(57)【要約】  例えば、核酸増幅およびハイブリダイゼーションアッセイを使用して、ヒトサイトメガロウイルスウイルス１（ＣＭＶ（ヒトヘルペスウイルス５、ＨＨＶ５））核酸を検出または定量化するためのオリゴマーヌクレオチド、組成物、方法、キット、および使用が提供される。ＣＭＶ標的配列の多相増幅もまた記載される。オリゴマーヌクレオチド、組成物、方法、キット、および使用を使用して、ＣＭＶのＵＬ５６遺伝子を増幅および／または検出することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ５６遺伝子配列に由来する核酸の標的領域を増幅するためのキットであって、（ａ）配列番号２に存在する１９〜３１ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１９〜３１個の連続核酸塩基を含む順方向プライマーと、（ｂ）配列番号３に存在する２１〜４０ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する２１〜４０個の連続核酸塩基を含む逆方向プライマーと、を含む、キット。
【請求項２】
前記順方向プライマー、前記逆方向プライマー、または前記順方向プライマーおよび前記逆方向プライマーの両方が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、または５’−メチルシトシンを含む、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記順方向プライマーが、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１９の核酸塩基配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
前記順方向プライマーが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の核酸塩基配列を含む非プロモータープライマーである、請求項４のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
前記逆方向プライマーが、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５の核酸塩基配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７】
前記逆方向プライマーが、配列番号６、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４７の核酸塩基配列を含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、前記順方向プライマーまたは前記逆方向プライマーの５’末端に連結されている、請求項１〜４または６〜７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９】
前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、配列番号７８のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記逆方向プライマーが、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、または配列番号４６の核酸塩基配列を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記順方向プライマーが、配列番号１１を含み、前記逆方向プライマーが、配列番号２３を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
プローブオリゴマーをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
前記プローブオリゴマーが、（ａ）配列番号５１もしくは配列番号５２の核酸塩基配列を含み、１つ以上のウラシルヌクレオチドが、チミンヌクレオチドに対して置換され得るか、または（ｂ）配列番号８１にハイブリダイズする２４〜３５個の連続核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記プローブオリゴマーが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、または５’−メチルシトシンを含む、請求項１５に記載のプローブオリゴマー。
【請求項１７】
前記プローブオリゴマーが、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３９、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、または配列番号７１の核酸塩基配列を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
前記プローブオリゴマーが、検出可能な標識を含有する、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記検出可能な標識が、蛍光分子を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記蛍光分子が、前記プローブオリゴマーの５’または３’末端に結合している、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記プローブオリゴマーが、前記プローブオリゴマーの５’末端の４〜５個の核酸塩基に相補的である、前記プローブオリゴマーの３’末端に４〜５個の核酸塩基を含有する、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
蛍光分子が、前記プローブオリゴマーの５’末端に結合し、クエンチャーが、前記プローブオリゴマーの３’末端に結合するか、または蛍光分子が、前記プローブオリゴマーの３’末端に結合し、クエンチャーが、前記プローブオリゴマーの５’末端に結合する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記プローブオリゴマーが、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、または配列番号７０の核酸塩基配列を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記順方向プライマーが、配列番号１１を含み、前記逆方向プライマーが、配列番号２３を含み、前記プローブオリゴヌクレオチドが、配列番号５３を含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
配列番号２に存在する１９〜３１ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１９〜３１個の連続核酸塩基を含むヘルパーオリゴマーをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
前記ヘルパーオリゴマーが、ブロックされている、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記ヘルパーオリゴマーが、配列番号１０または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、請求項２５または２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記ヘルパーオリゴマーが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
配列番号５に存在する２１〜２５ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する２１〜２７個の連続核酸塩基を含むディスプレーサーオリゴマーをさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記ディスプレーサーオリゴマーが、配列番号１２、配列番号２５、または配列番号４１のヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記ディスプレーサーオリゴマーが、配列番号６、配列番号１２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号８６、配列番号８７、および配列番号８８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
配列番号６、配列番号８、配列番号４３、または配列番号４５のヌクレオチド配列を含む標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）をさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
前記ＴＣＯが、前記ＴＣＯの単離を可能にする部分を含有する、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記部分が、ポリＡヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記部分が、（ｄＴ）３（ｄＡ）３０を含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
前記ＴＣＯが、配列番号７、配列番号９、配列番号４２、または配列番号４４のヌクレオチド配列を含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記キットが、配列番号４２のヌクレオチド配列を含む第１のＴＣＯと、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む第２のＴＣＯと、を含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３８】
標的捕捉試薬、標的捕捉洗浄溶液、標的エンハンサー試薬、増幅試薬、酵素試薬、プロモーター試薬、ＣＭＶ陽性対照核酸、陰性対照核酸、試料輸送培地、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、緩衝液、ならびに陽性および／または陰性対照試料のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
試料に存在するヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ５６遺伝子配列に由来する核酸の標的領域を増幅するための方法であって、
（ａ）前記試料を、ＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンを増幅するように構成された順方向プライマーおよび逆方向プライマーと接触させることであって、前記順方向プライマーが、配列番号２に存在する１９〜３１ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１９〜３１個の連続核酸塩基を含み、前記逆方向プライマーが、配列番号３に存在する２１〜４０ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する２１〜４０個の連続核酸塩基を含む、接触させることと、
（ｂ）前記試料を、前記標的領域を増幅するのに十分な条件に曝露し、それにより、増幅産物を生成することと、を含む、方法。
【請求項４０】
前記順方向プライマーおよび／または前記逆方向プライマーが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、または５’−メチルシトシンを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記順方向プライマーが、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１９の核酸塩基配列を含み、前記逆方向プライマーが、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または配列番号４７の核酸塩基配列を含む、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記順方向プライマーが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の核酸塩基配列を含み、前記逆方向プライマーが、配列番号６、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４７の核酸塩基配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、前記逆方向プライマーの５’末端に連結されている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記逆方向プライマーが、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、または配列番号４６の核酸塩基配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記順方向プライマーが、配列番号１１を含み、前記逆方向プライマーが、配列番号２３を含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記増幅産物の存在または不在を検出することをさらに含む、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記増幅産物の存在または不在を検出することが、前記増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブオリゴマーを利用する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記プローブオリゴマーが、配列番号５１もしくは配列番号５２の核酸塩基配列を含み、１つ以上のウラシルヌクレオチドが、チミンヌクレオチドに対して置換され得るか、または（ｂ）配列番号８１にハイブリダイズする２４〜３５個の連続核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記プローブオリゴマーが、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３９、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、または配列番号７１の核酸塩基配列を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記プローブオリゴマーが、前記プローブオリゴマーの５’末端の４〜５個の核酸塩基に相補的である、前記プローブオリゴマーの３’末端に４〜５個の核酸塩基を含有する、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
蛍光分子が、前記プローブオリゴマーの５’末端に結合し、クエンチャーが、前記プローブオリゴマーの３’末端に結合するか、または蛍光分子が、前記プローブオリゴマーの３’末端に結合し、クエンチャーが、前記プローブオリゴマーの５’末端に結合する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記プローブオリゴマーが、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、または配列番号７０の核酸塩基配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記順方向プライマーが、配列番号１１を含み、前記逆方向プライマーが、配列番号２３を含み、前記プローブオリゴヌクレオチドが、配列番号５３を含む、請求項３９〜４４および４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記増幅することが、熱サイクリング反応を含む、請求項３９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記熱サイクリング反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記増幅することが、等温核酸増幅反応を含む、請求項３９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記等温核酸増幅反応が、転写媒介増幅（ＴＭＡ）を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記増幅することが、核酸配列ベースの増幅、レプリカーゼ媒介増幅、Ｑβ−レプリカーゼ媒介増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または鎖置換増幅（ＳＤＡ）を含む、請求項３９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記増幅されたＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンの存在または不在を検出することが、前記増幅されたＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンを定量化することをさらに含む、請求項４７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記増幅されたＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンを定量化することが、前記ＣＭＶアンプリコンの産生を監視することを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
検出することおよび／または定量化することが、リアルタイムで分析される、請求項４７〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
試料中のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ５６遺伝子標的核酸配列を定量化する方法であって、
（ａ）前記試料を、配列番号４３または配列番号４５の核酸塩基配列を含む少なくとも１つの標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）および配列番号４７の核酸塩基配列を含む第１のプロモータープライマーと、前記ＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子標的核酸配列への前記少なくとも１つのＴＣＯおよび第１のプロモータープライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させ、それにより、前記少なくとも１つのＴＣＯおよび前記第１のプロモータープライマーの各々にハイブリダイズした標的核酸配列を含む前増幅ハイブリッドを生成することと、
（ｂ）固体支持体への標的捕捉およびそれに続く洗浄によって前記前増幅ハイブリッドを単離して、ステップ（ａ）で前記ＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子標的核酸配列にハイブリダイズしなかった前記第１のプロモータープライマーのいずれも除去することと、
（ｃ）第１相の実質的に等温の転写関連増幅反応において、その線形増幅は支持するが、その指数関数的増幅は支持しない条件下で、配列番号１９の核酸塩基配列を含む非プロモータープライマーを含む第１相の増幅反応混合物中で、ステップ（ｂ）で単離された前記前増幅ハイブリッドの前記ＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅し、それにより、第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすことであって、前記第１の増幅産物が、前記第１相の実質的に等温の転写関連増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない、もたらすことと、
（ｄ）前記第１の増幅産物を、配列番号４７の核酸塩基配列を含む第２のプロモータープライマーおよび配列番号５７の核酸塩基配列を含むプローブオリゴマーを含む第２相の増幅反応混合物と組み合わせ、前記第２相の増幅反応混合物中の第２相の実質的に等温の転写関連増幅反応において、前記第１の増幅産物の指数関数的増幅を実施し、それにより、第２の増幅産物を合成することと、
（ｆ）一定の時間間隔で前記プローブオリゴマーを用いて、前記第２相の増幅反応混合物中の前記第２の増幅産物の合成を検出することと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の結果を使用して、前記試料中の前記標的核酸配列を定量化することと、を含む、方法。
【請求項６４】
前記少なくとも１つのＴＣＯが、配列番号４３の核酸塩基配列を含む第１のＴＣＯと、配列番号４５の核酸塩基配列を含む第２のＴＣＯと、を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１および第２のプロモータープライマーが各々、ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列を含む、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記固体支持体が、固定化捕捉プローブを含む、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記固体支持体が、磁気的に引き付け可能な粒子を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１相および第２相の等温転写関連増幅反応の前記各々が、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含み、前記逆転写酵素が、内因性ＲＮａｓｅＨ活性を含む、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ステップ（ｃ）の前記第１の増幅産物が、前記試料中の前記標的核酸配列と同じ極性を有するｃＤＮＡ分子であり、ステップ（ｄ）の前記第２の増幅産物が、ＲＮＡ分子である、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
ステップ（ｄ）の前記プローブオリゴマーが、前記第２の増幅産物にハイブリダイズするときに検出可能なシグナルを生成する立体配置高感度プローブである、請求項６３〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
ステップ（ｄ）の前記プローブオリゴマーが、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである、請求項６３〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１のＴＣＯが、配列番号４２の核酸塩基配列を含み、前記第２のＴＣＯが、配列番号４４の核酸塩基配列を含み、前記第１および第２のプロモータープライマーが各々、配列番号４６の核酸塩基配列を含み、前記プローブオリゴマーが、配列番号５６の核酸塩基配列を含む、請求項６４〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１相の増幅反応混合物および／または第２相の増幅反応混合物が、ヘルパーオリゴマーおよび／またはディスプレーサーオリゴマーをさらに含む、請求項６３〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ヘルパーオリゴマーが、１９〜３１核酸塩基長であり、配列番号１４の核酸塩基配列を含み、前記ディスプレーサーオリゴマーが、２１〜２７核酸塩基長であり、配列番号４１の核酸塩基配列を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ヘルパーオリゴマー、前記ディスプレーサーオリゴマー、または前記ヘルパーオリゴマーおよび前記ディスプレーサーオリゴマーの両方が、ブロックされている、請求項７４または７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７２０，６５８号に対する優先権を主張し、この特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
出願された５３５３７２＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記述された配列表は、サイズが１７キロバイトであり、２０１９年８月２１日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ、ヒトヘルペスウイルス５（ＨＨＶ５）とも呼ばれる）は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を含むウイルスのより大きなファミリーの一部である。ＣＭＶは、ヒトにおける感染を引き起こす、エンベロープ化した二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＣＭＶは、ほぼ全ての人に感染し得る一般的なウイルスである。それは、非常に一般的であるため、発展途上国のほぼ全ての成人および米国の成人の５０％〜８５％が感染している。ＣＭＶは、血液、唾液、尿、精液、膣液、および母乳などの体液を通して人から人へ伝播する。他のヘルペスウイルスと同様に、ＣＭＶは、断続的に再活性化し得る生涯にわたる潜伏を確立する。治療法は、存在しない。免疫適格性宿主では、ＣＭＶ感染は一般に、無症候性かつ自己限定的である。
【０００４】
ＣＭＶ感染は、妊娠中の女性、乳児、および免疫低下個体における懸念の原因である。妊娠中の活性ＣＭＶ感染は、ウイルスを乳児に感染させる可能性がある。特に臓器移植のために免疫が低下した人々にとって、ＣＭＶ感染は、罹患率および死亡率の重要な原因である。しかしながら、薬物治療が、新生児および免疫系が弱い人々の治療に役立つ可能性がある。
【０００５】
実質臓器移植（ＳＯＴ）レシピエントでは、ドナー（Ｄ）臓器からレシピエント（Ｒ）に伝染したＣＭＶは、ＣＭＶ血清陰性ＳＯＴレシピエント（Ｒ−）において一次感染、またはＣＭＶ血清陽性ＳＯＴレシピエント（Ｒ＋）において再感染を引き起こす可能性がある。Ｄ−／Ｒ＋ＳＯＴレシピエントでは、免疫抑制によるＣＭＶ特異的免疫の障害は、内因性潜伏ＣＭＶの再活性化をもたらし得る。Ｄ−／Ｒ＋ＳＯＴレシピエントは、既存の宿主免疫を欠如しているため、彼らは、ＣＭＶ疾患を発症するリスクが高いが、Ｒ＋レシピエントは、中リスク群を成す（Ｒａｚｏｎａｂｌｅ２０１３）。一度感染すると、ＣＭＶは、その生涯にわたる潜伏に対する傾向のために、身体から根絶することができない。したがって、ＳＯＴ患者におけるＣＭＶ療法の目標は、ウイルス複製の抑制によって、移植片に対するＣＭＶ感染の間接的な影響および／またはＣＭＶ疾患の発症を予防することである。ウイルス負荷試験は、ＣＭＶ感染による活性疾患を診断するための主要な方法であり、移植レシピエントのケアにおける日常的な構成要素となっている（Ｒｙｃｈｅｒｔ  Ｊ．，ｅｔ．ａｌ２０１４）。
【０００６】
妊娠中の女性、および免疫が低下した者または弱まった者では、試験が重要である。現在の診断試験は、抗ＣＭＶ抗体を探す。しかしながら、そのような試験は、正確さのために多数の試験を必要とし、個人は、症候性でなければならない。追加の診断試験には、培養、ＰＣＲ、およびＣＭＶ  ｐｐ６５抗原血症アッセイが含まれる。末梢血中のＣＭＶ感染白血球の数を定量化するＣＭＶ  ｐｐ６５抗原血症アッセイは、免疫低下患者におけるＣＭＶ感染の検出および監視に使用されている。
【０００７】
したがって、ＣＭＶの高感度かつ特異的な検出および定量化を可能にする組成物および方法に対するニーズが存在する。本開示は、これらのニーズを満たすこと、他の利益を提供すること、または少なくとも公衆に有用な選択を提供することを目的としる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
試料中のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を検出および／もしくは定量化するため、またはＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子配列を増幅するための増幅オリゴマー、核酸、方法、組成物、およびキットが記載される。増幅オリゴマーには、順方向プライマー、逆方向プライマー、プロモータープライマー（例えば、Ｔ７プライマー）、非プロモータープライマー（例えば、ＮＴ７プライマー）、ヘルパーオリゴマー、およびディスプレーサーオリゴマーが挙げられる。増幅された配列の検出、および試料からのＣＭＶヌクレオチド配列の単離をそれぞれ促進する、プローブオリゴマーおよび標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）がさらに記載される。本方法は、ウイルス核酸を増幅して、試料中のＣＭＶ標的配列を検出することを伴う。本方法は、高感度の検出ＣＭＶを有利に提供することができる。
【０００９】
増幅オリゴマーは、当該技術分野で既知の任意の核酸増幅方法を使用する、ＣＭＶ配列の増幅、検出、および／または定量化に使用することができる。核酸増幅方法は、熱サイクリングを使用してもよいか、またはそれらは、等温であってもよい。当該技術分野で既知の核酸増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、レプリカーゼ媒介増幅（Ｑβ−レプリカーゼ媒介増幅を含む）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、等温転写関連増幅、および多相等温転写関連増幅があげられるが、これらに限定されない。
【００１０】
記載の増幅オリゴマーを使用して、ＣＭＶ配列を増幅することができる。増幅されたＣＭＶ配列であるアンプリコンは、配列番号１の全部もしくは一部分、および／またはその相補体を含む。増幅オリゴマーは、配列番号１の全部もしくは一部分、および／またはその相補体を含むＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子アンプリコンを増幅し、それを任意選択的に検出するように構成される。いくつかの実施形態では、アンプリコンは、配列番号５１および／もしくはその相補体ならびに／または配列番号５３および／もしくはその相補体を含む。アンプリコンは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。当該技術分野の様々な方法を使用して、ＣＭＶアンプリコンを検出することができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、順方向プライマーまたは非プロモータープライマーは、配列番号２に存在するヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する１９〜３１個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、非プロモータープライマーは、プロモータープライマー末端の下流で、プロモータープライマーの伸長のｃＤＮＡ産物中のその標的配列に特異的に結合する増幅オリゴヌクレオチドである。プロモータープライマーは、非プロモータープライマーと組み合わされて、増幅対を形成し、一緒に標的核酸の一部分を増幅するように構成される。いくつかの実施形態では、順方向プライマーまたは非プロモータープライマーは、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。順方向プライマーまたは非プロモータープライマーは、配列番号７９にハイブリダイズし、ＤＮＡまたはＲＮＡの重合を開始することができる。例示的な順方向プライマーおよび非プロモータープライマーを、表１Ｂに提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、逆方向プライマーまたはプロモータープライマーは、配列番号３に存在するヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する２１〜４０個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、逆方向プライマーまたはプロモータープライマーは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または配列番号４７のヌクレオチド配列を含む。逆方向プライマーまたはプロモータープライマーは、配列番号８０にハイブリダイズし、ＤＮＡまたはＲＮＡの重合を開始することができる。例示的な逆方向プライマーおよびプロモータープライマーを、表１Ｂに提供する。
【００１３】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を、記載の順方向および／または逆方向プライマーのいずれかに付加して、プロモータープライマーを形成することができる。ＲＮＡポリメラーゼプライマー配列は、記載の順方向または逆方向プライマーの５’末端に機能的に連結される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、逆方向プライマーの５’末端に連結されている。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり得るが、これに限定されない。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、配列番号７８のヌクレオチド配列を含有することができる。Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列を有するプロモータープライマーは、Ｔ７プライマーと称される。いくつかの実施形態では、プロモータープライマーまたはＴ７プライマーは、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、または配列番号４６のヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーは、鋳型ヌクレオチド配列への順方向プライマーのハイブリダイゼーションを促進または増強する。同様に、いくつかの実施形態では、ディスプレーサーオリゴマーは、鋳型核酸配列への逆方向プライマーのハイブリダイゼーションを促進または増強する。例示的なヘルパーおよびディスプレーサーオリゴマーを、表１Ｂに提供する。鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションの促進または増強は、標的ヌクレオチド配列の増幅を促進または増強することができる。順方向および／または逆方向プライマーのハイブリダイゼーションの促進に使用される場合、ヘルパーオリゴマーおよびディスプレーサーオリゴマーは、ブロックされ得る。ブロックされると、ヘルパーまたはディスプレーサーオリゴマーは、その３’末端から重合をプライミングすることができない。いくつかの実施形態では、ヘルパーおよび／またはディスプレーサーオリゴマーは、順方向プライマーまたは逆方向プライマーであり得る。いくつかの実施形態では、記載のヘルパーおよび／またはディスプレーサーオリゴマーは、ヘルパーまたはディスプレーサーオリゴマーの５’末端に連結して、プロモータープライマーを形成する、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーは、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９を含む。いくつかの実施形態では、ディスプレーサーオリゴマーは、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号６、配列番号４１、または配列番号１２を含む。例示的なヘルパーオリゴマーおよびディスプレーサーオリゴマーを、表１Ｂに提供する。
