(57)【要約】がんの処置のための方法および組成物が本明細書に記載される。局面は、がんを有する対象に(1) CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤、または(2) 減少したCBMシグナロソーム複合体レベルを有するように遺伝子操作された細胞を投与する段階を含む。様々な態様では、本方法は、対象に第2の治療法、例えばチェックポイント阻害剤または抗がん療法を投与する段階をさらに含む。2021508720.tif 000041
2021508720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象にCARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の活性を阻害する剤を投与する段階を含む、方法。
【請求項２】
がんが、がん腫、黒色腫、肉腫、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
がんが、黒色腫または結腸がんである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
がんが、固形腫瘍である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
固形腫瘍が、副腎皮質腫瘍、胞状軟部肉腫、軟骨肉腫、結腸直腸がん、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、卵黄嚢腫瘍、類上皮血管内皮腫、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍(固形腫瘍)、骨・軟部組織巨細胞腫、肝芽腫、肝細胞がん、黒色腫、腎腫、神経芽腫、非横紋筋肉腫軟部肉腫(NRSTS)、骨肉腫、傍脊椎肉腫、腎細胞がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、またはウィルムス腫瘍からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
がんが、黒色腫、頭頸部がん、肺がん(例えば非小細胞肺がん)、膀胱がん、腎がん、前立腺がん、中枢神経系(CNS)がん、乳がん、胃がん、甲状腺がん、卵巣がん、または非ホジキンリンパ腫である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
がんが、黒色腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、または腎がんである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
がんが、微小腫瘍環境を伴う可溶性がんである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
がんが、転移性である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
投与する段階の前に、がんを有すると対象を診断する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
投与する段階の前に、がんを有すると対象を診断するアッセイの結果を受け取る段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
対象にチェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
チェックポイント阻害剤が、小分子、阻害性核酸、阻害性ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合ドメイン、または抗体試薬である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
抗体もしくはその抗原結合ドメインまたは抗体試薬が、免疫チェックポイントポリペプチドに結合してその活性を阻害する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
免疫チェックポイントポリペプチドが、PD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、およびTIGITからなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
免疫チェックポイントポリペプチドが、PD-1、PD-L1、またはPD-L2である、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
チェックポイント阻害剤が、PD-1、PD-L1、またはPD-L2を阻害する、請求項12〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
PD-1を阻害するチェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ(Keytruda)、ニボルマブ、AUNP-12、およびピディリズマブからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
PD-L1を阻害するチェックポイント阻害剤が、アテゾリズマブ、MPDL3280A、アベルマブ、およびデュルバルマブからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
前記剤により阻害される活性が、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の機能である、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記剤により阻害される活性が、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の形成である、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記剤により阻害される活性が、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の少なくとも1つの成分の機能である、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記剤により阻害される活性が、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の少なくとも1つの成分の発現レベルである、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の活性が、制御性T細胞中で阻害される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
制御性T細胞が、腫瘍浸潤性制御性T細胞である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記剤が、小分子、阻害性核酸、抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体試薬、または阻害性ポリペプチド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
小分子が、MALT1パラカスパーゼ活性の小分子阻害剤である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
MALT1パラカスパーゼ活性の小分子阻害剤が、MI-2もしくはその類似体であるMI-2A1、MI-2A2、MI-2A3、MI-2A4、MI-2A5、MI-2A6、MI-2A7、ピラゾロピリミジン誘導体、フェノチアジン誘導体、チアゾロ-ピリジン誘導体、およびテトラペプチドZ-VRPR-FMK(SEQ ID NO: 7)、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
フェノチアジン誘導体が、メパジン、チオリダジン、もしくはプロマジン、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記剤が、(S)-メパジンまたはその薬学的に許容される塩を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記剤が、WO 2015/181747またはWO 2018/085247に開示されているMALT1阻害剤を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
前記剤が、WO 2018/020474に開示されているMALT1阻害剤を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
対象に少なくとも1つの抗がん療法を投与する段階をさらに含む、請求項1〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
抗がん療法が、化学療法、放射線療法、化学放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、および幹細胞療法からなる群より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
免疫療法が、腫瘍ワクチン、キメラ抗原受容体T細胞(CAR T細胞)、養子T細胞療法、養子ナチュラルキラー(NK)細胞療法、または養子NK T細胞療法である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
抗がん療法が、CAR T細胞療法である、請求項33〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
患者に、
(1) (S)-メパジン、
(2) チェックポイント阻害剤、および
(3) CAR-T細胞療法
を投与する段階を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象にMI-2阻害剤およびPD-1またはPDL-1の阻害剤を投与する段階を含む、方法。
【請求項３９】
がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象にメパジン(例えば(S)-メパジン)およびPD-1またはPDL-1の阻害剤を投与する段階を含む、方法。
【請求項４０】
投与する段階の前に、がんを有すると対象を診断する段階をさらに含む、請求項38または39記載の方法。
【請求項４１】
投与する段階の前に、がんを有すると対象を診断するアッセイの結果を受け取る段階をさらに含む、請求項38または39記載の方法。
【請求項４２】
減少したCARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム活性を有するように遺伝子操作された細胞。
【請求項４３】
CARMA1、Bcl10、およびMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の機能を阻害するように遺伝子操作された、請求項42記載の細胞。
【請求項４４】
CARMA1、Bcl10、およびMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子産物の機能を阻害するように遺伝子操作された、請求項42記載の細胞。
【請求項４５】
CARMA1、Bcl10、およびMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを減少させるように遺伝子操作された、請求項42記載の細胞。
【請求項４６】
CARMA1、Bcl10、およびMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを減少させるように遺伝子操作された、請求項42記載の細胞。
【請求項４７】
免疫細胞である、請求項42記載の細胞。
【請求項４８】
免疫細胞がT細胞である、請求項47記載の細胞。
【請求項４９】
T細胞が、制御性T細胞である、請求項48記載の細胞。
【請求項５０】
がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象に請求項42〜49のいずれか一項記載の細胞を投与する段階を含む、方法。
【請求項５１】
投与する段階の前に、がんを有すると対象を診断する段階をさらに含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
投与する段階の前に、がんを有すると対象を診断するアッセイの結果を受け取る段階をさらに含む、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
対象にチェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含む、請求項50〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
対象に抗がん療法を投与する段階をさらに含む、請求項50〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
チェックポイント阻害剤療法に耐性のあるがんを処置する方法であって、
該処置を必要とする対象に
a. CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の活性を阻害する剤、または請求項42〜49のいずれか一項記載の細胞を投与する段階; および
b. 第2の治療法を投与する段階
を含む、方法。
【請求項５６】
投与する段階の前に、チェックポイント阻害剤療法に耐性のあるがんを有すると対象を診断する段階をさらに含む、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
投与する段階の前に、チェックポイント阻害剤療法に耐性のあるがんを有すると対象を診断するアッセイの結果を受け取る段階をさらに含む、請求項55記載の方法。
【請求項５８】
第2の治療法が、チェックポイント阻害剤または抗がん療法である、請求項55〜57のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
チェックポイント阻害剤療法が、抗PD-L1療法、抗PD-L2療法、抗PD-1療法、抗CTLA-4療法、抗TIM-3療法、抗LAG-3療法、抗VISTA療法、および抗TIGIT療法からなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
チェックポイント阻害剤療法が、抗PD-1療法または抗PD-L1療法である、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
がんを処置することにおける使用のためのMALT1阻害剤であって、チェックポイント阻害剤との併用療法用の、MALT1阻害剤。
【請求項６２】
がんが、黒色腫、頭頸部がん、肺がん(例えば非小細胞肺がん)、膀胱がん、腎がん、前立腺がん、中枢神経系(CNS)がん、乳がん、胃がん、甲状腺がん、卵巣がん、または非ホジキンリンパ腫である、請求項61記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項６３】
がんが、黒色腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、または腎がんである、請求項61記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項６４】
チェックポイント阻害剤が、PD-1阻害剤またはPD-L1阻害剤である、請求項61〜63のいずれか一項記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項６５】
チェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ(Keytruda)、ニボルマブ、AUNP-12、またはピディリズマブである、請求項64記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項６６】
チェックポイント阻害剤が、アテゾリズマブ、MPDL3280A、アベルマブ、またはデュルバルマブである、請求項64記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項６７】
(S)-メパジンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項61〜66のいずれか一項記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項６８】
使用が、CAR-T免疫療法をさらに含む、請求項61〜66のいずれか一項記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項６９】
がんを処置することにおける使用のためのMALT1阻害剤であって、CAR-T免疫療法との併用療法用の、MALT1阻害剤。
【請求項７０】
がんが、黒色腫、頭頸部がん、肺がん(例えば非小細胞肺がん)、膀胱がん、腎がん、前立腺がん、中枢神経系(CNS)がん、乳がん、胃がん、甲状腺がん、卵巣がん、または非ホジキンリンパ腫である、請求項69記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項７１】
がんが、黒色腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、または腎がんである、請求項69記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項７２】
(S)-メパジンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項69〜71のいずれか一項記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項７３】
使用が、チェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項69〜72のいずれか一項記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項７４】
チェックポイント阻害剤が、PD-1阻害剤またはPD-L1阻害剤である、請求項73記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項７５】
チェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ(Keytruda)、ニボルマブ、AUNP-12、またはピディリズマブである、請求項74記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【請求項７６】
チェックポイント阻害剤が、アテゾリズマブ、MPDL3280A、アベルマブ、またはデュルバルマブである、請求項74記載の使用のためのMALT1阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)項に基づいて、2017年12月28日出願の米国仮出願第62/611,186号の恩典を主張するものであり、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
参照による組み入れ
本明細書と同時に提出されかつ以下のように識別されるコンピュータ可読ヌクレオチド/アミノ酸配列表が全体として本明細書に組み入れられる: ASCIIテキストファイル、名称030258-090990WOPT_SL.txt、作成2018年12月28日、サイズ38,540バイト。
【０００３】
技術分野
本明細書に記載の技術は、がんの処置に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
固形腫瘍には、それらを調節または拒絶する可能性を有するエフェクターT細胞(Teff)、およびTeffの機能を制限することで腫瘍増殖を促進する制御性T細胞(Treg)が浸潤する1。Teffの抗腫瘍活性は、治療的に発揮されうるものであり、現在、ヒトがんのいくつかの選択された形態の処置に利用されている。しかし、Tregの弱い腫瘍関連炎症応答および低いインターフェロン(IFN)-γ分泌、ならびに免疫抑制機能は、依然として腫瘍免疫療法の有効性を広げる上での大きなハードルである2。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書では、CARMA1-Bcl10-MALT1(CBM)シグナロソーム複合体の妨害時に、腫瘍浸潤性Tregの大部分がIFN-γを産生し、腫瘍増殖が阻害されることを示す、実験データが部分的に提示される。全身性自己免疫を回避するTregのごく一部分におけるCBMシグナロソーム複合体の活性を妨害する手段としての、CARMA1の両方の対立遺伝子または単に一方の対立遺伝子の遺伝子欠失は、この抗腫瘍効果を生成するために十分であった。これは、Tregによるエフェクター活性の獲得が主に腫瘍調節を開始させることを示している。TregによるIFN-γ産生に伴って、腫瘍細胞上でマクロファージが活性化され、MHC-Iが上方制御された。これは腫瘍の免疫反応性の増強を反映するものである。また、腫瘍細胞はPD-L1の発現を上方制御した。これは適応免疫耐性の活性化を示すものである3。したがって、CBMシグナロソーム複合体の妨害と同時のPD-1遮断は、それがなければ抗PD-1単剤療法に応答しない腫瘍の拒絶を引き起こした。本明細書に記載の実験的知見は、自己反応性TregプールにおけるCBMシグナロソーム複合体の部分的妨害およびIFN-γ分泌の誘導が、全身性自己免疫を引き起こさないが、免疫チェックポイント療法の成功のために腫瘍微小環境を刺激するには十分であることを部分的に示す。
【０００６】
したがって、本明細書に記載の本発明の一局面は、がんを処置するための方法であって、該処置を必要とする対象にCARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の活性を阻害する剤を投与する段階を含む方法を提供する。
【０００７】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、がんは、がん腫、黒色腫、肉腫、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫である。別の態様では、がんは固形腫瘍である。例示的な固形腫瘍としては、副腎皮質腫瘍、胞状軟部肉腫、軟骨肉腫、結腸直腸がん、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、卵黄嚢腫瘍、類上皮血管内皮腫、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍(固形腫瘍)、骨・軟部組織巨細胞腫、肝芽腫、肝細胞がん、黒色腫、腎腫、神経芽腫、非横紋筋肉腫軟部肉腫(NRSTS)、骨肉腫、傍脊椎肉腫、腎細胞がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。任意の局面の一態様では、がんは転移性である。
【０００８】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、がんは黒色腫または結腸がんである。
【０００９】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、本方法は、投与する段階の前に、がんを有すると対象を診断する段階をさらに含む。
【００１０】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、本方法は、投与する段階の前に、がんを有すると対象を診断するアッセイの結果を受け取る段階をさらに含む。
【００１１】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、本方法は、対象に免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含む。チェックポイント阻害剤は、小分子、阻害性核酸、阻害性ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合ドメイン、または抗体試薬でありうる。本明細書に記載の任意の局面の一態様では、抗体もしくはその抗原結合ドメイン、または抗体試薬は、免疫チェックポイントポリペプチドに結合してその活性を阻害する。例示的な免疫チェックポイントポリペプチドとしては、PD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、またはTIGITが挙げられる。任意の局面の一態様では、免疫チェックポイントポリペプチドは、PD-1、PD-L1、またはPD-L2である。
【００１２】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、チェックポイント阻害剤は、PD-1、PD-L1、またはPD-L2を阻害する。PD-1を阻害する例示的なチェックポイント阻害剤としては、ペンブロリズマブ(Keytruda)、ニボルマブ、AUNP-12、およびピディリズマブが挙げられる。PD-L1を阻害する例示的なチェックポイント阻害剤としては、アテゾリズマブ、MPDL3280A、アベルマブ、またはデュルバルマブが挙げられる。
【００１３】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の活性は制御性T細胞中で阻害される。任意の局面の一態様では、制御性T細胞は腫瘍浸潤性制御性T細胞である。
【００１４】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、剤により阻害される活性は、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の機能である。任意の局面の一態様では、剤により阻害される活性は、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の形成である。本明細書に記載の任意の局面の一態様では、剤により阻害される活性は、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の少なくとも1つの成分の機能である。本明細書に記載の任意の局面の一態様では、剤により阻害される活性は、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の少なくとも1つの成分の発現レベルである。
【００１５】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、剤は、小分子、阻害性核酸、抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体試薬、または阻害性ポリペプチドである。本明細書に記載の任意の局面の一態様では、小分子はMALT1パラカスパーゼ活性の小分子阻害剤である。MALT1パラカスパーゼ活性の例示的な阻害剤としては、MI-2またはその類似体、ピラゾロピリミジン誘導体、フェノチアジン誘導体、およびテトラペプチドZ-VRPR-FMK(SEQ ID NO: 7)が挙げられるがそれに限定されない。任意の局面の一態様では、フェノチアジンは、メパジン、チオリダジン、またはプロマジンである。他の態様では、MALT1阻害剤は、それぞれの内容が全体として参照により本明細書に組み入れられるWO2018020474、WO2018119036、WO2018141749、またはUS20180251489に記載の1つまたは複数の化合物または誘導体を含む。一態様では、MALT1阻害剤は、その内容が全体として参照により組み入れられるUS20180251489に例えば記載のテトラペプチドZ-VRPR-FMK(SEQ ID NO: 7)のペプチド誘導体である。別の態様では、MALT1阻害剤は、その内容が全体として参照により本明細書に組み入れられるWO2018141749に例えば記載の(S)-1-(6-(4-(アミノメチル)-1H-ピラゾール-1-イル)-5-クロロピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素である。別の態様では、MALT1阻害剤は、その内容が全体として参照により本明細書に組み入れられるWO2018119036に例えば記載のピラゾロ誘導体を含む。別の態様では、MALT1阻害剤は、1つまたは複数の置換チアゾロ-ピリジン化合物、例えばその内容が全体として参照により本明細書に組み入れられるWO2018020474に記載の置換チアゾロ-ピリジン化合物を含む。
【００１６】
本明細書に記載の様々な局面の別の態様では、本方法は、対象に抗がん療法を投与する段階をさらに含む。例示的な抗がん療法としては化学療法、放射線療法、化学放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、および幹細胞療法が挙げられる。本明細書に記載の任意の局面の一態様では、免疫療法は腫瘍ワクチン、キメラ抗原受容体T細胞(CAR T細胞)、養子T細胞療法(例えば養子CD4+もしくはCD8+エフェクターT細胞療法)、養子ナチュラルキラー(NK)細胞療法、または養子NK T細胞療法である。
【００１７】
本明細書に記載の本発明の別の局面は、がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象にMI-2阻害剤およびPD-1阻害剤を投与する段階を含む方法を提供する。
【００１８】
本明細書に記載の本発明のさらに別の局面は、がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象にメパジンおよびPD-1阻害剤を投与する段階を含む方法を提供する。
【００１９】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、投与は全身投与である。任意の局面の一態様では、投与は局所投与である。
【００２０】
本明細書に記載の本発明の別の局面は、減少したCARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム活性を有するように遺伝子操作された細胞を提供する。一態様では、細胞は、CARMA1、Bcl10、またはMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の機能を阻害するように遺伝子操作されている。別の態様では、細胞は、CARMA1、Bcl10、またはMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子産物の機能を阻害するように遺伝子操作されている。別の態様では、細胞は、CARMA1、Bcl10、またはMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを減少させるように遺伝子操作されている。さらに別の態様では、細胞は、CARMA1、Bcl10、またはMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを減少させるように遺伝子操作されている。
【００２１】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、細胞は免疫細胞である。任意の局面の一態様では、細胞はT細胞である。任意の局面の別の態様では、細胞は制御性T細胞である。
【００２２】
本明細書に記載の本発明の別の局面は、がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象に本明細書に記載のいずれかの遺伝子操作細胞を投与する段階を含む方法を提供する。一態様では、本方法は、対象にチェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含む。別の態様では、本方法は、対象に抗がん療法を投与する段階をさらに含む。
【００２３】
本明細書に記載の本発明の別の局面は、チェックポイント阻害剤療法に耐性のあるがんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象に(a)CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の活性を阻害する剤、または 本明細書に記載の任意の細胞を投与する段階; および(b) 第2の治療法を投与する段階を含む方法を提供する。
【００２４】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、本方法は、投与する段階の前に、チェックポイント阻害剤療法に耐性のあるがんを有すると対象を診断する段階をさらに含む。
【００２５】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、本方法は、投与する段階の前に、チェックポイント阻害剤療法に耐性のあるがんを有すると対象を診断するアッセイの結果を受け取る段階をさらに含む。
【００２６】
本明細書に記載の任意の局面の一態様では、第2の治療法はチェックポイント阻害剤または抗がん療法である。
【００２７】
例示的なチェックポイント阻害剤療法としては、抗PD-L1療法、抗PD-L2療法、抗PD-1療法、抗CTLA-4療法、抗TIM-3療法、抗LAG-3療法、抗VISTA療法、および抗TIGIT療法が挙げられる。本明細書に記載の任意の局面の一態様では、チェックポイント阻害剤療法は抗PD-1療法である。
【００２８】
定義
本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語および語句の意味を便宜的に以下に示す。別途記載がない限り、または文脈から暗示されない限り、以下の用語および語句は以下に示される意味を含む。定義は、特定の態様を記述することに役立つように示されるものであり、特許請求される本技術の範囲が特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本技術を限定するようには意図されていない。別途定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本技術が属する技術分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。当技術分野におけるある用語の使用と本明細書に示されるその定義との間に明らかな矛盾が存在する場合、本明細書内に示される定義が優先するものとする。
【００２９】
分子生物学および医学における一般的用語の定義は、例えばThe Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見ることができ、その内容はいずれも全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００３０】
本明細書では、「減少させる(decrease)」、「減少した(reduced)」、「減少(reduction)」、または「阻害する」という用語はいずれも、統計的に有意な量の減少を意味するように使用されている。いくつかの態様では、「減少させる(reduce)」、「減少(reduction)」、もしくは「減少させる(decrease)」、または「阻害する」は、通常、基準レベル(例えば所与の処置または剤の非存在)と比べて少なくとも10%の減少を意味し、例えば、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、またはそれ以上の減少を含みうる。本明細書において使用される「減少」または「阻害」は、基準レベルと比べて完全な阻害または減少を包含しない。「完全阻害」とは、基準レベルと比べて100%の阻害のことである。適切であれば、減少は、好ましくは、所与の疾患(例えば黒色腫または結腸がん)を有さない個体の正常範囲内として許容されるレベルまでの減少でありうる。
