(57)【要約】本開示は、複数のＤＮＡ集団を含む混合試料中の１つのＤＮＡ集団を選択的に富化するための方法及び生成物を提供する。いくつかの実施形態では、混合試料は、特に、感染した個体からの臨床試料中の哺乳類宿主ＤＮＡと混合された病原微生物ＤＮＡを含む、微生物ＤＮＡ及び哺乳類宿主ＤＮＡの１つまたはそれを超える集団を含む。本発明は、少なくとも第１の核酸集団及び第２の核酸集団を含む混合試料の増幅によって生成されたＤＮＡの増幅試料における微生物核酸の富化のための改善された方法の開発に部分的に依存している。
2021500077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の集団と第２の集団を含むＤＮＡの混合試料の増幅によってＤＮＡの集団を富化するための改善された方法であって、前記改善が、
（ａ）前記ＤＮＡの混合試料を、ＤＮＡの前記第１の集団における複数のオリゴヌクレオチド配列に特異的に結合する複数のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させること；および
（ｂ）前記ＤＮＡの混合試料に対して増幅を行い、増幅されたＤＮＡの混合試料を生成すること；
を含み、
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡの前記第１の集団の増幅を抑制し、それにより、前記増幅された混合試料中のＤＮＡの前記第１の集団と比較して、ＤＮＡの前記第２の集団を富化する、方法。
【請求項２】
（ａ）前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも５０のＤＮＡの前記第２の集団に対するＤＮＡの前記第１の集団における相対出現率を有する６〜５０のヌクレオチドの配列を含み、そして
（ｂ）前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも２のＤＮＡの前記第２の集団に対するＤＮＡの前記第１の集団における相対出現率を有する少なくとも６〜２５のヌクレオチドの３’配列を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも６、７、８、９又は１０のヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれが、５０、４５、４０、３５、３０又は２５より少ないヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれの３’配列が、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれの３’配列が、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１又は１０より少ないオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも７５、１００、１５０、２００又は２５０のＤＮＡの前記第２の集団に対するＤＮＡの前記第１の集団における相対出現率を有する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれの３’配列が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のＤＮＡの前記第２の集団に対するＤＮＡの前記第１の集団における相対出現率を有する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、７５又は１００の異なるブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドが、少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７又は１０８の異なるブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ブロッキングオリゴヌクレオチドの前記第１の集団に相補的なゲノム配列間の最大距離が、２Ｇ／Ｎ、３Ｇ／Ｎ、４Ｇ／Ｎ又は５Ｇ／Ｎであって、Ｇは前記第１の集団に対応するゲノムＤＮＡのサイズであり、Ｎは、前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチド中の異なるブロッキングオリゴヌクレオチドの数である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれが、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドをＤＮＡの前記第１の集団に架橋させる鎖間架橋剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記架橋剤が光活性化されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記架橋剤がソラレンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれが、３’末端にスペーサーを含み、これにより、ＤＮＡポリメラーゼがテンプレート依存のＤＮＡ合成によって前記オリゴヌクレオチドを伸長するのを防ぐ、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
各スペーサーが、対応する前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’ＯＨに結合した脂肪族分子を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれが、ウイング付きブロッカーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイング付きブロッカーが、ＤＮＡの前記第１の集団における配列に相補的である４０〜６０ヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイング付きブロッカーが、前記相補的ヌクレオチド配列の各末端に１０〜１００ヌクレオチドのウイングオリゴヌクレオチド配列を含み、前記ウイングオリゴヌクレオチド配列が、ＤＮＡの前記第１の集団における隣接配列に相補的ではない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅が鎖置換型ポリメラーゼを使用して行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記増幅がｐｈｉ２９ポリメラーゼを使用して行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記混合試料が、ヒト及び／又は他の真核生物起源の、血液、痰、尿、粘液、唾液、組織膿瘍、創部ドレナージ、便、リンパ、洗浄液、脳脊髄液、又は流体吸引物若しくは組織抽出物から得られるか、又はそれらに由来する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記混合試料が、ヒト対象から得られるか、またはヒト対象に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の集団が哺乳類のＤＮＡを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の集団がヒトＤＮＡを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の集団が微生物ＤＮＡを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の集団が第１のタイプの微生物ＤＮＡを含み、前記第２の集団が第２のタイプの微生物ＤＮＡを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記微生物ＤＮＡが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、又は菌血症に関連する任意の他の細菌種からのＤＮＡを含む、請求項２６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記混合試料中の前記微生物ＤＮＡが１０未満の微生物ゲノムに対応する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の集団が哺乳類ＤＮＡを含み、前記第２の集団が微生物ＤＮＡを含み、哺乳類ＤＮＡ対微生物ＤＮＡの比が、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７又は１０８である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記増幅された試料中の微生物ＤＮＡが、前記混合試料と比較して１０倍〜１００倍富化される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合試料中の前記哺乳類ＤＮＡが、によって低減される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＤＮＡの前記第１の集団が哺乳類のミトコンドリアＤＮＡを含み、前記第２の集団が微生物ＤＮＡを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、配列番号１〜配列番号１６から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、配列番号１７〜配列番号３２から選択される配列に結合する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）各ブロッキングヌクレオチドが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の細菌ＤＮＡの試料と比較した哺乳類ＤＮＡの試料内における相対出現率を有する配列に相補的である少なくとも６〜２５の連続したヌクレオチドを含み、そして
（ｂ）それぞれが、相補的配列に架橋する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドをブロックする、
複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
哺乳類ＤＮＡの前記試料が哺乳類核ＤＮＡである、請求項３６に記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
哺乳類ＤＮＡの前記試料が哺乳類ミトコンドリアＤＮＡである、請求項３６記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
細菌ＤＮＡの前記試料が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅのゲノムＤＮＡからなる群から選択されるゲノムＤＮＡである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
各ブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドをＤＮＡの前記第１の集団に架橋させる鎖間架橋剤をさらに含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
前記架橋剤が光活性化されている、請求項４０に記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
前記架橋剤がソラレンである、請求項４１に記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれが、３’末端にスペーサーを含み、これにより、ＤＮＡポリメラーゼがテンプレート依存のＤＮＡ合成によって前記オリゴヌクレオチドを伸長するのを防ぐ、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
各スペーサーが、対応する前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’ＯＨに結合した脂肪族分子を含む、請求項４３に記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドのそれぞれが、ウイング付きブロッカーである、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
前記ウイング付きブロッカーが、ＤＮＡの前記第１の集団における配列に相補的である４０〜６０のヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
前記ウイング付きブロッカーが、前記相補的ヌクレオチド配列の各末端に１０〜１００のヌクレオチドのウイングオリゴヌクレオチド配列を含み、前記ウイングオリゴヌクレオチド配列は、ＤＮＡの前記第１の集団における隣接配列に相補的ではない、請求項４５に記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の複数のブロッキングオリゴヌクレオチド、及び
鎖置換型ポリメラーゼ
を含むキット。
【請求項４９】
前記鎖置換型ポリメラーゼがｐｈｉ２９ポリメラーゼである、請求項４８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
哺乳類組織における病原微生物による感染は、主要な医療上の問題である。菌血症として知られている血液の細菌感染は、一般に抗生物質で処置できるが、全身が炎症を起こして、多臓器の虚脱を引き起こし、処置せずに放置すると最終的には死に至ることもある生命を脅かす病気である、敗血症をもたらす場合がある。抗菌剤耐性の高まりとともに、細菌感染の処置はさらに困難になってきている。合衆国だけでも、年間約２００万人の患者が抗菌剤耐性菌による細菌感染にかかっており、感染の結果としておよそ１０万人の患者が死亡することになる。病院で診断された感染のほぼ半分は現在、少なくとも１つの一般的な抗菌剤に耐性があり、薬剤耐性感染の場合、死亡リスクは２倍になる可能性がある。感染に関与する病原体（複数の場合もある）とその抗菌剤感受性パターンを迅速かつ正確に同定することは、永久損傷や死を回避するために重要であり得る。
【０００２】
病原体とその抗菌剤感受性パターンを迅速かつ包括的に同定するための主な課題は、病原体が通常、生物試料のごく一部にすぎないことである。例えば、臨床的に関連のある血液試料では、血液１ミリリットルあたり１０個未満の病原性細胞が存在する可能性がある。同時に、数十億のヒト細胞が存在することもあり、それぞれがその約１，０００倍のゲノム材料を保持しているため、診断、特に核酸に基づく診断に対し手ごわい課題が提起されている。この課題を克服するための従来の方法は、増殖許容環境（例、細菌や真菌のための栄養豊富なブロス、又はウイルスのための許容細胞株）で標本を培養することにより、より大きな病原体集団を生成させることであった。病原体を培養すると、病原体：ヒトＤＮＡの比率を少なくとも１００万倍に増加させことができるが、時間がかかり、多くの場合、好結果が得られないことになり得る。
【０００３】
例えば、血液からの細菌培養は、純粋なコロニーを生成するのに少なくとも３６時間かかることがあり得、重度の敗血症の症例のほぼ半分で病原微生物を培養することができない（Ｍａｒｔｉｎら（２００３）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４８：１５４６−１５５４）。さらに、抗生物質の存在下で細菌を培養することは、依然として包括的な抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）についての至適基準であるが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなど、培養が困難な病原体の場合、このプロセスは、３週間以上を要することがないにしても、少なくとも数日間を要する。この遅延は、重篤な血流感染での死亡リスクが１時間あたり８％増加する可能性がある患者にとっては致命的であり得る。医師は待つのではなく、感染に対し「絨毯爆撃」のごとき戦略で臨むように設計された強力で広域スペクトルの抗生物質を使用する経験的治療を使用して処置する。このアプローチは費用がかかり、患者を重大な薬物毒性に曝し、抗生物質耐性の蔓延を助長する。最も重要な経験的治療は、多剤耐性病原微生物のリスクにより、ますます効果が薄れてきている。
【０００４】
診断までの時間を短縮するために、核酸に基づく診断が採用されることが多い。現在のアッセイは、主にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の形での標的化核酸増幅を利用することにより、病原体ゲノムの短い（＜１キロベース）、事前に選択された領域をバックグラウンドのヒトＤＮＡレベルを超える検出可能なレベルまで選択的に増幅させる。ＰＣＲに基づく診断は迅速かもしれないが、標的化プローブに依存するものであるため、ＰＣＲに基づく診断は有限の数のターゲットに制限されることから、数千存在する既知の病原体種、及び少なくとも１，６００である既知の抗菌剤耐性遺伝子を包括的に同定することが妨げられ、またＰＣＲに基づく診断は、複雑な多型に基づく耐性の決定において常に正確であるとは限らない。さらに、標的化増幅は、抗菌剤耐性（ＡＭＲ）遺伝子の遺伝的背景に影響されず、これは、多微生物性細菌感染などの症例、汚染物質（例、ｍｅｃＡを保持するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の存在、及び遺伝子の位置が重要である場合に不可欠なことである。
【０００５】
病原体の包括的な同定を可能にし、周知であり特徴が十分に確認された耐性遺伝子だけでなく、耐性のより複雑なメカニズムも同定するために、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）は、過去数年のうちに病原体同定と抗菌剤感受性の両方にとっての有望な新しい診断法として浮上している。全ゲノム増幅（ＷＧＡ）後に病原微生物の全ゲノムを配列決定することにより、従来の培養に関連するいくつかの問題を解決することができる。例えば、細胞培養におけるインビボ複製の代わりにインビトロ酵素活性を使用してＤＮＡ配列を増幅すると、使用可能な量の微生物遺伝物質を生成するために要する時間を数日間から数時間に劇的に短縮できる。さらに、細胞培養を回避することで、最新の培養方法でも培養することができない、病原性微生物種を含む微生物からのＤＮＡの増幅も可能になる（例、Ｋｖｉｓｔら（２００７）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４（４）：９２６−９３５；Ｈｕａｎｇら（２０１５）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１６：７９−１０２）。しかしながら、当技術分野では、宿主ＤＮＡ又は汚染ＤＮＡが目的のＤＮＡよりも８〜９ｌｏｇも豊富であり得る場合に全ゲノム配列の効率的な生成を成功させるための改善された方法が依然として必要である。不偏の方法で微生物と哺乳類の核酸の混合物を含む生物試料において病原性微生物ＤＮＡを含む、核酸のサブセットを選択的又は優先的に増幅及び富化することで、ＷＧＡを使用した高感度診断が可能になり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎら（２００３）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４８：１５４６−１５５４
