(57)【要約】  本明細書中で提供されるのは、いくつかの側面において、スフィンゴ糖脂質、およびスフィンゴ糖脂質に付着した送達される剤を含む、送達ビヒクルである。いくつかの態様において、スフィンゴ糖脂質は、オリゴ糖および短鎖（例として、Ｃ０−Ｃ３）セラミドを含む。いくつかの態様において、送達される剤は、治療剤である。スフィンゴ糖脂質は、細胞へまたは細胞小器官へ、ならびに粘膜表面を横切って、剤を送達することを可能とする。いくつかの態様において、本明細書中に記載されたスフィンゴ糖脂質を使用して送達される剤は、単独で送達される剤と比較して、より長い半減期を呈する。スフィンゴ糖脂質送達ビヒクルを使用して疾患を処置するための、対象へ治療剤を送達する方法もまた提供される。
2021501161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴ糖脂質および送達される剤を含み、スフィンゴ糖脂質は、オリゴ糖、および（ａ）短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ３）を含むセラミドまたは（ｂ）脂肪酸を含有しないセラミドを含み、および、送達される剤は、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖に付着している、送達ビヒクル。
【請求項２】
スフィンゴ糖脂質が、ガングリオシドである、請求項１に記載の送達ビヒクル。
【請求項３】
ガングリオシドが、シアル酸を含む、請求項２に記載の送達ビヒクル。
【請求項４】
ガングリオシドが、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）である、請求項３に記載の送達ビヒクル。
【請求項５】
ガングリオシドが、モノシアロジヘキソシルガングリオシド（ＧＭ３）である、請求項３に記載の送達ビヒクル。
【請求項６】
スフィンゴ糖脂質が、グロボシドである、請求項１に記載の送達ビヒクル。
【請求項７】
グロボシドが、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）である、請求項６に記載の送達ビヒクル。
【請求項８】
スフィンゴ糖脂質が、セレブロシドである、請求項１に記載の送達ビヒクル。
【請求項９】
セレブロシドが、グルコセレブロシド、ガラクトセレブロシド、またはラクトセレブロシドである、請求項８に記載の送達ビヒクル。
【請求項１０】
セレブロシドが、スルファチドである、請求項８に記載の送達ビヒクル。
【請求項１１】
セラミドが、炭素原子間に二重結合を持たない短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ３）を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の送達ビヒクル。
【請求項１２】
セラミドが、炭素原子間に二重結合を持つＣ２脂肪酸鎖を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の送達ビヒクル。
【請求項１３】
セラミドが、炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を持つＣ３脂肪酸鎖を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の送達ビヒクル。
【請求項１４】
セラミドが、脂肪酸を含まない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の送達ビヒクル。
【請求項１５】
送達される剤が、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖および炭水化物、脂質、糖タンパク質、小分子、合成の有機および無機の薬物であって対象へ投与したときに生物学的効果を奏するもの、およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の送達ビヒクル。
【請求項１６】
送達される剤が、治療剤である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の送達ビヒクル。
【請求項１７】
治療剤が、抗炎症剤、ワクチン抗原、ワクチンアジュバント、抗体、酵素、抗がん薬または化学療法薬、凝固因子、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、抗生物質、または、心血管疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、アレルギー、血液障害、代謝障害、もしくは皮膚疾患の処置のための薬物、である、請求項１６に記載の送達ビヒクル。
【請求項１８】
送達される剤が、タンパク質またはペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の送達ビヒクル。
【請求項１９】
タンパク質またはペプチドが、ワクチン抗原である、請求項１８に記載の送達ビヒクル。
【請求項２０】
タンパク質またはペプチドが、抗体である、請求項１８に記載の送達ビヒクル。
【請求項２１】
タンパク質またはペプチドが、酵素である、請求項１８に記載の送達ビヒクル。
【請求項２２】
タンパク質またはペプチドが、ＧＬＰ-１、またはその機能性フラグメントである、請求項１８に記載の送達ビヒクル。
【請求項２３】
タンパク質またはペプチドが、Exendin-4、またはその機能性フラグメントである、請求項１８に記載の送達ビヒクル。
【請求項２４】
治療剤に付着したスフィンゴ糖脂質を含み、スフィンゴ糖脂質は、オリゴ糖、および（ａ）短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ３）を含むセラミドまたは（ｂ）脂肪酸を含有しないセラミドを含み、および、治療剤は、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖に付着している、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項２５】
スフィンゴ糖脂質が、ガングリオシドである、請求項２４に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項２６】
ガングリオシドが、シアル酸を含む、請求項２５に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項２７】
ガングリオシドが、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）である、請求項２６に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項２８】
ガングリオシドが、モノシアロジヘキソシルガングリオシド（ＧＭ３）である、請求項２６に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項２９】
スフィンゴ糖脂質が、グロボシドである、請求項２４に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項３０】
グロボシドが、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）である、請求項２９に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項３１】
スフィンゴ糖脂質が、セレブロシドである、請求項２４に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項３２】
セレブロシドが、グルコセレブロシド、ガラクトセレブロシド、またはラクトセレブロシドである、請求項３１に記載の送達ビヒクル。
【請求項３３】
セレブロシドが、スルファチドである、請求項３１に記載の送達ビヒクル。
【請求項３４】
セラミドが、炭素原子間に二重結合を持たない短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ３）を含む、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項３５】
セラミドが、炭素原子間に二重結合を持つＣ２脂肪酸鎖を含む、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項３６】
セラミドが、炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を持つＣ３脂肪酸鎖を含む、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項３７】
セラミドが、脂肪酸を含まない、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項３８】
治療剤が、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖および炭水化物、脂質、糖タンパク質、小分子、合成の有機および無機の薬物であって対象へ投与したときに生物学的効果を奏するもの、およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項２４〜３７のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項３９】
治療剤が、抗炎症剤、ワクチン抗原、ワクチンアジュバント、抗体、酵素、抗がん薬または化学療法薬、凝固因子、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、抗生物質、または、心血管疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、アレルギー、血液障害、代謝障害、もしくは皮膚疾患の処置のための薬物、である、請求項２４〜３７のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項４０】
送達される治療剤が、タンパク質またはペプチドである、請求項２４〜３７のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項４１】
タンパク質またはペプチドが、ワクチン抗原である、請求項４０に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項４２】
タンパク質またはペプチドが、抗体である、請求項４０に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項４３】
タンパク質またはペプチドが、酵素である、請求項４０に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項４４】
タンパク質またはペプチドが、ＧＬＰ−１、またはその機能性フラグメントである、請求項４０に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項４５】
タンパク質またはペプチドが、Exendin-4、またはその機能性フラグメントである、請求項４０に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項４６】
治療剤に付着したモノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）を含み、ＧＭ１は、オリゴ糖、および（ａ）短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ３）を含むセラミド；または（ｂ）脂肪酸鎖を含有しないセラミドを含み、および、治療剤は、ＧＭ１のオリゴ糖に付着している、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体。
【請求項４７】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の送達ビヒクル、および薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項４８】
請求項２４〜４６のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、および薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項４９】
細胞内へとまたは粘膜表面を横切って剤を送達する方法であって、送達ビヒクルもしくは剤の取り込みまたは粘膜表面を横切る送達ビヒクルもしくは剤の吸収に適した条件下で、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の送達ビヒクルを細胞または粘膜表面と接触させることを含む、前記方法。
【請求項５０】
細胞内へとまたは粘膜表面を横切って剤を送達する方法であって、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体もしくは剤の取り込みまたは粘膜表面を横切るスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体もしくは剤の吸収に適した条件下で、請求項２４〜４６のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療薬複合体を細胞または粘膜表面と接触させることを含む、前記方法。
【請求項５１】
細胞内へとまたは粘膜表面を横切って剤を送達する方法であって、組成物もしくは剤の取り込みまたは粘膜表面を横切る組成物もしくは剤の吸収に適した条件下で、請求項４７または請求項４８に記載の組成物を細胞または粘膜表面と接触させることを含む、前記方法を提供する。
【請求項５２】
対象において細胞内へとまたは粘膜表面を横切って剤を送達する方法であって、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の送達ビヒクル、請求項２４〜４６のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、または請求項４７または請求項４８に記載の組成物を対象へ投与することを含む、前記方法。
【請求項５３】
対象において剤の半減期を向上させる方法であって、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の送達ビヒクル、請求項２４〜４６のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、または請求項４７または請求項４８に記載の組成物を対象へ投与することを含む、前記方法。
【請求項５４】
それを必要とする対象において疾患または状態を処置する方法であって、有効量の請求項１〜２３のいずれか一項に記載の送達ビヒクル、請求項２４〜４６のいずれか一項に記載のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、または請求項４７または請求項４８に記載の組成物を対象へ投与することを含み、ここで有効量は、対象において疾患または状態が起こる度合いを改善／低減するのに十分な量である、前記方法。
【請求項５５】
送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、または組成物が、非経口的に投与される、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、または組成物が、非経口的でなく、または皮下に、投与される、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、その内容全体が参照によって本明細書中に組み込まれる「SHORT CHAIN CERAMIDE-BASED LIPIDS AND USES THEREOF」という表題の２０１７年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第62/578,341号および「SHORT CHAIN CERAMIDE-BASED LIPIDS AND USES THEREOF」という表題の２０１８年３月１５日に出願された米国仮特許出願第62/643,680号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の利益を主張する。
【０００２】
政府支援
この出願は、アメリカ国立衛生研究所から認可第R37 DK048106号、第RO1 DK104868号、第R21 DK090603号、第RO1 DK084424号および第P30 DK034854号のもとで授与された政府支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
臨床医学にタンパク質およびペプチド生物学的製剤を適用するための主要な難題の１つは、大きな分子を標的組織から分離させる上皮および内皮細胞バリアをくぐり抜ける合理的かつ効率的な方法の欠如である。粘膜表面の内壁を覆う上皮細胞の場合には、大きな溶質の吸収のための経路は、細胞の１つの表面を他と（宿主を環境と）接続する経細胞エンドソームトラフィッキングのプロセスであるトランスサイトーシスによる。血液脳関門を典型例とする、血液を組織から分離する緊密な内皮バリアを横切るタンパク質およびペプチド積荷の輸送についても、同じことがいえる。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示のいくつかの側面は、スフィンゴ糖脂質および送達される剤を含み、スフィンゴ糖脂質は、オリゴ糖、および（ａ）短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ３）を含むセラミドまたは（ｂ）脂肪酸を含有しないセラミドを含み、および、送達される剤は、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖に付着している、送達ビヒクルを提供する。
いくつかの態様において、スフィンゴ糖脂質は、ガングリオシドである。いくつかの態様において、ガングリオシドは、シアル酸を含む。いくつかの態様において、ガングリオシドは、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）である。いくつかの態様において、ガングリオシドは、モノシアロジヘキソシルガングリオシド（ＧＭ３）である。
いくつかの態様において、スフィンゴ糖脂質は、グロボシドである。いくつかの態様において、グロボシドは、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）である。
【０００５】
いくつかの態様において、スフィンゴ糖脂質は、セレブロシドである。いくつかの態様において、セレブロシドは、グルコセレブロシド、ガラクトセレブロシド、またはラクトセレブロシドである。いくつかの態様において、セレブロシドは、スルファチドである。
いくつかの態様において、セラミドは、炭素原子間に二重結合を持たない短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ３）を含む。いくつかの態様において、セラミドは、炭素原子間に二重結合を持つＣ２脂肪酸鎖を含む。いくつかの態様において、セラミドは、炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を持つＣ３脂肪酸鎖を含む。いくつかの態様において、セラミドは、脂肪酸を含まない。
いくつかの態様において、送達される剤は、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖および炭水化物、脂質、糖タンパク質、小分子、合成の有機および無機の薬物であって対象へ投与したときに生物学的効果を奏するもの、およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。
【０００６】
いくつかの態様において、送達される剤は、治療剤である。いくつかの態様において、治療剤は、抗炎症剤、ワクチン抗原、ワクチンアジュバント、抗体、酵素、抗がん薬または化学療法薬、凝固因子、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、抗生物質、または、心血管疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、アレルギー、血液障害、代謝障害、もしくは皮膚疾患の処置のための薬物、である。
