tif 000071
【０５９５】
ＯｍｎｉＭｏｕｓｅパネル（合計８個のｍＡｂ）を別々に生成し、細胞への結合について更に特性評価した。細胞結合を上記のように行い、以下の表にまとめた。試験した８個のｍＡｂのうち、６個はＣＤ３３発現細胞に直接結合したが、２個はしなかった。
【０５９６】
【表４７】
2021524249.tif 000072
【０５９７】
【表４８】
2021524249.tif 000073
【０５９８】
細胞上でＣＤ３３に結合している６つのｍＡｂを、上記の方法を使用して組換え抗原に対する全反応速度分析を介して生物物理学的に更に特性評価し、以下の表にまとめた。試験した６つのｍＡｂのうち、１つは、ピコモル濃度の親和性でヒトＣＤ３３に（Ｃ３３Ｂ９１２）、及び、カニクイザルＣＤ３３に対してはナノモル濃度以下で結合し、一方、１つは、ヒトＣＤ３３に対しては非常に強い親和性を有していたが、カニクイザルＣＤ３３（Ｃ３３Ｂ９１１）に対してはわずかナノモル濃度の親和性しか有していなかった。更に２つのクローンは、ヒト及びカニクイザルＣＤ３３（Ｃ３３Ｂ９１３及びＣ３３Ｂ９１６）の両方に対してナノモル濃度以下であったが、いずれも親和性はＣ３３Ｂ９１２の範囲ではなかった。
【０５９９】
【表４９】
2021524249.tif 000074
【０６００】
先のＯＭＮＩＲａｔキャンペーンで既に同定されたいくつかの対照ｍＡに加えて、ＯＭＮＩＭｏｕｓｅ由来の６つの細胞結合ｍＡｂについてもエピトープビニング実験を実施した。ヒトＣＤ３３に対するそのナノモル濃度以下の親和性及び異なるエピトープビンの数に基づいて、対照ｍＡｂを選択した。ビニングソフトウェアＨｔＴｏｏｌｓは、実験ごとにエピトープビン数を割り当てるので、既に定義されたエピトープビンに対するいくつかの対照を有することが、交差比較のために重要であった。２つのＯＭＮＩＭｏｕｓｅ由来のヒトＣＤ３３高親和性クローン（Ｃ３３Ｂ９１１及びＣ３３Ｂ９１２）は両方とも、上記のビン４（この実験におけるビン４）からのクローンにビニングしたが、ナノモル濃度以下のクローン（Ｃ３３Ｂ９１６）は、Ｃ３３Ｂ８３６（上記実験におけるビン１）と共にこの実験における２にビニングした。
【０６０１】
【表５０】
2021524249.tif 000075
【０６０２】
ＣＤ３３は、２つのＩｇＧドメイン、膜遠位Ｖドメイン、及び膜近位Ｃ２ドメインで構成される。ＳＮＰｒｓ１２４５９４１９は、ＣＤ３３プレｍＲＮＡ転写物の選択的オルタナティブスプライシングを引き起こして、Ｃ２のみの形態を細胞上で発現させ得るので、このドメインを標的とすることにより、臨床的有益性を与えることができる。２つのドメインのうちのいずれにｍＡｂが結合可能であったかを確認するために、結合抗原としてヒトＣＤ３３  ＥＣＤ−ＨＳＡ、ヒトＣＤ３３  Ｖ−ＨＳＡ、及びヒトＣＤ３３  Ｃ２−ＨＳＡを使用して、４つの異なるエピトープビンをカバーする、最高結合能力を有する６つのｍＡｂに対して上記プロトコルに従ってオフレートスクリーニングを行った。以下の表に示すように、ビン４に予め分類された２つのクローンは、両方ともｈｕＣＤ３３  Ｃ２ドメインに結合したが、ｈｕＣＤ３３  Ｖドメインには結合せず、一方、ビン２及び３のクローンは、Ｖドメインには結合したが、Ｃ２ドメインには結合しなかった。ビン５に分類された２つのクローンは、いずれのドメインにも結合しなかったため、その正確な結合位置は、２つのドメインにまたがっている可能性がある。３つの市販のｍＡｂをこの実験に含めたところ（ＷＭ５３（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐ６７．７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びＬＳＢｉｏクローン９０６（ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）））、全てＶドメインへの結合は示したが、Ｃ２ドメインへの結合は示さなかった。表５１のＣ２ドメイン結合データに関連して表４２及び４５のエピトープビンを見ると、ヒト完全長タンパク質に対して約２５ｎＭから約３０ｐＭの親和性の範囲でＣ２ドメインに潜在的に結合し得るｍＡｂが合計１５個存在する。
【０６０３】
【表５１】
2021524249.tif 000076
【０６０４】
更にインビボ及びインビトロ試験を裏付けるために、スケールアップ及びｆａｂアーム交換のために選択クローン（Ｃ３３Ｂ８３６、Ｃ３３Ｂ７８２、Ｃ３３Ｂ７７８、Ｃ３３Ｂ９０４、Ｃ３３Ｂ８０６、Ｃ３３Ｂ８３０、Ｃ３３Ｂ９３７、Ｃ３３Ｂ７９２、Ｃ３３Ｂ７６０、及びＣ３３Ｂ７７７）を選択して、抗ＣＤ３抗体を含む二重特異性分子を生成した。ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１．２５×１０５〜２．２５×１０５生存細胞／ｍＬでＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地に播種し、３７℃、７％ＣＯ２のシェーカーインキュベータ（ＩＮＦＯＲＳ  ＨＴ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ  Ｐｒｏ）においてポリカーボネート製、使い捨て、滅菌、排気、バッフルなし三角振盪フラスコ内で培養した。１２５ｍＬ〜２Ｌの振盪フラスコにおけるルーチンな細胞増殖の場合、振盪直径１９ｍｍの振盪器については振盪速度を１３０ｒｐｍに設定した。細胞を継代培養し、この場合、生存率９８〜９９％で、密度が４×１０６〜６×１０６生存細胞／ｍＬで対数増殖に達した。
【０６０５】
トランスフェクションの２日前に、必要とされる培養体積に対して１．５×１０６生存細胞／ｍＬでＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）細胞を播種した。トランスフェクションの日に、生存細胞密度及び生存率を求めた。細胞を、６×１０６生存細胞／ｍＬの密度でトランスフェクトした。最適なトランスフェクションのために、ＴＥバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中≧１ｍｇ／ｍＬ濃度の滅菌重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡを使用した。
【０６０６】
製造元のＭａｘ  Ｔｉｔｅｒトランスフェクションプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＭＡＮ００１４３３７）に従って、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）細胞をトランスフェクトした。以下に示す全ての量及び体積は、最終的なトランスフェクトされた培養体積１ｍＬあたりであった。簡潔に述べると、プラスミドＤＮＡを、以下の比で０．０４ｍＬの冷ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈した：０．１２５ｇの重鎖ＤＮＡ：０．３７５ｇの軽鎖ＤＮＡ：０．５ｇのｐＡｄｖａｎｔａｇｅ。６．４μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクション試薬を希釈し、０．０４ｍＬの冷ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地と穏やかに混合し、１分間インキュベートした。希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を希釈したＤＮＡに添加し、穏やかに混合し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、複合体をシェーカーフラスコ内のＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）細胞に添加し、３７℃、７％ＣＯ２のシェーカーインキュベータ内で一晩インキュベートした。
【０６０７】
Ｍａｘ  Ｔｉｔｅｒプロトコルのために、トランスフェクション後１日目に、６μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ及び１６０μＬのＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄを添加し、フラスコを３２℃、７％ＣＯ２のシェーカーインキュベータに移した。トランスフェクション後５日目に、２回目の１６０μＬのＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄをフラスコに添加し、振盪しながら３２℃のインキュベータに戻した。トランスフェクション後１２日目に培養物を収集し、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、０．２μｍ  Ａｃｒｏｐａｋ  １５００フィルターカプセル（Ｐａｌｌ）を通して清澄化した。
【０６０８】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、発現した抗体を清澄化した上清から精製した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを、１×Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．２で平衡化した後、個々の培養上清をロードした。未結合タンパク質を、１×Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．２で広範囲にわたって洗浄することによって除去した。結合タンパク質を０．１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５で溶出した。ピーク画分を２．５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）で中和し、プールした。中和された画分プールを、アッセイ及び生物物理的特性評価のために１×ｄＰＢＳに透析した、又は二重特異性アセンブリに利用した。
【０６０９】
各溶出プールのタンパク質濃度をＯＤ２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって求め、アミノ酸配列に基づいて吸光度、吸光係数を用いて計算した。
【０６１０】
６  ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体の調製及び機能評価
６−１  精製された親ｍＡｂを使用したＦａｂアーム交換
ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体の形成は、２つの親ｍＡｂ、ターゲティングアームに特異的なもの（例えば、ＣＤ３３）及びエフェクターアームに特異的なもの（例えばＣＤ３）を必要とする。ＣＤ３３ｍＡｂを高親和性（ＣＤ３Ｂ３７６：配列番号６５２のＶＨ及び配列番号６６１のＶＬ）又は低親和性ＣＤ３アーム（ＣＤ３Ｂ４５０：配列番号６５７のＶＨ及び配列番号６７８のＶＬ）アームで組換えた。これらの親ｍＡｂ（ＣＤ３３及びＣＤ３アーム）は、ターゲティング親（ＣＤ３３）が４０９Ｒ  Ｇｅｎｍａｂ変異（ＩｇＧ４のネイティブアミノ酸）を含有し、一方、殺傷親（ＣＤ３）はＦ４０５Ｌ変異及びＲ４０９Ｋを含有する、ＩｇＧ４  ＰＡＡフォーマット（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）である。単一特異性抗ＣＤ３抗体を、そのＦｃ領域にＦｃ置換Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ（ＣＤ３アーム）（ＥＵインデックスに従って付番）を有するＩｇＧ４として発現させた。単一特異性抗体を、上記のように発現させ、精製した。精製後、親ＣＤ３３抗体を、７５ｍＭ  ２−ＭＥＡ（２−メルカプトエチルアミン）中の還元条件下で所望の親ＣＤ３抗体と混合し、３１℃で５時間又は室温で一晩インキュベートした。組換え反応は、モル濃度比に基づいており、設定量のＣＤ３３抗体（例えば、１０ｍｇ又は約７４．６ナノモル）をＣＤ３抗体（例えば、約６７．８ナノモル）と組み合わせ、ＣＤ３３抗体をＣＤ３抗体の６％過剰量で添加した。ＣＤ３３抗体原液の濃度は、０．８〜６ｍｇ／ｍＬで変化し、組換え反応の体積は、各対形成で変化した。その後、組換え反応物をＰＢＳに対して一晩透析して、還元剤を除去した。組換え後に残存する未反応のＣＤ３親抗体の量を最小化するために、過剰のＣＤ３３抗体（比）を用いてＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体反応を行った。
【０６１１】
組換え反応で使用した親ｍＡｂ（すなわち、ＣＤ３３、ＣＤ３、又はヌル）と共に、産生された最終的なＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体を表４７に列挙する。
【０６１２】
選択されたＣＤ３３ヒットはまた、非殺傷アーム（ヌル）と対形成して、試験目的のための陰性対照が生じた。対照二重特異性抗体については、Ｂ２Ｍ１、ＩｇＧ４  ＰＡＡフォーマットにおけるＲＳＶ抗体を生成し、精製し、ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９又はＣＤ３Ｂ３７６−Ｆ４０５Ｌ、Ｒ４０９Ｋのいずれかと組み合わせて、それぞれ、ＣＤ３Ｂ２８８（ＣＤ３×ヌル）及びＣＤ３Ｂ５１０（ＣＤ３Ｂ３７６×ヌル）を生成した。ＣＤ３３アームをＢ２３Ｂ４９と組み合わせて、表５２のようにＣＤ３３×ヌルを生成した。
【０６１３】
【表５２−１】
2021524249.tif 000077
【０６１４】
【表５２−２】
2021524249.tif 000078
Ｐｅｐ：ペプチド；Ｎｕｃ：ヌクレオチド；ＳＥＱ  ＩＤ：配列番号
【０６１５】
６−２  ＡＭＬ一次サンプルにおけるＡＭＬ芽球及びＴ細胞の活性化の、エクスビボにおけるＣＤ３３×ＣＤ３によって媒介される減少
ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害能を更に評価するために、上位４個の抗体を使用して、ＡＭＬ患者全血を使用するエクスビボ細胞傷害アッセイを行った（図６２）。このアッセイは患者の血液中の自家Ｔ細胞の存在に依存するので、このアッセイでは、追加のＴ細胞を供給することなく４８時間にわたってＡＭＬ患者由来の希釈された全血に様々な二重特異性抗体（ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９及びＣＤ３Ｂ３７６のいずれかと対形成したＣＤ３３抗体）を添加した。４８時間目に、サンプルをＣＤ３  ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ２５  ＰＥ、ＣＤ３３  ＦＩＴＣ、及びＣＤ３８  ＡＰＣで染色した（全ての抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから購入した）。次いで、サンプルを１×Ｌｙｓｅ  ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で少なくとも３回洗浄した。次いで、サンプルを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎバッファ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。まず、二重特異性抗体の存在下で、ＡＭＬ患者癌細胞の画分（ＣＤ３−ＣＤ３８＋細胞として定義）中の生ＣＤ３３＋細胞を定量することによって、腫瘍細胞傷害の程度を求めた。以下の等式を使用して、ＰＢＳ／未処理対照に対するパーセントとして細胞傷害を計算した：（ＰＢＳ／未処理対照中のＣＤ３３＋％−処理サンプル中のＣＤ３３＋％）／（ＰＢＳ／未処理対照中のＣＤ３３＋％）。ＣＤ３＋画分中のＣＤ２５＋事象のパーセントとしてＴ細胞活性化を計算した。
【０６１６】
図６２に示すように、ＣＤ３アーム（ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ２１９）のいずれかと対形成した全てのＣＤ３３リード抗体は、４８時間後、Ｔ細胞の活性化と相関する総細胞傷害の用量依存的な減少を促進した。ヌルアーム対照抗体（ヌル×ＣＤ３Ｂ２１９及びヌル×ＣＤ３Ｂ３７６）は、腫瘍細胞傷害もＴ細胞活性化も示さなかった。この結果も、ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体が自家状況において機能することを証明する。これらの結果は、４つの他のＡＭＬドナーサンプルの代表的なものである（データは示さない）。表５３は、ＣＤ３３×ＣＤ３多重特異性抗体で生成されたＥＣ５０値をまとめたものである。ＥＣ５０値から分かるように、Ｃ３アーム（Ｃ３ＣＢ８８、Ｃ３ＣＢ１８９）のいずれかと対形成したＣ３３Ｂ９０４、及びＣＤ３アーム（Ｃ３ＣＢ７、Ｃ３ＣＢ９７）のいずれかと対形成したＣ３３Ｂ８３６が、最も強力かつ有効な抗体であった。したがって、更なる特性評価ではこれらの４つの抗体に焦点をあてた。
