(57)【要約】  本発明は、優れた抗酸化活性を有する機能性ペプチドであって、抗酸化活性が微弱であるという従来の限界を克服するために、生体適合性に優れながらも従来のＧＳＨに比べて顕著に優れた抗酸化活性を有するペプチドを提供する。本発明のペプチドは、酸化的ストレスによって誘発された活性酸素による生体組織や細胞の損傷を効果的に回復させたり、或いは抗酸化活性を促進させることができる。したがって、このような抗酸化活性を有するペプチドは、酸化的ストレスによる細胞損傷に効果的に作用し、細胞損傷を予防及び回復させるのに利用可能である。【選択図】  図６
2021534230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを含む抗酸化組成物。
［一般式１］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１
［一般式２］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３
式中、
Ｘａａ１は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ３は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）及びオルニチン（ＯＲＮ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。
【請求項２】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＭＥＴ（Ｏ）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＵ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＬＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＶＡＬ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−Ａｂｕ−ＧＬＹ及びγ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＧＬＹからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の抗酸化組成物。
【請求項３】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の抗酸化組成物。
【請求項４】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ及びγ−ＧＬＵ−ＴＹＲからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の抗酸化組成物。
【請求項５】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の抗酸化組成物。
【請求項６】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の抗酸化組成物。
【請求項７】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の抗酸化組成物。
【請求項８】
ａ）酵母懸濁液に酵素を添加して加水分解させる段階；及び
ｂ）加水分解後に得られた酵母加水分解物から５００Ｄａ以下の分子量を有するペプチド分画物を回収する段階；で構成される抗酸化組成物の製造方法。
【請求項９】
前記ａ）段階は、
ａ−１）前記酵母懸濁液の固形分対比で０．５〜１．５重量％アルカラーゼを添加し、３〜５時間１次加水分解させる段階；
ａ−２）前記１次加水分解物の固形分対比で０．５〜１．５重量％フラボザイムを添加し、５〜１５時間２次加水分解させる段階；及び
ａ−３）前記２次加水分解物の固形分対比で０．１〜０．５重量％アルカラーゼとフラボザイムを添加し、２０〜３０時間２次加水分解させる段階；を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分とする細胞の酸化的損傷治療用薬学組成物。
［一般式１］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１
［一般式２］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３
式中、
Ｘａａ１は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ３は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）及びオルニチン（ＯＲＮ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。
【請求項１１】
前記細胞の酸化的損傷は、自由ラジカル又は反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成によるものであることを特徴とする、請求項１０に記載の薬学組成物。
【請求項１２】
一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分として含む抗酸化用食品組成物。
［一般式１］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１
［一般式２］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３
式中、
Ｘａａ１は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ３は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）及びオルニチン（ＯＲＮ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。
【請求項１３】
一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分として含む抗酸化用飼料組成物。
［一般式１］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１
［一般式２］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３
式中、
Ｘａａ１は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ３は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）及びオルニチン（ＯＲＮ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。
【請求項１４】
一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分として含む抗酸化用化粧料組成物。
［一般式１］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１
［一般式２］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３
式中、
Ｘａａ１は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ３は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）及びオルニチン（ＯＲＮ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。
【請求項１５】
細胞の酸化的損傷の予防又は治療用医薬の製造のための、一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドの用途。
［一般式１］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１
［一般式２］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３
式中、
Ｘａａ１は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ３は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）及びオルニチン（ＯＲＮ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。
【請求項１６】
前記細胞の酸化的損傷は、自由ラジカル又は反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成によるものであることを特徴とする、請求項１５に記載のペプチドの用途。
【請求項１７】
ヒト、又はヒト以外の動物に一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを経口投与する細胞の酸化的損傷の治療方法。
［一般式１］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１
［一般式２］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３
式中、
Ｘａａ１は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ３は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）及びオルニチン（ＯＲＮ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。
【請求項１８】
前記細胞の酸化的損傷は、自由ラジカル又は反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成によるものであることを特徴とする、請求項１７に記載の細胞の酸化的損傷の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化活性を有する生体適合性ペプチド素材に関し、より詳細には、ラジカル消去能をはじめとして、抗酸化転写因子であるＮｒｆ２の発現と抗酸化酵素であるＳＯＤ２の発現を促進する機能を有するペプチド及びこれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、細胞は、生物学的過程によって現れる内因的要因（呼吸、体内エネルギー代謝など）と外部環境による外因的要因（汚染物質、毒性物質、紫外線、病原菌侵入など）によるストレスにより、細胞内で活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ））又は自由ラジカル（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）のような有害酸素を生成する。
【０００３】
正常の細胞は代謝過程を通じて前記有害酸素を抗酸化酵素で除去する。しかし、ストレスが持続するなどの深刻な場合には、細胞内で有害酸素が除去されずに蓄積され、炎症反応や細胞損傷が起き、これは様々な疾患に進む原因となる。
【０００４】
さらに、前記有害酸素によって細胞のＤＮＡ損傷、タンパク質変性、酵素不活性化などが起きることがあり、細胞内に拡散した、または、血流に乗って移動した脂質過酸化物は新しい活性酸素生成を促進させ、様々な組織で動脈硬化、癌、心筋梗塞、脳卒中、心臓疾患、リウマチ性関節炎、筋萎縮側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒｎａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）やパーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）のような退行性脳神経疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、糖尿病、肝炎、腎臓炎、アトピー、自己免疫疾患、炎症反応、老化などの進行を促進する（Ａｌａｍ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｓａｕｄｉ  Ｐｈａｒｍ  Ｊ．２０１３；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，９（４）：２６０−２６４，１９９６）。
