(57)【要約】  本発明は、高α−アミラーゼ活性を有する大麦植物に関する。本発明の大麦植物は、例えば、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異を有し得る。本発明はさらに、前記大麦植物から作製された植物生成物を提供する。【選択図】図４Ａ
2021509580.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大麦植物またはその一部であって、
・ＨｖＨＲＴ遺伝子中に、配列番号２の１つまたは複数のアミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子をもたらす変異、または少なくとも前記ＨｖＨＲＴ遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、前記ＨｖＨＲＴ遺伝子のコード領域が配列番号２のポリペプチドをコードする；および／または
・ＧＡＲＥボックス中に変異を含む変異体α−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・ＧＡＲＥボックス中に変異を含む、または配列ＴＡＡＣＡＡＡを有する変異体α−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に、配列番号６の１つまたは複数のアミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子をもたらす変異、または少なくとも前記ＨｖＨＢＬ１２遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、前記ＨｖＨＢＬ１２遺伝子のコード領域が配列番号６のポリペプチドをコードする；および／または
・非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有し、前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスが配列（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）を含み、１つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、Ｘは任意のヌクレオチドでよく、ｎは０または１、ｍは０〜２０の範囲の整数である；および／または
・非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・ＷＲＫＹ３８遺伝子中に、配列番号１１および配列番号１２の両方に存在する１つまたは複数のアミノ酸を欠く変異体ＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＷＲＫＹ３８遺伝子をもたらす変異、または少なくとも前記ＷＲＫＹ３８遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、前記ＷＲＫＹ３８遺伝子のコード領域が配列番号１１または配列番号１２のポリペプチドをコードする、大麦植物またはその一部。
【請求項２】
前記大麦植物が、前記ＨｖＨＲＴ遺伝子に変異を有し、前記変異が、
・少なくとも配列番号２のアミノ酸５２７〜５３０に対応するアミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子をもたらす変異；または
・前記ＨｖＨＲＴ遺伝子の欠失をもたらす変異、である、請求項１に記載の大麦植物。
【請求項３】
少なくとも配列番号２の１１８個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項４】
ａ．前記ＧＡＲＥボックス中に変異を含む変異体α−アミラーゼプロモーターを含み、前記ヌクレオチドＴＡＡＣＡＲＡの１つが置換または欠失されている少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子、および／または
ｂ．前記配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含む少なくとも５種のα−アミラーゼ遺伝子、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項５】
前記配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含むａｍｙ２クラスター中に、少なくとも２種などの少なくとも１種の、例えば、少なくとも３種のα−アミラーゼ遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項６】
前記ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有し、前記変異が：
ａ．配列番号６の１つまたは複数のアミノ酸またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログを欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子をもたらす変異；または
ｂ．前記ＨｖＨＢＬ１２遺伝子の欠失をもたらす変異、
である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項７】
配列番号６またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの少なくとも２２個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項８】
前記ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有し、前記変異が：
ａ．配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２００〜２０６、２２０、２２６、２５０および／また２５２の少なくとも１つを欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子をもたらす変異；
ｂ．前記ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子の欠失をもたらす変異、
である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項９】
少なくとも配列番号１１または配列番号１２の１５４個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１０】
非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも５種のα−アミラーゼ遺伝子を含み、前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスが、
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＹＴＧＲＣＣ）；
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）；
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＹＴＧＲＣＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＣＴＧＲＣＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＹＴＧＧＣＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＣＴＧＡＣＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＧＣＣ）；および
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＴＣ）；
からなる群より個別に選択され、式中、ＲはＧまたはＡ、ＹはＣまたはＴ、ｎは０または１、ｍは、０〜２０の範囲の整数である、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１１】
ａｍｙ１＿１クラスターを含み、少なくとも１つのα−アミラーゼプロモーターが、配列ＴＴＧＡＴＣを含む非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含む、請求項１０に記載の大麦植物。
【請求項１２】
発芽の開始の４８時間後、少なくとも１１０Ｕ／ｇなどの少なくとも１００Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有するが、ただし、発芽の開始の前に外皮なしであるかまたは少なくとも一部の前記外皮が取り除かれていることが前提である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１３】
発芽の開始の４８時間後、少なくとも２０ｍＵ／ｇの限界デキストリナーゼを有するが、ただし、前記発芽の開始の前に、外皮なしであるかまたは少なくとも一部の前記外皮が取り除かれていることが前提である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１４】
２つ以上の変異または請求項１に記載の特性を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１５】
１種または複数の追加の遺伝子中に変異、例えば、１つまたは複数の次の変異：
ａ．機能的ＬＯＸ−１の完全喪失をもたらすＬＯＸ−１コード遺伝子中の変異、
ｂ．機能的ＬＯＸ−２の完全喪失をもたらすＬＯＸ−２コード遺伝子中の変異、
ｃ．機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらすＭＭＴコード遺伝子中の変異、
ｄ．低減したＣｓｌＦ６活性を有する変異体ＣｓｌＦ６タンパク質をコードするＣｓｌＦ６コード遺伝子中の変異、
を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１６】
大麦粉、緑麦芽、キルン乾燥麦芽、麦芽汁および飲料からなる群より選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の大麦植物を含む、またはそれから作製された植物生成物。
【請求項１７】
粉砕緑麦芽または粉砕キルン乾燥麦芽である、請求項１６に記載の植物生成物。
【請求項１８】
水性抽出物の製造方法であって、
ａ．請求項１〜１５のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．大麦粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップが、前記穀粒が少なくとも３０％の含水量を有するまで水溶液中で前記穀粒をインキュベーションすることを含み、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／（ｋｇ乾燥重量大麦粒）を、前記水溶液中を通過させるステップ；および
ｃ．前記発芽穀粒を微粉化し、同時に、前記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップであって、ただし、前記大麦粒がステップｂ）とｃ）との間で常に２０％未満の含水量にならないことが前提である、ステップ；
ｄ．前記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、大麦の水性抽出物を製造するステップ、
を含む、方法。
【請求項１９】
飲料の製造方法であって、
（ｉ）請求項１８に記載の方法により水性抽出物を作製するステップ；
（ｉｉ）前記抽出物を飲料に処理するステップ、
を含む、方法。
【請求項２０】
飲料の製造方法であって、
ｉ．請求項１〜１５のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または麦芽から水性抽出物を作製するステップ、
ｉｉ．前記抽出物を飲料に処理するステップ、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高められた加水分解酵素活性を有する大麦植物に関する。特に、本発明の大麦植物は、発芽の初期段階で高められた加水分解酵素活性を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
商業的麦芽製造工程では、４〜６日間にわたる、デンプン性胚乳の貯蔵デンプンおよびタンパク質の部分的流動化を可能とする制御された条件下で大麦粒を発芽させる、または麦芽にする。麦芽製造工程は通常、乾燥大麦粒を水中に浸漬することにより開始される。この工程は、浸麦として知られ、目的は、穀粒を洗浄するためのみでなく、その含水量を約４０％（ｗ／ｗ）まで上昇させて、次に続く胚乳流動化ステップをより急速に行わせるためでもある。浸麦中、水を一度排水し、穀粒の再通気を可能とする。このステップは、「エアレスト（ａｉｒ  ｒｅｓｔ）」として知られ、主として、浸漬穀粒が約１６時間後に酸素欠乏になるという理由で必要になると考えられる。約８時間の「エアレスト」後、穀粒は水に再浸漬され、さらに８時間にわたる浸麦処理−または一連の再浸麦ステップにより浸麦処理が完結される。乾燥穀粒の含水量を４０％以上にまで増加させる２段階浸麦工程は、全体で約３２時間を要する。
【０００３】
浸麦穀粒は、発芽のために拡散培養され、その間に、酵素がアリューロンおよび胚盤上皮細胞から分泌され（デンプン性胚乳細胞中に先在する若干量と一緒に）、細胞壁、デンプンおよびタンパク質を分解する。正常な発芽条件下では、植物ホルモンのジベレリン酸（ＧＡ）が結節領域、または胚中のどこかで合成され、そこから水勾配に沿って拡散すると考えられている。
【０００４】
麦芽製造者は通常、穀粒中の可能な限り多くのデンプン分解酵素の合成を、素早く行わせることを目指している。多くの商業的麦芽製造プログラムでは、アリューロン層からの酵素分泌の工程を加速するために、ＧＡが添加され得る。デンプン分解酵素（これには、デンプン脱分枝酵素であるαおよびβ−アミラーゼ（例えば、限界デキストリナーゼ）およびα−グルコシダーゼを含む）が、穀粒の貯蔵澱粉を部分的に単糖、オリゴ糖、およびグルコースに解重合する。デンプンの解重合生成物はその後、炭素源として酵母細胞により使用され、ビールエタノールに発酵される。
【０００５】
α−アミラーゼは、胚乳中のデンプンの分解に主要な役割を有する。穀類植物では、α−アミラーゼの発現は、厳密に調節されている。野生型大麦では、胚乳成長および成熟中にα−アミラーゼ遺伝子のごくわずかな発現が存在し、これは、この期間中のデンプンの広範囲の蓄積と一致する。発芽中、α−アミラーゼ活性は増大する。異常なα−アミラーゼ活性は植物の健康に重大な結果をもたらし得るので、α−アミラーゼ活性の厳密な調節は重要である。例えば、特定の大麦品種では、未成熟発芽が起こる場合がある。これは、新芽および根の成長、高いα−アミラーゼ産生、および成熟時の穀粒の萎びることに関係し得る（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。また、α−アミラーゼ活性は、正常な穀粒に比べて萎びた穀粒が増加することが多いことが明らかになった（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ｓｌｎ１変位を有する栽培品種Ｈｉｍａｌａｙａ大麦はまた、未成熟新芽形成および高α−アミラーゼ産生の両方を有することが一貫して示されている（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。米の発達中の胚乳におけるα−アミラーゼ遺伝子の過剰発現は、様々な程度の「粉っぽい」穀粒、すなわち、未成熟の、緩く充填されたデンプン粒を含む穀粒、を生成した（Ｎａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。
【０００６】
麦芽製造者はまた、大麦粒中の細胞壁多糖、特に（１，３；１，４）−β−グルカンおよびアラビノキシランを分解する高レベルの酵素を生じさせようと試みている。不完全に分解された（１，３；１，４）−β−グルカンは、醸造業者にとって特に面倒な場合がある。理由は、これらは、可溶型の麦芽から抽出されることがあり、これが高粘稠水溶液を形成し、醸造所における濾過工程を遅らせ、最終ビール中の望ましくない濁りの一因となるためである。従って、低レベルの可溶性（１，３；１，４）−β−グルカンは、重要な麦芽製造品質パラメーターであり、同時に、高レベルの（１，３；１，４）−β−グルカナーゼ酵素は、依然として重要な麦芽品質の尺度のままである。
【０００７】
上述のように、発芽工程は通常、４〜５日間を要する。制御された発芽ステップ後に、湿潤麦芽の含水量を約４０％から４〜５％まで乾燥する。この乾燥工程は焙燥工程と呼ばれ、極めてエネルギーを消費する工程であり、この産業の大きなコストを占める。キルン乾燥を含む全体工程は通常、６〜７日を要する。
【０００８】
醸造所では、キルン乾燥麦芽を粉砕して穀粒をこじ開け、得られた内容物はマッシング工程として知られる工程で温水により抽出される。上述のように、抽出された物質は、部分的に分解したデンプン、タンパク質および細胞壁分子を含み、これらは、麦芽から抽出された内在性穀物酵素によりさらに分解される。この段階で、幾人かの醸造業者は、追加の、および通常より安価な炭素源（補助剤）を加え、その後の、酵母発酵工程を補助し、麦芽のより高いコストを相殺する。前記補助剤は、大麦、米、小麦またはその他の未発芽穀粒由来の穀粉であってよいが、それらの追加は、加水分解酵素を共に添加する必要がある。理由は、麦芽中には補助剤の成分を分解するのに不十分な内在性酵素しか存在しないためである。添加された酵素は通常、未精製の比較的安価な真菌および／または細菌培養物の抽出物由来である。外来性酵素の添加は、いくつかの国では、特に、ビールを厳密に調節された状況下で製造しなければならない国では合法的ではない。
【０００９】
温水中で抽出されたデンプン、およびその他の胚乳成分のさらなる分解は、糖化と呼ばれる工程で進められる。マッシング工程後に、抽出物は、多くの場合、麦芽汁濾過機中で濾過され、冷却される。抽出物は、ホップまたはホップ抽出物の存在下で煮沸され、放出された糖のエタノールへの発酵のために、冷却時に酵母培養物が添加され得る。そのように製造されたビールは通常、成熟され、濾過後にビンづめされる。ビールはまた、ビンづめの前に炭酸ガスで飽和され得る。
【発明の概要】
【００１０】
前述で概略を述べたように、時間およびエネルギーを消費するビール製造ステップの１つは、麦芽製造である。麦芽製造工程の律速段階は、穀粒中での十分なデンプン分解酵素の合成である。従って、麦芽製造に必要な時間を低減できる材料と方法の提供に対する必要性が存在する。特に、発芽の開始直後に、十分なデンプン分解酵素を含む穀物粒の発芽を可能とする方法に対する必要性が存在する。
【００１１】
しかし、上述のように、高α−アミラーゼ活性は、植物の適応度に与える望ましくない効果に関連する。特に、高いα−アミラーゼ活性は、穀物デンプン含量および／または穂発芽に関連し得る。穂発芽は、植物の生理学的に成熟穀粒が、デンプン貯蔵粒としてではなく、発芽種子としての挙動を始める現象である。穂発芽は、穀物の収穫前の早熟発芽と、その結果としての種子生存率および最終用途価値の低下を特徴とする。従って、穂発芽は、大麦に相対的に急速な種子生存率の低下を起こさせ、また、麦芽製造工程は発芽を必要とするので、その発生は、大麦作物の麦芽製造に極めて望ましくない。穂発芽は、完全穀物成熟後の降雨および長期雨天と関連する場合が最も多い。α−アミラーゼ活性は、前発芽および未成熟発芽と相関し、発芽損傷の指標として使用できる（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００１２】
従って、発芽の開始直後に高レベルのデンプン分解酵素活性を有するが、それでも、高収率であり、および／または穂発芽の発生が少ない、高いデンプン含量の穀粒を有する大麦植物に対する必要性が存在する。
【００１３】
本発明は、発芽の開始直後に高レベルのデンプン分解酵素活性を有する大麦植物、特に、高レベルのα−アミラーゼおよび限界デキストリナーゼ活性を有する前記大麦植物を提供する。このような大麦植物は、発芽時間を低減した穀物ベース飲料の製造方法に特に有用である。
【００１４】
本発明により解決された１つの技術的問題は、発芽の開始直後、例えば、発芽の開始の７２時間後にはすでに、あるいは、４８時間後の早期に、高いα−アミラーゼおよび限界デキストリナーゼ活性を有する大麦植物の提供であり、この場合、大麦植物は同時に、許容可能な農業形質を有する。一態様では、本発明は、ＨＲＴ遺伝子に変異を有する大麦植物を提供する。驚くべきことに、本発明は、ＨＲＴ機能の低下した大麦植物が生存可能であり、農業的に健全で、他の大麦栽培品種と同等の収率を有することを示している。同時に、このような大麦植物は、発芽の開始の４８時間後で既に高いα−アミラーゼおよび限界デキストリナーゼ活性を有する。本発明により解決される別の技術的問題は、低減した酸素の条件下であっても、十分な発芽を有する大麦植物の提供である。興味深いことに、ＨＲＴ機能の低下した大麦植物はまた、この技術的問題も解決する。
【００１５】
Ｒａｖｅｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８は、大麦遺伝子ＨｖＲＥＰＲＥＳＳＯＲ  ＯＦ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ（ＨｖＨＲＴ）の完全長タンパク質生成物は、一時的な発現後に、植物細胞で試験した場合、種々の異なるプロモーターに対して転写性リプレッサーとして機能することを記載した。一時的な発現は通常、天然発現レベルより遙かに高い発現レベルに到達し、従って、一時的な発現アッセイを用いてタンパク質の機能を最終的に結論づけることは不可能である。これらの人工的状況では、ＨＲＴの一時的な発現は、異なるα−アミラーゼプロモーター（Ａｍｙ２およびＡｍｙ１）の制御下ではレポーター遺伝子の発現低下に繋がるが、同様に、構成的ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター由来の発現低下にも繋がる（Ｒａｖｅｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。従って、Ｒａｖｅｎｔｏｓらに基づくと、３つのＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質のＨＲＴが結合し、異なるプロモーター配列由来の発現に影響を与えることができる。ＨＲＴ機能の低下した変異体は、多くの遺伝子からの異常転写を有する可能性がある。さらに、Ｒａｖｅｎｔｏｓらは、ＨＲＴ  ｍＲＮＡが未成熟組織中に、例えば、未成熟種子、未成熟胚芽および未成熟胚乳／アリューロン中に蓄積することを記載している。対照的に、ＨＲＴ  ｍＲＮＡは、発芽種子由来の層中ではほとんど検出できない。これを基準にすると、ＨＲＴは、高いα−アミラーゼ活性が望ましくない大麦の成長の時点では、α−アミラーゼが発現されないという保証に関与している可能性がある。植物成長中の高いα−アミラーゼ活性は望ましくない。理由は、それが、適切な穀粒充填を低下させ得る、穀物デンプンの低減に繋がり得る、および穂発芽を生じ得るためである。本発明は、このような大麦変異体がそれでも健全で生存可能であることを示す。さらに、Ｒａｖｅｎｔｏｓらは、ＨＲＴ  ｍＲＮＡは、発芽種子由来の層上にはほとんど検出されないことを開示しているが、以外にも、本発明は、ＨＲＴ機能の低下が、発芽種子中で増大したα−アミラーゼ活性を生ずることを示している。
【００１６】
推定リプレッサーの機能喪失型変異の効果は通常、予測困難である。まず第１に、リプレッサーが、一時的な発現試験に基づいて、実際にインビボ状況下でリプレッサーであるかどうかは、確実に予測され得ない。さらに、リプレッサーの変異が、多くの遺伝子に影響を与える可能性があり、従って、効果は、予測され得ない。加えて、変異が実際に、標的遺伝子の増大した発現に繋がるかどうかも、予測され得ない。例えば、ＫＧＭは、一時的遺伝子導入時に、ＧＡＭＹＢ機能のレベルで、α−アミラーゼプロモーター活性を特異的に抑制することが記載された（Ｗｏｏｄｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。それでも、ＫＧＭをコードする遺伝子中で２つの異なる変異（その１つは、未成熟停止コドンを導入する変異）は、α−アミラーゼ活性を高めなかった。
【００１７】
本発明は、大麦遺伝子ＨＢＬ１２（ホメオボックス様１２）の特定についてさらに記載する。本明細書では、大麦遺伝子はＨｖＨＢＬ１２とも呼ばれる。Ｍａｓｃｈｅｒら、２０１７は、大麦ゲノムの塩基配列決定について記載した。加えて、Ｍａｓｃｈｅｒら、２０１７は、合計１２３，８７５個の修正配列を含む、大麦モデル栽培品種Ｍｏｒｅｘのトランスクリプトームを提供する。この情報に基づいて、発明者らは、ＨｖＨＢＬ１２は、発芽穀物の胚芽組織を含むいくつかの組織中で発現されていることを見だした。
【００１８】
シロイヌナズナは、ＨｖＨＢＬ１２に対し限定的な配列同一性を有する遺伝子を含む。従って、シロイヌナズナのＡＴＨＢ１２（シロイヌナズナホメオボックス１２）遺伝子は、ＨｖＨＢＬ１２とDNA中の約７０％の配列同一性を有する。ＡＴＨＢ１２は、モデル植物のシロイヌナズナで発見され、調査されたホメオドメイン−ロイシンジッパー（ＨＤ−Ｚｉｐ）クラスＩ転写因子である。Ｖａｌｄeｓら（２０１２）は、ＡＴＨＢ１２発現は、ホルモンＡＢＡにより誘導されることを報告した。Ｓｏｎら（２０１０）は、遺伝子産物ＡＴＨＢ１２は、アラビドプシス茎中のＧＡ生合成経路の遺伝子、ＧＡ２０オキシダーゼ１（ＧＡ２０ｏｘ１）を抑制する。ＡＴＨＢ１２の機能喪失型変異を有するシロイヌナズナ植物は、より長い茎を有する。Ｖａｌｄeｓら、２０１２およびＳｏｎら、２０１０のいずれも、早期発芽中のＡＴＨＢ１２の役割について考察していない。
【００１９】
上述のように、本発明により解決された１つの技術的問題は、発芽の開始直後、例えば、発芽の開始の７２時間後にはすでに、あるいは、４８時間後の早期に、高いα−アミラーゼおよび限界デキストリナーゼ活性を有する大麦植物の提供であり、この場合、大麦植物は同時に、許容可能な農業形質を有する。一態様では、本発明は、ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する大麦植物を提供する。驚くべきことに、本発明は、ＨｖＨＢＬ１２機能の低下した大麦植物が生存可能であり、農業的に健全で、野生型大麦と同等の茎の長さを有し、他の大麦栽培品種と同等の収率を有することを示している。同時に、このような大麦植物は、発芽の開始の４８時間後で既に高いα−アミラーゼおよび限界デキストリナーゼ活性を有する。本発明により解決される別の技術的問題は、穀物発芽中に、酸素および低酸素状態に対して感受性が低い大麦植物の提供である。興味深いことに、ＨｖＨＢＬ１２機能の低下した大麦植物はまた、この技術的問題も解決する。
【００２０】
Ｚｏｕら、２００８は、Ａｍｙ３２ｂの発現は、タンパク質複合体により調節され、リプレッサーまたはアクチベーター複合体の相対量が発現を調節することを示唆している。Ｚｏｕら、２００８は、ＨｖＷＲＫＹ３８およびＢＰＢＦが転写リプレッサーとして機能し得ることをさらに示唆している。しかし、これらの示唆は、Ａｍｙ３２ｂプロモーターの制御下で、ＧＵＳレポーター遺伝子を用いた極めて人工的な状況に由来するデータに基づいている。さらに、Ｚｏｕら、２００８に基づくと、リプレッサーまたはアクチベーターのいずれの相対量がＡｍｙ３２ｂ発現の調節をもたらすのかを予測するのは不可能である。上述のように、推定リプレッサーの機能喪失型変異の効果は通常、予測困難である。
【００２１】
上述のように、本発明により解決された１つの技術的問題は、発芽の開始直後に、高いα−アミラーゼおよび限界デキストリナーゼ活性を有する大麦植物の提供であり、この場合、大麦植物は同時に、許容可能な農業形質を有する。一態様では、本発明は、ＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有する大麦植物を提供する。従って、高いα−アミラーゼ活性を有する大麦植物またはその一部を提供することは本発明の一態様であり、前記大麦植物は、
・ＨｖＨＲＴ遺伝子中にＨｖＨＲＴ機能の低下をもたらす変異を有する；および／または
・ＧＡＲＥボックス中に変異を含む変異体α−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・ＧＡＲＥボックス中に変異を含む、または配列ＴＡＡＣＡＡＡを有する変異体α−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中にＨｖＨＢＬ１２機能の低下をもたらす変異を有する；および／または
・非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有し、前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスが配列（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）を含み、１つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、Ｘは任意のヌクレオチドでよく、ｎは０または１、ｍは０〜２０の範囲の整数である；および／または
・非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；
・ＷＲＫＹ３８遺伝子中にＷＲＫＹ３８機能の低下をもたらす変異を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】４ｍｌ（左列）または８ｍｌ（右列）の水の存在下での標準的発芽試験後の栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ（野生型）および大麦変異体ＨＥＮＺ−２の発芽穀粒％を示す。
【図２】大麦粒の１ｋｇ乾燥重量当たり９０Ｌ／ｈの空気流量下、水中２４時間および４８時間のインキュベーション後の、栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ（野生型）および大麦変異体ＨＥＮＺ−２の穀粒の穀粒含水量を示す。
【図３】大麦粒の１ｋｇ乾燥重量当たり９０Ｌ／ｈの空気流量下、水中４８時間のインキュベーション後の、栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ（野生型）および大麦変異体ＨＥＮＺ−２を用いてｄｄＰＣＲにより測定した、ａｍｙ１＿１クラスター（左列の２つ）、ａｍｙ１＿２クラスター（中央列の２つ）およびＢＧＬ２Ａ＋ＢＧＬ２Ｂ  ｍＲＮＡ（右列の２つ−「ＢＧＬ２Ａ」として示す）のα−アミラーゼ遺伝子によりコードされたα−アミラーゼ  ｍＲＮＡの遺伝子発現を示す。
【図４】大麦粒の１ｋｇ乾燥重量当たり９０Ｌ／ｈの空気流量下で、水中、２４時間および４８時間インキュベーション後の、栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ（野生型）および大麦変異体ＨＥＮＺ−２のα−アミラーゼ活性（図４Ａ）、β−アミラーゼ活性（図４Ｂ）および限界デキストリナーゼ活性（図４Ｃ）を示す。
【図５】栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ（野生型）および大麦変異体ＨＥＮＺ−２穀粒のα−アミラーゼ活性（図５Ａ）、β−アミラーゼ活性（図５Ｂ）および限界デキストリナーゼ活性（図５Ｃ）を示す。これらは、殻を剥がし、大麦粒の１ｋｇ乾燥重量当たり９０Ｌ／ｈの空気流量下、水中で２４時間（２４時間）、または水中２４時間および空気中２４時間（４８時間）インキュベーションした。
【図６】４ｍｌ（左列）または８ｍｌ（右列）の水の存在下での標準的発芽試験後の栽培品種Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１（野生型）および大麦変異体ＨＥＮＺ−１０の発芽穀粒％を示す。
【図７】ｄｄＰＣＲにより測定した、水中４８時間のインキュベーション後の、栽培品種Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１（野生型）および大麦変異体ＨＥＮＺ−１０中のａｍｙ１＿１クラスター、ａｍｙ１＿２クラスター、限界デキストリナーゼ  ｍＲＮＡ（ＬＤ）、ＡＧＬ９７  ｍＲＮＡ、ＢＧＬ２Ａ  ｍＲＮＡおよびＢＧＬ２Ｂ  ｍＲＮＡのα−アミラーゼ遺伝子によりコードされたα−アミラーゼ  ｍＲＮＡの遺伝子発現を示す。
【図８】大麦粒の１ｋｇ乾燥重量当たり９０Ｌ／ｈの空気流量下、水中でのインキュベーション後にｄｄＰＣＲにより測定した、栽培品種Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１（野生型）および大麦変異体ＨＥＮＺ−１０中の、ａｍｙ１＿１クラスター、ａｍｙ１＿２クラスター、限界デキストリナーゼ  ｍＲＮＡ（ＬＤ）、ＢＧＬ２Ａ  ｍＲＮＡのα−アミラーゼ遺伝子によりコードされたα−アミラーゼ  ｍＲＮＡの遺伝子発現を示す。
【図９】大麦粒の１ｋｇ乾燥重量当たり９０Ｌ／ｈの空気流量下で、水中、２４時間および４８時間インキュベーション後の、Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１（野生型）および大麦変異体ＨＥＮＺ−１０中のα−アミラーゼ活性（図９Ａ）、β−アミラーゼ活性（図９Ｂ）および限界デキストリナーゼ活性（図９Ｃ）を示す。
【図１０】類似条件の圃場で栽培後のＨｕｌｌ−ｌｅｓｓ１（野生型）および大麦変異体ＨＥＮＺ−１０の植物高さを示す。
【図１１】ａｍｙ１＿１およびａｍｙ１＿２クラスターの異なるα−アミラーゼ遺伝子由来の、ならびにＨＥＮＺ−４３変異体のａｍｙ１＿１（図１１Ａ）由来の、ならびにａｍｙ２クラスター（図１１Ｂ）のα−アミラーゼ遺伝子由来の調節ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターの部分の整列を示す。ＨＥＮＺ−４３変異体の変異は、＃により標識されている。
【図１２】緑麦芽を作製するのに有用な装置の例を示す。装置はタンク（２）を備え、その中で穀粒を水溶液中に浸漬し、連続的に通気できる。装置は、大麦粒（１）の入り口、タンク、例えば、浸麦タンク（２）；ガス入り口、例えば、焼結石（３）；ポンプ、例えば、エアポンプ（４）；大麦粒出口（５）；穀物ポンプ（６）；大麦粒を細かく粉砕する装置、例えば、ミル（７）；入口（８）；容器、例えば、マッシング容器（９）；および出口（１０）を備える。
【図１３】９Ｌ／ｈの空気流量下、発芽の開始の４８時間後および７２時間後において水中浸漬下で発芽している大麦粒中のα−アミラーゼ活性を示す。図１３Ａは、大麦変異体ＨＥＮＺ−２および対照ホモ接合の大麦植物（野生型）のα−アミラーゼ活性を示し、一方、図１３Ｂは、大麦変異体ＨＥＮＺ−１０および大麦野生型Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１（野生型）のα−アミラーゼ活性を示す。
【図１４】大麦変異体ＨＥＮＺ−１０および大麦野生型Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１（野生型）において、空気流量なしで、発芽の開始の２４時間後、４８時間後および７２時間後の水中浸漬下で発芽している大麦粒中のα−アミラーゼ活性を示す。
【図１５】空気流量なしで、発芽の開始の７２時間後での水中浸漬下で発芽している大麦粒中のα−アミラーゼ活性を示す。図１５の上段パネルは、大麦変異体ＨＥＮＺ−２ａおよび栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦のα−アミラーゼ活性、図１５の中段パネルは、大麦変異体ＨＥＮＺ−５４および栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦のα−アミラーゼ活性および図１５の下段パネルは、大麦変異体ＨＥＮＺ−４３および栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦のα−アミラーゼ活性を示す。
【図１６】大麦変異体ＨＥＮＺ−２および対照ホモ接合大麦植物（野生型）の発芽の開始の０、１２時間後、２４時間後および４８時間後での発芽穀物のＲＴ  ｄｄＰＣＲにより測定した、ａｍｙ１＿１クラスター（図１６Ａ）、ａｍｙ１＿２遺伝子（図１６Ｂ）、およびａｍｙ２クラスター（図１６Ｃ）のα−アミラーゼ遺伝子によりコードされるα−アミラーゼ  ｍＲＮＡの遺伝子発現を示す。
【図１７】大麦変異体ＨＥＮＺ−２ａおよび栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（図１７Ａ）、大麦変異体ＨＥＮＺ−５４および栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（図１７Ｂ）および大麦変異体ＨＥＮＺ−４３および栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（図１７Ｃ）の発芽穀物でのＲＴ  ｄｄＰＣＲにより測定した、ａｍｙ１＿１クラスターのα−アミラーゼ遺伝子によりコードされるα−アミラーゼ  ｍＲＮＡの７２時間後の遺伝子発現を示す。
【図１８】大麦変異体ＨＥＮＺ−２ａおよび栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（図１８Ａ）、大麦変異体ＨＥＮＺ−５４および栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（図１８Ｂ）および大麦変異体ＨＥＮＺ−４３および栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（図１８Ｃおよび１８Ｄ）の発芽穀物でのＲＴ  ｄｄＰＣＲにより測定した、ａｍｙ１＿２遺伝子（図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃ）およびａｍｙ２クラスター（図１８Ｄ）のα−アミラーゼ遺伝子によりコードされるα−アミラーゼ  ｍＲＮＡの７２時間発芽後の遺伝子発現を示す。
【図１９】大麦変異体ＨＥＮＺ−２ａおよび栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（上段パネル）、大麦変異体ＨＥＮＺ−５４および栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（中段パネル）および大麦変異体ＨＥＮＺ−４３および栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（下段パネル）の発芽穀物でのＲＴ  ｄｄＰＣＲにより測定した、限界デキストリナーゼ  ｍＲＮＡの７２時間後の発現を示す。
【図２０】大麦変異体ＨＥＮＺ−２ａおよび栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（図２０Ａ）、大麦変異体ＨＥＮＺ−５４および栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（図２０Ｂ）および大麦変異体ＨＥＮＺ−４３および栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦（図２０Ｃ）の発芽穀物でのＲＴ  ｄｄＰＣＲにより測定した、Ｂｇｌ２遺伝子由来の７２時間後の遺伝子発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
