(57)【要約】  微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参抽出物を有効成分として含む筋肉分化促進用組成物に関し、前記加工高麗人参抽出物が筋芽細胞から筋肉への分化を促進し、筋肉分化抑制因子であるミオスタチンによる筋萎縮現象を抑制することを確認し、優れた効果の筋肉障害関連疾患の予防又は治療用組成物が開発できると期待される。【選択図】図６
2021524506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
加工高麗人参抽出物を有効成分として含む
ことを特徴とする筋肉分化促進用組成物。
【請求項２】
前記加工高麗人参抽出物は、
（ａ）アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を、高麗人参粉末及びフスマで構成された培地に接種する段階；
（ｂ）前記段階（ａ）の菌を培養する段階；
（ｃ）前記段階（ｂ）の培養物を限外濾過膜（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）で精製する段階；
（ｄ）前記段階（ｃ）の精製物から酵素を分離する段階；
（ｅ）高麗人参粉末、紅参粉末、高麗人参抽出物又は紅参抽出物に前記段階（ｄ）の酵素を添加する段階；
（ｆ）前記段階（ｅ）の添加物を発酵する段階；
（ｇ）前記段階（ｆ）の発酵物を分離する段階；
（ｈ）前記段階（ｇ）の上澄液を濃縮する段階；
（ｉ）前記段階（ｈ）の濃縮物を酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸及び酒石酸からなる群から選ばれる１種以上の有機酸で反応する段階；
（ｊ）前記段階（ｉ）の反応物を中和及び濾過、精製、濃縮、乾燥させる段階；
で製造された加工高麗人参抽出物である
請求項１に記載の筋肉分化促進用組成物。
【請求項３】
前記組成物は、ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３をそれぞれ０．５〜３０重量％を含有する
請求項１又は２に記載の筋肉分化促進用組成物。
【請求項４】
前記組成物は、筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）分化を促進する
請求項１又は２に記載の筋肉分化促進用組成物。
【請求項５】
前記組成物は、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）による筋萎縮現象を抑制する
請求項１又は２に記載の筋肉分化促進用組成物。
【請求項６】
請求項１又は２の筋肉分化促進用組成物及び薬学的に許容可能な担体を含む
ことを特徴とする筋肉疾患の予防又は治療用薬学組成物。
【請求項７】
前記筋肉疾患は、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋疾患（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋肉損傷（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋異栄養症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋神経の伝導性疾患（ｍｙｏｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋肉炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、糖尿病性筋萎縮症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、神経損傷（ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）及び退行性筋肉疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）からなる群から選ばれる
請求項６に記載の筋肉疾患の予防又は治療用薬学組成物。
【請求項８】
前記悪液質は、エイズ（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）、腹腔疾患（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、慢性心不全症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、先天性心不全症（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ）、クローン病（ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、治療されないか深刻な１型糖尿、神経性食欲不振及びホルモン不足による悪液質である
請求項７に記載の筋肉疾患の予防又は治療用薬学組成物。
【請求項９】
請求項１又は２の筋肉分化促進用組成物及び食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含む
ことを特徴とする筋肉疾患改善用の健康機能食品。
【請求項１０】
前記筋肉疾患は、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋疾患（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋肉損傷（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋異栄養症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋神経の伝導性疾患（ｍｙｏｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋肉炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、糖尿病性筋萎縮症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、神経損傷（ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）及び退行性筋肉疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）からなる群から選ばれる
請求項９に記載の筋肉疾患改善用の健康機能食品。
【請求項１１】
前記悪液質は、エイズ（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）、腹腔疾患（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、慢性心不全症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、先天性心不全症（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ）、クローン病（ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、治療されないか深刻な１型糖尿、神経性食欲不振及びホルモン不足による悪液質である
請求項１０に記載の筋肉疾患改善用の健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加工高麗人参抽出物を含む筋肉分化促進用組成物に関し、より詳細には、筋肉分化促進効果がある微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参抽出物を有効成分として含む筋肉疾患の予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉（ｍｕｓｃｌｅ）は、人の身体で最大の構成を占める組織である。人体の適正筋肉量を確保することは、体格を維持し、身体の各器官が各自の機能を実行し、各種の疾患を予防するのに不可欠である。
【０００３】
筋肉は、大きく、平滑筋（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ）、心臓筋（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ）、骨格筋（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）に分けられる。骨格筋は、私たちの体全体でかなりの部分を占めながら、骨格の動きを促進させる。これらの骨格筋は、分裂せず、多核体である筋繊維で構成されており、胚の形成過程で作られる。胚の形成過程が終わった後には、出生後の生長や筋肉分化（ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）過程によって筋肉が形成される。また、筋肉の分化は、凍傷や捻挫、打撲傷などにより筋肉が損傷するときにも起こる。
【０００４】
筋肉分化（ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）過程は、まず衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ）が活性化され、活性化された衛星細胞が筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）に分化する（非特許文献１）。分化した筋芽細胞は、分裂が起こり、筋芽細胞の融合（ｆｕｓｉｏｎ）が起こることで、筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）に発達し、これらの筋管細胞が集まって筋繊維（ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒ）を形成し、筋繊維は束となって最終的に筋肉を形成することになる。
【０００５】
筋肉分化過程は、マイオディー（ＭｙｏＤ）、Ｍｙｆ５（ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ５）、ミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、ＭＲＦ４（ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４）のような様々な筋肉の調節因子（ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒｓ）によって調節され、そのうち、マイオディー（ＭｙｏＤ）は、ミオシンＨ鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ，ＭＨＣ）、筋クレアチンリン酸化酵素（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ，ＭＣＫ）のような筋肉特異遺伝子の発現を開始させ、衛星細胞が筋芽細胞に分化することを誘導し、マイオディーの活性によるミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）発現の誘導は、筋芽細胞の融合に最も重要な要素であり、筋管細胞の形成に関与する（非特許文献２）。
【０００６】
一方、ミオカイン（ｍｙｏｋｉｎｅ）は、筋肉収縮の反応において骨格筋から発現したり合成される活性物質で、自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）、周辺分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）又は内分泌（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）方式で役割を果たし、筋肉の他に別の組織の機能も調節するものと知られている（非特許文献３）。ミオカインの代表には、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ，ＭＳＴＮ）、インターロイキン−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６，ＩＬ−６）、イリシン（ｉｒｉｓｉｎ）などがある。
【０００７】
ミオスタチンは、形質転換成長因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β，ＴＧＦ−β）群に属する遺伝子で、筋肉細胞に直接作用して、筋肉分化及び筋肉細胞分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を抑制するタンパク質である（非特許文献４−５）。複数の先行研究においてミオスタチン遺伝子がノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）又はノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）された場合には、筋肉の肥大及びインスリン抵抗性が減少し（非特許文献４−５）、運動時にミオスタチンの発現量が減少することにより、筋肉の大きさが増加すると知られている（非特許文献６）。
【０００８】
また、筋肉の分化に重要な筋原繊維タンパク質の発現に中核的な転写因子であるマイオディー（ＭｙｏＤ）の分解過程は、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）アクチビンタイプＩＩ受容体（ａｃｔｉｖｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡｃｔＲＩＩＢ）−Ｓｍａｄ２経路によって活性化されるＵＰＰ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ）過程によって媒介タンパク質分解を増加させて筋萎縮を誘導するものと知られている。
【０００９】
一方、老化した細胞や衛星細胞から筋芽細胞への分化、筋芽細胞の分裂などのような筋肉分化過程中に問題が発生した場合、筋萎縮症（ｍｕｓｃｌｅ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋疾患（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋肉損傷（ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋異栄養症（ｍｕｓｃｌｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋神経の伝導性疾患（ｍｙｏｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）及び神経損傷（ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ）などの様々な筋肉の障害及び疾患が発生することがある（非特許文献７−８）
【００１０】
また、前記筋肉分化過程中における問題によって発生する筋肉疾患の一つである筋肉減少症は、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）によって発病することもある。悪液質は、慢性消耗性複合症候群の一種で、癌、結核、血友病などの末期に見られる高度な全身衰弱症状を意味する。特に、悪性腫瘍、慢性心不全などの慢性疾患を随伴し、食欲不振を伴う体重減少、筋肉量及び体脂肪減少、炎症反応などを示す。
【００１１】
このような悪液質による筋肉減少は、骨格筋量の持続した減少と機能損傷による複合症候群に伴うもので、漸進的で徐々に進行する筋肉量消失が現れる老化及び筋肉分化障害による筋肉減少疾患と違い、急性の筋肉減少症状が現れる。このような生理的特性の差異は、予防及び治療においても差異を示す。したがって、筋肉減少という徴候が発生しても、その発生原因によって、悪液質、老化及び筋肉分化障害のそれぞれの特性に合う治療が必要である（非特許文献９）。
【００１２】
一方、筋肉分化障害及び疾患を克服するための方法として、筋肉細胞を再生する方法が最近になって報告されており、このような筋肉細胞の再生は、筋肉細胞の外部分に存在する衛星細胞を刺激し、衛星細胞が分裂して筋肉組織を形成するものと知られている。筋肉細胞の再生は、損傷した筋肉の修復だけでなく、老化による自然的な筋肉損失にも適用可能であると報告されたこともある（非特許文献１０）。
【００１３】
また、癌悪液質進行過程において筋肉分化過程に重要な筋肉調節因子であるマイオディー及びミオゲニンの発現が減少されるとの研究結果が報告されており（非特許文献１１）、癌又はエイズによる筋肉消耗（悪液質）マウスモデルにおいて、筋肉分化過程に重要な筋肉調節因子であるミオゲニン、ミオシン（ｍｙｏｓｉｎ）などの発現が減少するという研究結果も報告された（非特許文献１２）。また、癌悪液質が誘発されているマウスモデルにおいてミオスタチンの抑制が筋肉の体積と機能に影響を及ぼすという研究結果も報告され（非特許文献１３）、筋肉分化促進による悪液質の治療も期待している。