【非特許文献２】Ｋｖｉｓｔら（２００７）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４（４）：９２６−９３５
【非特許文献３】Ｈｕａｎｇら（２０１５）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１６：７９−１０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、少なくとも第１の核酸集団及び第２の核酸集団を含む混合試料の増幅によって生成されたＤＮＡの増幅試料における微生物核酸の富化のための改善された方法の開発に部分的に依存している。さらに、本発明は、非標的化増幅反応（ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（例、等温増幅中のランダムヘキサマーの使用）を行うときに、望ましくない配列の増幅を低減し、その結果、試料を所望の核酸について富化できる改善されたブロッキングオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００８】
一態様において、本発明は、少なくとも第１の核酸集団及び第２の核酸集団を含む混合試料の増幅によって生成されたＤＮＡの増幅試料における、核酸（例、微生物又は非宿主の核酸）の集団を富化するための改善された方法を提供するもので、この改善は、増幅段階中における少なくとも第１の核酸集団及び第２の核酸集団の混合試料中の第１の核酸集団におけるある特定の配列（例、哺乳類又は宿主の配列）の増幅を抑制することを含む。本発明によれば、第１の集団のある特定の配列（例、哺乳類又は宿主のＤＮＡ）の増幅は、混合試料中の第１の核酸集団における少なくとも１つのＤＮＡ配列に特異的に結合し、その結合したＤＮＡ配列の増幅を抑制する少なくとも１つのブロッキングオリゴヌクレオチドを混合試料に加えることにより抑制される。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットに実質的に相補的である第１の核酸集団に存在する１セットのＤＮＡ配列の増幅を抑制するブロッキングオリゴヌクレオチドのセットが使用される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主ゲノム）より、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主ゲノム）の方でより頻繁に現れる配列に相補的な６〜２３のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記配列は、第２の核酸集団と比べて第１の核酸集団ではその２倍〜５０倍の頻度で現れる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、微生物ゲノムは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、又は菌血症に関連する任意の他の細菌種である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号１６から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号１７〜配列番号３２から選択される配列に結合する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドのセットは、第１のＤＮＡ集団（例、哺乳類の核又はミトコンドリアゲノム）全体に分布する相補的配列に結合する。いくつかの実施形態において、Ｎ個のブロッキングオリゴヌクレオチドのセットは、第１のＤＮＡ集団全体に分布する相補的配列に結合する。好ましくは、相補的配列は集団全体に均一に分布しているが、これは統計的にはありそうもない。したがって、いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドの第１の集団に相補的なゲノム配列間の最大距離は、２Ｇ／Ｎ、３Ｇ／Ｎ、４Ｇ／Ｎ又は５Ｇ／Ｎであり、ここでＧは、第１の集団に対応するゲノムＤＮＡのサイズであって、Ｎは、前記複数のブロッキングオリゴヌクレオチドにおける異なるブロッキングオリゴヌクレオチドの数である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットは、２〜１０８の異なるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットは、２〜１０３のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットは、１０３〜１０５のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットは、１０５〜１０７のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットは、１０７〜１０８のオリゴヌクレオチドを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）の相補配列に架橋する鎖間架橋剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、架橋剤は光活性化可能である。いくつかの実施形態では、架橋剤はソラレンである。いくつかの実施形態では、架橋剤は、シスプラチン、ホルムアルデヒド、ナイトロジェンマスタード、又はマイトマイシンＣである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第２の核酸集団は微生物の核酸である。いくつかの実施形態では、微生物の核酸は、細菌、ウイルス、真菌、又は原生動物のＤＮＡである。
【００１５】
いくつかの実施形態において、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主ＤＮＡ）及び第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主ＤＮＡ）の混合試料は、ヒト及び／又は他の真核生物起源の、血液、痰、尿、粘液、唾液、組織膿瘍、創部ドレナージ、便、リンパ、洗浄液（ｌａｖａｇｅ）、脳脊髄液、又は流体吸引物若しくは組織抽出物から得られるか、又はそれらに由来する。いくつかの実施形態では、混合試料は、ヒト対象から得られるか又はそれに由来する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、増幅は、鎖置換型ポリメラーゼを使用して行われる。いくつかの実施形態では、増幅は、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ；Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）；Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）；Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）；Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）；クレノウフラグメント；ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージフラグメント；Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素；ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＤＮＡポリメラーゼ（商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）；Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）；Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）；及びＳＤポリメラーゼを含む群から選択される鎖置換型ポリメラーゼによるものである。いくつかの実施形態において、増幅は、ｐｈｉ２９ポリメラーゼによるものである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、混合試料は、１ミリリットルあたり１０６未満の微生物ゲノムからのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、混合試料は、１ミリリットルあたり１０未満の微生物ゲノムからのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、混合試料中には１ミリリットルあたり１０〜１０６の微生物ゲノムからのＤＮＡが存在する。いくつかの実施形態において、混合試料中には１ミリリットルあたり１０〜１０３の微生物ゲノムからのＤＮＡが存在する。いくつかの実施形態において、混合試料中には１ミリリットルあたり１０３〜１０５の微生物ゲノムからのＤＮＡが存在する。いくつかの実施形態において、混合試料中には１ミリリットルあたり１０５〜１０６の微生物ゲノムからのＤＮＡが存在する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主ＤＮＡ）の増幅は、改善された方法で処理されていない試料と比較して１０倍〜１００倍といった増加を示す。
【００１９】
いくつかの実施形態において、混合試料が本明細書で提供される改善された方法で処理される場合、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主ＤＮＡ）の増幅が少なくとも５０％減少している。いくつかの実施形態において、混合試料が本明細書で提供される改善された方法で処理される場合、第１の核酸集団では少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の減少がある。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’末端にスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、６〜５０のヌクレオチドを含む。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明は、（ａ）第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主ＤＮＡ）との比較において１キロベースあたりの第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主ＤＮＡ）内でより頻繁に観察される配列に相補的である少なくとも１５の連続したヌクレオチド及び（ｂ）相補的な配列に架橋する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、第１の核酸集団は哺乳類ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、哺乳類ＤＮＡは哺乳類ミトコンドリアＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第２の核酸集団は微生物ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、微生物ＤＮＡは細菌ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、細菌ＤＮＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、又は菌血症に関連する任意の他の細菌種に由来する。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、光活性化ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドはソラレンである。いくつかの実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端にある。
【００２３】
いくつかの態様において、本発明は、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）における一本鎖ＤＮＡ分子に特異的に結合する少なくとも１つのブロッキングオリゴヌクレオチド及び前記ブロッキングオリゴヌクレオチドに共有結合した鎖間架橋剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端に結合したスペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のＤＮＡ集団は哺乳類ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、哺乳類ＤＮＡは、哺乳類ミトコンドリアＤＮＡであり、必要に応じてヒトミトコンドリアＤＮＡである。いくつかの実施形態では、架橋剤はソラレンである。いくつかの実施形態では、スペーサーはＣ３スペーサーである。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、６〜５０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、２〜１０８のブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。
【００２４】
いくつかの態様において、本発明は、組成物及び鎖置換ポリメラーゼを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、鎖置換型ポリメラーゼはｐｈｉ２９ポリメラーゼである。
【００２５】
いくつかの実施形態において、第２の核酸集団は、少なくとも１つの微生物ゲノムに由来する。いくつかの実施形態において、微生物ゲノムは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、又は菌血症に関連する任意の他の細菌種である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号１６から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号１７〜配列番号３２から選択される配列に結合する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドのセットは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、または宿主）全体にほぼ等しく分布している。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットは、２〜１０８のオリゴヌクレオチドを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを第１のＤＮＡ集団（例えば、哺乳類、ミトコンドリア、または宿主ＤＮＡ）中の相補配列に架橋させる鎖間架橋剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、架橋剤は光活性化可能である。いくつかの実施形態では、架橋剤はソラレンである。いくつかの実施形態では、ソラレンはオリゴヌクレオチドの３’末端にある。
【００２８】
いくつかの実施形態において、混合試料は、１ミリリットルあたり１０未満の微生物ＤＮＡ分子からのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、混合試料は、１ミリリットルあたり１０〜１０６の微生物ゲノムからのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、混合試料中には１ミリリットルあたり１０〜１０３の微生物ゲノムからのＤＮＡが存在する。いくつかの実施形態において、混合試料中には１ミリリットルあたり１０３〜１０５の微生物ゲノムからのＤＮＡが存在する。いくつかの実施形態において、混合試料中には１ミリリットルあたり１０５〜１０６の微生物ゲノムからのＤＮＡが存在する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、第２の核酸集団（例、微生物、細菌、または非宿主）の増幅は、改善された方法で処理されていない試料と比較して、１０倍〜１００倍といった増加を示す。
【００３０】
いくつかの実施形態において、混合試料が本明細書で提供される改善された方法で処理される場合、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主ＤＮＡ）の増幅が少なくとも５０％減少している。いくつかの実施形態において、混合試料が本明細書で提供される改善された方法で処理される場合、第１の核酸集団では少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の減少がある。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’末端にスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、６〜５０のヌクレオチドを含む。
【００３１】
いくつかの態様において、本発明は、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、または宿主ＤＮＡ）における一本鎖ＤＮＡ分子に特異的に結合する少なくとも１つのブロッキングオリゴヌクレオチド及び前記ブロッキングオリゴヌクレオチドに共有結合した鎖間架橋剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端に結合したスペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態において、第１の核酸集団は哺乳類ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、哺乳類ＤＮＡはヒトＤＮＡである。いくつかの実施形態では、架橋剤はソラレンである。いくつかの実施形態では、スペーサーはＣ３スペーサーである。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、６〜５０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、２〜１０８のブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。
【００３２】
いくつかの態様において、本発明は、組成物及び鎖置換ポリメラーゼを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、鎖置換型ポリメラーゼはｐｈｉ２９ポリメラーゼである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、増幅反応へのアサシンブロッカー（Ａｓｓａｓｓｉｎ  Ｂｌｏｃｋｅｒ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドの適用を示す。宿主（例、核及びヒトのミトコンドリアの）と非宿主（例、微生物の）のＤＮＡの混合物を含む試料を、サイズが１〜１００  ｋｂの範囲のフラグメントに断片化する。宿主ＤＮＡフラグメント及び非宿主ＤＮＡフラグメントを、宿主ＤＮＡフラグメントのサブセットに選択的に結合する１又はそれを超えるアサシンブロッカーＤＮＡオリゴヌクレオチドとインキュベートする。次いで、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドを、ＵＶ活性化によって宿主ＤＮＡフラグメントのサブセットに架橋させる。次いで、宿主ＤＮＡ及び非宿主ＤＮＡの非特異的ＰＣＲ増幅を、鎖置換型ポリメラーゼを使用して実施する。アサシンブロッカーＤＮＡオリゴヌクレオチドは、鎖置換型ポリメラーゼの活性をブロックし、それによりアサシンブロッカーオリゴヌクレオチドが結合した宿主ＤＮＡのサブセットの増幅をブロックする。非特異的ＰＣＲの結果は、非宿主ＤＮＡが富化された混合物である。
