(57)【要約】  本発明は、操作された抗体またはＦｃ結合治療剤の定常重ドメイン３（「ＣＨ３ドメイン」）のＡＢ、ＥＦ、またはＣＤ構造ループへの１つ以上の異種抗体エピトープの組み込みに関する。この異種エピトープは、タグ付けされた薬剤の標的特異性にかかわらず、エピトープタグ特異的検出器抗体によって特異的に検出可能な「エピトープタグ」としての役割を果たす。したがって、このエピトープタグは、内因性抗体も含有する試料を含む生体試料中の任意のタグ付けされた抗体またはＦｃ結合剤の迅速な検出に有用である。【選択図】図７
2021524283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗体エピトープアミノ酸配列を含むＣＨ３足場であって、少なくとも１つの抗体エピトープアミノ酸配列が、免疫グロブリンＦｃ領域に由来するＣＨ３ドメインの野生型アミノ酸配列の少なくとも１つの修飾を含む、ＣＨ３足場。
【請求項２】
前記野生型配列の少なくとも１つの修飾が、前記ＣＨ３足場のＡＢ、ＥＦ、またはＣＤループ内で生じる、請求項１に記載のＣＨ３足場。
【請求項３】
前記少なくとも１つの修飾が、アミノ酸の置換、欠失、または挿入である、請求項２に記載のＣＨ３足場。
【請求項４】
前記少なくとも１つの抗体エピトープアミノ酸配列が、前記ＡＢループ内に位置する、請求項３に記載のＣＨ３足場。
【請求項５】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰγに由来する配列を含む、請求項４に記載のＣＨ３足場。
【請求項６】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、抗体の定常軽鎖に由来する配列を含む、請求項４に記載のＣＨ３足場。
【請求項７】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、配列番号３３〜５７からなる群から選択される配列を含む、請求項４に記載のＣＨ３足場。
【請求項８】
前記ＥＦおよびＣＤループが、野生型アミノ酸配列のみを含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載のＣＨ３足場。
【請求項９】
前記少なくとも１つの抗体エピトープアミノ酸配列が、前記ＥＦループ内に位置する、請求項３に記載のＣＨ３足場。
【請求項１０】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰγに由来する配列を含む、請求項９に記載のＣＨ３足場。
【請求項１１】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、抗体の定常軽鎖に由来する配列を含む、請求項９に記載のＣＨ３足場。
【請求項１２】
単一抗体エピトープアミノ酸配列が、配列番号６０〜６７からなる群から選択される配列を含む、請求項９に記載のＣＨ３足場。
【請求項１３】
前記ＡＢおよびＣＤループが、前記野生型アミノ酸配列のみを含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のＣＨ３足場。
【請求項１４】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、前記ＣＤループ内に位置する、請求項４に記載のＣＨ３足場。
【請求項１５】
前記単一抗体エピトープアミノ酸配列が、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰγに由来する配列を含む、請求項１４に記載のＣＨ３足場。
【請求項１６】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、抗体の定常軽鎖に由来する配列を含む、請求項１４に記載のＣＨ３足場。
【請求項１７】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、配列番号３〜３０からなる群から選択される配列を含む、請求項１４に記載のＣＨ３足場。
【請求項１８】
前記ＡＢおよびＥＦループが、前記免疫グロブリン重鎖の野生型アミノ酸配列のみを含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のＣＨ３足場。
【請求項１９】
前記ＣＨ３足場が、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域に由来する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＣＨ３足場。
【請求項２０】
前記ヒト抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項１９に記載のＣＨ３足場。
【請求項２１】
前記ヒト抗体がＩｇＧ１である、請求項２０に記載のＣＨ３足場。
【請求項２２】
前記ＩｇＧ１が、Ｇ１ｍ１またはｎＧ１ｍ１アロタイプである、請求項２１に記載のＣＨ３足場。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＣＨ３足場を含む、ヒト抗体またはその一部。
【請求項２４】
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項２３に記載のヒト抗体またはその一部。
【請求項２５】
前記抗体またはその一部が、１つ以上のそのＣＤＲおよびその抗体エピトープアミノ酸配列のうちの１つ以上を除いて、ヒト化されている、請求項２３または２４に記載の抗体またはその一部。
【請求項２５】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＣＨ３足場を含む、操作されたヒトＦｃ領域またはその一部。
【請求項２６】
Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する、請求項２５に記載のＦｃ領域またはその一部。
【請求項２７】
前記ヒト抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項２６に記載のＦｃ領域またはその一部。
【請求項２８】
前記ヒト抗体がＩｇＧ１である、請求項２７に記載のＦｃ領域またはその一部。
【請求項２９】
前記ＩｇＧ１が、Ｇ１ｍ１またはｎＧ１ｍ１アロタイプである、請求項２７に記載のＦｃ領域またはその一部。
【請求項３０】
抗体またはその一部であって、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の抗体エピトープ配列に特異的である、抗体またはその一部。
【請求項３１】
ＡＢ、ＥＦ、およびＣＤ構造ループ領域を有するＣＨ３足場を操作するための方法であって、前記構造ループ領域のうちの少なくとも１つが、抗体エピトープアミノ酸配列を含み、前記抗体エピトープアミノ酸配列が、前記構造ループ領域内の野生型配列の少なくとも１つの修飾を含み、
（ｉ）ＡＢ、ＥＦ、およびＣＤ構造ループ領域を有するＣＨ３足場をコードする核酸分子を提供するステップと、
（ｉｉ）前記ＡＢ、ＥＦ、およびＣＤ構造ループ領域のうちの少なくとも１つをコードする核酸配列を修飾するステップと、
（ｉｉｉ）修飾された前記核酸分子を発現系に移すステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）に従って修飾された前記核酸配列によってコードされる修飾された前記ＣＨ３足場を発現させるステップと、を含む、方法。
【請求項３２】
前記アミノ酸配列修飾が、アミノ酸の置換、欠失、または挿入である、請求項３１に記載のＣＨ３足場を操作するための方法。
【請求項３３】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰγに由来する配列を含む、請求項３１に記載のＣＨ３足場を操作するための方法。
【請求項３４】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、抗体の定常軽鎖に由来する配列を含む、請求項３１に記載のＣＨ３足場を操作するための方法。
【請求項３５】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、前記ＡＢループに位置し、配列番号３３〜５７からなる群から選択される配列を含む、請求項３１に記載のＣＨ３足場を操作するための方法。
【請求項３６】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、前記ＥＦループ内に位置し、配列番号６０〜６７からなる群から選択される配列を含む、請求項３１に記載のＣＨ３足場を操作するための方法。
