(57)【要約】  本開示は、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性である、多能性幹細胞、造血前駆細胞及び造血細胞を含む修飾細胞（例えば、修飾Treg）を提供する。本開示は、多能性幹細胞、造血前駆細胞及び造血細胞を含むステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性修飾細胞を生成する方法を提供する。本開示は組成物及び治療方法も提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
NR3C1をコードする遺伝子座における遺伝的修飾を含むステロイド耐性CRISPR修飾細胞であって、前記修飾がNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、前記修飾がNR3C1のエクソン、スプライスドナー又はスプライスアクセプター内に位置し、前記修飾細胞が前記遺伝的修飾によりステロイド耐性にされている、ステロイド耐性CRISPR修飾細胞。
【請求項２】
細胞が多能性幹細胞、造血前駆細胞又は造血細胞である、請求項1に記載の修飾細胞。
【請求項３】
遺伝的修飾がCRISPR-Cas9系、CRISPR-Cpf1系、Cas9オーソログ、Cas9パラログ、Cas関連ファミリーメンバー、ジンクフィンガー、TALEN又はメガヌクレアーゼによりもたらされる、請求項1〜2のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項４】
修飾がインデルである、請求項1に記載の修飾細胞。
【請求項５】
インデルがNR3C1のエクソン2内に位置する、請求項4に記載の修飾細胞。
【請求項６】
NR3C1におけるインデルがCRISPR系によりもたらされる、請求項4〜5のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項７】
CRISPR系がCRISPRヌクレアーゼ及びガイドRNAを含む、請求項3又は請求項6に記載の修飾細胞。
【請求項８】
ガイドRNAが、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項7に記載の修飾細胞。
【請求項９】
ガイドRNAが、配列番号7〜10のいずれか1つに示される核酸配列を含む、請求項7に記載の修飾細胞。
【請求項１０】
ガイドRNAが、配列番号8に示される核酸配列を含む、請求項7に記載の修飾細胞。
【請求項１１】
修飾が塩基対置換である、請求項1に記載の修飾細胞。
【請求項１２】
NR3C1における置換がCRISPR系によりもたらされる、請求項11に記載の修飾細胞。
【請求項１３】
CRISPR系が塩基エディター及びガイドRNAを含む、請求項11〜12のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項１４】
塩基エディターがCRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメイン又はその変異体と塩基編集ドメインとを含む、請求項13に記載の修飾細胞。
【請求項１５】
CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインがCas9ドメインである、請求項14に記載の修飾細胞。
【請求項１６】
CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインが変異Cas9ドメインである、請求項14に記載の修飾細胞。
【請求項１７】
変異Cas9ドメインがヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインである、請求項16に記載の修飾細胞。
【請求項１８】
塩基編集ドメインがデアミナーゼドメインである、請求項14〜17のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項１９】
デアミナーゼドメインがシトシン又はアデニンに対する特異性を有する、請求項18に記載の修飾細胞。
【請求項２０】
デアミナーゼドメインがシチジン又はアデノシンデアミナーゼである、請求項18に記載の修飾細胞。
【請求項２１】
置換がNR3C1内に未成熟終止コドンを導入し、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらす、請求項11〜20のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項２２】
ガイドRNAが、NR3C1のエクソンにおける標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項13〜21のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項２３】
ガイドRNAが、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項13〜21のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項２４】
ガイドRNAが、配列番号17〜54のいずれか1つに示される核酸配列を含む、請求項13〜23のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項２５】
ガイドRNAが、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーを含む標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項14〜20のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項２６】
置換がNR3C1 mRNAのスプライシングを破壊することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらす、請求項25に記載の修飾細胞。
【請求項２７】
ガイドRNAが、配列番号55又は56のいずれか1つに示される核酸配列を含む、請求項25に記載の修飾細胞。
【請求項２８】
修飾細胞がコルチコステロイドに耐性である、請求項1〜27のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項２９】
修飾細胞が糖質コルチコステロイドに耐性である、請求項1〜28のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項３０】
糖質コルチコステロイドが、プロゲステロン型糖質コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン型糖質コルチコステロイド、メタゾン型糖質コルチコステロイド及びアセトニド型糖質コルチコステロイドからなる群から選択される、請求項29に記載の修飾細胞。
【請求項３１】
糖質コルチコステロイドが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、プレドニゾン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、デフラザコート、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、フルドロコルチゾン及びデオキシコルチコステロンからなる群から選択される、請求項29に記載の修飾細胞。
【請求項３２】
細胞のゲノム内に外因性カルシニューリンインヒビター（CNI）耐性遺伝子を含むカルシニューリンインヒビター（CNI）耐性遺伝的修飾細胞であって、前記CNI耐性遺伝子がCRISPR媒介性相同組換え修復（HDR）の結果として挿入され、前記修飾細胞が前記耐性遺伝子によりCNI耐性にされている、カルシニューリンインヒビター（CNI）耐性遺伝的修飾細胞。
【請求項３３】
細胞が、多能性幹細胞、造血前駆細胞又は造血細胞である、請求項32に記載の修飾細胞。
【請求項３４】
遺伝的修飾が、CRISPR-Cas9系、CRISPR-Cpf1系、Cas9オーソログ、Cas9パラログ、Cas関連ファミリーメンバー、ジンクフィンガー、TALEN又はメガヌクレアーゼによりもたらされる、請求項32に記載の修飾細胞。
【請求項３５】
カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子が、NR3C1をコードする遺伝子座において挿入されている、請求項32に記載の修飾細胞。
【請求項３６】
カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子が、PPP3Ca、PPP3Cb及びPPP3Ccからなる群から選択されるカルシニューリンA（CNa）遺伝子の突然変異形態、又はPPP3R1及びPPP3R2からなる群から選択されるカルシニューリンB（CNb）遺伝子の突然変異形態である、請求項32〜35のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項３７】
突然変異カルシニューリン遺伝子が、外因性ドナーDNA配列を使用する相同組換えによりNR3C1遺伝子座内に挿入されている、請求項36に記載の修飾細胞。
【請求項３８】
外因性ドナーDNA配列が、配列番号11に示される核酸配列を含む、請求項37に記載の修飾細胞。
【請求項３９】
カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子がカルシニューリン変異タンパク質をコードする、請求項32〜38のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項４０】
カルシニューリン変異タンパク質が、CNa12、CNa22及びCNb30からなる群から選択される、請求項39に記載の修飾細胞。
【請求項４１】
カルシニューリン変異体が、配列番号3〜5のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項39に記載の修飾細胞。
【請求項４２】
カルシニューリン変異タンパク質がカルシニューリンインヒビターには結合するが、カルシニューリンには結合せず、それにより、カルシニューリンインヒビターの隔離及びカルシニューリン阻害の予防をもたらす、請求項39〜41のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項４３】
修飾細胞が、シクロスポリンA（CsA）、ボクロスポリン、タクロリムス（FK-506、フジマイシン）、ピメクロリムス並びにそれらの誘導体及び類似体からなる群から選択されるカルシニューリンインヒビターに耐性である、請求項32〜42のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項４４】
（1）NR3C1をコードする遺伝子座内にインデルを含む第1遺伝的修飾であって、前記インデルがNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能である、第1遺伝的修飾と、（2）細胞のゲノム内に挿入された外因性カルシニューリンインヒビター（CNI）耐性遺伝子を含む第2遺伝的修飾であって、前記CNI耐性遺伝子が、NR3C1をコードする遺伝子座内のインデルの部位に存在する、第2遺伝的修飾とを含み、前記遺伝的修飾によりステロイド耐性かつCNI耐性にされている、遺伝的に修飾されたステロイド耐性及びCNI耐性細胞。
【請求項４５】
細胞が多能性幹細胞、造血前駆細胞又は造血細胞である、請求項44に記載の修飾細胞。
【請求項４６】
遺伝子座がNR3C1のエクソン2に対応する、請求項44に記載の修飾細胞。
【請求項４７】
インデルが、配列番号7〜10のいずれか1つに示される核酸配列を含むガイドRNAを含むCRISPR系によりもたらされる、請求項44〜46のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項４８】
インデルが、配列番号8に示される核酸配列を含むガイドRNAを含むCRISPR系によりもたらされる、請求項44〜47のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項４９】
（1）NR3C1遺伝子座内に修飾を含む第1遺伝的修飾であって、前記修飾がNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能である第1遺伝的修飾と、（2）細胞のゲノム内に挿入された外因性カルシニューリンインヒビター（CNI）耐性遺伝子を含む第2遺伝的修飾とを含み、遺伝的修飾の結果としてステロイド耐性及びCNI耐性にされている、遺伝的に修飾されたステロイド耐性及びCNI耐性細胞。
【請求項５０】
細胞が多能性幹細胞、造血前駆細胞又は造血細胞である、請求項49に記載の修飾細胞。
【請求項５１】
第1又は第2修飾がCRISPR-Cas9系、CRISPR-Cpf1系、Cas9オーソログ、Cas9パラログ、Cas関連ファミリーメンバー、ジンクフィンガー、TALEN又はメガヌクレアーゼによりもたらされる、請求項49に記載の修飾細胞。
【請求項５２】
修飾がインデルである、請求項49に記載の修飾細胞。
【請求項５３】
インデルがNR3C1のエクソン2内に位置する、請求項52に記載の修飾細胞。
【請求項５４】
NR3C1におけるインデルがCRISPR系によりもたらされる、請求項52〜54のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項５５】
CRISPR系がCRISPRヌクレアーゼ及びガイドRNAを含む、請求項54に記載の修飾細胞。
【請求項５６】
ガイドRNAが、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項55に記載の修飾細胞。
【請求項５７】
ガイドRNAが、配列番号7〜10のいずれか1つに示される核酸配列を含む、請求項55〜56のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項５８】
ガイドRNAが、配列番号8に示される核酸配列を含む、請求項55〜57のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項５９】
修飾が塩基対置換である、請求項49に記載の修飾細胞。
【請求項６０】
NR3C1における置換がCRISPR系によりもたらされる、請求項59に記載の修飾細胞。
【請求項６１】
CRISPR系が塩基エディター及びガイドRNAを含む、請求項60に記載の修飾細胞。
【請求項６２】
塩基エディターが、CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメイン又はその変異体と塩基編集ドメインとを含む、請求項61に記載の修飾細胞。
【請求項６３】
CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインがCas9ドメインである、請求項62に記載の修飾細胞。
【請求項６４】
CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインが変異Cas9ドメインである、請求項62に記載の修飾細胞。
【請求項６５】
変異Cas9ドメインがヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインである、請求項64に記載の修飾細胞。
【請求項６６】
塩基編集ドメインがデアミナーゼドメインである、請求項62〜65のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項６７】
デアミナーゼドメインがシトシン又はアデニンに対する特異性を有する、請求項66に記載の修飾細胞。
【請求項６８】
デアミナーゼドメインがシチジン又はアデノシンデアミナーゼである、請求項66に記載の修飾細胞。
【請求項６９】
置換がNR3C1内に未成熟終止コドンを導入し、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらす、請求項59〜68のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項７０】
ガイドRNAが、NR3C1のエクソンにおける標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項61〜69のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項７１】
ガイドRNAが、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項61〜70のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項７２】
ガイドRNAが、配列番号17〜54のいずれか1つに示される核酸配列を含む、請求項61〜70のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項７３】
ガイドRNAが、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーを含む標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項61〜68のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項７４】
置換が、NR3C1 mRNAのスプライシングを破壊することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらす、請求項73に記載の修飾細胞。
【請求項７５】
ガイドRNAが、配列番号55〜56のいずれか1つに示される核酸配列を含む、請求項73〜74のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項７６】
修飾細胞がコルチコステロイドに耐性である、請求項49〜75のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項７７】
修飾細胞が糖質コルチコステロイドに耐性である、請求項49〜76のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項７８】
糖質コルチコステロイドが、プロゲステロン型糖質コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン型糖質コルチコステロイド、メタゾン型糖質コルチコステロイド及びアセトニド型糖質コルチコステロイドからなる群から選択される、請求項77に記載の修飾細胞。
【請求項７９】
糖質コルチコステロイドが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、プレドニゾン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、デフラザコート、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、フルドロコルチゾン及びデオキシコルチコステロンからなる群から選択される、請求項77に記載の修飾細胞。
【請求項８０】
カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子が、PPP3Ca、PPP3Cb及びPPP3Ccからなる群から選択されるカルシニューリンA（CNa）遺伝子の突然変異形態、又はPPP3R1及びPPP3R2からなる群から選択されるカルシニューリンB（CNb）遺伝子の突然変異形態である、請求項49〜79のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項８１】
カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子がカルシニューリン変異タンパク質をコードする、請求項49〜80のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項８２】
カルシニューリン変異タンパク質が、CNa12、CNa22及びCNb30からなる群から選択される、請求項81に記載の修飾細胞。
【請求項８３】
カルシニューリン変異タンパク質が、配列番号3〜5のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項81〜82のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項８４】
カルシニューリン変異タンパク質がカルシニューリンインヒビターには結合するが、カルシニューリンには結合せず、それにより、カルシニューリンインヒビターの隔離及びカルシニューリン阻害の予防をもたらす、請求項81〜83のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項８５】
突然変異カルシニューリン遺伝子が、外因性ドナーDNA配列を使用する相同組換えにより細胞のゲノム内に挿入されている、請求項80〜84のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項８６】
突然変異カルシニューリン遺伝子がNR3C1遺伝子座内に挿入されている、請求項80〜85のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項８７】
修飾細胞が、シクロスポリンA（CsA）、ボクロスポリン、タクロリムス（FK-506、フジマイシン）、ピメクロリムス並びにそれらの誘導体及び類似体からなる群から選択されるカルシニューリンインヒビターに耐性である、請求項49〜85のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項８８】
修飾細胞が、修飾された免疫細胞である、請求項49〜87のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項８９】
修飾細胞が、修飾された制御性T細胞（Treg）である、請求項49〜88のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項９０】
修飾細胞が、修飾されたエフェクターT細胞（Teff）である、請求項49〜88のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項９１】
修飾細胞が自家細胞である、請求項49〜89のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項９２】
修飾細胞が同種異系細胞である、請求項49〜89のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項９３】
修飾細胞がヒト対象から単離される、請求項49〜92のいずれか1項に記載の修飾細胞。
【請求項９４】
ヒト対象が幹細胞移植を受けている、又は幹細胞移植の候補者である、請求項93に記載の修飾細胞。
【請求項９５】
ヒト対象が実質臓器移植を受けている、又は実質臓器移植の候補者である、請求項93に記載の修飾細胞。
【請求項９６】
ヒト対象が自己免疫障害に罹患している、請求項93に記載の修飾細胞。
【請求項９７】
ヒト対象が移植片対宿主病（GVHD）に罹患している、請求項93に記載の修飾細胞。
【請求項９８】
ヒト対象が1型糖尿病に罹患している、請求項93に記載の修飾細胞。
【請求項９９】
NR3C1をコードする遺伝子座における修飾をもたらす遺伝子編集系を細胞内に導入することを含む、修飾細胞を生成する方法であって、前記修飾がNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートしうる、方法。
【請求項１００】
細胞が多能性幹細胞、造血前駆細胞又は造血細胞である、請求項99に記載の方法。
【請求項１０１】
修飾NR3C1のエクソン2におけるインデルである、請求項99に記載の方法。
【請求項１０２】
遺伝子編集系がCRISPR系である、請求項99に記載の方法。
【請求項１０３】
CRISPR系がCRISPRヌクレアーゼ及びガイドRNAを含む、請求項102に記載の方法。
【請求項１０４】
ガイドRNAが、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項103に記載の方法。
【請求項１０５】
ガイドRNAが、配列番号7〜10のいずれか1つに示される核酸配列を含む、請求項103〜104のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０６】
ガイドRNAが、配列番号8に示される核酸配列を含む、請求項103〜105のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０７】
修飾が塩基対置換である、請求項99に記載の方法。
【請求項１０８】
CRISPR系が塩基エディター及びガイドRNAを含む、請求項102に記載の方法。
【請求項１０９】
塩基エディターが、CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメイン又はその変異体と塩基編集ドメインとを含む、請求項108に記載の方法。
【請求項１１０】
CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインがCas9ドメインである、請求項109に記載の方法。
【請求項１１１】
CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインが変異Cas9ドメインである、請求項109に記載の方法。
【請求項１１２】
変異Cas9ドメインがヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインである、請求項111に記載の方法。
【請求項１１３】
塩基編集ドメインがデアミナーゼドメインである、請求項109〜112のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１４】
デアミナーゼドメインがシトシン又はアデニンに対する特異性を有する、請求項113に記載の方法。
【請求項１１５】
デアミナーゼドメインがシチジン又はアデノシンデアミナーゼである、請求項113に記載の方法。
【請求項１１６】
置換がNR3C1内に未成熟終止コドンを導入し、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらす、請求項107〜115のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１７】
ガイドRNAが、NR3C1のエクソンにおける標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項108〜116のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１８】
ガイドRNAが、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項108〜117のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１９】
ガイドRNAが、配列番号17〜54のいずれか1つに示される核酸配列を含む、請求項108〜117のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２０】
ガイドRNAが、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーを含む標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む、請求項108〜115のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２１】
置換がNR3C1 mRNAのスプライシングを破壊することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらす、請求項120に記載の方法。
【請求項１２２】
ガイドRNAが、配列番号55〜56のいずれか1つに示される核酸配列を含む、請求項120〜121のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２３】
CRISPRヌクレアーゼ／塩基エディター及びガイドRNAが、リボ核タンパク質（RNP）複合体を含む、請求項99〜122のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２４】
CRISPRヌクレアーゼ／塩基エディター及び／又はガイドRNAが、ポリヌクレオチドによりコードされる、請求項99〜122のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２５】
ポリヌクレオチドが、ベクター及び／又は合成mRNAを含む、請求項124に記載の方法。
【請求項１２６】
RNP又はポリヌクレオチドが、エレクトロポレーションにより導入される、請求項123〜125のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２７】
細胞のゲノム内への外因性カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子の挿入を更に含む、請求項99〜126のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２８】
外因性カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子の挿入が、相同組換えによるものである、請求項127に記載の方法。
【請求項１２９】
挿入が、NR3C1をコードする遺伝子座におけるインデルの部位で生じる、請求項127〜128のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３０】
挿入が、NR3C1をコードする遺伝子座におけるインデルの部位で生じる、請求項127〜129のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３１】
挿入が、外因性ドナーDNA配列からの相同組換えにより、NR3C1をコードする遺伝子座におけるインデルの部位で生じる、請求項127〜130のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３２】
外因性ドナーDNA配列が、配列番号11に示される核酸配列を含む、請求項131に記載の方法。
【請求項１３３】
外因性ドナーDNA配列がウイルス形質導入により導入される、請求項131〜132のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３４】
外因性ドナーDNA配列がエレクトロポレーションにより導入される、請求項131〜132のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３５】
外因性ドナーDNA配列が、レポーター分子をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む、請求項131〜134のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３６】
プロモーターとレポーター分子をコードする核酸とが、リンカーにより隔てられている、請求項135に記載の方法。
【請求項１３７】
リンカーがT2A配列を含む、請求項136に記載の方法。
【請求項１３８】
カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子が、PPP3Ca、PPP3Cb及びPPP3Ccからなる群から選択されるカルシニューリンA（CNa）遺伝子の突然変異形態、又はPPP3R1及びPPP3R2からなる群から選択されるカルシニューリンB（CNb）遺伝子の突然変異形態である、請求項132〜137のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３９】
カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子がカルシニューリン変異タンパク質をコードする、請求項132〜138のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４０】
カルシニューリン変異タンパク質が、CNa12、CNa22及びCNb30からなる群から選択される、請求項139に記載の方法。
【請求項１４１】
カルシニューリン変異タンパク質が、配列番号3〜5のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項139〜140のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４２】
修飾細胞が、修飾された免疫細胞である、請求項99〜141のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４３】
修飾細胞が、修飾された制御性T細胞（Treg）である、請求項99〜142のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４４】
修飾細胞が、修飾されたエフェクターT細胞（Teff）である、請求項99〜142のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４５】
修飾細胞が自家細胞である、請求項99〜144のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４６】
修飾細胞が同種異系細胞である、請求項99〜144のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４７】
修飾細胞がヒト対象から単離される、請求項99〜146のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４８】
ヒト対象が幹細胞移植を受けている、又は幹細胞移植の候補者である、請求項147に記載の方法。
【請求項１４９】
ヒト対象が実質臓器移植を受けている、又は実質臓器移植の候補者である、請求項147に記載の方法。
【請求項１５０】
ヒト対象が自己免疫障害に罹患している、請求項147に記載の方法。
【請求項１５１】
ヒト対象が移植片対宿主病（GVHD）に罹患している、請求項147に記載の方法。
【請求項１５２】
ヒト対象が1型糖尿病に罹患している、請求項147に記載の方法。
【請求項１５３】
請求項1〜98のいずれか1項に記載の修飾細胞を対象に投与することを含む、免疫抑制効果を要する対象において免疫抑制効果を達成する方法。
【請求項１５４】
対象が同種応答及び／又は自己免疫応答を被っている、請求項153に記載の方法。
【請求項１５５】
同種応答及び／又は自己免疫応答の開始前に、請求項1〜98のいずれか1項に記載の修飾細胞の集団を対象に投与することを含む、予防的治療効果を要する対象において予防的治療効果を達成するための方法。
【請求項１５６】
同種応答及び／又は自己免疫応答が生物学的物質の移植の後で生じる、請求項155に記載の方法。
【請求項１５７】
生体学的物質が、細胞、組織及び臓器（器官）からなる群から選択される、請求項156に記載の方法。
【請求項１５８】
生物学的物質が同種異系である、請求項156〜157のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５９】
対象がヒトである、請求項153〜158のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６０】
ヒト対象が幹細胞移植を受けている、又は幹細胞移植の候補者である、請求項159に記載の方法。
【請求項１６１】
ヒト対象が実質臓器移植を受けている、又は実質臓器移植の候補者である、請求項159に記載の方法。
【請求項１６２】
ヒト対象が自己免疫障害に罹患している、請求項159に記載の方法。
【請求項１６３】
ヒト対象が移植片対宿主病（GVHD）に罹患している、請求項159に記載の方法。
【請求項１６４】
ヒト対象が1型糖尿病に罹患している、請求項159に記載の方法。
【請求項１６５】
修飾細胞をステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターと組合せて投与する、請求項153〜164のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６６】
ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターを修飾細胞の投与の前に投与する、請求項165に記載の方法。
【請求項１６７】
ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターを修飾細胞の投与と同時に、又は投与の後に投与する、請求項165に記載の方法。
【請求項１６８】
ステロイドがコルチコステロイドである、請求項165〜167のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６９】
ステロイドが糖質コルチコステロイドである、請求項165〜168のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７０】
糖質コルチコステロイドが、プロゲステロン型糖質コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン型糖質コルチコステロイド、メタゾン型糖質コルチコステロイド及びアセトニド型糖質コルチコステロイドからなる群から選択される、請求項169に記載の方法。
【請求項１７１】
糖質コルチコステロイドが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、プレドニゾン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、デフラザコート、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、フルドロコルチゾン及びデオキシコルチコステロンからなる群から選択される、請求項169に記載の方法。
【請求項１７２】
カルシニューリンインヒビターが、シクロスポリンA（CsA）、ボクロスポリン、タクロリムス（FK-506、フジマイシン）、ピメクロリムス並びにそれらの誘導体及び類似体からなる群から選択される、請求項165〜171のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物耐性免疫細胞及びその用途に関する。
関連出願に対する相互参照
本出願は、2018年5月17日付け出願の米国仮特許出願第62/672,868号（その全体を、本明細書に記載されているのと同様に、本明細書に組み入れることとする）に基づく優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
制御性T細胞（Treg）は、Treg集団の遺伝的又は物理的除去の破滅的結果により実証されるとおり、免疫細胞恒常性の維持に決定的に重要である。特に、Treg細胞は、ドミナントネガティブ調節を他の免疫細胞に強制することにより、免疫系における秩序を維持する。これは大まかには自然Treg又は適応性（adaptive）（誘導性）Tregに分類される。自然Tregは、胸腺から発生し移動して免疫恒常性における中心的な役割を果たすCD4+ CD25+ T細胞である。適応性Tregは、胸腺以外でCD25（IL-2Rアルファ）の発現を獲得する非制御性CD4+ T細胞であり、典型的には、炎症及び疾患プロセス、例えば自己免疫及び癌により誘導される。
【０００３】
制御性T細胞（Treg）は過剰な免疫系活性化を抑制し、免疫寛容を促進させる。Tregは先天免疫と獲得免疫との両方を調節するため、最近、免疫療法にTregを使用することに強い関心が寄せられている。治療成績を改善するのに臨床的寛容を要する状態、すなわち、自己免疫疾患、実質臓器移植及び造血幹細胞移植には、Treg細胞免疫療法が有益でありうる。臨床的に実施可能なTreg免疫療法の障害には、Tregの安定性、オフセル（off-cell）効果及び細胞調製物の純度と効力との実証が含まれる。移植片対宿主病（GVHD）を治療するためのTreg養子移入を含む臨床試験は、ヒトにおけるTreg免疫療法の安全性及び有効性を予備的に実証した。これらの試験において、TregはGVHD患者の血中で2週間以上は持続しないことが判明した。
【０００４】
したがって、短い持続性のような障害を克服する免疫細胞を開発することが当技術分野で必要とされている。特に、インビボでの持続性が向上したTregを開発することが当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
概括
ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターは、移植片対宿主病（GVHD）を有する対象を治療する際の標準治療予防法であり、Tregの持続性及び機能を阻害しうる。GVHDの標準治療予防法（例えば、カルシニューリンインヒビター、ステロイド）と組合されたTエフェクター（Teff）細胞のTreg抑制は、Tregの持続性及び機能を直接阻害しうる。本発明は、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターに対して耐性となるように遺伝的に修飾された免疫細胞（例えば、Treg）が、機能及び生存の改善を示すという知見に基づく。本発明はステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性免疫細胞（例えば、Treg）を提供する。本発明はまた、そのような遺伝的に修飾された免疫細胞を生成する方法、並びにステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターを予防用物質として使用する場合の、同種応答及び／又は同種免疫を治療するための、同免疫細胞の使用方法を提供する。
【０００６】
第1の態様においては、本発明は、NR3C1をコードする遺伝子座における遺伝的修飾を含むステロイド耐性遺伝的修飾造血細胞又はその前駆細胞を提供し、ここで、前記修飾はNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、前記修飾はNR3C1のエクソン、スプライスドナー又はスプライスアクセプター内に位置し、修飾細胞は遺伝的修飾の結果としてステロイド耐性にされている。遺伝的修飾はCRISPR-Cas系、CRISPR-Cpf1系、Cas9オーソログ、Cas9パラログ、Cas関連ファミリーメンバー、ジンクフィンガー、TALEN又はメガヌクレアーゼによりもたらされうる。修飾はインデルでありうる。インデルはNR3C1のエクソン2内に位置しうる。NR3C1におけるインデルはCRISPR系によりもたらされうる。CRISPR系はCRISPRヌクレアーゼ及びガイド（guide）RNAを含みうる。ガイドRNAは、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。ガイドRNAは、配列番号7〜10のいずれか1つに示される核酸配列を含みうる。ガイドRNAは、配列番号8に示される核酸配列を含みうる。修飾は塩基対置換でありうる。NR3C1における置換はCRISPR系によりもたらされうる。CRISPR系は、塩基エディター（base editor）及びガイドRNAを含みうる。塩基エディターは、CRISPR不活化（CRISPRにより不活化された）又はニッキングDNA結合ドメイン又はその変異体（バリアント）と塩基編集ドメインとを含みうる。CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインは、Cas9ドメインでありうる。CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインは、変異Cas9ドメインでありうる。変異Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインでありうる。塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメインでありうる。デアミナーゼドメインは、シトシン又はアデニンに対する特異性を有しうる。デアミナーゼドメインは、シチジン又はアデノシンデアミナーゼでありうる。置換は、NR3C1内に未成熟終止コドンを導入することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらしうる。ガイドRNAは、NR3C1のエクソンにおける標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。ガイドRNAは、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。ガイドRNAは、配列番号17〜54のいずれか1つに示される核酸配列を含みうる。ガイドRNAは、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーを含む標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。置換は、NR3C1 mRNAのスプライシングを破壊すること（disrupting）が可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらしうる。ガイドRNAは、配列番号55又は56のいずれか1つに示される核酸配列を含みうる。修飾細胞は、コルチコステロイドに耐性でありうる。修飾細胞は、糖質コルチコステロイドに耐性でありうる。糖質コルチコステロイドは、プロゲステロン型糖質コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン型糖質コルチコステロイド、メタゾン型糖質コルチコステロイド及びアセトニド型糖質コルチコステロイドからなる群から選択されうる。糖質コルチコステロイドは、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、プレドニゾン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、デフラザコート、メチルプレドニゾロン、トリアム���ノロン、フルドロコルチゾン及びデオキシコルチコステロンからなる群から選択されうる。
【０００７】
他の態様においては、本開示は、細胞のゲノム内に外因性カルシニューリンインヒビター（CNI）耐性遺伝子を含む、カルシニューリンインヒビター（CNI）耐性の遺伝的修飾造血細胞又はその前駆細胞を提供し、ここで、CNI耐性遺伝子はCRISPR媒介性相同組換え修復（HDR）の結果として挿入されており、修飾細胞は、耐性遺伝子の結果としてCNI耐性にされている。カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子は、NR3C1をコードする遺伝子座において挿入されうる。カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子は、PPP3Ca、PPP3Cb及びPPP3Ccからなる群から選択されるカルシニューリンA（CNa）遺伝子の突然変異形態、又はPPP3R1及びPPP3R2からなる群から選択されるカルシニューリンB（CNb）遺伝子の突然変異形態でありうる。突然変異カルシニューリン遺伝子は、外因性ドナーDNA配列を使用する相同組換えによりNR3C1遺伝子座内に挿入されうる。外因性ドナーDNA配列は、配列番号11に示される核酸配列を含みうる。カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子はカルシニューリン変異タンパク質をコードしうる。カルシニューリン変異タンパク質は、CNa12、CNa22及びCNb30からなる群から選択されうる。カルシニューリン変異体は、配列番号3〜5のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含みうる。カルシニューリン変異タンパク質はカルシニューリンインヒビターには結合しうるが、カルシニューリンには結合できず、それにより、カルシニューリンインヒビターの隔離及びカルシニューリン阻害の予防をもたらしうる。修飾細胞は、シクロスポリンA（CsA）、ボクロスポリン、タクロリムス（FK-506、フジマイシン）、ピメクロリムス並びにそれらの誘導体及び類似体からなる群から選択されるカルシニューリンインヒビターに耐性でありうる。
【０００８】
さらなる態様においては、本開示は、（1）NR3C1をコードする遺伝子座内にインデルを含む第1遺伝的修飾であって、インデルがNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能な、第1遺伝的修飾と、（2）細胞のゲノム内に挿入された外因性CNI耐性遺伝子を含む第2遺伝的修飾であって、前記CNI耐性遺伝子が、NR3C1をコードする遺伝子座内のインデルの部位に存在する、第2遺伝的修飾と、を含む遺伝的に修飾されたステロイド耐性及びカルシニューリンインヒビター（CNI）耐性造血細胞又はその前駆細胞を提供し、ここで、修飾細胞は遺伝的修飾の結果としてステロイド耐性及びCNI耐性にされている。遺伝子座は、NR3C1のエクソン2に対応しうる。インデルは、配列番号7〜10のいずれか1つに示される核酸配列を含むガイドRNAを含むCRISPR系によりもたらされうる。インデルは、配列番号8に示される核酸配列を含むガイドRNAを含むCRISPR系によりもたらされうる。
【０００９】