【００３４】
【図２】図２は、宿主（例、ヒトミトコンドリアの）ＤＮＡ（下鎖）に結合したアサシンブロッカーＤＮＡオリゴヌクレオチド（上鎖）の図である。アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドは、３’末端がスペーサーに続いてソラレン基により修飾されている。ソラレン基は、ＵＶ照射の存在下で宿主ＤＮＡへの鎖間架橋を形成する。この鎖間架橋は、ｐｈｉ２９などの鎖置換型ポリメラーゼの進行をブロックする。
【００３５】
【図３】図３は、６０ヌクレオチド（６０マー）ターゲットオリゴヌクレオチドに相補的であった２５ヌクレオチド（２５マー）オリゴヌクレオチドを使用して、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドをターゲットオリゴヌクレオチドに架橋する場合の効果を示す。アサシンブロッカーの非特異的結合を評価するための陰性対照として、レーン３及びレーン５で９０マーのオフターゲットオリゴヌクレオチドを使用した。レーン１は、２５マーのアサシンブロッカーオリゴヌクレオチドと、ＵＶ光に曝露された６０マーのターゲットオリゴヌクレオチドを含む試料であり、レーン２は、２５マーのアサシンブロッカーオリゴヌクレオチドと、ＵＶ光に曝露されなかった６０マーのターゲットオリゴヌクレオチドを含む試料であり、レーン３は、２５マーのアサシンブロッカーオリゴヌクレオチドと、ＵＶ光に曝露された９０マーのオフターゲットオリゴヌクレオチドを含む試料であり、レーン４は、ＵＶ光に曝露された６０マーのターゲットオリゴヌクレオチドを含む試料であり、レーン５は、ＵＶ光に曝露された９０マーのオフターゲットオリゴヌクレオチドである。アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドとターゲットオリゴヌクレオチドの安定した相互作用には、架橋を形成するためにＵＶ光が必要である（レーン１対レーン２）。架橋アサシンブロッカーオリゴヌクレオチド：ターゲットオリゴヌクレオチド複合体の移動については、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチド又はターゲットオリゴヌクレオチド単独（レーン１対レーン４及びレーン６）のいずれの場合よりもゲルを通過するのが緩慢である。アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドは、ターゲットオリゴヌクレオチドに特異的に結合し、オフターゲットオリゴヌクレオチドには結合しない（レーン３対レーン５）。
【００３６】
【図４】図４は、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドを使用する場合の宿主（例、ヒトミトコンドリアの）ＤＮＡの減少を示す。アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドを使用しない場合の減少パーセントを宿主ＤＮＡに対して正規化する。
【００３７】
【図５】図５は、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドで処理された試料（黒色）またはアサシンブロッカーオリゴヌクレオチドで処理されていない試料（灰色）からの哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ配列の１６，５６９塩基対にわたるリード数（リードの深度）を示す。
【００３８】
【図６】図６は、ウイング付き宿主ＤＮＡブロッキング（ｗｉｎｇｅｄ  ｈｏｓｔ  ＤＮＡ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ）の製造プロセスである。ステージ１：ゲノム全体に分布する２つの異なるパリンドローム制限部位、部位Ｘ及び部位Ｙの位置を伴う二本鎖宿主ＤＮＡ。ステージ２：二重制限酵素消化を使用して、宿主ゲノムＤＮＡがフラグメントに分解される。両端にＸ部位を有するフラグメントもあれば、両端にＹ部位を有するフラグメントもあり、いずれの場合でも本明細書では「ホモフラグメント」と称す。対照的に、いくつかのフラグメントは、一方の端にＸ部位、他方の端にＹ部位を有しており、これらを本明細書では「ヘテロフラグメント」と称す。ステージ３：「ｈアダプター」を、宿主ＤＮＡフラグメントにライゲーションする。２つのｈアダプターがある。アダプター１は、３’オーバーハングと、Ｘ制限部位にマッチする粘着末端を有する。アダプター２は、５’オーバーハングと、Ｙ制限部位にマッチする粘着末端を有する。ステージ４：ｈアダプターがライゲーションされたフラグメントを、ｈアダプターにマッチするプライマーを使用してＰＣＲ反応で増幅する。プライマーの一方は５’リン酸基を有し得、他方のプライマーは５’ビオチンまたは異なる捕捉基（例、Ｈｉｓタグ）を有し得る。この配置において、増幅される唯一のフラグメントは、一端にＸ制限部位及び他端にＹ制限部位を有するもの、すなわち、ヘテロフラグメントである。ステージ５：ラムダ一本鎖エキソヌクレアーゼを使用してリン酸化鎖を消化（解重合）し、「ブロッキングプローブ」または「ブロッキングプライマー」と呼ばれる一本鎖ＤＮＡフラグメントを残す。ストレプトアビジンを使用してビオチン化鎖を選択的にプルダウンするなど、一本鎖ＤＮＡを取得する別の方法を使用してもよい。
【００３９】
【図７】図７は、増幅反応への宿主ウイング付きＤＮＡブロッカーの適用を示す。ステージ１：出発試料には、宿主ＤＮＡと非宿主ＤＮＡの混合物が含まれる。ステージ２：ＤＮＡを１〜１５  ｋｂのサイズのフラグメントに断片化する。ステージ３：フラグメントを、宿主ＤＮＡフラグメントに選択的に結合するブロッキングプローブとインキュベートする。ステージ４：非鎖置換型ポリメラーゼを使用して、非特異的ＰＣＲまたは他の増幅を行う。ポリメラーゼがブロッキングフラグメントに到達すると、それ以上処理できないため、宿主ＤＮＡの増幅を進めることができない。ブロッキングプローブ自体がプライマーとして機能しないことが重要である。「ウイング」、すなわち３’ｈアダプターに対応する配列は、宿主ＤＮＡにハイブリダイズしないため、ブロッキングプローブの伸長を妨げる。宿主ＤＮＡの増幅がブロックされるため、結果は非宿主ＤＮＡが富化された混合物となる。
【００４０】
【図８】図８は、Ｍ１３ファージブロッカーを使用した、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡの存在下におけるＭ１３ファージアンプリコン増幅の抑制を示す。概念実証実験では、Ｍ１３ファージに対して製造されたブロッカーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡの存在下でＭ１３ファージＤＮＡゲノムのセグメントの増幅をブロックする。すべての実験条件には、Ｅ．ｃｏｌｉとＭ１３ファージＤＮＡの両方が含まれていた。
【００４１】
【図９】図９は、Ｍ１３ブロッカーを使用したＭ１３ファージアンプリコン抑制の定量を示す。図７に示されるバンドからの蛍光強度プロファイルを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量する。
【００４２】
【図１０】図１０は、Ｍ１３ブロッカーを使用したＭ１３ファージアンプリコン抑制の分析を示す。ゲルバンド全体の平均生蛍光強度（ａｖｅｒａｇｅ  ｒａｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を、図８で決定されたプロファイルに基づいて定量した。次いで、正味のバンド蛍光強度を、平均生蛍光強度から平均バックグラウンド蛍光を差し引くことにより計算した。ブロッカーの効果を、ブロッカー添加前後の正味のバンド蛍光強度を比較することによって計算した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
（発明の詳細な説明）
定義。
本明細書で使用されるすべての科学的及び技術的用語は、以下に別段の定義がない限り、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書を優先する。本明細書で使用されている技法と言えば、当技術分野で一般に理解されている技法を指すものとし、当業者にとって明らかなものとなるそれらの技法の変形又は均等内容の技法若しくは後に開発される技法の代替法を含む。本発明である主題をより明確かつ簡潔に説明するために、明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるある特定の用語について以下の定義を提供する。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」という用語は、視覚化するのに顕微鏡を必要とする微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を意味する。微生物の非限定的な例には、細菌、古細菌、真菌、原生生物、ウイルス、及び微小の動物（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ａｎｉｍａｌ）が含まれる。病原微生物は宿主生物において疾患を引き起こす可能性がある。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド塩基を含むポリマーである。ヌクレオチド塩基は、ＤＮＡヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）、ＲＮＡヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、又はＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドの混合物から構成され得る。ヌクレオチド塩基は修飾されていてもよい（例、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチド、又は架橋ヌクレオチド、例えばロックされた核酸（ＬＮＡ）、又は拘束エチルヌクレオチド（ｃＥｔ））。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「細菌」という用語は、原核生物界の単細胞微生物を意味する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「哺乳類」という用語は、髪または柔皮を有し、子供に栄養を与えるための雌性による乳汁の分泌、及び子供を生むことによって区別される温血脊椎動物真核生物を意味する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「富化」は、少なくとも２つのＤＮＡ集団を含む混合試料中において、１つのＤＮＡ集団（例えば、微生物ＤＮＡ）が第２の集団（例えば、哺乳類ＤＮＡ）と比較して増加していることを指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「増幅」は、核酸の集団を増加させるプロセスを指す。核酸の集団は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、又は転写媒介性増幅（ＴＭＡ）を含む、いくつかの方法のうちの１つで拡大される。いくつかの実施形態において、核酸増幅は、等温鎖置換増幅、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、又はプライマー伸長前増幅である。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「混合試料」は、少なくとも２つの供給源からのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、混合試料は、核酸の第１の集団及び第２の集団を含む。いくつかの実施形態において、核酸の第１の集団は哺乳類ＤＮＡであり、核酸の第２の集団は微生物ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸の第１の集団は哺乳類のミトコンドリアＤＮＡであり、核酸の第２の集団は細菌ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸の第１の集団は宿主ＤＮＡであり、核酸の第２の集団は非宿主ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸の第１の集団及び第２の集団は、両方とも微生物ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸の第１の集団及び第２の集団は、両方とも細菌ＤＮＡである。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「相対出現率」という用語は、第２のＤＮＡ集団に対する、第１のＤＮＡ集団におけるヌクレオチド配列の相対出現率を指す。相対出現率は、（ａ）第１の集団におけるヌクレオチド配列の出現率を（ｂ）第２の集団におけるヌクレオチド配列の出現率で割ることにより計算され得る。各集団におけるヌクレオチド配列の出現率は、（ａ）ヌクレオチド配列に対応する集団におけるＤＮＡの量（例えば、ｂｐ（塩基対）の数）（重複コピーを含む）を、（ｂ）集団内のＤＮＡの総量（例えば、ｂｐの数）で割ることにより推定され得る。相対出現率は、ゲノム配列全体またはその一部の情報に基づいて、または実験的に概算され得る。例えば、Ｇ  ｂｐのゲノムにおいてＹコピーで出現するＸ  ｂｐのヌクレオチド配列は、ＸＹ／Ｇの出現率を有することになる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「菌血症」は、血液中における細菌の存在を指す。いくつかの実施形態において、血液中に存在する細菌は、宿主に疾患を引き起こす感染性細菌である。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「相補的」は、あるポリヌクレオチド配列の、別のポリヌクレオチド配列に選択的に結合またはアニーリングする能力を指す。本発明のブロッキングオリゴヌクレオチド（例えば、アサシンブロッカーまたはウイング付きブロッカー（Ｗｉｎｇｅｄ  Ｂｌｏｃｋｅｒ）オリゴヌクレオチド）は、混合試料中の１つのＤＮＡ集団における配列に相補的である。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「ブロッキングオリゴヌクレオチド」は、相補的ヌクレオチド配列に結合してその増幅を阻害するヌクレオチド塩基のポリマーを指す。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、アサシンブロッカーと相補的ヌクレオチド配列との間の鎖間架橋の形成により、相補的ヌクレオチド配列に結合し、その増幅を阻害するアサシンブロッカーである。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ウイング付きブロッカーの５’末端及び３’末端での結合が欠如しているために相補的ヌクレオチド配列に結合し、その増幅を阻害するウイング付きブロッカーである。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「鎖間架橋」は、ＤＮＡ二重らせんの反対の鎖上のＤＮＡ塩基間の共有結合を指す。これらの架橋は非常に安定しており、ＤＮＡ増幅をブロックするもので、増幅を続行させるには、架橋ヌクレオチドの切除が必要となる。本発明のいくつかの実施形態では、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドを、哺乳類ミトコンドリアＤＮＡに架橋させ、それにより増幅をブロックする。いくつかの実施形態において、鎖間架橋は、ソラレン化学基を含む修飾ヌクレオチド塩基と哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ中の相補的ヌクレオチド塩基との間に形成される。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「ソラレン」とは、５’−ＡＴ配列でＤＮＡに挿入することによりＤＮＡ鎖間架橋を形成する天然化合物を指し、ソラレンはＵＶＡ照射の存在下でチミジンヌクレオチドと結合してチミジン付加物を形成する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「スペーサー」とは、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドのデオキシリボース３’位に共有結合することができ、その結果、別のヌクレオチドの５’リン酸と反応してヌクレオチド間に５’→３’ホスホジエステル結合を形成させるのにその３’位が利用できなくなるようにする化学部分を意味する。したがって、スペーサーは、テンプレート依存のＤＮＡ合成によってＤＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長するのを妨げ、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ合成または増幅のプライマーとして機能するのを妨げる。適切なスペーサーは、通常、オリゴヌクレオチドの３’ＯＨと反応できる低分子量の脂肪族部分であり、様々な形で市販されており（例：３’Ａｍｉｎｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ（商標）、Ｃ３  Ｓｐａｃｅｒ（商標）、Ｓｐａｃｅｒ  ９（商標）、Ｓｐａｃｅｒ  １８（商標）、ｄＳｐａｃｅｒ（商標）、イリノイ州スコーキー、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、最も単純なのは−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ（ここで、ｎは２〜１０であり、Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２であり得る）の形態のものである。スペーサーは、３’デオキシリボースなどの環状脂肪族部分であることもできる。
【００５８】
発明の原理。
本発明は、核酸の少なくとも２つの集団を含む混合臨床試料において、核酸（例、病原性微生物ＤＮＡを含む微生物核酸）の集団を選択的または優先的に増幅することで、混合試料中に存在する病原微生物を含む微生物の迅速かつ効率的な同定を支援する改善された方法の開発にある程度依存する。いくつかの実施形態において、本方法では、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主の核酸）のある特定の配列に架橋されたブロッキングオリゴヌクレオチドを使用して、その第１の核酸集団の増幅を抑制し、それによって第２の核酸集団（例、微生物、細菌又は非宿主核酸）の富化を増強する。他の実施形態において、本方法では、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主のＤＮＡ）のある特定の配列に結合してその増幅を抑制するウイング付きヘリックス（Ｗｉｎｇｅｄ  Ｈｅｌｉｘ）ドメインを含むブロッキングオリゴヌクレオチドを使用して、その第１の核酸集団の増幅を抑制し、それによって第２の核酸集団の富化を増強する。