【００１４】
高麗人参の主な機能性成分であるジンセノシド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）は、植物界の種々のサポニンのうち、高麗人参サポニンだけを特に命名するもので、現在まで総１５０種類以上のジンセノシドが見出されている（非特許文献１４）。ジンセノシドは、抗癌、抗アレルギー、抗炎症の他に中枢神経抑制及び精神安定、鎮痛、記憶力改善、肝傷害報告、タンパク質及び脂質合成促進、抗糖尿、抗ストレス、抗酸化活性物質生成促進、免疫調節、血小板凝集抑制、抗老化作用などの薬理効能が明らかになっており、これは、ジンセノシドの種類別に異なって現れる。
【００１５】
ジンセノシドＲｇ１及びＲｂ１は中枢神経系活動を向上させ、ジンセノシドＲｅ、Ｒｇ１及びパナキサン（ｐａｎａｘａｎ）Ａ及びＢは糖尿病に効能があり、ジンセノシドＲｅ及びＲｇ１は血管新生を促進し、ジンセノシドＲｇ３及びＲｈ２は抗癌効能を示すことが知られている（非特許文献１５−１６）。最近の研究では、いくつかの高麗人参抽出物が悪液質、疲労又は筋肉萎縮に効能を示すことが明らかにされている。０．９〜１．４％のジンセノシドＲｇ１と１．７〜３．０％のジンセノシドＲｂ１を含有しているＧＩＮＳＥＬＥＣＴは、抗腫瘍剤であるシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）を処理したネズミの体重減少と運動能力減少を予防し（非特許文献１７）、ジンセノシドＲｇ１は、タンパク質分解経路を抑制して飢饉による筋萎縮を予防することが報告された（非特許文献１８）。
【００１６】
そこで、本発明者は、高麗人参のジンセノシド成分を用いて筋肉分化促進効果を確認する過程で、微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参抽出物が、筋肉分化抑制因子であるミオスタチンを抑制し、筋肉分化を促進するということを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
従来の先行技術である特許文献１は、２０（Ｒ）（Ｓ）−ジンセノシドＲｈ２、ジンセノシドＲｋ２及びジンセノシドＲｈ３からなる群から選ばれる１種以上の化合物を含有する、筋肉細胞増殖活性化を用いた筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、心筋梗塞及び心血管系疾患の予防又は治療用組成物に関するものであり、本発明の組成物構成と作用機序及び適用疾病の範囲において異なる。また、特許文献２には、ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の含有量が増加した加工高麗人参抽出物を含む筋肉減少症治療用組成物が記載されているが、本発明のミオスタチン抑制及び筋肉分化促進効果は記載も暗示もされていない。特許文献３には、ミオスタチン拮抗剤を含む筋肉減少症治療用組成物が記載されているが、本発明のジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の含有量が増加した加工高麗人参抽出物のミオスタチン抑制効果は記載も暗示もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】韓国登録特許第１７７１４８６号
【特許文献２】韓国登録特許第１５９５４２６号
【特許文献３】韓国公開特許第２０１７−００９４２９２号
【特許文献４】韓国登録特許第０９９２８００号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献２】Ｚａｎｏｕ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献３】Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，２００８
【非特許文献４】Ｇｒｏｕｓｓａｒｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００
【非特許文献５】Ｈｕｈ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献６】Ｈｕｈ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２
【非特許文献７】Ｂｏｎａｌｄｏ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献８】Ｗａｇａｔｓｕｍａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献９】リュ・スンワン，２０１７
【非特許文献１０】Ｃｏｎｂｏｙ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献１１】Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１６
【非特許文献１２】Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００９
【非特許文献１３】Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献１４】Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｐ．，２００９
【非特許文献１５】Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，２００８
【非特許文献１６】Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４
【非特許文献１７】Ｌｏｂｉｎａ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献１８】Ｌｉ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、加工高麗人参抽出物を含む筋肉分化促進用組成物を提供することにある。
また、本発明の目的は、前記筋肉分化促進用組成物を含む、筋肉疾患の予防又は治療用薬学組成物及び改善用健康機能食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、加工高麗人参抽出物を有効成分として含む筋肉分化促進用組成物に関する。
【００２２】
前記加工高麗人参抽出物は、（ａ）アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を、高麗人参粉末及びフスマで構成された培地に接種する段階；（ｂ）前記段階（ａ）の菌を培養する段階；（ｃ）前記段階（ｂ）の培養物を限外濾過膜（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）で精製する段階；（ｄ）前記段階（ｃ）の精製物から酵素を分離する段階；（ｅ）高麗人参粉末、紅参粉末、高麗人参抽出物又は紅参抽出物に前記段階（ｄ）の酵素を添加する段階；（ｆ）前記段階（ｅ）の添加物を発酵する段階；（ｇ）前記段階（ｆ）の発酵物を分離する段階；（ｈ）前記段階（ｇ）の上澄液を濃縮する段階；（ｉ）前記段階（ｈ）の濃縮物を酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸及び酒石酸からなる群から選ばれる１種以上の有機酸で反応する段階；及び（ｊ）前記段階（ｉ）の反応物を中和及び濾過、精製、濃縮、乾燥させる段階；で製造されたものであり得る。
【００２３】
前記組成物は、ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３をそれぞれ０．５〜３０重量％を含有することができる。
前記組成物は、筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）分化を促進することができる。
前記組成物は、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）による筋萎縮現象を抑制することができる。
【００２４】
また、本発明は、前記筋肉分化促進用組成物及び薬学的に許容可能な担体を含む筋肉疾患の予防又は治療用薬学組成物に関する。
本発明はまた、前記筋肉分化促進用組成物及び食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含む筋肉疾患改善用の健康機能食品に関する。
【００２５】
前記筋肉疾患は、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋疾患（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋肉損傷（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋異栄養症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋神経の伝導性疾患（ｍｙｏｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋肉炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、糖尿病性筋萎縮症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、神経損傷（ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）及び退行性筋肉疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）からなる群から選択され得る。
【００２６】
前記悪液質は、エイズ（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）、腹腔疾患（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、慢性心不全症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、先天性心不全症（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ）、クローン病（ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、治療されないか深刻な１型糖尿、神経性食欲不振及びホルモン不足による悪液質であり得る。
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、加工高麗人参抽出物を有効成分として含む筋肉分化促進用組成物に関する。
【００２８】
前記加工高麗人参抽出物は、特許文献２、４の製造方法で製造されたサポニン分解酵素を製造した後、製造されたサポニン分解酵素と有機酸による加水分解を用いて微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参粉末又は加工高麗人参抽出物である。
【００２９】
前記加工高麗人参抽出物は、（ａ）アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を、高麗人参粉末及びフスマで構成された培地に接種する段階；（ｂ）前記段階（ａ）の菌を培養する段階；（ｃ）前記段階（ｂ）の培養物を限外濾過膜（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）で精製する段階；（ｄ）前記段階（ｃ）の精製物から酵素を分離する段階；（ｅ）高麗人参粉末、紅参粉末、高麗人参抽出物又は紅参抽出物に前記段階（ｄ）の酵素を添加する段階；（ｆ）前記段階（ｅ）の添加物を発酵する段階；（ｇ）前記段階（ｆ）の発酵物を分離する段階；（ｈ）前記段階（ｇ）の上澄液を濃縮する段階；（ｉ）前記段階（ｈ）の濃縮物を酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸及び酒石酸からなる群から選ばれる１種以上の有機酸で反応する段階；及び（ｊ）前記段階（ｉ）の反応物を中和及び濾過、精製、濃縮、乾燥させる段階；で製造された微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参粉末又は加工高麗人参抽出物である。
前記微量のジンセノシドは、筋肉分化促進効果があるジンセノシドであり得、好ましくは、ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３である。
【００３０】
前記筋肉分化促進用組成物は、ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３を含有するもので、ジンセノシドＲｈ２又はＲｇ３が単独で含まれた組成物に比べて、ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の混合組成物がより筋肉分化促進効果に優れる。
【００３１】
前記ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の含有量はそれぞれ、０．２〜３０重量％であり得、好ましくは０．５〜３０重量％であり、より好ましくは１〜２０重量％である。
【００３２】
前記“筋肉分化”は、衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ）が活性化されて筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）に分化し、筋芽細胞の融合が起きて筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）が形成された後、筋管細胞が筋繊維（ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒ）をなし、筋繊維が束となって筋肉を形成することを指し、マイオディー（ＭｙｏＤ）、Ｍｙｆ５（ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ５）、ミオゲニン（ｍｙｇｅｎｉｎ）、ＭＲＦ４（ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ４）のような様々な筋肉調節因子と、ミオシンＨ鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ，ＭＨＣ）、筋クレアチンリン酸化酵素（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ，ＭＣＫ）のような筋肉特異性因子が関与している。
前記筋肉分化促進用組成物は、筋芽細胞から筋管細胞への分化を促進することができ、筋管細胞の幅を増加させることができる。
前記筋肉分化促進用組成物は筋管細胞の萎縮を抑制させることができる。
前記筋肉分化促進用組成物は、マイオディーのような筋肉調節因子の発現を増加させることができる。
前記筋肉分化促進用組成物はミオスタチンを抑制させることができる。
【００３３】
前記“ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）”は、筋肉細胞に直接作用して筋肉分化及び筋肉細胞分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を抑制するタンパク質である。ミオスタチンは、老化、筋異栄養症、筋萎縮性側索硬化症、慢性心不全症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、エイズ、癌悪液質、腎不全（ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）などのような様々な疾病から過発現するものと知られている。
また、本発明は、前記筋肉分化促進用組成物を有効成分として含む筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物に関する。
前記薬学的組成物は、筋肉細胞への分化を促進させることによって筋肉疾患を予防又は治療するために用いることができる。
【００３４】
また、本発明の薬学的組成物は、ミオスタチンを抑制することによって筋肉疾患を予防又は治療することができる。好ましくは、ミオスタチンによる筋萎縮を抑制させることによって筋肉疾患を予防又は治療する。
【００３５】
前記筋肉疾患は、筋肉細胞の欠乏、異常減少又は筋肉細胞の機能障害によって発生し得る疾病である。好ましくは、筋肉細胞の欠乏又は異常減少に起因するものである。