いくつかの態様において、送達される剤は、タンパク質またはペプチドである。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、ワクチン抗原である。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、抗体である。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、酵素である。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、またはその機能性フラグメントである。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、Exendin-4、またはその機能性フラグメントである。
【０００７】
本開示の他の側面は、治療剤に付着したスフィンゴ糖脂質を含み、スフィンゴ糖脂質は、オリゴ糖、および（ａ）短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ３）を含むセラミドまたは（ｂ）脂肪酸を含有しないセラミドを含み、および、送達される剤は、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖に付着している、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体を提供する。
いくつかの態様において、スフィンゴ糖脂質は、ガングリオシドである。いくつかの態様において、ガングリオシドは、シアル酸を含む。いくつかの態様において、ガングリオシドは、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）である。いくつかの態様において、ガングリオシドは、モノシアロジヘキソシルガングリオシド（ＧＭ３）である。
いくつかの態様において、スフィンゴ糖脂質は、グロボシドである。いくつかの態様において、グロボシドは、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）である。
【０００８】
いくつかの態様において、スフィンゴ糖脂質は、セレブロシドである。いくつかの態様において、セレブロシドは、グルコセレブロシド、ガラクトセレブロシド、またはラクトセレブロシドである。いくつかの態様において、セレブロシドは、スルファチドである。
いくつかの態様において、セラミドは、炭素原子間に二重結合を持たない短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ３）を含む。いくつかの態様において、セラミドは、炭素原子間に二重結合を持つＣ２脂肪酸鎖を含む。いくつかの態様において、セラミドは、炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を持つＣ３脂肪酸鎖を含む。いくつかの態様において、セラミドは、脂肪酸を含まない。
いくつかの態様において、治療剤は、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖および炭水化物、脂質、糖タンパク質、小分子、合成の有機および無機の薬物であって対象へ投与したときに生物学的効果を奏するもの、およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。
【０００９】
いくつかの態様において、治療剤は、抗炎症剤、ワクチン抗原、ワクチンアジュバント、抗体、酵素、抗がん薬または化学療法薬、凝固因子、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、抗生物質、または、心血管疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、アレルギー、血液障害、代謝障害、もしくは皮膚疾患の処置のための薬物、である。
いくつかの態様において、治療剤は、タンパク質またはペプチドである。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、ワクチン抗原である。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、抗体である。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、酵素である。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、またはその機能性フラグメントである。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、Exendin-4、またはその機能性フラグメントである。
【００１０】
本開示の他の側面は、治療剤に付着したモノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）を含み、ＧＭ１は、オリゴ糖、および（ａ）短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ３）を含むセラミドまたは（ｂ）脂肪酸を含有しないセラミドを含み、および、治療剤は、ＧＭ１のオリゴ糖に付着している、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体を提供する。
本明細書中に記載された送達ビヒクルまたはスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体を含む組成物が提供される。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体を含む。
【００１１】
本開示の他の側面は、細胞内へとまたは粘膜表面を横切って剤を送達する方法であって、送達ビヒクルもしくは剤の取り込みまたは粘膜表面を横切る送達ビヒクルもしくは剤の吸収に適した条件下で、本明細書中に記載された送達ビヒクルを細胞または粘膜表面と接触させることを含む、方法を提供する。
本開示の他の側面は、細胞内へとまたは粘膜表面を横切って剤を送達する方法であって、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体もしくは剤の取り込みまたは粘膜表面を横切るスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体もしくは剤の吸収に適した条件下で、本明細書中に記載されたスフィンゴ糖脂質−治療薬複合体を細胞または粘膜表面と接触させることを含む、方法を提供する。
【００１２】
本開示の他の側面は、細胞内へとまたは粘膜表面を横切って剤を送達する方法であって、組成物もしくは剤の取り込みまたは粘膜表面を横切る組成物もしくは剤の吸収に適した条件下で、本明細書中に記載された組成物を細胞または粘膜表面と接触させることを含む、方法を提供する。
本開示の他の側面は、対象において細胞内へとまたは粘膜表面を横切って剤を送達する方法であって、本明細書中に記載された送達ビヒクル、本明細書中に記載されたスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、または本明細書中に記載された組成物を対象へ投与することを含む、方法を提供する。
対象において剤の半減期を向上させる方法であって、本明細書中に記載された送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、または組成物を対象へ投与することを含む、方法が提供される。
【００１３】
それを必要とする対象において疾患または状態を処置する方法であって、本明細書中に記載された送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、または組成物を対象へ投与することを含む、方法が提供される。
それを必要とする対象において疾患または状態を処置する方法であって、本明細書中に記載された送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、または組成物を対象へ投与することを含む、方法が提供される。
いくつかの態様において、送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、または組成物は、非経口的に投与される。いくつかの態様において、送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体、または組成物は、非経口的でなく、または皮下に、投与される。
【００１４】
上の概要は、本明細書中に開示された技術の態様、利点、特色および使用のいくつかを非限定的な様式で例示する意味を持つものである。本明細書中に開示された技術の他の態様、利点、特色および使用は、詳細な説明、図面、例、および請求の範囲から明らかになる。
【００１５】
図面の簡単な説明
添付図面は、縮尺どおりに描かれたことを意図していない。図面において、種々の図で例示されている各々の同一または同一に近い構成要素は、似たような数字符号によって表される。明確さの目的のため、全部の図面中で全部の構成要素に標識を付しているわけではないことがある。図面においては、以下：
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅ。ＧＭ１のセラミドドメインへの修飾は、向上した経上皮輸送を結果としてもたらす。（図１Ａ）全Ｄアミノ酸レポーターペプチドへ融合しているＧＭ１スフィンゴ脂質の代表的な構造。レポーターペプチドは、親和性精製のために使用されるリシン連結ビオチン、およびＮ末端Alexa Fluor 488を含有する。
【図１Ｂ】（図１Ｂ）ＧＭ１−ペプチド融合物または融合されていないレポーターペプチドを、フィルター支持体上に成長したＭＤＣＫ−ＩＩ細胞に頂端から加え、および生細胞共焦点顕微鏡法によって撮像した。Ｃ１２：０−ＧＭ１−レポーターペプチド融合物（Ｃ１８：１またはＣ２０：１スフィンゴシンのいずれかを持つ）のトランスサイトーシスは、基底外側膜の蛍光により明白である。Ｃ１６：０−ＧＭ１レポーター分子は、細胞内の斑点、おそらくリソソームへ、送達される。スケールバー１０μｍ。
【図１Ｃ−１Ｄ】（図１Ｃ）指定された脂肪酸鎖長および飽和度での、Ｔ８４細胞単分子層を横切る指定されたＧＭ１−レポーターペプチド融合物の輸送。短い脂肪酸を持つセラミドドメインを含有するＧＭ１−ペプチド融合物は、融合されていないレポーターペプチドに対してほぼ１０倍の経上皮輸送の増加を有する。（図１Ｄ）Ｔ８４単分子層を横切るＣ６：０−ＧＭ１ペプチド融合物の経上皮輸送は、用量依存的であり、および、コンジュゲートしていないレポーターペプチドの輸送をはるかに超過する。
【図１Ｅ】（図１Ｅ）Ｔ８４単分子層を、融合されていないペプチドおよび融合されていないＣ６：０−ＧＭ１で同時に処置した。混合実験は、増幅された経細胞輸送にはスフィンゴ糖脂質担体へのレポーターペプチドの融合が要求される、ということを確認する。
【００１７】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ〜２Ｄ。短鎖ＧＭ１セラミドの輸送はトランスサイトーシスを介して起こる。（図２Ａ）見かけ上の透過性（ＰＡＰＰ）として報告された、Ｔ８４細胞単分子層を横切るＣ６：０およびＣ１２：０ ＧＭ１−ペプチド融合物の輸送は、４℃の温度ブロックの間には最小限の輸送が起こるということを示す。（図２Ｂ）２ｍＭ ＥＤＴＡの非存在下（左および中央パネル）および存在下（右パネル）における０．５μＭのＣ６：０−ＧＭ１ペプチド融合物を負荷されたＭＤＣＫ−ＩＩ単分子層の分析。生細胞共焦点画像は、膜トラフィッキングによる経細胞輸送および最小限の傍細胞漏出と一致して、１０℃の温度ブロックの間には最小限の輸送が起こるということを示す（中央パネル）。破壊されたタイトジャンクションの存在下（すなわち、ＥＤＴＡの存在下、右パネル）では、基底外側膜が傍細胞受動拡散（経細胞漏出）によって染色されている。
【図２Ｃ−２Ｄ】（図２Ｃ）ＭＤＣＫ−ＩＩ単分子層を横切るトランスサイトーシスは、エンドサイトーシスのダイナミン阻害によりブロックされる（５０μＭ Dyngo-4A）。Dyngo-4A処置された細胞では（灰色のバー）、Ｃ６：０（ｎ＝８）およびＣ１２：０（ｎ＝８） ＧＭ１−ペプチド融合物の両方の経上皮輸送に有意な減少があるが、融合されていないレポーターペプチド（ｎ＝６）はそうではない。（図２Ｄ）ＥＸＯ２に対するｅｓｉＲＮＡトランスフェクションによるexocyst複合体が枯渇した細胞単分子層における（灰色のバー）、Ｃ６：０−ＧＭ１ペプチド融合物（ｎ＝６）または融合されていないレポーターペプチド（ｎ＝５）の経細胞輸送。（平均±ｓ．ｅ．ｍ）（ｎｓ＝有意でない、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；Bonferroniの多重比較検定）。
【００１８】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｅ。短鎖ＧＭ１種による膜から溶液への放出。（図３Ａ）０．５μＭのレポーターペプチド、Ｃ６：０またはＣ１２：０−ＧＭ１ペプチド融合物での、１０分間パルスおよび３時間の追跡の後のＭＤＣＫ−ＩＩ細胞単分子層の生細胞共焦点画像。画像は頂端膜（左カラム）または細胞体の途中（右カラム）の平面で撮られる。
【図３Ｂ−３Ｃ】（図３Ｂ〜３Ｃ）Ｃ２：０（ｎ＝５）、Ｃ６：０（ｎ＝８）、Ｃ１２：０（ｎ＝１２）のＧＭ１−ペプチド融合物およびＣ１２：０−ＧＭ３−ペプチド融合物（ｎ＝９）の、ＭＤＣＫ細胞膜から媒体（Ｂ）または脱脂ＢＳＡを含有する媒体（Ｃ）への拡散の時間変化。
【図３Ｄ−３Ｅ】（図３Ｄ）Ｃ１２：０−ＧＭ３ペプチド融合物は、Ｃ１２：０−ＧＭ１−ペプチド融合物と比較して向上した経上皮輸送を有し、およびダイナミン依存的である（ｎ＝４）。（図３Ｅ）Ｃ１２：０−ＧＭ１−ペプチド分子の膜放出の速度は、１００ｍＭラクトースの存在下で向上したが、１００ｍＭマンニトールではそうではなく、これはガラクトース特異的レクチンの膜アンカーを暗示する（ｎ＝１０）（平均±ｓ．ｅ．ｍ）。
【００１９】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜４Ｅ。in vivoでの腸管および鼻腔上皮バリアを横切る吸収。（図４Ａ）指定されたＧＭ１ペプチド融合物、ビヒクル単独、または融合されていないレポーターペプチドの胃内投与後の血中への腸管上皮バリアを横切る吸収を示すin vivo研究（５つの独立した実験）。（図４Ｂ）Ｃ１２：０−ＧＭ３、Ｃ６：０−ＧＭ１ペプチド融合物またはペプチドの胃内投与の１５分後の血中への腸管を横切る吸収（ｎ＝２）。
【図４Ｃ−４Ｄ】（図４Ｃ)胃強制飼養の１時間後、Ｃ４：０−ＧＭ１ペプチド融合物は肝臓へと吸収され、他方、融合されていないレポーターペプチドは検出されない（４つの独立した実験）。（図４Ｄ）鼻腔上皮中への取り込み；局所的な鼻腔投与の後、組織を４％ホルムアルデヒドで固定し、および、上皮を標識するために抗ＥｐＣＡＭで、および核についてはＤＡＰＩで染色した。融合されていないレポーターペプチド（左パネル）およびＣ６：０−ＧＭ１ペプチド融合物（右パネル）の輸送を比較した二光子顕微鏡法による画像。スケールバー ２０μｍ上部パネル、１０μｍ下部パネル。
【図４Ｅ】（図４Ｅ)鼻腔投与の３０分後の血液の生化学的分析は、Ｃ６：０およびＣ１２：０−ＧＭ１ペプチド融合物の全身吸収を示す（２つの独立した実験）。各グラフ上の各データポイントは個々のマウスを表し、および、バーは平均±ｓ．ｅ．ｍを表す。（ｎｓ＝有意でない、＊ｐ＜０．５；＊＊＊ｐ＜０．０００１、Tukeyの多重比較検定）。
【００２０】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｆ。ＧＭ１に媒介されるＧＬＰ−１の吸収は、血糖代謝に影響を及ぼす。（図５Ａ）Ｃ６：０およびＣ２：０ ＧＭ１セラミド種への共役のために使用したＧＬＰ−１および全Ｄ ＧＬＰ−１異性体配列。
【図５Ｂ−５Ｃ】（図５Ｂ）Ｔ８４細胞単分子層を横切る、Ｃ６：０−ＧＭ１−ＧＬＰ−１または融合されていないＧＬＰ−１を用いたIn vitroトランスサイトーシスアッセイ（３つの独立した実験）（対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．５）。（図５Ｃ）１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＣ６：０−ＧＭ１−ＧＬＰ−１の胃強制飼養後の代表的な腹腔内耐糖能試験。各点は、平均±ｓ．ｅ．ｍを表す（ｎ＝４マウス）。Ｃ６：０−ＧＭ１−ＧＬＰ−１を補給されたマウスは、融合されていないＧＬＰ−１またはビヒクルで強制飼養されたマウスとは対照的に、グルコースチャレンジ後のより早い回復を示す。
【図５Ｄ】（図５Ｄ）各データポイントが個々のマウスを表し、および、バーが平均±ｓ．ｅ．ｍを表す、８つの独立した実験での、曲線下面積（ＡＵＣ）として定量化された、指定されたＧＭ１−ＧＬＰ−１種、ＧＬＰ−１単独、またはビヒクルの耐糖能に対する効果。
【図５Ｅ−５Ｆ】（図５Ｅ)胃強制飼養の１５分後の血液中のＧＬＰ−１を、各々の種についてルシフェラーゼバイオアッセイを使用して定量化した（４つの独立した実験での、１００μｌｓ血液あたりの化合物のｆｍｏｌｓ）。（図５Ｆ）３つの独立した実験での、血中の積荷を直接測定するために使用したＧＬＰ−１の全Ｄ異性体の全身吸収。（Ａ〜Ｅ）グラフ上の各データポイントは個々のマウスを表し、および、バーは平均±ｓ．ｅ．ｍを表す（ｎｓ＝有意でない、＊ｐ＜０．５；＊＊＊ｐ＜０．０００１、Tukeyの多重比較検定）。
【００２１】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄ。（図６Ａ）精製されたＣ１２：０−ＧＭ１−ペプチド融合物のＨＰＬＣおよび質量分析。化合物は、元々の脂質のＣ１８：１およびＣ２０：１スフィンゴシン異性体を分離するための分解能での高い純度、および正しい質量を示す。
【図６Ｂ】（図６Ｂ)我々のＧＭ１−ペプチドコンストラクトが有効であることを立証するために個別的に試験した官能基。
【図６Ｃ】（図６Ｃ）様々な官能基の効果を試験するために、レポーターペプチドでまたは異なる脂質融合物で処置されたＭＤＣＫ単分子層の共焦点撮像を行った。スケールバー１０μｍ。 指定された分子とのインキュベーションの後、単分子層を、蛍光ラベルされたコレラ毒素Ｂ−サブユニットで処置し、および基底外側膜での蛍光について検査した。全ての場合において、Ｃ１２：０−ＧＭ１融合物は、再循環およびトランスサイトーシス経路中へと選別される。
【図６Ｄ】（図６Ｄ）ＧＭ１−Ｃ６：０およびＧＭ１−Ｃ１２：０−ペプチド融合物は、トランスフェリン受容体との共局在によって測定されたとおり再循環エンドソームへと（下部パネル）、およびlysotrackerによって測定されたとおりリソソームから離れて選別される（上部パネル）。
【００２２】
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ〜７Ｇ。（図７Ａ）我々のトランスサイトーシスアッセイの略図表現。ストレプトアビジンビーズの添加によって、基底外側媒体からビオチン（小さい丸）およびフルオロフォア（星形）を含有するＧＭ１−ペプチド融合物を親和性単離した。（図７Ｂ）トランスサイトーシスアッセイについての標準曲線は、我々のアッセイがピコモル濃度に敏感であることを実証する。
【図７Ｃ−７Ｄ】（図７Ｃ）極めて短鎖の脂肪酸鎖での、Ｔ８４細胞単分子層を横切るＧＭ１−レポーターペプチド融合物の輸送。データは、極めて短い脂肪酸鎖を持つセラミドドメインを含有するＧＭ１−ペプチド融合物が、コンジュゲートしていないレポーターペプチドに対して１０倍の経上皮輸送の増加を有するということを示す。（図７Ｄ）トリプシン処置後の細胞の定量的蛍光測定によって決定された異なるＧＭ１−ペプチド融合分子の膜負荷。
【図７Ｅ−７Ｆ】（図７Ｅ）処置前の（対照、灰色のバー）またはレポーターペプチドまたはＣ６：０−ＧＭ１ペプチド融合物での３時間の処置後の（白いバー）Ｔ８４細胞のＴＥＥＲ測定。（図７Ｆ）Ｃ６：０またはＣ１２：０−ＧＭ１ペプチド融合物での３時間の処置の後のＭＴＴアッセイは、広範囲の用量で細胞生存率に何ら効果を示さない。
【図７Ｇ】（図７Ｇ）１ｍｇ／ｍＬ AlexaFlour-594がコンジュゲートされたデキストランと、指定されたＧＭ１−ペプチド融合物とで、同時に処置されたＭＤＣＫ単分子層における透過性アッセイ。３時間にわたる頂端から基底外側コンパートメントへ輸送されたデキストランAlexaFlour-594（ＭＷ＝１０ｋＤａ）の累計量は、ＧＭ１−ペプチド融合物の添加による影響を受けなかった。結果は、代表的な実験の平均±ｓ．ｅ．ｍとして要約する。
【００２３】
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ〜８Ｆ。（図８Ａ）０．５μＭ Ｃ６：０またはＣ１２：０−ＧＭ１ペプチド融合物を用いた１０分間パルスおよび１０分間の追跡の後のＭＤＣＫ細胞単分子層の生細胞共焦点画像。画像は基底外側膜のレベルで撮られる。（図８Ｂ）Ｃ６：０−ＧＭ３ペプチド融合物は、Ｃ６：０−ＧＭ１−ペプチド融合物と比較して向上した経上皮輸送を示す（ｎ＝２）。
