(57)【要約】  パーキンソン病を正確に同定するための方法及び組成物を開示する。より具体的には、本開示は、生存中の組織サンプルにおける、パーキンソン病の判定に関する。
2021534381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象がパーキンソン病（ＰＤ）を有するか否かの判定方法であって、
（ａ）前記対象の少なくとも１つの神経的形質を含む生体サンプルを、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触させることと、
（ｂ）前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体が、前記生体サンプルの前記神経的形質内で局在化するか否かを検出することと、
（ｃ）前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体が前記神経的形質内で局在化するときに、前記対象がＰＤを有すると判定することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプルが組織サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経的形質が神経細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記神経的形質が以前の神経細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記神経的形質が神経細胞に隣接している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触する前に、少なくとも１つのプロテアーゼと接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルを少なくとも１つのホスファターゼと接触させることを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象の前記生体サンプルを、前記神経的形質を結合可能な一次抗体と接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記神経的形質に結合可能な前記一次抗体が、ユビキチンＣ末端加水分解酵素Ｌ１（ＰＧＰ９．５、ＵＣＨＬ１、ＮＤＧＯＡ；ＰＡＲＫ５；ＰＧＰ９５；ＳＰＧ７９；Ｕｃｈ−Ｌ１；ＨＥＬ−１１７；ＰＧＰ  ９．５；ＨＥＬ−Ｓ−５３）、ＲＮＡ結合ｆｏｘ−１ホモログ３（ＲＢＦＯＸ３、ＦＯＸ３、ＮＥＵＮ、ＦＯＸ−３、ＨＲＮＢＰ３）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２、ＭＡＰ２Ａ、ＭＡＰ２Ｂ、ＭＡＰ２Ｃ）、１６０ｋＤａの中神経フィラメント（ＮＥＦＭ、ＮＦＭ、ＮＥＦ３、ＮＦ−Ｍ）、２００ｋＤａの重神経フィラメント（ＮＥＦＨ、ＮＦＨ、ＣＭＴ２ＣＣ）、シナプトフィジン（ＳＹＰ、ＭＲＸ９６、ＭＲＸＳＹＰ）、及び、ディスク大型ＭＡＧＵＫ足場タンパク質４（ＤＬＧ４、ＤＬＧＨ４、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ９５、ＳＡＰ−９０、ＳＡＰ９０、ＳＡＰ９０Ａ）からなる群から選択されるタンパク質を結合可能な抗体から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出することが組織化学的分析を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体が、残基Ｓ１２９においてリン酸化したα−シヌクレインを検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが凍結サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが前記神経的形質の切片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、皮膚組織、結腸組織、及び顎下腺からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体、及び、前記神経的形質に結合可能な一次抗体が同一の宿主種に由来し、前記宿主種がマウス又はウサギである、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）が、前記サンプルを、抱合体化した第１のラベルを有する第１の二次抗体と接触させることを更に含み、前記第１の二次抗体が、前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と免疫反応性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルを、前記第１の二次抗体の前記第１のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と接触させて、前記サンプルのリン酸化α−シヌクレインの近くで、第１の検出可能なシグナルを生成することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルを前記神経的形質に結合可能な前記一次抗体と接触させる前に、前記方法が、前記サンプルを１００℃で少なくとも１５分間インキュベートすることによって、前記サンプル中の前記免疫複合体を変性させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、前記サンプルを、抱合体化した第２のラベルを有する、第２の二次抗体と接触させることを更に含み、前記第２の二次抗体が、前記神経的形質を結合可能な前記一次抗体と免疫反応性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルを、前記第２の二次抗体の前記第２のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と反応させて、前記サンプルの前記神経的形質の近くで、第２の検出可能なシグナルを生成することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の検出可能なシグナルと前記第２の検出可能なシグナルが異なっている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の検出可能なシグナルが銀染色であり、前記第２の検出可能なシグナルがＱＭ−Ｄａｂｓｙｌ又はＦａｓｔ−Ｒｅｄである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象がＰＤを有する疑いがある、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と、
（ｂ）神経的形質に結合可能な一次抗体と、
を含むキット。
【請求項２７】
（ａ）抱合体化した第１のラベルを有する第１の二次抗体であって、前記第１の二次抗体が、前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な前記一次抗体と免疫反応性である第１の二次抗体と、
（ｂ）前記第１の二次抗体の前記第１のラベルと反応したとき、第１の検出可能なシングルを生成するひとまとまりの試薬と、
（ｃ）抱合体化した第２のラベルを有する第２の二次抗体であって、前記第２の二次抗体が、前記神経的形質を結合可能な前記一次抗体と免疫反応性である、第２の二次抗体と、
（ｄ）前記第２の二次抗体の前記第２のラベルと反応したとき、第２の検出可能なシングルを生成するひとまとまりの試薬と、
を更に含み、
前記第１の検出可能なシグナルと前記第２の検出可能なシグナルが異なっている、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記第１の検出可能なシグナルが銀染色であり、前記第２の検出可能なシグナルがＱＭ−Ｄａｂｓｙｌ又はＦａｓｔ−Ｒｅｄである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記神経的形質に結合可能な前記一次抗体が、ユビキチンＣ末端加水分解酵素Ｌ１（ＰＧＰ９．５、ＵＣＨＬ１、ＮＤＧＯＡ；ＰＡＲＫ５；ＰＧＰ９５；ＳＰＧ７９；Ｕｃｈ−Ｌ１；ＨＥＬ−１１７；ＰＧＰ  ９．５；ＨＥＬ−Ｓ−５３）、ＲＮＡ結合ｆｏｘ−１ホモログ３（ＲＢＦＯＸ３、ＦＯＸ３、ＮＥＵＮ、ＦＯＸ−３、ＨＲＮＢＰ３）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２、ＭＡＰ２Ａ、ＭＡＰ２Ｂ、ＭＡＰ２Ｃ）、１６０ｋＤａの中神経フィラメント（ＮＥＦＭ、ＮＦＭ、ＮＥＦ３、ＮＦ−Ｍ）、２００ｋＤａの重神経フィラメント（ＮＥＦＨ、ＮＦＨ、ＣＭＴ２ＣＣ）、シナプトフィジン（ＳＹＰ、ＭＲＸ９６、ＭＲＸＳＹＰ）、及び、ディスク大型ＭＡＧＵＫ足場タンパク質４（ＤＬＧ４、ＤＬＧＨ４、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ９５、ＳＡＰ−９０、ＳＡＰ９０、ＳＡＰ９０Ａ）からなる群から選択されるタンパク質を結合可能な抗体から選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
対象がパーキンソン病（ＰＤ）を有するか否かの判定方法であって、
（ａ）ＰＤを有することが疑われる対象から、生体サンプルの固定又は凍結切片を調製することと、
（ｂ）リン酸化α−シヌクレインが前記切片の神経的形質内で局在化するか否かを検出することと、
（ｃ）リン酸化α−シヌクレインが神経的形質内で局在化するときに、前記対象をＰＤと診断することと、
を含む、方法。
【請求項３１】
工程（ｃ）が、
前記切片を、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体及び前記神経的形質を結合可能な一次抗体と接触させることを更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記神経的形質に結合可能な一次抗体が、ユビキチンＣ末端加水分解酵素Ｌ１（ＰＧＰ９．５、ＵＣＨＬ１、ＮＤＧＯＡ；ＰＡＲＫ５；ＰＧＰ９５；ＳＰＧ７９；Ｕｃｈ−Ｌ１；ＨＥＬ−１１７；ＰＧＰ  ９．５；ＨＥＬ−Ｓ−５３）、ＲＮＡ結合ｆｏｘ−１ホモログ３（ＲＢＦＯＸ３、ＦＯＸ３、ＮＥＵＮ、ＦＯＸ−３、ＨＲＮＢＰ３）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２、ＭＡＰ２Ａ、ＭＡＰ２Ｂ、ＭＡＰ２Ｃ）、１６０ｋＤａの中神経フィラメント（ＮＥＦＭ、ＮＦＭ、ＮＥＦ３、ＮＦ−Ｍ）、２００ｋＤａの重神経フィラメント（ＮＥＦＨ、ＮＦＨ、ＣＭＴ２ＣＣ）、シナプトフィジン（ＳＹＰ、ＭＲＸ９６、ＭＲＸＳＹＰ）、及び、ディスク大型ＭＡＧＵＫ足場タンパク質４（ＤＬＧ４、ＤＬＧＨ４、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ９５、ＳＡＰ−９０、ＳＡＰ９０、ＳＡＰ９０Ａ）からなる群から選択されるタンパク質を結合可能な抗体から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｉ．前記切片を、抱合体化した第１のラベルを有する第１の二次抗体であって、前記第１の二次抗体が、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な前記一次抗体と免疫反応性である第１の二次抗体と接触させることと、
ｉｉ．前記切片を、抱合体化した第２のラベルを有する第２の二次抗体であって、前記第２の二次抗体が、前記神経的形質を結合可能な前記一次抗体と免疫反応性である、第２の二次抗体と接触させることと、
を更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ｉ．前記切片を、前記第１の二次抗体の前記第１のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と接触させて、前記サンプルのリン酸化α−シヌクレインの近くで、第１の検出可能なシグナルを生成することと、
ｉｉ．前記切片を、前記第２の二次抗体の前記第２のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と反応させて、前記サンプルの前記神経的形質の近くで、第２の検出可能なシグナルを生成することと、
を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記切片を前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触させた後、及び、前記切片を前記神経的形質を結合可能な前記一次抗体と接触させる前に、前記サンプル中で免疫複合体を変性させることを更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記切片が、一次抗体と接触する前に、少なくとも１つのプロテアーゼと接触する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記切片を少なくとも１つのホスファターゼと接触させることを更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体及び前記神経的形質を結合可能な前記一次抗体が、同一の宿主種に由来する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の検出可能なシグナルと前記第２の検出可能なシグナルが異なっている、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の検出可能なシグナルが銀染色であり、前記第２の検出可能なシグナルがＱＭ−Ｄａｂｓｙｌ又はＦａｓｔ−Ｒｅｄである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
対象におけるＰＤの診断方法であって、
（ａ）ＰＤを有することが疑われる対象由来の少なくとも１つの神経的形質を含む生体サンプルを得ることと、
（ｂ）前記サンプルを抗ＰＧＰ．５抗体と接触させ、リン酸化α−シヌクレインとＰＧＰ９．５との同時局在化を判定することにより、リン酸化α−シヌクレインが前記サンプルの前記神経的形質により局在化するか否かを検出することと、
（ｃ）前記神経的形質において、リン酸化α−シヌクレインとＰＧＰ９．５との同時局在化があることが断定的に判定されたとき、前記対象をＰＤと診断することと、
を含む、方法。
【請求項４２】
対象におけるＰＤの診断及び治療方法であって、
（ａ）ＰＤを有することが疑われる対象由来の少なくとも１つの神経的形質を含む生体サンプルを得ることと、
（ｂ）前記サンプルを抗ＰＧＰ．５抗体と接触させ、リン酸化α−シヌクレインとＰＧＰ９．５との同時局在化を判定することにより、リン酸化α−シヌクレインが前記サンプルの前記神経的形質により局在化するか否かを検出することと、
（ｃ）前記神経的形質において、リン酸化α−シヌクレインとＰＧＰ９．５との同時局在化があることが断定的に判定されたとき、前記対象をＰＤと診断することと、
（ｄ）ＰＤを有すると診断された前記対象において、ＰＤを治療する治療法を投与することと、
を含む、方法。
【請求項４３】
ＰＤと診断された対象の治療方法であって、前記対象に、α−シヌクレイン抗体の効果的な治療方式を投与することを含み、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な抗体、及び、神経的形質を結合可能な抗体が、前記対象由来の皮膚サンプルの神経的形質内で同時局在化することが示されている、方法。
【請求項４４】
ＰＤを有すると判定された対象の治療方法であって、前記対象に、α−シヌクレイン抗体の効果的な治療方式を投与することを含み、前記対象が、請求項１〜２５、又は３０〜４１のいずれか一項に記載の方法により、ＰＤを有すると判定された方法。
【請求項４５】
α−シヌクレイン抗体の前記効果的な治療方式が、α−シヌクレインの残基１〜２０、α−シヌクレインの残基１〜１０、α−シヌクレインの残基４〜１５、α−シヌクレインの残基９１〜９９、α−シヌクレインの残基１１７〜１２３、α−シヌクレインの残基１１８〜１２６内で結合するモノクローナル抗体；プラシネズマブ（ＰＲＸ００２）；抗体クローン１Ｈ７（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２２０）のＣＤＲを有するヒト化抗体；抗体クローン９Ｅ４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２２１）のＣＤＲ、抗体クローンＮＩ−２０２．２１Ｄ１１のＣＤＲ、及び抗体クローンＮＩ−２０２．１２Ｆ４のＣＤＲを有するヒト化抗体、例えば、米国特許第８，０９２，８０１号、同第８，６０９，８２０号、同第８，７９０，６４４号、同第８，９４０，２７６号、同第９，５８０，４９３号に開示されているα−シヌクレイン抗体などからなる群から選択されるα−シヌクレイン抗体を含む、請求項４３又は請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な抗体が、Ｒｏｃｈｅ製のモノクローナル抗体クローン７Ｅ２、Ｒｏｃｈｅ製のモノクローナル抗体クローン３Ｇ２、Ａｂｃａｍ製のモノクローナル抗体クローンＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）（Ｐ／Ｎ  ａｂ１６８３８１）、Ａｂｃａｍ製のモノクローナル抗体Ｐ−ｓｙｎ／８１Ａ（Ｐ／Ｎ  ａｂ１８４６７４）、ＷＡＫＯ製のモノクローナル抗体クローンｐＳｙｎ＃６４（Ｐ／Ｎ  ０１５−２５１９１）、Ａｂｃａｍ製のモノクローナル抗体クローンＬＢ５０９（Ｐ／Ｎ  ａｂ２７７６６）、Ｐｒｏｔｈｅｎａ製のモノクローナル抗体クローン５Ｃ１２（ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＰＴＡ−９１９７）、及び、Ｐｒｏｔｈｅｎａ製のモノクローナル抗体クローン１１Ａ５（ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＰＴＡ−８２２２）のうちの１つである、請求項１〜２５、若しくは３０〜３１のいずれか一項に記載の方法、又は、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
前記神経的形質を結合可能な前記一次抗体が、Ａｂｃａｍ製のモノクローナル抗体クローンＥＰＲ４１１８（Ｐ／Ｎ  ａｂ１０８９８６）、Ａｂｃａｍ製のモノクローナル抗体クローン１３Ｃ／Ｉ３Ｃ４（Ｐ／Ｎ  ａｂ８１８９）、又は、Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ（商標）製の、ＲＴＤ  Ｐ／Ｎ  ７６０−４４３４とのポリクローナル抗体のうちの１つである、請求項１〜２５、若しくは３０〜３１のいずれか一項に記載の方法、又は、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４８】
リン酸化α−シヌクレインの検出方法であって、
（ａ）生体サンプルを、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触させることと、
（ｂ）前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体を検出することと、
を含む、方法。
【請求項４９】
前記サンプルが、前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触する前に、少なくとも１つのプロテアーゼと接触する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記サンプルを少なくとも１つのホスファターゼと接触させることを更に含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記検出することが組織化学的分析を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体が、残基Ｓ１２９においてリン酸化したα−シヌクレインを検出する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体が、７Ｅ２抗体クローン、又は３Ｇ２抗体クローンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記サンプルが固定されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記サンプルが、ホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記サンプルが凍結サンプルである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
工程（ａ）が、前記サンプルを、抱合体化した第１のラベルを有する第１の二次抗体と接触させることを更に含み、前記第１の二次抗体が、前記リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と免疫反応性である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記サンプルを、前記第１の二次抗体の前記第１のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と接触させて、前記サンプルのリン酸化α−シヌクレインの近くで、第１の検出可能なシグナルを生成することを更に含む、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年８月９日に出願された、米国特許仮出願第６２／７１６，５０４号の利益を主張し、当該出願は、本明細書中にその全体が参照により組み込まれている。
【０００２】
分野
本開示は、パーキンソン病の正確な同定のための方法及び組成物に関する。より具体的には、本開示は、生存中の組織サンプルにおける、パーキンソン病の判定に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
パーキンソン病（ＰＤ）は現在、対象の症状の臨床検査、及び、脳内でのドーパミントランスポーター機能のイメージング（ＤａＴｓｃａｎ）により評価されている。パーキンソン病用の治療薬の開発は、ＰＤを有する対象を正確に同定する診断試験が存在しないことにより、妨げられている。ＰＤの決定的な診断は、脳の黒質領域におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失と組み合わさり、ニューロンに凝集したα−シヌクレイン（ａＳｙｎ）が存在することであり、死後にのみ生じ得る。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、生存中の対象において、パーキンソン病を決定的かつ正確に同定する、当該技術分野における必要性を特定した。
【０００５】
対象がパーキンソン病（ＰＤ）を有するか否かの判定方法であって、（ａ）対象の少なくとも１つの神経的形質を含む生体サンプルを、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触させることと、（ｂ）リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体が、生体サンプルの神経的形質内で局在化するか否かを検出することと、（ｃ）リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体が神経的形質内で局在化するときに、対象がＰＤを有すると判定することと、を含む、方法を本明細書で提供する。
【０００６】
方法のいくつかにおいて、サンプルは組織サンプルを含む。方法のいくつかにおいて、神経的形質は神経細胞を含む。方法のいくつかにおいて、神経的形質は、以前の神経細胞を含む。方法のいくつかにおいて、神経的形質は神経細胞に隣接している。
【０００７】
方法のいくつかにおいて、サンプルは、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触する前に、少なくとも１つのプロテアーゼと接触する。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルを少なくとも１つのホスファターゼと接触させることを更に含む。
【０００８】
方法のいくつかにおいて、方法は、対象の生体サンプルを、神経的形質を結合可能な一次抗体と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、神経的形質に結合可能な一次抗体は、ユビキチンＣ末端加水分解酵素Ｌ１（ＰＧＰ９．５、ＵＣＨＬ１、ＮＤＧＯＡ；ＰＡＲＫ５；ＰＧＰ９５；ＳＰＧ７９；Ｕｃｈ−Ｌ１；ＨＥＬ−１１７；ＰＧＰ  ９．５；ＨＥＬ−Ｓ−５３）、ＲＮＡ結合ｆｏｘ−１ホモログ３（ＲＢＦＯＸ３、ＦＯＸ３、ＮＥＵＮ、ＦＯＸ−３、ＨＲＮＢＰ３）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２、ＭＡＰ２Ａ、ＭＡＰ２Ｂ、ＭＡＰ２Ｃ）、１６０ｋＤａの中神経フィラメント（ＮＥＦＭ、ＮＦＭ、ＮＥＦ３、ＮＦ−Ｍ）、２００ｋＤａの重神経フィラメント（ＮＥＦＨ、ＮＦＨ、ＣＭＴ２ＣＣ）、シナプトフィジン（ＳＹＰ、ＭＲＸ９６、ＭＲＸＳＹＰ）、及び、ディスク大型ＭＡＧＵＫ足場タンパク質４（ＤＬＧ４、ＤＬＧＨ４、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ９５、ＳＡＰ−９０、ＳＡＰ９０、ＳＡＰ９０Ａ）からなる群から選択されるタンパク質を結合可能な抗体から選択される。
【０００９】
方法のいくつかにおいて、検出することは、組織化学的分析を含む。方法のいくつかにおいて、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体は、残基Ｓ１２９においてリン酸化したα−シヌクレインを検出する。
【００１０】
方法のいくつかにおいて、サンプルは固定されている。いくつかの実施形態では、サンプルはホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである。方法のいくつかにおいてサンプルは凍結サンプルである。方法のいくつかにおいて、サンプルは、神経的形質の切片を含む。方法のいくつかにおいて、サンプルは、皮膚組織、結腸組織、及び顎下腺からなる群から選択される。
【００１１】
方法のいくつかにおいて、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体、及び、神経的形質に結合可能な一次抗体は、宿主種がマウス又はウサギである、同一の宿主種に由来する。
【００１２】
方法のいくつかにおいて、工程（ａ）は、サンプルを、抱合体化した第１のラベルを有する第１の二次抗体であって、当該第１の二次抗体が、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と免疫反応性である第１の二次抗体と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルを、第１の二次抗体の第１のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と接触させて、サンプルのリン酸化α−シヌクレインの近くで、第１の検出可能なシグナルを生成することを含む。
【００１３】
方法のいくつかにおいて、サンプルを神経的形質に結合可能な一次抗体と接触させる前に、方法は、サンプルを１００℃で少なくとも１５分間インキュベートすることによって、サンプル中の免疫複合体を変性させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルを、抱合体化した第２のラベルを有する第２の二次抗体であって、当該第２の二次抗体が、神経的形質を結合可能な一次抗体と免疫反応性である第２の二次抗体と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルを、第２の二次抗体の第２のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と反応させて、サンプルの神経的形質の近くで、第２の検出可能なシグナルを生成することを含む。いくつかの実施形態では、第１の検出可能なシグナルと第２の検出可能なシグナルは異なっている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能なシグナルは銀染色であり、第２の検出可能なシグナルはＱＭ−Ｄａｂｓｙｌ又はＦａｓｔ−Ｒｅｄである。
【００１４】
方法のいくつかにおいて、対象はＰＤを有することが疑われている。
【００１５】
本明細書においては、（ａ）リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体；及び（ｂ）神経的形質に結合可能な一次抗体を含むキットもまた提供される。いくつかの実施形態では、キットは、（ｃ）抱合体化した第１のラベルを有する、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と免疫反応性の第１の二次抗体；（ｄ）第１の二次抗体の第１のラベルと反応したとき、第１の検出可能なシングルを生成するひとまとまりの試薬；（ｅ）抱合体化した第２のラベルを有する、神経的形質を結合可能な一次抗体と免疫反応性の第２の二次抗体；及び、（ｆ）第２の二次抗体の第２のラベルと反応したとき、第２の検出可能なシングルを生成するひとまとまりの試薬を更に含み、第１の検出可能なシグナルと第２の検出可能なシグナルは異なっている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能なシグナルは銀染色であり、第２の検出可能なシグナルはＱＭ−Ｄａｂｓｙｌ又はＦａｓｔ−Ｒｅｄである。
【００１６】
キットのいくつかにおいて、神経的形質に結合可能な一次抗体は、ユビキチンＣ末端加水分解酵素Ｌ１（ＰＧＰ９．５、ＵＣＨＬ１、ＮＤＧＯＡ；ＰＡＲＫ５；ＰＧＰ９５；ＳＰＧ７９；Ｕｃｈ−Ｌ１；ＨＥＬ−１１７；ＰＧＰ  ９．５；ＨＥＬ−Ｓ−５３）、ＲＮＡ結合ｆｏｘ−１ホモログ３（ＲＢＦＯＸ３、ＦＯＸ３、ＮＥＵＮ、ＦＯＸ−３、ＨＲＮＢＰ３）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２、ＭＡＰ２Ａ、ＭＡＰ２Ｂ、ＭＡＰ２Ｃ）、１６０ｋＤａの中神経フィラメント（ＮＥＦＭ、ＮＦＭ、ＮＥＦ３、ＮＦ−Ｍ）、２００ｋＤａの重神経フィラメント（ＮＥＦＨ、ＮＦＨ、ＣＭＴ２ＣＣ）、シナプトフィジン（ＳＹＰ、ＭＲＸ９６、ＭＲＸＳＹＰ）、及び、ディスク大型ＭＡＧＵＫ足場タンパク質４（ＤＬＧ４、ＤＬＧＨ４、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ９５、ＳＡＰ−９０、ＳＡＰ９０、ＳＡＰ９０Ａ）からなる群から選択されるタンパク質を結合可能な抗体から選択される。
【００１７】
本明細書において、対象がパーキンソン病（ＰＤ）を有するか否かの判定方法であって、（ａ）ＰＤを有することが疑われる対象から、生体サンプルの固定又は凍結切片を調製することと、（ｂ）リン酸化α−シヌクレインが切片の神経的形質内で局在化するか否かを検出することと、（ｃ）リン酸化α−シヌクレインが神経的形質内で局在化するときに、対象をＰＤと診断することと、を含む、方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、工程（ｃ）は、（ｄ）切片を、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体及び神経的形質を結合可能な一次抗体と接触させることを更に含む。
【００１８】