【００５９】
一態様において、本発明は、所望の第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主の核酸）の富化を増強するために、増幅から有利にブロックされ得る第１のＤＮＡ集団（例、哺乳類ＤＮＡ）からＤＮＡ配列を選択する方法を提供する。アサシンブロッカー配列の適切な候補（「候補ブロッキング配列」）は、アサシンブロッカーが、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主のＤＮＡ）より第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主のＤＮＡ）を優先的に増幅するように選択される。候補ブロッキング配列は、第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主のＤＮＡ）に比べて、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主のＤＮＡ）でより頻繁に出現するべきである。例えば、候補ブロッキング配列の最初の６ヌクレオチドは、第２の核酸集団と比較して、第１の核酸集団では頻度が２倍〜５０倍と高くなるべきである。さらに、候補ブロッキングオリゴヌクレオチド配列の最初の２３ヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主のＤＮＡ）に存在するべきであり、第１の核酸集団に対し、第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主のＤＮＡ）では存在しないか又は非常に希少である。候補ブロッキング配列はまた、ハイブリダイゼーションに適した温度（例、２５〜５０℃）で相補配列にアニーリングできるものでなくてはならない。候補ブロッキング配列はまた、架橋剤による架橋を促進するためにある特定のモチーフ（例えば、ソラレンの特定の末端にあるＡとＴ）を含むことが必要な場合もある。候補ブロッカー配列のセットは、核酸の集団全体がその増幅に関して抑制される場合、核酸の集団の大きな領域をブロックするように、全体として第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、または宿主のゲノム）にわたって間隔を空けて配置されなければならない。核酸の１つの集団に適したブロッキング配列が核酸の別の集団に及ばない場合があるため、混合試料でブロックされるべき核酸の各集団を個別に検査しなければならない。前記適用に所望されるのがごく少数のアサシンブロッカーであり、第１の核酸集団が大きい場合、候補ブロッキング配列が第１の核酸集団でブロックする領域の数も、アルゴリズムによって定量され、より多くの領域をブロックする配列が好ましい。
【００６０】
したがって、本発明で使用されるブロッキングオリゴヌクレオチドは、混合試料中において増幅されないか、又は核酸配列の他の集団よりも増幅される程度が少ない核酸（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）ＤＮＡ配列の第１の集団のブロックされたセットを明らかにする。その結果、病原微生物感染の診断に役立つ病原微生物ＤＮＡを含む可能性のある、第２のＤＮＡ集団（例、微生物、細菌、又は非宿主のＤＮＡ）が富化されているＤＮＡの増幅試料が得られる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、第１の核酸集団は、哺乳類のミトコンドリアＤＮＡ配列を含む。哺乳類細胞には多くのミトコンドリアが含まれており、ミトコンドリアは通常、ミトコンドリアゲノムの複数のコピーを含んでいるため、１哺乳類細胞あたりのミトコンドリアゲノムのコピー数は非常に高くなる可能性がある。例えば、ｍｔＤＮＡのコピー数は、１細胞あたり数百から数千のコピーの範囲であると推定されている（Ｈｏｓｇｏｏｄら（２０１０）、”Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ，”  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、３１（５）：８４７−８４９）。しかしながら、いくつかのミトコンドリアの配列は、病原微生物の配列と実質的に類似している。したがって、そのような病原微生物配列もブロックされることになるため、ミトコンドリア配列がすべてブロックされた配列の第１の集団に含まれるべきというわけではない。
【００６２】
同様に、いくつかの実施形態において、第１の核酸集団は、哺乳類のＤＮＡ配列を含む。しかしながら、いくつかの哺乳類配列は病原微生物の配列と実質的に類似している。したがって、そのような病原微生物配列もブロックされることになるため、哺乳類配列がすべて第１の核酸集団に含まれるべきというわけではない。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％は、哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ配列をブロックすることになる。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドの５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又は８０％未満が哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ配列をブロックすることになる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％が哺乳類ＤＮＡ配列をブロックすることになる。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドの５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又は８０％未満が哺乳類ＤＮＡ配列をブロックすることになる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％が、哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ配列及び／又は哺乳類ＤＮＡ配列をブロックすることになる。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドの５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％未満が、哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ配列及び／又は哺乳類ＤＮＡ配列をブロックすることになる。
【００６６】
病原微生物。
いくつかの態様において、本発明は、核酸の少なくとも２つの集団を含む混合試料の増幅によって生成されたＤＮＡの増幅試料における核酸（例、微生物、細菌、又は非宿主）ＤＮＡの第２の集団の富化のための改善された方法を提供する。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態では、微生物は細菌である。細菌は通常、健康な哺乳類に存在するが、細菌と哺乳類宿主との間の正常なバランスの乱れ、又は宿主内の異常な細菌又は病原細菌の存在が感染につながる可能性がある。
【００６８】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、通常人体に存在する細菌であり、鼻、気道、及び皮膚で頻繁に見出される。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは常に病原性があるわけではないが、膿瘍を含む皮膚感染症、呼吸器感染症、及び食中毒の一般的な原因である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症の一般的な処置方法は抗生物質の使用であるが、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）やバンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）などのＳ．ａｕｒｅｕｓの抗生物質耐性株の出現は、世界的な健康上の臨床的課題となっている。
【００６９】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は、通常人体に存在する細菌であり、皮膚で頻繁に見出される。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは一般的に病原性ではないが、免疫系が損なわれた対象にはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染症を発症するリスクがあり、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓはプラスチック製の表面で増殖して人体に広がる可能性があるため、外科的移植片（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｉｍｐｌａｎｔ）を有する対象に対し特定の脅威をもたらす。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株は、リファマイシン、フルオロキノロン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、及びスルホンアミドなどの抗生物質に耐性を示すことが多い。
【００７０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）は、一般的に病原性ではない細菌であり、消化管及び泌尿生殖器管で見出される率はヒトの場合その３０％にも達し得る。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによる病原性感染症は、新生児及び免疫無防備状態の個体にとっては懸念事項である。成人のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ感染症は生命を脅かす可能性があり、菌血症、軟部組織感染症、骨髄炎、心内膜炎、及び髄膜炎が含まれる。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、クリンダマイシンとエリスロマイシンに対する耐性が高まっている。
【００７１】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）は、ヒトや他の哺乳類の消化管に生息する細菌である。しかしながら、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓは心内膜炎、敗血症、尿路感染症、及び髄膜炎を引き起こす可能性がある。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ感染症は、特にＥ．ｆａｅｃａｌｉｓがゲンタマイシンとバンコマイシンによる処置に耐性がある場合、生命を脅かす可能性がある。
【００７２】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）は、ヒトや他の哺乳類の消化管に生息する細菌であるが、病原性でもあり、髄膜炎や心内膜炎などの疾患を引き起こす可能性がある。Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ感染症は、特にＥ．ｆａｅｃｉｕｍがバンコマイシンによる処置に耐性がある場合、生命を脅かす可能性がある。
【００７３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ヒトや他の哺乳類の消化管に生息する細菌であるが、病原性である可能性もあり、胃腸炎、尿路感染症、新生児髄膜炎、出血性大腸炎、及び菌血症などの状態をもたらす可能性がある。Ｅ．ｃｏｌｉは、フルオロキノロン、セファロスポリン、及びカルバペネムなどの複数の抗生物質に対する耐性が高まっている。
【００７４】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、ヒトや他の哺乳類の口、皮膚、及び腸に通常見られる細菌である。しかしながら、吸入すると、ヒトや哺乳類の肺、特に肺胞に破壊的な変化を引き起こす可能性がある。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症は一般に、糖尿病、アルコール依存症、がん、肝疾患、慢性閉塞性肺疾患、糖質コルチコイド療法、及び腎不全の対象を含む、免疫系が損なわれた対象に見られる。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、フルオロキノロン、セファロスポリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カルバペネム、及びトリメトプリム／スルファメトキサゾールなどの複数の抗生物質に対する耐性が高まっている。
【００７５】
いくつかの実施形態では、微生物は病原微生物である。いくつかの実施形態では、微生物は細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は菌血症と関連している。いくつかの実施形態において、細菌は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ，Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ，Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、又は臨床感染に関連する他の細菌種である。
【００７６】
哺乳類のＤＮＡ。
細菌と哺乳類のＤＮＡの物理的組成は異なるが、両方とも同じ基本的な遺伝コードを利用している。例えば、細菌のＤＮＡは、核やミトコンドリア内ではなく、細胞の細胞質に自由に浮遊した状態で見出され、ヒストンタンパク質に拘束されておらず、反復配列がほとんどなく、形状が直線的ではなく円形である。これら及びその他の違いを利用して、細菌ＤＮＡを哺乳類ＤＮＡから分離することができる。
【００７７】
哺乳類細胞は、「哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ」として知られる核ＤＮＡとは別の追加のゲノムを含む。ミトコンドリアＤＮＡは、ミトコンドリア内の小さな環状の二本鎖ＤＮＡ分子で、多数のミトコンドリアタンパク質をコードする遺伝子が含まれている。ミトコンドリアＤＮＡは哺乳類の核及び細菌のＤＮＡとは異なり、細菌よりも反復配列が多いが、哺乳類の核ＤＮＡよりは少ない。各哺乳類細胞には、染色体のわずか２〜４個の完全なセットと比較して、約１００個のミトコンドリアＤＮＡ分子が含まれている。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本明細書の改善された方法で処理された混合試料では、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）で少なくとも５０％の減少がある。いくつかの実施形態において、本発明の改良された方法で処理された混合試料中の第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）では、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．９９％の減少がある。いくつかの実施形態において、本発明の改善された方法で処理された試料中のミトコンドリアＤＮＡでは９０％〜９９．９９％の減少がある。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアＤＮＡの少なくとも９０％の減少がある。いくつかの実施形態では、本発明の改善された方法で処理された試料における第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）において、９０％の減少、９０．５％の減少、９１％の減少、９１．５％の減少、９２％の減少、９２．５％の減少、９３％の減少、９３．５％の減少、９４％の減少、９４．５％の減少、９５％の減少、９５．５％の減少、９６％の減少、９６．５％の減少、９７％の減少、９７．５％の減少、９８％の減少、９８．５％の減少、９９％の減少、又は９９．５％の減少がある。
【００７９】
混合試料。
いくつかの態様において、本発明は、少なくとも２つの核酸集団の混合試料中の第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主ＤＮＡ）を富化するための改善された方法を提供する。本明細書で使用される場合、「富化」は、少なくとも２つのＤＮＡ集団を含む混合試料中における第２の集団（例、哺乳類ＤＮＡ）に対する１つのＤＮＡ集団（例、微生物ＤＮＡ）の増加を指す。本明細書で使用される場合、「混合試料」は、少なくとも２つの異なる供給源からのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、混合試料は、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）及び第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主）を含む。本明細書で使用される場合、「宿主ＤＮＡ」は哺乳類に由来するＤＮＡを指し、「非宿主ＤＮＡ」は微生物に由来するＤＮＡを指す。いくつかの実施形態において、混合試料は、哺乳類及び非哺乳類のＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、混合試料は、哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ及び微生物ＤＮＡを含む。
【００８０】
少なくとも１つの微生物ＤＮＡ集団と少なくとも１つの哺乳類ＤＮＡ集団を含む混合試料は、感染した対象から入手される。混合試料に存在する微生物種の迅速な同定は、適切な抗菌剤で感染を処置するために重要である。近年出現している抗生物質耐性菌株の数を考えると、これは細菌感染では特に重要である。存在する微生物種を同定し、適切な抗菌剤で処置することにより、感染の期間と重症度を軽減し、恐らくは死を防ぐことができる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）及び第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主）の混合試料は、ヒト及び／又は他の真核生物起源の、血液、痰、尿、粘液、唾液、組織膿瘍、創部ドレナージ、便、リンパ、洗浄液、脳脊髄液、又は流体吸引物若しくは組織抽出物から得られるか、又はそれらに由来する。いくつかの実施形態では、混合試料は微生物及び哺乳類のＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、微生物及び哺乳類のＤＮＡの混合試料は血液である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、混合試料は、１ミリリットルあたり１０〜１０８の微生物ゲノムからのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、混合試料中には１ミリリットルあたり１０〜１０３の微生物ゲノムからのＤＮＡが存在する。いくつかの実施形態において、混合試料中には１ミリリットルあたり１０３〜１０５の微生物ゲノムからのＤＮＡが存在する。いくつかの実施形態において、混合試料中には１ミリリットルあたり１０５〜１０６の微生物ゲノムからのＤＮＡが存在する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、混合試料は、ヒト対象から得られるか又はそれに由来する。