本明細書で使用される場合、それが使われる文脈に応じて、「ａ」は、１つ（１種）または１つ（１種）を超える、を意味し得る。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語の「α−アミラーゼ」は、α−アミラーゼ活性を有する酵素を意味する。特に、本発明によるα−アミラーゼは、３つ以上の（１→４）−α−結合Ｄ−グルコース単位を含む多糖中の（１→４）−α−Ｄ−グルコシド結合のエンド加水分解を触媒できる酵素である。α−アミラーゼ活性は、Ｋ−ＣＥＲＡ０１／１２により測定し得る（プロトコルおよびキットは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語の「補助剤」は、ビールの作製中に加えられる炭素リッチ原材料源を意味する。補助剤は、非発芽穀物粒であってもよく、これは、本発明により作製された発芽穀粒と共に粉砕されてもよい。補助剤はまた、シロップ、糖などであってもよい。
【００２６】
数値に関連して本明細書で使用される場合、用語の「約」は、好ましくは±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語の「アミノ酸」は、タンパク質を構成するアミノ酸を意味する。好ましくは、タンパク質を構成するアミノ酸は、標準的遺伝子コードによりコードされる２０個のアミノ酸の内の１つである。ＩＵＰＡＣの１文字および３文字コードは、アミノ酸を命名するために使用される。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語の「Ｘに対応するアミノ酸」は、参照ポリペプチド（例えば、配列番号２、６、１１または１２のポリペプチドのいずれか）のアミノ酸に対して、所与のポリペプチド（例えば、変異体ＨＲＴ、ＨＢＬ１２またはＷＲＫＹ３８ポリペプチド）のアミノ酸について言及する。前記ポリペプチドと参照ポリペプチドとの間で整列後に、アミノ酸が前記整列中のＸと同じ位置にある場合に、そのアミノ酸は、Ｘに対応する。
【００２９】
用語の「アミロース」は、α−Ｄ−グルコースのホモポリマーを意味する。アミロースは、そのグルコース単位がほぼ例外なく、α−１−４−グリコシド結合により結合されるので、直鎖分子構造を有する。
【００３０】
用語の「アミロペクチン」は、α−Ｄ−グルコースのホモポリマーを意味する。アミロペクチン分子は、α−１−６−グリコシド結合を高頻度に含む。これらは、α−１−４−結合グルコース鎖中に分岐点を導入する。これを行わなければ分子軸に沿って規則的な間隔で現れる並行鎖のクラスターを生じる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語の「大麦粉」は、粉砕した大麦穀粒を意味する。
【００３２】
用語のβ−アミラーゼは、鎖の非還元末端から連続的にマルトース単位を取り除くように、多糖中の（１->４）−α−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素を意味する。β−アミラーゼ活性は、Ｋ−ＢＥＴＡ３により測定し得る（プロトコルおよびキットは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語の「若葉」は、穀物粒の発芽相中に認められる成長している胚芽を意味する。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語の「高収率」は、高収率大麦栽培品種の収率と同等の収率を意味する。特に、「高収率」は、同一条件下で成長した栽培品種Ｐｌａｎｅｔの大麦植物の収率の少なくとも９８％、例えば、少なくとも１００％などの少なくとも９５％の収率であり得る。
【００３５】
ビールなどの大麦ベース飲料の製造工程、特に、麦芽製造工程を言い表すのに使用される工程に関連する用語の「大麦」は、大麦穀粒を意味する。別段の指定がない限り、その他のすべての場合では、「大麦」は、大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ，Ｌ．）を意味し、これには、任意の育種系統または栽培品種または変種が含まれ、一方、大麦植物の一部は、大麦植物の任意の部分、例えば、任意の組織または細胞であり得る。
【００３６】
本明細書で定義の「穀類」植物は、主にそれらのデンプン含有種子または穀粒を目的として栽培されたイネ科植物ファミリーのメンバーである。穀類植物には、限定されないが、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、米（Ｏｒｙｚａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ）、オート麦（Ａｖｅｎａ）、サトウモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、およびライ麦−小麦交配種が挙げられる。
【００３７】
指定された核酸に関連して、「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」または「コードする（ｅｎｃｏｄｅｄ）」は、指定されたタンパク質への翻訳のための情報を含むことを意味する。タンパク質をコードする核酸またはポリヌクレオチドは、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列、例えば、イントロンを含むか、または例えば、ｃＤＮＡ中で、このような介在非翻訳配列を欠いていてもよい。タンパク質がコードされる情報は、コドンの使用により指定される。
【００３８】
本明細書で使用される場合、核酸に関連して「発現」は、ｍＲＮＡの転写および蓄積と理解されるべきである。タンパク質に関連して使用される「発現」は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味する。
【００３９】
用語の「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、これには、コード領域に先行するおよびそれに続くプロモーターおよびターミネーターが含まれる。さらに、植物遺伝子は通常、イントロンにより割り込まれるエクソンからなる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語の「発芽の開始」は、１５％未満の含水量の大麦粒が十分な水と接触して発芽を開始する時点を意味する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語の「麦芽製造」は、制御された環境条件下で起こる、穀物穀粒（特に、大麦穀粒）の制御された発芽を意味する。いくつかの実施形態では、「麦芽製造」は、前記発芽穀物穀粒を、例えば、キルン乾燥により、乾燥するステップをさらに含み得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語の「発芽穀粒」は、目視可能な若葉および茎を発達させた穀物を意味する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語の「緑麦芽」は、発芽穀物穀粒を意味し、これは、キルン乾燥のステップに供されていない。一般に、前記穀物穀粒は、制御された環境条件下で発芽されている。いくつかの実施形態では、緑麦芽は、粉砕緑麦芽である。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語の「キルン乾燥麦芽」は、発芽穀物穀粒を意味し、これは、キルン乾燥により乾燥されている。一般に、前記穀物穀粒は、制御された環境条件下で発芽されている。いくつかの実施形態では、キルン乾燥麦芽は粉砕キルン乾燥麦芽である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語の「限界デキストリナーゼ」は、アミロペクチンおよびプルラン中の、アミロペクチンおよびグリコーゲンのα−およびβ−限界デキストリン中の（１->６）−α−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒できる酵素を意味する。特に、限界デキストリナーゼは、ＥＣ３．２．１．１４２に分類される酵素であり得る。限界デキストリナーゼ活性は、Ｔ−ＬＤＺ１０００により測定される（プロトコルおよびキットは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）。
【００４６】
「マッシング」は、粉砕麦芽（例えば、緑麦芽またはキルン乾燥麦芽）および／または非発芽穀物穀粒の水中でのインキュベーションである。マッシングは、特定の温度および水の特定の体積中で実施されるのが好ましい。
【００４７】
用語の「粉砕された」は、例えば、切断、粉砕、磨砕または圧潰により微粉化された物質（例えば、大麦穀粒または麦芽）を意味する。大麦穀粒は、湿った状態で、例えば、グラインダーまたは湿式ミルを用いて粉砕できる。粉砕大麦穀粒または粉砕麦芽は、水性抽出物に有用な物質の状態にするために十分に微粉化される。粉砕大麦穀粒または粉砕麦芽は、生物学的方法によっては、本質的に未処理の植物に再生できない。
【００４８】
「変異」には、遺伝子のコードおよび非コード領域中の、欠失、挿入、置換、塩基転換、および点変異が含まれる。欠失は、全体遺伝子でも、または遺伝子の一部分であってもよい。点変異は、１つの塩基対の変化に関し、未成熟停止コドン、フレームシフト変異、スプライス部位の変異またはアミノ酸置換を生じ得る。変異を含む遺伝子は、「変異体遺伝子」と呼ばれることもある。前記変異体遺伝子が野生型とは異なる配列を有するポリペプチドをコードする場合、前記ポリペプチドは、「変異体ポリペプチド」と呼ばれることもある。変異体ポリペプチドは、野生型配列とは異なるアミノ酸配列を含む場合、変異を有すると言われることがある。命名法「ＸｎｎｎＹ」は、位置ｎｎｎのアミノ酸またはヌクレオチドＸが、Ｙにより置換されていることを示す。従って、例えば、ＸｎｎｎＳｔｏｐは、位置ｎｎｎのアミノ酸Ｘをコードするコドンが、停止コドンにより置換されていることを示す。
【００４９】
用語「植物生成物」は、植物または植物性物質の処理から得られた生成物を意味する。従って、前記植物生成物は、例えば、緑麦芽、キルン乾燥麦芽、麦汁、発酵または非発酵飲料、食品、または飼料製品であり得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語の「子孫」は、所与の植物の直接または間接的派生物である植物を意味する。従って、子孫は直接派生物に限定されることなく、多くの世代後の派生物も含む。一般に、特定の変位を有する大麦植物の子孫も同様に、その特定の変位を有する。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語の「配列同一性」は、整列後に、候補配列と参照配列との間のアミノ酸またはヌクレオチドの同一％を意味する。従って、参照配列と８０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、整列後に、参照配列中の対応するアミノ酸に対して、候補配列中の８０％のアミノ酸が同一であることが必要である。本発明による同一性は、コンピューター分析、例えば、限定されないが、ポリペプチド配列の整列用のＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａコンピューター整列プログラム（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７  ：５３９，ＰＭＩＤ：２１９８８８３５；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５  Ａｐｒｉｌ  ０６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３（Ｗ１）：Ｗ５８０−４  ＰＭＩＤ：２５８４５５９６；ＭｃＷｉｌｌｉａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３  Ｍａｙ  １３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５９７−６００  ＰＭＩＤ：２３６７１３３８、およびその中で示唆されたデフォルトパラメーターを用いて決定される。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａソフトウェアは、ＥＭＢＬ−ＥＢＩのｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／から利用できる。このプログラムをそのデフォルト設定で用いて、クエリーの成熟（生理活性）部分および参照ポリペプチドが整列される。完全に保存された残基の数がカウントされ、参照ポリペプチドの長さで除算される。ＭＵＳＣＬＥまたはＭＡＦＦＴアルゴリズムがヌクレオチド配列の整列のために使用され得る。配列同一性は、アミノ酸配列に対して示したものと類似の方法で計算され得る。本明細書で提供される配列同一性は、従って、参照配列の全体長さにわたり計算される。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、用語の「浸麦」は、穀物粒の含水量を増大させる工程を意味する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語の「デンプン」は、個別の高分子：アミロースおよびアミロペクチンの片方または両方の組成物を意味する。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語の「スプライス部位」は、スプライシングプロセスのためのスプライスシグナルとして機能するコンセンサス配列を意味する。スプライス部位変異は、スプライシングプロセス中にスプライシングが起こる、すなわち、前駆物質メッセンジャーＲＮＡを成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へとプロセッシングする、特定の部位の多数のヌクレオチドを挿入する、欠失させるまたは変化させる遺伝子変異である。エクソン認識を促進するスプライス部位コンセンサス配列は通常、イントロンのまさしくその末端に配置される。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語の「停止コドン」は、ｍＲＮＡ内で遺伝コード中の翻訳を終止させる三つ組みヌクレオチドを意味する。本明細書で使用される場合、用語の「停止コドン」はまた、ｍＲＮＡ内で停止コドンをコードする遺伝子内の三つ組みヌクレオチドを意味する。ＤＮＡ中の停止コドンは通常、次の配列：ＴＡＧ、ＴＡＡまたはＴＧＡの内の１つを有する。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、穀物の「含水量」という用語は、前記穀物中のＨ２Ｏのｗ／ｗ％を意味する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、穀物粒の酵素活性は、特定の穀物タイプから作製された粉末で測定された活性を意味する。例えば、１ｇの穀物粒当たり１０Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性は、前記穀物からの１ｇの粉末（乾燥物）由来の水性抽出物中で測定した前記α−アミラーゼ活性（１０Ｕ）を意味する。
【００５８】
本明細書で示すガスの体積は、１気圧、２０℃での前記ガスの体積を意味する。
【００５９】
本明細書で示すＯ２の体積は、１気圧、２０℃でのＯ２の体積を意味する。本発明の実施形態では、Ｏ２がガスの混合物中に含まれる場合、ガス混合物の総体積が決定され得、Ｏ２の体積は、Ｏ２を含む総体積のパーセンテージとして計算され得る。一例では、大気は２１％Ｏ２を含む。従って、本明細書で使用される大気中のＯ２の体積は、大気の総体積の２１％である。
【００６０】
用語の「麦汁」は、粉砕麦芽および／または粉砕穀物粒ならびに、任意選択で、追加の補助剤などの麦芽および／または穀物粒の液体抽出物を意味する。麦汁は通常、マッシングにより、続けて、任意選択で、温水でマッシング後、残留物糖類およびその他のビール粕由来の化合物を抽出する工程での「スパージング」により得られる。スパージングは通常、麦芽汁濾過機、マッシュフィルター、または抽出した水のビール粕からの分離を可能とする別の装置で実施される。マッシング後に得られた麦汁は通常、「第一麦汁」と呼ばれ、一方、スパージング後に得られた麦汁は通常、「第二麦汁」と呼ばれる。指定されない場合は、用語の麦汁は第一麦汁、第二麦汁、または両者の組み合わせであり得る。従来のビール製造中、麦汁はホップと一緒に煮沸される。ホップのない麦汁はまた、「甘い麦汁」と呼ばれることもあり、一方、ホップと共に煮沸された麦汁は、「煮沸麦汁」または単に麦汁と呼ばれることもある。
【００６１】
α−アミラーゼおよびα−アミラーゼプロモーター中に変位を有する大麦植物
本明細書で使用される場合、用語のα−アミラーゼは、デンプンなどのα−結合多糖内のα結合の加水分解を触媒できる酵素を意味する。α−アミラーゼは通常、ＥＣ３．２．１．１に分類される酵素である。α−アミラーゼは、アルファ−アミラーゼとしても知られる。
【００６２】
穀類植物は、α−アミラーゼをコードする２種以上の遺伝子を含み得る。従って、本発明による大麦植物は、α−アミラーゼをコードする２種以上の遺伝子を含み得る。多くの場合、α−アミラーゼをコードする遺伝子は、遺伝子クラスター中に組織化され得る。
【００６３】
本発明によるα−アミラーゼは特に、受入番号ＨＯＲＶＵ６Ｈｒ１Ｇ０７８３３０．１、ＨＯＲＶＵ６Ｈｒ１Ｇ０７８３６０．１、ＨＯＲＶＵ６Ｈｒ１Ｇ０７８４２０．１、ＨＯＲＶＵ６Ｈｒ１Ｇ０８０７９０．１、ＨＯＲＶＵ７Ｈｒ１Ｇ０９１１５０．１、ＨＯＲＶＵ７Ｈｒ１Ｇ０９１２４０．１、もしくはＨＯＲＶＵ７Ｈｒ１Ｇ０９１２５０．３またはそれらと少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの配列を有するポリペプチドであり得、前記受入番号は、Ｍａｓｃｈｅｒら（２０１７）により発表された大麦ゲノム塩基配列決定プロジェクト由来の受入番号である。この配列は、ＢＡＲＬＥＸデータベース：ｈｔｔｐｓ：／／ａｐｅｘ．ｉｐｋ−ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ．ｄｅ／ａｐｅｘ／ｆ？ｐ＝２８４：１０でも入手できる。
【００６４】
従って、本発明による大麦植物は、少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種、例えば、少なくとも３種、例えば、３種のα−アミラーゼ遺伝子クラスターを含み得る。特に、大麦植物は、ａｍｙ１＿１クラスター、ａｍｙ１＿２クラスターおよびａｍｙ２クラスターを含み得る。ａｍｙ１＿２クラスターは多くの場合、１種の遺伝子のみを含むが、それにもかかわらず、単純化のために、本明細書ではａｍｙ１＿２クラスターと呼ばれる。上述のクラスターに加えて、大麦植物は、追加のα−アミラーゼ遺伝子／クラスターを含み得る（例えば、ａｍｙ３、ａｍｙ４＿１およびａｍｙ４＿２遺伝子）。これらのクラスターのそれぞれは、１種または複数のα−アミラーゼ遺伝子を含み得る。
α−アミラーゼ遺伝子の配列の例は、Ｍａｓｃｈｅｒら（２０１７）により発表された大麦ゲノムプロジェクトから入手可能である。
【表１】
2021509580.tif 000003
【００６５】
一般的に、各α−アミラーゼ遺伝子は、プロモーター領域（本明細書ではα−アミラーゼプロモーターと表記される）、コード領域および１つまたは複数のイントロンを含む。本明細書で使用される場合、α−アミラーゼプロモーターは、α−アミラーゼ遺伝子のコード配列の開始コドン（ＡＴＧ）の直ぐ上流の８００ヌクレオチドなどの１０００ヌクレオチドの配列を含むまたはそれからなる。各クラスター内および異なる大麦栽培品種間の単一遺伝子コピーの正確な配列は、α−アミラーゼプロモーター中で有意差を示し得るが、特定の調節ボックスは、複数のα−アミラーゼ遺伝子間で保存されている。特に、前記調節ボックスは、ａｍｙ１＿１クラスター、ａｍｙ１＿２クラスターおよびａｍｙ２クラスターのα−アミラーゼ遺伝子間で保存され得る。図１１は、ａｍｙ１＿１およびａｍｙ１＿２クラスター（図１１Ａ）の異なるα−アミラーゼ遺伝子由来の、ならびにａｍｙ２クラスター（図１１Ｂ）のα−アミラーゼ遺伝子由来の前記調節ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターの部分整列を示す。
【００６６】
特に、１種または複数の本発明の大麦植物のα−アミラーゼ遺伝子は、配列ＴＡＡＣＡＲＡ（ＲはＧまたはＡ）を有するＧＡＲＥボックスを含み得る。これは特に、ａｍｙ１＿１クラスター、ａｍｙ１＿２クラスターまたはａｍｙ２クラスターのα−アミラーゼ遺伝子に対する事例である。通常、各α−アミラーゼプロモーターは、多くて１つのＧＡＲＥボックスを含む。ａｍｙ３およびａｍｙ４クラスターのα−アミラーゼ遺伝子は多くの場合、ＧＡＲＥボックスを含まない。
【００６７】
本発明の一実施形態では、大麦植物が変異導入したＧＡＲＥボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む１種または複数のα−アミラーゼ遺伝子を含むのが好ましい。換言すれば、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーターは、野生型ＧＡＲＥボックスを含まないが、その代わりに、変異体ＧＡＲＥボックスを含み、ヌクレオチドＴＡＡＣＡＲＡの内の１つまたは複数が置換または欠失されている。前記変異体ＧＡＲＥボックスは、ヌクレオチドＴＡＡＣＡＲＡの１つのみが置換または欠失されているＧＡＲＥボックスであるのが好ましい。特に、大麦植物は、変異導入したＧＡＲＥボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含むａｍｙ１＿１クラスター、ａｍｙ１＿２クラスターまたはａｍｙ２クラスターの内の１種または複数のα−アミラーゼ遺伝子を含み得る。
【００６８】
別の実施形態では、本発明の大麦植物は、配列ＴＡＡＣＡＡＡを含む１つのＧＡＲＥボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む、１種または複数のα−アミラーゼ遺伝子、好ましくは、少なくとも５種などの、少なくとも４種、例えば、少なくとも７種のα−アミラーゼ遺伝子などの少なくとも６種のα−アミラーゼ遺伝子を含む。特に、前記α−アミラーゼ遺伝子は、ａｍｙ１＿１クラスター、ａｍｙ１＿２クラスターまたはａｍｙ２クラスターのα−アミラーゼ遺伝子であり得る。前記α−アミラーゼ遺伝子は、ＰＹＲボックスも含み得る。本明細書で使用される場合、用語の「ＰＹＲボックス」は、配列ＣＭＴＴＴＴを意味し、ＭはＣまたはＡである。
【００６９】
さらに、１種または複数の本発明の大麦植物のα−アミラーゼ遺伝子は、タンデム型リピートＷ−ボックスを含み得る。標準的タンデム型リピートＷ−ボックスは、配列（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）を有し、各Ｘは任意のヌクレオチドでよく、ｎは０または１、ｍは０〜２０の範囲の整数である。任意の所与のタンデム型リピートＷ−ボックス内で、個別のＸは、同じまたは異なるヌクレオチドであってよい。通常、各α−アミラーゼプロモーターは、ただ１つのタンデム型リピートＷ−ボックスを含む。
【００７０】
本発明の一実施形態では、大麦植物が、非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む１種または複数のα−アミラーゼ遺伝子を含むのが好ましい。換言すれば、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーターは、標準的タンデム型リピートＷ−ボックスを含まないが、その代わりに、非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含み、標準的タンデム型リピートＷ−ボックス（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）の内の１つまたは複数のヌクレオチドが置換または欠失されている。置換または欠失されている前記１つまたは複数のヌクレオチドは、標準的タンデム型リピートＷ−ボックスの特定の１つまたは複数のヌクレオチドである（すなわち、任意のＸではない）。
【００７１】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、個別に次の配列からなる群より選択される非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む１種または複数のα−アミラーゼ遺伝子、例えば、少なくとも５種などの、少なくとも４種、例えば、少なくとも７種などの少なくとも６種のα−アミラーゼ遺伝子を含む：
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＹＴＧＲＣＣ）、式中、ＲはＧまたはＡ、ＹはＣまたはＴ、ｍは、０〜２０の範囲の整数であり；または
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）、式中、ＲはＧまたはＡ、ｍは、０〜２０の範囲の整数であり；または
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣ）、式中、ＲはＧまたはＡ、ｍは、０〜２０の範囲の整数であり；または
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＹＴＧＲＣＣ）、式中、ＲはＧまたはＡ、ＹはＣまたはＴ、ｎは０または１、ｍは、０〜２０の範囲の整数であり；または
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＣＴＧＲＣＣ）、式中、ＲはＧまたはＡ、ｎは０または１、ｍは、０〜２０の範囲の整数であり；または
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＹＴＧＧＣＣ）、式中、ＹはＣまたはＴ、ｎは０または１、ｍは、０〜２０の範囲の整数であり；または
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＣＴＧＡＣＣ）、式中、ｎは０または１、ｍは、０〜２０の範囲の整数であり；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＧＣＣ）、式中、ｎは０または１、ｍは、０〜２０の範囲の整数であり；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＴＣ）、式中、ｎは０または１、ｍは、０〜２０の範囲の整数である。
前述のように、ｍは０〜２０の範囲の整数であってよく、好ましくはｍは０〜１０の範囲の整数であり、さらにより好ましくはｍは０〜６の範囲の整数である。
【００７２】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、個別に次の配列の非標準タンデム型リピートＷ−ボックスからなる群より選択される非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含む、α−アミラーゼプロモーターを含む１種または複数のα−アミラーゼ遺伝子、例えば、少なくとも５種のα−アミラーゼプロモーターを含む：
・ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＡＣＣ（配列番号３１）；
・ＴＧＡＣＡＧＴＧＧＴＡＴＴＧＧＣＣ（配列番号３２）；
・ＴＧＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＴＧＧＣＣ（配列番号３３）；
・ＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＴＡＴＴＧＧＣＣ（配列番号３４）；
・ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＣ（配列番号３５）；
・ＴＧＡＣＣＧＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＣ（配列番号３６）；および
・ＴＴＧＡＣＴＴＧＡＴＣ（配列番号３７）。
【００７３】
本明細書で提供されるデータベース探索およびプロモーター再塩基配列決定は、ａｍｙ１＿１、ａｍｙ１＿２およびａｍｙ２クラスターのα−アミラーゼ遺伝子のα−アミラーゼプロモーターがＧＡＲＥボックス配列を含むことを示す。特に、野生型大麦中のａｍｙ２クラスターのα−アミラーゼ遺伝子は、配列ＴＡＡＣＡＧＡのＧＡＲＥボックスを含む。
【００７４】
ａｍｙ１＿１クラスターは、１〜５種のα−アミラーゼ遺伝子を含み得るが、すべてのα−アミラーゼ遺伝子が必要であるとは限らない。従って、いくつかの大麦植物（例えば、栽培品種Ｂａｒｋｅまたはその子孫）では、ａｍｙ１＿１クラスターは、少なくとも３つの主要コピーを含むが、他の大麦植物（例えば、栽培品種Ｐｌａｎｅｔまたはその子孫）は、ａｍｙ１＿１クラスター中に３種のα−アミラーゼ遺伝子を含み、そのうちの２種のみが発現される可能性がある。例えば、いくつかのα−アミラーゼプロモーターは、ＰＹＲボックスを欠いており、従って、発現されないと考えられている。本発明によるα−アミラーゼは、ａｍｙ１＿１クラスターの遺伝子によりコードされたα−アミラーゼであり得る。例えば、α−アミラーゼは、受入番号ＡＡＡ９８７９０．１またはＢＡＫ０３６０３．１またはそれらと少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの配列を有するポリペプチドであり得、前記受入番号は、ＮＣＢＩデータベースの受入番号である。α−アミラーゼはまた、受入番号ＨＯＲＶＵ６Ｈｒ１Ｇ０７８３３０．１、ＨＯＲＶＵ６Ｈｒ１Ｇ０７８３６０．１、ＨＯＲＶＵ６Ｈｒ１Ｇ０７８４２０．１、ＨＯＲＶＵ０Ｈｒ１Ｇ０３２７００．１、またはＨＯＲＶＵ０Ｈｒ１Ｇ０３２８５０．５またはそれらと少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの配列を有するポリペプチドであり得、前記受入番号は、ＢＡＲＬＥＸデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ａｐｅｘ．ｉｐｋ−ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ．ｄｅ／ａｐｅｘ／ｆ？ｐ＝２８４：１０）およびＭａｓｃｈｅｒら（２０１７）により報告された受入番号である。
【００７５】
本発明の大麦植物は、ａｍｙ１＿１クラスターを含み、少なくとも１つのα−アミラーゼプロモーター、好ましくはすべてのα−アミラーゼプロモーターが下記を含む：
・変異導入したＧＡＲＥボックスのみ（ＧＡＲＥボックス（ＴＡＡＣＡＲＡ）のヌクレオチドの１つが置換または欠失されている）、および／または
・配列ＴＡＡＣＡＡＡを有するＧＡＲＥボックス；および／または
・非標準タンデム型リピートＷ−ボックスのみ（標準的タンデム型リピートＷ−ボックス（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）の内の１つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、例えば、前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスは本明細書で上記した非標準タンデム型リピートＷ−ボックス配列のいずれかを有し得る）。
【００７６】
加えて、前記α−アミラーゼプロモーターは、ＰＹＲボックスを含み得る。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語の「変異導入したＧＡＲＥボックスのみ」は、１つのみのＧＡＲＥボックスを含む前記プロモーターを意味し、前記ＧＡＲＥボックスは変異導入されており、すなわち、前記プロモーターは前記変異導入したＧＡＲＥボックスに追加して野生型ＧＡＲＥボックスを含まない。同様に、本明細書で使用される場合、用語の「非標準タンデム型リピートＷ−ボックスのみ」は、１つのみのタンデム型リピートＷ−ボックスを含む前記プロモーターを意味し、前記タンデム型リピートＷ−ボックスは非標準タンデム型リピートＷ−ボックスであり、すなわち、前記プロモーターは前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスに追加して野生型標準的タンデム型リピートＷ−ボックスを含まない。
【００７８】
本発明により示されるように、配列ＴＡＡＣＡＡＡを有するＧＡＲＥボックスは、配列ＴＡＡＣＡＧＡを有するＧＡＲＥボックスに比べて、より低いＨＲＴ結合を有する。同様に、ＷＲＫＹ３８は、標準的タンデム型リピートＷ−ボックスに比べて、非標準タンデム型リピートＷ−ボックスに対しより低い結合を有すると考えられている。９６種の麦芽用大麦（２列の春大麦、２列の冬大麦、６列の冬大麦）のワールドパネルでは、６種のユニークなａｍｙ１＿１クラスターを見つけることができる。このパネルから、最高のα−アミラーゼ活性を有する大麦は常に、配列ＴＡＡＣＡＡＡを有するＧＡＲＥボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも３種のα−アミラーゼ遺伝子を含むａｍｙ１＿１クラスターを有する。都合の悪いことに、パネル中の試験した最高のα−アミラーゼ活性を有する大麦植物は、最大の収率ではなかった。一実施形態では、本発明は、高収率および高α−アミラーゼ活性の両方を有する大麦植物を提供する。
【００７９】
一実施形態では、大麦植物は、ａｍｙ１＿１クラスターを含み、少なくとも１つのα−アミラーゼプロモーターは、配列ＴＴＧＡＴＣを含む非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含む。例えば、大麦植物は、ａｍｙ１＿１クラスターを含み得、少なくとも１つのα−アミラーゼプロモーターは、配列ＣＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＣ（配列番号７２）を含む非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含む。特に、大麦植物は、図１１Ａで「ＨＥＮＺ−４３  ａｍｙ１＿１」として示される配列を含むα−アミラーゼプロモーターを含み得る。前記大麦植物は、例えば、ＨＥＮＺ−４３またはその子孫であり得る。例えば、大麦植物は、実施例１３Ａで記載のように特定された大麦植物またはその子孫であり得る。
【００８０】
ａｍｙ１＿２クラスターは通常、単一のα−アミラーゼ遺伝子を含む。ａｍｙ１＿２クラスターは通常、大麦ゲノム中のａｍｙ１＿１クラスターに密接に結合している。本発明によるα−アミラーゼは、ａｍｙ１＿２クラスターの遺伝子によりコードされたα−アミラーゼであり得る。例えば、α−アミラーゼは、受入番号ＡＡＡ９８６１５．１またはそれと少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの配列を有するポリペプチドであり得、前記受入番号は、ＮＣＢＩデータベースの受入番号である。α−アミラーゼはまた、受入番号ＨＯＲＶＵ６Ｈｒ１Ｇ０８０７９０．１またはそれと少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの配列を有するポリペプチドであり得、前記受入番号は、ＢＡＲＬＥＸデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ａｐｅｘ．ｉｐｋ−ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ．ｄｅ／ａｐｅｘ／ｆ？ｐ＝２８４：１０）およびＭａｓｃｈｅｒら（２０１７）に記載の受入番号である。
【００８１】
多くの場合、ａｍｙ１＿２クラスターのα−アミラーゼ遺伝子は、配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む。本発明の大麦植物は、下記を含むα−アミラーゼプロモーターを有するα−アミラーゼを含む、ａｍｙ１＿２クラスターを含み得る：
・変異導入したＧＡＲＥボックスのみ（ＧＡＲＥボックス（ＴＡＡＣＡＲＡ）のヌクレオチドの１つが置換または欠失されている）、および／または
・配列ＴＡＡＣＡＡＡを有するＧＡＲＥボックス；および／または
・非標準タンデム型リピートＷ−ボックスのみ（標準的タンデム型リピートＷ−ボックス（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）の内の１つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、例えば、前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスは本明細書で上記した非標準タンデム型リピートＷ−ボックス配列のいずれかを有し得る）。
【００８２】
ａｍｙ２クラスターは、α−アミラーゼ遺伝子の３つの発現したコピーからなり得る。これは、例えば、栽培品種Ｍｏｒｅｘの事例である。野生型大麦中では、ａｍｙ２クラスターのそれぞれのα−アミラーゼ遺伝子は、配列ＴＡＡＣＡＧＡのＧＡＲＥボックスを含み得る。
【００８３】
本発明によるα−アミラーゼは、ａｍｙ２クラスターの遺伝子によりコードされたα−アミラーゼであり得る。例えば、α−アミラーゼは、受入番号ＨＯＲＶＵ７Ｈｒ１Ｇ０９１１５０．１、ＨＯＲＶＵ７Ｈｒ１Ｇ０９１２４０．１、ＨＯＲＶＵ７Ｈｒ１Ｇ０９１２５０．３またはそれらと少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの配列を有するポリペプチドであり得、前記受入番号は、ＢＡＲＬＥＸデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ａｐｅｘ．ｉｐｋ−ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ．ｄｅ／ａｐｅｘ／ｆ？ｐ＝２８４：１０）およびＭａｓｃｈｅｒら（２０１７）に記載の受入番号である。
【００８４】
対照的に、本発明の大麦植物は、下記を含むα−アミラーゼプロモーターを有する１種または複数のα−アミラーゼ遺伝子を含む、ａｍｙ２クラスターを含み得る：
・変異導入したＧＡＲＥボックスのみ（ヌクレオチドＴＡＡＣＡＲＡの１つまたは複数が置換または欠失されている）、
・配列ＴＡＡＣＡＡＡを有するＧＡＲＥボックス、
・非標準タンデム型リピートＷ−ボックスのみ（標準的タンデム型リピートＷ−ボックス（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）の内の１つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、例えば、前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスは本明細書で上記した非標準タンデム型リピートＷ−ボックス配列のいずれかを有し得る）。
【００８５】
特に、大麦植物は、少なくとも１つのヌクレオチドが置換または欠失されている、配列ＴＴＧＡＣＴＴＧＡＣＣを含む変異導入したタンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを有する１種または複数のα−アミラーゼ遺伝子を含む、ａｍｙ２クラスターを含み得る。
【００８６】
ＨＲＴ
大麦遺伝子ＨｖＲＥＰＲＥＳＳＯＲ  ＯＦ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ（ＨｖＨＲＴ）の完全長タンパク質生成物は、一時的な発現後に、植物細胞で試験した場合、種々の異なるプロモーターに対して転写性リプレッサーとして機能する。これらのまさに人工的状況では、ＨＲＴの一時的な発現は、異なるα−アミラーゼプロモーター（Ａｍｙ２およびＡｍｙ１）の制御下ではレポーター遺伝子の発現低下に繋がるが、同様に、構成的ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター由来の発現低下にも繋がる。Ａｍｙ２プロモーターの抑制は、この系ではより強力であることが明らかになった（Ｒａｖｅｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。ＨＲＴは、いわゆる「ＧＡＲＥ（ＧＡ応答配列）ボックス」に結合し、これを遮断する。ＧＡＲＥボックスはまた、α−アミラーゼ遺伝子発現の推定アクチベーター、ＨｖＧＡＭｙｂの結合部位でもある（Ｇｕｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。
