(57)【要約】  本明細書で提供する方法および組成物の実施形態は、B7H3に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）に関する。いくつかの実施形態は、B7H3+細胞を含む腫瘍などの腫瘍を標的とする細胞ベースの免疫療法に関する。
2021534784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（CAR）をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
B7H3に特異的に結合する一本鎖可変領域断片（scFv）；
膜貫通ドメイン；
前記scFvと前記膜貫通ドメインの間に位置するスペーサー；および
細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記scFvが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（VH）CDR3、および配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（VL）CDR3を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記scFvが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVH CDR1、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVH CDR2、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVL CDR1、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVL CDR2を含む、請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記scFvが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVH領域を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記scFvが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVL領域を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記スペーサーが、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記スペーサーが、ヒト抗体のヒンジ領域の一部またはその改変バリアントを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記スペーサーが、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するIgG4ヒンジスペーサーを含むか、このスペーサーからなるか、実質的にこのスペーサーからなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記スペーサーが、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するIgG4ヒンジ−CH3スペーサーを含むか、このスペーサーからなるか、実質的にこのスペーサーからなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記スペーサーが、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するIgG4ヒンジ−CH2−CH3スペーサーを含むか、このスペーサーからなるか、実質的にこのスペーサーからなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記スペーサーが、IgG4ヒンジ−CH2（L235D、N297Q）−CH3スペーサーを含むか、このスペーサーからなるか、実質的にこのスペーサーからなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記膜貫通ドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するCD28膜貫通ドメイン（CD28tm）を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、第１シグナル伝達ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインを含み、該第１シグナル伝達ドメインと該共刺激シグナル伝達ドメインが、CD3ζの全体またはその一部と、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2CおよびB7-H3の各シグナル伝達ドメインならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激シグナル伝達ドメインとの組み合わせを含んでいてもよい、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号３１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸によってコードされるCD3ζのシグナル伝達部分を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸によってコードされる4-1BBのシグナル伝達部分を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
識別マーカーをコードする核酸をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記識別マーカーが切断型受容体である、請求項１６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記切断型受容体が、切断型EGFR（EGFRt）、切断型HER2（HER2t）および切断型CD19（CD19t）からなる群から選択される、請求項１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
リボソームスキップ配列をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記リボソームスキップ配列が、P2AまたはT2Aを含む、請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記単離されたポリヌクレオチドを含む細胞の選択に適した選択マーカーをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記選択マーカーが、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする導入遺伝子を含む、請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする導入遺伝子が、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体（DHFRdm）である、請求項２２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体が、L22Fアミノ酸変異およびF31Sアミノ酸変異を含む、請求項２３に記載の単離された核酸。
【請求項２５】
配列番号９と少なくとも９５％の同一性を有するVH CDR3をコードするヌクレオチド配列、および配列番号１２と少なくとも９５％の同一性を有するVL CDR3をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有するVH CDR1をコードするヌクレオチド配列、配列番号８と少なくとも９５％の同一性を有するVH CDR2をコードするヌクレオチド配列、配列番号１０と少なくとも９５％の同一性を有するVL CDR1をコードするヌクレオチド配列、および配列番号１１と少なくとも９５％の同一性を有するVL CDR2をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号１４と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
配列番号１６と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質。
【請求項３０】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３１】
ウイルスベクターである、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項３０または３１に記載のベクター。
【請求項３３】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項３４】
請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３５】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む細胞。
【請求項３６】
CD8+Ｔ細胞およびCD4+Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
前記CD8+細胞傷害性Ｔリンパ球が、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞が、CD45RO+、CD62L+およびCD8+である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーＴリンパ球である、請求項３６に記載の細胞。
【請求項４０】
前記CD4+ヘルパーリンパ球が、CD45RA+、CD62L+およびCD4+を含むがCD45ROを欠くナイーブCD4+Ｔ細胞である、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
前駆Ｔ細胞である、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４２】
造血幹細胞である、請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４３】
請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の細胞と薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物。
【請求項４４】
請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の細胞を作製する方法であって、
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の単離された核酸をリンパ球に導入する工程；
抗CD3抗体、抗CD28抗体およびサイトカインからなる群から選択される薬剤の存在下において、前記単離された核酸を含む前記リンパ球を培養する工程；および
前記単離された核酸を含む前記リンパ球を選択的に濃縮する工程
を含む方法。
【請求項４５】
前記選択的に濃縮する工程が、前記単離された核酸を含む前記リンパ球を選択試薬と接触させることを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記選択試薬がメトトレキサートを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記リンパ球が、CD45RA-、CD45RO+およびCD62L+の表現型を有する、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記リンパ球が、CD8+リンパ球またはCD4+リンパ球である、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記サイトカインが、IL-15、IL-7、IL-2およびIL-21からなる群から選択される、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
選択的に濃縮されたリンパ球を単離する工程をさらに含む、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記選択的に濃縮されたリンパ球を、該リンパ球により発現される識別マーカーに対する抗体と接触させる工程を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記識別マーカーが切断型受容体を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記切断型受容体が、切断型EGFR（EGFRt）、切断型HER2（HER2t）および切断型CD19（CD19t）からなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
B7H3＋細胞を含む腫瘍を有する対象を治療または緩和する方法であって、請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の細胞の有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項５５】
前記細胞が、前記対象由来の細胞から作製されたものである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記投与が静脈内投与である、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記投与が、前記対象の腫瘍部位における局所領域投与である、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記腫瘍が、悪性黒色腫、白血病、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、口腔扁平細胞癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、腎明細胞癌および神経膠腫からなる群から選択されるがんを含む、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記腫瘍が神経膠腫を含む、請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記腫瘍が、乏突起神経膠腫、未分化星状細胞腫、多形膠芽腫（GBM）、上衣腫および内在性橋膠腫（DIPG）からなる群から選択される神経膠腫を含む、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記腫瘍が多形膠芽腫（GBM）を含む、請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
追加の治療レジメンを投与する工程をさらに含む、請求項５４〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記追加の治療レジメンが放射線療法を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記追加の治療レジメンが、化学療法用化合物を含む、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記化学療法用化合物が、２’−デオキシアザシチジン、４−エピドキソルビシン、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、Ara-C、BMS-214662、ボルテゾミブ、カペシタビン、CHIR-258、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、ダカルバジン、デシタビン、ドキソルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フォロデシン、FR01228、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、KW-2449、lestautinib、ロナファルニブ、メルファラン、ミドスタウリン、マイトマイシンＣ、ネララビン、ペントスタチン、ロスコビチン、サパシタビン、セマキサニブ、バルプロ酸ナトリウム、ソラフェニブ、スニチニブ、タンズチニブ、テニポシド、チアラビン、チピファルニブ、トリコスタチンＡ、トロキサシタビン、バナジン酸塩、ベラパミル、ビダーザおよびゾスキダル三塩酸塩からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞の投与と前記追加の治療レジメンの投与が連続して行われる、請求項６２〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞の投与と前記追加の治療レジメンの投与が並行して行われる、請求項６２〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象が哺乳動物である、請求項５４〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記対象がヒトである、請求項５４〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
医薬品において使用するための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む細胞。
【請求項７１】
対象におけるB7H3+細胞を含む腫瘍の治療に使用するための細胞。
【請求項７２】
前記腫瘍が、悪性黒色腫、白血病、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、口腔扁平細胞癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、腎明細胞癌および神経膠腫からなる群から選択されるがんを含む、請求項７１に記載の細胞。
【請求項７３】
前記腫瘍が神経膠腫を含む、請求項７１または７２に記載の細胞。
【請求項７４】
前記腫瘍が、乏突起神経膠腫、未分化星状細胞腫、多形膠芽腫（GBM）、上衣腫および内在性橋膠腫（DIPG）からなる群から選択される神経膠腫を含む、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７５】
前記腫瘍が多形膠芽腫（GBM）を含む、請求項７１〜７４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７６】
CD8+Ｔ細胞およびCD4+Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項７１〜７５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７７】
ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項７６に記載の細胞。
【請求項７８】
前記CD8+細胞傷害性Ｔリンパ球が、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞が、CD45RO+、CD62L+およびCD8+である、請求項７７に記載の細胞。
【請求項７９】
ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーＴリンパ球である、請求項７６に記載の細胞。
【請求項８０】
前記CD4+ヘルパーリンパ球が、CD45RA+、CD62L+およびCD4+を含むがCD45ROを欠くナイーブCD4+Ｔ細胞である、請求項７９に記載の細胞。
【請求項８１】
前駆Ｔ細胞である、請求項７１〜８０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８２】
造血幹細胞である、請求項７１〜８１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８３】
単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（VH）CDR3、および／または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（VL）CDR3をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８４】