【００１５】
記載のプローブオリゴマー（検出オリゴマーとも呼ばれる）を使用して、ＣＭＶアンプリコンを検出することができる。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号４に存在するヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する２４〜３５個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号８１にハイブリダイズする２４〜３５個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号５１、配列番号５２、または配列番号５７のヌクレオチド配列を含み、１つ以上のウラシルヌクレオチドを、チミンヌクレオチドに対して置換することができる。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、ヘアピンを含有する。ヘアピンは、プローブオリゴマーの５’および３’末端に互いに相補的な４〜５個の核酸塩基を含むことができる。例示的なプローブオリゴマーを、表１Ｃに提供する。プローブオリゴマーは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを有し得る。記載のプローブオリゴマーのいずれについても、プローブオリゴマー中の１つ以上のヌクレオチドを、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとの組み合わせに対して置換することができる。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、ウリジンに対して置換された１、２、３、４、５、６、７以上のチミジンを有し得る。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマー中の全てのチミジンを、ウリジンに対して置換することができる。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、チミジンに対して置換された１、２、３、４、５、６、７以上のウリジンを有し得る。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマー中の全てのウリジンを、チミジンに対して置換することができる。いくつかの実施形態では、ウリジンのうちの１つ以上は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ウリジンの全てが、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。
【００１６】
プローブオリゴマーは、１つ以上の検出可能なマーカーまたは標識を含有することができる。検出可能なマーカーは、蛍光分子であり得るが、これに限定されない。蛍光分子は、プローブオリゴマーの５’もしくは３’末端、またはオリゴマーに沿った任意の場所に結合することができる。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、分子ビーコンまたはトーチであり得る。プローブオリゴマーは、プローブオリゴマーの５’末端に結合した蛍光分子およびプローブオリゴマーの３’末端に結合したクエンチャーを含有することができるか、または蛍光分子は、プローブオリゴマーの３’末端に結合することができ、クエンチャーは、プローブオリゴマーの５’末端に結合することができる。
【００１７】
記載の標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）を使用して、試料から標的ＣＭＶ配列を捕捉または単離することができる。ＣＭＶ  ＴＣＯは、ＣＭＶ内の標的ヌクレオチド配列の領域にハイブリダイズする（すなわち、相補的である）標的特異的（ＴＳ）ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＯ  ＴＳ配列は、標的核酸に存在するヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の相補性を有する１０〜３５ヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列内の領域（ＴＣＯ結合部位）にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ＴＣＯ  ＴＳ配列は、２０〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＴＣＯ  ＴＳ配列は、２２〜２６ヌクレオチド長であり、標的核酸に存在するヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相補性を有する。ＴＣＯ  ＴＳおよびＴＣＯ結合部位は、完全に相補的であっても、１つ以上のミスマッチが存在してもよい。ＴＣＯは、（例えば、特異的結合対相互作用によって）固定化捕捉プローブに結合する固定化捕捉プローブ結合領域を含む。特異的結合対（または結合パートナー）のメンバーは、互いを特異的に認識し、互いに結合する部分である。メンバーは、第１の結合対メンバー（ＢＰＭ１）および第２の結合対メンバー（ＢＰＭ２）と称されることがあり、これらは、一緒に特異的に結合する様々な部分を表す。特異的結合対は、例えば、受容体およびそのリガンド、酵素およびその基質、補因子または補酵素、抗体またはＦａｂ断片およびその抗原またはリガンド、糖およびレクチン、ビオチンおよびストレプタビジンまたはアビジン、リガンドおよびキレート剤、タンパク質またはアミノ酸およびその特異的結合金属（ヒスチジンおよびニッケルなど）、完全にまたは部分的に相補的な配列を含む実質的に相補的なポリヌクレオチド配列、ならびに相補的なホモポリマー配列によって例証される。特異的結合対は、天然に存在するもの（例えば、酵素および基質）、合成のもの（例えば、合成受容体および合成リガンド）、または天然に存在するＢＰＭと合成ＢＰＭとの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＳ配列および固定化捕捉プローブ結合領域は両方とも、核酸配列である。ＴＳ配列および捕捉プローブ結合領域は、互いに共有結合していても、１つ以上のリンカーによって結合された異なるオリゴヌクレオチド上にあってもよい。いくつかの実施形態では、捕捉プローブ結合領域は、ポリＡ配列、ポリＴ配列、またはポリＴ−ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＴ−ポリＡ配列は、（ｄＴ）３（ｄＡ）３０を含む。１つ以上のＴＣＯを、標的捕捉および／または増幅反応に使用してもよい。１つ以上のＴＣＯは、同じ標的配列に結合しても、異なる標的配列に結合してもよい。標的配列は、同じ遺伝子に由来しても、異なる遺伝子に由来してもよく、かつ／または同じ生物に由来しても異なる生物に由来してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ  ＴＣＯは、配列番号６、配列番号８、配列番号４３、もしくは配列番号４５のヌクレオチド配列、または配列番号６、配列番号８、配列番号４３、もしくは配列番号４５と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列を含有するＣＭＶ  ＴＣＯは、配列番号７、配列番号９、配列番号４２、もしくは配列番号４４、または配列番号７、配列番号９、配列番号４２、もしくは配列番号４４と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。例示的なプローブオリゴマーを、表１Ｄに提供する。ＴＣＯは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを有し得る。記載のＴＣＯのいずれかついても、ＴＣＯ中の１つ以上のシチジンを、５’−メチルｄＣに対して置換することができる。ＴＣＯは、５’−メチルｄＣに対して置換された１、２、３、４、５、６、７以上のシチジンを有し得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＯ中の全てのシチジンを、５’−メチルｄＣに対して置換することができる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、増幅オリゴマー、検出オリゴマー、またはＴＣＯは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含有する。オリゴマーは、１、２、３、４、５、６、７、８以上の修飾ヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの５０％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または１００％が修飾される。修飾ヌクレオチドには、修飾核酸塩基を有するヌクレオチドが含まれる。修飾核酸塩基には、合成および天然の核酸塩基、５−置換ピリミジン、５’−メチルシトシン、６−アザピリミジン、Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンが挙げられるが、これらに限定されない。修飾ヌクレオチドには、（２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、および２’−フルオロヌクレオチドなどの２’−ハロゲンヌクレオチドを含むがこれらに限定されない）２’修飾ヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、修飾塩基を有するヌクレオチドも含まれる。修飾ヌクレオチドには、ホスホロチオエート結合などであるがこれに限定されない、修飾結合を有するヌクレオチドも含まれる。いくつかの実施形態では、増幅オリゴマーは、２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。２つ以上の修飾ヌクレオチドは、同じ修飾を有しても、異なる修飾を有してもよい。いくつかの実施形態では、記載のオリゴマーのいずれも、１つ以上の５’−メチルシトシンを含有することができる。オリゴマーは、１、２、３、４、５以上の５’−メチルシトシンを有し得る。いくつかの実施形態では、記載のオリゴマー中の全てのシトシンヌクレオチドが、５’−メチルシトシン修飾ヌクレオチドである。いくつかのオリゴマーでは、５’−メチル−２’デオキシシトシン塩基を使用して、対応する非メチル化オリゴマーと比較して、オリゴマーに組み込まれた各５’メチル−２’デオキシシトシンのＴｍを約０．５℃〜１．３℃上げることによって、二本鎖の安定性を増加させることができる。
【００１９】
記載の増幅オリゴマーを使用して、ＣＭＶ  ＵＬ５６配列を増幅することができる。いくつかの実施形態では、記載の増幅オリゴマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの熱サイクリング反応を使用してＣＭＶ  ＵＬ５６配列を増幅することができる。いくつかの実施形態では、記載の増幅オリゴマーを使用して、転写媒介増幅（ＴＭＡ）などの等温反応を使用してＣＭＶ  ＵＬ５６配列を増幅することができる。転写媒介増幅は、単相または多相（例えば、二相性）であり得る。記載の増幅オリゴマーを利用することができる他の核酸増幅方法には、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、レプリカーゼ媒介増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。順方向またはヘルパーオリゴマーは、逆方向またはディスプレーサーオリゴマーと組み合わされて、増幅対を形成する。記載の順方向またはヘルパーオリゴマーのいずれも、記載の逆方向またはディスプレーサーオリゴマーのいずれかと組み合わされて、増幅対を形成することができる。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマー（順方向プライマー）および第２の増幅オリゴマー（逆方向プライマー）は、少なくとも約５６、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、または少なくとも約９５ヌクレオチド長のＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンを増幅するように構成される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、記載のオリゴマーは、単相または多相（例えば、二相性）転写媒介増幅に使用することができる。多相増幅では、標的核酸配列の少なくとも一部分を、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持しない条件下で第１相の増幅反応に供する。第１相の増幅反応は、第１の増幅産物を生成し、これを、その後に第１の増幅産物の指数関数的増幅を可能にする条件下で第２相の増幅反応に供し、それにより、第２の増幅産物を生成する。多相増幅は、単相形式と比較して、分析物濃度の下限で改善された感度および精度をもたらす。多相増幅は、改善された精度をもたらし、検出時間を短縮することができる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＣＭＶ標的核酸配列の多相増幅は、
ａ）ＣＭＶ標的核酸配列を含有するか、または含有することが疑われる試料を、標的捕捉混合物と接触させることであって、標的捕捉混合物が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴヌクレオチド（プロモータープライマー）、ならびに任意選択的に標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）および／またはディスプレーサーオリゴマーを含んで、前増幅ハイブリッドを形成する、接触させることと、
ｂ）前増幅ハイブリッドを単離することと、
ｃ）前増幅ハイブリッドを第１相の増幅混合物と接触させることであって、第１相の増幅混合物が、非ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴヌクレオチド（非プロモータープライマー）、任意選択的にヘルパーオリゴマー、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、およびＮＴＰを含み、第１相の増幅混合物が、指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を欠如している、接触させることと、
ｄ）実質的に等温の転写関連増幅反応において、線形増幅を支持して、第１の増幅産物を形成する条件下で、前増幅ハイブリッドの標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅することと、
ｅ）第１の増幅産物を第２相の増幅混合物と接触させることであって、第２相の増幅混合物が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴヌクレオチド、または第１相の増幅混合物に欠如している指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を含む、接触させることと、
ｆ）実質的に等温の転写関連増幅反応において、第１の増幅産物を指数関数的に増幅して、第２の増幅産物を生成することと、
ｇ）第２の増幅産物を検出することとを含む。
いくつかの実施形態では、第２相増幅混合物は、検出オリゴマーを含有する。いくつかの実施形態では、オリゴマーのいずれかのうちの１つ以上を、反応に使用してもよい。例えば、１つ以上のＴＣＯ、１つ以上のプロモータープライマー、１つ以上の非プロモータープライマー、１つ以上のディスプレーサーオリゴマー、１つ以上のヘルパーオリゴマー、および／または１つ以上のプローブオリゴマーである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前増幅ハイブリッドは、プロモータープライマーにハイブリダイズした標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、前増幅ハイブリッドは、１つ以上のＴＣＯおよびプロモータープライマーにハイブリダイズした標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、前増幅ハイブリッドは、１つ以上のＴＣＯ、プロモータープライマー、および任意選択的にディスプレーサーオリゴマーにハイブリダイズした標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、前増幅ハイブリッドを単離することは、固体支持体を使用して前増幅ハイブリッドを捕捉することを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、固定化捕捉プローブを含む。固体支持体は、磁気的に引き付け可能な粒子であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、前増幅ハイブリッドを単離することは、標的核酸にハイブリダイズしていないプロモータープライマーを除去することを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、第１相の等温転写関連増幅反応中、標的核酸を鋳型として使用して、その標的配列の標的核酸に特異的に結合したプロモータープライマーを逆転写酵素（ＲＴ）によって伸長させて、ｃＤＮＡコピーを作製する。次いで、ｃＤＮＡを鋳型として使用して、非プロモータープライマーを酵素的に伸長させて、二本鎖ＤＮＡを生成する。次に、二本鎖ＤＮＡは、プロモータープライマーによって提供されるＲＮＡポリメラーゼプロモーターからのＲＮＡ転写の鋳型として機能する。次いで、非プロモータープライマーは、ＲＮＡに結合し、逆転写酵素によって伸長されて、第１の増幅産物をもたらす。追加のプロモータープライマーの不在下では、指数関数的増幅は生じない。次いで、第１の増幅産物を第２相の増幅混合物と接触させて、指数関数的な第２相の増幅を開始する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第１相および第２相の等温転写関連増幅反応の各々は、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含む。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、内因性ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＣＭＶの多相増幅の第１相の増幅に使用するのに好適な組成物は、（ａ）任意選択的なＴＣＯ、（ｂ）ＣＭＶ標的核酸配列の第１の部分にハイブリダイズしたプロモータープライマー、（ｃ）任意選択的にＣＭＶ標的核酸配列の一部分にハイブリダイズしたディスプレーサーオリゴマー、（ｄ）非プロモータープライマー、（ｅ）任意選択的にヘルパーオリゴマー、および（ｆ）線形第１相の増幅反応中の標的核酸の増幅に必要であるが、標的核酸配列の指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を欠如している追加の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を欠如しているのは、追加の（遊離）プロモータープライマーである。いくつかの実施形態では、第１相の増幅は、前増幅ハイブリッド中の標的核酸にハイブリダイズしていないプロモータープライマーを欠如している。追加の構成要素には、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、緩衝液、および塩のうちの１つ以上が含まれ得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＣＭＶの多相増幅の第２相またはその後の相の増幅に使用するのに好適な組成物は、（ａ）第１の増幅産物、（ｂ）プロモータープライマー、（ｃ）非プロモータープライマー、（ｄ）指数関数的な第２相の増幅反応中の標的核酸の増幅に必要な他の必要な構成要素を含む。追加の構成要素には、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリマー、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、緩衝液、および塩の１つ以上が含まれ得る。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＣＭＶの多相増幅および／または検出のための方法であって、
（ａ）標的核酸配列の第１の部分へのプロモータープライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、ＣＭＶ標的核酸を含有するか、または含有することが疑われる試料を、標的核酸配列の第１の部分に特異的なプロモータープライマーと接触させ、それにより、プロモータープライマーおよび標的核酸配列を含む前増幅ハイブリッドを生成することと、
（ｂ）固体支持体への標的捕捉およびそれに続く洗浄によって前増幅ハイブリッドを単離して、ステップ（ａ）で標的核酸配列の第１の部分にハイブリダイズしなかったプロモータープライマーのいずれも除去することと、
（ｃ）第１相の実質的に等温の転写関連増幅反応において、その線形増幅は支持するが、その指数関数的増幅は支持しない（すなわち、第１相の増幅反応混合物が、第１の増幅産物の指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素を欠如している）条件下で、ステップ（ｂ）で単離された前増幅ハイブリッドの標的核酸配列の少なくとも一部分を、第１相の増幅反応混合物中で、増幅し、それにより、第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすことと、
（ｄ）第１の増幅産物を含む反応混合物を、第１の増幅産物の指数関数的増幅に必要であるが、第１の増幅産物を含む反応混合物には欠如している少なくとも１つの構成要素と組み合わせて、第２相の増幅反応混合物を生成することと、
（ｅ）実質的に等温の転写関連増幅反応において、第２相の増幅混合物中の第１の増幅産物を指数関数的に増幅して、第２の増幅産物を生成することと、
（ｆ）任意選択的に第２の増幅産物を検出することとを含む、方法が記載される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、第１の増幅産物の指数関数的増幅に必要な少なくとも１つの構成要素は、プライマープロモーター（例えば、標的核酸とハイブリダイズし、前増幅ハイブリッドの一部として単離したプロモータープライマーに加えて、プロモータープライマー）を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）の第１の増幅産物は、試料中の標的核酸配列と同じ極性を有するｃＤＮＡ分子であり、ステップ（ｅ）の第２の増幅産物は、ＲＮＡ分子である。第２の増幅産物は、配列特異的検出プローブを使用して検出することができる。配列特異的検出プローブは、第２の増幅産物にハイブリダイズするときに検出可能なシグナルを生成する立体配置高感度プローブであり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ステップ（ｆ）の配列特異的検出プローブは、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである。検出することは、一定の時間間隔で実施することができる。いくつかの実施形態では、検出することは、リアルタイムで実施される。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物を検出することは、線形検量線を使用して試料中の標的核酸配列を定量化することを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、標的エンハンサー試薬（ＴＥＲ）は、ＴＣＯまたは標的捕捉混合物の添加前に試料に添加される。いくつかの実施形態では、ＴＥＲは、１．６８Ｍの水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）を含む。試料と組み合わせるＴＥＲの量は、経験的に決定することができる。ＴＥＲを添加して、５０〜３５０ｍＭの試料中の最終ＬｉＯＨ濃度を提供することができる。試料をＴＥＲに添加しても、ＴＥＲを試料に添加してもよい。
【００３０】
ＣＭＶを増幅、検出、および／または定量化するための組成物およびキットが記載される。いくつかの実施形態では、記載の組成物およびキットは、直接的、迅速、特異的、および／または高感度のＣＭＶ検出を提供する。組成物およびキットは、記載の増幅オリゴマー、プローブオリゴマー、および／またはＴＣＯのうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物またはキットは、少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つの逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物またはキットは、少なくとも１つのＮＴ７プライマーおよび少なくとも１つのＴ７プライマーを含む。組成物またはキットは、少なくとも１つのプローブオリゴマーをさらに含むことができる。組成物またはキットは、少なくとも１つのＴＣＯをさらに含むことができる。組成物またはキットは、１つ以上のヘルパーオリゴマーおよび／またはディスプレーサーオリゴマーをさらに含むことができる。組成物またはキットは、捕捉ビーズ、標的捕捉試薬、標的捕捉洗浄溶液、標的エンハンサー試薬、増幅試薬（凍結乾燥ペレット）、増幅試薬再構成溶液、酵素試薬（凍結乾燥ペレット）、酵素試薬再構成溶液、プロモーター試薬（凍結乾燥ペレット）、プロモーター試薬再構成溶液、陽性キャリブレーター、ＣＭＶ陽性対照核酸、陰性対照核酸、ヌクレオチド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、試料輸送培地、および使用説明書のうちのいずれか１つ以上をさらに含むことができる。
【００３１】
標的ＣＭＶ配列を増幅、検出、および／または定量化するための方法であって、ＣＭＶを含有するか、または含有することが疑われる試料を、少なくとも２つの増幅オリゴマーと接触させて、ＣＭＶの標的領域を増幅するステップを含み、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、各々がＣＭＶのＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズする上記の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む、方法が記載される。インビトロ核酸増幅反応であって、試料に存在するＣＭＶ標的核酸が、増幅産物を生成するための鋳型として使用される、反応が実施される。いくつかの実施形態では、順方向および逆方向プライマーは各々、配列番号１またはその相補体にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、順方向および逆方向プライマーは、配列番号５１またはその相補体を含むアンプリコンを増幅する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本方法は、増幅産物の存在または不在を検出し、それにより、試料中のＣＭＶの存在または不在を示すことをさらに含む。増幅産物は、プローブオリゴマーを使用して検出される。記載のプローブオリゴマーを増幅反応において使用して、試料中のＣＭＶを検出および／または定量化することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、試料中のＣＭＶの定量化を使用して、実質臓器移植レシピエントの管理を助けることができる。抗ＣＭＶ療法を受けている患者では、連続ＣＭＶ  ＤＮＡ測定を使用して、治療に対するウイルス応答を評価することができる。ＣＭＶウイルス負荷情報を使用して、移植患者におけるＣＭＶ疾患を診断することもできる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、記載のオリゴヌクレオチド、組成物、および方法は、多重多相反応におけるＣＭＶの増幅および／または検出に使用するのに好適である。多重多相反応を使用して、ＣＭＶならびに１つ以上の他の標的配列および／または生物を検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
Ａ．定義
本教示を詳細に記載する前に、本開示が特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、それらは変化し得ることを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つのオリゴマー」への言及は、複数のオリゴマーなどを含む。接続詞「または」は、包括的な意味が文脈において不当でない限り、包括的な意味で、すなわち、「および／または」と同等であると解釈されるべきである。
【００３６】
本明細書において参照される特許、出願、公開出願、および他の刊行物は全て、それらの全体が参照によって組み込まれる。この節に記載されている定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願、および他の刊行物に記載されている定義に反するか、またはそうでなければ矛盾する場合、この節に記載されている定義が、参照により本明細書に組み込まれる定義に優先する。
【００３７】
文脈から別に明らかでない限り、本発明の任意の要素、実施形態、ステップ、特徴、または態様は、任意の他のものと組み合わせて実施することができる。
【００３８】
わずかかつごくわずかな偏差が本明細書の教示の範囲内であるように、本開示で考察される温度、濃度、時間などの前には黙示的な「約」が存在することが理解される。一般に、「約」という用語は、組成物の活性または安定性に有意な影響を及ぼさない組成物の構成要素の量のごくわずかな変動を示す。全ての範囲は、「終点を含まない」などの明示的な除外がない場合には終点を包含すると解釈されるべきである。したがって、例えば、「１０〜１５以内」には１０および１５の値が含まれる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定を意図するものではない。上記の概要および詳細な説明は両方とも、例示的かつ説明的なものにすぎず、教示を限定するものではないことを理解されたい。参照により組み込まれるいかなる資料の範囲も本開示の明示的内容と矛盾する限りにおいて、明示的内容が優先する。
【００３９】
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、近似の言語を適用して、それが関連する基本的な機能の変化をもたらすことなく許容できる程度に変化する可能性のある任意の定量的または定性的表現を修飾することができる。したがって、「約」または「およそ」などの用語によって修飾された値は、特定の正確な値に限定されるものではなく、特定の値とは異なる値を含み得る。いくつかの実施形態では、約またはおよそは、わずかな変動および／または５％未満の変動を示す。
【００４０】
特に記述がない限り、様々な構成要素を「含むこと」を列挙する本明細書中の実施形態は、列挙された構成要素「からなる」または「から本質的になる」とも企図され、様々な構成要素「からなること」を列挙する本明細書中の実施形態は、列挙された構成要素「を含む」または「から本質的になる」とも企図され、また様々な構成要素「から本質的になること」を列挙する本明細書中の実施形態は、列挙された構成要素「からなる」または「を含む」とも企図される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「から本質的になる」は、本明細書に記載の組成物および方法の基本的かつ新規の特徴を実質的に変化させない追加の構成要素（複数可）、組成物（複数可）、または方法ステップ（複数可）が、それらの組成物または方法に含まれ得ることを意味する。そのような特徴には、ＣＭＶ核酸を他の既知の病原体から区別する特異性で、任意選択的に検出される増幅されたウイルス配列を作製する増幅反応の開始から約４５分以内に約１〜１００コピーのウイルスを検出することができる感度で、試料に存在するＣＭＶ核酸配列を検出する能力が含まれる。
【００４１】
「試料」、「検体」、「生物学的試料」、「生物学的検体」、「臨床試料」、または「臨床検体」は、対象となる分析物、例えば、微生物、ウイルス、遺伝子などの核酸（例えば、標的核酸）、または分析物中の核酸配列もしくは分析物に由来する核酸配列を含むその構成要素を含有するか、または含有することが疑われる任意の試料である。「試料」は、ＣＭＶ、または核酸もしくは核酸の断片などのその構成要素を含有するものであっても、または含有することが疑われるものであってもよい。試料は、生物学的検体、臨床検体、および環境源などであるがこれらに限定されない、任意の源に由来するものであり得る。試料は、構成要素の複雑な混合物であり得る。試料には、例えば、血液、血漿、血清、血液細胞、唾液、および粘膜、（中枢神経系のＣＭＶ感染を診断するための）脳脊髄液を含む、生きたまたは死んだ哺乳動物または生物に由来する任意の組織または材料を含む「生物学的試料」、ならびに生殖器病変、肛門生殖器病変、口腔病変、粘膜皮膚病変、皮膚病変、および眼病変、またはそれらの組み合わせからの、またはそれらに由来する生検などの試料が含まれる。生物学的試料には、呼吸器組織、滲出液（例えば、気管支肺胞洗浄液）、痰、気管吸引液、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、泌尿生殖器液、および生検細胞または組織も含まれるが、これらに限定されない。試料は、例えば、培養培地中の細胞および組織の成長から生じる馴化培地を含む、インビトロ細胞培養成分の試料も含んでもよい。組織または細胞構造を物理的または機械的に破壊して、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などを含有し得る溶液中に細胞内核酸を放出するように試料を処理して、分析用試料を調製してもよい。環境試料の例には、水、氷、土壌、スラリー、破片、バイオフィルム、大気粒子、およびエアロゾルが含まれるが、これらに限定されない。試料は、例えば、培養培地中の細胞および組織の成長から生じる馴化培地を含む、インビトロ細胞培養成分の試料も含んでもよい。試料は、濾過、遠心分離、沈降、またはマトリックスもしくは支持体などの培地への付着を使用することによって試料を処理することから得られるもののような、処理された検体または材料であってもよい。試料の他の処理には、組織、細胞凝集体、または細胞を物理的または機械的に破壊して、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などの他の構成要素を含有し得る溶液中に核酸を含む細胞内構成要素を放出するための処理が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４２】
