(57)【要約】  本発明は、トリプシンとゼオライトを含み、前記ゼオライトのチャンネルが細孔であり、ゼオライトが二価の金属カチオンを含み、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：２００〜４：１０である止血組成物を提供する。本発明では、トリプシンとゼオライトとを特異的に結合させることにより、トリプシンをゼオライトの表面において一定のコンフォメーションを保持し、より高い血液凝固活性を得ることにより、血液凝固効果が極めて良好な止血組成物が得られる。本発明の止血組成物の製造方法は、簡単であり、コストが低く、使用が便利であり、創傷や手術止血に広く応用することができ、特に血友病患者の緊急止血に応用することができる。【選択図】  図２
2021500936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともゼオライトとトリプシンを含む止血組成物であって、前記ゼオライトのチャンネルが細孔であり、前記ゼオライトが二価の金属カチオンを含み、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：２００〜４：１０であることを特徴とする止血組成物。
【請求項２】
前記二価の金属カチオンが、コバルトイオン、ニッケルイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ストロンチウムイオンのいずれか１種または複数種から選択されることを特徴とする請求項１に記載の止血組成物。
【請求項３】
前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：１００〜３：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：６０〜２．５：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：５０〜２：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：４０〜１．５：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：２０〜１：１０であることを特徴とする請求項１に記載の止血組成物。
【請求項４】
前記二価の金属陽イオンがゼオライト骨格外の金属陽イオンの５０％〜９５％を占め、好ましくは、前記二価の金属陽イオンがゼオライト骨格外の金属陽イオンの６０％〜９０％を占め、好ましくは、前記二価の金属陽イオンがゼオライト骨格外の金属陽イオンの６５％〜８５％を占め、好ましくは、前記二価の金属陽イオンがゼオライト骨格外の金属陽イオンの７０％〜８０％を占め、好ましくは、前記二価の金属陽イオンがゼオライト骨格外の金属陽イオンの７２％〜７８％を占めることを特徴とする請求項１に記載の止血組成物。
【請求項５】
前記ゼオライトのシリカアルミナ比が１〜２０であり、好ましくは、前記シリカアルミナ比が１．２〜１５であり、好ましくは、前記シリカアルミナ比が１．５〜４であり、好ましくは、前記シリカアルミナ比が２〜３であることを特徴とする請求項１に記載の止血組成物。
【請求項６】
前記ゼオライトが、Ａ型ゼオライト、菱沸石、β型ゼオライト、モルデナイト、Ｘ型ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、ＺＳＭ−５型ゼオライトのいずれか１種または複数種から選択されることを特徴とする請求項１に記載の止血組成物。
【請求項７】
以下のステップを含む止血組成物の製造方法であって、
（１）ゼオライトのチャンネルが細孔であり、ゼオライトの表面に二価の金属カチオンを含むゼオライトの懸濁液を調製し、
（２）ゼオライトの懸濁液をトリプシンと接触させ、
（３）ゼオライトの表面にトリプシンを吸着させることで前記止血組成物を得る
ことを特徴とする止血組成物の製造方法。
【請求項８】
前記ゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比が１：０．５〜１：２０であり、好ましくは、前記ゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比が１：０．８〜１：１０であり、好ましくは、前記ゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比が１：１〜１：５であり、好ましくは、前記ゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比が１：１．５〜１：２．５であることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ステップ（１）におけるゼオライトの懸濁液に対し超音波処理を行うことを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記超音波処理の時間が０．５〜３０ｍｉｎであり、超音波周波数が２０〜２００ｋＨｚであり、超音波パワーが２００〜５０００Ｗであることを特徴とする請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ステップ（２）の接触温度が１０〜３７℃であり、好ましくは、前記ステップ（２）の接触温度が１５〜３０℃であり、好ましくは、前記ステップ（２）の接触温度が２０〜２５℃であることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記ステップ（３）が、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させた後に、さらにゼオライトの懸濁液とトリプシンを凍結乾燥させるステップを含み、好ましくは、前記凍結乾燥の温度が０℃〜−８０℃であり、好ましくは、前記凍結乾燥の温度が−１０℃〜−６０℃であり、好ましくは、前記凍結乾燥の温度が−２０℃〜−５０℃であり、好ましくは、前記凍結乾燥の温度が−３０℃〜−４５℃であることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：２００〜４：１０であり、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：１００〜３：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：６０〜２．５：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：５０〜２：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：４０〜１．５：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：２０〜１：１０であることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の止血組成物及び添加剤を含むことを特徴とする止血複合材料。
【請求項１５】
前記添加剤が、担体、抗菌材料、帯電防止材料、高分子多糖のいずれか一種または複数種から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の止血複合材料。
【請求項１６】
前記担体が、綿、絹、羊毛、プラスチック、セルロース、レーヨン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリエチレンフォーム、ポリアクリル酸フォーム、低密度ポリエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸メチルのいずれか１種または複数種から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の止血複合材料。
【請求項１７】
前記抗菌材料が、ナノ銀粒子、バニラアルデヒド、エチルバニラアルデヒド化合物のいずれか１種または複数種から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の止血複合材料。
【請求項１８】
前記高分子多糖類が、セルロース、リグニン、デンプン、キトサン、アガロースのいずれか１種または複数種から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の止血複合材料。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の止血組成物または請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の止血複合材料の止血分野における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学材料の技術分野に属し、具体的には、止血組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの場合、ヒト（動物を含む）は傷を受ける可能性がある。場合によって、創傷や出血は軽微であり、簡単な救急に加えて、通常の血液凝固機能を必要とするだけで正常な止血が可能である。しかし、不幸なことに、多くの不慮の場合、大量の出血が起こる可能性があり、例えば、皮膚が破れるか、貫通傷（ナイフや弾丸によって引き起こされる）により大動脈損傷を引き起こし、一般的な人であれば大部分の血液が数分で失われることで死亡する。従って、日常生活における突発的な事故の救急治療、病院で患者に対する手術中の創傷止血、特に戦争中の負傷戦士の救護において、患者に対する効果的かつ迅速な止血が重要である。
【０００３】
現在、例えば、脱水ゼオライト／結合剤（ＵＳ特許４８２２３４９号）、部分水和ゼオライト（ＵＳ特許７８５８１２３号）、カオリン／ガーゼ複合体（ＵＳ特許７６０４８１９号）、およびゼオライトとカオリンの組成物（ＵＳ特許８７０３６３４号）など、多くの緊急止血材料が開発されている。正常機能の血液凝固であろうと、止血材を利用した血液凝固の促進であろうと、その血液凝固過程は、血液凝固の目的を達成するために、血液凝固経路の各段階の反応プロセスに厳密に従わなければならず、また、血液凝固経路の各段階は、ある程度の時間を必要とし、その詳しい過程は図１に示されるとおりである。前記血液凝固経路の各段階の反応プロセスとは、一種の血液凝固因子から反応によって活性化血液凝固因子を形成することを指し、例えば、図１において、血液凝固因子ＸＩＩからＸＩＩａ（ＸＩＩの活性化血液凝固因子）を形成し、ＸＩａによって血液凝固因子ＩＸが活性化されてＩＸａ（ＩＸの活性化血液凝固因子）を形成する。血液凝固経路の一個の段階の反応に障害が起こると、必然的に血液凝固経路が正常に進行せず、血液凝固機能を実現することができない。現在、ゼオライトに代表される無機止血材料により血液凝固を促進する過程は、内因性血液凝固経路（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）に従う必要があり、すなわち以下の反応フローに従って厳密に行われなければならない：先ず、ゼオライトが血液凝固因子ＸＩＩを活性化してＸＩＩａを形成し、これにより内因性血液凝固カスケードが開始し、続いてＸＩＩａから血液凝固因子ＸＩを活性化してＸＩａを形成し、さらにＸＩａから血液凝固因子ＩＸを活性化してＩＸａを形成し、さらにＩＸａから血液凝固因子Ｘを活性化してＸａを形成し、血液凝固因子Ｘａにおいて、血液凝固因子ＩＩを活性化してトロンビンを形成し、続いてトロンビンがフィブリノーゲンを切断し、最後に血液凝固因子ＸＩＩＩａの作用で架橋化フィブリンを形成する。ゼオライトによる凝固因子ＸＩＩの活性化から最終的に架橋したフィブリンを形成するまでの多段階反応は、合計２〜６ｍｉｎの時間を必要とする。ゼオライトが血液凝固の過程を促進させることができるが、血液凝固時間が長すぎると、患者の失血が多くなりすぎ、一部の重要な臓器で失血により不可逆的な損傷が起き、生命が危険にさらされる。
