(57)【要約】  本発明は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントを活性成分として含む、筋疾患またはカヘキシーの予防または処置のための医薬組成物に関する。本発明において、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡの発現が年齢が上がるにつれて減少することが判明した。特に、大部分のｍｉＲＮＡが十分に分化した筋管で過発現されるとき、筋管直径増加が確認された。さらに、腫瘍誘発カヘキシーマウスモデルにおいて、カヘキシーはＡｔｒｏｇｉｎ−１タンパク質の阻害により改善することが確認された。従って、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントは、Ａｔｒｏｇｉｎ−１依存性筋疾患およびカヘキシーの処置および予防に有用である。
2021509914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントを活性成分として含む、筋疾患を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項２】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−６６８、ｍｉＲＮＡ−３７６ｃ、ｍｉＲＮＡ−４９４、ｍｉＲＮＡ−５４１、ｍｉＲＮＡ−３７７、ｍｉＲＮＡ−１１９７、ｍｉＲＮＡ−４９５、ｍｉＲＮＡ−３００、ｍｉＲＮＡ−４０９、ｍｉＲＮＡ−５４４ａ、ｍｉＲＮＡ−３７９、ｍｉＲＮＡ−４３１、ｍｉＲＮＡ−５４３およびｍｉＲＮＡ−３３７からなる群から選択される何れかである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ｍｉＲＮＡがＡｔｒｏｇｉｎ−１／ＭＡＦｂｘタンパク質の発現レベルを低下させる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ｍｉＲＮＡがＡｔｒｏｇｉｎ−１／ＭＡＦｂｘタンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’非翻訳領域(３’−ＵＴＲ)と直接相互作用し、Ａｔｒｏｇｉｎ−１／ＭＡＦｂｘ発現を抑制する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
筋疾患がサルコペニア、筋萎縮、筋ジストロフィーおよび心臓萎縮からなる群から選択される何れかである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを活性成分として含む、筋疾患を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項７】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−６６８、ｍｉＲＮＡ−３７６ｃ、ｍｉＲＮＡ−４９４、ｍｉＲＮＡ−５４１、ｍｉＲＮＡ−３７７、ｍｉＲＮＡ−１１９７、ｍｉＲＮＡ−４９５、ｍｉＲＮＡ−３００、ｍｉＲＮＡ−４０９、ｍｉＲＮＡ−５４４ａ、ｍｉＲＮＡ−３７９、ｍｉＲＮＡ−４３１、ｍｉＲＮＡ−５４３およびｍｉＲＮＡ−３３７からなる群から選択される何れかである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ベクターがプラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスおよびそれらのアナログからなる群から選択される何れかである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ウイルスがアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントを活性成分として含む、カヘキシーを予防または処置するための医薬組成物。
【請求項１１】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−６６８、ｍｉＲＮＡ−３７６ｃ、ｍｉＲＮＡ−４９４、ｍｉＲＮＡ−５４１、ｍｉＲＮＡ−３７７、ｍｉＲＮＡ−１１９７、ｍｉＲＮＡ−４９５、ｍｉＲＮＡ−３００、ｍｉＲＮＡ−４０９、ｍｉＲＮＡ−５４４ａ、ｍｉＲＮＡ−３７９、ｍｉＲＮＡ−４３１、ｍｉＲＮＡ−５４３およびｍｉＲＮＡ−３３７からなる群から選択される何れかである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを活性成分として含む、カヘキシーを予防または処置するための医薬組成物。
【請求項１３】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−６６８、ｍｉＲＮＡ−３７６ｃ、ｍｉＲＮＡ−４９４、ｍｉＲＮＡ−５４１、ｍｉＲＮＡ−３７７、ｍｉＲＮＡ−１１９７、ｍｉＲＮＡ−４９５、ｍｉＲＮＡ−３００、ｍｉＲＮＡ−４０９、ｍｉＲＮＡ−５４４ａ、ｍｉＲＮＡ−３７９、ｍｉＲＮＡ−４３１、ｍｉＲＮＡ−５４３およびｍｉＲＮＡ−３３７からなる群から選択される何れかである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ベクターがプラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスおよびそれらのアナログからなる群から選択される何れかである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ウイルスがアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
対象に請求項１〜９の何れかに記載の医薬組成物を投与する過程を含む、筋疾患を予防または処置する方法。
【請求項１７】
対象に請求項１０〜１５の何れかに記載の医薬組成物を投与する過程を含む、カヘキシーを予防または処置する方法。
【請求項１８】
筋疾患の予防または処置のための医薬の製造における、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントの使用。
【請求項１９】
筋疾患の予防または処置のための医薬の製造における、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターの使用。
【請求項２０】
カヘキシーの予防または処置のための医薬の製造における、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントの使用。
【請求項２１】
カヘキシーの予防または処置のための医薬の製造における、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントを活性成分として含む、筋疾患またはカヘキシーの予防または処置のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋の質量および機能は年齢と共に徐々に低下し、高齢者の死亡率および低クオリティ・オブ・ライフの主因となっている。加齢下での骨格筋は筋肉量の減少だけでなく、強度および機能に進行性の低下も示す。この疾患は「加齢性サルコペニア」と称される(Jun-Won Heo and et al., Aging-induced Sarcopenia and Exercise. The Official Journal of the Korean Academy of Kinesiology, 19(2). DOI: http://doi.org/10.15758/jkak.2017.19.2.43)。筋肉量は、３０歳代で毎年約１％減少する。加齢性サルコペニアの有病率は６０歳代の高齢者で約１０％であり、８０歳代で約５０％に増加する。年齢による筋肉減少は、身体活動の障害ならびに２型糖尿病、肥満、異脂肪血症および高血圧などの種々の疾患を誘発する。それ故に、健康な筋肉のための有効な治療剤の開発が喫緊である。しかしながら、今日まで、米国食品医薬品局(ＦＤＡ)で承認されている加齢性サルコペニアの治療剤はない。最近、加齢性サルコペニアについて、世界保健機構は、International Classification of Diseases, 10th Revision, Clinical Modification (ICD-10-CM)でその疾患コードを付けている。この状況に鑑み、加齢性サルコペニアの診断剤および治療剤の開発が加速することが期待される。
【０００３】
筋肉量は、同化と異化の動的つり合いにより決定される。筋萎縮はインターロイキン−１(ＩＬ−１)、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ−α)およびグルココルチコイドを含む種々の刺激を介して起こることが報告されている。このような筋萎縮で、筋肉特異的Ｅ３リガーゼ(例えば、ＭｕＲＦ１およびＡｔｒｏｇｉｎ−１／ＭＡＦｂｘ)が重要な役割を有することが知られている。このようなＥ３リガーゼは、筋肉が長期間動かされない場合の、神経損傷、糖尿病、敗血症、甲状腺機能亢進症および癌誘発カヘキシーなどの種々の疾患で顕著に増加することが報告されている。加齢した筋肉でのＥ３リガーゼ制御機構はほとんど知られておらず、マウス、ラットおよびヒト筋肉におけるＭｕＲＦ１およびＡｔｒｏｇｉｎ−１の遺伝子発現レベルのみが知られている。しかしながら、遺伝子発現試験のこれらの研究結果は、他の研究グループが提供する結果と矛盾するなど論議も呼んでいる。
【０００４】
同時に、マイクロＲＮＡ(ここでは以後ｍｉＲＮＡと称する)は、最も広く研究されている非コーディングＲＮＡの一つであり、転写後レベルで遺伝子発現の制御に主要な役割を有する。各々約２２ヌクレオチドからなる一本鎖分子であるマイクロＲＮＡ類は、しばしばポリシストロン性クラスターに配置され、同じ標的または同じ経路を共標的とする。デルタ様１ホモログタイプ３ヨードチロニンデヨージナーゼ(Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３)は、知られる最大ｍｉＲＮＡクラスターである。筋肉加齢におけるＤｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターの機能はほとんど知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明者らは、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡ類が、加齢が原因の筋肉減少に何らかの共通した役割を有するかを試験し、そして、その試験に基づき、加齢性サルコペニアの治療剤としてのそれらの使用の可能性を確認することを意図した。その結果、本発明者らは、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡ類がマウスで骨格筋および筋芽細胞の加齢に関与することを確認した。さらに、本発明者らは、筋肉加齢過程におけるｍｉＲＮＡ介在Ａｔｒｏｇｉｎ−１発現制御機構を解明し、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターにおけるｍｉＲＮＡ類に基づく遺伝的治療法が筋肉加齢ならびに癌誘発カヘキシーに有効な予防効果を有することを確認し、そうして本発明を完成させた。
【０００６】