【０００５】
その上、このような細胞内で起こるストレスは、細胞を破壊、皮膚真皮層の結合組織を切断、或いは交差結合を起こし、シワ形成、アトピー性皮膚炎、にきび又は皮膚癌のような皮膚関連疾病を起こす主要原因として知られている。
【０００６】
これに対して、人体は、持続的に発生する活性酸素を除去し、損傷した細胞を治癒できる抗酸化体系を備えている。一例として、３個のアミノ酸（Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グリシン）が結合したグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ＧＳＨ））がある。グルタチオンは、グルタミンシステイリガーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｌｉｇａｓｅ（ＧＣＬ））とグルタチオン合成酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳ））によって合成され、抗酸化酵素系としてグルタチオンペロキシダーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＧＰｘ））、グルタチオンレダクターゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＲ））、グルタチオンエス−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ））、キノンオキシドレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ：ｑｕｉｎｏｎｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ１（ＮＱＯ１））のような酵素の作用によって酸化−還元反応を繰り返し行い、抗酸化効能を示すなど、毒性物質を除去することが知られている（Ｍａｔｅｓ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９９；Ｖｒａｎｋｏｖｉｃ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１２）。
【０００７】
その他、酸化的ストレスに対する生体内主要防御機転は、細胞内に存在するＮｒｆ２（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ２−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ２）−ＡＲＥ（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）信号経路によるものであるが、前記Ｎｒｆ２−ＡＲＥ信号経路は、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）合成と抗酸化酵素系の合成を促進する。前記Ｎｒｆ２は転写因子であり、酸化的ストレス状況でＧＰｘ、ＧＲ、ＧＳＴ、スーパーオキシドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）、ＮＱＯ１、ヘムオキシゲナーゼ（Ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１（ＨＯ−１））のような抗酸化酵素を合成して活性酸素種を除去、抗酸化剤であるグルタチオンを合成するＧＣＬ、ＧＳなどのような酵素の発現を調節して細胞内にグルタチオンの量を増加させる役割を担うものとして知られている。これによって活性酸素種を除去する、或いは攻撃性のない物質に転換させる（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４）。
【０００８】
また、Ｎｒｆ２は様々な組織において活性酸素からの細胞生存率を向上させる。したがって、様々な組織内でＮｒｆ２発現が促進される場合、抗酸化に基づく細胞保護効能を有すると考えられる（Ｂａｉｒｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１１）。
【０００９】
人体内で抗酸化防御機転を効率的に維持させるためには、最も強力な活性酸素であるスーパーオキシドアニオンラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｉｏｎ  ｒａｄｉｃａｌ）を一次に中和させるＳＯＤ酵素の生成と反応速度を正常化させることが最も重要な要因の一つである。しかし、人は加齢に伴ってＳＯＤ酵素の生成と反応速度が低下するため、これを補完してくれる食品の摂取が重要である。抗酸化酵素のうちＳＯＤは、細胞のエネルギー代謝過程で正常に発生する活性酸素を減少させる酵素であり、細胞の抗酸化防御体系において重要な役割を果たしている。哺乳動物においてＳＯＤ２は、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｍｎ−ＳＯＤと呼ばれる。
【００１０】
しかしながら、公害や紫外線などの環境的ストレス又は生物学的ストレスを含む諸原因、老化及び退行性疾患のような老化と関連した疾病、経済成長及び食生活の変化などに伴う代謝症候群や成人病などによって人体の抗酸化体系は正常作動できなくなっていく。このような場合、抗酸化物質を供給して防御できるように、Ｎｒｆ２電子因子を活性化させて活性酸素種を除去できる物質、すなわち、抗酸化剤の体内供給が要求される。このような抗酸化剤の体内供給要求に応じて、抗酸化剤又は抗酸化効果を有する食品、医薬などを摂取して前記疾病を予防又は治療する、或いは老化を遅延させようとする努力が多方面からなされているが、このような全ての条件を満たす抗酸化物質は開発されていないのが現状である。
【００１１】
このような背景下で、本発明者らは、抗酸化効果を示しながら副作用がない食品原料を見出すために鋭意研究努力した結果、ペプチドが、抗酸化転写因子であるＮｒｆ２の発現を促進して活性酸素種を除去する機能、抗酸化酵素であるＳＯＤ２の発現を促進して活性酸素種を除去する機能、Ｎｒｆ２とＳＯＤ２の発現を同時に促進して活性酸素種を除去する機能を有することにより、強い抗酸化効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、素材自体に免疫反応がなく、生体復元後に無害に分解されながら、優れた抗酸化活性を示すことによって、適用時にラジカル消去能、Ｎｒｆ２、ＳＯＤ２の発現を促進して、抗酸化活性を増進させるペプチドを提供することを目的とする。このような抗酸化活性を有するペプチドは、生体組織又はその細胞に効果的に作用して酸化的ストレスに対する抗酸化活性を有する、細胞の酸化的損傷に関連した疾患治療剤として活用可能である。
【００１３】
本発明は前記のような問題点を勘案して案出されたものであり、本発明の目的は、一般式１又は２で表示されるアミノ酸配列からなる抗酸化活性を有するペプチドのいずれか一つ以上を含む抗酸化組成物及びその製造方法を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記ペプチドを有効成分とする細胞の酸化的損傷の予防、治療若しくは改善のための薬学組成物又はヒト以外の動物用薬学組成物を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、ヒト、又はヒト以外の動物に前記ペプチドを経口投与する細胞の酸化的損傷予防又は治療方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、細胞の酸化的損傷の予防若しくは治療用医薬、又は動物用医薬製造のための前記ペプチドの新規用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、一般式１又は２で表示されるアミノ酸配列からなる抗酸化活性を有するペプチドを含む抗酸化組成物を提供する。
【００１８】
［一般式１］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１
［一般式２］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３
式中、
Ｘａａ１は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ３は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）及びオルニチン（ＯＲＮ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。
【００１９】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＭＥＴ（Ｏ）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＵ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＬＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＶＡＬ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−Ａｂｕ−ＧＬＹ及びγ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＧＬＹからなる群から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドであり得る。
【００２０】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌからなる群から選ばれるいずれか一つ以上のジペプチドであってもよい。
【００２１】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ及びγ−ＧＬＵ−ＴＹＲからなる群から選ばれるいずれか一つ以上のジペプチドであってもよい。
【００２２】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧからなる群から選ばれるいずれか一つ以上のトリペプチドであってもよい。
【００２３】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であってもよい。
【００２４】
前記ペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であってもよい。
【００２５】
本発明は、下記段階で構成される抗酸化組成物の製造方法を提供する。
ａ）酵母懸濁液に酵素を添加して加水分解させる段階、及び
ｂ）加水分解後に得られた酵母加水分解物から５００Ｄａ以下の分子量を有するペプチド分画物を回収する段階。
【００２６】
前記ａ）段階は、ａ−１）前記酵母懸濁液の固形分対比で０．５〜１．５重量％アルカラーゼを添加し、３〜５時間１次加水分解させる段階；
ａ−２）前記１次加水分解物の固形分対比で０．５〜１．５重量％フラボザイムを添加し、５〜１５時間２次加水分解させる段階；及び
ａ−３）前記２次加水分解物の固形分対比で０．１〜０．５重量％アルカラーゼとフラボザイムを添加し、２０〜３０時間２次加水分解させる段階；を含むことができる。
【００２７】
本発明は、前記一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分とする細胞の酸化的損傷治療用薬学組成物、食品組成物、飼料組成物、化粧料組成物を提供する。
【００２８】
前記細胞の酸化的損傷は、自由ラジカル又は反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成によるものであり得る。
【００２９】
本発明は細胞の酸化的損傷の予防又は治療用医薬の製造のための、前記一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドの用途を提供する。
【００３０】
本発明は、ヒト、又はヒト以外の動物に前記一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを経口投与する、細胞の酸化的損傷の治療方法を提供する。