【００３１】
本明細書では、「増加した(increased)」、「増加させる(increase)」、または「増強する」という用語はいずれも、統計的に有意な量の増加を意味するように使用されている。いくつかの態様では、「増加した(increased）」、「増加させる(increase)」、または「増強する」という用語は、基準レベルと比べて少なくとも10%の増加、例えば基準レベルと比べて少なくとも約20%の増加、または少なくとも約30%の増加、または少なくとも約40%の増加、または少なくとも約50%の増加、または少なくとも約60%の増加、または少なくとも約70%の増加、または少なくとも約80%の増加、または少なくとも約90%の増加、または最大100%の増加、または10〜100%の間の任意の増加、あるいは基準レベルと比べて少なくとも約2倍の増加、または少なくとも約3倍の増加、または少なくとも約4倍の増加、または少なくとも約5倍の増加、または少なくとも約10倍の増加、または2倍〜10倍以上の間の任意の増加を意味しうる。マーカー(例えば細胞表面上でのPD-1の発現)または症状においては、「増加」とは上記レベルの統計的に有意な増加のことである。
【００３２】
本明細書において使用される「対象」とは、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は霊長類、げっ歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、例えばチンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが挙げられる。げっ歯類としては、例えばマウス、ラット、ウッドチャック、ケナガイタチ、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、例えばウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコ種、例えばイエネコ、イヌ種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚、例えばマス、ナマズ、およびサケが挙げられる。いくつかの態様では、対象は哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。本明細書では、「個体」、「患者」、および「対象」という用語は互換的に使用される。
【００３３】
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシでありうるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物を、疾患、例えばがんの動物モデルを代表する対象として有利に使用することができる。対象は雄または雌でありうる。対象は任意の発育年齢の対象、例えば胎児、新生児、幼児、児童、青少年、青年、若年成人、成人、または老年期対象でありうる。
【００３４】
対象は、処置を必要とする状態(例えば特に黒色腫、結腸がん、もしくは別の種類のがん)または該状態に関連する1つもしくは複数の合併症と以前に診断されたか、あるいはそれに罹患しているかまたはそれを有すると同定され、場合によっては、該状態または該状態に関連する1つもしくは複数の合併症に対する処置を既に受けた、対象でありうる。あるいは、対象は、該状態または関連合併症を有すると以前に診断されていない対象であってもよい。例えば、対象は、該状態または該状態に関連する1つもしくは複数の合併症に関する1つまたは複数の危険因子を示す対象であってもよく、危険因子を示さない対象であってもよい。対象は、該状態に対する処置または治療(例えば抗がん療法)を以前に受けた対象でありうる。
【００３５】
特定の状態に対する処置の「必要がある対象」は、該状態を有する対象、該状態を有すると診断された対象、または該状態を発生させる危険性がある対象でありうる。
【００３６】
本明細書において使用される「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「寛解」という用語は、目的が疾患または障害、例えば、特定の療法、例えばチェックポイント阻害剤療法に耐性のあるがんを含む、黒色腫、結腸がん、または他のがんに関連する状態を逆転させるか、軽減するか、寛解させるか、阻害するか、遅らせるか、またはその進行もしくは重症度を停止させることにある、治療的処置を意味する。「処置すること」という用語は、状態、疾患、または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を減少させるかまたは軽減することを含む。処置は、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少する場合に、一般に「有効」である。あるいは、疾患の進行が減少または停止した場合に、処置は「有効」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置の非存在下で予想される場合と比べての症状の停止、または少なくとも症状の進行もしくは悪化の緩徐化も含む。有益なまたは所望の臨床結果としては、1つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化した(すなわち悪化していない)状況、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の寛解または緩和、緩解(部分的であれ全面的であれ)、および/あるいは死亡率の減少が挙げられるがそれに限定されない。
【００３７】
本明細書において使用される「がん」とは、制御されない増殖、分化の欠如、局所組織浸潤、および転移を生じさせる、正常な細胞調節を失った細胞の過剰増殖を意味する。がんは、組織学的種類(例えばがんが発生する組織)および原発部位(例えばがんが最初に発生する身体の位置)に基づいて分類され、がん腫、黒色腫、肉腫、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫でありうる。「がん」は固形腫瘍を意味してもよい。本明細書において使用される「腫瘍」という用語は、例えば悪性型または良性型の細胞または組織の異常増殖を意味する。「がん」は転移性でありうる。これは、がん細胞が原発起源部位から拡散して続発部位に遊走したことを意味する。
【００３８】
一態様では、本明細書において使用される「遺伝子操作された」という用語およびその文法的等価物は、核酸、例えば生物のゲノム内の核酸の、ヒトが設計した1つまたは複数の改変を意味しうる。別の態様では、遺伝子操作されたとは、遺伝子の改変、追加、および/または欠失を意味しうる。「遺伝子操作細胞」とは、遺伝子が追加され、欠失し、かつ/または改変された細胞を意味しうる。本明細書において使用される「細胞」または「遺伝子操作細胞」という用語およびそれらの文法的等価物は、ヒトまたは非ヒト動物起源の細胞を意味しうる。
【００３９】
本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語はアミノ酸のポリマーを意味する。本明細書では、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は互換的に使用される。ペプチドとは、長さが通常は約2〜60個のアミノ酸の、相対的に短いポリペプチドのことである。通常、本明細書において使用されるポリペプチドは、タンパク質に最も一般的に見られる20個のL-アミノ酸などのアミノ酸を含む。しかし、当技術分野において公知である他のアミノ酸および/またはアミノ酸類似体を使用してもよい。ポリペプチド中の1個または複数のアミノ酸を、例えば炭水化物基、ホスフェート基、脂肪酸基、共役用、官能化用のリンカーなどの化学的実体の付加により修飾することができる。非ポリペプチド部分がそれに共有結合的または非共有結合的に結合したポリペプチドもなお「ポリペプチド」と見なされる。例示的な修飾としてはグリコシル化およびパルミトイル化が挙げられる。ポリペプチドを天然供給源から精製するか、組換えDNA技術を使用して産生するか、または従来の固相ペプチド合成などの化学的手段を通じて合成することができる。本明細書において使用される「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」という用語は、ポリペプチド物質それ自体、および/または、ポリペプチドを生化学的に特徴づける配列情報(すなわち、アミノ酸名の略語として使用される文字または3文字コードの連続)を意味しうる。別途指示がない限り、本明細書に示されるポリペプチド配列はN末端からC末端への方向で示される。
【００４０】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリペプチド(例えば阻害性ポリペプチド)をコードする核酸は、ベクターに含まれる。本明細書に記載のいくつかの局面では、本明細書に記載の所与のポリペプチドをコードする核酸配列、またはその任意のモジュールは、ベクターに操作可能に連結されている。本明細書において使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞への送達用に、または異なる宿主細胞間の移動用に設計された、核酸構築物を意味する。本明細書において使用されるベクターはウイルス性または非ウイルス性でありうる。「ベクター」という用語は、適切な調節エレメントに結合する際に複製可能であり、かつ遺伝子配列を細胞に移入することができる、任意の遺伝要素を包含する。ベクターとしてはクローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどを挙げることができるがそれに限定されない。
【００４１】
本明細書において使用される「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写制御配列に連結された配列からのRNAまたはポリペプチドの発現を導くベクターを意味する。発現された配列は、多くの場合、細胞とは異種であるが、必ずしもそうであるわけではない。発現ベクターはさらなる要素を含んでもよく、例えば、発現ベクターは2つの複製系を有してもよく、これにより発現ベクターを2つの生物中に、例えば、発現用にヒト細胞中に、クローニングおよび増幅用に原核生物宿主中に維持することが可能になる。「発現」という用語は、RNAおよびタンパク質を産生すること、ならびに適宜タンパク質を分泌することに関与する細胞プロセスを意味し、細胞プロセスとしては例えば転写、転写物プロセシング、翻訳、ならびにタンパク質のフォールディング、修飾、およびプロセシングが適宜挙げられるがそれに限定されない。「発現産物」としては、遺伝子から転写されたRNA、および、遺伝子から転写されたmRNAの翻訳により得られるポリペプチドが挙げられる。「遺伝子」という用語は、適切な制御配列に操作可能に連結される際にインビトロまたはインビボでRNAに転写(DNA)される核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域に先行する領域および後続する領域、例えば、5'非翻訳(5' UTR)または「リーダー」配列および3' UTRまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント(エキソン)の間に介在する配列(イントロン)を含んでも含まなくてもよい。
【００４２】
本明細書において使用される「薬学的組成物」という用語は、有効剤と薬学的に許容される担体、例えば薬学業界において一般的に使用される担体との組み合わせを意味する。本明細書では、「薬学的に許容される」という語句は、正しい医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触させての使用に好適であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わず、妥当なベネフィット/リスク比に相応している、化合物、原料、組成物、および/または剤形を意味するように使用される。いずれかの局面のいくつかの態様では、薬学的に許容される担体は水以外の担体でありうる。いずれかの局面のいくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、人工担体または操作担体、例えば、有効成分が事実上そこに発生しないことがわかっている担体でありうる。
【００４３】
本明細書において使用される「投与する」という用語は、所望の部位において剤の少なくとも部分的な送達を生じさせる方法または経路によって本明細書に開示される治療用組成物(例えば剤)または薬学的組成物を対象に入れることを意味する。本明細書に開示される剤を含む薬学的組成物を、対象において有効な処置を生じさせる任意の適切な経路で投与することができる。一態様では、投与は全身投与である。本明細書において使用される「全身投与」とは、対象の循環系中への剤の投与経路を意味する。一態様では、投与は局所投与である。本明細書において使用される「局所投与」とは、作用部位(例えば腫瘍)への剤の投与を意味する。治療用組成物または薬学的組成物の全身投与により引き起こされる有害副作用を回避するためには、局所投与が望ましいことがある。
【００４４】
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は統計的有意性を意味し、2標準偏差(2SD)以上の差を一般に意味する。
【００４５】
実施例以外において、または別途指示される場合以外において、本明細書において使用される成分または反応条件の量を表すすべての数字は、すべての場合で「約」という用語によって修正されるものと理解すべきである。パーセントに関して使用される場合の「約」という用語は±1%を意味しうる。
【００４６】
本明細書において使用される「含む」という用語は、示される規定の要素に加えて他の要素が存在してもよいことを意味する。「含む」の使用は、制限よりもむしろ包含を示す。
【００４７】
「からなる」という用語は、態様の記述に記載されていないあらゆる要素を排除する、本明細書に記載の組成物、方法、およびその各構成要素を意味する。
【００４８】
本明細書において使用される「から本質的になる」という用語は、所与の態様に必要な要素を意味する。この用語は、本技術の該態様の基礎的で新規のまたは機能的な特徴に実質的に影響しないさらなる要素の存在を許容する。
【００４９】
単数形「1つの（a）)」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈上別途明らかな指示がない限り、複数の参照対象を含む。同様に、「または」という語は、文脈上別途明らかな指示がない限り、「および」を含むように意図されている。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。「e.g.」という用語はラテン語のexempli gratiaに由来するものであり、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、「e.g.」という略語は「例えば」という用語と同義である。
【００５０】
他の用語は、以下の本技術の様々な局面および態様に関する記述内で定義される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ−１Ｏ】成熟Treg中のCARMA1の損失は致死的であるが、免疫寛容を維持するには発現減少で十分であることを示した、例示的な実験データを示す。(図1A) Foxp3YFP-Cre x CARMA1+/+、x CARMA1fl/+、およびx CARMA1fl/flマウス(「FCre x C1+/+, f/+, f/f」)のLN由来のTregおよびCD4+ Tconv中の細胞内CARMA1タンパク質発現。(図1Bおよび図1C) 若年マウスの体重増加(n=5/群)(図1B)および生存率(+/+、+/f、f/fについてそれぞれn=8、10、20)(図1C)。(図1D〜図1F) 表示されたマウスの21日齢時の動物の外見(図1D)、脾臓およびリンパ節の外見(図1E)、ならびに肝臓、肺、および皮膚の組織学的外見(図1F)。(図1F)中のスケールバーはそれぞれ150μm、50μm(挿入図)を示す。(図1G) αCD3およびαCD28抗体コーティングプレート上でのエクスビボ活性化時の表示されたマウスのLN由来のCD4+およびCD8+従来型T細胞のエフェクターサイトカイン発現。(図1H) 表示されたマウスのLN中の総CD4+ T細胞の中でのTregの出現頻度、および総Tregの中でのCD44hi CD62Llow eTregの出現頻度。i、αCD3およびαCD28抗体コーティングプレート上でのエクスビボ活性化時の表示されたマウスのLN由来のTregのエフェクターサイトカイン発現。(図1J) 加齢FYFP-Cre/+ x C1+/+、x C1f/+、およびx C1f/fマウス(n=4/群)の末梢血中のCD44hi CD62Lloエフェクターメモリー表現型を有する従来型T細胞の出現頻度。(図1K) 表示されたマウスの1歳齢時の脾臓およびLNの外見。(図1L) αCD3およびαCD28抗体コーティングプレート上でのエクスビボ活性化時の表示されたマウスの9週齢時のLN由来のYFP+ Tregのエフェクターサイトカイン発現。(図1M) 表示されたマウスのLN中の総CD4+ T細胞の中でのYFP+ Tregの出現頻度、および総YFP+ Tregの中でのCD44hi CD62Llow eTregの出現頻度。(図1N) 表示された9週齢マウス由来のYFP+ eTreg中の表示されたタンパク質の発現。1G、1H、1I、1L、1M、および1N中のデータは、同様の結果を伴う2つの独立した実験を表す。(図1O) 1歳齢Foxp3YFP-Cre/+ x R26YFP x CARMA1fl/fl、x CARMA1fl/+、およびx CARMA1fl/flマウスのLN由来のYFPbright CD4 T細胞をFoxp3neg exTregの出現頻度について選別および解析した。すべてのグラフは平均値、および個々の複製値または±SEMを示す。b、cでは、* = 任意のp＜0.05。他のパネルでは、* = p＜0.05、** = p＜0.01、*** = p＜0.001、**** = p＜0.0001。
【図２Ａ−２Ｈ】CARMA1の発現減少により腫瘍浸潤性Tregが、腫瘍増殖を主に調節するIFNγ分泌性エフェクター細胞に変換されることを示した、例示的な実験データを示す。(図2Aおよび図2B) ヘテロ接合雌Foxp3YFP-Cre/+ x CARMA1+/+、CARMA1fl/+、およびx CARMA1fl/flマウス(「FCre/+ x C1+/+, f/+, f/f」)にD4M.3A黒色腫を移植し、18日目にtdLNおよび腫瘍組織由来のYFP+ Tregを総CD4+ T細胞の中での出現頻度(図2A)およびFoxp3発現(図2B)について解析した。(図2C) 半数のTregにおいてCARMA1の一方または両方の対立遺伝子が欠失した、表示されたマウス中でのD4M.3A腫瘍増殖。(図2C〜図2F) D4M.3A黒色腫の移植後18日目の表示されたマウスの、CARMA1の一方または両方の対立遺伝子を欠くYFP+ Treg中での、同じ組織中のYFPneg Treg中での、ならびに腫瘍組織(図2Dおよび図2E)またはtdLN(図2F)中のCD4+およびCD8+従来型T細胞中での、エフェクターサイトカインのインサイチュー発現(注: Foxp3YFP-Cre対照マウスのYFP+ Tregによるサイトカイン発現は、マウスゲノム中の偽LoxP配列上でのCreリコンビナーゼ活性を通じたDNA損傷により生じる低レベルの細胞不安定性により生じる。これはYFPneg Treg中では観察されなかった)。(図2G) D4M.3A黒色腫が移植され、中和α-IFNγ抗体で処置されたかまたは処置されなかった、表示されたマウス中での腫瘍増殖。(図2H) FYFP-Cre/+ x C1f/+またはx C1+/+マウス由来の106個のCD4+ YFP+ TregをC57BL/6またはIFNγ欠損宿主に静脈内注射し、翌日、宿主にD4M.3A黒色腫を移植し、腫瘍増殖を記録した。図2A〜図2F中のデータは、同様の結果を伴う2つの独立した複製値を表す。すべてのグラフは平均値、および個々の複製値または±SEMを示す。図2C、図2G、図2Hでは、* = 任意のp＜0.05。他のパネルでは、* = p＜0.05、** = p＜0.01、*** = p＜0.001、**** = p＜0.0001。
【図３Ａ−３Ｆ】CARMA1欠失Tregが腫瘍組織の炎症を急速に引き起こすだけでなく適応免疫耐性も誘導することを示した、例示的な実験データを示す。(図3A〜図3C) Foxp3GFP-CreERT2 x CARMA1+/+およびx CARMA1fl/flマウス(「FCreERT2 x C1+/+、f/f」)にD4M.3A黒色腫を移植し、8日目から5回の一日量のタモキシフェンで処置し、かつ同日から実験終了までFTY720で毎日処置した。(図3B) タモキシフェン処置開始から5日後にtdLNおよび腫瘍組織由来のYFP+ TregおよびCD4+ TconvをFACSにより精製し、サイズが減少した産物を生じさせるPCRによってLoxP導入CARMA1遺伝子の欠失について解析した。(図3D)全数のTreg中で CARMA1が誘導的に欠失した雌マウス(図3C)または全数または半数のTreg中でCARMA1が欠失した雌マウス(図3D)における腫瘍増殖。矢印は処置開始を示す。(図3Eおよび図3F) 腫瘍担持FGFP-CreERT2 x C1+/+およびx C1f/fマウスのタモキシフェン処置開始から3日後の、F4/80+腫瘍マクロファージ上でのMHCクラスIIの表面発現(図3E)、ならびに青色蛍光H2B-Cerulean発現融合タンパク質を発現するD4M.3A腫瘍細胞上でのMHCクラスIおよびPD-L1の発現(図3F)。c〜f中のデータは、同様の結果を伴う2つの独立した複製値を表す。すべてのグラフは平均値、および個々の複製値または±SEMを示す。図3Cおよび図3Dでは、* = p＜0.05対FCreERT2 x C1+/+、# = p＜0.05対FCreERT2/+ x C1f/f。図3Eおよび図3Fでは、* = p＜0.05。
【図４Ａ−４Ｊ】Treg中でのCARMA1欠失、および薬理学的MALT1プロテアーゼ阻害が、PD-1チェックポイント遮断療法と相乗作用することを示した、例示的な実験データを示す。(図4A) 雌Foxp3GFP-CreERT2 x CARMA1+/+およびx CARMA1fl/flマウスにD4M.3A黒色腫を移植し、9日目から実験終了までタモキシフェンで処置し、かつブロッキングα-PD-1抗体29F.1A12またはアイソタイプ対照抗体200μgの3回量で処置し、腫瘍増殖を記録した。(図4B) MALT1プロテアーゼ阻害剤はCBMシグナロソーム複合体のmRNA安定化機能およびNF-κB活性最適化機能を妨害する。(図4Cおよび図4D) MALT1阻害剤メパジンまたはMI-2で処置されたC57BL/6(図4C)またはRAG1欠損宿主(図4D)中でのD4M.3A腫瘍増殖。(図4E〜図4G) 腫瘍細胞上でのMHC IおよびPD-L1の発現(図4E)、適応免疫耐性遺伝子(Pdl1、Socs1)、MHC I抗原提示遺伝子(Tap1)、IFNγシグナル伝達遺伝子(Stat1、Irf1)、T細胞動員遺伝子(CXCL10)、M1マクロファージ活性化遺伝子(Nos2)、および細胞毒性遺伝子(Gzmb)の発現(図4F)、ならびにCD4+およびCD8+ T細胞の出現頻度(図4G)に対する、3日以内のメパジン効果。(図4H〜図4J) 雄C57BL/6宿主中での低免疫原性D4M.3A腫瘍(図4H)および免疫原性D4M.3A-SIINFEKL腫瘍(「SIINFEKL」はSEQ ID NO: 8として開示される)(図4I)、ならびに雌C57BL/6宿主中でのMC38腫瘍(図4J)のα-PD-1とメパジンとの併用処置時の相乗的腫瘍調節。括弧内の数字は、メパジン処置の中断後少なくとも4週間再発しなかった腫瘍の割合を示す。4A、4C、4D、4H、および4I中のデータは、同様の結果を伴う2つの独立した複製値を表す。すべてのグラフは平均値、および個々の複製値または±SEMを示す。グラフ中の矢印は処置開始を示す。4Aでは、* = p＜0.05対C1+/+、# = p＜0.05対C1+/+/α-PD-1、& = p＜0.05対C1f/f; 4C、4H、4I、および4Jでは、* = 任意のp＜0.05対媒体、# = p＜0.05対α-PD-1、& = p＜0.05対メパジン; 4E〜4Gでは、* = p＜0.05、*** = p＜0.001。
【図５Ａ−５Ｂ】Foxp3YFP-Cre/+ x CARMA1+/+、x CARMA1fl/+、およびx CARMA1fl/flマウスのLN中でのCD44hi CD62Lnegエフェクターメモリー表現型を有するCD4+ Foxp3negおよびCD8+従来型T細胞の出現頻度を示した、例示的な実験データを示す。(図5A) データは群当たり5匹のマウスを表すものであり、独立した実験において確認された。*はp＜0.05を示す。(図5B) 図1Nに示されるデータの本来のヒストグラム。データは群当たり3〜5匹のマウスを表すものであり、独立した実験において確認された。
【図６Ａ−６Ｈ】(図6A) 表示されたマウスの21日齢時の肝臓、皮膚、および肺の組織学的外見。スケールバーはそれぞれ150μm、50μm(挿入図)を示す。(図6B) 健康C57BL/6 Rag KOマウスの腎臓、肝臓、および胃の組織切片と、表示された遺伝子型の21日齢マウス由来の血清とを反応させ、自己組織反応性IgGをα-マウスIgG染色により明らかにした。核をDAPIで染色した。(図6C〜図6E) 表示されたマウスにおけるCD11b+脾臓骨髄区画のサイズならびにLy6G+好中球、CD11c+ MHC IIhi DC、Ly6Chi単球、Lyc6Glo SSChi好酸球、およびLy6Clo SSCloマクロファージの比率。(図6F) 脾臓骨髄サブセット上でのMHC I、MHC II、およびPD-L1の発現。(図6G) 表示されたマウスの12日齢および21日齢時のLN中でのCD44hi CD62Lloエフェクターメモリー表現型を有するCD4+ Foxp3negおよびCD8+従来型T細胞の出現頻度。(図6H) αCD3/CD28コーティングプレート上での8時間エクスビボ刺激時の21日齢マウス由来のTconvのエフェクターサイトカイン発現。* = p＜0.05、** = p＜0.01、*** = p＜0.001、**** = p＜0.0001。
【図７Ａ−７Ｆ】(図7A) Foxp3Creの発現時に構成的活性型IKK2/β変異体を発現するFCre x C1+/+またはf/f x Rosa26STOP f/f-IKK2caマウスの生存率。(図7B) 表示されたマウスの21日齢時のLN中でのCD44hi CD62Lloエフェクターメモリー表現型CD4+ Foxp3negおよびCD8+ Tconv細胞の出現頻度。(図7C〜図7D) 表示されたマウスのLN中の総CD4+ T細胞の中でのTregの出現頻度および総Tregの中でのCD44hi CD62Llow eTregの出現頻度(図7C)、ならびにαCD3およびαCD28抗体コーティングプレート上での8時間エクスビボ刺激時のLN Tregによるエフェクターサイトカイン発現(図7D)。(図7E) 表示されたマウスのLN由来のTregによる表示された転写因子の同時発現。(図7F) T-bet、GATA-3、またはRORγtを発現するFCre x C1f/f TregによるCD44およびCD62Lの発現の、総C1f/f Tregとの比較(輪郭プロット)。* = p＜0.05、*** = p＜0.001、**** = p＜0.0001。
【図８Ａ−８Ｈ】(図8A) 雌ヘテロ接合FoxpYFP-Cre/+(「FCre/+」) x C1f/fマウスは、Foxp3Cre対立遺伝子のX染色体位置およびランダムなX染色体不活性化が理由で、半数のTreg中でYFP-Creを発現し、CARMA1f/fを欠失させ、一方、もう半数のTregは依然として機能的である。(図8B) 加齢FCre/+ x C1+/+、f/+、またはfl/flマウス(n=4/群)の末梢血中のCD44hi CD62Lloエフェクターメモリー表現型を有するCD4+ Foxp3negおよびCD8+ Tconvの出現頻度。(図8C) 表示されたマウスの1歳齢時の脾臓およびLNの外見。(図8D〜図8F) 9週齢FCre/+ x C1+/+、f/+、またはf/fマウス由来のYFP+ cTregおよびeTregによるFoxp3、表示されたeTreg分化マーカー、ならびに増殖マーカーKi67およびアポトーシス促進タンパク質BIMの発現。注: e〜f中のeTregに関するデータは図1k〜図1lに示されるものと同じであり、図8G〜図8H中のcTregおよびYFP- Tregとの比較を容易にするために示される。(図8G〜図8H) dおよびfに示される同じ動物に由来するeTreg(g)、ならびにYFP- cTregおよびeTreg上でのeTregマーカー(h)の出現頻度。* = p＜0.05、** = p＜0.01、*** = p＜0.001、**** = p＜0.0001。
【図９Ａ−９Ｄ】(図9A) FCre x C1+/+ x Rosa26STOP f/f-YFPマウスのLNおよび脾臓からCD4+ CD45RBhi YFP- TconvおよびCD4+ CD45RBlo YFPbright Tregを純度98%超まで二重選別した。これにより、YFP-Cre融合タンパク質に加えて可溶性EYFPの高発現に基づくCre発現Tregの明確な区別が可能になる。(図9B) FCre x C1+/+またはFCre/+ x C1f/+もしくはf/fマウス由来のYFPbright TregおよびFCre x C1+/+マウス由来のCellTrace Violet標識TconvをαCD3 AbおよびT細胞除去脾細胞の存在下、表示された比で3日間同時培養し、抑制率をTconv増殖減少率として測定した。(図9C) 様々な遺伝子型のTreg、およびTconvを同時にRag欠損宿主に養子移入し、8週間後、末梢血中のそれぞれの出現頻度を確定した。(図9D) 1歳齢FCre/+ x C1+/+、f/+、またはf/f x Rosa26STOP f/f-YFPマウスのLNからCD4+ YFPbright細胞を選別した後、Foxp3タンパク質の発現に関して染色することでFoxp3-「exTreg」の出現頻度を確定した。* = p＜0.05、** = p＜0.01、*** = p＜0.001、**** = p＜0.0001。Sidak事後検査付きの二元配置分散分析を図9Aにおいて使用した。
【図１０Ａ−１０Ｂ】(図10A) Grinberg-Bleyelらが作成したeTreg遺伝子シグネチャーと本試験におけるそれとの重複(いずれの場合でも、cTregとeTregとの間の変化倍率＞2、padj＜0.01を使用した)。(図10B) 公に入手可能なNCBI GEOデータセットを含むすべてのデータセットのバッチ補正後の、雌ヘテロ接合FCre/+ x C1f/fマウスならびに雌ホモ接合FCre x c-Relf/fおよびFCre x p65/RelAf/fマウス由来のcTreg(左側)またはeTreg(右側)と、それぞれの「WT」対照由来のそれとの間で差次的に発現された(変化倍率＞2、padj＜0.05)遺伝子間の重複。
【図１１Ａ−１１Ｅ】(図11A) 腫瘍増殖18日目のIfng KO宿主のtdLN中の表示された遺伝子型の養子移入YFP+ Tregの出現頻度。図11B〜図11D、Ifng KO宿主中の腫瘍中での養子移入YFP+ Tregの出現頻度(図11B〜図11C)およびエフェクターサイトカイン発現(図11D)。(図11E) 表示された遺伝子型のYFP+ Tregが移入され、かつ中和αIFNγ Abまたは表示されたアイソタイプ対照で処置された、Ifng KO宿主中でのD4M.3A黒色腫増殖。d中では、**** = p＜0.0001。図11Eでは、* = 任意のp＜0.05対すべての他の群。
【図１２Ａ−１２Ｄ】(図12A〜図12B) D4M.3A黒色腫をFCre/+ x C1+/+またはf/f x Rosa26STOP f/f-IKK2caマウスに移植して、tdLNおよび腫瘍組織中でのCD4+ T細胞の中でのTregの出現頻度およびCD44hi eTregの出現頻度(図12A)、ならびにTregの正規化Foxp3発現(図12B)を記録した。(図12C) 腫瘍浸潤性Tregによるエフェクターサイトカイン発現。(図12D) 腫瘍増殖。a〜cでは、* = p＜0.05、** = p＜0.01、*** = p＜0.001、**** = p＜0.0001。図12Dでは、*、& = それぞれ任意のp＜0.05対C1+/+、C1+/+ x IKK2ca。
【図１３Ａ−１３Ｋ】(図13A) D4M.3A移植FCre/+ x C1++、f/+、またはf/fマウス中の腫瘍関連マクロファージ上でのMHC II発現。(図13B) 8日目から除去αCD8 Abで処置され、9日目からメパジンで処置されたかまたは処置されていないマウス中でのD4M.3A腫瘍増殖。(図13C) 9日目からメパジンまたは媒体で処置されたFCre/+ x C1+/+またはf/fマウス中でのD4M.3A腫瘍増殖。(図13D) YFP+ TregをFCre x C1+/+マウスから選別し、10μMメパジンまたは媒体で8時間または24時間、同時のαCD3/28 mAb TCR刺激(8時間の時点のみ)ありまたはなしで処置し、Foxp3、eTreg分化マーカーの発現、細胞生存率、およびeTregの出現頻度を記録した。(図13E) 3日間のメパジンまたは媒体処置後の全腫瘍組織溶解液中でのFoxp3および様々なTreg関連遺伝子の発現のRT-qPCR解析。(図13F〜図13J) 3日間のメパジンまたは媒体処置後の、腫瘍組織免疫浸潤物の組成、ならびにCD45+細胞の出現頻度(図13G)および様々な免疫細胞サブセットの出現頻度(図13H)、ならびにTconvによるKi67発現(図13I)およびマクロファージによるMHC II発現(図13J)。(図13K) 12日間のメパジンおよびαPD-1 Ab処置後の腫瘍浸潤性Tregによるエフェクターサイトカイン同時発現。* = p＜0.05、** = p＜0.01、*** = p＜0.001。図13Cでは、*、# = それぞれ任意のp＜0.05対C1+/+、C1+/+ + メパジン。