【０００４】
また、血友病患者は、先天的に血液凝固経路中のＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ血液凝固因子が欠乏しているため、血液凝固経路を介して血液凝固を実現することができない。血友病患者が出血した場合、止血は正常の人に比べてはるかに困難であり、生体止血製剤を加えることで血液凝固を実現する必要があり、よく用いる生体止血製剤としては、トロンビン、フィブリンゲルなどであってもよい。図１に示されるように、トロンビンによる血液凝固作用の過程は以下のとおりである：トロンビンがフィブリノーゲンを直接切断し、フィブリンモノマーを形成し、最後に血液凝固因子ＸＩＩＩａの作用で架橋化フィブリンを形成するが、一般的に要する血液凝固時間は０．５〜１ｍｉｎである。フィブリンゲルは、トロンビンとフィブリノーゲンを提供することができるため、血液凝固機能を実現することができるが、一般的に必要な凝固時間は０．５〜１ｍｉｎである。そのうち、トロンビンはフィブリノーゲンを切断するために用いられ、同時に活性化された血液凝固因子ＸＩＩＩａを形成し、切断後のフィブリノーゲンはフィブリンモノマーを形成し、フィブリンモノマーはＸＩＩＩａの作用により互いに架橋し、安定した架橋フィブリン凝集塊を形成し、これにより止血の作用を果たす。しかし、トロンビンまたはフィブリンゲルの製造が困難であり、要求される純度が高く、保存条件（−２０℃）が厳しく、コストが非常に高く（トロンビンの市場価格は一般的に２０００ＲＭＢ／ｍｇである；フィブリンゲルの市場価格は、一般的に一回の使用量にあたる一包あたり８０００ＲＭＢである）、そのため、その実用価値および商業価値が低い。
【０００５】
ゼオライトはよく用いる無機材料であり、酵素は生物反応を促進する生物材料であり、無機材料と生物材料の両者の結合には大きな課題が存在し、その主な原因は以下のとおりである：ゼオライトは「剛性」の無機材料であり、酵素は「可撓性」の生体大分子であり、酵素がゼオライトの表面に接触する時、剛性のゼオライトの表面は酵素の「可撓性」特性、すなわちコンフォメーションを変化させやすい。かもゼオライトに結合した酵素は、一部がゼオライトの表面に接触し、これにより反応物に接触する可能性が低下し、すなわち反応速度が遅くなり、酵素とゼオライトの結合は酵素の活性を低下させる。そのため、ゼオライトの表面に酵素を導入すると、ゼオライトの表面において異なる程度に酵素が失活してしまう。例えば、ゼオライトは無機止血材料であり、トロンビンは高効率の生物止血製剤であるが、両者が結合すると、大部分のトロンビン（９４％）はゼオライトの表面で失活し、トロンビンの血液凝固効果を発揮する時間が０．５ｍｉｎから２．２ｍｉｎまで延長し（図４）、止血効果が悪く、緊急止血の要求にはるかに及ばない。現在、従来技術では止血が速く、コストが低く、かつ血友病に有効な無機生物酵素結合止血材料が発見されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来技術の不足に対して、本発明が解決しようとする技術的問題は、止血が速く、コストが低く、かつ血友病に有効な無機生物酵素止血組成物を提供することである。検討過程において、発明者らは、特定の種類のゼオライト、特定の性能の酵素、および特定のゼオライトと酵素との質量比を選択し、ゼオライトの表面を改質することによって、ゼオライトと酵素の間の相互作用及びゼオライトの表面における酵素のコンフォメーションを制御し、従来の学術的思考の枠組みを打破し、止血が速く、コストが低く、かつ血友病に有効な無機生物酵素止血材料を初めて製造した。発明者らは、チャンネルの大きさ、ゼオライトの二価の金属陽イオンの極化作用、トリプシンとゼオライトの質量比１：２００〜４：１０の配合比例を制御し、以上の制御手段の総合的な作用によりゼオライトの表面での酵素のコンフォメーションを「規範」化し、驚くべきことに、トリプシンがゼオライトの内部骨格に入らず、かつトリプシンが規則的なコンフォメーションと配向に従ってゼオライトの表面に分布し（図２）、特にトリプシンの活性部分がゼオライトに向かず、反応物を「捕捉する」のに有利であることを見出した。このような特殊な止血組成物を設計することにより、驚くべきことに、無機材料と生体材料の効率的な結合を実現し、酵素がゼオライトの表面で失活するという技術的難題を克服した。本発明の止血組成物のトリプシン活性は低下しないだけでなく、逆に止血組成物の止血効果がトリプシン又はゼオライトに対して大幅に向上し、血液凝固時間が大幅に低下する（図３）。本発明の止血組成物は、トロンビンなどの高価な生物製剤に関するものではなく、安価で入手しやすいトリプシンと、細孔と二価カチオンを有するゼオライトを特異的に特定の比例で組み合わせるだけで、止血が速く、コストが低く、血友病に対して効果的に止血するという目的を達成する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の技術的手段を採用する：本発明では、簡単な方法で全く新しい材料である、少なくともゼオライトとトリプシンを含む止血組成物であって、前記ゼオライトのチャンネルが細孔であり、前記ゼオライトが二価の金属カチオンを含み、前記トリプシンとゼオライトの質量比が１：２００〜４：１０である（図２）止血組成物が得られる。
【０００８】
さらに、本発明の前記二価の金属陽イオンは、ゼオライト骨格外の金属陽イオンに属し、ゼオライト骨格外の金属陽イオンは、ゼオライト骨格の負電荷の平衡を保つ陽イオンであり、ゼオライトのチャンネル（ｃｈａｎｎｅｌ）とケージ（ｃａｇｅ）の中に位置する。
【０００９】
本発明の前記細孔は、ゼオライトのチャンネルのサイズが２ｎｍ以下である。
【００１０】
さらに、前記二価の金属カチオンは、コバルトイオン、ニッケルイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ストロンチウムイオンのいずれか１種または複数種から選択される。
【００１１】
さらに、前記トリプシンとゼオライトの質量比は１：１００〜３：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比は１：６０〜２．５：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比は１：５０〜２：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比は１：４０〜１．５：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比は１：２０〜１：１０である。
【００１２】
さらに、前記二価の金属陽イオンは、ゼオライト骨格外の金属陽イオンの５０％〜９５％を占め、好ましくは、前記二価の金属陽イオンはゼオライト骨格外の金属陽イオンの６０％〜９０％を占め、好ましくは、前記二価の金属陽イオンはゼオライト骨格外の金属陽イオンの６５％〜８５％を占め、好ましくは、前記二価の金属陽イオンはゼオライト骨格外の金属陽イオンの７０％〜８０％を占め、好ましくは、前記二価の金属陽イオンはゼオライト骨格外の金属陽イオンの７２％〜７８％を占める。
【００１３】
さらに、前記ゼオライトのシリカアルミナ比は１〜２０であり、好ましくは、前記シリカアルミナ比は１．２〜１５であり、好ましくは、前記シリカアルミナ比は１．５〜４であり、好ましくは、前記シリカアルミナ比は２〜３である。
【００１４】
さらに、前記ゼオライトは、Ａ型ゼオライト、菱沸石、β型ゼオライト、モルデナイト、Ｘ型ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、ＺＳＭ−５型ゼオライトのいずれか１種または複数種から選択される。
【００１５】
本発明の第二の目的は、以下のステップを含む止血組成物の製造方法を提供することである。
【００１６】
（１）ゼオライトのチャンネルが細孔であり、ゼオライトの表面に二価の金属カチオンを含むゼオライトの懸濁液を調製する。
【００１７】
（２）ゼオライトの懸濁液をトリプシンと接触させる。
【００１８】
（３）ゼオライトの表面にトリプシンを吸着させることで前記止血組成物を得る。
【００１９】
さらに、前記ゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比は１：０．５〜１：２０であり、好ましくは、前記ゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比は１：０．８〜１：１０であり、好ましくは、前記ゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比は１：１〜１：５であり、好ましくは、前記ゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比は１：１．５〜１：２．５である。
【００２０】
さらに、前記ステップ（１）におけるゼオライトの懸濁液を超音波処理を行う。
【００２１】
さらに、前記超音波処理の時間は０．５〜３０ｍｉｎであり、超音波周波数は２０〜２００ｋＨｚであり、超音波パワーは２００〜５０００Ｗである。
【００２２】
さらに、前記ステップ（２）における接触温度は１０〜３７℃であり、好ましくは、前記ステップ（２）の接触温度は１５〜３０℃であり、好ましくは、前記ステップ（２）の接触温度は２０〜２５℃である。
【００２３】
さらに、前記ステップ（３）でトリプシンをゼオライトの表面に吸着させた後に、さらにゼオライトの懸濁液とトリプシンを凍結乾燥させるステップを含み、好ましくは、前記凍結乾燥の温度は０℃〜−８０℃であり、好ましくは、前記凍結乾燥の温度は−１０℃〜−６０℃であり、好ましくは、前記凍結乾燥の温度は−２０℃〜−５０℃であり、好ましくは、前記凍結乾燥の温度は−３０℃〜−４５℃である。
【００２４】
さらに、前記トリプシンとゼオライトの質量比は１：２００〜４：１０であり、前記トリプシンとゼオライトの質量比は１：１００〜３：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比は１：６０〜２．５：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比は１：５０〜２：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比は１：４０〜１．５：１０であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトの質量比は１：２０〜１：１０である。
【００２５】
本発明の第三の目的は、前述のいずれかの形態の止血組成物及び添加剤を含む止血複合材料を提供することである。
【００２６】
さらに、前記添加剤は、担体、抗菌材料、帯電防止材料、高分子多糖のいずれか一種または複数種から選択される。
【００２７】
さらに、前記担体は、止血用組成物を創傷に接触させるための基体である。
【００２８】
さらに、前記抗菌材料は、それ自体が微生物を殺滅または抑制する機能を有する材料である。
【００２９】