単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（VH）CDR1、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するVH CDR2、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（VL）CDR1、および／または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するVL CDR2をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８５】
配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（VH）をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８６】
配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（VL）をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８７】
単離されたポリペプチドまたは該単離されたポリペプチドを含む組成物であって、該ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、ポリペプチドまたは組成物。
【請求項８８】
請求項８３〜８６のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項８７に記載のポリペプチドを含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権および関連出願の相互参照
本出願は、2018年8月31日に出願された米国仮出願第62/725599号の利益を主張するものであり、この出願は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
【０００２】
電子形式の配列表
本願は、ASCIIテキストファイルとしての電子形式の配列表とともにEFS-Web経由で出願されたものである。この電子形式の配列表は、SCRI170WOSEQLIST.txtのファイル名で作成され、2019年8月27日に最終更新されたものであり、15,402バイトのサイズである。この電子形式の配列表に記載の情報は、引用によりその全体が本明細書に援用される。
【０００３】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態は、B7H3に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）に関する。いくつかの実施形態は、B7H3+細胞を含む腫瘍などの腫瘍を標的とする細胞ベースの免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
CD276としても知られているB7ホモログ3（B7H3）は、ヒトの第15染色体によりコードされるＩ型膜貫通タンパク質である。この細胞外ドメインは、ヒトでは、エキソンの重複により、免疫グロブリンの可変ドメインと定常ドメインからなる同一のペアを２つ含む（４つのIg-B7-H3アイソフォーム）。B7H3の細胞内テールは短く、公知のシグナル伝達モチーフを有していない。B7H3は、様々な生物種において普遍的に発現されている。マトリックスメタロペプチダーゼ（MMP）により細胞表面から切断された可溶性形態や、イントロンの選択的スプライシングにより生成された可溶性形態も、ヒト血清中で検出可能である。
【０００５】
B7H3は、抗原提示細胞上に誘導され、Ｔ細胞機能の抑制に重要な役割を果たす。B7H3は、広範な種類のヒトの固形がんにおいて高度に過剰発現されており、患者の予後不良および臨床転帰不良と相関することが多いことは重要である。たとえば、悪性黒色腫、白血病、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がん、結腸直腸がん、その他のがんなどのヒトの悪性腫瘍においてB7H3が過剰発現されることが多くの研究で報告されている。たとえば、Wang J, et al., J Invest Dermatol. 133:2050-8; Hu Y, et al., Hematology. 20:187-95; Sun J, et al., OncoTargets Ther. 7:1979-86; Zang X, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 104:19458-63; Zang X et al, Mod Pathol. 23:1104-12; Chen Y, et al., OncoTargets Ther. 7:1465-72；およびIngebrigtsen VA et al., BMC Cancer. 14:602を参照されたい。免疫化学分析では、様々な種類のがんの大半において、患者の腫瘍組織の60%〜93%がB7H3の異常発現を示すことが検出されているが、正常な健常組織では、その発現は限定的であることが認められている。ほとんどの場合、B7H3の高発現は、予後不良および臨床転帰不良と相関がある。したがって、B7H3を標的とする改良された治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
B7H3に特異的に結合する一本鎖可変領域断片（scFv）；
膜貫通ドメイン；
前記scFvと前記膜貫通ドメインの間に位置するスペーサー；および
細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、ポリヌクレオチドを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（VH）CDR3、および配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（VL）CDR3を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVH CDR1、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVH CDR2、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVL CDR1、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVL CDR2を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVH領域を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記scFvは、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するVL領域を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、アミノ酸配列X1PPX2Pを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、ヒト抗体のヒンジ領域の一部またはその改変バリアントを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するIgG4ヒンジスペーサーを含むか、このスペーサーからなるか、実質的にこのスペーサーからなる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するIgG4ヒンジ−CH3スペーサーを含むか、このスペーサーからなるか、実質的にこのスペーサーからなる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するIgG4ヒンジ−CH2−CH3スペーサーを含むか、このスペーサーからなるか、実質的にこのスペーサーからなる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、前記スペーサーは、IgG4ヒンジ−CH2（L235D、N297Q）−CH3スペーサーを含むか、このスペーサーからなるか、実質的にこのスペーサーからなる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するCD28膜貫通ドメイン（CD28tm）を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、第１シグナル伝達ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインを含み、該第１シグナル伝達ドメインと該共刺激シグナル伝達ドメインは、CD3ζの全体またはその一部と、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C、MyD88およびB7-H3の各シグナル伝達ドメインならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激シグナル伝達ドメインとの組み合わせを含んでいてもよい。
【００１９】
いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸によってコードされるCD3ζのシグナル伝達部分を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸によってコードされる4-1BBのシグナル伝達部分を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態は、識別マーカーをコードする核酸をさらに含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、前記識別マーカーは切断型受容体である。いくつかの実施形態において、前記切断型受容体は、切断型EGFR（EGFRt）、切断型HER2（HER2t）および切断型CD19（CD19t）からなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態は、リボソームスキップ配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記リボソームスキップ配列は、P2AまたはT2Aを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態は、前記単離されたポリヌクレオチドを含む細胞の選択に適した選択マーカーをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、前記ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする導入遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体（DHFRdm）である。いくつかの実施形態において、前記ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、L22Fアミノ酸変異およびF31Sアミノ酸変異を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態は、配列番号９と少なくとも９５％の同一性を有するVH CDR3をコードするヌクレオチド配列、および配列番号１２と少なくとも９５％の同一性を有するVL CDR3をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態は、配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有するVH CDR1をコードするヌクレオチド配列、配列番号８と少なくとも９５％の同一性を有するVH CDR2をコードするヌクレオチド配列、配列番号１０と少なくとも９５％の同一性を有するVL CDR1をコードするヌクレオチド配列、および配列番号１１と少なくとも９５％の同一性を有するVL CDR2をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施形態は、配列番号１４と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態は、配列番号１６と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００２９】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記単離されたポリヌクレオチドに関連する前記実施形態のいずれかによるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む。
【００３０】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記単離されたポリヌクレオチドに関連する前記実施形態のいずれかによる単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。
【００３２】
いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。
【００３３】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記単離されたポリヌクレオチドに関連する前記実施形態のいずれかによる単離されたポリヌクレオチドを含む細胞を含む。
【００３４】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記ベクターに関連する前記実施形態のいずれかによるベクターを含む細胞を含む。
【００３５】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記単離されたポリヌクレオチドに関連する前記実施形態のいずれかによる単離されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む細胞を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、CD8+Ｔ細胞およびCD4+Ｔ細胞からなる群から選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記CD8+細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、CD45RO+、CD62L+およびCD8+である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーＴリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記CD4+ヘルパーリンパ球は、CD45RA+、CD62L+およびCD4+を含むがCD45ROを欠くナイーブCD4+Ｔ細胞である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆Ｔ細胞である。
【００４０】
いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。
【００４１】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記細胞に関連する前記実施形態のいずれかによる細胞と、薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物を含む。
【００４２】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記細胞に関連する前記実施形態のいずれかによる細胞を作製する方法であって、
前記単離された核酸に関連する前記実施形態のいずれかによる単離された核酸をリンパ球に導入する工程；
抗CD3抗体、抗CD28抗体およびサイトカインからなる群から選択される薬剤の存在下において、前記単離された核酸を含む前記リンパ球を培養する工程；および
前記単離された核酸を含む前記リンパ球を選択的に濃縮する工程
を含む方法を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記選択的に濃縮する工程は、前記単離された核酸を含むリンパ球を選択試薬と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記選択試薬はメトトレキサートを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、前記リンパ球は、CD45RA-、CD45RO+およびCD62L+の表現型を有する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、前記リンパ球は、CD8+リンパ球またはCD4+リンパ球である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、前記サイトカインは、IL-15、IL-7、IL-2およびIL-21からなる群から選択される。
【００４７】
いくつかの実施形態は、選択的に濃縮されたリンパ球を単離する工程をさらに含む。
【００４８】
いくつかの実施形態は、前記選択的に濃縮されたリンパ球を、該リンパ球により発現される識別マーカーに対する抗体と接触させる工程をさらに含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、前記識別マーカーは切断型受容体を含む。いくつかの実施形態において、前記切断型受容体は、切断型EGFR（EGFRt）、切断型HER2（HER2t）および切断型CD19（CD19t）からなる群から選択される。
【００５０】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、B7H3+細胞を含む腫瘍を有する対象を治療または緩和する方法であって、前記細胞に関連する前記実施形態のいずれかによる細胞の有効量を前記対象に投与する工程を含む方法を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、前記対象由来の細胞から作製されたものである。
【００５２】
いくつかの実施形態において、前記投与は静脈内投与である。
【００５３】
いくつかの実施形態において、前記投与は、前記対象の腫瘍部位における局所領域投与である。
【００５４】
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、悪性黒色腫、白血病、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、口腔扁平細胞癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、腎明細胞癌および神経膠腫からなる群から選択されるがんを含む。
【００５５】
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫を含む。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、乏突起神経膠腫、未分化星状細胞腫、多形膠芽腫（GBM）、上衣腫および内在性橋膠腫（DIPG）からなる群から選択される神経膠腫を含む。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、多形膠芽腫（GBM）を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態は、追加の治療レジメンを投与する工程をさらに含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、前記追加の治療レジメンは、放射線療法を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態において、前記追加の治療レジメンは、化学療法用化合物を含む。いくつかの実施形態において、前記化学療法用化合物は、２’−デオキシアザシチジン、４−エピドキソルビシン、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、Ara-C、BMS-214662、ボルテゾミブ、カペシタビン、CHIR-258、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、ダカルバジン、デシタビン、ドキソルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フォロデシン、FR01228、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、KW-2449、lestautinib、ロナファルニブ、メルファラン、ミドスタウリン、マイトマイシンＣ、ネララビン、ペントスタチン、ロスコビチン、サパシタビン、セマキサニブ、バルプロ酸ナトリウム、ソラフェニブ、スニチニブ、タンズチニブ、テニポシド、チアラビン、チピファルニブ、トリコスタチンＡ、トロキサシタビン、バナジン酸塩、ベラパミル、ビダーザおよびゾスキダル三塩酸塩からなる群から選択される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、前記細胞の投与と前記追加の治療レジメンの投与は、連続して行われる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、前記細胞の投与と前記追加の治療レジメンの投与は並行して行われる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、前記対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記対象はヒトである。