【図１４Ａ−１４Ｎ】(図14A) 出生14日目からαIFNγ Abで処置されたFCre x Cf/fマウスの生存率の、FCre x C1+/+マウスおよびscurfyマウスとの比較。(図14B) 表示された9週齢マウス由来のYFP+ eTreg中の表示されたタンパク質の発現。データは、同様の結果を伴う2つの独立した実験を表す。すべてのグラフは平均値、および個々の複製値または±SEMを示す。*、&、# = それぞれ任意のp＜0.05対WT、scurfy、およびαIFNγ。(図14C〜図14D) FCre/+ x C1+/+、x C1fl/+、およびx C1fl/flマウスのLNから選別されたYFP+ eTregおよびcTregのバルクRNA配列解析。トランスクリプトームの主成分解析(図14C)、およびC1+/+とC1f/fとの間で差次的に発現された(変化倍率＞2、padj＜0.05)遺伝子のeTreg(上側)およびcTreg(下側)中での大規模発現のヒートマップ表示(図14D)。(図14E) 表示された遺伝子型のeTregによる「eTregシグネチャー」遺伝子(C1+/+ cTregとC1+/+ eTregとの間で変化倍率＞2、padj＜0.01)の大規模発現のヒートマップ表示。選択されたeTreg遺伝子をアノテートする。(図14F) 半数のTregにおいてCARMA1の一方または両方の対立遺伝子が欠失した、表示されたマウス中でのMC38腫瘍増殖。(図14G) 腫瘍組織由来のIFNγ+およびIFNγ- Treg中での正規化Foxp3発現。n.d. = 検出不能。(図14H) Foxp3GFP-CreERT2 x CARMA1+/+およびx CARMA1fl/flマウス(「FCreERT2 x C1+/+、f/f」)にD4M.3A黒色腫を移植し、8日目から5回の一日量のタモキシフェンで処置し、かつ同日から実験終了までFTY720で毎日処置した。5日間の処置後のtdLNおよび腫瘍からYFP+ Tregを選別し、CARMA1発現についてRT-qPCRで解析した。n.d. = 検出不能。(図14I) FCreERT2 x C1f/fまたはFCreERT2/+ x C1+/+もしくはf/fマウス由来の腫瘍組織中の半数または全数のTreg中でのCARMA1の欠失から5日後のYFP+ Treg中でのエフェクターサイトカインのインサイチュー発現。(図14J) CBM複合体エフェクター経路、ならびにMALT1プロテアーゼ阻害剤メパジンおよびMI-2の効果。(図14K〜図14L) 腫瘍内でのTregの数、およびTregでのインサイチューエフェクターサイトカイン発現(図14K)、MHC I、ならびにIfng、適応免疫耐性遺伝子(Pdl1、Socs1)、MHC I抗原提示遺伝子(Tap1)、IFNγシグナル伝達遺伝子(Stat1、Irf1)、T細胞動員遺伝子(CXCL10)、M1マクロファージ活性化遺伝子(Nos2)の発現(図14L)に対する、3日以内のメパジン効果。(図14M〜図14N) 雄マウス中での低免疫原性D4M.3A腫瘍(図14M)および免疫原性D4M.3A-SIINFEKL腫瘍(「SIINFEKL」はSEQ ID NO: 8として開示される)(図14N)のαPD-1とメパジンとの併用処置時の相乗的腫瘍調節。括弧内の数字は、メパジン処置の中断後少なくとも12ヶ月間再発しなかった腫瘍の割合を示す。図14Mおよび図14N中のデータは、同様の結果を伴う2つの独立した複製値を表す。すべてのグラフは平均値、および個々の複製値または±SEMを示す。グラフ中の矢印は処置開始を示す。* = 任意のp＜0.05対媒体; 図14Mでは、* = p＜0.05、*** = p＜0.001。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
詳細な説明
本明細書に示される例示的な実験データは、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤とチェックポイント阻害剤との併用投与により腫瘍サイズが急速または顕著に減少した一方で、腫瘍サイズの減少がチェックポイント阻害剤単剤療法では観察されなかったことを部分的に示す。したがって、本明細書において示される実験データは、チェックポイント阻害剤または抗がん処置に対する感受性がより高くなるように腫瘍微小環境を刺激するための治療法を提示する。
【００５３】
CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体
本明細書に記載の方法および組成物は、CARMA1-Bcl10-MALT1(CBM)シグナロソーム複合体の阻害が、腫瘍増殖を停止させるために十分な、腫瘍浸潤性制御性T細胞によるIFN-γの分泌を生じさせたという知見に部分的に基づく。制御性T細胞によるIFN-γの産生によって、腫瘍細胞の免疫反応性が増加し、腫瘍細胞表面上でのPD-L1の発現が上方制御された。CBMシグナロソーム複合体阻害と抗PD-1療法との併用により腫瘍細胞が拒絶された一方で、CBMシグナロソーム複合体阻害または抗PD-1療法のみではそうならなかった。
【００５４】
本明細書において使用される「CARM1-Bcl10-MALT1(CBM)シグナロソーム複合体」とは、CARDおよび膜結合型グアニル酸キナーゼ様ドメイン含有タンパク質1(CARMA1。CARD11およびBimp3としても知られる)、B細胞リンパ腫/白血病10(Bcl10)、ならびに粘膜関連リンパ組織リンパ腫移行タンパク質1で構成される、三分子タンパク質複合体を意味する。CBMシグナロソーム複合体は、PKCθ/PKCβの下流で活性化されるものであり、抗原受容体刺激時にいくつかの下流機能、例えばB細胞およびT細胞中でのNF-κB活性化(例えばNF-κBの核内移行および標的遺伝子の活性化)を媒介する上で分子足場として決定的な役割を果たす。さらに、細胞中でのCBMシグナロソーム複合体の集合により、例えばパラカスパーゼMALT1のタンパク質分解活性が活性化され、これにより、例えばNF-κBの負の制御因子が切断および不活性化され、さらにNF-κB活性が増強される。酵素活性はMALT1に関してのみ同定されている。本明細書において使用される「CBMシグナロソーム複合体の成分」とはCARMA1、Bcl10、またはMALT1を意味する。
【００５５】
抗原-受容体ライゲーションおよびシグナルカスケード伝達時に、CARMA1/CARD11は、自己阻害コンフォメーションから放出されて、下流パートナーBcl10およびMALT1と結合して機能的CBMシグナロソーム複合体を集合的に構築するように利用可能になる。CARMA1はCARD-CARD相互作用を通じてBcl10と相互作用し、Bcl10のC末端はMALT1のN末端Igドメインと直接相互作用する。電子顕微鏡観察(EM)、X線結晶構造解析、および核磁気共鳴(NMR)技術によりCBMシグナロソーム複合体の集合機構および構造構築が明らかになった。CBMシグナロソーム複合体は、らせん状フィラメント集合体であり、そこでCARMA1は複合体中の準化学量論的成分として現れ、フィラメント形成用の核形成因子として機能する。Bcl10 CARDはフィラメントのコアを形成し、MALT1はBcl10のC末端と相互作用することでフィラメントの周辺と接触してオリゴマー化および活性化される。CBMシグナロソーム複合体の機能(例えばNF-κBシグナル伝達を活性化する能力)は、本明細書に記載の適切な高次集合を必要とする。Bcl10およびMALT1で構成されるオリゴマーが、E3リガーゼであるTRAF6をオリゴマー化および活性化することによりIKK複合体を活性化することが提示されている。細胞からいずれかの成分を欠乏させることで、複合体の高次集合を阻害することができる。
【００５６】
CBMシグナロソーム複合体は超分子ハブの役割を果たし、そこで該複合体は、NF-κB活性化をもたらす異なる受容体誘導シグナル伝達経路を統合する。NF-κBの異常活性化は多くのNF-κBシグナル伝達依存性リンパ球性腫瘍に関連している。
【００５７】
CBMシグナロソーム複合体は、例えば全体として参照により本明細書に組み入れられるQiao, Q, et al. Molecular Cell. Sept 2013; 51 (6) 766-779およびYang, C, et al. Cytokine Growth Factor Rev. 2014 Apr; 25(2): 175-183においてさらに考察されている。
【００５８】
CBMシグナロソーム複合体の阻害
本明細書に記載の本発明の様々な局面では、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤が対象に投与される。一態様では、剤は、CBMシグナロソーム複合体の活性を基準レベルと比べて少なくとも10%阻害することができる。一態様では、剤は、CBMシグナロソーム複合体の活性を基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上阻害することができる。基準レベルは、例えば、剤の投与前のCBMシグナロソーム複合体の活性、または剤で処理されていない(例えば剤と接触していない)細胞中でのCBMシグナロソーム複合体の活性でありうる。本明細書において使用される「CBMシグナロソーム複合体の活性」とは、CBMシグナロソーム複合体の形成、機能、または発現レベルを意味する。
【００５９】
一態様では、剤は、T細胞中のCBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する。一態様では、剤は、制御性T細胞中のCBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する。任意の局面の一態様では、制御性T細胞は腫瘍浸潤性制御性T細胞である。本明細書において使用される「腫瘍浸潤性制御性T細胞」とは、腫瘍細胞間に見られる制御性T細胞、例えばその細胞表面の少なくとも一部分において腫瘍細胞と接触していることがわかる制御性T細胞を意味する。当業者は、例えば、対象から得られる腫瘍試料の組織学的染色により、腫瘍浸潤性制御性T細胞を同定することができるであろう。
【００６０】
一態様では、活性はCBMシグナロソーム複合体の形成である。一態様では、剤は、細胞中の無傷の複合体の量により測定される、無傷のCBMシグナロソーム複合体の量を、基準レベルと比べて少なくとも10%減少させる。一態様では、剤は、無傷のCBMシグナロソーム複合体の量を基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させる。基準レベルは、例えば剤の投与前の無傷な複合体の量でありうる。上記のように、複合体の高次集合がその機能に必要である。一態様では、本明細書に記載の剤は複合体の形成を阻害する。剤は、複合体内に含まれる高次集合に必要な結合部位(例えばBcl10上のMALT1に対する結合部位)に結合しかつそれを阻害することで、複合体の形成を阻害することができる。一態様では、剤は、自己阻害コンフォメーションからのCARMA1の放出を阻害することができる。一態様では、剤は、CBMシグナロソーム複合体形成に必要な上流因子(例えばPKCθまたはPKCβリン酸化)を阻害する。一態様では、剤は、CBMシグナロソーム複合体の少なくとも1つの成分の発現レベルを基準レベルと比べて少なくとも10%減少させることができる。一態様では、剤は、CBMシグナロソーム複合体の少なくとも1つの成分の発現レベルを基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させることができる。基準レベルは、例えば剤の投与前の少なくとも1つの成分(例えばCARMA1、Bcl10、またはMALT1)の発現レベルでありうる。当業者は、剤がCBMシグナロソーム複合体の形成を阻害する上で有効であるか否かを、例えば免疫共沈降またはショ糖密度勾配解析を使用して複合体の無損傷性を評価することで確定することができる。複合体の少なくとも1つの成分のレベルが減少したか否かを確定するために、当業者は、PCRベース解析またはウエスタンブロッティングを行うことで、所与の成分についてそれぞれmRNAレベルまたはタンパク質レベルを評価することができる。
【００６１】
本明細書に記載の本発明の様々な態様は、CARMA1のレベルおよび/または活性が阻害されることを必要とする。本明細書において使用されるカスパーゼ動員ドメインファミリーメンバー11(CARMA1)は、CARD11、PPBL、BETA、BIMP3、IMD11、およびIMD11Aとしても知られており、CARMA1/Bcl10/MALT1(CBM)多タンパク質複合体の足場タンパク質部分を指す。CARMA1配列はいくつかの種、例えばヒトCARMA1(NCBI Gene ID: 84433)のポリペプチド(例えばNCBI Ref Seq NP_001311210.1)およびmRNA(例えばNCBI Ref Seq NM_001324281.1)について知られている。CARMA1は、その天然変異体、分子、および対立遺伝子を含むヒトCARMA1を指しうる。CARMA1は、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物CARMA1を指す。
【００６２】
SEQ ID NO: 1の核酸配列は、CARMA1をコードする核酸配列を含む。
【００６３】
本明細書に記載の本発明の様々な態様は、Bcl10のレベルおよび/または活性が阻害されることを必要とする。本明細書において使用されるBcl10は、CLAP、mE10、CIPER、IMD37、c-E10、およびCARMENとしても知られており、免疫シグナル伝達アダプタータンパク質である。Bcl10はCARMA1/Bcl10/MALT1(CBM)多タンパク質複合体の一成分である。Bcl10配列はいくつかの種、例えばヒトBcl10(NCBI Gene ID: 8915)のポリペプチド(例えばNCBI Ref Seq NP_001320715.1)およびmRNA(例えばNCBI Ref Seq NM_001307644.1)について知られている。Bcl10は、その天然変異体、分子、および対立遺伝子を含むヒトBcl10を指しうる。Bcl10は、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物Bcl10を指す。
【００６４】
SEQ ID NO: 2の核酸配列は、Bcl10をコードする核酸配列を含む。
【００６５】
本明細書に記載の本発明の様々な態様は、MALT1のレベルおよび/または活性が阻害されることを必要とする。本明細書において使用されるMATL1パラカスパーゼ(MALT1)は、MLT、MLT1、IMD12、およびPCASP1としても知られており、NF-κBのBCL10誘導活性化において役割を果たすカスパーゼ様プロテアーゼをコードする遺伝子である。このタンパク質は、抗原受容体刺激後にNF-κBシグナル伝達およびリンパ球活性化を開始させる、CARMA1-BCL10-MALT1(CBM)シグナロソームの一成分である。MALT1配列はいくつかの種、例えばヒトMALT1(NCBI Gene ID: 10892)のポリペプチド(例えばNCBI Ref Seq NP_006776.1)およびmRNA(例えばNCBI Ref Seq NM_006785.4)について知られている。MALT1は、その天然変異体、分子、および対立遺伝子を含むヒトMALT1を指しうる。MALT1は、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物MALT1を指す。
【００６６】
SEQ ID NO: 3の核酸配列は、MALT1をコードする核酸配列を含む。
【００６７】
別の態様では、活性はCBMシグナロソーム複合体の機能である。一態様では、剤は、CBMシグナロソーム複合体がその下流標的を活性化すること(例えばNF-κBの核内移行および活性化)を阻害する。一態様では、剤は、MALT1のパラカスパーゼ活性を基準レベルと比べて少なくとも10%減少させる。一態様では、剤は、MALT1のパラカスパーゼ活性を基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させる。基準レベルは、例えば剤の投与前のMALT1のパラカスパーゼ活性でありうる。一態様では、剤はMALT1基質との相互作用またはMALT1基質の活性化を少なくとも10%阻害する。一態様では、剤は、MALT1基質との相互作用またはMALT1基質の活性化を基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上阻害する。基準レベルは、例えば剤の投与前のMALT1基質との相互作用またはMALT1基質の活性化でありうる。一態様では、剤はMALT1基質の切断を少なくとも10%減少させる。一態様では、剤は、MALT1基質の切断を基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させる。基準レベルは、例えば剤の投与前のMALT1基質の切断でありうる。リンパ球中では、MALT1はその誘導性モノユビキチン化により調節されることが示されている。一態様では、剤はMALT1のモノユビキチン化を少なくとも10%減少させる。一態様では、剤は、MALT1のモノユビキチン化を基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させる。基準レベルは、例えば剤の投与前のMALT1のモノユビキチン化でありうる。当業者は、標準的アッセイを使用して(例えば核内NF-κBを検出するために免疫蛍光を使用して)、剤が下流標的の活性化を阻害する上で効率的であるか否かを確定することができるであろう。MALT1パラカスパーゼ活性を例えばHalifinger, S, et al. Caspases, Paracaspases, and Metacaspases. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 1133. Feb 2014; 177-188に記載のように測定することができる。当業者はモノユビキチン化を、抗モノユビキチン化抗体を使用するウエスタンブロッティングにより検出することができる。
【００６８】
別の態様では、活性はCBMシグナロソーム複合体の発現レベルである。一態様では、剤は、CBMシグナロソーム複合体の発現レベルを基準レベルと比べて10%減少させる。一態様では、剤は、CBMシグナロソーム複合体の発現レベルを基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させる。基準レベルは、例えば剤の投与前のCBMシグナロソーム複合体のレベルでありうる。一態様では、剤は、CARMA1遺伝子、Bcl10遺伝子、またはMALT1遺伝子より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを基準レベルと比べて10%減少させる。一態様では、剤は、CARMA1遺伝子、Bcl10遺伝子、またはMALT1遺伝子より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させる。基準レベルは、例えば剤の投与前のCARMA1遺伝子、Bcl10遺伝子、またはMALT1遺伝子の発現レベルでありうる。一態様では、剤は、CARMA1遺伝子、Bcl10遺伝子、またはMALT1遺伝子より選択される少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを基準レベルと比べて10%減少させる。一態様では、剤は、CARMA1遺伝子、Bcl10遺伝子、またはMALT1遺伝子より選択される少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させる。基準レベルは、例えば剤の投与前のCARMA1遺伝子産物、Bcl10遺伝子産物、またはMALT1遺伝子産物のレベルでありうる。当技術分野において公知の方法を使用して、剤が遺伝子の発現レベル(例えばPCRベースアッセイによる)または遺伝子産物の発現レベル(例えばウエスタンブロッティングによる)を減少させたか否かを確定することができる。
【００６９】
一態様では、剤の投与後に、腫瘍浸潤性制御性T細胞がサイトカインIFNγを分泌し始める。当業者は、顕微鏡観察によりIFNγを検出するための免疫蛍光、またはIFNγレベルを検出するためのELISAを例えば使用して、腫瘍微小環境中の制御性T細胞がIFNγを発現しているか否かを確定することができるであろう。
【００７０】
剤
一態様では、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤が、がんの処置として投与される。例えば、剤は小分子、阻害性核酸、抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体試薬、または阻害性ポリペプチドでありうる。
【００７１】
本明細書に開示される方法において使用される剤は、例えば有機酸または無機酸との塩形態でありうる。この酸付加塩形成に好適な酸の例としてはトリフルオロ酢酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、マロン酸、サリチル酸、p-アミノサリチル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、マレイン酸、スルホン酸、ホスホン酸、過塩素酸、硝酸、ギ酸、プロピオン酸、グルコン酸、乳酸、酒石酸、ヒドロキシマレイン酸、ピルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、p-アミノ安息香酸、p-ヒドロキシ安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、亜硝酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、エチレンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフチルスルホン酸、スルファニル酸、カンファースルホン酸、キナ酸、マンデル酸、o-メチルマンデル酸、水素-ベンゼンスルホン酸、ピクリン酸、アジピン酸、d-o-トリル酒石酸、タルトロン酸、(o、m、p)-トルイル酸、ナフチルアミンスルホン酸、および当技術分野において周知の他の鉱酸またはカルボン酸が挙げられる。遊離塩基形態と、従来の様式で塩を生成するために十分な量の所望の酸とを接触させることで、塩を調製する。
【００７２】
剤は、例えば、CBMシグナロソーム複合体に含まれる少なくとも1つの遺伝子(例えばCARMA1、Bcl10、またはMALT1)を阻害することができる。剤が例えばCBMシグナロソーム複合体との接触時にその活性、形成、および/または発現レベルを阻害することができれば、当該の剤はCBMシグナロソーム複合体の活性を阻害するために有効であると見なされる。
【００７３】
一態様では、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤は小分子である。小分子は、生物学的プロセスを制御可能な低分子量(例えば500〜900ダルトンの範囲)の有機化合物として定義されうる。小分子は、膜を通じて拡散して所与の標的(例えばCBMシグナロソーム複合体)に到達することができることが望ましい。小分子は、高い親和性で所与の標的に結合し、結合時にエフェクターとして作用することができる。所与の標的に結合する小分子は、当技術分野において公知であり、当業者により確定可能である。小分子をスクリーニングするための方法は、当技術分野において公知であり、例えばCBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する上で効率的な小分子を同定するために使用可能である。
【００７４】
一態様では、小分子はMALT1パラカスパーゼ活性の小分子阻害剤である。一態様では、MALT1パラカスパーゼ活性阻害剤はMALT1阻害剤2(MI-2、化学名: 2-クロロ-N-[4-[5-(3,4-ジクロロフェニル)-3-(2-メトキシエトキシ)-1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル]フェニルアセトアミド)である。MI-2はMALT1に直接結合してMALT1のプロテアーゼ機能を不可逆的に抑制するものであり、Tocris; カタログ番号4848; ミネソタ州ミネアポリスから市販されている。
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【００７５】
一態様では、MALT1パラカスパーゼ活性阻害剤はMI-2類似体である。MI-2類似体(MI-2A1、MI-2A2、MI-2A3、MI-2A4、MI-2A5、MI-2A6、およびMI-2A7)は、抗MALT1パラカスパーゼ活性を有するものとして同定されており、例えば全体として参照により本明細書に組み入れられるFontan, L, et al. Cancer Cell. 2012 Dec 11; 22(6): 812-824およびXin BT, et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry 24, 2016: 3312-3329にさらに記載されている。
【００７６】
いくつかの場合では、MI-2類似体は、その開示が全体として参照により本明細書に組み入れられるWO 2014/074815に開示されている。いくつかの場合では、MALT1阻害剤は、その開示が全体として参照により本明細書に組み入れられるWO 2014/074815に開示されている化合物である。いくつかの場合では、該化合物は
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の構造を有し、式中、破線結合は、結合が存在しても存在しなくてもよいことを示し; Y1とY2との間に二重結合が存在する場合、Y1はNまたはCRであり、Y2はCであり、Ar1は存在し; Y1とY2との間に単結合が存在する場合、Y1はCR2であり、Y2はOまたはSであり、Ar1は存在せず、それぞれ独立して選択されるRはHまたは(C1〜C6)アルキルであり; R1はアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルであり、ここで任意のアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルはハロまたは(C1〜C6)アルコキシで一置換または独立して多置換されていてもよいが、但し、酸素原子とY3を含む環との間に二重結合が存在する場合、R1は存在せず、Ar3は存在し、また、酸素原子と当該の環との間に単結合が存在する場合、R1は存在し、Yと酸素原子を有する炭素原子との間の二重結合が存在し、Ar3は存在せず; Ar1は、1〜3個のJ1基で置換されたフェニルであり; J1はハロまたは(C1〜C6)アルコキシであり; Ar2は、1〜3個のJ2基で置換されたフェニルであり; J2は式-N(R)C(O)-R2の基であり、R2はアルキル、アリール、またはアリールアミノであり、ここで任意のアルキル、アリール、またはアリールアミノは0〜2個のハロ基、ニトロ基、または(C1〜C6)アルコキシ基で置換されており; Ar3は、1〜3個のJ3基で置換されたフェニルであり; J3はハロまたは(C1〜C6)アルコキシである。いくつかの場合では、該化合物は
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である。
【００７７】
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2021508720.tif 000007
2021508720.tif 000008
【００７８】
別の態様では、MALT1パラカスパーゼ活性阻害剤はピラゾロピリミジン誘導体である。ピラゾロピリミジン誘導体ファミリーの阻害性MALT1作用は、例えばそれぞれの内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第15/312,321号またはWO 2015/181747にさらに記載されている。ピラゾロピリミジン誘導体は、WO 2015/181747に開示されている式(I)の構造を有しうる:
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式中、
R1はハロゲン、シアノ、またはハロゲンで置換されていてもよいC1〜C3アルキルであり;
R2は、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、ヒドロキシル、N,N-ジ-CrC6アルキルアミノ、N-モノ-CrC6アルキルアミノ、O-Rg、Rg、フェニルで、または、C1〜C6アルコキシ、N,N-ジ-CrC6アルキルアミノ、Rg、もしくはフェニルでさらに置換されていてもよいC1〜C6アルコキシで、1回または複数回置換されていてもよい、C1〜C6アルキル; C1〜C6アルキル、N,N-ジ-CrC6アルキルアミノ、もしくはC1〜C6アルコキシ-C1〜C6アルキル、および/または、それらが結合している原子と一緒になって1〜20個の原子を含む縮合もしくはスピロ環式4〜6員飽和複素環を形成しうる2個の任意的な該置換基で置換されていてもよい、C3〜C6シクロアルキル; C1〜C6アルコキシで置換されていてもよいフェニル; アミノまたはヒドロキシで置換されていてもよいC1〜C6アルキルで置換されていてもよい、NおよびOより選択される1〜3個のヘテロ原子を有する5〜6員ヘテロアリール環; Rg; あるいはN,N-ジ-CrC6アルキルアミノカルボニルであり; ここで、
Rgは、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ-C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ-カルボニルで置換されていてもよい、NおよびOより選択される1〜3個のヘテロ原子を有する5〜6員複素環であり;
Rは、Rdで1回または複数回独立して置換されたフェニルであり; ここでRaは互いに独立してハロゲン; シアノ; -COOCrC6アルキル; C1〜C6アルコキシ; ハロゲンで、または、C1〜C6アルキルで置換されていてもよい、NおよびOより選択される1〜2個のヘテロ原子を有する5〜6員ヘテロシクリル環で置換されていてもよい、C1〜C6アルキル; アミノで、アミノもしくはヒドロキシルで置換されていてもよいC1〜C6アルキルで、またはN-モノ-もしくはN,N-ジ-CrC6アルキルアミノカルボニルで置換されていてもよい、NおよびOより選択される1〜3個のヘテロ原子を有する5〜6員ヘテロアリール環であり; かつ/あるいは、
2個のRaは、それらが結合している環原子と一緒になって、C1〜C6アルキルまたはオキソで置換されていてもよい、1〜2個のN原子を有する5〜6員複素環または芳香族複素環を形成してもよく;
Rb、Rc、およびRdは互いに独立してハロゲン; オキソ; ヒドロキシル; シアノ; ハロゲンで置換されていてもよいC1〜C6アルコキシ; C1〜C6アルコキシカルボニル; フェニル; N,N-ジ-CrC6アルキルアミノ; ハロゲンまたはフェニルで置換されていてもよいC1〜C6アルキル; アミノもしくはヒドロキシルで、またはモノ-もしくはジ-N-d-C6アルキルアミノカルボニルで置換されていてもよい、1〜3個のN原子を有する5〜6員ヘテロアリール環; O-Rh; あるいはRhであり; ここでRhは、C1〜C6アルキル、ヒドロキシル、またはオキソで置換されていてもよい、N、O、およびSより選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員ヘテロシクリル環である。
【００７９】
ピラゾロピリミジン誘導体としてはZaleplon(商標)、Indiplon(商標)、Ocinaplon、Divaplon、およびLorediplonが挙げられるがそれに限定されない。ピラゾロピリミジン誘導体は、分子式C6H5N3を有する一連の異性体複素環式化合物である。それらは、いくつかの医薬品および農薬を例えば含む様々な複合体化合物の中心コアを形成する。ピラゾロ[1,5-a]ピリミジンとして知られる、ピラゾロピリミジンの1つの異性体が、ベンゾジアゼピンに(効果について)関連する鎮静薬および抗不安薬のクラスの基礎となる。一態様では、MALT1パラカスパーゼ活性阻害剤は、ピラゾロ[1,5-a]ピリミジンを含む化学構造を含む。
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【００８０】
いくつかの場合では、MALT1阻害剤は、(S)-1-(5-シアノピリジン-3-イル)-3-(7-(1-メトキシエチル)-2-メチルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-(ジフルオロメチル)ピリジン-4-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(2-(トリフルオロメチル)ピリジン-4-イル)尿素; 1-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-イソプロピルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)-5-(トリフルオロメチル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-(1-(2-メトキシエトキシ)エチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)-5-(トリフルオロメチル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-(1-メトキシ-2-メチル-プロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; 1-(2-クロロ-7-(1-(メトキシメチル)シクロプロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノピリジン-3-イル)尿素; 1-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-((1R,2S)-1,2-ジメトキシプロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; 1-(7-((S)-1-(((R)-1-アセチルピロリジン-3-イル)オキシ)エチル)-2-クロロピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)尿素; (S)-1-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシ-2-メチルプロピル)-ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(7-(1-メトキシ-2-メチルプロピル)-2-メチルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)尿素; 1-(2-フルオロ-7-((S)-1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(2-(1-ヒドロキシエチル)-6-(トリフルオロメチル)ピリジン-4-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; 1-(2-クロロ-7-(1,2-ジメトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)尿素; 1-(2-クロロ-7-((S)-1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(2-(2,2,2-トリフルオロ-1-ヒドロキシ-エチル)ピリジン-4-イル)尿素; (S)-1-(5-クロロ-2-(2-メトキシエトキシ)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)-ピラゾロ[1,5-a]-ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)-3-(7-(1-メトキシ-2-メチルプロピル)-2-メチルピラゾロ[1,5-a]-ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-シアノピリジン-4-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)-3-(7-(1-メトキ���エチル)-2-メチルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; 1-(2-クロロ-7-((1R,2S)-1,2-ジメトキシプロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)尿素; 1-(7-((S)-1-(((S)-1-アセチルピロリジン-3-イル)オキシ)エチル)-2-クロロピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(7-(1-メトキシエチル)-2-メチルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-6-クロロ-4-(3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)ウレイド)-N,N-ジメチルピコリンアミド; (S)-1-(5-(ジフルオロ-メチル)ピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)-ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-(トリフルオロ-メチル)ピリジン-3-イル)尿素; (S)-3-クロロ-5-(3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)ウレイド)-N,N-ジメチルピコリンアミド; (S)-1-(5-クロロ-ピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-クロロ-6-(ピロリジン-1-カルボニル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ-[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-3-クロロ-5-(3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)ウレイド)-N-メチルピコリンアミド; (S)-1-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-クロロピリジン-3-イル)尿素; (S)-1-(7-(1-アミノエチル)-2-クロロピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノピリジン-3-イル)-3-(7-(1-ヒドロキシエチル)-2-メチルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-(ジフルオロメチル)ピリジン-4-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-ヒドロキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; 1-(2-((S)-2-アミノプロポキシ)-5-クロロピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-((S)-1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-2-(ジフルオロメチル)-4-(3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)ウレイド)ピリジン 1-オキシド; 1-(2-クロロ-7-((1R,2S)-1,2-ジメトキシプロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)尿素; 1-(2-クロロ-7-(1-(メトキシメチル)シクロプロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(2-シアノピリジン-4-イル)尿素; および(S)-3-クロロ-5-(3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)ウレイド)ピコリンアミドより選択されるピラゾロピリミジン誘導体である。