【００３１】
前記細胞の酸化的損傷は、自由ラジカル又は反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成によるものであり得る。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、優れた抗酸化活性を有する機能性ペプチドであって、抗酸化活性が微弱であるという従来の限界を克服するために、生体適合性に優れながらも従来のＧＳＨに比べて著しく優れた抗酸化活性を有するペプチドを提供する。本発明のペプチドは、酸化的ストレスによって誘発された活性酸素による生体組織や細胞の損傷を効果的に回復、或いは抗酸化活性を促進させることができる。したがって、このような抗酸化活性を有するペプチドは酸化的ストレスによる細胞損傷に効果的に作用し、細胞損傷を予防及び回復させることに活用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】それぞれの酵母加水分解物（Ａ４、ＡＦ１０、ＡＦ２４）に対するＤＰＰＨ消去能を測定したグラフである。ここで、Ｃｏｎｔｒｏｌは、なんの酵素でも処理していない酵母加水分解物で、Ａ２は、アルカラーゼで２時間分解された酵母加水分解物で、Ａ４は、アルカラーゼで４時間分解された酵母加水分解物で、ＡＦ１０は、アルカラーゼで４時間分解後にフラボザイムで１０時間分解した酵母加水分解物で、ＡＦ２４は、アルカラーゼで４時間分解後にフラボザイムで１０時間分解した後、２４時間追加分解した酵母加水分解物である。
【図１Ｂ】それぞれの酵母加水分解物（Ａ４、ＡＦ１０、ＡＦ２４）に対する還元力を測定したグラフである。
【図２Ａ】それぞれの酵母加水分解物の分画物（製造例１〜４）に対するＤＰＰＨ消去能を測定したグラフである。ここで、Ｃｏｎｔｒｏｌは、なんの酵素でも処理していない酵母加水分解物で、１０ｋＤａ以上は、製造例１の酵母加水分解物の分画物で、１０〜５ｋＤａは、製造例２の酵母加水分解物の分画物で、５〜１ｋＤａは、製造例３の酵母加水分解物の分画物で、１ｋＤａ以下は、製造例４の酵母加水分解物の分画物である。
【図２Ｂ】それぞれの酵母加水分解物の分画物（製造例１〜４）に対する還元力を測定したグラフである。
【図３】抗酸化活性を有するペプチドをスクリーニングするために、実験例２から選ばれた１ｋＤａ以下酵母加水分解物濾過液を高性能液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）で分子量分布を確認し、分子量によって２次分画物（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）を表記したグラフである。
【図４Ａ】酵母加水分解物のうち抗酸化活性が最も優れた２次分画物ＩＩから同定された代表的なペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル及び予想構造を示すグラフである。ここでは、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（ＧＳＨ）である。
【図４Ｂ】酵母加水分解物のうち抗酸化活性が最も優れた２次分画物ＩＩから同定された代表的なペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル及び予想構造を示すグラフである。ここでは、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙである。
【図４Ｃ】酵母加水分解物のうち抗酸化活性が最も優れた２次分画物ＩＩから同定された代表的なペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル及び予想構造を示すグラフである。ここでは、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｄはγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌである。
【図４Ｄ】酵母加水分解物のうち抗酸化活性が最も優れた２次分画物ＩＩから同定された代表的なペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル及び予想構造を示すグラフである。ここでは、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌである。
【図５Ａ】酵母加水分解物から確認された１００種のペプチドに対するＮｒｆ２  ｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲを用いて分析したグラフである。
【図５Ｂ】酵母加水分解物から確認された１００種のペプチドに対するＮｒｆ２  ｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲを用いて分析したグラフである。
【図５Ｃ】酵母加水分解物から確認された１００種のペプチドに対するＮｒｆ２  ｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲを用いて分析したグラフである。
【図６】酵母加水分解物から確認された１００種のペプチドに対するＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲを用いて分析したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００３５】
代表的なアミノ酸とそれぞれの略語は、以下のとおりである。アラニン（Ａｌａ，Ａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）、トリプトファン（Ｔｒｐ，Ｗ）、バリン（Ｖａｌ，Ｖ）、アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）、チロシン（Ｔｒｙ，Ｙ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）、リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）。
【００３６】
また、修飾されたアミノ酸とそれぞれの略語は、以下のとおりである。バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）。特に、式中で（Ｏ２）はスルホキシド構造であることを意味する。
【００３７】
本発明において、ペプチドとは、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合して形成された線形の分子を意味する。
【００３８】
本発明のペプチドは、当業界に公知の化学的合成方法、特に、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって製造できる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））。
【００３９】
本明細書において、“抗酸化活性”という用語は、環境的ストレス又は生物学的ストレスによる細胞内代謝又は紫外線の影響による酸化的ストレスによって反応性の高い自由ラジカル（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）又は活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）による細胞の酸化を抑制することを意味し、自由ラジカル又は活性酸素種を除去してそれによる細胞の損傷が減少することを含む。
【００４０】
本発明において、“抗酸化組成物” という用語は、組成物の全重量に対して抗酸化ペプチドを２０〜５０重量％、好ましくは３０〜４０重量％で含む組成物を意味し、前記組成物は薬学的に許容可能な、担体、賦形剤又は希釈剤を含むことができ、これは通常の技術者にとって周知の技術的内容に該当する。
【００４１】
本発明の一態様は、次の一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを含む抗酸化組成物に関する：
［一般式１］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１
［一般式２］
γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２−Ｘａａ３
式中、
Ｘａａ１は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ２は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、オルニチン（ＯＲＮ）、メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｍ（Ｏ））、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、チオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、及び２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、
Ｘａａ３は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）及びオルニチン（ＯＲＮ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。
【００４２】
本発明において、前記一般式は、本発明のペプチド構造を表現するために記載されたものであり、その修飾も本発明に属するということが当業者には明らかに認識できよう。
【００４３】
一実施形態において、本発明のペプチドのＮ末端又はＣ末端は、ヒドロキシ基（−ＯＨ）又はアミノ基（−ＮＨ２）に修飾されてもよい。前記アミノ酸の修飾は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善させる作用を有する。ここで、前記用語“安定性”は、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性及び保存安定性（例：常温保存安定性）を意味する。前記保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明に係るペプチドを保護する作用を有する。
【００４４】
本発明の抗酸化活性を有するペプチドは、順次の酵素分解段階を通じて酵母加水分解物を得、これから１次、２次分離精製してペプチドを分離した後、これらペプチドのＮｒｆ２、ＳＯＤ２  ｍＲＮＡの促進効果を比較して得られたものである。このペプチドは、天然のＧＳＨペプチドに比べてＮｒｆ２  ｍＲＮＡ、ＳＯＤ２  ｍＲＮＡの促進活性がより高く、短い配列（２〜３個のアミノ酸残基からなる。）のペプチドだけでも、著しく優れた抗酸化効果（ＤＰＰＨ消去能、還元力、Ｎｒｆ２  ｍＲＮＡ発現促進、ＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現促進）を有するので、抗酸化活性を有する様々な分野に有用に利用可能である。
【００４５】
したがって、本発明に係る抗酸化活性を有するペプチドは、活性酸素を除去し、細胞、組織又は器官の酸化的ストレスによって誘発される活性酸素による酸化的損傷を予防又は治療するための組成物の形態で提供することができる。また、前記抗酸化組成物は、活性酸素に対する細胞損傷を予防又は治療する効果を有する飼料、飼料添加剤又は食品添加剤として提供されてもよい。
【００４６】
本発明の一般式１又は２で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、Ｌ−グルタミン酸のガンマ鎖にアミノ酸残基が順次に結合して２〜３個の短い配列を有するものである。
【００４７】
