(57)【要約】【課題】ベクター構築物、核酸分子、ファージ粒子、ファージディスプレイおよび蛍光ファージ粒子の産生方法の提供。【解決手段】以下のコンポーネントを含むベクター構築物：（ｉ）タンパク質をＴａｔ分泌経路中に誘導するシグナルペプチドをコードする配列、及び（ｉｉ）ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質をコードする配列に融合した蛍光団をコードする配列、並びにこうしたベクター又は核酸分子を含み蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を表面で発現するファージ粒子と一緒に、コンポーネント（ｉ）及び（ｉｉ）を含む核酸分子、こうした蛍光ファージ粒子を産生させる方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のコンポーネントを含むベクター構築物：
（ｉ）タンパク質をＴａｔ分泌経路中に誘導するシグナルペプチドをコードする配列、及び
（ｉｉ）ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質をコードする配列に融合した蛍光団をコードする配列。
【請求項２】
前記蛍光団が、βバレル構造体又は構築体を有する又は含む蛍光団である、請求項１に記載のベクター構築物。
【請求項３】
前記蛍光団がＧＦＰ、ＧＦＰ誘導体である、又はＧＦＰ構築体を有する、請求項２に記載のベクター構築物。
【請求項４】
前記蛍光団がｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ又はその変異体である、請求項３に記載のベクター構築物。
【請求項５】
前記ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎが配列番号４を含む、又は変異体配列が配列番号４と少なくとも７０％同一である配列である、請求項４に記載のベクター構築物。
【請求項６】
前記シグナルペプチドがＴｏｒＡ又はその変異体である、請求項１から５のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項７】
前記ＴｏｒＡ変異体がＴｏｒ  ＡＢ７又はその変異体である、請求項６に記載のベクター構築物。
【請求項８】
前記Ｔｏｒ  ＡＢ７が配列番号２を含む、又は変異体配列が配列番号２と少なくとも７０％同一である配列である、請求項７に記載のベクター構築物。
【請求項９】
前記ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質がＭ１３、ｆｄ若しくはｆ１ファージ又はそれらの変異体に由来するｐＶＩＩＩコートタンパク質に対応する、請求項１から８のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項１０】
前記ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質が配列番号８を含む、又は変異体配列が配列番号８と少なくとも７０％同一である配列である、請求項１から９のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項１１】
前記ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質又は変異体配列が、配列番号８の位置３３又は対応する位置にバリンからイソロイシンへの変異を有する、請求項１０に記載のベクター構築物。
【請求項１２】
前記イソロイシン残基をコードする核酸配列がコドンＡＴＡを含む、請求項１１に記載のベクター構築物。
【請求項１３】
前記ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質が、配列番号６１若しくは配列番号６１と少なくとも７０％同一である配列を含む、又は配列番号６０若しくは配列番号６０と少なくとも７０％同一である配列を含む核酸配列によってコードされる、請求項１１又は請求項１２に記載のベクター構築物。
【請求項１４】
前記ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質が配列番号２５を含む、又は変異体配列が配列番号２５と少なくとも７０％同一である配列である、請求項１から９のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項１５】
前記ベクターが、前記蛍光団と前記ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質の間のリンカーをコードする配列を更に含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項１６】
前記リンカーが配列番号６又はその変異体を含み、変異体配列が配列番号６と少なくとも７０％同一である配列である、請求項１５に記載のベクター構築物。
【請求項１７】
前記ベクターが、検出可能なタグをコードする配列を更に含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項１８】
前記タグが前記シグナルペプチドと前記蛍光団の間に位置する、請求項１７に記載のベクター構築物。
【請求項１９】
前記タグがＦＬＡＧタグ若しくはその誘導体又は別の負電荷タグである、請求項１７又は請求項１８に記載のベクター構築物。
【請求項２０】
前記ベクターが１個以上のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を更に含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項２１】
前記蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳を推進する前記ＲＢＳが弱いＲＢＳである、請求項２０に記載のベクター構築物。
【請求項２２】
前記ベクター構築物が、配列番号１６を含む配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列をコードする、請求項１から２１のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項２３】
前記ベクター構築物が、配列番号１８を含む配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列をコードする、請求項１から２１のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項２４】
前記ベクター構築物が、配列番号２０を含む配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列をコードする、請求項１から２１のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項２５】
前記ベクター構築物が、配列番号２２を含む配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列をコードする、請求項１から２１のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項２６】
前記ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質又は変異体配列が、配列番号８の位置３３に対応する位置にバリンからイソロイシンへの変異を有する、請求項２３から２５のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項２７】
前記イソロイシン残基をコードする核酸配列がコドンＡＴＡを含む、請求項２６に記載のベクター構築物。
【請求項２８】
前記ベクター構築物が、非ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質をコードする配列に融合した目的タンパク質をコードする配列を更に含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項２９】
前記ベクターがファージミド又はファージベクターである、請求項１から２８のいずれか一項に記載のベクター構築物。
【請求項３０】
請求項１から２９のいずれか一項に記載のコンポーネントを含む核酸分子。
【請求項３１】
請求項１から３０のいずれか一項に記載のベクター又は核酸分子を含み、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を表面で発現する、ファージ粒子。
【請求項３２】
前記ファージ粒子が繊維状ファージの粒子である、請求項３１に記載のファージ粒子。
【請求項３３】
ファージ粒子のライブラリであって、前記ファージ粒子が請求項３１又は請求項３２に記載のものであり、複数の異なる目的タンパク質が前記ファージ粒子の表面で発現される、ファージ粒子のライブラリ。
【請求項３４】
請求項１から３０のいずれか一項に記載のベクター構築物又は核酸分子を含む、ファージディスプレイシステム。
【請求項３５】
タンパク質Ｔａｔ  Ａ、Ｔａｔ  Ｂ及びＴａｔ  Ｃを過剰発現する大腸菌宿主細胞を更に含む、請求項３４に記載のファージディスプレイシステム。
【請求項３６】
請求項１から３０のいずれか一項に記載のベクター構築物若しくは核酸分子又は請求項３４若しくは請求項３５に記載のファージディスプレイシステムの使用を含む、蛍光ファージ粒子を産生させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファージディスプレイ、特に蛍光ファージ粒子及び蛍光ファージ粒子の産生のための核酸ベクターに関する。より詳細には、本発明は、蛍光団をコードする配列がｐＶＩＩＩファージコートタンパク質をコードする配列に融合したベクター構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去３０年にわたって、ファージディスプレイは、新規結合タンパク質の発見及び進展のための強力で効率的な方法になった。競合するコンビナトリアル技術が存在するが、使いやすさと共に高度の多用性を示すものはない。それにもかかわらず、ファージパニング後に所望の表現型をスクリーニングすることは依然として困難であり、最適な結合剤は特定されていない。蛍光標識リガンド及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、その回収と合わせて定量的に結合剤を非結合剤から効率的に分離するので、酵母ディスプレイなどのフローサイトメトリー適合性細胞コンビナトリアル技術によって提供される実時間選択は重要な利点を有する（非特許文献１及び２）。
【０００３】
効率的ＦＡＣＳに基づく方法は、幾つかの理由でファージディスプレイとはまだ統合されていない：１）ファージ粒子は、フロー中でサイズ（前方及び側方散乱）によって検出するには小さすぎ、したがって直接蛍光標識又は標識抗ファージ抗体などによる間接可視化が必要であり、感度及び有用性がかなり制限される（非特許文献３）、２）ＦＡＣＳは回収可能な物理的粒子を必要とし、したがって、ファージ粒子単独では小さすぎるので、標的が細胞表面で発現されるか、又はビーズなどの固相に固定化されなければならない、３）化学的結合によるファージの直接蛍光標識は、遊離反応基が結合部位若しくはその近くに存在するときには標的結合を破壊する可能性があり、又は抗原結合の立体障害をもたらす、４）抗体検出は、クローンを損失させる可能性があり選択効率を低下させる追加のインキュベーション及び洗浄ステップを必要とする。
【０００４】
したがって、固有の蛍光検出モジュールをファージプラットホームに統合すると、ＦＡＣＳに基づく方法を使用する能力をかなり改善し、蛍光を用いた検出に基づく他のタイプのアッセイに極めて有用なツールを提供するであろう。
【０００５】
ファージ粒子表面の蛍光タンパク質の機能性ディスプレイは、以前に行われている。例えば、Ｖｅｌａｐｐａｎら（非特許文献４）は、ある形態のＧＦＰがｐＩＸ又はｐＩＩＩファージコートタンパク質との融合体として発現され得るが、最良の構築物は、蛍光団とファージコートタンパク質の直接遺伝子融合体を含まなかったが、代わりに各コンポーネントが別々の個々のコンポーネントとしてコードされ、発現される、間接的翻訳後形式で蛍光団とファージコートタンパク質を連結するコイルドコイル配置を用いたことを示した。さらに、Ｓｐｅｃｋら（非特許文献５）は、ＧＦＰ及び幾つかのＧＦＰ誘導体がファージミド系においてｐＩＩＩファージコートタンパク質の切断型（Ｃ末端ドメインのみ）との直接融合体として発現され得ることを示した。
【０００６】
ｐＶＩＩＩは、繊維状ファージ上の主要なコート（カプシド）タンパク質であり、したがってｐＶＩＩＩコートタンパク質への蛍光団の融合は、ファージ粒子１個当たりのコピー数が多く、残りの４つのカプシドタンパク質のいずれかの上のチップディスプレイと非干渉であるために、潜在的に有利である。しかし、異種分子とｐＶＩＩＩコートタンパク質の伝統的ファージディスプレイに基づく融合体についての報告は、短いペプチドのディスプレイに限定される。
【０００７】
さらに、上述したように、古典的なファージディスプレイ技術を用いた蛍光団の機能性ファージディスプレイは、問題になり得る。その一つの理由は、蛍光団タンパク質が極めて感受性が高く、通常は、機能性であるために細胞質中で発現され、折り畳まれ、それが、ペリプラズムへの発現蛍光団−ファージコートタンパク質融合タンパク質の移行及びファージ表面に提示される機能性蛍光団を得る上で問題になり得ることである（非特許文献６）。
【０００８】
この問題に対処する現行技術は、蛍光標識抗ｐＶＩＩＩ抗体を使用するものであり、蛍光標識抗ｐＶＩＩＩ抗体は、ファージ粒子を蛍光標識するのに使用することができ、次いでファージ粒子を標準技術、例えばフローサイトメトリー又は蛍光染色法によって検出することができる。
【０００９】
より最近では、Ｈｅｓｓら（非特許文献７）は、ソルターゼ酵素を使用してファージ粒子の表面に存在するｐＶＩＩＩ分子にＧＦＰ分子を結合させる翻訳後技術を用いてファージｐＶＩＩＩコートタンパク質上のＧＦＰの融合を示すことによってこれらの問題の幾つかを克服した。これは、ソルターゼ酵素によって認識され得る短いペプチド挿入物を用いてｐＶＩＩＩコートタンパク質を発現するファージ粒子を得る標準ファージディスプレイ技術を使用することによって行われた。次いで、ファージ表面の修飾ｐＶＩＩＩコートタンパク質を標準供給源から得られるＧＦＰ分子に翻訳後連結するために、このペプチド挿入物を標準ソルターゼ技術に供することができる。
【００１０】
したがって、Ｈｅｓｓら（前掲）は、ｐＶＩＩＩタンパク質がＧＦＰ蛍光団に融合したファージ粒子を提供するが、それは、融合タンパク質が産生されるようにｐＶＩＩＩコートタンパク質をコードする核酸配列と蛍光団をコードする配列との遺伝子融合体がファージ粒子内に存在する古典的ファージディスプレイ技術では成されない。これは、Ｈｅｓｓのシステムに遺伝子型−表現型の関連性が存在しないことも意味する。これは、古典的ファージディスプレイ手法の重要な特徴が、目的タンパク質（例えば、標的リガンドに結合するタンパク質）を提示する選択されたファージ粒子がこの提示された目的タンパク質をコードする遺伝物質を含み、次いで目的タンパク質が得られ、更に分析又は処置され得ることである、スクリーニング技術には不利である。
【００１１】
本発明においては、驚くべきことに、上記などの先行技術の教示からの予想とは反対に、本発明者らは、蛍光タンパク質がｐＶＩＩＩファージコートタンパク質との遺伝子融合体としてファージ粒子上で提示され得ることを見いだした。これは、大腸菌Ｔａｔ分泌経路の使用と蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を組み合わせるベクター構築物の提供によって成された。こうしたベクターは、有利なことに、機能的で検出可能な蛍光タンパク質を提示するファージ粒子の産生を可能にする。換言すれば、ファージ粒子は、本質的に（又は本来的に）蛍光性である。
【００１２】
本発明者らは、蛍光ｐＶＩＩＩ融合タンパク質と別のコートタンパク質に融合した目的タンパク質の両方の同時表面ディスプレイを行うために、目的タンパク質（ＰＯＩ）と代替（非ｐＶＩＩＩ）ファージコートタンパク質の第２の融合体を組み込むのにこうしたベクターを使用できることも示した。換言すれば、本発明者らは、固有の蛍光能力とＰＯＩによって提供される別の能力、例えば標的結合活性の両方を有するベクター及びファージ粒子の産生を本明細書で示した。したがって、ベクター及びベクターを用いて産生されるファージ（本明細書ではＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅとも称する）のこの蛍光ファージシステムは、有利なことに、蛍光スクリーニングの利点及び容易性を、選択されたＰＯＩを古典的ファージディスプレイ由来の表現型−遺伝子型の関連性を用いて迅速に容易に調べる能力と組み合わせるために、選択及びスクリーニングに使用することができる。この蛍光ファージシステムは、それ自体で、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）として従来行われる古典的マイクロタイタープレートに基づくスクリーニング手法、又は類似の、現在簡易化され、代わりに定量的蛍光測定に依拠し得る、例えば蛍光結合免疫吸着検定法（ＦＬＩＳＡ）にそのまま適合するので、非ＦＡＣＳアッセイに使用される。他の使用についても本明細書で記述する。
【００１３】
さらに、本発明者らは、ファージディスプレイシステムの固有の部分としての検出モジュールとして遺伝子融合タンパク質を現在有し得ることを基礎として、コンビナトリアル分子進化を使用して、融合タンパク質を最適化し、改善もし得ることを示した。これは、蛍光団及びｐＶＩＩＩの一部をコードする配列を無作為化し、続いてＦＡＣＳにおいて母構築物に比べたシグナルの増加について表現型スクリーニングすることによって行われた。これは、得られるシグナルを母構築物で見られるよりも増加させる新しい変異融合タンパク質の特定を可能にした。この効果は、産生性大腸菌宿主への異種タンパク質のより良好な適応によると思われ、最終結果は、産生細胞とこの細胞によって産生されるファージ粒子からの両方の増加蛍光シグナルになる機能性融合タンパク質プールの増加である。さらに、本発明者らは、大腸菌宿主細胞におけるＴａｔトランスポーターの過剰発現が蛍光シグナルをかなり改善し得ることも示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，１９９７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，５５３−５５７
【非特許文献２】Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１，１６３−１７０
【非特許文献３】Ｂｏｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＰＮＡＳ  １０６：１３８０−１３８５
【非特許文献４】Ｖｅｌａｐｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（４）：ｅ２２，２０１０
【非特許文献５】Ｓｐｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＰＥＤＳ，２４，４７３−４８４，２０１１
【非特許文献６】ＤｅＬｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（３３），２９８２５−２９８３１，２００２
【非特許文献７】Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３：１４７８−１４８７，２０１２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、一態様においては、本発明は、以下のコンポーネントを含むベクター構築物を提供する。
（ｉ）タンパク質をＴａｔ分泌経路中に誘導するシグナルペプチドをコードする配列、及び
（ｉｉ）ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質をコードする配列に融合した蛍光団をコードする配列。
【００１６】
本発明のベクターは、発現ベクター又は発現構築物であり、すなわち、一般には、適切な宿主細胞において所望のコードされたタンパク質コンポーネントの発現（タンパク質合成）を可能にする核酸配列を含む。
【００１７】
上記概説したように、本発明はファージディスプレイの分野である。したがって、本発明のベクターは、ファージベクター又はファージミドベクター（プラスミド）とすることができ、その基本的構築物及びコンポーネントは、当業者によく知られており、種々のファージコートタンパク質に融合した異種又は外来タンパク質がファージ粒子の表面に提示されるように、適切な宿主細胞においてファージタンパク質の発現及びファージ粒子のパッケージングを行うために選択される。
【００１８】
したがって、本発明のベクターを使用して、適切な大腸菌株などの適切な宿主細胞を形質転換するときには、ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質に融合しファージ粒子の表面に提示される幾つかの機能性蛍光団分子を含むファージ粒子が、ベクター配列、又はファージ粒子に含まれるファージゲノムの種々のファージコンポーネントをコードする別の核酸配列を用いて産生される。ファージの表面に提示されるこうした機能性蛍光団は、（例えば、蛍光顕微鏡法若しくはフローサイトメトリー、又は蛍光リーダー若しくは検出器、例えば、プレートリーダー若しくはスキャナー又は照度計によって検出可能な）蛍光染色などの従来技術によって検出することができる。
【００１９】
本発明は、本発明のベクターの一部を形成することができる核酸配列又は核酸分子に及ぶ。したがって、本発明の別の一態様は、以下のコンポーネントを含む核酸分子又は核酸配列を提供する。
（ｉ）タンパク質をＴａｔ分泌経路中に誘導するシグナルペプチドをコードする配列、及び
（ｉｉ）ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質をコードする配列に融合した蛍光団をコードする配列。
【００２０】
本発明は、更に、本発明のベクター又は核酸分子を含み、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を表面で発現する、ファージ又はファージ粒子を提供する。こうしたファージ又はファージ粒子は、任意の繊維状ファージとすることができる。好ましい例は、腸内細菌ファージ、例えば、Ｍ１３、ｆｄ及びｆ１ファージである。
【００２１】
本発明のベクターは、したがって、シグナルペプチドをコードする配列を含む。このシグナルペプチド（又はシグナル配列、リーダー配列、ペリプラズムリーダーペプチド若しくはペリプラズムリーダー配列）は、例えばタンパク質をＴａｔトランスポーターに向ける、又は誘導することによって、タンパク質をツインアルギニン転座（Ｔａｔ）搬出又は分泌経路（又は転座経路）に誘導する、又は向ける、任意の適切な配列（アミノ酸配列）とすることができる。こうしたシグナルペプチドを本明細書ではＴａｔシグナルペプチドとも称する。本発明のベクターにおいては、シグナルペプチドをコードするこの配列は、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質（ｐＶＩＩＩタンパク質に融合した蛍光団タンパク質）をコードする配列に作動可能に結合し、こうしてタンパク質（蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質）をＴａｔ分泌経路中に誘導する。
【００２２】
Ｔａｔ経路は、大腸菌などの細菌宿主細胞に見られる幾つかの転座又は分泌経路の一つである。この経路においては、タンパク質が細胞質の還元条件中で折り畳まれた後、完全に折り畳まれたタンパク質が内膜を横切ってペリプラズムに転座する。ペリプラズムに到達すると、シグナルペプチドは、次いで、適切なシグナルペプチダーゼによって除去される。サイトゾル区画からペリプラズム区画へのタンパク質の転座に関与する大腸菌などのグラム陰性菌における他の公知の転座又は分泌経路は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）依存性ＳＥＣ経路、古典的分泌（Ｓｅｃ）経路又はＹｉｄＣ依存性経路である（Ｂａｎｅｙｘ，２００４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：１３９９−１４０８）。Ｔａｔ経路に対して、ＳＥＣ経路は、折り畳まれていないタンパク質を内膜を横切ってペリプラズムに輸送し、スレッディング機構を含むが、ＹｉｄＣ媒介輸送は、フリッパーゼ機構を利用した少なくとも部分的に折り畳まれた輸送を含むこともできる（Ｋｕｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  ５０９：５１６−５２０）。
【００２３】
Ｔａｔ経路に適切なシグナル配列又はシグナルペプチドは当業者によく知られており、これらのいずれでも使用することができ、実際にはタンパク質をＴａｔ経路中に誘導する保持若しくは改善された能力を示すその誘導体若しくは変異体を使用することができる。実際には、Ｔａｔ経路（ツインアルギニン転座）の名称は、Ｔａｔ経路を介した輸送を運命づけられたタンパク質のＮ末端領域に見られる高度に保存されたツインアルギニンリーダーモチーフ（Ｓ／ＴＲＲＸＦＬＫ、配列番号３３）を指す。この配列においては、Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは任意の極性アミノ酸とすることができる。したがって、これは、本発明のベクター中のシグナルペプチドの一部を形成することができる例示的配列であろう。
【００２４】
好ましい例は、タンパク質をＴａｔ経路を介して搬出する開始配列よりも改善された能力（例えば、機能性突然変異体の獲得）を保持又は所有する、大腸菌トリメチルアミンＮオキシド還元酵素（Ｔｏｒ  Ａ）シグナル配列又はその誘導体（若しくは変異体）であろう。例示的な好ましい誘導体は、例えば、ＤｅＬｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（３３），２９８２５−２９８３１，２００２）に記載されている。
【００２５】
野生型Ｔｏｒ  Ａリーダー配列の完全配列は以下の通りである（ＭＮＮＮＤＬＦＱＡＳＲＲＲＦＬＡＱＬＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＴ、配列番号３２）。このシグナルペプチド配列、又はそれがその一部であるタンパク質をＴａｔトランスポーターに向けるＴｏｒＡの特徴を共有する任意の他のシグナルペプチド配列を、本発明のベクターに使用することができる（例えば、ｉｎｔｅｒｐｒｏ  ｅｎｔｒｙ  ＩＰＲ００６３１１又はＢｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６：１６７に記載のように）。上記Ｔｏｒ  Ａ野生型リーダー配列においては、ツインアルギニンコンセンサスモチーフに下線が引かれ、この配列を含むシグナルペプチドを、Ｔａｔ経路へのターゲティングが保持されるならば、本発明のベクターに使用することができる。
【００２６】
本発明に使用される特に好ましいシグナルペプチドは、野生型ＴｏｒＡシグナルペプチドに比べてＴａｔ経路を介したタンパク質のペリプラズムターゲティングが改善されるように操作されたＴｏｒ  ＡＢ７シグナルペプチド（ＭＮＮＮＤＬＦＱＴＳＲＱＲＦＬＡＱＬＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＴ、配列番号２）である。Ｔｏｒ  ＡＢ７シグナルペプチドは、配列ＴＳＲＱＲＦＬＡ（配列番号３４）を有し、又は含み、下線の引かれた残基は野生型ＴｏｒＡシグナル配列とは異なる残基であり、この配列を含むシグナルペプチドは、Ｔａｔ経路へのターゲティングが保持されるならば、特に好ましい。
【００２７】
あるいは、ＤｅＬｉｓａら、前掲の表ＩＩに開示されたＴｏｒ  Ａ  Ｂ６、Ｅ２、Ｆ１、Ｆ１１又はＨ２突然変異体を使用することもできる。
【００２８】
したがって、本発明に使用される好ましいシグナルペプチドは、野生型ＴｏｒＡシグナルペプチドに比べてＴａｔ経路を介したタンパク質のペリプラズムターゲティングが改善されるように操作されたＴｏｒ  ＡＢ６シグナルペプチド（ＭＮＮＮＤＬＦＱＴＳＲＲＲＬＬＡＱＬＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＴ、配列番号３５）である。Ｔｏｒ  ＡＢ６シグナルペプチドは、配列ＴＳＲＲＲＬＬＡ、配列番号３６を有し、又は含み、下線の引かれた残基は野生型ＴｏｒＡシグナル配列とは異なる残基であり、この配列を含むシグナルペプチドは、Ｔａｔ経路へのターゲティングが保持されるならば、特に好ましい。
【００２９】
したがって、本発明に使用される好ましいシグナルペプチドは、野生型ＴｏｒＡシグナルペプチドに比べてＴａｔ経路を介したタンパク質のペリプラズムターゲティングが改善されるように操作されたＴｏｒ  ＡＥ２シグナルペプチド（ＭＮＮＮＤＩＦＱＡＳＲＲＲＦＬＡＱＰＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＴ、配列番号３７）である。Ｔｏｒ  ＡＥ２シグナルペプチドは、配列ＩＦＱＡＳＲＲＲＦＬＡＱＰ、配列番号３８を有し、又は含み、下線の引かれた残基は野生型ＴｏｒＡシグナル配列とは異なる残基であり、この配列を含むシグナルペプチドは、Ｔａｔ経路へのターゲティングが保持されるならば、特に好ましい。
【００３０】
したがって、本発明に使用される好ましいシグナルペプチドは、野生型ＴｏｒＡシグナルペプチドに比べてＴａｔ経路を介したタンパク質のペリプラズムターゲティングが改善されるように操作されたＴｏｒ  ＡＦ１シグナルペプチド（ＭＮＮＮＥＬＦＱＡＳＲＲＲＦＬＡＱＬＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＴ、配列番号３９）である。Ｔｏｒ  ＡＦ１シグナルペプチドは、配列ＥＬＦＱＡＳＲＲＲＦＬＡ、配列番号４０を有し、又は含み、下線の引かれた残基は野生型ＴｏｒＡシグナル配列とは異なる残基であり、この配列を含むシグナルペプチドは、Ｔａｔ経路へのターゲティングが保持されるならば、特に好ましい。
