(57)【要約】  免疫応答性に関連する染色体領域および相互作用を分析するためのプロセス。【特許請求の範囲】
【請求項１】
集団におけるサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスであり、その染色体の状態に関係する染色体相互作用がゲノムの定義された領域内に存在するかまたは存在しないかを決定することを含むプロセスであって、前記サブグループは個体がどの程度免疫応答性であるかに関し；かつ
−前記染色体相互作用が、任意には、どの染色体相互作用が集団の免疫応答性相互作用サブグループに対応する染色体状態に関連付けられるのかを決定する方法により同定されており、該方法は、染色体の異なる状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させ、そして相補配列がハイブリダイズできるようにすることを含み、ここで、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用に集まっている両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、かつ核酸の第１のセットおよび第２のセットの間のハイブリダイゼーションのパターンによりどの染色体相互作用が免疫応答性サブグループに特異的であるかの決定が可能となり；そして
−染色体相互作用が、
（ｉ）表１に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（ii）表１に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iii）（ｉ）または（ii）を含むか、または（ｉ）または（ii）に隣接する４，０００塩基領域に存在する；
または
（ａ）表１３に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（ｂ）表１３に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）を含むか、または（ａ）または（ｂ）に隣接する４，０００塩基領域に存在する；
または
（α）表１６に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（β）表１６に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（γ）（α）または（β）を含むか、または（α）または（β）に隣接する４，０００塩基領域に存在する
のいずれかである
プロセス。
【請求項２】
染色体相互作用の特異的な組み合わせが、
（ｉ）表１のプローブにより表されるすべての染色体相互作用を含む；または
（ii）表１のプローブにより表される少なくとも１０、５０、１００、１５０、２００または３００個の染色体相互作用を含む；および／または
（iii）表１に挙げられる少なくとも１０、５０、１００、１５０または２００個の領域または遺伝子に一緒に存在する；および／または
（iv）表１のプローブにより表される染色体相互作用を含むか、または表１のプローブにより表される染色体相互作用に隣接する４，０００塩基領域に存在する少なくとも１０、５０、１００、１５０、２００または３００個の染色体相互作用を含む
に分類される請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
染色体相互作用の特異的な組み合わせが、
（ｉ）表１３のプローブにより表されるすべての染色体相互作用を含む；または
（ii）表１３のプローブにより表される少なくとも１０、５０、１００、１５０、２００または３００個の染色体相互作用を含む；および／または
（iii）表１３に挙げられる少なくとも１０、５０、１００、１５０または２００個の領域または遺伝子に一緒に存在する；および／または
（iv）表１３のプローブにより表される染色体相互作用を含むか、または表１３のプローブにより表される染色体相互作用に隣接する４，０００塩基領域に存在する少なくとも１０、５０、１００、１５０、２００または３００個の染色体相互作用を含む
に分類される請求項１記載のプロセス。
【請求項４】
染色体相互作用の特異的な組み合わせが、
（ｉ）表１６のプローブにより表されるすべての染色体相互作用を含む；または
（ii）表１６のプローブにより表される少なくとも１０、５０、１００、１５０、２００または３００個の染色体相互作用を含む；および／または
（iii）表１６に挙げられる少なくとも１０、５０、１００、１５０または２００個の領域または遺伝子に一緒に存在する；および／または
（iv）表１６のプローブにより表される染色体相互作用を含むか、または表１６のプローブにより表される染色体相互作用に隣接する４，０００塩基領域に存在する少なくとも１０、５０、１００、１５０、２００または３００個の染色体相互作用を含む
に分類される請求項１記載のプロセス。
【請求項５】
染色体相互作用が、
−個体由来のサンプルにおいて、および／または
−染色体相互作用の部位でのＤＮＡループの存在または非存在を検出することにより、および／または
−染色体コンフォメーションに集められる染色体の遠位領域の存在または非存在を検出することにより、および／または
−前記分類のあいだに生成され、その配列が、染色体相互作用に集められる染色体の領域に各々対応する２つの領域を含むライゲーションされた核酸の存在を検出することにより、ここで、ライゲーションされた核酸の検出が、好ましくは、
（ｉ）表１に記載される特異的プローブ配列のいずれかに少なくとも７０％の同一性を有するプローブを用いる、および／または（ii）表４のいずれかのプライマーペアと少なくとも７０％の同一性を有するプライマーペア；または
（ａ）表１３に記載される特異的プローブ配列のいずれかに少なくとも７０％の同一性を有するプローブを用いる、および／または（ｂ）表１３のいずれかのプライマーペアと少なくとも７０％の同一性を有するプライマーペア；または
染色体相互作用が、
（α）表１６に記載される特異的プローブ配列のいずれかに少なくとも７０％の同一性を有するプローブを用いる、および／または（β）表１７のいずれかのプライマーペアと少なくとも７０％の同一性を有するプライマーペア
のいずれかを用いるものである
分類される請求項１記載のプロセス。
【請求項６】
−核酸の第２のセットが核酸の第１のセットより大きな個体グループ由来である；および／または
−核酸の第１のセットが、少なくとも８個体由来である；および／または
−核酸の第１のセットは、第１のサブグループ由来の少なくとも４個体、および好ましくは第１のサブグループとは重複しない第２のサブグループからの少なくとも４個体由来である；および／または
−プロセスが医学的治療に対して個体を選択するために実施される；および／または
−免疫応答性が免疫療法または免疫チェックポイント療法に対する応答性である；および／または
−免疫応用性が癌免疫療法に対する応答性である；および／または
−プロセスが、１以上の定義された時点での免疫応答性を決定するために行なわれ、任意には少なくとも１つの時点が治療経過中である
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
−核酸の第２のセットが非選択グループを表し；および／または
−核酸の第２のセットが、定義された位置でアレイに結合され；および／または
−核酸の第２のセットが、少なくとも１００の異なる遺伝子における染色体相互作用を表し；および／または
−核酸の第２のセットが、少なくとも１，０００の異なる染色体相互作用を表す少なくとも１，０００の異なる核酸を含み；および／または
−核酸の第１のセットおよび核酸の第２のセットが、１０〜１００ヌクレオチド塩基長を有する少なくとも１００核酸を含む
請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
核酸の第１のセットが、
（ｉ）染色体相互作用に集まっている染色体領域の架橋工程；
（ii）前記架橋された領域を、任意には酵素による制限消化切断により、切断させる工程；および
（iii）前記架橋され切断されたＤＮＡ端をライゲーションして核酸の第１のセット（特にライゲーションされたＤＮＡを含む）を生成する工程
を含むプロセスにおいて得られる請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
−少なくとも１０〜２００の異なる染色体相互作用が、好ましくは１０〜２００の異なる領域または遺伝子において分類され；かつ任意には
（ａ）５０〜１００の異なる染色体相互作用が分類され、各々が表１に定義される異なる遺伝子および／または異なる領域にある；または
（ｂ）５０〜１００の異なる染色体相互作用が分類され、各々が表１３に定義される異なる遺伝子および／または異なる領域にある；または
（ｃ）２０〜４０の異なる染色体相互作用が分類され、各々が表１６に定義される異なる遺伝子および／または異なる領域にある；
および／または
−個体が免疫療法を受けるかどうかを選択するために行われ、ここで免疫療法は、好ましくは低分子免疫療法、抗体免疫療法または細胞免疫療法を含む
請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記ゲノムの定義された領域が、
（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む；および／または
（ii）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現する；および／または
（iii）非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を発現する；および／または
（iv）少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基をコードする核酸配列を発現する；および／または
（ｖ）制御エレメントを発現する；および／または
（vii）ＣＴＣＦ結合部位を含む
請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
免疫療法のための治療剤を同定または設計するために行われる請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセスであって、
−好ましくは前記プロセスが、候補薬剤が、免疫応答性の異なるレベルに関連付けられる染色体状態への変化を引き起こすことができるかどうかを検出するために使用される；
−染色体相互作用が、表１のいずれかのプローブにより表され；および／または
−染色体相互作用が表１に挙げられるいずれかの領域または遺伝子に存在し；
および任意には：
−染色体相互作用が、請求項１に定義される、いずれの染色体相互作用が染色体の状態に関連するかを決定する方法により同定されており、および／または
−染色体相互作用の変化が、（ｉ）表１に記載されているプローブ配列のいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプローブ、および／または（ii）表４のプライマーペアのいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプライマーペアを用いてモニターされる
プロセス。
【請求項１２】
免疫療法のための治療剤を同定または設計するために行われる請求項１〜１１のいずれか１項に記載のプロセスであって、
−好ましくは前記プロセスが、候補薬剤が、免疫応答性の異なるレベルに関連付けられる染色体状態への変化を引き起こすことができるかどうかを検出するために使用される；
−染色体相互作用が、表１３のいずれかのプローブにより表され；および／または
−染色体相互作用が表１３に挙げられるいずれかの領域または遺伝子に存在し；
および任意には：
−染色体相互作用が、請求項１に定義される、いずれの染色体相互作用が染色体の状態に関連するかを決定する方法により同定されており、および／または
−染色体相互作用の変化が、（ｉ）表１３に記載されているプローブ配列のいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプローブ、および／または（ii）表１３のプライマーペアのいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプライマーペアを用いてモニターされる
プロセス。
【請求項１３】
免疫療法のための治療剤を同定または設計するために行われる請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセスであって、
−好ましくは前記プロセスが、候補薬剤が、免疫応答性の異なるレベルに関連付けられる染色体状態への変化を引き起こすことができるかどうかを検出するために使用される；
−染色体相互作用が、表１６のいずれかのプローブにより表され；および／または
−染色体相互作用が表１６に挙げられるいずれかの領域または遺伝子に存在し；
および任意には：
−染色体相互作用が、請求項１に定義される、いずれの染色体相互作用が染色体の状態に関連するかを決定する方法により同定されており、および／または
−染色体相互作用の変化が、（ｉ）表１６に記載されているプローブ配列のいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプローブ、および／または（ii）表１７のプライマーペアのいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプライマーペアを用いてモニターされる
プロセス。
【請求項１４】
染色体相互作用の検出に基づき標的を選択すること、および好ましくは、標的のモジュレーターをスクリーニングして免疫療法のための治療剤を同定することを含み、前記標的が任意にはタンパク質である請求項１１、１２または１３記載のプロセス。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセスによって治療剤が必要であると同定されている個体における免疫療法における使用のための治療剤。
【請求項１６】
分類または検出が、ライゲーション産物を増幅可能なプライマーおよびＰＣＲ反応中にライゲーション部位に結合するプローブを用いる定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるライゲーション産物の特異的な検出を含み、前記プローブが染色体相互作用に集まっている各染色体領域由来の配列に相補的な配列を含み、好ましくは、前記プローブは、
前記ライゲーション産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および／または
オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合される蛍光団、および／または
オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合される消光団、および
任意に、
前記蛍光団がＨＥＸ、テキサスレッドおよびＦＡＭから選択され；および／または
前記プローブが１０〜４０ヌクレオチド塩基長、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド塩基長の核酸配列
を含む請求項１〜１４のいずれか１項に記載のプロセスまたは請求項１５記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体相互作用を検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患プロセスは複雑であり、結果は利用可能な方法を用いて予測することはできない。特に、どのような患者が特定の治療に反応するであろうかを予測することは難しい。
【発明の概要】
【０００３】
座位の特定の染色体コンフォメーションシグネチャー（ＣＣＳｓ）が存在するか、または病理または治療に関連する調節エピジェネティック制御設定のために存在しない。ＣＣＳｓは、穏やかなオフレートを有し、特別な表現型または病理を表す場合、ＣＣＳｓは薬理学的シグナル伝達でのみ、新しい表現型に変化するか、または外部干渉の結果として変化する。さらに、これらの事象の測定はバイナリであり、そのためこの読み出しは、さまざまなレベルのＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、およびほとんどの非コーディングＲＮＡの連続読み出しとはまったく対照的である。特定のバイオマーカーの変化の大きさは患者ごとに大きく異なり、患者のコホートを層別化するために使用すると分類統計に問題が生じるため、これまでほとんどの分子バイオマーカーに使用されている連続読み出しはデータ分析に課題をもたらす。これらの分類統計は、大きさというものがなく、表現型の違いの「はい、または、いいえ」のバイナリスコアのみを提供するバイオマーカーを使用するのに適している−染色体コンフォメーション（ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標））バイオマーカーが、潜在的な診断、予後予測および予測のバイオマーカーのための優れたリソースであることを示す。
【０００４】
本発明者らは、免疫応答性（immunoresponsiveness）に関連する染色体相互作用を有するゲノムの領域を、集団におけるサブグループの同定を可能にするアプローチを使用して同定した。２つの異なる症状を治療するための異なる療法を用いる２つの別々の試験から同定された領域、遺伝子、および特異的染色体相互作用は、細胞表面のシグナル伝達経路を制御する免疫応答およびＴ細胞活性化の制御によるなど、患者における総合的な免疫応答を決定するために見出された。本発明者らの研究により、免疫応答性における変化を、例えば疾患または治療の経過中、追いかけることが可能となる。
【０００５】
したがって、本発明は、集団におけるサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスであり、その染色体の状態に関係する染色体相互作用がゲノムの定義された領域内に存在するかまたは存在しないかを決定することを含むプロセスであって、前記サブグループは個体がどの程度免疫応答性であるかに関し；かつ
−前記染色体相互作用が、任意には、どの染色体相互作用が集団の免疫応答性相互作用サブグループに対応する染色体状態に関連付けられるのかを決定する方法により同定されており、該方法は、染色体の異なる状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させ、そして相補配列がハイブリダイズできるようにすることを含み、ここで、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用に集まっている両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、かつ核酸の第１のセットおよび第２のセットの間のハイブリダイゼーションのパターンによりどの染色体相互作用が免疫応答性サブグループに特異的であるかの決定が可能となり；そして
−染色体相互作用が、
（ｉ）表１に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（ii）表１に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iii）（ｉ）または（ii）を含むか、または（ｉ）または（ii）に隣接する４，０００塩基領域に存在する
プロセスを提供する。
【０００６】
本発明はまた、集団におけるサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスであり、その染色体の状態に関係する染色体相互作用がゲノムの定義された領域内に存在するかまたは存在しないかを決定することを含むプロセスであって、前記サブグループは個体がどの程度免疫応答性であるかに関し；かつ
−前記染色体相互作用が、任意には、どの染色体相互作用が集団の免疫応答性相互作用サブグループに対応する染色体状態に関連付けられるのかを決定する方法により同定されており、該方法は、染色体の異なる状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させ、そして相補配列がハイブリダイズできるようにすることを含み、ここで、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用に集まっている両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、かつ核酸の第１のセットおよび第２のセットの間のハイブリダイゼーションのパターンによりどの染色体相互作用が免疫応答性サブグループに特異的であるかの決定が可能となり；そして
