(57)【要約】  凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）および／またはその活性化形態第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）、またはＦＸＩおよび／またはＦＸＩａのフラグメントに結合するその抗体、ならびにその抗体を含有する組成物が開示される。血栓症および血栓症に関連する合併症または状態などの凝固関連状態を治療および／または予防するための抗体を調製する方法および抗体の使用も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＦＸＩまたはＦＸＩａに特異的に結合する単離された抗ＦＸＩまたは抗ＦＸＩａ抗体であって、前記抗体が、配列番号１１〜１３、２７〜２９、４３〜４５、５９〜６１、７５〜７７、９１〜９３、１０７〜１０９、１２３〜１２５、１３９〜１４１、１５５〜１５７、１７１〜１７３、１８７〜１８９、１９７、１９９、２０１、２０４、２０６、および２０８、ならびに少なくとも９０％の同一性を共有する配列からなる群から選択される３つのＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、または配列番号１４〜１６、３０〜３２、４６〜４８、６２〜６４、７８〜８０、９４〜９６、１１０〜１１２、１２６〜１２８、１４２〜１４４、１５８〜１６０、１７４〜１７６、１９０〜１９２、１９８、２００、２０２、２０５、２０７、および２０９、ならびに少なくとも９０％の同一性を共有する配列からなる群から選択される３つのＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、またはその免疫学的に活性な部分を含む、抗体。
【請求項２】
前記抗体が、前記ヒトＦＸＩまたはＦＸＩａのＡ３ドメインに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号９、配列番号２５、配列番号４１、配列番号５７、配列番号７３、配列番号８９、配列番号１０５、配列番号１２１、配列番号１３７、配列番号１５３、配列番号１６９、配列番号１８５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０４、配列番号２０６、および配列番号２０８、ならびに少なくとも９０％の同一性を共有する配列からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号１０、配列番号２６、配列番号４２、配列番号５８、配列番号７４、配列番号９０、配列番号１０６、配列番号１２２、配列番号１３８、配列番号１５４、配列番号１７０、配列番号１８６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０５、配列番号２０７、および配列番号２０９、ならびに少なくとも９０％の同一性を共有する配列からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項６】
対象における血餅の形成を阻害する方法であって、治療有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７】
対象における血餅の形成を阻害する方法であって、治療有効量の請求項５に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項８】
血栓症または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象の止血を損なうことのない、方法。
【請求項９】
血栓症または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項５に記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象の止血を損なうことのない、方法。
【請求項１０】
敗血症を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象の止血を損なうことのない、方法。
【請求項１１】
敗血症を治療または予防する方法であって、治療有効量の請求項５に記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、前記投与が、前記対象の止血を損なうことのない、方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、宿主細胞において発現ベクターにクローニングされた前記抗体をコードする核酸を発現させることを含む、方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞からの、発現された抗体を精製することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現ベクターが、ｐＴＴ５ベクターまたはｐｃＤＮＡ３ベクターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ１９３Ｔ細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法によって産生された抗体もしくはその機能的フラグメント、またはその免疫学的に活性な部分。
【請求項１７】