さらに、前記担体は、綿、絹、羊毛、プラスチック、セルロース、レーヨン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリエチレンフォーム、ポリアクリル酸フォーム、低密度ポリエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸メチルのいずれか１種または複数種から選択される。
【００３０】
さらに、前記抗菌材料は、ナノ銀粒子、バニラアルデヒド、エチルバニラアルデヒド化合物のいずれか１種または複数種から選択される。
【００３１】
さらに、前記高分子多糖類は、セルロース、リグニン、デンプン、キトサン、アガロースのいずれか１種または複数種から選択される。
【００３２】
本発明の第四の目的は、上述したいずれかの形態の止血組成物または上述したいずれかの形態の止血複合材料の止血分野における使用を提供することである。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の有益な効果は以下のとおりである。
【００３４】
１．止血組成物による血液凝固効果は、単独のゼオライト又は単独のトリプシンの血液凝固効果よりはるかに優れ、血液凝固時間は大幅に短縮され、突発的な大量出血に遭遇した場合、非常に効率的に止血でき、大動脈出血による致死のリスクを低減させ、重要な臓器の損傷をおさえ、血友病患者に対しても非常に短い時間で止血ができる。
【００３５】
２．現在、大動脈出血の緊急的状況や血友病患者の出血といった特殊な状況に対して、最も有効な止血材料はトロンビンに代表される血液製品である。しかし、トロンビンに代表される血液製品は、高価であり（トロンビンの価格は２０００ＲＭＢ／ｍｇである）、含有量が少なく（ヒトや動物の血液から抽出する必要がある）、貯蔵が困難である（低温保存が必要であり、体外で失活しやすい）などの欠点がある。トリプシン（０．１ＲＭＢ／ｍｇ）とゼオライト（３００ＲＭＢ／トン＝３×１０−７ＲＭＢ／ｍｇ）はいずれも非常に安価であり、無機材料が生体高分子に特異的に結合することにより、トリプシンとゼオライトの止血組成物の血液凝固性能がトロンビンの性能と同等、ひいてはそれ以上であり、止血材料のコストを大幅に低減することができ、商業化の将来性を有する。特に、血友病患者に対して、止血組成物は携帯型緊急止血材料とすることができ、その出血のリスクを減少させ、血友病患者の一生涯にかかる止血投薬費用を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】血液凝固経路の模式図である。
【図２】本発明の止血組成物の構造模式図である。
【図３】自然血液凝固時間、トリプシン、Ａ型ゼオライト、トロンビン及び本発明のトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物の正常血液の血液凝固効果の比較図である。
【図４】自然血液凝固時間、トロンビン、トロンビンゼオライト複合材料、トリプシン及び本発明のトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物の正常血液の血液凝固効果の比較図である。
【図５】自然血液凝固時間、トリプシン４Ａ型ゼオライト組成物、トリプシンＡ型ゼオライト（ＮＨ４＋）組成物、本発明のトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物の正常血液の血液凝固効果の比較図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、図面と実施例を参照して本発明をさらに説明する。
【００３８】
血液凝固効果の測定
【００３９】
（１）正常血液の血液凝固時間
２５ｍｇのサンプルを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。その後、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温した正常血液を１ｍＬ加え、正常血液が凝固した時の時間を当該サンプルの凝固時間とした。
【００４０】
（２）Ｘ因子欠乏血液の血液凝固時間
２５ｍｇのサンプルを２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、Ｘ因子欠乏血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。その後、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸ因子欠乏血液を１ｍＬ加え、Ｘ因子欠乏血液が凝固した時の時間を当該サンプルの凝固時間とした。
【００４１】
（３）ＶＩＩＩ因子欠乏血液の血液凝固時間
２５ｍｇのサンプルを２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、ＶＩＩＩ因子欠乏血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。その後、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＶＩＩＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加え、ＶＩＩＩ因子欠乏血液が凝固した時の時間を当該サンプルの凝固時間とした。
【００４２】
（４）ＩＸ因子欠乏血液の血液凝固時間
２５ｍｇのサンプルを２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、ＩＸ因子欠乏血液を３７℃の水浴中で３０分間保温した。その後、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＩＸ因子欠乏血液を１ｍＬ加え、ＩＸ因子欠乏血液が凝固した時の時間を当該サンプルの凝固時間とした。
【００４３】
（５）ＸＩ因子欠乏血液の血液凝固時間
２５ｍｇのサンプルを２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、ＸＩ因子欠乏血液を３７℃の水浴中で３０分間保温した。その後、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加え、ＸＩ因子欠乏血液が凝固した時の時間を当該サンプルの凝固時間とした。
【００４４】
比較例１
自然血液凝固時間は、正常な人が出血してから血液凝固するまでに必要な時間である。
【００４５】
自然血液凝固効果の測定：３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。体外実験の際、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２  ２０μＬを２ｍＬの遠心管に入れ、その後、保温した正常血液１ｍＬを加え、正常血液が凝固した時の時間を自然血液凝固時間（９．６ｍｉｎ）とした。
【００４６】
比較例２
Ａ型ゼオライトの血液凝固効果の測定
【００４７】
（１）シリカアルミナ比が２であるＡ型ゼオライト（Ｎａ型、すなわち１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの１００％を占める細孔）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたＡ型ゼオライトは、ゼオライト骨格外の金属カチオンの含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【００４８】
（２）上記で調製された２５ｍｇのＡ型ゼオライトを２ｍＬの遠心管に加え、３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。続いて、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温した正常血液１ｍＬを加え、正常血液が凝固した時の時間をＡ型ゼオライトの血液凝固時間とした。Ａ型ゼオライトの血液凝固時間は２．８ｍｉｎであった（表１）。これより分かるように、Ａ型ゼオライトの血液凝固効果は一般的である。
【００４９】
２５ｍｇのＡ型ゼオライトを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を予め３７℃の水浴中で３０分間保温した。そして、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加え、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液が凝固する時の時間をＡ型ゼオライトの血液凝固時間としたが、その過程で上記欠陥のある血液が長時間凝固しなかった（表１）。このことから、Ａ型ゼオライトが血友病の患者に対して血液凝固促進作用がないことが分かった。
【００５０】
比較例３
トリプシンの血液凝固効果の測定
【００５１】
（１）２５ｍｇのトリプシンを取って２ｍＬの遠心管に取り、３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。その後、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温した正常血液を１ｍＬ加え、正常血液が凝固した時の時間をトリプシンの血液凝固時間（４ｍｉｎ）とした。このことから、トリプシンの血液凝固効果が一般的であることが分かった。
【００５２】
（２）２５ｍｇのトリプシンを取って２ｍＬの遠心管に加え、３７℃で体外血液凝固実験を行い、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。その後、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加えた。Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液が凝固する時間は、それぞれ４、４．６、４、４ｍｉｎであり、このことから、トリプシンの血液凝固効果が一般的であることが分かった。
【００５３】
比較例４
トロンビンの血液凝固効果の測定
【００５４】
（１）トロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ４６４８トロンビン、製造元Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を取って１ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、５０μＬを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。続いて、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温した正常血液を１ｍＬ加え、正常血液が凝固する時の時間をトロンビンの血液凝固時間とした。トロンビンの血液凝固時間は０．５ｍｉｎであり、その血液凝固効果は高い（図３参照）。
【００５５】
（２）トロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ４６４８トロンビン、製造元Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を取って１ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、５０μＬを取って２ｍＬの遠心管に加え、３７℃で体外血液凝固実験を行い、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。続いて、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加えた。Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液が凝固する時の時間は、それぞれ０．５、０．５２、０．５１、０．５４ｍｉｎであった。このことからトロンビンの血液凝固効果が高いことが分かった（表１）。
