(57)【要約】  抗ヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン特異的抗体及びその断片、並びにそのような抗体及び／又は断片の使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴｉｍ-３（Ｔ細胞免疫グロブリンムチンドメイン含有３）のＩｇＶドメイン若しくはヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）  ＧＹＳＦＴＧＹＴＩＮ（配列番号１）（ＣＤＲ１）；
ＬＦＮＰＹＮＧＧＴＴ（配列番号２）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＲＹＹＧＹＤＡＭＤＹ（配列番号３）（ＣＤＲ３）
若しくは
ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号７）（ＣＤＲ１）；
ＷＩＤＰＥＮＤＮＴＩＹ（配列番号８）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＤＦＧＹＶＡＷＬＶＹ（配列番号９）（ＣＤＲ３）
の１つ以上を含む重鎖、及び
ｂ）  ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＨＬＡ（配列番号４）（ＣＤＲ１）；
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）（ＣＤＲ２）；
ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号６）（ＣＤＲ３）；
若しくは
ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１０）（ＣＤＲ１）；
ＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号１１）（ＣＤＲ２）；
ＱＱＹＳＳＹＰＴ（配列番号１２）（ＣＤＲ３）
の１つ以上を含む軽鎖
を含む抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
ヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン又はヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
ＧＹＳＦＴＧＹＴＩＮ（配列番号１）（ＣＤＲ１）；
ＬＦＮＰＹＮＧＧＴＴ（配列番号２）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＲＹＹＧＹＤＡＭＤＹ（配列番号３）（ＣＤＲ３）
を含む重鎖、及び
ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＨＬＡ（配列番号４）（ＣＤＲ１）；
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）（ＣＤＲ２）；
ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号６）（ＣＤＲ３）
を含む軽鎖
を含む抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
ヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン又はヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号７）（ＣＤＲ１）；
ＷＩＤＰＥＮＤＮＴＩＹ（配列番号８）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＤＦＧＹＶＡＷＬＶＹ（配列番号９）（ＣＤＲ３）
を含む重鎖、及び
ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１０）（ＣＤＲ１）；
ＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号１１）（ＣＤＲ２）；
ＱＱＹＳＳＹＰＴ（配列番号１２）（ＣＤＲ３）
を含む軽鎖
を含む抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記軽鎖及び前記重鎖のフレームワーク領域が、ヒトのフレームワーク領域と８５％以上の同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記軽鎖及び前記重鎖のフレームワーク領域が、ヒトのフレームワーク領域である、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
ＫＤが１０．０ｎＭより小さい親和性でヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン又はヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
ＫＤが０．５ｎＭより小さい親和性でヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン又はヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合する、請求項６に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
ヒトＦｃ領域の配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
ヒトＴｉｍ-３とデキサメタゾン処理ジャーカットＴ細胞に発現するホスファチジルセリンとの結合を阻害する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
１つ以上の
ＧＹＳＦＴＧＹＴＩＮ（配列番号１）（ＣＤＲ１）
ＬＦＮＰＹＮＧＧＴＴ（配列番号２）（ＣＤＲ２）
ＡＲＲＹＹＧＹＤＡＭＤＹ（配列番号３）（ＣＤＲ３）
を含む重鎖を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
１つ以上の
ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＨＬＡ（配列番号４）（ＣＤＲ１）
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）（ＣＤＲ２）
ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号６）（ＣＤＲ３）
を含む軽鎖を含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
１つ以上の
ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号７）（ＣＤＲ１）
ＷＩＤＰＥＮＤＮＴＩＹ（配列番号８）（ＣＤＲ２）
ＡＲＤＦＧＹＶＡＷＬＶＹ（配列番号９）（ＣＤＲ３）
を含む重鎖を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
１つ以上の
ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１０）（ＣＤＲ１）
ＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号１１）（ＣＤＲ２）
ＱＱＹＳＳＹＰＴ（配列番号１２）（ＣＤＲ３）
を含む軽鎖を含む、請求項６〜９又は１２のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗体又はその抗原結合断片は、キメラであるか、又はヒト化されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片及びＦ（ａｂ）’断片からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
１つ以上の
ＧＹＳＦＴＧＹＴＩＮ（配列番号１）（ＣＤＲ１）；
ＬＦＮＰＹＮＧＧＴＴ（配列番号２）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＲＹＹＧＹＤＡＭＤＹ（配列番号３）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の重鎖をコードする核酸。
【請求項１７】
１つ以上の
ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号７）（ＣＤＲ１）；
ＷＩＤＰＥＮＤＮＴＩＹ（配列番号８）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＤＦＧＹＶＡＷＬＶＹ（配列番号９）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の重鎖をコードする核酸。
【請求項１８】
１つ以上の
ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＨＬＡ（配列番号４）（ＣＤＲ１）；
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）（ＣＤＲ２）；
ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号６）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の軽鎖をコードする核酸。
【請求項１９】
１つ以上の
ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１０）（ＣＤＲ１）；
ＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号１１）（ＣＤＲ２）
ＱＱＹＳＳＹＰＴ（配列番号１２）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の軽鎖をコードする核酸。
【請求項２０】
請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の核酸の１つ以上を含む宿主細胞。
【請求項２１】
治療薬と連結又は結合した、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２２】
前記治療薬が、細胞障害性薬剤、放射性同位体、免疫調節剤又は二次抗体である、請求項２１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２３】
ヒトＴｉｍ-３を阻害するのに有効な量の、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又はそのヒトＴｉｍ-３結合断片を投与することを含む、対象のヒトＴｉｍ-３を阻害する方法。
【請求項２４】
前記対象はがんに罹患している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｔｉｍ-３が媒介するＴ細胞の抑制を阻害するのに有効な量の、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又はそのヒトＴｉｍ-３結合断片を投与することを含む、対象のＴｉｍ-３が媒介するＴ細胞の抑制を阻害する方法。
【請求項２６】