【図８Ｃ−８Ｄ】（図８Ｄおよび８Ｄ）Ｃ１２：０−ＧＭ１およびＣ１２：０−ＧＭ３ペプチド融合物についての、５ｍＭラクトース存在下での、ＭＤＣＫ細胞膜から溶液中への拡散の時間変化。Ｃ１２：０−ＧＭ１−ペプチド分子 の膜放出の速度は、５ｍＭラクトースの存在下で向上した（ｎ＝４）（平均±ｓ．ｅ．ｍ）。対照的に、Ｃ１２：０−ＧＭ３ペプチド融合物についての細胞膜から溶液への拡散の速度は、５ｍＭラクトースでの処置による影響を受けなかった（ｎ＝４）（平均±ｓ．ｅ．ｍ）。
【図８Ｅ−８Ｆ】（図８Ｅ〜８Ｆ）５ｍＭのＮ−アセチル−ガラクトサミン−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）の存在下では、ＧＭ１−ペプチド融合分子は、より速い、細胞膜から溶液への拡散の速度を示した（ｎ＝６）（平均±ｓ．ｅ．ｍ）。５ｍＭ ＧａｌＮＡｃでの処置は、ＧＭ３−ペプチド融合分子についての拡散の速度に何ら効果を有しなかった（ｎ＝６）（平均±ｓ．ｅ．ｍ）。
【００２４】
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂ。（図９Ａ）我々のＣ６：０−ＧＭ１−ＧＬＰ−１融合物の酵素活性を、融合されていないＧＬＰ−１および市販のExendin-4と比較して確認する、代表的なルシフェラーゼアッセイ。（図９Ｂ）Ｃ６：０およびＣ４：０−ＧＭ１ペプチド融合物の、ビヒクルおよび融合されていないレポーターペプチドと比較した、経口投与後の血液中への腸管上皮バリアを横切る吸収を示すin vivo研究。対照的に、Ｃ２：０−ＧＭ１−ペプチド融合物は吸収されない。
【００２５】
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｃ。（図１０Ａ）Ｃ２：０が他の候補と同等かまたはそれよりも良い可能性がある、異なるＧＭ１脂肪酸種の腸管上皮Ｔ８４細胞を横切るレポーターペプチドの輸送。（図１０Ｂ）ＨＥＫ細胞に使用したバイオアッセイは、ＧＬＰ１受容体のためのＧＭ１融合ＧＬＰコンストラクトの相対的活性を試験する。Ｃ２：０−ＧＬＰ１は、対・対照の融合されていないＧＬＰ−１で示される。
【図１０Ｃ】（図１０Ｃ）極性化された上皮ＭＤＣＫバリアを横切るＣ２：０ ＧＭ１へ融合している治療用ＧＬＰ１ペプチドの輸送。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂ。（図１１Ａ）我々のＣ６：０−ＧＭ１−ＧＬＰ−１融合物の、融合されていないＧＬＰ−１および市販のExendin-4と比較した酵素活性を確認する代表的なルシフェラーゼアッセイ。（図１１Ｂ）Ｃ６：０およびＣ４：０−ＧＭ１ペプチド融合物の、ビヒクルおよび融合されていないレポーターペプチドと比較した、経口投与後の血液中への腸管上皮バリアを横切る吸収を示すin vivo研究。対照的に、Ｃ２：０−ＧＭ１−ペプチド融合物は吸収されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ある態様の詳細な記載
緊密な粘膜上皮バリアを横切る生物学的に活性な分子の送達は、経口薬物送達のための大半の治療用ペプチドの適用を妨げる主要な難題である。本開示は、いくつかの側面において、短鎖の非天然性スフィンゴ糖脂質を送達ビヒクルとして使用する方法を提供する。本明細書中では、インクレチンホルモンＧＬＰ−１の粘膜吸収を可能にするために細胞内脂質選別の内因性プロセスを活用する合成スフィンゴ糖脂質のセットが同定される。Ｃ６：０またはそれよりも小さい脂肪酸を含有するセラミドドメインを持つスフィンゴ糖脂質に共有結合的に融合しているペプチド積荷は、in vitroおよびin vivoで２０〜１００倍高い効率で上皮バリアを横切って輸送された。これは、分子内選別におけるセラミドドメインの構造−機能によって、および細胞膜中への挿入および細胞膜中での保持についてのスフィンゴ糖脂質種の親和性によって説明づけられた。In vivoでは、短鎖スフィンゴ糖脂質に融合しているＧＬＰ−１は、胃強制飼養の後、迅速にかつ全身的に吸収されたことで、ＧＬＰ−１単独の腹腔内注射に匹敵する血清バイオアベイラビリティで耐糖能に影響を及ぼした。これは、生物学的製剤の粘膜吸収には前例のないことであり、および、多数の他の臨床適用とともに技術を定義する。
【００２７】
スフィンゴ糖脂質は、細胞膜の外膜葉内に存在する。それらは、細胞が異空間に面しているリガンド連結オリゴ糖ドメイン、および膜二重層中に脂質をアンカーするセラミドドメインを含有する。セラミドは、多様な構造を有することができる脂肪酸へ共役しているスフィンゴシン鎖（典型的にはＣ１８：１またはＣ２０：１）からなる。オリゴ糖ドメインは、膜葉の間の脂質フリップフロップを防ぎ、ベシクルトラフィッキングのみによって全てのスフィンゴ糖脂質を細胞内コンパートメントにわたり分布させることを引き起こす。タンパク質およびあるスフィンゴ脂質の、真核細胞の様々な細胞内コンパートメントへの選別は、ベシクル担体による分泌およびエンドサイトーシス経路を通じた膜の動きに依存する。タンパク質については、これは、タンパク質そのものの内にまたは関連付けられる受容体またはシャペロンの構造内に構造的にコードされた、多重かつ階層的に秩序化された選別決定要因に従って起こる。
【００２８】
細胞内へとまたは粘膜バリアを横切って剤（例として、治療剤）を送達するための、異なる構造の脂肪酸（例として、二重結合を持つかまたは持たない、長いかまたは短い脂肪酸鎖）を含むセラミドを含有するスフィンゴ糖脂質アイソフォームを使用する方法が、記載されている（例として、参照によって本明細書中に組み込まれる米国特許第9,457,097号における）。
本開示は、少なくとも一部分では、Ｃ３以下の脂肪酸鎖を持つセラミドを含有するスフィンゴ糖脂質は、細胞毒性を引き起こすことなしに細胞内へとまたは粘膜バリアを横切って剤（例として、治療剤）を送達するために使用することができる、という予想外の知見に基づく。Ｃ４よりも短い脂肪酸鎖（例として、Ｃ３、Ｃ２、Ｃ１、またはＣ０）を持つセラミドは細胞毒性を持つことが当該技術分野において知られており（例として、参照によって本明細書中に組み込まれるSueyoshi et al., Journal of Lipid Research, Volume 42, 1197-1202, 2001に記載されたとおり）、会合する剤の細胞内トラフィッキングを導くことを可能とするとは期待されないので、それは予想外なことである。
【００２９】
したがって、本開示のいくつかの側面は、スフィンゴ糖脂質および送達される剤を含む送達ビヒクルに関し、ここで、スフィンゴ糖脂質は、オリゴ糖、および（ａ）短鎖脂肪酸（Ｃ１〜Ｃ３）を含むセラミドまたは（ｂ）脂肪酸を含有しないセラミド（本明細書中ではリソセラミドまたはスフィンゴシンとも称される）を含み、およびここで、送達される剤は、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖に付着している。
【００３０】
「送達ビヒクル」は、所望の場所へ、例として、限定なしに、細胞に進入するようにまたは所望の細胞コンパートメント（例として、小胞体）に到達するように、対象の所望の部分（例として、器官）に到達するように、または対象における罹患部位（例として、腫瘍部位）に到達するように、剤（例として、治療剤）を送達する分子またはシステムを指す。いくつかの態様において、送達ビヒクルは、送達される剤を包含する。いくつかの態様において、送達ビヒクルは、送達される剤と会合（またはこれに付着）する。これらの状況では、送達ビヒクルと送達される剤とを含む複合体が形成されており、本明細書中では「スフィンゴ糖脂質−薬剤複合体」と称される。いくつかの態様において、剤は治療剤であり、および、送達ビヒクルと送達される治療剤とを含む複合体は、本明細書中では「スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体」と称される。
【００３１】
「スフィンゴ糖脂質」は、アミノアルコールスフィンゴシンを含有する糖脂質のサブタイプである。スフィンゴ糖脂質は、オリゴ糖が付着したスフィンゴ脂質としてみなされ得る。本開示に従って使用され得るスフィンゴ糖脂質の非限定的な例は、ガングリオシド、セレブロシドおよびグロボシドを包含する。
【００３２】
「スフィンゴ脂質」は、スフィンゴイド塩基の骨格および脂肪族アミノアルコールのセットを含有する脂質のクラスに属する。スフィンゴ脂質は、一般的には、骨格部分としての、長鎖の（スフィンゴイド）塩基（スフィンゴシン、スフィンガニン、４−ヒドロキシスフィンガニン、または関連化合物）から構成される（参照によって本明細書中に組み込まれるKarlsson et al., Chem. Phys. Lipids, 5:6-43, 1970）これは通例では、アミド連結長鎖脂肪酸（セラミドのため）、および１位における頭部基によって修飾されている。３００クラスを超えるスフィンゴ脂質が知られており、そのほとんどは、単純なものから複雑なものまでの炭水化物を持つ頭部基を有する（例として、参照によって本明細書中に組み込まれるMerrill et al., New Comprehensive Biochemistry: Biochemistry of Lipids, Lipoproteins, and Membranes, pp. 309-338, Elsevier Science, Amsterdam, 1996に記載されたとおり）。スフィンゴ脂質は、植物を包含する全ての真核（およびいくつかの原核）生物の主要な構成要素である（例として、参照によって本明細書中に組み込まれるLynch et al., Lipid Metabolism in Plants, pp. 285-308, CRC Press, Boca Raton, Fla. 1993に記載されたとおり）。いくつかの態様において、スフィンゴ脂質は、セラミドである。
【００３３】
いくつかの態様において、本開示のスフィンゴ糖脂質は、ガングリオシドである。「ガングリオシド」は、オリゴ糖鎖上に連結した１以上のシアル酸（例として、ｎ−アセチルノイラミン酸、ＮＡＮＡ）を持つスフィンゴ脂質（例として、セラミド）から構成される分子である。ガングリオシドは、細胞シグナル伝達イベントをモジュレートする細胞原形質膜であり、および脂質ラフト中に集中しているように見える。いくつかの態様において、ガングリオシドは、１つのシアル酸を含む。いくつかの態様において、ガングリオシドは、１つより多くのシアル酸（例として、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）を含む。６０よりも多くのガングリオシドが知られており、これらは互いに、主にＮＡＮＡ残基の位置および数という点で異なる。
【００３４】
いくつかの態様において、ガングリオシドは、１つのシアル酸を含む。シアル酸を含有する例示のガングリオシドは、限定なしに、以下を包含する：
モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）およびモノシアロジヘキソシルガングリオシド（ＧＭ３）。Ｇの文字はガングリオシドを指し、およびＭは、ＧＭ１またはＧＭ３が１つのシアル酸のみを有することから、モノシアル酸を表す。番号付けは、電気泳動における、他のモノシアル酸ガングリオシドの中でのその相対移動度に基づく。シアル酸を含有するガングリオシドの構成は、ＮＡＮＡ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−セラミドに凝縮することができる。ＧＭ１は、重要な生理学的特性を有し、および神経可塑性および修復機構、および脳内におけるニューロトロフィンの放出に影響する。ＧＭ３は、パーキンソン病と関連付けられることが示唆されている（例として、参照によって本明細書中に組み込まれるChan et al., PLoS One. 2017 Feb 17;12(2):e0172348における）。
【００３５】
本開示に従って使用され得るガングリオシドの非限定的な例は、ＧＭ２−１、ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ２ａ、ＧＭ２ｂ、ＧＭ１、ＧＭ１ａ、ＧＡ１、ＧＭ１ｂ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１アルファ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ａ、ＧＴ１、ＧＴ１ｂ、ＯＡｃ−ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＴ３、ＧＱ１ｂ、およびＧＧａｌを包含する。
いくつかの態様において、本開示のスフィンゴ糖脂質は、グロボシドである。「グロボシド」は、セラミドの側鎖（またはＲ基）として１つより多くのオリゴ糖を持つスフィンゴ糖脂質のタイプである。オリゴ糖は、通例、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｄ−グルコースまたはＤ−ガラクトースの組み合わせである。いくつかの態様において、グロボシドは、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）である。「グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）」は、「セラミドトリヘキソシド」とも称され、および、ガラクトースのラクトシルセラミドへのアルファ連結によって形成される。
【００３６】
いくつかの態様において、本開示のスフィンゴ糖脂質は、セレブロシドである。「セレブロシド」は、動物の筋肉および神経細胞膜における重要な構成成分であるモノグリコシルセラミドである。セレブロシドは、１−ヒドロキシル部分に単一の糖残基を持つセラミドからなる。例示のセレブロシドは、限定なしに、グルコセレブロシド、ガラクトセレブロシド、およびラクトセレブロシドを包含する。
【００３７】
いくつかの態様において、セレブロシドは、スルファチドである。「スルファチド」は、硫脂質のクラス、特定的には、硫酸基を含有する糖脂質であるスルホ糖脂質のクラスを指す。スルファチドは、主として小胞体内で始まり、およびゴルジ装置内で終えるように合成され、そこではセラミドがガラクトセレブロシドへ変換されおよび後に硫化されてスルファチドを作る。ミエリン鞘中に見出されるガラクト脂質の全ての、それらの５分の１はスルファチドである。スルファチドは、主として、中枢神経系中のオリゴデンドロサイトによっておよび末梢神経系中のシュワン細胞において形成されるミエリン原形質膜の細胞外葉上で見出される。しかしながら、スルファチドは、真核生物における多数の細胞の原形質膜の細胞外葉上にもまた存在する。
【００３８】
「セラミド」は、スフィンゴシンと脂肪酸とから構成されるスフィンゴ脂質である。スフィンゴシンは、スフィンゴ脂質（例として、セラミド）の最重要部分を形成する、典型的には長さ１８炭素または２０炭素の不飽和炭化水素鎖を持つアミノアルコールである。セラミドの脂肪酸は、多様な構造を有することができる。例えば、脂肪酸鎖は、長さ０（脂肪酸なし）〜３０炭素（例として、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）であり得る。いくつかの事例では、脂肪酸変化は、１以上のシス−二重結合を含有し得る。本明細書中で使用するとおりの「シス−二重結合」は、２つの炭素原子の間に形成された二重結合のアイソフォームを指す。二重結合に加えて、他の化学基（例として、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＯＨ）もまた、シス−二重結合に関与する炭素原子と結合を形成し、および、「シス」は、Ｈ以外の化学基が炭素鎖の同じ側にあることを指定する。当業者は、これらの用語に精通している。
【００３９】
本開示のセラミドは、二重結合を持たないかまたは１つもしくは２つの二重結合を持つ長さ０〜３炭素の脂肪酸鎖を含有し、および、「短鎖セラミド」と称される。これらの脂肪酸の各々は、本明細書中では以下のとおり称される：０−炭素脂肪酸（脂肪酸なし、スフィンゴシンまたはリソセラミドともまた称される）；１−炭素脂肪酸（Ｃ１）；二重結合を持たない２−炭素脂肪酸（Ｃ２：０）、二重結合を持たない３−炭素脂肪酸（Ｃ３：０）；１つの二重結合を持つ２−炭素脂肪酸（Ｃ２：１）；１つの二重結合を持つ３−炭素脂肪酸（Ｃ３：１）；および２つの二重結合を持つ３−炭素脂肪酸（Ｃ３：２）。いくつかの態様において、本開示のスフィンゴ糖脂質は、Ｃ２：０−ＧＭ１またはＣ２：０−ＧＭ３、すなわち、それぞれ二重結合を持たない２−炭素脂肪酸を持つセラミドを含有するＧＭ１またはＧＭ３である（例として、図１Ａに示されたとおり）。いくつかの態様において、本開示のスフィンゴ糖脂質は、リソセラミド−ＧＭ１であり、スフィンゴシン−ＧＭ１ともまた称される。いくつかの態様において、本開示のスフィンゴ糖脂質は、リソセラミド−ＧＭ３であり、スフィンゴシン−ＧＭ３ともまた称される。
【００４０】
本明細書中に記載された短鎖セラミドを含有するスフィンゴ糖脂質は、細胞膜を横切ってまたは粘膜バリアを横切って剤を送達するための送達ビヒクルとして作用しおよび細胞内トラフィッキングを導くことを可能とすることが見出された。例えば、いくつかの態様において、スフィンゴ糖脂質−薬剤複合体は、スフィンゴ糖脂質によって、所望の細胞内の場所、例として、小胞体（ＥＲ）へと、導かれ得る。いくつかの態様において、スフィンゴ糖脂質−薬剤複合体は、スフィンゴ糖脂質によって、分解経路（例として、リソソーム）から離れるように導かれる。このことから、いくつかの態様において、剤がスフィンゴ糖脂質−薬剤複合体の一部であるときには、剤が単独で細胞内へと送達されるときと比較して、剤の細胞半減期が引き延ばされる。いくつかの態様において、剤がスフィンゴ糖脂質−薬剤複合体の一部であるときには、剤が単独で細胞内へと送達されるときと比較して、剤の細胞半減期が少なくとも２０％引き延ばされる。いくつかの態様において、剤がスフィンゴ糖脂質−薬剤複合体の一部であるときには、剤が単独で細胞内へと送達されるときと比較して、剤の細胞半減期が少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍またはそれ以上引き延ばされる。いくつかの態様において、剤がスフィンゴ糖脂質−薬剤複合体の一部であるときには、剤が単独で細胞内へと送達されるときと比較して、剤の細胞半減期が２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍、１０００倍またはそれ以上引き延ばされる。
【００４１】
いくつかの態様において、剤がスフィンゴ糖脂質に付着してスフィンゴ糖脂質−薬剤複合体を形成しているとき、剤は、粘膜バリアを横切って（例として、トランスサイトーシスにより）送達される。粘膜バリアは、緻密な上皮細胞の内膜（例として、胃内または腸内）から構成される。腸管粘膜バリアともまた呼ばれる腸管バリアは、腸内での望ましくない管腔内容物の妥当な封じ込めを確実にしつつ、栄養を吸収する能力を保存する、腸内粘膜の特性を指す。胃粘膜バリアは、それが消化に必要な胃酸を安全に入れておくことを可能にさせる、胃の特性である。
【００４２】
いくつかの態様において、剤は、単独では粘膜バリアを横切ることを可能としないが、本明細書中に記載されたスフィンゴ糖脂質と複合すると粘膜バリアを横切ることを可能とする。いくつかの態様において、剤が本明細書中に記載されたスフィンゴ糖脂質と複合しているとき、粘膜バリアを横切る剤の送達は、剤が単独で送達されるときと比較して向上する（例として、少なくとも２０％）。例えば、剤が本明細書中に記載されたスフィンゴ糖脂質と複合しているとき、粘膜バリアを横切る剤の送達は、剤が単独で送達されるときと比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍またはそれ以上向上する。いくつかの態様において、剤が本明細書中に記載されたスフィンゴ糖脂質と複合しているとき、粘膜バリアを横切る剤の送達は、剤が単独で送達されるときと比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍、１０００倍またはそれ以上向上する。
【００４３】
スフィンゴ糖脂質−薬剤複合体を形成するために、剤は、スフィンゴ糖脂質に、例として共有結合的にまたは非共有結合的に、付着している。いくつかの態様において、剤は、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖に付着している。剤は、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖に、当該技術分野において知られるあらゆる方法によって付着し得る。いくつかの態様において、剤は、非共有結合的に、例として、限定なしに、ファン・デル・ワールス力、疎水性相互作用、水素結合相互作用、またはイオン相互作用によって、付着している。
【００４４】
