(57)【要約】  １つの態様において、本願は、患者における癌の処置のための方法であって、方法はワクチンでの患者のワクチン接種を含み、ワクチンは胚源から得られるまたは患者からの体細胞の再プログラム化によって得られる哺乳動物の多能性幹細胞の有効量を含み、ワクチン接種は必要とする患者に哺乳動物の多能性幹細胞を投与する工程を含む、方法；および癌の処置における使用のためのワクチン製剤を記載している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌の処置のための方法であって、方法はワクチンでの患者のワクチン接種を含み、ワクチンは患者からの体細胞の再プログラム化によって得られる哺乳動物の多能性幹細胞の有効量を含み、ワクチン接種は必要とする患者に哺乳動物の多能性幹細胞を投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
多能性幹細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物の多能性幹細胞が未分化多能性幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
多能性幹細胞が、ｓｈＲＮＡ  ｐ５３の起こりうる付加と共に、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ−４およびＳｏｘ２を含む４つの再プログラム化因子を含むミニイントロン(mini-intronic)プラスミドを使用して産生される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
幹細胞が、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、末梢血細胞および腎上皮細胞からなる群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
アジュバントが、ワクチンに対する免疫応答を増強するための免疫学的薬剤である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ワクチンが、以下の方法：ａ）独立型のワクチン接種として；ｂ）腫瘍切除前のアジュバント療法として；ｃ）腫瘍切除後のアジュバント療法として、ｄ）転移状況において；ｅ）腫瘍または癌の非存在下で予防状況として；およびｆ）化学療法、免疫療法、標的療法と組み合わせて、生物学的薬剤を使用して、小分子剤を使用して、生物学的または小分子剤を含むナノ粒子と共に、またはそれらの組合せ、の少なくとも１つにしたがって投与される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
癌が、乳癌、黒色腫および中皮腫からなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
癌が、白血病、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、骨髄増殖性疾患、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経内分泌癌腫、膀胱癌、皮膚癌、脳および脊髄癌、頭頸部癌、甲状腺、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、消化器癌、（下）喉頭癌、食道癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、眼癌、腎細胞癌、腎臓、肝臓、卵巣癌、胃癌、精巣癌、甲状腺および胸腺癌からなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
多能性幹細胞癌ワクチンでの哺乳動物のワクチン接種のための方法であって、方法は、
レシピエントからの体細胞の再プログラム化によって哺乳動物の多能性幹細胞を導入すること；および
多能性幹細胞をレシピエントに提供すること
を含む、方法。
【請求項１１】
哺乳動物細胞が、未分化多能性細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞が、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ−４およびＳｏｘ２を含む４つの再プログラム化因子を含むミニイントロンプラスミドを使用して産生される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞が、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、末梢血細胞および腎上皮細胞からなる群から選択される、請求項１０から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ワクチンが、ワクチン接種の前に注がれる、請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ワクチンが、ワクチンに対する免疫応答を増強するための免疫学的薬剤であるアジュバントをさらに含む、請求項１０から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物からの体細胞の再プログラム化によって得られる哺乳動物の多能性幹細胞の有効量、およびワクチンに対する免疫応答を増強するためのアジュバントまたは免疫学的薬剤を含む熱的に安定なワクチン組成物。
【請求項１７】
多能性幹細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
哺乳動物の多能性幹細胞が未分化多能性幹細胞である、請求項１６または１７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
幹細胞が、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、末梢血細胞および腎上皮細胞からなる群から選択される、請求項１６から１８のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
アジュバントが、ＣｐＧ，ＱＳ２１、ポリ（ジ（カルボキシラートフェノキシ）ホスファゼン（poly(di(carboxylatophenoxy)phosphazene）；リポ多糖類の誘導体、例えば、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）、スレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）；ＯＭ−１７４；コレラ毒素（ＣＴ）、およびリーシュマニア伸長因子からなる群から選択される、請求項１６から１９のいずれかに記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１月２日に提出された仮出願番号６２／６１２，８２６の３５  ＵＳＣ  １１９（ｅ）に基づく優先権を主張し、その開示は参照により本願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
１世紀近く前に、研究者たちは、胚性物質による免疫化が移植された腫瘍の拒絶につながることを観察した。最近では、共有トランスクリプトームプロファイルおよび抗原がさまざまな腫瘍細胞および胚細胞で同定された。これは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）が抗腫瘍応答を促進するための免疫化剤として使用することができるという仮説を導いた。
【０００３】
不活化された生物体またはタンパク質産物からなる従来のワクチンに対する全細胞ワクチン接種の成功の鍵の１つは、未知の抗原を含む幅広い抗原をＴ細胞に提示できることである。しかし、抗腫瘍免疫を誘導するワクチンとしての胎児および胚の材料の使用は、主としてこれらの治療法を取り巻く倫理的課題のために、動物モデルを超えてまだ進んでいない。
【０００４】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の発見により、ＥＳＣとほぼ同一の遺伝子発現および表面マーカープロフィールを共有する患者自身の組織からの多能性細胞を作成することを可能にし、主要な倫理的障害を回避する。
【０００５】
癌ワクチン接種の潜在的な有効性を示唆している、自己移植によるｉＰＳＣの腫瘍形成性（Kooreman and Wu, 2010; Okita et al., 2007）および免疫原性（de Almeida et al., 2014; Zhao et al., 2011）特性のため、ｉＰＳＣは癌ワクチン接種の魅力的な候補である。重要なことには、自己ｉＰＳＣは、同種異系のＥＳＣよりも正確なおよび典型的な患者の腫瘍抗原のパネルを提供することができる。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要：
１つの態様において、本出願は、予防的にまたは治療的にのいずれかで複数のタイプの癌を標的とする癌ワクチンの産生のための組成物および方法を提供する。１つの局面において、ワクチンによって産生される癌細胞に対する免疫は、アジュバントおよびｉＰＳＣまたはミニイントロンプラスミド産生ｉＰＳＣ（ＭＩＰ−ｉＰＳＣ）、例えばアジュバントＣｐＧおよびｉＰＳＣ、またはアジュバントＣｐＧおよびＭＩＰ−ｉＰＳＣを組み合わせる。ＭＩＰ−ｉＰＳＣは、免疫細胞の大きなレパートリーを活性化するミニイントロンプラスミドを使用して産生され、ｉＰＳＣおよび癌細胞間で共有される癌関連または癌に関連するエピトープを標的とし、癌の発生および／または進行に対する長期免疫を提供する。
【０００７】
別の局面において、興味ある癌型は潜在的に無制限であり、初期のパイロット試験は乳癌、黒色腫、膵臓癌および中皮腫において有効性を示す。ｉＰＳＣおよび癌細胞間の癌エピトープにおける大きな重複に基づいて、免疫は、固形腫瘍（例えば、乳房、肺、皮膚、グリア芽腫、頭頸部、甲状腺、膵臓、肝臓、結腸直腸、腎臓、胃、肉腫、卵巣、膀胱、前立腺、食道、子宮内膜、子宮頸）ならびに血液学的癌（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、白血病）に対して発生する可能性がある。
【０００８】
１つの態様において、自己癌ワクチン産生およびワクチン接種レジメンのための方法であって、方法が、ｉＰＳＣベースのワクチンのインビトロでの産生および連続する週を含む数週間、例えば、４週間連続でレシピエントへのワクチン接種、例えば皮下にワクチン接種を含む方法が提供される。１つの変形において、ワクチン接種は、少なくとも２週間連続、３週間連続、４週間連続、５週間連続、または少なくとも６週間連続にわたって毎週行われる。別の変形において、ワクチンは、アジュバントＣｐＧまたは同等の特性を有する任意の他のアジュバントと一緒のｉＰＳＣの使用であって、アジュバントは、ワクチンに対する免疫応答を増強または強化するための免疫学的薬剤、例えば抗体、ペプチドまたは小分子である、使用を含む。
【０００９】
１つの態様において、多能性幹細胞は、炎症誘発性（pro-inflammatory）タンパク質を過剰発現する（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦγ、ＤＮＭＴインヒビターを使用することによって）、または前免疫原性（pro-immunogenic）タンパク質を過剰発現する（例えば、ＭＨＣ  クラス  Ｉ、β２ｍ、Ｔａｐａｓｉｎ、またはｃ−Ｍｙｃ／Ｏｃｔ４）ように遺伝的に操作されていない。１つの変形において、多能性幹細胞は、炎症誘発性タンパク質を過剰発現する（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦγ、ＤＮＭＴインヒビターを使用することによって）、または前免疫原性タンパク質を過剰発現する（例えば、ＭＨＣ  クラス  Ｉ、β２ｍ、Ｔａｐａｓｉｎ、またはｃ−Ｍｙｃ／Ｏｃｔ４）ように遺伝的に操作されている。ワクチンに対する免疫応答を上方調節する前免疫原性抗原を遺伝的に過剰発現するための方法は、Yaddanapudi, K. et al. (2012). Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS ONE 7, e42289に記載されている。