【００５６】
比較例５
トロンビンゼオライト複合材料の調製：５ｇのＡ型ゼオライトを３０ｍＬの蒸留水に分散した。トロンビンをｐＨ７．０のリン酸緩衝液に溶解し、質量濃度が０．１％であるトロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ４６４８トロンビン、製造元Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液１０ｍＬを得た。その後、両者を体積比３：１で混合し、Ａ型ゼオライトとトロンビンの重量比例が１０：１である混合溶液４０ｍＬを得た。撹拌下で、０．５ｇのグリセロールと１ｇのマンニトールを加え、且つ質量濃度５％の塩化カルシウム溶液５０μＬを一滴ずつ滴下し、均一に混合し、更に撹拌状態で体積濃度１％のグルタルアルデヒド溶液２５０μＬを一滴ずつ滴下して架橋し、その後、適当な形状の金型に注ぎ、２時間放置し、ゲルを形成した後、−２０℃で２４時間冷凍し、更に−４０℃で３６ｈ真空冷凍乾燥し、金型を反転させ、磨砕、パッケージし、トロンビンゼオライト複合材料を得た。
【００５７】
トロンビンゼオライト複合材料の血液凝固効果の測定
【００５８】
（１）２５ｍｇのトロンビンゼオライト複合材料を取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。続いて、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温した正常血液を１ｍＬ加え、正常血液が凝固する時の時間をトロンビンゼオライト複合材料の凝固時間（２．２ｍｉｎ）とした。トロンビンを固定したトロンビンゼオライト複合材料の血液凝固効果が低下した。
【００５９】
（２）２５ｍｇのトロンビンゼオライト複合体を取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。続いて、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加えた。Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液が凝固する時の時間は、それぞれ４、３．６、４、４ｍｉｎであり、トロンビンを固定したトロンビンゼオライト複合材料の凝固効果が低下した（図４）。
【００６０】
トロンビンＡ型ゼオライト複合材料２の調製：アルミノケイ酸比が２であるＡ型ゼオライト（Ｎａ型、すなわち１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの１００％を占める細孔）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液で室温で１２ｈ浸漬した。上記の調製されたＡ型ゼオライトを水溶液中に均一に分散させ、Ａ型ゼオライトの懸濁液を形成し、Ａ型ゼオライトとトロンビンを十分に接触させ（トロンビンとＡ型ゼオライトの質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トロンビンをＡ型ゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トロンビンをゼオライトの表面に分散させ、トロンビンＡ型ゼオライト複合材料２を得た。
【００６１】
トロンビンゼオライト複合材料の血液凝固試験と同様に、トロンビンＡ型ゼオライト複合材料２に対して正常血液、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸおよびＸＩ因子欠乏血液の血液凝固効果試験を行ったところ、血液凝固時間は、それぞれ２、５、５、５．５、５．２ｍｉｎであった。
【００６２】
比較例４と比較例５との比較から、トロンビンとゼオライトとの複合体の血液凝固時間が、トロンビン単独の血液凝固時間よりも長いこと、即ち対応する血液凝固効果がトロンビン単独よりも低く、二種類の止血材の複合性能が単独の止血材よりも優れた性能は発揮していないことが分かった（表１参照）。
【実施例１】
【００６３】
トリプシンＡ型ゼオライト止血組成物の調製
【００６４】
（１）シリカアルミナ比が２であるＡ型ゼオライト（Ｎａ型、すなわち１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの１００％を占める細孔）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液で室温で１２ｈ浸漬し、得られたＡ型ゼオライトは、ゼオライト骨格外の金属カチオンの含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【００６５】
（２）上記調製により得られた２５ｍｇのＡ型ゼオライトを１ｍＬの水溶液に均一に分散させ、Ａ型ゼオライトの懸濁液を形成し、Ａ型ゼオライトとトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとＡ型ゼオライトの質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをＡ型ゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散させることで、トリプシンＡ型ゼオライト止血組成物を得た。
【００６６】
トリプシンＡ型ゼオライト止血組成物の正常血液凝固時間は０．４ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間はそれぞれ０．５、０．４、０．４、０．４５ｍｉｎであり、このことから、トリプシンＡ型ゼオライト止血組成物が正常血液に対して血液凝固効果が良好であり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固効果も良好であり、血液凝固時間が大幅に短縮され、血友病患者に対して凝固促進作用が良好であり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液にＡ型ゼオライトを加えた場合、血液が長時間凝固しないことが分かった（表１）。
【００６７】
実施例１と比較例２、３との比較から、トリプシンＡ型ゼオライト止血組成物の血液凝固効果は、Ａ型ゼオライト又はトリプシンの血液凝固効果（図３）に比べてはるかに良好であり、血液凝固時間が大幅に短縮されることが分かった。本発明に記載の止血組成物中のゼオライト（チャンネル構造及び金属陽イオン）は、トリプシンの空間配向に対して正の調節を行い、ゼオライトの表面のトリプシンが血液凝固カスケード（ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅ）を促進する過程においてプロトロンビンがトロンビンに変換する活性を向上させ、その血液凝固促進活性がトリプシン単独の活性より優れ、さらにゼオライト単独の血液凝固促進活性より優れている。突発的な大量出血に遭遇した場合、非常に効率的な止血が可能となり、大動脈出血による致死リスクを低下させ、重要な臓器の損傷を減少させることができる。止血組成物の止血効果はトロンビンの作用に相当し、止血材料のコストを大幅に低減することができ、商業化の将来性を有する。
【００６８】
【表１】
2021500936.tif 000003
【実施例２】
【００６９】
異なる二価カチオンのトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物の調製
【００７０】
（１）シリカアルミナ比が２であり、チャンネルが細孔であるＡ型ゼオライト（Ｎａ型）を、それぞれ、５Ｍ濃度の塩化コバルト、塩化ニッケル、塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩化ストロンチウム溶液のうち１種又は複数種に室温で１２ｈ浸漬し、得られたＡ型ゼオライトは、それぞれ異なる二価カチオンを含む。
【００７１】
（２）上記調製により得られた２５ｍｇの異なる二価カチオンを含んだＡ型ゼオライトを１ｍＬの水溶液に均一に分散させ、Ａ型ゼオライトの懸濁液を形成し、Ａ型ゼオライトとトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとＡ型ゼオライトの質量比が１：１０になるように添加する）、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させるように、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散させ、異なる二価カチオンのトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物を得た。
【００７２】
異なる二価カチオン（コバルト、ニッケル、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム）のトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物（表２）と比較例１〜３の血液凝固効果について、二価カチオンのトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物の血液凝固効果が、自然血液凝固、トリプシン、Ａ型ゼオライトの血液凝固効果よりはるかに優れていた。Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果も良好であり、凝固時間が大幅に短縮された。
【００７３】
【表２】
2021500936.tif 000004
【００７４】
備考：１）トリプシンＣｏ−Ａ型ゼオライト止血組成物は、コバルトイオンを含むＡ型ゼオライトとトリプシンとの組み合わせを含んだ止血組成物を意味する。２）トリプシンＣｏ−Ａ型／Ｎｉ−Ａ型ゼオライト止血組成物は、コバルトイオンとニッケルイオンとを含むＡ型ゼオライトとトリプシンとを組み合わせた止血組成物を意味する。３）表中の一価の陽イオンは、ナトリウムイオンである。
【００７５】
さらに、前記実施例２に記載のゼオライトの一価の陽イオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、水素イオンのいずれか一種又は複数種から選択することもできる。実施例２に記載の一価の陽イオンをカリウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、水素イオンのいずれか１種または複数種に置き換えた場合、二価の金属陽イオンを含む対応するトリプシンゼオライト止血組成物も本発明に記載の血液凝固効果を実現することができる。
【実施例３】
【００７６】
異なるトリプシンとゼオライトの質量比例のトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物の調製
【００７７】
（１）シリカアルミナ比が２であり、チャンネルが細孔であるＡ型ゼオライトを、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたＡ型ゼオライトは、それぞれ２価のマグネシウムイオンを含み、ゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占め、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【００７８】
