(57)【要約】  本発明は、ガレクチン−３タンパク質に結合する特異的結合分子、その産生方法およびその使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガレクチン−３タンパク質に特異的に結合する特異的結合分子であって、前記特異的結合分子は、
配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、
を含む、特異的結合分子。
【請求項２】
結合特異分子がヒト結合特異分子である、請求項１に記載の結合特異分子。
【請求項３】
前記特異的結合分子が抗体またはその断片である、請求項１又は２に記載の特異的結合分子。
【請求項４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３に記載の特異的結合分子。
【請求項５】
前記断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）若しくはＦｖ断片、またはｓｃＦｖ分子である、請求項３に記載の結合特異分子。
【請求項６】
配列番号１０に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合特異分子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子をコードする核酸配列。
【請求項８】
配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子をコードする核酸配列。
【請求項９】
配列番号１１の核酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子をコードする核酸配列。
【請求項１０】
請求項７〜９に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子と、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ断片、好ましくはヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片とを含む、融合タンパク質。
【請求項１３】
医薬品として使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子または請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
炎症性疾患の予防および／または治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子または請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
アテローム性動脈硬化症の予防および／または治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子または請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
活性物質として治療有効量の請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子または請求項１２に記載の融合タンパク質と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
診断剤として使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子または請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
炎症性疾患のインビボ診断方法で使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子または請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
アテローム性動脈硬化症のインビボ診断方法で使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子または請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
診断剤としての請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子または請求項１２に記載の融合タンパク質と、担体とを含む、診断用組成物。
【請求項２１】
好ましくは炎症性疾患に罹患しているまたは罹患している疑いのある患者における、ガレクチン−３タンパク質の検出用診断キットであって、前記キットが、請求項１〜６のいずれか一項に記載の特異的結合分子または請求項１２の融合タンパク質を含む、診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガレクチン−３タンパク質に特異的に結合する特異的結合分子、その産生方法およびその使用方法に関する。
【０００２】
レクチンは、特異的な炭化水素構造に結合するタンパク質である。これにより特定の複合糖質を認識することができる。ガレクチンは、ベータ−ガラクトシドと結合する、構造的に関連したレクチンのファミリーであり、その数は１０を超える。ガレクチン−３は、ガレクチンファミリーに属する、２６ｋＤａのベータ−ガラクトシド結合タンパク質である。このタンパク質は、カルボキシ末端糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）およびアミノ末端縦列反復配列から構成される。ガレクチン−３は、多くの臓器の上皮ならびにマクロファージ、樹状細胞およびクッパー細胞を含む種々の炎症細胞に見られる。ガレクチン−３の発現は、炎症中、細胞増殖中、細胞分化中およびウイルスタンパク質によるトランス活性化を介して増加する。ガレクチン−３は、心臓線維化、心臓リモデリングおよび炎症に関与している。多くの研究により、ガレクチン−３が種々の機構を介して炎症を調節し得ることが示されてきた。内在性ガレクチン−３は、肺、肝臓および心臓における線維化、糖尿病、虚血性心疾患、アレルギー性疾患など、種々の炎症性疾患の原因に関与していると示されてきた。ガレクチン−３は、ヒトアテローム動脈硬化プラーク内のマクロファージに高く発現することが知られている。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は、大きい径または中程度の径を有する、動脈に悪影響を及ぼす慢性および全身性炎症性疾患である。この病状は、安定または不安定アテロームプラークへと成長し得る、脂質に富んだプラークを動脈壁内に形成することによって特徴づけられる。安定アテロームは、アテローム性動脈硬化病変の拡張による重篤な管腔閉塞が生じ、その結果の１つとして虚血が存在するまで無症状の傾向がある。不安定アテロームは、破裂および血栓形成といった高いリスクがある、薄い線維性被膜で覆われた大きい脂質コアが存在するため、より大きな影響がある。こうした事象は、脳卒中や心筋梗塞の病態を誘発する。現在、患者への動脈内膜切除術の提案前には、内頸動脈の高度狭窄症（＞７０％の管腔狭窄）が生じると想定されている。ただし管腔狭窄の程度は、高リスク患者の特定にいつでも有効であるわけではなく、動脈血管床における閉塞が５０％未満でも大きな事象へとつながり得る。アテローム性動脈硬化症は、西欧世界では主要な死因であり、年間１９００万人が死亡する。
【０００４】
したがって、新規かつ有効な形態の炎症性疾患の診断または治療、特に、副作用が低い局所投与による持続的で制御された療法を提供可能な治療に対する必要性が存在している。炎症性疾患、詳細にはアテローム性動脈硬化症の予防、治療および診断を行うため、本発明者らは、ガレクチン−３タンパク質に特異的に結合する、新規の特異的結合分子を開発した。
【０００５】
本発明は、ガレクチン−３タンパク質に特異的に結合する特異的結合分子に関し、当該特異的結合分子は、
−配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
−配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、
を含む。
【０００６】
詳細には、本発明者らは本発明の特異的結合分子は、ガレクチン−３タンパク質に特異的に結合可能であることを示した。
【０００７】
本明細書にて使用する場合、「特異的結合分子」は互いに対して結合特異性を有する一対の分子のメンバーである。特異的結合対のメンバーは、天然に誘導されるか、または全体的もしくは部分的に合成して産生されてよい。分子の対の一方のメンバーは、その表面上に突起または空隙であり得る領域を有する。これは、分子の対の他方のメンバーの特定の空間的組織または極性組織に特異的に結合し、それゆえに補完的である。したがって、対の両メンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。特異的結合対の型の事例には、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質がある。本発明は、一般には抗原−抗体型反応に関係する。本発明の特異的結合分子は、他の分子に対するよりもガレクチン−３タンパク質に対し大きな親和力で結合する。例えば、この分子はガレクチン−３タンパク質に対して特異的に結合する。ガレクチン−３タンパク質に対して結合する特異的結合分子には、抗ガレクチン−３タンパク質抗体およびアプタマーが挙げられる。典型的には、特異的結合分子は、約１０−６Ｍ未満、より詳細には約１０−７Ｍ未満、または１０−８Ｍ未満または１０−９Ｍ未満または更に低い親和力（ＫＤ）により結合する。
【０００８】
用語「ＫＤ」は、特定のｓｃＦｖ抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指す。典型的には本発明の特異的結合分子は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いるビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて測定、またはＯｃｔｅｔ  ＨＴＸ機器によるバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術を用いて測定した場合、約１０−６Ｍ未満、より詳細には約１０−７Ｍ未満または１０−８Ｍ未満または１０−９Ｍ未満または更に低い平衡解離定数（ＫＤ）により標的抗原へと結合する。
【０００９】
有利な実施形態では、特異的結合分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。有利には、特異的結合分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に有利な実施形態では、特異的結合分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００１０】
有利な実施形態では、特異的結合分子の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。有利には、特異的結合分子の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に有利な実施形態では、特異的結合分子の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
当該技術分野で既知の「同一性」とは、配列同士を比較することで決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係性である。当該技術分野では、同一性はポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列間の配列類似度もまた意味する。場合によっては、この配列類似度は上記配列の紐間での一致度によって決定される。２つのポリペプチド配列間または２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定する方法は数多く存在しているが、同一性決定のために一般的に使用される方法は、コンピュータプログラム中で分類するものである。２つの配列間での同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムとしては、ＥＭＢＯＳＳ（Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）−Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７）、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、Ｎｅｅｄｌｅが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１２】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当業者に既知の数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。２つの配列間を比較するための数学的アルゴリズムの一例としては、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８によるアルゴリズムであり、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７にあるように改良されたものが挙げられる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムは、当該アルゴリズムを既に組み込んでいる。
【００１３】
一実施形態では、特異的結合分子はヒト化され得る。分子が治療剤として使用されることになる場合、特異的結合分子のヒト化が所望されてよい。特に有利な実施形態では、結合特異分子は、ヒト結合特異分子である。
【００１４】
特に有利な実施形態では、特異的結合分子は抗体であるか、またはその断片であり得る。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫学的に免疫グロブリン分子の活性部分を指す。これはすなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子であり、天然または部分的もしくは完全に合成的にかのどちらかで産生される。当該用語は、抗体結合ドメインまたはそれと相同なドメインである結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質もまた網羅する。こうしたポリペプチドやタンパク質は、天然源に由来する場合もあり得るが、部分的または完全に合成的に産生される場合もある。
【００１５】
