(57)【要約】組み換えＥ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼの製造方法が、本願明細書中で提供される。本願明細書中の方法は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞中で高いレベルで、商業的に入手可能なアスパラギナーゼ調製物と比較可能な活性を有するアスパラギナーゼの製造を可能にする。
2021500892.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養培地中でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞を培養すること、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞のペリプラズム中で組み換えＩＩ型アスパラギナーゼをコードする核酸を含む発現構築物から組み換えＩＩ型アスパラギナーゼを発現させることを含み、ここで、該組み換えＩＩ型アスパラギナーゼが該ペリプラズム中で約３１％から約６０％ＴＣＰ可溶性ＩＩ型アスパラギナーゼの収量で製造される、組み換えＩＩ型アスパラギナーゼを製造する方法。
【請求項２】
可溶性組み換えＩＩ型アスパラギナーゼがペリプラズム中で約１０ｇ／Ｌから約３８ｇ／Ｌの収量で製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの量の活性を活性アッセイを使用して測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
組み換えＩＩ型アスパラギナーゼをコードする核酸が宿主細胞中での発現のために最適化される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
組み換えＩＩ型アスパラギナーゼがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組み換えＩＩ型アスパラギナーゼをコードする核酸が配列番号１または３と少なくとも８５％相同な配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
組み換えＩＩ型アスパラギナーゼが配列番号２と少なくとも８５％相同なアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞が１以上の天然アスパラギナーゼの発現を欠損している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
１以上の発現欠損した天然アスパラギナーゼがＩ型アスパラギナーゼ；ＩＩ型アスパラギナーゼ；およびその組み合わせから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞が１以上のプロテアーゼの発現を欠損している、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞が１以上のフォールディングモジュレーターを過剰発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が、
ａ）ＬｅｐＢを過剰発現する宿主細胞；
ｂ）Ｔｉｇを過剰発現する宿主細胞；
ｃ）ＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐを過剰発現する宿主細胞；
ｄ）Ｌｏｎ、ＨｓｌＵＶ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ、ＡｐｒＡ、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１、またはＡｐｒＡを欠損している宿主細胞；
ｅ）ＡｓｐＧ１を欠損している宿主細胞；
ｆ）ＡｓｐＧ２を欠損している宿主細胞；
ｇ）フォールディングモジュレーターを過剰発現せず、かつ、プロテアーゼを欠損していない宿主細胞；
ｈ）フォールディングモジュレーターを過剰発現せず、プロテアーゼを欠損せず、かつ、ＡｓｐＧ１を欠損していない宿主細胞；
ｉ）フォールディングモジュレーターを過剰発現せず、プロテアーゼを欠損せず、かつ、ＡｓｐＧ２を欠損していない宿主細胞；および
ｊ）フォールディングモジュレーターを過剰発現せず、プロテアーゼを欠損せず、かつ、ＡｓｐＧ１またはＡｓｐＧ２を欠損していない宿主細胞
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞が、
ａ）ＬｏｎおよびＨｓｌＵＶを欠損している宿主細胞；
ｂ）Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ、およびＡｐｒＡを欠損している宿主細胞；
ｃ）Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１、およびＡｐｒＡを欠損し、かつ、ＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐを過剰発現する宿主細胞；
ｄ）ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２を欠損している宿主細胞；
ｅ）ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２を欠損し、かつ、Ｔｉｇを過剰発現する宿主細胞；
ｆ）ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２を欠損し、かつ、ＬｅｐＢを過剰発現する宿主細胞；
ｇ）ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２を欠損し、かつ、ＬｏｎおよびＨｓｌＵＶを欠損している宿主細胞
ｈ）ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２を欠損し、かつ、Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ、およびＡｐｒＡを欠損している宿主細胞；および
ｉ）ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ１、およびＡｐｒＡを欠損し、かつ、ＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐを過剰発現する宿主細胞
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
発現構築物が分泌リーダーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
分泌リーダーが、製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの宿主細胞のペリプラズムへの転移を誘導する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
分泌リーダーが、ＡｎｓＢ、８４８４、ＩＢＰ−Ｓ３１Ａ、ｐｂｐ、８５８４、ＬＡＯ、Ａｚｕ、ＰｂｐＡ２０Ｖ、ＣｕｐＣ２、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＡｎｓＢ分泌リーダーを含む群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの測定された活性を対照ＩＩ型アスパラギナーゼの同じ量における測定された活性と同じ活性アッセイを使用して比較することをさらに含み、ここで製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの測定された活性は対照ＩＩ型アスパラギナーゼの活性と比較可能である、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
製造された組み換えＩＩ型アスパラギナーゼは、患者における半減期を増加させるように修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
発現構築物から発現される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼが、組み換えＥ．ｃｏｌｉ  ＩＩ型アスパラギナーゼであり、核酸が、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＡｎｓＢ分泌リーダーに作動可能に連結された組み換えＥ．ｃｏｌｉ  ＩＩ型アスパラギナーゼをコードし、組み換えＥ．ｃｏｌｉ  ＩＩ型アスパラギナーゼが、同じ方法によりペリプラズム中で製造される組み換えＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＩＩ型アスパラギナーゼのものより約２０％から約１００％大きい収量でペリプラズム中で製造され、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＩＩ型アスパラギナーゼが、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＡｎｓＢ分泌リーダーに作動可能に連結された組み換えＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＩＩ型アスパラギナーゼをコードする核酸を含む第２の発現構築物から発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
第２の発現構築物が、配列番号５５として記載されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、参照により本願明細書中に組み込まれる２０１７年１０月２７日に提出された米国仮出願番号６２／５７８，３０２の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１８年１０月１６日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーの名前は３８１９４−７５１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔで、サイズは５４，８４６バイトである。
【背景技術】
【０００３】
本願の背景
Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｌ−アスパラギンのＬ−アスパラギン酸への変換を触媒する。細菌Ｅ．ｃｏｌｉからのＬ−アスパラギナーゼＩＩ型は、開裂可能な分泌シグナル配列で製造される四量体高親和性ペリプラズム酵素である。それはＬ−アスパラギンアミドヒドロラーゼとしても知られ、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する患者の処置に適応された商業的に承認された医薬品中の有効成分である。例えば、米国においてＡＬＬ処置のために承認されるＥｌｓｐａｒ（登録商標）は、有効成分Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型を有する。Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）は、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）に共有結合したＬ−アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギンアミドヒドロラーゼ）を含有する。Ｏｎｃａｓｐａｒは、ファーストラインＡＬＬ並びに天然Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼに対するＡＬＬおよび過敏症の処置について、米国において承認される。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型は、他の腫瘍性状態の処置にも使用される。Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉの培養物から精製されて、薬物物質、例えば天然アスパラギナーを欠損している遺伝的に修飾されたＥ．ｃｏｌｉを生じることができる。いくつかの場合において、それは異種の分泌シグナルペプチドとの遺伝子融合から発現される。
【０００４】
アスパラギナーゼのペリプラズム局在は、封入体の減少した製造、減少したタンパク質分解、および真正のタンパク質Ｎ末端の生成を含む、異なる発現系における利点を提供することができる。分泌経路補因子の限定された可用性および／またはペリプラズム空間の空間的制限のため、発現収量は低くなることができる。組み換えアスパラギナーゼの細胞質発現は、細菌宿主細胞細胞質環境がアスパラギナーゼ単量体の可溶性、分解、およびミスフォールディングに関してほとんどペナルティを示さない場合、より高い収量を生成できる。
【発明の概要】
【０００５】
組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの製造方法が、本願明細書中で提供される。いくつかの実施形態において、該方法は、培養培地中でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞を培養し、ペリプラズム中で約３１％から約６０％ＴＣＰ可溶性アスパラギナーゼの収量で製造される組み換えアスパラギナーゼをコードする核酸を含む発現構築物からのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞のペリプラズム中に組み換えアスパラギナーゼを発現させることを含む。いくつかの実施形態において、可溶性組み換えアスパラギナーゼは、ペリプラズム中で約１０ｇ／Ｌから約３８ｇ／Ｌの収量で製造される。いくつかの実施形態において、該方法はさらに、活性アッセイを使用して、製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの量の活性を測定することを含む。いくつかの実施形態において、組み換えアスパラギナーゼをコードする核酸は、宿主細胞中での発現に最適化される。いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型である。いくつかの実施形態において、組み換えアスパラギナーゼをコードする核酸は、配列番号１または３と少なくとも８５％相同である。いくつかの実施形態において、組み換えアスパラギナーゼは、配列番号２と少なくとも８５％相同である。いくつかの実施形態において、組み換えアスパラギナーゼの発現は、培養培地へのＩＰＴＧの添加で誘導される。いくつかの実施形態において、ＩＰＴＧは、培養培地中で約０．１４ｍＭから約０．３ｍＭの濃度である。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ宿主細胞が約０．０５ｇ／ｇから約０．４ｇ／ｇの湿潤細胞重量まで成長すると、組み換えアスパラギナーゼの発現が誘導される。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は約５．０から約８．０のｐＨで培養される。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は約２２°Ｃから約３３°Ｃの温度で培養される。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は、約３ｇ／Ｌから約８ｇ／Ｌのマンニトールを含む培地中で培養される。実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は、マンニトールを含まない培地中で培養される。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は、約０．１ｍＭから約１ｍＭのＣａＣｌ２を含む培地中で培養される。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は、１以上のアスパラギナーゼの発現を欠損している。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は、１以上の天然アスパラギナーゼの発現を欠損している。いくつかの実施形態において、発現欠損した天然アスパラギナーゼは、Ｉ型アスパラギナーゼである。いくつかの実施形態において、発現欠損した天然アスパラギナーゼは、ＩＩ型アスパラギナーゼである。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は１以上のプロテアーゼの発現を欠損している。い��つかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は１以上のフォールディングモジュレーターを過剰発現する。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は、以下の少なくとも１つから選択される：ＬｅｐＢを過剰発現する宿主細胞；Ｔｉｇを過剰発現する宿主細胞；ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、およびＳｋｐ（ＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐ）を過剰発現する宿主細胞；Ｌｏｎ、ＨｓｌＵＶ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ、ＡｐｒＡ、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１、またはＡｐｒＡを欠損している宿主細胞；ＡｓｐＧ１を欠損している宿主細胞；ＡｓｐＧ２を欠損している宿主細胞；フォールディングモジュレーターを過剰発現せず、かつプロテアーゼを欠損していない宿主細胞；フォールディングモジュレーターを過剰発現せず、プロテアーゼを欠損せず、かつＡｓｐＧ１を欠損していない宿主細胞；フォールディングモジュレーターを過剰発現せず、プロテアーゼを欠損せず、かつＡｓｐＧ２を欠損していない宿主細胞；およびフォールディングモジュレーターを過剰発現せず、プロテアーゼを欠損せず、かつＡｓｐＧ１またはＡｓｐＧ２を欠損していない宿主細胞。いくつかの実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞は、以下から選択される：ＬｏｎおよびＨｓｌＵＶを欠損している宿主細胞；Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ、およびＡｐｒＡを欠損している宿主細胞；Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１、およびＡｐｒＡが欠損し、かつＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐを過剰発現する宿主細胞；ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２を欠損している宿主細胞；ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２が欠損し、かつＴｉｇを過剰発現する宿主細胞；ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２が欠損し、かつＬｅｐＢを過剰発現する宿主細胞；ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２が欠損し、かつＬｏｎおよびＨｓｌＵＶを欠損している宿主細胞；ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２が欠損し、かつＬｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ、およびＡｐｒＡを欠損している宿主細胞；およびＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ１、およびＡｐｒＡが欠損し、かつＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐを過剰発現する宿主細胞。いくつかの実施形態において、発現構築物は分泌リーダーを構成する。いくつかの実施形態において、分泌リーダーは、Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｄａｌｅｓ分泌リーダーＡｎｓＢ、８４８４、ＩＢＰ−Ｓ３１Ａ、ｐｂｐ、８５８４、ＬＡＯ、Ａｚｕ、ＰｂｐＡ２０Ｖ、ＣｕｐＣ２および  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＡｎｓＢ分泌リーダーを含む群から選択される。いくつかの実施形態において、分泌リーダーは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞のペリプラズムに製造される組み換えアスパラギナーゼの転移を誘導する。いくつかの実施形態において、該方法はさらに、製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの測定された活性を、同じ活性アッセイを使用して同じ量の対照ＩＩ型アスパラギナーゼで測定された活性と比較することを含む。いくつかの実施形態において、対照ＩＩ型アスパラギナーゼは、患者における使用が商業的に承認されているＥ．ｃｏ��ＩＩＩ型アスパラギナーゼを含む。いくつかの実施形態において、製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼは、対照ＩＩ型アスパラギナーゼの活性の約８０％から約１２０％を有する患者における使用のために選択される。いくつかの実施形態において、製造された組み換えＩＩ型アスパラギナーゼは、患者における半減期を増加させるように修飾される。いくつかの実施形態において、製造された組み換えＩＩ型アスパラギナーゼは、患者における半減期を増加させるように修飾される。いくつかの実施形態において、発現構築物から発現される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼは、組み換えＥ．ｃｏｌＩＩＩ型アスパラギナーゼであり、ここで核酸は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＡｎｓＢ分泌リーダーに作動可能に連結された組み換えＥ．ｃｏｌＩＩＩ型アスパラギナーゼをコードし、そしてここで組み換えＥ．ｃｏｌＩＩＩ型アスパラギナーゼは、同じ方法によりペリプラズム中で製造された組み換えＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＩＩ型アスパラギナーゼの収量より約２０％から約１００％大きい収量でペリプラズム中で製造され、ここでＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＩＩ型アスパラギナーセ゛は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＡｎｓＢ分泌リーダーに作動可能に連結された組み換えＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＩＩ型アスパラギナーゼをコードする核酸を含む第２の発現構築物から発現される。いくつかの実施形態において、第２の発現構築物は、配列番号５５として記載されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む。
【０００６】
参照による組み込み
本願明細書中で言及されているすべての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが特異的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本願明細書中に組み込まれる。
【０００７】
本開示の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される説明的な実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１．ＳＤＳ−ＣＧＥゲル様画像−ティア１発現プラスミドスクリーン。可溶性（上部パネル）および不溶性（下部パネル）のアスパラギナーゼ小規模（０．５ｍｌ）成長全ブロスソニケートを還元ＳＤＳ−ＣＧＥで分析した。左端のレーンは、分子重量マーカーラダー（上部パネルＭＷラダー１１９ｋＤａ、６８ＫＤａ、４８ＫＤａ、２９ＫＤａ、２１ｋＤａ、１６ｋＤａ）下部パネルＭＷラダー１１９ｋＤａ、６８ｋＤａ、４８ＫＤａ、２９ＫＤａ、２１ＫＤａ、１６ｋＤａ）を示し、右端のレーンは同じラダーを示す。左から右に、ラダー１のすぐ右から順に、ヌル、ＳＴＲ５５４６７、ＳＴＲ５５６８９、ＳＴＲ５５５５９、ＳＴＲ５５５６１、ＳＴＲ５５５６９、ＳＴＲ５５５７５、ＳＴＲ５５５５５、ＳＴＲ５５５７１、ＳＴＲ５５５６０、ＳＴＲ５５５７０、ＳＴＲ５５５７２、ＳＴＲ５５６０１、ＳＴＲ５５５８５、ＳＴＲ５５５９２、ＳＴＲ５５５０１、および対照：Ｓｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼ１０００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼ５００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼ２５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼ１２５μｇ／ｍｌ、およびＳｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼ６２．５μｇ／ｍｌにおいて観察される発現パターンを示すレーンである。ゲル画像の右側の矢印は、アスパラギナーゼ標的タンパク質（３５ｋＤａ）の移動を示す。
【０００９】