対象のがんを治療するのに有効な量の、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む、対象のがんを治療する方法。
【請求項２７】
前記がんがヒトＴｉｍ-３陽性のがんである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象のヒトＴｉｍ-３陽性細胞を検出する方法であって、
ヒトＴｉｍ-３陽性細胞を標識するのに有効な量の検出可能なマーカーが結合した請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与し、
前記対象における前記標識の存在を検出し、
これにより、対象のヒトＴｉｍ-３陽性細胞を検出することを含む、方法。
【請求項２９】
前記標識を画像化により検出する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞ががん細胞である、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記がんが血液悪性腫瘍である、請求項２４、２６、２７又は３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記がんが固形腫瘍を含む、請求項２４、２６、２７又は３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１又は抗ＣＴＬＡ４療法を受けている、請求項２４、２６、２７又は３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第62/720,234号（出願日：2018年8月21日）の利益を主張し、その内容は全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、EFS-Webを介してASCII形式で提出した配列表を含み、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。2019年8月21日に作成したASCIIの写しはSequenceListing.txtというファイル名で、サイズは15.6KBである。
【背景技術】
【０００３】
本明細書で参照する全ての刊行物、特許、特許出願及び図書の開示は、本発明に関連する技術をより完全に説明するために、それらの全体が参照としてこの明細書に組み込まれる。
【０００４】
Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）としても知られるＴ細胞免疫グロブリンムチンドメイン含有３（Ｔｉｍ-３）はＩ型膜貫通タンパク質であり、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞、Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ細胞、及びマクロファージや樹状細胞などの自然免疫細胞で発現する抑制性受容体である。Ｔｉｍ-３は、そのリガンドと相互作用することにより免疫応答を抑制することができる。Ｔｉｍ-３は、Ｎ末端免疫グロブリン（ＩｇＶ）ドメイン、Ｏ結合型グリコシル化部位を含むムチンドメイン、Ｎ結合糖を有する膜貫通ドメインとムチンドメインとの間にあるストークドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含む（Monney 2002）。本発明者の研究室は、以前に、Ｔｉｍ-３のＩｇＶドメインが炭水化物に結合することができる機能ドメインであることを報告した（Cao 2007）。Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメインは、全てのＴｉｍファミリータンパク質では特徴的な構造であるものの他の免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーでは認められない固有のＣＣ’−ＦＧ溝と、２つの非標準的な（noncanonical）ジスルフィド結合を含む（Cao 2007）。ＰＤ-１阻害治療に対する免疫逃避が、Ｔｉｍ-３を含む他の免疫チェックポイントのアップレギュレーションと関連していると報告した研究者もいる（Koyama 2016）。炭水化物（Cao 2007；Wilker 2007）に加えて、ガレクチン-９（Zhu 2005）、ホスファチジルセリン（DeKruyff 2010）、ＨＭＧＢ１（高移動度タンパク質ボックス１）（Chiba 2012）及びＬＩＬＲＢ２（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２）（国際公開第2016/111947号）を含む他の分子が、Ｔｉｍ-３のリガンドであると報告されている。
【０００５】
発明の概要
ヒトＴｉｍ-３（Ｔ細胞免疫グロブリンムチンドメイン含有３）のＩｇＶドメイン若しくはヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合し、
ａ）  ＧＹＳＦＴＧＹＴＩＮ（配列番号１）（相補性決定領域（ＣＤＲ）１（ＣＤＲ１））；
ＬＦＮＰＹＮＧＧＴＴ（配列番号２）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＲＹＹＧＹＤＡＭＤＹ（配列番号３）（ＣＤＲ３）；
若しくは
ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号７）（ＣＤＲ１）；
ＷＩＤＰＥＮＤＮＴＩＹ（配列番号８）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＤＦＧＹＶＡＷＬＶＹ（配列番号９）（ＣＤＲ３）；
の１つ以上を含む重鎖、及び
ｂ）  ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＨＬＡ（配列番号４）（ＣＤＲ１）；
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）（ＣＤＲ２）；
ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号６）（ＣＤＲ３）；
若しくは
ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１０）（ＣＤＲ１）；
ＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号１１）（ＣＤＲ２）；
ＱＱＹＳＳＹＰＴ（配列番号１２）（ＣＤＲ３）
の１つ以上を含む軽鎖、を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００６】
ヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン若しくはヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合し、
ＧＹＳＦＴＧＹＴＩＮ（配列番号１）（ＣＤＲ１）；
ＬＦＮＰＹＮＧＧＴＴ（配列番号２）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＲＹＹＧＹＤＡＭＤＹ（配列番号３）（ＣＤＲ３）；
を含む重鎖、及び
ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＨＬＡ（配列番号４）（ＣＤＲ１）；
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）（ＣＤＲ２）；
ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号６）（ＣＤＲ３）
を含む軽鎖、を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００７】
ヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン若しくはヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合し、
ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号７）（ＣＤＲ１）；
ＷＩＤＰＥＮＤＮＴＩＹ（配列番号８）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＤＦＧＹＶＡＷＬＶＹ（配列番号９）（ＣＤＲ３）
を含む重鎖、及び
ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１０）（ＣＤＲ１）；
ＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号１１）（ＣＤＲ２）；
ＱＱＹＳＳＹＰＴ（配列番号１２）（ＣＤＲ３）
を含む軽鎖、を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００８】
ＫＤが１０．０ｎＭより小さい親和性でヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン又はヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合する単離された抗体を提供する。
【０００９】
１つ以上の
ＧＹＳＦＴＧＹＴＩＮ（配列番号１）（ＣＤＲ１）；
ＬＦＮＰＹＮＧＧＴＴ（配列番号２）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＲＹＹＧＹＤＡＭＤＹ（配列番号３）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の重鎖をコードする核酸を提供する。
【００１０】
１つ以上の
ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号７）（ＣＤＲ１）；
ＷＩＤＰＥＮＤＮＴＩＹ（配列番号８）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＤＦＧＹＶＡＷＬＶＹ（配列番号９）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の重鎖をコードする核酸を提供する。
【００１１】
１つ以上の
ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＨＬＡ（配列番号４）（ＣＤＲ１）；
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）（ＣＤＲ２）；
ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号６）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の軽鎖をコードする核酸を提供する。
【００１２】
１つ以上の
ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１０）（ＣＤＲ１）；
ＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号１１）（ＣＤＲ２）
ＱＱＹＳＳＹＰＴ（配列番号１２）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の軽鎖をコードする核酸を提供する。
【００１３】