方法のいくつかにおいて、神経的形質に結合可能な一次抗体は、ユビキチンＣ末端加水分解酵素Ｌ１（ＰＧＰ９．５、ＵＣＨＬ１、ＮＤＧＯＡ；ＰＡＲＫ５；ＰＧＰ９５；ＳＰＧ７９；Ｕｃｈ−Ｌ１；ＨＥＬ−１１７；ＰＧＰ  ９．５；ＨＥＬ−Ｓ−５３）、ＲＮＡ結合ｆｏｘ−１ホモログ３（ＲＢＦＯＸ３、ＦＯＸ３、ＮＥＵＮ、ＦＯＸ−３、ＨＲＮＢＰ３）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２、ＭＡＰ２Ａ、ＭＡＰ２Ｂ、ＭＡＰ２Ｃ）、１６０ｋＤａの中神経フィラメント（ＮＥＦＭ、ＮＦＭ、ＮＥＦ３、ＮＦ−Ｍ）、２００ｋＤａの重神経フィラメント（ＮＥＦＨ、ＮＦＨ、ＣＭＴ２ＣＣ）、シナプトフィジン（ＳＹＰ、ＭＲＸ９６、ＭＲＸＳＹＰ）、及び、ディスク大型ＭＡＧＵＫ足場タンパク質４（ＤＬＧ４、ＤＬＧＨ４、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ９５、ＳＡＰ−９０、ＳＡＰ９０、ＳＡＰ９０Ａ）からなる群から選択されるタンパク質を結合可能な抗体から選択される。
【００１９】
方法のいくつかにおいて、方法は、切片を、抱合体化した第１のラベルを有する第１の二次抗体であって、当該第１の二次抗体が、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と免疫反応性である第１の二次抗体と接触させることと、切片を、抱合体化した第２のラベルを有する第２の二次抗体であって、当該第２の二次抗体が、神経的形質を結合可能な一次抗体と免疫反応性である第２の二次抗体と接触させることと、を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、切片を、第１の二次抗体の第１のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と接触させて、サンプルのリン酸化α−シヌクレインの近くで、第１の検出可能なシグナルを生成することと、切片を、第２の二次抗体の第２のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と反応させて、サンプルの神経的形質の近くで、第２の検出可能なシグナルを生成することと、を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、切片をリン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触させた後、及び、切片を神経的形質を結合可能な一次抗体と接触させる前に、サンプル中で免疫複合体を変性させることを更に含む。
【００２０】
方法のいくつかにおいて、切片は、一次抗体と接触する前に、少なくとも１つのプロテアーゼと接触する。いくつかの実施形態では、方法は、切片を少なくとも１つのホスファターゼと接触させることを更に含む。
【００２１】
方法のいくつかにおいて、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体及び神経的形質を結合可能な一次抗体は、同一の宿主種に由来する。
【００２２】
方法のいくつかにおいて、第１の検出可能なシグナルと第２の検出可能なシグナルは異なっている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能なシグナルは銀染色であり、第２の検出可能なシグナルはＱＭ−Ｄａｂｓｙｌ又はＦａｓｔ−Ｒｅｄである。
【００２３】
本明細書において、対象におけるＰＤの診断方法であって、（ａ）ＰＤを有することが疑われる対象由来の少なくとも１つの神経的形質を含む生体サンプルを得ることと、（ｂ）サンプルを抗ＰＧＰ．５抗体と接触させ、リン酸化α−シヌクレインとＰＧＰ９．５との同時局在化を判定することにより、リン酸化α−シヌクレインがサンプルの神経的形質により局在化するか否かを検出することと、（ｃ）神経的形質において、リン酸化α−シヌクレインとＰＧＰ９．５との同時局在化があることが断定的に判定されたとき、対象をＰＤと診断することと、を含む、方法もまた提供する。
【００２４】
本明細書において、対象におけるＰＤの診断及び治療方法であって、（ａ）ＰＤを有することが疑われる対象由来の少なくとも１つの神経的形質を含む生体サンプルを得ることと、（ｂ）サンプルを抗ＰＧＰ．５抗体と接触させ、リン酸化α−シヌクレインとＰＧＰ９．５との同時局在化を判定することにより、リン酸化α−シヌクレインがサンプルの神経的形質により局在化するか否かを検出することと、（ｃ）神経的形質において、リン酸化α−シヌクレインとＰＧＰ９．５との同時局在化があることが断定的に判定されたとき、対象をＰＤと診断することと、（ｄ）ＰＤを有すると診断された対象において、ＰＤを治療する治療法を投与することと、を含む、方法もまた提供する。
【００２５】
本明細書においては、ＰＤと診断された対象の治療方法であって、対象に、α−シヌクレイン抗体の効果的な治療方式を投与することを含み、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な抗体、及び、神経的形質を結合可能な抗体が、対象由来の皮膚サンプルの神経的形質に同時局在化することが示されている方法もまた、提供する。
【００２６】
また、ＰＤを有すると判定された対象の治療方法であって、本明細書で開示される方法のいずれか１つによりＰＤを有すると判定された対象に、α−シヌクレイン抗体の効果的な治療方式を投与することを含む、方法も、本明細書中で提供する。
【００２７】
そのようないくつかの方法において、α−シヌクレイン抗体の効果的な治療方式は、α−シヌクレインの残基１〜２０、α−シヌクレインの残基１〜１０、α−シヌクレインの残基４〜１５、α−シヌクレインの残基９１〜９９、α−シヌクレインの残基１１７〜１２３、α−シヌクレインの残基１１８〜１２６内で結合するモノクローナル抗体；プラシネズマブ（ＰＲＸ００２）；抗体クローン１Ｈ７（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２２０）のＣＤＲを有するヒト化抗体；抗体クローン９Ｅ４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２２１）のＣＤＲ、抗体クローンＮＩ−２０２．２１Ｄ１１のＣＤＲ、及び抗体クローンＮＩ−２０２．１２Ｆ４のＣＤＲを有するヒト化抗体、例えば、米国特許第８，０９２，８０１号、同第８，６０９，８２０号、同第８，７９０，６４４号、同第８，９４０，２７６号、同第９，５８０，４９３号（それら全体が本明細書に参照により組み込まれる）に開示されている、α−シヌクレイン抗体などからなる群から選択されるα−シヌクレイン抗体を含む。そのようないくつかの抗体は、配列番号４９の残基３１〜３５を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４９の残基５０〜６８を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号４９の残基１０１〜１０２を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号５０の残基２３〜３３を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号５０の残基４９〜５５を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号５０の残基８８〜９８を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。そのようないくつかの抗体は、配列番号５１を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５２を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号５３を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号５４を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号５５を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号５６を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。そのようないくつかの抗体は、配列番号５７を含む重鎖、及び配列番号５８を含む軽鎖を含む。
【００２８】
そのようないくつかの方法において、抗体はプラシネズマブ（ＰＲＸ００２）である。そのようないくつかの方法において、抗体は、それぞれ配列番号１８〜２０と呼ばれる３つの軽ＣＤＲ、及び、それぞれ配列番号２２〜２４と呼ばれる３つの重鎖ＣＤＲを含む。そのようないくつかの方法において、抗体は、配列番号１７と呼ばれる軽鎖、及び配列番号２１と呼ばれる重鎖を含む。
【００２９】
そのようないくつかの方法において、抗体は、本明細書に、その全体が参照により組み込まれる、米国特許第８，６０９，８２０号に開示されている、９Ｅ４である。そのようないくつかの方法において、抗体は、それぞれ配列番号２６〜２８と呼ばれる３つの軽ＣＤＲ、及び、それぞれ配列番号３０〜３２と呼ばれる３つの重鎖ＣＤＲを含む。そのようないくつかの方法において、抗体は、配列番号２５と呼ばれる軽鎖、及び配列番号２９と呼ばれる重鎖を含む。
【００３０】
そのようないくつかの方法において、抗体はＮＩ−２０２．２１Ｄ１１である。そのようないくつかの方法において、抗体は、それぞれ配列番号３４〜３６と呼ばれる３つの軽ＣＤＲ、及び、それぞれ配列番号３８〜４０と呼ばれる３つの重鎖ＣＤＲを含む。そのようないくつかの方法において、抗体は、配列番号３３と呼ばれる軽鎖可変領域、及び配列番号３７と呼ばれる重鎖可変領域を含む。
【００３１】
そのようないくつかの方法において、抗体はＮＩ−２０２．１２Ｆ４である。そのようないくつかの方法において、抗体は、それぞれ配列番号４２〜４４と呼ばれる軽重ＣＤＲ、及び、それぞれ配列番号４６〜４８と呼ばれる３つの重鎖ＣＤＲを含む。そのようないくつかの方法において、抗体は、配列番号４１と呼ばれる軽鎖可変領域、及び配列番号４５と呼ばれる重鎖可変領域を含む。
【００３２】
本明細書においては、リン酸化α−シヌクレインの検出方法であって、生体サンプルを、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触させることと、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体を検出することと、を含む方法もまた提供する。方法のいくつかにおいて、サンプルは、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触する前に、少なくとも１つのプロテアーゼと接触する。いくつかの方法では、方法は、サンプルを少なくとも１つのホスファターゼと接触させることを更に含む。いくつかの方法において、検出することは、組織化学的分析を含む。いくつかの方法において、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体は、残基Ｓ１２９においてリン酸化したα−シヌクレインを検出する。特定の方法において、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体は、７Ｅ２抗体クローン、又は３Ｇ２抗体クローンである。いくつかの方法において、サンプルは固定されている。特定の方法において、サンプルはホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである。いくつかの方法において、サンプルは、凍結サンプルである。
【００３３】
いくつかの方法おいて、方法は、サンプルを、抱合体化した第１のラベルを有する第１の二次抗体であって、当該第１の二次抗体を、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と免疫反応性である第１の二次抗体と接触させることを更に含む。いくつかの方法では、方法は、サンプルを、第１の二次抗体の第１のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と接触させて、サンプルのリン酸化α−シヌクレインの近くで、第１の検出可能なシグナルを生成することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
本特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面（複数可）を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、申請に応じて、必要な手数料を支払うことにより、米国特許庁から提供されることになる。
【００３５】
【図１Ａ】図１Ａは、示すとおり（ＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）上部パネル；Ｐ−ｓｙｎ／８１Ａ  中部パネル；５Ｈ５  下部パネル）のα−シヌクレイン抗体及び濃度を用いて、ＰＤを有する対象由来の脳内の、Ｓ１２９でリン酸化されたα−シヌクレインの例示的な染色を示す。
【００３６】
【図１Ｂ】図１Ｂは、示すとおり（２Ｇ１１  上部パネル；７Ｅ２  中部パネル；３Ｇ２  下部パネル）の抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン抗体及び濃度を用いて、ＰＤを有する対象由来の脳組織内での、例示的な染色を示す。
【００３７】
【図１Ｃ】図１Ｃは、示すとおり（１１Ａ５  上部パネル；ｐＳｙｎ＃６４（ＷＡＫＯ）下部パネル）の抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン抗体及び濃度を用いて、ＰＤを有する対象由来の脳組織内での、例示的な染色を示す。
【００３８】
【図２Ａ】図２Ａは、非ＰＤ対象由来の脳組織においては、抗原の回復を伴わず、３Ｇ２及び７Ｅ２リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン抗体によって、染色は観察されなかったことを示す（７Ｅ２  中部パネル（０．０８μｇ／ｍＬ）；３Ｇ２  下部パネル（０．０８μｇ／ｍＬ））。抗体５Ｃ１２（０．５μｇ／ｍＬ）による全α−シヌクレインの染色を、上部パネルに示す。プロテアーゼ又はホスファターゼ処理は行っていない。画像は１０倍の倍率で撮影した。抗体をＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋ内で染色した。
【００３９】
【図２Ｂ】図２Ｂは、非ＰＤ対象由来の脳組織においては、抗原の回復を伴わず、３Ｇ２及び７Ｅ２リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン抗体によって、染色は観察されなかったことを示す（７Ｅ２  中部パネル（０．０８μｇ／ｍＬ）；３Ｇ２  下部パネル（０．０８μｇ／ｍＬ））。抗体５Ｃ１２（０．５μｇ／ｍＬ）による全α−シヌクレインの染色を、上部パネルに示す。プロテアーゼ又はホスファターゼ処理は行っていない。画像は１０倍の倍率で撮影した。抗体をＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋ内で染色した。
【００４０】
【図３Ａ】図３Ａは、ホスファターゼ処理（下部パネル）後には存在しない、抗原回復（細胞コンディショニング）後の、抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体による、非ＰＤ脳組織における非常にわずかな細胞質染色（上部パネル）を示す。アルカリホスファターゼ処理は、５０μｇ／ｍＬで２時間であった。
【００４１】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ホスファターゼ処理（下部パネル）後には存在しない、抗原回復（細胞コンディショニング）後の、抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン３Ｇ２抗体による、非ＰＤ脳組織における非常にわずかな細胞質染色（上部パネル）を示す。アルカリホスファターゼ処理は、５０μｇ／ｍＬで２時間であった。
【００４２】
【図４Ａ】図４Ａは、ＰＤを有する対象由来の皮質脳組織中での、ＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）抗体によるレヴィー小体染色は、アルカリホスファターゼ処理により激しく減少したことを示す（下部パネル；５０μｇ／ｍＬで２時間）。画像は１０倍の倍率で撮影した。ＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）抗体（０．４μｇ／ｍＬ）を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した。
【００４３】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＰＤを有する対象由来の皮質脳組織中での、８１Ａ抗体によるレヴィー小体染色は、アルカリホスファターゼ処理により激しく減少したことを示す（下部パネル；５０μｇ／ｍＬで２時間）。画像は１０倍の倍率で撮影した。８１Ａ抗体（２．０μｇ／ｍＬ）をＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した。
【００４４】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＰＤを有する対象由来の皮質脳組織中での、１１Ａ５抗体によるレヴィー小体染色は、アルカリホスファターゼ処理により穏やかに減少したことを示す（下部パネル；５０μｇ／ｍＬで２時間）。画像は１０倍の倍率で撮影した。１１Ａ５抗体（０．４μｇ／ｍＬ）を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した。
【００４５】
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＰＤを有する対象由来の皮質脳組織中での、７Ｅ２抗体によるレヴィー小体染色は、アルカリホスファターゼ処理により穏やかに減少したことを示す（下部パネル；５０μｇ／ｍＬで２時間）。画像は１０倍の倍率で撮影した。７Ｅ２抗体（０．０８μｇ／ｍＬ）を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した。
【００４６】
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＰＤを有する対象由来の皮質脳組織中での、３Ｇ２抗体によるレヴィー小体染色は、アルカリホスファターゼ処理により穏やかに減少したことを示す（下部パネル；５０μｇ／ｍＬで２時間）。画像は１０倍の倍率で撮影した。３Ｇ２抗体（０．０８μｇ／ｍＬ）を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した。
【００４７】
【図５Ａ】図５Ａは、プロテアーゼ処理（ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ１、３６℃で４分間）が、レヴィー小体染色を減少させることなく、ＰＤを有する対象由来の皮質脳組織内で、１１Ａ５抗体により非レヴィー小体染色を減少させたことを示す。画像は１０倍の倍率で撮影した。１１Ａ５抗体（０．４μｇ／ｍＬ）を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した。
【００４８】
【図５Ｂ】図５Ｂは、プロテアーゼ処理（ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ１、３６℃で４分間）が、レヴィー小体染色を減少させることなく、ＰＤを有する対象由来の皮質脳組織内で、７Ｅ２抗体により非レヴィー小体染色を減少させたことを示す。画像は１０倍の倍率で撮影した。７Ｅ２抗体（０．０８μｇ／ｍＬ）を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した。
【００４９】
【図５Ｃ】図５Ｃは、プロテアーゼ処理（ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ１、３６℃で４分間）が、レヴィー小体染色を減少させることなく、ＰＤを有する対象由来の皮質脳組織内で、３Ｇ２抗体により非レヴィー小体染色を減少させたことを示す。画像は１０倍の倍率で撮影した。３Ｇ２抗体（０．０８μｇ／ｍＬ）を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した。
【００５０】
【図６】図６は、プロテアーゼ処理の不存在下にて、リン酸化特異的α−シヌクレイン抗体７Ｅ２（中部パネル）及び３Ｇ２（下部パネル）により、プロテアーゼ処理後の全α−シヌクレイン抗体５Ｃ１２（上部パネル）と同一である、ＰＤを有する対象由来の脳組織における、染色パターンが生成したことを示す。画像は１０倍の倍率で撮影した。全抗体を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋ内で希釈した（５Ｃ１２抗体は０．５μｇ／ｍＬ；７Ｅ２抗体は０．０８μｇ／ｍＬ；及び３Ｇ２抗体は０．０８μｇ／ｍＬ）。
【００５１】
【図７Ａ】図７Ａは、プロテアーゼベースの抗原回復の不存在下にて、抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体（下部パネル）が、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ１処理（３６℃で４分間）に結合した、抗全α−シヌクレイン５Ｃ１２抗体（上部パネル）を使用して検出したものに類似の、ＰＤを有する対象由来の皮膚切片で凝集したα−シヌクレインを検出したことを示す。
【００５２】
【図７Ｂ】図７Ｂは、プロテアーゼベースの抗原回復の不存在下にて、抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン１１Ａ５抗体（上部パネル）及び３Ｇ２抗体が、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ１処理（３６℃で４分間）に結合した、抗全α−シヌクレイン５Ｃ１２抗体（図７Ａ上部パネル）を使用して検出したものに類似の、ＰＤを有する対象由来の皮膚切片で凝集したα−シヌクレインを検出したことを示す。
【００５３】
【図７Ｃ】図７Ｃは、プロテアーゼベースの抗原回復の不存在下にて、抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインＭＪＦ−Ｒ１３抗体（上部パネル）及びＰ−Ｓｙｎ／８１Ａ抗体が、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ１処理（３６℃で４分間）に結合した、抗全α−シヌクレイン５Ｃ１２抗体（図７Ａ上部パネル）を使用して検出したものに類似の、ＰＤを有する対象由来の皮膚切片で凝集したα−シヌクレインを検出したことを示す。
【００５４】
【図８Ａ】図８Ａは、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋにより、ＰＤサンプルにおいて、抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体（１．０μｇ／ｍＬ）の染色強度を保存しながら、最小のバックグラウンドがもたらされることを示す。画像は、上部パネルでは１０倍の倍率で、下部パネルでは４０倍の倍率で撮影した。上部及び下部パネルの画像は、同一の組織切片の、異なる視野からのものである。
【００５５】
【図８Ｂ】図８Ｂは、９０１０３希釈液により、ＰＤサンプルにおいて、抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体（１．０μｇ／ｍＬ）の染色強度を保存しながら、最小のバックグラウンドがもたらされることを示す。画像は、上部パネルでは１０倍の倍率で、下部パネルでは４０倍の倍率で撮影した。上部及び下部パネルの画像は、同一の組織切片の、異なる視野からのものである。
【００５６】
【図９】図９は、スライド当たりで染色した神経細胞形質パーセントの形態における定量的測定が実施された、１．０μｇ／ｍＬ公称濃度を上回る、及び下回る抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体の試験（ガードバンド実験）の結果を示す。本実験のために、色素体による抗体適用及び検出の前に、組織切片はプロテアーゼによってもホスファターゼによっても、処理しなかった。ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した、０．５μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、及び１．５μｇ／ｍＬの抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体により、ＰＤを有する対象由来の皮膚組織を染色することによって、１．０μｇ／ｍＬの公称値からおよそ±５０％の幅がある抗体濃度での、ロバストな染色が示される。
【００５７】
【図１０Ａ】図１０Ａは、抗ＰＧＰ９．５抗体ＥＰＲ４１１８（０．２μｇ／ｍＬ）が、通常の対象（非ＰＤ対象）由来の皮膚サンプル中で、神経細胞形質を染色することを示す。
【００５８】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、抗ＰＧＰ９．５抗体１３Ｃ４／Ｉ３Ｃ４（０．２μｇ／ｍＬ）が、通常の対象（非ＰＤ対象）由来の皮膚サンプル中で、神経細胞形質を染色することを示す。
【００５９】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ製のポリクローナル抗ＰＧＰ９．５抗体（１．０μｇ／ｍＬ；ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）カタログ番号７６０−４４３４）が、通常の対象（非ＰＤ対象）由来の皮膚サンプル中で、神経細胞形質を染色することを示す。
【００６０】
【図１１Ａ】図１１Ａは、非ＰＤ対象由来の、新鮮に切断した組織スライドにおける、膠原線維の強力なバックグラウンド染色（約２４〜４８時間）を示す。染色は、０．１μｇ／ｍＬ及びＶＥＮＴＡＮＡ  ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キットにて、抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体を用いて実施した。組織切片は、ＣＣ１抗原回復処理を受けなかった。抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体、及びＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＨＱ  Ｌｉｎｋｅｒを適用しなかったときに、同様の結果が得られ（データは図示せず）、このことは、コラーゲンバックグランド染色が、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒにより生み出されたことを示している。
【００６１】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、スライドを切断してからおよそ５ヶ月後に染色した、非ＰＤ対象由来の組織スライドにおける、膠原線維の最小バックグラウンド染色を示す。
【００６２】
【図１２Ａ】図１２Ａは、組織スライドでの膠原線維のバックグラウンド染色が、非ＰＤ対象由来の組織スライド内でのプロテアーゼによる抗原回復により悪化する可能性があることを示す。組織を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体（０．１μｇ／ｍＬ）で試験した。
【００６３】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、組織スライドでの膠原線維のバックグラウンド染色は、非ＰＤ対象由来の組織スライド内でのＣＣ１抗原回復により減少する可能性があることを示す。組織を、ＣＣ１による事前の抗原回復なしに（上部パネル）、又は、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＵＬＴＲＡ自動染色機器で、ＣＣ１を４８分間１００℃で用いる抗原回復の後で（下部パネル）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体（１．０μｇ／ｍＬ）でインキュベートした。
【００６４】
【図１３】図１３は、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ検出キット（右パネル）は、ＰＤ皮膚（上部パネル）及び対照皮膚（下部パネル）サンプルの両方において、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キット（左パネル）と比較して、ＰＧＰ９．５に対して低い染色強度をもたらすことを示す。ＯｐｔｉＶｉｅｗ検出：ＨＱ  Ｌｉｎｋｅｒ＋ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ。ｕｌｔｒａＶｉｅｗ検出：抗Ｒｂ／Ｍｓ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ。組織サンプルを１００℃で３２分間、ＣＣ１により前処理し、ＰＧＰ９．５  ＥＰＲ４１１８抗体（０．５μｇ／ｍＬ）をＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した。画像は４０倍の倍率で撮影した。
【００６５】
【図１４】図１４は、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ検出キットによる増幅プロセスによって、ＰＤ皮膚（上部パネル）及び対照皮膚（下部パネル）サンプルの両方において、非特異的バックグラウンド染色の増加がもたらされることを示す。増幅：Ｍｓ抗Ｒｂ、続いてＲｂ抗Ｍｓ  ＩｇＧ。ｕｌｔｒａＶｉｅｗ検出：抗Ｒｂ／Ｍｓ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ。抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体（１．０μｇ／ｍＬ）を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋに希釈した。ＣＣ１でもプロテアーゼでも、前処理は行っていない。画像は４０倍の倍率で撮影した。
【００６６】
【図１５】図１５は、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰ検出キット（上部パネル）、並びにＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｐｕｒｐｌｅキット（中部及び下部パネル）は共に、ヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合体染色付着と共に用いたとき、バックグランドはほとんど、又は全くなく、ＰＤを有する対象由来の皮膚サンプルにおいて、凝集した抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインを検出することを示す。リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインは、黒（銀染色）又は紫（ＴＡＭＲＡ）に染色した。ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋ中での、１．０μｇ／ｍＬの抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン７Ｅ２抗体。検出：銀（上部パネル）若しくはＴＡＭＲＡ（中部パネル）によるヤギ抗ウサギＨＲＰ、又はＴＡＭＲＡ（ＨＱ抱合体化ヤギ抗ウサギ抗体／抗ＨＱ−ＨＲＰ、下部パネル）によるＯｐｔｉＶｉｅｗ。ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋ中で、０．５μｇ／ｍＬのＰＧＰ９．５抗体ＥＰＲ４１１８は、黄色に染色される。検出：Ｄａｂｓｙｌによるヤギ抗ウサギＡＰ（黄色）。ＣＣ１でもプロテアーゼでも、前処理は行っていない。