【０６１７】
【表５３】
2021524249.tif 000079
【０６１８】
６−３  ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体がＣＤ３３のＣ２ドメインに結合し、ＣＤ３３一塩基多型（ＳＮＰ）発現細胞株の細胞傷害を誘導することの証明。
ＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体を用いたインビトロＴ細胞媒介細胞傷害アッセイ
最近の研究によって、ＡＭＬ集団の約５０％に一塩基多型型（ＳＮＰ）ｒｓ１２４５９４１９が存在し、ＣＤ３３のエクソン２がスキップされ、その結果、ＣＤ３３のＶドメインが欠失することが示された。この研究はまた、ＣＤ３３のＶドメインに結合するＭｙｌｏｔａｒｇがＳＮＰを発現する患者において有効性を有さなかったので、再発リスクが低下し、ＡＭＬ集団の約５０％において生存率が改善されたことも示した（Ｌａｍｂａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７，ＪＣＯ，ＣＤ３３  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  Ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｒｅｐｏｒｔ  Ｆｒｏｍ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｔｒｉａｌ  ＡＡＭＬ０５３１）。上述の研究におけるＭｙｌｏｔａｒｇに関するデータに鑑みて、インビトロＴ細胞媒介性細胞傷害アッセイを行って、ＣＤ３アーム（ＣＤ３Ｂ２１９又はＣＤ３Ｂ３７６）と対形成したＣＤ３３ヒット（Ｖ結合Ｃ３３Ｂ８３６対Ｃ２結合Ｃ３３Ｂ９０４）が、ＳＮＰｒｓ１２４５９４１９発現細胞株の殺傷を媒介するかどうかを評価した。簡潔に述べると、エフェクター細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙから購入した汎Ｔ細胞）を収集し、計数し、洗浄し、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞培地中１×１０６細胞／ｍＬになるように再懸濁させた。標的細胞（ＫＧ１、ＳＨ２、及びＯＣＩＡＭＬ３）をＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中２×１０５細胞／ｍＬになるように再懸濁させた。ＫＧ１、ＳＨ２及びＯＣＩＡＭＬ３は、それぞれ、ＣＤ３３  ＳＮＰｒｓ１２４５９４１９変異の野生型、ヘテロ接合型、及びホモ接合型を表すように選択した。エフェクター細胞及びＣＦＳＥ標識標的細胞を、滅菌９６ウェル丸底プレートにおいてエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）＝５：１で混合した。１０μＬのＦｃブロック（ＲｅｏＰｒｏ  Ｆｃ断片）を、５μＬの二重特異性抗体のアリコートと共に、様々な濃度を含有する各ウェルに添加した。培養物を、５％ＣＯ２下、３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎバッファ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をサンプルに添加し、培養物を、ＲＴで暗所において２０分間インキュベートし、洗浄し、１００〜２００μＬのＦＡＣバッファに再懸濁させた。ＣＡＮＴＯＩＩフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、薬剤誘導細胞傷害を決定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア又はＤｉｖｅソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。対象となる集団は、二重陽性ＣＦＳＥ＋／ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ＋細胞である。図６３に示すように、ヌルアーム対照（ヌル×ＣＤ３Ｂ２１９及びヌル×ＣＤ３Ｂ３７６）とは異なり、Ｖ結合及びＣ２結合ＣＤ３３×ＣＤ３多重特異性抗体は、４８時間でＳＮＰｒｓ１２４５９４１９変異細胞株ＫＧ１についてＣＤ３３＋野生型のＴ細胞リダイレクトによる細胞傷害を誘導した。対照的に、ＶバインダーＣ３３Ｂ８３６（Ｃ３ＣＢ９７、Ｃ３ＣＢ７）とは異なり、Ｃ２結合Ｃ３３Ｂ９０４と対になった二重特異性抗体（Ｃ３ＣＢ１８９、Ｃ３ＣＢ８８）のみが、それぞれｒｓ１２４５９４１９  ＳＮＰ変異についてヘテロ接合型又はホモ接合性であったＳＨ２及びＯＣＩＡＭＬ３細胞株の細胞傷害を媒介した。この理由から、Ｃ３３Ｂ９０４と対形成した二重特異性抗体（Ｃ３ＣＢ１８９、Ｃ３ＣＢ８８）を、更なる分析及び特性評価に進めた。まとめると、これらのデータは、Ｃ３３Ｂ９０４と対形成した二重特異性抗体などのＣＤ３３  Ｃ２結合二重特異性抗体が、Ｖ結合競合因子抗ＣＤ３３抗体よりも広範なＡＭＬ患者群において有効性を示す能力を有することを示唆している。
【０６１９】
６−４  エクスビボでＣＤ３３×ＣＤ３は、エクスビボ全血ＭＯＬＭ−１３細胞傷害アッセイにおいてＭＯＬＭ−１３及び単球におけるスパイクの低減を媒介した。
ＭＯＬＭ−１３細胞及び正常ヒト単球におけるスパイクの排除におけるＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害能を評価するために、外因的に添加されたＣＤ３３＋ＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ−１３と共に正常健常ヒト全血を使用するエクスビボ細胞傷害アッセイを利用した。このアッセイはドナーの血液中の自家Ｔ細胞の存在に依存するので、上記実験と同様に、追加のＴ細胞を供給することなく４８時間にわたって６人の異なる正常ヒトドナー由来の希釈された全血に様々な二重特異性抗体（ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９及びＣＤ３Ｂ３７６のいずれかと対形成したＣＤ３３抗体）を添加した。希釈前に、各ドナーの血液中のＴ細胞の濃度を調べた。次いで、ＡＭＬ患者サンプルにおけるエフェクター：標的比を再現するためにエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）が１：５になるように、血液をＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）標識ＭＯＬＭ−１３細胞で希釈した。４８時間目に、サンプルをＣＤ３  ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ２５  ＰＥ、ＣＤ３３  ＦＩＴＣ、及びＣＤ１４  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅで染色した（全ての抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した）。次いで、サンプルを１×Ｌｙｓｅ  ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で少なくとも３回洗浄した。次いで、サンプルを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎバッファ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。まず、二重特異性抗体の存在下で、ＣＤ１４＋単球の画分中の生ＣＤ３３＋細胞を定量することによって、腫瘍細胞傷害の程度を求めた。死ＣＦＳＥ＋細胞のパーセントを調べることにより、ＭＯＬＭ−１３細胞の細胞傷害を判定した。以下の等式を使用して、ＰＢＳ／未処理対照に対するパーセントとして単球の細胞傷害を計算した：（ＰＢＳ／未処理対照中のＣＤ３３＋ＣＤ１４＋％−処理サンプル中のＣＤ３３＋ＣＤ１４＋％）／（ＰＢＳ／未処理対照中のＣＤ３３＋ＣＤ１４＋％）。図６４のデータは、両方のＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＤ３アーム、ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ２１９のいずれかと対になった同じＣＤ３３リードＣ３３Ｂ９０４）が、４８時間でＭＯＬＭ−１３細胞及びＣＤ３３＋単球の細胞傷害を特異的に誘導することを示す。ヌルアーム対照を、陰性二重特異性抗体対照として使用した。ヌルアーム対照は、ＭＯＬＭ−１３及びＣＤ３３＋単球の細胞傷害活性をほとんど乃至全く示さなかった。これらのデータは、６人の異なる正常ドナーの平均値を示す。ＭＯＬＭ−１３及びＣＤ１４＋単球の細胞傷害についての平均ＥＣ５０値を表５４に示す。
【０６２０】
【表５４】
2021524249.tif 000080
【０６２１】
６−５  カニクイザルに対するＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体の種交差反応性の証明
エクスビボにおいて、ＣＤ３３×ＣＤ３は、カニクイザル全血を用いたエクスビボ細胞傷害アッセイにおいて単球の減少を媒介した
機能的交差反応性を証明し、正常カニクイザル単球の排除におけるＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害能を評価するために、健常カニクイザル全血を使用したエクスビボ細胞傷害アッセイを利用した。このアッセイはドナーの血液中の自家Ｔ細胞の存在に依存するので、上記実験と同様に、追加のＴ細胞を供給することなく４８時間にわたって６頭の異なる正常カニクイザルドナー由来の希釈された全血に様々な二重特異性抗体（ＣＤ３アームＣＤ３Ｂ２１９及びＣＤ３Ｂ３７６のいずれかと対形成したＣＤ３３抗体）を添加した。４８時間目に、サンプルをＣＤ３  ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ２５  ＰＥ、ＣＤ３３  ＦＩＴＣ、及びＣＤ１４  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅで染色した（全ての抗体は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入したＣＤ３３抗体を除いてＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した）。次いで、１×Ｌｙｓｅ  ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でサンプルを少なくとも３回洗浄した後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎバッファ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。まず、二重特異性抗体の存在下で、ＣＤ１４＋単球の画分中の生ＣＤ３３＋細胞を定量することによって、単球細胞傷害の程度を求めた。以下の等式を使用して、ＰＢＳ／未処理対照に対するパーセントとして細胞傷害を計算した：（ＰＢＳ／未処理対照中のＣＤ３３＋ＣＤ１４＋％−処理サンプル中のＣＤ３３＋ＣＤ１４＋％）／（ＰＢＳ／未処理対照中のＣＤ３３＋ＣＤ１４＋％）。ＣＤ３＋画分中のＣＤ２５＋事象のパーセントとしてＴ細胞活性化を計算した。図６５のデータは、両方のＣＤ３３×ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＤ３アーム、ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ２１９のいずれかと対になった同じＣＤ３３リードＣ３３Ｂ９０４）が、４８時間でＣＤ３３＋単球の細胞傷害及びＴ細胞活性化を特異的に誘導したことを示す。ヌルアーム対照を、陰性二重特異性抗体対照として使用したところ、ほとんど乃至全く細胞傷害もＴ細胞活性も示さなかった。表５５は、６頭の異なるカニクイザルドナーの平均値を示す。
【０６２２】
【表５５】
2021524249.tif 000081
【０６２３】
６−６  Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＭＯＬＭ−１３ヒトＡＭＬ異種移植片におけるＣ３ＣＢ１８９及びＣ３ＣＢ８８の有効性
２０００万個のＴ細胞でヒト化された雌ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスにおける、樹立されたルシフェラーゼでトランスフェクトされた播種性ＭＯＬＭ−１３ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）異種移植片において、Ｃ３ＣＢ１８９及びＣ３ＣＢ８８の有効性を評価した。静脈内腫瘍移植後５日目にライブバイオルミネッセンスイメージング（ＢＬＩ）によって、動物をｎ＝１０／群に無作為化した。０．００５、０．０５、及び０．５ｍｇ／ｋｇのＣ３ＣＢ１８９及びＣ３ＣＢ８８、又は０．５ｍｇ／ｋｇのヌル×ＣＤ３抗体対照を、６週間にわたって３〜４日毎に腹腔内投与した。
【０６２４】
腫瘍移植後１３日目に、１群あたり少なくとも８頭の動物が残存していた場合、バイオルミネッセンスによって決定したときの腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を計算した。ヌル×ＣＤ３対照と比較して、全ての濃度のＣ３ＣＢ１８９（図６６）及びＣ３ＣＢ８８（図６８）で統計的に有意な腫瘍増殖阻害が観察された。ヌル×ＣＤ３処理対照と比較して、０．００５、０．０５、及び０．５ｍｇ／ｋｇのＣ３ＣＢ１８９は、それぞれ７６％、１００％、及び８２％の腫瘍増殖阻害を惹起し、０．００５、０．０５、及び０．５ｍｇ／ｋｇのＣ３ＣＢ８８は、それぞれ１００％、１００％、及び９１％の腫瘍増殖阻害を惹起した。
【０６２５】
Ｃ３ＣＢ１８９及びＣ３ＣＢ８８による処理の結果、腫瘍量が低減し、ヌル×ＣＤ３対照群の１６日中央生存期間よりも大きく寿命が延長（ＩＬＳ）された。全用量にわたって、Ｃ３ＣＢ１８９で処理した動物は、１９〜２７．５日間の中央生存期間を有しており（図６７）、Ｃ３ＣＢ８８で処理した動物は、２６〜２８．５日間の中央生存期間を有していた（図６９）。対照群と比較して、０．００５、０．０５、及び０．５ｍｇ／ｋｇのＣ３ＣＢ１８９は、それぞれ１９％、７２％、及び５０％寿命を延長させ、Ｃ３ＣＢ８８は、それぞれ６３％、７８％及び７２％の寿命延長をもたらした。
【０６２６】
７  ＴＭＥＦＦ２抗体
７−１  抗原の生成
ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＵＩＫ５配列に基づいて、ヒト細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＴＭＥＦＦ２を産生した。Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグ（配列番号５９６）及びＡｖｉタグ配列を有するＥＣＤコンストラクトを設計した（コンストラクトＴＭＥＷ１；配列番号５７８）。ＦＳ２及びＥＧＦドメインを含有するコンストラクト（アミノ酸１５１〜３２０は、６×Ｈｉｓタグ（配列番号５９６）及びａｖｉタグ配列とのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合体として設計した（コンストラクトＴＭＥＷ７；配列番号５７９）。６×Ｈｉｓタグ（配列番号５９６）を有する（コンストラクトＴＭＥＷ１９；配列番号５８０）又はＨｉｓタグを有するラットＩｇＧ１  Ｆｃに融合している（コンストラクトＴＭＥＷ２０；配列番号５８１）ＴＭＥＦＦ２膜近位ドメイン（残基２３０〜３２０）を含有するコンストラクトを設計した。ＴＭＥＦＦ２の残基２３０〜３２０は、ＴＭＥＦＦ２の残基２６１〜３０１にまたがるＥＧＦドメインを含有する。製造元のプロトコルに従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、ＨＥＫ２９３由来細胞、Ｅｘｐｉ２９３（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にヒトＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤ発現コンストラクトを一過的にトランスフェクトした。軌道振盪器において８％ＣＯ２で３７℃において５日間細胞をインキュベートした後、収集した。発現した細胞を遠心分離により除去し、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｒｅｓｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する固定化金属アフィニティクロマトグラフィー、続いて、ダルッベッコリン酸生理食塩水バッファｐＨ７．２（１×ＤＰＢＳ）中におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ｈｉｓタグを有する可溶性ＴＭＥＦＦ２タンパク質を培地から精製した。生成された抗原のアミノ酸列を表５８に示す。