いくつかの態様において、剤は、共有結合的に付着している。例えば、いくつかの態様において、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖は、反応性の化学基によって官能化されていてもよい。かかる反応基の一例は、「クリック化学ハンドル」である。クリック化学は、Sharplessによって２００１年に導入された科学的アプローチであり、および、小さい単位を一緒につなぎ合わせることにより物質を素早くかつ確実に生成するために合わせた化学を記載している。例として、Kolb, Finn and Sharpless Angewandte Chemie International Edition (2001) 40: 2004-2021; Evans, Australian Journal of Chemistry (2007) 60: 384-395を参照。例示のカップリング反応（そのいくつかは「クリック化学」として分類され得る）は、活性化した酸またはハロゲン化アシルからのエステル、チオエステル、アミド（例として、ペプチド結合などの）の形成；求核置換(例として、ハロゲン化物の求核置換または歪環系の開環などの);アジド−アルキンHuisgon環化付加；チオール−イン付加；イミン形成；およびMichael付加（例として、マレイミド付加）を包含するがこれらに限定されない。
【００４５】
クリック化学ハンドルの非限定的な例は、アジドハンドル、アルキンハンドル、またはアジリジンハンドルを包含する。アジドは、式Ｎ３−を持つアニオンである。これは、アジ化水素酸（ＨＮ３）のコンジュゲート塩基である。Ｎ３−は、ＣＯ２、ＮＣＯ−、Ｎ２Ｏ、ＮＯ２＋およびＮＣＦと等電子数である直線状アニオンである。アジドは、数個の共鳴構造によって記載することができ、重要な１つは−Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ−である。アルキンは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する不飽和炭化水素である。１つのみの三重結合を持ち他の官能基を持たない最も単純な非環式アルキンは、一般化学式ＣｎＨ２ｎ−２を持つ同族列を形成する。アルキンは伝統的にはアセチレンとして知られているが、ただし、アセチレンという名称はまた、特定的には、ＩＵＰＡＣ命名法を使用して正式にはエチレンとして知られているＣ２Ｈ２も指す。他の炭化水素のように、アルキンは、一般的には疎水性であるが、より反応性である傾向がある。アジリジンは、１つのアミン基（−ＮＨ−）および２つのメチレン橋（−ＣＨ２−）を持つ３員の複素環であるアジリジン官能基を含有する有機化合物である。親化合物は、分子式Ｃ２Ｈ５Ｎを持つアジリジン（またはエチレンイミン）である。
【００４６】
他の非限定的な、例示の反応基は、以下を包含する：アセタール、ケタール、ヘミアセタール、およびヘミケタール、カルボン酸、強い非酸化酸、強い酸化酸、弱酸、アクリラートおよびアクリル酸、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、クロロホルマート、アルコールおよびポリオール、アルデヒド、アセチレン水素アミドもしくはイミドを持つかまたは持たないアルキン、アミン、芳香族、アミン、ホスフィン、ピリジン、無水物、ハロゲン化アリール、アゾ、ジアゾ、アジド、ヒドラジン、およびアジド化合物、強塩基、弱塩基、カルバマート、炭酸塩、クロロシラン、共役（conjugated）ジエン、シアン化物、無機物、ジアゾニウム塩、エポキシド、エステル、硫酸エステル、リン酸エステル、チオリン酸エステル、ホウ酸エステル、エーテル、可溶性フッ化物塩、フッ化有機化合物、ハロゲン化有機化合物、ハロゲン化剤、脂肪族飽和炭化水素、脂肪族不飽和炭化水素、炭化水素、芳香族、分類には情報が不十分であるもの、イソシアナートおよびイソチオシアナート、ケトン、金属水素化物、アルキル金属、アリール金属、およびシラン、アルカリ金属、硝酸塩および亜硝酸塩化合物、無機物、窒化物、リン化物、炭化物、およびケイ化物、ニトリル、ニトロ、ニトロソ、硝酸塩、亜硝酸塩化合物、有機物、非レドックス活性無機化合物、有機金属、オキシム、過酸化物、有機物、フェノール塩、フェノールおよびクレゾール、重合可能な化合物、第四級アンモニウムおよびホスホニウム塩、強還元剤、弱還元剤、酸性塩、塩基性塩、シロキサン、無機硫化物、有機硫化物、亜硫酸およびチオ硫酸塩、スルホン酸塩、ホスホン酸塩、有機チオホスホン酸塩、チオカルバマートのエステルおよび塩、およびジチオカルバマートのエステルおよび塩。
【００４７】
オリゴ糖に付着している剤（例として、反応化学基を介して）は、オリゴ糖と反応し、よって共有結合的な付着を結果としてもたらす、対応する化学基を含有し得る。いくつかの態様において、剤は、オリゴ糖に、リンカー、例としてペプチドリンカーを介して、付着している。いくつかの態様において、剤は、タンパク質またはペプチドである。このことから、タンパク質またはペプチドのアミノ酸の１つ以上が、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、オリゴ糖への付着のためのリンカー、などの化学物質を包含するように修飾されていてもよい。
【００４８】
本開示の他の側面は、本明細書中に記載されたスフィンゴ糖脂質によって送達され得る剤を提供する。剤は、あらゆる生物活性剤または治療剤であり得る。「治療剤」は、疾患または障害に対し治療的効果を有する剤を指す。スフィンゴ糖脂質と治療剤との間の複合は、本明細書中では、「スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体」と称される。治療剤は、限定なしに、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖および炭水化物、脂質、糖タンパク質、小分子、合成の有機および無機の薬物であって対象へ投与したときに生物学的効果を奏するもの、およびそれらの組み合わせ、であり得る。いくつかの態様において、治療剤は、抗炎症剤、ワクチン抗原、ワクチンアジュバント、抗体、酵素、抗がん薬または化学療法薬、凝固因子、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、抗生物質、または、心血管疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、アレルギー、血液障害、代謝障害、もしくは皮膚疾患の処置のための薬物、である。いくつかの態様において、治療剤は、タンパク質またはペプチドである。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、またはその機能性フラグメントである。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは、Exendin-4、またはその機能性フラグメントである。
【００４９】
「グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）」は、プログルカゴン遺伝子の組織特異的な翻訳後プロセッシングに由来する３０アミノ酸長さのペプチドホルモンである。これは、腸管内の腸内分泌Ｌ細胞および脳幹中の孤束核内のあるニューロンによって、食物消費の際に生産されおよび分泌される。初期生成物ＧＬＰ−１（１−３７）はアミド化およびタンパク質分解的切断を受けやすく、これは２つの切断型のおよび等電位の生物学的に活性な形態、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドおよびＧＬＰ−１（７−３７）を生じさせる。活性なＧＬＰ−１は、リンカー領域によって分離されたアミノ酸位置１３〜２０および２４〜３５からの２つのαらせんを構成する。ＧＬＰ−１は、それを（およびその機能的アナログを）真性糖尿病の潜在的な処置法として徹底的な調査の対象にさせるような数種の生理学的特性を持ち合わせている。さらに、ＧＬＰ−１は、インスリンの分泌を向上させることによりグルコース依存的な様式で血糖レベルを減少させる能力を有する。よって、ＧＬＰ−１は、数多の調節および保護効果と関連付けられている。ＧＬＰ−１に基づいた処置は、糖尿病を持つ生活の２つの極めて重要な側面である、体重減少およびより低い低血糖リスクと関連付けられている。
【００５０】
「Exendin-4」は、インスリン分泌を促進するグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）受容体のペプチドアゴニストである。Exendin-4は、無傷のヒトグルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）にＧＬＰ−１に類似のやり方で結合し、および、ＧＬＰ−１に対する５０％のアミノ酸相同性を保有する。Exendin-4は、食事を摂ることに応答した膵臓応答の増大（例として、インスリン分泌を増加させる）を介してグルコース制御を円滑化し、摂食に応答したグルカゴンの膵臓放出を抑制し、胃を空にする速度を低減させ、食欲を抑制し、および肝臓脂肪含有量を低減させる。
【００５１】
いくつかの態様において、治療剤は、ワクチン抗原である。「ワクチン抗原」は、対象へ投与されたときに、抗原を特異的に結合する抗体の生産を活性化または増加させる分子または部分である。いくつかの態様において、抗原は、タンパク質または多糖である。病原体の抗原は、当業者によく知られており、および、細菌、ウイルスおよび他の微生物の一部分（コート、カプセル、細胞壁、鞭毛、線毛、および毒素）を包含するがこれらに限定されない。ワクチンは、典型的には抗原を含み、および、レシピエントの対象において免疫応答を誘導するために意図的に対象へ投与される。抗原は、病原性ウイルス、細菌、または真菌からのものであり得る。
【００５２】
病原性ウイルスの例は、限定なしに、以下を包含する：Retroviridae（例として、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶともまた呼ばれる）またはＨＩＶ−ＩＩＩなどのヒト免疫不全ウイルス；および、ＨＩＶ−ＬＰなどの、他の単離体）；Picornaviridae（例として、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Calciviridae（例として、胃腸炎を引き起こす菌株）；Togaviridae（例として、馬脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Flaviridae（例として、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Coronaviridae（例として、コロナウイルス）；Rhabdoviridae（例として、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Filoviridae（例として、エボラウイルス）；Paramyxoviridae（例として、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；Orthomyxoviridae（例として、インフルエンザウイルス）；Bungaviridae（例として、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；Arena viridae（出血熱ウイルス）；Reoviridae（例として、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；Birnaviridae；Hepadnaviridae（Ｂ型肝炎ウイルス）；Parvoviridae（パルボウイルス）；Papovaviridae（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Adenoviridae（ほとんどのアデノウイルス）；Herpesviridae（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；Poxviridae（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびIridoviridae（例として、アフリカ豚熱ウイルス）；および分類されていないウイルス（例として、海綿状脳症の病因剤、デルタ肝炎の剤（Ｂ型肝炎ウイルスの、欠陥のあるサテライトであると思われる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の剤（クラス１＝内部的に伝達される；クラス２＝非経口的に伝達される（すなわち、Ｃ型肝炎）；Norwalkおよび関連するウイルス、およびアストロウイルス）。
【００５３】
病原性細菌の例は、限定なしに、以下を包含する：Helicobacter pyloris、Borelia burgdorferi、Legionella pneumophilia、Mycobacteria spp.（例として、M. tuberculosis、M. avium、M. intracellulare、M. kansasii、M. gordonae）、Staphylococcus aureus、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Listeria monocytogenes、Streptococcus pyogenes（Ａ群連鎖球菌）、Streptococcus agalactiae（Ｂ群連鎖球菌）、Streptococcus（ビリダンス連鎖球菌群）、Streptococcus faecalis、Streptococcus bovis、Streptococcus（嫌気性株）、Streptococcus pneumoniae、pathogenic Campylobacter sp.、Enterococcus sp.、Haemophilus influenzae、Bacillus anthracis、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium sp.、Erysipelothrix rhusiopathiae、Clostridium perfringens、Clostridium tetani、Enterobacter aerogenes、Klebsiella pneumoniae、Pasturella multocida、Bacteroides sp.、Fusobacterium nucleatum、Streptobacillus moniliformis、Treponema pallidum、Treponema pertenue、Leptospira、およびActinomyces israelli。
【００５４】
病原性真菌の例は、限定なしに、以下を包含する：Cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum、Coccidioides immitis、Blastomyces dermatitidis、Chlamydia trachomatis、Candida albicans。他の感染性生物（すなわち、原生生物）は、以下を包含する：Plasmodium falciparumおよびToxoplasma gondii。
本明細書中に記載されたスフィンゴ糖脂質を使用して送達され得る剤の他の非限定的な例が提供される。
【００５５】
本開示のリポソーム薬物送達系に使用され得る、非限定的な、例示の化学医薬組成物は、アクチノマイシン、全トランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンを包含する。いくつかの態様において、化学療法剤は、ドキソルビシンである。
【００５６】
抗新生物化合物の例は、限定なしに、以下を包含する：ニトロソウレア、例として、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプゾトシン；メチルヒドラジン、例として、プロカルバジン、ダカルバジン；ステロイドホルモン、例として、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、アンドロゲン、テトラヒドロデオキシコルチコステロン（tetrahydrodesoxycaricosterone）、サイトカインおよび成長因子；アスパラギナーゼ。
免疫活性化合物の例は、限定なしに、以下を包含する：免疫抑制剤、例として、ピリメタミン、トリメトプテリン、ペニシラミン、シクロスポリン、アザチオプリン；免疫刺激剤、例として、レバミゾール、ジチオカルバミン酸ジエチル、エンケファリン、エンドルフィン。
【００５７】
抗微生物化合物の例は、限定なしに、以下を包含する：抗生物質、例として、ベータラクタム、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム（carbapenims）およびモノバクタム、ベータラクタマーゼインヒビター、アミノグリコシド、マクロライド、テトラサイクリン、スペクチノマイシン；抗マラリア薬、殺アメーバ薬、抗原虫薬、抗真菌薬、例として、アムホテリシンベータ、抗ウイルス薬、例として、アシクロビル、イドクスウリジン、リバビリン、トリフルリジン、ビダルビン、ガンシクロビル。
寄生虫駆除剤の例は、限定なしに、以下を包含する：抗駆虫薬、放射性医薬品、胃腸薬。
血液作用化合物の例は、限定なしに、以下を包含する：免疫グロブリン；血液凝固タンパク質；例として、抗血友病因子、第ＩＸ因子複合体；抗凝固薬、例として、ジクマロール、ヘパリンＮａ；フィブロリジンインヒビター、トラネキサム酸。
【００５８】
心血管薬の例は、限定なしに、以下を包含する：末梢性抗アドレナリン作動薬、中枢作用性降圧薬、例として、メチルドーパ、メチルドーパＨＣｌ；降圧直接血管拡張剤薬、例として、ジアゾキシド、ヒドララジンＨＣｌ；レニン−アンジオテンシン系に影響を及ぼす薬物；末梢血管拡張薬、フェントラミン；抗狭心症薬；強心薬配糖体；強心性血管拡張薬；例として、アムリノン、ミルリノン、エノキシモン、フェノキシモン、イマゾダン、スルマゾール；抗不整脈薬；カルシウム流入阻害薬；血液脂質に影響を及ぼす薬物；ラニチジン、ボセンタン、レズリン。
【００５９】
呼吸器薬の例は、限定なしに、以下を包含する：交感神経様作用薬（交感神経興奮薬）：アルブテロール、メシル酸ビトルテロール、ドブタミンＨＣｌ、ドーパミンＨＣｌ、エフェドリンＳＯ、エピネフリン、フェンフルラミンＨＣｌ、イソプロテレノールＨＣｌ、メトキサミンＨＣｌ、ノルエピネフリン重酒石酸塩、フェニレフリンＨＣｌ、リトドリンＨＣｌ；コリン模倣薬、例として、アセチルコリンＣｌ；抗コリンエステラーゼ、例として、エドロフォニウムＣｌ；コリンエステラーゼ再活性化因子；アドレナリン遮断薬、例として、アセブトロールＨＣｌ、アテノロール、エスモロールＨＣｌ、ラベタロールＨＣｌ、メトプロロール、ナドロール、メシル酸フェントラミン、プロプラノロールＨＣｌ；抗ムスカリン薬、例として、アニソトロピンメチルブロミド、アトロピンＳＯ４、クリニジウムＢｒ、グリコピロラート、イプラトロピウムＢｒ、スコポラミンＨＢｒ。
【００６０】
神経筋遮断薬の例は、限定なしに、以下を包含する：脱分極、例として、ベシル酸アトラクリウム、ヘキサフルオレニウムＢｒ、ヨウ化メトクリン、スクシニルコリンＣｌ、ツボクラリンＣｌ、ベクロニウムＢｒ；中枢作用筋弛緩薬、例として、バクロフェン。
神経伝達物質および神経伝達剤の例は、限定なしに、以下を包含する：アセチルコリン、アデノシン、アデノシン三リン酸、アミノ酸神経伝達物質、例として、興奮性アミノ酸、ＧＡＢＡ、グリシン；生体アミン神経伝達物質、例として、ドーパミン、エピネフリン、ヒスタミン、ノルエピネフリン、オクトパミン、セロトニン、チラミン；神経ペプチド、一酸化窒素、Ｋ＋チャネル毒素、
【００６１】
抗パーキンソン病薬の例は、限定なしに、以下を包含する：アマンタジン （amaltidine）ＨＣｌ、メシル酸ベンズトロピン、例として、カルビドパ。
利尿薬の例は、限定なしに、以下を包含する：ジクロルフェナミド、メタゾラミド、ベンドロフルメチアジド、ポリチアジド。
子宮抗片頭痛薬の例は、限定なしに、以下を包含する：カルボプロストトロメタミン、メシル酸塩、メチセルギドマレイン酸塩。
【００６２】
ホルモンの例は、限定なしに、以下を包含する：下垂体ホルモン、例として、絨毛性ゴナドトロピン、コシントロピン、メノトロピン、ソマトトロピン、コルチコトロピン（iorticotropin）、プロチレリン、チロトロピン、バソプレシン、リプレシン；副腎ホルモン、例として、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、トリアムシノロン；膵臓ホルモン、例として、グルカゴン、インスリン；副甲状腺ホルモン、例として、ジヒドロタキステロール（dihydrochysterol）；甲状腺ホルモン、例として、カルシトニンエチドロン酸二ナトリウム、レボチロキシンＮａ、リオチロニンＮａ、リオトリックス、チログロブリン、酢酸テリパラチド；抗甲状腺薬；エストロゲンホルモン；プロゲスチンおよびアンタゴニスト、ホルモン避妊薬、精巣ホルモン；消化管ホルモン：コレシストキニン、エンテログリカン、ガラニン、胃抑制ポリペプチド、上皮成長因子ウロガストロン、胃抑制ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、ガストリン、ペンタガストリン、テトラガストリン、モチリン、ペプチドＹＹ、セクレチン、血管作動性腸管ペプチド、シンカリド。