他の態様においては、本開示は、（1）NR3C1遺伝子座内に修飾を含む第1遺伝的修飾であって、前記修飾がNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能な、第1遺伝的修飾と、（2）細胞のゲノム内に挿入された外因性CNI耐性遺伝子を含む第2遺伝的修飾と、を含む遺伝的に修飾されたステロイド耐性及びカルシニューリンインヒビター（CNI）耐性造血細胞又はその前駆細胞を提供し、ここで、修飾細胞は遺伝的修飾の結果としてステロイド耐性及びCNI耐性にされている。第1又は第2修飾は、CRISPR-Cas9系、CRISPR-Cpf1系、Cas9オーソログ、Cas9パラログ、Cas関連ファミリーメンバー、ジンクフィンガー、TALEN又はメガヌクレアーゼによりもたらされうる。修飾はインデルでありうる。インデルはNR3C1のエクソン2内に位置しうる。NR3C1におけるインデルは、CRISPR系によりもたらされうる。CRISPR系はCRISPRヌクレアーゼ及びガイドRNAを含みうる。ガイドRNAは、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。ガイドRNAは、配列番号7〜10のいずれか1つに示される核酸配列を含みうる。ガイドRNAは、配列番号8に示される核酸配列を含みうる。修飾は塩基対置換でありうる。NR3C1における置換は、CRISPR系によりもたらされうる。CRISPR系は、塩基エディター及びガイドRNAを含みうる。塩基エディターは、CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメイン又はその変異体と塩基編集ドメインとを含みうる。CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインは、Cas9ドメインでありうる。CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインは、変異Cas9ドメインでありうる。変異Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインでありうる。塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメインでありうる。デアミナーゼドメインは、シトシン又はアデニンに対する特異性を有しうる。デアミナーゼドメインは、シチジン又はアデノシンデアミナーゼでありうる。置換は、NR3C1内に未成熟終止コドンを導入することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらしうる。ガイドRNAは、NR3C1のエクソンにおける標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。ガイドRNAは、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。ガイドRNAは、配列番号17〜54のいずれか1つに示される核酸配列を含みうる。ガイドRNAは、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーを含む標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。置換は、NR3C1 mRNAのスプライシングを破壊することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらしうる。ガイドRNAは、配列番号55〜56のいずれか1つに示される核酸配列を含みうる。修飾細胞は、コルチコステロイドに耐性でありうる。修飾細胞は、糖質コルチコステロイドに耐性でありうる。糖質コルチコステロイドは、プロゲステロン型糖質コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン型糖質コルチコステロイド、メタゾン型糖質コルチコステロイド及びアセトニド型糖質コルチコステロイドからなる群から選択されうる。糖質コルチコステロイドは、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、プレドニゾン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、デフラザコート、メチルプレドニゾ���ン、トリアムシノロン、フルドロコルチゾン及びデオキシコルチコステロンからなる群から選択されうる。カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子は、PPP3Ca、PPP3Cb及びPPP3Ccからなる群から選択されるカルシニューリンA（CNa）遺伝子の突然変異形態、又はPPP3R1及びPPP3R2からなる群から選択されるカルシニューリンB（CNb）遺伝子の突然変異形態でありうる。カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子は、カルシニューリン変異タンパク質をコードしうる。カルシニューリン変異タンパク質は、CNa12、CNa22及びCNb30からなる群から選択されうる。カルシニューリン変異タンパク質は、配列番号3〜5のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含みうる。カルシニューリン変異タンパク質は、カルシニューリンインヒビターには結合しうるが、カルシニューリンには結合できず、それにより、カルシニューリンインヒビターの隔離及びカルシニューリン阻害の予防をもたらしうる。突然変異カルシニューリン遺伝子は、外因性ドナーDNA配列を使用する相同組換えにより細胞のゲノム内に挿入されうる。突然変異カルシニューリン遺伝子はNR3C1遺伝子座内に挿入されうる。修飾細胞は、シクロスポリンA（CsA）、ボクロスポリン、タクロリムス（FK-506、フジマイシン）、ピメクロリムス並びにそれらの誘導体及び類似体からなる群から選択されるカルシニューリンインヒビターに耐性でありうる。修飾細胞は、修飾された免疫細胞でありうる。修飾細胞は、修飾された制御性T細胞（Treg）でありうる。修飾細胞は、自家細胞でありうる。修飾細胞は、同種異系細胞でありうる。修飾細胞はヒト対象から単離されうる。ヒト対象は、幹細胞移植を受けた対象であってもよく、又は幹細胞移植の候補者である。ヒト対象は、実質臓器移植を受けた対象であってもよく、又は実質臓器移植の候補者である。ヒト対象は、自己免疫障害に罹患していることが可能である。ヒト対象は、移植片対宿主病（GVHD）に罹患していてもよい。ヒト対象は、1型糖尿病に罹患していてもよい。
【００１０】
さらなる態様においては、本開示は、NR3C1をコードする遺伝子座における修飾をもたらすCRISPR系を細胞内に導入することを含む、修飾された造血細胞又はその前駆細胞を生成する方法を提供し、ここで、修飾は、NR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートしうる。修飾は、NR3C1のエクソン2におけるインデルでありうる。CRISPR系は、CRISPRヌクレアーゼ及びガイドRNAを含みうる。ガイドRNAは、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。ガイドRNAは、配列番号7〜10のいずれか1つに示される核酸配列を含みうる。ガイドRNAは、配列番号8に示される核酸配列を含みうる。修飾は、塩基対置換でありうる。CRISPR系は、塩基エディター及びガイドRNAを含みうる。塩基エディターは、CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメイン又はその変異体と塩基編集ドメインとを含みうる。CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインは、Cas9ドメインでありうる。CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインは、変異Cas9ドメインでありうる。変異Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Cas9ドメインでありうる。塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメインでありうる。デアミナーゼドメインは、シトシン又はアデニンに対する特異性を有しうる。デアミナーゼドメインは、シチジン又はアデノシンデアミナーゼでありうる。置換は、NR3C1内に未成熟終止コドンを導入することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらしうる。ガイドRNAは、NR3C1のエクソンにおける標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。ガイドRNAは、NR3C1のエクソン2における標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。ガイドRNAは、配列番号17〜54のいずれか1つに示される核酸配列を含みうる。ガイドRNAは、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーを含む標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含みうる。置換は、NR3C1 mRNAのスプライシングを破壊することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらしうる。ガイドRNAは、配列番号55〜56のいずれか1つに示される核酸配列を含みうる。CRISPRヌクレアーゼ／塩基エディター及びガイドRNAは、リボ核タンパク質（RNP）複合体を構成しうる。CRISPRヌクレアーゼ／塩基エディター及び／又はガイドRNAは、ポリヌクレオチドによりコードされうる。ポリヌクレオチドは、ベクター及び／又は合成mRNAを含みうる。RNP又はポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションにより導入されうる。方法は、細胞のゲノム内への外因性カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子の挿入を更に含みうる。外因性カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子の挿入は、相同組換えによるものでありうる。挿入は、NR3C1をコードする遺伝子座におけるインデルの部位で生じうる。挿入は、NR3C1をコードする遺伝子座におけるインデルの部位で生じうる。挿入は、外因性ドナーDNA配列からの相同組換えにより、NR3C1をコードする遺伝子座におけるインデルの部位で生じうる。外因性ドナーDNA配列は、配列番号11に示される核酸配列を含みうる。外因性ドナーDNA配列はウイルス形質導入により導入されうる。外因性ドナーDNA配列は、エレクトロポレーションにより導入されうる。外因性ドナーDNA配列は、レポーター��子をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む。レポーター分子をコードする核酸とプロモーターとは、リンカーにより隔てられうる。リンカーは、T2A配列を含みうる。カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子は、PPP3Ca、PPP3Cb及びPPP3Ccからなる群から選択されるカルシニューリンA（CNa）遺伝子の突然変異形態、又はPPP3R1及びPPP3R2からなる群から選択されるカルシニューリンB（CNb）遺伝子の突然変異形態でありうる。カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子は、カルシニューリン変異タンパク質をコードしうる。カルシニューリン変異タンパク質は、CNa12、CNa22及びCNb30からなる群から選択されうる。カルシニューリン変異タンパク質は、配列番号3〜5のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含みうる。修飾細胞は、修飾された免疫細胞でありうる。修飾細胞は、修飾された制御性T細胞（Treg）でありうる。修飾細胞は、自家細胞でありうる。修飾細胞は、同種異系細胞でありうる。修飾細胞は、ヒト対象から単離されうる。ヒト対象は、幹細胞移植を受けた対象であってもよく、又は幹細胞移植の候補者である。ヒト対象は、実質臓器移植を受けた対象であってもよく、又は実質臓器移植の候補者である。ヒト対象は、自己免疫障害に罹患していてもよい。ヒト対象は、移植片対宿主病（GVHD）に罹患していてもよい。ヒト対象は、1型糖尿病に罹患していてもよい。
【００１１】
他の態様においては、本開示は、本開示で提供される修飾細胞を対象に投与することを含む、免疫抑制効果を要する対象において免疫抑制効果を達成する方法を提供する。対象は、同種応答及び／又は自己免疫応答を被った対象であってもよい。
【００１２】
さらなる態様においては、本開示は、同種応答及び／又は自己免疫応答の開始前に、本開示で提供される修飾細胞の集団を対象に投与することを含む、予防的治療効果を要する対象において予防的治療効果を達成するための方法を提供する。同種応答及び／又は自己免疫応答は、生物学的物質の移植の後で生じうる。生体学的物質は、細胞、組織及び臓器からなる群から選択されうる。生物学的物質は、同種異系でありうる。対象は、ヒトでありうる。ヒト対象は、幹細胞移植を受けた対象であってもよく、又は幹細胞移植の候補者である。ヒト対象は、実質臓器移植を受けた対象であってもよく、又は実質臓器移植の候補者である。ヒト対象は、自己免疫障害に罹患していてもよい。ヒト対象は、移植片対宿主病（GVHD）に罹患していてもよい。ヒト対象は、1型糖尿病に罹患していてもよい。修飾細胞は、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターと組合せて投与されうる。ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターは、修飾細胞の投与の前に投与されうる。ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターは、修飾細胞の投与と同時に、又は投与の後に投与されうる。ステロイドは、コルチコステロイドでありうる。ステロイドは、糖質コルチコステロイドでありうる。糖質コルチコステロイドは、プロゲステロン型糖質コルチコステロイド、ヒドロコルチゾン型糖質コルチコステロイド、メタゾン型糖質コルチコステロイド及びアセトニド型糖質コルチコステロイドからなる群から選択されうる。糖質コルチコステロイドは、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、プレドニゾン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、デフラザコート、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、フルドロコルチゾン及びデオキシコルチコステロンからなる群から選択されうる。カルシニューリンインヒビターは、シクロスポリンA（CsA）、ボクロスポリン、タクロリムス（FK-506、フジマイシン）、ピメクロリムス並びにそれらの誘導体及び類似体からなる群から選択されうる。
【００１３】
図面の簡潔な説明
本発明の前記及び他の特徴及び利点は、添付図面と併せて理解される例示実施形態の詳細な説明から十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、本発明の1つの実施形態のTregバンク化プロトコルの1つの形態を示す概要図を示す。
【図２Ａ】図2A〜2Dは、Treg生存に対するデキサメタゾンの効果を示すデータを示す。記載されているとおりに4つの実験を行った。示されているデータは全実験からの集計データであり、平均±平均の1標準誤差を表す。図2Aは、培養条件のタイムラインを示す概要図を示す。図2Bは、生存に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。図2Cは、FOXP3+ CD127- 細胞に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。図2Dは、抑制活性に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。P値は各Treg：PBMC比において2つの群間で0.05以下であった。
【図２Ｂ】図2A〜2Dは、Treg生存に対するデキサメタゾンの効果を示すデータを示す。記載されているとおりに4つの実験を行った。示されているデータは全実験からの集計データであり、平均±平均の1標準誤差を表す。図2Aは、培養条件のタイムラインを示す概要図を示す。図2Bは、生存に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。図2Cは、FOXP3+ CD127- 細胞に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。図2Dは、抑制活性に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。P値は各Treg：PBMC比において2つの群間で0.05以下であった。
【図２Ｃ】図2A〜2Dは、Treg生存に対するデキサメタゾンの効果を示すデータを示す。記載されているとおりに4つの実験を行った。示されているデータは全実験からの集計データであり、平均±平均の1標準誤差を表す。図2Aは、培養条件のタイムラインを示す概要図を示す。図2Bは、生存に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。図2Cは、FOXP3+ CD127- 細胞に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。図2Dは、抑制活性に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。P値は各Treg：PBMC比において2つの群間で0.05以下であった。
【図２Ｄ】図2A〜2Dは、Treg生存に対するデキサメタゾンの効果を示すデータを示す。記載されているとおりに4つの実験を行った。示されているデータは全実験からの集計データであり、平均±平均の1標準誤差を表す。図2Aは、培養条件のタイムラインを示す概要図を示す。図2Bは、生存に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。図2Cは、FOXP3+ CD127- 細胞に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。図2Dは、抑制活性に対するデキサメタゾンの効果を示すグラフを示す。P値は各Treg：PBMC比において2つの群間で0.05以下であった。
【図３Ａ】図3A〜3DはCRISPRガイドRNA及びCas９によるNR3C1糖質コルチコイド受容体の遺伝子編集のプロセスを示す。図3Aは、遺伝子導入のプロセスを例示する概要図を示す。T細胞又はTregを回収し、48時間（新鮮）又は72時間（凍結）にわたってCD3/CD28ビーズで活性化した。Neonエレクトロポレーション装置を使用して、Cas9 mRNA又はタンパク質を遺伝子特異的ガイドRNAと共に送達した。図3Bは、NR3C1遺伝子標的化を例示する概要図を示す。エクソン2における4つの部位を特定し、試験した。4名の候補者を特定した。サーベイヤー（Surveyor）法を用いて候補者を試験した。図3Cは、サーベイヤーアッセイを例示する概要図を示す。修飾された遺伝子（「突然変異アンプリコン」）及び修飾されていない遺伝子（「野生型アンプリコン」）をハイブリダイズさせてホモ二本鎖又はヘテロ二本鎖を得る。遺伝子編集された配列と野生型配列とのペア形成により生じたヘテロ二本鎖をサーベイヤー酵素により切断し、編集可能なDNA断片を得る。
【図３Ｂ】図3A〜3DはCRISPRガイドRNA及びCas９によるNR3C1糖質コルチコイド受容体の遺伝子編集のプロセスを示す。図3Aは、遺伝子導入のプロセスを例示する概要図を示す。T細胞又はTregを回収し、48時間（新鮮）又は72時間（凍結）にわたってCD3/CD28ビーズで活性化した。Neonエレクトロポレーション装置を使用して、Cas9 mRNA又はタンパク質を遺伝子特異的ガイドRNAと共に送達した。図3Bは、NR3C1遺伝子標的化を例示する概要図を示す。エクソン2における4つの部位を特定し、試験した。4名の候補者を特定した。サーベイヤー（Surveyor）法を用いて候補者を試験した。図3Cは、サーベイヤーアッセイを例示する概要図を示す。修飾された遺伝子（「突然変異アンプリコン」）及び修飾されていない遺伝子（「野生型アンプリコン」）をハイブリダイズさせてホモ二本鎖又はヘテロ二本鎖を得る。遺伝子編集された配列と野生型配列とのペア形成により生じたヘテロ二本鎖をサーベイヤー酵素により切断し、編集可能なDNA断片を得る。
【図３Ｃ】図3A〜3DはCRISPRガイドRNA及びCas９によるNR3C1糖質コルチコイド受容体の遺伝子編集のプロセスを示す。図3Aは、遺伝子導入のプロセスを例示する概要図を示す。T細胞又はTregを回収し、48時間（新鮮）又は72時間（凍結）にわたってCD3/CD28ビーズで活性化した。Neonエレクトロポレーション装置を使用して、Cas9 mRNA又はタンパク質を遺伝子特異的ガイドRNAと共に送達した。図3Bは、NR3C1遺伝子標的化を例示する概要図を示す。エクソン2における4つの部位を特定し、試験した。4名の候補者を特定した。サーベイヤー（Surveyor）法を用いて候補者を試験した。図3Cは、サーベイヤーアッセイを例示する概要図を示す。修飾された遺伝子（「突然変異アンプリコン」）及び修飾されていない遺伝子（「野生型アンプリコン」）をハイブリダイズさせてホモ二本鎖又はヘテロ二本鎖を得る。遺伝子編集された配列と野生型配列とのペア形成により生じたヘテロ二本鎖をサーベイヤー酵素により切断し、編集可能なDNA断片を得る。
【図３Ｄ】図3A〜3DはCRISPRガイドRNA及びCas９によるNR3C1糖質コルチコイド受容体の遺伝子編集のプロセスを示す。図3Aは、遺伝子導入のプロセスを例示する概要図を示す。T細胞又はTregを回収し、48時間（新鮮）又は72時間（凍結）にわたってCD3/CD28ビーズで活性化した。Neonエレクトロポレーション装置を使用して、Cas9 mRNA又はタンパク質を遺伝子特異的ガイドRNAと共に送達した。図3Bは、NR3C1遺伝子標的化を例示する概要図を示す。エクソン2における4つの部位を特定し、試験した。4名の候補者を特定した。サーベイヤー（Surveyor）法を用いて候補者を試験した。図3Cは、サーベイヤーアッセイを例示する概要図を示す。修飾された遺伝子（「突然変異アンプリコン」）及び修飾されていない遺伝子（「野生型アンプリコン」）をハイブリダイズさせてホモ二本鎖又はヘテロ二本鎖を得る。遺伝子編集された配列と野生型配列とのペア形成により生じたヘテロ二本鎖をサーベイヤー酵素により切断し、編集可能なDNA断片を得る。
【図４Ａ】図4A〜4Dは、TregにおけるCRISPR/Cas9媒介性NR3C1ノックアウトを示す。ガイドRNA候補GR1及びGR2を、Cas9ペプチドを含むリボ核タンパク質粒子（RNP）として、活性化Treg内にエレクトロポレーションした。図4Aは、培養プロセスを例示する概要図を示す。図4Bは、示されている条件で30μg/mLのデキサメタゾンを添加した72時間後にTregの生存を評価したプロットを示す。図4C及び図4Dは、デキサメタゾン添加前（図4C）及びデキサメタゾン添加後（図4D）のNR3C1遺伝子座の分子分析を示す。NR3C1遺伝子座を細胞のプールから増幅し、インデル分析をTIDEにより行った。総遺伝子修飾率は、デキサメタゾン添加前及び添加後の細胞に関して、それぞれ35%及び44%であった。グラフは、各集団で観察されたインデルパターンに対応する。いずれの理論によっても束縛されるものではないが、フレーム外インデル（例えば、3で割り切れないもの）は遺伝子不活性化をもたらすと予想される。Y軸は合計比率（%）としてのインデルの数を示す。X軸は未修飾体（位置0におけるバーとして示されている）に対するインデルを示す。欠失は0の位置の左側に示されており、各バーは標的部位から1〜10bp離れている。+1 bpの挿入は0位の右側に示されている。アスタリスクは+1、-1及び7 bpの挿入／欠失を示し、これらの事象の頻度はデキサメタゾン曝露と共に増加した（図4Cを図4Dと比較）。図4C〜4Dにおける暗黒色バーは0.5%未満の編集事象を示す。
【図４Ｂ】図4A〜4Dは、TregにおけるCRISPR/Cas9媒介性NR3C1ノックアウトを示す。ガイドRNA候補GR1及びGR2を、Cas9ペプチドを含むリボ核タンパク質粒子（RNP）として、活性化Treg内にエレクトロポレーションした。図4Aは、培養プロセスを例示する概要図を示す。図4Bは、示されている条件で30μg/mLのデキサメタゾンを添加した72時間後にTregの生存を評価したプロットを示す。図4C及び図4Dは、デキサメタゾン添加前（図4C）及びデキサメタゾン添加後（図4D）のNR3C1遺伝子座の分子分析を示す。NR3C1遺伝子座を細胞のプールから増幅し、インデル分析をTIDEにより行った。総遺伝子修飾率は、デキサメタゾン添加前及び添加後の細胞に関して、それぞれ35%及び44%であった。グラフは、各集団で観察されたインデルパターンに対応する。いずれの理論によっても束縛されるものではないが、フレーム外インデル（例えば、3で割り切れないもの）は遺伝子不活性化をもたらすと予想される。Y軸は合計比率（%）としてのインデルの数を示す。X軸は未修飾体（位置0におけるバーとして示されている）に対するインデルを示す。欠失は0の位置の左側に示されており、各バーは標的部位から1〜10bp離れている。+1 bpの挿入は0位の右側に示されている。アスタリスクは+1、-1及び7 bpの挿入／欠失を示し、これらの事象の頻度はデキサメタゾン曝露と共に増加した（図4Cを図4Dと比較）。図4C〜4Dにおける暗黒色バーは0.5%未満の編集事象を示す。
【図４Ｃ】図4A〜4Dは、TregにおけるCRISPR/Cas9媒介性NR3C1ノックアウトを示す。ガイドRNA候補GR1及びGR2を、Cas9ペプチドを含むリボ核タンパク質粒子（RNP）として、活性化Treg内にエレクトロポレーションした。図4Aは、培養プロセスを例示する概要図を示す。図4Bは、示されている条件で30μg/mLのデキサメタゾンを添加した72時間後にTregの生存を評価したプロットを示す。図4C及び図4Dは、デキサメタゾン添加前（図4C）及びデキサメタゾン添加後（図4D）のNR3C1遺伝子座の分子分析を示す。NR3C1遺伝子座を細胞のプールから増幅し、インデル分析をTIDEにより行った。総遺伝子修飾率は、デキサメタゾン添加前及び添加後の細胞に関して、それぞれ35%及び44%であった。グラフは、各集団で観察されたインデルパターンに対応する。いずれの理論によっても束縛されるものではないが、フレーム外インデル（例えば、3で割り切れないもの）は遺伝子不活性化をもたらすと予想される。Y軸は合計比率（%）としてのインデルの数を示す。X軸は未修飾体（位置0におけるバーとして示されている）に対するインデルを示す。欠失は0の位置の左側に示されており、各バーは標的部位から1〜10bp離れている。+1 bpの挿入は0位の右側に示されている。アスタリスクは+1、-1及び7 bpの挿入／欠失を示し、これらの事象の頻度はデキサメタゾン曝露と共に増加した（図4Cを図4Dと比較）。図4C〜4Dにおける暗黒色バーは0.5%未満の編集事象を示す。
【図４Ｄ】図4A〜4Dは、TregにおけるCRISPR/Cas9媒介性NR3C1ノックアウトを示す。ガイドRNA候補GR1及びGR2を、Cas9ペプチドを含むリボ核タンパク質粒子（RNP）として、活性化Treg内にエレクトロポレーションした。図4Aは、培養プロセスを例示する概要図を示す。図4Bは、示されている条件で30μg/mLのデキサメタゾンを添加した72時間後にTregの生存を評価したプロットを示す。図4C及び図4Dは、デキサメタゾン添加前（図4C）及びデキサメタゾン添加後（図4D）のNR3C1遺伝子座の分子分析を示す。NR3C1遺伝子座を細胞のプールから増幅し、インデル分析をTIDEにより行った。総遺伝子修飾率は、デキサメタゾン添加前及び添加後の細胞に関して、それぞれ35%及び44%であった。グラフは、各集団で観察されたインデルパターンに対応する。いずれの理論によっても束縛されるものではないが、フレーム外インデル（例えば、3で割り切れないもの）は遺伝子不活性化をもたらすと予想される。Y軸は合計比率（%）としてのインデルの数を示す。X軸は未修飾体（位置0におけるバーとして示されている）に対するインデルを示す。欠失は0の位置の左側に示されており、各バーは標的部位から1〜10bp離れている。+1 bpの挿入は0位の右側に示されている。アスタリスクは+1、-1及び7 bpの挿入／欠失を示し、これらの事象の頻度はデキサメタゾン曝露と共に増加した（図4Cを図4Dと比較）。図4C〜4Dにおける暗黒色バーは0.5%未満の編集事象を示す。
【図５Ａ】図5A〜5CはTregにおける相同組換え修復（homology directed repair）（HDR）を示す。図5Aは遺伝子標的化法を示す。GFPと共発現するカルシニューリン耐性遺伝子を、それがNR3C1遺伝子のエクソン2に標的化されて21アミノ酸の喪失をもたらすように設計した。ドナーをAAV-6粒子内に封入し、標的遺伝子座におけるドナー内部及びドナー外部のプライマー（水平矢印で示されている）を使用するインサイド／アウトPCRを用いてスクリーニングを行った。図5Bは遺伝子標的化の最適化を示す。活性化TregをNR3C1 Cas9 RNPと共にエレクトロポレーションし、示されている異なる量のAAV-6ドナーを添加した。インサイド／アウトPCRの結果は、図5Cに示されているドナーと隣接遺伝子座配列との間の連結部のサンガー配列決定確認と共に示されている。
【図５Ｂ】図5A〜5CはTregにおける相同組換え修復（homology directed repair）（HDR）を示す。図5Aは遺伝子標的化法を示す。GFPと共発現するカルシニューリン耐性遺伝子を、それがNR3C1遺伝子のエクソン2に標的化されて21アミノ酸の喪失をもたらすように設計した。ドナーをAAV-6粒子内に封入し、標的遺伝子座におけるドナー内部及びドナー外部のプライマー（水平矢印で示されている）を使用するインサイド／アウトPCRを用いてスクリーニングを行った。図5Bは遺伝子標的化の最適化を示す。活性化TregをNR3C1 Cas9 RNPと共にエレクトロポレーションし、示されている異なる量のAAV-6ドナーを添加した。インサイド／アウトPCRの結果は、図5Cに示されているドナーと隣接遺伝子座配列との間の連結部のサンガー配列決定確認と共に示されている。
【図５Ｃ】図5A〜5CはTregにおける相同組換え修復（homology directed repair）（HDR）を示す。図5Aは遺伝子標的化法を示す。GFPと共発現するカルシニューリン耐性遺伝子を、それがNR3C1遺伝子のエクソン2に標的化されて21アミノ酸の喪失をもたらすように設計した。ドナーをAAV-6粒子内に封入し、標的遺伝子座におけるドナー内部及びドナー外部のプライマー（水平矢印で示されている）を使用するインサイド／アウトPCRを用いてスクリーニングを行った。図5Bは遺伝子標的化の最適化を示す。活性化TregをNR3C1 Cas9 RNPと共にエレクトロポレーションし、示されている異なる量のAAV-6ドナーを添加した。インサイド／アウトPCRの結果は、図5Cに示されているドナーと隣接遺伝子座配列との間の連結部のサンガー配列決定確認と共に示されている。
【図６Ａ】図6A〜6Dは、最適なTreg増殖条件下でGR2-Cas9及びAAVを使用するTregにおけるHDRが、カルシニューリン突然変異体（CnB mut）の挿入により、糖質コルチコイド破壊Tregの生存をレスキューすることを示す。図6Aは、培養プロセスを例示する概要図を示す。図6（B）（P < 0.07）は2日間にわたる対照及びカルシニューリン突然変異体（CnB mut）AAV形質導入Tregの増殖倍数を示す。図6Cは、対照（黒）又はカルシニューリン突然変異体（CnB mut; 灰色）に関して示されている、デキサメタゾンの不存在下又は存在下のGFP発現率（%）を示す。図6Dは、示されているデキサメタゾン濃度に曝露又は模擬形質導入されたTregの相対生存を示す。P値は、示されているとおりであり、4つの別々の培養からの集計データを表す。
【図６Ｂ】図6A〜6Dは、最適なTreg増殖条件下でGR2-Cas9及びAAVを使用するTregにおけるHDRが、カルシニューリン突然変異体（CnB mut）の挿入により、糖質コルチコイド破壊Tregの生存をレスキューすることを示す。図6Aは、培養プロセスを例示する概要図を示す。図6（B）（P < 0.07）は2日間にわたる対照及びカルシニューリン突然変異体（CnB mut）AAV形質導入Tregの増殖倍数を示す。図6Cは、対照（黒）又はカルシニューリン突然変異体（CnB mut; 灰色）に関して示されている、デキサメタゾンの不存在下又は存在下のGFP発現率（%）を示す。図6Dは、示されているデキサメタゾン濃度に曝露又は模擬形質導入されたTregの相対生存を示す。P値は、示されているとおりであり、4つの別々の培養からの集計データを表す。
【図６Ｃ】図6A〜6Dは、最適なTreg増殖条件下でGR2-Cas9及びAAVを使用するTregにおけるHDRが、カルシニューリン突然変異体（CnB mut）の挿入により、糖質コルチコイド破壊Tregの生存をレスキューすることを示す。図6Aは、培養プロセスを例示する概要図を示す。図6（B）（P < 0.07）は2日間にわたる対照及びカルシニューリン突然変異体（CnB mut）AAV形質導入Tregの増殖倍数を示す。図6Cは、対照（黒）又はカルシニューリン突然変異体（CnB mut; 灰色）に関して示されている、デキサメタゾンの不存在下又は存在下のGFP発現率（%）を示す。図6Dは、示されているデキサメタゾン濃度に曝露又は模擬形質導入されたTregの相対生存を示す。P値は、示されているとおりであり、4つの別々の培養からの集計データを表す。
【図６Ｄ】図6A〜6Dは、最適なTreg増殖条件下でGR2-Cas9及びAAVを使用するTregにおけるHDRが、カルシニューリン突然変異体（CnB mut）の挿入により、糖質コルチコイド破壊Tregの生存をレスキューすることを示す。図6Aは、培養プロセスを例示する概要図を示す。図6（B）（P < 0.07）は2日間にわたる対照及びカルシニューリン突然変異体（CnB mut）AAV形質導入Tregの増殖倍数を示す。図6Cは、対照（黒）又はカルシニューリン突然変異体（CnB mut; 灰色）に関して示されている、デキサメタゾンの不存在下又は存在下のGFP発現率（%）を示す。図6Dは、示されているデキサメタゾン濃度に曝露又は模擬形質導入されたTregの相対生存を示す。P値は、示されているとおりであり、4つの別々の培養からの集計データを表す。
【図７Ａ】図7A〜7Dは、IL-2濃度に関連したTreg薬物感受性を示す。図7Aは、図7Bのデータを得るために用いた培養プロセスを例示する概要図を示す。図7Bは、薬物の不存在下（対照）又はCsA若しくはタクロリムス（FK506）の存在下で培養されたTregの生存率（%）を示すデータを示す（p = 全ての比較に関して有意でない）。薬物の不存在下の対照Tregに対する生存率（%）が示されている。300 U/mLのIL-2濃度を用いた。図7Cは、図7Dのデータを得るために用いた培養プロセスを例示する概要図を示す。図7Dは、示されている3O、100又は300 U/mLのIL-2の存在下、示されている濃度の薬物と共に培養されたものと比較した場合の、IL-2 300 U/mLにおける薬物不存在下のTregに対する相対生存率（%）を示すデータを示す。平均値は、3つ（図7B）又は4つ（図7D）の別々の培養の平均±標準誤差と共に示されている。
【図７Ｂ】図7A〜7Dは、IL-2濃度に関連したTreg薬物感受性を示す。図7Aは、図7Bのデータを得るために用いた培養プロセスを例示する概要図を示す。図7Bは、薬物の不存在下（対照）又はCsA若しくはタクロリムス（FK506）の存在下で培養されたTregの生存率（%）を示すデータを示す（p = 全ての比較に関して有意でない）。薬物の不存在下の対照Tregに対する生存率（%）が示されている。300 U/mLのIL-2濃度を用いた。図7Cは、図7Dのデータを得るために用いた培養プロセスを例示する概要図を示す。図7Dは、示されている3O、100又は300 U/mLのIL-2の存在下、示されている濃度の薬物と共に培養されたものと比較した場合の、IL-2 300 U/mLにおける薬物不存在下のTregに対する相対生存率（%）を示すデータを示す。平均値は、3つ（図7B）又は4つ（図7D）の別々の培養の平均±標準誤差と共に示されている。
【図７Ｃ】図7A〜7Dは、IL-2濃度に関連したTreg薬物感受性を示す。図7Aは、図7Bのデータを得るために用いた培養プロセスを例示する概要図を示す。図7Bは、薬物の不存在下（対照）又はCsA若しくはタクロリムス（FK506）の存在下で培養されたTregの生存率（%）を示すデータを示す（p = 全ての比較に関して有意でない）。薬物の不存在下の対照Tregに対する生存率（%）が示されている。300 U/mLのIL-2濃度を用いた。図7Cは、図7Dのデータを得るために用いた培養プロセスを例示する概要図を示す。図7Dは、示されている3O、100又は300 U/mLのIL-2の存在下、示されている濃度の薬物と共に培養されたものと比較した場合の、IL-2 300 U/mLにおける薬物不存在下のTregに対する相対生存率（%）を示すデータを示す。平均値は、3つ（図7B）又は4つ（図7D）の別々の培養の平均±標準誤差と共に示されている。
【図７Ｄ】図7A〜7Dは、IL-2濃度に関連したTreg薬物感受性を示す。図7Aは、図7Bのデータを得るために用いた培養プロセスを例示する概要図を示す。図7Bは、薬物の不存在下（対照）又はCsA若しくはタクロリムス（FK506）の存在下で培養されたTregの生存率（%）を示すデータを示す（p = 全ての比較に関して有意でない）。薬物の不存在下の対照Tregに対する生存率（%）が示されている。300 U/mLのIL-2濃度を用いた。図7Cは、図7Dのデータを得るために用いた培養プロセスを例示する概要図を示す。図7Dは、示されている3O、100又は300 U/mLのIL-2の存在下、示されている濃度の薬物と共に培養されたものと比較した場合の、IL-2 300 U/mLにおける薬物不存在下のTregに対する相対生存率（%）を示すデータを示す。平均値は、3つ（図7B）又は4つ（図7D）の別々の培養の平均±標準誤差と共に示されている。
【図８】図8は同種異系BMTレシピエントにおけるGVHD予防のためのステロイド用量応答を示す。n = 8/群。BALB/cマウスに致死的に照射し、B6 BM+ 2 M T細胞及びステロイド（示されている用量で第1日〜第28日）を投与した。低用量のラパマイシン（第0日〜第14日、第27日まで週3回）を比較物質として使用した。各群はビヒクル対照とは有意に異なることが判明した。
【図９】図9は、同種異系BMTレシピエントにおける、ステロイドに基づくGVHD療法を示す。n = 8/群。BALB/cマウスに致死的に照射し、B6 BM+ 1.5 M T細胞及びステロイド（示されているとおりに第3日〜第28日又は第4日〜第28日に10mg/kg/日）を投与した。第3日の処理はビヒクル対照よりも有意に優れていることが判明した（p = 0.03）。
【図１０】図10は、同種異系BMTレシピエントにおける、ステロイドに基づくGVHD療法を示す。n = 15（BM − 丸）、16（ビヒクル − 正方形）及び25（プレドニゾロン - 三角形）。BALB/cマウスに致死的に照射し、B6 BM+ 1.5 M T細胞及びステロイド（10mg/kg/日で第3日〜第28日）を投与した。第3日の処理はビヒクル対照よりも有意に優れていることが判明した（p = 0.0016）。
【図１１Ａ】図11A〜11DはマウスにおけるGVHDのモニタリングを示す。照射（50 rad）NSGマウスにヒトPBMC（15×106）±メチルプレドニゾロン（15mg/kg）を注射し、GVHDの徴候をモニターした。図11Aは、コホート（各群n＝7のマウス）、投与スケジュール及び分析点を示す実験の例示図を示す。図11Bは、PBMCのみ、又はPBMC+ プレドニゾロン（p = 0.104）の投与を受けたマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。図11Cは、体重減少によりモニターされた疾患進行を示す（p = 有意ではない）。図11Dは、PBMC由来CD45+、CD4+、CD8+及びCD4+ Foxp3+ T細胞の数を定量することによりモニターされた疾患進行を示す（それぞれ、p < 0.03、< 0.05、< 0.03及び有意ではない）。評価のために第19日に動物から採血した。
【図１１Ｂ】図11A〜11DはマウスにおけるGVHDのモニタリングを示す。照射（50 rad）NSGマウスにヒトPBMC（15×106）±メチルプレドニゾロン（15mg/kg）を注射し、GVHDの徴候をモニターした。図11Aは、コホート（各群n＝7のマウス）、投与スケジュール及び分析点を示す実験の例示図を示す。図11Bは、PBMCのみ、又はPBMC+ プレドニゾロン（p = 0.104）の投与を受けたマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。図11Cは、体重減少によりモニターされた疾患進行を示す（p = 有意ではない）。図11Dは、PBMC由来CD45+、CD4+、CD8+及びCD4+ Foxp3+ T細胞の数を定量することによりモニターされた疾患進行を示す（それぞれ、p < 0.03、< 0.05、< 0.03及び有意ではない）。評価のために第19日に動物から採血した。
【図１１Ｃ】図11A〜11DはマウスにおけるGVHDのモニタリングを示す。照射（50 rad）NSGマウスにヒトPBMC（15×106）±メチルプレドニゾロン（15mg/kg）を注射し、GVHDの徴候をモニターした。図11Aは、コホート（各群n＝7のマウス）、投与スケジュール及び分析点を示す実験の例示図を示す。図11Bは、PBMCのみ、又はPBMC+ プレドニゾロン（p = 0.104）の投与を受けたマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。図11Cは、体重減少によりモニターされた疾患進行を示す（p = 有意ではない）。図11Dは、PBMC由来CD45+、CD4+、CD8+及びCD4+ Foxp3+ T細胞の数を定量することによりモニターされた疾患進行を示す（それぞれ、p < 0.03、< 0.05、< 0.03及び有意ではない）。評価のために第19日に動物から採血した。
【図１１Ｄ】図11A〜11DはマウスにおけるGVHDのモニタリングを示す。照射（50 rad）NSGマウスにヒトPBMC（15×106）±メチルプレドニゾロン（15mg/kg）を注射し、GVHDの徴候をモニターした。図11Aは、コホート（各群n＝7のマウス）、投与スケジュール及び分析点を示す実験の例示図を示す。図11Bは、PBMCのみ、又はPBMC+ プレドニゾロン（p = 0.104）の投与を受けたマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。図11Cは、体重減少によりモニターされた疾患進行を示す（p = 有意ではない）。図11Dは、PBMC由来CD45+、CD4+、CD8+及びCD4+ Foxp3+ T細胞の数を定量することによりモニターされた疾患進行を示す（それぞれ、p < 0.03、< 0.05、< 0.03及び有意ではない）。評価のために第19日に動物から採血した。
【図１２Ａ】図12A〜12DはマウスにおけるGVHDのモニタリングを示す。照射（50 rad）NSGマウスにヒトPBMC（15×106）±FK506（36又は12mg/kg）又はCsA（80mg/kg）を注射し、GVHDの徴候をモニターした。図12Aは、コホート（全群各n = 7のマウス、ただし、CsAではn = 5）、投与スケジュール及び分析点を示す実験の例示図を示す。図12Bは、PBMCのみ、又はPBMC+ CNI（PBMCのみ対FK506 (36mg/kg), p < 0.04）の投与を受けたマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。図12Cは、体重減少によりモニターされた疾患進行を示す（p = 有意ではない）。図12Dは、PBMC由来CD45+、CD4+、CD8+及びCD4+ Foxp3+ T細胞の数を定量することによりモニターされた疾患進行を示す（それぞれ、p < 0.03、< 0.05、< 0.02及び有意ではない）。評価のために第18日に動物から採血した。
【図１２Ｂ】図12A〜12DはマウスにおけるGVHDのモニタリングを示す。照射（50 rad）NSGマウスにヒトPBMC（15×106）±FK506（36又は12mg/kg）又はCsA（80mg/kg）を注射し、GVHDの徴候をモニターした。図12Aは、コホート（全群各n = 7のマウス、ただし、CsAではn = 5）、投与スケジュール及び分析点を示す実験の例示図を示す。図12Bは、PBMCのみ、又はPBMC+ CNI（PBMCのみ対FK506 (36mg/kg), p < 0.04）の投与を受けたマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。図12Cは、体重減少によりモニターされた疾患進行を示す（p = 有意ではない）。図12Dは、PBMC由来CD45+、CD4+、CD8+及びCD4+ Foxp3+ T細胞の数を定量することによりモニターされた疾患進行を示す（それぞれ、p < 0.03、< 0.05、< 0.02及び有意ではない）。評価のために第18日に動物から採血した。
【図１２Ｃ】図12A〜12DはマウスにおけるGVHDのモニタリングを示す。照射（50 rad）NSGマウスにヒトPBMC（15×106）±FK506（36又は12mg/kg）又はCsA（80mg/kg）を注射し、GVHDの徴候をモニターした。図12Aは、コホート（全群各n = 7のマウス、ただし、CsAではn = 5）、投与スケジュール及び分析点を示す実験の例示図を示す。図12Bは、PBMCのみ、又はPBMC+ CNI（PBMCのみ対FK506 (36mg/kg), p < 0.04）の投与を受けたマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。図12Cは、体重減少によりモニターされた疾患進行を示す（p = 有意ではない）。図12Dは、PBMC由来CD45+、CD4+、CD8+及びCD4+ Foxp3+ T細胞の数を定量することによりモニターされた疾患進行を示す（それぞれ、p < 0.03、< 0.05、< 0.02及び有意ではない）。評価のために第18日に動物から採血した。
【図１２Ｄ】図12A〜12DはマウスにおけるGVHDのモニタリングを示す。照射（50 rad）NSGマウスにヒトPBMC（15×106）±FK506（36又は12mg/kg）又はCsA（80mg/kg）を注射し、GVHDの徴候をモニターした。図12Aは、コホート（全群各n = 7のマウス、ただし、CsAではn = 5）、投与スケジュール及び分析点を示す実験の例示図を示す。図12Bは、PBMCのみ、又はPBMC+ CNI（PBMCのみ対FK506 (36mg/kg), p < 0.04）の投与を受けたマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。図12Cは、体重減少によりモニターされた疾患進行を示す（p = 有意ではない）。図12Dは、PBMC由来CD45+、CD4+、CD8+及びCD4+ Foxp3+ T細胞の数を定量することによりモニターされた疾患進行を示す（それぞれ、p < 0.03、< 0.05、< 0.02及び有意ではない）。評価のために第18日に動物から採血した。
【図１３】図13は、コホート（n = 7のマウス）、投与スケジュール及び分析点を示す例示図を示す。照射（50 rad）NSGマウスにヒトPBMC（15×106）±プレドニゾロン（10mg/kg）、FK506（12mg/kg）又はCsA（20mg/kg）を注射し、GVHDの徴候（生存、体重、臨床スコア及びヒトT細胞増殖を含む）をモニターした。
【図１４Ａ】図14A〜14Cは、示されている種々の操作を行った後の増殖に対する影響を示す。
【図１４Ｂ】図14A〜14Cは、示されている種々の操作を行った後の増殖に対する影響を示す。
【図１４Ｃ】図14A〜14Cは、示されている種々の操作を行った後の増殖に対する影響を示す。
【図１５】図15は、カルシニューリン変異タンパク質をコードする核酸ドナーインサートを例示する概要図を示す。
【図１６】図16は、置換の導入が可能なCas9-デアミナーゼ融合遺伝子／ペプチドである塩基エディタープラットフォームを例示する概要図、並びに本開示の方法を使用する標的化法及び分子分析及び定量の一般的スキームを示す。
【図１７】図17は、Tregにおける塩基編集を達成する一般的工程を示すフロー図を示す。
【図１８】図18は、NR3C1内に未成熟終止コドンを導入するように設計されたgRNA（配列番号20）でエレクトロポレーションされた細胞及び対照細胞のゲノム配列決定データを示す。gRNAに対応するゲノムの各位置におけるT、G、C又はAヌクレオチドの存在割合（%）が示されている。
【図１９】図19は、NR3C1内に未成熟終止コドンを導入するように設計されたgRNA（配列番号20）でエレクトロポレーションされた細胞及び対照細胞のゲノム配列決定データを示す。gRNAに対応するゲノムの各位置におけるT、G、C又はAヌクレオチドの存在割合（%）が示されている。