【請求項３７】
前記抗体エピトープアミノ酸配列が、前記ＣＤループに位置し、配列番号３〜３０からなる群から選択される配列を含む、請求項３１に記載のＣＨ３足場を操作するための方法。
【請求項３８】
前記ＣＨ３足場がヒトＩｇＧ抗体に由来する、請求項３１に記載のＣＨ足場を操作するための方法。
【請求項３９】
前記ヒトＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項３１に記載のＣＨ足場を操作するための方法。
【請求項４０】
前記ＣＨ３足場がＩｇＧ１に由来する、請求項３９に記載のＣＨ３足場を操作するための方法。
【請求項４１】
前記ＩｇＧ１がＧ１ｍ１またはｎＧ１ｍ１アロタイプを発現する、請求項４０に記載のＣＨ３足場を操作するための方法。
【請求項４２】
前記発現系が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択されるＩｇＧ  Ｆｃ領域の核酸配列を含み、ＣＨ３足場をコードする前記核酸分子が、野生型ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列を完全にまたは部分的に置き換えるように前記発現系中に配置される、請求項３１〜４１のいずれか１項に記載のＣＨ３足場を操作するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、生物学的試料中の抗体ベースの生物学的製剤の検出を容易にするための異種抗体エピトープの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用抗体およびＦｃ融合タンパク質などの抗体ベースの生物学的製剤は、一般に、その投与後の生物学的製剤に対する望ましくないレシピエント媒介性免疫応答を最小限に抑えるように、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）足場上で開発される。しかしながら、ヒトは自然に全身を循環するＩｇＧを産生するため、投与される生物学的製剤のＩｇＧ足場の環境は、内因性ヒトＩｇＧのバックグラウンドの存在に起因して、患者試料内の生物学的製剤の検出を困難にする。生物学的製剤の血清レベルおよび薬物動態（「ＰＫ」）挙動を追跡するためのアッセイは、生物学的製剤の投与の最適化に日常的に有用であるため、患者試料中の生物学的製剤を検出する能力を有することが重要である。
【０００３】
実践者は、一般に、抗イディオタイプのモノクローナル抗体に依存して、抗体ベースの生物学的製剤の独自のＦａｂエピトープおよびイディオタイプを検出して、内因性ＩｇＧバックグラウンドに対してそれらを検出する。しかしながら、各個々の抗体ベースの生物学的製剤は独自の検出抗体を必要とするため、各抗イディオタイプのモノクローナル抗体の開発は、時間および資源を要する。
【０００４】
あるいは、抗イディオタイプ抗体を作製する必要性は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に由来するＣＨ３足場のＡＢ、ＥＦ、またはＣＤループに１つ以上の非天然に存在するエピトープを組み込み、次いで、これを抗体ベースの生物学的製剤に組み込むことによって排除することができる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、内因性抗体のバックグラウンドに対する生物学的製剤の検出を容易にするための、典型的には患者試料との関連での異種抗体エピトープの抗体ベースの生物学的製剤への組み込みに関する。より具体的には、異種抗体エピトープが、ＩｇＧ１由来のＣＨ３足場のＡＢ、ＥＦ、またはＣＤ構造ループのうちの１つ以上に組み込まれ、次いで、これが抗体ベースの生物学的製剤に組み込まれる。本質的に、本発明に従うＣＨ３足場の不均一なエピトープまたは複数のエピトープは、エピトープタグ付きＣＨ３ドメインを含むタンパク質またはタンパク質の複合体の迅速な識別を可能にするための「エピトープタグ」として機能する。
【０００６】
さらに、同じエピトープを、実質的に無限の数の異なる抗体ベースの生物学的製剤に組み込むことができる。したがって、本発明に従う迅速な生物学的検出システムは、異なる生物学的製剤と共に使用するために一般化することができ、一方、試料中の生物学的製剤を検出するための従来の方法は、異なる生物学的製剤ごとに異なる抗イディオタイプ抗体を振り分けて使用することに依存する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＰＤＢ  ４Ｎ０Ｕによって表される、新生児Ｆｃ受容体（「ＦｃＲｎ」）と、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と、Ｆｃ領域との複合体の結晶構造を図示し、ＰｙＭＯＬ分子モデリングソフトウェアを使用して可視化する。結晶構造の鎖Ａは、ＩｇＧ受容体ＦｃＲｎ大サブユニットｐ５１（濃い灰色のリボンで示される）である。結晶構造の鎖Ｂは、β２マイクログロブリンサブユニット（薄い灰色のリボンで示される）である。鎖Ｄ（ＨＳＡ）は示されていない。鎖Ｅは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域ホモ二量体の１つのサブユニットである（黒色で強調表示された領域を有する薄い灰色の略画）。黒いスティックで強調表示された残渣は、ＣＤおよびＡＢ／ＥＦループを表す。スティックを含まない黒色の略画で描写されるＦｃ残基は、Ｆｃ：ＦｃＲｎ界面の５Å以内であり、二量体化に重要であると予測される残基と重複する。
【図２Ａ】様々なヒトＩｇ−折り畳みドメインタンパク質のアミノ酸配列のマルチ配列アライメントを示し、その結晶構造は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのタンパク質データベース（「ＰＤＢ」）で入手可能であり、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン配列の領域に対応する、ＰＤＢ  ４ＷＩ２：Ａのアミノ酸１０４〜１０８とのマルチ配列アライメントを示す。配列アライメントソフトウェアプログラムＭＡＦＦＴを用いてアライメントを行った。
【図２Ｂ】様々なヒトＩｇ−折り畳みドメインタンパク質のアミノ酸配列のマルチ配列アライメントを示し、その結晶構造は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのタンパク質データベース（「ＰＤＢ」）で入手可能であり、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン配列の領域に対応する、ＰＤＢ  ４ＷＩ２：Ａのアミノ酸１０９〜２０２とのマルチ配列アライメントを示す。配列アライメントソフトウェアプログラムＭＡＦＦＴを用いてアライメントを行った。
【図２Ｃ】様々なヒトＩｇ−折り畳みドメインタンパク質のアミノ酸配列のマルチ配列アライメントを示し、その結晶構造は、のためのＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのタンパク質データベース（「ＰＤＢ」）で入手可能であり、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン配列の領域に対応する、ＰＤＢ  ４ＷＩ２：Ａのアミノ酸２０３〜２０８とのマルチ配列アライメントを示す。配列アライメントソフトウェアプログラムＭＡＦＦＴを用いてアライメントを行った。
【図３】図２に示されるものから選択されたＩｇ−折り畳みドメインタンパク質群を表すアミノ酸配列と、ＰＤＢ  ４ＷＩ２に由来するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン配列とのアライメントを示す。
【図４】ＰｙＭＯＬ分子モデリングソフトウェアを使用して灰色の略画で可視化される、ＰＤＢ  ４ＷＩ２の配列に由来する野生型ヒトＦｃ領域の結晶構造を図示する。炭水化物は、灰色のスティックで示される。ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループは、黒色で示される。ＡＢループおよびＥＦループ内の表面曝露側鎖は、スティックで表される。側鎖の表面曝露は、抗体との接触の可能性を予測する。