【００６３】
酵素の例は、限定なしに、以下を包含する：ヒアルロニダーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、PGEアデノシンデアミナーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、シンターゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼ、消化酵素（例として、プロテアーゼ、リパーゼ、カルボヒドラーゼ、およびヌクレアーゼ）。いくつかの態様において、酵素は、ラクターゼ、ベータガラクトシダーゼ、膵酵素、油分解酵素、ムチナーゼ、セルラーゼ、イソマルターゼ、アルギナーゼ、消化リパーゼ（例として、舌リパーゼ、膵リパーゼ、ホスホリパーゼ）、アミラーゼ、セルラーゼ、リゾチーム、プロテアーゼ（例として、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エラスターゼ）、エステラーゼ（例として、ステロールエステラーゼ）、二糖類分解酵素（例として、スクラーゼ、ラクターゼ、ベータガラクトシダーゼ、マルターゼ、イソマルターゼ）、ＤＮＡ分解酵素、およびＲＮＡ分解酵素からなる群から選択される。
【００６４】
静脈麻酔薬の例は、限定なしに、以下を包含する：ドロペリドール、エトミダート、クエン酸フェンタニル（fetanyl）／ドロペリドール、ヘキソバルビタール、塩酸ケタミン、メトヘキシタールＮａ、チアミラールＮａ、チオペンタールＮａ。
抗てんかん薬の例は、限定なしに、カルバマゼピン、クロナゼパム、ジバルプロエクスＮａ、エトスクシミド、メフェニトイン、パラメタジオン、フェニトイン、プリミドンを包含する。
【００６５】
治療剤として使用され得るペプチドおよびタンパク質の例は、限定なしに、以下を包含する：アンキリン、アレスチン、細菌膜タンパク質、クラスリン、コネキシン、ジストロフィン、エンドセリン受容体、スペクトリン、セレクチン、サイトカイン；ケモカイン；成長因子、インスリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ニューロペプチド、ニューロペプチドＹ、ニューロテンシン、トランスフォーミング増殖因子アルファ、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターフェロン（ＩＦＮ）、およびホルモン、成長阻害剤、例として、ゲニステイン、ステロイド等々；糖タンパク質、例として、ＡＢＣトランスポーター、血小板糖タンパク質、ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体、ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ複合体、ビトロネクチン、トロンボモジュリン、ＣＤ４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ４４、リンパ球機能関連抗原、細胞間接着分子、血管細胞接着分子、Ｔｈｙ−１、アンチポーター、ＣＡ−１５−３抗原、フィブロネクチン、ラミニン、ミエリン関連糖タンパク質、ＧＡＰ、ＧＡＰ−４３、Exendin-4、およびＧＬＰ−１。
【００６６】
サイトカインおよびサイトカイン受容体の例は、限定なしに、以下を包含する：インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−３受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−５受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１１受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１４受容体、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１６受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、リンホカイン阻害因子、マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来成長因子、幹細胞因子、腫瘍成長因子ベータ、腫瘍壊死因子、リンホトキシン、Ｆａｓ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ。
【００６７】
成長因子およびタンパク質ホルモンの例は、限定なしに、以下を包含する：エリスロポエチン、アンギオジェニン、肝細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、神経成長因子、腫瘍成長因子アルファ、トロンボポエチン、甲状腺刺激因子、甲状腺放出ホルモン、ニューロトロフィン、上皮成長因子、ＶＥＧＦ、毛様体神経栄養因子、ＬＤＬ、ソマトメジン、インスリン成長因子、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ。
【００６８】
ケモカインの例は、限定なしに、以下を包含する：ＥＮＡ−７８、ＥＬＣ、ＧＲＯ−アルファ、ＧＲＯ−ベータ、ＧＲＯ−ガンマ、ＨＲＧ、ＬＩＦ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＩＧ、ＭＤＣ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＳＣＦ、ＬＩＦ、レプチン、ＲＡＮＴＥＳ、リンホタクチン、エオタキシン−１、エオタキシン−２、ＴＡＲＣ、ＴＥＣＫ、ＷＡＰ−１、ＷＡＰ−２、ＧＣＰ−１、ＧＣＰ−２；アルファ−ケモカイン受容体：ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７；ベータ−ケモカイン受容体：ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７。
【００６９】
いくつかの態様において、本明細書中に記載された送達ビヒクルを使用して送達され得る抗体は、限定なしに、以下を包含する抗原を標的とする：（ａ）分化抗原ＣＤ−１〜ＣＤ−１６６およびこれらの分子に対するリガンドまたは対抗受容体の抗クラスター；（ｂ）抗サイトカイン抗体、例として、抗ＩＬ−１〜抗ＩＬ−１８およびこれらの分子に対する受容体；（ｃ）抗免疫受容体抗体、Ｔ細胞受容体、主組織適合複合体ＩおよびＩＩ、Ｂ細胞受容体、セレクチンキラー阻害性受容体、キラー活性化受容体、ＯＸ−４０、ＭａｄＣＡＭ−１、Ｇｌｙ−ＣＡＭ１、インテグリン、カドヘリン（cadherens）、シアロアドヘリン（sialoadherens）、Ｆａｓ、ＣＴＬＡ−４、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、Ｆｃイプシロン受容体、Ｆｃミュー受容体、およびこれらのリガンド、に対する抗体；（ｄ）抗メタロプロテイナーゼ抗体、例として、コラゲナーゼ、ＭＭＰ−１〜ＭＭＰ−８、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２；抗細胞溶解／炎症誘発性分子、例として、パーフォリン、補体構成成分、プロスタノイド、窒素酸化物（nitron oxide）、トロンボキサン；ならびに抗接着分子、例として、癌胎児性抗原、ラミン、フィブロネクチン。
【００７０】
非限定的な、例示の抗体およびそのフラグメントは、以下を包含する：ベバシズマブ（AVASTIN（登録商標））、トラスツズマブ（HERCEPTIN（登録商標））、アレムツズマブ（CAMPATH（登録商標）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病に適応される）、ゲムツズマブ（MYLOTARG（登録商標）、ｈＰ６７．６、抗ＣＤ３３、急性骨髄性白血病などの白血病に適応される）、リツキシマブ（RITUXAN（登録商標））、トシツモマブ（BEXXAR（登録商標）、抗ＣＤ２０、Ｂ細胞悪性腫瘍に適応される）、ＭＤＸ−２１０（ＨＥＲ−２／ｎｅｕがん遺伝子産物および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のためのＩ型Ｆｃ受容体（ＦｃガンマＲＩ）へ同時に結合する二重特異性抗体）、オレゴボマブ（OVAREX（登録商標）、卵巣がんに適応される）、エドレコロマブ（PANOREX（登録商標））、ダクリズマブ（ZENAPAX（登録商標））、パリビズマブ（SYNAGIS（登録商標）、ＲＳＶ感染などの呼吸器の状態に適応される）、イブリツモマブ チウキセタン（ZEVALIN（登録商標）、非ホジキンリンパ腫に適応される）、セツキシマブ（ERBITUX（登録商標））、ＭＤＸ−４４７、ＭＤＸ−２２、ＭＤＸ−２２０（抗ＴＡＧ−７２）、ＩＯＲ−Ｃ５、ＩＯＲ−Ｔ６（抗ＣＤ１）、ＩＯＲ ＥＧＦ／Ｒ３、セロゴバブ（celogovab）（ONCOSCINT（登録商標）ＯＶ１０３）、エプラツズマブ（LYMPHOCIDE（登録商標））、ペムツモマブ（THERAGYN（登録商標））およびグリオマブ−Ｈ（脳がん、メラノーマに適応される）。他の抗体および抗体フラグメントは企図され、および本開示に従って使用され得る。
【００７１】
調節タンパク質は、いくつかの態様において、転写因子または免疫調節タンパク質であり得る。非限定的な、例示の転写因子は、以下を包含する：Ｒｅｌ−Ａ、ｃ−Ｒｅｌ、Ｒｅｌ−Ｂ、ｐ５０およびｐ５２などのＮＦｋＢファミリーのもの；Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ−１、Ｆｒａ−２、Ｊｕｎ、ＪｕｎＢおよびＪｕｎＤなどのＡＰ−１ファミリーのもの；ＡＴＦ；ＣＲＥＢ；ＳＴＡＴ−１、−２、−３、−４、−５および−６；ＮＦＡＴ−１、−２および−４；ＭＡＦ；甲状腺因子；ＩＲＦ；Ｏｃｔ−１および−２；ＮＦ−Ｙ；Ｅｇｒ−１；およびＵＳＦ−４３、ＥＧＲ１、Ｓｐ１、およびＥ２Ｆ１。
【００７２】
抗ウイルス剤の例は、限定なしに、以下を包含する：逆転写酵素インヒビターおよびヌクレオシドアナログ、例として、ｄｄＩ、ｄｄＣ、３ＴＣ、ｄｄＡ、ＡＺＴ；プロテアーゼインヒビター、例として、インビラーゼ；ＡＢＴ−５３８；ＲＮＡプロセッシングにおけるインヒビター、例として、リバビリン。
本明細書中に記載されたセラミド構造をスフィンゴ糖脂質へ共役させることによって送達され得る他の知られている治療薬の非限定的な例は、以下を包含する：
【００７３】
（ａ）カポテン（Capoten）、モノプリル（Monopril）、プラバコール（Pravachol）、アバプロ（Avapro）、プラビックス（Plavix）、セフジル（Cefzil）、デュリセフ（Duricef）／ウルトラセフ（Ultracef）、アザクタム（Azactam）、ヴァイデックス（Videx）、ゼリット（Zerit）、マキシピーム（Maxipime）、ベプシド（VePesid）、パラプラチン（Paraplatin）、プラチノール（Platinol）、タキソール（Taxol）、ＵＦＴ、バスパー（Buspar）、セルゾン（Serzone）、スタドール（Stadol）ＮＳ、エストレース（Estrace）、グルコファージ（Glucophage）（Bristol-Myers Squibb）；
（ｂ）セクロール（Ceclor）、ロラビド（Lorabid）、ジナバク（Dynabac）、プロザック（Prozac）、ダルボン（Darvon）、ペルマックス（Permax）、ジプレキサ（Zyprexa）、ヒューマログ（Humalog）、アキシッド（Axid）、ジェムザール（Gemzar）、エビスタ（Evista）（Eli Lily）；
（ｃ）バソテック（Vasotec）／バセレティック（Vaseretic）、メバコール（Mevacor）、ゾコール（Zocor）、プリニビル（Prinivil）／プリンザイド（Prinizide）、プレンジル（Plendil）、コザール（Cozaar）／ハイザール（Hyzaar）、ペプシド（Pepcid）、プリロセック（Prilosec）、プリマキシン（Primaxin）、ノロキシン（Noroxin）、リコンビバックス（Recombivax）ＨＢ、バリバックス（Varivax）、チモプティク（Timoptic）／ＸＥ、トルソプト（Trusopt）、プロスカー（Proscar）、フォサマックス（Fosamax）、シネメット（Sinemet）、クリキシバン（Crixivan）、プロペシア（Propecia）、ビオックス（Vioxx）、シングレア（Singulair）、マクサルト（Maxalt）、イベルメクチン（Ivermectin）（Merck&Co.）；
（ｄ）ジフルカン（Diflucan）、ユナシン（Unasyn）、スルペラゾン（Sulperazon）、ジスロマック（Zithromax）、トロバン（Trovan）、プロカジア（Procardia）ＸＬ、カルデュラ（Cardura）、ノルバスク（Norvasc）、ドフェチリド（Dofetilide）、フェルデン（Feldene）、ゾロフト（Zoloft）、ゼルドックス（Zeldox）、グルコトロール（Glucotrol）ＸＬ、ジルテック（Zyrtec）、エレトリプタン（Eletriptan）、バイアグラ（Viagra）、ドロロキシフェン（Droloxifene）、アリセプト（Aricept）、リピトール（Lipitor）（Pfizer）；
（ｅ）バンチン（Vantin）、レスクリプター（Rescriptor）、ビスタイド（Vistide）、ジェノトロピン（Genotropin）、ミクロナーゼ（Micronase）／グリン．（Glyn.）／グリブ．（Glyb.）、フラグルニン（Fragrnin）、トータルメドロール（Total Medrol）、ザナックス（Xanax）／アルプラゾラム、サーミオン（Sermion）、ハルシオン（Halcion）／トリアゾラム、フリードックス（Freedox）、ドスティネックス（Dostinex）、エドロナックス（Edronax）、ミラペックス（Mirapex）、ファルモルビシン（Pharmorubicin）、アドリアマイシン（Adriamycin）、カルンプトサー（Carnptosar）、レミサール（Remisar）、デポ・プロベラ（Depo-Provera）、カバージェクト（Caverject）、デトルシトール（Detrusitol）、エストリング（Estring）、ヒアロン（Healon）、キサラタン（Xalatan）、ロゲイン（Rogaine）（Phannacia & Upjohn）；
（ｆ）ロピッド（Lopid）、アキュプリル（Accrupil）、ディランティン（Dilantin）、コグネックス（Cognex）、ニューロンティン（Neurontin）、ロエストリン（Loestrin）、ディルゼム（Dilzem）、フェムパッチ（Fempatch）、エストロステップ（Estrostep）、レズリン（Rezulin）、リピトール（Lipitor）、オムニセフ（Omnicef）、フェムハート（FemHRT）、スラミン（Suramin）およびクリナフロキサシン（Clinafloxacin）（Warner Lambert）。
【００７４】
本発明のスフィンゴ糖脂質−治療剤複合体によって送達され得る治療剤のさらなる非限定的な例は：Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. 9th ed. McGraw-Hill 1996において見出され得る。
【００７５】
スフィンゴ糖脂質および送達される剤を含む送達ビヒクル、またはスフィンゴ糖脂質−薬剤複合体（例として、スフィンゴ糖脂質−治療剤）複合体は、医薬組成物へと製剤化されていてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。「薬学的に許容し得る」は、健全な医学的判断の範囲内で過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比で釣り合っているそれらの化合物、材料、組成物および／または投薬形態を指す。
【００７６】
「薬学的に許容し得る担体」は、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤またはカプセル化材料などの、薬学的に許容し得る材料、化合物またはビヒクルであって、１つの器官または身体の一部分から物の器官または身体の一部分へと対象とする剤を運ぶことまたは輸送することに関与するものであり得る。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、および患者の組織に傷害性でない（例として、生理学的に適合性、滅菌されている、生理学的ｐＨ、等々）という意味で「許容し得る」ものでなくてはならない。用語「担体」は、適用を円滑化するために活性成分と組み合わせられる天然または合成の、有機もしくは無機の成分を指し示す。医薬組成物の構成成分はまた、本開示の分子とともにまたは互いに、所望の薬効を実質的に損なう相互作用がないような様式で混じり合う能力も持つ。
【００７７】
薬学的に許容し得る担体をして役立つことができる材料のいくつかの例は、以下を包含する：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロースなどの、セルロースおよびその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑沢剤；（８）ココアバターおよび坐剤ロウなどの賦形剤；（９）落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブオイル、コーン油および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物資非含水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボナートおよび／またはポリ無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清構成要素；（２２）エタノールなどのＣ２〜Ｃ１２アルコール；および（２３）医薬製剤において用いられる他の非毒性の適合性物質。
【００７８】
湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、フレーバー剤、香り付与剤、防腐剤および抗酸化剤もまた、製剤中に存在することができる。
【００７９】
医薬組成物は、便利に単位用量形態で提示されてもよく、また、薬学の技術分野においてよく知られている方法のあらゆるものによって調製されてもよい。用語「単位用量」は、本開示の医薬組成物への参照において使用されるときには、各々の単位が、要求される希釈剤；すなわち、担体またはビヒクル、と関連して所望の治療効果を生み出すために算出された所定の量の活性材料を含有する、対象への１単位の投薬として好適である物理的に孤立した単位を指す。
【００８０】
医薬組成物の剤形は、投与のルートに依存的なものであり得る。非経口投与、または腫瘍内、腫瘍周囲、病変内もしくは病変周囲投与のために好適な注射可能な調製物は、例えば、滅菌された注射可能な水性または油性の懸濁物を包含し、および、知られている技術により、好適な分散または湿潤剤および懸濁剤を使用して、製剤化され得る。滅菌された注射可能な調製物はまた、例えば、１，３プロパンジオールまたは１，３ブタンジオール中における溶液のような、無毒の非経口的に許容し得る希釈剤または溶媒中における、滅菌された溶液、懸濁物またはエマルションであってもよい。
【００８１】
許容し得るビヒクルおよび溶媒の中でも、採用され得るものは、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌された固定油が、慣用的に溶媒または懸濁媒体として採用される。この目的のために、あらゆる低刺激性固定性油が採用され得、これには合成モノまたはジ−グリセリドが包含される。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤での使用が見出される。注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、または、滅菌水または他の滅菌された注射可能な媒体中に使用前に溶解または分散されることができる滅菌された固体組成物の形態である滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。
【００８２】
経口投与に適切である組成物は、所定の量の抗炎症剤を各々が含有する、カプセル、錠剤、トローチなどの孤立した単位として提示され得る。他の組成物は、シロップ、エリキシルまたはエマルションなどの、水性液体または非水性液体中における懸濁物を包含する。