【００３１】
したがって、本発明に使用される好ましいシグナルペプチドは、野生型ＴｏｒＡシグナルペプチドに比べてＴａｔ経路を介したタンパク質のペリプラズムターゲティングが改善されるように操作されたＴｏｒ  ＡＦ１１シグナルペプチド（ＭＮＮＮＤＬＦＱＴＴＲＲＲＦＬＡＱＬＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＴ、配列番号４１）である。Ｔｏｒ  ＡＦ１１シグナルペプチドは、配列ＴＴＲＲＲＦＬＡ、配列番号４２を有し、又は含み、下線の引かれた残基は野生型ＴｏｒＡシグナル配列とは異なる残基であり、この配列を含むシグナルペプチドは、Ｔａｔ経路へのターゲティングが保持されるならば、特に好ましい。
【００３２】
したがって、本発明に使用される好ましいシグナルペプチドは、野生型ＴｏｒＡシグナルペプチドに比べてＴａｔ経路を介したタンパク質のペリプラズムターゲティングが改善されるように操作されたＴｏｒ  ＡＨ２シグナルペプチド（ＭＮＮＮＤＳＦＱＴＳＲＲＲＦＬＡＱＬＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＴ、配列番号４３）である。Ｔｏｒ  ＡＨ２シグナルペプチドは、配列ＳＦＱＴＳＲＲＲＦＬＡ、配列番号４４を有し、又は含み、下線の引かれた残基は野生型ＴｏｒＡシグナル配列とは異なる残基であり、この配列を含むシグナルペプチドは、Ｔａｔ経路へのターゲティングが保持されるならば、特に好ましい。
【００３３】
さらに、上記シグナルペプチド、特にＴｏｒ  ＡＢ７シグナルペプチド由来の更なる誘導体又は変異体は、こうした誘導体又は変異体配列がタンパク質をＴａｔ経路中に誘導する保持又は改善された能力を示すならば、本発明のベクターに使用することができる。タンパク質をＴａｔ経路中に誘導する能力は、任意の簡便な技術、例えば大腸菌ｔａｔＣ及びｔａｔＡＥ突然変異株を用いて、又は例えばＤｅＬｉｓａら、前掲に記載のようにタンパク質レポーターアッセイを用いて、容易に確認することができる。
【００３４】
適切な変異体は、上記シグナルペプチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一などの少なくとも７０％、７５％又は８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列又はアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、又はからなるシグナルペプチドを含み得る。これらの変異体配列は、タンパク質をＴａｔ分泌経路中に誘導することができるシグナルペプチドとして作用する機能特性を保持又は所有すべきである。シグナルペプチドとして作用する機能特性を保持又は所有するタンパク質をコードする能力が保持されるならば、これらの配列（又はこれらの相同配列）の機能性切断物又は断片を使用することもできる。変異シグナルペプチドの他の好ましい例は、上記シグナルペプチド中に最高６個、例えば最高５、４、３、２又は１個の改変アミノ酸を含む配列である。
【００３５】
本明細書に概説した実施形態においては、本発明のベクターは、第２の非ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質融合体、例えば、目的タンパク質（ＰＯＩ）に融合した第２の（異なる）ファージコートタンパク質をコードすることができ、次いでこれらの実施形態の一部においては、別のタイプの（すなわち、非Ｔａｔ）シグナル配列を非ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質融合体と一緒に使用することができ（非ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質融合体に作動可能に結合することができ）、又はシグナル配列を使用しなくともよく、例えば、ＰＯＩ−ｐＩＸ融合体を有する場合、シグナル配列を使用する必要がなく、時には使用しないことが好ましい。シグナル配列を使用しない実施形態においては、例えば、ＰＯＩ−ｐＩＸ融合構築物を有する場合、こうしたｐＩＸ融合タンパク質は、一般に、ＹｉｄＣ経路中に誘導される。非Ｔａｔシグナル配列が使用される実施形態においては、非ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質融合体は、選択されたシグナル配列の性質によって判断されて非Ｔａｔ分泌経路中、例えば、Ｓｅｃ分泌経路中に誘導される。
【００３６】
本発明のベクターにおいては、シグナルペプチド（Ｔａｔシグナルペプチド）をコードする配列が、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質をコードする配列に結合し、例えば作動可能に結合し、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質をＴａｔ分泌経路中に誘導する。
【００３７】
「融合タンパク質」、「融合」などの用語は、本明細書では、同じポリペプチド配列中又は同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中の２つ以上のタンパク質コンポーネントの機能的連結を記述するのに使用される。こうした融合タンパク質は、同じ核酸配列によってコードされるので、遺伝子融合体とも記述される（時には「融合遺伝子」又は「融合ヌクレオチド配列」と呼ばれる）。２つ（以上）のタンパク質コンポーネント（又はコード核酸配列）はこうした融合タンパク質において直接隣接することができるが、同様にこれらのコンポーネントは、適切なペプチドスペーサー又はリンカーによって連結することができる。当該技術分野でよく知られているように、スペーサー又はリンカーは、個々のタンパク質コンポーネントの各々が機能的に発現されるようにするのに、例えば、それらの天然の機能を果たす又は維持する適切な３次元構造をそれらが形成できるようにするのに重要であり得る。
【００３８】
したがって、本発明のベクターによってコードされる融合タンパク質においては、ペプチドスペーサー（又はリンカー）は、一般に、（時にはｐＶＩＩＩ融合タンパク質と称される）融合タンパク質の蛍光団とｐＶＩＩＩ部分の間、又は目的タンパク質（ＰＯＩ）と第２のファージコートタンパク質の間に含まれる。別の実施形態においては、こうしたリンカー又はスペーサーは、含まれる必要がなく、又はコンポーネントの一部の間にしか含まれなくてもよい。したがって、本発明のベクターにおいては、蛍光団又はＰＯＩをコードする配列を、コンポーネント間のスペーサー又はリンカー配列を用いて、又は用いずに、それぞれｐＶＩＩＩ又は他のファージタンパク質をコードする配列に融合させることができる。すべてのこれらの可能性（すなわち、スペーサー又はリンカー配列を含む又は含まない融合タンパク質又はコード核酸）は、なおも直接融合又は直接遺伝子融合とみなされる。
【００３９】
この考察はファージコートタンパク質と蛍光団又はＰＯＩとの間のリンカー又はスペーサーに焦点を合わせたが、リンカー配列は、本発明のベクターに適宜含むことができ、例えば、本明細書で述べるベクターの他のコンポーネント間、例えば、シグナルペプチドと蛍光団の間に含むことができる。
【００４０】
したがって、「ｐＶＩＩＩ融合タンパク質」という用語は、外来ペプチド又はタンパク質、この場合は蛍光団に融合したｐＶＩＩＩタンパク質（ファージｐＶＩＩＩタンパク質）又はその断片を指す。「ｐＩＩＩ融合タンパク質」、「ｐＶＩ融合タンパク質」、「ｐＶＩＩ融合タンパク質」又は「ｐＩＸ融合タンパク質」という用語は、外来ペプチド、例えば目的タンパク質（ＰＯＩ）に融合したｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ若しくはｐＩＸタンパク質（ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ又はｐＩＸファージタンパク質）（適宜）又はその断片を指す。
【００４１】
本発明のベクターは、したがって、ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質をコードする配列に融合（遺伝子融合）した蛍光団（本明細書では時には蛍光団−ｐＶＩＩＩと称する）をコードする配列（核酸配列）を含む。蛍光団及びｐＶＩＩＩは、ベクター中で任意の適切な順又は間隔とすることができる。ただし、発現され、ファージ粒子中にパッケージされると、蛍光団とｐＶＩＩＩの機能性融合タンパク質が形成され、融合タンパク質のｐＶＩＩＩコンポーネントがファージコートの一部を形成し、蛍光団がファージ粒子の表面で機能的に発現又は提示されることが条件である。融合タンパク質の蛍光団部分は、したがって、融合タンパク質のｐＶＩＩＩ部分とインフレームの位置にある。これは、蛍光団とｐＶＩＩＩが同じポリペプチド配列で、又は換言すれば直接融合体として、発現されることを意味する。本発明のベクターにおいては、融合タンパク質の蛍光団コンポーネントが融合タンパク質のｐＶＩＩＩコンポーネントに対してＮ末端（又はＮ末端若しくはその近く）に位置することが一般に好ましい。
【００４２】
蛍光団が主要なファージコートタンパク質ｐＶＩＩＩに古典的（８＋８野生型（ファージミド）又は８８野生型（ゲノム））相補性発現手法によって融合すると、本発明のベクターを用いて産生される最終ファージ粒子は、野生型ｐＶＩＩＩタンパク質のコピーと一緒に、ファージ粒子の長さに沿って無作為に分布する蛍光団の複数のコピーを有する。例えば、Ｍ１３ファージは、主要なコートタンパク質ｐＶＩＩＩの約２７００個のコピーをそれらの表面に有するので、蛍光団の多数のコピーが存在し得る。したがって、蛍光団のこうした機能的発現は、蛍光、例えば検出可能な蛍光を、任意の適切な好都合なアッセイによってモニターすることによって簡便に評価することができる。実施例に示すように、蛍光のこうしたモニタリングは、大腸菌などの形質転換宿主細胞において、例えば蛍光顕微鏡を用いて、蛍光を解析することによって、又はファージ粒子の試料、例えば液体試料の蛍光をプレートリーダー若しくは他の好都合なな装置を用いて分析することによって、簡便に行うことができる。ＦＡＣＳ又はＦＬＩＳＡ分析を使用することもできる。
【００４３】
蛍光団とｐＶＩＩＩファージコートタンパク質の遺伝子融合体を有することは本発明に重要であるので、好都合には、適切な蛍光団は、核酸配列によってコードすることができる生物学的蛍光団又は別の蛍光団であり、それによって本発明のベクターに含まれる。好ましくは、こうした蛍光団も本質的に蛍光性であり、又は直接検出可能である。活性化可能又は漂白可能である蛍光団を使用することもできる。
【００４４】
本発明に使用される好ましい蛍光団は、βバレル構造体又は構築体を有する又は含む生物学的蛍光団である。
【００４５】
こうした蛍光団は、当業者によく知られており（例えば、Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，１２０（２４）：４２４７−４２６０による総説参照）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はＧＦＰと同じ折り畳み形態を有するその誘導体（ＧＦＰ誘導体とも称される）を含む。換言すれば、本発明に使用されるこうした蛍光団は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βバレル構築体若しくは構造体又はＧＦＰ構築体を有するその蛍光団誘導体を含む。こうした非ＧＦＰ蛍光団は、簡便には、ＧＦＰ様蛍光団、又はＧＦＰ誘導体、又はＧＦＰ構築体を含む蛍光団と称することができる。緑色蛍光タンパク質は、現在は複数の生物から単離されており、ＧＦＰという用語は古典的に、また本明細書では、クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａから最初に単離されたタンパク質を指す。しかし、この野生型タンパク質は、文献に現在記載されている多種多様なＧＦＰ誘導体又はＧＦＰ様蛍光団を生成するために種々の修飾に供されている。
【００４６】
こうした蛍光団は、１つ以上のβバレルを単位として含み、例えば、単一のβバレル（βバレル単量体）又は複数のβバレル、例えばβバレルホモ四量体を含むことができる。
【００４７】
すべてのこうした蛍光団は、類似の３Ｄ円柱構造を有し、又は含み、ポリペプチド骨格の大きい一部分は、発色団を含む中心アルファヘリックスを包囲するベータシートの１１本のストランドを一般に含むβバレル構造体中に巻かれている。βバレル構造体は、ＧＦＰ様蛍光団ファミリー（ＧＦＰ誘導体）を特徴づける「β−ｃａｎ」構造と称することができるものを生成するほぼ完全な円柱を形成する。したがって、別の観点からは、この「β−ｃａｎ」構造を含む蛍光団も本発明に使用するのに好ましい。このβバレル円柱は、一般に、幅約２４〜３０オングストローム、長さ４０〜４２オングストロームである。
【００４８】
蛍光団のＧＦＰファミリー（ＧＦＰプラスＧＦＰ変異体若しくは誘導体又はＧＦＰ様蛍光団）としては、スペクトル発光プロファイルに応じて、元のＧＦＰの変異体青（ＢＦＰ）、シアン（ＣＦＰ）及び黄（ＹＦＰ）並びに緑色変異体が挙げられる。高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）及び高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）は更なる例である。
【００４９】
蛍光団のＧＦＰファミリー（ＧＦＰプラスＧＦＰ変異体若しくは誘導体、又はＧＦＰ様蛍光団若しくはＧＦＰ関連蛍光団）は、幾つかの本質的に異なる性質、例えば、発光色、蛍光強度、及び安定性などの他の性質を有し（実際には、こうした異なる性質を有するように操作することができ）、上記βバレル構造体又は構築体の存在及び保持は、それらが一般に同様に挙動することを意味する。したがって、蛍光団のＧＦＰファミリーのメンバー（又はそれらの変異体、例えば、少なくとも７０％配列相同性若しくは本明細書に記載の別の値の機能性変異体）は、本発明に使用するのに好ましい蛍光団である。
【００５０】
こうした蛍光団（及びそれらのアミノ酸配列）をコードする核酸配列は、当該技術分野でよく知られ、記述されており、文献又は標準データベースから容易に得ることができる（例えば、ｐｆａｍ  ｅｎｔｒｙ  ＰＦ０１３５３又はＩｎｔｅｒｐｒｏ  ｅｎｔｒｙ  ＩＰＲ０１１５８４参照）。
【００５１】
本発明に使用される適切な蛍光団、又はＧＦＰ様蛍光団（又はＧＦＰ変異蛍光団）、又はβバレル含有蛍光団の具体例は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（極度に明るい黄緑色蛍光を有する別の緑色蛍光タンパク質、Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０（５）：４０７−４０９）、ｍＧＦＰｍｕｔ２（ＧＦＰのＦＡＣＳ最適化バージョン、Ｃｏｒｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ  １７３：３３−３８）及びｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光タンパク質、Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２，１５６７−１５７２）である。「ｍ」は単量体を表す。他の例としてはＥＧＦＰ（又はＥＣＦＰ若しくはＥＹＦＰ）が挙げられる。本発明に使用される好ましい蛍光団は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ又はその誘導体若しくは変異体、及びＧＦＰ又はその誘導体若しくは変異体、例えば、ｍＧＦＰｍｕｔ２又は幾つかの別の誘導体若しくは変異体、例えば、ＥＧＦＰ（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：６６３−６６４）である。本発明に使用されるより好ましい蛍光団は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ又はその誘導体若しくは変異体である。
【００５２】
ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（Ｓｈａｎｅｒら、２０１３、前掲）は、Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍから誘導される明るい単量体緑色蛍光タンパク質である。Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ由来の元の天然タンパク質は四量体であり、本発明に使用される単量体（ｍ）ＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（ｍＮＧ）を得るために（Ｓｈａｎｅｒら、２０１３、前掲に記載のように）修飾された。最終突然変異体は、四量体出発タンパク質に比べて２１個の置換を含み、鋭い励起及び発光ピーク（５０６ｎｍ及び５１７ｎｍ）を有する。したがって、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎは、標準緑色蛍光タンパク質バンドパス又はロングパスフィルターセットを用いて発光光子の本質的損失なしに画像化することができる。ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎに対する合成構築物の配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションコードＫＣ２９５２８２．１であり、完璧を期すために以下に繰り返す。核酸配列は７１１塩基対長である（配列番号４５）。
【００５３】
1 atggtgagca agggcgagga ggataacatg gcctctctcc cagcgacaca tgagttacac
61 atctttggct ccatcaacgg tgtggacttt gacatggtgg gtcagggcac cggcaatcca
121 aatgatggtt atgaggagtt aaacctgaag tccaccaagg gtgacctcca gttctccccc
181 tggattctgg tccctcatat cgggtatggc ttccatcagt acctgcccta ccctgacggg
241 atgtcgcctt tccaggccgc catggtagat ggctccggat accaagtcca tcgcacaatg
301 cagtttgaag atggtgcctc ccttactgtt aactaccgct acacctacga gggaagccac
361 atcaaaggag aggcccaggt gaaggggact ggtttccctg ctgacggtcc tgtgatgacc
421 aactcgctga ccgctgcgga ctggtgcagg tcgaagaaga cttaccccaa cgacaaaacc
481 atcatcagta cctttaagtg gagttacacc actggaaatg gcaagcgcta ccggagcact
541 gcgcggacca cctacacctt tgccaagcca atggcggcta actatctgaa gaaccagccg
601 atgtacgtgt tccgtaagac ggagctcaag cactccaaga ccgagctcaa cttcaaggag
661 tggcaaaagg cctttaccga tgtgatgggc atggacgagc tgtacaagta a
【００５４】
コードタンパク質のタンパク質識別名はＡＧＧ５６５３５．１であり、以下に概説する配列を有する（２３６個のアミノ酸、配列番号４６）。
【００５５】
1 mvskgeednm aslpathelh ifgsingvdf dmvgqgtgnp ndgyeelnlk stkgdlqfsp
61 wilvphigyg fhqylpypdg mspfqaamvd gsgyqvhrtm qfedgasltv nyrytyegsh
121 ikgeaqvkgt gfpadgpvmt nsltaadwcr skktypndkt iistfkwsyt tgngkryrst
181 arttytfakp maanylknqp myvfrktelk hsktelnfke wqkaftdvmg mdelyk
【００５６】
ベクターがｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光団をコードする本発明の実施形態においては、上で概説した核酸配列を本発明のベクターに組み込むことができる。本発明のベクターにおいてはｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎをコードする配列はシグナルペプチドの下流の融合タンパク質としてコードされるので、本発明のベクターに組み込まれるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎヌクレオチド配列は、好都合には、除去される最初の開始コドン（ａｔｇ）及び終止コドン（ｔａａ）を有する。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態においては、例えば大腸菌における、細菌発現に対して最適化された、この核酸配列のコドン最適化バージョンが使用される。任意の適切なコドン最適化バージョンを使用することができるが、本発明に使用することができるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎのコドン最適化バージョンの具体的配列を以下に概説する。（やはり、ベクターへの組み込みを良くするために開始及び終止コドンを省略した）。
【００５８】
GTTTCTAAAGGTGAAGAAGACAACATGGCTTCTCTGCCGGCTACCCACGAACTGCACATCTTCGGTTCTATCAACGGTGTTGACTTCGACATGGTTGGTCAGGGTACCGGTAACCCGAACGACGGTTACGAAGAACTGAACCTGAAATCTACCAAAGGTGACCTGCAGTTCTCTCCGTGGATCTTAGTTCCGCACATCGGTTACGGTTTCCACCAGTACCTGCCGTACCCGGACGGTATGTCTCCGTTCCAGGCTGCTATGGTTGACGGTTCTGGTTACCAGGTTCACCGTACCATGCAGTTCGAAGACGGTGCTTCTCTGACCGTTAACTACCGTTACACCTACGAAGGTTCTCACATCAAAGGTGAAGCTCAGGTTAAAGGTACCGGTTTCCCGGCTGACGGTCCGGTTATGACCAACTCTCTGACCGCTGCTGACTGGTGCCGTTCTAAAAAAACCTACCCGAACGACAAAACCATCATCTCTACCTTCAAATGGTCTTACACCACCGGTAACGGTAAACGTTACCGTTCTACCGCTCGTACCACCTACACCTTCGCTAAACCGATGGCTGCTAACTACCTGAAAAACCAGCCGATGTACGTTTTCCGTAAAACCGAACTGAAACACTCTAAAACCGAACTGAACTTCAAAGAATGGCAGAAAGCTTTCACCGACGTTATGGGTATGGACGAACTGTACAAA（配列番号３）
【００５９】
これらのコドン最適化バージョンはすべて上記ＡＧＧ５６５３５．１と同じアミノ酸配列をコードする。しかし、初期メチオニン残基をコードするヌクレオチド配列が省略されるので、コードされたアミノ酸配列は、以下の通りである。
【００６０】
VSKGEEDNM ASLPATHELH IFGSINGVDF DMVGQGTGNP NDGYEELNLK
STKGDLQFSP WILVPHIGYG FHQYLPYPDG MSPFQAAMVD GSGYQVHRTM
QFEDGASLTV NYRYTYEGSH IKGEAQVKGT GFPADGPVMT NSLTAADWCR
SKKTYPNDKT IISTFKWSYT TGNGKRYRST ARTTYTFAKP MAANYLKNQPMYVFRKTELK HSKTELNFKE WQKAFTDVMG MDELYK（配列番号４）。
【００６１】
上述したように、また、本明細書により詳細に考察するように、本発明の別の実施形態においては、ベクターは、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（ｍＮＧ）蛍光団の誘導体又は変異体、例えば、配列番号４若しくは４６の誘導体若しくは変異体、又は配列番号４５若しくは３の誘導体若しくは変異体をコードする配列を含む。
【００６２】
したがって、別の実施形態においては、コードされたｍＮＧ蛍光団は、配列番号４との配列相同性が少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一などの少なくとも７０％、７５％又は８０％であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。これらの変異ｍＮＧ配列は、蛍光団として作用する機能特性を保持又は所有すべきである。蛍光団として作用する機能特性を保持又は所有するタンパク質をコードする能力が保持されるならば、配列番号４（又はこれらの相同配列）又は別のｍＮＧ配列の機能性切断物又は断片を使用することもできる。
【００６３】
同様に、ｍＮＧ蛍光団をコードする核酸分子は、配列番号４５又は３との配列相同性が少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一などの少なくとも７０％、７５％又は８０％であるヌクレオチド配列を含む、又はからなることができる。これらの変異ｍＮＧヌクレオチド配列は、蛍光団として作用する機能特性を保持又は所有するタンパク質をコードすべきである。蛍光団として作用する機能特性を保持又は所有するタンパク質をコードする能力が保持されるならば、配列番号４５又は３（又はこれらの相同配列）又は別のｍＮＧ配列の機能性切断物又は断片を使用することもできる。
【００６４】
「ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質」、「ｐＶＩＩＩタンパク質」、「ｐＶＩＩＩファージタンパク質」、「ｐＶＩＩＩコートタンパク質」などの用語は、本明細書では、繊維状ファージ（野生型又は天然配列）から生じる若しくは誘導されるｐＶＩＩＩタンパク質、又はこうしたｐＶＩＩＩタンパク質の配列に対応する配列を有するｐＶＩＩＩタンパク質を指す。ｐＶＩＩＩタンパク質が誘導される好ましい繊維状ファージ、又はｐＶＩＩＩタンパク質が対応するは、Ｍ１３、ｆｄ及びｆ１ファージである。蛍光団をｐＶＩＩＩ融合タンパク質として提示する能力を有するならば、任意の適切なｐＶＩＩＩタンパク質を使用することができる。好ましくは、本発明のベクターによってコードされるｐＶＩＩＩタンパク質は、成熟（完全長）ｐＶＩＩＩタンパク質に対応し、すなわちｐＶＩＩＩシグナルペプチドがない。好ましくは、本発明のベクターによってコードされるｐＶＩＩＩタンパク質は、そのシグナル配列がないＭ１３繊維状ファージ由来の野生型（完全長）成熟ｐＶＩＩＩタンパク質に対応する以下のアミノ酸配列を含む、又はからなる。
【００６５】
AEGDDPAKAAFNSLQASATEYIGYAWAMVVVIVGATIGIKLFKKFTSKAS（配列番号８）
【００６６】
ベクターに封入するためのこの配列をコードする例示的核酸配列を本明細書では配列番号７として示す。
【００６７】
別の実施形態においては、コードされたｐＶＩＩＩタンパク質は、配列番号８との配列相同性が少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一などの少なくとも７０％、７５％又は８０％であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。上述したように、これらの変異ｐＶＩＩＩ配列は、蛍光団をｐＶＩＩＩ融合タンパク質として提示する機能的能力を保持又は所有すべきである。蛍光団をｐＶＩＩＩ融合タンパク質として提示する能力が保持されたならば、配列番号８（又はこれらの相同配列）又は別のｐＶＩＩＩ配列の機能性切断物又は断片を使用することもできる。
【００６８】
同様に、ｐＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号７との配列相同性が少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一などの少なくとも７０％、７５％又は８０％であるヌクレオチド配列を含む、又はからなる。これらの変異ｐＶＩＩＩヌクレオチド配列は、ファージ粒子上で提示され得るｐＶＩＩＩ融合タンパク質として蛍光団をコードする機能的能力を保持又は所有すべきである。ファージ粒子上で提示され得るｐＶＩＩＩ融合タンパク質として蛍光団をコードする能力が保持されたならば、配列番号７（又はこれらの相同配列）又は別のｐＶＩＩＩ配列の機能性切断物又は断片を使用することもできる。
【００６９】
好ましいｐＶＩＩＩ変異体は、本明細書に記載のように、配列番号８の位置３３若しくはそれに対応する位置にバリンからイソロイシンへの変異を有し（すなわち、配列番号８の位置３３若しくはそれに対応する位置にイソロイシン残基を有し）、又は配列番号７の残基９７〜９９若しくはそれに対応する位置にＡＴＡイソロイシンコドンを有する。特に好ましいｐＶＩＩＩ変異体は、本明細書に記載のようにＦ０３クローン中に見られるｐＶＩＩＩ配列である。好ましいｐＶＩＩＩ断片又は切断物は、配列番号８の位置３３に対応する残基をアミノ酸又はヌクレオチドレベルで含む機能性断片又は切断物である。
【００７０】
本明細書に記載のように、一部の実施形態においては、本発明のベクターは、ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＩＸコートタンパク質などの別の非ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質をコードする。
【００７１】