【００８１】
いくつかの場合では、ピラゾロピリミジンMALT1阻害剤化合物は、その開示が全体として参照により組み入れられるWO 2017/081641に開示されている通りである。該化合物は
2021508720.tif 000011
の構造を有することができ、式中、R1はフルオロ、クロロ、メチルまたはシアノであり; R2およびR3は互いに独立して、C1〜C6アルコキシで置換されていてもよいC1〜C6アルコキシ; ハロゲンもしくはC1〜C6アルコキシで置換されていてもよいC1〜C6アルキル; C1〜C6アルキルで置換されていてもよいアミノ; フタルイミド; または、C1〜C3アルキルカルボニルで置換されていてもよい窒素もしくは酸素ヘテロ原子を含む5員もしくは6員複素環で置換されていてもよい、ヒドロキシであり; あるいは、R2およびR3は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、NおよびOより選択される1個のヘテロ原子を含む3〜5員炭素環または複素環を形成し; R4は水素; C C6アルコキシで置換されていてもよいC C6アルキルであり; X1はN、N-O、またはCR6であり; X2はNまたはCR7であり; R5はクロロ; シアノ; またはハロゲンおよび/もしくはヒドロキシで置換されていてもよいC C6アルキルであり; R6は水素; オキソ; メトキシ; 1,2,3-トリアゾール-2-イル; または窒素原子においてR9およびR10で置換されたアミノカルボニルであり; R7は水素; ハロゲンおよび/もしくはヒドロキシで置換されていてもよいC1〜C6アルキル; またはN,N-ジメチルアミノカルボニルであり; R8は水素; メトキシまたはアミノで置換されていてもよいC1〜C6アルコキシであり; R9および10は互いに独立して水素; C1〜C6アルコキシ、N-モノ-C1〜C6アルキルアミノ、またはN,N-ジ-C1〜C6アルキルアミノで置換されていてもよいC1〜C6アルキルであり; あるいは、R9および10は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、C1〜C6アルキル、ヒドロキシ、またはオキソで置換されていてもよい、酸素、窒素、および硫黄からなる群より選択される1個、2個、または3個の環ヘテロ原子を有する5〜7員複素環を形成するが、但し、X1およびX2は同時にNであってはならず、あるいは、X2がNである場合にX1はN-Oであってはならない。いくつかの場合では、該化合物は(S)-1-(2-(ジフルオロメチル)ピリジン-4-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(2-(トリフルオロメチル)ピリジン-4-イル)尿素; 1-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-イソプロピルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)-5-(トリフルオロメチル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-(1-(2-メトキシエトキシ)エチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)-5-(トリフルオロメチル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-(1-メトキシ-2-メチル-プロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; 1-(2-クロロ-7-(1-(メトキシメチル)シクロプロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノピリジン-3-イル)尿素; 1-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-((1R,2S)-1,2-ジメトキシプロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピ���ジン-3-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; 1-(7-((S)-1-(((R)-1-アセチルピロリジン-3-イル)オキシ)エチル)-2-クロロピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)尿素; (S)-1-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシ-2-メチルプロピル)-ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(7-(1-メトキシ-2-メチルプロピル)-2-メチルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)尿素; 1-(2-フルオロ-7-((S)-1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(2-(1-ヒドロキシエチル)-6-(トリフルオロメチル)ピリジン-4-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; 1-(2-クロロ-7-(1,2-ジメトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)尿素; 1-(2-クロロ-7-((S)-1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(2-(2,2,2-トリフルオロ-1-ヒドロキシ-エチル)ピリジン-4-イル)尿素; (S)-1-(5-クロロ-2-(2-メトキシエトキシ)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)-ピラゾロ[1,5-a]-ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)-3-(7-(1-メトキシ-2-メチルプロピル)-2-メチルピラゾロ[1,5-a]-ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-シアノピリジン-4-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)-3-(7-(1-メトキシエチル)-2-メチルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; 1-(2-クロロ-7-((1R,2S)-1,2-ジメトキシプロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)尿素; 1-(7-((S)-1-(((S)-1-アセチルピロリジン-3-イル)オキシ)エチル)-2-クロロピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)-3-(7-(1-メトキシエチル)-2-メチルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-6-クロロ-4-(3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)ウレイド)-N,N-ジメチルピコリンアミド; (S)-1-(5-(ジフルオロ-メチル)ピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)-ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-(トリフルオロ-メチル)ピリジン-3-イル)尿素; (S)-3-クロロ-5-(3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)ウレイド)-N,N-ジメチルピコリンアミド; (S)-1-(5-クロロ-ピリジン-3-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(5-クロロ-6-(ピロリジン-1-カルボニル)ピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ-[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-3-クロロ-5-(3-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)ウレイド)-N-メチルピコリンアミド; (S)-1-(2-クロロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-クロロピリジン-3-イル)尿素; (S)-1-(7-(1-アミノエチル)-2-ク��ロピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-クロロ-6-(2H-1,2,3-トリアゾール-2-イル)ピリジン-3-イル)尿素; (S)-1-(5-シアノピリジン-3-イル)-3-(7-(1-ヒドロキシエチル)-2-メチルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-1-(2-(ジフルオロメチル)ピリジン-4-イル)-3-(2-フルオロ-7-(1-ヒドロキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; 1-(2-((S)-2-アミノプロポキシ)-5-クロロピリジン-3-イル)-3-(2-クロロ-7-((S)-1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)尿素; (S)-2-(ジフルオロメチル)-4-(3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)ウレイド)ピリジン 1-オキシド; 1-(2-クロロ-7-((1R,2S)-1,2-ジメトキシプロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(5-シアノ-6-メトキシピリジン-3-イル)尿素; 1-(2-クロロ-7-(1-(メトキシメチル)シクロプロピル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)-3-(2-シアノピリジン-4-イル)尿素; および(S)-3-クロロ-5-(3-(2-フルオロ-7-(1-メトキシエチル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-イル)ウレイド)ピコリンアミドより選択される。
【００８２】
いくつかの場合では、MALT1阻害剤は、その開示が全体として参照により組み入れられるWO 2018/085247に開示されている化合物である。いくつかの場合では、該化合物は以下の構造を有する:
2021508720.tif 000012
式中、Aは縮合二環式ヘテロアリール環であり; Bはフェニルまたはピリジニルであり; R1およびR3は出現する毎に独立して水素、ハロゲン、置換もしくは非置換アシル、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、置換もしくは非置換カルボシクリル、置換もしくは非置換ヘテロシクリル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、-ORA、-N(RA)2、-SRA、-CN、-SCN、-C(=NRA)RA、-C(=NRA)ORA、-C(=NRA)N(RA)2、-C(=O)RA、-C(=O)ORA、-C(=O)N(RA)2、-NO2、-NRAC(=O)RA、-NRAC(=O)ORA、-NRAC(=O)N(RA)2、-OC(=O)RA、-OC(=O)ORA、-OC(=O)N(RA)2、または窒素原子に結合している場合は窒素保護基であり; Rは置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクリレン、置換もしくは非置換アリーレン、置換もしくは非置換ヘテロアリーレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換アルキルヘテロアリーレン、置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NRA-、-NRAC(=O)-、-NRAC(=O)O-、-NRAC(=O)N(RA)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、または-OC(=O)N(RA)-であり; RAは出現する毎に独立して水素、置換もしくは非置換アシル、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換カルボシクリル、置換もしくは非置換ヘテロシクリル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、窒素原子に結合している場合は窒素保護基、酸素原子に結合している場合は酸素保護基、または硫黄原子に結合している場合は硫黄保護基であり、あるいは、2個のRA基は一緒になって置換もしくは非置換複素環を形成し; Lは置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換アルケニレン、置換もしくは非置換アルキニレン、置換もしくは非置換カルボシクリレン、置換もしくは非置換ヘテロシクリレン、置換もしくは非置換アリーレン、置換もしくは非置換ヘテロアリーレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NRA-、-NRAC(=O)-、-NRAC(=O)RA、-C(=O)RA-、-NRAC(=O)O-、-NRAC(=O)N(RA)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、または-OC(=O)N(RA)-、あるいはそれらの組み合わせであり; EはE3ユビキチンリガーゼ結合性部分であり; mおよびnはそれぞれ独立して0または1であるが、但し、m + n = 1であり; kは0、1、2、3、または4であり; pは0、1、2、3、または4である。いくつかの場合では、Aは
2021508720.tif 000013
である。いくつかの場合では、-R2-L-は
2021508720.tif 000014
であり; R4は水素またはC1〜6アルキルであり; tは0、1、2、3、4、5、または6である。いくつかの場合では、Eは
2021508720.tif 000015
である。様々な場合では、該化合物は以下の構造を有する: 
2021508720.tif 000016
式中、XはN、CH、またはCR3であり; YはCHまたはNであり; ZはNH、S、またはOである; 
2021508720.tif 000017
式中、XはN、CH、またはCR3である; 
2021508720.tif 000018
式中、XはN、CH、またはCR3である; 
2021508720.tif 000019
式中、tは2または4である; 
2021508720.tif 000020
式中、tは2または4である; 
2021508720.tif 000021
式中、tは2または4である; 
2021508720.tif 000022
式中、tは0、1、2、3、4、5、または6である; 
2021508720.tif 000023
式中、tは0、1、2、3、4、5、または6である; あるいは
2021508720.tif 000024
式中、tは0、1、2、3、4、5、または6である。
【００８３】
別の態様では、MALT1パラカスパーゼ活性阻害剤はフェノチアジン誘導体である。フェノチアジンは、式S(C6H4)2NHを有する有機化合物であり、複素環式化合物のチアジンクラスに関連している。フェノチアジンは医療では使用されておらず、メディシナルケミストリーにおけるプロトタイプリード構造であり、フェノチアジン誘導体は広く使用されている。フェノチアジン誘導体は、フェノチアジンコア構造を含むものであり、メパジン、チオリダジン、プロマジン、クロルプロマジン(Thorazine(商標)、Aminazine(商標)、Chlor-PZ(商標)、Klorazine(商標)、Promachlor(商標)、Promapar(商標)、Sonazine(商標)、Chlorprom(商標)、Chlor-Promanyl(商標)、Largactil(商標))、プロマジン(Sparine(商標)、Propazine(商標))、トリフルプロマジン(Clinazine(商標)、Novaflurazine(商標)、Pentazine(商標)、Terfluzine(商標)、Triflurin(商標)、Vesprin(商標))、メソリダジン(Serentil(商標))、チオリダジン(Mellaril(商標)、Novoridazine(商標)、Thioril(商標)、Sonapax(商標))、フルフェナジン(Prolixin(商標)、Permitil(商標)、Modecate(商標)、Moditen(商標))、ペルフェナジン(Trilafon(商標)、Etrafon(商標)、Triavil(商標)、Phenazine(商標)、Etaperazin(商標))、プロクロルペラジン(Compazine(商標)、Stemetil(商標))、およびトリフロペラジン(Stelazine(商標)、Triphtazine(商標))が挙げられるがそれに限定されない。一態様では、MALT1パラカスパーゼ活性阻害剤は、フェノチアジンを含む化学構造を含む。一態様では、MALT1パラカスパーゼ活性阻害剤はフェノチアジン誘導体であるメパジンである。メパジンは、MALT1阻害作用を含むものであり、例えば全体として参照により本明細書に組み入れられるNagel D. et al, Cancer Cell, 2012においてさらに考察されている。
【００８４】
いくつかの場合では、メパジンは(S)-メパジンまたはその薬学的に許容される塩として存在する。(S)-メパジンは、例えばその開示が全体として参照により組み入れられる米国特許第9,718,811号において詳細に考察されている。
【００８５】
2021508720.tif 000025
【００８６】
いくつかの態様では、MALT1阻害剤は、例えばその開示が全体として参照により組み入れられるWO 2018/119036に開示されているピラゾール誘導体であり、例えば以下の構造を有する:
2021508720.tif 000026
式中、R1はi) フルオロまたはアミノ置換基で置換されていてもよいナフタレン-1-イル; ならびにii) O、N、およびSからなる群より選択される1〜4個のヘテロ原子を含み、ここで1個を超えないヘテロ原子がOまたはSである、9〜10員ヘテロアリールからなる群より選択され; ここでii)の該ヘテロアリールは、重水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、トリフルオロメチル、シクロプロピル、メトキシメチル、ジフルオロメチル、1,1-ジフルオロエチル、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、1-エトキシエチル、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチルチオ、シアノ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、4-オキソテトラヒドロフラン-2-イル、5-オキソピロリジン-2-イル、1,4-ジオキサニル、アミノカルボニル、メチルカルボニル、メチルアミノカルボニル、オキソ、1-(t-ブトキシカルボニル)アゼチジン-2-イル、N-(メチル)ホルムアミドメチル、テトラヒドロフラン-2-イル、3-ヒドロキシ-ピロリジン-1-イル、ピロリジン-2-イル、3-ヒドロキシアゼチジニル、アゼチジン-3-イル、またはアゼチジン-2-イルより選択される1個または2個の置換基で独立して置換されていてもよく; R2はC1〜4アルキル、1-メトキシ-エチル、ジフルオロメチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、およびトリフルオロメチルからなる群より選択され; G1はNまたはC(R4)であり; G2はNまたはC(R3)であり; ここで、いずれの場合でも、G1およびG2のうち一方のみがNであり; R3は独立してトリフルオロメチル、シアノ、C1〜4アルキル、フルオロ、クロロ、ブロモ、メチルカルボニル、メチルチオ、メチルスルフィニル、およびメタンスルホニルからなる群より選択され; あるいは、G1がNである場合、R3はC1〜4アルコキシカルボニルよりさらに選択され; R4はi) G2がNである場合、水素; ii) C1〜4アルコキシ; iii) シアノ; iv) シクロプロピルオキシ; v) トリアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、ピロリル、チアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、2-アミノ-ピリミジン-4-イル、2H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-c]ピリジン-2-イル、2H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-b]ピリジン-2-イル、3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-b]ピリジン-3-イル、1H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-c]ピリジン-1-イルからなる群より選択されるヘテロアリールであって、オキソ、C1〜4アルキル、カルボキシ、メトキシカルボニル、アミノカルボニル、ヒドロキシメチル、アミノメチル、(ジメチルアミノ)メチル、アミノ、メトキシメチル、トリフルオロメチル、アミノ(C2〜4アルキル)アミノ、またはシアノより独立して選択される1個または2個の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール; vi) 1-メチル-ピペリジン-4-イルオキシ; vii) 4-メチル-ピペラジン-1-イルカルボニル; viii) (4-アミノブチル)アミノカルボニル; ix) (4-アミノ)ブトキシ; x) 4-(4-アミノブチル)-ピペラジン-1-イルカルボニル; xi) メトキシカルボニル; xii) 5-クロロ-6-(メトキシカルボニル)ピリジン-3-イルアミノカルボニル; xiii) 1,1-ジオキソ-イソチアゾリジン-2-イル; xiv) 3-メチル-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル; xv) 2-オキソピロリジン-1-イル; xvi) (E)-(4-アミノブタ-1-エン-1-イル-アミノカルボニル; xvii) ジフルオロメトキシ; およびxviii) モルホリン-4-イルカルボニルからなる群より選択され; R5は独立して水素、クロロ、��ルオロ、ブロモ、メトキシ、メチルスルホニル、シアノ、C1〜4アルキル、エチニル、モルホリン-4-イル、トリフルオロメチル、ヒドロキシエチル、メチルカルボニル、メチルスルフィニル、3-ヒドロキシ-ピロリジン-1-イル、ピロリジン-2-イル、3-ヒドロキシアゼチジニル、アゼチジン-3-イル、アゼチジン-2-イル、メチルチオ、および1,1-ジフルオロエチルからなる群より選択され; あるいは、R4およびR5は一緒になって8-クロロ-4-メチル-3-オキソ-3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]オキサジン-6-イル、8-クロロ-3-オキソ-3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]オキサジン-6-イル、2-メチル-1-オキソ-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-7-イル、4-メチル-3-オキソ-3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]オキサジン-6-イル、3-オキソ-3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]オキサジン-6-イル、1-メチル-1H-ピラゾロ[3,4-b]ピリジン-5-イル、1H-ピラゾロ[3,4-b]ピリジン-5-イル、2,3-ジヒドロ-[1,4]ジオキシノ[2,3-b]ピリジン-5-イル、1,3-ジオキソロ[4,5]ピリジン-5-イル、1-オキソ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-5-イル、2,2-ジメチルベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル、2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-6-イル、1-オキソイソインドリン-5-イル、または2-メチル-1-オキソイソインドリン-5-イル、1H-インダゾール-5-イルを形成してもよく; R6は水素、C1〜4アルキル、フルオロ、2-メトキシ-エトキシ、クロロ、シアノ、またはトリフルオロメチルであり; R7は水素またはフルオロである。いくつかの場合では、MALT1阻害剤は、WO 2018/119036の40〜133頁の表1に列挙された化合物(化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、または450)である。
【００８７】
様々な場合では、MALT1阻害剤は、その開示が全体として参照により本明細書に組み入れられるWO 2018/021520に開示されている化合物である。
【００８８】
別の態様では、MALT1パラカスパーゼ活性阻害剤はテトラペプチドZ-VRPR-FMK(SEQ ID NO: 7)(Z-VRPR-FMK(SEQ ID NO: 7); C31H49FN10O6)である。Z-VRPR-FMK(SEQ ID NO: 7)は、MALT1パラカスパーゼタンパク質分解活性の選択的MALT1阻害剤である。
2021508720.tif 000027
【００８９】
Z-VRPR-FMK(SEQ ID NO: 7)誘導体は、本明細書に記載の方法および組成物での使用が特に想定される。いくつかの態様では、Z-VRPR-FMK(SEQ ID NO: 7)誘導体として、その内容が全体として参照により本明細書に組み入れられるWO2009065897に記載の誘導体を挙げることができる。Z-VRPR-FMK(SEQ ID NO: 7)誘導体の非限定的な例としてはZ-LSSR-CHO(SEQ ID NO: 9)、Z-LSSR-CMK(SEQ ID NO: 10)、Z-GASR-CHO(SEQ ID NO: 11)、およびZ-GASR-CMK(SEQ ID NO: 12)が挙げられる(例えばWO2009065897参照)。
【００９０】
開示される方法における使用が想定される他のMALT1阻害剤としてはチアゾロ-ピリジン、例えば、その開示が全体として参照により組み入れられるWO 2018/020474に開示されているものが挙げられる。いくつかの場合では、チアゾロ-ピリジンは以下の構造を有する:
2021508720.tif 000028
式中、R1は水素、ハロゲン、シアノ、置換もしくは非置換アルキル、およびシクロアルキルより選択され; R2はa) アルキル、またはオキソ(=O)、ハロゲン、シアノ、シクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、ヘテロアリール、置換もしくは非置換ヘテロシクリル、-OR4、-C(=O)OH、-SO2(アルキル)、-C(=O)O(アルキル)、-NR5R5A、-NR5C(=O)R6、C(=O)R6、およびC(=O)NR5R5Aより独立して選択される1〜4個の置換基で置換されたアルキル; b) シクロアルキル、またはハロゲン、シアノ、置換もしくは非置換アルキル、-OR4、-C(=O)OH、-C(=O)O(アルキル)、C(=O)R6、およびC(=O)NR5R5Aより独立して選択される1〜4個の置換基で置換されたシクロアルキル; c) シクロアルケニル; d) シアノ; e) 置換もしくは非置換アリール; f) 置換もしくは非置換ヘテロアリール; g) ヘテロシクリル、または環炭素原子もしくは環窒素原子上で置換されたヘテロシクリル(環炭素原子上で置換されている場合、オキソ(=O)、ハロゲン、シアノ、置換もしくは非置換アルキル、シクロアルキル、-OR4、-C(=O)OH、-C(=O)O-アルキル、-C(=O)NR5R5A、-NHC(=O)(アルキル)、-N(H)R5、および-N(アルキル)2より独立して選択される1〜4個の置換基で置換されており、複素環基が環窒素上で置換されている場合、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、SO2(アルキル)、'C(=O)R6、C(=O)O(アルキル)、-C(=O)N(H)R5、および-C(=O)N(アルキル)R5より独立して選択される置換基で置換されている); ならびにh) -NRaRb(ここでRaおよびRbは独立して水素、シクロアルキル、およびアルキル、またはオキソ(=O)、ハロゲン、シクロアルキル、-OR4、および置換もしくは非置換アリールより独立して選択される1〜4個の置換基で置換されたアルキルより選択される)より選択され; R3はa) ヘテロアリール、またはハロゲン、シアノ、-COOR4b、-OR4a、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクリル、置換もしくは非置換アリール、ニトロ、-SO2アルキル、-SO2NH(アルキル)、-SO2NH2、-SO2NH(CF3)、-SO2N(アルキル)2、-NHSO2(アルキル)、-COR6、-CON(H)OH、-CONR5R5a、-N(R5)COR5a、および-NR5R5aより選択される1〜4個の置換基で置換されたヘテロアリール、b) アリール、あるいは、ハロゲン、シアノ、-COOR4b、-OR4a、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクリル、置換もしくは非置換アリール、ニトロ、-SO2アルキル、-SO2NH(アルキル)、-SO2NH2、-SO2NH(CF3)、-SO2N(アルキル)2、-NHSO2(アルキル)、-COR6、-CONR5R5a、-CO(NH)OH、-N(R5)COR5a、-NR5R5a、およびヘテロアリール、または置換もしくは非置換アルキルより選択される1〜4個の置換基で置換されたヘテロアリールより選択される、1〜4個の置換基で置換されたアリール、c) ヘテロシクリル、または3/4オキソ(=O)および置換もしくは非置換アルキルより選択される1〜4個の置換基で置換されたヘテロシクリル、ならびにd) 
2021508720.tif 000029