【図５】ＰｙＭＯＬ分子モデリングソフトウェアを使用して灰色の略画において可視化されるＰＤＢ  ４ＷＩ２の配列に由来する野生型ヒトＦｃ領域の結晶構造を示す。炭水化物は、灰色のスティックで示される。ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループは、黒色で示される。ＣＤループ内の表面曝露側鎖は、スティックで表される。側鎖の表面曝露は、抗体との接触の可能性を予測する。
【図６】ヒトＦｃ領域のＡＢ−ＥＦループ領域の表面を示す。ＡＢ−ＥＦループ内の表面残基は、球として示される。ＰＤＢ構造４ＷＩ２を、ＰｙＭＯＬソフトウェアパッケージを使用して可視化した。
【図７】ＡＢループおよびＥＦループにおけるモデル化表面残基を示す。配列番号３８および配列番号６７をそれぞれＡＢループおよびＥＦループに組み込むように変異させてエピトープタグを作製したＰＤＢ＃４ＷＩ２のＰｙＭＯＬ視覚化。
【図８】野生型またはタグ付けされた（ＣＤ−ＧｌｕまたはＣＤ−４Ｉ２Ｘ）Ｆｃドメインのいずれかを有するヒト抗体を検出する抗Ｇｌｕ抗体の能力を評価する、ウェスタンブロットの走査画像である。
【図９】様々な比（マイクログラム／ｍＬ：マイクログラム／ｍＬ）のＣＤ−ＷＴ抗体の存在または不在下でのＣＤ−ＧＬＵのＥＬＩＳＡに基づく検出を示す。
【図１０】一連の異なるタグを含有する抗体の、抗体の野生型（ｍ１，１７）ＦｃのＦｃＲｎへの結合を競合的に阻害する能力を評価する、競合結合ＦＲＥＴ実験からのデータを示す。
【図１１】一連の異なるタグを含有する抗体の、抗体の野生型（ｍ１，１７）ＦｃのＣＤ１６ａへの結合を競合的に阻害する能力を評価する競合ＦＲＥＴアッセイからのデータを示す。
【図１２】一連のＦｃ受容体に対するｍ１，１７およびＣＤ−ＧＬＵのＳＰＲに基づく親和性測定値。
【図１３】ＦｃγＲＩに結合するためのＣＤ−ＷＴ（濃い灰色）およびＣＤ−ＧＬＵ（薄い灰色）のオンレート（ｋａ、１／Ｍ）対オフレート（ｋｄ、１／ｓ）をプロットする。データは、ＣＤ−ＷＴと比較してＣＤ−ＧＬＵのオフレートがわずかに（１．２倍）増加することを指摘する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、免疫グロブリンＦｃ構造の定常重ドメイン３（「ＣＨ３ドメイン」）またはそのＣＨ３含有断片への１つ以上の異種抗体エピトープの組み込みに関する組成物および方法に関する。例えば、本発明は、ヒトＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインに異種エピトープを組み込むことができる。本発明に従うかかるＣＨ３ドメインが組み込まれたエピトープは、エピトープタグ付きＣＨ３ドメインを含むタンパク質またはタンパク質の複合体の迅速な識別を可能にするための「エピトープタグ」として機能することができる。概して、本発明によるＣＨ３ドメインエピトープタグのアミノ酸配列はまた、ＣＨ３ドメインから誘導または修飾され、ＣＨ３ドメインの塩基性三次構造を保持し、したがって、本明細書において「ＣＨ３足場」とも称される。言い換えれば、ＣＨ３ドメインエピトープタグは、「ＣＨ３足場」の文脈内に存在する。ヒトＩｇＧ１分子に由来するＣＨ３足場は、本発明によるＣＨ３足場の好ましい構造的環境であるが、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４などの任意のＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリン分子に由来するＣＨ３足場である。同様に、本発明に従うＣＨ３足場は、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインに関して少なくとも部分的に保存されている三次構造を有する非免疫グロブリンタンパク質の構造ドメインから誘導または修飾することもできる。
【０００９】
実際に、本発明によるＣＨ３足場は、天然に存在するＣＨ３ドメインの２つのβシート、すなわち、逆平行に配置されたβ鎖Ａ、Ｂ、Ｄ、およびＥを含有する４本鎖βシートに対して充填された、逆平行型β鎖Ｃ、Ｆ、およびＧを含有する３本鎖βシートの充填を含む、免疫グロブリン折り畳み（Ｉｇ−折り畳み）として知られる天然に存在するＣＨ３ドメインの構造的特徴を実質的に保持する。水素結合、疎水性相互作用、およびジスルフィド結合を形成する残基を含む、βシートの充填を維持することに関与するアミノ酸残基が当該技術分野で既知である。特定の実施形態において、Ｉｇ−折り畳みを維持するために重要な残基は修飾されない。ある特定の実施形態において、フレームワーク残基は実質的に修飾されておらず、例えば、野生型ＣＨ３ドメインと比較して、操作されたＣＨ３足場において、フレームワーク残基の１５％以下、または１０％以下、または５％以下が修飾されている。天然ＣＨ３のβシートの２つのβ鎖（例えば、ＡＢループ）または２つの異なるシートの鎖（例えば、ＣＤまたはＥＦループ）のいずれかを接続するループでのまたはその付近の修飾は、他の領域への修飾と比較して、より許容される（すなわち、天然ＣＨ３の構造または立体配座を破壊する可能性が低い）。免疫グロブリン重鎖（「ＩＨＣ」）との関連でのＣＨ３足場は、野生型ＣＨ３分子のＦｃＲｎ結合構造を保持する。例えば、ＦｃＲｎ結合機能に重要であると考えられる残基。
【００１０】
本発明によるエピトープタグ付きＣＨ３足場を含有するように操作されているタンパク質は、一般に、治療用抗体（疾患または障害の治療または予防のために対象に投与するのに好適な抗体）、ならびにＦｃ融合タンパク質およびＦｃ結合薬物または治療薬などのＦｃ結合治療生成物であり、これらは、まとめてＦｃ−生物学的製剤と称することができる。
【００１１】
本発明による抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、一般に、単一抗体またはその一部の遺伝子がトランスフェクトされた単一のクローナルＢリンパ球集団、クローナルハイブリドーマ細胞集団、または細胞のクローナル集団によって産生されたと理解される。モノクローナル抗体は、例えば、骨髄腫細胞と免疫リンパ球細胞との融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって、当業者に既知の方法によって産生される。
【００１２】
本発明に従うモノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体も含まれる。より具体的には、本発明による「完全ヒト」抗体とも呼ばれる「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリン由来のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲを含む抗体である。例えば、抗体のフレームワークおよびＣＤＲは、同一の起源ヒト重鎖もしくはヒト軽鎖アミノ酸配列、またはその両方に由来する。あるいは、フレームワーク領域は、１つのヒト抗体に由来してよく、異なるヒト抗体由来のＣＤＲを含むように操作されてよい。
【００１３】
本発明に従うエピトープタグ付き抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより大きな多重特異性でよい。多重特異性抗体は、ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよく、または異種ポリペプチドもしくは固体支持体材料等の異種エピトープに特異的であってもよい。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１７７１５号、同第ＷＯ９２／０８８０２号、同第ＷＯ９１／００３６０号、同第ＷＯ９２／０５７９３号、米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号を参照されたい。
【００１４】