「ｐＩＩＩファージコートタンパク質」、「ｐＩＩＩタンパク質」、「ｐＩＩＩファージタンパク質」、「ｐＩＩＩコートタンパク質」などの用語は、本明細書では、繊維状ファージ（野生型又は天然配列）から生じる若しくは誘導されるｐＩＩＩタンパク質、又はこうしたｐＩＩＩタンパク質の配列に対応する配列を有するｐＩＩＩタンパク質を指す。ｐＩＩＩタンパク質が誘導される好ましい繊維状ファージ、又はｐＩＩＩタンパク質が対応するは、Ｍ１３、ｆｄ及びｆ１ファージである。ＰＯＩをｐＩＩＩ融合タンパク質として提示する能力を有するならば、任意の適切なｐＩＩＩタンパク質を使用することができる。好ましくは、本発明のベクターによってコードされるｐＩＩＩタンパク質は、成熟ｐＩＩＩタンパク質に対応し、すなわちｐＩＩＩシグナルペプチドがない。好ましくは、本発明のベクターによってコードされるｐＩＩＩタンパク質は、そのシグナル配列がないＭ１３繊維状ファージ由来の野生型成熟ｐＩＩＩタンパク質に対応する以下のアミノ酸配列を含む、又はからなる（（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＹ５９８８２０．１）も参照。
【００７２】
>pIII_1
AETVESCLAKPHTENSFTNVWKDDKTLDRYANYEGCLWNATGVVVCTGDETQCYGTWVPIGLAIPENEGGGSEGGGSEGGGSEGGGTKPPEYGDTPIPGYTYINPLDGTYPPGTEQNPANPNPSLEESQPLNTFMFQNNRFRNRQGALTVYTGTVTQGTDPVKTYYQYTPVSSKAMYDAYWNGKFRDCAFHSGFNEDPFVCEYQGQSSDLPQPPVNAGGGSGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSGSGDFDYEKMANANKGAMTENADENALQSDAKGKLDSVATDYGAAIDGFIGDVSGLANGNGATGDFAGSNSQMAQVGDGDNSPLMNNFRQYLPSLPQSVECRPFVFGAGKPYEFSIDCDKINLFRGVFAFLLYVATFMYVFSTFANILRNKES（配列番号１２）
【００７３】
ベクターに封入するためのこのアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列を配列番号１１として以下に示す。
【００７４】
2021501593.tif 000002
【００７５】
別の実施形態においては、コードされたｐＩＩＩタンパク質は、配列番号１２との配列相同性が少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一などの少なくとも７０％、７５％又は８０％であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。これらの変異ｐＩＩＩ配列は、ＰＯＩをｐＩＩＩ融合タンパク質として提示する機能的能力を保持又は所有すべきである。ＰＯＩをｐＩＩＩ融合タンパク質として提示する能力が保持されたならば、配列番号１２（又はこれらの相同配列）又は別のｐＩＩＩ配列の機能性切断物又は断片を使用することもできる。例えばｐＩＩＩのＣ末端部分のみを含む切断物を提示するための適切な切断型ｐＩＩＩタンパク質の例は、当該技術分野でよく知られ、記述されている。
【００７６】
「ｐＶＩファージコートタンパク質」又は「ｐＶＩタンパク質」又は「ｐＶＩファージタンパク質」又は「ｐＶＩコートタンパク質」などの用語は、本明細書では、繊維状ファージ（野生型又は天然配列）から生じる若しくは誘導されるｐＶＩタンパク質、又はこうしたｐＶＩタンパク質の配列に対応する配列を有するｐＶＩタンパク質を指す。ｐＶＩタンパク質が誘導される好ましい繊維状ファージ、又はｐＶＩタンパク質が対応するは、Ｍ１３、ｆｄ及びｆ１ファージである。ＰＯＩをｐＶＩ融合タンパク質として提示する能力を有するならば、任意の適切なｐＶＩタンパク質を使用することができる。好ましくは、本発明のベクターによってコードされるｐＶＩタンパク質は、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ由来のｐＶＩタンパク質に対応する以下のアミノ酸配列を含む、又はからなる（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＹ５９８８２０．１）。
【００７７】
MPVLLGIPLLLRFLGFLLVTLFGYLLTFLKKGFGKIAIAISLFLALIIGLNSILVGYLSDISAQLPSDFVQGVQLILPSNALPCFYVILSVKAAIFIFDVKQKIVSYLDWDK（配列番号１３）
【００７８】
別の実施形態においては、コードされたｐＶＩタンパク質は、配列番号１３との配列相同性が少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一などの少なくとも７０％、７５％又は８０％であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。これらの変異ｐＶＩ配列は、ＰＯＩをｐＶＩ融合タンパク質として提示する機能的能力を保持又は所有すべきである。ＰＯＩをｐＶＩ融合タンパク質として提示する能力が保持されたならば、配列番号１３（又はこれらの相同配列）又は別のｐＶＩ配列の機能性切断物又は断片を使用することもできる。
【００７９】
「ｐＶＩＩファージコートタンパク質」又は「ｐＶＩＩタンパク質」又は「ｐＶＩＩファージタンパク質」又は「ｐＶＩＩコートタンパク質」などの用語は、本明細書では、繊維状ファージ（野生型又は天然配列）から生じる若しくは誘導されるｐＶＩＩタンパク質、又はこうしたｐＶＩＩタンパク質の配列に対応する配列を有するｐＶＩＩタンパク質を指す。ｐＶＩＩタンパク質が誘導される好ましい繊維状ファージ、又はｐＶＩＩタンパク質が対応するは、Ｍ１３、ｆｄ及びｆ１ファージである。ＰＯＩをｐＶＩＩ融合タンパク質として提示する能力を有するならば、任意の適切なｐＶＩＩタンパク質を使用することができる。好ましくは、本発明のベクターによってコードされるｐＶＩＩタンパク質は、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ由来の野生型ｐＶＩＩタンパク質に対応する以下のアミノ酸配列を含む、又はからなる（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＹ５９８８２０．１）。
【００８０】
MEQVADFDTIYQAMIQISVVLCFALGIIAGGQR（配列番号１４）
【００８１】
別の実施形態においては、コードされたｐＶＩＩタンパク質は、配列番号１４との配列相同性が少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一などの少なくとも７０％、７５％又は８０％であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。これらの変異ｐＶＩＩ配列は、ＰＯＩをｐＶＩＩ融合タンパク質として提示する機能的能力を保持又は所有すべきである。ＰＯＩをｐＶＩＩ融合タンパク質として提示する能力が保持されたならば、配列番号１４（又はこれらの相同配列）又は別のｐＶＩＩ配列の機能性切断物又は断片を使用することもできる。
【００８２】
「ｐＩＸファージコートタンパク質」又は「ｐＩＸタンパク質」又は「ｐＩＸファージタンパク質」又は「ｐＩＸコートタンパク質」などの用語は、本明細書では、繊維状ファージ（野生型又は天然配列）から生じる若しくは誘導されるｐＩＸタンパク質、又はこうしたｐＩＸタンパク質の配列に対応する配列を有するｐＩＸタンパク質を指す。ｐＶＩＩタンパク質が誘導される好ましい繊維状ファージ、又はｐＩＸタンパク質が対応するは、Ｍ１３、ｆｄ及びｆ１ファージである。ＰＯＩをｐＩＸ融合タンパク質として提示する能力を有するならば、任意の適切なｐＩＸタンパク質を使用することができる。好ましくは、本発明のベクターによってコードされるｐＩＸタンパク質は、ｐＩＸタンパク質に対応する。好ましくは、本発明のベクターによってコードされるｐＩＸタンパク質は、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ由来の野生型ｐＩＸタンパク質に対応する以下のアミノ酸配列を含む、又はからなる（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＹ５９８８２０．１）。
【００８３】
MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSS（配列番号１５）
【００８４】
別の実施形態においては、コードされたｐＩＸタンパク質は、配列番号１５との配列相同性が少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一などの少なくとも７０％、７５％又は８０％であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。これらの変異ｐＩＸ配列は、ＰＯＩをｐＩＸ融合タンパク質として提示する機能的能力を保持又は所有すべきである。ＰＯＩをｐＩＸ融合タンパク質として提示する能力が保持されたならば、配列番号１５（又はこれらの相同配列）又は別のｐＩＸ配列の機能性切断物又は断片を使用することもできる。
【００８５】
本発明においては、「配列相同性」は、アミノ酸レベルでのタンパク質間の同一性の尺度、及びヌクレオチドレベルでの核酸間の同一性の尺度である。タンパク質配列同一性は、配列を並べたときの各配列における所与の位置のアミノ酸配列を比較することによって求めることができる。同様に、核酸配列同一性は、配列を並べたときの各配列における所与の位置のヌクレオチド配列を比較することによって求めることができる。変異体又は誘導体分子を本明細書で、例えばパーセント同一性値によって、例えば少なくとも７０％などと表すときには、こうした変異体又は誘導体が、一般に、機能性変異体又は誘導体である、すなわち、保持又は改善された機能を示すことを理解すべきである。
【００８６】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性割合を求める方法は、当該技術分野でよく知られ、記述されており、これらのどちらでも使用することができる。例えば、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性割合を求めるために、配列を最適な比較目的で並べる（例えば、第２のアミノ酸又は核酸配列との最適な整合のために第１のアミノ酸の配列又は核酸配列に間隙を導入することができる）。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占有されるときには、分子はその位置において同一である。２つの配列の同一性割合は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一＝同一位置の＃／位置（例えば、重複位置）の全＃×１００）。一部の実施形態においては、２つの配列は同じ長さである。
【００８７】
配列を手作業で整列させ、同一アミノ酸の数を数えることができる。あるいは、同一性割合を求めるために２つの配列の整列を数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。こうしたアルゴリズムを（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込む。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で実施して、本発明の核酸分子と相同であるヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で実施して、本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。比較目的で間隙のある整列を得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うことができる。ＮＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するときには、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。あるいは、配列を例えばＥＭＢＬデータベースにおけるＢＬＡＳＴプログラムによって整列させた後に配列相同性を計算することができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）。一般に、例えば、「スコア行列」及び「ギャップペナルティー」に対する初期設定を整列のために使用することができる。本発明の状況においては、ＢＬＡＳＴＮ及びＰＳＩ  ＢＬＡＳＴ初期設定が有利であり得る。同一性割合の計算においては、正確な一致のみを数える。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態においては、１個以上のリボソーム（リボソームの）結合部位（ＲＢＳ）がベクター構築物に含まれる。こうしたコンポーネントを翻訳開始領域（ＴＩＲ）と称することもできる。
【００８９】
ＲＢＳ配列は、ベクター中でＲＢＳ配列が機能するのに適切な位置にある。ＲＢＳの役割は、タンパク質翻訳開始中にリボソームを補充することであり、したがって、好都合には、翻訳したいタンパク質の開始コドンの上流、又は翻訳したいタンパク質のＯＲＦの上流に適切な距離で位置する。したがって、本発明のベクターにおいては、ＲＢＳ配列は、好都合には、シグナルペプチドをコードする配列の上流に位置する（シグナルペプチドが例えば蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質のＯＲＦの一部である実施形態）。シグナルペプチドがＯＲＦ中に存在しない実施形態においては、例えば、ＰＯＩが第２の非ｐＶＩＩＩコートタンパク質に融合した一部の実施形態においては、ＲＢＳ配列は、好都合には、ＰＯＩ又はコートタンパク質をコードする配列の上流に適切な距離で位置する。適切な距離は公知であり、選択されるＲＢＳに応じて当業者によって容易に決定されるであろう。例示的距離は、ＡＴＧ開始コドンから７又は８ヌクレオチドであり得るが、これは変わり得る。
【００９０】
ＲＢＳ／ＴＩＲ配列は、下流に位置する配列の翻訳強度（タンパク質発現レベル）を調節し、異なるタイプのＲＢＳは、異なるレベルのタンパク質発現、例えば、弱い又は強い発現を生じ得る。弱い又は強いＲＢＳ／ＴＩＲ配列は、当該技術分野でよく知られており、所望のタンパク質発現レベルに応じて当業者が容易に選択することができる。予想どおりに、強いＲＢＳは、弱いＲＢＳに比べてより多くの翻訳（強い翻訳）を促進又は誘発する。以下でより詳細に説明するように、本発明の好ましい実施形態においては、特に蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳を推進するために弱いＲＢＳが使用される。
【００９１】
特に、本発明の好ましいベクターにおいては、ＲＢＳは、タンパク質をＴａｔ分泌経路中に誘導するシグナルペプチドをコードする配列の開始コドンの上流（又は５’若しくはＮ末端）に含まれる。本発明に使用される好ましいＲＢＳは、ベクター構築物に含まれ得るシャイン  ダルガーノ（ＳＤ）配列又はＳＤに基づく配列である。ＳＤ配列は、当該技術分野でよく知られ、記述されており、これらのいずれでも使用することができる。例えば、コアＳＤ配列はＧＡＧＧ（配列番号４７）であり、別のコンセンサス配列はＡＧＧＡＧＧ（配列番号４８）又はＡＧＧＡＧＧＵ（配列番号４９）である。したがって、これらのコア又はコンセンサス配列を含むＳＤ配列を使用することができる。
【００９２】
弱い又は強いＳＤ配列は、当該技術分野でよく知られており、任意の所与のＯＲＦのタンパク質発現レベル又は量を制御するために、当業者が容易に選択することができる。例えば、強いＳＤは、リボソームに良く結合することができる。こうした強いＳＤは、一般に、ＳＤコア配列又は上で概説したコンセンサス配列の一つを正確に又はほとんど変化なしに含み、及び／又は例えば、すぐ近くの幾つかのＡ及び／又はＧ残基を含む。あるいは、強いＳＤは、ＳＤコア又はコンセンサス配列（又は高度に関連した配列）と併せて別のコンポーネントの挿入によって得ることができる。こうした追加のコンポーネントは、当業者によく知られており、例えば、古典的又はコンセンサスＳＤ配列をイプシロン配列（例えば、ＴＴＡＡＣＴＴＴＡ、配列番号５０）と併せて使用することができる。例えば、本発明においては、好ましい強いＳＤは、イプシロン配列（例えば、ＴＴＡＡＣＴＴＴＡ、配列番号５０）にも含まれるＴ７ｇ１０  ＴＩＲ（Ｏｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ  ７３：２２７−２３５）である。したがって、強いＳＤが使用される本発明のベクターの具体例においては、ＴａｔシグナルペプチドのＡＴＧ開始部位の上流領域は、配列ＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ、配列番号３１を有し得る（イプシロン配列は下線部、ＳＤコンセンサス配列は太字）。しかし、他の強いＳＤ／ＴＩＲ配列を当業者は容易に選択することができる。
【００９３】
それに対して、弱いＳＤ配列は、一般に、本明細書に概説したコア又はコンセンサスＳＤ配列とはより異なる配列を含む。弱いＳＤ配列は、依然としてリボソームに結合することができるが、より低レベル又はより低効率である。例えば、本発明に使用される弱いＳＤ配列は、本明細書に概説したコアコンセンサスＳＤ配列から１又は２個の修飾を含むことができる。本発明のベクターに使用される好ましい弱いＳＤ配列は、ＡＧＧＡＧＡ、配列番号３０を含む、又はからなる（すなわち、コンセンサス配列ＡＧＧＡＧＧ、配列番号４８とは異なる１個のヌクレオチドを含む）。この弱いＳＤ配列は、好ましくは、ＡＴＧ開始部位から８ヌクレオチドの位置にあるが、この距離は、上述したように時には変わり得る。したがって、弱いＳＤが使用される本発明のベクターの具体例においては、ＴａｔシグナルペプチドのＡＴＧ開始部位の上流領域は、配列ＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＡ、配列番号５１を有し得る（変異ＳＤ配列を太字で示す）。しかし、他の弱いＳＤ／ＴＩＲ配列を当業者は容易に選択することができる。
【００９４】
予想どおりに、強いＳＤは、少量の（又は弱い若しくはより低効率の）翻訳を促進又は誘発する弱いＳＤに比べてより多くの翻訳（強い又は高い翻訳）を促進又は誘発する。
【００９５】
強い又は弱いＲＢＳ又はＳＤ配列を本発明のベクター構築物に使用することができる。本発明の目的の一つは、ファージの（表面の）コートに取り込まれる蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の数を増加させることによってファージ粒子の蛍光を増加させることである。これは、一般に、より多くの翻訳を得るために、強いＳＤ配列の使用を好むであろう。したがって、やや驚くべきことに、一部の実施形態においては、弱いＳＤ（又は弱いＲＢＳ）配列が、例えば、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質のより良好な機能性ディスプレイの点で、又は蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質のディスプレイの増加（例えば、粒子１個当たりのコピー数の増加）の点で、より良好な結果を生じ、好ましくはファージ粒子の蛍光を増加させる。
【００９６】
したがって、一部の実施形態においては、Ｔａｔシグナルペプチドを含むＯＲＦをコードする配列の上流のベクター構築物及び蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質における弱いＳＤ（又は弱いＲＢＳ）配列の使用が好ましい。換言すれば、Ｔａｔシグナルペプチド、したがって蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳を制御又は推進するＲＢＳ（又はＳＤ）は、弱いＳＤ（又は弱いＲＢＳ）である。好ましくは、こうした弱いＳＤ配列の使用は、強いＳＤ（又は強いＲＢＳ）が使用される構築物と比べたときに、又はコンセンサスＳＤ配列、例えば、ＡＧＧＡＧＧ（又は上で定義した別のコンセンサス配列）が使用されるときに、ファージのコートに取り込まれる完全な蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質のコピー数を増加させる。
【００９７】
実際には、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳効率が低い、弱い、低下した、又は最適でないベクター構築物が一般に好ましい。例えば、本明細書に記載の好ましい修飾／変異分子は、例えば、元の親配列に比べて、例えば特に蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳効率又は速度が低下又はかなり低下したものである。好ましくは、こうした低い又は弱い（又は低下した）翻訳効率又は速度は、ファージ表面の蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質のコピー数の増加及び／又はファージ表面の機能性蛍光団の数の増加、したがって蛍光の増加をもたらす。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態においては、任意選択であるが、１個以上のタグ、例えばタンパク質又はペプチドタグをベクター構築物に含むことができる。こうしたタグは、検出のために都合良く使用することができ、したがって、これらの実施形態においては、任意の検出可能なタグを使用することができる。タグは、例えば、例えばＦＡＣＳによる、ファージ蛍光のスクリーニングが行われる前に、タグ含有融合タンパク質の濃縮などの別の目的で使用することもできる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＨＩＳ、ＨＡＴ、Ｖ５タグなどの抗原ペプチドタグ（又はエピトープタグ）は、特定のタグに対する公知の容易に入手可能な蛍光標識抗体を用いることによって容易に標識化可能であるので、ＦＡＣＳ技術又は別の蛍光検出技術が使用されるときに本発明の実施形態で使用するのに特に好ましい。当該技術分野で既知の他の抗原ペプチドタグも同様に使用することができる。
【００９９】
ＦＬＡＧタグは、本発明のベクターに使用される好ましいタグである。ＦＬＡＧタグは、オクタペプチドタグであり、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１０）を含む。当該技術分野でよく知られており、標準である、ＦＬＡＧタグ誘導体を使用することもできる。さらに、種々のＦＬＡＧタグを認識することができ、したがってＦＬＡＧタグの検出のために蛍光標識して使用することができる抗体、例えばＭ１及びＭ２抗体も当該技術分野において十分に記述されている。
【０１００】
（抗原ペプチドタグ、特にＦＬＡＧタグの代わりとして、又はそれに加えて）本発明に使用される別のタグは、ビオチンタグであり、これは、例えば、固相上でストレプトアビジン、アビジン若しくはアビジン様分子に結合することによって捕捉することができ、又はストレプトアビジン、アビジン若しくはアビジン様分子の蛍光標識体を使用することによって標識、例えば蛍光標識することができる。本発明の構築物に使用される適切なビオチンタグは、当業者によく知られている。本発明の方法に使用されるビオチンタグは、ビオチン分子自体、例えば、ファージ表面の発現された蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質に、例えば化学結合を介して、結合したビオチン分子を含むことができる。こうしたビオチンタグを結合する方法は、当該技術分野でよく知られている。
【０１０１】
あるいは、ビオチンタグは、ビオチン化反応の基質として作用し、それによってビオチン分子に結合することができる部分、例えばペプチドを含むことができる。こうしたペプチドタグは、本発明のベクターに容易に組み込むことができる。例えば、本発明に使用される例示的ビオチンタグは、ビオチンリガーゼによってインビトロ又はインビボでビオチン化される、Ａｖｉｄｉｔｙ  ＬＬＣ，Ａｕｒｏｒａ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ製市販タグであるＡｖｉＴａｇ（商標）（ＭＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号５２）である。
【０１０２】
好ましいビオチンタグの別の例は、ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツからやはり市販され、ストレプトアビジンのビオチン結合ポケットに結合可能である、Ｓｔｒｅｐタグである。好ましくは、Ｓｔｒｅｐタグは、８アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号５３）を含む。ストレプトアビジン又はアビジンに結合可能である任意の他のタンパク質又はペプチドタグも同様に使用することができる。
【０１０３】
上記タグの１つ以上の組合せを使用して、多重標識が存在するようにファージ粒子を標識することができる。
【０１０４】
好ましいタグは、例えば標準組換え及びクローニング技術を用いて、本発明のベクター構築物（例えば、ファージディスプレイ構築物）に容易に組み込むことができるタンパク質タグ又はペプチドタグである。
【０１０５】
タグ配列は、タグが機能する、例えば、発現される、検出可能であるのに適切な任意の位置でベクター中に位置することができる。こうしたタグは、したがって、タグが付けられ、タグを用いて検出される、構築物の部分に対して内部、Ｎ末端又はＣ末端とすることができる。本発明においては、タグは、構築物の蛍光団−ｐＶＩＩＩ部分の発現を検出するのに都合良く使用することができる。したがって、タグは、好都合には、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質をコードする構築物の部分（ＯＲＦ）内、例えば、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質のＮ末端内（内部）若しくはＮ末端（若しくはその近く）、又はＣ末端（若しくはその近く）に位置することができる。
【０１０６】
本発明のベクターにおいては、タンパク質タグをコードする配列の好ましい位置は、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体の蛍光団のＮ末端又はその近くである。例えば、タンパク質タグをコードする配列は、シグナルペプチドと蛍光団の間に位置することができる。
【０１０７】
本発明の好ましい実施形態においては、タンパク質タグは、ＦＬＡＧタグ（又はその誘導体）又は別の負電荷タグである。理論に拘泥するものではないが、好ましくは蛍光団のＮ末端又はその近く、例えばシグナルペプチドと蛍光団の間に位置する負電荷タグを有すると、安定性の改善、したがって、他のβ構造で認められた現象である蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の折り畳みをもたらし得ると考えられる（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，２０１２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４１７：３０９−３３５及びＤｕｄｇｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＮＡＳ，１０９：１０８７９−１０８８４）。
【０１０８】
蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を有する本発明の構築物の例示的構造を図１に示す。本明細書に記載のように、図１に示すＦＬＡＧタグ（又は別のタグ）が好ましいが、任意選択である。
【０１０９】
本発明の好ましいベクターにおいては、スペーサー又はリンカーをコードする配列が蛍光団をコードする配列とｐＶＩＩＩファージコートタンパク質をコードする配列の間に含まれる。該配列は、接続されたタンパク質、特にＮ末端タンパク質（ここでは一般に蛍光団）の折り畳みを助けることができ、スペーサー又はリンカーの長さを適宜調節して、両コンポーネントの最良又は満足な機能的折り畳みを可能にすることができる。適切な長さは、当業者が容易に決定することができる。しかし、例示的長さは、５〜１５アミノ酸（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，９：６４７−６５４）、例えば６〜１０アミノ酸であろう。本発明に使用される特定のリンカーは、８アミノ酸長である。リンカーの配列は、通常、長さよりも関連性が低い。しかし、例示されたベクターに使用されるリンカーは、配列ＧＧＧＳＧＧＧＳを有する（配列番号６、例えば配列番号５によってコードされる）。このリンカーは、したがって、本発明の幾つかの実施形態で好ましいが、別の配列及び長さのリンカー（スペーサー）も使用できることを理解されたい。
【０１１０】
本発明の好ましいベクター（又は核酸分子）は、（ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、リンカー及びｐＶＩＩＩのＮ末端３０アミノ酸を含む）配列番号Ａ若しくは１６を含む配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列（同一性割合の別の例示的値は本明細書に記述されている）をコードする。
【０１１１】
本発明の別の好ましいベクター（又は核酸分子）は、（ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、リンカー及び完全長ｐＶＩＩＩを含む）配列番号Ｃ若しくは１８を含む配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列（同一性割合の別の例示的値は本明細書に記述されている）をコードする。
【０１１２】
本発明の別の好ましいベクター（又は核酸分子）は、（Ｔｏｒ  ＡＢ７、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、リンカー及び完全長ｐＶＩＩＩを含む）配列番号Ｅ若しくは２０を含む配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列（同一性割合の別の例示的値は本明細書に記述されている）をコードする。