「接触させること」という用語は、２つ以上の構成要素を一緒にすることを意味する。接触させることは、全ての構成要素を流体または半流体混合物中で混合することによって達成することができる。接触させることは、１つ以上の構成要素が、固体組織切片または基板などの固体表面上の１つ以上の他の構成要素と物理的に接触するときに達成することができる。
【００４３】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、一緒に連結されて、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ、およびそれらの類似体であるポリマーを含むポリヌクレオチドを形成する窒素複素環塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む多量体化合物を指す。核酸「主鎖」は、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」もしくはＰＮＡ、ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホン酸結合、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な結合から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換、例えば、２’メトキシもしくは２’ハロゲン化物置換を有する同様の化合物であり得る。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、それらの類似体（例えば、イノシンまたは他のもの、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ５−３６，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄ．，１１ｔｈ  ｅｄ．，１９９２を参照されたい）、プリンまたはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザプリンもしくはアザプリン、デアザピリミジンもしくはアザピリミジン、５もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基、２、６、もしくは８位に置換基を有するプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、ならびにＯ４−アルキル−ピリミジン（米国特許第５，３７８，８２５号およびＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）であり得る。核酸は、主鎖がポリマーの位置（複数可）に窒素含有塩基を含まない、１つ以上の「無塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡまたはＤＮＡの糖、塩基、および結合のみを含んでも、従来の構成要素および置換の両方を含んでもよい（例えば、２’メトキシ結合を有する従来の塩基、または従来の塩基および１つ以上の塩基類似体を含有するポリマー）。核酸は、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）、糖立体配置を模倣するＲＮＡ中にロックされた二環式フラノース単位を有する１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似体を含み、これは、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増強する（Ｖｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３（４２）：１３２３３−４１）。核酸は、核酸の機能または挙動を変化させる修飾塩基、例えば、追加のヌクレオチドが核酸に付加されるのをブロックする３’末端ジデオキシリボヌクレオチドの付加を含み得る。ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を及ぼし得るオリゴマーの実施形態には、ＰＮＡオリゴマー、２’−メトキシもしくは２’−フルオロ置換ＲＮＡを含むオリゴマー、またはハイブリダイゼーション複合体の全電荷、電荷密度、もしくは立体会合（ｓｔｅｒｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に影響を及ぼすオリゴマー（荷電した結合（例えば、ホスホロチオエート）もしくは中性基（例えば、メチルホスホネート）を含有するオリゴマーを含む）が含まれる。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、ま��は他の核酸の長さの範囲に言及する場合、その範囲は、全ての整数を含む（例えば、１９〜２５個の連続ヌクレオチド長には、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、および２５個が含まれる）ことが理解される。
【００４４】
「標的核酸」または「標的」は、標的核酸配列を含有する核酸である。「標的核酸配列」、「標的配列」、または「標的領域」は、増幅される、ＣＭＶなどの標的生物のヌクレオチド配列を含む特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列である。標的配列またはその相補体は、ハイブリダイズして、標的核酸の増幅および／または検出に使用されるオリゴヌクレオチド、増幅オリゴマー、および／または検出オリゴマーを捕捉する配列を含有する。標的核酸は、増幅されなくてもよい標的配列以外の他の配列を含んでもよい。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。標的核酸は、ゲノム核酸、ｒＲＮＡなどの転写された核酸、またはゲノム核酸もしくは転写された核酸に由来する核酸であり得るが、これらに限定されない。
【００４５】
配列同一性は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを使用し、デフォルトのギャップパラメータを使用して配列を整列させることによって、ならびに検査および最良の整列（すなわち、比較ウィンドウ全体にわたる最高の配列類似性の割合をもたらす）を使用して決定することができる。配列同一性の割合は、比較ウィンドウ全体にわたって２つの最適に整列された配列を比較し、両方の配列で同一の残基が生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数をもたらし、比較ウィンドウ内のギャップ（すなわち、ウィンドウサイズ）を計数せずにマッチした位置の数をマッチした位置およびミスマッチの位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合をもたらすことによって計算される。別に示さない限り、２つの配列間の比較ウィンドウは、２つの配列のうちのより短い方の全長によって定義される。
【００４６】
「相補性」という用語は、従来のワトソン・クリックまたは他の非従来型のいずれかによって、ポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチド配列と水素結合（複数可）を形成する（ハイブリダイズする）能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成することができる第１の核酸配列内の連続鎖中の塩基の割合を示す（例えば、１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個が、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。相補性パーセントは、同一性パーセントと同様の様式で計算される。
【００４７】
ＣＭＶ配列の例示的な部分を、表１Ａに提供する（簡潔にするために、当該技術分野で既知の完全なＣＭＶゲノムは、含まれない）。別に示さない限り、「ＣＭＶ核酸にハイブリダイズすること」は、ＣＭＶ核酸のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか、またはゲノム配列から転写されたＲＮＡにハイブリダイズすることを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、増幅オリゴマー、プローブオリゴマー、またはＴＣＯは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含有することができる。増幅オリゴマーは、１、２、３、４、５、６以上の修飾ヌクレオチドを有し得る。修飾ヌクレオチドには、修飾核酸塩基を有するヌクレオチドが含まれる。修飾核酸塩基には、合成および天然の核酸塩基、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンが含まれるが、これらに限定されない。修飾ヌクレオチドには、（２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、および２’−フルオロヌクレオチドなどの２’−ハロゲンヌクレオチドを含むがこれらに限定されない）２’修飾ヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、修飾塩基を有するヌクレオチドも含まれる。「Ｃ残基」は、文脈が別に示さない限り、メチル化（５−メチルシトシン）および非メチル化シトシンを含む。
【００４９】
「ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物」とは、本質的に同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物は、異なる糖部分（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、ＲＮＡ中のウラシルおよびＤＮＡ中のチミンの存在によって異なり得る。等価物は特定の配列に対して同程度の相補性を有するため、ＲＮＡ等価物とＤＮＡ等価物との間の相違は、相同性の相違には寄与しない。別に示さない限り、ＣＭＶ核酸への言及は、ＣＭＶ  ＲＮＡおよびそのＤＮＡ等価物を含む。
【００５０】
「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「オリゴ」は、一緒に結合した２つ以上のヌクレオシドサブユニットまたは核酸塩基サブユニットから構成されたポリマーである。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡならびにそれらの類似体であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、５〜１５ｎｔの下限および５０〜５００ｎｔの上限を有するサイズ範囲にある。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、１０〜１００個の核酸塩基、１０〜９０個の核酸塩基、１０〜８０個の核酸塩基、１０〜７０個の核酸塩基、または１０〜６０個の核酸塩基のサイズ範囲にある。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、約５〜１５、１６、１７、１８、１９、または２０の核酸塩基の下限および約５０〜１００の核酸塩基の上限を有するサイズ範囲にある。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、約１０〜２１の核酸塩基の下限および約２２〜１００の核酸塩基の上限を有するサイズ範囲にある。オリゴマーは、野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写産物からはならない。オリゴマーは、任意の周知のインビトロの化学的または酵素的方法を使用することによって合成的に作製することができ、標準的な方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することによって合成後に精製することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴマー（プロモータープライマーとも呼ばれる、例えば、Ｔ７プライマー）、非ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有オリゴマー（非Ｔ７プライマー、ＮＴ７プライマー、または非プロモータープライマーとも呼ばれる）、プローブオリゴマー（検出オリゴマーもしくは検出プローブ、プローブ、またはトーチとも呼ばれる）、標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）、順方向プライマー、逆方向プライマー、ヘルパーオリゴマー、およびディスプレーサーオリゴマーを含むオリゴマーが記載される。
【００５１】
「固定化捕捉プローブ」は、ＴＣＯを固体支持体に結合するための手段を提供する。いくつかの実施形態では、固定化捕捉プローブは、固体支持体に結合した塩基配列認識分子を含有し、これは、非結合材料からの結合した標的ポリヌクレオチドの分離を促進する。溶液中に遊離するマトリックスおよび粒子などの、任意の既知の固体支持体を使用してもよい。例えば、固体支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および磁気的に引き付け可能な粒子であり得る。いくつかの実施形態では、支持体は、単分散である（すなわち、サイズが均一±約５％である）磁性球を含む。固定化捕捉プローブは、直接的に（例えば、共有結合もしくはイオン相互作用を介して）、または間接的に固体支持体に結合し得る。有用な固体支持体の一般的な例には、磁性粒子またはビーズが含まれる。
【００５２】
「標的捕捉」という用語は、細胞断片、細胞小器官、タンパク質、脂質、炭水化物、または他の核酸などの試料混合物の他の構成要素から標的核酸を選択的に分離または単離することを指す。標的捕捉システムは、（例えば、ＴＣＯ  ＴＳ配列などの目的の標的核酸に特異的な配列を使用することによって）他の試料構成要素から所定の標的核酸を特異的かつ選択的に分離することができるか、またはそれは、標的の他の特徴（例えば、その物理的特徴を示さない他の試料構成要素からそれを区別する標的核酸の物理的特性）を使用することによって、他の試料構成要素から標的核酸を非特異的かつ選択的に分離することができる。標的捕捉方法および組成物は、以前に詳細に記載されている（米国特許第６，１１０，６７８号および同第６，５３４，２７３号、ならびに米国公開第２００８／０２８６７７５Ａ１号）。いくつかの実施形態では、標的捕捉は、溶液相のＴＣＯおよび支持体に結合した固定化捕捉プローブを利用して、標的核酸と複合体を形成し、他の構成要素から捕捉された標的を分離する。
【００５３】
「分離すること」、「単離すること」、または「精製すること」という用語は一般に、混合物中の１つ以上の他の構成要素から、試料などの混合物の１つ以上の構成要素を除去することを指す。試料構成要素は、細胞断片、タンパク質、炭水化物、脂質、および他の核酸を含み得る、一般に水性溶液相の核酸を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、混合物中の他の構成要素から分離または除去される。
【００５４】
「核酸増幅」または「増幅」は、標的核酸配列もしくはその相補的配列またはそれらの断片（すなわち、完全標的核酸より少なく含有する増幅配列）の複数コピーを生成する任意のインビトロ手順を指す。核酸増幅手順の例には、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、および他のもの（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，４３７，９９０号、同第５，１３０，２３８号、同第４，８６８，１０５号、および同第５，１２４，２４６号）、レプリカーゼ媒介増幅（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、欧州特許出願第０３２０３０８号）、ならびに鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号）などの転写関連方法が含まれる。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱβ−レプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、および熱サイクリングステップを使用して、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの２つの相補鎖の複数のコピーを合成する。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの別々のオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数サイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する。ＳＤＡは、標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニックを入れ、それに続いて一連のプライマー伸長および鎖置換ステップで増幅する、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを使用する。特定の実施形態はＰＣＲまたはＴＭＡを使用するが、本明細書に開示されるオリゴマーが他の増幅方法におけるプライマーとして容易に使用され得ることは当業者に明らかである。
【００５５】
転写関連増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、プロモーター含有オリゴヌクレオチドを使用し、任意選択的に他のオリゴヌクレオチドを含み得ることで、最終的に核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写物を生成する（Ｋａｃｉａｎらの米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号、Ｂｕｒｇらの米国特許第５，４３７，９９０号、ＧｉｎｇｅｒａｓらのＰＣＴ第ＷＯ８８／０１３０２号および同第ＷＯ８８／１０３１５号、Ｍａｌｅｋらの米国特許第５，１３０，２３８号、Ｕｒｄｅａらの米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈらのＰＣＴ第ＷＯ９４／０３４７２号、ならびにＲｙｄｅｒらのＰＣＴ第ＷＯ９５／０３４３０号に詳細に記載され、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＴＭＡを使用する方法は、以前に詳細に記載されている（米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５４５，５１６号、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５６】
「実質的に等温の増幅」という用語は、実質的に一定の温度で行われる増幅反応を指す。反応の等温部分は、可変温度での１つ以上のステップ、例えば、第１の変性ステップおよび最終熱不活性化ステップまたは冷却ステップの前または後にあり得る。この定義は、温度の小さな変動を排除するのではなく、むしろ増幅産物を生成するために基本的に「サイクリング温度」に依存する当該技術分野で既知の他の増幅技術から等温増幅技術を区別するために使用されることが理解される。等温増幅は、例えば、ＰＣＲが加熱ならびにそれに続くプライマーのハイブリダイゼーションおよび低温での重合による変性サイクルに依存する点で、ＰＣＲとは異なる。
【００５７】
「アンプリコン」または「増幅産物」は、核酸増幅反応において生成され、かつ標的核酸に由来する核酸分子である。アンプリコンまたは増幅産物は、標的核酸と同じか、またはそれとは反対方向のものであり得る標的核酸配列を含有する。
【００５８】
「増幅オリゴマー」は、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指し、核酸増幅反応に関与する。増幅オリゴマーは、プライマー、順方向プライマー、逆方向プライマー、プロモータープライマー、非プロモータープライマー、ヘルパーオリゴマー、またはディスプレーサーオリゴマーであり得る。いくつかの実施形態では、増幅オリゴマーは、標的核酸配列またはその相補鎖の領域に相補的な少なくとも約１０個の連続塩基、および所望により少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の連続塩基を含有する。連続塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、または完全に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、増幅オリゴマーは、標的核酸配列またはその相補鎖の領域と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５個の連続塩基を含有する。いくつかの実施形態では、増幅オリゴマーは、標的核酸配列に相補的ではない追加の３’または５’配列を含有する。当業者は、列挙された範囲がその範囲内の全ての整数および有理数（例えば、９２％または９８．３７７％）を含むことを理解するであろう。特定の増幅オリゴマーは、約１０〜約６０塩基長であり、任意選択的に修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、少なくとも１つのメチル化シトシンおよび／または少なくとも１つの２’−修飾ヌクレオチドを含有し得る。
【００５９】
「単相増幅」は、増幅の開始時に、核酸増幅に必要な全ての構成要素が反応混合物に存在する核増幅反応を指す。
【００６０】
「線形増幅」は、反応中の標的核酸の量に線形比例する標的核酸の増加を生成するように設計される増幅機構を指す。例えば、転写関連反応を使用してＤＮＡ標的から複数のＲＮＡコピーを作製することができ、コピー数の増加は、線形因子（例えば、鋳型の開始コピー×ｎ）によって記載することができる。いくつかの実施形態では、多相増幅手順における第１相の線形増幅は、第２相の増幅反応の開始前に、標的核酸鎖またはそれらの相補体の開始数を少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍増加させる。線形増幅システムの例は、“Ｔ７−ｂａｓｅｄ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ”（ＴＬＡＤ、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：Ａｒｔ．Ｎｏ．１９，Ｍａｙ９，２００３を参照されたい）である。他の方法を、本明細書に開示する。したがって、「線形増幅」という用語は、標的核酸配列の指数関数的増幅をもたらさない増幅反応を指す。「線形増幅」という用語は、逆転写の場合のような単一ｃＤＮＡ分子へのＲＮＡ分子の転写などの、核酸鎖の単一コピーを単に作製する方法を指すものではない。
【００６１】
「指数関数的増幅」は、反応中の標的核酸の量に幾何学的に比例する標的核酸の増加を生成するように設計される核酸増幅を指す。例えば、ＰＣＲは、あらゆる元の標的鎖および存在するあらゆる合成鎖に対して、１つのＤＮＡ鎖を生成する。同様に、転写関連増幅は、あらゆる元の標的鎖およびその後に合成されるあらゆる鎖に対して、複数のＲＮＡ転写物を生成する。合成された鎖がその後の増幅ラウンドにおいて鋳型として使用されるため、増幅は、指数関数的である。増幅反応は、増幅反応がそのような増加を生成するように設計されている限り、指数関数的増幅とみなされる指数関数的に増加する量の核酸を実際に生成する必要はない。
【００６２】
「プライマー」は、鋳型核酸とハイブリダイズし、かつ重合によって伸長される３’末端を有するオリゴマーを指す。プライマーは、例えば、標的配列に相補的ではない５’領域を含むことによって任意選択的に修飾され得る。そのような修飾には、タグ、プロモーター、またはプライマーもしくは標的オリゴヌクレオチドの操作もしくは増幅に使用されるかもしくは有用な他の配列などの機能付加が含まれ得る。転写媒介増幅の文脈において、５’プロモーター配列で修飾されたプライマーは、「プロモーター−プライマー」と称され得る。分子生物学または生化学の当業者は、プライマーとして機能し得るオリゴマーを、５’プロモーター配列を含み、次いでプロモーター−プライマーとして機能するように修飾することができること、同様に、任意のプロモーター−プライマーが、その５’プロモーター配列の有無にかかわらずプライマーとして機能することができることを理解するであろう。
【００６３】
リアルタイムでアンプリコンを検出するサイクリック増幅方法において、「閾値サイクル」（Ｃｔ）という用語は、標的の増幅に関連するシグナルの出現時間の尺度であり、一般に正規化レポーターシグナルの標準偏差の１０倍である。増幅が「閾値サイクル」に達すると、一般にプローブが結合する配列の陽性の増幅産物があると考えられる。次いで、増幅産物の同一性を、ゲル電気泳動、核酸配列決定、および他のそのような周知の方法などの当業者に既知の方法によって決定することができる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「相対蛍光単位」（「ＲＦＵ」）という用語は、蛍光強度の測定単位である。ＲＦＵは、測定に使用される検出手段の特性により変化し、試料と対照との間の相対強度を比較するための測定として使用することができる。分析感度（検出限界またはＬｏＤ）は、５０％組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）から決定される。ＴＣＩＤ５０／ｍｌは、播種された細胞培養物の５０％において病理学的変化を生成する病原体の量である。
【００６５】
「検出プローブ」または「プローブ」は、標的核酸の検出のために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で増幅配列を含む標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴマーを指す。検出は、直接的（すなわち、標的に直接ハイブリダイズするプローブ）または間接的（すなわち、プローブを標的に連結させる中間構造体にハイブリダイズするプローブ）のいずれかであり得る。プローブの標的配列は一般に、プローブが特異的にハイブリダイズする、より大きい配列内の特異的配列を指す。検出プローブは、相補的（標的特異的）配列、および非相補的（標的に相補的ではない）配列を含み得る。そのような標的に相補的ではない配列には、検出および／または増幅の促進に使用することができる、ヘアピン構造などの所望の二次または三次構造を付与する配列が含まれ得る。（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００６／００６８４１７Ａ１号および同第２００６／０１９４２４０Ａ１号）。相補的配列および非相補的配列は、連続していても、リンカーによって結合されてもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、またはＣ１６リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ９リンカーである。検出オリゴマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡであっても、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含有しても、それらの組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、検出オリゴマーは、１つ以上の２’メトキシヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、検出オリゴマーは、全ての２’メトキシリボヌクレオチドを含有する。定義された配列のプローブは、化学合成、および組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現などによる当業者に既知の技術によって生成することができる。
【００６６】
検出は、標的増幅中に存在し、アンプリコンにリアルタイムでハイブリダイズする一本鎖核酸トーチを使用して達成することができる。各トーチは、フルオロフォアおよびクエンチャーを有する。トーチは、各末端に相補的領域を含有する。これらの相補的領域は、互いに結合し、「閉鎖」トーチを形成する。閉鎖構成では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しており、フルオロフォアシグナルはクエンチされる。すなわち、それは、光によって励起されたときに検出可能なシグナルを放出しない。しかしながら、トーチが相補的標的に結合すると、トーチ内の相補的領域は、強制的に離されて、「開放」トーチを形成する。開放形態では、フルオロフォアおよびクエンチャーは近接しておらず、フルオロフォアシグナルは励起時に検出可能である（すなわち、もはやクエンチされていない）。アンプリコン−トーチ結合は、フルオロフォアからのクエンチャーの分離をもたらし、これにより、光刺激および特定の波長でのシグナル放出に応答したフルオロフォアの励起が可能になる。トーチは、増幅中に存在し、相補的アンプリコンがリアルタイムで生成されるにつれて、それに結合する可能性がある。より多くのアンプリコンが作製されるにつれて、より多くのトーチが結合し、より多くのシグナルが作製される。シグナルは最終的に、それがバックグラウンドを超える検出され得るレベルに達し、最終的に全ての利用可能なトーチがアンプリコンに結合し、シグナルが最大に達する点に達する。増幅の開始時、および増幅配列のコピー数が少ない場合、プローブオリゴマーのほとんどが閉鎖する（３’および５’末端が塩基対合し、蛍光シグナルがクエンチされる）。増幅中、より多くのプローブオリゴマーが、標的配列に結合するため、プローブオリゴの３’および５’末端が分離し、蛍光の増加（蛍光の消光の低下）を生じさせる。さらなる増幅後、蛍光シグナルは、最大に近づく。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「標識」または「検出可能な標識」は、検出されるプローブまたは検出可能なシグナルを生じさせるプローブに直接的または間接的に結合された部分または化合物を指す。直接的結合は、共有結合または非共有相互作用（例えば、水素結合、疎水性もしくはイオン相互作用、およびキレートもしくは配位錯体形成）を使用し得るが、間接的結合は、架橋部分またはリンカー（例えば、抗体または追加のオリゴヌクレオチドを介する）を使用し得、これらは検出可能なシグナルを増幅する。任意の検出可能な部分、例えば、放射性核種、ビオチンまたはアビジンなどのリガンド、酵素、酵素基質、反応性基、検出可能な色を付与する色素または粒子などの発色団（例えば、ラテックスまたは金属ビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光性、リン光性、または化学発光性化合物）、および蛍光化合物（すなわち、フルオロフォア）を使用してもよい。フルオロフォアには、約４９５〜６５０ｎｍの範囲内の光を吸収し、約５２０〜６７０ｎｍの範囲内の光を放出するものが含まれ、これらには、ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ  ＦＬＵＯＲ（商標）（オレンジまたはレッド）、ＱＵＡＳＡＲ（商標）、フルオレセイン、ヘキソクロロ−フルオレセイン（ＨＥＸ）、ローダミン、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＤＡＢＣＹＬ、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ルシファーイエロー、エオシン、エリスロシン、テキサスレッド、ＲＯＸ、ＣＹ色素（ＣＹ５など）、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素化合物として知られているものが含まれるが、これらに限定されない。フルオロフォアは、フルオロフォアに近接したときに光を吸収してバックグラウンド蛍光を低減するクエンチャー分子と組み合わせて使用してもよい。そのようなクエンチャーは、当該技術分野で周知であり、ＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（またはＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−２（ＢＨＱ２）を含むがこれらに限定されない、ＢＨＱ（商標）（商標））またはＴＡＭＲＡ（商標）化合物が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態には、混合物中の結合標識プローブが非結合標識プローブと比較して検出可能な変化を示す均一系において検出可能である「均一で検出可能な標識」が含まれ、これは、ハイブリダイズしていない標識プローブからハイブリダイズした標識プローブを物理的に除去することなく標識を検出することを可能にする（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。特定の均一で検出可能な標識には、周知の標準的なＡＥまたはＡＥ誘導体などのアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物（米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号）を含む、化学発光化合物が含まれる。標識を合成する方法、標識を核酸に結合する方法、および標識からのシグナルを検出する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓ���ｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）ａｔ  Ｃｈａｐｔ．１０、ならびに米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、および同第４，５８１，３３３号、ならびに欧州特許出願第０７４７７０６号）。ＡＥ化合物を核酸に結合する特定の方法は、既知である（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および米国特許第５，６３９，６０４号、第１０欄の６行目〜第１１欄の３行目、および実施例８を参照されたい）。特定のＡＥ標識位置は、プローブの中央領域およびＡ／Ｔ塩基対の領域付近、プローブの３’もしくは５’末端、またはプローブが所望の標的配列と比較して検出するべきではない既知の配列とのミスマッチ部位もしくはその付近である。他の検出可能に標識されたプローブには、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子トーチ、および分子ビーコンが含まれる。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、ドナーおよびアクセプター標識を含み、蛍光は、クエンチャーの存在からフルオロフォアを放出するために増幅中にプローブを酵素的に分解したときに検出される。分子トーチおよびビーコンは、開放および閉鎖配置で存在し、閉鎖配置は、フルオロフォアをクエンチし、開放位置は、フルオロフォアをクエンチャーから分離して蛍光を可能にする。標的へのハイブリダイゼーションは、そうでなければ閉鎖したプローブを開放する。