本発明の目的は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターにおけるｍｉＲＮＡを活性成分として含む、筋肉加齢またはカヘキシーの予防または処置のための医薬組成物の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントを活性成分として含む、筋疾患の予防または処置のための医薬組成物を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを活性成分として含む、筋疾患の予防または処置のための医薬組成物を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントを活性成分として含む、カヘキシーの予防または処置のための医薬組成物を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを活性成分として含む、カヘキシーの予防または処置のための医薬組成物を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、筋疾患を予防または処置するための医薬組成物を対象に投与することを含む、筋疾患を予防または処置する方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、カヘキシーを予防または処置するための医薬組成物を対象に投与することを含む、カヘキシーを予防または処置する方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、筋疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、Ｄｌｋｌ−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントの使用を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、筋疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターの使用を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、カヘキシーを予防または処置するための医薬の製造のための、Ｄｌｋｌ−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントの使用を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、カヘキシーを予防または処置するための医薬の製造のための、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターの使用を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明において、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡ類の発現が加齢により減少することが判明した。さらに十分に分化した筋管で特定のｍｉＲＮＡが過発現されるとき、筋管直径の増加が確認された。さらに、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスター内の種々のｍｉＲＮＡがＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’−ＵＴＲと相互作用し、筋肉特異的Ｅ３リガーゼであるＡｔｒｏｇｉｎ−１のタンパク質発現が抑制されることが確認された。さらに、高齢マウスの筋肉に該ｍｉＲＮＡを発現するアデノウイルスを感染させたとき、骨格筋萎縮が劇的に改善された。さらに、腫瘍誘発カヘキシーマウスモデルおいても、カヘキシーが該ｍｉＲＮＡを使用するＡｔｒｏｇｉｎ−１タンパク質阻害により改善されたことが確認された。それ故に、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントは、Ａｔｒｏｇｉｎ−１依存性筋疾患予防およびカヘキシー改善に、有用に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１ａ】図１ａ〜１ｄは、若齢マウスおよび高齢マウスから単離した前脛骨筋(ＴＡ)筋肉および筋繊維のｍｉＲＮＡ発現プロファイルの比較分析の実施により得た結果を示す。具体的に、図１ａは、年齢によりＴＡ筋肉組織で異なって発現されるｍｉＲＮＡの分布を示すチャートを示す。左側円グラフは、加齢したＴＡ筋肉におけるｍｉＲＮＡ類の５６％(６１)が発現減少したことを示す。右側ドーナツグラフは、発現が減少したｍｉＲＮＡ類の６９％(４２)がＤｌｋ−Ｄｉｏ３ゲノム領域に位置することを示す。
【００１９】
【図１ｂ】図１ｂは、発現が増加した４８個のｍｉＲＮＡ類および発現が減少した６１個のｍｉＲＮＡ類を使用した１０９個のｍｉＲＮＡ類の発現レベル(＞１.５倍)に基づく加齢による分類を示す。
【００２０】
【図１ｃ】図１ｃは、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３ゲノム領域に位置する４２個のｍｉＲＮＡ類の発現レベルによる年齢による分類を示す。各カラムは、若齢マウス(６か月)および高齢マウス(２４か月)のＴＡ筋肉におけるｍｉＲＮＡ発現レベルを示す。
【００２１】
【図１ｄ】図１ｄは若齢マウス(３か月)および高齢マウス(２７か月)から単離された筋芽細胞で異なって発現されるｍｉＲＮＡ類の分布を示すチャートを示す。左側円グラフは、加齢した筋芽細胞におけるｍｉＲＮＡ類の６０％(７１)が発現減少を示すことを示す。右側ドーナツグラフは、発現が減少したｍｉＲＮＡ類の８３％(５９)がＤｌｋ−Ｄｉｏ３ゲノム領域に位置することを示す。
【００２２】
【図１ｅ】図１ｅは、発現が増加した４７個のｍｉＲＮＡ類および発現が減少した７１個のｍｉＲＮＡ類を使用した１１８個のｍｉＲＮＡ類の発現レベル(＞２倍)による分類を示す。
【００２３】
【図１ｆ】図１ｆは、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３ゲノム領域に位置する５９個のｍｉＲＮＡ類の発現レベルに基づく加齢による分類を示す。各行は、若齢または高齢のＴＡ筋肉から単離した筋芽細胞におけるｍｉＲＮＡレベルを示す。
【００２４】
【図２】図２は  Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに存在するｍｉＲＮＡ類の発現レベルの加齢による変化を示す。具体的に、ヒト年齢(２５〜８０歳)とヒトＤｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに存在する１８個のｍｉＲＮＡ類の発現レベルの相関が説明される。ｍｉＲＮＡ類はヒト大殿筋筋肉から単離された。データをスピアマンの相関検定を使用して評価した(ρ；９５％ＣＩ；ｎ＝２０)。
【００２５】
【図３ａ】図３ａは筋肥大表現型に至るｍｉＲＮＡ類のスクリーニング計画を示す。Ｃ２Ｃ１２細胞の分化誘導４日後、ｍｉＲＮＡ模倣体を分化筋管に個々にトランスフェクトして、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに存在するｍｉＲＮＡ類の活性を確認した。筋管直径をトランスフェクション２４時間後に測定した。
【００２６】
【図３ｂ】図３ｂはｍｉＲＮＡ模倣体をトランスフェクトした分化筋肉細胞の画像を示す。筋管を、直径測定のためにエオシンＹで染色した。目盛尺は５０μmである。
【００２７】
【図３ｃ】図３ｃはｍｉＲＮＡ模倣体でトランスフェクション後種々の直径を有する筋管のパーセンテージを示す。色が濃いほど、直径が大きいことを示す。顕微鏡イメージングソフトウェア(NIS-Elements Basic Research, Nikon)を使用する直径測定のために、４画像を無作為に選択した。データを平均±ＳＤで表した。
【００２８】
【図４ａ】図４ａはマウスＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲで、ｍｉＲＮＡ類の３８結合部位(その中で１２がヒトで保存される)が予測されることを示す。
【００２９】
【図４ｂ】図４ｂは、ｍｉＲＮＡでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞でＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲを有するルシフェラーゼレポーターの相対的活性を示す(*  Ｐ＜０.０５、**  Ｐ＜０.０１、***  Ｐ＜０.００１)。
【００３０】
【図４ｃ】図４ｃはｍｉＲＮＡでトランスフェクトした分化Ｃ２Ｃ１２細胞の免疫ブロットアッセイ結果を示す。結果をＧＡＰＤＨで標準化した。
【００３１】
【図４ｄ】図４ｄは図４ｃのＡｔｒｏｇｉｎ−１の相対的発現レベルの定量化を示す。
【００３２】
【図４ｅ】図４ｅはＭｉＲ−４９３、ｍｉＲ−３７６ｂおよびｍｉＲ−４３３でトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋管のＡｔｒｏｇｉｎ−１の免疫ブロットアッセイ結果を示す。Ａｔｒｏｇｉｎ−１の発現レベルをImageJソフトウェアを使用して定量化し、結果をＧＡＰＤＨ発現で標準化した。
【００３３】
【図４ｆ】図４ｆはｍｉＲＮＡでトランスフェクトした分化ヒト骨格筋肉筋芽細胞(ＨＳＭＭ)の免疫ブロットアッセイ結果を示す。結果をＧＡＰＤＨで標準化した。
【００３４】
【図４ｇ】図４ｇは図４ｆの相対的Ａｔｒｏｇｉｎ−１の発現レベルの定量化を示す。
【００３５】
【図４ｈ−４ｉ】図４ｈおよび４ｉは、若齢マウスまたは高齢マウスから単離したＴＡ筋肉のＡｔｒｏｇｉｎ−１の免疫アッセイおよび定量化結果を示す。結果を平均ＡＣＴＮｌ発現レベルで標準化した(***  Ｐ＜０.００１)。
【００３６】
【図４ｊ】図４ｊは、示す年齢でのヒト筋肉組織におけるＡｔｒｏｇｉｎ−１の免疫ブロットアッセイ結果を示す。結果をＧＡＰＤＨで標準化した。
【００３７】
【図４ｋ】図４ｋはヒト年齢とＡｔｒｏｇｉｎ−１発現の相関分析の結果を示す。結果をスピアマンの相関検定を使用して評価した(ρ；９５％ＣＩ)。
【００３８】
【図４ｌ】図４ｌは若齢マウスまたは高齢マウスから単離したＴＡ筋肉の相対的Ａｔｒｏｇｉｎ−１  ｍＲＮＡの発現レベルを示す。結果をＡＣＴＢで標準化した。
【００３９】
【図４ｍ】図４ｍは２５〜８０歳のヒト対象の筋肉におけるＡｔｒｏｇｉｎ−１  ｍＲＮＡの発現レベルを示す。結果をＧＡＰＤＨで標準化した。結果をスピアマンの相関検定を使用して評価した(ρ；９５％ＣＩ；ｎ＝２０)。
【００４０】
【図４ｎ】図４ｎは逐次分析に含まれるｍｉＲＮＡ類を示す。ここで、*はヒトで保存される。
【００４１】
【図５ａ】図５ａは高齢マウスにおける筋肉重量および体重の比率を示す。
【００４２】
【図５ｂ】図５ｂは若齢マウスおよび高齢マウスの筋肉の断面像を示す(赤色、ラミニン；青色、ＤＡＰＩ；目盛尺、５０μm)。
【００４３】
【図５ｃ】図５ｃは断面領域(ＣＳＡ)の形態学的分析結果を示す。４つの異なる画像を無作為に選択し、各ＣＳＡをImageJソフトウェアを使用して分析した(*  Ｐ＜０.０５)。
【００４４】
【図６】図６は若齢のＴＡ筋肉および高齢のＴＡ筋肉のＣ２Ｃ１２筋肥大表現型を強くもたらす、上位５つのｍｉＲＮＡ類の発現を示す。具体的に、若齢または高齢のＴＡ筋肉(ｎ＝５)のｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−５４１およびｍｉＲ−１１９７の相対的発現レベルが説明される。結果をＵ６小核ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)レベルで標準化し、平均±ＳＤとして表した(*  Ｐ＜０.０５)。
【００４５】
【図７ａ】図７ａはマウスＡｔｒｏｇｉｎ−１の完全長３’ＵＴＲ(上部)および切断型３’ＵＴＲ(下部)でのｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐの推定結合部位を示す。ヒトとマウス間で保存されている領域のみ含まれる。
【００４６】
【図７ｂ】図７ｂは野生型(ＷＴ)Ａｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲまたは欠失変異(Ｍｕｔ)Ａｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲでのルシフェラーゼレポーター活性を測定することによる、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐのＷＴまたは変異体３’ＵＴＲに対する効果の確認を示す(***  Ｐ＜０.００１)。