【図２０】図20は、NR3C1内に未成熟終止コドンを導入するように設計されたgRNA（配列番号21）でエレクトロポレーションされた細胞及び対照細胞のゲノム配列決定データを示す。gRNAに対応するゲノムの各位置におけるT、G、C又はAヌクレオチドの存在割合（%）が示されている。
【図２１】図21は、NR3C1内に未成熟終止コドンを導入するように設計されたgRNA（配列番号21）でエレクトロポレーションされた細胞及び対照細胞のゲノム配列決定データを示す。gRNAに対応するゲノムの各位置におけるT、G、C又はAヌクレオチドの存在割合（%）が示されている。
【図２２】図22は、本開示の方法を使用するスプライス部位内への置換の導入を示す概要図である。
【図２３】図23は、NR3C1のスプライスアクセプター内に修飾を導入するように設計されたgRNA（配列番号55）でエレクトロポレーションされた細胞及び対照細胞のゲノム配列決定データを示す。gRNAに対応するゲノムの各位置におけるT、G、C又はAヌクレオチドの存在割合（%）が示されている。
【図２４】図24は、NR3C1のスプライスアクセプター内に修飾を導入するように設計されたgRNA（配列番号55）でエレクトロポレーションされた細胞及び対照細胞のゲノム配列決定データを示す。gRNAに対応するゲノムの各位置におけるT、G、C又はAヌクレオチドの存在割合（%）が示されている。
【図２５】図25は、NR3C1のスプライスドナー内に修飾を導入するように設計されたgRNA（配列番号56）でエレクトロポレーションされた細胞及び対照細胞のゲノム配列決定データを示す。gRNAに対応するゲノムの各位置におけるT、G、C又はAヌクレオチドの存在割合（%）が示されている。
【図２６】図26は、NR3C1のスプライスドナー内に修飾を導入するように設計されたgRNA（配列番号56）でエレクトロポレーションされた細胞及び対照細胞のゲノム配列決定データを示す。gRNAに対応するゲノムの各位置におけるT、G、C又はAヌクレオチドの存在割合（%）が示されている。
【図２７】図27は2つの実験の概要を示す。ある実験においては、BE4を使用した2ラウンドのビーズ刺激により、エフェクターT細胞（Teff）における糖質コルチコイド受容体遺伝子座を塩基編集した。第2の実験においては、BE4を使用した1回のみのビーズ刺激により、エフェクターT細胞における糖質コルチコイド受容体遺伝子座を塩基編集した。
【図２８】図28は、デキサメタゾンの存在下又は不存在下で、gRNA GR2（表1の配列番号8）又はBE4（表2の配列番号20）を使用して修飾されたドナーからの、糖質コルチコイド受容体塩基編集の後のCD4+ エフェクターT細胞（Teff）の相対生存率（%）のデータを示す。第1ドナーの細胞には2ラウンドの刺激を与え、第2ドナーの細胞には1ラウンドの刺激を与えた。2ラウンドの刺激を受けたTeffはデキサメタゾン（Dex）に対して非常に感受性であった。両方の実験において、2ラウンドのBE4での編集は30μg/mlのGR2より有効であった（それぞれ、p < 0.001、p < 0.01）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本発明は、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性である修飾造血細胞又はその前駆体（例えば、修飾Treg）に関する組成物及び方法を提供する。幾つかの実施形態においては、修飾細胞は、ステロイドに媒介される細胞の持続性及び生存の低減をもたらす、1以上の内因性遺伝子を破壊するように遺伝的に編集されている。幾つかの実施形態においては、修飾細胞は、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を導入するように遺伝的に編集されている。ある実施形態においては、本開示の修飾細胞は、NR3C1遺伝子座内に1以上のインデルを含む。ある実施形態においては、本開示の修飾細胞は、NR3C1遺伝子座内に1以上のインデルを含み、更に、NR3C1遺伝子座における1以上のインデル内に挿入されたカルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を含む。
【００１６】
幾つかの実施形態においては、提供する細胞、組成物及び方法は持続性及び／又は生存の増強をもたらした。例えば、本発明のTregは持続性及び／又は生存の増強を示す。臨床場面においては、ステロイド及びカルシニューリンインヒビターの投与は、例えば同種異系細胞移植を受けた個体に対する標準治療予防処置に相当する。制御性T細胞の養子移入は、同種異系細胞移植後の負の影響を低減するためのアプローチである。本明細書に記載のとおり、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターは、Tregの持続性及び生存に負の影響を及ぼすことが見出された。したがって、本開示の修飾細胞は、標準治療予防処置の存在下、より持続的であり、長寿命である。
【００１７】
本明細書に開示されている個々の方法及び実験条件は変動しうるため、本明細書に記載されている方法はそのような方法及び条件に限定されないと理解されるべきである。また、本明細書中で用いる用語は、個々の実施形態を説明することを目的としたものであるに過ぎず、限定的であるとは意図されないと理解されるべきである。
【００１８】
更に、本明細書に記載されている実験は、特に示されていない限り、当業者の技量の範囲内の通常の分子細胞生物学的及び免疫学的技術を用いる。そのような技術は当業者によく知られており、文献において十分に説明されている。例えば、Ausubelら編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008)（全ての補遺を含む）、MR Green及びJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)、並びにHarlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2nd edition)を参照されたい。
【００１９】
A．定義
特に定められていない限り、本明細書中で用いる科学技術用語は、当業者に一般に理解されている意味を有する。潜在的な曖昧さが生じた場合には、本明細書に記載されている定義がいずれの辞書的又は非本質的定義にも優先する。文脈に矛盾しない限り、単数形用語はその複数形を含むものとし、複数形用語はその単数形を含むものとする。特に示されていない限り、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。「含む」並びに「含み」及び「含まれる」のような他の形態は限定的なものではない。
【００２０】
一般に、本明細書に記載されている細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関して用いられている用語法は、当技術分野でよく知られており、一般に用いられている。本明細書に記載されている方法及び技術は、特に示されていない限り、当技術分野でよく知られている通常の方法に従い、そして本明細書の全体にわたって引用され考察されている種々の一般的参考文献及びより詳細な参考文献に記載されているとおりに、一般に行われる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従い、又は当技術分野で一般に行われているとおりに、又は本明細書に記載されているとおりに行われる。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学及び医薬化学に関して用いられている用語法、並びにそれらの実験手法及び技術は、当技術分野においてよく知られており一般に用いられているものである。化学合成、化学分析、医薬の調製、製剤化及び送達並びに患者の治療には、標準的な技術が用いられる。
【００２１】
本開示がより容易に理解されうるように、選択された用語を以下に定義する。
【００２２】
単数形は、本明細書においては、その単数形の文法的対象の1以上（すなわち、少なくとも1つ）のものを示すために用いられる。例えば、「要素（an element）」は1つの要素又は複数の要素を意味する。
【００２３】
測定可能な値、例えば量、時間的持続時間などを示す際に本明細書中で用いる「約」は、特定されている値からの±20%又は±10%、好ましくは±5%、より好ましくは±1%、より一層好ましくは±0.1%の変動（ただし、そのような変動は、開示されている方法を実施するのに適切なものである）を含むことを意味する。
【００２４】
本明細書中で用いる、疾患を「軽減する（alleviate）」は、疾患の、1以上の症状の重症度を軽減することを意味する。
【００２５】
本明細書中で用いる「自家（autologous）」なる語は、後で再導入されることになる個体と同じ個体に由来する任意の物質に関するものであると意図される。
【００２６】
「疾患（disease）」は、動物の健康状態において動物が恒常性を維持できない状態であり、疾患が改善されなければ、動物の健康状態は悪化し続ける。これとは対照的に、動物における「障害（disorder）」は、動物が恒常性を維持しうる健康状態であるが、その場合の動物の健康状態は、障害が存在しない場合ほどは好ましくない。障害は、治療されずに放置されたとしても、動物の健康状態の更なる悪化を必ずしも引き起こさない。
【００２７】
本明細書中で用いる「ダウンレギュレーション」なる語は1以上の遺伝子の遺伝子発現の低減又は排除を意味する。
【００２８】
「有効量」又は「治療的有効量」は、本明細書においては互換的に用いられ、特定の生物学的結果を達成する、又は治療的若しくは予防的利益をもたらすのに有効な、本明細書に記載されている化合物、製剤、物質又は組成物の量を意味する。そのような結果には、哺乳動物に投与された場合に、本発明の組成物の不存在下で検出される免疫応答と比較して、検出可能なレベルの免疫抑制又は寛容を引き起こす量が含まれうるが、これに限定されるものではない。免疫応答は、当技術分野で認められている多数の方法によって容易に評価されうる。本発明で投与される組成物の量は変動し、治療される疾患又は状態、治療される哺乳動物の年齢及び健康・身体状態、疾患の重症度、投与される個々の化合物などのような多数の要因に基づいて容易に決定されうる、と当業者は理解するであろう。
【００２９】
「コードする」は、ヌクレオチド（すなわち、rRNA、tRNA及びmRNA）の定義された配列又はアミノ酸の定義された配列を有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型として機能する、遺伝子、cDNA又はmRNAのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、及びそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子がタンパク質をコードしていると言えるのは、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合である。mRNA配列と同一であり配列表に通常示されているヌクレオチド配列を有するコード鎖と、cDNA又は遺伝子の転写のための鋳型として用いられる非コード鎖との両方が、その遺伝子又はcDNAのタンパク質又は他の産物をコードすると称されうる。
【００３０】
本明細書中で用いる「内因性（endogenous）」は、生物、細胞、組織若しくは系に由来する、又はそれらの内部で産生される任意の物質に関するものである。
【００３１】
本明細書中で用いる「外因性（exogenous）」なる語は、生物、細胞、組織若しくは系から導入される、又はそれらの外部で産生される任意の物質に関するものである。
【００３２】
本明細書中で用いる「増殖（expand）」なる語は、細胞（例えば、Treg）の数の増加のような、数の増加を意味する。1つの実施形態においては、エクスビボで増殖した細胞は、培養内に最初に存在した数と比較して数が増加している。もう1つの実施形態においては、エクスビボで増殖した細胞は、培養内の他の細胞型と比較して数が増加している。本明細書中で用いる「エクスビボ」なる語は、生きた生物（例えば、ヒト）から取り出され、生物の外部（例えば、培養皿、試験管又はバイオリアクター内）で増殖した細胞に関するものである。
【００３３】
本明細書中で用いる「発現（expression）」なる語は、対応プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
【００３４】
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを意味する。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含む。発現のための他の要素（エレメント）は宿主細胞又はインビトロ発現系により供給されうる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドが組込まれたコスミド、プラスミド（例えば、裸のプラスミド又はリポソーム内に含有されたプラスミド）及びウイルス（例えば、センダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような当技術分野で公知の全ての発現ベクターが含まれる。
【００３５】
本明細書中で用いる「遺伝的に操作された（genetically engineered）」及び「遺伝的に修飾された（genetically modified）」（又は「遺伝的修飾」）なる語は互換的に用いられ、人間の手により（例えば、組換え又は遺伝子編集DNA技術を用いて）作製又は修飾された非天然核酸分子又はそのような分子から（例えば、転写、翻訳などにより）誘導されるものを含むように修飾された細胞に関するものである。外因性ポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド及び／又は他の方法で修飾されたポリヌクレオチドを含有する細胞は遺伝的修飾細胞とみなされ、したがって、天然に存在する対応物と比較して、非天然物とみなされる。幾つかの場合においては、遺伝的修飾細胞は1以上の組換え核酸を含有する。他の場合においては、遺伝的修飾細胞は1以上の合成核酸又は遺伝的に操作された核酸（例えば、天然に存在する対応物において見出される配列と比較して少なくとも1つの人工的に作製された挿入、欠失、逆位又は置換を含有する核酸）を含有する。
【００３６】
本明細書中で用いる「同一性」は、2つのポリマー分子の間、特に2つのアミノ酸分子の間、例えば2つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列同一性を意味する。2つのアミノ酸配列が同一位置に同一残基を有する場合、例えば、2つのポリペプチド分子のそれぞれの位置がアルギニンにより占められている場合、それらはその位置で同一である。2つのアミノ酸配列がアラインメントにおいて同一位置に同一残基を有する度合又は同一性は、しばしば、百分率として表される。2つのアミノ酸配列の間の同一性は、一致する位置又は同一位置の数の一次関数であり、例えば、2つの配列における位置の半分（例えば、10アミノ酸長のポリマーにおける5つの位置）が同一である場合、2つの配列は50%同一であり、位置の90%（例えば、10個中9個）が一致又は同一である場合、2つのアミノ酸配列は90%同一である。
【００３７】
本明細書中で用いる「免疫応答」なる語は、リンパ球が抗原分子を外来性として識別し、抗体の形成を誘導し、及び／又はリンパ球を活性化して抗原を除去する際に生じる、抗原に対する細胞応答として定義される。
【００３８】
「免疫抑制」又は「免疫抑制性」は、全体的な免疫応答を低減することを意味するものとして本明細書において用いられる。
【００３９】
「挿入／欠失」は一般に「インデル」と略称され、ゲノム内に特定のヌクレオチド配列が存在する（挿入）又は存在しない（欠失）、遺伝的多型の一種である。
【００４０】
「単離（isolated）」は、天然状態から変化している又は取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物に天然に存在する核酸又はペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から部分的又は完全に分離されている同じ核酸又はペプチドは「単離」されている。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することが可能であり、又は非天然環境、例えば宿主細胞において存在することが可能である。
【００４１】
本明細書中で用いる「ノックダウン」なる語は1以上の遺伝子の遺伝子発現の低減を意味する。
【００４２】
本明細書中で用いる「ノックアウト」なる語は1以上の遺伝子の遺伝子発現の除去を意味する。
【００４３】
本明細書中で用いる「レンチウイルス」はレトロウイルス科の属を意味する。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染しうる点で、レトロウイルスの中でも独特である。それは宿主細胞のDNAに相当な量の遺伝情報を送達可能であり、したがって、それは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIV及びFIVはレンチウイルスの全ての例である。レンチウイルスに由来するベクターは、相当なレベルの遺伝子導入をインビボで達成する手段を提供する。
【００４４】
本明細書中で用いる「修飾」なる語は、本発明の分子又は細胞の状態又は構造の変化を意味する。分子は、化学的、構造的及び機能的を含む多数の様態で修飾されうる。細胞は、核酸の導入により修飾されうる。ある実施形態においては、細胞における1以上の核酸が改変されている場合、修飾細胞は、「遺伝的に修飾」又は「遺伝的に編集」されている可能性がある。
【００４５】
本明細書中で用いる「調節する（modulating）」なる語は、処理若しくは化合物の不存在下での対象における応答のレベルと比較して、及び／又は処理されていないこと以外は同じ対象における応答のレベルと比較して、対象における応答のレベルの検出可能な増加又は減少をもたらすことを意味する。この用語は、天然のシグナル若しくは応答を阻害し、及び／又は天然のシグナル若しくは応答に影響を及ぼし、それにより、対象、好ましくはヒトにおいて、有益な治療応答をもたらすことを含む。
【００４６】
本発明の文脈においては、一般に存在する核酸塩基に関する以下の略語を用いる。「A」はアデノシンを意味し、「C」はシトシンを意味し、「G」はグアノシンを意味し、「T」はチミジンを意味し、「U」はウリジンを意味する。
【００４７】
特に示されていない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、お互いの縮重形態であり同一アミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はRNAをコードするヌクレオチド配列なる分節は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかの形態でイントロンを含有する限り、イントロンをも含みうる。
【００４８】
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）、又は胸骨内注射、又は注入技術が含まれる。
【００４９】
本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」なる語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。更に、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で用いる核酸及びポリヌクレオチドは互換的に用いられる。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、これが単量体「ヌクレオチド」へと加水分解されうるという一般的知識を有する。単量体ヌクレオチドはヌクレオシドへと加水分解されうる。本明細書中で用いるポリヌクレオチドには、組換え手段（すなわち、通常のクローニング技術及びPCRなどを用いる、組換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング）及び合成手段（これらに限定されるものではない）を含む当技術分野で利用可能な任意の手段により得られる全ての核酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本明細書中で用いる「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」なる語は、互換的に用いられ、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を意味する。タンパク質又はペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含有する必要があり、タンパク質配列又はペプチド配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合により互いに連結された2以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質が含まれる。本明細書中で用いるこの用語は、例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも当技術分野で一般に称される短い鎖と、多数のタイプが存在するタンパク質と当技術分野で一般に称される、より長い鎖との両方を意味する。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド又はそれらの組合せが含まれる。
【００５１】
本明細書中で用いる「多能性」は、3つ全ての胚葉（外胚葉、内胚葉及び中胚葉）の細胞を含む、身体又は体細胞の全系統（すなわち、胚本体）の形態へと分化する、細胞の能力を意味する。
【００５２】
本明細書中で用いる「多能性幹細胞」なる語は、継続的な自己再生が可能であり、適切な条件下で3つ全ての胚葉の細胞へと分化しうる細胞を意味する。多能性幹細胞（PSC）の例には、胚性幹細胞（ESC）及び人工多能性幹細胞（iPSC）が含まれる。本明細書中で用いる「胚性幹細胞」又は「ESC」は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞又は多能性細胞の集団を意味する。例えば、Thomsonら, Science 282:1145-1147 (1998)を参照されたい。これらの細胞はOct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及びTRA-1-81を発現し、高い核対細胞質比及び顕著な核小体を有する小型コロニーとしてインビトロで見出される。本明細書中で用いる「iPS細胞」又は「iPSC」なる語は、多能性細胞又は多能性細胞の集団であって、それらの起源分化体細胞に関して変動可能である、及び能力決定因子の具体的な組合せに関して変動可能である、及びそれらを単離するために用いられる培養条件に関して変動可能であるものであるが、それでも、それらのそれぞれの起源分化体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、ESCのような高い能力の細胞に類似した特徴を示す（本明細書に記載されているとおり）ものを意味する。例えば、Yuら, Science 318:1917-1920 (2007)を参照されたい。IPSCは、それらのそれぞれの起源分化体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、ES細胞のような、より高い能力の細胞に類似した特徴を示し、細胞は、体細胞のような非多能性細胞（例えば、多分化能（multipotent）細胞、少能性（oligopotent）細胞、単能性（unipotent）細胞及び最終分化細胞）を初期化（リプログラミング）することにより得られる。ESC及びiPSCは種々の商業的供給者から入手可能である。
【００５３】
「対象（subject）」なる語は、免疫応答が誘発されうる生きた生物（例えば、哺乳動物）を含むと意図される。本明細書中で用いる「対象」又は「患者」は、ヒト又は非ヒト哺乳動物でありうる。非ヒト哺乳動物には、例えば家畜及びペット、例えばヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ及びネズミといった哺乳動物が含まれる。好ましくは、対象はヒトである。
【００５４】
「標的部位」又は「標的配列」は、結合が生じるのに十分な条件下で、結合性分子が特異的に結合しうる核酸部分を定めるゲノム核酸配列を意味する。
【００５５】
本明細書中で用いる「治療的（therapeutic）」なる語は、治療及び／又は予防を意味する。治療的効果は、病態の抑制、寛解又は根絶により得られる。
【００５６】
「移植片（移植）」は、移植される生体適合性格子（biocompatible lattice）又はドナー組織、臓器若しくは細胞を意味する。移植片の一例には、皮膚細胞又は組織、骨髄、並びに実質臓器、例えば心臓、膵臓、腎臓、肺及び肝臓が含まれうるが、これらに限定されるものではない。移植片はまた、宿主に投与される任意の物質をも意味しうる。例えば、移植片は核酸又はタンパク質を意味しうる。
【００５７】
本明細書中で用いる「トランスフェクト」又は「形質転換（transformed）」又は「形質導入（transduction）」なる語は、外因性核酸を宿主細胞内に移入又は導入する方法を意味する。「トランスフェクト」又は「形質転換」又は「形質導入」された細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換又は形質導入された細胞である。細胞は対象の初代細胞及びその後代を含む。
【００５８】
本明細書中で用いる、疾患を「治療する（treat）」なる語は、対象が経験している疾患又は障害の、少なくとも1つの徴候又は症状の頻度又は重症度を低減することを意味する。
【００５９】
「ベクター」は、単離核酸を含む物質であって、前記離核酸を細胞の内部に送達するために使用されうる物質の組成物である。多数のベクターが当技術分野で公知であり、それらには、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に付随するポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。したがって、「ベクター」なる語は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。この用語は、細胞内への核酸の導入を促進させる非プラスミド化合物及び非ウイルス化合物、例えばポリリジン化合物、リポソームなどをも含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
範囲：本開示の全体を通して、本発明の種々の態様が範囲の形態で示されうる。範囲の形態の記載は単に便宜上及び簡潔さのためのものであるに過ぎず、本発明の範囲に対する杓子定規の限定として解釈されるべきではないと理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲、及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などのような部分範囲、及びその範囲内の個々の数値、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3及び6を具体的に開示していると見なされるべきである。これは範囲の幅に無関係に適用される。
【００６１】
B．修飾細胞
本発明は、ステロイド（例えば、糖質コルチコイド）の効果に耐性である修飾細胞（例えば、修飾多能性幹細胞、修飾免疫細胞、修飾制御性T細胞、修飾多能性幹細胞に由来する免疫細胞）を提供する。本発明は、カルシニューリンインヒビター（例えば、CsA、FK506）の効果に耐性である修飾細胞（例えば、免疫細胞、制御性T細胞）を提供する。ある実施形態においては、本発明は、ステロイド（例えば、糖質コルチコイド）とカルシニューリンインヒビター（例えば、CsA、FK506）との両方の効果に耐性である修飾細胞（例えば、免疫細胞、制御性T細胞）を提供する。また、他の免疫抑制薬（例えば、mTORインヒビター、ミコフェノール酸、メトトレキサート、フルダラビン、ペントスタチン、シクロホスファミドなど）の効果に耐性である修飾細胞を提供する。また、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターの効果に感受性である修飾エフェクターT細胞（Teff）を提供する。
【００６２】
ステロイド耐性細胞
本明細書に記載されているとおり、ステロイド（例えば、糖質コルチコイド）は、移植片対宿主病（GVHD）を有する対象を治療する際の標準的治療予防法の代表例であり、エフェクターT細胞（Teff）機能を低下させ、Tregの持続性及び機能を直接阻害しうる。ステロイドは細胞の生存に直接的な影響を及ぼしうる。例えば、ステロイドであるデキサメタゾンの存在下でのTregの生存を著しく低下させる。
【００６３】
本開示は、ステロイド耐性細胞（例えば、遺伝子編集ステロイド耐性多能性幹細胞、ステロイド耐性制御性T細胞（Treg）、ステロイド耐性造血細胞又はその前駆細胞）を提供する。本明細書中で用いる「ステロイド耐性」細胞は、ステロイド（例えば、糖質コルチコイド）の効果に耐性である細胞を意味する。本明細書中で用いる、物質に対して「耐性又は寛容」である細胞は、修飾を伴わない細胞の増殖を抑制又は予防する量の物質の存在下で細胞増殖するように遺伝的に修飾された細胞を意味する。本開示のステロイド耐性細胞は、ステロイドと接触しても、生理学的変化を最小限のみ示す、又は全く示さない。実際、ステロイド耐性細胞はステロイドと相互作用（例えば、結合）しない。ステロイド耐性細胞がステロイドの効果に耐性であるかどうかを評価する種々の方法が当技術分野で公知である。例えば、ステロイドの存在下での細胞の生存は、細胞計数技術を用いて、又はレポーターに基づく技術を用いて測定されうる。当業者は、当技術分野で公知である種々の方法を用いて、ステロイド耐性細胞に対するステロイドの効果を決定しうるであろう。
【００６４】
幾つかの実施形態においては、ステロイド耐性は1以上の内因的発現遺伝子の遺伝子編集により達成される。したがって、本開示は遺伝子編集ステロイド耐性細胞（例えば、遺伝子編集ステロイド耐性多能性幹細胞、遺伝子編集ステロイド耐性Treg、修飾造血細胞又はその前駆細胞）を提供する。幾つかの実施形態においては、細胞は、1以上の内因的発現遺伝子の発現を破壊するように遺伝的に編集されており、破壊は1以上の内因的発現遺伝子の発現の低減、喪失、排除、ノックアウト又は破壊をもたらし、それにより、細胞にステロイド耐性を付与する。
【００６５】
幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性細胞は、1以上の核内受容体をコードする1以上の内因性遺伝子の発現を破壊するように遺伝的に編集されている。核内受容体は、ステロイド及び甲状腺ホルモン並びに他の分子の感知に関与する、細胞内で見出されるタンパク質のクラスである。これらの受容体は他のタンパク質と共に働いて、特定の遺伝子の発現を調節する。種々の核内受容体が当技術分野で公知であり、例えば以下のようなサブファミリーに大まかに分類される：サブファミリー1, 甲状腺ホルモン受容体様；サブファミリー2, レチノイドX受容体様；サブファミリー3, エストロゲン受容体様；サブファミリー4, 神経成長因子IB様；及びサブファミリー5, ステロイド産生因子様、サブファミリー6, 生殖細胞核因子様。核内受容体の各サブファミリーは更に幾つかの群に分類されうる。例えば、サブファミリー3に属する核内受容体は、例えば、クラスA, エストロゲン受容体；クラスB, エストロゲン関連受容体；及びクラスC, 3-ケトステロイド受容体に更に分類されうる。サブファミリー3のクラスCに属する核内受容体の幾つかのメンバーが公知である。例えば、NR3C1遺伝子（NCBI参照配列NG_009062.1）は糖質コルチコイド受容体をコードし、NR3C2遺伝子（NCBI参照配列NG_013350.1）は鉱質コルチコイド受容体をコードし、NR3C3遺伝子（NCBI参照配列NG_016475.1）はプロゲステロン受容体をコードし、NR3C4遺伝子（NCBI参照配列NG_009014.2）はアンドロゲン受容体をコードする。
【００６６】
ある実施形態においては、本開示のステロイド耐性細胞は、NR3C1の発現を破壊するように遺伝的に編集されている。NR3C1は糖質コルチコイド受容体（GR又はGCR）をコードする。糖質コルチコイドは、糖質コルチコイド受容体に結合するコルチコステロイドのクラスであり、グルコース代謝の調節及び副腎皮質での合成におけるその役割に関して伝統的に公知である。本明細書中で用いる「糖質コルチコイド」及び「糖質コルチコステロイド」は互換的に用いられる。糖質コルチコイドには、プロゲステロン型糖質コルチコイド、ヒドロコルチゾン型糖質コルチコイド、メタゾン型糖質コルチコイド及びアセトニド型糖質コルチコイドが含まれるが、これらに限定されるものではない。糖質コルチコイドには、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デフラザコート、デオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、フルドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、ロテプレドノール、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン及びトリアムシノロン並びにそれらの誘導体及び類似体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
したがって、幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性細胞（例えば、遺伝子編集ステロイド耐性多能性幹細胞、ステロイド耐性造血細胞又はその前駆細胞）は遺伝的に編集されており（NR3C1遺伝子座に標的化されてNR3C1の発現の破壊又は変化（例えば、（調節領域、エクソン及びイントロンを含むように）NR3C1遺伝子座内にインデル及び／又は置換を導入することによるもの）をもたらすヌクレオチド結合試薬、例えばCRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a（Cpf1）、Cas9オーソログ、パラログ、Cas関連ファミリーメンバー、ジンクフィンガー、TALEN又はメガヌクレアーゼ候補による1以上のDNA又はRNA塩基の改変、挿入、欠失、置換又は逆位により定められる）、ここで、ステロイド耐性細胞は、プロゲステロン型糖質コルチコイド、ヒドロコルチゾン型糖質コルチコイド、メタゾン型糖質コルチコイド及びアセトニド型糖質コルチコイドからなる群から選択される1以上の糖質コルチコイドに耐性である。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性細胞は、NR3C1の発現を破壊するように遺伝的に編集されており、ここで、ステロイド耐性細胞は、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デフラザコート、デオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、フルドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、ロテプレドノール、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン及びトリアムシノロン並びにそれらの誘導体及び類似体からなる群から選択される1以上の糖質コルチコイドに耐性である。ある実施形態においては、本開示のステロイド耐性細胞は、NR3C1の発現を破壊するように遺伝的に編集されており、ここで、ステロイド耐性細胞はデキサメタゾンに耐性である。
【００６８】
幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性細胞（例えば、遺伝子編集ステロイド耐性多能性幹細胞、ステロイド耐性造血細胞又はその前駆細胞）はステロイド（例えば、デキサメタゾン）の存在下で細胞生存の増加を示す。幾つかの実施形態においては、NR3C1の発現を破壊するように遺伝的に編集されているステロイド耐性細胞［例えば、（調節領域、エクソン及びイントロンを含むように）NR3C1遺伝子座内にインデル及び／又は置換を導入することによるもの］はステロイドの存在下で細胞生存の増加を示す。ある実施形態においては、NR3C1の発現を破壊するように遺伝的に編集されているステロイド耐性細胞は、デキサメタゾンの存在下で細胞生存の増加を示す。幾つかの実施形態においては、細胞生存の増加は少なくとも105%、少なくとも110%、少なくとも115%、少なくとも120%、少なくとも125%、少なくとも130%、少なくとも135%、少なくとも140%、少なくとも145%、少なくとも150%、少なくとも155%、少なくとも160%、少なくとも165%、少なくとも170%、少なくとも175%、少なくとも180%、少なくとも185%、少なくとも190%、少なくとも195%、少なくとも200%、少なくとも205%、少なくとも210%、少なくとも215%、少なくとも220%、少なくとも225%、少なくとも230%、少なくとも235%、少なくとも240%、少なくとも245%、少なくとも250%、少なくとも255%、少なくとも260%、少なくとも265%、少なくとも270%、少なくとも275%、少なくとも280%、少なくとも285%、少なくとも290%、少なくとも295%、少なくとも300%、少なくとも350%、少なくとも400%又はそれ以上である。
【００６９】
カルシニューリンインヒビター耐性細胞
本明細書に記載されているとおり、カルシニューリンインヒビター（CNI）は、移植片対宿主病（GVHD）を有する対象を治療する際の標準的治療予防法の代表例であり、エフェクターT細胞（Teff）機能を低下させ、Tregの持続性及び機能を直接阻害しうる。カルシニューリンインヒビターは細胞の生存に直接的な影響を及ぼしうる。例えば、ステロイドであるデキサメタゾンの存在下でのTregの生存を著しく低下させる。
【００７０】
本開示は、CNI耐性細胞（例えば、CNI耐性多能性幹細胞、CNI耐性制御性T細胞（Treg）、CNI耐性造血細胞又はその前駆細胞）を提供する。本明細書中で用いる「カルシニューリンインヒビター耐性」細胞は、CNI（例えば、シクロスポリン）の効果に耐性である細胞を意味する。本開示のCNI耐性細胞は、CNIと接触しても、生理学的変化を最小限のみ示す、又は全く示さない。実際、CNI耐性細胞はCNIと相互作用（例えば、結合）しない。CNI耐性細胞がCNIの効果に耐性であるかどうかを評価する種々の方法が当技術分野で公知である。例えば、CNIの存在下での細胞の生存は、細胞計数技術を用いて、又はレポーターに基づく技術を用いて測定されうる。当業者は、当技術分野で公知である種々の方法を用いて、CNI耐性細胞に対するCNIの効果を決定しうるであろう。
【００７１】
カルシニューリンは、T細胞活性化の中核をなす、カルシウム及びカルモジュリン依存性ヘテロ二量体セリン-スレオニンホスファターゼである。カルシニューリンは、T細胞受容体への嵌合の後、転写因子NFAT（活性化T細胞の核因子）を脱リン酸化して、それが核へ移行してIL-2（インターロイキン2）のような中心的標的遺伝子を活性化することを可能にする。FKBP12（FK506結合性タンパク質）と複合体を形成したFK506（タクロリムス；フジマイシン）、又はCyPA（シクロフィリンA）と複合体を形成したCsAは、カルシニューリンの活性部位へのNFATの接近を遮断して、その脱リン酸化を妨げ、それにより、T細胞活性化を阻害する。カルシニューリンは2つのサブユニット、すなわち、サブユニットA及びサブユニットBにより形成される。サブユニットAは、そのホスファターゼ活性をもたらす触媒サブユニット（CnA）であり、サブユニットBは、特に細胞内カルシウムに応答してCnAの活性化を調節する調節サブユニット（CnB）である。
【００７２】
カルシニューリンは、シクロスポリン、ボクロスポリン、ピメクロリムス及びタクロリムス並びにそれらの誘導体及び類似体（これらに限定されるものではない）を含むカルシニューリンインヒビターと称される薬物のクラスの標的である。カルシニューリンインヒビター（CNI）は、イムノフィリンと称される細胞内タンパク質、すなわち、シクロスポリンA（CsA;当技術分野ではクリクロスポリンとしても公知である）の場合にはシクロフィリン、そしてタクロリムス（FK506としても公知である）の場合にはFK結合性タンパク質に結合する。ついでこの複合体はカルシニューリンに結合して、その活性を阻害し、それによりT細胞活性化を阻害する。シクロスポリンは、消化管による不活性化に対して分子を耐性にして経口免疫抑制薬として使用可能にするN-メチル化アミノ酸を含有する環状エンデカペプチドである。ボクロスポリンは、カルシニューリンに対する作用の増強及び代謝安定性の増大を伴う、シクロスポリンの類似体である。タクロリムス（FK506;フジマイシン）はマクロライド系抗生物質である。ピメクロリムス及びタクロリムスは、マクロラクタム免疫抑制物質のアスコマイシンクラスに属し、カルシニューリン経路によるT細胞活性化の阻害及び多数の炎症性サイトカインの放出の阻害により作用する。
【００７３】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているとおり、CNI耐性は、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を細胞内に導入することにより達成されうる。したがって、本開示は、CNIに耐性である修飾細胞（例えば、CNI耐性多能性幹細胞、修飾CNI耐性Treg）を提供する。幾つかの実施形態においては、細胞は、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を発現するように修飾されている。細胞が、CNI耐性遺伝子を発現するように修飾されている場合、細胞は、内因性カルシニューリン遺伝子の発現を破壊するように更に修飾されうる。
【００７４】
幾つかの実施形態においては、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子は、FK506及び／又はCsAに耐性であるカルシニューリン突然変異体（ミュータント）を産生させるために、FK506-FKBP12及びCsA-CyPAの一方又は両方の結合を妨げるように中心的アミノ酸残基において修飾されているカルシニューリンの変異体を含む。本発明のカルシニューリンインヒビター耐性遺伝子は、FK506及び／又はCsAのようなカルシニューリンインヒビターに耐性であるカルシニューリンの変異体をコードする核酸配列でありうる。幾つかの実施形態においては、カルシニューリン変異体はFK506には結合するが、カルシニューリンには結合せず、その結果、薬物の隔離及びカルシニューリン阻害の予防がもたらされる。
【００７５】
幾つかの実施形態においては、カルシニューリン変異体は、V314、Y341、M347、T351、W352、L354及びK360からなる群から選択される1以上の位置における、野生型カルシニューリンヘテロ二量体Aの、1以上の置換を含みうる。幾つかの実施形態においては、カルシニューリン変異体は、例えばT351及びL354位、又はV314及びY341位における、野生型カルシニューリンヘテロ二量体Aの二重置換を含みうる。幾つかの実施形態においては、配列番号1の341位のバリン残基はリジン又はアルギニン残基により置換可能であり、341位のチロシン残基はフェニルアラニン残基により置換可能であり、347位のメチオニンはグルタミン酸、アルギニン又はトリプトファン残基により置換可能であり、351位のスレオニンはグルタミン酸残基により置換可能であり、352位のトリプトファン残基はシステイン、グルタミン酸又はアラニン残基により置換可能であり、353位のセリンはヒスチジン又はアスパラギン残基により置換可能であり、354位のロイシンはアラニン残基により置換可能であり、360位のリジンはアラニン又はフェニルアラニン残基により置換可能である。本明細書に記載されているアミノ酸位置の対応は、多くの場合、配列番号1（GenBank：ACX34092.1）に記載されている野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体Aポリペプチドの形態のアミノ酸の位置に関して表されている。幾つかの実施形態においては、カルシニューリン変異体は、V120、N123、L124又はK125からなる群から選択される1以上の位置における、野生型カルシニューリンヘテロ二量体Bの、1以上の置換を含みうる。幾つかの実施形態においては、カルシニューリン変異体は、例えばL124及びK125位における、野生型カルシニューリンヘテロ二量体Bの二重置換を含みうる。幾つかの実施形態においては、配列番号2のアミノ酸配列の120位のバリンはセリン、アスパラギン酸、フェニルアラニン又はロイシン残基により置換可能であり、123位のアスパラギンはトリプトファン、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、ヒスチジン又はセリンにより置換可能であり、124位のロイシンはスレオニン残基により置換可能であり、125位のリジンはアラニン、グルタミン酸、トリプトファンにより置換可能であり、あるいはロイシン-アルギニン又はイソロイシン-グルタミン酸のような2つの残基が、125位のリジンの後に付加されうる。本明細書に記載されているアミノ酸位置の対応は、多くの場合、配列番号2（GenBank：ACX34905.1）に記載されている野生型ヒトカルシニューリンヘテロ二量体Bポリペプチドの形態のアミノ酸の位置に関して表されている。カルシニューリン変異体はBrewinら, 2009, Blood, 114(23): 4792-4803（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００７６】
ある実施形態においては、本開示のCNI耐性細胞（例えば、CNI耐性多能性幹細胞、CNI耐性造血細胞又はその前駆細胞）は、カルシニューリンの変異体を発現するように修飾されている。ある実施形態においては、カルシニューリン変異体は、CNa12（配列番号3； GenBank：GQ463594.1）、CNa22（配列番号4； GenBank：GQ463595.1）及びCNb30（配列番号5; GenBank：GQ463597.1）からなる群から選択される。
【００７７】
カルシニューリンの標的、すなわち、カルシニューリンインヒビターは、転写因子NFATであり、これはCD28の下流で活性化され、Tregの発生に必要である。幾つかの実施形態においては、CNI耐性は1以上の内因的発現NFAT遺伝子の遺伝子編集により達成されうる。したがって、本開示は遺伝子編集CNI耐性細胞（例えば、遺伝子編集ステロイド耐性Treg）を提供する。幾つかの実施形態においては、細胞は、1以上のNFAT遺伝子の発現を破壊するように遺伝的に編集されており、破壊は、1以上の内因的発現遺伝子の発現の低減、喪失、排除、ノックアウト又は破壊をもたらし、それにより、細胞にCNI耐性を付与する。
【００７８】
幾つかの実施形態においては、本開示のCNI耐性細胞（例えば、CNI耐性多能性幹細胞、CNI耐性造血細胞又はその前駆細胞）は、1以上のNFAT遺伝子の発現を破壊するように遺伝的に編集されている。NFAT転写因子ファミリーはNFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4及びNFAT5の5つのメンバーを含む。NFAT c1〜c4はカルシウムシグナル伝達により調節される、NFATファミリーの古典的メンバーとして公知である。活性化されたカルシニューリンはNFATタンパク質のアミノ末端におけるセリンリッチ領域及びSPリピートを迅速に脱リン酸化して、コンホメーション変化をもたらし、これは核局在化シグナルを露出させて、NFATの核内移行をもたらす。幾つかの実施形態においては、本開示のCNI耐性細胞は、NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4及びNFAT5からなる群から選択される1以上の内因的発現遺伝子を破壊するように遺伝的に編集されている。ある実施形態においては、本開示のCNI耐性細胞は、NFATc1、NFATc2及びNFATc4からなる群から選択される1以上の内因的発現遺伝子を破壊するように遺伝的に編集されている。
【００７９】
幾つかの実施形態においては、本開示のCNI耐性細胞（例えば、CNI耐性多能性幹細胞、CNI耐性造血細胞又はその前駆細胞）は、全てのNFATアイソフォームの活性を遮断するNFATインヒビターを発現するように修飾されている。幾つかの実施形態においては、CNI耐性細胞は、VIVITペプチド（配列番号6）を含むNFATインヒビターを発現するように修飾されている。NFAT活性を阻害しうる種々のVIVITペプチド含有物質が当技術分野で公知である。幾つかの実施形態においては、例えば、VIVITペプチド含有物質は、配列番号67に示される配列を含むカルシニューリン媒介性NFAT活性化のインヒビターである（ワールドワイドウェブのtocris.com/products/nfat-inhibitor_3930において入手可能）。
【００８０】