【００８４】
核酸増幅。
本発明は、核酸集団を増幅する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「増幅」は、核酸の集団を増加させるプロセスを指す。核酸集団の増幅は一般に、核酸の供給源（例、哺乳類ＤＮＡ、微生物ＤＮＡ）の同定の前に行われる。当技術分野で既知の核酸増幅技術の非限定的な例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、プライマー伸長前増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、又は転写媒介性増幅（ＴＭＡ）が含まれる。
【００８５】
前述の方法のいずれかによる１つの核酸集団の増幅には、プライマーとポリメラーゼが必要である。本明細書中で使用される場合、「プライマー」は、増幅されるべき核酸の集団における配列に相補的であるオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「相補的」は、ヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列と塩基対合できることを指す。塩基対合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグスティーン塩基対合、または当技術分野で既知の塩基対合の他の任意の方法によるものであり得る。本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」は、プライマーを伸長することにより、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸の長い伸長部を合成する酵素である。ポリメラーゼは、核酸合成のテンプレートとして既存の核酸鎖を利用し、典型的には、ワトソン・クリック塩基対合を使用して、成長する核酸鎖に付加する正しいヌクレオチドを選択するもので、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と対合し、Ａはウラシル（Ｕ）と対合し、及びシトシン（Ｃ）はグアノシン（Ｇ）と対合する。ポリメラーゼの非限定的な例には、ポリメラーゼアルファ、ポリメラーゼデルタ、及びポリメラーゼイプシロンなどの真核生物のポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、及びＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒなどの細菌のポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩなどのＲＮＡポリメラーゼ、並びに；鎖置換型ポリメラーゼが含まれる。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、「鎖置換型ポリメラーゼ」は、プライマーテンプレートを伸長するときに、ＤＮＡ二重らせんの鎖を分離する酵素をいう。いくつかの実施形態において、鎖置換ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ；Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（商標）；Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（商標）；Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）；Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）；クレノウフラグメント；ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージフラグメント；Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素；Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）；Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）；Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）；及びＳＤポリメラーゼからなる群から選択される。本明細書中で使用される場合、「ｐｈｉ２９」は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓファージｐｈｉ２９からの複製ポリメラーゼを指す。ｐｈｉ２９ポリメラーゼは、並外れた鎖置換とプロセッシブな合成特性、及び固有の３’→５’エキソヌクレアーゼ校正能を備えている。
【００８７】
いくつかの態様において、本発明は、混合試料中の核酸の１つの集団の選択的増幅のための方法を提供する。「選択的増幅」とは、別の核酸集団と比べて、ある核酸集団の方を増幅することを指す。混合試料における選択的核酸増幅の非限定的な方法には、ヌクレアーゼによるＤＮＡ試料の消化、及び核酸の１つの集団の増幅の阻害が含まれる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、混合試料における核酸の１つの集団の選択的増幅は、第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主ＤＮＡ）と比べて第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主ＤＮＡ）でより頻繁に見出される配列を利用する。いくつかの実施形態では、第１の核酸集団は、哺乳類のＤＮＡ配列を含む。これらの哺乳類のＤＮＡ配列は、核及び／又はミトコンドリアのＤＮＡ配列であり得る。いくつかの実施形態では、哺乳類ＤＮＡ配列は、哺乳類ミトコンドリアＤＮＡで見出される。いくつかの実施形態では、哺乳類ＤＮＡ配列は、哺乳類核ＤＮＡで見出される。
【００８９】
いくつかの態様において、本発明は、少なくとも２つの核酸集団を含む混合試料中において第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主）を増幅する改善された方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１の核酸集団は哺乳類ＤＮＡであり、第２の核酸集団は微生物ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、微生物ＤＮＡの増幅は、本発明の改善された方法で処理されていない試料と比較して、１０倍〜１００倍に増加している。いくつかの実施形態では、微生物ＤＮＡの増幅は、本発明の改善された方法で処理されていない試料と比較して、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、又は１００倍といった増加である。いくつかの実施形態では、微生物ＤＮＡの増幅は、本発明の改善された方法で処理されていない試料と比較して、少なくとも１０倍といった増加である。いくつかの実施形態では、微生物ＤＮＡの増幅は、本発明の改善された方法で処理されていない試料と比較して１００倍未満の増加である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、増幅は、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ；Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（商標）；Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（商標）；Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）；Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）；クレノウフラグメント；ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージフラグメント；Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素；Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）；Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）；Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（登録商標）；及びＳＤポリメラーゼを含む群から選択される鎖置換型ポリメラーゼを用いて行われる。いくつかの実施形態において、増幅は、ｐｈｉ２９ポリメラーゼによるものである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、核酸増幅は全ゲノム増幅（ＷＧＡ）である。１９９２年に始まって以来、縮重オリゴヌクレオチドプライムポリメラーゼ連鎖反応（ＤＯＰ−ＰＣＲ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、及び複数アニーリングとループベース増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）［３］を含む、ＷＧＡへの異なる斬新なアプローチが開発されてきた。ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼによるＭＤＡは、ｐｈｉ２９鎖がＤＮＡ合成中に遭遇する二本鎖ＤＮＡを置換する等温増幅を利用するため、推奨される方法となっている。
【００９２】
ｐｈｉ２９によるＷＧＡの重要な態様は、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドを使用して、すべての可能なゲノム配列を増幅することである。これは不偏ＤＮＡ増幅アプローチにとって重要であるが、ランダムヘキサマーの使用は、望ましくないヒト核酸汚染のためにヒト生物試料から単離された病原微生物ＤＮＡの試料を扱う際の負担となる。ヒトゲノムは平均的な微生物ゲノムの約１，０００倍であり、ヒト細胞よりもはるかに数が少ない病原微生物の配列決定を行う際に手ごわい課題を提示する。物理的及び化学的アプローチはヒト染色体ＤＮＡを枯渇させるのに部分的には効果的であるが、ヒトミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の汚染は除去するのがより困難であることが証明されている［４］。環状の性質と１細胞あたりのｍｔＤＮＡのコピー数が多いため、ミトコンドリアＤＮＡの汚染は、配列決定されたすべてのリードの３０％にも相当し得る。ＭＤＡ中の生物試料からのｍｔＤＮＡ増幅の防止により、臨床的に重要な病原微生物の配列決定の効率が改善される。
【００９３】
ブロッキングオリゴヌクレオチド。
いくつかの実施形態において、本発明は、第２の核酸集団と比較して第１の核酸集団でより頻繁に出現する配列を含む６〜５０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、第２の核酸集団に対する第１の核酸集団における前記配列の相対出現率は少なくとも５０である。本明細書で使用される場合、「相対出現率」とは、別の核酸集団と比べた場合の、ある配列が１つの核酸集団において出現する頻度を指す。
【００９４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはブロッキングオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「ブロッキングオリゴヌクレオチド」は、相補的ヌクレオチド配列に特異的に結合してその増幅を阻害するヌクレオチド塩基のポリマーを指す。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、アサシンブロッカーと相補的ヌクレオチド配列との間の鎖間架橋の形成により、相補的ヌクレオチド配列に結合し、その増幅を阻害するアサシンブロッカーオリゴヌクレオチドである。
【００９５】
いくつかの実施形態において、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチド配列は、第１の核酸集団に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の核酸集団は、哺乳類ＤＮＡ配列に由来する。いくつかの実施形態において、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドは、哺乳類核ＤＮＡ配列に相補的である。いくつかの実施形態において、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドは、哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ配列に相補的である。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「鎖間架橋」は、ＤＮＡ二重らせんの反対の鎖上のＤＮＡ塩基間の共有結合を指す。これらの架橋は安定しており、ＤＮＡ鎖の分離をブロックし、それにより、架橋されたヌクレオチドが切除されるまで増幅をブロックする。架橋剤の非限定的な例には、ソラレン、シスプラチン、マイトマイシンＣ、アルデヒド、亜硝酸、及び活性酸素種が含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドは、ターゲットとされるＤＮＡの集団に架橋され、それにより増幅をブロックする。いくつかの実施形態において、鎖間架橋は、ソラレン化学基を含む修飾されたヌクレオチド塩基と、ターゲットとされるＤＮＡの集団中の相補的ヌクレオチド塩基との間に形成される。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「ソラレン」とは、５’−ＡＴ配列でＤＮＡに挿入することによりＤＮＡ鎖間架橋を形成する天然化合物を指し、ソラレンはＵＶＡ照射の存在下でチミジンヌクレオチドと結合してチミジン付加物を形成する。ＤＮＡ鎖間架橋剤として、ソラレンプラスＵＶＡ（ＰＵＶＡ）療法は、乾癬やある特定のタイプの皮膚がんを含む過剰増殖性皮膚障害の処置に利用される。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、相補的ヌクレオチド配列に結合してその増幅を阻害するウイング付きブロッカーである。本明細書で使用される場合、「ウイング付きブロッカー」は、ウイング付きブロッカーの５’末端及び３’末端での結合が欠如しているために相補的ＤＮＡに結合し、その増幅をブロックするオリゴヌクレオチドである。この５’末端及び３’末端における結合の欠如により、ポリメラーゼは２つの核酸鎖を結合及び分離することができなくなり、その結果増幅がブロックされる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドはスペーサーを含む。スペーサーは、ポリメラーゼの結合を妨げるため、相補的核酸鎖の増幅をブロックする。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、又はＣ１２スペーサーを含む。アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドのスペーサーは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端からのＤＮＡ合成を妨げる。
【０１００】
いくつかの態様において、本発明は、（ａ）第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主）との比較において１キロベースあたりの第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）内でより頻繁に観察される配列に相補的である少なくとも１５の連続したヌクレオチド及び（ｂ）相補的な配列に架橋する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、哺乳類ゲノムはミトコンドリアゲノムである。いくつかの実施形態では、細菌ゲノムは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、５’修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドはソラレンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは５’修飾ヌクレオチドである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主）と比べて、１キロベースあたりの第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）内でより頻繁に観察される配列に相補的である少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主）と比べて、１キロベースあたりの第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）内でより頻繁に観察される配列に相補的である少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、または少なくとも３５の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸集団は哺乳類ＤＮＡであり、第２の核酸集団は微生物ＤＮＡである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、少なくとも２２ヌクレオチド、少なくとも２３ヌクレオチド、少なくとも２４ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも２６ヌクレオチド、少なくとも２７ヌクレオチド、少なくとも２８ヌクレオチド、少なくとも２９ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３１ヌクレオチド、少なくとも３２ヌクレオチド、少なくとも３３ヌクレオチド、少なくとも３４ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも３６ヌクレオチド、少なくとも３７ヌクレオチド、少なくとも３８ヌクレオチド、少なくとも３９ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも４１ヌクレオチド、少なくとも４２ヌクレオチド、少なくとも４３ヌクレオチド、少なくとも４４ヌクレオチド、少なくとも４５ヌクレオチド、少なくとも４６ヌクレオチド、少なくとも４７ヌクレオチド、少なくとも４８ヌクレオチド、少なくとも４９ヌクレオチド、又は少なくとも５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１５〜５０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、２０〜５０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１５〜３５のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１５〜２５のヌクレオチドを含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）でより頻繁に観察される配列に少なくとも５０％相補的である。