【００８３】
他の送達系は、時間放出、遅延放出または持続放出送達系を包含することができる。かかる系は、抗炎症剤の繰り返し投与を回避することができ、対象および医師に対する利便性を増加させる。多数のタイプの放出送達系が利用可能であり、および当業者に知られている。それらは、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリシュウ酸塩、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物などのポリマー基剤系を包含する。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第5,075,109号に記載されている。
【００８４】
送達系はまた、以下の非ポリマー系を包含する：コレステロールなどのステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸またはモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドなどの中性脂肪、を包含する脂質；ヒドロゲル放出系；シラスチック系；ペプチドに基づいた系；ワックスコーティング；慣用のバインダーおよび賦形剤；部分的に融合されたインプラント；等。特定的な例は、これらに限定されるものでないが、以下を包含する：（ａ）米国特許第4,452,775号、4,667,014号、4,748,034号および5,239,660号に記載されたものなどの、マトリックス内の形態で抗炎症剤が含有される侵食系、および（ｂ）米国特許第3,832,253号および3,854,480号に記載されているなどの、ポリマーから制御された速度で活性な構成成分が透過する拡散系。加えて、ポンプに基づいたハードウェア送達系を使用することができ、そのいくつかはインプラントに適合される。
【００８５】
長期持続型放出インプラントの使用は、慢性状態の処置のために特に好適であり得る。長期放出は、本明細書中で使用され、インプラントが少なくとも３０日間、および好ましくは６０日間、活性成分の治療的レベルを送達するように構築および配置されることを意味する。長期持続型放出インプラントは、当業者によく知られており、および、上に記載された放出系のいくつかを包含する。
【００８６】
いくつかの態様において、治療的投与のために使用される医薬組成物は、滅菌されていなければならない。滅菌性は、滅菌濾過膜（例として、０．２ミクロン膜）を通した濾過によって容易に成し遂げられる。代替的に、防腐剤を、微生物の成長または作用を予防するために使用することができる。様々な防腐剤がよく知られており、および、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸を包含する。医薬組成物は、通常、凍結乾燥された形態でまたはそれが熱および酸化変性に対して高度に安定であれば水性溶液として、保管されることになる。調製物のｐＨは、典型的には、約６〜８になるが、ただし、ある事例では、より高いかまたはより低いｐＨ値もまた適当であるとすることができる。
【００８７】
本開示の他の側面は、細胞内へとまたは粘膜表面を横切って剤（例として、治療剤）を送達する方法であって、送達ビヒクルもしくは剤の取り込みまたは粘膜表面を横切る送達ビヒクルもしくは剤の吸収（例として、トランスサイトーシスを介して）に適した条件下で、送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−薬剤複合体（例として、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体）、または、送達ビヒクルまたはスフィンゴ糖脂質−薬剤複合体（例として、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体）を含む医薬組成物を細胞または粘膜表面と接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−薬剤複合体、または、送達ビヒクルまたはスフィンゴ糖脂質−薬剤複合体（例として、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体）を含む医薬組成物が、対象へ投与される。
【００８８】
いくつかの態様において、有効量の送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−薬剤複合体、または、送達ビヒクルまたはスフィンゴ糖脂質−薬剤複合体（例として、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体）を含む医薬組成物が、対象へ投与される。「有効量」は、対象において所望の効果を有するのに必要または十分な量である。有効量は、処置される特定の状態、処置される対象の年齢および体調、状態の重症度、処置の期間、併用療法（もしあれば）の性質、特定的な投与の経路、ならびに医療従事者の知識および専門技能の内にある他の要因により、変動し得る。例えば、有効量は、腫瘍、がん、または細菌、ウイルスもしくは真菌感染を解消するのに必要な量とすることができる。この量は、個体間で変動することになり、および、当業者に知られている方法を使用して経験的に決定することができる。
【００８９】
送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−薬剤複合体、または、送達ビヒクルまたはスフィンゴ糖脂質−薬剤複合体（例として、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体）を含む医薬組成物は、あらゆるルートによって投与され得る。投与のルートは、経口および胃腸管が関与するあらゆる他の手段などの経腸ルート、および、注射（皮下、静脈内、筋肉内注射）によるものまたは注入（典型的には静脈内ルートによる）などの非経口ルートを包含する。注射は、ボーラスまたは持続注入とすることができる。
【００９０】
本明細書中に記載された組成物・方法は、多数の文脈において使用することができ、および、それらを使用されることができる対象は、例えば、ヒトまたは、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、サル、ラットまたはマウスなどの脊椎動物である。
【００９１】
疾患または障害を処置する方法もまた提供される。送達ビヒクル、スフィンゴ糖脂質−薬剤複合体、または、送達ビヒクルまたはスフィンゴ糖脂質−薬剤複合体（例として、スフィンゴ糖脂質−治療剤複合体）を含む医薬組成物は、処置を要するかもしくはその恩恵が得られる１以上の状態／疾患を、有するか、有していたかまたは発症しやすい対象へ投与され得る。例えば、本明細書中に記載された組成物は、免疫系欠損、感染性疾患（ウイルス、真菌、細菌、または寄生生物）、自己免疫疾患、糖尿病、血液障害、がん、代謝障害、アレルギー、炎症性腸疾患および皮膚障害を、処置するか、予防するかまたは改善するために使用され得る。加えて、抗原に付着したガングリオシドは、対象のワクチンに対する応答を刺激するために投与されることができる。抗原は、以下からなる群から選択される：病原体に特徴的である抗原、自己免疫疾患に特徴的である抗原、アレルゲンに特徴的である抗原および腫瘍に特徴的である抗原。いくつかの態様において、処置される疾患または障害は、糖尿病である。いくつかの態様において、処置される疾患または障害は、感染症、例として、病原性ウイルス、細菌、または真菌によるものである。いくつかの態様において、疾患または障害は、がんである。
【００９２】
免疫系欠損は、対象の免疫系が正常に機能していないか、またはそれが、対象の免疫応答をブーストするのに、例えば腫瘍またはがん（例として、脳、肺（例として、小細胞および非小細胞）、卵巣、乳房、前立腺、結腸、の腫瘍ならびに他の癌および肉腫）または対象における感染を解消するのに有用となるようには機能していない、あらゆる疾患または障害を包含する。
【００９３】
自己免疫疾患の例は、限定なしに、以下を包含する：アジソン病、真性糖尿病（１型）、グレーブス病、間質性膀胱炎、エリテマトーデス、多発性硬化症および橋本甲状腺炎。アレルギー状態は、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、花粉症、気管支喘息、蕁麻疹（じんましん）および食物アレルギー、および他のアトピー状態を包含する。
非限定的な例示のがんは、以下を包含する：新生物、悪性腫瘍、転移、またはがん性と見なされるような制御されない細胞成長によって特徴づけられるあらゆる疾患もしくは障害。がんは、原発性または転移がんであり得る。
【００９４】
がんは、成人および小児の急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、虫垂のがん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、胆道がん、骨肉腫、線維性組織球腫、脳がん、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、膠芽腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視床下部神経膠腫、乳房がん、男性乳房がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、起源不明の癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、子宮頸部のがん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性および骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、大腸がん、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、
【００９５】
ユーイングファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃がん、消化管間質腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛細胞性白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部および視経路神経膠腫、眼内黒色腫、島細胞腫、カポジ肉腫、腎臓がん、腎細胞がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、原発性中枢神経系リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、扁平上皮頸部がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、
【００９６】
骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体がん、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、前立腺がん、直腸がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚がん、小腸がん、扁平上皮癌、扁平上皮頸部がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺がん、甲状腺がん、移行上皮がん、絨毛性腫瘍、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣のがん、外陰部がん、絨毛癌、血液腫瘍、成人Ｔ細胞白血病、リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、間質性腫瘍および胚細胞腫瘍、またはウィルムス腫瘍、を包含するがこれらに限定されない。
【００９７】
いくつかの態様において、がんは、肺がん、乳房がん、前立腺がん、大腸がん、胃がん、肝がん、膵臓がん、脳および中枢神経系のがん、皮膚がん、卵巣がん、白血病、子宮内膜がん、骨、軟骨および軟組織肉腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、腎芽細胞腫、網膜芽細胞腫、または生殖腺胚細胞腫瘍である。
【００９８】
本明細書中に開示された技術の態様、利点、特色および使用のいくつかは、下記の例から、より充分に理解される。例は、本開示の利益のいくつかを例示して具体的な態様を記載することを意図するが、本開示の全範囲の実例を示すことを意図してはおらず、したがって、本開示の範囲を限定しない。
【００９９】
例
スフィンゴ糖脂質の内因性トランスサイトーシス経路を活用することによる治療用ペプチドの粘膜吸収
臨床医学にタンパク質およびペプチド生物学的製剤を適用するための主要な難題の１つは、大きな分子を標的組織から分離させる上皮および内皮細胞バリアをくぐり抜ける合理的かつ効率的な方法の欠如である。粘膜表面の内壁を覆う上皮細胞の場合には、大きな溶質の吸収のための経路は、細胞の１つの表面を他と（宿主を環境と）接続する経細胞エンドソームトラフィッキングのプロセスであるトランスサイトーシスによる。血液脳関門を典型例とする、血液を組織から分離する緊密な内皮バリアを横切るタンパク質およびペプチド積荷の輸送についても、同じことがいえる。ここでは、スフィンゴ糖脂質の構造・機能を、それらのトランスサイトーシスにおける細胞内トラフィッキングについて、および治療用ペプチドの経細胞輸送を可能にするためのビヒクルとしてのそれらの使用について試験することによって、これらの問題に取り組む。
【０１００】
これらの研究は、宿主細胞の小胞体（ＥＲ）の中へのコレラ毒素の進入の原因を担いおよび疾患に要求される脂質受容体であるスフィンゴ糖脂質ＧＭ１の、細胞内トラフィッキングにおいて、セラミド（脂質）ドメインの構造が決定的な役割を担う（８）、という我々の研究によって知らされた。「ねじれた」シス−不飽和Ｃ１８：１もしくはＣ１６：１脂肪酸または非天然性「短鎖」Ｃ１２：０脂肪酸を持つセラミドを含有するＧＭ１種は、上皮細胞の選別／再循環エンドソームに進入し、様々な細胞内の行先：これはゴルジおよびＥＲへの再循環経路および逆行経路を包含する、への輸送を可能にさせる。これらの脂質は、効率的には後期エンドソーム−リソソーム経路中へと乗り入れない。対照的に、長い飽和脂肪酸鎖（Ｃ１６：０またはそれよりも長い）を持つＧＭ１スフィンゴ脂質は、後期エンドソームおよびリソソーム中へとほぼ排他的に選別される（８）。密接に関連しているこれらの脂質の細胞内分布を分離させる選別ステップは、初期選別エンドソームから出現し、および、それはこれまでのところ試験されている全ての細胞株にわたってロバストなステップであることが見出された。我々の観察は、脂質選別のための２つの主要なモデル：１つは分子形状によるものであり（９〜１１）、他方は膜ミクロドメイン（脂質ラフト）によるものである（１２〜１４）、と一致する。
【０１０１】
極性化された上皮細胞中では、選別エンドソームから別の経路が出現し、およびトランスサイトーシスによる細胞を横切る膜輸送に至る再循環エンドソームに効率的に進入するシス−不飽和または短鎖脂肪酸を持つ同じＧＭ１種もまた、この経路中へと選別される（１５、１６）。宿主細胞への乗り入れのためにスフィンゴ糖脂質を結合させる細菌毒素およびウイルスから類推して（１７〜２０）、この結果はタンパク質またはペプチド治療薬積荷の取り込みおよび経上皮輸送を可能にする手段を提案した。
【０１０２】
粘膜送達について、このアイディアを試験するための第１の試みは、これらのスフィンゴ糖脂質種が治療薬積荷をトランスサイトーシス経路中へと選別する能力を持っていたということを示した。しかし、in vitroでの上皮バリアを横切る輸送またはin vivoでの体循環中への吸収に効果を及ぼす溶液中への放出は、検出可能ではなかった（１６）。分子内選別におけるスフィンゴ糖脂質のための追加の構造・機能研究を実施したところ、脂質を治療用ペプチドの粘膜吸収のための分子担体として作用させることを可能にするセラミドおよびオリゴ糖ドメインの修飾が、腹腔内注射のものに匹敵するバイオアベイラビリティのレベルを達成するということが示された。
【０１０３】
本明細書中で実証されたとおり、スフィンゴ脂質のシリーズを合成し、およびそれらの細胞外オリゴ糖ドメインを介してレポーターペプチドへまたはＧＬＰ−１へ融合させた。Ｃ６：０またはそれよりも小さい脂肪酸を含有するセラミドドメインを持つ脂質への融合は、in vitroで＞１０倍大きいトランスサイトーシスの効率を可能にしており、細胞を横切る能動的な脂質選別およびトランスサイトーシス後の細胞膜から溶液中への放出増幅された放出の速度によって説明づけられる。In vivoでは、ＧＬＰ−１−糖脂質融合分子は、胃強制飼養の後、迅速にかつ全身的に吸収されたことで、ＧＬＰ−１単独の腹腔内注射と同じくらい効果的に耐糖能に影響を及ぼした。
【０１０４】
結果
ＧＭ１のセラミドドメインについての構造−機能研究
ＧＭ１スフィンゴ糖脂質が生物学的製剤の薬物送達に活用できるかどうかを試験するために、非分解性の全Ｄ異性体レポーターペプチドを最初にセラミドドメインについての構造機能研究を可能にするために開発した。レポーターペプチドは、高親和性ストレプトアビジン濃縮のためのビオチン、および定量的検出のためのフルオロフォア分子への化学的ライゲーションを可能にするためのアルキン反応基の２つの官能基を含有するように設計した。Ｃ−末端の反応性アミノオキシは、レポーターペプチドを異なるＧＭ１種のオリゴ糖ドメインに共役させるために使用した（図１Ａおよび図６Ａ）（１６）。レポーターペプチド上の官能基、すなわち、ビオチン、アルキン、フルオロフォアおよびその組み合わせを、ＧＭ１トラフィッキングに対する交絡効果の不在を検証するために試験した（図６Ｂ）。これは、ＧＭ１−ペプチド融合分子を標識するために蛍光コレラ毒素Ｂサブユニットを使用して、エンドソーム選別およびトランスサイトーシスについての共焦点顕微鏡法により評価した（図６Ｃ）。
【０１０５】
全ての場合において、シス−不飽和または短鎖脂肪酸セラミドドメインを含有するペプチド共役ＧＭ１種は、再循環およびトランスサイトーシス経路と一致して小さい細胞質性ベシクルおよび基底外側膜中へと選別され、他方、飽和した長い脂肪酸セラミドドメインを含有するペプチド共役ＧＭ１種はそうならなかった；これらは、その代わりに、後期エンドソーム／リソソームと一致して、より大きい細胞質斑点内へと選別された。両方のイベントは、エンドサイトーシスによる取り込みと一致して、４℃でブロックされた。これらの結果は、以前の研究と一致し（８、１６）、およびレポーターコンストラクトが有効であることを立証する。
【０１０６】
その後調製された全てのスフィンゴ糖脂質−ペプチド融合分子を、Alexa Fluor-488（AF488）へ共役させ、ＨＰＬＣによって精製し、および質量分析によって構造を確認した（図６Ａおよび方法）。ＭＤＣＫ細胞においてパルス追跡によって試験したとき、ペプチド−ＧＭ１融合分子は内在化され、および、予言されたとおり選別された（８）。長い飽和脂肪酸を含有するＧＭ１種（Ｃ１６：０−ＧＭ１）は、リソソームへの選別と一致して、細胞内斑点へ局在化し（図１Ｂ、下部パネル）、および、短い脂肪酸を含有するＧＭ１種は、頂端および基底外側原形質膜および小さい細胞内ベシクルへの局在化により裏付けられたとおり、再循環およびトランスサイトーシス経路中へと選別された（図１Ｂ中央パネル）。
【０１０７】
リソソームをマークするためにlysotrackerを、および再循環エンドソームをマークするためにトランスフェリン受容体を使用して、この解釈を確認した（図６Ｄ）。ペプチドは、単独では、細胞単分子層に結合または進入しなかった（上部パネル）。使用したＧＭ１は元々、ウシ脳から精製されたことで異なるＧＭ１種を合成していたので、最終生成物は、長鎖塩基の２つのアイソフォームを含む：１つはＣ１８：１、および他方はＣ２０：１のスフィンゴシン鎖を含有する。Ｃ１２：０脂肪酸を含有するＧＭ１種については、２つのスフィンゴシンアイソフォームを精製し、およびトランスサイトーシスにおいて同一に辿ることが見出された（図１Ｂ、中央の２つのパネル）。よって、選別反応を支配するのは脂肪酸の構造である（８）。
【０１０８】
セラミド脂肪酸鎖の構造・機能を試験するために、トランスサイトーシスのための定量的アッセイを開発した（図７Ａおよび７Ｂ）。アッセイは、ピコモル濃度に敏感であり、および大きな6-logダイナミックレンジにわたって直接的である（図７Ｂ）。異なるＧＭ１−ペプチド融合物（０．１μＭ）を、極性化された上皮細胞単分子層の頂端リザーバへ適用し、および、基底外側リザーバへの輸送を、３時間後にストレプトアビジン捕捉によっておよびマイクロプレートリーダーTECAN SPARK（登録商標） 10Mにおいて分析した（図１Ｃ、図７Ｃ）。トランスサイトーシスの後の細胞膜から溶液中への脂質−ペプチド融合分子の放出を増幅させるために、脱脂ウシ血清アルブミン（１％ｗ／ｖ）を基底外側リザーバへ加えた。
