(57)【要約】  （ｉ）親ポリペプチドのｐＩと同じかそれより低いｐＩを有する変異体ポリペプチドを製造するために、変異を親ポリペプチド中に導入することによって、親ポリペプチドを進化させる工程、（ｉｉ）変異体ポリペプチドを、正常生理条件下で変異体ポリペプチドの活性を測定する正常生理条件下での第１のアッセイ、および異常条件下で変異体ポリペプチドの活性を測定する異常条件下での第２のアッセイに供する工程であって、正常生理条件および異常条件下は同じ条件下であるが異なった値を有する、工程、および（ｉｉｉ）第１のアッセイにおける同じ活性と比較して、第２のアッセイにおいて、増加した活性を示す変異体ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを選択する工程を含む、親ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを製造する方法。条件的活性型ポリペプチドおよび用途も提供される。
2021534194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを製造する方法であって、
（ｉ）親ポリペプチドのｐＩと同じかそれより低いｐＩを有する１つ以上の変異体ポリペプチドを製造するために、１つ以上の変異を親ポリペプチド中に導入することによって、親ポリペプチドを進化させる工程；
（ｉｉ）１つ以上の変異体ポリペプチドを、正常生理条件下で１つ以上の変異体ポリペプチドの活性を測定するために正常生理条件下での第１のアッセイ、および異常条件下で１つ以上の変異体ポリペプチドの活性を測定するために異常条件下での第２のアッセイに供する工程であって、正常生理条件および異常条件下は同じ条件であるが異なった値を有する、工程、および
（ｉｉｉ）第１のアッセイにおける同じ活性と比較して第２のアッセイにおいて増加した活性を示す１以上の変異体ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを選択する工程
を含む方法。
【請求項２】
条件的活性型ポリペプチドが、親ポリペプチドのｐＩよりも低いｐＩを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
条件的活性型ポリペプチドは、ｐＩが７．４を下回るか、またはｐＩが７．３を下回るか、またはｐＩが７．２を下回るか、またはｐＩが７．１を下回るか、またはｐＩが７．０を下回る、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上の変異が、親ポリペプチド中に置換されるアミノ酸のｐＩよりも高いｐＩを有する親ポリペプチド中のアミノ酸の残基に対するアミノ酸の残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
１つ以上の変異が、前記置換の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つ以上の変異が、親ポリペプチドのｐＩよりも低いｐＩを有するアミノ酸の残基の少なくとも１つの挿入を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の変異が、前記挿入の２、３、４、または５個を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１つ以上の変異が、親ポリペプチドのｐＩよりも高いｐＩを有するアミノ酸の残基の少なくとも１つの欠失を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
１つ以上の変異が、前記欠失の２、３、４、または５個を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上の変異が、変異体ポリペプチドの表面上に露出した位置に位置する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
進化工程が、変異体ポリペプチドへの１つ以上の追加の変異の導入を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
変異体ポリペプチドの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％が、親ポリペプチドのｐＩと同じかそれより低いｐＩを有することを確認するた工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉｉ）の前に親ポリペプチドのｐＩよりも大きいｐＩを有する変異体ポリペプチドを廃棄する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
条件的活性型ポリペプチドのｐＩを測定する工程をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
条件的活性型ポリペプチドのｐＩが、親ポリペプチドのｐＩよりも、少なくとも０．１、または少なくとも０．２、または少なくとも０．３、または少なくとも０．４、または少なくとも０．５、または少なくとも０．６、または少なくとも０．８、または少なくとも１．０、または少なくとも１．２、または少なくとも１．４、または少なくとも１．５、または少なくとも１．７、または少なくとも２．０、または少なくとも２．５、または少なくとも３．０、または少なくとも３．５、または少なくとも４．０、または少なくとも５．０単位低い、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
親ポリペプチドが、抗体、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、調節タンパク質、機能性ペプチド、バイオシミラー、免疫調節薬、受容体、およびリガンドから選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
親ポリペプチドが、全長抗体、一本鎖抗体、抗体断片、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、およびＦｃドメインから選択される抗体である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
親ポリペプチドが治療用抗体または治療用に開発されている抗体候補である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
親ポリペプチドがＩｇＧ抗体である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
１つ以上の変異が、ＩｇＧ抗体の可変領域にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
１つ以上の変異が、ＩｇＧ抗体の定常領域にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
１つ以上の変異が、ＩｇＧ抗体の１つ以上の相補性決定領域にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
条件が、ｐＨ、温度、浸透圧、オスモル濃度、酸化ストレス、および電解質濃度から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
条件がｐＨである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
第１のアッセイのｐＨが７．２超から７．６未満であり、第２のアッセイのｐＨが７．２未満または７．６を超える、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第１のアッセイにおける同じ活性に対する第２のアッセイにおける条件的活性型ポリペプチドの活性の比率が、少なくとも１．３、または１．５、または少なくとも１．７、または少なくとも２．０、または少なくとも３．０、または少なくとも４．０、または少なくとも６．０、または少なくとも８．０、または少なくとも１０．０、または少なくとも２０．０、または少なくとも４０．０、または少なくとも６０．０、または少なくとも１００．０である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
第１のアッセイおよび第２のアッセイの両方が、分子量が９００ａ．ｍ．ｕ．未満、５００ａ．ｍ．ｕ．未満、２００ａ．ｍ．ｕ．未満、または１００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子またはイオンの存在下で実施される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
分子またはイオンが、ヒスチジン、ヒスタミン、水素付加アデノシン二リン酸、水素付加アデノシン三リン酸、クエン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、乳酸塩、二硫化物、硫化水素、アンモニウム、リン酸二水素およびその任意の組合せから選択され、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
分子またはイオンが、約３ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲にある濃度を有する重炭酸イオンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
分子またはイオンが、１ｍＭ〜１００ｍＭ、２ｎＭ〜５００ｎＭ、３ｎＭ〜２００ｎＭ、５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度を有する二硫化物イオンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
分子またはイオンが、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、二硫化ナトリウム、または二硫化カリウムから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
生理条件が正常生理ｐＨであり、異常条件が正常生理ｐＨとは異なった異常ｐＨであり、分子またはイオンが正常生理ｐＨと異常ｐＨとの間にｐＫａを有する、請求項２７−３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
分子またはイオンのｐＫａが、異常ｐＨから最大０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８、または１．０、２．０単位まで離れている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ｐＩを有する親ポリペプチドに由来する条件的活性型ポリペプチドであって、前記条件的活性型ポリペプチドが
（ａ）親ポリペプチドのｐＩと同じかそれより低いｐＩを有し、および
（ｂ）正常生理条件での第１のアッセイにおける同じ活性に対する異常条件での第２のアッセイにおける活性の比率が少なくとも１．３であり、ここで、条件的活性型ポリペプチドの活性は、分子量が９００ａ．ｍ．ｕ未満の少なくとも１つの分子またはイオンの存在下で測定される、条件的活性型ポリペプチド。
【請求項３５】
分子量が５００ａ．ｍ．ｕ未満、２００ａ．ｍ．ｕ未満、または１００ａ．ｍ．ｕ未満である、請求項３４に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項３６】
第１のアッセイにおける同じ活性に対する異常条件での第２のアッセイにおける活性の正常生理条件の比率が、少なくとも１．５、少なくとも１．７、または少なくとも２．０、または少なくとも３．０、または少なくとも４．０、または少なくとも６．０、または少なくとも８．０、または少なくとも１０．０、または少なくとも２０．０、または少なくとも４０．０、または少なくとも６０．０、または少なくとも１００．０である、請求項３４〜３５のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項３７】
条件的活性型ポリペプチドのｐＩが、親ポリペプチドのｐＩよりも、少なくとも０．１、または少なくとも０．２、または少なくとも０．３、または少なくとも０．４、または少なくとも０．５、または少なくとも０．６、または少なくとも０．８、または少なくとも１．０、または少なくとも１．２、または少なくとも１．４、または少なくとも１．５、または少なくとも１．７、または少なくとも２．０、または少なくとも２．５、または少なくとも３．０、または少なくとも３．５、または少なくとも４．０、または少なくとも５．０単位だけ低い、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項３８】
条件的活性型ポリペプチドが、抗体、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、調節タンパク質、機能性ペプチド、バイオシミラー、免疫調節薬、受容体、およびリガンドから選択される、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項３９】
条件的活性型ポリペプチドが、全長抗体、一本鎖抗体、抗体断片、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、およびＦｃドメインから選択される抗体である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項４０】
抗体がＩｇＧ抗体である、請求項３９に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項４１】
条件がｐＨ、温度、浸透圧、オスモル濃度、酸化ストレス、および電解質濃度から選択される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項４２】
正常生理条件が７．２超から７．６未満の範囲のｐＨであり、異常条件が５．５超から７．２未満の範囲のｐＨである、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項４３】
分子またはイオンが、正常生理ｐＨと異常ｐＨとの間にｐＫａを有する、請求項４２に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項４４】
分子またはイオンのｐＫａが、異常ｐＨから最大０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８、または１．０、２．０単位離れている、請求項４３に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項４５】
分子またはイオンが、ヒスチジン、ヒスタミン、水素付加アデノシン二リン酸、水素付加アデノシン三リン酸、クエン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、乳酸塩、二硫化物、硫化水素、アンモニウム、リン酸二水素およびそれらの任意の組合せから選択される、請求項３４〜４４のいずれか一項記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項４６】
分子またはイオンが、約３ｍＭから約２００ｍＭ、約５ｍＭから約１５０ｍＭ、約５ｍＭから約１００ｍＭ、約１０ｍＭから約１００ｍＭ、約２０ｍＭから約１００ｍＭ、約２５ｍＭから約１００ｍＭ、約３０ｍＭから約１００ｍＭ、約３５ｍＭから約１００ｍＭ、約４０ｍＭから約１００ｍＭ、または約５０ｍＭから約１００ｍＭの範囲の濃度を有する重炭酸イオンである、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項４７】
分子またはイオンが、１ｍＭ〜１００ｍＭ、２ｎＭ〜５００ｎＭ、３ｎＭ〜２００ｎＭ、５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度を有する二硫化物イオンである、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項４８】
分子またはイオンが、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、二硫化ナトリウム、または二硫化カリウムから選択される、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチド。
【請求項４９】
請求項３４〜４８のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチドの有効量と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５０】
固形腫瘍、炎症性関節、または脳疾患または脳障害の治療のための請求項３４〜４８のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチドの使用。
【請求項５１】
請求項３４〜４８のいずれか一項に記載の条件的活性型ポリペプチドを治療を必要とする患者に投与する工程を含む、固形腫瘍、炎症性関節、または脳疾患もしくは脳障害の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、条件的活性を有するポリペプチドを提供する分野に関する。具体的には、本開示は、ｐＨ依存的活性を有する条件的活性型ポリペプチドおよび親ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを作成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、特に酵素又は抗体を様々な条件において活性又は安定であるように種々の特性に関して進化させる方法について記載している文献は多数ある。例えば、酵素を高温で安定であるように進化させることが行われている。高温で酵素活性が向上する状況では、その向上の実質的な部分は、一般にＱ１０法則（酵素の場合には１０℃の上昇につき代謝回転が二倍になると推定される）によって説明されるより高い速度論的活性によるものであり得る。
【０００３】
加えて、その正常な動作条件でタンパク質を不安定化させる、ひいては正常な動作条件でタンパク質活性を低下させる天然の突然変異が存在する。例えば、より低温で活性であるが、しかし典型的にはその由来である野生型タンパク質と比較して低いレベルで活性である公知の温度突然変異体がある。
【０００４】
親ポリペプチドがその通常の動作条件では不活性又は事実上不活性（５０％、３０％、又は１０％未満の活性及び特に１％の活性）であるが、異常条件では同等の又はより良好なその活性を維持するように進化させるためには、不安定化させる突然変異が、その不安定効果を打ち消すことのない、活性を増加させる突然変異と共存することが必要であり得る。不安定化させる突然変異は、Ｑ１０などの標準法則によって予測される効果を上回ってポリペプチドの活性を低下させるであろうことが予想され、従って、例えばその正常な動作条件下では活性が低い又は不活性である一方で、異常条件では効率的に機能するポリペプチドを進化させることが可能になると、条件的活性型ポリペプチドが作り出される。
【０００５】
条件的活性型のポリペプチド、例えば、ある条件では活性が低いかまたは事実上不活性であり、且つ別の条件では活性であるポリペプチドを生成することが望ましい。また、ある種の環境で活性化されるかまたは不活性化される、或いは時間の経過に伴い活性されるかまたは不活性化されるポリペプチドを生成することも望ましい。温度以外にも、条件的活性のためにポリペプチドを進化させたり改良したりできる他の条件としては、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化ストレス、電解質濃度などがある。進化させる際には、ポリペプチドの活性に加え、化学的抵抗性、及びタンパク質分解抵抗性を含めた他の特性を改良することが望ましい場合も多い。
【０００６】
さらに、ポリペプチドの等電点（ｐＩ）がポリペプチド（ｔ1/2）の半減期と逆相関することが観察されている。Ｍｏｍａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ  ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  ＰＮＡＳ，  ｖｏｌ．，  ７３，  ｐｐ．  ３０９３−３０９７，  １９７６を参照されたい。血漿中の抗体の半減期はその等電点値と正の相関を示しているので、これは特に抗体に当てはまる。特に、ｐＩ値が高い抗体は、ｐＩ値が低い抗体と比較して、全身クリアランスが速いだけでなく、バイオアベイラビリティも低い。抗体のｐＩが１〜２単位減少すると、血漿クリアランスの減少（すなわち、半減期が長くなる）と相関することが示されている。Ｓｅｅ  Ｒｙｍａｎ，  ＣＰＴ  Ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ｖｏｌ．６，  ｐｐ．  ５７６−５８８，  ２０１７を参照されたい。
【０００７】
ポリペプチドのｐＩを変化させる戦略が記載されている。例えば、米国特許第９，９０８，９３２号は、ｐＩを約５．４５から約６．５５の間に有する７つのタンパク質サブ集団を有する組換えタンパク質の等電点プロファイルをシフトさせる方法を開示している。この方法は、（ａ）組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、生産バイオリアクター中で、生成物を産生するのに十分な条件下で、第１の期間培養すること；および（ｂ）製品の等電点プロファイルをより酸性のプロファイルにシフトさせるのに十分な条件下で、少なくとも６時間からなる第２の期間、生成物をインキュベートすることの工程を含む。等電点をシフトした生成物は、７つのタンパク質亜集団の第４および第５の最も酸性のタンパク質亜集団の量の増加、および７つのタンパク質亜集団の第１および第２の最も塩基性タンパク質亜集団の量の減少を示す。
【０００８】
米国特許第９，６０５，０６１号は、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインの一方または両方から選択される定常ドメイン中の非ネイティブのアミノ酸による置換を含む少なくとも６個のアミノ酸変異を導入することによって抗体のｐＩを修飾する方法を開示している。置換アミノ酸は、変異体抗体のｐＩが親抗体のｐＩに対して少なくとも０．５ｌｏｇ低下するように、ネイティブのアミノ酸よりも低いｐＩを有する。
【０００９】
ＵＳ２００９／０３２４５８９は、可変領域の残基を含む抗体の表面に露出した残基の修飾を介して、抗体の表面電荷を制御することにより、血中のＩｇＧ抗体の半減期を増加させる方法を開示している。この方法は、（ａ）親ポリペプチドの表面上に露出している少なくとも１つのアミノ酸残基の電荷を変化させるためにＦｃＲｎ結合ドメインを含む親ポリペプチドをコードする核酸を改変すること；（ｂ）変異体ポリペプチドを発現するために改変された核酸を発現するために宿主細胞を培養すること；および（ｃ）宿主細胞培養物からＦｃＲｎ結合ドメインを含む発現された変異体ポリペプチドを回収すること、の工程を含む。
【００１０】
特定の環境および／または特定の条件下でより高い活性および／または選択性を有し、好ましくは血漿中での半減期が増加した条件的活性型ポリペプチドが依然として必要とされている。半減期が増加している条件的活性型ポリペプチドもまた、腫瘍微小環境などの異常条件が存在する場所で優先的に作用するだけでなく、その半減期が増加しているために、作用の延長または全体的な活性期間の延長をもたらす。さらに、これらの条件的活性型ポリペプチドは、正常生理条件が存在する正常の組織／臓器に対して生じる有害な副作用がより少ない可能性がある。副作用を減らす可能性があるため、より長期の治療、またはより高用量の治療が可能となり、その条件的活性型ポリペプチドはより高い有効性につながる。
【００１１】
国際公開第２０１０／１０４８２１号パンフレット及び国際公開第２０１１／００９０５８号パンフレットは、条件的活性型タンパク質を進化させてスクリーニングする方法を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
１つの態様において、開示は、（ｉ）親ポリペプチドのｐＩと同じかそれより低いｐＩを有する１つ以上の変異体ポリペプチドを製造するために、１つ以上の変異を親ポリペプチド中に導入することによって、親ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを進化させる工程、（ｉｉ）１つ以上の変異体ポリペプチドを、正常生理条件下で１つ以上の変異体ポリペプチドの活性を測定する正常生理条件下での第１のアッセイ、および異常条件下で１つ以上の変異体ポリペプチドの活性を測定する異常条件下での第２のアッセイに供する工程であって、正常生理条件および異常条件下は同じ条件下であるが異なった値を有する、工程、および（ｉｉｉ）第１のアッセイにおける同じ活性と比較して、第２のアッセイにおいて、増加した活性を示す１以上の変異体ポリペプチドからを選択する工程を含む、親ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを製造する方法に関するものである。
【００１３】
前述の実施形態において、条件的活性型ポリペプチドが、親ポリペプチドのｐＩよりも低いｐＩを有していてもよい。
【００１４】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、条件的活性型ポリペプチドは、ｐＩが７．４を下回るか、またはｐＩが７．３を下回るか、またはｐＩが７．２を下回るか、またはｐＩが７．１を下回るかまたはｐＩが７．０を下回ることができる。
【００１５】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、１つ以上の変異が、親ポリペプチド中に置換されるアミノ酸のｐＩよりも高いｐＩを有する親ポリペプチド中のアミノ酸の残基に対するアミノ酸の残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。
【００１６】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、１つ以上の変異が、前記置換の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を含むことができる。
【００１７】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、１つ以上の変異が、親ポリペプチドのｐＩよりも低いｐＩを有するアミノ酸の残基の少なくとも１つの挿入を含むことができる。
【００１８】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、１つ以上の変異が、前記挿入の２、３、４、または５個を含むことができる。
【００１９】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、１つ以上の変異が、親ポリペプチドのｐＩよりも高いｐＩを有するアミノ酸の残基の少なくとも１つの欠失を含むことができる。
【００２０】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、１つ以上の変異が、前記欠失の２、３、４、または５個を含むことができる。
【００２１】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、１つ以上の変異が、変異体ポリペプチドの表面上に露出した位置に位置してもよい。
【００２２】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、進化させる工程は、変異体ポリペプチドへの１つ以上の追加の変異の導入を含むことができる。
【００２３】
前述の実施形態のいずれか１つは、変異体ポリペプチドの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％が、親ポリペプチドのｐＩと同じかそれより低いｐＩを有することを確認する工程をさらに含むことができる。
【００２４】
前述の実施形態は、工程（ｉｉ）前に親ポリペプチドのｐＩよりも大きいｐＩを有する変異体ポリペプチドを廃棄する工程をさらに含むことができる。
【００２５】
前述の実施形態のいずれか１つは、条件的活性型ポリペプチドのｐＩを測定する工程をさらに含むことができる。
【００２６】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、条件的活性型ポリペプチドのｐＩが、親ポリペプチドのｐＩよりも、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．８、少なくとも１．０、少なくとも１．２、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．７、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも３．５、少なくとも４．０、または少なくとも５．０単位低い可能性がある。
【００２７】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、親ポリペプチドが、抗体、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、調節タンパク質、機能性ペプチド、バイオシミラー、免疫調節薬、受容体、およびリガンドから選択され得る。