【０６２７】
【表５６】
2021524249.tif 000082
【０６２８】
７−２  抗ＴＭＥＦＦ２抗体の生成
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を発現しているトランスジェニックラット（ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標））を用いた抗体生成。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座（ラットＣＨ遺伝子座に連結された天然立体構造の２２のヒトＶＨ、全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む）を完全にヒトのＩｇＬ遺伝子座（Ｊκ−Ｃκに連結された１２のＶκ及びＪλ−Ｃλに連結された１６のＶλ）と共に含有する（例えば、Ｏｓｂｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０（４）：１４８１−１４９０を参照）。したがって、このラットは、ラット免疫グロブリンの発現減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチ及び体細胞変異を受けて、完全にヒトの可変領域を有する高親和性キメラヒト／ラットＩｇＧモノクローナル抗体が生成される。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用、並びにこのようなラットが有しているゲノム改変は、国際公開第１４／０９３９０８号に記載されている。
【０６２９】
ＯｍｎｉＲａｔを、ヒトＴＭＥＦＦ２コンストラクトＦＳ２−ＥＧＦ−Ｔｅｖ−ＨＳＡ（Ｃ３４Ｓ）−Ｈｉｓ−Ａｖｉタグ（ＴＭＥＷ７、配列番号５７９）で免疫化し、コンストラクトｓｐＴＭＥＦＦ２（２３０−３２０）Ｇ３Ｓ−ＲＡＩｇＧ１Ｆｃ（ＴＭＥＷ２０、配列番号５８１）でブーストした。８９日間の免疫化レジメン後、ラットからリンパ節を摘出し、ハイブリドーマを生成するために使用し、ＥＬＩＳＡ及び／又はＳＰＡＲＣＬ（Ｓｐａｔｉａｌ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によるヒトＴＭＥＦＦ２−ＦＬ−ＥＣＤ−ＨＩＳ−Ａｖｉタグ（ＴＭＥＷ１）タンパク質への結合についてハイブリドーマ上清をスクリーニングした。ＴＭＥＦＦ  ＥＣＤ、ＦＳ２−ＥＧＦ、又はＥＧＦドメインのみのＴＭＥＦＦ２に対する結合の二次ＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣＬスクリーニングのために、いくつかの上清を選択した。スクリーニング結果に基づいて、いくつかのハイブリドーマクローンを配列決定し、発現させ、機能性について特性評価した。
【０６３０】
ファージディスプレイライブラリからの抗体生成
Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５−９６，２０１０及び国際公開第２００９／０８５４６２号）に記載の通り、２セットのデノボｐＩＸファージディスプレイライブラリから標準的な方法を使用してＴＭＥＦＦ２結合Ｆａｂを選択した。簡潔に述べると、ヒトスカフォールドを多様化させることによってＶ３．０及びＶ５．０と呼ばれる２セットのライブラリを生成し、ここでは、生殖系列ＶＨ遺伝子ＩＧＨＶ１−６９＊０１、ＩＧＨＶ３−２３＊０１、及びＩＧＨＶ５−５１＊０１を、Ｈ３ループを介してヒトＩＧＨＪ−４ミニ遺伝子で組換え（Ｖ５．０ではＩＧＨＪ−６ミニ遺伝子も用いた）、並びに、ヒト生殖系列ＶＬカッパ遺伝子Ｏ１２（ＩＧＫＶ１−３９＊０１）、Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１＊０１）、Ａ２７（ＩＧＫＶ３−２０＊０１）、及びＢ３（ＩＧＫＶ４−１＊０１）をＩＧＫＪ−１ミニ遺伝子で組換えて、完全なＶＨ及びＶＬドメインを構築した。多様化のために、タンパク質及びペプチド抗原と高頻度で接触するＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３ループ周辺の重鎖及び軽鎖可変領域内の位置を選択した。選択した位置における配列多様性は、それぞれのＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ遺伝子のＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ生殖系列遺伝子ファミリーにおいて各々の位置に存在する残基に制限した。Ｈ３ループにおける多様性は、Ｖ３．０ライブラリについては７〜１４アミノ酸長、Ｖ５．０ライブラリについては６〜１９アミノ酸長の短鎖乃至中鎖の合成ループを使用して作製した。Ｈ３におけるアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動を再現するよう設計された。ライブラリを作製するために利用したスカフォールドは、そのヒトＶＨ及びＶＬ生殖系列遺伝子の由来に従って命名した。Ｖ３．０及びＶ５．０のセットの両方について、３つの重鎖ライブラリを各々、４個の生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖ライブラリと組み合わせて、選択実験に使用されるライブラリの各セットについて１２の固有のＶＨ：ＶＬの組み合わせを作製した。
【０６３１】
Ｖ領域クローニング
ファージのハイブリドーマ細胞溶解物からの全ＲＮＡを、製造元のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ  ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。得られたＲＮＡを、Ｄｒｏｐ  Ｓｅｎｓｅを使用して定量し、−８０℃で保存したか又はＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてｃＤＮＡ合成に使用した。それぞれ重鎖、κ鎖、及びλ鎖の定常領域にアニーリングする遺伝子特異的プライマーを使用して、第１の鎖のｃＤＮＡ合成を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物は、最高３μｇの精製ＲＮＡ、遺伝子特異的プライマー、ｄＮＴＰミックス、反応バッファ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）（４０Ｕ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ／Ｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１８０８０−０５１）で構成されており、５０℃で５０分間及び８５℃で５分間インキュベートした。得られた一本鎖ｃＤＮＡを−２０℃で保存した、又はＰＣＲ増幅に直接使用した。ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ反応を行った。最適化されたＰＣＲ条件を使用して、それぞれ、リーダー配列並びに重鎖、κ及びλ鎖の定常領域に、フォワード及びリバースプライマーをアニーリングさせることによって、ｖ領域断片を増幅させた。得られたＰＣＲ断片を配列決定し、回収したｖ−領域のアミノ酸配列のコドンを最適化し、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ４定常領域を有するｐＵｎｄｅｒベースの発現ベクター（ＩｇＧ４ＰＡＡアイソタイプ）にクローニングした。
【０６３２】
Ｅｘｐｉ２９３小規模トランスフェクション及び精製
免疫化キャンペーン又はファージディスプレイから同定された選択抗体をクローニングし、ＩｇＧ１ＰＡＡとして発現させ、小さい２ｍＬスケールで精製した。Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地に１．２５×１０５〜２．２５×１０５生存細胞／ｍＬの密度で播種し、３７℃、７％ＣＯ２で１２５ｍＬ〜２Ｌ振盪フラスコ内において培養した。細胞を継代培養し、この場合、生存率９８〜９９％で、密度が３×１０６〜５×１０６生存細胞／ｍＬで対数増殖に達した。
【０６３３】
トランスフェクションの日に、生存細胞密度及び生存率を求めた。製造元のトランスフェクションプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＭＡＮ０００７８１４）に従って、３×１０６生存細胞／ｍＬの密度で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後６日目に８５０×Ｇで１５分間遠心分離することによって培養物を収集した後、精製した。ｍＡｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  ｒｅｓｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して清澄化した上清から抗体を精製し、ＰＢＳに透析した。ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、濾液に対するＡ２８０測定により、タンパク質濃度を求めた。
【０６３４】
７−３  抗ＴＭＥＦＦ２抗体の特性評価
抗ＴＭＥＦＦ２抗体は高親和性でＴＭＥＦＦ２に結合する。
ＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤ（ＴＭＥＷ１：ＴＭＥＦＦ２−ＦＬ  ＥＣＤ−Ｈｉｓ−Ａｖｉタグ）及び／又は膜近位領域（ＴＭＥＷ１９：ｓｐＴＭＥＦＦ２（２３０−３２０）Ｇ３Ｓ−Ｈ６）への選択ＩｇＧ４ＰＡＡ抗ＴＭＥＦＦ２抗体の結合を、Ｐｒｏｔｅｏｎ（ＴＭＥＢ６７４、ＴＭＥＢ６７５、ＴＭＥＢ  ５６５及びＴＭＥＢ５７０）又はＢｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲ（ＴＭＥＢ７６２及びＴＭＥＢ７５７）を用いて評価した。選択された抗体の結合の反応速度パラメータを表５９に示す。抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ピコモル濃度の親和性でＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤ及びＴＭＥＦＦ２膜近位領域の両方に結合することが見出された。
【０６３５】
【表５７】
2021524249.tif 000083
【０６３６】
ＰｒｏｔｅＯｎ  ＳＰＲ
抗ＴＭＥＦＦ２  ｍＡｂのヒトＴＭＥＦＦ２のＥＣＤ及び膜近位領域への結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＳＰＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定した。精製されたｍＡｂ（ＰＢＳＴ中１μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した）をアッセイにおいてリガンドとして使用し、Ｆｃ捕捉を介してヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）ＩｇＧ  Ｆｃに固定化した。ＧＡＨ  ＩｇＧ  Ｆｃのアミンカップリングのために、ＥＤＣ（４０ｍＭ）及びＮＨＳ（１０ｍＭ）の１：１混合物を注入直前に混合してチップ表面を活性化し、垂直配向で注入した。次いで、酢酸バッファ（ｐＨ５．０）中ＧＡＨ−Ｆｃ（３０μｇ／ｍＬ）抗体を、垂直配向で３０μＬ／分で３００秒間表面上に流した。続いて、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を同じ配向で注入することによって、表面における残りの反応性カルボキシル基を全て不活化させた。固定化のために抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で使用した。抗体を水平方向に表面上に流した。５つの濃度の３倍希釈系列（最高濃度は１００〜６００ｎＭの範囲）のヒトＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤ又は膜近位領域を、捕捉された分子に結合させるために垂直配向でアナライトとして流した。また、ベースラインシグナルにおける任意のドリフトをモニタリングするために、垂直方向で６番目のチャネルにバッファサンプルを注入した。全ての濃度についての会合及び解離相を、１００μＬ／分の流速でそれぞれ３分間及び３０（又は１５）分間モニタリングした。結合抗原を除去するために１８秒パルスの０．８％リン酸を用いて、次の相互作用サイクルのために結合表面を再生した。応答データから２セットの参照データを減じることによって生データを処理した：１）抗原と空のチップ表面との間の非特異的相互作用を補正するためのインタースポットシグナル；２）非特異的ベースラインドリフトを補正するための空のチャネルシグナル（チップ上にＰＢＳＴのみを流した場合）。
【０６３７】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ  ＳＰＲ
抗ＴＭＥＦＦ２  ｍＡｂのヒトＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤへの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ  ＳＰＲによって測定した。アッセイのフォーマットは、高密度抗ヒトＦｃ表面を使用してｍＡを捕捉した後、単一サイクルの反応速度論による方法を用いてヒトＴＭＥＦＦ２濃度滴定を注入するためのものであった。ＨＢＳＰ（ＧＥ）バッファ中流量３０μＬ／分でＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＧＥ）において、フローセル１及び２に１０ｍＭ酢酸バッファ、ｐＨ４．５中３０ｇ／ｍＬでのアミンカップリングを介してヤギ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００５−０９８）を直接固定化した。ｍＡｂを、フローセル２において０．５μｇ／ｍＬ（約２００〜３００ＲＵ）で抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ表面上に捕捉した。次いで、ランニングバッファをＨＢＳＰ＋１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡに変更した。３倍希釈系列中の３０ｎＭ濃度のＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤを、単一サイクルの反応速度論による方法を用いて低濃度から高濃度まで注入した。最後、すなわち最高濃度の注入の３０分後にオフレートをモニタリングし、次いで、０．８％リン酸（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて表面を再生した。同じｍＡｂを捕捉し、同じサンプルランの条件を使用して、バッファブランクのランも完了した。応答データから２セットの参照データを減じることによって生データを処理した：１）サンプルフローセル２から減じた参照フローセル１、及び２）実験ランから減じたバッファブランクのラン。各ｍＡｂについて全濃度において処理したデータを１：１の単純なラングミュア結合モデルにグローバルフィットさせて、反応速度定数（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ）及び親和性（ＫＤ）定数の推定値を抽出した。
【０６３８】
抗ＴＭＥＦＦ２抗体の熱安定性