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）でより頻繁に観察される配列に少なくとも５５％相補的である。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）でより頻繁に観察される配列に少なくとも６０％相補的である。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）でより頻繁に観察される配列に少なくとも６５％相補的である。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）でより頻繁に観察される配列に少なくとも７０％相補的である。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）でより頻繁に観察される配列に少なくとも７５％相補的である。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）でより頻繁に観察される配列に少なくとも８０％相補的である。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）でより頻繁に観察される配列に少なくとも８５％相補的である。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）でより頻繁に観察される配列に少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）でより頻繁に観察される配列に少なくとも９５％相補的である。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主核酸）でより頻繁に観察される配列に少なくとも９９％相補的である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号１６に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号１７〜配列番号３２に示される配列に相補的である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、５’末端にウイング付きブロッカーを含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’末端にウイング付きブロッカーを含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、５’末端及び３’末端にウイング付きブロッカーを含む。いくつかの実施形態において、ウイング付きブロッカーは、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主ゲノム）に相補的ではない５〜１５のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ウイング付きブロッカーは、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、又は１５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ウイング付きブロッカーは、８〜１５のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ウイング付きブロッカーは、５〜１０のヌクレオチドを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）に架橋させる鎖間架橋剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、架橋剤は光活性化される。いくつかの実施形態では、架橋剤はソラレンである。いくつかの実施形態において、第１の核酸集団は哺乳類ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、哺乳類ＤＮＡはミトコンドリアＤＮＡである。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、本発明は、第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）と第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主）の混合試料の増幅によって生成されたＤＮＡの増幅試料における第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主ＤＮＡ）の富化のための改善された方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１の核酸集団は哺乳類ＤＮＡであり、第２の核酸集団は微生物ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、哺乳類ＤＮＡの増幅は、混合試料に、混合試料中の少なくとも１つの哺乳類ＤＮＡに特異的に結合し、その哺乳類ＤＮＡの増幅を抑制する少なくとも１つのブロッキングオリゴヌクレオチドを加えることによって抑制される。いくつかの実施形態において、前記改善された方法は、哺乳類ゲノム全体にほぼ等しく分布している少なくとも２つのブロッキングオリゴヌクレオチドのセットを混合試料に加えることを含む。いくつかの実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドのセットは、２〜１０８のブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、哺乳類ＤＮＡは哺乳類ミトコンドリアＤＮＡである。
【０１０９】
いくつかの態様において、本発明は、ａ）第２の核酸集団（例、微生物、細菌、又は非宿主）との比較において１キロベースあたりの第１の核酸集団（例、哺乳類、ミトコンドリア、又は宿主）内でより頻繁に観察される配列に相補的である少なくとも１５の連続したヌクレオチド及び（ｂ）相補的な配列に架橋する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１つのブロッキングオリゴヌクレオチド及び鎖間架橋剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、２〜１０８のブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。
【０１１０】
いくつかの態様において、本発明は、組成物及び鎖置換型ポリメラーゼを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、鎖置換型ポリメラーゼはｐｈｉ２９ポリメラーゼである。
【０１１１】
医学的状態及び処置。
本発明の方法及びオリゴヌクレオチドは、病原微生物による感染を含む医学的状態の診断及び処置に使用することができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法及びオリゴヌクレオチドは、対象において感染を引き起こす病原微生物（複数可）を同定するために使用される。病原微生物（複数可）は、細菌、ウイルス、真菌、原生生物、又は酵母であり得る。本発明の方法は、混合試料における哺乳類ＤＮＡの増幅の抑制を実現させる。いくつかの実施形態において、混合試料は、対象からの臨床試料であり、必要に応じて前記臨床試料は、ヒト及び／又は他の真核生物起源の、血液、痰、血液、痰、尿、粘液、唾液、組織膿瘍、創部ドレナージ、便、リンパ、洗浄液、脳脊髄液、又は流体吸引物若しくは組織抽出物である。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法及びオリゴヌクレオチドは、以下から選択される病原微生物を同定するために使用される：Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ／ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｕｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｆｆｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｙｅｒｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎｅｕｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｐｈａ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  Ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃｅｄｅｃｅａ  ｄａｖｉｓａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆａｒｍｅｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｅｄｌａｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏａｇｕｌａｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｔａｒｄａ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｇｅｍｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ｃ１  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｇｒｏｕｐ  Ｃ２  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｇｒｏｕｐ  Ｃ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ｄ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｇｒｏｕｐ  Ｇ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｇｒｏｕｐ  Ｇ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｓｐｐ．、Ｋｏｃｕｒｉａ  ｋｒｉｓｔｉｎａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ  ａｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｉｍａｅｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉｃ、Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓ��ｉ、Ｐａｎｄｏｒａｅａ  ｓｐｐ．、Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐｐ．、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｙｅｅｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｐｅｎｎｅｒｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ  ｇｉｌａｒｄｉｉ、Ｒｏｔｈｉａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐ��ｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ、Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ  ｂｅｒｎａｒｄｉａｅ、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｔｙｒｏｓｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｏｎｆｕｓｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ  ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｕｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｓｐｐ．、Ｍｕｃｏｒｍｙｃｏｓｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、アデノウイルス、アルファウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、ボカウイルス、ブニヤウイルス、チクングニアウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス
、デング、エコーウイルス、エボラ、エンテロウイルス、エプスタイン−バールウイルス、フラビウイルス科、口蹄疫ウイルス、ハンタウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、ヒトヘルペスウイルス８、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ヒトポリオーマウイルス、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス、インフルエンザ、ラッサウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、メタニューモウイルス、モルシポックスウイルス、モルビリウイルス、ムンプス、ニパウイルス、ノロウイルス、パラインフルエンザ、パレコウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス、ポリオーマウイルス、ポックスウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、ルビウイルス、サポウイルス、トガウイルス科、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ウスツウイルス（Ｕｓｕｔｕ  ｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、及びジカウイルス。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法及びオリゴヌクレオチドは、病原微生物感染の適切な処置を選択するために使用される。いくつかの実施形態では、臨床試料は、病原微生物感染を有するか、または有する疑いのある対象から得られる。いくつかの実施形態では、感染は菌血症である。いくつかの実施形態では、適切な処置は抗生物質による処置である。抗生物質の非限定的な例としては、バンコマイシン、バクテリウム、メチシリン、セフトビプロール、セフタロリン、ダルバカンシン、ダプトマイシン、フシジン酸、リネゾリド、ムピロシン、オリタバンシン、テジゾリド（ｔｅｄｚｏｌｉｄ）、テラバンシン、テトラサイクリン、アモキシシリン、ペニシリン、ドキシサイクリン、セファレキシン、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、メトロニダゾール、アジスロマイシン、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、及びレボフロキサシンが含まれる。いくつかの実施形態では、感染はウイルス感染である。いくつかの実施形態では、適切な処置は抗ウイルス剤である。抗ウイルス剤の非限定的な例には、アバカビル、アシクロビル、バラビル、シドフォビル、ダルナビル、エンテカビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、オステラミビル、ペンシクロビル、及びザルシタビンが含まれる。いくつかの実施形態では、感染は真菌感染である。いくつかの実施形態では、適切な処置は抗真菌剤である。抗真菌剤の非限定的な例には、アンフォテリシンＢ、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン、ナイスタチン、リモシジン、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール（ｉｓｏｃｏｎｚａｏｌｅ）、及びアニデュラファンギンが含まれる。
【実施例】
【０１１５】
以下の実施例により、本発明のある特定の実施形態を実証する。しかしながら、これらの実施例は、例示目的のみのためであり、本発明の条件及び範囲に関して完全に決定的であることを意図するものではなく、またそのように解釈されるべきではないことを理解されたい。実施例は、他に詳細に記載されている場合を除いて、当業者に周知で常用的でもある標準的な技術を使用して実施された。
【０１１６】
実施例１
アサシンブロッカーＤＮＡオリゴヌクレオチド配列の設計。
哺乳類ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子の第１の集団の増幅を抑制するために、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドは、微生物ＤＮＡ集団よりも哺乳類ＤＮＡ集団でより頻繁に出現するＤＮＡ配列に相補的になるように設計された。選択された哺乳類配列は、第１の集団にユニークなものであり、増幅されるべき第２のＤＮＡ集団との重複は最小限であった。
【０１１７】