【図２】図２．ＳＤＳ−ＣＧＥ  ゲル様画像振とうフラスコ発現分析。可溶性（上部パネル）および不溶性（下部パネル）アスパラギナーゼ振とうフラスコ発現ソニケートを還元ＳＤＳ−ＣＧＥで分析した。左端のレーンは、分子重量マーカーラダー（上部パネルＭＷラダー６８ｋＤａ、４８ｋＤａ、２９ｋＤａ、２１ｋＤａ、１６ｋＤａ：下部パネルＭＷラダー６８ｋＤａ、５８ｋＤａ、２９ｋＤａ、２１ｋＫａ、１６ｋＤａ）、１４番目のレーンおよび右端のレーンは同じラダーを示す。左から右に、ラダー１のすぐ右から順に、以下の株の可溶性画分中で観察された発現パターンを示すレーンである：Ｉ０でのＳＴＲ５５９７６、Ｉ２４でのＳＴＲ５５９７６、Ｉ２４でのＳＴＲ５５９７６、Ｉ２４でのＳＴＲ５５９７６、Ｉ０でのＳＴＲ５５９７７、Ｉ２４でのＳＴＲ５５９７７、Ｉ２４でのＳＴＲ５５９７７、Ｉ２４でのＳＴＲ５５９７７、Ｉ０でのＳＴＲ５５９８２、Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８２、Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８２、Ｉ２４でのＳＴＲ５５９８２、ここでＩ０試料は誘導時に得られ、Ｉ２４試料は誘導の２４時間後に得られる。左から右に、ラダー２のすぐ右から順に、Ｓｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼ１０００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼ５００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼ２５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼ１２５μｇ／ｍｌ、およびＳｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼ６２．５μｇ／ｍｌである。ゲル画像の右側の矢印は、アスパラギナーゼ標的タンパク質（３５ｋＤａ）の移動を示す。Ｓｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼを対照標準曲線として実行した。
【００１０】
【図３】図３．マススぺクトロメトリーデータ−振とうフラスコ発現分析。左のパネルは、ＳＴＲ５５９７６についてのＬＣ−ＭＳデータを示し、右のパネルは、ＳＴＲ５５９７７についてのデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
概要
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞中で、可溶性組み換えアスパラギナーゼを製造する方法が、本願明細書中で開示される。全細胞タンパク質のパーセンテージとしてのアスパラギナーゼ製造の高いレベル、例えば６０％までのＴＣＰアスパラギナーゼ、例えば、検出可能な分解なく活性な四量体を形成することができるアスパラギナーゼ単量体が本願明細書中で記載される。アスパラギナーゼ製造の高い力価、例えば、アスパラギナーゼ１リットルあたり２０グラムまで、例えば、検出可能な分解なく活性な四量体を形成することができるアスパラギナーゼ単量体が、本願発明の方法を用いて得られる。アスパラギナーゼを製造するための宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを含むが、これらに限定されない。アスパラギナーゼ発現構築物は、選択した宿主株に応じてコドン最適化されることができる。
【００１２】
本願発明の方法において有用な核酸構築物は、分泌リーダー−アスパラギナーゼ融合タンパク質の発現を結果として生じる分泌シグナル（分泌リーダー）、例えばＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに天然なペリプラズム分泌リーダーをコードする核酸配列に作動可能に連結されたアスパラギナーゼ遺伝子をコード化することができる。いくつかの実施形態において、ペリプラズムの分泌リーダーは、１以上のＦｌｇＩ、８４８４、ＤｓｂＣ、Ｉｂｐ−Ｓ３１Ａ、または５１９３を含む。実施形態において、宿主細胞は、プロテアーゼの不活性化を結果として生じる１以上のプロテアーゼ−コーディング遺伝子中の変異を有する。プロテアーゼまたは任意の他の遺伝子産物の不活性化を結果として生じる変異は、遺伝子のコード配列または調節配列のいずれかにおける置換、挿入、または欠失変異を含むがそれらに限定されないタンパク質不活性化を引き起こすかまたはタンパク質発現を妨げるとして当該技術分野において既知の任意のタイプの変異であることができることが理解される。フォールディングモジュレーターの過剰発現は、フォールディングモジュレーター遺伝子のプラスミド発現または染色体組み込みなど、任意の方法を使用して達成できることが理解される。実施形態において、宿主細胞は、少なくとも１つのプロテアーゼ不活性化を有し、少なくとも１つのフォールディングモジュレーターを過剰発現する。
【００１３】
実施形態において、分泌リーダーは、可溶性アスパラギナーゼを宿主細胞のペリプラズムに輸送する。他の実施形態において、アスパラギナーゼは細胞質中に保持される。実施形態において、アスパラギナーゼ精製プロセスは、アスパラギナーゼ可溶化およびその後のリフォールディングを必要としない。実施形態において、アスパラギナーゼの少なくとも一部は封入体中で発現されない。実施形態において、組み換えアスパラギナーゼは、精製のためのいかなるペプチドタグを含まずに発現され、精製時に追加の処理を必要としない。分泌リーダーがアスパラギナーゼタンパク質に融合される実施形態において、分泌リーダーは可溶的に発現されたアスパラギナーゼから効率的に処理される。他の実施形態において、アスパラギナーゼのペリプラズム製造のための発現プラスミドは、選択および維持のためにいかなる抗生物質耐性マーカー遺伝子も利用せず、ゆえに、バイオ医薬品の製造に必要なプラスミドＤＮＡのその後の除去のための複雑なプロセスを排除する。他の実施形態において、発酵条件は大容量製造に拡張可能である。本願明細書中で提供される方法は、高いレベルの可溶性、活性なアスパラギナーゼを生じる。
【００１４】
当業者にとって既知のように、アミノ酸配列は、遺伝子コードにおける重複のために、異なるヌクレオチド配列によりコードされることができる。ゆえに、本願発明は、同じアミノ酸配列を有するが異なるヌクレオチド配列によりコードされるペプチドまたはタンパク質の使用を含む。
【００１５】
アスパラギナーゼ
ＩＩ型Ｌ−アスパラギナーゼを含むアスパラギナーゼは、Ｌ−アスパラギンのＬ−アスパラギン酸およびアンモニアへの加水分解を触媒する酵素である（Ｌ−アスパラギン＋Ｈ２Ｏ＝Ｌ−アスパラギン酸＋ＮＨ３）。ＩＩ型Ｌ−アスパラギナーゼは、ＡＬＬおよびいくつかの他の癌を処置するためのマルチ薬剤化学治療のレジメンの一部として使用される。正常細胞はアスパラギンを合成することができるが、特定の癌細胞はアスパラギン合成酵素の欠如のためにアスパラギンを合成することができない。したがって、アスパラギナーゼの患者への投与は、可溶性アスパラギンの加水分解および循環アスパラギンを結果として生じる。これは、正常細胞に対するより少ない効果効果を有する癌細胞の死につながることができる。アスパラギナーゼは、例えば、参照により本願明細書中に組み込まれる、「Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ」、  ＩＯＳ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｍａｔｓｏｕｋａｓ，  Ｊ．，  およびＭａｖｒｏｍｏｕｓｔａｋｏｓ，  Ｔ．，  編における、Ｐｒｉｔｓａ  およびＫｙｒｉａｋｉｄｉｓ，  ２００２、「Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」中に記載される。
【００１６】
Ｅｌｓｐａｒ（登録商標）（生物製剤ライセンス申請１０１０６３）は、患者におけるすべての処置について米国で商業的に承認されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型産物である。その活性な成分は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型である（参照により本明細書中で組み込まれるＥｌｓｐａｒ（登録商標）パッケージインサートを参照）。Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（生物製剤ライセンス申請１０３４１１）中の活性成分は、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）に共有結合したＥ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型である（参照により本明細書中で組み込まれるＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）パッケージインサートを参照）。Ｏｎｃａｓｐａｒは、ファーストラインＡＬＬ並びに天然Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼに対するＡＬＬおよび過敏症の処置について、米国において承認される。
【００１７】
Ｅ．ｃｏｌｉは、２のアスパラギナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼＩ型およびＬ−アスパラギナーゼＩＩ型を製造する。アスパラギンへの低い親和性を有するＬ−アスパラギナーゼＩ型は細胞質中に位置する。Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型は、開裂可能な分泌リーダー配列で製造される、アスパラギンに対して高い親和性を有する四量体ペリプラズム酵素である。米国特許出願番号Ｕ．Ｓ．２０１６／００６０６１３、参照により全体が組み込まれる「ペグ化Ｌ−アスパラギナーゼ」は、細菌ソースからの既知のＬ−アスパラギナーゼの共通の構造的特徴を記載する。ＵＳ２０１６／００６０６１３によれば、すべてが２つの隣接するＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインの間に４つの活性な部位を有するホモ四量体であり、すべてが三次および四次構造において高い類似性を有し、Ｌ−アスパラギナーゼの触媒部位の配列は、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、およびＥ．ｃｏｌｉＬ−アスパラギナーゼＩＩの間で高度に保存されている。
【００１８】
実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａ−１−３  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型（本願明細書中で配列番号１に記載されるアミノ酸配列；配列番号６−１３は、分泌リーダー配列を含む）は、本願発明の方法を使用して製造される。このアスパラギナーゼは、例えば、参照によりその全体が本願明細書中に組み込まれる米国特許番号７，８０７，４３６、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｏｓｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｌ−  Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ  ＩＩ」に記載され、ここで該配列は配列番号１として記載される。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａ−１−３  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型はまた、参照により本願明細書中に組み込まれるＮａｋａｍｕｒａ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９７２、「Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｌ−  Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ａ−Ｌ−３」、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３６：１２，  ２２５１−２２５３にも記載される。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａ−１−３は、参照により本願明細書中に組み込まれるＲｏｂｅｒｔｓ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９６８、「Ｎｅｗ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−  Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ９５：６，  ２１１７−２１２３に記載される高いレベルのアスパラギナーゼを製造するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＡＰ株に由来する。
【００１９】
実施形態において、本願発明の方法を使用して製造されるＬ−アスパラギナーゼＩＩ型タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型酵素であり、これは、両方が参照により本願明細書中に組み込まれるＪｅｎｎｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７２：  １４９１−１４９８  （ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．  Ｍ３４２７７）により記載されたａｎｓＢ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有する（天然分泌リーダー配列を含む配列番号３および分泌リーダー配列を含まない配列番号５として記載されるアミノ酸配列）。
【００２０】
米国特許番号７，８０７，４３６は、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．からのＬ−アスパラギナーゼＩＩ型酵素（Ｅｌｓｐａｒ（登録商標））およびＫｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．からのＬ−アスパラギナーゼＩＩ型酵素に対して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２酵素サブユニットは、Ａｌａ２７の代わりにＶａｌ２７、Ａｓｐ６４の代わりにＡｓｎ６４、Ｔｈｒ２５２の代わりにＳｅｒ２５２およびＡｓｎ２６３の代わりにＴｈｒ２６３を有することを報告する。
【００２１】
実施形態において、本願発明の方法を使用して製造されたＬ−アスパラギナーゼＩＩ型は、参照により本願明細書中に組み込まれるＭａｉｔａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｅｃ．  １９７４、「Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｌ−  Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７６（６）：１３５１−４により示されるアミノ酸配列を有する。
【００２２】
実施形態において、本願発明の方法を使用して製造されるＬ−アスパラギナーゼＩＩ型は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａ−１−３  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型酵素の変異体であり、ここで、変異体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａ−１−３  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型酵素のＬ−アスパラギナーゼＩＩ型活性の約８０％から約１２０％、またはそれを超える、約８５％から約１２０％、約９０％から約１２０％、約９５％から約１２０％、約９８％から約１２０％、約１００％から約１２０％、約８０％から約１００％、約８０％から約９０％、約８５％から約１１５％、約９０％から約１１０％、約９５％から約１５５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約１００％を有する。
【００２３】
実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ型は、配列を有する核酸によりコードされ、ここでコドンは宿主細胞中での発現のために所望のように最適化される。
【００２４】
実施形態において、本願発明の方法を使用して製造される組み換えアスパラギナーゼは、野生型Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼ遺伝子と少なくとも約７０％同一である核酸配列によりコードされる。実施形態において、組み換えアスパラギナーゼは、野生型Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼと少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、組み換えアスパラギナーゼは、野生型Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼ核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、組み換えアスパラギナーゼは、野生型Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有する。本願明細書中でパーセンテージとして表現される「同一性」または「相同性」は、２つの配列間の類似性の尺度を記載する。いくつかの実施形態において、２つの配列間の同一性の程度は、技術分野において既知のコンピュータープログラムおよび数学アルゴリズムを使用して確認される。パーセント配列同一性（相同性）を計算するかかるアルゴリズムは一般に、比較領域にわたる配列のギャップおよび不一致を説明する。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）検索アルゴリズム（例えば、ＮＣＢＩを通じて公的に入手可能な入手可能なＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３  （１９９０）を参照）は、以下のような例示的な検索パラメータを有する：Ｍｉｓｍａｔｃｈ−２；ギャップオープン５；ギャップ拡張２。ポリペプチド配列比較について、典型的に、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ  ２５０、ＢＬＯＳＵＭ  ６２、またはＢＬＯＳＵＭ  ５０などのスコアリングマトリックスと組み合わせて使用される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）およびＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムは、同一性の程度を定量化するためにも使用される（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）；  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １３２：１８５  （２０００）；  およびＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４７：１９５  （１９８１））。
【００２５】
Ｅ．ｃｏｌｉからの組み換えＩＩ型アスパラギナーゼはまた、Ｃｏｌａｓｐａｓｅ（登録商標）、Ｅｌｓｐａｒ（登録商標）、Ｋｉｄｒｏｌａｓｅ（登録商標）、Ｌｅｕｎａｓｅ（登録商標）、およびＳｐｅｃｔｒｉｌａ（登録商標）なる名前で既知である。Ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ（登録商標）は、Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼのペグ化バージョンの名前である。アスパラギナーゼは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫の患者に、静脈内、筋肉内、または皮下注射により投与される。
【００２６】
患者の使用が商業的に承認されたアスパラギナーゼＩＩ型産物は、各国の薬物承認機関から入手可能なアスパラギナーゼ産物の産物情報にアクセスすることにより同定できる。例えば、産物情報および承認記録は、例えばアメリカ食品医薬品局からのＥｌｓｐａｒ（Ｅ．ｃｏｌｉＬ−アスパラギンアミドヒドロラーゼ、ＥＣ−２型；ＢＬＡ＃１０１０６３）およびＥｒｗｉｎａｚｅ（登録商標）（アスパラギナーゼＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、ＢＬＡ＃１２５３５９）について米国において公的に入手可能であり、参照により本願明細書中に組み込まれる（１０９０３  Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ  ２０９９３、およびＦＤＡウェブサイトでのオンライン）。欧州における産物情報は、欧州医薬品庁（３０  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｐｌａｃｅ、Ｃａｎａｒｙ  Ｗｈａｒｆ、Ｌｏｎｄｏｎ  Ｅ１４  ５ＥＵ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、およびＥＭＡウェブサイトでのオンライン）から入手可能である（例えば、それぞれが本願明細書中で参照により組み込まれるＯｎｃａｓｐａｒ：ペグ化Ｅ．ｃｏｌｉＬ−アスパラギナーゼに関する最初に２０１６年１月１９日に公開されたＥＰＡＲ産物情報；Ｓｐｅｃｔｒｉｌａ：最初に２０１６年１月２８日に公開されたＥＰＡＲ産物情報；および国家承認医薬品のリスト、２０１６年４月２７日、欧州医薬品庁を参照）。
【００２７】
いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼの修飾されたバージョンが生成される。一般に、アミノ酸配列に関して、「修飾」なる語は、置換、挿入、伸長、欠失、および誘導体化を単独または組み合わせて含む。特定の実施形態において、アスパラギナーゼの修飾されたバージョンは、患者に投与されるときの増加した半減期などの増強される特性を有する。いくつかの実施形態において、半減増加された半減期を有するアスパラギナーゼの修飾されたバージョンがペグ化される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、「非必須」アミノ酸残基の１以上の修飾を含んでもよい。この文脈において、「非必須」アミノ酸残基は、ペプチド（例えば、アナログペプチド）の活性（例えば、アゴニスト活性）を廃止または実質的に減少させることなく、新規アミノ酸配列において変更、例えば欠失、置換、または誘導体化できる残基である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、「必須」アミノ酸残基の１以上の修飾を含んでもよい。この文脈において、「必須」アミノ酸残基は、新規アミノ酸配列において変更、例えば欠失、置換、または誘導体化されると、参照ペプチドの活性が実質的に減少または廃止される残基である。必須アミノ酸残基が変更されるかかる実施形態において、修飾されたペプチドは、提供される方法で目的のアスパラギナーゼの活性を所有してもよい。置換、挿入、および欠失は、Ｎ末端またはＣ末端であっても、タンパク質の内部であってもよい。例として、タンパク質は、ペプチド分子全体に連続的な様式でまたは間隔をあけての両方で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える置換を含んでもよい。単独でまたは置換と組み合わせて、ペプチドは、連続した方法でまたはペプチド分子全体の空間に配置されてのいずれかで１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える挿入を含んでもよい。ペプチドは、単独でまたは置換および／または挿入と組み合わせて、連続した方法でまたはペプチド分子全体の空間に配置されてのいずれかで１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える欠失を含んでもよい。ペプチドは、単独でまたは置換、挿入、および／または欠失と組み合わせて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるアミノ酸付加を含んでもよい。
【００２８】
置換は、保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖または物理化学的特性（例えば、静電、水素結合、等配電子、疎水性の特徴）を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。アミノ酸は、天然または非天然であってもよい。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において既知である。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、メチオニン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。置換は、非保存的変化をも含んでもよい。
【００２９】
発現系