本発明によるＣＨ３足場を含むように操作することができる治療用抗体の例としては、ＣＤ２０を標的とするキメラマウス／ヒトＩｇＧ１（例えば、リツキシマブ）、ＨＥＲ２を標的とするヒト化ＩｇＧ１（例えば、トラスツズマブ）、ＢおよびＴリンパ球上のＣＤ５２を標的とするヒト化ＩｇＧ１（例えば、アレムツズマブ）、ＲＡＮＫＬを標的とするヒトＩｇＧ２（例えば、デノスマブ）、ヒト化ＩｇＧ４標的化α−４インテグリン（例えば、ナタリズマブ）、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１およびＨＥＲ１を標的とするヒトＩｇＧ２（例えば、パニツムマブ）、補体タンパク質Ｃ５を標的とするヒト化ＩｇＧ２／４κ（例えば、エクリズマブ）、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１およびＨＥＲ１を標的とするキメラマウス／ヒトＩｇＧ１（例えば、セツキシマブ）、ＶＥＧＦを標的とするヒト化ＩｇＧ１（例えば、ベバシズマブ）、ＴＮＦ−αを標的とするヒトＩｇＧ１（例えば、リマダマブ）、ならびにＴＮＦ−αを標的とするキメラマウス／ヒトＩｇＧ１（例えば、インフリキシマブ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明のエピトープタグ付き抗体と同様に、本発明によるＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域はまた、ヒト免疫グロブリンＧ（「ＩｇＧ」）クラスフレームワーク、より具体的にはＩｇＧ１サブクラスに由来することが好ましい。Ｆｃ融合タンパク質は、単量体タンパク質または多量体タンパク質、例えば、そのＦｃ領域を介した多量体化によって形成され得る二量体または四量体タンパク質でよい。Ｆｃ領域は、Ｆｃ融合タンパク質のＰＫ挙動を提供する。
【００１６】
一般に、Ｆｃ融合タンパク質は、抗体の結晶化可能断片（Ｆｃ）領域を別の生物学的に活性なタンパク質ドメインまたはペプチドと結合して、独自の構造−機能特性および治療可能性を有する分子を生成する、生物操作されたポリペプチドである。Ｆｃ領域が受容体の天然形態の細胞外ドメインに融合されるＦｃ融合タンパク質は、リガンドのトラップとして機能することができる。本発明によるＣＨ３足場を含むように操作することができるＦｃ融合タンパク質の例としては、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたＣＴＬＡ−４（例えば、ベラタセプト）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２（例えば、アフリバセプト）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたＩＬ−１Ｒ（例えば、リロナセプト）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたトロンボポエチン結合ペプチド（例えば、ロミプロスチム）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合された突然変異ＣＴＬＡ−４（例えば、アバタセプト）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたＬＦＡ−３（例えば、アレファセプト）、およびヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたＴＮＦＲ（例えば、エタネルセプト）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１７】
エピトープタグ付きＣＨ３足場を検出するために使用される本発明による抗体、およびエピトープタグ付きＣＨ３足場を含むタンパク質は、本明細書において一般に、「検出器抗体」と称される。本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」または「特異的結合」という用語は、分子の異種集団における対象の同族リガンドの決定性である結合反応を指す。したがって、指定された条件下（例えば、イムノアッセイ条件下）で、本発明に従う検出器抗体は、その特定の標的、例えば、本発明に従うＣＨ３エピトープタグに結合し、患者試料中の内因性抗体など、試料中に存在する他の分子に有意な量では結合しない。特異的結合とは、結合がその標的に対する親和性に関して選択的であり、通常、結合定数または結合動態が少なくとも１０倍異なる場合、好ましくは差が少なくとも１００倍であり、より好ましくは少なくとも１０００倍である場合に達成されることを意味する。
【００１８】
「エピトープ」という用語は、天然およびモノクローナル抗体、ならびにそのような分子の断片を含む、抗体構造によって特異的に結合することができる、典型的にはアミノ酸の配列によって形成される構造を指す。言い換えれば、エピトープは、特異的結合パートナーを完全に構成し得るか、または抗体もしくはその断片の結合ドメインへの特異的結合パートナーの一部でよい、分子構造でよい。本発明によるＣＨ３足場のエピトープタグは、通常、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは５〜１５個のアミノ酸、または１０〜２０個のアミノ酸を含み、エピトープタグの修飾ＡＢ、ＥＦ、またはＣＤループ配列を境界とする１つ以上のアミノ酸を含んでよい。さらに、エピトープは概して直線的であるが、本発明によるエピトープはまた、立体構造でもよく、例えば、エピトープの三次構造を形成するために、ポリペプチドの折り畳みによって非連続配列をまとめることによって形成されたエピトープでもよい。
【００１９】
本発明に従って、エピトープタグは、ＣＨ３足場のＡＢ、ＥＦもしくはＣＤループの野生型アミノ酸配列の少なくとも１つの修飾、または治療用抗体に応答して個体によって産生される内因性抗体によって認識されないエピトープの形成をもたらすそれらの任意の組み合わせ、またはエピトープタグ付きＣＨ３足場を含むＦｃ融合タンパク質を特徴とする。様々な戦略が、エピトープタグの設計に使用されてもよい。例えば、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループ内の配列修飾は、ＡＢ、ＣＤ、またはＥＦループ野生型配列の、他の構造関連Ｉｇ−折り畳みタンパク質の対応する構造領域に由来する配列への置換に基づいてよい。したがって、候補エピトープ配列は、ＩＨＣのＣＨ３ドメインの配列に対する様々なＩｇ−折り畳みタンパク質の一次アミノ酸配列のマルチ配列アライメントを行うことによって特定することができる。例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのタンパク質データベース（「ＰＤＢ」）でカタログ化されたＩｇ−折り畳みタンパク質結晶形態の一次アミノ酸配列は、ＩＨＣ  ＣＨ３ドメインの一次配列に対して整列され得る。
【００２０】
アライメント分析は、結晶構造比較によって知られるように、ＩｇＧ折り畳み内の間隔、アミノ酸電荷、等電点（ｐｌ）、極性、および三次元（３Ｄ）構造保存を含む、配列位置保存の一般的なクラスを考慮することができる。配列アライメントはまた、アミノ酸がＣＨ３ドメインの三次構造、一般的にはＣＨ３ドメインの三次構造、または具体的にはＡＢ、ＥＦ、もしくはＣＤループ構造を維持するために不可欠であることを予測する保存配列において絶対同一性を強調することができる。かかるアミノ酸は、「アンカー残基」とも呼ばれることがある。例えば、Ｖａｌ−Ｓｅｒジペプチド配列、ＡＢループのＣ末端、およびＣＤループのＮ末端に位置する２つの残基のＴｒｐは、アンカー残基である。配列アライメントが、別様に保存された候補Ｉｇ−折り畳み由来のエピトープ中のアンカー残基の不在を明らかにする場合、ドナーＩｇ−折り畳みタンパク質の野生型配列は、ドナー配列中の位置におけるアミノ酸の、野生型ＣＨ３配列中のその位置に対応するアンカー残基への置換によって修飾され得る。
【００２１】
本発明によるエピトープタグアミノ酸配列から誘導され得るＩｇ−折り畳みドメインを有するＩｇ−折り畳みタンパク質の例は、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）およびＳＩＲＰガンマ（ＳＩＲＰγ）である。ＳＩＲＰαおよびＳＩＲＰγの結晶形態は、ＰＤＢ中で２ＷＮＧおよび４Ｉ２Ｘ：Ｅとして認識される。例えば、本発明によれば、ＬＴＫＮ（配列番号３２）等の野生型配列に対応するＩＨＣのＡＢループ内の位置におけるアミノ酸は、ＳＩＲＰαおよびＳＩＲＰγ由来配列ＴＰＱＨ（配列番号４３）およびＴＰＥＨ（配列番号４７）でそれぞれ置換することができる。また、軽鎖定常ドメイン（「ＣＬ」）由来配列ＬＴＳＧ（配列番号４５）で置換することもできる。
【００２２】