本明細書に記載の１つ以上の核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００１４】
治療薬と連結若しくは結合した、本明細書に記載の抗体又はその断片を提供する。
【００１５】
ヒトＴｉｍ-３を阻害するのに有効な量の、本明細書に記載の抗体又はその断片を投与することを含む、対象のヒトＴｉｍ-３を阻害する方法を提供する。
【００１６】
Ｔｉｍ-３が媒介するＴ細胞の抑制を阻害するのに有効な量の、本明細書に記載の抗体又はその断片を投与することを含む、対象のＴｉｍ-３が媒介するＴ細胞の抑制を阻害する方法を提供する。
【００１７】
対象のがんを治療するのに有効な本明細書に記載の抗体又はその断片を投与することを含む、対象のがんを治療する方法を提供する。
【００１８】
対象のヒトＴｉｍ-３陽性細胞を検出する方法であって、ヒトＴｉｍ-３陽性細胞を標識するのに有効な量の検出可能なマーカーが結合した本明細書に記載の抗体又はその断片を投与し、対象における前記標識の存在を検出し、これにより、対象のヒトＴｉｍ-３陽性細胞を検出することを含む方法を提供する。
【００１９】
本明細書に記載の抗体又はその断片をコードする単離された核酸分子を提供する。ある態様では、核酸はＤＮＡである。ある態様では、核酸はｃＤＮＡである。ある態様では、核酸はＲＮＡである。
【００２０】
いくつかの態様では、抗体の抗原結合断片は、抗体のＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片である。いくつかの態様では、抗体の抗原結合断片は、抗体のヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片である。
【００２１】
本明細書に記載の核酸分子をコードするベクターを提供する。本明細書に記載の核酸分子又は本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２２】
抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片を製造する方法は、本明細書に記載の宿主細胞が抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片を産生する条件で、宿主細胞を培養することを含む。
【００２３】
本明細書に記載の抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
治療有効量の、本明細書に記載の抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象におけるＴｉｍ-３の活性を低下させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＥＬＩＳＡは、５０Ｂ５がＴｉｍ-３−ＩｇＶタンパク質及びＴｉｍ-３の細胞外のタンパク質（ＩｇＶムチンストーク）に結合するが、ヒトＩｇＧ対照タンパク質には結合しないことを示す。
【図２】ＦＡＣＳは、５０Ｂ５がヒトＴｉｍ-３を発現する細胞に結合するが、マウスＴｉｍ-３には結合しないことを示す。５０Ｂ５：太線、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照：影のヒストグラム。
【図３】表面プラズモン共鳴による５０Ｂ５の速度論的パラメーター。
【図４】Ａ：混合リンパ球反応では、分裂したＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞は、４日目にＴｉｍ-３を発現したが、分裂していないＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞はそうではなかった。  Ｂ：混合リンパ球反応で、ｍＡｂ ５０Ｂ５は、４日目にＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞からのＩＦＮγ産生を有意に増強した；Ｎ＝８；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】ＦＡＣＳは、１５Ｂ４がヒトＴｉｍ-３を発現する細胞に結合することを示す。１５Ｂ４：太線、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照：影のヒストグラム。
【図６】表面プラズモン共鳴による速度論的パラメーター。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ヒトＴｉｍ-３（Ｔ細胞免疫グロブリンムチンドメイン含有３）のＩｇＶドメイン若しくはヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合し、
ａ）  ＧＹＳＦＴＧＹＴＩＮ（配列番号１）（ＣＤＲ１）；
ＬＦＮＰＹＮＧＧＴＴ（配列番号２）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＲＹＹＧＹＤＡＭＤＹ（配列番号３）（ＣＤＲ３）；
若しくは
ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号７）（ＣＤＲ１）；
ＷＩＤＰＥＮＤＮＴＩＹ（配列番号８）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＤＦＧＹＶＡＷＬＶＹ（配列番号９）（ＣＤＲ３）；
の１つ以上を含む重鎖、及び
ｂ）  ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＨＬＡ（配列番号４）（ＣＤＲ１）；
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）（ＣＤＲ２）；
ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号６）（ＣＤＲ３）；
若しくは
ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１０）（ＣＤＲ１）；
ＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号１１）（ＣＤＲ２）；
ＱＱＹＳＳＹＰＴ（配列番号１２）（ＣＤＲ３）
の１つ以上を含む軽鎖、を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００２７】
ヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン若しくはヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合し、
ＧＹＳＦＴＧＹＴＩＮ（配列番号１）（ＣＤＲ１）；
ＬＦＮＰＹＮＧＧＴＴ（配列番号２）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＲＹＹＧＹＤＡＭＤＹ（配列番号３）（ＣＤＲ３）；
を含む重鎖、及び
ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＨＬＡ（配列番号４）（ＣＤＲ１）；
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）（ＣＤＲ２）；
ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号６）（ＣＤＲ３）
を含む軽鎖、を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００２８】
ヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン若しくはヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合し、
ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号７）（ＣＤＲ１）；
ＷＩＤＰＥＮＤＮＴＩＹ（配列番号８）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＤＦＧＹＶＡＷＬＶＹ（配列番号９）（ＣＤＲ３）；
を含む重鎖、及び
ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１０）（ＣＤＲ１）；
ＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号１１）（ＣＤＲ２）；
ＱＱＹＳＳＹＰＴ（配列番号１２）（ＣＤＲ３）
を含む軽鎖、を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００２９】
いくつかの態様では、軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域は、ヒトのフレームワーク領域と８５％以上の同一性を有する。
【００３０】
いくつかの態様では、軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域は、ヒトのフレームワーク領域である。ＫＤが１０．０ｎＭより小さい親和性でヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン若しくはヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３１】
いくつかの態様では、抗体は、ＫＤが１．０ｎＭより小さい親和性でヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン又はヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合する。いくつかの態様では、抗体は、ＫＤが０．５ｎＭより小さい親和性でヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメイン又はヒトＴｉｍ-３のＩｇＶムチンストークに結合する。
【００３２】
いくつかの態様では、抗体はマウスＴｉｍ-３に結合しない。
【００３３】
いくつかの態様では、抗体は、デキサメタゾン処理ジャーカットＴ細胞に発現するホスファチジルセリンとヒトＴｉｍ-３との結合を阻害する。
【００３４】
いくつかの態様では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＦｃ領域の配列を有する。
【００３５】
いくつかの態様では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、
ＧＹＳＦＴＧＹＴＩＮ（配列番号１）（ＣＤＲ１）
ＬＦＮＰＹＮＧＧＴＴ（配列番号２）（ＣＤＲ２）
ＡＲＲＹＹＧＹＤＡＭＤＹ（配列番号３）（ＣＤＲ３）
の１つ以上を含む重鎖を含む。
【００３６】
いくつかの態様では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、
ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＨＬＡ（配列番号４）（ＣＤＲ１）
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）（ＣＤＲ２）
ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号６）（ＣＤＲ３）
の１つ以上を含む軽鎖を含む。
【００３７】