(式中、Xはハロゲンであり、A環は、オキソ(=O)基で置換されていてもよい、S、O、およびNより選択されるヘテロ原子を含む複素環である)より選択され; R4は水素、シクロアルキル、および置換もしくは非置換アルキルより選択され; R4Aはa) 水素、アルキル、およびシクロアルキル、ならびにb) ハロゲン、-O-アルキル、-NR5R5A、および置換もしくは非置換ヘテロシクリルより独立して選択される1〜4個の置換基で置換されたアルキルより選択され; R4bは水素およびアルキルより選択され; R5およびR5Aはそれぞれ独立してa) 水素、アルキル、およびシクロアルキル、b) O-アルキル、NH2、および-CONH2で置換されたアルキル、c) ヘテロアリール、ならびにd) アルキルで置換されたヘテロシクリルより選択され; R6はアルキル、ヘテロシクリル、およびシクロアルキルより選択され; アルキル基が置換されている場合、オキソ(=O)、ハロゲン、シアノ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、-OR7、-C(=O)OH、-C(=O)O(アルキル)、-NR8R8A、-NR8C(=O)R9、およびC(=O)NR8R8Aより独立して選択される1〜4個の置換基で置換されており; アリール基が置換されている場合、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アルキル、ペルハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、-OR7、-NR8R8A、-NR8C(=O)R9、C(=O)R9、C(=O)NR8R8A、-SO2-アルキル、-C(=O)OH、-C(=O)O-アルキル、およびハロアルキルより独立して選択される1〜4個の置換基で置換されており; ヘテロアリール基が置換されている場合、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アルキル、ハロアルキル、ペルハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、-OR7、-NR8R8a、-NR7C(=O)R9、C(=O)R9、C(=O)NR8NR8a、-SO2アルキル、-C(=O)OH、および-C(=O)O-アルキルより独立して選択される1〜4個の置換基で置換されており; 複素環基が置換されている場合、環炭素原子または環ヘテロ原子上で置換されており、環炭素原子上で置換されている場合、オキソ(=O)、ハロゲン、シアノ、アルキル、シクロアルキル、ペルハロアルキル、-OR7、C(=O)NR8R8a、-C(=O)OH、-C(=O)O-アルキル、-N(H)C(=O)(アルキル)、-N(H)R8、および-N(アルキル)2より独立して選択される1〜4個の置換基で置換されており; 複素環基が環窒素上で置換されている場合、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、-SO2(アルキル)、C(=O)R9、およびC(=O)O(アルキル)より独立して選択される置換基で置換されており; 複素環基が環硫黄上で置換されている場合、1個または2個のオキソ(=O)基で置換されており; R7は水素、アルキル、ペルハロアルキル、およびシクロアルキルより選択され; R8およびR8aはそれぞれ独立して水素、アルキル、およびシクロアルキルより選択され; R9はアルキルおよびシクロアルキルより選択される。いくつかの場合では、該化合物はWO 2018/020474の17〜37頁の番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91 ,92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124��125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、または240の化合物である。
【００９１】
いずれかの局面のいくつかの態様では、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤は阻害性核酸である。所与の遺伝子(例えばCARMA1、Bcl10、および/またはMALT1)の発現の阻害剤は、例えば阻害性核酸でありうる。いずれかの局面のいくつかの態様では、阻害性核酸は阻害性RNA(iRNA)、例えばsiRNA、またはshRNAである。二本鎖RNA分子(dsRNA)は、RNA干渉(RNAi)として知られる高度に保存された制御機構において遺伝子発現を遮断することが示されている。本明細書に記載の阻害性核酸は、標的mRNA転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である長さが30個以下のヌクレオチド、すなわち長さが15〜30個のヌクレオチド、一般に長さが19〜24個のヌクレオチドの領域を有する、RNA鎖(アンチセンス鎖)を含みうる。これらのiRNAの使用によって、mRNA転写物の標的化分解が可能になり、したがって標的の発現および/または活性が減少する。
【００９２】
本明細書において使用される「iRNA」という用語は、本明細書において定義される用語であるRNAを含み、かつRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)経路によりRNA転写物の標的化切断を媒介する、剤を意味する。一態様では、本明細書に記載のiRNAは、標的、例えばCBMシグナロソーム複合体または成分(例えばCARM1、Bcl10、および/もしくはMALT1)の発現および/または活性の阻害を実行する。特定の態様では、細胞と阻害剤(例えばiRNA)とを接触させることで、細胞中の標的mRNAレベルが、iRNAの非存在下の細胞に見られる標的mRNA(例えばCBMシグナロソーム複合体またはその成分)のレベルに対して少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、最大100%減少する。
【００９３】
いずれかの局面のいくつかの態様では、iRNAはdsRNAでありうる。dsRNAは、dsRNAが使用される条件下でハイブリッド形成して二本鎖構造を形成するために十分に相補的である2本のRNA鎖を含む。dsRNAの一方の鎖(アンチセンス鎖)は、標的配列に実質的に相補的であり、一般的には完全に相補的である、相補性領域を含む。標的配列は、標的の発現中に形成されるmRNAの配列に由来しうる。他方の鎖(センス鎖)は、アンチセンス鎖に相補的である領域を含み、したがって、これら2本の鎖は適切な条件下で組み合わせられる際にハイブリッド形成して二本鎖構造を形成する。
【００９４】
一態様では、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書において使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、マイクロRNA配列などのDNAまたはmRNA配列に相補的である合成核酸配列を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的に結合して転写レベル、翻訳レベル、またはスプライシングレベルで発現を停止させることでDNAまたはRNA標的の発現を遮断するように設計されうる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でCBMシグナロソーム複合体またはその成分とハイブリッド形成するように設計された相補的核酸配列である。例えば、CARMA1を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトCARMA1遺伝子(例えばSEQ ID NO: 1)のコード配列の一部分に相補的な少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、またはそれ以上の塩基を含むことができ、Bcl10を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトBcl10遺伝子(例えばSEQ ID NO: 2)のコード配列の一部分に相補的な少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、またはそれ以上の塩基を含むことができ、MALT1を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトMALT1遺伝子(例えばSEQ ID NO: 3)のコード配列の一部分に相補的な少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、またはそれ以上の塩基を含むことができる。
【００９５】
さらに別の態様では、iRNA、例えばdsRNAのRNAが、安定性または他の有益な特性を増強するために化学修飾される。本発明において特徴づけられる核酸は、当技術分野において十分確立された方法、例えば参照により本明細書に組み入れられる"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載の方法により合成および/または修飾可能である。
【００９６】
阻害性核酸の例示的な態様としては例えばsiRNA、shRNA、miRNA、および/またはmiRNAを挙げることができ、これらは当技術分野において周知であり、したがって本明細書では説明されない。
【００９７】
いずれかの局面のいくつかの態様では、剤は、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害するsiRNAである。いずれかの局面のいくつかの態様では、剤は、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害するshRNAである。いずれかの局面のいくつかの態様では、剤は、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害するmiRNAである。当業者は、CBMシグナロソーム複合体の活性を標的にするsiRNA、shRNA、またはmiRNAを、例えばワールドワイドウェブ上でwww.dharamacon.gelifesciences.com/design-center/に見られるsiDESIGN Centerなどの公に利用可能な設計ツールを使用して設計することができる。一般に、siRNA、shRNA、またはmiRNAはDharmacon(コロラド州ラファイエット)またはSigma Aldrich(ミズーリ州セントルイス)などの企業により作製される。当業者は、siRNA、shRNA、またはmiRNAがCBMシグナロソーム複合体の活性を下方制御の標的にする上で有効であるか否かを、例えば、siRNA、shRNA、またはmiRNAを細胞に遺伝子導入し、CBMシグナロソーム複合体の活性をウエスタンブロッティング(CBMシグナロソーム複合体の発現レベルを検出するための)または機能アッセイ(例えばCBMシグナロソーム複合体の下流標的の活性化、例えばNF-κBシグナル伝達)により検出することで、容易に評価することができるであろう。
【００９８】
一態様では、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤は抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体試薬である。本明細書において使用される「抗体試薬」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、かつ所与の抗原に特異的に結合する、ポリペプチドを意味する。抗体試薬は、抗体、または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含みうる。いずれかの局面のいくつかの態様では、抗体試薬は、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含みうる。例えば、抗体は重鎖(H鎖)可変領域(本明細書ではVHと略す)および軽鎖(L鎖)可変領域(本明細書ではVLと略す)を含みうる。別の例では、抗体は2つの重鎖(H鎖)可変領域および2つの軽鎖(L鎖)可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合断片(例えば単鎖抗体、FabおよびsFab断片、F(ab')2、Fd断片、Fv断片、scFv、CDR、およびドメイン抗体(dAb)断片(例えば全体として参照により本明細書に組み入れられるde Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39を参照))、ならびに完全抗体を包含する。抗体はIgA、IgG、IgE、IgD、またはIgM(ならびにそれらのサブタイプおよび組み合わせ)の構造的特徴を示しうる。抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、ブタ抗体、ラット抗体、ならびに霊長類(ヒトおよび非ヒト霊長類)ならびに霊長類化抗体を含む、任意の供給源に由来しうる。また、抗体としてはミニボディ、ナノボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体などが挙げられる。
【００９９】
VH領域およびVL領域を、「相補性決定領域」(「CDR」)と呼ばれる超可変性領域と、散在している「フレームワーク領域」(「FR」)と呼ばれる比較的保存された領域とにさらに細分することができる。フレームワーク領域およびCDRの範囲は正確に規定されている(全体として参照により本明細書に組み入れられるKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242およびChothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を参照)。通常、各VHおよびVLは3個のCDRおよび4個のFRで構成されており、これらはアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順で配置されている: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
【０１００】
一態様では、抗体または抗体試薬は、CARMA1をコードするアミノ酸配列(SEQ ID NO: 4)に対応するアミノ酸配列に結合する。
【０１０１】
別の態様では、抗CARMA1抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO: 4の配列を含むアミノ酸配列に結合するか、またはSEQ ID NO: 4の配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含むアミノ酸配列に結合する。一態様では、抗CARMA1抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO: 4の配列全体を含むアミノ酸配列に結合する。別の態様では、抗体または抗体試薬は、標的、例えばCARMA1に結合するために、かつ、例えばCARMA1の機能を阻害するために十分な、SEQ ID NO: 4の配列の断片を含む、アミノ酸配列に結合する。
【０１０２】
一態様では、抗体または抗体試薬は、Bcl10をコードするアミノ酸配列(SEQ ID NO: 5)に対応するアミノ酸配列に結合する。
【０１０３】
別の態様では、抗Bcl10抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO: 5の配列を含むアミノ酸配列に結合するか、またはSEQ ID NO: 5の配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含むアミノ酸配列に結合する。一態様では、抗Bcl10抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO: 5の配列全体を含むアミノ酸配列に結合する。別の態様では、抗体または抗体試薬は、標的、例えばBcl10に結合するために、かつ、例えばBcl10の機能を阻害するために十分な、SEQ ID NO: 5の配列の断片を含む、アミノ酸配列に結合する。
【０１０４】
一態様では、抗体または抗体試薬は、MALT1をコードするアミノ酸配列(SEQ ID NO: 6)に対応するアミノ酸配列に結合する。
【０１０５】
別の態様では、抗MALT1抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO: 6の配列を含むアミノ酸配列に結合するか、またはSEQ ID NO: 6の配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくはそれ以上の配列同一性を示す配列を含むアミノ酸配列に結合する。一態様では、抗MALT1抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO: 6の配列全体を含むアミノ酸配列に結合する。別の態様では、抗体または抗体試薬は、標的、例えばMALT1に結合するために、かつ、例えばMALT1の機能を阻害するために十分な、SEQ ID NO: 6の配列の断片を含む、アミノ酸配列に結合する。
【０１０６】
一態様では、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤は阻害性ポリペプチドである。本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語はアミノ酸のポリマーを意味する。本明細書では、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は互換的に使用される。ペプチドは相対的に短いポリペプチドであり、通常は長さが約2〜60個のアミノ酸、2〜10個のアミノ酸、2〜20個のアミノ酸、2〜30個のアミノ酸、2〜40個のアミノ酸、2〜50個のアミノ酸、2〜60個のアミノ酸、50〜60個のアミノ酸、40〜60個のアミノ酸、30〜60個のアミノ酸、20〜60個のアミノ酸、10〜60個のアミノ酸、2〜15個、10〜30個のアミノ酸、20〜50個のアミノ酸、30〜60個のアミノ酸、30〜40個のアミノ酸、または40〜50個のアミノ酸である。通常、本明細書において使用されるポリペプチドは、タンパク質に最も一般的に見られる20個のL-アミノ酸などのアミノ酸を含む。しかし、当技術分野において公知である他のアミノ酸および/またはアミノ酸類似体を使用してもよい。ポリペプチド中の1個または複数のアミノ酸を、例えば炭水化物基、ホスフェート基、脂肪酸基、共役用、官能化用のリンカーなどの化学的実体の付加により修飾することができる。非ポリペプチド部分がそれに共有結合的または非共有結合的に結合したポリペプチドもなお「ポリペプチド」と見なされる。例示的な修飾としてはグリコシル化およびパルミトイル化が挙げられる。ポリペプチドを天然供給源から精製するか、組換えDNA技術を使用して産生するか、または従来の固相ペプチド合成などの化学的手段を通じて合成することができる。本明細書において使用される「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」という用語は、ポリペプチド物質それ自体、および/または、ポリペプチドを生化学的に特徴づける配列情報(すなわち、アミノ酸名の略語として使用される文字または3文字コードの連続)を意味しうる。別途指示がない限り、本明細書に示されるポリペプチド配列はN末端からC末端への方向で示される。
【０１０７】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリペプチド(例えば阻害性ポリペプチド)をコードする核酸はベクターに含まれる。本明細書に記載のいくつかの局面では、本明細書に記載の所与のポリペプチドをコードする核酸配列、またはその任意のモジュールはベクターに操作可能に連結されている。本明細書において使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞への送達用に、または異なる宿主細胞間の移動用に設計された、核酸構築物を意味する。本明細書において使用されるベクターはウイルス性または非ウイルス性でありうる。「ベクター」という用語は、適切な調節エレメントに結合する際に複製可能であり、かつ遺伝子配列を細胞に移入することができる、任意の遺伝要素を包含する。ベクターとしてはクローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどを挙げることができるがそれに限定されない。
【０１０８】
遺伝子操作細胞
本明細書に記載の本発明の一局面は、がんを有する対象を処置するために使用可能な、減少したCBMシグナロソーム複合体の活性を有するように遺伝子操作された細胞を提供する。細胞は、リンパ球、好中球、単球、またはマクロファージなどの免疫細胞でありうる。一態様では、細胞はT細胞である。様々な種類のT細胞としてはエフェクターT細胞、ヘルパーT細胞、細胞毒性(キラー)T細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、粘膜関連インバリアントT細胞、γδT細胞が挙げられるがそれに限定されない。一態様では、細胞は制御性T細胞である。
【０１０９】
一態様では、細胞はエクスビボ細胞である。
【０１１０】
一態様では、遺伝子操作細胞は同種細胞である。別の態様では、遺伝子操作細胞は自家細胞である。
【０１１１】
T細胞は、当分野において公知の標準的技術を使用して対象から取得可能であり、例えば、T細胞は、患者から採取される末梢血から単離される。制御性T細胞は、例えばフローサイトメトリーを使用して制御性T細胞特異的マーカーについて細胞を解析することで同定可能である。制御性T細胞特異的マーカーとしてはCD4、FoxP3、CD45RA、およびCD25が挙げられるがそれに限定されない。一態様では、CD127の低発現(すなわちCD127lo)を単独でまたは他のマーカーとの組み合わせでヒトTregの同定因子として使用することができる。
【０１１２】
一態様では、細胞は、例えば複合体内に含まれる高次集合に必要な結合部位(例えばBcl10上のMALT1に対する結合部位)の妨害、欠失、または改変によって複合体の形成を阻害するように遺伝子操作されている。一態様では、細胞は、自己阻害コンフォメーションからのCARMA1の遊離を阻害するかまたは遅らせるように遺伝子操作されている。一態様では、細胞は、CBMシグナロソーム複合体の少なくとも1つの成分のレベルを基準レベルと比べて少なくとも10%減少させるように遺伝子操作されている。一態様では、細胞は、CBMシグナロソーム複合体の少なくとも1つの成分のレベルを基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させるように遺伝子操作されている。基準レベルは、例えば非遺伝子操作細胞中のCBMシグナロソーム複合体のレベルでありうる。一態様では、細胞は、CBMシグナロソーム複合体形成に必要な少なくとも1つの上流因子(例えばPKCθ/PKCβリン酸化)を減少させるかまたは阻害するように遺伝子操作されている。
【０１１３】
別の態様では、細胞は、CBMシグナロソーム複合体がその下流標的を活性化すること(例えばNF-κBの核内移行および活性化)を阻害するように遺伝子操作されている。一態様では、細胞は、MALT1のパラカスパーゼ活性を阻害するように遺伝子操作されている。一態様では、細胞は、MALT1基質との相互作用またはMALT1基質の活性化を阻害するように遺伝子操作されている。一態様では、細胞は、MALT1基質の切断を阻害するように遺伝子操作されている。別の態様では、細胞は、MALT1のモノユビキチン化を阻害するように遺伝子操作されている。
【０１１４】
一態様では、細胞は、CBMシグナロソーム複合体の発現レベルを基準レベルと比べて10%減少させるように遺伝子操作されている。一態様では、細胞は、CBMシグナロソーム複合体の発現レベルを基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させるように遺伝子操作されている。一態様では、細胞は、CARMA1遺伝子、Bcl10遺伝子、またはMALT1遺伝子より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを基準レベルと比べて10%減少させるように遺伝子操作されている。一態様では、細胞は、CARMA1遺伝子、Bcl10遺伝子、またはMALT1遺伝子より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させるように遺伝子操作されている。一態様では、細胞は、CARMA1遺伝子、Bcl10遺伝子、またはMALT1遺伝子より選択される少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを基準レベルと比べて10%減少させるように遺伝子操作されている。一態様では、細胞は、CARMA1遺伝子、Bcl10遺伝子、またはMALT1遺伝子より選択される少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを基準レベルと比べて少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上減少させるように遺伝子操作されている。基準レベルは、例えば非遺伝子操作細胞中のCBMシグナロソーム複合体のレベルでありうる。
【０１１５】
一態様では、遺伝子操作細胞はIFNγサイトカインを分泌する。細胞が上記のように遺伝子操作されているか否かを確定するための方法は、本明細書に見ることができる。
【０１１６】
当業者は、例えばCBMシグナロソーム複合体の活性を減少させるために、標準的技術を使用して細胞を遺伝子操作することができる。一態様では、最近発見されたCRISPR関連(Cas)系、例えばCRISPR-Cas9をゲノム編集に使用することができる。ゲノム編集用のCRISPR-Cas技術は、全体として参照により本明細書に組み入れられるDoudna, JA, and Charpentier, E. Science, 346: 6213, 2014に十分に記載されている。
【０１１７】
代替的な態様では、CBMシグナロソーム複合体の活性を減少させるための細胞の変異を、当技術分野において公知のTALENまたはZFN技術を利用して導入することができる。所望の配列特異性を実現するためにヌクレアーゼを遺伝子操作する方法は当技術分野において公知であり、例えばそれぞれ全体として参照により本明細書に組み入れられるKim (2014); Kim (2012); Belhaj et al. (2013); Urnov et al. (2010); Bogdanove et al. (2011); Jinek et al. (2012); Silva et al. (2011); Ran et al. (2013); Carlson et al. (2012); Guerts et al. (2009); Taksu et al. (2010); およびWatanabe et al. (2012)に記載されている。
【０１１８】
代替的な態様では、CBMシグナロソーム複合体の活性は、当分野において公知の他の技術によって減少する。いくつかの態様では、細胞は、CBMシグナロソーム複合体の活性を減少させる剤に曝露される。剤は阻害性核酸、阻害性ポリペプチド、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドでありうる。剤は、ゲノムに統合されたCBMシグナロソーム複合体の活性の減少(例えば該活性の安定的な減少)を誘導することが望ましい。
【０１１９】
発現可能なCBMシグナロソーム複合体の欠如、またはCBMシグナロソーム複合体成分の遺伝子発現の欠如を、例えばRT-PCR、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ELISA、または免疫組織化学的検査により評価することができる。機能的CBMシグナロソーム複合体の存在を評価するために、CBMシグナロソーム複合体が例えばNFκBシグナル伝達を活性化可能であるか否かを、標準的技術を使用して評価することができる。
【０１２０】
がんの処置
本明細書に記載の本発明の一局面は、がんを処置するための方法であって、該処置を必要とする対象にCARMA1-Bcl10-MATL1シグナロソーム複合体の活性を阻害する剤を投与する段階を含む方法を提供する。
【０１２１】
本明細書に記載の本発明の別の局面は、がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象に本明細書に記載のいずれかの遺伝子操作細胞を投与する段階を含む方法を提供する。
【０１２２】
様々な態様では、本方法は、対象にチェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含む。様々な態様では、本方法は、対象に抗がん療法を投与する段階をさらに含む。
【０１２３】
本明細書に記載の本発明の一局面は、がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象にMI-2阻害剤およびPD-1阻害剤を投与する段階を含む方法を提供する。
【０１２４】
本明細書に記載の本発明の別の局面は、がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象にメパジンおよびPD-1阻害剤を投与する段階を含む方法を提供する。
【０１２５】
本明細書に記載の本発明のさらに別の局面は、チェックポイント阻害剤療法に耐性のあるがんを処置するための方法であって、対象に、本明細書に記載のCARMA1-Bcl10-MATL1シグナロソーム複合体の活性を阻害する剤、またはいずれかの遺伝子操作細胞を投与する段階; および第2の治療法を投与する段階を含む方法を提供する。第2の治療法はチェックポイント阻害剤または抗がん療法でありうる。第2の治療法として投与されるチェックポイント阻害剤は、がんがそれに対し耐性を持っているチェックポイント阻害剤療法と同じであってもよい(例えば、抗PD-1療法に耐性のあるがんが、本明細書に記載のCARMA1-Bcl10-MATL1シグナロソーム複合体の活性を阻害する剤、またはいずれかの遺伝子操作細胞、および抗PD-1阻害剤で処置される)。あるいは、第2の治療法として投与されるチェックポイント阻害剤は、がんがそれに耐性があるチェックポイント阻害剤療法と異なっていてもよい(例えば、抗PD-1療法に耐性のあるがんが、本明細書に記載のCARMA1-Bcl10-MATL1シグナロソーム複合体の活性を阻害する剤、またはいずれかの遺伝子操作細胞、および抗PD-L1阻害剤で処置される)。
【０１２６】
非限定的なチェックポイント阻害剤療法としては抗PD-L1療法、抗PD-L2療法、抗PD-1療法、抗CTLA-4療法、抗TIM-3療法、抗LAG-3療法、抗VISTA療法、または抗TIGIT療法が挙げられる。がんはチェックポイント阻害剤療法に対する耐性を獲得していることがある(例えば、チェックポイント阻害剤療法による処置は、対象においてがんを処置する上で以前は有効であったが、現在は有効でなくなっている)。熟練した臨床医は、所与のがんに関するがん処置の有効性を測定する(例えば腫瘍の増殖速度を測定する)ための標準的技術を使用して、がんがチェックポイント阻害剤療法に耐性があるかまたは耐性を得たか否かを確定することができる。
【０１２７】
一態様では、がんは、がん腫、黒色腫、肉腫、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫である。
【０１２８】
がん腫とは、上皮組織中で発生するがんのことである。がん腫は、すべてのがんの約80〜90%を占める。がん腫は、分泌可能な臓器または腺(例えば胸、肺、前立腺、結腸、または膀胱)を冒しうる。がん腫には2つのサブタイプがある: 臓器または腺中で発生する腺がん、および扁平上皮中で発生する扁平上皮がん。腺がんは、一般に粘膜中で発生し、肥厚斑様の白色粘膜として観察される。多くの場合、腺がんは、それらが発生する軟部組織を通じて容易に伝播する。扁平上皮がんは身体のどの領域からでも発生しうる。がん腫の例としては前立腺がん、結腸直腸がん、マイクロサテライト安定性結腸がん、マイクロサテライト不安定性結腸がん、肝細胞がん、乳がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、黒色腫、基底細胞がん、扁平上皮がん、腎細胞がん、非浸潤性乳管がん、浸潤性乳管がんが挙げられるがそれに限定されない。
【０１２９】
肉腫は、支持組織および結合組織、例えば骨、腱、軟骨、筋肉、および脂肪中で発生するがんである。通常、肉腫は、それらが増殖する組織に似ている。肉腫の非限定的な例としては骨肉腫もしくは骨原性肉腫(骨から発生)、軟骨肉腫(軟骨から発生)、平滑筋肉腫(平滑筋から発生)、横紋筋肉腫(骨格筋から発生)、中皮肉腫もしくは中皮腫(体腔の内膜から発生)、線維肉腫(線維組織から発生)、血管肉腫もしくは血管内皮腫(血管から発生)、脂肪肉腫(脂肪組織から発生)、神経膠腫もしくは星細胞腫(脳内に見られる神経原性結合組織から発生)、粘液肉腫(原始胚性結合組織から発生)、または間葉腫もしくは混合性中胚葉腫瘍(混合性結合組織型から発生)が挙げられる。
【０１３０】
黒色腫は、色素含有メラノサイトから形成されるがんの一種である。黒色腫は、通常は皮膚に発生するが、口、腸、または眼に発生することもある。
【０１３１】
骨髄腫は、骨髄の形質細胞中で発生するがんである。骨髄腫の非限定的な例としては多発性骨髄腫、形質細胞腫、およびアミロイドーシスが挙げられる。
【０１３２】
白血病(「血液がん」としても知られる)は、血液細胞産生部位である骨髄のがんである。多くの場合、白血病は未熟白血球の過剰産生に関連している。未熟白血球は適切に機能せず、このため患者は感染症に罹りやすくなる。さらに、白血病は、赤血球を冒すものであり、血液凝固不全、および貧血による疲労を引き起こすことがある。白血病は急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ球性白血病(ALL)、および慢性リンパ球性白血病(CLL)として分類可能である。白血病の例としては骨髄性白血病または顆粒球性白血病(骨髄および顆粒球の白血球の悪性腫瘍)、リンパ性白血病、リンパ球性白血病、またはリンパ芽球性白血病(リンパおよびリンパ球の血液細胞の悪性腫瘍)、ならびに真性赤血球増加症または赤血病(赤血球を主に含む様々な血液細胞製剤の悪性腫瘍)が挙げられるがそれに限定されない。
【０１３３】
リンパ腫は、体液を精製して白血球またはリンパ球を産生するリンパ系(例えば脾臓、扁桃腺、および胸腺)のリンパ腺またはリンパ節中で発生する。白血病とは異なり、リンパ腫は固形腫瘍を形成する。リンパ腫は特定の臓器、例えば胃、乳房、または脳内で生じることもあり、これを節外性リンパ腫と呼ぶ。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫という2つのカテゴリーに細分類される。ホジキンリンパ腫中でのリード・シュテルンベルク細胞の存在によりホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫とが臨床的に区別される。リンパ腫の非限定的な例としてはびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、ヘアリーセル白血病(HCL)が挙げられる。一態様では、がんはDLBCLまたは濾胞性リンパ腫である。
【０１３４】
一態様では、がんは固形腫瘍である。固形腫瘍の非限定的な例としては副腎皮質腫瘍、胞状軟部肉腫、軟骨肉腫、結腸直腸がん、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、卵黄嚢腫瘍、類上皮血管内皮腫、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍(固形腫瘍)、骨・軟部組織巨細胞腫、肝芽腫、肝細胞がん、黒色腫、腎腫、神経芽腫、非横紋筋肉腫軟部肉腫(NRSTS)、骨肉腫、傍脊椎肉腫、腎細胞がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。固形腫瘍は、骨、筋肉、または臓器に見ることができ、肉腫またはがん腫でありうる。
【０１３５】
一態様では、がんは転移性である。
【０１３６】
本明細書では、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤を、同じ起源のがんを処置するために使用することができ、例えば、この剤が結腸がんを処置する上で有効であることから、すべてのがん腫をこの剤で処置することができ、あるいは、この剤が黒色腫および結腸がんを処置する上で有効であることから、すべての固形腫瘍をこの剤で処置することができることが想定される。さらに、本明細書では、CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤が、すべてのがんを処置するために使用可能であり、本明細書に列挙されるがんの種類に限定されるべきではないことが想定される。