（２）上記調製により得られた２５ｍｇのＡ型ゼオライトを１ｍＬの水溶液に均一に分散し、Ａ型ゼオライトの懸濁液を形成し、Ａ型ゼオライトとトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとＡ型ゼオライトの質量比が１：２００、１：１００、１：６０、１：５０、１：４０、１：２０、１：１０、１．５：１０、２：１０、２．５：１０、３：１０、４：１０となるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散し、異なる比例のトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物を得た（表３）。
【００７９】
【表３】
2021500936.tif 000005
【００８０】
異なる比例のトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物（それぞれ１：２００、１：１００、１：６０、１：５０、１：４０、１：２０、１：１０、１．５：１０、２：１０、２．５：１０、３：１０、４：１０の質量比で調製）と比較例１〜３の血液凝固効果は、トリプシンとゼオライトの質量比が１：２００〜４：１０の範囲内で、異なる比例のトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物の血液凝固効果（表３）は、自然血液凝固、トリプシン、ゼオライトの血液凝固効果よりはるかに優れていた。Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する血液凝固効果も良好で、血液凝固時間が大幅に短縮された。
【００８１】
比較例６
（１）シリカアルミナ比が２であり、チャンネルが細孔であるＡ型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化ナトリウム溶液に室温で２４ｈ浸漬し、得られたゼオライト骨格外金属カチオンがＮａであるＡ型ゼオライト（すなわち４Ａ型ゼオライト）は、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外金属カチオンの１００％を占めた。
【００８２】
（２）上記調製により得られた２５ｍｇの４Ａ型ゼオライトを１ｍＬの水溶液に均一に分散させ、４Ａ型ゼオライトの懸濁液を形成し、４Ａ型ゼオライトとトリプシンを十分に接触させ（トリプシンと４Ａ型ゼオライトの質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散させ、トリプシン４Ａ型ゼオライト止血組成物を得た。
【００８３】
トリプシン４Ａ型ゼオライト組成物の正常血液凝固時間は５ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ６．５、６、６、６．５ｍｉｎであり、このことから、トリプシン４Ａ型ゼオライト組成物の正常血液およびＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果も好ましくないことが分かった。
【００８４】
実施例１と比較例６との比較から、トリプシン４Ａ型ゼオライト組成物の血液凝固効果がトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物（図５）よりはるかに劣り、トリプシン４Ａ型ゼオライト組成物はひいては４Ａ型ゼオライト又はトリプシンの血液凝固効果よりも劣り、４Ａ型ゼオライト（二価陽イオンなし）におけるトリプシンの活性が低下し、ひいては全て失活し、ゼオライトの血液凝固促進効果を低下させることを示す。
【００８５】
ここで、ゼオライト骨格外の金属カチオンが一価のカチオンである場合（含有量が１００％である）、ゼオライトとトリプシンからなる組成物は、凝固促進活性が低く、本発明の止血組成物に属さない。
【００８６】
前記一価陽イオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、アンモニウムイオン、水素イオンのいずれか１種又は複数種から選択される。
【００８７】
比較例７
（１）シリカアルミナ比が２であり、チャンネルが細孔であるＡ型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化アンモニウム溶液で室温で２４ｈ浸漬し、得られたＡ型ゼオライトは、ゼオライト骨格外の金属カチオンの６０％を占める１価のアンモニウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの４０％を占めた。
【００８８】
（２）上記調製により得られたＡ型ゼオライト（ＮＨ４＋）を１ｍＬ水溶液に均一に分散させ、Ａ型ゼオライト（ＮＨ４＋）の懸濁液を形成し、Ａ型ゼオライト（ＮＨ４＋）とトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとＡ型ゼオライト（ＮＨ４＋）の質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散させ、トリプシンＡ型ゼオライト（ＮＨ４＋）組成物を得た。
【００８９】
トリプシンＡ型ゼオライト（ＮＨ４＋）組成物の正常血液凝固時間は５．２ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ６．１、６．４、６．４、６．５ｍｉｎであり、このことから、トリプシンＡ型ゼオライト（ＮＨ４＋）組成物の正常血液およびＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果も好ましくないことが分かった。
【００９０】
実施例１と比較例７との比較から、トリプシンＡ型ゼオライト（ＮＨ４＋）組成物の血液凝固効果がトリプシンＡ型ゼオライト止血組成物よりもはるかに劣り（図５）、トリプシンＡ型ゼオライト（ＮＨ４＋）組成物はひいてはＡ型ゼオライト（ＮＨ４＋、２．８ｍｉｎ）またはトリプシンの血液凝固効果よりも劣り、Ａ型ゼオライト（ＮＨ４＋、２価陽イオンなし）におけるトリプシンの活性が低下し、ひいてはすべて失活し、ゼオライトの血液凝固促進効果を低下させることを示す。
【００９１】
比較例８
（１）シリカアルミナ比が１５であり、チャンネルが細孔であるβゼオライト（Ｎａ型）を、０．１Ｍ濃度のアンモニア水溶液で室温で２４ｈ浸漬し、得られたβゼオライトは、ゼオライト骨格外の金属カチオンの４０％を占める１価のアンモニウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの６０％を占めた。
【００９２】
（２）上記調製により得られたβゼオライト（ＮＨ４＋）を１ｍＬ水溶液に均一に分散し、βゼオライト（ＮＨ４＋）の懸濁液を形成し、βゼオライト（ＮＨ４＋）とトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとβゼオライト（ＮＨ４＋）の質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散し、トリプシンβゼオライト（ＮＨ４＋）組成物を得た。
【００９３】
トリプシンβゼオライト（ＮＨ４＋）組成物の正常血液凝固時間は５．６ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ６．１、６．４、６．３、６．５ｍｉｎであり、このことから、トリプシンβゼオライト（ＮＨ４＋）組成物の正常血液およびＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果も好ましくないことが分かった。トリプシンβゼオライト（ＮＨ４＋）組成物の血液凝固効果は、トリプシンβゼオライト止血組成物よりはるかに劣り、トリプシンβゼオライト（ＮＨ４＋、２．８ｍｉｎ）組成物は、ひいてはβゼオライト（ＮＨ４＋）またはトリプシンの血液凝固効果よりも劣り、βゼオライト（ＮＨ４＋、二価陽イオンなし）におけるトリプシンの活性が低下し、ひいてはすべて失活し、ゼオライトの血液凝固促進効果を低下させることを示す。
【００９４】
比較例９
（１）シリカアルミナ比が２であり、チャンネルが細孔であるＡ型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたＡ型ゼオライトは、ゼオライト骨格外の金属カチオンの９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【００９５】
（２）上記調製により得られた２５ｍｇのＡ型ゼオライトを１ｍＬの水溶液に均一に分散させ、Ａ型ゼオライトの懸濁液を形成し、Ａ型ゼオライトとトリプシン０．８３ｍｇを十分に均一に分散させ（トリプシンとＡ型ゼオライトの質量比が１：３００になるようにする）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散させ、トリプシンＡ型ゼオライト組成物（１：３００）を得た。
【００９６】
トリプシンＡ型ゼオライト組成物（１：３００）の正常血液凝固時間は２．８ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ血液凝固因子欠乏血液は、トリプシンＡ型ゼオライト組成物（１：３００）を加えた後、血液が長時間凝固しない。このことから、Ａ型ゼオライトとトリプシンの比例を特定しなければ、良好な血液凝固促進作用を発揮することができず、トリプシンとゼオライトの比例が１：２００未満である場合、血液凝固促進効果が悪いことが分かった。
【００９７】
比較例１０
（１）シリカアルミナ比が２であり、チャンネルが細孔であるＡ型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたＡ型ゼオライトは、ゼオライト骨格外の金属カチオンの９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【００９８】
（２）上記調製により得られたＡ型ゼオライトを１ｍＬ水溶液に均一に分散させ、Ａ型ゼオライトの懸濁液を形成し、Ａ型ゼオライトとトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとＡ型ゼオライトの質量比が５：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散させ、トリプシンＡ型ゼオライト組成物（５：１０）を得た。
【００９９】
正常血液およびＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液は、トリプシンＡ型ゼオライト組成物（５：１０）を加えた後、血液が長時間凝固しない。このことから、Ａ型ゼオライトとトリプシンの比例を特定しなければ、良好な血液凝固促進作用を発揮することができず、トリプシンとゼオライトの比例が４：１０を超えると、かえって血液に抗血液凝固現象が起き、血液の大量流失を助長してしまう。
【０１００】
実施例１と比較例３、９、１０との比較から、本発明に記載の組成物におけるゼオライトとトリプシンの質量比は特定の質量比範囲（１：２００〜４：１０）を満たす必要があり、両者の質量比が該特定の質量比範囲外（比較例９、比較例１０）である場合、形成されたゼオライトとトリプシン複合体の血液に対する凝固時間はトリプシン単独の血液凝固時間より長いこと、すなわち凝固促進活性がトリプシン単独の血液凝固活性より低く、本発明の効率的な止血性能を達成できないことが分かった。