【００１０】
別の態様において、多能性幹細胞は、１つ以上の癌抗原（例えば、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−１、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｐ５３、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、ＡＦＰ、ｒａｓ）、炎症誘発性タンパク質および／または前免疫原性タンパク質を過剰発現するように遺伝的に操作されている。別の態様において、ワクチンは、ｉＰＳＣを使用して患者自身の組織（例えば、皮膚、筋肉、脂肪、骨髄、器官、毛髪、血液および尿、または組織の組合せ）から産生され、それにより患者特異的ワクチンを作ることができる。
【００１１】
１つの態様において、患者における癌の処置のための方法であって、方法はワクチンでの患者のワクチン接種を含み、ワクチンは胚源から得られるまたは患者または別の患者またはヒトからの体細胞の再プログラム化によって得られる、またはｉＰＳＣの同種異系の供給源から得られる哺乳動物の多能性幹細胞の有効量を含み、ワクチン接種は必要とする患者に哺乳動物の多能性幹細胞を投与する工程を含む、方法が提供される。本願明細書において使用されるとき、方法は、癌の処置のための患者と呼ばれることができる任意の哺乳動物に等しく適用できる。
【００１２】
方法の１つの変形において、哺乳動物の多能性幹細胞は、特定化されていない体細胞に由来する。体細胞の再プログラム化のための方法および胚性幹細胞の使用なしで任意の細胞系統の患者特異的幹細胞を再生するための方法のサマリーについてRajasingh, J. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 2012, 111:51-82参照。１つの変形において、ｉＰＳＣは、ウイルスおよび非統合非ウイルス方法を使用してゲノム再プログラム化することによって産生される。別の変形において、多能性幹細胞は、アジュバントと製剤化される、例えば、多能性幹細胞は、アジュバントと組み合わせられるか、または乳化される。
【００１３】
上記方法の１つの局面において、多能性幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。方法の別の局面において、哺乳動物の多能性幹細胞は未分化多能性幹細胞である。方法の別の局面において、多能性幹細胞は、ｓｈＲＮＡ  ｐ５３の起こりうる付加と共に、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ−４およびＳｏｘ２を含む４つの再プログラム化因子を含むミニイントロンプラスミドを使用して産生される。方法の１つの変形において、多能性幹細胞は、例えばＧＭ−ＣＳＦを使用することによって、免疫原性タンパク質を過剰発現するように遺伝的に操作されていない。方法の別の変形において、多能性幹細胞は、癌抗原、炎症誘発性タンパク質、および／または前免疫原性タンパク質を過剰発現するように遺伝的に操作されている。１つの態様において、多能性幹細胞は、炎症誘発性タンパク質を過剰発現する（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦｇ、ＤＮＭＴインヒビターを使用することによって）、または前免疫原性タンパク質を過剰発現する（例えば、ＭＨＣ  クラス  Ｉ、β２ｍ，Ｔａｐａｓｉｎ、またはｃ−Ｍｙｃ／Ｏｃｔ４）、または１つ以上の癌抗原を過剰発現する（例えば、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−１、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｐ５３、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、ＡＦＰ、ｒａｓ）、または炎症誘発性タンパク質および／または前免疫原性タンパク質を過剰発現するように遺伝的に操作されている。別の態様において、ワクチンは、ｉＰＳＣを使用して患者自身の組織（例えば、皮膚、筋肉、脂肪、骨髄、臓器、毛髪、血液および尿、または組織の組合せ）から産生され、それにより患者特異的ワクチンを作ることができる。方法の別の局面において、多能性幹細胞は、部分的に分化した胚様体を含む。
【００１４】
上記方法の別の局面において、幹細胞は、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、末梢血細胞および腎上皮細胞からなる群から選択される。方法の１つの変形において、多能性幹細胞は、多能性と関連する細胞フラグメントまたはエピトープを含む。別の変形において、ワクチンはワクチン接種の前に照射される。別の変形において、ワクチンは皮下注射によって投与され、および４週間以下で投与される。方法の１つの変形において、ワクチン接種は毎週行われる。別の変形において、ワクチンは、毎日、週に数回、例えば、週に２回または３回、または２週間ごとに投与されてよく、持続期間は、２、３、４、５、６、７、または８週間であってよい。
【００１５】
上記方法の別の局面において、アジュバントは、ワクチンに対する免疫応答を増強するための免疫学的薬剤である。ワクチンの治療有効用量は、本願のワクチンの投与の非存在下での効果と比較して、インビボでの免疫応答を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％またはそれ以上増強または強化させることができる。Ｔ細胞応答を測定するために使用されるアッセイは、限定はしないが、遅延型過敏症テスト、ペプチド主要組織適合遺伝子複合体テトラマーを使用するフローサイトメトリー、リンパ球増殖アッセイ、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）、サイトカインフローサイトメトリー、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ、ＣＴＬ前駆体頻度アッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステルアッセイ、多機能Ｔ細胞アッセイ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるサイトカインｍＲＮＡの測定、および限界希釈分析を含む。免疫応答を評価するための他のアッセイは、限定はしないが、遺伝子発現プロファイリング、一度に複数の抗原に対する抗体応答を評価するタンパク質マイクロアレイ、ルシフェラーゼ免疫沈降、リンパ球免疫モニタリングのための単一細胞レベルで免疫系において複数の細胞内シグナル伝達分子を測定するためのｐｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ、および血清中の抗体免疫をモニタリングする表面プラズモン共鳴バイオセンサーを含む。方法の１つの変形において、アジュバントは、ＣｐＧ、ＱＳ２１、ポリ（ジ（カルボキシラートフェノキシ）ホスファゼン（poly(di(carboxylatophenoxy)phosphazene）；リポ多糖類の誘導体、例えばモノホスホリルリピドＡ、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）、スレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）；ＯＭ−１７４；コレラ毒素（ＣＴ）、およびリーシュマニア伸長因子；またはそれらの混合物からなる群から選択される。
【００１６】
方法の別の局面において、ワクチンは、腫瘍切除後のアジュバント療法として投与される。方法の１つの変形において、ワクチンは、化学療法、他の免疫療法、例えば抗体、およびこれらの薬剤または分子を含むナノ粒子を含む小分子と共に投与される。別の変形において、ワクチンは、ネオアジュバント（手術前）、アジュバント（手術後）、または転移状況においてまたは予防状況で癌が発生する前に与えることができる。方法の別の局面において、ワクチンは、腫瘍切除前のネオアジュバント療法として投与される。方法の別の局面において、ワクチンは、転移状況において治療として投与される。方法の別の局面において、ワクチンは、単一または複数の化学療法剤、免疫療法、例えば抗−ＰＤＬ１、抗−ＰＤ１、または抗−ＣＴＬＡ４抗体、他の生物製剤、およびこれらの薬剤を含むナノ粒子を含む小分子、例えばジプロボシムと組み合わせて投与される。方法の別の局面において、癌は、乳癌、黒色腫および中皮腫からなる群から選択される。方法のさらなる別の局面において、癌は、白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、骨髄増殖性疾患、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経内分泌癌腫、膀胱癌、皮膚癌、脳および脊髄癌、頭頸部癌、骨癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、経直腸癌、子宮内膜癌、消化器癌、（下）喉頭癌、食道癌、胚細胞癌、移行性細胞癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、胆管癌腫、分化の乏しい癌腫、前立腺癌、眼癌、腎細胞癌、卵巣癌、胃癌、精巣癌、甲状腺および胸腺癌からなる群から選択される。
【００１７】
別の態様において、多能性幹細胞癌ワクチンでの哺乳動物のワクチン接種のための方法であって、方法は、１）胚源からの、または２）レシピエントからの体細胞の再プログラム化によって哺乳動物の多能性幹細胞を導入すること；および多能性幹細胞をレシピエントに提供することを含む、方法が提供される。方法の別の側面において、哺乳動物細胞は未分化多能性細胞である。
【００１８】
方法の１つの局面において、多能性幹細胞は、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ−４およびＳｏｘ２を含む４つの再プログラム化因子を含むミニイントロンプラスミドを使用して産生される。方法の１つの変形において、多能性幹細胞は、免疫原性タンパク質を過剰発現するように、例えばＧＭ−ＣＳＦを使用することによって、遺伝的に操作されていない。方法の１つの変形において、多能性幹細胞は、免疫原性タンパク質を過剰発現するように、例えばＧＭ−ＣＳＦを使用することによって、遺伝的に操作または改変されている。
【００１９】
方法の別の局面において、多能性幹細胞は、癌抗原および／または免疫原性タンパク質を過剰発現するように遺伝的に操作されている。方法の別の局面において、多能性幹細胞は、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、末梢血細胞および腎上皮細胞からなる群から選択される。方法の１つの変形において、多能性幹細胞は、多能性と関連する細胞フラグメントまたはエピトープを含む。
【００２０】
上記方法の別の局面において、ワクチンは、ワクチン接種の前に照射される。方法の１つの変形において、ワクチンは、４週間以下、例えば３週間、２週間または約１週間の期間にわたって皮下注射される。別の変形において、ワクチン接種は毎週行われる。別の変形において、ワクチン接種は毎日、週に数回、例えば週に２回または３回、または２週間ごとに行われてよく、および期間は２、３、４、５、６、７、または８週間またはそれ以上であってよい。
【００２１】
上記方法の別の局面において、ワクチンは、ワクチンに対する免疫応答を増強するための免疫学的薬剤であるアジュバントをさらに含む。上記方法の１つの変形において、腫瘍切除後のアジュバントワクチン接種は、きれいな切除領域（ＲＡ）および癌細胞を標的とする免疫系の再活性化をもたらす。上記方法のそれぞれの別の変形において、方法は、腫瘍特異的応答、有効な抗原提示、陽性Ｔヘルパー免疫応答の少なくとも１つを提供し、細胞傷害性Ｔ細胞活性をもたらす。