【００６２】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、医薬品において使用するための、前記単離されたポリヌクレオチドに関連する前記実施形態のいずれかによる単離されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む細胞を含む。
【００６３】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、対象におけるB7H3+細胞を含む腫瘍の治療に使用するための細胞を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、悪性黒色腫、白血病、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、口腔扁平細胞癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、腎明細胞癌および神経膠腫からなる群から選択されるがんを含む。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫を含む。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、乏突起神経膠腫、未分化星状細胞腫、多形膠芽腫（GBM）、上衣腫および内在性橋膠腫（DIPG）からなる群から選択される神経膠腫を含む。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、多形膠芽腫（GBM）を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、CD8+Ｔ細胞およびCD4+Ｔ細胞からなる群から選択される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記CD8+細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、CD45RO+、CD62L+およびCD8+である。
【００６７】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーＴリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記CD4+ヘルパーリンパ球は、CD45RA+、CD62L+およびCD4+を含むがCD45ROを欠くナイーブCD4+Ｔ細胞である。
【００６８】
いくつかの実施形態において、前記細胞は前駆Ｔ細胞である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。
【００７０】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（VH）CDR3、および／または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（VL）CDR3をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７１】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（VH）CDR1、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するVH CDR2、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（VL）CDR1、および／または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するVL CDR2をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７２】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域（VH）をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００７３】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（VL）をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００７４】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、単離されたポリペプチドまたは該単離されたポリペプチドを含む組成物であって、該ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１３または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、ポリペプチドまたは組成物を含む。
【００７５】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、前記単離されたポリヌクレオチドに関連する前記実施形態のいずれかによる単離されたポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドに関連する前記実施形態のいずれかによるポリペプチドを含む細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】様々なB7H3 CARをコードするポリヌクレオチドの概略図である。
【００７７】
【図１Ｂ】短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを含むB7H3 CAR Ｔ細胞のEGFRtによる識別を示したグラフである。
【００７８】
【図１Ｃ】短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つB7H3 CARをコードする各ポリヌクレオチドを形質導入したＴ細胞におけるCD3ζの発現を示したウエスタンブロットの写真である。
【００７９】
【図１Ｄ】Epd-110GH細胞、PNET-109FH細胞株、D283細胞株またはMed411FH細胞株で刺激した際の、短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを含むB7H3 CAR Ｔ細胞によるインビトロでの特異的溶解率（％）およびサイトカインの放出量を示した一連のグラフである。サイトカインとして、IFNγ、IL-2およびB7H3 TNFを測定した。
【００８０】
【図１Ｅ】U87細胞を接種し、短い（Ｓ）スペーサー領域または中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域を持つCARを含むB7H3 CAR Ｔ細胞で処置したマウスにおける、ホタルルシフェラーゼ（ffluc）マーカーを使用して検出したB7H3+U87腫瘍細胞の数と、カプランマイヤー曲線により調べた生存率を示した一連のグラフである。（Ｘ）mock；（■）短いスペーサー領域を持つB7H3 CAR；（●）中程度の長さのスペーサー領域を持つB7H3 CAR。
【００８１】
【図２Ａ】短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを含むCD4+ B7H3 CAR Ｔ細胞における、EGFRtの発現、プロテインＬに結合する免疫グロブリンの発現、および抗Fcに結合するFcの発現を示した一連のグラフである。
【００８２】
【図２Ｂ】短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つB7H3 CARをコードする各ポリヌクレオチドで形質導入したCD4+細胞またはCD8+細胞の様々なクローンにおけるCD3ζの発現を示したウエスタンブロットの写真である。
【００８３】
【図２Ｃ】U87細胞、B7H3の発現を欠く改変U87細胞、Be2細胞またはD283細胞で刺激した際の、短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを含むB7H3 CAR Ｔ細胞によるインビトロでの特異的溶解率（％）を示した一連のグラフである。（Ｘ）mock；（▲）短いスペーサー領域を持つB7H3 CAR；（○）中程度の長さのスペーサー領域を持つB7H3 CAR；および（■）長いスペーサー領域を持つB7H3 CAR。
【００８４】
【図２Ｄ】Jurkat細胞、Jurkat OKT3細胞、U87細胞、B7H3の発現を欠く改変U87細胞、Be2細胞またはD283細胞で刺激した際の、短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを含むCD4+ B7H3 CAR Ｔ細胞またはCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞によるサイトカインの放出量を示した一連のグラフである。サイトカインとして、IFNγ、IL-2およびTNFを測定した。
【００８５】
【図２Ｅ】U87細胞を接種し、短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを含むCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞で処置したマウスにおける、fflucマーカーを使用して検出したB7H3+U87腫瘍細胞の数と、カプランマイヤー曲線により調べた生存率を示した一連のグラフである。（Ｘ）mock；（●）短いスペーサー領域を持つB7H3 CAR；（●）中程度の長さのスペーサー領域を持つB7H3 CAR；および（▲）長いスペーサー領域を持つB7H3 CAR。
【００８６】
【図３Ａ】中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域およびDHFRdm選択マーカーを持つB7H3 CARをコードするポリヌクレオチドで形質導入したCD4+細胞におけるEGFRt、ヒトFabおよび（抗Fcに結合する）Fcの発現を示した一連のグラフである。
【００８７】
【図３Ｂ】Jurkat細胞、Jurkat OKT3細胞、U87細胞、B7H3の発現を欠く改変U87細胞、Be2細胞およびD283細胞で刺激したCD4+ B7H3 CAR Ｔ細胞によるサイトカインの放出量を示した一連のグラフである。サイトカインとして、IFNγ、IL-2およびTNFを測定した。
【００８８】
【図４】Ｔ細胞によるB7H3陽性標的細胞株の溶解に関するデータを示した一連のグラフである（実施例４）。
【００８９】
【図５】B7H3陽性標的細胞株と共培養したＴ細胞によるサイトカインの産生に関するデータを示した一連のグラフである（実施例５）。
【００９０】
【図６】インビボでのＴ細胞によるU87腫瘍細胞の根絶に関するデータを示した一連のグラフである（実施例６）。
【００９１】
【図７】インビボでのＴ細胞による皮下のBe2神経芽腫細胞の根絶に関するデータを示した一連のグラフである（実施例７）。
【００９２】
【図８】インビボでのＴ細胞による皮下のBe2神経芽腫細胞の根絶に関するデータを示した一連のグラフである（実施例８）。
【００９３】
【図９】インビボでのCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞によるU251T神経膠腫細胞の根絶に関するデータを示した一連のグラフである（実施例９）。
【００９４】
【図１０】インビボでのCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞によるびまん性内在性橋膠腫（DIPG）原発腫瘍細胞の根絶に関するデータを示した一連のグラフである（実施例１０）。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
用語の定義
本明細書において、「核酸」または「核酸分子」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ポリヌクレオチドが挙げられ、たとえば、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得られる断片、ならびに／またはライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用および／もしくはエキソヌクレアーゼ作用により得られる断片などが挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（DNAやRNAなど）、天然のヌクレオチドの類似体（たとえば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンおよび／またはアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖および／または炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリンおよび／もしくはアルキル化ピリミジン、アシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、ならびにその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合、ホスホロアミデート結合などが挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。いくつかの実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列を提供する。いくつかの実施形態において、前記核酸はRNAまたはDNAである。
【００９６】
本明細書において、「抗体」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、免疫系において細菌やウイルスなどの異物を特定し、それらを中和する機能を有し、形質細胞によって産生されるＹ字型の大きなタンパク質が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの文脈において、「抗体」は、抗体の抗原結合断片を指す。抗体タンパク質は４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合により連結された同一の重鎖２本と同一の軽鎖２本を含んでいてもよい。それぞれの重鎖および軽鎖は、免疫グロブリンドメインと呼ばれる構造ドメインから構成される。これらのドメインは70〜110個のアミノ酸を含むことができ、そのサイズおよび機能により様々なカテゴリーに分類される。キメラ抗原受容体は、抗体断片（好ましくは抗原結合断片）を含むリガンド結合ドメインを含むことができる。
いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸であって、
ａ）ヒトB7H3タンパク質に結合するか、かつ／またはヒトB7H3タンパク質と相互作用するリガンド結合ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、
ｂ）前記リガンド結合ドメインが前記ヒトB7H3タンパク質と相互作用するのに十分な長さのポリペプチドスペーサーをコードする第２のポリヌクレオチド、
ｃ）膜貫通ドメインをコードする第３のポリヌクレオチド、および
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードする第４のポリヌクレオチド
を含む核酸を提供する。
いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは抗体断片である。標的部分に結合可能な抗体またはその結合断片の例としては、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、Fab、Fab2、Fab3、scFv、Bis-scFv、ミニボディ、トリアボディ、ダイアボディ、テトラボディ、VhHドメイン、V-NARドメイン、IgNARおよびラクダIgが挙げられる。抗体の別の例として、IgG（たとえば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4）、IgM、IgE、IgDおよびIgAが挙げられる。さらに、抗体の例として、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体が挙げられる。
【００９７】
本明細書において、「一本鎖可変領域断片」または「scFv」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、短いリンカーペプチドで連結された免疫グロブリンの重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）を含む融合タンパク質が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、このリンカーは、柔軟性を得るためにグリシンを含んでいてもよく、溶解性を得るために親水性アミノ酸（たとえばセリンまたはトレオニン）を含んでいてもよい。前記リンカーは、VHのＮ末端とVLのＣ末端を連結することができ、あるいはVHのＣ末端とVLのＮ末端を連結することもできる。いくつかの実施形態において、CAR上に存在するリガンド結合ドメインは、一本鎖可変領域断片（scFV）である。いくつかの実施形態において、CAR上に存在するscFvドメインは、B7H3タンパク質に特異的である。
【００９８】
本明細書において、「ベクター」、「発現ベクター」または「構築物」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、細胞に異種核酸を導入するために使用される核酸であって、様々な調節エレメントを含むことから、細胞において異種核酸を発現させることができる核酸が挙げられるが、これに限定されない。ベクターとしては、プラスミド、ミニサークル、酵母および／またはウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、プラスミド、ミニサークルまたはウイルスゲノムである。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、フォーミーウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。
【００９９】
本明細書において、「キメラ抗原受容体」、「CAR」または「キメラＴ細胞受容体」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、前記疾患または障害に関連する分子と結合する抗体配列またはその他のタンパク質配列のリガンド結合ドメインを含み、該リガンド結合ドメインが、スペーサードメインを介して、Ｔ細胞受容体またはその他の受容体の１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（たとえば共刺激ドメイン）に連結された合成設計受容体が挙げられるが、これに限定されない。キメラ受容体は、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、およびキメラ抗原受容体（CAR）と呼ぶこともできる。CARは、免疫受容体を発現する細胞に任意の特異性を移植することができる遺伝子組換え受容体である。研究者によっては、「キメラ抗原受容体」すなわち「CAR」は、抗体または抗体断片、スペーサー、シグナル伝達ドメインおよび膜貫通領域を含むものであると理解されている。しかしながら、本明細書に記載のCARは、様々な構成要素またはドメイン（たとえばリガンド結合領域（たとえば抗体断片、scFvまたはそれらの一部）、スペーサー、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインなど）が改変されており、これよって驚くべき効果が得られたことから、本明細書の開示全体においてCARの構成要素をそれぞれ独立したエレメントとして区別していることが多い。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体のスペーサーは、CARに所望の結合特性を付与することを目的として（たとえば、スペーサーが特定のアミノ酸長となるように）選択される。次に、様々な長さのスペーサーが、たとえば細胞上などに提示された複数のCARは、CARが指向性を示す標的部分との結合力または相互作用能に関してスクリーニングされる。