【００２８】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、親ポリペプチドが、全長抗体、一本鎖抗体、抗体断片、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、およびＦｃドメインから選択される抗体であってもよい。
【００２９】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、親ポリペプチドが治療用抗体または治療用に開発されている抗体候補であり得る。
【００３０】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、親ポリペプチドはＩｇＧ抗体であってもよい。
【００３１】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、１以上の変異は、ＩｇＧ抗体の可変領域にあってもよい。
【００３２】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、１以上の変異は、ＩｇＧ抗体の定常領域にあってもよい。
【００３３】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、１以上の変異は、ＩｇＧ抗体の１つ以上の相補性決定領域にあってもよい。
【００３４】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、条件が、ｐＨ、温度、浸透圧、オスモル濃度、酸化ストレス、および電解質濃度から選択され得る。
【００３５】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、条件がｐＨであってもよい。
【００３６】
前述の実施形態では、第１のアッセイのｐＨが７．２超から７．６未満でよく、第２のアッセイのｐＨは７．２未満または７．６を超え得る。
【００３７】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、第１のアッセイにおける同じ活性に対する第２のアッセイにおける条件的活性型ポリペプチドの活性の比率は、少なくとも１．３、１．５、または少なくとも１．７、または少なくとも２．０、または少なくとも３．０、または少なくとも４．０、または少なくとも６．０、または少なくとも８．０、または少なくとも１０．０、または少なくとも２０．０、または少なくとも４０．０、または少なくとも６０．０、または少なくとも１００．０であってよい。
【００３８】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、第１のアッセイおよび第２のアッセイの両方が、分子量が９００ａ．ｍ．ｕ．未満、５００ａ．ｍ．ｕ．未満、２００ａ．ｍ．ｕ．未満、または１００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子またはイオンの存在下で実施され得る。
【００３９】
前述の実施形態では、分子またはイオンが、ヒスチジン、ヒスタミン、水素付加アデノシン二リン酸、水素付加アデノシン三リン酸、クエン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、乳酸塩、二硫化物、硫化水素、アンモニウム、リン酸二水素およびその任意の組合せから選択され得る。
【００４０】
前述の実施形態において、分子またはイオンが、約３ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲にある濃度を有する重炭酸イオンでよい。
【００４１】
前述の実施形態では、分子またはイオンは、１ｍＭ〜１００ｍＭ、２ｎＭ〜５００ｎＭ、３ｎＭ〜２００ｎＭ、５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度を有する二硫化物イオンであってもよい。
【００４２】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、分子またはイオンは、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、二硫化ナトリウム、または二硫化カリウムから選択され得る。
【００４３】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、生理条件は正常生理ｐＨであってもよく、異常条件は正常生理ｐＨとは異なった異常ｐＨであり、分子またはイオンが正常生理ｐＨと異常ｐＨとの間にｐＫａを有する。
【００４４】
前述の実施形態では、分子またはイオンのｐＫａは、異常ｐＨから０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８、または１．０、２．０単位まで離れてもよい。
【００４５】
第２の態様では、開示は、ｐＩを有する親ポリペプチドに由来する条件的活性型ポリペプチドに関するものであり、前記条件的活性型ポリペプチドは、（ａ）親ポリペプチドのｐＩと同じかそれより低いｐＩを有し、および（ｂ）正常生理条件での第１のアッセイにおける同じ活性に対する異常条件での第２のアッセイにおける活性の比率が少なくとも１．３であり、ここで、条件的活性型ポリペプチドの活性は、分子量が９００ａ．ｍ．ｕ未満の少なくとも１つの分子またはイオンの存在下で測定される。
【００４６】
第２の態様では、分子量は５００ａ．ｍ．ｕ．未満、２００ａ．ｍ．ｕ．未満、または１００ａ．ｍ．ｕ．未満であり得る。
【００４７】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、正常生理条件での第１のアッセイにおける同じ活性に対する、異常条件での第２のアッセイにおける活性の比率は、少なくとも１．５、少なくとも１．７、または少なくとも２．０、または少なくとも３．０、または少なくとも４．０、または少なくとも６．０、または少なくとも８．０、または少なくとも１０．０、または少なくとも２０．０、または少なくとも４０．０、または少なくとも６０．０、または少なくとも１００．０であってよい。
【００４８】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、条件的活性型ポリペプチドのｐＩは、親ポリペプチドのｐＩよりも、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．８、少なくとも１．０、少なくとも１．２、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．７、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも３．５、少なくとも４．０、または少なくとも５．０単位低い可能性がある。
【００４９】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、条件的活性型ポリペプチドが、抗体、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、調節タンパク質、機能性ペプチド、バイオシミラー、免疫調節薬、受容体、およびリガンドから選択され得る。
【００５０】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、条件的活性型ポリペプチドが、全長抗体、一本鎖抗体、抗体断片、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、およびＦｃドメインから選択される抗体であってもよい。
【００５１】
前述の実施形態では、抗体がＩｇＧ抗体であってもよい。
【００５２】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、条件が、ｐＨ、温度、浸透圧、オスモル濃度、酸化ストレス、および電解質濃度から選択され得る。
【００５３】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、正常生理条件が、７．２超から７．６未満の範囲のｐＨであってよく、異常条件が、５．５が７．２未満の範囲にあるｐＨである。
【００５４】
前述の実施形態において、分子またはイオンは、正常生理学的ｐＨと異常ｐＨとの間にｐＫａを有することができる。
【００５５】
前述の実施形態では、分子またはイオンのｐＫａは、異常ｐＨから０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８、または１．０、２．０単位まで離れてもよい。
【００５６】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、分子またはイオンは、ヒスチジン、ヒスタミン、水素付加アデノシン二リン酸、水素付加アデノシン三リン酸、クエン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、乳酸塩、二硫化物、硫化水素、アンモニウム、リン酸二水素およびそれらの任意の組合せから選択され得る。
【００５７】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、分子またはイオンは、約３ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度を有する重炭酸イオンであってよい。
【００５８】
前述の実施形態のいずれか１つにおいて、分子またはイオンは、１ｍＭ〜１００ｍＭ、２ｎＭ〜５００ｎＭ、３ｎＭ〜２００ｎＭ、５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度を有する二硫化物イオンであってもよい。
【００５９】
前の実施形態のいずれか１つにおいて、分子またはイオンが、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、二硫化ナトリウム、または二硫化カリウムから選択され得る。
【００６０】
さらに別の態様では、開示は、条件的活性型ポリペプチドの有効量および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００６１】
さらに別の態様では、開示は、固形腫瘍、炎症性関節、または脳疾患もしくは障害の治療のための条件的活性型ポリペプチドの使用に関する。
【００６２】
さらに別の態様では、開示は、前記治療を必要とする患者に条件的活性型ポリペプチドを投与する工程を含む、固形腫瘍、炎症性関節、または脳疾患もしくは脳障害の治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、デオキシヘモグロビンにおける塩橋の形成を示す図であり、ここでは３つのアミノ酸残基が２つの塩橋を形成し、これらの塩橋がデオキシヘモグロビンのＴ四次構造を安定化させるため、酸素に対する親和性の低下につながる。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
定義
本明細書に提供される例が容易に理解されるように、幾つかの高頻度で出現する方法及び／又は用語をここに定義するものとする。以下の用語の定義は米国特許第８，７０９，７５５Ｂ２号明細書から参照によってその全体が援用される：「薬剤」、「曖昧な塩基要件」、「アミノ酸」、「増幅」、「キメラ特性」、「コグネイト」、「比較ウィンドウ」、「保存的アミノ酸置換」、「〜に対応する」、「分解上有効な」、「定義された配列フレームワーク」、「定義された配列カーネル」、「消化」、「方向性ライゲーション」、「ＤＮＡシャフリング」、「薬物」又は「薬物分子」、「有効量」、「エピトープ」、「酵素」、「進化」又は「進化する」、「断片」又は「誘導体」又は「類似体」、「全域単一アミノ酸置換」、「遺伝子」、「遺伝的不安定性」、「異種」、「同種」又は「同祖」、「産業上の利用」、「同一」又は「同一性」、「同一性範囲」、「単離された」、「単離核酸」、「リガンド」、「ライゲーション」、「リンカー」又は「スペーサー」、「微小環境」、「進化させる分子特性」、「突然変異」、「Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ」、「正常生理条件」又は「野生型動作条件」、「核酸分子」、「核酸分子」、「〜をコードする核酸配列」又は「〜のＤＮＡコード配列」又は「〜をコードするヌクレオチド配列」、「酵素（タンパク質）をコードする核酸」又は「酵素（タンパク質）をコードするＤＮＡ」又は「酵素（タンパク質）をコードするポリヌクレオチド」、「特異的核酸分子種」、「ワーキング核酸試料を核酸ライブラリにアセンブルする」、「核酸ライブラリ」、「構築物」、「オリゴヌクレオチド」（又は同義語として「オリゴ」）、「同種」、「作動可能に連結された」、「親ポリヌクレオチドセット」、「患者」又は「対象」、「生理条件」、「集団」、「プロフォーム」、「擬似ランダム」、「準反復単位」、「ランダムペプチドライブラリ」、「ランダムペプチド配列」、「受容体」、「組換え」酵素、「合成」酵素、「関連ポリヌクレオチド」、「減少的再集合」、「参照配列」、「反復インデックス（ＲＩ）」、「制限部位」、「選択可能なポリヌクレオチド」、「配列同一性」、「類似性」、「特異的に結合する」、「特異的ハイブリダイゼーション」、「特異的ポリヌクレオチド」、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」、「実質的に同一」、「実質的に純粋な酵素」、「実質的に純粋」、「処理する」、「可変セグメント」、及び「バリアント」。
【００６５】
以下の用語の定義は、ＷＯ２０１７／０７８８３９より全面的に参照により援用する：「約」、「活性」、「抗体」、「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」、「抗原」または「Ａｇ」、「アンチセンスＲＮＡ」、「バイオシミラー」、「後続生物学的製剤」、「バイオシミラー抗体」、「癌」または「癌性」、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲｓ」、「サイトカイン」または「サイトカイン類」、「電解質」、「全長抗体」、「増殖因子」、「ホルモン」、「免疫調節剤」、「個体」または「対象」、「ライブラリ」、「リガンド」、「受容体」、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」、「多重特異性抗体」、「ナノ粒子」、「天然に存在する」、「組換え抗体」、「調節タンパク質」、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、「治療用タンパク質」、「治療的有効量」、「腫瘍微小環境」、「野生型」。
【００６６】
本明細書で使用する用語であるポリペプチドの「表面に露出したアミノ酸残基」とは、ポリペプチドのアミノ酸残基を意味し、ポリペプチドが液体（例えば、血液、ヒト血清、細胞質など）中に存在する場合、その側鎖の少なくとも一部が液体と接触している。ポリペプチドの表面に露出したアミノ酸残基は、Ｘ線結晶解析によって決定することができる。表面に露出している可能性のあるアミノ酸残基は、例えば、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ  プログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）のようなコンピュータプログラムを用いて、抗体の３次元モデルからの座標を用いて決定することもできる。そのような目的で利用可能な他のソフトウェアには、例えば、ＳＹＢＹＬ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍｏｄｕｌｅソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）が含まれる。アルゴリズムがユーザ入力サイズパラメータを必要とする場合、計算に使用するプローブの「サイズ」を半径約１．４  Ａｎｇｓｔｒｏｍ  （Å）以下に設定することができる。例えば、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを用いて表面露出アミノ酸残基および領域を決定する方法は、Ｐａｃｉｏｓ  （Ｐａｃｉｏｓ，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ，  ｖｏｌ．  １８，  ｐｐ．  ３７７−３８６，  １９９４；  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｏｄｅｌ．，  ｖｏｌ．  １，  ｐｐ．  ４６−５３，  １９９５）によって記載されている。
【００６７】
用語「条件的活性型ポリペプチド」とは、少なくとも１つの条件下で親ポリペプチドよりも活性が高く（例えば、異常条件）、第２の条件下で親ポリペプチドよりも活性が低い（例えば、正常生理条件）親ポリペプチドのバリアントまたは変異体を指すか、または第２の条件下（例えば、正常生理条件）よりも少なくとも１つの条件下（例えば、異常条件）でより活性が高い親ポリペプチドのバリアントまたは変異体を指す。１つの実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは、第２の異常条件のもとで、第１の正常生理条件のもとより少なくとも１．３、少なくとも１．５、少なくとも２．０、または少なくとも２．５、または少なくとも３．０、または少なくとも５．０、または少なくとも１０、または少なくとも１５、または少なくとも２０、または少なくとも６０、または少なくとも８０、または少なくとも１００倍多い活性を有する。この条件的活性型ポリペプチドは、１つ以上の選択された生体位置で活性を呈し、及び／又は生体の別の位置では活性の増加又は低下を呈し得る。例えば、ある態様では、条件的活性型ポリペプチドは体温では実質的に不活性であるが、それより低い温度活性である。条件的活性型ポリペプチドには、条件的活性型タンパク質、タンパク質断片、抗体、抗体断片、酵素、酵素断片、受容体および受容体の断片、サイトカインおよびその断片、ホルモンおよびその断片、リガンドおよびその断片、調節タンパク質およびその断片、増殖因子およびその断片、ならびにストレスタンパク質、円蓋関連タンパク質、ニューロンタンパク質、消化管タンパク質、増殖因子、ミトコンドリアタンパク質、細胞質タンパク質、動物タンパク質、構造タンパク質、植物タンパク質およびこれらのタンパク質のいずれかの断片を含むポリペプチドが含まれる。本明細書に記載される条件的活性型ポリペプチドの各々は、好ましくは条件的活性型生物学的ポリペプチドである。
【００６８】
本明細書でポリペプチドについて使用される「血漿中半減期の増加」又は「血漿中半減期の延長」とは、ポリペプチドの血漿中滞留時間（血漿中半減期（ｔ1/2））の増加又は血漿中クリアランス（ＣＬ）の低下をいう。これは、経時的な濃度曲線下面積（ＡＵＣ）として表すことができる。
【００６９】
本明細書で用いるポリペプチドの用語「等電点」または「ｐＩ」とは、ポリペプチドが正味の電荷をもたないｐＨを意味する。ポリペプチドのｐＩは、実験的に決定することができ、またはポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算することができる。例えば、ｐＩは、当業者に公知のポリペプチドの等電点電気泳動によって決定することができる。ｐＩの理論計算はポリペプチドのアミノ酸に基づくアミノ酸配列分析ソフト（ＧＥＮＥＴＹＸなど）を用いて決定できる。
【００７０】
親ポリペプチドの用語「等電点バリアント」または「ｐＩバリアント」とは、変異体ポリペプチドが由来した親ポリペプチドに比べてｐＩが減少した親ポリペプチドの変異体ポリペプチドを指し、変異体ポリペプチドは、ｐＩがより高いアミノ酸の残基をｐＩがより低いアミノ酸の残基と置換するか、親ポリペプチドのｐＩよりも高いアミノ酸の残基を欠失させるか、または親ポリペプチドのｐＩよりも低いアミノ酸の残基を挿入するかのいずれかにより得られる。本発明は、条件的活性型ｐＩバリアントならびに親ポリペプチドと同じｐＩを有する条件的活性型ポリペプチドの両方に及ぶ。
【００７１】
用語「親ポリペプチド」及び「親タンパク質」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載の方法を用いて条件的活性型ポリペプチドを作製するため進化させ得るポリペプチド又はタンパク質を指す。親ポリペプチドは、天然に存在しないタンパク質であり得る。例えば、治療用ポリペプチド若しくはタンパク質又は変異体若しくはバリアントのポリペプチドを親ポリペプチドとして使用し得る。親ポリペプチドの例としては、抗体、抗体断片、酵素、酵素断片、サイトカイン及びその断片、ホルモン及びその断片、リガンド及びその断片、受容体及びその断片、調節タンパク質及びその断片、並びに増殖因子及びその断片が挙げられる。
【００７２】
用語「ｐＨ依存的」は、本明細書で使用されるとき、異なるｐＨ値で異なる特性又は活性を有するポリペプチドを指す。
【００７３】
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、単量体がペプチド又はジスルフィド結合によって一緒につながったアミノ酸ポリマーを指す。ポリペプチドは、完全長の天然に存在するアミノ酸鎖又は断片、その変異体又はバリアント、例えば、結合相互作用において対象となるアミノ酸鎖の選択領域であり得る。ポリペプチドはまた、合成アミノ酸鎖、又は天然に存在するアミノ酸鎖若しくはその断片と合成アミノ酸鎖との組み合わせであってもよい。断片は、完全長タンパク質の一部であるアミノ酸配列を指し、典型的には約８〜約５００アミノ酸長、好ましくは約８〜約３００アミノ酸、より好ましくは約８〜約２００アミノ酸、さらにより好ましくは約１０〜約５０又は１００アミノ酸長である。加えて、天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンが、ポリペプチドに含まれ得る。一般に見られる非遺伝子コードアミノ酸もまた、ポリペプチドに含まれ得る。アミノ酸は、Ｄ型光学異性体又はＬ型光学異性体のいずれかであり得る。特定の文脈での使用にはＤ型異性体が好ましく、以下に詳述する。加えて、他のペプチドミメティクスもまた、例えばポリペプチドのリンカー配列において有用である（Ｓｐａｔｏｌａ，１９８３，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７を参照）。一般に、用語「タンパク質」は、共有結合性又は非共有結合性の結合によって一体に保持された２個又は数個のポリペプチド鎖を含む構造を包含すること以外には、何ら用語「ポリペプチド」との大きな違いを伝えようと意図するものではない。
【００７４】
用語「小分子」は、典型的には９００ａ．ｍ．ｕ．未満、又はより好ましくは５００ａ．ｍ．ｕ．未満又はより好ましくは２００ａ．ｍ．ｕ．未満又はさらにより好ましくは１００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量を有する分子を指す。同じ分子量の範囲がこれらのアッセイで使用されるイオンに適用される。本発明のアッセイ及び環境において、小分子又はイオンは多くの場合に、主としてアッセイ又は環境のｐＨに依存して、分子と分子の脱プロトン化イオンとの混合物として存在し得る。
【００７５】
本開示は、親ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを生成する方法を提供する。この方法は、（ｉ）親ポリペプチドのｐＩと同じかそれより低いｐＩを有する１つ以上の変異体ポリペプチドを製造するために親ポリペプチドに１つ以上の変異を導入することによって親ポリペプチドを進化させる工程；（ｉｉ）１つ以上の変異体ポリペプチドを、正常生理条件下での１つ以上の変異体ポリペプチドの活性を測定するための正常生理条件下での第１のアッセイおよび異常条件下での１つ以上の変異体ポリペプチドの活性を測定するための異常条件下での第２のアッセイに供する工程、ここで、正常生理条件と異常条件は同じ条件であるが、異なる値を有する工程；および（ｉｉｉ）正常生理条件下での第１のアッセイにおける同活性と比較して異常条件下での第２のアッセイにおける増加した活性を示す１つ以上の変異体ポリペプチドから条件的活性型ポリペプチドを選択する工程を含む。
【００７６】
Ａ．  ポリペプチドのｐＩに影響する変異
親ポリペプチドのｐＩと比較して、同じまたは減少したｐＩを有する条件的活性型ポリペプチドを生成するために、親ポリペプチドを突然変異させてもよい。好ましくは、条件的活性型ポリペプチドは、親ポリペプチドのｐＩと比較して減少したｐＩを有するであろう。代わりに、または同時に、条件的活性型ポリペプチドは、７．４未満、または７．３未満、または７．２未満、または７．１未満、または７．０未満のｐＩを有し得る。この条件的活性型ポリペプチドはｐＨ選択性、すなわち、例えば、７．２超から７．６未満までの範囲にあり得る正常生理ｐＨにおいてよりも活性が望まれるｐＨにおいてより高い活性をも示すであろう。
【００７７】
アミノ酸残基置換、欠失、挿入およびそれらの組合せを含む任意の適当な突然変異誘発技術を使用することができる。アミノ酸残基置換は、親ポリペプチド中のネイティブのアミノ酸残基を、置換されたネイティブのアミノ酸残基のアミノ酸のｐＩよりも低いｐＩを有する別のアミノ酸の残基と置換する。アミノ酸のｐＩを表１に示す。この表は、ポリペプチドに位置するアミノ酸残基ではなく、個々の分子としてアミノ酸のｐＩを示しているが、ポリペプチドの一部分の場合のアミノ酸残基のｐＩの効果は、表１のアミノ酸のｐＩの傾向に従う。したがって、例えば、より高いｐＩを有するアミノ酸のネイティブ残基を、ネイティブのアミノ酸のより高いｐＩよりも低いｐＩを有するアミノ酸の残基で置き換えると、ポリペプチドのｐＩが低下する。実際には、親ポリペプチドのネイティブのアミノ酸残基は、ネイティブのアミノ酸のｐＩよりも低いｐＩを有する別のアミノ酸の残基で置換してもよい。例えば、ネイティブのアミノ酸残基が塩基性アミノ酸の残基である場合、ポリペプチドのｐＩを低下させるために、弱酸性アミノ酸の残基又は強酸性アミノ酸の残基で置換してもよい。別の例では、ネイティブのアミノ酸残基が弱酸性アミノ酸の残基である場合、強酸性アミノ酸の残基で置換されて、ポリペプチドのｐＩを下げてもよい。
【表１】
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【００７８】
いくつかの実施形態において、親ポリペプチドのｐＩに影響を及ぼすために、２つ以上のアミノ酸残基が親ポリペプチドに置換される。例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上のアミノ酸残基置換を親ポリペプチドに導入してもよい。いくつかの実施形態において、各置換は、より低いｐＩを有するアミノ酸の残基を、より高いｐＩを有するアミノ酸の残基で置換する。他の実施形態において、置換の一部のみが、より低いｐＩを有するアミノ酸の残基を、より高いｐＩを有するアミノ酸の残基で置換する。後者の場合、多重置換の総合的な影響は、親ポリペプチドのｐＩと同じｐＩを変異体ポリペプチドについて維持するか、または親ポリペプチドのｐＩよりも低いｐＩを変異体ポリペプチドについて提供するかのいずれかとなるように、置換の組合せが選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ｐＩに影響を及ぼすために使用されるアミノ酸残基置換は、保存的置換、非保存的置換、またはそれらの組合せであり得る。
【００８０】
親ポリペプチドのｐＩを減少させるアミノ酸残基欠失は、親ポリペプチドのｐＩより高いｐＩを有するアミノ酸の残基を欠失させることを含む。例えば、親ポリペプチドのｐＩが約７．２の場合、親ポリペプチドから塩基性アミノ酸の任意の１つ以上の残基を欠失させると、親ポリペプチドのｐＩが減少することになる。いくつかの実施形態において、少なくとも２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸残基が親ポリペプチドから欠失される。いくつかの実施形態において、各欠失は、親ポリペプチドのｐＩよりも低いｐＩを有するアミノ酸の残基を欠失する。他の実施形態において、欠失の一部のみが、親ポリペプチドのｐＩよりも高いｐＩを有するアミノ酸の残基を欠失する。後者の場合、欠失の組合せは、多重欠失の総合的な影響がポリペプチドのｐＩを維持または低下させることになるように選択される。
【００８１】
親ポリペプチドのｐＩを低下させるアミノ酸残基挿入には、親ポリペプチドのｐＩより低いｐＩを有するアミノ酸の残基を挿入することが含まれる。例えば、親ポリペプチドのｐＩが約７．２の場合、親ポリペプチドへの弱酸性アミノ酸または強酸性アミノ酸の任意の１つ以上の残基の挿入は、親ポリペプチドのｐＩの減少をもたらすであろう。いくつかの実施形態において、少なくとも２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸残基が親ポリペプチドに挿入される。いくつかの実施形態において、各挿入は、親ポリペプチドのｐＩよりも低いｐＩを有するアミノ酸の残基を挿入する。他の実施形態において、挿入の一部のみが、親ポリペプチドのｐＩよりも低いｐＩを有するアミノ酸の残基を挿入する。後者の場合、多重挿入の総合的な影響がポリペプチドのｐＩを維持または低下させるように挿入の組合せを選択する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、上記のアミノ酸残基置換、アミノ酸残基欠失、およびアミノ酸残基挿入のうちの２つ以上の組合せが、親ポリペプチドのｐＩを左右するために使用される。例えば、変異体ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基置換および１つ以上のアミノ酸残基欠失を含み得る。別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基置換および１つ以上のアミノ酸残基挿入を有し得る。さらに別の例では、変異体ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基欠失および１つ以上のアミノ酸残基挿入を有し得る。さらに別の例では、変異体ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基置換、１つ以上のアミノ酸残基欠失、および１つ以上のアミノ酸残基挿入の全てを有し得る。いずれの場合も、挿入、置換および／または欠失のすべてまたは一部のみが、ポリペプチドのｐＩまたは置換されているアミノ酸のｐＩのいずれよりも低いｐＩを有するアミノ酸の残基を用いてもよい。それぞれの場合において、挿入、置換および／または欠失の組合せは、多重挿入、置換および／または欠失の総合的な影響がポリペプチドのｐＩを維持または低下させることになるように選択される。