抗体は、「重」鎖および「軽」鎖と命名された、異なる２つのポリペプチド鎖から構成される大まかにはＹ字型の分子であり、ジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖および２つの軽鎖から構成されている。各重鎖は、可変ドメイン（「ＶＨドメイン」）および３つの定常ドメイン（「ＣＨ１」、「ＣＨ２」および「ＣＨ３」ドメイン）から構成される。一方、各軽鎖は、可変ドメイン（「ＶＬドメイン」）および定常ドメイン（「ＣＬドメイン」）から構成される。更に、各可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬドメイン）は、４つの「フレームワーク領域」（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）および一般的に「相補性決定領域」１、２および３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と命名された３つの高頻度可変性領域から構成される。前者は、より少ない抗体間での可変性を示し、可変ドメインの構造的フレームワークを形成するベータシートの形成に関与するものである。後者は、各ベータシート端部に折りたたまれた可変ドメイン内に並べられた３つのループに対応するものである。３つのＣＤＲ領域は、抗体または抗体断片の特異度を決定する上で決定的である。これは、３つのＣＤＲ領域が主に抗原に接触する可変ドメインの一部であり、特に各鎖のＣＤＲ３領域は、重鎖および軽鎖の再編成領域に対応し、他のものに比べて更により可変であり、かつ特異的抗原とより直接的に接触するためである。抗体例としては、免疫グロブリンのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）およびそのアイソタイプのサブクラスが挙げられる。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体は、本明細書では「ｍＡｂ」と呼ばれる場合がある。
【００１６】
抗体は多くの方法で修飾されることが可能であるが、用語「抗体」は、任意の特異的結合メンバーおよびまたは必要とされる特異度を有する結合ドメインを有する物質を網羅すると解釈される。したがって、本用語は、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含み、天然または全体的もしくは部分的に合成するもののいずれかである、抗体断片、誘導体、機能性同等物および抗体の相同体、ヒト化抗体を網羅する。これにより、別のポリペプチドへと融合される免疫グロブリン結合ドメイン、またはその同等物を含むキメラ分子も含まれる。
【００１７】
本発明の特異的結合分子は抗体であり得る。より有利には、モノクローナル抗体であり得る。
【００１８】
一実施形態では、本発明の特異的結合分子は、ガレクチン−３タンパク質に対するモノクローナル抗体であり、
−配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
−配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、
を含む。
【００１９】
有利な実施形態では、モノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。有利には、モノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に有利な実施形態では、モノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。モノクローナル抗体の好適な重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＮＦＧＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＲＳＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＳＴＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）である。
【００２０】
有利な実施形態では、モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。有利には、モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に有利な実施形態では、モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
モノクローナル抗体の好適な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＴＩＳＳＳＬＡＷＦＱＱＲＰＧＥＡＰＮＬＬＩＹＳＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＳＣＱＱＴＹＳＡＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２）である。
【００２２】
有利には、ガレクチン−３タンパク質に対するモノクローナル抗体は、
−配列番号３、配列番号４および配列番号５から構成されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、配列番号１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
−配列番号６、配列番号７および配列番号８から構成されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、配列番号２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、を含む。
【００２３】
モノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の好適なＣＤＲ１は、ＧＤＳＶＳＳＮＮＦＧ（配列番号３）である。
【００２４】
モノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の好適なＣＤＲ２は、ＴＹＹＲＳＫＷＹＮ（配列番号４）である。
【００２５】
モノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の好適なＣＤＲ３は、ＡＲＱＧＳＴＹＦＤＹ（配列番号５）である。
【００２６】
モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の好適なＣＤＲ１は、ＱＴＩＳＳＳ（配列番号６）である。
【００２７】
モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の好適なＣＤＲ２は、ＳＡＳ（配列番号７）である。
【００２８】
モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の好適なＣＤＲ３は、ＱＱＴＹＳＡＰＰＴ（配列番号８）である。
【００２９】
一実施形態では、本発明のモノクローナル抗体はヒト化されている。本発明のモノクローナル抗体は、抗体のアミノ酸配列を修飾することによってヒト化され得る。本発明の特異的結合分子の免疫原性を減少させる方法には、好適な抗体フレームワーク足場上へのＣＤＲグラフト、または例えば変異誘発性により誘導される部位による可変表面残基のリモデリング、または他の一般的に使用される分子生物学的技術により実施される。ヒト化抗体は、例えばマウス抗体といった非ヒトの可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する修飾抗体であってよい。一実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。
【００３０】
別の有利な実施形態では、本発明の特異的結合分子は、抗体の断片であり得る。全抗体の断片は、結合抗原の機能を果たし得ることが示されている。結合断片の例としては、
（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、
（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、
（ｉｉｉ）単抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、
（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片、
（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、
（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片であって、２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片、
（ｖｉｉ）一本鎖可変断片分子（ｓｃＦｖ）であって、ＶＨドメインおよびＶＬドメインにおいて２つのドメインを関連付けさせ、抗原結合部位形成を可能にするペプチドリンカーによりこれらのドメインを連結する一本鎖可変断片分子（ｓｃＦｖ）、
（ｖｉｉｉ）二重一本鎖Ｆｖ二量体、
（ｉｘ）「二重特異性抗体」であって、遺伝子の融合により構築される多価または多重特異性断片、
（ｘ）Ｆｃ部分を有する２つのｓｃＦｖ断片によりなるｓｃＦｖ−Ｆｃが挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の第１（アミノ最末端）定常領域ドメインを含む。これは例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムではおおよそ１１４〜２２３の位置（ＥＵ位置１１８〜２１５）から延びるものである。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接しており、アミノ末端は免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に隣接している。また、ＣＨ１ドメインは、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の一部を形成しない。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＬドメイン」は、免疫グロブリン軽鎖の定常領域ドメインを含む。これは例えば、Ｋａｂａｔ位置ではおおよそ１０７Ａ〜２１６の位置（ＥＵ位置１０８〜２１４（カッパ））から延びるものである。カッパＣドメイン向けのＥｕ／Ｋａｂａｔ変換表を以下に提供する。ＣＬドメインはＶＬドメインに隣接しており、免疫グロブリン軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明の特異的結合分子は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）分子である。本発明の文脈内では、用語「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ分子」または「ｓｃＦｖ断片」または「ｓｃＦｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、ペプチドリンカーを介して連結された抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む、折りたたまれた一本のポリペプチドを指す。当該ｓｃＦｖ分子においては、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨの順のいずれかであり得る。こうしたドメインの産生を促進する以外に、ｓｃＦｖ分子は、スペーサを介してｓｃＦｖと連結されるタグ分子を含有してよい。したがって、ｓｃＦｖ分子は、対応する抗体の免疫原性定常ドメイン以外を認識する抗原へと関連付けられるＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。
【００３４】
「ペプチドリンカー」は、柔軟なペプチドを意味し、ｓｃＦｖ分子を適切に折りたたむことが可能である。これはすなわち、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを適切に折りたたみ、これらをまとめることが可能ということである。更に当該ペプチドリンカーは、単量体機能化単位への折りたたみが可能でなければならない。有利には、ペプチドリンカーは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の間に位置づけられる。ｓｃＦｖがＶＨからＶＬへの向き（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）で会合される場合、３〜１２個の残基のリンカーを有するｓｃＦｖは、機能性Ｆｖドメインへと折りたたむことができない。代わりに別の分子と関連付けられ、二価二量体を形成する。３個未満に残基を減少させることで、三量体が発生する。この場合、好適なリンカーは、結果として少なくとも１２個、好ましくは２５個未満のアミノ酸、好ましくは１５〜２５個のアミノ酸、好ましくは１６〜２２個のアミノ酸または好ましくは１８〜２１個のアミノ酸を有する必要がある。また、好ましくは、好適なリンカーのアミノ酸配列に対して高い比率のグリシン残基を含む必要があり、好ましくは、好適なリンカーの少なくとも５０％のアミノ酸はグリシン残基である。１８個のアミノ酸残基リンカーは、使用され得る最小の配列サイズである。次いで好適なペプチドリンカーは、１８〜２５個のアミノ酸、好ましくは１８〜２１個のアミノ酸を有する必要がある。有利には、本発明の好適なペプチドリンカーは、１８個のアミノ酸を有する。好適なペプチドリンカーの例としては、配列番号９に対して少なくとも８５％の同一性を有するペプチドが挙げられる。有利には、ペプチドリンカーは、配列番号９に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％の同一性を有するペプチドを含む。好適なリンカーの一例は、配列ＥＦＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲ（配列番号９）のリンカーである。
【００３５】
特に有利な実施形態では、ガレクチン−３タンパク質に特異的に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）分子は、
−配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
−配列番号９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドリンカーと、
−配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、
を含む。
【００３６】