【０１１３】
本発明の別の好ましいベクター（又は核酸分子）は、（Ｔｏｒ  ＡＢ７、ＦＬＡＧタグ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、リンカー及び完全長ｐＶＩＩＩを含む）配列番号Ｇ若しくは２２を含む配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列（同一性割合の別の例示的値は本明細書に記述されている）をコードする。
【０１１４】
（Ｔｏｒ  ＡＢ７、ｍＮＧ、リンカー及びＰＶＩＩＩのＮ末端３０アミノ酸を含む）配列番号Ｋ若しくは２６又は（Ｔｏｒ  ＡＢ７、ＦＬＡＧタグ、ｍＮＧ、リンカー及びＰＶＩＩＩのＮ末端３０アミノ酸を含む）配列番号Ｍ若しくは２８、又はそれと少なくとも７０％同一である配列（同一性割合の別の例示的値は本明細書に記述されている）を含む配列をコードするベクター（又は核酸分子）も提供される。
【０１１５】
これらのベクター配列（例えば、配列番号Ａ若しくは１６、Ｃ若しくは１８、Ｅ若しくは２０、Ｇ若しくは２２、Ｋ若しくは２６、又はＭ若しくは２８、又はそれらの変異体をコードする配列）のいずれか一つは、親ベクターに使用することができ、以下に概説する更なる変異又は修飾に供することができる配列の例である。
【０１１６】
本発明に使用される更なる例示的ベクター配列を図９に示す（配列番号５４及び５５）。
【０１１７】
例えば配列番号Ｃ又は１８、Ｅ又は２０、Ｇ又は２２、５４又は５５における好ましいｐＶＩＩＩ変異体は、本明細書に記載のように、配列番号８の位置３３若しくはそれに対応する位置にバリンからイソロイシンへの変異を有し（すなわち、配列番号８の位置３３若しくはそれに対応する位置にイソロイシン残基を有し）、又は配列番号７の残基９７〜９９若しくはそれに対応する位置にＡＴＡイソロイシンコドンを有する。特に好ましいｐＶＩＩＩ変異体は、本明細書に記載のようにＦ０３クローン中に見られるｐＶＩＩＩ配列である。
【０１１８】
上述した本発明のファージディスプレイベクターを使用して、蛍光ファージ粒子の産生に使用することができる更なる修飾又は変異ベクターを生成することもできる。こうした修飾（又は変異、誘導若しくは突然変異）ベクターも本発明の一部を形成する。こうした修飾（又は変異）は、例えば、新しいベクターを形成する親ベクターの核酸配列における１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換又は挿入を含み、前記親ベクターは、上で定義した本発明のベクターの一つであり、また、生成した新しいベクターを試験して、性質の改善された蛍光ファージ粒子の産生に使用することができるベクターを特定することを含む。こうした方法を使用して、蛍光ファージ粒子、好ましくは改善された蛍光ファージ粒子を産生する能力についてすべてを試験することができる複数の新しいベクター（好都合には新しいベクターのライブラリ）を形成することができる。
【０１１９】
例えば１個以上のヌクレオチド（したがって、コードされたアミノ酸）の付加、欠失、置換又は挿入の形の前記修飾は、ベクターの機能ドメインのいずれかにおいて、すなわち、ベクターの一部をコードするシグナルペプチド（好ましくはＴｏｒ  Ａ、より好ましくはＴｏｒ  ＡＢ７）、蛍光団（好ましくはｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ）、蛍光団とｐＶＩＩＩの間のリンカー、ｐＶＩＩＩ、又はタグ（好ましくはＦＬＡＧタグ）の１つ以上（又は全部）において行うことができる。好ましくは、修飾は、蛍光団（好ましくはｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ）、蛍光団とｐＶＩＩＩの間のリンカー、又はｐＶＩＩＩコード領域の１つ以上（又は全部）に位置する。修飾がｐＶＩＩＩコード領域に位置する場合、一部の実施形態においては、変異は、ｐＶＩＩＩのＮ末端半分、例えば、最初の９０ヌクレオチド（又はｐＶＩＩＩの最初の３０、例えば最初の２５〜２８若しくは２５〜３０アミノ酸）内に位置する。
【０１２０】
親ベクターへのこうした修飾又は変異は、当該技術分野でよく知られ記述されている技術を用いて任意の適切な様式で、例えば、ランダム又は定方向変異誘発の方法を行うことによって、実施することができる。好ましくは、成される変異は置換であり、これらは、好都合かつ好ましくは、ランダム変異導入によって行うことができ、特に複数の（例えば、ライブラリの）突然変異体を生成し、スクリーニングして、性質が改善されたものを選択したいときに行うことができる。ランダム変異導入は、任意の適切な方法、例えば、誤りがちなＰＣＲによって、又は変異誘発物大腸菌株を用いて、行うことができる。好ましく簡便な技術は、実施例に記述するが、ｄＮＴＰ類似体をＰＣＲによって組み込んで、ランダム変異をベクター（例えば、ファージミド）ＤＮＡに導入するものである。市販のキットを利用して、こうしたランダム変異導入を行うことができる。本明細書に記述された実施形態においては、単一又はごく少数（例えば、最高５つ）の変異、例えば、本明細書に記載のｐＶＩＩＩタンパク質におけるバリンからイソロイシン（ＶからＩ）への変異（又はコードするヌクレオチド配列における対応する変異）を行う場合、特定の残基を標的として修飾することができる定方向変異誘発又は別のタイプの変異誘発が適切である。
【０１２１】
これらの方法によって生成される新しいベクターは、適切な宿主細胞に転換されると、好ましくは、改善された機能特性、好ましくは改善された蛍光特性を有する蛍光ファージ粒子を産生する。
【０１２２】
本発明は、したがって、元の出発野生型又は親ファージ粒子（すなわち、非突然変異又は野生型親ベクターによって産生されたファージ粒子）に比べて蛍光強度の改善（改善された輝度）を示すファージ粒子を産生可能な変異又は突然変異ベクターを更に提供する。こうした改善は、ａ）バクテリオファージ粒子表面の蛍光団数の増加、例えば、ウイルスカプシドタンパク質に融合した蛍光団によって産生大腸菌宿主からファージ粒子集合体の固有の性質としてのファージ表面／コートへの蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の組み込み若しくは組み入れの増加（換言すれば、粒子１個当たりの蛍光団−ｐＶＩＩＩ分子の数又は平均数の増加）、又はｂ）個々の蛍光色素の輝度の増加、例えば、融合タンパク質における蛍光部分の固有の輝度（蛍光強度）の増加、又はｃ）ａ）とｂ）の両方の組合せ、すなわち蛍光団の輝度と数の増加によって行うことができる。単独で、又はａ）及び／又はｂ）と組み合わせて用いることができる別の選択肢は、例えば折り畳みの改善（例えば、より効率的な）又は溶解性の増加による、蛍光団の機能性ディスプレイの改善であろう。大腸菌における異種タンパク質発現は、わずかな翻訳された、しかし非機能性のタンパク質産物、例えば不溶性タンパク質産物をもたらすことが多い。したがって、ファージ表面の機能性蛍光団の数を増加させることによっても改善が可能である。
【０１２３】
ａ）の場合、個々の蛍光団の輝度を増加させる必要はない。したがって、この結果は、出発蛍光団分子と同じ蛍光強度を示す蛍光団を用いて得ることができ、又は、実際には、より多数の蛍光分子が個々のファージの表面に提示され、こうした減少を補うことができるので、個々の蛍光団分子の低下した蛍光強度でも許容される可能性がある。
【０１２４】
任意の適切なアッセイを使用して、バクテリオファージ表面の蛍光団数が増加した変異ベクターを含むファージ粒子をスクリーニングすることができる。例えば、（ファージ表面で検出可能な）ある種の検出可能なタグは、こうしたスクリーニングを行うのに都合良く使用することができる。好ましくは、これらのタグは、蛍光部分によって示される蛍光レベルとは無関係であり、ファージ表面の蛍光部分の数の指標を評価することができる。検出可能なタグの例は、当業者によく知られている。例えば、ＦＬＡＧタグを使用することができる。検出は、当該タグに対する抗体を用いて都合良く行うことができる。例えば蛍光標識抗体、例えばＦＬＡＧタグに対する抗体を用いたＦＡＣＳは、特に好ましく、関連する蛍光軸上で正の方向にシフトした粒子をモニターし、選択して、個々の粒子をより容易にスクリーニングすることができる。検出可能なタグを使用する代わりに、抗ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ  ３２Ｆ６（ＣｈｒｏｍｏＴｅｋ  ＧｍｂＨ）又は類似のものなどの蛍光団を特異的に認識する抗体をＦＡＣＳに使用することができる。例示的方法、例えば、ＦＡＣＳに基づく方法、又は当該蛍光団からの蛍光シグナルを測定可能な類似の方法（例えば、ＦＬＩＳＡ）を実施例に示す。
【０１２５】
ｂ）の場合、個々のファージ粒子の表面の蛍光団数を増加させる必要はない。したがって、この結果は、個々のファージ粒子の表面の同数の蛍光団を用いて得ることができ、又は、実際には、個々の蛍光色素の輝度の増加、例えば、蛍光部分の固有の輝度（蛍光強度）の増加がこうした減少を補うことができるので、より少ない個々の蛍光団分子でも許容される可能性がある。
【０１２６】
任意の適切なアッセイを使用して、バクテリオファージ表面で発現される融合タンパク質における個々の蛍光色素の輝度が増加した変異ベクターを含むファージ粒子をスクリーニングすることができる。例えば、ＦＡＣＳ又はある別の種の蛍光アッセイは、蛍光団の別の定量化方法、例えば、ウエスタンブロットの使用、又は蛍光団に対する抗体、例えば、実施例に示したＦＡＣＳ選別に使用される抗ＮｅｏｎＧｒｅｅｎナノボディの使用と組み合わせて、蛍光レベルを測定するのに、例えば、溶液中のファージ粒子の蛍光レベルを測定するのに、使用することができる）。ＦＡＣＳは、特に好ましく、関連する蛍光軸上で正の方向にシフトした粒子をモニターし、選択して、個々の粒子をより容易にスクリーニングすることができる。例示的方法、例えば、ＦＡＣＳに基づく方法又はＦＬＩＳＡを実施例に示す。
【０１２７】
好ましくは、こうした増加（実際には、本明細書に記載の他の増加、改善又は正の効果）は、適切な対照レベル又は値に比べて（例えば、非変異、親又は野生型ベクターで得られた蛍光レベルに比べて）、測定可能な増加などであり、（適宜）、より好ましくは、重要な増加、好ましくは、例えば確率値≦０．０５の統計的に有意な増加である。蛍光強度の好ましい増加は、親ベクターよりも２倍若しくは３倍を超える又は少なくとも２倍若しくは３倍、例えば、最高５倍、１０倍又は２０倍の増加であり得る。こうした増加又は改善の評価に使用することができる親ベクターの簡便な比較又はベースラインレベルは、配列番号Ｅ若しくは２０、配列番号Ｇ若しくは２２、又は配列番号Ｃ若しくは１８（又は実際には配列番号Ａ若しくは１６、Ｋ若しくは２６、又はＭ若しくは２８）をコードする配列を含むベクターとすることができる。
【０１２８】
改善された蛍光特性を示す、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を表面で発現する蛍光ファージを産生することができる変異バージョンのベクターが開発された。これらの変異バージョンの一部は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光部分の輝度が個体基準で改善される（実施例２に示すＦＡＣＳプロファイル上のｙ軸のシフトアップによって証明される）。これらの変異バージョンの他の一部は、バクテリオファージ表面のディスプレイが改善され、すなわち蛍光団数が増加する（標識抗体によるＦＬＡＧタグの測定によって評価して、実施例２に示すＦＡＣＳプロファイル上のｘ軸に沿った右へのシフトアップによって証明される）。これらの変異バージョンの他の一部は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光部分の輝度の個体基準での改善とバクテリオファージ表面の蛍光団数の増加の両方を示す（実施例２に示すＦＡＣＳプロファイルの右上四半分におけるクローンの存在によって証明される）。
【０１２９】
上述したように、ファージ粒子の蛍光を改善する変異残基は、ベクターの任意の部分に位置することができるが、好ましくは、融合タンパク質のｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ若しくはｐＶＩＩＩ部分（より好ましくはｐＶＩＩＩ部分）、又はｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎとｐＶＩＩＩの間のリンカーに位置することができる。変異がｐＶＩＩＩ領域に位置する場合、一部の実施形態においては、変異は、ｐＶＩＩＩのＮ末端半分、例えば、最初の９０ヌクレオチド（又はｐＶＩＩＩの最初の３０、例えば最初の２５〜２８若しくは２５〜３０アミノ酸）内に位置する。
【０１３０】
上述したように、本発明の好ましい実施形態においては、ベクターのｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ部分に対するコードされたアミノ酸配列は、配列番号４で与えられる（例示的ヌクレオチド配列は配列番号３で与えられる）。したがって、ファージ粒子の蛍光を保持又は改善する変異残基の少なくとも一部がベクターのｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ部分に位置する実施形態においては、こうした変異ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎコンポーネントは、配列番号３若しくは配列番号４、又はヌクレオチド若しくはアミノ酸レベルでそれと少なくとも７０％同一である配列（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一）を含むことができる。あるいは、こうした変異コンポーネントは、配列番号３又は配列番号４において、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルで、好ましくはアミノ酸レベルで、それぞれ最高３０％、２５％、２０％、１５％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％の変異レベルを含むことができる。好ましい変異ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎコンポーネントは、最高１５％、好ましくは最高１３％又は１０％、より好ましくは最高５％又は４％の変異レベルを含むことができる。
【０１３１】
変異ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ配列の別の好ましい例は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ配列、例えば、配列番号４に最高３０、例えば最高２５、２０、１５、１２若しくは１０、例えば１、又は最高２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個の改変アミノ酸を含む配列である。
【０１３２】
上述したように、本発明の好ましい実施形態においては、ベクターのｐＶＩＩＩ部分に対するコードされたアミノ酸配列は、配列番号８で与えられる（例示的ヌクレオチド配列は配列番号７で与えられる）。したがって、ファージ粒子の蛍光を保持又は改善する変異残基の少なくとも一部がベクターのｐＶＩＩＩ部分に位置する実施形態においては、こうした変異ｐＶＩＩＩコンポーネントは、配列番号７若しくは配列番号８、又はヌクレオチド若しくはアミノ酸レベルでそれと少なくとも７０％同一である配列（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一）を含むことができる。あるいは、こうした変異コンポーネントは、配列番号７又は配列番号８において、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルで、好ましくはアミノ酸レベルで、それぞれ最高３０％、２５％、２０％、１５％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％の変異レベルを含むことができる。好ましい変異ｐＶＩＩＩコンポーネントは、最高１５％、好ましくは最高１３％又は１０％、より好ましくは最高５％又は４％の変異レベルを含むことができる。
【０１３３】
変異ｐＶＩＩＩ配列の別の好ましい例は、ｐＶＩＩＩ配列、例えば配列番号８に最高１０、例えば最高９、８、７、６、５、４、３、２又は１個の改変アミノ酸を含む配列である。
【０１３４】
本明細書に記載のように、別の変異残基が存在し得るものの、好ましい変異ベクター配列は、配列番号８の残基（又は位置）３３又はそれに対応する残基にバリンからイソロイシンへの置換を含む（すなわち、配列番号８の位置３３又はそれに対応する位置にイソロイシン残基を有する）。より好ましくは、イソロイシンをコードするコドンはＡＴＡである。例えば、バリンコドンＧＴＣをイソロイシンコドンＡＴＡで置換することができる。したがって、変異ベクターが配列番号８若しくは配列番号８と少なくとも７０％同一である配列、又は最高１５％の変異レベル、又は配列番号８におけるある数、例えば最高３５個の改変アミノ酸を含むことができる上記考察の実施形態では、好ましい実施形態においてこのイソロイシン残基又はコドンが存在する。
【０１３５】
やはり上述したように、本発明の幾つかの実施形態においては、変異残基がＰＶＩＩＩタンパク質のＮ末端半分に、例えば、ｐＶＩＩＩの最初の３０アミノ酸（配列番号Ｉ又は２４で与えられる例示的ヌクレオチド配列、ｐＶＩＩＩの最初の９０ヌクレオチド）を含む配列番号Ｊ又は２５で与えられるベクターのｐＶＩＩＩ部分に対するコードされたアミノ酸配列に、存在する。したがって、ファージ粒子の蛍光を保持又は改善する変異残基の少なくとも一部がベクターのｐＶＩＩＩ部分に位置する実施形態においては、こうした変異ｐＶＩＩＩコンポーネントは、配列番号Ｉ若しくは２４、又は配列番号Ｊ若しくは２５、又はヌクレオチド若しくはアミノ酸レベルでそれと少なくとも７０％同一である配列（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一）を含むことができる。あるいは、こうした変異コンポーネントは、配列番号Ｉ若しくは２４又は配列番号Ｊ若しくは２５において、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルで、好ましくはアミノ酸レベルで、それぞれ最高３０％、２５％、２０％、１５％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％の変異レベルを含むことができる。好ましい変異ｐＶＩＩＩコンポーネントは、最高１５％、好ましくは最高１３％又は１０％、より好ましくは最高５％又は４％の変異レベルを含むことができる。
【０１３６】
変異ｐＶＩＩＩ配列の別の好ましい例は、ｐＶＩＩＩ配列、例えば配列番号Ｊ又は２５に最高５、例えば最高４、３、２又は１個の改変アミノ酸を含む配列である。
【０１３７】
上述したように、本発明の好ましい実施形態においては、ベクターのリンカー部分（ここでは、本発明者らは、蛍光団とｐＶＩＩＩコンポーネントの間のリンカーを指している）に対するコードされたアミノ酸配列は、配列番号６で与えられる（例示的ヌクレオチド配列は配列番号５で与えられる）。したがって、ファージ粒子の蛍光を保持又は改善する変異残基の少なくとも一部がベクターのこのリンカー部分に位置する実施形態においては、こうした変異リンカーコンポーネントは、配列番号５若しくは配列番号６、又はヌクレオチド若しくはアミノ酸レベルでそれと少なくとも７０％同一である配列（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一）を含むことができる。あるいは、こうした変異コンポーネントは、配列番号５又は配列番号６において、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルで、好ましくはアミノ酸レベルで、それぞれ最高３０％、２５％、２０％、１５％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％の変異レベルを含むことができる。好ましい変異リンカーコンポーネントは、最高１５％、好ましくは最高１３％又は１０％、より好ましくは最高５％又は４％の変異レベルを含むことができる。
【０１３８】
変異リンカー配列の別の好ましい例は、リンカー配列、例えば配列番号６に１、２又は３個の改変アミノ酸を含む配列である。別の実施形態においては、リンカー配列、例えば配列番号６に変異がない。
【０１３９】
上述したように、本発明の幾つかの実施形態においては、ベクターのＴｏｒＡＢ７部分に対するコードされたアミノ酸配列は、配列番号２で与えられる（例示的ヌクレオチド配列は配列番号１で与えられる）。したがって、ファージ粒子の蛍光を保持又は改善する変異残基の少なくとも一部がベクターのＴｏｒＡＢ７部分に位置する実施形態においては、こうした変異ＴｏｒＡＢ７コンポーネントは、配列番号２若しくは配列番号１、又はそれと少なくとも７０％同一である配列（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一）を含むことができる。あるいは、こうした変異コンポーネントは、配列番号１又は配列番号２において、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルで、好ましくはアミノ酸レベルで、それぞれ最高３０％、２５％、２０％、１５％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％の変異レベルを含むことができる。好ましい変異ＴｏｒＡＢ７コンポーネントは、最高１５％、好ましくは最高１３％又は１０％、より好ましくは最高５％又は４％の変異レベルを含むことができる。
【０１４０】
変異ＴｏｒＡＢ７配列の別の好ましい例は、ＴｏｒＡＢ７配列、例えば配列番号２に最高６、例えば最高５、４、３、２又は１個の改変アミノ酸を含む配列である。
【０１４１】
本発明の別の好ましい実施形態においては、変異は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎとｐＶＩＩＩの間のリンカー、及びｐＶＩＩＩコード領域の１つ以上（又は全部）に存在し得る。一部の好ましい実施形態においては、変異はｐＶＩＩＩコード領域に存在し得る。変異がｐＶＩＩＩ領域に位置する場合、一部の実施形態においては、変異は、ｐＶＩＩＩのＮ末端半分、例えば、最初の９０ヌクレオチド（又はｐＶＩＩＩの最初の３０、例えば最初の２５〜２８若しくは２５〜３０アミノ酸）内に位置する。したがって、ファージ粒子の蛍光を保持又は改善する変異残基の少なくとも一部がベクターのこれらの領域に位置する実施形態においては、こうした変異ベクターは、配列番号Ａ若しくは１６又は配列番号Ｃ若しくは１８、又は配列番号Ａ若しくは１６又はＣ若しくは１８と少なくとも７０％同一である配列（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一）を含むことができる。あるいは、こうした変異コンポーネントは、配列番号Ａ又はＣに最高３０％、２５％、２０％、１５％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％の変異レベルを含むことができる。好ましい変異コンポーネントは、最高１５％、好ましくは１３％又は１０％、より好ましくは最高５％又は４％の変異レベルを含むことができる。
【０１４２】
変異ベクター配列の別の好ましい例は、配列番号Ａ若しくは１６又はＣ若しくは１８に最高３０、例えば最高２５、２０、１５、１２若しくは１０、例えば１、又は最高２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個の改変アミノ酸を含む配列である。
【０１４３】
本明細書に記載のように、別の変異残基が存在し得るものの、好ましい変異ベクター配列は、配列番号Ｃ若しくは１８の残基２７６又はそれに対応する残基にバリンからイソロイシンへの置換を含む（すなわち、配列番号Ｃ若しくは１８の位置２７６又はそれに対応する位置にイソロイシン残基を有する）。より好ましくは、イソロイシンをコードするコドンはＡＴＡである。例えば、バリンコドンＧＴＣをイソロイシンコドンＡＴＡで置換することができる。したがって、変異ベクターが配列番号Ｃ若しくは１８若しくは配列番号Ｃ若しくは１８と少なくとも７０％同一である配列、又は最高１５％の変異レベル、又は配列番号Ｃ若しくは１８におけるある数、例えば最高３５個の改変アミノ酸を含むことができる上記考察の実施形態では、好ましい実施形態においてこのイソロイシン残基又はコドンが存在する。
【０１４４】
本発明の別の好ましい実施形態においては、変異は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎとｐＶＩＩＩの間のリンカー、ｐＶＩＩＩコード領域、及びＴｏｒＡＢ７シグナルペプチドの１つ以上（又は全部）に存在し得る。一部の好ましい実施形態においては、変異はｐＶＩＩＩコード領域に存在し得る。
【０１４５】
変異がｐＶＩＩＩ領域に位置する場合、一部の実施形態においては、変異は、ｐＶＩＩＩのＮ末端半分、例えば、最初の９０ヌクレオチド（又はｐＶＩＩＩの最初の３０、例えば最初の２５〜２８若しくは２５〜３０アミノ酸）内に位置する。したがって、ファージ粒子の蛍光を保持又は改善する変異残基の少なくとも一部がベクターのこれらの領域に位置する実施形態においては、こうした変異ベクターは、配列番号Ｅ若しくは２０又は配列番号Ｋ若しくは２６、又はアミノ酸レベルで配列番号Ｅ若しくは２０又は配列番号Ｋ若しくは２６と少なくとも７０％同一である配列（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一）を含むことができる。あるいは、こうした変異コンポーネントは、配列番号Ｅ若しくは２０又は配列番号Ｋ若しくは２６に最高３０％、２５％、２０％、１５％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％の変異レベルを含むことができる。好ましい変異コンポーネントは、最高１５％、好ましくは１３％又は１０％、より好ましくは最高５％又は４％の変異レベルを含むことができる。
【０１４６】
変異ベクター配列の別の好ましい例は、配列番号Ｅ若しくは２０又はＫ若しくは２６に最高３５、例えば最高３０、２５、２０、１７、１５、１２若しくは１０、例えば１、又は最高２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個の改変アミノ酸を含む配列である。
【０１４７】
本明細書に記載のように、別の変異残基が存在し得るものの、好ましい変異ベクター配列は、配列番号Ｅ若しくは２０の残基３１７又はそれに対応する残基にバリンからイソロイシンへの置換を含む（すなわち、配列番号Ｅ若しくは２０の位置３１７又はそれに対応する位置にイソロイシン残基を有する）。より好ましくは、イソロイシンをコードするコドンはＡＴＡである。例えば、バリンコドンＧＴＣをイソロイシンコドンＡＴＡで置換することができる。したがって、変異ベクターが配列番号Ｅ若しくは２０又は配列番号Ｅ若しくは２０と少なくとも７０％同一である配列、又は最高１５％の変異レベル、又は配列番号Ｅ若しくは２０におけるある数、例えば最高３５個の改変アミノ酸を含むことができる上記考察の実施形態では、好ましい実施形態においてこのイソロイシン残基又はコドンが存在する。
【０１４８】
本発明の別の好ましい実施形態においては、変異は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎとｐＶＩＩＩの間のリンカー、ｐＶＩＩＩコード領域、ＴｏｒＡＢ７シグナルペプチド、及びＦＬＡＧ配列の１つ以上（又は全部）に存在し得る。
【０１４９】
変異がｐＶＩＩＩ領域に位置する場合、一部の実施形態においては、変異は、ｐＶＩＩＩのＮ末端半分、例えば、最初の９０ヌクレオチド（又はｐＶＩＩＩの最初の３０、例えば最初の２５〜２８若しくは２５〜３０アミノ酸）内に位置する。したがって、ファージ粒子の蛍光を保持又は改善する変異残基の少なくとも一部がベクターのこれらの領域に位置する実施形態においては、こうした変異ベクターは、配列番号Ｇ若しくは２２又は配列番号Ｍ若しくは２８、又は配列番号Ｇ若しくは２２又は配列番号Ｍ若しくは２８と少なくとも７０％同一である配列（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一）を含むことができる。あるいは、こうした変異コンポーネントは、配列番号Ｇ若しくは２２又は配列番号Ｍ若しくは２８に最高３０％、２５％、２０％、１５％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％の変異レベルを含むことができる。好ましい変異コンポーネントは、最高１５％、好ましくは１３％又は１０％、より好ましくは最高５％又は４％の変異レベルを含むことができる。
【０１５０】
変異ベクター配列の別の好ましい例は、配列番号Ｇ若しくは２２又はＭ若しくは２８に最高３５、例えば最高３０、２５、２０、１７、１５、１２若しくは１０、例えば１、又は最高２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個の改変アミノ酸を含む配列である。
【０１５１】
本明細書に記載のように、別の変異残基が存在し得るものの、好ましい変異ベクター配列は、配列番号Ｇ若しくは２２の残基３２５又はそれに対応する残基にバリンからイソロイシンへの置換を含む（すなわち、配列番号Ｇ若しくは２２の位置３２５又はそれに対応する位置にイソロイシン残基を有する）。より好ましくは、イソロイシンをコードするコドンはＡＴＡである。例えば、バリンコドンＧＴＣをイソロイシンコドンＡＴＡで置換することができる。したがって、変異ベクターが配列番号Ｇ若しくは２２若しくは配列番号Ｇ若しくは２２と少なくとも７０％同一である配列、又は最高１５％の変異レベル、又は配列番号Ｇ若しくは２２におけるある数、例えば最高３５個の改変アミノ酸を含むことができる上記考察の実施形態では、好ましい実施形態においてこのイソロイシン残基又はコドンが存在する。