ＴＭＥＢ６７５は、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）により通常よりも低い熱安定性プロファイルを示し、アンフォールディング開始Ｔｍ＝５２℃であり、第１の熱転移（Ｔｍ１）＝６０．４℃であった。ＴＭＥＢ６７５の配列のより厳密な検査（実施例４を参照）は、重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域内の体細胞超変異（ＳＨＭ）の存在を示した。いくつかの再遺伝子操作された変異体をサブクローニングし、発現させ、精製し、ＤＳＣによりプロファイリングした。得られたｍＡｂ  ＴＭＥＢ７６２及びＴＭＥＦＢ７５７は、望ましい熱安定性プロファイルを示した（それぞれＴｍ１＝６９．４℃及びＴｍ１＝６９．７℃）。ＴＭＥＢ６７５と比較して、ＴＭＥＢ７６２は、重鎖において以下のアミノ酸改変：Ｒ１４Ｐ、Ｐ２０Ｌ、Ｈ８１Ｑを有し、一方、ＴＭＥＦＢ７５７は、重鎖において以下のアミノ酸改変：Ｒ１４Ｐ及びＰ２０Ｌを有していた。ＴＭＥＢ６７５と比較して、ＴＭＥＢ７６２は、軽鎖において以下のアミノ酸改変：Ａ１Ｄ及びＡ９１Ｐを有し、一方、ＴＭＥＦＢ７５７は、軽鎖にＡ９１Ｐを有していた。残基の付番はＫａｂａｔに従う。ＴＭＥＢ６７５、ＴＭＥＢ７６２のＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤへの結合の反応速度パラメータを表５９に示す。
【０６３９】
７−４  抗ＴＭＥＦＦ２抗体の構造特定
標準的な技術を用いて、抗体のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳物を得た。ポリペプチド配列の決定後、可変領域又は完全長抗体をコードしているいくつかの抗体ｃＤＮＡを、発現をスケールアップするための標準的な方法を用いてコドンを最適化した。
【０６４０】
表６０は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２アミノ酸配列を示す。
【０６４１】
表６１は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０６４２】
表６２は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２アミノ酸配列を示す。
【０６４３】
表６３は、選択抗ＴＭＥＦＦ２のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０６４４】
表６４は、選択抗ＴＭＥＦＦ２のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。
【０６４５】
表６５は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体の重鎖及び軽鎖の配列番号を示す。
【０６４６】
表６６は、選択抗ＴＭＥＦＦ２の重鎖アミノ酸配列を示す。
【０６４７】
表６７は、選択抗ＴＭＥＦＦ２の軽鎖アミノ酸配列を示す。
【０６４８】
表６８は、様々な抗ＴＭＥＦＦ２抗体鎖をコードしているポリヌクレオチドの配列番号を示す。
【０６４９】
【表５８】
2021524249.tif 000084
【０６５０】
【表５９】
2021524249.tif 000085
【０６５１】
【表６０】
2021524249.tif 000086
【０６５２】
【表６１】
2021524249.tif 000087
【０６５３】
【表６２】
2021524249.tif 000088
【０６５４】
【表６３】
2021524249.tif 000089
【０６５５】
【表６４】
2021524249.tif 000090
【０６５６】
【表６５】
2021524249.tif 000091
【０６５７】
【表６６】
2021524249.tif 000092
【０６５８】
配列番号３９（ＴＭＥＢ６７５  ＶＨ  ｃＤＮＡ）
Ｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇａｇａｇｇａｇｇａａｇｃｃｔｇａｇａｃｃｃａｇｃｔｇｔｇｃｃｇｃｃａｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｔｔｃａｇｃａｇｃｔａｃａｇｃａｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｃａｇｇｃａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｃａａａｇｇａｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｇａｔｔａｃｇｃｃｇａｃａｇｃｇｔｇａａｇｇｇｃａｇｇｔｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｇｇａｃａａｔａｇｃａａｇａａｃａｃｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｃａｃａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇｇａｔｇｃｃｃｃｔｇａａｃａｇｃｃｃｔｃａｃｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｃａｇｃ
【０６５９】
配列番号４０（ＴＭＥＢ５７０，ＴＭＥＢ５６５  ＶＨ  ｃＤＮＡ）
Ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｇａａａａａａｃｃｇｇｇｃａｇｃａｇｃｇｔｇａａａｇｔｇａｇｃｔｇｃａａａｇｃｇａｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｃｔｔｃａｇｃｔｃｃｔａｔｔａｃａｔｔａｇｃｔｇｇｇｔｇｃｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃｃａｇｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇａｔｇｇｇｔｇｇｃａｔｔａｔｃｃｃａａｔｃａｇｔｇｇｇｃｇｔｇｃｔａａｔｔａｔｇｃｇｃａｇａａａｔｔｔｃａｇｇｇｃｃｇｃｇｔｇａｃｃａｔｔａｃｃｇｃｔｇａｔｇａａａｇｃａｃｃａｇｃａｃｃｇｃｇｔａｔａｔｇｇａａｃｔｇａｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃａｇｃｇａａｇａｔａｃｃｇｃｇｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃｇｃｇｃｇｃｇａｃｇｇｃｔａｃａｇｔａｇｔｇｇａｃｇｔａｇｃａｃａａｃａｔａｃｇｃａｔｔｔｇａｃｔａｔｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｇａｇｔ
【０６６０】
配列番号４１（ＴＭＥＢ６７４  ＶＨ  ｃＤＮＡ）
Ｇａａｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｔｇｇａｇａｇｃｇｇａｇｇａｇｇａｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｇｇａａｇｃｃｔｇａｇａｃｔｇａｇｃｔｇｃｇｃｃｇｃｔａｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｔｔｃａｇｃａｇｃｔａｃａｇｃａｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｇａｇａｃａｇｇｃｔｃｃｔｇｇｃａａｇｇｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｔｃａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｇｃｔｔｔａｃｃａｇｃｔａｃｇｃｃｇａｃａｇｃｇｔｇａａｇｇｇｃａｇｇｔｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｇｇａｃａａｃａｇｃａａｃａａｃａｃｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｃａｇａｔｇａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｔｔｃｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇｇａｔｇｃｃｃｃｔｇａａｃａｇｃｃｃｃｃａｔｇａｃｔｇｃｔｇｇｇｇａｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃ
【０６６１】
配列番号４２（ＴＭＥＢ６７５  ＶＬ  ｃＤＮＡ）
Ｇｃｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｔａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｔａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇｇｇｔｇａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇｇｃａｔｃａｇａａａｃｇａｃｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａｇｃｃｃｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｇｃｃｇｃｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｔｇｃｃｔａｇｃａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇａａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｇａｃｔａｃａａｃｔａｃｇｃｃｃｔｇａｃａｔｔｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａｇ
【０６６２】
配列番号４３（ＴＭＥＢ５７０  ＶＬ  ｃＤＮＡ）
Ｇａａａｔｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｃｇｇｇｃｇａａｃｇｃｇｃｇａｃｃｃｔｇａｇｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇａｇｃｃａｇａｇｃｇｔｔｔｃｃａｃａｔａｃｔａｃｃｔｇｇｃｇｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃｇｇｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｃｇｃｃｔｇｃｔｇａｔｔｔａｃｇｇｔｇｃｃｔｃｃｔａｔｃｇｃｇｃｇａｃｃｇｇｃａｔｔｃｃｇｇａｔｃｇｃｔｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｔｔｃｃｇｇｃａｃｃｇａｔｔｔｔａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｃｔｇｇａａｃｃｇｇａａｇａｔｔｔｔｇｃｇｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃｃａｇｃａｇｔａｃｇｇｔｃａｃａｇｃｃｃｇａｔｔａｃｔｔｔｔｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃａａａｇｔｇｇａａａｔｃａａａ
【０６６３】
配列番号４４（ＴＭＥＢ６７４  ＶＬ  ｃＤＮＡ）
Ｇｃｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｔａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｔａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇｇｇｔｇａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇｇｃａｔｃａｇｇａａｃｇａｃｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａｇｃｃｃｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｇｃｃｇｃｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｔｇｃｃｔａｇｃａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇａａｇｃｇｇｃａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｇａｃｔａｃａａｃｔａｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｔｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａｇｇ
【０６６４】
配列番号４５（ＴＭＥＢ５６５  ＶＬ  ｃＤＮＡ）
Ｇａａａｔｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｃｇｇｇｃｇａａｃｇｃｇｃｇａｃｃｃｔｇａｇｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇａｇｃｃａｇａｇｃｇｔｔｇｃｃａｃｃｔａｔｔａｔｃｔｔｇｃｇｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃｇｇｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｃｇｃｃｔｇｃｔｇａｔｔｔａｃｇｇｔｇｃａｔｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｇａｃｃｇｇｃａｔｔｃｃｇｇａｔｃｇｃｔｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｔｔｃｃｇｇｃａｃｃｇａｔｔｔｔａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｃｔｇｇａａｃｃｇｇａａｇａｔｔｔｔｇｃｇｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃｃａｇｃａｇｔａｃｇｇｃｔａｔａａｃｃｃａａｔｔａｃｃｔｔｔｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃａａａｇｔｇｇａａａｔｃａａａ
【０６６５】
配列番号４６（ＴＭＥＢ６７５  ＨＣ  ｃＤＮＡ）
ｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇａｇａｇｇａｇｇａａｇｃｃｔｇａｇａｃｃｃａｇｃｔｇｔｇｃｃｇｃｃａｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｔｔｃａｇｃａｇｃｔａｃａｇｃａｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｃａｇｇｃａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｃａａａｇｇａｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｇａｔｔａｃｇｃｃｇａｃａｇｃｇｔｇａａｇｇｇｃａｇｇｔｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｇｇａｃａａｔａｇｃａａｇａａｃａｃｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｃａｃａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇｇａｔｇｃｃｃｃｔｇａａｃａｇｃｃｃｔｃａｃｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｃａｇｃｇｃｔｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｇａｇｃａｃｃｔｃｃｇａｇａｇｃａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｇａａａａｃｃｔａｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔａｇａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａｇａｇｔｔｇａｇｔｃｃａａａｔａｔｇｇｔｃｃｃｃｃａｔｇｃｃｃａｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇｇｇａｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃｇｔｃｃｔｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃａｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａｇｇｃｔａａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｇａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇｔａａａ
【０６６６】
配列番号４７（ＴＭＥＢ５７０，ＴＭＥＢ５６５  ＨＣ  ｃＤＮＡ）
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｇａａａａａａｃｃｇｇｇｃａｇｃａｇｃｇｔｇａａａｇｔｇａｇｃｔｇｃａａａｇｃｇａｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｃｔｔｃａｇｃｔｃｃｔａｔｔａｃａｔｔａｇｃｔｇｇｇｔｇｃｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｇｇｃｃａｇｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇａｔｇｇｇｔｇｇｃａｔｔａｔｃｃｃａａｔｃａｇｔｇｇｇｃｇｔｇｃｔａａｔｔａｔｇｃｇｃａｇａａａｔｔｔｃａｇｇｇｃｃｇｃｇｔｇａｃｃａｔｔａｃｃｇｃｔｇａｔｇａａａｇｃａｃｃａｇｃａｃｃｇｃｇｔａｔａｔｇｇａａｃｔｇａｇｃａｇｃｃｔｇｃｇｃａｇｃｇａａｇａｔａｃｃｇｃｇｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃｇｃｇｃｇｃｇａｃｇｇｃｔａｃａｇｔａｇｔｇｇａｃｇｔａｇｃａｃａａｃａｔａｃｇｃａｔｔｔｇａｃｔａｔｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｇａｇｔｇｃｔｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｇａｇｃａｃｃｔｃｃｇａｇａｇｃａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｇａａａａｃｃｔａｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔａｇａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａｇａｇｔｔｇａｇｔｃｃａａａｔａｔｇｇｔｃｃｃｃｃａｔｇｃｃｃａｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇｇｇａｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃｇｔｃｃｔｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃａｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａｇｇｃｔａａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｇａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇｔａａａ
【０６６７】
配列番号４８（ＴＭＥＢ６７４  ＨＣ  ｃＤＮＡ）
ｇａａｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｔｇｇａｇａｇｃｇｇａｇｇａｇｇａｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｇｇａａｇｃｃｔｇａｇａｃｔｇａｇｃｔｇｃｇｃｃｇｃｔａｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｔｔｃａｇｃａｇｃｔａｃａｇｃａｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｇａｇａｃａｇｇｃｔｃｃｔｇｇｃａａｇｇｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｔｃａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｇｃｔｔｔａｃｃａｇｃｔａｃｇｃｃｇａｃａｇｃｇｔｇａａｇｇｇｃａｇｇｔｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｇｇａｃａａｃａｇｃａａｃａａｃａｃｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｃａｇａｔｇａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｔｔｃｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇｇａｔｇｃｃｃｃｔｇａａｃａｇｃｃｃｃｃａｔｇａｃｔｇｃｔｇｇｇｇａｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇａｇｃａｇｃｇｃｔｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｇａｇｃａｃｃｔｃｃｇａｇａｇｃａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｇａａａａｃｃｔａｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔａｇａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａｇａｇｔｔｇａｇｔｃｃａａａｔａｔｇｇｔｃｃｃｃｃａｔｇｃｃｃａｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇｇｇａｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃｇｔｃｃｔｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃａｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａｇｇｃｔａａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｇａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇｔａａａ
【０６６８】
配列番号４９（ＴＭＥＢ６７５  ＬＣ  ｃＤＮＡ）
Ｇｃｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｔａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｔａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇｇｇｔｇａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇｇｃａｔｃａｇａａａｃｇａｃｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａｇｃｃｃｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｇｃｃｇｃｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｔｇｃｃｔａｇｃａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇａａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｇａｃｔａｃａａｃｔａｃｇｃｃｃｔｇａｃａｔｔｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａｇｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔ
【０６６９】
配列番号５０（ＴＭＥＢ５７０  ＬＣ  ｃＤＮＡ）
Ｇａａａｔｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｃｇｇｇｃｇａａｃｇｃｇｃｇａｃｃｃｔｇａｇｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇａｇｃｃａｇａｇｃｇｔｔｔｃｃａｃａｔａｃｔａｃｃｔｇｇｃｇｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃｇｇｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｃｇｃｃｔｇｃｔｇａｔｔｔａｃｇｇｔｇｃｃｔｃｃｔａｔｃｇｃｇｃｇａｃｃｇｇｃａｔｔｃｃｇｇａｔｃｇｃｔｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｔｔｃｃｇｇｃａｃｃｇａｔｔｔｔａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｃｔｇｇａａｃｃｇｇａａｇａｔｔｔｔｇｃｇｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃｃａｇｃａｇｔａｃｇｇｔｃａｃａｇｃｃｃｇａｔｔａｃｔｔｔｔｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃａａａｇｔｇｇａａａｔｃａａａｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔ
【０６７０】
配列番号５１（ＴＭＥＢ６７４  ＬＣ  ｃＤＮＡ）
ｃｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｔａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｔａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇｇｇｔｇａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇｇｃａｔｃａｇｇａａｃｇａｃｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａｇｃｃｃｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｇｃｃｇｃｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｔｇｃｃｔａｇｃａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇａａｇｃｇｇｃａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｇａｃｔａｃａａｃｔａｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｔｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａｇｇｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔ
【０６７１】
配列番号５９０（ＴＭＥＢ５６５  ＬＣ  ｃＤＮＡ）
Ｇａａａｔｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｃｇｇｇｃｇａａｃｇｃｇｃｇａｃｃｃｔｇａｇｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇａｇｃｃａｇａｇｃｇｔｔｇｃｃａｃｃｔａｔｔａｔｃｔｔｇｃｇｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃｇｇｇｃｃａｇｇｃｇｃｃｇｃｇｃｃｔｇｃｔｇａｔｔｔａｃｇｇｔｇｃａｔｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｇａｃｃｇｇｃａｔｔｃｃｇｇａｔｃｇｃｔｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｔｔｃｃｇｇｃａｃｃｇａｔｔｔｔａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｔａｇｃｃｇｃｃｔｇｇａａｃｃｇｇａａｇａｔｔｔｔｇｃｇｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃｃａｇｃａｇｔａｃｇｇｃｔａｔａａｃｃｃａａｔｔａｃｃｔｔｔｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃａａａｇｔｇｇａａａｔｃａａａｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔ
【０６７２】
配列番号６１８（ＴＭＥＢ７６２  ＶＨ  ｃＤＮＡ）
ｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｃｇｇａｇｇａａｇｃｃｔｇａｇａｃｔｃａｇｃｔｇｔｇｃｃｇｃｃａｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｔｔｃａｇｃａｇｃｔａｃａｇｃａｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｃａｇｇｃａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｃａａａｇｇａｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｇａｔｔａｃｇｃｃｇａｃａｇｃｇｔｇａａｇｇｇｃａｇｇｔｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｇｇａｃａａｔａｇｃａａｇａａｃａｃｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇｇａｔｇｃｃｃｃｔｇａａｃａｇｃｃｃｔｃａｃｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｃａｇｃ
【０６７３】
配列番号６１９（ＴＭＥＢ７６２  ＶＬ  ｃＤＮＡ）
ｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｔａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｔａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇｇｇｔｇａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇｇｃａｔｃａｇａａａｃｇａｃｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａｇｃｃｃｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｇｃｃｇｃｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｔｇｃｃｔａｇｃａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇａａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｇａｃｔａｃａａｃｔａｃｃｃｃｃｔｇａｃａｔｔｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａｇ
【０６７４】
配列番号６２０（ＴＭＥＢ７６２  ＨＣ  ｃＤＮＡ）
ｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｃｇｇａｇｇａａｇｃｃｔｇａｇａｃｔｃａｇｃｔｇｔｇｃｃｇｃｃａｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｔｔｃａｇｃａｇｃｔａｃａｇｃａｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｃａｇｇｃａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｃａａａｇｇａｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｇａｔｔａｃｇｃｃｇａｃａｇｃｇｔｇａａｇｇｇｃａｇｇｔｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｇｇａｃａａｔａｇｃａａｇａａｃａｃｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇｇａｔｇｃｃｃｃｔｇａａｃａｇｃｃｃｔｃａｃｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｃａｇｃｇｃｔｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｇａｇｃａｃｃｔｃｃｇａｇａｇｃａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｇａａａａｃｃｔａｃａｃｔｔｇｃａａｃｇｔａｇａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａｇａｇｔｔｇａｇｔｃｃａａａｔａｔｇｇｔｃｃｃｃｃａｔｇｃｃｃａｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇｇｇａｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃｇｔｃｃｔｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃａｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａｇｇｃｔａａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇａｔｇｇｃａｇｇａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇｔａａａ
【０６７５】
配列番号６２１（ＴＭＥＢ７６２  ＬＣ  ｃＤＮＡ）
ｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｔａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｔａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇｇｇｔｇａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇｇｃａｔｃａｇａａａｃｇａｃｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａｇｃｃｃｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｇｃｃｇｃｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｔｇｃｃｔａｇｃａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇａａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｇａｃｔａｃａａｃｔａｃｃｃｃｃｔｇａｃａｔｔｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａｇｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔｔａｇ
【０６７６】
配列番号６２２（ＴＭＥＢ７５７  ＶＨ  ｃＤＮＡ）
ｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｃｇｇａｇｇａａｇｃｃｔｇａｇａｃｔｃａｇｃｔｇｔｇｃｃｇｃｃａｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｔｔｃａｇｃａｇｃｔａｃａｇｃａｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｃａｇｇｃａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｃａａａｇｇａｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｇａｔｔａｃｇｃｃｇａｃａｇｃｇｔｇａａｇｇｇｃａｇｇｔｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｇｇａｃａａｔａｇｃａａｇａａｃａｃｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｃａｃａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇｇａｔｇｃｃｃｃｔｇａａｃａｇｃｃｃｔｃａｃｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｃａｇｃ
【０６７７】
配列番号６２３（ＴＭＥＢ７５７  ＶＬ  ｃＤＮＡ）
ｇｃｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｔａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｔａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇｇｇｔｇａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇｇｃａｔｃａｇａａａｃｇａｃｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａｇｃｃｃｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｇｃｃｇｃｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｔｇｃｃｔａｇｃａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇａａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｇａｃｔａｃａａｃｔａｃｃｃｃｃｔｇａｃａｔｔｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａｇ
【０６７８】
配列番号６２４（ＴＭＥＢ７５７  ＨＣ  ｃＤＮＡ）
ｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｃｔｇｇａａａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｃｇｇａｇｇａａｇｃｃｔｇａｇａｃｔｃａｇｃｔｇｔｇｃｃｇｃｃａｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｔｔｃａｇｃａｇｃｔａｃａｇｃａｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｃａｇｇｃａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｃａａａｇｇａｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｔｔａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｇｇｃｔｔｃａｃｃｇａｔｔａｃｇｃｃｇａｃａｇｃｇｔｇａａｇｇｇｃａｇｇｔｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｇｇａｃａａｔａｇｃａａｇａａｃａｃｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｃａｃａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇｇａｔｇｃｃｃｃｔｇａａｃａｇｃｃｃｔｃａｃｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｃａｇｃｇｃｔｔｃｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｃｇｔｃｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｇａｇｃａｃｃｔｃｃｇａｇａｇｃａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｇａａａａｃｃｔａｃａｃｔｔｇｃａａｃｇｔａｇａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａｇａｇｔｔｇａｇｔｃｃａａａｔａｔｇｇｔｃｃｃｃｃａｔｇｃｃｃａｃｃａｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇｇｇａｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃｇｔｃｃｔｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃａｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａｇｇｃｔａａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇａｔｇｇｃａｇｇａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇｔａａａ
【０６７９】
配列番号６２５（ＴＭＥＢ７５７  ＬＣ  ｃＤＮＡ）
ｇｃｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｇｃｃｃｔａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｔａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇｇｇｔｇａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃａｇｃｃａｇｇｇｃａｔｃａｇａａａｃｇａｃｃｔｇｇｇｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａｇｃｃｃｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｇｃｃｇｃｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｔｇｃｃｔａｇｃａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇａａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｇａｃｔａｃａａｃｔａｃｃｃｃｃｔｇａｃａｔｔｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａｇｃｇｔａｃｇｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｔｔａｇ
【０６８０】
選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のフレームワークを、表６９に示す。
【０６８１】
【表６７】
2021524249.tif 000093
【０６８２】
配列番号５３（ＶＨ３＿３−２３フレームワーク）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０６８３】
配列番号５４（ＶＨ１＿１−６９フレームワーク）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳ  ＳＹＡＩＳ  ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ  ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ  ＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
【０６８４】
配列番号５５（ＶＫＩ＿Ｌ１１フレームワーク）
ａｉｑｍｔｑｓｐｓｓｌｓａｓｖｇｄｒｖｔｉｔｃｒａｓｑｇｉｒｎｄｌｇｗｙｑｑｋｐｇｋａｐｋｌｌｉｙａａｓｓｌｑｓｇｖｐｓｒｆｓｇｓｇｓｇ  ｔｄｆｔｌｔｉｓｓｌｑｐｅｄｆａｔｙｙｃ  ｌｑｄｙｎｙｐ
【０６８５】
配列番号５９１（ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７フレームワーク）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ  ＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰ
【０６８６】
７−５  抗ＴＭＥＦＦ２抗体のエピトープマッピング
Ｈ／Ｄ交換を使用して、ＴＭＥＢ５７０及びＴＭＥＢ６７５のエピトープマッピングを行った。ＴＭＥＷ１（配列番号５７８）を、これらのアッセイにおいてＴＭＥＦＦ２の供給源として使用した。
【０６８７】
１３０μＬの対照バッファ（５０ｍＭリン酸、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中１０μｇのＴＭＥＷ１を、１３０μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５Ｍ  ＴＣＥＰバッファ（最終的なｐＨは２．５であった）を添加し、混合物を１０℃で３分間インキュベートすることによって変性させた。次いで、混合物を、インハウスでパッキングしたペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ（ｗ／ｗ、１：１）カラム（２．１×３０ｍｍ）を使用したオンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化に供した。得られたペプチドを、Ｑ  ＥｘａｃｔｉｖｅＴＭ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）に接続されたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣで構成されるＵＰＬＣ−ＭＳシステムを使用して分析した。ペプチドを、２％→３４％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中、０．２％ギ酸）の１６．５分の勾配で５０ｍｍ×１ｍｍのＣ８カラム上で分離した。溶媒Ａは、水中０．２％ギ酸であった。注入バルブ、及びペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩカラム、及びそれらに関連する接続チューブは、１０℃で維持された冷却ボックス内で維持した。第２の切換弁、Ｃ８カラム、及びそれらに関連するステンレス鋼の接続チューブは、−６℃で維持された別の冷却循環ボックス内にあった。ＴＭＥＷ１配列に対するＭＳ／ＭＳデータをＭａｓｃｏｔで検索することを通じて、ペプチド同定を行った。プリカーサー及びプロダクトイオンに対する質量許容差は、それぞれ７ｐｐｍ及び０．０２Ｄａであった。
【０６８８】
１０μＬのＴＭＥＷ１（５μｇ）、又は１０μＬのＴＭＥＷ１及びＴＭＥＢ５７０又はＴＭＥＢ６７５混合物（５μｇ：１５μｇ）を、１０℃で０秒、３０秒、３６０秒、３６００秒、又は１４４００秒、１２０μＬの重水標識バッファ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）と共にインキュベートした。各時点での水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換を、２回で実施した。１３０μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５Ｍ  ＴＣＥＰバッファ（最終的なｐＨは２．５であった）を添加することによって、水素／重水素交換をクエンチした。その後、クエンチしたサンプルを、上記に記載されるようにオンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化及びＬＣ−ＭＳ分析に供した。質量スペクトルはＭＳのみのモードで記録した。
【０６８９】
ＭＳの生データを、ＨＤＸ  ＷｏｒｋＢｅｎｃｈ、Ｈ／Ｄ交換ＭＳデータを分析するためのソフトウェアを使用して処理した（Ｐａｓｃａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１２，２３（９），１５１２−１５２１）。重水素化ペプチドとその天然形態（ｔ０）との平均質量差を使用して、重水素レベルを算出した。タンパク質の約９７〜９９％を特定のペプチドにマッピングすることができた。重水素ビルドアップ曲線は、ペプチドの交換時間にわたって、傾きにおいて有意な差を示した。
【０６９０】