【００６８】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、２つの完全または部分的に相補的な核酸鎖が、平行方向または逆平行方向で、特定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で一体になり、二本鎖領域を有する安定な構造を形成する能力を意味する。ハイブリッドと呼ばれることもあるこの二本鎖構造の２つの構成鎖は、水素結合によって結び付いている。これらの水素結合は、最も一般的には、単一核酸鎖上の塩基アデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含有するヌクレオチド間で形成されるが、塩基対合は、これらの「正準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」対のメンバーではない塩基間で形成することもできる。非正準塩基対合は、当該技術分野で周知である。（例えば、Ｒ．Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（１１ｔｈ  ｅｄ．１９９２）を参照されたい。）
【００６９】
「優先的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、増幅または検出プローブオリゴマーがその標的核酸にハイブリダイズして安定なオリゴマー：標的ハイブリッドを形成することができるが、十分な数の安定なオリゴマー：非標的ハイブリッドを形成しないことを意味する。標的核酸に優先的にハイブリダイズする増幅および検出オリゴマーは、標的核酸の増幅および検出に有用であるが、特に系統学的に密接に関連する生物における非標的核酸には有用ではない。したがって、オリゴマーは、非標的核酸よりも十分に高い程度で標的核酸にハイブリダイズし、当業者が、必要に応じて、特定のインフルエンザウイルスに由来する核酸を増幅し、および／またはその存在（または不在）を正確に検出することを可能にする。一般に、オリゴヌクレオチド配列とその標的配列との間の相補性の程度を低下させることは、その標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度または比率を低下させるであろう。しかしながら、１つ以上の非相補的ヌクレオシドまたは核酸塩基を含めることは、オリゴヌクレオチドが非標的生物を識別する能力を促進し得る。
【００７０】
優先的ハイブリダイゼーションは、当該技術分野で既知であり、かつ本明細書、例えば、以下に提供される実施例などに記載される技術を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、試験試料中の標的ハイブリダイゼーションシグナルと非標的ハイブリダイゼーションシグナルとの間に少なくとも１０倍の差、少なくとも２０倍の差、少なくとも５０倍の差、少なくとも１００倍の差、少なくとも２００倍の差、少なくとも５００倍の差、または少なくとも１，０００倍の差が存在する。いくつかの実施形態では、試験試料中の非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドシグナルレベル以下である。
【００７１】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」とは、オリゴマーが標的核酸（ＨＰＩＶ核酸など）に優先的にハイブリダイズすることを可能にするが、密接に関連する非標的核酸に由来する核酸には優先的にハイブリダイズすることを可能にしない条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の定義は変化しないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに使用することができる実際の反応環境は、オリゴマーのＧＣ含量および長さ、オリゴマー配列と試験試料に存在し得る非標的核酸配列との間の類似性の程度、ならびに標的配列を含む因子によって変化し得る。ハイブリダイゼーション条件には、温度およびハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成が含まれる。１つ以上のＣＭＶ株に由来する標的核酸を本開示のオリゴマーで増幅および／または検出するための例示的なハイブリダイゼーションアッセイ条件は、塩濃度が約０．６〜０．９Ｍの範囲内である場合、約６０℃の温度に対応する。特定のハイブリダイゼーションアッセイ条件は、以下の実施例の節に記載される。他の許容されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者によって容易に確認され得る。
【００７２】
言及されるオリゴマーと「ＣＭＶ核酸へのハイブリダイゼーションについて、ストリンジェントな条件下で競合する」とは、オリゴマーが、ストリンジェントな条件下で、その標的ＣＭＶ配列への言及されるオリゴマーの結合を実質的に低下させるか、競合するオリゴマーが、過剰に供給されたときに、飽和濃度以下において、言及されるオリゴマーの結合を約２０％、３０％、４０％、５０％以上低下させることができるか、または競合するオリゴマーのＴｍが、標的に対して、言及されるオリゴマーのＴｍよりも高いかもしくはその約５℃、４℃、３℃、２℃、もしくは１℃以内であることを意味する。好適なオリゴヌクレオチド競合アッセイ条件および手順は、当該技術分野で既知である。
【００７３】
「アッセイ条件」とは、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの安定したハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。アッセイ条件は、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの優先的ハイブリダイゼーションを必要としない。
【００７４】
配列が完全に相補的である必要はないが、配列は、２つの核酸配列の安定したハイブリダイゼーション、例えば、プローブおよび標的配列の安定したハイブリッドを可能にする場合に「十分に相補的」である。すなわち、「十分に相補的な」配列は、標準的な塩基対合（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕ）を使用することによって、サブセットの一連（ｓｕｂｓｅｔ  ｓｅｒｉｅｓ）の相補的ヌクレオチド間の水素結合によって別の配列にハイブリダイズするが、２つの配列は、配列全体が安定したハイブリダイゼーション複合体を形成するのに適切なハイブリダイゼーション条件にある限り、相補的ではない１つ以上の残基（脱塩基位置を含む）を含有し得る。十分に相補的な配列は、互いにハイブリダイズする配列において少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または完全に相補的であり得る。適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知であり、配列組成に基づいて予測することができるか、または所定の試験を使用することによって経験的に決定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．の§§１．９０〜１．９１、７．３７〜７．５７、９．４７〜９．５１、および１１．４７〜１１．５７、特に§§９．５０〜９．５１、１１．１２〜１１．１３、１１．４５〜１１．４７、および１１．５５〜１１．５７）。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーまたはディスプレーサーオリゴマーなどのオリゴマーは、ブロックされている。ブロックされた、または「伸長不能な」オリゴマーは、その３’末端またはその近くに、ポリメラーゼによる新生核酸鎖の伸長を防ぐ（すなわち、オリゴマーがブロックされている）ブロッキング部分を含む。いくつかの実施形態では、３’末端付近のブロッキング基は、３’末端の５個の残基内にあり、オリゴマーへのポリメラーゼの結合を制限するのに十分に大きい。いくつかの実施形態では、ブロッキング基は、３’末端に共有結合する。多くの異なる化学基、例えば、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシリボヌクレオチド残基、およびコルジセピンを使用して、３’末端をブロックすることができる。ブロッキング部分のさらなる例には、３’−デオキシヌクレオチド（例えば、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド）；３’−リン酸化ヌクレオチド；フルオロフォア、クエンチャー、もしくは伸長を妨害する他の標識；（例えば、曝露された５’−ＯＨもしくはリン酸を任意選択的に有する３’から３’へのホスホジエステルを通して先行するヌクレオチドに連結された）反転ヌクレオチド；またはポリメラーゼによる新生核酸鎖のさらなる伸長を防ぐためにオリゴヌクレオチドに結合されたタンパク質もしくはペプチドが含まれる。本開示の伸長不能なオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０塩基長であり得、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上のヌクレオチド長まで伸長し得る。検出可能な標識を含む伸長不能なオリゴヌクレオチドを、プローブとして使用することができる。いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーまたはディスプレーサーオリゴマーは、ブロックされている（すなわち、伸長不能であるか、またはブロッキング部分を含有する）。
【００７６】
特に特許請求の範囲における「配列番号Ｘの配列」への言及は、別に示さない限り、対応する配列表に記載の塩基配列を指し、主鎖（例えば、ＲＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）の同一性または塩基修飾（例えば、シトシン残基のメチル化）を必要としない。
【００７７】
オリゴマー中の「縮重」位置は、２つ以上の塩基対がオリゴマーの集団に存在する位置を指す。例えば、ヌクレオチドは、ＣまたはＴ／Ｕを表すＹとして表すことができる。縮重位置を有するオリゴマーは、縮重位置の導入が所望される合成ステップにおいて、所望の縮重の組み合わせに対応するヌクレオチド前駆体の混合物を提供することによって合成することができる。
【００７８】
オリゴマー中の「非ワトソンクリック」（ＮＷＣ）位置は、オリゴマーが、Ｇ−Ｕ、Ｇ−Ｔ、またはＧ−Ａ（ＧまたはＵ／Ｔ／Ａのいずれかは、オリゴマー中の塩基であり得る）などの非ワトソンクリック対合により、少なくとも１つの核酸配列にハイブリダイズするように構成される位置を指す。いくつかの実施形態では、ＮＷＣ位置は、ゆらぎ（Ｇ−ＵまたはＧ−Ｔ）またはプリン−プリン（Ｇ−Ａ）対を介してハイブリダイズするように構成される。
【００７９】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的な定義は、分子生物学の分野に関連する技術書、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）またはＴｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，１９９１，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）に見出すことができる。
【００８０】
Ｂ．オリゴマー
増幅される領域を含有するＣＭＶ標的領域を、表１Ａに示す。ＣＭＶ標的領域の増幅に好適な増幅オリゴマーは、表１Ｂに見出すことができる。増幅オリゴマーは、順方向（Ｆｗｄ）プライマー／ヘルパー領域、逆方向（Ｒｅｖ）プライマー領域、および／またはディスプレーサー領域に存在するヌクレオチド配列を含有し、表１Ａに示す順方向（Ｆｗｄ）プライマー／ヘルパー、逆方向（Ｒｅｖ）プライマー、およびディスプレーサー相補的（Ｃｏｍｐｌ．）領域にハイブリダイズする。プローブオリゴマーは、プローブ領域に存在するヌクレオチド配列を含有し、表１Ａに示すプライマー相補的（Ｃｏｍｐｌ．）領域にハイブリダイズする。ＣＭＶアンプリコンの検出に好適なプローブオリゴマーは、表１Ｃに見出すことができる。ＣＭＶ核酸の捕捉に好適なＴＣＯは、表１Ｄに見出すことができる。例示的なＴ７プロモーター配列は、表１Ｅに見出すことができる。
【表１Ａ】
2021534758.tif 000002
【表１Ｂ−１】
2021534758.tif 000003
【表１Ｂ−２】
2021534758.tif 000004
【表１Ｃ】
2021534758.tif 000005
【表１Ｄ】
2021534758.tif 000006
【表１Ｅ】
2021534758.tif 000007
【００８１】
記載の増幅オリゴマーは、ＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子核酸に特異的にハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、増幅オリゴマーは、約１９〜４０塩基長、または約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０塩基長の標的ハイブリダイズ領域を有する。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどの標的ハイブリダイズ領域に加えて、標的ハイブリダイズ領域の５に位置し得る第２の配列領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、第２の配列領域を含まない。
【００８２】
いくつかの実施形態では、増幅オリゴマーは、表１Ｂの配列のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、増幅オリゴマーは、表１Ｂの配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態では、増幅オリゴマーは、ストリンジェントな条件下でＣＭＶ標的核酸への結合について表１Ｂの配列のいずれかと競合するオリゴマーを含む。ＣＭＶ標的核酸は、配列番号１またはその相補体であり得るが、これらに限定されない。記載の順方向プライマーまたは非プロモータープライマーのいずれかを、任意の記載の逆方向プライマーまたはプロモータープライマーと組み合わせて、増幅オリゴマー対（増幅オリゴマーの組み合わせ）を形成することができる。同様に、ヘルパーオリゴマー、ディスプレーサーオリゴマー、またはプローブオリゴマーのいずれかを、任意の増幅オリゴマー対と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマー（例えば、順方向プライマー）および第２の増幅オリゴマー（例えば、逆方向プライマー）は、少なくとも約５６、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、または少なくとも約９５ヌクレオチド長のＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンを増幅するように構成される。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマー（例えば、順方向プライマー）および第２の増幅オリゴマー（例えば、逆方向プライマー）は、５６〜３４０、５６〜３１２、５６〜２５２、または５６〜２２７、９５〜３４０、９５〜３１２、９５〜２５２、または９５〜２２７ヌクレオチド長のＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンを増幅するように構成される。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマー（例えば、順方向プライマー）および第２の増幅オリゴマー（例えば、逆方向プライマー）は、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ヌクレオチド長のＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンを増幅するように構成される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、順方向プライマーまたは非プロモータープライマーは、配列番号２に存在する１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または１９〜３１ヌクレオチド配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有する１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または１９〜３１個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、順方向プライマーまたは非プロモータープライマーは、配列番号２に存在するヌクレオチド配列を有する１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または１９〜３１個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、順方向プライマーまたは非プロモータープライマーは、配列番号１０または配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、順方向プライマーまたは非プロモータープライマーは、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、順方向プライマーまたは非プロモータープライマーは、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９と９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、順方向プライマーまたは非プロモータープライマーは、配列番号７９にハイブリダイズし、ＤＮＡまたはＲＮＡの重合を開始することができる。いくつかの実施形態では、順方向プライマーまたは非プロモータープライマーは、配列番号７９へのハイブリダイズについて、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のいずれかと競合することができるオリゴマーを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、逆方向プライマーまたはプロモータープライマーは、配列番号３に存在する２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または２１〜４０ヌクレオチド配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有する２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または２１〜４０個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、逆方向プライマーまたはプロモータープライマーは、配列番号３に存在するヌクレオチド配列を有する２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または２１〜４０個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、逆方向プライマーまたはプロモータープライマーは、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、逆方向プライマーまたはプロモータープライマーは、配列番号６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、または配列番号４７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、逆方向プライマーまたはプロモータープライマーは、配列番号６、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、または配列番号４７と９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、逆方向プライマーまたはプロモータープライマーは、配列番号８０にハイブリダイズし、ＤＮＡまたはＲＮＡの重合を開始することができる。いくつかの実施形態では、逆方向プライマーまたはプロモータープライマーは、配列番号８０へのハイブリダイズについて、配列番号６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、または配列番号４７のいずれかと競合することができるオリゴマーを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を、記載の順方向および／または逆方向プライマーのいずれかに付加して、プロモータープライマーを形成することができる。ＲＮＡポリメラーゼプライマー配列は、順方向または逆方向プライマーの５’末端に機能的に連結される。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり得るが、これらに限定されない。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、配列番号７８のヌクレオチド配列を含有することができる。いくつかの実施形態では、プロモータープライマーは、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、または配列番号４６のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーは、鋳型ヌクレオチド配列への順方向プライマーのハイブリダイゼーションを促進または増強する。いくつかの実施形態では、ディスプレーサーオリゴマーは、鋳型核酸配列への逆方向プライマーのハイブリダイゼーションを促進または増強する。鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションの促進または増強は、標的ヌクレオチド配列の増幅を促進または増強することができる。いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーおよび／またはディスプレーサーオリゴマーは、ブロックされ得る（すなわち、伸長不能である）。ブロックされると、ヘルパーおよび／またはディスプレーサーオリゴマーは、３’末端から重合をプライミングすることができない。例えば、ヘルパー／ディスプレーサーオリゴマーは、３’−末端３’−デオキシヌクレオチド（例えば、末端２’，３’−ジデオキシヌクレオチド）を有するか、３’末端−反転ヌクレオチド（例えば、最後のヌクレオチドが、それが３’から３’へのホスホジエステル結合もしくはその類似体（ホスホロチオエートなど）によって最後から２番目のヌクレオチドに結合するように反転している）を有するか、または結合したフルオロフォア、クエンチャー、もしくは伸長を妨害する他の標識（おそらく末端ヌクレオチドの３’位を介して結合するが、必ずしもそうとは限らない）を有する、３’−リン酸化によって伸長不能にすることができる。記載のヘルパーオリゴマーのいずれについても、ヘルパーオリゴマー中の１つ以上のヌクレオチドは、修飾され得る。いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーは、３’反転（逆極性）ヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、反転ヌクレオチドは、反転ｄＣである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーは、配列番号２に存在する１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または１９〜３１ヌクレオチド配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有する１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または１９〜３１個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーは、配列番号２に存在するヌクレオチド配列を有する１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または１９〜３１個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーは、配列番号１０または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９と９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパーオリゴマーは、配列番号７９へのハイブリダイズについて、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のいずれかと競合することができるオリゴマーを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ディスプレーサーオリゴマーは、配列番号５に存在する２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２１〜２７ヌクレオチドと少なくとも９０％の同一性を有する２１、２２、２３、２４、２５、または２１〜２７個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、ディスプレーサーオリゴマーは、配列番号５に存在するヌクレオチド配列を有する２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２１〜２７個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、ディスプレーサーオリゴマーは、配列番号２５、配列番号１２、または配列番号４１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ディスプレーサーオリゴマーは、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号６、配列番号４１、および配列番号１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ディスプレーサーオリゴマーは、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号６、配列番号４１、または配列番号１２と９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ディスプレーサーオリゴマーは、配列番号８２へのハイブリダイズについて、配列番号２５、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号６、配列番号４１、または配列番号１２のいずれかと競合することができるオリゴマーを含む。記載のディスプレーサーオリゴマーのいずれについても、ディスプレーサーオリゴマー中の１つ以上のヌクレオチドは、修飾され得る。いくつかの実施形態では、ディスプレーサーオリゴマーは、３’反転（逆極性）ヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、反転ヌクレオチドは、反転ｄＣである。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ヘルパーまたはディスプレーサーオリゴマーは、順方向プライマーまたは逆方向プライマーであり得る。いくつかの実施形態では、記載のヘルパーオリゴマーまたはディスプレーサーオリゴマーは、ヘルパーまたはディスプレーサーオリゴマーの５’末端に連結して、プロモータープライマーを形成する、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有し得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識（複数可）を含むオリゴマーが提供される。そのようなオリゴマーは、プローブ（プローブオリゴマー）として使用することができる。プローブオリゴマーを使用して、記載の増幅オリゴマーを使用して作製されたＣＭＶ増幅産物の存在または不在を検出する。
【００９１】
プローブオリゴマーを使用して、ＣＭＶアンプリコンを検出することがすることができ、すなわち、プローブオリゴマーは、ＣＭＶアンプリコンにハイブリダイズする。ＣＭＶアンプリコンは、記載の増幅オリゴマーのいずれかを使用して生成することができる。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号４に存在する２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または２４〜３５ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または２４〜３５個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号４に存在するヌクレオチド配列を有する２４〜３５個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号８１にハイブリダイズする２４〜３５個の連続核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号５１または配列番号５２のヌクレオチド配列を含み、１つ以上のウラシルヌクレオチドを、チミンヌクレオチドに対して置換することができる。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号２１、配列番号２６、または配列番号３９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、ヘアピンを含有する。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーの５’および３’末端の４〜５個の核酸塩基は、互いに相補的である。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、および配列番号７０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブオリゴマーは、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、または配列番号７０のと少なくとも９０％の同一性を有する核酸塩基配列を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、非ヌクレオチド標識である。好適な標識には、検出可能な光シグナルを放出する化合物、例えば、均一な混合物中で検出することができるフルオロフォアまたは発光（例えば、化学発光）化合物が含まれる。２つ以上の標識および２つ以上の型の標識が、特定のプローブ上に存在してもよいか、または検出は、各プローブが異なる検出可能なシグナルを生成する化合物で標識されるプローブの混合物の使用に依存してもよい（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１８０，３４０号および同第６，３５０，５７９号を参照されたい）。標識は、共有結合、キレート化、およびイオン相互作用を含む様々な手段によってプローブに結合することができるが、いくつかの実施形態では、標識は、共有結合する。例えば、いくつかの実施形態では、検出プローブは、例えば、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物などの結合した化学発光標識を有する（例えば、米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，６３９，６０４号、同第５，５８５，４８１号、および同第５，６５６，７４４号を参照されたい）。蛍光標識または化学発光標識などの標識は、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合することができる（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号、同第５，６５６，７４４号、および同第５，６３９，６０４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、検出オリゴマーは、オリゴヌクレオチドの５’末端と標識との間に塩基スペーサーを含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、プローブ（例えば、蛍光標識を含む）は、第１の標識と相互作用する第２の標識をさらに含む。例えば、第２の標識は、クエンチャーであり得る。そのようなプローブは、例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイにおいて使用することができ、このアッセイでは、プローブを標的またはアンプリコンにハイブリダイズさせ、それに続いて５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼによる核溶解が、蛍光標識の解放、およびそれにより、蛍光の増加、または第２の標識との相互作用とは独立した蛍光をもたらす。
【００９４】
いくつかの用途では、少なくともある程度の自己相補性を示す１つ以上のプローブを使用して、検出前にハイブリダイズしていないプローブの除去を最初に必要とせずに試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を促進する。そのような検出プローブのいくつかの実施形態には、例えば、一般にヘアピンと称される立体配置などの、分子内ハイブリダイゼーションによって保持される立体配置を形成するプローブが含まれる。好適なヘアピンプローブには、「分子トーチ」（トーチとも呼ばれる）（例えば、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号を参照されたい）ならびに「分子ビーコン」（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号および米国特許第５，３１２，７２８号を参照されたい）が含まれる。スペーサー（またはリンカー）は、アルキル基であり得る。いくつかの実施形態では、トーチは、５’末端の５−６ヌクレオチド配列に相補的であり、それとハイブリダイズすることができる５−６ヌクレオチド配列を３’末端に含有する。いくつかの実施形態では、リンカーを介してトーチに連結された５’末端の５−６ヌクレオチドに相補的であり、それとハイブリダイズすることができる３’末端の５−６ヌクレオチド配列。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ１−１６リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ９リンカーである。分子トーチは、標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインよりも標的配列へのハイブリダイゼーションを促進するように設計される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズするときとは対照的に、分子トーチが自己ハイブリダイズするときには異なるシグナルが生成されるように位置付けられた相互作用標識（例えば、蛍光／クエンチャー）を含み、それにより、それに関連する実行可能な標識を有するハイブリダイズしていないプローブの存在下で試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を可能にする。いくつかの実施形態では、トーチは、５’末端に結合した蛍光分子、および３’末端に結合したクエンチャーを含有する。あるいは、蛍光分子をトーチの３’末端に結合させ、クエンチャーを検出オリゴマーの５’末端に結合させてもよい。