前記抗体が、翻訳後修飾されている、請求項１６に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）および／またはその活性化形態第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）、ならびにＦＸＩおよび／またはＦＸＩａのフラグメントに結合することができる抗体、ならびに血栓症を治療するための、止血を損なうことのない抗凝固剤としての使用を含むそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓症は、血管内の血餅を伴い、それによって患部の血流を遮断または妨害する状態である。血餅が循環器系に沿って心臓、脳、および肺などの重要な身体部分に移動する場合、この状態は深刻な合併症に繋がる可能性があり、心臓発作、脳卒中、肺塞栓症などを引き起こす。血栓症は、ほとんどの脳卒中および心筋梗塞、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、肺塞栓症、ならびに他の心血管事象の主な原因である。１、２血栓症は、低分子量ヘパリン、ワルファリン、および第Ｘａ因子直接阻害剤などの抗凝固剤によって治療または予防され得る。これらの現在利用可能な療法の最も一般的な副作用は、止血の障害である。３〜５したがって、これらの療法は、治療後に患者を注意深く監視する必要があるため、用量および患者のコンプライアンスによって制限される。
【０００３】
最小限の副作用で効果的な血栓症療法または予防が必要である。本開示は、当技術分野の必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００４】
特定の実施形態において本明細書に提供されるのは、凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）および／またはその活性化形態第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）、ならびにＦＸＩおよび／またはＦＸＩａのフラグメントに結合する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、組換え抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａのＡ３ドメインに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１１〜１６、２７〜３２、４３〜４８、５９〜６４、７５〜８０、９１〜９６、１０７〜１１２、１２３〜１２８、１３９〜１４４、１５５〜１６０、１７１〜１７６、および１８７〜１９２のアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含む１つ以上のＣＤＲを含む。
【０００５】
本明細書で提供されるのは、血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および／または予防するための医薬組成物である。医薬組成物は、本明細書に開示されるような１つ以上の抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容されるアジュバント、担体、賦形剤、防腐剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む。
【０００６】
本明細書に提供されるのは、本明細書に開示されるような抗ＦＸＩおよび／もしくは抗ＦＸＩａ抗体、またはいずれかの抗体の機能的フラグメントをコードする核酸、ならびに核酸を含むベクター、ならびにベクターを含む宿主細胞である。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞において核酸によってコードされる抗体またはその機能的フラグメントを産生することができる発現ベクターである。
【０００７】
本明細書で提供されるのは、血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および／または予防に使用するための、本明細書に開示されるような１つ以上の抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を含むキットである。あるいは、キットは、血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および／または予防に使用するための、本明細書に開示されるような１つ以上の抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を含む医薬組成物を含む。特定の実施形態では、キットは、使用説明書をさらに含む。
【０００８】
本明細書で提供されるのは、血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および／または予防する方法である。本方法は、それを必要とする対象に治療有効量の本明細書に開示されるような１つ以上の抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を投与することを含む。あるいは、本方法は、それを必要とする対象に抗ＦＸＩ抗体、抗ＦＸＩａ抗体、またはいずれかの抗体の機能的フラグメントを含有する治療有効量の医薬組成物を投与することを含む。