【０１３７】
様々な場合では、本明細書に開示される方法を使用して処置される対象は、固形腫瘍、または微小腫瘍環境を伴う可溶性がんに罹患している。様々な場合では、がんは黒色腫、頭頸部がん、肺がん(例えば非小細胞肺がん)、膀胱がん、腎がん、前立腺がん、中枢神経系(CNS)がん、乳がん、胃がん、甲状腺がん、卵巣がん、または非ホジキンリンパ腫である。いくつかの場合では、がんは黒色腫である。様々な場合では、がんは膀胱がんである。様々な場合では、がんは腎がんである。様々な場合では、がんは非小細胞肺がんである。様々な場合では、がんは頭頸部がんである。
【０１３８】
チェックポイント阻害剤
一態様では、本方法は、対象にチェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含む。一態様では、チェックポイント阻害剤は小分子、阻害性核酸、阻害性ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合ドメイン、または抗体試薬である。一態様では、チェックポイント阻害剤は抗体もしくはその抗原結合ドメイン、または抗体試薬であり、免疫チェックポイントポリペプチドに結合してその活性を阻害する。治療剤の標的となる一般的なチェックポイントとしてはPD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、またはTIGITが挙げられるがそれに限定されない。一態様では、チェックポイント阻害剤は抗体もしくはその抗原結合ドメイン、または抗体試薬であり、PD-1、PD-L1、またはPD-L2ポリペプチドに結合してその活性を阻害する。
【０１３９】
公知のチェックポイント制御因子(例えばPD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、またはTIGIT)の阻害剤は当技術分野において公知である。チェックポイント阻害剤(チェックポイント標的および製造業者を括弧内に記す)の非限定的な例としてはMGA271(B7-H3: MacroGenics); イピリムマブ(CTLA-4; Bristol Meyers Squibb); ペンブロリズマブ(PD-1; Merck); ニボルマブ(PD-1; Bristol Meyers Squibb); アテゾリズマブ(PD-L1; Genentech); IMP321(LAG3: Immuntep); BMS-986016(LAG3; Bristol Meyers Squibb); IPH2101(KIR; Innate Pharma); トレメリムマブ(CTLA-4; Medimmune); ピディリズマブ(PD-1; Medivation); MPDL3280A(PD-L1; Roche); MEDI4736(PD-L1; AstraZeneca); MSB0010718C(PD-L1; EMD Serono); AUNP12(PD-1; Aurigene); アベルマブ(PD-L1; Merck); デュルバルマブ(PD-L1; Medimmune); またはTSR-022(TIM3; Tesaro)を挙げることができる。
【０１４０】
一態様では、チェックポイント阻害剤はPD-1を阻害する。PD-1阻害剤としてはペンブロリズマブ(Keytruda(商標))、ニボルマブ、AUNP-12、またはピディリズマブが挙げられるがそれに限定されない。別の態様では、チェックポイント阻害剤はPD-L1を阻害する。PD-L1阻害剤としてはアテゾリズマブ、MPDL3280A、アベルマブ、またはデュルバルマブが挙げられるがそれに限定されない。
【０１４１】
プログラム死リガンド1(PD-L1; 表面抗原分類274(CD274)またはB7相同体1(B7-H1)としても知られる)は、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、および肝炎などの特定の事象において免疫系を抑制するように機能する膜貫通タンパク質である。PD-L1をその受容体であるプログラム死1リガンド(PD-1)に結合させることで、T細胞の増殖を減少させる阻害性シグナルが伝達され、アポトーシスが誘導可能になる。異常PD-L1および/またはPD-1発現は、様々な腫瘍中でがん細胞回避を促進することが示されている。PD-L1/PD-1遮断は、PD-1またはそのリガンドPD-L1に結合する抗体を含む種々の機構により達成可能である。PD-1遮断剤およびPD-L1遮断剤の例は、全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,488,802号; 第7,943,743号; 第8,008,449号; 第8,168,757号; 第8,217,149号、ならびにPCT特許出願公開番号WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400、およびWO2011161699に記載されている。特定の態様では、PD-1阻害剤として抗PD-L1抗体が挙げられる。PD-1阻害剤としては抗PD-1抗体および類似の結合性タンパク質、例えば、ニボルマブ(MDX 1106、BMS 936558、ONO 4538); リガンドPD-L1およびPD-L2によりPD-1に結合してPD-1の活性化を遮断する完全ヒトIgG4抗体; ランブロリズマブ(MK-3475またはSCH 900475); PD-1に対するヒト化モノクローナルIgG4抗体; PD-1に結合するヒト化抗体CT-011; B7-DCの融合タンパク質AMP-224; 抗体Fc部分; PD-L1(B7-H1)遮断用のBMS-936559(MDX-1105-01)が挙げられる。
【０１４２】
抗がん療法
一態様では、剤は、抗がん療法、例えば、がんを有する対象を処置する上で本明細書に記載の組成物と併用されるように意図される処置法との組み合わせで、投与される。抗がん療法は、例えば化学療法、放射線療法、化学放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、手術、または幹細胞療法でありうる。
【０１４３】
一態様によれば、化学療法剤が、本明細書に記載の組成物との組み合わせで対象に投与される。例示的な化学療法剤としては白金化学療法剤、アントラサイクリン治療剤、またはアルキル化化学療法剤が挙げられるがそれに限定されない。化学療法剤の非限定的な例としてはアントラサイクリン(例えばドキソルビシン(例えばリポソームドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤(例えばシクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド)、免疫細胞抗体(例えばアレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ)、代謝拮抗剤(例えば葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えばフルダラビン)を含む)、mTOR阻害剤、TNFRグルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質(GITR)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えばアクラシノマイシンA、グリオトキシン、またはボルテゾミブ)、免疫調節剤、例えばサリドマイドまたはサリドマイド誘導体(例えばレナリドミド)が挙げられる。併用療法における使用が考慮される一般的な化学療法剤としてはアナストロゾール(Arimidex(登録商標))、ビカルタミド(Casodex(登録商標))、硫酸ブレオマイシン(Blenoxane(登録商標))、ブスルファン(Myleran(登録商標))、ブスルファン注射剤(Busulfex(登録商標))、カペシタビン(Xeloda(登録商標))、N4-ペントキシカルボニル-5-デオキシ-5-フルオロシチジン、カルボプラチン(Paraplatin(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標))、クロラムブシル(Leukeran(登録商標))、シスプラチン(Platinol(登録商標))、クラドリビン(Leustatin(登録商標))、シクロホスファミド(Cytoxan(登録商標)またはNeosar(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Cytosar-U(登録商標))、シタラビンリポソーム注射剤(DepoCyt(登録商標))、ダカルバジン(DTIC-Dome(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシンD、Cosmegan)、塩酸ダウノルビシン(Cerubidine(登録商標))、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射剤(DaunoXome(登録商標))、デキサメタゾン、ドセタキセル(Taxotere(登録商標))、塩酸ドキソルビシン(Adriamycin(登録商標)、Rubex(登録商標))、エトポシド(Vepesid(登録商標))、リン酸フルダラビン(Fludara(登録商標))、5-フルオロウラシル(Adrucil(登録商標)、Efudex(登録商標))、フルタミド(Eulexin(登録商標))、テザシチビン(tezacitibine)、ゲムシタビン(ジフルオロデオキシシチジン)、ヒドロキシ尿素(Hydrea(登録商標))、イダルビシン(Idamycin(登録商標))、イホスファミド(IFEX(登録商標))、イリノテカン(Camptosar(登録商標))、L-アスパラギナーゼ(ELSPAR(登録商標))、ロイコボリンカルシウム、メルファラン(Alkeran(登録商標))、6-メルカプトプリン(Purinethol(登録商標))、メトトレキサート(Folex(登録商標))、ミトキサントロン(Novantrone(登録商標))、Mylotarg、パクリタキセル(Taxol(登録商標))、Phoenix(イットリウム90/MX-DTPA)、ペントスタチン、ポリフェプロザン20カルムスチンインプラント(Gliadel(登録商標))、クエン酸タモキシフェン(Nolvadex(登録商標))、テニポシド(Vumon(登録商標))、6-チオグアニン、チオテパ、チラパザミン(Tirazone(登録商標))、注射用塩酸トポテカン(Hycamptin(登録商標))、ビンブラスチン(Velban(登録商標))、ビンクリスチン(Oncovin(登録商標))、およびビノレルビン(Navelbine(登録商���))が挙げられる。例示的なアルキル化剤としてはナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、およびトリアゼン: ウラシルマスタード(Aminouracil Mustard(登録商標)、Chlorethaminacil(登録商標)、Demethyldopan(登録商標)、Desmethyldopan(登録商標)、Haemanthamine(登録商標)、Nordopan(登録商標)、Uracil nitrogen mustard(登録商標)、Uracillost(登録商標)、Uracilmostaza(登録商標)、Uramustin(登録商標)、Uramustine(登録商標))、クロルメチン(Mustargen(登録商標))、シクロホスファミド(Cytoxan(登録商標)、Neosar(登録商標)、Clafen(登録商標)、Endoxan(登録商標)、Procytox(登録商標)、Revimmune(商標))、イホスファミド(Mitoxana(登録商標))、メルファラン(Alkeran(登録商標))、クロラムブシル(Leukeran(登録商標))、ピポブロマン(Amedel(登録商標)、Vercyte(登録商標))、トリエチレンメラミン(Hemel(登録商標)、Hexalen(登録商標)、Hexastat(登録商標))、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド(Temodar(登録商標))、チオテパ(Thioplex(登録商標))、ブスルファン(Busilvex(登録商標)、Myleran(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標))、ロムスチン(CeeNU(登録商標))、ストレプトゾシン(Zanosar(登録商標))、およびダカルバジン(DTIC-Dome(登録商標))が挙げられるがそれに限定されない。さらなる例示的なアルキル化剤としてはオキサリプラチン(Eloxatin(登録商標)); テモゾロミド(Temodar(登録商標)およびTemodal(登録商標)); ダクチノマイシン(アクチノマイシンDとしても知られる、Cosmegen(登録商標)); メルファラン(L-PAM、L-サルコリシン、およびフェニルアラニンマスタードとしても知られる、Alkeran(登録商標)); アルトレタミン(ヘキサメチルメラミン(HMM)としても知られる、Hexalen(登録商標)); カルムスチン(BiCNU(登録商標)); ベンダムスチン(Treanda(登録商標)); ブスルファン(Busulfex(登録商標)およびMyleran(登録商標)); カルボプラチン(Paraplatin(登録商標)); ロムスチン(CCNUとしても知られる、CeeNU(登録商標)); シスプラチン(CDDPとしても知られる、Platinol(登録商標)およびPlatinol(登録商標)-AQ); クロラムブシル(Leukeran(登録商標)); シクロホスファミド(Cytoxan(登録商標)およびNeosar(登録商標)); ダカルバジン(DTIC、DIC、およびイミダゾールカルボキサミドとしても知られる、DTIC-Dome(登録商標)); アルトレタミン(ヘキサメチルメラミン(HMM)としても知られる、Hexalen(登録商標)); イホスファミド(Ifex(登録商標)); プレドニムスチン; プロカルバジン(Matulane(登録商標)); メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード、ムスチン、および塩酸メクロレタミンとしても知られる、Mustargen(登録商標)); ストレプトゾシン(Zanosar(登録商標)); チオテパ(チオホスファミド、TESPA、およびTSPAとしても知られる、Thioplex(登録商標)); シクロホスファミド(Endoxan(登録商標)、Cytoxan(登録商標)、Neosar(登録商標)、Procytox(登録商標)、Revimmune(登録商標)); ならびにベンダムスチンHCl(Treanda(登録商標))が挙げられるがそれに限定されない。例示的なmTOR阻害剤としては、例えばテムシロリムス; リダフォロリムス(以前はデフォロリムスとして知られていた。(1R,2R,45)-4-[(2R)-2[(1R,95,125,15R,16E,18R,19R,21R,235,24E,26E,28Z,305,325,35R)-1,18-ジヒドロキシ-19,30-ジメトキシ-15,17,21,23,29,35-ヘキサメチル-2,3,10,14,20-ペンタオキソ-11,36-ジオキサ-4-アザトリシクロ[30.3.1.04'9]ヘキサトリアコンタ-16,24,26,28-テトラエン-12-イル]プロピル]-2-メトキシシクロヘキシル ジメチルホスフィネート���AP23573およびMK8669としても知られ、PCT公開番号WO 03/064383に記載); エベロリムス(Afinitor(登録商標)またはRADOO1); ラパマイシン(AY22989、Sirolimus(登録商標)); セマピモド(CAS 164301-51-3); テムシロリムス、(5-{2,4-ビス[(35,)-3-メチルモルホリン-4-イル]ピリド[2,3-(i]ピリミジン-7-イル}-2-メトキシフェニル)メタノール(AZD8055); 2-アミノ-8-[iraw5,-4-(2-ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]-6-(6-メトキシ-3-ピリジニル)-4-メチル-ピリド[2,3-JJピリミジン-7(8H)-オン(PF04691502、CAS 1013101-36-4); N2-[1,4-ジオキソ-4-[[4-(4-オキソ-8-フェニル-4H-1-ベンゾピラン-2-イル)モルホリニウム-4-イル]メトキシ]ブチル]-L-アルギニルグリシル-L-a-アスパルチルL-セリン-、分子内塩(SF1126、CAS 936487-67-1)、ならびにXL765が挙げられる。例示的な免疫調節剤としては、例えばアフツズマブ(Roche(登録商標)から入手可能); ペグフィルグラスチム(Neulasta(登録商標)); レナリドミド(CC-5013、Revlimid(登録商標)); サリドマイド(Thalomid(登録商標))、アクチミド(CC4047); ならびにIRX-2(インターロイキン1、インターロイキン2、およびインターフェロンγを含むヒトサイトカインの混合物、CAS 951209-71-5、IRX Therapeuticsから入手可能)が挙げられる。例示的なアントラサイクリンとしては、例えばドキソルビシン(Adriamycin(登録商標)およびRubex(登録商標)); ブレオマイシン(lenoxane(登録商標)); ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシン、および塩酸ルビドマイシン、Cerubidine(登録商標)); ダウノルビシンリポソーム(クエン酸ダウノルビシンリポソーム、DaunoXome(登録商標)); ミトキサントロン(DHAD、Novantrone(登録商標)); エピルビシン(Ellence(商標)); イダルビシン(Idamycin(登録商標)、Idamycin PFS(登録商標)); マイトマイシンC(Mutamycin(登録商標)); ゲルダナマイシン; ハービマイシン; ラビドマイシン; ならびにデスアセチルラビドマイシンが挙げられる。例示的なビンカアルカロイドとしては、例えば酒石酸ビノレルビン(Navelbine(登録商標))、ビンクリスチン(Oncovin(登録商標))、およびビンデシン(Eldisine(登録商標)); ビンブラスチン(硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチン、およびVLBとしても知られる、Alkaban-AQ(登録商標)およびVelban(登録商標)); ならびにビノレルビン(Navelbine(登録商標))が挙げられる。例示的なプロテオソーム阻害剤としてはボルテゾミブ(Velcade(登録商標)); カルフィルゾミブ(PX-171-007、(5)-4-メチル-N-((5)-1-(((5)-4-メチル-1-((R)-2-メチルオキシラン-2-イル)-1-オキソペンタン-2-イル)アミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)-2-((5,)-2-(2-モルホリノアセトアミド)-4-フェニルブタンアミド)-ペンタンアミド); マリゾミブ(NPT0052); クエン酸イキサゾミブ(MLN-9708); デランゾミブ(CEP-18770); およびO-メチル-N-[(2-メチル-5-チアゾリル)カルボニル]-L-セリル-O-メチル-N-[(11S')-2-[(2R)-2-メチル-2-オキシラニル]-2-オキソ-L-(フェニルメチル)エチル]-L-セリンアミド(ONX-0912)が挙げられる。
【０１４４】
当業者は、本明細書に記載の方法および組成物と共に使用する化学療法剤を容易に同定することができる(例えばPhysicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014, Edward Chu, Vincent T. DeVita Jr., Jones & Bartlett Learning; Principles of Cancer Therapy, Chapter 85 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 18th edition; Therapeutic Targeting of Cancer Cells: Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology, Chs. 28-29 in Abeloff's Clinical Oncology, 2013 Elsevier; およびFischer D S (ed): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 2003を参照)。
【０１４５】
一態様によれば、放射線療法が、本明細書に記載の組成物との組み合わせで対象に投与される。本明細書に開示される本発明による放射線療法は、非侵襲性(外部)および侵襲性(内部)の両方の放射線療法を包含する。外部放射線療法では、処置は体外の放射線源により実行され、一方、侵襲性放射線療法では、処置は体内に埋め込まれた放射線源により実行される。非侵襲性または侵襲性放射線療法により処置される代表的な疾患としては、例えばがん、関節リウマチ、血管形成、または再狭窄が挙げられる。
【０１４６】
一態様によれば、化学放射線療法、例えば化学療法および放射線療法の組み合わせが、本明細書に記載の組成物との組み合わせで対象に投与される。
【０１４７】
一態様によれば、免疫療法が、本明細書に記載の組成物との組み合わせで対象に投与される。本明細書において使用される「免疫療法」とは、例えば、がん細胞の増殖を停止させるかもしくは遅らせるために、がん細胞の転移を停止させるために、かつ/またはがん細胞をプログラム細胞死の標的とするために、対象の免疫系を増強するように設計された、処置を意味する。例示的な免疫療法としてはモノクローナル抗体、非特異的免疫療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、養子T細胞療法(例えば養子CD4+またはCD8+エフェクターT細胞療法)、養子ナチュラルキラー(NK)細胞療法、養子NK T細胞療法、およびがん(例えば腫瘍)ワクチンが挙げられる。
【０１４８】
一態様によれば、非特異的免疫療法が、本明細書に記載の組成物との組み合わせで対象に投与される。2つの一般的な非特異的免疫療法としては例えばインターフェロンおよびインターロイキンが挙げられる。インターフェロン(例えばRoferon-A[2α]、Intron A[2β]、Alferon[2α])は、がん細胞をプログラム細胞死の標的にするように、かつ/またはがん細胞の増殖を遅らせるように、免疫系に促す。インターロイキン(例えばインターロイキン2、IL-2、またはアルデスロイキン(Proleukin))は、がん細胞をプログラム細胞死の標的にする細胞を産生するように免疫系に促す。インターロイキンは、例えば腎がん、および黒色腫を含む皮膚がんを処置するために使用される。非特異的免疫療法は、単剤療法として投与されてもよく、化学療法もしくは放射線療法などの別の抗がん療法の後に、またはそれと同時に投与されてもよい。
【０１４９】
一態様によれば、腫瘍溶解性ウイルスが、本明細書に記載の組成物との組み合わせで対象に投与される。腫瘍溶解性ウイルス療法は、遺伝子改変ウイルス(例えば単純ヘルペスウイルスまたは他のウイルス)を利用することで、免疫応答によりがん細胞をプログラム細胞死の標的にする。腫瘍溶解性ウイルスは局所投与され、例えば腫瘍に注射され、腫瘍中でウイルスはがん細胞に入って複製される。複製によりがん細胞を溶解させることができ、これにより抗原が放出され、がん細胞をプログラム細胞死の標的にする免疫応答が活性化される。所望の効果が得られる(例えば腫瘍が根絶される)までウイルスの投与を繰り返すことができる。腫瘍溶解性ウイルス療法(例えばタリモジーン・ラハーパレプベック(Imlygic)またはT-VEC)は黒色腫の処置について承認されている。
【０１５０】
一態様では、がんを有する対象に、遺伝子操作T細胞が、本明細書に記載の組成物との組み合わせで投与される。T細胞療法は、外来性キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子操作されたT細胞を利用する。本明細書において使用される「キメラ抗原受容体」または「CAR」とは、抗原結合ドメイン(例えば抗体の抗原結合部分(例えばscFV))、膜貫通ドメイン、ならびにT細胞シグナル伝達および/またはT細胞活性化ドメイン(例えば細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む、人工的に構築されたハイブリッドポリペプチドを意味する。CARは、モノクローナル抗体の抗原結合を利用して、MHCに制限されずにT細胞の特異性および反応性を選択された標的に向け直す能力を有する。CARに関するさらなる考察は、例えばそれぞれ全体として参照により本明細書に組み入れられるMaus et al. Blood 2014 123:2624-35; Reardon et al. Neuro-Oncology 2014 16:1441-1458; Hoyos et al. Haematologica 2012 97:1622; Byrd et al. J Clin Oncol 2014 32:3039-47; Maher et al. Cancer Res 2009 69:4559-4562; およびTamada et al. Clin Cancer Res 2012 18:6436-6445に見ることができる。
【０１５１】
一態様では、がんを有する対象に、腫瘍細胞の細胞表面上の腫瘍抗原を標的にするCAR T細胞が、本明細書に記載の組成物との組み合わせで投与される。本明細書において使用される「腫瘍抗原」という用語は、がん細胞により差次的に発現され、したがってがん細胞を標的にするために利用可能な、抗原を意味する。がん抗原は、明らかに腫瘍特異的な免疫応答を潜在的に刺激しうる抗原である。いくつかのこれらの抗原は、正常細胞によりコードされるが、正常細胞により必ずしも発現されるわけではない。これらの抗原は、正常細胞中では通常サイレントである(すなわち発現されない)抗原、特定の分化段階でのみ発現される抗原、ならびに一時的に発現される抗原、例えば胚性抗原および胎児性抗原として特徴づけることができる。他のがん抗原は変異細胞遺伝子、例えばがん遺伝子(例えば活性化rasがん遺伝子)、抑制遺伝子(例えば変異p53)、および内部欠失または染色体転座により生じる融合タンパク質によりコードされる。さらに他のがん抗原はウイルス遺伝子、例えばRNAおよびDNA腫瘍ウイルスに担持されるウイルス遺伝子によりコードされうる。多くの腫瘍抗原は複数の固形腫瘍に関して規定されている: MAGE 1、2、および3、免疫により規定; MART-1/Melan-A、gp100、がん胎児性抗原(CEA)、HER2、ムチン(すなわちMUC-1)、前立腺特異的抗原(PSA)、ならびに前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)。さらに、ウイルスタンパク質、例えばB型肝炎(HBV)、エプスタイン・バー(EBV)、ヒトパピローマ(HPV)によりコードされるいくつかのウイルスタンパク質は、それぞれ肝細胞がん、リンパ腫、子宮頸がんの発生において重要であることが示されている。
【０１５２】
一態様では、がんを有する対象に、非小細胞肺がん、上皮がん、神経膠腫上のEGFR(上皮増殖因子受容体); 膠芽腫上のEGFRvIII(上皮増殖因子受容体の変種III); 卵巣がん、乳がん、膠芽腫、結腸がん、骨肉腫、髄芽腫上のHER2(ヒト上皮増殖因子受容体2); 中皮腫、卵巣がん、膵臓腺がん上のMSLN(メソテリン); 前立腺がん上のPSMA(前立腺特異的膜抗原); 膵臓腺がん、乳がん、結腸直腸がん上のCEA(がん胎児性抗原); 神経芽腫、黒色腫上のGD2(ジシアロガングリオシド2); 神経膠腫上のIL13Rα2(インターロイキン13Ra2); 肝細胞がん上のGPC3(グリピカン3); 腎細胞がん(RCC)上のCAIX(炭酸脱水酵素IX); 神経芽腫、黒色腫、卵巣腺がん上のL1-CAM(L1細胞接着分子); 卵巣上皮がん上のCA125(がん抗原125、MUC16としても知られる); 膠芽腫、胆管がん(CCA)上のCD133(表面抗原分類133、プロミニン1としても知られる); 悪性胸膜中皮腫(MPM)上のFAP(線維芽細胞活性化タンパク質); 黒色腫および卵巣がん上のCTAG1B(がん/精巣抗原1B、NY-ESO-1としても知られる); 精嚢がん上のMUC1(ムチン1); 卵巣がん上のFR-α(葉酸受容体α)を標的にするCAR T細胞が、本明細書に記載のいずれかの組成物との組み合わせで投与される。
【０１５３】
一態様では、がんを有する対象に、チェックポイント阻害剤を標的にするCAR T細胞が、本明細書に記載の組成物との組み合わせで投与される。一態様では、がんを有する対象に抗PD-1 CAR T細胞が投与される。一態様では、がんを有する対象に抗PD-L1 CAR T細胞が本明細書に記載の組成物との組み合わせで投与される。
【０１５４】
一態様では、がんを有する対象に、がんワクチンが、本明細書に記載の組成物との組み合わせで投与される。がんワクチンで処置および/または予防可能ながんとしては膀胱がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、腎がん、白血病、肺がん、黒色腫、骨髄腫、膵がん、および前立腺がんが挙げられるがそれに限定されない。
【０１５５】
一態様では、養子T細胞療法が本明細書に記載の組成物との組み合わせで投与される。養子T細胞療法において使用可能である例示的なT細胞としてはCD4+もしくはCD8+エフェクターT細胞、制御性T細胞、または細胞溶解性T細胞が挙げられる。
【０１５６】
一態様では、がんを有する対象に、養子NK細胞療法が、本明細書に記載の組成物との組み合わせで投与される。ナチュラルキラー(NK)細胞は、腫瘍抗原に対する事前の感作を必要とせずにがん細胞をプログラム細胞死の標的にするように機能する免疫細胞である。NKは様々な機構を通じて、例えば受容体媒介細胞毒性を通じてがん細胞を標的にする。NK細胞は、生殖系列コード受容体、例えばc型レクチンホモ二量体NKG2Dを発現し、NKG2Dは、腫瘍細胞上で発現されるストレス誘導リガンド(例えばULBP、MICA/MICB)に結合する。ライゲーション時に、NK細胞は脱顆粒し、パーフォリンおよびグランザイムを放出して標的細胞のアポトーシスを誘導する。NK細胞の脱顆粒は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC)と呼ばれるプロセスを通じて開始されてもよい。NK細胞およびT細胞を(例えばIL-2、IL-12、IL-15、またはIL-18などのサイトカインで)修飾することで、それらのがん細胞に対する能力および特異性を高めることができる。対象に投与されるNK細胞は自家細胞または同種細胞でありうる。対象に投与されるNK細胞はインビボまたはエクスビボで増殖しうる。養子NK細胞またはT細胞療法で処置可能ながんとしては進行黒色腫、腎細胞がん、急性骨髄性白血病、リンパ腫、固形腫瘍、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、非B細胞系統血液悪性腫瘍、Her2+乳がん、およびHer2+胃がんが挙げられるがそれに限定されない。養子NK細胞および養子NK T細胞療法の使用は、例えば全体として参照により本明細書に組み入れられるDavis, ZB, et al. Cancer J. 2015 Nov-Dec; 21(6): 486-491においてさらに考察されている。
【０１５７】
一態様では、養子T細胞療法、例えばCD4+もしくはCD8+エフェクターT細胞療法、またはNK T細胞療法は腫瘍抗原と反応性がある。養子T細胞療法用のT細胞は、例えば腫瘍組織、血液、または他の患者組織から精製可能である。精製T細胞は、例えば細胞培養液中にてエクスビボで、例えば活性化され、増殖し、かつ/または遺伝子改変されうる。活性化、増殖、および/または遺伝子改変T細胞を、例えば患者に、例えば静脈内注射または他の許容される経路によって、本明細書に記載の組成物との組み合わせで投与することができる。CBMシグナロソームの活性を阻害する剤が、投与された細胞の腫瘍部位への動員を増強することが想定される。
【０１５８】
一態様によれば、ホルモン療法が、本明細書に記載の組成物との組み合わせで対象に投与される。ホルモン療法は、例えばがん細胞の増殖を停止させるかまたは遅らせるために、ホルモンを身体に加える、身体から遮断する、または身体から除去するように設計されている。ホルモン療法は、例えばプロゲステロン、卵巣摘出術、タモキシフェン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)アゴニストまたは類似体、およびアンドロゲン療法の投与を含みうる。ホルモン療法は、体内のホルモンレベルを減少させるために腺、例えば甲状腺、膵臓、および卵巣を除去することを指すこともある。ホルモン療法は当技術分野において公知であり、当業者により投与可能である。
【０１５９】
一態様によれば、幹細胞療法が、本明細書に記載の組成物との組み合わせで対象に投与される。幹細胞療法は、すべての幹細胞を妨害するための処置(例えば化学療法、放射線療法、またはそれらの組み合わせ)を受ける前に対象の幹細胞を除去することを含みうる。この処置の後に幹細胞を患者に再投与することができる(例えば幹細胞移植片)。幹細胞移植片は自家細胞または同種細胞でありうる。幹細胞移植片はタンデム移植片(例えば連続した2つ以上の移植片)、ミニ移植片(例えば通常の移植片未満で対象の免疫系が抑制される)、または同系幹細胞移植片(例えば同一の双生児から受け取った同種幹細胞)でありうる。幹細胞療法で処置可能ながんとしては白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、精巣がん、神経芽腫、および特定の小児がんが挙げられるがそれに限定されない。
【０１６０】
投与
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、がんを有するかまたはがんを有すると診断された対象の処置であって、本明細書に記載のCBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤を投与するか、または本明細書に記載のいずれかの遺伝子操作細胞を投与する段階を含む処置に関する。本明細書では、対象が、チェックポイント阻害剤療法に耐性があるかまたは以前は耐性があったがんを含むことが想定される。がんを有する対象は、医師が、がん(例えば黒色腫またはの他のがん)を診断する現行の方法を使用することで同定可能である。この疾患を特徴づけかつ診断に役立つ、がんの症状および/または合併症は、当技術分野において周知であり、疲労、体重減少、骨痛、リンパ節腫脹またはリンパ節痛、および頭痛を含むがそれに限定されない。例えばがんの診断に役立ちうる試験としては、パンチ生検または切除生検、および非侵襲的画像診断(例えば磁気共鳴画像法またはコンピュータ断層撮影スキャン)が挙げられるがそれに限定されず、所与の状態に関して当技術分野において公知である。状態の家族歴、またはがんの危険因子への曝露も、対象が状態を有しやすいか否かを確定すること、またはがんの診断を行うことに役立ちうる。
【０１６１】