【０１００】
本明細書において、「Ｔ細胞」すなわち「Ｔリンパ球」は、どのような種類の哺乳動物から得られたＴ細胞であってもよく、サル、イヌ、ヒトなどから得られたＴ細胞であってもよいが、霊長類から得られたＴ細胞であることが好ましい。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、たとえば治療用組成物の形態などの該Ｔ細胞が投与される予定のレシピエント対象または該Ｔ細胞が投与されたレシピエント対象と同種（同じ生物種であるが別のドナーに由来するもの）である。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は自家である（ドナーとレシピエントは同じである）。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は同系である（ドナーとレシピエントは異なるが、一卵性双生児である）。
【０１０１】
本明細書において、成熟Ｔ細胞は、表面タンパク質としてCD4を発現し、CD4+Ｔ細胞と呼ばれる。CD4+Ｔ細胞は、一般に、免疫系においてヘルパーＴ細胞としての役割を果たすことが運命づけられているものとして扱われる。たとえば、抗原提示細胞がクラスII MHC上に抗原を発現する場合、CD4+細胞は細胞間相互作用（たとえばCD40および／またはCD40L）の組み合わせおよびサイトカインを介して抗原提示細胞を補助する。しかしながら、稀に例外があり、たとえば、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞のサブグループもCD4を発現する。これらのCD4+発現Ｔ細胞群は、いずれもヘルパーＴ細胞とは見なされない。
【０１０２】
本明細書において、「セントラルメモリー」Ｔ細胞（または「TCM」）という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、抗原を経験した細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）であり、ナイーブ細胞と比較して、その表面上にCD62LもしくはCCR-7および／またはCD45ROを発現するが、CD45RAは発現していないか、CD45RAの発現が低下しているCTLが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、セントラルメモリー細胞は、ナイーブ細胞と比較して、CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45ROおよび／またはCD95の発現が陽性であり、CD54RAの発現が低下している。
【０１０３】
本明細書において、「エフェクター」Ｔ細胞または「TE」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、抗原を経験した細胞傷害性Ｔリンパ球であり、セントラルメモリーＴ細胞またはナイーブＴ細胞と比較して、CD62L、CCR7およびCD28を発現していないか、CD62L、CCR7およびCD28の発現が低下しており、かつ／またはグランザイムＢおよび／もしくはパーフォリンが陽性である細胞傷害性Ｔリンパ球が挙げられるが、これに限定されない。
【０１０４】
本明細書において、「前駆Ｔ細胞」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、胸腺へと遊走して、前駆Ｔ細胞になることができ、Ｔ細胞受容体を発現していないリンパ球系前駆細胞が挙げられるが、これに限定されない。すべてのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞由来の造血前駆細胞（リンパ球系前駆細胞）は胸腺に定着して細胞分裂により拡大増殖し、未熟な胸腺細胞の大集団を作り出す。ごく初期の胸腺細胞はCD4もCD8も発現せず、したがって、ダブルネガティブ（CD4-CD8-）細胞に分類される。これらはその発達が進むにつれて、ダブルポジティブ胸腺細胞（CD4+CD8+）となり、最終的にシングルポジティブ（CD4+CD8-またはCD4-CD8+）胸腺細胞に成熟して、その後、胸腺から末梢組織に放出される。
【０１０５】
本明細書において、「医薬添加剤」または「医薬担体」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、治療を目的とした薬学的に活性な薬剤またはＴ細胞を処方および／または投与するための溶媒として使用されるキャリアまたは不活性媒体が挙げられるが、これらに限定されない。担体としては、高分子ミセル、リポソーム、リポタンパク質ベースのキャリア、ナノ粒子キャリア、デンドリマーおよび／または当業者に公知のＴ細胞用のその他の担体が挙げられる。理想的な担体または添加剤としては、毒性がなく、生体適合性、非免疫原性および生分解性を有し、宿主の防御機構によって認識されないものが挙げられる。
【０１０６】
詳細な説明
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、ヒトB7ホモログ3（B7H3）に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）に関する。いくつかの実施形態は、B7H3に特異的に結合するCARをコードするポリヌクレオチド、このようなCARを発現する細胞、およびこのような細胞を使用してB7H3+腫瘍を有する対象を治療することに関する。
【０１０７】
本明細書で提供する実施形態のいくつかは、B7H3 CARおよびこのようなCARをコードするポリヌクレオチドに関する。本明細書で提供されるB7H3 CARの実施形態のいくつかは、インビトロおよびインビボにおいて特に顕著な活性を有する。たとえば、Ｔ細胞において発現されるB7H3 CARに関する特定の実施形態は、インビトロにおいてサイトカインの放出を刺激する活性が有意に増加しており、インビボにおいて腫瘍細胞の増殖を抑制する活性が顕著に増加しており、かつ対象の生存を有意に延長させることが実証されている。さらに、Ｔ細胞において発現されるB7H3 CARに関する特定の実施形態は、インビトロにおいて数種類の中枢神経系腫瘍細胞に対して顕著な活性を有し、かつヒト膠芽腫細胞を有するインビボ異種移植モデルにおいて顕著な活性を有することも実証されている。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、B7H3 CARをコードするポリヌクレオチドをＴ細胞に形質導入することによって、B7H3 CAR Ｔ細胞を作製することができる。この形質導入された細胞は、B7H3 CARを発現することができ、B7H3抗原を発現する細胞を標的とすることができる。いくつかの実施形態において、対象からＴ細胞を採取することができる。対象から採取したＴ細胞をエクスビボで操作してB7H3 CARを発現させ、前記対象に再導入することができる。再導入されたＴ細胞は、前記対象において、B7H3抗原を発現する腫瘍細胞を標的とすることができる。本明細書で提供するB7H3 CARに関するいくつかの実施形態は、該CARの安定性および活性を増強しうる改変IgG4ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、前記B7H3 CARは、CD28膜貫通領域を含み、細胞内共刺激分子の組み合わせによるエフェクター機能を備える。いくつかの実施形態において、B7H3 CARをコードするポリヌクレオチドは、識別マーカーなど（切断型EGFR（EGFRt）など）の第２のポリペプチドをコードすることができる。このような識別マーカーは、この識別マーカーを共発現する細胞を単離するのに有用であってもよく、このような細胞で治療した対象において前記識別マーカーを発現する細胞の量を測定するのに有用であってもよい。本明細書で述べるように、CD4 Ｔ細胞およびCD8 Ｔ細胞におけるB7H3 CARの発現に成功を収めており、一連のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを用いることにより、強力かつ特異的な抗腫瘍活性の付与が確認されている。
【０１０９】
標的指向性部分としてscFvを使用する場合、このscFvはＴ細胞による認識と標的に関連することから、CARの設計がより複雑なものとなる。TCRとこれが認識するHLA分子の間の古典的な相互作用は空間的関係性に依存するが、CARとその標的識別能力は、エピトープの位置、標的の構造、CARの細胞外スペーサーの長さおよび柔軟性などの複数のパラメータに依存する。標的に対するCARの結合性に様々な長さの細胞外スペーサーが及ぼす影響の根底にある正確なメカニズムはいまだ不明である。本開示の態様では、様々な長さのIgG4重鎖スペーサーをB7H3 CARに組み込むことによって、特定のB7H3 CARが、インビトロおよびインビボにおいて顕著かつ予想外の活性を有することが見出されたことについて述べる。
【０１１０】
キメラ抗原受容体（CAR）
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、B7H3 CARおよび該B7H3 CARをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。本明細書において、「B7H3 CAR」という用語は、B7H3抗原を標的とするCARに関する。いくつかの実施形態において、CARは、標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン、該抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサードメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む合成設計されたタンパク質を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記抗原結合ドメインは、抗体、抗体の抗原結合断片、または抗体に由来する融合タンパク質（一本鎖可変領域断片（scFv）など）を含んでいてもよい。scFvは、従来の二本鎖抗体の重鎖の可変ドメインと軽鎖の可変ドメインが連結されて形成された単一のポリペプチド鎖である一本鎖Fv抗体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達ドメインと共刺激ドメインを含んでいてもよい。
【０１１１】
本明細書で提供するCARの実施形態のいくつかは、B7H3抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、CARの抗原結合ドメインは、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するものであってもよい。このような抗体の例は、国際特許出願公開WO 2011109400、米国特許公開第2013/0149236号およびLoo D., et al., (2012) Clin Cancer Res; 18(14); 3834-45に開示されている（これらの文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）。前記抗体は、相補性決定領域１（CDR1）、相補性決定領域２（CDR2）および相補性決定領域３（CDR3）などの相補性決定領域（CDR）を含んでいてもよい重鎖可変領域（VH）を含んでいてもよい。また、前記抗体は、相補性決定領域１（CDR1）、相補性決定領域２（CDR2）および相補性決定領域３（CDR3）などの相補性決定領域を含んでいてもよい軽鎖可変領域（VL）を含んでいてもよい。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARの抗原結合ドメインは、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するVH CDR3、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するVH CDR1、および／またはB7H3に特異的に結合する抗体に由来するVH CDR2を少なくとも含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARの抗原結合ドメインは、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するVH領域を少なくとも含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARの抗原結合ドメインは、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するVL CDR3、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するVL CDR1、および／またはB7H3に特異的に結合する抗体に由来するVL CDR2を少なくとも含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARの抗原結合ドメインは、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するVL領域を少なくとも含んでいてもよい。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARの抗原結合ドメインは、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するscFvを含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するVH CDR3、VH CDR1および／またはVH CDR2を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するVH領域を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するVL CDR3、VL CDR1および／またはVL CDR2を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するVL領域を含む。いくつかの実施形態において、前記scFvは、B7H3に特異的に結合する抗体に由来するVH領域とVL領域の両方を含むか、またはこのようなVH領域およびVL領域のCDRエレメントを含む。VH領域とVL領域は、リンカーを介して互いに結合することができる。VH領域とVL領域は、VH−VLの順またはVH−VLの順で連結することができる。
【０１１４】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態において有用なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の一例を表１に挙げる。
【表１】
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2021534784.tif 000004
【０１１５】
いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARは、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH CDR1を含んでいてもよく、このアミノ酸配列からなるVH CDR1を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、VH CDR1は、配列番号７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARは、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH CDR2を含んでいてもよく、このアミノ酸配列からなるVH CDR2を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、VH CDR2は、配列番号８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARは、配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH CDR3を含んでいてもよく、このアミノ酸配列からなるVH CDR3を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、VH CDR3は、配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARは、配列番号１３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH領域を含んでいてもよく、このアミノ酸配列からなるVH領域を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、VH領域は、配列番号１４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARは、配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むVL CDR1を含んでいてもよく、このアミノ酸配列からなるVL CDR1を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、VL CDR1は、配列番号１０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARは、配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むVL CDR2を含んでいてもよく、このアミノ酸配列からなるVL CDR2を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、VL CDR2は、配列番号１１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARは、配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むVL CDR3を含んでいてもよく、このアミノ酸配列からなるVL CDR3を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、VL CDR3は、配列番号１２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、B7H3に特異的に結合するCARは、配列番号１５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むVL領域を含んでいてもよく、このアミノ酸配列からなるVL領域を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、VL領域は、配列番号１６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、２つのアミノ酸配列間や２つのヌクレオチド配列間などの２つの配列間の同一性のパーセンテージは、たとえば、最適化された比較を行うことを目的として配列をアラインさせることによって決定することでき、たとえば、第１の配列の配列中にギャップを挿入して配列をアラインすることができる。次に、対応する位置のアミノ酸同士またはヌクレオチド同士を比較し、２つの配列間においてアミノ酸またはヌクレオチドが一致している位置の数の関数として、２つの配列間の同一性のパーセンテージを求める。たとえば、同一性（％）＝（一致している位置の数／位置の総数）×１００により求める。２つの配列間の比較は、実際には、たとえば数学的アルゴリズムなどを使用した公知の方法により行うことができる。このような数学的アルゴリズムの具体例として、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)（この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）に記載されているものが挙げられるが、これに限定されない。このようなアルゴリズムは、Schaffer et al., Nucleic Acids Res., 29:2994-3005 (2001)（この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）で述べられているように、BLASTNプログラムおよびBLASTXプログラム（バージョン2.2）に組み込まれている。本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかにおいて、CARまたはその構成要素をコードするポリヌクレオチドの核酸配列は、本明細書で提供されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列からなっていてもよく、実質的にこのようなヌクレオチド配列からなっていてもよく、このようなヌクレオチド配列を含んでいてもよい。本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかにおいて、CARポリペプチドまたはその構成要素をコードするアミノ酸配列は、本明細書で提供されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなっていてもよく、実質的にこのようなアミノ酸配列からなっていてもよく、このようなアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。保存的アミノ酸変化によって、得られるペプチドのアミノ酸配列において同義変化が起こる。たとえば、同等の極性を有する１つ以上のアミノ酸は同等の機能を有し、得られるペプチドのアミノ酸配列において同義変化が起こる。特定の残基をより小さい残基で置換することによる電荷が変わらない置換も、たとえこれらの残基が別々のグループに属していたとしても、保存的置換であると考えてもよい（たとえば、フェニルアラニンからより小さいイソロイシンへの置換）。いくつかの実施形態において、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸類似体またはバリアントの使用を含んでいてもよい。保存的アミノ酸置換のファミリーの一例を表２に挙げる。