有利な実施形態では、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。有利には、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に有利な実施形態では、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。ｓｃＦｖ分子の好適な重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＮＦＧＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＲＳＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＧＳＴＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）である。
【００３７】
有利な実施形態では、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）分子の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。有利には、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）分子の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に有利な実施形態では、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）分子の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。ｓｃＦｖ分子の好適な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＴＩＳＳＳＬＡＷＦＱＱＲＰＧＥＡＰＮＬＬＩＹＳＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＳＣＱＱＴＹＳＡＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２）である。
【００３８】
有利な実施形態では、ガレクチン−３タンパク質に特異的に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）分子は、
−配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
−配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
−配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、を含む。
【００３９】
有利には、ガレクチン−３タンパク質に対するｓｃＦｖ分子は、
−配列番号３、配列番号４および配列番号５から構成されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、配列番号１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
−配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーと、
−配列番号６、配列番号７および配列番号８から構成されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む、配列番号２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、を含む。
【００４０】
ｓｃＦｖ分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の好適なＣＤＲ１は、ＧＤＳＶＳＳＮＮＦＧ（配列番号３）である。
【００４１】
ｓｃＦｖ分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の好適なＣＤＲ２は、ＴＹＹＲＳＫＷＹＮ（配列番号４）である。
【００４２】
ｓｃＦｖ分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の好適なＣＤＲ３は、ＡＲＱＧＳＴＹＦＤＹ（配列番号５）である。
【００４３】
ｓｃＦｖ分子の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の好適なＣＤＲ１は、ＱＴＩＳＳＳ（配列番号６）である。
【００４４】
ｓｃＦｖ分子の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の好適なＣＤＲ２は、ＳＡＳ（配列番号７）である。
【００４５】
ｓｃＦｖ分子の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の好適なＣＤＲ３は、ＱＱＴＹＳＡＰＰＴ（配列番号８）である。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明による当該ｓｃＦｖ分子はペプチドタグを更に含むことができる。これは特に、ナノ物体、任意選択的にはコアｓｃＦｖ抗体（ＶＨドメインおよびＶＬドメインならびにペプチドリンカーを含む）とペプチドタグの間の短いペプチドスペーサへとｓｃＦｖ分子をグラフトする場合には、精製または表面の機能化に有利である。
【００４７】
精製用として好適なペプチドタグの例としては、Ｈｉｓ６タグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号１５）、タンパク質Ｃタグ（ＨＰＣ４）（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ、配列番号１６）、ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号１７）、Ｖ５エピトープタグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ、配列番号１８）、短いバージョンのＶ５エピトープタグ（ＩＰＮＰＬＬＧＬＤ、配列番号１９）またはｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号２０）が挙げられる。特にナノ物体へとｓｃＦｖ分子をグラフトする場合、表面を機能化するために好適なペプチドタグの例としては、ソルターゼＬＰＥＴＧ（ＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧＡＡ、配列番号２１）、ＩｇＭ−Ｔａｉｌ（ＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ、配列番号２３）、ＣＣ−Ｔａｇ（ＧＧＧＧＳＣＣＡＡ、配列番号２２）が挙げられる。
【００４８】
好適なペプチドスペーサの例としては、配列番号２４に対して少なくとも８５％の同一性を有するペプチドが挙げられる。有利には、ペプチドスペーサは、配列番号２４に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％の同一性を有するペプチドを含む。
【００４９】
好適なペプチドスペーサの例としては、配列ＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴ（配列番号２４）のペプチドスペーサである。
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明による当該ｓｃＦｖ分子は完全ヒトｓｃＦｖ分子である。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明はガレクチン−３タンパク質に対する特異的結合分子に関し、配列番号１０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸を含むか、またはこれからなる。この中で、当該２４５アミノ酸配列の１〜１２０および１３９〜２４５のアミノ酸はそれぞれ配列番号１および配列番号２から構成される。
【００５２】
特定の実施形態では、本発明はガレクチン−３タンパク質に対する抗体に関し、配列番号１０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸を含むか、またはこれからなる。この中で、当該２４５アミノ酸配列の１〜１２０および１３９〜２４５のアミノ酸はそれぞれ配列番号１および配列番号２から構成される。
【００５３】
特定の実施形態では、本発明はガレクチン−３タンパク質に対するｓｃＦｖ分子に関し、配列番号１０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸を含むか、またはこれからなる。この中で、当該２４５アミノ酸配列の１〜１２０、１２１〜１３８および１３９〜２４５のアミノ酸はそれぞれ配列番号１、配列番号９、配列番号２から構成される。
【００５４】
本発明はまた、上記のような特異的結合分子をコードする核酸配列に関する。
【００５５】
特定の実施形態では、特異的結合分子をコードする核酸配列は、配列番号１１に対して核酸配列と少なくとも８５％の同一性を含む。有利には、核酸配列は、配列番号１１に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を含む。特定の実施形態では、特異的結合分子をコードする核酸配列は、配列番号１１の核酸配列を有する。
【００５６】
特定の実施形態では、当該特異的結合分子は、配列番号１０を含むか、またはこれからなり、特異的結合分子の核酸配列は、配列番号１１もしくは例えば遺伝子コードを縮重した結果としての配列番号１０をコードする任意の誘導された核配列を含むか、またはこれからなる。
【００５７】
本発明の別の目的は、例えばウイルスベクターまたはプラスミドベクターといった発現ベクターである。これは、本明細書で定義されるような特異的結合分子をコードする核酸配列を含む。本発明の文脈では、用語「ベクター」は、所望のコード配列を含有するポリヌクレオチド配列および操作可能な結合を用いた制御配列を指す。こうした配列を用いて変換された宿主は、コードされたタンパク質を産生することができる。ベクターは選択された宿主細胞内で自律的に複製してもよく、または問題となっている宿主細胞に対する組込みベクターであってよい。当該ベクターは当業者によく知られた方法により調製される。得られたクローンは、リポフェクション、電気穿孔法、ヌクレオフェクション、遺伝子銃の使用、ポリカチオン剤、熱ショックまたは化学的方法といった標準的な方法で好適な宿主細胞へと導入されてよい。
【００５８】
本発明の別の目的は、当該１つまたは複数のベクターによって遺伝子導入された宿主細胞である。宿主細胞は、例えば細菌細胞だけでなく、酵母細胞または詳細には哺乳動物細胞などの動物細胞といった原核生物系または真核生物系の中から選択されてよい。昆虫細胞または植物細胞もまた使用されてよい。
【００５９】
本発明の特定の実施形態では、特異的結合分子が抗体である場合、この抗体は結果的に宿主細胞における組換えにより産生され、１つまたは複数のベクターを用いて変換される。このベクターにより、抗体の重鎖および／または軽鎖に対し、ヌクレオチド配列コードの発現および／または分泌が可能となる。ベクターは通常、プロモータ、翻訳開始および終止シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含む。ベクターは、宿主細胞内で安定した方法で維持され、翻訳されたタンパク質の分泌を特定する特異的なシグナルを任意選択的に有し得る。使用される宿主細胞によっては、こうした種々の要素は当業者により選択および最適化される。当該ベクターは当業者により一般的に使用される方法により調製される。得られたクローンは、リポフェクション、電気穿孔法、ヌクレオフェクション、遺伝子銃の使用、ポリカチオン剤の使用、熱ショックまたは化学的方法といった標準的な方法で好適な宿主へと導入されてよい。宿主細胞は、例えば細菌細胞だけでなく、酵母細胞または詳細には哺乳動物細胞などの動物細胞といった原核生物系または真核生物系から選択されてよい。モノクローナル抗体産生用の好ましい哺乳動物細胞は、ラット系統ＹＢ２／０、ハムスター系統ＣＨＯである。後者は詳細にはＣＨＯ  ｄｈｆｒ−およびＣＨＯ  Ｌｅｃ１３、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）、ＥＢ６６、ＨＥＫ２９３、Ｋ５６２、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＢＨＫまたはＣＯＳである。Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１といった昆虫細胞を使用することもまた可能である。別の産生方式は、遺伝子導入生物内での組換え抗体の発現である。例えば植物または詳細にはウサギ、ヤギまたはブタといった遺伝子導入動物の乳においてである。遺伝子導入乳もまた、組換え抗体産生のための方法として使用され得る。
【００６０】
好ましい実施形態によれば、抗体は、非ヒト遺伝子導入哺乳動物の乳内で産生され、遺伝子組換えを行ってこの糖タンパク質を産生する。哺乳動物は、例えば、ヤギ、雌ヒツジ、雌のバイソン、バッファロー、ラクダ、ラマ、マウスもしくはラット、またはウシ、雌ブタ、ウサギまたは雌ウマであってよい。
【００６１】
乳腺により抗体は分泌される。これは遺伝子導入哺乳動物の乳内に存在することが可能であり、抗体の発現を組織によって制御することに関係している。こうした制御方法は当業者に周知である。動物の特定細胞内において、糖タンパク質を発現可能とする配列により、発現は制御される。こうした配列は、詳細には「ＷＡＰ」、「ベータ−カゼイン」、「ベータ−ラクトグロブリン」型のプロモータ配列であり、ペプチドシグナル型の配列であり得る。好ましくは抗体は、５’ベータ−カゼインプロモータの制御下にあり、タンパク質の産生に必要とされるコード配列のシークエンスを含む発現ベクターを用いて、遺伝子導入ヤギの乳腺で産生される。遺伝子導入動物の乳から目的のタンパク質を抽出するプロセスは、欧州特許第０２６４１６６号に記載されている。
【００６２】
有利には、１リットルの乳につき４グラムを超える抗体が産生され、有利には１リットルの乳につき５グラム、１０グラム、１５グラム、２０グラム、２５グラム、３０グラム、３５グラムを超える、有利には１リットルにつき最大７０グラムの抗体が産生される。
【００６３】
本発明の特定の実施形態では、特異的結合分子がｓｃＦｖ分子である場合、ｓｃＦｖ分子は、
１）ファージクローンから構成されるｓｃＦｖ分子ライブラリを調製する工程であって、該ファージクローンのそれぞれが、表面上にてｓｃＦｖ分子を発現する工程と、
２）抗原によりｓｃＦｖ分子ライブラリを選別することにより、該当する抗原に結合可能なｓｃＦｖ分子（「ｓｃＦｖ−ファージ」）を発現するファージクローンを選択する工程と、を組み込むことによって産生され得る。
【００６４】