【００３６】
前記筋肉疾患は、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋疾患（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋肉損傷（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋異栄養症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋神経の伝導性疾患（ｍｙｏｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋肉炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、糖尿病性筋萎縮症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、神経損傷（ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）、退行性筋肉疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）などであり得るが、これに限定されない。
【００３７】
前記悪液質は、消耗症候群（ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）とも呼ばれ、食欲不振を伴う体重減少、筋肉量及び体脂肪減少、炎症反応などを特徴とする。このような悪液質は、癌、エイズ（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）、腹腔疾患（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、慢性心不全症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、先天性心不全症（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ）、クローン病（ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、治療されないか深刻な１型糖尿、神経性食欲不振、ホルモン不足などによって発生し得るが、これに限定されない。好ましくは、エイズ（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）、腹腔疾患（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、慢性心不全症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、先天性心不全症（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ）、クローン病（ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、治療されないか深刻な１型糖尿、神経性食欲不振及びホルモン不足による悪液質であり、より好ましくは、エイズ（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）による悪液質である。
【００３８】
前記退行性筋肉疾患は、筋肉が持続して破壊されるもので、デュシェンヌ型筋萎縮症（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋萎縮症（Ｂｅｃｋｅｒ’ｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋萎縮症（Ｌｉｍｂ−ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、先天性筋萎縮症（ｃｏｎｇｅｎｔｉａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋萎縮症（ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性萎縮症（ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼球咽頭型筋萎縮症（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、末端筋萎縮症（ｄｉｓｔａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリードレフュス型筋萎縮症（ｅｍｅｒｙ−ｄｒｅｉｆｕｓｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などであり得る。
【００３９】
本発明において筋萎縮は、筋肉収縮が持続して現れるものであり得る。前記筋肉収縮において、筋肉内グリコーゲンの合成増加が、筋肉収縮を持続させることがある。例えば、前記退行性筋肉疾患の一つであるデュシェンヌ筋萎縮症を病んでいる患者の筋肉においてグリコーゲンが増加していることが確認された。また、糖原蓄積病（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）はグリコーゲン代謝異常による疾患で、骨格筋へのグリコーゲン蓄積が筋肉痙攣、進行性筋力低下を招く。
前記薬学的組成物は、前記筋肉分化促進用組成物及び薬学的に許容可能な担体を含むことができる。
【００４０】
前記薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して用いることができる。前記薬学的組成物に含み得る担体、賦形剤及び希釈剤には、ラクトース、デキストローズ、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調剤する。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、本発明の筋肉分化促進用組成物に、少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤する。また、単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などがあるが、通常用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他にも様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤には、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）−６１、カカオジ、ラウリンジ、グリセロゼラチンなどを用いることができる。
【００４１】
本発明の薬学的組成物の投与量は、治療する対象の年齢、性別、体重、治療する特定疾患又は病理状態、疾患又は病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断によって変わるだろう。このような因子に基づく投与量の決定は、当業者の水準内にあり、一般に、投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜およそ２０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。より好ましい投与量は、１ｍｇ／ｋｇ／日〜５００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は、一日に一回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量はいかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、ネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与することができる。投与のあらゆる方式が予想でき、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜又は脳血管内注射、及び皮膚塗布によって投与可能である。
【００４３】
また、本発明は、前記筋肉分化促進用組成物を有効成分として含む筋肉疾患改善用の健康機能食品に関する。
前記健康機能食品は、前記筋肉分化促進用組成物及び食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含む筋肉疾患改善用の健康機能食品である。
【００４４】
前記健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤又は液剤などの形態を含み、本発明の抽出物を添加できる食品には、例えば、各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。
【発明の効果】
【００４５】
本発明は、サポニン分解酵素を製造した後、製造されたサポニン分解酵素と有機酸による加水分解物を用いた微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参抽出物を有効成分として含む筋肉分化促進用組成物に関し、前記加工高麗人参抽出物が筋芽細胞の筋肉への分化を促進し、筋肉分化抑制因子であるミオスタチンを抑制することを確認した。
これによって、本発明の加工高麗人参抽出物を用いて、優れた効果を有する筋肉疾患の予防又は治療用組成物が開発できると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】筋芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞の筋管細胞への分化の有無を確認した結果である。
【図２】本発明の加工高麗人参抽出物の細胞毒性を確認した結果である。
【図３】本発明の加工高麗人参抽出物処理濃度及び時間による筋管細胞分化効果を確認した結果であり、（Ａ）は筋管細胞の細胞イメージを、（Ｂ）は分化した筋管細胞の数を、（Ｃ）は分化した筋管細胞の細胞核数を確認した結果である。
【図４】本発明の加工高麗人参抽出物の処理濃度による筋管細胞の幅の増加を確認した結果であり、（Ａ）は筋管細胞のイメージを、（Ｂ）は筋管細胞の幅を測定して数値化した結果である。
【図５】ミオスタチン（ＭＳＴＮ）処理濃度による筋管細胞の萎縮程度を確認した結果である。
【図６】本発明の加工高麗人参抽出物の、ミオスタチンによる筋管細胞萎縮を抑制する効果を確認した結果であり、（Ａ）は筋管細胞のイメージを、（Ｂ）は筋管細胞の幅を測定して数値化した結果である。
【図７】本発明の加工高麗人参抽出物のミオスタチンによる筋管細胞萎縮関連信号伝達因子であるＳｍａｄ２のリン酸化抑制効果を確認した結果であり、（Ａ）はリン酸化したＳｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）の発現を確認したバンドを、（Ｂ）は発現バンドの密度を数値化した結果である。
【図８】本発明の加工高麗人参抽出物の筋原繊維タンパク質発現に中核的な転写因子であるマイオディー（ＭｙｏＤ）及びこれを分解する酵素であるＭＡＦｂｘの発現調節効果を確認した結果であり、（Ａ）はマイオディー、ＭＡＦｂｘ、及びＧＡＰＤＨのタンパク質発現を確認したバンドを、（Ｂ）はミオスタチン及び本発明の加工高麗人参抽出物の有無条件においてＧＡＰＤＨに対するＭＡＦｂｘの発現を数値化した結果であり、（Ｃ）はミオスタチン及び本発明の加工高麗人参抽出物の有無条件においてＧＡＰＤＨに対するマイオディーの発現を数値化した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、別の形態で具体化してもよい。むしろ、ここで紹介される内容が徹底且つ完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供されるものである。
【００４８】
本発明の加工高麗人参抽出物は、特許文献２、４に開示の方法で製造した。
＜比較例１．高麗人参粉末の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを熱風乾燥後に粉砕し、６０ｇの高麗人参粉末を得た。
＜比較例２．高麗人参濃縮液の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを熱風乾燥させた後、１Ｌの７０％酒精を添加して７０℃で８時間撹拌後に抽出、濾過、及び濃縮し、５０ｇの高麗人参濃縮液を得た。
＜比較例３．高麗人参濃縮液粉末の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを熱風乾燥させた後、１Ｌの７０％酒精を添加して７０℃で８時間撹拌後に抽出、濾過、濃縮、及び乾燥させ、３０ｇの高麗人参濃縮液粉末を得た。
【００４９】
＜比較例４．紅参粉末の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを９８℃で１時間蒸気で蒸して乾燥後に粉砕し、４０ｇの紅参粉末を得た。
＜比較例５．紅参濃縮液の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを９８℃で１時間蒸気で蒸して乾燥させた後、１Ｌの７０％酒精を添加して７０℃で８時間撹拌後に抽出、濾過、及び濃縮し、３０ｇの紅参濃縮液を得た。
＜比較例６．紅参濃縮液粉末の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを９８℃で１時間蒸気で蒸して乾燥させた後、１Ｌの７０％酒精を添加して７０℃で８時間撹拌後に抽出、濾過、濃縮、及び乾燥させ、２５ｇの紅参濃縮液粉末を得た。
【００５０】
＜比較例７．高麗人参粉末＋Ｒｈ２  ０．３％＋Ｒｇ３  ０．３％の製造＞
比較例１の高麗人参粉末９９．４ｇにジンセノシドＲｈ２  ０．３ｇとＲｇ３  ０．３ｇを混合した。
＜比較例８．紅参粉末＋Ｒｈ２  ０．３％＋Ｒｇ３  ０．３％の製造＞
比較例４の紅参粉末９９．４ｇにジンセノシドＲｈ２  ０．３ｇとＲｇ３  ０．３ｇを混合した。
＜比較例９．紅参粉末＋Ｒｈ２１％の製造＞
比較例４の紅参粉末９９ｇにジンセノシドＲｈ２  １ｇを混合した。
＜比較例１０．紅参粉末＋Ｒｇ３  １％の製造＞
比較例４の紅参粉末９９ｇにジンセノシドＲｇ３  １ｇを混合した。
＜比較例１１．紅参粉末＋Ｒｈ２  ０．５％＋Ｒｇ３  ０．５％の製造＞
比較例４の紅参粉末９９ｇにジンセノシドＲｈ２  ０．５ｇとＲｇ３  ０．５ｇを混合した。
【００５１】
＜実施例１．高麗人参粉末を用いた加工高麗人参粉末の製造＞
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過及び濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例１の高麗人参粉末２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに２Ｌの精製水を加えた後にクエン酸２５０ｇを添加し、５０℃で１８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮し、２００ｇの加工高麗人参粉末を得た。
＜実施例２．高麗人参濃縮液を用いた加工高麗人参濃縮液の製造＞
【００５２】
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種して２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過、濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例２の高麗人参濃縮液２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに２Ｌの精製水を添加した後、クエン酸２５０ｇを添加し、５０℃で１８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮し、１９０ｇの加工高麗人参濃縮液を得た。
＜実施例３．高麗人参濃縮液粉末を用いた加工高麗人参濃縮液粉末の製造＞
【００５３】
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種して２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過、濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例３の高麗人参濃縮液粉末２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを添加し、酢酸２５０ｇを添加し、５０℃で８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮、乾燥させ、１９５ｇの加工高麗人参濃縮液粉末を得た。