幾つかの実施形態においては、本開示のCNI耐性細胞（例えば、CNI耐性多能性幹細胞、CNI耐性造血細胞又はその前駆細胞）は、CNI（例えば、CsA）の存在下で細胞生存の増加を示す。幾つかの実施形態においては、CNI耐性細胞は、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を発現するように修飾されており、CNI耐性細胞はCNIの存在下で細胞生存の増加を示す。幾つかの実施形態においては、本開示のCNI耐性細胞は、シクロスポリン、ボクロスポリン、ピメクロリムス及びタクロリムス並びにそれらの誘導体及び類似体からなる群から選択されるCNIの存在下、細胞生存の増加を示す。ある実施形態においては、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を発現するように修飾されているCNI耐性細胞は、CsA及び／又はタクロリムス（FK506）並びにそれらの誘導体及び類似体の存在下、細胞生存の増加を示す。幾つかの実施形態においては、細胞生存の増加は少なくとも105%、少なくとも110%、少なくとも115%、少なくとも120%、少なくとも125%、少なくとも130%、少なくとも135%、少なくとも140%、少なくとも145%、少なくとも150%、少なくとも155%、少なくとも160%、少なくとも165%、少なくとも170%、少なくとも175%、少なくとも180%、少なくとも185%、少なくとも190%、少なくとも195%、少なくとも200%、少なくとも205%、少なくとも210%、少なくとも215%、少なくとも220%、少なくとも225%、少なくとも230%、少なくとも235%、少なくとも240%、少なくとも245%、少なくとも250%、少なくとも255%、少なくとも260%、少なくとも265%、少なくとも270%、少なくとも275%、少なくとも280%、少なくとも285%、少なくとも290%、少なくとも295%、少なくとも300%、少なくとも350%、少なくとも400%又はそれ以上である。
【００８１】
糖質コルチコイド及びカルシニューリンインヒビター耐性細胞
本明細書に記載されているとおり、糖質コルチコイド耐性は、内因的に発現されるNR3C1遺伝子を破壊することにより達成されうる。カルシニューリンインヒビター耐性は、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子（例えば、カルシニューリンの変異体）を細胞内に導入することにより達成されうる。
【００８２】
本開示は、糖質コルチコイド及びカルシニューリンインヒビター耐性細胞（例えば、糖質コルチコイド及びカルシニューリンインヒビター耐性多能性幹細胞、糖質コルチコイド及びカルシニューリンインヒビター耐性造血細胞又はその前駆細胞）を提供する。そのような細胞は、（例えば、（調節領域、エクソン及びイントロンを含むように）NR3C1遺伝子座内にインデル及び／又は置換を導入することにより）NR3C1の発現を破壊するように、及びCNI耐性遺伝子を発現するように修飾されている。幾つかの実施形態においては、本開示の糖質コルチコイド及びCNI耐性細胞は、NR3C1発現を破壊するように修飾されており、そして更に、CNI耐性遺伝子（例えば、カルシニューリン変異体）を発現するように修飾されている細胞である。幾つかの実施形態においては、CNI耐性遺伝子は、標的化又はランダム組み込みにより細胞のゲノム内に組み込まれうる。標的化及びランダム組み込みの種々の方法が当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。ある実施形態においては、CNI耐性遺伝子は細胞のゲノム内の、NR3C1遺伝子座内の標的化部位内に組み込まれている。幾つかの実施形態においては、CNI耐性遺伝子は、NR3C1遺伝子座の外部の、細胞のゲノム内に組み込まれている。CNI耐性遺伝子が、NR3C1遺伝子座の外部の、細胞のゲノム内に組み込まれている場合、CNI耐性遺伝子をゲノムのコード領域内に組み込まない導入方法を選択することが望まれうる（例えば、CNI耐性遺伝子をゲノムの非コード領域内に組み込むことが望ましいかもしれない）。
【００８３】
ある実施形態においては、本開示の糖質コルチコイド及びCNI耐性細胞（例えば、糖質コルチコイド及びカルシニューリンインヒビター耐性多能性幹細胞、糖質コルチコイド及びカルシニューリンインヒビター耐性造血細胞又はその前駆細胞）は、（例えば、（調節領域、エクソン及びイントロンを含むように）NR3C1遺伝子座内にインデル及び／又は置換を導入することにより）NR3C1の発現を破壊するように修飾されており、そしてCNI耐性遺伝子を発現するように更に修飾されている細胞である。このような細胞は、糖質コルチコイド（例えばデキサメタゾン）及びカルシニューリンインヒビター（CsA及び／又はFK506）に耐性となる。幾つかの実施形態においては、NR3C1発現を破壊するように、及びCNI耐性遺伝子（例えば、カルシニューリン変異体）を発現するように修飾されている糖質コルチコイド及びCNI耐性細胞は、糖質コルチコイド及びカルシニューリンインヒビター並びにそれらの誘導体及び類似体の存在下、細胞生存の増加を示す。幾つかの実施形態においては、糖質コルチコイド（例えば、デキサメタゾン）又はその誘導体及び類似体の存在下での細胞生存の増加は、少なくとも105%、少なくとも110%、少なくとも115%、少なくとも120%、少なくとも125%、少なくとも130%、少なくとも135%、少なくとも140%、少なくとも145%、少なくとも150%、少なくとも155%、少なくとも160%、少なくとも165%、少なくとも170%、少なくとも175%、少なくとも180%、少なくとも185%、少なくとも190%、少なくとも195%、少なくとも200%、少なくとも205%、少なくとも210%、少なくとも215%、少なくとも220%、少なくとも225%、少なくとも230%、少なくとも235%、少なくとも240%、少なくとも245%、少なくとも250%、少なくとも255%、少なくとも260%、少なくとも265%、少なくとも270%、少なくとも275%、少なくとも280%、少なくとも285%、少なくとも290%、少なくとも295%、少なくとも300%、少なくとも350%、少なくとも400%又はそれ以上である。幾つかの実施形態においては、CNI（例えば、FK506、CsA）又はその誘導体及び類似体の存在下での細胞生存の増加は少なくとも105%、少なくとも110%、少なくとも115%、少なくとも120%、少なくとも125%、少なくとも130%、少なくとも135%、少なくとも140%、少なくとも145%、少なくとも150%、少なくとも155%、少なくとも160%、少なくとも165%、少なくとも170%、少なくとも175%、少なくとも180%、少なくとも185%、少なくとも190%、少なくとも195%、少なくとも200%、少なくとも205%、少なくとも210%、少なくとも215%、少なくとも220%、少なくとも225%、少なくとも230%、少なくとも235%、少なくとも240%、少なくとも245%、少なくとも250%、少なくとも255%、少なくとも260%、少なくとも265%、少なくとも270%、少なくとも275%、少なくとも280%、少なくとも285%、少なくとも290%、少なくとも295%、少なくとも300%、少なくとも350%、少なくとも400%又はそれ以上である。
【００８４】
他の免疫抑制薬耐性細胞
罹患対象におけるGVHDの治療及び管理中に、他の免疫抑制薬が使用されうる。糖質コルチコイド及びCNIと同様に、これらの免疫抑制薬もTregの持続性及び機能を低減しうる。
【００８５】
例えば、シロリムス（ラパマイシン）、エベロリムス並びにそれらの類似体及び誘導体（ラパログとしても公知である）はラパマイシンファミリーに属し、例えば実質臓器移植及び造血幹細胞移植のための免疫抑制療法に使用されうる。これらのラパマイシンファミリー免疫抑制物質は、細胞内受容体FKBP12と結合することにより、哺乳類ラパマイシン標的（mTOR）を阻害する。FKBP12-ラパマイシン複合体は、mTORのFKBP12-ラパマイシン結合性（FRB）ドメインに直接結合して、その活性を阻害する。幾つかの実施形態においては、本開示の免疫抑制物質耐性細胞はmTOR阻害に耐性である（例えば、mTORインヒビター耐性Treg）。本開示のmTORインヒビター耐性細胞には、FKBP12-ラパマイシン複合体の形成を妨げるように修飾されている細胞（例えば、FKBP12における特異的突然変異）、及びFRBドメインへのFKBP12-ラパマイシン複合体の結合を妨げるように修飾されている細胞（例えば、FRBドメインにおける特異的突然変異）が含まれうるが、これらに限定されるものではない。mTOR経路は、詳細に研究されている生物学的経路であるため、mTOR阻害に対する耐性を達成するための種々の方法が当業者に公知である。
【００８６】
免疫抑制薬の他の例としては、ミコフェノール酸（ミコフェノラートとしても公知である）が挙げられる。ミコフェノール酸は、イノシン-5'-一リン酸（IMP）からグアノシン-5'-一リン酸（GMP）へのデノボ合成に不可欠な酵素であるイノシン-5'-一リン酸デヒドロゲナーゼ（IMPDH）の強力で可逆的な非競合的インヒビターである。もう1つの免疫抑制薬としては、メトトレキサート（以前はアメトプテリンとして公知であった）が挙げられる。メトトレキサートは、葉酸代謝拮抗剤タイプの代謝拮抗物質であり、テトラヒドロ葉酸合成に関与する酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）を阻害しうる。したがって、幾つかの実施形態においては、本開示の免疫抑制物質耐性細胞はミコフェノール酸及び／又はメトトレキサート並びにそれらの類似体及び誘導体に耐性である（例えば、ミコフェノール酸及び／又はメトトレキサート耐性Treg）。本開示のミコフェノール酸及び／又はメトトレキサート耐性細胞には、例えば、L22F及びF31Sの置換を含むヒトDHFRの変異体を発現するように、並びに／又はT333I及びS351Yの置換を含有するイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼII（IMPDH2）の変異体を発現するように修飾されている細胞が含まれうる。
【００８７】
免疫抑制薬の他の例には、フルダラビン、ペントスタチン（デオキシコホルマイシン）及びシクロホスファミド（サイトホスファン）が含まれるが、これらに限定されるものではない。フルダラビンはプリン類似体であり、リボヌクレオチドレダクターゼ及びDNAポリメラーゼを妨害することによりDNA合成を阻害する。ペントスタチンはプリン類似体であり、ヌクレオシドアデノシンを模倣し、アデノシンデアミナーゼを阻害して、DNAをプロセシングする細胞の能力を妨げる。シクロホスファミドは、混合機能オキシダーゼ酵素（例えば、シトクロムP450系のもの）により、4-ヒドロキシシクロホスファミド及びホスホルアミドマスタードを含む（これらに限定されるものではない）活性代謝物へと変換される。ホスホルアミドマスタードは、グアニンN-7位においてDNA鎖間及びDNA鎖内の両方でDNA架橋を形成する（それぞれ、鎖間架橋及び鎖内架橋として公知である）。これらの薬物に対する耐性のメカニズムは当技術分野で公知であり、本開示の免疫抑制薬耐性細胞、例えば、フルダラビン、ペントスタチン及び／又はシクロホスファミドに耐性である修飾細胞（例えば、修飾造血細胞又はその前駆細胞）を生成するために用いられうる。
【００８８】
C．修飾細胞を生成する方法
本発明の細胞は、本明細書に記載されている内因性遺伝子のいずれかの発現を破壊するように遺伝的に編集されている。したがって、幾つかの実施形態においては、本発明の修飾細胞（例えば、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を含む修飾細胞）は、本明細書に記載されている1以上の内因性遺伝子の発現を破壊するように遺伝的に編集されている。
【００８９】
種々の遺伝子編集技術が当業者に公知である。遺伝子編集技術には、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクター（TALE）ヌクレアーゼ（TALEN）、クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（CRISPR）-CRISPR関連タンパク質9（Cas9）ゲノム編集系及びCRISPR-Cpf1ゲノム編集系が含まれるが、これらに限定されるものではない。ホーミングエンドヌクレアーゼは、一般に、二量体としてそのDNA基質を切断し、明らかな結合ドメイン及び切断ドメインを有さない。ZFNは、FokI切断ドメインにより認識される5〜7塩基対（bp）のスペーサー配列に隣接する、2つのジンクフィンガー結合部位からなる標的部位を認識する。TALENは、FokI切断ドメインにより認識される12〜20bpのスペーサー配列に隣接する、2つのTALE DNA結合部位からなる標的部位を認識する。Cas9ヌクレアーゼは、DNAヘリックスのいずれかの鎖に存在しうる適合性プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の直上流に位置する、単一ガイドRNA（gRNA）内の標的化配列に相補的なDNA配列に標的化される。したがって、当業者は、本発明のための適切な遺伝子編集技術を選択しうるであろう。
【００９０】
幾つかの態様においては、破壊は、破壊される遺伝子（例えば、NR3C1）に特異的なRNA誘導性ヌクレアーゼ、例えばCRISPR-Cas系、例えばCRISPR-Cas9系又はCRISPR-Cpf1系を使用する遺伝子編集により行われる。幾つかの実施形態においては、遺伝子座の領域を標的化する標的化ドメインを含むガイドRNA（gRNA）及びCas9を含む物質を細胞内に導入する。幾つかの実施形態においては、物質はCas9ポリペプチドとgRNAとのリボ核タンパク質（RNP）複合体（Cas9/gRNA RNP）であり、又はそれを含む。幾つかの実施形態においては、導入は、インビトロで、物質又はその一部を細胞とインビトロで接触させることを含み、これは、細胞及び物質を最大で24、36若しくは48時間又は3、4、5、6、7若しくは8日間培養又はインキュベートすることを含みうる。幾つかの実施形態においては、導入は、細胞への物質の送達をもたらすことを更に含みうる。種々の実施形態においては、本開示の方法、組成物及び細胞は、Cas9とgRNAとのリボ核タンパク質（RNP）複合体を、例えばエレクトロポレーションにより、細胞に直接的に送達することを用いる。幾つかの実施形態においては、RNP複合体は、3'ポリAテールと5'アンチリバースキャップアナログ（Anti-Reverse Cap Analog）（ARCA）キャップとを含むように修飾されているgRNAを含む。
【００９１】
CRISPR/Cas9系は、標的化遺伝的改変を誘発するための簡便かつ効率的な系である。Cas9タンパク質による標的認識は、ガイドRNA（gRNA）内の「シード（seed）」配列と、gRNA結合領域の上流にプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列を含有する保存されたジヌクレオチドとを要する。それにより、CRISPR/Cas9系は、gRNA細胞を再設計することにより、実質的に任意のDNA配列を切断するように操作されうる。CRISPR/Cas9系は、単一のCas9タンパク質を2以上のgRNAと共発現させることにより、複数のゲノム遺伝子座を同時に標的化して、この系を、複数の遺伝子編集又は標的遺伝子の相乗的活性化に適したものにしうる。
【００９２】
Cas9タンパク質及びガイドRNAは、標的配列を識別して切断する複合体を形成する。Cas9は、6つのドメイン、REC I、REC II、ブリッジヘリックス（Bridge Helix）、PAMインタラクティング（interacting）、HNH及びRuvCから構成される。REC IドメインはガイドRNAに結合し、ブリッジヘリックスは標的DNAに結合する。HNHドメイン及びRuvCドメインはヌクレアーゼドメインである。ガイドRNAは、標的DNA配列に相補的な5'末端を有するように操作される。ガイドRNAがCas9タンパク質に結合すると、コンホメーション変化が生じて、タンパク質を活性化する。Cas9は、一旦活性化されると、そのプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列に合致した配列に結合することにより、標的DNAを探索する。PAMは、ガイドRNAに相補的な領域の1ヌクレオチド下流の2又は3ヌクレオチドの塩基配列である。非限定的な一例においては、PAM配列は、5'-NGG-3'である。Cas9タンパク質が適切なPAMにおいてその標的配列を見つけると、それはPAMの上流の塩基を融解させ、それらをガイドRNA上の相補領域とペア形成させる。ついでRuvCドメイン及びHNHヌクレアーゼドメインがPAMの上流の第3ヌクレオチド塩基の後で標的DNAを切断する。
【００９３】
遺伝子発現を阻害するために使用されるCRISPR/Cas系の非限定的な一例であるCRISPR干渉（CRISPRi）が、米国特許出願公開番号US20140068797に記載されている。CRISPRiは、エンドヌクレアーゼ活性を欠く触媒的に失活したCas9を利用する。ガイドRNAと共発現されると、DNA認識複合体が生成され、これは転写伸長、RNAポリメラーゼ結合又は転写因子結合を特異的に阻害する。このCRISPRi系は標的化遺伝子の発現を効率的に抑制する。
【００９４】
標的遺伝子に特異的なガイド核酸配列とCasエンドヌクレアーゼとが細胞内に導入され、標的遺伝子において二本鎖切断をCasエンドヌクレアーゼが導入することを可能にする複合体を形成すると、CRISPR/Cas遺伝子破壊が生じる。ある実施形態においては、CRISPR/Cas系は、発現ベクター、例えばpAd5F35-CRISPRベクター（これに限定されるものではない）を含む。他の実施形態においては、Cas発現ベクターは、Cas9エンドヌクレアーゼの発現を誘導する。他のエンドヌクレアーゼ、例えばCas12A（Cpf1）、T7、Cas3、Cas8A、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、当技術分野で公知の他のヌクレアーゼ及びそれらの任意の組合せ（これらに限定されるものではない）も使用されうる。
【００９５】
ある実施形態においては、CRISPR/Cas系は、活性が変化したCas9変異体を含みうる。例示的な変異Cas9ヌクレアーゼには、Cas9ニッカーゼ（nCas9）、触媒的に失活したCas9（dCas9）、超精密（hyper accurate）Cas9（HypaCas9）（Chenら Nature, 550(7676), 407-410 (2017)）、高忠実度（high-fidelity）Cas9（Cas9-HF）（Kleinstiverら Nature 529(7587), 490-495 (2016)）、高特異性Cas9（eCas9）（Slaymakerら Science 351(6268), 84-88 (2016)）及び拡張PAM Cas9（xCas9）（Huら Nature doi: 10.1038/nature26155 (2018)）が含まれうるが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
ある実施形態においては、Cas発現ベクターの誘導は、Cas発現ベクター内の誘導性プロモーターを活性化する因子に細胞を曝露することを含む。そのような実施形態においては、Cas発現ベクターは、誘導性プロモーター、例えば、抗生物質（例えば、テトラサイクリン又はテトラサイクリン誘導体、例えばドキシサイクリン）への曝露により誘導可能な誘導性プロモーターを含む。当業者に公知の他の誘導性プロモーターも使用されうる。誘導因子は、誘導性プロモーターの誘導をもたらす選択的条件（例えば、薬剤、例えば抗生物質への曝露）でありうる。これはCas発現ベクターの発現をもたらす。
【００９７】
本明細書中で用いる「ガイドRNA」又は「gRNA」なる語は、細胞における標的配列（例えば、ゲノム配列又はエピソーム配列）へのRNA誘導性（guided）ヌクレアーゼ（例えば、Cas9）の特異的会合（又は「標的化」）を促進させる任意の核酸を意味する。gRNA配列は、チミン又は「T」ヌクレオチドの代わりにウラシル又は「U」ヌクレオチドを用いて示されうる、と当業者に理解されるであろう。
【００９８】
本明細書中で用いる「モジュラー」又は「二重RNA」ガイドは、2以上（典型的には2つ）の別個のRNA分子、例えばCRISPR RNA（crRNA）及びトランス活性化crRNA（tracrRNA）を含み、これらは通常、例えば二本鎖形成（duplexing）により、お互いに会合している。gRNA及びそれらの成分は文献全体に記載されている（例えば、Brinerら Mol. Cell, 56(2), 333-339 (2014)（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。
【００９９】
本明細書中で用いる「単分子gRNA」、「キメラgRNA」又は「単一ガイドRNA（sgRNA）」は、単一RNA分子を含む。sgRNAは、互いに連結されたcrRNA及びtracrRNAでありうる。例えば、crRNAの3'末端は、tracrRNAの5'末端に連結されうる。crRNAとtracrRNAとは、共に単一の単分子又はキメラgRNAを形成することが可能であり、その連結は、例えば、crRNAの（その3'末端における）相補的領域とtracrRNAの（その5'末端における）相補的領域とを架橋する4ヌクレオチド（例えば、GAAA）の「テトラループ」又は「リンカー」配列によるものでありうる。
【０１００】
本明細書中で用いる「反復」配列又は領域は、tracrRNAのアンチリピート（anti-repeat）配列に相補的である、crRNAの3'末端又はその近くのヌクレオチド配列である。
【０１０１】
本明細書中で用いる「アンチリピート」配列又は領域は、crRNAの反復配列に相補的である、tracrRNAの5'末端又はその近くのヌクレオチド配列である。
【０１０２】
ゲノム編集のためのgRNA/Cas9複合体を含む、ガイドRNAの構造と機能に関する更なる詳細は、少なくとも、Maliら Science, 339(6121), 823-826 (2013); Jiangら Nat. Biotechnol. 31(3). 233-239 (2013); 及びJinekら Science, 337(6096), 816-821 (2012)（これらを参照により本明細書に組み入れることとする）において見出されうる。
【０１０３】
本明細書中で用いる「ガイド配列」又は「標的化配列（targeting sequence）」は、単分子の場合もモジュラーの場合も、編集が望まれる細胞のゲノム内のDNA配列内の標的ドメイン又は標的ポリヌクレオチドに完全又は部分的に相補的であるgRNAのヌクレオチド配列を意味する。ガイド配列は、典型的には、10〜30ヌクレオチド長、好ましくは16〜24ヌクレオチド長（例えば、16、17、18、19、20、21、22、23又は24ヌクレオチド長）であり、Cas9 gRNAの5'末端又はその近くに存在する。
【０１０４】
本明細書中で用いる「標的ドメイン」又は「標的ポリヌクレオチド配列」又は「標的配列」は、gRNAのガイド配列に相補的である、細胞のゲノム内のDNA配列である。
【０１０５】
CRISPR複合体の形成の場合、「標的配列」は、ガイド配列が幾らかの相補性を有するように設計されている配列を意味し、この場合、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションはCRISPR複合体の形成を促進させる。ハイブリダイゼーションを引き起こしCRISPR複合体の形成を促進させるのに十分な相補性が存在すれば、完全な相補性は必ずしも必要でない。標的配列は、DNA又はRNAポリヌクレオチドのような任意のポリヌクレオチドを含みうる。ある実施形態においては、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。他の実施形態においては、標的配列は、真核細胞の細胞小器官、例えば、ミトコンドリア又は核内に存在しうる。典型的には、CRISPR系の場合、CRISPR複合体（標的配列にハイブリダイズし、1以上のCasタンパク質と複合体形成するガイド配列を含むもの）の形成は、標的配列又はその近く（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50又はそれ以上の塩基対以内）で、一方又は両方の鎖の切断をもたらす。標的配列の場合と同様に、これが機能に十分である限り、完全な相補性は必要でないと考えられている。
【０１０６】
ある実施形態においては、CRISPR系の要素の発現が1以上の標的部位におけるCRISPR複合体の形成を導くように、CRISPR系の要素の1以上の発現を駆動する1以上のベクターを宿主細胞（例えば、多能性幹細胞）内に導入する。例えば、Casヌクレアーゼ、crRNA及びtracrRNAのそれぞれは、別々のベクター上の別々の調節要素に機能的に連結されうるであろう。本明細書中で用いる「機能的に連結」なる語は、一方の機能が他方から影響を受けるように、単一核酸断片上で複数の核酸配列が結合していることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、それがそのコード配列の発現に影響を及ぼしうる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）である。
【０１０７】
あるいは、同じ又は異なる調節要素から発現される2以上の要素が、第1ベクターには含まれないCRISPR系のいずれかの成分を与える1以上の追加的ベクターと、単一ベクターにおいて組合されうる。単一ベクターにおいて組合されるCRISPR系要素は任意の適切な配向で配置されうる。例えば、1つの要素はもう1つの要素の5'側（「上流」）又は3'側（「下流」）に位置しうる。1つの要素のコード配列は、もう1つの要素のコード配列と同じ又は反対の鎖上に位置することが可能であり、同じ又は反対の方向に向けて配置されうる。ある実施形態においては、単一のプロモーターが、CRISPR酵素をコードする転写産物と、ガイド配列、tracrの相手（mate）の配列（所望により、ガイド配列に機能的に連結されていてもよい）及びtracr配列［1以上のイントロン配列内に埋め込まれているもの（例えば、それぞれが別々のイントロンにおいて、又は2以上が少なくとも1つのイントロンにおいて、又は全てが単一イントロンにおいて）］の1以上との発現を駆動する。
【０１０８】
ある実施形態においては、CRISPR酵素は、1以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、CRISPR酵素に加えて約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれ以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。CRISPR酵素融合タンパク質は、任意の追加的なタンパク質配列を含むことが可能であり、そして所望により、任意の2つのドメインの間のリンカー配列を含んでいてもよい。CRISPR酵素に融合されうるタンパク質ドメインの例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、及び以下の活性の1以上を有するタンパク質ドメイン：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除（release）因子活性、ヒストン修飾活性、RNA切断活性及び核酸結合活性。CRISPR酵素を含む融合タンパク質の一部を構成しうる追加的ドメインは米国特許出願公開番号US20110059502（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。ある実施形態においては、標的配列の位置を特定するために、タグ付きCRISPR酵素が使用される。
【０１０９】
哺乳類細胞及び非哺乳類細胞（例えば、ヒト多能性幹細胞）又は標的組織内に核酸を導入するためには、通常のウイルス性遺伝子導入法及び非ウイルス性遺伝子導入法が用いられうる。そのような方法は、CRISPR系の成分をコードする核酸を宿主生物内又は培養内の細胞に投与するために用いられうる。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラスミド、RNA（例えば、本明細書に記載されているベクターの転写物）、裸核酸、及びリポソームのような送達ビヒクルと複合体形成した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、細胞への送達の後でエピソームゲノム又は組み込みゲノムのいずれかを有するDNA及びRNAウイルスが含まれる（Anderson, 1992, Science 256:808-813; 及びYuら, 1994, Gene Therapy 1:13-26）。
【０１１０】
幾つかの実施形態においては、CRISPR/CasはII型CRISPR/Cas系に由来する。他の実施形態においては、CRISPR/Cas系はCas9ヌクレアーゼに由来する。本発明において使用されうる例示的なCas9ヌクレアーゼには、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）Cas9（SpCas9）、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Cas9（SaCas9）、サーモフィラス菌（S. thermophilus）Cas9（StCas9）、髄膜炎菌（N. meningitidis）Cas9（NmCas9）、カンピロバクター・ジェジュニ（C. jejuni）Cas9（CjCas9）及びジオバチルス（Geobacillus）Cas9（GeoCas9）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
一般に、Casタンパク質は少なくとも1つのRNA認識及び／又はRNA結合ドメインを含む。RNA認識及び／又はRNA結合ドメインはガイドRNAと相互作用する。Casタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、DNase又はRNaseドメイン）、DNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、RNAseドメイン、タンパク質-タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン及び他のドメインをも含みうる。Casタンパク質は、核酸結合親和性及び／若しくは特異性を増加させるように、並びに／又は酵素活性を改変するように、並びに／又はタンパク質の別の特性を改変するように修飾されうる。ある実施形態においては、融合タンパク質のCas様タンパク質は野生型Cas9タンパク質又はその断片に由来しうる。他の実施形態においては、Casは修飾Cas9タンパク質に由来しうる。例えば、Cas9タンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性など）の1以上を改変するように修飾されうる。あるいは、修飾Cas9タンパク質が野生型Cas9タンパク質より小さくなるように、RNA誘導性切断に関与しないCas9タンパク質のドメインがタンパク質から除去されうる。一般に、Cas9タンパク質は少なくとも2つのヌクレアーゼ（すなわち、DNアーゼ）ドメインを含む。例えば、Cas9タンパク質は、RuvC様ヌクレアーゼドメイン及びHNH様ヌクレアーゼドメインを含みうる。RuvCドメインとHNHドメインとは一緒に働いて一本鎖を切断して、DNAの二本鎖切断をもたらす（Jinekら, 2012, Science, 337:816-821）。ある実施形態においては、Cas9由来タンパク質は、ただ1つの機能的ヌクレアーゼドメイン（RuvC様又はHNH様ヌクレアーゼドメインのいずれか）を含有するように修飾されうる。例えば、Cas9由来タンパク質は、それが機能的でなくなるように（すなわち、ヌクレアーゼ活性が喪失するように）ヌクレアーゼドメインの1つが欠失又は突然変異するように修飾されうる。ヌクレアーゼドメインの1つが不活性である幾つかの実施形態においては、Cas9由来タンパク質は二本鎖核酸内に切れ目（nick）を導入しうるが（そのようなタンパク質は「ニッカーゼ」と称される）、二本鎖DNAを切断することはできない。前記実施形態のいずれかにおいて、ヌクレアーゼドメインのいずれか又は全ては、よく知られた方法、例えば部位特異的突然変異誘発、PCR媒介突然変異誘発及び全遺伝子合成並びに当技術分野で公知の他の方法を用いて、1以上の欠失突然変異、挿入突然変異及び／又は置換突然変異により不活化されうる。
【０１１２】
本明細書中で用いる「塩基エディター（base editor）」は、鎖ハイブリダイゼーションにより標的核酸配列に結合するガイドRNAに結合しうるCRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインと、そして更に標的核酸配列の塩基を編集しうる塩基編集ドメインとを含むタンパク質又は融合タンパク質である。ある実施形態においては、CRISPR系は塩基エディター及びガイドRNAを含む。
【０１１３】
「塩基エディター」なる語は「次世代」塩基エディター、例えば第3世代塩基エディター（BE3系）、第4世代塩基エディター（BE4系）及びアデニン塩基エディターを含む。塩基除去修復インヒビターUGIがCas9ニッカーゼに融合している第3世代塩基エディター（BE3系）は未修飾DNA鎖に切れ目を入れ、その結果、細胞は、ミスマッチ修復のための鋳型として、編集された鎖を使用することが促進される。その結果、細胞は、U含有鎖（シチジン脱アミノ化により導入されたもの）を鋳型として使用してDNAを修復して、塩基編集をコピーする。第4世代塩基エディター（BE4系）は、塩基除去修復インヒビターUGIの、2つのコピーを使用する。アデニン塩基エディター（ABE）が開発されており、これはゲノムDNAにおいて標的化A・T塩基対をG・Cへと（ヒト細胞において0〜100%の効率）へと、高い産物純度（典型的には少なくとも99.9%）及び低いインデル率（典型的には0.1%以下）で効率的に変換する。例えば、Gaudelliら, Nature 551:464-471 (2017)を参照されたい。標的遺伝子の発現を破壊するためにATG「開始」コドンにヌル突然変異を導入する塩基エディターを含む他の塩基エディターも、本明細書に記載されている方法による使用に適していると理解されるであろう。
【０１１４】
塩基エディターは、ガイドRNAに結合しうる任意の適切なCRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインを含みうる。幾つかの実施形態においては、CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインは、2つのDNA切断ドメインのうちの1つが不活性化されているCas9ヌクレアーゼであり、すなわち、Cas9はニッカーゼである。ヌクレアーゼ不活性化Cas9タンパク質は（ヌクレアーゼ「失活（dead）」Cas9にちなんで）「dCas9」タンパク質と称されうる。不活性DNA切断ドメインを有するCas9タンパク質（又はその断片）を生成するための方法は公知である（例えば、Jinekら, Science. 337:816-821(2012); Qiら, “Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression” (2013) Cell. 28; 152(5):1173-83（それらのそれぞれの全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは2つのサブドメイン、すなわち、HNHヌクレアーゼサブドメイン及びRuvC1サブドメインを含むことが公知である。HNHサブドメインは、gRNAに相補的な鎖を切断し、一方、RuvC1サブドメインは非相補的鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異はCas9のヌクレアーゼ活性をサイレンシングしうる。例えば、D10A及びH840Aの突然変異は、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）Cas9のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Jinekら, Science. 337:816-821(2012); Qiら, Cell. 28; 152(5):1173-83 (2013)）。適切なCRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインには、WO2015089406A1（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているD10A、D10A/D839A/H840A及びD10A/D839A/H840A/N863Aの突然変異ドメインを含むヌクレアーゼ不活性変異Cas9ドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１５】
CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ不活性化Cas9）は、標的細胞又はゲノムに導入されると、そのプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列に合致する配列への結合により、標的DNAを探索する。幾つかの実施形態においては、CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインは非標準的PAM配列（例えば、非NGG PAM配列）を認識しうる。そのようなPAM配列は当技術分野で公知であり、例えば、5'-NGA-3'、5'-NGCG-3'、5'-NGAG-3'、5'-NNGRRT-3'及び5'-NNNRRT-3'を包含する。当業者は、所与のCRISPRヌクレアーゼにより認識される適切なPAM配列を決定しうるであろう。
【０１１６】
「塩基編集ドメイン」なる語は、核酸配列（例えば、DNA又はRNA）内の塩基（例えば、A、T、C、G又はU）に修飾（例えば、塩基置換）を施しうるポリペプチドを含む因子を意味する。幾つかの実施形態においては、塩基編集ドメインはDNA編集ドメインである。幾つかの実施形態においては、塩基編集ドメインは核酸内の塩基を脱アミノ化しうる。幾つかの実施形態においては、塩基エディターは、DNA分子内の塩基を脱アミノ化しうる。幾つかの実施形態においては、塩基編集ドメインはデアミナーゼドメインである。
【０１１７】
幾つかの実施形態においては、デアミナーゼはアデノシンデアミナーゼである。幾つかの実施形態においては、アデノシンデアミナーゼはアデニンを脱アミノ化しうる。幾つかの実施形態においては、アデノシンデアミナーゼはDNAのデオキシアデノシン残基におけるアデニンを脱アミノ化しうる。アデノシンデアミナーゼは任意の適切な生物（例えば、大腸菌（E. coli））に由来しうる。幾つかの実施形態においては、アデニンデアミナーゼは、本明細書に記載されている突然変異のいずれかに対応する1以上の突然変異（例えば、ecTadAにおける突然変異）を含む天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。幾つかの実施形態においては、アデノシンデアミナーゼは原核生物に由来する。幾つかの実施形態においては、アデノシンデアミナーゼは細菌に由来する。幾つかの実施形態においては、アデノシンデアミナーゼは大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、チフス菌（Salmonella typhi）、シェワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）又は枯草菌（Bacillus subtilis）に由来する。幾つかの実施形態においては、アデノシンデアミナーゼは大腸菌に由来する。幾つかの実施形態においては、デアミナーゼは、活性を獲得又は増強するために、合理的に操作及び／又は進化される。
【０１１８】
ある例示的な実施形態においては、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼである。幾つかの実施形態においては、デアミナーゼはアポリポタンパク質B mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーデアミナーゼである。幾つかの実施形態においては、デアミナーゼは、APOBEC1ファミリーデアミナーゼである。幾つかの実施形態においては、デアミナーゼは活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（AID）である。幾つかの実施形態においては、デアミナーゼはACF1/ASEデアミナーゼである。幾つかの実施形態においては、デアミナーゼはアデノシンデアミナーゼである。幾つかの実施形態においては、デアミナーゼはADATファミリーデアミナーゼである。幾つかの実施形態においては、塩基編集ドメインはCas9ドメインのN末端に融合されている。幾つかの実施形態においては、塩基編集ドメインは、Cas9ドメインのC末端に融合されている。幾つかの実施形態においては、Cas9ドメインと塩基編集ドメインとはリンカーを介して融合されている。
【０１１９】
塩基編集タンパク質の種々のCRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメイン及び塩基編集ドメインは、米国特許公開番号US20150166985A1、US20150166980A1、US20150166984A1、US20170121693A1及びUS20180073012A1並びに米国特許第9,068,179号及び第9,840,699号（それらの全てを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１２０】
1つの非限定的な実施形態においては、ベクターはCRISPR系の発現を駆動する。本発明において有用な適切なベクターは当技術分野に豊富に存在する。使用されるベクターは、複製、及び所望により、真核細胞における組み込みに適したものである。典型的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列並びに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含む。本発明のベクターは、核酸の標準的遺伝子送達法にも使用されうる。遺伝子送達の方法は当技術分野で公知である（米国特許第5,399,346号、第5,580,859号及び第5,589,466号（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする））。
【０１２１】
更に、ベクターはウイルスベクターの形態で細胞に供与されうる。ウイルスベクター技術は当技術分野でよく知られており、例えば、Sambrookら（4th Edition, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2012）並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、ガンマレトロウイルス及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物において機能的である複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位及び1以上の選択マーカーを含有する（例えば、WO 01/96584; WO 01/29058; 及び米国特許第6,326,193号）。
【０１２２】
幾つかの実施形態においては、ガイドRNA及びCas9又は塩基エディターは、リボ核タンパク質（RNP）複合体（例えば、Cas9/RNA-タンパク質複合体）として細胞に送達されうる。RNPは、gRNAと複合体形成した精製Cas9タンパク質又は精製塩基エディターから構成され、幹細胞及び免疫細胞（Addgene, Cambridge, MA, Mirus Bio LLC, Madison, WI）（これらに限定されるものではない）を含む複数のタイプの細胞に効率的に送達されることが当技術分野でよく知られている。幾つかの実施形態においては、Cas9又は塩基エディター/RNA-タンパク質複合体はエレクトロポレーションにより細胞に送達される。
【０１２３】
幾つかの実施形態においては、本開示の遺伝子編集細胞は、細胞（例えば、Treg）における1以上の内因性遺伝子を破壊するためにCRISPR/Cas9を使用して編集されている。幾つかの実施形態においては、CRISPR/Cas9は、内因性NR3C1を破壊するために使用され、それにより、NR3C1発現のダウンレギュレーションをもたらす。幾つかの実施形態においては、本開示の遺伝子編集細胞は、細胞内の1以上の内因性遺伝子（例えば、Treg）を破壊するために塩基エディターを使用して塩基編集されている（例えば、置換が細胞内に導入されている）。幾つかの実施形態においては、塩基エディターは、内因性NR3C1を破壊するために使用され、それにより、NR3C1発現のダウンレギュレーションをもたらす。
【０１２４】
本明細書に記載されているとおり、NR3C1のダウンレギュレーションは、ステロイド、例えば糖質コルチコイドに対する耐性をもたらす。したがって、幾つかの実施形態においては、本開示はステロイド耐性細胞（例えば、糖質コルチコイド耐性Treg）を提供し、ここで、CRISPR/Cas9が、内因性NR3C1を破壊するために使用され、それにより、NR3C1発現のダウンレギュレーションをもたらす。したがって、本開示のステロイド耐性CRISPR修飾細胞は、NR3C1をコードする遺伝子座におけるCRISPR媒介性挿入及び／又は欠失（インデル）を含み、ここで、インデルはNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートしうる。したがって、本開示のステロイド耐性CRISPR修飾細胞は、NR3C1をコードする遺伝子座における塩基編集（例えば、標的化塩基置換）を含み、ここで、塩基編集はNR3C1の遺伝子発現を除去／ダウンレギュレートしうる。
【０１２５】
NCBI参照配列NM_001018074.1によれば、NR3C1遺伝子座は9個のエクソンを含有する。幾つかの実施形態においては、NR3C1をコードする遺伝子座におけるCRISPR媒介性インデルはNR3C1のエクソン1、エクソン2、エクソン3、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8又はエクソン9に位置する。したがって、幾つかの実施形態においては、gRNAは、NR3C1のエクソン1、エクソン2、エクソン3、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8又はエクソン9内の標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む。ある実施形態においては、NR3C1をコードする遺伝子座におけるインデルはNR3C1のエクソン2に位置する。ある実施形態においては、ガイドRNAは、NR3C1のエクソン2の標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む。内因性NR3C1の破壊に使用するのに適したgRNAを表1に示す。ある実施形態においては、ガイド配列はNR3C1遺伝子における標的配列に対して十分に相補的であり、配列番号7〜10のいずれか記載されている核酸配列を含む。
【０１２６】
【表１】
2021524233.tif 000003
【０１２７】
幾つかの実施形態においては、NR3C1をコードする遺伝子座における化膿レンサ球菌（S. pyogenes）CRISPR/Cas9塩基エディター媒介性置換は未成熟終止コドンを導入する。したがって、幾つかの実施形態においては、gRNAは、標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含み、標的配列においては、1以上の塩基対置換が正常野生型コドンを終止コドンへと変換する。ある実施形態においては、NR3C1をコードする遺伝子座における置換はNR3C1のエクソンに位置する。ある実施形態においては、ガイドRNAは、NR3C1のエクソンにおける標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む。内因性NR3C1に未成熟終止コドンを導入する置換をもたらすのに使用される適切なgRNAを表2に記載する。ある実施形態においては、ガイド配列はNR3C1遺伝子における標的配列に対して十分に相補的であり、配列番号17〜54のいずれか1つに示される核酸配列を含む。
【０１２８】
【表２】
2021524233.tif 000004
【０１２９】
幾つかの実施形態においては、NR3C1をコードする遺伝子座におけるCRISPR媒介性置換は、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーに位置する。したがって、幾つかの実施形態においては、gRNAは、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーを含む標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む。ある実施形態においては、NR3C1をコードする遺伝子座における置換は、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナー又はその近くに位置し、ここで、置換は、NR3C1の正常なスプライシングを破壊することが可能であり、それにより、NR3C1の発現をダウンレギュレート／除去しうる。ある実施形態においては、ガイドRNAは、NR3C1のスプライスアクセプターを含む標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む。ある実施形態においては、ガイドRNAは、NR3C1のスプライスドナーを含む標的配列に対して十分に相補的であるガイド配列を含む。NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーにおける又はそれらの近くにおける置換をもたらすのに使用される適切なgRNAを表3に示す。ある実施形態においては、ガイド配列はNR3C1遺伝子における標的配列に対して十分に相補的であり、配列番号55〜56のいずれか1つに示される核酸配列を含む。