本明細書に記載の剤または遺伝子操作細胞を、がん(例えば黒色腫または結腸がん)を有するかまたは有すると診断された対象に投与することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、がんの症状を軽減するために、対象に有効量のCBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤または遺伝子操作細胞を投与する段階を含む。本明細書において使用される「がんの症状を軽減する」とは、がんに関連する任意の状態または症状の寛解のことである。この減少は、同等の未処置対照と比べて少なくとも5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%、99%、またはそれ以上であり、当業者に公知である任意の標準的技術により測定される。対象に本明細書に記載の剤または遺伝子操作細胞を投与するための種々の手段は当業者に公知である。
【０１６２】
一態様では、剤または遺伝子操作細胞は全身投与または局所投与される。一態様では、剤または遺伝子操作細胞は静脈内投与される。別の態様では、剤または遺伝子操作細胞は例えば腫瘍部位において局所投与される。CBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤の投与経路は、送達される剤の種類(例えば阻害性核酸、または小分子)に応じて最適化されるものであり、当業者が決定可能である。一態様では、本明細書に記載の剤または遺伝子操作細胞は腸内/胃腸(経口)投与、非経口投与、または外用投与される。
【０１６３】
本明細書において使用される「有効量」という用語は、がんの少なくとも1つの症状(例えば頭痛)を軽減するために必要な剤または遺伝子操作細胞の量を意味する。したがって、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与される際に特定の抗がん効果を実現するために十分な剤または遺伝子操作細胞の量を意味する。また、本明細書において使用される有効量は、様々な状況において、がんの症状の発生を遅延させるために、がんの症状の経過を改変する(例えばがんの進行を遅らせることであるがそれに限定されない)ために、またはがんの症状を逆転させるために十分な剤または遺伝子操作細胞の量を含むであろう。したがって、正確な「有効量」を指定することは一般に実行可能ではない。しかし、任意の所与の症例に関して、適切な「有効量」を、当業者は単に日常的な実験を使用して決定することができる。
【０１６４】
有効量、毒性、および治療有効性を、細胞培養液または実験動物中で標準的な薬学的手順により評価することができる。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて変動しうる。毒性効果と治療効果との間の用量比を治療指数とし、それをLD50/ED50比で表すことができる。大きい治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療有効量を細胞培養アッセイによって最初に推定することができる。また、細胞培養液または適切な動物モデル中で確定されるIC50(すなわち、症状の最大半減阻害を実現する剤の濃度)を含む循環血漿中濃度範囲を実現するために、動物モデルにおいて用量を製剤化することができる。血漿中レベルを例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果を、好適なバイオアッセイ、例えば特に非侵襲的画像診断によってモニタリングすることができる。投与量は、医師が決定することができ、観察される処置効果に合わせて必要に応じて調整することができる。
【０１６５】
併用処置
本明細書では、本明細書に記載のCBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤、またはいずれかの遺伝子操作細胞を、単剤療法として対象に投与することができることが想定されるが、対象においてがんを処置するために併用療法を使用してもよい。様々な態様では、対象にチェックポイント阻害剤または抗がん療法がさらに投与される。一局面では、剤または遺伝子操作細胞は第2の治療法(例えばチェックポイント阻害剤または抗がん療法)と共に投与される。
【０１６６】
本明細書において使用される「組み合わせで」投与されるとは、対象が障害で苦しんでいる間に、2つ(またはそれ以上)の異なる処置を対象に送達すること、例えば、対象が障害または疾患(例えばがん)と診断された後に、かつ障害が治癒するもしくは除去されるかまたは処置が他の理由で終了する前に、2つ以上の処置を送達することを意味する。いくつかの態様では、第2の処置の送達が始まるときに1つの処置の送達がまだ行われており、したがって投与が重複している。本明細書では、これを「同時」または「同時送達」と呼ぶこともある。他の態様では、一方の処置の送達は、他方の処置の送達が開始する前に終了する。いずれかの場合のいくつかの態様では、併用投与が理由で処置がより有効になる。例えば、第2の処置が第1の処置の非存在下で投与される場合に見られるよりも、第2の処置がさらに有効になり、例えば、さらに少ない量の第2の処置で同等の効果が見られ、または第2の処置で症状がさらに大きく減少し、あるいは、類似の状況が第1の処置で見られる。いくつかの態様では、送達は、障害に関連する症状または他のパラメータの減少が、他方の処置の非存在下で送達される一方の処置で観察される減少よりも大きくなる送達である。2つの処置による効果は部分的に相加的、全面的に相加的、または相加的以上でありうる。送達は、第2の処置が送達される際に、送達された第1の処置の効果がなお検出可能である、送達でありうる。本明細書に記載の剤、および少なくとも1つのさらなる治療を同時投与するか、同じもしくは別々の組成物で投与するか、または順次投与することができる。順次投与では、本明細書に記載の剤を最初に投与することができ、さらなる剤を次に投与することができ、あるいは、投与順序を逆転させることもできる。障害が活動性である間に、または疾患が緩解または活動性低下している間に、剤、および/または他の治療剤、治療手順、もしくは治療様式を投与することができる。剤を別の処置の前に、別の処置と同時に、処置後に、または障害の緩解中に投与することができる。
【０１６７】
一態様では、剤または遺伝子操作細胞をチェックポイント阻害剤または抗がん療法の前に投与することができる。一態様では、剤または遺伝子操作細胞をチェックポイント阻害剤または抗がん療法の後に投与することができる。一態様では、剤または遺伝子操作細胞をチェックポイント阻害剤または抗がん療法と実質的に同時に投与することができる。
【０１６８】
一態様では、剤または遺伝子操作細胞を局所投与することができる。一態様では、剤または遺伝子操作細胞を全身投与することができる。一態様では、チェックポイント阻害剤または抗がん療法を局所投与することができる。一態様では、チェックポイント阻害剤または抗がん療法を全身投与することができる。対象に、1) 剤または遺伝子操作細胞、および2) チェックポイント阻害剤または抗がん療法を投与する場合、作用(例えば局所投与または全身投与)の標的は同じであってもよく(例えば、剤およびチェックポイント阻害剤が局所投与される)、異なっていてもよい(例えば、剤が局所投与され、チェックポイント阻害剤が全身投与される)。一態様では、剤または遺伝子操作細胞および第2の治療法が局所投与される。一態様では、剤または遺伝子操作細胞および第2の治療法が全身投与される。一態様では、剤または遺伝子操作細胞が局所投与され、第2の治療法が全身投与される。一態様では、剤または遺伝子操作細胞が全身投与され、第2の治療法が局所投与される。所与の抗がん療法の投与経路および投与様式は、当技術分野において公知であり、熟練した臨床医により確定可能である。剤または遺伝子操作細胞は、組成物中に、チェックポイント阻害剤または抗がん療法(例えば化学療法剤)と共に含まれてもよい。
【０１６９】
投与量
本明細書において使用される「単位剤形」という用語は、好適な1回の投与用の投与量を意味する。一例として、単位剤形は、送達装置、例えばシリンジまたは点滴静注バッグに配置される治療剤の量でありうる。一態様では、1つの単位剤形が1回の投与で投与される。別の態様では、2つ以上の単位剤形が同時投与される。
【０１７０】
本明細書に記載の剤の投与量は、医師が決定することができ、観察される処置効果に合わせて必要に応じて調整することができる。処置期間および処置頻度に関して、熟練した臨床医は、通常、処置によっていつ治療効果が得られるかを確定するために、かつ、さらなる細胞を投与するか否か、処置を中断するか否か、処置を再開するか否か、または処置レジメンに他の改変を加えるか否かを決定するために、対象をモニタリングする。投与量は、細胞毒性効果などの有害副作用を引き起こすほど多くすべきではない。任意の合併症に際しては、個々の医師が投与量を調整してもよい。
【０１７１】
投与量範囲は、効力に依存するものであり、所望の効果、例えば腫瘍サイズの減少を生じさせるために十分な多さの量を含む。一般に、投与量は、剤(例えば阻害性抗体、小分子MATL1阻害剤、もしくは阻害性核酸)、チェックポイント阻害剤、または抗がん処置(例えば化学療法剤)の種類、ならびに患者の年齢、性別、および体調によって変動する。通常、投与量は0.001mg/kg体重〜5g/kg体重の範囲である。いくつかの態様では、投与量範囲は0.001mg/kg体重〜1g/kg体重、0.001mg/kg体重〜0.5g/kg体重、0.001mg/kg体重〜0.1g/kg体重、0.001mg/kg体重〜50mg/kg体重、0.001mg/kg体重〜25mg/kg体重、0.001mg/kg体重〜10mg/kg体重、0.001mg/kg体重〜5mg/kg体重、0.001mg/kg体重〜1mg/kg体重、0.001mg/kg体重〜0.1mg/kg体重、0.001mg/kg体重〜0.005mg/kg体重である。あるいは、いくつかの態様では、投与量範囲は0.1g/kg体重〜5g/kg体重、0.5g/kg体重〜5g/kg体重、1g/kg体重〜5g/kg体重、1.5g/kg体重〜5g/kg体重、2g/kg体重〜5g/kg体重、2.5g/kg体重〜5g/kg体重、3g/kg体重〜5g/kg体重、3.5g/kg体重〜5g/kg体重、4g/kg体重〜5g/kg体重、4.5g/kg体重〜5g/kg体重、4.8g/kg体重〜5g/kg体重である。いずれかの局面のいくつかの態様では、用量範囲は1μg/kg体重〜20μg/kg体重である。あるいは、用量範囲は、血清レベルを1μg/mL〜20μg/mLに維持するように設定される。いくつかの態様では、投与量範囲は1μg/mL〜15μg/mL、1μg/mL〜10μg/mL、1μg/mL〜5μg/mL、1μg/mL〜2.5μg/mL、2.5μg/mL〜20μg/mL、5μg/mL〜20μg/mL、10μg/mL〜20μg/mL、15μg/mL〜20μg/mL、10μg/mL〜5μg/mL、5μg/mL〜15μg/mL、5μg/mL〜10μg/mL、2.5μg/mL〜10μg/mL、または2.5μg/mL〜15μg/mLである。
【０１７２】
一般に、本明細書に記載の遺伝子操作細胞を含む薬学的組成物(例えば遺伝子操作細胞)を、範囲内のすべての整数値を含む、細胞104〜105個/kg体重、細胞104〜106個/kg体重、細胞104〜107個/kg体重、細胞104〜108個/kg体重、細胞104〜109個/kg体重、細胞108〜109個/kg体重、細胞107〜109個/kg体重、細胞106〜109個/kg体重、細胞105〜109個/kg体重、細胞104〜109個/kg体重、細胞104〜106個/kg体重、細胞105〜107個/kg体重、細胞107〜109個/kg体重、細胞105〜108個/kg体重、または細胞106〜107個/kg体重の投与量で投与することができる。必要であれば、遺伝子操作細胞組成物をこれらの投与量で複数回投与してもよい。免疫療法において周知の注入技術を使用して細胞を投与することができる(例えばRosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照)。
【０１７３】
特定の局面では、活性化遺伝子操作制御性T細胞を対象に投与した後、血液を再抽出し(またはアフェレーシスを行い)、該血液に由来するT細胞を本明細書に記載のように活性化し、これらの活性化および増殖T細胞を患者に再注入することが望ましいことがある。所望であれば、このプロセスを数週間毎に複数回行ってもよい。
【０１７４】
投与様式としては例えば静脈内(i.v.)注射または注入を挙げることができる。本明細書に記載の組成物を患者に経動脈投与、腫瘍内投与、結節内投与、または髄内投与することができる。いくつかの態様では、T細胞の組成物を腫瘍またはリンパ節に直接注射することができる。一態様では、本明細書に記載の組成物を体腔内または体液(例えば腹水(ascites)、胸水、腹水(peritoneal fluid)、もしくは脳脊髄液)中に投与する。
【０１７５】
非経口剤形
本明細書に記載の剤または遺伝子操作細胞の非経口剤形を、硬膜外、脳内、脳室内、皮膚上、経鼻投与、動脈内、関節内、心臓内、空洞内注射、皮内、病変内、筋肉内、眼内、骨内注入、腹腔内、くも膜下腔内、子宮内、膣内投与、静脈内、膀胱内、硝子体内、皮下、経皮、血管周囲投与、または経粘膜を含むがそれに限定されない様々な経路で、対象に投与することができる。非経口剤形の投与が混入物に対する患者の自然防御を通常はバイパスすることから、非経口剤形は無菌であるか、または患者への投与前に滅菌可能であることが好ましい。非経口剤形の例としては、注射向けに用意された溶液剤、薬学的に許容される注射用媒体に溶解または懸濁するように用意された乾燥製剤、注射向けに用意された懸濁液剤、制御放出非経口剤形、および乳剤が挙げられるがそれに限定されない。
【０１７６】
本開示の非経口剤形を得るために使用することができる好適な媒体は、当業者に周知である。例としては滅菌水; 注射用水USP; 食塩水; グルコース溶液; 塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、ブドウ糖注射液、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸加リンガー注射液などであるがそれに限定されない水性媒体; エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどであるがそれに限定されない水混和性媒体; ならびにトウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなどであるがそれに限定されない非水性媒体が挙げられるがそれに限定されない。
【０１７７】
有効性
例えば本明細書に記載の状態(例えば黒色腫)の処置における、または本明細書に記載の応答(例えば腫瘍サイズの減少)を誘導するための、本明細書に記載のCBMシグナロソーム複合体の活性を阻害する剤、または遺伝子操作細胞の有効性を、熟練した臨床医が確定することができる。しかし、ある処置が、本明細書において使用される用語「有効な処置」と見なされるのは、本明細書に記載の方法による処置後に、本明細書に記載の状態の1つまたは複数の徴候または症状が好ましく変化するか、他の臨床的に許容される症状が改善し、さらには寛解するか、あるいは所望の応答が例えば少なくとも10%誘導される場合である。例えば、有効性を、本明細書に記載の方法に従って処置される状態のマーカー、指標、症状(例えば頭痛もしくは骨痛)、および/または発生率、あるいは適切な任意の他の測定可能なパラメータを測定することで評価することができる。本明細書に記載の方法による処置によって、状態のマーカーまたは症状のレベルが例えば少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%、またはそれ以上減少しうる。
【０１７８】
また、有効性を、個人が悪化しなくなること(すなわち疾患の進行が停止すること)により測定してもよく、これは入院加療、または医学的介入の必要性により評価される。これらの指標を測定する方法は当業者に公知であり、かつ/または本明細書に記載されている。
【０１７９】
本出願全体を通じて引用される、参考文献、発行特許、特許出願公開、および同時係属中の特許出願を含む、すべての特許および他の刊行物は、例えば本明細書に記載の技術との関連で使用されることがある、これらの刊行物に記載の方法論を記述および開示するために、参照により本明細書に明確に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前の該刊行物の開示に関してのみ示される。この点において、何物も、本発明者らが当該の開示に先行する資格が先行発明または他の理由のために与えられないことの承認として解釈されるべきではない。これらの文献の日付に関するすべての記載、またはこれらの文献の内容に関するすべての表現は、本出願人らが入手可能な情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確さに関する承認を構成するものではない。
【０１８０】
本開示の態様の記載は、網羅的であるようには、または開示された正確な形態に本開示を限定するようには意図されていない。本開示の具体的な態様または本開示の実例が例示目的で本明細書に記載されているが、当業者が認識するように、様々な同等の修正が本開示の範囲内で可能である。例えば、方法工程または機能が所与の順序で提示されているが、代替的な態様では機能を異なる順序で行ってもよく、機能を実質的に同時に行ってもよい。本明細書に示される本開示の教示を適宜、他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載の様々な態様を組み合わせることでさらなる態様を実現することができる。本開示の局面を、必要であれば上記参考文献および出願の組成物、機能、および概念を使用するように修正することで、本開示のなおさらなる態様を実現することができる。さらに、生物学的機能の同等性を考慮することにより、生物学的または化学的作用の種類および量に影響を与えることなく、何らかの変化をタンパク質構造に加えることができる。詳細な説明に照らして、これらのおよび他の変更を本開示に加えることができる。すべてのこれらの修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるように意図されている。
【０１８１】
前述のいずれかの態様の特定の要素を、組み合わせるか、または他の態様における要素に置き換えることができる。さらに、本開示の特定の態様に関連する利点をこれらの態様に関して記載してきたが、他の態様もこれらの利点を示しうるものであり、本開示の範囲内にあるすべての態様が必ずしもこれらの利点を示すわけではない。
【０１８２】
本明細書に記載の技術を以下の実施例でさらに説明するが、以下の実施例は本技術をさらに限定するものと決して解釈されるべきではない。
【０１８３】
本発明を、以下のいずれかの番号付き項目において規定することができる。
1) がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象にCARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の活性を阻害する剤を投与する段階を含む、方法。
2) がんが、がん腫、黒色腫、肉腫、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫からなる群より選択される、項目1の方法。
3) がんが、黒色腫または結腸がんである、項目1の方法。
4) がんが、固形腫瘍である、項目1〜3のいずれかの方法。
5) 固形腫瘍が、副腎皮質腫瘍、胞状軟部肉腫、軟骨肉腫、結腸直腸がん、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、卵黄嚢腫瘍、類上皮血管内皮腫、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍(固形腫瘍)、骨・軟部組織巨細胞腫、肝芽腫、肝細胞がん、黒色腫、腎腫、神経芽腫、非横紋筋肉腫軟部肉腫(NRSTS)、骨肉腫、傍脊椎肉腫、腎細胞がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、またはウィルムス腫瘍からなる群より選択される、項目4の方法。
6) がんが転移性である、項目1〜5のいずれかの方法。
7) 対象にチェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含む、項目1の方法。
8) チェックポイント阻害剤が、小分子、阻害性核酸、阻害性ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合ドメイン、または抗体試薬である、項目7の方法。
9) 抗体もしくはその抗原結合ドメイン、または抗体試薬が、免疫チェックポイントポリペプチドに結合してその活性を阻害する、項目8の方法。
10) 免疫チェックポイントポリペプチドが、PD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、またはTIGITからなる群より選択される、項目9の方法。
11) 免疫チェックポイントポリペプチドが、PD-1、PD-L1、またはPD-L2である、項目9の方法。
12) チェックポイント阻害剤が、PD-1、PD-L1、またはPD-L2を阻害する、項目7〜11のいずれかの方法。
13) PD-1を阻害するチェックポイント阻害剤がペンブロリズマブ(Keytruda)、ニボルマブ、AUNP-12、またはピディリズマブからなる群より選択される、項目12の方法。
14) PD-L1を阻害するチェックポイント阻害剤が、アテゾリズマブ、MPDL3280A、アベルマブ、またはデュルバルマブからなる群より選択される、項目12の方法。
15) 剤により阻害される活性が、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の機能である、項目1の方法。
16) 剤により阻害される活性が、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の形成である、項目1の方法。
17) 剤により阻害される活性が、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の少なくとも1つの成分の機能である、項目1の方法。
18) 剤により阻害される活性が、CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の少なくとも1つの成分の発現レベルである、項目1の方法。
19) CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の活性が、制御性T細胞中で阻害される、項目1の方法。
20) 制御性T細胞が、腫瘍浸潤性制御性T細胞である、項目1の方法。
21) 剤が、小分子、阻害性核酸、抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体試薬、または阻害性ポリペプチドからなる群より選択される、項目1の方法。
22) 小分子が、MALT1パラカスパーゼ活性の小分子阻害剤である、項目21の方法。
23) MALT1パラカスパーゼ活性の小分子阻害剤が、MI-2もしくはその類似体、またはピラゾロピリミジン誘導体、フェノチアジン誘導体、またはテトラペプチドZ-VRPR-FMK(SEQ ID NO: 7)からなる群より選択される、項目22の方法。
24) フェノチアジン誘導体が、メパジン、チオリダジン、またはプロマジンである、項目23の方法。
25) 投与が全身投与である、項目1の方法。
26) 投与が局所投与である、項目1の方法。
27) 対象に少なくとも1つの抗がん療法を投与する段階をさらに含む、項目1記載の方法。
28) 抗がん療法が、化学療法、放射線療法、化学放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、または幹細胞療法からなる群より選択される、項目27の方法。
29) 免疫療法が、腫瘍ワクチン、キメラ抗原受容体T細胞(CAR T細胞)、養子T細胞療法、養子ナチュラルキラー(NK)細胞療法、または養子NK T細胞療法である、項目28の方法。
30) がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象にMI-2阻害剤およびPD-1阻害剤を投与する段階を含む、方法。
31) がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象にメパジンおよびPD-1阻害剤を投与する段階を含む、方法。
32) 減少したCARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム活性を有するように遺伝子操作された細胞。
33) CARMA1、Bcl10、またはMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の機能を阻害するように遺伝子操作されている、項目32の細胞。
34) CARMA1、Bcl10、またはMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子産物の機能を阻害するように遺伝子操作されている、項目32の細胞。
35) CARMA1、Bcl10、またはMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを減少させるように遺伝子操作されている、項目32の細胞。
36) CARMA1、Bcl10、またはMALT1からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを減少させるように遺伝子操作されている、項目32の細胞。
37) 免疫細胞である、項目32の細胞。
38) 免疫細胞がT細胞である、項目37の細胞。
39) T細胞が、制御性T細胞である、項目38の細胞。
40) がんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象に項目32〜39のいずれかの細胞を投与する段階を含む、方法。
41) 対象にチェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに含む、項目40の方法。
42) 対象に抗がん療法を投与する段階をさらに含む、項目40の方法。
43) チェックポイント阻害剤療法に耐性のあるがんを処置する方法であって、該処置を必要とする対象に
a. CARMA1-Bcl10-MALT1シグナロソーム複合体の活性を阻害する剤、または項目32〜39のいずれかの細胞を投与する段階; および
b. 第2の治療法を投与する段階
を含む、方法。
44) チェックポイント阻害剤療法が、抗PD-L1療法、抗PD-L2療法、抗PD-1療法、抗CTLA-4療法、抗TIM-3療法、抗LAG-3療法、抗VISTA療法、または抗TIGIT療法からなる群より選択される、項目43の方法。
45) チェックポイント阻害剤療法が、抗PD-1療法である、項目43の方法。
46) 第2の治療法が、チェックポイント阻害剤または抗がん療法である、項目43の方法。
【実施例】
【０１８４】
実施例1
先行研究は、腫瘍浸潤性Tregを同族抗原に局所曝露することが、それらの腫瘍促進性免疫抑制機能を維持するために必要であることを示した4。したがって、T細胞受容体(TCR)依存性シグナル伝達経路が腫瘍反応性Tregの機能を無効にするための治療標的となりうるか否かを調べた。足場タンパク質CARMA1/Card11は、CARMA1/Bcl10/MALT1(CBM)多タンパク質複合体の一部であり、この複合体は、T細胞中でTCR依存性PKCθ活性に応答して集合し、AP-1、mTOR、および古典的NF-κB経路の活性化、ならびにmRNAの安定化を含むいくつかの機能を促進するシグナル伝達プラットフォームの役割を果たす5。CARMA1、Bcl10、またはMALT1の構成的遺伝子欠失は胸腺Treg発生を抑止するが6-9、成熟Tregの機能におけるそれらの役割は不明である。
【０１８５】
Foxp3YFP-CreマウスとCARMA1fl/flマウスとを交雑させること(以下「FCre x C1fl/fl」と呼ぶ)により生じる成熟Treg中でのCARMA1の条件的欠失により、リンパ節(LN)由来のFoxp3+ CD4+ Treg中のCARMA1タンパク質は、CARMA1遺伝子の一方の対立遺伝子を欠くFCre x C1fl/+マウス、および両方の対立遺伝子を欠くFCre x C1fl/fマウスにおいて比例的に減少した(図1A)。FCre x C1fl/flマウスは、出生17〜19日後から成長障害を起こし、大部分が4週齢より前に死んだが、FCre x C1fl/+マウスはそうならなかった(図1Bおよび図1C)。FCre x C1fl/fl動物は、脾腫、リンパ節腫脹、および炎症性サイトカインを産生するエフェクターメモリーT細胞の増殖を特徴とする、TH1優位多臓器リンパ増殖性疾患を発生させたが、FCre x C1fl/+マウスは対照マウスと相似し(図1D〜図1Gおよび図5A)、少なくとも9ヶ月齢までは健康なままであった(データは示さず)。したがって、CARMA1はTregが免疫恒常性を維持するために必須であるが、その発現減少は十分に許容される。
【０１８６】
CARMA1の非存在下で胸腺Tregの発生が不可能になることは、主に古典的NF-κB経路の活性化が無効になることが原因であり、NF-κB活性化因子IKK2/βの構成的活性型であるIKK2caの発現を通じて回復可能である11。最近、末梢Treg機能におけるNF-κBタンパク質c-Relおよびp65/RelAの重要な役割が証明された12-14。これは、NF-κBの機能不全の主な原因がTreg中でのCARMA1欠失の効果でありうることを示唆している。しかし、Treg中でのIKK2ca発現は、FCre x C1fl/flマウスの寿命を延長せず、Teffサイトカイン発現を減少させなかった(図7A〜図7B)。このことは、c-RelおよびRelAの活性化は明らかに必須であるが14,15、さらなるCBM複合体エフェクター機能も同様に末梢Treg機能を維持する上で決定的に重要であることを示唆している。
【０１８７】
CD4+ T細胞の中でのTregの全体的出現頻度はCARMA1発現によって変動しなかったが、活性化CD44hi CD62LnegまたはエフェクターTreg(「eTreg」)の比率はCARMA1の非存在下で大きく減少した(図1H)。同時に、CARMA1欠損Tregは、エクスビボ活性化時に、Foxp3発現を保持しながら、IFNγをほぼ均一に分泌し、IL-4、IL-17、およびTNFをより低い出現頻度で分泌した(図1H)。同時に、CARMA1欠損Tregは、エクスビボ刺激時に、Foxp3発現を保持しながら、IFNγをほぼ均一に分泌し、IL-4、IL-17、およびTNFをより低い出現頻度で分泌した(図1I)。NF-κBの回復により、CARMA1欠損TregによるIFNγの発現は減少せず、TNFの過剰分泌が防止されたのみであった(図7C〜図7D)。意外にも、FCre x C1fl/flマウス中で、ほぼすべてのTregはTH1サイトカインIFNγを分泌はしたが、はるかに少なく、大部分のeTregはTH1細胞系統を確定する転写因子T-betを発現した。これらのうち多くがRORγtを同時発現した一方で、GATA-3を同時発現したものはほとんどなかった(図1Gおよび図7E〜図7F)。したがって、CARMAの完全欠失はTreg中でのサイトカイン発現の顕著な制御不全を引き起こしたが、部分欠失ではそうならなかった。この制御不全は、IFNγの場合、その制御因子T-betの発現とは無関係であり、これらの動物における炎症性疾患の発病の原因となりうる。実際、機能的Tregを欠くscurfyマウスよりもFCre x C1fl/flマウスの方が速やかに死んだが、IFNγが中和された際の両者の寿命が同様であったことが認められた(図14A)。したがって、少なくとも炎症条件下では、CARMA1欠損Tregは、IFNγを分泌し、それにより炎症性疾患において免疫調節細胞型を病原性細胞型に変換するように誘導されうる。
【０１８８】
ヘテロ接合雌FCre/+ x C1fl/flマウスでは、ランダムX染色体不活性化により、半数のTregのみでCreが発現されCARMA1が欠失する。これは、例えばCreリコンビナーゼに融合した黄色蛍光タンパク質(YFP)の発現に基づいて同定可能である(図8A)。これらの動物においてリンパ増殖性疾患は観察されなかった。これは、残存CARMA1非欠損(YFP-)Tregが免疫恒常性を維持したこと、および、健康マウスにおいては完全CARMA1欠損Tregでさえも炎症を開始させないことを示している(図1Iおよび図1M; 図8B〜図8C)。したがって、これらの細胞はエクスビボ活性化時にIFNγを分泌しなかった(図1I)。しかし、CARMA1欠損Tregがおそらくニッチ空間をめぐってCARMA1非欠損Tregと競合するこの状況において、CARMA1の一方または両方の対立遺伝子を欠くCD44hi eTregの出現頻度の比例的減少が特に生じたことが観察された(図1M)。また、残存YFP+ CD44hi eTregは、Foxp3の発現量およびTregエフェクター分化マーカーの発現量が少なくなり、増殖も少なくなったが、アポトーシス促進タンパク質BIMの発現量は多くなった(図1nおよび図5b(図14A; 図8D〜図8H))。CARMA-1欠損Tregのインビトロ抑制機能は減少したが、消滅したわけではなく(図9A〜図9D)、一方、Rag欠損宿主に養子移入する際に、Tregは生き残ることができず、リンパ球減少症により促進される同時養子移入Teffの増殖を抑制しなかった(図8C)。しかし、Foxp3の先行発現がYFPの不可逆的な高レベル発現により記録されるR26YFPマウス中で検出可能なように、CARMA1の欠如はFoxp3neg exTregの形成を増加させなかった(図14E; 図9D)。網羅的遺伝子発現解析に基づけば、CARMA1欠損eTregはWT cTregと異なるのと同程度にWT eTregとも異なっており、一方、CARMA1欠損cTregはWT cTregと中程度にしか異なっていなかった(図14C)。後者では、96個の遺伝子がWT eTregに対して差次的に発現され、これと比べて、CARMA1欠損eTreg中では、344個の遺伝子がWT eTregに対して上方制御または下方制御された(図14D; 図10A)。WT cTregとWT eTregとの差に基づいて、本発明者らは「eTregシグネチャー」を確定した。これは既に報告されたこれら細胞型の間の差と大きく重複したものである(図5B)12,15。これら689個の遺伝子に基づけば、eTreg遺伝子発現プログラムにおいて、ヘミ接合性CARMA1欠失は中程度の影響しか示さず、一方、ホモ接合性欠失は大きな変化を特異的に誘導した(図14Eおよび図10C)。驚くべきことに、これらの変化は、NF-κBタンパク質c-RelまたはRelA/p65のTreg特異的欠失によりeTreg中で誘導された変化とは部分的な重複しか示さなかった(図10D)15。このことはTreg恒常性における他のCBM複合体エフェクター経路の重要性を強調するものである。したがって、CARMA1発現の損失および既にある減少は、非炎症条件下で、Tregエフェクターの分化および生存を損なうが、病原性になるかまたはexTregに変換されるようにTregを誘導するものではない。しかし、FCre x C1fl/flマウス中でのTreg抑制機能の全般的損失により開始される初期炎症では、CARMA1欠損TregはIFNγを分泌し、これにより炎症性疾患がさらに促進される。
【０１８９】