【００２２】
方法の１つの変形において、処置の方法は、ワクチンによる自己免疫応答の兆候をもたらさない；または処置の方法は、ワクチンによる自己免疫性応答の検出可能な兆候を実質的にもたらさない。方法の別の変形において、ワクチンは腫瘍切除後のアジュバント療法として使用される。１つの変形において、方法は、癌、例えば黒色腫または乳癌、または本明細書に記載されている癌の目に見える再発がなく、患者に少なくとも１つのアジュバントラウンド；または少なくとも２つのアジュバントラウンドの（Ｃ＋Ｉ）ワクチンを提供する。別の変形において、方法は、成熟抗原提示細胞（ＡＰＣ）の上方制御およびヘルパーＴ細胞の上方制御をもたらす。
【００２３】
別の変形において、ワクチンは、ＩＬ−４発現Ｂ細胞、ＴＮＦ−アルファ発現ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１ｈｉ骨髄細胞の全身性上方調節および腫瘍促進Ｔｈ１７細胞の低下の少なくとも１つによって、残存癌細胞、例えば黒色腫細胞を拒絶することにおいて免疫系を再活性化する。別の変形において、方法は、腫瘍注射部位およびワクチン接種部位の近くの分解を含む、腫瘍の分解を引き起こす。１つの変形において、方法は、処置後の、腫瘍サイズの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、８５％、９０％または９５％以上の低下をもたらす。別の変形において、方法は、免疫系の刺激（priming）および免疫系の再活性化をもたらし、癌細胞を特異的に標的とする。上記方法のそれぞれの別の変形において、方法は、複数の癌型に対するアジュバント免疫療法として使用されてよく、診断後１週間、２週間、３週間、４週間または約５週間以内に有効であり得る。別の変形において、方法は、複数の癌型に対して効果的なおよび特異的な応答をもたらす予防的免疫を提供する。別の変形において、効果的なおよび特異的な応答は、リンパ節における成熟ＡＰＣの上方調節と、それに続く局所的にヘルパーＴ細胞および細胞障害性Ｔ細胞の増加；および期間後、系統的にヘルパーＴ細胞および細胞障害性Ｔ細胞の増加にも起因する。別の変形において、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−５を発現するＢ細胞およびＴ細胞は、ワクチン接種における腫瘍退縮を予測する可能性がある。
【００２４】
方法の別の変形において、ワクチン接種は、複数の癌型に対して広範な腫瘍免疫を作り、免疫系に大量の（数十から数百または数千までを含んでよい）腫瘍抗原を提示する。方法の別の変形において、ワクチン接種は、治療関連副作用（例えば、自己免疫性応答、体重減少、サイトカイン放出症候群およびそれらの組合せ）なしで確立された癌を標的とすることにおいて免疫系を再活性化し、方法は、診断後数週間以内に作ることができる。したがって、方法は、慣用の癌の一次処置直後に、個別化されたアジュバント免疫療法のための実行可能な選択肢を提示する。方法の別の変形において、ワクチンは、筋肉内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、脾臓内、結節内(intranodal)、腫瘍内または鼻腔内方法によって投与される。
【００２５】
別の態様において、胚源から得られるまたは哺乳動物からの体細胞の再プログラム化によって得られる哺乳動物の多能性幹細胞の有効量、および所望により、ワクチンに対する免疫応答を増強するためのアジュバントまたは免疫学的薬剤を含む熱的に安定なワクチン組成物が提供される。１つの変形において、熱的に安定なワクチンまたは熱安定なワクチンは、コールドチェーン保存を必要としない保存を可能にし、コールドチェーン保存能力がないかまたは限定された領域でのワクチンの容易な導入を可能にする。１つの変形において、ワクチンは、グリコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール  ３００およびグリセリン、またそれらの混合物の有効量（例えば、０．０１％から１％ｗｔ／ｗｔ、０．０５％から０．５％ｗｔ／ｗｔ、０．０５％から１％ｗｔ／ｗｔ、または０．０１％から０．５％ｗｔ／ｗｔのおよその範囲）をさらに含む。別の変形において、ワクチンは、標準の液体製剤または噴霧乾燥製剤のいずれかとして、約３５℃で最大６か月、最大１２か月、最大２４か月、または最大３６か月間安定である。
【００２６】
ワクチンの乾燥方法の１つの局面は、噴霧乾燥方法を含む。噴霧乾燥方法は、例えば、高圧ノズルから噴霧する方法、または当分野で知られている噴霧器などの遠心力を使用することによる方法を含んでよい。噴霧乾燥のために使用することができるガスまたは空気は、所望の含水量を有するワクチン粉末を乾燥させるのに十分な温度での加熱空気または熱風を含む。１つの局面において、ガスは、窒素または窒素富化空気などの不活性ガスである。
【００２７】
１つの局面において、高温ガス温度は、約３０℃から５０℃、３０℃から６０℃、３０℃から７０℃、または約３０℃から１００℃であってよい。高圧ノズルで使用されるプロセス中のスプレーのために使用することができる高圧は、約１０から１，０００ｐｓｉ、１００から８００ｐｓｉまたは２００から５００ｐｓｉを含んでよい。噴霧乾燥は、乾燥ワクチンの残留水または残留水分含有量が約１％から約６％、１％から５％、２％から６％、３％から６％または約３％から５％に制御されることができるような条件下で実施されてよい。
【００２８】
１つの局面において、エマルジョンは、次に、商業的供給者、例えばＢｕｃｈｉ、Ｎｉｒｏ、Ｙａｍａｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｏｋａｗａｒａ  Ｋａｋｏｋｉ  Ｃｏ．からの慣用の噴霧乾燥装置、および同様の市販のスプレードライヤーにおいてスプレー乾燥されてよい。噴霧乾燥プロセス、例えば回転噴霧、圧力噴霧および二流体噴霧もまた使用されてよい。これらのプロセスで使用されるデバイスの例は、Ｐａｒｕｂｉｓｕ  Ｍｉｎｉ−Ｓｐｒａｙ  ＧＡ−３２およびＰａｒｕｂｉｓｕ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｉｅｒ  ＤＬ−４１（Yamato Chemical Co.）またはＳｐｒａｙ  Ｄｒｉｅｒ  ＣＬ−８、Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｉｅｒ  Ｌ−８、Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｉｅｒ  ＦＬ−１２、Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｉｅｒ  ＦＬ−１６またはＳｐｒａｙ  Ｄｒｉｅｒ  ＦＬ−２０、（Okawara Kakoki Co.）を含み、ロータリーディスク噴霧器を使用する噴霧乾燥方法のために使用されてよい。本願の粉末を生成する噴霧器のノズルは、例えば、ノズルタイプ１Ａ、１、２Ａ、２、３（Yamato Chemical Co.）または同様の市販のノズルを含んでよく、上記スプレードライヤーのために使用されてよい。加えて、ディスク型ＭＣ−５０、ＭＣ−６５またはＭＣ−８５（Okawara Kakoki Co.）が、スプレードライヤー噴霧器の回転ディスクとして使用されてよい。
【００２９】
別の局面において、乾燥プロセスから得られるワクチン粉末は、約５から１，０００ミクロン、約１０から５００ミクロン、１０から３５０ミクロン、２０から２５０ミクロン、４０から２００ミクロン、または約５０から１５０ミクロンの範囲の平均粒子サイズを有する粒子の１重量％、５重量％、７重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％またはそれ以上を含んでよい。１つの局面において、乾燥プロセスから得られる粉末は、５０から１５０ミクロンの平均粒径を有する粒子の約１％から１０重量％を含む。
【００３０】
ワクチン組成物の別の局面において、多能性幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。ワクチン組成物の別の局面において、哺乳動物の多能性幹細胞は未分化多能性幹細胞である。ワクチン組成物の別の局面において、幹細胞は、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、末梢血細胞および腎上皮細胞からなる群から選択される。
【００３１】
ワクチン組成物のさらなる別の局面において、アジュバントは、ＣｐＧ，ＱＳ２１、ポリ（ジ（カルボキシラートフェノキシ）ホスファゼン；リポ多糖類の誘導体、例えばモノホスホリルリピドＡ、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）、スレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）；ＯＭ−１７４；コレラ毒素（ＣＴ）、およびリーシュマニア伸長因子からなる群から選択される。
【００３２】
１つの変形において、本願は、ワクチンでの患者のワクチン接種を含む、患者において癌の処置における使用のための製剤であって、ワクチンは、胚源から得られるまたは患者からの体細胞の再プログラム化によって得られる哺乳動物の多能性幹細胞の有効量を含み、ワクチン接種は、必要とする患者に哺乳動物の多能性幹細胞を投与する工程を含む、製剤を記載している。
【００３３】
本明細書に記載の方法のそれぞれの１つの変形において、患者において癌を処置することにおける使用のためのワクチン接種であって、ワクチンは、胚源から得られるまたは患者からの体細胞の再プログラム化によって得られる哺乳動物の多能性幹細胞の有効量を含み、ワクチン接種は、必要とする患者に哺乳動物の多能性幹細胞を投与する工程を含む、ワクチン接種が提供される。別の変形において、ワクチンは、胚源から得られるまたは哺乳動物からの体細胞の再プログラム化によって得られる哺乳動物の多能性幹細胞の有効量、およびワクチンに対する免疫応答を増強するためのアジュバントまたは免疫学的薬剤を含む熱的に安定なワクチン組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、最大のＢ細胞応答を測定することによる最適なワクチン接種スケジュールの評価を示す表示である。
【００３５】
【図２】図２は、マウスにおける乳癌および黒色腫の予防処置のインビボ有効性を示す表示である。
【００３６】
【図３】図３は、予防ワクチン接種が、ｄＬＮにおける抗原提示の増加および後のｄＬＮおよび脾臓におけるエフェクター／メモリーＴ細胞応答をもたらすことを示す表示である。
【００３７】
【図４】図４は、インビトロならびに乳癌の同所性腫瘍モデルにおけるインビボでのＣ＋Ｉワクチンの腫瘍特異的特性を示す表示である。
【００３８】
【図５】図５は、ＴＩＬが、Ｂ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞抗腫瘍応答を有する炎症誘発性表現型を示すことを示す表示である。
【００３９】
【図６】図６は、Ｃ＋Ｉワクチン接種が、ワクチン特異的Ｔ細胞クローンの上方調節および腫瘍拒絶のポジティブコントロールグループと同様に全身性免疫プロフィールをもたらすことを示す表示である。
【００４０】
【図７】図７は、腫瘍切除後のアジュバントワクチン接種が、きれいなＲＡおよび癌細胞を標的とする免疫系の再活性化をもたらすことを示す表示である。
【００４１】
【図８】図８は、Ａ）ＰＢＳ、ＣｐＧおよびｉＰＳＣプラスＣｐＧワクチンとしての組織の相対的効果；Ｂ）ｉＰＳＣ＋ＣｐＧワクチンがＰＢＭＣにおけるＩＬ−２＋ＣＤ４５＋細胞を増加させた、およびｉＰＳＣ＋ＣｐＧワクチンが脾臓におけるエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させた；Ｃ）膵臓癌細胞刺激の７２時間後のｉＰＳＣワクチンの刺激を受けた(primed)ＰＢＭＣ増殖の結果を示すグラフ的および説明的表示を含む。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明：