−染色体相互作用が、
（ａ）表１３に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（ｂ）表１３に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）を含むか、または（ａ）または（ｂ）に隣接する４，０００塩基領域に存在する
プロセスを提供する。
【０００７】
本発明はさらに、集団におけるサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスであり、その染色体の状態に関係する染色体相互作用がゲノムの定義された領域内に存在するかまたは存在しないかを決定することを含むプロセスであって、前記サブグループは個体がどの程度免疫応答性であるかに関し；かつ
−前記染色体相互作用が、任意には、どの染色体相互作用が集団の免疫応答性相互作用サブグループに対応する染色体状態に関連付けられるのかを決定する方法により同定されており、該方法は、染色体の異なる状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させ、そして相補配列がハイブリダイズできるようにすることを含み、ここで、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用に集まっている両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、かつ核酸の第１のセットおよび第２のセットの間のハイブリダイゼーションのパターンによりどの染色体相互作用が免疫応答性サブグループに特異的であるかの決定が可能となり；そして
−染色体相互作用が、
（α）表１６に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（β）表１６に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（γ）（α）または（β）を含むか、または（α）または（β）に隣接する４，０００塩基領域に存在する
プロセスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】試験に用いられた患者の臨床注釈の例を示す。
【図２】最良のバイオマーカーの名称、それらが位置する遺伝子座を示す。
【図３】アレイ分析（レスポンダーおよびノンレスポンダーに関するベースラインを比較する）からの最良の予測バイオマーカーおよび最良の応答バイオマーカー（ベースラインおよび１２週でのレスポンダーを比較する）に関するベン図を示す。
【図４】いくつかの最終的なシグネチャーバイオマーカーに対する個人の患者バイナリＰＣＲ読み出しの例である：１  ＣＣｓが存在、０  ＣＣＳが非存在。
【図５】抗−ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体で治療した肺がんを患う患者の２つの群を示す。
【図６】グループＩとIIとを識別する統計的に有意な上位１３のマーカーの統計分析を示す。
【図７Ａ】ＰＤ−Ｌ１コホートから選択された上位１３マーカーの主成分分析（ＰＣＡ）を示す。
【図７Ｂ】ＰＤ−Ｌ１コホートから選択された上位１３マーカーの主成分分析（ＰＣＡ）を示す。
【図８】異なる抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナルを使用して肺がん患者に対して行われた別の第３の試験で、１５人の患者のベースラインサンプルが、治療に対する応答／非応答の注釈で盲検として提供された方法を示す。
【図９】挙げられた５つのマーカーに基づいて構築されたランダムフォレスト分類子が、１５個のサンプル（予測欄）のそれぞれに対して予測コールを生成する方法を示す。
【図１０】非盲検検証（実際欄）と比較した各サンプルの予測コールを示す。層別化の効率を表に示す。
【図１１】分類子に対する標準ｒＯＣ曲線を示す。ＡＵＣ＝０．７８６
【図１２】この分析で使用されるすべてのサンプルの主成分分析を示す：第１試験から８、第２試験から２４、検証から１５。
【図１３】レスポンダーの共通２５２２リードの重複を示す。
【図１４】最も統計的に有意である−レスポンダーに対する両方の試験で２７６の共通の有意なリードを調べていることを示す（左側に試験Ｉ、右側に試験II）。
【図１５】１のみがノンレスポンダーに関することを示す（左側に試験Ｉ、右側に試験II）。
【図１６】応答マーカーと非応答マーカー（試験ＩおよびIII）のアレイ読み取りの遺伝子座が、インターフェロンガンマ経路に関与する遺伝子とどのように重複するかを示す。
【図１７】応答マーカーと非応答マーカー（試験ＩおよびIII）のアレイ読み取りの遺伝子座が、インターフェロンガンマ経路に関与する遺伝子とどのように重複するかを示す。統計的に有意なデータのみを示す。
【図１８】応答マーカーと非応答マーカー（試験ＩおよびIII）のアレイ読み取りの遺伝子座が、インターフェロンガンマ経路に関与する遺伝子とどのように重複するかを示す。すべての試験Ｉ〜IIIについて示す。
【図１９】４つのコホート：ＩＮＦＧ経路に対する遺伝子座（ＯＲＦｓ）、抗−ＰＤ−Ｌ１レスポンダーおよびノンレスポンダー、すべての抗−ＰＤ−１、にわたるベン図を示す。
【図２０】４つのコホート：ＩＮＦＧ経路に対する遺伝子座（ＯＲＦｓ）、抗−ＰＤ−１レスポンダーおよびノンレスポンダー、すべての抗−ＰＤ−Ｌ１、にわたるベン図を示す。
【図２１】試験Ｉ〜IIIとＩＮＦＧ遺伝子の間で共有されるレスポンダーマーカーのすべての遺伝子座を示す。
【図２２Ａ】試験Ｉ〜IIIとＩＮＦＧ遺伝子の間で共有されるレスポンダーマーカーのすべての遺伝子座を示す。
【図２２Ｂ】３つの試験Ｉ〜IIIのすべてで共有された有意な応答ＥｐｉＳｗｉｔｃｈマーカーのいくつかを含む９５の遺伝子座のリストを示す。
【図２３Ａ】これらの遺伝子座をアレイ上で評価した場合の、有意なマーカーリードの数とマーカーリードの総数を示す図２２からの遺伝子座リストを示す。
【図２３Ｂ】これらの遺伝子座をアレイ上で評価した場合の、有意なマーカーリードの数とマーカーリードの総数を示す図２２からの遺伝子座リストを示す。
【図２３Ｃ】これらの遺伝子座をアレイ上で評価した場合の、有意なマーカーリードの数とマーカーリードの総数を示す図２２からの遺伝子座リストを示す。
【図２３Ｄ】これらの遺伝子座をアレイ上で評価した場合の、有意なマーカーリードの数とマーカーリードの総数を示す図２２からの遺伝子座リストを示す。
【図２４】ＰＤＦ−Ｌ１の有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＣＳに関連付けられたＯＲＦに一致したインターフェロンシグナル伝達経路を示す。
【図２５】染色体相互作用を検出する好ましい方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施態様
本発明は、免疫系の調節、特に細胞表面シグナル伝達経路およびＴ細胞活性化による免疫系の調節に関するエピジェネティックなマーカーのパネルに関する。
【００１０】
本発明はまた、特定の治療に対するその応答性を判定するために免疫系の状態をモニターすることを含む。これは、適切な療法を患者に与えることができることを意味し、患者が「レスポンダー」状態を保っているかまたは失っているかどうかを判定することができる。本発明は、したがって、一実施形態において、患者の要求を正確に反映する個別化された療法を患者与えることを可能にする、「レスポンダー」状態の「ライブ」進行中の読み出しを提供する。
【００１１】
免疫応答性
本発明は、免疫応答性を判定することに関する。これは、好ましくは、抗体または免疫細胞（例えばＴ細胞または樹状細胞）を含む組成物の投与または本明細書において言及されている任意の治療物質の投与などの免疫系に関連する分子または細胞を含む治療法に対する応答性である。ワクチン療法などの免疫系を調節または刺激する物質に対する応答性であってもよい。免疫応答性は、したがって、免疫療法に対する応答性であることが好ましい。免疫療法は、免疫のチェックポイントを調節、阻止または刺激してもよく、したがって、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４または本明細書において開示される任意の他の免疫チェックポイント分子を標的とするか、または調節してもよく、したがって、免疫チェックポイント療法であってもよい。好ましくは、免疫応答性は、抗体療法、または本明細書において開示される任意の特定の療法（後節の特定の薬物を参照されたい）に対する応答性である。療法は、併用療法であってもよい。
【００１２】
一実施形態において、免疫応答性は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体などのＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−Ｌ１阻害剤に対する応答性である。ＰＤ−１は、「プログラム細胞死タンパク質」であり、ＰＤ−Ｌ１は、「プログラム死−リガンド１」である。
【００１３】
免疫応答性は、好ましくはがん治療に対し、このため典型的には特定の個体がその治療に応答するかどうかに関し、ここで、個体は、がんであってもよく、またはがんでなくてもよく、またはがんの危険性があってもよい。がんは、典型的には本明細書において言及される任意のがんであり、例えば、メラノーマ、肺がん、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓がん、肝細胞癌、前立腺がん、乳がん、白血病、急性骨髄性白血病、膵臓がん、甲状腺がん、鼻腔がん、脳腫瘍、膀胱がん、子宮頸がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、大腸がんまたは腎臓がんである。
【００１４】
用語「抗体」は、抗原標的に結合する能力を保持する抗体のすべてのフラグメントおよび誘導体、例えば一本鎖ｓｃＦＶまたはＦａｂを含む。
【００１５】
後述するように、免疫応答性は、本明細書において言及される任意の療法、細胞または薬物に対して決定することができる。いくつかの実施形態においては、本明細書において言及される細胞または薬物は、免疫応答性が決定されている個体に投与することができる。
【００１６】
本発明のプロセス
本発明のプロセスは、免疫応答性に関連する染色体相互作用を検出する分類システムを含む。この分類は、本明細書において記載されるＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）システムであって、染色体相互作用に集まる染色体の架橋領域に基づくシステムを用い、染色体ＤＮＡを切断させ、その後、架橋エンティティーに存在する核酸をライゲーションし、染色体相互作用を形成した両領域由来の配列を有するライゲーションした拡散を誘導することにより行うことができる。このライゲーションした拡散の検出により、特定の染色体相互作用の存在または非存在の検出が可能となる。
【００１７】
染色体相互作用は、第１および第２の核酸の集団が使用される上述の方法を用いて同定することができる。これらの核酸は、Ｅｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）技術を用いて生み出すこともできる。
【００１８】
本発明に関連するエピジェネティックな相互作用
本明細書において使用する場合、「エピジェネティックな」および「染色体」相互作用という用語は、典型的には、染色体上の遺伝子座の遠位領域間での相互作用を意味し、該相互作用は、染色体の領域の状態に応じて動的であり、かつ変容し、形成され、または壊れる。
【００１９】
本発明の特定のプロセスにおいて、染色体相互作用は、その相互作用の一部である染色体の両領域由来の配列を含むライゲーションした核酸をまず生成することによって検出される。そのようなプロセスにおいて、両領域は、任意の適切な手段によって架橋され得る。好ましい態様において、相互作用は、ホルムアルデヒドを用いて架橋されるが、任意のアルデヒド、またはＤ−ビオチノイル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルもしくはジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって架橋してもよい。パラホルムアルデヒドは、４オングストローム離れているＤＮＡ鎖を架橋し得る。好ましくは、染色体相互作用は、同じ染色体上であり、任意には２〜１０オングストローム離れている。
【００２０】
染色体相互作用は、染色体の領域の状態、例えばそれが生理学的条件の変化に応答して転写されているまたは抑制されているかどうかを反映し得る。本明細書において規定されるサブグループに特異的である染色体相互作用は、安定であることが見出されており、ゆえに２つのサブグループ間での差を測定する確実な手段を提供する。
【００２１】
加えて、ある特徴（疾患状況など）に特異的な染色体相互作用は、通常、例えばメチル化またはヒストンタンパク質の結合への変化などの他のエピジェネティックマーカーと比較して、生物学的過程の初期に起こると考えられる。ゆえに、本発明のプロセスは、生物学的過程の初期ステージを検出することができる。このことは、結果として、より効果的であり得る早期介入（例えば治療）を可能とする。さらに、同じサブグループ内の個体間では、関連する染色体相互作用にほとんど変動がない。染色体相互作用を検出することは、１遺伝子あたり最大５０種の考え得る異なる相互作用を有して非常に有益であり、そのため本発明のプロセスは、５００，０００種の異なる相互作用を詮索し得る。
【００２２】
好ましいマーカーのセット
本明細書において、用語「マーカー」または「バイオマーカー」は、本発明において検出され得る（分類され得る）特異的な染色体相互作用を意味する。特異的マーカーが本明細書に開示される。それらのいずれかは、いずれのマーカーも本発明において使用することができる。さらなるマーカーのセットは、例えば、本明細書において開示される組み合わせまたは数で使用されてもよい。本明細書の表に開示されるマーカーが好ましい。これらは、任意の適切な方法、例えば、ｑＰＣＲ法などの本明細書に開示されるＰＣＲまたはプローブに基づく方法などにより分類され得る。マーカーは、位置により、またはプローブおよび／またはプライマー配列により本明細書において定義される。
【００２３】
エピジェネティックな相互作用の位置および原因
エピジェネティックな染色体相互作用は、関連するまたは記載されていない遺伝子をコードすることが示される染色体の領域と重複し得かつ含み得るが、同様に遺伝子間領域にあってもよい。さらに留意すべきは、本発明者らは、すべての領域におけるエピジェネティックな相互作用が、染色体座の状態を判定することにおいて同様に重要であることを発見したことである。これらの相互作用は、必ずしも遺伝子座に位置する特定の遺伝子のコード領域にあるわけではなく、遺伝子間領域にあってもよい。
【００２４】
本発明において検出される染色体相互作用は、基礎となるＤＮＡ配列への変化によって、環境因子、ＤＮＡメチル化、非コーディングアンチセンスＲＮＡ転写産物、非変異原性発癌物質、ヒストン修飾、クロマチン再構成、および特異的な局所ＤＮＡ相互作用によって引き起こされ得る。染色体相互作用につながる変化は、基礎となる核酸配列への変化であって、それ自体は遺伝子産物または遺伝子発現の様式に直接影響を及ぼさない変化によって引き起こされ得る。そのような変化は、例えば遺伝子の内部および／または外側のＳＮＰ、遺伝子融合、および／または遺伝子間ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、および非コーディングＲＮＡの欠失であり得る。例えば、おおよそ２０％のＳＮＰが非コーディング領域にあることが知られており、それゆえ説明されるプロセスは、非コーディングの場面においても有益である。一態様において、一体となって相互作用を形成する染色体の領域は、同じ染色体上で５ｋｂ、３ｋｂ、１ｋｂ、５００塩基対、または２００塩基対未満離れている。
【００２５】
検出される染色体相互作用は、好ましくは表１または５において言及される遺伝子のいずれかの内部にある。しかしながら、それは、遺伝子の上流または下流、例えば遺伝子からまたはコーディング配列から最大５０，０００、最大３０，０００、最大２０，０００、最大１０，０００、または最大５０００塩基上流または下流にあってもよい。
【００２６】
検出される染色体相互作用は、好ましくは表１または５において言及される遺伝子のいずれかの内部にある。しかしながら、それは、遺伝子の上流または下流、例えば遺伝子からまたはコーディング配列から最大５０，０００、最大３０，０００、最大２０，０００、最大１０，０００、または最大５０００塩基上流または下流にあってもよい。
【００２７】
検出される染色体相互作用は、好ましくは表１または５において言及される遺伝子のいずれかの内部にある。しかしながら、それは、遺伝子の上流または下流、例えば遺伝子からまたはコーディング配列から最大５０，０００、最大３０，０００、最大２０，０００、最大１０，０００、または最大５０００塩基上流または下流にあってもよい。
【００２８】
サブグループ、診断および個別化治療
本発明の目的は、免疫応答性のレベルを決定することである。これは、１以上の定義された時点、例えば少なくとも１、２、５、８または１０の異なる時点であり得る。少なくとも１、２、５または８の時点間の期間は、少なくとも５、１０、２０、５０、８０または１００日間であってもよい。典型的には、少なくとも１、２または５時点が治療開始前であり、および／または少なくとも１、２または５時点が治療開始後である。
【００２９】
本明細書において使用するとき、「サブグループ」とは、好ましくは、集団サブグループ（集団内のサブグループ）、より好ましくは特定の真核細胞または哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト、非ヒト霊長類、または齧歯類、例えばマウスもしくはラット）などの特定の動物の集団内のサブグループを意味する。最も好ましくは、「サブグループ」とは、ヒト集団内のサブグループを意味する。
【００３０】
本発明は、集団における特定のサブグループを検出することおよび治療することを含む。本発明者らは、染色体相互作用が、所与の集団における部分集合（例えば少なくとも２つの部分集合）の間で異なることを発見した。これらの違いを同定することにより、医師は、プロセスにおいて説明される集団の１つの部分集合の一部として彼らの患者を類別することが可能となる。それゆえ、本発明は、エピジェネティックな染色体相互作用に基づき、患者に対して薬物療法を個別化するプロセスを医師に提供する。
【００３１】
一実施形態において、本発明は、個体が「レスポンダー」であるかどうかを検査することに関する。いったん人が「レスポンダー」であるということが見出されると、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ４などの免疫チェックポイント分子を標的とする治療法である関連療法が施され得る。一実施形態においては、個体がノンレスポンダーであることが見出された場合、その後その個体は、本明細書に挙げられる任意の組み合わせ療法などの組み合わせ療法を施され得る。典型的には、組み合わせ療法は、抗体および低分子を含む。
【００３２】
ライゲーションした核酸を生成する
本発明のある特定の形態は、ライゲーションした核酸、とくにライゲーションしたＤＮＡを利用する。これらは、染色体相互作用に集まる両領域由来の配列を含み、それゆえ、相互作用についての情報を提供する。本明細書において記載されるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）法は、そのようなライゲーションした核酸の生成を用いて、染色体相互作用を検出する。
【００３３】
したがって、本発明のプロセスは、次の工程（これらの工程を含む方法など）：
（ｉ）染色体座に存在するエピジェネティックな染色体相互作用を、好ましくはインビトロで架橋する工程；
（ii）任意に、架橋したＤＮＡを染色体座から単離する工程；
（iii）架橋したＤＮＡを、例えば少なくとも１回それを切る酵素（とくに、該染色体座内で少なくとも１回切る酵素）で制限消化により切断させる工程；