【００４７】
【図７ｃ】図７ｃはＡＳＯ(ビオチンを伴うまたは伴わない)およびストレプトアビジンビーズを使用して得たプルダウン分析結果を示す。定量分析をｑＲＴ−ＰＣＲにより実施した(**  Ｐ＜０.０１)。
【００４８】
【図８】図８はＣ２Ｃ１２細胞におけるストレプトアビジンビーズを使用して得たＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲのプルダウン分析結果を示す。データを、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表した。
【００４９】
【図９ａ−９ｂ】図９ａおよび９ｂは、ｍｉＲ−３７６Ｃ−３ｐまたは阻害剤(Ｉ)−ｍｉＲ−３７６Ｃ−３ｐをトランスフェクトした分化初代筋芽細胞(図９ａ)およびＨＳＭＭ(図９ｂ)のＡｔｒｏｇｉｎ−１の免疫ブロットアッセイ結果を示す。Ａｔｒｏｇｉｎ−１の発現レベルをImageJソフトウェアを使用して定量化し、ＡＣＴＢで標準化した。
【００５０】
【図９ｃ】図９ｃはｍｉＲ−３７６Ｃ−３ｐまたは阻害剤(Ｉ)−ｍｉＲ−３７６Ｃ−３ｐでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞のＡｔｒｏｇｉｎ−１の免疫ブロットアッセイ結果を示す。結果をＡＣＴＢ発現で標準化した。
【００５１】
【図１０ａ】図１０ａはｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐまたは対照(野生型、Ｃｔｒｌ)を発現する分化筋肉細胞の画像を示す(緑色、ＭｙＨＣ；青色、ＤＡＰＩ；目盛尺、５０μm)。
【００５２】
【図１０ｂ】図１０ｂはｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐまたは対照(野生型、Ｃｔｒｌ)を発現する分化筋肉細胞の繊維直径のパーセンテージについての定量化グラフを示す。
【００５３】
【図１０ｃ】図１０ｃはｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐまたは対照(野生型、Ｃｔｒｌ)を発現する分化筋肉細胞の繊維直径の平均の定量化グラフを示す(**  Ｐ＜０.０１)。
【００５４】
【図１０ｄ】図１０ｄはｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐまたは対照でトランスフェクトした分化ＨＳＭＭのゲノムＤＮＡ含量で標準化したタンパク質割合を示す(**  Ｐ＜０.０１)。
【００５５】
【図１０ｅ】図１０ｅは２３か月齢マウスのＴＡ筋肉(ＡｄｍｉＲａ−３７６ｃ−３ｐ)および対照ＴＡ筋肉(ＡｄｍｉＲａ−Ｃｔｒｌ)へのアデノウイルス注射の計画を示す。
【００５６】
【図１１ａ】図１１ａはＡｄｍｉＲａ−３７６ｃ−３ｐまたは対照(ＡｄｍｉＲａ−Ｃｔｒｌ)を感染させたＣ２Ｃ１２筋管のＡｔｒｏｇｉｎ−１の免疫ブロットアッセイ結果を示す。Ｃ２Ｃ１２細胞の筋管への分化３日後、筋肉細胞をＡｄｍｉＲａ−３７６ｃ−３ｐまたは対照(ＡｄｍｉＲａ−Ｃｔｒｌ)で感染させた。アデノウイルス感染２４時間後、Ａｔｒｏｇｉｎ−１発現をウェスタンブロッティングで測定し、ＡＣＴＢの結果で標準化した。
【００５７】
【図１１ｂ】図１１ｂはＧＦＰ標識ＡｄｍｉＲａ−３７６ｃ−３ｐまたは対照で観戦させた２３か月齢ＴＡ筋肉組織の感染後７日目の蛍光画像を示す(目盛尺、１mm)。
【００５８】
【図１２ａ−１２ｃ】図１２ａ〜１２ｃはウイルス感染筋肉断面の画像のグラフ(図１２ａ)、そのパーセンテージ(図１２ｂ)およびその平均(図１２ｃ)を示す(赤色、ラミニン；青色、ＤＡＰＩ；目盛尺、５０μm；*  Ｐ＜０.０５；**  Ｐ＜０.０１)。
【００５９】
【図１２ｄ】図１２ｄは２３か月齢マウスのＡｄｍｉＲａ−Ｃｔｒｌ−または３７６ｃ−３ｐ感染ＴＡ筋肉組織のＡｔｒｏｇｉｎ−１およびｅＩＦ３ｆの免疫ブロットアッセイ結果を示す。
【００６０】
【図１２ｅ】図１２ｅは図１２ｄの免疫ブロットアッセイ結果におけるImageJを使用した相対的Ａｔｒｏｇｉｎ−１およびｅＩＦ３ｆの発現レベルを示す。結果を平均ＡＣＴＮ１レベルで標準化した。データを平均±ＳＤとして表した(*  Ｐ＜０.０５、**  Ｐ＜０.０１)。
【００６１】
【図１２ｆ】図１２ｆは若齢または高齢マウスのＴＡ筋肉疲労分析により得た結果を示す。
【００６２】
【図１２ｇ】図１２ｇはアデノウイルス感染高齢マウスのＴＡ筋肉疲労分析により得た結果を示す。
【００６３】
【図１３ａ】図１３ａはｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐまたはｓｉ−Ａｔｒｏｇｉｎ−１でトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋管の画像を示す。１００μM  デキサメサゾン(ｄｅｘ)での２４時間処置を行ったまたは行わなかった(緑色、ＭｙＨＣ；青色、ＤＡＰＩ；目盛尺、５０μm)。
【００６４】
【図１３ｂ−１３ｃ】図１３ｂおよび１３ｃは図１３ａの筋繊維の定量化直径のパーセンテージ(ｂ)および平均(ｃ)をグラフ的に説明する。筋管直径測定のために４つの異なる画像を無作為に選択した(*  Ｐ＜０.０５、**  Ｐ＜０.０１)。
【００６５】
【図１３ｄ】図１３ｄはＡｔｒｏｇｉｎ−１の免疫ブロットアッセイ結果を示す。
【００６６】
【図１３ｅ】図１３ｅはｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐまたはｓｉ−Ａｔｒｏｇｉｎ−１でトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋管の相対的ゲノムＤＮＡ含量で標準化したタンパク質割合を示す(*  Ｐ＜０.０５、**  Ｐ＜０.０１)。
【００６７】
【図１４ａ】図１４ａは正常Ｃ２Ｃ１２筋管またはＡｔｒｏｇｉｎ−１発現が阻害されたＣ２Ｃ１２筋管の画像を示す(緑色、ＭｙＨＣ；青色、ＤＡＰＩ；目盛尺、５０μm)。
【００６８】
【図１４ｂ−１４ｃ】図１４ｂおよび１４ｃは、定量化筋管直径のパーセンテージ(図１４ｂ)および平均(図１４ｃ)をグラフ的に説明する。筋管直径測定のために４つの異なる画像を無作為に選択した(*  Ｐ＜０.０５)。
【００６９】
【図１５ａ】図１５ａはｃｏｌｏｎ−２６(Ｃ２６)培養培地(ＣＭ)を用いてまたは用いずに培養したｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐまたは対照でトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋管の画像を示す(緑色、ＭｙＨＣ；青色、ＤＡＰＩ；目盛尺、５０μm)。
【００７０】
【図１５ｂ−１５ｃ】図１５ｂおよび１５ｃは定量化繊維直径のパーセンテージ(図１５ｂ)および平均(図１５ｃ)を示す。筋管直径測定のために３画像を無作為に選択した(*  Ｐ＜０.０５)。
【００７１】
【図１５ｄ】図１５ｄはＣＭの存在または非存在によりｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋肉細胞のＡｔｒｏｇｉｎ−１およびｅＩＦ３ｆの免疫ブロットアッセイ結果を示す。相対的Ａｔｒｏｇｉｎ−１およびｅＩＦ３ｆタンパク質の発現レベルをImageJを使用して測定した。結果をＧＡＰＤＨ発現で標準化した。
【００７２】
【図１５ｅ】図１５ｅはＣ２６腫瘍担持マウス(ｎ＝６)のＴＡ筋肉組織にアデノウイルスを注射する方法の略図を示す。Ｃ２６腫瘍細胞を有する８週齢マウスに接種後７日目および１０日目、ＡｄｍｉｒＲａ−３７６ｃ−３ｐまたはＡｄｍｉＲａ−対照(１０８ＣＦＵ／５０μl／注射)をそれぞれ一方のＴＡ筋肉およびその対側筋肉に注射した。
【００７３】
【図１６ａ】図１６ａはＣ２６腫瘍接種前およびＣ２６腫瘍接種後１４日目に測定した体重を示す。
【００７４】
【図１６ｂ】図１６ｂは腫瘍接種マウス(カヘキシー誘発群)および非腫瘍接種マウス(正常)のＴＡ筋肉重量対脛骨長比を示す。データを平均±ＳＤとして表した(ｎ＝６；*  Ｐ＜０.０５、**  Ｐ＜０.０１)。
【００７５】
【図１７ａ】図１７ａは腫瘍注射後１４日目のＡｄｍｉＲａ−３７６ｃ−３ｐまたは対照ウイルスを感染させたＴＡ筋肉組織の重量のパーセンテージを示す。データを脛骨長で標準化した(**  Ｐ＜０.０１)。
【００７６】
【図１７ｂ−１７ｃ】図１７ｂおよび１７ｃは断面領域(ＣＳＡ)の形態学的分析結果を示す。ＣＳＡ測定のためにImageJソフトウェアを使用して６画像を無作為に選択し、測定を実施した。データを平均±ＳＤとして表した(*  Ｐ＜０.０５、**  Ｐ＜０.０１)。
【００７７】
【図１８】図１８はＤｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡ類の加齢が介在するＡｔｒｏｇｉｎ−１タンパク質発現制御モデルを示す。Ａｔｒｏｇｉｎ−１タンパク質発現レベルは、高齢の筋肉組織のＤｌｋ１−Ｄｉｏ３ゲノム領域におけるｍｉＲＮＡ類の全体的発現減少により増加した。加齢によるＡｔｒｏｇｉｎ−１発現増加はｅＩＦ３ｆなどの標的タンパク質の分解を誘発する可能性があり、故に加齢した筋肉の筋萎縮をもたらし得る。この一連の事象は加齢性サルコペニア発症の根底にある重要な機序であることが解明された。
【００７８】
【図１９ａ】図１９ａはヒト年齢とｍｉＲ−２３ａ−３ｐの発現の相関分析の結果を示す。結果をｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。さらに、結果をスピアマンの相関検定を使用して評価した(ρ；９５％ＣＩ)。
【００７９】
【図１９ｂ】図１９ｂは加齢によるＴＡ筋肉におけるｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９ｂ−３ｐの相対的発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
ある態様において、本発明は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントを活性成分として含む、筋疾患の予防または処置のための医薬組成物を提供する。
【００８１】
本発明において、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡ−６６８(配列番号１)、ｍｉＲＮＡ−３７６ｃ(配列番号２)、ｍｉＲＮＡ−４９４(配列番号４)、ｍｉＲＮＡ−５４１(配列番号５)、ｍｉＲＮＡ−３７７(配列番号１０)、ｍｉＲＮＡ−１１９７(配列番号６)、ｍｉＲＮＡ−４９５(配列番号７)、ｍｉＲＮＡ−３００(配列番号１４)、ｍｉＲＮＡ−４０９(配列番号１６)、ｍｉＲＮＡ−５４４ａ(配列番号１８)、ｍｉＲＮＡ−３７９(配列番号１９)、ｍｉＲＮＡ−４３１(配列番号２３)、ｍｉＲＮＡ−５４３(配列番号３０)およびｍｉＲＮＡ−３３７(配列番号３６)からなる群から選択される何れかであり得る。
【００８２】
ここで使用する用語「Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスター」は「デルタ様１ホモログタイプ３ヨードチロニンデヨージナーゼ」の略であり、最大ｍｉＲＮＡクラスターとして知られる。
【００８３】