ヒトのミトコンドリアゲノムは小さく（約１６．６  ｋｂ）、ヒト核ゲノムと細菌ゲノムの両方からのユニークなプラス鎖とマイナス鎖に分布した配列を含む。アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドの配列は、細菌、真菌、及びウイルスのゲノムと比較して、ミトコンドリアゲノムでは１キロベース（ｋｂ）あたりの頻度が高い配列に相補的になるように設計された。細菌、真菌、及びウイルスのゲノムの非限定的な例には、以下が含まれる：Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ／ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｕｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｓｉｎｇｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｆｆｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｙｅｒｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎｅｕｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｒｉｎａｅ、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｐｈａ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  Ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃｅｄｅｃｅａ  ｄａｖｉｓａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆａｒｍｅｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｅｄｌａｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔ���ｔａｎｉ、Ｃｏａｇｕｌａｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｔａｒｄａ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｇｅｍｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ｃ１  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｇｒｏｕｐ  Ｃ２  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｇｒｏｕｐ  Ｃ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ｄ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｇｒｏｕｐ  Ｇ  ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｇｒｏｕｐ  Ｇ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｓｐｐ．、Ｋｏｃｕｒｉａ  ｋｒｉｓｔｉｎａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ  ａｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｉｍａｅｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐ��ａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉｃ、Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、Ｐａｎｄｏｒａｅａ  ｓｐｐ．、Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐｐ．、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｙｅｅｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｐｅｎｎｅｒｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ  ｇｉｌａｒｄｉｉ、Ｒｏｔｈｉａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ���ｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ、Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ  ｂｅｒｎａｒｄｉａｅ、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｔｙｒｏｓｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｏｎｆｕｓｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ  ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｕｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｓｐｐ．、Ｍｕｃｏｒｍｙｃｏｓｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ、
Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、アデノウイルス、アルファウイルス、アルボウイルス、アストロウイルス、ボカウイルス、ブニヤウイルス、チクングニアウイルス、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、デング、エコーウイルス、エボラ、エンテロウイルス、エプスタイン−バールウイルス、フラビウイルス科、口蹄疫ウイルス、ハンタウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、ヒトヘルペスウイルス８、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ヒトポリオーマウイルス、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス、インフルエンザ、ラッサウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、メタニューモウイルス、モルシポックスウイルス、モルビリウイルス、ムンプス、ニパウイルス、ノロウイルス、パラインフルエンザ、パレコウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス、ポリオーマウイルス、ポックスウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、ルビウイルス、サポウイルス、トガウイルス科、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ウスツウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、及びジカウイルス。配列は、ミトコンドリアゲノムのプラス鎖とマイナス鎖の両方から１〜２キロベースごとに選択された。複数のアサシンブロッカーオリゴヌクレオチドを利用して、ミトコンドリアゲノム全体にほぼ均等に分布している配列に相補的であるようにすると、ヒトミトコンドリアＤＮＡ増幅をブロックする効果を最大限にすることもできる。また、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチド配列は、架橋を容易にするために、３’末端のＴＡＴＡまたはＡＴＡＴで終結していた（下記の実施例２を参照）。
【０１１８】
ヒトミトコンドリア配列の相対出現率の計算
増幅に対しブロックされるべきヒトミトコンドリアＤＮＡ配列への結合に関する所定のオリゴヌクレオチドの優先度は、微生物ゲノム（第２の集団）と比較したミトコンドリアゲノム（第１の集団）内の相補配列の相対出現率によって定量され得る。この計算では、ＴＡＴＡまたはＡＴＡＴで終結する２３ヌクレオチド塩基（２３マー）を含むヒトミトコンドリアゲノム内のすべての可能なオリゴヌクレオチドが分析される。２３マーの３’末端にある最後の８ヌクレオチド（８マー）が分析で使用される。２３ヌクレオチド配列は、微生物ＤＮＡゲノムと比較した場合、哺乳類ミトコンドリアＤＮＡゲノムにユニークなものである。哺乳類ミトコンドリアＤＮＡゲノムと比較して、微生物ＤＮＡゲノムでは８ヌクレオチド配列の頻度は低くなっている。所定のブロッキングオリゴヌクレオチドについてのヒトミトコンドリア配列の優先度または相対出現率は、次の式を使用して計算される：
相対出現率＝［（ヒトミトコンドリアゲノムに８マーが出現する回数）／（ヒトミトコンドリアゲノムの長さ）］／［（参照細菌ゲノムに８マーが出現する回数）／（参照細菌ゲノムの長さ）］
【０１１９】
この実施例では、特定のゲノムはヒトミトコンドリアＤＮＡ（第１の集団）であった。相対出現率を最高値から最低値に並べ替え、ヒトミトコンドリアの相対出現率の値が２より大きいユニークなオリゴヌクレオチド配列を選択した。ヒトミトコンドリアゲノムにおいて２キロベースごとに分布する配列に相補的であったオリゴヌクレオチド配列のセットを、さらなる試験に利用した。代表的なアサシンブロッカーオリゴヌクレオチド配列を表１に列挙する。
【表１】
2021500077.tif 000003
【化１】
2021500077.tif 000004
【０１２０】
実施例２
アサシンブロッカーの相補配列への架橋
第１のＤＮＡ集団の増幅は、実施例１で設計されたアサシンブロッカーオリゴヌクレオチドを、ヒトミトコンドリアＤＮＡの第１の集団におけるその相補配列に架橋させることによってブロックすることができる。この架橋は、ｐｈｉ２９などの鎖置換型ポリメラーゼによる配列の全ゲノム増幅をブロックする（図２）。
【０１２１】
３’アミノ基が修飾された凍結乾燥アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドを、実施例１の要領で設計し、購入した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイオワ州コーラルビル）。凍結乾燥オリゴヌクレオチドをリン酸緩衝食塩水（１Ｘ  ＰＢＳ）に再懸濁し、ＮＨＳ−ＳＰＢ（スクシンイミジル−［４−（ソラレン−８−イルオキシ）］−ブチレート、「ソラレン」）分子（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）とコンジュゲートした。コンジュゲーション反応をＴｒｉｓ−ＨＣｌでクエンチし、過剰のソラレンを脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）で除去した。コンジュゲートしたソラレン基を、ＵＶＡ処理によって活性化し、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドと相補的ヒトミトコンドリアＤＮＡ配列との間に鎖間架橋を作成する。
【０１２２】
実施例３
ターゲットＤＮＡへのアサシンブロッカーの配列特異的共有結合架橋形成の実証
ターゲットＤＮＡへのアサシンブロッカーオリゴヌクレオチドの配列特異的共有結合による架橋形成を実証するために、ソラレンが３’末端にコンジュゲートした様々なアサシンブロッカーオリゴヌクレオチド、ターゲットオリゴヌクレオチド、及びオフターゲットオリゴヌクレオチドの反応混合物を、０．５  μＭでの４０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ  ７．９）、５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２から成るアニーリング緩衝液に添加した。反応混合物を９４℃に５分間加熱し、１５分かけて１６℃に冷却した。次に、反応混合物を３５０  ｎｍの紫外（ＵＶ）光で２０分間処理した。反応混合物の生成物を、１Ｘ  ＴＢＥ緩衝液中の１０％Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）−尿素ゲルで分離した。ゲルをＳＹＢＲ−ゴールド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）で染色し、Ｅ−ｇｅｌ  Ｉｍａｇｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）で可視化した。（図３）。
【０１２３】
ヒトミトコンドリアＤＮＡの減少を、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の微生物ＤＮＡとともにヒト核及びミトコンドリアＤＮＡを含む混合試料から実証した（図５）。混合試料中の細胞を、ＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）により記載された要領で、アルカリ溶解緩衝液で溶解し、次いで６５℃に加熱した。ヒトミトコンドリアＤＮＡをターゲットとするアサシンブロッカーオリゴヌクレオチド１μＬを、１μＭ濃度で添加したもの（アサシンブロッカー＋）、又はＴＢＥ緩衝液（アサシンブロッカー−）を溶解した試料に添加し、３５０  ｎｍのＵＶ光で２０分間処理した。ＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）により記載された要領で試料を増幅し、ＭｉｎＩＯＮシーケンシング（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オックスフォード、イギリス）で配列決定した。アサシンブロッカー＋試料とアサシンブロッカー−試料の両方からのリードを、ヒトミトコンドリアＤＮＡにマッピングし、ヒトミトコンドリアのリードの深度をグラフで表示する。
【０１２４】
図５に示すように、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドでの処理により、ヒト核、ヒトミトコンドリア、及びＥ．ｃｏｌｉの核酸を含む混合試料からのヒトミトコンドリアゲノム全体にわたる配列決定リードの有意な減少がもたらされる。
【０１２５】
実施例４
アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドはヒトミトコンドリアＤＮＡ増幅を減少させる
アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドの使用による、ヒト核酸集団及び細菌核酸集団を含む混合試料におけるヒトミトコンドリアＤＮＡ増幅の減少を調べた。ヒト対象からの臨床血液試料（ｎ＝４）に、１００コロニー形成単位／ミリリットル（１００  ＣＦＵ／ｍＬ）または１０  ＣＦＵ／ｍＬで細菌（例、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、又はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）をスパイクした。ＵＶ光で活性化された場合のアサシンブロッキング（Ａｓｓａｓｓｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）オリゴヌクレオチドの使用により、ＵＶ光で架橋形成されていない対照試料と比較して、全リードのパーセンテージとして配列決定されたヒトミトコンドリアＤＮＡの９０％を超える減少がもたらされた（図４）。アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドが相補的ヒトミトコンドリア配列に架橋されている場合のヒトミトコンドリアＤＮＡ増幅の減少率は、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチドが架橋されていない対照試料と比較すると９０％を超えていた。
【０１２６】
実施例５
ウイング付きブロッカーＤＮＡオリゴヌクレオチドの製造方法
以下の工程を使用して、増幅が望ましくない種のゲノム全体をブロックするウイング付きブロッカーオリゴヌクレオチドを生成した。ここに例を示す（図６）：
１．）４マーの切断活性が異なる２つの制限酵素（例、ＭｓｐＩとＭｓｅＩ）を使用して、富化された宿主（例、哺乳類ミトコンドリア）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を消化する。
２．）１００  ｂｐ未満の消化されたｇＤＮＡフラグメントを除去する。
３．）制限酵素によって作製された平滑オーバーハングを補完するように設計されたウイング付きブロッカーオリゴヌクレオチドを、リガーゼを使用して前記消化されたｇＤＮＡフラグメントにライゲーションする。
４．）フォワードプライマーの５’末端がリン酸化されており、リバースプライマーの５’末端がビオチン化されている（またはラムダエキソヌクレアーゼ消化を防ぐために別のバルク修飾が含まれている）特注設計プライマーを使用して、プライマーがライゲーションした宿主ｇＤＮＡをＰＣＲ増幅する。
５．）プライマーに適合した宿主ＤＮＡを消化し、ラムダエキソヌクレアーゼを使用して５’リン酸化鎖を分解する。
【０１２７】
これにより、５’末端と３’末端の両方に２０〜５０塩基対の「ウイング」（宿主ｇＤＮＡと非相補的な領域）が隣接する宿主ｇＤＮＡの一部を含む一本鎖ブロッカーのライブラリーができる。これらのブロッカーは宿主ゲノム全体に広がる。
【０１２８】
宿主ゲノムは、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール沈殿を利用して宿主細胞から精製されたが、当技術分野で知られている任意の方法を利用することができる。理想的には、ＤＮＡは、高分子量の染色体フラグメントを保持し、５，０００塩基対より小さいＤＮＡフラグメントを生じる過剰な剪断を回避する方法で抽出される。次に、ＭｓｐＩ（Ｒ０１０６Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）及びＭｓｅＩ（Ｒ０５２５Ｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）による二重制限酵素消化を使用して、ＤＮＡを消化する。例えば、０．５μｇのゲノムＤＮＡを、５μＬの１０×最適化緩衝液と３８．５μＬのＤＮＡ不含有及びヌクレアーゼ不含有の水と混合する。この混合物に、０．５μＬのＭｓｐＩと１μＬのＭｓｅＩといった制限酵素を加え、ピペッティングして混合する。３７℃で５〜１５分間インキュベートした後、サイズ排除スピンカラムを使用して、前記制限酵素と生じた２０塩基対未満の長さのフラグメントを、消化されたゲノムＤＮＡから除去する。フィルターベースのカラムについては、消化されたＤＮＡ産物を大幅に失うことになるため、使用するべきではない。
【０１２９】
個別に、ＧＣ末端アダプターとＡＴ末端アダプターは、等体積の短いプライマーと長いプライマーを１００μＭの濃度で混合し、室温で１０分間インキュベートすることによって作製される。０．０２  ｐｍｏｌでの１μＬの消化されたＤＮＡを、０．５  ｐｍｏｌでの１μＬのＧＣ末端アダプター、０．５  ｐｍｏｌでの１μＬのＡＴ末端アダプター、２μＬの水、及び５μＬの５の２ｘＩｎｓｔａｎｔ  Ｓｔｉｃｋｙ−ｅｎｄ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｍ０３７０、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）と混合する。ピペッティングで１０回混合した後、末端適合させた断片化ゲノムＤＮＡを氷上に置き、サイズ排除スピンカラムで再度浄化する。ダブルウイング付きの生成物が所望される場合は、次いで浄化した生成物に対し、Ｐ１及びＰ２プライマーを使用して、６６℃のアニーリング温度で３０〜３５サイクル、ＰＣＲ増幅を行い、取り込まれていないプライマーをサイズ排除スピンカラムで除去する。シングルウイング付きの生成物が所望される場合、浄化した生成物に対し、Ｐ１プライマーと組み合わせて、酵素開裂されたフラグメント内にあると計算上で決定された特定の配列に結合する特別設計された、好ましくはＰＣＲ産物の長さを最大限にするように設計されたプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅を行う。
【化２】
2021500077.tif 000005
【０１３０】
これらのアダプター配列には、それらのｈ形状以外に特別なものはないことに注意することは重要である。当業者であれば、本明細書に記載されるものと類似した、任意のｈ形状アダプター配列でも、本発明の方法によって使用され得ることを認識するはずである。
【化３】
2021500077.tif 000006
【０１３１】