（iv）架橋した切断されたＤＮＡ端を（特に、ＤＮＡループを形成するために、）ライゲーションする工程；ならびに
（ｖ）任意に、ライゲーションしたＤＮＡおよび／またはＤＮＡループの存在を、特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの技法を用いて、同定し、特異的な染色体相互作用の存在を同定する工程
によりライゲーションした核酸（例えば、ＤＮＡ）を生成する工程を含む。
【００３４】
これらの工程は、本明細書に記載されるいずれかの実施形態のために染色体相互作用を検出するために行われてもよい。工程はまた、本明細書に記載される核酸の第１のセットおよび／または第２のセットを生成するために行われてもよい。
【００３５】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、ライゲーションした核酸を検出するまたは同定するために用いることができ、例えば産生されたＰＣＲ産物のサイズは、特異的染色体相互作用が存在することを示すことができ、それゆえ遺伝子座の状態を同定するために用いられ得る。好ましい実施形態においては、表４に示される少なくとも１、２または３個のプライマーまたはプライマーペアがＰＣＲ反応において使用される。別の実施形態においては、表１３に示される少なくとも１、２または３個のプライマーまたはプライマーペアがＰＣＲ反応において使用される。他の実施形態においては、表１７に示される少なくとも１、２または３個のプライマーまたはプライマーペアがＰＣＲ反応において使用される。当業者であれば、目的の染色体座内でＤＮＡを切るために用いられ得る無数の制限酵素を承知しているであろう。用いられる特定の酵素が、調査される遺伝子座およびそこに位置するＤＮＡの配列に依存することは明らかであろう。本発明において説明されるようにＤＮＡを切るために用いられ得る制限酵素の非限定的な例は、ＴａｑＩである。
【００３６】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術などの実施形態
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術は、表現型に特異的なエピジェネティックな染色体コンフォメーションシグネチャーの検出における、マイクロアレイＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーデータの使用に関する。本明細書において記載される様式で、ライゲーションした核酸を利用するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）などの実施形態は、いくつかの利点を有する。例えば本発明の核酸の第１のセット由来の核酸配列は、核酸の第２のセットとハイブリダイズするまたはハイブリダイズしないため、それらの確率的ノイズは低レベルである。これは、エピジェネティックなレベルにおける複雑なメカニズムを測定する比較的簡潔なやり方を可能にする二元的結果を提供する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術は、迅速な処理時間および低コストも有する。一実施形態において、処理時間は３〜６時間である。
【００３７】
サンプルおよびサンプル処置
本発明のプロセスは、普通、サンプル上で行われるであろう。サンプルは、普通、個体由来のＤＮＡを含有すると考えられる。それは、通常細胞を含有すると考えられる。一実施形態において、サンプルは、最小限に侵襲的な手段によって獲得され、例えば血液サンプルであり得る。ＤＮＡが抽出されてもよく、標準的な制限酵素で細かく切断されてもよい。これは、どの染色体コンフォメーションが保持されかつＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームで検出されるかをあらかじめ判定し得る。水平移動を含めた、組織と血液との間での染色体相互作用の同期により、血液サンプルを用いて、疾患に関連した組織などの組織における染色体相互作用を検出することができる。がんなどのある特定の病状に関しては、変異による遺伝子ノイズが、関連組織における染色体相互作用「シグナル」に影響を及ぼし得、それゆえ血液を用いることが有利である。
【００３８】
本発明の核酸の特性
本発明は、本明細書において、本発明のプロセスにおいて使用される、または生成されるものとして説明されるライゲーションした核酸などの特定の核酸に関する。これらは、本明細書に記載された第１および第２の核酸と同じであってもよく、第１および第２の核酸の特性のいずれかを有していてもよい。本発明の核酸は、典型的に、染色体相互作用に集まる染色体の２つの領域の一方由来の配列をそれぞれが含む２つの部分を含む。典型的には、それぞれの部分は、少なくとも８、１０、１５、２０、３０、または４０ヌクレオチド長、例えば１０〜４０ヌクレオチド長である。好ましい核酸は、とくに核酸がいずれかの表に記載される遺伝子のいずれか由来の配列を含む。典型的には、好ましい核酸は、表１に記載される特定のプローブ配列、またはそのような配列のフラグメントおよび／またはホモログを含む。別の好ましい核酸は、表１３に記載される特定のプローブ配列、またはそのような配列のフラグメントおよび／またはホモログを含む。別の好ましい核酸は、表１６に記載される特定のプローブ配列、またはそのような配列のフラグメントおよび／またはホモログを含む。
【００３９】
好ましくは、核酸はＤＮＡである。特異的配列が提供される場合、本発明は、特定の実施形態において必要とされる相補的配列を使用してもよいと理解される。好ましくは、核酸はＤＮＡである。特異的配列が提供される場合、本発明は、特定の実施形態において必要とされる相補的配列を使用してもよいと理解される。
【００４０】
表４に示されるプライマーも、本明細書に記載されているように本発明において使用されてもよい。一実施形態において、表４に示される配列；または表４に示されるいずれかの配列のフラグメントおよび／またはホモログ、のいずれかを含むプライマーが使用される。表１３に示されるプライマーも、本明細書に記載されているように本発明において使用されてもよい。一実施形態において、表１３に示される配列；または表１３に示されるいずれかの配列のフラグメントおよび／またはホモログ、のいずれかを含むプライマーが使用される。表１７に示されるプライマーも、本明細書に記載されているように本発明において使用されてもよい。一実施形態において、表１７に示される配列；または表１７に示されるいずれかの配列のフラグメントおよび／またはホモログ、のいずれかを含むプライマーが使用される。
【００４１】
核酸の第二のセット−「インデックス」配列
核酸の第二のセットは、インデックス配列のセットであるという機能を有し、かつ本質的に、サブグループ特異的配列を同定するのに適している核酸配列のセットである。それらは、「バックグラウンド」染色体相互作用を表すことができ、かつ何らかのやり方で選択されてもよく、または選択されなくてもよい。それらは、一般に、すべての考え得る染色体相互作用の部分集合である。
【００４２】
核酸の第二のセットは、任意の適切な方法によって導き出され得る。それらは、コンピューターにより導き出されてもよく、またはそれらは、個体における染色体相互作用に基づいてもよい。それらは、典型的に、核酸の第一のセットよりも大きな集団グループを表す。一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、特定の遺伝子セットにおけるすべての考え得るエピジェネティックな染色体相互作用を表す。別の特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、本明細書において記載される集団に存在するすべての考え得るエピジェネティックな染色体相互作用の大部分を表す。一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、少なくとも２０、５０、１００または５００の遺伝子、例えば２０〜１００、または５０〜５００の遺伝子におけるエピジェネティックな染色体相互作用の少なくとも５０％または少なくとも８０％を表す。
【００４３】
核酸の第二のセットは、典型的に、集団における疾患状態／表現型を改変する、調節する、または何らかのやり方で仲介する少なくとも１００の考え得るエピジェネティックな染色体相互作用を表す。核酸の第二のセットは、種における疾患状態（典型的には診断または予後に関する）に影響を及ぼす染色体相互作用を表してもよい。核酸の第二のセットは、典型的には、免疫応答性サブグループに関連するおよび関連しない両方のエピジェネティックな相互作用に表す配列を含む。
【００４４】
一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、集団における天然に生じる配列に少なくとも部分的に由来し、かつ典型的には、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法によって得られる。該核酸は、天然に生じる核酸に存在する核酸の対応する部分と比較して、単一のまたは複数の変異をさらに含んでもよい。変異には、１つまたは複数のヌクレオチド塩基対の欠失、置換、および／または付加が含まれる。一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、天然に生じる種に存在する核酸の対応する部分と少なくとも７０％の配列同一性を有するホモログおよび／またはオルソログを表す配列を含んでもよい。別の特定の実施形態において、天然に生じる種に存在する核酸の対応する部分と少なくとも８０％の配列同一性または少なくとも９０％の配列同一性が提供される。
【００４５】
核酸の第二のセットの特性
一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットには、少なくとも１００の異なる核酸配列、好ましくは少なくとも１０００、２０００、または５０００の異なる核酸配列、最大で１００，０００、１，０００，０００、または１０，０００，０００の異なる核酸配列が存在する。典型的な数は、１，０００〜１００，０００の異なる核酸配列など、１００〜１，０００，０００であろう。これらのすべてまたは少なくとも９０％または少なくとも５０％は、異なる染色体相互作用に相当するであろう。
【００４６】
一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、１００〜１０，０００の異なる遺伝子座または遺伝子など、少なくとも２０の異なる遺伝子座もしくは遺伝子、好ましくは少なくとも４０の異なる遺伝子座もしくは遺伝子、およびより好ましくは少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも５０００の異なる遺伝子座もしくは遺伝子における染色体相互作用を表す。核酸の第二のセットの長さは、それらが、ワトソン・クリック塩基ペアリングに従って核酸の第一のセットに特異的にハイブリダイズし、サブグループに特異的な染色体相互作用の同定を可能にするのに適したものである。典型的には、核酸の第二のセットは、染色体相互作用に集まる２つの染色体領域に配列が対応する２つの部分を含むであろう。核酸の第二のセットは、典型的に、長さが少なくとも１０、好ましくは２０、およびさらに好ましくは３０塩基（ヌクレオチド）である核酸配列を含む。別の実施形態において、核酸配列は、長さが多くても５００、好ましくは多くても１００、およびさらに好ましくは多くても５０塩基対であり得る。好ましい実施形態において、核酸の第二のセットは、１７〜２５の間の塩基対の核酸配列を含む。一実施形態において、核酸配列の第二のセットの少なくとも１００、８０％、または５０％は、上述の長さを有する。好ましくは、異なる核酸は、いかなる重複する配列も有さず、例えば該核酸の少なくとも１００％、９０％、８０％、または５０％は、少なくとも５連続ヌクレオチドにわたって同じ配列を有しない。
【００４７】
核酸の第二のセットが「インデックス」として作用することを考慮すると、第二核酸の同じセットは、サブグループの種々の特徴を表す第一核酸の種々のセットとともに用いてもよく、すなわち核酸の第二のセットは、種々の特徴に関連する染色体相互作用を同定するために用いることができる核酸の「普遍的な（universal）」コレクションを表してもよい。
【００４８】
核酸の第一のセット
核酸の第一のセットは、通常、免疫応答性に関連するサブグループ由来である。第一核酸は、本明細書において言及される核酸の第二のセットの特徴および特性のいずれかを有してもよい。核酸の第一のセットは、通常、本明細書に説明される処置および処理、とくにＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の架橋および切断工程を受けている個体由来のサンプルに由来する。典型的には、核酸の第一のセットは、個体から採取されたサンプルに存在する染色体相互作用のすべてまたは少なくとも８０％または５０％を表す。
【００４９】
典型的には、核酸の第一のセットは、核酸の第二のセットによって表される染色体相互作用と比較して、核酸の第二のセットによって表される遺伝子座または遺伝子にわたる染色体相互作用のより小さな集団を表す、すなわち核酸の第二のセットは、遺伝子座または遺伝子の規定のセットにおける相互作用のバックグラウンドまたはインデックスセットを表している。
【００５０】
核酸のライブラリ
本明細書において言及される核酸集団の種類のいずれかは、「第一」または「第二」核酸などの、その種類の少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００の異なる核酸を含むライブラリの形態で存在してもよい。そのようなライブラリは、アレイに結合している形態であってもよい。
【００５１】
ハイブリダイゼーション
本発明は、核酸の第一のセットおよび核酸の第二のセット由来の全体的にまたは部分的に相補的な核酸配列がハイブリダイズするのを可能にするための手段を要する。一実施形態において、核酸の第一のセットのすべてと核酸の第二のセットのすべてとを単一アッセイで、すなわち単一ハイブリダイゼーション工程で接触させる。しかしながら、任意の適切なアッセイを用いることができる。
【００５２】
標識された核酸およびハイブリダイゼーションのパターン
本明細書において言及される核酸は、好ましくは達成できたハイブリダイゼーションの検出を支援する蛍光団（蛍光分子）または放射性標識などの独立した標識を用いて標識され得る。ある特定の標識は、ＵＶ光の下で検出することができる。例えば、本明細書に説明されるアレイ上でのハイブリダイゼーションのパターンは、２つのサブグループ間のエピジェネティックな染色体相互作用の相違点を表し、したがって、エピジェネティックな染色体比較するプロセス、およびどのエピジェネティックな染色体相互作用が本発明の集団のサブグループに特異的であるかの決定を提供する。
【００５３】
用語「ハイブリダイゼーションのパターン」は、核酸の第一のセットと第二のセットとの間のハイブリダイゼーションの存在および非存在、すなわち、どの特定の第一セット由来の核酸がどの特定の第二セット由来の核酸とハイブリダイズするかを広くカバーし、それは、任意の特別なアッセイまたは技術に限定されるものではないが、「パターン」を検出できる表面またはアレイを必要とする。
【００５４】
特別な特徴を有するサブグループを選択
本発明は、染色体相互作用、典型的には５〜２０または５〜５００のそのような相互作用、好ましくは２０〜３００または５０〜１００の相互作用の有無を検出して、個体における免疫応答性に関連する特徴の有無を決定することを含むプロセスを提供する。好ましくは、染色体相互作用は、本明細書において言及される遺伝子のいずれかにおけるものである。一実施形態において、分類される染色体相互作用は、表１の核酸により表されるものである。別の実施形態においては、染色体相互作用は、表１３に表されるものである。別の実施形態においては、染色体相互作用は表１６に表されるものである。表中、「検出されたループ」と名付けられた欄は、どのサブグループが各プローブにより検出されるか（すなわちレスポンダーまたはノンレスポンダー）を示す。
【００５５】
試験される個体
試験される個体の由来となる種の例は、本明細書において言及される。加えて、本発明のプロセスにおいて試験される個体は、いくつかの方法で選択されていてもよい。個体は、本明細書において言及されるいずれかの症状に罹りやすくてもよく、および／または本明細書において言及されるいずれかの治療を必要としてもよい。個体は、本明細書において言及されるいずれかの治療法を受けてもよい。
【００５６】
一実施形態において、試験される個体は、治療法に応答しないことを示し、それらの検査の目的は、それらが初期の段階において応答しなくても、疾患の第二の段階において治療法に応答する「偽−進行者」であるかどうかを発見することである。
【００５７】
好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用
本発明のすべての実施態様に関して、好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用が、表、例えば表１に言及される。典型的には、本発明のプロセスにおいて、染色体相互作用は、表１に挙げられる少なくとも１、２、１０、５０、１００、１５０、２００または３００の関連遺伝子から検出される。好ましくは、表１のプローブ配列によって表される少なくとも１、２、１０、５０、１００、１５０、２００または３００の関連する特定の染色体相互作用の有無が検出される。染色体相互作用は、本明細書において言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えばコーディング配列から、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流にあり得る。
【００５８】
一実施形態において、表１ａの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１ｂの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１ｃの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１ｄの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１ｅの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１ｆの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１ｇの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。
【００５９】
典型的には、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０または７０の染色体相互作用は、本明細書に開示された表または表の一部に開示された遺伝子または領域のいずれかから分類される。典型的には、分類される染色体相互作用は、表２に言及される遺伝子の少なくとも２０、５０、１００、２００、３００またはすべての遺伝子に存在する。典型的には、分類された染色体相互作用は、表３に言及される遺伝子の少なくとも１０、２０、５０、７０またはすべての遺伝子に存在する。
【００６０】
本発明のすべての実施形態に関し、好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用が、表１３に言及される。典型的には、本発明のプロセスにおいて、染色体相互作用は、表１３に挙げられる少なくとも１、２、１０、５０、１００、１５０、２００または３００の関連遺伝子から検出される。好ましくは、表１３のプローブ配列によって表される少なくとも１、２、１０、５０、１００、１５０、２００または３００の関連する特定の染色体相互作用の有無が検出される。染色体相互作用は、本明細書において言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えばコーディング配列から、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流にあり得る。
【００６１】