ここで使用する用語「ｍｉＲＮＡ」は、ＤＮＡから翻訳されるが、タンパク質に翻訳されない約２１〜２４ヌクレオチドの非コーディングＲＮＡをいう。ｍｉＲＮＡはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして知られる初代転写物からｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと名付けられた短ステムループ構造、そして最後に機能的ｍｉＲＮＡに加工される。成熟の間、各ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは高相補性の２つの独特なフラグメントを提供し、該フラグメントの一方はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームに端を起点とし、他方はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の３’アームに端を起点とする。成熟ｍｉＲＮＡ分子は１以上のメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)と部分的に相補的であり、その主機能は遺伝子発現の下方制御である。
【００８４】
ｍｉＲＮＡ類は、国際命名法により、予め決定された形式の固有名が次のとおり定められている。
【００８５】
成熟ｍｉＲＮＡは「ｓｓｓ−ｍｉＲ−Ｘ−Ｙ」の形式で命名され、ここで「ｓｓｓ」はｍｉＲＮＡ種を表す三文字コードであり、例えば、ヒトを記号化する「ｈｓａ」であり得る。ｍｉＲで、大文字「Ｒ」はｍｉＲＮＡが、成熟ｍｉＲＮＡであることを示す。Ｘは特定の種のｍｉＲＮＡ配列に割り当てられる、何らかの固有番号である。いくつかの高度に相同性のｍｉＲＮＡ類が知られるとき、該番号の後に文字が付される。例えば、「３７６ａ」および「３７６ｂ」は高度に相同性のｍｉＲＮＡをいう。Ｙは成熟ｍｉＲＮＡがｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の５’アーム(この場合、Ｙは「−５ｐ」)またはその３’アーム(この場合、Ｙは「−３ｐ」)に対応するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの開裂により得られたかを示す。
【００８６】
本明細書で述べるＤｌｋ１−Ｄｉｏ３領域に位置するｍｉＲＮＡ類で、例として「ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ」で、「ｈｓａ」はｍｉＲＮＡがヒトｍｉＲＮＡに関することをいい、「ｍｉＲ」は成熟ｍｉＲＮＡに関することをいい、「３７６」はこの特定のｍｉＲＮＡに割り当てられる何らかの番号をいい、そして「３ｐ」は成熟ｍｉＲＮＡがｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の３’アームから得られていることを意味する。
【００８７】
同時に、本発明において、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３領域に位置するｍｉＲＮＡは−３ｐおよび／または−５ｐに対応するｍｉＲＮＡであり得る。ある実施態様において、本発明のｍｉＲＮＡ−３７６ｃはｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐまたはｍｉＲＮＡ３７６ｃ−５ｐであり得る。
【００８８】
ここで使用する用語「ｍｉＲＮＡバリアント」は、本発明によるＤｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡ(配列番号１、２、４、５、６、７、１０、１４、１６、１８、１９、２３、３０または３６)と９０％以上、より具体的に９５％以上およびさらにより具体的に９８％の相同性を維持する塩基配列を有するｍｉＲＮＡをいう。本発明において、ｍｉＲＮＡバリアントはｍｉＲＮＡフラグメントであり得る。
【００８９】
ここで使用する用語「ｍｉＲＮＡフラグメント」は、ｍｉＲＮＡ参照配列との比較の場合、欠失を有する配列または対応する位置で参照配列と同じ配列セグメントのセグメントを含み得る。「参照配列」は、配列比較の基礎として使用することが指定された配列をいう。本発明において、ｍｉＲＮＡ参照配列は、配列番号１、２、４、５、６、７、１０、１４、１６、１８、１９、２３、３０または３６の配列を有するポリヌクレオチドであり得る。
【００９０】
ここで使用する用語「ｍｉＲＮＡ模倣体」は、ｍｉＲＮＡ作用を模倣できるポリヌクレオチドをいい、該模倣体は治療的に標的化され得る。
【００９１】
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡはＡｔｒｏｇｉｎ−１／ＭＡＦｂｘタンパク質の発現レベルを低下させる。さらに、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡはＡｔｒｏｇｉｎ−１／ＭＡＦｂｘタンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’非翻訳領域(３’−ＵＴＲ)と直接相互作用し、筋肉分解酵素であるＡｔｒｏｇｉｎ−１／ＭＡＦｂｘの発現を抑制できる。
【００９２】
ここで使用する用語「Ａｔｒｏｇｉｎ−１」は、ＭｕＲＦ１などの代表的筋肉特異的Ｅ３リガーゼの一つをいう。他の筋疾患と異なり、筋肉加齢におけるＡｔｒｏｇｉｎ−１の役割は比較的知見が少ない。本発明のある実施態様において、高齢マウスの筋肉組織で、Ａｔｒｏｇｉｎ−１のタンパク質レベルは顕著に増加し、一方その遺伝子発現レベルはほとんど変化しなかった。これは、ｍｉＲＮＡがＡｔｒｏｇｉｎ−１発現を転写後方式で制御することを意味する(図１８参照)。今日までの研究で、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂおよびｍｉＲ−２３ａはＡｔｒｏｇｉｎ−１を標的として筋肥大をもたらすことが知られる。しかしながら、本発明において、これらｍｉＲＮＡ類は若齢の筋肉組織と高齢の筋肉組織で異なって発現されなかった(図１９ａおよび１９ｂ参照)。この観点から、発現が加齢により減少するＤｌｋ−１−Ｄｉｏ３クラスターのｍｉＲＮＡが、Ａｔｒｏｇｉｎ−１介在加齢性サルコペニアの重要な内部因子であり得ることを見ることができる。
【００９３】
ここで使用する用語「筋疾患」は筋肉強度弱化により発症し得る全ての疾患をいい、その例は、サルコペニア、筋萎縮、筋ジストロフィーまたは心臓萎縮を含むが、これらに限定されない。具体的に、「サルコペニア」は加齢性サルコペニアであり得る。
【００９４】
「筋肉強度弱化」は、１以上の筋肉の強度が低下した状態を意味する。筋肉強度弱化はどこか一つの筋肉、体の一部、上肢、下肢などに限定され得るかまたは体中に出現し得る。さらに、筋肉疲労および筋肉痛を含む筋肉強度弱化の主観的症状を、身体検査により客観的方法で定量化し得る。筋肉強度弱化の原因は、筋肉損傷、筋肉細胞分化減少による筋肉量減少および筋肉加齢を含むが、これらに限定されない。
【００９５】
加齢性サルコペニアは、腕、脚などを形成する骨格筋が大きく減少し、加齢および運動不足による筋肉細胞の減少が原因である、筋疾患をいう。サルコペニアは、筋肉を意味する「サルコ」と欠如または減少を意味するペニアの複合語である。２０１７年初頭、世界保健機構(ＷＨＯ)は、公式な疾患として、正常より筋肉量が少ない状態として認定し、加齢性サルコペニアに疾患分類コードを割り当てた。
【００９６】
筋萎縮は、筋肉が縮小し、腕および脚の筋肉がほとんど対称性に徐々に縮小する疾患である。種々の形態の筋萎縮がある。筋萎縮性側索硬化症および進行性脊髄性筋萎縮症は最も一般的である。何れの疾患も、運動神経繊維および脊髄の細胞の進行性変性によるが、その原因は不明である。具体的に、筋萎縮性側索硬化症は「ルー・ゲーリック病」とも称され、脊髄または間脳の運動細胞が徐々に破壊され、これら細胞の制御下にある筋肉が縮小し、それにより強さを発揮することが不可能となる、疾患である。進行性脊髄性筋萎縮症において、錐体路の変性は示されず、脊髄前角細胞の変性は慢性に進行する。
【００９７】
筋肉退行性萎縮は、徐々に筋萎縮および筋肉弱化が顕在化する疾患であり、病理学的観点で、筋繊維壊死により特徴づけられる、変性性筋障害を意味する。筋肉退行性萎縮において、筋肉細胞膜損傷は、筋肉強度弱化および萎縮が生じるように、筋繊維を壊死および変性過程に向かわせる。筋肉退行性萎縮は弱化筋肉の程度および分布、発症年齢、進行速度、症状重症度および家族歴により下位疾患に分類され得る。このような筋肉退行性萎縮の非限定的例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、末梢型筋ジストロフィーおよび先天性筋ジストロフィーを含む。
【００９８】
心臓萎縮は、外部または内部因子により心臓が縮小する疾患である。飢餓、消耗性疾患または老化の場合、心臓萎縮は、心筋繊維を痩せて薄いものとし、そうして脂肪組織減少をもたらす、心臓の褐色萎縮症状に至り得る。
【００９９】
他の態様において、本発明は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを活性成分として含む、筋疾患の予防または処置のための医薬組成物を提供する。ここで、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡは上記のとおりである。
【０１００】
ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスおよびそのアナログを含み得るが、これらに限定されない。具体的に、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスおよびポックスウイルスからなる群から選択される任意の１以上であり得る。より具体的に、ウイルスは、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスであり得るが、これらに限定されない。Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが搭載されたベクターは、当分野で知られるクローニング法により製造でき、その製造はこのような方法に特に限定されない。
【０１０１】
同時に、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドを搭載したベクターを活性成分として含む、筋疾患を予防または処置するための本発明の医薬組成物の好ましい投与量は個体の状態および体重、疾患重症度、薬物の形態、投与経路および期間により変わり、当業者により適切に選択され得る。具体的に、患者は、１×１０５〜１×１０１８のウイルス粒子、感染性ウイルス単位(ＴＣＩＤ５０)またはプラーク形成単位(ｐｆｕ)を投与され得る。好ましくは、患者は１×１０５、２×１０５、５×１０５、１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位またはプラーク形成単位を投与され得て、個々の数値および範囲はその間に含まれ得る。さらに、ウイルスの投与用量は０.１ml、１ml、２ml、３ml、４ml、５ml、６ml、７ml、８ml、９ml、１０ml以上であってよく、その間の全数値および範囲を含み得る。
【０１０２】
さらに他の態様において、本発明は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントを活性成分として含む、カヘキシーの予防または処置のための医薬組成物を提供する。本発明において、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡおよびそのバリアントは上記のとおりである。
【０１０３】
ここで使用する用語「カヘキシー」は、癌、結核、血友病などの末期に見られ得る、高度な全身衰弱の症状をいう。カヘキシーは、全身の各種臓器障害に起因する一種の中毒状態と考えられる。筋肉弱化、急速な体重減少、貧血、嗜眠および皮膚黄色化を含む症状が起こる。カヘキシーの根底の疾患は悪性腫瘍、バセドウ甲状腺腫、下垂体機能低下症などを含む。マクロファージにより産生される腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)などの生物学的活性物質もカヘキシーを増悪させる因子であることが判明している。
【０１０４】