生成された二本鎖ＰＣＲ産物は、次いで一本鎖産物に変換されなければならない。一本鎖産物は、大きな比率を占める相補的なＤＮＡ鎖に結合するブロッカーである。二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの変換は、所望の鎖を選択的に増幅する非対称ＰＣＲ、不要な鎖のラムダエキソヌクレアーゼ消化、鎖のストレプトアビジンビーズ分離、及びインビトロ転写など、限定されるわけではないが、いくつかのプロセスを使用して達成され得る（Ｍｕｒｇｈａら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１４）。ここでは、最初の３つの方法について説明する。
【０１３２】
Ａ）非対称ＰＣＲを使用する場合の増幅プライマー配列
非対称ＰＣＲでは、一本鎖の増幅を促進するために、等しくない濃度のプライマーを使用する。この実施例の工程４で説明したＰＣＲ反応では、図６の工程４に示すようにＰ１及びＰ２プライマーを使用してブロッカーが増幅されるが、この反応を、Ｐ１：Ｐ２プライマー投入の比率が１：１０から１：５０になるように変更する。非特異的な増幅を回避するために、ＰＣＲサイクルの数を１５〜２０サイクルに減らさなければならない。結果として得られる非対称ＰＣＲ産物を、長さが２０塩基対未満のフラグメントを排除する同じサイズ排除スピンカラムを使用して精製する。
【０１３３】
Ｂ）ラムダエキソヌクレアーゼ消化を使用する場合の増幅プライマー配列
代替アプローチでは、ラムダエキソヌクレアーゼ酵素を使用して、不要なＤＮＡ鎖を優先的に分解する。ラムダエキソヌクレアーゼは、５’リン酸化二本鎖ＤＮＡの好ましい基質を有し、５’から３’の方向で作用する。その高い処理能力により、ＤＮＡフラグメント内で鎖全体が確実に分解される。ラムダエキソヌクレアーゼ消化に適した二本鎖ＤＮＡを調製するには、Ｐ１増幅プライマーを５’リン酸基で修飾しなければならず、これは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（アイオワ州コーラルビル）などの商業的製造業者から入手され得る。次いで、５’−リン酸化Ｐ１増幅プライマーを、非リン酸化Ｐ２増幅プライマーと組み合わせて記載されているＰＣＲ反応で使用する。３０〜３５サイクルの増幅とサイズベースのカラム精製の後、３μＬの精製産物を、０．５μＬのラムダエキソヌクレアーゼ（Ｍ０２６２、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）、１μＬの１０×エキソヌクレアーゼＩ緩衝液、及び５．５μＬのＤＮＡ及びヌクレアーゼ不含有の水と３７℃で６０分間インキュベートする。前記生成物はサイズ排除カラム（例、ＣｅｎｔｒｉＳｐｉｎ  ２０、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ウフリーホールド）で浄化され、この直後にウイング付きブロッカープローブとして使用することができる。
【０１３４】
Ｃ）ストレプトアビジンビーズ分離を使用する場合の増幅プライマー配列
次の工程では、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ（例、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、所望のブロッカーをその相補鎖から分離する。ストレプトアビジンビーズ分離に適した二本鎖ＤＮＡを調製するには、Ｐ１増幅プライマーを５’ビオチン基で修飾しなければならず、これは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（アイオワ州コーラルビル）などの商業的製造業者から入手され得る。次いで、５’−ビオチン化Ｐ１増幅プライマーを、図６、工程４に示し、実施例５、工程４に示すＰＣＲ反応で、非ビオチン化Ｐ２増幅プライマーと組み合わせて使用し、その後３０〜３５サイクルの増幅及びサイズベースのカラム精製を行う。磁気ビーズを、製造業者の指示に従って洗浄し、次いでＰＣＲ増幅産物を、洗浄されたビーズとともに、緩やかに攪拌しながら室温で１５〜３０分間インキュベートする。次いで、ビーズ−ＤＮＡの混合物を２〜３分間マグネット中に入れ、上清を捨て、ビーズを洗浄緩衝液で３〜４回洗浄する。次いで、５０μＬのビーズ−ＤＮＡ混合物と４０μＬの０．１２５  Ｍ水酸化ナトリウムを室温で２分間、２回連続してインキュベートすることにより、所望のブロッカー鎖を、磁気ビーズに結合している相補鎖から変性させる（Ｍｕｒｇｈａら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１４）。洗浄液の上清（合計約８０μＬ）を合わせ、１２μＬの１  Ｍ  ＨＣｌと８μＬの１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８で中和する。生成物をサイズ排除カラム（例、ＣｅｎｔｒｉＳｐｉｎ  ２０、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ニュージャージー州フリーホールド）で浄化し、この直後にブロッカープローブとして使用し得る。
【０１３５】
実施例６
Ｈアダプターを使用して一本鎖ウイング付きブロッカーを作成する方法
ここでは、ヒトゲノムＤＮＡからのポリメラーゼによる伸長をブロックするためのウイングを有する一本鎖ブロッカーを作製する方法について記載する。まず、ヒトＤＮＡの確定的フラグメントは、オーバーハングを伴う異なるパリンドローム部位を消化する２つの制限酵素で、ヒト細胞から抽出したＤＮＡを消化することによって生成される。前記部位を、本明細書では「部位Ａ」及び「部位Ｂ」と称す。次いで、「ｈアダプター」及びＤＮＡリガーゼとインキュベートする。２つのｈアダプターＡとＢがあり、それぞれ部位Ａと部位Ｂにマッチしている。ｈ−アダプターはそれぞれ、例えば６〜３０ヌクレオチドを含む一対の相補的オリゴヌクレオチドを含む。前記対の一方の鎖は、他方の鎖より長い。Ａ  ｈアダプターはＡ制限部位にライゲーションし、Ｂ  ｈアダプターはＢアダプターにライゲーションする。次いで、長いＡアダプター鎖に相補的な１つのＰＣＲプライマー（プライマーＡ）と、Ｂアダプター鎖と同じ配向の１つのプライマー（プライマーＢ）を使用して、混合物を増幅する。各制限部位の１つを含むフラグメントのみが増幅され得る。増幅後、各二本鎖アンプリコンは、いずれの場合にも５’末端に、正確にプライマーＡを含む１本の鎖とプライマーＢを含む１本の鎖を有する。これらを使用して、いずれか一方の鎖を優先的にプルダウンまたは破壊し、一本鎖ＤＮＡを残すことができる。例えば、プライマーＡに５’リン酸基を付加し、アンプリコンを、リン酸化ＤＮＡを破壊する酵素で消化し得る。このプロセスは、図６に概略的に示されている。別法として、制限消化を１つだけ実行すると、両端のみに基づいて２つの鎖を区別不可能にする対称性を持つフラグメントが生じることになる。同様に、二重消化を行うが、次いで完全二本鎖アダプターでライゲーションした場合、得られるフラグメントは区別できるが、ＰＣＲは３つすべての組み合わせの増幅を生じさせることになる（図６を参照）。
【０１３６】
実施例７
ウイング付きブロッカーを使用して大きな比率を占める集団の核酸の増幅を防ぐ方法
以下の工程を使用して、ウイング付きブロッカーを適用し、大きな比率を占める集団のゲノム核酸の増幅を妨げたが、これは、ＤＮＡブロッカーの場合について例示されている（図７）。
１．占める比率の大きい集団及び占める比率の小さい集団からのゲノムＤＮＡの混合物を、１，０００〜１５，０００塩基対のフラグメントに断片化する。
２．断片化されたｇＤＮＡを、実施例５で製造された大きな比率を占める集団のＤＮＡブロッカーと、室温から７０℃までで５分間から一晩までインキュベートする。
３．断片化したｇＤＮＡ、ランダムヘキサマープライマー、及び長いアンプリコン用に最適化された高忠実度ポリメラーゼ（例、ＬｏｎｇＡｍｐ  Ｔａｑ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を用いてＰＣＲ増幅を実行する。
【０１３７】
ＰＣＲ反応は、非鎖置換型ポリメラーゼで実行され得る。例えば、２５μＬの反応体積でＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｍ０５３０、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用する場合、マスター・ミックスには、５μＬの５×  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）、１０ｍＭで０．５μＬのｄＮＴＰ、０．７５μＬのＤＭＳＯ、及び０．２５μＬのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）が含まれる。６．５μＬのＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（マスター・ミックス）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を、混合ゲノムＤＮＡ溶液及び一本鎖ブロッカーと組み合わせることができる。例えば、図８は、６．５μＬのマスター・ミックス、１μＬの１  ｎｇ／μＬでのＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ（約２００，０００のＥ．ｃｏｌｉゲノムコピーに相当）、１μＬの０．０５  ｎｇ／μＬでのＭ１３ｍｐ１８  ＲＦ  ＩバクテリオファージＤＮＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）（約６５０万ゲノムコピーに相当）を、細菌性１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列に特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにＭ１３バクテリオファージゲノムに特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーの存在下／非存在下で組み合わせることにより生成された。実施例５によって生成された一本鎖Ｍ１３バクテリオファージブロッカーを用いて、反応体積を２５μＬまでひき上げた。わずかに変更されたＰＣＲ増幅手順を使用して、混合物に対しＰＣＲ増幅を行った。最初の改変として、Ｍ１３バクテリオファージブロッカー濃度が目的の遺伝子領域の指数関数的増幅後でも適切なブロッキングをもたらすのに十分であることを確実にするために実行されたのはわずか２０サイクルの増幅であった。２つ目の改変としては、伸長温度を６８℃に下げて、ポリメラーゼの処理能力を損なうことなくブロッカーアンプリコンハイブリダイゼーションの熱力学的安定性を最適化することであった。ＰＣＲプログラムは、９８℃で３０秒間の初回変性、続いて９８℃で１０秒間の変性２０サイクル、６５℃で２０秒間のアニーリング、６８℃で３０秒間の伸長、そして  ７２℃で１０分間の最終伸長を使用した。次いで、生成物を１．２％アガロースゲルで泳動し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量した。
【０１３８】
実施例８
ウイング付きブロッカーの適用によるＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡの存在下におけるＭ１３ファージＤＮＡの抑制
概念実証実験では、Ｍ１３ファージに対する本発明者らの製造したブロッカーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡの存在下でＭ１３ファージＤＮＡゲノムのセグメントの増幅をブロックした（図８）。この場合のブロッキングプローブは、例５に記載されているプロセスを使用して作製された（図６及び図７も参照）が、ただしこれらのブロッカーは、例５に記載されているダブルウイングではなく、３’末端にはシングルウイングしか有していない。この実験は、シングルウイングブロッカーが、過剰なＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡの存在下でＭ１３アンプリコンの増幅を減少させることができることを示しており、これは、無傷のままである細菌性１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子バンドの場合と比べてＭ１３バンドの輝度が減少していることにより実証された。Ｅ．ｃｏｌｉ及びＭ１３ファージＤＮＡはすべてのウェルに含まれていた。バンドの各領域の蛍光強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。
【０１３９】
Ｍ１３バンド及び１６Ｓバンドの蛍光強度プロファイルを図９に示す。Ｍ１３バンドを、Ｍ１３プライマープラス及びマイナスブロッカーで定量し、Ｍ１３と１６Ｓの両プライマープラス及びマイナスブロッカーが含まれる反応と比較した（ブロッカーは、ユニバーサル増幅プライマーＰ１とＭ１３特異的リバースプライマー３８７Ｒを使用してシングルウイングで製造された）。ゲル全体の平均バックグラウンド蛍光強度を差し引いて、各バンドについての補正平均強度を計算した。Ｍ１３ブロッカーの存在下におけるＭ１３アンプリコン増幅の減少は４２〜６８％であり、Ｅ．ｃｏｌｉアンプリコン増幅の存在下では、おそらくＰＣＲリソースについての競合が原因で効率が低下していた。Ｍ１３ブロッカーの存在下におけるＥ．ｃｏｌｉアンプリコン増幅の減少は１３％であり（図９）、これもまた、ＰＣＲリソースについての競合による可能性がある。
【０１４０】
実施例９
混合微生物ＤＮＡ試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを富化するためのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓに対するアサシンブロッカー又はウイング付きブロッカーの設計。
雌性の生殖管試料は、多くの場合主にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、最も頻繁にはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓで構成されており、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、ＨＳＶ−２、又はＨＩＶなどの生殖器病原体は、通常、自然な状態の膣細菌叢よりもはるかに少ない量で見出される。病原体の同定と特性付けの目的で、膣スワブなどの生殖器標本からの病原体のゲノムの配列決定に興味がある場合、アサシンブロッカーまたはウイング付きブロッカーの使用による乳酸菌、例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓの増幅を選択的に抑制することにより、病原体のゲノムの配列決定結果の感度を高めることができる。
【０１４１】
表２は、ユニークな２３マーであり、目的の潜在的な感染性生物であるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓと比較した場合、８マーとしてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓでより頻度も高いアサシンブロッカーを示す。表２には、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓゲノムの最初の２０  ｋｂについてのアサシンブロッカーオリゴヌクレオチドが列挙されているが、アサシンブロッカーオリゴヌクレオチド配列も、２，０００，０００塩基対ゲノムの残りについて同定されることになる。これらのアサシンブロッカーは、実施例２及び実施例３で詳述されているように、膣スワブなどの生殖器標本から抽出されたＤＮＡに適用されて、主要な生物であるＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓの増幅を抑制し、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓゲノムのより深い配列決定を可能にする。Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓに対してアサシンブロッカーを使用すると、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓからＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓへの配列決定リードの比率が１：１０００から１：１０、さらには１：１に増加し、その結果、標準的な次世代配列決定方法でのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓゲノムの優れたカバレッジを可能にする（例、１試料あたり１００万リード、及び１５０塩基対、ペアードエンドリード）。
【表２−１】
2021500077.tif 000007
【表２−２】
2021500077.tif 000008
【０１４２】
ウイング付きブロッカーを、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓに対して製造することもできる。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓの精製培養物を溶解し、ゲノムＤＮＡを単離して浄化し、このゲノムＤＮＡを使用して、実施例５で詳述するプロセスを用いることによりＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ  ウイング付きブロッカーを製造する。次いで、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ  ウイング付きブロッカーを、実施例７で詳述されているように、膣スワブなどの生殖器標本から抽出したＤＮＡに適用して、主要な生物であるＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓの増幅を抑制し、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓゲノムのより深い配列決定を可能にする。
【０１４３】
本発明のいくつかの実施形態を例として記載したが、本発明の精神から逸脱せず、または特許請求の範囲を超えることなく、本発明に対し多くの修正、変形、及び調節を加え、並びに当業者の技能の範囲内にある多数の均等物または代替解決策を使用して本発明を実現できることは明らかである。
【０１４４】
すべての出版物、特許、及び特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願のそれぞれが、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０１４５】
参考文献
【化４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2021500077.tif 000014
【図６】
2021500077.tif 000015
【図７】
2021500077.tif 000016
【図８】
2021500077.tif 000017
【図９】
2021500077.tif 000018
【図１０】
2021500077.tif 000019
【配列表】
2021500077000001.app
【国際調査報告】
2021500077.tif 000020
2021500077.tif 000021
2021500077.tif 000022
2021500077.tif 000023