【０００９】
本明細書で提供されるのは、血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および／または予防するための医薬剤を処方する、本明細書に開示されるような抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体の使用である。
【００１０】
本明細書に提供されるのは、本明細書に開示されるような抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を産生する方法である。本方法は、抗体をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換し、宿主細胞において抗体を発現させるステップを必然的に伴う。本方法は、発現された抗体を宿主細胞から精製することをさらに含み得る。さらに、精製された抗体は、修飾組換え抗体が対応するヒト抗体の活性を保持するように修飾に供され得る。あるいは、本明細書に開示される抗体は、ハイブリドーマを培養することから産生され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ−１Ｅ】ヒト血漿中のＡＰＴＴアッセイによる５つの抗ＦＸＩ抗体の効果を例示する。０〜４００ｎＭの範囲の濃度で５つの異なる抗体を補充したヒト血漿を、実施例３に記載されるようにＡＰＴＴアッセイで試験した。試験された５つの抗体には、１９Ｆ６（Ａ）、３４Ｆ８（Ｂ）、４２Ａ５（Ｃ）、１Ａ６（Ｄ）、および１４Ｅ１１（Ｅ）が含まれていた。この実験では、抗体１Ａ６および１４Ｅ１１を陽性対照として使用した。
【図２Ａ−２Ｃ】サル血漿中のＡＰＴＴアッセイに対する抗体１９Ｆ６（Ａ）、３４Ｆ８（Ｂ）、および４２Ａ５（Ｃ）の効果を例示する。０〜４００ｎＭの範囲の濃度で３つの異なる抗体を補充したサル血漿を、実施例４に記載されるようにＡＰＴＴアッセイで試験した。
【図３Ａ−３Ｆ】固定化ｈ−１９Ｆ６（Ａ）、ｈ−３４Ｆ８（Ｂ）、およびｈ−４２Ａ５（Ｃ）へのＦＸＩ結合のＳＰＲセンサーグラム、ならびに固定化ｈ−１９Ｆ６（Ｄ）、ｈ−３４Ｆ８（Ｅ）、およびｈ−４２Ａ５（Ｆ）へのＦＸＩａ結合のＳＰＲセンサーグラムを例示する。データを１：１結合モデルに適合し、ＦＸＩの試験濃度（０．００５〜１ｎｇ／ｍＬ）での曲線適合がセンサーグラムにオーバーレイされていると示される。各曲線は、ＦＸＩまたはＦＸＩａの異なる試験濃度を示す。
【図４Ａ−４Ｃ】ヒトＦＸＩａがＳ−２３６６を加水分解するのを阻害する抗体ｈ−１９Ｆ６（Ａ）、ｈ−３４Ｆ８（Ｂ）、およびｈ−４２Ａ５（Ｃ）の濃度応答曲線を例示する。
【図５Ａ−５Ｂ】ＦＸＩａ媒介性ＦＩＸのＦＩＸａへの活性化に対する抗体ｈ−１９Ｆ６（Ａ）およびｈ−４２Ａ５（Ｂ）の阻害効果を例示する。ヒトＦＩＸ（２００ｎＭ）を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含むＰＢＳ中のＦＸＩａ（５ｎＭ）と共に室温で、１μＭのｈ−１９Ｆ６またはｈ−４２Ａ５と共にインキュベートした。示された間隔でサンプルを収集し、ヤギ抗ヒトＦＩＸ  ＩｇＧ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用するウエスタンブロットによってＦＩＸ、ならびにＦＩＸａを決定した。図５Ｃ〜５Ｄは、ＦＸＩＩａ媒介性ＦＸＩのＦＸＩａへの活性化に対する抗体ｈ−１９Ｆ６（Ｃ）およびｈ−４２Ａ５（Ｄ）の阻害効果を例示する。ヒトＦＸＩ（５００ｎＭ）を、１μＭのｈ−１９Ｆ６またはｈ−４２Ａ５の存在下でＦＸＩＩａ（５０ｎＭ）と共にインキュベートした。ＦＸＩ、ならびにＦＸＩａ産生を表すＦＸＩａ軽鎖を、示された時点でウエスタンブロットによって決定した。ヒトＩｇＧ４（１μＭ）を対照として使用した。
【図６Ａ−６Ｃ】カニクイザルにおけるＡＰＴＴに対する抗体ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ−４２Ａ５の効果を例示する。サルに、示された用量のｈ−３４Ｆ８（Ａ）、ｈ−１９Ｆ６（Ｂ）、およびｈ−４２Ａ５（Ｃ）を静脈内投与した。エクスビボ凝血時間ＡＰＴＴを投薬前（時間０）、ならびに投薬後０．５、１、３、６、１２、および２４時間で決定した。
【図７Ａ−７Ｃ】カニクイザルにおけるＰＴに対する抗体ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ−４２Ａ５の効果を例示する。サルに、示された用量のｈ−３４Ｆ８（Ａ）、ｈ−１９Ｆ６（Ｂ）、およびｈ−４２Ａ５（Ｃ）を静脈内投与した。エクスビボ凝血時間ＰＴを投薬前（時間０）、ならびに投薬後０．５、１、３、６、１２、および２４時間で決定した。
【図８Ａ−８Ｃ】カニクイザルにおけるＡＶシャント血栓症に対する抗体ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ−４２Ａ５の効果を例示する。漸増レベルのｈ−３４Ｆ８（Ａ）、ｈ−１９Ｆ６（Ｂ）、またはｈ−４２Ａ５（Ｃ）をサルに静脈内投与し（ｈ−３４Ｆ８およびｈ−１９Ｆ６ではｎ＝３、ｈ−４２Ａ５ではｎ＝４）、投薬前からの凝血重量の変化をＡＶシャント血栓症のサルモデルで決定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１対ビヒクル。