有利な実施形態では、工程１）のｓｃＦｖ分子ライブラリは国際公開第２００７／１３７６１６号に開示されている方法によって得られる。簡潔には、国際公開第２００７／１３７６１６号に開示されている方法は、重鎖の可変領域および／または軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドのランダム変異導入を実行する工程を含み、ランダム変異導入は、重鎖の可変領域および／または軽鎖の可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドのライブラリに基づいて実行され、ランダム変異導入プロセスにより、可変領域をコードする配列の少なくとも７０％に沿って無作為に分布した突然変異が引き起こされる。
【００６５】
特に有利な実施形態によれば、ｓｃＦｖ分子ライブラリはフェーズディスプレイにより発現され、インビボにて選択される。該当する抗原はガレクチン−３タンパク質である。
【００６６】
特に有利な実施形態によれば、繊維状ヘルパーファージを対数期の組換えファージミド感染細菌へと加えた後に、ファージ表面にｓｃＦｖを発現させることにより、ｓｃＦｖ−ファージミドコンビナトリアルライブラリからｓｃＦｖファージを得た。３ラウンドのバイオパニングをアテローム損傷したウサギに実行した。簡潔には、この手順は以下の通りであった。すなわち、ｓｃＦｖ−ファージの２．４×１０１２のコロニー形成ユニット（ｃｆｕ）を、アテローム性ウサギへと投与した。１時間循環させた後、このウサギを屠殺し、大動脈を回収した。大動脈に結合したｓｃＦｖ−ファージを異なる分画にて溶出させた。溶出されたｓｃＦｖ−ファージは、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌で再度増幅され、続いて上記のようにファージ表面にてｓｃＦｖを発現した。増幅されたｓｃＦｖファージを別のアテローム性動物へと再投与した。同様の手順に従ってラウンド２およびラウンド３を実施した。再投与されたコロニー形成ユニット数は、ラウンド２では４．８×１０１１、ラウンド３では３．９×１０１１であった。
【００６７】
次いで、ｓｃＦｖ−ファージをＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌で増幅した。詳細には、この細菌はＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。細胞をペレット化し、詳細には、５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの間の濃度で、有利には１００μｇ／ｍｌの濃度であるアンピシリンおよび詳細には１％（ｗ／ｖ）〜４％（ｗ／ｖ）、有利には２％（ｗ／ｖ）の濃度で、２ｘＴＹ寒天（２ＴＹＧＡ）を含有するグルコース上に播く。これを少なくとも１０時間、有利には１６時間、２０℃〜４０℃の温度、有利には３０℃の温度でインキュベートする。バイオパニングの３度目のラウンド後、ＦＡＣＳスクリーニング用に、播いたクローンを２ＴＹＧＡ選択培地で満たされたディープウェルマスターブロックへと別々に採取する。
【００６８】
本発明の別の目的は、上記のような特異的結合分子を含む融合タンパク質およびヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ断片に関する。有利には、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片である。特定の実施形態では、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ断片は、配列番号１２に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。有利には、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ断片は、配列番号１２に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に有利な実施形態では、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ断片は、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。
【００６９】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３である。
【００７０】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００７１】
好ましい実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１４の核酸配列を有する。
【００７２】
好ましい実施形態では、当該融合タンパク質は、配列番号１３を含むか、またはこれからなり、当該核酸配列は、配列番号１４もしくは例えば遺伝子コードを縮重した結果としての配列番号１３をコードする、任意の誘導された核配列を含むか、またはこれからなる。
【００７３】
本発明における融合タンパク質の構築は、従来の分子クローニング技術に基づくものである。ＰＣＲ合成法を使用し、上記融合タンパク質をベクターへとコードするＤＮＡのクローニングを行った。融合タンパク質を発現するためのベクターは、分子生物学で一般的に使用されるプラスミドであってよい。シグナルペプチド配列は、細胞からのタンパク質分泌を保証するため、融合タンパク質のアミノ末端前方に含まれる。ベクター配列には、遺伝子発現を駆動するためのプロモータ、タンパク質翻訳のための開始シグナルおよび停止シグナル、ならびにポリアデニル化（ポリＡ）配列が含まれる。ベクターは抗生物質耐性遺伝子を含んでよく、細菌内でのプラスミド複製を促進させる。更に、ベクターはまた、安定した遺伝子導入細胞株の選択のため、真核生物細胞選択遺伝子を含んでよい。
【００７４】
プラスミド構築後、融合タンパク質のＤＮＡ配列は配列決定により確認される。次いで、対応するタンパク質はプラスミドＤＮＡを細胞内へと遺伝子導入することにより発現され得る。多くの発現系は、融合タンパク質発現用に利用可能である。哺乳動物細胞、細菌、酵母、昆虫細胞などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態では、融合タンパク質はｓｃＦｖ分子およびヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ断片を含む。これらはそれぞれ上に記載された通りである。
【００７６】
本発明はまた、医薬品として使用することを目的とした、特異的結合分子または上で定義したような融合タンパク質に関する。詳細には、本発明は炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性腎疾患（（Ｒｅｂｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，３１  ａｕｇｕｓｔ  ２０１７，「Ｐｌａｓｍａ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−３  ｌｅｖｅｌ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ」）、心房細動（Ｔａｋｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＣ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｓｃｉ．，２０１６，ｖｏｌ  １（３），ｐａｇｅｓ  １４３−１５４：「Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａｔｒｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｃａｔｈｅｔｅｒ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ」）、がん（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）、重篤な甲状腺腫瘍（Ｄ’ａｌｅｓｓａｎｄｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）または直腸がん（Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）、肥大型心筋症（Ｇａｗｏｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）、ＨＩＶ感染症（Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）の診断、予防および／または治療で使用することを目的とした特異的結合分子または融合タンパク質に関する。
【００７７】
用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」または「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」または「予防的治療（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「予防的治療（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患の予防につながる治療、ならびに疾患の発生または疾患が生じるリスクを減少および／または遅延させる治療を含む。
【００７８】
本発明によれば、特異的結合分子または融合タンパク質は、高い血清コレステロールにもかかわらずアテロームプラークの形成または進行を予防または低減させることに対し特に有用である。
【００７９】
用語「治療」または「治癒的治療」は、治癒につながる治療または疾患の症状または疾患が引き起こす苦痛を緩和、改善および／または排除、低減および／または安定させるような治療として定義される。
【００８０】
本発明によれば、特異的結合分子または融合タンパク質は、ガレクチン−３タンパク質を阻害またはこれと拮抗させることにより、アテローム性動脈硬化症、慢性腎臓疾患、心房細動、がん、重篤な甲状腺腫瘍または直腸がん、肥大型心筋症、ＨＩＶ感染症の治療に特に有用である。結果として、アテロームプラークの形成または進行の低減、詳細には高い血清コレステロールにもかかわらず、特にアテロームプラーク体積の減少へとつなげる。
【００８１】
本発明の別の目的は、活性物質として上で定義されるような、薬学有効量の特異的結合分子または融合タンパク質および少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。
【００８２】
有利には、活性物質として上で定義されるような、治療有効量の特異的結合分子または融合タンパク質を含む医薬組成物は、炎症性疾患に罹患している対象または罹患している疑いのある対象に投与される。より好ましくは、炎症性疾患はアテローム性動脈硬化症である。
【００８３】
一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は非ヒト動物であり、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたは霊長類である。
【００８４】
本明細書で提供される治療有効量の抗体を、治療の必要がある対象に投与することに関する実施形態によれば、「治療有効」または「治療するための有効量」または「薬学的に有効」は、特異的結合分子または融合タンパク質または疾患状態を阻害するか、もしくは元に戻すため（例えば、炎症性疾患および好ましくはアテローム性動脈硬化症を治療するため）必要な組成物の量を示す。治療有効量の決定は、医薬品の毒性および有効性などの要因によって特異的に変化する。これらの要因は、効能、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重症度、好ましい投与方式といった他の要因によって異なる。毒性は、当該技術分野で周知の方法を使用して測定されてよい。有効性は、同様の教示を使用して測定されてよい。有効性は、例えば、アテロームプラークの体積減少によって測定され得る。したがって、薬学有効量は、臨床医が、毒物学的に許容可能であるが効果的であると見なす量である。
【００８５】
投与量は、投与方式に応じて、局所的または全身的な、所望の薬物（例えば、特異的結合分子または融合タンパク質）レベルを達成するために適切に調整され得る。当該用量では対象における応答が不十分である場合、更に高い容量（または異なるより局所的な送達経路による高い有効量）が、患者が許容可能な程度まで使用されてよい。適切な全身レベルの抗体を得るために、１日につき複数回の投与も使用されてよい。適切な全身レベルは、例えば、薬物の患者のピークまたは維持される血漿レベルの測定によって決定され得る。「用量」および「投与量」は、本明細書では互換的に使用される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、対象に投与される特異的結合分子または融合タンパク質または医薬組成物の量は、毎週または２週間ごとまたは４週間ごとまたは８週間ごとに０．１ｍｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、毎週または２週間ごとまたは４週間ごとまたは８週間ごとに１〜４００ｍｇ／ｋｇ、毎週または２週間ごとまたは４週間ごとまたは８週間ごとに５〜３００ｍｇ／ｋｇである。
【００８７】
他の実施形態では、対象に投与される特異的結合分子または融合タンパク質または医薬組成物の量は、約０．０５ｍｇ／ｍ２〜２，０００ｍｇ／ｍ２、詳細には１０ｍｇ／ｍ２〜２，０００ｍｇ／ｍ２の範囲の用量である。詳細には、投与される単位用量は、患者あたり１５ｍｇ〜約３ｇまで変動し得る。
【００８８】
投与される単位用量は、患者あたり１００μｇ〜約１ｇまで変動し得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、提供される組成物は、インビボ用途に使用される。インビボにて意図される投与方式によっては、使用される組成物は例えば、錠剤、丸剤、粉末、カプセル、ゲル、軟膏、液体、懸濁液など、固体、半固体または液体の剤形であってよい。好ましくは、組成物は、正確な投与量を単回投与するに好適である、単位剤形で投与される。組成物はまた、所望される製剤によっては少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含んでよい。これらは、動物またはヒトへ投与するための医薬組成物を処方するために一般的に使用される水性ベースのビヒクルとして定義されている。希釈剤は、目的の特異的結合分子または融合タンパク質の生物学的活性に悪影響を与えないように選択される。当該希釈剤の事例としては、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、ハンクス溶液が挙げられる。同様の希釈剤は、凍結乾燥した目的の組換えタンパク質を再構成するために使用されてよい。更に、医薬組成物はまた、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバント、無毒性であり非治療的、非免疫原性の安定剤などを含んでよい。当該希釈剤または担体の有効量は、成分の可溶性、生物学的活性に関して薬学的に許容可能な製剤を得るために有効な量のことである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は滅菌状態である。