図１．最大のＢ細胞応答を測定することにより最適なワクチン接種スケジュールを評価すること。（ａ）非特異的ＭＥＦ結合における有意な増加なしで、ＤＢ７へのＩｇＧ結合％により評価されるように、最適なワクチン接種は、Ｃ＋Ｉワクチン接種の毎週で４週間に設定された（ｎ＝３  コントロール動物、ｎ＝４  ｉＰＳＣの刺激を受けた動物、ｎ＝４  Ｃ＋Ｉの刺激を受けた２週、およびｎ＝４  Ｃ＋Ｉの刺激を受けた４週動物、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を伴うＡＮＯＶＡ）。（ｂ）胚性繊維芽細胞、ｉＰＳＣおよびＤＢ７癌細胞へのＰＢＳ  ４週、ｉＰＳＣ  ４週、Ｃ＋Ｉ  ２週、またはＣ＋Ｉ  ４週のワクチン接種したマウスの血清ＩｇＧ結合の典型的なＦＡＣＳプロット。分化した細胞に対するコントロールサンプルとして、部分的に分化した細胞培養を分析に含めた。このことは、ＩｇＧ陽性および陰性細胞により示され、ＩｇＧ結合が分析された細胞の未分化部分に特異的であることを示した。Ｃ＋Ｉ  ４週のワクチン接種したマウスは、ＤＢ７乳癌細胞への最も良いＩｇＧ結合を示した。（ｃ）ワクチン製造が多能性についてマウスｉＰＳＣを選別すること、照射、アジュバント溶液の再懸濁、および脇腹、部位１から４における皮下注射からなることを示す概要。
【００４３】
図２．マウスにおける乳癌および黒色腫の予防処置のインビボ有効性。（ａ）Ｃ＋ＩワクチンでのＦＶＢマウスのワクチン接種は、４週間までに１０匹のマウスのうち７匹において癌細胞の完全な拒絶およびＤＢ７腫瘍サイズにおいて全体的な低下をもたらした（ｎ＝グループあたり１０）。（ｂ，ｃ）Ａに示されているデータの定量化。Ｃ＋ＩワクチンでのＣ５７ＢＬ／６マウスのワクチン接種は、２週までに侵襲性Ｂ１６Ｆ０黒色腫細胞系によって開始された黒色腫サイズの有意な低下をもたらした（ｎ＝８  ＰＢＳ、ｎ＝９  ｉＰＳＣで刺激を受けた、ｎ＝１０  ＣｐＧで刺激を受けた、およびｎ＝９  Ｃ＋Ｉで刺激を受けた）。（ｄ）パネルＣに示されている腫瘍サイズデータの定量化。平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されるｂおよびｄにおけるデータ、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を伴うＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【００４４】
図３．予防ワクチン接種は、ｄＬＮにおける抗原提示の増加および後のｄＬＮおよび脾臓におけるエフェクター／メモリーＴ細胞応答をもたらす。（ａ）Ｂ１６Ｆ０導入の２週間後、ｉＰＳＣおよびＣ＋Ｉワクチン接種したマウスは、Ｃ＋Ｉのワクチン接種したマウスの末梢血において制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）のパーセンテージの有意な低下およびエフェクター／メモリーヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４４＋）における増加を示した。この時点で、エフェクター／メモリー細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４４＋）の限定された上方調節のみが見られた。（ｂ）Ｃ＋ＩグループにおけるｄＬＮは、エフェクター／メモリーヘルパーＴ細胞の有意により高いパーセンテージおよび（ｃ）成熟抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＭＨＣ−ＩＩ＋ＣＤ８６＋）および樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩ＋ＣＤ８６＋）による抗原提示の増加を有した。（ｄ）Ｃ＋Ｉのワクチン接種したＦＶＢマウスは、ＤＢ７導入の４週間後に脾臓において活性化細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋グランザイム−Ｂ＋）のパーセンテージの増加を示した。（ｅ）これらのマウスのｄＬＮは、成熟抗原提示マクロファージならびに（ｆ）エフェクター／メモリーヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の頻度の増加を示した。（ｎ＝グループあたり５、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を伴うＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【００４５】
図４．インビトロならびに乳癌の同所性腫瘍モデルにおいてインビボでのＣ＋Ｉワクチンの腫瘍特異的特性。（ａ）ｉＰＳＣ溶解物およびＤＢ７溶解物への暴露時にＣｐＧ単独（ビヒクル；ｎ＝４）グループと比較して、Ｃ＋Ｉのワクチン接種したグループ（ｉＰＳＣのワクチン接種した；ｎ＝６）において脾細胞の免疫細胞活性化のためのデュアルＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（赤色：グランザイム−β、青色：ＩＦＮ−γ）（図Ｓ４Ａ、Ｂも参照）。（ｂ）ビヒクルグループと比較してＣ＋Ｉのワクチン接種したグループにおいてＩＦＮ−γスポットの数の有意な増加。（色の違いに基づいてＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ソフトウェアにより計算されたスポット。＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）。（ｃ）腫瘍接種後３週間で乳癌の同所性腫瘍モデルにおいてビヒクルマウスと比較してＣ＋Ｉワクチン接種したマウスにおいて腫瘍容積の典型的なイメージ。（ｄ）養子移入後３週間で乳癌の同所性腫瘍モデルにおいてビヒクルマウスと比較してＣ＋Ｉワクチン接種したマウスからの脾細胞の養子移入を受けた後で腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍容積の典型的なイメージ。（ｅ）パネルＣからの結果の定量化は、３週間の経過にわたって乳癌の同所性腫瘍モデルにおいてビヒクルマウスと比較してＣ＋Ｉワクチン接種したマウスにおいて腫瘍容積の有意な低下を示す。（ｆ）ビヒクルのワクチン接種したマウスからの脾細胞を受けるマウス（ｎ＝８）と比較してＣ＋Ｉのワクチン接種したマウス（ｎ＝７）からの脾細胞の養子移入後の３週間の経過にわたってパネルＤから腫瘍を有するマウスにおける腫瘍容積の有意な低下（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析）。
【００４６】
図５．ＴＩＬは、Ｂ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞抗腫瘍応答を有する炎症誘発性表現型を示す。（ａ）２ｘ１０６  ＡＣ２９（Ａ）中皮腫細胞がＣｐＧ＋ｉＰＳＣ（Ｃ＋Ｉ）のワクチン接種したマウス（ｎ＝５）において注射された１週間後、このＣ＋Ｉ／ＡグループにおいてＴＩＬは、ＣｙＴＯＦデータのＳＰＡＤＥ分析により評価されるように、ＰＢＳ（Ｐ）のワクチン接種したマウス（ｎ＝５；Ｐ／Ａグループ）と比較して、エフェクター／メモリーＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の頻度の増加およびＴ−ｒｅｇ数の低下を示した。ポジティブコントロールグループ、Ｃ＋Ｉのワクチン接種したおよびＣｐＧ＋ＡＣ２９（Ｃ＋Ａ）のワクチン接種したマウスは、それぞれ、単球およびマクロファージおよび間質細胞の後に強化される存在と共に、ｉＰＳＣ（ｎ＝５；Ｃ＋Ｉ／Ｉ）およびＡＣ２９細胞（ｎ＝５；Ｃ＋Ａ／Ａ）を完全に拒絶した。（ｂ）ＣｙＴＯＦデータのＣｉｔｒｕｓ分析は、Ｃ＋ＩマウスにおけるＢ細胞およびヘルパーＴ細胞クラスターにおいてＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−５のより高いレベルが、腫瘍内の免疫応答に関与することが明らかになった。
【００４７】
図６．Ｃ＋Ｉワクチン接種は、ワクチン特異的Ｔ細胞クローンの上方調節および腫瘍拒絶のポジティブコントロールグループと同様に全身性免疫プロフィールをもたらす。（ａ）腫瘍細胞導入後１週間での異なる処置グループからの血清のＬｕｍｉｎｅｘ分析は、ＰＢＳコントロールマウス（ＰＢＳ／ＡＣ２９）と比較して陽性コントロールマウス（Ｃ＋Ｉ／ｉＰＳＣ、Ｃ＋Ａ／ＡＣ２９）において全身性サイトカインの有意に低い存在を示す。Ｃ＋Ｉ／ＡＣ２９グループは、陽性コントロールサンプルと同様の傾向に従う（Ｃ＋Ｉ／ｉＰＳＣおよびＣ＋Ａ／ＡＣ２９、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を伴うＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（ｂ）Ｃ＋Ｉワクチン接種したマウス（Ｃ＋Ｉ１からＣ＋Ｉ５／ＡＣ２９）中、ＴＩＬ内でより良いユニークなワクチン関連分散(variance)があったが、一方、ＰＢＳワクチン接種したマウス（ＰＢＳ１から５／ＡＣ２９）は、リンパ球器官に一般的に存在するＴ細胞中でより高い均一性を証明した（図Ｓ６Ｃ−Ｄ）。
【００４８】
図７．腫瘍切除後のアジュバントワクチン接種は、きれいな(clean)ＲＡおよび癌細胞を標的とする免疫系の再活性化をもたらす。（ａ）Ｒ１腫瘍切除を受けたＢ１６Ｆ０腫瘍を有するマウスは、異なる処置グループにランダム化され、４週間Ｃ＋Ｉ、ＣｐＧ、またはＰＢＳのいずれかで毎週ワクチン接種された。（ｂ）切除領域（ＲＡ）における皮膚生検（＊）からのＤＮＡは、ｄｄＰＣＲにより評価されるように、Ｃ＋Ｉワクチンでの４回のワクチン接種ラウンド後に腫瘍細胞のパーセントにおいて有意な低下を示した。（ｃ）腫瘍切除後のワクチン接種は、Ｔｈ１７細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＲ−ｂ＋（ＩＬ−２／ＩＬ−１７Ａ）；ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋ＴＣＲ−ｂ＋（ＩＬ−１７Ａ））の低下およびＴＮＦ−αを発現する骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４４＋ＧＲ１ｈｉ（ＴＮＦ−ａ））およびＩＬ−４を発現するＣＤ１９＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋Ｂ細胞の存在の増加をもたらした（ｎ＝８  ＰＢＳ、ｎ＝１０  ＣｐＧ、ｎ＝１０  Ｃ＋Ｉ、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験を伴うＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５）。ＳＱ：皮下注射。
【００４９】
組成物および方法は、多能性ベクター（ＭＩＰ）の産生、このベクターでのｉＰＳＣの産生、癌ワクチンを確立するおよび予防的におよび治療的に対象をワクチン接種するために提供される。
【００５０】
本願明細書において使用される癌ワクチンは、癌細胞を標的とすることにおいて同じ宿主の免疫系を刺激する(prime)ためにアジュバントと組み合わせての宿主の多能性幹細胞の使用である。
【００５１】
宿主は、一般的に、ヒト、イヌ、ネコ、またはウマを含むがこれらに限定されない哺乳動物である。実験動物、例えば齧歯動物は、癌選択試験、エピトープスクリーニングおよびメカニズム試験のために興味あるものである。より大きな動物試験、例えばブタおよびサルが、安全性試験のために興味があるものである。
【００５２】
発明の目的のために、多能性細胞は、レシピエントに対して自己、同種異系または異種のものであってよい。
【００５３】