【００６７】
【図１６】図１６は、抗リン酸化α−シヌクレイン７Ｅ２抗体、及びｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰ検出キットにより、皮膚の神経的形質に付着した黒色の銀染色により、ＥＰＲ４１１８抗体、及びＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＵｌｔｒａＭａｐ抗−Ｒｂアルカリホスファターゼ及びＱＭ−ＤＡＢＳＹＬを用いて黄色に染色したＰＧＰ９．５のバックグラウンドにおける、凝集したリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインの、コントラストの高い可視化がもたらされたことを示す。組織サンプルは、ＰＤを有する対象由来の皮膚サンプル（上部パネル）、及び、通常の対象（非ＰＤ）由来の皮膚サンプル（下部パネル）である。
【００６８】
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＰＤを有する対象由来の皮膚サンプル内の、大きな血管の神経的形質における、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン（黒／銀染色）及びＰＧＰ９．５（黄色）の免疫組織化学的検出を示す。
【００６９】
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＰＤを有する対象由来の皮膚サンプル内の、小さな神経束の神経的形質における、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン（黒／銀染色）及びＰＧＰ９．５（黄色）の免疫組織化学的検出を示す。
【００７０】
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＰＤを有する対象由来の皮膚サンプル内の、エクリン汗腺の神経的形質における、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン（黒／銀染色）及びＰＧＰ９．５（黄色）の免疫組織化学的検出を示す。
【００７１】
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、ＰＤを有する対象由来の皮膚サンプル内の、大きな神経束の神経的形質における、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン（黒／銀染色）及びＰＧＰ９．５（黄色）の免疫組織化学的検出を示す。
【００７２】
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、ＰＤを有する対象由来の皮膚サンプル内の、立毛筋の神経的形質における、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン（黒／銀染色）及びＰＧＰ９．５（黄色）の免疫組織化学的検出を示す。
【００７３】
【図１８】図１８は、非ＰＤ対照対象（上部パネル）及びＰＤ対象（下部パネル）由来の皮膚神経束で観察可能な、びまん性顆粒、及び固有の種類の銀リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン染色の例を示す。プロテアーゼ又はホスファターゼ処理を行わずに、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイを使用して、頭皮生検の切片を染色した（手順１）。黄色に染色した構造物は、ＰＧＰ９．５を発現する神経である。
【００７４】
【図１９】図１９は、顆粒タイプのリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン（上部パネル）と、ミエリン塩基性タンパク質（下部パネル）との間での、同様の周辺神経染色パターンを示し、シュワン細胞におけるびまん性ｐＳ１２９α−シヌクレインの、潜在的な局在化を示唆している。
【００７５】
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＣＣ１処理を伴わない、１１Ａ５抗体（０．４μｇ／ｍＬ）によるリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインの染色（上部パネル）は、３２分間１００℃で、ＵＬＴＲＡ  ＣＣ１で処理した後に減少した（下部パネル）ことを示す。
【００７６】
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ＣＣ１処理を伴わない、７Ｅ２抗体（０．０８μｇ／ｍＬ）によるリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインの染色（上部パネル）は、３２分間１００℃で、ＵＬＴＲＡ  ＣＣ１で処理した後に減少した（下部パネル）ことを示す。
【００７７】
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、ＣＣ１処理を伴わない、３Ｇ２抗体（０．０８μｇ／ｍＬ）によるリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインの染色（上部パネル）は、３２分間１００℃で、ＵＬＴＲＡ  ＣＣ１で処理した後に減少した（下部パネル）ことを示す。
【００７８】
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、ＣＣ１処理を伴わない、ＭＪＦ−Ｒ１３抗体（０．４μｇ／ｍＬ）によるリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインの染色（上部パネル）は、３２分間１００℃で、ＵＬＴＲＡ  ＣＣ１で処理した後に減少した（下部パネル）ことを示す。
【００７９】
【図２０Ｅ】図２０Ｅは、ＣＣ１処理を伴わない、Ｐ−Ｓｙｎ／８１Ａ抗体（２．０μｇ／ｍＬ）によるリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインの染色（上部パネル）は、３２分間１００℃で、ＵＬＴＲＡ  ＣＣ１で処理した後に減少した（下部パネル）ことを示す。
【００８０】
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＰＤを有する対象由来の皮膚切片における、（７Ｅ２抗体クローンで検出した）固有の種類のリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン染色における、（未処理；左パネルと比較して）適度な増加をもたらした、４分間の、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ２での処理（右パネル）を示す。４分間の、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ２での処理はまた、ＰＤを有する患者由来の皮膚切片において、顆粒タイプのリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン染色及びＰＧＰ９．５染色を、劇的に減少させた。
【００８１】
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、４分間の、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ２での処理（右パネル）が、固有の種類として誤解される可能性がある、非ＰＤ対象由来の皮膚切片中で、（７Ｅ２抗体クローンで検出した）リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインを（未処理；左パネルと比較して）有意に減少させたことを示す。
【００８２】
【図２２】図２２は、プロテアーゼ未処理（上部パネル）と比較して、ＰＤを有する対象由来の皮膚において、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン抗体を用いる染色における、４分間（中部パネル）又は１２分間（下部パネル）でのプロテアーゼ３による処理の効果を示す。リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインは、黒に染色した。ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋ中での、１．０μｇ／ｍＬの７Ｅ２抗体クローン（検出：銀によるヤギ抗ウサギＨＲＰ）。ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋ中での、０．５μｇ／ｍＬのＰＧＰ９．５抗体ＥＰＲ４１１８は、黄色に染色した（検出：Ｄａｂｓｙｌによるヤギ抗ウサギＡＰ）。ＣＣ１でもプロテアーゼでも、前処理は行っていない。
【００８３】
【図２３Ａ】図２３Ａは、ｐＨ９で８分間、アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ由来の、精製仔牛小腸アルカリホスファターゼ）前処理すること（下部パネル）により、アルカリホスファターゼで処理されていない、組織で通常観察される、密度の高い固有の種類の染色に影響を及ぼすことなく、びまん性顆粒リン酸化α−シヌクレイン染色が取り除かれることを示す（上部パネル）。
【００８４】
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ｐＨ９で２４分（上部パネル）又は４０分間（下部パネル）、アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ由来の、精製仔牛小腸アルカリホスファターゼ）前処理することにより、アルカリホスファターゼで処理されていない、組織で通常観察される、密度の高い固有の種類の染色に影響を及ぼすことなく、びまん性顆粒リン酸化α−シヌクレイン染色が取り除かれることを示す。
【００８５】
【図２４】図２４は、ｐＨ８で８分間、アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ製の組み換えアルカリホスファターゼ；３０μｇ／ｍＬ）処理により、ＡＰ未処理（上部パネル）、又はｐＨ１０でのＡＰ処理（中部パネル）と比較して、固有のリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン（下部パネル）の染色の減少がもたらされたことを示す。
【００８６】
【図２５】図２５は、アルカリホスファターゼ、続いてプロテアーゼ３での前処理により、密度の高い固有の染色の有意な喪失を伴わずに、びまん性顆粒リン酸化α−シヌクレイン染色が取り除かれることを示す。
【００８７】
【図２６】図２６は、ＥＰＲ４１１８抗体（１．０μｇ／ｍＬ）を用いるＰＧＰ９．５検出は、ＵＬＴＲＡ  ＣＣ１のバルク溶液を用いる抗原回復の期間を増加させる（０分−上部パネル；１６分−中部パネル；又は、６４分−下部パネル）と、向上したことを示す。
【００８８】
【図２７】図２７は、１６分間１００℃での、ＵＬＴＲＡ  ＣＣ２による抗原回復によって、ＥＰＲ４１１８抗体を用いるＰＧＰ９．５染色の増強が得られたことを示す。
【００８９】
【図２８】図２８は、皮膚サンプルにおけるパーキンソン病特性決定のための、α−シヌクレイン（ａＳｙｎ）及びＰＧＰ９．５の同時検出のための２つの手順の概要を示す。
【００９０】
【図２９】図２９は、ＰＤを有する対象、及び通常の非ＰＤ対象由来の頭皮生検の４μｍの切片において、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン染色を含有する神経的形質のパーセンテージを示す、個々の値のプロットを示す。１５個のＰＤ、及び９個の非ＰＤ対照頭皮皮膚サンプルのコホートを、２つの異なるリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイ手順：Ｒｅｅ（手順１）なし、及び（手順２）プロテアーゼ／ホスファターゼありで染色した。
【００９１】
【図３０Ａ】図３０Ａは、ＰＤを有する対象、及び通常の非ＰＤ対象由来の頭皮生検の４μｍの切片において、固有の種類のリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン染色を有する神経的形質のパーセンテージを示す、個々の値のプロットを示す。１５個のＰＤ、及び７個の非ＰＤ対照頭皮皮膚サンプルのコホートを、プロテアーゼ／ホスファターゼなし（手順１）、及びあり（手順２）で、及びまた、ｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａにより開発された、プロテアーゼ耐性α−シヌクレインＤＡＢ  ＩＨＣアッセイを用いて、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイ手順で染色した。
【００９２】
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、ＰＤを有する対象、及び通常の非ＰＤ対象由来の頭皮生検の４μｍの切片において、びまん性顆粒タイプのリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン染色を有する神経的形質のパーセンテージを示す、個々の値のプロットを示す。１５個のＰＤ、及び７個の非ＰＤ対照頭皮皮膚サンプルのコホートを、プロテアーゼ／ホスファターゼなし（手順１）、及びあり（手順２）で、及びまた、ｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａにより開発された、プロテアーゼ耐性α−シヌクレインＤＡＢ  ＩＨＣアッセイを用いて、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイ手順で染色した。
【００９３】
【図３１】図３１は、ＰＤを有する対象、及び通常の非ＰＤ対象由来の腹部皮膚生検の４μｍの切片において、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン染色を含有する神経的形質のパーセンテージを示す、個々の値のプロットを示す。２０個のＰＤ、及び２０個の非ＰＤ対照腹部皮膚生検サンプルのコホートを、２つの異なるリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイ手順：プロテアーゼ／ホスファターゼなし（手順１）、及びあり（手順２）で染色した。
【００９４】
【図３２Ａ】図３２Ａは、手順２（下部パネル）と比較した、手順１（上部パネル）による通常の結腸組織の染色での差を示す。スケールバーは５０μｍである。
【００９５】
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、手順２（下部パネル）と比較した、手順１（上部パネル）による通常の結腸組織の染色での差を示す。スケールバーは５０μｍである。
【００９６】
【図３３Ａ】図３３Ａは、手順２を用いた、ＰＤを有する対象由来の顎下腺組織の例示的染色を示す。画像は１０倍の倍率で撮影した。
【００９７】
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、手順２を用いた、ＰＤを有する対象由来のＳ状結腸組織の例示的染色を示す。画像は２０倍の倍率で撮影した。
【００９８】
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、手順２を用いた、ＰＤを有する対象由来の頭皮組織の例示的染色を示す。画像は２０倍の倍率で撮影した。
【００９９】
【図３４】図３４は、小児皮膚組織では、手順１（Ｐ１；上部パネル）が、手順２（Ｐ２：下部パネル）では存在しない、固有のモルホロジーを有する重質のリン酸化α−シヌクレイン銀染色を生み出したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本開示は、別様においてはＰＤを有すると診断されない対象、及び、パーキンソン病を有するリスクがある、又はパーキンソン病が疑われる対象における、パーキンソン病（ＰＤ）の正確かつ決定的な判定のための方法及び組成物に関する。方法及び組成物は、進行性核上性麻痺、多系統萎縮症、ウイルス性パーキンソン症候群、本態性振戦、薬剤又は毒性により誘発されるパーキンソン症候群、外傷後パーキンソン症候群、動脈硬化性パーキンソン症候群、グアムのパーキンソン症候群・認知症合併症、皮質脳底神経節性縮退、又は標準圧力水頭症を含むがこれらに限定されない、パーキンソン病様の症状と関連する場合がある、移動障害を有する患者におけるパーキンソン病を取り除くためにもまた、使用可能である。開示した方法は、対象の少なくとも１つの神経的形質を含む生体サンプルを、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触させることを含む。リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体が、生体サンプルの神経的形質内で局在化するか否かを検出することで、生残対象がＰＤを有するか否かに関する判定を行うことができる。対象としては、ＰＤの前症候性である患者、及び、ＰＤの正確な診断が現在、ルーチン的に可能ではない場合に、病気の初期段階にある患者を挙げることができる。更に、死後分析は、死後に収集した生体サンプルで行うことができる。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、用語「生体サンプル」は、本開示の方法及びキットで試験可能なサンプルを含み、ヒト及び動物の体、固定又は凍結組織試料、並びに固定細胞試料が挙げられる。用語「組織」とは、生命体内で同様の機能を発揮する、相互接続した細胞のまとまりを意味する。生体サンプルとしては、健常な、若しくは明らかに健常なヒト対象由来の、又は、パーキンソン病などの、診断若しくは治療されるべき状態若しくは疾患に影響を受けている、若しくはこれに影響を受けている疑いがある、ヒト対象由来の、サンプルを挙げることができる。生体サンプルは、（腫瘍生検などの生検を含む）任意の器官又は組織から入手されるサンプルであることができる。また、サンプルは、剖検の間に採取されたサンプルなどの、死亡した患者に由来することができる。生体サンプルは、細胞学的サンプルもまた含むことができる（いくつかの例においては、細胞学的サンプルは、皮膚組織、結腸組織、顎下腺組織、又は脳由来の組織切片などの組織が元となることができる）。別の例において、サンプルは細胞、又は、対象から入手した生体サンプルから調製した細胞ペレットであることができる。
【０１０２】
いくつかの例において、生体サンプルとしては、通常又は癌性組織、例えば、皮膚組織（例えば、対象の頭皮、腹部、又は胴体由来）、結腸組織、顎下腺組織、脳組織、嗅球、肺組織、卵巣組織、膵臓組織、中皮組織、胃腸組織、頭頸組織、胸組織、肝臓組織、腎臓組織、前立腺組織、子宮組織、脳脊髄液（又は、脳脊髄液から単離した細胞及び／若しくは神経的形質）、骨、肺細胞、卵巣細胞、膵臓細胞又は中皮細胞、結腸細胞、頭頸細胞、胸細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、前立腺細胞、子宮細胞、骨細胞、脳細胞、及び肺細胞を挙げることができる。例えば、皮膚、結腸、顎下腺、嗅球、肺、卵巣、肝臓、若しくは膵臓、又は、細胞材料を含有するその他の腫瘍由来のサンプルは、腫瘍の全て又は一部の外科的切除により、微細の針状脳生検、腫瘍又はパンチ生検由来の微細の針状吸引物を収集することにより、及び、当該技術分野において既知のその他の方法により、入手することができる。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、用語「神経的形質」とは、神経細胞、及び、神経分布していることが知られている組織構築物を意味する。例えば、神経的形質は、神経細胞の一部、神経細胞、以前の神経細胞の一部、以前の神経細胞、又は、神経細胞と以前の神経細胞の両方、及び／又はこれらの一部であることができる。方法のいくつかにおいて、神経的形質は神経細胞に隣接している、例えば、以前の神経細胞は健常な神経細胞に隣接している。その他の種類の神経的形質としては、真皮に広範に分布している、無髄の、又は薄く有髄化している、表皮内神経線維；汗腺、毛嚢、立毛筋、及び血管を含むがこれらに限定されない、自律神経系構造物に神経分布させる、アドレナリン作動性、ノルアドレナリン作動性、コリン作動性の交感神経線維又は血管拡張性のペプチド作動性線維を含むがこれらに限定されない、神経分布していることが知られている組織構築物が挙げられる。いくつかの方法においては、神経的形質は、壊死性又はアポトーシス性である、以前の神経細胞又は神経細胞の構成成分を含むことができる。
【０１０４】
本開示の文脈において、用語「一次抗体」とは、抗体結合剤、例えば、「標的」（例えば、リン酸化α−シヌクレイン又は神経的形質の構成成分）に、より具体的には、サンプルの標的の単一単位（例えば、標的分子のエピトープ）に特異的に結合する、全抗体分子、前記分子の断片又は誘導体（例えば、抗体又は重合化抗体を含む抱合体）を意味する。本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、一次抗体は、残基Ｓ１２９でリン酸化α−シヌクレインを結合可能な抗体（ｐＳ１２９  ａＳｙｎ）であることができる。本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、一次は、神経的形質の構成成分を結合可能な抗体であることができる。一次抗体は、以下の開示の見出し「抗体」の元で、より完全に記載される。
【０１０５】
一次抗体が神経的形質内で局在化するか否かを検出するために、サンプルを抗体と接触させ、サンプルにおける抗体の存在を調査する。例えば、一次抗体が検出可能な標識で標識されるときに、一次抗体の局在化の判定を達成することができる。サンプルでの標識の検出は、神経的形質内での抗体の局在化に対応する。
【０１０６】
本明細書で開示する方法のいくつかは、対象の生体サンプルを、神経的形質内でリン酸化α−シヌクレイン以外のタンパク質を結合可能な、第２の一次抗体と接触させることを更に含む。第２の一次抗体を用いることで、神経的形質内での、第１の一次抗体と第２の一次抗体の両方の局在化の判定が可能となる。ＰＤの判定は、神経的形質内での両方の抗体の同時局在化の判定の際に正確かつ決定的に判定される。
【０１０７】
第２の一次抗体は例えば、神経的形質の構成成分であるタンパク質を結合可能な抗体から選択することができ、例えば、以下のうちの１つから選択することができる：ユビキチンＣ末端加水分解酵素Ｌ１（ＰＧＰ９．５、ＵＣＨＬ１、ＮＤＧＯＡ；ＰＡＲＫ５；ＰＧＰ９５；ＳＰＧ７９；Ｕｃｈ−Ｌ１；ＨＥＬ−１１７；ＰＧＰ  ９．５；ＨＥＬ−Ｓ−５３）、ＲＮＡ結合ｆｏｘ−１ホモログ３（ＲＢＦＯＸ３、ＦＯＸ３、ＮＥＵＮ、ＦＯＸ−３、ＨＲＮＢＰ３）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２、ＭＡＰ２Ａ、ＭＡＰ２Ｂ、ＭＡＰ２Ｃ）、１６０ｋＤａの中神経フィラメント（ＮＥＦＭ、ＮＦＭ、ＮＥＦ３、ＮＦ−Ｍ）、２００ｋＤａの重神経フィラメント（ＮＥＦＨ、ＮＦＨ、ＣＭＴ２ＣＣ）、シナプトフィジン（ＳＹＰ、ＭＲＸ９６、ＭＲＸＳＹＰ）、及び、ディスク大型ＭＡＧＵＫ足場タンパク質４（ＤＬＧ４、ＤＬＧＨ４、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ９５、ＳＡＰ−９０、ＳＡＰ９０、ＳＡＰ９０Ａ）。
【０１０８】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体、及び、神経的形質に結合可能な一次抗体は、同一の宿主種に由来し、宿主種はマウス又はウサギであることができる。いくつかの方法においては、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体、及び、神経的形質に結合可能な一次抗体は、マウス又はウサギなどの、異なる宿主種に由来する。
【０１０９】
用語「局在化」及び「同時局在化」とは、同一神経的形質内での、標的タンパク質又は標的タンパク質の位置を意味する。いくつかの方法においては、神経的形質内でのタンパク質の同時局在化は、タンパク質を独立して示すシグナルが、各シグナルのバックグラウンドと比較したときに、神経的形質内で同定されるときに判定される。神経的形質の外にあるペプチドを示すシグナルは、神経的形質内に局在化するタンパク質を示さない。一例として、神経的形質内に局在化するリン酸化α−シヌクレインを示すシグナルは、バックグラウンドシグナルよりも１、２、３、若しくは４標準偏差高い、又は、バックグラウンドシグナルよりも、又は少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、若しくは少なくとも１０倍高い、シグナルである。
【０１１０】
抗体の局在化及び同時局在化の判定方法としては例えば、組織化学的分析が挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「免疫組織化学」又は「ＩＨＣ」とは、サンプル内での抗原の、抗体等の特異的結合剤との相互作用を判定することにより、固定又は凍結サンプル内で、抗原の存在又は分布を測定する方法を意味する。したがって、本開示は、ＰＤを有することが疑われている対象の生体サンプルの固定又は凍結切片を用いることにより、対象がパーキンソン病（ＰＤ）を有するか否かを判定する方法を提供する。切片内の神経的形質で局在化したリン酸化α−シヌクレインを検出することができ、対象は、リン酸化α−シヌクレインが神経的形質内で局在化したときに、ＰＤを有すると診断され得る。本開示の方法としては、切片を、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な第１の一次抗体と接触させることが挙げられる。方法としては、切片を、神経的形質を結合可能な第２の一次抗体と接触させることもまた挙げることができる。
【０１１１】
本明細書で開示される方法のいくつかとしても、自動化ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色器などの、自動化組織化学染色プラットフォームもまた挙げることができる。自動化ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色器としては典型的には、少なくとも、染色プロトコルで用いられる様々な試薬の貯蔵容器、試薬をスライド上に分配するための貯蔵容器と流体連通した、試薬分配ユニット、スライドから、使用済みの試薬と他の廃棄物を取り除くための、廃棄物除去システム、及び、試薬分配ユニットと廃棄物除去システムの作用を調節する制御システムが挙げられる。染色工程の実施に加えて、多くの自動化スライド染色器は、（サンプルをスライドに付着させるための）スライドベーク、脱蝋（脱パラフィン処理とも呼ばれる）、抗原回復、対比染色、脱水及び洗浄、並びにカバーガラス処理を含む、染色に付属した工程もまた実施することができる（又は、そのような付属工程を実施する個別のシステムと適合性がある）。Ｐｒｉｃｈａｒｄ，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１３８，ｐｐ．１５７８−１５８２（２０１４）（その全体が本明細書に参照により組み込まれる）は、ｉｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ  ＦＬＸ（登録商標）（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、ＷＡＶＥ（登録商標）（Ｃｅｌｅｒｕｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＤＡＫＯ  ＯＭＮＩＳ（登録商標）及びＤＡＫＯ  ＡＵＴＯＳＴＡＩＮＥＲ  ＬＩＮＫ（登録商標）４８（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（登録商標）（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、Ｌｅｉｃａ  ＢＯＮＤ（登録商標）、並びにＬａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（商標）Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）自動化スライド染色器を含む、自動化ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色器、及びそれらの様々な特徴の、いくつかの具体例について記載している。更に、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、米国特許第５，６５０，３２７号、同第５，６５４，２００号、同第６，２９６，８０９号、同第６，３５２，８６１号、同第６，８２７，９０１号、及び同第６，９４３，０２９号、並びに、米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号及び同第２００４００５２６８５号を含む、自動化分析を実施するためのシステム及び方法を開示する、多数の米国特許の譲受人である。市販されている染色ユニットは通常、以下の原理のうちの１つで作動する：（１）スライドが水平に配置され、試薬が、組織サンプルを含有するスライドの表面に水たまりとして分配される、開放式個別スライド染色（ＤＡＫＯ  ＡＵＴＯＳＴＡＩＮＥＲ  ＬＩＮＫ（登録商標）４８（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びｉｎｔｅｌｌｉＰＡＴＨ（登録商標）（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）染色器で実装されるものなど）；（２）試薬が、サンプル上に配置された不活性流体層で覆われるか、又はこれを通して分配されるかのいずれかである、液体オーバーレイ技術（ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＢｅｎｃｈＭａｒｋ及びＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（登録商標）染色器で実装されるものなど）；（３）スライド表面が（別のスライド又はカバープレートであり得る）別の表面に隣接して配置され、毛管力が上がり、液体試薬をサンプルと接触したままとする細いギャップを作製する、毛管ギャップ染色（ＤＡＫＯ  ＴＥＣＨＭＡＴＥ（登録商標）、Ｌｅｉｃａ  ＢＯＮＤ（登録商標）、及びＤＡＫＯ  ＯＭＮＩＳ（登録商標）染色器により用いられる染色原理など）。毛管ギャップ染色の、何回かの反復では、流体は（ＤＡＫＯ  ＴＥＣＨＭＡＴＥ（登録商標）及びＬｅｉｃａ  ＢＯＮＤ（登録商標）などでの）ギャップ内では混合しない。ダイナミックギャップ染色と呼ばれる、毛管ギャップ染色の変形において、毛管力を使用して、サンプルをスライドにアプライし、その後、平行な表面を互いに移動させて、インキュベーション中に試薬を撹拌して、試薬混合を行う（ＤＡＫＯ  ＯＭＮＩＳ（登録商標）スライド染色器（Ａｇｉｌｅｎｔ）で実装される染色原理など）。ギャップ染色の移動において、移動可能なヘッドをスライドの上に合わせる。ヘッドの低い方の面を、充分小さい第１のギャップによりスライドから離し、液体のメニスカスが、スライドの移動中に液体からスライド上に形成されることを可能にする。スライドの幅未満の横方向寸法を有する混合拡張部は、移動可能なヘッドの低い方の面から伸びて、混合拡張部とスライドとの間で、第１のギャップよりも小さい第２のギャップを画定する。ヘッドの移動中、混合拡張部の横方向寸法は、一般に第２のギャップから第１のギャップに伸びる向きに、スライド上で液体の水平移動を行うには充分である。国際公開第２０１１−１３９９７８  Ａ１号を参照のこと。スライドに試薬を付着させるには近年、インクジェット技術を用いることが提案されている。国際公開第２０１６−１７０００８  Ａ１号を参照のこと。染色技術のこの一覧は包括的なものであることを意図しておらず、バイオマーカー染色を実施するための、あらゆる完全又は半自動化システムが、組織化学染色プラットフォームに組み込まれることができる。