【００８３】
所望の変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドのｐＩと同じかそれより低いｐＩを有するであろう。いくつかの変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドのｐＩと同じｐＩをもつであろう。他の変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドのｐＩよりも少なくとも０．１、または少なくとも０．２、または少なくとも０．３、または少なくとも０．４、または少なくとも０．５、または少なくとも０．６、または少なくとも０．８、または少なくとも１．０、または少なくとも１．２、または少なくとも１．４、または少なくとも１．５、または少なくとも１．７、または少なくとも２．０、または少なくとも２．５、または少なくとも３．０、または少なくとも３．５、または少なくとも４．０、または少なくとも５．０単位低いｐＩを有し得る。
【００８４】
いくつかの実施形態において、置換されているネイティブのアミノ酸残基、欠失されているアミノ酸残基、および／またはアミノ酸残基が挿入されている位置は、親ポリペプチドの表面上に露出している。露出したアミノ酸残基または位置の変異は、親ポリペプチドの３次元構造を破壊する可能性が低いことが理解される。
【００８５】
アミノ酸残基置換、挿入および欠失は、例えば部位特異的突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２  （１９８５））またはオーバーラップ伸長ＰＣＲによって、親ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列上で行うことができる。親ポリペプチドが抗体である場合、変異は、抗体のアフィニティー成熟、または抗体重鎖または軽鎖の鎖シャフリング；またはファージディスプレイライブラリーを用いた抗原パニングに基づく選択（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１７：２２８−２５７  （１９９３））によっても達成され得る。これらの突然変異誘発法は、単独で、または適切な組合せで行うことができる。
【００８６】
いくつかのさらなる実施形態において、親ポリペプチドのｐＩに対してｐＩを維持または減少させる変異に加えて、変異体ポリペプチドは、ｐＩを維持または減少させるために導入された変異を有する位置以外の位置で追加の突然変異誘発を受けることもできる。追加の突然変異誘発は、例えば、包括的位置進化、包括的位置欠失、包括的位置挿入、またはその組合せなど、ＵＳ２０１３／０１１６１２５に詳しく記載されている任意の公知の突然変異誘発法を用いることができる。
【００８７】
例えば、親ポリペプチドは、親ポリペプチドのｐＩに対してｐＩを維持または減少させる１以上のアミノ酸残基置換を含むように変異させてもよい。例えば、変異したポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのｐＩを低下させるためにすでに導入されている１つ以上の変異を有する位置以外の位置における包括的位置置換、包括的位置欠失および包括的位置挿入を含む包括的位置進化を受けることもできる。
【００８８】
任意のポリペプチドのｐＩは、等電点電気泳動法ゲル電気泳動（例えば、キャピラリー等電点電気泳動法ゲル電気泳動）または他の方法（例えば、Ｒｉｇｈｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ａｎａｌ．  ５４：３７９−４０９，  ２０１１；  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ４６３：５１５−５４０，  ２００９；  Ｋｏｓｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １２：２９１８−２９２６，  ２０１２；  Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ３０：７４２−７５７，  ２００９；  Ｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ３０：１１−２８，  ２００９に記載の方法を参照）によって測定され得る。さらに、Ｒｉｂｅｉｒｏ  Ｊ  Ｍ．  Ｓｉｌｌｅｒｏ  Ａ．，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０（４）：２３５−４２，  １９９０；  Ｒｉｂｅｉｒｏ  Ｊ  Ｍ．  Ｓｉｌｌｅｒｏ  Ａ．，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１（３）：１３１−４１，  １９９１；  ａｎｄ  Ｓｉｌｌｅｒｏ  Ａ．  Ｒｉｂｅｉｒｏ  Ｊ  Ｍ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７９（２）：３１９−２５，  １９８９に記載されている方法など、アミノ酸配列に基づいてポリペプチドのｐＩを推定又は計算できる方法がある。
【００８９】
抗体、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、調節タンパク質、機能性ペプチド、バイオシミラー、免疫調節剤、治療用タンパク質、受容体、およびリガンドを含む任意のタンパク質を、本発明の親ポリペプチドとして使用することができる。親ポリペプチドはまた、上記タンパク質のいずれかの断片であってもよい。例えば、親ポリペプチドは、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、レニン、ヒアルロニダーゼ、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、サブスタンスＰ  （ＳＰ）、ニューロペプチドＹ  （ＮＰＹ）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＴＰ）、バソプレシンまたはアンジオスタチンであってよい。例えば、親ポリペプチドは、ストレスタンパク質、円蓋関連タンパク質、ニューロンタンパク質、消化管タンパク質、増殖因子、ミトコンドリアタンパク質、サイトゾルタンパク質、動物タンパク質、構造タンパク質、植物タンパク質、またはこれらのいずれかのタンパク質の断片であり得る。
【００９０】
１つの例示的な実施形態において、親ポリペプチドは抗体である。親抗体は、治療用抗体であってもよく、または治療的使用のために開発されている候補抗体であってもよい。親抗体の例には、非ホジキンリンパ腫の治療に承認されているキメラ抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（リツキサン（登録商標）、ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）  （例えば米国特許第５，７３６，１３７号参照）；Ｇｅｎｍａｂによって現在開発されている抗ＣＤ２０であるＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、米国特許第  ５，５００，３６２号に記載されている抗ＣＤ２０抗体ＡＭＥ−１３３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、ｈＡ２０（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、ＨｕｍａＬＹＭ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）、及びＰＲＯ７０７６９（ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０４２６、表題「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）が含まれる。ＥＧＦＲ  （ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  （ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む、上皮増殖因子受容体ファミリーのメンバーを標的とする多数の抗体は、本発明のｐＩが生物工学的に改変された定常領域から利益を得ることができる。例えば、本発明のｐＩが生物工学的に改変された定常領域は、乳癌を治療するために承認されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、ジェネンテック）（例えば米国特許第５，６７７，１７１号参照）；ジェネンテックによって現在開発されているペルツズマブ（ｒｈｕＭａｂ−２Ｃ４、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標））；米国特許４，７５３，８９４に記載されている抗Ｈｅｒ２抗体；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ）  （米国特許第４，９４３，５３３号；  ＰＣＴ  ＷＯ  ９６／４０２１０）、さまざまな癌の臨床試験中のキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；Ａｂｇｅｎｉｘ−Ｉｍｍｕｎｅｘ−Ａｍｇｅｎ社により現在開発中であるＡＢＸ−ＥＧＦ  （Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ６，２３５，８８３）；Ｇｅｎｍａｂ社により現在開発中のＨｕＭａｘ−ＥＧＦ  （米国特許第１０／１７２，３１７号）、４２５、ＥＭＤ５５９００およびＥＭＤ７２００（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）  （米国特許第５，５５８，８６４号；  Ｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７，  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５２（２）：５４９−６０；  Ｒｏｄｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５（４）：３１５−２０；  Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３）；ＩＣＲ６２  （Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）  （ＰＣＴ  ＷＯ  ９５／２００４５；  Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  １９９３，  ２２（１−３）：１２９−４６；  Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９３，  ６７（２）：２４７−５３；  Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６，  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  ７３（２）：２２８−３５；  Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ  ｅ��  ａｌ，  ２００３，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  １０５（２）：２７３−８０）；  ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈＲ３  （ＹＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃａｎａｄａ  ａｎｄ  Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  Ｃｕｂａ  （Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，８９１，９９６；  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ６，５０６，８８３；  Ｍａｔｅｏ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７，  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３（１）：７１−８１）；  ｍＡｂ−８０６  （Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）  （Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １００（２）：６３９−４４）；  ＫＳＢ−１０２  （ＫＳ  Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）；  ＭＲ１−１  （ＷＡＸ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）  （ＰＣＴ  ＷＯ  ０１６２９３１Ａ２）；  およびＳＣ１００
（Ｓｃａｎｃｅｌｌ）  （ＰＣＴ  ＷＯ  ０１／８８１３８）に実質的に類似した抗体に使用を見出すことができる。別の好ましい実施態様において、本発明のｐＩが生物工学的に改変された定常領域は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病の治療のために現在承認されているヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）における使用を見出すことができる。本発明の生物工学的に改変された定常領域は、以下を含む他の臨床製品および候補物に実質的に類似している様々な抗体での使用を見出すことができるが、これらに限定されない：  ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３  （Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３（登録商標））、Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎにより開発された抗ＣＤ３抗体；ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ（Ｚｅｖａｌｉｎ）（登録商標）ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧによって開発された抗ＣＤ２０抗体；ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ  （Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈによって開発された抗ＣＤ３３  （ｐ６７タンパク質）  抗体；ａｌｅｆａｃｅｐｔ  （Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標））、Ｂｉｏｇｅｎによって開発された抗ＬＦＡ−３  Ｆｃ融合体；ａｂｃｉｘｉｍａｂ  （ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｌｉｌｌｙによって開発されたＮｏｖａｒｔｉｓによって開発されたｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ  （Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅによって開発されたｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ  （Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））；ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  （Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒによって開発された抗ＴＮＦａｌｐｈａ  抗体；ａｄａｌｉｍｕｍａｂ  （Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、Ａｂｂｏｔｔによって開発された抗ＴＮＦａｌｐｈａ  抗体；Ｈｕｍｉｃａｄｅ（商標）、Ｃｅｌｌｔｅｃｈによって開発された抗ＴＮＦａｌｐｈａ  抗体，；ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ  （Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、Ｉｍｍｕｎｅｘ／Ａｍｇｅｎによって開発された抗ＴＮＦａｌｐｈａ  Ｆｃ  融合体；ＡＢＸ−ＣＢＬ、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発された抗ＣＤ１４７  抗体；ＡＢＸ−ＩＬ８、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発された抗ＩＬ８  抗体；ＡＢＸ−ＭＡ１、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発された抗ＭＵＣ１８  抗体；Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ  （Ｒ１５４９、９０Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中の抗ＭＵＣ１；Ｔｈｅｒｅｘ  （Ｒ１５５０）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発された抗ＭＵＣ１  抗体；Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発されたＡｎｇｉｏＭａｂ  （ＡＳ１４０５）；Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発されたＨｕＢＣ−１；Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発されたＴｈｉｏｐｌａｔｉｎ  （ＡＳ１４０７）；Ａｎｔｅｇｒｅｎ（登録商標）  （ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、Ｂｉｏｇｅｎによって開発された抗ａｌｐｈａ−４−ｂｅｔａ−１  （ＶＬＡ−４）およびａｌｐｈａ−４−ｂｅｔａ−７  抗体；ＶＬＡ−１  ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎによって開発された抗ＶＬＡ−１  インテグリン抗体；ＬＴＢＲ  ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎによって開発された抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）  抗体；ＣＡＴ−１５２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発された抗ＴＧＦ−１３２  抗体；Ｊ６９５、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＡｂｂｏｔｔによって開発された抗ＩＬ−１２  抗体；ＣＡＴ−１９２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＧｅｎｚｙｍｅによって開発された抗ＴＧＦβ１  抗体；ＣＡＴ−２１３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発された抗Ｅｏｔａｘｉｎ１  抗体；ＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−Ｂ（商標）  、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  および  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．  によって開発された抗Ｂｌｙｓ  抗体；ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍＡｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  および  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．  によって開発された抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１  抗体；Ａｖａｓｔｉｎ（商標）（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、ｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発された抗ＶＥＧＦ  抗体；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発された抗ＨＥＲ  受容体ファミリー抗体；Ａｎｔｉ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＡＴＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発された抗組織因子抗体；Ｘｏｌａｉｒ（商標）（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発された抗ＩｇＥ  抗体；Ｒａｐｔｉｖａ（商標）（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ｘｏｍａによって開発された抗ＣＤ１１ａ  抗体；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  および  Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されたＭＬＮ−０２  抗体  （ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ＬＤＰ−０２）；ＨｕＭａｘ  ＣＤ４、Ｇｅｎｍａｂによって開発された抗ＣＤ４  抗体；ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、Ｇｅｎｍａｂ  およびＡｍｇｅｎによって開発された  抗ＩＬ１５  抗体；Ｇｅｎｍａｂ  および  Ｍｅｄａｒｅｘによって開発されたＨｕＭａｘ−Ｉｎｆｌａｍ；ＨｕＭａｘ−Ｃａｎｃｅｒ、Ｇｅｎｍａｂ  および  Ｍｅｄａｒｅｘ  および  Ｏｘｆｏｒｄ  ＧｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓによって開発された抗Ｈｅｐａｒａｎａｓｅ  Ｉ  抗体；Ｇｅｎｍａｂ  および  Ａｍｇｅｎによって開発されたＨｕＭａｘ−Ｌｙｍｐｈｏｍａ；Ｇｅｎｍａｂによって開発，されたＨｕＭａｘ−ＴＡＣ；ＩＤＥＣ−１３１、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発された抗ＣＤ４０Ｌ  抗体；ＩＤＥＣ−１５１  （Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発された抗ＣＤ４  抗体；ＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発された抗ＣＤ８０  抗体；ＩＤＥＣ−１５２、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発された抗ＣＤ２３；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発された抗マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体（複数）；ＢＥＣ２、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発された抗イディオタイプ抗体；ＩＭＣ−１Ｃ１１、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発された抗ＫＤＲ  抗体；ＤＣ１０１、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発された抗ｆｌｋ−１  抗��；Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発された抗ＶＥ  カドヘリン抗体；ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ（商標）（ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発された抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）  抗体；ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（商標）（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発された抗ＣＤ２２抗体；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されたＡＦＰ−Ｃｉｄｅ；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されたＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されたＬｋｏＣｉｄｅ；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されたＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ；  ＭＤＸ−０１０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発された抗ＣＴＬＡ４  抗体；ＭＤＸ−０６０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発された抗ＣＤ３０  抗体；Ｍｅｄａｒｅｘ  によって開発されたＭＤＸ−０７０；Ｍｅｄａｒｅｘ  によって開発されたＭＤＸ−０１８、Ｏｓｉｄｅｍ（商標）（ＩＤＭ−１）およびＭｅｄａｒｅｘおよび  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓによって開発された抗Ｈｅｒ２  抗体、ＨｕＭａｘ（商標）−ＣＤ４、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発された抗ＣＤ４  抗体；ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、Ｍｅｄａｒｅｘ  およびＧｅｎｍａｂによって開発された抗ＩＬ１５  抗体；ＣＮＴＯ  １４８、Ｍｅｄａｒｅｘ  およびＣｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊによって開発された抗ＴＮＦα  抗体；ＣＮＴＯ  １２７５、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊによって開発された抗サイトカイン抗体；ＭＯＲ１０１  および  ＭＯＲ１０２、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発された抗細胞間接着分子−１  （ＩＣＡＭ−１）  （ＣＤ５４）抗体（複数）；  ＭＯＲ２０１、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発された抗ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  （ＦＧＦＲ−３）  抗体；Ｎｕｖｉｏｎ（登録商標）  （ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発された抗ＣＤ３  抗体；ＨｕＺＡＦ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発された抗ガンマインターフェロン抗体；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発された抗α５β１  インテグリン；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発された抗ＩＬ−１２；ＩＮＧ−１、Ｘｏｍａによって開発された抗Ｅｐ−ＣＡＭ  抗体；ＭＬＮ０１、Ｘｏｍａによって開発された抗Ｂｅｔａ２インテグリン抗体；Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって開発されたｐＩ−ＡＤＣ  抗体；この段落で上に引用したすべての参考文献は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００９１】