＜実施例４．紅参粉末を用いた加工紅参粉末の製造＞
【００５４】
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種して２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過、濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例４の紅参粉末２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを加え、酢酸２５０ｇを添加し、５０℃で８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮、乾燥させ、１９５ｇの加工紅参粉末を得た。
＜実施例５．紅参濃縮液を用いた加工紅参濃縮液の製造＞
【００５５】
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種して２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過、濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例５の紅参濃縮液２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを加え、クエン酸２５０ｇを添加し、５０℃で１８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮し、１９０ｇの加工紅参濃縮液を得た。
＜実施例６．紅参濃縮液粉末を用いた加工紅参濃縮液粉末の製造＞
【００５６】
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種して２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過、濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例６の紅参濃縮液粉末２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを加え、酢酸２５０ｇを添加し、５０℃で８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮、乾燥させ、１９５ｇの加工紅参濃縮液粉末を得た。
【００５７】
下記の表１に、韓国登録特許第９９２８００号に開示の方法で分析し、本発明の実施例及び比較例の製造物に含まれているジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の含有量を示す。本発明の実施例１〜実施例６に該当する高麗人参粉末及び紅参粉末に対するサポニン分解酵素を製造した後、製造されたサポニン分解酵素と有機酸による加水分解を用いて微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参粉末又は加工高麗人参抽出物の方が、これらの反応対象物質である高麗人参粉末及び紅参粉末に比べてジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３が増加して多量含まれることを確認した。比較例７〜比較例１１は、本発明の実施例と違いサポニン分解酵素と有機酸加水分解処理をしていない高麗人参粉末と紅参粉末に単純にジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３を添加して、本発明の実施例と同一のジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の含有量にし、これらから筋肉分化促進効果を比較するために製造した。
【００５８】
【表１】
2021524506.tif 000003
【００５９】
＜実験例１．動物細胞培養及び筋管細胞分化誘導＞
筋肉分化過程で筋芽細胞の分裂が起き、筋芽細胞同士の融合が起き、筋管細胞に発達して最終的に筋肉を形成する。したがって、本発明の加工高麗人参抽出物の筋肉分化への影響を確認するために筋管細胞への分化活性を確認した。
【００６０】
筋管細胞への分化促進活性を確認するために、マウス筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）であるＣ２Ｃ１２（Ｃ２Ｃ１２  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７７２）細胞を用いた。Ｃ２Ｃ１２細胞は、１０％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が含まれているＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）培地を入れ、３７℃、５％  ＣＯ２培養器で培養した。
【００６１】
前記で培養したＣ２Ｃ１２細胞をプレートに分注し、細胞が８０〜９０％程度満ちるまで培養した。培養液を除去し、２％ウマ血清（ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）が含まれたＤＭＥＭ培地を添加し培養して筋管細胞への分化を誘導させた後、形成された筋管細胞を顕微鏡で確認し、その結果を図１に示した。
図１に見られるように、（Ａ）の分化前と違い、（Ｂ）の分化を誘導した後には複数の筋芽細胞が融合して管状の筋管細胞を形成することを確認した。
このことから、Ｃ２Ｃ１２細胞にウマ血清を処理することによって筋肉分化を誘導できることが分かった。
【００６２】
＜実験例２．加工高麗人参抽出物の細胞毒性確認＞
本発明の加工高麗人参抽出物の細胞毒性の有無を確認するために、前記実験例１で分化させた筋管細胞を用いた。
【００６３】
前記実験例１の筋管細胞を９６ウェルプレートに分注して２４時間培養した後、前記本発明の加工高麗人参抽出物を０〜１００μｇ／ｍｌとなるように処理し、さらに２４時間培養した。培養後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイキット及びメーカーから提供するマニュアルを用いて細胞内ＡＴＰ濃度を測定して細胞生存率を測定し、その結果を図２に示した。
【００６４】
図２に見られるように、前記加工高麗人参抽出物のうち実施例２の加工高麗人参抽出物の濃度３０μｇ／ｍｌまでは細胞生存率の減少がわずかであるが、５０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌでは、加工高麗人参抽出物を処理していない正常細胞に比べて細胞生存率が７〜１２％程度減少した。すなわち、実施例２の加工高麗人参抽出物濃度が５０μｇ／ｍｌ以上であれば、細胞毒性が現れ得ることが予測できた。
このような結果は、他の実施例の加工高麗人参抽出物を処理した場合にも類似に得られた。
このことから、本発明の加工高麗人参抽出物の最高処理濃度が３０μｇ／ｍｌであることが分かった。
【００６５】
＜実験例３．加工高麗人参抽出物の筋管細胞形成促進確認＞
筋肉分化過程で筋芽細胞の分裂が起き、筋芽細胞同士の融合が起き、筋管細胞に発達して最終的に筋肉を形成する。したがって、本発明の加工高麗人参抽出物の筋肉分化への影響を確認するために筋管細胞形成誘導活性を確認した。
【００６６】
前記実験例１の筋管細胞形成誘導実験方法と同一にして実験を行った。このとき、ウマ血清処理後、前記実施例２の加工高麗人参抽出物を０、１０、３０μｇ／ｍｌとなるように処理した後、６日間培養した。培養０日、２日、４日、６日目に該当の細胞を固定（ｆｉｘｉｎｇ）し、Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋキット（Ｓｙｍｅｘ社、ＺＳ０００３、日本）及びメーカーから提供するマニュアルを用いて細胞核及び細胞質を染色した後、顕微鏡を用いてイメージを撮影し、筋管細胞の数及び細胞核の数を分析し、その結果を図３に示した。
【００６７】
図３に見られるように、実施例２の加工高麗人参抽出物を処理した場合、処理時間及び濃度にしたがって筋管細胞が増えることを、細胞イメージ（Ａ）、筋管細胞の数（Ｂ）及び細胞核数（Ｃ）から確認した。
【００６８】
また、前記実験方法と同じ方法で前記実施例１〜実施例６及び比較例１〜比較例１１の加工高麗人参抽出物を１０μｇ／ｍｌとなるように処理した後、４日間培養し、筋管細胞の数を分析し、その結果を下記の表２に示した。
【００６９】
【表２】
2021524506.tif 000004
【００７０】
前記表２から分かるように、比較例１〜比較例６の加工高麗人参抽出物を処理した場合の筋管細胞数は、ウマ血清のみを処理した対照群と類似であるのに対し、実施例１〜実施例６の加工高麗人参抽出物を処理した場合には筋管細胞数が増加したことを確認した。また、比較例１及び比較例４の高麗人参粉末又は紅参粉末にジンセノシドＲｈ２、Ｒｇ３の一方を追加したり或いは両方を追加した比較例７〜比較例１１の加工高麗人参抽出物を処理した場合には、比較例１及び比較例４の加工高麗人参抽出物に比べて筋管細胞の数が増加し、特に、ジンセノシドＲｈ２又はＲｇ３をそれぞれ追加した比較例９及び比較例１０の加工高麗人参抽出物を処理した場合に比べて、両ジンセノシドを共に追加した比較例７、比較例８、比較例１０及び比較例１１の加工高麗人参抽出物を処理した場合に筋管細胞数が多いことを確認した。
このことから、本発明の加工高麗人参抽出物のようにジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３を共に投与した場合に筋肉分化促進効果が増加することが分かった。
【００７１】
＜実験例４．加工高麗人参抽出物の筋管細胞幅の増加効果確認＞
筋肉分化過程中に生成された筋管細胞は、その長さ及び幅が増加しながら周辺の筋管細胞と融合して筋繊維を形成する。したがって、本発明の加工高麗人参抽出物の筋肉分化への影響を確認するために、筋管細胞の幅の増加効果を確認した。
【００７２】
前記実験例１の方法でＣ２Ｃ１２細胞を筋管細胞に分化させた後、前記実施例２の加工高麗人参抽出物を０、１、１０、３０μｇ／ｍｌとなるように処理し、２４時間培養した。培養した細胞を４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で１５分間固定させ、０．２％トリトンＸ−１００（ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を１５分間処理した後、５％  ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）で６時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させた。ブロッキング後、細胞形態を観察するために、細胞に筋管形成維持タンパク質であるＭＨＣ（ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）に対する抗体を入れて４℃で１２時間反応させた後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光物質が結合した２次抗体を室温で４時間反応させて免疫蛍光染色した後、蛍光顕微鏡によって、ＭＨＣに付いている蛍光物質を用いて筋管細胞イメージを観察し、Ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを用いて筋管細胞の幅を測定した。その結果を、図４に示した。このとき、筋管細胞の幅は、無作為に５箇所から総１００個以上の筋管細胞の幅を測定して定量化した。
【００７３】
図４（Ａ）の筋管細胞のイメージ及び図４（Ｂ）の筋管細胞幅を測定した結果から分かるように、Ｃ２Ｃ１２から分化した筋管細胞の幅が、実施例２の加工高麗人参抽出物処理濃度にしたがって増加することを確認した。
【００７４】
また、本明細書には示していなが、本発明の実施例１〜実施例５の加工高麗人参抽出物を処理した場合にも、前記実施例２の加工高麗人参抽出物を処理した場合と同様に、筋管細胞の幅が増加することを確認した。
このことから、本発明の加工高麗人参抽出物が筋管細胞の幅の増加によって筋肉分化を促進する効果があることが分かった。
【００７５】
＜実験例５．加工高麗人参抽出物の筋萎縮抑制効果確認＞
実験例５−１．筋萎縮動物細胞モデルの製造
本発明の加工高麗人参抽出物の筋萎縮抑制効果を確認するために、筋萎縮動物細胞モデルを製造した。この時、筋萎縮が起きると筋管細胞の幅及び長さが減少することに基づいて動物細胞モデルを製造した。
【００７６】
前記実験例１の筋管細胞分化誘導と同じ方法で筋管細胞を分化させた後、ＦＢＳが含まれていないＤＭＥＭ培地を入れて３時間培養した。培養後、各細胞に、筋肉分化抑制物質であるミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ，ＭＳＴＮ）を濃度別に２４時間処理し、筋萎縮が誘導されたかどうか確認するために、筋管細胞の幅の変化を測定した。筋管細胞幅の変化の測定は、前記実験例４と同じ方法で測定し、免疫蛍光染色した後、蛍光顕微鏡によってＭＨＣに付いている蛍光物質を用いて筋管細胞イメージを観察し、Ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを用いて筋管細胞の幅を測定し、その結果を図５に示した。
【００７７】
図５に見られるように、ミオスタチンを処理していない筋管細胞に比べて、ミオスタチンを処理した場合、処理濃度が増加するにしたがって筋管細胞の幅が減少することを確認し、０．４μｇ／ｍｌのミオスタチンを処理した場合に筋管細胞の幅が最大に減少した。
【００７８】
このことから、本発明の加工高麗人参抽出物の筋萎縮抑制効果を確認するための筋萎縮動物細胞モデルの製造に当たってミオスタチン０．４μｇ／ｍｌを処理することにした。
【００７９】
実験例５−２．加工高麗人参抽出物の筋萎縮抑制効果確認
本発明の加工高麗人参抽出物の筋萎縮抑制効果を確認するために、前記実験例５−１の筋萎縮動物細胞モデルの製造方法と同じ方法で筋萎縮を誘導した後、筋管細胞の幅の変化を観察し、その結果を図６に示した。この時、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）０．４μｇ／ｍｌと前記実施例２の加工高麗人参抽出物３０μｇ／ｍｌを２４時間単独処理又は併用処理し、ミオスタチン及び実施例２の加工高麗人参抽出物を処理していない筋管細胞を対照群として用いた。
【００８０】
図６（Ａ）の筋管細胞のイメージ及び６（Ｂ）の筋管細胞幅を測定した結果から分かるように、対照群に比べて、実施例２の加工高麗人参抽出物を処理した場合には筋管細胞の幅が増加するが、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）を処理すれば筋管細胞の幅が減少することを確認した。また、ミオスタチンと実施例２の加工高麗人参抽出物を併せて処理した場合には、ミオスタチンによって減少した筋管細胞の幅が増加することを確認した。
【００８１】
このことから、本発明の加工高麗人参抽出物が、筋肉分化過程中に筋管細胞の幅を増加させる一方で、ミオスタチンによる筋萎縮を抑制するということが分かった。
【００８２】
＜実験例６．加工高麗人参抽出物のミオスタチン関連信号伝達抑制効果確認＞
実験例６−１．Ｓｍａｄ２リン酸化抑制効果確認
ミオスタチン（ＭＳＴＮ）は、アクチビンタイプＩＩ受容体（ａｃｔｉｖｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡｃｔＲＩＩＢ）−Ｓｍａｄ２信号伝達経路の活性化を通じてユビキチンプロテアソーム経路（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ，ＵＰＰ）媒介タンパク質分解を増加させ、筋萎縮を誘導するものと知られている。そこで、本発明の加工高麗人参抽出物の、ミオスタチンによる筋萎縮抑制効果を確認するために、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｓｍａｄ２信号伝達経路のうちＳｍａｄ２のリン酸化抑制の有無を確認した。
【００８３】