具体的に、前記一般式１又は２で表示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、抗酸化活性を有するものであり、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＭＥＴ（Ｏ）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＵ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＬＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＶＡＬ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−Ａｂｕ−ＧＬＹ及びγ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＧＬＹからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であり得る。
【００４８】
一実施形態によれば、前記ペプチドは、好ましくは一般式１のペプチドでよく、前記式において、Ｘａａ１は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、バリンアミド（ｖａｌｉｎｅ  ａｍｉｄｅ）（Ｖ−ＮＨ２）、バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）（Ｖａｌｉｎｏｌ（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｂｕｔａｎｏｌ））（Ｖ−ｏｌ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、及びチオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり得る。
【００４９】
具体的に、前記一般式１のペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌからなる群から選ばれるいずれか一つ以上のジペプチドであり、これは、抗酸化効果の他、Ｎｒｆ２  ｍＲＮＡ及びＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現促進効果も有し、従来の抗酸化効果を有するＧＳＨに比べて短い配列であるにもかかわらず、同等又はより優れた効果を有するので、合成、製造及び保管において遥かに有用であるという長所がある。
【００５０】
前記一般式１のペプチドは、より好ましくは、Ｘａａ１がシステイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、グルタミン（Ｑ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））、及びチオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であってもよい。これは、抗酸化効果を有するものと広く知られていたＧＳＨに比べて著しく有意なＮｒｆ２発現及びＳＯＤ２発現の促進効果を同時に有しており、具体的に、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ及びγ−ＧＬＵ−ＴＹＲからなる群から選ばれるいずれか一つ以上のジペプチドであってもよい。
【００５１】
一実施形態によれば、前記一般式２のペプチドにおいて、Ｘａａ２は、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、Ｘａａ３は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）及びアルギニン（Ｒ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。これは、ＧＳＨに比べて著しく有意なレベルのＮｒｆ２発現及びＳＯＤ２発現の促進効果を有し、具体的に、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧからなる群から選ばれるいずれか一つ以上のトリペプチドであってもよい。
【００５２】
一実施形態によれば、ＧＳＨに比べて著しく有意なＮｒｆ２発現及びＳＯＤ２発現の促進効果を同時に有するペプチドは、より好ましくは、前記一般式１において、Ｘａａ１は、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、グルタミン（Ｑ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、チオール基の水素がメチル基に置換されたシステイン（Ｃ（Ｓ−Ｍｅ））及びチオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、前記一般式２において、Ｘａａ２は、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、Ｘａａ３は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）及びアルギニン（Ｒ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。具体的に、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧからなる群から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドが好ましい。
【００５３】
最も好ましくは、前記一般式１において、Ｘａａ１は、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）及びチオール基の水素がメチル基に置換され、スルホキシド構造を有するシステイン（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、前記一般式２において、Ｘａａ２は、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸であり、Ｘａａ３は、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）及びグリシン（Ｇ）から選ばれるいずれか一つのアミノ酸である。
【００５４】
具体的には、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳからなる群から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドであり得るが、これは、抗酸化効果（還元力、ＤＰＰＨ消去能、及びＮｒｆ２  ｍＲＮＡ活性）を有する上に、陽性対照群であるＧＳＨに比べて約２〜３倍以上のＮｒｆ２  ｍＲＮＡ、ＳＯＤ２  ｍＲＮＡの発現量促進効果も有する。
【００５５】
一方、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳは、ＧＳＨに比べて２〜８倍以上のＮｒｆ２、ＳＯＤ２  ｍＲＮＡの発現量促進効果を示す顕著な効果を有する。
【００５６】
本発明の抗酸化組成物は、薬学組成物、健康食品組成物、飼料、飼料添加剤、化粧料組成物及びヒト以外の動物用薬学組成物などとしても用いることができる。
【００５７】
本発明において、“抗酸化活性”は、環境的ストレス又は生物学的ストレスによる細胞内代謝又は紫外線の影響による酸化的ストレスによって反応性の高い自由ラジカル（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）又は活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）による細胞の酸化を抑制することを意味し、自由ラジカル又は活性酸素種を除去し、これによる細胞の損傷が減少することを含む。これに関する効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験から検証した。
【００５８】
前記抗酸化組成物は、組成物全重量に対して抗酸化ペプチドを２０〜５０重量％、好ましくは３０〜４０重量％で含む組成物を意味し、前記組成物は、薬学的に許容可能な、担体、賦形剤又は希釈剤を含むことができ、これは、通常の技術者にとって周知の技術内容に該当する。
【００５９】
本発明の他の態様は、次の段階を含むペプチド分画物を含む抗酸化組成物の製造方法に関する。
ａ）酵母懸濁液に酵素を添加して加水分解させる段階；及び
ｂ）加水分解後に得られた酵母加水分解物を濾過又は精製し、５００Ｄａ以下の分子量を有するペプチド分画物を回収する段階。
【００６０】
前記ａ）段階は、好ましくは、ａ−１）前記酵母懸濁液の固形分対比で０．５〜１．５重量％アルカラーゼを添加し、３〜５時間１次加水分解させる段階；
ａ−２）前記１次加水分解物の固形分対比で０．５〜１．５重量％フラボザイムを添加し、５〜１５時間２次加水分解させる段階；及び
ａ−３）前記２次加水分解物の固形分対比で０．１〜０．５重量％アルカラーゼとフラボザイムを添加し、２０〜３０時間２次加水分解させる段階；によって行ってもよい。前記方法によって酵母加水分解物を製造する場合、抗酸化効果に優れたペプチドを多量に含む分画物が得られる。
【００６１】
前記加水分解段階は、４０〜７０℃の温度で行われることが好ましい。４０℃以下では加水分解がよく行われず、物理的ストレスによる抗酸化代謝物質の分泌も十分に誘導できないため、十分なペプチドが得難い。前記温度範囲が７０℃を超えると、細胞の死滅が進行する不具合がある。
【００６２】
前記加水分解段階のｐＨ条件は６〜７が好ましい。
【００６３】
前記ｂ）段階は、具体的には、加水分解後に得られた酵母加水分解物を分子量によって分画し、５００Ｄａ以下の分子量を有するペプチド分画物を回収する。
【００６４】
前記（ｂ）段階を行う前に、前記酵母加水分解物から残余物を除去する段階をさらに含むことができ、残余物除去方法は、遠心分離、濾過など、公知の混合物から固形分を除去する方法を用いることができる。好ましくは、遠心分離を用いることができる。
【００６５】
本発明の（ｂ）段階の前に、前記酵母加水分解物に含まれた酵素を不活性化処理する段階をさらに含むことができる。この段階は、前記残余物除去段階の前後に行われ、好ましくは、（ｂ）段階の前に、前記酵母加水分解物に含まれた酵素を不活性化処理し、遠心分離方法によって残余物を除去して上澄液を分離して得る方法を用いることができる。前記不活性化処理方法は、好ましくは、熱処理を用いることができ、加水分解物を１００℃〜１２０℃の温度で１０〜３０分間維持する方法を用いることができる。
【００６６】
前記（ｂ）段階は、５００Ｄａ以下の分子量を有するペプチド分画物を得る段階であり、分画物収得方法は、物質を分子量によって分離する公知の方法を用いることができ、例えば、透析、電気泳動及び各種カラムクロマトグラフィーなどを行うことができる。前記クロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、親和性カラムクロマトグラフィー及び限外濾過などの技法を単独又は組合せで適用させて除去することができる。好ましくは、本発明の分画物収得方法は、透析膜を用いた透析方法によって目的分子量以上又は以下の物質を除去する方法であり得る。
【００６７】
前記得られた分画物は、１０００Ｄａ以下の分子量を有する分画であり、好ましくは、１００Ｄａ〜７００Ｄａ以下の分子量を有する分画物である。より好ましくは、５００Ｄａ以下の分子量を有する分画物であり得る。
【００６８】
また、前記得られた全分画物に対して、抗酸化活性を有するペプチドは７０〜８５重量％であり得る。
【００６９】
本発明のさらに他の態様は、前記一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分とする細胞の酸化的損傷治療用薬学組成物に関する。
【００７０】
また、本発明は、前記一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分とする細胞の酸化的損傷の予防、治療若しくは改善のための薬学組成物、又はヒト以外の動物用薬学組成物に関する。
【００７１】
また、本発明は、ヒト、又はヒト以外の動物に、前記一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを経口投与する、細胞の酸化的損傷の予防又は治療方法に関する。
【００７２】
また、本発明は、細胞の酸化的損傷の予防若しくは治療用医薬、又は動物用医薬製造のための、前記一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドの新規用途に関する。
【００７３】