【００９５】
本開示に関連して使用され得る相互作用ドナー／アクセプター標識対の例には、ＦＲＥＴ対と非ＦＲＥＴ対とを区別しようとせずに、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオロセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ＣａｌＲｅｄ−６１０／ＢＨＱ−２、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、Ｑｕａｓａｒ７５０／ＢＨＱ−２、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチル−ローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨＱ１、ＣＹ５／ＢＨＱ２、ＣＹ３／ＢＨＱ１、ＣＹ３／ＢＨ２、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、ドナー色素およびアクセプター色素が異なる場合、アクセプターの増感蛍光の出現またはドナー蛍光のクエンチングによって、エネルギー移動が検出され得ることを理解するであろう。ＤＡＢＣＹＬおよびＱＳＹ７色素などの非蛍光アクセプターは、直接（すなわち、非増感）アクセプター励起から生じるバックグラウンド蛍光の潜在的な問題を有利に排除する。ドナー−アクセプター対の一方のメンバーとして使用され得る例示的なフルオロフォア部分には、フルオレセイン、ＲＯＸ、およびＣＹ色素（例えば、ＣＹ５）が含まれる。ドナー−アクセプター対の別のメンバーとして使用され得る例示的なクエンチャー部分には、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）、Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｘｔｅｒ，Ｍｉｃｈ）、およびＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な、ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ、およびＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ部分が挙げられる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、標識オリゴマー（例えば、プローブ）は、伸長不能である（すなわち、ブロックされている）。例えば、標識オリゴマーは、３’−末端３’−デオキシヌクレオチド（例えば、末端２’，３’−ジデオキシヌクレオチド）を有するか、３’末端−反転ヌクレオチド（例えば、最後のヌクレオチドが、それが３’から３’へのホスホジエステル結合もしくはその類似体（ホスホロチオエートなど）によって最後から２番目のヌクレオチドに結合するように反転している）を有するか、または結合したフルオロフォア、クエンチャー、もしくは伸長を妨害する他の標識（おそらく末端ヌクレオチドの３’位を介して結合するが、必ずしもそうとは限らない）を有する、３’−リン酸化によって伸長不能にすることができる。いくつかの実施形態では、３’−末端ヌクレオチドは、メチル化されていない。
【００９７】
いくつかの実施形態では、第１相の増幅前に標的核酸配列を単離することが望ましい場合がある。この目的のために、試料は、標的核酸配列の一部分（ＴＣＯ結合部位）へのＴＣＯのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）と接触させることができる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、例えば、固定化捕捉プローブとの相互作用によって、固体支持体上に直接捕捉される。いくつかの実施形態では、標的核酸は、分子複合体（前増幅ハイブリッド）のメンバーとして固体支持体上に捕捉され、ＴＣＯは、標的核酸および固定化捕捉プローブを架橋する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、磁場を使用して操作することができる複数の磁性または磁化可能な粒子またはビーズを含む。標的核酸配列を単離するステップは、ＴＣＯ：標的核酸配列ハイブリッドを洗浄して、その後の増幅を妨害し得る望ましくない構成要素を除去することを含み得る。標的核酸配列を単離するステップは、ＴＣＯ：標的核酸配列ハイブリッドを洗浄して、標的核酸にハイブリダイズしていない過剰なプロモータープライマーを実質的に除去することも含み得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、標的核酸配列を単離するステップは、標的核酸配列へのプロモータープライマーおよびＴＣＯのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、試料をプロモータープライマーおよびＴＣＯと接触させることを含む。プロモータープライマーが標的とする標的配列の部分は、ＴＣＯが標的とする部分とは異なる（例えば、重複しない）可能性がある。プロモータープライマーが標的とする標的配列の部分は、ＴＣＯが標的とする部分と完全にもしくは部分的に重複しても、それと同一であってもよい。
【００９９】
いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＣＯ、１つ以上のプロモータープライマー、および任意選択的に１つ以上のディスプレーサーオリゴマーが、標的捕捉試薬（ＴＣＲ混合物）中に提供される。１つ以上のプロモータープライマーおよび任意選択的に１つ以上のディスプレーサーオリゴマーを、１つ以上の標的核酸配列にハイブリダイズさせて、（ＴＣＯ（複数可）と共に）前増幅ハイブリッドを形成し、標的捕捉ステップ中に１つ以上の標的核酸配列と共に単離することができる。この方法の１つの利点は、標的捕捉中にプロモータープライマー（複数可）を標的核酸配列（複数可）にハイブリダイズさせることによって、捕捉された核酸を洗浄して、ハイブリダイズしていないオリゴマーを含む試料構成要素を除去することができることである。多相増幅反応では、ハイブリダイズしていないプロモータープライマーを除去することにより、過剰なプロモータープライマーからの干渉なく第１相の増幅を生じさせることができ、それにより、多重反応に一般的な問題を実質的に低下させるか、または排除する。単相多重増幅反応では、プライマーは、互いに干渉する可能性がある。過剰なプライマーは、一重および多重反応において、より容易にミスプライミング（非標的核酸にハイブリダイズ）する。様々な生物が各々独自のｒＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドを有する多重反応では、ミスプライミングは、より大きな懸念事項である。多相増幅は、ストリンジェントな条件下でプロモータープライマーをその目的の標的にハイブリダイズさせ、次いで過剰なプロモータープライマーを洗い流すことによって、これらの問題に対処する。多相増幅の第１相の増幅反応に存在する結果として生じる１：１のプライマー／標的比は、ミスプライミングのレベルまたは増幅時のいかなるミスプライミングの影響も低下させながら、その後の過剰なプライマーの添加を可能にするレベルまで、標的核酸の集団を後押しすることができる。
【０１００】
記載のオリゴマーのいずれも、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有することができる。修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、または５’−メチルシトシンであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドは、２’−ＯＭｅリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴマー中のヌクレオチドの全てが修飾される。２つ以上の修飾ヌクレオチドは、同じであっても、異なってもよい。いくつかの実施形態では、記載のオリゴマーのいずれも、１つ以上の５’−メチルシトシンを含有し得る。オリゴマーは、１、２、３、４、５、６、７以上の５’−メチルシトシンを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴマー中の全てのシトシンヌクレオチドは、５’−メチルシトシン修飾ヌクレオチドである。オリゴマーは、１、２、３、４、５、６、７以上の２’−ＯＭｅリボヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴマー中の全てのヌクレオチドは、２’−ＯＭｅリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、チミジンヌクレオチドを、ウリジンヌクレオチドに対して置換することができる。いくつかの実施形態では、全てのチミジンヌクレオチドを、ウリジンヌクレオチドに対して置換することができる。いくつかのオリゴマーでは、５’−メチル−２’デオキシシトシン塩基を使用して、（対応する非メチル化オリゴマーに対して）オリゴヌクレオチドに組み込まれた各５’メチル−２’デオキシシトシンのＴｍを約０．５℃〜１．３℃上げることによって、二本鎖の安定性を増加させることができる。
【０１０１】
Ｃ．多相増幅
核酸鋳型から複数の転写物を生成することによって標的配列を増幅する、一般に「転写関連増幅」と称される等温増幅システムの態様を使用する方法が開示される。そのような方法は一般に、１つ以上の増幅オリゴヌクレオチドを使用し、そのうちの１つは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、リボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、ならびにＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を提供して、標的配列の近くに機能的プロモーター配列を生成し、次いでプロモーターから標的配列を転写する（例えば、米国特許第４，８６８，１０５号、同第５，１２４，２４６号、同第５，１３０，２３８号、同第５，３９９，４９１号、同第５，４３７，９９０号、同第５，５５４，５１６号、および同第７，３７４，８８５号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ１９８８／００１３０２号、同第ＷＯ１９８８／０１０３１５号、同第ＷＯ１９９５／００３４３０号）。例には、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、および自家持続配列複製（３ＳＲ）が含まれる。
【０１０２】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態の理解を助けるために、以前に詳細に記載されたＴＭＡ方法（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、および同第５，８２４，５１８号）を簡潔に要約する。ＴＭＡでは、増幅される配列を含有する標的核酸は、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）として提供される。二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）を一本鎖核酸に変換する任意の従来の方法を使用することができる。プロモータープライマー（例えば、Ｔ７プライマー）は、その標的配列で標的核酸に特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、標的鎖を鋳型として使用してプロモータープライマーの３’末端を伸長して、ｃＤＮＡコピーを作製し、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖をもたらす。ＲＮａｓｅ活性（例えば、ＲＴ酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ）は、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを消化する。第２のプライマー（例えば、非プロモータープライマーまたはＮＴ７プライマー）は、プロモーター−プライマー末端の下流で、ｃＤＮＡ中のその標的配列に特異的に結合する。次いで、ＲＴは、ｃＤＮＡを鋳型として使用して第２のプライマーの３’末端を伸長することによって、新たなＤＮＡ鎖を合成して、機能的プロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡを作製する。機能的プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼは、転写を開始して、最初の標的鎖に相補的な複数（例えば、１００〜１０００個）のＲＮＡ転写物（増幅されたコピーまたはアンプリコン）を生成する。第２のプライマーは、各アンプリコン中のその標的配列に特異的に結合し、ＲＴは、アンプリコンＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを作製して、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖を生成する。ＲＮａｓｅは、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖アンプリコンＲＮＡを消化し、プロモータープライマーの標的特異的配列は、新しく合成されたＤＮＡのその相補的配列に結合し、ＲＴは、プロモータープライマーの３’末端およびｃＤＮＡの３’末端を伸長させて、ＲＮＡポリメラーゼが結合する機能的プロモーターを含有し、標的鎖に相補的な追加のアンプリコンを転写するｄｓＤＮＡを作製する。反応中にこれらのステップを繰り返し使用する自己触媒サイクルは、最初の標的配列の増幅を生成する。アンプリコンは、増幅中（リアルタイム検出）または反応の終点（終点検出）で、アンプリコンに含有される配列に特異的に結合するプローブを使用することによって検出することができる。結合したプローブから生じるシグナルの検出は、試料中の標的核酸の存在を示す。
【０１０３】
多相増幅手順を使用してＣＭＶを増幅および／または検出する方法が記載される。本方法は、以下のステップを含む、試料中のＣＭＶ標的核酸配列を増幅することを含む。最初に、標的核酸配列を、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持しない条件下で第１相の増幅反応に供する。第１相の増幅反応は、第１の増幅産物を生成し、これを、その後に第１の増幅産物の指数関数的増幅を可能にする条件下で第２相の増幅反応に供し、それにより、第２の増幅産物を生成する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、プロモータープライマーが標的とする標的配列の部分（プロモータープライマー結合部位）は、ＴＣＯが標的とする部分（使用される場合）とは異なる（例えば、重複しない）可能性がある。プロモータープライマー結合部位は、ＴＣＯ結合部位と完全にまたは部分的に重複しても、同一であってもよい。いくつかの実施形態では、標的配列の増幅された領域は、標的捕捉結合部位と部分的にまたは完全に重複する。いくつかの実施形態では、標的配列の増幅された領域は、標的捕捉結合部位と重複しない。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、第１の増幅ステップの前に、試料を、試料中の標的核酸配列の一部分へのプロモータープライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、１つ以上のプロモータープライマーと接触させる。プロモータープライマーのＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼによって認識される。１つ以上のプロモータープライマーは、同じを標的としても、異なる標的核酸配列を標的としてもよい。異なる標的核酸配列は、同じ生物に由来しても、異なる生物に由来してもよい。
【０１０６】
第１相の増幅反応は、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持しない条件下で実施される。いくつかの実施形態では、第１相の増幅反応は、線形増幅反応である。第１相の増幅反応は、典型的には、約２倍〜約１０，０００倍の増幅を生成する。いくつかの実施形態では、第１相の増幅反応は、標的核酸配列の約１０倍〜約１０，０００倍の増幅を生成する。いくつかの実施形態では、第１相の増幅反応は、実質的に等温であり、すなわち、それは、ＰＣＲおよび他の一般的な増幅技術に特徴的な熱サイクリングを伴わない。第１相の増幅反応は、４３±２℃、４３±１℃、４２±１℃、４２±０．５℃、４３±０．５℃、４４±０．５℃、４１〜４５℃、または４２〜４４℃で実施することができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、第１相の増幅反応は、標的核酸配列を、標的核酸配列の線形増幅を支持し、その指数関数的増幅に必要とされる少なくとも１つの構成要素を欠如している第１相の増幅反応混合物（例えば、ＡＭＰまたはＡＭＰ１混合物）と接触させることを伴う。いくつかの実施形態では、その指数関数的増幅に必要とされる少なくとも１つの構成要素は、追加のまたは過剰なプロモータープライマーである。いくつかの実施形態では、ＡＭＰまたはＡＭＰ１反応混合物は、１つ以上の増幅酵素を含む。１つ以上の増幅酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＡＭＰまたはＡＭＰ１混合物は、ＲＮａｓｅ  Ｈ、またはＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素などのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＭＰまたはＡＭＰ１混合物は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素、およびＲＮＡポリメラーゼを含む。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼであり得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ＡＭＰまたはＡＭＰ１混合物は、１つ以上の非ＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有増幅オリゴヌクレオチド（例えば、非プロモータープライマー（すなわち、ＮＴ７プライマー））を含有する。１つ以上の非プロモータープライマーは、同じ標的核酸配列を標的としても、異なる標的核酸配列を標的としてもよい。異なる標的核酸配列は、同じ生物に由来しても、異なる生物に由来してもよい。いくつかの実施形態では、ＡＭＰまたはＡＭＰ１混合物は、１つ以上の非プロモータープライマー（複数可）、ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。ＡＭＰまたはＡＭＰ１混合物は、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、および塩を含むがこれらに限定されない、他の構成要素をさらに含有し得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、指数関数的増幅に必要な１つ以上の構成要素が欠如しており、指数関数的増幅を阻害する作用因子が存在し、かつ／または反応混合物の温度が指数関数的増幅の助けとなるものではないため、第１相の増幅反応は、指数関数的増幅反応を支持することができない。非限定的に、指数関数的増幅に必要な１つ以上の構成要素の欠如、および／または阻害剤、および／または反応条件は、増幅オリゴヌクレオチド（例えば、プロモータープライマー、非プロモータープライマー、またはそれらの組み合わせ）、酵素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ）、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、Ｃｌｅａｖａｓｅ、ＲＮａｓｅ、ホスホリラーゼ、グリコシラーゼなど）、酵素補因子、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｍｇ２＋、塩、緩衝液、酵素阻害剤、ブロッキングオリゴヌクレオチド、ｐＨ、温度、塩濃度、およびそれらの任意の組み合わせのいずれかから選択することができる。場合によっては、第１相の反応に存在する指数関数的増幅の阻害剤の効果を逆転させる作用因子などの欠如している構成要素が、間接的に関与し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の構成要素の欠如は、プロモータープライマー（前増幅ハイブリッドの一部として標的核酸にハイブリダイズしたプロモータープライマーを超える追加のプロモータープライマー）である。
【０１０９】
第２相（または３つ以上の相が存在する場合、より後の相）の増幅反応は、標的核酸配列の指数関数的増幅を可能にする条件下で実施される。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応は、指数関数的増幅反応である。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応は、例えば、転写関連増幅反応または鎖置換増幅反応などの実質的に等温反応である。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応である。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応は、４３±２℃、４３±１℃、４２±１℃、４２±０．５℃、４３±０．５℃、４４±０．５℃、４１〜４５℃、または４２〜４４℃で実施される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、第２（またはより後の）相の増幅は、第２相の増幅反応混合物（例えば、ＰＲＯまたはＡＭＰ２混合物）を有する第１の増幅産物を、標的核酸配列の指数関数的増幅を支持する第１相の増幅反応混合物と組み合わせて接触させることを含む。したがって、第２相の増幅反応混合物は、典型的には、最低限、第１相の増幅反応混合物に欠如している指数関数的増幅に必要な１つ以上の構成要素（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応混合物は、増幅オリゴヌクレオチド（プロモータープライマーなど）、逆転写酵素、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホリラーゼ、酵素補因子、キレート剤、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｍｇ２＋、最適なｐＨ、最適な温度、塩、およびそれらの組み合わせから選択される１つ以上の構成要素を含む。ポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応混合物は、ＲＮａｓｅ  ＨまたはＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素などのＲＮａｓｅを含む。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応混合物は、プロモータープライマー、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素、および／またはＲＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応混合物は、検出オリゴをさらに含む。検出オリゴマーは、トーチまたは分子ビーコンであり得るが、これらに限定されない。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、標的捕捉試薬（ＴＣＲ）は、１つ以上のＴＣＯ、１つ以上のＴ７プロモータープライマー、および任意選択的に１つ以上のディスプレーサーオリゴマーを含有し、ＡＲ（ＡＭＰまたはＡＭＰ１）試薬は、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、塩、１つ以上の非Ｔ７プライマー、および任意選択的に１つ以上のヘルパーオリゴマーを含有し、プロモーター（ＰＲまたはＡＭＰ２）試薬は、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、塩、界面活性剤、１つ以上のＴ７プロモータープライマー、および１つ以上のトーチオリゴヌクレオチドを含有し、酵素（ＥＮＺ）試薬は、緩衝液、界面活性剤、キレート剤、逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼを含有する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、記載の方法は、第２の増幅産物を、増幅オリゴヌクレオチド（プロモータープライマーまたは非プロモータープライマー）、逆転写酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素）、ポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）、ヌクレアーゼ、ホスホリラーゼ、酵素補因子、キレート剤、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｍｇ２＋、塩、およびそれらの組み合わせから選択されるがこれらに限定されない、１つ以上の増幅構成要素のボーラスと接触させるステップをさらに含む。増幅反応構成要素のいくつかが枯渇する可能性があるため、この追加のステップは、第２相の増幅反応に対する後押しを提供することができる。
【０１１３】
本方法を使用して、生物学的試料中のＣＭＶ標的核酸配列を検出および／または定量化することができる。第２相の増幅反応は、定量的増幅反応であり得る。第２の増幅産物を検出するための方法も記載される。第２の増幅産物の検出および／または定量化は、当該技術分野で既知の様々な検出技術を使用して行うことができる。検出および／または定量化は、例えば、検出プローブ、配列決定反応、電気泳動、質量分析、融解曲線分析、またはそれらの組み合わせを使用することによって達成することができる。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、検出プローブを使用して検出および／または定量化される。検出プローブは、分子トーチ（米国特許第６，５３４，２７４号に記載のトーチ）、分子ビーコン、ハイブリダイゼーションスイッチプローブ、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、検出および／または定量化は、リアルタイムで実施され得る。検出プローブは、実質的に等しい成功の度合いで、第１および／または第２相の増幅反応に含まれ得る。検出プローブは、第１および／または第２相の増幅反応混合物（例えば、ＡＭＰもしくはＡＭＰ１混合物および／またはＰＲＯもしくはＡＭＰ２混合物）中に供給され得る。いくつかの実施形態では、ＰＲＯ混合物は、検出プローブを含有する。検出プローブは、トーチを含むことができる。
【０１１４】
Ｄ．組成物およびキット
本開示は、試料中のＣＭＶの増幅、検出、および／または定量化に有用なオリゴマー、組成物、およびキットを提供する。オリゴマー、組成物、およびキットは、熱サイクリングおよび等温増幅方法、ならびに単相および／または多相増幅方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意のオリゴマーの組み合わせは、キット中に提供することができる。
【０１１５】
試料中のＣＭＶ標的核酸の存在もしくは不在を決定するため、またはその量を定量化するための反応混合物も記載される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本開示による反応混合物は、以下、オリゴマーの組み合わせ（増幅対）、ならびに任意選択的にＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子標的核酸の増幅のための本明細書に記載のヘルパーオリゴマーおよび／またはディスプレーサーオリゴマー、ならびにＣＭＶ増幅産物の存在もしくは不在を決定するための本明細書に記載の検出プローブオリゴマーのうちの少なくとも１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、様々な反応混合物は、標的捕捉（ＴＣＲ）混合物、増幅（ＡＲまたはＡＭＰ１）混合物、プロモーター（ＰＲまたはＡＭＰ２）混合物、および酵素（ＥＮＺ）混合物のうちの１つ以上を含む。反応混合物は独立して、試料中のＣＭＶ標的核酸の増幅および／または検出のための本明細書に記載のプロモータープライマー（例えば、Ｔ７プライマー）、非プロモータープライマー（ＮＴ７オリゴヌクレオチド）、ヘルパーオリゴマー、ディスプレーサーオリゴマー、ＴＣＯ、検出オリゴマー、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、緩衝液、塩、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含み得る。キットは、例えば、各々本明細書に記載のＴＥＲ、ＴＣＲ、ＡＭＰ１（ＡＲ）混合物、および／またはＡＭＰ２（ＰＲ）混合物のうちの１つ以上を含むことができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、キットは、対照ＴＣＯ、対照プロモータープライマー、対照非プロモータープライマー、対照検出オリゴマー、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、１つ以上の対照オリゴヌクレオチドを含む。キットは、ＣＭＶの増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドを含んでも、ＣＭＶおよび１つ以上の他の生物の増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【０１１８】
組成物、キット、および／または反応混合物は、例えば、（参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１３／０２０９９９２に記載のポリ−（Ｋ）捕捉プローブ、およびポリ−（Ａ）含有捕捉プローブを含むがこれらに限定されない）標的捕捉プローブなどのいくつかの任意選択的な構成要素をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、キット、組成物、または反応混合物（複数可）は、酵素（複数可）（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および／またはＲＮＡポリメラーゼ）、陽性対照核酸、陰性対照核酸、対照核酸、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ）、ＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、およびＣＴＰ）、Ｃｌ、ＭｇＣｌ２、酢酸カリウム、緩衝液、ＢＳＡ、スクロース、トレハロース、ＤＭＳＯ、ベタイン、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、アンモニウムイオン、ＥＤＴＡ、ならびに等温増幅および／または検出に好適な他の試薬または緩衝液のうちの１つ以上をさらに含有する。ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素であり得るが、これに限定されない。緩衝液は、トリス−ＨＣｌおよびトリス−酢酸であり得るが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００であり得るが、これらに限定されない。反応混合物は、ＣＭＶゲノムの１つの標的領域のみのための増幅オリゴマーを含んでも、複数のＣＭＶ標的領域のための増幅オリゴマーを含んでもよい。加えて、増幅オリゴマーの組み合わせと共に検出プローブを含む反応混合物については、反応混合物のための増幅オリゴマーおよび検出プローブオリゴマーの選択は、共通の標的領域によって連結される（すなわち、反応混合物は、反応混合物の増幅オリゴマーの組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含むであろう）。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、反応混合物は、ＫＣｌを含む。いくつかの実施形態では、ＫＣｌ濃度は、約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＫＣｌ濃度は、約５０ｍＭ超、例えば、約６０〜１５０ｍＭ、約７５〜１２５ｍＭ、約８０〜１２０ｍＭ、約８５〜１１５ｍＭ、または約９０〜１１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＫＣｌ濃度は、５５〜６５、６５〜７５、７５〜８５、８５〜９５、９５〜１０５、１０５〜１１５、１１５〜１２５、１２５〜１３５、または１３５〜１４５であり、上記の各々は、ｍＭであり、任意選択的に「約」によって修飾される。いくつかの実施形態では、本開示による組成物は、例えば、上記の濃度のいずれかのＫＣｌを含む。いくつかの実施形態では、本開示による方法は、例えば、上記の濃度のいずれかのＫＣｌの存在下で、増幅反応を実施することを含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ＣＭＶの増幅および／または検出のための記載のオリゴマーは、製造日から少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１５ヶ月、少なくとも１８ヶ月、または少なくとも２４ヶ月の貯蔵寿命を有する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、例えば、キットまたは組成物中に提供される。オリゴマーは一般に、例えば、ＣＭＶ核酸に特異的にハイブリダイズするように構成される標的ハイブリダイズ領域を含む。異なる長さおよび塩基組成のオリゴマーを使用して、ＣＭＶ核酸を増幅することができるが、いくつかの実施形態では、本開示のオリゴマーは、約１９〜４０塩基長、または約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０塩基長の標的ハイブリダイズ領域を有する。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどの標的ハイブリダイズ領域に加えて、標的ハイブリダイズ領域の５に位置し得る第２の配列領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、第２の配列領域を含まない。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、一方のオリゴマーが、ＣＭＶ核酸のセンス鎖にハイブリダイズするように構成され、他方が、ＣＭＶ核酸のアンチセンス鎖にハイブリダイズするように構成される、オリゴマーの対が提供される。そのようなオリゴマーは、ＰＣＲ、転写媒介増幅、または当該技術分野で既知の他の形態の増幅のためのプライマー対を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、プライマー対、またはプライマー対および（例えば、プローブとして使用するために）任意選択的に標識される第３のオリゴマーなどの１つ以上のオリゴマーは、ＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子にハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、プライマー対、またはプライマー対および（例えば、プローブとして使用するために）任意選択的に標識されている第３のオリゴマーなどの１つ以上のオリゴマーは、配列番号１および／またはその相補体によって表されるＣＭＶ配列にハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、１つ以上の内部対照プローブオリゴマーも提供される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、１つ以上のオリゴマーは、縮重位置を含む。いくつかの実施形態では、記載されたオリゴマーは、縮重位置を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のオリゴマーは、非ワトソンクリック（ＮＷＣ）位置を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、ＮＷＣ位置を含む。例示的なＮＷＣ位置には、表１Ａ〜Ｅの様々な例示的なオリゴマー中のＵ残基が含まれる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、セット、キット、組成物、または反応混合物中の１つ以上のオリゴマーは、メチル化シトシン（例えば、５−メチルシトシン）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、１、２、３、４、５以上のメチル化シトシンを含有する。いくつかの実施形態では、オリゴマー中のシトシンの少なくとも約半分は、メチル化されている。いくつかの実施形態では、オリゴマー中のシトシンの全てまたは実質的に全て（例えば、１つまたは２つを除く全て）は、メチル化されている。いくつかの実施形態では、３’末端または３’末端の２、３、４もしくは５塩基内のシトシンは、メチル化されていない。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、組成物またはキットは、トーチまたはビーコンを含むプローブオリゴマーを含む。各トーチは、フルオロフォアおよびクエンチャー、例えば、ＩＣトーチではアクリジンクエンチャーを有する６’−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、およびＣＭＶではダブシルクエンチャーを有するフルオレセイン（ＦＡＭ）を有する。ＣＭＶおよびＩＣ標的に関連するフルオロフォアは、異なる波長の光を放出するため、これらの標的を互いに区別することを可能にする。