前記実験例５−２と同じ方法で分化させた筋管細胞にミオスタチン及び前記実施例２の加工高麗人参抽出物を処理して細胞を確保し、これを用いてウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）を行った。この時、実施例２の加工高麗人参抽出物は、処理濃度が０、１０、３０、１００μｇ／ｍｌとなるように処理した。確保した細胞に溶解緩衝溶液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れ、細胞を溶解させた後に遠心分離し、上澄液のタンパク質を確保した。確保した上澄液のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離し、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｆｌｕｏｒｉｄｅ）メンブレインに移した。メンブレインをブロッキング溶液でブロッキングさせた後、Ｓｍａｄ２及びリン酸化されたＳｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）の量を確認するために、それぞれの１次抗体を処理した後、１次抗体に対する２次抗体を処理し、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いてタンパク質発現を確認した。この時、タンパク質バンド密度を測定して数値化し、その結果を図７に示した。
【００８４】
図７（Ａ）のタンパク質発現バンドの結果、及び７（Ｂ）の発現量を数値化した結果に見られるように、筋管細胞にミオスタチン（ＭＳＴＮ）を処理した場合にはＳｍａｄ２のリン酸化（ｐＳｍａｄ２）が増加したが、実施例２の加工高麗人参抽出物を処理した場合には、処理濃度が増加するにしたがってＳｍａｄ２のリン酸化（ｐＳｍａｄ２）が減少することを確認した。
【００８５】
実験例６−２．ＭｙｏＤ分解経路抑制効果確認
筋肉分化に重要な筋原繊維タンパク質発現に中核的な転写因子であるマイオディー（ＭｙｏＤ）の分解過程は、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｓｍａｄ２経路によって活性化されるＵＰＰ過程によって主に導かれることが知られている。ＵＰＰ過程は、対象タンパク質に特化したユビキチン化Ｅ３リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）によって調節されるが、この過程に中核的なマイオディーのＥ３リガーゼはＭＡＦｂｘと知られている。そこで、本発明の加工高麗人参抽出物の、ミオスタチンによる筋萎縮抑制効果を確認するために、マイオディーとＭＡＦｂｘの含有量変化を確認した。
【００８６】
前記実験例５−２と同じ方法で分化させた筋管細胞にミオスタチン及び前記実施例２の加工高麗人参抽出物を処理して細胞を確保した。この時、実施例２の加工高麗人参抽出物の場合、処理濃度が３０μｇ／ｍｌとなるように処理した。確保した細胞を用いて前記実施例６−１と同じ方法でマイオディーとＭＡＦｂｘに該当する抗体を用いてウェスタンブロットを行い、その結果を図８に示した。
【００８７】
図８（Ａ）のＭＡＦｂｘ及びマイオディータンパク質発現バンドの結果、及び図８（Ｂ）のＭＡＦｂｘ及び図８（Ｃ）のマイオディー発現量を数値化した結果に見られるように、筋管細胞にミオスタチン（ＭＳＴＮ）を処理した場合にはＭＡＦｂｘの発現が増加し、マイオディーの発現は減少するのに対し、実施例２の加工高麗人参抽出物を処理した場合には、ＭＳＴＮによって増加したＭＡＦｂｘが減少し、ＭＳＴＮによって減少したマイオディーの発現が増加することを確認した。
【００８８】
前記実験例６−１及び実験例６−２の結果から、本発明の加工高麗人参抽出物が、筋肉分化抑制剤であるミオスタチンの信号伝達過程を抑制することによって筋肉分化を促進するということが分かった。
【図１】
2021524506.tif 000005
【図２】
2021524506.tif 000006
【図３】
2021524506.tif 000007
【図４】
2021524506.tif 000008
【図５】
2021524506.tif 000009
【図６】
2021524506.tif 000010
【図７】
2021524506.tif 000011
【図８】
2021524506.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月20日(2021.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加工高麗人参抽出物を含む筋肉分化促進用組成物に関し、より詳細には、筋肉分化促進効果がある微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参抽出物を有効成分として含む筋肉疾患の予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉（ｍｕｓｃｌｅ）は、人の身体で最大の構成を占める組織である。人体の適正筋肉量を確保することは、体格を維持し、身体の各器官が各自の機能を実行し、各種の疾患を予防するのに不可欠である。
【０００３】
筋肉は、大きく、平滑筋（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ）、心臓筋（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ）、骨格筋（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）に分けられる。骨格筋は、私たちの体全体でかなりの部分を占めながら、骨格の動きを促進させる。これらの骨格筋は、分裂せず、多核体である筋繊維で構成されており、胚の形成過程で作られる。胚の形成過程が終わった後には、出生後の生長や筋肉分化（ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）過程によって筋肉が形成される。また、筋肉の分化は、凍傷や捻挫、打撲傷などにより筋肉が損傷するときにも起こる。
【０００４】
筋肉分化（ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）過程は、まず衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ）が活性化され、活性化された衛星細胞が筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）に分化する（非特許文献１）。分化した筋芽細胞は、分裂が起こり、筋芽細胞の融合（ｆｕｓｉｏｎ）が起こることで、筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）に発達し、これらの筋管細胞が集まって筋繊維（ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒ）を形成し、筋繊維は束となって最終的に筋肉を形成することになる。
【０００５】
筋肉分化過程は、マイオディー（ＭｙｏＤ）、Ｍｙｆ５（ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ５）、ミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、ＭＲＦ４（ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４）のような様々な筋肉の調節因子（ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒｓ）によって調節され、そのうち、マイオディー（ＭｙｏＤ）は、ミオシンＨ鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ，ＭＨＣ）、筋クレアチンリン酸化酵素（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ，ＭＣＫ）のような筋肉特異遺伝子の発現を開始させ、衛星細胞が筋芽細胞に分化することを誘導し、マイオディーの活性によるミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）発現の誘導は、筋芽細胞の融合に最も重要な要素であり、筋管細胞の形成に関与する（非特許文献２）。
【０００６】
一方、ミオカイン（ｍｙｏｋｉｎｅ）は、筋肉収縮の反応において骨格筋から発現したり合成される活性物質で、自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）、周辺分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）又は内分泌（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）方式で役割を果たし、筋肉の他に別の組織の機能も調節するものと知られている（非特許文献３）。ミオカインの代表には、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ，ＭＳＴＮ）、インターロイキン−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６，ＩＬ−６）、イリシン（ｉｒｉｓｉｎ）などがある。
【０００７】
ミオスタチンは、形質転換成長因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β，ＴＧＦ−β）群に属する遺伝子で、筋肉細胞に直接作用して、筋肉分化及び筋肉細胞分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を抑制するタンパク質である（非特許文献４−５）。複数の先行研究においてミオスタチン遺伝子がノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）又はノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）された場合には、筋肉の肥大及びインスリン抵抗性が減少し（非特許文献４−５）、運動時にミオスタチンの発現量が減少することにより、筋肉の大きさが増加すると知られている（非特許文献６）。
【０００８】
また、筋肉の分化に重要な筋原繊維タンパク質の発現に中核的な転写因子であるマイオディー（ＭｙｏＤ）の分解過程は、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）アクチビンタイプＩＩ受容体（ａｃｔｉｖｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡｃｔＲＩＩＢ）−Ｓｍａｄ２経路によって活性化されるＵＰＰ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ）過程によって媒介タンパク質分解を増加させて筋萎縮を誘導するものと知られている。
【０００９】
一方、老化した細胞や衛星細胞から筋芽細胞への分化、筋芽細胞の分裂などのような筋肉分化過程中に問題が発生した場合、筋萎縮症（ｍｕｓｃｌｅ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋疾患（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋肉損傷（ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋異栄養症（ｍｕｓｃｌｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋神経の伝導性疾患（ｍｙｏｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）及び神経損傷（ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ）などの様々な筋肉の障害及び疾患が発生することがある（非特許文献７−８）
【００１０】
また、前記筋肉分化過程中における問題によって発生する筋肉疾患の一つである筋肉減少症は、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）によって発病することもある。悪液質は、慢性消耗性複合症候群の一種で、癌、結核、血友病などの末期に見られる高度な全身衰弱症状を意味する。特に、悪性腫瘍、慢性心不全などの慢性疾患を随伴し、食欲不振を伴う体重減少、筋肉量及び体脂肪減少、炎症反応などを示す。
【００１１】
このような悪液質による筋肉減少は、骨格筋量の持続した減少と機能損傷による複合症候群に伴うもので、漸進的で徐々に進行する筋肉量消失が現れる老化及び筋肉分化障害による筋肉減少疾患と違い、急性の筋肉減少症状が現れる。このような生理的特性の差異は、予防及び治療においても差異を示す。したがって、筋肉減少という徴候が発生しても、その発生原因によって、悪液質、老化及び筋肉分化障害のそれぞれの特性に合う治療が必要である（非特許文献９）。
【００１２】
一方、筋肉分化障害及び疾患を克服するための方法として、筋肉細胞を再生する方法が最近になって報告されており、このような筋肉細胞の再生は、筋肉細胞の外部分に存在する衛星細胞を刺激し、衛星細胞が分裂して筋肉組織を形成するものと知られている。筋肉細胞の再生は、損傷した筋肉の修復だけでなく、老化による自然的な筋肉損失にも適用可能であると報告されたこともある（非特許文献１０）。
【００１３】
また、癌悪液質進行過程において筋肉分化過程に重要な筋肉調節因子であるマイオディー及びミオゲニンの発現が減少されるとの研究結果が報告されており（非特許文献１１）、癌又はエイズによる筋肉消耗（悪液質）マウスモデルにおいて、筋肉分化過程に重要な筋肉調節因子であるミオゲニン、ミオシン（ｍｙｏｓｉｎ）などの発現が減少するという研究結果も報告された（非特許文献１２）。また、癌悪液質が誘発されているマウスモデルにおいてミオスタチンの抑制が筋肉の体積と機能に影響を及ぼすという研究結果も報告され（非特許文献１３）、筋肉分化促進による悪液質の治療も期待している。
【００１４】
高麗人参の主な機能性成分であるジンセノシド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）は、植物界の種々のサポニンのうち、高麗人参サポニンだけを特に命名するもので、現在まで総１５０種類以上のジンセノシドが見出されている（非特許文献１４）。ジンセノシドは、抗癌、抗アレルギー、抗炎症の他に中枢神経抑制及び精神安定、鎮痛、記憶力改善、肝傷害報告、タンパク質及び脂質合成促進、抗糖尿、抗ストレス、抗酸化活性物質生成促進、免疫調節、血小板凝集抑制、抗老化作用などの薬理効能が明らかになっており、これは、ジンセノシドの種類別に異なって現れる。
【００１５】
ジンセノシドＲｇ１及びＲｂ１は中枢神経系活動を向上させ、ジンセノシドＲｅ、Ｒｇ１及びパナキサン（ｐａｎａｘａｎ）Ａ及びＢは糖尿病に効能があり、ジンセノシドＲｅ及びＲｇ１は血管新生を促進し、ジンセノシドＲｇ３及びＲｈ２は抗癌効能を示すことが知られている（非特許文献１５−１６）。最近の研究では、いくつかの高麗人参抽出物が悪液質、疲労又は筋肉萎縮に効能を示すことが明らかにされている。０．９〜１．４％のジンセノシドＲｇ１と１．７〜３．０％のジンセノシドＲｂ１を含有しているＧＩＮＳＥＬＥＣＴは、抗腫瘍剤であるシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）を処理したネズミの体重減少と運動能力減少を予防し（非特許文献１７）、ジンセノシドＲｇ１は、タンパク質分解経路を抑制して飢饉による筋萎縮を予防することが報告された（非特許文献１８）。
【００１６】
そこで、本発明者は、高麗人参のジンセノシド成分を用いて筋肉分化促進効果を確認する過程で、微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参抽出物が、筋肉分化抑制因子であるミオスタチンを抑制し、筋肉分化を促進するということを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
従来の先行技術である特許文献１は、２０（Ｒ）（Ｓ）−ジンセノシドＲｈ２、ジンセノシドＲｋ２及びジンセノシドＲｈ３からなる群から選ばれる１種以上の化合物を含有する、筋肉細胞増殖活性化を用いた筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、心筋梗塞及び心血管系疾患の予防又は治療用組成物に関するものであり、本発明の組成物構成と作用機序及び適用疾病の範囲において異なる。また、特許文献２には、ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の含有量が増加した加工高麗人参抽出物を含む筋肉減少症治療用組成物が記載されているが、本発明のミオスタチン抑制及び筋肉分化促進効果は記載も暗示もされていない。特許文献３には、ミオスタチン拮抗剤を含む筋肉減少症治療用組成物が記載されているが、本発明のジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の含有量が増加した加工高麗人参抽出物のミオスタチン抑制効果は記載も暗示もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】韓国登録特許第１７７１４８６号