同様に、ＫＳＲＷＱＱ（配列番号５９）等の野生型配列に対応するＩＨＣのＥＦループ内の位置におけるアミノ酸は、ＬＴＲＷＤＶ（配列番号６１）、ＬＤＲＷＤＶ（配列番号６５）、およびＫＤＲＷＥＲ（配列番号６３）等のＳＩＲＰα−、ＳＩＲＰγ−、およびＣＬ由来配列でそれぞれ置換することができる。より具体的には、配列番号６１、６５、および６３は、それぞれ配列番号７０、７１および７２によって記載されるＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγ、およびＣＬ配列のうちの位置１８６〜１９１、１８７〜１９２、ならびに１８３〜１８８に対応する。配列番号６１、６５、および６３の配列「ＲＷ」は、それぞれ、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγ、およびＣＬにおける対応する配列位置で野生型配列「ＲＥ」、「ＰＷ」、および「ＥＹ」を置き換える。より具体的には、「ＲＷ」配列は、野生型ＣＨ３ドメインのＥＦループにおける対応する配列位置におけるＲＷの存在を再現する。したがって、「ＲＷ」は、ＣＨ３足場の全体構造を保持するためのアンカー配列として機能する。
【００２３】
ＳＩＲＰγおよびＳＩＲＰαはまた、ＩＨＣのＣＤループ内の位置にアミノ酸に対応する領域を含有し、ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号２）等の野生型配列に対応する。実際、ＣＨ３野生型配列は、ＳＩＲＰγおよびＳＩＲＰα由来配列ＮＧＮＥＬＳＤＦ（配列番号４）で置換され得る。ＣＨ３  ＣＤループの野生型配列は、ＣＬ由来配列ＩＤＧＳＥＲＱＮＧ（配列番号６）で置換することができる。配列番号６および４は、それぞれ配列番号７２および７０によって記載されるＣＬ配列およびＳＩＲＰα配列の位置１５０〜１５８および１５６〜１６３に対応する。
【００２４】
エピトープタグを設計するための追加の戦略は、野生型配列を変化させるＡＢ、ＥＦ、およびＣＤループの配列修飾を選択することと、望ましくない立体効果を生み出すであろう修飾の回避を含む、ループの全体的な３Ｄ構造を保持することとを含む。したがって、本発明に従うＣＨ３足場は、ＡＢ、ＥＦ、またはＣＤループ配列へのアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含んでもよく、電荷、ｐｌ、および極性などの野生型ループ配列アミノ酸の特性が、エピトープタグのための天然のフレームワークを維持するために保存されてもよいが、溶媒に曝露されたアミノ酸（すなわち、エピトープ特異的抗体がアクセス可能な表面）の絶対的な配列同一性が、検出器抗体によって特異的結合を有利にするように変更されてもよい。
【００２５】
ＣＨ３足場について新規のエピトープタグを設計する際に３Ｄ構造関係および立体関係を考慮するための様々な戦略が当該技術分野で既知である。例えば、ＰｙＭＯＬなどの分子可視化システムソフトウェアを使用して、ＰＤＢ  ４ＷＩ２または４Ｎ０Ｕの結晶構造に由来するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域と同様であるがこれらに限定されない、抗体の関連において候補ＡＢ、ＥＦ、およびＣＤループエピトープタグ配列をモデル化することができる。
【００２６】
本発明によるＡＢループエピトープタグの非限定的な例は、ＬＴＫＮ（配列番号３２）等の野生型配列のＩＳＲＱ（配列番号４１）での置換を含有する。一方、本発明に従うＥＦループエピトープタグの非限定的な例は、ＫＳＲＷＱＱ（配列番号５９）等の野生型配列をＮＤＲＷＱＱ（配列番号６７）で置換する。本発明によるＣＤエピトープタグ配列の非限定的な例としては、以下の配列を含み、これは、一般にＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号２）等のＩｇＧ１野生型配列をＤＮＰＶＹ（配列番号８）、ＳＮＩＡＱＰＲＮＹ（配列番号１０）、ＳＮＧＱＰＥＫＲＮＥＮＮＹ（配列番号１２）、ＳＮＧＱＰＥＬＡＮＥＮＮＹ（配列番号１４）、ＳＮＧＱＰＤＲＲＹ（配列番号１６）、ＳＮＧＱＰＤＮＦ（配列番号１８）、またはＳＮＧＱＰＤＱＱＹ（配列番号２０）で置き換える。
【００２７】
上述のように、本発明によるエピトープタグは、ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＥＦ、もしくはＣＤループの野生型（ＷＴ）アミノ酸配列の少なくとも１つの修飾、またはそれらの任意の組み合わせによって特徴付けられる。したがって、本発明に従うＣＨ３ドメインを有するＩＨＣまたはその一部は、そのＡＢループ、そのＥＦループ、またはそのＣＤループ内にのみ位置する単一のエピトープタグを有することができる。あるいは、本発明に従うＣＨ３ドメインを有するＩＨＣまたはその一部は、２つのエピトープタグのみを有し得、１つのエピトープタグはそのＡＢループ内に位置し、他方はそのＥＦループ内に位置する。同様に、本発明に従うＣＨ３ドメインを有するＩＨＣまたはその一部は、２つのエピトープタグのみを有し得、１つのエピトープタグはそのＡＢループ内に位置し、もう１つはそのＣＤループ内に位置する。また、本発明に従うＣＨ３ドメインを有するＩＨＣまたはその一部は、２つのエピトープタグのみを有し得、１つのエピトープタグはそのＥＦループ内に位置し、他方はそのＣＤループ内に位置する。本発明に従う、３つのエピトープタグを有するためにＣＨ３ドメインを有するＩＨＣまたはその一部を必要とする使用の場合、ＩＨＣまたはその一部は、それぞれ、そのＡＢ、ＥＦ、およびＣＤループに位置する３つのエピトープタグを含有する。
【００２８】
上述のように、本発明に従って、ヒトＩｇＧ１サブクラスに基づく、またはそれと関連した抗体ベースの生物学的製剤が好ましい。より具体的には、エピトープタグ付きの抗体ベースの生物学的製剤のＦｃ領域は、様々なＩｇＧ１アロタイプ（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ＆Ｌｅｆｒａｎｃ）に由来し得る。例えば、Ｆｃ領域は、Ｇ１ｍ１またはｎＧ１ｍ１のいずれかのアロタイプの一次アミノ酸配列を有するＩｇＧ１抗体に由来してよい。Ｇ１ｍ１およびｎＧ１ｍ１アロタイプは、ＡＢループ内のそれらのアミノ酸配列の違いによって自然に区別されるため、ＡＢループエピトープタグの設計は、それらの位置で配列同一性を維持することによって、それらの配列差を維持することができる。より具体的には、野生型Ｇ１ｍ１アロタイプは、アミノ酸配列ＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳを含み、対応するｎＧ１ｍ１配列はＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳである。前述の配列において太字で強調表示されるアミノ酸は、アロタイプの特定の決定基である。したがって、ｎＧ１ｍ１由来のＦｃ領域のＡＢループ中の強調表示されたＥおよびＭ残基の存在は、Ｇ１ｍ１特異的抗体がＦｃ領域に結合することを防止するであろう。同様に、Ｇ１ｍ１由来Ｆｃ領域のＡＢループ中の強調表示されたＤおよびＬ残基の存在は、ｎＧ１ｍ１特異的抗体がＦｃ領域に結合することを防止する。
【００２９】
アロタイプはまた、ＩｇＧ１抗体のＩＨＣのＣＨ１ドメイン内に存在してもよい。エピトープタグ付きの抗体ベースの生物学的製剤のＩＨＣは、様々なＩｇＧ１アロタイプに由来してよい。例えば、ＩＨＣは、Ｇ１ｍ３（ＩＭＧＴ  Ｒ１２０；ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）、またはＧ１ｍ１７（ＩＭＧＴ  Ｋ１２０）、アロタイプのいずれかの一次アミノ酸配列を有するＩｇＧ１抗体に由来してよい。より具体的には、エピトープタグ付き抗体のＩＨＣ、抗体ベースの生物学的製剤は、アロタイプの組み合わせに由来してよい。より具体的には、ＩＨＣは、Ｇ１ｍ１およびＧ１ｍ１７アロタイプの組み合わせを組み込むＧ１ｍ１７，１（「ｍ１，１７」）アロタイプでよい。
【００３０】
エピトープ配列の設計におけるアロタイプ配列の前述の考慮に加えて、本発明に従うエピトープタグは、例えば、上記で考察した戦略を使用して、エピトープとして機能するように特に設計されたエピトープタグの一部を境界とする野生型アミノ酸配列を含むことができるが、このことは必要とされない。例えば、ＩｇＧ１の野生型Ｇ１ｍ１アロタイプと関連付けられた（アミノ／カルボキシ）隣接配列を境界とするＡＢループエピトープタグ配列。同様に、ＩｇＧ１の野生型ｎＧ１ｍ１アロタイプと会合する（アミノ／カルボキシ）隣接配列を境界とするＡＢループエピトープタグ配列。
【００３１】
ＩｇＧ１野生型配列（Ｄ）および（ＧＱＶ）によってそれぞれそのアミノ末端側およびカルボキシ末端側に隣接するＥＦループエピトープタグ配列はまた、前述の野生型配列の一部または全てを含むことができる。最後に、それぞれＩｇＧ１野生型配列（ＷＥ）および（ＫＴＴ）によってそのアミノ末端側およびカルボキシ末端側に隣接するＣＤループエピトープタグ配列は、前述の野生型配列の一部または全ても含むことができる。
【００３２】