いくつかの場合において、本願明細書中の方法は、発現構築物からの組み換えアスパラギナーゼをＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞中で発現させることを含む。いくつかの場合において、発現構築物はプラスミドである。いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼ配列をコードするプラスミドは選択マーカーを含む、プラスミドを維持する宿主細胞は選択的な条件で成長する。いくつかの実施形態において、プラスミドは選択マーカーを含まない。いくつかの実施形態において、発現構築物は宿主細胞ゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アスパラギナーゼをペリプラズムに誘導する分泌シグナルに融合したアスパラギナーゼをコードする。いくつかの実施形態において、分泌シグナルは宿主細胞中で開裂される。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アスパラギナーゼを細胞質に誘導する分泌シグナル無しにアスパラギナーゼをコードする。
【００３０】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主株を含む宿主株において、本願発明の方法において有用な調節配列（例えば、プロモーター、分泌リーダー、およびリボソーム結合部位）を含む異種タンパク質を発現するための方法が、例えば、それぞれが参照によりその全体が本願明細書中に組み込まれる米国特許番号７，６１８，７９９、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、米国特許番号７，９８５，５６４、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｅｃ−ｓｙｓｔｅｍ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ」、ともに「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄｌｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｈｏｓｔｓ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｃｅｒｔａｉｎ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」なるタイトルの米国特許番号９，３９４，５７１および９，５８０，７１９、米国特許番号９，４５３，２５１、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ」、米国特許番号８，６０３，８２４、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、および米国特許番号８，５３０，１７１、「Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」において記載される。実施形態において、本願発明との関連で使用される分泌リーダーは、米国特許番号７，６１８，７９９、７，９８５，５６４、９，３９４，５７１、９，５８０，７１９、９，４５３，２５１、８，６０３，８２４および８，５３０，１７１のいずれかにおいて開示される分泌リーダーである。これらの特許は、異種タンパク質発現を増加させるために、フォールディングモジュレーターを過剰発現するように操作されているか、または異種プロテアーゼ変異が導入されている、本願明細書中の方法の実践において有用な細菌宿主株をも記載する。
【００３１】
実施形態において、本願発明の方法において使用される発現株は、表１１に列挙されるような実施例３に記載される任意の発現株である。実施形態において、本願発明の方法において使用される発現株は、表１１に列挙されるような実施例３において記載される発現株の背景表現型を有する微生物発現株であり、ここで株は、表１１に列挙されるようなそれぞれの分泌リーダーとの融合において組み換えアスパラギナーゼを発現する。実施形態において、本願発明の方法において使用される発現株は、発現株がフォールディングモジュレーターオーバーエクスプレッサーでないことを除いて、表１１に列挙されるような実施例３において記載される発現株ＳＴＲ５７８６４、ＳＴＲ５７８６５、ＳＴＲ５７８６６、ＳＴＲ５７８６０、ＳＴＲ５７８６１、ＳＴＲ５７８６２、ＳＴＲ５７８６３の背景表現型を有する微生物発現株である。実施形態において、本願発明の方法において使用される発現株は、マンニトール無しで培養される、表１１に列挙されるような実施例３に記載される発現株ＳＴＲ５７８６４、ＳＴＲ５７８６５、ＳＴＲ５７８６６、ＳＴＲ５７８６０、ＳＴＲ５７８６１、ＳＴＲ５７８６２、ＳＴＲ５７８６３の背景表現型を有する微生物発現株である。
【００３２】
プロモーター
本願明細書中の方法に従って使用されるプロモーターは、構成的プロモーターまたは制御されたプロモーターであることができる。有用な制御されたプロモーターの共通の例は、ｌａｃプロモーター（すなわち、ｌａｃＺプロモーター）、特に米国特許番号４，５５１，４３３において記載されるｔａｃおよびｔｒｃプロモーターからＤｅＢｏｅｒ並びにＰｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５およびＴ７ｌａｃプロモーターに由来するファミリーのものを含む。１つの実施形態において、プロモーターは宿主細胞生物に由来しない。特定の実施形態において、プロモーターはＥ．ｃｏｌｉ生物由来である。
【００３３】
誘導性プロモーター配列は、本願明細書中の方法に従ってアスパラギナーゼの発現を制御するために使用される。実施形態において、本願明細書中の方法において有用な誘導性プロモーターは、ｌａｃプロモーター（すなわち、ｌａｃＺプロモーター）、特に米国特許番号４，５５１，４３３において記載されるｔａｃおよびｔｒｃプロモーターからＤｅＢｏｅｒ並びにＰｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５およびＴ７ｌａｃプロモーターまでに由来するファミリーのものを含む。１つの実施形態において、プロモーターは宿主細胞生物に由来しない。特定の実施形態において、プロモーターはＥ．ｃｏｌｉ生物に由来する。いくつかの実施形態において、ｌａｃプロモーターはプラスミドからのアスパラギナーゼの発現を制御するために使用される。ｌａｃプロモーター誘導体またはファミリーメンバー、例えばｔａｃプロモーターの場合、インデューサーはＩＰＴＧ（「イソプロピルチオガラクトシド」とも呼ばれるイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）である。特定の実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞中でｌａｃプロモーターからのアスパラギナーゼの発現を誘導するために培養にＩＰＴＧが添加される。
【００３４】
本願明細書中の方法に従った発現系において有用な非ｌａｃ型プロモーターの共通の例は、例えば、表１に列挙されたものを含む。
【表１】
2021500892.tif 000003
【００３５】
例えば、全て本願明細書中で参照により組み込まれるＪ．  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｏｍｅｒｏ  ＆  Ｖ．  Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ，１９９９，  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ａ．  Ｄｅｍａｉｎ  ＆  Ｊ．  Ｄａｖｉｅｓ，  ｅｄｓ．）  ｐｐ．  ４６０−７４  （ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）；  Ｈ．  Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，  ２００１，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １２：４３９−４４５；  Ｒ．  Ｓｌａｔｅｒ  ＆  Ｒ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ２０００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｊ．  Ｗａｌｋｅｒ  ＆  Ｒ．  Ｒａｐｌｅｙ，  ｅｄｓ．）  ｐｐ．  １２５−５４  （Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）；およびＬ−Ｍ．  Ｇｕｚｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７７（１４）：  ４１２１−４１３０を参照のこと。選択された細菌宿主細胞に対して天然なプロモーター、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓアントラニル酸塩または安息香酸オペロンプロモーター（Ｐａｎｔ、Ｐｂｅｎ）のヌクレオチド配列を有するプロモーターは、標的ポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現をコントロールするために使用されてもよい。同じ配列内であっても異なる配列内であっても、また同じ生物に由来しても異なる生物に由来しても、１を超えるプロモーターが別のものに共有結合しているタンデムプロモーター、例えばＰａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター（インタープロモーターハイブリッド）またはＰｌａｃ−Ｐｌａｃタンデムプロモーターを使用してもよい。
【００３６】
制御されたプロモーターは、プロモーターが一部である遺伝子の転写をコントロールするためにプロモーター調節タンパク質を利用する。制御されたプロモーターが本願明細書中で使用される場合、対応するプロモーター調節タンパク質も、本願明細書中の方法に従う発現系の一部であるだろう。プロモーター調節タンパク質の例は以下を含む：アクチベータータンパク質、例えば大腸菌カタボライトアクチベータータンパク質、ＭａｌＴタンパク質；ＡｒａＣファミリー転写アクチベーター；リプレッサータンパク質、例えばＥ．ｃｏｌｉＬａｃＩタンパク質；および、二重機能調節タンパク質、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮａｇＣタンパク質。多くの制御された−プロモーター／プロモーター−調節タンパク質ペアは当該技術分野において既知である。１つの実施形態において、目的の標的タンパク質および異種タンパク質の発現構築物は、同じ調節要素のコントロール下にある。
【００３７】
プロモーター調節タンパク質は、エフェクター化合物、すなわち、調節タンパク質と可逆的または不可逆的に相互作用して、該タンパク質が放出またはプロモーターのコントロール下にある遺伝子の少なくとも１つのＤＮＡ転写調節領域に結合するのを可能にし、それにより該遺伝子の転写の開始においてトランストランスクリプターゼ酵素の作用を許可またはブロックする化合物と相互作用する。エフェクター化合物はインデューサーまたはコリプレッサーのいずれかに分類され、これらの化合物は天然エフェクター化合物および無償性インデューサー化合物を含む。多くの制御されたプロモーター／プロモーター−調節タンパク質／エフェクター化合物トリオは当該技術分野において既知である。いくつかの場合において、エフェクター化合物は細胞培養または発酵全体で使用されるが、制御されたプロモーターが使用される１つの実施形態において、宿主細胞バイオマスの所望の量または密度の成長後、適するエフェクター化合物は培養に添加され、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする所望の遺伝子の発現を直接的にまたは直接的に結果として生じる。
【００３８】
ｌａｃファミリープロモーターが利用される実施形態において、ｌａｃＩ遺伝子は時にシステム中に存在する。通常構成的に発現される遺伝子であるｌａｃＩ遺伝子は、Ｌａｃファミリープロモーターのｌａｃオペレーターに結合するＬａｃリプレッサータンパク質であるＬａｃＩタンパク質をコードする。ゆえに、ｌａｃファミリープロモーターが利用されると、ｌａｃＩ遺伝子も時に発現系中に含まれて発現される。
【００３９】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓにおいて有用なプロモーターシステムは、文献、例えば上記でも参照される米国特許出願公開番号２００８／０２６９０７０に記載される。
【００４０】
他の調節要素
実施形態において、可溶性組み換えアスパラギナーゼは、製造中に細胞の細胞質またはペリプラズムのいずれかに存在する。タンパク質、例えばアスパラギナーゼの標的化に有用な分泌リーダーは、本願明細書中の他の場所で、および上記で参照される米国特許出願公開番号２００８／０１９３９７４、米国特許出願公開番号２００６／０００８８７７および米国特許出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．１２／６１０，２０７に記載される。いくつかの実施形態において、アスパラギナーゼをＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞のペリプラズムに輸送する分泌リーダーに融合したアスパラギナーゼをコードする発現構築物が提供される。いくつかの実施形態において、分泌リーダー分泌リーダーはアスパラギナーゼタンパク質から開裂される。いくつかの実施形態において、分泌リーダーは、可溶性アスパラギナーゼの製造を容易にする。
【００４１】
本明細書中の方法の実践において有用な発現構築物は、タンパク質コード配列に加えて、それに作動可能に連結された以下の調節要素：プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、転写ターミネーター、および翻訳スタートおよびストップシグナルを含む。
【００４２】
実施形態において、発現ベクターは、最適なリボソーム結合配列を含有する。目的のタンパク質の翻訳開始領域を変更することにより翻訳強度を調整することは、あまりにも速い翻訳速度により主に封入体として蓄積する異種細胞質の製造を改善するために使用できる。異種タンパク質の細菌細胞のペリプラズム空間への分泌は、翻訳速度がタンパク質分泌速度と同期するように、タンパク質翻訳レベルを最大化するのではなく最適化することにより増強されることもできる。
【００４３】
翻訳開始領域は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）のすぐ上流から開始コドンのおよそ２０ヌクレオチド下流まで延びる配列として定義されている（参照によりその全体が本願明細書中に組み込まれるＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７８−８５）。原核生物において、代替ＲＢＳ配列は、Ｓｈｉｎｅおよび  Ｄａｌｇａｒｎｏ  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７１：１３４２−１３４６，  １９７４）により記載されるカノニカル、またはコンセンサス、ＲＢＳ配列（ＡＧＧＡＧＧ；配列番号４５）を使用して翻訳レベルに関して減少する翻訳速度を提供することにより、異種タンパク質の翻訳レベルを最適化するために利用できる。「翻訳速度」または「翻訳効率」により、細胞内のタンパク質へのｍＲＮＡ翻訳率が意図される。ほとんどの原核生物において、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、１６ＳリボソームＲＮＡのピリミジンに富む領域との相互作用を通じて、ｍＲＮＡ上の開始コドンに対して３０Ｓリボソーム成分の結合および配置を支援する。（本願明細書中でＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列とも呼ばれる）ＲＢＳは、転写の開始から下流および翻訳の開始から上流、典型的に開始コドンの４から１４ヌクレオチド上流、より典型的に開始コドンの８から１０ヌクレオチド上流のｍＲＮＡ上に位置する。翻訳におけるＲＢＳ配列の役割のため、翻訳の効率およびＲＢＳ配列の効率（または強度）の間には直接的な関係がある。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＲＢＳ配列の修飾は、異種タンパク質の翻訳速度の減少を結果として生じる。翻訳速度のこの減少は、製造されるタンパク質のグラムあたり、または宿主タンパク質のグラムあたりの適切に処理されるタンパク質またはポリペプチドのレベルの増加に対応してもよい。減少した翻訳速度は、組み換え１グラムあたり、または宿主細胞タンパク質１グラムあたりの、製造される回復可能なタンパク質またはポリペプチドの増加したレベルとも相関することができる。減少した翻訳速度は、増加した発現、増加した活性、増加した溶解性、または増加した転座（例えば、ペリプラズムの区画へまたは細胞外空間に分泌される）のいずれの組み合わせにも対応できる。この実施形態において、「増加した」なる語は、目的のタンパク質またはポリペプチドが同じ条件、または実質的に同じ条件下で発現される時の、製造される、適切に処理される、可溶性の、および／または回復可能なタンパク質またはポリペプチドのレベルに対し、ここでポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、カノニカルＲＢＳ配列を含む。同じように、「減少した」なる語は、目的のタンパク質またはポリペプチドの翻訳速度に対し、ここで、タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、カノニカルＲＢＳ配列を含む。翻訳速度は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、少なくとも約７５％またはそれを超えて、または少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍またはそれを超えて減少できる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本願明細書中で記載されたＲＢＳ配列変異体は、高い、中程度、または低い翻訳効率を結果として生じるとして分類できる。１つの実施形態において、配列は、カノニカルＲＢＳ配列の翻訳活性と比較して、翻訳活性のレベルに従ってランク付けされる。高いＲＢＳ配列は、カノニカル配列の活性の約６０％から約１００％を有する。中程度のＲＢＳ配列は、カノニカル配列の活性の約４０％から約６０％を有する。低いＲＢＳ配列は、カノニカル配列の活性の約４０％未満を有する。
【００４６】
ＲＢＳ配列の例が表２に示される。レポーター遺伝子としてＣＯＰ−ＧＦＰを使用して翻訳強度について配列がスクリーニングされ、コンセンサスＲＢＳ蛍光のパーセンテージに従ってランク付けされた。各ＲＢＳ変異体は、３つの一般的な蛍光ランクの１つに配置された：高い（「Ｈｉ」−１００％コンセンサスＲＢＳ蛍光）、中程度（「Ｍｅｄ」−４６−５１％ｏｆコンセンサスＲＢＳ蛍光）、および低い（「Ｌｏ」−１６−２９％コンセンサスＲＢＳ蛍光）。
【表２】
2021500892.tif 000004
【００４７】
有用なＲＢＳは、例えば米国特許出願公開番号２００８／０２６９０７０および米国特許出願．Ｓｅｒ．Ｎｏ．１２／６１０，２０７に従って、発現系中で宿主細胞として有用ないずれかの種から得られる。多くの具体的で多様なコンセンサスＲＢＳ、例えば、Ｄ．  Ｆｒｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ２３４（２）：２５７−６５  （８  Ｊｕｌ．  １９９９）；  およびＢ．  Ｅ．  Ｓｕｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７（１２）：１１２３−３０  （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００１）に記載され、参照されるものは既知である。加えて、天然または合成いずれかのＲＢＳ、例えばＥＰ  ０２０７４５９  （合成ＲＢＳ）；  Ｏ．  Ｉｋｅｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８１（３）：５６３−７０  （１９８９）に記載されるものは使用してもよい。さらに、方法、パラメーター、および翻訳と転写要素、および本願明細書中の方法において有用な他の要素の例は、例えば、米国特許番号５，０５５，２９４からＧｉｌｒｏｙおよび米国特許番号５，１２８，１３０から  Ｇｉｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．；米国特許番号５，２８１，５３２から  Ｒａｍｍｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；米国特許番号４，６９５，４５５および４，８６１，５９５からＢａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．；米国特許番号４，７５５，４６５からＧｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．；および米国特許番号５，１６９，７６０からＷｉｌｃｏｘに記載される。
【００４８】
宿主株
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓを含む細菌宿主、および密接に関連する細菌生物は、本願明細書中の方法の実践における使用のために検討される。特定の実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ宿主細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。いくつかの場合において、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００４９】
本願明細書中の方法の実践において有用な宿主細胞および構築物は、当該技術分野において既知の試薬および方法を用いて同定または作成され、文献、例えば、参照によりその全体が本願明細書中に組み込まれる米国特許出願公開番号２００９／０３２５２３０、「タンパク質発現系」に記載される。この公開は、染色体ｌａｃＩ遺伝子インサートを含む栄養要求性のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞中への核酸構築物の導入による組み換えポリペプチドの製造を記載する。核酸構築物は、宿主細胞中の核酸の発現を誘導することができるプロモーターに作動可能に連結された組み換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、また栄養要求性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列も含む。栄養要求性選択マーカーは、栄養要求性宿主細胞に原栄養性を回復させるポリペプチドである。実施形態において、細胞はプロリン、ウラシル、またはそれらの組み合わせに対して栄養要求性である。実施形態において、宿主細胞はＭＢ１０１（ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ−７８４１）に由来する。両方が本願明細書中で参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開番号２００９／０３２５２３０、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５、「Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｐｙｒＦ  ａｎｄ  ｐｒｏＣ，  ｉｎ  ｓｏｍｅ  ｃａｓｅｓ，  ｒｅｐｌａｃｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｃｅｌＬ−ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ２１（２）：  ３４３−８は、株ＭＢ１０１中のｐｙｒＦ遺伝子を欠失させることにより構築されたウラシルに対して栄養要求性の製造宿主株を記載する。ｐｙｒＦ遺伝子は、株ＭＢ２１４（ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ−７８４０）からクローン化され、ｐｙｒＦ欠失を補完して原栄養性を回復するプラスミドを生成した。特定の実施形態において、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞中のｐｙｒＦ−ｐｒｏＣ二重栄養要求性選択マーカーシステムが使用される。記載されるｐｙｒＦ欠失製造宿主株は、本願明細書中の方法の実践において有用であるとして本願明細書中で記載されるものを含む他の所望のゲノム変化を導入するための背景としてしばしば使用される。
【００５０】
実施形態において、本願発明の方法に有用な宿主細胞は、少なくとも１つのプロテアーゼの発現を欠損している、少なくとも１つのフォールディングモジュレーターを過剰発現する、またはその両方である。実施形態において、宿主細胞はプロテアーゼの発現を欠損せず、フォールディングモジュレーターを過剰発現せず、したがってプロテアーゼおよびフォールディングモジュレーター発現に関して野生型である。これらの実施形態のいずれにおいても、加えて、宿主細胞は天然Ｌ−アスパラギナーを欠損している。実施形態において、天然Ｌ−アスパラギナーゼの欠損は、当該技術分野において既知の任意の適切な方法を使用して、天然Ｌ−アスパラギナーゼ遺伝子を欠失または他の方法で不活性化することにより生成される。実施形態において、宿主細胞は、天然Ｉ型Ｌ−アスパラギナーゼ、天然ＩＩ型Ｌ−アスパラギナーゼ、またはその両方を欠損している。実施形態において、宿主細胞は、プロテアーゼおよびフォールディングモジュレーター発現に関して野生型であり、天然Ｉ型Ｌ−アスパラギナーゼおよびＩＩ型Ｌ−アスパラギナーを欠損している。例えば、本願発明の方法において有用な宿主細胞は、既知の方法を使用して、ＭＢ１０１から当業者により生成できる。実施形態において、宿主細胞は、ＭＢ１０１中のＩ型Ｌ−アスパラギナーゼ遺伝子、ＩＩ型Ｌ−アスパラギナーゼ遺伝子、またはその両方を欠失または他の方法で不活性化することにより生成される。