【０１０１】
比較例１１
メソポーラスシリカＭＣＭ−４１（チャンネルは２．８〜４．５ｎｍ）を１ｍＬ水溶液に均一に分散させ、メソポーラスシリカＭＣＭ−４１の懸濁液を形成し、メソポーラスシリカＭＣＭ−４１とトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとメソポーラスシリカＭＣＭ−４１の質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンＭＣＭ−４１組成物を得た。
【０１０２】
トリプシンＭＣＭ−４１組成物の正常血液凝固時間は５ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ５．５、６．３、６．２、６．１ｍｉｎであり、このことから、トリプシンＭＣＭ−４１組成物の正常血液およびＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果も好ましくないことが分かった。トリプシンＭＣＭ−４１組成物は、ひいてはＭＣＭ−４１（３ｍｉｎ）またはトリプシンの血液凝固効果よりも劣った。
【０１０３】
比較例１２
シリカアルミナ比が２であるメソポーラスＡ型ゼオライト（Ｎａ型、チャンネルは５ｎｍ）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液で室温で１２ｈ浸漬し、得られたＡ型ゼオライトは、ゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１０４】
上記調製により得られたメソポーラスＡ型ゼオライトを１ｍＬ水溶液に均一に分散させ、メソポーラスＡ型ゼオライトの懸濁液を形成し、メソポーラスＡ型ゼオライトとトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとメソポーラスＡ型ゼオライトの質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンメソポーラスＡ型ゼオライト組成物を得た。
【０１０５】
トリプシンメソポーラスＡ型ゼオライト組成物の正常血液凝固時間は５．５ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ５．６、５．３、５．２、５．１ｍｉｎであり、このことから、トリプシンメソポーラスＡ型ゼオライト組成物の正常血液とＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果も好ましくないことが分かった。トリプシンメソポーラスＡ型ゼオライト組成物は、ひいてはメソポーラスＡ型ゼオライトまたはトリプシンの血液凝固効果よりも劣った。
【０１０６】
実施例１と比較例１１、１２との比較から、トリプシンメソポーラスゼオライト組成物の血液凝固促進効果は、本発明のトリプシンゼオライト止血組成物よりも低く、トリプシンメソポーラスゼオライト組成物は、メソポーラスゼオライト単独又はトリプシン単独の血液凝固促進効果よりも劣っていることが分った。同じゼオライトとトリプシンの質量比、同じ二価の金属カチオンの条件下で、ゼオライトの孔径の大きさは、ゼオライトとトリプシンからなる止血組成物の止血性能において肝心な役割を果たす。これは、トリプシンがメソポーラスゼオライトのメソポーラスに入るが、生体大分子がゼオライトのメソポーラスチャンネルに入ることができず、血液と接触する時、メソポーラスチャンネル内のトリプシンが血液中の血液凝固経路の血液凝固因子と接触することができず、血液凝固経路反応を迅速に活性化することができず、これにより血液凝固を促進する効果を低下させるためである。
【０１０７】
本発明に記載のメソポーラスは、ゼオライトのチャンネルであり、サイズが５０ｎｍ以下であり、且つ細孔のサイズより大きい。
【０１０８】
比較例１３
（１）アルミナ比が１．５であり、チャンネルが細孔である菱沸石（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液で室温で１２ｈ浸漬し、得られた菱沸石は、ゼオライト骨格外の金属カチオンの含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１０９】
（２）上記調製により調製された菱沸石の凝固効果測定：２５ｍｇの菱沸石を取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間恒温にする。続いて、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温した正常血液を１ｍＬ加え、正常血液が凝固する時の時間を菱沸石の凝固時間とした。菱沸石の凝固時間が２ｍｉｎであった。このことから菱沸石の凝固効果が一般的であることが分かった。
【０１１０】
以上のように調製して得られた菱沸石２５ｍｇを２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。そして、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加え、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液が凝固する時の時間を菱沸石の凝固時間としたが、その過程で上記欠陥のある血液が長時間凝固していなかった。このことから、血友病の患者に対して菱沸石は凝固促進作用がないことが分かった。
【実施例４】
【０１１１】
トリプシン菱沸石止血組成物の調製
【０１１２】
（１）シリカアルミナ比が１．５であり、チャンネルが細孔である菱沸石（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られた菱沸石は、ゼオライト骨格外の金属カチオンの含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１１３】
（２）上記調製により得られた２５ｍｇの菱沸石を１ｍＬの水溶液に均一に分散し、菱沸石の懸濁液を形成し、菱沸石とトリプシンを十分に接触させ（トリプシンと菱沸石の質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散し、トリプシン菱沸石止血組成物を得た。
【０１１４】
トリプシン菱沸石止血組成物の正常血液凝固時間は０．３５ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液凝固時間は、それぞれ０．４５、０．３５、０．３５、０．４５ｍｉｎであり、このことから、トリプシン菱沸石止血組成物が正常血液に対して凝固効果に優れ、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果にも優れ、凝固時間が大幅に短縮され、血友病患者に対して良好な凝固促進作用を有することが分かった。Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ血液凝固因子欠乏血液は、菱沸石を添加した場合、血液が長時間凝固しなかった。実施例４と比較例１３との比較から、トリプシン菱沸石止血組成物の血液凝固効果は、菱沸石単独又はトリプシン単独の血液凝固効果に比べてはるかに優れ、血液凝固時間が大幅に短縮されることが分かった。
【０１１５】
比較例１４
（１）シリカアルミナ比が１５であり、チャンネルが細孔であるβゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液で室温で１２ｈ浸漬し、得られたβゼオライトは、ゼオライト骨格外の金属カチオンの９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１１６】
（２）上記により調製して得られたβゼオライトの血液凝固効果測定：２５ｍｇのβゼオライトを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。続いて、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温した正常血液を１ｍＬ加え、正常血液が凝固する時の時間をβゼオライトの凝固時間とした。βゼオライトの凝固時間は３ｍｉｎであり、このことから、βゼオライトの凝固効果が一般的であることが分かった。
【０１１７】
２５ｍｇのβゼオライトを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を予め３７℃の水浴中で３０分間保温した。そして、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加え、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液が凝固する時の時間をβゼオライトの凝固時間としたが、その過程で上記欠陥のある血液が長時間凝固せず、βゼオライトが血友病の患者に対して凝固促進作用がないことが分かった。
【実施例５】
【０１１８】
トリプシンβゼオライト止血組成物の調製
【０１１９】
（１）シリカアルミナ比が１５であり、チャンネルが細孔であるβゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたβゼオライトは、ゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１２０】
（２）上記調製により得られた２５ｍｇのβゼオライトを１ｍＬの水溶液に均一に分散し、βゼオライトの懸濁液を形成し、βゼオライトとトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとβゼオライトの質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散し、トリプシンβゼオライト止血組成物を得た。
【０１２１】
トリプシンβゼオライト止血組成物の正常血液凝固時間は０．５２ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ０．５５、０．５５、０．５、０．５ｍｉｎであり、このことから、トリプシンβゼオライト止血組成物は正常血液に対して凝固効果が良好であり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果も良好であり、凝固時間が大幅に短縮され、血友病患者に対して凝固促進効果が良好であることが分かった。Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液は、βゼオライトを添加した場合、血液が長時間凝固しない。実施例５と比較例１４との比較から、トリプシンβゼオライト止血組成物の血液凝固効果は、βゼオライト又はトリプシンの血液凝固効果よりはるかに優れ、血液凝固時間が大幅に短縮されることが分かった。
【０１２２】
比較例１５
（１）シリカアルミナ比が１０であり、チャンネルが細孔であるモルデナイト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたモルデナイトは、ゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオン含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１２３】