【表２】
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【０１２５】
いくつかの実施形態において、B7H3 CARは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサードメインを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、適切な長さのスペーサードメインを使用することによって、抗原結合ドメインに可動性を付与することができ、これによって、標的抗原に対する結合を最適化することができる。本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかにおいて有用なスペーサードメインの例は、国際特許出願公開WO 2014031687、米国特許公開第20180200298号およびKunkele A., et al. (2015) Cancer Immunol Res; 3(4); 368-79に記載されている（これらの文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のヒンジ領域の少なくとも一部に由来するものであってもよい。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のCH2領域および／またはCH3領域に由来するものであってもよい。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、重鎖可変領域とコア領域の間に位置する上部ヒンジ領域のアミノ酸配列と、ポリプロリン領域を含むコアヒンジ領域のアミノ酸配列とを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上部ヒンジ領域は、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸を有するか、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個または約１０個のアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域は、アミノ酸配列X1PPX2P（配列番号１７）を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、システイン、グリシンまたはアルギニンであり、X2は、システインまたはトレオニンである。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、IgGの改変ヒンジ領域を含んでいてもよい。たとえば、改変ヒンジ領域は、IgGのヒンジ領域と少なくとも９０％、９２％、９５％または１００％の配列同一性を有していてもよく、これらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の配列同一性を有していてもよい。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、スペーサー領域の長さは、少なくとも10〜229アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜229アミノ酸長、少なくとも10〜200アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜200アミノ酸長、少なくとも10〜175アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜175アミノ酸長、少なくとも10〜150アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜150アミノ酸長、少なくとも10〜125アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜125アミノ酸長、少なくとも10〜100アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜100アミノ酸長、少なくとも10〜75アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜75アミノ酸長、少なくとも10〜50アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜50アミノ酸長、少なくとも10〜40アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜40アミノ酸長、少なくとも10〜30アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜30アミノ酸長、少なくとも10〜20アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜20アミノ酸長、または少なくとも10〜15アミノ酸長もしくは少なくとも約10〜15アミノ酸長であってもよく、ここに挙げたいずれかの範囲の上下限値の間の整数で示される長さであってもよい。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、（1アミノ酸長以上かつ）12アミノ酸長以下もしくは（1アミノ酸長以上かつ）約12アミノ酸長以下、（1アミノ酸長以上かつ）119アミノ酸長以下もしくは（1アミノ酸長以上かつ）約119アミノ酸長以下、または（1アミノ酸長以上かつ）229アミノ酸長以下もしくは（1アミノ酸長以上かつ）約229アミノ酸長以下である。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、ヒトIgG4のヒンジスペーサーを含んでいてもよく、このスペーサーからなっていてもよく、実質的にこのスペーサーからなっていてもよい。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいてもよく、このポリペプチドからなっていてもよく、実質的にこのポリペプチドからなっていてもよい。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、ヒトIgG4ヒンジ−CH3スペーサーを含んでいてもよく、このスペーサーからなっていてもよく、実質的にこのスペーサーからなっていてもよい。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、配列番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいてもよく、このポリペプチドからなっていてもよく、実質的にこのポリペプチドからなっていてもよい。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、ヒトIgG4ヒンジ−CH3−CH4スペーサーを含んでいてもよく、このスペーサーからなっていてもよく、実質的にこのスペーサーからなっていてもよい。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、配列番号２０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいてもよく、このポリペプチドからなっていてもよく、実質的にこのポリペプチドからなっていてもよい。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、ヒトIgG4ヒンジ−CH2（L235D、N297Q）−CHEスペーサーを含んでいてもよく、このスペーサーからなっていてもよく、実質的にこのスペーサーからなっていてもよい。本明細書で提供する方法および組成物の実施形態において有用なスペーサードメインのアミノ酸配列の一例を表３に挙げる。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、表３に挙げたアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【表３】
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【０１２９】
いくつかの実施形態において、B7H3 CARは、膜貫通ドメインを含んでいてもよい。膜貫通ドメインは、CARを細胞膜に繋ぎ止める役割を果たすことができる。いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来するものであってもよい。いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインの長さは、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、２１アミノ酸長、２２アミノ酸長、２３アミノ酸長、２４アミノ酸長、２５アミノ酸長、２６アミノ酸長、２７アミノ酸長または２８アミノ酸長であってもよく、約１０アミノ酸長、約１１アミノ酸長、約１２アミノ酸長、約１３アミノ酸長、約１４アミノ酸長、約１５アミノ酸長、約１６アミノ酸長、約１７アミノ酸長、約１８アミノ酸長、約１９アミノ酸長、約２０アミノ酸長、約２１アミノ酸長、約２２アミノ酸長、約２３アミノ酸長、約２４アミノ酸長、約２５アミノ酸長、約２６アミノ酸長、約２７アミノ酸長または約２８アミノ酸長であってもよい。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖またはζ鎖の膜貫通領域、たとえば、CD28、CD3、CD45、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137またはCD154の膜貫通領域を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通ドメイン（CD28tm）に由来するものであってもよい。本明細書で提供する方法および組成物の実施形態において有用なCD28tmドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の一例を表４に挙げる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号２９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【表４】
2021534784.tif 000007
【０１３０】
いくつかの実施形態において、B7H3 CARは、膜貫通ドメインに連結された細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。前記細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原結合ドメインが標的抗原に結合した場合に細胞の機能を活性化することができる。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記CARを発現するＴ細胞などのCAR発現細胞の機能を活性化することができる。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、形質導入された細胞（Ｔ細胞など）の少なくとも１つの機能を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインの少なくとも一部に由来するドメインを含んでいてもよい。Ｔ細胞の活性化は、少なくとも２種類の細胞内シグナル伝達タンパク質を介して行われ、２種類のうちの一方は、抗原依存性の一次活性化を開始してＴ細胞受容体様のシグナルを提供する細胞内シグナル伝達タンパク質（第１の細胞質シグナル伝達タンパク質など）であり、もう一方は、抗原非依存的に作用して第２のシグナルすなわち共刺激シグナルを提供する細胞内シグナル伝達タンパク質（第２の細胞質シグナル伝達タンパク質など）である。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、第１の細胞質シグナル伝達タンパク質の機能ドメインを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、第１の細胞質シグナル伝達タンパク質の機能ドメインと、１つ以上の第２の細胞質シグナル伝達タンパク質の少なくとも１つの機能ドメインを含んでいてもよい。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、第１シグナル伝達ドメインや共刺激シグナル伝達ドメインなどのシグナル伝達ドメインとして、細胞内の成分と相互作用することにより、シグナルを中継したり、シグナルの中継に関与したりすることができるタンパク質または受容体タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞質内ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態において、このような相互作用は、エフェクター分子またはエフェクタータンパク質との特異的なタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−リガンド相互作用を介した細胞内ドメインによる情報伝達によって起こり、次いでシグナル伝達の連鎖反応が起こることによって、その目的地へとシグナルを送ることができる。いくつかの実施形態において、シグナル伝達ドメインとして、共刺激ドメインが挙げられる。いくつかの態様において、共刺激ドメインとしては、たとえばTCR/CD3複合体のCD3ζ鎖などによって提供される第１シグナルに加えて、たとえば、免疫応答、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞溶解活性、パーフォリン活性および／またはグランザイム活性などのＴ細胞エフェクター応答などの応答を増強するシグナルをＴ細胞に提供するシグナル伝達部分が挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインとして、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、リンパ球機能関連抗原１（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2CもしくはB7-H3の全体もしくはその一部、ならびに／またはCD83に特異的に結合するリガンドの全体もしくはその一部を挙げることができる。
【０１３２】
刺激性に作用する第１の細胞内シグナル伝達タンパク質は、細胞内受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）として知られるシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。ITAMを含む第１の細胞内シグナル伝達ドメインとしては、CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79bまたはCD66dに由来するものが挙げられる。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインの全体もしくはその一部またはそのバリアントと、4-1BBのシグナル伝達ドメインの全体もしくはその一部またはそのバリアントとを含んでいてもよい。CD3ζのシグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列、および4-1BBのシグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列の一例を表５に挙げる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、表５に挙げたアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【表５】
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【０１３４】
いくつかの実施形態において、B7H3 CARをコードするポリヌクレオチドは、マルチシストロン性であってもよく、２つ以上のポリペプチドをコードしてもよい。いくつかの実施形態において、CARをコードするポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチドから複数の遺伝子の翻訳を可能とするエレメントを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、このエレメントは、内部リボソーム導入部位（IRES）またはリボソームスキップ配列を含んでいてもよい。「リボソームスキップ配列」としては、翻訳中のリボソームにリボソームスキップ配列を「スキップ」させ、ペプチド結合を形成することなくリボソームスキップ配列の直後の領域から翻訳を再開させるという機能を有する配列を挙げることができる。たとえば、いくつかのウイルスはリボソームスキップ配列を有することから、単一の核酸から複数のタンパク質を連続して翻訳することができ、翻訳されたタンパク質はペプチド結合によって連結されずに別個のタンパク質として得られる。いくつかの実施形態において、前記リボソームスキップ配列はP2A配列、T2A配列、E2A配列またはF2A配列である。いくつかの実施形態において、前記リボソームスキップ配列はT2A配列である。本明細書で提供する方法および組成物の実施形態において有用なT2Aのヌクレオチド配列の一例を表５に挙げる。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、CARをコードするポリヌクレオチドは、該CARをコードするヌクレオチド配列と第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の間に内部リボソーム導入部位（IRES）またはリボソームスキップ配列を有していてもよい。いくつかの実施形態において、前記CARと第２のポリペプチドは、細胞において共発現させることができる。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、識別マーカーおよび／または選択マーカーをコードするものであってもよく、たとえば、識別マーカーおよび／または選択マーカーを発現する細胞を識別、単離および／または濃縮するために使用することができるタンパク質などをコードするものであってもよい。このようなマーカーの例として、発現細胞の識別に利用できるが、最小限の活性しか持たない切断型受容体が挙げられる。切断型受容体の例として、米国特許第8,802,374号（この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている切断型上皮成長因子受容体（EGFRt）が挙げられる。本明細書で提供する方法および組成物の実施形態において有用なEGFRtをコードするヌクレオチド配列の一例を表５に挙げる。切断型受容体のさらなる例として、切断型HER2（HER2t）および切断型CD19（CD19t）が挙げられる。選択マーカーの例として、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする導入遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ジヒドロ葉酸還元酵素は、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体（DHFRdm）であってもよい。このような実施形態のいくつかにおいて、ジヒドロ葉酸還元酵素の二重変異体は、L22Fアミノ酸変異およびF31Sアミノ酸変異を含む。選択マーカーのさらなる例として、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph）、抗生物質であるG418に対する耐性をコードするTn5由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neoまたはaph）、およびアデノシンデアミナーゼ遺伝子（ADA）が挙げられる。いくつかの実施形態において、EGFRtなどの識別マーカーを使用して、細胞集団を単離することができる。いくつかの実施形態において、識別マーカーに対する抗体を使用して、EGFRtなどの識別マーカーを発現する細胞を捕捉することができる。前記抗体は、ビオチンやストレプトアビジンなどの第１の結合パートナーを含んでいてもよい。この抗体は、ビーズなど（磁気ビーズなど）の基材に結合させた第２の結合パートナー（ビオチンやストレプトアビジンなど）を使用して捕捉することができる。いくつかの実施形態において、EGFRtなどの識別マーカーを使用することにより、CAR Ｔ細胞を投与した対象における該CAR Ｔ細胞の量を測定することができる。