一実施形態において、表１３ａの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１３ｂの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１３ｃの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１３ｄの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１３ｅの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１３ｆの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１３ｇの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１３ｈの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。一実施形態において、表１３ｉの少なくとも５、１０、１５、２０またはすべての染色体相互作用が分類される。
【００６２】
典型的には、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０または７０の染色体相互作用は、本明細書に開示された表または表の一部に開示された遺伝子または領域のいずれかから分類される。典型的には、分類される染色体相互作用は、表１３に言及される遺伝子の少なくとも２０、５０、１００、２００、３００またはすべての遺伝子に存在する。典型的には、分類された染色体相互作用は、表１３に言及される遺伝子の少なくとも１０、２０、５０、７０またはすべての遺伝子に存在する。
【００６３】
本発明のすべての実施態様に関し、好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用が、表１６に言及される。典型的には、本発明のプロセスにおいて、染色体相互作用は、表１６に挙げられる少なくとも１、２、１０、２０、３０または４０の関連遺伝子から検出される。好ましくは、表１６のプローブ配列によって表される少なくとも１、２、１０、２０、３０または４０の関連する特定の染色体相互作用の有無が検出される。染色体相互作用は、本明細書において言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えばコーディング配列から、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流にあり得る。
【００６４】
一実施形態において、表１８における少なくとも５、１０または１５またはすべての染色体相互作用が分類される。
【００６５】
典型的には、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０または７０の染色体相互作用は、本明細書に開示された表または表の一部に開示された遺伝子または領域のいずれかから分類される。典型的には、分類される染色体相互作用は、表１３に言及される遺伝子の少なくとも２０、５０、１００、２００、３００またはすべての遺伝子に存在する。典型的には、分類された染色体相互作用は、表１３に言及される遺伝子の少なくとも１０、２０、５０、７０またはすべての遺伝子に存在する。
【００６６】
一実施形態において、少なくとも５、１０、２０、３０、４０または７０の異なる染色体相互作用は、表１、１３および１６のいずれかに定義されるものから分類される。別の実施形態においては、分類される少なくとも５０％、８０％またはすべての染色体相互作用は、表１、１３および１６由来である。
【００６７】
一実施形態において、遺伝子座（染色体相互作用が検出される遺伝子および／または場所を含む）は、ＣＴＣＦ結合部位を含んでもよい。これは、転写抑制因子ＣＴＣＦに結合することができる任意の配列である。その配列は、遺伝子座において１、２または３コピーで存在し得るCCCTC配列からなってもよく、またはCCCTC配列を含んでもよい。ＣＴＣＦ結合部位配列は、CCGCGNGGNGGCAG配列（ＩＵＰＡＣ表記法で）を含み得る。ＣＴＣＦ結合部位は、染色体相互作用の少なくとも１００、５００、１０００または４０００塩基以内、または表１に示される染色体領域のいずれかの内部にあり得る。ＣＴＣＦ結合部位は、染色体相互作用の少なくとも１００、５００、１０００または４０００塩基以内、または表１３に示される染色体領域のいずれかの内部にあり得る。
【００６８】
一実施形態において、検出される染色体相互作用は、表１３に示される遺伝領域のいずれかに存在する。ライゲーションした核酸がプロセスにおいて検出される場合には、その後、表１３のプローブ配列のいずれかに示される配列が検出され得る。
【００６９】
ゆえに、典型的に、プローブの両方の領域由来（すなわち、染色体相互作用の両方の部位由来）の配列が検出され得る。好ましい実施形態において、任意の表に示されるプローブと同じまたは相補的な配列を含むまたはそれからなるプローブが、プロセスにおいて用いられる。いくつかの実施形態において、表に示されるプローブ配列のいずれかと相同である配列を含むプローブが用いられる。
【００７０】
本明細書に提供される表
表１は、免疫応答性に関連する染色体相互作用を表すプローブ（Ｅｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）マーカー）データおよび遺伝子データを示す。プローブ配列は、染色体相互作用に集まる遺伝子領域の両部位から産生されるライゲーション産物を検出するために使用することのできる配列を示す。すなわち、プローブは、ライゲーション産物の配列に相補的な配列を含む。第１のＳｔａｒｔ−Ｅｎｄ位置の２セットは、プローブ位置を示し、第２のＳｔａｒｔ−Ｅｎｄ位置の２セットは、関連する４ｋｂ領域を示す。次の情報は、プローブデータの表に提供される。
−ＨｙｐｅｒＧ＿Ｓｔａｔｅｓ：超幾何学的富化のパラメータに基づいて遺伝子座における有意なＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）マーカーのその数を見出す確率に対するｐ値
−プローブ＿カウント合計：その遺伝子座で試験されたＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの総数
−プローブ＿カウントＳｉｇ：その遺伝子座で統計的に有意であることが見出されたＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの数
−ＦＤＲ  ＨｙｐｅｒＧ：多重試験（偽発見率）補正された超幾何的ｐ値
−Ｓｉｇ割合：その遺伝子座で試験されたマーカーの数に対する有意なＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの割合
−ｌｏｇＦＣ：エピジェネティック比率（ＦＣ）の対数の底２
−ＡｖｅＥｘｐｒ：すべてのアレイおよびチャネルのプローブに対する平均ｌｏｇ２−発現
−Ｔ：モデレートｔ−統計
−ｐ−値：未調整ｐ−値
−ａｄｊ．ｐ．Ｖａｌ：調整ｐ−値またはｑ−値
−Ｂ：Ｂ−統計量（ｌｏｄまたはＢ）は、その遺伝子が別個に発現される対数オッズである。
−ＦＣ：非ログ倍率変化（Fold Change）
−ＦＣ＿１：ゼロを中心とする非ログ倍率変化
−ＬＳ：バイナリ値はＦＣ＿１値に関する。１．１未満のＦＣ＿１値は、−１に設定され、ＦＣ＿１値が１．１より大きい場合、１に設定される。これらの値の間は、その値は０である。
【００７１】
表１は、関連する染色体相互作用が生じることが見出されている遺伝子を示す遺伝子座の表におけるｐ−値は、ＨｙｐｅｒＧ＿Ｓｔａｔｓ（超幾何学的富化のパラメータに基づいて遺伝子座における有意なＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）マーカーのその数を見出す確率に対するｐ−値）と同じである。ＬＳ欄は、その特定のレスポンダー状態と関連する相互作用の有無を示す。
【００７２】
プローブは、Ｔａｑ１部位から３０ｂｐ離れた位置に設計される。ＰＣＲの場合、ＰＣＲプライマーもライゲーション産物を検出するように設計されているが、Ｔａｑ１からの位置は異なる。
【００７３】
プローブ位置：
Ｓｔａｒｔ１−フラグメント１上のＴａｑＩの３０塩基上流
Ｅｎｄ１−フラグメント１上のＴａｑＩ制限部位
Ｓａｒｔ２−フラグメント２上のＴａｑＩ制限部位
Ｅｎｄ２−フラグメント２上のＴａｑＩの３０塩基下流
【００７４】
４ｋｂ配列位置：
Ｓｔａｒｔ１−フラグメント１上のＴａｑＩの４０００塩基上流
Ｅｎｄ１−フラグメント１上のＴａｑＩ制限部位
Ｓａｒｔ２−フラグメント２上のＴａｑＩ制限部位
Ｅｎｄ２−フラグメント２上のＴａｑＩの４０００塩基下流
【００７５】
ｌａｓｓｏ全体またはｅｌａｓｔｉｃ−ｎｅｔ正則化をフィッティングするための手順に関連したＧＬＭＮＥＴ値（０．５に設定されたλ（ｅｌａｓｔｉｃ−ｎｅｔ））。
【００７６】
表１および４は免疫応答性に関する。表２は、実施された２つの試験の間の重複を示し、表３は、インターフェロンガンマに関連するマーカーとの重複を示す。本発明は、いずれかの表に開示される／表されるマーカーを用いて実施することができる。表１３および１を含む他の表は、上記表１に示したのと同様に解釈することができる。
【００７７】
サンプル調製および染色体相互作用検出のための好ましい実施形態
サンプルを調製する方法および染色体コンフォメーションを検出する方法が、本明細書において説明される。例えばこの節で記載されるように、これらの方法の最適化された（非従来的な）バージョンが用いられ得る。
【００７８】
典型的に、サンプルは、少なくとも２×１０5個の細胞を含有するであろう。サンプルは、最大５×１０5個の細胞を含有し得る。一実施形態において、サンプルは、２×１０5〜５．５×１０5個の細胞を含有するであろう。
【００７９】
染色体座に存在するエピジェネティックな染色体相互作用の架橋が、本明細書において説明される。これは、細胞溶解が起きる前に実施され得る。細胞溶解は、４〜６または約５分間など、３〜７分間実施され得る。いくつかの実施形態において、細胞溶解は、少なくとも５分間かつ１０分間未満実施される。
【００８０】
制限酵素でＤＮＡを消化することが、本明細書において説明される。典型的には、ＤＮＡ制限は、約６５℃などの約５５℃〜約７０℃で、約２０分間などの約１０〜３０分間の期間実施される。
【００８１】
好ましくは、最大４０００塩基対の平均フラグメントサイズを有する、ライゲーションしたＤＮＡのフラグメントをもたらす高頻度カッター制限酵素が用いられる。任意で、制限酵素は、約２５６塩基対などの約２００〜３００塩基対の平均フラグメントサイズを有する、ライゲーションしたＤＮＡのフラグメントをもたらす。一実施形態において、典型的なフラグメントサイズは、４００〜２，０００または５００〜１，０００塩基対など、２００塩基対〜４，０００塩基対である。
【００８２】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ法の一実施形態において、ＤＮＡ沈殿工程は、ＤＮＡ制限消化工程とＤＮＡライゲーション工程との間では実施されない。
【００８３】
ＤＮＡライゲーションが本明細書において説明される。典型的には、ＤＮＡライゲーションは、約１０分間など、５〜３０分間実施される。
【００８４】
サンプル中のタンパク質は、例えばプロテイナーゼ、任意でプロテイナーゼＫを用いて酵素的に消化され得る。タンパク質は、約３０分間〜１時間の期間、例えば約４５分間酵素的に消化され得る。一実施形態において、タンパク質の消化、例えばプロテイナーゼＫ消化の後に、架橋反転またはフェノールＤＮＡ抽出の工程はない。
【００８５】
一実施形態において、ＰＣＲ検出は、好ましくはライゲーションした核酸の存在／非存在に対するバイナリ読み出しを備え、ライゲーションした核酸の単一コピーを検出することができる。
【００８６】
図２５は、染色体相互作用を検出する好ましい方法を示す。
【００８７】
本発明のプロセスおよび使用
本発明のプロセスは、種々のやり方で説明することができる。それは、（ｉ）染色体相互作用に集まる染色体領域をインビトロ架橋する工程；（ii）該架橋したＤＮＡを切り取りまたは制限消化切断に供する工程；および（iii）該架橋し切断されたＤＮＡ末端をライゲーションして、ライゲーションした核酸を形成する工程、を含むライゲーションした核酸を作製する方法であって、該ライゲーションした核酸の検出を用いて、遺伝子座における染色体状態を決定し得、そして好ましくは、
−遺伝子座は、表１に言及される遺伝子座、領域または遺伝子のいずれかであり得、および／または、
−染色体相互作用は、本明細書において言及される、または表１に開示されるいずれかのプローブに対応する、いずれかの染色体相互作用であり得、および／または
−ライゲーションした産物は、（ｉ）表１に開示されるいずれかのプローブ配列と同じであるかまたは相同である配列；または（ii）（ii）と相補的である配列を有し得るまたは含み得る
方法として説明することができる。
【００８８】
本発明のプロセスは、染色体相互作用が、ゲノムの定義されたエピジェネティックに活性な領域内に存在するかまたは存在しないかどうかを決定する工程を含む、集団内の種々のサブグループを表す染色体状態を検出するための方法であって、好ましくは、
−サブグループは、免疫応答性の有無によって規定され、および／または
−染色体状態は、表１に言及されるいずれかの遺伝子座、領域または遺伝子にあり得；および／または
−染色体相互作用は、表１に言及されるいずれかのもの、もしくはその表に開示されるいずれかのプローブに対応するいずれかのものであり得る
方法として説明することができる。
【００８９】
本発明のプロセスは、（ｉ）染色体相互作用に集まる染色体領域をインビトロ架橋する工程；（ii）該架橋したＤＮＡを切り取りまたは制限消化切断に供する工程；および（iii）該架橋し切断されたＤＮＡ末端をライゲーションして、ライゲーションした核酸を形成する工程、を含むライゲーションした核酸を作製する方法であって、該ライゲーションした核酸の検出を用いて、遺伝子座における染色体状態を決定し得、そして好ましくは、
−遺伝子座は、表１３に言及される遺伝子座、領域または遺伝子のいずれかであり得、
−および／または、染色体相互作用は、本明細書において言及される、または表１３に開示されるいずれかのプローブに対応する、いずれかの染色体相互作用であり得、および／または
−ライゲーションした産物は、（ｉ）表１３に開示されるいずれかのプローブ配列と同じであるかまたは相同である配列；または（ii）（ii）と相補的である配列を有し得るまたは含み得る
方法として説明することができる。
【００９０】
本発明のプロセスは、染色体相互作用が、ゲノムの規定のエピジェネティックに活性な領域内に存在するかまたは存在しないかを決定する工程を含む、集団内の種々のサブグループを表す染色体状態を検出するための方法であって、好ましくは、
−サブグループは、免疫応答性の有無によって規定され、および／または
−染色体状態は、表１３に言及されるいずれかの遺伝子座、領域または遺伝子にあり得；および／または
−染色体相互作用は、表１３に言及されるいずれかのもの、もしくはその表に開示されるいずれかのプローブに対応するいずれかのものであり得る
方法として説明することができる。
【００９１】
本発明のプロセスは、（ｉ）染色体相互作用に集まる染色体領域をインビトロ架橋する工程；（ii）該架橋したＤＮＡを切り取りまたは制限消化切断に供する工程；および（iii）該架橋し切断されたＤＮＡ末端をライゲーションして、ライゲーションした核酸を形成する工程、を含むライゲーションした核酸を作製する方法であって、該ライゲーションした核酸の検出を用いて、遺伝子座における染色体状態を決定し得、そして好ましくは、
−遺伝子座は、表１６に言及される遺伝子座、領域または遺伝子のいずれかであり得、
−および／または、染色体相互作用は、本明細書において言及される、または表１６に開示されるいずれかのプローブに対応する、いずれかの染色体相互作用であり得、および／または
−ライゲーションした産物は、（ｉ）表１６に開示されるいずれかのプローブ配列と同じであるかまたは相同である配列；または（ii）（ii）と相補的である配列を有し得るまたは含み得る
方法として説明することができる。
【００９２】
本発明のプロセスは、染色体相互作用が、ゲノムの規定のエピジェネティックに活性な領域内に存在するかまたは存在しないかを判定する工程を含む、集団内の種々のサブグループを表す染色体状態を検出するための方法であって、好ましくは、
−サブグループは、免疫応答性の有無によって規定され、および／または
−染色体状態は、表１６に言及されるいずれかの遺伝子座、領域または遺伝子にあり得；および／または
−染色体相互作用は、表１６に言及されるいずれかのもの、もしくはその表に開示されるいずれかのプローブに対応するいずれかのものであり得る
方法として説明され得る。
【００９３】
本発明は、表１に言及されるいずれかの遺伝子座、遺伝子または領域での染色体相互作用の検出を含む。本発明は、染色体相互作用を検出するための本明細書に記載の核酸およびプローブの使用、例えば、少なくとも１、５、１０、５０、１００、２００、２５０、３００の異なる遺伝子座または遺伝子における染色体相互作用を検出するための少なくとも１、５、１０、５０、１００、２００、２５０、３００のそのような核酸またはプローブの使用を含む。本発明は、表４に挙げられるいずれかのプライマーまたはプライマーペアを使用する、または本明細書に記載のこれらのプライマーの変異体（プライマー配列を含むまたはプライマー配列のフラグメントおよび／またはホモログを含む配列）を使用する染色体相互作用の検出を含む。
【００９４】
本発明は、表１３に言及されるいずれかの遺伝子座、遺伝子または領域での染色体相互作用の検出を含む。本発明は、染色体相互作用を検出するための本明細書に記載の核酸およびプローブの使用、例えば、少なくとも１、５、１０、５０、１００、２００、２５０、３００の異なる遺伝子座または遺伝子における染色体相互作用を検出するための少なくとも１、５、１０、５０、１００、２００、２５０、３００のそのような核酸またはプローブの使用を含む。本発明は、表１３に挙げられるいずれかのプライマーまたはプライマーペアを使用する、または本明細書に記載のこれらのプライマーの変異体（プライマー配列を含むまたはプライマー配列のフラグメントおよび／またはホモログを含む配列）を使用する染色体相互作用の検出を含む。
【００９５】
本発明は、表１６に言及されるいずれかの遺伝子座、遺伝子または領域での染色体相互作用の検出を含む。本発明は、染色体相互作用を検出するための本明細書に記載の核酸およびプローブの使用、例えば、少なくとも１、５、１０、５０、１００、２００、２５０、３００の異なる遺伝子座または遺伝子における染色体相互作用を検出するための少なくとも１、５、１０、５０、１００、２００、２５０、３００のそのような核酸またはプローブの使用を含む。本発明は、表１７に挙げられるいずれかのプライマーまたはプライマーペアを使用する、または本明細書に記載のこれらのプライマーの変異体（プライマー配列を含むまたはプライマー配列のフラグメントおよび／またはホモログを含む配列）を使用する染色体相互作用の検出を含む。
【００９６】
染色体相互作用が定義された遺伝子、領域、または位置の「内（within）」で生じるかどうかを分析する場合、相互作用に集まる染色体の両方の部分が定義された遺伝子、領域または位置内にあるか、またはいくつかの実施形態においては染色体の一部のみが定義された遺伝子、領域または位置内にある。
【００９７】
新たな治療を同定するための本発明の方法の使用
染色体相互作用に関する知識は、疾患状態に対する新しい治療を同定するために使用することができる。本発明は、免疫療法に関する新規治療剤を同定または設計するために本明細書において定義される染色体の方法および使用を提供する。
【００９８】
ホモログ
ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログが、本明細書において言及される。そのようなホモログは、典型的に、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、１００またはそれよりも多くの連続ヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体の領域由来である核酸の部分にわたり、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する。相同性は、ヌクレオチド同一性（時には、「厳密な相同性（hard homology）」と称される）に基づいて算出され得る。
【００９９】