【０１３０】
【表３】
2021524233.tif 000005
【０１３１】
したがって、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、修飾多能性幹細胞、修飾Treg）を生成する方法は、NR3C1のエクソン2においてインデルを生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、インデルはNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートしうる。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、修飾多能性幹細胞、修飾Treg）を生成する方法は、NR3C1のエクソン2においてインデルを生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、インデルはNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、CRISPR系は、配列番号7に示される核酸配列を含むガイドRNAを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、修飾多能性幹細胞、修飾Treg）を生成する方法は、NR3C1のエクソン2においてインデルを生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、インデルはNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、CRISPR系は、配列番号8に示される核酸配列を含むガイドRNAを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、修飾多能性幹細胞、修飾Treg）を生成する方法は、NR3C1のエクソン2においてインデルを生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、インデルはNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、CRISPR系は、配列番号9に示される核酸配列を含むガイドRNAを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、修飾多能性幹細胞、修飾Treg）を生成する方法は、NR3C1のエクソン2においてインデルを生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、インデルはNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、CRISPR系は、配列番号10に示される核酸配列を含むガイドRNAを含む。
【０１３２】
したがって、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、修飾多能性幹細胞、修飾Treg）を生成する方法は、NR3C1のエクソンにおいて置換を生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、置換はNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートしうる。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、修飾多能性幹細胞、修飾Treg）を生成する方法は、NR3C1のエクソンにおいて置換を生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、置換はNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、CRISPR系は、配列番号17〜54のいずれか1つに示される核酸配列を含むガイドRNAを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、Treg）を生成する方法は、NR3C1のエクソンにおいて置換を生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、置換はNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、CRISPR系は、配列番号20又は21に示される核酸配列を含むガイドRNAを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、Treg）を生成する方法は、NR3C1のエクソンにおいて置換を生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、置換はNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、CRISPR系は、配列番号20に示される核酸配列を含むガイドRNAを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、Treg）を生成する方法は、NR3C1のエクソンにおいて置換を生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、置換はNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、CRISPR系は、配列番号21に示される核酸配列を含むガイドRNAを含む。
【０１３３】
したがって、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、修飾多能性幹細胞、修飾Treg）を生成する方法は、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーにおいて置換を生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、置換はNR3C1の正常なスプライシング破壊することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートしうる。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、修飾多能性幹細胞、修飾Treg）を生成する方法は、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーにおいて置換を生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、置換はNR3C1の正常なスプライシングを破壊することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、CRISPR系は、配列番号55又は56に示される核酸配列を含むガイドRNAを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、Treg）を生成する方法は、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーにおいて置換を生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、置換はNR3C1の正常なスプライシングを破壊することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、CRISPR系は、配列番号55に示される核酸配列を含むガイドRNAを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性修飾細胞（例えば、Treg）を生成する方法は、NR3C1のスプライスアクセプター又はスプライスドナーにおいて置換を生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、置換はNR3C1の正常なスプライシングを破壊することが可能であり、それにより、NR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、CRISPR系は、配列番号56に示される核酸配列を含むガイドRNAを含む。
【０１３４】
幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性及びカルシニューリンインヒビター耐性修飾細胞（例えば、Treg）を生成する方法は、NR3C1においてインデルを生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、インデルはNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、そして前記方法は、更に、外因性カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を細胞のゲノム内に挿入することを含む。幾つかの実施形態においては、CNI耐性遺伝子の挿入はNR3C1のインデルの部位で生じる。幾つかの実施形態においては、NR3C1におけるインデルはNR3C1のエクソン2に存在する。幾つかの実施形態においては、CNI耐性遺伝子はカルシニューリン変異体をコードし、ここで、カルシニューリン変異体は、PPP3Ca、PPP3Cb及びPPP3Cc（触媒サブユニットの、3つのアイソフォーム）からなる群から選択されるカルシニューリンA（CNa）遺伝子の突然変異体形態、又はPPP3R1及びPPP3R2（調節サブユニットの、2つのアイソフォーム）からなる群から選択されるカルシニューリンB（CNb）遺伝子の突然変異体形態である。幾つかの実施形態においては、カルシニューリン変異体は、CNa12（配列番号3）、CNa22（配列番号4）及びCNb30（配列番号5）からなる群から選択される。
【０１３５】
幾つかの実施形態においては、本開示のステロイド耐性及びカルシニューリンインヒビター耐性修飾細胞（例えば、Treg）を生成する方法は、NR3C1において置換を生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、置換はNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、そして、方法は更に、外因性カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を細胞のゲノム内に挿入することを含む。幾つかの実施形態においては、NR3C1における置換はNR3C1のエクソンに存在する。幾つかの実施形態においては、NR3C1における置換はNR3C1のエクソン2に存在する。幾つかの実施形態においては、NR3C1における置換はNR3C1のスプライスアクセプターに存在する。幾つかの実施形態においては、NR3C1における置換はNR3C1のスプライスドナーに存在する。幾つかの実施形態においては、CNI耐性遺伝子の挿入はNR3C1における置換の部位において、又はその近くで、又はその下流で（例えば、NR3C1遺伝子座内で）生じる。幾つかの実施形態においては、CNI耐性遺伝子の挿入はNR3C1遺伝子座の外側で生じる。幾つかの実施形態においては、CNI耐性遺伝子はカルシニューリン変異体をコードし、ここで、カルシニューリン変異体は、PPP3Ca、PPP3Cb及びPPP3Ccからなる群から選択されるカルシニューリンA（CNa）遺伝子の突然変異体形態、又はPPP3R1及びPPP3R2からなる群から選択されるカルシニューリンB（CNb）遺伝子の突然変異体形態である。幾つかの実施形態においては、カルシニューリン変異体は、CNa12（配列番号3）、CNa22（配列番号4）及びCNb30（配列番号5）からなる群から選択される。
【０１３６】
したがって、ステロイド耐性及びカルシニューリンインヒビター耐性修飾細胞（例えば、Treg）を生成する方法は、NR3C1のエキソン2においてインデルを生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、インデルはNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、そして前記方法は、更に、NR3C1におけるインデルの部位内に外因性CNI耐性遺伝子を挿入することを含み、ここで、外因性CNI耐性遺伝子は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むカルシニューリン変異体をコードする。したがって、ステロイド耐性及びカルシニューリンインヒビター耐性修飾細胞（例えば、Treg）を生成する方法は、NR3C1のエキソン2においてインデルを生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、インデルはNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、そして前記方法は、更に、NR3C1におけるインデルの部位内に外因性CNI耐性遺伝子を挿入することを含み、ここで、外因性CNI耐性遺伝子は、配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むカルシニューリン変異体をコードする。したがって、ステロイド耐性及びカルシニューリンインヒビター耐性修飾細胞（例えば、Treg）を生成する方法は、NR3C1のエキソン2においてインデルを生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、インデルはNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、そして、方法は更に、NR3C1におけるインデルの部位内に外因性CNI耐性遺伝子を挿入することを含み、ここで、外因性CNI耐性遺伝子は、配列番号5に示されるアミノ酸配列を含むカルシニューリン変異体をコードする。
【０１３７】
幾つかの場合においては、修飾細胞は、胚性又は人工（induced）のいずれかの修飾多能性幹細胞である。そのような場合、本発明で提供される方法は、修飾多能性幹細胞から造血前駆細胞又は造血細胞への分化を促進させる条件下、修飾多能性幹細胞を分化させることを更に含む。幾つかの場合においては、方法は、修飾造血前駆細胞及び分化造血細胞型を得るのに必要かつ十分な分化因子の存在下、修飾多能性幹細胞を培養することを含む。ついで、修飾多能性幹細胞を、任意の適切な分化方法、例えば米国特許第9574179号、第8093049号に記載されている方法により分化させて、修飾多能性幹細胞由来造血細胞又はその前駆体を得ることが可能である。
【０１３８】
したがって、幾つかの場合においては、ステロイド耐性及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性修飾細胞（例えば、Treg）を生成する方法は、本明細書に記載されているとおりにNR3C1をコードする遺伝子座において置換を生じさせるCRISPR系を多能性幹細胞内に導入することを含み、ここで、置換はNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートすることが可能であり、そして幾つかの場合においては、前記方法は、更に、多能性細胞のゲノム内に外因性カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を挿入することを含む。
【０１３９】
幾つかの態様においては、提供される組成物及び方法は、細胞の組成物中の細胞の少なくとも約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%以上が所望の遺伝的修飾を含有するものを含む。例えば、内因性遺伝子（例えば、NR3C1）のノックアウト又は遺伝的破壊（例えば、インデル及び／又は置換）のための物質（例えば、gRNA/Casヌクレアーゼ）が導入された細胞の組成物中の細胞の約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%は、標的化内因性ポリペプチドを発現せず、標的化遺伝子の連続的及び／又は機能的コピーを含有しない。幾つかの実施形態においては、本開示の方法、組成物及び細胞は、標的化遺伝子のノックアウト又は遺伝的破壊（例えば、インデル及び／又は置換）のための物質（例えば、gRNA/Casヌクレアーゼ）が導入された細胞の組成物中の細胞の少なくとも約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%以上が標的化ポリペプチドを発現しないものを含む。幾つかの実施形態においては、標的化遺伝子のノックアウト又は遺伝的破壊（例えば、インデル及び／又は置換）のための物質（例えば、gRNA/Cas9）が導入された細胞の組成物中の細胞の少なくとも約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%以上が、そのような割合の細胞において両方の対立遺伝子においてノックアウトされている、すなわち、2対立遺伝子欠失を含む。
【０１４０】
幾つかの実施形態においては、標的化遺伝子内又はその近くで（例えば、切断部位から上流又は下流方向に100若しくは約100塩基対以内、50若しくは約50塩基対以内、又は25若しくは約25塩基対以内、又は10若しくは約10塩基対以内）のCas9媒介性切断効率（例えば、インデルの割合（%）、置換の割合（%））が、標的化遺伝子のノックアウト又は遺伝的破壊のための物質（例えば、gRNA/Cas9）が導入された細胞の組成物中の細胞において、約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%以上である組成物及び方法を提供する。
【０１４１】
幾つかの実施形態においては、提供される細胞、組成物及び方法は、標的化遺伝子のノックアウト又は遺伝的破壊のための物質（例えば、gRNA/Casヌクレアーゼ）が導入された細胞の組成物中の細胞の約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%以上において、内因的に伝達されるシグナルの低減又は破壊をもたらす。
【０１４２】
幾つかの実施形態においては、組成物中の細胞は、同じ条件下で評価された場合、対応又は参照組成物中の細胞の表現型と比較して、細胞の表現型を保持する。幾つかの実施形態においては、組成物中の細胞は、標的遺伝子を破壊する効果が細胞に及ぼす影響を除いて、同じ条件下で評価された場合、対応又は参照組成物中の細胞の表現型と比較して、細胞の表現型を保持する。
【０１４３】
幾つかの実施形態においては、組成物中の細胞には、ナイーブ細胞、エフェクターメモリー細胞、中央メモリー細胞、幹中央メモリー細胞、エフェクターメモリー細胞及び長寿命エフェクターメモリー細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、細胞には、免疫抑制細胞、例えば制御性T細胞（Treg）、直接的に免疫抑制性となるように修飾されている非Treg（例えば、IL-10又はTGF-βの分泌によるもの）、及び間接的に免疫抑制性となるように修飾されている非Treg（例えば、抗原提示細胞（APC）を殺す細胞傷害性Tリンパ球（CTL））が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、細胞には、樹状細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、免疫調節マクロファージ、間葉系幹細胞、多能性成体前駆細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胸腺前駆細胞、免疫制御性B細胞、免疫制御性NK細胞、免疫制御性単球、ベトー細胞、自然リンパ球系細胞、インバリアントナチュラルキラー（NK）T細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、細胞には、造血細胞及びその前駆細胞が含まれる。幾つかの実施形態においては、細胞には、本明細書に記載されているとおりに修飾されたエフェクターT細胞が含まれる。幾つかの実施形態においては、細胞は、前記細胞型のいずれかのインビトロ由来、多能性幹細胞由来細胞である。
【０１４４】
幾つかの実施形態においては、標的化遺伝子（例えば、NR3C1）の遺伝的破壊を含む細胞の割合は、遺伝的破壊を含有しない対応又は参照の集団又は組成物と同じ又は実質的に同じ不活化長寿命記憶又は中央記憶表現型を示す。幾つかの実施形態においては、そのような特性、活性又は表現型は、インビトロアッセイにおいて、例えば細胞の免疫抑制活性をアッセイすることにより測定されうる。幾つかの実施形態においては、評価される活性、特性又は表現型のいずれかは、物質のエレクトロポレーション又は他の導入の後の種々の日において、例えば3、4、5、6、7日後又はそれらの日まで評価されうる。幾つかの実施形態においては、そのような活性、特性又は表現型は、同じ条件下で比較された場合、標的化遺伝子の遺伝子破壊を含まない細胞を含有する対応組成物の活性と比較して、組成物中の細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%又は100%により保持される。
【０１４５】
本明細書中で用いる「対応組成物」又は「細胞の対応集団（対応細胞集団）」（「参照組成物」又は「細胞の参照集団（対応細胞集団）」とも称される）は、細胞又は細胞集団が前記物質と共には導入されなかったこと以外は同じ又は実質的に同じ条件下で得られ、単離され、作製され、生成され、及び／又はインキュベートされた細胞（例えば、Treg、Teff）を意味する。幾つかの態様においては、前記物質の導入を含まないこと以外は、そのような細胞は、前記物質と共に導入された細胞と同じ又は実質的に同じように処理され、その結果、抑制性分子のアップレギュレーション又は発現を含む、細胞の活性又は特性に影響を及ぼしうる任意の1以上の条件は、前記物質の導入以外では、細胞の間で変動せず、又は実質的に変動しない。
【０１４６】
細胞マーカー（例えば、Tregマーカー）の発現及び／又はレベルを評価するための方法及び技術は、当技術分野で公知である。そのようなマーカーの検出のための抗体及び試薬は、当技術分野でよく知られており、容易に入手可能である。そのようなマーカーを検出するためのアッセイ及び方法には、フローサイトメトリー、例えば細胞内フローサイトメトリー、ELISA、ELISPOT、細胞数測定ビーズアレイ又は他の多重方法、ウエスタンブロット及び他の免疫親和性に基づく方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、修飾細胞を、そのような細胞に特有のマーカーの発現に関するフローサイトメトリー又は他の免疫親和性に基づく方法により検出することが可能であり、ついでそのような細胞を別のマーカーに関して共染色することが可能である。
【０１４７】
幾つかの実施形態においては、細胞、組成物及び方法は、養子移入される造血細胞又はその前駆細胞（例えば、Treg、Teff）における標的遺伝子の発現の喪失（欠失）、ノックアウト、破壊又は低減をもたらす。幾つかの実施形態においては、方法は、エクスビボで、初代細胞、例えば対象からの初代造血細胞又はその前駆細胞（例えば、Treg、Teff）に対して実施される。幾つかの態様においては、そのような細胞を産生又は生成する方法は、標的化される内因性遺伝子（例えば、NR3C1）をコードする遺伝子を破壊しうる1以上の物質を細胞内に導入すること、及びカルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を細胞内に導入することを含む。本明細書中で用いる「導入（introducig）」なる語は、インビトロ又はインビボのいずれかで、DNAを細胞内に導入する種々の方法を含み、そのような方法は形質転換、形質導入、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション）及び感染を含む。導入がエレクトロポレーションを伴う場合、ポリヌクレオチド（例えば、プラスミド、一本鎖DNA、小環状DNA）がエレクトロポレーションされうる。ベクターは、DNAコード分子を細胞内に導入するのに有用である。可能なベクターには、プラスミドベクター及びウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又は他のベクター、例えばアデノウイルスベクター若しくはアデノ随伴ベクターが含まれる。
【０１４８】
細胞の集団は、対象から得られた細胞、例えば末梢血単核細胞（PBMC）サンプル、臍帯血サンプル、未分画T細胞サンプル、リンパ球サンプル、白血球サンプル、アフェレーシス産物又は白血球アフェレーシス産物から得られた細胞でありうる。
【０１４９】
幾つかの実施形態においては、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子をコードする核酸を導入する工程、及び物質（例えば、Cas/gRNA RNP）を導入する工程は、同時に、又は任意の順序で連続的に行われうる。幾つかの実施形態においては、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子及び1以上の遺伝子編集物質（例えば、Cas/gRNA RNP）の導入の後、細胞の増加及び／又は増殖を刺激する条件下、細胞を培養又はインキュベートする。
【０１５０】
したがって、養子細胞療法におけるTregのような細胞の機能を増強する細胞、組成物及び方法（改善された効力をもたらすものを含む）を提供し、これらは、例えば、投与される修飾細胞の活性及び効力を増強する一方で、導入細胞に対する曝露又は持続性を経時的に維持することにより、あるいは、投与される修飾細胞の持続性及び／又は生存を増強することによりもたらされる。幾つかの実施形態においては、修飾細胞は、対象にインビボで投与された場合に、ある利用可能な方法と比較して増強した増殖及び／又は持続性を示す。幾つかの実施形態においては、提供される細胞は、対象にインビボで投与された場合に、持続性の増強を示す。幾つかの実施形態においては、内因性遺伝子（例えば、NR3C1）をコードする遺伝子の発現を低減する又はその遺伝子を破壊する物質と共には細胞が導入されない方法により遺伝的に操作された細胞の投与を含む方法のような別の方法により達成されるものと比較して、投与時の対象における修飾細胞の持続性が優れている。幾つかの実施形態においては、持続性は、少なくとも約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上増強される。
【０１５１】
幾つかの実施形態においては、投与された細胞の持続性の程度又は度合は対象への投与後に検出又は定量されうる。例えば、幾つかの実施形態においては、対象の血液又は血清又は器官又は組織（例えば、疾患部位）における修飾細胞の量を評価するために、定量的PCR（qPCR）を使用する。幾つかの実施形態においては、DNAの1マイクログラム当たりの、例えばカルシニューリンインヒビター耐性遺伝子をコードするDNA若しくはプラスミドのコピー数として、あるいは例えば血液若しくは血清のサンプルの1マイクロリットル当たりの、又はサンプルの1マイクロリットル当たりの末梢血単核細胞（PBMC）若しくは白血球若しくはTregの総数当たりのCNI耐性遺伝子発現細胞の数として、持続性を定量する。幾つかの実施形態においては、例えばカルシニューリンインヒビター耐性遺伝子コード化タンパク質に特異的な抗体を一般的に使用して細胞を検出するフローサイトメトリーアッセイも実施されうる。機能性細胞の数又は割合を検出するために、細胞に基づくアッセイも使用されうる。
【０１５２】
本開示は、本発明のカルシニューリンインヒビター耐性修飾細胞（例えば、Treg）を産生又は生成する方法を提供する。細胞は、一般に、外因性カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子産物をコードする1以上の遺伝的に操作された核酸を導入することにより操作される。幾つかの実施形態においては、細胞はまた、標的化遺伝子（例えば、NR3C1）を破壊しうる物質（例えば、Cas9/gRNA RNP）の存在下、外因性CNI耐性遺伝子産物をコードする核酸と共に同時又は連続的に導入される。
【０１５３】
幾つかの実施形態においては、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子（例えば、カルシニューリン変異体をコードするもの）は相同組換え修復（homology directed repair）（HDR）によりゲノム内に挿入される。本明細書中で用いる「相同組換え修復」又は「HDR」は、細胞内の二本鎖DNA切断を修復するメカニズムである。HDRは一般に相同組換えプロセスに基づくものであり、それにより、二本鎖DNA切断を修復するために一連の核酸配列相同性が利用される。HDR中に、核酸ドナーの相同配列鎖が切断DNAの切除部分に侵入し、又は前記部分にハイブリダイズする。DNAポリメラーゼは、切除DNAをプライマーとして使用し、侵入したドナーの配列を鋳型として使用して、切断したDNAを伸長させる。伸長及び切断修復の後、切断部位における新たな配列は、修復プロセスにおいて使用された核酸ドナーに存在していたあらゆる配列を有する。HDRのプロセスはJasinら（Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013 Nov; 5(11): a012740）（それを参照により本明細書に組み入れることとする）に更に詳細に記載されている。
【０１５４】
幾つかの実施形態においては、宿主細胞（例えば、特定の対立遺伝子において複合ヘテロ接合である相同染色体）の相同標的核酸における特定のヌクレオチド位置でのゲノム操作を可能にするために、核酸ドナー鋳型（例えば、CNI耐性遺伝子の挿入のためのもの）は遺伝子編集複合体（例えば、CRISPR/Cas系）と共に使用されうる。幾つかの態様においては、本開示は、標的化遺伝子編集のための方法を提供し、方法は、組換え遺伝子編集複合体が染色体の標的部位に遺伝的病変（例えば、ニック又は二本鎖切断）を誘発し、本発明のドナー鋳型が修復メカニズム（例えば、HDR）を機能させ、それにより、病変を修復する条件下、組換え遺伝子編集複合体の、少なくとも1つの成分を、核酸ドナー鋳型と共に細胞（例えば、疾患対象の細胞）に送達することを含む。
【０１５５】
ある実施形態においては、核酸ドナー鋳型（本明細書においては外因性ドナーDNA配列とも称される）は、相同組換えによるNR3C1遺伝子座内へのカルシニューリンインヒビター耐性遺伝子（例えば、突然変異／変異カルシニューリン遺伝子）の挿入を促進させる。したがって、ある実施形態においては、突然変異カルシニューリン遺伝子は、配列番号11に示される核酸配列を含む外因性ドナーDNA配列を使用する相同組換えにより、NR3C1遺伝子座内に挿入される。外因性ドナーDNA配列の概要図が本明細書における図15に示されている。
【０１５６】
幾つかの実施形態においては、ドナーDNA配列は、転写制御要素、例えばMNDプロモーター、CMBプロモーター、EF-1アルファプロモーター、PGKプロモーター（これらに限定されるものではない）を含みうる。幾つかの実施形態においては、ドナーDNA配列は、レポーター分子、例えば蛍光マーカー（例えば、GFP）、上皮増殖因子受容体（EGFR）、神経成長因子受容体（NGFR）、誘導性カスパーゼ（これらに限定されるものではない）を含みうる。ドナーDNA配列が第1挿入要素（例えば、CNI耐性遺伝子）と第2要素（例えば、レポーター分子）との両方を含む場合には、協調的発現が望まれうる。1以上の遺伝子の協調的発現の種々の方法が当技術分野で公知である。幾つかの実施形態においては、第1挿入要素（例えば、CNI耐性遺伝子）と第2挿入要素（例えば、GFP）とはリンカーにより隔てられている。本開示において使用されるリンカーは、複数のタンパク質が同一核酸配列（例えば、マルチシストロン又はバイシストロン配列）によりコードされることを可能にし、これらは、別々のタンパク質成分へと分離されるポリタンパク質として翻訳される。例えば、CNI耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを含む本開示のドナー核酸において使用されるリンカーは、CNI耐性遺伝子産物及びレポーター遺伝子産物が、別々のCNI耐性遺伝子産物及びレポーター遺伝子産物成分へと分離されるポリタンパク質として翻訳されることを可能にする。
【０１５７】
幾つかの実施形態においては、リンカーは、内部リボソーム進入部位（IRES）をコードする核酸配列を含む。本明細書中で用いる「内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site）」又は「IRES」は、タンパク質コード領域の開始コドン（例えば、ATG）への直接的な内部リボソーム進入を促進させ、それにより、遺伝子のキャップ非依存性翻訳をもたらす要素（element）を意味する。種々の内部リボソーム進入部位が当業者に公知であり、それらには、ウイルス起源又は細胞mRNA起源から入手可能なIRES、例えば免疫グロブリン重鎖結合タンパク質又は結合免疫グロブリンタンパク質（BiP）；血管内皮増殖因子（VEGF）；線維芽細胞増殖因子2；インスリン様増殖因子；翻訳開始因子eIF4G；酵母転写因子TFIID及びdHAP4；並びに例えばカルジオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、HCV、フレンドマウス白血病ウイルス（FrMLV）及びモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）から入手可能なIRESが含まれるが、これらに限定されるものではない。当業者は、本発明で使用するための適切なIRESを選択しうるであろう。
【０１５８】
幾つかの実施形態においては、リンカーは、自己切断ペプチドをコードする核酸配列を含む。本明細書中で用いる「自己切断ペプチド」又は「2Aペプチド」は、翻訳に際して、複数の構成タンパク質へと分離するポリタンパク質として、複数のタンパク質がコードされることを可能にするオリゴペプチドを意味する。「自己切断」なる語の使用は、タンパク質分解切断反応を意味することを意図したものではない。種々の自己切断又は2Aペプチドが当業者に公知であり、それらには、ピコルナウイルス科のメンバー、例えば口蹄疫ウイルス（FMDV）、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV）、ゾーシーアシグナ（Thosea asigna）ウイルス（TaV）及びブタテッショウウイルス-1（PTV-1）、並びにカリオウイルス（cariovirus）、例えばタイロウイルス及び脳心筋炎ウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。FMDV、ERAV、PTV-1及びTaVに由来する2Aペプチドは本明細書においてはそれぞれ「F2A」、「E2A」、「P2A」及び「T2A」と称される。当業者は、本発明で使用される適切な自己切断ペプチドを選択しうるであろう。
【０１５９】
幾つかの実施形態においては、リンカーは、フューリン（furin）切断部位をコードする核酸配列を更に含む。フューリンは遍在的発現プロテアーゼであり、トランスゴルジに存在し、タンパク質前駆体をそれらの分泌前にプロセシングする。フューリンはそのコンセンサス認識配列のCOOH末端において切断する。種々のフューリンコンセンサス認識配列（又は「フューリン切断部位」）が当業者に公知であり、それらには、Arg-X-Lys-Arg（配列番号12）又はArg-X-Arg-Arg（配列番号13）、X1-Arg-X-X1-Arg（配列番号14）及びArg-X-X-Arg（配列番号15）（ここで、Xは、天然に存在する任意のアミノ酸であり、X1はArg又はLysである）、例えばArg-Gln-Lys-Arg（配列番号16）が含まれるが、これらに限定されるものではない。当業者は、本発明で使用される適切なフューリン切断部位を選択しうるであろう。
【０１６０】
本明細書中で用いる「核酸ドナー」又は「核酸ドナー鋳型」又は「ドナー鋳型」又は「ドナー配列」又は「ドナー」又は「核酸インサート」又は「インサート」なる語は、修復メカニズム（例えば、相同組換え修復（HDR））における修復鋳型として使用されうる任意の核酸配列、例えばデオキシリボ核酸を意味する。核酸ドナーは二本鎖又は一本鎖、例えば二本鎖DNA（dsDNA）又は一本鎖DNA（ssDNA）でありうる。本開示の核酸ドナーは、種々の長さのポリヌクレオチドを含みうる。ある実施形態においては、核酸ドナーは約100ヌクレオチド長未満、約100ヌクレオチド長、約200ヌクレオチド長、約300ヌクレオチド長、約400ヌクレオチド長、約500ヌクレオチド長、約600ヌクレオチド長、約700ヌクレオチド長、約800ヌクレオチド長、約900ヌクレオチド長、約1000ヌクレオチド長又は約1000ヌクレオチド長以上でありうる。200ヌクレオチド長以下の核酸ドナーは、「短い」核酸ドナーとも称されうる。ある実施形態においては、核酸ドナーは一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ssODN）である。細胞のゲノム内に挿入される核酸ドナーは、当業者が必要とする任意のヌクレオチド長でありうる。何ら限定的なものではないが、例えば、ヌクレオチド部分は単一ヌクレオチドと同程度の短さのもの、又は10キロベースを超えるものでありうる。
【０１６１】
幾つかの実施形態においては、本開示の核酸ドナーは、細胞のゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列、例えば、細胞のゲノム内に挿入される外因性配列を含む。外因性配列は遺伝子（例えば、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子）を含みうる。遺伝子は、タンパク質、例えば治療用タンパク質又は選択的マーカータンパク質（例えば、カルシニューリン変異体）をコードしうる。ある実施形態においては、選択的マーカーは、細胞増殖を低減する又は細胞死を引き起こす物質に対する耐性を付与する選択的マーカータンパク質をコードしうる。そのような物質の例には、アンピシリン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ネオマイシン、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、テトラサイクリン及びゼオシンが含まれるが、これらに限定されるものではない。他の実施形態においては、選択的マーカーは蛍光又は発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ又はGFP）をコードしうる。遺伝子は、遺伝子が挿入される細胞と同じ種の生物に由来しうる。遺伝子は、遺伝子が挿入される細胞と異なる種の生物に由来しうる。遺伝子は、複数の種の配列を含むキメラ配列でありうる。核酸ドナーは、非コードRNAをコードする配列を含みうる。非コードRNAの例には、トランスファーRNA（tRNA）、リボソームRNA（rRNA）、小型RNA、例えばsiRNA、miRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、エキソソームRNA（exRNA）が含まれるが、これらに限定されるものではない。核酸ドナーは、発現されない配列を含みうる。核酸ドナーは、細胞内の内因性遺伝子の発現を低減又は排除する配列を含みうる。
【０１６２】
HDR媒介性遺伝子編集の場合、本開示の核酸ドナーは、更に、5'末端及び3'末端における相同性アーム、例えば第1相同性アーム及び第2相同性アームを含む。相同性アームは、HDRをもたらす細胞のゲノム内の標的部位と十分な相同性を共有する核酸配列である。各相同性アームは種々の長さのポリヌクレオチドを含みうる。相同性アームの核酸配列は、前記のとおり、既存核酸ドナー配列の伸長である、と当業者に理解されるであろう。
【０１６３】
ある実施形態においては、第1相同性アームは約20ヌクレオチド長〜約1000ヌクレオチド長でありうる。ある実施形態においては、第1相同性アームは約20ヌクレオチド長未満、約20ヌクレオチド長、約30ヌクレオチド長、約40ヌクレオチド長、約50ヌクレオチド長、約60ヌクレオチド長、約70ヌクレオチド長、約80ヌクレオチド長、約90ヌクレオチド長、約100ヌクレオチド長、約200ヌクレオチド長、約300ヌクレオチド長、約400ヌクレオチド長、約500ヌクレオチド長、約600ヌクレオチド長、約700ヌクレオチド長、約800ヌクレオチド長、約900ヌクレオチド長、約1000ヌクレオチド長又は約1000ヌクレオチド長以上でありうる。
【０１６４】
ある実施形態においては、第2相同性アームは約20ヌクレオチド長〜約1000ヌクレオチド長でありうる。ある実施形態においては、第2相同性アームは約20ヌクレオチド長未満、約20ヌクレオチド長、約30ヌクレオチド長、約40ヌクレオチド長、約50ヌクレオチド長、約60ヌクレオチド長、約70ヌクレオチド長、約80ヌクレオチド長、約90ヌクレオチド長、約100ヌクレオチド長、約200ヌクレオチド長、約300ヌクレオチド長、約400ヌクレオチド長、約500ヌクレオチド長、約600ヌクレオチド長、約700ヌクレオチド長、約800ヌクレオチド長、約900ヌクレオチド長、約1000ヌクレオチド長又は約1000ヌクレオチド長以上でありうる。
【０１６５】
ある実施形態においては、核酸ドナーの第1相同性アームと第2相同性アームとは、異なる長さのヌクレオチドを含みうる。何ら限定的ではない例示目的の一例としては、核酸ドナーの5'末端の相同性アーム（第1相同性アーム）は100ヌクレオチド長であることが可能であり、核酸ドナーの3'末端の相同性アーム（第2相同性アーム）は150ヌクレオチド長であることが可能である。
【０１６６】
幾つかの実施形態においては、カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子（例えば、カルシニューリン変異体をコードするもの）は、発現ベクターにより細胞内に導入される。本明細書では、本発明のカルシニューリン変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクターが提供される。適切な発現ベクターには、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、アデノウイルスベクター、操作されたハイブリッドウイルス、裸DNA、例えばトランスポゾン媒介性ベクター、例えばスリーピング・ビューティー（Sleeping Beauty）、ピギーバック（Piggybac）及びインテグラーゼ（Integrase）、例えばPhi31が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの他の適切な発現ベクターには、単純ヘルペスウイルス（HSV）及びレトロウイルス発現ベクターが含まれる。
【０１６７】
アデノウイルス発現ベクターはアデノウイルスに基づいており、ゲノムDNA内への組み込み能力は低いが、宿主細胞へのトランスフェクション効率は高い。アデノウイルス発現ベクターは、（a）発現ベクターのパッケージングを支持するのに十分な、及び（b）最終的に宿主細胞内でカルシニューリン変異体を発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有する。幾つかの実施形態においては、アデノウイルスゲノムは36kbの線状二本鎖DNAであり、ここで、本発明の発現ベクターを作製するためにアデノウイルスDNAの大きな断片を置換するために外来DNA配列（例えば、カルシニューリン変異体をコードする核酸）が挿入されうる（例えば、Danthinne及びImperiale, Gene Therapy (2000) 7(20): 1707-1714を参照されたい）。
【０１６８】
他の発現ベクターは、アデノウイルス共役（adenovirus coupled）系を利用するアデノ随伴ウイルスに基づいている。このAAV発現ベクターは、宿主ゲノム内への高い組み込み頻度を有する。それは非分裂細胞に感染可能であるため、例えば組織培養又はインビボでの哺乳類細胞内への遺伝子の送達に有用である。AAVベクターは広い感染宿主域を有する。種々のAAVベクターが当技術分野で公知であり、それらには、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9又はAAVrh10に由来するものが含まれるが、これらに限定されるものではない。AAVベクターの生成及び使用に関する詳細は米国特許第5,139,941号及び第4,797,368号に記載されている。
【０１６９】
レトロウイルス発現ベクターは宿主ゲノム内に組み込まれることが可能であり、大量の外来遺伝物質を送達することが可能であり、広範囲の種及び細胞型に感染することが可能であり、特別な細胞系においてパッケージングされることが可能である。レトロウイルスベクターは、複製欠損型のウイルスを得るために特定の位置においてウイルスゲノム内に核酸（例えば、カルシニューリン変異体をコードする核酸）を挿入することにより構築される。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞型に感染しうるが、カルシニューリン変異体の組み込み及び安定な発現は宿主細胞の分裂を要する。
【０１７０】
レンチウイルスベクターはレンチウイルスに由来し、一般的なレトロウイルス遺伝子gag、pol及びenvに加えて、調節機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含有する複雑なレトロウイルスである（例えば、米国特許第6,013,516号及び第5,994,136号を参照されたい）。レンチウイルスの幾つかの例には、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1、HIV-2）及びサル免疫不全ウイルス（SIV）が含まれる。レンチウイルスベクターは、HIV病原性遺伝子を多重に弱毒化することにより生成されており、例えば、env、vif、vpr、vpu及びnef遺伝子を欠失させて、ベクターを生物学的に安全なものにする。レンチウイルスベクターは非分裂細胞に感染可能であり、例えば、カルシニューリン変異体をコードする核酸のインビボ及びエクスビボの両方の遺伝子導入及び発現に使用されうる（例えば、米国特許第5,994,136号を参照されたい）。
【０１７１】
本開示の核酸を含む発現ベクターは、当業者に公知の任意の手段により宿主細胞内に導入されうる。発現ベクターは、所望により、トランスフェクションのためのウイルス配列を含みうる。あるいは、発現ベクターは、融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどにより導入されうる。発現ベクターの導入の前に、宿主細胞を培養内で成長させ、増殖させることが可能であり、ついでベクターの導入及び組み込みのための適切な処理を行うことが可能である。ついで、宿主細胞を増殖させ、ベクター内に存在するマーカーによりスクリーニングすることが可能である。使用されうる種々のマーカーが当技術分野で公知であり、hprt、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などを含みうる。本明細書中で用いる「細胞」、「細胞株（cell line）」及び「細胞培養（cell culture）」なる語は、互換的に用いられうる。幾つかの実施形態においては、宿主細胞は、造血細胞又はその前駆体、例えばTreg、T細胞、NK細胞、又はNKT細胞である。
【０１７２】
本発明はまた、本開示のカルシニューリン変異体を含み、安定に発現する遺伝的に操作された細胞を提供する。幾つかの実施形態においては、遺伝的に操作された細胞は、治療的に重要な結果をもたらす遺伝的に操作された制御性T細胞（Treg）、Tリンパ球（T細胞）、ナイーブT細胞（TN）、メモリーT細胞（例えば、中央メモリーT細胞（TCM）、エフェクターメモリー細胞（TEM））、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）及びマクロファージである。1つの実施形態においては、遺伝的に操作された細胞は自家細胞である。
【０１７３】
修飾細胞（例えば、カルシニューリン変異体を含むもの）は、本開示の核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を安定にトランスフェクトすることにより産生されうる。本開示の修飾細胞を生成するための追加的な方法には、化学的形質転換法（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム及び／又はカチオン性ポリマーを使用するもの）、非化学的形質転換法（例えば、エレクトロポレーション、光学的形質転換、遺伝子エレクトロトランスファー及び／又は流体力学的送達）及び／又は粒子に基づく方法（例えば、遺伝子銃及び／又はマグネトフェクションを使用するインペールフェクション（impalefection））。本開示のカルシニューリン変異体を発現するトランスフェクト化細胞は、エクスビボで増殖されうる。
【０１７４】
発現ベクターを宿主細胞内に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を生成する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Sambrookら (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照されたい。発現ベクターを宿主細胞内に導入するための化学的方法には、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに脂質系、例えば水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームが含まれる。
【０１７５】