親抗体は、完全長抗体、抗体断片、一本鎖抗体、ＦａｂまたはＦｃドメインであり得る。親抗体はＩｇＧ抗体であり得る。いくつかの抗体アイソタイプのうち、ＩｇＧ抗体は分子量が十分に大きいため、その主要代謝経路は腎排泄を介さない。ＩｇＧはＦｃＲｎを介してサルベージ経路を介して再利用されることが知られており、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が長い。ＩｇＧ抗体は、内皮細胞において主に代謝経路を介して代謝されると想定されている（Ｈｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．１６０、ｐｐ．１０２９−１０３５、１９９８）。具体的には、ＩｇＧ抗体が内皮細胞に非特異的に取り込まれると、ＩｇＧ抗体はＦｃＲｎに結合することにより再利用される一方、ＦｃＲｎに結合しないＩｇＧ抗体は分解されると考えられている。ＩｇＧ抗体の血漿半減期は、例えば、ＷＯ２００７／１１４３１９およびＷＯ２００９／０４１６４３に記載されるように、そのｐＩと逆相関する。
【００９２】
ＩｇＧ抗体の中で、親抗体は、高いエフェクター機能を含む種々の理由により、治療用抗体の共通のアイソタイプであるＩｇＧ１抗体であり得る。しかしながら、ＩｇＧ１の重鎖定常領域は、ＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置の一部のＩｇＧ２アミノ酸残基をアミノ酸残基置換によりＩｇＧ１骨格に導入することにより、生じたＩｇＧ１のｐＩが低下し、さらに血漿中では親ＩｇＧ１抗体よりも長い半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は位置１３７でグリシンを有しており、ＩｇＧ２は同じ位置でグルタミン酸（強酸性アミノ酸）を有している。ＩｇＧ１の位置１３７のグリシンをグルタミン酸で置換すると、変異体ＩｇＧ１抗体のｐＩが低下し、ＩｇＧ１抗体の半減期が増大する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、親ポリペプチドのｐＩに対してｐＩを維持または減少させるために本明細書に記載されている一つ以上の変異または変異の組合せは、抗体重鎖、抗体軽鎖、または抗体重鎖と抗体軽鎖の両方に位置する。
Ｂ．  抗体の重鎖中の変異
【００９４】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドのｐＩを維持または減少させる目的で本明細書に記載されている変異または変異の組合せは、少なくともＩｇＧ抗体の重鎖のＣＨ１領域においてなされる。これらの実施形態において、変異は、ＣＨ１領域の位置１１９、１３１、１３３、１３７、１３８、１６４、１９２、１９３、１９６、１９９、２０３、２０５、２０８、２１０、２１４、２１７および２１９における変異およびこれらの位置の変異の任意の組合せから独立して選択され得る。変異は、これらの１７の位置のうちの１つ、またはこれらの１７の位置の全ての考えられる組合せおよびサブ組合せにおいて、置換、欠失または挿入によって導入することができる。例えば、変異体抗体は、これら１７の位置の１つ以上において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個のＣＨ１置換を有し得る。したがって、ＣＨ１領域にある任意の単一の変異または変異の組合せも可能である。さらに、ＣＨ１領域における１以上の変異は、任意に、１つ以上の他の変異との組合せ、またはＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジおよびＬＣ領域のいずれかにおける変異の組み合わせてもよい。そのような場合には、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジおよびＬＣ領域における変異の組合せを選択して、親抗体のｐＩと比較して変異体抗体のｐＩを低下させることができる。
【００９５】
重鎖のｐＩを減少させ得る有用な置換は、ＩｇＧ抗体重鎖のＣＨ１領域における位置１２１、１２４、１２９、１３２、１３４、１２６、１５２、１５５、１５７、１５９、１０１、１６１、１６２、１６５、１７６、１７７、１７８、１９０、１９１、１９４、１９５、１９７、２１２、２１６および２１８の１つ以上におけるアスパラギン酸またはグルタミン酸残基の置換を含む。
【００９６】
抗体重鎖のＣＨ１領域における特異的置換は、限定されるわけではないが、位置１１９における非ネイティブのグルタミン酸、位置１３１における非ネイティブのシステイン、位置１３３における非ネイティブのアルギニン、リジン又はグルタミン、位置１３７における非ネイティブのグルタミン酸、位置１３８における非ネイティブのセリン、位置１６４における非ネイティブのグルタミン酸、位置１９２における非ネイティブのアスパラギン、位置１９３における非ネイティブのフェニルアラニン、位置１９６における非ネイティブのリジン、位置１９９における非ネイティブのスレオニン、位置２０３における非ネイティブのアスパラギン酸、位置２０５における非ネイティブのグルタミン酸またはグルタミン、位置２０８における非ネイティブのアスパラギン酸、位置２１０における非ネイティブのグルタミン酸又はグルタミン、位置２１４における非ネイティブのスレオニン、位置２１７における非ネイティブのアルギニンおよび位置２１９における非ネイティブのシステイン、およびその任意の組合せを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態において、変異は、位置２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２３３、２３４、２３５および２３６を含む、抗体重鎖のヒンジ領域において作成される。具体的には、１、２、３、４または５の変異、および特に、１、２、３、４または５の置換を位置２２１−２２５で行うことができる。ここでも、考えられるすべての組合せが、単独で、あるいは他の領域の他の変異と組み合わせて意図される。
【００９８】
抗体重鎖のヒンジ領域における特異的変異は、限定されるものではないが、位置２２１における欠失、位置２２２における非ネイティブのバリンまたはスレオニン、位置２２３における欠失、位置２２４における非ネイティブのグルタミン酸、位置２２５における欠失、位置２３５における欠失、位置２３６における欠失または非ネイティブのアラニンおよびその任意の組合せを含み得る。いくつかの場合において、抗体重鎖のヒンジ領域に１つ以上のこれらの変異のみが導入され、他の実施形態において、いずれかの組合せにおいて、これらの変異の１つ以上が、親抗体の他の領域における変異の１つ以上と結合される。
【００９９】
いくつかの実施形態において、変異は、位置２７４、２９６、３００、３０９、３２０、３２２、３２６、３２７、３３４および３３９を含む抗体の重鎖のＣＨ２領域において作成することができる。具体的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の変異を、抗体の重鎖のＣＨ２領域のこれら１０の位置中の任意の組合せにおいて作成することができる。
【０１００】
抗体重鎖のＣＨ２領域における特異的置換は、位置２７４の非ネイティブのグルタミンまたはグルタミン酸、位置２９６の非ネイティブのフェニルアラニン、位置３００の非ネイティブのフェニルアラニン、位置３０９の非ネイティブのバリン、位置３２０の非ネイティブのグルタミン酸、位置３２２の非ネイティブのグルタミン酸、位置３２６の非ネイティブのグルタミン酸、位置３２７の非ネイティブのグリシン、位置３３４の非ネイティブのグルタミン酸、位置３３９の非ネイティブのスレオニン、およびこれらの置換の任意の組合せ、さらに抗体の他の領域の１以上の他の変異との組合せを含み得るが、これらに限定されない。
【０１０１】
変異は、抗体重鎖のＣＨ３領域の位置３５５、３５９、３６２、３８４、３８９、３９２、３９７、４１８、４１９、４４４および４４７の変異から独立して選択することができる。変異体抗体は、ＣＨ３領域内のこれらの位置に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個の変異を任意の組合せで有していてもよい。さらに、本明細書中に記載されるように、ＣＨ３領域中の任意の１以上の変異を、抗体のＣＨ２、ＣＨ１、ヒンジおよびＬＣ領域中の１以上の他の変異と組み合わせることができる。
【０１０２】
抗体重鎖のＣＨ３領域における特異的置換は、位置３５５の非ネイティブのグルタミンまたはグルタミン酸、位置３８４の非ネイティブのセリン、位置３９２の非ネイティブのアスパラギンまたはグルタミン酸、位置３９７の非ネイティブのメチオニン、位置４１９の非ネイティブのグルタミン酸、位置３５９の非ネイティブのグルタミン酸、位置３６２の非ネイティブグルタミン酸、位置３８９の非ネイティブのグルタミン酸、位置４１８の非ネイティブのグルタミン酸、位置４４４の非ネイティブのグルタミン酸、および位置４４７の非ネイティブのアスパラギン酸、ならびにこれらの置換の２つ以上の任意の組合せを含み得るが、これらに限定されない。
【０１０３】
したがって、以下の抗体重鎖の欠失または置換のすべての可能な組み合わせを行うことができ、各変異は任意選択で含まれるかまたは除外される：位置１１９の非ネイティブのグルタミン酸、位置１３１の非ネイティブのシステイン、位置１３３の非ネイティブのアルギニン、リジンまたはグルタミン、位置１３７の非ネイティブのグルタミン酸、位置１３８の非ネイティブのセリン、位置１６４の非ネイティブのグルタミン酸、位置１９２の非ネイティブのアスパラギン、位置１９３の非ネイティブのフェニルアラニン、位置１９６の非ネイティブのリジン、位置１９９での非ネイティブのスレオニン、位置２０３の非ネイティブのアスパラギン酸、位置２０５の非ネイティブのグルタミン酸またはグルタミン、位置２０８の非ネイティブのアスパラギン酸、位置２１０の非ネイティブのグルタミン酸またはグルタミン、位置２１４の非ネイティブのスレオニン、位置２１７の非ネイティブのアルギニンおよび位置２１９の非ネイティブのシステイン、位置２２１の欠失、位置２２２の非ネイティブのバリンまたはスレオニン、位置２２３の欠失、位置２２４の非ネイティブのグルタミン酸、位置２２５の欠失、位置２３５の欠失、位置２２１の欠失、位置２２２の非ネイティブのバリンまたはスレオニン、位置２２３の欠失、位置２２４の非ネイティブのグルタミン酸、位置２２５の欠失、位置２３５の欠失、位置２７４の非ネイティブのグルタミンまたはグルタミン酸、位置２９６の非ネイティブのフェニルアラニン、位置３００の非ネイティブのフェニルアラニン、位置３０９の非ネイティブのバリン、位置３２０の非ネイティブのグルタミン酸、位置３２２の非ネイティブのグルタミン酸、位置３２６の非ネイティブのグルタミン酸、位置３２７の非ネイティブのグリシン、位置３３４の非ネイティブのグルタミン酸、位置３３９の非ネイティブのスレオニン、位置３５５の非ネイティブのグルタミン又はグルタミン酸、位置３８４の非ネイティブのセリン、位置３９２の非ネイティブのアスパラギン又はグルタミン酸、位置３９７の非ネイティブのメチオニン、位置４１９の非ネイティブのグルタミン酸、位置３５９の非ネイティブのグルタミン酸、位置３６２の非ネイティブのグルタミン酸、位置３８９の非ネイティブのグルタミン酸、位置４１８の非ネイティブのグルタミン酸、位置４４４の非ネイティブのグルタミン酸、および位置４４７の非ネイティブのアスパラギン酸。
【０１０４】
Ｃ．抗体軽鎖の変異
いくつかの実施形態において、変異は、ＩｇＧ抗体の軽鎖にあることができる。変異は、軽鎖の位置１２６、１４５、１５２、１５６、１６９、１９９、２０２および２０７から独立に選択された位置に位置することができる。抗体は、任意の組合せにおいて、これらの位置で軽鎖中に１、２、３、４、５、６、７または８個の変異を有し得る。さらに、任意の単一または組合せの軽鎖変異を、上記の抗体の重鎖変異の任意の１つ以上と組み合わせることができる。
【０１０５】
抗体軽鎖における特異的置換としては、位置１２６における非ネイティブのグルタミンまたはグルタミン酸、位置１４５における非ネイティブのグルタミン、グルタミン酸またはスレオニン、位置１５２における非ネイティブのアスパラギン酸、位置１５６における非ネイティブのグルタミン酸、位置１６９における非ネイティブのグルタミンまたはグルタミン酸、位置１９９における非ネイティブグルタミン酸、位置２０２における非ネイティブのグルタミン酸および位置２０７における非ネイティブのグルタミン酸が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１０６】
Ｄ．重鎖および軽鎖変異
いくつかの実施形態において、変異体抗体は、上述のように、重鎖および軽鎖の両方において変異を有し得る。いくつかの実施形態において、変異体抗体は、重鎖においてのみ変異を有し得、その場合、変異体抗体は親抗体の軽鎖を有するであろう。いくつかの実施形態において、変異体抗体は、軽鎖においてのみ変異を有し得、その場合、変異体抗体は親抗体の重鎖を有するであろう。
【０１０７】
したがって、抗体の重鎖および軽鎖における以下の変異の任意の可能な組み合わせを行うことができ、各変異は任意選択で含まれるかまたは除外される：ａ）重鎖：位置１１９の非ネイティブのグルタミン酸；位置１３１の非ネイティブのシステイン；位置１３３の非ネイティブのアルギニン、リジンまたはグルタミン；位置１３７の非ネイティブのグルタミン酸；位置１３８の非ネイティブのセリン；位置１６４の非ネイティブのグルタミン酸；位置１９２の非ネイティブのアスパラギン；位置１９３の非ネイティブのフェニルアラニン、位置１９６の非ネイティブのリジン、位置１９９の非ネイティブのスレオニン、位置２０３の非ネイティブのアスパラギン酸、位置２０５の非ネイティブのグルタミン酸またはグルタミン、位置２０８の非ネイティブのアスパラギン酸、位置２１０の非ネイティブのグルタミン酸またはグルタミン、位置２１４の非ネイティブのスレオニン、位置２１７の非ネイティブアルギニンおよび位置２１９の非ネイティブのシステイン、位置２２１の欠失、位置２２２の非ネイティブのバリンまたはスレオニン、位置２２３の欠失、位置２２４の非ネイティブのグルタミン酸、位置２２５の欠失、位置２３５の欠失、位置２２１の欠失、位置２２２の非ネイティブのバリンまたはスレオニン、位置２２３の欠失、位置２２４の非ネイティブのグルタミン酸、位置２２５の欠失、および位置２３５の欠失、位置２７４の非ネイティブのグルタミンまたはグルタミン酸、位置２９６の非ネイティブのフェニルアラニン、位置３００の非ネイティブのフェニルアラニン、位置３０９の非ネイティブのバリン、位置３２０の非ネイティブのグルタミン酸、位置３２２の非ネイティブのグルタミン酸、位置３２６の非ネイティブのグルタミン酸、位置３２７の非ネイティブのグリシン、位置３３４の非ネイティブのグルタミン酸、位置３３９の非ネイティブのスレオニン、位置３５５の非ネイティブのグルタミンまたはグルタミン酸、位置３８４の非ネイティブのセリン、位置３９２の非ネイティブのアスパラギンまたはグルタミン酸、位置３９７の非ネイティブのメチオニン、位置４１９の非ネイティブのグルタミン酸、位置３５９の非ネイティブのグルタミン酸、位置３６２の非ネイティブのグルタミン酸、位置３８９の非ネイティブのグルタミン酸、位置４１８の非ネイティブのグルタミン酸、位置４４４の非ネイティブのグルタミン酸、および位置４４７の欠失または非ネイティブのアスパラギン酸。軽鎖：ｂ）位置１２６の非ネイティブのグルタミンまたはグルタミン酸、位置１４５の非ネイティブのグルタミン、グルタミン酸またはスレオニン、位置１５２の非ネイティブのアスパラギン酸、位置１５６の非ネイティブのグルタミン酸、位置１６９の非ネイティブのグルタミンまたはグルタミン酸、位置１９９の非ネイティブのグルタミン酸、位置２０２の非ネイティブのグルタミン酸および位置２０７の非ネイティブのグルタミン酸。
Ｅ．  抗体の定常領域の変異
【０１０８】
いくつかの実施形態において、１以上の変異は、ＩｇＧ抗体のような抗体の重鎖定常領域、軽鎖定常領域、またはその両方に位置してもよい。例えば、抗体の重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異が存在し得る。
【０１０９】
重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域の変異は、親抗体のｐＩと比較して、少なくとも０．２、０．４、０．６、０８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５または５．０単位だけ、親抗体のｐＩを低下させるのに充分である。
Ｆ．  親抗体の可変領域
【０１１０】
いくつかの実施形態において、１以上の変異は、ＩｇＧ抗体のような抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはその両方に位置する。１つの実施形態において、変異は、例えば、抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の１つ以上、および／またはフレームワーク領域（ＦＲ）、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の１つ以上に位置する。定常領域の変異が免疫原性の増大につながる可能性があるため、可変領域に変異を導入することは定常領域の変異に比べて有利であると考えられる。
【０１１１】
１つの例では、位置する変異は、抗原結合によってマスクされない可変領域内の位置にある。抗原結合によってマスクされない位置は、抗原結合抗体の表面に露出したままの位置である。あるいは、変異は、抗原結合を実質的に妨害しない位置で作られてもよい。
【０１１２】
ＣＤＲおよびＦＲを同定する方法は、公知である（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （１９８７），  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．；  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３４２，  ｐ．  ８７７，  １９８９）。ＦＲにおける改変可能なアミノ酸残基には、非共有結合結合を経由して抗原に直接的に結合する残基（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３３：７４７−５３，  １９８６）、ＣＤＲ構造に何らかの効果または効果を与える残基（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６：９０１−９１７，  １９８７）、および重鎖可変領域と軽鎖可変領域との相互作用に関係する残基物（出願公開ＥＰ  ２３９４００Ａ１）が含まれる。
【０１１３】
上記の突然変異誘発法は、１つ以上の変異体ポリペプチドの集合を産生する。これらの変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドのｐＩと同じかそれより低いｐＩを有する可能性がある。上述のさまざまな突然変異誘発法を用いて作製できる変異体ポリペプチドの中には、親ポリペプチドのｐＩと同じかそれ以上のｐＩをもつものがあるかもしれない。これは、例えば、包括的位置進化、包括的位置欠失、包括的位置挿入によって導入された追加の変異、またはその組合せによって引き起こされ、ｐＩの維持または減少のために導入された変異の影響を克服しうる。このため、いくつかの実施形態において、本発明は、特定の変異体ポリペプチドまたは少なくとも変異体ポリペプチドの実質的部分が、親ポリペプチドのｐＩより低いｐＩを有することを確認する。これは、変異体ポリペプチドのかなりの部分が、親ポリペプチドのｐＩよりも低いｐＨを有する領域に集中していることを示す等電点ゲル電気泳動によって達成され得る。例えば、変異体ポリペプチドの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％は、親ポリペプチドのｐＩより低いｐＩを有していてもよい。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、親ポリペプチドのｐＩと同一またはそれより高いｐＩを有する変異体ポリペプチドの一部またはすべてを除外するために、変異体ポリペプチドを任意に濾過する。これらの変異体ポリペプチドの濾過は、等電点電気泳動ゲル電気泳動によって達成することもでき、それによって、親ポリペプチドのｐＩよりも低いｐＨを有する領域に集束された変異体ポリペプチドを収集し、さらなる工程に使用することができる。親ポリペプチドのｐＩと同じかそれより高いｐＨを有する領域に焦点を合わせた変異体ポリペプチドは除外され得る。
Ｇ．  条件的活性型ポリペプチドのスクリーニング
【０１１５】
変異体ポリペプチドを条件活性についてスクリーニングする。このようにして、条件活性と親ポリペプチドよりも低いｐＩの両方を有するポリペプチドを同定することができる。これは、特に治療用抗体のような抗体についての、特徴の望ましい組合せである。
【０１１６】
条件的活性型ポリペプチドを選択するための変異体ポリペプチドを選別する方法は、ＷＯ  ２０１７／０７８８３９に記載されている。条件的活性型ポリペプチドは、対応する正常生理条件で同じ変異体ポリペプチドの同じ活性と比較して、正常生理条件から逸脱した異常条件で増加した活性をスクリーニングすることによって、任意に
（ａ）同じ異常条件で親ポリペプチドの同じ活性と比較して、正常生理条件から逸脱した異常条件での活性の増加についてスクリーニングすること、
（ｂ）同じ正常生理条件下で親ポリペプチドの同じ活性と比較して、正常生理条件下での活性の減についてスクリーニングすること、または
上記（ａ）および（ｂ）の組合せによって、選択することができる。
【０１１７】
条件的活性型ポリペプチドは、選択性を有し得、すなわち、正常生理条件での活性に対する異常条件での活性の比が、少なくとも約１．３、少なくとも約１．５、または少なくとも約１．７、または少なくとも約２．０、または少なくとも約３．０、または少なくとも約４．０、または少なくとも約６．０、または少なくとも約８．０、または少なくとも約１０．０、または少なくとも約２０．０、または少なくとも約４０．０、または少なくとも約６０．０、または少なくとも約１００．０である。
【０１１８】
異常条件および正常生理条件は、同じ条件の異なる値である。例えば、異常条件と正常生理条件は、２つの異なる温度、または２つの異なるｐＨ値であってもよい。条件は、温度、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化的ストレス、電解質濃度、並びに２つ以上のかかる条件の組み合わせから選択される。
【０１１９】
例えば、温度の正常生理条件は３７．０℃の正常ヒト体温であってもよく、一方、温度の異常条件は３７．０℃の温度と異なる温度、例えば正常生理的温度よりも１〜２℃高いものであり得る腫瘍微小環境における温度であってもよい。別の例において、正常生理条件は７．２〜７．８、又は７．２〜７．６の範囲の正常ヒト生理的ｐＨ及び腫瘍微小環境ににみられ得るとき５．５〜７．２、６〜７、又は６．２〜６．８の範囲などの異常ｐＨであってもよい。
【０１２０】
正常生理条件下及び異常条件下の両方のアッセイとも、アッセイ媒体中で実施し得る。アッセイ媒体は、例えば緩衝液並びに他の成分を含有し得る溶液であり得る。アッセイ媒体に用いることのできる一般的な緩衝液としては、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、クレブス緩衝液などの重炭酸塩緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。アッセイに好適な当業者に公知の他の緩衝液が用いられてもよい。これらの緩衝液は、血漿又はリンパ液など、ヒト又は動物の体液の組成の特性又は成分を模擬するために用いられ得る。
【０１２１】
本発明の方法において有用なアッセイ溶液は、無機化合物、イオン及び有機分子から選択される少なくとも１つの構成成分、好ましくはヒト又は動物などの哺乳類の体液中に一般に見出されるものを含有し得る。かかる構成成分の例としては、栄養構成成分及び代謝産物、並びに体液中に見出され得る任意の他の構成成分が挙げられる。本発明は、この構成成分が緩衝液系の一部であっても、又はそうでなくてもよいことを企図する。例えば、アッセイ溶液は、重炭酸塩を加えたＰＢＳ緩衝液であってもよく、ここで重炭酸塩はＰＢＳ緩衝液の一部ではない。或いは、重炭酸塩はクレブス緩衝液の一成分である。
【０１２２】
構成成分が両方のアッセイ溶液（第１及び第２の条件用の）に実質的に同じ濃度で存在し、一方、これらの２つのアッセイ溶液は、ｐＨ、温度、電解質濃度、又は浸透圧など、他の点で異なってもよい。従って、構成成分は、第１及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件の２つの条件間のそれぞれ違いでなく、むしろ定数として用いられる。
【０１２３】
一部の実施形態において、構成成分は両方のアッセイ溶液に、その構成成分の哺乳類、特にヒトにおける正常生理的濃度に近い又はそれと同じ濃度で存在する。
【０１２４】
無機化合物又はイオンは、ホウ酸、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、リン酸二アンモニウム、硫酸マグネシウム、リン酸一アンモニウム、リン酸一カリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、硝酸カルシウム、カルシウムキレート、銅キレート、鉄キレート、マンガンキレート及び亜鉛キレート、モリブデン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウム、二硫化ナトリウム、二硫化カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、硝酸カリウム、塩酸、二酸化炭素、硫酸、リン酸、炭酸、尿酸、塩化水素、尿素、リンイオン、硫酸イオン、塩化物イオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン及び銅イオンのうちの１つ以上から選択され得る。
【０１２５】
無機化合物の一部の正常生理的濃度の例としては、２〜７．０ｍｇ／ｄＬの濃度範囲の尿酸、８．２〜１１．６ｍｇ／ｄＬの濃度範囲のカルシウムイオン、３５５〜３８１ｍｇ／ｄＬの濃度範囲の塩化物イオン、０．０２８〜０．２１０ｍｇ／ｄＬの濃度範囲の鉄イオン、１２．１〜２５．４ｍｇ／ｄＬの濃度範囲のカリウムイオン、３００〜３３０ｍｇ／ｄＬの濃度範囲のナトリウムイオン、１５〜３０ｍＭの濃度範囲の炭酸、約８０μＭのクエン酸イオン、０．０５〜２．６ｍＭの範囲のヒスチジンイオン、０．３〜１μＭの範囲のヒスタミン、１〜２０μＭの範囲のＨＡＰＴイオン（水素付加アデノシン三リン酸）、及び１〜２０μＭの範囲のＨＡＤＰイオンが挙げられる。
【０１２６】
一部の実施形態において、第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件、それぞれ、両方のアッセイ溶液中に存在するイオンは、水酸化物イオン、ハロゲン化物イオン（塩化物、臭化物、ヨウ化物）、オキシハロゲン化物イオン、硫酸イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、重硫酸イオン、炭酸イオン、重炭酸イオン、スルホン酸イオン、オキシハロゲン化物イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、過硫酸イオン、モノ過硫酸イオン、ホウ酸イオン、アンモニウムイオン、又は有機イオン、例えばカルボン酸イオン、フェノラートイオン、スルホン酸イオン（硫酸メチルなどの有機硫酸塩）、バナジウム酸イオン、タングステン酸イオン、ホウ酸イオン、有機ボロン酸イオン、クエン酸イオン、シュウ酸イオン、酢酸イオン、五ホウ酸イオン、ヒスチジンイオン、及びフェノラートイオンから選択される。
【０１２７】
第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件、それぞれ、両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、例えば、ヒスチジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、ピロリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシンなどのアミノ酸及びこれらの混合物から選択され得る。
【０１２８】
アミノ酸の一部の正常生理的濃度の例としては、３．９７±０．７０ｍｇ／ｄＬのアラニン、２．３４±０．６２ｍｇ／ｄＬのアルギニン、３．４１±１．３９ｍｇ／ｄＬのグルタミン酸、５．７８±１．５５ｍｇ／ｄＬのグルタミン、１．７７±０．２６ｍｇ／ｄＬのグリシン、１．４２±０．１８ｍｇ／ｄＬのヒスチジン、１．６０±０．３１ｍｇ／ｄＬのイソロイシン、１．９１±０．３４ｍｇ／ｄＬのロイシン、２．９５±０．４２ｍｇ／ｄＬのリジン、０．８５±０．４６ｍｇ／ｄＬのメチオニン、１．３８±０．３２ｍｇ／ｄＬのフェニルアラニン、２．０２±６．４５ｍｇ／ｄＬのスレオニン、１．０８±０．２１ｍｇ／ｄＬのトリプトファン、１．４８±０．３７ｍｇ／ｄＬのチロシン及び２．８３±０．３４ｍｇ／ｄＬのバリンが挙げられる。