【０１２７】
追加の構成要素または反応混合物、組成物、および／またはキットには、捕捉ビーズ、標的捕捉試薬、標的捕捉洗浄溶液、標的エンハンサー試薬、増幅試薬（凍結乾燥ケーキ）、増幅試薬再構成溶液、酵素試薬（凍結乾燥ケーキ）、酵素試薬再構成溶液、プロモーター試薬（凍結乾燥ケーキ）、プロモーター試薬再構成溶液、陽性キャリブレーター、ＣＭＶ陽性対照核酸、陰性対照核酸、および／または試料輸送培地が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、キットは、本開示による方法を実施するための一組の説明書をさらに含み、説明書は、添付文書、および／またはキットもしくはその構成要素の包装に関連し得る。
【０１２８】
本明細書に開示されるあらゆる方法が、本方法の目的に向けられた本方法に関与する材料の対応する使用の開示としても理解されるべきである。ＣＭＶ配列を含むオリゴマーのいずれか、ならびにそのようなオリゴマーを含む任意の組み合わせ（例えば、キットおよび組成物）は、ＣＭＶの検出および／もしくは定量化またはＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子配列の増幅に使用するため、ならびにＣＭＶの検出および／もしくは定量化またはＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子配列の増幅のための組成物の調製に使用するために開示されるものとしても理解されるべきである。
【０１２９】
Ｅ．ＣＭＶを増幅、検出、およびまたは定量化する方法
ＣＭＶを検出および／もしくは定量化する方法、または上記のオリゴマー、組成物、もしくはキットのうちの１つ以上を使用してＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子配列を増幅する方法が記載される。
【０１３０】
大まかに述べると、本方法は、以下の構成要素、（例えば、臨床試料などの試料からの）ＣＭＶ核酸がＴＣＯにアニーリングされている標的捕捉；捕捉オリゴマーと会合していない材料を除去するための単離、例えば、洗浄；増幅；および増幅と共にリアルタイムで実施され得るアンプリコン検出、例えば、アンプリコン定量化のうちの１つ以上を含むことができる。ある特定の実施形態は、上記のステップの各々を伴う。ある特定の実施形態は、任意選択的に先行する線形増幅ステップと共に、指数関数的増幅を伴う。ある特定の実施形態は、指数関数的増幅およびアンプリコン検出を伴う。ある特定の実施形態は、上に列挙した構成要素のうちのいずれか２つを伴う。ある特定の実施形態は、すぐ上に列挙した任意の２つの構成要素、例えば、洗浄および増幅、または増幅および検出を伴う。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、増幅は、（１）試料を、少なくとも２つのオリゴマーと接触させて、ＣＭＶ標的ＵＬ５６遺伝子核酸に対応するＣＭＶ核酸標的領域を増幅することであって、オリゴマーが、上記の少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む（例えば、指数的増幅のためにセンス方向に配向された１つ以上のプライマーおよびアンチセンス方向に配向された１つ以上のプライマー）、増幅することと、（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、試料に存在する任意のＣＭＶ標的核酸が、増幅産物を生成するための鋳型として使用される、実施することと、（３）増幅産物の存在または不在を検出し、それにより、試料中のＣＭＶの存在もしくは不在を決定すること、または試料中のＣＭＶ核酸の量を定量化することとを含む。
【０１３２】
本開示による検出方法は、本方法のその後のステップに供される試料を得るステップをさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、使用される試料を「得ること」は、例えば、本方法の１つ以上のステップが実施される試験施設もしくは他の場所で試料を受け取ること、および／または本方法の１つ以上のステップが実施される施設内の場所から（例えば、貯蔵施設もしくは他の保管所から）試料を検索することを含む。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、本方法は、例えば、捕捉ステップ前などの増幅前に、試料中の他の構成要素からＣＭＶ標的核酸を精製することをさらに含む。そのような精製は、試料中に含有される生物を他の試料構成要素から分離および／もしくは濃縮するか、または非核酸試料構成要素、例えば、タンパク質、炭水化物、塩、脂質などを除去もしくは分解する方法を含んでもよい。いくつかの実施形態では、試料中のＤＮＡは、例えば、ＤＮａｓｅを用いて分解され、任意選択的にＤＮａｓｅを除去もしくは不活性化するか、または分解されたＤＮＡを除去する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、標的核酸を精製することは、標的核酸を捕捉して、標的核酸を他の試料構成要素から特異的または非特異的に分離することを含む。非特異的標的捕捉方法は、実質的に水性の混合物からの核酸の選択的沈殿、他の試料構成要素を除去するために洗浄される支持体への核酸の付着、またはＣＭＶ核酸および他の試料構成要素を含有する混合物から核酸を物理的に分離する他の手段を伴ってもよい。
【０１３５】
標的捕捉は、典型的には、ハイブリダイズ条件下でＣＭＶ標的配列にハイブリダイズする１つ以上のＴＣＯを含有する溶液相混合物中で生じる。ＴＣＯを含む実施形態の場合、ＣＭＶ−標的：ＴＣＯ複合体は、ＴＣＯテールが固定化プローブにハイブリダイズするようにハイブリダイゼーション条件を調整することによって捕捉される。ある特定の実施形態は、常磁性ビーズなどの微粒子固体支持体を使用する。いくつかの実施形態では、プロモータープライマーは、捕捉中に存在する。ハイブリダイゼーション条件は、前増幅ハイブリッドの単離および精製を可能にするように調整される。
【０１３６】
単離は、捕捉の後に続くことができ、固体支持体上の複合体は、他の試料構成要素から分離される。単離は、任意の適切な技術、例えば、ＣＭＶ−標的配列と会合した支持体を１回以上（例えば、２回または３回）洗浄して、他の試料構成要素および／または非結合オリゴマーを除去することによって達成することができる。常磁性ビーズなどの微粒子固体支持体を使用する実施形態では、ＣＭＶ標的と会合した粒子は、洗浄溶液中で懸濁され、磁気的な引き付けによって洗浄溶液から回収され得る。取り扱いステップの数を制限するために、支持体上の複合体中のＣＭＶ標的配列を増幅オリゴマーと単に混合し、増幅ステップへと進めることによって、ＣＭＶ標的核酸を増幅してもよい。
【０１３７】
ＣＭＶ標的配列を指数関数的に増幅させることは、増幅される標的領域に隣接する少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用するインビトロ増幅反応を利用する。いくつかの実施形態では、上記の少なくとも第１（順方向）および第２（逆方向）のオリゴマーを使用して、標的配列を増幅する。増幅反応は、熱サイクリングまたは等温であり得る。好適な増幅方法には、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介または転写関連増幅（ＴＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
検出ステップは、例えば、増幅産物を標識された検出プローブとハイブリダイズし、標識されたプローブから（いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション後にプローブから放出された標識から、を含む）生じるシグナルを検出することなどによって、増幅された標的配列に特異的に関連するシグナルを検出するための様々な既知の技術のいずれかを使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、標識プローブは、上で考察されたように、クエンチャーまたは第１の標識と相互作用する他の部分などの第２の部分を含む。検出ステップは、例えば、その核酸塩基配列の全部または一部分など、増幅配列に関する追加の情報も提供し得る。検出は、増幅反応が完了した後に実施されても、例えば、リアルタイムでの標的領域の増幅と同時に実施されてもよい。いくつかの実施形態では、検出ステップは、均一な検出、例えば、混合物からハイブリダイズしていないプローブを除去することなくハイブリダイズしたプローブを検出することを可能にする（例えば、米国特許第５，６３９，６０４号および同第５，２８３，１７４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、核酸は、検出可能な電荷などの物理的変化をもたらす表面と会合する。増幅された核酸は、それらをマトリックスの中または上で濃縮し、核酸もしくはそれらに関連する色素（例えば、臭化エチジウムもしくはサイバーグリーンなどの挿入剤）を検出するか、または溶液相中の核酸に関連する色素の増加を検出することによって検出され得る。他の検出方法は、増幅産物中の配列に特異的にハイブリダイズし、プローブ：産物複合体の存在を検出するように構成される核酸検出プローブを使用しても、増幅産物に関連する検出可能なシグナルを増幅させ得るプローブの複合体を使用すること（例えば、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４２４，４１３号、同第５，４５１，５０３号、および同第５，８４９，４８１号）によってもよい。増幅産物と特異的に会合する直接的または間接的に標識されたプローブは、試料中の標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを提供する。特に、増幅産物は、ＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子中の配列またはそれに相補的な標的配列を含有し、プローブは、増幅産物に含有される配列に直接的にまたは間接的に結合して、試験試料中のＣＭＶ核酸の存在を示す。
【０１３９】
増幅ステップの終了近くまたは終了時に増幅産物を検出するいくつかの実施形態では、線形検出プローブを使用して、増幅産物へのプローブのハイブリダイゼーションを示すシグナルを提供してもよい。そのような検出の一例は、標的核酸にハイブリダイズする発光標識されたプローブを使用する。次いで、発光標識は、ハイブリダイズしていないプローブから加水分解される。検出は、ルミノメーターを使用して化学発光によって実施される（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ８９／００２４７６号を参照されたい）。リアルタイム検出を使用するいくつかの実施形態では、検出プローブは、例えば、プローブが増幅産物に結合するときに検出されるレポーター部分で標識される分子ビーコン、分子トーチ、またはハイブリダイゼーションスイッチプローブなどのヘアピンプローブであってもよい。そのようなプローブは、標的ハイブリダイズ配列および非標的ハイブリダイズ配列を含み得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、検出は、時間間隔で実施される。検出は、一定の時間間隔で蛍光を測定することによって行うことができる。時間間隔は、１〜６０秒、１〜１２０秒、１〜１８０秒、１〜２４０秒、または１〜３００秒であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、時間間隔は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０秒である。一定の時間間隔で実施される検出では、各間隔は、サイクルと称される。検出は、２０〜２４０サイクル、３０〜２１０サイクル、４０〜１８０サイクル、５０〜１５０サイクル、または６０〜１２０サイクルにわたって実施することができる。例えば、６０分間にわたる３０秒ごとの検出は、１２０サイクルをなす。検出は、サイクルの開始時に生じても、終了時に生じてもよい。検出は、継続的に実施されてもよい。
【０１４１】
本明細書に記載の組成物および方法の実施形態は、以下の実施例によってさらに理解することができる。実施例で使用される方法ステップは、本明細書で記載されており、以下の情報は、方法で使用される典型的な試薬および条件をより具体的に記載している。上記の説明に提供されるガイダンスに従う限り、プロセスまたは結果に実質的に影響を及ぼさない他の試薬および条件を使用してもよい。さらに、開示される方法および組成物は、手動で、または自動化されたデバイスにおいて１つ以上のステップ（例えば、ピペッティング、混合、インキュベーションなど）を実施するシステムで実施されても、任意の型の既知のデバイス（例えば、試験管、多管ユニットデバイス、９６ウェルマイクロタイタープレートなどの多ウェルデバイスなど）で使用されてもよい。
【０１４２】
Ｆ．実施形態の一覧
１．ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ５６遺伝子配列に由来する核酸の標的領域を増幅するためのキットであって、（ａ）配列番号２に存在する１９〜３１ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１９〜３１個の連続核酸塩基を含む順方向プライマーと、（ｂ）配列番号３に存在する２１〜４０ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する２１〜４０個の連続核酸塩基を含む逆方向プライマーとを含む、キット。
２．順方向プライマー、逆方向プライマー、または順方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１に記載のキット。
３．修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、または５’−メチルシトシンを含む、実施形態２に記載のキット。
４．順方向プライマーが、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１９の核酸塩基配列を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のキット。
５．順方向プライマーが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の核酸塩基配列を含む非プロモータープライマーである、実施形態４のいずれかに記載のキット。
６．逆方向プライマーが、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５の核酸塩基配列を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のキット。
７．逆方向プライマーが、配列番号６、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４７の核酸塩基配列を含む、実施形態６に記載のキット。
８．ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、順方向プライマーまたは逆方向プライマーの５’末端に連結している、実施形態１〜４または６〜７のいずれか１つに記載のキット。
９．ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列である、実施形態８に記載のキット。
１０．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、配列番号７８のヌクレオチド配列を含む、実施形態９に記載のキット。
１１．逆方向プライマーが、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、または配列番号４６の核酸塩基配列を含む、実施形態１０に記載のキット。
１２．順方向プライマーが、配列番号１１を含み、逆方向プライマーが、配列番号２３を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のキット。
１３．プローブオリゴマーをさらに含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のキット。
１４．プローブオリゴマーが、（ａ）配列番号５１もしくは配列番号５２の核酸塩基配列を含み、１つ以上のウラシルヌクレオチドが、チミンヌクレオチドに対して置換され得るか、または（ｂ）配列番号８１にハイブリダイズする２４〜３５個の連続核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１３に記載のキット。
１５．プローブオリゴマーが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１４に記載のキット。
１６．修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、または５’−メチルシトシンを含む、実施形態１５に記載のプローブオリゴマー。
１７．プローブオリゴマーが、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３９、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、または配列番号７１の核酸塩基配列を含む、実施形態１４〜１６のいずれか１つに記載のキット。
１８．プローブオリゴマーが、検出可能な標識を含有する、実施形態１４〜１７のいずれか１つに記載のキット。
１９．検出可能な標識が、蛍光分子を含む、実施形態１８に記載のキット。
２０．蛍光分子が、プローブオリゴマーの５’または３’末端に結合している、実施形態１９に記載のキット。
２１．プローブオリゴマーが、プローブオリゴマーの５’末端の４〜５個の核酸塩基に相補的である、プローブオリゴマーの３’末端に４〜５個の核酸塩基を含有する、実施形態１４〜２０のいずれか１つに記載のキット。
２２．蛍光分子が、プローブオリゴマーの５’末端に結合し、クエンチャーが、プローブオリゴマーの３’末端に結合するか、または蛍光分子が、プローブオリゴマーの３’末端に結合し、クエンチャーが、プローブオリゴマーの５’末端に結合する、実施形態２１に記載のキット。
２３．プローブオリゴマーが、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、または配列番号７０の核酸塩基配列を含む、実施形態２２に記載のキット。
２４．順方向プライマーが、配列番号１１を含み、逆方向プライマーが、配列番号２３を含み、プローブオリゴヌクレオチドが、配列番号５３を含む、実施形態１４〜２２のいずれか１つに記載のキット。
２５．配列番号２に存在する１９〜３１ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１９〜３１個の連続核酸塩基を含むヘルパーオリゴマーをさらに含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載のキット。
２６．ヘルパーオリゴマーが、ブロックされている、実施形態２５に記載のキット。
２７．ヘルパーオリゴマーが、配列番号１０または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、実施形態２５または２６に記載のキット。
２８．ヘルパーオリゴマーが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態２７に記載のキット。
２９．配列番号５に存在する２１〜２５ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する２１〜２７個の連続核酸塩基を含むディスプレーサーオリゴマーをさらに含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載のキット。
３０．ディスプレーサーオリゴマーが、配列番号１２、配列番号２５、または配列番号４１のヌクレオチド配列を含む、実施形態２９に記載のキット。
３１．ディスプレーサーオリゴマーが、配列番号６、配列番号１２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号８６、配列番号８７、および配列番号８８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態３０に記載のキット。
３２．配列番号６、配列番号８、配列番号４３、または配列番号４５のヌクレオチド配列を含む標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）をさらに含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載のキット。
３３．ＴＣＯが、ＴＣＯの単離を可能にする部分を含有する、実施形態３２に記載のキット。
３４．部分が、ポリＡヌクレオチド配列を含む、実施形態３３に記載のキット。
３５．部分が、（ｄＴ）３（ｄＡ）３０を含む、実施形態３３に記載のキット。
３６．ＴＣＯが、配列番号７、配列番号９、配列番号４２、または配列番号４４のヌクレオチド配列を含む、実施形態３５に記載のキット。
３７．キットが、配列番号４２のヌクレオチド配列を含む第１のＴＣＯと、配列番号４４のヌクレオチド配列を含む第２のＴＣＯとを含む、実施形態３２〜３６のいずれか１つに記載のキット。
３８．標的捕捉試薬、標的捕捉洗浄溶液、標的エンハンサー試薬、増幅試薬、酵素試薬、プロモーター試薬、ＣＭＶ陽性対照核酸、陰性対照核酸、試料輸送培地、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、緩衝液、ならびに陽性および／または陰性対照試料のうちの１つ以上をさらに含む、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載のキット。
３９．試料に存在するヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ５６遺伝子配列に由来する核酸の標的領域を増幅するための方法であって、
（ａ）試料を、ＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンを増幅するように構成された順方向プライマーおよび逆方向プライマーと接触させることであって、順方向プライマーが、配列番号２に存在する１９〜３１ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１９〜３１個の連続核酸塩基を含み、逆方向プライマーが、配列番号３に存在する２１〜４０ヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する２１〜４０個の連続核酸塩基を含む、接触させることと、
（ｂ）試料を、標的領域を増幅するのに十分な条件に曝露し、それにより、増幅産物を生成することとを含む、方法。
４０．順方向プライマーおよび／または逆方向プライマーが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、実施形態３９に記載の方法。
４１．少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、または５’−メチルシトシンを含む、実施形態４０に記載の方法。
４２．順方向プライマーが、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１９の核酸塩基配列を含み、逆方向プライマーが、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または配列番号４７の核酸塩基配列を含む、実施形態３９〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．順方向プライマーが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の核酸塩基配列を含み、逆方向プライマーが、配列番号６、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４７の核酸塩基配列を含む、実施形態４２に記載の方法。
４４．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、逆方向プライマーの５’末端に連結されている、実施形態４３に記載の方法。
４５．逆方向プライマーが、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、または配列番号４６の核酸塩基配列を含む、実施形態４４に記載の方法。
４６．順方向プライマーが、配列番号１１を含み、逆方向プライマーが、配列番号２３を含む、実施形態３９〜４３のいずれか１つに記載の方法。
４７．増幅産物の存在または不在を検出することをさらに含む、実施形態３９〜４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．増幅産物の存在または不在を検出することが、増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブオリゴマーを利用する、実施形態４７に記載の方法。
４９．プローブオリゴマーが、配列番号５１もしくは配列番号５２の核酸塩基配列を含み、１つ以上のウラシルヌクレオチドが、チミンヌクレオチドに対して置換され得るか、または（ｂ）配列番号８１にハイブリダイズする２４〜３５個の連続核酸塩基を含むヌクレオチド配列を含む、実施形態４８に記載の方法。
５０．プローブオリゴマーが、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３９、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、または配列番号７１の核酸塩基配列を含む、実施形態４９に記載の方法。
５１．プローブオリゴマーが、プローブオリゴマーの５’末端の４〜５個の核酸塩基に相補的である、プローブオリゴマーの３’末端に４〜５個の核酸塩基を含有する、実施形態４８〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．蛍光分子が、プローブオリゴマーの５’末端に結合し、クエンチャーが、プローブオリゴマーの３’末端に結合するか、または蛍光分子が、プローブオリゴマーの３’末端に結合し、クエンチャーが、プローブオリゴマーの５’末端に結合する、実施形態５１に記載の方法。
５３．プローブオリゴマーが、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、または配列番号７０の核酸塩基配列を含む、実施形態５２に記載の方法。
５４．順方向プライマーが、配列番号１１を含み、逆方向プライマーが、配列番号２３を含み、プローブオリゴヌクレオチドが、配列番号５３を含む、実施形態３９〜４４および４６〜５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．増幅することが、熱サイクリング反応を含む、実施形態３９〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．熱サイクリング反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、実施形態５５に記載の方法。
５７．増幅することが、等温核酸増幅反応を含む、実施形態３９〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５８．等温核酸増幅反応が、転写媒介増幅（ＴＭＡ）を含む、実施形態５７に記載の方法。
５９．増幅することが、核酸配列ベースの増幅、レプリカーゼ媒介増幅、Ｑβ−レプリカーゼ媒介増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または鎖置換増幅（ＳＤＡ）を含む、実施形態３９〜５４のいずれか１つに記載の方法。
６０．増幅されたＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンの存在または不在を検出することが、増幅されたＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンを定量化することをさらに含む、実施形態４７〜５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．増幅されたＣＭＶ  ＵＬ５６アンプリコンを定量化することが、ＣＭＶアンプリコンの産生を監視することを含む、実施形態６０に記載の方法。
６２．検出することおよび／または定量化することが、リアルタイムで分析される、実施形態４７〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．試料中のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ５６遺伝子標的核酸配列を定量化する方法であって、
（ａ）試料を、配列番号４３または配列番号４５の核酸塩基配列を含む少なくとも１つの標的捕捉オリゴマー（ＴＣＯ）および配列番号４７の核酸塩基配列を含む第１のプロモータープライマーと、ＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子標的核酸配列への少なくとも１つのＴＣＯおよび第１のプロモータープライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させ、それにより、少なくとも１つのＴＣＯおよび第１のプロモータープライマーの各々にハイブリダイズした標的核酸配列を含む前増幅ハイブリッドを生成することと、
（ｂ）固体支持体への標的捕捉およびそれに続く洗浄によって前増幅ハイブリッドを単離して、ステップ（ａ）でＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子標的核酸配列にハイブリダイズしなかった第１のプロモータープライマーのいずれも除去することと、
（ｃ）第１相の実質的に等温の転写関連増幅反応において、その線形増幅は支持するが、その指数関数的増幅は支持しない条件下で、配列番号１９の核酸塩基配列を含む非プロモータープライマーを含む第１相の増幅反応混合物中で、ステップ（ｂ）で単離された前増幅ハイブリッドのＣＭＶ  ＵＬ５６遺伝子標的核酸配列の少なくとも一部分を増幅し、それにより、第１の増幅産物を含む反応混合物をもたらすことであって、第１の増幅産物が、第１相の実質的に等温の転写関連増幅反応中の核酸合成の鋳型ではない、もたらすことと、
（ｄ）第１の増幅産物を、配列番号４７の核酸塩基配列を含む第２のプロモータープライマーおよび配列番号５７の核酸塩基配列を含むプローブオリゴマーを含む第２相の増幅反応混合物と組み合わせ、第２相の増幅反応混合物中の第２相の実質的に等温の転写関連増幅反応において、第１の増幅産物の指数関数的増幅を実施し、それにより、第２の増幅産物を合成することと、
（ｆ）一定の時間間隔でプローブオリゴマーを用いて、第２相の増幅反応混合物中の第２の増幅産物の合成を検出することと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の結果を使用して、試料中の標的核酸配列を定量化することとを含む、方法。
６４．少なくとも１つのＴＣＯが、配列番号４３の核酸塩基配列を含む第１のＴＣＯと、配列番号４５の核酸塩基配列を含む第２のＴＣＯとを含む、実施形態６３に記載の方法。
６５．第１および第２のプロモータープライマーが各々、ＲＮＡポリメラーゼの５’プロモーター配列を含む、実施形態６３または６４に記載の方法。
６６．ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、実施形態６５に記載の方法。
６７．固体支持体が、固定化捕捉プローブを含む、実施形態６３〜６７のいずれか１つに記載の方法。
６８．固体支持体が、磁気的に引き付け可能な粒子である、実施形態６７に記載の方法。
６９．第１相および第２相の等温転写関連増幅反応の各々が、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含み、逆転写酵素が、内因性ＲＮａｓｅＨ活性を含む、実施形態６３〜６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．ステップ（ｃ）の第１の増幅産物が、試料中の標的核酸配列と同じ極性を有するｃＤＮＡ分子であり、ステップ（ｄ）の第２の増幅産物が、ＲＮＡ分子である、実施形態６３〜６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．ステップ（ｄ）の第プローブオリゴマーが、第２の増幅産物にハイブリダイズするときに検出可能なシグナルを生成する立体配置高感度プローブである、実施形態６３〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．ステップ（ｄ）のプローブオリゴマーが、蛍光標識された配列特異的ハイブリダイゼーションプローブである、実施形態６３〜７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．第１のＴＣＯが、配列番号４２の核酸塩基配列を含み、第２のＴＣＯが、配列番号４４の核酸塩基配列を含み、第１および第２のプロモータープライマーが各々、配列番号４６の配列の核酸塩基を含み、プローブオリゴマーが、配列番号５６の核酸塩基配列を含む、実施形態６４〜７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．第１相の増幅反応混合物および／または第２相の増幅反応混合物が、ヘルパーオリゴマーおよび／またはディスプレーサーオリゴマーをさらに含む、実施形態６３〜７３のいずれか１つに記載の方法。