使用に適した脂質は、商業的供給源から入手可能である。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）は、Sigma, St. Louis, MOから入手可能であり、リン酸ジセチル（「DCP」）はK & K Laboratories (Plainview, NY)から入手可能であり、コレステロール（「Choi」）はCalbiochem-Behringから入手可能であり、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）及び他の脂質はAvanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)から入手可能である。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約-20℃で保存できる。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用されうる。「リポソーム」は、封入脂質二重層又は凝集体の生成により形成される種々の単層脂質ビヒクル及び多層脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体とを含有する小胞構造を有するものとして特徴づけられる。多層リポソームは、水性媒体により分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されると自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再配列し、脂質二重層の間に水及び溶解溶質を封入する（Ghoshら, 1991 Glycobiology 5: 505-10）。通常の小胞構造とは溶液中で異なる構造を有する組成物も含まれる。例えば、脂質はミセル構造をとることが可能であり、又は単に脂質分子の不均一凝集体として存在しうる。また、リポフェクタミン-核酸複合体も想定される。
【０１７６】
外因性核酸を宿主細胞内に導入する又は細胞を本発明のインヒビターに曝露するのに使用される方法とは無関係に、宿主細胞における核酸の存在を確認するために、種々のアッセイが行われうる。そのようなアッセイには、当業者によく知られた分子生物学的アッセイ、例えばサザンブロット法及びノーザンブロット法、RT-PCR及びPCR；生化学的アッセイ、例えば、特定のペプチドの存在又は不存在を、例えば免疫学的手段（ELISA及びウエスタンブロット）により、又は本発明の範囲に含まれる物質を特定するための本明細書に記載されているアッセイにより検出することが含まれる。
【０１７７】
ある実施形態においては、宿主細胞内に導入される核酸はRNAである。他の実施形態においては、RNAは、インビトロで転写されたRNA又は合成RNAを含むmRNAである。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で生成された鋳型を使用する、インビトロ転写により生成されうる。適切なプライマー及びRNAポリメラーゼを使用して、任意の供給源からの目的のDNAがインビトロmRNA合成用の鋳型へとPCRにより直接的に変換されうる。DNAの供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列又は任意の他の適切なDNA源でありうる。
【０１７８】
PCRを使用して、mRNAのインビトロ転写用の鋳型を生成し、ついでそれを細胞内に導入することが可能である。PCRを行うための方法は当技術分野でよく知られている。PCRにおいて使用されるプライマーは、PCRの鋳型として使用されるDNAの領域に、実質的に相補的な領域を有するように設計される。本明細書中で用いる「実質的に相補的」は、プライマー配列中の塩基の大部分又は全てが相補的である、ヌクレオチドの配列に関するものである。実質的に相補的な配列は、PCRに使用されるアニーリング条件下、意図されるDNA標的にアニーリング又はハイブリダイズしうる。プライマーは、DNA鋳型の任意の部分に実質的に相補的となるように設計できる。例えば、プライマーは、5'及び3'UTRを含む、細胞内で通常転写される遺伝子の部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計できる。プライマーはまた、目的の特定のドメインをコードする遺伝子の部分を増幅するように設計されうる。ある実施形態においては、プライマーは、5'及び3' UTRの全部又は一部を含むヒトcDNAのコード領域を増幅するように設計される。PCRに有用なプライマーは、当技術分野でよく知られている合成方法により生成される。「フォワードプライマー」は、増幅されるDNA配列の上流にあるDNA鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「上流」は、本明細書においては、コード鎖に対して増幅されるDNA配列の5'側の位置を意味するものとして用いられる。「リバースプライマー」は、増幅されるDNA配列の下流にある二本鎖DNA鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「下流」は、本明細書においては、コード鎖に対して増幅されるDNA配列の3'側の位置を意味するものとして用いられる。
【０１７９】
RNAの安定性及び／又は翻訳効率を向上させる能力を有する化学構造も使用されうる。RNAは、好ましくは、5'及び3'UTRを有する。1つの実施形態においては、5'UTRは0〜3000ヌクレオチド長である。コード領域に付加される5'及び3'UTR配列の長さは、種々の方法により改変可能であり、そのような方法は、異なるUTR領域にアニーリングするPCR用プライマーの設計を含むが、これに限定されるものではない。このアプローチを用いて、当業者は、転写RNAのトランスフェクションの後で最適な翻訳効率を達成するのに必要な5'及び3'UTRの長さを修飾しうる。
【０１８０】
5'及び3'UTRは、目的遺伝子のための、天然に存在する内因性5'及び3'UTRでありうる。あるいは、フォワードプライマー及びリバースプライマー内にUTR配列を組み込むことにより、又は鋳型の任意の他の修飾により、目的遺伝子にとって内因性ではないUTR配列が付加されうる。目的遺伝子にとって内因性ではないUTR配列の使用は、RNAの安定性及び／又は翻訳効率を改変するのに有用でありうる。例えば、3'UTR配列における、AUリッチ要素は、mRNAの安定性を低下させうることが公知である。したがって、当技術分野でよく知られたUTRの特性に基づいて、転写RNAの安定性を増強するように、3'UTPが選択又は設計されうる。
【０１８１】
ある実施形態においては、5'UTRは内因性遺伝子のコザック配列を含有しうる。あるいは、目的遺伝子にとって内因性ではない5'UTRが、前記のとおりにPCRにより付加された場合、コンセンサスコザック配列は、5'UTR配列を付加することにより再設計されうる。コザック配列は幾つかのRNA転写産物の翻訳効率を増加させうるが、効率的な翻訳のために、必ずしも全てのRNAが必要ではない。多数のmRNAに関するコザック配列の要件が当技術分野で公知である。他の実施形態においては、5'UTRは、細胞内でRNAゲノムが安定しているRNAウイルスに由来しうる。他の実施形態においては、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、種々のヌクレオチド類似体が3'又は5'UTRにおいて使用されうる。
【０１８２】
遺伝子クローニングを必要とすることなくDNA鋳型からRNAへの合成を可能にするためには、転写される配列の上流のDNA鋳型に転写プロモーターが結合されるべきである。RNAポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの5'末端に付加されると、RNAポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のPCR産物に組み込まれる。ある実施形態においては、プロモーターは、本明細書に記載されているとおり、T7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、T3及びSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。T7、T3及びSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当技術分野で公知である。
【０１８３】
1つの実施形態においては、mRNAは、5'末端のキャップと、細胞内のリボソーム結合、翻訳の開始及びmRNA安定性を決定する3'ポリ（A）テールとの両方を有する。環状DNA鋳型、例えばプラスミドDNAにおいては、RNAポリメラーゼは、真核細胞における発現に適さない長いコンカテマー産物を産生する。3'UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAの転写は通常サイズのmRNAを与え、それが転写後にポリアデニル化されたとしても、これは真核生物トランスフェクションに有効でない。
【０１８４】
線状DNA鋳型においては、ファージT7 RNAポリメラーゼは、転写産物の3'末端を鋳型の最後の塩基を超えて伸長させうる（Schenborn及びMierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva及びBerzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)）。
【０１８５】
転写DNA鋳型のポリA/Tセグメントは、ポリTテール、例えば100Tテール（サイズは50〜5000 Tでありうる）を含有するリバースプライマーを使用するPCR中に、又はDNA連結若しくはインビトロ組換え（これらに限定されるものではない）を含む任意の他の方法によりPCR後に産生されうる。また、ポリ（A）テールはRNAに安定性を付与し、その分解を低減する。一般に、ポリ（A）テールの長さは転写RNAの安定性と正に相関する。1つの実施形態においては、ポリ（A）テールは100〜5000個のアデノシンである。
【０１８６】
RNAのポリ（A）テールは、ポリAポリメラーゼ、例えば大腸菌ポリAポリメラーゼ（E-PAP）を使用して、インビトロ転写の後で更に伸長されうる。ある実施形態においては、ポリ（A）テールの長さを100ヌクレオチドから300〜400ヌクレオチドに増加させると、RNAの翻訳効率が約2倍増加する。また、3'末端への異なる化学基の結合は、mRNAの安定性を増強しうる。そのような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含有しうる。例えば、ポリ（A）ポリメラーゼを使用して、ポリ（A）テール内にATP類似体が組込まれうる。ATP類似体はRNAの安定性を更に増強しうる。
【０１８７】
5'キャップもRNA分子の安定性をもたらす。好ましい実施形態においては、本明細書に開示されている方法により産生されるRNAは5'キャップを含む。当技術分野で公知であり本明細書に記載されている技術を用いて、5'キャップは提供される（Cougotら, Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinskiら, RNA, 7:1468-95 (2001); Elangoら, Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)）。
【０１８８】
幾つかの実施形態においては、インビトロ転写RNAのように、RNAは細胞内にエレクトロポレーションされる。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤及び界面活性剤のような、細胞の浸透性及び生存性を向上させる因子を含有しうる、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質が配合されうる。
【０１８９】
幾つかの実施形態においては、本開示のカルシニューリン変異体をコードする核酸は、RNA、例えばインビトロ合成RNAである。RNAのインビトロ合成のための方法は当技術分野で公知であり、カルシニューリン変異体をコードする配列を含むRNAを合成するために任意の公知方法が用いられる。RNAを宿主細胞内に導入するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Zhaoら Cancer Res. (2010) 15: 9053を参照されたい。カルシニューリン変異体をコードするヌクレオチド配列を含むRNAの、宿主細胞内への導入は、インビトロ又はエクスビボ又はインビボで行われうる。例えば、宿主細胞（例えば、Treg、NK細胞、細胞傷害性Tリンパ球など）は、カルシニューリン変異体をコードするヌクレオチド配列を含むRNAでインビトロ又はエクスビボでエレクトロポレーションされうる。
【０１９０】
開示されている方法は、標的癌細胞を殺す遺伝的修飾T細胞の能力の評価を含む、癌、幹細胞、急性及び慢性感染症、自己免疫疾患、細胞療法及び遺伝子治療の分野の基礎研究及び治療におけるT細胞活性の調節に適用されうる。
【０１９１】
方法はまた、例えばプロモーター又は投入RNAの量を変化させることにより広範囲にわたって発現レベルを調節することを可能にし、発現レベルを個別に調節することを可能にする。更に、mRNA生成の、PCRに基づく技術は、種々の構造及びそれらのドメインの組合せを有するmRNAの設計を著しく促進させる。
【０１９２】
本発明のRNAトランスフェクション法の1つの利点は、RNAトランスフェクションが本質的に一過性であり、ベクターを使用しないことである。RNA導入遺伝子はリンパ球に送達され、追加的なウイルス配列を要することなく最小発現カセットとして、短時間のインビトロ細胞活性化の後、リンパ球において発現される。これらの条件下、宿主細胞ゲノム内に導入遺伝子が組み込まれる可能性は低い。RNAのトランスフェクションの効率及びリンパ球集団全体を均一に修飾するその能力ゆえに、細胞のクローニングは必要ない。
【０１９３】
インビトロ転写RNA（IVT-RNA）での細胞の遺伝的修飾は、2つの異なる方法を利用し、それらは共に種々の動物モデルにおいて連続的に試験されている。細胞は、リポフェクション又はエレクトロポレーションにより、インビトロ転写RNAでトランスフェクトされる。導入されたIVT-RNAの長期的発現を達成するために、種々の修飾を用いてIVT-RNAを安定化させることが望ましい。
【０１９４】
幾つかのIVTベクターが文献において公知であり、インビトロ転写のための鋳型として標準的方法で使用され、安定化RNA転写産物の産生のために遺伝的に修飾されている。当技術分野で現在用いられている方法は、以下の構造を有するプラスミドベクターに基づいている：RNA転写を可能にする5'RNAポリメラーゼプロモーター、並びにそれに続く目的遺伝子であって、3'側及び／又は5'側で非翻訳領域（UTR）に隣接しているもの、並びに50〜70Aヌクレオチドを含有する3'ポリアデニルカセット。インビトロ転写の前に、環状プラスミドは、ポリアデニルカセットの下流において、II型制限酵素（認識配列は切断部位に対応する）により線状化される。したがって、ポリアデニルカセットは、転写産物において、後のポリ（A）配列に対応する。この操作の結果、幾つかのヌクレオチドは線状化後に酵素切断部位の一部として残り、3'末端においてポリ（A）配列を伸長させ、又は遮蔽する。この非生理学的オーバーハングが、そのような構築物から細胞内で産生されるタンパク質の量に影響を及ぼすかどうかは明らかではない。
【０１９５】
他の態様においては、RNA構築物は、エレクトロポレーションにより細胞に送達される。例えば、US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1に教示されている、哺乳類細胞内への核酸構築物のエレクトロポレーションの形態及び方法を参照されたい。任意の公知細胞型のエレクトロポレーションに必要な電界強度を含む種々のパラメータが関連研究文献並びに当分野の多数の特許及び特許出願において、一般に公知である。例えば、米国特許第6,678,556号、米国特許第7,171,264号及び米国特許第7,173,116号を参照されたい。エレクトロポレーションの治療的適用のための装置は、例えば、MedPulser（商標）DNAエレクトロポレーション治療システム（Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.）として商業的に入手可能であり、米国特許第6,567,694号、米国特許第6,516,223号、米国特許第5,993,434号、米国特許第6,181,964号、米国特許第6,241,701号及び米国特許第6,233,482号のような特許に記載されている。エレクトロポレーションは、例えばUS20070128708A1に記載されているとおり、インビトロでの細胞のトランスフェクションにも使用されうる。エレクトロポレーションは、インビトロで核酸を細胞内に送達するためにも利用されうる。したがって、当業者に公知の多数の利用可能な装置及びエレクトロポレーション系のいずれかを使用する、発現構築物を含む核酸の、細胞内へのエレクトロポレーション媒介性投与は、目的RNAを標的細胞に送達するための刺激的な新たな手段をもたらす。
【０１９６】
幾つかの実施形態においては、細胞（例えば、多能性幹細胞、Treg）は、外因性カルシニューリン変異体をコードする核酸分子及び遺伝子編集物質（例えば、Cas9/gRNA RNP）の導入の前、途中及び／又は後にインキュベート又は培養されうる。幾つかの実施形態においては、細胞（例えば、多能性幹細胞、Treg）は、外因性受容体をコードする核酸分子の導入の前、途中又は後、例えば、外因性受容体をコードするウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）での細胞の形質導入の前、途中又は後にインキュベート又は培養されうる。幾つかの実施形態においては、細胞（例えば、T細胞）は、遺伝子編集物質（例えば、Cas9/gRNA RNP）の導入の前、途中又は後、例えば、物質と細胞との接触の前、途中又は後、あるいは例えばエレクトロポレーションによる、細胞内への物質の送達の前、途中又は後にインキュベート又は培養されうる。幾つかの実施形態においては、インキュベーションは、外因性受容体をコードする核酸分子の導入、及び遺伝子編集物質、例えばCas9/gRNA RNPの導入の両方に関連して行われうる。
【０１９７】
幾つかの実施形態においては、遺伝子編集物質、例えば、Cas9/gRNA RNPの導入は、カルシニューリン変異体をコードする核酸分子の導入の後に行われる。幾つかの実施形態においては、物質の導入の前に、例えば任意の刺激剤又は活性化剤の除去により、細胞は休止される。幾つかの実施形態においては、物質の導入の前に、刺激剤又は活性化剤及び／又はサイトカインは除去されない。当業者は、前記の1以上の核酸配列のそれぞれが宿主細胞内に導入される順序を決定しうるであろう。
【０１９８】
したがって、修飾造血細胞又はその前駆細胞を生成する方法を提供し、前記方法は、NR3C1のエクソン2にインデルを生じさせるCRISPR系を細胞内に導入することを含み、ここで、インデルはNR3C1の遺伝子発現をダウンレギュレートしうる。例示的な実施形態においては、方法は、外因性カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子を細胞のゲノム内に挿入することを更に含み、挿入はインデルNR3C1の部位で生じる。
【０１９９】
D．核酸及び発現ベクター
本開示は、外因性カルシニューリン変異体をコードする核酸を提供する。幾つかの実施形態においては、本開示の核酸は、転写制御要素、例えばプロモーター及びエンハンサーなどに機能的に連結されうる。適切なプロモーター及びエンハンサー要素は当業者に公知である。
【０２００】
細菌細胞における発現の場合、適切なプロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダP及びtrcが含まれるが、これらに限定されるものではない。真核細胞における発現の場合、適切なプロモーターには、軽鎖及び／又は重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサー要素、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期SV40プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復配列に存在するプロモーター、マウスメタロチオネイン-Iプロモーター、及び当技術分野で公知の種々の組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。可逆的誘導性プロモーターを含む適切な可逆的プロモーターは当技術分野で公知である。そのような可逆的プロモーターは真核生物及び原核生物のような多数の生物から単離され、誘導されうる。第2の生物における使用のための第1の生物（例えば、第1の原核生物及び第2の真核生物、第1の真核生物及び第2の原核生物など）から誘導された可逆的プロモーターの修飾は当技術分野でよく知られている。そのような可逆的プロモーター、及びそのような可逆的プロモーターに基づくが追加的な制御タンパク質も含む系には、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼI（alcA）遺伝子プロモーター、アルコールトランスアクチベータータンパク質（A1cR）に応答するプロモーターなど））、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、TetActivAtors、TetON、TetOFFなどを含むプロモーター系）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラット糖質コルチコイド受容体プロモーター系、ヒトエストロゲン受容体プロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系など）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター系など）、病因関連調節プロモーター（例えば、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節プロモーターなど）、温度調節プロモーター（例えば、熱ショック誘導性プロモーター（例えば、HSP-70、HSP-90、ダイズ熱ショックプロモーターなど））、光調節プロモーター、合成誘導性プロモーターなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０１】
幾つかの実施形態においては、プロモーターは、CD8細胞特異的プロモーター、CD4細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター又はNK特異的プロモーターである。例えば、CD4遺伝子プロモーターが使用されうる。例えば、Salmonら Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:7739; 及びMarodonら (2003) Blood 101:3416を参照されたい。他の例としては、CD8遺伝子プロモーターが使用されうる。NK細胞特異的発現はNcrI（p46）プロモーターの使用により達成されうる。例えば、Eckelhartら Blood (2011) 117:1565を参照されたい。
【０２０２】
酵母細胞における発現の場合、適切なプロモーターは、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター、ENOプロモーター、PYK1プロモーターなどのような構成的プロモーター、又はGAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ADH2プロモーター、PHOSプロモーター、CUP1プロモーター、GALTプロモーター、MET25プロモーター、MET3プロモーター、CYC1プロモーター、HIS3プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、ADC1プロモーター、TRP1プロモーター、URA3プロモーター、LEU2プロモーター、ENOプロモーター、TP1プロモーター及びAOX1（例えば、ピキア（Pichia）において使用するためのもの）のような調節可能なプロモーターである。適切なベクター及びプロモーターの選択は、当技術分野における通常の技術水準の範囲内である。原核宿主細胞における使用のための適切なプロモーターには以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター；trpプロモーター；lacオペロンプロモーター；ハイブリッドプロモーター、例えばlac/tacハイブリッドプロモーター、tac/trcハイブリッドプロモーター、trp/lacプロモーター、T7/lacプロモーター；trcプロモーター；tacプロモーターなど；araBADプロモーター；インビボ調節プロモーター、例えばssaGプロモーター又は関連プロモーター（例えば、米国特許公開第20040131637号を参照されたい）、pagCプロモーター（Pulkkinen及びMiller, J. Bacteriol. (1991) 173(1): 86-93; Alpuche-Arandaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89(21): 10079-83）、nirBプロモーター（Harborneら Mol. Micro. (1992) 6:2805-2813）など（例えば、Dunstanら, Infect. Immun. (1999) 67:5133-5141; McKelvieら, Vaccine (2004) 22:3243-3255; 及びChatfieldら, Biotechnol. (1992) 10:888-892を参照されたい）；sigma70プロモーター、例えば、コンセンサスsigma70プロモーター（例えば、GenBankアクセッション番号AX798980、AX798961及びAX798183を参照されたい）；静止期プロモーター、例えばdpsプロモーター、spvプロモーターなど；病原性島SPI-2に由来するプロモーター（例えば、WO96/17951を参照されたい）；actAプロモーター（例えば、Shetron-Ramaら, Infect. Immun. (2002) 70:1087-1096を参照されたい）；rpsMプロモーター（例えば、Valdivia及びFalkow Mol. Microbiol. (1996). 22:367を参照されたい）；tetプロモーター（例えば、Hillen, W.及びWissmann, A. (1989) In Saenger, W.及びHeinemann, U. (編), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein--Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162を参照されたい）；SP6プロモーター（例えば、Meltonら, Nucl. Acids Res. (1984) 12:7035を参照されたい）など。大腸菌（Escherichia coli）のような原核生物における使用のための適切な強力なプロモーターには、Trc、Tac、T5、T7及びPLambdaが含まれるが、これらに限定されるものではない。細菌宿主細胞における使用のためのオペレーターの非限定的な例には、ラクトースプロモーターオペレーター（ラクトースと接触するとLacIリプレッサータンパク質がコンホメーションを変化させ、それにより、Ladリプレッサータンパク質がオペレーターに結合するのを妨げる）、トリプトファンプロモーターオペレーター（トリプトファンと複合体を形成した場合、TrpRリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合するコンホメーションを有する;トリプトファンの不存在下では、TrpRリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合しないコ���ホメーションを有する）、及びtacプロモーターオペレーター（例えば、deBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25を参照されたい）が含まれる。
【０２０３】
適切なプロモーターの他の例には、前初期サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター配列が含まれる。このプロモーター配列は、それに機能的に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動しうる強力な構成的プロモーター配列である。限定的なものではないが、シミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）又はヒト免疫不全ウイルス（HIV）長末端反復配列（LTR）プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、EF-1アルファプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えばアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーター（これらに限定されるものではない）を含む他の構成的プロモーター配列も使用されうる。更に、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として想定される。誘導性プロモーターの使用は、分子スイッチを提供し、前記分子スイッチは、それが機能的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現のスイッチを、そのような発現が望まれる場合にはオンにすることが可能であり、又は発現が望まれない場合にはスイッチをオフにすることが可能である。誘導性プロモーターの例には、メタロチオニンプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０４】
幾つかの実施形態においては、適切なプロモーターを含有する遺伝子座又は構築物又は導入遺伝子は、誘導可能な系の誘導によって、不可逆的にスイッチが切り替えられる。不可逆的なスイッチの誘導のための適切な系は、当技術分野でよく知られており、例えば、不可逆的なスイッチの誘導はCre-lox媒介性組換えを利用しうる（例えば、Fuhrmann-Benzakeinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 28:e99（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。不可逆的に切り替え可能なプロモーターを作製する際に、当技術分野で公知のリコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、組換え部位などの任意の適切な組合せが使用されうる。本明細書に記載されている部位特異的組換えを行うための方法、メカニズム及び要件は、不可逆的に切り替えられるプロモーターを作製するのに有用であり、当技術分野でよく知られている。例えば、Grindleyら Annual Review of Biochemistry (2006) 567-605; 及びTropp, Molecular Biology (2012) (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, Mass.)（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【０２０５】
本開示の核酸は発現ベクター及び／又はクローニングベクター内に存在しうる。発現ベクターは、選択的マーカー、複製起点、並びにベクターの複製及び／又は維持をもたらす他の特徴を含みうる。適切な発現ベクターには、例えばプラスミド、ウイルスベクターなどが含まれる。多数の適切なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、多数が対象組換え構築物の生成のために商業的に利用手可能である。以下のベクターが例示として挙げられるが、何ら限定的なものと解釈されるべきではない：細菌ベクター：pBs、ファージスクリプト、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（Stratagene, La Jolla, Calif., USA）；pTrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及びpRIT5（Pharmacia, Uppsala, Sweden）；真核生物ベクター：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG（Stratagene）pSVK3、pBPV、pMSG及びpSVL（Pharmacia）。
【０２０６】
発現ベクターは、一般に、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入をもたらす、プロモーター配列の近くに位置する簡便な制限部位を有する。発現宿主において機能的な選択的マーカーが存在しうる。適切な発現ベクターには、限定的なものではないが、ウイルスベクター、例えば、以下のウイルスに基づくベクターが含まれる：ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Liら, Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1994) 35: 2543-2549; Borrasら, Gene Ther. (1999) 6: 515-524; Li及びDavidson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7700-7704; Sakamotoら, H. Gene Ther. (1999) 5: 1088-1097; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984及びWO 95/00655を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス（例えば、Aliら, Hum. Gene Ther. (1998) 9: 81-86, Flanneryら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 6916-6921; Bennettら, Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1997) 38: 2857-2863; Jomaryら, Gene Ther. (1997) 4:683 690, Rollingら, Hum. Gene Ther. (1999) 10: 641-648; Aliら, Hum. Mol. Genet. (1996) 5: 591-594; Srivastava, WO 93/09239, Samulskiら, J. Vir. (1989) 63: 3822-3828; Mendelsonら, Virol. (1988) 166: 154-165; 及びFlotteら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 10613-10617を参照されたい）、SV40、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 10319-23; Takahashiら, J. Virol. (1999) 73: 7812-7816を参照されたい）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス及び乳腺腫瘍ウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクター）など。
【０２０７】
使用に適した追加的な発現ベクターとしては、例えばレンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、操作されたハイブリッドウイルスベクター、トランスポゾン媒介性ベクターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ウイルスベクター技術は当技術分野でよく知られており、例えばSambrookら, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY、並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０８】
一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位及び1以上の選択的マーカーを含有する（例えば、WO 01/96584、WO 01/29058及び米国特許第6,326,193号）。
【０２０９】
本発明のベクターは、自己不活性化ベクターでありうる。本明細書中で用いる「自己不活性化ベクター」なる語は、3' LTRエンハンサープロモーター領域（U3領域）が（例えば、欠失又は置換により）修飾されているベクターを意味する。自己不活性化ベクターは、ウイルス複製の最初のラウンドを超えたウイルス転写を妨げうる。その結果、自己不活性化ベクターは、感染し次いで宿主ゲノム（例えば、哺乳類ゲノム）内に1回だけ組み込まれることが可能であり、それ以上進むことは不可能である。したがって、自己不活性化ベクターは複製可能ウイルスの生成のリスクを著しく低減しうる。
【０２１０】
幾つかの実施形態においては、本発明の核酸は、RNA、例えばインビトロ合成RNAでありうる。RNAのインビトロ合成のための方法は、当業者に公知であり、本開示のカルシニューリン変異体をコードする配列を含むRNAを合成するために任意の公知方法が用いられうる。RNAを宿主細胞内に導入するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Zhaoら Cancer Res. (2010) 15: 9053を参照されたい。本開示のカルシニューリン変異体をコードするヌクレオチド配列を含むRNAを宿主細胞内に導入することは、インビトロ又はエクスビボ又はインビボで行われうる。例えば、宿主細胞（例えば、Treg、NK細胞、細胞傷害性Tリンパ球など）を、本開示のカルシニューリン変異体をコードするヌクレオチド配列を含むRNAでインビトロ又はエクスビボでエレクトロポレーションすることが可能である。
【０２１１】
ポリペプチド又はその一部の発現を評価するために、細胞内に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターによりトランスフェクト又は感染させようとする細胞の集団から発現細胞を特定し選択することを促進させうる選択的マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又はその両方をも含有しうる。幾つかの実施形態においては、選択的マーカーは別個のDNA断片上に担持され、コトランスフェクション法において使用されうる。選択的マーカー及びレポーター遺伝子は共に、宿主細胞における発現を可能にする適切な調節配列に隣接しうる。有用な選択的マーカーは抗生物質耐性遺伝子を含むが、これに限定されるものではない。
【０２１２】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定し、調節配列の機能を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物又は組織において存在しない又は発現されない遺伝子であり、その発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性により示されるポリペプチドをコードする。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞内に導入された後の適切な時点で評価される。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Ui-Teiら, 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。
【０２１３】
E．細胞の供給源
本発明に適した細胞には、ナイーブ細胞、エフェクターメモリー細胞、中央メモリー細胞、幹中央メモリー細胞、エフェクターメモリー細胞及び長寿命エフェクターメモリー細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、細胞には、免疫抑制細胞、例えば制御性T細胞（Treg）、直接的に免疫抑制性となるように修飾された非Treg（例えば、IL-10又はTGF-βの分泌によるもの）、及び間接的に免疫抑制性となるように修飾された非Treg（例えば、抗原提示細胞（APC）を殺す細胞傷害性Tリンパ球（CTL））が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、細胞には、樹状細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、免疫調節マクロファージ、間葉系幹細胞、多能性成体前駆細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、自然リンパ球、インバリアントナチュラルキラー（NK）T細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、細胞には、造血細胞及びその前駆細胞が含まれる。
【０２１４】
増殖の前に、免疫細胞の供給源をエクスビボ操作のために対象から得る。エクスビボ操作のための標的細胞の供給源には、例えば、自家又は異種ドナー血液、臍帯血又は骨髄も含まれうる。例えば、免疫細胞の供給源は、本発明の修飾免疫細胞で処置される対象からのもの、例えば、対象の血液、対象の臍帯血又は対象の骨髄でありうる。対象の非限定的な例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びそれらのトランスジェニック種が含まれる。好ましくは、対象はヒトである。
【０２１５】
免疫細胞は、血液、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯、リンパ又はリンパ器官を含む多数の供給源から得られうる。免疫細胞は免疫系の細胞、例えば先天免疫又は獲得免疫の細胞、例えば骨髄性又はリンパ性細胞、例えばリンパ球、典型的にはT細胞及び／又はNK細胞である。他の例示的な細胞には、幹細胞、例えば多分化能（multipotent）幹細胞及び多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞（ESC）及び人工多能性幹細胞（iPSC）が含まれる。幾つかの態様においては、細胞はヒト細胞である。細胞は、治療される対象に対して同種異系及び／又は自家由来でありうる。細胞は、典型的には、初代細胞、例えば、対象から直接単離されたもの、及び／又は対象から単離され凍結されたものである。
【０２１６】
ある実施形態においては、免疫細胞は、T細胞、例えばCD8+ T細胞（例えば、CD8+ナイーブT細胞、中央メモリーT細胞又はエフェクターメモリーT細胞）、CD4+ T細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT細胞）、制御性T細胞（Treg）、幹細胞メモリーT細胞、リンパ球前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）又は樹状細胞である。幾つかの実施形態においては、細胞は、単球又は顆粒球、例えば骨髄細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球及び／又は好塩基球である。ある実施形態においては、標的細胞は、人工多能性幹（iPS）細胞、又はiPS細胞に由来する細胞（例えば、対象から生成され、1以上の標的遺伝子の発現を改変するように（例えば、それにおける突然変異を誘導するように）又は操作するように操作され、そして例えばT細胞、例えばCD8+ T細胞（例えば、CD8+ナイーブT細胞、中央メモリーT細胞又はエフェクターメモリーT細胞）、CD4+ T細胞、幹細胞メモリーT細胞、リンパ系前駆細胞又は造血幹細胞へと分化された細胞）である。
【０２１７】
幾つかの実施形態においては、細胞には、T細胞又は他の細胞型の、1以上のサブセット、例えば、全T細胞集団、CD4+細胞、CD8+細胞及びそれらの亜集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化能、増殖、再循環、局在化及び／又は持続能、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官又は区画における存在、マーカー又はサイトカイン分泌プロファイル、及び／又は分化度により定義されるものが含まれる。T細胞及び／又はCD4+及び／又はCD8+ T細胞の亜型（亜型）及び亜集団としては、ナイーブT（TN）細胞、エフェクターT細胞（TEFF）、メモリーT細胞及びそれらの亜型、例えば幹細胞記憶T（TSCM）、中央記憶T（TCM）、エフェクター記憶T（TEM）又は最終分化エフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未成熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞、天然に存在する及び適応制御性T（Treg）細胞、ヘルパーT細胞、例えばTH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞、アルファ／ベータT細胞及びデルタ／ガンマT細胞が挙げられる。ある実施形態においては、当技術分野で利用可能な多数のT細胞系が使用されうる。
【０２１８】
幾つかの実施形態においては、方法は、対象から免疫細胞を単離し、それらを調製し、処理し、培養し、及び／又は操作することを含む。幾つかの実施形態においては、操作される細胞の調製は1以上の培養及び／又は調製工程を含む。記載されている操作のための細胞は、サンプル、例えば生物学的サンプル、例えば、対象から得られた又は対象に由来するものから単離されうる。幾つかの実施形態においては、細胞が単離される対象は、疾患又は病態を有するもの、あるいは細胞療法を要するもの、あるいは細胞療法が適用されるものである。幾つかの実施形態における対象は、特定の治療的介入（例えば、細胞が単離され、処理され、及び／又は操作されている養子細胞療法）を要するヒトである。したがって、幾つかの実施形態における細胞は、初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。サンプルには、対象から直接採取された組織、流体及び他のサンプル、並びに1以上の処理工程、例えば分離、遠心分離、遺伝的操作（例えば、ウイルスベクターでの形質導入）、洗浄及び／又はインキュベーションから得られたサンプルが含まれる。生物学的サンプルは、生物学的供給源から直接得られたサンプル又は処理されたサンプルでありうる。生物学的サンプルには、体液、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿及び汗、組織及び器官サンプル、例えば、それらに由来する処理サンプルが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２１９】
幾つかの態様においては、細胞が由来する又は細胞が単離されるサンプルは血液又は血液由来サンプルであり、あるいはアフェレーシス若しくは白血球アフェレーシス産物であり、又はそれらに由来する。例示的なサンプルには以下のものが含まれる：全血、末梢血単核細胞（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺若しくは他の器官、及び／又はそれらに由来する細胞。細胞療法、例えば養子細胞療法の場合、サンプルには、自家由来サンプル及び同種異系由来サンプルが含まれる。
【０２２０】
幾つかの実施形態においては、細胞は、細胞株、例えばT細胞株に由来する。幾つかの実施形態における細胞は、異種起源、例えばマウス、ラット、非ヒト霊長類及びブタから得られる。幾つかの実施形態においては、細胞の単離は1以上の調製及び／又は非親和性ベースの細胞分離工程を含む。幾つかの例においては、細胞を洗浄し、遠心分離し、及び／又は1以上の試薬の存在下でインキュベートして、例えば、不要成分を除去し、所望成分を富化し、特定の試薬に感受性である細胞を細胞溶解又は除去する。幾つかの例においては、1以上の特性、例えば密度、付着特性、サイズ、特定の成分に対する感受性及び／又は耐性に基づいて、細胞を分離する。
【０２２１】
幾つかの例においては、例えば、アフェレーシス又は白血球アフェレーシスにより、対象の循環血液から細胞を得る。幾つかの態様においては、サンプルはリンパ球、例えばT細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球及び／又は血小板を含有し、幾つかの態様においては、赤血球及び血小板以外の細胞を含有する。幾つかの実施形態においては、対象から収集した血球を洗浄して、例えば血漿画分を取り出し、後続処理工程のために、適切なバッファー又は培地（媒体）に細胞を入れる。幾つかの実施形態においては、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄する。幾つかの態様においては、洗浄工程は、製造業者の説明書に従い接線流濾過（TFF）により行われる。幾つかの実施形態においては、細胞を、洗浄後、種々の生体適合性バッファーに再懸濁させる。ある実施形態においては、血液細胞サンプルの成分を取り出し、細胞を培養培地に直接再懸濁させる。幾つかの実施形態においては、方法は、密度に基づく細胞分離方法、例えば、赤血球を細胞溶解しパーコール（Percoll）又はフィコール（Ficoll）勾配による遠心分離に付すことによる、末梢血からの白血球の調製を含む。