【０１０９】
全ての研究において、異なるＧＭ１−ペプチド融合分子の等しい負荷のための条件は、膜二重層中へと組み込まれなかった接着したスフィンゴ糖脂質を放出させるためにトリプシンで処置した細胞の定量的蛍光測定によって決定した（図７Ｄ）。異なるＧＭ１−ペプチド融合分子についてのトランスサイトーシスを、見かけ上の透過係数（ＰＡＰＰ；ｃｍ／ｓ）として定量化し、および融合されていないレポーターペプチド（標識されたペプチド）またはネガティブコントロールとしての未処置の単分子層に対して比較した（図１Ｃ、図７Ｃ）。
【０１１０】
ヒト腸管T84細胞単分子層について試験したとき、Ｃ６：０、Ｃ４：０、Ｃ２：０脂肪酸、またはリソ−ＧＭ１については対照と比較して、経上皮輸送（ＰＡＰＰ）におけるおよそ１０倍の増加が見出された。短鎖セラミド脂肪酸への不飽和シス−二重結合の導入（Ｃ１２：１およびＣ６：１）は、飽和種（Ｃ１２：０およびＣ６：０）との比較でトランスサイトーシスへの見かけ上の効果を有しなかった（図１Ｃ）。この結果は、天然の長脂肪酸鎖ＧＭ１スフィンゴ糖脂質のトラフィッキングにおいてシス−二重結合が誘導する劇的な効果とは対照的である（８、１５）。経上皮輸送は、Ｃ６：０−ＧＭ１−ペプチド融合物（灰色のバー）について用量依存的であり、および、広範囲の濃度にわたって、コンジュゲートしていないレポーターペプチド（白いバー）の輸送を大きく超過した（図１Ｄ）。
【０１１１】
個々の分子として、コンジュゲートされていないＧＭ１およびレポーターペプチドを使用した混合実験は、ペプチド積荷の経細胞輸送が、ＧＭ１スフィンゴ糖脂質への融合に依存していたということを確認した（図１Ｅ）。融合されていないレポーターペプチドもＧＭ１−ペプチド融合物も、いずれも、代謝活性の測定（ＭＴＴアッセイ）によって決定された細胞生存率、または経上皮抵抗性（ＴＥＥＲ）もしくはデキストランフラックスとして評価された単分子層の完全性およびタイトジャンクション機能に対し、いかなる検出可能な交絡効果も有しなかった（図７Ｅ〜７Ｇ）。
【０１１２】
トランスサイトーシスによるＧＭ１−ペプチド融合物の能動輸送
数種のアプローチを使用して、上皮細胞単分子層を横切る積荷輸送の機構はトランスサイトーシスによるものであって傍細胞漏出によるものではないということを確認した。第１に、４℃での上皮単分子層を横切る輸送を試験した。かかる低温は、トランスサイトーシスを包含する全ての膜動力学を有効に停止させるが、しかし傍細胞溶質拡散に対しては最小限の効果を有する。Ｔ８４細胞単分子層を横切るＧＭ１−ペプチド融合物の検出可能な輸送は、トランスサイトーシスを介した輸送と一致して、４℃では検出されなかった（図２Ａ）。生細胞共焦点顕微鏡法によってトランスサイトーシスを測定したとき、同じ結果が得られた。
【０１１３】
これらの実験では、エンドサイトーシスによる細胞内への取り込みを最小限にして頂端膜中へのＧＭ１セラミドの組み込みを可能にさせるために、上皮細胞単分子層の頂端膜をＣ６：０−ＧＭ１−ペプチド融合物とともに０℃で４５分間インキュベートした（図２Ｂ、ｘ−ｚおよびｙ−ｚ画像）。単分子層を洗浄し、および１５分間３７℃で追跡したかまたは１０℃の制限温度に保った。Ｃ６：０−ＧＭ１−ペプチド融合物は、３７℃で追跡した細胞においては基底外側膜に局在化して見出されたが、しかし１０℃ではそうではなかった（図２Ｂ；それぞれ左および中央パネル）。１０℃では、細胞外Ｃａ２＋（ＥＤＴＡ処理）の除去によりタイトジャンクションをこじ開けた後でのみ、ＧＭ１−ペプチド融合分子が基底外側膜に接近できた（図２Ｂ、右パネル）。
【０１１４】
第３のアプローチでは、生理学的温度でのエンドサイトーシスを、ダイナミンインヒビターであるDyngo-4Aを使用してブロックした。Ｃ６：０およびＣ１２：０ ＧＭ１−ペプチド融合分子については、基底外側リザーバ中への輸送は、トランスサイトーシスによる能動的経細胞輸送と一致して、Dyngo-4A処置によって強く阻害された（図２Ｃ）。対照的に、Dyngo-4Aは、傍細胞漏出による溶質の拡散について期待されるとおり、レポーターペプチド単独の輸送に対して検出可能な効果を有しなかった。類似した結果が、遺伝学的アプローチを使用して得られた。exocyst複合体は、免疫グロブリンの効率的なレポーター媒介トランスサイトーシスのために必要であり（２１、２２）、および、ＥＸＯＣ２サブユニットのｅｓｉＲＮＡノックダウンは、Ｃ６：０−ＧＭ１ペプチド融合分子の経上皮輸送において予測された５０％減少を引き起こした（図２Ｄ）。対照的に、融合されていないレポーターペプチドの輸送は、exocyst KDによる影響を受けなかった。よって、あるＧＭ１種へのペプチド積荷の融合は、トランスサイトーシスによる上皮バリアを横切るペプチドの能動輸送を可能にする。
【０１１５】
極めて短鎖のＧＭ１種による増幅された溶液中への放出の速度
極めて短鎖の脂肪酸がいかにして上皮細胞単分子層膜を横切る輸送を増幅させたかを説明するために、第１に、トランスサイトーシスの速度をパルス追跡によって測定した。ＭＤＣＫ細胞単分子層の頂端膜を、１０℃にて、等量のＣ１２：０およびＣ６：０−ＧＭ１−ペプチド融合物で負荷し、洗浄し、および次いで３７℃でインキュベートし、および経時的に生細胞共焦点顕微鏡法によって撮像した。トランスサイトーシスを基底外側膜での蛍光として測定した。この方法により、２つのＧＭ１種の間でのトランスサイトーシスの速度の検出可能な違いは見出されなかった（図８Ａ）。両方の場合において、基底外側膜は、１０分間の追跡の後で蛍光を発していた。より長い追跡時間では、しかしながら、Ｃ６：０−とＣ１２：０−ペプチド融合分子の間で劇的な違いが観察された（図３Ａ）。Ｃ１２：０−ＧＭ１ペプチド融合物で負荷された単分子層は、頂端（下部左パネル）および基底外側膜（下部右パネル）の両方において明るく染色された。顕著に対照的に、Ｃ６：０−ＧＭ１ペプチド融合物で負荷された単分子層は、蛍光を示さなかった（中央パネル）。
【０１１６】
この結果は、積荷の放出を引き起こし、および経時的にペプチド−ＧＭ１融合物に関して細胞を空にする、基底外側膜から溶液への放出のより高い速度を示唆するものと解釈された。このアイディアを試験するために、蛍光ＧＭ１−ペプチド融合分子についての細胞膜から溶液への放出の速度を定量化した（方法を参照）。単独でのＤＭＥＭ中へのＧＭ１放出の速度（図３Ｂ）、ならびに、細胞膜からの脂質抽出を増幅させる、脱脂ウシアルブミン（ＢＳＡ）を含有するＤＭＥＭ中へのＧＭ１放出の速度を、測定した（２３）（図３Ｃ）。結果は、Ｃ６：０−ＧＭ１融合分子 （図３Ｂおよび３Ｃ）について、より長鎖のＣ１２：０−ＧＭ１−ペプチド分子と比較して、膜から溶液へのより速くより完全な拡散を示した。溶液中へのより速くより完全な放出は、Ｃ２：０−ＧＭ１−ペプチド融合分子についてもまた観察された（図３Ｂおよび３Ｃ）。よって、短鎖ＧＭ１種による経上皮輸送のより高い効率は、大部分が、トランスサイトーシス後における膜から溶液へのそれらの放出のより高い効率によって説明づけられる。
【０１１７】
スフィンゴ糖脂質は、セラミドに加えて、別の機能的ドメインである、細胞外オリゴ糖頭部基を含有する。これらは、構造的に多様であり、および様々な生物学的活動において働く（２４）。全ての場合において、しかしながら、オリゴ糖頭部基は、スフィンゴ脂質を細胞膜の外葉中にトラップするよう作用し、よって脂質を、細胞を横切るそれらの分布について膜トラフィッキングに依存的なものにする。トランスサイトーシスおよび膜放出に対するセラミド構造の効果がＧＭ１スフィンゴ糖脂質に特有であったのか、または他のスフィンゴ糖脂質種へ一般化することができたものなのかを試験するために、レポーターペプチドを、Ｃ１２：０またはＣ６：０脂肪酸のいずれかを持つセラミドドメインを含有するように合成されたＧＭ３ガングリオシドへ融合させた。ＧＭ３のオリゴ糖ドメインは、ＧＭ１とは２つの糖の不在により異なり、およびよって、ＧＭ１においてレクチン結合部位として強く機能する末端ガラクトース（およびＧａｌＮＡｃ）を欠いている。トランスサイトーシスについて試験したとき、ＧＭ３−Ｃ１２：０−ペプチド融合分子は、密接に関連しているＧＭ１−Ｃ１２：０−ペプチド融合物よりもはるかにより効率的に；およびＧＭ１−Ｃ６：０およびＣ２：０種と同じくらい効率的に、上皮単分子層を横断するということが、予想外なことに見出された（図３Ｄ）。
【０１１８】
類似して、ＧＭ３−Ｃ６：０−ペプチドについての経上皮輸送は、直接的に比較したとき、ＧＭ１−Ｃ６：０−ペプチドについて観察されたそれよりもおよそ２倍大きかった（図８Ｂ）。輸送は、ダイナミンインヒビターDyngo-4Aでの事前処置によって強く阻害されており、これはトランスサイトーシスによる活性な経細胞トラフィッキングを暗示する。膜放出研究では、Ｃ１２：０−ＧＭ３−ペプチド融合物については、ＧＭ１融合分子と比較したとき、溶液へのより高い放出の速度が観察された（図３Ｂおよび３Ｃ）。よって、ＧＭ１スフィンゴ糖脂質種は、同じセラミドドメインを含有するＧＭ３種よりも、より緊密に膜中に保持されるように見える。ＧＭ３が遊離末端ガラクトースを欠くことから、末端ガラクトースを含有するＧＭ１脂質は、細胞表面でのレクチン結合の形態によって膜にさらに係留されていたかも知れないと推定された。このアイディアを試験するために、競合リガンドとしての１００ｍＭ ラクトース（Ｇｌｃ−Ｇａｌ二糖）の存在下または非存在下においてＣ１２：０−ＧＭ１種についての膜放出の速度を研究した（図３Ｅ）。
【０１１９】
これらの研究は、過剰な遊離ラクトースの存在下で膜からの向上した放出を示すが、過剰なマンニトールではそうではなく、これはガラクトース特異的レクチンの膜係留との相互作用を暗示している（図３Ｅ）。よって、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖ドメインははまた、上皮バリアを横切る輸送の効率にも影響を及ぼすことができる。このアイディアを確認するため、末端ｎ−アセチルガラクトサミンおよびＧＭ１中に含有されるガラクトース二糖（ＧａｌＮＡｃ）を欠いたＣ１２：０−ＧＭ３種についての膜放出の速度を評価した。高い100mMの濃度のラクトースは、ＧＭ１およびＧＭ３種の両方と競合して膜から離れさせたが、しかしより低い用量（５ｍＭ）では、ラクトースはGM1種のみの放出を向上させたということが見出された（図８Ｃおよび８Ｄ）。同じように、二糖ＧａｌＮＡｃ（５ｍＭ）は、ＧＭ１融合分子のみの放出を向上させるのに有効であった（図８Ｅおよび８Ｆ）。よって、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖ドメインはまた、上皮バリアを横切る輸送の効率にも、おそらくは細胞表面のレクチン様分子と相互作用することにより、影響を及ぼすことができる。
【０１２０】
スフィンゴ糖脂質に媒介されるin vivoでの上皮バリアを横切る吸収
スフィンゴ糖脂質に媒介されるin vivoでの腸管を横切る輸送について試験するために、融合されていないレポーターペプチドまたはＣ４：０−ＧＭ１−ペプチド融合分子を等しい用量（０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ）でマウスに胃内強制飼養し、および、血液中への吸収を１５分および３０分後にストレプトアビジン補足アッセイを使用して分析した。両方の時点で、ＧＭ１−ペプチド融合分子については体循環中への吸収の証拠が見出されたが（適用された用量の３％近く）、しかし、融合されていないペプチドについてはそうではなかった（図４Ａ）。同じ結果が、Ｃ１２：０−ＧＭ３−ペプチド融合分子について得られた（図４Ｂ）。肝臓への更新を測定し、ここでは、胃強制飼養の１時間後、スフィンゴ糖脂質−ペプチド融合物が処置されたマウスの肝臓中に見出されたが、しかし、融合されていないペプチドについてはそうではなかった（図４Ｃ）。よって、スフィンゴ糖脂質への融合は、腸管を横切る、および、血液および肝臓の２つのサンプリングされた組織中への、ペプチド積荷の吸収を円滑化した。レポーターペプチドはそれ自身では、検出可能には吸収されなかった。
【０１２１】
これらの結果を一般化することができるかどうかを試験するために、Ｃ６：０−およびＣ１２：０−ＧＭ１−ペプチド融合物を、別の緊密な上皮粘膜表面である鼻腔上皮へ適用した。この場合には、Ｃ６：０−ＧＭ１−ペプチド（図４Ｄ）を、多列（上部右パネル）および単純柱状上皮組織（下部右パネル）のエリアの中を包含する鼻腔上皮の全領域中における上皮バリア内の二光子顕微鏡法によって可視化することができた（図４Ｄ）。同じ用量で適用された融合されていないペプチドの取り込みは、極めて稀にしか検出されなかった（左パネル）。ＧＭ１−ペプチド融合分子についての体循環への吸収を、鼻腔投与の１５分後の血液中の含有量を測定することによって生化学的に確認した(図４Ｅ）。ここでは、ＧＭ１−ペプチド融合分子についての血中レベルに、バックグラウンドに近いペプチド単独と比較しておよそ１０倍の増加が見出された。予想外なことに、腸内におけるC12:0-GM3-ペプチド種についての我々の結果に類似して、鼻腔上皮では、Ｃ１２：０−ＧＭ１−ペプチド融合分子の十分な吸収の証拠が見出された。結果は、異なる組織は異なるやり方で、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖ドメインと相互作用し得る、ということを提案する。この場合には、鼻腔上皮はＧＭ１オリゴ糖を結合させないことがあり得、よってトランスサイトーシスの後の細胞膜から溶液中へのより効率的な放出および全身吸収を可能にさせる。
【０１２２】
インクレチンホルモンＧＬＰ−１の経口吸収を可能にするためのＣ６：０−ＧＭ１種の適用
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および関連するペプチドは、体重減少を促進することおよびグルコース刺激性のインスリン放出を敏感にさせることの両方により、２型真性糖尿病の管理において重要な薬物になってきている（２５−２７）。多数の個人において臨床的有用性を限定する主要な因子は、全ての現在利用可能な調製物が皮下注射により送達されなければならないという事実である。ＧＬＰ−１の経口吸収を可能にするためにスフィンゴ糖脂質トラフィッキングの特性を適用することができたかどうかを試験するために、記載されたとおりのＣ６：０−ＧＭ１セラミド種へ（１６）、長期半減期型のＧＬＰ−１（図５Ａ）をＣ末端ペプチドリンカーとともに（簡略化のためにここではＧＬＰ−１と称される）共役させた。糖脂質−ＧＬＰ−１融合分子の生体活性を、ｈＧＬＰ−１受容体およびＣＲＥ（ｃＡＭＰ）ルシフェラーゼレポーターを発現するＨＥＫ細胞を使用して定量的に評価した（１６）。対照として、市販の長期作用型ＧＬＰ−１（Exendin-4）、および融合されていないＧＬＰ−１−ペプチドを、並行して評価した（図９Ａ、図１０Ａ）。Ｃ６：０−ＧＭ１のＧＬＰ−１への融合は、いくらかの機能の喪失を引き起こしたが、しかし分子は対照のそれに近く匹敵するぐらい、インクレチンホルモンと同等に極めて強力なままであった。
【０１２３】
ＧＬＰ−１ペプチド積荷は４０残基であり、レポーターペプチドと比較してサイズがおよそ４倍大きい。第１に、ＧＭ１スフィンゴ糖脂質がかかるより大きな積荷を輸送できるかどうかを試験するために、in vitroでの腸管Ｔ８４細胞単分子層を横切る輸送を研究した。これらの研究では、ＧＬＰ−１輸送を、以前に記載されたとおりのルシフェラーゼバイオアッセイ（１６）によって定量化した（図５Ｂ）。ここでは、スフィンゴ糖脂質への融合の、経上皮ＧＬＰ−１輸送に対するなおより大きな見かけ上の効果（対照を２０〜１００倍上回る）が見出された。これは、より大きなサイズの４０残基のＧＬＰ−１ペプチドについての、はるかに低い傍細胞漏出の速度によって説明づけられる。タイトジャンクションからのかかるサイズ排除は、無傷の上皮バリアを横切る傍細胞溶質拡散のよく知られている決定要因である。
【０１２４】
in vivoでの吸収および生物学的なインクレチン活性を試験するために、等しい用量（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）のＣ６：０−ＧＭ１−ＧＬＰ−１融合物、融合されていないＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１経口）、またはビヒクルを野生型マウスへと胃強制飼養し、およびグルコース代謝に対する効果を耐糖能試験によって測定した（図５Ｃ）。Ｃ６：０−ＧＭ１−ＧＬＰ−１融合分子を強制飼養された動物では、融合されていないＧＬＰ−１ペプチドを強制飼養された動物と比較して、より低いピークおよびより迅速な血糖の正常レベルへの戻りが見出された（図５Ｃおよび５Ｄ）。胃内投与されたＣ６：０−ＧＭ１−ＧＬＰ−１の、耐糖能に対する効果は、ＧＬＰ−１ペプチド単独の腹腔内注射によって達成される効果に類似しており、胃内送達されたＧＭ１−ペプチド融合分子についての同等に高いレベルのバイオアベイラビリティを暗示している（図５Ｄ）。
【０１２５】
体循環中へのＣ６：０−ＧＭ１−ＧＬＰ−１の腸管吸収を、２つのやり方によって確認した。第１に、血液試料におけるＧＬＰ−１活性を、ストレプトアビジン捕捉および定量的ルシフェラーゼバイオアッセイによって測定した（図５Ｅ）。結果は、ＧＭ１−ＧＬＰ−１融合分子の血中への吸収を示しているが、しかし融合されていないＧＬＰ−１についてはそうではない。第２のアプローチでは、我々のレポーターペプチド（図５Ａ）について記載されたものと同じストレプトアビジン捕捉アッセイを使用した血中の４０残基の異性体の直接的な定量測定を可能にさせるために、ＡＦ４８８へ共役したＧＬＰ−１の全Ｄアミノ酸（非分解性）異性体を合成した。再び、ＧＬＰ−１積荷の吸収の証拠が、Ｃ６：０−ＧＭ１に融合されているときに見出されたが、融合されていないＧＬＰ−１ペプチドについては見出されなかった（図５Ｆ）。これらの実験は、２つの異なる研究室で、２つの異なる動物施設を使用して行い、同じ結果であった。全てのアッセイにおいて（図５Ｃ〜５Ｆ）、Ｃ６：０−ＧＭ１への融合によって可能になった腸管吸収の効率は、再びであるが、ペプチド単独のＩＰ注射とほぼ同じくらい効率的であったということが見出されており、胃強制飼養により適用されたＧＭ１−融合分子についての高いレベルのバイオアベイラビリティを暗示している。
【０１２６】
注目すべきことに、しかしながら、Ｃ２：０−ＧＭ１−ＧＬＰ−１融合分子は、耐糖能への影響を有さず（図５Ｄ）、および、この分子はin vitroで容易に上皮単分子層を横切って輸送された（図１Ｃ）にもかかわらずなお、胃強制飼養の後で検出可能には吸収されなかった（図９Ｂ）。これは、膜負荷および放出アッセイから推論されるとおり、Ｃ２：０−（およびリソ−）セラミドドメインの細胞中への組み込みについてのより低い親和性によって説明づけられ得る（図３Ｂおよび図７Ｄ）。生物学的な違い（in vitroでのトランスサイトーシス対in vivoでの吸収）は、上皮取り込みおよび輸送の条件がin vitroでのそれらほど最適化されないin vivoにおいてのみ現れる。よって、Ｃ４：０を越えた脂肪酸のさらなる短縮が経上皮輸送を増幅させるはずであり、およびよって臨床的有用性があろうかと一見思われたが、これはそうではなく、および、結果は技術のさらなる発展を知らせている。
【０１２７】
要約すると、短い脂肪酸を持つＧＭ１およびＧＭ３スフィンゴ糖脂質への治療用ペプチドの融合は、トランスサイトーシスによって緊密な上皮バリアを横切るそれらの能動輸送を可能にする。インクレチンホルモンＧＬＰ−１の場合には、脂質担体への融合は、高いバイオアッセイでの胃内（経口）吸収および血糖への期待される効果を可能にさせ、これは臨床適用におけるこの技術の潜在的な使用を強調する。
【０１２８】
考察
本明細書中に記載された知見は、in vivoでの粘膜表面を横切る治療用ペプチドの吸収を可能にするための新規な合成方法を描く。アプローチは、トランスサイトーシス経路におけるトラフィッキングを可能にさせ、およびよってバリアの破壊なしに粘膜表面を横切って能動輸送されるための、セラミドドメイン構造の構造に、主として依存する、スフィンゴ糖脂質のための脂質選別の自然生物学に基づく。全身薬物送達を要求する応用のためには、 短鎖脂肪酸を含有するセラミドドメインを持つ非天然性スフィンゴ糖脂質担体は、トランスサイトーシスの後での細胞膜から循環中への効率的な放出を可能にさせることが要求される。スフィンゴ糖脂質担体によって可能になる、見かけ上の高いレベルの腸管バイオアベイラビリティは、前例のないことである。
【０１２９】
シス−不飽和または短鎖脂肪酸スフィンゴ糖脂質によって引き入れられる経細胞トラフィッキングの機構（単数または複数）は、完全には理解されていない。ＧＭ１スフィンゴ糖脂質についての最もロバストな選別イベントは、初期エンドソーム中で起こるように見え、そこでは長飽和鎖セラミドが後期エンドソーム／リソソームへ乗り入れ、およびシス−不飽和および短鎖グリコセラミドは乗り入れない（（８）、およびSchmiederおよびLencerの公開していない結果）。不飽和および短鎖セラミドドメインは、それらの再循環エンドソームおよびその他の場所へのトラフィッキングを決定づける、選別機構を引き込むという可能性があるが、それらのトラフィッキングがリソソーム経路からの脱出後には確率論的であり、本質的に大部分の膜流動に沿って辿るという可能性もある。換言すれば、ロバストな選別イベントは長鎖飽和スフィンゴ糖脂質についてのみ起こり得、それらをリソソームへ導く。