【００９０】
インビボ治療中、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼内、膣内、直腸内を含む任意の経路によって投与される。関節内、静脈内および腹腔内の投与経路もまた使用されてよい。当業者は、治療すべき障害によって投与経路を変更することを認識している。例えば、本明細書による組成物または特異的結合分子または融合タンパク質は、経口、非経口、または局所投与を介して対象へと投与されてよい。一実施形態では、本明細書による組成物または特異的結合分子または融合タンパク質は、静脈内注入により投与される。
【００９１】
全身的に送達することを所望する場合、組成物は例えば急速静注または持続投与といった注射による非経口投与のために処方されてよい。注射用製剤は、例えば防腐剤を添加したアンプルまたは複数用量容器といった単位剤形にて呈示されてよい。組成物は懸濁液、油性または水性ビヒクル中溶液またはエマルジョンなどの形態をとってよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤といった処方用薬剤を含有してよい。
【００９２】
非経口投与用の薬学的製剤は、水に可溶な形態である活性組成物の水溶液を含む。更には、活性組成物の懸濁液は、必要に応じて油性懸濁注射液として調製されてよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油またはエチルオレートもしくはトリグリセライドなどの合成脂肪酸エステルまたはリポソームが挙げられる。水性懸濁注射液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してよい。これは例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランである。任意選択的には、懸濁液はまた、好適な安定剤または組成物の溶解度を増加させて、高濃度溶液の調製を可能にする薬剤を含有してよい。代替的には、活性組成物は、使用前に好適なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成するための粉末形態であってよい。
【００９３】
経口投与の場合、医薬組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容可能な賦形剤を用いて、例えば錠剤またはカプセルなどの従来手段で調製された形態をとってよい。錠剤は、当該技術分野で周知の方法によってコーティングされてよい。経口投与用の液体製剤は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとってよく、またはそれらは、使用前に水または他の好適なビヒクルを用いて構成するための乾燥製品として呈示されてよい。当該液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加剤を用いた従来手段によって調製されてよい。製剤はまた、必要に応じて緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤を含有してよい。１つまたは複数の成分は、抗体の経口送達が効果的であるように化学的に修飾されてよい。一般的に、企図される化学修飾は、抗体へ少なくとも１つの分子を付着させることであり、この場合、当該分子はａ）タンパク質分解の阻害および（ｂ）胃または腸管から血流への取り込みを可能にする。抗体の全体的な安定性の増加および体内循環時間の増加も望ましい。当該分子の例には、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンが挙げられる。使用可能と考えられる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカンである。上記にて示したように、薬学用途に好ましいのはポリエチレングリコール分子である。経口組成物の場合、放出場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸もしくは回腸）または大腸であり得る。当業者は、胃で溶解しないが、十二指腸または腸の他の場所で物質を放出するような利用可能な製剤を有する。好ましくは、腸管内といった胃環境外にて、抗体を保護するか、または生物学的活性物質を放出することのいずれかにより、放出は胃環境の有害効果を避けられる。
【００９４】
口腔内投与の場合、組成物は、従来手段で処方された錠剤またはトローチ剤の形態をとってよい。
【００９５】
吸入による投与の場合には、本開示による使用のための組成物は、好適な噴霧剤を使用することによる、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの呈示形態で従来のように送達されてよい。好適な噴霧剤とは例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または別の好適なガスである。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は計量された量を送達するためのバルブを提供することにより決定されてよい。吸入剤または吸入器に使用するためであり、組成物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末ベースを含有した、例えばゼラチンのカプセルおよび薬包が処方されてよい。
【００９６】
本明細書では、肺送達もまた企図されている。吸入し、血流へとつながる肺上皮細胞を横切りながら、組成物は哺乳動物の肺へと送達され得る。治療用製品を肺送達するために設計されている、当業者には既知である広範囲の機械的デバイスは、本開示の実践にて使用されることが企図されている。これはネブライザー、計量済容量の吸入器、粉末吸入器を含むがこれらに限定されない。
【００９７】
本明細書に開示されている医薬組成物の経鼻送達も企図されている。本開示の医薬組成物は、治療用製品を鼻へと投与した後に肺に製品を沈着させる必要なく、経鼻送達により直接血流への経路を通ることができる。経鼻送達用の製剤には、デキストランまたはシクロデキストランを有するものが含まれる。
【００９８】
例えばココアバターまたは他のグリセリドといった従来の坐薬ベースを含有する坐薬または停留浣腸剤などの組成物は、直腸内または膣内組成物中に処方されてよい。
【００９９】
医薬組成物はまた、好適な固体もしくはゲル相の担体または賦形剤を含んでよい。当該担体または賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
好適な液体または固体薬学調製形態は例えば、吸入用の水溶液または生理食塩溶液、マイクロカプセルにされるもの、渦巻形状にされるもの、微小金粒子上へコーティングされるもの、リポソーム内に含有されるもの、噴霧されるもの、エアロゾル、皮膚中への移植用ペレットまたは引っかくことで皮膚中へと導入されるための鋭い物体へと乾燥させたものといったものがある。医薬組成物はまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル、坐薬、シロップ、乳濁液、懸濁液、クリーム、飴または活性組成物の持続放出を伴う製剤を含む。これらの製剤中の賦形剤および添加剤および／または崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香味剤、甘味料または可溶化剤といった助剤が上記のように慣習的に使用されている。医薬組成物は、種々の薬物送達系での使用に好適である。
【０１０１】
本発明の別の主題は、必要のある患者に炎症性疾患の予防的治療を行うための方法に関し、当該患者への特異的結合分子または融合タンパク質、または活性物質として治療有効量の特異的結合分子もしくは融合タンパク質および上で定義されるような少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物の投与を含む。より好ましくは、炎症性疾患はアテローム性動脈硬化症である。
【０１０２】
特に有利な実施形態では、本発明は、炎症性疾患の予防を目的とする医薬品の製造において、活性成分として、治療有効量の特異的結合分子または融合タンパク質を含む医薬組成物の使用に関する。
【０１０３】
特に有利な実施形態では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の予防を目的とする医薬品の製造において、活性成分として、治療有効量の特異的結合分子または融合タンパク質を含む医薬組成物の使用に関する。
【０１０４】
本発明の別の主題は、必要のある患者に炎症性疾患の治療を行うための方法に関し、当該患者への特異的結合分子または融合タンパク質または活性物質として治療有効量の特異的結合分子もしくは融合タンパク質および上で定義されるような少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物の投与を含む。より好ましくは、炎症性疾患はアテローム性動脈硬化症である。
【０１０５】
特に有利な実施形態では、本発明は、炎症性疾患の治療を目的とする医薬品の製造において、活性成分として、治療有効量の特異的結合分子または融合タンパク質を含む医薬組成物の使用に関する。
【０１０６】
特に有利な実施形態では、本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療を目的とする医薬品の製造において、活性成分として、治療有効量の特異的結合分子または融合タンパク質を含む医薬組成物の使用に関する。
【０１０７】
本発明はまた、診断剤として使用することを目的とした、特異的結合分子または上で定義されるような融合タンパク質に関する。有利には、医療用画像化または治癒的治療の有効性を診断モニタリングすることを目的とした診断用組成物の調製のため、上で定義されるような特異的結合分子または融合タンパク質および上で言及したような薬学的に許容可能な量の特異的結合分子または融合タンパク質の投与を含む、診断方法に対する。医療用画像化システムの例には、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）システム、Ｘ線システム（従来のシステムおよびコンピュータＸ線撮影（ＣＲ）を含むデジタルまたはデジタル化画像システムの両方が含まれる）、磁気共鳴（ＭＲ）システム、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）システム、超音波システムおよび核医学システムが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）での診断では、通常は生理食塩水などの注入による静脈内投与は、典型的には１〜５００μｍｏｌのＧｄ／ｋｇ（例：ガドリニウムベースの分子：ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標）−１００〜３００μｍｏｌのＧｄ／ｋｇ、ｄｏｔａｒｅｍ（登録商標）−１００μｍｏｌのＧｄ／ｋｇ、酸化鉄ベースの分子：ｅｎｄｏｒｅｍ（登録商標）（１５μｍｏｌのＦｅ／ｋｇ）、ｓｉｎｅｒｅｍ（登録商標）（４５μｍｏｌのＦｅ／ｋｇ）、ｒｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）（１３μｍｏｌのＦｅ／ｋｇ）、ｆｅｒｕｍｏｘｓｉｌ（登録商標）またはｌｕｍｉｒｅｍ（登録商標）（６μｍｏｌのＦｅ／ｋｇ）、ｆｅｒｉｄｅｘ（登録商標）（１５μｍｏｌのＦｅ／ｋｇ）の用量で実行される。薬学的に許容可能な単位用量は、キレートの性質、投与経路、および患者、特に研究される障害の性質によって変化することになる。静脈内投与および磁気共鳴による観察の場合、特異的結合分子または融合の濃度は、典型的には０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌであり、場合によっては０．００１〜０．１ｍｍｏｌ／ｋｇが患者に投与されることになる。例えば３回の用量（０．３ｍｍｏｌ／ｋｇ）といった、より高い臨床容量もまた実施されてよい。投与速度、濃度、注入速度は、臨床的適応および製品仕様によって適用される。最終的にはＭＲＩ手順中の造影剤の挙動もまた考慮される。患者のデータ、最初に行われる試験投与、得られた濃度曲線を考慮した上で、実行可能な投与の調節をしながら任意の適切なプロトコールが使用される。プロトコールによっておよび取得途中の緩和曲線を考慮したプロトコール中に、注入速度を算出してよい（有利には、データ処理ツールにより自動的に算出される）。例えば、投与速度（ｒａｔｅ／ｓｐｅｅｄ）がデータベースを考慮した最適濃度にとって十分ではない場合、注射器は自動的にＭＲＩ手順中の投与速度を増加させる。
【０１０９】
有利な実施形態では、本発明は、炎症性疾患のインビボ診断方法で使用するための、特異的結合分子または融合タンパク質に関する。特に有利な実施形態では、本発明は、磁気共鳴画像法（ＲＭＩ）を使用することにより、炎症性疾患のインビボ診断方法で使用するための、特異的結合分子ｙまたは融合タンパク質に関する。より好ましくは、炎症性疾患はアテローム性動脈硬化症である。
【０１１０】
本発明によれば、特異的結合分子または融合タンパク質は、特異的に結合するガレクチン−３タンパク質によりアテローム性動脈硬化症の診断に特に有用である。この特異的に結合するガレクチン−３タンパク質は、アテローム性動脈硬化症におけるアテローム性動脈硬化炎症プロセスにて過剰発現し、これはアテロームプラークの形成または進行の特定につながる。
【０１１１】
本発明の別の主題は、診断剤および「担体」としての化学ナノ粒子といった、上で定義されるような特異的結合分子または融合タンパク質を含む診断用組成物に関する。「担体」とは、所望の解剖学的部位に化学ナノ粒子を輸送するための、結合タンパク質または融合タンパク質に結合された化学媒体を意図している。本発明によれば、担体は、固体または液体形態であり得る。担体の例としては、例えば酸化鉄、金−酸化鉄、鉄−コバルト、鉄−白金ナノ粒子といった金属ナノ粒子などのナノ粒子、フェライトまたはガドリニウムイオンを大部分含有するランタニド金属複合材、磁性リポソーム、ボロカプテイトナトリウム、磁性ＳＬＮ（固体脂質ナノ粒子）、ＬＯＮ（脂質油性ナノ粒子）、磁性水中油滴型ナノエマルジョン、ＵＳＰＩＯ（超小型常磁性酸化鉄）、近赤外蛍光色素またはＰＥＴイメージング用の放射性分子（Ｆ１８、Ｃｕ６４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
特に有利な実施形態では、担体はナノ粒子である。特に有利な実施形態では、上で定義されるような特異的結合分子または融合タンパク質は、ナノ粒子上に移植される。特に有利な実施形態では、診断用組成物は、磁気共鳴画像法（ＲＭＩ）を使用することにより、炎症性疾患のインビボ診断方法で使用される。より好ましくは、炎症性疾患はアテローム性動脈硬化症である。