いくつかの態様では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、
ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号７）（ＣＤＲ１）
ＷＩＤＰＥＮＤＮＴＩＹ（配列番号８）（ＣＤＲ２）
ＡＲＤＦＧＹＶＡＷＬＶＹ（配列番号９）（ＣＤＲ３）
の１つ以上を含む重鎖を含む。
【００３８】
いくつかの態様では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、
ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１０）（ＣＤＲ１）
ＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号１１）（ＣＤＲ２）
ＱＱＹＳＳＹＰＴ（配列番号１２）（ＣＤＲ３）
の１つ以上を含む軽鎖を含む。
【００３９】
いくつかの態様では、単離された抗体又はその断片は、キメラであるか、ヒト化されている。
【００４０】
いくつかの態様では、単離された抗体又はその断片は、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片及びＦ（ａｂ）’断片からなる群から選択される。厳密にいうと、ｓｃＦｖは抗体の断片ではなく融合タンパク質であるが、本明細書では、特に言及しない限り、抗体の断片はｓｃＦｖを含むことに注意されたい。
【００４１】
１つ以上の
ＧＹＳＦＴＧＹＴＩＮ（配列番号１）（ＣＤＲ１）；
ＬＦＮＰＹＮＧＧＴＴ（配列番号２）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＲＹＹＧＹＤＡＭＤＹ（配列番号３）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の重鎖をコードする核酸を提供する。
【００４２】
１つ以上の
ＧＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号７）（ＣＤＲ１）；
ＷＩＤＰＥＮＤＮＴＩＹ（配列番号８）（ＣＤＲ２）；
ＡＲＤＦＧＹＶＡＷＬＶＹ（配列番号９）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の重鎖をコードする核酸を提供する。
【００４３】
１つ以上の
ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＨＬＡ（配列番号４）（ＣＤＲ１）；
ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）（ＣＤＲ２）；
ＨＱＹＬＳＳＹＴ（配列番号６）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の軽鎖をコードする核酸を提供する。
【００４４】
１つ以上の
ＫＡＳＱＮＶＤＴＡＶＡ（配列番号１０）（ＣＤＲ１）；
ＳＡＳＮＲＹＴ（配列番号１１）（ＣＤＲ２）
ＱＱＹＳＳＹＰＴ（配列番号１２）（ＣＤＲ３）
を含む抗体の軽鎖をコードする核酸を提供する。
【００４５】
本明細書に記載の１つ以上の核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００４６】
治療薬と連結若しくは結合した、本明細書に記載の抗体又はその断片を提供する。
【００４７】
いくつかの態様では、治療薬は、細胞障害性薬剤、放射性同位体、免疫調節剤又は二次抗体である。
【００４８】
ヒトＴｉｍ-３を阻害するのに有効な量の、本明細書に記載の抗体若しくはその断片又はそのヒトＴｉｍ-３結合断片を投与することを含む、対象のヒトＴｉｍ-３を阻害する方法を提供する。
【００４９】
いくつかの態様では、対象はがんに罹患している。
【００５０】
Ｔｉｍ-３が媒介するＴ細胞の抑制を阻害するのに有効な量の、本明細書に記載の抗体若しくはその断片又はそのヒトＴｉｍ-３結合断片を投与することを含む、対象のＴｉｍ-３が媒介するＴ細胞の抑制を阻害する方法を提供する。
【００５１】
対象のがんを治療するのに有効な量の、本明細書に記載の抗体又はその断片を投与することを含む、対象のがんを治療する方法を提供する。
【００５２】
いくつかの態様では、がんはヒトＴｉｍ-３陽性のがんである。
【００５３】
対象のヒトＴｉｍ-３陽性細胞を検出する方法であって、ヒトＴｉｍ-３陽性細胞を標識するのに有効な量の検出可能なマーカーが結合した本明細書に記載の抗体又はその断片を投与し、対象における前記標識の存在を検出し、これにより、対象のヒトＴｉｍ-３陽性細胞を検出することを含む方法を提供する。
【００５４】
いくつかの態様では、標識は画像化により検出する。
【００５５】
いくつかの態様では、細胞はがん細胞である。
【００５６】
いくつかの態様では、がんは血液悪性腫瘍である。いくつかの態様では、がんは、肺癌、胃癌、頭頸部癌、神経鞘腫、黒色腫又は濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫である。
【００５７】
いくつかの態様では、がんは固形腫瘍を含む。
【００５８】
いくつかの態様では、対象は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１又は抗ＣＴＬＡ４療法を受けている。
【００５９】
いくつかの態様では、抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片は、(i) ヒト生殖細胞系列IGHV1-2*02、IGHV1-2*04、IGHV1-2*05、IGHV1-18*04、IGHV1-69-2*01、IGHV1-46*01、IGHD5-12*01、IGHD5-24*01、IGHD6-25*01、IGHJ3*01、IGHJ4*01、IGHJ4*03、IGHJ6*01、IGHJ6*02のフレームワーク配列を含むＶＨフレームワーク、及び／又は  (ii) ヒト生殖細胞系列IGKV1-13*02、IGKV1-27*01、IGKV3-7*02、IGKV4-1*01、IGKV1D-13*02、IGKV3D-7*01、IGKJ1*01、IGKJ2*01、IGKJ4*01、IGKJ4*02のフレームワーク配列を含むＶＬフレームワーク、を含む。
【００６０】
いくつかの態様では、抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片は、Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメインと約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２Ｍの結合親和性（ＫＤ）で結合する。
【００６１】
いくつかの態様では、抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片は、モノクローナル抗体である。
【００６２】
いくつかの態様では、抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片は、組換え抗体である。
【００６３】
いくつかの態様では、抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片は、ヒトのフレームワーク領域を有する。
【００６４】
いくつかの態様では、抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片は、ヒトの定常領域を有する。
【００６５】
いくつかの態様では、抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体を提供する。
【００６６】
いくつかの態様では、抗体のＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片を提供する。
【００６７】
いくつかの態様では、抗体のＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２又はｓｃＦｖである。
【００６８】
本明細書に記載の抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片をコードする単離された核酸分子を提供する。ある態様では、核酸はＤＮＡである。ある態様では、核酸はｃＤＮＡである。ある態様では、核酸はＲＮＡである。
【００６９】
本明細書に記載の核酸分子をコードするベクターを提供する。本明細書に記載の核酸分子又は本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００７０】
抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片を製造する方法は、本明細書に記載の宿主細胞が抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片を産生する条件で、宿主細胞を培養することを含む。
【００７１】
本明細書に記載の抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体又はそのＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン結合断片及び担体を含む組成物を提供する。ある態様では、組成物は医薬組成物であり、担体は薬学的担体である。本明細書に記載の抗体又はその結合断片及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
【００７２】
本明細書では、「抗体」という用語はインタクトな抗体、すなわち完全なＦｃ及びＦｖ領域を有することを指す。「断片」は、非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）など、抗体の一部分又は相互に連結した抗体の一部分を指し、抗体全体ではないがその抗原結合部分であって、特異的結合においてインタクトな抗体と競合する。この場合、抗原はヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶドメインである。
【００７３】
そのような断片は、例えば、インタクトな抗体を切断することにより、又は組換えにより調製することができる。Fundamental Immunology, Ch. 7（Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）参照。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、インタクトな抗体の酵素的若しくは化学的切断により、又は分子生物学の技術により製造してもよい。いくつかの態様では、断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（ペプチドリンカーを介して連結した軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ））である。ある態様では、ｓｃＦｖは、ヒト可変ドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４と同一の配列を有する可変ドメインフレームワーク配列を含む。ある態様では、ｓｃＦｖは、５〜３０アミノ酸残基を有するリンカーペプチドを含む。ある態様では、ｓｃＦｖは、１つ以上のグリシン、セリン及びスレオニン残基を含むリンカーペプチドを含む。