【０１１２】
抗体結合の検出
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、工程（ａ）は、サンプルを、抱合体化した第１のラベルを有する、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と免疫反応性の第１の二次抗体と接触させることを更に含む。本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、方法は、サンプルを、第１の二次抗体の第１のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と接触させて、サンプルのリン酸化α−シヌクレインの近くで、第１の検出可能なシグナルを生成することを含む。
【０１１３】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、方法は、サンプルを、抱合体化した検出可能な第２のラベルを有する、神経的形質を結合可能な一次抗体と免疫反応性の第２の二次抗体と接触させることを更に含む。本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、方法は、サンプルを、第２の二次抗体の第２のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と反応させて、サンプルの神経的形質の近くで、第２の検出可能なシグナルを生成することを含む。本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、第１の検出可能なシグナルと第２の検出可能なシグナルは異なっている。本明細書で開示する特定の方法において、第１の検出可能なシグナルは銀染色であり、第２の検出可能なシグナルはＱＭ−Ｄａｂｓｙｌ又はＦａｓｔ−Ｒｅｄである。
【０１１４】
本開示の文脈において、用語「二次抗体」とは、標的抗原に結合した一次抗体に特異的に結合する抗原結合ドメインを有する抗体結合剤、例えば、全抗体分子、前記分子の断片又は誘導体（例えば、抗体又は重合化抗体を含む抱合体）を意味する。二次抗体は、一次抗体に結合する複数の二次抗体による、感度増加及びシグナル増幅を補助することができる。いくつかの実施形態では、二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの酵素；又は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ染料などの蛍光染料；又は、様々な用途で用いることができるその他の分子に抱合体化することができる。
【０１１５】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、サンプルは、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触する前に、少なくとも１つのプロテアーゼと接触する。本明細書で開示する特定の方法において、方法は、サンプルを少なくとも１つのホスファターゼと接触させることを更に含む。方法のいくつかにおいて、サンプルは、プロテアーゼとホスファターゼの両方と接触する。プロテアーゼ、又はプロテアーゼとホスファターゼの使用は、ＰＤの判定が第１の一次抗体のみで達成される、又は、判定が、第１の一次抗体と第２の一次抗体の両方の使用により達成される、方法に従い使用することができる。本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、ホスファターゼを用いることで、パーキンソン病を有しない対象で通常見られるリン酸化α−シヌクレインを取り除くことにより、パーキンソン病を有する対象に固有の、リン酸化α−シヌクレインの検出が向上する。プロテアーゼを用いることで、リン酸化α−シヌクレインの一次抗体へのアクセス可能性を取り除くことにより、リン酸化α−シヌクレインの検出が向上する。
【０１１６】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、サンプルを神経的形質に結合可能な一次抗体と接触させる前に、方法は、例えば、サンプルを１００℃で少なくとも１５分間インキュベートすることによって、サンプル中の免疫複合体を変性させることを含む。特定の方法において、変性は、約５分間〜少なくとも約６０分間、約８０℃〜少なくとも約１１０℃にて生じることができる。例えば、変性は、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、約１００℃、約１０５℃、又は約１１０℃にて、少なくとも約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、又は約４８分、又は約５０分、又は約５５分、又は少なくとも約６０分の間、生じることができる。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、用語「プロテアーゼ」又は「ペプチダーゼ」又は「プロテイナーゼ」とは、ペプチド結合の加水分解により、タンパク質分解又はタンパク質異化作用を実施する酵素を意味する。プロテアーゼは、触媒残基に応じて７つの大きな群に分類することができる。例えば、（セリンアルコールを用いる）セリンプロテアーゼ、（システインチオールを用いる）システインプロテアーゼ、（トレオニン二級アルコールを用いる）トレオニンプロテアーゼ、（アスパルテートカルボン酸を用いる）アスパラギン酸プロテアーゼ、（グルタメートカルボン酸を用いる）グルタミン酸プロテアーゼ、（金属、通常亜鉛を用いる）メタロプロテアーゼ、及び、（離脱反応を実施するためにアスパラギンを用いる）アスパラギンペプチドリアーゼ。プロテアーゼの例としては、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、エンドプロテアーゼＧｌｕＣ、プロテイナーゼＫ、トロンビン、ファクターＸａ、アルカリ性プロテアーゼ（例えばアルカリ性ＶＩＩＩプロテアーゼ）、パパイン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ペプシン、カテプシンＤ、及びカルボキシペプチダーゼＡを挙げることができるが、これらに限定されない。市販されているプロテアーゼの例としては、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ１（Ｐ／Ｎ  ７６０−２０１８）、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ２（Ｐ／Ｎ  ７６０−２０１９）、又はＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ３（Ｐ／Ｎ  ７６０−２０２０）を挙げることができるが、これらに限定されない。プロテアーゼのインキュベーション時間は当業者により決定されることができるが、インキュベーション時間は、約２分以下〜少なくとも約２０分の範囲であることができ、温度は、約１５℃以下〜少なくとも約４５℃の範囲であることができる。例えば、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は少なくとも約４０℃において、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、又は少なくとも約２０分。特定の例において、インキュベーションは、約３６℃で約４分間、又は、約４０℃で約４分間、又は、４０℃で約４分３０秒間、又は、４０℃で約５分間、又は、約３６℃で約１２分間であることができる。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、用語「ホスファターゼ」とは、水を用いて、リン酸モノエステルを、リン酸イオンとアルコールに分裂させる酵素を意味する（ホスファターゼは、分子からリン酸基を取り除く）。ホスファターゼの例としては、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、リンタンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）、リンタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）、リンタンパク質ホスファターゼ２Ｂ（ＰＰ２Ｂ）、リンタンパク質ホスファターゼ２Ｃ（ＰＰ２Ｃ）、及びλタンパク質ホスファターゼを挙げることができるが、これらに限定されない。市販されているホスファターゼの例としては、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ製のウシアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｐ／Ｎ  ３３５９１２３００１）を挙げることができるが、これらに限定されない。ホスファターゼのインキュベーション時間は当業者により決定されることができるが、インキュベーション時間は、約５分〜少なくとも約１２分の範囲であることができ、温度は、約２０℃〜少なくとも約５０℃の範囲であることができる。例えば、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約３０℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は少なくとも約４０℃において、約８分、約９分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約４５分、約６０分、約９０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、又は少なくとも約１２時間。特定の例において、インキュベーションは、約３６℃で約２時間、又は３７℃で約１０分間、又は３７℃で約６０分間、又は３７℃で約４５分間、又は約３７℃で約６０分間であることができる。
【０１１９】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、インキュベーション時間は変化し、インキュベーション温度に左右される。実質的に完全な抗体結合、発色、及び方法の他の工程のためのインキュベーション期間が周知である。工程の多く、例えば、抗原のアンマスキング、抗体結合、及び発色は、約４分〜約９０分の時間、少なくとも約３５℃、好ましくは約４０℃〜約４５℃、又は最大１００℃の高温で実施される。例えば、特定の方法において、一次抗体は、３６℃で３２分間、サンプルと共にインキュベートすることができるか、又は、約２２℃で２０分間インキュベートすることができる。別の例において、プロテアーゼは、３６℃で１２分間、サンプルと共にインキュベートすることができるか、又は、プロテアーゼは、３６℃で４分間、サンプルと共にインキュベートすることができる。更に別の例において、抗原のアンマスキングは、少なくとも約１００℃で約３０〜９０分間、実施することができる。しかし、酵素活性に応じた工程の例外（抗原のアンマスキング及び発色）はあるものの、大部分の工程は、インキュベーション期間が適切に増加する場合、最低４℃の温度でもまた実施することができる。
【０１２０】
抗原染色試薬が、アンマスキングを必要とする抗原に特異的なものである場合、組織切片を、一次抗体の添加前に、タンパク質分解酵素、即ちプロテアーゼで処理することができる。タンパク質分解酵素、即ちプロテアーゼは、組織切片を覆う、蒸発阻害液体に添加することができ、蒸発阻害液体を通って、下の組織切片まで沈み込む。抗原のアンマスキングのための、十分な期間（例えば約４〜約３０分）のインキュベーションの後、スライドを洗浄し、蒸発阻害液体を再度塗布することができる。
【０１２１】
方法のいくつかにおいて、抗体適用の前に、組織切片を覆うのに十分な量、便利には約１００〜２００μＬの、プロテアーゼ溶液を、パラフィン包埋ホルマリン固定組織に適用することができる。プロテアーゼによる処理によって、抗原の、標識試薬への暴露を補助することができ、これにより、より正確な結果が可能となる。方法のいくつかにおいて、インキュベーション期間は、架橋を破壊するのに充分なものであるが、抗原が破壊されるほど長いものではない。期間は、ホルマリン中での温度、酵素濃度、組織厚、組織の種類、及び時間量によって変化する。適切な時間は、当業者により速やかに決定することができる。例えば、約３６℃で約４分間、又は、約４０℃で約４分間、又は、４０℃で約４分３０秒間、又は、４０℃で約５分間、又は、約３６℃で約１２分間が、効果的であることができる。インキュベーションの後、プロテアーゼ溶液を洗浄し、染色／標識プロセスにおける次の試薬を適用する。これらの範囲が観察されない場合、プロテアーゼによる、組織の過剰分解、及び／又は過小分解が生じている可能性があり、これにより、それぞれ、抗原の破壊／マスクされた抗原がもたらされ得る。インキュベーション後、スライドを水洗することができる。
【０１２２】
抗体
【０１２３】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、抗原のエピトープを特異的に認識し、特異的に結合する、少なくとも軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドを意味する。抗体としては、少なくとも軽鎖若しくは重鎖免疫グロブリン可変領域、又は免疫グロブリン様分子（例えば、限定されるものではないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、これらの組み合わせ、並びに、任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ、及びマウスなどの哺乳類における免疫応答の間に産生される、同様の分子）、並びに、非哺乳類種、例えばサメ免疫グロブリンが挙げられる。抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は抗体断片、及び当技術分野で公知の他のものが含まれる。いくつかの例では、抗体は、酵素又はフルオロフォアなどの検出可能な標識で標識される。抗体としては、他の分子への結合を実質的に除外する、対象分子（又は、対象の非常に類似する分子の群）に特異的に結合する、抗体断片もまた挙げられる。
【０１２４】
用語「抗体」は、天然に存在する、又は組み換え抗体の抗原結合断片もまた含む。用語「抗体」に包含される結合断片の非限定例としては、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。Ｆａｂは、全抗体を酵素のパパインで分解して、インタクトな軽鎖、及び１つの重鎖の一部を得ることにより、又は遺伝子組み換えにより同様に作製した、抗体分子の一価の抗原結合断片を含有する断片である。Ｆａｂ’は、全抗体をペプシンで、続いて還元により処理して、インタクトな軽鎖、及び重鎖の一部を得ることで得られる、抗体分子の断片であり、２つのＦａｂ’断片が、抗体分子１つ当たりから得られる。（Ｆａｂ’）２は、全抗体を酵素のペプシンで、続いての還元なしに処理することで、又は、遺伝子組み換えにより同様に処理することで得られる、抗体の断片である。Ｆ（Ａｂ’）２は、ジスルフィド結合により結合している、２つのＦＡｂ’断片の二量体である。Ｆｖは、軽鎖の可変領域、及び、２つの鎖として発現した、重鎖の可変領域を含有する、遺伝子組み換えされた断片である。一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合した一本鎖分子としての、好適なポリペプチドリンカーにより結合した、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する、遺伝子組み換えされた分子である。これらの断片の作製方法は、当該技術分野において日常的なものである。
【０１２５】
生体サンプル中のその他の分子に対する結合定数よりも、少なくとも１０３Ｍ−１超、少なくとも１０４Ｍ−１超、又は少なくとも１０５Ｍ−１超である、対象分子（即ち、リン酸化α−シヌクレイン、及び、神経的形質にて内在性のタンパク質）に対する結合定数を有する、抗体及び抗体結合断片。いくつかの例では、抗体は、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１．５×１０−８、少なくとも約２．０×１０−８、少なくとも約２．５×１０−８、少なくとも約３．０×１０−８、少なくとも約３．５×１０−８、少なくとも約４．０×１０−８、少なくとも約４．５×１０−８、又は、少なくとも約５．０×１０−８Ｍの結合親和性などの、リン酸化α−シヌクレイン又はＰＧＰ９．５に対する高い結合親和性を有する。特定の実施形態において、リン酸化α−シヌクレイン又はＰＧＰ９．５に結合する抗体は、≦１０４ｎＭ、≦１０３ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ、又は≦０．０００１ｎＭ、又は≦０．００００１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−４Ｍ又は〜１０−６Ｍ、例えば、１０−７Ｍ〜１０−９Ｍ、例えば、１０−１０Ｍ〜１０−１２Ｍ、又は、例えば１０−１３Ｍ〜１０−１５Ｍ）を有する。一実施形態において、Ｋｄは、対象の抗体のＦａｂ版、及びその抗原により実施される、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定することができる。別の例において、Ｋｄは、偏光変調斜め入射反射率差法（ＯＩ−ＲＤ）に基づく、マイクロアレイ検出のための標識非含有光学スキャナを使用して測定することができる。更に別の例において、Ｋｄは、約１０応答単位（ＲＵ）にて、不動化抗原ＣＭ５により、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００、又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定することができる。
【０１２６】
抗体は、重及び軽鎖で構成されており、それらの各々には可変重（ＶＨ）領域及び可変軽（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域がある。まとまって、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原を結合することの原因となる。各重及び軽鎖は、定常領域及び可変領域を含有する（領域は「ドメイン」としても知られている）。組み合わせると、重及び軽鎖可変領域は特異的に、抗原を結合する。軽及び重鎖可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる、３つの超可変領域により中断された「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域とＣＤＲの大きさは、定義されている（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照のこと）。Ｋａｂａｔデータベースは現在、オンラインで維持されている。異なる軽又は重鎖のフレームワーク領域の配列は相対的に、種の中で保存されている。抗体のフレームワーク領域、即ち、構成する軽及び重鎖の、組み合わさったフレームワーク領域は、３次元空間にＣＤＲを配置してアラインする役割を果たす。
【０１２７】
ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。各鎖のＣＤＲは通常、Ｎ末端から始まって連続して番号付けされている、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、また、通常は、特定のＣＤＲが位置する鎖により同定される。したがって、ＶＨＣＤＲ３は、それが見いだされる抗体の重鎖の可変領域に位置する一方で、ＶＬＣＤＲ１は、それが見いだされる抗体の軽鎖の可変領域由来のＣＤＲ１である。リン酸化α−シヌクレインを結合する抗体は、特定のＶＨ領域、及びＶＬ領域配列、そして故に、特定のＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（即ち、異なる抗原に対する異なる組み合わせ部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体毎に異なるのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の、限定的な数のアミノ酸位置のみが、抗原結合に直接関与している。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。
【０１２８】
α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ、ＰＤ１；ＮＡＣＰ；ＰＡＲＫ１；ＰＡＲＫ４；ａＳｙｎとも呼ばれる）、及びリン酸化α−シヌクレインに対するいくつかの抗体が知られている。α−シヌクレインは、シヌクレインファミリーのメンバーであり、β及びγ−シヌクレインもまた含む。シヌクレインは脳内で発現し、α及びβ−シヌクレインは、ホスホリパーゼＤ２を選択的に阻害する。α−シヌクレインは、シナプス前性シグナル伝達、及び膜トラフィッキングを一体化する役割を果たし得る。α−シヌクレインでの変異は、パーキンソン病の病因で示唆されている。α−シヌクレインペプチドは、アルツハイマー病を有する患者の脳内での、アミロイドプラークの主要構成成分である。特定の方法において、リン酸化α−シヌクレインを検出することができる。α−シヌクレイン配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（商標）配列データベースから一般に入手可能である（例えば、寄託番号ＮＭ＿０００３４５．３によりコードされている、アミノ酸寄託番号ＮＰ＿０００３３６．１）。当業者は、α−シヌクレイン多様体及びアイソフォームを含む、更なるα−シヌクレイン核酸及びタンパク質配列を同定することができる。α−シヌクレインを検出するための抗体が当技術分野において既知であり、以下を挙げることができるが、これらに限定されない：免疫原としてのヒトα−シヌクレイン残基１２２〜１３５に対応するホスホペプチドを有する、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  ＣＰＳ  Ｒ＆Ｄ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ＆Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＤＸＲＥＡＡ）により生成される、ホスホＳ１２９α−シヌクレインに対する、ウサギモノクローナル抗体クローン７Ｅ２、及び３Ｇ２。リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン（ａＳｙｎ）に対する更なるモノクローナル抗体は、例えばＡｂｃａｍ（クローンＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）、Ｐ／Ｎ  ａｂ１６８３８１、及びＰ−ｓｙｎ／８１Ａ、Ｐ／Ｎ  ａｂ１８４６７４）、又はＷＡＫＯ（クローンｐＳｙｎ＃６４、Ｐ／Ｎ  ０１５−２５１９１）から購入することができる。Ｓ１２９のリン酸化状態に関係なく、α−シヌクレインに対するマウスモノクローナル抗体クローンＬＢ５０９は、Ａｂｃａｍ（Ｐ／Ｎ  ａｂ２７７６６）から購入することができる。Ｐｒｏｔｈｅｎａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の、抗α−シヌクレインマウスモノクローナル抗体クローン５Ｃ１２（Ｓ１２９リン酸化に無関係；ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＰＴＡ−９１９７）、及び、抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインマウスモノクローナル抗体クローン１１Ａ５（ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＰＴＡ−８２２２）もまた使用することができる。下表１０もまた参照のこと。
【０１２９】
抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインの例は、免疫原としてのヒトα−シヌクレイン残基１２２〜１３５に対応するホスホペプチドを有する、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  ＣＰＳ  Ｒ＆Ｄ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ＆Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＤＸＲＥＡＡ）により生成した、ウサギモノクローナル抗体クローン７Ｅ２である。７Ｅ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号０１のアミノ酸配列を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域を含む。７Ｅ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号０５のアミノ酸配列を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域を含む。
【０１３０】
配列番号０１（７Ｅ２軽鎖）：
ＡＱＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＳＳＱＳＶＹＮＮＮＮＬＶＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＱＶＩＹＫＡＳＫＶＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＬＥＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＧＧＹＳＧＤＩＹＴＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
【０１３１】
配列番号０２  ７Ｅ２  ＬＣ  ＣＤＲ１：ＱＳＶＹＮＮＮＮ
【０１３２】
配列番号０３  ７Ｅ２  ＬＣ  ＣＤＲ２：ＫＡＳＫＶＡＳ
【０１３３】
配列番号０４  ７Ｅ２  ＬＣ  ＣＤＲ３：ＬＧＧＹＳＧＤＩＹＴ
【０１３４】
配列番号０５（７Ｅ２重鎖）：
ＣＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＴＩＳＳＹＨＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＴＳＧＮＩＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＤＬＲＭＴＳＬＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＬＧＩＡＴＧＹＳＦＷＧＨＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＮＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ
【０１３５】
配列番号０６  ７Ｅ２  ＨＣ  ＣＤＲ１：ＧＦＴＩＳＳＹＨＭＳ
【０１３６】
配列番号０７  ７Ｅ２  ＨＣ  ＣＤＲ２：ＩＳＴＳＧＮＩ
【０１３７】
配列番号０８  ７Ｅ２  ＨＣ  ＣＤＲ３：ＡＲＬＧＩＡＴＧＹＳＦ
【０１３８】
いくつかの実施形態では、配列番号０１で表されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を共有しているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体を提供する。更なる実施形態において、配列番号０５で表されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を共有しているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する抗体を提供する。
【０１３９】
抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインの別の例は、免疫原としてのヒトα−シヌクレイン残基１２２〜１３５に対応するホスホペプチドを有する、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  ＣＰＳ  Ｒ＆Ｄ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ＆Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＤＸＲＥＡＡ）により生成した、ウサギモノクローナル抗体クローン３Ｇ２である。３Ｇ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号０９のアミノ酸配列を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域を含む。３Ｇ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域を含む。
【０１４０】
配列番号０９（３Ｇ２軽鎖）：
ＡＱＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＳＳＱＳＶＹＮＮＮＮＬＶＷＦＱＫＫＰＧＱＰＰＫＱＬＩＹＫＡＳＫＶＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＬＥＣＤＤＡＡＴＹＹＣＬＧＧＹＳＧＤＩＹＴＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
【０１４１】
配列番号１０  ３Ｇ２  ＬＣ  ＣＤＲ１：ＱＳＶＹＮＮＮＮ
【０１４２】
配列番号１１  ３Ｇ２  ＬＣ  ＣＤＲ２：ＫＡＳＫＶＡＳ
【０１４３】
配列番号１２  ３Ｇ２  ＬＣ  ＣＤＲ３：ＬＧＧＹＳＧＤＩＹＴ
【０１４４】
配列番号１３（３Ｇ２重鎖）：
ＱＥＱＬＫＥＳＧＧＧＬＶＴＰＧＧＴＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＴＩＳＳＹＨＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＴＳＧＮＩＹＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＤＬＲＭＴＳＬＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＬＧＩＡＴＧＹＳＦＷＧＨＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＮＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ
【０１４５】
配列番号１４  ３Ｇ２  ＨＣ  ＣＤＲ１：ＧＦＴＩＳＳＹＨＭＳ
【０１４６】
配列番号１５  ３Ｇ２  ＨＣ  ＣＤＲ２：ＩＳＴＳＧＮＩ
【０１４７】
配列番号１６  ３Ｇ２  ＨＣ  ＣＤＲ３：ＡＲＬＧＩＡＴＧＹＳＦ
【０１４８】
いくつかの実施形態では、配列番号０９で表されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を共有しているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体を提供する。更なる実施形態において、配列番号１３で表されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を共有しているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する抗体を提供する。