ＴＭＥＢ５７０エピトープ：ＴＭＥＷ１は、残基２３５〜２４９（配列番号５７５に従って残基付番）で重水素取り込みのわずかな減少を示し、例えば、膜近位領域内の残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５９２）は、ＴＭＥＢ５７０への結合時にＨ／Ｄ交換から保護されていた。
【０６９１】
ＴＭＥＢ６７５エピトープ：ＴＭＥＷ１は、残基２５２〜２６８（配列番号５７５に従って残基付番）で重水素取り込みのわずかな減少を示し、例えば、膜近位領域内の残基ＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号６００）は、ＴＭＥＢ６７５への結合時にＨ／Ｄ／交換から保護されていた。
【０６９２】
したがって、ＴＭＥＢ５７０  ＴＭＥＦＦ２エピトープ残基は、ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５９２）を包含し、ＴＭＥＢ６７５エピトープ残基は、ＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号６００）を包含していた。両抗体は、膜近位領域内でＴＭＥＦＦ２に結合した。
【０６９３】
７−６  二重特異性ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３抗体の生成
選択単一特異性抗ＴＭＥＦＦ２及び抗ＣＤ３抗体（実施例１〜７を参照）を、ＩｇＧ４／κとして発現させた。Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換（ＥＵ付番）を抗ＣＤ３抗体に導入したが、抗ＴＭＥＦＦ２抗体は野生型ＩｇＧ４を有していた。位置４０５及び４０９における置換に加えて、ＩｇＧ４ｍＡｂは、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するように遺伝子操作された。
【０６９４】
単一特異性抗体を発現させ、プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム）を使用する標準的な方法を使用して精製した。溶出後、プールを、Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．２の中に透析した。
【０６９５】
国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載の通り、インビトロＦａｂアーム交換において単一特異的ＴＭＥＦＦ２  ｍＡｂと単一特異的ＣＤ３  ｍＡｂとを組み合わせることにより、二重特異性ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３抗体を生成した。簡潔に述べると、ＰＢＳ、ｐＨ７〜７．４中約１〜２０ｍｇ／の、モル比１：１の各抗体を７５ｍＭの２−メルカプトエタノールアミン（２−ＭＥＡ）と一緒に混合し、２５〜３７℃において２〜６時間インキュベートし、続いて、標準的な方法を使用して透析、ダイアフィルトレーション、接線流濾過、及び／又はスピン細胞濾過により２−ＭＥＡを除去した。
【０６９６】
標準的な方法を用いて、残留親抗ＴＭＥＦＦ２及び抗ＣＤ３抗体を最小化するために、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いてインビトロＦａｂアーム交換を行った後、二重特異性抗体を更に精製した。
【０６９７】
表７３及び表７４は、生成された二重特異性抗体を示す。
【０６９８】
【表６８】
2021524249.tif 000094
【０６９９】
【表６９】
2021524249.tif 000095
【０７００】
７−７  二重特異性ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３抗体の特性評価
分析超遠心分離（ＡＵＣ）による純度分析
分析超遠心分離（ＡＵＣ）によって、溶液中の巨大分子のサイズ、形状、凝集の状態、及び可逆的相互作用を決定することができる。沈降速度（ＳＶ）は、遠心分離スピンとして、サンプルホルダー（セル）の外半径に移動する巨大分子の濃度勾配を可能にするＡＵＣ技術である。これにより、分子のサイズ及び形状の要因である沈降係数の決定が可能になり、それは、各分子に固有である。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  ＡＵＣ機器をこの目的のために使用した。１．２ｃｍのＢｅｃｋｍａｎセンターピース（５０Ｋｒｐｍの速度に設定）及び石英窓を備える遠心セルにサンプルをロードした。細胞を集め、１３０ｌｂまでトルクを与える。遠心セルを、Ａｎ−５０（８穴）又はＡｎ−６０（４穴）ローターに入れ、ＡＵＣチャンバ内に配置した。ランを開始する前に、チャンバ内のローターで少なくとも１時間、ＡＵＣの温度を２０．５℃に平衡化した。スキャンカウント（２５０スキャン）、スキャン収集の頻度（９０秒）、データ分解能（１０μＭ）、２８０ｎｍの波長で、ｍＡｂサンプルについて４０Ｋｒｐｍでランを実行した。直接境界フィッティングソフトウェアＳＥＤＡＮＡＬを使用してデータを分析した。二重特異性抗体ＴＭＣＢ１５０及びその親ｍＡｂの純度を測定した。ＴＭＣＢ１５０は、ＡＵＣによって決定したとき、９７．１％モノマー、２．８％ダイマーモノマーを示し、凝集を示さず、更なる生物物理的特性評価のために一過的に発現させた研究材料について許容可能な基準を満たした。ＴＭＥＢ７６２は、９５．５％モノマー、４．５％ダイマーを示し、凝集は示さなかったが、一方、ＣＤ３Ｂ３７６は、９７．７％モノマー及び２．２％ダイマーを示し、凝集は示さなかった。最低２段階精製された分子の＞５％の凝集体レベルは、生物活性、溶解性、安定性、及び貯蔵寿命に有意な影響を及ぼし得る。
【０７０１】
ＤＳＣによる抗ＴＭＥＦＦ２／ＣＤ３二重特異性物の配座安定性
ＴＭＣＢ１５０熱アンフォールディングをＤＳＣ（示差走査熱量測定）によって決定し、これは、アンフォールディング開始Ｔｍ＝５２．６℃であり、６１．８℃で第１の熱転移（Ｔｍ１）、６７．６℃で第２の熱転移（Ｔｍ２）、及び７５．５℃で第３の熱転移（Ｔｍ３）を示した。上記の通りＤＳＣによって評価した親抗体（抗ＴＭＥＦＦ２、ＴＭＥＢ７６２、及び抗ＣＤ３、ＣＤ３Ｂ３７６）の熱転移プロファイルに基づいて、ＴＭＣＢ１５０のＴｍ１は、ＣＤ３Ｂ３７６  ＦＡＢのアンフォールディングに対応し、ＴＭＣＢ１５０のＴｍ３は、ＴＭＥＢ７６２  Ｆａｂのアンフォールディング転移に対応する。
【０７０２】
血清安定性
ヒト血清成分に対する非特異的又はオフターゲット結合についてのリード候補の特性を評価するために、血清安定性アッセイを展開する。これにより、不十分な薬物動態及び生物分布特性を予測することができる。蛍光ベースのクロマトグラフィー法を使用して、ＴＭＣＢ１５０の結合及び安定性をバッファ及びヒト血清の両方において評価する。二重特異性抗体を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲート（製造元の指示書に従ったＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎキット）で標識し、４℃及び３７℃で２日間、Ｈｅｐｅｓバッファ及びヒト血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）中でインキュベートし、次いで、蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステムを用いてＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析する。各ピークの曲線下面積の積分から凝集率を計算する。ＴＭＣＢ１５０は、時間ゼロにおいてＨｅｐｅｓバッファ中で２．４％の凝集を示し、摂氏４度及び３７度において２日後にそれぞれ２．０％及び１．３％の凝集を示した。ヒト血清において、ＴＭＣＢ１５０は、時間ゼロで１，７％の凝集、そして、摂氏４度及び３７度の両方で２日後に１．１％の凝集を示した。
【０７０３】
非特異的結合
リード分子の、無関係な表面への非特異的結合を、バイオセンサー技術（Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ）によって決定する。無関係なタンパク質でコーティングされたＳＰＲ表面上に抗体を通過させる。抗体がこれらの無関係な表面に対して有意な結合を示す場合、その抗体は、インビボ特性が乏しく、製造上の問題を示すと予測される。リード分子を最終濃度１μＭで試験する。無関係な表面としては、負に帯電しているタンパク質（ダイズトリプシン阻害剤）、正に帯電しているタンパク質（リゾチーム及びβ−デフェンシン）、疎水性（Ｒｈ−インテグリンａ４ｂ７）、ヒトＩｇＧ、粘着性タンパク質（Ｒｈ−ＣＤ１９）が挙げられる。この実験では、適切な対照を使用する。リードを２つの表面上に流し、一方はブランクであり、他方は直接固定化された分子を有する。試験表面ＲＵからブランクＲＵを減じることによって、応答単位（ＲＵ）レベルを求める。ＴＭＣＢ１５０及び親ｍＡｂのＲＵを以下の表に示す。応答単位≧１００は、帯電／疎水性／ＩｇＧ表面への非特異的結合のリスクが高いことを予測し、これは、製造中に問題を生じさせ、ＰＫ特性が不十分であると解釈される。抗体のいずれも、無関係な表面に対する非特異的結合を示さず、このことから、製造及びインビボ挙動についてのリスクが低い、乃至無いと予測される。
【０７０４】
【表７０】
2021524249.tif 000096
【０７０５】
高濃度安定性
注入体積を減少させて皮下投与を容易にするために、多くのモノクローナル抗体は高濃度（≧１００ｍｇ／ｍＬ）で製剤化される。加えて、全てのモノクローナル抗体は、精製プロセス中に一時的に高濃度（≧５０ｍｇ／ｍＬ）に曝される。したがって、高濃度安定性は、これらの分子の重要な品質属性である。３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜を備えた遠心限外濾過装置を用いて濃縮を行う。最初に、５．１〜５．３ｍｇの各タンパク質を同じ出発濃度に希釈し、１５分間隔で４０００×ｇで遠心分離した。各１５分間の遠心分離段階の終了時に、濃縮器を遠心分離器から取り出し、残りのサンプル体積の視覚的推定値を記録する。ＳｏｌｏＶＰＥ機器によって濃度を測定する。濃縮したサンプルを４Ｃ及び４０Ｃで２週間インキュベートし、一定時間間隔でアリコートを引き出し、分析ＳＥＣにより完全性を確認した。ＴＭＣＢ１５０及び親ｍＡｂ（ＣＤ３Ｂ３７６及びＴＭＥＢ７６２）は正常に濃縮された。ＴＭＣＢ１５０の最終濃度は９９．４ｍｇ／ｍＬであり、親ｍＡｂの濃度は５２．２ｍｇ／ｍＬ（ＴＭＥＢ７６２）及び５２．６ｍｇ／ｍＬ（ＣＤ３Ｂ３７６）であった。濃度は４Ｃ及び４０Ｃで２週間同じままであり、これは、分子が、凝集の可能性もエッペンドルフチューブへの吸着の可能性もない、良好な内部特性を有することを示唆している。ＳＥＣピークの積分から測定した種％（Ａ：凝集体；Ｍ：モノマー；Ｆ：断片）を以下の表に提供する。高濃度では、４０Ｃで２週間保管した後、分子はインタクトであり、凝集体は４〜５％であり、断片は≦０．３％であり、このことから良好な貯蔵寿命が予測される。
【０７０６】
【表７１】
2021524249.tif 000097
【０７０７】
動態排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）による抗ＴＭＥＦＦ２／ＣＤ３二重特異性抗体の親和性決定
ＫｉｎＥｘＡ  ３２００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、二重特異性ｍＡｂ  ＴＭＣＢ１５０及びその二価ＴＭＥＦＦ２親ＴＭＥＢ７６２  ｍＡｂの、ヒトＴＭＥＦＦ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する溶液平衡親和性ＫＤを測定した。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣＬ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、０．１％  ＢＳＡ、及び０．０２％  ＮａＮ３中における一定濃度の抗ＴＭＥＦＦ２  ｍＡｂを用いて、ヒトＴＭＥＦＦ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の連続希釈物を調製した。結合相互作用が平衡に達するまで、反応混合物をＲＴでインキュベートした。ＫｉｎＥｘＡソフトウェアシミュレーションを使用して、インキュベーションの継続時間を求めた。ビス−アクリルアミド／アズラクトンコポリマー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で構成されるプレ活性化ビーズにおけるアミンカップリングによるＴＭＥＦＦ２−ＥＣＤの直接共有結合性固定化によって、ビーズを調製した。インキュベーション後、混合物をＴＭＥＦＦ２修飾ビーズに通し、蛍光標識された二次抗体を使用して捕捉抗体を検出することによって、混合物中の遊離抗体を評価するために、サンプルをＫｉｎＥｘＡ機器で実験した。ＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して、データを１：１結合モデルにフィッティングさせた。
【０７０８】
【表７２】
2021524249.tif 000098
【０７０９】
抗ＴＭＥＦＦ２／ＣＤ３二重特異性抗体のＮ末端ＣＤ３εペプチドに対する結合親和性の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び抗ヒトＦｃバイオセンサー表面を使用して実施したＳＰＲによって、反応速度定数を測定した。抗ヒト免疫グロブリン抗体を、ＣＭ４センサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面に共有結合させた。対象となる抗体を抗ヒト免疫グロブリンセンサチップ上に捕捉し、続いて、０．０５％界面活性剤Ｐ２０（Ｔｗｅｅｎ（商標）２０）及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中に様々な濃度でＮ末端ＣＤ３εペプチドを注入した。１００μＬ／分で０．８％リン酸３０μＬを２パルス注入して、表面を再生した。報告データは、捕捉抗体を含む流動細胞と、捕捉抗体を含まない参照細胞との間のＳＰＲシグナルの差異である。基準−引算シグナル（reference-subtracted signal）からブランク注入のデータを引算することによって、シグナルに対する器具の追加の寄与を除去した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して全ての濃度（グローバルフィット）における会合及び解離相を１：１結合モデルにフィッティングさせることにより、データを分析した。９５％ＣＩ×標準偏差／反復の数の平方根のｔ値によって計算される平均＋９５％ＣＩ（信頼間隔）として、データを報告する。
【０７１０】
【表７３】
2021524249.tif 000099
【０７１１】
７−８  二重特異性ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３抗体は、前立腺癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷に効果的である。
前立腺癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷
選択二重特異性ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３抗体を、前立腺癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷を媒介する能力について評価した。
【０７１２】
活性カスパーゼ３／７による蛍光基質の切断を介して細胞殺傷を間接的に測定するカスパーゼ細胞傷害アッセイを用いて、ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞媒介性殺傷を測定した。基質の切断により蛍光ＤＮＡ色素が得られ、蛍光は細胞核に制限される。同じ座標でウェルを正確に撮像することができる電動式１０倍対物レンズを使用して、アッセイの全過程を通して各ウェルにおいて繰り返し蛍光測定を行う。規定のサイズ制限に基づいて及び／又は二次標識の使用を通して、標的細胞集団を特定する。
【０７１３】