【特許文献２】韓国登録特許第１５９５４２６号
【特許文献３】韓国公開特許第２０１７−００９４２９２号
【特許文献４】韓国登録特許第０９９２８００号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献２】Ｚａｎｏｕ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献３】Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，２００８
【非特許文献４】Ｇｒｏｕｓｓａｒｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００
【非特許文献５】Ｈｕｈ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献６】Ｈｕｈ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２
【非特許文献７】Ｂｏｎａｌｄｏ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献８】Ｗａｇａｔｓｕｍａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献９】リュ・スンワン，２０１７
【非特許文献１０】Ｃｏｎｂｏｙ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３
【非特許文献１１】Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１６
【非特許文献１２】Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００９
【非特許文献１３】Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献１４】Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｐ．，２００９
【非特許文献１５】Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，２００８
【非特許文献１６】Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００４
【非特許文献１７】Ｌｏｂｉｎａ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献１８】Ｌｉ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、加工高麗人参抽出物を含む筋肉分化促進用組成物を提供することにある。
また、本発明の目的は、前記筋肉分化促進用組成物を含む、筋肉疾患の予防又は治療用薬学組成物及び改善用健康機能食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、加工高麗人参抽出物を有効成分として含む筋肉分化促進用組成物に関する。
【００２２】
前記加工高麗人参抽出物は、（ａ）アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を、高麗人参粉末及びフスマで構成された培地に接種する段階；（ｂ）前記段階（ａ）の菌を培養する段階；（ｃ）前記段階（ｂ）の培養物を限外濾過膜（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）で精製する段階；（ｄ）前記段階（ｃ）の精製物から酵素を分離する段階；（ｅ）高麗人参粉末、紅参粉末、高麗人参抽出物又は紅参抽出物に前記段階（ｄ）の酵素を添加する段階；（ｆ）前記段階（ｅ）の添加物を発酵する段階；（ｇ）前記段階（ｆ）の発酵物を分離する段階；（ｈ）前記段階（ｇ）の上澄液を濃縮する段階；（ｉ）前記段階（ｈ）の濃縮物を酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸及び酒石酸からなる群から選ばれる１種以上の有機酸で反応する段階；及び（ｊ）前記段階（ｉ）の反応物を中和及び濾過、精製、濃縮、乾燥させる段階；で製造されたものであり得る。
【００２３】
前記組成物は、ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３をそれぞれ０．５〜３０重量％を含有することができる。
前記組成物は、筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）分化を促進することができる。
前記組成物は、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）による筋萎縮現象を抑制することができる。
【００２４】
また、本発明は、前記筋肉分化促進用組成物及び薬学的に許容可能な担体を含む筋肉疾患の予防又は治療用薬学組成物に関する。
本発明はまた、前記筋肉分化促進用組成物及び食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含む筋肉疾患改善用の健康機能食品に関する。
【００２５】
前記筋肉疾患は、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋疾患（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋肉損傷（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋異栄養症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋神経の伝導性疾患（ｍｙｏｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋肉炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、糖尿病性筋萎縮症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、神経損傷（ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）及び退行性筋肉疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）からなる群から選択され得る。
【００２６】
前記悪液質は、エイズ（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）、腹腔疾患（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、慢性心不全症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、先天性心不全症（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ）、クローン病（ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、治療されないか深刻な１型糖尿、神経性食欲不振及びホルモン不足による悪液質であり得る。
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、加工高麗人参抽出物を有効成分として含む筋肉分化促進用組成物に関する。
【００２８】
前記加工高麗人参抽出物は、特許文献２、４の製造方法で製造されたサポニン分解酵素を製造した後、製造されたサポニン分解酵素と有機酸による加水分解を用いて微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参粉末又は加工高麗人参抽出物である。
【００２９】
前記加工高麗人参抽出物は、（ａ）アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を、高麗人参粉末及びフスマで構成された培地に接種する段階；（ｂ）前記段階（ａ）の菌を培養する段階；（ｃ）前記段階（ｂ）の培養物を限外濾過膜（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）で精製する段階；（ｄ）前記段階（ｃ）の精製物から酵素を分離する段階；（ｅ）高麗人参粉末、紅参粉末、高麗人参抽出物又は紅参抽出物に前記段階（ｄ）の酵素を添加する段階；（ｆ）前記段階（ｅ）の添加物を発酵する段階；（ｇ）前記段階（ｆ）の発酵物を分離する段階；（ｈ）前記段階（ｇ）の上澄液を濃縮する段階；（ｉ）前記段階（ｈ）の濃縮物を酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸及び酒石酸からなる群から選ばれる１種以上の有機酸で反応する段階；及び（ｊ）前記段階（ｉ）の反応物を中和及び濾過、精製、濃縮、乾燥させる段階；で製造された微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参粉末又は加工高麗人参抽出物である。
前記微量のジンセノシドは、筋肉分化促進効果があるジンセノシドであり得、好ましくは、ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３である。
【００３０】
前記筋肉分化促進用組成物は、ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３を含有するもので、ジンセノシドＲｈ２又はＲｇ３が単独で含まれた組成物に比べて、ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の混合組成物がより筋肉分化促進効果に優れる。
【００３１】
前記ジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の含有量はそれぞれ、０．２〜３０重量％であり得、好ましくは０．５〜３０重量％であり、より好ましくは１〜２０重量％である。
【００３２】
前記“筋肉分化”は、衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ）が活性化されて筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）に分化し、筋芽細胞の融合が起きて筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）が形成された後、筋管細胞が筋繊維（ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒ）をなし、筋繊維が束となって筋肉を形成することを指し、マイオディー（ＭｙｏＤ）、Ｍｙｆ５（ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ５）、ミオゲニン（ｍｙｇｅｎｉｎ）、ＭＲＦ４（ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ４）のような様々な筋肉調節因子と、ミオシンＨ鎖（ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ，ＭＨＣ）、筋クレアチンリン酸化酵素（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ，ＭＣＫ）のような筋肉特異性因子が関与している。
前記筋肉分化促進用組成物は、筋芽細胞から筋管細胞への分化を促進することができ、筋管細胞の幅を増加させることができる。
前記筋肉分化促進用組成物は筋管細胞の萎縮を抑制させることができる。
前記筋肉分化促進用組成物は、マイオディーのような筋肉調節因子の発現を増加させることができる。
前記筋肉分化促進用組成物はミオスタチンを抑制させることができる。
【００３３】
前記“ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）”は、筋肉細胞に直接作用して筋肉分化及び筋肉細胞分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を抑制するタンパク質である。ミオスタチンは、老化、筋異栄養症、筋萎縮性側索硬化症、慢性心不全症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、エイズ、癌悪液質、腎不全（ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）などのような様々な疾病から過発現するものと知られている。
また、本発明は、前記筋肉分化促進用組成物を有効成分として含む筋肉疾患の予防又は治療用薬学的組成物に関する。
前記薬学的組成物は、筋肉細胞への分化を促進させることによって筋肉疾患を予防又は治療するために用いることができる。
【００３４】
また、本発明の薬学的組成物は、ミオスタチンを抑制することによって筋肉疾患を予防又は治療することができる。好ましくは、ミオスタチンによる筋萎縮を抑制させることによって筋肉疾患を予防又は治療する。
【００３５】
前記筋肉疾患は、筋肉細胞の欠乏、異常減少又は筋肉細胞の機能障害によって発生し得る疾病である。好ましくは、筋肉細胞の欠乏又は異常減少に起因するものである。
【００３６】
前記筋肉疾患は、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、筋疾患（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋肉損傷（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋異栄養症（ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋神経の伝導性疾患（ｍｙｏｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋肉炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、糖尿病性筋萎縮症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、神経損傷（ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）、退行性筋肉疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）などであり得るが、これに限定されない。
【００３７】
前記悪液質は、消耗症候群（ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）とも呼ばれ、食欲不振を伴う体重減少、筋肉量及び体脂肪減少、炎症反応などを特徴とする。このような悪液質は、癌、エイズ（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）、腹腔疾患（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、慢性心不全症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、先天性心不全症（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ）、クローン病（ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、治療されないか深刻な１型糖尿、神経性食欲不振、ホルモン不足などによって発生し得るが、これに限定されない。好ましくは、エイズ（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）、腹腔疾患（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、慢性心不全症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、先天性心不全症（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ）、クローン病（ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、治療されないか深刻な１型糖尿、神経性食欲不振及びホルモン不足による悪液質であり、より好ましくは、エイズ（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）による悪液質である。
【００３８】