本発明において、“細胞の酸化的損傷”という表現は、環境的ストレス又は生物学的ストレスによる細胞内代謝又は紫外線のような外因性原因による酸化的ストレスによって反応性の高い自由ラジカル（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）又は活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）が誘発され、これによって細胞が損傷することを意味する。
【００７４】
本明細書において用語‘有効成分として含む’とは、本発明のペプチドが細胞の酸化的損傷を改善、治療又は予防する効能又は活性を達成するのに十分な量を含むことを意味する。
【００７５】
本発明において‘予防’とは、本発明に係る組成物を個体に投与して細胞の酸化的損傷の発病を抑制又は遅延させる全ての行為を意味し得る。本発明において‘治療’とは、本発明に係る組成物を、細胞の酸化的損傷が疑われる個体に投与し、細胞の酸化的損傷による症状が好転する、或いは有益となるようにする全ての行為を意味し得る。
【００７６】
本発明が予防又は治療しようとする細胞の酸化的損傷による疾患の種類は制限されないが、好ましくは、内因性又は外因性原因によって細胞内代謝又は紫外線のような外因性原因による酸化的ストレスによって反応性の高い自由ラジカル（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）又は活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）が誘発され、これによって細胞が損傷することから誘導される疾患であってもよい。
【００７７】
前記細胞の酸化的損傷に関連した疾患は、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側鎖硬化症及び筋萎縮症から選ばれる神経退行性疾患；又は色素性網膜症、黄斑変性及び白内障のような眼球疾患；又は心筋梗塞、脳梗塞、虚血性疾患；又は関節炎、血管炎、糸球体腎炎及び紅斑性ループスから選ばれる炎症性疾患；及びアテローム性動脈硬化症から選ばれるいずれか一つ以上であってもよい。
【００７８】
本発明において、前記一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドは、ｔＢＨＰ（直接作用酸化応力誘導作用剤（ｄｉｒｅｃｔ−ａｃｔｉｎｇ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を処理し、酸化ストレスを誘導した細胞から抗酸化防御機転であるＮｒｆ２  ｍＲＮＡとＳＯＤ２  ｍＲＮＡの発現を促進及び上昇させることを確認した。このように、ｔＢＨＰによって低下した細胞生存率を顕著に増加させることができる。すなわち、本発明の薬学組成物を添加する場合、抗酸化酵素活性を増加させることを発見したが、これは、抗酸化剤、基本的には酵素の発現を誘導し、細胞の適応を示唆する。
【００７９】
前記一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドは、細胞性抗酸化活性を増加させ、内因性又は外因性原因による酸化的ストレスによる細胞損傷を抑制し、投与された容量において細胞毒性がなく、安定であるという点で相当な利点を有する。
【００８０】
前記‘医薬’、‘動物用薬学組成物’又は‘動物用医薬’は、有効成分として、前記ペプチドの他、薬学組成物などの製造に通常用いられる適切な添加剤、担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。本発明に係る薬学的に許容可能な添加剤、担体、賦形剤及び希釈剤は、前記組成物に対して０．１〜９０重量部含んでいてもよいが、これに限定されない。
【００８１】
前記添加剤としては、澱粉、ゼラチン化澱粉、微結晶セルロース、ポビドン、コロイダルシリコンジオキシド、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアガム、全糊化澱粉、トウモロコシ澱粉、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ（ｏｐａｒｙ）、澱粉グリコール酸ナトリウム、カルナバ蝋、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトール及びタルクなどを用いることができる。
【００８２】
前記‘担体’は、細胞又は組織内への化合物の付加を容易にする化合物である。前記‘希釈剤’は、対象化合物の生物学的活性形態を安定化させるだけでなく、化合物を溶解させる水で希釈される化合物である。
【００８３】
前記担体、賦形剤及び希釈剤は、特に限定されないが、例えば、乳糖、ブドウ糖、砂糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などを挙げることができる。
【００８４】
前記医薬、動物用薬学組成物又は動物用医薬の使用量は、患者又は治療対象動物の年齢、性別、体重によって異なり得るが、特に、治療対象個体の状態、治療対象疾患の特定のカテゴリー又は種類、投与経路、使用される治療剤の属性に依存し得る。
【００８５】
本発明の薬学組成物は、実際の臨床投与時に、経口及び非経口の様々な剤形で投与できるが、製剤化する場合には、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記ペプチドに少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース又はゼラチンなどを混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤の他、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も用いることができる。経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、耐溶液剤、乳剤及びシロップ剤などが該当するが、通常用いられる単純希釈剤である水、液状パラフィンの他、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤としては、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤を含むことができる。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤には、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。
【００８６】
本発明の薬学組成物は、目的とする方法によって経口投与又は非経口投与でき、非経口投与時に、皮膚外用又は腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射又は胸部内注射の注入方式を選択することが好ましい。
【００８７】
本発明の薬学組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度によってその範囲が様々であり、１日投与量は、本発明のペプチドの量を基準に０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、１日１回〜６回投与できる。
【００８８】
本発明の薬学組成物は、単独で、又は手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使用することができる。
【００８９】
本発明の薬学組成物の適用方法としては、特に制限されず、経口投与又は注射などを用いた全ての侵襲的又は非侵襲的投与が利用可能であり、坐薬投与又は経皮投与を採用してもよい。有効成分を、経口、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用担体と共に、慣用の医薬製剤の形態で投与できる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤の形態、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤の形態、凍結乾燥剤などの形態を挙げることができる。それらの製剤は、製剤上の常套手段によって調製することができる。また、本発明の医薬組成物には、医薬的、生理学的に許容される全ての固体又は液体の担体、添加物などを任意に添加してもよい。
【００９０】
前記担体としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチル澱粉、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ゼラチン、アルブミン、アミノ酸、水、生理食塩水などを挙げることができる。また、必要によって、本発明の医薬組成物に、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することができる。
【００９１】
前記治療方法は、ヒト、又はヒト以外の動物、特にほ乳動物に前記組成物を経口又は非経口投与することであり、例えば、内因性又は外因性酸化的ストレスによって細胞が損傷した、或いは細胞損傷が誘発された治療対象個体に前記組成物を経口投与することである。
【００９２】
前記治療のための投与量、投与方法及び投与回数は、前記薬学組成物、医薬、動物用薬学組成物又は動物用医薬の投与量、投与方法及び投与回数を参考にすることができる。
【００９３】
本発明のさらに他の態様は、前記一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分として含む抗酸化用食品組成物に関する。
【００９４】
前記食品組成物とは、前記ペプチドをカプセル、錠剤、粉末、顆粒、液状、丸、片状、ペースト状、シロップ、ゲル、ジェリー又はバー（ｂａｒ）の形態に製剤化したものであってもよく、又は飲料、茶類、香辛料、ガム、菓子類などの食品素材に添加して一般食品の形態に製造したものであってもよい。これを摂取する場合、健康上特定の効果をもたらすものを意味するが、一般薬品とは違い、食品を原料とし、薬品の長期服用時に発生しうる副作用などがないという長所がある。
【００９５】
前記食品組成物は、日常的に摂取することが可能な点で非常に有用である。このような食品組成物において、前記ペプチドの添加量は、対象である食品の種類によって異なるため一様に規定することはできないが、食品本来の味を損なわない範囲で添加すればよく、対象食品に対して通常０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜２０重量％の範囲とする。また、カプセル、錠剤、粉末、顆粒、液状、丸、片状、ペースト状、シロップ、ゲル、ジェリー又はバー（ｂａｒ）形態の食品の場合には、通常０．１〜１００重量％、好ましくは０．５〜８０重量％の範囲で添加すればよい。
【００９６】
前記食品組成物は、有効成分として、前記一般式１及び一般式２で表示されるいずれか一つ以上のペプチドの他、食品製造時に通常添加される成分を含むことができ、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。上述した炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。
【００９７】
香味剤として天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど］）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を用いることができる。例えば、本発明の食品組成物がドリンク剤と飲料類として製造される場合には、本発明の前記ペプチドの他、クエン酸、液状果糖、砂糖、ブドウ糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、及び各種植物抽出液などをさらに含むことができる。
【００９８】
本発明の食品組成物は、ヒト用食品、飲料、動物用飼料及び飼料添加剤を含む。
【００９９】
さらに、本発明によって得られた前記一般式１及び一般式２で表示されるいずれか一つ以上のペプチドを活性成分として含む動物用飼料添加剤において、前記ペプチドは、多糖体で構成され、粉末形態に作製して、動物飼料にさらに含まれる動物用飼料添加剤を製造することができる。この場合、動物用飼料は、動物用粉末飼料、子牛代用乳又は子豚の餌付け飼料などからなる群から選べばよく、前記ペプチドの乾燥重量対比の含有量は、飼料１ｋｇ当たり１〜２ｇ（０．１％レベル）の範囲内であれば十分である。