【００８７】
大麦ＨＲＴの野生型コード配列は、本明細書では配列番号１として提供される。ＨｖＨＲＴ  ＣＤＳ配列ＡＫ３６２７３４．１（栽培品種Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ）、ＡＫ２５２０４０．１（Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ）、ＨＯＲＶＵ２Ｈｒ１Ｇ０３５６３０．１（栽培品種Ｍｏｒｅｘ）、ＡＪ００１３１７．１（Ｈｉｍａｌａｙａ）、およびＩＢＳＣ２０１２（ＢＡＲＬＥＸデータベースｈｔｔｐｓ：／／ａｐｅｘ．ｉｐｋ−ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ．ｄｅ／ａｐｅｘ／ｆ？ｐ＝２８４：１０で入手可能）中のゲノムＤＮＡコンティグから誘導した、栽培品種ＢｏｗｍａｎおよびＢａｒｋｅに対する、マニュアルアセンブルした配列の複数配列アラインメントは、ＣＤＳ配列間で１００％の配列同一性を示した。野生型大麦ＨＲＴのタンパク質配列は、本明細書では配列番号２として提供される。ＨｖＨＲＴタンパク質配列ＡＫ３６２７３４．１（栽培品種Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ）、ＡＫ２５２０４０．１（Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ）、ＨＯＲＶＵ２Ｈｒ１Ｇ０３５６３０．１（栽培品種Ｍｏｒｅｘ）、ＡＪ００１３１７．１／ＣＡＡ０４６７７．１（Ｈｉｍａｌａｙａ）、およびＩＢＳＣ２０１２中のゲノムＤＮＡコンティグから誘導した、栽培品種ＢｏｗｍａｎおよびＢａｒｋｅに対する、マニュアルアセンブルおよび翻訳した配列の複数配列アラインメントは、タンパク質配列間で１００％の配列同一性を示した。ＨｖＨＲＴタンパク質は、２つの推定核局在化部位（ＮＬＳ）を含む。従って、配列番号２（Ａｒｇ２７６〜Ａｒｇ２９２）のアミノ酸２７６〜２９２、および配列番号２（Ａｒｇ５２７〜Ａｒｇ５３０）のアミノ酸５２７〜５３０は、推定ＮＬＳを構成する（Ｒａｖｅｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。さらに、ＨｖＨＲＴは、ジンクフィンガーを想起させる３つの推定ＤＮＡ結合ドメイン（本明細書ではＨＲＴｄｂとも呼ばれる）を含み、次のコンセンサス配列を含む：ＶＣＧＸ４ＤＧＸ２ＣＸ２ＣＸ３ＰＶＸ２ＲＫＲＣＸ２ＨＫＧＸＲ、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。従って、配列番号２のアミノ酸３０２〜３３１、配列番号２のアミノ酸４６３〜４９１および配列番号２のアミノ酸５０９〜５３９は、推定ＤＮＡ結合ドメインを構成する。
【００８８】
ＨＲＴ遺伝子中に変異を有する大麦植物
一実施形態では、本発明は、ＨＲＴ機能の低下に繋がる、および特にＨＲＴ機能の完全喪失に繋がるＨＲＴ遺伝子中の変異を有する大麦植物を提供する。ＨＲＴ機能の低下は、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルに基づきＨＲＴの発現レベルを測定することにより決定され得る。一実施形態では、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物中のＨｖＨＲＴ  ｍＲＮＡのレベルに比べて、大麦植物が５０％未満、好ましくは２５％未満、およびさらにより好ましくは１０％未満の変異体または野生型ＨｖＨＲＴ  ｍＲＮＡを含む場合、大麦植物はＨＲＴ機能が低下すると考えられる。野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、大麦植物が５％未満、好ましくは１％未満の変異体または野生型ＨｖＨＲＴ  ｍＲＮＡを含む場合、大麦植物はＨＲＴ機能を完全喪失すると考えられ得る。前記変異体ＨｖＨＲＴは、ｍＲＮＡコード領域に変異を有する変異導入したＨｖＨＲＴ遺伝子によりコードされたｍＲＮＡである。ＨｖＨＲＴ  ｍＲＮＡは、配列番号２またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードするＲＮＡであり、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子は、配列番号２またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードする遺伝子である。前記機能的ホモログは、好ましくは、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を共有する。一実施形態では、ＨＲＴ機能が完全喪失した大麦植物は、従来の定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定し多場合、検出可能な変異体または野生型ＨｖＨＲＴ  ｍＲＮＡを含み得ない。
【００８９】
一実施形態では、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物中のＨｖＨＲＴ  タンパク質のレベルに比べて、大麦植物が５０％未満、好ましくは２５％未満、およびさらにより好ましくは１０％未満の変異体または野生型ＨｖＨＲＴ  タンパク質を含む場合、大麦植物はＨＲＴ機能が低下すると考えられる。野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、大麦植物が５％未満、好ましくは１％未満の変異体または野生型ＨｖＨＲＴ  タンパク質を含む場合、大麦植物はＨＲＴ機能を完全喪失すると考えられ得る。前記変異体ＨｖＨＲＴタンパク質は、コード領域に変異を有する変異導入したＨｖＨＲＴ遺伝子によりコードされるポリペプチドである。ＨｖＨＲＴタンパク質は、配列番号２またはその機能的ホモログのポリペプチドであり、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子は、配列番号２またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードする遺伝子である。前記機能的ホモログは、好ましくは、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を共有する。一実施形態では、ＨＲＴ機能が完全喪失した大麦植物は、従来のウェスタンブロッティングで検出して、検出可能な変異体または野生型ＨｖＨＲＴ  タンパク質を含み得ない。
【００９０】
一実施形態では、大麦植物は、ＧＡＲＥボックスを含むプロモーターからの発現の増大が観察できると、ＨＲＴ機能が低下すると考えられる。従って、ＨＲＴ機能の低下は、Ａｍｙ２クラスター由来のα−アミラーゼプロモーターの制御下でレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を含むレポーター構築物、例えば、Ｒａｖｅｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、２３３１４ページのセクション“Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  ｉｎ  Ｏｎｉｏｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｂａｒｌｅｙ  Ａｌｅｕｒｏｎｅ  Ｃｅｌｌｓ”中に記載の構築物の一時的遺伝子導入により測定され得る。
野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を有すること以外は同じ遺伝子型である大麦植物に対する前記レポーター構築物の遺伝子導入に比べて、所与の大麦植物に対する前記レポーター構築物の遺伝子導入後に、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２５％のルシフェラーゼの増加は、ＨＲＴ機能の低下がある前記大麦植物を示す。
【００９１】
一実施形態では、大麦植物は、前記大麦植物が１つまたは複数の次のドメインを欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードするＨＲＴ遺伝子を生ずる変異を有する場合、ＨＲＴ機能の低下があると考えられる：
・ＮＬＳ１：配列番号２のＲ２７６〜Ｒ２９２
・ＮＬＳ２：配列番号２のＲ５２７〜Ｒ５３０
・ＨＲＴｄｂ１：配列番号２のＶ３０２〜Ｒ３３１
・ＨＲＴｄｂ２：配列番号２の：Ｌ４６３〜Ｅ４９１
・ＨＲＴｄｂ３：配列番号２のＶ５０９〜Ａ５３９
【００９２】
ＨＲＴ遺伝子中にＨＲＴ機能の低下に繋がる変異を有する大麦植物は、異なるタイプの変異、例えば、本明細書のこのセクションに記載のいずれかの変異を有し得る。
【００９３】
一実施形態では、大麦植物は、ＨｖＨＲＴ遺伝子のプロモーター領域中に、またはＨｖＨＲＴ遺伝子のイントロン中に、ＨｖＨＲＴ  ｍＲＮＡの異常転写および／またはＨｖＨＲＴタンパク質の異常翻訳に繋がる変異を有する。このような大麦植物は、特に、本明細書のこのセクションで上記の低減したＨｖＨＲＴ  ｍＲＮＡレベル、および／または本明細書のこのセクションで上記の低減したＨｖＨＲＴタンパク質レベルを有し得る。
【００９４】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、ＨｖＨＲＴ遺伝子の欠失を生ずる変異を有する。ＨｖＨＲＴ遺伝子のゲノム配列は、種々の大麦品種間で異なるが、コード領域は高度に保存されている。ＨｖＨＲＴ大麦遺伝子にゲノム配列の例には、ＮＣＢＩの受入番号ＩＤ＃ＡＪ００１３１７．１の配列が挙げられる。さらに、ＨｖＨＲＴ遺伝子の大部分のゲノム配列は、ｍｏｒｅｘ＿コンティグ＿３６８１８０およびｍｏｒｅｘ＿コンティグ＿１５７０２４４（栽培品種Ｍｏｒｅｘ）（ＩＢＳＣ、２０１２）で見つけることができるが、これらのコンティグは、重なり合っておらず、一部のイントロン配列が欠損している。いくつかの野生型大麦植物のＨＲＴのコード配列は、本明細書では配列番号１として提供される。
【００９５】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を生ずる変異を有する。一実施形態では、変異は、未成熟停止コドンを形成する変異であり得る。別の実施形態では、変異はＨｖＨＲＴ遺伝子のスプライス部位の変異である。前記変異は、ＨｖＨＲＴ  ｍＲＮＡの異常スプライシングに繋がり得る。
【００９６】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、少なくとも配列番号２のアミノ酸５２７〜５３０に対応するアミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を生ずる変異を有する。少なくともアミノ酸ＸＸ〜ＹＹを欠く変異体ＨｖＨＲＴは、アミノ酸ＸＸ〜ＹＹに加えてその他のアミノ酸を欠く可能性があると理解される。
【００９７】
一実施形態では、大麦植物は、少なくとも配列番号２のアミノ酸４６３〜４９１を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み得、例えば、前記変異体ＨｖＨＲＴタンパク質は、少なくとも配列番号２のアミノ酸４６３〜４９１およびアミノ酸５２７〜５３０を欠く可能性がある。
【００９８】
一実施形態では、大麦植物は、少なくとも配列番号２のアミノ酸５０９〜５３９を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み得る。
【００９９】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号２の少なくとも２１個の最Ｃ末端アミノ酸、例えば、少なくとも８５個の最Ｃ末端アミノ酸などの少なくとも３９個の最Ｃ末端アミノ酸、例えば、少なくとも１００個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み得る。例えば、大麦植物は、少なくとも配列番号２の１１８個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み得る。
【０１００】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号２の多くても５２６個のＮ末端アミノ酸、例えば、配列番号２の多くても４６２個のＮ末端アミノ酸などの配列番号２の多くても５０８個のＮ末端アミノ酸、好ましくは配列番号２の多くても４３１個のＮ末端アミノ酸を含むＨｖＨＲＴのＮ末端フラグメントを含む短縮ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み得る。
【０１０１】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、コドン１〜５２７のいずれか１つ、例えば、コドン１〜４６３のいずれか１つなどの、コドン１〜５０９のいずれか１つ、例えば、コドン１〜４３１のいずれか１つの未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み得る。例えば、大麦植物は、コドン４３１に未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み得る。コドンは、配列番号１に従って、５’末端から開始して番号を付け、３つのヌクレオチドが１つのコドンを構成する。
【０１０２】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号２のＷ４３１ｓｔｏｐ変異を有する変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む。好ましい一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号４のポリペプチドをコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む。特に、前記大麦植物は、配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド１２９３のＧ→Ａ変異を含み得る。例えば、大麦植物は、配列番号３のコード配列を含む変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み得る。
【０１０３】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号２のＷ１７０ｓｔｏｐ変異を有する変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む。例えば、大麦植物は、コドン１７０（上記で説明したように、配列番号１に関連したコドンナンバリング）に未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み得る。特に、前記大麦植物は、配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド５１０のＧ→Ａ変異を含み得る。前記大麦植物は、例えば、ＨＥＮＺ−５３またはその子孫であり得る。例えば、大麦植物は、実施例１４で記載のように特定された大麦植物またはその子孫であり得る。
【０１０４】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号２のＷ３７１ｓｔｏｐ変異を有する変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む。例えば、大麦植物は、コドン３７１（上記で説明したように、配列番号１に関連したコドンナンバリング）に未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み得る。特に、前記大麦植物は、配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド１１１３のＧ→Ａ変異を含み得る。前記大麦植物は、例えば、ＨＥＮＺ−５４またはその子孫であり得る。例えば、大麦植物は、実施例１４で記載のように特定された大麦植物またはその子孫であり得る。
【０１０５】
本特許出願においては、ブダペスト条約に基づいて、「ＨＥＮＺ−２」と命名された大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）の種子はＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ  Ｓｃｏｔｌａｎｄに寄託された。ＨＥＮＺ−２大麦植物は、２０１８年１１月１２日に寄託され、受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７０を受け取った。
【０１０６】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、２０１８年１１月１２日にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７０で寄託され、「ＨＥＮＺ−２」と呼ばれる大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）またはその子孫である。従って、本発明の大麦植物は、２０１８年１１月１２日にＮＣＩＭＢに寄託された受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７０を有する大麦植物ＨＥＮＺ−２またはその任意の子孫大麦植物であり得、子孫大麦植物は、配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド１２９３のＧ→Ａ変異を有し、および／または前記大麦植物のＨｖＨＲＴ遺伝子は、配列番号２のＷ４３１ｓｔｏｐ変異を含む変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする。
【０１０７】
ＨｖＨＢＬ１２
大麦遺伝子ＨｖＨＢＬ１２は、以前に報告されてこなかった。大麦栽培品種Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ由来のＨｖＨＢＬ１２遺伝子のコード配列は、本明細書では配列番号５として提供される。この配列によりコードされるＨｖＨＢＬ１２タンパク質の配列は、本明細書では配列番号６として提供される。追加のコード配列は、Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏから入手可能であるが、この配列は、コドン２１６に停止コドンを有する。発明者らは、これは、非機能性コピーであると考えている。ＨｖＨＢＬ１２の２つの配列は、受入番号ＡＫ３７６９５３．１およびＡＫ３６１２１２．１として、ＮＣＢＩデータベースに寄託された。この配列は、配列番号６に比較して、Ｎ１４１Ｄ、Ｍ１４２ＶおよびＥ１８４Ｄを含む種々の多型を含むタンパク質をコードする。配列番号６のポリペプチド、ならびに多型Ｎ１４１Ｄ、Ｍ１４２ＶおよびＥ１８４Ｄのいずれかを有する配列番号６のポリペプチドは、すべて、本明細書では野生型ＨｖＨＢＬ１２タンパク質と見なされる。
【０１０８】
ＨｖＨＢＬ１２遺伝子のゲノム配列は、種々の大麦品種間で異なり得る。ＨｖＨＢＬ１２大麦遺伝子のゲノム配列の例は、ｍｏｒｅｘ＿コンティグ＿５６８５５（栽培品種Ｍｏｒｅｘ）（ＩＢＳＣ、２０１２）、およびＮＣＢＩデータベース中の受入番号ＡＫ３７６９５３．１およびＡＫ３６１２１２．１（部分配列）を有する配列で見つけられる。しかし、ＮＣＢＩデータベースのコード配列の開始は、おそらく不正確である。ＨｖＨＢＬ１２遺伝子のコード配列はまた、種々の大麦品種間で幾分異なる。機能的ＨｖＨＢＬ１２遺伝子のコード配列は、配列番号５として本明細書で提供される配列、またはそれに少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する配列を有し、前記配列は、配列番号６またはそれに少なくとも９５％の配列同一性を共有する機能的ホモログのポリペプチドをコードするのが好ましい。大麦中のＨｖＨＢＬ１２遺伝子のコード配列の例には、配列番号５として本明細書で提供される配列または受入番号ＨＯＲＶＵ５Ｈｒ１Ｇ０８１０９０．１（Ｍａｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）を有する配列が挙げられる。
【０１０９】
ＨｖＨＢＬ１２タンパク質配列を用いたタンパク質配列ｂｌａｓｔは、ＨｖＨＢＬ１２がホメオボックス−ロイシンジッパータンパク質といくつかの相同性を有することを示す。
【０１１０】
配列番号６のアミノ酸２６〜７９は、推定ホメオボックスドメインを構成し、一方、配列番号６のアミノ酸８１〜１２２は、推定ホメオボックス関連ロイシンジッパーを構成する。
【０１１１】
ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する大麦植物
一実施形態では、本発明は、ＨｖＨＢＬ１２機能の低下に繋がる、および特にＨｖＨＢＬ１２機能の完全喪失に繋がるＨｖＨＢＬ１２遺伝子中の変異を有する大麦植物を提供する。ＨｖＨＢＬ１２機能の低下は、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルに基づきＨｖＨＢＬ１２の発現レベルを測定することにより決定され得る。一実施形態では、野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物中のＨｖＨＢＬ１２  ｍＲＮＡのレベルに比べて、大麦植物が５０％未満、好ましくは２５％未満、およびさらにより好ましくは１０％未満の変異体または野生型ＨｖＨＢＬ１２  ｍＲＮＡを含む場合、大麦植物はＨｖＨＢＬ１２機能が低下すると考えられる。野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、大麦植物が５％未満、好ましくは１％未満の変異体または野生型ＨｖＨＢＬ１２  ｍＲＮＡを含む場合、大麦植物はＨｖＨＢＬ１２機能を完全喪失すると考えられ得る。前記変異体ＨｖＨＢＬ１２は、ｍＲＮＡコード領域に変異を有する変異導入したＨｖＨＢＬ１２遺伝子によりコードされたｍＲＮＡである。ＨｖＨＢＬ１２  ｍＲＮＡは、配列番号６またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードするＲＮＡであり、野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子は、配列番号６またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードする遺伝子である。前記機能的ホモログは、好ましくは、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を共有する。一実施形態では、ＨｖＨＢＬ１２機能が完全喪失した大麦植物は、従来の定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合、検出可能な変異体または野生型ＨｖＨＢＬ１２  ｍＲＮＡを含み得ない。
【０１１２】
一実施形態では、野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物中のＨｖＨＢＬ１２タンパク質のレベルに比べて、大麦植物が５０％未満、好ましくは２５％未満、およびさらにより好ましくは１０％未満の変異体または野生型ＨｖＨＢＬ１２タンパク質を含む場合、大麦植物はＨｖＨＢＬ１２機能が低下すると考えられる。野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、大麦植物が５％未満、好ましくは１％未満の変異体または野生型ＨｖＨＢＬ１２タンパク質を含む場合、大麦植物はＨｖＨＢＬ１２機能を完全喪失すると考えられ得る。前記変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質は、コード領域に変異を有する変異導入したＨｖＨＢＬ１２遺伝子によりコードされるポリペプチドである。ＨｖＨＢＬ１２タンパク質は、配列番号６のポリペプチドまたはその機能的ホモログであり、野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子は、配列番号６のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードする遺伝子である。前記機能的ホモログは、好ましくは、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を共有する。一実施形態では、ＨｖＨＢＬ１２機能が完全喪失した大麦植物は、従来のウェスタンブロッティングで検出して、検出可能な変異体または野生型ＨｖＨＢＬ１２  タンパク質を含み得ない。
【０１１３】
一実施形態では、大麦植物は、前記大麦植物が１つまたは複数の次のドメインを欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードするＨｖＨＢＬ１２遺伝子を生ずる変異を有する場合、ＨｖＨＢＬ１２機能の低下があると考えられる：
・ホメオボックスドメイン：配列番号６のアミノ酸２６〜７９
・ホメオボックス関連ロイシンジッパー：配列番号６のアミノ酸８１〜１２２
・Ｃ末端部分：配列番号６のアミノ酸２２８〜２５０
【０１１４】
ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中にＨｖＨＢＬ１２機能の低下に繋がる変異を有する大麦植物は、異なるタイプの変異、例えば、本明細書のこのセクションに記載のいずれかの変異を有し得る。
【０１１５】
一実施形態では、大麦植物は、ＨｖＨＢＬ１２遺伝子のプロモーター領域中に、またはＨｖＨＢＬ１２遺伝子のイントロン中に、ＨｖＨＢＬ１２  ｍＲＮＡの異常転写および／またはＨｖＨＢＬ１２タンパク質の異常翻訳に繋がる変異を有する。このような大麦植物は、特に、本明細書のこのセクションで上記の低減したＨｖＨＢＬ１２  ｍＲＮＡレベル、および／または本明細書のこのセクションで上記の低減したＨｖＨＢＬ１２タンパク質レベルを有し得る。
【０１１６】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、ＨｖＨＢＬ１２遺伝子の欠失を生ずる変異を有する。
【０１１７】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を生ずる変異を有する。一実施形態では、変異は、未成熟停止コドンを形成する変異であり得る。別の実施形態では、変異はＨｖＨＢＬ１２遺伝子のスプライス部位の変異である。前記変異は、ＨｖＨＢＬ１２  ｍＲＮＡの異常スプライシングに繋がり得る。
【０１１８】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号６の１つまたは複数のアミノ酸またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログを欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を生ずる変異を有する。
【０１１９】
一実施形態では、大麦植物は、少なくとも次記を欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含み得る：
・配列番号６の、または多型Ｎ１４１Ｄ、Ｍ１４２ＶまたはＥ１８４Ｄの１つまたは複数を有する配列番号６のアミノ酸２６〜７９；または
・配列番号６の、または多型Ｎ１４１Ｄ、Ｍ１４２ＶまたはＥ１８４Ｄの１つまたは複数を有する配列番号６のアミノ酸８１〜１２２；または
・配列番号６の、または多型Ｎ１４１Ｄ、Ｍ１４２ＶまたはＥ１８４Ｄの１つまたは複数を有する配列番号６のアミノ酸２２８〜２５０。
【０１２０】
少なくともアミノ酸ＸＸ〜ＹＹを欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２は、アミノ酸ＸＸ〜ＹＹに加えてその他のアミノ酸を欠く可能性があると理解される。
【０１２１】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号６またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの少なくとも５個の最Ｃ末端アミノ酸、例えば、少なくとも１５個の最Ｃ末端アミノ酸などの少なくとも１０個の最Ｃ末端アミノ酸、例えば、少なくとも２０個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含み得る。例えば、大麦植物は、配列番号６またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの少なくとも２２個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含み得る。
【０１２２】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号６またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有する機能的ホモログの多くても２４５個のＮ末端アミノ酸、例えば、配列番号６またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有する機能的ホモログの多くても２３５個のＮ末端アミノ酸などの配列番号２またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有する機能的ホモログの多くても２４０個のＮ末端アミノ酸、好ましくは配列番号６またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有する機能的ホモログの多くても２２７個のＮ末端アミノ酸を含むＨｖＨＢＬ１２のＮ末端フラグメントを含む短縮ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含み得る。
【０１２３】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、コドン１〜２４５のいずれか１つ、例えば、コドン１〜２３５のいずれか１つなどの、コドン１〜２４０のいずれか１つ、例えば、コドン１〜２２８のいずれか１つの未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含み得る。例えば、大麦植物は、コドン２２８に未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含み得る。コドンは、配列番号５に従って、５’末端から開始して番号を付け、３つのヌクレオチドが１つのコドンを構成する。
【０１２４】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号６のＷ２２８ｓｔｏｐ変異を有する変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む。好ましい一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号９の、または多型Ｎ１４１Ｄ、Ｍ１４２ＶまたはＥ１８４Ｄの１つまたは複数を有する配列番号９のポリペプチドをコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む。特に、前記大麦植物は、配列番号５のＨｖＨＢＬ１２コード配列のヌクレオチド６８４のＧ→Ａ変異を含み得る。例えば、大麦植物は、配列番号８のコード配列を含む変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含み得る。
【０１２５】
このセクションで言及される配列番号６の機能的ホモログは、特に、多型Ｎ１４１Ｄ、Ｍ１４２ＶおよびＥ１８４の１つまたは複数を有する配列番号６であり得る。
【０１２６】
本特許出願においては、ブダペスト条約に基づいて、「ＨＥＮＺ−１０」と命名された大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）の種子はＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ  Ｓｃｏｔｌａｎｄに寄託された。ＨＥＮＺ−１０大麦植物は、２０１８年１１月１２日に寄託され、受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７１を受け取った。
【０１２７】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、２０１８年１１月１２日にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７１で寄託され、「ＨＥＮＺ−１０」と呼ばれる大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、またはその子孫である。従って、本発明の大麦植物は、２０１８年１１月１２日にＮＣＩＭＢに寄託された受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７１を有する大麦植物ＨＥＮＺ−１０またはその任意の子孫大麦植物であり得、大麦植物は、配列番号５のＨｖＨＢＬ１２コード配列のヌクレオチド６８４のＧ→Ａ変異を有し、および／または前記大麦植物のＨｖＨＢＬ１２遺伝子は、配列番号６のＷ２２８ｓｔｏｐ変異を含む変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする。
【０１２８】
ＨｖＷＲＫＹ３８
大麦遺伝子ＨｖＷＲＫＹ３８の完全長タンパク質生成物は、タンデム型リピートＷ−ボックスに結合することにより転写性リプレッサーとして機能すると考えられる。ＨｖＷＲＫＹ３８は、グループＩＩ  ＷＲＫＹ転写因子のメンバーであり、１つのみのＷＲＫＹドメインを含む。Ｚｏｕら（２００８）は、ＨｖＷＲＫＹ３８およびＢＰＢＦがＡｍｙ３２ｂの転写リプレッサーとして機能し得ることを示唆している。
【０１２９】
大麦ＷＲＫＹ３８の１つの野生型コード配列は、本明細書では配列番号１０として提供される。受入番号ＡＪ５３６６６７．１（栽培品種Ｉｎｇｒｉｄ）、ＡＫ３６０２６９．１（栽培品種Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ）、ＡＹ５４１５８６．１（栽培品種Ｎｕｒｅ）、ＭＬＯＣ＿６０８９０．１（栽培品種Ｍｏｒｅｘ）を有する配列および栽培品種Ｂｏｗｍａｎのコンティグ＿２４２３７６由来の配列（ＩＢＳＣ、２０１２）から得たＨｖＷＲＫＹ３８  ＣＤＳ配列の複数配列アラインメントは、配列番号１０のヌクレオチド１５９および２９２の位置の２つの多型を有するＣＤＳ配列間で極めて高い配列同一性を示した。野生型大麦ＨｖＷＲＫＹ３８のタンパク質配列は、本明細書では配列番号１１または配列番号１２として提供される。上述のゲノム配列から翻訳したＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質配列の複数配列アラインメントは、すべてのＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質が本明細書で配列番号１１または配列番号１２として示される配列を有し、アミノ酸９８がＶａｌまたはＭｅｔであり得ることを示した。これらの配列の両方は、本明細書では野生型ＨｖＷＲＫＹ３８配列と見なされる。ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質は、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２００〜２０６の位置にＷＲＫＹドメイン、配列番号１１または配列番号１２のロイシン−ジッパーモチーフ中の保存された疎水性残基Ｌｅｕ６３、Ｖａｌ７０、Ｌｅｕ７７、Ｖａｌ８４およびＬｅｕ９１ならびに配列番号１１または配列番号１２のＣｙｓ２２０、Ｃｙｓ２２６、Ｈｉｓ２５０およびＨｉｓ２５２を含む推定ジンクフィンガー様モチーフ（ＣＸ４−５ＣＸ２２−２３ＨＸ１Ｈ）を含む。
【０１３０】
ＷＲＫＹ３８遺伝子のゲノム配列は、種々の大麦品種間で異なり得る。ＷＲＫＹ３８大麦遺伝子のゲノム配列の例は、ＮＣＢＩデータベースの受入番号ＡＹ５４１５８６．１ならびにＢＡＲＬＥＸデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ａｐｅｘ．ｉｐｋ−ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ．ｄｅ／ａｐｅｘ／ｆ？ｐ＝２８４：１０）から入手可能な、ｍｏｒｅｘ＿コンティグ＿４４８７７（栽培品種Ｍｏｒｅｘ）（ＩＢＳＣ、２０１２）、およびｂｏｗｍａｎ＿コンティグ＿２４２３７６（栽培品種Ｂｏｗｍａｎ）である。
【０１３１】
ＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有する大麦植物
一実施形態では、本発明は、ＨｖＷＲＫＹ３８機能の低下に繋がる、および特にＨｖＷＲＫＹ３８機能の完全喪失に繋がるＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子中の変異を有する大麦植物を提供する。ＨｖＷＲＫＹ３８機能の低下は、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルに基づきＨｖＷＲＫＹ３８の発現レベルを測定することにより決定され得る。一実施形態では、野生型ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物中のＨｖＷＲＫＹ３８  ｍＲＮＡのレベルに比べて、大麦植物が５０％未満、好ましくは２５％未満、およびさらにより好ましくは１０％未満の変異体または野生型ＨｖＷＲＫＹ３８  ｍＲＮＡを含む場合、大麦植物はＨｖＷＲＫＹ３８機能が低下すると考えられる。野生型ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、大麦植物が５％未満、好ましくは１％未満の変異体または野生型ＨｖＷＲＫＹ３８  ｍＲＮＡを含む場合、大麦植物はＨｖＷＲＫＹ３８機能を完全喪失すると考えられ得る。前記変異体ＨｖＷＲＫＹ３８は、ｍＲＮＡコード領域に変異を有する変異導入したＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子によりコードされたｍＲＮＡである。ＨｖＷＲＫＹ３８  ｍＲＮＡは、配列番号１１もしくは配列番号１２またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードするＲＮＡであり、野生型ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子は、配列番号１１もしくは配列番号１２またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードする遺伝子である。前記機能的ホモログは、好ましくは、配列番号１１もしくは配列番号１２と少なくとも９５％の配列同一性を共有する。 一実施形態では、ＨｖＷＲＫＹ３８機能が完全喪失した大麦植物は、従来の定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合、検出可能な変異体または野生型ＨｖＷＲＫＹ３８  ｍＲＮＡを含み得ない。
【０１３２】