７５．ヘルパーオリゴマーが、１９〜３１核酸塩基長であり、配列番号１４の核酸塩基配列を含み、ディスプレーサーオリゴマーが、２１〜２７核酸塩基長であり、配列番号４１の核酸塩基配列を含む、実施形態７４に記載の方法。
７６．ヘルパーオリゴマー、ディスプレーサーオリゴマー、またはヘルパーオリゴマーおよびディスプレーサーオリゴマーの両方が、ブロックされている、実施形態７４または７５に記載の方法。
【実施例】
【０１４３】
実施例１．ＣＭＶ増幅．ＣＭＶの塩とオリゴマーとの様々な濃度の組み合わせを評価して、好適な条件の増幅を決定した。プライマー、プローブ、ＫＣｌ、およびＭｇＣｌ２混合物を混合することによって、ＰＰＲ（再構成緩衝液を含有するプライマープローブ）混合物を作製した。以下の混合物を作製して、ＣＭＶ  ＤＯＥに使用した。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
2021534758.tif 000015
【０１４４】
ＰＰＲ混合物１〜１２をボルテックスし、スピンダウンし、２５０μＬの油を上部に添加し、再度スピンダウンしてから、機器に充填した。ＰＰＲ混合物１３もスピンダウンしたが、２５０μＬの代わりに４００μＬの上部の油を用いた。
【０１４５】
節１のＰＰＲ混合物で試験するために、ＣＭＶプラスミドを１０００ｃｐ／ｒｘｎに希釈した。以下を行うことによって、ＣＭＶプラスミドをＳＴＭ中で１０００ｃｐ／ｒｘｎに希釈した。
【表１−９】
2021534758.tif 000016
【０１４６】
３４ｍｌを３０本の管にアリコートした。３０本全ての管をＰａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で処理し、各管の２回の抽出および各抽出あたり３回の複製を行った（ＰＰＲ１〜１２ではｎ＝１２およびＰＰＲ１３ではｎ＝３６）。以下のパラメータを有するＤｅｖＴｏｏｌ（４．９．８．０）を使用して、データを分析した。
【表１−１０】
2021534758.tif 000017
【表１−１１】
2021534758.tif 000018
【表１−１２】
2021534758.tif 000019
【表１−１３】
2021534758.tif 000020
【表１−１４】
2021534758.tif 000021
【０１４７】
シグナル対ノイズは、高塩分および高オリゴマーで最高のままである。オリゴマーの低下は、シグナル対ノイズにわずかに影響を及ぼすに過ぎない。いくつかの実施形態では、塩は、＞４ｍＭであった。
【０１４８】
結論：Ｃｔおよびベースラインは、プライマー＋Ｍｇおよびプライマー＋プローブ、ＲＦＵプライマー＋Ｍｇおよびプローブ＋Ｍｇで有意性を示す。全てが、０．０００１を超える適合性の欠如を示し、ＲＦＵは０．０４１２の最低値を示す。最も望ましい選択肢は、１μＭのプライマー、０．８μＭのプローブ、および６ｍＭのＭｇＣｌである。しかしながら、より少ないＭｇＣｌは、非常に良い結果も示す。より低い塩分は、ＲＦＵを増加させ、バックグラウンドも増加させるため、ＪＰＭは、バックグラウンドのみに基づいて、６ｍＭを最適と推定する可能性が高い。しかし、より少ないプライマーおよびプローブは、同様のＣｔを示すが、各０．２μＭの差ごとにＲＦＵの２０％の低下をもたらす。データは、Ｃｔは５７％の可変性を占めるに過ぎないが、ＲＦＵおよびベースラインは９０％および９４％であるため、Ｃｔが全ての条件にわたって類似し過ぎていることを示唆する。
【０１４９】
実施例２：ＣＭＶプラスミドの検出限界。ＣＭＶプラスミドを血清中で評価して、検出限界（ＬｏＤ）を決定した。４５０μＬの標的捕捉試薬および１２６μＬの標的エンハンサー試薬と組み合わせた３６０μＬの試料を使用して、試料溶解を実施した。インキュベーション後、混合物を標的捕捉洗浄試薬で洗浄し、５０μＬの最終体積で溶出した。ＣＭＶ  ＰＰＲを作製して、血清中のプラスミドのＬｏＤを決定した。
【表２−１】
2021534758.tif 000022
【０１５０】
２本の管を用意した。一方は、再構成管中に１２００μＬのＰＰＲ混合物および４００μＬの油を上部に添加した。他方は、８５０μＬのＰＰＲ混合物を再構成管に添加し、３５０μＬの油を上部に添加した。機器に充填する前に、全ての管を再度スピンダウンした。ＣＭＶプラスミドを血清中で３つの濃度に希釈し、節１のＰＰＲ混合物で試験した。以下を行うことによって、ＣＭＶプラスミドをプールされた血清中で１００、１０、および１ｃｐ／ｒｘｎに希釈した。
【表２−２】
2021534758.tif 000023
【表２−３】
2021534758.tif 000024
【０１５１】
プールされた血清試料は、各３ｍｌの血清０５１〜０５６からなった。４００μＬの２０ｍｇ／ｍＬのストックＰｒｏＫ溶液を７６００μＬのＳＴＭに添加することによって、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを有するＳＴＭを調製した。
【０１５２】
１２３０μＬの各濃度のＣＭＶプラスミドを、２．２の１２３０μＬのＳＴＭ：ＰｒｏＫ（溶液輸送培地：プロテイナーゼＫ）混合物を含有する２本の管に添加した。残りの体積は溶解せず、必要に応じて−７０℃で貯蔵した。各管は、各濃度ｎ＝２０で、１０回のＰＣＲ複製（３回の抽出では３回のＰＣＲ複製および第４では１回のＰＣＲ複製で４回の抽出）で処理した。３９０ｕｌのＳＴＭ：ＰｒｏＫ混合物および３９０μＬの血清プールからなる陰性対照を作製した。１回の抽出を、抽出あたり３回のＰＣＲ複製で処理した。全ての試料を処理し、以下のパラメータを有するＤｅｖＴｏｏｌ（４．９．８．０）を使用して、データを分析した。
【表２−４】
2021534758.tif 000025
【０１５３】
結論：プールされた血清中のＣＭＶプラスミドのＬｏＤは、１０ｃｐ／ｒｘｎ、または９５％で溶解した試料管中で２７７．７８ｃｐ／ｍｌである。ＴＭＡ  ＣＭＶチームでは、プラスミドは、血清中で試験されていない。
【表２−５】
2021534758.tif 000026
【表２−６】
2021534758.tif 000027
【０１５４】
実施例３：血清および血漿中のＣＭＶ予備ウイルス検出限界。実施例２に記載の１ログの増分、および１：０．２のＳＴＭ比で、血清および血漿中のＣＭＶウイルス（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）について、検出限界を決定した。
【０１５５】
ＣＭＶ  ＰＰＲを作製して、血清および血漿中のウイルスのＬｏＤを決定した。以下のＰＰＲ混合物である。
【表３−１】
2021534758.tif 000028
【０１５６】
２本の管を用意した。一方は、再構成管中に１１００μＬのＰＰＲ混合物および４００μＬの油を上部に添加した。他方は、１０００μＬのＰＰＲ混合物を再構成管に添加し、４００μＬの油を上部に添加した。機器に充填する前に、全ての管を再度スピンダウンした。ＣＭＶウイルスを血清および血漿中で５つの濃度に希釈し、節１のＰＰＲ混合物で試験した。以下を行うことによって、ＣＭＶをプールされた血清およびプールされた血漿中で１００００、１０００、１００、１０、および１のＴＣＩＤ５０／ｍｌに希釈した。
【表３−２】
2021534758.tif 000029
【表３−３】
2021534758.tif 000030
【０１５７】
プールされた血清試料は各々、３ｍｌの血清からなり、プールされた血漿は各々、３ｍｌの血漿からなった。濃度は、１００のＴＣＩＤ５０／ｍｌのＢｉｏＦｉｒｅ  ＬｏＤに基づく。２．６ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを有するＳＴＭを、以下を行うことによって調製した。
【表３−４】
2021534758.tif 000031
【０１５８】
ＰｒｏＫがＳＴＭ中に長時間置かれないことを確実にするために、この混合物は、試料を溶解する準備ができる直前に作製された。血清および血漿の両方における８００μＬの各濃度のＣＭＶプラスミドを、１８５μＬのＳＴＭ：ＰｒｏＫ混合物を含有する１本の管に添加した。各管を２回の抽出および３回のＰＣＲで処理した。１１５μＬのＳＴＭ：ＰｒｏＫ混合物、ならびに５００μＬの血清プールおよび血漿プールからなる陰性対照を、別々に作製した。１回の抽出を、抽出あたり３回のＰＣＲ複製で処理した。全ての試料を、Ｐａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）で処理した。以下のパラメータを有するＤｅｖＴｏｏｌ（４．９．８．０）を使用して、データを分析した。
【表３−５】
2021534758.tif 000032
【表３−６】
2021534758.tif 000033
【表３−７】
2021534758.tif 000034
【０１５９】
血清の１Ｅ１（すなわち、１×１０１または１０）のＴＣＩＤ５０／ｍｌは、抽出ごとにほぼ１ログの差をもたらした。１本の管のみを処理したため、全ての抽出は、同じ管からのものであった。これは、珍しい出来事である。同じ濃度の血漿は、期待される結果をもたらした。全ての他の試料も、抽出／ＰＣＲ複製間で同様の結果をもたらした。
【０１６０】
結論：予備的なＬｏＤは、血清および血漿の両方において約１０のＴＣＩＤ５０／ｍｌの１００％の検出を示す。Ｃｔには遅延が存在するため、血漿に何らかの阻害の問題を有したか、またはウイルス自体の分解をもたらしたようである。また、１Ｅ１のＴＣＩＤ５０／ｍｌの血清の結果は、高い標準偏差を示した。半分のログの増分でのさらなる分析は、血清および血漿中のＣＭＶウイルスの真のＬｏＤの決定に役立つ。
【０１６１】
実施例４．血清および血漿中のＣＭＶ予備ウイルス検出限界。実施例２に記載の半分のログの増分、および１：０．２のＳＴＭ比で、血清および血漿中のＣＭＶウイルス（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）について、検出限界を決定した。ＣＭＶ  ＰＰＲを作製して、血清および血漿中のウイルスのＬｏＤを決定した。以下のＰＰＲ混合物を作製した。
【表４−１】
2021534758.tif 000035
【０１６２】
５本の管を用意した。４本は、再構成管中に１２００μＬのＰＰＲ混合物および４００μＬの油を上部に添加した。他方は、４００μＬのＰＰＲ混合物を再構成管に添加し、２５０μＬの油を上部に添加した。機器に充填する前に、全ての管を再度スピンダウンした。ＣＭＶウイルスを血清および血漿中で４つの濃度に希釈し、節１のＰＰＲ混合物で試験した。以下を行うことによって、ＣＭＶをプールされた血清およびプールされた血漿中で３１．６、１０、３．１６、および１のＴＣＩＤ２０／ｍｌに希釈した。
【表４−２】
2021534758.tif 000036
【表４−３】
2021534758.tif 000037
【０１６３】
プールされた血清試料は各々、３ｍｌの血清からなり、プールされた血漿は各々、３ｍｌの血漿からなった。２．６ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを有するＳＴＭを、以下を行うことによって調製した。
【表４−４】
2021534758.tif 000038
【０１６４】
ＰｒｏＫがＳＴＭ中に長時間置かれないことを確実にするために、この混合物は、試料を溶解する準備ができる直前に作製された。血清および血漿の両方における１４００μＬの各濃度のＣＭＶプラスミドを、３２５μＬのＳＴＭ：ＰｒｏＫ混合物を含有する２本の管に添加した。各管を、１回のＰＣＲ複製で１回の抽出と共に、３回の抽出および３回のＰＣＲ複製で各々処理した。２本の管を処理したため、濃度あたりｎ＝２０であった。１１５μＬのＳＴＭ：ＰｒｏＫ混合物、ならびに５００μＬの血清プールおよび血漿プールからなる陰性対照を別々に作製した。１回の抽出を、抽出あたり３回のＰＣＲ複製で処理した。全ての試料を、Ｐａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎシステムで処理した。以下のパラメータを有するＤｅｖＴｏｏｌを使用して、データを分析した。
【表４−５】
2021534758.tif 000039
【表４−６】
2021534758.tif 000040
【表４−７】
2021534758.tif 000041
【表４−８】
2021534758.tif 000042
【０１６５】
２０回のＰＣＲ複製のうち、６回は、平均と比較して非常に早期であった。６つ全てが、同じ管からのものであった（抽出１および２）。
【０１６６】
結論：血漿および血清中のＣＭＶのＬｏＤは、幾分可変的である。Ｃｔには２つのマトリックス間で差が存在するため、血漿は、１００％のＣＭＶ検出を防ぐ阻害剤を有する可能性がある。血漿は、３．１６のＴＣＩＤ５０／ｍｌのＬｏＤ、つまりＢｉｏＦｉｒｅあたり１３５．９ｃｐ／ｍｌを有する。血清は、１のＴＣＩＤ５０／ｍｌのＬｏＤ、つまりＢｉｏＦｉｒｅあたり４３ｃｐ／ｍｌを示す。
【０１６７】
実施例５．分析物特異的試薬ＣＭＶ反応性およびＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ  ＣＭＶ対照の分析。ＣＭＶの４つの株とのＣＭＶ反応性を、現在のＣＭＶ  ＰＣＲオリゴセットを使用して評価した。全てのＣＭＶ単離株を、元の株の１０倍のＬｏＤで試験した。Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）のＣＭＶ対照を分析して、ウイルス全体からのｃｐ／ｍｌでのアッセイ感度を決定し、ＴＣＩＤ５０／ｍｌでの同じ株の範囲の決定にも役立てた。以下のＣＭＶ  ＰＰＲを調製した。
【表５−１】
2021534758.tif 000043
【０１６８】
１本の再構成管を、１２００μＬのＰＰＲ混合物および４００μＬの油で調製し、もう１本を、７００μＬのＰＰＲ混合物および上部の３００μＬの油で調製した。全ての管をスピンダウンしてから、Ｐａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎシステムに充填した。ＣＭＶウイルス単離株を、血漿中で１Ｅ１．５  ＴＣＩＤ５０／ｍｌに希釈し、ＰａｎｔｈｅｒＦｕｓｉｏｎシステムで処理した。
【表５−２】
2021534758.tif 000044
【０１６９】
（血漿中で）以下を行うことによって、ＣＭＶウイルスストックを１Ｅ１．５  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（ＡＤ−１６９株では１０×ＬｏＤ）に希釈した。
【表５−３Ａ】
2021534758.tif 000045
【表５−３Ｂ】
2021534758.tif 000046
【表５−３Ｃ】
2021534758.tif 000047
【表５−３Ｄ】
2021534758.tif 000048
【０１７０】
以下を行うことによって、ＰｒｏＫを（試料中最終０．５ｍｇ／ｍｌになるように）３ｍｇ／ｍｌでＰＢＳに添加した。
【表５−４】
2021534758.tif 000049
【０１７１】
３１．６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの８００μＬの各ウイルス試料を、１６０μのＰＢＳ：ＰｒｏＫ混合物に添加し、上下にピペッティングすることによって混合した。Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘからの不活性化ウイルスストック（ｃｐ／ｍｌ）も分析して、アッセイ感度を決定した。以下を行うことによって、ストックをＰＢＳ中に希釈した。
【表５−５】
2021534758.tif 000050
【０１７２】
陰性対照を処理し、これは１００μＬのＰＢＳ：ＰｒｏＫ混合物を有する５００μＬの血漿プールからなった。陰性対照を除く全ての試料を、２回の抽出（各抽出あたり３回のＰＣＲ複製）で処理した。陰性対照を、１回の抽出および３回のＰＣＲ複製で処理した。全ての試料を、以下の配列ファイルを使用してＰａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎシステムで処理した。
【表５−６】
2021534758.tif 000051
【０１７３】
データ分析を、以下のパラメータに従って実施した。
【表５−７】
2021534758.tif 000052
【表５−８】
2021534758.tif 000053
【表５−９】
2021534758.tif 000054
【表５−１０】
2021534758.tif 000055
【０１７４】
結論：非常に早期に出現した株は、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ中で最低の濃度を有した。この単離株は、数週間後に低い力価に達するにすぎなかった。しかしながら、それは、早期のＣｔをもたらした。全ての単離株について、各々の真のＬｏＤは、ＡＤ−１６９株よりも低く、１  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ未満である。ＰＢＳ中の不活性化ウイルスＮＡＴｔｒｏｌのＬｏＤは、１００〜１０ｃｐ／ｍｌであり、これは、ＰＣＲの理論上の限界である。ウイルス株ＴＣＩＤ５０／ｍｌは、３．１６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜１  ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。ＢｉｏＦｉｒｅは、４３および１３６ｃｐ／ｍｌであった。機器に搭載されたＰＣＲ効率は、３．４の勾配および０．９８超のＲ２を生成する。
【０１７５】
実施例６．ＣＭＶ特異性。ＣＭＶ特異性を、ＣＭＶチーム変換に基づいて１Ｅ＋０６ｃｐ／ｍｌに可能な最も近い濃度に基づいて評価した。ＣＭＶ  ＰＰＲを調製した。以下のＣＭＶ  ＰＰＲを調製した。
【表６−１】
2021534758.tif 000056
【０１７６】
１本の再構成管を、１０００μＬのＰＰＲ混合物および上部の４００μＬの油で調製した。全ての管をスピンダウンしてから、Ｐａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎシステムに充填した。ＳＤ−ＡＪＨ−０００２６３の８つのパネルを、Ｐａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎシステム（１回の抽出および抽出あたり３回のＰＣＲ複製）で試験した。陽性対照を試験し、これは１０００ｃｐ／ｍｌのＣＭＶプラスミドからなった。
【表６−２】
2021534758.tif 000057
【０１７７】
陰性対照を処理し、これは６００μＬのＳＴＭからなった。両方の対照を、１回の抽出および１回のＰＣＲ複製で処理して、ＰＰＲが正しく行われたかどうかを決定した。全ての試料を、以下の配列ファイルを使用してＰａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎシステムで処理した。
【表６−３】
2021534758.tif 000058
【０１７８】
データ分析を、以下のパラメータに従って実施した。
【表６−４】
2021534758.tif 000059
【表６−５】
2021534758.tif 000060
【表６−６】
2021534758.tif 000061
【０１７９】
高い細胞／ｃｐ計数を有するパネルは、ＩＣ  Ｃｔの遅延を示した。
【０１８０】
結論：全てのパネルは、ＣＭＶに対して陰性であり、ＩＣに対して陽性であった。
【０１８１】
実施例７．ＣＭＶ陽性およびＣＭＶ陰性血漿臨床試料の分析。５０個のＣＭＶ陽性および５０個のＣＭＶ陰性血漿試料を評価して、ＣＭＶ  ＰＣＲアッセイの性能を決定した。検体を、１０×ＴＣＯおよび０．５ｍｇ／ｍｌのＰｒｏＫを有する１：０．２のＰＢＳで試験した。以下のＰＰＲ混合物を調製した。
【表７−１】
2021534758.tif 000062
【０１８２】
４つのＰＰＲは、１２００μＬを再構成管に添加し、４００μＬの油を上部に添加した。
【表７−２】
2021534758.tif 000063
【０１８３】
４つのＰＰＲは、１２００μＬを再構成管に添加し、４００μＬの油を上部に添加した。５０個のＣＭＶ陰性および５０個のＣＭＶ陽性臨床血漿を、各ＰＰＲ混合物で試験した。追加の１０×ＴＣＯおよび３ｍｇ／ｍｌのＰｒｏＫをＰＢＳに添加し、１００μＬを標識した管に添加した：１Ｌあたり０．６６６ｍｇ、０．０００６６６ｍｇ／ｍｌ、０．０００２９９７ｍｇ／ｒｘｎ、３６０μＬの試料入力、試料／反応物中０．０００３ｍｇ、０．００３０ｍｇの１０×試料／反応物
【表７−３】
2021534758.tif 000064
【０１８４】
処理した陰性は、６００μＬのＰＢＳを含んだ。陽性対照は、５０ｃｐ／ｒｘｎでスパイクされたＰＢＳ中のＣＭＶプラスミドからなった。
【０１８５】
ステップ１．初期希釈
ストック濃度＝１．００×１０７
最終濃度＝１．００×１０５
ストック体積（μＬ）＝１０
ＰＢＳのμＬ＝９９０
最終体積（μＬ）１０００
【０１８６】
ステップ２．ＳＴＭ中のＣＭＶキャリブレーター、必要な濃度（計算）
開始濃度（ｃｐ／ｍｌ）＝１．００×１０５
５μＬのｒｘｎあたりの試験量（ｃｐ）＝５０
「検体」管中のｃｐ／ｍＬ＝１３８８．８９
開始体積（μＬ）＝２２
ＰＢＳのμＬ＝１５７８
最終体積（μＬ）＝１６００
【０１８７】
全ての臨床検体を、２．１から１００μＬのＰＢＳ／ＰｒｏＫ／ＴＣＯ混合物を含有する管に５００μＬ添加し、３回上下に混合することによって混合した。試料を、以下の表に従うことによって試験した。
【表７−４】
2021534758.tif 000065
【０１８８】
２５個の陽性および２５個の陰性試料を、各々１つの機器で処理した。試料を、以下のＤＮＡ熱サイクリング条件を使用してＰａｎｔｈｅｒＦｕｓｉｏｎシステムで処理した。
【表７−５】
2021534758.tif 000066
【０１８９】
データ分析を、以下のパラメータに従って実施した。
【表７−６】
2021534758.tif 000067
【０１９０】
不一致の試料を、１つの高陽性および１つの低陽性と共に、ＣＭＶ  ＴＭＡ試験のために処理した。
【表７−７】
2021534758.tif 000068
【表７−８−１】
2021534758.tif 000069
【表７−８−２】
2021534758.tif 000070
【０１９１】
注記：マルチコア対シングルコアは、ＲＥＤ６７７バックグラウンドの差、およびしたがって全体的なＲＦＵ値の差をもたらした。注記：ＣＭＶ＿Ｎｅｇ２２は、異常な曲線をもたらし、プローブの塩基対ミスマッチを示している可能性がある。
【表７−９−１】
2021534758.tif 000071
【表７−９−２】
2021534758.tif 000072
【表７−１０】
2021534758.tif 000073
【０１９２】
注記：ＣＭＶ１１２は、異常な曲線をもたらし、プローブの塩基対ミスマッチを示している可能性がある。
【表７−１１】
2021534758.tif 000074
【表７−１２】
2021534758.tif 000075
【０１９３】
注記：ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＣＭＶ試験（「Ｒｏｃｈｅ」または「Ｒｏｃｈｅ試験」）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ）を使用して陰性であり、ＣＭＶ  ＰＣＲによって陽性であった全ての試料は、ＣＭＶ  ＴＭＡ定量化によって陽性であった。これらの値は、低陽性および高陽性と共に、２つのアッセイのＴＴｉｍｅとＣｔとの間に強い相関関係を返した。ＴＴｉｍｅは、試料の増幅および検出反応中に試料シグナル値が閾値シグナル値（典型的には、所定のバックグラウンドシグナル値）を超えたときの増幅時間を表すのに使用される用語である。
【０１９４】
結論：５０個のＲｏｃｈｅ試験陰性血漿検体の初期試験では、４４／５０個が、ＣＭＶ  ＰＣＲによって陰性であった（８０％）。６つの不一致が、ＣＭＶ  ＴＭＡ定量によって陽性であることが確認され、これはＴＴｉｍｅとＣｔとの間の値に強い相関関係を示した。これにより、６つの検体をデータセットから除外した場合、１００％の特異性が得られる。
【０１９５】
４０／５０個の試料は、ＣＭＶ  ＰＣＲによって陽性であったが、Ｒｏｃｈｅ試験では５０個の試料全てがＣＭＶについて陽性であった。１０個の検体を、ＣＭＶ  ＴＭＡ定量化によって試験し、８個の検体は低陽性であり、理論上の限界未満であった（したがって、初期試験では陽性ではなかった）。他の２つも、ＣＭＶ  ＴＭＡ定量化によって陰性であった。陽性だった８つは、Ｒｏｃｈｅによって与えられるＩＵ／ｍｌをはるかに下回った（１〜３ログより低い）。ＣＭＶ  ＰＣＲアッセイは、５〜１０ｃｐ／ｒｘｎの範囲内の検体をピックアップする能力および１００％の特異性を有する有望な結果を示す。
【０１９６】
実施例８．ＣＭＶオリゴスクリーニング。様々な組み合わせのＣＭＶオリゴマー設計を、ＣＭＶプラスミドを使用して評価した。設計は、ＣＭＶ  ＴＭＡオリゴマー設計に基づく。ＣＭＶオリゴマーを、様々な組み合わせでスクリーニングし、試験した。以下のＰＰＲ混合物を作製した。
【表８−１−１】
2021534758.tif 000076
【表８−１−２】
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【表８−１−３】
2021534758.tif 000078
【０１９７】
５５０μＬのＰＰＲ混合物を８つ別々の再構成管に添加し、２５０μＬの油を各々の上部に添加した。機器に充填する前に、全ての管を再度スピンダウンした。
【０１９８】
ＣＭＶプラスミドを、ＰＰＲ混合物を有するＳＴＭ中、３つの濃度で試験した。以下を行うことによって、ＣＭＶプラスミドを１０００、１００、および１０ｃｐ／ｒｘｎに希釈した。
【表８−２】
2021534758.tif 000079
【０１９９】
各濃度あたり１．３４ｍｌを４本の管に添加した。各管の１回の抽出を、抽出あたり３回のＰＣＲ複製で処理した。陰性対照も試験し、これは２．９ｍｌのＳＴＭのみからなった。１回の抽出でＮ＝３。全ての試料を、Ｐａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎシステムで処理した。以下のパラメータを有するＤｅｖＴｏｏｌを使用して、データを分析した。
【表８−３】
2021534758.tif 000080
【表８−４】
2021534758.tif 000081
【表８−５−１】
2021534758.tif 000082
【表８−５−２】
2021534758.tif 000083
【０２００】
結論：結果は、全てのオリゴセットについて１０ｃｐ／ｒｘｎまで１００％の検出を示す。最良の組み合わせには、配列番号１１および配列番号２３が含まれる。いずれのプローブも良好な結果を示し、配列番号５３は、１０００ｃｐ／ｒｘｎではるかに高いＲＦＵおよびより高いシグナル対ノイズ比を示し、配列番号５３は、１００および１０ｃｐ／ｒｘｎでより高いＲＦＵを示す。配列番号１３、配列番号２３、および配列番号５３も、全ての濃度で良好な結果を示すが、配列番号１１／配列番号２３の組み合わせと比較して、１０ｃｐ／ｒｘｎで遅れ始める。
【０２０１】
実施例９．ＣＭＶ定量化。ＣＭＶ定量化アッセイは、ヒト血漿などの生物学的試料を含むがこれに限定されない、試料中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの定量化のためのインビトロ核酸増幅試験である。ＣＭＶ定量化アッセイは、自動化された検出システムと組み合わせることができる。ＣＭＶ定量化アッセイを使用して、実質臓器移植レシピエントの管理を助けることができる。抗ＣＭＶ療法を受けている患者では、連続ＤＮＡ測定を使用して、治療に対するウイルス応答を評価することができる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、ＣＭＶ定量化アッセイは、リアルタイム検出を有する転写媒介増幅試験である。このアッセイは、試料中のＣＭＶの検出および／または定量化に使用され、検出システムと組み合わせることができる。検出システムは、検体処理、増幅、検出、定量化のためのデータ削減、およびアンプリコン不活性化の自動化を提供する機器であり得る。
【０２０３】
試薬：対照およびキャリブレーターは、任意選択的に別々のボックスに提供する。各アッセイキットボックスに提供される試薬、キャリブレーター、および対照の詳細を、以下の表９Ａに詳述する。各キットは、増幅試薬、プロモーター試薬、および酵素試薬の３つの凍結乾燥材料を含有する。これらは、各凍結乾燥試薬に特異的な再構成試薬を使用して、ユーザーによって再構成される。各キットには、液体形式で提供される標的捕捉試薬（ＴＣＲ）および標的エンハンサー試薬（ＴＥＲ）が含まれるが、残りの試薬は、凍結乾燥される。キャリブレーターおよび追加の対照は、別々に提供してもよい。
【表９Ａ】
2021534758.tif 000084
【０２０４】
例示的な試薬には、以下が挙げられる。
【０２０５】
「試料輸送培地」または「ＳＴＭ」は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）である。
【０２０６】
「標的捕捉試薬」または「ＴＣＲ」は、（ｄＴ）１４オリゴヌクレオチドがそれに共有結合した２５０μｇ／ｍｌの磁性粒子（１ミクロンのＳｅｒａ−Ｍａｇ（商標）ＭＧ−ＣＭ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と共に塩化リチウムおよびＥＤＴＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４）である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、１つ以上のＴＣＯ、および／または１つ以上のＴ７プライマー、および任意選択的に１つ以上のディスプレーサーオリゴマーを含有する。
【０２０７】
「標的捕捉洗浄溶液」または「ＴＣ洗浄溶液」は、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）の無水エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）のメチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）のプロピルパラベン、および０．１％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸ナトリウムを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）である。
【０２０８】
「増幅試薬」または「ＡＲ」は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、４つのリボヌクレオチド三リン酸（ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、およびｒＵＴＰ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．７）である。プライマーおよび／またはプローブは、増幅試薬中の反応混合物に添加されても、試薬（無プライマー増幅試薬）とは別々に添加されてもよい。
【０２０９】
増幅または前増幅反応混合物中で使用される場合、「酵素試薬」または「ＥＲ」は、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、塩、および補因子を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）である。
【０２１０】
「標的エンハンサー試薬」（ＴＥＲ）溶液は、１．６ＮのＬｉＯＨを含有する。
【０２１１】
手順：ＣＭＶ定量化アッセイは、転写媒介増幅（ＴＭＡ）のリアルタイムの監視を使用して、ＣＭＶウイルスを定量化する。このアッセイは、ＣＭＶのＵＬ５６遺伝子を標的とする。試料中のウイルスの量は、シグナルを既知の濃度のウイルスＤＮＡ（キャリブレーター）から生成されたシグナルと比較することによって決定される。加えて、対照を２４時間ごとに実行して、試験の妥当性を確実にする。アッセイは、３つの基本的な処理ステップを使用する検出システムを使用して実施される。
１）ウイルスが溶解され、磁性粒子にハイブリダイズし、検体構成要素から分離される標的捕捉。
２）蛍光シグナルの同時収集によるＴＭＡを使用する標的の増幅。
３）各試料の定量的結果を生成するためのシグナルの処理。
【０２１２】
標的捕捉中、界面活性剤で処理して、ウイルスエンベロープを可溶化し、タンパク質を変性させ、ウイルスゲノムＤＮＡを放出させることによって、ウイルスＤＮＡを検体から単離する。捕捉オリゴヌクレオチドは、試験検体に存在する場合、ＣＭＶ  ＤＮＡの高度に保存された領域にハイブリダイズする。ハイブリダイズされた標的は、磁性粒子に結合し、これは、その後に磁場を使用して試料から分離される。
【０２１３】
標的増幅は、転写媒介増幅を介して等温的に生じる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の２つの酵素を使用して、捕捉されたＤＮＡから順転写および逆転写のサイクルを介して指数関数的にＲＮＡを生成する。
【０２１４】
検出は、標的増幅中に存在し、アンプリコンにリアルタイムでハイブリダイズする一本鎖核酸トーチを使用して達成する。各トーチは、フルオロフォアおよびクエンチャーを有する。トーチがアンプリコンにハイブリダイズしていない場合、クエンチャーは、フルオロフォアに近接しており、蛍光を抑制する。アンプリコン−トーチ結合は、フルオロフォアからのクエンチャーの分離をもたらし、これにより、光刺激および特定の波長でのシグナル放出に応答したフルオロフォアの励起が可能になる。
【０２１５】
表９Ｂは、ＣＭＶ定量化アッセイで使用することができる処理ステップを示す。
【表９Ｂ】
2021534758.tif 000085
【０２１６】
アッセイ処理：リアルタイム検出および定量化を、蛍光光度計を使用して実施した。
【０２１７】
任意選択的に標的エンハンサー試薬（ＴＥＲ）と組み合わせた標的捕捉試薬（ＴＣＲ）は、ＣＭＶを溶解し、磁性粒子への放出されたＣＭＶ  ＤＮＡの捕捉を促進する。ＴＣＲに存在するラウリル硫酸リチウムを使用して、ウイルスを溶解する。このプロセスによって放出されたＣＭＶ  ＤＮＡは、ＣＭＶ特異的オリゴヌクレオチドまたは「捕捉オリゴ」（「標的捕捉オリゴ」とも称される）を使用して磁性粒子上に捕捉される。ＴＣＲは、ＣＭＶとは無関係のＤＮＡの配列である内部キャリブレーター／内部対照（ＩＣ）も含有し得る。ＩＣは、同じ管中の標的と共に処理され、試験の内部対照および内部キャリブレーターの両方として機能する。
【０２１８】
ステップ１．各管に６０μＬのＴＥＲを添加し、それに続いて５００μＬの試料を添加する。各反応管に４００μＬのＴＣＲを添加した。ＴＣＲ緩衝液は、ウイルスを溶解するための１０ｇ／１００ｍＬのラウリル硫酸リチウム、標的捕捉のための磁性粒子、ならびに増幅のためのＩＣおよびＣＭＶ特異的オリゴヌクレオチドを含有する。流体を混合して、混合物の均一性を確実にする。
【０２１９】