【０２２２】
ある実施形態においては、免疫細胞は、個体の循環血から、アフェレーシス又は白血球アフェレーシスにより得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球、例えばT細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含有する。アフェレーシスにより収集した細胞を洗浄して、血漿画分を取り出し、後続処理工程のために、細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）のような適切なバッファー又は培地に入れることが可能であり、あるいは、洗浄溶液はカルシウムを含有せず、そしてマグネシウムを含有しないことが可能であり、又は全てでなくとも多数の2価カチオンを含有しないことが可能である。洗浄後、細胞を、種々の生体適合性バッファー、例えば、Ca非含有、Mg非含有PBSに再懸濁させることが可能である。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去することが可能であり、細胞を培地に直接再懸濁させることが可能である。
【０２２３】
幾つかの実施形態においては、単離方法は、1以上の特異的分子、例えば表面マーカー、例えば表面タンパク質、細胞内マーカー又は核酸の、細胞における発現又は存在に基づいて、異なる細胞型を分離することを含む。幾つかの実施形態においては、そのようなマーカーに基づく分離のための任意の公知方法が用いられうる。幾つかの実施形態においては、分離は、親和性は免疫親和性に基づく分離である。例えば、幾つかの態様における単離は、1以上のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞発現又は発現レベルに基づいて、細胞及び細胞集団を分離することを含み、分離は、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体又は結合相手の存在下でインキュベーションを行い、ついで一般的には洗浄工程を行い、そして抗体又は結合相手に結合していない細胞から、抗体又は結合相手に結合している細胞を分離することにより達成される。
【０２２４】
そのような分離工程は、試薬に結合している細胞が更なる使用のために保持されるポジティブ選択、及び／又は抗体又は結合相手に結合していない細胞が保持されるネガティブ選択に基づくものでありうる。幾つかの例においては、両方の画分が更なる使用のために保持される。幾つかの態様においては、ネガティブ選択は、不均一集団における細胞型を特異的に特定する抗体が利用できない場合に特に有用であることがあり、その場合、分離は、所望集団以外の細胞により発現されるマーカーに基づいて最も良好に行われる。分離は、100%の富化、又は特定のマーカーを発現する特定の細胞集団若しくは細胞の除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞型のような特定の細胞型のポジティブ選択又は富化は、そのような細胞の数又は割合を増加させることを意味するが、マーカーを発現しない細胞の完全な欠如をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現する細胞型のような特定の細胞型のネガティブ選択、除去又は枯渇は、そのような細胞の数又は割合を減少させることを意味するが、全てのそのような細胞の完全な除去をもたらす必要はない。
【０２２５】
幾つかの例においては、複数ラウンドの分離工程を行い、この場合、1つの工程からポジティブ又はネガティブに選択された画分を、別の分離工程、例えば後続のポジティブ又はネガティブ選択に付す。幾つかの例においては、例えば、ネガティブ選択の標的であるマーカーにそれぞれが特異的である複数の抗体又は結合相手と共に細胞をインキュベートすることにより、複数のマーカーを同時に発現する細胞を単一の分離工程が枯渇させうる。同様に、種々の細胞型上で発現される複数の抗体又は結合相手と共に細胞をインキュベートすることにより、複数の細胞型が同時にポジティブ選択されうる。
【０２２６】
幾つかの実施形態においては、表面マーカーのような1以上の特定のマーカーに関して陽性である細胞（マーカー+）又はマーカーを高レベルで発現する細胞（マーカーhigh）に関して、あるいは1以上の特定のマーカーに関して陰性である細胞（マーカー-）又はマーカーを比較的低レベルで発現する細胞（マーカーlow）に関して、T細胞集団の1以上を富化又は枯渇させる。例えば、幾つかの態様においては、T細胞の特定の亜集団、例えば、1以上の表面マーカーに関して陽性である細胞又はマーカーを高レベルで発現する細胞、例えばCD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+及び／又はCD45RO+ T細胞をポジティブ又はネガティブ選択技術により単離する。幾つかの場合においては、そのようなマーカーは、T細胞の特定の集団（例えば、非メモリー細胞）には存在しない又は比較的低レベルで発現されるが、T細胞の他の特定の集団（例えば、メモリー細胞）には存在し又は比較的高レベルで発現されるマーカーである。ある実施形態においては、細胞（例えば、CD8+細胞又はT細胞、例えば、CD3+細胞）を、CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127及び／若しくはCD62Lに関して陽性である、又は、それらを高い表面レベルで発現する細胞について富化させ（すなわち、ポジティブ選択し）、並びに／又は、CD45RAに関して陽性である若しくはそれを高い表面レベルで発現する細胞について枯渇させる（例えば、ネガティブ選択する）。幾つかの実施形態においては、CD122、CD95、CD25、CD27及び／又はIL7-Ra（CD127）に関して陽性である又はそれらを高い表面レベルで発現する細胞を富化又は枯渇させる。幾つかの例においては、CD8+ T細胞を、CD45ROに関して陽性（又はCD45RAに関して陰性）及びCD62Lに関して陽性である細胞について富化させる。例えば、CD3+, CD28+ T細胞は、CD3/CD28結合磁気ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T細胞エキスパンダー（Expander））を使用して、ポジティブ選択されうる。
【０２２７】
幾つかの実施形態においては、非T細胞、例えばB細胞、単球又は他の白血球上で発現されるマーカー、例えばCD14のネガティブ選択により、T細胞をPBMCサンプルから分離する。幾つかの態様においては、CD4+ヘルパー及びCD8+細胞傷害性T細胞を分離するために、CD4+又はCD8+選択工程を用いる。そのようなCD4+及びCD8+集団は、1以上のナイーブ、記憶及び／又はエフェクターT細胞亜集団において発現される又は比較的高度に発現されるマーカーに関するポジティブ又はネガティブ選択により、亜集団へと更に選別されうる。幾つかの実施形態においては、ナイーブ、中央記憶、エフェクター記憶及び／又は中央記憶幹細胞について、例えば、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づくポジティブ又はネガティブ選択により、CD8+細胞を更に富化又は枯渇させる。幾つかの実施形態においては、中央記憶T（TCM）細胞の富化を行って、効力を増強し、例えば、投与後の長期生存、増殖及び／又は生着を改善し、これは、幾つかの態様においては、そのような亜集団において特に頑強である。幾つかの実施形態においては、TCMに富むCD8+ T細胞とCD4+ T細胞との組合せは効力を更に増強する。
【０２２８】
幾つかの実施形態においては、CD8+末梢血リンパ球のCD62L+及びCD62L-サブセットの両方にメモリーT細胞が存在する。CD62L- CD8+及び／又はCD62L+ CD8+画分についてPBMCを富化又は枯渇させることが可能であり、これは、例えば、抗CD8及び抗CD62L抗体を使用して行われうる。幾つかの実施形態においては、CD4+ T細胞集団及びCD8+ T細胞亜集団、例えば、中央記憶（TCM）細胞について富化された亜集団を得る。幾つかの実施形態においては、中央記憶T（TCM）細胞の富化はCD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及び／又はCD127の陽性又は高い表面発現に基づく。幾つかの態様においては、それは、CD45RA及び／又はグランザイムBを発現又は高発現する細胞のネガティブ選択に基づく。幾つかの態様においては、TCM細胞に富むCD8+集団の単離を、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇、及びCD62Lを発現する細胞のポジティブ選択又は富化により行う。ある態様においては、中央記憶T（TCM）細胞の富化を、CD4発現に基づいて選択された細胞の陰性画分から開始して行い、それを、CD14及びCD45RAの発現に基づくネガティブ選択、並びにCD62Lに基づくポジティブ選択に付す。そのような選択は、幾つかの態様においては同時に行われ、他の態様においてはいずれかの順序で連続的に行われる。幾つかの態様においては、CD8+細胞集団又は亜集団を調製するのに用いるのと同じCD4発現ベースの選択工程を、CD4+細胞集団又は亜集団を生成するためにも用い、それにより、CD4ベースの分離からの陽性画分及び陰性画分の両方を維持し、所望により1以上の更なるポジティブ又はネガティブ選択工程の後、方法の後続工程で使用する。
【０２２９】
CD4+ Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することにより、ナイーブ細胞、中央メモリー細胞及びエフェクター細胞に選別される。CD4+リンパ球は標準的な方法により得られうる。幾つかの実施形態においては、ナイーブCD4+ Tリンパ球はCD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T細胞である。幾つかの実施形態においては、中央記憶CD4+細胞はCD62L+及びCD45RO+である。幾つかの実施形態においては、エフェクターCD4+細胞はCD62L-及びCD45ROである。一例においては、ネガティブ選択によりCD4+細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及びCD8に対する抗体を含む。幾つかの実施形態においては、抗体又は結合相手は固体支持体又はマトリックス、例えば磁性ビーズ又は常磁性ビーズに結合されて、ポジティブ及び／又はネガティブ選択のための細胞の分離を可能にする。
【０２３０】
幾つかの実施形態においては、遺伝的操作の前に、又は遺伝的操作に関連して、細胞をインキュベート及び／又は培養する。インキュベーション工程は培養、栽培、刺激、活性化及び／又は増殖を含みうる。幾つかの実施形態においては、組成物又は細胞を刺激条件又は刺激物質の存在下でインキュベートする。そのような条件は、集団内の細胞の増殖、増加、活性化及び／若しくは生存を誘導するように、並びに／又は抗原曝露を模倣するように、並びに／又は遺伝的操作、例えば組換え抗原受容体の導入のために細胞をプライミングするように設計された条件を含む。条件は特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、物質、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン及び／又は刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合相手、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、並びに細胞を活性化するように設計された任意の他の物質の1以上を含みうる。幾つかの実施形態においては、刺激条件又は物質は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化しうる1以上の物質、例えばリガンドを含む。幾つかの態様においては、物質はT細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを始動又は開始させる。そのような物質には、抗体、例えば、TCR成分及び／又は共刺激受容体に特異的な抗体、例えば抗CD3、抗CD28、例えば、ビーズのような固体支持体に結合しているもの、及び／又は1以上のサイトカインが含まれうる。所望により、増殖方法は、抗CD3及び／又は抗CD28抗体を（例えば、少なくとも約0.5ng/mlの濃度で）培地に添加する工程を更に含みうる。幾つかの実施形態においては、刺激物質には、IL-2及び／又はIL-15、例えば、少なくとも約10単位/mLの濃度のIL-2が含まれる。
【０２３１】
他の実施形態においては、赤血球を細胞溶解し、例えばPERCOLL（商標）勾配による遠心分離により単球を枯渇させることにより、T細胞を末梢血から単離する。あるいは、T細胞は、臍帯から単離されうる。いずれの場合においても、ポジティブ又はネガティブ選択技術によりT細胞の特定の亜集団が更に単離されうる。
【０２３２】
そのようにして単離された臍帯血単核細胞は、CD34、CD8、CD14、CD19及びCD56（これらに限定されるものではない）を含む特定の抗原を発現する細胞について枯渇されうる。これらの細胞の枯渇は、単離された抗体、抗体を含む生物学的サンプル、例えば腹水、物理的支持体に結合した抗体、及び細胞結合抗体を使用して達成されうる。
【０２３３】
ネガティブ選択によるT細胞集団の富化は、ネガティブ選択細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組合せを用いて達成できる。好ましい方法は、ネガティブ選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、ネガティブ磁気免疫接着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は選択である。例えば、ネガティブ選択によりCD4+細胞を富化するためには、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及びCD8に対する抗体を含む。
【０２３４】
ポジティブ又はネガティブ選択による所望の細胞集団の単離のためには、表面（例えば、ビーズのような粒子）及び細胞の濃度を変動させることが可能である。ある実施形態においては、細胞とビーズとの最大接触を確保するために、ビーズと細胞とが一緒に混合される体積を有意に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望まれうる。例えば、ある実施形態においては、20億細胞/mlの濃度を用いる。ある実施形態においては、10億細胞/mlの濃度を用いる。さらなる実施形態においては、1億細胞/mlを超える濃度を用いる。さらなる実施形態においては、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500又は5000万細胞/mlの細胞の濃度を用いる。さらなる他の実施形態においては、7500万、8000万、8500万、9000万、9500万又は1億細胞/mlからの細胞濃度を用いる。さらなる実施形態においては、1億2500万又は1億5000万細胞/mlの濃度を用いることが可能である。高濃度の使用は細胞収量、細胞活性化及び細胞増殖の増加をもたらしうる。
【０２３５】
T細胞は洗浄工程後に凍結されることも可能であり、これは単球除去工程を必要としない。理論に束縛されることを望むものではないが、凍結及び後続解凍工程は、細胞集団中の顆粒球及び或る程度の単球を除去することにより、より均一な産物を与える。血漿及び血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液に懸濁させることが可能である。多数の凍結溶液及びパラメーターが当技術分野で公知であり、この場合に有用であるが、非限定的な例において、1つの方法は、20% DMSO及び8% ヒト血清アルブミンを含有するPBS又は他の適切な細胞凍結媒体を使用することを含む。ついで細胞を毎分1℃の速度で-80℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相内に貯蔵する。-20℃又は液体窒素中の即座の無制御凍結だけでなく、制御凍結の他の方法も用いられうる。
【０２３６】
1つの実施形態においては、T細胞の集団は末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製T細胞集団及びT細胞株のような細胞を含む。他の実施形態においては、末梢血単核細胞がT細胞の集団を構成する。更に他の実施形態においては、精製されたT細胞がT細胞の集団を含む。
【０２３７】
ある実施形態においては、T制御性細胞（Treg）はサンプルから単離されうる。サンプルには、臍帯血又は末梢血が含まれうるが、これらに限定されるものではない。ある実施形態においては、Tregはフローサイトメトリー選別により単離される。サンプルは、当技術分野で公知の任意の手段により、単離前に、Tregについて富化されうる。単離されたTregは、使用前に凍結保存及び／又は増殖されうる。Tregを単離するための方法は、米国特許番号7,754,482号、第8,722,400号及び第9,555,105号並びに米国特許出願第13/639,927号（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０２３８】
F．細胞の増殖
細胞の修飾の前においても後においても、細胞、例えば免疫細胞は、例えば、米国特許第6,352,694号、第6,534,055号、第6,905,680号、第6,692,964号、第5,858,358号、第6,887,466号、第6,905,681号、第7,144,575号、第7,067,318号、第7,172,869号、第7,232,566号、第7,175,843号、第5,883,223号、第6,905,874号、第6,797,514号、第6,867,041号及び米国特許公開番号20060121005に記載されている方法を用いて、活性化され、数において増加されうる。
【０２３９】
Treg細胞を増殖させるための方法の例は、当業者によく知られており、以下のものを包含するが、それらに限定されるものではない：磁気ビーズ又はナノ粒子上に吸収された刺激性抗体、一般的には抗CD3及び抗CD28の使用及び刺激性サイトカイン（一般的にはIL-2、IL-15及びIL-4の群からのもの）の使用；刺激性抗体、一般的には抗CD3及び抗CD28の使用、及び磁気ビーズ又はナノ粒子上に吸収された刺激性抗体に特異的なリガンドの使用及び刺激性サイトカイン（一般的にはIL-2、IL-15及びIL-4の群からのもの）の使用；細胞培養容器の表面上にコーティングされた刺激性抗体、一般的には抗CD3及び抗CD28の使用及び刺激性サイトカイン（一般的にはIL-2、IL-15及びIL-4の群からのもの）の使用；WO2006/108882（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているフィーダー細胞の使用。T細胞を制御性T細胞に分化させるための方法の例は当技術分野でよく知られており、ラパマイシン、デキサメタゾン、IL-10、IFN-アルファ、寛容原性抗原提示細胞、例えば樹状細胞などへの曝露を包含するが、これらに限定されるものではない。
【０２４０】
幾つかの実施形態においては、制御性T細胞は、Wakkachら（Immunity 2003 May; 18(5):605-17）に記載されている方法により入手可能であり、前記方法は、a）対象から前駆細胞集団を単離すること、b）IL-10（培地内で50〜250U/mlの範囲濃度、好ましくは100U/ml）の存在下で前駆細胞集団を培養することにより、樹状細胞の集団を得ること、c）工程b）の細胞を、特定の抗原の存在下、対象から単離されたCD4+ Tリンパ球集団と接触させて、抗原に対するCD4+ T細胞を制御性T細胞集団に分化させること、及び、d）工程c）から制御性T細胞集団を回収することを含む。方法はまた、工程b）のDCの代わりにデキサメタゾン及びビタミンD3又は寛容化若しくは未成熟DCを使用して行われうる。
【０２４１】
幾つかの実施形態においては、制御性T細胞は、特許US6746670に記載されている方法により入手可能であり、前記方法は、a）対象から単離された、特定の抗原に対するCD4+ T細胞集団を、適切な量のIFN-アルファ（好ましくは、培地1ml当たり5ng）を含有する培地内で培養すること、及び、b）制御性T細胞集団の回収することを含む。工程a）において、培地は適切な量、好ましくは100U/mlのIL-10を更に含みうる。工程b）において、制御性T細胞集団を、増殖を可能にするIL-15を含む培地内で培養することが可能であり、IL-15は、好ましくは、培地内で5ng/mlである。
【０２４２】
幾つかの実施形態においては、制御性T細胞は、特許出願WO02/092793に記載されている方法により入手可能であり、前記方法は、a）人工抗原提示細胞により提示される特定の抗原の存在下、CD4+ T細胞集団をインビトロで活性化させること、b）少なくとも10%の制御性T細胞を含む活性化CD4+ T細胞を回収することを含む。幾つかの実施形態においては、人工抗原提示細胞はHLA II系分子及びヒトLFA-3分子を発現し、共刺激分子B7-1、B7-2、B7-H1、CD40、CD23及びICAM-Iを発現しない。
【０２４３】
幾つかの実施形態においては、制御性T細胞は、Grouxら（Nature 1997, 389(6652):737-42）に記載されている方法により入手可能であり、前記方法は、a）特定の抗原及び適切な量のIL-10（好ましくは、培地1ml当たり100U）の存在下、CD4+ T細胞集団をインビトロで活性化させること、及び、b）制御性T細胞集団を回収することを含む。好ましくは、IL-10は培地内に存在する。
【０２４４】
幾つかの実施形態においては、制御性T細胞は、特許出願WO2007/010406に記載されている方法により入手可能であり、前記方法は、a）白血球集団又は末梢血単核細胞（PBMC）集団を特定の抗原で刺激すること、b）刺激された集団から抗原特異的Treg細胞集団を回収すること、及び、c）所望により、抗原特異的Treg細胞集団を増殖させることを含む。
【０２４５】
制御性T細胞を得る他の方法も当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第9,228,172号及び米国特許公開番号US201601571471A1に記載されているとおりに、非Treg集団からのTregの生成を誘導することを含む。
【０２４６】
幾つかの実施形態においては、エクスビボで培養・増殖された制御性T細胞は、米国特許第7,651,855号、第8,129,185号及び第9,181,526号に記載されている方法により得られうる。幾つかの実施形態においては、制御性T細胞は、米国特許第9,273,282号及び第9,187,727号に記載されているとおりに、臍帯血から得られた細胞の集団から単離されうる。制御性T細胞を増殖させるための方法は米国特許公開番号20130101567にも記載されている。幾つかの実施形態においては、Tregは、米国特許第9,228,172号及び米国特許公開番号20160151471に記載されている方法に従い、非TregをTregに変換することにより得られうる。幾つかの実施形態においては、制御性T細胞は、米国特許第9,644,179号及び米国特許公開番号20170211042に記載されている方法に従い、T細胞をTregに変換することにより得られうる。
【０２４７】
白血球は、幾つかの細胞型を包含し、これらはそれらの重要性、それらの分布、それらの数、それらの寿命及びそれらの潜在能により特徴づけられる。これらの型は、以下のとおりである。多核又は顆粒状リンパ球として、好酸球、好中球、好塩基球、単核細胞又は末梢血単核細胞（PBMC）が挙げられ、これらは大きな白血球であり、免疫系の主要細胞型（リンパ球及び単球）を構成する。白血球又はPBMCは、当技術分野で公知の任意の方法により、末梢血から分離されうる。有利には、PBMCの分離のために、遠心分離、好ましくは密度勾配遠心分離、好ましくは不連続密度勾配遠心分離が用いられうる。別の方法は、特異的モノクローナル抗体の使用である。ある実施形態においては、PBMCは、典型的には、標準的な方法を用いて、フィコール-ハイパック（Ficoll-Hypaque）により、全血産物から単離される。他の実施形態においては、PBMCは白血球アフェレーシスにより回収される。
【０２４８】
幾つかの実施形態においては、制御性T細胞は、a）白血球集団又は末梢血単核細胞（PBMC）集団を、特定の抗原の存在下、間葉系幹細胞と共に培養すること、及びb）Treg細胞集団を回収することにより得られうる。そのような方法は、PBMC又は白血球の代わりに、ナイーブ又はメモリーT細胞を使用することによっても行われうる。
【０２４９】
幾つかの実施形態においては、Treg細胞は、IL-2及びTGF-ベータの存在下、T細胞を培養することにより得られうる（Davidsonら The Journal of Immunology, 2007, 178:4022-4026）。他の実施形態においては、Treg細胞は、TGF-ベータの存在下、T細胞を培養することにより得られる。
【０２５０】
本明細書に開示されている方法による細胞増殖は、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍又はそれ以上、及びそれらの間のあらゆる全又は部分整数の倍数に増殖されうる。
【０２５１】
培養後、細胞を培養装置内の細胞培地内で一定の時間にわたり、又は細胞がコンフルエントに達するまで、若しくは最適な継代のための高細胞密度に達するまでインキュベートした後、別の培養装置に移すことことが可能である。培養装置は、インビトロで細胞を培養するために一般に使用される任意の培養装置のものでありうる。好ましくは、コンフルエンスのレベルは、細胞を別の培養装置に移す前に70%以上である。より好ましくは、コンフルエンスのレベルは90%以上である。一定の時間は、インビトロでの細胞の培養に適した任意の時間でありうる。細胞培地は細胞培養中にいつでも交換されうる。好ましくは、細胞培地は約2〜3日ごとに交換される。ついで、細胞を培養装置から回収し、細胞を直ちに使用し、又は後の使用のために保存するために凍結保存することが可能である。ある実施形態においては、本発明は、増殖した細胞を凍結保存することを含む。凍結保存された細胞は、核酸を細胞内に導入する前に解凍される。
【０２５２】
幾つかの実施形態においては、方法は、細胞を単離し、細胞を増殖させることを含む。他の実施形態においては、本発明は、増殖前に細胞を凍結保存することを更に含む。更に他の実施形態においては、凍結保存された細胞を、キメラ膜タンパク質をコードするRNAでのエレクトロポレーションのために解凍する。
【０２５３】
本明細書に記載されている培養工程（本明細書に記載されている物質との接触又はエレクトロポレーション後）は、非常に短いことが可能であり、24時間未満、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22又は23時間でありうる。本明細書に更に詳細に記載されている培養工程（本明細書に記載されている物質との接触）は、より長いことが可能であり、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日又はそれ以上でありうる。
【０２５４】
培養における細胞を説明するために、種々の用語が用いられている。細胞培養は、一般に、生きた生物から採取され、制御条件下で成長に付された細胞に関するものである。初代細胞培養は、最初の継代培養の前の、生物から直接採取された細胞、組織又は器官の培養である。細胞の成長及び／又は分裂を促進させる条件下で増殖培地内に細胞を配置すると、細胞は培養内で増殖して、より大きな細胞集団を生成する。細胞が培養内で増殖する場合、細胞増殖の速度は、典型的には、細胞数が2倍になるのに要する時間（倍加時間としても公知である）により測定される。
【０２５５】
継代培養の各ラウンドは、継代（passage）と称される。細胞が継代培養された場合、それは、継代された、と称される。細胞の特定の集団又は細胞株は、継代された回数によって呼称又は特徴づけられることがある。例えば、10回継代された培養細胞集団は、P10培養と称されうる。初代培養、すなわち、組織から細胞を単離した後の最初の培養はP0と称される。最初の継代培養の後の細胞は、二次培養（P1又は継代1）と称される。第2継代培養後の細胞は3次培養（P2又は継代2）となり、以下同様である。継代期間中に多数の個体数倍加が生じる可能性があり、したがって、培養の個体数倍加の数は継代数より大きくなる、と当業者に理解されるであろう。継代間の期間中の細胞の増殖（すなわち、個体数倍加の数）は、播種密度、基質、培地及び継代間の期間（これらに限定されるものではない）を含む多数の要因に左右される。
【０２５６】
ある実施形態においては、細胞は数時間（約3時間）〜約14日間又はその間の任意の整数値の時間にわたって培養されうる。Treg細胞培養に適した条件は、当業者に公知の増殖及び生存に必要な因子及び／又は細胞増殖のための他の任意の添加物を含む。細胞の増殖のための他の添加物には、界面活性剤、血漿タンパク質分画、及び還元剤、例えばN-アセチル-システイン及び2-メルカプトエタノールが含まれるが、これらに限定されるものではない。培地には、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及びX-Vivo 20、オプティマイザー（Optimizer）が含まれ、それらはアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及びビタミンが添加されており、無血清であるか、又は適切な量の血清（又は血漿）若しくは一定の組合せのホルモン、及び／又はTregの成長及び増殖に十分な量のサイトカインが添加されている。抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシンは実験培養にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば適切な温度（例えば、37℃）及び雰囲気（例えば、空気 + 5% CO2）において維持される。
【０２５７】
本明細書に開示されている方法により単離された細胞は、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍又はそれ以上に増殖されうる。ある実施形態においては、Tregは約20倍〜約50倍の範囲又はそれ以上に増殖される。ある実施形態においては、ヒトT制御性細胞は、抗CD3抗体でコーティングされたKT64.86人工抗原提示細胞（aAPC）により増殖される。Tregを増殖させ活性化するための方法は、本明細書に記載されている。
【０２５８】
ある実施形態においては、Tregを増殖させる方法は、更なる適用のために、増殖したTregを単離することを更に含みうる。別の実施形態においては、増殖方法は、増殖したTregの後続エレクトロポレーション及びそれに続く培養を更に含みうる。後続のエレクトロポレーションは、物質をコードする核酸をTregの増殖集団内に導入すること、例えば、増殖Tregの形質導入、増殖Tregのトランスフェクション又は核酸での増殖Tregのエレクトロポレーションを含むことが可能であり、ここで、前記物質はTregを更に刺激する。物質は、増殖又は機能を更に刺激することにより、Tregを刺激しうる。
【０２５９】
G．治療方法
本明細書に記載されている修飾細胞（例えば、Treg）は、免疫療法、特に抑制免疫療法のための組成物中に含まれうる。組成物は医薬組成物を含んでもよく、更に、薬学的に許容される担体を含みうる。修飾細胞を含む医薬組成物の治療的有効量が投与されうる。
【０２６０】
ある態様においては、本発明は、養子細胞移植療法を要する対象に本発明の修飾T細胞を投与することを含む、養子細胞移植療法のための方法を含む。他の態様においては、本発明は、疾患又は病態の治療を要する対象に、修飾T細胞の集団を投与することを含む、対象における疾患又は病態の治療方法を含む。
【０２６１】
遺伝的に編集された修飾細胞（例えば、遺伝的に編集された修飾Treg、遺伝的に編集された修飾Tef）を対象に投与することを含む、疾患又は病態の治療を要する対象における疾患又は病態の治療方法も含まれる。ある実施形態においては、疾患又は病態の治療を要する対象の疾患又は状態の治療方法は、本開示のステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター及び／又は免疫抑制薬耐性細胞を対象に投与することを含む。
【０２６２】
養子細胞療法のための免疫細胞の投与方法は公知であり、提供される方法及び組成物に関して用いられうる。例えば、養子T細胞療法は、例えば、Gruenbergら, 米国特許出願公開番号2003/0170238; Rosenberg, 米国特許第4,690,915号; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85に記載されている。例えば、Themeliら (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukaharaら (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davilaら (2013) PLoS ONE 8(4): e61338を参照されたい。幾つかの実施形態においては、細胞療法、例えば養子T細胞療法を自家移植により行い、ここで、細胞療法を受けることになる対象から、又はそのような対象からのサンプルから、細胞を単離及び／又は調製する。したがって、幾つかの態様においては、細胞は、治療を要する対象、例えば患者に由来し、細胞を、単離及び処理の後、同じ対象に投与する。
【０２６３】
幾つかの実施形態においては、細胞療法、例えば養子T細胞療法を、同種異系移植により行い、ここで、細胞療法を受けることになる又は最終的に受ける対象以外の対象、例えば第1の対象から、細胞を単離及び／又は調製する。そのような実施形態においては、ついで細胞を、同じ種の、異なる対象、例えば第2の対象に投与する。幾つかの実施形態においては、第1の対象と第2の対象とは遺伝的に同一である。幾つかの実施形態においては、第1の対象と第2の対象とは遺伝的に類似している。幾つかの実施形態においては、第2の対象は、第1の対象と同じHLAクラス又はスーパータイプを発現する。
【０２６４】
幾つかの実施形態においては、対象は、細胞又は細胞含有組成物の投与の前に、疾患又は病態（例えば、GVHD）を標的とする治療用物質で治療されている。幾つかの実施形態においては、対象はその他の治療用物質に対して難治性又は非応答性である。幾つかの実施形態においては、対象は、例えば化学療法、放射線療法及び／又は造血幹細胞移植（HSCT）（例えば、同種異系HSCT）を含む別の治療的介入による治療の後、持続性又は再発性疾患を有する。幾つかの実施形態においては、投与は、対象が他の治療に耐性になっているにもかかわらず、対象を有効に治療する。幾つかの実施形態においては、対象は、GVHDに対する標準治療予防法、例えばステロイド（例えば、糖質コルチコイド）及び／又はカルシニューリンインヒビター（例えば、FK506、CsA）で治療されている。
【０２６５】
幾つかの場合においては、細胞は、本明細書に記載されている遺伝的に編集されたTeffである。幾つかの実施形態においては、方法は、糖質コルチコイド又はCaNIで治療された造血幹細胞移植患者である対象に、遺伝的に編集されたTeffを投与することを含む。いずれの特定の理論又は作用様式にも束縛されるものではないが、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターに対する感受性を増強するように、糖質コルチコイド受容体遺伝子座が修飾されている修飾Teffの投与はそのような患者におけるTeffの生存を増強又は維持すると考えられている。幾つかの場合においては、修飾Teffは腫瘍特異的であり、又は特定の腫瘍型に関して富化されている。幾つかの場合においては、修飾Teffは病原体特異的である（例えば、サイトメガロウイルス又はBKウイルスに特異的である）。
【０２６６】
幾つかの実施形態においては、対象は、その他の治療用物質に応答性であり、前記治療用物質での治療は疾患負担を軽減する。幾つかの態様においては、対象は、最初は治療用物質に応答性であるが、経時的に疾患又は病態の再発を示す。幾つかの実施形態においては、対象は再発していない。幾つかのそのような実施形態においては、対象を、再発リスクを有する、例えば高い再発リスクを有すると判定し、したがって、例えば再発の可能性を低減し又は再発を予防するために、細胞を予防的に投与する。幾つかの態様においては、対象は別の治療用物質による過去の治療を受けていない。
【０２６７】
幾つかの実施形態においては、対象は、例えば、化学療法、放射線療法及び／又は造血幹細胞移植（HSCT）（例えば、同種異系HSCT）を含む、別の治療的介入による治療の後、持続性又は再発性疾患を有する。幾つかの実施形態においては、投与は、対象が別の治療に耐性になっているにもかかわらず、対象を有効に治療する。
【０２６８】
幾つかの実施形態においては、対象は幹細胞移植を受けており、又は幹細胞移植の候補である。幾つかの実施形態においては、対象は実質臓器移植を受けており、又は実質臓器移植の候補である。幾つかの実施形態においては、対象は自己免疫障害に罹患している。幾つかの実施形態においては、対象は移植片対宿主病（GVHD）に罹患している。幾つかの実施形態においては、対象は1型糖尿病に罹患している。
【０２６９】
ある実施形態においては、疾患又は病態の治療を要する対象における疾患又は病態の治療方法は、本発明のステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性細胞の治療的有効量を対象に投与することを含む。ある実施形態においては、疾患又は病態の治療を要する対象における疾患又は病態の治療方法は、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性Tregの治療的有効量を対象に投与することを含む。
【０２７０】
本発明のステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性細胞は、リンパ造血系の細胞における老化及び／又は細胞毒性を抑制及び／又は誘発するように働く、糖質コルチコイド及びカルシニューリンインヒビターの投与のような免疫療法の通常の標準治療の条件において、生着、生存、持続及び／又は増殖しうる。したがって、本発明の細胞は、より長い持続的な期間にわたってそれらの治療効果を発揮しうる。
【０２７１】
本発明のステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性細胞を投与すると、移植組織は拒絶から保護される。ある実施形態においては、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性細胞は、持続的な免疫抑制をもたらしうる。ある実施形態においては、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性細胞は、同種異系抗原に応答してT細胞増殖を抑制しうる。幾つかの実施形態においては、細胞、組織及び／又は器官の移植に際して、移植細胞、組織及び／又は器官において同種異系抗原が遍在的に発現されうる。そのような場合、移植細胞、組織及び／又は器官への相当な免疫細胞浸潤が生じて、移植細胞、組織及び／又は器官の破壊をもたらしうる。したがって、幾つかの実施形態においては、本発明のステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性細胞は、免疫細胞の浸潤を低減することが可能であり、したがって、移植細胞、組織及び／又は器官の破壊を防ぎうる。幾つかの場合においては、移植細胞、組織及び／又は器官は毒性をもたらしうる。したがって、幾つかの実施形態においては、本発明のステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性細胞は、移植細胞、組織及び／又は器官媒介性毒性を低減しうる。
【０２７２】
したがって、本発明は、予防的治療効果を要する対象において、予防的治療効果を達成するための方法、及び／又は免疫抑制効果を要する対象（例えば、同種応答又は自己免疫応答を経験している者）において、免疫抑制効果を達成するための方法を提供する。幾つかの実施形態においては、予防的治療効果を要する対象において予防的治療効果を達成するための方法、及び／又は同種応答若しくは自己免疫応答を有する、免疫抑制効果を要する対象において、免疫抑制効果を達成するための方法は、本発明のステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性細胞を対象に投与することを含む。
【０２７３】
本発明の方法は、限定的なものではないが、以下のものを含む任意のタイプの移植器官、組織又は細胞の拒絶からの保護を含むと解釈されるべきである：肺、心臓（例えば、心筋細胞）、心臓弁、皮膚（例えば、線維芽細胞）、肝臓（例えば、肝細胞）、手、腎臓、膵臓、腸、胃、胸腺、骨、腱、角膜、精巣、神経、静脈、血液（例えば、全血、白血球、赤血球、血小板、血漿、血清）、骨髄（例えば、単球、マクロファージ、間葉系幹細胞）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞（MSC）、造血幹細胞（HSC））、ランゲルハンス島細胞、神経細胞（例えば、ニューロン、マクログリア、ミクログリア）、免疫細胞（例えば、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞又はNKT（ナチュラルキラーT）細胞）及び造血細胞並びにそれらの成分。方法が拒絶からの保護をもたらしうる他の組織及び細胞型には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（B及びT）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋肉細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、表皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス島細胞、膵インスリン分泌細胞、膵アルファ-2細胞、膵ベータ細胞、膵アルファ-1細胞、骨細胞、骨前駆細胞、神経幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、大動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、臍静脈内皮細胞、線維芽細胞、肝星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クプファー細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、毛細胞、膀胱細胞、腎細胞、網膜細胞、桿体細胞、錐体細胞、心臓細胞、肝細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、メモリー細胞、T細胞、B細胞、形質細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、管周細胞、セルトリ細胞、黄体細胞、子宮頸細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、濾胞細胞、粘膜細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、ドーパミン作動性細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、胚性幹細胞、線維芽細胞及び線維芽細胞。本発明の方法は、移植片対宿主病（GVHD）に対する防御も含む。
【０２７４】
ある実施形態においては、対象には、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性細胞に加えて、二次治療、例えば免疫抑制薬が投与されうる。免疫抑制薬の例には、プレドニゾン、アザチオプリン、タクロリムス及びシクロスポリンAが含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、二次治療はステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターである。幾つかの実施形態においては、ステロイドはコルチコステロイドである。幾つかの実施形態においては、ステロイドは、プロゲステロン型糖質コルチコイド、ヒドロコルチゾン型糖質コルチコイド、メタゾン型糖質コルチコイド及びアセトニド型糖質コルチコイドからなる群から選択される糖質コルチコイドである。幾つかの実施形態においては、糖質コルチコイドは、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、プレニゾン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、デフラザコート、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、フルドロコルチゾン及びデオキシコルチコステロン並びにそれらの誘導体及び類似体からなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、カルシニューリンインヒビターは、シクロスポリン、ボクロスポリン、ピメクロリムス及びタクロリムス並びにそれらの誘導体及び類似体からなる群から選択される。
【０２７５】
幾つかの実施形態においては、対象に二次治療を行う。二次治療には、化学療法、放射線療法、外科手術及び投薬が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２７６】
本発明の細胞は、適切な前臨床及び臨床実験及び試験において決定される投与量及び経路及び時点で投与されうる。細胞組成物は、これらの範囲内の投与量で複数回投与されうる。本発明の細胞の投与は、当業者により決定される所望の疾患又は病態を治療するのに有用な他の方法と組合されうる。
【０２７７】
投与される本発明の細胞は、治療を受ける対象にとって自家でありうる。
【０２７８】
本発明の細胞の投与は、当業者に公知の任意の簡便な方法で行われうる。本発明の細胞は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、植込又は移植により対象に投与されうる。本明細書に記載されている組成物は、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（iv）注射又は腹腔内において患者に投与されうる。他の例においては、本発明の細胞は、対象における炎症部位、対象における局所疾患部位、リンパ節、器官、腫瘍などに直接注射される。
【０２７９】
幾つかの実施形態においては、細胞を所望の投与量で投与し、これは、幾つかの態様においては、所望の用量若しくは数の細胞若しくは細胞型及び／又は所望の比率の細胞型を含む。したがって、幾つかの実施形態における細胞の投与量は、細胞の総数（又は体重1kg当たりの数）及び個々の集団又は亜型の所望の比率に基づく。幾つかの実施形態においては、細胞の投与量は個々の集団における細胞又は個々の細胞型の所望の総数（又は体重1kg当たりの数）に基づく。幾つかの実施形態においては、投与量は全細胞の所望の数、所望の比率、及び個々の集団における細胞の所望の総数のような特徴の組合せに基づく。
【０２８０】
幾つかの実施形態においては、細胞の集団又は亜型は、T細胞の所望の用量のような全細胞の所望の用量の許容差で又はその範囲内で投与される。幾つかの態様においては、所望の用量は所望の細胞数、又は細胞が投与される対象の体重の単位当たりの所望の細胞数、例えば細胞/kgである。幾つかの態様においては、所望の用量は、細胞の最小数以上、又は体重の単位当たりの細胞の最小数以上である。幾つかの態様においては、所望の用量で投与される全細胞のうち、個々の集団又は亜型は所望の結果（output）の比又はその近く、例えばそのような比の特定の許容差又は誤差内で存在する。
【０２８１】
幾つかの実施形態においては、細胞は、細胞の個々の集団又は亜型の1以上の、所望の用量の許容差で、又はその範囲内で投与される。幾つかの態様においては、所望の用量は亜型又は集団の細胞の所望の数、又は細胞が投与される対象の体重の単位当たりのそのような細胞の所望の数、例えば細胞/kgである。幾つかの態様においては、所望の用量は集団又は亜型の細胞の最小数以上、あるいは体重の単位当たりの集団又は亜型の細胞の最小数以上である。したがって、幾つかの実施形態においては、投与量は全細胞の所望の一定用量及び所望の比に基づいており、並びに／又は個々の亜型若しくは亜集団の1以上（例えば、それぞれ）の所望の一定用量に基づいている。
【０２８２】
ある実施形態においては、細胞、又は細胞の亜型の個々の集団は、約100万〜約1000億個の細胞、例えば100万〜約500億個の細胞（例えば、約500万個の細胞、約2500万個の細胞、約5億個の細胞、約10億個の細胞、約50億個の細胞、約200億個の細胞、約300億個の細胞、約400億個の細胞又は前記値の任意の2つにより定められる範囲）、例えば、約1000万〜約1000億個の細胞（例えば、約2000万個の細胞、約3000万個の細胞、約4000万個の細胞、約6000万個の細胞、約7000万個の細胞、約8000万個の細胞、約9000万個の細胞、約100億個の細胞、約250億個の細胞、約500億個の細胞、約750億個の細胞、約900億個の細胞又は前記値の任意の2つにより定められる範囲）、そして幾つかの場合においては、約1億〜約500億個の細胞（例えば、約1億2000万個の細胞、約2億5000万個の細胞、約3億5000万個の細胞、約4億5000万個の細胞、約6億5000万個の細胞、約8億個の細胞、約9億個の細胞、約30億個の細胞、約300億個の細胞、約450億個の細胞）の範囲又はこれらの範囲の間の任意の値で対象に投与される。