【０１５２】
ベクターがＦＬＡＧタグを含むこうした実施形態においては、ＦＬＡＧタグは無修飾又は非変異のままで、例えば、配列番号１０の配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を保持することが好ましい。
【０１５３】
特に好ましい実施形態においては、本発明のベクターは、突然変異又は変異配列の翻訳効率又は速度が低下する、かなり低下する、より弱くなる、又は減少するような変異を含む。したがって、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳効率が低い、弱い、低下した、減少した、又は最適でないベクター構築物が一般に好ましい。好ましい修飾／変異分子は、例えば、その具体例が本明細書に記述された元の親（非変異又は無修飾）配列に比べて、例えば特に蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳効率が低下又はかなり低下（又は減少）したものである。例として、これは、ｐＶＩＩＩタンパク質（したがって、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を含むＯＲＦ全体）の翻訳効率が低下又はかなり低下するように変異ｐＶＩＩＩコンポーネントを有することによって行うことができる。しかし、同様に、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の他の部分、例えば、蛍光団（例えば、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ蛍光団）、リンカー配列、又はシグナルペプチドの変異も翻訳効率の低下を招き得ることが予想される。
【０１５４】
翻訳効率が低下した変異体は、当業者によって発明された又は知られている適切な方法によって、スクリーニング又は試験することができる。例えば、関連する対照（例えば、非変異又は野生型融合タンパク質）に比べた翻訳効率の低下が試験されるシステムにおいてタンパク質の絶対量が低下したかどうか評価するために、正規化宿主細胞数、及びタンパク質機能性とは無関係な手段、例えばウエスタンブロットによって定量化されるタンパク質産生について時間追跡アッセイを行うことができる。
【０１５５】
好ましくは、こうした減少（実際には、本明細書に記載の他の減少、低下又は負の効果）は、適切な対照レベル又は値に比べて（例えば、非変異、親若しくは野生型ベクターで得られた翻訳のレベル、例えば翻訳効率若しくは速度、又は別の関連する対照に比べて）、測定可能な減少などであり、（適宜）、より好ましくは、重要な減少、好ましくは、例えば確率値≦０．０５の統計的に有意な減少である。
【０１５６】
理論に拘泥するものではないが、この低下した翻訳効率又は速度、及び例えば宿主細胞における融合タンパク質のより漸進的な又はより遅い蓄積は、最終的に、正常な又は高い翻訳効率が認められるベクター構築物（例えば、親構築物、その具体例は本明細書に記述されている）に比べてファージのコートに取り込まれる蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質のコピー数を増加させると考えられる。あるいは、ファージのコート中の機能性蛍光団融合体の数は、取り込まれる単位の絶対数を必ずしも変えずに増加する。本発明の目的の一つは、ファージのコート（表面）に取り込まれる蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の数の増加によって、又はファージ表面の機能性融合タンパク質の数の増加によって、ファージ粒子の蛍光を増加させることであるので、一部の実施形態において、特に蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳効率の低下が、例えば、蛍光団ｐＶＩＩＩ融合タンパク質のより良好な機能性ディスプレイ、及び／又は蛍光団ｐＶＩＩＩ融合タンパク質のディスプレイの増加（例えば、粒子１個当たりのコピー数の増加）の点で、より良好な結果を生じ、次いでファージ粒子の蛍光を増加させ得ることは、やや驚くべきことである。
【０１５７】
ファージ粒子の蛍光を改善する変異の一例は、配列番号８に示したｐＶＩＩＩタンパク質の残基３３におけるＶからＩへの修飾である。この変異は、親配列に比べて、又は換言すればこの位置におけるＶからＩへの変異を持たない配列に比べて、蛍光が改善されることが示された実施例に記載のクローンＦ０３で見られる。興味深いことに、核酸配列を調べると、親／野生型／無修飾ｐＶＩＩＩにおける位置３３のバリンをコードするコドンＧＴＣがイソロイシンをコードするコドンＡＴＡに変化した。これは、大腸菌における極めて稀なコドンであり、したがってＦ０３クローンにおける蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳効率の大きな低下の一因と考えられる。したがって、別の適切な変異は、核酸配列におけるＡＴＡなどのレアコドン（大腸菌における稀なコドン）の組み込みをもたらすものであろう（Ｔは、当然、対応するＲＮＡ配列ではＵである）。適切なレアコドンは、当業者によく知られているが、幾つかの例は、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＡＧＡ、ＣＧＧなどのＡｒｇコドン、又はＣＴＡ（Ｌｅｕ）、ＣＣＣ（Ｐｒｏ）若しくはＴＣＧ（Ｓｅｒ）である。別の例は、通常のＡＴＧ開始コドンをより稀なコドン、例えば、より稀なＧＴＧコドンに交換することであろう。
【０１５８】
実験の実施例から分かるように、例えばＧＴＣバリンコドンからＡＴＡイソロイシンコドンへの変化の存在としてのこの位置におけるＶからＩへの変異の存在は、例えば、野生型／親／無修飾ｐＶＩＩＩ配列で認められた蛍光の約２倍（又は１００％以上）蛍光を大きく改善する。観測された蛍光は既に明るかった。実際には、親ベクターを発現することによって付与される蛍光は、当該技術分野で既知のファージ粒子に対して最も明るい蛍光を示したと考えられる。したがって、この蛍光を倍加することは、かなり有利な改善である。
【０１５９】
したがって、本明細書に記載のように、別の変異残基が存在し得るものの、好ましい変異ベクター配列は、配列番号８の残基３３又はそれに対応する残基にバリンからイソロイシンへの置換を含む（すなわち、配列番号８の位置３３又はそれに対応する位置にイソロイシン残基を有する）ｐＶＩＩＩ配列を有する。より好ましくは、イソロイシンをコードするコドンはＡＴＡである。例えば、バリンコドンＧＴＣをイソロイシンコドンＡＴＡで置換することができる。したがって、変異ベクターが配列番号８若しくは配列番号８の変異体、例えば、配列番号８と少なくとも７０％同一である配列、又は最高１５％の変異レベル、又は配列番号８におけるある数、例えば最高３５個の改変アミノ酸を含むことができる本明細書に記載の実施形態では、好ましい実施形態においてこのイソロイシン残基又はコドンが存在する。したがって、好ましいベクター構築物においては、ベクターに含まれる（又はコードされる）ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質又は変異体配列は、配列番号８の位置３３又は対応する位置にバリンからイソロイシンへの変異（イソロイシン残基）を有する。好ましくは、前記イソロイシン残基をコードする核酸配列は、コドンＡＴＡを含む。
【０１６０】
同様に、別の変異残基が存在し得るものの、ヌクレオチドレベルでは、ｐＶＩＩＩタンパク質をコードする好ましい変異ベクター配列は、配列番号７の残基９７〜９９又はそれに対応する残基にＧＴＣからＡＴＡへの置換を含む。したがって、変異ベクターが配列番号７、又は配列番号７の変異体、例えば、配列番号７と少なくとも７０％同一である配列を含むことができる本明細書に記載の実施形態では、好ましい実施形態においてイソロイシンをコードするこのＡＴＡコドンが存在する。
【０１６１】
したがって、好ましいベクター構築物は、配列番号６１又は配列番号６１と少なくとも７０％同一である配列を含むｐＶＩＩＩファージコートタンパク質を含む。あるいは、ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質は、配列番号６０を含む配列又は配列番号６０と少なくとも７０％同一である配列によってコードされる。
【０１６２】
例えば、一部の実施形態においては、コードされたｐＶＩＩＩタンパク質は、配列番号６１との配列相同性が少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一などの少なくとも７０％、７５％又は８０％であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。上述したように、これらの変異ｐＶＩＩＩ配列は、蛍光団をｐＶＩＩＩ融合タンパク質として提示する機能的能力を保持又は所有すべきである。蛍光団をｐＶＩＩＩ融合タンパク質として提示する能力が保持されたならば、配列番号６１（又はこれらの相同配列）又は別のｐＶＩＩＩ配列の機能性切断物又は断片を使用することもできる。
【０１６３】
同様に、ｐＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号６０との配列相同性が少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一などの少なくとも７０％、７５％又は８０％であるヌクレオチド配列を含む、又はからなる。これらの変異ｐＶＩＩＩヌクレオチド配列は、ファージ粒子上で提示され得るｐＶＩＩＩ融合タンパク質として蛍光団をコードする機能的能力を保持又は所有すべきである。ファージ粒子上で提示され得るｐＶＩＩＩ融合タンパク質として蛍光団をコードする能力が保持されたならば、配列番号６０（又はこれらの相同配列）又は別のｐＶＩＩＩ配列の機能性切断物又は断片を使用することもできる。
【０１６４】
実施例に示すＦ０３クローンは、配列番号２のＴｏｒＡＢ７配列、配列番号１０のＦＬＡＧタグ、配列番号４のｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光団、配列番号６のリンカー配列、及び（配列番号６０によってコードされる）配列番号６１のｐＶＩＩＩファージコートタンパク質を含む。したがって、これらの配列の１つ以上又は全部を含む又はコードするベクターが好ましいが、ＦＬＡＧタグは任意選択である。配列番号４のｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光団、配列番号６のリンカー配列、及び（配列番号６０によってコードされる）配列番号６１のｐＶＩＩＩファージコートタンパク質をコードする配列を含むベクターが好ましく、図９に示した配列を含むベクターも好ましいが、ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質は、（配列番号６０によってコードされる）配列番号６１で示されるアミノ酸配列を有する又は含む。これらの配列の１つ以上又は全部と少なくとも７０％同一である変異体も本明細書に記載のように企図される。しかし、こうした変異体配列においては、イソロイシン残基が配列番号６１又はその変異体配列の残基３３（又は対応する残基）に存在することが好ましい。（配列番号６０に見られるように）このイソロイシン残基がコドンＡＴＡによってコードされることも好ましい。
【０１６５】
幾つかの別の実施形態においては、上述したように蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質（又はコード核酸）のｐＶＩＩＩ（又は別の）コンポーネントにおける変異によって蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳効率が低下する変異体、特にＶからＩへの変異体／突然変異体の使用は、本明細書に記載のようにＴａｔシグナルペプチド及び蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を含むＯＲＦをコードする配列の上流のベクター構築物における弱いＳＤ（又は弱いＲＢＳ）配列の使用などの蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳効率を低下させる別の特徴と組み合わせることができる。
【０１６６】
本発明の好ましいベクターは、ｐＶＩＩＩ以外のファージコートタンパク質に融合した目的タンパク質（ＰＯＩ）又は標的単位を含む第２のファージコートタンパク質融合体をコードすることができる。こうした第２のファージコートタンパク質融合体は、好ましくは、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質と同じベクター上で与えられる。しかし、第２のコートタンパク質融合体を別のベクター上で与えることもできる。例示的非ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質は、当業者によく知られており、例えば、ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ又はｐＩＸとの融合体を使用することができる。こうした実施形態は、ファージ粒子の２つの異なるコートタンパク質上のＰＯＩ、例えば標的タンパク質と蛍光団を同時に提示することができる。好ましい第２の融合体は、目的タンパク質（ＰＯＩ）又はｐＩＸに対する標的単位であろう。
【０１６７】
本発明のベクターは、したがって、非ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質をコードする配列に融合した（遺伝子融合した）ＰＯＩをコードする配列（核酸配列）を更に含むことができる。ＰＯＩ及び非ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質は、ベクター中で任意の適切な順又は間隔とすることができる。ただし、発現され、ファージ粒子中にパッケージされると、ＰＯＩと非ｐＶＩＩＩコートタンパク質の機能性融合タンパク質が形成され、融合タンパク質の非ｐＶＩＩＩコートタンパク質コンポーネントがファージコートの一部を形成し、ＰＯＩがファージ粒子の表面で機能的に発現又は提示されることが条件である。融合タンパク質のＰＯＩ部分は、したがって、融合タンパク質の非ｐＶＩＩＩコートタンパク質部分とインフレームの位置にある。本発明のベクターにおいては、第２の融合タンパク質のＰＯＩコンポーネントは、第２の融合タンパク質の非ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質コンポーネントに対してＮ末端（又はＮ末端若しくはその近く）又はＣ末端（又はＣ末端若しくはその近く）に位置することができる。これは、一般に、使用された非ｐＶＩＩＩファージコートタンパク質のタイプに基づいて決定され、当業者に直ちに明らかになる。
【０１６８】
第２のファージコートタンパク質へのＰＯＩの融合が使用される実施形態においては、コートタンパク質融合（すなわちｐＶＩＩＩ及び非ｐＶＩＩＩ融合）の各々が別のオープンリーディングフレームとして発現されることが好ましい。したがって、こうした実施形態においては、ベクターは、２つの別々のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）又はＳＤ若しくはＴＩＲ領域を含むことができ、一方は蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質の翻訳を誘導し、他方はＰＯＩ−第２のコートタンパク質融合タンパク質の翻訳を誘導する。任意の適切なＲＢＳなどを使用して、ＰＯＩ−第２のコートタンパク質融合タンパク質の翻訳を誘導することができる（例えば、本明細書に記載の強い、弱い又はコンセンサス配列）。２つのコートタンパク質融合体のためのＲＢＳ配列は、したがって、同じでも、異なってもよく、例は本明細書に記載されている。
【０１６９】
２つの融合タンパク質を含むこうした構築物の例示的構造を図２に示す。
【０１７０】
こうしたベクターにおいては、２つの融合タンパク質をコードする配列を任意の順にすることができるが、一部の実施形態においては、ＰＯＩ融合タンパク質は、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質に対してＮ末端に位置する。
【０１７１】
本明細書に記載のように、シグナル配列又はシグナルペプチドを非ｐＶＩＩＩ融合タンパク質のＯＲＦに含むことができる。これは、使用される非ｐＶＩＩＩ融合タンパク質のタイプに主として依存する。ｐＩＩＩ融合タンパク質は一般にシグナルペプチドを必要とするのに対して、シグナルペプチドはｐＶＩＩ及びｐＩＸ融合タンパク質では任意選択であり（すなわち、存在してもしなくてもよい）、シグナル配列は一般にｐＶＩでは使用されない。例えば、ｐＶＩは一般にＣ末端融合体として使用される。第２のシグナルペプチドが使用される本発明の幾つかの実施形態においては、Ｔａｔ以外のシグナルペプチドが使用される。
【０１７２】
こうした実施形態においては、両方のコートタンパク質融合体が同じプロモーター配列の制御下で発現されることも好ましいが、別の実施形態においては、別個の又は異なる（例えば、２個の）プロモーター配列を使用することができる。例示的プロモーター配列は、当業者によく知られており、これらのいずれかを使用することができる。例示的プロモーター配列は、例えば、ＩＰＴＧを用いて誘導することができるｌａｃプロモーターとすることができる。他のプロモーターとしては、ｔａｃ、ａｒａｂＢ又はｐｓｐが挙げられる。
【０１７３】
重要なことには、本明細書に示す結果によれば、ファージ表面のｐＶＩＩＩ−蛍光団融合タンパク質の発現は、同じファージ粒子、例えばｐＩＸ上の異なるコートタンパク質上で提示されるＰＯＩ、特に標的タンパク質の結合能力（例えば、抗体の抗原結合能力）を妨害しない。したがって、ｐＶＩＩＩ−蛍光団融合タンパク質を任意の他のファージコートタンパク質上の目的タンパク質の発現と併せて使用することができる。
【０１７４】
ファージ上のディスプレイに適切であれば、任意の目的タンパク質（ＰＯＩ）を本発明のベクター中でコードすることができる。好ましい例は、標的分子／標的単位、又は別の実体に結合する（を標的とする）ことができる結合パートナーである。ＰＯＩの幾つかの好ましい例は、抗体又はその断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ナノボディ）、ＭＨＣ分子（クラスＩ又はクラスＩＩ）、Ｔ細胞受容体、又はＤＡＲｐｉｎ、アンキリンファミリー、フィブロネクチンファミリー、ノッチン、アンチカリンなどの非Ｉｇ誘導結合タンパク質（Ｈｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １５：１４−２７）、及びペプチドである。
【０１７５】
本発明のベクターは、特定の標的実体、例えば標的タンパク質に対する結合パートナー（例えば、抗体）を選択するために、古典的ファージディスプレイに使用することができる。こうした適用例においては、ＰＯＩのライブラリをファージ粒子上で非ｐＶＩＩＩ融合タンパク質（第２のコートタンパク質融合体）の一部として発現し、標準の周知の技術によって標的実体に結合するかどうか選択することができる。蛍光ｐＶＩＩＩ融合タンパク質によって与えられる検出可能なファージ表面蛍光をスクリーニング及び検出に使用することができる。
【０１７６】
したがって、ＰＯＩは一般に外来性又は異種であり、実際には蛍光団も同様である。外来又は異種タンパク質に言及するときに意味するものは、ファージコートタンパク質（又はその断片）に融合した（任意のリンカーアミノ酸を含む又は含まない）、例えば、ファージコートタンパク質のＮ末端に融合した、関連するファージコートタンパク質、例えば、ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＩＸ又はｐＶＩＩＩタンパク質などの本来は一部でないタンパク質又はペプチドである。
【０１７７】
本発明のベクター（又は核酸分子）中に存在し得る他の任意選択の特徴は、当業者によく知られている。例えば、ベクター、例えば、（ファージディスプレイベクター又は構築物と総称することができる）ファージベクター又はファージミドベクターは、他の適切なコンポーネント、例えば、複製開始点、転写開始のための誘導性若しくは非誘導性プロモーター／オペレーター、エンハンサー、終結配列、抗生物質耐性遺伝子及びマーカー、シャペロンタンパク質（例えば、ＦｋｐＡなどのペリプラズムシャペロンタンパク質）をコードする配列、シグナル配列、リンカー、プロテアーゼ部位、一般的なタグ若しくはレポーター分子、クローニング及び他の操作を可能にする制限部位、例えばＰＣＲによる構築物の増幅を可能にするプライマー結合部位、又は他の望ましい配列要素、例えば、例えばＰＣＲによる異なるライブラリの識別を可能にするＤＮＡ配列を場合によっては更に含むことができる。ファージディスプレイ構築物内のこうした追加のコンポーネントがそれらの所望の機能を果たすための適切な供給源及び位置決めは、当業者の通常の実務の十分な範囲内であろう。
【０１７８】
本発明のベクター及び核酸配列の発現並びに蛍光ファージ粒子のパッケージ及び産生に使用することができるファージディスプレイの適切な細菌宿主は、当業者によく知られており、それに応じて選択することができる。好ましい細菌宿主細胞は、大腸菌株などのグラム陰性菌である。例示的大腸菌株としては、ＸＬ−１  ｂｌｕｅ、ＴＧ１、ＥＲ２７３８、ＡＶＢ１００ＦｍｋＩＩ’、ＭＣ１０６１、ＳＳ３２０及びＴＯＰ１０Ｆ’が挙げられる。一部の実施形態においては、ＸＬ−１  ｂｌｕｅ株が好ましい。
【０１７９】
本発明に使用される好ましい細菌宿主、例えば大腸菌宿主は、Ｔａｔ輸送タンパク質又はＴａｔ輸送タンパク質のコンポーネントを過剰発現する、例えば、タンパク質Ｔａｔ  Ａ、Ｔａｔ  Ｂ及びＴａｔ  Ｃを過剰発現するように操作された宿主である。例えば、Ｔａｔ輸送タンパク質のコンポーネント、例えば少なくともタンパク質Ｔａｔ  Ａ、Ｔａｔ  Ｂ及びＴａｔ  Ｃを発現ベクター上で発現することによる、こうした過剰発現の方法は当業者によく知られている。これらのコンポーネント、例えばタンパク質Ｔａｔ  Ａ、Ｔａｔ  Ｂ及びＴａｔ  Ｃの配列及び供給源は、当該技術分野において、例えば標準データベースから容易に入手可能である。例示的方法を添付の実施例に示す。次いで、これらの宿主細胞に本発明のベクターを導入又は供給し、これらの宿主細胞を使用して蛍光ファージ粒子を産生することができる。
【０１８０】
実験の実施例に示すように、こうした宿主の使用は、例えば、細菌宿主細胞を過剰発現する非Ｔａｔトランスポーターが使用されるときに観察される蛍光に比べて、宿主細胞中で産生され、宿主細胞によって分泌されるファージ粒子の蛍光の改善（蛍光強度の増加）に加えて、ファージ粒子を発現する細菌細胞の蛍光の改善（蛍光強度の増加）を可能にすることができる。この改善された蛍光はかなりのものになる可能性があり、例えば、蛍光強度の観察された好ましい増加は、宿主細胞を過剰発現する非Ｔａｔトランスポーターが使用されるときに観察される蛍光の２倍若しくは３倍を超える又は少なくとも２倍若しくは３倍、例えば、最高５倍、１０倍、２０倍又は３０倍の増加であり得る。
【０１８１】
Ｔａｔ輸送タンパク質を異種発現又は過剰発現するように、例えば、少なくともタンパク質Ｔａｔ  Ａ、Ｔａｔ  Ｂ及びＴａｔ  Ｃを異種発現又は過剰発現するように操作された、こうした細菌宿主細胞、例えば大腸菌、例えばＸＬ−１  ｂｌｕｅ又は本明細書に記載の他のものは、本発明の更なる態様を形成する。
【０１８２】
本明細書に記載のように、本発明のベクターは、ファージディスプレイに使用され、したがってファージミドベクター又はファージベクターとすることができる。
【０１８３】
ファージディスプレイは、当該技術分野でよく知られ記述されている技術である。これに関して、１９８５年に、Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈは、大腸菌細胞に感染するウイルスである繊維状ファージの表面でポリペプチドを提示する方法を確立した（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８，１３１５−１３１７）。それ以来、いわゆるファージディスプレイは、タンパク質工学並びに特定の標的に結合するペプチド及びタンパク質の選択のための強力な技術に進化した（Ｌｏｓｅｔ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｌｉｅ，２０１２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５８，４０−４６）。繊維状ファージＭ１３は、５つの異なる構造タンパク質から構築される。タンパク質ＶＩＩＩ（ｐＶＩＩＩ）は主要なコートタンパク質であり、粒子は一端が３〜５コピーのｐＩＩＩ及びｐＶＩでキャッピングされ、他端が３〜５コピーのｐＶＩＩ及びｐＩＸでキャッピングされている。粒子はＦ線毛＋大腸菌にｐＩＩＩを介して感染し、そのｓｓＤＮＡが細菌細胞に注入される。ここで、ファージＤＮＡが複製され、転写され、増殖培地への溶解性分泌前に新しいファージ粒子が組み立てられる。
【０１８４】
ファージディスプレイにおいては、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子は、通常、コートタンパク質（ほとんどの場合ｐＩＩＩ）をコードする遺伝子とそのＮ末端シグナル配列の間に位置して、ＰＯＩ−コートタンパク質融合体を産生するが、本発明の一部の実施形態においては、シグナル配列は必ずしも存在しない。「ファージライブラリ」という用語は、ＰＯＩのアミノ酸配列が異なる独特のファージのコレクションを指し、標準分子クローニング技術によって調製される。ライブラリは、１０10を超えるメンバーを含み、特定の結合剤の選択に使用することができる。
【０１８５】
本発明の別の一態様は、したがって、本明細書に記載の本発明のベクター（又は核酸分子）によって産生され、したがってそれを含む蛍光ファージ、例えば蛍光繊維状ファージのライブラリを提供する。前記蛍光ファージは、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を含む。場合によっては、前記繊維状ファージは、ＰＯＩ又はＰＯＩのライブラリもｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ又はｐＩＸとの融合体として提示する。他のファージディスプレイライブラリと同様に、個々のファージ粒子は、同じＰＯＩを発現／提示するが、複数の粒子の存在は、複数の（又はライブラリ若しくは多数の）異なるＰＯＩのディスプレイを可能にする。
【０１８６】
ファージディスプレイを含む本発明の態様では、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」Ｓａｃｈｄｅｖ  Ｓ．Ｓｉｄｈｕ、１９９５、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｂａｒｂａｓら、１９９４などの汎用のファージディスプレイ教科書を関連技術及び定義のために参照することができる。
【０１８７】
蛍光団−及びＰＯＩ−コートタンパク質融合は、ファージゲノム中の関連コートタンパク質をコードする配列に蛍光団若しくはＰＯＩをコードする配列を挿入することによって完全ファージゲノム（ファージベクターディスプレイ）中でコードすることができ、又はファージミド（ファージミドディスプレイ）上でコードすることができる。ファージミドは、蛍光団−ｐＶＩＩＩ及び場合によってはＰＯＩ−非ｐＶＩＩＩコート融合タンパク質をコードすることができる高コピー数プラスミドであり、ファージ産生に必要な遺伝物質を供給するヘルパーファージによる重感染が必要である。したがって、ファージミドディスプレイにおいては、一般に、蛍光団及び場合によってはＰＯＩディスプレイに利用されるコートタンパク質の２つの供給源、すなわちヘルパーファージコード野生型タンパク質及びファージミドコード蛍光団−ｐＶＩＩＩ及び場合によってはＰＯＩ−コートタンパク質融合体が存在する。次いで、新しいビリオンは、蛍光団−ｐＶＩＩＩ／ＰＯＩ−非ｐＶＩＩＩコートタンパク質融合体と野生型コートタンパク質の混合物を有する。同様に、ファージゲノム系が使用される場合、野生型ファージタンパク質も一般に存在する必要があるが、本発明の一部の実施形態においては、野生型のＰＯＩ−非ｐＶＩＩＩコートタンパク質は存在しない。
【０１８８】
しかし、本発明においては、非ｐＶＩＩＩコートタンパク質上で提示されるＰＯＩの１個又は複数のコピーを有するようにファージ粒子を操作することができる。これは、使用されるヘルパーファージによって制御することができ、本発明の好ましい実施形態においては、非ｐＶＩＩＩコートタンパク質上で提示されるＰＯＩの複数のコピーを有するファージ粒子が使用される。これは、任意の適切な様式で行うことができる。しかし、特に、ディスプレイレベルを増加させ、（結合活性を増加させることもできる）ファージ表面でＰＯＩの複数のコピーを生成するために、ｐＩＸ上の高結合価ディスプレイを可能にするＤｅｌｔａＰｈａｇｅと呼ばれる修飾タイプのヘルパーファージを使用することができる。こうした修飾ヘルパーファージは、低結合価ディスプレイしか許容しないＭ１３Ｋ０７、ＶＣＳＭ１３、Ｒ４０８などの通常のヘルパーファージの使用と対照的である。
【０１８９】
ＤｅｌｔａＰｈａｇｅと呼ばれるヘルパーファージは、Ｎｉｃｏｌａｙ  Ｒｕｓｔａｄ  Ｎｉｌｓｓｅｎによって開発された（Ｎｉｌｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０，ｅ１２０；国際公開第２０１１／０３６５５５号）。このヘルパーファージにおいては、少なくとも１つの（例えば、２つの）アンバー変異がｐＩＸ開始コドンの近くに挿入され、それによってヘルパーファージコードｐＩＸを条件付きで不活性化した。次いで、このヘルパーファージが、ＰＯＩ−ｐＩＸ融合体をコードするファージミドで形質転換された宿主細胞（例えば、大腸菌）に重感染されると、アンバー変異を抑制する宿主細胞（例えば、ｓｕｐＥ＋株）ではＰＯＩ−ｐＩＸの中間結合価ディスプレイが見られるのに対して、アンバー変異を抑制しない宿主細胞（例えば、ｓｕｐＥ−株）ではＰＯＩ−ｐＩＸの高結合価ディスプレイが見られる。これは、ｓｕｐＥ＋宿主細胞株（例えば、ｓｕｐＥ＋大腸菌）においては、ヘルパーファージ由来の野生型ｐＩＸが翻訳され、野生型ｐＩＸはＰＯＩ−ｐＩＸとディスプレイを競合し、両方の混合物が提示されるので、中間結合価ディスプレイを与えるからである。しかし、ヘルパーファージ上の野生型ｐＩＸの産生はｓｕｐＥ−株では阻止され、ファージミドコードＰＯＩ−ｐＩＸのみが存在し、高結合価ディスプレイを与える。