【００７４】
ある態様では、ｓｃＦｖのリンカーは長さが１０〜２５のアミノ酸である。ある態様では、ペプチドリンカーは、グリシン、セリン及び／又はスレオニン残基を含む（例えば、Bird 1988及びHuston 1988参照、これら文献の全体が参照として本明細書に組み込まれる）か、又は、ダイアボディを含む、ヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶドメインと特異的に結合するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。Ｎ末端からＣ末端まで、成熟した軽鎖及び重鎖可変ドメインは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４領域を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、Chothia & Lesk 1987又はChothia 1989（これらの全体が参照として本明細書に組み込まれる）の定義に従う。本明細書では、「ポリペプチド」という用語は、天然又は人工のタンパク質、タンパク質の断片及びポリペプチド類似体が含まれる。ポリペプチドは、単量体又は高分子であってもよい。本明細書では、Ｆｄ断片は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成る抗体の断片を意味し、Ｆｖ断片は、抗体の一本鎖のＶ１及びＶＨドメインから成り、ｄＡｂ断片（Ward 1989、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）はＶＨドメインから成る。いくつかの態様では、断片のアミノ酸の長さは、少なくとも５、６、８又は１０である。別の態様では、断片のアミノ酸の長さは、少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０、又は少なくとも７０、８０、９０、１００、１５０若しくは２００である。
【００７５】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書では、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、個々の抗体は、わずかに存在する可能性のある変異、例えば、天然で生じる突然変異を除いて同一である集団を指す。したがって、「モノクローナル」という用語は、異なる抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。ある態様では、そのようなモノクローナル抗体は、通常、ヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体に結合するペプチド配列を含む抗体を含む。異なる抗原決定基（エピトープ）に対する抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体調製物中のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加え、モノクローナル抗体は、通常、他の免疫グロブリンで汚染されていないという点で有利である。したがって、その配列が同定された後は、モノクローナル抗体は、非ハイブリドーマ技術、例えば、組換えによって調製することができる。
【００７６】
本明細書に記載された発明の態様では、抗体は単離されている。本明細書では、「単離された抗体」という用語は、その起源又は由来に基づいて、(1) 天然の状態で共存する要素とは無関係である、(2) 他の同種のタンパク質を含まない、(3) 異なる種の細胞で生産される、(4) 人間が手を加えなければ自然界では生じない、の１つ、２つ、３つ又は全てを有する抗体を指す。
【００７７】
ある態様では、抗体はヒト化されている。非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、最小限の非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含むキメラ抗体である。ある態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＨＶＲ）（又はＣＤＲ）が、所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある態様では、抗体は、本明細書に記載のマウス抗体（ｍＡｂ１５Ｂ４及びｍＡｂ５０Ｂ５）の重鎖及び軽鎖の１、２、３、４、５又は６つ全てのＣＤＲ１−３を有する。好ましい態様では、マウスｍＡｂのフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応するヒト免疫グロブリン可変ドメインフレームワーク（ＦＲ）残基に置き換えられる。これらは、抗体性能をさらに向上するために、実施の形態においてさらに改変されてもよい。さらに、特定の態様では、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に存在しない残基を含んでいてもよい。ある態様では、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に存在しない残基を含まない。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含むことができ、当該可変ドメインでは、全て又はある態様では実質的に全ての超可変ループは非ヒト免疫グロブリン（例．本明細書に記載のｍＡｂ １５Ｂ４及びｍＡｂ ５０Ｂ５）のループに対応し、全て又はある態様では実質的に全てのＦＲはヒト免疫グロブリンの配列である。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むこともできる。例えば、Jones 1986；Riechmann 1988；Presta 1992；Vaswani & Hamilton 1998；Harris 1995；Hurle & Gross 1994並びに米国特許第6,982,321号及び第7,087,409号を参照、これら文献の全体が参照として本明細書に組み込まれる。ヒト化抗体がレシピエント抗体又はドナー抗体に存在しない残基を含む態様では、抗体のＦｃ領域は国際公開第99/58572号に記載されているように修飾される。この公報の全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【００７８】
モノクローナル抗体をヒト化する技術はよく知られており、例えば、米国特許第4,816,567号、第5,807,715号、第5,866,692号、第6,331,415号、第5,530,101号、第5,693,761号、第5,693,762号、第5,585,089号及び第6,180,370号に記載されている。これら明細書の全体が参照として本明細書に組み込まれる。げっ歯類又は改変されたげっ歯類のＶ領域とその相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト定常ドメインが融合した抗体を含む、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含む多くの「ヒト化」抗体分子が記載されている。例えば、Winter 1991；Lobuglio 1989；Shaw 1987及びBrown 1987を参照、これらの全体が参照として本明細書に組み込まれる。他の文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に移植された、げっ歯類の超可変領域又はＣＤＲを記載している。例えば、Riechmann 1988；Verhoeyen 1988及びJones 1986を参照、これら文献の全体が参照として本明細書に組み込まれる。別の文献は、げっ歯類の組換えられたフレームワーク領域を有するげっ歯類のＣＤＲを記載している−欧州特許出願公開第0519596号（全体が参照として本明細書に組み込まれる）。これらの「ヒト化」分子は、非ヒト抗体であるげっ歯類の抗体に対する望ましくない免疫応答であって、ヒトで抗体の治療期間や有効性を制限する免疫応答を最小限とするように設計されている。抗体の定常領域は、免疫学的に不活性である（例えば、補体溶解を引き起こさない）ように操作することができる。例えば、国際公開第99/58572号；英国特許出願第9809951.8号を参照。利用することができる他の抗体のヒト化方法は、Daugherty 1991；米国特許第6,180,377号；第6,054,297号；第5,997,867号；第5,866,692号；第6,210,671号及び第6,350,861号、並びに国際公開第01/27160号に記載されており、これら文献の全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【００７９】
ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に対して変更された、１つ以上又は全てのＣＤＲ（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２又はＣＤＲ Ｈ３）を有し、これらは１つ以上の元の抗体に「由来する」１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる。ある態様では、本発明の抗体は、元の抗体に対して変更された、１つ以上又は全てのＣＤＲ（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２又はＣＤＲ Ｈ３）を有するヒト化ｍＡｂ １５Ｂ４及びｍＡｂ ５０Ｂ５である。ある態様では、本発明の抗体は、元の抗体に対して変更されていないＣＤＲ（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２又はＣＤＲ Ｈ３）を有するヒト化ｍＡｂ １５Ｂ４及びｍＡｂ ５０Ｂ５である。
【００８０】
いくつかの態様では、本明細書の抗体又は断片は、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物（例えば、マウス）から単離した抗体のように、組換えにより得ることはできる。
【００８１】
ある態様では、本明細書に記載の抗Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体は、ヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶドメインに特異的に結合することができるか、又は特異的に結合する。本明細書では、「特異的に結合することができる」又は「特異的に結合する」という用語は、１μＭ未満、好ましくは１ｎＭ未満、最も好ましくは１０ｐＭ未満の解離定数で（特定の）抗原に結合する抗体又はその断片の性質を指す。ある態様では、抗体（又は断片）のＴｉｍ-３ ＩｇＶドメインに対するＫｄは１０．０ｎＭより小さい。ある態様では、抗体（又は断片）のＴｉｍ-３ ＩｇＶドメインに対するＫｄは１．０ｎＭより小さい。ある態様では、抗体（又は断片）のＴｉｍ-３ ＩｇＶドメインに対するＫｄは０．５ｎＭより小さい。ある態様では、抗体（又は断片）のＴｉｍ-３ ＩｇＶドメインに対するＫｄは０．１ｎＭ又はこれより小さい。
【００８２】