一実施形態では、野生型ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物中のＨｖＷＲＫＹ３８  タンパク質のレベルに比べて、大麦植物が５０％未満、好ましくは２５％未満、およびさらにより好ましくは１０％未満の変異体または野生型ＨｖＷＲＫＹ３８  タンパク質を含む場合、大麦植物はＨｖＷＲＫＹ３８機能が低下すると考えられる。野生型ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、大麦植物が５％未満、好ましくは１％未満の変異体または野生型ＨｖＷＲＫＹ３８  タンパク質を含む場合、大麦植物はＨｖＷＲＫＹ３８機能を完全喪失すると考えられ得る。前記変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質は、コード領域に変異を有する変異導入したＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子によりコードされるポリペプチドである。ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質は、配列番号１１もしくは配列番号１２またはその機能的ホモログのポリペプチドであり、野生型ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子は、配列番号１１もしくは配列番号１２またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードする遺伝子である。前記機能的ホモログは、好ましくは、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも９５％の配列同一性を共有する。一実施形態では、ＨｖＷＲＫＹ３８機能が完全喪失した大麦植物は、従来のウェスタンブロッティングで検出して、検出可能な変異体または野生型ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質を含み得ない。
【０１３３】
一実施形態では、大麦植物は、タンデム型リピートＷ−ボックスを含むプロモーターからの発現の増大が観察できると、ＨｖＷＲＫＹ３８機能が低下すると考えられる。従って、ＨｖＷＲＫＹ３８機能の低下は、例えば、ａｍｙ２−１遺伝子由来のα−アミラーゼプロモーターの制御下でレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を含むレポーター構築物の一時的遺伝子導入により測定され得る。このような構築物は、Ｒａｖｅｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、２３３１４ページのセクション“Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  ｉｎ  Ｏｎｉｏｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｂａｒｌｅｙ  Ａｌｅｕｒｏｎｅ  Ｃｅｌｌｓ”中に記載の構築物と同様にして作製され得る。野生型ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を有すること以外は同じ遺伝子型である大麦植物に対する前記レポーター構築物の遺伝子導入に比べて、所与の大麦植物に対する前記レポーター構築物の遺伝子導入後に、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２５％のルシフェラーゼの増加は、ＨｖＷＲＫＹ３８機能の低下がある前記大麦植物を示す。
【０１３４】
一実施形態では、大麦植物は、前記大麦植物が１つまたは複数の次のドメインを欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードするＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を生ずる変異を有する場合、ＨｖＷＲＫＹ３８機能の低下があると考えられる：
・配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２００〜２０６
・配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸６３（Ｌｅｕ）
・配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸７０（Ｖａｌ）
・配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸７７（Ｌｅｕ）
・配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸８４（Ｖａｌ）
・配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸９１（Ｌｅｕ）
・配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２２０（Ｃｙｓ）
・配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２２６（Ｃｙｓ）
・配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２５０（Ｈｉｓ）
・配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２５２（Ｈｉｓ）
【０１３５】
ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子中にＨｖＷＲＫＹ３８機能の低下に繋がる変異を有する大麦植物は、異なるタイプの変異、例えば、本明細書のこのセクションに記載のいずれかの変異を有し得る。
【０１３６】
一実施形態では、大麦植物は、ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子のプロモーター領域中に、またはＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子のイントロン中に、ＨｖＷＲＫＹ３８  ｍＲＮＡの異常転写および／またはＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質の異常翻訳に繋がる変異を有する。このような大麦植物は、特に、本明細書のこのセクションで上記の低減したＨｖＷＲＫＹ３８  ｍＲＮＡレベル、および／または本明細書のこのセクションで上記の低減したＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質レベルを有し得る。
【０１３７】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子の欠失を生ずる変異を有する。
【０１３８】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を生ずる変異を有する。一実施形態では、変異は、未成熟停止コドンを形成する変異であり得る。別の実施形態では、変異はＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子のスプライス部位の変異である。前記変異は、ＨｖＷＲＫＹ３８  ｍＲＮＡの異常スプライシングに繋がり得る。
【０１３９】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２００〜２０６、２２０、２２６、２５０および／または２５２に対応する少なくとも１つのアミノ酸を欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を生ずる変異を有する。少なくともアミノ酸ＸＸ〜ＹＹを欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８は、アミノ酸ＸＸ〜ＹＹに加えてその他のアミノ酸を欠く可能性があると理解される。
【０１４０】
一実施形態では、大麦植物は、少なくとも配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２００〜２０６を欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含み得る。一実施形態では、大麦植物は、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２２０、２２６、２５０および／または２５２の少なくとも１つを欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含み得る。
【０１４１】
一実施形態では、大麦植物は、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸６３、７０、７７、８４および／または９１の少なくとも１つを欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含み得る。
【０１４２】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１０２個の最Ｃ末端アミノ酸、例えば、少なくとも１２８個の最Ｃ末端アミノ酸などの少なくとも１０４個の最Ｃ末端アミノ酸、例えば、少なくとも１３４個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含み得る。例えば、大麦植物は、少なくとも配列番号１１または配列番号１２の１５４個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含み得る。
【０１４３】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号１１または配列番号１２の多くても２５１個のＮ末端アミノ酸、例えば、配列番号１１または配列番号１２の多くても２２５個のＮ末端アミノ酸などの配列番号１１または配列番号１２の多くても２４９個のＮ末端アミノ酸、例えば、配列番号１１または配列番号１２の多くても２１９個のＮ末端アミノ酸、好ましくは配列番号１１または配列番号１２の多くても１９９個のＮ末端アミノ酸を含むＨｖＷＲＫＹ３８のＮ末端フラグメントを含む短縮ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含み得る。
【０１４４】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、コドン１〜２５２のいずれか１つ、例えば、コドン１〜２２６のいずれか１つなどの、コドン１〜２５０のいずれか１つ、例えば、コドン１〜２２０のいずれか１つ、好ましくはコドン１〜２００のいずれか１つの未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含み得る。例えば、大麦植物は、コドン２００に未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含み得る。コドンは、配列番号１０に従って、５’末端から開始して番号を付け、３つのヌクレオチドが１つのコドンを構成する。
【０１４５】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、配列番号１１または配列番号１２のＷ２００ｓｔｏｐ変異を有する変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む。好ましい一実施形態では、本発明の大麦植物は、アミノ酸９８がＭｅｔである配列番号１４または配列番号１４のポリペプチドをコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む。特に、前記大麦植物は、配列番号１０のＨｖＷＲＫＹ３８コード配列のヌクレオチド６００のＧ→Ａ変異を含み得る。例えば、大麦植物は、配列番号１３のコード配列を含む変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含み得る。
【０１４６】
大麦植物
本発明によるＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中に変異を有する大麦植物は、任意の育種系統または栽培品種または変種を含む、種Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）の任意の植物であり得る。
【０１４７】
「野生大麦」であるＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ亜種のホルデウム・スポンタネウムは、大麦の今日の栽培品種の祖先と考えられる。培養植物化しているが、大麦の不均一な混合物は、大麦在来種と呼ばれる。今日では、ほとんどの在来種は、先進農業では純系栽培品種により置き換えられている。在来種と比較して、最近の大麦栽培品種は、多くの改善された特性を有する（Ｎｅｖｏ，１９９２；Ｐｅｌｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【０１４８】
本発明中では、用語「大麦植物」は、大麦在来種または最近の大麦栽培品種などの大麦植物を含む。従って、本発明は、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異、例えば、本明細書で記載のいずれかの変異、を含む任意の大麦植物に関する。
【０１４９】
しかし、本発明での使用のために好ましい大麦植物は、最近の大麦栽培品種または純系である。本発明で使用され得る大麦栽培品種は、例えば、Ｐａｕｓｔｉａｎ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｑｕｅｎｃｈ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｋｌａｇｅｓ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｌｅｎｈｅｉｍ、Ａｒｉｅｌ、Ｌｅｎｋａ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｓｔｅｆｆｉ、Ｇｉｍｐｅｌ、Ｃｈｅｒｉ、Ｋｒｏｎａ、Ｃａｍａｒｇｕｅ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｅｒｋａｄｏ、Ｐｒｉｓｍａ、Ｕｎｉｏｎ、Ｂｅｋａ、Ｋｙｍ、Ａｓａｈｉ  ５、ＫＯＵ  Ａ、Ｓｗａｎ  Ｈａｌｓ、Ｋａｎｔｏ  Ｎａｋａｔｅ  Ｇｏｌｄ、Ｈａｋａｔａ  Ｎｏ．２、Ｋｉｒｉｎ−ｃｈｏｋｕ  Ｎｏ．１、Ｋａｎｔｏ  ｌａｔｅ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｇｏｌｄ、Ｆｕｊｉ  Ｎｉｊｏ、Ｎｅｗ  Ｇｏｌｄｅｎ、Ｓａｔｕｋｉｏ  Ｎｉｊｏ、Ｓｅｉｊｏ  Ｎｏ．１７、Ａｋａｇｉ  Ｎｉｊｏ、Ａｚｕｍａ  Ｇｏｌｄｅｎ、Ａｍａｇｉ  Ｎｉｊｐｏ、Ｎｉｓｈｉｎｏ  Ｇｏｌｄ、Ｍｉｓａｔｏ  ｇｏｌｄｅｎ、Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、ＲｏｓａｌｉｎａおよびＪｅｒｓｅｙからなる群より選択され、好ましくは、Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｑｕｅｎｃｈ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、ＮｅｒｕｄａおよびＰｏｗｅｒからなる群より選択され、好ましくは、Ｐａｕｓｔｉａｎ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｋｌａｇｅｓ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｌｅｎｈｅｉｍ、Ａｒｉｅｌ、Ｌｅｎｋａ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｓｔｅｆｆｉ、Ｇｉｍｐｅｌ、Ｃｈｅｒｉ、Ｋｒｏｎａ、Ｃａｍａｒｇｕｅ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｅｒｋａｄｏ、Ｐｒｉｓｍａ、Ｕｎｉｏｎ、Ｂｅｋａ、Ｋｙｍ、Ａｓａｈｉ  ５、ＫＯＵ  Ａ、Ｓｗａｎ  Ｈａｌｓ、Ｋａｎｔｏ  Ｎａｋａｔｅ  Ｇｏｌｄ、Ｈａｋａｔａ  Ｎｏ．２、Ｋｉｒｉｎ−ｃｈｏｋｕ  Ｎｏ．１、Ｋａｎｔｏ  ｌａｔｅ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｇｏｌｄ、Ｆｕｊｉ  Ｎｉｊｏ、Ｎｅｗ  Ｇｏｌｄｅｎ、Ｓａｔｕｋｉｏ  Ｎｉｊｏ、Ｓｅｉｊｏ  Ｎｏ．１７、Ａｋａｇｉ  Ｎｉｊｏ、Ａｚｕｍａ  Ｇｏｌｄｅｎ、Ａｍａｇｉ  Ｎｉｊｐｏ、Ｎｉｓｈｉｎｏ  Ｇｏｌｄ、Ｍｉｓａｔｏ  ｇｏｌｄｅｎ、Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ、ＳｃａｒｌｅｔｔおよびＪｅｒｓｅｙからなる群より選択され、好ましくは、Ｐａｕｓｔｉａｎ、Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｔａｎｇｅｎｔ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｐｏｗｅｒ、Ｑｕｅｎｃｈ、ＮＦＣ  Ｔｉｐｐｌｅ、Ｂａｒｋｅ、Ｃｌａｓｓ、Ｖｉｎｔａｇｅ、Ａｐｐｌａｕｓ、Ｂｏｗｉｅ、Ｂｒｏａｄｗａｙ、Ｃｈａｍｐ、Ｃｈａｎｓｏｎ、Ｃｈａｒｌｅｓ、Ｃｈｉｍｂｏｎ、Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔａｎ、Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｄｒａｇｏｏｎ、Ｅｌｌｉｎｏｒ、Ｅｍｂｒａｃｅ、Ｅｔｏｉｌｅ、Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ、Ｆｌａｉｒ、Ｈｉｇｈｗａｙ、ＫＷＳ  Ｂｅｃｋｉｅ、ＫＷＳ  Ｃａｎｔｔｏｎ、ＫＷＳ  Ｃｏｒａｌｉｅ、ＫＷＳ  Ｆａｎｔｅｘ、ＫＷＳ  Ｉｒｉｎａ、ＫＷＳ  Ｊｏｓｉｅ、ＫＷＳ  ��ｅｌｌｉｅ、ＬＧ  Ｄｉａｂｌｏ、ＬＧ  Ｆｉｇａｒｏ、ＬＧ  Ｎａｂｕｃｏ、ＬＧ  Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｌａｕｒｅａｔｅ、Ｌａｕｒｉｋｋａ、Ｌａｕｘａｎａ、Ｌｕｔｈｅｒ、Ｏｄｙｓｓｅｙ、Ｏｖａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＲＧＴ  Ｅｌｙｓｉｕｍ、ＲＧＴ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ、ＲＧＴ  Ｐｌａｎｅｔ、Ｒｏｔａｔｏｒ、Ｓａｒｂｉ、Ｓｃｈｏｌａｒ、ＳｕｂｗａｙおよびＧｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅからなる群より選択され得る。
【０１５０】
大麦植物は、任意の好適な形態であり得る。例えば、本発明による大麦植物は、生存可能大麦植物、乾燥植物、ホモジナイズした植物、または粉砕大麦穀粒であり得る。植物は、成熟植物、胚芽、穀粒、発芽穀粒、麦芽化穀粒（例えば、緑麦芽またはキルン乾燥麦芽の形態の）、粉砕麦芽化穀粒、粉砕穀粒、などであり得る。
【０１５１】
大麦植物の部分は、穀粒、胚芽、葉、茎、根、花、またはそれらの一部などの任意の好適な部分であり得る。一部は、例えば、穀粒、胚芽、葉、茎、根、花、の断片であり得る。大麦植物の部分はまた、ホモジネートの一部、または粉砕大麦植物または穀粒の一部であり得る。
【０１５２】
本発明の一実施形態では、大麦植物の部分は、前記大麦植物の、組織培養物中にインビトロで増殖され得る生存細胞などの細胞であり得る。しかし、他の実施形態では、大麦植物の部分は、全体大麦植物に成熟できない生存細胞、すなわち、生殖物質ではない細胞であり得る。
【０１５３】
本発明の大麦植物の特性
本発明は、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異を有する大麦植物を提供する。このような大麦植物の１つの大きな利点は、α−アミラーゼ活性の増大である。特に、前記大麦植物は、発芽中の早期に穀粒中のα−アミラーゼ活性の増加があり得る。
【０１５４】
大麦植物のα−アミラーゼ活性は、厳密に調節される。発芽中、α−アミラーゼ活性は、デンプンの糖への変換に役立つ。しかし、植物成長中の他の時点では、例えば、登熟中、α−アミラーゼ活性は望ましくない。理由は、それが遅い登熟、低下したデンプン含量、萎びた穀粒および／または穂発芽をもたらし得るためである。
【０１５５】
しかし、本発明の大麦植物は、野生型大麦と同等の農業品質などの良好な農業品質を有することをさらに特徴とするのが好ましい。従って、例えば、大麦植物が、例えば、栽培品種Ｐｌａｎｅｔなどの高収率の最新の栽培品種の収率と同等の収率を有することが好ましいであろう。
【０１５６】
従って、発芽中の高められたα−アミラーゼ活性を有するが、それでも、良好な植物の適応度を有する、大麦植物を提供することは本発明の一態様である。
【０１５７】
特に、本明細書で記載の変異を有する本発明の大麦植物は、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の収率の少なくとも９０％の収率を有し得る。ＨｖＨＲＴ遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の収率の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の収率を有し得る。ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の収率の少なくとも９０％の収率を有し得る。
【０１５８】
従って、本発明による大麦植物は、少なくとも４０ｇなどの少なくとも３８ｇの１０００穀粒重量（ＴＫＷ）を有し得る。特に、本明細書で記載のいずれかの変異を有する本発明の大麦植物は、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のＴＫＷの少なくとも９０％のＴＫＷを有し得る。ＨｖＨＲＴ遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のＴＫＷの少なくとも９５％などの少なくとも９０％のＴＫＷを有し得る。ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のＴＫＷの少なくとも９５％などの少なくとも９０％のＴＫＷを有し得る。
【０１５９】
本発明による大麦植物は、少なくとも６０％ｗ／ｗなどの少なくとも５５％ｗ／ｗのデンプン含量を有し得る。パーセンテージは、総穀物乾燥重量に対する乾燥デンプン重量％として提供される。特に、本明細書で記載のいずれかの変異を有する本発明の大麦植物は、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のデンプン含量の少なくとも９０％のデンプン含量を有し得る。ＨｖＨＲＴ遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のデンプン含量の少なくとも９５％などの少なくとも９０％のデンプン含量を有し得る。ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のデンプン含量の少なくとも９５％などの少なくとも９０％のデンプン含量を有し得る。
【０１６０】
本発明による大麦植物は、少なくとも９．５％ｗ／ｗのタンパク質含量を有し得る。パーセンテージは、総穀物乾燥重量に対する乾燥タンパク質重量％として提供される。特に、本明細書で記載のいずれかの変異を有する本発明の大麦植物は、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のタンパク質含量の少なくとも９０％のタンパク質含量を有し得る。ＨｖＨＲＴ遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のタンパク質含量の少なくとも９５％などの少なくとも９０％のタンパク質含量を有し得る。ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のタンパク質含量の少なくとも９５％などの少なくとも９０％のタンパク質含量を有し得る。
【０１６１】
本明細書で記載のいずれかの変異を有する本発明の大麦植物は、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の高さの少なくとも９０％の高さを有し得る。ＨｖＨＲＴ遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の高さの少なくとも９５％などの少なくとも９０％の高さを有し得る。ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の高さの少なくとも９５％などの少なくとも９０％の高さを有し得る。
【０１６２】
大麦植物中のジベレリン酸のレベルの低減は、より大きい数の穂と関連していると記述されてきた。従って、大麦変異体ｓｄｗ１／ｄｅｎｓｏは、低減したＧＡ生合成遺伝子発現を有し、面積当たり増大した数の穂を有する（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。従って、増大したＧＡレベルの大麦植物は、穂の数が減少するというリスクがある。しかし、本発明の大麦植物は、好ましくは、野生型大麦植物とほぼ同じ数の穂を有する。従って、本明細書で記載のいずれかの変異を有する本発明の大麦植物は、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の穂の数／ｍ２の少なくとも９０％の穂の数／ｍ２を有し得る。ＨｖＨＲＴ遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の穂の数／ｍ２の少なくとも９５％などの少なくとも９０％の穂の数／ｍ２を有し得る。ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する本発明の大麦植物は、例えば、野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の穂の数／ｍ２の少なくとも９５％などの少なくとも９０％の穂の数／ｍ２を有し得る。
【０１６３】
本明細書で記載のいずれかの変異を有する本発明による大麦植物は、好ましくは、穂発芽を起こさない。特に、規則的な水の噴霧を２０日間受けた本発明の大麦植物から収穫した穀粒の発芽比率は、前記噴霧を受けず、成熟時に収穫された同じ種類の大麦植物の発芽比率と同じまたはそれより大きい。特に、本明細書の下記実施例３Ｂで記載のように測定した場合、本発明による大麦植物は、好ましくは、穂発芽を起こさない。
【０１６４】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、発芽の開始の４８時間後、少なくとも１６Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有する。
【０１６５】
一実施形態では、９Ｌ／ｈの空気流量下で水中浸漬の間に前記大麦植物が発芽した場合、本発明の大麦植物は、発芽の開始の４８時間後少なくとも４Ｕ／ｇ、および／または発芽の開始の７２時間後少なくとも７Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有する。これは、例えば、ＨｖＨＲＴ遺伝子中に変異を有する大麦植物の場合に該当する。
【０１６６】
一実施形態では、９Ｌ／ｈの空気流量下で水中浸漬の間に前記大麦植物が発芽した場合、本発明の大麦植物は、発芽の開始の４８時間後少なくとも１５Ｕ／ｇ、および／または発芽の開始の７２時間後少なくとも２０Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有する。これは、例えば、ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する大麦植物の場合に該当する。
【０１６７】
一実施形態では、空気流量のない水中浸漬の間に前記大麦植物が発芽した場合、本発明の大麦植物は、発芽の開始の７２時間後少なくとも６Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有する。これは、例えば、ＨｖＨＲＴ遺伝子中に変異を有する大麦植物の場合に該当する。
【０１６８】
一実施形態では、空気流量のない水中浸漬の間に前記大麦植物が発芽した場合、本発明の大麦植物は、発芽の開始の４８時間後に少なくとも４Ｕ／ｇの、および／または発芽の開始の７２時間後に少なくとも１４Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有する。これは、例えば、ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する大麦植物の場合、または少なくとも４種の、非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含むα−アミラーゼ遺伝子を有する大麦植物の場合に該当する。
【０１６９】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、発芽の開始の４８時間後、前記変異を有さないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のα−アミラーゼ活性の少なくとも１１０％などの少なくとも１０５％、例えば、少なくとも１２０％のα−アミラーゼ活性を有する。
【０１７０】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、発芽の開始の７２時間後、前記変異を有さないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のα−アミラーゼ活性の少なくとも１５０％などの少なくとも１２０％、例えば、少なくとも１７０％のα−アミラーゼ活性を有する。これは、特に、本明細書で記載のいずれかの変異などのＨｖＨＲＴ中に変異を有する大麦植物の場合に該当する。
【０１７１】
一実施形態では、通気なしで水中浸漬の間に発芽した場合、本発明の大麦植物は、発芽の開始の７２時間後、前記変異を有さないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のα−アミラーゼ活性の少なくとも１２０％、例えば、少なくとも１７０％などの少なくとも１５０％のα−アミラーゼ活性を有する。これは、特に、本明細書で記載のいずれかの変異などのＨｖＨＢＬ１２中に変異を有する大麦植物の場合に該当する。
【０１７２】
一実施形態では、通気なしで水中浸漬の間に発芽した場合、本発明の大麦植物は、発芽の開始の７２時間後、前記変異を有さないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のα−アミラーゼ活性の少なくとも２００％などの少なくとも１５０％、例えば、少なくとも３００％のα−アミラーゼ活性を有する。これは、特に、本明細書で記載のこれらのいずれかなどの、非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有する大麦植物の場合に該当する。
【０１７３】
一実施形態では、本発明の大麦植物は裸麦植物であり、前記大麦植物は、発芽の開始の４８時間後、少なくとも１５０Ｕ／ｇなどの少なくとも１４０Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも１７０Ｕ／ｇなどの少なくとも１６０Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有する。一実施形態では、大麦植物は裸麦植物であり、前記大麦植物は、発芽の開始の４８時間後、少なくとも１１０Ｕ／ｇなどの少なくとも１００Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有する。
【０１７４】
一実施形態では、大麦植物は裸麦植物であり、発芽の開始の４８時間後、少なくとも３５ｍＵ／ｇなどの少なくとも３０ｍＵ／ｇ、例えば、少なくとも４０ｍＵ／ｇの限界デキストリナーゼを有する。一実施形態では、本発明の大麦植物は、発芽の開始の４８時間後、少なくとも２０ｍＵ／ｇの限界デキストリナーゼ活性を有する。
【０１７５】
一実施形態では、大麦植物は皮麦植物であり、これは、発芽の開始の４８時間後、少なくとも１５０Ｕ／ｇなどの少なくとも１４０Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも１７０Ｕ／ｇなどの少なくとも１６０Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有するが、ただし、発芽の開始の前に大麦穀粒から少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である。一実施形態では、大麦植物は皮麦植物であり、これは、発芽の開始の４８時間後、少なくとも１１０Ｕ／ｇなどの少なくとも１００Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有するが、ただし、発芽の開始の前に大麦穀粒から少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である。一実施形態では、大麦植物は皮麦植物であり、これは、発芽の開始の４８時間後、少なくとも３５ｍＵ／ｇなどの少なくとも３０ｍＵ／ｇ、例えば、少なくとも４０ｍＵ／ｇの限界デキストリナーゼ活性を有するが、ただし、発芽の開始の前に大麦穀粒から少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である。一実施形態では、大麦植物は皮麦植物であり、これは、少なくとも２０ｍＵ／ｇの限界デキストリナーゼ活性を有するが、ただし、発芽の開始の前に大麦穀粒から少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である。例えば、前記外皮は、機械的処理により取り除かれ得る。前記外皮は、少なくとも３％などの少なくとも２％、例えば、３〜６％の範囲の大麦穀粒の総重量の減少が生じるように、機械的処理により取り除かれ得る。
【０１７６】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、応力条件下で発芽が改善され得る。従って、一実施形態では、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％の前記大麦植物の穀粒が、高水条件下で、例えば、実施例３Ｃで記載のように測定した場合、発芽する。
【０１７７】
２つ以上の変異を含む大麦植物
本発明は、２つ以上の変異を含む大麦植物を提供する。従って、本発明の大麦植物は、１つまたは複数の次の変異を含み得る：
・１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「α−アミラーゼプロモーター中に変異を有するα−アミラーゼおよび大麦植物」で記載のいずれかの変異、
・ＨｖＨＲＴ遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「ＨＲＴ遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異、
・ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異、
・ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「ＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異。
【０１７８】
本明細書で記載の変異に加えて、大麦植物はまた、１つまたは複数のさらなる変異も含み得る。従って、大麦植物は、１つまたは複数の次の変異を含み得る。
上記した１つまたは複数の変異に加えて、大麦植物は、機能的ＬＯＸ−１の完全喪失をもたらすＬＯＸ−１コード遺伝子中の変異も含み得る。
前記変異は、例えば、国際公開第２００５／０８７９３４号に記載のいずれかの変異であり得る。例えば、大麦植物は、未成熟停止コドンを含むＬＯＸ−１をコードする遺伝子を含み得、前記コドンは、国際公開第２００５／０８７９３４号の配列番号２の塩基番号３５７２〜３５７４またはスプライス部位変異に対応し、前記変異は、国際公開第２００５／０８７９３４号の配列番号２の塩基番号２３１１に対応する。
【０１７９】
上記した１つまたは複数の変異に加えて、大麦植物は、機能的ＬＯＸ−２の完全喪失をもたらすＬＯＸ−２コード遺伝子中の変異も含み得る。前記変異は、例えば、国際公開第２０１０／０７５８６０号に記載のいずれかの変異であり得る。例えば、大麦植物は、国際公開第２０１０／０７５８６０号の配列番号１のヌクレオチド位置２６８９に、未成熟停止コドンの形成をもたらす変異を含むＬＯＸ−２コード遺伝子を含み得る。
【０１８０】
上記した１つまたは複数の変異に加えて、大麦植物は、機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらすＭＭＴコード遺伝子中の変異も含み得る。前記変異は、例えば、国際公開第２０１０／０６３２８８号に記載のいずれかの変異であり得る。例えば、大麦植物は、国際公開第２０１０／０６３２８８号の配列番号３の塩基番号３０７６のＧ→Ａ変異を含むＭＭＴコード遺伝子または国際公開第２０１０／０６３２８８号の配列番号１６の塩基番号１４６２のＧ→Ａ変異を含むＭＭＴコード遺伝子を含み得る。
【０１８１】
上記した１つまたは複数の変異に加えて、大麦植物は、ＣｓｌＦ６コード遺伝子中にも変異を含み得、前記変異遺伝子は、ＣｓｌＦ６活性が低減した変異体ＣｓｌＦ６タンパク質をコードする。前記変異は、例えば、本出願と同じ出願者に譲渡され、同じ出願日を有する「Ｃｅｒｅａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」と題する同時係属出願に記載のいずれかの変異であり得る。例えば、大麦植物は、前記同時係属出願の配列番号１または配列番号３のＧ８４７Ｅ変異またはＧ７４８Ｄ変異またはＴ７０９Ｉ変異を含む変異体ＣｓｌＦ６をコードするＣｓｌＦ６コード遺伝子を含み得る。前記同時係属出願の配列番号１は、ジェンバンク受入番号ＮＣＢＩ：ＥＵ２６７１８１．１を有する。
【０１８２】
植物生成物
本発明は、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異を有する大麦植物から作製された植物生成物に関する。
【０１８３】
植物生成物は、大麦植物から作製された任意の産物、例えば、食品、飼料または飲料であり得る。従って、植物生成物は、本明細書の下記セクション「飲料およびその製造方法」で記載のいずれかの飲料であり得る。植物生成物はまた、大麦植物の水性抽出物および／または前記大麦植物の穀粒から作製された麦芽であり得、例えば、植物生成物は麦汁であり得る。前記水性抽出物は、例えば、本明細書の下記セクション「水性抽出物およびその製造方法」で記載のように作製され得る。
【０１８４】
一実施形態では、植物生成物は麦芽、例えば、本明細書の下記セクション「緑麦芽、麦芽およびその製造製方法」で記載のいずれかの麦芽などの緑麦芽またはキルン乾燥麦芽、または麦芽ベース飲料などの麦芽ベース産物であり得る。緑麦芽および／またはキルン乾燥麦芽の主要用途は飲料製造用であるが、これは、その他の産業工程でも、例えば、製パン工業で酵素源として、または食品産業で香味剤および着色剤として、例えば、麦芽または麦芽粉末で、または麦芽シロップとして間接的に、等々に使用できる。従って、本発明による植物生成物は、いずれかの上述の産物であり得る。
【０１８５】
別の態様では、本発明による植物生成物は、大麦シロップ、または大麦麦芽シロップなどのシロップを含む、あるいは、これからなる。植物生成物はまた、大麦または麦芽の抽出物であり得る。従って、植物生成物は麦汁であり得る。
【０１８６】