特定の理論に拘束されることは望ましくないが、CARMA1の欠如がcTregの維持よりもeTregの維持をいっそう損なうことから、また、腫瘍にeTregが集合することから、CARMA1欠失が腫瘍内Tregの数を優先的に減少させうると仮定された。CARMA1欠損TregによるeTregの低形成、および炎症状況でのIFNγ分泌を考慮して(図1H〜図1I)、これらのマウスの悪性腫瘍増殖に対する応答を調べた。実際、低免疫原性BRAFV600E x PTENnull黒色腫であるD4M.3A腫瘍16を若年雌ヘテロ接合FCre/+ x C1fl/flマウスに皮下移植することで生じた条件により、Treg維持に対するCARMA1欠損の効果が増幅された。というのも、eTregの出現頻度だけでなく総YFP+ Tregの出現頻度もtdLN中でCARMA1発現減少の関数として減少し、これに伴ってFoxp3発現がいっそう顕著に減少したからである(図2A〜図2B)。興味深いことに、D4M.3A黒色腫およびMC38結腸がんの増殖の減速が、Tregの半数がCARMA1遺伝子の一方または両方の対立遺伝子を欠くマウスにおいて観察された(図2Cおよび図14F)。わずか半数のTregの単なる機能損失が腫瘍耐性の損失を引き起こすとは予想されていなかったことから11、これは予想外であった。これは活性Tregが媒介する抗腫瘍活性を示唆するものであった。実際、エクスビボ再刺激がなくても、完全CARMA1欠損または単なる部分CARMA1欠損のTregの大部分が、TNFおよびIFNγの両方を分泌し、一方、これらのエフェクターサイトカインは、これらの条件下で腫瘍浸潤性CD4+およびCD8+従来型T細胞中で検出不能であった(図2D〜図2E)。重要なことに、サイトカイン分泌はtdLN中で観察されなかった(図2F)。このことは、CARMA1欠損eTregの形成が無腫瘍マウスのLN中よりもtdLN中でさらに強力に損なわれたが(図1M)、該eTregによるエフェクターサイトカインの分泌が腫瘍環境に限定されることを示している。部分CARMA1欠損Tregおよび完全CARMA1欠損Tregの両方において、腫瘍組織中でのIFNγ発現は下方制御と相関したが、Foxp3の損失は相関しなかった(図14G)。注目すべきことに、Treg中でのNrp-1のヘテロ接合性損失を伴うマウスについて最近記述された、IFNγ産生TregによるWT Tregの不安定化18は、この場合では生じなかった。というのも、同じ腫瘍中のYFP-Creneg CARMA1非欠損Treg中で発現の増加が検出不能であったからである(図示せず)。Treg媒介抗腫瘍免疫におけるIFNγの重要な役割と一致して、IFNγの中和はFCre/+ x C1fl/flマウス中で腫瘍増殖を完全に回復させた(図2G)。しかし、この抗腫瘍効果も、Treg不安定化後にNK細胞を含む他の細胞源が産生したIFNγにより生じた可能性がある。Treg産生IFNγの役割を具体的に試験するために、FCre/+ x C1f/+マウスから得られたCARMA1発現の減少を伴うTregを腫瘍担持C57BL/6またはIfng-/-マウスに養子移入した。両種類の宿主中で、腫瘍増殖は同様に阻止されたが、IFNγが中和された際にはそうならなかった。このことは、観察された抗腫瘍効果を媒介するためにTreg由来IFNγが必要かつ十分であることを示している(図2H; 図11A〜図11E)。したがって、部分または完全CARMA1欠損Tregは、健康マウスにおいては炎症性疾患を引き起こさないが、腫瘍組織中で不安定化されてIFNγを分泌し、これにより腫瘍増殖を減速させる。
【０１９０】
IKK2caの発現は、tdLN中では総TregおよびeTregの出現頻度を回復させたが、腫瘍組織中では回復させなかった(図12A)。また、IKK2caはFoxp3発現を回復させず、腫瘍浸潤性CARMA1欠損TregによるTNFおよびIFNγの同時発現を部分的にしか減少させず、したがって該Tregの抗腫瘍活性を妨げなかった(図12B〜図12D)。このこともまた、腫瘍反応性Tregを安定化する上で、NF-κBタンパク質の活性化15に加えて、1つまたはいくつかのCBM複合体エフェクター機能が重要であることを強調するものである。
【０１９１】
腫瘍組織に既に浸潤しているTregをCARMA1欠失が不安定化することができたか否かを調べるために、Foxp3GFP-CreERT2 x CARMA1fl/fl(「FCreERT2 x C1fl/fl」)マウスを生じさせ、タモキシフェンで処置することで、移植腫瘍が既に定着した場合のGFP-CreERT2融合タンパク質の核内リコンビナーゼ活性を活性化した(図3A)。続いてさらなるTregをtdLNから動員することを防ぐために、記載のように4、リンパ組織からのリンパ球放出をS1P-1機能的アンタゴニストFTY720での処置を通じて同時に遮断した。処置から2日以内に、腫瘍増殖の減速が明らかになった(図3C)。CARMA1欠損Tregによる、同様に速やかであるがわずかに顕著さが低い効果、ならびにTNFおよびIFNγ分泌の増加が、雌ヘテロ接合FCreERT2/+ x C1fl/flマウスにおけるわずか半数のTreg中での欠失により生じた(図3D; 図14I)。しかし、タモキシフェン処置から10日後の健康な組織中では炎症性プロセスは観察されなかった。このことは、全身免疫寛容がこの時間枠にわたって維持されたことを示している(データは示さず)。Treg中でのCARMA1の一方または両方の対立遺伝子の構成的欠失時にやはり観察されたように、腫瘍増殖の減速および腫瘍内Tregの不安定化に伴って、MHCクラスIIタンパク質のマクロファージ細胞表面発現が急速かつ顕著に誘導された(図3E; 図13A)。本発明者らはまた、腫瘍細胞中でのMHCクラスIの発現を観察した。この発現は、腫瘍細胞をCTL媒介溶解に対して感作させるものと予想された(図3F)。これらの変化は、IFNγ分泌性Tregが広範な腫瘍炎症を引き起こすことを示したが、腫瘍細胞上でのIFNγ・制御性T細胞同時阻害性リガンドPD-L1の上方制御は、適応免疫寛容の同時誘導を示唆しており3、おそらくこれにより、さらなる抗腫瘍免疫エフェクター機能の動員を通じて腫瘍炎症を促進する腫瘍増殖調節の向上が制限された(図3F)。
【０１９２】
腫瘍細胞によるPD-L1の発現上昇を考慮して、PD-1経路の抗体媒介性遮断が、IFNγを分泌するTregの抗腫瘍効果と相乗作用しうると仮定された。実際、Treg中でのCARMA1欠失時にαPD-1療法が開始されたとき、いずれかの処置のみの場合よりもはるかに速やかで一貫したD4M.3A黒色腫の調節が観察された(図4A)。このことは、Treg中でCBMシグナロソームを標的にすることが、がん患者においてチェックポイント遮断療法の効力を増強するために非常に有効なアプローチとなりうることを示している。
【０１９３】
現在、足場タンパク質CARMA1の薬理学的阻害剤は利用可能ではないが、MALT1パラカスパーゼ活性阻害剤はCBM複合体依存性エフェクター経路の大部分を減弱させると予想される(図4B)。実際、Tregを欠くCARMA1欠損マウスと同様に、パラカスパーゼ活性を欠く変異MALT1タンパク質を発現するマウス(完全な薬理学的阻害を再現する)は制御性T細胞の発生不全を示した19-21。したがって、アロステリックMALT1阻害剤メパジン22および触媒部位結合剤MI-223を、固形腫瘍に対する活性の可能性について試験したところ、Treg中でのCARMA1欠失後に観察されたように(図4C)、CD8+ T細胞が除去された場合であっても(図13B)、いずれも同様に黒色腫増殖を減速させたことがわかった。また、全身性MALT1阻害がTreg以外の細胞を標的にし、黒色腫細胞に対する直接的効果を示しうることから24、リンパ球を欠くRag1欠損マウスの処置を試験したが、これらの動物において腫瘍増殖に対する効果は観察されなかった(図4D)。また、MALT1阻害はTreg中でのCARMA1欠失の抗腫瘍効果に対する相加作用を示さなかった。このことは、その抗腫瘍活性がTreg中でのCBM複合体機能の妨害以外の効果によるものではないことを示している(図13C)。これらの結果、およびMALT1阻害が従来型CD4+およびCD8+エフェクターT細胞のエフェクター機能を減弱させるとしても増強することはないと予想されるという事実を考慮すれば25、腫瘍増殖に対するMALT1阻害の影響が、Tregに対する効果を通じて媒介される可能性が最も高いと結論づけられる。
【０１９４】
実際、Treg中でCARMA1欠失時に観察されたことと同様に、メパジンは腫瘍浸潤性TregによるTNF発現およびIFNγ発現の速やかな誘導を引き起こし(図14K)、一方、Tregのインビトロ処置は、Foxp3およびGITRのわずかな減少しか開始させず、エフェクターサイトカイン発現は開始させなかった(図13Dおよび図示せず)。また、メパジンは腫瘍細胞上でのMHC I発現およびPD-L1発現の上方制御を引き起こした(図4E)。さらに、全腫瘍組織トランスクリプトーム解析は、腫瘍組織中での炎症増強および適応免疫耐性の両方を示す、広範なIFN-γ制御遺伝子の誘導を明らかにした(図4G)。しかし、CARMA1欠失とは対照的に、MALT1阻害はTregの出現頻度を減少させず、腫瘍組織中のTreg関連遺伝子の発現を変化させなかった(図14K; 図13E)。にもかかわらず、メパジン処置は、免疫細胞浸潤を全般的に増強したことに加えて、腫瘍組織中でCTL細胞およびNK細胞の出現頻度を高めた(図13F〜図13J)。
【０１９５】
腫瘍変異負荷はがん患者におけるチェックポイント遮断に対する応答を予想するものであり26,27、変異負荷が低い腫瘍は、依然として、一部の種類のがんおよび患者の部分群に対するこの形態の免疫療法の成功を制限する大きな困難である。したがって、エクソーム解析に基づけばC57BL/6J基準エクソームと比べて非常に小さな変異負荷を保有するD4M.3A黒色腫は、雄宿主においてαPD-1単剤療法に対して完全に耐性があり(図4H)、これは、雄D4M.3A腫瘍がおそらくはY抗原発現に基づいて部分的応答を示した雌宿主とは対照的である(図4A)。しかし、同時MALT1阻害は、αPD-1処置と相乗作用し、雄宿主であっても腫瘍増殖を停止させた(図4H)。αPD-1処置はTregによるIFNγ発現をさらに増加させなかった。このことは、TregによるPD-1発現がその炎症促進性機能を制限しなかったこと、および、PD-1遮断が主にPD-1発現エフェクター細胞に作用したことを示す(図13K)。さらに、ニワトリ卵白由来SIINFEKL(SEQ ID NO: 8)エピトープを代替の変異性新生抗原として発現させることでD4M.3A腫瘍に対する一定程度の免疫原性が導入された際に、αPD-1単剤療法に対する顕著な初期応答が観察されたが、腫瘍の40%は再発した。しかし、αPD-1 Abとメパジンとの併用は、いっそう速やかな腫瘍の拒絶を生じさせ、再発頻度を減少させた(図4I)。最後に、抗腫瘍応答に対するMALT1阻害の効果が他のがんの種類にも及ぶか否かを調べるために、結腸がん由来上皮MC38腫瘍が移植された動物を処置した。αPD-1単剤療法は後期腫瘍に対して中程度の影響しか示さなかったが、メパジンとの併用は、動物6匹中4匹において再発なしに顕著な腫瘍調節および腫瘍拒絶を可能にした(図4J)。したがって、全身MALT1阻害は、腫瘍環境の炎症を引き起こし、低免疫原性腫瘍をαPD-1療法に応答性のあるようにする一方で、免疫原性腫瘍の応答を強力に増強し、また、臨床的チェックポイント遮断療法に共通の問題であることが明らかになった再発28の頻度を最小化する。
【０１９６】
理論に拘束されることは望ましくないが、MALT1の薬理学的阻害を通じた、または他の手段による、CBM複合体機能の妨害が、局所的に不安定化された自己反応性Tregにより媒介される腫瘍内Th1自己免疫反応を誘発するために、したがって全身自己免疫毒性を誘導することなく同時PD-1標的化免疫チェックポイント遮断または他の形態の免疫療法に応答するがん患者の割合を増加させるために、有用な治療戦略でありうることが提示される。
【０１９７】
実施例2
方法および材料
マウス
Foxp3YFP-Cre(Ref. 1)、Foxp3GFP-Cre-ERT2(Ref. 2)、Rosa26YFP(Ref. 4)、Ifng KO(Ref. 5)、およびC57BL/6/JマウスをJackson laboratoriesから購入した。Ramnik J. Xavier、James J. Moon(MGH)がそれぞれCARMA1fl/flマウス(Ref.6)、Rag1 KOマウスを提供した。動物をMassachusetts General Hospital(MGH)における特定の無病原体施設に収容し、すべての動物試験はMGH Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)により承認され、IACUCが施行したガイドラインおよび規則に従って行われた。生存試験では、瀕死状態により指示が出される安楽死の際のマウスの年齢をカプラン・マイヤープロットで記録した。
【０１９８】
腫瘍細胞株
BRAFV600E x PTENnull黒色腫細胞株D4M.3A7をDavid. E. Fisherが提供した。いくつかの実験では、例えばフローサイトメトリーによる可視化を容易にするために、記載のように8、D4M.3Aにレンチウイルスを形質導入することで青色蛍光ヒストンH2B-Cerulean融合タンパク質を発現した(D4M.3A-H2B-Cerulean)。ニワトリ卵白アルブミン由来H-2Kb制限SIINFEKLペプチド(SEQ ID NO: 8)を発現するD4M.3A-SIINFEKL(「SIINFEKL」はSEQ ID NO: 8として開示される)を生じさせるために、D4M.3A細胞に、ヒストンH2BとCeruleanとの融合物を発現するように遺伝子操作されたVSV-G偽型pHAGE-EF1αレンチウイルスベクターを形質導入した。ヒストンH2BとCeruleanは、抗原提示のためのプロセシングを容易にするために、卵白アルブミンタンパク質中で2個のSIINFEKL(SEQ ID NO: 8)ミニ遺伝子およびその天然フランキング配列により分離されている。結腸腺がん細胞株MC389をAndrew D. Lusterから得た。すべての腫瘍株を10% FCS入りのDMEM中で増殖させ、指数増殖期の際に実験に使用した。
【０１９９】
腫瘍増殖試験および処置
106個のD4M.3A、D4M.3A-H2B-Cerulean、D4M.3A-SIINFEKL、またはMC38腫瘍細胞のCa2+を含まないHBSS 100μL中溶液をマウスの側腹部に皮下注射した。可能である場合は常に、動物を処置群にランダム化した。腫瘍量を処置開始から2〜3日毎に測定し、V = (長さ x 幅2)/2として計算した。
【０２００】
オリーブ油およびエタノールの9:1混合物100μl中のタモキシフェン1mg/マウスの溶液を、指示通り毎日腹腔内注射した。H2O 150μl中のFTY720 1mg/kg体重の溶液を、実験終了まで隔日で腹腔内注射した。マウス当たり500μgのαIFNγ抗体(クローンXMG1.2)を、出生後14日目または腫瘍移植日に、その後は実験終了まで隔日で腹腔内注射した。aPD1(クローン29F.1A12)またはラットIgG2aアイソタイプ対照(クローン2A3)200μgのPBS 100μl溶液を隔日で表示された時点にて3回腹腔内注射した。αCD8α(クローンYTS169.4)150μgのPBS 100μl溶液を、表示された時点から実験終了まで隔日で腹腔内注射した。別途指示がない限り、5% DMSO入り精製H2O中のメパジン16mg/kg体重の溶液、または5% DMSO入り精製H2O中のMI-2 20mg/kg体重の溶液を、表示された時点から実験終了まで毎日腹腔内注射した。養子Treg細胞移入試験では、CD4+ YFP+ TregをFoxp3YFP-Cre x CARMA1fl/+またはCARMA1+/+マウスのLNおよび脾臓から磁気活性化細胞選別(Miltenyi)を通じて純度95%超まで精製し、腫瘍移植の前日に細胞106個/マウスを尾静脈に静脈内注射した。
【０２０１】
単細胞懸濁液の調製、抗体染色、およびフローサイトメトリー
顎下静脈穿刺を通じて集められたヘパリン添加末梢血を、ACK赤血球溶解緩衝液で処理した。LNおよび脾臓を40μm細胞濾過器に通した後、赤血球溶解を行った(脾臓のみ)。腫瘍を小さな断片に刻み、攪拌下、1.5mg/mlコラゲナーゼIVおよび50U/ml DNAse Iによって37℃で30分間処理した。
【０２０２】
Biolegendからの以下の抗体によって細胞表面タンパク質を4℃で20分間染色した: α-CD11b(M1/70)、-CD120b/TNFR2(ポリクローナルアルメニアンハムスターIgG)、-CD274/PD-L1(10F.9G2)、-CD357/GITR(DTA-1)、-CD4(GK1.5)、-CD45(30-F11)、-CD62L(MEL-14)、-CD73(TY/11.8)、-CD8α(53-6.7)、-CD90.2(30-H12)、-F4/80(BM8)、-H-2Kb(AF6-88.5)、-I-A/I-E(M5/114.15.2)、および-CD44(IM7)。
【０２０３】
透過処理、ならびに抗CD152/CTLA-4抗体(UC10-4B9)、抗TNF抗体(MP6-XT22)、抗IL-4抗体(11B11)、抗IL-17A抗体(TC11-18H10.1)、抗IFNγ抗体(XMG1.2)、抗Ki67抗体(16A8)(BD Biosciences)、抗BIM抗体(C34C5)、抗CARD11/CARMA1抗体(1D12)(Cell Signaling)、抗Foxp3抗体(FJK-16s、eBioscience)、および抗GFP抗体(ウサギポリクローナル、Invitrogen)を使用する固定化(マウス制御性T細胞染色キット; eBioscience)の後に、細胞内タンパク質および核内タンパク質を室温で60分間染色した。ポリクローナルヤギα-ウサギIg(H+L)二次抗体(Life Technologies)を使用して一次α-CARMA1染色を明らかにした。
【０２０４】
抗体染色の前に、Fc受容体をTruStain fcX(Biolegend)によって4℃で20分間ブロッキングし、続いて死細胞を固定可能生死判定用バイオレット色素Zombie Red(Biolegend)によって室温で15分間染色した。細胞をLSR II、LSRFortessa、またはLSRFortessa X-20フローサイトメーター(BD Biosciences)上で解析し、データをFlowJoソフトウェアバージョン9.9.5で解析した。
【０２０５】
インサイチューおよびエクスビボ刺激サイトカイン分泌の解析
インサイチューサイトカイン分泌を検出するために、完全溶解ブレフェルジンA 500μgのPBS 250μl溶液をマウスにゆっくりと静脈内注射し、6時間後に屠殺し、細胞内サイトカイン染色を行った。
【０２０６】
エクスビボ再刺激時のT細胞中でのサイトカイン分泌を検出するために、腫瘍およびリンパ節由来の単細胞懸濁液を、10% FCS入りのRPMI 1640に再懸濁させ、1μg/mL Golgiplugおよびモネンシン(いずれもBiolegendから)の存在下でα-CD3(クローン145-2C11)/α-CD28(クローン37.51)抗体コーティング(抗体10μg/mlで終夜)組織培養プレートに37℃で8時間加え、細胞を細胞内サイトカイン染色のために処理した。
【０２０７】
exTregの解析
上記のように、CD4+ YFPbright細胞を最初にFoxp3YFP-Cre/+ x CARMA1fl/fl(またはfl/+もしくは+/+) x Rosa26YFPマウスのLNおよび脾臓からFACSにより精製し、Foxp3発現についてフローサイトメトリー解析のために染色した。
【０２０８】
インビボおよびインビトロ抑制
インビボ抑制試験では、Foxp3YFP-Cre/CreマウスのLNおよび脾臓由来の3x105個のMiltenyi(負の選択)濃縮CD4+およびFACS選別(純度98%超)CD45RBhigh YFP-細胞を、Foxp3YFP-Cre/+ x CARMA1fl/fl(またはfl/+もしくは+/+) x Rosa26YFPマウスのLNおよび脾臓由来の1x105個のMiltenyi(負の選択)濃縮CD4+およびFACS選別(純度98%超)YFPbright Treg細胞と共に、またはそれを伴わずに、Rag1 KOマウスの尾静脈に静脈内注射した。
【０２０９】
インビトロ抑制試験では、Foxp3YFP-Cre/CreマウスのLNおよび脾臓由来の1x104個のFACS選別(純度98%超)CD4+ YFP-従来型T細胞を、Foxp3YFP-Cre/+ x CARMA1fl/fl(またはfl/+もしくは+/+) x Rosa26STOP f/f-YFPマウスのLNおよび脾臓由来の2.5x104個のT細胞除去脾細胞ならびに異なる濃度(1:1〜1:16)のMiltenyi(負の選択)濃縮CD4+およびFACS選別(純度98%超)YFPbright Treg細胞の存在下で、5μM CellTrace Violetで標識し、250ng/mlのαCD3 mAb(145-2c11、Biolegend)で刺激した。既に記載したように11、CD4+ YFP-従来型T細胞の増殖を72時間後に読み取った。簡潔に言えば、抑制パーセントの尺度を0(Tregの非存在下での従来型T細胞の増殖)から100(増殖が完全に存在しないこと)までとした。
【０２１０】
RNA配列決定試験
試料採取
FCre/+ x C1+/+、f/+、またはf/fマウスのLNおよび脾臓由来のCD4+ T細胞を免疫磁気細胞選別(Miltenyi負の選択)により予め濃縮した後、5x103個/動物のYFP+ CD4+ CD44lo CD62L+ cTregおよび同数のYFP+ CD4+ CD44hi CD62Lneg eTregを純度99%超まで選別して、TCL緩衝液(Qiagen)および1% β-メルカプトエタノールからなる溶解緩衝液10μL中に直接採取した。次に試料を急速冷凍し、-80℃で保持した後、以下に記載のように、Smart-Seq2プロトコルの修正版に従って11-13、さらなる処理を行った。合計18個の試料を採取したが、2個の試料は技術的理由により廃棄した。
【０２１１】
逆転写
試料を氷上で2分間解凍した後、2,500rpm、4℃で1分間遠心分離し、RNA濃度を正規化した。試料当たり1.9μLのRNAをフルスカート96ウェルプレート(Eppendorf)に移動させた。次に各試料を、10μM RTプライマー
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1μL、10mM dNTP(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)1μL、およびSUPERase・In RNase阻害剤(20U/μL、Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)0.1μLと混合した。試料を、Eppendorf Mastercyclerを使用して72℃で3分間変性させた後、直ちに氷上に置いた。続いて、5倍RT緩衝液(Thermo Fisher Scientific)2μL、5Mベタイン(Sigma-Aldrich)2μL、100mM MgCl2(Sigma-Aldrich)0.9μL、10μM TSO
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1μL、SUPERase・In RNase阻害剤(20U/μL、Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)0.25μL、Maxima H Minus逆転写酵素(200U/μL、Thermo Fisher Scientific)0.1μL、およびヌクレアーゼフリー水0.75μLからなる逆転写ミックス7μLをすべてのウェルに加えた。プレートを50℃で90分間インキュベートした後、85℃で5分間熱失活することで、逆転写を行った。
【０２１２】
PCR予備増幅およびcDNA精製
10μM PCRプライマー
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0.5μL、2倍KAPA HiFi HotStart ReadyMix(KAPA Biosystems)12.5μL、およびヌクレアーゼフリー水1μLからなる、PCRミックス14μLを各ウェルに加えて、最終PCR反応量を25μLとした。98℃で3分間の初期インキュベーション、続いて16回の(98℃で15秒間、67℃で20秒間、および72℃で6分間)のサイクル、ならびに72℃で5分間の最終伸長により反応を行った。PCR産物をAgencourt AMPureXP SPRIビーズ(Beckman-Coulter)20μL(0.8倍)との混合により精製した後、室温で6分間インキュベートした。次にプレートを磁石上に6分間置いた後、上清を除去した。SPRIビーズを新たに用意した70%エタノール100μLで2回洗浄し、洗浄中はビーズの損失を回避するように注意を払った。すべての残留微量エタノールを除去してから、SPRIビーズを室温で10分間乾燥させた。次にビーズをTE緩衝液(Teknova)20μLに再懸濁させ、室温で5分間インキュベートした。プレートを磁石上に5分間置いた後、増幅cDNAを含む上清を新たな96ウェルプレートに移した。このcDNA SPRI精製手順をもう一度繰り返すことで、すべての残留プライマー二量体を除去した。増幅cDNAの濃度をSynergy H1ハイブリッドマイクロプレートリーダー(BioTek)上でQubit dsDNA高感度アッセイキット(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)を使用して測定した。いくつかの選択されたウェルのcDNAサイズ分布を高感度バイオアナライザーチップ(Agilent)上で評価したところ、予想サイズ分布は約2kbで鋭いピークを示した。
【０２１３】
配列決定ライブラリー調製
カスタムインデックスアダプター付きのNextera XT DNA試料キット(Illumina)を使用してライブラリー調製を行い、これにより、384ウェルPCRプレート(Eppendorf)中で18個のライブラリーを同時に作成することが可能になった。各ライブラリーでは、増幅cDNAを濃度範囲0.15〜0.20ng/μLに正規化した。タグメンテーション反応は、正規化cDNA 0.625μLをタグメンテーションDNA(TD)緩衝液1.25μLおよびAmpliconタグメント酵素ミックス(ATM)0.625μLと混合することからなった。2.5μL反応液を55℃で10分間インキュベートした後、直ちに氷上に置いて、このインキュベーション段階を完了させた。反応液を中和タグメント(NT)緩衝液0.625μLで反応停止させ、室温で10分間インキュベートした。Nexstera PCRマスター(NPM)ミックス1.875μL、10μM i5アダプター
2021508720.tif 000033
(ここで[i5]は8bp i5バーコード配列を意味する(配列は下記参照))0.625μL、および10μM i7アダプター
2021508720.tif 000034
(ここで[i7]は8bp i7バーコード配列の逆補体を表す(使用配列は下記参照))0.625μLを加えることで、ライブラリーを増幅した。72℃で3分間、95℃で30秒間の初期インキュベーション、続いて12回の(95℃で10秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間)のサイクル、および72℃で5分間の最終伸長によりPCRを行った。PCR増幅後、各ライブラリー2.5μLを一緒に1.5mLエッペンドルフチューブにプールした。プールをAgencourt AMPureXP SPRIビーズ(Beckman-Coulter)67.5μL(一緒にプールされた30個の2.5ul試料に対して0.9倍比)と混合し、室温で5分間インキュベートした。次にプールを磁石(DynaMag-2、Life Technologies)上に配置し、5分間インキュベートした。上清を除去し、SPRIビーズを新たに用意した70%エタノール1mLで2回洗浄した。すべての残留微量エタノールを除去してから、SPRIビーズを室温で10分間乾燥させた。ビーズをヌクレアーゼフリー水100μLに再懸濁させ、室温で5分間インキュベートした。次に管を再び磁石上に3分間置いた後、上清を新たな1.5mLエッペンドルフチューブに移した。同じアプローチを使用して、ライブラリーのこのSPRI精製手順をもう一度繰り返すことで、すべての残留プライマー二量体を除去した。プールされたライブラリーの濃度を、Qubit dsDNA高感度アッセイキット(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)を使用して測定し、ライブラリーサイズ分布を高感度バイオアナライザーチップ(Agilent)上で測定したところ、予想サイズ分布300〜500bpが示された。18個のプールされた試料を、Illumina NextSeq 500機器上でNextSeq 500/550高出力v2キット(75サイクル)を使用して、ペアードエンドとして配列決定した。
【０２１４】
i5バーコード: 
2021508720.tif 000035
【０２１５】
i7バーコード: 
2021508720.tif 000036
【０２１６】
データソース
公に入手可能なGSE82008遺伝子発現マトリックスデータをGEO NCBIリポジトリからダウンロードした。
【０２１７】
RNA配列解析
生の配列決定読取値を、Illumina bcl2fastq2 Illuminaソフトウェア(バージョン2.17.1.14)を使用して逆多重化し、FASTQファイルに変換した。次にFASTQ配列決定読取値を、デフォルトパラメータ付きのSTARアライナー12を使用して、mm10基準ゲノムに対してアラインした。RSEM(バージョン1.2.8)を使用して、アラインされた読取値から遺伝子発現レベルを定量化し、各実験条件についてカウント発現マトリックスを作成した13。2つを超える条件において100万当たりカウント数(CPM)＜0.5の低発現遺伝子をフィルタリングで除外し、合計14168個の遺伝子をさらなる解析に供した。log2正規化CPMデータの分布を可視化してカバー率について評価したところ、すべての条件は同様の分布を示した。
【０２１８】
遺伝子発現解析
遺伝子発現マトリックスをRのlimmaパッケージを使用して解析した14。デザインおよびバッチマトリックスを考慮に入れてlimmaのremovebatchEffect機能をデフォルトパラメータに使用してバッチ効果を除去した後、limmaの多次元スケーリング(plotMDS)機能を使用して分位正規化データの全般的位相を可視化した。差次的遺伝子発現をlimmaの経験的ベイジアン統計(eBayes)機能を使用して行うと同時に、バッチ共変数にブロッキング項目を使用してバッチ補正を行った。対数変化倍率が1を超えかつp値がカットオフ値未満である差次的発現遺伝子をgプロットのheatmap.2機能を使用して可視化した。すべてのp値を、多重仮説検定についてBenjamini-Hochberg補正を使用して補正した。遺伝子発現解析を行うために使用したRスクリプトについては補遺の「材料および方法」を参照。c-Rel KOおよびp65 KOとWT休止および活性化Tregとの間で差次的に発現された遺伝子のリストを得るために、同じ差次的発現段階を使用してGSE82008からの遺伝子発現データを再解析した。Grinberg-Bleyerらからの831個の「eTregシグネチャー」遺伝子のリストを著者らとの直接のやりとりを通じて得た。本試験およびGrinberg-BleyerらによるeTregシグネチャーのリストを含む差次的発現遺伝子間の重複を、limmaのvennDiagram機能を使用して可視化した。
【０２１９】
定量的RT-PCR
遺伝子発現解析のために、RNAを、tdLNおよび腫瘍由来の純度99%超まで選別されたCD4+ GFP+ Tregから、または均質化された腫瘍組織から単離し(AllPrep、DNA/RNA Miniキット; Qiagen)、iScript cDNA合成キット(Bio-RAD)を使用して逆転写した。iQ SYBRグリーンスーパーミックス(Bio-RAD)および以下のプライマーを使用して定量的RT-PCRを行った: 
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結果を、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに対する2-ΔCTとして表した。
【０２２０】
組織学
すべての臓器から得た組織試料を10%緩衝ホルマリン中で48時間固定し、トリミングし、マイクロカセットに入れ、パラフィンろうに包埋した。5μm切片を標準的手順に従ってヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０２２１】
免疫蛍光
RAG1 KOマウス由来の腎臓、肝臓、および胃をOCTに包埋し、ドライアイス上で平衡化された冷メチルブタン中で急速冷凍した。10μm切片を予備冷却90%メタノールによって-20℃で10分間透過処理し、1%ヤギ血清および0.25% BSA入りTruStain FcX(93、Biolegend)のPBS溶液中で60分間ブロッキングし、Foxp3YFP-Cre/Y x CARMA1fl/fl(またはfl/+もしくは+/+)マウス由来の血清(1:100希釈)と共に120分間インキュベートし、抗マウスIgG (H+L)-Alexa Fluor647(1:500)(A-21235、Thermo Fisher)およびDAPI(Sigma)で120分間染色した。切片をProlong(Thermo Fisher)中のカバーガラスに載せ、20倍レンズ(Apochromat、0.8W)を使用するLSM 780 AxioObserver共焦点顕微鏡(Carl Zeiss)で画像化した。
【０２２２】
統計解析
別途指示がない限り、2つの群間の比較には両側スチューデントt検定を使用し、一方、複数の群にわたる比較には、ボンフェローニ事後検定有りの二元配置分散分析(複数時点)またはチューキー事後検定有りの一元配置分散分析(単一時点)を使用した。ログランク(マンテル・コックス)検定を使用して生存率曲線を比較した。すべての統計検定をGraphPad Prismソフトウェアにより行い、p＜0.05を統計的に有意であると見なした。試料サイズを予め確定するために統計的方法は使用しなかった。実験および結果評価中に、研究者は割り付けに対して盲検化されていなかった。
【０２２３】
データ入手可能性
本研究中に作成されたデータセットは、合理的な要請があれば対応する著者らから入手可能である。RNA配列決定データはGEO NCBIリポジトリに寄託される予定である。
【０２２４】
参考文献
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2021508720.tif 000040
【図１−１】
2021508720.tif 000042
【図１−２】
2021508720.tif 000043
【図１−３】
2021508720.tif 000044
【図１−４】
2021508720.tif 000045
【図１−５】
2021508720.tif 000046
【図１−６】
2021508720.tif 000047
【図１−７】
2021508720.tif 000048
【図１−８】
2021508720.tif 000049
【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
2021508720.tif 000052
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１４−８】
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【図１４−９】
2021508720.tif 000116
【図１４−１０】
2021508720.tif 000117
【配列表】
2021508720000001.app
【国際調査報告】
2021508720.tif 000118
2021508720.tif 000119