【０１４９】
本開示は、本明細書に定義するような、神経的形質の一部である１つ以上のタンパク質を検出する方法もまた提供する。このようなタンパク質は、以下から選択されるタンパク質を結合可能な抗体により、検出することができる：ユビキチンＣ末端加水分解酵素Ｌ１（ＰＧＰ９．５、ＵＣＨＬ１、ＮＤＧＯＡ；ＰＡＲＫ５；ＰＧＰ９５；ＳＰＧ７９；Ｕｃｈ−Ｌ１；ＨＥＬ−１１７；ＰＧＰ  ９．５；ＨＥＬ−Ｓ−５３；及び寄託番号ＮＭ＿００４１８１．４→ＮＰ＿００４１７２．２）、ＲＮＡ結合ｆｏｘ−１ホモログ３（ＲＢＦＯＸ３、ＦＯＸ３、ＮＥＵＮ、ＦＯＸ−３、ＨＲＮＢＰ３；及び寄託番号ＮＭ＿００１０８２５７５．２→ＮＰ＿００１０７６０４４．１）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２、ＭＡＰ２Ａ、ＭＡＰ２Ｂ、ＭＡＰ２Ｃ；及び寄託番号ＮＭ＿００１０３９５３８．１→ＮＰ＿００１０３４６２７．１）、１６０ｋＤａの中神経フィラメント（ＮＥＦＭ、ＮＦＭ、ＮＥＦ３、ＮＦ−Ｍ；及び寄託番号ＮＭ＿００５３８２．２→ＮＰ＿００５３７３．２）、２００ｋＤａの重神経フィラメント（ＮＥＦＨ、ＮＦＨ、ＣＭＴ２ＣＣ；及びＮＭ＿０２１０７６．３→ＮＰ＿０６６５５４．２）、シナプトフィジン（ＳＹＰ、ＭＲＸ９６、ＭＲＸＳＹＰ；ＮＭ＿００３１７９．２→ＮＰ＿００３１７０．１）、又は、ディスク大型ＭＡＧＵＫ足場タンパク質４（ＤＬＧ４、ＤＬＧＨ４、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ９５、ＳＡＰ−９０、ＳＡＰ９０、ＳＡＰ９０Ａ；及び寄託番号ＮＭ＿００１３６５．４→ＮＰ＿００１３５６．１）。当業者は、多様体及びアイソフォームを含む、更なるＰＧＰ９．５、ＲＢＦＯＸ３、ＭＡＰ２、ＮＥＦＭ、ＮＥＦＨ、ＳＹＰ、及びＤＬＧ４核酸及びタンパク質配列を同定することができる。ＰＧＰ９．５、ＲＢＦＯＸ３、ＭＡＰ２、ＮＥＦＭ、ＮＥＦＨ、ＳＹＰ、及びＤＬＧ４を検出するための抗体は、当技術分野において既知である。例えば、ＰＧＰ９．５を結合可能な抗体としては、ウサギ（クローンＥＰＲ４１１８、Ｐ／Ｎ  ａｂ１０８９８６）、又はマウス（クローン１３Ｃ／Ｉ３Ｃ４、Ｐ／Ｎ  ａｂ８１８９）由来の、抗ヒトＰＧＰ９．５モノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されず、Ａｂｃａｍから購入可能である。ＲＴＤ  Ｐ／Ｎ  ７６０−４４３４を有するウサギポリクローナル抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ（商標）から入手することができる。
【０１５０】
本明細書で使用する場合、用語「接触させること」とは、例えば、固体状及び／又は液体状の両方で、２つ以上の部分間での会合、特に物理的な直接会合を可能にする配置（例えば、抗原放出溶液と接触した、スライドに固定した生体サンプルなどの生体サンプルの配置）を意味する。
【０１５１】
本明細書で使用する場合、用語「特異的に結合する」とは、定義された標的に優先的に結合する剤の（例えば、抗体の、特異的抗原への、又は、核酸プローブの、特異的核酸配列への）結合を意味する。標的は、存在、位置、及び／又は濃度が測定されている、又は測定可能な、任意の分子であることができる。標的分子の例としては、タンパク質及び核酸が挙げられる。標的分子は通常、特異的な結合分子と検出可能な標識との、１つ以上の抱合体を用いて検出される。抗原に関しては、「特異的に結合する」とは、抗体又は他のリガンドが、全体的、又は部分的に、特異的なポリペプチドと優先的に会合することを意味する。核酸配列に関して、「特異的に結合する」とは、核酸プローブが、全体的、又は部分的に、特異的な核酸配列と優先的に会合することを意味する。特異的結合剤は、実質的に、定義された標的のみに結合する。わずかな程度の非特異的な相互作用が、特異的結合剤などの分子と、非標的ポリペプチド又は非標的核酸配列との間で生じ得ることが認識されている。選択的反応性抗体は抗原に結合するものの、この結合は、低い親和性で生じ得る。抗体の、抗原への特異的結合は通常、非標的ポリペプチドと比較して、結合した抗体、又は他のリガンドの、標的ポリペプチドへの、（単位時間当たり）２倍超、例えば５倍超、１０倍超、又は１００倍超の量の増加をもたらす。様々なイムノアッセイフォーマットが、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するのに好適である。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫学的検定は、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するのに日常的に使用されている。
【０１５２】
抗原（例えば標的抗原）を含むサンプルは、抗体−抗原結合を可能にする条件下にて、抗体と共にインキュベートされる。抗体に抱合体化した検出可能な標識により（直接検出）、又は、一次抗体に対して増加した二次に抱合体化した検出可能な標識により（例えば、間接検出）、抗体−抗原結合を検出することができる。検出可能な標識としては、放射性同位元素、蛍光色素（例えばフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、及びローダミン）、並びに色素分子を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１５３】
本明細書で使用する場合、用語「検出する」とは、剤（例えばシグナル又は特定の抗原又はタンパク質）が、サンプルに存在するか否かを判定することを意味する。いくつかの例では、検出は、定量化を更に含むことができる。本明細書で使用する場合、用語「検出すること」とは、標的分子が生体サンプルに存在するか否かの判定といった、何かが存在化するか否かを判定する、任意の方法を意味する。例えば、検出することは、サンプルが特異的な特徴を示すか否かを判定する、視覚又は機械装置を用いることを含むことができる。特定の例において、検出とは、標的に結合したプローブを視覚的に観察すること、又は、プローブが標的に結合していないことを観察することを意味する。例えば、光学顕微鏡及び他の微視的手段が、本明細書で記載した方法の色素体沈殿物を検出するために、一般的に使用される。
【０１５４】
標識
【０１５５】
本明細書で使用する場合、「検出可能な標識」とは、サンプル内での標的の存在及び／又は濃度を示す、（例えば、視覚的、電気的、又は他の方法で）検出可能なシグナルを生成可能な分子又は材料を意味する。特異的結合分子に抱合体化したとき、検出可能な標識を使用して、特異的結合分子が向けられている標的を指定する、かつ／又は定量化することができる。それによって、サンプル内での標的の存在及び／又は濃度を、検出可能な標識により生成したシグナルを検出することで、検出することができる。検出可能な標識は直接的又は間接的に検出可能であり、異なる特異的結合分子に抱合体化した、いくつかの異なる検出可能な標識を組み合わせて使用して、１つ以上の標的を検出することができる。個別に検出可能な複数の検出可能な標識を、異なる標的を特異的に結合する異なる特異的結合分子と抱合体化して、サンプル内での複数の標的の検出をもたらすことができる、多重化アッセイを提供することができる。検出可能なシグナルは、光子（高周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視光周波数、及び紫外線周波数光子）の吸収、放出、及び／又は散乱を含む、任意の既知の、又は未だ発見されていないメカニズムにより生成することができる。
【０１５６】
検出可能な標識としては、発色性、蛍光性、蛍光体、及び発光性分子及び材料、（例えば、無色物質を着色物質に、若しくはその逆に変換することにより、又は、沈殿物を生成するか、若しくはサンプルの濁度を増加させることにより）ある物質を別の物質に変換して、検出可能な差異を生み出す触媒（例えば酵素）を挙げることができる。検出可能な標識の具体例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はβ−グルクロニダーゼなどの酵素；フルオレセイン、発光団、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ染料、レゾルフィン、及びローダミンなどのフルオロフォア（蛍光分子の多くの更なる例は、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲに見いだすことができる）；量子ドットなどのナノ粒子；Ｇｄ３＋などの、放射性又は常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレートといった、金属キレート；並びにリポソーム、例えば、トラップされた蛍光分子を含有するリポソームが挙げられる。検出可能な標識が酵素を含む場合、色素体、蛍光性化合物、又は発光性化合物などの、検出可能な基質を酵素と組み合わせて使用し、検出可能なシグナルを生成する（多種多様なこのような化合物が、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．から市販されている）。
【０１５７】
本明細書で使用する場合、用語「色素体」とは、顔料又は染料などの、着色生成物への転換が可能な物質を意味する。ある種の色素体は、酸化した際に着色生成物になる、電子供与体である。着色生成物の作製、又は、例えば酸化による、化学的転換の際に不溶性となる性質によって、色素体がＩＨＣに有用となる。色素性化合物の非限定例としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−クロロ−２−メチル−ベンゼンジアゾニウム（Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＡＰ  Ｏｒａｎｇｅ、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルフォネート］（ＡＢＴＳ）、Ｎｅｗ  Ｆｕｃｈｓｉｎ、ヨードニトロテトラゾウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー及びテトラゾリウムバイオレットが挙げられる。更なる色素体、例えば、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＡＰブルー、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、及びテトラゾリウムバイオレットが、当業者に知られている。ＤＡＢは、アルコール及びその他の有機溶媒に高度に不溶性の茶色の最終生成物を生成する色原体である。ＤＡＢの酸化により重合が引き起こされ、オスミウム四酸化物との反応能力が得られることで、その染色強度、及び電子密度が増加する。
【０１５８】
あるいは、酵素を金属組織学的検出スキームで使用することができる。金属組織学的検出法としては、水溶性金属イオン（例えば銀又は金）、酸化剤、及び還元剤と共に、オキシド還元酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼなど）を用いて、検出可能な沈殿物を再度形成することが挙げられる。適切な条件（即ち、標識酵素の添加）にて、銀（＋１）又は金（＋３）などの可溶性金属イオンの、銀又は金原子への還元が行われ、明視野顕微鏡の元で、明確な点として目視可能となる。
【０１５９】
キット
【０１６０】
本開示は、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と、神経的形質に結合可能な一次抗体とを含むキットもまた提供する。本明細書にて開示するキットのいくつかにおいて、キットは、（ａ）抱合体化した第１のラベルを有する、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と免疫反応性の第１の二次抗体；（ｂ）第１の二次抗体の第１のラベルと反応したとき、第１の検出可能なシングルを生成するひとまとまりの試薬；（ｃ）抱合体化した第２のラベルを有する、神経的形質を結合可能な一次抗体と免疫反応性の第２の二次抗体；及び、（ｄ）第２の二次抗体の第２のラベルと反応したとき、第２の検出可能なシングルを生成するひとまとまりの試薬を更に含み、第１の検出可能なシグナルと第２の検出可能なシグナルは異なっている。キットのいくつかにおいて、第１の検出可能なシグナルは銀染色であり、第２の検出可能なシグナルはＱＭ−Ｄａｂｓｙｌ又はＦａｓｔ−Ｒｅｄである。
【０１６１】
本明細書で使用する場合、用語「キット」とは、対象の検体を検出するのに必要な試薬を保持する、１つ以上の入れ物、容器、装置などの、パッケージ化された組み合わせを意味する。キットには、方法を実施するための、手書きの、又はコンピューター化された取扱説明書が付属する。キットは、標識された抗体、核酸、リガンドなどを含有してよい。生体サンプルで対象の検体を検出するためのキットは、１つ以上の容器であって、各容器が、対象の検体の特異的結合要素、酸化還元不活性の還元性種、前記還元性種を活性にするための酵素標識、金属イオン、及び、金属強化のための試薬、を保持するように適合した、容器を含むことができる。いくつかの実施形態では、上記特異的結合要素は、固体支持体上で不動化されている。
【０１６２】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、α−シヌクレインに結合可能な一次抗体は、表１０に開示する抗体のうちの１つである。例えば、α−シヌクレインを検出するための抗体としては、リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインに対する、ウサギモノクローナル抗体クローン７Ｅ２及び３Ｇ２を挙げることができるが、これらに限定されない。リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインに対する更なるモノクローナル抗体としては、例えばＡｂｃａｍクローンＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）、Ｐ／Ｎ  ａｂ１６８３８１、及びＰ−ｓｙｎ／８１Ａ、Ｐ／Ｎ  ａｂ１８４６７４、又はＷＡＫＯクローンｐＳｙｎ＃６４、Ｐ／Ｎ  ０１５−２５１９１を挙げることができる。Ｓ１２９のリン酸化状態に関係なく、α−シヌクレインに対するマウスモノクローナル抗体クローンＬＢ５０９（例えば、Ａｂｃａｍ（Ｐ／Ｎ  ａｂ２７７６６））を使用することができる。Ｐｒｏｔｈｅｎａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の、抗α−シヌクレインマウスモノクローナル抗体クローン５Ｃ１２（Ｓ１２９リン酸化に無関係；ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＰＴＡ−９１９７）、及び、抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインマウスモノクローナル抗体クローン１１Ａ５（ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＰＴＡ−８２２２）もまた使用することができる。
【０１６３】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、神経的形質に結合可能な一次抗体は、以下からなる群から選択されるタンパク質を結合可能な抗体から選択される：ユビキチンＣ末端加水分解酵素Ｌ１（ＰＧＰ９．５、ＵＣＨＬ１、ＮＤＧＯＡ；ＰＡＲＫ５；ＰＧＰ９５；ＳＰＧ７９；Ｕｃｈ−Ｌ１；ＨＥＬ−１１７；ＰＧＰ  ９．５；ＨＥＬ−Ｓ−５３）、ＲＮＡ結合ｆｏｘ−１ホモログ３（ＲＢＦＯＸ３、ＦＯＸ３、ＮＥＵＮ、ＦＯＸ−３、ＨＲＮＢＰ３）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２、ＭＡＰ２Ａ、ＭＡＰ２Ｂ、ＭＡＰ２Ｃ）、１６０ｋＤａの中神経フィラメント（ＮＥＦＭ、ＮＦＭ、ＮＥＦ３、ＮＦ−Ｍ）、２００ｋＤａの重神経フィラメント（ＮＥＦＨ、ＮＦＨ、ＣＭＴ２ＣＣ）、シナプトフィジン（ＳＹＰ、ＭＲＸ９６、ＭＲＸＳＹＰ）、及び、ディスク大型ＭＡＧＵＫ足場タンパク質４（ＤＬＧ４、ＤＬＧＨ４、ＰＳＤ−９５、ＰＳＤ９５、ＳＡＰ−９０、ＳＡＰ９０、ＳＡＰ９０Ａ）。
【０１６４】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、方法は、切片を、抱合体化した第１のラベルを有する、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と免疫反応性の第１の二次抗体と接触させることと、切片を、抱合体化した第２のラベルを有する、神経的形質を結合可能な一次抗体と免疫反応性の第２の二次抗体と接触させることと、を更に含む。
【０１６５】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、方法は、切片を、第１の二次抗体の第１のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と接触させて、サンプルのリン酸化α−シヌクレインの近くで、第１の検出可能なシグナルを生成することと、切片を、第２の二次抗体の第２のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と反応させて、サンプルの神経的形質の近くで、第２の検出可能なシグナルを生成することと、を更に含む。
【０１６６】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、方法は、切片をリン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触させた後、及び、切片を神経的形質を結合可能な一次抗体と接触させる前に、サンプル中で免疫複合体を変性させることを更に含む。
【０１６７】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、切片は、一次抗体と接触する前に、少なくとも１つのプロテアーゼと接触する。ある種の方法において、方法は、切片を少なくとも１つのホスファターゼと接触させることを更に含む。
【０１６８】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体及び神経的形質を結合可能な一次抗体は、同一の宿主種に由来する。
【０１６９】
本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、第１の検出可能なシグナルと第２の検出可能なシグナルは異なっている。本明細書で開示する方法のいくつかにおいて、第１の検出可能なシグナルは銀染色であり、第２の検出可能なシグナルはＱＭ−Ｄａｂｓｙｌ又はＦａｓｔ−Ｒｅｄである。
【０１７０】
本明細書において、対象におけるＰＤの診断方法であって、（ａ）ＰＤを有することが疑われる対象由来の少なくとも１つの神経的形質を含む生体サンプルを得ることと、（ｂ）サンプルを抗ＰＧＰ．５抗体と接触させ、リン酸化α−シヌクレインとＰＧＰ９．５との同時局在化を判定することにより、リン酸化α−シヌクレインがサンプルの神経的形質内で局在化するか否かを検出することと、（ｃ）神経的形質において、リン酸化α−シヌクレインとＰＧＰ９．５との同時局在化があることが断定的に判定されたとき、対象をＰＤと診断することと、を含む、方法もまた提供する。場合によっては、神経的形質が、抗ＰＧＰ９．５抗体と関連するシグナルなしで同定可能な場合に、方法は、抗ＰＧＰ９．５抗体を用いずに達成可能であり得る。例えば、経験豊富な病理学者は、このようなシグナルなしで、組織サンプル内の神経的形質を認識することができる。病理学者は、神経的形質と共に局在化したリン酸化α−シヌクレインと関連するシグナルの存在により、ＰＤを有する対象を診断することができる。
【０１７１】
このような方法としては例えば、サンプルで検出されたリン酸化α−シヌクレイン及び神経的形質をスコア付けすることを挙げることができる。いくつかの方法においては、スライド全体での神経的形質の数を計数し、リン酸化α−シヌクレインを含有する神経的形質のパーセンテージとして表現する。神経的形質が標的神経的形質タンパク質の存在により同定される場合、リン酸化α−シヌクレインタンパク質と、標的神経的形質タンパク質の存在は、０．２５平方ミリメートルの面積を有する、５×５光格子を用いて、サンプル内で、リン酸化α−シヌクレインにより染色した神経的形質の絶対数を測定し、０．２５平方ミリメートルの面積を有する、５×５光格子を用いて、サンプル内で、標的神経的形質抗体により染色した神経的形質の絶対数を測定し、リン酸化α−シヌクレインで染色した細胞の絶対数を、１平方ミリメートル領域での神経的形質の数に補外し、標的神経的形質抗体で染色した神経的形質の絶対数を、１平方ミリメートル領域での神経的形質の数に補外し、リン酸化α−シヌクレインタンパク質と、標的神経的形質タンパク質のスコアを生成することを含むことができる。したがって、方法は、格子内で、リン酸化α−シヌクレインに対して正に染色する神経的形質の数、及び、標的神経的形質タンパク質に対して正に染色する神経的形質の数（リン酸化α−シヌクレイン及び／又は標的神経的形質に対して正の神経的形質など）を計数することを含むことができる。ある特定の例において、これらの値を、以下の式：細胞計数／（格子の０．０１５６倍）に挿入する。この式は、等倍率においてもモデル間で可変性である、対物レンズの直径により左右される。異なる倍率、又は異なる対物レンズを使用する場合、他の式を使用することができる。いくつかの例では、無作為に選択したサンプルの領域を、スコア付けのために選択する。したがって、図３２に示すように、画像内で同時局在化した、各黒色及び黄色の点は、リン酸化α−シヌクレイン、及び標的神経的形質タンパク質による神経的形質の染色を表す。
【０１７２】
部分的に、リン酸化α−シヌクレインと、対象由来の生体サンプルの神経的形質との同時局在化があることが断定的に判定されたときに、ＰＤを有する対象を診断することによる、対象がパーキンソン病（ＰＤ）を有するか否かを判定する方法、対象におけるＰＤの診断方法、並びに、対象におけるＰＤの診断及び治療方法を本明細書で提供する。例えば、対象から入手したサンプルが、本明細書において提供する方法を使用して、通常のサンプル（例えば、同じ組織種の非ＰＤサンプル）と比較して、リン酸化α−シヌクレインと神経的形質との同時局在化の増加を有すると分析、又はスコア付けされた場合、対象は、パーキンソン病を有するものであると判定されることができる、又はそのように診断されることができる。例えば、通常のサンプルの神経的形質内のリン酸化α−シヌクレイン（例えば、そのようなサンプルの参照値又は値の範囲）と比較して、組織サンプルの神経的形質内のリン酸化α−シヌクレインでの、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、又は少なくとも５００％の増加（例えば少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍）。対照的に、対象から入手した生体サンプルが、本明細書において提供する方法を使用して、通常のサンプル（例えば、非ＰＤサンプル）と比較して、神経的形質内で同様の、又は減少したリン酸化α−シヌクレインを有すると分析、又はスコア付けされた場合、対象は、パーキンソン病を有しない可能性があるものとして判定されることができる、又はそのように診断されることができる。いくつかの例では、開示した方法は、対象が、パーキンソン病を有するものであると判定されることができる、又はそのように診断されることができる場合に、対象に、１種以上の治療法又は治療を投与することを更に含むことができる。
【０１７３】
本明細書においては、ＰＤと診断された対象の治療方法であって、対象に、α−シヌクレイン抗体の効果的な治療方式を投与することを含み、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な抗体、及び、神経的形質を結合可能な抗体が、対象由来の皮膚サンプルの神経的形質に同時局在化することが示されている方法もまた、提供する。特定の方法において、本明細書記載の方法のいずれかにより、ＰＤを有すると判定された対象は、対象に、α−シヌクレイン抗体の効果的な治療方式を投与することで治療することができる。
【０１７４】
本明細書で使用する場合、用語「治療する」、「治療」、及び「治療すること」とは、パーキンソン病及び関連する運動障害の、一次的又は二次的症状の１つ以上の改善を意味する。パーキンソン病の一次的症状としては、四肢を休めている間の、四肢の振戦、運動が全体的に遅いこと（運動緩徐）、筋肉の剛性又は硬さの増加、歩行又は平衡問題（体位の機能障害）が挙げられるが、これらに限定されない。パーキンソン病の二次的症状としては、運動開始又は停止の困難さ、微細な運動技術の喪失、歩行中に、体の、影響を受ける側での腕の振りの喪失、体の、影響を受ける側での足の引きずり、顔の表現の減少、声及び／又は話し方の変化、認知疾患、睡眠疾患、胃腸の機能障害、並びに、鬱又は不安を感じることが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
本開示の方法によってもまた治療可能な、関連運動障害としては、アカシジア、アキネジア（運動の喪失）、アテトーシス（歪んだねじれ（ｔｏｒｓｉｏｎ  ｏｒ  ｔｗｉｓｔｉｎｇ））、運動失調、バリズム（激しい不随意性の急激かつ不規則な運動）、脳性小児麻痺、舞踏病（例えばシデナム舞踏病、リウマチ性舞踏病、ハンチントン病）、筋緊張異常（例えば変形性筋緊張異常、眼瞼痙攣、書痙、痙性斜頸）、本態性振戦（顎及び下唇の、偶発性かつ不随意性の上下運動）間代性筋痙攣、レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）、攣縮、紋切り型の運動障害、常同症、遅発性ジスキネジー、チック障害（トゥレット症候群、体位性振戦、動力学的振戦、本態性振戦、小脳性振戦、生理学的振戦）、並びにウィルソン病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
治療及び／又は治療法の開始前に、全ての対象は、神経変性疾患及びパーキンソン病の専門技術及び経験を有する集学的チームにより評価及び管理されなければならない。ＰＤを有する対象は通常、神経科医、作業療法士、理学療法士、カウンセラー、ソーシャルワーカー、登録済み栄養士、及び言語療法士を含むがこれらに限定されない、異なる専門の医師で構成された、医療専門家及び集学的ヘルスケアチームを有する。対象でＰＤが診断された後、医療専門家又は医療専門家のチームは通常、処方された薬物治療の１つ以上（例えば、メシル酸ベンズトロピン（Ｃｏｇｅｎｔｉｎ）、エンタカポン（Ｃｏｍｔａｎ）、ドーパー、ラロドパ、レボドパ及びカルビドパ（Ｓｉｎｅｍｅｔ）、プラミペキソール（Ｍｉｒａｐｅｘ）、ラサギリン（Ａｚｉｌｅｃｔ）、ロピニロールＨｃｌ（Ｒｅｑｕｉｐ）、ロチゴチン（Ｎｅｕｐｒｏ）、サフィナミド（Ｘａｄａｇｏ）、タスマル、若しくはトリへクスフェニジル（Ａｒｔａｎｅ））、手術（例えば脳深部電気刺激法、淡蒼球破壊術、視床切開、若しくはガンマナイフ）、代替療法（コエンザイムＱ１０、マッサージ、針、太極拳、ヨガ、アレクサンダー法、若しくは瞑想）、並びに／又は健康的な食事及び運動を含む１つ又はいくつかの治療オプションを推奨する。治療レジメンは、医療専門家又は医療専門家のチームにより決定され、各対象に特異的であることができる。当業者は、ＰＤの様々な他の治療に通暁している。
【０１７７】
そのようないくつかの方法において、α−シヌクレイン抗体の効果的な治療方式は、α−シヌクレインの残基１〜２０、α−シヌクレインの残基１〜１０、α−シヌクレインの残基４〜１５、α−シヌクレインの残基９１〜９９、α−シヌクレインの残基１１７〜１２３、α−シヌクレインの残基１１８〜１２６内で結合するモノクローナル抗体；プラシネズマブ（ＰＲＸ００２）；抗体クローン１Ｈ７（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２２０）のＣＤＲを有するヒト化抗体；抗体クローン９Ｅ４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２２１）のＣＤＲ、抗体クローンＮＩ−２０２．２１Ｄ１１のＣＤＲ、及び抗体クローンＮＩ−２０２．１２Ｆ４のＣＤＲを有するヒト化抗体、例えば、米国特許第８，０９２，８０１号、同第８，６０９，８２０号、同第８，７９０，６４４号、同第８，９４０，２７６号、同第９，５８０，４９３号（それら全体が本明細書に参照により組み込まれる）に開示されている、α−シヌクレイン抗体などからなる群から選択されるα−シヌクレイン抗体を含む。
【０１７８】
そのようないくつかの抗体は、配列番号４９の残基３１〜３５を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４９の残基５０〜６８を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号４９の残基１０１〜１０２を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号５０の残基２３〜３３を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号５０の残基４９〜５５を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号５０の残基８８〜９８を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。そのようないくつかの抗体は、配列番号５１を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５２を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号５３を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号５４を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号５５を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号５６を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。そのようないくつかの抗体は、配列番号５７を含む重鎖、及び配列番号５８を含む軽鎖を含む。
【０１７９】
配列番号４９（米国特許第８，９４０，２７６号の配列番号９）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＤＦＥＫＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＱＷＶＡＲＩＫＳＴＡＤＧＧＴＴＳＹＡＡＰＶＥＧＲＦＩＩＳＲＤＤＳＲＮＭＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＳＡＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１８０】
配列番号５０（米国特許第８，９４０，２７６号の配列番号１２）
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＲＩＴＣＳＧＥＡＬＰＭＱＦＡＨＷＹＱＱＲＰＧＫＡＰＶＩＶＶＹＫＤＳＥＲＰＳＧＶＰＥＲＦＳＧＳＳＳＧＴＴＡＴＬＴＩＴＧＶＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＰＤＳＴＮＴＹＥＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【０１８１】