それゆえ、特定の態様において、ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログは、本明細書において配列同一性％を参照して触れられる。典型的に、そのようなホモログは、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、１００個以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体の領域由来である核酸の部分にわたり、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１００】
例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性および／または配列同一性％を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えば、そのデフォルト設定で用いられる）を提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。例えばAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されているように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、相同性および／または配列同一性％を算出し得、および／または配列を整列させ得る（（典型的にそれらのデフォルト設定で）同等のまたは対応する配列を同定するなど）。
【０１０１】
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードでアライメントした場合に合致する、またはある正の値を有する閾値スコアＴを満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）をまず同定する工程を伴う。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される(Altschul et al、上記）。これらの初回の近隣ワードヒットは、それらを含有するＨＳＰを見出す検索を始めるための種として作用する。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。それぞれの方向におけるワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアがその最大限に達した値から分量Ｘだけ下落する；負のスコアを取る１つもしくは複数の残基アライメントの累積により、累積スコアがゼロもしくはそれより下に行く；または、いずれかの配列の末端に到達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターのＷ５  ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。
【０１０２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間での類似性についての統計解析を実施する；例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性についての１つの測定は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは、２つのポリヌクレオチド配列間の合致が偶然に生じるであろう確率の表示を提供する。例えば、第一の配列を第二の配列と比較した最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、配列はもう一方の配列と類似していると見なされる。
【０１０３】
相同な配列は、典型的に、１０、１５、または２０塩基未満など、１、２、３、４個、またはそれを上回る数の塩基だけ異なる（それはヌクレオチドの置換、欠失、または挿入であり得る）。これらの変化は、相同性および／または配列同一性％を算出する工程に関して上記で言及された領域のいずれかにわたり測定され得る。
【０１０４】
「プライマーペア」の相同性は、例えば、２つの配列を単一の配列と見なすことで（２つの配列が連結されているかのように）計算することができ、その後に単一配列として再度考慮される別のプライマーペアと比較することができる。
【０１０５】
アレイ
核酸の第二のセットがアレイに結合され得、そして一実施形態において、好ましくは少なくとも３００、９００、２０００、または５０００個の遺伝子座に相当する、アレイに結合している少なくとも１５，０００、４５，０００、１００，０００、または２５０，０００種の異なる第二の核酸が存在する。一実施形態において、第二の核酸の種々の集団のうちの１つ、または複数、またはすべては、アレイの１つを上回る数の個別の領域に結合され、事実上アレイで反復され、エラー検出を可能にする。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに基づく。アレイへの第一の核酸の結合の検出は、二色システムによって実施され得る。
【０１０６】
治療剤（応答性が決定される、または本発明による検査に基づき選択される）
治療剤が本明細書において言及される。本発明は、ある個体、例えば本発明のプロセスにより同定される個体において疾患症状を予防または治療することにおける使用のためのそのような薬剤を提供する。これは、必要としている個体に治療上効果的な量の薬剤を投与することを含み得る。本発明は、ある個体において症状を予防または治療するための医薬の製造におけるその薬剤の使用を提供する。
【０１０７】
薬剤の製剤化は、該薬剤の性質に依存すると考えられる。薬剤は、該薬剤および薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含有する薬学的組成物の形態で提供される。適切なキャリアおよび希釈剤には、等張生理食塩溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。典型的な経口投薬組成物には、錠剤、カプセル、液体溶液、および液体懸濁液が含まれる。薬剤は、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、または経口の投与のために製剤化され得る。
【０１０８】
薬剤の用量は、様々なパラメータに従って、とりわけ用いられる物質；治療される対象となる個体の年齢、重量、および病状；投与の経路；ならびに要求されるレジメンに従って決定され得る。医師は、任意の特定の薬剤に対する投与の要求経路、および投薬量を決定することができる。しかしながら、適切な用量は、例えば１日に１〜３回摂取されるべき、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重（１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重など）であり得る。
【０１０９】
一実施形態において、本発明は、治療剤、例えば本明細書において言及されるいずれかの治療剤に対する応答性を検出することを含む。これは、治療を開始する前、および／または治療経過中であり得る。
【０１１０】
治療法は、単独または、組み合わせ、例えばＰＤ−１および、またはそのリガンドＰＤ−Ｌ１の免疫チェックポイントモジュレーター（阻害剤）との組み合わせ療法であってもよい。治療法は、ＣＴＬＡ４（イピリムマブ／ヤーボイ）または低分子などのチェックポイントを標的とする別の薬物と組み合わせた抗−ＰＤ−１または抗−ＰＤ−Ｌ１の組み合わせとすることができる。ＰＤ−１阻害剤は、ペンブロリツマブ（キイトルーダ）またはニボルマブ（オプジーボ）であり得る。ＰＤ−Ｌ１のモジュレーターまたは治療剤は、アテゾリツマブ（テセントリク）、アベルマブ（バベンチオ）、デュルバルマブ（イミフィンジ）、ＣＡ−１７０、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリツマブ、ピジリツマブ、ＢＭＳ９３５５５９、ＧＶＡＸＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭＤＸ−１１０５／ＢＭＳ−９３６５５９、ＡＭＰ−２２４、ＭＥＤＩ０６８０であり得る。
【０１１１】
治療法は、インターフェロンガンマまたはＪＡＫ−ＳＴＡＲＴ経路を標的とするおよび／またはモジュレートする薬剤含むことができる。
【０１１２】
治療剤は、本明細書においていずれかの表（例えば、表９、１０または１１）に開示したいずれかのそのような薬剤であり得、またはいずれかの表（表１、１３または１６を含む）において本明細書に開示されたいずれかのタンパク質を含む、本明細書に開示されたいずれかの「標的」を標的とすることができる。組み合わせに開示される任意の薬剤は、個別投与のためにも開示されているとみなされるべきであるということが理解される。
【０１１３】
本明細書において言及される物質の形態
本明細書において言及される核酸または治療剤などの物質のいずれも、精製したまたは単離した形態にあり得る。それらは（The）、天然に見出されるものとは異なる形態にあり得、例えばそれらは、それらが天然ではともに生じない他の物質と組み合わせて存在し得る。核酸（本明細書において規定される配列の一部分を含む）は、天然に見出されるものと異なる配列を有し得、例えば、相同性に関する節で記載される配列において、少なくとも１、２、３、４個、またはそれを上回る数のヌクレオチド変化を有する。核酸は、５’または３’末端に異種配列を有し得る。核酸は、天然に見出されるものとは化学的に異なり得、例えばそれらは何らかのやり方で修飾され得るが、好ましくはなおもワトソン・クリック塩基対合が可能である。適当な場合には、核酸は、二重鎖または一本鎖の形態で提供される。本発明は、本明細書において言及される特異的核酸配列のすべてを一本鎖または二本鎖の形態で提供し、ゆえに開示される任意の配列に対する相補鎖を含む。
【０１１４】
本発明は、特定のサブグループと関連がある染色体相互作用の検出を含む、本発明の任意の方法を行うためのキットも提供する。そのようなキットは、本発明の方法によって生成されるライゲーションした核酸を検出し得る薬剤など、関連する染色体相互作用を検出し得る特異的な結合薬剤を含み得る。キットに存在する好ましい薬剤には、ライゲーションした核酸、または例えば本明細書において記載されるように、ライゲーションした核酸をＰＣＲ反応において増幅し得るプライマーペアにハイブリダイズし得るプローブが含まれる。
【０１１５】
本発明は、関連する染色体相互作用を検出し得るデバイスも提供する。デバイスは、好ましくは、本明細書において記載される任意のそのような薬剤、プローブ、またはプライマーペアなど、染色体相互作用を検出し得る任意の特異的な結合薬剤、プローブ、またはプライマーペアを含む。
【０１１６】
検出方法
一実施形態において、染色体相互作用に関連するライゲーションされた配列の定量的検出は、ＰＣＲ反応中の活性化時に検出可能なプローブを使用して実施され、該ライゲーションされた配列は、エピジェネティックな染色体相互作用に集まる２つの染色体領域由来の配列を含み、該方法は、ライゲーションされた配列をＰＣＲ反応中にプローブと接触させること、およびプローブの活性化の程度を検出することを含み、該プローブは、ライゲーション部位に結合する。この方法は、典型的には、二重標識蛍光加水分解プローブを使用して、特定の相互作用をＭＩＱＥに準拠した方法で検出可能とする。
【０１１７】
プローブは一般に、活性化された場合にのみ検出されるように、不活性状態および活性状態を有する検出可能な標識で標識される。活性化の程度は、ＰＣＲ反応に存在するテンプレート（ライゲーション産物）の程度に関連するであろう。検出は、ＰＣＲの全期間または一部、例えば、ＰＣＲのサイクルの少なくとも５０％または８０％の間に実行されてもよい。
【０１１８】
プローブは、オリゴヌクレオチドの一端に共有結合された蛍光団、およびヌクレオチドの他端に結合された消光団を含むことができ、蛍光団の蛍光は、消光団によって消光される。一実施形態において、蛍光団はオリゴヌクレオチドの５’末端に結合され、消光団はオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合される。本発明の方法で使用できる蛍光団には、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ヤキマイエロー、ＨＥＸ、シアニン３、ＡＴＴＯ  ５５０、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、テキサスレッド、シアニン３．５、ＬＣ６１０、ＬＣ  ６４０、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、シアニン５、シアニンが５．５およびＡＴＴＰ  ６８０が含まれる。適切な蛍光団と一緒に使用できる消光団には、ＴＡＭ、ＢＨＱ１、ＤＡＢ、Ｅｃｌｉｐ、ＢＨＱ２およびＢＢＱ６５０が含まれ、任意には、蛍光団がＨＥＸ、テキサスレッドおよびＦＡＭから選択される。蛍光団と消光団との好ましい組み合わせには、ＦＡＭとＢＨＱ１およびテキサスレッドとＢＨＱ２が含まれる。
【０１１９】
ｑＰＣＲアッセイにおけるプローブの使用
本発明の加水分解プローブは、典型的には、濃度を適合させた陰性対照で最適化された温度勾配である。好ましくは、単一工程ＰＣＲ反応が最適化される。より好ましくは、標準曲線が計算される。ライゲーションされた配列の連結におよび結合する特定のプローブを使用する利点は、ネスト化されたＰＣＲアプローチを使用せずに、ライゲーションされた配列の特異性を実現できることである。本明細書に記載される方法は、低コピー数の標的の正確かつ精細な定量を可能にする。標的のライゲーションされた配列は、温度勾配最適化の前に、精製、例えばゲル精製することができる。ターゲットのライゲーションされた配列は配列決定され得る。好ましくは、ＰＣＲ反応は、約１０ｎｇ、または５〜１５ｎｇ、または１０〜２０ｎｇ、または１０〜５０ｎｇ、または１０〜２００ｎｇのテンプレートＤＮＡを使用して行われる。フォワードプライマーとリバースプライマーは、例えば、配列に相補的であることにより、一方のプライマーがライゲーションされたＤＮＡ配列で表される染色体領域の１つの配列に結合し、他方のプライマーがライゲーションされたＤＮＡ配列で表される他の染色体領域に結合するように設計される。
【０１２０】
ライゲーションしたＤＮＡ標的の選択
本発明は、ライゲーションされた配列に結合および増幅する能力に基づいてプライマーを選択し、そして特にそれが標的配列の曲率で結合する標的配列のプローブ配列に基づく特性を選択することを含む、本明細書で定義されるＰＣＲ法で使用するプライマーおよびプローブの選択を含む。
【０１２１】
プローブは、典型的には、制限部位にまたがる制限断片が並置されるライゲーションされた配列に結合するように設計／選択される。本発明の一実施形態では、特定の染色体相互作用に関連する可能性のあるライゲーションされた配列の予測曲率は、例えば、本明細書で参照される特定のアルゴリズムを使用して計算される。曲率は、ヘリカルターンあたりの度数で表すことができ、例えばヘリカルターンあたり１０．５°である。ライゲーションされた配列は、ヘリカルターンあたり少なくとも５°、通常はヘリカルターンあたり少なくとも１０°、１５°または２０°、例えばヘリカルターンあたり５°〜２０°の曲率傾向ピークスコアを有するターゲットに対して選択される。好ましくは、ヘリカルターンあたりの曲率傾向スコアは、ライゲーション部位の上流および／または下流の少なくとも２０、５０、１００、２００または４００塩基、例えば、２０〜４００塩基について計算される。したがって、一実施形態では、ライゲーション産物の標的配列は、これらのレベルの湾曲のいずれかを有する。ターゲット配列は、最低の熱力学的構造自由エネルギーに基づいて選択することもできる。
【０１２２】
特別な実施形態
一実施形態においては、染色体内相互作用のみが分類／検出され、染色体外相互作用（異なる染色体間）は分類／検出されない。
【０１２３】
特別な実施形態においては、特定の染色体相互作用、例えば本明細書において言及される任意の具体的な相互作用（例えば、本明細書において言及されるいずれかのプローブまたはプライマーペアにより定義されるような）は分類されない。いくつかの実施形態においては、染色体相互作用は、本明細書に記載された遺伝子のいずれかに、例えば、図２および４に記載されている任意のまたはすべての遺伝子などの、図に記載された任意の遺伝子に分類されない。
【０１２４】
一実施形態において、表５〜７のいずれかまたはすべてのプローブまたはプライマーによりより表される染色体相互作用は、いずれも分類されない。別の実施形態において、表５〜７のいずれかまたはすべてに挙げられる遺伝子のいずれかに存在する染色体相互作用は、いずれも分類されない。さらなる実施形態において、表５〜７のいずれかまたはすべてに挙げられる領域のいずれかに存在する染色体相互作用は、いずれも分類されない。
【０１２５】
一実施形態において、免疫応答性は、抗体療法に関係しない。別の実施形態においては、免疫応答性は、抗−ＰＤ−１療法、例えばメラノーマの抗−ＰＤ−１療法に関係しない。別の実施形態においては、免疫応答性は、血液がん、白血病、前立腺がん、乳がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の１つ以上の治療と関係しない。
【０１２６】
スクリーニング法
本発明は、どの染色体相互作用が集団の免疫応答性サブグループに対応する染色体状態と関係するのかを決定する方法であり、サブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させ、相補的配列をハイブリダイズさせ、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用に集まっている両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、かつ核酸の第１のセットおよび第２のセットの間のハイブリダイゼーションのパターンによりどの染色体相互作用が免疫応答性サブグループに特異的であるかの決定が可能となる方法を提供する。サブグループは、例えば特定の病状や療法を参照して、本明細書に定義された具体的なサブグループのいずれかであり得る。
【０１２７】
刊行物
本明細書において言及されるすべての刊行物の内容は、参照により本明細書に組み入れられ、そして本発明に関連する特質をさらに規定するために用いられ得る。
【０１２８】
表
表１は、免疫応答性検査用マーカーの最終のセットを示す。
表２は、抗ＰＤ−１および抗−ＰＤ−Ｌ１試験の間で共有されるマーカーを示す。
表３は、インターフェロンガンマ活性化ＯＲＦと重複するマーカーを示す。
表４は、免疫応答性に関するマーカーを検出するために使用することのできるプライマーペアを示す。
表５〜７は、特定の実施形態に含まれないマーカー、遺伝子および領域を示す。
表８は、免疫チェックポイント分子を示す。
表９は、がん療法の例を提供する。
表１０および１１は、本発明の特定の実施形態のための組み合わせ療法および単独療法を示す。いくつかの実施形態では、これらは、その応答性について検査される療法である。別の実施形態では、これらの治療法は、本発明による検査の結果によって患者に施される。
表１２は、本発明に関係する遺伝子の説明を提供する。
表１３は、免疫応答性を検査するためのマーカーのさらなるセットを示す。
表１４および１５は、本発明の実施形態に関する遺伝子を説明する。
表１６〜１８は、免疫応答性を検査するためのマーカーを示す。
【０１２９】
本発明の実施形態
Ａ項。集団におけるサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスであり、その染色体の状態に関係する染色体相互作用がゲノムの定義された領域内に存在するかまたは存在しないかを検出することを含むプロセスであって、前記サブグループは個体がその程度免疫応答性であるかに関し；かつ
−前記染色体相互作用が、任意には、どの染色体相互作用が集団の免疫応答性相互作用サブグループに対応する染色体状態に関連付けられるのかを決定する方法により同定されており、該方法は、染色体の異なる状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させ、そして相補配列がハイブリダイズできるようにすることを含み、ここで、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用に集まっている両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、かつ核酸の第１のセットおよび第２のセットの間のハイブリダイゼーションのパターンによりどの染色体相互作用が免疫応答性サブグループに特異的であるかの決定が可能となり；そして