【０１９０】
したがって、本発明の好ましい実施形態においては、ベクター構築物は、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質に加えてＰＯＩ−ｐＩＸ融合タンパク質を含むファージミドベクターであり、こうしたベクター構築物は、野生型ｐＩＸファージタンパク質の発現を制御することができ、ひいてはファージ表面のＰＯＩ−ｐＩＸ融合タンパク質の数を制御することができるように条件変異を有するヘルパーファージと併用される。条件変異が抑制されない実施形態においては、野生型ｐＩＸが発現されず、ＰＯＩ−ｐＩＸのみが発現され、ＰＯＩ−ｐＩＸ融合タンパク質のみが表面で生成し、高結合価ディスプレイになる。条件変異が抑制される実施形態においては、野生型ｐＩＸタンパク質が発現され、野生型ｐＩＸとＰＯＩ−ｐＩＸ融合タンパク質の混合物が表面で生成する。
【０１９１】
適切な条件変異は当業者によく知られており、ヘルパーファージベクターは、ｐＩＸが条件変異の制御下にあるように容易に設計することができる。例えば、ＤｅｌｔａＰｈａｇｅと呼ばれるヘルパーファージにおいては、上述したように、１個以上の抑制可能な終止コドンの形の条件変異（例えば、アンバー変異）が、条件変異を抑制する又は抑制しない適切な宿主細胞と併せて使用される。
【０１９２】
「ファージミド」という用語は、当該技術分野の用語であり、プラスミドとして増殖することができ、ウイルス粒子中で一本鎖ＤＮＡとしてパッケージすることもできるベクターを作製するために繊維状ファージＦｆとプラスミドのハイブリッドとして開発されたクローニングベクターの１タイプを指す。プラスミドと同様に、ファージミドは、ＤＮＡ断片をクローン化するのに使用することができ、ある範囲の技術（形質転換、電気穿孔法）によって細菌宿主に導入することができる。しかし、ファージミドと「ヘルパー」ファージ、例えば、ＶＣＳＭ１３又はＭ１３Ｋ０７を含む細菌宿主の感染は、一本鎖ＤＮＡ複製及びファージ粒子へのファージミドＤＮＡのパッケージングを可能にするのに必要なウイルスコンポーネントを与える。
【０１９３】
本明細書に記載のように、本発明の別の一態様は、本発明のベクター（又は核酸分子）を含み、機能性蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を表面で発現し、ＰＯＩを含む第２のコート融合タンパク質も場合によっては発現する、ファージ粒子を提供する。したがって、ファージ粒子は、ファージゲノム又はファージミドを含むことができる。
【０１９４】
バクテリオファージとしばしば呼ばれるファージは、感染し、複製し、細菌から分泌されるウイルスを意味する、当該技術分野で認知された形式で本明細書では使用される。繊維状バクテリオファージ又は繊維状ファージは、ファージコートタンパク質でパッケージされた一本鎖ＤＮＡゲノム（ｓｓＤＮＡゲノム）を有するファージである。分泌された繊維状ファージ粒子は、表現型的に繊維状構造を有する。
【０１９５】
本明細書ではファージ又は繊維状ファージという用語は、ファージゲノム由来のビリオンとファージミド由来のビリオンの両方を包含する。
【０１９６】
「ヘルパーファージ」という用語は、当該技術分野の用語であり、それ自体がファージゲノムでも機能性ウイルスでもないが、ファージゲノムから誘導される１又は数個の要素を含む単なるプラスミドである、別個の無関係な欠陥ウイルス、例えばファージミドを助けて、欠陥ウイルス（例えば、ファージミド）によって既に占有された、欠陥ウイルス（例えば、ファージミド）が欠損し、その生活環を完成し、例えばファージミドを含むビリオンを形成するのに必要であるタンパク質を供給する、同じ宿主細胞を感染によって再生する、ウイルスを指す。
【０１９７】
本発明に使用される好ましいヘルパーファージは、本明細書に記載されており、Ｍ１３Ｋ０７（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ（Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ）、Ｒ４０８（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などである。好ましい実施形態においては、ヘルパーファージは、記述された条件（又は抑圧）変異を有するヘルパーファージ、例えば、本明細書に記載のＤｅｌｔａＰｈａｇｅ構築物、又はＰｈａｂｅｒｇｅ、Ｅｘ−ｐｈａｇｅ、ＶＣＳＭ１３ｄ３若しくはＲ４０８ｄ３とすることができる。
【０１９８】
本発明によって提供される別の一態様は、本発明のベクター（又は核酸分子）を含むファージディスプレイシステムである。好ましいファージディスプレイシステムは、本発明のベクター（又は核酸分子）、例えば本発明のファージミドベクター、及び例えば本明細書に定義されたヘルパーファージを含む。本発明の別の好ましいファージディスプレイシステムは、本発明のベクター、例えば本発明のファージミドベクター、並びにＴａｔ輸送タンパク質を過剰発現する、例えば少なくともタンパク質Ｔａｔ  Ａ、Ｔａｔ  Ｂ及びＴａｔ  Ｃを過剰発現する、細菌宿主細胞、例えば大腸菌宿主細胞を含む。こうした宿主細胞も本明細書に記載されており、本明細書に記載のすべてのファージディスプレイシステム、キット、方法及び使用におけるコンポーネントとして含むことができる。
【０１９９】
本発明の方法に使用される本明細書に記載の別の一態様は、本発明のベクター（又は核酸分子）を含むキット、又は、例えば、本発明のファージミド及びヘルパーファージ、好ましくは本明細書に記載のヘルパーファージ、例えば本明細書に記載の条件（又は抑圧）変異を有するヘルパーファージで構成される、上述したファージディスプレイシステムを含むキット、又は本発明のベクター、例えば本発明のファージミドベクター、並びにＴａｔ輸送タンパク質を過剰発現する、例えば少なくともタンパク質Ｔａｔ  Ａ、Ｔａｔ  Ｂ及びＴａｔ  Ｃを過剰発現する、細菌宿主細胞、例えば大腸菌宿主細胞を含むキットである。キットは、必要な使用説明書を含むこともできる。
【０２００】
こうしたキットに含まれる本発明の好ましいベクター（又は核酸分子）は、Ｔａｔシグナルペプチドをコードする配列と蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質をコードする配列とを含む本明細書に記載の蛍光団−ｐＶＩＩＩベクターを含むことができる。場合によっては、ベクター（又は核酸分子）は、例えば本明細書に記載の、第２のファージコートタンパク質（非ｐＶＩＩＩファージタンパク質）をコードする配列、及び次いで第２のファージタンパク質に融合するＰＯＩにおけるクローニングに適切な１個以上のクローニング部位（例えば、マルチクローニング部位）を含むこともできる。
【０２０１】
したがって、好ましいキットは、ＰＯＩと非ｐＶＩＩＩコートタンパク質の第２の融合タンパク質と場合によっては一緒に、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を含む蛍光ファージ粒子を産生するための試薬のコレクションを含む、又はからなることができる。本発明のベクター同様、キットは、別のファージミド、ヘルパーファージ、菌種及び説明書から選択される１つ以上のコンポーネントを含むことができる。こうした追加のコンポーネントの好ましい選択肢は本明細書に記載されている。
【０２０２】
本発明の更なる態様は、蛍光ファージ粒子を産生するための、又はファージディスプレイに使用するための、本発明のベクター構築物、核酸分子、ファージディスプレイシステム又はキットの使用を提供する。あるいは、本発明は、蛍光ファージ粒子を産生する方法（又はファージディスプレイの方法）であって、本発明のベクター構築物、核酸分子、ファージディスプレイシステム又はキットの使用を含む方法を提供する。
【０２０３】
本明細書に定義された本発明の蛍光ファージ粒子は、生体外適用及びアッセイのための分子ツールとして使用することもできる。粒子は、検出可能な蛍光試薬が要望される任意のアッセイに使用することができる。
【０２０４】
本発明の好ましいファージ粒子は、本明細書に記載のように、特異的結合パートナー又は標的単位、例えば、抗体などであり得るＰＯＩも提示するので、これらは、特異的結合対のメンバー又は標的試薬として機能することができ、こうした蛍光ファージ粒子は、特定の結合対メンバー又は標的単位が必要な任意のアッセイに使用することができる。次いで、蛍光団は、粒子を検出し、したがってその標的へのＰＯＩの結合を検出するのに容易に使用することができる。重要なことには、こうした使用の場合、ファージ粒子表面の蛍光団−ｐＶＩＩＩのディスプレイが別のファージコートタンパク質上で提示された標的モジュールと干渉しないことが本明細書で示された。
【０２０５】
本発明の蛍光ファージ粒子は、（例えば、溶液中又は細胞上の）蛍光検出、特に蛍光染色を含む任意のアッセイに使用することもできる。したがって、粒子の使用に好ましいアッセイは、ＦＡＣＳ分析又は（ＦＡＣＳ分析に類似の検出システムを有する）免疫蛍光若しくはＦＬＩＳＡアッセイである。免疫蛍光又はＦＬＩＳＡアッセイに粒子を使用できると、抗体を染色（又は検出）する必要がなく、単に検出のための蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体の固有の蛍光に依拠する。ＦＡＣＳ分析に粒子を使用できると、実時間選択（例えば、実時間ファージディスプレイ）を実施して抗体の染色（又は検出）を不要にすることができる大きな利点があり、単に検出のための蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体の固有の蛍光に依拠する。生体外診断への使用も企図される。
【０２０６】
したがって、本発明の更なる態様は、本明細書に定義された本発明の蛍光ファージ粒子を含む試薬、及び例えば生体外アッセイにおける、分子ツールとしてのこうした蛍光ファージ粒子の使用を提供する。
【０２０７】
本明細書で参照する配列の一部を関連する識別名と一緒に下表に要約する。
【０２０８】
【表１】
2021501593.tif 000003
【０２０９】
【表２】
2021501593.tif 000004
【０２１０】
【表３】
2021501593.tif 000005
【０２１１】
【表４】
2021501593.tif 000006
【０２１２】
【表５】
2021501593.tif 000007
【０２１３】
【表６】
2021501593.tif 000008
【０２１４】
【表７】
2021501593.tif 000009
【０２１５】
この表のすべての配列を、本明細書では、この技術分野における慣行に沿って５’から３’方向に列挙する。
【０２１６】
本発明を以下の図面を参照して以下の非限定的実施例に関連して更に記述する。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】図１Ａは、本明細書に記載の蛍光団−ｐＶＩＩＩファージミド構築物のコンポーネントの幾つかを示す模式図である。ＳＤ＝（弱い又は強い）シャイン  ダルガーノ配列、Ｓｉｇ配列＝シグナル配列（ここではＴｏｒＡＢ７として示すが、タンパク質をＴＡＴ分泌経路に誘導する任意のシグナル配列とすることができる）、ＦＬＡＧ＝ＦＬＡＧタグ、ｐＶＩＩＩ＝ファージｐＶＩＩＩコートタンパク質。ボックスは、作製され、試験されたベクターのＳＤ、Ｓｉｇ  Ｓｅｑ及び蛍光団部分における種々のコンポーネントの変異体を示す。すべての変異体は、示した変異を除いて、同一配列であった。図１Ｂは、蛍光団−ｐＶＩＩＩディスプレイＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ粒子の図である。ファージ粒子は、ファージ粒子の長さに沿って無作為に分布する蛍光団の複数のコピーを有する。
【図２】図２Ａは、本明細書に記載のデュアルディスプレイファージミド構築物のコンポーネントの幾つかを示す模式図である。Ｌａｃ＝ｌａｃプロモーター、ＳＤ＝シャイン  ダルガーノ配列、ＰＯＩ＝目的タンパク質、ｐＩＸ＝ファージｐＩＸコートタンパク質、Ｓｉｇ配列＝シグナル配列、ＦＬＡＧ＝ＦＬＡＧタグ、ｐＶＩＩＩ＝ファージｐＶＩＩＩコートタンパク質。ボックスは、作製され、試験されたベクターのＳＤ、Ｓｉｇ  Ｓｅｑ及び蛍光団部分における種々のコンポーネントの変異体を示す。すべての変異体は、示した変異を除いて、同一配列であった。図２Ｂは、デュアルディスプレイＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ粒子の図である。ファージ粒子は、ヘルパーファージに応じてｐＩＸ上で提示されるＰＯＩの１個又は複数のコピー、及びファージ粒子の長さに沿って無作為に分布する蛍光団の複数のコピーを有する。
【図３】ｐＶＩＩＩに融合した蛍光団ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＧＦＰｍｕｔ２を含むファージミド構築物による大腸菌染色を示す図である。形質転換された大腸菌細胞を終夜３０℃で増殖させて蛍光団の発現を可能にした。細胞培養物をスライドガラスに添加し、蛍光を共焦点顕微鏡によって可視化した。ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ及びｅＧＦＰｍｕｔ２は、大部分の細胞において明瞭な明るい蛍光を示す。ｍＣｈｅｒｒｙは、弱いが検出可能な蛍光を示す。
【図４Ａ】ファージミド救出におけるＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅの評価を示す図である。弱い又は強いＳＤ配列、Ｔｏｒ  ＡＢ７又はｇｐ８シグナル配列、及びｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ又はｍＧＦＰｍｕｔ２蛍光団を含むＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅファージミドの６種の変異体を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’の１００ｍｌ培養物中で増殖し、続いてＭ１３Ｋ０７又はＤｅｌｔａｐｈａｇｅヘルパーファージで救出した。ファージをＰＥＧ沈殿によって濃縮し、続いて感染滴定し、結果をｃｆｕampR／ｍｌとして示した。
【図４Ｂ】ファージミド救出におけるＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅの評価を示す図である。ファージミドとヘルパーファージの比をｃｆｕampR／ｃｆｕkanRによって求めた。
【図４Ｃ】ファージミド救出におけるＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅの評価を示す図である。救出されたＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ粒子を１×１０12ｃｆｕampRに正規化し、Ｖｉｃｔｏｒ3多標識プレートリーダーにおいてＦＩＴＣフィルターを用いて蛍光を試験した。蛍光強度を任意単位で示す。
【図５】図５Ａは、異なる大腸菌株の使用による蛍光強度に対する効果の評価を示す図である。４つの異なる大腸菌株にＦＬＡＧタグを有する又は持たないＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅを導入し、終夜増殖させ、ＯＤ600nmについて正規化した。細菌蛍光をＶａｒｉｏｓｋａｎ多モードプレートリーダーで測定し、蛍光強度を任意単位として示す。図５Ｂは、異なる大腸菌株の使用による蛍光強度に対する効果の評価を示す図である。４つの異なる株からＤｅｌｔａＰｈａｇｅを用いて救出された正規化Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ試料（Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ粒子）の蛍光強度をＶａｒｉｏｓｋａｎ多モードプレートリーダーで分析した。蛍光強度を任意単位で示す。
【図６】図６Ａは、ＥＬＩＳＡ及びＦＬＩＳＡにおけるＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ性能の評価を示す図である。正規化ファージ試料の蛍光強度をＶｉｃｔｏｒ3プレートリーダーで分析し、強度を任意単位として示す。図６Ｂは、ＥＬＩＳＡ及びＦＬＩＳＡにおけるＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ性能の評価を示す図である。正規化ファージ試料の希釈系列を１μｇ／ｍｌ  ｐｈＯｘ−ＢＳＡ被覆ウェル又は乳遮断ウェルに添加した。捕捉されたファージを抗Ｍ１３  ＨＲＰ  ｍＡｂを用いて検出し、溶解性ＴＭＢを用いて現像した。図６Ｃは、ＥＬＩＳＡ及びＦＬＩＳＡにおけるＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ性能の評価を示す図である。同じ希釈系列の蛍光シグナルをＶｉｃｔｏｒ3プレートリーダーで並行して分析した。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａは、フローサイトメトリーによるＢＷ  ＴＣＲ  ４Ｂ２Ａ１細胞のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ染色を示す図である。２×１０5個の細胞への５×１０11ｃｆｕ／ｍｌの正規化ファージ入力を全体を通して使用した。導入ＢＷ  ４Ｂ２Ａ１細胞の染色。結合ファージをＰＥ複合抗ＦＤ  ＩｇＹを用いて検出した。図７Ｂは、フローサイトメトリーによるＢＷ  ＴＣＲ  ４Ｂ２Ａ１細胞のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ染色を示す図である。２×１０5個の細胞への５×１０11ｃｆｕ／ｍｌの正規化ファージ入力を全体を通して使用した。非導入ＢＷ細胞の染色。結合ファージをＰＥ複合抗ＦＤ  ＩｇＹを用いて検出した。
【図７Ｃ−Ｄ】図７Ｃは、フローサイトメトリーによるＢＷ  ＴＣＲ  ４Ｂ２Ａ１細胞のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ染色を示す図である。２×１０5個の細胞への５×１０11ｃｆｕ／ｍｌの正規化ファージ入力を全体を通して使用した。ＢＷ  ４Ｂ２Ａ１細胞の染色。結合ファージを固有のファージ蛍光によって検出した。図７Ｄは、フローサイトメトリーによるＢＷ  ＴＣＲ  ４Ｂ２Ａ１細胞のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ染色を示す図である。２×１０5個の細胞への５×１０11ｃｆｕ／ｍｌの正規化ファージ入力を全体を通して使用した。正規化ファージ試料の蛍光強度をＶｉｃｔｏｒ3プレートリーダーで分析し、強度を任意単位として示す。
【図８】突然変異体ライブラリと一緒に使用される選別／ゲーティング戦略の概要を示す図である。ラウンド１は、細胞に基づく選別とディスプレイレベルの高いクローンのファージに基づく濃縮との組合せであった。ラウンド２は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎシグナル及び高レベルの表面ＦＬＡＧを有するクローン（二重陽性細胞）に焦点を合わせた。単一のクローンをサンガー配列決定法、フローサイトメトリー及び蛍光測定によって分析した。
【図９（１）】（本発明の好ましい一実施形態である）ＦＬＡＧ＿ｍＮＧ＿ｐＶＩＩＩベクターの配列を示す図である。ヌクレオチド配列を配列番号５４、アミノ酸配列を配列番号５５として示す。このベクターのＴｏｒＡＢ７、ＦＬＡＧ、ｍＮＧ（ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ）、リンカー及びｐＶＩＩＩコンポーネントすべてを示す。
【図９（２）】図９（１）の続きである。
【図１０】図１０Ａは、元のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ（ｍＮＧｗｔ）とスクリーニングの主要な候補（ｍＮＧＦ０３）の比較を示す図である。異なるファージミドを含むＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞を１６時間３７℃でグルコースの非存在下で培養して、融合タンパク質を発現させた。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞の光学濃度を測定し、すべての試料を光学濃度に基づいてＡ６００値１に調節した。１：２ステップの段階希釈物を調製した。図１０Ｂは、元のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ（ｍＮＧｗｔ）とスクリーニングの主要な候補（ｍＮＧＦ０３）の比較を示す図である。ファージを標準手順に従ってＤｅｌｔａｐｈａｇｅを用いてパッケージした。試料濃度を感染滴定によって測定し、すべての試料を５．０ｅ＋１２ＣＦＵAMP／ｍＬに正規化した。蛍光測定をＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸにおいて４８８ｅｘ／５１７ｅｍで行った。
【図１１】図１１Ａは、ｐｈＯｘ−ｐＩＸ融合系におけるｐＶＩＩＩ−ｍＮＧＦ０３クローンの評価を示す図である。細胞をパッケージングプロセス中に採取した。（グルコース）を含む出発培養物からの蛍光を測定して、蛍光測定のベースラインを確立した（Ｇｌｕ）。同じ細胞の蛍光を終夜パッケージング後に測定した（グルコースを含まない）。すべての試料を光学濃度に基づいてＡ６００値１に正規化した。１：２ステップの段階希釈物を調製した。図１１Ｂは、ｐｈＯｘ−ｐＩＸ融合系におけるｐＶＩＩＩ−ｍＮＧＦ０３クローンの評価を示す図である。ファージ濃度を試料中に存在するＤＮＡ量に基づいて測定した。生データを最低の値４．１８Ｅ＋１２に合わせて調節した。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａは、フローサイトメトリーによるＳＫＷ−３  Ｒ１２−Ｃ９細胞のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ染色を示す図である。５×１０4個の細胞への５×１０12ｃｆｕ／ｍｌの正規化ファージ入力を全体を通して使用した。導入ＳＫＷ−３  Ｒ１２−Ｃ９細胞の染色。結合ファージをＡＰＣ複合抗ＦＤ  ＩｇＹを用いて検出した。図１２Ｂは、フローサイトメトリーによるＳＫＷ−３  Ｒ１２−Ｃ９細胞のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ染色を示す図である。５×１０4個の細胞への５×１０12ｃｆｕ／ｍｌの正規化ファージ入力を全体を通して使用した。非導入ＳＫＷ−３細胞の染色。結合ファージをＡＰＣ複合抗ＦＤ  ＩｇＹを用いて検出した。
【図１２Ｃ−Ｄ】図１２Ｃは、フローサイトメトリーによるＳＫＷ−３  Ｒ１２−Ｃ９細胞のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ染色を示す図である。５×１０4個の細胞への５×１０12ｃｆｕ／ｍｌの正規化ファージ入力を全体を通して使用した。ＳＫＷ−３  Ｒ１２−Ｃ９細胞の染色。結合ファージを固有のファージ蛍光によって検出した。図１２Ｄは、フローサイトメトリーによるＳＫＷ−３  Ｒ１２−Ｃ９細胞のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ染色を示す図である。５×１０4個の細胞への５×１０12ｃｆｕ／ｍｌの正規化ファージ入力を全体を通して使用した。正規化ファージ試料の蛍光強度をＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸプレートリーダーで分析し、強度を任意単位として示す。
【図１３】図１３Ａは、ＥＬＩＳＡ及びＦＬＩＳＡにおけるＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ性能の評価を示す図である。正規化ファージ試料の希釈系列（ｐＮＧＦ０３、ＴＡＴ高に用いた様々な力価をｘ軸上に示す）を１μｇ／ｍｌ  ｐｈＯｘ−ＢＳＡ被覆ウェル又は乳遮断ウェルに添加した。捕捉されたファージの蛍光シグナルをＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸプレートリーダーで分析した。図１３Ｂは、ＥＬＩＳＡ及びＦＬＩＳＡにおけるＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ性能の評価を示す図である。正規化ファージ試料の希釈系列（ｐＮＧＦ０３、ＴＡＴ高に用いた様々な力価をｘ軸上に示す）を１μｇ／ｍｌ  ｐｈＯｘ−ＢＳＡ被覆ウェル又は乳遮断ウェルに添加した。捕捉されたファージの蛍光シグナルをＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸプレートリーダーで分析した。図１３Ｃは、ＥＬＩＳＡ及びＦＬＩＳＡにおけるＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ性能の評価を示す図である。同じ試料を抗Ｍ１３  ＨＲＰ  ｍＡｂを用いて検出し、溶解性ＴＭＢを用いて現像した。図１３Ｄは、ＥＬＩＳＡ及びＦＬＩＳＡにおけるＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ性能の評価を示す図である。正規化ファージ（５．０Ｅ＋１２ＣＦＵAMP／ｍＬ）試料の蛍光強度をＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸプレートリーダーで分析し、強度を任意単位として示す。
【図１４】細菌蛍光レベルの比較を示す図である。ｍＮＧＦ０３ファージミドに加えてＴＡＴ  ＡＣ及びＢ遺伝子に対する発現ベクターを含むＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞を１６時間３７℃でグルコースの非存在下で培養して、融合タンパク質を発現させた。ファージミドを含まない細胞を負の対照として使用した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞の光学濃度を測定し、すべての試料を光学濃度に基づいてＡ６００値１に調節した。１：２ステップの段階希釈物を調製した。蛍光測定をＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸにおいて４８８ｅｘ／５１７ｅｍで行った。
【発明を実施するための形態】
【０２１８】
実施例１−ペリプラズムターゲティングの使用による主要カプシドタンパク質ｐＶＩＩＩ上の機能性生物学的蛍光団の効率的Ｍ１３ディスプレイ
材料及び方法
デュアルディスプレイファージミドの構築
すべての蛍光団−ｐＶＩＩＩ構築物をコンピュータで組み立て、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（中国）に注文した。ｓｃＦｖ  ＧＢ１１３（Ｎｉｌｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０，ｅ１２０）を有するｐＧＡＬＤ９ΔＬＦＮファージミドのＮｈｅＩクローニング部位に断片を挿入した（Ｌｏｓｅｔ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，６，ｅ１７４３３、ベクターの詳細はＧｅｎｂａｎｋ  ＨＱ５２８２５０にもある）。クローニング手順を配列決定によって確認した（ＧＡＴＣ、ドイツ）。
【０２１９】
ＦＬＡＧ−ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎを生成するために、ＦＬＡＧタグ及びｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎのＮ末端部分を含む遺伝子断片をＧｅｎｓｃｒｉｐｔに注文し、ＳｎａｂＩ及びＢｓｇＩ制限部位を用いて挿入した。このファージミドの一般的構造を図２Ａの模式図に示す。このベクター配列の一部を図９に示す。
【０２２０】
ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＧＦＰｍｕｔ２蛍光団をコードするファージミドを同様に作製した。
【０２２１】
ファージ産生
１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２０μｇ／ｍｌテトラサイクリン及び０．１グルコースを含む２×ＹＴ培地（ＹＴ−ＴＡＧ）５ｍｌにそれぞれのファージミドを含む大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅのグリセロールストック由来の細胞を接種し、終夜３７℃でオービタルシェーカー上で増殖させた。ＹＴ−ＴＡＧ２００ｍｌに前培養物をＯＤ600  ０．０２５で接種し、３７℃で振盪しながら増殖させた。その同種ｐＩＸの条件付きノックダウンを有するヘルパーファージであるヘルパーファージＤｅｌｔａＰｈａｇｅのＭＯＩ１０を培養物に感染させ（Ｎｉｌｓｓｅｎら、２０１２、前掲）、ｐＩＸ−ＰＯＩの高結合価ディスプレイをＯＤ600  ０．３〜０．４で可能にした。６０分のインキュベーション後、培養物をペレットにし、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充した２×ＹＴに再懸濁させ、振盪を２８℃で１６時間続けた。細菌細胞を遠心分離及び０．２μｍ減圧フィルターろ過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって除去し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）と１：５で混合した。氷上で終夜インキュベーション後、試料を遠心分離し（５０００×ｇ、４５ｍｉｎ、４℃）、ペレットを２５ｍｌリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。試料をＰＥＧ／ＮａＣｌと１：５で混合し、氷上で４時間インキュベーションし、前のように遠心分離し、ペレットを１ｍｌ  ＰＢＳに再懸濁させた。ビリオン力価をＫｏｃｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２９，１１９６−１１９８，２００２に記載のように感染性スポット滴定によって評価した。