配列番号５１（米国特許第９，５８０，４９３号の配列番号１６；ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１−ＶＨ  ＣＤＲ１）
ＮＹＡＭＨ
【０１８２】
配列番号５２（米国特許第９，５８０，４９３号の配列番号１７；ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１−ＶＨ  ＣＤＲ２）
ＷＩＮＡＧＮＧＫＲＫＹＳＱＫＦＱＤ
【０１８３】
配列番号５３（米国特許第９，５８０，４９３号の配列番号１８；ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１−ＶＨ  ＣＤＲ３）
ＥＥＤＨＡＧＳＧＳＹＬＳＭＤＶ
【０１８４】
配列番号５４（米国特許第９，５８０，４９３号の配列番号２３；ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１−ＶＫ  ＣＤＲ１）
ＫＳＳＱＮＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡ
【０１８５】
配列番号５５（米国特許第９，５８０，４９３号の配列番号２４；ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１−ＶＫ  ＣＤＲ２）
ＷＡＳＴＲＥＳ
【０１８６】
配列番号５６（米国特許第９，５８０，４９３号の配列番号２５；ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１−ＶＫ  ＣＤＲ３）
ＱＱＹＹＳＳＰＬＴ
【０１８７】
配列番号５７（米国特許第８，６０９，８２０号の配列番号１０）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＩＳＳＧＧＧＳＴＹＹＰＤＮＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＡＧＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１８８】
配列番号５８（米国特許第８，６０９，８２０号の配列番号：５）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＩＱＴＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＩＲＫＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＬＡＴＹＹＣＱＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【０１８９】
そのようないくつかの方法において、抗体はプラシネズマブ（ＰＲＸ００２）である。そのようないくつかの方法において、抗体は、それぞれ配列番号１８〜２０と呼ばれる３つの軽ＣＤＲ、及び、それぞれ配列番号２２〜２４と呼ばれる３つの重鎖ＣＤＲを含む。そのようないくつかの方法において、抗体は、配列番号１７と呼ばれる軽鎖、及び配列番号２１と呼ばれる重鎖を含む。
【０１９０】
配列番号１７  ＞１０６８０Ｌ｜プラシネズマブ｜ヒト化｜ＬＣ｜
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＩＱＴＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＩＲＫＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＬＡＴＹＹＣＱＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０１９１】
配列番号１８  プラシネズマブＬＣ  ＣＤＲ１  ＫＳＩＱＴＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ
【０１９２】
配列番号１９  プラシネズマブＬＣ  ＣＤＲ２  ＷＡＳＩＲＫＳ
【０１９３】
配列番号２０  プラシネズマブＬＣ  ＣＤＲ３  ＱＱＹＹＳＹＰＬＴ
【０１９４】
配列番号２１  ＞１０６８０Ｈ｜プラシネズマブ｜ヒト化｜ＨＣ｜
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＩＳＳＧＧＧＳＴＹＹＰＤＮＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＡＧＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１９５】
配列番号２２  プラシネズマブＨＣ  ＣＤＲ１  ＮＹＧＭＳ
【０１９６】
配列番号２３  プラシネズマブＨＣ  ＣＤＲ１  ＳＩＳＳＧＧＧＳＴＹＹＰＤＮＶＫＧ
【０１９７】
配列番号２４  プラシネズマブＨＣ  ＣＤＲ１  ＧＧＡＧＩＤＹ
【０１９８】
そのようないくつかの方法において、抗体は、本明細書に、その全体が参照により組み込まれる、米国特許第８，６０９，８２０号に開示されている、９Ｅ４である。方法は、配列番号２９の３つのＫａｂａｔ  ＣＤＲを含むヒト化重鎖、及び、配列番号２５の３つのＣＤＲを含むヒト化軽鎖（ただし、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦ若しくはＹにより占有され、かつ／又は、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬ若しくはＦにより占有され、かつ／又は、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤ若しくはＮにより占有され、かつ／又は、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳ若しくはＡにより占有される）を含む抗体を提供する。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６はＦにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ８３はＬにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｈ７３はＤにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｈ９３はＡにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６はＦにより占有され、位置Ｌ８３はＬにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６はＦにより占有され、位置Ｈ７３はＤにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６はＦにより占有され、位置Ｈ９３はＡにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６はＦにより占有され、位置Ｌ８３はＬにより占有され、位置Ｈ７３はＤにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６はＦにより占有され、位置Ｌ８３はＬにより占有され、位置Ｈ９３はＡにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６はＦにより占有され、位置Ｌ８３はＬにより占有され、位置１１７３はＤにより占有され、位置Ｈ９３はＡにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６、Ｌ８３、Ｈ７３、及びＨ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）の残基はＦにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＡにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置１１７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＤにより占有され、位置１１９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＡにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置１１７３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＮにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ７３（Ｋａｂａｔ番号付け���はＤにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。そのようないくつかの抗体において、位置Ｌ３６（Ｋａｂａｔ番号付け）はＦにより占有され、位置Ｌ８３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＬにより占有され、位置Ｈ９３（Ｋａｂａｔ番号付け）はＳにより占有される。そのようないくつかの方法において、抗体は、それぞれ配列番号２６〜２８と呼ばれる３つの軽ＣＤＲ、及び、それぞれ配列番号３０〜３２と呼ばれる３つの重鎖ＣＤＲを含む。そのようないくつかの方法において、抗体は、配列番号２５と呼ばれる軽鎖可変領域、及び配列番号２９と呼ばれる重鎖可変領域を含む。
【０１９９】
配列番号２５  ９Ｅ４  ＬＣ可変領域
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＩＱＴＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＩＲＫＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【０２００】
配列番号２６  ９Ｅ４  ＬＣ  ＣＤＲ１  ＫＳＩＱＴＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ
【０２０１】
配列番号２７  ９Ｅ４  ＬＣ  ＣＤＲ２  ＷＡＳＩＲＫＳ
【０２０２】
配列番号２８  ９Ｅ４  ＬＣ  ＣＤＲ３  ＱＱＹＹＳＹＰＬＴ
【０２０３】
配列番号２９  ９Ｅ４  ＨＣ可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＩＳＳＧＧＧＳＴＹＹＰＤＮＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＡＧＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２０４】
配列番号３０  ９Ｅ４  ＨＣ  ＣＤＲ１  ＮＹＧＭＳ
【０２０５】
配列番号３１  ９Ｅ４  ＨＣ  ＣＤＲ２  ＳＩＳＳＧＧＧＳＴＹＹＰＤＮＶＫＧ
【０２０６】
配列番号３２  ９Ｅ４  ＨＣ  ＣＤＲ３  ＧＧＡＧＩＤＹ
【０２０７】
そのようないくつかの方法において、抗体はＮＩ−２０２．２１Ｄ１１である。そのようないくつかの方法において、抗体は、それぞれ配列番号３４〜３６と呼ばれる３つの軽ＣＤＲ、及び、それぞれ配列番号３８〜４０と呼ばれる３つの重鎖ＣＤＲを含む。そのようないくつかの方法において、抗体は、配列番号３３と呼ばれる軽鎖可変領域、及び配列番号３７と呼ばれる重鎖可変領域を含む。
【０２０８】
配列番号３３  ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１  ＬＣ可変領域
ＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＮＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＨＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＴＳＬＱＴＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＳＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【０２０９】
配列番号３４  ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１  ＬＣ  ＣＤＲ１  ＫＳＳＱＮＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡ
【０２１０】
配列番号３５  ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１  ＬＣ  ＣＤＲ２  ＷＡＳＴＲＥＳ
【０２１１】
配列番号３６  ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１  ＬＣ  ＣＤＲ３  ＱＱＹＹＳＳＰＬＴ
【０２１２】
配列番号３７  ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１  ＨＣ可変領域
ＥＶＱＬＶＥＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＩＮＡＧＮＧＫＲＫＹＳＱＫＦＱＤＲＶＴＩＮＲＤＴＳＡＳＴＩＹＭＥＬＳＳＬＧＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＥＤＨＡＧＳＧＳＹＬＳＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２１３】
配列番号３８  ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１  ＨＣ  ＣＤＲ１  ＮＹＡＭＨ
【０２１４】
配列番号３９  ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１  ＨＣ  ＣＤＲ２  ＷＩＮＡＧＮＧＫＲＫＹＳＱＫＦＱＤ
【０２１５】
配列番号４０  ＮＩ−２０２．２１Ｄ１１  ＨＣ  ＣＤＲ３  ＥＥＤＨＡＧＳＧＳＹＬＳＭＤＶ
【０２１６】
そのようないくつかの方法において、抗体はＮＩ−２０２．１２Ｆ４である。そのようないくつかの方法において、抗体は、それぞれ配列番号４２〜４４と呼ばれる軽重ＣＤＲ、及び、それぞれ配列番号４６〜４８と呼ばれる３つの重鎖ＣＤＲを含む。そのようないくつかの方法において、抗体は、配列番号４１と呼ばれる軽鎖可変領域、及び配列番号４５と呼ばれる重鎖可変領域を含む。
【０２１７】
配列番号４１  ＮＩ−２０２．１２Ｆ４  ＬＣ可変領域
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＲＩＴＣＳＧＥＡＬＰＭＱＦＡＨＷＹＱＱＲＰＧＫＡＰＶＩＶＶＹＫＤＳＥＲＰＳＧＶＰＥＲＦＳＧＳＳＳＧＴＴＡＴＬＴＩＴＧＶＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＰＤＳＴＮＴＹＥＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【０２１８】
配列番号４２  ＮＩ−２０２．１２Ｆ４  ＬＣ  ＣＤＲ１  ＳＧＥＡＬＰＭＱＦＡＨ
【０２１９】
配列番号４３  ＮＩ−２０２．１２Ｆ４  ＬＣ  ＣＤＲ２  ＫＤＳＥＲＰＳ
【０２２０】
配列番号４４  ＮＩ−２０２．１２Ｆ４  ＬＣ  ＣＤＲ３  ＱＳＰＤＳＴＮＴＹＥＶ
【０２２１】
配列番号４５  ＮＩ−２０２．１２Ｆ４  ＨＣ可変領域
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＤＦＥＫＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＱＷＶＡＲＩＫＳＴＡＤＧＧＴＴＳＹＡＡＰＶＥＧＲＦＩＩＳＲＤＤＳＲＮＭＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＳＡＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２２２】
配列番号４６  ＮＩ−２０２．１２Ｆ４  ＨＣ  ＣＤＲ１  ＫＡＷＭＳ
【０２２３】
配列番号４７  ＮＩ−２０２．１２Ｆ４  ＨＣ  ＣＤＲ２  ＲＩＫＳＴＡＤＧＧＴＴＳＹＡＡＰＶＥＧ
【０２２４】
配列番号４８  ＮＩ−２０２．１２Ｆ４  ＨＣ  ＣＤＲ３  ＴＳＡＨ
【０２２５】
本明細書においては、リン酸化α−シヌクレインの検出方法であって、生体サンプルを、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触させることと、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体を検出することと、を含む方法もまた提供する。方法のいくつかにおいて、サンプルは、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と接触する前に、少なくとも１つのプロテアーゼと接触する。いくつかの方法では、方法は、サンプルを少なくとも１つのホスファターゼと接触させることを更に含む。いくつかの方法において、検出することは、組織化学的分析を含む。いくつかの方法において、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体は、残基Ｓ１２９においてリン酸化したα−シヌクレインを検出する。特定の方法において、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体は、７Ｅ２抗体クローン、又は３Ｇ２抗体クローンである。いくつかの方法において、サンプルは固定されている。特定の方法において、サンプルはホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである。いくつかの方法において、サンプルは、凍結サンプルである。
【０２２６】
いくつかの方法おいて、方法は、サンプルを、抱合体化した第１のラベルを有する第１の二次抗体であって、当該第１の二次抗体を、リン酸化α−シヌクレインを結合可能な一次抗体と免疫反応性である第１の二次抗体と接触させることを更に含む。いくつかの方法では、方法は、サンプルを、第１の二次抗体の第１のラベルと反応性のひとまとまりの試薬と接触させて、サンプルのリン酸化α−シヌクレインの近くで、第１の検出可能なシグナルを生成することを含む。
【実施例】
【０２２７】
パーキンソン病は、当該病気を患う対象の脳に、レヴィー小体及びレヴィー神経突起が存在することを特徴とする、進行性神経変性病である。レヴィー小体は、特性決定した機能が不十分なタンパク質である、α−シヌクレイン（ａＳｙｎ）の凝集形態により高度に濃縮される。ａＳｙｎの凝集は、パーキンソン病を有する対象の末梢神経でも発見された。凝集したａＳｙｎは、免疫組織化学法（ＩＨＣ）を用いて検出可能であり、プロテアーゼ処理に対する耐性により、非凝集ａＳｙｎとは区別可能である。しかしながら、長時間のプロテアーゼ処理により、ＩＨＣアッセイにて組織モルホロジーが劣化する可能性があり、非凝集ａＳｙｎから凝集ａＳｙｎを区別するための代替法が必要とされている。異常な高割合の凝集ａＳｙｎは、非凝集ａＳｙｎと比較して、Ｓｅｒ１２９残基でリン酸化している（ｐＳ１２９）ことが発見されている。本明細書で示すように、ａＳｙｎ凝集に対するサロゲートマーカーとしてのｐＳ１２９−ａＳｙｎを用いる、凝集ａＳｙｎに対する高感度かつ高特異度アッセイを開発した。
【０２２８】
材料
組織源。頭皮、腹部領域の皮膚、結腸、及び顎下腺のサンプルは、脳・人体寄付プログラムのディレクターである、Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｇ．Ｂｅａｃｈの好意により、Ｂａｎｎｅｒ  Ｓｕｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＢＳＨＲＩ）から入手した。標準的な臨床評価に加えて、パーキンソン病の診断は、レヴィー小体の存在により、組織ドナーで確認した。同様に、通常の非ＰＤ対照対象の状態を、レヴィー小体の欠如により判定した。サンプル（１６名の男性、８名の女性；年齢６５〜９５；１５名がＰＤ、９名が非ＰＤ）を、死後入手してホルマリンに固定した。通常の個体、及びＰＤを有する対象からの、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）皮質脳ブロックをそれぞれ、Ｒｏｃｈｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＲＴＤ）内部組織バンク、及びＦｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ＦＦＰＥ皮膚生検ブロックの小コホートを、Ｆｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの１〜１６歳の８名の個体（３名の男性、５名女性）から入手し、凝集ａＳｙｎに似ていない、ｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色の程度を評価した。３６名の対象からの、７２個のＦＦＰＥ皮膚生検ブロックの、より大きなコホートを、神経学のＭｏｎｔｒｅａｌ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔでＤｒ．Ｒｏｎ  Ｐｏｓｔｕｍａから入手した。対象が示した症状の臨床検査に基づくと、３６名の対象のうち１５名がＰＤ、５名が非定型パーキンソン症候群を有すると診断された。残り（１６名の対象）は、ＰＤを有しない対照対象であった。２つの皮膚パンチ生検を、臨床訪問中に対象で実施し、ＦＦＰＥブロックを、ＰｒｏｔｈｅｎａによりＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓに移した。他の全ての組織試料は、ＲＴＤ内部組織バンクから入手した。特に断りのない限り、ＦＦＰＥの全組織切片の厚さは、４μｍであった。
【０２２９】
α−シヌクレイン（ａＳｙｎ）及びＰＧＰ９．５に対する抗体。ホスホＳ１２９ａＳｙｎに対する、ウサギモノクローナル抗体クローン７Ｅ２及び３Ｇ２を、免疫原としてのヒトａＳｙｎ残基１２２〜１３５に対応するホスホペプチドを有する、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  ＣＰＳ  Ｒ＆Ｄ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ＆Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＤＸＲＥＡＡ）により作製した。ホスホＳ１２９ａＳｙｎに対する更なるモノクローナル抗体は、Ａｂｃａｍ（クローンＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）、Ｐ／Ｎ  ａｂ１６８３８１及びＰ−ｓｙｎ／８１Ａ、Ｐ／Ｎ  ａｂ１８４６７４）又はＷＡＫＯ（クローンｐＳｙｎ＃６４、Ｐ／Ｎ  ０１５−２５１９１）から購入した。Ｓ１２９のリン酸化状態に関係なく、ａＳｙｎに対するマウスモノクローナル抗体クローンＬＢ５０９は、Ａｂｃａｍ（Ｐ／Ｎ  ａｂ２７７６６）から購入した。抗ａＳｙｎマウスモノクローナル抗体クローン５Ｃ１２（Ｓ１２９リン酸化は無関係）、及び抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインマウスモノクローナル抗体クローン１１Ａ５は、Ｐｒｏｔｈｅｎａ  Ｃｏｒｐからの贈与品であった。表１０もまた参照のこと。
【０２３０】
３つの抗ヒトＰＧＰ９．５抗体を、本研究で使用した。２つのモノクローナル抗体、１つのウサギ（クローンＥＰＲ４１１８、Ｐ／Ｎ  ａｂ１０８９８６）、及び他のマウス（クローン１３Ｃ／Ｉ３Ｃ４、Ｐ／Ｎ  ａｂ８１８９）は、Ａｂｃａｍから購入した。ＲＴＤ  Ｐ／Ｎ  ７６０−４４３４を有するウサギポリクローナル抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ（商標）から入手した。
【０２３１】
酵素。ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ１（Ｐ／Ｎ  ７６０−２０１８）を使用して、ｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａが開発した自動化プロテアーゼ耐性α−シヌクレインＤＡＢ  ＩＨＣアッセイで、非凝集ａＳｙｎを取り除いた。自動化ｐＳ１２９ａＳｙｎ及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイ（後述のＢｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイ手順２）の、特定の一実装において、組み換えウシアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ、安定化希釈剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｐ／Ｎ  ０６００２９１９００１）中に３０μｇ／ｍＬ）、及びＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ３（Ｐ／Ｎ  ７６０−２０２０）をそれぞれ使用して、凝集ａＳｙｎに似ていないｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色を取り除き、ｐＳ１２９−ａＳｙｎの検出を向上させた。
【０２３２】
自動化ホスホＳ１２９−ａＳｙｎ及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイ、並びにプロテアーゼ耐性α−シヌクレインＤＡＢ  ＩＨＣアッセイのための、市販及び使用者が提供した試薬。下表１は、プロテアーゼ耐性ａＳｙｎの検出（以下の「方法」を参照）のための、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイ手順１及び２、並びにＤＡＢベースのｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａアッセイ手順で使用する、バルク溶液、酵素、抗体、検出キット、及び付属品を含む試薬の一覧を含有する。
【表１】
2021534381.tif 000003
【０２３３】
装置。以下のシリアル番号：３１０５２０、３１０８４１、３１０９３４、３１０９４０、３１１０００、３１１１１２、３１１２７６、３１１２７９、及び３１１３１１を有するＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＵＬＴＲＡ機器を使用した。
【０２３４】
方法
ａＳｙｎ又はＰＧＰ９．５に対する抗体を使用する、パーキンソン病を有する、及び有しないドナーからのＦＦＰＥ脳及び皮膚切片のＤＡＢ染色
【０２３５】
バルク溶液の標準的な補充物を含む、自動化ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＵＬＴＲＡ機器で、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ検出キット又はＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ検出キットを使用して、ＦＦＰＥ脳切片を染色した。脱パラフィン処理の後、スライドを、示した３つの抗原回復手順の１つに１回、又は組み合わせて通した、又は全く通さなかった。３つの抗原回復手順は、以下のとおりであった：１）ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ１（Ｐ／Ｎ  ７６０−２０１８）を、スライド上で反応緩衝液により約３．７倍に希釈し、４分間３６℃でインキュベートし、２）別途注記のない限り、３２分（α−シヌクレインに対する抗体）、又は６４分（ＰＧＰ９．５に対する抗体）のいずれかで、１００℃での、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＵＬＴＲＡ  ＣＣ１溶液（Ｐ／Ｎ  ９５０−２２４）、及び３）２時間３６℃での、アルカリホスファターゼ（ＡＰ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓからの組み換え、高活性のＥＩＡグレード、Ｒｏｃｈｅ）。安定化溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ｐ／Ｎ  ０６００２９１９００１）中のアルカリホスファターゼを、５０μｇ／ｍＬにて、分配器でカクテル化し、一滴を、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）反応緩衝液に浸漬した組織スライドにアプライした後、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ１０と反応緩衝液の１：１混合物を一滴、及び、２０ｍＭのＭｇＣｌ２を一滴、連続適用した。一次抗体は、示した濃度で、手で適用するか、又は分配器から自動で適用した。特に断りのない限り、全ての一次抗体に対するインキュベーションは、３６℃で３２分間実施した。ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ検出キット（Ｐ／Ｎ  ７６０−５００）又はＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キット（Ｐ／Ｎ  ７６０−７００）を用いて検出を実施する際、特に断りのない限り、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＨＱ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌｉｎｋｅｒ、及びＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒは、３６℃で１６分インキュベートし、Ｕ  ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＤＡＢ又はＵ  ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ手順での標準的条件を使用して、ＤＡＢ染色を沈着させた。ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ヘマトキシリンＩＩ（Ｐ／Ｎ  ７９０−２２０８、３６℃で４分間）、及びブルーイング試薬（Ｐ／Ｎ  ７６０−２０３７、３６℃で４分間）を使用して、機器で対比染色を実施した。Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ自動化スライド染色器及びカバースリッパ（Ｓａｋｕｒａ）で、スライドをキシレン中でカバースリッパした後、アルコール脱水した。
【０２３６】