「処置」は、治療的処置および予防的または防止的処置の両方を指す。処置を必要とするものは、障害をすでに有するものならびに障害が予防されるべきであるものを含む。別の態様において、任意の状態または障害の「処置する」または「処置」は、１つの態様において、予防的にを含む、対象に存在する状態または障害を改善することを指す。別の態様において、「処置する」または「処置」は、対象によって識別不可能であってよい、少なくとも１つの物理的パラメーターを改善することを含む。さらに別の態様において、「処置する」または「処置」は、物理的に（例えば、識別可能な症状の安定化）または生理学的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）のいずれかまたは両方で、状態または障害を調節することを含む。さらに別の態様において、「処置する」または「処置」は、状態または障害の発症を遅延させることを含む。さらに別の態様において、「処置する」または「処置」は、状態（例えば、疼痛）または状態（例えば、癌）の１つ以上の症状（例えば、疼痛）のいずれかの低下または除去、または状態または状態の１つ以上の症状の進行を遅らせること、または状態または状態の１つ以上の症状の重症度を低下させることを含む。さらに別の態様において、「処置する」または「処置」は、予防的に本願明細書に記載されているワクチンを投与することを含む。
【００５４】
処置の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜および農業用動物、および動物園、スポーツ、またはペット動物を含む哺乳動物に分類される任意の動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを指す。１つの局面において、哺乳動物はヒトである。
【００５５】
「多能性」および多能性幹細胞によって、このような細胞が成体生物体において細胞の全ての型に分化する能力を有することが意味される。「人工多能性幹細胞」なる用語は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）のように、生物体において細胞の全ての型に分化する能力を維持しながら長期間にわたって培養することができるが、ＥＳＣ（胚盤胞の内部細胞塊に由来する）とは異なり、分化した体細胞、すなわち、より狭いより定義された可能性を有し、実験的操作の非存在下で、生物体において細胞の全ての型を引き起こすことができなかった細胞に由来する、多能性細胞を含む。「ｉＰＳＣになる可能性を有する」によって、分化した体細胞が、ｉＰＳＣになるように誘導されることができる、すなわち、それになるように再プログラム化されることができることが意味される。言い換えれば、体細胞は、多能性細胞の形態学的特性、増殖能および多能性を有する細胞を確立するように再分化するために誘導させることができる。ｉＰＳＣは、大きな核−細胞質比、明確な境界および顕著な核小体を有する平らなコロニーとして増殖する、ヒトＥＳＣ様形態を有する。加えて、ｉＰＳＣは、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴおよびｚｆｐ４２を含むが、これらに限定されない、当業者によって知られている１つ以上の重要な多能性マーカーを発現する。加えて、多能性細胞は、奇形腫を形成することができる。加えて、それらは、生体における外胚葉、中胚葉、または内胚葉組織を形成またはに寄与することができる。
【００５６】
体細胞は、３、４、５、６またはそれ以上の因子の組合せで、胚性幹細胞（ＥＳＣ）から明らかに区別することができない状態に脱分化した／再プログラム化することができる；これらの再プログラム化された細胞は、「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳＣ、ｉＰＣ、ｉＰＳＣ）と称され、種々の組織から生産することができる。
【００５７】
ワクチンはまた、アジュバントを含んでよい。ワクチンにおいて有用なアジュバントは、当業者によく知られており、したがって、適当なアジュバントの選択は、本出願のレビュー時に当業者によって日常的に行われることができる。有用なアジュバントの例は、限定はしないが、完全および不完全フロイント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチドおよび油エマルジョンを含む。いくつかの態様において、ワクチンは、無菌で、パイロジェンフリーで、等張に製剤化される、および粒子フリーである注射可能な組成物である。注射可能な組成物に必要な純度の標準は、注射可能な組成物を調製するために使用される生産および精製方法と同様に、よく知られている。ワクチンは、当分野で知られている任意の手段により投与され得る。注射可能な医薬組成物は、非経腸的、すなわち、静脈内、皮下および筋肉内に投与され得る。いくつかの態様において、ワクチン医薬組成物は、鼻腔内にまたは舌下または経口内組織への投与などにより口腔の組織に投与され得る。
【００５８】
「幹細胞」なる用語は、それ自体を複製または自己複製するおよび種々の細胞型の分化細胞に発達することができる未分化細胞を指す。分裂を受ける幹細胞の産物は、元の細胞と同じ能力を有する少なくとも１つのさらなる細胞である。「幹細胞」なる用語は、胚性幹細胞および成体幹細胞、全能性細胞および多能性細胞、および自己細胞、ならびに異種細胞を包含することが意図される。幹細胞およびその培養物：多能性幹細胞は、あらゆる種類の組織（通常、胎児または前胎児組織などの胚組織）に由来する細胞であり、幹細胞は、適切な条件下で３つの胚葉の全て（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の誘導体である異なる細胞型の子孫を生産することができる特性を有する。これらの細胞型は、確立された細胞系の形態において提供されてよく、またはそれらは、初代胚組織から直接的に得られ、分化のために直ちに使用されてよい。ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリー（NIH Human Embryonic Stem Cell Registry）においてリストされた細胞、例えばｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（BresaGen, Inc.）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２，ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ES Cell International）；Ｍｉｚ−ｈＥＳ１（MizMedi Hospital-Seoul National University）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（University of California at San Francisco）；およびＨ１、Ｈ７，Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Wisconsin Alumni Research Foundation (WiCell Research Institute)）が含まれる。人工多能性幹細胞は、ウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して多能性マーカー（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧおよびＫＬＦ４）を外因的に過剰発現し、それによりトランスフェクトされた細胞系に多能性を誘導することによって作成される。
【００５９】
多能性幹細胞は、特定の系統に関与していない場合、未分化と考えられる。ＥＳＣは、特定の分化系統に関与していない場合、未分化と考えられる。このような細胞は、胚または成体起源の分化した細胞からそれらを区別する形態学的特性を示す。未分化ＥＳＣは、当業者によって容易に認識され、典型的には、高い核／細胞質比および顕著な核小体を有する細胞のコロニーにおける顕微鏡像の２つの次元に現れる。未分化ＥＳＣは、未分化細胞の存在を検出するためのマーカーとして使用され得る遺伝子を発現し、このポリペプチド産物は陰性選択のためのマーカーとして使用してよい。
【００６０】
「処置する」または「処置」なる用語は、疾患または医学的状態、例えば癌を軽減、改善、逆転、緩和、進行の阻害、または予防することを指す。別の局面において、該用語はまた、予防、治療および治癒を含む。「処置」を受けている、または「処置」を受ける対象または患者は、癌に対するかかる処置を必要とする任意の哺乳動物、例えば霊長類、およびヒト、および他の哺乳動物、例えばウマ、ウシ、ブタおよびヒツジ；および家畜化された哺乳動物およびペットである。
【００６１】
再プログラム化すること：ＭＩＰ、またはＭＩＰプラスミドの結果であると予期されるときと同様の癌ワクチン特性を産生する任意のベクターを使用して細胞を再プログラム化すること。
【００６２】
興味ある体細胞は、限定はしないが、繊維芽細胞、血球、尿の細胞などを含む。
【００６３】
アジュバント：アジュバントは、多能性幹細胞を標的とするために、レシピエントの免疫系の免疫学的応答を増強する免疫学的薬剤である。アジュバントは、本出願に記載されているものおよび多能性幹細胞を標的とするためにレシピエントの免疫系の免疫学的応答を増強するための当分野で知られているものを含む。「アジュバント」なる用語は、免疫応答を刺激することができる任意の物質または薬剤を指す。一部のアジュバントは、免疫系の細胞の活性化を引き起こすことができる。例えば、アジュバントは免疫細胞にサイトカインを産生および分泌させることを引き起こすことができる。免疫系の細胞の活性化を引き起こすことができるアジュバントの例は、限定はしないが、本願明細書に記載されているナノエマルジョン製剤、Ｑサポナリアの木の樹皮から精製されたサポニン、例えばＱＳ２１、ポリ（ジ（カルボキシラートフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー；Virus Research Institute, USA）；リポ多糖類の誘導体、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ；RibiImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ribi）およびスレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ribi）；ＯＭ−１７４（リピドＡに関連するグルコサミン二糖類；OM Pharma SA, Meyrin, Switzerland）；コレラ毒素（ＣＴ）、およびリーシュマニア伸長因子（精製されたリーシュマニアタンパク質；Corixa Corporation, Seattle, Wash.）；またはそれらの混合物を含む。当分野で知られている他のアジュバントは、例えば、リン酸または水酸化アルミニウム塩を含んでよい。いくつかの態様において、例えば、本願発明の多能性幹細胞は、１つ以上のアジュバントと共に投与される。いくつかの態様において、使用されるアジュバントは、ＵＳ２００５１５８３２９；ＵＳ２００９０１０９６４；ＵＳ２００４０４７８８２；または米国特許第６，２６２，０２９号に記載されている。
【００６４】
本願明細書において使用される、「免疫応答を増強（または誘導）するための有効な量」（例えば、免疫応答を誘導または増強するための組成物）なる句は、哺乳動物において免疫応答を刺激、産生および／または誘発するために必要な投与レベルまたは量（例えば、哺乳動物に投与されるとき）を指す。有効量は、本願明細書に記載されているように（例えば、同じか、または異なっている経路を介して）異なる期間にわたって１つ以上の投与において投与することができる。適用または投与は、特定の製剤または投与経路または期間に限定されることを意図していない。
【００６５】
本願明細書において使用される、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）は、癌細胞上に存在する既知および未知の抗原／エピトープを指す。
【００６６】
癌ワクチンでの最適な免疫応答は、多能性細胞上に存在するこれらのＴＡＡおよびＴＳＡを標的とするように宿主の免疫系を刺激し、ＴＡＡおよびＴＳＡを発現する癌型に対する免疫を提供することである。