【００５１】
本願発明の方法において有用な製造宿主株は、当該技術分野において既知のおよび文献に記載の多くの適する方法のいずれかを使用して、例えば、ｐｙｒＦ遺伝子、および／またはＩ型Ｌ−アスパラギナーゼ遺伝子、および／またはＩＩ型Ｌ−アスパラギナーゼ遺伝子を不活性化することにより、公的に入手可能な宿主細胞、例えば、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＭＢ１０１を使用して生成できることは、当業者には理解されるだろう。原栄養性回復プラスミドは、株、例えば株ＭＢ２１４からのｐｙｒＦ遺伝子を保有するプラスミドに、当該技術分野において既知のおよび文献に記載される多くの適する方法のいずれかを使用して形質転換できることもまた理解される。加えて、かかる株において、当該技術分野で周知の方法を使用して、プロテアーゼは不活性化され、フォールディングモジュレーター過剰発現構築物は導入することができる。
【００５２】
実施形態において、宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目である。宿主細胞がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目である場合、それはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属を含むファミリーＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅのメンバーであってもよい。ガンマプロテオバクテリア宿主は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ種のメンバーおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ種のメンバーを含む。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ目、ファミリーＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の宿主細胞は、当業者により同定可能であり、文献に記載される（例えば、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｒｃｈａｅａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（オンライン公開、２０１５））。
他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ生物も有用であってもよい。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓおよび密接に関連する種は、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｒｃｈａｅａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（オンライン公開、２０１５）に記載されるファミリーおよび／または属に属するプロテオバクテリアの群を含むグラム陰性プロテオバクテリア亜群１を含む。表３は、生物のこれらのファミリーおよび属を示す。
【表３】
2021500892.tif 000005
【００５３】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよび密接に関連する細菌は、一般に「Ｇｒａｍ（−）プロテオバクテリア亜群１」または「グラム陰性好気性桿菌および球菌」（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｒｃｈａｅａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（オンライン公開、２０１５））として定義される群の一部である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主株は、文献、例えば上記で引用される米国特許出願公開番号２００６／００４０３５２に記載される。
【００５４】
「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１」はまた、分類において使用される基準に従ってこの見出しに分類されるであろうプロテオバクテリアを含む。見出しはまた、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ、Ｏｃｅａｎｉｍｏｎａｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、および  Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属に属する生物の再群化により生み出されるＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属（およびそれ由来のＢｌａｓｔｏｍｏｎａｓ属）、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｒｃｈａｅａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  （オンライン公開、２０１５）において定義されるＡｃｅｔｏｂａｃｔｅに属する生物を再群化することにより生み出されたＡｃｉｄｏｍｏｎａｓ属などの以前にこのセクションに分類されていたが、もはや分類されていない群を含む。加えて宿主は、それぞれＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ、およびＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓとして分類されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎａｌｉａ  （ＡＴＣＣ  １４３９３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓｉ（ＡＴＣＣ  １９３７５）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ  （ＡＴＣＣ  ８０７１）属からの細胞を含む。同じように、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（ＡＴＣＣ  １５６６８）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（ＡＴＣＣ  １１９９６）は、それぞれＣｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓおよびＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉとして再分類されており；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ（ＡＴＣＣ  １９３７５）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａ（ＡＴＣＣ  １５０５７）は、それぞれＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓおよびＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａとして再分類されている。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１」はまた、ファミリー：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、（今はしばしばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅの「Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ群」なる異名により呼ばれる）Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａ、および（今はしばしば「Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ」なる異名により呼ばれる）Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅのいずれかに属するものとして分類されたプロテオバクテリアも含む。結果として、本願明細書中で他の方法で記載された属に加えて、「グラム陰性プロテオバクテリア亜属１」に含まれるプロテオバクテリア１属は、さらに以下を含む：１）Ａｚｏｒｈｉｚｏｐｈｉｌｕｓ属のアゾトバクター群細菌；２）細胞ビブリオ、Ｏｌｉｇｅｌｌａ、およびＴｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ属のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅファミリー細菌；３）Ｃｈｅｌａｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｓｉｆｅｒ、（「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ」とも呼ばれる）Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ、および���ｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属のＲｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅファミリー細菌；４）Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｌｄｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓａｒｃｉｎａ、およびＭｅｔｈｙｌｏｓｐｈａｅｒａ属のＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅファミリー細菌。
【００５５】
いくつかの場合において、宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１６」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１６」は、（括弧中に示される例示的な株のＡＴＣＣまたは他の寄託番号を有する）以下のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種のプロテオバクテリアの群として定義される：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ  （ＡＴＣＣ  ７００６８９）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  （ＡＴＣＣ  １０１４５）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  （ＡＴＣＣ  １４９０９）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ  （ＡＴＣＣ  ３３６６０）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ  （ＡＴＣＣ  １３６７４）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ  （ＡＴＣＣ  ５１５５５）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ  （ＡＴＣＣ  ２５４１１）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ  （ＡＴＣＣ  ３３６３４）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ  （ＡＴＣＣ  ８０６２）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  （ＡＴＣＣ  １７４４０）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ  （ＡＴＣＣ  １４２３５）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅａ  （ＡＴＣＣ  ３３６３６）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｇａｒｉｃｉ  （ＡＴＣＣ  ２５９４１）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｇｉｎｏｖｏｒａ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｓｐｌｅｎｉｉ  （ＡＴＣＣ  ２３８３５）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｅｌａｉｃａ  （ＡＴＣＣ  ２７１６２）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ  （ＡＴＣＣ  １９３７２）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ  （ＡＴＣＣ  ３３６６２）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｕｔａｎｏｖｏｒａ  （ＡＴＣＣ  ４３６５５）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓａ  （ＡＴＣＣ  ５５７０３）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ  （ＡＴＣＣ  ３３６６３）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  （ＡＴＣＣ  ９４４６，  ＡＴＣＣ  １３９８５，  ＡＴＣＣ  １７４１８，  ＡＴＣＣ  １７４６１）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ  （ＡＴＣＣ  ４９７３）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ  （ＡＴＣＣ  ４９９６８）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ  （ＡＴＣＣ  ４６８３）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｓｓｉｃｏｌａ  （ＡＴＣＣ  ３３６１６）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｉｐｈｉｌａ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｎｇａｔａ  （ＡＴＣＣ  １０１４４）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｅｃｔｅｎｓ  （ＡＴＣＣ  １２７７５）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒｅｎｎｅｒｉ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏ��ａｓ  ｃｅｄｒｅｌｌａ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｒｕｇａｔａ  （ＡＴＣＣ  ２９７３６）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  （ＡＴＣＣ  ３５８５８）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｓｓａｒｄｉｉ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ  （ＡＴＣＣ  ７００８７１）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ  （ＡＴＣＣ  １０８４４）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｉｇｕｌａｅ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ  （ＡＴＣＣ  ４６８５）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｅｓｉａｅ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｘａｎｔｈａ  （ＡＴＣＣ  ９８９０）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｏｌａａｓｉｉ  （ＡＴＣＣ  ３３６１８）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ  （ＡＴＣＣ  ７００４７４）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ  （ＡＴＣＣ  １９３７４）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｅｒｉ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌａ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａ  （ＡＴＣＣ  １９８６７）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｕｔｔｉｅｎｓｉｓ  （ＡＴＣＣ  １４６７０）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｏｒａ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｊｅｓｓｅｎｉｉ  （ＡＴＣＣ  ７００８７０）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ  （ＡＴＣＣ  １４６６９）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｉｎｉ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｔａ  （ＡＴＣＣ  ２５４１７）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｐｈｉｔｉｃａ  （ＡＴＣＣ  ３３６６５）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  （ＡＴＣＣ  １９２４４）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ  （ＡＴＣＣ  １９０）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｉｃｔｏｒｕｍ  （ＡＴＣＣ  ２３３２８）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｉｌｖａ  （ＡＴＣＣ  ３１４１８）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ  （ＡＴＣＣ  ７００４７６）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｓｓｅｌｉｉ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ  （ＡＴＣＣ  ４３２７２）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ  （ＡＴＣＣ  ７００３８３）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  （ＡＴＣＣ  １２６３３）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅａｃｔａｎｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｉｎｏｓａ  （ＡＴＣＣ  １４６０６）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂａｌｅａｒｉｃａ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｔｅｏｌａ  （ＡＴＣＣ  ４３２７３）；．  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ  （ＡＴＣＣ  １���５８８）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ  （ＡＴＣＣ  ３３６１４）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｖｅｌｌａｎａｅ  （ＡＴＣＣ  ７００３３１）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ  （ＡＴＣＣ  ３３６１５）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  （ＡＴＣＣ  １０８５７）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ  （ＡＴＣＣ  ３５１０４）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｌｉａｅ  （ＡＴＣＣ  ３３０５０）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  （ＡＴＣＣ  １９３１０）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ  （ＡＴＣＣ  １３２２３）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ  （ＡＴＣＣ  ３５９６１）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ  （ＡＴＣＣ  ７００６８８）；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ；および  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｘｉａｍｅｎｅｎｓｉｓ。１つの実施形態において、アスパラギナーゼの発現のための宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。
【００５６】
いくつかの場合において、宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１７」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１７」は、例えば以下のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  種に属するものを含む「ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ」として当該技術分野において既知のプロテオバクテリアの群として定義される：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒｅｎｎｅｒｉ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｄｒｅｌｌａ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｄｒｉｎａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｒｕｇａｔａ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｓｓａｒｄｉｉ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｉｇｕｌａｅ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｅｓｉａｅ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｘａｎｔｈａ；  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｏｌａａｓｉｉ；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ。
【００５７】
プロテアーゼ
１つの実施形態において、本願明細書中で提供される方法は、１以上のプロテアーゼ遺伝子中の１以上の変異（例えば、部分的または完全な欠失）を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞を使用して、組み換えアスパラギナーゼタンパク質を製造することを含む。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ遺伝子中の変異は、組み換えアスパラギナーゼタンパク質の生成を促進する。
【００５８】