−染色体相互作用が、
（ｉ）表１に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（ii）表１に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iii）（ｉ）または（ii）を含むか、または（ｉ）または（ii）に隣接する４，０００塩基領域に存在する；
または
（ａ）表１３に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（ｂ）表１３に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）を含むか、または（ａ）または（ｂ）に隣接する４，０００塩基領域に存在する；
または
（α）表１６に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（β）表１６に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（γ）（α）または（β）を含むか、または（α）または（β）に隣接する４，０００塩基領域に存在する
のいずれかである
プロセス。
【０１３０】
Ｂ項．染色体相互作用の特異的な組み合わせが、
（ｉ）表１のプローブにより表されるすべての染色体相互作用を含む；または
（ii）表１のプローブにより表される少なくとも１０、５０、１００、１５０、２００または３００個の染色体相互作用を含む；および／または
（iii）表１に挙げられる少なくとも１０、５０、１００、１５０または２００個の領域または遺伝子に一緒に存在する；および／または
（iv）表１のプローブにより表される染色体相互作用を含むか、または表１のプローブにより表される染色体相互作用に隣接する４，０００塩基領域に存在する少なくとも１０、５０、１００、１５０、２００または３００個の染色体相互作用を含む
に分類されるＡ項記載のプロセス。
【０１３１】
Ｃ項．染色体相互作用の特異的な組み合わせが、
（ｉ）表１３のプローブにより表されるすべての染色体相互作用を含む；または
（ii）表１３のプローブにより表される少なくとも１０、５０、１００、１５０、２００または３００個の染色体相互作用を含む；および／または
（iii）表１３に挙げられる少なくとも１０、５０、１００、１５０または２００個の領域または遺伝子に一緒に存在する；および／または
（iv）表１３のプローブにより表される染色体相互作用を含むか、または表１３のプローブにより表される染色体相互作用に隣接する４，０００塩基領域に存在する少なくとも１０、５０、１００、１５０、２００または３００個の染色体相互作用を含む
に分類されるＡ項記載のプロセス。
【０１３２】
Ｄ．染色体相互作用が、
−個体由来のサンプルにおいて、および／または
−染色体相互作用の部位でのＤＮＡループの存在または非存在を検出することにより、および／または
−染色体コンフォメーションに集められる染色体の遠位領域の存在または非存在を検出することにより、および／または
−前記分類のあいだに生成され、その配列が、染色体相互作用に集められる染色体の領域に各々対応する２つの領域を含むライゲーションされた核酸の存在を検出することにより、ここで、ライゲーションされた核酸の検出が、好ましくは、
（ｉ）表１に記載される特異的プローブ配列のいずれかに少なくとも７０％の同一性を有するプローブを用いる、および／または（ii）表４のいずれかのプライマーペアと少なくとも７０％の同一性を有するプライマーペア；または
（ａ）表１３に記載される特異的プローブ配列のいずれかに少なくとも７０％の同一性を有するプローブを用いる、および／または（ｂ）表１３のいずれかのプライマーペアと少なくとも７０％の同一性を有するプライマーペア
のいずれかを用いるものである上記の項のいずれかに記載のプロセス。
【０１３３】
Ｅ．−核酸の第２のセットが核酸の第１のセットより大きな個体グループ由来である；および／または
−核酸の第１のセットが、少なくとも８個体由来である；および／または
−核酸の第１のセットは、第１のサブグループ由来の少なくとも４個体、および好ましくは第１のサブグループとは重複しない第２のサブグループからの少なくとも４個体由来である；および／または
−プロセスが医学的治療に対して個体を選択するために実施される；および／または
−免疫応答性が免疫療法または免疫チェックポイント療法に対する応答性である；および／または
−免疫応用性が癌免疫療法に対する応答性である；および／または
−プロセスが、１以上の定義された時点での免疫応答性を決定するために行なわれ、任意には少なくとも１つの時点が治療経過中である
上記の項のいずれかに記載のプロセス。
【０１３４】
Ｆ．−核酸の第２のセットが非選択グループを表し；および／または
−核酸の第２のセットが、定義された位置でアレイに結合され；および／または
−核酸の第２のセットが、少なくとも１００の異なる遺伝子における染色体相互作用を表し；および／または
−核酸の第２のセットが、少なくとも１，０００の異なる染色体相互作用を表す少なくとも１，０００の異なる核酸を含み；および／または
−核酸の第１のセットおよび核酸の第２のセットが、１０〜１００ヌクレオチド塩基長を有する少なくとも１００核酸を含む
上記の項のいずれかに記載のプロセス。
【０１３５】
Ｇ．核酸の第１のセットが、
（ｉ）染色体相互作用に集まっている染色体領域の架橋工程；
（ii）前記架橋された領域を、任意には酵素による制限消化切断により、切断させる工程；および
（iii）前記架橋され切断されたＤＮＡ端をライゲーションして核酸の第１のセット（特にライゲーションされたＤＮＡを含む）を生成する工程
を含むプロセスにおいて得られる上記の項のいずれかに記載のプロセス。
【０１３６】
Ｈ．−少なくとも１０〜２００の異なる染色体相互作用が、好ましくは１０〜２００の異なる領域または遺伝子において分類され；かつ任意には（ａ）５０〜１００の異なる染色体相互作用が分類され、各々が表１に定義される異なる遺伝子および／または異なる領域にある；または（ｂ）５０〜１００の異なる染色体相互作用が分類され、各々が表１３に定義される異なる遺伝子および／または異なる領域にある；
および／または
−個体が免疫療法を受けるかどうかを選択するために行われ、ここで免疫療法は、好ましくは低分子免疫療法、抗体免疫療法または細胞免疫療法を含む
上記の項のいずれかに記載のプロセス。
【０１３７】
Ｉ．（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む；および／または
（ii）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現する；および／または
（iii）非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を発現する；および／または
（iv）少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基をコードする核酸配列を発現する；および／または
（ｖ）制御エレメントを発現する；および／または
（vii）ＣＴＣＦ結合部位を含む
上記の項のいずれかに記載のプロセス。
【０１３８】
Ｊ．免疫療法のための治療剤を同定または設計するために行われる上記の項のいずれかに記載のプロセスであって、
−好ましくは前記プロセスが、候補薬剤が、免疫応答性の異なるレベルに関連付けられる染色体状態への変化を引き起こすことができるかどうかを検出するために使用される；
−染色体相互作用が、表１のいずれかのプローブにより表され；および／または
−染色体相互作用が表１に挙げられるいずれかの領域または遺伝子に存在し；
および任意には：
−染色体相互作用が、請求項１に定義される、いずれの染色体相互作用が染色体の状態に関連するかを決定する方法により同定されており、および／または
−染色体相互作用の変化が、（ｉ）表１に記載されているプローブ配列のいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプローブ、および／または（ii）表４のプライマーペアのいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプライマーペアを用いてモニターされる
プロセス。
【０１３９】
Ｋ．免疫療法のための治療剤を同定または設計するために行われる上記の項のいずれかに記載のプロセスであって、
−好ましくは前記プロセスが、候補薬剤が、免疫応答性の異なるレベルに関連付けられる染色体状態への変化を引き起こすことができるかどうかを検出するために使用される；
−染色体相互作用が、表１３のいずれかのプローブにより表され；および／または
−染色体相互作用が表１３に挙げられるいずれかの領域または遺伝子に存在し；
および任意には：
−染色体相互作用が、請求項１に定義される、いずれの染色体相互作用が染色体の状態に関連するかを決定する方法により同定されており、および／または
−染色体相互作用の変化が、（ｉ）表１３に記載されているプローブ配列のいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプローブ、および／または（ii）表１３のプライマーペアのいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプライマーペアを用いてモニターされる
プロセス。
【０１４０】
Ｌ．染色体相互作用の検出に基づき標的を選択すること、および好ましくは、標的のモジュレーターをスクリーニングして免疫療法のための治療剤を同定することを含み、前記標的が任意にはタンパク質である上記Ｊ項またはＫ項記載のプロセス。
【０１４１】
Ｍ．Ａ項〜Ｉ項のいずれかに記載のプロセスによって治療剤が必要であると同定されている個体における免疫療法における使用のための治療剤。
【０１４２】
Ｎ．分類または検出が、ライゲーション産物を増幅可能なプライマーおよびＰＣＲ反応中にライゲーション部位に結合するプローブを用いる定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるライゲーション産物の特異的な検出を含み、前記プローブが染色体相互作用に集まっている各染色体領域由来の配列に相補的な配列を含み、好ましくは、前記プローブは、
前記ライゲーション産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および／または
オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合される蛍光団、および／または
オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合される消光団、および
任意に、
前記蛍光団がＨＥＸ、テキサスレッドおよびＦＡＭから選択され；および／または
前記プローブが１０〜４０ヌクレオチド塩基長、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド塩基長の核酸配列
を含むＡ項〜Ｋ項のいずれかに記載のプロセスまたはＭ項記載の治療剤。
【０１４３】
具体的な態様
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術は、遺伝子座における正常および異常な病状の間での調節的変化についてのエピジェネティックな調節的シグネチャーを検出する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、染色体コンフォメーションシグネチャーとしても知られるヒト染色体の調節的高次構造と関連がある遺伝子調節の基本的なエピジェネティックレベルを同定しかつモニターする。染色体シグネチャーは、遺伝子脱調節のカスケードにおける個別の一次工程である。それらは、ＤＮＡメチル化およびＲＮＡプロファイリングなど、後期エピジェネティックおよび遺伝子発現のバイオマーカーを利用するバイオマーカープラットフォームに対して、固有の一連の利点を有する高次バイオマーカーである。
【０１４４】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイアッセイ
カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングプラットフォームは、１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋの固有の染色体コンフォメーションという４つの密度があり、それぞれのキメラフラグメントはアレイで４回繰り返され、それぞれ６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１０万という効果的な密度を作製する。
【０１４５】
カスタム設計されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ
１５ＫのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見技術で詮索された３００個前後の遺伝子座を含むゲノム全体をスクリーニングし得る。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに構築され；この技術は、６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１０万個という４つの密度のプローブを付与する。各ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブは四つ組として提示されるため、アレイあたりの密度は１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋに減り、ゆえに再現性についての統計的評価を可能にする。遺伝子座あたりの詮索される潜在的ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの平均数は５０であり；そのため、検討され得る遺伝子座の数は３００、９００、２０００、および５０００である。
【０１４６】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）カスタムアレイパイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、１組のサンプルを有する二色システムであり、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリ生成の後、Ｃｙ５で標識され、かつ比較／解析される対象となるサンプル（対照）の他方はＣｙ３で標識される。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｃａｎスキャナーを用いてスキャンされ、かつ結果として生じた特質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを用いて抽出される。次いで、データは、ＲにおけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ処理スクリプトを用いて処理される。アレイは、ＲにおけるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒにおける標準的な二色パッケージ：Ｌｉｍｍａ*を用いて処理される。アレイの正規化は、Ｌｉｍｍａ*におけるアレイ内正規化機能を用いてなされ、かつこれは、オンチップのＡｇｉｌｅｎｔ陽性対照およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）陽性対照に対してなされる。データはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｌａｇコールに基づいてフィルターにかけられ、Ａｇｉｌｅｎｔ対照プローブは除去され、かつ技術的複製プローブは平均化されて、それらはＬｉｍｍａ*を用いて解析される。プローブは、比較されておりかつ次いで偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  ｒａｔｅ）を用いることによって補正されている２つのシナリオ間でのそれらの差に基づいてモデル化される。＜＝１．１または＝＞１．１でありかつｐ＝０．０１のＦＤＲ  ｐ値を通過する、＜３０％の変動係数（ＣＶ）を有するプローブが、さらなるスクリーニングに用いられる。プローブセットを縮小するために、さらなる多因子分析が、ＲにおけるＦａｃｔｏｒＭｉｎｅＲパッケージを用いて実施される。
【０１４７】
*注記：ＬＩＭＭＡは、マイクロアレイ実験における差異的発現を評価するための線形モデルおよび経験ベイズ法である。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−Ｓｅｑにより生じる遺伝子発現データの解析のためのＲパッケージである。
【０１４８】
プローブのプールは、最終選抜のために、調整されたｐ値、ＦＣ、および＜３０％のＣＶ（任意のカットオフポイント）のパラメータに基づいて初めに選択される。さらなる解析および最終リストは、最初の２つのパラメータ（調整されたｐ値；ＦＣ）のみに基づいて導出される。
【０１４９】
統計的パイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームへの転換のための高値ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを選択するために、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）スクリーニングアレイを、ＲにおけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）解析パッケージを用いて処理する。
【０１５０】
工程１
プローブを、改変した線形回帰モデルの産物であるそれらの補正ｐ値（偽発見率、ＦＤＲ）に基づいて選択する。ｐ値≦０．１より下のプローブが選択され、次いでそれらのエピジェネティック比（ＥＲ）によってさらに減らされ、さらなる解析に選択されるためにプローブＥＲは≦−１．１または≧１．１でなければならない。最後のフィルターは変動係数（ＣＶ）であり、プローブは≦０．３より下でなければならない。
【０１５１】
工程２
統計リストの上位４０種のマーカーが、ＰＣＲ転換に対するマーカーとしての選択のためにそれらのＥＲに基づいて選択される。最も大きい負のＥＲ負荷を有する上位２０種のマーカー、および最も大きい正のＥＲ負荷を有する上位２０種のマーカーがリストを形成する。
【０１５２】
工程３
工程１からの結果として生じたマーカーである統計的に有意なプローブが、超幾何学的濃縮（ＨＥ）を用いたエンリッチメント解析の基盤を形成する。この解析は、有意なプローブリストからのマーカー縮小を可能にし、かつ工程２からのマーカーとともに、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームに転換されるプローブのリストを形成する。
【０１５３】
統計的プローブをＨＥによって処理して、どの遺伝的位置が統計的に有意なプローブの濃縮を奏するかを判定し、どの遺伝的位置がエピジェネティックな差の中心地であるかが示される。
【０１５４】
補正されたｐ値に基づく最も有意な濃縮された遺伝子座が、プローブリスト作成のために選択される。０．３または０．２のｐ値より下の遺伝的位置が選択される。工程２からのマーカーとともに、これらの遺伝的位置にマッピングする統計的プローブが、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ転換のための高値マーカーを形成する。
【０１５５】
アレイの設計および処理
アレイの設計
１．遺伝子座をＳＩＩソフトウェア（現在、ｖ３．２）を用いて処理して、
ａ．これらの特異的遺伝子座におけるゲノムの配列（５０ｋｂ上流および２０ｋｂ下流を有する遺伝子配列）を取り出す。
ｂ．この領域内の配列がＣＣｓに関与している確率を規定する。
ｃ．特異的ＲＥを用いて配列を切る。
ｄ．制限フラグメントが、ある特定の配向で相互作用する可能性があるかを判定する。
ｅ．一緒に相互作用する種々のＣＣｓの可能性をランク付けする。
２．アレイサイズ、それゆえ利用可能なプローブ箇所の数（ｘ）を判定する。
３．ｘ／４個の相互作用を取り出す。