【０１２９】
第１の条件及び第２の条件、又は正常生理条件及び異常条件、それぞれ、両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸、尿酸、アラントイン、アデノシン、尿素、アンモニア及びコリンなどの非タンパク質窒素含有化合物から選択され得る。これらの化合物の一部の正常生理的濃度の例としては、１．０７±０．７６ｍｇ／ｄＬのクレアチン、０．９〜１．６５ｍｇ／ｄＬのクレアチニン、０．２６±０．２４ｍｇ／ｄＬのグアニジノ酢酸、４．０±２．９ｍｇ／ｄＬの尿酸、０．３〜０．６ｍｇ／ｄＬのアラントイン、１．０９±０．３８５ｍｇ／ｄＬのアデノシン、尿素２７．１±４．５ｍｇ／ｄＬ及び０．３〜１．５ｍｇ／ｄＬのコリンが挙げられる。
【０１３０】
正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、クエン酸、α−ケトグルタル酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、アセト酢酸、β−ヒドロキシ酪酸、乳酸、ピルビン酸、α−ケトン酸、酢酸、及び揮発性脂肪酸などの有機酸から選択され得る。これらの有機酸の一部の正常生理的濃度の例としては、２．５±１．９ｍｇ／ｄＬのクエン酸、０．８ｍｇ／ｄＬのα−ケトグルタル酸、０．５ｍｇ／ｄＬのコハク酸、０．４６±０．２４ｍｇ／ｄＬのリンゴ酸、０．８〜２．８ｍｇ／ｄＬのアセト酢酸、０．５±０．３ｍｇ／ｄＬのβ−ヒドロキシ酪酸、８〜１７ｍｇ／ｄＬの乳酸、１．０±０．７７ｍｇ／ｄＬのピルビン酸、０．６〜２．１ｍｇ／ｄＬのａ−ケトン酸、１．８ｍｇ／ｄＬの揮発性脂肪酸が挙げられる。
【０１３１】
正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、グルコース、ペントース、ヘキソース、キシロース、リボース、マンノース及びガラクトースなどの糖類（炭水化物）、並びに、ラクトース、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ、Ｇａｌα１−４Ｇａｌ、Ｍａｎα１−２Ｍａｎ、ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ及びＯ−、Ｎ−、Ｃ−、又はＳ−グリコシドを含めた二糖類から選択され得る。これらの糖類の一部の正常生理的濃度の例としては、８３±４ｍｇ／ｄＬのグルコース、１０２±７３ｍｇ／ｄＬの多糖類（ヘキソースとして）、７７±６３ｍｇ／ｄＬのグルコサミン、０．４〜１．４ｍｇ／ｄＬのヘキスロン酸塩（グルクロン酸として）及び２．５５±０．３７ｍｇ／ｄＬのペントースが挙げられる。
【０１３２】
正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、コレステロール、レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン及び胆汁酸などの脂肪又はその誘導体から選択され得る。これらの化合物の一部の正常生理的濃度の例としては、４０〜７０ｍｇ／ｄＬの遊離コレステロール、１００〜２００ｍｇ／ｄＬのレシチン、０〜３０ｍｇ／ｄＬのセファリン、１０〜３０ｍｇ／ｄＬのスフィンゴミエリン及び０２．〜０．３ｍｇ／ｄＬの胆汁酸（コール酸として）が挙げられる。
【０１３３】
正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、フィブリノゲン、抗血友病グロブリン、免疫γ−グロブリン、免疫オイグロブリン、同種凝集素、β−偽グロブリン、糖タンパク質、リポタンパク質及びアルブミンなどのタンパク質から選択され得る。例えば、哺乳類血清アルブミンの正常生理的濃度は３．５〜５．０ｇ／ｄＬである。一実施形態において、アルブミンはウシ血清アルブミンである。
【０１３４】
正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液中に存在する有機化合物は、ビタミンＡ、カロチン、ビタミンＥ、アスコルビン酸、チアミン、イノシトール、葉酸、ビオチン、パントテン酸、リボフラビンなどのビタミン類から選択され得る。これらのビタミン類の一部の正常生理的濃度の例としては、０．０１９〜０．０３６ｍｇ／ｄＬのビタミンＡ、０．９０〜１．５９ｍｇ／ｄＬのビタミンＥ、０．４２〜０．７６ｍｇ／ｄＬのイノシトール、０．００１６２〜０．００１９５ｍｇ／ｄＬの葉酸及びビオチン０．０００９５〜０．００１６６ｍｇ／ｄＬが挙げられる。
【０１３５】
アッセイ溶液中（正常生理条件下及び異常条件下の両方のアッセイ用）の無機化合物、イオン、又は有機分子の濃度は、ヒト又は動物血清中のその無機化合物、イオン、又は有機分子の正常生理的濃度の範囲内であり得る。しかしながら、生理的正常範囲外の濃度もまた用いられ得る。例えば、ヒト血清中におけるマグネシウムイオンの正常範囲は１．７〜２．２ｍｇ／ｄＬ、及びカルシウムは８．５〜１０．２ｍｇ／ｄＬである。アッセイ溶液中のマグネシウムイオン濃度は約０．１７ｍｇ／ｄＬ〜約１１ｍｇ／ｄＬであってもよい。アッセイ溶液中のカルシウムイオン濃度は約０．８５ｍｇ／ｄＬ〜約５１ｍｇ／ｄＬであってもよい。一般則として、アッセイ溶液中の無機化合物、イオン、又は有機分子の濃度は、ヒト血清中のその無機化合物、イオン、又は有機分子の正常生理的濃度の５％、又は１０％、又は２０％、又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％もの低さであるか、又はヒト血清中のその無機化合物、イオン、又は有機分子の正常生理的濃度の１．５倍、又は２倍、又は３倍、又は４倍又は５倍、又は７倍又は９倍又は１０倍又はさらには２０倍もの高さであってもよい。アッセイ溶液の種々の構成成分を、それぞれの正常生理的濃度と異なる濃度レベルで使用し得る。
【０１３６】
正常生理条件下及び異常条件下でのアッセイを用いて変異体ポリペプチドの活性を計測する。アッセイ中、変異体ポリペプチド及びその結合パートナーの両方がアッセイ溶液中に存在する。変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の関係は、例えば、抗体−抗原、リガンド−受容体、酵素−基質、又はホルモン−受容体であり得る。変異体ポリペプチドがその活性を発現するには、変異体ポリペプチドがその結合パートナーと接触してそれに結合することが可能でなければならない。次には変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの結合後に変異体ポリペプチドのその結合パートナーに対する活性が発現し、それを計測する。
【０１３７】
一部の実施形態において、アッセイで用いられるイオンは、スクリーニングする変異体ポリペプチドとその結合パートナー、特に荷電アミノ酸残基を含むものとの間の架橋の形成において機能し得る。従ってイオンは、変異体ポリペプチド及びその結合パートナーの両方との水素結合及び／又はイオン結合による結合能を有し得る。これは、巨大分子（変異体ポリペプチド又はその結合パートナー）には到達し難いこともある部位にイオンが到達可能であることにより、変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助し得る。場合によっては、アッセイ溶液中のイオンは、変異体ポリペプチド及びその結合パートナーが互いに結合する可能性を増加させ得る。さらに、イオンは、それに加えて又は代えて、大型分子（変異体ポリペプチド又はその結合パートナー）に結合することによって変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助し得る。この結合は、結合パートナーとの結合を促進する特定のコンホメーションに大型分子のコンホメーションを変化させ、及び／又は大型分子をそのようなコンホメーションに保持し得る。
【０１３８】
イオンが変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を、恐らくは変異体ポリペプチド及びその結合パートナーとのイオン結合の形成によって補助し得ることが観察されている。従って、イオンのない同じアッセイと比較してスクリーニングがはるかに効率的となり得るとともに、より多くのヒット（候補条件的活性型ポリペプチド）を同定することができる。好適なイオンは、マグネシウムイオン、硫酸イオン、重硫酸イオン、炭酸イオン、クエン酸イオン、ＨＡＰＴイオン、ＨＡＤＰイオン、重炭酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、過硫酸イオン、モノ過硫酸イオン、ホウ酸イオン、乳酸イオン、クエン酸イオン、ヒスチジンイオン、ヒスタミンイオン、及びアンモニウムイオンから選択され得る。
【０１３９】
イオンは、そのイオンのｐＫａに近いｐＨで変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するよう機能することが分かっている。かかるイオンは、好ましくは変異体ポリペプチドのサイズと比べて比較的小さい。
【０１４０】
一実施形態において、異常条件が正常生理条件下における正常生理的ｐＨと異なるｐＨである場合、候補条件的活性型ポリペプチドのヒット数を増加させるのに好適なイオンは、アッセイで試験する異常ｐＨに近いｐＫａを有するイオンから選択され得る。例えば、イオンのｐＫａは、異常ｐＨから最大２ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大１ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．８ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．６ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．５ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．４ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．３ｐＨ単位離れていてもよく、異常ｐＨから最大０．２ｐＨ単位離れていてもよく、又は異常ｐＨから最大０．１ｐＨ単位離れていてもよい。
【０１４１】
本発明において有用なイオンの例示的ｐＫａ（このｐＫａは温度が異なるとごく僅かに変わり得る）は、以下のとおりである：アンモニウムイオンはｐＫａが約９．２４であり、リン酸二水素はｐＫａが約７．２であり、酢酸はｐＫａが約４．７６であり、ヒスチジンはｐＫａが約６．０４であり、重炭酸イオンはｐＫａが約６．４であり、クエン酸塩はｐＫａが６．４であり、乳酸イオンはｐＫａが約３．８６であり、ヒスタミンはｐＫａが約６．９であり、ＨＡＴＰはｐＫａが６．９５であり（ＨＡＴＰ3-⇔ＡＴＰ4-＋Ｈ+）、及びＨＡＤＰはｐＫａが６．８８である（ＨＡＤＰ3-⇔ＡＤＰ4-＋Ｈ+）。
【０１４２】
一実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは二硫化物の存在下でアッセイ及び選択される。二硫化物はｐＫａが７．０５である。一部の実施形態では、正常生理条件に相当するアッセイと異常生理条件に相当するアッセイとに異なる二硫化物濃度が用いられ得る。或いは、正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ媒体は二硫化物濃度がほぼ同じで、また特定の条件の値が何らか異なるものであり、例えばこのアッセイは異なるｐＨで行われ得る。アッセイで用いられる二硫化物濃度は１ｍＭ〜１００ｍＭであり得る。好ましくは、アッセイ媒体は、２〜５００ｎＭ、又は３〜２００ｎＭ、又は５〜１００ｎＭの二硫化物濃度を有する。一部の態様において、二硫化物濃度は１ｍＭ〜２０ｍＭ、又は２ｍＭ〜１０ｍＭであり得る。二硫化物の存在下で行われるアッセイは公知である。
【０１４３】
特定の実施形態において、異常条件のｐＨ（即ち異常ｐＨ）が分かると、候補条件的活性型ポリペプチドのヒットを増加させるのに好適なイオンが、異常ｐＨの又はそれに近いｐＫａを有するイオンから選択されてもよく、例えば、候補イオンは、異常ｐＨから最大４ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大３ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大２ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大１ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．８ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．６ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．５ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．４ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．３ｐＨ単位離れた、異常ｐＨから最大０．２ｐＨ単位離れた、又は異常ｐＨから最大０．１ｐＨ単位離れたｐＫａを有し得る。
【０１４４】
前述のとおり、イオンは、変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するのに、そのイオンのｐＫａの又はそれに近いｐＨで最も有効である。例えば、ｐＨ７．２〜７．６のアッセイ溶液では、重炭酸イオン（ｐＫａが約６．４である）は、変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するのにあまり有効でないことが分かっている。アッセイ溶液のｐＨを６．７、さらには約６．０にまで低下させるに従い、重炭酸イオンは、変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の補助に次第に有効となる。結果として、ｐＨ６．０のアッセイであれば、ｐＨ７．２〜７．６のアッセイと比較してより多くのヒットが同定され得る。同様に、ヒスチジンは、ｐＨ７．４では、変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するのにあまり有効でない。アッセイ溶液のｐＨを６．７、さらには約６．０にまで低下させるに従い、ヒスチジンは変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の補助に次第に有効となり、また、例えば約６．２〜６．４の範囲のｐＨでは、より多くのヒットを同定することも可能になる。
【０１４５】
正常生理条件のアッセイ溶液のｐＨ（即ち、正常生理的ｐＨ）と異常条件のアッセイ溶液のｐＨ（即ち、異常ｐＨ）とが異なる場合、正常生理的ｐＨと異常ｐＨとのほぼ中点からほぼ異常ｐＨに至る範囲のｐＫａを有するイオンが、スクリーニングする変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を大幅に補助し得ることが見出された。結果として、このスクリーニングアッセイは、異常条件で活性が高いヒット又は候補条件的ポリペプチドをより多く見付けるのに、はるかに効率的である。
【０１４６】
一部の実施形態では、ｐＫａはさらには異常ｐＨから少なくとも１ｐＨ単位離れていてもよい。異常ｐＨが酸性ｐＨである場合、好適なイオンのｐＫａは、（異常ｐＨ−１）から異常ｐＨと正常生理的ｐＨとの中点に至るまでの範囲であり得る。異常ｐＨが塩基性ｐＨである場合、好適なイオンのｐＫａは、（異常ｐＨ＋１）から異常ｐＨと正常生理的ｐＨとの中点に至るまでの範囲であり得る。イオンは、本願に記載されるものから選択され得る。しかしながら、本願に明示的に記載されていないさらに多くのイオンもまた用いることができる。スクリーニングアッセイの異常ｐＨ及び正常生理的ｐＨが選択されると、当業者は、本明細書に記載の指針を用いて、異常条件で高い活性を有するヒットをより多く同定する点でスクリーニングの効率を増加させるのに好適なｐＫａを有する任意のイオンを選択し得ることが理解される。
【０１４７】
例えば、ある例示的スクリーニングについて異常ｐＨが８．４であり、正常生理的ｐＨが７．４である場合、約７．９（中点）〜９．４（即ち、８．４＋１）の範囲のｐＫａを有する任意のイオンをスクリーニングに用い得る。この範囲のｐＫａを有する幾つかのイオンとしては、トリシン（ｐＫａ  ８．０５）、ヒドラジン（ｐＫａ  ８．１）、ビシン（ｐＫａ  ８．２６）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ｐＫａ  ８．３）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ｐＫａ  ８．４）、タウリン（ｐＫａ  ９．０６）に由来するイオンが挙げられる。別の例では、ある例示的スクリーニングについて異常ｐＨが６であり、正常生理的ｐＨが７．４である場合、約５（即ち、６−１）〜６．７（中点）の範囲のｐＫａを有する任意のイオンをスクリーニングに用い得る。この範囲のｐＫａを有する幾つかのイオンとしては、リンゴ酸塩（ｐＫａ  ５．１３）、ピリジン（ｐＫａ  ５．２３）、ピペラジン（ｐＫａ  ５．３３）、カコジル酸塩（ｐＫａ  ６．２７）、コハク酸塩（ｐＫａ  ５．６４）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＫａ  ６．１０）、クエン酸塩（ｐＫａ  ６．４）、ヒスチジン（ｐＫａ  ６．０４）及びビス−トリス（６．４６）に由来するイオンが挙げられる。当業者は、膨大な数の化学マニュアル及びテキストを参考にして、無機化学化合物及び有機化学化合物の両方を含め、その範囲内にあるｐＫａを有するイオンに変換し得る既知の化学化合物を同定することが可能であろう。好適なｐＫａを有する化学化合物の中では、より小さい分子量のものが好ましいこともある。
【０１４８】
従って、本発明では、予想外にも、最終的に同定される条件的活性型ポリペプチドの作製が正しいポリペプチド変異体の生成に依存するのみならず、アッセイ溶液中における好適なｐＫａのイオンの使用にも依存することが見出された。イオンは大規模ライブラリからの高活性の変異体の効率的な選択を促進し得るため、本発明では、変異体ポリペプチドの大規模ライブラリの（例えば、ＣＰＥ及びＣＰＳによる）生成に加えて、アッセイ溶液中に使用する好適なイオン（適切なｐＫａを有するもの）を見付けることに労力を注ぐべきであると考えられる。さらに、好適なイオンがない場合、スクリーニングの効率が低く、高活性の変異体が見付かる可能性が低下することが考えられる。結果的に、好適なイオンなしに同じ数の高活性の変異体を得るためには、複数回のスクリーニングラウンドが必要となり得る。
【０１４９】
アッセイ溶液中のイオンはアッセイ溶液の構成成分からインサイチューで形成されてもよく、又はアッセイ溶液に直接含められてもよい。例えば、空気からＣＯ2をアッセイ溶液に溶解させて炭酸イオン及び重炭酸イオンを提供してもよい。別の例では、リン酸二水素ナトリウムをアッセイ溶液に添加してリン酸二水素イオンを提供してもよい。
【０１５０】
アッセイ溶液中におけるこの構成成分の濃度は（正常生理条件下のアッセイ及び異常条件下のアッセイの両方について）、ヒトなどの哺乳類の天然に存在する体液中で典型的に見られる同じ構成成分の濃度と同じ又は実質的に同じであってもよい。他の実施形態において、構成成分の濃度は、特に変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するように機能し得るイオンである構成成分の場合にはより高くてもよく、これは、かかるイオンの濃度が高いほど変異体ポリペプチド及びその結合パートナーとのイオン結合が形成され、事実上結合が促進されて、より多くのヒット又は候補条件的活性型ポリペプチドが見付かる可能性が高まり得ることが観察されているためである。
【０１５１】
一部の実施形態において、アッセイ溶液中のイオン濃度は、特に正常生理的濃度を超える濃度が用いられる場合に、アッセイを用いてより多くのヒットが見付かる可能性と正の相関があり得る。例えば、ヒト血清は約１５〜３０ｍＭの重炭酸イオン濃度を有する。一例において、アッセイ溶液中の重炭酸イオン濃度を３ｍＭから１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ及び１００ｍＭに増加させたとき、重炭酸塩濃度が増加する毎にアッセイにおけるヒットの数もまた増加した。これを踏まえると、アッセイ溶液には、約３ｍＭ〜約２００ｍＭ、又は約５ｍＭ〜約１５０ｍＭ又は約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、又は約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ又は約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ又は約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ又は約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ又は約３５ｍＭ〜約１００ｍＭ又は約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ又は約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の重炭酸塩濃度を用いることができる。
【０１５２】
別の実施形態において、アッセイ溶液中のクエン酸塩濃度は、約３０μＭ〜約１２０μＭ、又は約４０μＭ〜約１１０μＭ、又は約５０μＭ〜約１１０μＭ、又は約６０μＭ〜約１００μＭ、又は約μＭ〜約９０μＭ、又は約μＭであり得る。
【０１５３】
一実施形態において、正常生理条件は７．２〜７．６の範囲の正常生理的ｐＨであり、異常条件は５．５〜７．２、６〜７、又は６．２〜６．８の範囲の異常ｐＨである。正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は正常生理的ｐＨ及び５０ｍＭの重炭酸イオンを有する。異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は異常ｐＨ及び５０ｍＭの重炭酸イオンを有する。重炭酸イオンのｐＫａは約６．４であるため、重炭酸イオンは、ｐＨ６．０〜６．４、例えばｐＨ６．０又は６．２の異常ｐＨで変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助することができる。
【０１５４】
さらに別の実施形態において、正常生理条件は７．２〜７．６の範囲の正常生理的ｐＨであり、及び異常条件は５．５〜７．２、６〜７、又は６．２〜６．８の範囲の異常ｐＨである。正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は正常生理的ｐＨ及び８０μＭのクエン酸イオンを有する。異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は異常ｐＨ及び８０μＭのクエン酸イオンを有する。クエン酸イオンはｐＫａが６．４であるため、クエン酸イオンは、ｐＨ６．０〜６．４の異常条件のアッセイ溶液中で変異体ポリペプチドと結合パートナーとの間の結合を有効に補助することができる。従って、ｐＨ６．０〜６．４の条件下でより高い結合活性を有し且つ７．２〜７．８のｐＨ条件下でより低い活性を有する候補条件的活性型ポリペプチドがより多く同定され得る。酢酸塩、ヒスチジン、重炭酸塩、ＨＡＴＰ及びＨＡＤＰを含めた他のイオンも同様に機能し、こうしたイオンを含有するアッセイ溶液によって、イオンのｐＫａ前後のｐＨでより高い結合活性を有し且つイオンのｐＫａと異なるｐＨ（例えば正常生理的ｐＨ）でより低い結合活性を有する変異体ポリペプチドを有効にスクリーニングすることが可能となる。
【０１５５】
さらに別の実施形態において、正常生理条件は３７℃の正常生理的温度であり、異常条件は３８〜３９℃の異常温度（一部の腫瘍微小環境における温度）である。正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は正常生理的温度及び２０ｍＭの重炭酸イオンを有する。異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は異常温度及び２０ｍＭの重炭酸イオンを有する。
【０１５６】
さらに別の実施形態において、正常生理条件は正常ヒト血清中の電解質の特定の濃度であり、異常条件は、動物又はヒトにおいて異なる位置に存在し得るか又はヒト血清中の正常生理的電解質濃度を変化させる動物又はヒトの状態によって生じ得る異なる異常な濃度である同じ電解質の濃度である。
【０１５７】
変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーの間の結合にはまた、幾つもの他の方法で影響を与えることができる。典型的には、この影響は、アッセイ溶液に１つ以上の追加的な構成成分を含めることによって及ぼされ得る。これらの追加的な構成成分は、変異体ポリペプチド、結合パートナーのいずれか一方又は両方と相互作用するように設計され得る。加えて、これらの追加的な構成成分は、２つ以上の相互作用の組み合わせ並びに２つ以上のタイプの相互作用の組み合わせを用いて結合に影響を与え得る。
【０１５８】
一実施形態において、目的の結合相互作用は抗体と抗原との間である。この実施形態では、１つ以上の追加的な構成成分をアッセイ溶液に含めることにより、抗体、抗原又は両方に影響を及ぼし得る。このようにして、所望の結合相互作用を増強し得る。
【０１５９】
変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとイオン結合を形成して変異体ポリペプチドと結合パートナーとの間の結合を補助し得るイオンに加え、本発明はまた、変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助するために利用し得る他の構成成分も含む。一実施形態では、変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーと水素結合を形成し得る分子を利用し得る。別の実施形態では、変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとの疎水性相互作用能を有する分子を使用し得る。さらに別の実施形態では、変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとのファンデルワールス相互作用能を有する分子が企図される。
【０１６０】
「水素結合」は、炭素、窒素、酸素、硫黄、塩素、又はフッ素などの電気陰性原子に共有結合的に結合した水素（水素結合供与体）と、窒素、酸素、硫黄、塩素、又はフッ素などの電子供与原子の非共有電子対（水素結合受容体）との間の比較的弱い非共有結合性の相互作用を指す。
【０１６１】
変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとの水素結合形成能を有する構成成分には、極性結合を伴う有機分子並びに無機分子が含まれる。変異体ポリペプチド及び／又は変異体ポリペプチドの結合パートナーは、典型的には、水素結合を形成し得るアミノ酸を含有する。好適なアミノ酸は、水素結合形成能を有する極性基を備えた側鎖を有する。好適なアミノ酸の非限定的な例としては、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。
【０１６２】
これらのアミノ酸は水素供与体及び水素受容体の両方として機能し得る。例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＴｙｒに見られ得るような−ＯＨ基の酸素原子、Ｇｌｕ及びＡｓｐに見られ得るような−Ｃ＝Ｏ基の酸素原子、Ｃｙｓ及びＭｅｔに見られ得るような−ＳＨ基又は−ＳＣ−の硫黄原子、Ｌｙｓ及びＡｒｇに見られ得るような−ＮＨ3+基の窒素原子、並びにＴｒｐ、Ｈｉｓ及びＡｒｇに見られ得るような−ＮＨ−基の窒素原子は、全て水素受容体として機能し得る。また、このリスト中の基で水素原子を含むもの（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＨ3+及び−ＮＨ−）は水素供与体としても機能し得る。
【０１６３】
一部の実施形態では、変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーの骨格もまた、１つ以上の水素結合の形成に関与し得る。例えば、骨格は、ペプチド結合にあるように、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−の反復構造を有し得る。この構造の酸素及び窒素原子が水素受容体として機能し得る一方、水素原子が水素結合に関与し得る。
【０１６４】
水素結合に用いられ得る水素又は酸素原子が関わる少なくとも１つの極性結合を有する無機化合物としては、例えば、Ｈ2Ｏ、ＮＨ3、Ｈ2Ｏ2、ヒドラジン、炭酸塩、硫酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。アルコール類；フェノール類；チオール類；脂肪族アミン類、アミド類；エポキシド類、カルボン酸類；ケトン類、アルデヒド類、エーテル類、エステル類、有機塩化物、及び有機フッ素などの有機化合物。水素結合を形成し得る化合物は、例えば、“Ｔｈｅ  Ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｏｎｄ，”Ｌｉｎｕｓ  Ｐａｕｌｉｎｇ，Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９４０，ｐａｇｅｓ  ２８４〜３３４で考察されているものなど、化学文献において周知である。