例示的な標的プロテアーゼ遺伝子は、以下のように分類されるそれらのプロテアーゼを含む：アミノペプチダーゼ；ジペプチダーゼ；ジペプチジルペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼ；ペプチジルジペプチダーゼ；セリン型カルボキシペプチダーゼ；メタロカルボキシペプチダーゼ；システイン型カルボキシペプチダーゼ；オメガペプチダーゼ；セリンプロテイナーゼ；システインプロテイナーゼ；アスパラギン酸プロテイナーゼ；メタロプロテイナーゼ；または未知のメカニズムのプロテイナーゼ。
【００５９】
アミノペプチダーゼは、サイトゾルアミノペプチダーゼ（ロイシルアミノペプチダーゼ）、膜アラニルアミノペプチダーゼ、シスチニルアミノペプチダーゼ、トリペプチドアミノペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、アルギニルアミノペプチダーゼ、グルタミルアミノペプチダーゼ、ｘ−プロアミノペプチダーゼ、細菌性ロイシルアミノペプチダーゼ、好熱性アミノペプチダーゼ、クロストリジウムアミノペプチダーゼ、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、ｘ−ｔｒｐアミノペプチダーゼ、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ｄ−立体特異的アミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼｅｙを含む。ジペプチダーゼは、ｘ−ｈｉｓジペプチダーゼ、ｘ−ａｒｇジペプチダーゼ、ｘ−ｍｅｔｈｙＬ−ｈｉｓジペプチダーゼ、ｃｙｓ−ｇｌｙジペプチダーゼ、ｇｌｕ−ｇｌｕジペプチダーゼ、プロ−ｘジペプチダーゼ、ｘ−プロジペプチダーゼ、ｍｅｔ−ｘジペプチダーゼ、非立体特異的ジペプチダーゼ、サイトゾル非特異的ジペプチダーゼ、膜ジペプチダーゼ、ベータ−ａｌａ−ｈｉｓジペプチダーゼを含む。ジペプチジルペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼは、ジペプチジルペプチダーゼｉ、ジペプチジルペプチダーゼｉｉ、ジペプチジルペプチダーゼｉｉｉ、ジペプチジルペプチダーゼｉｖ、ジペプチジルジペプチダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、トリペプチジルペプチダーゼＩＩを含む。ペプチジルジペプチダーゼは、ペプチジルジペプチダーゼａおよびペプチジルジペプチダーゼｂを含む。セリン型カルボキシペプチダーゼは、リソソームプロ−ｘカルボキシペプチダーゼ、セリン型Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＣ、カルボキシペプチダーゼＤを含む。メタロカルボキシペプチダーゼは、カルボキシペプチダーゼａ、カルボキシペプチダーゼＢ、リジン（アルギニン）カルボキシペプチダーゼ、ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、アラニンカルボキシペプチダーゼ、ムラモイルペンタペプチドカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼｈ、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＭ、ムラモイルテトラペプチドカルボキシペプチダーゼ、ｚｉｎｃ  ｄ−ａｌａ−ｄ−ａｌａカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ２、膜プロ−ｘカルボキシペプチダーゼ、チューブリニル−ｔｙｒカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼｔを含む。オメガペプチダーゼは、アシルアミノアシル−ペプチダーゼ、ペプチジル−グリシンアミダーゼ、ピログルタミル−ペプチダーゼＩ、ベータ−アスパルチル−ペプチダーゼ、ピログルタミル−ペプチダーゼＩＩ、ｎ−ホルミルメチオニル−ペプチダーゼ、プテロイルポリ−［ガンマ］−グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、ガンマ−ｇｌｕ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、アシルムラモイル−ａｌａペプチダーゼを含む。セリンプロテイナーゼは、キモトリプシン、キモトリプシンｃ、メトリジン、トリプシン、トロンビン、凝固因子Ｘａ、プラスミン、エンテロペプチダーゼ、アクロシン、アルファ−溶菌プロテアーゼ、グルタミル，エンドペプチダーゼ、カテプシンＧ、凝固因子ｖｉｉ���、凝固因子ｉｘａ、ククミシ、プロリルオリゴペプチダーゼ、凝固因子ｘｉａ、ブラキウリン、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、膵エラスターゼ、白血球エラスターゼ、凝固因子ｘｉｉａ、キマーゼ、補体成分ｃ１ｒ５５、補体成分ｃ１ｓ５５、古典的補体経路ｃ３／ｃ５変換酵素、補体因子Ｉ、補体因子Ｄ、代替補体経路ｃ３／ｃ５変換酵素、セレビシン、ヒポデルミンＣ、リシルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ１ａ、ガンマ−レニ、ベノビンａｂ、ロイシルエンドペプチダーゼ、トリプターゼ、スクテラリン、ケキシン、サブチリシン、オリジン、エンドペプチダーゼｋ、サーモマイコリン、テルミターゼ、エンドペプチダーゼＳＯ、Ｔ−プラスミノーゲンアクチベーター、プロテインＣ、膵エンドペプチダーゼＥ、膵エラスターゼｉｉ、ＩＧＡ特異的セリンエンドペプチダーゼ、Ｕ−プラスミノーゲン、アクチベーター、ベノビンＡ、フリン、ミエロブラスチン、セメノゲラーゼ、グランザイムＡまたは細胞毒性Ｔリンパ球プロテイナーゼ１、グランザイムＢまたは細胞毒性Ｔリンパ球プロテイナーゼ２、ストレプトグリシンＡ、トレプトグリシンＢ、グルタミルエンドペプチダーゼＩＩ、オリゴペプチダーゼＢ、リムルス凝固因子ｃ、リムルス凝固因子、リムルス凝固酵素、オムプチン、リプレッサーｌｅｘａ、細菌リーダーペプチダーゼＩ、トガビリン、フラビリンを含む。システインプロテイナーゼは、カテプシンＢ、パパイン、フィシン、キモパパイン、アスクレパイン、クロストリパイン、ストレプトパイン、アクチニド、カテプシン１、カテプシンＨ、カルパイン、カテプシンｔ、グリシル，エンドペプチダーゼ、癌プロコアグラント、カテプシンＳ、ピコルナイン３Ｃ、ピコルナイン２Ａ、カリカイン、アナナイン、ステムブロメライン、フルートブロメライン、レグマイン、ヒストリセイン、インターロイキン１−ベータ変換酵素を含む。アスパラギン酸プロテイナーゼは、ペプシンＡ、ペプシンＢ、ガストリクシン、キモシン、カテプシンＤ、ネオペンテシン、レニン、レトロペプシン、プロ−オピオメラノコルチン変換酵素、アスペルギロペプシンＩ、アスペルギロペプシンＩＩ、ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン、ムコロペプシン、カンジダペプシン、サッカロペプシン、ロドトルラペプシン、フィサロペプシン、アクロシリンドロペプシン、ポリポロペプシン、ピクノポロペプシン、シタリドペプシンａ、シタリドペプシンｂ、キサントモナペプシン、カテプシンｅ、バリアペプシン、細菌リーダーペプチダーゼＩ、シュードモナペプシン、プラスメプシンを含む。メタロプロテイナーゼは、アトロリジンａ、微生物コラゲナーゼ、ロイコリシン、間質性コラゲナーゼ、ネプリライシン、エンベリシン、ｉｇａ特異的メタロエンドペプチダーゼ、プロコラーゲンＮ−エンドペプチダーゼ、チメットオリゴペプチダーゼ、ニューロリシン、ストロメライシン１、メプリンＡ、プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼ、ペプチジル−ｌｙｓメタロエンドペプチダーゼ、アスタシン、ストロメライシン，２、マトリリシンゼラチナーゼ、エアロモノリシン、プソイドリシン、サーモリシン、バシロリシン、オーレオリシン、コッコリシン、ミコリシン、ベータ−���解メタロエンドペプチダーゼ、ペプチジル−ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ、好中球コラゲナーゼ、ゼラチナーゼＢ、リーシュマノリシン、サッカロリシン、オートリシン、ジュウテロリシン、セラリシン、アトロリシンＢ、アトロリシンＣ、アトロキサーゼ、アトロリシンＥ、アトロリシンＦ、アダマリシン、ホリリシン、ルベリシン、ボトロパシン、ボロリシン、オフィオリシン、トリメレリシンＩ、トリメトリシンＩＩ、ムクロリシン、ピトリリシン、インシュリシン、Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ、ルセリシン、ミトコンドリア媒介ペプチダーゼ、ダクチリシン、ナルジリシン、マグノリシン、メプリンＢ、ミトコンドリア処理ペプチダーゼ、マクロファージエラスターゼ、コリオリシン、トキシリシンを含む。未知のメカニズムのプロテイナーゼは、サーモプシンおよび多触媒エンドペプチダーゼ複合体を含む。
【００６０】
特定のプロテアーゼは、プロテアーゼおよびシャペロン様活性の両方を有する。これらのプロテアーゼがタンパク質収量および／または質に悪影響を及ぼしている場合、それらのプロテアーゼ活性を特異的に欠失させることはしばしば有用であり、それらのシャペロン活性がタンパク質収量および／または質にプラスの影響を与えてもよい場合、それらは過剰発現される。これらのプロテアーゼは、Ｈｓｐ１００（Ｃｌｐ／Ｈｓｌ）ファミリーメンバーＲＸＦ０４５８７．１（ｃｌｐＡ）、ＲＸＦ０８３４７．１、ＲＸＦ０４６５４．２（ｃｌｐＸ）、ＲＸＦ０４６６３．１、ＲＸＦ０１９５７．２（ｈｓｌＵ）、ＲＸＦ０１９６１．２（ｈｓｌＶ）；ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼファミリーメンバーＲＸＦ０５３４５．２（ｐｐｉＢ）；メタロペプチダーゼＭ２０ファミリーメンバーＲＸＦ０４８９２．１（アミノヒドロラーゼ）；メタロペプチダーゼＭ２４ファミリーメンバーＲＸＦ０４６９３．１（メチオニンアミノペプチダーゼ）およびＲＸＦ０３３６４．１（メチオニンアミノペプチダーゼ）；およびセリンペプチダーゼＳ２６シグナルペプチダーゼＩファミリーメンバーＲＸＦ０１１８１．１（シグナルペプチダーゼ）を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
実施形態において、アスパラギナーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼＩＩ型を発現するのに有用な宿主株は、本願発明の方法において、（例えば、欠失、部分的欠失、またはノックアウトから結果として生じる）プロテアーゼ欠損または不活性化を有するおよび／または、例えばプラスミドまたは細菌染色体からのフォールディングモジュレーターを過剰発現するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主株、例えば、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。実施形態において、宿主株は、Ｌｏｎ、ＨｓｌＵＶ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ、ＡｐｒＡ、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１、およびＡｐｒＡから選択された少なくとも１つのプロテアーを欠損している。実施形態において、宿主株は、ＬｅｐＢ、Ｔｉｇ、およびＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐから選択されたフォールディングモジュレーターを過剰発現する（つまり、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、およびＳｋｐの組み合わせ；Ｓｋｐは本願明細書中で配列番号５７として記載されるコード配列の例とともに配列番号５６として記載されるＯｍｐＨＲＸＦ４７０２．１である）。ＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐオーバーエクスプレッサー宿主において、フォールディングモジュレーターＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、およびＳｋｐ（それぞれ米国特許番号９，３９４，５７１の配列番号２５および２６および本願明細書中の配列番号５７）は、オペロンから発現できる。実施形態において、宿主株は、Ｌｏｎ、ＨｓｌＵＶ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ、ＡｐｒＡ、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１、およびＡｐｒＡから選択された少なくとも１つのプロテアーゼが欠損し、ＬｅｐＢ、Ｔｉｇ、およびＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐから選択された少なくとも１つのフォールディングモジュレーターを過剰発現する。上記実施形態のいずれかにおいて、宿主株は栄養要求性マーカーｐｙｒＦおよびｐｒｏＣを発現し、プロテアーゼ欠損を有する、および／またはフォールディングモジュレーターを過剰発現する。実施形態において、宿主株は当該技術分野において既知の任意の他の適当な選択マーカーを発現する。上記実施形態のいずれかにおいて、アスパラギナーゼ、例えば、天然Ｉ型および／またはＩＩ型アスパラギナーゼは、宿主株中で不活性化されている。実施形態において、宿主株は以下のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ宿主細胞である：ＬｏｎおよびＨｓｌＵＶを欠損している；Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ、およびＡｐｒＡを欠損している；Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１、およびＡｐｒＡが欠損し、かつＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐを過剰発現する；ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２を欠損している；ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２が欠損し、かつＴｉｇを過剰発現する；ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２が欠損し、かつＬｅｐＢを過剰発現する；ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２が欠損し、かつＬｏｎおよびＨｓｌＵＶを欠損している；ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２が欠損し、かつＬｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ、およびＡｐｒＡを欠損している宿主細胞；または、ＡｓｐＧ１および／またはＡｓｐＧ２Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｐｒｃ１、およびＡｐｒＡが欠損し、かつＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐを過剰発現する宿主細胞。ＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐオーバーエクスプレッサー宿主において、フォールディングモジュレーターＤｓｂＡ、ＤｓｂＣおよびＳｋｐ（本願明細書中で配列番号５６および５７）はオペロンから発現できる。ＨｓｌＵＶ（ＨｓｌＶＵとも呼ばれる）は、ＨｓｌＶプロテアーゼおよびＨｓｌＵ  ＡＴＰａｓｅの複合体である。ＨｓｌＵおよびＶ機能および構造は、例えば、それぞれ参照によりその全体が本願明細書中に組み込まれるＢｏｃｈｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  ＰＮＡＳ  ９４：６０７０−６０７４；  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  ＰＮＡＳ  ９９（１１）：  ７３９６−７４０１；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ９：１７７−１８４による文献に記載される。
【００６２】
これらおよび他のプロテアーゼおよびフォールディングモジュレーターは、当該技術分野において既知であり、文献、例えば米国特許番号８，６０３，８２４に記載される。例えば、特許の表ＤはＴｉｇ（ｔｉｇ、トリガーファクター、ＦＫＢＰタイプｐｐｉａｓｅ（ｅｃ  ５．２．１．８）ＲＸＦ０４６５５、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０Ａ８５０（ＴＩＧ＿Ｅ．ＣＯＬＩ））を記載する。「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄｌｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｈｏｓｔｓ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｃｅｒｔａｉｎ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題され、本願明細書中でその全体が参照により組み込まれるＷＯ２００８／１３４４６１は、Ｔｉｇ（ＲＸＦ０４６５５．２、そこで配列番号３４）、ＬｅｐＢ（ＲＸＦ０１１８１．１、そこで配列番号５６）、ＤｅｇＰ１（ＲＸＦ０１２５０、そこで配列番号５７）、ＡｐｒＡ（ＲＸＦ０４３０４．１、そこで配列番号８６）、Ｐｒｃ１（ＲＸＦ０６５８６．１、そこで配列番号１２０）、ＤｅｇＰ２、（ＲＸＦ０７２１０．１、そこで配列番号１２４）、Ｌｏｎ（ＲＸＦ０４６５３、そこで配列番号９２）；ＤｓｂＡ（ＲＸＦ０１００２．１、そこで配列番号２５）、およびＤｓｂＣ（ＲＸＦ０３３０７．１、そこで配列番号２６）を記載する。これらの配列および他のプロテアーゼおよびフォールディングモジュレーターのものも、米国特許番号９，５８０，７１９（そこで９３−９８列中の配列番号の表）に記載される。例えば、米国特許番号９，５８０，７１９は、ＨｓｌＵ（ＲＸＦ０１９５７．２）およびＨｓｌＶ（ＲＸＦ０１９６１．２）をコードする配列を、それぞれ配列番号１８および１９として提供する。
【００６３】
コドン最適化
１つの実施形態において、本願明細書中の方法は、目的の株におけるコドンの使用のために最適化された構築物からの組み換えアスパラギナーゼの発現を含む。実施形態において、株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。細菌宿主中での発現を改善するためにコドンを最適化する方法は、当該技術分野において既知であり、文献に記載される。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主株中での発現のためのコドンの最適化は、参照によりその全体が本願明細書中に組み込まれる米国特許出願公開番号２００７／０２９２９１８、「Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ」に記載される。
【００６４】
異種発現系において、最適化工程は、宿主が外来タンパク質を製造する能力を改善してもよい。タンパク質発現は、転写、ｍＲＮＡ処理、および翻訳の安定性および開始に影響を与える因子を含む因子の宿主により支配される。ポリヌクレオチド最適化工程は、宿主が外来タンパク質を製造する能力を改善する工程、ならびに研究者が発現構築物を効率的に設計するのを支援する工程を含んでもよい。最適化戦略は、例えば、翻訳開始領域の修飾、ｍＲＮＡ構造要素の変更、および異なるコドンバイアスの使用を含んでもよい。細菌宿主における異種タンパク質の発現を改善するために核酸配列を最適化する方法は、当該技術分野において既知であり、文献に記載される。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主株中での発現のためのコドンの最適化は、例えば、参照によりその全体が本願明細書中に組み込まれる米国特許出願公開番号２００７／０２９２９１８、「Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ」に記載される。
【００６５】
最適化は、異種遺伝子の多数の配列特徴のいずれにも対処する。特定の例として、まれなコドン誘導翻訳の一時停止は、しばしば、減少した異種タンパク質発現を結果として生じる。まれなコドン誘導翻訳の一時停止は、宿主生物においてはほとんど使用されず、入手可能なｔＲＮＡプールに欠損しているためタンパク質翻訳に負の効果を有してもよい目的のポリヌクレオチド内のコドンの存在を含む。宿主生物における最適な翻訳を改善する１つの方法は、合成ポリヌクレオチド配列から除去されるまれな宿主コドンを時に結果として生じるコドン最適化を実施することを含む。
【００６６】
代替の翻訳開始はまた、減少した非同一のタンパク質発現の減少を時に結果として生じる。代替の翻訳開始は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能することができるモチーフを誤って含有する合成ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合において、これらの部位は、遺伝子内部部位から切断されたタンパク質の翻訳の開始を結果として生じる。精製中に除去することがしばしば困難な切断されたタンパク質の製造の可能性を減少させる１つの方法は、最適化されたポリヌクレオチド配列から推定内部ＲＢＳ配列を排除することを含む。
【００６７】
反復誘発性のポリメラーゼのずれは、減少した異種タンパク質発現をしばしば結果として生じる。反復誘発性のポリメラーゼのずれは、フレームシフト変異を時に結果として生じるＤＮＡポリメラーゼのずれまたは途絶を引き起こすことが示されているヌクレオチド配列の反復を含む。かかる反復はまた、ＲＮＡポリメラーゼのずれをしばしば引き起こす。高いＧ＋Ｃ含量バイアスを有する生物において、ＧまたはＣヌクレオチド反復から構成されるより高い程度の反復が時にある。したがって、ＲＮＡポリメラーゼのずれを誘発する可能性を減少させる１つの方法は、ＧまたはＣヌクレオチドの拡張反復を変更することを含む。
【００６８】
二次構造への干渉はまた、減少した異種タンパク質発現を時に結果として生じる。二次構造は、ＲＢＳ配列または開始コドンをしばしば隔離し、タンパク質発現の減少に相関される。ステムループ構造はまた、転写の休止および減衰にもしばしば関与する。最適化されたポリヌクレオチド配列は通常、ＲＢＳおよびヌクレオチド配列の遺伝子コード領域内の最小限の二次構造を含有し、改善された転写および翻訳を可能にする。
【００６９】
異種タンパク質発現に時に影響する別の特徴は、制限部位の存在である。宿主発現ベクターへの転写ユニットの後続のサブクローニングに干渉する制限部位を除去することにより、ポリヌクレオチド配列が最適化される。
【００７０】
例えば、最適化プロセスはしばしば、宿主により非相同に発現される所望のアミノ酸配列を同定することにより始まる。アミノ酸配列から候補ポリヌクレオチドまたはＤＮＡが設計される。合成ＤＮＡ配列の設計中、コドンの使用頻度は、宿主発現生物のコドンの使用と比較され、まれな宿主コドンは合成配列から除去される。加えて、合成候補ＤＮＡ配列は、望ましくない酵素の制限部位を除去するおよび任意の所望のシグナル配列、リンカーまたは非翻訳領域を加えるかまたは除去するために、時に修飾される。合成ＤＮＡ配列は、Ｇ／Ｃ反復およびステムループ構造など、翻訳プロセスに干渉してもよい二次構造の存在について、しばしば分析される。候補ＤＮＡ配列を合成する前に、最適化された配列設計は、しばしばチェックされて、配列が所望のアミノ酸配列を正しくコードすることを確認する。最終的に、候補ＤＮＡ配列は、当該技術分野において既知の技術などのＤＮＡ合成技術を使用して合成される。
【００７１】
本願明細書の別の実施形態において、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓなどの宿主生物における一般的なコドンの使用は、異種ポリヌクレオチド配列の発現を最適化するためにしばしば利用される。宿主発現系における特定のアミノ酸にとって好ましいとはめったに考えられないコドンのパーセンテージおよび分布が評価される。５％および１０％使用の値は、まれなコドンの決定のためのカットオフ値としてしばしば使用される。例えば、表４に列挙されるコドンは、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＭＢ２１４ゲノム中で５％未満の計算された出現を有し、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主中で発現される最適化された遺伝子において一般に回避される。
【表４】
2021500892.tif 000006
【００７２】
本開示は、使用されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞における発現のために最適化された任意の配列を含む、任意のアスパラギナーゼコード配列の使用を検討する。使用のために検討された配列は、限定されないが、以下を除くように最適化を含む、所望の任意の程度でしばしば最適化される：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞中で５％未満で出現するコドン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞中で１０％未満で出現するコドン、まれなコドン誘導翻訳休止、推定上の内部ＲＢＳ配列、ＧまたはＣヌクレオチドの拡張反復、干渉二次構造、制限部位、またはそれらの組み合わせ。
【００７３】