【０１１３】
実施形態によれば、こうした診断用組成物は、患者の診断プロファイルの関数、特に造影剤への患者の許容プロファイルの関数の通り、先行技術の診断用組成物と組み合わせてまたはその代わりに投与されるために選択されてよい。熟練者によりおよび／または自動的に任意のタグシステム（患者により携帯されるＲＦＩＤタグ）により選択が行われてよく、例えば、本用途の製剤などに最適な造影剤の選択など、投与タイプを調整してよい。
【０１１４】
本発明の別の主題は、好ましくは、炎症性疾患に罹患しているまたは罹患している疑いのある患者におけるガレクチン−３タンパク質の検出用診断キットに関するものであり、当該キットは、上で定義されるような特異的結合分子または融合タンパク質を含む、注射可能な溶液を含む。より好ましくは、炎症性疾患はアテローム性動脈硬化症である。
【０１１５】
本発明によれば、診断キットは特異的結合分子または融合タンパク質および対象体内のアテローム病変を選択的に特定するための担体を含む注射可能溶液、および有効量の注射可能溶液を対象へと静脈内投与するために構成された送達器具を含み、対象体内の複数のアテロームプラークを選択的に特定する。
【０１１６】
本発明によれば、診断キットは特異的結合分子または融合タンパク質および対象体内のアテローム病変を選択的に標識するための蛍光マーカーを含む注射可能溶液、および有効量の注射可能溶液を対象へと静脈内投与するために構成された送達器具を含み、対象体内の複数のアテロームプラークを選択的に特定する。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】本発明の特異的結合分子のベクターの制限酵素カードである。
【図２】図２は、アテローム標本から調製され、パラフィン包埋されたヒト、マウスおよびウサギのアテローム切片に結合する、ＨＥＫ細胞内で産生された融合タンパク質の容量を示す。断面の異なる領域を同定した。すなわち、（ａ）外膜、（Ｍ）中間部、（Ｉ）内膜である。アテローム性動脈硬化したウサギ、マウスおよびヒト組織切片を用いてＰ３抗体をインキュベートした。最初の行は二次抗体のみに対応している（抗ヒトＦｃ  ＨＲＰ）。下の行はｓｃＦｖ−Ｆｃ  Ｐ３に対応する。二次ヤギ抗ヒトＦｃ抗体を添加した後、ＨＲＰと結合させ、ＤＡＢ基質キット試薬を用いて切片を明らかにした。ｓｃＦｖ−Ｆｃ  Ｐ３によって認識される抗原は、暗色染色によりその存在を示した。二次抗体の存在下では染色は観察されなかった。ヒト切片では低いバックグラウンド染色のみが認められた。スケールバーは１００μｍを表す。核をヘマトキシリンで対比染色した。
【図３】Ｐ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃまたは市販の制御抗体を用いたヒト動脈内膜切除による切片ならびにＡｐｏＥ−／−マウスおよびＷＴマウスの大動脈の免疫蛍光染色である。（Ａ）ヒトの動脈内膜切除術による切片の二重免疫蛍光染色。Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ４８８抗マウス抗体（＋４８８−Ａｂ抗Ｍｓ）を使用し、市販の抗ヒトガレクチン−３抗体（Ｍｓ抗ガレクチン−３）の特異的結合を明らかにした。Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ５６８抗ヒト抗体（＋５６８−Ａｂ抗ヒト）を使用し、Ｐ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ヒトＰ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の特異的結合を明らかにした。ここでは、ａ）二次抗体のみ、ｂ）一次抗体を指す。ヒト動脈内膜切除術の切片における共免疫蛍光染色からわかるように、Ｐ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび抗ヒトＧａｌ３抗体は重複染色を示した。サイズバー：５０μｍ。（Ｂ）ＡｐｏＥ−／−マウスおよびＷＴマウスにおけるエクスビボ注射後の、Ｐ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃ蛍光肉眼検査。ヒトＩｇＧをネガティブコントロール抗体として使用した。Ｐ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃは、ＡｐｏＥ−／−マウスにおけるアテロームの特異的な標識を示した。
【図４】ＯｐｔｉＨＥＫ  Ｃ３  ｈ／ｌ（図４Ａ）およびＯｐｔｉＨＥＫ  Ｃ３  Ｉ／ｈベクター（図４Ｂ）の制限酵素カードである。
【図５】ＯｐｔｉＨＥＫＶ４−ＣＨ−Ｃ３およびＯｐｔｉＨＥＫＶ４−ＣＬ−Ｃ３ベクターの制限酵素カードである。
【図６】図６は、アテローム標本から調製され、パラフィン包埋されたヒトおよびマウスのアテローム切片に結合する、ＨＥＫ細胞内で産生された特異的結合分子（ＩｇＧ１）の容量を示す。
【図７】図７は、ＡＰＯＥ−／−マウスの磁気共鳴画像（ＲＭＩ）を使用して、インビボのアテローム性動脈硬化症を診断するための酸化鉄を含有するナノ粒子上に移植された特異的結合分子（Ｐ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃ−２Ｃ抗体）の容量を示す。ａ．セグメント化されたＲ２＊マップは、３ｍｇＦｅＫｇ−１でＡｐｏＥ−／−マウス内へのＳＰＩＯ−ＮＥ−Ｐ３の注入前（左）および注入後（右）のプラークレベルを推定したものであり、対応する振幅のＭＲ画像（ＴＥ＝４ｍｓ）で重ねあわされた。Ｉ．黒＊：肝臓。ｂ．３匹のマウスで測定された平均Ｒ２＊値（マウスあたり最大８スライス、合計２３スライス）。エラーバー：各スライス（ＳＥＭ）で測定された平均Ｒ２＊の標準誤差。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：アテローム性動脈硬化したウサギモデルにおけるインビボファージディスプレイ選択
ニュージーランドウサギ動物モデルにおける不安定プラーク形成
全ての動物実験は、ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８５−２３，ｒｅｖｉｓｅｄ  １９９６）に基づいて実施され、地域の倫理委員会により承認されていた。ウサギモデルは、事前に記載したように高コレステロールの食事を与えられており、２か月間隔で２回の外科手術を実施した。最初の手術は胸部から腹部大動脈までの脱内皮化で構成され、次の手術はＸ線透視ガイドの下で胸部下行大動脈まで大腿動脈を切開することによる、バルーンを用いて実施される血管形成術からなる。
【０１１９】
アテローム性動脈硬化したウサギモデルにおけるインビボファージディスプレイ選択
ＳｃＦｖ−ファージライブラリの調製
特許文献である国際公開第２００７１３７６１６号に記載される、完全ヒト組換え断片ｓｃＦｖ抗体ライブラリは、インビボファージディスプレイ選択にて使用された。ファージレスキューのため、ファージライブラリをＭ１３−ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｆｒａｎｃｅ）で感染させ、続いてＰＥＧ／ＮａＣｌを用いてファージを沈殿させた。１１，０００ｇにて４℃、４５分間遠心分離にかけた後、ｓｃＦｖ−ファージ粒子を含有するペレットを最終容積５００μＬの滅菌冷ＰＢＳで再懸濁させ、ろ過した。
【０１２０】
インビボファージディスプレイ
ファージディスプレイ法により、３ラウンドのバイオパニングをアテローム性ウサギに実行した。ウサギの耳翼辺縁静脈へと３０分間注入された、ｓｃＦｖ−ファージの２．４×１０１２コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）の連続フロー（１５０μＬ／分）を用いて最初の選択を実施した。１時間循環させたのち、このウサギを屠殺して心臓を介して１２０ｍＬのＰＢＳで灌流させ、血液からファージが排出されたことを確認した。大動脈は大動脈弓から腸骨分岐部まで回収され、Ｅ１（大動脈弓および胸部領域）とＥ２（擦過した腎臓および腹腔領域）切片に分割した。ｓｃＦｖ−ファージの量が４．８×１０１１および３．９×１０１１ｃｆｕにそれぞれ低下させた以外は同様の手順に従い、ラウンド２およびラウンド３が実施された。
【０１２１】
内皮細胞表面に結合するｓｃＦｖ−ファージだけでなく、内膜へと遊走するものおよび病変へと浸潤する細胞へと内部移行するものにもアクセスするため、大動脈組織からＦ１、Ｆ２およびＦ３画分をそれぞれ回収した。
【０１２２】
内皮組織内および内皮細胞内のｓｃＦｖ画分の溶出プロトコールは、Ｄｅｒａｍｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌによるプロトコールを少し変更したものに従い実行された。内皮細胞表面結合ｓｃＦｖ−ファージ画分（Ｆ１画分）は、５００μＬ、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出され、直ちに１５μＬ、２．５Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和された。溶出手順を繰り返して異なる試料をプールし、プロテアーゼ阻害剤混合物（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。細菌に感染させる前にフラクションを４℃で保存した。
【０１２３】
組織内ｓｃＦｖファージ画分（Ｆ２画分）を溶出させるため、大動脈組織を、２．５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｅｕｒｏｂｉｏ）で１ｍＬへと調節した２，０００Ｕ／ｍＬのコラーゲン分解酵素２型（Ｇｉｂｃｏ）を含有する、９００μＬのＰＢＳ（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まない）でインキュベートした。ガラススライドを用いて引っかき傷を形成し、組織解離を促進させた。次いで、４℃で２０秒、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（Ｕｌｔｒａｔｕｒａｘ  ＴＰ−２０，Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ）を動作させ、均質な溶液を得た。次いで、破砕物を３７℃で３０分、時間に正確にボルテックスミキサーにかけながらインキュベートさせ、最終的に、１，０００ｇで１０分間遠心分離にかけ、不溶物質を除去した。同様の手順に従い、製剤を更に２回均質化した。それぞれ遠心分離にかけた後、溶出されたｓｃＦｖ−ファージを含有する上澄みを収集して、プロテアーゼ阻害剤混合物が存在する清浄な管にプールした。
【０１２４】
内部移行されたｓｃＦｖ−ファージ画分（Ｆ３画分）にアクセスするため、不溶物質を０．１ＭのＴＥＡ（テトラエチルアンモニウムクロリド）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ｐＨ１１．５）を５００μＬ用いて、５分間室温でインキュベートさせ、次いで更に５分間、強力にボルテックスミキサーにかけた。試料を１５０μＬ、１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を添加することにより中和させた。１，０００ｇで１０分間遠心分離にかけた後、上澄みを収集した。
【０１２５】
ＳｃＦｖ−ファージ画分Ｆ１、Ｆ２およびＦ３は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）（ＯＤ＝０．５）に感染させることにより別々にレスキューされた。細胞をペレット化させ、２ｘＴＹ寒天（２ＴＹＧＡ）を含有するアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）およびグルコース（２％（ｗ／ｖ））上に播き、３０℃で１６時間インキュベートした。１４５ｍｍのペトリ皿に広げることにより、グリセロールストックを構成することが可能となり、８０ｍｍ皿上で限界希釈することにより、選択した濃縮度を評価することが可能となった。バイオパニングの３度目のラウンド後、ＦＡＣＳスクリーニングおよび更なる分析用として、播いたクローンを２ＴＹＧＡ選択培地（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  ｏｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で満たされたディープウェル９６マスターブロックへと別々に採取した。
【０１２６】
ファージ抗体の調製
個別のファージ感染したＸＬ１  Ｂｌｕｅを、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを加え、５００μＬの２ｘＴＹ／アンピシリン／５％グルコースの入った９６ディープウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  ｏｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）内で増殖させた。一晩インキュベートした後、２５μＬの細菌培養物を５００μＬの２ｘＴＹＧＡＴで播種させ、３時間インキュベートした。３．１０８個のヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を含有する２５μＬの２ＴＹを添加することにより、ファージ産生を誘発させた。１時間３７℃で感染させた後、２６℃で回転させながら、最終成長させるため、細菌をペレットとし、４０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えた５００μＬの２ｘ２ＴＹＧＡ中に再懸濁させた（Ｎｅｗｂｒｕｎｓｗｉｋ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）。次いで１０，０００ｇで１０分間、細菌をスピンダウンさせ、上澄みを直ちにフローサイトメトリーアッセイのために使用した。
【０１２７】
実施例２：組換え抗体の開発、ＨＥＫ細胞または昆虫細胞の発現、精製、特性解析
１．昆虫細胞からの産生および精製
融合タンパク質ＳｃＦｖ−Ｆｃは、バキュロウイルス−昆虫細胞系を使用して産生した。簡潔には、本発明のｓｃＦｖをコードするｃＤＮＡは、以下、Ｐ３／Ａ−ＶＨ  ５’用には、ＧＣＴＡ  ＣＴＴＡＡＧ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＴＧＣ  ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＣＧＧ  ３’（配列番号２５）、Ｐ３／Ａ−ＶＬ  ５’には、ＧＣＴＡ  ＣＧＴＡＣＧ  ＣＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＴ  ３’（配列番号２６）およびテンプレートとしてＳｃＦｖＰ３−Ｆｃといったプライマーを用いたＰＣＲにより増幅された。
【０１２８】