本発明はまた、本発明に従うＣＨ３足場をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、本発明に従うポリヌクレオチドは、単一のＣＨ３足場ポリペプチド、または本発明に従うＣＨ３足場を含有するポリペプチドもしくはその画分、例えば、ＩＨＣ、抗体断片、もしくはＦｃ融合タンパク質の成分をコードすることができる。
【００３３】
本発明の分子をコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の方法によって得られる。実際、周知の分子生物学的方法を用いて、構造ループ領域のうちの少なくとも１つが抗体エピトープアミノ酸配列を含む、ＡＢ、ＥＦ、およびＣＤ構造ループ領域を有するＣＨ３足場をコードするポリヌクレオチドを設計し、製造することができる。上述のように、本発明による抗体エピトープアミノ酸配列は、ＣＨ３足場のＡＢ、ＥＦ、またはＣＤ構造ループ領域のうちの少なくとも１つの配列修飾を含有する。したがって、本発明によるＣＨ３足場をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、野生型ＣＨ３ドメイン配列と比較してそのＡＢ、ＥＦ、またはＣＤループのうちの少なくとも１つ内に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または挿入を有するＣＨ３足場の発現をもたらす配列修飾を含むことができる。この点において、本発明によるポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド配列を含有することができ、ヌクレオチド配列は、１つ以上のＡＢ、ＥＦ、またはＣＤループが構造的に関連するＩｇ−折り畳みタンパク質に由来するアミノ酸配列を含有するＣＨ３足場を発現するように修飾される。例えば、本発明によるポリヌクレオチドは、ＣＨ３足場をコードするヌクレオチド配列を含有することができ、そのＡＢ、ＥＦ、またはＣＤループのうちの１つ以上は、Ｉｇ−折り畳みタンパク質、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγ、または定常軽鎖などの別の免疫グロブリン鎖に由来するアミノ酸配列を含有する。
【００３４】
本発明によるポリヌクレオチドは、タンパク質発現ベクターに組み込むことができ、次いで、タンパク質発現系宿主細胞にトランスフェクトして、ＣＨ３足場またはＣＨ３足場含有タンパク質、例えば、ＩＨＣ、抗体断片、またはＦｃ融合タンパク質の成分の発現を駆動することができる。
【００３５】
本発明はまた、本発明に従うＣＨ３足場の操作されたエピトープに特異的に結合する、抗体および抗原結合断片を含む分子をスクリーニングおよび同定するための方法を提供する。エピトープに結合する分子は、例えば、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であってもよい。本発明に従うエピトープタグ付きＣＨ３足場と反応する抗体およびその抗原結合断片を製造するための方法またはプロセスも提供される。
【００３６】
本発明は、エピトープ結合分子を同定するための方法の利用可能性に制限を加えないが、そのような方法の例は、（ｉ）プローブとして本発明に従うエピトープタグ付きＣＨ３足場を使用して生体試料またはペプチドライブラリをスクリーニングすることと、（ｉｉ）当該プローブに特異的に結合する分子を単離することと、（ｉｉｉ）当該分子を同定することと、を含む。したがって、本発明によるＣＨ３足場の操作されたエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断片を使用して、過剰な未タグ付け抗体または抗体断片を含有する試料中のエピトープタグ付きＣＨ３足場を有する抗体を検出することができる。例えば、本発明によるＣＨ３足場の操作されたエピトープに特異的に結合する抗体は、少なくとも１：２５００００、１：１０００００、１：１００００、１：１０００、１：１００、またはその中の任意の比率を含む、のタグ付けされている：タグ付けされていない抗体の比で、タグ付けされていない抗体も含有する溶液中で操作されたエピトープタグ付け（「タグ付けされた」）抗体を特異的に区別および検出することができる。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例は、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループ内のアミノ酸配列の設計および分析プロセスを説明し、タグの抗体コグネイトを使用して試料中の特殊抗体の容易な検出を可能にするエピトープタグを作製する。ＡＢ、ＥＦ、およびＣＤループのためのエピトープタグ配列を設計するために、４つの一般的な戦略を用いた：ｉ）野生型配列を、ＣＨ３ループ構造と配列類似性もしくは構造的類似性を共有する他のＩｇ−折り畳みタンパク質の領域に由来する配列、またはその両方で置換、ｉｉ）ＡＢ、ＥＦ、およびＣＤループにおける立体的に好ましいアミノ酸置換を特定するための分子モデリングソフトウェアの使用、ｉｉｉ）野生型配列を考慮した構造的仮定に基づいて、ＡＢ、ＥＦ、およびＣＤループ配列のアミノ酸配列、長さ、またはその両方への配列修飾の導入、ならびにｉｖ）ＣＤループのアミノ酸配列を置き換えるための市販の抗体に対するコグネイトエピトープの組み込み。
【００３８】
実施例１．Ｉｇ−折り畳みタンパク質由来エピトープタグ。簡潔には、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループ内の配列修飾は、ＡＢ、ＣＤ、またはＥＦループ野生型配列の、他の構造関連Ｉｇ−折り畳みタンパク質の対応する構造領域に由来する配列への置換に基づいた。このアプローチは、ヒトＣＨ３ドメインへの組み込みのための独自のエピトープの同定をもたらした。ＡＢループの配列修飾は、Ｇ１ｍ１、ならびにｎＧ１ｍ１アロタイプ（それぞれ、ＤＥＬ対ＥＥＭ）の環境において作製された。
【００３９】
図２Ａ〜２Ｃに要約されるように、ＡＢ、ＥＦ、およびＣＤループ配列に対応する候補Ｉｇ−折り畳みＣＨ３ループ配列を、ＰＤＢ  ４ＷＩ２に関連する結晶構造に由来するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの配列に対して、様々なＩｇ−折り畳みタンパク質の一次アミノ酸配列のマルチ配列アライメントを行うことによって特定した。アラインメントには、結晶構造が２０１８年４月１１日時点で構造バイオインフォマティクスタンパク質データバンク（「ＰＤＢ」）のためのＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙで入手可能であった８つのＩｇ−折り畳みタンパク質が含まれた。Ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／を参照されたい。候補Ｉｇ−折り畳みタンパク質のＰＤＢ  Ｉｄは、２ＷＮＧ、４Ｉ２Ｘ：Ａ、４Ｉ２Ｘ：Ｅ、４ＧＲＬ、１ＥＸＵ、１Ｔ７Ｗ、３ＢＶＮ、および４ＧＵＰである。
【００４０】
アライメント分析は、Ｉｇ−折り畳みタンパク質内のＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループの間隔の全体的な保存を示した。配列モチーフまたは「アンカー残基」がループの各々の間に存在した。タンパク質間の絶対配列同一性は低かった。これらのタンパク質のサブセット、具体的には４Ｉ２Ｘ：Ａ、４Ｉ２Ｘ：Ｅ、および２ＷＮＧのマルチ配列アライメントは、４ＷＩ２のＣＨ３ドメインとより高い配列同一性を有する領域を特定した（図３）。
【００４１】
アラインメント分析は、Ｉｇ−折り畳み領域内の間隔、電荷、等電点（ｐｌ）、および極性を含む、いくつかの一般的なクラスの配列位置保存を考慮した。バリン−セリン、ＡＢループへのＣ末端、およびＣＤループへのＮ末端の２つの残基におけるトリプトファン等の潜在的な保存されたアンカー残基の絶対的同一性に重点を置いた。２つの結晶、２ＷＮＧおよび４Ｉ２Ｘに見られるタンパク質のアミノ酸配列は、他の６つのＩｇ−折り畳みタンパク質よりも、ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループにおけるＩｇＧ１  ＣＨ３配列でより保存された。結晶２ＷＮＧは、制御膜糖タンパク質、シグナル制御タンパク質α（ＳＩＲＰα）に対応する。結晶４Ｉ２Ｘは、抗体Ｆａｂ断片およびＳＩＲＰγ（ＳＩＲＰγ）の軽鎖に対応する２つのＩｇ−折り畳みタンパク質、４Ｉ２Ｘ：Ａおよび４Ｉ２Ｘ：Ｅを含有する。