ステップ２．試料を、任意選択的に４３．７℃の移行インキュベーター内でインキュベートして、試料を予熱してから、６４℃の高温インキュベーターに移動させる。
【０２２０】
ステップ３．次いで、試料を６４℃に設定した高温インキュベーターに移動させる。６４℃でのインキュベーション中、ＣＭＶが破壊され、ゲノムＤＮＡが放出される。ＴＣＲには、いくつかのオリゴヌクレオチドが存在する。これらの最初のものは、標的に相補的であり、Ｔ７プロモーター領域を組み込むＴ７プロモータープライマーである。このオリゴヌクレオチドの長さのために、それは、標的配列内のミスマッチによる影響が少なく、それにより、等しい遺伝子型の検出を改善する。二本鎖ＤＮＡを開放して、標的へのＴ７プライマーの結合を確実にするのに役立つディスプレーサプライマーも存在する。
【０２２１】
ステップ４．試料を移行インキュベーターに戻して、冷却プロセスを開始する。ＴＣＲには、捕捉オリゴヌクレオチド、およびポリＴオリゴヌクレオチドに共役した磁性ビーズが存在する。捕捉オリゴヌクレオチドは、それらが標的を捕捉することを可能にする標的に相補的な配列、およびそれらが磁性ビーズ上のポリＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にする３０塩基のポリＡテールを有する。初期冷却ステップ中およびステップ５でも続いて、標的およびＩＣは、磁性粒子上に捕捉される。
【０２２２】
ステップ５．試料を、冷却器勾配（１７℃〜１９℃）で冷却し、ＣＭＶおよびＩＣ標的と磁性ビーズとの間のより緊密な結合を生じさせる。
【０２２３】
ステップ６．試料を、磁気パーキングステーションに移動させる。ここで、試料を、磁気洗浄ステーションに入る前に、磁性粒子を管の側面に引っ張る磁石に供する。
【０２２４】
ステップ７．次いで、試料を磁気洗浄ステーションに移動させ、ここでは、磁性粒子を洗浄することによって、潜在的な干渉物質が反応から除去される。磁石は、磁性粒子を、試料を含有する管の側面に一時的に移動させ、液体が取り除かれる。洗浄緩衝液を添加し、このプロセスを繰り返して、干渉する潜在性がある物質の除去を確実にする。次いで、精製された磁性ビーズを含有する試料を、試薬添加のために増幅充填ステーションに移動させる。
【０２２５】
増幅およびシグナル検出：増幅は、標的をより簡単に検出することができるように、標的の多数のコピーを作製する。これは、ＴＭＡ技術分野（参照により組み込まれる特許）を使用して達成される。増幅試薬、プロモーター試薬、および酵素試薬を使用して、増幅を開始および持続し、生成物をリアルタイムで検出した。．これらの試薬は、使用前に再構成される凍結乾燥試薬であり得る。再構成された増幅試薬は、緩衝液であり、ＣＭＶおよびＩＣに特異的な非Ｔ７オリゴヌクレオチドを含有する。標的への非Ｔ７オリゴヌクレオチドの結合に役立つ、ブロックされたヘルパーオリゴマーも存在する。それは、アンプリコンの構築に必要な原材料も含有する。
【０２２６】
ＣＭＶ定量化アッセイは、線形増幅および指数関数的増幅の２相の増幅を使用する。第２相の指数関数的増幅は、プロモーター試薬を使用して達成される。再構成されたプロモーター試薬は、ＣＭＶおよびＩＣ標的のためのＴ７オリゴヌクレオチドを含有する緩衝液である。プロモーター試薬は、増幅されたＣＭＶまたはＩＣをリアルタイムで検出する標的特異的トーチと共に、ＲＮＡアンプリコンのコピーの構築に必要な材料も含有する。再構成された酵素試薬は、緩衝液であり、ＣＭＶおよびＩＣ標的の両方の増幅を開始および持続する２つの酵素を含有する。
【０２２７】
増幅：最初に、プロモータープライマーは、試料の標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する。置換プライマーを使用して、プロモータープライマー結合を改善することもできる。次いで、逆転写酵素は、プロモータープライマーまたはプロモータープライマーおよび置換プライマーを伸長して、一本鎖ＤＮＡを作製する。プロモータープライマーを有する一本鎖ＤＮＡが作製される。次いで、順方向プライマーが、ｓｓＤＮＡに結合し、ＲＮＡポリメラーゼが、鎖を延長する。単一ＲＮＡ鎖は、ＲＮＡの複数のコピーの鋳型として機能する。
【０２２８】
ステップ８．増幅試薬（５０μＬ／試験）を試料に添加し、増幅充填ステーションで混合する。
【０２２９】
ステップ９．試料を４３．７℃の移行インキュベーターに移動させて、試料の温度を上昇させる。
【０２３０】
ステップ１０．試料を、酵素試薬（２５μＬ／試験）を添加した増幅充填ステーションに戻す。
【０２３１】
ステップ１１．試料を４２．７℃に設定した増幅インキュベーターに移動させる。試料は、このインキュベーター内に５分間留まり、その間に第１の増幅ラウンドが開始される。Ｔ７開始プライマーは、ＣＭＶ標的に相補的であり、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列も含有する。酵素試薬に存在する逆転写酵素は、Ｔ７開始プライマー−標的複合体に結合し、ＣＭＶ標的からの相補的ＤＮＡの生成を開始する。逆転写酵素は、ディスプレーサーオリゴマーを使用する置換反応も開始して、ＣＭＶ標的から一本鎖ＤＮＡを生成する。ＩＣについても、同様の反応が同時に生じる。この一本鎖ＤＮＡは、Ｔ７プロモーター領域を組み込む。増幅試薬は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に結合し、二本鎖ＤＮＡの作成を開始する非Ｔ７プライマーも含有する。次いで、これは、酵素試薬からのＲＮＡポリメラーゼによって使用されて、ＲＮＡの複数のコピーが作製される。次いで、このＲＮＡは、非Ｔ７プライマーを使用する逆転写酵素によって一本鎖ＤＮＡアンプリコンに変換される。この相は、線形増幅または濃縮相として知られている。
【０２３２】
ステップ１２．５分間の線形増幅相の後、試料を増幅充填ステーションに戻し、ここでは、プロモーター試薬が添加および混合される。
【０２３３】
ステップ１３．試料を増幅インキュベーターに戻して、さらなるラウンドの増幅を行う。プロモーター試薬（２５μＬ／試験）は、追加のＣＭＶおよびＩＣ  Ｔ７プライマーを含有する。プロモーター試薬の添加は、ＣＭＶおよびＩＣ標的の追加ラウンドの指数関数的増幅を開始および持続する。増幅インキュベーターは、増幅によって生成された蛍光シグナルを測定する蛍光光度計も組み込む。第２のＴ７プロモータープライマーの添加は、前のステップで作製された一本鎖ｃＤＮＡへのＤＮＡの相補鎖の生成を開始する。次いで、これは、ＲＮＡポリメラーゼによって使用されて、ＲＮＡの複数のコピーが作製される。内部対照は、ＣＭＶと同様の機構を使用して、ＲＮＡ標的および二本鎖ＤＮＡからｃＤＮＡを作製する。
【０２３４】
プロモーター試薬には、上記のトーチも存在する。
【０２３５】
シグナルおよび結果の処理：ＣＭＶ標的およびＩＣの両方のシグナルを、最初にベースライン減算を実施することによって処理する。ベースライン減算は、各曲線のベースラインを推定し、次いで各データ点からそのレベルの蛍光を除去する。その結果、各曲線のベースラインは、同じレベルから始まる。
【０２３６】
次いで、全ての試料の最大蛍光が同じになるように、データをスケーリング（正規化）する。次いで、得られた曲線を、標準的な曲線当て嵌めアルゴリズムによって分析する。
【０２３７】
ベースライン減算および正規化が完了した後、各曲線のＴＴｉｍｅを計算することができる。ＴＴｉｍｅは、正規化された蛍光シグナル（ｙ軸）がバックグラウンドシグナルから現れる（ｘ軸上の）時間である。これは、所定のカットオフによって設定される。各反応のＴＴｉｍｅを、標的および対応するＩＣ曲線の両方について計算する。
【０２３８】
個々の変動を補正するために、ＣＭＶ  ＴＴｉｍｅをＩＣ  ＴＴｉｍｅで割って、「比」を生成する。ＣＭＶ  ＴＴｉｍｅは、初期検体中のＣＭＶ濃度に反比例する。１００ＩＵ／ｍＬから１Ｅ８ＩＵ／ｍＬまで変化する試料によって生成されたＣＭＶ曲線を、別個の曲線に分離する。各反応のＩＣ標的濃度が一定であるため、ＩＣ  ＴＴｉｍｅは、比較的一定である。ＣＭＶとＩＣ増幅システムとの間のわずかな競合は、ＩＣ  ＴＴｉｍｅがわずかに、しかし予測可能な様式で増加することを意味する。次いで、既知のＣＭＶ濃度のキャリブレーターを使用し、ＴＴｉｍｅ比を標的濃度に対してプロットして、ＣＭＶおよびＩＣ  ＴＴｉｍｅの比を使用して、検量線を生成する。検量線を確立すると、得られた比を検量線と比較することによって、未知の試料中のＣＭＶの濃度を計算することができる。
【０２３９】
保存された検量線。検量線は線形であり、アッセイの勾配は負である。この検量線は、試薬ロットごとに生成することができる。検量線の数式を確立し、線がｘ軸と交差する点を外挿によって決定する。
【０２４０】
結果を生成する前に、各試薬キットは、キャリブレーターの３回の複製を実行して較正される。一方は低濃度および他方はより高濃度の２つの陽性対照が存在し、陰性対照が使用される。キャリブレーターは、事前に定義された濃度の緩衝液中にＣＭＶの合成ＤＮＡを含有する。検量線は線形の性質のため、ユーザーが実行するキャリブレーターと検量線のｘ切片との組み合わせを使用して、試薬キットに特異的な検量線を生成する。
【０２４１】
結果報告：結果は、キャリブレーターおよび対照試料から生成された情報を使用して計算することができる。
【０２４２】
実施例１０．多相（二相性）増幅／検出。
【０２４３】
「試料輸送培地」または「ＳＴＭ」は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）を含んだリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）である。
【０２４４】
「標的捕捉試薬」または「ＴＣＲ」は、（ｄＴ）１４オリゴヌクレオチドがそれに共有結合した１２５μｇ／ｍｌの磁性粒子（１ミクロンのＳＥＲＡ−ＭＡＧ（商標）ＭＧ−ＣＭ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と共に塩化リチウムおよびＥＤＴＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４）である。ＴＣＲは、１つ以上のＴＣＯ、１つ以上のＴ７プライマー、および１つ以上のディスプレーサーを含み得る複数のオリゴを含有する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、１つ以上のディスプレーサーオリゴマーを含有する。
【０２４５】
「標的捕捉洗浄溶液」または「ＴＣ洗浄溶液」は、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）の無水エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）のメチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）のプロピルパラベン、および０．１％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸ナトリウムを含んだＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７−８、ｐＨ７．５±５、またはｐＨ７．５）である。
【０２４６】
「増幅試薬」または「ＡＲ」は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、４つのリボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）を含んだトリス緩衝液（ｐＨ７〜８、ｐＨ７．５±５、またはｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．９、もしくはｐＨ８）である。１つ以上のプライマー、ヘルパーオリゴマー、ディスプレーサーオリゴマー、およびまたはプローブオリゴマーが、増幅試薬を通して反応混合物に添加されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のプライマー、ヘルパーオリゴマー、ディスプレーサーオリゴマー、およびまたはプローブオリゴマーは、試薬とは別に反応混合物に添加されてもよい。いくつかの実施形態では、第１相の増幅反応の場合、増幅試薬は、１つ以上の非プロモータープライマーおよび１つ以上のヘルパーオリゴマーを含有し得る。いくつかの実施形態では、第２相の増幅反応の場合、増幅試薬は、１つ以上のプロモータープライマー、１つ以上のディスプレーサーオリゴマー、および１つ以上のプローブオリゴマーを含有し得る。
【０２４７】
「プロモーター試薬」またはＰＲは、塩化マグネシウム、塩化カリウム、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、４つのリボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）を含んだトリス緩衝液である。プライマー、ヘルパー、およびプローブのいくつかは、プロモーター試薬を通して反応混合物に添加されてもよい。
【０２４８】
増幅または前増幅反応混合物で使用される場合、「酵素試薬」または「ＥＮＺ」は、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、塩、および補因子を含んだＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ６．５〜８、ｐＨ７．０±５、またはｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．９、もしくはｐＨ８）である。
【０２４９】
「標的エンハンサー試薬」（ＴＥＲ）は、１．６８ＭのＬｉＯＨ水酸化リチウムを含有するアルカリ性溶液である。
【０２５０】
Ｔ７プライマーは、標的捕捉中に標的配列にハイブリダイズし、それに続いて第１の増幅反応前の洗浄ステップＴ７プライマー中に過剰なＴ７プライマーを除去する。いくつかの実施形態では、ＴＣＯは、標的捕捉中に標的配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ディスプレーサーオリゴマーは、標的捕捉中に標的配列にハイブリダイズする。過剰なＴＣＯおよび／またはディスプレーサーオリゴマーも、第１の増幅反応前の洗浄ステップ中に除去され得る。
【０２５１】
第１の増幅相（ＡＭＰ１）中、ＮＴ７プライマーおよび任意選択的にヘルパーを含むオリゴが、追加のＴ７プライマーを除いて、必要な増幅の全ておよび酵素試薬と共に導入される。逆転写酵素の存在下で、捕捉された標的にハイブリダイズしたＴ７プライマーが伸長され、ｃＤＮＡコピーが作製される。その後に、ＮＴ７プライマーは、ｃＤＮＡにハイブリダイズして、伸長し、Ｔ７プライマーのプロモーター領域を充填し、活性二本鎖ＤＮＡ鋳型を作製する。次いで、Ｔ７ポリメラーゼは、鋳型から複数のＲＮＡ転写産物を生成する。その後に、ＮＴ７プライマーは、ＲＮＡ転写産物にハイブリダイズし、伸長し、標的ＲＮＡ鋳型の無プロモーターｃＤＮＡコピーを生成する。ＲＮＡ鎖は、逆転写酵素のＲＮａｓｅ活性によって分解される。１相増幅混合物中には利用可能な遊離Ｔ７プライマーがないため、反応はそれ以上進行しない。第２相は、Ｔ７プライマー、非Ｔ７プライマー、ならびに任意選択的にヘルパーおよび検出オリゴヌクレオチドを含み得る追加のオリゴの添加で開始されるため、１相で生成されたｃＤＮＡプールの指数関数的増幅および検出が開始される。
【０２５２】
多重増幅および検出には、ＴＣＯ、Ｔ７プライマー、ＮＴ７プライマー、トーチオリゴヌクレオチド、ならびに任意選択的にディスプレーサーおよびヘルパーの各々の１つ以上が使用される。オリゴヌクレオチドは、同じ標的核酸中の１つ以上の異なる配列を増幅しても、異なる標的核酸中の配列を増幅しても、それらの組み合わせであってもよい。異なる標的核酸は、同じ生物に由来しても、異なる生物に由来してもよい。
【０２５３】
Ａ．例示的な実験プロトコル１：
【０２５４】
プレート設定：
【０２５５】
いくつかの実施形態では、２つの自動化されたＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒデバイスで使用するための４つの異なるプレートを設定する。
１．プレート１（ＴＣＲプレート）は、試料を含有する。このプレートに、標的捕捉試薬（例えば、１００μＬ）を添加する。ＴＣＯおよびＴ７プライマー、ならびに任意選択的にディスプレーサーオリゴマーが、標的核酸（例えば、４００μＬの試料）にハイブリダイズする。磁石を使用し、磁性ビーズ（固体支持体上の捕捉プローブ）を使用して、ＴＣＯ：標的核酸：Ｔ７プライマー：（任意選択的なディスプレーサーオリゴマー）（前増幅ハイブリッド）を捕捉する。単相ＴＭＡの場合、Ｔ７プライマーは、ＴＣＲ混合物に存在しない可能性がある。いくつかの実施形態では、試料をＴＥＲに添加し、それに続いてＴＣＯを含有するＴＣＲ、および二相性増幅ではＴ７プライマーを添加する。いくつかの実施形態では、ＴＥＲを試料に添加し、それに続いてＴＣＯを含有するＴＣＲ、および二相性増幅ではＴ７プライマーを添加する。いくつかの実施形態では、ＴＥＲは、ＴＣＲおよび試料の混合物に添加されてもよい。ＴＣＯ、Ｔ７プライマー、および任意選択的にディスプレーサーオリゴマーが試料中の標的核酸にハイブリダイズするように、これらの試薬の混合物を、より高い温度である期間にわたってインキュベートしてもよい。ＴＣＯは、磁性ビーズにもハイブリダイズする。ハイブリダイズしたＴＣＯ、Ｔ７プライマー、任意選択的なディスプレーサーオリゴマー（前増幅ハイブリッド）を有する標的核酸を、磁石を使用して、磁性ビーズを分離することによって捕捉する。次いで、試料およびＴＣＲの混合物を管から除去し、ビーズをＡｐｔｉｍａ洗浄緩衝液で２回洗浄する。
２．プレート２は、深ウェルプレートであり、２００〜５００μＬ／ウェルのＡＰＴＩＭＡ洗浄緩衝液を保持する。Ａｐｔｉｍａ洗浄緩衝液は、捕捉された標的（前増幅ハイブリッド）の洗浄に使用される界面活性剤およびアルコールを含有する。
３．プレート３は、２００〜５００μＬ／ウェルのＡＰＴＩＭＡ洗浄緩衝液を含有し、捕捉された標的（増幅前ハイブリッド）の第２の洗浄の提供に使用される。
４．プレート４は、５０μＬ／ウェルのＡＭＰまたはＡＭＰ１試薬を含有する。いくつかの実施形態では、ＡＭＰまたはＡＭＰ１試薬は、緩衝液、塩、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、および１つ以上のＮＴ７プライマー、ならびに任意選択的におよび／または１つ以上のヘルパーオリゴマーを含有する。
【０２５６】
標的捕捉および単離：いくつかの実施形態では、試料を、最初に標的エンハンサー試薬と接触させる。二相性ＴＭＡの場合、ＴＣＯ（複数可）、Ｔ７プライマー（複数可）、および任意選択的にディスプレーサーオリゴマーを、標的核酸を含有するか、または含有することが疑われる試料に添加する。単相ＴＭＡの場合、ＴＣＯ（複数可）を、標的核酸を含有するか、または含有することが疑われる試料に添加する。いくつかの実施形態では、存在する場合、Ｔ７プライマーを、１つの標的核酸に対して約１つのＴ７プライマーの比で添加する。ＴＣＯ、Ｔ７プライマー、およびディスプレーサーオリゴマーを、ある期間にわたって標的核酸と共にインキュベートして、標的核酸へのこれらのオリゴマーのハイブリダイゼーションを可能にして、前増幅ハイブリッドを形成する。次いで、前増幅ハイブリッドを捕捉し、精製し、過剰なまたはハイブリダイズしていないオリゴマーを除去する。次いで、ＴＣＯの場合はポリ（ｄＴ）などの結合パートナーを有する磁性粒子を使用して、前増幅ハイブリッドを単離する。
１．プレート１（ＴＣＲプレート）をヒートブロックに入れ、６２℃まで２０〜３０分間加熱し、それに続いてより低温（例えば、２３℃）で２０分〜２時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、ＴＣＲプレートを６５℃の蓋でカバーして、ウェルの上部に結露が形成されるのを防ぐ。次いで、捕捉された前増幅ハイブリッドを、プレート２に移動させる。
２．第１の洗浄（約１０分）後、深ウェルコーム／マグネットカバーをプレート２に追加して、前増幅ハイブリッドを捕捉する。捕捉された前増幅ハイブリッドを、プレート３に移動させる。
３．第２の洗浄後、小さなコーム（マグネットカバー）をプレート３に追加して、前増幅ハイブリッドを捕捉する。洗浄した前増幅ハイブリッドを捕捉し、プレート４に移動させる。第４のプレートを、熱サイクラーに移動させて、リアルタイムで等温増幅および検出する。
【０２５７】
二相性転写媒介増幅およびリアルタイム検出。
【０２５８】
第１相の増幅：ＮＴ７プライマー（複数可）、酵素、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、および任意選択的に１つ以上のヘルパーオリゴマー（複数可）（ＡＭＰ１混合物）を含有するＡＭＰ試薬を、前増幅ハイブリッドを含有する精製された標的核酸に。混合物をある期間にわたってインキュベートして、第１の増幅産物の形成を可能にする。
１．ＮＴ７プライマー、任意選択的にヘルパーオリゴマー、および精製された標的核酸を含有するＡＭＰ１プレートを、ハイブリダイズしたＴ７プライマーと共に、約４２〜４４℃で５〜１５分間インキュベートする。
２．逆転写酵素、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有する２５μＬのＥＮＺ混合物を添加し、密封および混合し、約４２〜４４℃で５分間インキュベートする。
【０２５９】
第２相の増幅：Ｔ７プライマーを含有するプロモーター試薬（ＡＭＰ２）、および任意選択的にトーチなどのプローブオリゴマーを第１の増幅産物に添加し、ある期間にわたってインキュベートして、第２の増幅産物の形成を可能にする。いくつかの実施形態では、１つ以上のヘルパーオリゴマー（複数可）およびより多くの非Ｔ７プライマーを、第２相の増幅中に添加する。
３．２５μＬのＡＭＰ２（ＰＲとも称される）混合物を各ウェルに添加し、密封し、混合する。いくつかの実施形態では、ＡＭＰ２混合物は、緩衝液、塩、界面活性剤、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、１つ以上のＴ７プライマー、トーチプローブ（複数可）、ならびに任意選択的により多くの非Ｔ７プライマーおよび／またはヘルパーオリゴマー（複数可）を含有する。
４．反応プログラム：４２〜４３℃で３０秒の１２０回のサイクル、各サイクルの終了時に標識検出（収集）を実行する。
【０２６０】
検出：検出オリゴヌクレオチドからの蛍光シグナルを一定の間隔で記録することによって、標的核酸配列の増幅をリアルタイムで検出する。
【０２６１】
Ｂ．例示的な実験プロトコル２：
【０２６２】
標的捕捉および単離：いくつかの実施形態では、試料を、最初に標的エンハンサー試薬と接触させる。二相性ＴＭＡの場合、ＴＣＯ（複数可）、Ｔ７プライマー（複数可）、および任意選択的にディスプレーサーオリゴマーを、標的核酸を含有するか、または含有することが疑われる試料に添加する。単相ＴＭＡの場合、ＴＣＯ（複数可）を、標的核酸を含有するか、または含有することが疑われる試料に添加する。ＴＣＯ、Ｔ７プライマー、およびディスプレーサーオリゴマーを、ある期間にわたって標的核酸と共にインキュベートして、標的核酸へのこれらのオリゴのハイブリダイゼーションを可能にして、前増幅ハイブリッドを形成する。次いで、前増幅ハイブリッドを捕捉し、精製し、過剰なまたはハイブリダイズしていないオリゴを除去する。次いで、ＴＣＯの場合はポリ（ｄＴ）などの結合パートナーを有する磁性粒子を使用して、前増幅ハイブリッドを単離する。
【０２６３】
試料、ＴＣＲ、および任意選択的にＴＥＲの混合物を、６０〜６５℃で２０〜３０分間加熱し、それに続いてより低温で２０分〜２時間インキュベートする。前増幅ハイブリッドを、磁石を使用して捕捉して、それらがハイブリダイズしている磁性ビーズを分離する。試料および試薬の混合物を管から取り除く。管に洗浄緩衝液を添加し、混合し、次いでそれを磁石と共にインキュベートして、磁性ビーズを分離することによって、磁性ビーズを１〜２回洗浄する。ビーズが捕捉された後、洗浄緩衝液を各管から除去する。
【０２６４】
二相性転写媒介増幅およびリアルタイム検出。
【０２６５】
第１相の増幅：ＮＴ７プライマー（複数可）、酵素、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、および任意選択的に１つ以上のヘルパーオリゴマー（複数可）（ＡＭＰ１混合物）を含有するＡＭＰ試薬を、前増幅ハイブリッドを含有する精製された標的核酸に添加する。混合物をある期間にわたってインキュベートして、第１の増幅産物の形成を可能にする。
ａ．ＮＴ７プライマー、任意選択的にヘルパーオリゴマー、および精製された標的核酸（前増幅ハイブリッド）を含有するＡＭＰ１混合物を、約４２〜４４℃で５〜１５分間インキュベートする。
ｂ．逆転写酵素、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有する２５μＬのＥＮＺ混合物を添加し、混合し、約４２〜４４℃で５分間インキュベートする。
【０２６６】
第２相の増幅：Ｔ７プライマーを含有するプロモーター試薬、およびトーチなどのプローブオリゴマーを第１の増幅産物に添加し、ある期間にわたってインキュベートして、第２の増幅産物の形成を可能にする。いくつかの実施形態では、１つ以上のヘルパーオリゴマー（複数可）およびより多くの非Ｔ７プライマーを、第２相の増幅中に添加する。
ａ．２５μＬのＡＭＰ２（別にＰＲと称される）混合物を各管に添加し、混合する。いくつかの実施形態では、ＡＭＰ２混合物は、緩衝液、塩、界面活性剤、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、１つ以上のＴ７プライマー、トーチプローブ（複数可）、ならびに任意選択的により多くの非Ｔ７プライマーおよび／またはヘルパーオリゴマー（複数可）を含有する。
【０２６７】
反応プログラム：４２〜４３℃で３０〜６０分間のインキュベーション、約３０秒間隔でラベル検出（収集）を実行する。
【０２６８】
検出：検出オリゴヌクレオチドからの蛍光シグナルを一定の間隔で記録することによって、標的核酸配列の増幅をリアルタイムで検出する。
【０２６９】
実施例１１．血漿試料からのリアルタイム二相性ＴＭＡ  ＣＭＶアッセイ。ＣＭＶのいずれかのＵＬ５６遺伝子（配列番号４２および４４）に対するＴＣＯを使用して、標的捕捉を達成した。２つのＴＣＲ（標的捕捉混合物）配合物、Ａ（６７９ｍＭのＬｉＯＨを含有する）およびＢ（４５３ｍＭのＬｉＯＨ）を、プラスミドおよび血漿試料に添加した。いくつかの反応については、標的捕捉相中に１００μＬまたは２００μＬの標的エンハンサー試薬（ＴＥＲ）を試料に添加した。いくつかの実施形態では、使用されるＴＥＲの量は、２５〜２００μＬである。いくつかの実施形態では、使用されるＴＥＲの量は、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００μＬである。いくつかの実施形態では、標的捕捉段階におけるＬｉＯＨの量は、５０〜３５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、標的捕捉段階におけるＬｉＯＨの量は、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、または約３５０ｍＭである。
【０２７０】
ＴＣＯ（複数可）を、１×ＴＣＲ緩衝液（４００μＬ／反応）に添加した。いくつかの試料では、内部対照標的核酸も添加された。二相性ＴＭＡ反応については、示される量のＴ７プライマーを添加した。
【０２７１】
単相ＴＭＡの場合、Ｔ７プライマー、ＮＴ７プライマー、およびトーチオリゴをＡＭＰ緩衝液に添加して、ＡＭＰ試薬を形成し、７５μＬのＡＭＰ試薬を各試料に添加した。
【０２７２】
二相性ＴＭＡの場合、ＮＴ７オリゴをＡＭＰ緩衝液に添加して、ＡＭＰ１試薬（ＡＲ）を形成し、Ｔ７オリゴおよびトーチオリゴをＡＭＰ緩衝液に添加してＡＭＰ２（ＰＲ）試薬を形成した。標的捕捉後、５０μＬのＡＭＰ１試薬を各試料に添加した。
【０２７３】
単相ＴＭＡの場合、各試験に２５μＬのＥＮＺを添加し、試料を１４００ＲＰＭで１分間混合した。反応物を４３℃で１０分間インキュベートした。
【０２７４】
二相性ＴＭＡの場合、２５μＬのＥＮＺを各試験に添加し、試料を１４００ＲＰＭで１分間混合した。ＡＭＰ１反応物を４３℃で５分間インキュベートした。次いで、２５μＬのＡＭＰ２を各試料に添加し、プレートを１４００ＲＰＭで１分間混合した。次いで、試料を４３℃でインキュベートし、蛍光をリアルタイムで測定した。
【０２７５】
各実験には、表１１−３に列挙した内部対照オリゴマーを含有する対照反応が含まれた。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【０２７６】
要約：示されるオリゴヌクレオチドを使用すると、２００μＬのＴＥＲを有する配合物Ｂ  ＴＣＲを使用した場合、プラスミド試料および血漿試料の両方でＣＭＶ  ＵＬ５６が容易に検出された。２００μＬのＴＥＲを有する配合物Ａ  ＴＣＲが血漿試料中のＣＭＶ  ＵＬ５６を検出する性能は、それほど良好ではなかった。
【０２７７】
実施例１２．ＣＭＶ検出限界。上記の実験は、１０９ＩＵ／ｍＬ〜２５０ＩＵ／ｍＬのＣＭＶの検出限界（ＬＯＤ）を示した。ウイルス負荷緩衝液および酵素の組み込み、ならびに塩、オリゴ、およびｄＮＴＰ／ＮＴＰ濃度を含む様々なパラメータを変化させて、試料中のＣＭＶの検出を改善した。様々なパラメータを調整することで、ＬＯＤが３７ＩＵ／ｍＬに、定量化限界（ＬＯＱ）が４０ＩＵ／ｍＬに改善した。加えて、条件が改善されると、より速いＣＶＭ  ＴＴｉｍｅが観察された。
【０２７８】
これらの研究には、ＣＭＶ  ＵＬ５６をコードする１×１０２〜１×１０７コピー／ｍＬのプラスミドをキャリブレーターとして使用した。いくつかの研究では、３０コピー／ｍＬのＣＭＶ  ＵＬ５６プラスミドパネルの増幅を分析した。他の研究では、処理された血漿（部品番号ＢＩ００５２）中で約７０、３０、１０、および３コピー／ｍＬに希釈した、培養ウイルスの増幅を分析した。正確な値は、確定的には決定されていない。それにもかかわらず、これらの低濃度のウイルスパネルを使用して、試験した様々な条件の感度を比較することができた。
【表１２−１】
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【表１２−２】
2021534758.tif 000092
【０２７９】
ＡＭＰ試薬中の７．５％のＤＭＳＯの添加は、感度の改善をもたらした。ＤＭＳＯの添加は、より高い感度、より速いＣＭＶ  ＴＴｉｍｅ、およびより少ない変動を示した（表１２−５および１２−６）。
【０２８０】
ｐＨ滴定研究を、ＨＥＰＥＳ／トレハロース緩衝液配合物で行った。結果は、より高いＡＭＰ１ｐＨが感度を改善することを示した。ＡＭＰ１およびＡＭＰ２の高いｐＨは、ＡＭＰ１単独がｐＨを増加させるのと比較して、感度を低下させた。さらなる評価のために、８．５のｐＨ（トリス塩基を１１．４〜２２ｍＭに増加させた）を選択した。
【０２８１】
いくつかの反応では、ＡＭＰ試薬中のＭｇＣＬ２の増加も、感度を改善した。
【０２８２】
初期研究に基づいて、以下に記載のように追加の最適化を実施した。ＣＭＶの検出をさらに改善するために、ＡＭＰ緩衝液中にディスプレーサーオリゴおよびヘルパーＮＴ７オリゴを添加した場合と同様に、追加のＴＣＯを試験した。ＣＭＶの検出および精度を改善した（すなわち、標準偏差を低下させる）、２つのディスプレーサーオリゴ（配列番号１２および配列番号４１）ならびに３つのヘルパーＮＴ７オリゴ（配列番号１４、配列番号１７、および配列番号１８）を特定した。
【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【０２８３】
両方のディスプレーサが感度を改善したが、配列番号４１のディスプレーサーは、配列番号１２のディスプレーサーよりも感度のより大きな増加を提供した。結果を表１２−５に示す。
【０２８４】
ヘルパーＮＴ７オリゴの添加は、ＣＭＶ定量化の標準偏差ログコピーを低下させることによって、ＣＭＶの精度を改善した。配列番号１４のヘルパーＮＴ７オリゴは、最低の標準偏差を示した。．結果を表１２−６に示す。
【０２８５】
より少ない量のＴＥＲ／ＬｉＯＨ、ならびにディスプレーサおよびＮＴ７ヘルパーオリゴヌクレオチドの添加を含む上記に特定された改善を組み合わせて、ＣＭＶ検出をさらに試験した。次いで、これらの条件を、元のアッセイ条件（Ａｐｔｉｍａアッセイ試薬）と並行して実行した。結果を表１２−７に示す。
【０２８６】
表１２−８に示されるように、感度は、増加した純度を有する新たに合成されたオリゴヌクレオチドを使用して、さらに増加した。
【表１２−８】
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【０２８７】
ＴＣＲの添加前にＴＥＲを試料に添加すると、感度の有意な改善が観察された。最初にＴＥＲを試料管またはウェルに添加し、それに続いて試料を添加した。混合後、ＴＣＲをＴＥＲ処理試料に添加した。結果を表１２−９に示す。
【表１２−９】
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【表１２−１０】
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【０２８８】
結論：感度およびＴＴｉｍｅは、上記の条件を使用して改善した。この新たな配合物およびＴＥＲ添加の順序により、３７ＩＵ／ｍＬのＬＯＤおよび４０ＩＵ／ｍＬのＬＯＱが達成された。いくつかの実施形態では、組成物は、ＣＭＶ検出オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ、Ｔ７プライマー、ＮＴ７プライマー、ディスプレーサーオリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチド、およびトーチオリゴヌクレオチド）、ならびに内部対照オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ、Ｔ７プライマー、ＮＴ７プライマー、およびトーチオリゴヌクレオチド）を含有する。
【０２８９】
実施例１３．トーチ特定。１１個のトーチを、勾配を排除し、精度および陽性を最適化するように設計および試験した。
【表１３−１】
2021534758.tif 000101
【表１３−２】
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【表１３−３】
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【０２９０】
試験したもののうち、配列番号２０、配列番号６０、および配列番号７０のトーチは、陰性試料中で勾配を示した。配列番号５４のトーチは、トーチ配列番号２０よりも低いＲＦＵ範囲およびＲ２３５６に対する低い陽性を有した。全てのオリゴを、変異ＣＭＶ配列でさらに試験して、それらが変異の存在下でも正確に定量化されることを確認した。配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、および配列番号６８のトーチは、変異体４のより低い検出感度を示した。結果の要約は、表１３−４に見出すことができる。
【表１３−４】
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【０２９１】
トーチ（配列番号５６）および（配列番号５８）は、ＦＡＭバックグラウンド減算曲線（ＣＭＶ標的チャネル）において陰性試料に対していかなる勾配も生成しなかった。配列番号５６および配列番号５８のトーチは、ｍｕｔａｎｔ４パネルでの改善された陽性、同等の回収率、および全てのパネルでの改善された感度も示した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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