前記退行性筋肉疾患は、筋肉が持続して破壊されるもので、デュシェンヌ型筋萎縮症（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ベッカー型筋萎縮症（Ｂｅｃｋｅｒ’ｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肢帯型筋萎縮症（Ｌｉｍｂ−ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、先天性筋萎縮症（ｃｏｎｇｅｎｔｉａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、顔面肩甲上腕型筋萎縮症（ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋強直性萎縮症（ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、眼球咽頭型筋萎縮症（ｏｃｕｌｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ）、末端筋萎縮症（ｄｉｓｔａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、エメリードレフュス型筋萎縮症（ｅｍｅｒｙ−ｄｒｅｉｆｕｓｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などであり得る。
【００３９】
本発明において筋萎縮は、筋肉収縮が持続して現れるものであり得る。前記筋肉収縮において、筋肉内グリコーゲンの合成増加が、筋肉収縮を持続させることがある。例えば、前記退行性筋肉疾患の一つであるデュシェンヌ筋萎縮症を病んでいる患者の筋肉においてグリコーゲンが増加していることが確認された。また、糖原蓄積病（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）はグリコーゲン代謝異常による疾患で、骨格筋へのグリコーゲン蓄積が筋肉痙攣、進行性筋力低下を招く。
前記薬学的組成物は、前記筋肉分化促進用組成物及び薬学的に許容可能な担体を含むことができる。
【００４０】
前記薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して用いることができる。前記薬学的組成物に含み得る担体、賦形剤及び希釈剤には、ラクトース、デキストローズ、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調剤する。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、本発明の筋肉分化促進用組成物に、少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤する。また、単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などがあるが、通常用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他にも様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤には、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）−６１、カカオジ、ラウリンジ、グリセロゼラチンなどを用いることができる。
【００４１】
本発明の薬学的組成物の投与量は、治療する対象の年齢、性別、体重、治療する特定疾患又は病理状態、疾患又は病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断によって変わるだろう。このような因子に基づく投与量の決定は、当業者の水準内にあり、一般に、投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜およそ２０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。より好ましい投与量は、１ｍｇ／ｋｇ／日〜５００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は、一日に一回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量はいかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、ネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与することができる。投与のあらゆる方式が予想でき、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜又は脳血管内注射、及び皮膚塗布によって投与可能である。
【００４３】
また、本発明は、前記筋肉分化促進用組成物を有効成分として含む筋肉疾患改善用の健康機能食品に関する。
前記健康機能食品は、前記筋肉分化促進用組成物及び食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含む筋肉疾患改善用の健康機能食品である。
【００４４】
前記健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤又は液剤などの形態を含み、本発明の抽出物を添加できる食品には、例えば、各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。
【発明の効果】
【００４５】
本発明は、サポニン分解酵素を製造した後、製造されたサポニン分解酵素と有機酸による加水分解物を用いた微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参抽出物を有効成分として含む筋肉分化促進用組成物に関し、前記加工高麗人参抽出物が筋芽細胞の筋肉への分化を促進し、筋肉分化抑制因子であるミオスタチンを抑制することを確認した。
これによって、本発明の加工高麗人参抽出物を用いて、優れた効果を有する筋肉疾患の予防又は治療用組成物が開発できると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】筋芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞の筋管細胞への分化の有無を確認した結果である。
【図２】本発明の加工高麗人参抽出物の細胞毒性を確認した結果である。
【図３】本発明の加工高麗人参抽出物処理濃度及び時間による筋管細胞分化効果を確認した結果であり、（Ａ）は筋管細胞の細胞イメージを、（Ｂ）は分化した筋管細胞の数を、（Ｃ）は分化した筋管細胞の細胞核数を確認した結果である。
【図４】本発明の加工高麗人参抽出物の処理濃度による筋管細胞の幅の増加を確認した結果であり、（Ａ）は筋管細胞のイメージを、（Ｂ）は筋管細胞の幅を測定して数値化した結果である。
【図５】ミオスタチン（ＭＳＴＮ）処理濃度による筋管細胞の萎縮程度を確認した結果である。
【図６】本発明の加工高麗人参抽出物の、ミオスタチンによる筋管細胞萎縮を抑制する効果を確認した結果であり、（Ａ）は筋管細胞のイメージを、（Ｂ）は筋管細胞の幅を測定して数値化した結果である。
【図７】本発明の加工高麗人参抽出物のミオスタチンによる筋管細胞萎縮関連信号伝達因子であるＳｍａｄ２のリン酸化抑制効果を確認した結果であり、（Ａ）はリン酸化したＳｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）の発現を確認したバンドを、（Ｂ）は発現バンドの密度を数値化した結果である。
【図８】本発明の加工高麗人参抽出物の筋原繊維タンパク質発現に中核的な転写因子であるマイオディー（ＭｙｏＤ）及びこれを分解する酵素であるＭＡＦｂｘの発現調節効果を確認した結果であり、（Ａ）はマイオディー、ＭＡＦｂｘ、及びＧＡＰＤＨのタンパク質発現を確認したバンドを、（Ｂ）はミオスタチン及び本発明の加工高麗人参抽出物の有無条件においてＧＡＰＤＨに対するＭＡＦｂｘの発現を数値化した結果であり、（Ｃ）はミオスタチン及び本発明の加工高麗人参抽出物の有無条件においてＧＡＰＤＨに対するマイオディーの発現を数値化した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、別の形態で具体化してもよい。むしろ、ここで紹介される内容が徹底且つ完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供されるものである。
【００４８】
本発明の加工高麗人参抽出物は、特許文献２、４に開示の方法で製造した。
＜比較例１．高麗人参粉末の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを熱風乾燥後に粉砕し、６０ｇの高麗人参粉末を得た。
＜比較例２．高麗人参濃縮液の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを熱風乾燥させた後、１Ｌの７０％酒精を添加して７０℃で８時間撹拌後に抽出、濾過、及び濃縮し、５０ｇの高麗人参濃縮液を得た。
＜比較例３．高麗人参濃縮液粉末の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを熱風乾燥させた後、１Ｌの７０％酒精を添加して７０℃で８時間撹拌後に抽出、濾過、濃縮、及び乾燥させ、３０ｇの高麗人参濃縮液粉末を得た。
【００４９】
＜比較例４．紅参粉末の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを９８℃で１時間蒸気で蒸して乾燥後に粉砕し、４０ｇの紅参粉末を得た。
＜比較例５．紅参濃縮液の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを９８℃で１時間蒸気で蒸して乾燥させた後、１Ｌの７０％酒精を添加して７０℃で８時間撹拌後に抽出、濾過、及び濃縮し、３０ｇの紅参濃縮液を得た。
＜比較例６．紅参濃縮液粉末の製造＞
６年根高麗人参２００ｇを９８℃で１時間蒸気で蒸して乾燥させた後、１Ｌの７０％酒精を添加して７０℃で８時間撹拌後に抽出、濾過、濃縮、及び乾燥させ、２５ｇの紅参濃縮液粉末を得た。
【００５０】
＜比較例７．高麗人参粉末＋Ｒｈ２  ０．２％＋Ｒｇ３  ０．３％の製造＞
比較例１の高麗人参粉末９９．５ｇにジンセノシドＲｈ２  ０．２ｇとＲｇ３  ０．３ｇを混合した。
＜比較例８．紅参粉末＋Ｒｈ２  ０．３％＋Ｒｇ３  ０．３％の製造＞
比較例４の紅参粉末９９．５ｇにジンセノシドＲｈ２  ０．２ｇとＲｇ３  ０．３ｇを混合した。
＜比較例９．紅参粉末＋Ｒｈ２１％の製造＞
比較例４の紅参粉末９９ｇにジンセノシドＲｈ２  １ｇを混合した。
＜比較例１０．紅参粉末＋Ｒｇ３  １％の製造＞
比較例４の紅参粉末９９ｇにジンセノシドＲｇ３  １ｇを混合した。
＜比較例１１．紅参粉末＋Ｒｈ２  ０．５％＋Ｒｇ３  ０．５％の製造＞
比較例４の紅参粉末９９ｇにジンセノシドＲｈ２  ０．５ｇとＲｇ３  ０．５ｇを混合した。
【００５１】
＜実施例１．高麗人参粉末を用いた加工高麗人参粉末の製造＞
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過及び濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例１の高麗人参粉末２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに２Ｌの精製水を加えた後にクエン酸２５０ｇを添加し、５０℃で１８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮し、２００ｇの加工高麗人参粉末を得た。
＜実施例２．高麗人参濃縮液を用いた加工高麗人参濃縮液の製造＞
【００５２】
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種して２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過、濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例２の高麗人参濃縮液２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに２Ｌの精製水を添加した後、クエン酸２５０ｇを添加し、５０℃で１８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮し、１９０ｇの加工高麗人参濃縮液を得た。
＜実施例３．高麗人参濃縮液粉末を用いた加工高麗人参濃縮液粉末の製造＞
【００５３】
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種して２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過、濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例３の高麗人参濃縮液粉末２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを添加し、酢酸２５０ｇを添加し、５０℃で８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮、乾燥させ、１９５ｇの加工高麗人参濃縮液粉末を得た。
＜実施例４．紅参粉末を用いた加工紅参粉末の製造＞
【００５４】
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種して２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過、濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例４の紅参粉末２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを加え、酢酸２５０ｇを添加し、５０℃で８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮、乾燥させ、１９５ｇの加工紅参粉末を得た。
＜実施例５．紅参濃縮液を用いた加工紅参濃縮液の製造＞
【００５５】
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種して２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過、濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例５の紅参濃縮液２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを加え、クエン酸２５０ｇを添加し、５０℃で１８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮し、１９０ｇの加工紅参濃縮液を得た。
＜実施例６．紅参濃縮液粉末を用いた加工紅参濃縮液粉末の製造＞
【００５６】
高麗人参粉末２５０ｇ、フスマ７５０ｇを入れて１２１℃、１．５気圧下で高圧蒸気滅菌機で滅菌した。滅菌された培地に滅菌水２Ｌを入れて混合した後、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）懸濁液（５×１０５胞子／培地重さｇ）を接種して２８℃で７日間培養した。培養完了後、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過した。濾過した培養液を限外濾過膜（１００ｋＤａ以上）を用いて濾過、濃縮し、酵素液６０ｇを得た。比較例６の紅参濃縮液粉末２００ｇに酵素液３０ｇを添加して２８℃で１８時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮した。前記濃縮物２００ｇに精製水２Ｌを加え、酢酸２５０ｇを添加し、５０℃で８時間撹拌した。反応が完了すると、７０％酒精を添加して濾過、濃縮、乾燥させ、１９５ｇの加工紅参濃縮液粉末を得た。
【００５７】
下記の表１に、韓国登録特許第９９２８００号に開示の方法で分析し、本発明の実施例及び比較例の製造物に含まれているジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の含有量を示す。本発明の実施例１〜実施例６に該当する高麗人参粉末及び紅参粉末に対するサポニン分解酵素を製造した後、製造されたサポニン分解酵素と有機酸による加水分解を用いて微量のジンセノシド成分が増加した加工高麗人参粉末又は加工高麗人参抽出物の方が、これらの反応対象物質である高麗人参粉末及び紅参粉末に比べてジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３が増加して多量含まれることを確認した。比較例７〜比較例１１は、本発明の実施例と違いサポニン分解酵素と有機酸加水分解処理をしていない高麗人参粉末と紅参粉末に単純にジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３を添加して、本発明の実施例と同一のジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３の含有量にし、これらから筋肉分化促進効果を比較するために製造した。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