（２）上記調製により得られたモルデナイトの血液凝固効果測定：２５ｍｇのモルデナイトを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。続いて、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温した正常血液を１ｍＬ加え、正常血液が凝固する時の時間をモルデナイトの血液凝固時間とした。モルデナイトの血液凝固時間は２．５ｍｉｎであり、このことからモルデナイトの血液凝固効果が一般的であることが分かった。
【０１２４】
２５ｍｇモルデナイトを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を予め３７℃の水浴中で３０分間保温した。その後、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加え、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液が凝固する時の時間をモルデナイトの凝固時間としたが、その過程で上記欠陥のある血液が長時間凝固せず、このことからモルデナイトが血友病の患者に対して凝固促進作用がないこと分かった。
【実施例６】
【０１２５】
トリプシンモルデナイト止血組成物の調製
【０１２６】
（１）シリカアルミナ比が１０であり、チャンネルが細孔であるモルデナイト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたモルデナイトは、ゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１２７】
（２）上記調製により得られた２５ｍｇのモルデナイトを１ｍＬの水溶液に均一に分散し、モルデナイトの懸濁液を形成し、モルデナイトとトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとモルデナイトの質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをモルデナイト表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをモルデナイト表面に分散し、トリプシンモルデナイト止血組成物を得た。
【０１２８】
トリプシンモルデナイト止血組成物の正常血液凝固時間は０．４５ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ０．４５、０．４５、０．５、０．５ｍｉｎであり、このことからトリプシンモルデナイト止血組成物は正常血液に対して凝固効果が良好であり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果も良好であり、凝固時間が大幅に短縮され、血友病患者に対して凝固促進効果が良好であることが分かった。Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液はモルデナイトを添加した場合、血液が長時間凝固しない。実施例６と比較例１５との比較から、トリプシンモルデナイト止血組成物の血液凝固効果はモルデナイト又はトリプシンの血液凝固効果よりはるかに優れ、血液凝固時間が大幅に短縮されることが分かった。
【０１２９】
比較例１６
（１）シリカアルミナ比が１であり、チャンネルが細孔であるＸ型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたモルデナイトは、ゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１３０】
（２）上記調製により得られたＸ型ゼオライトの血液凝固効果測定：２５ｍｇのＸ型ゼオライトを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。続いて、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温した正常血液を１ｍＬ加え、正常血液が凝固する時の時間をＸ型ゼオライトの血液凝固時間とした。Ｘ型ゼオライトの血液凝固時間は２．１ｍｉｎであり、このことからＸ型ゼオライトの血液凝固効果が一般的であることが分かった。
【０１３１】
２５ｍｇのＸ型ゼオライトを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を予め３７℃の水浴中で３０分間保温した。その後、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加え、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液が凝固する時の時間をモルデナイトの凝固時間としたが、その過程で上記欠陥のある血液が長時間凝固せず、このことからＸ型ゼオライトが血友病の患者に対して凝固促進作用がないこと分かった。
【実施例７】
【０１３２】
トリプシンＸ型ゼオライト止血組成物の調製
【０１３３】
（１）シリカアルミナ比が１であり、チャンネルが細孔であるＸ型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたモルデナイトは、ゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１３４】
（２）上記調製して得られた２５ｍｇのＸ型ゼオライトを１ｍＬの水溶液に均一に分散し、Ｘ型ゼオライトの懸濁液を形成し、Ｘ型ゼオライトとトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとＸ型ゼオライトの質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散し、トリプシンＸ型ゼオライト止血組成物を得た。
【０１３５】
トリプシンＸ型ゼオライト止血組成物の正常血液凝固時間は０．４８ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ０．４８、０．４５、０．５、０．５ｍｉｎであり、このことからトリプシンＸ型ゼオライト止血組成物は正常血液に対して凝固効果が良好であり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果も良好であり、凝固時間が大幅に短縮され、血友病患者に対して凝固促進効果が良好であることが分かった。Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液はＸ型ゼオライトを加えた場合、血液が長時間凝固しない。実施例７と比較例１６との比較から、トリプシンＸ型ゼオライト止血組成物の血液凝固効果はＸ型ゼオライト又はトリプシンの血液凝固効果に比べてはるかに優れ、血液凝固時間が大幅に短縮されることが分かった。
【０１３６】
比較例１７
（１）シリカアルミナ比が３であり、チャンネルが細孔であるＹ型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたＹ型ゼオライトはゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１３７】
（２）上記調製により得られたＹ型ゼオライトの血液凝固効果測定：２５ｍｇのＹ型ゼオライトを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。続いて、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温した正常血液を１ｍＬ加え、正常血液が凝固する時の時間をＹ型ゼオライトの凝固時間とした。Ｙ型ゼオライトの凝固時間は２ｍｉｎであった。このことから、Ｙ型ゼオライトの凝固効果が一般的であることが分かった。
【０１３８】
２５ｍｇのＹ型ゼオライトを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を予め３７℃の水浴中で３０分間保温した。そして０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加え、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液が凝固する時の時間をＹ型ゼオライトの凝固時間としたが、その過程で上記欠陥のある血液が長時間凝固せず、Ｙ型ゼオライトが血友病の患者に凝固促進作用を与えないことが分かった。
【実施例８】
【０１３９】
トリプシンＹ型ゼオライト止血組成物の調製
【０１４０】
（１）シリカアルミナ比が３であり、チャンネルが細孔であるＹ型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたＹ型ゼオライトはゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１４１】
（２）上記調製して得られた２５ｍｇのＹ型ゼオライトを１ｍＬの水溶液に均一に分散し、Ｙ型ゼオライトの懸濁液を形成し、Ｙ型ゼオライトとトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとＹ型ゼオライトの質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散し、トリプシンＹ型ゼオライト止血組成物を得た。
【０１４２】
トリプシンＹ型ゼオライト止血組成物の正常血液凝固時間は０．３ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ０．３３、０．４、０．３、０．３ｍｉｎであり、このことからトリプシンＹ型ゼオライト止血組成物は正常血液に対して凝固効果に優れ、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果も優れ、凝固時間が大幅に短縮され、血友病患者に対して良好な凝固促進作用があることが分かった。Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液はＹ型ゼオライトを添加した場合、血液が長時間凝固しない。実施例８と比較例１７との比較から、トリプシンＹ型ゼオライト止血組成物の血液凝固効果はＹ型ゼオライト又はトリプシンの血液凝固効果よりはるかに優れ、血液凝固時間が大幅に短縮されることが分かった。
【０１４３】
比較例１８
（１）シリカアルミナ比が２０であり、チャンネルが細孔であるＺＳＭ−５型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたＺＳＭ−５型ゼオライトはゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１４４】
（２）上記調製したＺＳＭ−５型ゼオライトの血液凝固効果測定：２５ｍｇのＺＳＭ−５型ゼオライトを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、正常血液を予め３７℃の水浴で３０分間保温した。続いて、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温した正常血液を１ｍＬ加え、正常血液が凝固する時の時間をＺＳＭ−５型ゼオライトの凝固時間とした。ＺＳＭ−５型ゼオライトの凝固時間は２ｍｉｎであり、このことからＺＳＭ−５型ゼオライトの凝固効果が一般的であることが分かった。
【０１４５】