【０２２２】
蛍光測定
励起／発光スペクトルをＦＰ−８５００分光蛍光計（Ｊａｓｃｏ）で測定した。機器のクロストークと感度のバランスを保つ際に、本発明者らは、発光フィルターに±２．５ｎｍの変動を許容しながら、励起と発光の分離を１５ｎｍに設定した。測定を励起と発光の両方で５ｎｍ間隔で行った。
【０２２３】
細菌の蛍光測定
Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ  ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ又はＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ  ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ−ＦＬＡＧファージミドを有する大腸菌の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した５ｍｌ  ２×ＹＴに接種し、終夜３７℃でインキュベーションした。細胞をペレットにし、１×ＰＢＳに再懸濁させ、続いてＯＤ600nmに基づいて正規化した。試料を１：２希釈系列で調製し、蛍光をＶａｒｉｏｓｋａｎ多モードプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）を用いて機器の限度内のｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの適切なｅｘ／ｅｍ設定で測定した（５００／５２５）。
【０２２４】
スライドガラス上の細菌の共焦点顕微鏡法
ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ、ｍＧＦＰｍｕｔ２及びｍＣｈｅｒｒｙ  Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅファージミドの全３種の変異体を有する大腸菌の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した５ｍｌ  ２×ＹＴに接種し、終夜３７℃でインキュベーションした。細菌培養物３μｌをピペットでスライドガラス上に取り、カバーガラスをその上に置いた。ＦＶ１０００共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて各蛍光団に適切な利用可能なレーザー波長で細菌を可視化した（４８８ｎｍ：ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ及びｍＧＦＰｍｕｔ２、５４３ｎｍ：ｍＣｈｅｒｒｙ）。
【０２２５】
ファージの蛍光測定
ファージ試料（１×ＰＢＳ希釈）を正規化し、ＦＩＴＣ−フィルター（４８８／５１０）を備えたＶｉｃｔｏｒ3多標識リーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて１ｓ．励起で、又はＶａｒｉｏｓｋａｎ多モードプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）を用いて機器の限度内のｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの適切なｅｘ／ｅｍ設定で（５００／５２５）蛍光を測定することによって、ファージの蛍光強度測定を行った。
【０２２６】
ファージ捕捉ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートを１μｇ／ｍｌ  ｐｈＯｘ−ＢＳＡを用いて終夜４℃で被覆し、０．１％Ｔｗｅｅｎ（Ｘ）及び４％脱脂粉乳を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴＭ）を用いてブロックした。ＰＢＳＴＭで希釈された２．５×１０12ｃｆｕ／ｍｌから始まるファージ試料の１：４段階希釈物を３つ組で添加した。結合ファージを抗ｍ１３  ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって検出し、続いてＴＭＢ溶液を用いて現像し、吸光度を６１０ｎｍで読んだ、又はＶｉｃｔｏｒ3多標識リーダーにおける蛍光測定によって検出した。
【０２２７】
フローサイトメトリー
一定分量２×１０5個のＢＷ  ４Ｂ２Ａ１  ＴＣＲ導入及び非導入ＢＷ細胞（負の対照）をＶ形９６ウェル皿（ＮＵＮＣ）中に分散させた。総体積を２５０μｌ／ウェルに５％ｗ／ｖ  ＦＣＳ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調節した。プレートを３００ｇ／５ｍｉｎで室温で遠心分離し、上清を廃棄した。５％ＦＣＳ／ＰＢＳで予めブロックされた正規化力価５×１０11ｃｆｕampR／ｍｌのファージの一定分量５０μｌ／ウェルを添加し（対照ウェルには５％ＦＣＳ／ＰＢＳのみ）、プレートを４℃で１時間インキュベーションした。細胞を２００μｌ／ウェルの５％ＦＣＳ／ＰＢＳで洗浄し、細胞を３００ｇ／５ｍｉｎ／ＲＴで遠心分離してペレットにし、上清を廃棄した。５％ＦＣＳ／ＰＢＳ中のＰＥ複合ニワトリ抗ｆｄ（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を適切なウェルに添加し、非染色試料には５％ＦＣＳ／ＰＢＳを添加し、続いて４℃で３０分間インキュベーションした。ウェルを上記のように洗浄し、２００μｌ／ウェルの２％ＰＦＡで固定し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）分析まで暗所で維持した。データ解析をＦｌｏｗＪｏ（ｖ１０．２）ソフトウェアによって行った。
【０２２８】
結果と考察
構築
幾つかのファージミド変異体がｐＧＡＬＤ９ΔＬＦＮ（Ｌｏｓｅｔ，Ｇ．Ａ．ら、２０１１、前掲）ファージミドベクターに基づいて設計された（図１及び２参照）。図２に示したデュアルディスプレイファージミドの場合には、こうしたファージミドは、ｐＩＸに融合した目的タンパク質（ＰＯＩ）（本明細書では、抗体ＧＢ１１３の抗体断片ｓｃＦｖ）をコードする。この系は、ｐＩＸ上のディスプレイが例えば抗体選択において極めて都合良く働くということが以前に見いだされたので選択された（Ｈｏｙｄａｈｌ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ，６，３９０６６；Ｌｏｓｅｔ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６，ｅ１４７０２）。ファージミドは、高い折り畳み効率のためにペリプラズムシャペロンＦｋｐＡもコードする（Ｇｕｎｎａｒｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０，８）。標的タンパク質と蛍光団を２つの異なるコートタンパク質上で同時に提示するために、ｐＶＩＩＩ融合体がファージミドにおいてｐＩＸの終結直後に挿入された。これによって、新しいＯＲＦを同じプロモーター（ｌａｃ）によって調節することが可能になり、したがってｐＩＸとｐＶＩＩＩの両方に融合したデュアルディスプレイファージ粒子を産生することができる（図２Ａ及び２Ｂ）。
【０２２９】
（図２Ａに示すように）幾つかの変異が構築物に含まれた。翻訳強度における変異の効果を調べるために、本発明者らは弱いＳＤ（配列ＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＡを有するＴａｔシグナルペプチドのＡＴＧ開始部位の上流領域と一緒に配列ＡＧＧＡＧＡを含む）又は強いＳＤ（配列ＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴを有するＴａｔシグナルペプチドのＡＴＧ開始部位の上流領域と一緒に、イプシロン配列ＴＴＡＡＣＴＴＴＡも含む、Ｔ７ｇ１０  ＴＩＲを使用した）を含めた。より強い翻訳は、より多量のｐＶＩＩＩ融合体を増殖粒子中に押し込むことができる。転座経路の重要性を調べるために、本発明者らは、ｇｐ８ｓｓ又はＴｏｒＡＢ７をペリプラズムターゲティングリーダーペプチドとして導入した。リーダーペプチドｇｐ８ｓｓは、融合体のターゲティングを分泌系のＳｅｃ経路に向けさせ、それを通してタンパク質が折り畳まれていない状態で転座し、ペリプラズムの酸化環境における折り畳みを可能にする（Ｍａｎｔｉｎｇ，Ｅ．Ｈ．ａｎｄ  Ｄｒｉｅｓｓｅｎ，Ａ．Ｊ．，２０００，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３７，２２６−２３８）。ＴｏｒＡＢ７リーダーペプチドは、ＧＦＰのペリプラズムターゲティングが改善されるように操作され（ＤｅＬｉｓａら、２００２、前掲）、融合体をツインアルギニン輸送（ＴＡＴ）経路に向けさせ、そこでタンパク質は、転座前に細胞質の還元条件で折り畳まれる。次いで、完全に折り畳まれたタンパク質はペリプラズムに転座する（Ｂｅｒｋｓ，Ｂ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，８，１７４−１８１）。
【０２３０】
種々の蛍光タンパク質がｐＶＩＩＩとの融合体としてどのように働くかを調べるために、３つの異なる蛍光タンパク質を評価した：大腸菌ライブラリからの標準ＦＩＴＣフィルターを用いたＦＡＣＳ選択における最適な検出のための赤方偏移について選択されたＦＡＣＳ最適化バージョンのＧＦＰであるＧＦＰｍｕｔ２（Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ，１７３，３３−３８）。変異体ＧＦＰも大腸菌中で発現されると優れた折り畳み体であることが証明された。別の緑色蛍光タンパク質ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ（Ｓｈａｎｅｒ，Ｎ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０，４０７−４０９）も選択された。本発明者らは、転座経路にかかわらず機能的に提示されることが判明した生物学的蛍光団のディスプレイを用いて行われた以前の研究の結果に基づいて（Ｓｐｅｃｋら、２０１１、前掲）、ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｓｈａｎｅｒ，Ｎ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，１５６７−１５７２）も含むようにした。別段の記載がない限り、ｐＩＸ融合体は、マウスＴ細胞受容体（ＴＣＲ）４Ｂ２Ａ１ともっぱら反応し（Ｂｏｇｅｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０，２３５９−２３６２）、フローサイトメトリーにおいてファージ上で提示されると十分働くことが以前に示された（Ｎｉｌｓｓｅｎ，Ｎ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０，ｅ１２０）抗体断片ｓｃＦｖ  ＧＢ１１３であった。
【０２３１】
ファージ産生及び確認
ｐＶＩＩＩ−蛍光団融合体が実際に蛍光タンパク質を産生することを確認するために、本発明者らは、形質転換大腸菌細胞の培養物を蛍光顕微鏡法によって検査した。これに備えて、本発明者らは、強いＳＤとＳＥＣ標的蛍光タンパク質の組合せを含むファージミドで形質転換された細菌が、グルコースリプレッサーが除去されると培養増殖しないことを発見し、したがってこのファージミドバージョンを更に実験することはしなかった（データ示さず）。
【０２３２】
蛍光団ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＧＦＰｍｕｔ２を有するファージミド変異体（図２Ａ）を大腸菌中に転換し、次いで終夜３０℃で増殖させて蛍光団を発現させた。これらのファージミド変異体はすべて弱いＳＤ配列及びＴｏｒＡＢ７シグナル配列を含んだ。細胞培養物をスライドガラスに添加し、蛍光を共焦点顕微鏡によって可視化した。結果を図３に示す。ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ及びｍＧＦＰｍｕｔ２は明瞭な明るい蛍光を示し、ｍＣｈｅｒｒｙは弱い蛍光を示すことがわかる。全３種の蛍光団を用いた検出可能な蛍光レベルの存在は、蛍光団が発現され、正しく折り畳まれることを示している。この蛍光団発現は、ウエスタンブロット法によって確認された（データ示さず）。したがって、上記ファージミド系は、機能性蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質を提示するように作用している。
【０２３３】
ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ及びｍＧＦＰｍｕｔ２がｍＣｈｅｒｒｙよりも良好な検出可能な蛍光を示したので、更なる実験をこれらの構築物を用いて行った。
【０２３４】
系への第２のコートタンパク質融合体の添加がファージ産生及び／又はファージミドパッケージングに影響を及ぼすかどうか評価するために、本発明者らは、緑色蛍光タンパク質（ｍＧＦＰｍｕｔ２及びｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ）を有するすべてのＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ変異体を作製し、ファージ産生及びファージミドパッケージングを感染滴定によって測定した（図４Ａ）。すべてのファージ試料が、本発明者らのｐＩＸ系において以前に認められたものと類似の最終力価に達した（Ｌｏｓｅｔら、２０１１、ｅ１７４３３、前掲、及びＮｉｌｓｓｅｎら、２０１２、前掲）。さらに、以前に認められたように、ｐＩＸ−ＰＯＩの高結合価ディスプレイを可能にする、その同種ｐＩＸの条件付きノックダウンを有するヘルパーファージＤｅｌｔａＰｈａｇｅを用いたファージミド救出は、ファージ産生に影響を及ぼさないと思われた（Ｎｉｌｓｓｅｎら、２０１２、前掲）。弱いＳＤとＳＥＣターゲティングの組合せは、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎに対してヘルパーファージゲノムの優先的なパッケージングを引き起こし、同じ効果がｍＧＦＰｍｕｔ２に対して強いＳＤとＴＡＴターゲティングでも認められた（図４Ｂ）。しかし、これらの結果によれば、２つのコートタンパク質融合体を含むデュアルディスプレイファージミドは、パッケージされ、ｐＩＸ融合体のみが存在するときに見られるものと同等レベルでファージ産生を可能にする。
【０２３５】
Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ粒子上で提示される機能性蛍光タンパク質のレベルを評価するために、正規化Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ試料をＶｉｃｔｏｒ3多標識リーダーにおいてＦＩＴＣフィルター（４８８ｎｍ／５１０ｎｍ）を用いて分析した（図４Ｃ）。弱いＳＤとＴＡＴ標的ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの組合せは、バックグラウンド蛍光を少なくとも３倍超えたので際立った。しかし、強いＳＤとＴＡＴターゲティングを有するＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅもバックグラウンドの約２倍の強度を示したのに対して、例えば、弱いＳＤとＴＡＴターゲティングを有するｍＧＦＰｍｕｔ２  Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅの強度はバックグラウンド信号をわずかしか上回らなかった。ｐＩＸ  ＰＯＩのディスプレイ価の変動は、ｐＶＩＩＩ上の蛍光タンパク質の機能性ディスプレイレベルに影響を及ぼさないと思われた。高い最終力価に達することは、ライブラリ選択などの下流の用途に極めて重要であり、ＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅがｐＩＸ系で以前に認められたよりも少なく産生されることはなかった。Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ構築物は実際に蛍光ファージ粒子を産生し、変異体の１つ、すなわち弱いＳＤを有するＴＡＴ標的ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎは満足な信号対雑音比に達した。なお、ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎは鋭い励起ピークを５０６ｎｍに、同様に鋭い発光ピークを５１７ｎｍに有するが、これはＶｉｃｔｏｒ3で使用されたフルオレセインフィルター（４８５ｎｍ／５３５ｎｍ）には一致しない。このフィルターを用いて測定される強度は、極めて過小評価される可能性がある。それでも、弱いＳＤとＴＡＴ標的ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの組合せは、最高性能の構築物として際立ち、したがって下流の特性分析に選択された。
【０２３６】
ｐＶＩＩＩ上で提示されたときのｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの励起及び発光スペクトルを調べ、確認するために、２×１０11個／ｍｌのファージ粒子を分光蛍光計で分析した（データ示さず）。正の対照として、本発明者らは、予想波長（４９０ｎｍ／５１０ｎｍ）に明瞭で明確なピークを示す２μｇ／ｍｌの溶解性ｅＧＦＰを含めた。負の対照として、本発明者らは、ｓｃＦｖ  ＧＢ１１３を提示するが蛍光団を提示しないファージ粒子を分析した。ここで、本発明者らは、鋭いピークを４４０ｎｍ／４５５ｎｍに観察した。ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎのディスプレイを有するファージ試料を分析すると、正しく折り畳まれたｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎから予想されたピークに加えて同じ鋭いピークが出現した（５０５ｎｍ／５２０ｎｍ）（Ｓｈａｎｅｒら、２０１３、前掲）。
【０２３７】
機能性ディスプレイの最適化
本発明者らは、大腸菌の標準研究室株において発現及び折り畳みに差があるかどうか、また、差が機能性ディスプレイレベルに変換されるかどうかを調べたかった。さらに、本発明者らは、蛍光タンパク質発現の検出タグを含めたく、ＦＬＡＧタグをｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎのＮ末端に付加した。４種の大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＡＶＢ１００Ｆ’、ＳＳ３２０及びＴｏｐ１０Ｆ’をＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ±ＦＬＡＧで形質転換した。
【０２３８】
次いで、蛍光強度を生きた大腸菌細胞において直接測定した（図５Ａ）。株間の蛍光に明らかな差があった。ＸＬ１−ｂｌｕｅで発現されたタンパク質は強度が最高であり、その近くにＡＶＢ１００Ｆ’が続いた。これら２つの株は、ＳＳ３２０及びＴＯＰ１０Ｆ’よりも著しく高い蛍光強度を示したが、機能的発現及び折り畳みがこれらの株でも明瞭に認められた。驚いたことに、本発明者らの観察によれば、ＦＬＡＧの付加が全体の蛍光強度を高くしたと思われた。次いで、これらのＦＬＡＧを含む構築物を使用して、４つの個々の株で産生されたファージ試料からの蛍光強度を測定し（図５Ｂ）、４つの異なる株にパッケージされたＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅからのｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ−ＦＬＡＧの蛍光を再度比較した（図５Ｂ）。ＸＬ１−ｂｌｕｅ、続いてＡＶＢ１００Ｆ’が優れた株であることが判明した。ＳＳ３２０及びＴｏｐ１０Ｆ’にパッケージされたファージは、蛍光強度が低かった。
【０２３９】
それらは密接に関連したが、異なる株は、蛍光団の機能的発現及び折り畳みに極めて大きい差を示した。さらに、ＸＬ１−ＢｌｕｅとＡＶＢ１００はｐＶＩＩＩ−蛍光団融合体を単独で産生するときには細菌蛍光が極めて類似したが、ＸＬ１−ｂｌｕｅにおいて産生されたＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ粒子は蛍光強度がほぼ２倍であった。これらのデータの示唆するところによれば、蛍光団を機能的にサイトゾル中で折り畳む好都合な能力は、ＸＬ１−ＢｌｕｅとＡＶＢ１００で共有され、ＳＳ３２０とＴＯＰ１０Ｆ’とは対照的である。しかし、ＸＬ１−Ｂｌｕｅは、やはりＡＶＢ１００と比較して、折り畳まれた蛍光団をサイトゾルからペリプラズムに輸送し、それをビリオン中に統合する優れた能力を有するように見える。したがって、これらの株（又は実際には別の大腸菌株）のいずれかを使用することができるが、ある場合にはＸＬ１−ｂｌｕｅが好ましい。
【０２４０】
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光結合免疫吸着検定法（ＦＬＩＳＡ）
本発明者らが同じファージ粒子上のｐＶＩＩＩとは異なるカプシド上で機能性蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体と異なる機能的融合体の両方を提示する能力を組み合わせることができるか否かを判断するために、本発明者らは、十分に記述された抗ｐｈＯｘ  ｓｃＦｖ（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３）を、ｐＩＸ融合体としてファージミドを発現する蛍光団−ｐＶＩＩＩに挿入することにした。本発明者らは、次いで、ファージを調製し、上記ＦＬＩＳＡと同様に古典的ＥＬＩＳＡでｐｈｏｘ結合についてそれらを試験した。比較のために、本発明者らは、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体を含まない抗ｐｈｏｘ  ｓｃＦｖ−ｐＩＸ提示ファージを調製し、並行して試験した。
【０２４１】
正規化量のファージ粒子の蛍光強度は、Ｖｉｃｔｏｒ3プレートリーダーで測定され（図６Ａ）、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体を提示するファージからのみ極めて高い蛍光強度を示した。重要なことには、同じファージ試料をｓｃＦｖ標的結合について標準ＥＬＩＳＡで試験すると、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体の有無とは無関係に特異的な同一の結合が観察された（図６Ｂ）。したがって、データの示すところによれば、ｐＶＩＩＩ上の蛍光団のディスプレイは、デュアルディスプレイファージ上のｐＩＸ融合体中の標的部分によって媒介される抗原結合性に影響を及ぼさなかった。再度同じファージ試料を標的結合についてＶｉｃｔｏｒ3プレートリーダーを用いたＦＬＩＳＡで試験すると、本発明者らは、いずれの試料からも蛍光シグナルを観察できなかった（図６Ｃ）。したがって、データによれば、ウェル中の適用されたすべてのファージの蛍光測定が容易に行われるのに対して、現在の構成では、本発明者らは、ＦＬＩＳＡにおける洗浄後に標的上に保持された減少量のファージを明確に検出する感度を持たなかった。重要なことには、データが最終的に示すところによれば、同じファージ粒子上の蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体とｓｃＦｖ−ｐＩＸ融合体のデュアルディスプレイは、ｓｃＦｖ−ｐＩＸ融合体の表現型に影響を及ぼさない。
【０２４２】
細胞表面で発現されるタンパク質のフローサイトメトリーによる検出
Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅの強力な用途は、染色抗体を必要とせずに、検出を蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体の固有の蛍光にのみ依拠するＦＡＣＳの実時間選択にそれを使用することであろう。これを評価するために、本発明者らは、ＧＢ１１３  ｓｃＦｖ−ｐＩＸ提示Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅをマウス４Ｂ２Ａ１  Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞上で発現されるＴ細胞受容体への特異的結合についてフローサイトメトリーによって試験した。比較のために、本発明者らは、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体を含まないＧＢ１１３  ｓｃＦｖ−ｐＩＸ提示ファージを調製し、並行して試験した。
【０２４３】
ＴＣＲ  ４Ｂ２Ａ１を発現する細胞への特異的結合を標準方法によって確認するために、本発明者らは、ＰＥ複合抗ｆｄ抗体を使用して結合ファージを検出した。これは、ＴＣＲに結合したＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅと通常のファージの並列比較も可能にし（図７Ａ）、どちらもＴＣＲネガティブマウスＢＷ５８細胞に結合しなかった（ＰＭＩＤ：２５５８０２２）（図７Ｂ）。検出ｍＡｂの添加されない細胞を染色しようとすると、本発明者らは、溶液中のときのＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ  ｓｃＦｖ  ＧＢ１１３から観察された強い蛍光シグナル（図７Ｄ）にもかかわらず、対照に比べて蛍光強度の増加がないことを認めた（図７Ｃ）。したがって、Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅは溶液中で強い蛍光シグナルを示したが、本発明者らは、それが表面結合抗原に結合するのをフローサイトメトリーで検出することができなかった。これは、このＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅが多数のアッセイに極めて有用であり、有利であるが、この形のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅは、細胞の直接染色及びＦＡＣＳ選別を可能にするのに必要な粒子１個当たりの輝度にまだ達していないことを意味する。
【０２４４】
結言
ファージと細胞の技術の併用力に依拠しようとする以前の努力が報告されたが、まだ通常の使用は見られない。ファージ粒子上の蛍光タンパク質の機能性ディスプレイは、以前に行われたが、これまでは限定的な成功しか示されず、ｐＶＩＩＩコートタンパク質上では達成されていない。この時点で、ソルターゼタグ付きｐＶＩＩＩへの蛍光団のインビトロ間接カップリングが最大の見込みを示したが（Ｈｅｓｓら、２０１２、前掲）、この手順は非効率で、骨が折れ、高価である。
【０２４５】
本発明者らは、ここで、固有の蛍光能力と標的結合活性の両方を有するファージ粒子の産生を示す。ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎは、ｐＶＩＩＩ上のディスプレイについて調査されたものの中で優れた蛍光団であることが判明した。本発明者らは、ｐＶＩＩＩ上の生物学的蛍光団の機能性ディスプレイに最適な条件が、サイトゾル折り畳みのためのＴａｔ経路を介した融合体の転座を含むことを見いだした。本発明者らは、驚くべきことに、弱いＳＤがより高い機能性ディスプレイを与えることも見いだした。これの正確な理由は不明であるが、大腸菌折り畳み機構の過負荷の一形態が生じていると推測される。ＸＬ１−Ｂｌｕｅは、産生ファージ粒子に対して最高の蛍光強度を与えることが示された。
【０２４６】
この試薬の潜在的最終用途は、抗体の選択及びスクリーニングに限定されない。ファージ上で提示され得る任意のタンパク質をＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅファージミドに挿入して、単層検出試薬を生成することができる。
【０２４７】
Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅは強い蛍光を示し、ＰＯＩとの第２のコートタンパク質融合体を介して標的分子に結合するその能力と合わせて、その固有の蛍光によって標識又は染色試薬／抗体を使用しないために多数のアッセイにおいて有利な有用性を有するが、抗原に結合したときに検出に十分な明るさではまだなかった。これを達成する可能な方法は、Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ粒子の輝度を増加させることかもしれない。これは、理論的に、１）粒子１個当たりのｐＶＩＩＩ−ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ数を増加させること、又は２）折り畳みを改善することによってｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの機能性ディスプレイを改善すること、又は３）ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの固有の輝度を増加させること、又はすべての組合せによって達成されるかもしれない。
【０２４８】
このために、本発明者らは、有利なことに、有効性の改善された（蛍光特性の改善された）Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ構築物の変異体を開発することができた。
【０２４９】
実施例２−Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ変異体の産生