【０１６５】
一部の実施形態において、アルコール類としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、１−ヘキサノール、２−オクタノール、ｌ−デカノール、シクロヘキサノール、及び高級アルコール類；ジオール類、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ジエチレングリコール、及びポリアルキレングリコール類を挙げることができる。好適なフェノール類としては、ヒドロキノン、レソルシノール、カテコール、フェノール、ｏ−、ｍ−、及びｐ−クレゾール、チモール、α及びβ−ナフトール、ピロガロール、グアヤコール、及びフロログルシノールが挙げられる。好適なチオール類としては、メタンチオール、エタンチオール、１−プロパンチオール、２−プロパンチオール、ブタンチオール、ｔｅｒｔ−ブチルメルカプタン、ペンタンチオール類、ヘキサンチオール、チオフェノール、ジメルカプトコハク酸、２−メルカプトエタノール、及び２−メルカプトインドールが挙げられる。好適なアミン類としては、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、アニリン、ジメチルアミン及びメチルエチルアミン、トリメチルアミン、アジリジン、ピペリジン、Ｎ−メチルピペリジン、ベンジジン、シクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｏ−、ｍ−、及びｐ−トルイジン及びＮ−フェニルピペリジンが挙げられる。好適なアミド類としては、エタンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメトキシアセトアミド及びＮ−メチル−Ｎ−ｐ−シアノエチルホルムアミドが挙げられる。エポキシド類としては、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、スチレンオキシド、エポキシドグリシドール、シクロヘキセンオキシド、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド又はエチルベンゼンヒドロペルオキシド、イソブチレンオキシド、及び１，２−エポキシオクタンを挙げることができる。カルボン酸類としては、テレフタル酸、イソフタル酸、フタル酸、サリチル酸、安息香酸、酢酸、ラウリン酸、アジピン酸、乳酸、クエン酸、アクリル酸、グリシン、ヘキサヒドロ安息香酸、ｏ−、ｍ−、及びｐ−トルイル酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、及びパラアミノ安息香酸を挙げることができる。ケトン類としては、アセトン、３−プロパノン、ブタノン、ペンタノン、メチルエチルケトン、ジイソブチルケトン、エチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルケトン、シクロヘキサノン、アセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルブチルケトン、メチルアミルケトン、メチルヘキシルケトン、ジエチルケトン、エチルブチルケトン、ジプロピルケトン、ジイソブチルケトン、ジアセトンアルコール、ホロン、イソホロン、シクロヘキサノン、メチルシクロヘキサノン、及びアセトフェノンを挙げることができる。アルデヒド類としては、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、イソブチルアルデヒド（ｓｏｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、バレル��ルデヒド、オクトアルデヒド、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、シクロヘキサノン、サリチルアルデヒド、及びフルフラールを挙げることができる。エステル類としては、酢酸エチル、酢酸メチル、ギ酸エチル、酢酸ブチル、乳酸エチル、酪酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸アミル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸アミル、酢酸メチルイソアミル、酢酸メトキシブチル、酢酸ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸アミル、酪酸メチル、酪酸エチル、酪酸ブチル、酪酸アミル、アセト酢酸メチル、及びアセト酢酸エチルが挙げられる。本発明で用い得るエーテル類としては、ジメチルエーテル、メチルエチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルプロピルエーテル、及びジメトキシエタンが挙げられる。エーテル類は、エチレンオキシド、テトラヒドロフラン、及びジオキサンなど、環状であってもよい。
【０１６６】
有機塩化物としては、クロロホルム、ペンタクロロエタン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、四塩化炭素、テトラクロロメタン、テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、及び二塩化エチレンが挙げられる。有機フッ素としては、フルオロメタン、ジフルオロメタン、トリフルオロメタン、トリフルオロエタン、テトラフルオロエタン、ペンタフルオロエタン、ジフルオロプロパン、トリフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ペンタフルオロプロパン、ヘキサフルオロプロパン、及びヘプタフルオロプロパンを挙げることができる。
【０１６７】
水素結合は結合の強度によって、強い、中程度の、又は弱い水素結合に分類することができる（Ｊｅｆｆｒｅｙ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ａ．；Ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）。強い水素結合は、２．２〜２．５Åの供与体−受容体距離及び１４〜４０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のエネルギーを有する。中程度の水素結合は、２．５〜３．２Åの供与体−受容体距離及び４〜１５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のエネルギーを有する。弱い水素結合は、３．２〜４．０Åの供与体−受容体距離及び＜４ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のエネルギーを有する。水素結合の幾つかの例は、エネルギーレベルと共に、Ｆ−Ｈ・・・：Ｆ（３８．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｏ−Ｈ・・・：Ｎ（６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｏ−Ｈ・・・：Ｏ（５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｎ−Ｈ・・・：Ｎ（３．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及びＮ−Ｈ・・・：Ｏ（１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）である。さらに詳しくは、Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｔｒｏｎｇ”ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．４８，ｐａｇｅｓ  ５１１−５４４，１９９７；Ｇｕｔｈｒｉｅ，“Ｓｈｏｒｔ  ｓｔｒｏｎｇ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄｓ：ｃａｎ  ｔｈｅｙ  ｅｘｐｌａｉｎ  ｅｎｚｙｍｉｃ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ？”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｒｃｈ  １９９６，３：１６３−１７０を参照のこと。
【０１６８】
一部の実施形態において、本発明に用いられる構成成分は変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーと強い水素結合を形成することができる。これらの構成成分は、高い電気陰性度の原子を有する傾向がある。最も高い電気陰性度を有することが知られる原子は、順にＦ＞Ｏ＞Ｃｌ＞Ｎである。従って、本発明は好ましくは、水素結合の形成において、フッ素、ヒドロキシル基又はカルボニル基を含む有機化合物を使用する。一実施形態では、強い水素結合を形成するため本発明において有機フッ素を使用し得る。
【０１６９】
別の実施形態において、変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとの疎水性相互作用能を有する構成成分が利用される。かかる構成成分には、疎水基を有する有機化合物が含まれる。
【０１７０】
「疎水性相互作用」は、疎水性化合物又は化合物の疎水性領域と別の疎水性化合物又は他の化合物の疎水性領域との間の可逆的引力相互作用を指す。この種の相互作用については、“Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ａ．Ｂｅｎ−Ｎａｉｒｎ（１９８０），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１７１】
疎水性材料は、その非極性の性質のため、水分子の反発力を受ける。水溶液中の比較的非極性の分子又は基が水よりむしろ他の非極性分子又は基と会合するとき、これは「疎水性相互作用」と呼ばれる。
【０１７２】
変異体ポリペプチド及びその結合パートナーは、典型的には、疎水性相互作用能を有するアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、典型的には、疎水性相互作用能を有する非極性基を有する少なくとも１つの側鎖を有することによって特徴付けられ得る。疎水性アミノ酸としては、例えば、アラニン（Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、バリン（Ｖａｌ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）、程度は小さいが、メチオニン（Ｍｅｔ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。
【０１７３】
変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとの疎水性相互作用能を有する構成成分には、疎水性分子又は少なくとも１つの疎水性部分を含有する分子である有機化合物が含まれる。一部の実施形態において、これらの疎水性構成成分は、芳香族炭化水素、置換芳香族炭化水素、多環芳香族炭化水素、芳香族又は非芳香族複素環、シクロアルカン類、アルカン類、アルケン類、及びアルキン類から選択される炭化水素であり得る。疎水基には、芳香族基、アルキル、シクロアルキル、アルケニル及びアルキニル基が含まれ得る。用語「アルキル」、「アルケニル」及び「アルキニル」は、本明細書で使用されるとき、直鎖アルケニル／アルキニル基、分枝鎖アルケニル／アルキニル基、シクロアルケニル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルケニル／アルキニル基を含めた、１〜３０個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基を指す。かかる炭化水素部分はまた、１つ以上の炭素原子上で置換されていてもよい。
【０１７４】
疎水性相互作用の強度は、互いに相互作用し得る利用可能な「疎水性物質」の量に基づくことが理解され得る。従って、疎水性相互作用は、例えば、疎水性相互作用に関わる分子中の疎水性部分の量及び／又は「疎水性」の性質を増加させることにより調整し得る。例えば、疎水性部分（その本来の形態では炭化水素鎖を含み得る）を修飾して、その炭素骨格の炭素の１つに疎水性側鎖を付加することによってその疎水性（その部分が関与する疎水性相互作用の強度を増加させる能力）を増加させることができる。好ましい実施形態において、これは、例えば様々なステロイド化合物及び／又はそれらの誘導体、例えばステロール系化合物、より詳細にはコレステロールを含めた様々な多環式化合物の付加を含み得る。一般に、側鎖は、直鎖、芳香族、脂肪族、環式、多環式、又は当業者によって企図されるとおりの他の任意の様々なタイプの疎水性側鎖であってよい。
【０１７５】
変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとのファンデルワールス相互作用能を有するタイプの構成成分は、必ずしもというわけではないが、通常は、極性部分を有する化合物である。本明細書で使用されるとき、「ファンデルワールス相互作用」は、双極子間相互作用及び／又は量子動力学の結果としての隣接する原子、部分、分子の変動する極性の相互関係によって生じる原子間、部分間、分子間、及び表面間の引力を指す。
【０１７６】
本発明におけるファンデルワールス相互作用は、変異体ポリペプチド又は結合パートナーと構成成分との間の引力である。ファンデルワールス相互作用は３つの供給源から生じ得る。第一に、一部の分子／部分が、電気的には中性であっても、永久電気双極子であり得る。一部の分子／部分の構造における電子電荷分布の固定的な歪みのため、分子／部分の片側が常に幾らか正であり、反対側が幾らか負である。かかる永久双極子が互いに整列しようとする傾向により、正味の引力がもたらされる。これが２つの永久双極子の間の相互作用（ケーソム力）である。
【０１７７】
第二に、永久双極子である分子の存在は、他の隣接する極性又は非極性分子の電子電荷を一時的に歪ませ、それによってさらなる分極を誘起し得る。永久双極子が隣接する誘起双極子と相互作用することによって追加的な引力が生じる。これは永久双極子と対応する誘起双極子との間の相互作用であり、デバイ力と称され得る。第三に、関与する分子が永久双極子でないとしても（例えば有機液体ベンゼン）、分子における２つの瞬間的に誘起される双極子によって分子間に引き付ける力は存在する。これは２つの瞬間的に誘起される双極子間の相互作用であり、ロンドン分散力と称され得る。
【０１７８】
変異体ポリペプチド及び／又は結合パートナーには、ファンデルワールス相互作用能を有するアミノ酸が多数ある。これらのアミノ酸は、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）を含め、極性側鎖を有し得る。これらのアミノ酸はまた、アラニン（Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、バリン（Ｖａｌ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）を含め、非極性基を有する側鎖も有し得る。
【０１７９】
変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーとのファンデルワールス相互作用能を有する構成成分には、アッセイ溶液に可溶性の極性又は非極性無機化合物が含まれる。アッセイ溶液は概して水溶液であり、従ってこれらの極性又は非極性無機化合物は、好ましくは水に可溶性である。ファンデルワールス相互作用に好ましい材料は、双極子間相互作用能を有するような極性のものである。例えばＡｌＦ3は極性Ａｌ−Ｆ結合を有し、水に可溶性である（２０℃で約０．６７ｇ／１００ｍｌ水）。ＨｇＣｌ2は極性Ｈｇ−Ｃｌ結合を有し、２０℃で７．４ｇ／１００ｍｌで水に可溶性である。ＰｒＣｌ2は極性Ｐｒ−Ｃｌ結合を有し、２０℃で約１ｇ／１００ｍｌで水に可溶性である。
【０１８０】
ファンデルワールス相互作用能を有する好適な極性化合物としては、アルコール類、チオール類、ケトン類、アミン類、アミド類、エステル類、エーテル類、及びアルデヒド類が挙げられる。これらの化合物の好適な例は、水素結合に関連して上記に記載している。ファンデルワールス相互作用能を有する好適な非極性化合物としては、芳香族炭化水素、置換芳香族炭化水素、多環芳香族炭化水素、芳香族又は非芳香族複素環、シクロアルカン類、アルカン類、アルケン類、アルキン類が挙げられる。
【０１８１】
水素結合構成成分、疎水性構成成分及びファンデルワールス構成成分を利用して、幾つもの方法で変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの結合に影響を与えることができる。一実施形態では、水素結合、疎水性相互作用及び／又はファンデルワールス相互作用によって変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間に架橋が形成され得る。かかる架橋は変異体ポリペプチドと結合パートナーとを互いに近接させて結合を促進し、及び／又は変異体ポリペプチド及び／又は結合パートナーを互いに対して結合を促進するような位置に置き得る。
【０１８２】
別の実施形態において、水素結合及び／又は疎水性相互作用は、例えば、結合可能性が増加する形でポリペプチド及び結合パートナーを互いに集合又は会合させることにより、変異体ポリペプチドがその結合パートナーに結合する可能性を増加させ得る。従って、これらの相互作用のうちの１つ以上を単独で又は組み合わせて用いることで、例えば、結合部位が互いのより近くに引き寄せられるようにするか、又は分子の非結合部分を互いに離して配置し、それによって結合部位を互いのより近くに位置させることにより、変異体ポリペプチド及び結合パートナーを互いにより近接して集合させ、又は変異体ポリペプチド及び結合パートナーを結合が促進される形で配置し得る。
【０１８３】
なおも別の実施形態において、水素結合及び／又は疎水性相互作用は変異体ポリペプチド及び／又はその結合パートナーのコンホメーションに影響を与えて、変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの結合の一層の助けとなるコンホメーションをもたらし得る。具体的には、変異体ポリペプチド及び／又は結合パートナーのアミノ酸の１つ以上との結合又は相互作用により、変異体ポリペプチド又は結合パートナーにおける変異体ポリペプチド／結合パートナー結合反応に有利な１つ以上のコンホメーション変化が生じ得る。
【０１８４】
本発明は２つのアッセイペアを実施し、１つは、正常生理条件における変異体ポリペプチドの由来となった元の親ポリペプチドと比較したときの正常生理条件でのアッセイにおける変異体ポリペプチドの活性の低下を求めるものであり、及び第２のアッセイは、異常条件における変異体ポリペプチドの由来となった元の親ポリペプチドと比較したときの異常条件下でのアッセイにおける変異体ポリペプチドの活性の増加を求めるものである。ＷＯ２０１７／０７８８３９に記載されている実施例は、正常生理ｐＨよりも、活性が望まれる異常ｐＨでより活性であるよりも条件的活性型ポリペプチドを選択することを例示している。
【０１８５】
一実施形態では、変異体ポリペプチドは、正常生理条件でのアッセイおよび異常条件下でのアッセイに供される。条件的活性型ポリペプチドは、正常生理条件下でのアッセイにおける変異体ポリペプチドの同じ活性と比較して、異常条件下でのアッセイにおける活性の増加を有する変異体ポリペプチドから選択される。
【０１８６】
本発明のアッセイペアで用いられる条件は、温度、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化的ストレス、電解質濃度及びアッセイ溶液又は媒体の任意の他の構成成分の濃度から選択され得る。従って、アッセイ媒体の特定の構成成分は、アッセイの両方のペアにおいて実質的に同じ濃度で用いられ得る。そのような場合、構成成分は典型的には、血清、腫瘍微小環境、滑液環境、神経環境又は投与ポイントで直面し得るか、投与された治療が通過し得るか、若しくは治療ポイントで直面し得る任意の他の環境など、ヒト又は動物における特定の環境を模擬する目的で存在する。これらの環境を模擬する１つ以上の構成成分の選択の重要な一側面は、それによってアッセイペアを用いて実施される選択プロセスの結果が向上し得ることである。例えば、特定の環境を模擬することにより、選択過程において当該環境の特定の構成成分が変異体ポリペプチドに及ぼす様々な効果を評価することが可能となる。特定の環境の構成成分は、例えば、変異体ポリペプチドを変化させ、又はそれと結合し、変異体ポリペプチドの活性を阻害し、変異体ポリペプチドを不活性化するなどし得る。
【０１８７】
一部の実施形態において、アッセイ溶液の１つ以上の構成成分は、好ましくは、二硫化物、硫化水素、ヒスチジン、ヒスタミン、クエン酸塩、重炭酸塩、乳酸塩、及び酢酸塩などの小分子又はイオンである。一実施形態において、小分子又はイオン構成成分は、好ましくはアッセイ溶液中に約１００μｍ〜約１００ｍＭ、又はより好ましくは約０．５〜約５０ｍＭ、又は約１〜約１０ｍＭの濃度で存在する。
【０１８８】
アッセイ溶液中の構成成分の濃度は、ヒトなどの哺乳類の天然に存在する体液中に典型的に見られる同じ構成成分の濃度と同じ又は実質的に同じであってもよい。これは、体液中の構成成分の正常生理的濃度と称することができる。他の実施形態において、アッセイ溶液中の特定の構成成分の濃度は、ヒトなどの哺乳類の天然に存在する体液中に典型的に見られる同じ構成成分の濃度より低くてもよく、又はそれより高くてもよい。
【０１８９】
別の実施形態において、構成成分は、アッセイペアの各々で実質的に異なる濃度で存在し得る。そのような場合、正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液と異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液とを区別する条件であるのは構成成分の濃度であるため、構成成分の存在、非存在又は濃度が、アッセイされる条件となる。従って、本発明の方法のこの実施形態によって作製される条件的活性型ポリペプチドは、構成成分の濃度に少なくとも部分的に依存する活性に関して選択され得る。
【０１９０】
一部の実施形態において、構成成分はアッセイ溶液の一方のペアに存在し、しかしアッセイ溶液の他方のペアには全く存在しなくてもよい。例えば、異常条件のアッセイ溶液中の乳酸塩濃度が、腫瘍微小環境の乳酸塩濃度を模擬するレベルに設定されてもよい。乳酸塩は、正常生理条件のアッセイ溶液のペアには存在しなくてもよい。
【０１９１】
一実施形態において、正常生理条件は正常生理条件を代表する第１の乳酸塩濃度であり、異常条件は、体内の特定の位置に存在する異常条件を代表する第２の乳酸塩濃度である。
【０１９２】
別の例において、腫瘍微小環境に見られ得るようにグルコースが存在しないことを模擬するため、異常条件のアッセイ溶液中にグルコースが存在しなくてもよく、一方、正常生理条件のアッセイ溶液のペアにおいては、グルコースは血漿グルコース濃度を模擬するレベルに設定されてもよい。この特徴を用いると、条件的活性型ポリペプチドを輸送中には不活性又は最小限の活性で位置又は環境に優先的に送達し、異常条件のアッセイ溶液中の構成成分の濃度が存在する環境に到達したときに条件的活性型ポリペプチドを活性化させることができる。
【０１９３】
例えば、腫瘍微小環境は典型的には、ヒト血清と比較して低いグルコース濃度及び高い乳酸塩濃度の両方を有する。グルコースの正常生理的濃度は血清中で約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である。他方で、腫瘍微小環境ではグルコース濃度は０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭの範囲で典型的には極めて低い。一実施形態において、正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲のグルコース濃度を有し、異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は約０．０５ｍＭ〜約０．５ｍＭの範囲のグルコース濃度を有する。このように作製された条件的活性型ポリペプチドは、低グルコース環境（腫瘍微小環境中）では高グルコース環境（正常組織又は血液中）よりも高い活性を有する。この条件的活性型ポリペプチドは腫瘍微小環境において機能性であるが、血流を通過中は低い活性を有し得る。
【０１９４】
血清中の乳酸塩の正常生理的濃度は約１ｍＭ〜約２ｍＭの範囲である。他方で、腫瘍微小環境では乳酸塩濃度は典型的には１０ｍＭ〜２０ｍＭの範囲である。一実施形態において、正常生理条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は約１ｍＭ〜約２ｍＭの範囲の乳酸塩濃度を有し、異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液は約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲の乳酸塩濃度を有する。このように作製された条件的活性型ポリペプチドは、高乳酸塩濃度環境（腫瘍微小環境中）では低乳酸塩環境（正常組織又は血液中）よりも高い活性を有する。従ってこの条件的活性型ポリペプチドは腫瘍微小環境において機能性であるが、血流を通過中は低い活性を有し得る。
【０１９５】
同様に、筋肉痛では乳酸塩の濃度が正常より高い（異常である）ことが知られている。従って、筋肉痛環境で活性となり得る変異体ポリペプチドを探すとき、異常条件のアッセイペアはより高い濃度の乳酸塩の存在下で実施して筋肉痛環境を模擬することができ、一方、正常生理条件のアッセイペアは、より低い濃度の乳酸塩で、又は乳酸塩の非存在下で実施することができる。このようにして、筋肉痛環境において乳酸塩濃度の増加に伴い活性が向上する変異体ポリペプチドを選択することができる。かかる条件的活性型ポリペプチドは、例えば抗炎症剤として有用であり得る。
【０１９６】
別の実施形態において、アッセイ溶液の両方のペアに２つ以上の構成成分を使用し得る。このタイプのアッセイでは、条件的活性型ポリペプチドは、上記に記載した２つのタイプのアッセイの両方の特徴を用いて選択し得る。或いは、２つ以上の構成成分を用いて条件的活性型ポリペプチドの選択性を増加させることができる。例えば、腫瘍微小環境に戻ると、異常条件のアッセイペアは、高乳酸塩濃度及び低グルコース濃度の両方を備えるアッセイ媒体で実施することができ、一方、対応する正常生理条件のアッセイペアは、比較的低い乳酸塩濃度及び比較的高いグルコース濃度の両方を備えるアッセイ媒体で実施することができる。
【０１９７】
本発明は、無機化合物、イオン、及び有機分子から選択される各構成成分を単独で又は組み合わせで用いて、構成成分のある濃度において同じ構成成分の異なる濃度と比べて活性が高い条件的活性型ポリペプチドを選択し得ることを企図する。
【０１９８】
正常環境（正常生理条件）と異常環境（異常条件）とを区別する条件として１つ以上の代謝産物の異なる濃度に頼るアッセイは、血漿中よりも腫瘍微小環境中で活性が高い条件的活性型ポリペプチドの選択に特に好適となることができ、なぜなら腫瘍微小環境は典型的には、血漿中の同じ代謝産物の濃度と比較して異なる濃度を有する代謝産物を数多く有するためである。
【０１９９】
Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｔｏｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”ＮＭＲ  ＩＮ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＥ，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．２−１２，１９９７は、正常脳及び脳腫瘍における代謝産物を比較した。このグループは、Ｎ−アセチルアスパラギン酸が正常脳では５０００〜６０００μＭの濃度を有するが、この濃度は膠芽腫では僅か３００〜４００μＭ、星状細胞腫では１５００〜２０００μＭ、及び未分化星状細胞腫では６００〜１５００μＭであることを発見した。さらに、イノシトールは正常脳では１５００〜２０００μＭの濃度を有するが、この濃度は膠芽腫では２５００〜４０００μＭ、星状細胞腫では２７００〜４５００μＭ、及び未分化星状細胞腫では３８００〜５８００μＭである。ホスホリルエタノールアミンは正常脳では９００〜１２００μＭの濃度を有するが、この濃度は膠芽腫では２０００〜２８００μＭ、星状細胞腫では１１７０〜１３７０μＭ、及び未分化星状細胞腫では１５００〜２５００μＭである。グリシンは正常脳では６００〜１１００μＭの濃度を有するが、この濃度は膠芽腫では４５００〜５５００μＭ、星状細胞腫では７５０〜１１００μＭ、及び未分化星状細胞腫では１９００〜３５００μＭである。アラニンは正常脳では７００〜１１５０μＭの濃度を有するが、この濃度は膠芽腫では２９００〜３６００μＭ、星状細胞腫では８００〜１２００μＭ、及び未分化星状細胞腫では３００〜７００μＭである。これらの代謝産物はまた、血中で異なる濃度を有することもあり、例えば、Ｎ−アセチルアスパラギン酸は血中で約８５０００μＭの濃度を有し；イノシトールは血中で約２１７００μＭの濃度を有し；グリシンは血中で約２２０〜４００μＭの濃度を有し；アラニンは血中で約２２０〜３００μＭの濃度を有する。