２５ｍｇのＺＳＭ−５型ゼオライトを取って２ｍＬの遠心管に入れ、３７℃で体外血液凝固実験を行い、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を３７℃の水浴中で３０分間保温した。そして、０．２Ｍ  ＣａＣｌ２を２０μＬ加え、最後に保温したＸ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液を１ｍＬ加え、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩ因子欠乏血液が凝固する時の時間をＺＳＭ−５型ゼオライトの凝固時間としたが、その過程で上記欠陥のある血液が長時間凝固せず、このことからＺＳＭ−５型ゼオライトが血友病の患者に対して凝固促進作用がないことが分かった。
【実施例９】
【０１４６】
トリプシンＺＳＭ−５型ゼオライト止血組成物の調製
【０１４７】
（１）シリカアルミナ比が２０であり、チャンネルが細孔であるＺＳＭ−５型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたＺＳＭ−５型ゼオライトはゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１４８】
（２）上記調製により得られた２５ｍｇのＺＳＭ−５型ゼオライトを１ｍＬの水溶液に均一に分散し、ＺＳＭ−５型ゼオライトの懸濁液を形成し、ＺＳＭ−５型ゼオライトとトリプシンを十分に接触させ（トリプシンとＺＳＭ−５型ゼオライトの質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散し、トリプシンＺＳＭ−５型ゼオライト止血組成物を得た。
【０１４９】
トリプシンＺＳＭ−５型ゼオライト止血組成物の正常血液凝固時間は０．４ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ０．４３、０．４２、０．４、０．４ｍｉｎであり、このことからトリプシンＺＳＭ−５型ゼオライト止血組成物は正常血液に対して凝固効果が良好であり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果も良好であり、凝固時間が大幅に短縮され、血友病患者に対して良好な凝固促進作用があることが分かった。Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液はＺＳＭ−５型ゼオライトを添加した場合、血液が長時間凝固しない。実施例９と比較例１８との比較から、トリプシンＺＳＭ−５型ゼオライト止血組成物の血液凝固効果はＺＳＭ−５型ゼオライト又はトリプシンの血液凝固効果よりはるかに優れ、血液凝固時間が大幅に短縮されることが分かった。
【実施例１０】
【０１５０】
トリプシンＺＳＭ−５型／Ｙ型ゼオライト止血組成物の調製
【０１５１】
（１）シリカアルミナ比が２０であり、チャンネルが細孔であるＺＳＭ−５型ゼオライト（Ｎａ型）とシリカアルミナ比が４であり、チャンネルが細孔であるＹ型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたゼオライトはゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１５２】
（２）上記調製により得られた２５ｍｇのＺＳＭ−５型ゼオライトとＹ型ゼオライト（１：１）を１ｍＬの水溶液に均一に分散させ、ＺＳＭ−５型ゼオライトとＹ型ゼオライトの懸濁液を形成し、ＺＳＭ−５型ゼオライトとＹ型ゼオライトをトリプシンと十分に接触させ（トリプシンと、ＺＳＭ−５型ゼオライト及びＹ型ゼオライトの質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散させ、トリプシンＺＳＭ−５型／Ｙ型ゼオライト止血組成物を得た。
【０１５３】
トリプシンＺＳＭ−５型／Ｙ型ゼオライト止血組成物の正常血液凝固時間は０．３４ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ０．３３、０．３２、０．４、０．３４ｍｉｎであり、このことから、トリプシンＺＳＭ−５型／Ｙ型ゼオライト止血組成物は正常血液に対して凝固効果に優れ、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果にも優れ、凝固時間が大幅に短縮され、血友病患者に対して凝固促進作用があることが分かった。トリプシンＺＳＭ−５型／Ｙ型ゼオライト止血組成物の血液凝固効果はゼオライト又はトリプシンの血液凝固効果よりはるかに優れ、血液凝固時間が大幅に短縮された。
【実施例１１】
【０１５４】
トリプシンモルデナイト／Ｘ型ゼオライト止血組成物の調製
【０１５５】
（１）シリカアルミナ比が２０であり、チャンネルが細孔であるモルデナイト（Ｎａ型）とシリカアルミナ比が１．２であり、チャンネルが細孔であるＸ型ゼオライト（Ｎａ型）を、５Ｍ濃度の塩化マグネシウム溶液に室温で１２ｈ浸漬し、得られたゼオライトはゼオライト骨格外の金属カチオン含有量の９５％を占める２価のマグネシウムイオンを含み、１価のナトリウムイオンがゼオライト骨格外の金属カチオンの５％を占めた。
【０１５６】
（２）上記調製により得られた２５ｍｇのモルデナイトとＸ型ゼオライト（１：１）を１ｍＬの水溶液に均一に分散させ、モルデナイトとＸ型ゼオライトの懸濁液を形成し、モルデナイトとＸ型ゼオライトを、トリプシンと十分に接触させ（トリプシンと、モルデナイト及びＸ型ゼオライトの質量比が１：１０になるように添加する）、２５℃で３０ｍｉｎ混合し、トリプシンをゼオライトの表面に吸着させ、且つ上記溶液を−２０℃で５ｈ真空乾燥させ、トリプシンをゼオライトの表面に分散させ、トリプシンモルデナイト／Ｘ型ゼオライト止血組成物を得た。
【０１５７】
トリプシンモルデナイト／Ｘ型ゼオライト止血組成物の正常血液凝固時間は０．４ｍｉｎであり、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液の凝固時間は、それぞれ０．４３、０．３７、０．４、０．３６ｍｉｎであり、このことから、トリプシンモルデナイト／Ｘ型ゼオライト止血組成物は正常血液に対して凝固効果に優れ、Ｘ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ凝固因子欠乏血液に対する凝固効果にも優れ、凝固時間が大幅に短縮され、血友病患者に対して良好な凝固促進作用があることが分かった。トリプシンモルデナイト／Ｘ型ゼオライト止血組成物の血液凝固効果は、ゼオライト又はトリプシンの血液凝固効果よりはるかに優れ、血液凝固時間が大幅に短縮された。
【０１５８】
そのうち、本発明の実施例１〜１１に記載のゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比は１：０．５〜１：２０であり、好ましくは、前記ゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比は１：０．８〜１：１０であり、好ましくは、前記ゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比は１：１〜１：５であり、好ましくは、前記ゼオライトの懸濁液におけるゼオライトと脱イオン水の質量比は１：１．５〜１：２．５である。
【０１５９】
さらに、本発明の実施例１〜１１で、前記ゼオライトの懸濁液を超音波処理する。
【０１６０】
さらに、本発明の実施例１〜１１に記載の超音波処理の時間は０．５〜３０ｍｉｎであり、超音波周波数は２０〜２００ｋＨＺであり、超音波パワーは２００〜５０００Ｗである。
【０１６１】
さらに、本発明の実施例１〜１１に記載のトリプシンとゼオライトとの接触温度は１０〜３７℃であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトとの接触温度は１５〜３０℃であり、好ましくは、前記トリプシンとゼオライトとの接触温度は２０〜２５℃である。
【０１６２】
さらに、本発明の実施例１〜１１に記載のトリプシンをゼオライトの表面に吸着した後にさらにゼオライトの懸濁液とトリプシンを凍結乾燥するステップを含み、好ましくは、前記凍結乾燥の温度は０℃〜−８０℃であり、好ましくは、前記凍結乾燥の温度は−１０℃〜−６０℃であり、好ましくは、前記凍結乾燥の温度は−２０℃〜−５０℃であり、好ましくは、前記凍結乾燥の温度は−３０℃〜−４５℃である。
【０１６３】
以上のように、本発明の止血複合体の凝固促進効果を達成するために、特定のゼオライトとトリプシンの質量比（１：２００〜４：１０）、特定のゼオライト骨格外の金属カチオン（２価の金属カチオン）、特定のゼオライトの孔径の大きさ（細孔）の相乗作用が必要であり、三つの条件はいずれも不可欠であり、このようにしなければ本発明に記載の止血性能に優れた止血組成物を形成することができない。無機材料と生体大分子を特異的に結合させることにより、トリプシンとゼオライトの止血組成物の血液凝固性能は、単独のトロンビンの血液凝固性能と同等、ひいてはそれ以上であり、止血材料のコストを大幅に低減させることができ、商業化の将来性を有している。
【０１６４】
本発明は、従来技術の偏見を克服し、驚くほど止血が速く、コストが低く、かつ血友病に有効な無機生物酵素止血材料を初めて製造した。前記止血組成物の血液凝固効果は、ゼオライト単独又はトリプシン単独の血液凝固性能よりはるかに優れ、血液凝固時間が大幅に短縮され、失血量が著しく低下する。本発明の前記止血組成物中のゼオライト（細孔のチャンネル構造、二価の金属陽イオン、特定のゼオライトとトリプシンの質量比）はトリプシンの空間コンフォメーション、空間配向に対して正の調節を行い、ゼオライトの表面のトリプシンの空間コンフォメーションが血液凝固経路（ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅ）中のプロトロンビンと接触させるのにより有利であり、これにより血液凝固経路（ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅ）中のプロトロンビンのトロンビンへ変換する活性の向上を促進し、血液凝固促進活性を向上させる。トリプシンとゼオライトとの相乗作用からなる本発明の前記止血組成物の全体的な効果は、トリプシン単独またはゼオライト単独の効果よりはるかに優れ、その血液凝固促進活性は、トリプシン単独の血液凝固促進活性よりはるかに優れ、ゼオライト単独の血液凝固促進活性よりもはるかに優れ、ひいては、トロンビン単独の血液凝固活性よりはるかに優れている。突発的な大量出血に遭遇した場合、止血組成物は効率よく止血することができ、大動脈出血の致死リスクを低下させ、重要な臓器の損傷を減少させ、血友病患者に対しても良好な血液凝固促進作用を有する。
【０１６５】
以上の実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。また、本発明の教示内容に接した後、当業者は本発明に対して様々な変更や修正を行うことができ、それらの同等形態も同様に本出願の特許請求の範囲に規定された範囲内にあることが理解されるべきである。
【図１】
2021500936.tif 000006
【図２】
2021500936.tif 000007
【図３】
2021500936.tif 000008
【図４】
2021500936.tif 000009
【図５】
2021500936.tif 000010
【国際調査報告】
2021500936.tif 000011
2021500936.tif 000012
2021500936.tif 000013
2021500936.tif 000014
2021500936.tif 000015
2021500936.tif 000016
2021500936.tif 000017
2021500936.tif 000018