【０１００】
本発明の食品及び健康食品組成物は、本発明のペプチドをそのまま添加、或いは他の食品又は食品成分と併用することができ、通常の方法にて適宜使用することができる。
【０１０１】
また、本発明のさらに他の態様は、前記一般式１及び一般式２で表示されるアミノ酸配列から選ばれるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分として含む抗酸化用化粧料組成物に関する。
【０１０２】
前記抗酸化用化粧料組成物は、皮膚外用軟膏、クリーム、柔軟化粧水、栄養化粧水、パック、エッセンス、ヘアトニック、シャンプー、リンス、ヘアーコンディショナー、ヘアートリートメント、ジェル、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、アイクリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、マスクパック、ファウンデーション、栄養エッセンス、サンスクリーン、石鹸、クレンジングフォーム、クレジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション及びボディークレンザーからなる群から選ばれる剤形を有することができるが、これに限定されない。それらの各剤形の組成物は、その剤形の製剤化に必要であり、適宜各種の基剤及び添加物を含有でき、それらの成分の種類と量は当業者にとって容易に選定可能である。
【０１０３】
本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲルである場合には、担体成分として、動物繊維、植物繊維、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛などを用いることができる。
【０１０４】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム又はポリアミドパウダーを用いることができ、特に、スプレーの場合は、さらに、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。
【０１０５】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合は、担体成分として、溶媒、溶媒化剤又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルが用いられる。
【０１０６】
本発明の剤形が懸濁液の場合は、担体成分として、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、又はトラカントなどを用いることができる。
【０１０７】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンザーである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノ−ルアミド、植物性油、ラノリン誘導体又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどを用いることができる。
【実施例】
【０１０８】
以下、好ましい実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらによって限定されないことは、当業界における通常の知識を有する者には明らかであろう。
【０１０９】
実験例１．酵母の加水分解物から抗酸化活性を有する低分子ペプチドのスクリーニング
１．酵母の加水分解物製造
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌体をｐＨ７．０に調節して６０℃に到達するように加熱した後、エンドペプチダーゼ（アルカラーゼ）を固形分対比で１％投入し、その後、２時間又は４時間酵素分解を行った（‘Ａ２’又は‘Ａ４’試料）。アルカラーゼで分解された試料（Ａ４）にエキソペプチダーゼ（フラボザイム）を固形分対比で１％投入した後、１０時間酵素分解を行った（‘ＡＦ１０’試料）。合計１０時間分解後、５５℃でアルカラーゼとフラボザイムを固形分対比で０．１２５％投入した後、２４時間酵素分解を行った（‘ＡＦ２４’試料）。分解された上澄み液を８５℃で３０分間失活させた後、限外濾過工程を用いて、分子量１０ｋＤａ未満のペプチドを分離した。前記アルカラーゼとフラボザイムはノボザイムから購入した。
【０１１０】
前記それぞれの酵母加水分解物（Ａ４、ＡＦ１０、ＡＦ２４）における抗酸化効能（ＤＰＰＨ）と還元力（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｐｏｗｅｒ）を測定した。
【０１１１】
２．ＤＰＰＨ（２，２−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌ−ｈｙｄｒａｚｙｌ−ｈｙｄｒａｔｅ）分析方法
酵母加水分解物のＤＰＰＨ消去能による抗酸化力は、チェ・チャンソブ等（２００３）とＳｈｅｋｈａｒ等（２０１４）の方法を用いて測定した。蒸留水に溶かしたサンプル試料（１〜５０００μｇ／ｍｌ）２０μｌをＤＰＰＨ（０．１１１ｍＭ）が含まれているエタノール溶液１８０μｌに添加した。これを２５℃で３０分間反応させた後、５１７ｎｍで吸光度を測定した。標準曲線作成のためにアスコルビン酸が用いられ、ＤＰＰＨ消去能（％）は［（無添加吸光度−サンプル試料吸光度）／無添加吸光度］×１００の数式で計算して求めた。
【０１１２】
３．還元力分析方法
酵母加水分解物の還元能力は、Ｏｙａｉｚｕ（１９８６）の方法を用いて測定した。具体的には、蒸留水に溶かしたサンプル試料（１〜５０００μｇ／ｍｌ、６０μｌ）をリン酸緩衝液（１５０μｌ、０．２Ｍ、ｐＨ６．６）、フェリシアン化カリウム（Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、１５０μｌ、１％）と混合した後、５０℃で２０分間反応させた。さらに、トリクロロ酢酸（１０％）１５０μｌを入れた後、２０００ｇで１０分間遠心分離した。サンプル試料が含まれた上澄み液１５０μｌをＤ．Ｗ１５０μｌ、ＦｅＣｌ３（３０μｌ、０．１％）に添加した。これを２５℃で１０分間反応させた後、７００ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１３】
４．結論
図１は、それぞれの酵母加水分解物（Ａ４、ＡＦ１０、ＡＦ２４）に対するＤＰＰＨ消去能（図１Ａ）と還元力（図１Ｂ）を測定したグラフである。ここで、Ｃｏｎｔｒｏｌは、なんの酵素でも処理していない酵母加水分解物であり、Ａ２は、アルカラーゼで２時間分解された酵母加水分解物、Ａ４は、アルカラーゼで４時間分解された酵母加水分解物、ＡＦ１０は、アルカラーゼで４時間分解後にフラボザイムで１０時間分解した酵母加水分解物、ＡＦ２４は、アルカラーゼで４時間分解後にフラボザイムで１０時間分解した後、２４時間さらに分解した酵母加水分解物である。
【０１１４】
図１に示すように、アルカラーゼとフラボザイムを順次に処理して多段に分解したＡＦ２４の試料において最高のＤＰＰＨ消去能及び還元力が得られることを確認した。すなわち、同一の酵母加水分解物においても酵素と時間によって異なるＤＰＰＨ消去能（図１Ａ）と還元力（図１Ｂ）を有することが分かる。したがって、本発明では、抗酸化効果を有するペプチドのスクリーニングのためにＡＦ２４試料を使用した。
【０１１５】
実験例２．酵母加水分解物の分子量によって１次分離及び各分画物の抗酸化活性分析
前記酵母加水分解物のうち、抗酸化活性に最も優れたＡＦ２４試料から、抗酸化活性に優れたペプチドを分離及び選定するために、前記ＡＦ２４酵母加水分解物を分子量（サイズ）別に分画物を製造し、それに対する酸化効能（ＤＰＰＨ）及び還元力（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｐｏｗｅｒ）を測定して比較した。
【０１１６】
１．酵母加水分解物の分画物製造
具体的には、前記ＡＦ２４酵母加水分解物を限外濾過膜サイズ１０ｋＤａ、５ｋＤａ、１ｋＤａでそれぞれ濾過し、分画別濾過液を１０５℃で４８時間水分を除去した後、乾燥重量を測定し、以下の表１のように含有量を求めた。表１によれば、酵母加水分解物の分画物の大部分が１ｋＤａ以下のサイズを有する物質であることが分かる。
【０１１７】
【表１】
2021534230.tif 000003
【０１１８】
２．酵母加水分解物分子量（サイズ）別分画物の抗酸化活性実験
それぞれの酵母加水分解物の分画物（製造例１〜４）に対して、実験例１のＤＰＰＨ消去能及び還元力測定方法で、ＤＰＰＨ消去能及び還元力を測定した。
【０１１９】
図２は、それぞれの酵母加水分解物の分画物（製造例１〜４）に対するＤＰＰＨ消去能（図２Ａ）と還元力（図２Ｂ）を測定したグラフである。ここで、Ｃｏｎｔｒｏｌはなんの酵素でも処理していない酵母加水分解物であり、１０ｋＤａ以上は、製造例１の酵母加水分解物の分画物であり、１０〜５ｋＤａは、製造例２の酵母加水分解物の分画物であり、５〜１ｋＤａは、製造例３の酵母加水分解物の分画物であり、１ｋＤａ以下は、製造例４の酵母加水分解物の分画物である。
【０１２０】
図２に示すように、５ｋＤａ以下で６％以上のＤＰＰＨ消去能を示し、１ｋＤａ以下の分画物（製造例４）で３〜８倍以上の最高の抗酸化活性を示すことを確認した。還元力もＤＰＰＨ消去能と同様に、１ｋＤａ以下の分画物（製造例４）で４倍以上の顕著に優れた抗酸化活性を示すことを確認した。そこで、本発明では、抗酸化効果を有するペプチドのスクリーニングのために、１ｋＤａ以下の酵母加水分解物濾過液を選定した。
【０１２１】
実験例３．１ｋＤａ以下酵母加水分解物濾過液を分子量によって２次分離
前記１ｋＤａ以下酵母加水分解物濾過液から分子量によって２次分離した後、抗酸化活性を測定して、抗酸化活性を有するペプチドをスクリーニングするための最終試料を選定した。
【０１２２】
１．ＨＰＬＣ分析
前記実験例２から選定された１ｋＤａ以下酵母加水分解物濾過液を、分子量分布度を確認し、分子量分布によって２次分離しようとした。このために、１ｋＤａ以下酵母加水分解物濾過液を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ｓｅｒｉｅｓ）機器及びＧＰＣメソッドシステムソフトウェアを用いて、分子量分布度を確認した。このとき、ＨＰＬＣ条件は、以下の表２の通りである。
【０１２３】
ＨＰＣＬは、具体的に、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰＬ  ａｑｕａｇｅｌ−ＯＨ  ２０カラムに１ｋＤａ以下の酵母加水分解物濾過液１０μｌを注入し、１分当り１ｍｌの流速で合計２０分間分離した。移動相は水とアセトニトリル、トリフルオロ酢酸をそれぞれ５０、５０、０．１の割合で混合して使用し、試料は２２０ｎｍの波長で検出した。
【０１２４】
【表２】
2021534230.tif 000004
【０１２５】
２．結論
図３は、抗酸化活性を有するペプチドをスクリーニングするために、実験例２から選定された１ｋＤａ以下の酵母加水分解物濾過液を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分子量分布を確認し、分子量によって２次分画物（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）を表記したグラフである。
【０１２６】
図３に示すように、実験例２から選定された１ｋＤａ以下の酵母加水分解物濾過液は、全分子量が１ｋＤａ（１，０００ダルトン）以下であった。これは、分子量５００ダルトン以上のペプチドが１５．１％（２次分画物Ｉ）、分子量５００ダルトン以下のペプチドが８１．９％（２次分画物ＩＩ）、アミノ酸が３．０％（２次分画物ＩＩＩ）からなっていることを確認した。したがって、抗酸化活性を有するペプチドのスクリーニングのために、最も抗酸化活性に優れた２次分画物ＩＩを最終選定し、２次分画物ＩＩからペプチドを同定した。
【０１２７】
実験例４．２次分画物ＩＩから抗酸化活性を有する１００種のペプチド同定
最終選定された２次分画物ＩＩから抗酸化機能性ペプチドをスクリーニングするために、２次分画物ＩＩに存在するペプチドを同定し、抗酸化活性を比較した。
【０１２８】
１．ペプチド同定