自動化ホスホＳ１２９α−シヌクレイン及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイ（Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイ手順）。ＦＦＰＥ皮膚切片を、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｗａｓｈ  ＩＩ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｐ／Ｎ  ７８０−００３）を含むバルク溶液の標準補充物と共に、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＵＬＴＲＡ機器に配置した。認可されたＵ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  ＩＨＣ  Ｓｉｌｖｅｒ＿ＱＭ＿ＤＡＢ手順に基づく２つのプロトコル（プロトコル１及びプロトコル２）を使用して、連続した皮膚切片を染色した。脱パラフィン処理の後、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル１（下表２を参照）は、７Ｅ２抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインによるインキュベーションの前に、抗原回復工程を有しなかった。対照的に、アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ、安定化溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ｐ／Ｎ  ０６００２９１９００１）中で希釈して３０μｇ／ｍＬ）、及びＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ３（Ｐ／Ｎ  ７６０−２０２０）を、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル２（下表３を参照）での７Ｅ２抗体インキュベーションの前に、スライドに連続して（処理の間に洗浄を行い）アプライした。アルカリホスファターゼ及びプロテアーゼ処理の条件はそれぞれ、３７℃で８分、及び３６℃で４分である。Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル１及び２の両方は、同じ抗体インキュベーション、及び検出工程を有した：１）３２分間３６℃での、７Ｅ２抗体とのインキュベーション、２）ＨＲＰ抱合体化ヤギ抗ウサギ抗体（３６℃で４８分間のインキュベーション）を用いる、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰキットによる、ホスホ−ａＳｙｎ、及び金属銀の沈殿の検出、３）ＰＧＰ９．５の抗原回復としての役割も果たす、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＵＬＴＲＡ  ＣＣ２バルク溶液（Ｐ／Ｎ  ９５０−２２３）による、１００℃で１６分間の、一次及び二次抗体複合体の脱活性化、４）３６℃で３２分間の、ＥＰＲ４１１８抗ＰＧＰ９．５抗体とのインキュベーション、５）３２分間３６℃での、ＡＰ抱合体化ヤギ抗ウサギ抗体（ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＵｌｔｒａＭａｐ抗Ｒｂ  Ｐｈｏｓ、Ｐ／Ｎ  ７６０−４３１４）とのインキュベーション、並びに６）４−（ジエチルアミノ）アゾベネン−４−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）に抱合体化した、ホスフェート保護キノンメチドのＡＰ誘導活性化による、ＰＧＰ９．５の検出。以前にアプライした１倍反応緩衝液（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｐ／Ｎ  ９５０−３００）により希釈した後の、７Ｅ２及びＥＲＰ４１１８抗体の、およそのスライド上での濃度はそれぞれ、０．２７及び０．１４μｇ／ｍＬであった。ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ヘマトキシリンＩＩ（Ｐ／Ｎ  ７９０−２２０８、３６℃で８分間）、及びブルーイング試薬（Ｐ／Ｎ  ７６０−２０３７、３６℃で８分間）を使用して、機器で対比染色を実施した。Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ自動化スライド染色器及びカバースリッパ（Ｓａｋｕｒａ）で、スライドをキシレン中でカバースリッパした後、アルコール脱水した。プロトコル１のまとめについては表２を、プロトコル２のまとめについては表３を、参照のこと。
【表２】
2021534381.tif 000004
【表３】
2021534381.tif 000005
【０２３７】
自動化プロテアーゼ耐性α−シヌクレインＤＡＢ  ＩＨＣアッセイ（ｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａアッセイプロトコル）。凝集α−シヌクレインは、プロテアーゼに対して不十分な基質であることが知られているため、プロテアーゼにより、非凝集α−シヌクレインを取り除いた後に、凝集ａＳｙｎを組織化学染色することを、レヴィー小体の検出のために用いることができる。この原理に基づくアッセイは、皮膚生検での凝集α−シヌクレインを検出する（ｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａアッセイプロトコル）ために、Ｐｒｏｔｈｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓとの共同で、Ｒｏｃｈｅ  ｐＲＥＤにより開発された。本アッセイは、エピトープが、Ｓｅｒ１２９リン酸化部位の外側の領域である、α−シヌクレイン残基１０９〜１２０にマッピングされた、５Ｃ１２抗体に頼っている。ｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａプロトコルを表４に示し、本研究で用いるプロトコルを表５として示す。ｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａアッセイプロトコルのために、プロテアーゼ処理を、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ１（Ｐ／Ｎ  ７６０−２０１８）を用いて１２分間３６℃で実施し、５Ｃ１２抗体を、以前にアプライした１倍ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）反応緩衝液（Ｐ／Ｎ  ９５０−３００）で希釈した後に、０．２７μｇ／ｍＬのおよそのスライド上濃度で、２０分間周囲温度にて（器具のスライドヒーターを無効にして）インキュベートした。表４に示すように、５Ｃ１２抗体の分配器製剤は、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）抗体希釈液（Ｐ／Ｎ  ２５１−０１８、Ｂｒｉｊ−３５、内部Ｐ／Ｎ  ９５０２８なし）に１μｇ／ｍＬで希釈されている。一次抗体でのインキュベーション後に、凝集α−シヌクレインを、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キット（Ｐ／Ｎ  ７６０−７００）を使用して検出した。ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ヘマトキシリンＩＩ（Ｐ／Ｎ  ７９０−２２０８、３６℃で８分間）、及びブルーイング試薬（Ｐ／Ｎ  ７６０−２０３７、３６℃で８分間）を使用して、機器で対比染色を実施した。Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ自動化スライド染色器及びカバースリッパ（Ｓａｋｕｒａ）で、スライドをキシレン中でカバースリッパした後、アルコール脱水した。
【表４】
2021534381.tif 000006
【表５】
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【０２３８】
ａＳｙｎシグナルのスライド評価及びスコア付け。皮膚でのａＳｙｎ染色パターンを評価する包括的経験を持つ、広範に認定された病理学者、又はアッセイ開発科学者により、スライドをスコア付けした。ｐＳ１２９−ａＳｙｎ及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイのために、固有の、及び／又はびまん性顆粒銀ｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色を示す神経的形質の数と共に、黄色のＰＧＰ９．５染色を有する全神経的形質の数を記録した。典型的な皮膚切片において、神経束及び立毛筋で、並びに、周辺のエクリン／皮脂腺及び血管においても、で、黄色のＰＧＰ９．５染色が観察された。少なくとも２５個の神経的形質をスライド当たりで計数したが、多くの場合、より多くを計数し、アッセイ感度が、評価した少数の神経的形質により逆効果を受けないようにした。皮膚面積が限られて、評価に利用可能な神経的形質の総数が２５未満であるスライドにおいて、皮膚面積全体を走査し、神経的形質の総数を計数した。結果は、特定の種類のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色を有する神経的形質の百分率として表した。神経的形質がモルホロジーにより認識された場合を除いて、プロテアーゼ耐性ａＳｙｎ  ＤＡＢ  ＩＨＣアッセイを用いて染色したスライドを、同様にスコア付けした。組織モルホロジーが、プロテアーゼ１による処理により大きく影響を受けた場合において、神経的形質の総数は、ｐＳ１２９−ａＳｙｎ及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイを用いて染色した隣接するスライドから導出した。
【０２３９】
統計分析。リン酸化α−シヌクレインシグナルの存在と、対象の臨床状態との関連は、Ｍｉｎｉｔａｂ１７統計ソフトウェアを使用して、カイ二乗検定により評価した。
【０２４０】
実施例１．ｐＳ１２９−ａＳｙｎに対する７Ｅ２ウサギモノクローナル抗体の特性決定
抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインウサギモノクローナル抗体７Ｅ２は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  ＣＰＳ  Ｒ＆Ｄ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ＆Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｅｓｉｇｎにより生成された。７Ｅ２の生成に用いた免疫原は、Ｎ末端のシステイン残基を介してＫＬＨに抱合体化したペプチドである。このペプチドの配列（ＮＥＡＹＥＭＰｐＳＥＥＧＹＱＤ（配列番号５９））は、ヒトα−シヌクレインの残基１２２〜１３５に対応する。表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）実験は、７Ｅ２抗体が、Ｓｅｒ１２９でリン酸化していない同じペプチドと比較して、Ｓｅｒ１２９でリン酸化したα−シヌクレイン（１２２〜１３５、ｐＳ１２９）免疫原ペプチドに対して、高い特異性を有することを示した。７Ｅ２抗体は、α−シヌクレイン（１２２〜１３５、ｐＳ１２９）ペプチドに対して、速い会合速度、及び遅い線形解離速度を示した。
【０２４１】
様々な解剖学的部位（ＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ，Ｐ／Ｎ  ＢＣ８）の、通常の３０コア、及び癌組織の２９コアを含有する、ヒト組織マイクロアレイを使用して、免疫組織学化学文脈において、７Ｅ２抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン抗体の特異性を調査した。体の回遊／腫瘍の回遊（ＴｏＢ／ＴｏＴ）分析は、７Ｅ２抗体により観察された唯一の非神経細胞染色はマクロファージであることを示した（マクロファージでのα−シヌクレインの発現が以前に報告されていた）。ＴｏＢ／ＴｏＴ分析の一覧については、表６〜９を参照のこと。ＴｏＢ／ＴｏＴの結果は、プロトコルが正確かつ特異的の両方であることを示している。
【表６−１】
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【表６−２】
2021534381.tif 000009
【表７−１】
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【表７−２】
2021534381.tif 000011
【表８−１】
2021534381.tif 000012
【表８−２】
2021534381.tif 000013
【表９−１】
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【表９−２】
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【０２４２】
実施例２．ＦＦＰＥ組織の免疫組織化学的染色に対する、他のｐＳ１２９−ａＳｙｎ抗体と比較しての、７Ｅ２の性能。
タンパク質分解に対する、凝集及び非凝集α−シヌクレインの異なる感度に基づき、凝集α−シヌクレインを検出することにより、脳内でのレヴィー小体の同定、及びパーキンソン病の決定的な診断の基礎が提供される。７Ｅ２を含むリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレインに対して、抗体がレヴィー小体を検出する能力を評価するために、パーキンソン病を有する２名のドナー由来の皮質脳切片を、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キットを用いて染色した。８つ全ての抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン抗体（８１Ａ、＃６４、ＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）、５Ｈ５、２Ｇ１１、７Ｅ２、３Ｇ２、及び１１Ａ５）は、レヴィー小体に特徴的なＰＤ脳切片内で、ＤＡＢ染色を生み出した（試験をした、非限定的な例示的α−シヌクレイン抗体の一覧については、表１０を参照のこと）。試験した８つの抗リン酸化α−シヌクレイン抗体クローンのうち、７Ｅ２、３Ｇ２、１１Ａ５、及びＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）が、ｐＳ１２９−ａＳｙｎに対する高い感度を示した（図１Ａ〜１Ｃを参照）。
【表１０】
2021534381.tif 000016
【０２４３】
非ＰＤ個体の脳切片では、抗原回復を有しない３Ｇ２及び７Ｅ２抗体では、染色は観察されなかった（図２Ａ及び２Ｂを参照）。ＵＬＴＲＡ  ＣＣ１抗原回復があると、サンプルをホスファターゼで処理したときには存在しなかったかすかな細胞質染色を、３Ｇ２及び７Ｅ２抗体は生み出した（図３Ａ及び３Ｂを参照）。レヴィー小体内で凝集したｐＳ１２９−ａＳｙｎに対する、８１Ａ、７Ｅ２、３Ｇ２、１１Ａ５、及びＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）の特異性を、長時間のホスファターゼ又は適度なプロテアーゼ処理により試験した。８．８μｇ／ｍＬの高活性組み換えアルカリホスファターゼ中の、３６℃で２時間の後、ＰＤドナー由来の皮質脳切片におけるレヴィー小体染色の程度は、深刻に（ＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）及び８１Ａで）、又は適度に（１１Ａ５、７Ｅ２、及び３Ｇ２で）のいずれかで減少した（図４Ａ〜図４Ｅを参照）。したがって、ホスファターゼ処理によって、レヴィー小体染色に著しい影響を与えることなく、非レヴィー小体染色が減少するようである。対照的に、ＶＥＮＴＡＮＡ（商標）プロテアーゼ１で、３６℃で４分間処理することによっては、ＰＤ脳切片内で１１Ａ５、７Ｅ２、又は３Ｇ２抗体により生み出されたレヴィー小体染色に対しては、無視できる程度の影響であった（図５Ａ〜図５Ｃを参照）。対照として、同じプロテアーゼ処理によって、レヴィー小体を除いて、ＰＤ脳内で、Ｓ１２９リン酸化又は非Ｓ１２９リン酸化ａＳｙｎ（ＬＢ５０９及び５Ｃ１２モノクローナル抗体）に対する２つの異なる抗体により生み出された、大部分のα−シヌクレイン染色が取り除かれた（データは図示せず）。
【０２４４】
概して、プロテアーゼ処理の不存在下での、リン酸化特異的α−シヌクレイン抗体７Ｅ２及び３Ｇ２により、プロテアーゼ処理後の全α−シヌクレイン抗体５Ｃ１２と同一である、ＰＤを有する対象由来の脳切片における、染色パターンが生成した（図６を参照）。しかし、３Ｇ２は概して、７Ｅ２よりも高いバックグラウンドを示した（データは図示せず）。不十分な染色性能に加えて、Ａｂｃａｍの８１Ａ、及びＷＡＫＯの＃６４は、他の抗リン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン抗体と比較して、低い特異性を示した。３Ｇ２及び７Ｅ２とは違って、８１Ａは、非ＰＤ個体由来の脳切片での、神経突起染色をもたらした（データは図示せず）。これは、Ｓｅｒ４７３にてリン酸化したニューロフィラメントライト（ＮＦＬ）に対して報告された、８１Ａの交差反応性を反映している可能性がある。低力価（１：１０００）にて、ＷＡＫＯ製の＃６４抗体クローンは、ホスファターゼ処理後に持続した、ＰＤ及び非ＰＤ対象の両方由来の脳切片における非特異的核染色をもたらし、これは、他の７つの抗体クローンでは観察されなかった（データは図示せず）。
【０２４５】
脳に加えて、抗ｐＳ１２９−ａＳｙｎ抗体クローンが、ＰＤを有する対象由来の皮膚サンプルにて、凝集ａＳｙｎを検出する能力を評価した。プロテアーゼベースの抗原回復の不存在下において、抗ｐＳ１２９−ａＳｙｎ抗体は全て、ＶＥＮＴＡＮＡ（商標）プロテアーゼ１処理に関連した抗全ａＳｙｎ５Ｃ１２抗体を用いて検出したものと同様に、ＰＤを有する対象由来の皮膚切片における凝集ａＳｙｎを検出可能であった（図７Ａ〜図７Ｃを参照）。抗体クローン８１Ａ、７Ｅ２、及びＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）を更に、ＰＤを有する対象、及び非ＰＤ対照対象由来の皮膚切片で試験した。脳サンプルでの７Ｅ２抗体と比較して、その類似した染色強度及びパターン、並びに高いバックグラウンド故に、３Ｇ２は試験しなかった。ＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）による染色は、平滑筋及びコラーゲンにおける非特異的バックグラウンドと関連していた一方で、８１Ａは非特異的核染色をもたらした（データは図示せず）。
【０２４６】
希釈及び滴定実験を実施して、７Ｅ２抗体を用いるリン酸化Ｓ１２９α−シヌクレイン染色を最適化した。希釈試験の結果は、希釈剤９００４０及び希釈剤９０１０３が、染色強度を保存しながら、最小のバックグラウンドを有することを示した（図８Ａ及び図８Ｂを参照）。滴定実験は、１μｇ／ｍＬの７Ｅ２分配器濃度が、近似の最大染色強度、及び最小のバックグラウンドを有することを示した（データは図示せず）。滴定実験の結果は、スライド１枚当たりの、染色された神経細胞形質パーセントの形態での定量的測定を実施した、ガードバンド実験におけるものにより強化された（図９を参照）。二重銀／黄色、及び一重ＤＡＢ検出スキームの両方を用いて実施する、安定性加速試験は、７Ｅ２が、４℃にて２４ヶ月間の予想貯蔵寿命を有することを示した（データは図示せず）。
【０２４７】
実施例３。免疫組織化学的染色のためのＰＧＰ９．５抗体の選択
タンパク質遺伝子産物９．５（ＰＧＰ９．５）（より記述的には、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素Ｌ１（ＵＣＨＬ１）として知られている）は、ユビキチン抱合体化タンパク質の脱ユビキチン化、及び、遊離モノユビキチンプール２０〜２４の維持に不可欠なチオエステラーゼである。これは脳内で非常に発現しており、全神経細胞タンパク質の１％〜５％を占めると推定されている。ＰＧＰ９．５は、ニューロン及び神経内分泌細胞に対するマーカーとして一般に使用されるが、ＰＧＰ９．５の発現は、これらの細胞型に排他的に制限されているわけではない。ＰＧＰ９．５に対する３つの異なる抗体、即ち、Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ（商標）のＲＴＤカタログ（Ｐ／Ｎ  ７６０−４４３４）で入手可能なポリクローナル抗体、並びに、Ａｂｃａｍ製の２つのモノクローナル抗体（ウサギ（ＥＰＲ４１１８）及びマウス（１３Ｃ／Ｉ３Ｃ４））を、皮膚での神経的形質、ニューロン、又は神経内分泌細胞の免疫組織化学的検出のために評価した。３つの抗体は全て神経細胞と認識できる構造物を特異的に染色可能であった（図１０Ａ〜図１０Ｃを参照）。３つの抗体濃度を一続きに滴定した後、ＥＰＲ４１１８及び１３Ｃ／Ｉ３Ｃ４は０．２μｇ／ｍＬにて、１．１３μｇ／ｍＬの分配器濃度にて、Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ製のポリクローナル抗体に匹敵する染色強度を有することが示された（図１０Ａ〜１０Ｃを参照）。しかし、これらの濃度において、１３Ｃ／Ｉ３Ｃ４抗体は、ＥＰＲ４１１８又はＣｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ（商標）ポリクローナル抗体と比較して、著しい量の非特異的なバックグラウンド染色を示した（図１０Ｂ〜図１０Ａと、図１０Ｃとを比較のこと）。
【０２４８】
様々な解剖学的部位（ＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）の、３０個の通常、及び２９個の癌組織コアを含有する、ＢＣ８ヒト組織マイクロアレイを使用して、ホスホＳ１２９−α−シヌクレイン及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイの免疫組織化学的文脈における、ＥＰＲ４１１８抗体の特異性を評価した。ＴｏＢ／ＴｏＴ分析は、様々な組織部位由来の、血管及び腺周辺、並びに、神経及び神経節細胞中における、ＰＧＰ９．５染色を示す。神経支配された特別な構造物（膵島）もまた、ＰＧＰ９．５に対して陽性に染色された（表６〜９を参照）。ＰＧＰ９．５染色は、腎小管、肺での希なストローマ細胞、精巣の生殖細胞、胎盤の栄養芽細胞、及び、様々な種類の癌由来の腫瘍細胞でもまた観察された。これらの発見は、様々な種類の腫瘍及び非神経細胞型における、以前に報告されたＰＧＰ９．５の発現と一致している。
【０２４９】
希釈試験、滴定、ガードバンド、及び安定性加速の結果（データは図示せず）により、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｇｏａｔ  Ｉｇ  Ｂｌｏｃｋ（ＶＥＮＴＡＮＡ  Ｐ／Ｎ  ７６０−６００８）における、０．５μｇ／ｍＬでのＥＰＲ４１１８の分配器製剤がもたらされた。本製剤において、ＥＰＲ４１１８は、安定性加速試験に基づき、４℃で２４ヶ月の貯蔵寿命を有すると想定される。ロット毎の試験結果（データは図示せず）は、ＥＰＲ４１１８抗体の性能が、２つの異なるメーカー（Ａｂｃａｍ及びＳｐｒｉｎｇ）により作製された、４つの異なる生産ロット間で一致することを示した。
【０２５０】
実施例４。ａＳｙｎ及びＰＧＰ９．５アッセイ、並びに検出構成の選択
プロテアーゼ耐性は、α−シヌクレインを含む、多くの凝集タンパク質の特徴であり、α−シヌクレインの病理学的形態の検出は、プロテアーゼ処理により向上する。Ｒｏｃｈｅ  ｐＲＥＤは、Ｐｒｏｔｈｅｎａと共同して、ＢＳＨＲＩ製のＰＤ及び非ＰＤサンプルのコホートにおける、凝集α−シヌクレインに対する高い特異性を有するアッセイを開発した（後に、Ｔａｒｇｏｓに委譲された）（表４及び５を参照）。ｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａ  ａＳｙｎアッセイは、リン酸化及び非リン酸化Ｓ１２９−ａＳｙｎの両方を認識する５Ｃ１２抗体、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ１による非凝集ａＳｙｎの除去、並びに、高感度ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いる検出に基づく。しかし、少なくとも数週間切断されている皮膚切片を用いるｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａ  ａＳｙｎアッセイでは、最小のバックグラウンドが観察された一方で、新しく切断されたスライドでは、膠原線維の強力な染色が観察された（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。膠原バックグラウンド染色は、プロテアーゼ１を用いると、更なる膠原回復と共に悪化した（図１２Ａを参照）が、Ｕｌｔｒａ  ＣＣ１を用いると減少した（図１２Ｂを参照）。７Ｅ２抗体が、同じ検出スキームを用いる同一膠原染色を起こした（データは図示せず）ため、膠原バックグラウンド染色の原因は５Ｃ１２抗体ではなかった。ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットは、あらゆる膠原染色を生み出さなかった（データは図示せず）一方で、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＨＱ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌｉｎｋｅｒ及びＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒを用いるチラミド−ＴＡＭＲＡ（ＶＥＮＴＡＮＡ  Ｐｕｒｐｌｅキット，ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ，Ｐ／Ｎ  ７６０−２２９）の沈着は発生した（データは図示せず）ため、バックグラウンドは、膠原線維による非凝集ＤＡＢの非特異的吸着によるものでもなかった。最終的に、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒが、膠原線維染色の原因であると判定した（データは図示せず）。膠原線維の生理学的架橋により、多くの種類の付加物の形成がもたらされる。抗ＨＱ  ＩｇＧが、そのような付加物の１つ以上と交差反応することが可能である。この仮説は、ＣＣ１処理と関連する膠原華僑の逆転後に、膠原バックグラウンド染色が減少することと一致する。
【０２５１】
ＢＳＨＲＩコホート由来の頭皮サンプルを集めて調査すると、様々な程度の、軽度から十分に重度の膠原バックグラウンドＤＡＢ染色が、凝集ａＳｙｎからの特定のシグナルの解釈と干渉することが示された（データは図示せず）。このことが、凝集ａＳｙｎの染色のための、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キットに匹敵する感度を有する、代替の検出法の調査を誘発した。図１３に示すように、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ検出キットは、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キットと比較して、一貫してＰＧＰ９．５に対して低い染色強度を付与する。結果的に、Ｍｓ抗Ｒｂ  ＩｇＧ、続いてＲｂ抗Ｍｓ  ＩｇＧ（ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）増幅キット、Ｐ／Ｎ  ７６０−０８０）を用いて増幅に結合したｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ検出キットを用いて、ｐＳ１２９−ａＳｙｎを染色した。増幅したｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ検出キットは、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キットと同様の染色強度を有するものの、増幅プロセスにより、著しい非特異的バックグラウンドが生じる（図１４を参照）。ＶＥＮＴＡＮＡ  ｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ検出キット（Ｐ／Ｎ  ７６０−０９１）を使用してｐＳ１２９−ａＳｙｎ又はＰＧＰ９．５を検出したときに、高いバックグラウンド染色もまた観察された（データは図示せず）。
【０２５２】
７Ｅ２抗体、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰ検出キット（Ｐ／Ｎ  ７６０−０９８）、及びＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（商標）Ｐｕｒｐｌｅキット（Ｐ／Ｎ  ７６０−２２９）を用いて、皮膚切片でｐＳ１２９−ａＳｙｎを染色するために、２つの更なる検出システムを評価した。図１５に示すように、ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＨＱ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  ａｎｄ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒではなく、ヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合体を染色沈着のために用いる限り、両方のシステムは、バックグランドがほとんど、又は全くない状態で、凝集ｐＳ１２９−ａＳｙｎを検出することができた。具体的には、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰ検出キットにより沈着した黒色の銀染色は、「方法」セクションに記載する、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（商標）ＵｌｔｒａＭａｐ抗Ｒｂ  Ａｌｋ  Ｐｈｏｓ（Ｐ／Ｎ  ７６０−４３１４）及びＱＭ−ＤＡＢＳＹＬを用いて黄色に染色したＰＧＰ９．５のバックグラウンドにおいて、凝集ｐＳ１２９−ａＳｙｎの高コントラストでの可視化をもたらした（図１６を参照）。ＰＤを有する対象由来の皮膚の、異なる種類の神経的形質における、銀／黒色ｐＳ１２９−ａＳｙｎ、及び黄色ＰＧＰ９．５染色のモルホロジーを、図１７Ａ〜図１７Ｅに示す。Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅ検出構成を用いると、２つの異なる種類のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色：顆粒びまん性に見える染色、及び、固有の、濃く見える染色が、ＰＤを有する対象由来の皮膚切片の大型神経束で観察された（図１８を参照）。後のセクションでより完全に記載するとおり、顆粒型のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色は、ＢＳＨＲＩコホートのＰＤを有する対象、及び非ＰＤ対象の両方由来のＦＦＰＥ皮膚切片で観察された。対照的に、固有の種類のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色は、ＰＤを有する対象由来の皮膚に、ほとんど排他的に制限されていた。後のセクションは、５Ｃ１２抗体、プロテアーゼ１、及びＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キットに基づくｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａアッセイと比較した、凝集ａＳｙｎに対する７Ｅ２抗体の感度、及び最適化されたＢｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコルについてもまた記載している。顆粒ｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色は多くの場合、神経の正中断面ではまとまった軸索として（図１８を参照）、及び、神経の横断面では周囲方向に取り囲むニューロンとして（図１９の上部パネル）見える。このような染色パターンは、シュワン細胞マーカーのミエリン塩基性タンパク質の染色パターンに類似しており（図１９の下部パネル）、顆粒状染色の外観を担うｐＳ１２９−ａＳｙｎタンパク質が、シュワン細胞内に位置している可能性があることを示唆している。シュワン細胞内にｐＳ１２９−ａＳｙｎが蓄積することは、多系統萎縮症を有する患者で以前に説明されている。
【０２５３】