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントを活性成分として含む筋疾患またはカヘキシーを予防または処置するための本発明の医薬組成物において、活性成分は、活性成分が活性を発揮し得る限り、用途、製剤配合目的などにより任意の量(有効量)で含まれてよい。典型的有効量は、組成物の総重量に基づき、０.００１重量％〜２０.０重量％の範囲内で決定され得る。ここで、用語「有効量」は、筋疾患またはカヘキシーに治療効果を発揮できる活性成分の量をいう。このような有効量は、当業者の通常の技術の範囲内で経験的に決定され得る。
【０１０５】
さらに、筋疾患またはカヘキシーを予防または処置するための本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。薬学的に許容される担体として、担体が患者への送達に適する非毒性物質である限り、あらゆる担体が使用され得る。蒸留水、アルコール、脂肪、蝋および不活性固体が担体として含まれ得る。薬理学的に許容されるアジュバント(緩衝液または分散剤)も医薬組成物に含まれ得る。
【０１０６】
具体的に、本発明の医薬組成物は、医薬組成物が当分野で知られる慣用の方法により投与経路に応じて非経腸製剤に製剤され得るように、活性成分に加えて薬学的に許容される担体を含む。ここで、用語「薬学的に許容される」は、担体が活性成分の活性を抑制することなく、適用(処方)される対象が順応可能であるよりも強い毒性を有しないことを意味する。
【０１０７】
筋疾患またはカヘキシーを予防または処置するための本発明の医薬組成物が非経腸製剤に製剤されるとき、医薬組成物を、当分野で知られる方法により、適当な担体と共に、注射剤の形態、経皮投与剤、経鼻吸入剤および坐剤として製剤される。注射剤に製剤されるとき、適当な担体として、滅菌水、エタノール、グリセロールおよびプロピレングリコールなどのポリオールまたはこれらの混合物が使用され得る。具体的に、リンゲル液、トリエタノールアミンまたは注射用滅菌水含有リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)、５％デキストロースなどの等張溶液などが使用され得る。
【０１０８】
筋疾患またはカヘキシーを予防または処置するための本発明の医薬組成物の投与量は、患者の状態、体重、性別または年齢、患者の重症度または投与経路により、１日あたり０.０１μg／kg〜１０ｇ／kgの範囲、特に、１日あたり０.０１mg／kg〜１ｇ／kgの範囲であり得る。投与は１日１回または数回実施し得る。このような投与量は、決して本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【０１０９】
さらに、本発明は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを活性成分として含む、カヘキシーの予防または処置のための医薬組成物を提供する。ここで、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡは上記のとおりである。
【０１１０】
上記のとおり、ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスおよびそのアナログを含み得るが、これらに限定されない。具体的に、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスおよびポックスウイルスからなる群から選択される任意の１以上であり得る。より具体的に、ウイルスは、アデノウイルスであり得るが、これらに限定されない。Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが負荷されたベクターは、当分野で知られるクローニング法により製造でき、その製造はこのような方法に特に限定されない。
【０１１１】
同時に、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドを搭載したベクターを活性成分として含む、カヘキシーを予防または処置するための本発明の医薬組成物の好ましい投与量は個体の状態および体重、疾患重症度、薬物の形態、投与経路および期間により変わり、当業者により適切に選択され得る。具体的に、患者は、１×１０５〜１×１０１８のウイルス粒子、感染性ウイルス単位(ＴＣＩＤ５０)またはプラーク形成単位(ｐｆｕ)を投与され得る。好ましくは、患者は１×１０５、２×１０５、５×１０５、１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位またはプラーク形成単位を投与され得て、個々の数値および範囲はその間に含まれ得る。さらに、ウイルスの投与用量は０.１ml、１ml、２ml、３ml、４ml、５ml、６ml、７ml、８ml、９ml、１０ml以上であり得て、その用量に全数値および範囲を含み得る。
【０１１２】
さらに、本発明は、対象に筋疾患を予防または処置するための本発明の医薬組成物を投与する過程を含む、筋疾患を予防または処置する方法を提供する。
【０１１３】
さらに、本発明は、対象にカヘキシーを予防または処置するための本発明の医薬組成物を投与する過程を含む、カヘキシーを予防または処置する方法を提供する。
【０１１４】
対象は哺乳動物、特に、ヒトであり得るが、それらに限定されない。さらに、投与は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、鼻腔内、肺内、直腸内、動脈内、脳室内、病巣内、髄腔内、局所およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、ある任意の経路により実施され得る。投与方式は、投与する薬物のタイプにより変わり得る。
【０１１５】
さらに、本発明は、筋疾患の予防または処置のための医薬の製造におけるＤｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントの使用を提供し、そして筋疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターの使用を提供する。
【０１１６】
さらに、本発明は、カヘキシーの予防または処置のための医薬の製造におけるＤｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントの使用を提供し、そしてカヘキシーを予防または処置するための医薬の製造のための、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターの使用を提供する。
【実施例】
【０１１７】
以下、本発明を下記実施例を参照してさらに詳細に説明する。しかしながら、下記実施例は本発明を説明するためのみに提供し、本発明の範囲はそれに限定されない。
【０１１８】
実施例１. サンプル調製
Seoul National University Bundang Hospital(ＳＮＵＢＨ)で全人工股関節置換術(関節形成術)(ＴＨＲＡ)を受けた患者からのヒト骨格筋(大殿筋筋肉)を直ぐに液体窒素に移し、−７０℃で除増した。SNUBH’s Institutional Review Board(B-1710-050-009)は本実験を承認した。同意書を参加者または法定後見人から得て、計２０患者サンプル(２５歳、２７歳、３２歳、３３歳(２患者サンプル)、４１歳、４６歳(２患者サンプル)、５０歳(２患者サンプル)、５１歳、５５歳、６６歳、６７歳、７０歳、７１歳、７５歳、７９歳(２患者サンプル)および８０歳)をｍｉＲＮＡまたはＡｔｒｏｇｉｎ−１タンパク質の発現評価に使用した。
全２０サンプルをｍｉＲＮＡ発現アッセイに使用した。しかしながら、溶解度による制限のため、８サンプルのみ免疫ブロッティングに利用可能であった。３０μg以下のヒトサンプルからＲＮＡおよびタンパク質を単離し、精製した。ＭｉＲＮＡ発現を分析するために、TRIzol(Invitrogen)を使用してＲＮＡをさらに精製した。免疫ブロットアッセイのために、筋肉組織をT 10 Basic Ultra-Turrax Disperser(IKA, China)を使用して均質化し、次いでPRO-PREP(iNtRON Biotech)を使用して溶解した。
【０１１９】
実施例２. 動物モデル
若齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス(３か月齢)および高齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス(２４か月齢)を、Laboratory Animal Resource Center(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)の)から購入した。ＢＡＬＢ／ｃ(６週齢)マウスをDamul Science(Daejeon, Korea)から購入した。この試験の全マウスは、Damul Science(Daejeon, Korea)から購入した給餌機を使用して標準実験餌(３.１kcal／ｇ)で飼育した。筋肉組織でｍｉＲＮＡ模倣体を過発現させるため、５０μl(１０８ＣＦＵ)のアデノウイルス、ＡｄｍｉＲａ−３７６ｃ−３ｐまたは対照(Applied Biological Materials Inc, Canada)を、若齢マウスおよび高齢マウスのＴＡ筋肉またはその対側筋肉にそれぞれ注射した。
注射を週１回２９Ｇ(０.３３mm)インスリンシリンジを使用して実施した。注射４週間後、筋肉組織をアデノウイルス注射マウスから単離し、分析に使用した。カヘキシーマウスモデルを作るため、ＢＡＢＬ／ｃマウスに、インスリンシリンジを使用してＣ２６細胞(ＰＢＳ５０μl中５×１０５細胞)を皮下注射した。腫瘍接種後７日目および１０日目、５０μl(１０８ＣＦＵ)を腫瘍担持マウスのＴＡ筋肉またはその対側筋肉に筋肉内注射した。
結腸２６細胞(CLS Cell Lines Service)を、アンホテリシンＢ−ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０(Gibco)で培養した。マウスおよびウイルス実験は、KRIBB's Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコールに従い実施した。
【０１２０】
実施例３. 細胞培養
初代筋芽細胞を、実施例２のマウスの後脚筋肉から単離した。筋肉組織をはさみで細かく薄片とし、次いでディスパーゼII(２.４Ｕ／mL、Roche)、コラゲナーゼＤ(１％、Roche)および２.５μM  ＣａＣｌ２を含む分離緩衝液に入れ、その後３７℃で２０分間インキュベートした。スラリーをセロロジカル・ピペットを使用して摩砕し、７０μmナイロンメッシュ(BD Bioscienceｓ)を通して、デブリを除去した。
細胞を採取し、アンホテリシンＢ−ペニシリン−ストレプトマイシンおよび５ng／mLのｂＦＧＦを含む２０％ＦＢＳを加えたＨａｍのＦ−１０(Gibco)で培養した。線維芽細胞を除くために、細胞を非被覆プレートに１時間塗布し、固定化細胞をコラーゲン被覆培養皿に移した。初代筋繊維の分化を、細胞を抗生物質および５％ウマ血清を含むＤＭＥＭ(Gibco)分化培地で培養することにより誘導した。Ｃ２Ｃ１２細胞(ＡＴＣＣ)をアンホテリシンＢ−ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ(Gibco)で培養した。細胞塗布２４時間または４８時間後に分化が開始されるよう、培地を分化培地で置換した。
デキサメサゾン誘発萎縮について、Ｃ２Ｃ１２細胞を最初に４日間分化させ、次いで１００μM  デキサメサゾン(Sigma-Aldrich)を培地に加えた。ヒト骨格筋肉(Lonza)を１７歳ドナーから得て、ゲンタマイシン−アンホテリシンＢ、ヒト上皮細胞増殖因子(ｈＥＧＦ)、デキサメサゾン、Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを含む骨格筋肉基底培地２(Lonza)で培養した。２４〜４８時間後、分化が始まり、ゲンタマイシン−アンホテリシンＢおよび２％ウマ血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２(Gibco)で培養した。