【００６７】
既知のＴＡＡおよびＴＳＡは、限定はしないが、ＥＰＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ、ＴＥＲＴ、ＷＮＫ２、サバイビン(survivin)など（全てＯｎｃｏ；Bushman Lab, University of Pennsylvania）を含む。
【００６８】
ワクチン接種の方法：
癌ワクチンのための供給源としての多能性幹細胞は、例えば、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ブタなどを含む任意の哺乳動物種、特にヒト細胞から得ることができる。
【００６９】
多能性幹細胞は、安定な多能性幹細胞集団が形成されるまで、当分野で知られている標準方法を使用して、例えば支持細胞を含まない条件において増殖される。この集団は、磁気抗体選別（ＭＡＣＳ）または蛍光抗体選別（ＦＡＣＳ）を使用する多能性幹細胞選別により評価されるとき、＞９０％の純粋な多能性幹細胞パーセンテージを含むべきである。
【００７０】
癌ワクチンのために使用される細胞投与量（１ｘ１０６から１ｘ１０９の範囲）は、ワクチンが使用される哺乳動物に対して調整される必要がありうる。小さな齧歯動物において、ワクチンの有効性は、投与あたり２ｘ１０６個の多能性幹細胞に設定された。
【００７１】
多能性幹細胞は、注射部位での奇形腫形成を防ぐためにワクチン接種の前に照射されるべきである。この投与量は、細胞周期の阻止に対する多能性幹細胞の感受性または抵抗性にしたがって調整されるべきである。小さな齧歯動物、例えばマウスから産生されるｉＰＳＣについて、この投与量は、６０００ｒａｄ（１０００−１００００ｒａｄの範囲）に設定された。
【００７２】
ワクチン接種の部位は、免疫系への適切な抗原提示を可能にするために皮下空間にあるべきである。ワクチンが配置されるべき位置は、対象の形態に基づいて変化される場合があるが、局所的な免疫抑制反応を回避するために、異なる注射部位で実施されるべきである。１つの態様において、方法は、４週間の経過にわたって合計で４週ラウンドのワクチン接種を行われてよい。別の態様において、方法は、毎日、週に数回、または２週間ごとに行われてよく、期間は、２、３、４、５、６、７、または８週間であってよい。ワクチン接種の数は、ワクチンに対する対象の免疫応答および刺激状態に依存し、したがって、処置中に調整されてよい。
【００７３】
別の態様において、本願発明において多能性細胞はまた、それらの免疫原性特性を強化するために、またはそれらを、ＴＳＡおよびＴＡＡを標的とする宿主の免疫応答を刺激することにおいてより適切にするために、遺伝的に改変させることができる。
【００７４】
小分子薬剤または生物学的化合物は、癌細胞に対するＣ＋Ｉの刺激を受けた免疫細胞の細胞傷害性の可能性を増加させるためにＣ＋Ｉワクチンと共に使用することができる。かかる分子薬剤または生物学的化合物は、例えば、ジプロボシム、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１インヒビターなどを含んでよい。
【００７５】
１つの態様において、アジュバントの治療投与量は、癌ワクチンのために使用されるアジュバントに依存するであろう。アジュバントＣｐＧを使用する癌ワクチンの最初の説明において、投与量は、５μＭの作業濃度に設定された。しかしながら、処置される哺乳動物および癌のタイプに依存して、アジュバントの１０倍希釈または濃縮の係数、例えば０．０５μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭ；または１０μＭ、３０μＭ、または約５０μＭの濃度を、使用することができる。そのようなガイドラインは、活性剤の分子量について調製され、特定の処置に対するアジュバントの有効性にも基づくことは、当業者に理解されるであろう。投与量はまた、ワクチンを受ける哺乳動物のタイプによって変化させてよい。
【００７６】
実験的
以下の実施例は、当業者に本願発明を作成および使用する方法の完全な記載および説明を提供するように提示され、本願発明者らが発明と考えるものの範囲を限定することを意図せず、以下の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すことも意図していない。使用される数値（例えば、量、温度など）に対して正確性を保証するためように努力が払われたが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されていない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏（℃）であり、圧力は大気圧またはその付近である。
【００７７】
本願発明は、本発明を実施するための好ましいモードを含むように本発明者によって見出されたまたは提案された特定の態様に関して説明されている。本開示に照らして、本発明の意図された範囲から逸脱することなく、例示された特定の態様において多くの修飾および変更を行うことができることは、当業者に理解されよう。例えば、コドンの重複により、タンパク質配列に影響を与えることなく、基になるＤＮＡ配列に変更を加えることができる。さらに、生物学的機能の同等性の考慮により、種類または量において生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造に変更を加えることができる。かかる修飾の全ては特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【００７８】
本願発明の実施において有用な一般的な技術のさらなる詳細について、実行者は、細胞生物学、組織培養および発生学における標準的な教科書およびレビューを参照することができる。組織培養とＥＳＣに関して、読者は奇形癌および胚性幹細胞に言及したいと思う可能性がある：実際的なアプローチ（E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987）；マウス開発における技術のガイド（P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993）；インビトロでの胚性幹細胞分化（M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993）；胚性幹細胞の特性および用途：ヒト生物学および遺伝子治療への適用の見通し（P. D. Rathjen et al., Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998）。
【００７９】
分子および細胞の生化学における一般的な方法は、標準的なテキストブック、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift& Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997);およびCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)において見ることができる。本開示で言及される遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、商業的販売会社、例えばＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＣｌｏｎＴｅｃｈから利用できる。
【実施例】
【００８０】
実施例１：
ｉＰＳＣベースの癌ワクチン接種：癌に対する自己幹細胞ワクチン
我々は、自己由来のｉＰＳＣの免疫原性および腫瘍形成性特性を癌ワクチンに利用できるということを証明する。複数のマウス系統および複数の癌型を使用して、我々は、腫瘍の確立の完全阻害または腫瘍増殖の有意な低下のいずれかの、癌を標的とすることにおいて宿主の免疫系を刺激するためにｉＰＳＣを使用するインビトロおよびインビボ有効性を示す。したがって、本ワクチン接種方法は、腫瘍の確立の完全阻害または腫瘍増殖の有意な低下を提供する。
【００８１】
さらに、我々は、異なる段階での免疫応答に関与する免疫細胞の詳細な分析を提供する。我々はまた、腫瘍切除後のアジュバント免疫療法としてのワクチンの有効性を実証し、癌を標的とすることにおいて免疫系の再活性化をもたらし、切除領域から癌を除去する。
【００８２】
腫瘍確立および進行は、免疫系の監視を回避する高度に増殖性の低免疫原性細胞からなる。したがって、癌処置の分野における新しい手段は、癌を標的とすることにおいて免疫系を再活性化することに向けて追求されている。ある研究者たちは、有望な結果を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用することによってなし遂げようとしている。この治療の背後にあるアイデアは、癌特異的な抗原受容体を作成し、共刺激経路を組み込んでさえいるＣＡＲの最新の産生で、癌特異的な抗原受容体をエフェクター細胞、例えばＴ細胞に結合することである。しかしながら、結果は、恐らく標的化抗原の発現の喪失のために、患者の再発で変化しやすかった。これを回避する方法は、多数の腫瘍抗原は未だ未知であるが、新たな腫瘍特異的抗原を同定することであろう。
【００８３】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）および癌組織は、癌細胞と、既知の、しかしおそらくは未知の、ＴＳＡおよびＴＡＡと共有し、したがって、癌を標的とする免疫系を刺激する潜在的な薬剤となる可能性がある。次に、この細胞は、標的化された癌型に似ている代理細胞型として機能するであろう。癌を標的とすることにおいて免疫系の刺激のための胚細胞の使用は、癌の種々のタイプの処置のための有効性および安全性を示すことに失敗しており、倫理的に負担のかかったＥＳＣおよびアジュバントとしてＧＭ−ＣＳＦを過剰発現する遺伝的に修飾された細胞系の使用に依存している（Yaddanapudi et al., 2012）。これらの最新の構成要素は、これらの処置を臨床解釈に適さなくさせる。
【００８４】
腫瘍ワクチン接種に成功することが証明されているＦＶＢ株ｉＰＳＣ（図Ｓ２Ａ、Ｄ）およびアジュバントＣｐＧを使用して（Gilkeson et al., 1998; Goldstein et al., 2011; Mor et al., 1997; Mukherjee et al., 2007）、我々は、ＣｐＧ−ｉＰＳＣ（Ｃ＋Ｉ）組合せでマウス乳癌（ＤＢ７）に対する効果的な免疫応答を観察した。手短に言えば、我々は、まず、ＣｐＧの効果および最適なワクチン接種スケジュールを確立した。我々は、２週間または４週間ｉＰＳＣまたはＣ＋ＩでＦＶＢマウスを刺激し、Ｃ＋Ｉ  ４週間グループにおいてＤＢ７腫瘍溶解物に対して最も強いインビトロＴ細胞応答を見出した（図Ｓ２Ｅ、Ｆ）。加えて、Ｃ＋Ｉ組合せでの４週間のワクチン接種スケジュールは、ＤＢ７に対する最も高いＩｇＧ結合をもたらし（８０．０±３．４％）、したがって、後のワクチン接種ラウンドのために使用された（図１Ａ、Ｂ）。
【００８５】
ワクチン接種スケジュールを最適化した後、我々は、４つのグループ：１）ＰＢＳ、２）ＣｐＧのみ、３）ｉＰＳＣのみ、および４）Ｃ＋Ｉに分類して、４０匹のＦＶＢマウスのワクチン接種を進めた。週に１回のワクチン接種を４回行った後、５ｘ１０４  ＤＢ７癌細胞を皮下に注射し、腫瘍サイズをキャリパー測定を使用してモニターした。１週間後、全てのマウスが注射部位で同様の病変を示し、Ｃ＋Ｉ処置マウスの１０匹のうち７匹で退行し、他のグループにおいてより大きな腫瘍に進行した（図２Ａ、Ｂ；図Ｓ３Ａ、Ｂ）。腫瘍接種の４週間後、グループあたり５匹のマウスを殺し、血液、脾臓、および流入領域リンパ節（ｄＬＮ）の免疫プロフィールを分析した。グループあたり他の５匹のマウスは、最長１年間の長期生存試験に使用された。ほとんどが、実験終了後の最初の２週間で１ｃｍ３よりも大きい腫瘍サイズのために、殺した。しかしながら、Ｃ＋Ｉ  処置グループにおける２匹のマウスは、１年間生存し、実験の開始と同様にｉＰＳＣおよびＤＢ７に対する抗体価を有し、再導入時に５ｘ１０４の癌細胞を完全に拒絶することができた（図Ｓ３Ｃ、Ｄ）。ｉＰＳＣ由来の内皮細胞で刺激を受けたこの実験におけるコントロールマウスは、ＤＢ７細胞系に対するＩｇＧ応答を上昇することができず、それにより、ＦＢＳ含有培地での培養条件が交差反応性または内因性マウス白血病ウイルス抗原に関与することができるという可能性を排除した。