本明細書に記載の元の（親）ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質の配列（配列番号３及び４）におけるアミノ酸のランダム変異を行って、既存の（親）タンパク質よりも明るいバージョン又はファージコート中でｐＶＩＩＩ融合体として改善されたディスプレイを示すバージョンを産生することができるかどうか評価した。本発明者らが両方のカテゴリで改善を示す突然変異体を特定することが理想的であろう。しかし、本発明者らはこれが可能であるか確信がなかった。
【０２５０】
本発明者らは、ｐＶＩＩＩ遺伝子のｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ遺伝子、リンカー及び最初の９０ヌクレオチドに変異を有するＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅベクター変異体からなるライブラリを構築した。
【０２５１】
変異誘発に供された構築物の一部を以下に示す（これら３つの部分はベクター中で連続配列として見られるが、ここでは理解しやすいように個別に示した）。
【０２５２】
GTTTCTAAAGGTGAAGAAGACAACATGGCTTCTCTGCCGGCTACCCACG
AACTGCACATCTTCGGTTCTATCAACGGTGTTGACTTCGACATGGTTGGTCAGGGTACCGGTAACCCGAACGACGGTTACGAAGAACTGAACCTGAAATCTACCAAAGGTGACCTGCAGTTCTCTCCGTGGATCTTAGTTCCGCACATCGGTTACGGTTTCCACCAGTACCTGCCGTACCCGGACGGTATGTCTCCGTTCCAGGCTGCTATGGTTGACGGTTCTGGTTACCAGGTTCACCGTACCATGCAGTTCGAAGACGGTGCTTCTCTGACCGTTAACTACCGTTACACCTACGAAGGTTCTCACATCAAAGGTGAAGCTCAGGTTAAAGGTACCGGTTTCCCGGCTGACGGTCCGGTTATGACCAACTCTCTGACCGCTGCTGACTGGTGCCGTTCTAAAAAAACCTACCCGAACGACAAAACCATCATCTCTACCTTCAAATGGTCTTACACCACCGGTAACGGTAAACGTTACCGTTCTACCGCTCGTACCACCTACACCTTCGCTAAACCGATGGCTGCTAACTACCTGAAAAACCAGCCGATGTACGTTTTCCGTAAAACCGAACTGAAACACTCTAAAACCGAACTGAACTTCAAAGAATGGCAGAAAGCTTTCACCGACGTTATGGGTATGGACGAACTGTACAAA (mNeonGreen)
GGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCAGC（リンカー）
GCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCC
TGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTT pVIII（部分的、最初の９０ヌクレオチド）、（配列番号５６）
【０２５３】
ライブラリ構築
本発明者らは、ＰＣＲによるｄＮＴＰ類似体の組み込みを行って、ランダム変異をファージミドＤＮＡに導入した。Ｚａｃｃｏｌｏらによる論文（１９９６，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５５（４）：５８９−６０３）に基づいて、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、ライブラリ作製中に使用されたＰＣＲに基づく変異誘発キットを製造し、販売している。クローニングツールとして、本発明者らは、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用した。このキットは、配列重複１５〜８０ｎｔｓを有する任意の断片を連結する。
【０２５４】
変異誘発：
本発明者らは、ｄＮＴＰ類似体をＰＣＲ中に取り込むのに使用されるラウンド／サイクル数に基づく突然変異荷重が異なる１個の断片のライブラリを作製し、特徴づけた。本発明者らは、（全５個の機能ドメイン、すなわちＴｏｒＡＢ７、ＦＬＡＧ、ｍＮＧ、リンカー及び完全長ｐＶＩＩＩを含む）完全Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ  ｐＶＩＩＩ融合遺伝子及びそのフランキング領域（下記配列参照）を含む断片を選択する。この手法を用いて、本発明者らは、さかのぼって異なる領域を増幅して、変異誘発プロセスをもう一度経る必要なしに新しいライブラリを将来的に構築する可能性を有する。
【０２５５】
この構築物の個々の部分を以下に示す（これらの部分はベクター中で連続配列として見られるが、ここでは理解しやすいように個別に示した）。
【０２５６】
2021501593.tif 000010
【０２５７】
この配列を以下のプライマーを用いて作製した。
【０２５８】
pVIII_fwd: AGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCC（配列番号５８）
FkpA_R: GCTGATGCAAAGCCGG（配列番号５９）
【０２５９】
配列をＧＡＴＣ（ドイツ）によるサンガー配列決定サービスを利用して分析した。最高２８ラウンド（ＰＣＲサイクル）の変異を行い、アミノ酸レベルで約２５％（ヌクレオチドレベルで約１０％）の変異頻度であった。データは示さない。
【０２６０】
ＴｏｒＡＢ７シグナルペプチド及びＦＬＡＧタグを含む変異誘発された断片を図２に示すようにベクターにクローン化して戻した。このベクターのＴｏｒＡＢ７、ＦＬＡＧ、ｍＮＧ、リンカー及びｐＶＩＩＩコンポーネントの配列は、図９に示す通りである。
【０２６１】
ライブラリのクローニング：
クローニングプロセスは直截的であり、本発明者らは、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔの推奨に厳密に従った。
【０２６２】
完全な連結反応をエレクトロコンピテントＳＳ３２０に形質転換して、多様性の高いライブラリを作製した。ライブラリの滴定に基づく計算は１．０Ｅ＋０６であった。本発明者らは、次いで、ＳＳ３２０細胞からＤＮＡを調製し、Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅの標準パッケージング株であるＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞を電気穿孔した。
【０２６３】
ライブラリを標準パッケージング手順に従ってＨｙｐｅｒｐｈａｇｅと一緒にパッケージし、突然変異体ライブラリメンバーをＦＡＣＳによってスクリーニングした。
【０２６４】
ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩｕ上のゲーティング戦略
完全な選別戦略の概要を図８に示す。本発明者らは、２つの特性に基づいてライブラリをゲート制御した：ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ性能（緑；Ａｌｅｘａ４８８）及び融合タンパク質のディスプレイレベル（赤；ＡＰＣ）。（第２の特性の場合、表面結合ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質レベルを抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＡＰＣ複合抗体、すなわち、蛍光標識抗ＦＬＡＧタグ抗体を用いて定量化することができる）。第１のラウンドにおけるゲーティング戦略は、両方のチャネルの信号強度に関して自由であった。選別された細胞をパッケージして、対応するファージライブラリを作製した。次いで、抗ＦＬＡＧ（登録商標）−Ｍ２被覆ＩｍｍｕｎｏＴｕｂｅを使用して、融合タンパク質がファージコート中に統合されたクローンを濃縮した。新しいＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞にこの濃縮の産物を導入し、生成した細胞をラウンド１のような選別のために準備した。ラウンド２におけるゲーティングは、はるかに厳密であり、二重陽性クローンのみを選別するように意図された。
【０２６５】
図８に示したＦＡＣＳプロファイルからわかるように、表面の蛍光団数が増加したライブラリメンバー及び／又はｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎシグナルが増加したクローンが生成した。（選別前の結果を示す）図８の左側のＦＡＣＳパネルの左下四半分から、図８のラウンド２ＦＡＣＳプロファイル（すなわち、２ラウンドの選別後）に見られる右下四半分（高レベルの表面ＦＬＡＧ、ＡＰＣシグナル）、左上四半分（増加したｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎシグナル）又は右上四半分（高レベルの表面ＦＬＡＧ、ＡＰＣシグナルと増加したｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎシグナルの両方のクローン）へのクローンのシフトを参照されたい。
【０２６６】
こうした結果によれば、親ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ配列を使用したときに観察されたものよりもかなり増加及び改善された蛍光を有する変異体Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅを得ることができ、極めて有利な突然変異体を選択するために、単一のクローンを今では更に特徴づけることができる。
【０２６７】
実施例３−突然変異蛍光団の特性分析
上述したように調製したライブラリを、改善された蛍光特性を示す突然変異体についてスクリーニングすることができる。これらのスクリーニングによって特定される改善されたクローンの一つは、本明細書に記載のいわゆるＦ０３突然変異体である。このＦ０３突然変異体を、完全長ｐＶＩＩＩに変異を有するライブラリを含むスクリーニングの一つから特定した。配列を決定すると、Ｆ０３突然変異体のｐＶＩＩＩ部分のヌクレオチド配列は、以下の通りであった。
【０２６８】
GCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAA
GCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATG
GTTGTTGTCATTATAGGCGCCACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGC（配列番号６０）
【０２６９】
アミノ酸配列は、以下の通りであった。
【０２７０】
AEGDDP AKAAFNSLQASATEYIGYAW AMVVVIIGAT IGIKLFKKFT SKAS（配列番号６１）
【０２７１】
Ｆ０３クローンは、親クローンに比べてｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質に単一のアミノ酸変異のみを含み、それは、ｐＶＩＩＩタンパク質の位置３３におけるＶからＩへの変異であった。対応するコドンは、親クローンにおけるＧＴＣであり、それはＦ０３クローンにおけるＡＴＡであった。
【０２７２】
異なるファージミド（上記ＧＢ１１３融合系に関連したｍＮＧ−ｐＶＩＩＩ野生型／親融合タンパク質、すなわちｍＮＧｗｔ、又はｍＮＧ変異ｐＶＩＩＩ配列を有するＦ０３クローン、ｍＮＧＦ０３）を含むＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞を１６時間３７℃でグルコースの非存在下で培養して、融合タンパク質を発現させた。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞の光学濃度を測定し、すべての試料を光学濃度に基づいてＡ６００値１に調節した。１：２ステップの段階希釈物を調製した。
【０２７３】
結果を図１０に示す。パネル１０Ａは、元のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ（ｍＮＧｗｔ）を発現する生きたＸＬ−１  ｂｌｕｅ細胞において直接測定した蛍光強度とスクリーニングの主要な候補（ｍＮＧＦ０３）との比較を示す。
【０２７４】
パネル１０Ｂは、上述したように標準手順に従ってＤｅｌｔａｐｈａｇｅを用いて菌株中にパッケージされたファージ粒子の蛍光強度をモニターすることによる同じ比較を示す。試料濃度を感染滴定によって測定し、すべての試料を５．０ｅ＋１２ＣＦＵAMP／ｍＬに正規化した。蛍光測定をＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸにおいて４８８ｅｘ／５１７ｅｍで行った。
【０２７５】
Ｆ０３クローンは、細菌及びファージ粒子蛍光が増加し、親クローンで見られる蛍光の約２倍であることがわかる。
【０２７６】
ｍＮＧＦ０３−ｐＶＩＩＩ融合カセットを、上述したようにｐｈＯｘ−ｐＩＸ融合系にクローン化して、デュアル発現構築物を形成した。上述したｐｈＯｘ−ｍＮＧｗｔとｐｈＯｘ−ｍＮＧＦ０３の両方を発現する細菌細胞の蛍光強度を評価し（図１１Ａ）、ファージ粒子も同様に評価した（図１１Ｂ）。
【０２７７】
図１１Ａにおいては、細胞をパッケージングプロセス中に採取した。（グルコース）を含む出発培養物からの蛍光を測定して、蛍光測定のベースラインを確立した（Ｇｌｕ）。同じ細胞の蛍光を終夜パッケージング後に測定した（グルコースを含まない）。すべての試料を光学濃度に基づいてＡ６００値１に正規化した。１：２ステップの段階希釈物を調製した。図１１Ｂにおいては、ファージ濃度を試料中に存在するＤＮＡ量に基づいて測定した。生データを最低の値４．１８Ｅ＋１２に合わせて調節した。
【０２７８】
図１１Ａ及びＢから、ｐｈＯｘ系においては、細菌細胞（図１１Ａ）とファージ粒子（図１１Ｂ）の両方で測定して、ｍＮＧｗｔが良好な蛍光を生じることがわかる。図１１Ａ及びＢによれば、ｍＮＧＦ０３は、ｐｈＯｘ系においても蛍光を生じる。図１１Ｂから、力価を調節すると、ｐｈＯｘ−ｍＮＧＦ０３ファージのファージ１個当たりの蛍光シグナルがｍＮＧｗｔよりも良好であることもわかる。
【０２７９】
Ｈ５７抗マウスＴＣＲ  ｓｃＦｖがｐＩＸに融合した更なるデュアルディスプレイベクターを構築した。
【０２８０】
ｐＧＡＬＤ９ＦＮの構築
ｐＩＸに融合したＨｕｐｐａら、２０１０（Ｎａｔｕｒｅ  ４６３：９６３−７）によって記述されたＨ５７抗マウスＴＣＲ  ｓｃＦｖ抗体配列を遺伝子合成（ＧＳ）によって生成し、適合ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ  ＲＥ部位上のｐＧＡＬＤ９ΔＬＦＮファージミドへの標準分子クローニング（Ｈｕｐｐａら、２０１０、前掲；Ｌｏｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．，ＰＬｏｓＯＮＥ，６：ｅ１７４３３前掲）を行った。ＧＳ、クローニング処置、及び配列決定による確認をＥｕｒｏｆｉｎｓによって行った。
【０２８１】
Ｈ５７−ｍＮＧＦ０３の構築
完全ｍＮＧＦ０３−ｐＶＩＩＩカセットを含むカセットをｐＧＡＬＤ９ΔＬＦＮ−Ｈ５７ファージミド中に隣接ＮｈｅＩを用いてサブクローニングした。正しい配向をＥｕｒｏｆｉｎｓによる配列決定によって確認した。
【０２８２】
ＴＣＲ発現用レトロウイルスベクターの構築
Ｐ２Ａ切断可能ペプチド（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって結合されたアルファ及びベータがそれぞれマウスＣα及びＣβ上に移植されたＲ１２−Ｃ９  ＴＣＲのＶα及びＶβを含む遺伝子（Ｓｔｒａｅｔｅｍａｎｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を、本質的に記述されたようにＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限部位上に再構成されたＭＣＳを有するｐＭＳＣＶ−Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローン化した（Ｈｏｌｓｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １，４０６−４１７（２００６）。
【０２８３】
ＳＫＷ−３  Ｒ１２−Ｃ９細胞系の構築
ＧＰ２−２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にｐＭＳＣＶ−Ｎｅｏ  Ｒ１２−Ｃ９とｐＥｃｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を同時導入した。ウイルス上清をＳＫＷ−３細胞に導入した（ＣＬＳ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ドイツ）ＳＫＷ−３  Ｒ１２−Ｃ９細胞の形質導入プールをＰＥ  α−ｈＣＤ３  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とｍＣβ特異的Ｈ５７−Ａ６４７  ｍＡｂ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）で共染色し、陽性の被形質導入体をＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩｕ（ＢＤ）で単離した。
【０２８４】
フローサイトメトリー
一定分量５×１０4個のＳＫＷ−３  Ｒ１２−Ｃ９  ＴＣＲ導入及び非導入ＳＫＷ−３細胞（負の対照）をＶ形９６ウェル皿（Ｃｏｓｔａｒ）中に分散させた。総体積を２５０μｌ／ウェルに０．５％ｗ／ｖ  ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調節した。プレートを３００ｇ／５ｍｉｎで室温で遠心分離し、上清を廃棄した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで予めブロックされた正規化力価５×１０12ｃｆｕampR／ｍｌのファージの一定分量２５μｌ／ウェルを添加し（対照ウェルには０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳのみ）、プレートを３０分間室温でインキュベーションした。細胞を２００μｌ／ウェルの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、細胞を３００ｇ／５ｍｉｎ／ＲＴで遠心分離してペレットにし、上清を廃棄した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のＡＰＣ複合ニワトリ抗ｆｄ（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を適切なウェルに添加し、続いて３０分間４℃でインキュベーションした。ウェルを上記のように２回洗浄し、すぐにＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。データ解析をＦｌｏｗＪｏ（ｖ１０．５）ソフトウェアによって行った。
【０２８５】
細胞表面で発現されるタンパク質のフローサイトメトリーによる検出
Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅの強力な用途は、染色抗体を必要とせずに、検出を蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体の固有の蛍光にのみ依拠するＦＡＣＳの実時間選択にそれを使用することであろう。これを評価するために、本発明者らは、Ｈ５７  ｓｃＦｖ−ｐＩＸ提示ＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅをヒトＳＫＷ−３  Ｒ１２−Ｃ９  Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞上で発現されるＴ細胞受容体への特異的結合についてフローサイトメトリーによって試験した。比較のために、本発明者らは、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体を含まないＨ５７  ｓｃＦｖ−ｐＩＸ提示ファージを調製し、並行して試験した。
【０２８６】
ＴＣＲ  Ｒ１２−Ｃ９を発現する細胞への特異的結合を標準方法によって確認するために、本発明者らは、ＡＰＣ複合抗ｆｄ抗体を使用して結合ファージを検出した。これは、ＴＣＲに結合したＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅと通常のファージの並列比較も可能にし（図１２Ａ）、どちらもＴＣＲネガティブヒトＳＫＷ−３に結合しなかった（図１２Ｂ）。検出ｍＡｂの添加されない細胞を染色しようとすると、本発明者らは、溶液中のときのＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅ  ｓｃＦｖ  Ｈ５７から観察された強い蛍光シグナル（Ｈ５７−ｍＮＧＦ０３、図１２Ｄ）にもかかわらず、対照に比べて蛍光強度の増加がないことを認めた（図１２Ｃ）。したがって、Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｇｅは溶液中で強い蛍光シグナルを示したが、本発明者らは、それが表面結合抗原に結合するのをフローサイトメトリーで検出することができなかった。これは、このＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅが多数のアッセイ、例えば、ＦＡＣＳアッセイと多数の類似点及びコンポーネントを共有する後述するＦＬＩＳＡに極めて有用であり、有利であるが、この形のＦｌｕｏｒｏｐｈａｇｅは、細胞の直接染色及びＦＡＣＳ選別を可能にするのに必要な粒子１個当たりの輝度にまだ達していないことを意味する。
【０２８７】
実施例４−酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光結合免疫吸着検定法（ＦＬＩＳＡ）
材料及び方法
ＴＡＴ−ＡＢＣ発現ベクターの構築
ＴａｔＡＣ／Ｂ遺伝子を含むベクターをＧｅｎｓｍａｒｔ設計ツール（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌｔｄ．）を用いて設計した。すべての構築物をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌｔｄ．によって作製し、品質管理した。ＴａｔＢ配列源はＮＣ＿０００９１３．３：４０２２２１８−４０２２７３３（ＮＣＢＩ）であり、ＴａｔＡＣ配列源は＃Ｘ７３８８８．１（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｃｈｉｖｅ）である。検出目的でＴａｔＢをＣ末端６×ＨＩＳタグに融合し、ＴａｔＣをＣ末端ＦＬＡＧタグに融合した。
【０２８８】
ｐｈＯｘ−ｍＮＧＦ０３ファージミドを含むＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞を過剰発現するＴａＴ−ＡＣ／Ｂの構築
エレクトロコンピテントＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をＥＣＭ３９９電気穿孔システムの標準手順によって各ベクター１ｎｇで形質転換した。ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞を３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール及び５０μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎを含むＬＢ−寒天で増殖させて、両方の発現ベクターを有する細胞を選択した。ＴａｔＣ及びＴａｔＢの発現を二重陽性クローン由来の溶解物上で西洋ワサビペルオキシダーゼ複合抗ＦＬＡＧ−Ｍ２（１：５０００希釈）及び抗ＨＩＳ（１：２０００希釈）ｍＡＢを用いて標準ウエスタンブロット分析によって確認した。３種の細胞クローンをそれらの発現レベルに基づいて選択した。全３種の細胞クローン１０ｍＬにｐｈＯｘ−ｐＩＸ及びｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ−Ｆ０３−ｐＶＩＩＩ融合体を含むファージミドを有するファージを導入した。３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎ、５００ｍＭグルコース及び１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ−寒天上で培養物１０μｌをインキュベーションした。生成したクローンをその蛍光能力に基づいて試験した。
【０２８９】
この実施例においては、幾つかの実験において、Ｔａｔトランスポーターを過剰発現させることによって蛍光レベルを改善できるかどうか見るために、上述したようにＴａｔトランスポーターを過剰発現し、ｐｈＯｘ−ｍＮＧＦ０３ファージミドを発現するように操作されたＸＬ−１宿主細胞を使用した。
【０２９０】
幾つかの例示的結果を図１４に示す。グルコースの非存在下で細菌細胞の終夜培養物は、Ｔａｔトランスポーターが過剰発現されたときに（ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＴＡＴ；ｐｈＯｘ−ｍＮＧＦ０３）、Ｔａｔトランスポーター過剰発現のない細菌細胞（ＸＬ１−ｂｌｕｅ；ｐｈＯｘ−ｍＮＧＦ０３）に比べて、ｐｈＯｘ−ｍＮＧＦ０３ファージミドを含む細菌細胞の蛍光強度の高い増加を示す。
【０２９１】
さらに、本発明者らが同じファージ粒子上のｐＶＩＩＩとは異なるカプシド上で機能性蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体と異なる機能的融合体の両方を提示する能力を組み合わせることができるか否かを判断するために、本発明者らは、十分に記述された抗ｐｈＯｘ  ｓｃＦｖ（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３）を、ｐＩＸ融合体としてファージミドを発現する蛍光団−ｐＶＩＩＩに挿入することにした（この抗ｐｈＯＸファージミドも上記幾つかの実験に使用された）。本発明者らは、次いで、ファージを調製し、上記ＦＬＩＳＡと同様に古典的ＥＬＩＳＡでｐｈＯｘ結合についてそれらを試験した。比較のために、本発明者らは、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体を含まない抗ｐｈｏｘ  ｓｃＦｖ−ｐＩＸ提示ファージを調製し、並行して試験した。
【０２９２】
正規化量のファージ粒子の蛍光強度は、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸプレートリーダーで測定され（図１３Ｄ）、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体を提示するファージからのみ極めて高い蛍光強度を示した。再度ファージ粒子上で評価するとＦ０３クローンは、親（ｗｔ）クローンに比べてファージ粒子１個当たりの改善された蛍光を示す。
【０２９３】
重要なことには、同じファージ試料をｓｃＦｖ標的結合について標準ＥＬＩＳＡで試験すると、蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体の有無とは無関係に特異的な結合が観察された（図１３Ｃ）。したがって、データの示すところによれば、ｐＶＩＩＩ上の蛍光団のディスプレイは、デュアルディスプレイファージ上のｐＩＸ融合体中の標的部分によって媒介される抗原結合性に影響を及ぼさなかった。同じファージ試料を標的結合についてＶａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸプレートリーダーを用いたＦＬＩＳＡによって再度試験すると、本発明者らは、特にＸＬ−１細菌宿主細胞を過剰発現する高い力価のＴａｔを使用したときに（ＴＡＴ高）、ｍＮＧｗｔ−ｐＶＩＩＩ（図１３Ａ、ｐｈＯｘ−ｍＮＧｗｔ）及びｍＮＧＦ０３−ｐＶＩＩＩ融合タンパク質（図１３Ｂ）を提示しているファージ粒子からの蛍光シグナルを観察することができた。したがって、データによれば、これらのファージ粒子の固有の蛍光は、ＦＬＩＳＡにおいて洗浄後に標的上に保持された減少量のファージを特異的に検出する感度を与えるのに十分高く、これらのファージ粒子は、こうしたアッセイに有用であり、例えば、抗原に結合すると検出を可能にする。重要なことには、データが最終的に示すところによれば、同じファージ粒子上の蛍光団−ｐＶＩＩＩ融合体とｓｃＦｖ−ｐＩＸ融合体のデュアルディスプレイは、ｓｃＦｖ−ｐＩＸ融合体の表現型に影響を及ぼさない。
【図１】
2021501593.tif 000011
【図２】
2021501593.tif 000012
【図３】
2021501593.tif 000013
【図４Ａ】
2021501593.tif 000014
【図４Ｂ】
2021501593.tif 000015
【図４Ｃ】
2021501593.tif 000016
【図５】
2021501593.tif 000017
【図６】
2021501593.tif 000018
【図７Ａ−Ｂ】
2021501593.tif 000019
【図７Ｃ−Ｄ】
2021501593.tif 000020
【図８】
2021501593.tif 000021
【図９（１）】
2021501593.tif 000022
【図９（２）】
2021501593.tif 000023
【図１０】
2021501593.tif 000024
【図１１】
2021501593.tif 000025
【図１２Ａ−Ｂ】
2021501593.tif 000026
【図１２Ｃ−Ｄ】
2021501593.tif 000027
【図１３】
2021501593.tif 000028
【図１４】
2021501593.tif 000029
【配列表】
2021501593000001.app
【国際調査報告】
2021501593.tif 000030
2021501593.tif 000031
2021501593.tif 000032