【０１３６】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、B7H3に特異的に結合するCARをコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。
【０１３７】
CAR Ｔ細胞の作製方法
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、B7H3 CARをコードするポリヌクレオチドを含む細胞、およびこのような細胞を含む組成物を作製する方法を含んでいてもよい。このような実施形態のいくつかは、たとえば、B7H3 CARをコードする単離されたポリヌクレオチドをリンパ球に導入する工程；抗CD3抗体、抗CD28抗体およびサイトカインからなる群から選択される薬剤などの、前記単離されたポリヌクレオチドを含む細胞集団の拡大増殖を促進する薬剤の存在下において、前記単離されたポリヌクレオチドを含む前記リンパ球を培養する工程；ならびに前記単離されたポリヌクレオチドを含む前記リンパ球を選択的に濃縮する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記選択的に濃縮する工程は、前記単離された核酸を含む前記リンパ球を選択試薬と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記選択試薬はメトトレキサートを含む。いくつかの実施形態において、前記リンパ球は、CD45RA-、CD45RO+およびCD62L+の表現型を有する。いくつかの実施形態において、前記リンパ球は、CD8+リンパ球またはCD4+リンパ球である。いくつかの実施形態において、前記サイトカインは、IL-15、IL-7、IL-2およびIL-21からなる群から選択される。いくつかの実施形態は、選択的に濃縮されたリンパ球を単離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記選択的に濃縮されたリンパ球を、該リンパ球により発現される識別マーカーに対する抗体と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、前記識別マーカーは切断型受容体を含む。いくつかの実施形態において、前記切断型受容体は、切断型EGFR（EGFRt）、切断型HER2（HER2t）および切断型CD19（CD19t）からなる群から選択される。このような方法の一例は、米国特許公開第20180200298号に記載されている（この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）。
【０１３８】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、Ｔリンパ球集団の選択およびソーティングと、Ｔリンパ球集団の改変を含んでいてもよい。Ｔリンパ球集団の選択およびソーティングを行う実施形態のいくつかにおいて、Ｔリンパ球は、公知の技術によって回収することができ、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択のような、抗体に対する親和性結合を利用した方法などの公知の技術によって濃縮または除去することができる。濃縮工程および／または除去工程を行った後、公知の技術によって所望のＴリンパ球をインビトロで拡大培養することができる。このような公知の拡大培養法として、たとえば、米国特許第6,040,177号に記載の技術が挙げられる（この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は患者から得られた自家Ｔ細胞である。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、所望のＴ細胞集団またはＴ細胞亜集団は、インビトロにおいて、培養前のＴリンパ球集団を培地に加え、次に、この培地にフィーダー細胞（非分裂性の末梢血単核細胞（PBMC）など）を加えることによって拡大培養してもよい。前記非分裂性のフィーダー細胞は、γ線を照射したPBMCフィーダー細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、PBMCにγ線を照射する。いくつかの実施形態において、拡大培養方法は、EBVで形質転換した非分裂性リンパ芽球様細胞（LCL）をフィーダー細胞として加えることをさらに含んでいてもよい。LCLにγ線を照射してもよい。いくつかの実施形態において、拡大培養方法は、抗CD3抗体および／または抗CD28抗体を培地に加えることを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、拡大培養方法は、IL-2および／またはIL-15を培地に加えることを含んでもよい（IL-2の濃度は、たとえば、少なくとも約10単位/mlである）。いくつかの実施形態において、拡大培養したＴリンパ球として、ヒト腫瘍または病原体に存在する抗原に特異的であってもよいCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）およびCD4+ヘルパーＴリンパ球が挙げられる。拡大培養を行う前または拡大培養を行った後に、最初に単離された細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球をそれぞれ、ナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団およびエフェクターＴ細胞亜集団にソートすることができる。
【０１４０】
CD8+細胞は、標準的な方法を使用して得ることができる。いくつかの実施形態において、CD8+細胞は、ナイーブCD8+細胞、セントラルメモリーCD8+細胞およびエフェクターメモリーCD8+細胞のそれぞれに関連する細胞表面抗原を同定することによって、これらのCD8+細胞にさらにソートされる。実施形態において、メモリーＴ細胞は、CD8+末梢血リンパ球由来のCD62L+サブセットおよびCD62L-サブセットの両方に存在する。PBMCは、抗CD8抗体および抗CD62L抗体で染色した後に、CD62L-CD8+画分およびCD62L+CD8+画分にソートされる。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞（TCM）の表現型マーカーの発現は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3および／もしくはCD127を含み、かつ／またはグランザイムＢは陰性であるか、低発現を示す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、CD45RO+、CD62L+および／またはCD8+のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターＴ細胞（TE）は、CD62L、CCR7、CD28および／もしくはCD127が陰性であり、かつ／またはグランザイムＢおよびパーフォリンは陽性である。いくつかの実施形態において、ナイーブCD8+Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127および／またはCD45RAが挙げられる。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、細胞集団の表面上の特定の細胞表面マーカーの有無は、該表面マーカーに特異的な抗体およびアイソタイプを一致させたコントロール抗体による染色を使用したフローサイトメトリーにより確認することができる。細胞集団において特定のマーカーが陰性であることは、アイソタイプコントロールと比べて特異的抗体で強く染まる細胞集団が存在しないことを指し、陽性は、アイソタイプコントロールよりも特異的抗体で均一に染まる細胞集団が存在することを指す。いくつかの実施形態において、１種以上のマーカーの発現の低下は、対照の細胞集団と比較して、平均蛍光強度の低下が1 log10であること、および／または１種以上のマーカーを発現する細胞のパーセンテージが、細胞全体の少なくとも20%、細胞全体の少なくとも25%、細胞全体の少なくとも30%、細胞全体の少なくとも35%、細胞全体の少なくとも40%、細胞全体の少なくとも45%、細胞全体の少なくとも50%、細胞全体の少なくとも55%、細胞全体の少なくとも60%、細胞全体の少なくとも65%、細胞全体の少なくとも70%、細胞全体の少なくとも75%、細胞全体の少なくとも80%、細胞全体の少なくとも85%、細胞全体の少なくとも90%、細胞全体の少なくとも95%、もしくは細胞全体の少なくとも100%に低下すること、もしくは細胞全体の少なくとも約20%、細胞全体の少なくとも約25%、細胞全体の少なくとも約30%、細胞全体の少なくとも約35%、細胞全体の少なくとも約40%、細胞全体の少なくとも約45%、細胞全体の少なくとも約50%、細胞全体の少なくとも約55%、細胞全体の少なくとも約60%、細胞全体の少なくとも約65%、細胞全体の少なくとも約70%、細胞全体の少なくとも約75%、細胞全体の少なくとも約80%、細胞全体の少なくとも約85%、細胞全体の少なくとも約90%、細胞全体の少なくとも約95%、もしくは細胞全体の少なくとも約100%に低下すること、もしくは20〜100%の範囲の任意のパーセンテージに低下することを指す。いくつかの実施形態において、細胞集団が１種以上のマーカーについて陽性であることは、対照の細胞集団と比較して、１種以上のマーカーを発現する細胞のパーセンテージが、細胞全体の少なくとも50%、細胞全体の少なくとも55%、細胞全体の少なくとも60%、細胞全体の少なくとも65%、細胞全体の少なくとも70%、細胞全体の少なくとも75%、細胞全体の少なくとも80%、細胞全体の少なくとも85%、細胞全体の少なくとも90%、細胞全体の少なくとも95%、もしくは細胞全体の少なくとも100%であること、または細胞全体の少なくとも約50%、細胞全体の少なくとも約55%、細胞全体の少なくとも約60%、細胞全体の少なくとも約65%、細胞全体の少なくとも約70%、細胞全体の少なくとも約75%、細胞全体の少なくとも約80%、細胞全体の少なくとも約85%、細胞全体の少なくとも約90%、細胞全体の少なくとも約95%、もしくは細胞全体の少なくとも約100%であること、または50〜100%の範囲の任意のパーセンテージであることを指す。
【０１４２】
CD4+ヘルパーＴ細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞およびエフェクター細胞にソートされる。CD4+リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの実施形態において、ナイーブCD4+Ｔリンパ球は、CD45RO-、CD45RA+、CD62L+またはCD4+のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーCD4+細胞は、CD62L+またはCD45RO+である。いくつかの実施形態において、エフェクターCD4+細胞は、CD62L-またはCD45RO-である。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、抗原に特異的なCD4+集団およびCD8+集団は、ナイーブＴリンパ球または抗原特異的Ｔリンパ球を抗原で刺激することによって得ることができる。たとえば、サイトメガロウイルス抗原に特異的なＴ細胞株またはＴ細胞クローンは、サイトメガロウイルスに感染した対象からＴ細胞を単離し、インビトロにおいて同じサイトメガロウイルス抗原で該Ｔ細胞を刺激することによって作製することができる。ナイーブＴ細胞を使用してもよい。Ｔ細胞応答を誘導するための標的として使用される、腫瘍細胞に由来する抗原の数は特に限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の養子細胞免疫療法用組成物は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、乳がんまたは悪性黒色腫を含む疾患または障害の治療または緩和に有用である。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、単離されたＴリンパ球集団は、本明細書で提供されるCARをコードするポリヌクレオチドで改変することができる。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、治療を受ける予定の対象から得られたものである。別の実施形態において、前記Ｔリンパ球は、同種のヒトドナー、好ましくは健常ヒトドナーから得られたものである。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、CARをコードするポリヌクレオチドを含む組換え感染性ウイルス粒子を使用して、Ｔ細胞に遺伝子を送達することができる。本明細書で提供する方法および組成物の実施形態において有用なウイルスベクターの例として、シミアンウイルス４０（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レンチウイルスベクターおよび／またはレトロウイルスに由来するウイルスベクターが挙げられる。Ｔ細胞などの細胞に形質導入を行う技術の例として、リン酸カルシウム法によるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、および組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターによる感染が挙げられる。レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを使用した方法により、真核細胞への遺伝子移入を非常に効率的に行うことができる。さらに、レトロウイルスまたはレンチウイルスの組み込みは制御下で行うことができ、細胞１個あたり１コピーまたは数コピーの新しい遺伝情報を安定して組み込むことができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、CARをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、インビトロにおける細胞の選択を可能とする陽性マーカーを含んでいてもよい。このような陽性マーカーをコードする遺伝子の例として、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph）、抗生物質であるG418に対する耐性をコードするTn5由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neoまたはaph）、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子、およびアデノシンデアミナーゼ遺伝子（ADA）が挙げられる。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、CARをコードする発現ベクターを使用して、CD4+細胞およびCD8+細胞をそれぞれ別々に改変し、所定の集団を形成させることができる。いくつかの実施形態において、このようにして得られた細胞は、前述したように、さらに、ナイーブ細胞亜集団、セントラルメモリー細胞亜集団およびエフェクター細胞亜集団のそれぞれに固有の細胞表面抗原でソートすることによって、これらの細胞亜集団にソートされる。また、CD4+細胞集団およびCD8+細胞集団は、それらのサイトカインプロファイルまたは増殖活性により選択してもよい。たとえば、抗原で刺激した際の、IL-2、IL-4、IL-10、TNFαおよび／またはIFNγなどのサイトカインの産生が、偽形質導入細胞や形質導入CD8+細胞よりも増強されているCD4+Ｔリンパ球を選択することができる。いくつかの実施形態において、IL-2および／またはTNFαの産生が増強されているナイーブCD4+Ｔ細胞またはセントラルメモリーCD4+Ｔ細胞が選択される。同様に、偽形質導入CD8+細胞よりもIFNγの産生が増強されているCD8+細胞が選択される。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、抗原標的または腫瘍標的に応答して増殖するCD4+細胞およびCD8+細胞が選択される。たとえば、抗原標的または腫瘍標的で刺激した際に、偽形質導入細胞や形質導入CD8+細胞よりも活発に増殖するCD4+Ｔ細胞が選択される。いくつかの実施形態において、抗原を有する細胞に対して細胞傷害性を示すCD4+細胞および／またはCD8+細胞が選択される。実施形態において、CD4+細胞は、CD8+細胞よりも細胞傷害性が低いと予想される。いくつかの実施形態において、特定の種類のがんについて確立された動物モデルを使用することにより、インビボにおいて持続可能な形質導入キメラ受容体発現Ｔ細胞が選択される。実施形態において、短いスペーサー領域を有する形質導入キメラ受容体CD8+セントラルメモリー細胞は、動物モデルに導入後、約３日以上、約１０日以上、約２０日以上、約３０日以上、約４０日以上または約５０日以上にわたってインビボで持続可能であったことが示されている。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、CD4+Ｔ細胞およびCD8+Ｔ細胞は、たとえば、ナイーブ細胞集団、セントラルメモリー細胞集団およびエフェクターメモリー細胞集団などの亜集団にさらに分割することができる。いくつかの実施形態において、ナイーブCD4+細胞は、CD45RO-、CD45RA+、CD62L+かつ／またはCD4+のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーCD4+細胞は、CD62L陽性および／またはCD45RO陽性である。いくつかの実施形態において、エフェクターCD4+細胞は、CD62L陰性および／またはCD45RO陽性である。これらの集団は、それぞれ独立して本明細書に記載のCARで改変してもよい。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、メモリーＴ細胞は、CD8+末梢血リンパ球由来のCD62L+サブセットおよびCD62L-サブセットの両方に存在する。PBMCは、抗CD8抗体および抗CD62L抗体で染色した後に、CD62L-CD8+画分およびCD62L+CD8+画分にソートされる。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞（TCM）の表現型マーカーの発現は、CD62L、CCR7、CD28、CD3および／またはCD127を含み、グランザイムＢは陰性であるか、低発現を示す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、CD45RO+、CD62L+および／またはCD8+のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターＴ細胞（TE）は、CD62L、CCR7、CD28および／またはCD127が陰性であり、グランザイムＢおよび／またはパーフォリンが陽性である。いくつかの実施形態において、ナイーブCD8+Ｔリンパ球は、CD8+、CD62L+、CD45RO+、CCR7+、CD28+、CD127+および／またはCD45RO+を特徴とする。これらの集団は、それぞれ独立してCARで改変してもよい。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、CARを有する細胞を得るための形質導入および／または選択を行った後に、ヒト対象への少なくとも１回の注入に十分な細胞数が得られるまで、細胞集団をインビトロで拡大培養することができ、少なくとも１回の注入に十分な細胞数としては、通常、約１０４個／ｋｇ〜１０９個／ｋｇが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記形質導入細胞は、抗原を有する細胞、抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、IL-7、IL-15および／もしくはIL-21、またはそれらの組み合わせの存在下で培養することができる。いくつかの実施形態において、CD4+細胞の亜集団とCD8+細胞の亜集団を組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、改変されたナイーブCD4+細胞または改変されたセントラルメモリーCD4+細胞を、改変されたセントラルメモリーCD8+Ｔ細胞と組み合わせることによって、抗原を有する細胞（たとえば腫瘍細胞）に対して相乗的な細胞傷害作用を提供することができる。