【００４２】
ＰＤＢ  ４ＷＩ２  ＩｇＧ１結晶に由来するアミノ酸配列に基づくＣＨ３足場を、ヒトＣＨ３のＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループに対応する４Ｉ２Ｘ：ＡのＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγ、およびＣＬドメインの領域を埋め込むように設計した。表１〜３は、それぞれＣＤ、ＡＢ、およびＥＦループの野生型（ＷＴ）配列を置き換えるために使用されたＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγ、およびＣＬ由来エピトープタグアミノ酸配列を要約する。しかしながら、抗体構造の内部を指す側鎖を有する野生型配列中のアミノ酸は、それらの潜在的構造的意義、ならびにそれらの残基が曝露されず、したがって、検出抗体によってアクセスできないため、置換されなかった。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００４３】
実施例２．ＡＢおよびＥＦループにおける立体的に好ましいアミノ酸置換。分子可視化システムソフトウェアのＰｙＭＯＬを使用して、ＰＤＢ  ４ＷＩ２または４Ｎ０Ｕの結晶構造に由来するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を使用して、ループの位置をモデル化し、ＡＢループおよびＥＦループ内の溶媒曝露アミノ酸側鎖を同定した。ＰｙＭＯＬの変異誘発特徴を用いてアミノ酸置換をモデル化し、ＡＢループおよびＥＦループ内の表面曝露残基の様々なアミノ酸置換の立体効果を分析することができた。立体衝突をもたらさなかった置換を追加の分析のために検討した。表４および５は、ＡＢループおよびＥＦループの表面曝露ループにおける立体的に好ましい置換を同定することによって開発された、それぞれの候補ＡＢおよびＥＦエピトープアミノ酸配列を含有する。
【表４】
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【表５】
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【００４４】
実施例３．ＣＤループ配列修飾。分子可視化システムソフトウェアのＰｙＭＯＬを使用して、ＰＤＢ  ４ＷＩ２または４Ｎ０Ｕの結晶構造に由来するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を使用して、ループの位置をモデル化し、ＣＤループ配列内の溶媒曝露アミノ酸側鎖を同定した。このアプローチを用いて、ＣＤループの環境内での配列修飾の立体効果を分析することが可能であった。アミノ酸置換は、各アミノ酸位置における電荷、等電点（ｐｌ）、および極性の類似性に基づいて選択された。ＣＤエピトープの設計に関する別の一般的な考慮事項は、抗体の外側に疎水性パッチを避けることであった。表６は、前述の戦略を用いることによって選択された候補ＣＤエピトープタグ配列のリストを含む。
【表６】
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実施例４．ＣＤループのアミノ酸配列を置き換えるための市販の抗体のコグネイトエピトープの組み込み。表７は、野生型アミノ酸配列を市販の抗体によって認識される既知のエピトープタグ配列に置き換えることによって修飾されたＣＤループの説明を含む。
【表７】
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【００４５】
ＣＤ−Ｇｌｕエピトープをｍ１，１７骨格に組み込むことにより、市販の抗ＧＬＵ抗体（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＡＢ３７８８）でこの抗体を検出することができる。図８に示すように、ＣＤ−ＧＬＵは、野生型ｍ１，１７ＣＤループ（ＣＤ−ＷＴ）を含有する抗体またはＣＤ−４Ｉ２Ｘ：Ｅエピトープを含む抗体のいずれかと比較して、ウェスタンブロットを介して選択的に検出される。ＣＤ−ＧＬＵは、少なくとも１５〜４００ｎｇの範囲にわたってウェスタンブロットによって検出可能であった。ＣＤ−ＷＴまたはＣＤ−４Ｉ２Ｘ：Ｅのいずれについても、４００ｎｇまでの高レベルでシグナルは検出されなかった。
【００４６】
ＣＤ−ＧＬＵは、ＣＤ−ＷＴ抗体の存在下で検出され得る。ＣＤ−ＧＬＵおよびＣＤ−ＷＴを、０：１００、０：１０００、１：０、１０：０、１００：０、１：１００、１０：１００、１００：１００（μｇ／ｍＬ  ＣＤ−ＧＬＵ：μｇ／ｍＬ  ＣＤ−ＷＴ）の比率でリン酸緩衝生理食塩水中で混合し、ＥＬＩＳＡプレートの表面に三重にコーティングした。ＣＤ−ＧＬＵまたはＣＤ−ＷＴ（０：０）のいずれかを含まないリン酸緩衝生理食塩水は、バックグラウンドコントロールとして機能した。結合ＣＤ−ＧＬＵを、一次抗体として抗ＣＤＧＬＵＧＬＵポリクローナル抗血清（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＡＢ３７８８）の１：１０００希釈、およびマウス抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号４０９０−０５）の１：５０００希釈で検出した。ＯＰＤ基板で信号を現像し、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。図９に示すように、ＣＤ−ＷＴは、１０００μｇ／ｍＬまでの濃度で播種した場合、バックグラウンドレベルを超えて検出されなかった。対照的に、ＣＤ−ＷＴの不在下でプレーティングした場合、ＣＤ−ＧＬＵは、１０μｇ／ｍＬまで低い濃度で検出可能であった。１０および１００μｇ／ｍＬの濃度のＣＤ−ＧＬＵも、１００μｇ／ｍＬのＣＤ−ＷＴの存在下で検出した。
【００４７】
実施例５．エピトープの組み込みは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を劇的に変化させない。ＦｃＲｎに対する結合親和性は、抗体の薬物動態（ＰＫ）挙動、したがって抗体の血清半減期と相関する。設計されたエピトープがＦｃＲｎに結合するＩｇＧの能力を変化させ、したがってインビボでＰＫに影響を及ぼすかどうかを解決するために、ＣＤ−ＷＴ、ＣＤ−ＧＬＵ、ＣＤ−４Ｉ２Ｘ、ＡＢＥＦ−ＩＳＮＤ、およびＡＢＥＦ−４Ｉ２Ｘ：Ｅエピトープタグを含有する抗体パネルを、同じ可変ドメインの環境において発現させ、競合的ＦＲＥＴベースのアッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用してＦｃＲｎへの結合について評価した。図１０に実証されるように、ＣＤ−ＷＴは、ドナー標識ヒトＩｇＧの結合を用量依存的様態で効果的に競合することができる。試験した４つのエピトープのいずれかの組み込みは、抗体がドナー標識ヒトＩｇＧと競合する能力を劇的に変化させなかった。これらのデータは、設計プロセスによって予測されるように、ＦｃＲｎとの既知の相互作用部位とは異なる部位であるＣＤまたはＡＢＥＦループのいずれかへのエピトープの組み込みが、抗体がＦｃＲｎに結合する能力を著しく変化させないことを示唆する。したがって、これらのループへのエピトープの組み込みは、抗体のＰＫを改変するとは予測されない。
【００４８】
実施例６．Ｆｃγ受容体との結合は、エピトープ間で区別される。異なるクラスの免疫エフェクター細胞は、細胞表面上でＦｃγＲの独自の組み合わせを発現する。抗体によるそれらのＦｃγＲの、それらのＦｃドメインを介した関与は、免疫エフェクター細胞の活性を調節する。例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上でのＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）の関与は、抗体依存性細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導するために重要である。ＣＤ１６ａ、例えばＣＤ１６ａＶ１５８ＦおよびＣＤ１６ａＶ１７６Ｆにおける天然に存在する多型は、ＩｇＧ分子のＦｃドメインに対する受容体の結合親和性を変化させる。これは、次いで、ＩｇＧがインビトロでＡＤＣＣを誘導する能力を変化させ、いくつかの抗体ベースの治療薬に対する臨床的応答と相互に関連付けられた。競合的ＦＲＥＴアッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用して、ｍ１，１７アロタイプ、ならびにＣＤ−ＧＬＵ、ＣＤ−４Ｉ２Ｘ：Ｅ、ＡＢＥＦ−ＩＳＮＤ、およびＡＢＥＦ−４Ｉ２Ｘ：Ｅへの結合についてのＣＤ−ＷＴＦｃの能力を、ＣＤ１６ａ１５８Ｖへの結合について評価した。図１１に示すように、ＣＤ−ＧＬＵ、ＡＢＥＦ−ＩＳＮＤ、およびＡＢＥＦ−４Ｉ２Ｘ：Ｅは、野生型（ｍ１，１７アロタイプ）Ｆｃドメインを含有する抗体で観察されたものを模倣した用量依存的様態で、ＣＤ１６ａ１５８Ｖへの結合についてヒトＩｇＧと競合することができた。対照的に、ＣＤ−４Ｉ２Ｘ：Ｅ抗体は、ＣＤ１６ａ１５８Ｖ受容体に対する親和性の低下と一致して、同じレベルの競合を達成するために約１０倍の濃度を必要とした。