緑麦芽、キルン乾燥麦芽およびその製造方法
本発明は、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異を有する大麦植物から作製された麦芽も提供する。前記麦芽は、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異を有する大麦植物から作製された緑麦芽またはキルン乾燥麦芽であり得る。前記変異は、本明細書で上記のいずれかの変異であり得る。
【０１８７】
緑麦芽は、麦芽製造、すなわち、穀物粒の制御された環境条件下での発芽により作製され得る。通常、前記発芽は、大麦穀粒の浸麦ステップとこれに続く発芽ステップを含み得る。浸麦および発芽はまた、同時にまたは一部を同時に実施することも可能である。いくつかの実施形態では、麦芽の製造は、発芽穀粒の乾燥ステップを含み得る。前記乾燥ステップは、好ましくは、発芽穀粒の高温でのキルン乾燥であり得る。従って、キルン乾燥麦芽は、緑麦芽をキルン乾燥ステップに供すことにより作製され得る。
【０１８８】
従って、一実施形態では、麦芽製造方法は、下記ステップを含み得る：
（ａ）大麦植物、特に、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有する大麦植物の穀粒を用意するステップ；
（ｂ）前記大麦穀粒を浸麦するステップ；
（ｂ）前記大麦穀粒を発芽させるステップ；および
（ｃ）前記発芽亜大麦穀粒を、好ましくはキルン乾燥により乾燥するステップ。
【０１８９】
発芽大麦粒は、次のステップを含む方法によって作製され得る：
（ａ）大麦植物、特に、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有する大麦植物の穀粒を用意するステップ；
（ｂ）前記大麦穀粒を浸麦するステップ；
（ｂ）前記大麦穀粒を発芽させるステップ。
【０１９０】
浸麦および発芽ステップは、逐次に、同時にまたは一部を同時に実施することも可能である。
【０１９１】
好ましい一実施形態では、浸麦および発芽は発芽工程で同時に実施され、この工程は通常、通気下で大麦粒を水溶液中、多くても７２時間インキュベーションすることを含む。
【０１９２】
浸麦は、当業者に既知の任意の従来法により実施され得る。１つの非限定例には、乾湿交互条件下、１０〜２５℃の範囲の温度での浸麦を含む。浸麦中、例えば、大麦穀粒は、湿潤下、３０分〜３時間の範囲、続けて、乾燥下で３０分〜３時間の範囲でインキュベーションされ、任意選択で、２〜５時間の範囲の前記インキュベーションスキームが反復され得る。浸麦後の最終含水量は、例えば、４０〜５０％の範囲、例えば、４０〜４５％の範囲であり得る。
【０１９３】
本発明により提供される大麦植物は、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異を有することを特徴とする。このような大麦植物の１つの大きな利点は、発芽中のα−アミラーゼおよび限界デキストリナーゼなどの加水分解酵素の活性の増大である。これらの大麦植物の穀粒は、有利にも、短い発芽工程で発芽され得る。理由は、麦芽製造の１つの目的が効率的な加水分解酵素活性の誘導であるためである。興味深いことに、本発明の大麦植物は、発芽中の早期に短い発芽工程の使用を可能とする加水分解酵素活性レベルを有する。
【０１９４】
有用な短い発芽工程の例は、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４９８号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。有用な短い発芽工程の一例は、通常、通気下で大麦粒が水溶液中でインキュベーションされるステップを含む発芽工程で、全体発芽工程は長くても７２時間で実施される。
【０１９５】
上述のように、発芽は、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有する大麦植物の穀粒を通気下の水溶液中でインキュベーションするステップを含み得る。大麦粒は、前記水溶液中で大部分の前記大麦粒の発芽を可能とするのに十分な時間にわたり、インキュベーションされ得る。大麦粒はまた、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも３７％、例えば、３５〜６０％の範囲の含水量を得るために十分な時間にわたり、前記水溶液中でインキュベーションされ得る。通常、大麦粒は、水溶液中で、少なくとも２４時間などの少なくとも２０時間、インキュベーションされる。通常、穀粒は、前記水溶液中で、長くても６０時間などの長くても７２時間、例えば、長くても４８時間インキュベーションされる。従って、いくつかの実施形態では、大麦粒は、前記水溶液中で、２０〜６０時間の範囲などの２０〜７２時間、例えば、２０〜４８時間の範囲、例えば、２２〜２６時間の範囲などの２０〜３０時間の範囲にわたりインキュベーションされる。
【０１９６】
全体インキュベーション中に大麦粒が前記水溶液により完全に覆われるのが好ましい場合もある。
【０１９７】
前記大麦粒は、多くの場合、前記水溶液中でインキュベーションされ、同時に、Ｏ２をその水溶液中に通過させる。前記Ｏ２は、前記水溶液に純粋なＯ２として添加され得る。しかし、多くの場合、前記Ｏ２はガス混合物中に含まれる。一実施形態では、Ｏ２は大気中に含まれる。
【０１９８】
一般に、１ｋｇの大麦粒当たり、１時間当たり、少なくとも２Ｌ、好ましくは少なくとも３Ｌ、より好ましくは少なくとも４Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも５Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも６ＬのＯ２を前記水溶液中に通過させる。前記大麦粒の重量は乾燥重量である。例えば、１ｋｇの大麦粒（乾燥重量）当たり、１時間当たり、２〜１００Ｌの範囲、例えば、２〜５０Ｌの範囲などの２〜７５Ｌの範囲、例えば、４〜１００Ｌの範囲、例えば、４〜５０Ｌの範囲などの４〜７５Ｌの範囲、例えば、６〜１００Ｌの範囲、例えば、６〜５０Ｌの範囲などの６〜７５Ｌの範囲のＯ２を前記水溶液／大麦粒混合物中に通過させる。
【０１９９】
上述のように、多くの場合、水溶液中に通過させるのは大気である。従って、方法は、１ｋｇの大麦粒当たり、１時間当たり、少なくとも１０Ｌ、好ましくは少なくとも１５Ｌ、より好ましくは少なくとも２０Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも２５Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも３０Ｌの大気を前記水溶液中に通過させることを含む。前記大麦粒の重量は乾燥重量である。例えば、１ｋｇの大麦粒（乾燥重量）当たり、１時間当たり、１０〜５００Ｌの範囲、例えば、１０〜２５０Ｌの範囲などの、１０〜３７５Ｌの範囲、例えば、２０〜５００Ｌの範囲、例えば、２０〜２５０Ｌの範囲などの２０〜３７５Ｌの範囲、例えば、３０〜５００Ｌの範囲、例えば、３０〜２５０Ｌの範囲などの３０〜３７５Ｌの範囲の大気を前記水溶液中に通過させる。
【０２００】
いくつかの実施形態では、発芽のステップは、次記を含む：
ａ．前記穀粒を水溶液中でインキュベーションする少なくとも１つのステップであって、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／ｋｇ大麦穀粒乾燥重量を前記水溶液中に通過させるステップ；および
ｂ．前記大麦穀粒を空気中でインキュベーションする少なくとも１つのステップ。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、前記水溶液中で大麦粒のインキュベーション後、大麦粒は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、例えば、３０〜５０％の範囲などの３０〜６０％の範囲、例えば、３０〜５０％の範囲などの３０〜６０％の範囲の含水量を有する。
【０２０２】
前記大麦穀粒を空気中でインキュベーションする前記ステップ中で、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／ｋｇ大麦穀粒乾燥重量が、前記大麦穀粒中を通され得る。例えば、空気中のインキュベーション中に、上述した前記水溶液中でのインキュベーション中と同じ量のＯ２が大麦穀粒を通過し得る。
【０２０３】
この方法により作製した発芽大麦穀粒は、本明細書では緑麦芽とも呼ばれる。
【０２０４】
大麦粒の含水量は、大麦粒の重量を測定し、続けて、前記大麦粒を乾燥し、乾燥大麦粒の重量を測定することにより、決定され得る。湿潤および乾燥大麦粒の重量の差異は、水とみなされ、含水量は、水の重量を大麦粒の総重量（湿潤大麦粒）により除算した値として与えられる。％で与えられる含水量は、従ってｗ／ｗ％である。
【０２０５】
大麦粒は任意の有用な温度でインキュベーションされ得るが、含水量の急速増加を可能とするのに十分高い温度でインキュベーションが実施されるのが好ましいであろう。
【０２０６】
特に、大麦粒が２０〜３０℃の範囲の温度でインキュベーションされる本発明の実施形態では、前記大麦粒は、２０〜４８時間の範囲でインキュベーションされ得る。
【０２０７】
穀粒の発芽は、当業者に既知の任意の従来法によっても実施され得る。１つの非限定例には、乾湿交互条件下、任意選択で１〜４日の範囲で温度を変えて、１０〜２５℃の範囲の温度での発芽を含む。
【０２０８】
前述のように、本発明のいくつかの実施形態では、発芽大麦粒（すなわち、緑麦芽）は、キルン乾燥され得る。いくつかの実施形態では、緑麦芽はキルン乾燥されないのが好ましい。特に、緑麦芽が、通気下の水溶液中で前記大麦粒をインキュベーションするステップを含む発芽により作製される場合、その後の緑麦芽はキルン乾燥しないのが好ましい。
【０２０９】
緑麦芽がキルン乾燥される場合、これは、少なくとも７５℃などの従来の温度、例えば、８０〜８５℃の範囲などの、８０〜９０℃の範囲で行われ得る。従って、麦芽は、例えば、Ｈｏｕｇｈら（１９８２）により記載のいずれかの方法により製造され得る。しかし、限定されないが、麦芽を焙焼する方法を含む、特殊麦芽の製造方法などの麦芽の製造方法のための任意の他の方法も、本発明で使用され得る。
【０２１０】
キルン乾燥麦芽および緑麦芽は、例えば、粉砕によりさらに処理され得る。従って、本発明による植物生成物は、何らかの麦芽、例えば、未処理麦芽または粉末などの粉砕麦芽であり得る。従って、植物生成物は、例えば、粉砕、キルン乾燥麦芽または粉砕緑麦芽であり得る。粉砕麦芽およびその粉末は、麦芽および再発芽の能力を欠く死細胞の化学成分を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、大麦は皮麦であり、方法は、水溶液中で前記穀粒をインキュベーションする前に、少なくとも一部の前記外皮を取り除くステップを含む。外皮のある穀物粒は、穀物粒を外皮を取り除く物理的処理に供することにより、外皮を取り除くように処理され得る。前記物理的処理は、例えば、研磨、研摩、剥皮および平滑化からなる群より選択され得る。好ましくは、物理的処理は、外皮の減少を生じる。外皮の減少は、全体減量として測定され得る。従って、物理的処置は、好ましくは、穀物粒の合計重量の１〜４％、例えば、１．５〜３．０％の範囲の減少になる。
【０２１２】
水性抽出物およびその製造方法
本発明は、大麦ベース飲料ならびにそれを作製する方法を提供し、大麦植物は、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異、例えば、本明細書で記載のいずれかの変異、を有する。本発明はまた、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異を有する大麦植物の穀粒の水性抽出物も提供する。前記水性抽出物は、例えば、緑麦芽またはキルン乾燥麦芽から作製され得る。
【０２１３】
多くの場合、飲料の作製方法は、本発明の大麦植物の穀粒および／または本発明の大麦植物から作製される麦芽の水性抽出物の作製ステップを含む。
【０２１４】
水性抽出物は、一般的に、大麦粉、緑麦芽の粉末および／またはキルン乾燥麦芽の粉末を水中、または水溶液中でインキュベーションすることにより作製され得る。前記水溶液は、本明細書では「マッシング溶液」とも呼ばれる。特に、水性抽出物はマッシングにより作製され得る。
【０２１５】
本発明はまた、水性抽出物の製造方法を提供し、前記方法は、次のステップを含む：
ａ．大麦植物の穀粒を用意するステップであって、前記大麦植物が、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異、例えば、本明細書に記載のいずれかの変異を有するステップ；
ｂ．大麦穀粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップが前記穀粒を水溶液中で長くても７２時間インキュベーションすることを含むステップ；
ｃ．前記発芽穀粒を細かく粉砕し、同時に、前記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップであって、ただし、前記大麦穀粒がステップｂ）とｃ）との間で常に２０％未満の含水量にならないことが前提である、ステップ；
ｄ．前記粉砕発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、大麦の水性抽出物を製造するステップ。
【０２１６】
発芽ステップは、上記セクション「緑麦芽、キルン乾燥麦芽およびその製造方法」で詳細に記載されている。
【０２１７】
一般に、前記マッシング溶液は、水道水などの水であってよく、これに対し１種または複数の追加の薬剤が添加され得る。追加の薬剤は、開始時から水溶液中に存在し得るか、または水性抽出物を作製する工程中に添加され得る。前記追加の薬剤は酵素であり得る。従って、マッシング溶液は、１種または複数の酵素を含み得る。前記酵素は、開始時から水溶液中に加えられ得るか、またはその後、工程中に添加され得る。
【０２１８】
前記酵素は、例えば、１種または複数の加水分解酵素であり得る。好適な酵素には、リパーゼ、デンプン分解酵素（例えば、アミラーゼ）、グルカナーゼ［好ましくは（１−４）−および／または（１，３；１，４）−β−グルカナーゼ］、および／またはキシラナーゼ（例えば、アラビノキシラナーゼ）、および／またはプロテアーゼ、または１種または複数の上述の酵素を含む酵素混合物、例えば、Ｃｅｒｅｆｌｏ、Ｕｌｔｒａｆｌｏ、またはＯｎｄｅａ  Ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）が挙げられる。例えば、水溶液には、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、限界デキストリナーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ（例えば、エンド−（１，３；１，４）−β−グルカナーゼまたはエンド−１，４−β−グルカナーゼ）、キシラナーゼ（例えば、エンド−またはエキソ−１，４−キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼまたはフェルラ酸エステラーゼ）、グルコアミラーゼおよびプロテアーゼからなる群より選択される１種または複数の加水分解酵素が含まれ得る。
【０２１９】
一実施形態では、α−アミラーゼは添加されないか、または限られた量のα−アミラーゼが前記マッシング溶液に添加される。
【０２２０】
一実施形態では、限界デキストリナーゼおよびプルラナーゼは添加されないか、または限られた量の限界デキストリナーゼおよびプルラナーゼが前記マッシング溶液に添加される。
【０２２１】
好ましくは食品等級品質の前記追加の薬剤は、塩、例えば、ＣａＣｌ２または酸、例えば、Ｈ３ＰＯ４であり得る。
【０２２２】
水性抽出物は、一般的に、大麦粉、緑麦芽の粉末および／またはキルン乾燥麦芽の粉末をマッシング溶液中、１種または複数の所定の温度でインキュベーションすることにより作製される。前記所定の温度は、本明細書では「マッシング温度」とも呼ばれる。前記マッシング温度は、例えば、マッシングに使用される従来の温度であり得る。マッシング温度は一般的に、一定に保持される（等温マッシング）か、または徐々に、例えば、逐次的方法で高められる。いずれの場合でも、大麦粒および／または麦芽中の可溶性物質は、前記マッシング溶液中に遊離し、それにより、水性抽出物を形成する。
【０２２３】
マッシング温度は通常、４０〜８５℃の範囲などの３０〜９０℃の範囲、例えば、５０〜８５℃の範囲の温度である。多くの場合、マッシング溶液を用いたインキュベーションは、より高い温度、例えば、７５〜８０℃の範囲の温度に加熱する最終ステップを含む。
【０２２４】
例えば、マッシング容器の水溶液中のインキュベーションの後で水溶液は、別の容器、例えば、麦芽汁濾過機に移され、追加の時間、高温でインキュベーションされ得る。
【０２２５】
有用なマッシングプロトコルの非限定的例は、醸造文献、例えば、Ｈｏｕｇｈら（前出）で見つけることができる。
【０２２６】
マッシング（すなわち、大麦粉、緑麦芽の粉末および／またはキルン乾燥麦芽の粉末のマッシング溶液中でのインキュベーション）は、補助剤の存在下で起こり、これは、麦芽以外の任意の炭水化物源または発芽大麦粒、例えば、限定されないが、大麦、大麦シロップ、またはトウモロコシ、または米を、全粒または粗びき穀物、シロップまたはデンプンなどの処理生成物として含むと理解される。すべての上述の補助剤は、主として、追加の抽出物源（シロップは通常、麦汁加熱中に加えられる）として使用され得る。醸造所での補助剤の処理のための要件は、使われる補助剤の状態とタイプに依存する。
【０２２７】
マッシング溶液中でインキュベーション後、水性抽出物は通常、例えば、濾過により水性抽出物と残留非溶解固体粒子とに分離され得、後者は「ビール粕」とも表記される。選別は、例えば、麦芽汁濾過機中で実施され得る。あるいは、選別は、マッシュフィルターを用いた選別であり得る。こうして得られた水性抽出物は、「第一麦汁」とも表記される。スパージングとも表記される工程中に、水などの追加の液体をビール粕に加え得る。スパージングおよび濾過の後で、「第二麦汁」が得られ得る。更なる麦汁は、手順の反復により作製され得る。従って、水性抽出物は、麦汁、例えば、第一麦汁、第二麦汁、さらなる麦汁またはこれらの組み合わせであり得る。
【０２２８】
一実施形態では、水性抽出物の作製方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４９８号に記載のいずれかの装置、例えば、その中のページ２０〜２２に記載のいずれかの装置を用いて実施され得る。有用な装置の非限定的例は、本明細書の図１２に提供されている。
【０２２９】
飲料およびその製造方法
本発明はまた、大麦ベース飲料およびこのような飲料の製造方法も提供し、飲料は、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異、例えば、本明細書で記載のいずれかの変異を有する大麦植物から作製される。
【０２３０】
前記飲料は、アルコール性大麦ベース飲料または非アルコール性大麦ベース飲料であり得る。アルコール性大麦ベース飲料は、例えば、ビールまたは醸造アルコールであり得る。
【０２３１】
前記ビールは、任意の種類のビール、例えば、ラガーまたはエールであり得る。従って、ビールは、例えば、アルトビール、アンバーエール、バーレイワイン、ベルリーナー・ヴァイセ、ビエールドギャルド、ビター、ブロンドエール、ボック、ブラウン・エール、カリフォルニアコモン、クリーム・エール、ドルトムンダーエクスポート、ドッペルボック、デュンケル、デュンケルバイツェン、アイスボック、フルーツランビック、ゴールデンエール、ゴーゼ、グーズ、ヘーフェヴァイツェン、ヘレス、インディア・ペールエール、ケルシュ、ランビック、ライトエール、マイボック、モルト・リカー、マイルド、メルツェンビア、オールドエール、オード・ブライン、ペールエール、ピルスナー、ポーター、レッドエール、ロッゲンビア、セゾン、スコッチエール、スチームビール、スタウト、シュヴァルツビール、ラガー、ウィットビア、ヴァイスビアおよびヴァイツェンボックからなる群より選択され得る。
【０２３２】
前記醸造アルコールは、任意の種類の醸造アルコールであり得る。特に、醸造アルコールは、大麦、例えば、大麦麦芽をベースにし得る。このような醸造アルコールの非限定的例には、ウイスキーおよびウォッカが挙げられる。
【０２３３】
飲料は、非アルコール性飲料、例えば、非アルコール性大麦ベース飲料、例えば、非アルコール性ビールまたはマルチナなどの非アルコール性麦芽飲料であり得る。
【０２３４】
飲料は、例えば、次のステップを含む方法により作製され得る：
（ｉ）本発明による大麦植物の穀粒および／または本発明による大麦植物の穀粒から作製された緑麦芽および／またはキルン乾燥麦芽を用意するステップ、
（ｉｉ）前記穀粒および／または前記緑麦芽および／または前記キルン乾燥麦芽の水性抽出物を、例えば、本明細書で上記した水性抽出物作製セクションで記載のように、作製するステップ、
（ｉｉｉ）前記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
【０２３５】
水性抽出物は、ホップの含有または非含有下で煮沸され得るが、これはその後、煮沸麦汁と呼ばれることもある。第一、第二およびさらなる麦汁を混合し、その後、煮沸に供し得る。水性抽出物は、任意の好適な時間、例えば、６０分〜１２０分の範囲で煮沸され得る。
【０２３６】
ステップ（ｉｉｉ）は、次記を含み得る：
ａ．前記水性抽出物を、任意選択で、ホップまたはホップ抽出物の存在下で加熱するステップ；
ｂ．水性抽出物を冷却するステップ；
ｃ．前記水性抽出物を酵母で発酵させ、それにより、発酵飲料を製造するステップ；
【０２３７】
ステップ（ｉｉｉ）は特に、前記水性抽出物の発酵、例えば、麦汁の発酵を含む。従って、飲料は、水性抽出物の酵母による発酵により作製され得る。
【０２３８】
水性抽出物が作製されると、それは、従来の醸造方法を含む任意の方法により、ビールへと処理され得る。好適な醸造方法の例の非限定的記載は、例えば、Ｈｏｕｇｈら（１９８２）による報告で見つけることができる。多くの定期的に更新される大麦ビールおよびビール産物の分析方法は、例えば、限定されないが、米国穀物化学者学会（１９９５）、米国醸造化学者学会（１９９２）、欧州醸造学会（１９９８）、および英国醸造協会（１９９７）から入手できる。多くの特定の手順が特定の醸造所に採用され、最も大きく変化するのは現地の消費者の好みによることがわかっている。いずれかのこのようなビール製造方法を本発明で用い得る。
【０２３９】
水性抽出物からのビール製造の第１のステップは、好ましくは、本明細書で上記したように前記水性抽出物を煮沸させ、その後続けて、冷却および任意選択でワールプールレストを含む。１種または複数の追加の化合物、例えば、下記セクション「追加の化合物」に記載の１種または複数の追加の化合物、を水性抽出物に加えてもよい。冷却後、水性抽出物を、酵母、例えば、ビール酵母または出芽酵母などの醸造酵母を含む発酵タンクに移し得る。水性抽出物は、任意の好適な期間、一般的には、１〜１０日間などの１〜２０日間にわたり発酵され得る。発酵は、任意の有用な温度、例えば、１０〜２０℃の範囲の温度で実施される。方法はまた、１種または複数の酵素の追加を含み得、例えば、１種または複数の酵素が、発酵の前に、または発酵中に麦汁に添加され得る。特に、前記酵素は、プロリン−特異的エンドプロテアーゼであり得る。プロリン−特異的エンドプロテアーゼの非限定的例は、ＤＳＭから入手可能な「Ｂｒｅｗｅｒ’ｓ  Ｃｌａｒｅｘ」である。他の実施形態では、方法中に外来性の酵素は添加されない。
【０２４０】
数日間の長さの発酵工程中、糖はアルコールおよびＣＯ２に同時に転換され、いくつかの香味物質が発生する。任意の望ましい時間に、例えば、％Ｐの低下が観察されなくなると、発酵を終了させ得る。
【０２４１】
その後、ビールは、さらに処理、例えば、冷却され得る。それはまた、濾過および／またはラガーにするため貯蔵され得る−−この工程で、酵母様の少ない、心地よい香が発生する。添加物をさらに添加してもよい。さらに、ＣＯ２を添加し得る。最終的に、ビールは、低温殺菌および／または濾過された後に、包装され得る（例えば、容器またはビア樽に移される、瓶詰、または缶詰にされる）。ビールはまた、標準的な方法で低温殺菌され得る。
【０２４２】
追加の化合物
本発明の方法は、１種または複数の追加の化合物を加えるステップを含み得る。前記追加の化合物は、例えば、風味化合物、保存剤、機能性成分、染料、甘味剤、ｐＨ調整剤または塩であり得る。ｐＨ調整剤は、例えば、緩衝剤またはリン酸などの酸であり得る。
【０２４３】
機能性成分は、所与の機能を得るために添加される任意の成分であり得る。好ましくは、機能性成分は、飲料をより健康によりものにする。機能性成分の非限定例としては、ビタミンまたはミネラルが挙げられる。
【０２４４】
保存剤は、任意の食品等級保存剤であり得、例えば、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸塩（例えば、ソルビン酸カリウム）、亜硫酸塩および／またはその塩であり得る。
【０２４５】
追加の化合物はまた、ＣＯ２であり得る。特に、ＣＯ２は炭酸飲料を得るために添加され得る。
【０２４６】
本発明で使用される香味化合物は、任意の有用な香味化合物であり得る。香味化合物は、例えば、芳香剤、植物抽出物、植物濃縮物、植物部分およびハーブ浸剤からなる群より選択され得る。特に、風味化合物はホップであり得る。
【０２４７】
１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異を有する大麦植物の作製方法
１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異、例えば、本明細書で記載のいずれかの変異、を含む大麦植物は、任意の有用な方法で作製され得る。
【０２４８】
例えば、このような大麦植物は、次のステップを含む方法により作製できる：
・複数の大麦植物または大麦穀粒を、例えば、照射または化学処理、例えば、アジ化ナトリウムによる処理により、ランダム変異誘発に供するステップ；
・所望の変異（例えば、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中の変異）を有する大麦植物または大麦穀粒を特製するステップ。
【０２４９】
このような方法はまた、それぞれランダム変異を含む複数の大麦植物／穀粒を得るために、前記大麦植物／大麦穀粒を複製する１つまたは複数のステップも含み得る。
【０２５０】
特に、特定の変異を有する大麦植物が作製され、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号で記載されているように、所望の変異を特定するように設計されたプライマーおよびプローブを用いて本質的に特定され得る。α−アミラーゼプロモーター中に変異を有する大麦植物の特定に有用なプライマーおよびプローブの非限定例は、実施例１３Ａで提供されている。ＨＲＴ遺伝子中に変異を有する大麦植物の特定に有用なプライマーおよびプローブの非限定例は、実施例２Ａで提供されている。ＨＲＴ遺伝子中に変異を有する大麦植物の特定に有用なプライマーおよびプローブの２つの追加の非限定例は、実施例１４で提供されている。ＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する大麦植物の特定に有用なプライマーおよびプローブの非限定例は、実施例７Ａで提供されている。ＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有する大麦植物の特定に有用なプライマーおよびプローブの非限定例は、実施例１２Ａで提供されている。当業者なら、共通の一般知識および／または国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号（参照により本明細書に組み込まれる）で提供された手引きに基づいて、その他の変異体の特定のための有用なプライマーおよびプローブを設計できるであろう。
【０２５１】
１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異を有する大麦植物も同様に、種々の部位特異的変異誘発法を用いて作製され得、この方法は、例えば、本明細書で提供されるα−アミラーゼプロモーター、ＨＲＴ遺伝子、ＨＢＬ１２遺伝子および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子の配列に基づいて設計できる。一実施形態では、大麦植物は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、および国際公開第２０１７／１３８９８６号に記載のＤＮＡ切断抗生物質の内のいずれか１つを用いて作製される。一実施形態では、大麦植物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使って、例えば、ＲＮＡ誘導性Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使って作製される。これは、シングルガイドＲＮＡ配列が本明細書で提供される遺伝子配列に基づいて設計されること以外は、Ｌａｗｒｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）１６：２５８；ＤＯＩ  １０．１１８６／ｓ１３０５９−０１５−０８２６−７に記載のようにして実施され得る。一実施形態では、大麦植物は、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の組み合わせを使って、例えば、ＲＮＡ誘導性Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使って作製される。これは、ＴＡＬＥＮおよびシングルガイドＲＮＡ配列が本明細書で提供される遺伝子配列に基づいて設計されること以外は、Ｈｏｌｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１７）９５：１１１−１２１；ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１１０３−０１７−０６４０−６に記載のようにして実施され得る。
【０２５２】
一実施形態では、穀類植物は、相同組み換え修復、ＤＮＡ切断ヌクレアーゼとドナーＤＮＡフラグメントの組み合わせを用いて作製される。これは、ＤＮＡ切断ヌクレアーゼが本明細書で提供される遺伝子配列に基づいて設計され、ドナーＤＮＡフラグメントが本明細書で提供される変異導入した穀物変種のコード配列に基づいて設計されること以外は、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ（２０１６）９：６２８−６３１；ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｐ．２０１６．０１．００１に記載のようにして実施され得る。
【０２５３】
本発明の一実施形態では、目的は、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異を有する農学的に有用な大麦植物を提供することである。１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中の変異に加えて、商業的大麦変種生成の技術分野において、麦芽製造および／または醸造にとって、および／または飲料のための基材として有用であると考えられ得る追加の因子、例えば、穀粒収率およびサイズ、ならびに麦芽製造性能または醸造性能に関連する他のパラメーターが存在する。全てではないにしても多くの関連形質は、遺伝的制御下にあることが示されているので、本発明はまた、本報告で開示される大麦植物との交雑により作製され得る、最新のホモ接合高収率麦芽栽培品種を提供する。熟練大麦品種改良家は、他の大麦植物と交雑後、優れた栽培品種を生ずる大麦植物を選択し、発生させることができる。あるいは、品種改良家は、本発明の植物を、さらに変異誘発して、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中の変異に加えて、追加の変異を有する新規栽培品種を生成するために利用し得る。
【０２５４】
本発明はまた、自家受粉、戻し交雑、集団に対する交雑、などの方法を含む植物育種法により作製された１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に、変異を有する大麦植物を含む。戻し交雑法は、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中の変異を、別の栽培品種に導入するために本発明で使用できる。
【０２５５】
一実施形態では、本発明は、２０１８年１１月１２日にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７０で寄託され、「ＨＥＮＺ−２」と呼ばれる大麦植物の子孫、または２０１８年１１月１２日にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７１で寄託され、「ＨＥＮＺ−１０」と呼ばれる大麦植物の子孫に関する。
【０２５６】
植物育種の工程を加速する方法は、組織培養物および再生技術の適用による生成変異体の初期増殖を含む。従って、本発明の別の態様は、成長および分化時に、１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中、ＨＲＴ遺伝子中、ＨＢＬ１２遺伝子中、および／またはＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有する大麦植物を産生する細胞を提供することである。例えば、育種は、従来の交雑、稔性葯由来植物の作製または小胞子培養の使用を必要とし得る。
【０２５７】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、基本的な生物学的プロセスにより得られるとは限らない。技術的プロセスにより得られた大麦植物の子孫は、基本的な生物学的プロセスにより得られるとは限らないと本明細書では見なされる。理由は、親植物が技術的プロセスにより得られるためである。
【０２５８】
一実施形態では、大麦植物は、本明細書で記載のいずれかの変異を有し、前記変異は、化学的および／または物理的薬剤により誘導されている。
【０２５９】
一実施形態では、大麦植物は誘導された変異誘発のステップを含む方法により作製された、または前記植物は、誘導された変異誘発のステップを含む方法により作製された植物の子孫である。従って、大麦植物は、次のステップを含む方法により作製された大麦植物または次のステップを含む方法により作製された植物の子孫であり得る：
・大麦植物またはその一部を、例えば、ＮａＮ３などの化学的変異誘発剤で変異誘発するステップ、
・本明細書で記載のいずれかの変異を有する大麦植物を選択するステップ。
【表２】
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【０２６０】
項目
本発明は、例えば、次の項目で定められる通りであり得る。
１．高α−アミラーゼ活性を有する大麦植物またはその一部であって、
・ＨｖＨＲＴ遺伝子中にＨｖＨＲＴ機能の低下をもたらす変異を有する；および／または
・ＧＡＲＥボックス中に変異を含む変異体α−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・ＧＡＲＥボックス中に変異を含む、または配列ＴＡＡＣＡＡＡを有する変異体α−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１つのα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中にＨｖＨＢＬ１２機能の低下をもたらす変異を有する；および／または
・非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有し、前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスが配列（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）を含み、１つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、Ｘは任意のヌクレオチドでよく、ｎは０または１、ｍは０〜２０の範囲の整数である；および／または
・非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・ＷＲＫＹ３８遺伝子中にＷＲＫＹ３８機能の低下をもたらす変異を有する、大麦植物またはその一部。
２．大麦植物またはその一部であって、
ａ．ＨｖＨＲＴ遺伝子中に、配列番号２の１つまたは複数のアミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子をもたらす変異、または少なくともＨｖＨＲＴ遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、ＨｖＨＲＴ遺伝子のコード領域が配列番号２のポリペプチドをコードする；および／または
ｂ．ＧＡＲＥボックス中に変異を含む変異体α−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
ｃ．配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
ｄ．ＧＡＲＥボックス中に変異を含む、または配列ＴＡＡＣＡＡＡを有する変異体α−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
ｅ．ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に、配列番号６の１つまたは複数のアミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子をもたらす変異、または少なくともＨｖＨＢＬ１２遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、ＨｖＨＢＬ１２遺伝子のコード領域が配列番号６のポリペプチドをコードする；および／または
ｆ．非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有し、前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスが配列（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）を含み、１つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、Ｘは任意のヌクレオチドでよく、ｎは０または１、ｍは０〜２０の範囲の整数である；および／または
ｇ．非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
ｈ．ＷＲＫＹ３８遺伝子中に、配列番号１１および配列番号１２の両方に存在する１つまたは複数のアミノ酸を欠く変異体ＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＷＲＫＹ３８遺伝子をもたらす変異、または少なくともＷＲＫＹ３８遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、ＷＲＫＹ３８遺伝子のコード領域が配列番号１１または配列番号１２のポリペプチドをコードする、大麦植物またはその一部。
３．項目１または２に記載の大麦植物であって、ＨｖＨＲＴ遺伝子中に変異を有する、大麦植物。
４．項目３に記載の大麦植物であって、変異が下記である、大麦植物：
・少なくとも配列番号２のアミノ酸５２７〜５３０に対応するアミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を生ずる変異。