【０１５２】
疾患を治療または緩和する方法
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、B7H3+細胞を含む腫瘍を有する対象において、免疫療法を実施することにより、がんを治療または緩和することを含む。このような実施形態のいくつかは、がんの治療または緩和を必要とする対象に、B7H3抗原を標的とするCARを発現する細胞（Ｔ細胞など）の有効量を投与することを含んでいてもよい。細胞の有効量は、特定の細胞集団中の有効な細胞数を指す場合がある。
【０１５３】
本明細書において、「対象」として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、たとえば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類およびトリ（たとえばニワトリ）、ならびにその他の脊椎動物および無脊椎動物が挙げられる。本明細書において、「治療する」、「治療」または「治療すること」は、治療目的で対象に医薬組成物を投与することを含んでいてもよく、疾患の症状または帰結を低減させること（たとえば、原発腫瘍からの転移の発生の予防、転移性腫瘍の腫瘍細胞の数の低減、または転移性腫瘍の腫瘍細胞の増殖の抑制など）を含んでいてもよく、疾患を治癒すること（たとえば、疾患の症状の除去、たとえば、対象における転移性腫瘍の腫瘍細胞の排除など）を含んでいてもよい。本明細書において、「緩和する」または「緩和すること」は、疾患の１つ以上の症状をある程度まで軽減することができる治療効果を含んでいてもよい。本明細書において、「予防する」、「予防すること」および「予防」は、疾患の発生を抑制すること（たとえば原発腫瘍の転移の抑制など）を含んでいてもよく、対象においてがんの再増殖が始まる前に起こる主要な作用を予防すること、かつ／またはがんの重症度を抑制もしくは低減することを含んでいてもよい。本明細書において、「有効量」は、疾患を治療するのに十分な治療用化合物の量（たとえば投与量）を含んでいてもよい。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、B7H3+細胞を含む腫瘍は、悪性黒色腫、白血病、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、口腔扁平細胞癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、腎明細胞癌および／または神経膠腫などのがんを含む。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、乏突起神経膠腫、未分化星状細胞腫、多形膠芽腫（GBM）、上衣腫および／または内在性橋膠腫（DIPG）などの神経膠腫を含む。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は多形膠芽腫（GBM）を含む。たとえば、Zhou Z., et al., (2013), J Neurooncol. 111:257-64（この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCAR改変Ｔ細胞は、インビボにおいて少なくとも３日間または少なくとも１０日間にわたって持続することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCAR改変Ｔ細胞は、CFSE色素の希釈で測定した場合、インビボにおいて少なくとも２世代または少なくとも３世代にわたって増殖することができる。前記CAR改変Ｔ細胞の増殖および持続性は、前記疾患または障害の動物モデルに該CAR改変Ｔ細胞を投与し、この移入された細胞の持続能力および／または増殖能力を測定することによって測定することができる。別の実施形態において、増殖および活性化は、インビトロにおいて、抗原を有する細胞を使用して複数回にわたって活性化することにより試験することができる。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、対象におけるCAR改変細胞の有無は、該対象から試料を採取し、該試料中のEGFRt識別マーカーなどの識別マーカーの有無を検出することによって調べることができる。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、細胞免疫療法の実施には、遺伝子組換えヘルパーＴリンパ球細胞製剤を対象に投与することが含まれていてもよく、この組換えヘルパーＴリンパ球細胞製剤は、B7H3に特異的に結合するCARなどのCARを有するCD4+Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞免疫療法の実施には、遺伝子組換え細胞傷害性Ｔリンパ球細胞製剤を対象に投与することが含まれていてもよく、この組換え細胞傷害性Ｔリンパ球細胞製剤は、B7H3に特異的に結合するCARなどのCARを有するCD8+細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記CD4+Ｔヘルパーリンパ球は、前記CARの導入前に、ナイーブCD4+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD4+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD4+Ｔ細胞およびバルクCD4+Ｔ細胞から選択される。いくつかの実施形態において、前記CD4+ヘルパーリンパ球は、ナイーブCD4+Ｔ細胞であり、該ナイーブCD4+Ｔ細胞は、CD45RO-、CD45RA+および／またはCD62L+のCD4+Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球は、前記CARの導入前に、ナイーブCD8+Ｔ細胞、セントラルメモリーCD8+Ｔ細胞、エフェクターメモリーCD8+Ｔ細胞およびバルクCD8+Ｔ細胞から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、CD45RO+、CD62L+および／またはCD8+のＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞傷害性CD8+Ｔリンパ球はセントラルメモリーＴ細胞であり、前記CD4+ヘルパーＴリンパ球はナイーブCD4+Ｔ細胞である。
【０１５８】
本明細書に従って作製した細胞は、当業者であれば容易に理解できる公知の技術またはその変法に従って、養子免疫療法のための方法および組成物において使用することができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、前記細胞の製剤化は、まず該細胞を培地から回収し、次いで該細胞を洗浄し、投与に適した培地および容器システム（たとえば薬学的に許容される担体）中において該細胞を治療有効量まで濃縮することによって行われる。適切な注入用培地は、等張性培地製剤であればどのようなものであってもよく、典型的には、生理食塩水、Normosol R（アボット社）もしくはPlasma-Lyte A（バクスター社）、５％デキストロース水溶液、または乳酸リンゲル液を使用することができる。前記注入用培地には、ヒト血清アルブミン、ウシ胎児血清、またはその他のヒト血清成分を添加してもよい。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、前記組成物中の細胞の治療有効量は、少なくとも２つの細胞サブセット（たとえば、CD8+セントラルメモリーＴ細胞からなる１つのサブセットと、CD4+ヘルパーＴ細胞からなる１つのサブセット）である。いくつかの実施形態において、前記組成物中の細胞の治療有効量は、より典型的には、１０２個を超えかつ１０６個以下であり、１０８個以下または１０９個以下であり、１０１０個を超えてもよい。細胞の数は、前記組成物の最終的な用途や、該組成物に含まれる細胞の種類などによって決定される。たとえば、特定の抗原（たとえばB7H3）に特異的な細胞が所望される場合、このような細胞が前記集団を占める割合は７０％を超え、通常、８０％を超え、８５％を超え、かつ／または９０〜９５％を占める。本明細書で提供する使用において、前記細胞の量は、通常１Ｌ以下であり（ただし０Ｌではない）、５００ｍｌ以下であってもよく（ただし０ｍｌではない）、さらには２５０ｍｌ以下または１００ｍｌ以下であってもよい（ただし０ｍｌではない）。したがって、前記所望の細胞の密度は、典型的には１０４個／ｍｌを超え、通常１０７個／ｍｌを超え、通常１０８個／ｍｌ以上である。臨床的意義のあるこのような数の免疫細胞は、複数回の注入に分割して投与してもよく、その累積投与量は１０６個以上、１０７個以上、１０８個以上、１０９個以上、１０１０個以上、１０１１個以上または１０１２個以上に相当する。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARを含む細胞を含む医薬組成物は、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、骨髄内投与、リンパ節内投与、かつ／または脳脊髄液内投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARを含む細胞は、腫瘍部位に送達することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供するCARを含む細胞を含む医薬組成物は、本発明の細胞を腫瘍または免疫系コンパートメントに指向させるが、肺などの部位を避けることが可能な化合物と組み合わせることができる。
【０１６２】
併用療法
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、追加の治療レジメンと併用した免疫療法により、B7H3+細胞を有するがんなどの疾患または障害を対象において治療または緩和することを含む。本明細書において、併用投与は、免疫療法と追加の治療レジメンなどの２種以上の薬剤を対象に投与することを含んでいてもよく、その結果、これらの２種以上の薬剤がどのような時間にどのような方法で実際に投与されたかということとは関係なく、これらの２種以上の薬剤が同時に前記対象の血流中に見出されてもよい。たとえば、CARを発現する細胞などの第１の薬剤を対象に投与し、さらに追加の治療剤を投与することができる。いくつかの実施形態において、前記薬剤は同時に投与される。このような実施形態のいくつかにおいて、併用投与は、前記薬剤を組み合わせて単一の剤形とすることによって行われる。前記薬剤を組み合わせて単一の剤形とする場合、これらの薬剤は物理的に混合してもよい。いくつかの実施形態において、前記薬剤は連続投与される。いくつかの実施形態において、前記薬剤は、静脈内経路などの同じ経路を介して投与される。いくつかの実施形態において、前記薬剤は別個の経路を介して投与され、たとえば、前記薬剤のうちの一方が経口投与され、もう一方は静脈内投与される。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、追加の治療レジメンは、放射線療法を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、追加の治療レジメンは、化学療法剤の投与を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、細胞周期阻害剤である。本明細書において、「細胞周期阻害剤」は、細胞の分裂および／または複製を抑制または阻害する化学療法剤を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、細胞周期阻害剤として、ドキソルビシン、メルファラン、ロスコビチン、マイトマイシンＣ、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、シスプラチン、Ara-C、エトポシド、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、スニチニブ、ソラフェニブ、バルプロ酸ナトリウム、HDAC阻害剤、ダカルバジンなどの化学療法剤が挙げられる。追加の化学療法剤のさらなる例として、FR01228、トリコスタチンＡ、SAHAおよび／またはPDX101などのHDAC阻害剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞周期阻害剤は、DNA合成阻害剤である。本明細書において、「DNA合成阻害剤」は、がん細胞によるDNAの合成を抑制または阻害する化学療法剤を含んでいてもよい。DNA合成阻害剤の例として、AraC（シタラビン）、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、ペントスタチン、チアラビン、トロキサシタビン、サパシタビンまたはフォロデシンが挙げられる。追加の化学療法剤のさらなる例として、セマキサニブ（SU5416）、スニチニブ（SU11248）、ミドスタウリン（PKC412）、Lestautinib（CEP-701）、タンズチニブ（MLN518）、CHIR-258、ソラフェニブ（BAY-43-9006）および／またはKW-2449などのFLT3阻害剤が挙げられる。追加の化学療法剤のさらなる例として、チピファルニブ（R115777、Zarnestra）、ロナファルニブ（SCH66336、Sarasar（登録商標））および／またはBMS-214662などのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤が挙げられる。追加の化学療法剤のさらなる例として、エピポドフィロトキシン類、エトポシド、テニポシド、アントラサイクリン類、ドキソルビシンおよび／または４−エピドキソルビシンなどのトポイソメラーゼII阻害剤が挙げられる。追加の化学療法剤のさらなる例として、ゾスキダル三塩酸塩（Z.3HCL）、バナジン酸塩、ベラパミルなどのＰ糖タンパク質モジュレーターが挙げられる。追加の化学療法剤のさらなる例として、５−アザシチジンや２’−デオキシアザシチジンなどの低メチル化剤が挙げられる。
【０１６４】
キット
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、キットを含む。このような実施形態のいくつかにおいて、キットは、CARが発現されるように細胞を改変するための試薬を含んでいてもよい。このような実施形態のいくつかは、本明細書で提供される単離されたポリヌクレオチドであって、B7H3に特異的に結合する抗原結合ドメインを有するCARをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、キットは、B7H3に特異的に結合する抗原結合ドメインを有するCARをコードする前記単離されたポリヌクレオチドで細胞を形質導入するための試薬を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１６５】
実施例１−インビトロおよびインビボにおけるB7H3 CAR Ｔ細胞の活性
様々なスペーサードメインを使用して、ヒトB7H3を標的とするCARをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを構築した（図1A）。各ポリヌクレオチドは、ヒトB7H3に特異的に結合するscFvを含む抗原結合ドメイン、３種のスペーサードメインのいずれか１つ、CD28tm、41BBおよびCD3ζを含むシグナル伝達ドメイン、T2Aスキップ配列、ならびに切断型EGFR（EGFRt）を含む識別マーカーをコードするものであった。前記scFvには、配列番号14のVH領域をコードするヌクレオチド配列と、配列番号16のVL領域をコードするヌクレオチド配列が含まれていた。EGFRtによりCAR Ｔ細胞の選択を行い、インビボにおけるCAR Ｔ細胞の追跡マーカーとしても使用した。各スペーサーとして、ヒトIgG4ヒンジ領域を含む短い（Ｓ）スペーサー、ヒトIgG4ヒンジ領域とCH3ドメインを含む中程度の長さの（Ｍ）スペーサー、およびヒトIgG4ヒンジ領域とCH2ドメインとCH3ドメインを含む長い（Ｌ）スペーサーを使用した。この実施例では、長いスペーサーは、野生型のヌクレオチド配列を含んでいた。したがって、各ポリヌクレオチドは、短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域（野生型）を持つB7H3 CARをコードするものであった。
【０１６６】
Hudecek M, et al., (2013) Clin Cancer Res. 19:3153-64（この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている方法と実質的に同様の方法を使用して、前記B7H3-CARをコードする各ポリヌクレオチドでCD8+Ｔ細胞を形質導入し、短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞を作製した。
【０１６７】
Hudecek Mら（2013）に記載されている方法と実質的に同様の方法を使用して、前記CAR Ｔ細胞の細胞傷害アッセイ、サイトカイン放出アッセイおよび増殖アッセイを行った。図1Bは、短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞のEGFRtによる識別を示す。図1Cは、B7H3 CAR Ｔ細胞におけるCD3ζの発現を示したウエスタンブロットである。
【０１６８】
ヒト髄芽腫細胞株（Med411FHおよびD283）、原始神経外胚葉性腫瘍細胞株（PNET-109FH）および上衣腫細胞株（Epd-110GH）を含む様々なB7H3+細胞株とB7H3 CAR Ｔ細胞を使用して、細胞溶解アッセイを実施した。短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞はいずれもB7H3+細胞を効率的に溶解した（図1D）。短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞は、Med411FH細胞、D283細胞、PNET-109FH細胞またはEpd-110GH細胞による刺激に応答して、IFNγ、IL-2およびTNFαを含むサイトカインを産生した（図1D）。中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞は、短い（Ｓ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞と比較して、Med411FH細胞、PNET-109FH細胞またはEpd-110GH細胞による刺激に応答したサイトカインの産生量が大幅に多い傾向を示した。
【０１６９】