【０２００】
従って、これらの代謝産物は、少なくともＮ−アセチルアスパラギン酸、イノシトール、グリシン及びアラニンを含め、脳腫瘍で活性であるが血中又は正常脳組織では活性でない条件的活性型ポリペプチドを選択するためアッセイ溶液中において異なる濃度で使用し得る。例えば、膠芽腫の腫瘍微小環境で活性であるが、血中又は正常脳組織では活性でないか又は少なくとも活性が低い条件的活性型ポリペプチドを選択するため、Ｎ−アセチルアスパラギン酸が８５０００μＭの濃度のアッセイ溶液を正常生理条件下のアッセイペアに用いてもよく、Ｎ−アセチルアスパラギン酸が３５０μＭの濃度のアッセイ溶液を異常条件下のアッセイペアに用いてもよい。
【０２０１】
Ｍａｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｒｅ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｅｖｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１１９３−１１９８，２０１４は、膵臓の患者の診断前血漿中における分枝鎖アミノ酸を含む種々の異なる代謝産物の濃度を調べた。膵腫瘍患者には、膵癌を有しないヒトの血中における同じ代謝産物の濃度と比べて血流中に異なる濃度で存在する幾つかの代謝産物があることが分かった。Ｍａｙｅｒｓら（上掲）はまた、膵癌患者が正常対象と比較してその血漿中に分枝アミノ酸の有意な上昇を有することも見出した。高濃度で存在する分枝アミノ酸には、イソロイシン、ロイシン及びバリンが含まれる（Ｍａｙｅｒｓら（上掲）の表１）。正常な健常ヒトと比べて膵癌患者の血漿中で有意に異なる濃度で存在するＭａｙｅｒｓら（上掲）の図１に示される他の代謝産物がある。これらの代謝産物には、少なくともアセチルグリシン、グリシン、フェニルアラニン、チロシン、２−アミノアジピン酸、タウロデオキシコール酸塩／タウロケノデオキシコール酸塩、アコニット酸塩、イソクエン酸塩、乳酸塩、ａ−グリセロリン酸塩及び尿酸塩が含まれる。従って、特定の代謝産物が膵癌患者と正常な健常患者との血漿中において異なる濃度で存在するという知見に基づけば、膵癌の腫瘍微小環境もまたこれらの代謝産物に関して健常患者の膵臓微小環境に存在し得るものと異なる濃度を有するであろうことを予測し得る。
【０２０２】
従って、一実施形態において、これらの代謝産物の１つ以上が、正常生理条件のアッセイ溶液中に、健常人の血漿中におけるこれらの代謝産物の濃度（即ち、それらの代謝産物の正常生理的濃度）を近似する量で用いられ得る。例えば、健常人の血漿中における既知の正常生理的濃度は、イソロイシンについて約１．６０±０．３１ｍｇ／ｄＬ、ロイシンについて約１．９１±０．３４ｍｇ／ｄＬ、及びバリンについて約２．８３±０．３４ｍｇ／ｄＬである。正常生理条件のアッセイ溶液は、これらの分枝アミノ酸の１つ以上のこれらの範囲内の正常生理的濃度を有し得る。異常条件のアッセイ溶液は、対応する分枝アミノ酸の健常人における正常生理的濃度よりも約５倍、又は約１０倍、又は約２０倍、又は約５０倍、又は約７０倍、又は約１００倍、又は約１５０倍、又は約２００倍、又は約５００倍高い濃度の同じ分枝アミノ酸を有し得る。これは、Ｍａｙｅｒｓら（上掲）によって見出された血漿中に見られるこれらの分枝アミノ酸のより高い濃度は腫瘍微小環境から生じて血流中で希釈されるため、Ｍａｙｅｒｓら（上掲）の知見に基づけば膵腫瘍微小環境でこれらの分枝アミノ酸の濃度が有意に上昇していると予想され得ることを反映したものであり得る。同様に、異常条件下でのアッセイは、特定の代謝産物の濃度が正常な個体と比べて癌患者で有意に低かったとしても、膵癌患者の血中の他の代謝産物の濃度を反映するものであってよい。このようにして、スクリーニングが実際の環境を模擬し、それによって当該の特定の環境について最も高い活性の変異体が選択されることを確実にし得る。
【０２０３】
一部の他の実施形態において、正常生理条件のアッセイ溶液は、膵癌患者の血漿中の濃度を模擬してこれらの患者の実際の血漿環境を模擬する濃度の１つ以上の分枝アミノ酸を含み得る。かかる実施形態において、異常条件のアッセイ溶液は、膵癌患者の血漿中における対応する分枝アミノ酸の濃度よりも約２倍、又は約３倍、又は約４倍、又は約５倍、又は約７倍、又は約８倍、又は約１０倍、又は約１５倍、又は約２０倍、又は約５０倍高い濃度の同じ分枝アミノ酸を有して、これらのより高い濃度が腫瘍微小環境で起こり、血流中の濃度が腫瘍微小環境の実際の濃度の希釈に相当するという事実を反映し得る。同様に、他の代謝産物もまた、正常生理条件と異常条件とのアッセイ溶液中で異なる濃度を有してもよく、血流に関して収集されたデータから予想される実際の違いを反映し得る。場合によっては、膵臓の患者の血流中に特定の代謝産物の欠損が認められることもあり、その場合、計測された血流中濃度を反映する濃度を正常生理条件のアッセイに用いることができ、さらに低い濃度を異常条件のアッセイに用いて、前記代謝産物が腫瘍微小環境で消費されるものと見込まれるという予想を考慮に入れることができる。このようにアッセイ溶液を用いて選択された条件的活性型ポリペプチドは、膵癌患者の血漿中と比べて膵癌微小環境で活性がより高いものとなり得る。
【０２０４】
一部の実施形態では、本発明に膵癌患者の血漿全体を使用し得る。例えば、一実施形態において、正常生理条件下及び異常条件下のアッセイの一方又は両方についてアッセイ溶液に膵癌患者の血漿の１つ以上の構成成分の模擬を用い得る。例示的実施形態において、正常生理条件のアッセイ溶液は７．２〜７．６の範囲のｐＨを有し、且つ３０ｗｔ．％の膵癌患者の血漿が添加され、異常条件のアッセイ溶液は６．２〜６．８の範囲のｐＨを有し、且つ３０ｗｔ．％の膵癌患者の血漿が添加される。この実施形態において、膵癌患者の血漿は、（１）条件的活性型ポリペプチドがｐＨ７．２〜７．６の血中で活性化されないよう確実にすること、及び（２）また、条件的活性型ポリペプチドが膵癌患者の血中に見られるこの代謝産物組成の存在下であっても腫瘍微小環境でｐＨ５．５〜７．２、６〜７、又は６．２〜６．８によって活性化され得るよう確実にすることの両方のために存在する。これにより、治療が膵癌患者に合わせて調整されることになる。
【０２０５】
別の例示的実施形態において、正常生理条件のアッセイ溶液は７．２〜７．６の範囲のｐＨを有し、且つ３０ｗｔ．％の膵癌患者の血漿が添加され、異常条件のアッセイ溶液は５．５〜７．２又は６．２〜６．８の範囲のｐＨを有し、且つ膵癌患者の血漿は一切添加されない。
【０２０６】
上記で考察した幾つかのタイプのアッセイの各々において、無機化合物、イオン、及び有機分子から選択される同じ構成成分を使用し得る。例えば、乳酸塩の場合、乳酸塩は、正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液のペアにおいて実質的に同じ濃度で使用し得る。正常生理条件と異常条件とは、次には１つ以上の他の側面、例えば、温度、ｐＨ、別の構成成分の濃度等が異なることになる。異なる実施形態において、乳酸塩は正常生理条件と異常条件とを区別する因子の一つとして使用してもよく、それにより、乳酸塩が正常生理条件（非腫瘍微小環境）と比べて異常な腫瘍微小環境でより高い濃度であることを反映し得る。
【０２０７】
一部の実施形態において、正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液に２つ以上の構成成分が実質的に同じ濃度で添加される。例えば、クエン酸塩及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の両方がこれらのアッセイ溶液に添加される。両方のアッセイ溶液においてクエン酸塩濃度は約８０μＭであってもよく、ＢＳＡ濃度は約１０〜２０％であってもよい。より具体的には、正常生理条件下のアッセイペア用のアッセイ溶液は７．２〜７．６の範囲のｐＨを有し、クエン酸塩が約８０μＭの濃度及びＢＳＡが濃度約１０〜２０％であってもよい。異常条件下のアッセイペア用のアッセイ溶液は６．２〜６．８の範囲のｐＨを有し、クエン酸塩が約８０μＭの濃度及びＢＳＡが濃度約１０〜２０％であってもよい。
【０２０８】
一実施形態では、血清が正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液に実質的に同じ濃度で添加され得る。血清は多数の無機化合物、イオン、有機分子（ポリペプチドを含む）を有するため、アッセイ溶液は、これらの２つのアッセイ溶液間で実質的に同じ濃度で存在する無機化合物、イオン、有機分子から選択される構成成分を複数且つ多数有し得る。アッセイ溶液は、５〜３０ｖｏｌ．％、又は７〜２５ｖｏｌ．％、又は１０〜２０ｖｏｌ．％、又は１０〜１５ｖｏｌ．％の血清を有し得る。一部の他の実施形態では、正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液が血清を含まない。血清は、ヒト血清、ウシ血清、又は任意の他の哺乳類由来の血清であってもよい。一部の他の実施形態では、アッセイ溶液は血清を含まない。
【０２０９】
正常生理条件及び異常条件のアッセイ溶液は異なるｐＨを有し得る。かかるアッセイ溶液のｐＨは、重炭酸塩を使用して緩衝液中のＣＯ2及びＯ2レベルを用いて調整し得る。
【０２１０】
一部の他の実施形態において、２つ以上の構成成分のうちの少なくとも一方が、正常生理条件と異常条件とのアッセイ溶液に異なる濃度で添加される。例えば、乳酸塩及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の両方がアッセイ溶液に添加される。乳酸塩濃度は正常生理条件と異常条件とのアッセイ溶液間で異なり得る一方、ＢＳＡは両方のアッセイ溶液で同じ濃度を有し得る。乳酸塩は異常条件のアッセイ溶液で３０〜５０ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度及び正常生理条件のアッセイ溶液で８〜１５ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度を有してもよい。他方で、ＢＳＡは、約１０〜２０％など、両方のアッセイ溶液で同じ濃度を有する。これらのアッセイ溶液を用いることによってこのように選択された条件的活性型ポリペプチドは、ＢＳＡの存在下で８〜１５ｍｇ／ｄＬの低乳酸塩濃度と比べて３０〜５０ｍｇ／ｄＬの高乳酸塩濃度でより高活性である。
【０２１１】
一部の実施形態において、アッセイ溶液は、活性が２つ以上の条件に依存する条件的活性型ポリペプチドを選択するように設計されてもよい。一例示的実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは、ｐＨ及び乳酸塩の両方に依存する活性を有し得る。かかる条件的活性型ポリペプチドを選択するためのアッセイ溶液は、正常生理条件について、ｐＨが７．２〜７．６、乳酸塩が８〜１５ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度のアッセイ溶液であり得る。異常条件のアッセイ溶液は、ｐＨが６．２〜６．８、乳酸塩が３０〜５０ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度であり得る。任意選択で正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液が、変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助して、ひいては候補生物学的活性ポリペプチドのヒット数を増加させるイオンもまた含み得る。
【０２１２】
さらに別の例示的実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは、ｐＨ、グルコース及び乳酸塩に依存する活性を有し得る。かかる条件的活性型ポリペプチドを選択するためのアッセイ溶液は、正常生理条件について、ｐＨが７．２〜７．６、グルコースが２．５〜１０ｍＭの範囲の濃度、乳酸塩が８〜１５ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度のアッセイ溶液であり得る。異常条件のアッセイ溶液は、ｐＨが６．２〜６．８、グルコースが０．０５〜０．５ｍＭの範囲の濃度、乳酸塩が３０〜５０ｍｇ／ｄＬの範囲の濃度であり得る。任意選択で正常生理条件及び異常条件の両方のアッセイ溶液が、変異体ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合を補助して、ひいてはｐＨ６．２〜６．８で結合パートナーに結合する候補生物学的活性ポリペプチドの数を増加させるイオンもまた含み得る。かかるアッセイ溶液を用いて選択された条件的活性型ポリペプチドは、ｐＨ７．２〜７．６、グルコース濃度２．５〜１０ｍＭ及び乳酸塩濃度８〜１５ｍｇ／ｄＬの環境と比べてｐＨ６．２〜６．８、グルコース濃度０．０５〜０．５ｍＭ及び乳酸塩濃度３０〜５０ｍｇ／ｄＬの環境でより高活性である。
【０２１３】
無機化合物、イオン、及び有機分子から選択される２つ以上の構成成分は、選択された条件的活性型ポリペプチドを送達することになる位置／部位（即ち、標的部位）の環境を模擬する異常条件のアッセイ溶液を作り出すためものである。一部の実施形態において、標的部位の環境にある少なくとも３つの構成成分がアッセイ溶液に添加されてもよく、又は標的部位の環境にある少なくとも４つの構成成分がアッセイ溶液に添加されてもよく、又は標的部位の環境にある少なくとも５つの構成成分がアッセイ溶液に添加されてもよく、又は標的部位の環境にある少なくとも６つの構成成分がアッセイ溶液に添加されてもよい。
【０２１４】
一実施形態において、標的部位（条件的活性型ポリペプチドがより高活性となり得るところ）から採取された体液が異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液として直接使用されてもよい。例えば、対象、好ましくは治療を必要としている関節疾患を有する対象から滑液が採取されてもよい。採取された滑液は、任意選択で希釈され、条件的活性型ポリペプチドを選択するため異常条件のアッセイペアにおけるアッセイ溶液として用いられ得る。採取された滑液を、任意選択で希釈して、異常条件下のアッセイ用のアッセイ溶液、及び正常生理条件下のアッセイ用のヒト血漿を模擬するアッセイ溶液として用いることにより、選択される条件的活性型ポリペプチド（例えば、ＴＮＦ−α）は関節において他の位置又は器官におけるよりも高活性となり得る。例えば、炎症関節（関節炎など）を有する対象はＴＮＦ−αで治療し得る。しかしながら、ＴＮＦ−αは典型的には、他の組織及び器官に損傷を与える重度の副作用を有する。滑液では活性が高いが血中では活性でないか又は活性が低い条件的活性型ＴＮＦ−αは、体の他の部分に対するＴＮＦ−αの副作用を低減し又は潜在的に取り除きながらもＴＮＦ−αの活性を関節に送達し得る。
【０２１５】
複数の条件に依存した活性を有する条件的活性型ポリペプチドの開発により、対象の体内の標的部位に対する条件的活性型ポリペプチドの選択性の向上がもたらされることになる。理想的には、条件のうちの一部のみが存在する他の位置では、条件的活性型ポリペプチドは活性でないか、又は少なくとも活性が大幅に低い。一実施形態において、ｐＨ６．２〜６．８、グルコース濃度０．０５〜０．５ｍＭ及び乳酸塩濃度３０〜５０ｍｇ／ｄＬで活性な条件的活性型ポリペプチドは、腫瘍微小環境にはこれらの条件が全て存在するため、腫瘍微小環境に特異的に送達することができる。他の組織又は器官はこれらの条件のうちの１つ又は２つしか存在せず、３つ全ては有しないものであり得るため、この条件的活性型ポリペプチドを他の組織又は器官で完全に活性化させるには不十分である。例えば、運動後の筋肉は６．２〜６．８の範囲の低ｐＨを有し得る。しかしながら、それは別のアッセイ条件を有しないものであり得る。従って運動後の筋肉では条件的活性型ポリペプチドは活性でないか、又は少なくとも活性が低い。
【０２１６】
一部の実施形態において、条件的活性型ポリペプチドの活性が、条件的活性型ポリペプチドの選択に用いた条件に本当に依存することを確認する工程が行われ得る。例えば、条件的活性型ポリペプチドは、３つの条件：ｐＨ６．２〜６．８、グルコース濃度０．０５〜０．５ｍＭ及び乳酸塩濃度３０〜５０ｍｇ／ｄＬに依存するように選択される。選択された条件的活性型ポリペプチドは、次にこれらの３つの条件の各々で個別に、及び３つの条件のペアを含む環境で試験され、これらの試験条件又は環境で条件的活性型ポリペプチドが活性でない又は活性が低いことが確認され得る。
【０２１７】
一部の実施形態において、血清のある種の構成成分がアッセイ媒体から意図的に最小限に抑えられ、又は除外される。例えば、抗体のスクリーニング時、抗体と結合するか又は抗体を吸着する血清の構成成分をアッセイ媒体中では最小限に抑え、又はそこから除外することができる。かかる結合した抗体は偽陽性を生じ、それによって、条件的活性型ではない、むしろ種々の異なる条件下で単に血清中に存在する構成成分に結合するに過ぎない結合変異抗体が含まれることになり得る。従って、アッセイ中の変異体と潜在的に結合し得る構成成分が最小限に抑えられ又は除外されるようなアッセイ構成成分の慎重な選択を用いることにより、所望の結合パートナー以外のアッセイ中の構成成分に結合するために条件的活性に関して誤って陽性と同定され得る非機能性変異体の数を低減することができる。例えば、ヒト血清中の構成成分と結合する傾向のある変異体ポリペプチドをスクリーニングする一部の実施形態では、ヒト血清の構成成分に結合する変異体ポリペプチドによって生じる偽陽性の可能性を低減し又は排除するため、アッセイ溶液中にＢＳＡを使用し得る。同じ目標を達成するため詳細な例において他の類似の置き換えもまた行うことができる。
【０２１８】
一部の実施形態において、アッセイ条件は、細胞膜の内側、細胞膜上又は細胞膜の外側など、細胞膜近傍の環境、又は関節の環境を模擬する。細胞膜環境におけるスクリーニング時の結合活性に影響を及ぼし得る幾つかの要因としては、受容体の発現、インターナリゼーション、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）力価等が挙げられる。
【０２１９】
アッセイのフォーマットは当業者に公知の任意の好適なアッセイであってよい。例としては、ＥＬＩＳＡ、酵素活性アッセイ、インビトロ（臓器等）での実組織スクリーニング、組織スライド、全動物、細胞株及び３Ｄシステムの使用が挙げられる。例えば、好適な細胞ベースのアッセイについては国際公開第２０１３／０４０４４５号パンフレットに記載されており、組織ベースのアッセイについては米国特許第７，９９３，２７１号明細書に記載されており、全動物ベースのスクリーニング方法については米国特許出願公開第２０１０／０２６３５９９号明細書に記載されており、３Ｄシステムベースのスクリーニング方法については米国特許出願公開第２０１１／０１４３９６０号明細書に記載されている。
【０２２０】
一部の実施形態において、進化工程により、上記で考察した条件的活性特性に加えて他の所望の特性を同時に有し得る変異体ポリペプチドを作製し得る。進化させ得る好適な他の所望の特性としては、結合活性、発現、ヒト化等を挙げることができる。従って、本発明を用いて、これらの他の所望の特性のうちの少なくとも１つ以上もまた向上した条件的活性型ポリペプチドを作製し得る。
【０２２１】
一部の実施形態において、選択された条件的活性型ポリペプチドは、例えば第２の進化工程において、本明細書に開示される突然変異誘発技法のうちの１つを用いてさらに変異させることができ、それにより結合活性、発現、ヒト化など、選択された条件的活性型ポリペプチドの別の特性を向上させ得る。この第２の進化工程の後、条件的活性及び向上させた特性の両方に関して変異体ポリペプチドをスクリーニングし得る。
【０２２２】
一部の実施形態において、親ポリペプチドを進化させて変異体ポリペプチドを作製した後、第１の条件的活性型ポリペプチドが選択され、これは異常条件下でのアッセイにおける正常生理条件での第１の活性と比較した第１の活性の増加、の両方を呈する。次に第１の条件的活性型ポリペプチドが１つ以上の追加的な進化、発現及び選択工程にさらに供され、（１）正常生理条件下でのアッセイにおける第２の活性と比較した異常条件下でのアッセイにおける第２の活性の増加を呈するか、又は（２）第１の条件的活性型ポリペプチド及び／又は親ポリペプチドと比較して、異常条件での第１の活性と正常生理条件での第１の活性とのより大きい比を呈する少なくとも第２の条件的活性型ポリペプチドが選択され得る。第２の条件的活性型ポリペプチドは正常生理条件下でのそれぞれの活性と比較して異常条件下でより高い第１の活性及び第２の活性の両方、並びに親ポリペプチドと比較して正常生理条件下でより低い第１の活性及び第２の活性の両方を有し得る。
【０２２３】
特定の実施形態において、本発明は、異常条件での活性と正常生理条件での活性との活性比が大きい（例えば、異常条件と正常生理条件との間での選択性がより大きい）条件的活性型ポリペプチドを作製することを目標とする。異常条件での活性と正常生理条件での活性との比、即ち選択性は、少なくとも約２：１、又は少なくとも約３：１、又は少なくとも約４：１、又は少なくとも約５：１、又は少なくとも約６：１、又は少なくとも約７：１、又は少なくとも約８：１、又は少なくとも約９：１、又は少なくとも約１０：１、又は少なくとも約１１：１、又は少なくとも約１２：１、又は少なくとも約１３：１、又は少なくとも約１４：１、又は少なくとも約１５：１、又は少なくとも約１６：１、又は少なくとも約１７：１、又は少なくとも約１８：１、又は少なくとも約１９：１、又は少なくとも約２０：１、又は少なくとも約３０：１、又は少なくとも約４０：１、又は少なくとも約５０：１、又は少なくとも約６０：１、又は少なくとも約７０：１、又は少なくとも約８０：１、又は少なくとも約９０：１、又は少なくとも約１００：１であり得る。
【０２２４】
一実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは抗体であり、これは、異常条件での活性と正常生理条件での活性との比が少なくとも約５：１、又は少なくとも約６：１、又は少なくとも約７：１、又は少なくとも約８：１、又は少なくとも約９：１、又は少なくとも約１０：１、又は少なくとも約１５：１、又は少なくとも約２０：１、又は少なくとも約４０：１、又は少なくとも約８０：１であり得る。一実施形態において、条件的活性型ポリペプチドを用いて腫瘍部位が標的化され、ここで条件的活性型ポリペプチドは腫瘍部位（腫瘍微小環境中）で活性であり、且つ非腫瘍部位（正常生理条件）では活性が大幅に低いか又は不活性である。
【０２２５】
一実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは、本明細書の他の部分に開示するものなど、別の薬剤とコンジュゲートされることが意図される抗体である。この条件的活性型抗体は、異常条件での活性と正常生理条件での活性との比がより高いものであり得る。例えば、別の薬剤とコンジュゲートされる条件的活性型抗体は、異常条件での活性と正常生理条件での活性との比が少なくとも約１０：１、又は少なくとも約１１：１、又は少なくとも約１２：１、又は少なくとも約１３：１、又は少なくとも約１４：１、又は少なくとも約１５：１、又は少なくとも約１６：１、又は少なくとも約１７：１、又は少なくとも約１８：１、又は少なくとも約１９：１、又は少なくとも約２０：１であり得る。これは、コンジュゲートする薬剤が例えば毒性又は放射性である場合に、かかるコンジュゲート薬剤は疾患又は治療部位（異常条件が存在するところ）に集中させることが望ましいため、特に重要であり得る。
【０２２６】
Ｈ．  条件的活性型ポリペプチドのｐＩの確認
いくつかの実施形態において、選択された条件的活性型ポリペプチドのｐＩは、上記のいずれかの技術を使用して、親ポリペプチドのｐＩよりも低いことが確認される。例えば、条件的活性型ポリペプチドのｐＩは、親ポリペプチドのｐＩより少なくとも０．１、または少なくとも０．２、または少なくとも０．３、または少なくとも０．４、または少なくとも０．５、または少なくとも０．６、または少なくとも０．８、または少なくとも１．０、または少なくとも１．２、または少なくとも１．４、または少なくとも１．５、または少なくとも１．７、または少なくとも２．０、または少なくとも２．５、または少なくとも３．０、または少なくとも３．５、または少なくとも４．０、または少なくとも５．０単位低くてもよい。
【０２２７】
Ｉ．  条件的活性型ポリペプチド
別の態様では、本発明は、親ポリペプチドのｐＩよりも低いｐＩを有する条件的活性型ポリペプチドを提供する。条件的活性型ポリペプチドの活性は、対応する正常生理条件における同じ変異体ポリペプチドの同じ活性と比較して、正常生理条件から逸脱した異常条件で増大しており、また、場合によっては、
（ａ）同じ異常条件における親ポリペプチドの同じ活性と比較して、活性が正常生理条件から逸脱した異常条件で増加しているか、
（ｂ）同じ正常生理条件における親ポリペプチドの同じ活性と比較して、活性が正常生理条件でで減少しているか、または
（ｃ）上記（ａ）および（ｂ）の組合せである。
【０２２８】
条件的活性型ポリペプチドは正常生理条件で可逆的または不可逆的に不活性化されるが、異常条件では活性である。ある実施形態では、これらの条件的活性型ポリペプチドは、正常生理条件で親ポリペプチドの同じ活性と同じかそれ以上の、異常条件での活性をもつこともある。
【０２２９】
条件的活性型ポリペプチドは、ホスト内で限られた期間にわたって活性である治療薬の開発にとって特に価値がある。このことは、治療の作用を延長すればホストにとって有害となるであろうが、望む治療を行うためには限られた活性を要する場合には特に価値がある。有益な適用の例としては、局所的治療または全身治療、ならびに  局部的治療が挙げられる。条件的活性型ポリペプチドの利点の１つは、有害な副作用を潜在的に減少させる能力により、より高い用量を治療用途に使用できることである。正常生理条件での不活性化は、有害な副作用を減らすために使用することができる。
【０２３０】
正常生理条件での不活性化は、ポリペプチドの投与量と不活性化速度の組合せによって決定できる。この条件に基づく不活性化は、比較的短期間に実質的なマイナスの副作用を引き起こす可能性のある酵素療法にとって特に重要である。
【０２３１】
また、条件的活性型ポリペプチドは、時間可逆的または不可逆的に活性化または不活性化されることもあれば、体内の特定の器官を含む体内の特定の微小環境に位置する場合にのみ活性化または不活性化されることもある。例示的な微小環境は、腫瘍、滑液、および膀胱または腎臓の微小環境を含み得るが、これらに限定されない。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは、本明細書に記載される１以上の標的抗原に対する抗体または抗体断片である。
【０２３３】
異常条件および正常生理条件は上記で議論したように、温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化ストレス、電解質濃度、ならびに２つ以上のこのような条件の組合せから選択される条件であり得る。ある実施形態では、その条件はｐＨであり、条件的活性型ポリペプチドはｐＨ依存性である活性を有する。具体的には、条件的活性型ポリペプチドは、正常生理学的ｐＨでの場合と比較して、異常ｐＨでの活性が増加している。
【０２３４】
１つの態様において、本発明は、活性が望まれるｐＨの０．５、１、１．５、２、２．５、３または４単位の範囲内のｐＫａを有する種の存在下で、ｐＨ依存性活性を有する条件的活性型ポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は、約４〜約１０、又は約４．５〜約９．５又は約５〜約９、又は約５．５〜約８、又は約６．０〜約７．０のｐＫａを有する種の存在下でｐＨ依存的活性を有する条件的活性型ポリペプチドに関する。
【０２３５】
条件的活性型ポリペプチドの活性に大きい影響を有するアッセイ媒体中に存在する種は、少なくとも２つのイオン化状態：非荷電状又は低荷電状態と荷電又は高荷電状態とを有する種である傾向がある。そのため、特定のｐＨにおいて、その化学種が特定の活性のポリペプチドに与える結果の程度を決めるのに、条件的活性型ポリペプチドの活性に結果を与える化学種のｐＫａが役に立つことができる。
【０２３６】
別の態様において、本発明は、ヒスチジン、ヒスタミン、水素付加アデノシン二リン酸、水素付加アデノシン三リン酸、クエン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、乳酸塩、二硫化物、硫化水素、アンモニウム、リン酸二水素及びこれらの任意の組み合わせから選択される種の存在下でｐＨ依存的活性を有する条件的活性型ポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、ｐＨ依存性条件的活性型ポリペプチドは、第１の異なるｐＨにおいてよりも第２のｐＨにおいてより高い活性を有し、両活性は、これらの種の存在下でのにおいてアッセイにおいて測定される。条件的活性型ポリペプチドのｐＨ依存性を決定するには、ポリペプチドの同じ活性を同じアッセイ媒体中で２つの異なるｐＨ値においてアッセイする。
【０２３７】
同じアッセイ媒体中の第１のｐＨでの同じ活性に対する第２のｐＨでの活性の比は、ｐＨ依存性条件的活性型ポリペプチドの選択性と呼ばれる。ｐＨ依存性条件的活性型ポリペプチドは、少なくとも約１．３、または少なくとも約１．５、または少なくとも約１．７、または少なくとも約２．０、または少なくとも約３．０、または少なくとも約４．０、または少なくとも約６．０、または少なくとも約８．０、または少なくとも約１０．０、または少なくとも約２０．０、または少なくとも約４０．０、または少なくとも約６０．０、または少なくとも約１００．０の選択性を有する。