・ＨｖＨＲＴ遺伝子の欠失を生ずる変異。
５．項目３または４に記載の大麦植物であって、変異がＨｖＨＲＴ遺伝子中に未成熟停止コドンを導入する、大麦植物。
６．項目３〜５のいずれか１項に記載の大麦植物であって、変異がＨｖＨＲＴ遺伝子のスプライス部位中の変異である、大麦植物。
７．項目３〜６のいずれか１項に記載の大麦植物であって、少なくとも配列番号２のアミノ酸４６３〜４９１を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
８．項目３〜７のいずれか１項に記載の大麦植物であって、少なくとも配列番号２のアミノ酸５０９〜５３９を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
９．項目３〜８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号２の少なくとも２１個の最Ｃ末端アミノ酸、例えば、少なくとも８５個の最Ｃ末端アミノ酸などの少なくとも３９個の最Ｃ末端アミノ酸、例えば、少なくとも１００個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
１０．項目３〜９のいずれか１項に記載の大麦植物であって、少なくとも配列番号２の１１８個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
１１．項目３〜１０のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号２の多くても５２６個のＮ末端アミノ酸、例えば、配列番号２の多くても４６２個のＮ末端アミノ酸などの配列番号２の多くても５０８個のＮ末端アミノ酸、好ましくは配列番号２の多くても４３１個のＮ末端アミノ酸を含むＨｖＨＲＴのＮ末端フラグメントを含む短縮ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
１２．項目３〜１１のいずれか１項に記載の大麦植物であって、コドン１〜４３１のいずれか１つに未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
１３．項目３〜１２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１の４３１に未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
１４．項目３〜１３のいずれか１項に記載の大麦植物であって、変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み、前記変異体ＨｖＨＲＴタンパク質が配列番号２のＷ４３１ｓｔｏｐ変異を有する、大麦植物。
１５．項目３〜１４のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド１２９３のＧ→Ａ変異を含む変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
１６．項目３〜１５のいずれか１項に記載の大麦植物であって、受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７０でＮＣＩＭＢに寄託された大麦植物またはその子孫である、大麦植物。
１７．項目３〜１２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１の１７０に未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
１８．項目３〜１２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み、前記変異体ＨｖＨＲＴタンパク質が、配列番号２のＷ１７０ｓｔｏｐ変異を有する、大麦植物。
１９．項目３〜１２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド５１０のＧ→Ａ変異を含む変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
２０．項目３〜１２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１の３７１に未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
２１．項目３〜１２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含み、前記変異体ＨｖＨＲＴタンパク質が、配列番号２のＷ３７１ｓｔｏｐ変異を有する、大麦植物。
２２．項目３〜１２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド１１１３のＧ→Ａ変異を含む変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
２３．項目３〜２２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号４のポリペプチドをコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
２４．項目３〜２３のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号３のコード配列を含む変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、大麦植物。
２５．項目３〜２４のいずれか１項に記載の大麦植物であって、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、１０％未満の変異体または野生型ＨｖＨＲＴ  ｍＲＮＡを含み、ＨｖＨＲＴ  ｍＲＮＡが配列番号２のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードするＲＮＡであり、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子が配列番号２のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードする遺伝子であり、前記機能的ホモログが配列番号２に対し少なくとも９５％の配列同一性を共有する、大麦植物。
２６．項目２〜２５のいずれか１項に記載の大麦植物であって、ＨｖＨＲＴ遺伝子中の変異が、ＨｖＨＲＴ機能の完全喪失を引き起こす変異である、大麦植物。
２７．項目１〜２６のいずれか１項に記載の大麦植物であって、ＧＡＲＥボックス中に変異を含む変異体α−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を含み、ヌクレオチドＴＡＡＣＡＲＡの１つが置換または欠失されている、大麦植物。
２８．項目１〜２７のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異体α−アミラーゼプロモーターを含む、少なくとも３種のα−アミラーゼ遺伝子などの少なくとも２種のα−アミラーゼ遺伝子、例えば、少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
２９．項目１〜２８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含む少なくとも５種のα−アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
３０．項目１〜２９のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含む少なくとも７種のα−アミラーゼ遺伝子などの少なくとも６種のα−アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
３１．項目１〜３０のいずれか１項に記載の大麦植物であって、高収率を有する春大麦変種である、大麦植物。
３２．項目１〜３１のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含むａｍｙ２クラスター中に、少なくとも２種などの少なくとも１種の、例えば、少なくとも３種のα−アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
３３．項目２７〜３２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、ＨｖＨＲＴ遺伝子中に変異をさらに有し、前記変異が項目３〜２６のいずれか１項に記載の変異である、大麦植物。
３４．項目３〜３３のいずれか１項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の４８時間後、少なくとも１６Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有する、大麦植物。
３５．項目３〜３４のいずれか１項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の４８時間後、少なくとも１５０Ｕ／ｇなどの少なくとも１４０Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも１７０Ｕ／ｇなどの少なくとも１６０Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有するが、ただし、外皮なしであるか、または発芽の開始の前に大麦穀粒から少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である、大麦植物。
３６．項目３〜３５のいずれか１項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の４８時間後、少なくとも３５ｍＵ／ｇなどの少なくとも３０ｍＵ／ｇ、例えば、少なくとも４０ｍＵ／ｇの限界デキストリナーゼを有するが、ただし、外皮なしであるかまたは少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である、大麦植物。
３７．項目１または２に記載の大麦植物であって、ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する、大麦植物。
３８．項目３７に記載の大麦植物であって、変異が下記である、大麦植物：
ａ．配列番号６の１つまたは複数のアミノ酸またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログを欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を生ずる変異。
ｂ．ＨｖＨＢＬ１２遺伝子の欠失を生ずる変異。
３９．項目３７または３８に記載の大麦植物であって、変異がＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に未成熟停止コドンを導入する、大麦植物。
４０．項目３７〜３９のいずれか１項に記載の大麦植物であって、変異がＨｖＨＢＬ１２遺伝子のスプライス部位中の変異である、大麦植物。
４１．項目３７〜４０のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号６またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの少なくとも２０個の最Ｃ末端アミノ酸などの少なくとも１０個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む、大麦植物。
４２．項目３７〜４１のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号６またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの少なくとも２２個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む、大麦植物。
４３．項目３７〜４２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号６またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの多くても２２８個のＮ末端アミノ酸を含むＨｖＨＢＬ１２のＮ末端フラグメントを含む短縮ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む、大麦植物。
４４．項目３７〜４３のいずれか１項に記載の大麦植物であって、コドン１〜２２８のいずれか１つに未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む、大麦植物。
４５．項目３７〜４４のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号５の２２８に未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む、大麦植物。
４６．項目３７〜４５のいずれか１項に記載の大麦植物であって、変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含み、前記変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質が、配列番号６のＷ２２８ｓｔｏｐ変異を有する、大麦植物。
４７．項目３７〜４６のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号５のＨｖＨＢＬ１２コード配列のヌクレオチド６８４のＧ→Ａ変異を含む変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む、大麦植物。
４８．項目３７〜４７のいずれか１項に記載の大麦植物であって、受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７１でＮＣＩＭＢに寄託された大麦植物またはその子孫である、大麦植物。
４９．項目３７〜４８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号９の、または多型Ｎ１４１Ｄ、Ｍ１４２ＶまたはＥ１８４Ｄの１つまたは複数を有する配列番号９のポリペプチドをコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む、大麦植物。
５０．項目３７〜４９のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号８のコード配列を含む変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む、大麦植物。
５１．項目３７〜５０のいずれか１項に記載の大麦植物であって、野生型ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、１０％未満のＨｖＨＢＬ１２  ｍＲＮＡを含み、ＨｖＨＢＬ１２  ｍＲＮＡが配列番号６のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードするＲＮＡであり、野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子が配列番号６のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードする遺伝子であり、前記機能的ホモログが配列番号６に対し少なくとも９５％の配列同一性を共有する、大麦植物。
５２．項目３７〜５１のいずれか１項に記載の大麦植物であって、ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中の変異が、ＨｖＨＢＬ１２機能の完全喪失を引き起こす変異である、大麦植物。
５３．項目３７〜５２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、ＨｖＨＲＴ遺伝子中に、項目３〜２６のいずれか１項に記載の変異をさらに有し、および／または項目２７〜３２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのα−アミラーゼ遺伝子をさらに含む、大麦植物。
５４．項目１または２に記載の大麦植物であって、ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有する、大麦植物。
５５．項目５４に記載の大麦植物であって、変異が下記である、大麦植物：
ａ．配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２００〜２０６、２２０、２２６、２５０および／また２５２の少なくとも１つを欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を生ずる変異。
ｂ．ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子の欠失を生ずる変異。
５６．項目５４または５５に記載の大麦植物であって、変異がＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子中に未成熟停止コドンを導入する、大麦植物。
５７．項目５４〜５６のいずれか１項に記載の大麦植物であって、変異がＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子のスプライス部位中の変異である、大麦植物。
５８．項目５４〜５７のいずれか１項に記載の大麦植物であって、少なくとも配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２００〜２０６を欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、大麦植物。
５９．項目５４〜５８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１０２個の最Ｃ末端アミノ酸、例えば、少なくとも１２８個の最Ｃ末端アミノ酸などの少なくとも１０４個の最Ｃ末端アミノ酸、例えば、少なくとも１３４個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、大麦植物。
６０．項目５４〜５９のいずれか１項に記載の大麦植物であって、少なくとも配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１５４個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、大麦植物。
６１．項目５４〜６０のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１１または配列番号１２の多くても２５１個のＮ末端アミノ酸、例えば、配列番号１１または配列番号１２の多くても２２５個のＮ末端アミノ酸などの配列番号１１または配列番号１２の多くても２４９個のＮ末端アミノ酸、例えば、配列番号１１または配列番号１２の多くても２１９個のＮ末端アミノ酸、好ましくは配列番号１１または配列番号１２の多くても１９９個のＮ末端アミノ酸を含むＨｖＷＲＫＹ３８のＮ末端フラグメントを含む短縮ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、大麦植物。
６２．項目５４〜６１のいずれか１項に記載の大麦植物であって、コドン１〜２００のいずれか１つに未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、大麦植物。
６３．項目５４〜６２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１０のコドン１〜２００のいずれか１つに未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、大麦植物。
６４．項目５４〜６３のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１０の２００に未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、大麦植物。
６５．項目５４〜６４のいずれか１項に記載の大麦植物であって、変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含み、前記変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質が、配列番号１１または１２のＷ２００ｓｔｏｐ変異を有する、大麦植物。
６６．項目５４〜６５のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１０のＨｖＷＲＫＹ３８コード配列のヌクレオチド６００のＧ→Ａ変異を含む変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、大麦植物。
６７．項目５４〜６６のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１４のポリペプチド、またはアミノ酸９８がＭｅｔである配列番号１４のポリペプチドをコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、大麦植物。
６８．項目５４〜６７のいずれか１項に記載の大麦植物であって、配列番号１３のコード配列を含む変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、大麦植物。
６９．項目５４〜６８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、野生型ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、１０％未満の変異体または野生型ＨｖＷＲＫＹ３８  ｍＲＮＡを含み、ＨｖＷＲＫＹ３８  ｍＲＮＡが配列番号１１または１２のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードするＲＮＡであり、野生型ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子が配列番号１１または１２のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードする遺伝子であり、前記機能的ホモログが配列番号１１または１２に対して少なくとも９５％の配列同一性を共有する、大麦植物。
７０．項目５４〜６９のいずれか１項に記載の大麦植物であって、ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子中の変異が、ＨｖＷＲＫＹ３８機能の完全喪失を引き起こす変異である、大麦植物。
７１．項目５４〜７０のいずれか１項に記載の大麦植物であって、ＨｖＨＲＴ遺伝子中に変異をさらに有し、前記変異が項目３〜２６のいずれか１項に記載の変異であり、および／または項目２７〜３２のいずれか１項に記載の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子をさらに含み、および／またはＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異をさらに有し、前記変異が項目３７〜５２のいずれか１項に記載の変異である、大麦植物。
７２．項目１〜７１のいずれか１項に記載の大麦植物であって、非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも５種のα−アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
７３．項目１〜７２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも７種などの少なくとも６種のα−アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
７４．項目１〜７３のいずれか１項に記載の大麦植物であって、高収率を有する春大麦変種である、大麦植物。
７５．項目１〜７４のいずれか１項に記載の大麦植物であって、非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むａｍｙ２クラスター中に、少なくとも２種などの少なくとも１種の、例えば、少なくとも３種のα−アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
７６．項目１〜７５のいずれか１項に記載の大麦植物であって、非標準タンデム型リピートＷ−ボックスが、下記からなる群より個別に選択される、大麦植物：
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＹＴＧＲＣＣ）；
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）；
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＹＴＧＲＣＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＣＴＧＲＣＣ）
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＹＴＧＧＣＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＣＴＧＡＣＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＧＣＣ）；および
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＴＣ）；
式中、ＲはＧまたはＡ、ＹはＣまたはＴ、ｎは０または１、ｍは、０〜２０の範囲の整数である。
７７．項目１〜７６のいずれか１項に記載の大麦植物であって、ｍは０〜１０の範囲の整数である、大麦植物。
７８．項目１〜７７のいずれか１項に記載の大麦植物であって、ｍは０〜６の範囲の整数である、大麦植物。
７９．項目１〜７８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、１種または複数のα−アミラーゼ遺伝子が、次の配列から個別に選択される非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含む、大麦植物：
・ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＡＣＣ；
・ＴＧＡＣＡＧＴＧＧＴＡＴＴＧＧＣＣ；
・ＴＧＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＴＧＧＣＣ；
・ＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＴＡＴＴＧＧＣＣ；
・ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＣ；
・ＴＧＡＣＣＧＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＣ；および
・ＴＴＧＡＣＴＴＧＡＴＣ。
８０．項目１〜７９のいずれか１項に記載の大麦植物であって、ａｍｙ１＿１クラスターを含み、少なくとも１つのα−アミラーゼプロモーターが、配列ＴＴＧＡＴＣを含む非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含む、大麦植物。
８１．項目１〜８０のいずれか１項に記載の大麦植物であって、ａｍｙ１＿１クラスターを含み、少なくとも１つのα−アミラーゼプロモーターが、配列ＣＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＣ（配列番号７２）を含む非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含む、大麦植物。
８２．項目１〜８１のいずれか１項に記載の大麦植物であって、図１１Ａの「ＨＥＮＺ−４３  ａｍｙ１＿１」として示される配列を含むａｍｙ１＿１クラスターを含む、大麦植物。
８３．項目３７〜８２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の４８時間後、少なくとも１１０Ｕ／ｇなどの少なくとも１００Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有するが、ただし、発芽の開始の前に外皮なしであるかまたは少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である、大麦植物。
８４．項目３７〜８３のいずれか１項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の４８時間後、少なくとも２０ｍＵ／ｇの限界デキストリナーゼを有するが、ただし、前記発芽の開始の前に、外皮なしであるかまたは少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である、大麦植物。
８５．項目１〜８４のいずれか１項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の４８時間後、前記変異を有さないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のα−アミラーゼ活性の少なくとも１１０％などの少なくとも１０５％、例えば、少なくとも１５０％などの少なくとも１２０％、例えば、少なくとも１７０％のα−アミラーゼ活性を有する、大麦植物。
８６．項目１〜８５のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の収率の少なくとも９０％の収率を有する、大麦植物。
８７．項目１〜８６のいずれか１項に記載の大麦植物であって、少なくとも４０ｇなどの少なくとも３８ｇのＴＫＷを有する、大麦植物。
８８．項目１〜８７のいずれか１項に記載の大麦植物であって、少なくとも６０％ｗ／ｗなどの少なくとも５５％ｗ／ｗのデンプン含量を有する、大麦植物。
８９．項目１〜８８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、少なくとも９．５％ｗ／ｗのタンパク質含量を有する、大麦植物。
９０．項目１〜８９のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の高さの少なくとも９０％の高さを有する、大麦植物。
９１．項目１〜９０のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の穂の数／ｍ２の少なくとも９０％の穂の数／ｍ２を有する、大麦植物。
９２．項目１〜９１のいずれか１項に記載の大麦植物であって、穂発芽を起こさない、大麦植物。
９３．項目１〜９２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、規則的な水の噴霧を２０日間受けた穀粒の発芽比率が、前記噴霧を受けず、成熟時に収穫された同じ種類の大麦植物の穀粒の発芽比率と同じまたはそれより大きい、大麦植物。
９４．項目１〜９３のいずれか１項に記載の大麦植物であって、大麦植物の前記一部が穀粒である、大麦植物。
９５．項目１〜９４のいずれか１項に記載の大麦植物であって、本質的に生物学的方法により得られているとは限らない、大麦植物。
９６．項目１〜９５のいずれか１項に記載の大麦植物であって、次のステップを含む方法により作製された大麦植物、または次のステップを含む方法により作製された植物の子孫である、大麦植物：
・大麦植物またはその一部を、例えば、ＮａＮ３などの化学的変異誘発剤で変異誘発するステップ、
・本明細書で記載のいずれかの変異を有する大麦植物を選択するステップ。
９７．項目１〜９６のいずれか１項に記載の大麦植物であって、少なくとも３つなどの少なくとも２つの次の変異または特定を含む、大麦植物：
ａ．ＨｖＨＲＴ遺伝子中にＨｖＨＲＴ機能の低下に繋がる変異を有する；および／または
ｂ．ＧＡＲＥボックス中に変異を含む変異体α−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
ｃ．配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
ｄ．ＧＡＲＥボックス中に変異を含む、または配列ＴＡＡＣＡＡＡを有する変異体α−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
ｅ．ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中にＨｖＨＢＬ１２機能の低下に繋がる変異を有する；および／または
ｆ．非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有し、前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスが配列（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）を含み、１つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、Ｘは任意のヌクレオチドでよく、ｎは０または１、ｍは０〜２０の範囲の整数である；および／または
ｇ．非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
ｈ．ＷＲＫＹ３８遺伝子中にＷＲＫＹ３８機能の低下に繋がる変異を有する。
９８．項目１〜９７のいずれか１項に記載の大麦植物であって、少なくとも３つなどの少なくとも２つの次の変異を含む、大麦植物：
ａ．１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「α−アミラーゼプロモーター中に変異を有するα−アミラーゼおよび大麦植物」で記載のいずれかの変異、
ｂ．ＨｖＨＲＴ遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「ＨＲＴ遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異、
ｃ．ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異、
ｄ．ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「ＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異。
９９．項目１〜９８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、１種または複数の追加の遺伝子、例えば、１つまたは複数の次の変異を含む、大麦植物：
ａ．機能的ＬＯＸ−１の完全喪失をもたらすＬＯＸ−１コード遺伝子中の変異
ｂ．機能的ＬＯＸ−２の完全喪失をもたらすＬＯＸ−２コード遺伝子中の変異
ｃ．機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらすＭＭＴコード遺伝子中の変異
ｄ．ＣｓｌＦ６コード遺伝子中の変異で、前記変異遺伝子は、低減したＣｓｌＦ６活性を有する変異体ＣｓｌＦ６タンパク質をコードする。
１００．項目１〜９９のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部を含むまたはそれから作製された、植物生成物。
１０１．項目１００に記載の植物生成物であって、大麦粉、緑麦芽およびキルン乾燥麦芽からなる群より選択される、植物生成物。
１０２．項目１００または１０１に記載の植物生成物であって、前記大麦植物の処理した穀粒を含む緑麦芽およびキルン乾燥麦芽である、植物生成物。
１０３．項目１００〜１０２に記載の植物生成物であって、粉砕緑麦芽または粉砕キルン乾燥麦芽である、植物生成物。
１０４．項目１００または１０１に記載の植物生成物であって、大麦粉である、植物生成物。
１０５．項目１００に記載の植物生成物であって、前記大麦植物の穀粒からおよび／または前記大麦植物の処理した穀粒を含む緑麦芽またはキルン乾燥麦芽から作製した麦汁である、植物生成物。
１０６．項目１００に記載の植物生成物であって、前記大麦植物またはその一部から作製された飲料である、植物生成物。
１０７．項目１０６に記載の飲料であって、前記大麦植物の穀粒からおよび／または前記大麦植物の処理した穀粒を含む緑麦芽またはキルン乾燥麦芽から作製される、飲料。
１０８．項目１０６または１０７に記載の飲料であって、ビールである飲料。
１０９．緑麦芽の作製方法であって、次記のステップを含む方法：
（ｉ）項目１から９９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
（ｉｉ）前記穀粒を浸麦するステップ；
（ｉｉｉ）所定の状態下で浸麦穀粒を発芽させるステップ。
１１０．キルン乾燥麦芽の作製方法であって、次記のステップを含む方法：
（ｉ）項目１から９９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
（ｉｉ）前記穀粒を浸麦するステップ；
（ｉｉｉ）所定の状態下で浸麦穀粒を発芽させるステップ。
（ｉｖ）前記発芽穀粒を乾燥するステップ。
１１１．飲料の製造方法であって、次記のステップを含む方法：
（ｉ）項目１〜９９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または項目１０２または１０３に記載の緑麦芽またはキルン乾燥麦芽を用意するステップ；
（ｉｉ）前記穀粒および／または前記麦芽の水性抽出物を作製するステップ、
（ｉｉｉ）前記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
１１２．水性抽出物の製造方法であって、次記のステップを含む方法：
ａ．項目１〜９９のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．大麦粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップは、前記穀粒を穀粒が少なくとも３０％の含水量を有するまで水溶液中でインキュベーションすることを含み、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／（ｋｇ乾燥重量大麦粒）を、前記水溶液中を通過させるステップ；および
ｃ．前記発芽穀粒を微粉化し、同時に、前記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップであって、ただし、前記大麦粒がステップｂ）とｃ）との間で常に２０％未満の含水量にならないことが前提である、ステップ；
ｄ．前記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、大麦の水性抽出物を製造するステップ。
１１３．項目１１２に記載の方法であって、大麦の穀粒が発芽の全ステップ中で水溶液中に浸漬される、方法。
１１４．項目１１２または１１３に記載の方法であって、発芽ステップが下記を含む方法：
ｉ．前記穀粒を水溶液中でインキュベーションする少なくとも１つのステップであって、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／ｋｇ大麦粒乾燥重量を前記水溶液中に通過させるステップ；および
ｉｉ．前記大麦粒を空気中でインキュベーションする少なくとも１つのステップ。
１１５．項目１１２〜１１４のいずれか１項に記載の方法であって、１時間当たり、１ｋｇの大麦粒乾燥重量当たり、少なくとも３Ｌ、より好ましくは少なくとも４Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも５Ｌ、またさらにより好ましくは少なくとも６ＬのＯ２を前記水溶液中に通過させる、方法。