「Ｋｄ」という用語は、本明細書では、抗体−抗原相互作用の解離定数を指す。Ｔｉｍ-３ ＩｇＶドメインに対する抗体のＫｄ又は結合親和性を決定する方法の一つは、抗体の単機能Ｆａｂ断片の結合親和性を測定することである。（親和性定数は解離定数の逆数である。）抗体（例．ＩｇＧ）をパパインで切断するか、組換えにより発現させることによって、単機能Ｆａｂ断片を得ることができる。抗ヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体の断片の親和性は、例えば表面プラズモン共鳴（BIAcore3000（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、BlAcore Inc.、Piscataway N.J.）により求めることができる。ＣＭ５チップは、供給者の指示に従い、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイニド塩酸塩（ＥＤＣ）及びN-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で希釈し、０．００５ｍｇ／ｍＬで活性化チップに注入する。チップ全体で可変フロー時間を使用して、２つの抗原密度：詳細な速度論的研究では１００〜２００応答単位（ＲＵ）、スクリーニングアッセイでは５００〜６００ＲＵ、を実現する。精製したＦａｂの段階希釈（推定Ｋｄの０．１〜１０倍）を１００μｌ／分で１分間注入し、最大で２時間の解離時間を許容する。Ｆａｂタンパク質の濃度は、（アミノ酸分析によって決定された）濃度が既知のＦａｂを使用するＥＬＩＳＡ及び／又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で決定する。結合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ＢＩＡ評価プログラムを使用して、データを１：１ラングミュア結合モデル（Karlsson et al. “Kinetic and concentration analysis using BIA technology, Methods: A Companion to Methods Enzymol 6:99-110 (1994)参照、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）に適合させることにより、取得する。平衡解離定数（Ｋｄ）値は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎで求められる。この方法は、抗原に対する抗体又はその断片の結合親和性の決定に適している。当該技術分野において公知の他の方法、例えば、ＥＬＩＳＡも使用することができる。
【００８３】
抗体又はポリペプチドに「特異的に結合する」エピトープは、当該技術分野において十分に理解されている用語であり、そのような特異的又は優先的な結合を決定する方法も当該技術分野においてよく知られている。分子が、特定の細胞又は物質と、より頻繁に、より迅速に、より長く及び／又はより高い親和性で反応又は会合する場合、当該分子は「特異的結合」又は「優先的結合」を示すといわれる。抗体は、他の物質に結合する場合と比較して、標的に、高い親和性、結合力で、より容易に、及び／又はより長く結合する場合、当該抗体は、「特異的に結合する」又は「優先的に結合する」。例えば、ヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶドメインに特異的又は優先的に結合する抗体は、他のＴｉｍ-３エピトープ又は非Ｔｉｍ-３エピトープに結合する場合と比較して、高い親和性、結合力で、より容易に及び／又はより長くこのエピトープに結合する抗体である。この定義から、例えば、第１の標的に特異的又は優先的に結合する抗体（又は部分又はエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合する可能性も、結合しない可能性もあることもまた理解できる。したがって、「特異的結合」又は「優先的結合」は、必ずしも排他的な結合を必要としない（それを含むこともできる）。
【００８４】
抗体が「競合する」という用語は、本明細書では、一次抗体又はその抗原結合部分は、二次抗体又はその抗原結合部分による結合と非常に似た方法でエピトープに結合し、その結果、一次抗体とその同族エピトープとの結合は、二次抗体が存在しない場合と比較して、二次抗体が存在する場合、検出可能な程度に減少する。二次抗体のエピトープへの結合が一次抗体の存在下で検出可能な程度に減少する場合もあるが、必ずしもその必要はない。すなわち、二次抗体が一次抗体とエピトープの結合を阻害しなくても、一次抗体は二次抗体とエピトープの結合を阻害することができる。そして、各抗体が他の抗体とエピトープ又はリガンドとの結合を検出可能な程度に阻害する場合、その程度にかかわらず、それらの抗体は、それぞれのエピトープとの結合について、互いに「交差競合する」といわれる。本発明には、競合抗体及び交差競合抗体の両者が含まれる。そのような競合又は交差競合が生じるメカニズム（例．立体障害、コンフォメーションの変化又は共通のエピトープ若しくはその一部への結合）にかかわらず、本明細書の教示に基づいて、当業者は、本明細書に記載された方法にそのような競合抗体及び／又は交差競合抗体が含まれ、また、有用であり得ることを理解するであろう。
【００８５】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列により、抗体（免疫グロブリン）を異なるクラスに割り当てることができる。抗体又はその断片は、例えば、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＭの抗体又はその断片のいずれかであり得る。ある態様では、抗体は免疫グロブリンＧである。ある態様では、抗体断片は免疫グロブリンＧの断片である。ある態様では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である。ある態様では、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ２ａ、ヒトＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４からの配列を含む。これらの抗体サブクラスの組合せも使用することができる。使用する抗体の種類を選択する際に考慮する要素の１つは、抗体の血清半減期である。例えば、ＩｇＧの血清中での半減期は一般に２３日であり、ＩｇＡは６日、ＩｇＭは５日、ＩｇＤは３日、ＩｇＥは２日である（Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS. Cellular and Molecular Immunology, 4th edition, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 2000、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
【００８６】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」ということがある。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」ということがある。これらのドメインは一般に抗体の最も変化する部分であって、抗原結合部位を含む。「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分のアミノ酸配列が抗体間で大きく異なり、その部分が特定の抗原に対する抗体の結合及び特異性の発揮において使用されるという事実を指す。しかし、この配列の変化は抗体の可変ドメイン全体に均等に分布していない。これは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの超可変領域（ＨＶＲ）（又はＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインの高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、主にβシート構造をとる４つのＦＲ領域を含み、これらＦＲは、そのベータシート構造に接続し、場合によってはベータシート構造の一部を形成する、ループ状の３つのＣＤＲで接続されている。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接しており、他方の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞傷害における抗体の関与など、さまざまなエフェクター機能を示す。
【００８７】
脊椎動物種の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２つの明確に異なる型のいずれかに分けることができる。
【００８８】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、本明細書で定義されたＨＶＲ以外の可変ドメインである。
【００８９】
本明細書における「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変であり、及び／又はループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲで構成される。天然の抗体では、６つのＨＶＲの中でＨ３とＬ３が最も多様性を示し、特にＨ３は、抗体に高い特異性を付与する特別な役割を果たしていると考えられている。例えば、Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)参照。実際、重鎖のみからなる天然のラクダ抗体は、軽鎖がなくても機能的で安定である（例えば、Hamers-Casterman 1993；Sheriff & Constantine 1996参照）。いくつかのＨＶＲの記述が使用されており、それらは本明細書に含まれる。Kabat相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の変動性に基づいており、最も一般的に使用されている（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。重鎖及び軽鎖のそれぞれにＣＤＲ１、２及び３がある。代わりに、Chothiaは構造ループの位置に基づく（Chothia & Lesk 1987）。ＡｂＭ ＨＶＲは、Kabat ＨＶＲとChothia構造ループの妥協であり、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで用いられる。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。ＨＶＲは、以下の「拡張ＨＶＲ」であってもよい：ＶＬでは、２４〜３６又は２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６又は５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７又は８９〜９６（Ｌ３）、及び、ＶＨでは、２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５又は４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２、９４〜１０２又は９５〜１０２（Ｈ３）。これらの定義のそれぞれで、可変ドメイン残基は、上記Kabatらによって番号が付されている。