冷凍した汎ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）を、正常健常ドナーから陰性選択によって単離した。ＴＭＥＦＦ２を発現している前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ−ＡＲ）を、１０％  ＨＩ  ＦＢＳ＋補給物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。Ｔ細胞及び標的細胞を、選択試薬なしで、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ＋１０％  ＦＢＳ及び補給物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で合わせ、製造元ガイドラインに従って細胞各１ｍＬに対して０．６μＬのＮｕｃＶｉｅｗカスパーゼ試薬（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した。総体積０．１ｍＬの細胞を、透明な９６ウェル平底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）の適切なウェルに添加した。ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３二重特異性抗体を、上記のように調製したフェノールレッド不含ＲＰＭＩ中２×最終濃度で調製し、０．１ｍＬの化合物を各ウェルに添加した。ウェルの縁部における細胞凝集を最小化するために室温で３０分間インキュベートした後、３７℃、５％ＣＯ２で保持したＺｏｏｍ  Ｉｎｃｕｃｙｔｅ機器（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にプレートを移した。
【０７１４】
Ｉｎｃｕｃｙｔｅにおける処理の解像度は、製造ガイドラインに従って、試験される各細胞株に対して設計した。カスパーゼシグナルにおいてプラトーが観察され、続いて、最高濃度の試験化合物を含有するウェルにおける最大シグナルから３回以上の連続的な減少が観察されるまで、６時間ごとに測定を行った。
【０７１５】
アッセイが完了した後、適切な処理解像度を用いて各プレートを分析した。蛍光生データをＩｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍソフトウェアからエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にペーストした。ＧｒａｐｈＰａｄにおいて各ウェルの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって、カスパーゼ３／７活性を求めた。Ｌｏｇ１０ｎＭ化合物の関数としてＡＵＣ値をプロットした。各用量曲線のＥＣ５０（ナノモル（ｎＭ））を、非線形回帰分析（４パラメータフィット、最小二乗）に従って報告した。各アッセイは、最低３つの生物学的複製物を含有しており、５人の健常ドナー由来のＴ細胞を使用して各細胞株を試験した。非線形回帰モデルを使用して、非臨床統計によってデータを更に分析した。
【０７１６】
二重特異性ＴＭＥＦＦ２×ＣＤ３抗体は、インビボ前立腺癌腫瘍モデルにおいて効果的である。
【０７１７】
選択二重特異性抗体を、雄ＮＳＧマウスにおけるエクスビボＬｎＣａＰ前立腺癌モデルで試験した。試験のために、０．２ｍＬ／動物の５０％Ｃｕｌｔｒｅｘ中１０６個のＬｎＣａＰ細胞を、０日目に皮下注射により右側腹部に投与した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３の体積に達したときに動物を無作為化し、１５日目に２０６Ｔ細胞／マウスを腹腔内注入した。各群で１０頭の動物を使用した。Ｔ細胞注射の１〜３日後に、抗体による処理を開始した。抗体を週２回腹腔内投与した。投与前に、全ての動物にＩＶＩＧ＋Ｆｃブロックを投与した。腫瘍が約１２００ｍｍ３に達するまで、腫瘍体積及び体重を週２回評価した。処理群を表７９に示す。これらのアッセイでは、ＣＤ３結合アームとＨＩＶ  ｇｐ１２０に結合するヌルアームとを有するＣＤ３×ヌル抗体を陰性対照として使用した。
【０７１８】
【表７４】
2021524249.tif 000100
【０７１９】
表８０は、腫瘍移植後の各群あたりの３８日目の腫瘍増殖阻害率を示す。
【０７２０】
図７２は、腫瘍移植後の経時的な平均腫瘍体積の減少を示す。図７３は、０．０５、０．１、又は０．５ｍｇ／ｋｇのＴＭＥＢ７６２×ＣＤ３Ｂ３７６で処理した各マウスの平均腫瘍体積の減少を示す。
【０７２１】
【表７５】
2021524249.tif 000101
【０７２２】
２０ｅ６個のＴ細胞でヒト化された雄ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスにおける、樹立されたＬＮＣａＰ異種移植片において、ＴＭＥＢ７６２×ＣＤ３Ｂ３７６（ＴＭＣＢ１５０）の有効性も評価した。動物を、腫瘍移植後１３日目に平均腫瘍体積によって各々１０頭の動物群に無作為化した。０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＥＢ７６２×ＣＤ３Ｂ３７６又は０．５ｍｇ／ｋｇのヌル×ＣＤ３Ｂ３７６抗体対照を、５週間にわたって週２回ＩＰ投与した。腫瘍移植後３５日目に、１群あたり少なくとも８頭の動物が残っていた場合、腫瘍体積によって決定したときの腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を計算した。ヌル×ＣＤ３対照と比較して統計的に有意な腫瘍増殖阻害は、０．５及び０．１ｍｇ／ｋｇのＴＭＥＢ７６２×ＣＤ３Ｂ３７６では観察されたが、０．０５ｍｇ／ｋｇでは観察されなかった（図７３、ｐ≦０．０００１）。ヌル×ＣＤ３処理対照と比較して、０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＥＢ７６２×ＣＤＢ３７６は、それぞれ１１０％、８８％、及び２５％の腫瘍増殖阻害を惹起した。ＴＭＥＢ７６２×ＣＤＢ３７６処理の結果、それぞれ０．５及び０．１ｍｇ／ｋｇで７及び３頭の完全奏功が得られた。皮下ＬＮＣａＰ腫瘍を週２回キャリパーで測定し、結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）±ＳＥＭ（１群あたり≧８頭のマウスが残っていた）として提示した。
【０７２３】
ＴＭＣＢ１３２の投与に応答したＴ細胞活性化
ＬｎＣａＰ前立腺癌細胞におけるＴ細胞活性化を、フローサイトメトリーによって、具体的には、ＴＭＣＢ１３２による処理の７２時間後に、６人の別個の正常な健常ドナー（９６４２、９６７２、９７６２、９７７２、９８３２、９８５２）におけるＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２５陽性を評価することによって測定した（図７４）。ＬｎＣａＰ前立腺癌細胞に対するＴＭＣＢ１３２の投与に応答して、３：１エフェクター：標的比で添加されたＣＤ３＋汎Ｔ細胞の活性化が観察された。
【０７２４】
インビトロにおけるＴＭＣＢ１３２のＴ細胞媒介細胞傷害。
Ｔ細胞媒介性細胞傷害アッセイを使用して、Ｉｎｃｕｃｙｔｅプラットフォームでライブタイムラプスイメージングを使用して、インビトロにおけるＴＭＣＢ１３２の細胞傷害能を評価した。３：１の（エフェクター：標的）エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ比）で、健常ドナー由来の単離汎ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下で、ＴＭＥＦＦ２陽性細胞株ＬｎＣａＰにおいてＴＭＣＢ１３２を試験した。９６時間の期間にわたって活性カスパーゼ３／７の蛍光シグナルを測定することによって、アポトーシスによる細胞死をモニタリングした。ＴＭＣＢ１３２は、時間の経過とともに、生存ＬｎＣａＰ細胞の減少を用量依存的に促進した。カスパーゼ３／７活性又は蛍光シグナルの用量依存的増加は、Ｔ細胞の存在下でＬｎＣａＰ細胞における細胞死を示した（図７５）。データは、ＴＭＣＢ１３２が、ＬｎＣａＰ腫瘍細胞においてＴ細胞媒介死を誘導するのに効果的であることを示唆している。
【０７２５】
Ｔ細胞ヒト化マウスにおける樹立されたＳＣヒト前立腺異種移植片におけるＴＭＣＢ１３２の有効性。
ＴＭＣＢ１３２の抗腫瘍有効性を、２０ｅ６個のＴ細胞でヒト化された雄ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ，Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）マウスの樹立された皮下（ＳＣ）ヒト前立腺ＬＮＣａＰ異種移植片において評価した。動物を、腫瘍移植後１３日目に平均腫瘍体積によってそれぞれ１０頭の動物群に無作為化した。０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＥＢ１３２又は０．５ｍｇ／ｋｇのヌル×ＣＤ３Ｂ２１９抗体対照を、４週間にわたって週２回ＩＰ投与した。腫瘍移植後４５日目に、１群あたり少なくとも７頭の動物が残っていた場合、腫瘍体積によって決定したときの腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）を計算した。ヌル×ＣＤ３対照と比較して統計的に有意な腫瘍増殖阻害は、０．５及び０．１及び０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＥＢ１３２で観察された（図７５、ｐ≦０．０００１）。ヌル×ＣＤ３処理対照と比較して、０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＥＢ１３２は、それぞれ１０２％、１０９％、及び４７％の腫瘍増殖阻害を惹起した。ＴＭＥＢ１３２処理の結果、それぞれ０．５、０．１及び０．０５ｍｇ／ｋｇで３、２、及び１頭の完全奏功が得られた。
【図１Ａ】
2021524249.tif 000102
【図１Ｂ】
2021524249.tif 000103
【図２】
2021524249.tif 000104
【図３】
2021524249.tif 000105
【図４】
2021524249.tif 000106
【図５】
2021524249.tif 000107
【図６】
2021524249.tif 000108
【図７】
2021524249.tif 000109
【図８】
2021524249.tif 000110
【図９】
2021524249.tif 000111
【図１０】
2021524249.tif 000112
【図１１】
2021524249.tif 000113
【図１２Ａ】
2021524249.tif 000114
【図１２Ｂ】
2021524249.tif 000115
【図１２Ｃ】
2021524249.tif 000116
【図１２Ｄ】
2021524249.tif 000117
【図１２Ｅ】
2021524249.tif 000118
【図１３Ａ】
2021524249.tif 000119
【図１３Ｂ】
2021524249.tif 000120
【図１４】
2021524249.tif 000121
【図１５】
2021524249.tif 000122
【図１６】
2021524249.tif 000123
【図１７】
2021524249.tif 000124
【図１９】
2021524249.tif 000125
【図２０】
2021524249.tif 000126
【図２１】
2021524249.tif 000127
【図２２】
2021524249.tif 000128
【図２３Ａ】
2021524249.tif 000129
【図２３Ｂ】
2021524249.tif 000130
【図２３Ｃ】
2021524249.tif 000131
【図２３Ｄ】
2021524249.tif 000132
【図２４Ａ】
2021524249.tif 000133
【図２４Ｂ】
2021524249.tif 000134
【図２４Ｃ】
2021524249.tif 000135
【図２４Ｄ】
2021524249.tif 000136
【図２５Ａ】
2021524249.tif 000137
【図２５Ｂ】
2021524249.tif 000138
【図２５Ｃ】
2021524249.tif 000139
【図２５Ｄ】
2021524249.tif 000140
【図２６】
2021524249.tif 000141
【図２７】
2021524249.tif 000142
【図２８】
2021524249.tif 000143
【図２９】
2021524249.tif 000144
【図３０】
2021524249.tif 000145
【図３１】
2021524249.tif 000146
【図３２】
2021524249.tif 000147
【図３３】
2021524249.tif 000148
【図３４】
2021524249.tif 000149
【図３５】
2021524249.tif 000150
【図３６】
2021524249.tif 000151
【図３７Ａ】
2021524249.tif 000152
【図３７Ｂ】
2021524249.tif 000153
【図３８Ａ】
2021524249.tif 000154
【図３８Ｂ】
2021524249.tif 000155
【図３９Ａ】
2021524249.tif 000156
【図３９Ｂ】
2021524249.tif 000157
【図４０Ａ】
2021524249.tif 000158
【図４０Ｂ】
2021524249.tif 000159
【図４１Ａ】
2021524249.tif 000160
【図４１Ｂ】
2021524249.tif 000161
【図４２】
2021524249.tif 000162
【図４３Ａ】
2021524249.tif 000163
【図４３Ｂ】
2021524249.tif 000164
【図４４】
2021524249.tif 000165
【図４５】
2021524249.tif 000166
【図４６】
2021524249.tif 000167
【図４７Ａ】
2021524249.tif 000168
【図４７Ｂ】
2021524249.tif 000169
【図４８Ａ】
2021524249.tif 000170
【図４８Ｂ】
2021524249.tif 000171
【図４９】
2021524249.tif 000172
【図５０】
2021524249.tif 000173
【図５１】
2021524249.tif 000174
【図５２Ａ】
2021524249.tif 000175
【図５２Ｂ】
2021524249.tif 000176
【図５３Ａ】
2021524249.tif 000177
【図５３Ｂ】
2021524249.tif 000178
【図５４Ａ】
2021524249.tif 000179
【図５４Ｂ】
2021524249.tif 000180
【図５５Ａ】
2021524249.tif 000181
【図５５Ｂ】
2021524249.tif 000182
【図５６Ａ】
2021524249.tif 000183
【図５６Ｂ】
2021524249.tif 000184
【図５７】
2021524249.tif 000185
【図５８】
2021524249.tif 000186
【図５９】
2021524249.tif 000187
【図６０】
2021524249.tif 000188
【図６１】
2021524249.tif 000189
【図６２Ａ】
2021524249.tif 000190
【図６２Ｂ】
2021524249.tif 000191
【図６３Ａ】
2021524249.tif 000192
【図６３Ｂ】
2021524249.tif 000193
【図６３Ｃ】
2021524249.tif 000194
【図６４Ａ】
2021524249.tif 000195
【図６４Ｂ】
2021524249.tif 000196
【図６５Ａ】
2021524249.tif 000197
【図６５Ｂ】
2021524249.tif 000198
【図６６】
2021524249.tif 000199
【図６７】
2021524249.tif 000200
【図６８】
2021524249.tif 000201
【図６９】
2021524249.tif 000202
【図７０】
2021524249.tif 000203
【図７１】
2021524249.tif 000204
【図７２】
2021524249.tif 000205
【図７３】
2021524249.tif 000206
【図７４】
2021524249.tif 000207
【図７５】
2021524249.tif 000208
【図７６】
2021524249.tif 000209
【配列表】
2021524249000001.app
【国際調査報告】
2021524249.tif 000210
2021524249.tif 000211
2021524249.tif 000212
2021524249.tif 000213
2021524249.tif 000214
2021524249.tif 000215
2021524249.tif 000216