次いで、５’末端でＩｇＧ１シグナルペプチドをコードする配列、およびＣ末端にて２つの余分なシステイン残基を有するヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインをコードするｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ断片をインフレームで特異的転換ベクターへと挿入した。
【０１２９】
Ｓｆ９細胞は転換ベクターを用いたリポフェクションにより同時導入され、４０μＬのＤＯＴＡＰリポソーム遺伝子導入剤（Ｒｏｃｈｅ）の存在の下、ウイルスＤＮＡを精製した（Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｒｉｎｇｏｌｄ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，３３７，１９８９，ｐ．３８７−３８８）。組換えウイルスをプラークアッセイにより単離し、ＥＬＩＳＡにより増殖クローンを選別した。組換えウイルスのゲノム構造をサザンブロッティング法により制御した。統合された遺伝子の配列は、ＰＣＲによる増幅および配列決定（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）後に検証された。
【０１３０】
１細胞あたり３つのプラーク形成ユニット（ＰＦＵ）の感染多重度で選択された組換えウイルスを用いて、無血清培地での増殖に適合したＳｆ９細胞を感染させることにより、ＳｃＦｖ−Ｆｃを産生した。感染後３日間、細胞培養物の上澄みを採取し、ｓｃＦｖ−ＦｃをＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｅｒにて、ＨｉＴｒａｐ  ＦＦ、製造者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が推奨するタンパク質Ａで精製した。精製済ｓｃＦｖ−Ｆｃの品質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により評価された。ＳｃＦｖ製剤は０．２２μｍメンブレン（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過後滅菌され、使用前に４℃で保存した。
【０１３１】
２．ＨＥＫ細胞からの産生と精製
ＳｃＦｖ−Ｆｃを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いた一過性トランスフェクションにより産生した。発現ベクター（図１）は、ホモサピエンス用に最適化されたコドンを有する線形断片としてｓｃＦｖをコードしたｃＤＮＡ断片を最初に合成する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ）ことにより調製された。次いで断片は、シグナルペプチドおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片を含有するｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩとＮｏｔＩ制限酵素部位間で、Ｉｎｆｕｓｉｏｎキットを用いて組換えすることにより、サブクローニングした。１／２の比率（ＤＮＡ／遺伝子導入剤）で２５０ｋＤａのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、供給者の指示に従い、ＨＥＫ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞を精製した発現ベクターを用いて遺伝子導入した。３７℃、８％のＣＯ２、８ｍＭグルタミンを加えたＦ１７培地にて７日間産生した後、上澄みを採取して遠心分離にかけて分画した。ヒトＩｇＧ向けのＦａｓｔＥＬＩＳＡキット（ＲＤ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いたＥＬＩＳＡにより、投与に先立ち０．２μｍで滅菌ろ過した。精製済分子としてｓｃＦｖ−Ｆｃを使用した場合、精製はＡＫＴＡ  ａｖａｎｔ  ８０でＨｉＴｒａｐｐ  ＦＦ、タンパク質Ａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いたワンステップのアフィニティークロマトグラフィーで実行された。分子は、２５ｍＭのシトラートを用いて溶出、中和され、ＰＢＳに対して透析を行い、０．２μｍで滅菌ろ過され、使用前に４℃で保存した。精製済ｓｃＦｖ−Ｆｃの品質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより評価され、エンドトキシンレベルをＬＡＬテストにより測定した。
【０１３２】
３．フローサイトメトリーおよび免疫組織化学による特性解析
３．１アテロームタンパク質でコーティングされた磁気ビーズ上でのフローサイトメトリー
ａ／タンパク質抽出
タンパク質抽出は、前述のように実行した。簡潔には、アテローム性動脈硬化したタンパク質および健康なタンパク質を、プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）で補足した、市販にて入手可能なＴ−ＰＥＲ溶解バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）で可溶化させた。可溶化は、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＴＰ−２０  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ  ８（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて実行された。１３，０００ｇ、４℃で４５分間、２度遠心分離にかけた後、上澄み由来の不溶物質を廃棄し、製造者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）の指示に従いＢｒａｄｆｏｒｄアッセイキットを用いて、各可溶抽出物のタンパク質濃度を測定した。
【０１３３】
ｂ／アテローム性動脈硬化したウサギモデルから抽出されたタンパク質と磁気ビーズの結合
以前に記載したように、高脂肪の食事を与えられ、アテロームプラークを成長させたウサギから抽出された５０マイクログラムのタンパク質を、製造者（Ａｄｅｍｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）の指示に従って３００ｎｍのカルボキシル−アデムビーズに共有結合させた。再現性のために、試料ごとにコーティングされたタンパク質ビーズの３つのバッチを使用した。（Ｄｅｒａｍｃｈｉａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１２  Ｊｕｎ；１８０（６）：２５７６−８９およびＨｅｍａｄｏｕ  Ａ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．）
【０１３４】
ｃ／フローサイトメトリー分析
アテローム性動脈硬化したウサギタンパク質へのｓｃＦｖ−ファージおよびＳｃＦｖ−Ｆｃ融合抗体の結合は、フローサイトメトリーによって測定された。ビーズ上にコーティングされた４０マイクロリットルのアテローム性動脈硬化したウサギタンパク質を、５μｇ／ｍＬ〜１００μＬのｓｃＦｖ−ファージに添加し、ｓｃＦｖ−ＦｃはＰＢＳバッファ中、１０μｇ／ｍＬで希釈させ、４℃で３時間、回転させながらインキュベートさせた。マウス抗−ｐＶＩＩＩ（Ａｂｃａｍ，Ｆｒａｎｃｅ）およびウサギ抗ヒトＦｃγ特異的一次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を、１：１，０００または１：６５の希釈でそれぞれ添加した。これを４℃で一晩回転させながらインキュベートした。ｓｃＦｖ−ファージまたはｓｃＦｖ−Ｆｃの最終検出のため、Ａｌｅｘａ  ４８８標識抗マウス抗体（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＡｌｅｘａ  ４８８標識抗ウサギ抗体（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を１：４０および１：３０の希釈でそれぞれ使用した。
【０１３５】
３．２．ウサギ、マウスおよびヒト切片の免疫組織化学
ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合抗体を、アテローム標本から調製され、パラフィン包埋されたヒト、マウスおよびウサギのアテローム切片への結合について評価した。各パラフィン包埋された標本を脱パラフィン化し、再水和した。ブロッキング工程（Ｈ２Ｏ２ブロッキングおよびＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いた非特異部位ブロッキング）および賦活化工程（ｐＨ９）を実行した。ヒト切片の補足的ブロッキングは５％ヤギ血清を用いて実行され、続いて１００μｇ／ｍＬで特異的に希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋ＬまたはＦｃγを添加した。ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄後、次いでスライドをＳｃＦｖ−Ｆｃ抗体を用いて１０μｇ／ｍＬ、４℃で一晩インキュベートした。標本をＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で洗浄した。次いで、標本を二次ＨＲＰ−結合ヤギ抗ヒト（Ｆｃγ特異的）抗体（１：１，０００）Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）でインキュベートした。ネガティブコントロールスライドは二次抗体でのみインキュベートされた。
得られた結果を図２に示す。
【０１３６】
４．標的の特定
ａ−ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートは、５または１０μｇ／ｍＬの濃度である組換えガレクチン−３（Ａｂｃａｍ，Ｆｒａｎｃｅ）、ガレクチン３ＢＰ（Ａｂｃａｍ，Ｆｒａｎｃｅ）またはガレクチン３／ガレクチン３ＢＰ複合体を用いて、４℃で一晩コーティングされた。翌日、ＰＢＳ／５％乳を用いて１時間ブロックした。市販で入手可能な抗体またはｓｃＦｖ−Ｆｃ融合抗体を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合検出抗体を添加した。市販の抗体およびｓｃＦｖ−Ｆｃ融合抗体をそれぞれ１０μｇ／ｍＬと５０μｇ／ｍＬで希釈した。
【０１３７】
ｂ−免疫蛍光染色
ヒト組織標本は、ＣＨＵ  Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎの血管外科医であるＰｒ  ＤＵＣＡＳＳＥ  Ｅｒｉｃから提供された。免疫蛍光染色のために、ヒト切片を脱パラフィン化し、再水和した。賦活化工程（ｐＨ９）後、スライドを（１）ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１０、続いて（２）５％ヤギ血清、（３）１００μｇ／ｍＬで特異的に希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋ＬおよびＦｃγを添加することでブロックした。バキュロウイルスで産生された一次ｓｃＦｖ−Ｆｃまたは市販で入手可能な抗体を４℃で一晩添加した。スライドを、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ内で５０μｇ／ｍＬにて希釈したｓｃＦｖ−Ｆｃでインキュベートし、対照群として、二次抗体のみまたは製造者の指示に従って市販の抗体をインキュベートした。スライドを、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で１０分間６回洗浄し、二次抗体の希釈液を添加した（ｓｃＦｖ−Ｆｃ用にＡｌｅｘａ  ５６８標識抗ヒト抗体（１：２００）または市販の抗体用にＡｌｅｘａ  ４８８標識抗マウス（１：２００））。１時間のインキュベーション後、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ＶＷＲ，Ｆｒａｎｃｅ）でマウントした。スライドを蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）で観察した。
【０１３８】
結果は、Ａｌｅｘａ４８８抗マウス抗体で明らかにしたマウス抗ガレクチン３ＭＡｂｓおよびＡｌｅｘａ５６８標識抗ヒト抗体で明らかにした本発明の融合タンパク質の結合の重層化を示しており、これは同様の構造の標識を強調していた。Ｎｉｋｏｎ製の蛍光顕微鏡を用いて結果を得た。
【０１３９】
ｃ−エクスビボ蛍光イメージング
開胸により胸を開き、心臓を露出させて右心房を切開した。３０ゲージの針を左心室に挿入した。ＰＢＳ−ヘパリン（５０ＵＩ／ｍＬ、２．５ｍＬ（Ｓａｎｏｆｉ  Ａｖｅｎｔｉｓ，２３８  Ｖｉｔｒｙ−ｓｕｒ−Ｓｅｉｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ））を接種させ、続いて、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  Ｐ３抗体または製造者の指示に従い、蛍光染料であるＡｌｅｘａ６４７と結合させた対照ＩｇＧ（Ａｌｅｘａ  ６４７抗体標識キット、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）のいずれかの製剤を含有する２ｍＬのＰＢＳを用いて、１０ｍＬのＰＢＳ灌流を継続させた。２０分後、再びマウスへと５ｍＬの４％ｖ／ｖパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流を行った。次いで大動脈を取り出し、０．８％ｐ／ｖの高品位、２４５の低融点アガロースを含有した８０ｍｍのペトリ皿に埋め込んだ。大動脈は、Ａｌｅｘａ６４７取得用の専用キューブを備えた蛍光マクロスコープ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ  Ｆｒａｎｃｅ）を用いて画像化された。
【０１４０】
大動脈において、アテローム性マウスのアテロームプラークの検出が確認された結果を図３で示す。
【０１４１】
実施例３：ガレクチン−３タンパク質に特異的に結合する特異的結合タンパク質（ＩｇＧ１）の調製
１．バイシストロン性ベクターの構築
２つのバイシストロン性ベクターＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３  ｈ／ｌおよびＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３  ｌ／ｈを、軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列の中間産物のために使用した。
【０１４２】
Ａ．ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３  ｈ／ｌの構造
軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、ＰＣＲによってｐＣＥＰ４ベクター（実施例２区分２）から単離された。定常軽鎖（ＣＬ、図４ではＣＫとも呼ばれる）および定常重鎖ＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインは、イントロンを有するゲノム形態の下で提供される。表１で言及されるように、プライマーＰ１−ＶＨ−Ｃ３、Ｐ２−ＶＨ−Ｃ３、Ｐ１−ＶＬ−Ｃ３およびＰ２−ＶＬ−Ｃ３をそれぞれ使用し、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをＰＣＲにより単離した。表１で言及されるように、プライマーＣＨ−Ｉｎｔ５’、ＣＨ−Ｉｎｔ３’、ＣＫ−Ｉｎｔ５’およびＣＫＩ−Ｘｂａｌ−５’をそれぞれ使用し、定常重鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインをＰＣＲにより単離した。
【０１４３】
【表１】
2021500874.tif 000002
【０１４４】
簡潔には、発現ベクターＯｐｔｉＨＥＫ−ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃを制限酵素であるＮｈｅＩおよびＡｓｃＩにより消化させ、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して、ゲル上で精製した。
【０１４５】
次いで、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および定常重鎖ドメイン（ＣＨ）断片を、ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｖ４ベクターのＮｈｅＩとＡｓｃＩ制限酵素部位間で、注入キット（Ｏｚｙｍｅ）を用いて組換えすることによりサブクローニングし、中間ベクターＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｈを得た。次いで、中間ベクターであるＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｈを大腸菌細菌細胞へと形質転換させた。大腸菌コロニーを選別し、挿入ＶＨおよびＣＨを含む、適合するＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｈベクターを有するものを特定した。次いで適合ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｈベクターを制限酵素であるＳｐｅＩおよびＸｂａＩで消化させ、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキットを用いてゲル上で精製した。次いで、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）断片を、ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｈベクターのＳｐｅＩとＸｂａＩ制限酵素部位間で、注入キットを用いて組換えすることによりサブクローニングし、ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｈ／ｌベクターを得た。次いで、ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｈ／ｌベクターを大腸菌細菌細胞へと形質転換させた。大腸菌コロニーを選別し、適合するＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｈ／ｌベクターを有するものを特定した（図４Ａを参照されたい）。
【０１４６】
Ｂ．ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３ｌ／ｈの構築
軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、ＰＣＲによってｐＣＥＰ４ベクター（実施例２区分２）から単離された。定常軽鎖（ＣＬ、図５ではＣＫとも呼ばれる）および定常重鎖ＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインは、イントロンを有するゲノム形態の下で提供される。表２で言及されるように、プライマーＰ１−ＶＨ−Ｃ３−２、Ｐ２−ＶＨ−Ｃ３、Ｐ１−ＶＬ−Ｃ３−２およびＰ２−ＶＬ−Ｃ３−２をそれぞれ使用し、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをＰＣＲにより単離した。表２で言及されるように、プライマーＣＨ−Ｉｎｔ５’、ＣＨ−Ｉｎｔ３’、ＣＫ−Ｉｎｔ５’およびＣＫＩ−Ｘｂａｌ−５’をそれぞれ使用し、定常重鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインをＰＣＲにより単離した。
【０１４７】
【表２】
2021500874.tif 000003
【０１４８】
簡潔には、発現ベクターＯｐｔｉＨＥＫ−ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃを制限酵素であるＮｈｅＩおよびＡｓｃＩにより消化させ、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して、ゲル上で精製した。次いで、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）断片を、ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｖ４ベクターのＮｈｅＩとＡｓｃＩ制限酵素部位間で、注入キット（Ｏｚｙｍｅ）を用いて組換えすることによりサブクローニングし、中間ベクターＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｌを得た。次いで、中間ベクターであるＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｌを大腸菌細菌細胞へと形質転換させた。大腸菌コロニーを選別し、挿入ＶＬおよびＣＬを含む、適合するＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３を有するものを特定した。次いで適合ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｌベクターを制限酵素であるＮｈｅＩおよびＡｓｃＩで消化させ、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてゲル上で精製した。次いで、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および定常重鎖ドメイン（ＣＨ）断片を、ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｌベクターのＳｐｅＩとＸｂａＩ制限酵素部位間で、注入キットを用いて組換えすることによりサブクローニングし、ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｌ／ｈベクターを得た。次いで、ＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｌ／ｈベクターを大腸菌細菌細胞へと形質転換させた。大腸菌コロニーを選別し、適合するＯｐｔｉＨＥＫ−Ｃ３−ｌ／ｈベクターを有するものを特定した（図４Ｂを参照されたい）。
【０１４９】
２．モノシストロン性ベクターの構築
軽鎖と重鎖は、以下のプライマーを使用し、上で言及されたバイシストロン性ベクターからＰＣＲにより増幅される。
【０１５０】
【表３】
2021500874.tif 000004
【０１５１】
簡潔には、発現ベクターＯｐｔｉＨＥＫＶ４を制限酵素であるＮｈｅＩおよびＸｈｏＩにより消化させ、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して、ゲル上で精製した。次いで、ＰＣＲ断片を、ＯｐｔｉＨＥＫＶ４ベクターのＮｈｅＩとＸｈｏＩ制限酵素部位間で、注入キットを用いて組換えすることによりサブクローニングした（図５を参照されたい）。次いで、以前に得たモノシストロン性ベクターであるＯｐｔｉＨＥＫｖ４−ＣＬ−Ｃ３およびＯｐｔｉＨＥＫｖ４−ＣＨ−Ｃ３を、大腸菌細菌細胞へと形質転換させた。大腸菌コロニーをＰＣＲによって選別した。
【０１５２】
３．免疫グロブリンＩｇＧ１の発現
ＨＥＫ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞は、１／４の比率（ＤＮＡ／遺伝子導入剤）で２５０ｋＤａのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、供給者の指示に従い、重鎖および軽鎖をコードする、指示されたＬＣ（ＯｐｔｉＨＥＫｖ４−ＣＬ−Ｃ３）およびＨＣ（ＯｐｔｉＨＥＫｖ４−ＣＨ−Ｃ３）プラスミドを用いて遺伝子導入された。３７℃、８％のＣＯ２、８ｍＭグルタミンを加えたＦ１７培地にて７日間産生した後、上澄みを採取して遠心分離にかけて分画した。ヒトＩｇＧ向けのＦａｓｔＥＬＩＳＡキット（ＲＤ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いたＥＬＩＳＡにより、投与に先立ち０．２μｍで滅菌ろ過した。精製済分子としてＩｇＧ１を使用した場合、精製はＡＫＴＡ  ａｖａｎｔ  ８０でＨｉＴｒａｐｐ  ＦＦ、タンパク質Ａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いたワンステップのアフィニティークロマトグラフィーで実行された。ＩｇＧ１分子は、２５ｍＭのシトラートを用いて溶出され、ＰＢＳに対して透析を行い、０．２μｍで滅菌ろ過され、使用前に４℃で保存した。精製済ＩｇＧ１の品質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより評価され、エンドトキシンレベルをＬＡＬテストにより測定した。
【０１５３】
４．マウスおよびヒト切片の免疫組織化学
ＩｇＧ１分子は、２人の異なるドナーに由来するヒト生体組織検査から得られたパラフィン包埋されたアテローム性ヒト切片およびマウス動物モデルから調製されたマウス切片への結合について評価された。各パラフィン包埋された標本を脱パラフィン化し、再水和した。ブロッキング工程（Ｈ２Ｏ２ブロッキングおよびＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いた非特異部位ブロッキング）および賦活化工程（ｐＨ９）を実行した。ヒト切片の補足的ブロッキングは５％ヤギ血清を用いて実行され、続いて１００μｇ／ｍＬで特異的に希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋ＬまたはＦｃγを添加した。ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄後、次いでスライドをＳｃＦｖ−Ｆｃ抗体を用いて１０μｇ／ｍＬ、４℃で一晩インキュベートした。標本をＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で洗浄した。次いで、標本を二次ＨＲＰ−結合ヤギ抗ヒト（Ｆｃγ特異的）抗体（１：１，０００）Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）でインキュベートした。ネガティブコントロールスライドは二次抗体でのみインキュベートされた。
【０１５４】
得られた結果を図６に示す。
【０１５５】
ＩｇＧ分子は、マウスおよびヒトのアテローム構造を染色することが可能である。
【０１５６】
実施例４：酸化鉄を含有するナノ粒子上に移植されたｓｃＦｖ−Ｆｃ−２Ｃ  Ｐ３抗体を使用する、ＡＰＯＥ−／−マウスにおけるＭＲＩイメージング
ｓｃＦｖ−Ｆｃ−２Ｃ  Ｐ３抗体（実施例２．１にて産生された）を用いたナノ粒子（ＭＲＩイメージング用の酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ）を含有するナノエマルジョンである、ＳＰＩＯ−ＮＥ）の生体機能化は、マレイミドを基にしたタンパク質結合を用いて実行された。最初に、１００μｇのヒト抗体（１ｍｇ．ｍＬ−１）の２つのシステインを、１ｍＭであり、４℃の１８μＬのＴＣＥＰ溶液（分子比ＴＣＥＰ／Ｐ３は２０に等しい）を用いて４５分間活性化した。次いで、ナノエマルジョンを４℃で一晩活性化した抗体と共にインキュベートした。機能化後、磁気選別を利用したＮＥの超常磁特性により移植されていない抗体をナノエマルジョンから除去した。機能化は１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファおよび０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７）で実行された。
【０１５７】
プラークレベルでセグメント化されたＲ２＊マップを推定することにより、標的造影剤の蓄積を可視化し、水平方向の４．７Ｔ  Ｂｉｏｓｐｅｃ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定されたマルチグラジエントエコーシークエンスからこれを推定した。
【０１５８】
マルチスライスＭＧＥシークエンス：繰り返し時間ＴＲ  １，０００±１００ｍｓ、最初のエコー時間ＴＥ＝３．５ｍｓ、△ＴＥ＝４．５ｍｓ、１５回のエコー、α＝６０゜、ＮＥｘ＝４、解像度＝０．１×０．１×１ｍｍ。Ｒ２＊マップは、次の等式
【数１】
2021500874.tif 000005
を用いたＭＲシグナル（Ｓ）の適合度から抽出された。この場合、Ｓ０はＴＥアプローチが０ｍｓ時のシグナルである。
【０１５９】
局所的な勾配磁場（△Ｂ０／ｄｚ）のマップおよびＲ２＊マップを、Ｄａｈｎｋｅ  ｅｔ  ａｌにより提案された通りに推定した。標的ナノ粒子注入の２４時間後、ＭＲＩナノ粒子上に移植されたヒト抗体により、インビボでのアテロームプラークの蓄積を強調させることにより、平均Ｒ２＊値の増加を観察した。
【０１６０】
得られた結果を図７に示す。
【図１】
2021500874.tif 000006
【図２】
2021500874.tif 000007
【図３】
2021500874.tif 000008
【図４】
2021500874.tif 000009
【図５】
2021500874.tif 000010
【図６】
2021500874.tif 000011
【図７】
2021500874.tif 000012
【配列表】
2021500874000001.app
【国際調査報告】
2021500874.tif 000013
2021500874.tif 000014
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