【００９０】
本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、野生型配列のＦｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化する場合があるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０からそのＣ末端までと定義されている。Ｆｃ領域のＣ末端リジンは、例えば、抗体の産生若しくは精製中に除去される可能性があり、又は抗体の重鎖をコードする核酸の組換えによって除去することができる。したがって、本明細書で使用する無傷の抗体は、Ｃ末端のリジンを含むか、又は含まない抗体であってもよい。
【００９１】
本明細書に記載の抗体、ｓｃＦｖ又は抗体の断片を含む組成物又は医薬組成物は、好ましくは、保存及び輸送中の変性、酸化又は凝集によるタンパク質の活性又は構造的完全性の喪失を防ぐ安定剤を含む。組成物又は医薬組成物は、凝集の問題を克服することに寄与する可能性がある、塩、界面活性剤及び糖のような等張化剤の１つ以上を含むことができる。本発明の組成物又は医薬組成物を注射剤として使用する場合、そのｐＨはほぼ中性のｐＨであることが望ましく、また、対象への注射において有害な製剤中の気泡を回避するために、界面活性剤の量を最小限にすることも有利である。ある態様では、組成物又は医薬組成物は液体で、溶液中の高濃度の生物活性抗体を安定に保持し、吸入又は非経口投与に適している。ある態様では、組成物又は医薬組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内及び／又は皮下注射に適している。ある態様では、組成物又は医薬組成物は液体で、気泡形成及びアナフィラキシー様副作用の危険性を最小限に抑えている。ある態様では、組成物又は医薬組成物は等張である。ある態様では、組成物又は医薬組成物のｐＨは６．８〜７．４である。
【００９２】
ある態様では、本明細書に記載されたＳｃＦｖ又は抗体断片は、凍結乾燥され（lyophilized及び／又はfreeze dried）、使用時に再構成される。
【００９３】
薬学的に許容される担体の例には、リン酸緩衝生理食塩水、滅菌水（注射用水（ＵＳＰ）を含む）、ｏ／ｗ型エマルジョンなどのエマルジョン及びさまざまな湿潤剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。エアロゾル又は非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水、又は、例えば０．９％塩化ナトリウム溶液（ＵＳＰ）のような、通常の生理食塩水（０．９％）である。このような担体を含む組成物は、周知の方法（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990及びRemington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000参照、これらの全体が参照として本明細書に組み込まれる）で製造される。非限定的な例では、組成物は、１つ以上のリン酸水素二ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、ポリソルベート８０（例．9-(E)-オクタデセン酸2-[2-[3,5-ビス(2-ヒドロキシエトキシ)オキソラン-2-イル]-2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エチル）、エデト酸二ナトリウム水和物、スクロース、リン酸二水素ナトリウム一水和物及びリン酸水素二ナトリウム二水和物を含むことができる。
【００９４】
本明細書に記載の抗体若しくは抗体断片、又は、組成物若しくは医薬組成物は、凍結乾燥することができるか、又は、注射可能若しくは吸入可能な溶液、ゲル及び錠剤を含むが、これらには限定されない適切な形態で提供することができる。
【００９５】
本明細書において、「Ｆｃドメイン」という用語は、野生型配列のＦｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの境界は変化する場合があるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃドメインは、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０からそのＣ末端までと定義されている。ＦｃドメインのＣ末端リジンは、例えば、それをコードする核酸の組換えによって除去することができる。いくつかの態様では、抗体はＦｃドメインを含む。ある態様では、Ｆｃドメインの配列は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと同一であるか、又は９９％以上の類似性を有している。ある態様では、Ｆｃドメインの配列は、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインと同一であるか、又は９９％以上の類似性を有している。ある態様では、Ｆｃドメインの配列は、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃドメインと同一であるか、又は９９％以上の類似性を有している。ある態様では、Ｆｃドメインの配列は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインと同一であるか、又は９９％以上の類似性を有している。ある態様では、Ｆｃドメインは変異していない。ある態様では、ＦｃドメインはＣＨ２−ＣＨ３ドメインの界面が変異し、酸性でのＦｃＲｎに対するＩｇＧの親和性を増加する（Dall'Acqua 2006；Yeung 2009）。ある態様では、Ｆｃドメインの配列はヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと同一である。
【００９６】
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載された可変領域への改変を含む。例えば、本発明は、その特性に重大な影響を及ぼさない機能的に同等の可変領域及びＣＤＲを含む抗体、並びに増強又は減少した活性及び／又は親和性を有する変異体を含む。例えば、ヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶに対して所望の結合親和性を有する抗体を得るために、アミノ酸配列を変異させてもよい。ポリペプチドの修飾は当該技術分野において日常的に行われており、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾ポリペプチドの例には、アミノ酸残基が保存的置換されたポリペプチド、活性を著しく阻害しない若しくはリガンドに対するポリペプチドの親和性を成熟（増強）する１つ以上のアミノ酸の欠失又は付加を有するポリペプチド、又は化学的類似体を有するポリペプチドが含まれる。
【００９７】
アミノ酸配列の挿入には、１〜１００以上の残基を含むポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端への融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内への挿入が含まれる。末端への挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体又はエピトープタグに融合された抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、血液中で抗体の半減期を増加させる酵素又はポリペプチドの、抗体のＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
【００９８】
置換変異体は、抗体分子の少なくとも１つのアミノ酸残基が除かれ、その場所に別の残基が挿入されている。置換突然変異の誘発で最も関心のある部位には超可変領域が含まれるが、フレームワークの変更も考えられる。保存的な置換は、表１の「保存的置換」の列に示されている。そのような置換が生物学的活性を変化させる場合、表１において「代表的置換」の列で示され、又はアミノ酸クラスに関して以下に説明するような、より実質的な置換が行われ、生成物がスクリーニングされるかもしれない。
【００９９】
【表１】
2021534735.tif 000002
【０１００】
抗体の生物学的特性の実質的な変更は、(a) 置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えば、βシート若しくはらせん構造、(b) 標的部位の電荷若しくは疎水性、又は  (c) 側鎖の大部分、の維持に対する影響が大幅に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、一般的な側鎖の特性に基づいて以下のグループに分けられる：
(1)  非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
(2)  電荷を有さない極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
(3)  酸性（負電荷）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
(4)  塩基性（正電荷）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
(5)  鎖の配向に影響を及ぼす残基；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及び
(6)  芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０１０１】
非保存的置換は、これらのグループの１つのアミノ酸を別のグループと交換することによって行われる。
【０１０２】
行われてもよい置換の１つの例は、抗体中の１つ以上の化学的に反応性であり得るシステインを、限定されるものではないが、アラニン又はセリンなどの別の残基に変更することである。例えば、非標準的（non-canonical）システインを置換する可能性がある。置換は、可変ドメインのＣＤＲ若しくはフレームワーク領域、又は抗体の定常領域で行うことができる。いくつかの態様では、当該システインは標準的（canonical）である。分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しないシステイン残基も、一般に、セリンで置換してもよい。反対に、特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片の場合、抗体の安定性を改善するために、システイン結合を追加してもよい。
【０１０３】