【０１３０】
この技術を可能にする別の重要な構造的特徴は、オリゴ糖頭部基であるに違いない。このドメインは、外膜葉中にセラミド脂質をトラップし、葉間のフリップフロップを防ぎ、およびよって分子を、トラフィッキングビヒクルの本質的な特色である、細胞の全体を通じた動きについての膜動力学に依存するものにする。ＧＭ３を使用した我々の研究に示されたとおり、細胞外オリゴ糖は、いくつかの細胞タイプにおいて、経上皮輸送の効率にもまた影響を及ぼすことができる。測定される膜表面への脂質の係留は、隣接する膜レクチンへの結合により向上したという可能性があり得る。違いはまた、in vitroでの原形質膜局在および二重層／曲率動力学に関してＧＭ１とＧＭ３との間でも報告されている（２４、２８）。
【０１３１】
粘膜バリアを横切る吸収の場合には、臨床医学に関連性があるスフィンゴ糖脂質についての数種の適用が、本明細書中で提供される。１つは、ここに実証されたとおりのペプチドホルモンの全身送達のための、または特定的な粘膜表面へのアゴニストもしくはアンタゴニストペプチドの局所的な送達のためのビヒクルとして、である。他方は、粘膜ワクチン接種または経口耐容性を可能にするための抗原もしくはアジュバントの送達のためである。これらのスフィンゴ糖脂質は、同じやり方で治療タンパク質を輸送するという可能性がある。最終的に、上皮細胞における脂質選別についての基本原則の少なくともいくつかはこの細胞タイプに適用され；および、ここに定義されたスフィンゴ糖脂質担体はまた、緊密な内皮バリアを横切る生物学的製剤の輸送を可能にするためにも使用され得る。
【０１３２】
材料および方法
トランスサイトーシスアッセイ
Ｔ８４またはＭＤＣＫ−ＩＩ細胞を２４ウェルTranswell（登録商標）インサート（ポリエステル膜、Costar）上に塗布し、および、脱脂ＢＳＡ（ｄｆ−ＢＳＡ）を含有する血清なしのＤＭＥＭ中で平衡化させた。コンジュゲートしていないレポーターペプチドまたはＧＭ１−ペプチド融合物を０．１μＭでｄｆ−ＢＳＡへ１：１比にて複合させ、次いで頂端から３時間加えた。膜からの脂質の抽出を助けるために、過剰量のＢＳＡ（１％ｗｔ体積）を基底外側から加えた。３時間の継続的インキュベーションの後、１ｍＬの基底外側の媒体を回収し、および１０μｌｓ磁気ストレプトアビジンセファロースビーズとともに終夜４℃でインキュベートし、TBS-Tweenで洗浄し、および９５％ホルムアミド／ １０ｍＭ ＥＤＴＡ／ ０．４ｍｇ／ｍＬビオチンで溶出させた。レポーターペプチドまたはＧＭ１−ペプチド融合物の検出のために、Infinite M1000プレートリーダー（Tecan）を使用して蛍光を読み取った。各生物学的複製について、濃度を各化合物についての標準曲線から算出した。
【０１３３】
In vivo研究
WT C57/BL/6マウス（雄７〜９週齢）をJackson Laboratory（Maine USA）から購入し、および１週間順化させた。腸管吸収実験のために、終夜絶食させたマウスをイソフルランで軽度麻酔し、および０．５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量を２００μｌの強制飼養体積で補給した。化合物は、マウスへの投与の前に、１：１比率でｄｆ−ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に希釈した。全身吸収の分析のために、化合物投与の１５または３０分後に標準的な心臓穿刺手順を使用して血液試料を取った。１００μｌｓの血液を４００μｌｓのＲＩＰＡ緩衝剤で希釈し、および１０μｌｓストレプトアビジンセファロースとともに終夜４℃でインキュベートし、洗浄し、および我々のin vitroアッセイにおけるとおりに９５％ホルムアミド／ １０ｍＭ ＥＤＴＡ／ ０．４ｍｇ／ｍＬビオチンで溶出させた。
【０１３４】
肝臓組織を、液体窒素中で急速冷凍し、および、冷やした乳鉢および乳棒でドライアイスの上で粉砕した。乾燥重量を得た後、試料を１ｍＬ ＲＩＰＡ緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離し、および上清を１０μｌｓストレプトアビジンセファロースとともにインキュベートし、および束縛された分子を９５％ホルムアミド／ １０ｍＭ ＥＤＴＡ／ ０．４ｍｇ／ｍＬビオチンで溶出させた。肝臓に蓄積した化合物の量は、乾燥重量ｍｇにつき正規化した。
腹腔内耐糖能試験のために、終夜絶食させたWT C57/BL/6マウス（雄７〜９週齢）にＧＭ１−ＧＬＰ−１融合分子または融合されていないＧＬＰ−１で強制飼養するのに１０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量を使用した。２ｍｇ／ｇグルコース溶液のｉ．ｐ．投与に続くグルコース測定を、（１６）におけるとおりに直接的にグルコースストリップに適用した尾静脈血から得た。
【０１３５】
膜負荷および溶液中への脂質放出
ＭＤＣＫ−ＩＩ細胞を、実験の前日に９６ウェルプレート上に塗布した。細胞を１０℃の血清非含ＤＭＥＭ（フェノールレッドなし）で洗浄し、および、０．１μＭ ｄｆ−ＢＳＡを含有するＤＭＥＭで１５分間平衡化させた。細胞を、１：１（脂質：ｄｆ−ＢＳＡ）のモル比での０．１μＭのＧＭ１−ペプチド分子で４５分間１０℃にて負荷させた。負荷の後、細胞を洗浄し、適切な脂質組み込みを可能にさせるためにＤＭＥＭ（フェノールレッドなし）中で３７℃まで温め、および、膜二重層中へと組み込まれなかった接着したスフィンゴ糖脂質を放出させるためにＨＢＳＳ中の０．２５％トリプシンとともにインキュベートした。
【０１３６】
細胞を次に、ＤＭＥＭ単独、または１％ ｄｆ−ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ中で２分間、１５分間、または１時間インキュベートした。指定された時間の後、媒体を回収し、および、溶液中へと放出されたＧＭ１−ペプチド分子を、各化合物についての標準を使用して定量化した。細胞をその後ＲＩＰＡ緩衝剤中で溶解させ、および細胞と会合したＧＭ１−ペプチドの量を、知られている標準を使用して定量化した。溶液中へと放出されたＧＭ１−ペプチドの量を、組み込まれた総脂質（すなわち、媒体中のＧＭ１−ペプチド＋細胞と会合したＧＭ１−ペプチド）の比率として算出した。
【０１３７】
ガングリオシド−ペプチドコンジュゲートの合成
異なる脂肪酸種のガングリオシドは、Prof. Sandro Sonnino（U. Milan、イタリア国）によって供給された。修飾された官能残基を含有するペプチドは、Novo Nordisk（ＤＫ）によってカスタム合成された。ペプチド−脂質コンジュゲートの合成は、以前公開された改良法（１６）によって成し遂げた。典型的な２ｍＬ反応において、２ｍｇ（脂肪酸に依存しておよそ１３００ｎモル）のガングリオシドを、酸化用緩衝剤（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ５．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で過ヨウ化酸ナトリウム（１３μモル）を用いて３０分間、氷上でおよび光から保護して、酸化させた。反応を、グリセロールの添加（５％最終）によってクエンチした。反応を、Bond Elut SepPak C18カートリッジ（Agilent、ＭＡ）によって脱塩化し、および、カラムから溶出させるために使用したメタノールを、Speed Vac濃縮（Savant）により取り除いた。
【０１３８】
酸化された生成物を、次いで１０％ＤＭＦの存在下において２ｍＬ ＰＢＳ ｐＨ６．９中で再構成し、および１０ｍＭアニリンの存在下において 2700nモルのアミノオキシ含有ペプチドと反応させた(29)。反応を、nutator上での混合を伴い室温で２０時間インキュベートし、そこで形成されたＧＭ１−ペプチド融合物は正常に白い沈殿を結果としてもたらした。沈殿を、遠心分離により溶液から分離し、次いで手短な超音波処理の後に４００μＬの５０％イソプロパノール／水に懸濁させた。４．８μモルのシアノ水素化ホウ素ナトリウムと一緒にＰＢＳ ｐＨ６．９を添加し（２００μＬ）、およびオキシム結合を還元させるために３時間インキュベートした。脂質−ペプチドコンジュゲートを、セミ分取ＨＰＬＣにより精製し、および、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（AB Voyager）またはＥＳＩ ＬＣ−ＭＳ（Agilent, MA）のいずれかにより確認した。
【０１３９】
蛍光レポーターペプチド
マレイミド連結によってなされた図６Ａ〜６Ｃに記載された蛍光ペプチドを除いて、フルオロフォアでのペプチドの標識は、典型的には、銅に媒介されるクリック化学を介してなされた。Ｎ末端アルキン残基（プロパルギルグリシン）を含有する３２０μＭのペプチド−脂質融合物を、等モル濃度のAlexa Fluor 488−アジドと以下の条件下で反応させた。５０ｍＭ トリス−Ｃｌ、５ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）、１００ｍＭ アスコルビン酸ナトリウム、３７ｍＭ (ＤＭＳＯ／ｔ−ブタノール １：４中のトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン、ＴＢＴＡ)、１ｍＭ （トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、ＴＣＥＰ−Sigma）、および、nutatorを介した混合を伴い１６時間室温で反応させた。生成物をＨＰＬＣによって精製し、および質量分析によって確認した。生成物を、凍結乾燥し、および−２０℃で保管した。アッセイのためのストック溶液を作るために、化合物を３３％ ＤＭＦ／水に再懸濁させた。ｍ／ｚ質量分析の値は以下のとおりであった：ペプチド上の異なる官能基およびｄ１８：１長鎖塩基を持つＧＭ１−Ｃ１２：０レポーターコンジュゲートについては、アルキン＝2475.5 Da(1+)；ビオチン＝2734.4 Da(1+)；アルキン−ビオチン＝2829.4 (Da) (1+)；Alexa Fluor 488 マレイミド＝1552.2 Daおよびｄ２０：１＝1566.2 Da。このシリーズ中のＧＭ１−Ｃ１６：０種については、（２＋）質量は1580.2 Daで観察された。
【０１４０】
ＧＭ１脂肪酸種 リソ〜Ｃ１２：１での構造機能研究のほとんどは、３＋電荷を伴って検出された。ｄ１８：１およびｄ２０：１スフィンゴシンについてのｍ／ｚ値は、それぞれ、以下のとおりであった： リソ＝1101.1 Da (3+)および1110.5 Da (3+)； Ｃ２：０＝1115.1 Da (3+)および1124.5 Da (3+)； Ｃ４：０＝1124.5 Da (3+)および1133.8 Da (3+)； Ｃ６：０＝1134.1 Da (3+)および1142.5 Da (3+)； Ｃ６：１＝1133.1 Da (3+)および1143.5 Da (3+)； Ｃ１２：０＝1161.8 Da (3+)および1171.2 Da (3+)；Ｃ１２：１＝11161.1 Da (3+)および1170.5 Da (3+)。遊離ペプチドは、2102.8 Daで単一イオンピークとして観察された。ＧＭ３分子種コンジュゲートについては、ｍ／ｚは、以下で観察された： Ｃ６：０＝1212.1 Da (3+)および1026.1 Da (3+)； Ｃ１２：０＝1040.1 Da (3+)および1054.1 Da (3+)。
【０１４１】
ＧＬＰ１−ガングリオシドおよびＧＬＰ−Ｄ−コンジュゲートの合成
生物活性ＧＬＰ１融合脂質を生成するために、２つのペプチドを、トリアゾール連結を介して一緒につなぎ合わせた。長い半減期の配列を、重要なジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ−４）切断部位にて置換したイソ酪酸残基、およびＣ末端アジドリシンを含有させて合成した（図５Ａおよび６Ａ）。タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）は、元々配列中に設計したが、しかしこの論文の目的のためには使用しなかった。ペプチドを、上に記載されたとおりのクリック化学を使用してＮ末端アルキンを介してレポーターペプチド−脂質コンジュゲートにつなぎ合わせた。
【０１４２】
全Ｄ ＧＬＰ１−脂質融合物を合成するために、ペプチドを固相上の完全な鎖として作り、および、アミノオキシおよびビオチン基を含有させた（図５）。酸化ガングリオシドへの連結を、上に述べたとおり行った。生物学的ＧＬＰ１融合物についてのｍ／ｚ値は以下で観察された： Ｃ２：０＝1808.4 Da (4+)；Ｃ６：０＝1822.2、それとともに遊離ペプチドは2251.0 Daでの３＋電荷として見られた。ＧＬＰ１の全Ｄ異性体型である、ＧＭ１−Ｃ６：０へ融合しているＧＬＰＤについては、ｍ／ｚは2251.0 Daでの３＋電荷として、および遊離ペプチドは2726.7 Daでの２＋電荷として見られた。
【０１４３】
参考文献
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【０１４４】
本明細書中、例として、背景、概要、詳細な説明、例、および／または参考文献のセクションで言及した全ての刊行物、特許、特許出願、公報、およびデータベースエントリ（例として、配列データベースエントリ）は、各個の刊行物、特許、特許出願、公報、およびデータベースエントリが特定的におよび個別的に参照によって本明細書中に組み込まれたものであったかのように、本明細書によってそれらの全体が参照により組み込まれる。対立がある場合には、本明細書中のあらゆる定義を含めて、本願が支配する。
【０１４５】
均等物および範囲
当業者は、本明細書中に記載された態様の多数の均等物を、認識するか、または、慣行的な実験を使用するだけで確かめることを可能とする。本開示の範囲は、上の記載に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付した請求の範囲に規定されるとおりである。
【０１４６】
「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、それに反することが示されない限り、または文脈から別様に明白でない限り、１または１よりも多いことを意味し得る。群の２つ以上のメンバーの間に「または」を包含する請求項または説明は、それに反することが示されない限り、または文脈から別様に明白でない限り、群のメンバーの１つ、複数、または全てが存在すれば満たされると見なされる。２つ以上の群のメンバーの間に「または」を包含する群の開示は、グループのちょうど１つのメンバーが存在する態様、グループの１より多いメンバーが存在する態様、およびグループの全てのメンバーが存在する態様を提供する。簡潔化の目的のために、それらの態様は本明細書中においては個別的に書き出されてはいないが、これらの態様の各々が本明細書中で提供されており、特定的に請求の範囲とされるかもしくは排除されることがあり得る。
【０１４７】
本開示は、１以上の限定、要素、節、または説明的な用語が、請求項の１以上から、または１以上の関係する説明の部分から、別の請求項中へと導入された、全てのバリエーション、組合せ、および並び替えを網羅するということが理解されるべきである。例えば、他の１つの請求項に従属する請求項を、同じ基礎とした請求項に従属する他のいずれかの請求項中に見いだされる限定の１以上を包含するように改変することができる。さらにまた、請求項が組成物について謳っている場合、別様に示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうことが当該技術分野における通常の技能を有する者に明白でない限り、本明細書中に開示された作製もしくは使用する方法のいずれかによる、または、もしあれば、当該技術分野において知られる方法による、組成物を作製もしくは使用する方法が包含されるということが、理解されるべきである。
【０１４８】
要素がリストとして、例として、マーカッシュグループ形式にて提示される場合、要素の全部の考えられるサブグループもまた開示されるということ、および、いずれかの要素または要素のサブグループを群から取り除くことができる、ということが理解されるべきである。用語「含む」はオープンであり、および追加の要素およびステップの包含を許すことを意図しているということにもまた留意すべきである。一般的に、態様、物、または方法が、具体的な要素、特徴、またはステップを含むものとして呼ばれる場合、かかる要素、特徴、またはステップからなるか本質的にそれらからなる態様、物、または方法も、また同様に提供されるということが、理解されなければならない。簡潔化の目的のために、それらの態様は本明細書中においては個別的に書き出されてはいないが、これらの態様の各々が本明細書中で提供されており、特定的に請求の範囲とされるかもしくは排除されることがあり得る。
【０１４９】
範囲が与えられている場合、端点は包含される。さらにまた、別様に示されない限り、または文脈および／または当該技術分野における通常の技能を有する者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現された値は、いくつかの態様において記述された範囲内の、あらゆる特定の値を、文脈が明確に別様に書き記すものでない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までを想定することができるということが、理解されるべきである。簡潔化の目的のために、各範囲中の値は本明細書中においては個別的に書き出されてはいないが、これらの態様の各々が本明細書中で提供されており、特定的に請求の範囲とされるかもしくは排除されることがあり得る。別様に示されない限り、または文脈および／または当該技術分野における通常の技能を有する者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現された値は、与えられた範囲内のあらゆる部分範囲を想定することができ、ここで部分範囲の端点は、範囲の下限の単位の１０分の１と同じ精度まで表現される、ということもまた理解されるべきである。
【０１５０】
ウェブサイトが提供されている場合、ＵＲＬアドレスは、ブラウザ実行可能ではないコード（non-browser-executable codes）として提供され、それぞれのウェブアドレスのピリオド（periods）を括弧で表している。実際のウェブアドレスは、ピリオドを含有しない。
加えて、本開示のいずれかのある特定の態様が、請求項のいずれか１以上から明示的に除外されることがあり得る、ということが理解されるべきである。範囲が与えられている場合、範囲内にあるいずれかの値が、請求項のいずれか１以上から明示的に除外されることがあり得る。本開示の組成物および／または方法の、いずれかの態様、要素、特徴、応用、または側面を、請求項のいずれか１以上から除外することができる。簡潔化の目的のために、１以上の要素、特徴、目的、または側面が除外された全ての態様は、本明細書中において明示的に規定されてはいない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ−１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図２Ｃ−２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−３Ｃ】
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【図３Ｄ−３Ｅ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ−４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ−５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ−７Ｄ】
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【図７Ｅ−７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図８Ｃ−８Ｄ】
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【図８Ｅ−８Ｆ】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【国際調査報告】
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