ペプチドのアミノ酸配列分析のために質量分析機ＬＣ  ＭＳ／ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）を用いたが、その条件及び方法は表３に示す。
【０１２９】
具体的には、最終選定された２次分画物ＩＩ  ５μｌをＬＣ  ＭＳ／ＭＳシステムに注入し、ＢＥＨ  Ｃ４カラムで分離した。移動相は、１分当たり０．２ｍｌの流速で１分間１００％の溶媒Ａを流した後、９分間溶媒Ａが１００％から９９％になるようにした。その後、０．５分間溶媒Ａが９９％から０％になるように減少させ、最終４．５分間では溶媒Ａが再び１００％になるようにした。質量スペクトルは、５０〜１２００ｍ／ｚ範囲内においてポジティブモードで電子噴射イオン化を用いて分析した。その作動係数は、次の通りである：イオンソース温度、１２０℃；脱溶媒和（ｄｅｓｏｖａｔｉｏｎ）温度、４００℃。試料分析はＭａｓｓＬｙｎｘ  ４．１  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）を用いた。
【０１３０】
【表３】
2021534230.tif 000005
【０１３１】
２．結論
図４は、酵母加水分解物のうち抗酸化活性に最も優れた２次分画物ＩＩから同定された代表的なペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル及び予想構造を示すグラフである。図４Ａは、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（ＧＳＨ）、図４Ｂは、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、図４Ｃはγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、図４Ｄはγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌである。
【０１３２】
図４に示すように、その結果、酵母加水分解物のうち抗酸化活性に最も優れた２次分画物ＩＩから、合計１００種のペプチドを確認した。
【０１３３】
実験例５．１００種のペプチドに対するＮｒｆ２  ｍＲＮＡ発現量比較
１．１００種のペプチド合成
前記確認された１００種のペプチドを、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって製造し、質量分析機ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）を用いて分析した。その後、合成されたペプチドと同定して設計された各ペプチドが同一構造であるかを確認するために、ペプチド指標物質のｍｏｎｏ−ｉｓｏｔｏｐｅ値（１．０ｐｐｍ以下）を基準にＸＩＣモードで分子量値を抽出して正確に確認し、ＭＳ／ＭＳ上で２個以上のプロダクトイオン（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｏｎ）が一致することを確認した。全ての試料及び指標物質はフルスキャン、ポジティブモードで測定した。
【０１３４】
２．１００種のペプチドに対する抗酸化活性（Ｎｒｆ２  ｍＲＮＡ発現量）分析
本発明においては、１００種のペプチドに対して抗酸化活性を比較し、最終ペプチドを選定するために、ＰＣＲを用いてＮｒｆ２  ｍＲＮＡ発現変化を測定した。
【０１３５】
（１）細胞培養及び１００種のペプチド処理
腎臓細胞であるＨＥＫ２９３細胞株をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地に６ウェルプレートのウェル当たり６．６×１０５個ずつ分注し、３７℃、５％  ＣＯ２条件で２４時間培養した。翌日、無血清・無アミノ酸培地（ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ）に入れ替えた後、２０時間以上さらに培養した。Ｔｅｒｔ−ＢＨＰ（３００ｕＭ）と１００種のペプチドを５００ｕＭ濃度でそれぞれ処理し、１８時間培養した。
【０１３６】
（２）ＲＮＡ抽出
前記（１）における１００種のペプチドがそれぞれ処理された細胞からＲＮＡを抽出するために、ＴＲｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために、ＧｏＳｃｒｉｐｔ（商標）  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を使用した。ＲＮＡ  １μｇ、プライマーｏｌｉｇｏ  ｄｔ  ０．５μｇ、ランダムプライマー０．５μｇ、ＲＴ−ＰＣＲ  ｐｒｅ−ｍｉｘｔｕｒｅを入れて２５℃で５分アニール、４２℃で６０分エクステンション、７０℃で１５分失活の過程を経てｃＤＮＡを合成した。
【０１３７】
（３）ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ
ＰＣＲは、Ｍａｘｉｍｅ（商標）  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（ｉ−ＳｔａｒＴａｑ）（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｏｒｅａ）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲは、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）を使用した。ＰＣＲプレートウェルにｃＤＮＡ  １００ｎｇ、２μＭ（ｐｍｏｌｅ／μｌ）プライマー、２Ｘ  ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ(R)  ＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ  １０μｌとＤ．Ｗを添加した。次いで、９５℃で３分、９５℃で１０秒、５８℃で４０秒、合計４０サイクル（ｃｙｃｌｅ）で行った。ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いてＰＣＲ反応を行い、毎サイクル（ｃｙｃｌｅ）が終わる度に蛍光強度を測定した。Ｎｒｆ２発現を確認するためのＰＣＲ分析に使用したプライマー配列（ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を表４に示した。
【０１３８】
【表４】
2021534230.tif 000006
【０１３９】
３．結論
図５は、酵母加水分解物から確認された１００種のペプチドに対するＮｒｆ２  ｍＲＮＡ発現量を、リアルタイムＰＣＲを用いて分析したグラフである。図５には、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、陰性対照群であるｔＢＨＰ（直接作用酸化応力誘導作用剤（ｄｉｒｅｃｔ−ａｃｔｉｎｇ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）のみ処理したもの、陽性対照群ｔＢＨＰ処理後、ＧＳＨペプチドを処理したもの、及び該当する１００種ペプチド名（表５から表８参照）が記載されている。
【０１４０】
上記の実験例４から、合計１００種のペプチドを確認した。それらに対してＮｒｆ２  ｍＲＮＡ発現量を比較した結果、Ｎｒｆ２  ｍＲＮＡ発現量において増加数値を示す合計４８種のペプチドを選定し、それらに対して定量的なＮｒｆ２  ｍＲＮＡ発現量を測定し、図５に示した。選定された４８種と非選定された残りのペプチドの化学式と構造式を、下記の表５から表８に示した。表５及び表６は、選定された４８種のペプチドの配列である。表７及び表８は、非選定されたペプチドの配列である。
【０１４１】
【表５】
2021534230.tif 000007
【０１４２】
【表６】
2021534230.tif 000008
【０１４３】
【表７】
2021534230.tif 000009
【０１４４】
【表８】
2021534230.tif 000010
【０１４５】
表６及び表７において、α−ＧＬＵはグルタミン酸、β−ＧＬＵはβ−グルタミン酸を意味し、Ｎｌｅはノルロイシン（Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｎｖａはノルバリン（Ｎｏｒｖａｌｉｎｅ）、ｔＬ又はｔＬＥＵはｔｅｒｔ−ロイシンを意味する。βＡ又はβＡＬＡは、β−アラニンを意味する。また、γ−ＧＬＵで表示される配列は、Ｌ−グルタミン酸のガンマ鎖にアミノ酸残基が順次に結合して形成されるものを意味する。
【０１４６】
すなわち、酵母加水分解物から合計１００種のペプチドが確認されたが、Ｎｒｆ２  ｍＲＮＡ発現を促進する‘抗酸化活性’を示すペプチドは合計４８種に達することを確認した。
【０１４７】
正常細胞は、酸化剤であるｔＢＨＰ処理時に、酸化ストレスによって成長阻害を受ける。ｔＢＨＰが処理された細胞に、抗酸化効能を有するペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）を処理すれば、ｔＢＨＰによる細胞の酸化及び成長が抑制され、細胞の成長が回復する。
【０１４８】
図５に示すように、４８種のペプチド（γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＭＥＴ（Ｏ）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＵ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＬＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＶＡＬ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−Ａｂｕ−ＧＬＹ及びγ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＧＬＹ）は、Ｎｒｆ２  ｍＲＮＡ発現を増加させる役割を果たすことを確認した。
【０１４９】
また、４８種のペプチドのうち、陽性対照群であるＧＳＨと同一又はより優れたＮｒｆ２  ｍＲＮＡ発現増加効果を有するジペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌと確認され、これは、ＧＳＨに比べて短い配列であるにもかかわらず、同等或いはより優れた効果を有することが分かる。
【０１５０】
また、４８種のペプチドのうち、陽性対照群であるＧＳＨに比べて有意に優れたＮｒｆ２  ｍＲＮＡ発現量を示すトリペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧと確認され、より好ましく、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）又はγ−ＧＬＵ−ＨＩＳは同一濃度において、陽性対照群であるＧＳＨよりも４倍以上のＮｒｆ２  ｍＲＮＡの発現量を増加させていることが分かる（正常レベルにＮｒｆ２  ｍＲＮＡの発現量が回復した。）。特に、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳに比べてα−ＧＬＵ−ＨＩＳ、β−ＧＬＵ−ＨＩＳは効果がなかった。
【０１５１】
実験例６．１００種のペプチドに対するＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現量分析
他の抗酸化因子であるＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現を検討した。前記実験例５と同一にして、細胞株を培養し、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ実験を行った。具体的には次の通りである。
【０１５２】
１．実験例５における１００種のペプチドに対する抗酸化活性（ＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現量）分析
（１）細胞培養及び１００種のペプチド処理
腎臓細胞であるＨＥＫ２９３細胞株をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地に６ウェルプレートのウェル当たり６．６×１０５個ずつ分注し、３７℃、５％  ＣＯ２条件で２４時間培養した。翌日、無血清・無アミノ酸培地（ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ）に入れ替えた後、２０時間以上さらに培養した。Ｔｅｒｔ−ＢＨＰ（３００ｕＭ）と１００種のペプチドを５００ｕＭ濃度でそれぞれ処理し、１８時間培養した。