抗体は、例えば、その結合特性を変更するために、例えば、重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインを修飾してもよい。可変領域の変更は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる可能性がある。いくつかの態様では、１〜５以下の保存的アミノ酸の置換がＣＤＲドメインで行われる。他の態様では、１〜３以下の保存的アミノ酸の置換がＣＤＲドメインで行われる。例えば、ヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶドメインに対する抗体のＫＤを増加若しくは減少させるため、ｋｏｆｆを増加若しくは減少させるため、又は、抗体の結合特異性を変化させるために、１つ以上のＣＤＲ領域で変異を行ってもよい。部位特異的突然変異の技術は、当該技術分野において周知である。
【０１０４】
抗ヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶドメイン抗体の半減期を増加させるために、フレームワーク領域又は定常領域で改変又は変異を行うこともできる。例えば、国際公開第00/09560号を参照。抗体の免疫原性を変化させるため、別の分子と共有結合若しくは非共有結合する部位を設けるため、又は、補体結合、ＦｃＲ結合及び抗体依存性細胞傷害作用などの特性を変化させるために、フレームワーク領域又は定常領域の変異を行うこともできる。本発明によれば、単一の抗体は、可変ドメインの１つ以上のＣＤＲ若しくはフレームワーク領域又は定常領域に変異を有している可能性がある。
【０１０５】
ある態様では、本明細書に記載の抗体は組換えで製造される。ある態様では、融合タンパク質は真核生物の発現系で製造される。
【０１０６】
ある態様では、真核生物の発現系で製造される融合タンパク質は、ＦｃのＡｓｎ２９７に対応する残基におけるグリコシル化を含む。
【０１０７】
ある態様では、本明細書に記載の抗体若しくはその抗原結合断片を含む組成物又は医薬組成物は、抗体又はその抗原結合断片に関して実質的に純粋である。組成物又は医薬組成物の試料の少なくとも６０％〜７５％が単一の抗体若しくはその抗原結合断片である場合、本明細書に記載の抗体若しくはその抗原結合断片を含む組成物又は医薬組成物は、抗体又はその抗原結合断片に関して「実質的に純粋」である。本明細書に記載の抗体若しくはその抗原結合断片を含む実質的に純粋な組成物又は医薬組成物は、抗体について、単一の抗体を６０％、７０％、８０％又は９０％、より通常は約９５％、及び好ましくは９９％を超えて含むことができる。純度又は均一性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はＨＰＬＣのような当該技術分野において周知のさまざまな方法で試験をすることができる。
【０１０８】
ある態様では、ヒトＴｉｍ３は以下の配列を有する：
ＭＦＳＨＬＰＦＤＣＶＬＬＬＬＬＬＬＬＴＲＳＳＥＶＥＹＲＡＥＶＧＱＮＡＹＬＰＣＦＹＴＰＡＡＰＧＮＬＶＰＶＣＷＧＫＧＡＣＰＶＦＥＣＧＮＶＶＬＲＴＤＥＲＤＶＮＹＷＴＳＲＹＷＬＮＧＤＦＲＫＧＤＶＳＬＴＩＥＮＶＴＬＡＤＳＧＩＹＣＣＲＩＱＩＰＧＩＭＮＤＥＫＦＮＬＫＬＶＩＫＰＡＫＶＴＰＡＰＴＲＱＲＤＦＴＡＡＦＰＲＭＬＴＴＲＧＨＧＰＡＥＴＱＴＬＧＳＬＰＤＩＮＬＴＱＩＳＴＬＡＮＥＬＲＤＳＲＬＡＮＤＬＲＤＳＧＡＴＩＲＩＧＩＹＩＧＡＧＩＣＡＧＬＡＬＡＬＩＦＧＡＬＩＦＫＷＹＳＨＳＫＥＫＩＱＮＬＳＬＩＳＬＡＮＬＰＰＳＧＬＡＮＡＶＡＥＧＩＲＳＥＥＮＩＹＴＩＥＥＮＶＹＥＶＥＥＰＮＥＹＹＣＹＶＳＳＲＱＱＰＳＱＰＬＧＣＲＦＡＭＰ（配列番号１３）。
【０１０９】
ある態様では、抗体のＩｇＶドメインの配列は、
ＳＥＶＥＹＲＡＥＶＧＱＮＡＹＬＰＣＦＹＴＰＡＡＰＧＮＬＶＰＶＣＷＧＫＧＡＣＰＶＦＥＣＧＮＶＶＬＲＴＤＥＲＤＶＮＹＷＴＳＲＹＷＬＮＧＤＦＲＫＧＤＶＳＬＴＩＥＮＶＴＬＡＤＳＧＩＹＣＣＲＩＱＩＰＧＩＭＮＤＥＫＦＮＬＫＬＶＩＫＰＡ（配列番号２２）
を含む。
【０１１０】
本明細書では、例えば、Ａ及び／又はＢのように用いられる「及び／又は」は、(i) Ａ、(ii) Ｂ、及び (iii) Ａ及びＢという形態を包含する。
【０１１１】
本明細書に記載されたさまざまな要素の全ての組合せは、明細書中に異なる指示がない限り、又は文脈中で明らかに矛盾しない限り、本発明の範囲内である。
【０１１２】
本発明は、以下の詳細な実験によって、さらに理解することができる。
【実施例】
【０１１３】
ヒトＴｉｍ-３のＩｇＶドメインに特異的に結合するｍＡｂの生成：
ヒトＴｉｍ-３ ＩｇＶコード領域（Ｓ２２−Ａ１３２）にプラスミドｐＭＴ／ＢｉＰのヒトＩｇＧ１Ｆｃタグを融合することにより、Ｔｉｍ-３ ＩｇＶ−Ｉｇ融合タンパク質を得た（Zhao 2013）。Ｓ２系で融合タンパク質を発現し、次いで精製した。マウスをＴｉｍ-３ ＩｇＶ−Ｉｇ融合タンパク質で免疫し、脾細胞にＮＳＯ骨髄腫細胞を融合する標準的な方法でハイブリドーマを得た。
【０１１４】
ｍＡｂ ５０Ｂ５の説明：
ｍＡｂ ５０Ｂ５が得られた。これは、κ鎖を有するＩｇＧ１である。ＥＬＩＳＡアッセイでは、これは、Ｔｉｍ-３−ＩｇＶタンパク質及びＴｉｍ-３の細胞外のタンパク質（ＩｇＶムチンストーク）に結合したが、ヒトＩｇＧタンパク質には結合しなかった（図１）。ＦＡＣＳでは、５０Ｂ５は、細胞上に発現したヒトＴｉｍ-３に結合するが、マウスＴｉｍ-３には結合しないことが確認された（図２）。
【０１１５】
表面プラズモン共鳴法では、ｍＡｂ ５０Ｂ５のヒトＴｉｍ-３タンパク質に対する結合親和性は、ＫＤが０．１３ｎＭであった（図３）。ｍＡｂ ５０Ｂ５の阻害能を決定するために結合アッセイを行い、ｍＡｂ ５０Ｂ５は、デキサメタゾン処理ジャーカットＴ細胞に発現するホスファチジルセリンとヒトＴｉｍ-３との結合を妨げることを見いだした。Ｔｉｍ-３はＩＦＮγ産生Ｔ細胞で発現する抑制性受容体であることから、混合リンパ球反応により、ｍＡｂ ５０Ｂ５のアンタゴニストとしての能力を確認した。あるドナーのＰＢＭＣから得た単球から分化させた成熟樹状細胞を、別のドナーのＰＢＭＣから得た精製Ｔ細胞と４日間インキュベートした。表面にＴｉｍ-３を発現する分裂したＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞が見つかったが、Ｔｉｍ-３を発現する分裂していないＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞は見つからなかった（図４Ａ）。混合リンパ球反応では、ｍＡｂ ５０Ｂ５又はマウスＩｇＧ１（対照）を添加し、ｍＡｂ ５０Ｂ５が対照のＩｇＧ１と比較して３倍以上ＩＦＮγ産生を増加させることがわかった（図４Ｂ）。
【０１１６】
まとめると、これらの結果は、ｍＡｂ ５０Ｂ５がヒトＴｉｍ-３に対するアンタゴニスト抗体であることを示す。最後に、ｍＡｂ ５０Ｂ５ハイブリドーマの配列を決定し、ｍＡｂが固有のＶＨ及びＶＬの配列を有することがわかった。
【０１１７】
【化１】
2021534735.tif 000003
【０１１８】
ｍＡｂ １５Ｂ４の説明：
別のｍＡｂである１５Ｂ４を、上述した方法と同じ方法で得た。ｍＡｂ １５Ｂ４はκ鎖を有するＩｇＧ１で、細胞上に発現したヒトＴｉｍ-３に結合する（図５）。表面プラズモン共鳴法では、ｍＡｂ １５Ｂ４のヒトＴｉｍ-３タンパク質に対する結合親和性は、ＫＤが０．３２ｎＭであった（図６）。ｍＡｂ ５０Ｂ５の阻害能を決定するために結合アッセイを行い、ｍＡｂ １５Ｂ４は、デキサメタゾン処理ジャーカットＴ細胞に発現するホスファチジルセリンとヒトＴｉｍ-３との結合を妨げることを見いだした。最後に、１５Ｂ４ハイブリドーマの配列を決定し、ｍＡｂが固有のＶＨ及びＶＬの配列を有することがわかった。
【０１１９】
【化２】
2021534735.tif 000004
【０１２０】
参考文献
【０１２１】
Bird et al. Science 242(4877):423-426 (1988)
Brown et al. Cancer Res 47(13):3577-3583 (1987)
Cao et al. Immunity 26(3):311-321 (2007)
Chiba et al. Nat Immunol 13(9):832-842 (2012)
Chothia & Lesk J Mol Biol 196(4):901-917 (1987)
Chothia et al. Nature 342(6252):877-883 (1989)
Dall’Acqua et al. J Biol Chem 281(33):23514-23524 (2006)
Daugherty et al. Nucleic Acids Res 19(9):2471-2476 (1991)
DeKruyff et al. J Immunol 184(4):1918-1930 (2010)
Hamers-Casterman et al. Nature 363(6428):446-448 (1993)
Harris Biochem Soc Trans 23(4):1035-1038 (1995)
Hurle & Gross Curr Opin Biotechnol 5(4):428-433 (1994)
Huston et al. Proc Natl Acad Sci USA 85(16):5879-5883 (1988)
Jones et al. Nature 321(6069):522-525 (1986)
Koyama et al. Nat Commun 7:10501 (2016)
Lobuglio et al. Proc Natl Acad Sci USA 86(11):4220-4224 (1989)
Monney et al. Nature 415(6871):536-541 (2002)
Presta Curr Opin Biotechnol 3(4):394-398 (1992)
Riechmann et al. Nature 332(6162):323-327 (1988)
Shaw et al. J Immunol 138(12):4534-4538 (1987)
Sheriff & Constantine Nat Struct Biol 3(9):733-736 (1996)
Vaswani & Hamilton Ann Allergy Asthma Immunol 81(2):105-115 (1998)
Verhoeyen et al. Science 239(4847):1534-1536 (1988)
Ward et al. Nature 341(6242):544-546 (1989)
Wilker et al. Int Immunol 19(6):763-773 (2007)
Winter et al. Nature 349(6307):293-299 (1991)
Yeung et al. J Immunol 182:7663-7671 (2009)
Zhao et al. Proc Natl Acad Sci USA 110(24):9879-9884 (2013)
Zhu et al. Nat Immunol 6(12):1245-1252 (2005)
【図１】
2021534735.tif 000005
【図２】
2021534735.tif 000006
【図３】
2021534735.tif 000007
【図４】
2021534735.tif 000008
【図５】
2021534735.tif 000009
【図６】
2021534735.tif 000010
【配列表】
2021534735000001.app
【国際調査報告】
2021534735.tif 000011
2021534735.tif 000012
2021534735.tif 000013