さらに、本願明細書中で提供された方法の実践において有用な任意の分泌リーダーのアミノ酸配列は、任意の適する核酸配列によりコードされる。Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のためのコドン最適化は、例えば、Ｗｅｌｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、「Ｄｅｓｉｇｎ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、  ４（９）：  ｅ７００２，  Ｇｈａｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，    Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＴ−ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎｓ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、３８：２２１−２３２により記載される。
【００７４】
高いスループットスクリーン
いくつかの実施形態において、高いスループットスクリーンは、可溶性組み換えアスパラギナーゼを発現するための最適な条件を決定するためにしばしば行われる。スクリーンにおいて変化する条件は、例えば、宿主細胞、宿主細胞の遺伝的背景（例えば、異なるプロテアーゼの欠失）、発現構築物中のプロモーターのタイプ、コードされたアスパラギナーゼに融合した分泌リーダーのタイプ、成長の温度、誘導性プロモーターを使用した場合の誘導のＯＤ、追加されたインデューサーの量（例えば、ｌａｃＺプロモーターまたはその誘導体を使用した場合の誘導に使用されるＩＰＴＧの量）、タンパク質誘導の持続時間、培養物への誘導剤の添加に続く成長の温度、培養の攪拌速度、プラスミド維持のための選択の方法、容器内の培養の体積、および細胞溶解の方法を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、宿主株のライブラリー（または「アレイ」）が提供され、ここで、ライブラリー中の各株（または「宿主細胞の集団」）は、宿主細胞内の１以上の標的遺伝子の発現を調節するために遺伝的に修飾されている。「最適な宿主株」または「最適な発現系」は、アレイ中の表現型上で別個の宿主細胞の他の集団と比較して目的の発現されたタンパク質の量、質、および／または場所に基づいて、しばし同定または選択される。ゆえに、最適な宿主株は、希望の仕様に従って目的のポリペプチドを製造する株である。所望の仕様は、製造されるポリペプチドに応じて変化するが、仕様は、タンパク質の質および／または量、タンパク質が隔離されているか分泌されているか、タンパク質のフォールディングなどを含む。例えば、最適な宿主株または最適な発現系は、可溶性異種タンパク質の量、回復可能な異種タンパク質の量、適切に処理される異種タンパク質の量、適切にフォールディングされた非同一のタンパク質の量、活性な非同一のタンパク質の量、および／または指標株、すなわち比較のために使用される株により製造されるものに対する特定の絶対レベルまたは特定のレベルの異種タンパク質の総量により特徴付けられる収量を製造する。
【００７６】
異種タンパク質の発現において改善された収量および／または質を有する株を同定するために微生物宿主をスクリーニングする方法は、例えば、米国特許出願公開番号２００８０２６９０７０に記載される。
【００７７】
細菌成長条件
本願明細書中の方法において有用な成長条件は、約４℃から約４２℃の温度および約５．７から約８．８のｐＨをしばしば含む。ｌａｃＺプロモーターまたはその誘導体を有する発現構築物を使用する場合、培養物に終濃度約０．０１ｍＭから約１．０ｍＭでＩＰＴＧを加えることにより発現がしばしば誘導される。
【００７８】
培養物のｐＨは、ｐＨ緩衝液および当業者に既知な方法を使用して時に維持される。培養中のｐＨのコントロールは、アンモニア水を使用してしばしば達成される。実施形態において、培養物のｐＨは約５．７から約８．８である。特定の実施形態において、ｐＨは約５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、または８．８である。他の実施形態においてｓ、ｐＨは約５．７から５．９、５．８から６．０、５．９から６．１、６．０から６．２、６．１から６．３、６．２から６．５、６．４から６．７、６．５から６．８、６．６から６．９、６．７から７．０、６．８から７．１、６．９から７．２、７．０から７．３、７．１から７．４、７．２から７．５、７．３から７．６、７．４から７．７、７．５から７．８、７．６から７．９、７．７から８．０、７．８から８．１、７．９から８．２、８．０から８．３、８．１から８．４、８．２から８．５、８．３から８．６、８．４から８．７、または８．５から８．８である。さらに他の実施形態において、ｐＨは約５．７から６．０、５．８から６．１、５．９から６．２、６．０から６．３、６．１から６．４、または６．２から６．５である。特定の実施形態において、ｐＨは約５．７から約６．２５である。
【００７９】
実施形態において、成長温度は約４°Ｃから約４２°Ｃに維持される。特定の実施形態において、成長温度は約４°Ｃ、約５°Ｃ、約６°Ｃ、約７°Ｃ、約８°Ｃ、約９°Ｃ、約１０°Ｃ、約１１°Ｃ、約１２°Ｃ、約１３°Ｃ、約１４°Ｃ、約１５°Ｃ、約１６°Ｃ、約１７°Ｃ、約１８°Ｃ、約１９°Ｃ、約２０°Ｃ、約２１°Ｃ、約２２°Ｃ、約２３°Ｃ、約２４°Ｃ、約２５°Ｃ、約２６°Ｃ、約２７°Ｃ、約２８°Ｃ、約２９°Ｃ、約３０°Ｃ、約３１°Ｃ、約３２°Ｃ、約３３°Ｃ、約３４°Ｃ、約３５°Ｃ、約３６°Ｃ、約３７°Ｃ、約３８°Ｃ、約３９°Ｃ、約４０°Ｃ、約４１°Ｃ、または約４２°Ｃである。他の実施形態において、成長温度は約２５°Ｃから約２７°Ｃ、約２５°Ｃから約２８°Ｃ、約２５°Ｃから約２９°Ｃ、約２５°Ｃから約３０°Ｃ、約２５°Ｃから約３１°Ｃ、約２５°Ｃから約３２°Ｃ、約２５°Ｃから約３３°Ｃ、約２６°Ｃから約２８°Ｃ、約２６°Ｃから約２９°Ｃ、約２６°Ｃから約３０°Ｃ、約２６°Ｃから約３１°Ｃ、約２６°Ｃから約３２°Ｃ、約２７°Ｃから約２９°Ｃ、約２７°Ｃから約３０°Ｃ、約２７°Ｃから約３１°Ｃ、約２７°Ｃから約３２°Ｃ、約２６°Ｃから約３３°Ｃ、約２８°Ｃから約３０°Ｃ、約２８°Ｃから約３１°Ｃ、約２８°Ｃから約３２°Ｃ、約２９°Ｃから約３１°Ｃ、約２９°Ｃから約３２°Ｃ、約２９°Ｃから約３３°Ｃ、約３０°Ｃから約３２°Ｃ、約３０°Ｃから約３３°Ｃ、約３１°Ｃから約３３°Ｃ、約３１°Ｃから約３２°Ｃ、約３０°Ｃから約３３°Ｃ、または約３２°Ｃから約３３°Ｃに維持される。他の実施形態において、温度は培養中に変化する。特定の実施形態において、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする構築物からの発現を誘導する薬剤が培養に加えられる前に温度が約３０°Ｃから約３２°Ｃに維持され、発現を誘導する薬剤の添加、例えばＩＰＴＧが培養に加えられる後に、温度が約２５°Ｃから約２７°Ｃに下げられる。１つの実施形態において、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする構築物からの発現を誘導する薬剤を培養に加える前に温度が約３０°Ｃに維持され、発現を誘導する薬剤の添加後、温度が約２５°Ｃに下げられる。
【００８０】
誘導
本願明細書中で他に記載されるように、誘導性プロモーターは、組み換えアスパラギナーゼ、例えば、ｌａｃプロモーターの発現をコントロールするために発現構築物中でしばしば使用される。ｌａｃプロモーター誘導体またはファミリーメンバー、例えばｔａｃプロモーターの場合、エフェクター化合物は、ＰＴＧ様無償性インデューサー（「イソプロピルチオガラクトシド」とも呼ばれるイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）などのインデューサーである。実施形態において、ｌａｃプロモーター誘導体が使用され、細胞密度が約２５から約１６０のＯＤ５７５により同定されるレベルに達したときに、ＩＰＴＧの約０．０１ｍＭから約１．０ｍＭの終濃度への添加により、アスパラギナーゼ発現が誘導される。実施形態において、アスパラギナーゼの培養誘導時のＯＤ５７５は、約２５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０である。他の実施形態において、ＯＤ５７５は、約８０から約１００、約１００から約１２０、約１２０から約１４０、約１４０から約１６０である。他の実施形態において、ＯＤ５７５は約８０から約１２０、約１００から約１４０、または約１２０から約１６０である。他の実施形態において、ＯＤ５７５は約８０から約１４０、または約１００から１６０である。細胞密度は他の方法でしばしば測定され、他の単位で、例えば単位体積あたりの細胞数で表される。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ培養物の約２５から約１６０のＯＤ２５は、１ｍＬあたりおよそ４ｘ１０１０から約１．６ｘ１０１１のコロニー形成単位または１１から７０ｇ／Ｌ乾燥細胞重量と同等である。実施形態において、アスパラギナーゼ発現は、細胞密度が約０．０５ｇ／ｇから約０．４ｇ／ｇの湿潤細胞重量に達したときに、ＩＰＴＧの約０．０１ｍＭから約１．０ｍＭの終濃度への添加により誘導される。実施形態において、湿潤細胞重量は、約０．０５ｇ／ｇ、約０．１ｇ／ｇ、約０．１５ｇ／ｇ、約０．２ｇ／ｇ、約０．２５ｇ／ｇ、約０．３０ｇ／ｇ、約０．３５ｇ／ｇ、約０．４０ｇ／ｇ、約０．０５ｇ／ｇから約０．１ｇ／ｇ、約０．０５ｇ／ｇから約０．１５ｇ／ｇ、約０．０５ｇ／ｇから約０．２０ｇ／ｇ、約０．０５ｇ／ｇから約０．２５ｇ／ｇ、約０．０５ｇ／ｇから約０．３０ｇ／ｇ、約０．０５ｇ／ｇから約０．３５ｇ／ｇ、約０．１ｇ／ｇから約０．４０ｇ／ｇ、約０．１５ｇ／ｇから約０．４０ｇ／ｇ、約０．２０ｇ／ｇから約０．４０ｇ／ｇ、約０．２５ｇ／ｇから約０．４０ｇ／ｇ、約０．３０ｇ／ｇから約０．４０ｇ／ｇ、または約０．３５ｇ／ｇから約０．４０ｇ／ｇである。実施形態において、培養誘導時の細胞密度は、細胞密度または測定の単位の決定のために使用される方法にかかわらず、ＯＤ５７５での吸光度により本願明細書中で特定された細胞密度と同等である。当業者は、任意の細胞培養に適する変換を行う方法を知っているであろう。
【００８１】
実施形態において、培養の最終ＩＰＴＧ濃度は、約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０３ｍＭ、約０．０４ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．０６ｍＭ、約０．０７ｍＭ、約０．０８ｍＭ、約０．０９ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、または約１ｍＭである。他の実施形態において、培養物の最終ＩＰＴＧ濃度は、約０．０８ｍＭから約０．１ｍＭ、約．１ｍＭから約０．２ｍＭ、約．２ｍＭから約０．３ｍＭ、約．３ｍＭから約０．４ｍＭ、約．２ｍＭから約０．４ｍＭ、約０．０８から約０．２ｍＭ、または約０．１から１ｍＭである。
【００８２】
非ｌａｃ型プロモーターが使用される実施形態において、本願明細書中でおよび文献で記載されるように、他のインデューサーまたはエフェクターがしばしば使用される。１つの実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。
【００８３】
誘導剤の添加後、培養物は、その間組み換えアスパラギナーゼが発現される一定期間、例えば約２４時間しばしば成長される。誘導剤の添加後、培養物は、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約３６時間、または約４８時間、しばしば成長される。培養物に誘導剤を添加した後、培養物は約１から４８時間、約１から２４時間、約１０から２４時間、約１５から２４時間、または約２０から２４時間成長される。細胞培養物はしばしば、遠心分離により濃縮され、培養ペレットは、その後の溶解手順に適する緩衝液または溶液に再懸濁される。
【００８４】
実施形態において、細胞は、高圧機械的細胞破壊のための装置（例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ、Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ、Ｎｉｒｏ−ＳｏａｖｉホモジナイザーまたはＡＰＶ−Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーである商業的に入手可能なもの）を使用して破壊される。アスパラギナーゼを発現する細胞は、例えば超音波処理を使用して、しばしば破壊される。細胞を溶解するための当該技術分野において既知の任意の適する方法は、可溶性画分を放出するためにしばしば使用される。例えば、実施形態において、細胞壁溶解酵素およびＥＤＴＡなどの化学および／または酵素細胞溶解試薬がしばしば使用される。冷凍または以前に保存された培養物の使用も、本願明細書中の方法において検討される。培養物は時に、溶解前にＯＤ正規化される。例えば、細胞は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０のＯＤ６００にしばしば正規化される。
【００８５】
遠心分離は、任意の適する装置および方法を使用して実施される。不溶性画分から不溶性画分を分離する目的での細胞培養またはライセートの遠心分離は、当技術分野において周知である。例えば、溶解された細胞は時に、２０，８００×ｇで２０分間（４°Ｃで）遠心分離され、手動または自動液体処理を使用して上清が除去される。ペレット（不溶性）画分は、緩衝化溶液、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に再懸濁される。再懸濁はしばしば、例えば、オーバーヘッドミキサーに接続されたインペラー、磁気攪拌棒、ロッキングシェーカーなどの装置を使用して行われる。
【００８６】
「可溶性画分」、すなわちライセートの遠心分離後に得られる可溶性上清、および「不溶性画分」、すなわちライセートの遠心分離後に得られるペレットは、培養物の溶解および遠心分離の結果である。
【００８７】
発酵形式
１つの実施形態において、発酵は組み換えアスパラギナーゼの製造方法において使用される。本開示による発現系は、任意の発酵形式において培養される。例えば、バッチ、フェッドバッチ、半連続、および連続発酵モードは、本願明細書中で採用されてもよい。
【００８８】
実施形態において、発酵培地は、富栄養培地、最少培地、およびミネラル塩培地から選択されてもよい。他の実施形態において、最少培地またはミネラル塩培地のいずれかが選択される。特定の実施形態において、ミネラル塩培地が選択される。
【００８９】
ミネラル塩培地は、ミネラル塩および、グルコース、スクロース、またはグリセロールなどの炭素源からなる。ミネラル塩培地の例は、例えば、Ｍ９培地、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ培地（ＡＴＣＣ１７９）、およびＤａｖｉｓおよびＭｉｎｇｉｏｌｉ培地（Ｂ  Ｄ  Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｅ  Ｓ  Ｍｉｎｇｉｏｌｉ（１９５０）Ｊ．Ｂａｃｔ．６０：１７−２８を参照）を含む。ミネラル塩培地を作るために使用されるミネラル塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウム、硫酸マグネシウムまたは塩化マグネシウム、および塩化カルシウム、ホウ酸塩、および鉄、銅、マンガンおよび亜鉛の硫酸塩などの微量ミネラルから選択されるものを含む。典型的に、ミペプトン、トリプトン、アミノ酸、または酵母エキスなどの有機窒素源は、ミネラル塩培地中に含まれていない。代わりに、無機窒素源が使用され、これは、例えば、アンモニウム塩、アンモニア水、およびガス状アンモニアの中から選択されてもよい。ミネラル塩培地は典型的に、炭素源としてグルコースまたはグリセロールを含有する。ミネラル塩培地と比較して、最少培地は、ミネラル塩および炭素ソースをしばしば含有するが、例えば、アミノ酸、ビタミン、ペプトン、または他の成分を、最小限のレベルで添加されるものの、低いレベルで、しばしば補足される。培地は、当該技術分野、例えば、上記で参照され、参照により組み込まれる米国特許出願公開番号２００６／００４０３５２に記載される方法を使用してしばしば調製される。本願明細書中の方法において有用な培養手順およびミネラル塩培地の詳細は、Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１、「Ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ」、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０  （１）：１７−２７により記載される。
【００９０】
発酵は、任意の規模で実施してもよい。本開示による発現系は、任意の規模での組み換えタンパク質発現に有用である。ゆえに、例えば、マイクロリットル規模、ミリリットル規模、センチリットル規模、およびデシリットル規模の発酵体積を使用してもよく、１リットル規模およびより大きな発酵体積がしばしば使用される。
【００９１】
実施形態において、発酵体積は、約１リットル以上である。実施形態において、発酵体積は約０．５リットルから約１００リットルである。実施形態において、発酵体積は、約１リットル、約２リットル、約３リットル、約４リットル、約５リットル、約６リットル、約７リットル、約８リットル、約９リットル、または約１０リットルである。実施形態において、発酵体積は約０．５リットルから約２リットル、約０．５リットルから約５リットル、約０．５リットルから約１０リットル、約０．５リットルから約２５リットル、約０．５リットルから約５０リットル、約０．５リットルから約７５リットル、約１０リットルから約２５リットル、約２５リットルから約５０リットル、または約５０リットルから約１００リットルである。他の実施形態において、発酵体積は、５リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、２００リットル、５００リットル、１，０００リットル、２，０００リットル、５，０００リットル、１０，０００リットル、または５０，０００リットル以上である。
【００９２】
タンパク質分析
実施形態において、本願明細書中で提供される方法により製造される組み換えアスパラギナーゼタンパク質が分析される。組み換えアスパラギナーゼは時に、例えばバイオレイヤー干渉法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、ファーウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、吸光度、またはマススぺクトロメトリー（例えばタンデムマススぺクトロメトリー）により分析される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、生成される組み換えアスパラギナーゼタンパク質の濃度および／または量は、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、吸光度、クマシー染色、マススぺクトロメトリーなどにより決定される。
【００９４】
本明細書中で記載される不溶性画分および可溶性画分におけるタンパク質収量は、当業者に既知の方法、例えば、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、およびウェスタンブロット分析によりしばしば決定される。可溶性画分は、例えばバイオレイヤー干渉法を使用してしばしば評価される。
【００９５】
アスパラギナーゼ単量体は、例えば、細胞ライセート、細胞ソニケートにおいて、およびさらなる精製の際、活性な四量体を形成することができる。細菌発現系、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主株における組み換えアスパラギナーゼの発現に続き、組み換えタンパク質は、当該技術分野において既知の任意の適切な方法を使用して、例えば、宿主細胞タンパク質を除去するために精製できる。精製方法は、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはこれらの組み合わせおよび／または他の既知の方法を含む。アスパラギナーゼタンパク質精製は、文献、例えばそれぞれが参照によりその全体が本願明細書中に組み込まれる米国特許番号５，３１０，６７０、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ」および米国特許番号８，３２３，９４８、「Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」に記載される。発現実験に基づいて、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ中で発現されたＩＩ型アスパラギナーゼは、ソニケートにおける活性な四量体のアスパラギナーゼ酵素として存在する。
【００９６】
実施形態において、未精製または精製されたアスパラギナーゼ試料の量の測定可能な特性（例えば、活性なおよび／またはインタクトなタンパク質を示す活性、サイズ、長さ、または他の特性）を、アスパラギナーゼ標準試料（例えば、商業的に得られたアスパラギナーゼ）の同じ量の測定可能な特性と比較される。試料中のアスパラギナーゼタンパク質の量は、タンパク質測定のための当該技術分野において既知の任意の適当なアッセイにより決定できると理解される。
【００９７】
タンパク質収量の有用な尺度は、例えば、培養体積あたりの組み換えタンパク質の量（例えば、タンパク質のグラムまたはミリグラム／培養のリットル）、溶解後に得られた不溶性ペレット中で測定される組み換えタンパク質のパーセントまたは画分（例えば、抽出上清中の組み換えタンパク質の量／不溶性画分中のタンパク質の量）、活性なタンパク質のパーセントまたは画分（例えば、活性なタンパク質の量／アッセイ中で使用されるタンパク質の量）、総細胞タンパク質（ｔｃｐ）のパーセントまたは画分、タンパク質／細胞の量、およびパーセント乾燥バイオマスを含む。
【００９８】
実施形態において、本願明細書中の方法は、約２０％から約９０％の可溶性組み換えアスパラギナーゼタンパク質、例えば単量体または四量体ＩＩ型アスパラギナーゼの収量を得るために使用される。特定の実施形態において、可溶性組み換えアスパラギナーゼの収量は、約２０％総細胞タンパク質、約２５％総細胞タンパク質、約３０％総細胞タンパク質、約３１％総細胞タンパク質、約３２％総細胞タンパク質、約３３％総細胞タンパク質、約３４％総細胞タンパク質、約３５％総細胞タンパク質、約３６％総細胞タンパク質、約３７％総細胞タンパク質、約３８％総細胞タンパク質、約３９％総細胞タンパク質、約４０％総細胞タンパク質、約４１％総細胞タンパク質、約４２％総細胞タンパク質、約４３％総細胞タンパク質、約４４％総細胞タンパク質、約４５％総細胞タンパク質、約４６％総細胞タンパク質、約４７％総細胞タンパク質、約４８％総細胞タンパク質、約４９％総細胞タンパク質、約５０％総細胞タンパク質、約５１％総細胞タンパク質、約５２％総細胞タンパク質、約５３％総細胞タンパク質、約５４％総細胞タンパク質、約５５％総細胞タンパク質、約５６％総細胞タンパク質、約５７％総細胞タンパク質、約５８％総細胞タンパク質、約５９％総細胞タンパク質、約６０％総細胞タンパク質、約６５％総細胞タンパク質、約７０％総細胞タンパク質、約７５％総細胞タンパク質、約８０％総細胞タンパク質、約８５％総細胞タンパク質、または約９０％総細胞タンパク質である。いくつかの実施形態において、可溶性組み換えアスパラギナーゼの収量は、約２０％から約２５％総細胞タンパク質、約２０％から約３０％総細胞タンパク質、約２０％から約３５％総細胞タンパク質、約２０％から約４０％総細胞タンパク質、約２０％から約４５％総細胞タンパク質、約２０％から約５０％総細胞タンパク質、約２０％から約５５％総細胞タンパク質、約２０％から約６０％総細胞タンパク質、約２０％から約６５％総細胞タンパク質、約２０％から約７０％総細胞タンパク質、約２０％から約７５％総細胞タンパク質、約２０％から約８０％総細胞タンパク質、約２０％から約８５％総細胞タンパク質、約２０％から約９０％総細胞タンパク質、約２５％から約９０％総細胞タンパク質、約３０％から約９０％総細胞タンパク質、約３５％から約９０％総細胞タンパク質、約４０％から約９０％総細胞タンパク質、約４５％から約９０％総細胞タンパク質、約５０％から約９０％総細胞タンパク質、約５５％から約９０％総細胞タンパク質、約６０％から約９０％総細胞タンパク質、約６５％から約９０％総細胞タンパク質、約７０％から約９０％総細胞タンパク質、約７５％から約９０％総細胞タンパク質、約８０％から約９０％総細胞タンパク質、約８５％から約９０％総細胞タンパク質、約３１％から約６０％総細胞タンパク質、約３５％から約６０％総細胞タンパク質、約４０％から約６０％総細胞タンパク質、約４５％から約６０％総細胞タンパク質、約５０％から約６０％総細胞タンパク質、約５５％から約６０％総細胞タンパク質、約３１％から約５５％総細胞タンパク質、約３１％から約５０％総細胞タンパク質、約３１％から約４５％総細胞タンパク質、約３１％から約４０％総細胞タンパク質、約３１％から約３５％総細胞タンパク質、約３５％から約５５％総細胞タンパク質、または約４０％から約５０％総細胞タンパク質である。
【００９９】