【０１５３】
（２）ＲＮＡ抽出
前記（１）における１００種のペプチドがそれぞれ処理された細胞からＲＮＡを抽出するために、ＴＲｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために、ＧｏＳｃｒｉｐｔ（商標）  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を使用した。ＲＮＡ  １μｇ、プライマーｏｌｉｇｏ  ｄｔ  ０．５μｇ、ランダムプライマー０．５μｇ、ＲＴ−ＰＣＲ  ｐｒｅ−ｍｉｘｔｕｒｅを入れ、２５℃で５分アニール、４２℃で６０分エクステンション、７０℃で１５分失活の過程を経てｃＤＮＡを合成した。
【０１５４】
（３）ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ
ＰＣＲは、Ｍａｘｉｍｅ（商標）  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（ｉ−ＳｔａｒＴａｑ）（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｏｒｅａ）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲは、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ    ＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）を使用した。ＰＣＲプレートウェルにｃＤＮＡ１００ｎｇ，２μＭ（ｐｍｏｌｅ／μｌ）プライマー、２Ｘ  ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ(R)  ＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ  １０μｌとＤ．Ｗを添加した。次いで、９５℃で３分、９５℃で１０秒、５８℃で４０秒、合計４０サイクル（ｃｙｃｌｅ）で行った。ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）実時間ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いてＰＣＲ反応を行い、毎サイクル（ｃｙｃｌｅ）が終わる度に、蛍光強度を測定した。ＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現を確認するためのＰＣＲ分析に用いたプライマー配列は、表９に示した。
【０１５５】
【表９】
2021534230.tif 000011
【０１５６】
２．結論
図６は、酵母加水分解物から確認された１００種のペプチドに対するＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲを用いて分析したグラフである。図６には、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、陽性対照群ｔＢＨＰ処理後にＧＳＨペプチドを処理したもの、並びに表５及び表６における４８種ペプチド名が記載されている。
【０１５７】
図６に示すように、酸化的ストレスによって発現するＳＯＤ２  ｍＲＮＡの相対的な発現量を測定し、それぞれのペプチド別抗酸化効能を比較した。酵母加水分解物から得た合計１００種のペプチドを対象にＲＴ−ＰＣＲを行った結果、ＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現が増加したものは、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＭＥＴ（Ｏ）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌ、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ、γ−ＧＬＵ−Ａｂｕ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＬＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＶＡＬの３９種のペプチドが確認された。これら以外のペプチドではＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現増加効果がほとんど観察されなかった。
【０１５８】
前記３９種のペプチドにおけるＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現量を定量的に分析した結果、陽性対照群であるＧＳＨと同等又はより高いＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現量を示すジペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＭＥＴ（Ｏ）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌと確認され、これは、ＧＳＨに比べて短い配列であるにもかかわらず、同等又はより優れた効果を有することが分かる。
【０１５９】
また、陽性対照群であるＧＳＨよりも有意に優れたＳＯＤ２  ｍＲＮＡ発現量を示すトリペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−Ａｂｕ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧと確認された。
【０１６０】
好ましくは、約２〜３倍以上のＳＯＤ２  ｍＲＮＡの発現量促進効果を有するものは、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＭＥＴ（Ｏ）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳであった（正常レベル（ｃｏｎｔｒｏｌ）のＳＯＤ２  ｍＲＮＡの発現量に比べて著しく高かった。）。
【０１６１】
実験結果をまとめると、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌体を６０℃で加熱し、アルカラーゼを４時間処理して分解した後、ここにフラボザイムを添加して１０時間酵素分解し、アルカラーゼとフラボザイムを投入して２４時間酵素分解させ、その後、上澄液を得て酵母加水分解物を製造した。前記製造された酵母加水分解物を限外濾過膜を用いて１ｋＤａ以下の分子量を持つ分画物を１次分離し、ＨＰＬＣを用いて２１９．０９８１〜４０６．１４６２の分子量（［Ｍ＋Ｈ］＋（ｍ／ｚ））を持つ分画物を２次分離し、合計１００種のペプチドを同定した。
【０１６２】
前記１００種のペプチドに対して抗酸化活性（Ｎｒｆ２、ＳＯＤ２  ｍＲＮＡ）を分析した結果、合計４８種のペプチド（γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＭＥＴ（Ｏ）、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＵ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＬＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＯＲＮ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＶＡＬ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−Ａｂｕ−ＧＬＹ及びγ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＧＬＹ）が抗酸化効能を有することが分かった。
【０１６３】
陽性対照群であるＧＳＨに比べて配列長がより短いジペプチドのうち、γ−ＧＬＵ−ＡＬＡ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＬＥＵ、γ−ＧＬＵ−ＡＳＮ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＮＨ２、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ｏｌは、ＧＳＨと同等又はそれ以上の著しく優れたＮｒｆ２、ＳＯＤ２発現の促進活性を全て有することを確認した。中でも、ＧＳＨに比べて統計的に顕著に優れたＮｒｆ２、ＳＯＤ２発現の促進活性を有するジペプチドは、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ及びγ−ＧＬＵ−ＴＹＲであった。
【０１６４】
また、陽性対照群であるＧＳＨと配列長が同一であるトリペプチドのうち、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧは、ＧＳＨに比べて統計的に有意な程度以上の顕著なＮｒｆ２、ＳＯＤ２発現の促進活性を有することが確認された。
【０１６５】
すなわち、従来の抗酸化効果を有するものと知られていたＧＳＨに比べてより優れたＮｒｆ２発現及びＳＯＤ２発現の促進効果を有する合計２１種のペプチド（γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）、γ−ＧＬＵ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ、γ−ＧＬＵ−ＴＲＰ、γ−ＧＬＵ−ＴＹＲ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＰＨＥ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＭＥＴ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＳＮ及びγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＲＧ）が確認できた。
【０１６６】
これらの中でも、抗酸化効果（ＧＳＨと同等又はより優れた還元力とＤＰＰＨ消去能、Ｎｒｆ２  ｍＲＮＡ活性）を有する上に、陽性対照群であるＧＳＨに比べて約２〜３倍以上のＳＯＤ２  ｍＲＮＡの発現量促進効果を有するものは、合計６種のペプチド（γ−ＧＬＵ−ＣＹＳ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ２）、γ−ＧＬＵ−ＨＩＳ、γ−ＧＬＵ−ＩＬＥ、γ−ＧＬＵ−ＧＬＮ−ＧＬＵ、γ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＧＬＹ、γ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＣＹＳ）が確認され、ＧＳＨに比べて２〜８倍以上のＮｒｆ２、ＳＯＤ２  ｍＲＮＡの発現量促進効果を示すものはγ−ＧＬＵ−ＨＩＳと確認された。
【図１Ａ】
2021534230.tif 000012
【図１Ｂ】
2021534230.tif 000013
【図２Ａ】
2021534230.tif 000014
【図２Ｂ】
2021534230.tif 000015
【図３】
2021534230.tif 000016
【図４Ａ】
2021534230.tif 000017
【図４Ｂ】
2021534230.tif 000018
【図４Ｃ】
2021534230.tif 000019
【図４Ｄ】
2021534230.tif 000020
【図５Ａ】
2021534230.tif 000021
【図５Ｂ】
2021534230.tif 000022
【図５Ｃ】
2021534230.tif 000023
【図６】
2021534230.tif 000024
【国際調査報告】
2021534230.tif 000025
2021534230.tif 000026
2021534230.tif 000027
2021534230.tif 000028
2021534230.tif 000029
2021534230.tif 000030