【００８６】
複数の癌型を標的とすることにおいて我々のワクチンの有効性を証明するために、実験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統と同系の、黒色腫細胞系Ｂ１６Ｆ０を使用して行った。Ｃ５７ＢＬ／６ｉＰＳＣを産生し（図Ｓ２Ｂ、Ｄ）、４０匹のマウスをＰＢＳ、ＣｐＧ、ｉＰＳＣ、およびＣ＋Ｉグループに再び分類し、４週間毎週処置した。この後に、５ｘ１０４のＢ１６Ｆ０細胞を腰に皮下注射した。キャリパー測定による腫瘍増殖評価は、Ｃ＋Ｉグループにおいて２週目までに腫瘍進行の有意な低下を示した（図２Ｃ、Ｄ；図Ｓ３Ｅ、Ｆ）。コントロールグループにおける腫瘍サイズが大きいため、腫瘍注射の２週間後にマウスを殺した。その後、血液、ｄＬＮ、および脾臓における免疫細胞プロフィールを、フローサイトメトリーを使用して分析した。Ｃ＋Ｉグループにおけるサイトメトリー分析は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて腫瘍注射後２週間で血液中の制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）の有意な減少およびｄＬＮにおけるエフェクター／メモリーヘルパーＴ細胞の増加（図３Ａ、Ｂ）、ならびに成熟抗原提示細胞（ＡＰＣ）のパーセンテージの増加（図３Ｃ）を示した。
【００８７】
腫瘍拒絶の後期（４週）で、Ｃ＋Ｉのワクチン接種したグループにおいてＦＶＢマウスは、ｄＬＮにおける頻度の増加に加えて、脾臓におけるエフェクター／メモリー細胞傷害性Ｔ細胞の有意な増加を有した（図３Ｄ、Ｆ）。これらの細胞傷害性Ｔ細胞の腫瘍特異性は、ＤＢ７腫瘍溶解物に応答してＣ＋Ｉワクチン接種したマウスから単離された脾細胞によるＩＦＮ−γの増加した分泌によりさらに確認された（図４Ａ、Ｂ、図Ｓ４Ａ、Ｂ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同様に、成熟ＡＰＣおよびヘルパーＴ細胞の上方調節もまた、ＦＶＢマウスのｄＬＮにおいて見られた（図Ｓ４Ｃ−Ｆ）。
【００８８】
Ｃ５７ＢＬ／６およびＦＶＢマウス系統の両方は、試験を通して健常を維持し、ワクチンによる自己免疫性応答の兆候を示さなかった（図Ｓ７）。
【００８９】
Ｃ＋Ｉワクチンの有効性は、乳癌のより臨床的に関連性の高い同所性モデルで評価された。有意な腫瘍サイズの違いは、ビヒクルコントロールと比較してＣ＋Ｉワクチン接種したマウスにおいて癌細胞の同所性転移の早ければ１週間後に見られ、次に、３週間の経過にわたってさらに腫瘍低下が見られる（図４Ｃ、Ｅ）。同所性乳癌マウスのさらなるグループを使用して、インビボ腫瘍特異性を、Ｃ＋Ｉのワクチン接種したまたはビヒクルのワクチン接種したマウスからの脾細胞をこれらの腫瘍を有するマウスに養子移入することにより、試験した（図４Ｄ）。このことは、ビヒクルのワクチン接種したグループと比較してＣ＋Ｉのワクチン接種したグループにおいて腫瘍サイズの有意な低下をもたらした（図４Ｆ）。
【００９０】
予防処置のためのモデルとして、我々は、ＣＢＡ／Ｊマウスと同系の中皮腫細胞系ＡＣ２９を選択した。ＣＢＡ／Ｊ  ｉＰＳＣを作製し（図Ｓ２Ｃ、Ｄ）、マウスを、ＰＢＳ（Ｐ）、ＣｐＧおよびｉＰＳＣ（Ｃ＋Ｉ）、またはポジティブコントロールとして照射されたＡＣ２９癌細胞と共にＣｐＧ（Ｃ＋Ａ）で、毎週４週間ワクチン接種された。その後、２ｘ１０６のＡＣ２９細胞（Ａ）または２ｘ１０６のｉＰＳＣ（Ｉ）を皮下に注射し、１週間後、ＴＩＬを免疫プロフィールおよびＴＣＲシーケンスについて分析した。免疫プロファイリングを、表現型および細胞内染色キットを使用する飛行時間によるサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）分析で行い、これは、Ｐ／Ａコントロールと比較して（２１．１％、１４．２％および３．０％、各々）、エフェクター／メモリーＣＤ４＋（２４．０％）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（２２．４％）の増加した存在と共に、Ｃ＋Ｉ／ＡグループにおけるＴ−ｒｅｇの低下（１．９％）を示した（図５Ａ）。Ｃｉｔｒｕｓ（クラスター同定、特性化および回帰）分析を使用して、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−５を発現するＢ細胞およびＴ細胞は、ＰＢＳコントロールグループと比較してＣ＋Ｉワクチン接種したマウスにおいて腫瘍退縮を予測することが見いだされた（図５Ｂ；図Ｓ５Ａ−Ｂ、Ｄ）。全身性サイトカインレベルは、ワクチン接種したグループにおいて有意に低下し、腫瘍拒絶の陽性コントロールマウスと相関することが見られた（Ｃ＋Ｉ／ｉＰＳＣ；Ｃ＋Ａ／ＡＣ２９）（図６Ａ；図Ｓ６Ａ−Ｂ）。
【００９１】
ＰＢＳコントロールグループにおけるＴＣＲシーケンシングは、胸腺および脾臓に一般的に存在するＴ細胞クローンの重複を明らかにした（図Ｓ６Ｃ）。対照的に、Ｃ＋ＩグループにおけるＴＣＲは、異なるマウス間でより様々であった。また、恐らくＣ＋Ｉワクチンに対するマウス特異的応答に基づいて、胸腺においてクローンの頻度が一般的に低く、脾臓においてより類似した頻度であった（図６Ｂ；図Ｓ６Ｄ）。Ｃ＋Ｉグループにおいて５匹のうち４匹のマウスで共有され、他のグループにおいて存在せず、およびナイーブなマウスにおいて極めてまれでもあるＴＣＲクローンが１つあった。
【００９２】
腫瘍切除後のアジュバント療法としてのワクチンの有効性を評価するために、我々は、次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腰に５ｘ１０４のＢ１６Ｆ０腫瘍細胞を皮下注射し、２週間後に腫瘍をＲ２またはＲ１切除した。Ｒ２切除マウスは、Ｃ＋Ｉワクチンを２回アジュバントラウンドを受けた後に切除領域（ＲＡ）に黒色腫の再発は見られなかったが、ＰＢＳコントロールをワクチン接種したマウスはＲＡ内に腫瘍が見られた（図Ｓ７Ａ）。
【００９３】
４週間、Ｃ＋Ｉワクチン（ｎ＝１０）、ＣｐＧ（ｎ＝１０）、およびＰＢＳ（ｎ＝８）でワクチン接種されたＲ１切除マウスにおいて（図７Ａ）、ｄＬＮおよびＲＡを、Ｂ１６Ｆ０黒色腫株を検出および定量するために設計された腫瘍特異的プライマーを使用して分析した（図Ｓ７Ｂ−Ｇ）。ｄＬＮにおける腫瘍負荷は、ＣｐＧのみおよびＣ＋Ｉワクチングループの両方で低下し、腫瘍近くの注射で腫瘍の分解を誘導する強力なアジュバントとしてのＣｐＧの効果を示した（図Ｓ７Ｈ）。ワクチン接種部位からより離れていると、Ｃ＋Ｉのワクチン接種したグループのみがＲＡにおいて腫瘍再発を有意に低下させた（図７Ｂ）。全身的に、これは、免疫系の再活性化、ならびにコントロールグループと比較してＢ１６黒色腫促進Ｔｈ１７細胞の低下によって説明される（図７Ｃ；図Ｓ５Ｃ、Ｅ）。
【００９４】
方法の概要：
動物モデル。種々の実験のために（「ＣｐＧ＋ｉＰＳＣワクチン製造および免疫化」および「癌細胞系および移植」のセクション参照）、若い成体メスＦＶＢ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣＢＡ／Ｊマウス（６−８週齢）を使用した。動物を異なる処置グループにランダムに割り当てた。１ｃｍ３より大きな腫瘍サイズ、目に見える苦痛、疼痛、または病気を含む健康状態が実験期限前に安楽死を必要としたとき、腫瘍を有するマウスを実験から除外した。全ての実験は、スタンフォード大学実験動物管理パネル（ＡＰＬＡＣ）によって承認された。
【００９５】
繊維芽細胞からのマウスｉＰＳＣの産生。ＦＶＢ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、およびＣＢＡ／Ｊマウス（The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine）からの繊維芽細胞を、２０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１ｘ  ＮＥＡＡ（ThermoFisher Scientific）を有するＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）において培養した。繊維芽細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ThermoFisher Scientific）を使用して分離し、１ｘ１０６の繊維芽細胞をエレクトロポレーションバッファー（Neon system, ThermoFisher Scientific）に再懸濁した。細胞を、４つの再プログラム化因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４を含む新規なコドン最適化ミニイントロンプラスミド（ｃｏＭＩＰ）でトランスフェクトした（ＤDiecke S, Lu J, Lee J, Termglinchan V, Kooreman NG, Burridge PW, Ebert AD, Churko JM, Sharma A, Kay MA, Wu JC. Sci Rep. 2015 Jan 28;5:8081. doi: 10.1038/srep08081. PMID: 25628230）。トランスフェクション後、細胞を照射マウス胚フィーダー（ＭＥＦ）細胞に播種し、１５％  ＦＢＳ、１ｘ  ＮＥＡＡ、および１０ｎｇ／ｍｌ  マウス白血病阻害因子（ｍＬＩＦ；EMD Millipore, MA, USA）を含むＤＭＥＭで培養した。ｉＰＳＣコロニーが現れ始めた後、これらを手動でつつき（picked）、新しいフィーダー層に移した。ｉＰＳＣコロニーを増殖し、数回の継代後、０．２％  ゼラチンコーティングプレートに移し、電磁ビーズ選別（Miltenyi, Germany）を使用してＳＳＥＡ−１について分類し、純粋な未分化集団を維持した。特性化のために、多能性を評価するために、ｉＰＳＣをＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２（Santa Cruz, CA, USA）、ＳＳＥＡ１、およびｃ−Ｍｙｃ（EMD Millipore）について染色した。加えて、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（The Jackson Laboratory）の後肢において１ｘ１０６のｉＰＳＣの移植により、奇形腫アッセイを全てのｉＰＳＣ系統で行った。全ての細胞系をマイコプラズマ汚染について試験し、陰性であることが見いだされた。
【００９６】
ＣｐＧ＋ｉＰＳＣワクチン製造および免疫化。マウスあたり、２ｘ１０６のＳＳＥＡ−１で分類された同系マウスｉＰＳＣに注射前に６，０００ｒａｄを照射した。細胞を１００μｌの５μＭ  ＣｐＧ（Invivogen, San Diego, USA）に懸濁し、ＰＢＳに溶解し、１/４ｃｃインスリンシリンジ（Ｔｅｒｕｍｏ）にロードした。スタンフォード大学のＡＰＬＡＣのガイドラインに従って、マウスを誘導チャンバーに入れ、立ち直り反射がなくなるまで２ｌ／分の送達速度で１００％酸素中２％  イソフルラン（Isothesia, Butler Schein）で麻酔した。免疫化を、毎週注射部位を変更しながら、マウスの脇腹においてワクチンの皮下注射により行った。体重測定および全体的な外観の肉眼検査により、ワクチンに対する自己反応性の初期兆候について、マウスを毎週モニターした。ワクチン製造および投与量は、予防およびアジュバント処置実験について同じであった。
【００９７】