eGFPマーカーを発現するB7H3+U87腫瘍細胞2×106個をNOD-SCIDマウスに静脈内注射により移植した。このマーカーはGFPとfflucの融合タンパク質であり、ffluc部分はインビボでのイメージングに有用である。短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞を、腫瘍のないマウスまたはU87細胞を移植したマウスに尾静脈から注射した。Hudecek Mら（2013）に記載されている方法に従って、生物発光イメージングを実施した。NOD-SCIDマウスの体内に残っていた単球の活性により、野生型の長いスペーサーを含むCARの活性が抑制されたため、この実験では、長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞は使用しなかった。図1Eは、短い（Ｓ）スペーサー領域または中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞で処置したマウスが、コントロールマウスと比較して、U87腫瘍細胞の数の顕著な減少および生存率の顕著な上昇を示したことを示す。
【０１７０】
実施例２−インビトロおよびインビボにおけるB7H3 CAR Ｔ細胞の活性
短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つB7H3-CARをコードする各ポリヌクレオチドでCD4+Ｔ細胞およびCD8+Ｔ細胞を形質導入した。この実施例では、二重変異体（L235D、N297Q）を含む長いスペーサー領域を使用した。EGFRt、プロテインＬの結合パートナーである免疫グロブリン、および抗Fcの結合パートナーであるヒトFcを含む様々なタンパク質の発現を測定した（図2A）。長いスペーサー領域、中程度の長さのスペーサー領域または短いスペーサー領域を持つCARを含むB7H3 CAR Ｔ細胞において、EGFRtと前記免疫グロブリンが検出された。検出されたヒトFcの量は、長いスペーサー領域を持つCARを含むB7H3 CAR Ｔ細胞や中程度の長さのスペーサー領域を持つCARを含むB7H3 CAR Ｔ細胞よりも、短いスペーサー領域を持つCARを含むB7H3 CAR Ｔ細胞の方が少なかった。この結果は、短いスペーサーが特定のFc部分を含まないことと一致していた。形質導入したCD4+Ｔ細胞およびCD8+Ｔ細胞の様々な集団において、CD3ζの発現を測定した（図2B）。
【０１７１】
U87細胞（膠芽腫細胞株）、B7H3の発現を欠く改変U87細胞、Be2細胞（神経芽腫細胞株）およびD283細胞（髄芽腫細胞株）を含む様々な細胞株とB7H3 CAR Ｔ細胞を使用して、細胞溶解アッセイを実施した。短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞はいずれもB7H3+細胞を効率的に溶解した（図2C）。B7H3 CAR Ｔ細胞は、B7H3の発現を欠く改変U87細胞に対しては顕著な細胞傷害効果を示さなかった。短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞は、いずれもU87細胞、Be2細胞およびD283細胞のそれぞれに対して活性を示した。
【０１７２】
Jurkat細胞（Ｔ細胞株）、Jurkat OKT3細胞、U87細胞、B7H3の発現を欠く改変U87細胞、Be2細胞およびD283細胞を含む様々な細胞株による刺激に対するB7H3 CAR Ｔ細胞のサイトカイン産生をインビトロで測定した。短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するCD4+ B7H3 CAR Ｔ細胞はいずれも、Jurkat細胞、Jurkat OKT3細胞またはB7H3の発現を欠く改変U87細胞とインキュベートした場合と比較して、U87細胞、Be2細胞またはD283細胞による刺激に応答して多量のサイトカインを放出した（図2D）。中程度の長さの（Ｍ）のスペーサー領域を持つCARを有するCD4+ B7H3 CAR Ｔ細胞およびCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞を刺激すると、短い（Ｓ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するCD4+B7H3 CAR Ｔ細胞やCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞よりも有意に多量のサイトカインを放出した（図2D）。
【０１７３】
ffluc-eGFPマーカーを発現するU87細胞をNOD-SCIDマウスに接種した。短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞でマウスを処置した。短い（Ｓ）スペーサー領域、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞のいずれを使用した場合でも、マウスにおいて初期に検出されたU87細胞の数が減少した。特に、短いスペーサー領域（Ｓ）または中程度の長さの（Ｍ）のスペーサー領域を持つCARを有するCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞で処置したマウスでは、長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞で処置したマウスよりも、初期に検出されたU87細胞の数がさらに大幅かつ劇的に減少し、生存率も上昇した（図2E）。したがって、中程度の長さの（Ｍ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞は、短いスペーサー領域（Ｓ）または長い（Ｌ）スペーサー領域を持つCARを有するB7H3 CAR Ｔ細胞よりも、インビトロ活性およびインビボ活性が大幅に高いことが示された。
【０１７４】
実施例３−メトトレキサートによるB7H3 CAR Ｔ細胞の選択
中程度の長さのスペーサー領域とDHFR二重変異体（DHFRdm）選択マーカーを持つB7H3 CARをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターでCD4+Ｔ細胞を形質導入した。この細胞をメトトレキサートで処理した。様々な形質導入集団において、EGFRt、ヒトFabおよびヒトFcの発現を培養期間中に測定した（図3A）。処理を行った細胞において、EGFRt、ヒトFabおよびヒトFcが発現された。
【０１７５】
Jurkat細胞（Ｔ細胞株）、Jurkat OKT3細胞、U87細胞、B7H3の発現を欠く改変U87細胞、Be2細胞およびD283細胞を含む様々な細胞株による刺激に対するB7H3 CAR Ｔ細胞のサイトカインの産生をインビトロで測定した。U87細胞、Be2細胞またはD283細胞で刺激したB7H3 CAR Ｔ細胞におけるサイトカインの産生を測定した（図3B）。薬剤選択遺伝子（DHFRdm）を付加することにより、メトトレキサートの存在下において、CAR発現Ｔ細胞の濃縮が可能になる。
【０１７６】
実施例４−製造のための培養（プロダクションラン）におけるＴ細胞はB7H3陽性標的細胞株を溶解する
標的としての、51Crでそれぞれ標識したB7H3-（K562 B7H3 KO）細胞、コントロール細胞（K562 B7H3 KO＋OKT3）または様々なB7H3+細胞株（K562親細胞、U87MG細胞、U251TMG細胞、SKNBE2細胞およびD283 med細胞）を、中程度の長さのスペーサー領域を持つ第２世代（2GM）B7H3 CAR Ｔ細胞と４時間共培養した。シンチレーションカウンターを使用して、特異的な溶解を測定した（図４）。使用したB7H3 CAR Ｔ細胞は、CD4 Ｔ細胞（全体の55.7%）とCD8 Ｔ細胞（全体の44.2%）の混合物であり、EGFRtの陽性率が95%を超えていた。グラフに挿入されているヒストグラムは、各標的腫瘍細胞におけるB7H3の陽性率を示す。B7H3-K562（B7H3 KO）細胞株に対する特異的な溶解は、ほとんど検出されないか、まったく検出されなかった。これとは対照的に、コントロール細胞株および実験細胞株では顕著な特異的溶解が観察された。
【０１７７】
したがって、これらのデータから、B7H3 CAR Ｔ細胞がB7H3+コントロール細胞株および実験細胞株を特異的に溶解することが示された。
【０１７８】
実施例５−製造のための培養（プロダクションラン）におけるＴ細胞は、B7H3陽性標的細胞株との共培養時にサイトカインを産生する
標的としての、B7H3-（K562 B7H3 KO）細胞、コントロール細胞（K562 B7H3 KO＋OKT3）または様々なB7H3+細胞株（K562親細胞、U87MG細胞、U251TMG細胞、SKNBE2細胞およびD283 med細胞）を、中程度の長さのスペーサー領域を持つ第２世代（2GM）B7H3 CAR Ｔ細胞と24時間共培養した。使用したB7H3 CAR Ｔ細胞は、CD4 Ｔ細胞（全体の55.7%）とCD8 Ｔ細胞（全体の44.2%）の混合物であり、EGFRtの陽性率が95%を超えていた。グラフ（図５）は、目的とする様々な標的細胞との共培養により刺激した際のMock細胞またはB7H3 CAR Ｔ細胞によるサイトカインの放出量を示す。サイトカインとして、IFNγ、IL-2およびTNFαを測定した。
【０１７９】
これらのデータから、コントロール細胞（K562 B7H3 KO＋OKT3）または様々なB7H3+細胞株（K562親細胞、U87MG細胞およびSKNBE2細胞）と共培養したＴ細胞は各サイトカインを産生したが、B7H3-（K562 B7H3 KO）細胞と共培養したＴ細胞は、IFNγ、IL-2およびTNFαのいずれのサイトカインも産生しなかったことが示された（図５）。
【０１８０】
実施例６−製造のための培養（プロダクションラン）におけるＴ細胞は、インビボにおいてU87腫瘍細胞を根絶することができる
U87細胞をマウスに接種した後、現在使用されている組織培養製造センター（TCPC）のＴ細胞製造プロトコルまたは過去のPLAT-02製造プロトコルを使用して製造したCD4+ B7H3 CAR Ｔ細胞およびCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞でこのマウスを処置した。このマウスにおいてfflucマーカーで検出したB7H3+ U87腫瘍細胞の数と、このマウスの生存率を図６に示す。
【０１８１】
０日目に、約200,000個のGFP:ffluc U87腫瘍細胞（cJ06289）をマウスの頭蓋内に注射した（図６）。６日目に、（イメージングによる）フラックス解析を実施して、マウスの頭蓋内に腫瘍細胞が存在することを確認した（図６）。７日目に、CD4 Ｔ細胞とCD8 Ｔ細胞の比率を１：１とした2×106個のB7H3 CAR Ｔ細胞を頭蓋内の同じ座標に投与した。試験の終了まで、すなわち、90日目まで（イメージングによる）フラックス解析および生存率をモニターした（図６）。
【０１８２】
これらのデータから、いずれのB7H3 CAR Ｔ細胞集団を使用した場合でも、この頭蓋内U87モデルにおいてフラックスを減少させ、生存を延長させることができることが示された（図６）。したがって、これらのデータから、B7H3 CAR Ｔ細胞がインビボにおいてU87腫瘍細胞を根絶できることが示された。
【０１８３】
実施例７−製造のための培養（プロダクションラン）におけるＴ細胞は、インビボにおいて皮下腫瘍細胞を根絶することができる
Be2細胞をマウスに接種した後、現在使用されている組織培養製造センター（TCPC）のＴ細胞製造プロトコルまたは過去のCD19 CAR Ｔ細胞製造用PLAT-02プロトコルを使用して製造したCD4+B7H3 CAR Ｔ細胞およびCD8+B7H3 CAR Ｔ細胞またはCD4+CD19 CAR Ｔ細胞およびCD8+CD19 CAR Ｔ細胞でこのマウスを処置した。このマウスにおいてfflucマーカーで検出したB7H3+ Be2腫瘍細胞の数と、このマウスの生存率を図７に示す。
【０１８４】
このモデルでは、約4.3×106個のCD19t GFP:ffluc Be2腫瘍細胞（cJ06713）を０日目に皮下注射した（図７）。４日目に、（イメージングによる）フラックス解析を実施して、マウスの体内に腫瘍細胞が存在することを確認した（図７）。５日目に、CD4 Ｔ細胞とCD8 Ｔ細胞の比率を１：１とした約20×106個のCAR Ｔ細胞を静脈内注射で投与した（図７）。試験の終了まで、すなわち、90日目まで（イメージングによる）フラックス解析および生存率をモニターした（図７）。
【０１８５】
これらのデータから、B7H3 CAR Ｔ細胞とCD19 CAR Ｔ細胞のいずれを使用した場合でも、この皮下腫瘍Be2モデルにおいてフラックスを減少させ、生存を延長させることができることが示された（図７）。したがって、これらのデータから、B7H3 CAR Ｔ細胞とCD19 CAR Ｔ細胞はいずれも、インビボにおいて皮下腫瘍細胞を根絶できることが示された。
【０１８６】
実施例８−製造のための培養（プロダクションラン）におけるＴ細胞は、インビボにおいて皮下腫瘍細胞を根絶することができる
Be2細胞をマウスに接種した後、現在使用されている組織培養製造センター（TCPC）のＴ細胞製造プロトコルまたは過去のＴ細胞製造用PLAT-02プロトコルを使用して製造したCD4+B7H3 Ｔ細胞およびCD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞でこのマウスを処置した。このマウスにおいてfflucマーカーで検出したB7H3+ Be2腫瘍細胞の数と、このマウスの生存率を図８に示す。
【０１８７】
このモデルでは、約5×106個のCD19t GFP:ffluc Be2腫瘍細胞（cJ06713）を０日目に皮下注射した（図８）。６日目に、（イメージングによる）フラックス解析を実施して、マウスの体内に腫瘍細胞が存在すること確認した（図８）。５日目に、CD4 Ｔ細胞とCD8 Ｔ細胞の比率を１：１とした30×106個のB7H3 CAR Ｔ細胞を静脈内注射で投与した（図８）。試験の終了まで、すなわち、75日目まで（イメージングによる）フラックス解析および生存率をモニターした（図８）。
【０１８８】
これらのデータから、いずれのB7H3 CAR Ｔ細胞ロットを使用した場合でも、この皮下腫瘍Be2モデルにおいてフラックスを減少させ、生存を延長させることができることが示された（図８）。したがって、これらのデータから、これらのB7H3 CAR Ｔ細胞ロットはいずれも、インビボにおいて皮下腫瘍細胞を根絶できることが示された。
【０１８９】
実施例９−CD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞は、インビボにおいてU251T神経膠腫細胞を根絶することができる
U251T細胞を接種した後、CD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞で処置したマウスにおいて、fflucマーカーで検出したB7H3+ U251T腫瘍細胞の数と、このマウスの生存率を図９に示す。
【０１９０】
このモデルでは、約200,000個のGFP:ffluc U251T腫瘍細胞（cJ06194）を０日目に頭蓋内注射した（図９）。６日目に、（イメージングによる）フラックス解析を実施して、マウスの頭蓋内に腫瘍細胞が存在することを確認した（図９）。７日目に、約2×106個のMock細胞またはB7H3 CAR Ｔ細胞を頭蓋内の同じ座標に投与した。試験の終了まで、すなわち、90日目まで（イメージングによる）フラックス解析および生存率をモニターした（図９）。
【０１９１】
これらのデータから、B7H3 CAR Ｔ細胞集団を使用した場合、この頭蓋内U251Tモデルにおいてフラックスを減少させ、生存を延長させることができることが示された（図９）。したがって、これらのデータから、CD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞がインビボにおいてU251T神経膠腫細胞を根絶できることが示された。
【０１９２】
実施例１０−CD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞は、インビボにおいてびまん性内在性橋膠腫（DIPG）の原発腫瘍細胞を根絶することができる
DIPG細胞を接種した後、CD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞で処置したマウスにおいて、fflucマーカーで検出したB7H3+ DIPG腫瘍細胞の数と、このマウスの生存率を図10に示す。
【０１９３】
このモデルでは、約0.2×106個のmCherry:ffluc Pbt09mcl DIPG腫瘍細胞を０日目に頭蓋内注射した（図10）。39日目に、（イメージングによる）フラックス解析を実施して、マウスの頭蓋内に腫瘍細胞が存在することを確認した（図10）。40日目に、約2×106個のCD8バルクMock細胞またはCD8バルクB7H3 CAR Ｔ細胞を同じ座標に投与した（図10）。試験の終了まで、すなわち、90日目まで（イメージングによる）フラックス解析および生存率をモニターした（図10）。Mock群が腫瘍で死亡する前に試験を終了したが、B7H3 CAR Ｔ細胞による処置では、Mock処置群と比較してフラックスをベースラインまで低下させることができた。DIPGは、稀な種類の腫瘍であり、現在、細胞免疫療法によるアプローチの対象にはなっていない。
【０１９４】
これらのデータから、このB7H3 CAR Ｔ細胞集団を使用した場合、この頭蓋内DIPGモデルにおいてフラックスを減少させ、生存を延長させることができることが示された（図10）。したがって、これらのデータから、CD8+ B7H3 CAR Ｔ細胞がインビボにおいてDIPGの原発腫瘍細胞を根絶できることが示された。
【０１９５】
本明細書で使用されている「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」、「含む（containing）」または「特徴とする（characterized by）」という用語と同義であるとともに、オープンエンドで包括的な意味であり、本明細書には記載されていないさらなる要素や工程を除外するものではない。
【０１９６】
前述の説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示するものである。本発明の方法および材料は、変更することができ、製造方法および器具も変更することができる。このような変更は、本明細書に開示された本発明の実施または本開示を考慮に入れて、当業者であれば容易に理解することができる。したがって、本発明は、本明細書に開示された特定の実施形態に限定されず、本発明の真の範囲および要旨において可能なあらゆる変更およびその他の態様を包含する。
【０１９７】
本明細書において引用された公開特許出願、非公開特許出願、特許および学術文献を含む（ただしこれらに限定されない）すべての参考文献は、引用によりその全体が本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する。引用によって援用された文献、特許または特許出願が本明細書の開示内容と矛盾する場合、このような矛盾事項よりも本明細書の記載が採用および／または優先される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ−１】
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【図１Ｄ−２】
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【図１Ｄ−３】
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【図１Ｄ−４】
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【図１Ｄ−５】
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【図１Ｄ−６】
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【図１Ｄ−７】
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【図１Ｄ−８】
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【図１Ｅ−１】
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【図１Ｅ−２】
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【図１Ｅ−３】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図２Ｅ−１】
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【図２Ｅ−２】
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【図２Ｅ−３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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