【０２３８】
しばしばｐＨ依存性条件的活性型ポリペプチドは、条件的活性型ポリペプチドが由来する親ポリペプチドのアミノ酸残基に比べて、荷電アミノ酸残基の数（または割合）が増加していることが観察されている。３つの正電荷アミノ酸残基：リジン、アルギニン及びヒスチジン；及び２つの負電荷アミノ酸残基：アスパラギン酸及びグルタミン酸がある。いくつかの実施形態では、これらの荷電アミノ酸残基は、ｐＨ依存性条件的活性型ポリペプチドが由来する親ポリペプチドに比べて、ｐＨ依存性条件的活性型ポリペプチドで過剰に存在する。その結果、ｐＨ依存性条件的活性型ポリペプチドは、親ポリペプチドに比べて荷電アミノ酸残基が増加しているので、アッセイ媒体中の荷電種と相互作用する可能性が高い。これが、ひいては条件的活性型ポリペプチドの活性に影響する。
【０２３９】
また、ｐＨ依存的条件的活性型ポリペプチドが、典型的にはアッセイ媒体中の異なる種の存在下で異なる活性を有することも観察されている。少なくとも二つのイオン化状態、非荷電状又は低荷電状態と荷電又は高荷電状態をもつ種は、そのｐＫａ値に依存して、特定のｐＨでより大きく解離し、それによって条件的活性型ポリペプチド中に存在する電荷をもつアミノ酸残基との相互作用の可能性を高めることができる。この特徴は、条件的活性型ポリペプチドの選択性および／またはｐＨ依存性の活性を高めるために用いられる。
【０２４０】
条件的活性型ポリペプチド上の電荷の性質は、条件的活性型ポリペプチドの活性に影響を与えるのに好適な種の決定に用いられる一つの要因であり得る。一部の実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは親ポリペプチドと比較してより多くの正電荷アミノ酸残基：リジン、アルギニン及びヒスチジンを有し得る。あるいは、条件的活性型ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較してより多くの負電荷アミノ酸残基：アスパラギン酸とグルタミン酸を有し得る。このようにして、条件的活性型ポリペプチドは、その活性が望まれる環境に存在する特定の種との相互作用の所望のレベルを有するように、および／または減少した活性が望まれる環境に存在する特定の種との相互作用の所望のレベルを有するように選択することができる。
【０２４１】
ｐＨ依存性条件的活性型ポリペプチド上の荷電アミノ酸残基の位置も、条件的活性型ポリペプチドの活性に影響を及ぼす可能性がある。たとえば、荷電アミノ酸残基が条件的活性型ポリペプチドの結合部位に接近すると、ポリペプチドの結合活性が影響を受ける可能性がある。
【０２４２】
実施形態によっては、荷電した環境種と条件的活性型ポリペプチドとの相互作用によって、ｐＨ依存性条件的活性型ポリペプチドの活性が阻止されたり妨げられたりすることがある。例えば、荷電環境種と相互作用する荷電アミノ酸は、条件的活性型ポリペプチドの結合部位に対してアロステリック効果を示し得る。
【０２４３】
他の実施形態では、電荷環境種と条件的活性型ポリペプチドとの相互作用が、ポリペプチド上の異なった部分の間、とくに電荷部分や極性を部分の間に塩橋を形成することがある。塩橋の形成はポリペプチド構造を安定化することが知られている（Ｄｏｎａｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓａｌｔ  Ｂｒｉｄｇｅｓ：  Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，  Ｄｅｓｉｇｎａｂｌｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ７９（３）：  ８９８−９１５，  ２０１１；  Ｈｅｎｄｓｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｄｏ  ｓａｌｔ  ｂｒｉｄｇｅｓ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ？  Ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，”  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３：２１１−２２６，  １９９４）。塩橋は、通常は「ブリージング」と呼ばれる一定の微小な構造変異を受けるタンパク質構造を安定化または固定することができる（Ｐａｒａｋ，  ”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｃｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ，”  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．，  １３（５）：５５２−５５７，  ２００３）。タンパク質構造「ブリージング」は、構造のゆらぎによってタンパク質がそのパートナーを効率的に認識し結合できるようになる可能性があるため、タンパク質の機能とその結合に重要である（Ｋａｒｐｌｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，”  ＰＮＡＳ，  ｖｏｌ．  １０２，  ｐｐ．  ６６７９−６６８５，  ２０１５）。塩橋を形成することによって、条件的活性型ポリペプチド上の結合部位、とくに結合ポケットがパートナーに近づきにくくなることがある。これはおそらく塩橋が相手が結合部位に接近するのを直接妨げたり、タンパク質構造の「ブリージング」を減らしたりするからであろう。結合部位から離れた塩橋をもっていても、塩橋のアロステリック効果によって結合部位の立体構造が変化して結合を阻害することがある。従って、塩橋が条件的活性型ポリペプチドの構造を安定化させた（固定した）後、ポリペプチドはそのパートナーとの結合の点で低活性になり、活性の低下がもたらされ得る。
【０２４４】
塩橋によって安定化される構造をもつポリペプチドの１つとして、ヘモグロビンが知られている。構造的及び化学的研究から、ヘモグロビンの塩橋には少なくとも２組の化学基：ヒスチジンβ１４６及びα１２２（これらはｐＨ７に近いｐＫａ値を有する）のアミノ末端と側鎖が関与していることが明らかになっている。デオキシヘモグロビンでは、β１４６の末端カルボキシレート基が、他方のαβ二量体のαサブユニットにおけるリジン残基と塩橋を形成する。この相互作用によってヒスチジンβ１４６の側鎖が同じ鎖の負電荷アスパラギン酸９４との塩橋に関与し得る位置に固定されるが、但しヒスチジン残基のイミダゾール基がプロトン化されていることが条件である（図１）。高いｐＨでは、ヒスチジンβ１４６の側鎖はプロトン化されておらず、塩橋は形成されない。しかしながら、ｐＨが下がるにつれヒスチジンβ１４６の側鎖がプロトン化されるようになり、ヒスチジンβ１４６とアスパラギン酸β９４との間に塩橋が形成され、それによりデオキシヘモグロビンの四次構造を安定化し、活発に代謝している組織（ｐＨがより低い）で酸素が放出される傾向が高まることにつながる。ヘモグロビンは酸素に対してｐＨ依存的結合活性を示し、その結果として低ｐＨで、塩橋の形成に起因して酸素に対する結合活性が低下する。他方で、高ｐＨでは、これらの塩橋がないため酸素に対する結合活性は増加する。
【０２４５】
同様に、重炭酸イオンのようなイオンは、条件的活性型ポリペプチド中で塩橋を形成することによって、条件的活性型ポリペプチドのその相手への結合活性を減少させ得る。たとえば、重炭酸イオンのｐＫａより大きいｐＨでは、重炭酸イオンは負電荷になる。負電荷重炭酸イオンは、条件的活性型ポリペプチド上の正電荷部分または極性部分の間に塩橋を形成することがある。これらの塩橋は条件的活性型ポリペプチドとそのパートナーとの結合を阻止したり、減少させたりする。ｐＨが６．４より低いと、重炭酸イオンはプロトン化されて中和される。非電荷重炭酸塩は塩橋を形成することができないので、このようにして条件的活性型ポリペプチドとそのパートナーとの結合には影響しないであろう。このシナリオでは、条件的活性型ポリペプチドは、６．４を超える高いｐＨでの結合活性よりも、重炭酸塩のｐＫａである６．４未満のｐＨでのパートナーとのより高い結合活性を有することができる。この例では、条件的活性型ポリペプチドは重炭酸イオンの存在下で条件的に活性であり、すなわちｐＨ依存性の活性を示す。
【０２４６】
アッセイ媒体に重炭酸塩などの種が存在しないとき、条件的活性型ポリペプチドはその条件的活性を失い得る。これは、条件的活性型ポリペプチド上にこのポリペプチドの構造を安定化させる（固定する）塩橋がないことが原因である可能性が高い。したがって、重炭酸塩が存在しない場合、結合パートナーはどのｐＨでも条件的活性型ポリペプチド上の結合部位に近づくレベルが似ている可能性があり、それによってどのｐＨでも同様の活性が生じ、条件的活性が排除される。
【０２４７】
他の実施形態では、小分子やイオンと条件的活性型ポリペプチドとの相互作用によって、ポリペプチドの構造がその活性を変化させるような様式で変化する可能性がある。例えば、構造の変化は、結合部位に対する位置、立体障害または結合エネルギーを変化させることにより、条件的活性型ポリペプチドの結合親和性を改善し得る。このような場合には、活性が望まれるｐＨで条件的活性型ポリペプチドに結合する小分子やイオンを選択することが望ましい場合がある。
【０２４８】
塩橋（イオン結合）は、化合物およびイオンが条件的活性型ポリペプチドの活性に影響を及ぼすための最も強く最も一般的な方法であるが、このような化合物およびイオンと条件的活性型ポリペプチドとの間の他の相互作用も、条件的活性型ポリペプチドの構造を安定化または固定するために寄与し得ることを理解されたい。このような他の相互作用には、水素結合、疎水性相互作用、およびファンデルワールス相互作用が含まれる。
【０２４９】
一部の実施形態において、好適な化合物又はイオンを選択するため、条件的活性型ポリペプチドが、それを進化させる元になった親ポリペプチドと比較され、条件的活性型ポリペプチドがより高い割合の負電荷アミノ酸残基又は正電荷アミノ酸残基を有するかどうかが決定される。次いで、活性が所望されるｐＨおよび正常生理ｐＨそれぞれにおける適当な荷電を有する化合物またはイオンを、その大きさおよびｐＫａ値に基づいて選択して、条件的活性型ポリペプチドの活性に影響を及ぼすために使用することができる。例えば、条件的活性型ポリペプチドが親ポリペプチドよりも正荷電アミノ酸残基の比率が高い場合には、条件的活性型ポリペプチドと相互作用するために、典型的には、適当な小分子またはイオンは正常生理ｐＨで負電荷をもち、活性が望まれるｐＨでは中性であるべきである。一方、条件的活性型ポリペプチドが親ポリペプチドよりも負電荷をもつアミノ酸残基の比率が高い場合には、適当な小分子またはイオンは、典型的には、条件的活性型ポリペプチドと相互作用するために正常生理ｐＨで正電荷をもち、活性が望まれるｐＨでは中性であるべきである。
【０２５０】
他の実施形態において、条件的活性型ポリペプチドの活性は、小分子又はイオンと条件的活性型ポリペプチドの結合パートナーである標的ポリペプチドとの相互作用によって制御される。この場合、目標が小分子又はイオンと標的ポリペプチドとの間に相互作用を作り出すことである点を除き、上記の考察と同じ原理を同様に適用可能である。標的ポリペプチドは、例えば、条件的に活性な抗体の抗原、または条件的に活性な受容体のリガンドであり得る。
【０２５１】
適当な小分子またはイオンは、活性が望まれるｐＨで非荷電又は低荷電状態から、正常生理学的ｐＨで荷電又は高荷電状態に移行する任意の無機または有機化合物またはイオンであり得る。したがって、小分子またはイオンは、典型的には、活性が望まれるｐＨと正常生理ｐＨとの間にｐＫａを有するべきである。例えば、重炭酸塩は６．４のｐＫａを有する。従って、ｐＨ７．４などでは、負電荷重炭酸塩が条件的活性型ポリペプチドの荷電アミノ酸残基に結合して活性を低下させ得る。他方で、ｐＨ６．０など、より低いｐＨでは、低荷電重炭酸塩は条件的活性型ポリペプチドに同じ分量で結合せず、条件的活性型ポリペプチドのより高い活性が可能となり得る。
【０２５２】
二硫化物はｐＫａ７．０５を有する。したがって、ｐＨ  ７．４のような正常生理ｐＨでは、より多くの負電荷二硫化物が条件的活性型ポリペプチドの正電荷アミノ酸残基に結合し、その活性を低下させ得る。他方で、ｐＨ６．２〜６．８など、より低いｐＨでは、低荷電硫化水素／二硫化物は条件的活性型ポリペプチドに同じレベルで結合せず、そのため条件的活性型ポリペプチドのより高い活性が可能となる。
【０２５３】
活性が所望されるｐＨと正常生理ｐＨとの間にｐＫａを有する小分子またはイオンが、本発明における使用のために好ましい。好ましい種は、二硫化物、硫化水素、ヒスチジン、ヒスタミン、クエン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、及び乳酸塩から選択される。これらの小分子またはイオンはそれぞれｐＫａが６．２〜７．０である。さらに、トリシン（ｐＫａ８．０５）及びビシン（ｐＫａ８．２６）などの他の小分子もまた使用し得る。他の好適な小分子またはイオンは、ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，  ９６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｂｙ  ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，  ２０１５およびＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，  １９９８などの教科書に、本出願の原理を用いて見出すことができる。
【０２５４】
アッセイ媒体または環境中の小分子またはイオンの濃度は、好ましくは、対象中の小分子またはイオンの生理的濃度またはその付近である。例えば、重炭酸塩のヒト血清中における生理的濃度は１５〜３０ｍＭの範囲にある。従って、アッセイ媒体中の重炭酸塩の濃度は１０ｍＭ〜４０ｍＭ、又は１５ｍＭ〜３０ｍＭ、又は２０ｍＭ〜２５ｍＭ、又は約２０ｍＭであってもよい。アッセイ媒体中の二硫化物の濃度は３〜５００ｎＭ、又は５〜２００ｎＭ、又は１０〜１００ｎＭ、又は１０〜５０ｎＭであってもよい。
【０２５５】
本発明では、条件的活性型ポリペプチドは、環境中における特定の種の正常生理的濃度が目的のｐＨ範囲における条件的活性型ポリペプチドの活性に有意な効果を及ぼし得るような濃度で選択及び利用される。従って、多くの治療処置において、活性化からの条件的活性型ポリペプチドを最小にするかまたは防止しながら、血流を介して治療処置の送達を可能にするために、ｐＨ７．２〜７．４付近の血中またはヒト血清中の条件的活性型ポリペプチドに対する低活性を有することが有利であろう。したがって、このような処置のためには、ｐＨ７．２〜７．４以下のｐＫａを有する小分子またはイオンを選択することが、血流ｐＨでの小分子のイオン化の充分な量を確保して条件的活性型ポリペプチドの活性に重大な影響を及ぼすために有利であろう。同時に、小分子またはイオンのｐＫａは、条件的活性型ポリペプチド上の遊離結合部位への小分子またはイオンのプロトン化による条件的活性型ポリペプチドの活性化を保証するために、条件的活性型ポリペプチドの活性が望まれるｐＨ以上でなければならない。
【０２５６】
小分子またはイオンは、好ましくは、立体障害を最小化することによって標的ポリペプチドまたは条件的活性型ポリペプチド上の小ポケットに最大限接近することを保証するために、低分子量および／または比較的小さなコンホメーションを有する。このため、小分子またはイオンは、典型的には、９００ａ．ｍ．ｕ．未満、またはより好ましくは５００ａ．ｍ．ｕ．未満、またはより好ましくは２００ａ．ｍ．ｕ．未満、またはさらにより好ましくは１００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量を有する。例えば、硫化水素、二硫化物及び重炭酸塩は全て、以下の実施例１３及び実施例１４に示すとおり、標的ポリペプチド又は条件的活性型ポリペプチド上のポケットへの到達をもたらす低分子量及び小型構造を有する。
【０２５７】
小分子またはイオンは、実質的に同じ濃度、例えば重炭酸塩について約２０μＭで条件活性または環境を選択するために使用されるアッセイ中に存在してもよい。いくつかの実施形態では、小分子またはイオンは、異なる環境中に異なる濃度で存在してもよく、したがって、アッセイにおいてこれをシミュレートすることが望ましい場合がある。例えば、二硫化物は腫瘍微小環境中においてヒト血清中よりも高い濃度を有する。従って、第２のアッセイが酸性ｐＨ及びより高濃度の二硫化物の腫瘍微小環境をシミュレートし得る一方、第１のアッセイが中性又は弱塩基性ｐＨ及びより低濃度の二硫化物のヒト血清をシミュレートし得る。酸性ｐＨは６．０〜６．８の範囲であってもよく、一方、中性又は弱塩基性ｐＨは約７．４であってもよい。ヒト血清をシミュレートする第１のアッセイのためのより低い濃度の二硫化物が１０μＭ以下、または５μＭであり得る一方で、腫瘍微小環境をシミュレートする第２のアッセイのためのより高い濃度の二硫化物は３０μＭであり得る。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、例えば重炭酸塩とヒスチジンの組合せのように、２つ以上の異なった小分子および／またはイオンが存在する場合、条件的活性型ポリペプチドはｐＨ依存性である。
【０２５９】
小分子やイオンが存在しないと、条件的活性型ポリペプチドはｐＨ依存性を失うことがある。したがって、小分子またはイオンが存在しない場合、条件的活性型ポリペプチドは、活性が望まれる異常ｐＨと正常生理ｐＨとの間で同様の活性を有する可能性がある。
【０２６０】
ある実施形態では、活性が望まれる異常ｐＨは酸性ｐＨであり、正常生理ｐＨは塩基性または中性のｐＨである。例えば、異常ｐＨは、約５．５〜７．２の範囲のｐＨ、または約６．０〜７．０のｐＨ、または約６．２〜６．８のｐＨであり得る。正常生理ｐＨは、７．２超から７．６未満の範囲内のｐＨであり得る。酸性ｐＨでより活性であり、塩基性または中性ｐＨでより活性が低い条件的活性型ポリペプチドは、異常ｐＨが約５．５〜７．２、または約６．２〜６．８の酸性である腫瘍微小環境を標的とすることができる。
【０２６１】
他の実施形態では、活性が望まれる異常なｐＨは塩基性ｐＨであり、正常生理ｐＨが酸性または中性ｐＨである。例えば、ｐＨ依存性ポリペプチドがより活性である異常ｐＨは、例えば、滑液におけるような、例えば、７．６〜７．９の塩基性ｐＨであり得る（Ｊｅｂｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｐＨ  ｏｆ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｐＨ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ，”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，  ｖｏｌ．  ４１  Ｂ，  ｐｐ．  ３８８−４００，  １９５９を参照されたい）。正常生理ｐＨは、条件的活性型ポリペプチドがより活性でない、７．２〜７．６を超える血液のｐＨであり得る。これらの条件的活性型ポリペプチドは、関節疾患および関節炎を標的とするのに適していると考えられる。
【０２６２】
他の実施形態において、条件的活性型ポリペプチドは脳を標的化するように設計され得る。血液脳関門の両側にはｐＨの差があり、脳側のｐＨは血液やヒト血清のｐＨよりも約０．２ｐＨ単位低い。したがって、条件的活性型ポリペプチドがより活性化される脳内の異常ｐＨは約７．０〜７．２（脳内ｐＨ）であり得るが、正常生理ｐＨは７．２超から７．６未満であり得る。
【０２６３】
条件的活性型ポリペプチドは、酵素、サイトカイン、受容体、特に細胞受容体、調節性ポリペプチド、可溶性ポリペプチド、抗体、又はホルモンであってもよい。
【０２６４】
条件的活性型ポリペプチドは親ポリペプチドの断片であってもよい。例えば、条件的活性型ポリペプチドは、抗体断片、一本鎖抗体、酵素断片、受容体断片、サイトカイン断片、又はホルモン断片であってもよい。抗体断片は抗体のＦｃ断片であってもよい。
【０２６５】
Ｆｃ断片を、条件的活性型Ｆｃ断片を生成するための親ポリペプチドとして使用することができる。Ｆｃ断片の補体との結合を用いて抗体依存的細胞媒介性細胞傷害をもたらすことができる。異常ｐＨは、腫瘍微小環境におけるｐＨのように、５．５〜７．２または６．２〜６．８の範囲の酸性であり得るが、一方、正常的生理ｐＨは、７．２超から７．６未満の範囲である。異常ｐＨは、典型的にｐＨが４．０付近にあるリソソームのｐＨとは異なる。さらに、リソソームは、Ｆｃ断片が任意の他のポリペプチドと同じく分解の標的となる場所である。リソソームには補体がなく、リソソームを介して細胞媒介性細胞傷害が生じることはない。
【０２６６】
条件的活性型ポリペプチドは、ｐＨ依存性活性を有する機能性ドメインの少なくとも１つ、好ましくは両方を有する２つの機能性ドメインを有し得る。これら２つの機能性ドメインは同時に進化させて、同じ変異体ポリペプチド中の両方の機能性ドメインを同定する方法で選択を行うことができる。あるいは、２つの機能性ドメインは独立に進化させて選択されることもある。この場合、２つの機能性ドメインを融合させてキメラポリペプチドとすることができる。
【０２６７】
１つの態様では、条件的活性型ポリペプチドは、タンパク質のような因子の存在下で、親ポリペプチドと比較して活性が望まれる異常ｐＨでの活性の増加、および親ポリペプチドと比較して正常生理ｐＨでの活性の減少を示す。タンパク質は、血中、ヒト血清中、または腫瘍微小環境、炎症領域、滑液、脳などの身体の微小環境中に存在するタンパク質であってよい。一つの好適なタンパク質はアルブミン、特にウシアルブミン又はヒトアルブミンなどの哺乳類アルブミンであり得る。
【０２６８】
１つの態様において、アルブミンのようなタンパク質は、条件的活性型ポリペプチドをスクリーニングおよび選択するために使用されるアッセイ溶液中に存在する。別の態様では、アルブミンのようなタンパク質を有するアッセイ溶液を使用して、同じまたは異なる条件下で選択された条件的活性型ポリペプチドの活性を試験することもできる。
Ｊ．  条件的活性型ポリペプチドの工学
【０２６９】
本発明の選択された条件的活性型ポリペプチドは、”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，”  ”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｍａｓｋｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，”  および  ”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”と題した節において、ＷＯ  ２０１７／０７８８３９に記載されている方法のいずれかを用いてさらに改変することができる。         さらに、本発明の条件的活性型ポリペプチドおよび改変された条件的活性型ポリペプチドは、ＷＯ  ２０１７／０７８８３９に記載されているように、腫瘍溶解性ウイルスであるウイルス粒子中に挿入することができる。
Ｋ．  条件的活性型ポリペプチドの製造
【０２７０】
選択された条件的活性型ポリペプチド及び本発明の改変された条件的活性型ポリペプチドは、  ”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ”と題する項のＷＯ  ２０１７／０７８８３９に記載された方法を用いて、治療用、予防薬用、診断用、研究用に産生することができる。
Ｇ．  医薬組成物
【０２７１】
条件的活性型ポリペプチド、又は改変された条件的活性型ポリペプチドを含む医薬組成物、並びにそのような医薬組成物の使用は、ＷＯ  ２０１７／０７８８３９に記載されている。本発明は、条件的活性型ポリペプチドを含む医薬組成物、または、治療、予防および診断用途に使用され得るさらなる改変型の条件的活性型ポリペプチドを含む医薬組成物にまで及ぶ。
Ｌ．  条件的活性型ポリペプチドの用途
【０２７２】
本発明はまた、固形腫瘍、炎症関節、または脳疾患もしくは障害の治癒的または予防的治療のための条件的活性型ポリペプチドの使用を含む。
【０２７３】
また、本発明の範囲内に含まれるのは、本発明の条件的活性型ポリペプチドを前記治療を必要とする患者に投与することによる固形腫瘍、炎症性関節、または脳疾患または障害を治療する方法である。
【０２７４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、文脈上特に明確に指示されない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」には複数形の参照が含まれることに留意しなければならない。さらに、用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に用いられ得る。用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及び「〜で構成される（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」も同義的に用いられ得る。
【０２７５】
特に指示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される、分子量、百分率、比、反応条件など、成分、特性の量を表す全ての数値は、全ての例において、用語「約」が存在するか否かに関わらず、用語「約」によって修飾されているものと理解されるべきである。従って、反する旨が示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に示される数値パラメータは近似であり、本開示によって達成しようとする所望の特性に応じて変わり得る。最低限でも、且つ特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとすることなしに、各数値パラメータは、少なくとも、報告される有効桁の数字を踏まえて、且つ通常の丸め法を適用することによって解釈されなければならない。本開示の広い範囲を示す数値の範囲及びパラメータは近似であるにも関わらず、具体的な例に示される数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値も、そのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる特定の誤差を本質的に含む。
【０２７６】
本明細書に開示される各成分、化合物、置換基又はパラメータは、単独での使用、又は本明細書に開示される他のあらゆる成分、化合物、置換基又はパラメータの１つ以上と組み合わせた使用について開示されるものと解釈されるべきであることが理解されなければならない。
【０２７７】
また、本明細書に開示される各成分、化合物、置換基又はパラメータの各量／値又は量／値の範囲は、本明細書に開示される任意の他の１つ又は複数の成分、１つ又は複数の化合物、１つ又は複数の置換基又は１つ又は複数のパラメータについて開示される各量／値又は量／値の範囲との組み合わせでも開示されるものと解釈されるべきであること、従って、本明細書に開示される２つ以上の成分、化合物、置換基又はパラメータの量／値又は量／値の範囲の任意の組み合わせも本記載の目的上、互いに組み合わせて開示されることも理解されなければならない。
【０２７８】
さらに、本明細書に開示される範囲の各々は、同じ有効桁数を有する開示される範囲内にある具体的な各値の開示として解釈されるべきであることが理解される。従って、１〜４の範囲は、値１、２、３及び４の明示的な開示と解釈されるべきである。さらに、本明細書に開示される各範囲の各下限は、同じ成分、化合物、置換基又はパラメータについての本明細書に開示される各範囲の各上限及び各範囲内にある具体的な各値と組み合わせて開示されるものと解釈されるべきであることが理解される。従って、この開示は、各範囲の各下限を各範囲の各上限又は各範囲内の具体的な各値と組み合わせることによるか、又は各範囲の各上限を各範囲内の具体的な各値と組み合わせることによって得られる全ての範囲の開示と解釈されるべきである。
【０２７９】
さらに、説明又は例に開示される成分、化合物、置換基又はパラメータの具体的な量／値は、範囲下限又は上限のいずれかの開示として解釈されるべきであり、従って本出願の他の場所に開示される同じ成分、化合物、置換基若しくはパラメータの任意の他の範囲下限若しくは上限、又は具体的な量／値との組み合わせで、成分、化合物、置換基又はパラメータの範囲を形成することができる。
【０２８０】
本明細書で言及される文献は全て、本明細書によって全体として、又はそれらが具体的に頼りとされた開示を提供する代わりに参照により援用される。本出願人らは、開示されるいかなる実施形態も公衆に提供する意図はなく、及び任意の開示される変形例又は代替例が字義的に特許請求の範囲に含まれないこともあり得る程度まで、それらは均等論の下で本明細書の一部と見なされる。
【０２８１】
しかしながら、前述の説明に本発明の数値的な特徴及び利点が本発明の構造及び機能の詳細と共に示されているとしても、本開示は例示的なものに過ぎず、詳細、特に要素の形状、サイズ及び配置の点で、添付の特許請求の範囲を表現している用語の広義の一般的な意味によって示される最大限の範囲まで本発明の原理の範囲内で変更形態をなし得ることが理解されるべきである。
【図１】
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【国際調査報告】
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