結腸２６(Ｃ２６)条件培地について、結腸２６を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ(Gibco)からなる培地で培養した。７２時間後、上清を集め、０.２２ミクロンフィルターで濾過した。Ｃ２６培養培地処理は、分化培地(２％ウマ血清含有ＤＭＥＭ)で５０％であった。
【０１２１】
実施例４. トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
ｍｉＲＮＡの模倣体および阻害剤をmirVana(Invitrogen)またはAccuTargetTM(Bioneer)から購入した(下記表１および２参照)。ｓｉＲＮＡの情報を下記表３にさらに加える。初代筋芽細胞、Ｃ２Ｃ１２またはヒト骨格筋肉筋芽細胞を、RNAiMAX(Invitrogen)を使用してｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの模倣体および阻害剤(各５０nM〜１００nM)でトランスフェクトした。
【０１２２】
【表１】
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【０１２３】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０１２４】
【表５】
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【０１２５】
ルシフェラーゼアッセイについて、Ａｔｒｏｇｉｎ−１  ｍＲＮＡの完全長５５９８nt  ３’ＵＴＲまたはヒトとマウス間で保存されたｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐの結合部位のみを含むその２８４０nt  ３’ＵＴＲフラグメントをｐｍｉｒＧＬＯ(Promega)にクローン化した。ベクターｌｕｃ２(ルシフェラーゼ遺伝子)のコーディング配列が複数クローニング部位に存在し、ベクターｈＲｌｕｃ−ｎｅｏコーディング配列のコーディング配列は内部対照として存在した。ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ結合部分(３７８１〜３７８７に位置)が欠失したＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲ変異体もルシフェラーゼアッセイのためにｐｍｉｒＧＬＯベクターにクローン化した。
２９３Ｔ細胞をLipofectamine 2000(Invitrogen)を使用して５０nMのｍｉＲＮＡ模倣体およびルシフェラーゼプラスミド(２００mg)でトランスフェクトした。形質導入４８時間後、細胞ライセートをDual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)およびVictor X3(Perkin Elmer)を使用するアッセイに付した。
【０１２６】
実施例５. 定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびｍｉＲＮＡ発現アッセイ
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成を標準プロトコールにより実施した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を、ｃＤＮＡ、プライマーおよびSYBR Master Mix(Applied Biosystems)を含む２０μlの総反応量でStepOnePlusTM(Applied Biosystems)を使用して実施した。プライマー配列を下表４に示す。
【０１２７】
【表６】
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【０１２８】
データを、各反応においてＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現レベルを使用して標準化した。成熟マイクロＲＮＡの発現アッセイについて、TaqMan MicroRNAアッセイを製造業者のプロトコールに従い実施した(Applied Biosystems)。ＲＴ−ｑＰＣＲ反応をTaqMan Universal PCR Master Mix II(ウラシル−Ｎグリコシラーゼ不含)およびTaqMan Small RNA Assay mixを含む９６ウェルプレートで実施した。使用したＲＮＡ特異的プライマーおよび小ＲＮＡ特異的TaqMan MGBプローブの配列を表５に示す。Ｕ６  ｓｎＲＮＡを正規化のために使用した。
【０１２９】
【表７】
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【０１３０】
実施例６. アンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)プルダウン分析
ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用分析のために、マイクロＲＮＡと結合した標的ｍＲＮＡをハイブリダイゼーションに基づく方法を使用して精製した。Ｃ２Ｃ１２細胞を野生型または欠失変異ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ結合部位を含むＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲを有するルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトした。細胞ライセート(１mg)を４℃で３時間インキュベートし、次いで、Ａｔｒｏｇｉｎ−１−３’ＵＴＲまたはルシフェラーゼ２  ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするように設計されている２μgのビオチン付加ＡＳＯ(表６参照)とインキュベートした。
【０１３１】
【表８】
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【０１３２】
ストレプトアビジン−アガロースビーズ(Novagene)を合わせた混合物に加え、次いで４℃で２時間さらにインキュベートした。ビーズを１mlのＮＴ２緩衝液(５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＭｇＣｌ２および０.０５％ＮＰ−４０)で３回洗浄し、次いで複合体を２０単位のＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ(１５分、３７℃)および０.１％ＳＤＳ／０.５mg／mlプロテイナーゼＫ(１５分間、５５℃)で処理して、それぞれＤＮＡおよびタンパク質を除去した。ｃＤＮＡを酸フェノール抽出およびqScript microRNA cDNA合成キット(Quanta Biosciences)を使用してｍｉＲＮＡから合成し、またはＲＮＡをMaxima逆転写酵素を使用してランダム六量体を用いて合成して、ＲＮＡをＡＳＯプルダウンにより得た物質から単離した。ｃＤＮＡをBio-Rad iCyclerを使用してSYBR(Kapa Biosystems)を用いるｑＰＣＲ分析により発現を評価した。ＡＳＯプルダウン結果の標準化のために、各サンプルのＵ６  ｓｎＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの相対的レベルを定量した。
【０１３３】
実施例７. 免疫ブロットアッセイ
筋肉組織および単離筋肉細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む溶解緩衝液(５０mM  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.４、１５０mM  ＮａＣｌ、０.５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１mM  ＥＤＴＡ、１mM  ＭｇＣｌ２)で均質化した。ライセートを１５,０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、得られた上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥと続く免疫ブロットアッセイに付した。免疫ブロッティングに使用した抗体は、ＡＣＴＢ(β−アクチン、Abcam)、ＡＣＴＮ１(Santa Cruz Biotechnology)、ＡＫＴ(Santa Cruz Biotechnology)、ｍＴＯＲ(Cell Signaling Technology)、Ｓ６Ｋ(Cell Signaling Technology)、４ＥＢＰ(Cell Signaling Technology)、ＦＯＸＯ３ａ(Cell Signaling Technology)、ＭｕＲＦ１(Santa Cruz Biotechnology)、Ａｔｒｏｇｉｎ−１(Thermo scientific, ECM)およびｅＩＦ３ｆ(Novus)であった。ＧＡＰＤＨについて、社内開発抗体を使用した。ＡＣＴＢ、ＡＣＴＮ１またはＧＡＰＤＨを正規化のために使用した。
【０１３４】
実施例８. 細胞推計学分析
免疫染色のために、分化Ｃ２Ｃ１２筋管細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０.３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とインキュベートして、透過性を改善した。固定サンプルを３％ＦＢＳ含有ＰＢＳで遮断し、抗ＭｙＨＣ(Santa Cruz Biotechnology)で処理し、ＰＢＳで洗浄し、AlexaFluor 488(Invitrogen)二次抗体と反応させた。エオシン染色のために、分化Ｃ２Ｃ１２筋管細胞を冷メタノールに１５分間、−２０℃で固定し、エオシンＹ(Thermo Scientific)で１５分間染色した。
サンプルを蒸留水で３回洗浄し、その画像をNikon Eclipse Ti-U顕微鏡を使用して分析した。筋管細胞直径の分析のために、４画像を無作為に選択した。選択画像の筋管細胞直径を、顕微鏡イメージングソフトウェア(NIS-Elements Basic Research, Nikon)を使用して計算した。ゲノムＤＮＡを特異的ゲノムＤＮＡキット(NANOHELIX)を使用して単離し、細胞ライセートのタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質分析試薬(Pierce)により分析して、タンパク質対ゲノムＤＮＡ比を測定した。
免疫組織化学的分析のために、マウスＴＡ筋肉組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１５％〜３０％スクロースを浸透させた。厚さ１０μmの凍結マウス筋肉切片をクライオスタット(Leica)を使用して製造し、標準プロトコールに従いＤＡＰＩおよび抗体で染色した。サンプルを、０.０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中３％ＦＢＳで遮断し、抗ラミニン(Sigma-Aldrich)で処理し、ＰＢＳで洗浄し、AlexaFluor 546(Invitrogen)二次抗体と反応させた。断面積測定のため、６画像を無作為に選択した。これら画像の断面積を、NIH ImageJソフトウェアを使用して計算した。
【０１３５】
実施例９. 統計分析
定量的データは、特に断らない限り平均±標準偏差で表した。平均の差異は、スチューデントの独立ｔ検定を使用して評価し、Ｐ＜０.０５を統計的有意として分析した。
【０１３６】
実験例１. 年齢による筋肉のＤｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡの発現