実施形態において、本願明細書中の方法は、約２０％から約９０％総細胞タンパク質の、可溶性組み換えアスパラギナーゼタンパク質、例えば単量体または四量体ＩＩ型アスパラギナーゼの収量を得るために使用される。特定の実施形態において、可溶性組み換えアスパラギナーゼの収量は、約１グラム／リットル、約２グラム／リットル、約３グラム／リットル、約４グラム／リットル、約５グラム／リットル、約６グラム／リットル、約７グラム／リットル、約８グラム／リットル、約９グラム／リットル、約１０グラム／リットル、約１１グラム／リットル、約１２グラム／リットル、約１３グラム／リットル、約１４グラム／リットル、約１５グラム／リットル、約１６グラム／リットル、約１７グラム／リットル、約１８グラム／リットル、約１９グラム／リットル、約２０グラム／リットル、約２１グラム／リットル、約２２グラム／リットル、約２３グラム／リットル約２４グラム／リットル、約２５グラム／リットル、約２６グラム／リットル、約２７グラム／リットル、約２８グラム／リットル、約３０グラム／リットル、約３５グラム／リットル、約４０グラム／リットル、約４５グラム／リットル約５０グラム／リットル約１グラム／リットルから約５グラム／リットル、約１グラムから約１０グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約１２グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約１３グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約１４グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約１５グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約１６グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約１７グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約１８グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約１９グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約２０グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約２１グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約２２グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約２３グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約２４グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約３０グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約４０グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約５０グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約１２グラム／リットル、約１２グラム／リットルから約１４グラム／リットル、約１４グラム／リットルから約１６グラム／リットル、約１６グラム／リットルから約１８グラム／リットル、約１８グラム／リットルから約２０グラム／リットル、約２０グラム／リットルから約２２グラム／リットル、約２２グラム／リットルから約２４グラム／リットル、約２３グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１１グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１２グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１３グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１４グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１５グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１６グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１７グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１８グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１９グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約２０グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約２１グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約２２グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約２３グラム／リットルから約２５グラム／リットル、または約２４グラム／リットルから約２５グラム／リットルである。実施形態において、可溶性組み換えタンパク質収量は、約１０ｇｒａｍ／リットルから約１３グラム／リットル、約１２グラム／リットルから約１４グラム／リットル、約１３グラム／リットルから約１５グラム／リットル、約１４グラム／リットルから約１６グラム／リットル、約１５グラム／リットルから約１７グラム／リットル、約１６グラム／リットルから約１８グラム／リットル、約１７グラム／リットルから約１９グラム／リットル、約１８グラム／リットルから約２０グラム／リットル、約２０グラム／リットルから約２２グラム／リットル、約２２グラム／リットルから約２４グラム／リットル、または約２３グラム／リットルから約２５グラム／リットルである。実施形態において、可溶性組み換えタンパク質収量は、約１０グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１２グラム／リットルから約２４グラム／リットル、約１４グラム／リットルから約２２グラム／リットル、約１６グラム／リットルから約２０グラム／リットル、または約１８グラム／リットルから約２０グラム／リットルである。実施形態において、抽出されたタンパク質収量は、約５グラム／リットルから約１５グラム／リットル、約５グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約１５グラム／リットル、約１０グラム／リットルから約２５グラム／リットル、約１５グラム／リットルから約２０グラム／リットル、約１５グラム／リットルから約２５グラム／リットル、または約１８グラム／リットルから約２５グラム／リットルである。
【０１００】
実施形態において、可溶性画分中に検出される組み換えアスパラギナーゼ、例えば単量体または四量体ＩＩ型アスパラギナーゼの量は、製造される総組み換えアスパラギナーゼの量の約１０％から約１００％である。実施形態において、この量は、製造される総組み換えアスパラギナーゼの量の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％、または約１００％である。実施形態において、この量は、製造される総組み換えアスパラギナーゼの量の約１０％から約２０％、２０％から約５０％、約２５％から約５０％、約２５％から約５０％、約２５％から約９５％、約３０％から約５０％、約３０％から約４０％、約３０％から約６０％、約３０％から約７０％、約３５％から約５０％、約３５％から約７０％、約３５％から約７５％、約３５％から約９５％、約４０％から約５０％、約４０％から約９５％、約５０％から約７５％、約５０％から約９５％、約７０％から約９５％、または約８０から約１００％である。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、可溶性組み換えアスパラギナーゼ、例えば単量体または四量体ＩＩ型アスパラギナーゼの量は、培養物中の製造される総可溶性タンパク質のパーセンテージとして表される。所与の細胞密度での細胞培養の組み換えアスパラギナーゼタンパク質の重量／体積で表されるデータは、総細胞タンパク質のパーセント組み換えタンパク質として表されるデータに変換できる。例えば、所与の細胞密度での細胞培養の体積あたりの総細胞タンパク質の量を知って、体積タンパク質収量を％総細胞タンパク質に変換することは、当業者の能力の範囲内である。この数は、１）所与の細胞密度での培養の細胞重量／体積、および２）総タンパク質に含まれる細胞重量のパーセントがわかっている場合に決定できる。例えば、ＯＤ５５０が１．０の場合、Ｅ．ｃｏｌｉの乾燥細胞重量は０．５グラム／リットルであると報告される（「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  Ｂｅｎｃｈ  Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒｓ」、Ｌｉｎ，  Ｎ．Ｓ．，および  Ｓｗａｒｔｚ，  Ｊ．Ｒ．，  １９９２，  ＭＥＴＨＯＤＳ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４：  １５９−１６８）。細菌細胞は、多糖類、脂質、核酸、ならびにタンパク質で構成される。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、タンパク質がＥ．ｃｏｌｉ細胞の重量で５２．４％を占めると評価するＤａ  Ｓｉｌｖａ，  Ｎ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６、「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  ＸＸＶＩＩＩ：  ７４１−７４６、およびＥ．ｃｏｌｉ中のタンパク質含量を乾燥細胞重量で５５％と報告するＣｈｉｅｆ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃ．  Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，  Ｖｏｌ．  １，  ｐｐ．  ３−６における「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９８７，編を含むがこれらに限定されない参照により、約５２．４％から５５％タンパク質であると報告される。上記の測定値（つまり、乾燥細胞重量０．５グラム／リットル、および５５％細胞重量のタンパク質）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉについて１．０のＡ５５０での細胞培養の体積あたりの総細胞タンパク質の量は、２７５μｇ総細胞タンパク質／ｍｌ／Ａ５５０として計算される。湿潤細胞重量に基づく細胞培養の体積あたりの総細胞タンパク質の計算は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについての１．０のＡ６００が、１．７グラムの湿潤細胞重量／リットル、および０．３９グラムの乾燥細胞重量／リットルを結果として生じるというＧｌａｚｙｒｉｎａら（参照により本願明細書中に組み込まれるＭｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ２０１０，  ９：４２）による決定を使用することができる。例えば、乾燥細胞重量比較のためにこの湿潤細胞重量、および上記の５５％乾燥細胞重量としてのタンパク質を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉについて１．０のＡ６００での細胞培養の体積あたりの総細胞タンパク質の量は、２１５μｇ総細胞タンパク質／ｍｌ／Ａ６００として計算できる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓについて、所与の細胞密度での細胞培養の体積あたりの総細胞タンパク質の量は、Ｅ．ｃｏｌｉで見出されたものに類似する。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、Ｅ．ｃｏｌｉと同様に、グラム陰性の桿菌である。Ｅｄｗａｒｄｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９７２、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｍａｌｅａｔｅ  ａｓ  ａ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  ＸＩＶ，  １２３−１４７ページにより報告されたＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡＴＣＣ１１１５０の乾燥細胞重量は、０．５グラム／リットル／Ａ５００である。これは、Ａ５５０が１．０のＥ．ｃｏｌｉについて、Ｌｉｎらにより報告された重量と同じである。５００ｎｍおよび５５０ｎｍで行われた光散乱測定は非常に類似すると予想される。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＨＫ４４についての総細胞タンパク質に含まれる細胞重量のパーセントは、例えば、Ｙａｒｗｏｏｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｕｌｙ  ２００２、「Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｍｅｄｉａ  ｕｎｄｅｒ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ−Ｆｌｏｗ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６８（７）：３５９７−３６０５により５５％として記載される。このパーセンテージは、上記の参照によるＥ．ｃｏｌｉについて所与のものと類似または同じである。
【０１０２】
実施形態において、製造される可溶性組み換えアスパラギナーゼ、例えば単量体または四量体ＩＩ型アスパラギナーゼの量は、培養物中の製造される総可溶性タンパク質の約０．１％から約９５％である．実施形態において，この量は、培養物中の製造される総可溶性タンパク質の約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超える。実施形態において、この量は、培養物中の製造される総可溶性タンパク質の約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％である。実施形態において、この量は、培養物中の製造される総可溶性タンパク質の約５％から約９５％、約１０％から約８５％、約２０％から約７５％、約３０％から約６５％、約４０％から約５５％、約１％から約９５％、約５％から約３０％、約１％から約１０％、約１０％から約２０％、約２０％から約３０％、約３０％から約４０％、約４０％から約５０％、約５０から約６０％、約６０％から約７０％、または約８０％から約９０％である。
【０１０３】
実施形態において、製造される可溶性組み換えアスパラギナーゼ、例えば単量体または四量体ＩＩ型アスパラギナーゼの量は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）の約０．１％から約５０％である。実施形態において、この量は、ＤＣＷの約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、または５０％を超える。実施形態において、この量は、ＤＣＷの約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、または５０％である。実施形態において、この量は、培養物中で製造される総可溶性タンパク質の約５％から約５０％、約１０％から約４０％、約２０％から約３０％、約１％から約２０％、約５％から約２５％、約１％から約１０％、約１０％から約２０％、約２０％から約３０％、約３０％から約４０％、または約４０％から約５０％である。
【０１０４】
溶解性および活性
タンパク質の「溶解性」および「活性」は、関連する性質であるが、一般に異なる手段により決定される。タンパク質、特に疎水性タンパク質の溶解性は、疎水性アミノ酸残基がフォールディングされたタンパク質の外側に不適切に配置されていることを示す。例えば以下に記載されるような異なる方法を使用してしばしば評価されるタンパク質活性は、適切なタンパク質コンフォメーションの別の指標である。本明細書中で使用される「可溶性、活性な、または両方」は、当業者に既知の方法により、可溶性、活性な、または可溶性および活性両方であると決定されるタンパク質を指す。
【０１０５】
活性アッセイ
アスパラギナーゼ活性を評価するためのアッセイは、当該技術分野において既知であり、蛍光測定法、比色分析、化学発光法、分光光度法、および当業者に入手可能な他の酵素アッセイを含むが、これらに限定されない。これらのアッセイは、アスパラギナーゼ調製物の活性または有効性を商業的なまたは他のアスパラギナーゼ調製物と比較するために使用できる。
【０１０６】
実施形態において、活性または有効性は、アッセイされた総量と比較して、抽出物上清中のパーセント活性なタンパク質により表される。これは、アッセイにより使用されるタンパク質の総量に対する、アッセイにより活性であると決定されるタンパク質の量に基づく。他の実施形態において、活性または有効性は、標準または対照タンパク質と比較したタンパク質の％活性または有効性レベルにより表される。これは、標準試料中の活性なタンパク質の量に対する、上清抽出試料中の活性なタンパク質の量に基づく（ここでアッセイにおいて各試料からの同じ量のタンパク質が使用される）。
【０１０７】
実施形態において、製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼとの比較のために活性または有効性アッセイにおいて使用される標準または対照タンパク質は、Ｅｌｓｐａｒ（登録商標）中の活性な成分、または臨床使用のために承認され、当該技術分野において既知の任意の組み換えＩＩ型アスパラギナーゼ産物中の活性な成分である。実施形態において、製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの測定された活性または有効性は、ＩＩ型アスパラギナーゼ活性または有効性を測定する同じ方法を使用して、標準または対照ＩＩ型アスパラギナーゼの同じ量中で測定された活性または有効性と比較される。実施形態において、製造された組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの測定された活性または有効性は、患者における使用のために商業的に承認された対照ＩＩ型アスパラギナーゼの同じ量において測定される活性または有効性と比較される。
【０１０８】
実施形態において、組み換えアスパラギナーゼタンパク質の約４０％から約１００％は、活性、可溶性、またはその両方であると決定される。実施形態において、組み換えアスパラギナーゼタンパク質の約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％は、活性であると決定される。実施形態において、組み換えアスパラギナーゼタンパク質の約４０％から約５０％、約５０％から約６０％、約６０％から約７０％、約７０％から約８０％、約８０％から約９０％、約９０％から約１００％、約５０％から約１００％、約６０％から約１００％、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約４０％から約９０％、約４０％から約９５％、約５０％から約９０％、約５０％から約９５％、約５０％から約１００％、約６０％から約９０％、約６０％から約９５％、約６０％から約１００％、約７０％から約９０％、約７０％から約９５％、約７０％から約１００％、または約７０％から約１００％は、活性、可溶性、またはその両方であると決定される。
【０１０９】
他の実施形態において、組み換えアスパラギナーゼの約７５％から約１００％は、活性、可溶性、またはその両方であると決定される。実施形態において、組み換えアスパラギナーゼの約７５％から約８０％、約７５％から約８５％、約７５％から約９０％、約７５％から約９５％、約８０％から約８５％、約８０％から約９０％、約８０％から約９５％、約８０％から約１００％、約８５％から約９０％、約８５％から約９５％、約８５％から約１００％、約９０％から約９５％、約９０％から約１００％、または約９５％から約１００％は、活性、可溶性、またはその両方であると決定される。
【０１１０】
実施形態において、本願明細書中で記載される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼを製造または発現する方法は、製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの活性または有効性を測定すること、および製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの測定される活性または有効性を同じアッセイを使用して同じ量の対照ＩＩ型アスパラギナーゼ中で測定された活性または有効性と比較することをさらに含み、ここで製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの測定された活性または有効性は、対照ＩＩ型アスパラギナーゼの活性または有効性と比較可能である。実施形態において、比較可能な活性または有効性は１００％として定義される（１．０とも表せる）、つまり、製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼおよび対照ＩＩ型アスパラギナーゼの活性または有効性が等しい。実施形態において、対照ＩＩ型アスパラギナーゼと比較される製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの活性または有効性は、約８０％から約１２０％である。実施形態において、活性または有効性は約８５％から約１１５％である。実施形態において、活性または有効性は約９０％から約１１０％である。実施形態において、活性または有効性は約７０％から約１３０％である。実施形態において、活性または有効性は約６５％から約１３５％である。実施形態において，対照ＩＩ型アスパラギナーゼと比較される製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの活性または有効性は、約または少なくとも約６５％、約または少なくとも約６６％、約または少なくとも約６７％、約または少なくとも約６８％、約または少なくとも約６９％、約または少なくとも約７０％、約または少なくとも約７１％、約または少なくとも約７２％、約または少なくとも約７３％、約または少なくとも約７４％、約または少なくとも約７５％、約または少なくとも約７５％、約または少なくとも約７６％、約または少なくとも約７７％、約または少なくとも約７８％、約または少なくとも約７９％、約または少なくとも約８０％、約または少なくとも約８１％、約または少なくとも約８２％、約または少なくとも約８３％、約または少なくとも約８４％、約または少なくとも約８５％、約または少なくとも約８６％、約または少なくとも約８７％、約または少なくとも約８８％、約または少なくとも約８９％、約または少なくとも約９０％、約または少なくとも約９１％、約または少なくとも約９２％、約または少なくとも約９３％、約または少なくとも約９４％、約または少なくとも約９５％、約または少なくとも約９６％、約または少なくとも約９７％、約または少なくとも約９８％、約または少なくとも約９９％、約または少なくとも約１００％、約または少なくとも約１０１％、約または少なくとも約１０２％、約または少なくとも約１０３％、約または少なくとも約１０４％、約または少なくとも約１０５％、約または少なくとも約１０６％、約または少なくとも約１０７％、約または少なくとも約１０８％、約または少なくとも約１０９％、約または少なくとも約１１０％、約または少なくとも約１１１％、約または少なくとも約１１２％、約または少なくとも約１１３％、約または少なくとも約１１４％、約または少なくとも約１１５％、約または少なくとも約１１６％、約または少なくとも約１１７％、約または少なくとも約１１８％、約または少なくとも約１１９％、約または少なくとも約１２０％、約または少なくとも約１２１％、約または少なくとも約１２２％、約または少なくとも約１２３％、約または少なくとも約１２４％、約または少なくとも約１２５％、約または少なくとも約１２６％、約または少なくとも約１２７％、約または少なくとも約１２８％、約または少なくとも約１２９％、約または少なくとも約１３０％、約または少なくとも約１３１％、約または少なくとも約１３２％、約または少なくとも約１３３％、約または少なくとも約１３４％、または約または少なくとも約１３５％である。実施形態において、対照ＩＩ型アスパラギナーゼと比較される製造される組み換えＩＩ型アスパラギナーゼの活性または有効性は、約６８％から約１３２％、約７０％から約１３０％、約７２％から約１２８％、約７５％から約１２５％、約８０％から約１２０％、約８５％から約１１５％、約６５％から約１１０％、約６８％から約１１０％、約７０％から約１１０％、約７２％から約１１０％、約７８％から約１１０％、約８０％から約１１０％、約９０％から約１１０％、約９５％から約１０５％、約８５％から約１１０％、約９０％から約１１０％、約９５％から約１１０％、約９６％から約１１０％、約９７％から約１１０％、約９８％から約１１０％、約９９％から約１１０％、約１００％から約１１０％、約６５％から約１０５％、約６８％から約１０５％、約７０％から約１０５％、約７２％から約１０５％、約８０％から約１０５％、約８５％から約１０５％、約９０％から約１０５％、約９５％から約１０５％、約９６％から約１０５％、約９７％から約１０５％、約９８％から約１０５％、約９９％から約１０５％、約１００％から約１０５％、約６５％から約１００％、約６８％から約１００％、約７０％から約１００％、約７２％から約１００％、約７５％から約１００％、約７８％から約１００％、約８０％から約１００％、約８１％から約１００％、約８２％から約１００％、約８３％から約１００％、約８４％から約１００％、約８５％から約１００％、約８６％から約１００％、約８７％から約１００％、約８８％から約１００％、約８９％から約１００％、約９０％から約１００％、約９１％から約１００％、約９２％から約１００％、約９３％から約１００％、約９４％から約１００％、約９５％から約１００％、約９６％から約１００％、約９７％から約１００％、約９８％から約１００％、約９９％から約１００％、約９５％から約９９％、約９６％から約９９％、約９７％から約９９％、約７０％から約１３５％、約７５％から約１３５％、約８０％から約１３５％、約８５％から約１３５％、約９０％から約１３５％、約７５％から約１３０％、約８０％から約１３０％、約８５％から約１３０％、約９０％から約１３０％、約８０％から約１２５％、約８５％から約１２５％、約９０％から約１２５％、約８５％から約１２０％、約９０％から約１２０％、または約９５％から約１２０％である。