４．各相互作用に対して、パート１から制限部位まで３０ｂｐおよびパート２の制限部位まで３０ｂｐの配列を規定する。それらの領域がリピートでないことをチェックし、そうであれば除外し、かつリストの下にある次の相互作用を選ぶ。両方の３０ｂｐをつなぎ合わせてプローブを規定する。
５．ｘ／４個のプローブ、それに加えて規定の対照プローブのリストを創出し、かつ４回複製して、アレイ上に創出されるべきリストを創出する。
６．カスタムＣＧＨアレイに対するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｕｒｅ  ｄｅｓｉｇｎウェブサイトにプローブのリストをアップロードする。
７．プローブ群を用いて、ＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイを設計する。
【０１５６】
アレイの処理
１．鋳型産生のために、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＳＯＰ）を用いてサンプルを処理する。
２．アレイ処理ラボラトリーによって、エタノール沈殿で浄化する。
３．Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＴａｇ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ標識キット−Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ＣＧＨ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｏｄ，  Ｃｅｉｌｓ  ｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅｓのとおりサンプルを処理する。
４．Ａｇｉｌｅｎｔ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを用いるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いてスキャンする。
【０１５７】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーシグネチャーは、複雑な疾患表現型の層別化において高い構造安定性、感度、および特異性を示す。この技術は、エピジェネティクスの化学、染色体コンフォメーションシグネチャーのモニタリングおよび評価における最新のブレークスルーを、エピジェネティックバイオマーカーの非常に有益なクラスとして活用する。学術環境において展開されている現在の研究方法論は、ＣＣＳｓを検出するために細胞材料の生化学的処理に３〜７日を必要とする。これらの手順により、感度および再現性が制限され、さらに、設計段階ではＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）分析パッケージによって提供されるターゲットを絞った洞察の利点をもたない。
【０１５８】
コンピューターによるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイマーカー同定
ゲノム中のＣＣＳ部位は、関連するすべての層別化されたリードバイオマーカーを特定するために、試験コホートの臨床サンプルについてＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによって直接評価される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプラットフォームは、その高スループット容量と、多数の遺伝子座を迅速にスクリーニングする機能により、マーカーの同定に使用される。使用したアレイは、問い合わせされるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏソフトウェアによりマーカーを同定することが可能となるＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイであった。
【０１５９】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによって同定された潜在的なマーカーは、その後、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲまたはＤＮＡシーケンサー（すなわち、Ｒｏｃｈｅ  ４５４、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮなど）によって検証される。統計的に有意であり、最高の再現性を示す上位のＰＣＲマーカーは、最終的なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）シグネチャセットにさらに削減するために選択され、サンプルの独立したコホートで検証される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲは、確立された標準化された操作手順プロトコルに従って、訓練を受けた技術者により実行される。すべてのプロトコルおよび試薬の製造は、ＩＳＯ  １３４８５および９００１認定の下で行われ、作業の品質とプロトコルの移転能力を保証する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲおよびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイバイオマーカープラットフォームは、全血および細胞株両方の分析に適合する。試験は、少量の血液を使用して非常に低いコピー数の異常を検出するのに十分な感度である。
【実施例】
【０１６０】
最初の試験では、メラノーマを有する患者が、抗−ＰＤ−１（ペンブロリツマブ）で１２週間治療された。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈにより測定されるそれらのエピジェネティックな状態が、まず治療前のベースラインで、そしてその後１２週で、応答または非応答の臨床読み出しと共に評価された。我々は、次に、ベースラインで３Ｄゲノム構造プロファイル、染色体コンフォメーションシグネチャーの一部をスクリーニング、評価、検証して、ゲノム全体で３３２を超える遺伝子位置での治療に対する応答または非応答をもたらすプロファイルを特定した。これらは、技術的および生物学的リピートにおけるこれらの遺伝的位置での局所的な複数の３Ｃ相互作用を調べるＥｐｉＳｗｉｔｃｈアレイで評価され、ベースラインでレスポンダーおよびノンレスポンダー由来のサンプルを比較した。１４，０００以上のＥｐｉＳｗｉｔｃｈマーカーがアレイで直接評価された。最良のマーカーはＰＣＲに翻訳され、独立した患者コホートで評価された。
【０１６１】
図１は、試験に用いられた患者の臨床注釈の例を示す。色分けされた印：赤に挙げた患者をアレイスクリーニングに使用した。青の患者は、検証のための独立したコホートの一部として使用された。それらの患者は、ロバストなバイオマーカーの開発において重要であるマーカー選択のために使用されなかった。応答または非応答の臨床評価は、標準ＲＥＳＩＳＴ１．１基準により定義された。
【０１６２】
段階１は、初期アレイスクリーニングおよび１４０００のマーカーリード（パターン認識により予測されるすべて）に対する評価からなる。段階２は、統計学的に有意なマーカーリードのアレイからＰＣＲへの翻訳である。最終のシグネチャーにおける最終マーカー数の減少についての回帰分析によるマーカーのＰＣＲによるさらなる評価。段階３は、６個の最良バイオマーカーの最終シグネチャーの検証である（図２に示される）。図２の表は、最良のバイオマーカーの名称、それらが位置する遺伝子座を示し、すなわちこの遺伝子座においてそれらが全体の調節に特定の方法で寄与する。
【０１６３】
図３は、アレイ分析（レスポンダーおよびノンレスポンダーに関するベースラインを比較する）からの最良の予測バイオマーカーおよび最良の応答バイオマーカー（ベースラインおよび１２週でのレスポンダーを比較する）に関するベン図を示す。重複は、レスポンス開始時に存在する良好な応答バイオマーカーを与えるのみならず、１２週にわたってモニターすることもできる。
【０１６４】
図４は、いくつかの最終的なシグネチャーバイオマーカーに対する個人の患者バイナリＰＣＲ読み出しの例である：１  ＣＣｓが存在、０  ＣＣＳが非存在。視覚的にレスポンダーおよびノンレスポンダーのプロファイルの違いを見ることができる。Ｒはレスポンダーである。ＮＲはノンレスポンダーである。
【０１６５】
図５は、抗−ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体で治療した肺がんを患う患者の２つの群を示す。血液が、治療前のベースライン（ＢＬ）、および治療開始から２週間後（２Ｗ）で集められた。応答に対する２つのグループの同定は確立されたが、元の試験では、グループＩおよびグループIIに盲検化されている。最初の試験からの抗ＰＤ−１からの反応を予測する上位３０のＰＣＲに基づくマーカーリードは、挙げられたすべての患者について評価した。
【０１６６】
図６は、グループＩとIIとを識別する統計的に有意な上位１３のマーカーの統計分析を示す。ＰＤＣＤ１ＬＧ２およびＳＴＡＴ５もまた、元の抗ＰＤ−１試験における最上位の識別マーカーである：ノンレスポンダーに対してＰＤＣＤ１ＬＧ２、そしてレスポンダーに対してＳＴＡＴ５Ｂ。これは、グループＩおよびＩＩをレスポンダーグループおよびノンレスポンダーグループとして正しく同定する助けとなる。バイオマーカーは、第１の試験ではＰＤ−１、または第２の試験ではそのリガンドＰＤ−Ｌ１のいずれかによって誘発される、同じ免疫療法チェックポイント細胞ネットワークの規制緩和を監視し、同じマーカーで重複する機能を共有する−６個の非応答マーカー、７個の応答マーカー、ＰＤ−１に関する第１の試験からの７つの応答マーカーは、ＰＤ−Ｌ１を使用した第２の試験でなお有効である。
【０１６７】
図７は、ＰＤ−Ｌ１コホートから選択された上位１３マーカーの主成分分析（ＰＣＡ）を示す。これは３Ｄ  ＰＣＡであり、層別化の最初の３成分上にレスポンダーおよびノンレスポンダーの良好な分離を示す。注目すべきことに、ノンレスポンダー（暗い三角形）は、治療のベースライン（Ａ）および２週間（Ｂ）について同じ患者の間でも分ける。これは、エピジェネティックプロファイルがレスポンダーおよびノンレスポンダーでどの程度厳密に制御されているかに関連する別々の特徴である。
【０１６８】
図８は、異なる抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナルを使用して肺がん患者に対して行われた別の第３の試験で、１５人の患者のベースラインサンプルが、治療に対する応答／非応答の注釈で盲検として提供された方法を示す。第１の試験（メラノーマのＰＤ−１治療）の８人の患者および第２の試験（肺がんにおける異なるＰＤ−Ｌ１）の２４人の患者を用い、第１の試験と第２の試験を組み合わせ、マーカーのプールを評価し、その後、統計上の有意性に関して上位５つのマーカーを（表に記載）、１５の盲検サンプルを分類するために使用した。
【０１６９】
図９は、挙げられた５つのマーカーに基づいて構築されたランダムフォレスト分類子が、１５個のサンプル（予測欄）のそれぞれに対して予測コールを生成する方法を示す。図１０は、非盲検検証（実際欄）と比較した各サンプルの予測コールを示す。層別化の効率を表に示す。感度７１％、特異度８７．５％、陽性予測値８３％（この患者選択の内容において重要）、陰性予測値７７％。
【０１７０】
図１１は、分類子に対する標準ｒＯＣ曲線を示す。ＡＵＣ＝０．７８６
【０１７１】
図１２は、この分析で使用されるすべてのサンプルの主成分分析を示す：第１試験から８、第２試験から２４、検証から１５。最初の主要成分上、レスポンダーおよびノンレスポンダーの分離はすでに自明である。オープン分類子には、全４７サンプルに対して誤ってコールされたサンプルは２つのみである。
【０１７２】
第３の試験は、肺がんにおける抗ＰＤ−Ｌ１治療に関する。スクリーニングのアレイ段階で、１２人のレスポンダーと１２人のノンレスポンダーを、合計１８０，０００回の読み出し（技術的および生物学的繰り返し）に関するアレイ上、ベースラインで比較した。次に、アレイからの上位１００のマーカーリードのＰＣＲ翻訳と、それに続く検証が行われた。
【０１７３】
ＰＤ−１（試験Ｉ）、ＰＤ−Ｌ１（試験II）、ＰＤ−Ｌ１試験IIIのアレイからのマーカーリードの比較を行った。図１３は、レスポンダーの共通２５２２リードの重複を示す。  図１４は同じであるが、今度は最も統計的に有意である−レスポンダーに対する両方の試験で２７６の共通の有意なリードを調べていることを示す（左側に試験Ｉ、右側に試験II）。図１５も同じであるが、１のみがノンレスポンダーに関することを示す（左側に試験Ｉ、右側に試験II）。
【０１７４】
図１６は、応答マーカーと非応答マーカー（試験ＩおよびIII）のアレイ読み取りの遺伝子座が、インターフェロンガンマ経路に関与する遺伝子とどのように重複するかを示す。インターフェロンガンマ治療はＰＤ−Ｌ１発現を増加させる可能性があり、これは治療に対する応答の素因の臨床的観察である。図１７は同じであるが、統計的に有意なデータのみを示す。図１８は同じであるが、すべての試験Ｉ〜IIIについて示す。
【０１７５】
図１９は、４つのコホート：ＩＮＦＧ経路に対する遺伝子座（ＯＲＦｓ）、抗−ＰＤ−Ｌ１レスポンダーおよびノンレスポンダー、すべての抗−ＰＤ−１、にわたるベン図を示す。
【０１７６】
図２０は、４つのコホート：ＩＮＦＧ経路に対する遺伝子座（ＯＲＦｓ）、抗−ＰＤ−１レスポンダーおよびノンレスポンダー、すべての抗−ＰＤ−Ｌ１、にわたるベン図を示す。
【０１７７】
図２１は、試験Ｉ〜IIIとＩＮＦＧ遺伝子の間で共有されるレスポンダーマーカーのすべての遺伝子座を示す。図２２は同じであるが、３つの試験Ｉ〜IIIのすべてで共有された有意な応答ＥｐｉＳｗｉｔｃｈマーカーのいくつかを含む９５の遺伝子座のリストと共に示す。図２３は、これらの遺伝子座をアレイ上で評価した場合の、有意なマーカーリードの数とマーカーリードの総数を示す図２２からの遺伝子座リストを示す。図２４は、ＰＤＦ−Ｌ１の有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＣＳに関連付けられたＯＲＦに一致したインターフェロンシグナル伝達経路を示す。
【０１７８】
ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１治療におけるレスポンダーのマーカーとして共通のエピジェネティック設定を確立した後、我々はエピジェネティック設定の制御下で観察された遺伝的位置をタンパク質産物まで追跡し、既知のタンパク質−タンパク質ネットワークおよびそれらの機能的役割の観点からそれらのタンパク質のネットワーク関係を調査した。応答のＥｐｉＳｗｉｔｃｈマーカーの影響を受ける遺伝子座をＳｔｒｉｎｇデータベースネットワークに重ね合わせると、レスポンダーのエピジェネティックに制御されたタンパク質が、２つの機能：免疫応答−調節細胞表面受容体シグナル伝達経路およびＴ−細胞活性化の調節に関連する密接なネットワークに関与していることを示す。
【０１７９】
具体的な結論
マーカーは、ベースラインで、免疫療法（免疫チェックポイント療法を含む）に対する良好な反応が得られるように設定されている患者、すなわちレスポンダーとそうでない患者、すなわちノンレスポンダーまたは進行者とを同定するために統計学的に有意な普及力を有するということが同定されている。表１のマーカーは、メラノーマまたは肺がん（ＮＳＣＬＣ）のいずれかを患う３つの独立したコホートにわたるレスポンダーの共通の普遍的なプロファイルを表す。メラノーマ患者は、ＰＤ−１（ペムブロリズマブ）で治療され、ＮＳＣＬＣは、２つの異なるＰＤ−Ｌ１で治療された。これらは、治療を予測する不可知論的マーカーであり、さまざまな種類のがんに存在する。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２遺伝子座の間に位置する、ノンレスポンダーの１つの重要な不可知論的で普遍的な予測マーカーもある。
【０１８０】
表１のマーカーのリストは、レスポンダーの共通のネットワーク調節を反映している。  これらは、免疫学的ネットワーク応答を制御する標準的な免疫チェックポイント分子を標的とする治療への反応を含む、さまざまな治療および状態にわたる応答／非応答を監視するための不可知論的（agnostic）マーカーとして使用することができる。
【０１８１】
今後の研究
染色体構造シグネチャー（ＣＣＳ）に基づいてエピジェネティックな変化を同定するという目標の継続は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療のために、単独または併用で、抗ＰＤ−１療法に応答するであろう推測的な患者を選択できるようになるであろう。次に、このアレイスクリーニングから発見されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーは、ベースライン患者のサンプルで３つの免疫療法コホート、２つの抗ＰＤ−Ｌ１療法、１つの抗ＰＤ−１療法（ペンブロリズマブ）を用いるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームを用いてスクリーニングされ、そして検証された。２つの抗ＰＤ−Ｌ１応答ＣＣＳはＮＳＣＬＣ患者で開発され、ペンブロリズマブ応答ＣＣＳはメラノーマ患者で開発され、そしてＮＳＣＬＣ患者でさらに検証された。表１３、１６および１８は、さらなる研究の結果を提供し、免疫応答性を決定するために使用することができるマーカーのさらなるセットを示す。
【０１８２】
試験設計
転移性メラノーマの試験では、転移性メラノーマを患う１６人の患者由来の合計３２の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルが調べられた。これらの患者は抗ＰＤ１療法を受けていた。患者は、ベースラインおよび１２週間の２つの時点で腫瘍評価された。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈアレイを使用するディスカバリー段階では、合計１６のサンプルが使用された。アレイスクリーニングから同定された上位１００のＥｐｉＳｗｉｔｃｈマーカーは、ベースラインと１２週間のサンプルで検証され、抗ＰＤ１療法への応答および薬力学的効果が同定された。上位のＥｐｉＳｗｉｔｃｈマーカーは、抗ＰＤ−１療法に対するレスポンダーおよびノンレスポンダーの２つのグループに分類された。
【０１８３】
ＮＳＣＬＣ試験では、抗ＰＤ−Ｌ１療法で治療された非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者由来の合計１６のベースラインＰＢＭＣが調べられた。３０のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）予測マーカーが評価された。このプロジェクトの目的は、抗ＰＤ−Ｌ１療法で治療されたベースラインＮＳＣＬＣ患者における抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１予測プロファイルに共通するＥｐｉＳｗｉｔｃｈマーカーの予測能力を確認することであった。
【０１８４】
【表１】
2021501592.tif 000002
【０１８５】
【表２】
2021501592.tif 000003
【０１８６】
【表３】
2021501592.tif 000004
【０１８７】
【表４】
2021501592.tif 000005
2021501592.tif 000006
2021501592.tif 000007
【０１８８】
【表５】
2021501592.tif 000008
【０１８９】
【表６】
2021501592.tif 000009
【０１９０】
【表７】
2021501592.tif 000010
2021501592.tif 000011
【０１９１】
【表８】
2021501592.tif 000012
2021501592.tif 000013
【０１９２】
【表９】
2021501592.tif 000014
2021501592.tif 000015
【０１９３】
【表１０】
2021501592.tif 000016
2021501592.tif 000017
2021501592.tif 000018
【０１９４】
【表１１】
2021501592.tif 000019