癌細胞系および移植。乳癌系統ＤＢ７は、Ｄｒ．  Ｊｏｅ  Ｓｍｉｔｈ（University of Utah, USA）からの贈り物であった。ＦＶＢマウスに由来し、非転移性細胞株であった。Ｂ１６Ｆ０黒色腫細胞系は、ＡＴＣＣ（Manassas, VA, USA）から購入され、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスと同系である。それは、肺への低いリンパ系転移の可能性を有する。ＡＣ２９中皮腫癌系は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（St. Louis, MO, USA）から購入された。全ての細胞系をマイコプラズマ汚染について試験し、陰性であることが見いだされた。癌系を、通常の培養条件下で、ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳで増殖させた。Ｃ５７ＢＬ／６およびＦＶＢマウスについて、５ｘ１０４の癌細胞を１００μｌ  ＰＢＳに再懸濁し、マウスの腰に皮下注射した。ＣＢＡ／Ｊマウスに２ｘ１０６の癌細胞を注入した。腫瘍増殖をキャリパー測定によって毎週評価した。試験の終わりに、腫瘍を外植し、流入領域リンパ節および肺組織の肉眼的検査を転移について実施した。
【００９８】
ＩｇＧ結合アッセイ。細胞をＰＢＳで複数回洗浄し、ワクチン接種したマウスからの血清２μｌを添加したＦＡＣＳバッファー１００μｌに再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。この後、細胞を複数回洗浄し、抗ＩｇＧ  ＦＩＴＣ二次抗体（ThermoFisher Scientific）と４℃でさらに２０分間インキュベートした。アイソタイプコントロールとして、マウスＩｇＧおよびＩｇＭにあらかじめ吸着されるＩｇＧ抗体を含んだ。次に、細胞をＬＳＲ−ＩＩ  フローサイトメーターを使用して分析した。
【００９９】
飛行時間によるサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）。上記方法にしたがって、外植した組織から免疫細胞を単離した。細胞を、マウス脾臓／リンパ節表現型検査キット、マウス細胞内サイトカインＩパネルキットおよび生存能力色素シスプラチン（Fluidigm, South San Francisco, CA, USA）で染色した。細胞を標準化ビーズを添加した１ｍｌあたり１ｘ１０５−１ｘ１０８の細胞の濃度でＭａｘＰａｒ水に再懸濁し、ＣｙＴＯＦ２（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）マシンで実行した。データは、正規化ビーズを使用して正規化された。データを、Ｃｙｔｏｂａｎｋオンラインソフトウェアを使用して、密度正規化イベントのスパニングツリー進行分析（ＳＰＡＤＥ）（Mountain View, CA, USA）を使用して分析した。
【０１００】
クラスター同定、特性化および回帰（Citrus）。簡潔には、階層型クラスタリングおよび正規化回帰モデルに基づいて、Ｃｉｔｒｕｓは多次元データから層別クラスターおよび行動のリストを生成する。加えて、それは、これらのクラスターの機能（例えば、細胞内サイトカイン）を説明し、新しく取得したデータまたは検証サンプルについての予測モデルを提供できる。これらのクラスターからの層別特徴は、ｘ軸に中央表現（median expression）としてプロットされている（図５Ｂ、７Ｃ；図Ｓ５Ｂ）。ＣｙＴＯＦデータは、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用して分析され、生存可能な単一細胞についてゲートし(gated)、その後、ＦＣＳファイルをＣｉｔｒｕｓ  ０．８からＧＵＩにアップロードし、スクリプトをＲ（バージョン３．０．３）で実行した。Ｂ１６Ｆ０腫瘍溶解物に暴露された脾細胞の分析のために、０．２％（５６７事象）の最小クラスタリングでの１０，０００のサンプリング事象でＣｉｔｒｕｓ分析を行った。ＴＩＬのために、Ｃｉｔｒｕｓ分析は、５００事象最小クラスタリングでの１，０００サンプリング事象に基づいた。クラスタリング特徴は、２５未満の制約された(constrained)ｃｖ．ｍｉｎおよびｃｖ．ｆｄｒ．で興味あることが見いだされた。
【０１０１】
ＣＤＫＮ２Ａにおける大きなゲノム欠失のＰＣＲ検出。プライマーは、Ｂ１６黒色腫細胞系のＣＤＫＮ２Ａにおける大きな欠失の接合部を検出するように設計された（図Ｓ１Ｅ）。各２５μｌ  ＰＣＲ反応溶液は、１．２５ユニットのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびDNeasy Blood & Tissue Kit（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出された５０−１００ｎｇのゲノムＤＮＡを含んだ（図Ｓ７Ｃ）。次に、ＰＣＲ産物をＳａｎｇｅｒシーケンシングにより分析し、ＮＣＢＩにおいて遺伝子データベースでアラインした（図Ｓ７Ｄ）。
【０１０２】
デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）による黒色腫の腫瘍負荷の定量化。プライマーおよびプローブを、Ｂ１６黒色腫細胞系に特異的である３ＳＮＰ（赤色で着色された）を検出するように設計した。DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)を使用して、Ｒ１腫瘍切除の４週間後にＣ５７Ｂ／６マウスの腫瘍切除領域およびｄＬＮからＤＮＡを抽出した。各ｄｄＰＣＲ反応溶液を、４０から５０ｎｇのＤＮＡテンプレートおよびｄＵＴＰなしのＰｒｏｂｅ用のｄｄＰＣＲ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して２０μＬの最終容量に再構成した。それぞれのサンプルを、２つのプローブ：腫瘍負荷を評価するためのＭＴプローブ、および細胞量を評価するためのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＴＦＲＣプローブ（Ｍｍ０００００６９２＿ｃｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用することによって定量化された（図Ｓ７Ｅ、Ｆ）。最終的なプライマーおよびプローブ濃度は、それぞれ９００ｎＭおよび２５０ｎＭであった。液滴形成は、２０μＬのＰＣＲ反応溶液を有するＱＸ１００液滴発生器を使用して行われた。ゴム製ガスケットをカートリッジ上に置き、液滴発生器に装填した。次に、エマルジョン（容量〜３５μｌ）を、マルチチャネルピペットを使用して、９６−Ｗｅｌｌ  ｔｗｉｎ．ｔｅｃ（商標）  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅｓ  （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にゆっくりと移した。次に、プレートをホイルでヒートシールし、エマルジョンを、６２．５℃のアニーリング温度で製造業者のプロトコールにしたがってエンドポイントまで循環させた。次に、サンプルをＢｉｏＲａｄ  ＱＸ１００リーダーを使用して読み取った。標準曲線を０％、１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％、および１００％を含む腫瘍負荷の異なる量について作成し、一次回帰式を各ＤＮＡサンプルの腫瘍負荷を定量するために利用した（図Ｓ７Ｇ）。以下は、腫瘍負荷を検出するためのプライマーおよびプローブの配列である：
フォワードプライマー、５’ＡＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＴ３’；
リバースプライマー、５’ＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＡＧＧＣ３’；
変異体プローブ、５’（ＨＥＸ）ＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴ（Ｂｌａｃｋｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）３’；（赤色が変異体特異的対立遺伝子を示す）。
【０１０３】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シーケンシング。ＡＣ２９腫瘍が浸潤しているＴＩＬからのＤＮＡを、DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen)を使用して単離した。サンプルを、検査レベルＴＣＲシーケンシングのためのAdaptive Biotechnologies (Seattle, WA, USA)に提出した。提出されたサンプルからの最小ＤＮＡ含有量は、１．８から２．０のＤＮＡ品質Ａ２６０／２８０でサンプルあたり１５０ｎｇであった。データ分析ならびにサンプル間のＴＣＲクローン性の評価は、Adaptive Biotechnologiesと共同で行われた。それぞれのサンプル内のＴＣＲクローンのリストおよびＤＮＡサンプル内でのそれらの頻度が提供された。Ｔ細胞重複検索のために、２つのサンプルグループにおいて４または５のサンプルに出現するクローンのアミノ酸配列を比較した。Ｃ＋Ｉ処置グループおよびＰＢＳコントロールグループからのデータは、同様の平均生産的なユニーク値（ＰＢＳ：３５８２．２、ＣＩ：３００５．４）と同等に判断された。
【０１０４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。脾細胞（５ｘ１０５）を前記のように単離し、３７時間ｉＰＳＣまたはＤＢ７溶解物のいずれか（３５μｇ）と共培養し、その後、グランザイム−βおよびＩＦＮ−γの分泌を製造業者の指示（ｃａｔ＃  ＥＬＤ５８１９、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｉａｃｌｏｎｅ）にしたがってＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）により測定した。Adobe Photoshop CS6ソフトウェアを、ＩＦＮ−ｒ陽性スポットのサイズおよび数の計算のために使用した。
【０１０５】
脾細胞の養子移入。Ｃ＋Ｉのワクチン接種した（ｎ＝２０）およびビヒクルのワクチン接種した（ｎ＝２０）マウスを殺し、それらの脾細胞を単離した。脾臓を消化し、７０μｍの濾過器に通した。その後、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（cat# 118-156-101, Quality biology, Inc.）で溶解し、残りの脾細胞をＰＢＳで洗浄した。次に、脾細胞を２００μｌ  ＰＢＳ溶液に溶解し、尾静脈注射により乳癌の同所性モデルにおいて静脈内に注射した。
【０１０６】
同所性腫瘍モデル。ＦＶＢマウスに、乳房脂肪体組織へ２ｘ１０６のＤＢ７腫瘍細胞を直接的に注入した。癌細胞数の範囲は、以前のレポートに基づいており、モデルを検証して、１００％の腫瘍発生率に達した後、２ｘ１０６のＤＢ７癌細胞に設定された。
【０１０７】
統計値。全ての値は、示されるように平均±ｓ．ｄ．または平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表される。グループ間の差異は、対応のない両側スチューデントのｔ検定またはＧｒａｐｈＰａｄ  ソフトウェアを使用するＴｕｋｅｙの多重比較試験による一元／双方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれかにより適切に評価された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【０１０８】
本願全体を通して引用される特許および刊行物を含むすべての文書の全開示は、それぞれの個々の文献または特許出願が具体的かつ個別に出典明示により包含させることが示されているかのように、出典明示によりそれら全体において本願明細書に包含させる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
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