試験されていないあるアッセイ構成は、プロテアーゼ１による抗原回復の後の、５Ｃ１２抗体によるインキュベーション、及びｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰ検出キットを用いる検出である。このアッセイ構成は潜在的に、凝集ａＳｙｎに対して、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰ検出キットを用いて検出した７Ｅ２抗体と同様の感度を有する。しかし、これは、ＰＧＰ９．５は、細胞コンディショニング（ＣＣ）１又は２バルク溶液を用いる抗原回復を必要とし、プロテアーゼ１を、ＣＣ１又はＣＣ２処理と組み合わせることで、組織モルホロジーの著しい喪失がもたらされるため、ＰＧＰ９．５を神経細胞マーカーとして組み込む二重検出とは両立しない（データは図示せず）。
【０２５４】
実施例５。７Ｅ２抗体クローンを用いるホスホ−ａＳｙｎ染色、及び、ＥＰＲ４１１８抗体クローンを用いるＰＧＰ９．５染色に対する抗原回復条件の最適化
多くのエピトープの免疫組織化学的検出は、抗原回復手順後に向上する。７Ｅ２抗体を用いて、ＦＦＰＥ皮膚切片でのｐＳ１２９−ａＳｙｎの検出における、２つの異なる抗原回復処理プロセス：ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）ＵＬＴＲＡ細胞コンディショニング（ＵＬＴＲＡ  ＣＣ１）バルク溶液及びプロテアーゼの効果を評価した。ＥＰＲ４１１８抗体を用いる、ＰＧＰ９．５染色におけるＵＬＴＲＡ  ＣＣ１又はＵＬＴＲＡ  ＣＣ２溶液による処理の効果もまた評価した。
【０２５５】
大部分の標的とは対照的に、ｐＳ１２９−ａＳｙｎの染色は、３２分間１００℃のみでの、ＵＬＴＲＡ  ＣＣ１による処理の後に、逆説的に減少した（図２０Ａ〜図２０Ｅを参照）。ｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色でのＵＬＴＲＡ  ＣＣ１の負の効果が、ｐＳ１２９−ａＳｙｎに対する５つの異なる抗体：１１Ａ５、７Ｅ２、３Ｇ２、ＭＪＦ−Ｒ１３（８−８）、及び８１Ａ（図２０Ａ〜図２０Ｅを参照で観察され、このことは、Ｓ１２９残基でのリン酸化そのものが、処理により影響を受けた可能性があることを示唆している。
【０２５６】
プロテアーゼ処理は凝集ａＳｙｎの検出を改善することができるが、この現象を担う根本的な原因は不透明である。これは、非凝集ａＳｙｎの除去、若しくは、タンパク質アグリゲートに埋め込まれたエピトープへの、抗体のアクセスの改善に続く、プロテアーゼ分解、又はこれらの組み合わせが原因である可能性がある。３６℃で４分間又は１２分間、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ２で４分間（図２１Ａ及び図２１Ｂを参照）で、又は、ＶＥＮＴＡＮＡ（登録商標）プロテアーゼ３で処理することにより、ＰＤを有する対象由来の皮膚切片における、固有の種類のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色の適度な増加がもたらされた（図２２）。プロテアーゼ処理のより明白な効果は、ＰＤを有する対象、又は非ＰＤ対象由来の皮膚サンプルにおける、顆粒タイプのｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色の、完全な（プロテアーゼ２で４分間、若しくはプロテアーゼ３で１２分間）、又は部分的（プロテアーゼ３で４分間）除去である（図２１及び図２２）。この発見は、凝集ａＳｙｎに対して潜在的に高い特異性を有するｐＳ１２９−ａＳｙｎアッセイの機会を提示した。しかし、ＰＧＰ９．５検出のために、組織を後で１００℃でＣＣ２に通したときは、短いプロテアーゼ３の処理（４分）は、顆粒ｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色を完全に取り除かなかったが、プロテアーゼ２、又は長時間のプロテアーゼ３処理（４分を超える）では、不十分な組織モルホロジーがもたらされた（データは図示せず）。
【０２５７】
ＰＤサンプルでのみ確認される固有の種類のｐＳ１２９−ａＳｙｎ種を保存しながら、ＰＤ及び非ＰＤサンプルの両方で存在する顆粒タイプのｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色を完全に除去可能な、より特異的なアッセイプロトコルの可能性により、顆粒ｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色を取り除く代替方法の調査がもたらされた。Ｓ１２９残基が凝集ａＳｙｎ内でリン酸化したら、結合したホスフェート基は、可溶性ａＳｙｎ内のホスホＳ１２９よりも、タンパク質ホスファターゼによる除去に一層を耐性を有する（Ｗａｘｍａｎ＆Ｇｉａｓｓｏｎ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６７（５）：４０２−４１６（Ｍａｙ  ２００８））。幅広い基質特異性を有するホスファターゼであり、セリンリン酸化タンパク質に対して活性であることが示されている哺乳類アルカリホスファターゼの、ＦＦＰＥ皮膚切片内での顆粒ｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色を選択的に取り除く能力を試験した。７Ｅ２抗体インキュベーションの前に、ｐＨ９以上での、精製内因性（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＮＥＢ）又は組み換え（Ｒｏｃｈｅ）精製仔牛小腸アルカリホスファターゼによる、脱パラフィン処理した皮膚切片の処理によって、固有のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色のレベルに著しく影響を及ぼすことなく、顆粒ｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色の出現が予防された（図２３Ａ及び図２３Ｂを参照）。興味深いことに、ｐＨ８でのアルカリホスファターゼ処理は、固有のｐＳ１２９−ａＳｙｎの染色減少をもたらさなかった（図２４）。最初にアルカリホスファターゼにより、可溶性ａＳｙｎ内のＳ１２９リン酸化を除去し、続いて、プロテアーゼが媒介する抗原回復の向上による連続処理によって、凝集ａＳｙｎに対して潜在的に高い特異性を有する、代替のｐＳ１２９−ａＳｙｎ及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイプロトコル（Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル２）の基礎が形成された（図２５を参照）。
【０２５８】
ｐＳ１２９−ａＳｙｎとは異なり、ＥＰＲ４１１８抗体を用いるＰＧＰ９．５検出は、ＵＬＴＲＡ  ＣＣ１バルク溶液を用いる抗原回復の期間の増加と共に向上した（図２６）。ＵＬＴＲＡ  ＣＣ２による抗原回復によって、ＰＧＰ９．５染色において同様の向上が得られた（図２７）。自動化明視野デュプレックスＩＨＣアッセイは、図２８に示すように、連続した抗体インキュベーション及び色素体沈着サイクルを必要とする。同一種の両方の一次抗体を二重ＩＨＣアッセイプロトコルで用いるとき、第１サイクルで付着した一次及び二次抗体を取り除き、第１サイクルでの一次抗体と、第２サイクルでの二次抗体との交差反応の可能性を防止するために、１００℃での、ＵＬＴＲＡ  ＣＣ２インキュベーションの形態での熱不活化（ＨＤ）工程が必要である。第１サイクルで沈着した色素体が銀／黒色である（黒色染色の上部に沈着した黄色の染色は、黒のままである）ときに、熱不活化工程は必要ではないものの、ＣＣ２で１６分間１００℃で処理することは、ＥＰＲ４１１８抗体を用いるＰＧＰ９．５染色の抗原回復としての役割を果たす。
【０２５９】
実施例６。アッセイの再現性及び精度
前のセクションに記載した実験結果により、自動化ホスホＳ１２９−α−シヌクレイン、及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイに対する、２つの最適化プロトコル（Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル１及びプロトコル２）がもたらされた。上記セクションで詳述したとおり、プロトコル１は、ｐＳ１２９−ａＳｙｎ検出のための抗原回復工程を含有していない。プロトコル２は、脱パラフィン処理後、及び７Ｅ２抗体インキュベーション前に、サンプルをアルカリホスファターゼ、続いてプロテアーゼで処理したことを除いて、プロトコル１と全ての態様が同一である。Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル１及び２の実施内、及び実施間の再現性を、ＰＤを有する３名の異なる対象由来の頭皮サンプルで評価した。実施内の再現性に関して、各ＰＤ対象からの、５つの連続して切片化したスライドを、「方法」に記載のプロトコル１又は２を用いて染色し、固有のｐＳ１２９−ａＳｙｎを有する、及び有しない神経的形質の数を病理学者により数えた。各ＰＤ対象における全神経的形質の百分率としての、固有のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色を有する皮膚神経的形質の量を、５つの染色切片から平均し、表１１に示す。
【表１１】
2021534381.tif 000017
【０２６０】
実施間の再現性に関して、ＰＤを有する３名の異なる対象由来の３通りのスライドを、非連続の日に、３つの異なる機器でプロトコル１又は２を用いて染色した。１回の実施の中で、各ＰＤ対象由来の３つのスライドは、連続した切断切片であった。しかし、切片は異なる実施の間で連続していなかった。３回の実行のそれぞれから、固有のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色を有する神経的形質の平均百分率を、表１２に示す。
【表１２】
2021534381.tif 000018
【０２６１】
ＣＶが１５％を超えた場合において、最も可能性の高い偏差源は、連続して切片化したスライド間における神経的形質の数の差である。連続して切片化したスライドにまたがる神経的形質の連続性の研究により、神経的形質の数が１０％〜２０％違うことは、５〜１０  ４μｍ切片にまたがる形質分布の、スライド間の偏差に寄与している可能性があるという結論が出た（表１３を参照）。黄色のＤＡＢＳＹＬ色素体で染色したＰＧＰ９．５の強度は、アッセイ再現性研究の全ての染色スライドにわたって２．５であった。
【表１３−１】
2021534381.tif 000019
【表１３−２】
2021534381.tif 000020
【０２６２】
実験を行い、ｐＳ１２９−ａＳｙｎ及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイの精度を分析し、各切片における形質染色のパーセントでスコア付けした（約２５個の形質）。実施間の精度を分析するため、同じ機器上で、それぞれ３つのスライドの３回の実施を、少なくとも２日離して試験した（プロトコル１  ＣＶ：２．７７％固有、５．１３％びまん性；プロトコル２  ＣＶ：３．９９％固有、０．００％びまん性）。機器間の精度を分析するため、新しい機器上で、それぞれ３つのスライドの、更なる２回の実施を行い、第１の機器での最初の実施と比較した（プロトコル１  ＣＶ：３．２２％固有、１１．８６％、びまん性；プロトコル２  ＣＶ：３．４５％固有、０．００％びまん性）。まとめると、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル１及び２の両方に対する、実施間及び機器間の両方のＣＶは、移動を認めるのに必要な１５％閾値を下回っていた。
【０２６３】
実施例７。アッセイ確認−頭皮サンプル
リン酸化α−シヌクレイン及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイ（Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイという相性）の最適化の間に、なめらかな固有のリン酸化α−シヌクレイン染色パターンが、実行可能性試験に使用したＰＤ頭皮サンプルの小コホートと排他的に関係したことが観察された。この傾向が、ＰＤ及び非ＰＤ対象由来の頭皮サンプルのより大きなコホートに拡大されるのか否かを判定するために、ｐＳ１２９−ａＳｙｎ及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイ（Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイ）のプロトコル１及びプロトコル２の両方を使用して、１５名のＰＤ、及び９名の非ＰＤ対象由来の頭皮切片を染色した。更に、１０名のＰＤ、及び４名の非ＰＤ頭皮サンプルを含有するこのコホートのサブセット由来の切片を、自動化プロテアーゼ耐性ａＳｙｎ  ＤＡＢ  ＩＨＣアッセイ（ｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａアッセイプロトコル）を使用して染色した。図２９に示すように、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイのプロトコル１又はプロトコル２のいずれかを用いる染色の後、ＰＤ対象由来の１５個のサンプルのうち１３個（８７％）は、異なる種類のｐＳ１２９−ａＳｙｎを示した。９個の非ＰＤ頭皮サンプルのうち、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅプロトコル１を用いると、５つ（５６％）は、固有のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色を示した。対照的に、９個の非ＰＤ頭皮サンプルは、適度なプロテアーゼ及びホスファターゼ処理を伴うＢｕｍｂｌｅｂｅｅプロトコル２を用いると、固有のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色を示さなかった。びまん性顆粒タイプのｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色は、プロトコル１を用いると観察されたのみで、プロトコル２を用いては観察されなかった。
【０２６４】
Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル１、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル２、及びｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａアッセイプロトコルからの結果が入手可能な対象のサブセットにおいて、固有のａＳｙｎシグナルは、染色した１５個のうち、それぞれ１４個、１４個、及び１３個のＰＤ頭皮サンプルで観察された（図３０Ａ）。３つ全てのプロトコルを用いて染色した４つの非ＰＤ頭皮サンプルのうち、固有のａＳｙｎ染色は、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅプロトコル２又はｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａプロトコルによっては観察されなかった（図３０Ａを参照）。Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅプロトコル１を用いると、ＰＤ及び非ＰＤ頭皮サンプルの両方において、びまん性顆粒ａＳｙｎ染色が観察された（図３０Ｂ）。高感度検出化学（金属銀沈殿）と、ｐＳ１２９−ａＳｙｎに対する抗体との組み合わせを用いて、凝集ａＳｙｎを検出することは、非凝集ａＳｙｎのプロテアーゼによる除去と組み合わせた、修飾又は非修飾ａＳｙｎに対する抗体に基づくアプローチと、同様の感度を有する可能性があることを、これらの結果は示唆している。
【０２６５】
実施例８。アッセイ検証−腹部皮膚サンプル
ホスホａＳｙｎ及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイの感度及び特異度を更に評価するために、２０名のＰＤ、及び２０名の非ＰＤ対照対象由来の腹部領域皮膚サンプルを、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル１及び２を用いて染色した。分析結果を図３１に示す。Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル１及び２を用いて染色した２０個のＰＤ腹部皮膚サンプルのうち、固有のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色は、それぞれ１９個及び１７個のサンプルで観察された。対照的に、２０個の非ＰＤ腹部皮膚サンプルは、あらゆる固有のｐＳ１２９−ａＳｙｎシグナルを示さなかった。図３１に示すように、びまん性顆粒ｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色は、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル１を用いて染色したＰＤ及び非ＰＤ腹部皮膚サンプルの大部分に、並びに、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル２を用いて染色した１個のＰＤサンプルに低濃度で存在した。これらの結果は、２０名のＰＤ、及び２０名の非ＰＤ対象由来の腹部皮膚の拡大コホートにおける、固有のｐＳ１２９−ａＳｙｎ染色の存在とＰＤ臨床状態との、高い相関度を示した（ピアソンカイ二乗＝Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル１及び２に対してそれぞれ３６．２、及び２９．６、両方のプロトコルに対してＰ値＜０．０００１）。
【０２６６】
４つのＰＤ及び４つの非ＰＤ腹部皮膚サンプルのコホートは、ＦＦＰＥブロックフォーマットにで、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル、並びに、５Ｃ１２抗体及びプロテアーゼ１ベースのｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａアッセイプロトコルの両方を用いる試験のために、利用可能であった。このような分析の結果を下表１４に示す。
【表１４】
2021534381.tif 000021
【０２６７】
ｐＲＥＤ／Ｐｒｏｔｈｅｎａプロトコルを用いて試験した４つのＰＤ腹部皮膚サンプルのうち３つが、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコルのいずれかを用いて試験したものと比較して、固有のｐＳ１２９−ａＳｙｎを有する神経的形質のパーセンテージの低下を示した。３つ全ての手順を用いて染色した頭皮サンプルでは、これは観察されなかった（図３０）。不一致を説明するための可能性としては、腹部皮膚サンプルの組織モルホロジーが、頭皮サンプルの組織モルホロジーよりも、プロテアーゼ１処理による分解を受けやすかったことがある。プロテアーゼ１処理に対する、明らかに異なる感度の原因は、現時点では不明確である。解剖学的部位に加えて、腹部スライドは頭皮スライドよりも、染色時に近い時点で切断されていた。一般に、染色前に長時間（３０日超）、切断されて室温で放置されていたスライドは、プロテアーゼが誘発するモルホロジー分解を受けにくいことが観察された（データは図示せず）。
【０２６８】
実施例９。アッセイ検証−プレＳ４頭皮、結腸、及び顎下腺サンプル
皮膚に加えて、結腸及び顎下腺（ＳＭＧ）は非常に神経支配されており、凝集α−シヌクレインを検出するための生検部位であることができる。剖検の時点で採取した、３名のＰＤ、及び３名の非ＰＤ対象由来の、２通りの頭皮、結腸、及びＳＭＧサンプルを、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル２を用いて染色した。通常の結腸及びＳＭＧサンプルの以前の研究では、プロトコル１は、プロトコル２を用いるプロテアーゼ及びホスファターゼ処理により除去可能な、重質で固有のリン酸化α−シヌクレイン染色を生成したことが示されたためプロトコル１は用いなかった（図３２Ａ及び図３２Ｂを参照）。３つの異なる組織部位における固有のリン酸化α−シヌクレイン染色の、典型的な画像を示す（図３３Ａ〜図３３Ｃを参照）。染色したスライドは、３つの独立した読者により盲検で評価された（データは図示せず）。リーダーのうち一人は、他の２名とは異なるスコア付け法を用いたものの、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅプロトコル２を用いる固有のリン酸化α−シヌクレイン染色の存在に基づく、非ＰＤ対象からの、ＰＤの完全な分離には全面的な同意が存在した。特異度及び感度は共に１００％であった。
【０２６９】
実施例１０。アッセイ検証−皮膚生検サンプル
アッセイ開発及び検証に使用したＢＳＨＲＩ頭皮及び腹部皮膚サンプルは、部検の間に入手した。診断用途のための、リン酸化Ｓ１２９−α−シヌクレイン及びＰＧＰ９．５銀／黄色二重ＩＨＣアッセイの利用可能性を評価するために、ＰＤ症状が診断された、及び診断されていない対象から、臨床訪問の間に入手した皮膚パンチ生検のＦＦＰＥ切片を、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅアッセイプロトコル１及び２の両方を用いて染色した。３６名の対象由来の、合計７２個のＦＦＰＥブロックの組織切片を、各対象から２通りのブロックが利用可能となるように染色した。対象の臨床状態については盲検とした病理学者により、染色したスライドを確認した。サンプルは皮膚の小さなパンチ生検であったため、スライド１枚当たりで入手可能な神経的形質の数は限定的（約５〜１０）であった。その結果、銀染色神経的形質のパーセンテージの形態での定量的測定はなされなかった。顆粒でないことがはっきりしており、バックグラウンド銀散粉と区別するには十分なサイズを有する、固有の銀染色が存在する場合、スライドは、リン酸化ａＳｙｎに対して陽性であるとみなした。２通りのブロックのうちの１つの切片が、リン酸化ａＳｙｎ染色に対して陽性である場合、対象は全体として陽性であるとみなした。小児皮膚生検サンプルにおけるように、Ｂｕｍｂｌｅｂｅｅプロトコル１は、プロトコル２によっては存在しなかった、固有のモルホロジーを有する重質リン酸化ａＳｙｎ銀染色を生成した（図３４を参照）。これにより、プロトコル１を用いる陽性で固有のリン酸化ａＳｙｎ染色を有するのが、１５名のＰＤの９３％、及び１６名の対照対象の５０％（非定型パーキンソン症候群の５症例を含む、合計３６名の対象の６９％）がもたらされた。プロトコル２では、１５名のＰＤの６０％、及び１６名の対照対象の６％（合計３６名の対象の３１％）が、固有のリン酸化ａＳｙｎシグナルを示した（表１５及び１６を参照）。合計３６名の対象の、各個体の組織ブロック、及び対応するＰＤ状態の非盲検結果を、表１６に示す。合計３６名の対象からの結果をカイ二乗分析すると、固有のリン酸化ａＳｙｎシグナルの存在と、臨床的症状に基づくＰＤ状態の指定とには、非常に優位な相関が示された（ピアソンカイ二乗＝１０．５０６、ＤＦ＝１、Ｐ値＝０．００１）。非定型パーキンソン症候群を有する５名の対象を分析から除外しても、相関は有意なままであった（ピアソンカイ二乗＝１０．２３６、ＤＦ＝１、Ｐ値＝０．００１）。
【表１５】
2021534381.tif 000022
【表１６】
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【０２７０】
皮膚生検における、固有の種類のリン酸化ａＳｙｎ染色の存在に基づく、非ＰＤ対照対象から、ＰＤを有する対象を区別するための、高感度及び特異度を備えた、自動化二重リン酸化ａＳｙｎ及びＰＧＰ９．５免疫組織化学アッセイを、結果は示す。固有のリン酸化ａＳｙｎ染色のモルホロジー的外観、並びに、そのプロテアーゼ及びホスファターゼ処理に対する耐性は、凝集ａＳｙｎと一致する。このアッセイは、ａＳｙｎの凝集を標的にする治療的処置のためのＰＤ及び／又は候補を有する対象の同定における、潜在的価値を有し得る。
【０２７１】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「細胞を含む」は、１つ又は複数の細胞を含み、語句「少なくとも１つの細胞を含む」と等価であるとみなされる。用語「又は」とは、文脈で別様に明確に示されない限り、記述した代替要素の単一の要素、又は２つ以上の要素の組み合わせを意味する。本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「Ａ又はＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」とは、更なる要素を除外することなく、「Ａ、Ｂ、又はＡ及びＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。
【０２７２】
前述は、例示目的のためだけに示したものであり、上記の広範の用語で記載される開示の範囲を制限することを意図するものではない。本開示で引用する全ての参照文献は。参照により本明細書に組み込まれている。
【０２７３】
本開示の様々な特定の実施形態が本明細書に記載されているものの、本開示は、これらの正確な実施形態に限定されず、当業者により、様々な変化又は修正が、本開示の範囲及び精神を逸脱することなく、それらの中で効力を有することができることと理解されるべきである。
【０２７４】
上記実施例は単に説明のものであり、本開示のあらゆる可能な実施形態、用途、又は修正の排他的一覧であることを意味するものではない。したがって、本開示の方法及びシステムで記載される様々な修正及び変形が、本開示の範囲及び精神を逸脱することなく、当業者には明白となろう。本開示は、特定の実施形態に関連して記載されているものの、特許請求された開示は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、分子生物学、免疫学、化学、生化学、又は関連分野の当業者に明確である本開示を実施するための、記載した様式の様々な修正は、添付の特許請求の範囲内にあると意図される。
【０２７５】
本開示は、本明細書に記載する特定の方法論、手順、及び試薬などには、これらが当業者の認識により変化し得るため限定されないと理解されている。また、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を説明するためだけに用いられるものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されなければならない。
【０２７６】
本開示の実施形態、並びにこれらの様々な特徴及び有利な詳細は、非限定的実施形態を参照してより完全に説明され、かつ／又は、添付図面に示され、かつ以下の記載で詳述される。図中に示す特徴は必ずしも縮尺どおりではなく、一実施形態の特徴は、本明細書で明示的に記載されない場合であっても、当業者が認識するために、他の実施形態と共に用いられ得ることに留意すべきである。
【０２７７】
本明細書で引用したあらゆる数値は、一単位の増加での、小さい値から大きい値までのあらゆる値を含むが、ただし、任意の小さい値と、任意の大きな値との間に、少なくとも二単位の間隔が存在する。一例として、例えばサイズ、角度サイズ、圧力、時間などの、プロセス変数の構成要素又は値の濃度が、例えば１〜９０、具体的には２０〜８０、より具体的には３０〜７０であると述べられている場合、１５〜８５、２２〜６８、４３〜５１、３０〜３２などといった値が、本明細書で明示的に列挙されていると意図される。１未満の値に関しては、一単位は、適宜０．０００１、０．００１、０．０１、又は０．１とみなされる。これらは、具体的に意図されるものの単なる例であり、列挙された下限値と上限値との間の数値のあらゆる可能な組み合わせは、本出願で同様の方法で明示的に記述されているものとみなされるべきである。
【０２７８】
特定の方法、装置、及び材料が記載されるが、本明細書に記載するものに類似又は等価な、任意の方法及び材料を、本開示の実践又は試験において使用することができる。本明細書で引用されるあらゆる参照文献及び公報の開示は、それぞれが個別に参照により組み込まれるかのように、それら全体が同程度に明示的に、参照により組み込まれる。
【図１Ａ】
2021534381.tif 000024
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2021534381.tif 000029
【図３Ｂ】
2021534381.tif 000030
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021534381.tif 000032
【図４Ｃ】
2021534381.tif 000033
【図４Ｄ】
2021534381.tif 000034
【図４Ｅ】
2021534381.tif 000035
【図５Ａ】
2021534381.tif 000036
【図５Ｂ】
2021534381.tif 000037
【図５Ｃ】
2021534381.tif 000038
【図６】
2021534381.tif 000039
【図７Ａ】
2021534381.tif 000040
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
2021534381.tif 000043
【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2021534381.tif 000046
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
2021534381.tif 000054
【図１５】
2021534381.tif 000055
【図１６】
2021534381.tif 000056
【図１７Ａ】
2021534381.tif 000057
【図１７Ｂ】
2021534381.tif 000058
【図１７Ｃ】
2021534381.tif 000059
【図１７Ｄ】
2021534381.tif 000060
【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【図１９】
2021534381.tif 000063
【図２０Ａ】
2021534381.tif 000064
【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
2021534381.tif 000068
【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
2021534381.tif 000071
【図２３Ａ】
2021534381.tif 000072
【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
2021534381.tif 000075
【図２６】
2021534381.tif 000076
【図２７】
2021534381.tif 000077
【図２８】
2021534381.tif 000078
【図２９】
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【図３０Ａ】
2021534381.tif 000080
【図３０Ｂ】
2021534381.tif 000081
【図３１】
2021534381.tif 000082
【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
2021534381.tif 000084
【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021534381.tif 000089
2021534381.tif 000090
2021534381.tif 000091
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