【０２８３】
幾つかの実施形態においては、全細胞の用量及び／又は細胞の個々の亜集団の用量は、約1×105細胞/kg〜約1×1011細胞/kg、104〜約1011細胞/キログラム（kg）体重の範囲内、例えば、105〜106細胞/kg体重、例えば、約1×105細胞/kg、1.5×105細胞/kg、2×105細胞/kg又は1×106細胞/kg体重である。例えば、幾つかの実施形態においては、細胞は、約104〜約109 T細胞／キログラム（kg）体重、例えば105〜106 T細胞/kg体重、例えば1×105 T細胞/kg、1.5×105 T細胞/kg、2×105 T細胞/kg又は1×106 T細胞/kg体重で、又はそれらの或る誤差範囲内で投与される。他の例示的な実施形態においては、本開示の方法で使用される修飾細胞の適切な投与量範囲には、約1×105細胞/kg〜約1×106細胞/kg、約1×106細胞/kg〜約1×107細胞/kg、約1×107細胞/kg〜約1×108細胞/kg、約1×108細胞/kg〜約1×109細胞/kg、約1×109細胞/kg〜約1×1010細胞/kg、約1×1010細胞/kg〜約1×1011細胞/kgが含まれるが、これらに限定されるものではない。例示的な実施形態においては、本開示の方法で使用される適切な投与量は約1×108細胞/kgである。例示的な実施形態においては、本開示の方法で使用される適切な投与量は約1×107細胞/kgである。他の実施形態においては、適切な投与量は約1×107個の全細胞〜約5×107個の全細胞である。幾つかの実施形態においては、適切な投与量は約1×108個の全細胞〜約5×108個の全細胞である。幾つかの実施形態においては、適切な投与量は約1.4×107個の全細胞〜約1.1×109個の全細胞である。例示的な実施形態においては、本開示の方法で使用される適切な投与量は約7×109個の全細胞である。
【０２８４】
幾つかの実施形態においては、細胞は約104〜約109細胞/キログラム（kg）体重、例えば105〜106細胞/kg体重、例えば約1×105細胞/kg、1.5×105細胞/kg、2×105細胞/kg又は1×106細胞/kg体重で、又はそれらの或る誤差範囲内で投与される。幾つかの実施形態においては、細胞は約1×106、約2.5×106、約5×106、約7.5×106又は約9×106細胞及び／又はそれらを超える数及び／又は少なくともそれらの数で、又はそれらの或る誤差範囲内で投与される。幾つかの実施形態においては、細胞は約108〜1012又は約1010〜1011 T細胞、約10s〜1012、又は約1010〜1011細胞で、又はそれらの或る誤差範囲内で投与される。
【０２８５】
幾つかの実施形態においては、細胞は複数の細胞集団又は亜型の所望の結果（output）の比で、又はそれらの許容範囲内で投与される。幾つかの態様においては、所望の比は特定の比であることが可能であり、あるいは比の範囲であることが可能であり、例えば、幾つかの実施形態においては、所望の比は約5：1〜約5：1（又は約1：5超及び約5：1未満）、又は約1：3〜約3：1（又は約1：3超及び約3：1未満）、例えば約2：1〜約1：5（又は約1：5超及び約2：1未満）、例えば約5：1、4.5：1、4：1、3.5：1、3：1、2.5：1、2：1、1.9：1、1.8：1、1.7：1、1.6：1、1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9：1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5、又は1：5である。幾つかの態様においては、許容差は、所望の比の約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%以内であり、これらの範囲の間の任意の値を含む。
【０２８６】
幾つかの実施形態においては、修飾細胞の用量は、それを要する対象に、単一用量（1回量）又は複数用量で投与される。幾つかの実施形態においては、修飾細胞の用量は、複数用量で、例えば週1回又は7日ごと、2週間に1回又は14日ごと、3週間に1回又は21日ごと、4週間に1回又は28日ごとに投与される。例示的な実施形態においては、修飾細胞の単一用量が、それを要する対象に投与される。例示的な実施形態においては、修飾細胞の単一用量が、それを要する対象に、急速静脈内注入により投与される。
【０２８７】
疾患の予防又は治療のための適切な投与量は、治療される疾患のタイプ、細胞又は組換え受容体のタイプ、疾患の重症度及び経過、細胞が予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるか、過去の治療、対象の病歴及び細胞に対する応答、並びに主治医の裁量に左右されうる。組成物及び細胞は、幾つかの実施形態においては、1度に、又は一連の治療にわたって、対象に適切に投与される。
【０２８８】
幾つかの実施形態においては、細胞は併用療法の一部として投与され、例えば、別の治療的介入、例えば抗体又は操作された細胞又は受容体又は物質、例えば細胞毒性物質又は治療用物質と同時に、又は任意の順序で連続的に投与される。幾つかの実施形態における細胞は1以上の追加的治療用物質と共に、又は別の治療的介入と共に、同時に、又は任意の順序で連続的に、共投与される。幾つかの状況においては、細胞集団が1以上の追加的治療用物質の効果を増強するように、又はその逆となるように、細胞は、時間的に十分に近い別の療法と共投与される。幾つかの実施形態においては、細胞は、1以上の追加的治療用物質の前に投与される。幾つかの実施形態においては、細胞は1以上の追加的治療用物質の後で投与される。幾つかの実施形態においては、1以上の追加的物質には、サイトカイン、例えば持続性を増強するサイトカインが含まれる。幾つかの実施形態においては、方法は化学療法剤の投与を含む。
【０２８９】
細胞の投与の後、幾つかの実施形態における操作された細胞集団の生物活性は、例えば幾つかの公知方法のいずれかにより測定される。評価すべきパラメータには、インビボでの、例えばイメージングによる、又はエクスビボでの、例えばELISA若しくはフローサイトメトリーによる、操作された又は天然のT細胞又は他の免疫細胞の、抗原への特異的結合が含まれる。ある実施形態においては、操作された細胞が標的細胞を破壊する能力は、当技術分野で公知の任意の適切な方法、例えば、Kochenderferら, J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)及びHermanら J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)に記載されている、細胞毒性（細胞傷害性）アッセイを用いて測定されうる。ある実施形態においては、細胞の生物活性は、1以上のサイトカインの発現及び／又は分泌をアッセイすることにより測定される。幾つかの態様においては、生物活性は、臨床成績、例えば腫瘍負担又は腫瘍量の減少を評価することにより測定される。
【０２９０】
H．医薬組成物及び製剤
また、本発明の造血細胞又はその前駆細胞の集団、並びにそのような細胞を含有する、及び／又はそのような細胞に関して富化されている組成物であって、組換え受容体を発現する細胞が、組成物中の全細胞又は或る型の細胞（例えば、T細胞又はCD8+若しくはCD4+細胞）の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上を構成する、組成物を提供する。組成物には、投与のための、例えば養子細胞療法のための医薬組成物及び製剤が含まれる。細胞及び組成物を対象、例えば患者に投与するための治療方法も提供する。
【０２９１】
また、投与のための細胞を含む組成物、例えば医薬組成物及び製剤、例えば、所定用量又はその分割量の投与のための細胞数を含む単位剤形組成物を提供する。医薬組成物及び製剤は、一般に、所望により使用されうる1以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。幾つかの実施形態においては、組成物は少なくとも1つの追加的治療用物質を含む。
【０２９２】
「医薬製剤」なる語は、それに含有されている有効成分の生物活性が有効となることを可能にする形態の製剤であって、製剤が投与される対象にとって許容できないほどに毒性の追加的成分を含有しない製剤を意味する。「薬学的に許容される担体」は、対象に対して無毒性である、有効成分以外の医薬製剤中の成分を意味する。薬学的に許容される担体には、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの態様においては、担体の選択は、部分的には、個々の細胞及び／又は投与方法により決定される。したがって、種々の適切な製剤が存在する。例えば、医薬組成物は保存剤を含有しうる。適切な保存剤には、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム及び塩化ベンザルコニウムが含まれうる。幾つかの態様においては、2以上の保存剤の混合物が使用される。保存剤又はその混合物は、典型的には、組成物全体の重量の約0.0001重量%〜約2重量%の量で存在する。担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.編 (1980)に記載されている。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量及び濃度で被投与者に無毒性であり、限定的なものではないが以下のものが含まれる：バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド;ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール; 3-ペンタノール;及びm-クレゾール）；低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖、二糖及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばEDTA；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）。
【０２９３】
幾つかの態様においては、緩衝剤が組成物中に含まれる。適切な緩衝剤には、例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム及び種々の他の酸及び塩が含まれる。幾つかの態様においては、2以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤又はその混合物は、典型的には、組成物全体の重量の約0.001重量%〜約4重量%の量で存在する。投与可能な医薬組成物の調製方法は公知である。例示的な方法は、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)に更に詳細に記載されている。
【０２９４】
製剤は水溶液を含みうる。製剤又は組成物はまた、細胞で治療される特定の適応症、疾患又は病態に有用な複数の有効成分、好ましくは、それぞれの活性が互いに負の影響を及ぼさない、細胞を相補する活性を有するものを含有しうる。そのような有効成分は、適切には、意図される目的に有効な量で組合されて存在する。したがって、幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、薬学的に活性な他の物質又は薬物、例えば化学療法剤、例えばアスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン及び／又はビンクリスチンを更に含む。幾つかの実施形態における医薬組成物は、疾患又は病態を治療又は予防するのに有効な量、例えば治療的有効量又は予防的有効量の細胞を含有する。幾つかの実施形態における治療的又は予防的有効性は治療対象の定期的な評価によりモニターされる。所望の投与量は、細胞の単回ボーラス投与、細胞の複数回ボーラス投与又は細胞の持続注入投与により送達されうる。
【０２９５】
製剤には、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下又は坐剤投与用の製剤が含まれる。幾つかの実施形態においては、細胞集団は非経口的に投与される。本明細書中で用いる「非経口」なる語は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣及び腹腔内投与を含む。幾つかの実施形態においては、細胞は、静脈内、腹腔内又は皮下注射による末梢全身送達を用いて対象に投与される。幾つかの実施形態における組成物は、無菌液体製剤、例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液又は粘性組成物として提供され、これらは、幾つかの態様においては、選択されたpHへと緩衝化されうる。液体製剤は、通常、ゲル、他の粘性組成物及び固体組成物よりも調製が容易である。また、液体組成物は、特に注射による投与が幾分簡便である。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間をもたらすために、適切な粘度範囲内で製剤化されうる。液体又は粘性組成物は、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びそれらの適切な混合物を含有する、溶媒又は分散媒でありうる担体を含みうる。
【０２９６】
無菌注射液は、細胞を溶媒中に配合することにより、例えば、適切な担体、希釈剤又は賦形剤、例えば無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合により調製されうる。組成物は、所望の投与経路及び製剤に応じて、例えば湿潤剤、分散剤又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化又は粘度増強添加剤、保存剤、香味剤及び／又は着色剤のような補助物質を含有しうる。幾つかの態様においては、適切な製剤を調製するために、標準的なテキストが参照されうる。
【０２９７】
組成物の安定性及び無菌性を高める種々の添加剤、例えば抗微生物保存剤、抗酸化剤、キレート剤及びバッファーが添加されうる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール及びソルビン酸により維持されうる。注射可能な剤形の長期吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらされうる。
【０２９８】
インビボ投与に使用される製剤は一般に無菌性である。無菌性は、例えば滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成されうる。
【０２９９】
J．動物モデル
本発明は、（例えば、細胞又は組織の）移植の後の疾患又は病態のインビボ動物モデルを提供する。幾つかの実施形態においては、動物モデルは、（例えば、細胞又は組織の）同種異系移植の後の疾患又は病態のものである。幾つかの実施形態においては、動物モデルは、（例えば、細胞又は組織の）異種移植の後の疾患又は病態のものである。ある実施形態においては、本発明は、（例えば、細胞又は組織の）同種異系移植の後の移植片対宿主病（GVHD）のインビボ動物モデルを提供する。ある実施形態においては、本発明は、（例えば、細胞又は組織の）異種移植の後の移植片対宿主病（GVHD）のインビボ動物モデルを提供する。本発明はそのような動物モデルを作製する方法をも提供する。
【０３００】
幾つかの実施形態においては、同種異系又は異種移植の後のGVHDのインビボ動物モデルは、同種異系細胞の集団を含む動物を含む。本明細書中で用いる「同種異系（allogenic）」なる語は、遺伝的には異なるが同じ種のものであり、免疫学的に不適合でありうる物質に関するものである。例えば、同種異系細胞又は組織は、同じ種に由来する遺伝的に異なる起源に由来する細胞又は組織である。本明細書中で用いる「異種（xenogenic）」なる語は、異なる種に属する物質に関するものである。例えば、異種細胞又は組織は、異なる種に由来する細胞又は組織である。
【０３０１】
本発明で提供する、GVHDのインビボ動物モデルは、GVHDのマウスモデルである。幾つかの実施形態においては、同種異系細胞は、同種異系血漿単核細胞（PBMC）である。幾つかの実施形態においては、異種細胞は異種PBMCである。幾つかの実施形態においては、マウスGVHDモデルは、同種異系（すなわち、遺伝的に異なるマウスに由来する）又は異種（すなわち、異なる種に由来する）PBMCの集団を含む免疫不全マウスを含む。
【０３０２】
種々の免疫不全マウス系統が当技術分野で公知であり、「ヌード」、「scid」、「rag欠損」及び「高次多重遺伝子」品種の免疫不全マウス系統を包含するが、これらに限定されるものではない。ヌードマウスはFoxn1nu突然変異に関してホモ接合である。Foxn1は、毛包と胸腺との両方の発生に必要な転写因子をコードする。その不存在下では、マウスは無毛かつ無胸腺である。胸腺が形成されないため、CD4+及びCD8+ T細胞が分化し成熟する部位が存在せず、ヌードホモ接合体をT細胞欠損にする。ScidマウスはPrkdcscid突然変異に関してホモ接合である。Prkdc遺伝子は、DNA修復に必要な、並びにT細胞受容体（TCR）及び免疫グロブリン（Ig）遺伝子の体細胞組換え中に生じる二本鎖DNA切断を閉じるのに必要な、DNA依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニットをコードする。Prkdcタンパク質の不存在下では、TCR及びIg遺伝子は再配列できず、T細胞とB細胞との両方が欠損したマウスが生じる。Rag欠損マウスは、機能的なRag1又はRag2タンパク質を発現できないマウスである。Prkdc遺伝子と同様に、Rag1及びRag2は共に、TCR及びIg遺伝子の体細胞組換えに必要であり、どちらかの遺伝子の不存在はT細胞及びB細胞の欠損を引き起こす。Rag1tm1Mom又はRag2tm1.1Cgn突然変異のいずれかを有するマウスは、同一ではないとしても非常に類似した表現型を有する。高次多重遺伝子免疫不全マウスは、Prkdcscid又はRag欠損マウスのいずれかから構築され、追加的な免疫不全増強突然変異を有する。これらのマウスに本発明者らのNSGマウス及びNRGマウスが含まれ、これらは、それぞれPrkdcscid及びRag1tm1Momと組合されたインターロイキン2受容体ガンマサブユニット遺伝子における特定の突然変異（Il2rgtm1Wjl）を有する。これらのマウスはB、T及びNK細胞欠損体である。また、それらは共にNOD/ShiLtJ遺伝的背景を有するため、それらは溶血性補体欠損体であり、マクロファージ及び樹状細胞の機能に負の影響を及ぼす対立遺伝子を有する。ある実施形態においては、免疫不全マウスはBALB/cマウスである。ある実施形態においては、免疫不全マウスはNOD/Scid/IL-2Rg -/-（NSG）マウスである。
【０３０３】
幾つかの実施形態においては、同種異系PBMCの集団は、遺伝的に異なるドナーマウスに由来しうる。ある実施形態においては、ドナーマウスはC57BL/6マウスである。ある実施形態においては、同種異系PBMCの集団は、C57BL/6マウスの骨髄に由来する。したがって、本発明の同種異系GVHDマウスモデルは、ドナーC57BL/6マウスの骨髄に由来する同種異系PBMCの集団を含む免疫不全BALB/cマウスを含む。
【０３０４】
幾つかの実施形態においては、異種PBMCの集団はヒトに由来しうる。したがって、本発明の異種GVHDマウスモデルは、ヒトに由来する異種PBMCの集団を含む免疫不全NSGマウスを含む。
【０３０５】
幾つかの実施形態においては、本開示のGVHD動物モデルを作製する方法は、同種異系又は異種PBMCの集団を宿主動物（例えば、マウス）に注射／投与することを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のGVHDマウスモデルを作製する方法は、同種異系又は異種PBMCの集団を免疫不全マウスに注射／投与することを含む。幾つかの実施形態においては、本開示の同種異系GVHDマウスモデルを作製する方法は、同種異系PBMCの集団を免疫不全マウスに注射／投与することを含む。幾つかの実施形態においては、本開示の異種GVHDマウスモデルを作製する方法は、異種PBMCの集団を免疫不全マウスに注射／投与することを含む。
【０３０６】
幾つかの実施形態においては、免疫不全マウスは同種異系又は異種PBMCの注射の前に非致死的に照射される。ある実施形態においては、免疫不全マウスの非致死的照射は、約50 rad〜約200 radの放射線量にマウスを曝すことを含む。幾つかの実施形態においては、免疫不全マウスの非致死的照射は、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約175、約180、約185、約190、約195、約200、約205、約210、約215、約220、約225 rad又はそれらの間の任意の値の放射線量にマウスを曝すことを含む。当業者は、マウスに適用するための適切な非致死的放射線量を決定しうるであろう。
【０３０７】
ある実施形態においては、約1×106〜約20×106個の同種異系又は異種PBMCが免疫不全マウスに注射／投与される。幾つかの実施形態においては、約0.5×106、0.6×106、0.7×106、0.8×106、0.9×106、1×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、2×106、3×106、4×106、5×106、10×106、15×106、16×106、17×106、18×106、19×106、19.5×106、19.6×106、19.7×106、19.8×106、19.9×106、20×106、20.1×106、20.2×106、20.3×106、20.4×106、20.5×106、21×106、22×106、23×106、24×106、25×106個又はそれらの間の任意の個数の同種異系又は異種PBMCが免疫不全マウスに注射／投与される。当業者は、免疫不全マウスに注射するための適切な数のPBMCを決定しうるであろう。
【０３０８】
幾つかの実施形態においては、本発明のGVHD動物モデルの生存は、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターで処理された場合、野生型動物と比較して低減する。ある実施形態においては、本発明のGVHDマウスモデルの生存は、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビターで処置された場合、野生型マウスと比較して低減する。
【０３０９】
本明細書中で言及又は引用されている論文、特許及び特許出願並びに全ての他の文書及び電子的に入手可能な情報の内容の全体を、各個の刊行物が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。出願人は、任意のそのような論文、特許、特許出願又は他の物理的及び電子的文書からの全ての資料及び情報を本出願に物理的に組み入れる権利を留保する。
【０３１０】
本発明はその特定の実施形態に関して記載されているが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の変更を加えることが可能であり、均等物での置換を行うことが可能である、と当業者により理解されるべきである。本明細書に開示されている実施形態の範囲から逸脱することなく、適切な均等物を使用して、本明細書に記載されている方法の他の適切な修飾及び適合化を行うことが可能であることは、当業者に容易に理解されるであろう。また、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセス工程又は複数工程を本発明の目的、精神及び範囲に適合させるために、多数の修飾を施すことが可能である。全てのそのような修飾は本明細書における特許請求の範囲の範囲内であると意図される。以上においては特定の実施形態が詳細に記載されているが、それらは、以下の実施例を参照することによってより明らかに理解されるであろう。そのような実施例は専ら例示目的で含まれているに過ぎず、限定的なものではない。
【実施例】
【０３１１】
実施例
以下の実験的実施例は限定的なものではなく、ステロイド及び／又はカルシニューリンインヒビター耐性免疫細胞を生成するための組成物及び方法に関する。
【０３１２】
材料及び方法：
GMP準拠のTreg
Tregを2段階の手法でヒトアフェレーシス産物から精製した。この場合、CD25+細胞（Tregを含む）を、GMP等級mAb結合磁気ビーズを使用してポジティブ選択し、ついでナイーブ及び記憶Treg PB（それぞれ、CD4+25++127-45RA+及びCD4+25++127-45RA-）に関して選別した（図1）。精製した細胞をGMP品質の人工抗原提示細胞（aAPC）で刺激し、高用量IL-2（300 U/ml）中で14日間培養した。増殖したTregを第14日にバンク化（凍結）した。本明細書に記載されている実験のために、Tregを解凍し、GMP準拠抗CD3/28ビーズで7〜10日間再刺激した。培養の終了時にTregの純度及びインビトロ抑制機能を評価した。ナイーブTregと記憶Tregとが類似したFoxp3+ 細胞数を示し、全ての培養物はインビトロで抑制性であった。
【０３１３】
実施例1：Tregの生存及び増殖に対するデキサメタゾンの効果
Tregが糖質コルチコイド受容体活性化の免疫抑制効果に感受性であるかどうかを判定するために、バンク化Tregの供給源（ソース）を作製した。磁気ビーズ富化末梢血細胞からバンク化Tregを作製した（4+25++127lo並びにナイーブ細胞及びエフェクターメモリー細胞に関してそれぞれCD45RA+及びCD45RA-の変異体）。反復実験においてより高い一貫性を得るために、IL-2と、抗CD3 mAbがローディングされたK562-CD64/86細胞とを使用して、精製Tregを14日間の培養において増殖させた。バンク化tTregを解凍し、抗CD3/28 mAbビーズを使用して再刺激し、ついで、示されているとおりに4±1日以上にわたって更に増殖させた。ついで、Tregを培養物±デキサメタゾン（Dex：10、30、100μg/ml）に分割し、生存性色素（viability dye）及び計数ビーズ（counting beads）を使用してフローサイトメトリーにより相対生存性を2〜3日後に評価した。
【０３１４】
Dexは、培養内のTreg数を用量依存的に減少させた（図2B）。いずれの理論にも束縛されるものではないが、フローソーティングではなく磁気ビーズを使用して、ラパマイシンの不存在下で長期培養したことにより、Treg増殖培養は10〜35%のFoxp3- 細胞を含有した。細胞数の減少がTregの優先的喪失によるものであったという可能性を排除するために、前記培養物をCD127及びFoxp3によっても染色し、Treg（CD4+ CD127- Foxp3+）及び非TregについてDexに対する相対感受性を判定した（図2C）。Dex処理はTreg培養の純度に有意な影響を及ぼさなかった。このことは、Tregの生存率/生存が、Dexにより負の影響を受けたことを示している。30μg/ml Dexの存在下又は不存在下で増殖させたTregの抑制的機能を試験した（図2D）。再増殖培養内でのDexへのTregの曝露は抑制的機能を増強した。
【０３１５】
実施例2：遺伝子標的化法
核内受容体サブファミリー3,群C,メンバー1（NR3C1）遺伝子は、コルチゾール及び他の糖質コルチコイドが結合する受容体である糖質コルチコイド受容体（GR；NR3C1としても公知である）をコードしている。標的化法は、プログラム可能なヌクレアーゼ遺伝子破壊と、変異性（error prone）非相同末端結合経路（nonhomologous end-joining pathway）（NHEJ）を介した突然変異誘発性DNA修復とによって、エクソン2を破壊することであった。Tregにおける遺伝子標的化適用のための条件を明確に定めるために、NR3C1の直接遺伝子破壊及び新規相同組換え修復アプローチのための包括的アプローチを採用した。
【０３１６】
カルシニューリンインヒビター耐性遺伝子の標的化挿入を、それが糖質コルチコイド受容体遺伝子座を破壊するように行うことにより、二重薬物（ステロイド及びカルシニューリンインヒビター）耐性を生じさせるための方法を開発した。これを達成するために、クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（CRISPR）/Cas9系から誘導された4つの試薬を試験用に設計した。送達及び薬物投与パラメーターを最適化するために、Jurkat細胞において試験を行った。細胞内分解を防ぐためにヌクレアーゼ耐性ホスホロチオアート結合で特別に修飾されたガイドRNA（gRNA）を伴うCas9 mRNAを試験した。並行して、リボ核タンパク質（RNP）産物としてgRNAと複合体形成したCas9タンパク質を試験した。遺伝子破壊と相同組換え修復（HDR）に基づく遺伝子編集との両方に関して、2つの送達方法を比較した。投与、時機及びエレクトロポレーション条件の徹底的な最適化の後、Cas9 RNPがJurkat細胞における最適な遺伝子破壊及び修復のプラットフォームとして特定された。この方法は、化学修飾gRNAを必要とせず、幾つかの条件下では、研究及び臨床等級ゲノム工学及び細胞生成のためのより能率的な操作、合成及び送達方法に相当しうる。
【０３１７】
これらのパラメーターを使用して、T細胞のCRISPR/Cas9操作の利用を、図3Aに示されている実験計画を用いて遂行した。ヒト初代T細胞をIL-2の存在下で増殖させ、CD3/CD28ビーズで48〜72時間活性化した。CRISPR/Cas9試薬は、Neonエレクトロポレーション装置（ThermoFisher）を使用して送達されたガイドRNA転写産物（Synthego）及び組換えCas9ペプチド（Aldevron）を利用した。個々の候補はNR3C1のエクソン2に位置し、MIT CRISPRデザインツール（Design Tool）により特定された（図3B）。ヌクレアーゼ活性を評価するために、サーベイヤー（Surveyor）ヌクレアーゼアッセイを用いたところ（図3C）、サーベイヤーDNA断片化産物（図3D）から明らかなとおり、4つ全ての候補が活性であることが認められた。GR1及びGR2と称される特定された2つの候補が、最も高い活性レベルを示した（図3D）。
【０３１８】
実施例3：TregにおけるCRISPR/Cas9媒介性NR3C1ノックアウト
臨床的に適切なTregの培養において、GR1及びGR2ガイドが同様にNR3C1遺伝子座をノックアウトしうるかどうかを判断するために、バンク化Tregを解凍し、高用量IL-2（300U/ml）中で抗CD3/28ビーズで再刺激した。第3日に、GR1又はGR2 GRISPR/Cas9 RNPの不存在下又は存在下、前記のとおりにTregをエレクトロポレーションし、最適な増殖条件における培養に戻した。2日後、Treg培養を回収し、デキサメタゾン（30μg/ml）の存在下又は不存在下で更に48時間（合計7日間）再培養し、その時点で培養物を回収し、生存性色素及び計数ビーズを使用して、フローサイトメトリーにより相対生存性を評価した。30μg/mLの用量は、CRISPR/Cas9遺伝的修飾及び0〜100μg/mLのデキサメタゾン投与を受けたJurkat細胞及び初代T細胞において、ベータ試験を実施することにより特定された。図4Bに示されているとおり、GR2 CRISPR/Cas9でエレクトロポレーションされたTregはデキサメタゾンの存在下でその生存性が有意に増加した。非相同末端結合によるCRISPR/Cas9遺伝子修復はgRNA結合部位の近位に挿入及び欠失（インデル）をもたらす。したがって、TIDE（分解によるインデルの追跡（tracking of indels by decomposition））と称される配列トレース分解アルゴリズムを使用して、インデルパターンを評価した。デキサメタゾン曝露の前及び後のサンプルを分析した（それぞれ、図4C及び4D）。デキサメタゾン添加前にTregにおいて遺伝子不活性化をもたらすと予想されるフレーム外インデルの頻度は約35%であり、これは、GR2 GRISPR/Cas9試薬で処理された末梢血T細胞で実験的に観察されたもの（約40%）に近い値である。デキサメタゾンにおける培養の後、インデルの頻度は44%に増加した。いずれの理論によっても束縛されるものではないが、これは遺伝子修飾Tregの優先的生存を示している。また、デキサメタゾン耐性を獲得した細胞はフレーム外インデルの富化を示した。
【０３１９】
実施例4：Tregにおける相同組換え修復
二重薬物（ステロイド及びカルシニューリンインヒビター）耐性を達成するために、Jurkat細胞及び初代T細胞を使用して、最適な相同組換え修復（HDR）のための条件を定めた。Cas9 mRNA及びCas9 RNPアプローチを比較し、ヒトAAVS1遺伝子座においてレポーターHDR構築物を使用してHDRを促進するそれらの能力を評価した。これらの研究においては、Cas9 RNP及びその直後のAAVウイルスドナー鋳型の添加が最大値（65%を超えるHDR率）をもたらすことが観察された。HDR鋳型は、図5Aに示されているとおりに設計され、GFPと共発現されて、MNDプロモーターにより駆動されるカルシニューリン耐性遺伝子を含有していた。カルシニューリン耐性遺伝子に隣接して、NR3C1遺伝子に相同なドナー標的化アームが位置しており、その結果、挿入は、エクソン2を破壊し、それと共に21アミノ酸の欠失をもたらした（図5A）。Treg培養におけるHDRのための条件を定めるために、AAV形質導入に最適な条件（2×106細胞/mlのTreg密度）を用いた。ドナーをAAV-6血清型ウイルス粒子内にパッケージし、種々の感染多重度（MOI）で、GR2 gRNA及びCas9タンパク質でエレクトロポレーションされたTregに添加した。1つのPCRプライマーをドナーの内側に、もう1つをドナーの外側の隣接ゲノム遺伝子座に配置する、インサイドアウト（inside-out）PCR法を用いて、各MOIにおいてTregにおけるHDRを観察した（図5B）。サンガー配列決定は内因性遺伝子座とのドナーアームの連結を示した（図5C）。
【０３２０】
実施例5：最適Treg増殖条件下でGR2-Cas9及びAAVを使用する、TregにおけるHDR
臨床的に適切な培養状況においてHDRを最適化するために、バンク化Tregを解凍し、刺激し、2日間増殖させ、ついでGR2-Cas9でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を3×105のMOIでAAVで形質導入し、最適なTreg増殖条件に戻した。これらの条件下、形質導入後にTreg増殖は有意な影響を受けず（図6B）、HDRドナーからのGFP発現が観察された（図6C）。GR2-Cas9及びCnBmut.AAVで処理されたTreg集団は、デキサメタゾンと共に培養した場合、生存の増加を示した（図6D）。
【０３２１】
実施例5：本発明のTregは治療最高値の3倍超の条件でCsA又はFK506毒性に感受性でない
Tregの生存及び増殖に対するCNIのインビボ阻害効果をモデル化するために、バンク化Tregを解凍し、再刺激し、4±1日間増殖させ、シクロスポリン（20、200及び2000ng/ml）又はFK506（3、10、30ng/ml）の存在下又は不存在下で更に2〜3日間処理し、相対生存をフローサイトメトリーにより評価した。1つのサブセットがDex及びCNIに対して示差的に感受性であるかどうかを判定するために、並びにIL-2依存性の差異が、より低いIL-2濃度を許容しうるかどうかを判定するために、未分離のTreg、ナイーブTreg及び記憶Tregを使用して試験を行った。3つの母集団における結果のパラメーターに差異は見られなかった。
【０３２２】
図7は、これらの条件下、CsAもFK506も、治療最高値の3倍を超える濃度でさえ、インビトロでのTreg生存に有意な効果を与えなかったことを示している。カルシニューリンの主要標的の1つ、すなわちCNIは、転写因子NFATであり、これはCD28の下流で活性化され、Tregの発生に必要である。IL-2シグナル伝達もNFATを活性化しうる。いずれの理論にも束縛されるものではないが、インビトロでのTregに対するCsA及びFK506の毒性の欠如は、培養内の超生理学的なIL-2濃度によるものでありうる。IL-2濃度を低下させることで効果が現れうるかどうかを試験するために、解凍/再刺激したTregを培養の最後の3日間にわたって滴定濃度のIL-2のCsA又はFK506に曝露し、相対生存性をフローサイトメトリーにより評価した。
【０３２３】
実施例6：Tregの遺伝子修飾が免疫抑制環境において有効性を増強することを検証するための、GVHDのインビボモデル用の糖質コルチコイド及びカルシニューリンインヒビタープラットフォームの確立
遺伝子修飾（GR2-CRISPR/Cas9）又は遺伝子編集（GR2-CRISPR/Cas9/AAV-CaN mut.）されたTregが糖質コルチコイドの存在下でインビボ有効性を増強するかどうかを試験するために、糖質コルチコイド（メチルプレドニゾロン）が前臨床マウスモデルにおいてGVHDにどのように影響を及ぼすのかを最初に判定した。以下の幾つかの理由により、同種異系GVHDモデルを使用した：1）Csaの最適GVHD予防用量（最適は80mg/kg/日、一方、20また40mg/kg/日では無効）及びFK506の最適GVHD予防用量（カルボキシメチルセルロースにおいて36mg/kg/日（第100日の生存率55%〜90%、一方、ビヒクルでは第37日までに0%）、水溶液中で48mg/kg/dayで幾らかの毒性があり、12又は24mg/kg/dayではより低い効力; n = 16〜26/群）が確立されている；2）90%超のマウスにおいてGVHD予防をもたらす最適なTreg作製及び増殖プロトコル、そして更に、GVHDを均一に予防するには低すぎる閾値Treg:Teffctor比（0.75：1は準最適とみなされた；0.5：1は50%未満の長期生存レベルで防御をもたらした）を決定する力価測定（titered）用量が確立されている；並びに3）同種異系GVHDモデルは、Treg及びTeffectorの輸送、持続性及び機能を含むGVHD病態生理学的研究に非常に適しており、Treg及びTeffectorの詳細な研究を促進させる。これらの理由、及び同種異系GVHDモデルのよりロジスティックに実施可能で費用効果的な利点のため、GVHDの予防及び治療のための同種異系レシピエントにおける最適化ステロイド使用を最初に試験し、ついで、ヒトTreg産物の試験を可能にする異種モデルに適用した。致死的照射BALB/cレシピエントを使用して、C57BL/6（B6）ドナーの骨髄 + 2×106個のT細胞、1、3及び6mg/kg/用量の用量のメチルプレドニゾロンを第1日〜第28日に試験し、一方、ラパマイシンを0.5mg/kg/日で第0日〜第14日に、ついで第27日まで週3回で試験した。生存率及びp値を図8に示す。T細胞の用量を1.5×106に減少させ、第3日又は第4日（第1日の予防ではなく）からGVHD療法に移行し、ビヒクル及びプレドニゾロンと無処理を比較した（n = 8/群）。プレドニゾロンでの第3日のGVHD療法は、良好な結果を示した（図9）。
【０３２４】
プレドニゾロン治療を第4日まで遅らせても効果はなかった。次に、10mg/kg（第3日〜第28日）のプレドニゾロンが再現可能かどうかを判定するための実験を行い、これが当てはまることが観察された（図10）。
【０３２５】
これらのデータは、ステロイドがマウスの一部を救うが治癒的ではない、GVHDのステロイド治療モデルを提供し、ステロイド耐性又は感受性であるTregの添加を試験するための一形態を提供する。
【０３２６】
実施例7：異種GVHDモデルにおけるステロイド及びカルシニューリンインヒビターに基づくGVHD予防及び治療レジメンの確立
プレドニゾロン、CsA及びFK506の最適用量を決定するために、非致死的照射（50 rad）を行った免疫不全NOD/Scid/IL-2Rg-/-（NSG）マウスに15×106個のヒト末梢血単核細胞（PBMC）を投与した。図11Aに概要が示されているとおり、マウスに高用量のプレドニゾロン（30mg/kg、第0日〜第28日）を投与した。なぜなら、同種異系GVHDモデルにおいて、10mg/kgでは、不完全なGVHD予防しか認められなかったからである（図8〜10による）。プレドニゾロンのこの用量／スケジュールは生存上の利点をもたらさず、差は有意ではなかったものの処理マウスはより低い生存期間中央値を示した（25日対29日）（図11B）。生存に加えて、体重減少及びヒトT細胞増殖がこの異種GVHDモデルにおける疾患重症度のマーカーであることが示された。この実験においては、プレドニゾロン処理体の平均体重は対照と有意には異ならなかった（図11C）。これらのマウスは第19日に血中に有意に多数のヒトCD4+及びCD8+ T細胞を有していた（図11D）。
【０３２７】
異種GVHDモデルに対するCNIの効果を評価するために、マウスに通常どおりにヒトPBMCを投与し、FK506を2用量（36又は12mg/kg）で、又はCsA（80mg/kg）を投与した（図12A）。高用量FK506が投与されたマウスは生存率が有意に低下し（p < 0.03）、12mg/kgのFK506が投与されたマウスは、より低い生存期間中央値を示したが（20日対29日）、生存率に有意差はなかった（図12B; P = 0.45）。CsAの投与を受けたマウスの傾向は生存率の増加であった（現在P = 0.15）。FK506及びCsAは共に、有意な早期体重減少をもたらした（図12C）。FK506及びCsAは共に、ヒトCD45+、CD4+及びCD8+ 細胞のインビボ増殖を有意に低減した（図12D;各CNIコホート及び各細胞型対PBMCのみの対照動物でp < 0.05）。追跡調査が示すところによると、200 rad+ 1×107個のヒトPBMCで誘発された異種GVHDの病状はより高い再現性を示し、生存期間中央値は約25日から約20日へと短縮される。この修飾異種GVHDモデルにおける低用量のプレドニゾン及びCNIの効果を評価するために、マウスに照射し（200 rad）、ヒトPBMCを注射し（iv、1×107）、プレドニゾン（ip、10mg/kg）、FK506又はCsA（ip、それぞれ2mg/kg又は20mg/kg）を投与した（図13）。
【０３２８】
実施例8：遺伝子編集されたTregの特徴づけ
エレクトロポレーションの前に刺激性CD3/28ビーズの枯渇が必要であるため、これが増殖に負の影響を与えるかどうかを評価した。インビトロで増殖させたナイーブTregを解凍し、CD3/28ビーズ（3：1のビーズ：Treg）で再刺激し、第3日にサンプルを分割し、ビーズを1つのサンプルから磁気的に枯渇させた。ビーズの枯渇の後、Tregを更に4日間（合計7日間）にわたって培養に戻した。図14に示されているとおり、示されている種々の操作の後、増殖に対する有意な影響は見出されなかった（n = 5）。
【０３２９】
Tregは細胞外DNAに特に感受性であり、エレクトロポレーションは壊死性細胞死及びDNAの遊離を引き起こしうるため、エレクトロポレーションがTregの増殖に影響を及ぼすかどうかを試験した。インビトロで増殖させたナイーブTregを解凍し、CD3/28ビーズ（3：1のビーズ：Treg）で再刺激した。第3日に、ビーズを磁気的に枯渇させ、Tregをエレクトロポレーションで処理し又は処理せず、ついで細胞を更に4日間（合計7日間）わたって培養に戻した。エレクトロポレーションは増殖に有意な影響を及ぼさないことが見出された（図14B）。エレクトロポレーション効率のマーカーとして、Tregのサンプルをインビトロ転写GFP mRNAの存在下でエレクトロポレーションした。mRNAが、良好な忍容性を示しただけでなく、GFPが全細胞において高レベルで均一に発現され、発現は形質導入後少なくとも7日間持続した（図14C及び14D）。
【０３３０】
実施例9：Tregにおける塩基編集
塩基エディターをコードするタンパク質又はmRNAとしての塩基エディターを、塩基エディターでの編集のために塩基を標的化するためのガイドRNAと共にエレクトロポレーションすることにより、Treg細胞を塩基編集した。ついで、編集細胞のゲノムDNAを単離し、標的遺伝子座をPCR増幅した。ついで、PCR増幅遺伝子座をサンガー配列決定により配列決定した。標的部位において複数のピークを特定することにより、塩基変換を観察した。ついで、塩基編集頻度を定量するために、EDITR法を用いて、PCRアンプリコン配列データを分解した（Kluesnerら "EditR: A novel base editing quantification software using Sanger sequenceing".DOI: 10.1101/213496. 2017を参照されたい）。図19〜22及び24〜27においては、塩基編集配列が赤色のボックスで示されている。
【０３３１】
図16は、CRISPR不活化又はニッキングDNA結合ドメインがdCas9であり、塩基編集ドメインがシチジンデアミナーゼである、塩基編集を例示する概要図を示す。図17に示されているフロー図に従い、単離されたTregにおいて塩基編集を行った。塩基エディターはRNP複合体として送達可能であり、この場合、ガイドRNAは、内因性RNaseによる細胞内分解を防ぐホスホロチオアート結合で修飾されていても修飾されていなくてもよい。本適用においては、塩基エディターをメッセンジャーRNAとして送達し、ガイドRNAを、細胞内分解を防ぐ5'及び3'ホスホロチオアート結合を含有するように合成した。塩基編集標的化設計は、未成熟終止コドンが導入されるように、ヌクレオチドを変換するように意図／設計された。更に、イントロンの切除並びに適切なオープンリーディングフレーム配向及び発現に必要なスプライスドナー及びアクセプターとして定められるエクソン：イントロン境界の配列も、スプライシングを破壊するための変換のために標的化された。イントロンを保持する不適切にスプライシングされたRNAは、RNAを不安定化して、タンパク質発現の分解及び喪失を引き起こす。
【０３３２】
NR3C1のエクソン2に未成熟終止コドンを導入するために塩基編集を行った。配列番号7に示される配列を有するガイドRNA及び塩基エディターmRNAで、Tregのエレクトロポレーションを行った。遺伝子座の配列決定は、塩基編集が、ゲノム配列内のシトシン（C）のチミン（T）への編集をもたらし、それにより、未成熟TAA終止コドンを与えることを示した（図18及び19）。
【０３３３】
NR3C1のエクソン2に未成熟終止コドンを導入するために塩基編集を行った。配列番号8に示される配列を有するガイドRNA及び塩基エディターmRNAで、Tregのエレクトロポレーションを行った。遺伝子座の配列決定は、塩基編集が、ゲノム配列内のシトシン（C）のチミン（T）への編集をもたらし、それにより、未成熟TAG終止コドンを与えることを示した（図20及び21）。
【０３３４】
図22は仮想遺伝子のスプライス部位の破壊の結果の概要図を示す。スプライスドナー又はスプライスアクセプター部位のいずれかの塩基編集は、遺伝子の正常なスプライシングを破壊して、遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらしうる。
【０３３５】
NR3C1におけるスプライスアクセプターを破壊するために塩基編集を行った。配列番号55に示される配列を有するガイドRNA及び塩基エディターmRNAで、Tregのエレクトロポレーションを行った。遺伝子座の配列決定は、塩基編集が、ゲノム配列内のアデノシン（A）のグアニン（G）への編集をもたらし、それにより、突然変異GGスプライスアクセプター部位を与えることを示した（図23及び24）。
【０３３６】
NR3C1におけるスプライスドナーを破壊するために塩基編集を行った。配列番号56に示される配列を有するガイドRNA及び塩基エディターmRNAで、Tregのエレクトロポレーションを行った。遺伝子座の配列決定は、塩基編集が、ゲノム配列内のグアニン（G）のアデノシン（A）への編集をもたらし、それにより、突然変異スプライスドナー部位を与えることを示した（図25及び26）。
【０３３７】
実施例10：エフェクターT細胞における塩基編集
タンパク質としての塩基エディター又は塩基エディターをコードするmRNAを、塩基エディターでの編集のために塩基を標的化するガイドRNAと共にエレクトロポレーションして、エフェクターT細胞（Teff）を塩基編集した。図27は2つの実験の概要を示す。ある実験においては、BE4を使用し2ラウンドのビーズ刺激によりエフェクターT細胞（Teff）において糖質コルチコイド受容体遺伝子座を塩基編集した。第2の実験においては、BE4を使用し1回のみのビーズ刺激によりエフェクターT細胞において糖質コルチコイド受容体遺伝子座を塩基編集した。図28は、デキサメタゾンの存在下又は不存在下でgRNA GR2（表1の配列番号8）又はBE4（表2の配列番号20）を使用して修飾されたドナーからの糖質コルチコイド受容体塩基編集の後のCD4+ エフェクターT細胞（Teff）の相対生存率（%）を示すデータを示す。第1ドナーの細胞には2ラウンドの刺激を与え、第2ドナーの細胞には1ラウンドの刺激を与えた。2ラウンドの刺激を受けたTeffはデキサメタゾン（Dex）に対して非常に感受性であった。両方の実験において、2ラウンドのBE4での編集は30μg/mlのGR2より有効であった（それぞれ、p < 0.001、p < 0.01）。  
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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