ヒト骨格筋肉組織におけるＤｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡの年齢による発現パターンを試験した。ヒトＤｌｋ１−Ｄｉｏ３遺伝子座位は９９個の成熟ｍｉＲＮＡ(５４個のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ)を含み、そのうち８７個がヒトゲノムとマウスゲノム間で保存されている。骨格筋組織サンプル(ｎ＝２０)を、２５〜８０歳のヒト参加者から得て、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３に存在するｍｉＲＮＡから無作為に選択した１８個のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。結果を図１ａ〜１ｄおよび図２に示す。
図１ａ〜１ｄおよび図２に示されるとおり、１０個のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは年齢と共に顕著な発現減少を示し(Ｐ＜０.０５)、残りの８個のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは年齢と共に発現が減少する傾向があった。マウスおよびヒト筋肉におけるＤｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡの年齢による一貫した発現パターン減少は、これらの分子の筋肉加齢における重要な役割を示唆する。
【０１３７】
実験例２. 筋管細胞直径に対するＤｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡの効果の確認
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３遺伝子座位に位置するｍｉＲＮＡでマウスおよびヒトで配列が保存されているｍｉＲＮＡが、加齢した筋肉の主表現型の一つであった筋萎縮に関与するかを試験するために、ｍｉＲＮＡ模倣体を、筋管細胞に完全に分化したＣ２Ｃ１２細胞で過発現させ、筋管細胞直径に対するその効果を評価した。上記実験の操作は図３ａに示し、上記実験の結果は図３ｂおよび３ｃに示す。
図３ｂおよび３ｃに示すとおり、試験した４２個のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのうち３６が対照より顕著に大きい直径を誘発した。この結果から、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに存在するｍｉＲＮＡが年齢による骨格筋萎縮に寄与する可能性が確認され、ｍｉＲＮＡの投与が骨格筋肉サイズを増加させることを観察することができる。
【０１３８】
実験例３. Ａｔｒｏｇｉｎ−１タンパク質発現を制御するＤｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡ
TargetScan algorithm(www.targetscan.org)を使用して、模倣体トランスフェクト筋管細胞で見られる抗萎縮性表現型に介在するｍｉＲＮＡの標的を同定した。結果を図４ａ〜４ｎに示す。
２３個のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ由来の３８成熟ｍｉＲＮＡは、筋肉特異的Ｅ３リガーゼをコードするＡｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲを標的とすると予測された(図４ａ、表７)。ここで、下表７の*は、ヒトＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲにおける保存された位置を意味する。
【表９】
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【０１３９】
ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、これらｍｉＲＮＡが実際Ａｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲを標的とするか否かを確認した。その結果、２３個のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ中１４が半分以下までレポーター活性を顕著に低下させ(図４ｂ)、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターの少なくとも１４個のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡがＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲに直接結語うできることを示す。Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋肉細胞で、Ａｔｏｒｇｉｎ−１タンパク質の発現は特異的に減少したが、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、Ｓ６Ｋ、４ＥＢＰ、ＦＯＸＯ３ａおよびＭｕＲＦ１などの筋肉ホメオスタシスに関与する主タンパク質は変わらなかった。
６個のｍｉＲＮＡ(ｍｉＲ−３８１、６５４、１２７、１１９３、３６９および３７０)は、対照と比較してレポーター活性が３３％〜５０％減少し、３個のｍｉＲＮＡ(ｍｉＲ−４３３、３７６ｂおよび４９３)はＡｔｒｏｇｉｎ−１発現に影響しなかった(図４ｅ)。またヒト骨格筋肉筋芽細胞(ＨＳＭＭ)で、保存ｍｉＲＮＡはＡｔｒｏｇｉｎ−１発現抑制をもたらし、一方他の主タンパク質に影響はなかった(図４ｆおよび４ｇ)。さらに、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡが加齢した筋肉組織で顕著な発現減少を示すとの事実から推測できるとおり、Ａｔｒｏｇｉｎ−１タンパク質発現がマウスおよびヒト両者で若齢の筋肉組織と比較して、年齢と共に増加することを観察することができる(図４ｈ〜４ｋ)。
しかしながら、Ａｔｒｏｇｉｎ−１発現遺伝子に差はなく、年齢によるＡｔｒｏｇｉｎ−１タンパク質発現増加が、該クラスター内のｍｉＲＮＡが介在する転写後制御によるものであることを示す(図４ｌおよび４ｍ)。これらの結果は、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターにおけるｍｉＲＮＡの特定の群(図４ｎ)がＡｔｒｏｇｉｎ−１タンパク質の発現を制御し、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡの年齢による発現減少がＡｔｒｏｇｉｎ−１発現を増加させ、故にサルコペニアをもたらすことを示す。
【０１４０】
実験例４. 加齢性サルコペニアに対する筋肉の過発現ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐの効果の確認
２４か月齢の高齢マウスの筋肉組織は、３か月齢の若齢マウスの筋肉組織と比較して、筋肉量の顕著な減少および小断面領域の表現型を示した(図５ａ〜５ｃ)。Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターにおけるｍｉＲＮＡの治療能力のインビボ試験を実施するため、筋管の直径を大きくした最も有効なｍｉＲＮＡを選択した。筋管直径を大きく増加させた上位５つのｍｉＲＮＡ(図３ｃ)のうち、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐの発現は加齢したＴＡ筋肉で最も確実に減少した。それ故に、このｍｉＲＮＡを最後に選択した(図６)。ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐとＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲの特異的相互作用をさらに試験するために、レポーターアッセイをルシフェラーゼＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲ構築物およびｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ模倣体を使用して実施した。ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ模倣体(ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ)はルシフェラーゼ活性を減少させ、このような活性減少は、３’ＵＴＲのｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ結合部位を除いた場合消失した(図７ａおよび７ｂ)。
ビオチニル化Ａｔｒｏｇｉｎ−１  アンチセンスオリゴマー(Ｂｉ−ＡＳＯｓ)を使用して実施したプルダウン実験は、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐと内因性に存在するＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲの直接結合を示した(図７ｃおよび８)。
具体的に、Ｃ２Ｃ１２細胞を野生型または欠失変異ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ結合部位を含むＡｔｒｏｇｉｎ−１  ３’ＵＴＲを有するルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、ルシフェラーゼ２  ｍＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析でストレプトアビジンビーズおよびＡＳＯ(ビオチンの存在または非存在の分析に使用する)を使用して抽出し、ルシフェラーゼ２  ｍＲＮＡ富化を検出した。
ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐトランスフェクションは、初代筋芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞およびＨＳＭＭ全てでＡｔｒｏｇｉｎ−１発現を減少させた。逆に、阻害剤(Ｉ)−ｍＲ−３７６ｃ−３ｐはＡｔｒｏｇｉｎ−１発現を増加させた(図９ａ〜９ｃ)。ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐでトランスフェクトした筋管は、繊維厚減少も示し(図１０ａ〜１０ｃ)、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐでトランスフェクトしたＨＳＭＭは総細胞内タンパク質含量の有意な増加を示した(図１０ｄ)。
最後に、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐが高齢マウスの筋肉減少を改善するか否かを確認するため、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ(ＡｄｍｉＲａ−３７６ｃ−３ｐ)または対照アデノウイルス(ＡｄｍｉＲａ−Ｃｔｒｌ)を２３か月齢マウスのＴＡ筋肉に１か月投与し、免疫組織化学的分析により断面を試験した(図１０ｅ、１１ａおよび１１ｂ)。ここで、各実験群のマウスとして６マウスを使用した。ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ過発現ＴＡ筋肉は、対照より顕著に大きな筋繊維を示した(図１２ａ〜１２ｃ)。ＡｄｍｉＲａ−３７６ｃ−３ｐで感染させた筋肉は、Ａｔｒｏｇｉｎ−１  Ｅ３リガーゼの標的として知られるｅＩＦ３ｆの発現レベル増加を示し、Ａｔｒｏｇｉｎ−１発現減少と対照的であった(図１２ｄおよび１２ｅ)。さらに、筋肉疲労改善の結果が得られ、これは、加齢した筋肉の機能さえも改善する可能性を示した(図１２ｆおよび１２ｇ)。これらの結果は、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐが筋肉加齢に打ち勝つ有効な標的であり得ることを示す。