＜実験例１．動物細胞培養及び筋管細胞分化誘導＞
筋肉分化過程で筋芽細胞の分裂が起き、筋芽細胞同士の融合が起き、筋管細胞に発達して最終的に筋肉を形成する。したがって、本発明の加工高麗人参抽出物の筋肉分化への影響を確認するために筋管細胞への分化活性を確認した。
【００６０】
筋管細胞への分化促進活性を確認するために、マウス筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）であるＣ２Ｃ１２（Ｃ２Ｃ１２  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７７２）細胞を用いた。Ｃ２Ｃ１２細胞は、１０％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が含まれているＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）培地を入れ、３７℃、５％  ＣＯ２培養器で培養した。
【００６１】
前記で培養したＣ２Ｃ１２細胞をプレートに分注し、細胞が８０〜９０％程度満ちるまで培養した。培養液を除去し、２％ウマ血清（ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）が含まれたＤＭＥＭ培地を添加し培養して筋管細胞への分化を誘導させた後、形成された筋管細胞を顕微鏡で確認し、その結果を図１に示した。
図１に見られるように、（Ａ）の分化前と違い、（Ｂ）の分化を誘導した後には複数の筋芽細胞が融合して管状の筋管細胞を形成することを確認した。
このことから、Ｃ２Ｃ１２細胞にウマ血清を処理することによって筋肉分化を誘導できることが分かった。
【００６２】
＜実験例２．加工高麗人参抽出物の細胞毒性確認＞
本発明の加工高麗人参抽出物の細胞毒性の有無を確認するために、前記実験例１で分化させた筋管細胞を用いた。
【００６３】
前記実験例１の筋管細胞を９６ウェルプレートに分注して２４時間培養した後、前記本発明の加工高麗人参抽出物を０〜１００μｇ／ｍｌとなるように処理し、さらに２４時間培養した。培養後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイキット及びメーカーから提供するマニュアルを用いて細胞内ＡＴＰ濃度を測定して細胞生存率を測定し、その結果を図２に示した。
【００６４】
図２に見られるように、前記加工高麗人参抽出物のうち実施例２の加工高麗人参抽出物の濃度３０μｇ／ｍｌまでは細胞生存率の減少がわずかであるが、５０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌでは、加工高麗人参抽出物を処理していない正常細胞に比べて細胞生存率が７〜１２％程度減少した。すなわち、実施例２の加工高麗人参抽出物濃度が５０μｇ／ｍｌ以上であれば、細胞毒性が現れ得ることが予測できた。
このような結果は、他の実施例の加工高麗人参抽出物を処理した場合にも類似に得られた。
このことから、本発明の加工高麗人参抽出物の最高処理濃度が３０μｇ／ｍｌであることが分かった。
【００６５】
＜実験例３．加工高麗人参抽出物の筋管細胞形成促進確認＞
筋肉分化過程で筋芽細胞の分裂が起き、筋芽細胞同士の融合が起き、筋管細胞に発達して最終的に筋肉を形成する。したがって、本発明の加工高麗人参抽出物の筋肉分化への影響を確認するために筋管細胞形成誘導活性を確認した。
【００６６】
前記実験例１の筋管細胞形成誘導実験方法と同一にして実験を行った。このとき、ウマ血清処理後、前記実施例２の加工高麗人参抽出物を０、１０、３０μｇ／ｍｌとなるように処理した後、６日間培養した。培養０日、２日、４日、６日目に該当の細胞を固定（ｆｉｘｉｎｇ）し、Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋキット（Ｓｙｍｅｘ社、ＺＳ０００３、日本）及びメーカーから提供するマニュアルを用いて細胞核及び細胞質を染色した後、顕微鏡を用いてイメージを撮影し、筋管細胞の数及び細胞核の数を分析し、その結果を図３に示した。
【００６７】
図３に見られるように、実施例２の加工高麗人参抽出物を処理した場合、処理時間及び濃度にしたがって筋管細胞が増えることを、細胞イメージ（Ａ）、筋管細胞の数（Ｂ）及び細胞核数（Ｃ）から確認した。
【００６８】
また、前記実験方法と同じ方法で前記実施例１〜実施例６及び比較例１〜比較例１１の加工高麗人参抽出物を１０μｇ／ｍｌとなるように処理した後、４日間培養し、筋管細胞の数を分析し、その結果を下記の表２に示した。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
前記表２から分かるように、比較例１〜比較例６の加工高麗人参抽出物を処理した場合の筋管細胞数は、ウマ血清のみを処理した対照群と類似であるのに対し、実施例１〜実施例６の加工高麗人参抽出物を処理した場合には筋管細胞数が増加したことを確認した。また、比較例１及び比較例４の高麗人参粉末又は紅参粉末にジンセノシドＲｈ２、Ｒｇ３の一方を追加したり或いは両方を追加した比較例７〜比較例１１の加工高麗人参抽出物を処理した場合には、比較例１及び比較例４の加工高麗人参抽出物に比べて筋管細胞の数が増加し、特に、ジンセノシドＲｈ２又はＲｇ３をそれぞれ追加した比較例９及び比較例１０の加工高麗人参抽出物を処理した場合に比べて、両ジンセノシドを共に追加した比較例７、比較例８、及び比較例１１の加工高麗人参抽出物を処理した場合に筋管細胞数が多いことを確認した。
このことから、本発明の加工高麗人参抽出物のようにジンセノシドＲｈ２及びＲｇ３を共に投与した場合に筋肉分化促進効果が増加することが分かった。
【００７１】
＜実験例４．加工高麗人参抽出物の筋管細胞幅の増加効果確認＞
筋肉分化過程中に生成された筋管細胞は、その長さ及び幅が増加しながら周辺の筋管細胞と融合して筋繊維を形成する。したがって、本発明の加工高麗人参抽出物の筋肉分化への影響を確認するために、筋管細胞の幅の増加効果を確認した。
【００７２】
前記実験例１の方法でＣ２Ｃ１２細胞を筋管細胞に分化させた後、前記実施例２の加工高麗人参抽出物を０、１、１０、３０μｇ／ｍｌとなるように処理し、２４時間培養した。培養した細胞を４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で１５分間固定させ、０．２％トリトンＸ−１００（ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を１５分間処理した後、５％  ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）で６時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させた。ブロッキング後、細胞形態を観察するために、細胞に筋管形成維持タンパク質であるＭＨＣ（ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）に対する抗体を入れて４℃で１２時間反応させた後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光物質が結合した２次抗体を室温で４時間反応させて免疫蛍光染色した後、蛍光顕微鏡によって、ＭＨＣに付いている蛍光物質を用いて筋管細胞イメージを観察し、Ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを用いて筋管細胞の幅を測定した。その結果を、図４に示した。このとき、筋管細胞の幅は、無作為に５箇所から総１００個以上の筋管細胞の幅を測定して定量化した。
【００７３】
図４（Ａ）の筋管細胞のイメージ及び図４（Ｂ）の筋管細胞幅を測定した結果から分かるように、Ｃ２Ｃ１２から分化した筋管細胞の幅が、実施例２の加工高麗人参抽出物処理濃度にしたがって増加することを確認した。
【００７４】
また、本明細書には示していなが、本発明の実施例１〜実施例３、実施例５の加工高麗人参抽出物を処理した場合にも、前記実施例２の加工高麗人参抽出物を処理した場合と同様に、筋管細胞の幅が増加することを確認した。
このことから、本発明の加工高麗人参抽出物が筋管細胞の幅の増加によって筋肉分化を促進する効果があることが分かった。
【００７５】
＜実験例５．加工高麗人参抽出物の筋萎縮抑制効果確認＞
実験例５−１．筋萎縮動物細胞モデルの製造
本発明の加工高麗人参抽出物の筋萎縮抑制効果を確認するために、筋萎縮動物細胞モデルを製造した。この時、筋萎縮が起きると筋管細胞の幅及び長さが減少することに基づいて動物細胞モデルを製造した。
【００７６】
前記実験例１の筋管細胞分化誘導と同じ方法で筋管細胞を分化させた後、ＦＢＳが含まれていないＤＭＥＭ培地を入れて３時間培養した。培養後、各細胞に、筋肉分化抑制物質であるミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ，ＭＳＴＮ）を濃度別に２４時間処理し、筋萎縮が誘導されたかどうか確認するために、筋管細胞の幅の変化を測定した。筋管細胞幅の変化の測定は、前記実験例４と同じ方法で測定し、免疫蛍光染色した後、蛍光顕微鏡によってＭＨＣに付いている蛍光物質を用いて筋管細胞イメージを観察し、Ｉｍａｇｅ  Ｊプログラムを用いて筋管細胞の幅を測定し、その結果を図５に示した。
【００７７】
図５に見られるように、ミオスタチンを処理していない筋管細胞に比べて、ミオスタチンを処理した場合、処理濃度が増加するにしたがって筋管細胞の幅が減少することを確認し、０．４μｇ／ｍｌのミオスタチンを処理した場合に筋管細胞の幅が最大に減少した。
【００７８】
このことから、本発明の加工高麗人参抽出物の筋萎縮抑制効果を確認するための筋萎縮動物細胞モデルの製造に当たってミオスタチン０．４μｇ／ｍｌを処理することにした。
【００７９】
実験例５−２．加工高麗人参抽出物の筋萎縮抑制効果確認
本発明の加工高麗人参抽出物の筋萎縮抑制効果を確認するために、前記実験例５−１の筋萎縮動物細胞モデルの製造方法と同じ方法で筋萎縮を誘導した後、筋管細胞の幅の変化を観察し、その結果を図６に示した。この時、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）０．４μｇ／ｍｌと前記実施例２の加工高麗人参抽出物３０μｇ／ｍｌを２４時間単独処理又は併用処理し、ミオスタチン及び実施例２の加工高麗人参抽出物を処理していない筋管細胞を対照群として用いた。
【００８０】
図６（Ａ）の筋管細胞のイメージ及び６（Ｂ）の筋管細胞幅を測定した結果から分かるように、対照群に比べて、実施例２の加工高麗人参抽出物を処理した場合には筋管細胞の幅が増加するが、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）を処理すれば筋管細胞の幅が減少することを確認した。また、ミオスタチンと実施例２の加工高麗人参抽出物を併せて処理した場合には、ミオスタチンによって減少した筋管細胞の幅が増加することを確認した。
【００８１】
このことから、本発明の加工高麗人参抽出物が、筋肉分化過程中に筋管細胞の幅を増加させる一方で、ミオスタチンによる筋萎縮を抑制するということが分かった。
【００８２】
＜実験例６．加工高麗人参抽出物のミオスタチン関連信号伝達抑制効果確認＞
実験例６−１．Ｓｍａｄ２リン酸化抑制効果確認
ミオスタチン（ＭＳＴＮ）は、アクチビンタイプＩＩ受容体（ａｃｔｉｖｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡｃｔＲＩＩＢ）−Ｓｍａｄ２信号伝達経路の活性化を通じてユビキチンプロテアソーム経路（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ，ＵＰＰ）媒介タンパク質分解を増加させ、筋萎縮を誘導するものと知られている。そこで、本発明の加工高麗人参抽出物の、ミオスタチンによる筋萎縮抑制効果を確認するために、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｓｍａｄ２信号伝達経路のうちＳｍａｄ２のリン酸化抑制の有無を確認した。
【００８３】
前記実験例５−２と同じ方法で分化させた筋管細胞にミオスタチン及び前記実施例２の加工高麗人参抽出物を処理して細胞を確保し、これを用いてウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）を行った。この時、実施例２の加工高麗人参抽出物は、処理濃度が０、１０、３０、１００μｇ／ｍｌとなるように処理した。確保した細胞に溶解緩衝溶液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れ、細胞を溶解させた後に遠心分離し、上澄液のタンパク質を確保した。確保した上澄液のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離し、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｆｌｕｏｒｉｄｅ）メンブレインに移した。メンブレインをブロッキング溶液でブロッキングさせた後、Ｓｍａｄ２及びリン酸化されたＳｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）の量を確認するために、それぞれの１次抗体を処理した後、１次抗体に対する２次抗体を処理し、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いてタンパク質発現を確認した。この時、タンパク質バンド密度を測定して数値化し、その結果を図７に示した。
【００８４】
図７（Ａ）のタンパク質発現バンドの結果、及び７（Ｂ）の発現量を数値化した結果に見られるように、筋管細胞にミオスタチン（ＭＳＴＮ）を処理した場合にはＳｍａｄ２のリン酸化（ｐＳｍａｄ２）が増加したが、実施例２の加工高麗人参抽出物を処理した場合には、処理濃度が増加するにしたがってＳｍａｄ２のリン酸化（ｐＳｍａｄ２）が減少することを確認した。
【００８５】
実験例６−２．ＭｙｏＤ分解経路抑制効果確認
筋肉分化に重要な筋原繊維タンパク質発現に中核的な転写因子であるマイオディー（ＭｙｏＤ）の分解過程は、ミオスタチン（ＭＳＴＮ）−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｓｍａｄ２経路によって活性化されるＵＰＰ過程によって主に導かれることが知られている。ＵＰＰ過程は、対象タンパク質に特化したユビキチン化Ｅ３リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）によって調節されるが、この過程に中核的なマイオディーのＥ３リガーゼはＭＡＦｂｘと知られている。そこで、本発明の加工高麗人参抽出物の、ミオスタチンによる筋萎縮抑制効果を確認するために、マイオディーとＭＡＦｂｘの含有量変化を確認した。
【００８６】
前記実験例５−２と同じ方法で分化させた筋管細胞にミオスタチン及び前記実施例２の加工高麗人参抽出物を処理して細胞を確保した。この時、実施例２の加工高麗人参抽出物の場合、処理濃度が３０μｇ／ｍｌとなるように処理した。確保した細胞を用いて前記実験例６−１と同じ方法でマイオディーとＭＡＦｂｘに該当する抗体を用いてウェスタンブロットを行い、その結果を図８に示した。
【００８７】
図８（Ａ）のＭＡＦｂｘ及びマイオディータンパク質発現バンドの結果、及び図８（Ｂ）のＭＡＦｂｘ及び図８（Ｃ）のマイオディー発現量を数値化した結果に見られるように、筋管細胞にミオスタチン（ＭＳＴＮ）を処理した場合にはＭＡＦｂｘの発現が増加し、マイオディーの発現は減少するのに対し、実施例２の加工高麗人参抽出物を処理した場合には、ＭＳＴＮによって増加したＭＡＦｂｘが減少し、ＭＳＴＮによって減少したマイオディーの発現が増加することを確認した。
【００８８】
前記実験例６−１及び実験例６−２の結果から、本発明の加工高麗人参抽出物が、筋肉分化抑制剤であるミオスタチンの信号伝達過程を抑制することによって筋肉分化を促進するということが分かった。
【国際調査報告】
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