【００４９】
ＦｃγＲファミリーのさらなるメンバーは、免疫エフェクター細胞の様々なサブセット上に存在する。これらの中には、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、およびＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）がある。ＣＤ３２およびＣＤ１６ｂは、低親和性ＩｇＧ受容体であり、ＣＤ１６ａは、中間親和性で結合し、ＣＤ６４は、モノマーＩｇＧと高い親和性で結合する。ＣＤ１６ａと同様に、ＣＤ３２ａＨ１３１Ｒ等の多型は、結合親和性を変化させる他のＦｃγＲ中に存在する。野生型（ＣＤ−ＷＴ）およびＣＤ−ＧＬＵを、ＢＩＡｃｏｒｅ  ８Ｋ上で表面プラズモン共鳴を用いてさらに特徴付け、ＣＤ１６ａ１７６Ｖ、ＣＤ１６ａ１７６Ｆ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ａ１６７Ｈ、ＣＤ３２ａ１６７Ｒ、およびＣＤ３２ｂに対する親和性を測定し、直接比較した。ＦｃγＲへの結合時に５０〜１００ＲＵのＲｍａｘを生成することを目的として、約１５０ＲＵ  ＣＤ−ＷＴおよびＣＤ−ＧＬＵを抗Ｆａｂ固定化シリーズＳ  ＣＭ５センサチップ上で捕捉した。ＦｃγＲの各々に対する親和性を、少なくとも１０個の反復を使用して測定し、個々のＦｃγＲに特異的な親和性モデルを使用して評価した。二価分析物モデルを有する単一サイクル動態をＣＤ６４およびＣＤ１６ファミリー受容体に使用し、定常状態結合を使用して、受容体のＣＤ３２ファミリーへの結合を評価した。これらの研究の結果を、表８および９、ならびに図１２および１３に示す。全体的に、データは、ＣＤ−ＷＴおよびＣＤ−ＧＬＵによる同様の結合を反映し、ＣＤ−ＧＬＵに対する可能性のある傾向は、ＦｃγＲの全てのファミリーについて１．１〜１．４倍の範囲で適度な減少を有する。ＦｃγＲ１結合の場合、データは、差の原因となるＣＤ−ＷＴと比較して、ＣＤ−ＧＬＵのオフレートの小さいが一貫した増加を指す。ＦｃγＲ１への結合は、Ｆｃドメインのグリコシル化状態によって影響を受けることが知られている。ＣＤ−ＷＴに対するＣＤ−ＧＬＵのグリコシル化におけるわずかな差異が、観察された差異に関与することがある。
【表８】
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【表９】
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実施例７．ＣＤ−ＧＬＵの免疫原性予測。抗体配列の修飾は、異なる天然に存在するアロタイプ骨格の使用でさえ、免疫原性の速度の変化と関連付けられている。ＣＤ−ＧＬＵエピトープタグをｍ１、１７骨格に組み込む潜在的な免疫原性リスクを評価するために、アミノ酸配列を、それぞれＮｅｔＭＨＣｃｏｎｓおよびＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ（バージョン３．２）サーバーを使用して、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ結合ペプチドの導入について計算的に分析した。分析は、強い結合ペプチドおよび弱い結合ペプチドの２０万個のランダムな天然ペプチドのセットと比較して、ｎＭの結合親和性およびランク％で与えられる予測値を提供する。ＮｅｔＭＨＣｃｏｎｓは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインにまたがる組み込まれたＣＤ−ＧＬＵエピトープタグ（配列番号７３）を用いて、ｍ１，１７アロタイプＦｃのアミノ酸配列において１つのアミノ酸だけ登録上シフトした、３２１、すなわち９つのアミノ酸ペプチドを評価した。ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎは、重鎖配列を含有する同じＣＤ−ＧＬＵにわたって３１５、すなわち１５つのアミノ酸ペプチドを評価した。強力なＭＨＣＩ結合ペプチドは、５０ｎＭの親和性を有し、対照ペプチドに対して上位０．５％以内のものである。弱いＭＨＣＩ結合ペプチドは、５００ｎＭの親和性を有し、上位２％以内のものである。強いおよび弱いＭＨＣＩＩ結合ペプチドは、天然に存在する対照セットと比較して、それぞれ上位２％および１０％以内のものである。アルゴリズムは、３つの強ＭＨＣＩ結合ペプチドおよび３つの弱ＭＨＣＩ結合ペプチド、ならびに０個の強ＭＨＣＩＩ結合ペプチドおよび１１個の弱ＭＨＣＩＩ結合ペプチドを予測した。強いＭＨＣＩ結合ペプチドおよび弱いＭＨＣＩ結合ペプチドの例は、それぞれペプチド１３３および１１６である。同様に、ＭＨＣＩＩに弱く結合すると予測されるペプチドは、ペプチド１７８である。予測されるペプチドの全ては、野生型Ｆｃドメインの天然に存在する領域に位置する。ＣＤ−ＧＬＵエピトープの挿入は、ＭＨＣＩもＭＨＣＩＩ結合ペプチドも導入しない。ＣＤ−ＧＬＵエピトープの任意の部分を含有する重複ペプチドの結果を表１０および１１に列挙する。
【表１０】
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【表１１】
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【００５０】
実施例８．Ｆｃドメインを含有するＣＤ−ＧＬＵは、熱安定性を保持する。ＣＤ−ＧＬＵエピトープの存在または不在下でのみ異なる２つの抗体に対して、示差走査フルオロメトリーを行った。両方の抗体を、１．５５ｍｇ／ｍＬ（ＣＤ＿ＧＬＵ）または１．９７ｍｇ／ｍＬ（ＣＤ−ＷＴ）の濃度で、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ６．０中で製剤化した。熱安定性を、２５℃〜９５℃の１℃／分の温度ランプ下で示差走査フルオロメトリーによって分析した。温度変化（ｄＦｌｕｏｒ／ｄ温度、ｎｍ／℃）に対する蛍光変化の第１の誘導体プロットをプロットして、融解温度（Ｔｍｓ）を定義した。表１２に定義されるように、ＣＤ−ＷＴは３つを有し、ＣＤ−ＧＬＵは、ＩｇＧ分子の既知の融点と一致する２つの融点転移を有した。ＣＤ−ＧＬＵのＦｃドメインに対応する可能性が高い７５．２℃の融点は、ＣＤ−ＷＴで測定したものより約６度低かった。ＣＤ−ＷＴよりも低いが、観察された温度は、他の臨床的に関連する抗体で見られた温度と一致している（Ａｎｄｅｒｓｅｎら）。
【００５１】
【表１２】
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参考文献
Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＣＢ，Ｍａｎｎｏ  Ｍ，Ｒｉｓｃｈｅｌ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ａ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｇｏｖｅｒｎｓ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ＩｇＧ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｕｎｄｅｒ  ｗｅａｋ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１９：２７９−２９０．
Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９）Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．ｍＡｂｓ．１（４）：３３２−３３８．
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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