【０１４１】
実験例５. グルココルチコイドが原因の筋萎縮およびカヘキシーに対するｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐの効果の確認
Ａｔｒｏｇｉｎ−１は、インビボでだけでなく、インビボでグルココルチコイドが存在するまたは癌を発症している筋肉でも萎縮をもたらす。それ故に、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐがグルココルチコイドが原因の筋萎縮を改善できることを確認した。結果を図１３ａ〜１３ｅおよび図１４ａ〜１４ｃに示す。
図１３ａ〜１３ｅおよび１４ａ〜１４ｃに示すとおり、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐは、デキサメサゾンにより誘発される筋管の筋萎縮を阻止し、故に、筋萎縮がデキサメサゾンが原因である場合に、筋管はデキサメサゾンがない対照と類似する直径を示すようになる(図１３ａ〜１３ｃ)。ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐはデキサメサゾン処理により増加していたＡｔｒｏｇｉｎ−１発現も対照レベルまで低下させる(図１３ｄ)。さらに、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐは、デキサメサゾン処理により減少していた筋肉内タンパク質を正常に戻す(図１３ｅ)。ｓｉＲＮＡを使用するＡｔｒｏｇｉｎ−１のノックダウン実験は、筋肉の形態学的悪化をデキサメサゾンで処理した筋管のＡｔｒｏｇｉｎ−１タンパク質発現を抑制することにより阻止する(図１３ａ〜１３ｅおよび図１４ａ〜１４ｃ)。
さらに、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐが腫瘍誘発筋萎縮を改善するか否かについて試験を実施した。Ａｔｒｏｇｉｎ−１は急性筋萎縮の重要なマーカーであり、カヘキシーが発症する場合に過発現することが報告されている。Ｃ２Ｃｌ２筋管を、結腸癌細胞株Ｃ２６を培養した培地で処理した。その結果、筋管が顕著に薄くなることを確認できた。ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐを使用するトランスフェクションは、Ｃ２６の培養培地により誘発された筋管筋萎縮を、対照の筋管と類似の程度まで回復させることが確認された(図１５ａ〜１５ｃ)。これらの条件下、Ａｔｒｏｇｉｎ−１発現は減少し、対照的に、Ａｔｒｏｇｉｎ−１の標的として知られるｅＩＦ３ｆの発現が増加した。それ故に、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐがインビトロで筋萎縮を軽減することができることが確認された(図１５ｄ)。
さらに、Ｃ２６腫瘍誘発カヘキシーマウスモデルにおけるｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐの治療能力を確認するために、ＡｄｍｉＲａ−対照またはＡｄｍｉＲａ−３７６ｃ−３ｐをＴＡ筋肉にマウスにＣ２６腫瘍を接種７日目および１０日目に注射し、筋肉の状態を観察した(図１５ｅ)。腫瘍担持マウスの体重は非腫瘍マウスよりわずかに軽かったが、筋肉量は有意に少なかったことが確認された(図１６ａおよび１６ｂ)。ＡｄｍｉＲａ−３７６ｃ−３ｐ感染ＴＡ筋肉は１３％減少を示し、一方ＡｄｍｉＲａ−対照感染対側ＴＡ筋肉は２１％減少を示すことが観察された(図１７ａ)。ＡｄｍｉＲａ−３７６ｃ−３ｐ感染ＴＡ筋肉は、断面領域の８.５％増加を伴った(図１７ｂおよび１７ｃ)。実験結果は、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ過発現が腫瘍誘発カヘキシーで見られる筋萎縮を効果的に抑制できることを示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図４ｈ】
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【図４ｉ】
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【図４ｊ】
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【図４ｋ】
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【図４ｌ】
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【図４ｍ】
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【図４ｎ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１２ｇ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
2021509914.tif 000067
【図１４ｃ】
2021509914.tif 000068
【図１５ａ】
2021509914.tif 000069
【図１５ｂ】
2021509914.tif 000070
【図１５ｃ】
2021509914.tif 000071
【図１５ｄ】
2021509914.tif 000072
【図１５ｅ】
2021509914.tif 000073
【図１６ａ】
2021509914.tif 000074
【図１６ｂ】
2021509914.tif 000075
【図１７ａ】
2021509914.tif 000076
【図１７ｂ】
2021509914.tif 000077
【図１７ｃ】
2021509914.tif 000078
【図１８】
2021509914.tif 000079
【図１９ａ】
2021509914.tif 000080
【図１９ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月18日(2020.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントを活性成分として含む、筋疾患を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項２】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−６６８、ｍｉＲＮＡ−３７６ｃ、ｍｉＲＮＡ−４９４、ｍｉＲＮＡ−５４１、ｍｉＲＮＡ−３７７、ｍｉＲＮＡ−１１９７、ｍｉＲＮＡ−４９５、ｍｉＲＮＡ−３００、ｍｉＲＮＡ−４０９、ｍｉＲＮＡ−５４４ａ、ｍｉＲＮＡ−３７９、ｍｉＲＮＡ−４３１、ｍｉＲＮＡ−５４３およびｍｉＲＮＡ−３３７からなる群から選択される何れかである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ｍｉＲＮＡがＡｔｒｏｇｉｎ−１／ＭＡＦｂｘタンパク質の発現レベルを低下させる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ｍｉＲＮＡがＡｔｒｏｇｉｎ−１／ＭＡＦｂｘタンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’非翻訳領域(３’−ＵＴＲ)と直接相互作用し、Ａｔｒｏｇｉｎ−１／ＭＡＦｂｘ発現を抑制する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
筋疾患がサルコペニア、筋萎縮、筋ジストロフィーおよび心臓萎縮からなる群から選択される何れかである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを活性成分として含む、筋疾患を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項７】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−６６８、ｍｉＲＮＡ−３７６ｃ、ｍｉＲＮＡ−４９４、ｍｉＲＮＡ−５４１、ｍｉＲＮＡ−３７７、ｍｉＲＮＡ−１１９７、ｍｉＲＮＡ−４９５、ｍｉＲＮＡ−３００、ｍｉＲＮＡ−４０９、ｍｉＲＮＡ−５４４ａ、ｍｉＲＮＡ−３７９、ｍｉＲＮＡ−４３１、ｍｉＲＮＡ−５４３およびｍｉＲＮＡ−３３７からなる群から選択される何れかである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ベクターがプラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスおよびそれらのアナログからなる群から選択される何れかである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ウイルスがアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントを活性成分として含む、カヘキシーを予防または処置するための医薬組成物。
【請求項１１】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−６６８、ｍｉＲＮＡ−３７６ｃ、ｍｉＲＮＡ−４９４、ｍｉＲＮＡ−５４１、ｍｉＲＮＡ−３７７、ｍｉＲＮＡ−１１９７、ｍｉＲＮＡ−４９５、ｍｉＲＮＡ−３００、ｍｉＲＮＡ−４０９、ｍｉＲＮＡ−５４４ａ、ｍｉＲＮＡ−３７９、ｍｉＲＮＡ−４３１、ｍｉＲＮＡ−５４３およびｍｉＲＮＡ−３３７からなる群から選択される何れかである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを活性成分として含む、カヘキシーを予防または処置するための医薬組成物。
【請求項１３】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−６６８、ｍｉＲＮＡ−３７６ｃ、ｍｉＲＮＡ−４９４、ｍｉＲＮＡ−５４１、ｍｉＲＮＡ−３７７、ｍｉＲＮＡ−１１９７、ｍｉＲＮＡ−４９５、ｍｉＲＮＡ−３００、ｍｉＲＮＡ−４０９、ｍｉＲＮＡ−５４４ａ、ｍｉＲＮＡ−３７９、ｍｉＲＮＡ−４３１、ｍｉＲＮＡ−５４３およびｍｉＲＮＡ−３３７からなる群から選択される何れかである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ベクターがプラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスおよびそれらのアナログからなる群から選択される何れかである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ウイルスがアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
筋疾患の予防または処置のための医薬の製造における、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントの使用。
【請求項１７】
筋疾患の予防または処置のための医薬の製造における、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターの使用。
【請求項１８】
カヘキシーの予防または処置のための医薬の製造における、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントの使用。
【請求項１９】
カヘキシーの予防または処置のための医薬の製造における、Ｄｌｋ１−Ｄｉｏ３クラスターに位置するｍｉＲＮＡまたはそのバリアントをコードするヌクレオチドが挿入されたベクターの使用。
【国際調査報告】
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