１１６．項目１１２〜１１５のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｏ２がガス混合物内に含まれ、ガス混合物が大気である、方法。
１１７．項目１１２〜１１６のいずれか１項に記載の方法であって、発芽の全ステップが７２時間を超えない、より好ましくは、６０時間を超えない、さらにより好ましくは、５４時間を超えない、方法。
１１８．項目１１２〜１１７のいずれか１項に記載の方法であって、大麦は皮麦であり、方法は、水溶液中で前記穀粒をインキュベーションする前に、少なくとも一部の前記外皮を取り除くステップを含む、方法。
１１９．飲料の製造方法であって、次記のステップを含む方法：
（ｉ）項目１１２〜１１８のいずれか１項に記載の方法により水性抽出物を作製するステップ；
（ｉｉ）前記抽出物を飲料に処理するステップ。
１２０．項目１１９に記載の方法であって、ステップ（ｉｉｉ）が次記ステップを含む方法：
ａ．前記水性抽出物を、任意選択で、ホップまたはホップ抽出物の存在下で加熱するステップ；
ｂ．水性抽出物を冷却するステップ；
ｃ．前記水性抽出物を酵母で発酵させ、それにより、発酵飲料を製造するステップ。
１２１．項目１１９または１２０に記載の方法であって、飲料がビールである、方法。
１２２．高α−アミラーゼ活性を有する大麦植物を作製する方法であって、次のステップを含む方法。
ａ）大麦穀粒を用意するステップ；および
ｂ）前記大麦穀粒をランダムに変異誘発させ、それにより、少なくとも１つの大麦穀粒中に少なくとも１つの次の変異を導入するステップ：
・ＨｖＨＲＴ遺伝子中の変異、
・１つまたは複数のα−アミラーゼプロモーター中の変異、
・ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中の変異、
・ＷＲＫＹ３８遺伝子中の変異；
ｃ）少なくとも１つの前記変異を有する大麦穀粒またはその子孫を選択するステップ。
１２３．項目１２２に記載の方法であって、変異が、項目３〜２６、２７〜３２、３７〜５２、５４〜７０および７２〜８２の内のいずれか１つの項目で定義されている通りである、方法。
【０２６１】
実施例
本発明はさらに以下の実施例で説明されるが、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１
大麦遺伝子ＨｖＨＲＴは、大麦ゲノムバージョン２０１２で、ＩＤ＃  ＭＬＯＣ＿５１００５（栽培品種Ｍｏｒｅｘ）またはＩＤ＃  ＡＫ３６２７３４（栽培品種Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ）のＣＤＳとして、およびｍｏｒｅｘ＿コンティグ＿３６８１８０（栽培品種Ｍｏｒｅｘ）のゲノムＤＮＡとして示される（ＩＢＳＣ，２０１２）。大麦ゲノムバージョン２０１７（Ｍａｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）では、ＨｖＨＲＴは、ＣＤＳおよびＩＤ＃  ＨＯＲＶＵ２Ｈｒ１Ｇ０３５６３０によるタンパク質配列として示される。大麦ゲノムバージョン２０１７では、ＨｖＨＲＴは、染色体２Ｈ上の位置１５０．９０２．９９８ｂｐ〜１５０．９１１．０８７ｂｐに位置している。大麦ゲノムバージョン２０１７では、ＨｖＨＲＴは、転写２のエフェクターとして注釈が付いている。大麦ゲノムバージョン２０１２では、ＨｖＨＲＴは、３つのエクソン中で構成されている。元の配列は、ＩＤ＃ＡＪ００１３１７．１でＮＣＢＩに寄託された。
【０２６２】
ＨＥＮＺ−２の名称の大麦変異体は、下記実施例２で記載のように特定および単離された。ＨＥＮＺ−２は、大麦遺伝子ＨｖＨＲＴのコード配列中に未成熟ＳＴＯＰコドンを生ずるヌクレオチド置換を有する。ＨＥＮＺ−２変異体のＨＲＴ遺伝子のコード配列は、本明細書で配列番号３として提供され、一方、変異体ＨＲＴ遺伝子によりコードされる変異体タンパク質の配列は、配列番号４として提供される。
【０２６３】
変異は、トリプトファン４３１からＳＴＯＰへのアミノ酸交換（Ｗ４３１Ｓｔｏｐ）を生ずる。変異体バックグラウンドは、栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎである。単離された元の変異体は、多型のヘテロ接合であったが、後で増殖してホモ接合の変異体を得た。
【０２６４】
実施例２Ａ
オオムギ転写リプレッサー、ＨＲＴの遺伝子中に特定の変異を有する大麦変異体のｄｄＰＣＲベーススクリーニング
国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号に記載の方法を用いて、ＨｖＨＲＴ遺伝子中に特定の変異を有する大麦植物を特定した。
【０２６５】
ｄｄＰＣＲアッセイ
コード配列配列番号１のヌクレオチド位置１２９３のＨｖＨＲＴの変異体アレルと野性型アレルとの間を特に区別するユニークなｄｄＰＣＲアッセイを設計した。前述で概略を述べたように、大麦ＨｖＨＲＴのいくつかの遺伝子配列を利用でき、この実施例で使用したｄｄＰＣＲアッセイは、栽培品種Ｈｉｍａｌａｙａ、ジェンバンク番号ＮＣＢＩ：ＡＪ００１３１７．１のゲノム配列をベースにした。変異体検出プローブは、コード配列に相補的であり、ヌクレオチド位置１２９３にＡ塩基を含んだ。参照検出プローブは、コード配列に相補的であり、ヌクレオチド位置１２９３にＧ塩基を含んだ。２つの近傍プライマーを設計して、コード配列中のヌクレオチド１２９３の周辺のゲノム配列を増幅した。
ＨｖＨＲＴ座位に特異的な次のプライマーおよびプローブを設計した：
−標的特異的順方向プライマー（配列番号１５）：
５’−ＣＡＣＧＡＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＴＧ−３’；
−標的特異的逆方向プライマー（配列番号１６）：
５’−ＴＴＧＧＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣ−３’；
−変異体特異的検出プローブ（配列番号１７）：
５’−ＡＡＧＴＧＡＴＴＴＧＡＧＣＧＧＣＴ−３’    ６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識；
−参照特異的検出プローブ（配列番号１８）：
５’−ＡＧＧＡＡＧＴＧＧＴＴＴＧＡＧＣＧ−３’    ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）で標識。
【０２６６】
ランダムに変異誘発させた大麦粒のプールを作製し、続けて、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号のｐ．６６〜６９のＷＳ１、ＷＳ２およびＷＳ３ならびに実施例１〜７に記載のように、順序付きライブラリーを作製した。前記ランダム変異誘発ライブラリーの作製に用いた大麦栽培品種は、栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎの大麦であった。
【０２６７】
ライブラリー試料が変異導入した穀物を含むか否かの判定
次のステップは、ライブラリーが所望の変異導入穀物を含むかどうかの判定であった。スクリーニングは、基本的に、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号のＷＳ３および実施例３〜７に記載されているようにし、次の詳細事項も加えて実施した：
−３７６個のサブプール（ＧＬＰ＃１〜ＧＬＰ＃３７６と命名）（合わせて、約１２０，０００変異導入大麦植物に相当）に対し、スクリーニングを実施した。
【０２６８】
各サブブール由来の１つの５μＬのｇＤＮＡ試料（ＧＴ＃１〜ＧＴ＃３７６と命名）を作製した。ｇＤＮＡ試料ＧＴ＃１〜ＧＴ＃９４をマイクロタイタープレートの個別のウェルに加えた。各ウェルは、１７μｌのＰＣＲ反応混合物も含んでいた。各ウェルをピペッティングによる下層での吸引と上層での吐出により完全に混合した。
【０２６９】
ドロップレット分析のために、ＰＣＲ用のマイクロタイタープレートをＱｘ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上にロードした。得られたデータは、ソフトウェアＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（バージョンｖ１．７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析した。閾値は、２Ｄプロットを用いて決定し、チャネル１およびチャネル２振幅の増幅に対しそれぞれ３７００および２５００に設定した。存在比率の個別の値の比較は、ｇＤＮＡ（ＧＴ＃６４）が、変異体検出に関して、任意のその他の試料より高いシグナルを与えることを示した。ｇＤＮＡ（ＧＴ＃６４）の存在比率は、９４試験ｇＤＮＡ試料全ての存在比率の平均である０．０１２％に比較して、０．０６２％であった。
【０２７０】
目的の変異を特徴とする個別の穀粒の特定
遺伝子変異を有する個別の大麦粒は、基本的に、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号のＷＳ４（ｐ．６９〜７２）および実施例８〜１５に記載されているようにし、下記の連続的に順序付けた詳細事項を含めて実施して、特定した。
１．ＨｖＨＲＴ特異的ｄｄＰＣＲアッセイを用いたＧＴ＃１〜ＧＴ＃９４由来のｇＤＮＡの分析に基づいて、４５００個の穀粒のＧＬＰ＃６４［要請試料ｇＤＮＡ（ＧＴ＃６４）に対応する］は、目的の遺伝子変異を有する１つまたは複数の穀粒を含むであろうことが高い確率で考えられた。
２．ＦＧＬＰ＃６４は、ＧＬＰ＃６４から９６ｘ１２個の穀粒試料を連続的に除去することにより確立された。各１２個の穀粒分割量を１枚の薬包紙上に置いた後、２〜３ｍｍ深さの孔を胚乳中にあけるための１．６ｍｍドリルを備えた彫刻機（Ｍａｒａｔｈｏｎ−３，Ｓａｅｙａｎｇ  Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈ）を同時に用いて、１対の鉗子で連続的に固定した。回転運動により、粉末を胚乳から穀粒およびまわりの薬包紙の上端まで移動させた。１２個の穿孔穀粒試料をマイクロタイタープレートの別の２ｍＬのウェルに置き、穿孔大麦粒ＰＤＧＬＰ＃６４の二次的サブプールを得た。それぞれ１２個の穿孔大麦粒由来の粉末を含む９６個の粉末試料を、穿孔穀粒と一致する試料ナンバリングシステムを保持している１．５ｍＬのマイクロタイタープレート（ＰＦＧＬＰ＃６４）の別のウェルに移した。
３．次に、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ９６  Ｐｌａｎｔ  ＩＩ  ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）の説明書に詳細に記載されている半自動化ＤＮＡ抽出方法を用いて、ＰＦＧＬＰ＃６４のｇＤＮＡの抽出を行った。従って、マイクロタイタープレートの各ウェルは、１２穀粒の粉末由来のｇＤＮＡを含んだ。
４．ＰＦＧＬＰ＃６４由来のｇＤＮＡを上述のように分析した。データは、ソフトウェアＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（バージョンｖ１．７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析した。閾値は、２Ｄプロットを用いて決定し、チャネル１振幅およびチャネル２振幅に対しそれぞれ３７００および２５００に設定した。存在比率の個別の値の比較は、ＰＦＧＬＰ＃６４の１つのウェルが、変異体穀粒を含むことを示した。ウェルＣ０４は、３．９２％の存在比率を示し、ヘテロ接合の変異体ＰＤＧＬＰ＃６４の存在を示した。
５．ＰＤＧＬＰ＃６４のウェルＣ０４由来の１２個全ての穀粒が発芽した。１２個全ての小植物由来の葉物質は回収され、ＲＥＤＥｘｔｒａｃｔ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ＤＮＡ抽出に供された。葉試料由来のｇＤＮＡを上述のように分析した。データは、ソフトウェアＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（バージョンｖ１．７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析した。閾値は、２Ｄプロットを用いて決定し、チャネル１振幅およびチャネル２振幅に対しそれぞれ３７００および２５００に設定した。ＰＤＧＬＰ＃６４のウェルＣ０４由来の１つの小植物は、４５％の存在比率を示し、ヘテロ接合変異体の存在を確証した。前記植物由来の種子を増殖させ、子孫を交配させてホモ接合植物を得た。ホモ接合植物を増殖させてその物質を増やした。変異ホモ接合の植物をＨＥＮＺ−２と命名した。
【０２７１】
従って、ＨＥＮＺ−２大麦植物は、配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド１２９３のＧ→Ａ変異を含む。従って、ＨＥＮＺ−２は、配列番号２のＷ４３１ｓｔｏｐ変異を含む変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を有する。
【０２７２】
実施例２Ｂ
ランダム変異誘発ライブラリーの作製に使用した大麦栽培品種が栽培品種Ｐｌａｎｅｔの大麦であったこと以外は、大麦変異体ＨＥＮＺ−２ａは、基本的に、実施例２Ａに記載されているようにして得た。同じプライマーおよびプローブを使用した。
【０２７３】
ＨＥＮＺ−２ａはまた、配列番号１のＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド１２９３のＧ→Ａ変異を含む。従って、ＨＥＮＺ−２ａはまた、配列番号２のＷ４３１ｓｔｏｐ変異を含む変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を有する。
【０２７４】
従って、ＨＥＮＺ−２は、栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎバックグラウンドを有すると見なすことができるが、一方、ＨＥＮＺ−２ａは、栽培品種Ｐｌａｎｅｔバックグラウンドを有すると見なすことができる。
【０２７５】
実施例３Ａ
ＨＥＮＺ−２大麦変異体植物ならびに対照ホモ接合大麦植物は圃場で増殖された。対照ホモ接合の植物は、実施例２Ａに記載のヘテロ接合変異体の交配から得られ、この対照ホモ接合植物は配列番号２のＨｖＨＲＴをコードする野生型ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む。従って、対照ホモ接合の植物は、それらがＨｖＨＲＴ遺伝子変異を有さないこと以外は、ＨＥＮＺ−２と同一であると考えられる。
【０２７６】
ＨＥＮＺ−２大麦変異体植物ならびに対照ホモ接合大麦植物はニュージーランド（１つの区画）およびＦｕｈｎｅｎ（５つの個別の区画）の圃場で増殖された。標準的な手順に従って、１０ｍ２当たり、３．６倍のＴＫＷが作付けされた。区画をヘクタール当たり１５０ｋｇの窒素で処理し、標準的農業手順に従って殺菌剤処理を行った。ニュージーランドでは、区画は約２ｍ２であったが、Ｆｕｈｎｅｎでは、各区画は約７．５ｍ２であった。区画を繰り返し耕作し、ＨＥＮＺ−２と対照を相互に近接して栽培した。比較のために、ＨＥＮＺ−２および対照を同じ大きさの区画で成長させた。成熟時に大麦植物を収穫し、区画当たりの穀粒の重量を測定することにより、収率を決定した。所定の数の穀粒を秤量し、１０００穀粒の重量を計算することにより、１０００穀粒の穀粒重量（ＴＫＷ）を決定した。Ｆｏｓｓ  Ｔｅｃａｔｏｒ，Ｉｎｆｒａｔｅｃ  １２４１穀粒分析器（Ｆｏｓｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、製造業者の説明書に従って、大麦粒のデンプン含量（デンプン）およびタンパク質含量（タンパク質）を近赤外分析により測定した。デンプン含量およびタンパク質含量は、総穀粒乾燥重量の乾燥デンプンまたはタンパク質の重量％として得た。選択植物の底部（第１の節間の開始部、根の直ぐ上）から穂の先端（大麦の穂を直立に保持した）までの植物高さを測定することにより、平均植物高さを測定した。所定の面積由来の植物の穂の数を計数し、ｍ２当たりの穂の数を計算することにより、ｍ２当たりの穂を決定した。
結果を下表１に示す。
【表３】
2021509580.tif 000009
【０２７７】
表１のデータが示すように、驚くべきことに、ＨＥＮＺ−２変異体と対照植物との間で、収率、ＴＫＷ、デンプン含量、タンパク質含量、植物高さおよび穂／ｍ２に有意な差異は存在しない。
【０２７８】
実施例３Ｂ
種子生存率の直接低下に繋がるために、穂発芽は極めて望ましくない。穂発芽実験を実施し、大麦変異体ＨＥＮＺ−２の穂発芽の程度を評価した。対照として、栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎおよび栽培品種Ｆｌａｇｓｈｉｐの野生型大麦の穂発芽を測定した。栽培品種Ｆｌａｇｓｈｉｐの大麦は、高レベルの穂発芽を有することが知られている。実験を次のように実施した。ＨＥＮＺ−２、ＰａｕｓｔｉａｎおよびＦｌａｇｓｈｉｐを圃場の相互に近接した個々の区画で成長させた。穀物成熟時に、各区画の一部を収穫した（収穫１）。１時間当たり１０分間、１日当たり１２時間を、１０日間にわたり、植物上に水を噴霧することにより、残りの区画の領域を灌漑し、その後、各区画領域の一部を収穫した（収穫２）。残りの区画の領域に対し、同じ灌漑計画をさらに１０日間適用した後、収穫した（収穫３）。収穫の次の日に、３種全ての収穫物に対し、発芽試験を開始した。１００個の穀粒を９．５ｃｍのペトリ皿中の濾紙上に置き、３ｍｌまたは５ｍｌの水を加えることにより、発芽試験を実施した。３日間のインキュベーション後に、発芽した穀粒の比率を計数し、発芽穀粒％として得た。収穫１と収穫２との間で発芽比率の低下がある大麦品種は、穂発芽があったと考えられ、一方、収穫１から収穫２および３の間で発芽比率が同じ、または増加がある大麦品種は、穂発芽を起こさないと考えられる。結果を表２に示す。
【表４】
2021509580.tif 000010
Ｇ．Ｒ．は、発芽比率％を示す
Ｄｉｆｆ＊は、第１と第３との収穫の平均発芽比率の間の差異を％で示す。
【０２７９】
ＨＥＮＺ−２および栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎの両方は、第１と第３の収穫の間で発芽比率が増加し、従って、これらの大麦植物のいずれも、穂発芽が起こらなかった。さらに、ＨＥＮＺ−２と栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎの間の、第１と第３の収穫の間で観察された発芽比率の増加で有意差は存在しない。対照的に、栽培品種Ｆｌａｇｓｈｉｐは、発芽比率の有意な低下があり、従って、予測されるように、穂発芽を示した。
【０２８０】
実施例３Ｃ
類似の条件下の圃場で成長させたＨＥＮＺ−２大麦変異体植物および大麦植物栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ由来の穀粒物質を、標準的発芽試験で発芽させた：
・Ｐｆｅｕｆｆｅｒ  ｇｒａｉｎ  ｓｏｒｔｅｒを用いて、穀粒をサイズで選別し、２．５および２．８ｍｍより大きい穀粒を使用した。
〇 １００個の全粒を９０ｍｍのペトリ皿中の２枚のＷｈａｔｍａｎ定性濾紙（グレード１、８５ｍｍ、カタログ番号１００１−０８５）上に置き、４ｍｌの蒸留水を加えた。
〇 別の１００個の全粒を９０ｍｍのペトリ皿中の２枚のＷｈａｔｍａｎ定性濾紙（グレード１、８５ｍｍ、カタログ番号１００１−０８５）上に置き、８ｍｌの蒸留水を加えた（高水条件）。
・ペトリ皿を閉じて、湿潤クロスで覆った暗色ボックス中、２０℃で貯蔵した。
・４ｍｌのペトリ皿を２４時間、４８時間および７２時間後にチェックし、発芽穀物（小根出現）をペトリ皿から取り出し、発芽穀粒の数を記録した。
・８ｍｌのペトリ皿を７２時間後にチェックし、発芽穀物（小根出現）をペトリ皿から取り出し、発芽穀粒の数を記録した。
【０２８１】
７２時間後の結果を、図１に示す。野生型およびＨＥＮＺ−２由来の穀粒は、４ｍｌの水中で９９．５％発芽した。これは、物質が休眠中ではなかったことを示す。水感受性（８ｍｌ）を試験した場合、ＨＥＮＺ−２は、有意により高い発芽比率を有した（野生型の４０％に対し８０％）。これは、実施例４で記載の空気流量を有する麦芽ベッド中またはタンク中で認められるような水および酸素ストレス下で、ＨＥＮＺ−２が有意により良好に機能することを示す。
【０２８２】
実施例４
類似の条件下の圃場で成長させたＨＥＮＺ−２大麦変異体植物および大麦植物栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ由来の穀粒物質を、基本的に、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４９８号の実施例１に記載されているような水を有するタンク中で、下記の詳細事項を加えて、発芽させた：２００ｇの大麦粒（乾燥重量）をタンク中、１ｍＭのＧＡ含有水で覆って４８時間インキュベーションし、同時に、１ｋｇ乾燥重量の大麦粒当たり９０Ｌ／ｈ空気流量を供給した。発芽中、２４時間および４８時間後に、穀粒含水量を測定し、結果を図２に示す。ＨＥＮＺ−２は両方の事例で、野生型に比べて、より高い穀粒含水量であり、高い発芽を示した。
【０２８３】
４８時間後に、ｄｄＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ）および示した遺伝子に特異的なプライマーとプローブを用いて、α−アミラーゼ（ａｍｙ１＿１およびａｍｙ１＿２）ならびにβ−グルカナーゼ２Ａおよび２Ｂ（ＢＧＬ２Ａ）の遺伝子発現を同じ物質で測定した。実施例２０で記載の遺伝子発現用の一般的ｄｄＰＣＲプロトコルを用いた。ＢＧＬ２Ａ発現の測定に用いたプライマーおよびプローブはまた、ＢＧＬ２Ｂを増幅および検出し、従って、ＢＧＬ２ＡおよびＢＧＬ２Ｂの合わせた発現が測定された（図３の「ＢＧＬ２Ａ」として示した）。結果を図３に示す。ＨＥＮＺ−２物質は、全ての試験した遺伝子の有意により高い発現を示し、高発芽を示した。ＢＧＬ２Ａの配列は、受入番号ＨＯＲＶＵ７Ｈｒ１Ｇ１２０４５０．１で利用可能である。
【０２８４】
α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよび限界デキストリナーゼの活性は、同一物質で２４時間後および４８時間後に、以下示す標準的Ｍｅｇａｚｙｍｅアッセイを用いて測定した。
【０２８５】
試料作製
酵素活性分析の前に、発芽穀粒試料をタングステンカーバイド粉砕リング（Ｆｏｓｓ１０００４４６３）、ニッケルメッキインペラ（Ｆｏｓｓ１０００２６６６）および１ｍｍの出口スクリーン（Ｆｏｓｓ１０００１９８９）を備えた標準的Ｆｏｓｓ  Ｃｙｃｌｏｔｅｃｈミル（Ｆｏｓｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて粉砕した。発芽大麦粒の酵素活性の全ての測定は、試料の粉砕の４８時間後以内に行われた。
【０２８６】
α−アミラーゼ活性
発芽穀粒のα−アミラーゼ活性は、上記のセクション「試料作製」で記載のように、粉末をベースにした。α−アミラーゼ活性の測定のためのアッセイは、標準的実験装置を用いるＭｅｇａｚｙｍｅからのＣｅｒａｌｐｈａ  ｋｉｔを利用した。α−アミラーゼ活性の計算を含む、製造業者のプロトコル（Ｋ−ＣＥＲＡ  ０１／１２）に従ってアッセイを実施した。
【０２８７】
β−アミラーゼ活性
発芽穀粒のβ−アミラーゼ活性を測定する場合、上記のセクション「試料作製」で記載のように、粉末を作製した。β−アミラーゼ活性アッセイは、ＭｅｇａｚｙｍｅのＢｅｔａｍｙｌ  ｋｉｔ（Ｋ−ＢＥＴＡ３）と共に提供された推奨条件に従った。
【０２８８】
限界デキストリナーゼ活性
発芽穀粒の限界デキストリナーゼ活性を測定するために、上記のセクション「試料作製」で記載のように、粉末を作製した。限界デキストリナーゼ活性は、Ｍｅｇａｚｙｍｅからの、Ｌｉｍｉｔ  Ｄｅｘｔｒｉｚｙｍｅキット、Ｔ−ＬＤＺ１０００を用いて測定した。活性測定を含むアッセイは、製造業者のプロトコル（Ｔ−ＬＤＺ１０００  ０７／９）に従って実施した。
【０２８９】
結果を図４に示す。ＨＥＮＺ−２物質は、全ての試験した酵素の有意により高い活性を示し、高発芽を示した（例外：α−アミラーゼ２４時間試料、これは通常、どのようにしても低い）。
【０２９０】
実施例５
類似の条件下の圃場で成長させたＨＥＮＺ−２大麦変異体植物および大麦植物栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ由来の穀粒物質を、基本的に、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４９８号の実施例９に記載されているような水を有するタンク中で、下記の詳細事項を加えて、発芽させた：２００ｇの大麦粒を、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４９８号の実施例８に記載されているように、１分間剥皮を行った。続けて、剥皮した大麦粒をタンクに移し、０．０１％のＨ２Ｏ２、消泡剤２０４、１ｍＭのＧＡ３を含む５００ｍｌの水で覆い、９０Ｌ／ｈの空気を通気下、２４時間インキュベーションした。これは、１００ｍｌの水当たり、１８Ｌ／ｈの空気に相当する。過剰水は排水され、穀粒は９０Ｌ／ｈの空気の通気下、２４時間インキュベーションされた。α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよび限界デキストリナーゼの活性は、発芽の２４時間および４８時間後に、実施例４で記載の標準的Ｍｅｇａｚｙｍｅアッセイを用いて測定された。加えて、これら補酵素の、ＥＢＣ１９標準（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  Ｄｅ  Ｌａ  Ｂｒａｓｓｅｒｉｅ  Ｅｔ  Ｄｅ  Ｌａ  Ｍａｌｔｅｒｉｅ（ＩＦＢＭ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た）に従って作製された麦芽中の活性も測定された。結果を、図５に示す。ＨＥＮＺ−２物質は、全ての試験した酵素の有意により高い活性を示し、高発芽を示した。ＨＥＮＺ−２に対し測定した活性は、ＥＢＣ１９標準さえも超えた。
【０２９１】
実施例６
ＨＥＮＺ−１０の名称の大麦変異体は、下記に記載のように特定および単離された。ＨＥＮＺ−１０は、ＨＢＬ１２タンパク質の翻訳中に未成熟ＳＴＯＰコドンを生ずる大麦遺伝子ＨｖＨＢＬ１２中のヌクレオチド置換を有する。アミノ酸交換は、トリプトファン２２８からＳＴＯＰへの交換である（Ｗ２２８Ｓｔｏｐ）。変異体バックグラウンドは、裸麦変種である（本明細書では、「Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１」とも呼ばれる）。裸麦植物は通常、皮麦品種に比べて、発芽中に、より高いα−アミラーゼ活性を有する。変異体のＨｖＨＢＬ１２遺伝子のコード配列は、本明細書で配列番号８として提供され、一方、変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子によりコードされる変異体タンパク質の配列は、配列番号９として提供される。
【０２９２】
単離された元の変異体大麦植物は、変異ホモ接合であった。
【０２９３】
実施例７Ａ
ＨｖＨＢＬ１２の遺伝子中に特定の変異を有する大麦変異体のｄｄＰＣＲベーススクリーニング
国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号に記載の方法を用いて、特定の変異を有する大麦植物を特定した。
【０２９４】
ｄｄＰＣＲアッセイ
野性型コード配列（ジェンバンク番号ＮＣＢＩ：ＪＸ８７８４９１．１）中のヌクレオチド位置６８４のＨｖＨＢＬ１２の変異体アレルと野性型アレルとの間を特に区別するユニークなｄｄＰＣＲアッセイを設計した。ＨｖＨＢＬ１２に対するわずかに異なる配列が利用可能であり、ｄｄＰＣＲアッセイを、ジェンバンク番号ＮＣＢＩ：ＪＸ８７８４９１．１に基づいて設計した。変異体検出プローブは、コード配列に相補的であり、ヌクレオチド位置６８４にＡ塩基を含んだ（配列番号５のヌクレオチド６８４に対応する）。参照検出プローブは、コード配列に相補的であり、ヌクレオチド位置６８４にＧ塩基を含んだ。２つの近傍プライマーを設計して、コード配列中のヌクレオチド６８４の周辺のゲノム配列を増幅した。
ＨｖＨＢＬ１２座位に特異的な次のプライマーおよびプローブを設計した：
−標的特異的順方向プライマー（配列番号１９）：
５’−ＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＣＣＧＴＴ−３’；
−標的特異的逆方向プライマー（配列番号２０）：
５’−ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＧＣＴＣＣ−３’；
−変異体特異的検出プローブ（配列番号２１）：
５’−ＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴ−３’    ６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識；
−参照特異的検出プローブ（配列番号２２）：
５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＧＴ−３’    ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）で標識。
【０２９５】
ランダムに変異誘発させた大麦粒のプールを作製し、続けて、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号のｐ．６６〜６７のＷＳ１およびＷＳ２ならびに実施例１〜２に記載のように、順序付きライブラリーを作製した。前記ランダム変異誘発ライブラリーの作製に用いた大麦栽培品種は、タイプＨｕｌｌ−ｌｅｓｓ１の大麦であった。
【０２９６】
ライブラリー試料が変異導入した穀物を含むか否かの判定
次のステップは、ライブラリーが所望の変異導入穀物を含むかどうかの判定であった。スクリーニングは、基本的に、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号のＷＳ３（ｐ．６７〜６９）および実施例３〜７に記載されているようにし、次の詳細事項も加えて実施した：
−約１２０，０００変異導入大麦植物に相当する、合計３７６個のサブプール（ＧＬＰ＃１〜ＧＬＰ＃３７６と命名）を用いて、スクリーニングを実施した。
−各サブブール由来の１つの５μＬのｇＤＮＡ試料（ＧＴ＃１〜ＧＴ＃３７６と命名）を作製した。ｇＤＮＡ試料ＧＴ＃２８３〜ＧＴ＃３７６をマイクロタイタープレートの個別のウェルに加えた。各ウェルは、１７μｌのＰＣＲ反応混合物も含んでいた。各ウェルをピペッティングによる下層での吸引と上層での吐出により完全に混合した。
【０２９７】
ドロップレット分析のために、ＰＣＲ用のマイクロタイタープレートをＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上にロードした。得られたデータは、ソフトウェアＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（バージョンｖ１．７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析した。閾値は、２Ｄプロットを用いて決定し、チャネル１およびチャネル２振幅の増幅に対しそれぞれ３５００および１５００に設定した。存在比率の個別の値の比較は、ｇＤＮＡ（ＧＴ＃２９１）が、変異体検出に関して、任意のその他の試料より高いシグナルを与えることを示した。ｇＤＮＡ（ＧＴ＃２９１）の存在比率は、９４試験ｇＤＮＡ試料全ての存在比率の平均である０．００９４％に比較して、０．１０５％であった。
【０２９８】
目的の変異を特徴とする個別の穀粒の特定
遺伝子変異を有する個別の大麦粒は、基本的に、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号のＷＳ４（ｐ．６９〜７２）および実施例８〜１５に記載されているようにし、下記の連続的に順序付けた詳細事項を含めて実施して、特定した。
６．ＨｖＨＢＬ１２特異的ｄｄＰＣＲアッセイを用いたＧＴ＃２８３〜ＧＴ＃３７６由来のｇＤＮＡの分析に基づいて、４５００個の穀粒のＧＬＰ＃２９１［陽性試料ｇＤＮＡ（ＧＴ＃２９１）に対応する］は、目的の遺伝子変異を有する１つまたは複数の穀粒を含むであろうことが高い確率で考えられた。
７．ＦＧＬＰ＃２９１は、ＧＬＰ＃２９１から９６ｘ１２個の穀粒試料を連続的に除去することにより確立された。各１２個の穀粒分割量を１枚の薬包紙上に置いた後、２〜３ｍｍ深さの孔を胚乳中にあけるための１．６ｍｍドリルを備えた彫刻機（Ｍａｒａｔｈｏｎ−３，Ｓａｅｙａｎｇ  Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈ）を同時に用いて、１対の鉗子で連続的に固定した。回転運動により、粉末を胚乳から穀粒およびまわりの薬包紙の上端まで移動させた。１２個の穿孔穀粒試料をマイクロタイタープレートの別の２ｍＬのウェルに置き、穿孔大麦粒ＰＤＧＬＰ＃２９１の二次的サブプールを得た。それぞれ１２個の穿孔大麦粒由来の粉末を含む９６個の粉末試料を、穿孔穀粒と一致する試料ナンバリングシステムを保持している１．５ｍＬのマイクロタイタープレート（ＰＦＧＬＰ＃２９１）の別のウェルに移した。
８．次に、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ９６  Ｐｌａｎｔ  ＩＩ  ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）の説明書に詳細に記載されている半自動化ＤＮＡ抽出法を用いて、ＰＦＧＬＰ＃２９１のｇＤＮＡの抽出を行った。従って、マイクロタイタープレートの各ウェルは、１２穀粒の粉末由来のｇＤＮＡを含んだ。
９．ＰＦＧＬＰ＃２９１由来のｇＤＮＡを上述のように分析した。データは、ソフトウェアＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（バージョンｖ１．７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析した。閾値は、２Ｄプロットを用いて決定し、チャネル１振幅およびチャネル２振幅に対しそれぞれ４０００および１５００に設定した。１２．５％、４．４２％および７．３％の存在比率を示すマイクロタイタープレートの３つの個別のウェル（Ｅ０３、Ｅ１１、Ｇ０１）を特定し、全てが３つの独立したウェル中のＰＤＧＬＰ＃２９１の３つの個別の変異体の存在を示した。
１０．ＰＤＧＬＰ＃２９１のウェルＧ０１由来の１２個全ての穀粒が発芽した。１２個全ての小植物由来の葉物質は回収され、ＲＥＤＥｘｔｒａｃｔ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ＤＮＡ抽出に供された。葉試料由来のｇＤＮＡを上述のように分析した。データは、ソフトウェアＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（バージョンｖ１．７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析した。閾値は、２Ｄプロットを用いて決定し、チャネル１振幅およびチャネル２振幅に対しそれぞれ６０００および２０００に設定した。ＰＤＧＬＰ＃２９１のウェルＨ０１由来の１つの小植物は、９６．９％の存在比率を示し、ホモ接合変異体の存在を確証した。前記植物を増殖させてその物質を増やした。変異ホモ接合の植物をＨＥＮＺ−１０と命名した。
【０２９９】
従って、ＨＥＮＺ−１０大麦植物は、ＨｖＨＢＬ１２コード配列（配列番号５）のヌクレオチド６８４のＧ→Ａ変異を含む。従って、ＨＥＮＺ−１０は、コード配列配列番号８を含むＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む。従って、ＨＥＮＺ−１０は、Ｗ２２８ｓｔｏｐ変異を含む変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を有する。
【０３００】
実施例７Ｂ
ランダム変異誘発ライブラリーの作製に使用した大麦栽培品種が栽培品種Ｐｌａｎｅｔの大麦であったこと以外は、大麦変異体ＨＥＮＺ−６１は、基本的に、実施例７Ａに記載されているようにして得た。同じプライマーおよびプローブを使用した。
【０３０１】
ＨＥＮＺ−６１はまた、コード配列配列番号８を含むＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む。従って、ＨＥＮＺ−６１はまた、Ｗ２２８ｓｔｏｐ変異を含む変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を有する。
【０３０２】
従って、ＨＥＮＺ−１０は、Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１バックグラウンドを有すると見なすことができるが、一方、ＨＥＮＺ−６１は、栽培品種Ｐｌａｎｅｔバックグラウンドを有すると見なすことができる。
【０３０３】
実施例８Ａ
ＨＥＮＺ−１０大麦変異体植物およびＨｕｌｌ−ｌｅｓｓ１大麦植物は、圃場中の区画で類似の条件下、栽培された。平均植物高さを含む種々の農学的特徴を特定した。ＨＥＮＺ−１０大麦変異体植物は、目視検査では健全であるように見えた。５つの圃場試験区中の区画当たりの選択植物の底部（第１の節間の開始部、根の直ぐ上）から穂の先端（大麦の穂を直立に保持した）までの植物高さを測定することにより、平均植物高さを測定した。結果を、図１０に示す。興味深いことに、ＨＥＮＺ大麦変異体植物と親Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１大麦植物との間で、植物高さの差異は観察されなかった。
【０３０４】
ＨＥＮＺ−１０大麦変異体植物ならびにＨｕｌｌ−ｌｅｓｓ１大麦植物はニュージーランド（１つの区画）およびＦｕｈｎｅｎ（５つの個別の区画）の圃場で増殖された。増殖、区画サイズ、などは、基本的には上記実施例３Ａに記載の通りとした。収率、１０００穀粒の穀粒重量（ＴＫＷ）、デンプン含量（デンプン）（総穀粒乾燥重量の乾燥型デンプン％として）、タンパク質含量（タンパク質）（総穀粒乾燥重量の乾燥型タンパク質％として）、植物高さおよび穂／ｍ２は、上記実施例３Ａで記載のように測定した。
【表５】
2021509580.tif 000011
【０３０５】
表１のデータが示すように、驚くべきことに、ＨＥＮＺ−１０変異体と対照植物との間で、収率、ＴＫＷ、デンプン含量、タンパク質含量、植物高さに有意な差異は存在しない。
【０３０６】
実施例８Ｂ
ＨＥＮＺ−６１大麦変異体植物ならびに栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦植物は、圃場で個別に、しかし、近くの区画で増殖された。収率、１０００穀粒の穀粒重量（ＴＫＷ）、デンプン含量（デンプン）、タンパク質含量（タンパク質）、植物高さおよび穂／ｍ２は、上記実施例３Ａで記載のように測定した。
【０３０７】
ＨＥＮＺ−６１大麦変異体植物は、栽培品種Ｐｌａｎｅｔと類似の、収率、１０００穀粒の穀粒重量（ＴＫＷ）、デンプン含量（デンプン）、タンパク質含量（タンパク質）、植物高さおよび／または穂／ｍ２を有することが予測される。
【０３０８】
実施例９
類似の条件下の圃場で成長させたＨＥＮＺ−１０大麦変異体植物およびＨｕｌｌ−ｌｅｓｓ１大麦植物由来の穀粒物質を、以下のペトリ皿中の標準的発芽試験で発芽させた：
・Ｐｆｅｕｆｆｅｒ  ｇｒａｉｎ  ｓｏｒｔｅｒを用いて、穀粒をサイズで選別し、２．５および２．８ｍｍより大きい穀粒を使用した。
・１００個の全粒を９０ｍｍのペトリ皿中の２枚のＷｈａｔｍａｎ定性濾紙（グレード１、８５ｍｍ、カタログ番号１００１−０８５）上に置き、４ｍｌの蒸留水を加えた。