2021501592.tif 000020
【０１９５】
【表１２】
2021501592.tif 000021
2021501592.tif 000022
【０１９６】
【表１３】
2021501592.tif 000023
2021501592.tif 000024
【０１９７】
【表１４】
2021501592.tif 000025
2021501592.tif 000026
【０１９８】
【表１５】
2021501592.tif 000027
2021501592.tif 000028
【０１９９】
【表１６】
2021501592.tif 000029
2021501592.tif 000030
2021501592.tif 000031
【０２００】
【表１７】
2021501592.tif 000032
2021501592.tif 000033
【０２０１】
【表１８】
2021501592.tif 000034
2021501592.tif 000035
【０２０２】
【表１９】
2021501592.tif 000036
2021501592.tif 000037
【０２０３】
【表２０】
2021501592.tif 000038
2021501592.tif 000039
【０２０４】
【表２１】
2021501592.tif 000040
2021501592.tif 000041
【０２０５】
【表２２】
2021501592.tif 000042
2021501592.tif 000043
2021501592.tif 000044
2021501592.tif 000045
【０２０６】
【表２３】
2021501592.tif 000046
2021501592.tif 000047
【０２０７】
【表２４】
2021501592.tif 000048
2021501592.tif 000049
【０２０８】
【表２５】
2021501592.tif 000050
2021501592.tif 000051
【０２０９】
【表２６】
2021501592.tif 000052
2021501592.tif 000053
【０２１０】
【表２７】
2021501592.tif 000054
2021501592.tif 000055
【０２１１】
【表２８】
2021501592.tif 000056
2021501592.tif 000057
2021501592.tif 000058
【０２１２】
【表２９】
2021501592.tif 000059
2021501592.tif 000060
2021501592.tif 000061
【０２１３】
【表３０】
2021501592.tif 000062
2021501592.tif 000063
【０２１４】
【表３１】
2021501592.tif 000064
2021501592.tif 000065
【０２１５】
【表３２】
2021501592.tif 000066
2021501592.tif 000067
【０２１６】
【表３３】
2021501592.tif 000068
2021501592.tif 000069
【０２１７】
【表３４】
2021501592.tif 000070
2021501592.tif 000071
2021501592.tif 000072
【０２１８】
【表３５】
2021501592.tif 000073
2021501592.tif 000074
【０２１９】
【表３６】
2021501592.tif 000075
2021501592.tif 000076
【０２２０】
【表３７】
2021501592.tif 000077
2021501592.tif 000078
【０２２１】
【表３８】
2021501592.tif 000079
2021501592.tif 000080
【０２２２】
【表３９】
2021501592.tif 000081
2021501592.tif 000082
【０２２３】
【表４０】
2021501592.tif 000083
2021501592.tif 000084
2021501592.tif 000085
【０２２４】
【表４１】
2021501592.tif 000086
【０２２５】
【表４２】
2021501592.tif 000087
【０２２６】
【表４３】
2021501592.tif 000088
【０２２７】
【表４４】
2021501592.tif 000089
2021501592.tif 000090
【０２２８】
【表４５】
2021501592.tif 000091
2021501592.tif 000092
【０２２９】
【表４６】
2021501592.tif 000093
2021501592.tif 000094
【０２３０】
【表４７】
2021501592.tif 000095
2021501592.tif 000096
【０２３１】
【表４８】
2021501592.tif 000097
2021501592.tif 000098
【０２３２】
【表４９】
2021501592.tif 000099
2021501592.tif 000100
【０２３３】
【表５０】
2021501592.tif 000101
2021501592.tif 000102
【０２３４】
【表５１】
2021501592.tif 000103
2021501592.tif 000104
【０２３５】
【表５２】
2021501592.tif 000105
2021501592.tif 000106
【０２３６】
【表５３】
2021501592.tif 000107
【０２３７】
【表５４】
2021501592.tif 000108
【０２３８】
【表５５】
2021501592.tif 000109
【０２３９】
【表５６】
2021501592.tif 000110
【０２４０】
【表５７】
2021501592.tif 000111
【０２４１】
【表５８】
2021501592.tif 000112
【０２４２】
【表５９】
2021501592.tif 000113
【０２４３】
【表６０】
2021501592.tif 000114
【０２４４】
【表６１】
2021501592.tif 000115
【０２４５】
【表６２】
2021501592.tif 000116
【０２４６】
【表６３】
2021501592.tif 000117
【０２４７】
【表６４】
2021501592.tif 000118
【０２４８】
【表６５】
2021501592.tif 000119
【０２４９】
【表６６】
2021501592.tif 000120
【０２５０】
【表６７】
2021501592.tif 000121
2021501592.tif 000122
【０２５１】
【表６８】
2021501592.tif 000123
2021501592.tif 000124
2021501592.tif 000125
【０２５２】
【表６９】
2021501592.tif 000126
2021501592.tif 000127
2021501592.tif 000128
【０２５３】
【表７０】
2021501592.tif 000129
2021501592.tif 000130
【０２５４】
【表７１】
2021501592.tif 000131
【０２５５】
【表７２】
2021501592.tif 000132
【０２５６】
【表７３】
2021501592.tif 000133
【０２５７】
【表７４】
2021501592.tif 000134
【０２５８】
【表７５】
2021501592.tif 000135
【０２５９】
【表７６】
2021501592.tif 000136
【０２６０】
【表７７】
2021501592.tif 000137
2021501592.tif 000138
2021501592.tif 000139
2021501592.tif 000140
2021501592.tif 000141
2021501592.tif 000142
2021501592.tif 000143
2021501592.tif 000144
2021501592.tif 000145
2021501592.tif 000146
2021501592.tif 000147
2021501592.tif 000148
2021501592.tif 000149
2021501592.tif 000150
2021501592.tif 000151
2021501592.tif 000152
【０２６１】
【表７８】
2021501592.tif 000153
【０２６２】
【表７９】
2021501592.tif 000154
【０２６３】
【表８０】
2021501592.tif 000155
【０２６４】
【表８１】
2021501592.tif 000156
2021501592.tif 000157
【０２６５】
【表８２】
2021501592.tif 000158
【０２６６】
【表８３】
2021501592.tif 000159
2021501592.tif 000160
【０２６７】
【表８４】
2021501592.tif 000161
2021501592.tif 000162
【０２６８】
【表８５】
2021501592.tif 000163
2021501592.tif 000164
【０２６９】
【表８６】
2021501592.tif 000165
2021501592.tif 000166
【０２７０】
【表８７】
2021501592.tif 000167
2021501592.tif 000168
【０２７１】
【表８８】
2021501592.tif 000169
2021501592.tif 000170
【０２７２】
【表８９】
2021501592.tif 000171
2021501592.tif 000172
【０２７３】
【表９０】
2021501592.tif 000173
2021501592.tif 000174
【０２７４】
【表９１】
2021501592.tif 000175
2021501592.tif 000176
【０２７５】
【表９２】
2021501592.tif 000177
2021501592.tif 000178
【０２７６】
【表９３】
2021501592.tif 000179
2021501592.tif 000180
【０２７７】
【表９４】
2021501592.tif 000181
2021501592.tif 000182
【０２７８】
【表９５】
2021501592.tif 000183
2021501592.tif 000184
2021501592.tif 000185
【０２７９】
【表９６】
2021501592.tif 000186
2021501592.tif 000187
【０２８０】
【表９７】
2021501592.tif 000188
2021501592.tif 000189
【０２８１】
【表９８】
2021501592.tif 000190
2021501592.tif 000191
【０２８２】
【表９９】
2021501592.tif 000192
2021501592.tif 000193
【０２８３】
【表１００】
2021501592.tif 000194
2021501592.tif 000195
【０２８４】
【表１０１】
2021501592.tif 000196
2021501592.tif 000197
【０２８５】
【表１０２】
2021501592.tif 000198
2021501592.tif 000199
【０２８６】
【表１０３】
2021501592.tif 000200
2021501592.tif 000201
【０２８７】
【表１０４】
2021501592.tif 000202
2021501592.tif 000203
【０２８８】
【表１０５】
2021501592.tif 000204
2021501592.tif 000205
【０２８９】
【表１０６】
2021501592.tif 000206
2021501592.tif 000207
【０２９０】
【表１０７】
2021501592.tif 000208
2021501592.tif 000209
【０２９１】
【表１０８】
2021501592.tif 000210
2021501592.tif 000211
【０２９２】
【表１０９】
2021501592.tif 000212
2021501592.tif 000213
2021501592.tif 000214
【０２９３】
【表１１０】
2021501592.tif 000215
2021501592.tif 000216
【０２９４】
【表１１１】
2021501592.tif 000217
2021501592.tif 000218
【０２９５】
【表１１２】
2021501592.tif 000219
2021501592.tif 000220
【０２９６】
【表１１３】
2021501592.tif 000221
2021501592.tif 000222
【０２９７】
【表１１４】
2021501592.tif 000223
2021501592.tif 000224
【０２９８】
【表１１５】
2021501592.tif 000225
2021501592.tif 000226
【０２９９】
【表１１６】
2021501592.tif 000227
2021501592.tif 000228
2021501592.tif 000229
【０３００】
【表１１７】
2021501592.tif 000230
2021501592.tif 000231
【０３０１】
【表１１８】
2021501592.tif 000232
2021501592.tif 000233
【０３０２】
【表１１９】
2021501592.tif 000234
2021501592.tif 000235
【０３０３】
【表１２０】
2021501592.tif 000236
2021501592.tif 000237
【０３０４】
【表１２１】
2021501592.tif 000238
2021501592.tif 000239
【０３０５】
【表１２２】
2021501592.tif 000240
2021501592.tif 000241
【０３０６】
【表１２３】
2021501592.tif 000242
2021501592.tif 000243
【０３０７】
【表１２４】
2021501592.tif 000244
【０３０８】
【表１２５】
2021501592.tif 000245
【０３０９】
【表１２６】
2021501592.tif 000246
【０３１０】
【表１２７】
2021501592.tif 000247
【０３１１】
【表１２８】
2021501592.tif 000248
【０３１２】
【表１２９】
2021501592.tif 000249
【０３１３】
【表１３０】
2021501592.tif 000250
2021501592.tif 000251
【０３１４】
【表１３１】
2021501592.tif 000252
2021501592.tif 000253
【０３１５】
【表１３２】
2021501592.tif 000254
2021501592.tif 000255
【０３１６】
【表１３３】
2021501592.tif 000256
2021501592.tif 000257
【０３１７】
【表１３４】
2021501592.tif 000258
【０３１８】
【表１３５】
2021501592.tif 000259
【０３１９】
【表１３６】
2021501592.tif 000260
【０３２０】
【表１３７】
2021501592.tif 000261
【０３２１】
【表１３８】
2021501592.tif 000262
【０３２２】
【表１３９】
2021501592.tif 000263
【０３２３】
【表１４０】
2021501592.tif 000264
【０３２４】
【表１４１】
2021501592.tif 000265
2021501592.tif 000266
【０３２５】
【表１４２】
2021501592.tif 000267
2021501592.tif 000268
【０３２６】
【表１４３】
2021501592.tif 000269
2021501592.tif 000270
【０３２７】
【表１４４】
2021501592.tif 000271
2021501592.tif 000272
【０３２８】
【表１４５】
2021501592.tif 000273
2021501592.tif 000274
【０３２９】
【表１４６】
2021501592.tif 000275
2021501592.tif 000276
【０３３０】
【表１４７】
2021501592.tif 000277
2021501592.tif 000278
【０３３１】
【表１４８】
2021501592.tif 000279
2021501592.tif 000280
【０３３２】
【表１４９】
2021501592.tif 000281
【０３３３】
【表１５０】
2021501592.tif 000282
【０３３４】
【表１５１】
2021501592.tif 000283
2021501592.tif 000284
【０３３５】
【表１５２】
2021501592.tif 000285
2021501592.tif 000286
【０３３６】
【表１５３】
2021501592.tif 000287
2021501592.tif 000288
2021501592.tif 000289
【０３３７】
【表１５４】
2021501592.tif 000290
2021501592.tif 000291
2021501592.tif 000292
【０３３８】
【表１５５】
2021501592.tif 000293
2021501592.tif 000294
【０３３９】
【表１５６】
2021501592.tif 000295
2021501592.tif 000296
【０３４０】
【表１５７】
2021501592.tif 000297
2021501592.tif 000298
【０３４１】
【表１５８】
2021501592.tif 000299
【図１】
2021501592.tif 000300
【図２】
2021501592.tif 000301
【図３】
2021501592.tif 000302
【図４】
2021501592.tif 000303
【図５】
2021501592.tif 000304
【図６】
2021501592.tif 000305
【図７Ａ】
2021501592.tif 000306
【図７Ｂ】
2021501592.tif 000307
【図８】
2021501592.tif 000308
【図９】
2021501592.tif 000309
【図１０】
2021501592.tif 000310
【図１１】
2021501592.tif 000311
【図１２】
2021501592.tif 000312
【図１３】
2021501592.tif 000313
【図１４】
2021501592.tif 000314
【図１５】
2021501592.tif 000315
【図１６】
2021501592.tif 000316
【図１７】
2021501592.tif 000317
【図１８】
2021501592.tif 000318
【図１９】
2021501592.tif 000319
【図２０】
2021501592.tif 000320
【図２１】
2021501592.tif 000321
【図２２Ａ】
2021501592.tif 000322
【図２２Ｂ】
2021501592.tif 000323
【図２３Ａ】
2021501592.tif 000324
【図２３Ｂ】
2021501592.tif 000325
【図２３Ｃ】
2021501592.tif 000326
【図２３Ｄ】
2021501592.tif 000327
【図２４】
2021501592.tif 000328
【図２５】
2021501592.tif 000329
【配列表】
2021501592000001.app
【国際調査報告】
2021501592.tif 000330
2021501592.tif 000331
2021501592.tif 000332
2021501592.tif 000333
2021501592.tif 000334