【０１１１】
実施例
以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を説明する目的のために与えられ、いかなる形でも本開示を限定することは意図されない。本実施例は、本願明細書中に記載され方法とともに、現在代表的な実施形態であり、例示的であり、範囲を制限することは意図されない。そこでの変化および特許請求の範囲により定義される開示の精神の範囲内に包含される他の使用は、当業者に発生するだろう。
【実施例１】
【０１１２】
実施例１：アスパラギナーゼ発現構築物の調製
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａ−１−３  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ遺伝子を、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおける発現のために最適化して、細胞質およびペリプラズム発現のための発現ベクターのセットにクローン化した。使用されるアミノ酸配列を、本願明細書中で配列番号１として開示する。使用される核酸配列を、本願明細書中で配列番号２として開示する。
【０１１３】
発現を、一連の分泌リーダー配列を使用して評価し、一部を高ＲＢＳ配列で、そして一部を中程度のＲＢＳ配列で評価した。さらに、リーダーを使用せずに細胞質発現を評価した。
【０１１４】
各構築物をＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株ＤＣ４５４（ｐｙｒＦ欠損、ＰＤまたはＦＭＯ無し）およびＤＣ４４１（ｐｙｒＦ、Ｌｏｎ、およびＨｓｌＵＶ欠損）に形質転換し、結果として生じた発現株を、０．５ｍＬ培養物中でＥ．ｃｏｌｉ  Ａ−１−３  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ製造について評価した。全ブロスを超音波処理し、遠心分離し、そして可溶性画分をＣＧＥにより分析した。
【０１１５】
９６ウェル形式における成長および発現
発現プラスミドスクリーニングのために、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａ−１−３  Ｌ−アスパラギナーゼＩＩ発現プラスミドのそれぞれについてのライゲーション混合物を、以下のようにＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株ＤＣ４５４およびＤＣ４４１細胞に形質転換した。コンピテント細胞の２５マイクロリットルを解凍し、９６マルチウェルＮｕｃｌｅｏｖｅｔｔｅ（登録商標）プレート（Ｌｏｎｚａ  ＶＨＮＰ−１００１）に移し、各ウェルにライゲーション混合物を加えた。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ９６ウェルＳｈｕｔｔｌＴＭシステム（Ｌｏｎｚａ  ＡＧ）を使用して、細胞を電気穿孔した。次いで、細胞を、４００μｌのＭ９塩１％グルコース培地および微量元素を有する９６ウェルディープウェルプレートに移した。９６ウェルプレート（シードプレート）を、３０℃で４８時間振とうしながらインキュベートした。シード培養の１０マイクロリットルを、９６ウェルディープウェルプレート中に二重で移し、各ウェルは、微量元素および５％グリセロールを補足された５００μｌのＨＴＰ培地を含有し、以前のように２４時間インキュベートされた。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を２４時間の時点で各ウェルに０．３ｍＭの終濃度で添加して、標的タンパク質の発現を誘導した。マンニトール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ１９０２）を、各ウェルに１％の終濃度で添加して、フォールディングモジュレーター過剰発現株中でフォールディングモジュレーターの発現を誘導した。細胞密度を、誘導後２４時間で、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学密度により測定し、成長をモニターした。誘導後２４時間で、細胞を採取し、４００μｌの最終体積に１ＸＰＢＳ中で１：３に希釈し、次いで凍結した。試料を、以下に記載されるように調製し、分析した。    
【０１１６】
上位発現プラスミドについての発現結果を表５および６に示す。
【表５】
2021500892.tif 000007
【表６】
2021500892.tif 000008
【０１１７】
宿主株スクリーニングについて、発現プラスミドスクリーニング結果に基づいて選択された発現プラスミドをそれぞれ、アレイにおいて、野生型（ＷＴ）または親ＤＣ４５４株、プロテアーゼ欠失（ＰＤ）株、フォールディングモジュレーター過剰発現（ＦＭＯ）株およびプロテアーゼ欠失プラスフォールディングモジュレーターオーバーエクスプレッサー（ＰＤ／ＦＭＯ）株を含む２４のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株のそれぞれに形質転換した。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアスパラギナーゼ分泌リーダー（ＡｎｓＢ）に融合したＥ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼは、アレイ中に含まれた（配列番号１４として記載されるアミノ酸配列；配列番号１５として記載されるコード配列）。フォールディングモジュレーターは存在する場合、第２のプラスミド上でコードされ、発現はＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ−天然マンニトール誘導性プロモーターにより駆動された。宿主株スクリーン形質転換を次のように実施した。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株コンピテント細胞の２５マイクロリットルを解凍し、９６マルチウェルＮｕｃｌｅｏｖｅｔｔｅ（登録商標）プレート中に移し、１０μｌプラスミドＤＮＡ（１０ｎｇ）を各ウェルに添加した。上記のプラスミド発現スクリーニングについて記載されるように、細胞を電気穿孔し、培養し、ＨＴＰ形式で誘導し、採取した。試料を、下記に記載されるように調製して分析した。
【０１１８】
分析のための試料の調製
超音波処理およびそれに続く遠心分離により、可溶性画分を調製した。培養ブロス試料（４００μＬ）を、２４プローブチップホーンを有するＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＡＳＳ、Ｓｃｉｎｏｍｉｘ）で、以下の設定で超音波処理した。パルスあたり１０秒でウェルあたり２０パルス、および各パルス間１０秒で６０％パワー（Ｓｏｎｉｃｓ  Ｕｌｔｒａ−Ｃｅｌｌ）。ライセートを５，５００ｘｇで１５分間遠心分離し（４°Ｃ）、上清を収集した（可溶性画分）。
【０１１９】
ＳＤＳ−ＣＧＥ分析
タンパク質試料を、ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓチップおよび対応する試薬（それぞれ部品番号７６０５２８およびＣＬＳ７６０６７５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を有するＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してマイクロチップＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動により分析した。試料を、製造者のプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｎｏ．  ４５０５８９，  Ｒｅｖ．  ３）に従って調製した。簡単には、９６ウェルポリプロピレンコニカルウェルＰＣＲプレート中で、４μＬの試料を１４μＬのサンプルバッファーおよび７０ｍＭ  ＤＴＴ還元剤と混合し、加熱した。
【０１２０】
誘導後２４時間にサンプリングされた全ブロスを、上記で記載されるように処理し、可溶性画分をＳＤＳ−ＣＧＥにより分析した。
【０１２１】
商業的に入手可能なＬ−アスパラギナーゼ活性アッセイキット（Ｓｉｇｍａ）は、ヌル試料と比較した場合、上位収量株ＳＴＲ５５３８２（Ｌａｏリーダー）からのＨＴＰ培養ライセート試料中の有意なＬ−アスパラギナーゼ活性を検出した。
【０１２２】
アレイ中でスクリーニングされたプラスミドおよび対応する分泌リーダーは以下を含んだ：
【０１２３】
ｐ７４２−００６  （Ａｚｕ）
【０１２４】
ｐ７４２−００８  （ＬＡＯ）
【０１２５】
ｐ７４２−００９  （Ｉｂｐ−Ｓ３１Ａ）
【０１２６】
ｐ７４２−０１６  （Ｐｂｐ）
【０１２７】
ｐ７４２−０１７  （ＰｂｐＡ２０Ｖ）
【０１２８】
ｐ７４２−０２１  （リーダーＤ）
【０１２９】
ｐ７４２−０３７  （リーダーＲ）
【０１３０】
ｐ７４２−０３８  （８４８４）
【０１３１】
ｐ７４２−０４１  （Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＡｎｓＢ）  
【０１３２】
上記で記載されるように発現株を培養し、誘導した。可溶性および不溶性画分のＳＤＳ−ＣＧＥ分析は、アスパラギナーゼの高レベル発現を示した（図１）。表７に記載されるものを含む発現株において、高い力価を観察した。
【表７】
2021500892.tif 000009
【実施例２】
【０１３３】
実施例２：Ｌ−Ａｓｐ１およびＬ−Ａｓｐ２欠損宿主株の振とうフラスコ発現分析  
野生型宿主株ＤＣ４５４に基づいて、Ｌ−Ａｓｐ１およびＬ−Ａｓｐ２を欠損するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株ＰＦ１４３３を生成した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ａ−１−３アスパラギナーゼＩＩ型の発現分析を、２００ｍＬ振とうフラスコ培養物中で実施した（表８）。示される値は、１０の異なる超音波処理可溶性画分反復実験から得られた平均である。ＳＤＳ−ＣＧＥ定量を、Ｓｉｇｍａ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−Ａｓｐ２標準曲線を使用して行った。１ｇ／Ｌを超える可溶性単量体の製造を観察した。５×希釈試料の例示的なＳＤＳ−ＣＧＥ画像を図２に提供する。
【０１３４】
表８の最後の行は、同じ実験においてアッセイされた、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＡｎｓＢ分泌リーダーを有する天然Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＡｎｓＢを発現する株についての発現結果を示す。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓリーダー−Ｅ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼ構築物は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓリーダー−Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアスパラギナーゼを含む構築物よりも実質的に多くのタンパク質を発現した。
【表８】
2021500892.tif 000010
【０１３５】
振とうフラスコ発現の活性分析もまた決定した（表９）。振とうフラスコ発現株のそれぞれから生成された可溶性超音波処理試料を、製造者の指示に従って、Ｓｉｇｍａから購入した市販のキット（Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）を使用してアスパラギナーゼ活性について分析した。このキットは、生成されたアスパラギン酸に比例する比色最終産物を製造する結合酵素反応を使用して活性を測定する。ＳｉｇｍａからのＥ．ｃｏｌｉアスパラギナーゼＩＩ型（Ａ３８０９）を、陽性対照としてＳＴＲ５５９８２ヌルライセート中にスパイクした（最後の行）。活性を、単一の可溶性超音波処理試料の２のアッセイ反復実験から計算した。ライセートの１：２５，０００希釈では、いずれのヌルソニケートにおいても活性を検出しなかった。１：２５，０００希釈での７４２（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳｉｇｍａ  Ｌ−Ａｓｐ（Ｅ．ｃｏｌｉ）標準スパイクインライセートは、比較可能な活性を示した。
【表９】
2021500892.tif 000011
【０１３６】
振とうフラスコ発現のＬＣ−ＭＳ分析も行った（表１０）。調べられた７４２のタンパク質について、予想通りインタクトな質量を観察した。例示的なマススぺクトロメトリーデータを図３に提供する。予測された分子重量および観測された分子重量の間には有意差を検出しなかった。
【表１０】
2021500892.tif 000012
【０１３７】
存在する同定された四量体（活性）タンパク質形態を、サイズ排除クロマトグラフィーによりさらに評価した。可溶性超音波処理試料を、分析の前にイオン交換スピンカラムにより脱塩した。サイズ排除クロマトグラフィーは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌ−Ａｓｐ２標準（Ｓｉｇｍａ）と一致する、可溶性ソニケートにおいて観察される四量体の予想されるＭＷに相関するピークを示した。
【実施例３】
【０１３８】
実施例３：Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアスパラギナーゼ欠損宿主株の構築
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアスパラギナーゼ遺伝子ノックアウトプラスミドの構築
アスパラギナーゼタンパク質アミノ酸配列をインプットとして使用したＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＭＢ２１４ゲノム配列のＢＬＡＳＴ検索は、以下の有意なアラインメントを示す２のタンパク質コード遺伝子（ペグ）のアウトプットを結果として生じた：ペグ．３８８６（Ｌ−アスパラギナーゼ  ＥＣ  ３．５．１．１  ＩＩ型、配列番号５４）およびペグ．５０４８（Ｌ−アスパラギナーゼＥＣ  ３．５．１．１、配列番号５５）。各天然Ｌ−アスパラギナーゼ遺伝子についてクローン化された欠失構築物を、欠失について標的化された遺伝子の開始および終止コドンのみを残す各遺伝子についての上流および下流隣接領域の融合を含有するＤＮＡ配列断片を合成することによって開始した。これらのフラグメントは、次いで、ベクターｐＤＯＷ１２６１−２４のＳｒｆＩ部位中に平滑末端ライゲートされ、それぞれ欠失プラスミドｐＦＮＸ３９７０およびｐＦＮＸ３９６９を製造した。
【０１３９】
その後、ライゲーション反応をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５アルファ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換して、コロニーを分離し、正常にクローニングされた欠失プラスミドＤＮＡを精製した。
【０１４０】
天然Ｌ−アスパラギナーゼ−欠損宿主株の構築
以下の方法を使用して、選択された宿主株中で、各遺伝子の染色体欠失を順次実施した。欠失プラスミドを、ウラシル（ピリミジン）生合成に関与するｐｙｒＦ遺伝子中に染色体欠失を含有するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株中に電気穿孔した。欠失プラスミドは、ＰｙｒＦコード配列を含有するが、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞中では複製できない。電気穿孔した細胞を、１％グルコースおよび２５０ｕｇ／ｍＬプロリン（宿主株がプロリン栄養要求性の場合）を補足したＭ９塩寒天プレート上に播種した。結果として生じるクローンは、欠失プラスミド全体をゲノム内の２つの相同な領域の１つにある染色体中に組換えさせる組み込み事象により、ウラシルを合成することができる。組み込まれたプラスミドおよび染色体の間で第２の相同組換えを実行し、それにより欠失を残す細胞を選択するために、プラスミド組み込み株を、２５０ｕｇ／ｍＬウラシルおよび２５０ｕｇ／ｍＬプロリン（宿主株がプロリン栄養要求性の場合）を補足した３ｍＬ  ＬＢ培地中で定常期まで成長させた。次いで、細胞を、５００ｕｇ／ｍＬの５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をも含有するＬＢウラシル（２５０ｕｇ／ｍＬ）プラス２５０ｕｇ／ｍＬプロリン（宿主株がプロリン栄養要求株の場合）寒天培地上に播種した。組み換えにより組み込まれたプラスミドを失う細胞はまた、ｐｙｒＦ遺伝子も失い、したがって細胞成長を妨げる毒性化合物に他の方法で変換される５−ＦＯＡに耐性があると予想される。次いで、５−ＦＯＡ（５００ｕｇ／ｍＬ）の存在下で良好な成長を示す単一コロニーを採取し、２５０μｇ／ｍＬウラシルおよび２５０μｇ／ｍＬプロリン（宿主株がプロリン栄養要求性の場合）を補足した１％グルコースを含有する３ｍＬ液体Ｍ９最少培地中で成長させ、グリセロールストックとしておよび診断用ＰＣＲおよびシーケンシング反応のためのテンプレートとしての保存用培養物を生成した。
【０１４１】
天然Ｌ−アスパラギナーゼ遺伝子の染色体欠失の確認
診断用ＰＣＲ反応を使用して、ノックアウトプラスミドにクローン化された合成された遺伝子欠失配列の外側の染色体領域にアニールするプライマーを利用して、所望の天然Ｌ−アスパラギナーゼ遺伝子染色体欠失をスクリーンした。生成されたＰＣＲ産物のＤＮＡシーケンシングを使用して、所望の天然Ｌ−アスパラギナーゼ遺伝子欠失が、不所望の変異またはＤＮＡ再構成を伴わずに予想通り発生したことを決定した。
【０１４２】
下記のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアスパラギナーゼＫＯ宿主株を作製した。
【０１４３】
ＰＦ１４３３（ＰｙｒＦ、ＡｓｐＧ１、およびＡｓｐＧ２欠損）を、宿主株ＤＣ４５４（ＰｙｒＦ欠損）中のａｓｐＧ２およびａｓｐＧ１遺伝子の順次欠失により構築した。
【０１４４】
ＰＦ１４３４（ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、ＡｓｐＧ１、およびＡｓｐＧ２欠損）を、宿主株ＤＣ４５５（ｐｙｒＦ  ｐｒｏＣ）中のａｓｐＧ１およびａｓｐＧ２遺伝子の順次欠失により構築した。ＤＣ４５５株は、ＤＣ５４２およびＤＣ５４９両方の親株である。
【０１４５】
ＰＦ１４４２（ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、ＡｓｐＧ１、ＡｓｐＧ２Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１、およびＡｐｒＡ欠損）を、宿主株ＰＦ１２０１（ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、プロテアーゼＬｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１、およびＡｐｒＡ欠損）中のａｓｐＧ２およびａｓｐＧ１の順次欠失により構築した。
【０１４６】
ＰＦ１４４３（ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、ＡｓｐＧ１、およびＡｓｐＧ２欠損；ｐＤＯＷ３７００におけるＦＭＯ  ＬｅｐＢ）を、ｌｅｐＢコードＦＭＯプラスミドｐＤＯＷ３７００をＰＦ１４３４に形質転換することにより構築した。
【０１４７】
ＰＦ１４４４（ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、ＡｓｐＧ１、およびＡｓｐＧ２欠損；ｐＤＯＷ３７０７におけるＦＭＯ  Ｔｉｇ）を、ＴｉｇコードＦＭＯプラスミドｐＤＯＷ３７０３をＰＦ１４３４に形質転換することにより構築した。
【０１４８】
ＰＦ１４４５（ＰｙｒＦ、ＰｒｏＣ、ＡｓｐＧ１、ＡｓｐＧ２Ｌｏｎ、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、Ｓ２１９Ａ、Ｐｒｃ１、およびＡｐｒＡ欠損；ｐＦＮＸ４１４２におけるＦＭＯ  ＤｓｂＡＣ−Ｓｋｐ）を、ＤｓｂＡＣ−ＳｋｐコードプラスミドｐＦＮＸ４１４２でのＰＦ１４４２の形質転換により構築した。
【０１４９】
使用された株を、表１１に記載する。
【表１１】
2021500892.tif 000013
【実施例４】
【０１５０】
実施例４：選択された発現株の２Ｌ発酵および可溶性％ＴＣＰの計算
実施例３に記載された株ＳＴＲ５７８６３およびＳＴＲ５７８６０を、２Ｌ発酵にスケーリングし、それぞれ最大８の異なる発酵条件下でスクリーニングした。２Ｌ規模の発酵（およそ１Ｌの最終発酵体積）のための接種材料を、酵母抽出物およびグリセロールを補足した化学的に定義された培地６００ｍＬを含有する振とうフラスコを選択された株の凍結培養ストックで接種することにより生成した。３０°Ｃで振とうしながら１６から２４時間インキュベートした後、次いで、各振とうフラスコ培養の等分を、高いバイオマスを支持するように設計された化学的に定義された培地を含有する８ユニットのマルチプレックス発酵システムのそれぞれに無菌で移した。２Ｌ発酵槽において、培養物を、グリセロールフェッドバッチモードで、ｐＨ、温度、および溶存酸素についてコントロールされた条件で操作した。ファッドバッチ高細胞密度発酵プロセスは、成長期、次いで、培養が標的バイオマス（湿潤細胞重量）に達するとＩＰＴＧの添加により開始される誘導期で構成された。誘導期中の条件は、実験設計に従って変化した。発酵の誘導期はおよそ２４時間進行させた。分析試料を、発酵槽から回収し、細胞密度（５７５ｎｍでの光学密度）を決定し、次いで、その後の分析のために凍結され、標的遺伝子の発現レベルを決定した。誘導後２４時間の最終時点で、各容器の全発酵ブロスを、１５，９００ｘｇで６０から９０分間、遠心分離により採取した。細胞ペーストおよび上澄みを分離し、ペーストを保持して−８０°Ｃで凍結した。
【０１５１】
表１２は、いくつかの発酵条件下での株ＳＴＲ５７８６３およびＳＴＲ５７８６０での発現結果を示す。示されるように、初期株／発酵条件組み合わせのいくつかは、＞３０％ＴＣＰアスパラギナーゼ発現を結果として生じた。総細胞タンパク質を以下のように計算した：
【０１５２】
０．５５  ＤＣＷ総細胞タンパク質ｘ  Ａ５５０での５００μｇ／ｍＬ  ＤＣＷ  ＝  Ａ５５０＝１での総細胞タンパク質２７５μｇ／ｍｌ（またはｍｇ／Ｌ）
【０１５３】
最終時点（Ｉ２４）でのＴＣＰ＝ＯＤ５７５＊２７５ｍｇ／Ｌ  ＴＣＰ
【０１５４】
可溶性％ＴＣＰ＝１００＊  （可溶性力価／ＴＣＰ）
【０１５５】
【表１２】
2021500892.tif 000014
【実施例５】
【０１５６】
実施例５：さらなる発現株の２Ｌ発酵および可溶性％ＴＣＰの計算
本明細書中で記載されるように構築されたさらなる株、例えば、実施例３に記載されるさらなる株を、２Ｌ発酵にスケーリングし、実施例４に記載されるものと類似の方法で異なる発酵条件下でそれぞれスクリーニングする。
【表１３−１】
2021500892.tif 000015
【表１３−２】
2021500892.tif 000016
【表１３−３】
2021500892.tif 000017
【表１３−４】
2021500892.tif 000018
【表１３−５】
2021500892.tif 000019
【表１３−６】
2021500892.tif 000020
【表１３−７】
2021500892.tif 000021
【表１３−８】
2021500892.tif 000022
【表１３−９】
2021500892.tif 000023
【表１３−１０】
2021500892.tif 000024
【表１３−１１】
2021500892.tif 000025
【表１３−１２】
2021500892.tif 000026
【０１５７】
本開示の好ましい実施形態が本願明細書中で示され記載される一方、かかる実施形態は、例としてのみ提供される。開示から逸脱することなく、多数のバリエーション、変化、および置換が当業者に発生するだろう。本願明細書中で記載される開示の実施形態に対する種々の代替物は本願明細書中の方法の実践において採用されてもよいことが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造およびそれらの同等物がそれによりカバーされることが意図される。
【図１】
2021500892.tif 000027
【図２】
2021500892.tif 000028
【図３】
2021500892.tif 000029
【配列表】
2021500892000001.app
【国際調査報告】
2021500892.tif 000030