・別の１００個の全粒を９０ｍｍのペトリ皿中の２枚のＷｈａｔｍａｎ定性濾紙（グレード１、８５ｍｍ、カタログ番号１００１−０８５）上に置き、８ｍｌの蒸留水を加えた。
・ペトリ皿を閉じて、湿潤クロスで覆った暗色ボックス中、２０℃で貯蔵した。
・４ｍｌのペトリ皿を２４時間、４８時間および７２時間後にチェックし、発芽穀物（小根出現）をペトリ皿から取り出し、発芽穀粒の数を記録した。
・８ｍｌのペトリ皿を７２時間後にチェックし、発芽穀物（小根出現）をペトリ皿から取り出し、発芽穀粒の数を記録した。
【０３０９】
７２時間後の結果を、図６に示す。野生型Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１およびＨＥＮＺ−１０由来の穀粒は、４ｍｌの水中でそれぞれ、９８および９７．５％まで発芽した。これは、物質が休眠中ではなかったことを示す。水感受性（８ｍｌ）を試験した場合、ＨＥＮＺ−１０は、有意により高い発芽比率を有した（野生型の８９％に対し１００％）。これは、実施例４で記載の空気流量を有する麦芽ベッド中またはタンク中で認めることができる条件の水および酸素ストレス下で、ＨＥＮＺ−１０がより良好に機能することを示す。
【０３１０】
実施例１０
類似の条件下の圃場で成長させたＨＥＮＺ−１０大麦変異体植物およびＨｕｌｌ−ｌｅｓｓ１大麦植物由来の穀粒物質を、震盪機上の水を満たした三角フラスコ中、室温で４８時間発芽させた。４８時間後に、ｄｄＰＣＲおよび示した遺伝子に特異的なプライマーとプローブを用いて、α−アミラーゼ（ａｍｙ１＿１およびａｍｙ１＿２）、限界デキストリナーゼ（ＬＤ）、α−グルコシダーゼ９７（ＡＧＬ９７）およびβ−グルカナーゼ２Ａおよび２Ｂ（ＢＧＬ２ＡおよびＢＧＬ２Ｂ）の遺伝子発現を測定した。結果を、図７に示す。ＢＧＬ２Ｂの配列は、受入番号ＨＯＲＶＵ１Ｈｒ１Ｇ０５７６８０．１で利用可能である。ＨＥＮＺ−１０物質は、全ての試験した遺伝子の発現が増大し、そのＨｕｌｌ−ｌｅｓｓ１野生型親に比べて、高発芽を示した。Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１大麦では、例えば、早期の高α−アミラーゼにより示されるように、多くの野生型皮麦栽培品種に比べて、胚乳改変がより早期に開始されることに留意されたい。従って、ＨＥＮＺ−１０は、Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１に比べて、全ての試験した遺伝子の増大した発現を示すことに留意すべきである。従って、Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１が早期の高α−アミラーゼを既に有しているにもかかわらず、ＨＥＮＺ−１０はそれでも、さらに高いα−アミラーゼ活性を有する。
【０３１１】
実施例１１
類似の条件下の圃場で成長させたＨＥＮＺ−１０大麦変異体およびＨｕｌｌ−ｌｅｓｓ１大麦植物由来の穀粒物質を、基本的に、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４９８号の実施例１に記載されているような水を有するタンク中で、下記の詳細事項を加えて、発芽させた：２００ｇの大麦粒（乾燥重量）をタンク中、１ｍＭのＧＡ含有水で覆って４８時間インキュベーションし、同時に、９０Ｌ／ｈ空気流量を供給した。α−アミラーゼ（ａｍｙ１＿１およびａｍｙ１＿２）、限界デキストリナーゼ（ＬＤ）およびβ−グルカナーゼ２Ａ（ＢＧＬ２Ａ）の遺伝子発現を、示した遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを用いて、ｄｄＰＣＲにより４８時間後測定した。実施例２０で記載の遺伝子発現用の一般的ｄｄＰＣＲプロトコルを用いた。結果を、図８に示す。ＨＥＮＺ−１０物質は、全ての試験した遺伝子の有意により高い発現を示し、野生型Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１大麦に比べて、高発芽を示した。
【０３１２】
α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよび限界デキストリナーゼの活性を、同一物質で２４時間後および４８時間後に、実施例４で記載の標準的Ｍｅｇａｚｙｍｅアッセイを用いて測定した。結果を、図９に示す。ＨＥＮＺ−１０物質は、全ての試験した酵素のより高い活性を示し、高発芽を示した。
【０３１３】
実施例１２Ａ
ＨＥＮＺ−５０と呼ばれる大麦植物を、基本的に上記実施例２Ａで記載のようにして特定および単離した。ＨＥＮＺ−５０は、コード配列中に未成熟ＳＴＯＰを含む遺伝子を生ずる大麦遺伝子ＷＲＫＹ３８中のヌクレオチド置換を有する。従って、ＨＥＮＺ−５０は、ＨｖＷＲＫＹ３８（配列番号１０）のコード配列のヌクレオチド６００のＧ→Ａ変異を有する。大麦栽培品種Ｉｎｇｒｉｄ由来のＷＲＫＹ３８のコード配列は、本明細書で配列番号１０として提供される。大麦由来の２つの異なる野生型ポリペプチド配列ＷＲＫＹ３８は、配列番号１１および配列番号１２として提供される。ＨＥＮＺ−５０大麦植物は、大麦遺伝子ＨｖＷＲＫＹ３８中に未成熟ＳＴＯＰ（Ｗ２００Ｓｔｏｐ）を生じさせる点変異を有する。変異は、ＷＫＲＹモチーフのシグネチャ配列ＷＲＫＹＧＱＫ（配列番号１１または１２のａａ２００〜２０６）の開始点に位置する。ＨＥＮＺ−５０の変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子は、配列番号１４の配列を有する変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする。
【０３１４】
ＨＥＮＺ−５０大麦変異体植物は、基本的に、実施例２Ａに記載されているようにしてランダム変異誘発により作成された大麦栽培品種Ｐｌａｎｅｔ  Ｍ２変異体集団中で特定された。ＨＥＮＺ−５０は、ｄｄＰＣＲアッセイで次のプライマーおよびプローブを使用したこと以外は、基本的に上記実施例２Ａで記載のようにして特定および単離された。
標的特異的順方向プライマー（配列番号２３）
５’−ＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧ−３’
標的特異的逆方向プライマー（配列番号２４）
５’−ＴＧＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣ−３’
変異体特異的検出プローブ（配列番号２５）
５’−ＣＣＡＡＴＧＡＣＧＣＡＡＧＴＡＣＧ−３’    ＦＡＭで標識
参照物質特異的検出プローブ（配列番号２６）
５’−ＴＡＣＣＡＡＴＧＧＣＧＣＡＡＧＴＡ−３’    ＨＥＸで標識。
【０３１５】
実施例１２Ｂ
大麦変異体ＨＥＮＺ−５０および野生型大麦の栽培品種Ｐｌａｎｅｔをデンマークの温室中、類似の条件下で成長させた。１００個の穀粒のそれぞれを、１００ｍｌの脱イオン水を満たし、パラフィンで密封し、２５０ｒｐｍの振盪機上に置いた２５０ｍｌの三角フラスコ中で発芽させる。発芽中、穀粒はＨ２Ｏ中に常に浸漬される。フラスコ中の空気は別にして、空気は供給されない。
【０３１６】
α−アミラーゼの活性は、実施例４で記載の標準的Ｍｅｇａｚｙｍｅアッセイを用いて、発芽の開始の（すなわち、穀粒が水中に浸漬された時間から）７２時間後に測定される。
【０３１７】
ＨＥＮＺ−５０は、栽培品種Ｐｌａｎｅｔに比べて、有意により高いα−アミラーゼ活性を有することが予測される。
【０３１８】
実施例１３Ａ
ＨＥＮＺ−４３と呼ばれる大麦植物を、基本的に上記実施例２Ａで記載のようにして特定および単離した。ＨＥＮＺ−４３は、ａｍｙ１＿１クラスターの大麦α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター中にヌクレオチド置換を有する。変異は、タンデム型リピートＷ−ボックスの変異を生じ、これにより次の配列の非標準タンデム型リピートＷ−ボックスをもたらす：ＴＧＡＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＣ（配列番号３５）。換言すれば、ＨＥＮＺ−４３では、ａｍｙ１＿１遺伝子の野生型ＴＴＧＡＣＣ配列がＴＴＧＡＴＣに改変された。図１１Ａは、種々の野生型α−アミラーゼプロモーターの部分配列と、ＨＥＮＺ−４３変異体のａｍｙ１＿１クラスターの大麦α−アミラーゼ遺伝子との間の整列を示す。
【０３１９】
ランダム変異誘発ライブラリーの作製に使用した大麦栽培品種が栽培品種Ｐｌａｎｅｔの大麦であったこと、ならびにｄｄＰＣＲアッセイに次のプライマーおよびプローブを使用したこと以外は、ＨＥＮＺ−４３大麦変異体植物は、基本的に、実施例２Ａに記載されているようにして特定および単離された。
標的特異的順方向プライマー（配列番号２７）
５’−ＡＡＡＣＡＧＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＴＡＡＣ−３’
標的特異的逆方向プライマー（配列番号２８）
５’−ＧＣＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＣＡＴ−３’
変異体特異的検出プローブ（配列番号２９）
５’−ＡＧＧＣＡＣＣＧＡＴＣＡＡＴＡＣＧ−３’    ＦＡＭで標識
参照物質特異的検出プローブ（配列番号３０）
５’−ＡＡＧＧＣＡＣＣＧＧＴＣＡＡＴＡＣ−３’    ＨＥＸで標識。
【０３２０】
実施例１３Ｂ
ＨＥＮＺ−４３大麦変異体植物ならびに栽培品種Ｐｌａｎｅｔの野生型大麦植物は、圃場で個別に、しかし、近くの区画で増殖された。収率、１０００穀粒の穀粒重量（ＴＫＷ）、デンプン含量（デンプン）、タンパク質含量（タンパク質）、植物高さおよび穂／ｍ２は、上記実施例３Ａで記載のように測定した。
【０３２１】
ＨＥＮＺ−４３大麦変異体植物は、栽培品種Ｐｌａｎｅｔと類似の、収率、１０００穀粒の穀粒重量（ＴＫＷ）、デンプン含量（デンプン）、タンパク質含量（タンパク質）、植物高さおよび／または穂／ｍ２を有することが予測される。
【０３２２】
実施例１４
ＨＥＮＺ−５３およびＨＥＮＺ−５４と呼ばれる２種の大麦植物を、基本的に上記実施例２Ａで記載のようにして特定および単離した。
【０３２３】
ＨＥＮＺ−５３は、ＨｖＨＲＴ（配列番号１）のコード配列のヌクレオチド５１０のＧ→Ａ変異を有する。従って、ＨＥＮＺ−５３は、Ｗ１７０Ｓｔｏｐ変異を含む変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を有する。
【０３２４】
前記ランダム変異誘発ライブラリーの作製に使用した大麦栽培品種がタイプＰｌａｎｅｔの大麦であったこと、ならびにｄｄＰＣＲアッセイに次のプライマーおよびプローブを使用したこと以外は、ＨＥＮＺ−５３大麦変異体植物は、基本的に、本明細書の上記実施例２Ａに記載されているようにして特定および単離された：
標的特異的順方向プライマー（配列番号７３）
５’−  ＧＴＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＧＴＡＴＴ−３’
標的特異的逆方向プライマー（配列番号７４）
５’−  ＴＣＴＴＣＧＣＧＡＣＧＡＣＡＣ−３’
変異体特異的検出プローブ（配列番号７５）
５’−ＴＧＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡ−３’    ＦＡＭ（商標）で標識
参照物質特異的検出プローブ（配列番号７６）
５’−ＴＧＣＡＴＧＧＡＡＴＡＡＡＣＴＧＣＡＧ−３’    ＨＥＸ（商標）で標識。
【０３２５】
ＨＥＮＺ−５４は、ＨｖＨＲＴ（配列番号１）のコード配列のヌクレオチド１１１３のＧ→Ａ変異を有する。従って、ＨＥＮＺ−５４は、Ｗ３７１Ｓｔｏｐ変異を含む変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を有する。
【０３２６】
前記ランダム変異誘発ライブラリーの作製に使用した大麦栽培品種がタイプＰｌａｎｅｔの大麦であったこと、ならびにｄｄＰＣＲアッセイに次のプライマーおよびプローブを使用したこと以外は、ＨＥＮＺ−５４大麦変異体植物は、基本的に、本明細書の上記実施例２Ａに記載されているようにして特定および単離された：
標的特異的順方向プライマー（配列番号７７）
５’−ＴＧＣＴＡＡＴＣＣＡＡＧＣＡＡＡＣＧ−３’
標的特異的逆方向プライマー（配列番号７８）
５’−ＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＴＧＧＡ−３’
変異体特異的検出プローブ（配列番号７９）
５’−ＡＧＣＣＴＧＡＣＡＡＡＣＣＡＧＴＧ−３’    ＦＡＭ（商標）で標識
参照物質特異的検出プローブ（配列番号８０）
５’−ＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＡＡＣＣＡＧ−３’    ＨＥＸ（商標）で標識。
【０３２７】
実施例１５
大麦変異体ＨＥＮＺ−２、野生型大麦の栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ、大麦変異体ＨＥＮＺ−１０および野生型大麦Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１大麦を類似の条件下、ニュージーランドの圃場で成長させた。それぞれの大麦由来の１００個の穀粒を、１００ｍｌの脱イオン水を満たし、パラフィンで密封し、２５０ｒｐｍの振盪機上に置いた２５０ｍｌの三角フラスコ中で発芽させた。発芽中、穀粒はＨ２Ｏ中に常に浸漬された。１００ｍｌの水当たり、９Ｌ／ｈの空気流量の空気を水中に導入した。穀粒を水中、通気下で４８時間または７２時間インキュベーションした。
【０３２８】
α−アミラーゼの活性は、実施例４で記載の標準的Ｍｅｇａｚｙｍｅアッセイを用いて、発芽の開始の（すなわち、穀粒が水中に浸漬された時間から）４８時間後および７２時間後に測定された。
【０３２９】
結果は、図１３Ａおよび図１３Ｂに示されている。図１３Ａは、ＨＥＮＺ−２および栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ（野生型）のα−アミラーゼ活性を示す。図１３Ｂは、ＨＥＮＺ−１０およびＨｕｌｌ−ｌｅｓｓ１大麦（野生型）のα−アミラーゼ活性を示す。ＨＥＮＺ−２およびＨＥＮＺ−１０の両方は、それぞれの野生型対照に比べて、増大したα−アミラーゼ活性を有する。
【０３３０】
実施例１６
大麦変異体ＨＥＮＺ−１０および野生型大麦Ｈｕｌｌ−ｌｅｓｓ１を類似の条件下、ニュージーランドの圃場で成長させた。それぞれの大麦由来の１００個の穀粒を、１００ｍｌの脱イオン水を満たし、パラフィンで密封し、２５０ｒｐｍの振盪機上に置いた２５０ｍｌの三角フラスコ中で発芽させた。発芽中、穀粒はＨ２Ｏ中に常に浸漬された。フラスコ中の空気は別にして、空気は供給しなかった。
【０３３１】
α−アミラーゼの活性は、実施例４で記載の標準的Ｍｅｇａｚｙｍｅアッセイを用いて、発芽の開始の（すなわち、穀粒が水中に浸漬された時間から）２４時間後、４８時間後および７２時間後に測定された。
【０３３２】
結果を、図１４に示す。図１４は、ＨＥＮＺ−１０およびＨｕｌｌ−ｌｅｓｓ１大麦（野生型）のα−アミラーゼ活性を示す。ＨＥＮＺ−１０は、特に、７２時間後、α−アミラーゼ活性が有意に増大した。
【０３３３】
実施例１７
大麦変異体ＨＥＮＺ−２ａ、大麦変異体ＨＥＮＺ−５４、大麦変異体ＨＥＮＺ−４３および野生型大麦の栽培品種Ｐｌａｎｅｔを類似の条件下、デンマークの温室で成長させた。それぞれの大麦由来の１００個の穀粒を、１００ｍｌの脱イオン水を満たし、パラフィンで密封し、２５０ｒｐｍの振盪機上に置いた２５０ｍｌの三角フラスコ中で発芽させた。発芽中、穀粒はＨ２Ｏ中に常に浸漬された。フラスコ中の空気は別にして、空気は供給しなかった。
【０３３４】
α−アミラーゼの活性は、実施例４で記載の標準的Ｍｅｇａｚｙｍｅアッセイを用いて、発芽の開始の（すなわち、穀粒が水中に浸漬された時間から）７２時間後に測定された。
【０３３５】
結果を図１５に示し、これは、上段パネルでＨＥＮＺ−２ａ、中段パネルでＨＥＮＺ−５４および下段パネルでＨＥＮＺ−４３のα−アミラーゼ活性を示す。ＨＥＮＺ−２ａ、ＨＥＮＺ−５４およびＨＥＮＺ−４３は全て、α−アミラーゼ活性が有意に増大した。
【０３３６】
実施例１８
ＨＥＮＺ−２変異体大麦および実施例３Ａで記載の類似の条件で成長させた対照ホモ接合の大麦植物から穀粒を得た。
【０３３７】
５０個の穀粒を円錐形フラスコ中、２０℃で２４時間浸漬した（含水量約４０％に達した）。浸漬穀粒をペトリ皿（２ｍｌ  Ｈ２Ｏ）に移し、発芽させた。試料を浸漬後０、１２、２４および４８時間後（すなわち、穀粒をペトリ皿に移した時間後）に収集した。時点毎に３つの生物学的複製物を個別のペトリ皿中で作成した。３００ｎｇの合計ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、その後１０ｘに希釈した。試料毎に、３つの技術的ｃＤＮＡ副生物を作製した（従って、処理当たり系統当たり合計９つの副生物）。
【０３３８】
ａｍｙ１＿１、ａｍｙ１＿２およびａｍｙ２遺伝子からのｍＲＮＡの発現を、次のプライマーおよびプローブを用いてｄｄＰＣＲにより測定した。実施例２０で記載の遺伝子発現用の一般的ｄｄＰＣＲプロトコルを用いた。全てのアッセイを当該ｃＤＮＡ配列の３’末端で設計した。
【表６】
2021509580.tif 000012
【０３３９】
結果を、図１６に示す。図中、対照は「ＷＴ」と表示される。ＨＥＮＺ−２は、対照に比べて、分析した全てのａｍｙ遺伝子の転写物が増大した。ａｍｙ１発現は、ａｍｙ２発現より早期に影響を受けたように見えた。
【０３４０】
実施例１９
類似の条件下、デンマークの温室で成長させた大麦変異体ＨＥＮＺ−２ａ、大麦変異体ＨＥＮＺ−５４、大麦変異体ＨＥＮＺ−４３および野生型大麦の栽培品種Ｐｌａｎｅｔ由来の穀粒物質を使用した。１００個の穀粒を、１００ｍｌのＨ２Ｏを満たし、パラフィンで密封し、２５０ｒｐｍの振盪機上に置いた２５０ｍｌの三角フラスコ中で発芽させた。発芽中、穀粒はＨ２Ｏ中に常に浸漬された。フラスコ中の空気は別にして、空気は供給しなかった。
【０３４１】
α−アミラーゼ（ａｍｙ１＿１、ａｍｙ１＿２およびａｍｙ２）、限界デキストリナーゼ（ＬＤ）の遺伝子発現、およびβ−グルカナーゼ２Ａおよび２Ｂの両方（まとめて「ｂｇｌ２」と表記）の発現を７２時間後、下記に示したプライマーおよびプローブを用いて、ｄｄＰＣＲにより測定した。β−グルカナーゼ２Ａおよび２Ｂの両方は、同じプライマーおよびプローブを用いて増幅および検出できる。
【表７】
2021509580.tif 000013
【０３４２】
結果を、図１７〜２０に示す。ＨＥＮＺ−２ａ、ＨＥＮＺ−５４およびＨＥＮＺ−４３は全て、ａｍｙ１＿１、ａｍｙ１＿２およびａｍｙ２からの、限界デキストリナーゼ（ＬＤ）の、ｂｇｌ２遺伝子からの発現が増大した。
【０３４３】
実施例２０
遺伝子発現を標準的方法を用いてｄｄＰＣＲにより測定した。より具体的には、ＲＮＡは通常、最初にトリゾール（Ｑｉａｇｅｎ  ＃１５５９６０２６）プロトコルを用いて、続けて、Ａｕｒｕｍ（商標）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＃７３２６８２０）で洗浄して、凍結乾燥穀粒粉末（約５０ｍｇ）から抽出した。Ｂｉｏ−ＲａｄのｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（＃１７０８８９１）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【０３４４】
ｄｄＰＣＲ分析のために、各試料をプライマー、プローブ（ＦＡＭまたはＨＥＸで標識）、ｄｄＰＣＲ反応成分、ｄｄＰＣＲスーパーミックス（ｄＵＴＰなし）および水（ＢｉｏＲａｄ）と混合した。ドロップレットの生成（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ２００（商標）  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ＃１８６４１０１）の前に、試料を混合した。ドロップレットプレートをサーマルサイクラーでインキュベーションした。
【０３４５】
ＦＡＭおよび／またはＨＥＸ陽性ドロップレットの存在は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ２００（商標）ドロップレットリーダーで検出し、Ｂｉｏ−ＲａｄのＱｕａｎｔａｓｏｆｔソフトウェアを用いて解析した。
【０３４６】
参考文献
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６．Ｍａｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｎｄｌａｃｈ，Ｈ．，Ｈｉｍｍｅｌｂａｃｈ，Ａ．，Ｂｅｉｅｒ，Ｓ．，Ｔｗａｒｄｚｉｏｋ，Ｓ．Ｏ．，Ｗｉｃｋｅｒ，Ｔ．，＆  Ｂａｙｅｒ，Ｍ．（２０１７）．Ａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｒｄｅｒｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｒｌｅｙ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ，５４４（７６５１），４２７−４３３．Ｎａｋａｔａ  Ｍ，Ｆｕｋａｍａｔｓｕ  Ｙ，Ｍｉｙａｓｈｉｔａ  Ｔ，Ｈａｋａｔａ  Ｍ，Ｋｉｍｕｒａ  Ｒ，Ｎａｋａｔａ  Ｙ，Ｋｕｒｏｄａ  Ｍ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｔ  ａｎｄ  Ｙａｍａｋａｗａ  Ｈ（２０１７）Ｈｉｇｈ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｉｃｅ  ＿−Ａｍｙｌａｓｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ  Ｃｈａｌｋｙ  Ｇｒａｉｎｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．８：２０８９．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｌｓ．２０１７．０２０８９
７．Ｒａｖｅｎｔoｓ，Ｄ．，Ｓｋｒｉｖｅｒ，Ｋ．，Ｓｃｈｌｅｉｎ，Ｍ．，Ｋａｒｎａｈｌ，Ｋ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｗ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．，＆  Ｍｕｎｄｙ，Ｊ．（１９９８）．ＨＲＴ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｆｒｏｍ  ｂａｒｌｅｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３（３６），２３３１３−２３３２０．Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．６２（４）：１４７−１５４
８．Ｓｏｎ，Ｏ．，Ｈｕｒ，Ｙ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｍ．Ｒ．，＆  Ｐａｒｋ，Ｊ．（２０１０）．ＡＴＨＢ１２，ａｎ  ＡＢＡ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ（ＨＤ−Ｚｉｐ）ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔｅｍ  ｂｙ  ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ２０−ｏｘｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ．Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，５１（９），１５３７−１５４７．
９．Ｖａｌｄeｓ，Ａ．Ｅ．，Oｖｅｒｎaｓ，Ｅ．，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｈ．，Ｒａｄａ−Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ａ．，＆  Ｅｎｇｓｔｒoｍ，Ｐ．（２０１２）．Ｔｈｅ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ（ＨＤ−Ｚｉｐ）ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＡＴＨＢ７  ａｎｄ  ＡＴＨＢ１２  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２Ｃ  ａｎｄ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｐｌａｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，８０（４−５），４０５−４１８．
１０．Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｗｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ａｌｅｕｒｏｎｅ  Ｃｅｌｌｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４８，ｐｐ．１７６−１８６
【図１】
2021509580.tif 000014
【図２】
2021509580.tif 000015
【図３】
2021509580.tif 000016
【図４Ａ】
2021509580.tif 000017
【図４Ｂ】
2021509580.tif 000018
【図４Ｃ】
2021509580.tif 000019
【図５Ａ】
2021509580.tif 000020
【図５Ｂ】
2021509580.tif 000021
【図５Ｃ】
2021509580.tif 000022
【図６】
2021509580.tif 000023
【図７】
2021509580.tif 000024
【図８】
2021509580.tif 000025
【図９Ａ】
2021509580.tif 000026
【図９Ｂ】
2021509580.tif 000027
【図９Ｃ】
2021509580.tif 000028
【図１０】
2021509580.tif 000029
【図１１Ａ】
2021509580.tif 000030
【図１１Ｂ】
2021509580.tif 000031
【図１２】
2021509580.tif 000032
【図１３Ａ】
2021509580.tif 000033
【図１３Ｂ】
2021509580.tif 000034
【図１４】
2021509580.tif 000035
【図１５】
2021509580.tif 000036
【図１６Ａ】
2021509580.tif 000037
【図１６Ｂ】
2021509580.tif 000038
【図１６Ｃ】
2021509580.tif 000039
【図１７】
2021509580.tif 000040
【図１８】
2021509580.tif 000041
【図１９】
2021509580.tif 000042
【図２０】
2021509580.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月30日(2019.12.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大麦植物またはその一部であって、
・ＨｖＨＲＴ遺伝子中に、少なくとも配列番号２の１１８個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＲＴタンパク質をコードする変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子をもたらす変異、または少なくとも前記ＨｖＨＲＴ遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、前記ＨｖＨＲＴ遺伝子のコード領域が配列番号２のポリペプチドをコードする；および／または
・ＧＡＲＥボックス中に変異を含む変異体α−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・ＧＡＲＥボックス中に変異を含む、または配列ＴＡＡＣＡＡＡを有する変異体α−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に、配列番号６の１つまたは複数のアミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子をもたらす変異、または少なくとも前記ＨｖＨＢＬ１２遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、前記ＨｖＨＢＬ１２遺伝子のコード領域が配列番号６のポリペプチドをコードする；および／または
・非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも４種のα−アミラーゼ遺伝子を有し、前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスが配列（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）を含み、１つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、Ｘは任意のヌクレオチドでよく、ｎは０または１、ｍは０〜２０の範囲の整数である；および／または
・非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む、ａｍｙ２クラスター中の少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子を有する；および／または
・ＷＲＫＹ３８遺伝子中に、配列番号１１および配列番号１２の両方に存在する１つまたは複数のアミノ酸を欠く変異体ＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＷＲＫＹ３８遺伝子をもたらす変異、または少なくとも前記ＷＲＫＹ３８遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、前記ＷＲＫＹ３８遺伝子のコード領域が配列番号１１または配列番号１２のポリペプチドをコードする、大麦植物またはその一部。
【請求項２】
コドン１〜４３１のいずれか１つに未成熟停止コドンを有する変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、請求項１に記載の大麦植物。
【請求項３】
配列番号１の前記ＨｖＨＲＴコード配列のヌクレオチド１２９３のＧ→Ａ変異を含む変異体ＨｖＨＲＴ遺伝子を含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項４】
ａ．前記ＧＡＲＥボックス中に変異を含む変異体α−アミラーゼプロモーターを含み、前記ヌクレオチドＴＡＡＣＡＲＡの１つが置換または欠失されている少なくとも１種のα−アミラーゼ遺伝子、および／または
ｂ．前記配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含む少なくとも５種のα−アミラーゼ遺伝子、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項５】
前記配列ＴＡＡＣＡＡＡのＧＡＲＥボックスを含むａｍｙ２クラスター中に、少なくとも２種などの少なくとも１種の、例えば、少なくとも３種のα−アミラーゼ遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項６】
前記ＨｖＨＢＬ１２遺伝子中に変異を有し、前記変異が：
ａ．配列番号６の１つまたは複数のアミノ酸またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログを欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子をもたらす変異；または
ｂ．前記ＨｖＨＢＬ１２遺伝子の欠失をもたらす変異、
である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項７】
配列番号６またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログの少なくとも２２個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＨＢＬ１２タンパク質をコードする変異体ＨｖＨＢＬ１２遺伝子を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項８】
前記ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子中に変異を有し、前記変異が：
ａ．配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸２００〜２０６、２２０、２２６、２５０および／また２５２の少なくとも１つを欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子をもたらす変異；
ｂ．前記ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子の欠失をもたらす変異、
である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項９】
少なくとも配列番号１１または配列番号１２の１５４個の最Ｃ末端アミノ酸を欠く変異体ＨｖＷＲＫＹ３８タンパク質をコードする変異体ＨｖＷＲＫＹ３８遺伝子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１０】
非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含むα−アミラーゼプロモーターを含む少なくとも５種のα−アミラーゼ遺伝子を含み、前記非標準タンデム型リピートＷ−ボックスが、
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＹＴＧＲＣＣ）；
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣＣ）；
・（ＴＧＡＣＲ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＹＴＧＲＣＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＣＴＧＲＣＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＹＴＧＧＣＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＣＴＧＡＣＣ）；
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＧＣＣ）；および
・（ＴＧＡＣ（Ｃ）ｎ（Ｘ）ｍＴＴＧＡＴＣ）；
からなる群より個別に選択され、式中、ＲはＧまたはＡ、ＹはＣまたはＴ、ｎは０または１、ｍは、０〜２０の範囲の整数である、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１１】
ａｍｙ１＿１クラスターを含み、少なくとも１つのα−アミラーゼプロモーターが、配列ＴＴＧＡＴＣを含む非標準タンデム型リピートＷ−ボックスを含む、請求項１０に記載の大麦植物。
【請求項１２】
発芽の開始の４８時間後、少なくとも１１０Ｕ／ｇなどの少なくとも１００Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性を有するが、ただし、発芽の開始の前に外皮なしであるかまたは少なくとも一部の前記外皮が取り除かれていることが前提である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１３】
発芽の開始の４８時間後、少なくとも２０ｍＵ／ｇの限界デキストリナーゼを有するが、ただし、前記発芽の開始の前に、外皮なしであるかまたは少なくとも一部の前記外皮が取り除かれていることが前提である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１４】
２つ以上の変異または請求項１に記載の特性を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１５】
１種または複数の追加の遺伝子中に変異、例えば、１つまたは複数の次の変異：
ａ．機能的ＬＯＸ−１の完全喪失をもたらすＬＯＸ−１コード遺伝子中の変異、
ｂ．機能的ＬＯＸ−２の完全喪失をもたらすＬＯＸ−２コード遺伝子中の変異、
ｃ．機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらすＭＭＴコード遺伝子中の変異、
ｄ．低減したＣｓｌＦ６活性を有する変異体ＣｓｌＦ６タンパク質をコードするＣｓｌＦ６コード遺伝子中の変異、
を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１６】
大麦粉、緑麦芽、およびキルン乾燥麦芽からなる群より選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の大麦植物を含む、またはそれから作製された植物生成物。
【請求項１７】
粉砕緑麦芽または粉砕キルン乾燥麦芽である、請求項１６に記載の植物生成物。
【請求項１８】
水性抽出物の製造方法であって、
ａ．請求項１〜１５のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．大麦粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップが、前記穀粒が少なくとも３０％の含水量を有するまで水溶液中で前記穀粒をインキュベーションすることを含み、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／（ｋｇ乾燥重量大麦粒）を、前記水溶液中を通過させるステップ；および
ｃ．前記発芽穀粒を微粉化し、同時に、前記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップであって、ただし、前記大麦粒がステップｂ）とｃ）との間で常に２０％未満の含水量にならないことが前提である、ステップ；
ｄ．前記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、大麦の水性抽出物を製造するステップ、
を含む、方法。
【請求項１９】
飲料の製造方法であって、
（ｉ）請求項１８に記載の方法により水性抽出物を作製するステップ；
（ｉｉ）前記抽出物を飲料に処理するステップ、
を含む、方法。
【請求項２０】
飲料の製造方法であって、
ｉ．請求項１〜１５のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または麦芽から水性抽出物を作製するステップ、
ｉｉ．前記抽出物を飲料に処理するステップ、
を含む、方法。
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月20日(2020.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021509580000001.app
【国際調査報告】
2021509580.tif 000044
2021509580.tif 000045
2021509580.tif 000046
2021509580.tif 000047
2021509580.tif 000048