【図９Ａ−９Ｃ】カニクイザルにおける出血時間に対する抗体ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ−４２Ａ５の効果を例示する。漸増レベルのｈ−３４Ｆ８（Ａ）、ｈ−１９Ｆ６（Ｂ）、またはｈ−４２Ａ５（Ｃ）をサルに静脈内投与し（３４Ｆ８およびｈ−１９Ｆ６ではｎ＝３、ｈ−４２Ａ５ではｎ＝４）、出血時間を投薬前および各投薬後３０分で評価した。
【図１０Ａ−１０Ｂ】抗体ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ−４２Ａ５の抗血栓効果を例示する。サルの４つの群（ｎ＝５）に、２時間、ビヒクル、０．３ｍｇ／ｋｇのｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、またはｈ−４２Ａ５を静脈内投与しＦｅＣｌ３を各動物の左大腿動脈に適用して、血栓症を誘発した。血流速度を監視することによって、８０％の血栓性閉塞（Ａ）および１００％の血栓性閉塞（Ｂ）までの時間を決定した。＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１対ビヒクル。
【図１１Ａ−１１Ｄ】抗体ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、またはｈ−４２Ａ５による治療がサルにおける出血時間を延長しなかったことを例示する。サルの４つの群（ｎ＝５）に、ビヒクル、０．３ｍｇ／ｋｇのｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、またはｈ−４２Ａ５を静脈内投与し、テンプレートの出血時間を投薬前および投薬後１時間で測定した。ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ−４２Ａ５の治療群の個々の出血時間は、それぞれ（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）に示される。ビヒクル、ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、またはｈ−４２Ａ５の治療による出血時間の変化は、（Ｄ）に示される。
【図１２Ａ−１２Ｂ】サル血漿の凝血時間に対する抗体ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ−４２Ａ５の効果を例示する。サルの４つの群（ｎ＝５）に、それぞれビヒクル、０．３ｍｇ／ｋｇのｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ−４２Ａ５を静脈内投与し、血漿調製、ならびに凝血時間ＡＰＴＴおよびＰＴ決定のために投薬前および投薬後約３時間で収集した。ＡＰＴＴの変化およびＰＴの変化は、それぞれ（Ａ）および（Ｂ）に示される。＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１対ビヒクル。
【図１３】ヒトＦＸＩのアミノ酸配列（配列番号２０３）を例示する。
【図１４Ａ−１４Ｂ】カニクイザルにおけるＡPＴＴに対する修飾抗体ｈ−１９Ｆ６（Ａ）およびｈ−４２Ａ５（Ｂ）の効果を例示する。サルに、示された用量の修飾ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５を静脈内投与した。エクスビボ凝血時間ＡＰＴＴを投薬前（時間０）、ならびに投薬後０．５、２、６、１２、２４、４８、９６、１６８、２４０、および３３６時間で決定した。
【図１５Ａ−１５Ｂ】カニクイザルにおけるＰＴに対する修飾抗体ｈ−１９Ｆ６（Ａ）およびｈ−４２Ａ５（Ｂ）の効果を例示する。サルに、示された用量の修飾ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５を静脈内投与した。エクスビボ凝血時間ＰＴを投薬前（時間０）、ならびに投薬後０．５、２、６、１２、２４、４８、９６、１６８、２４０、および３３６時間で決定した。
【図１６Ａ−１６Ｂ】ヒト血漿中のＡＰＴＴおよびＰＴに対するｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の効果を例示する。図１６Ａは、ヒト血漿中のＡＰＴＴに対するｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の効果を示す。図１６Ｂは、ヒト血漿中のＰＴに対するｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の効果を示す。
【図１７】ヒトＦＸＩへの試験抗体の結合特異性を示す。ウエスタンブロッティングでは、１０μＬのヒト標準血漿またはＦＸＩ欠損血漿がＦＸＩ陽性およびＦＸＩ陰性対照として機能した。
【図１８】投薬前および投薬後１時間に記録された出血時間に対するＡＶシャント血栓症モデルにおけるｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の効果を示す。
【図１９Ａ−１９Ｄ】ヒトＦＸＩへのｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の結合特性を示す。図１９Ａは、示された濃度のＦＸＩの流れに供されたセンサーチップ上に捕捉されたｈ−１９Ｆ６のセンサーグラムを示す。図１９Ｂは、示された濃度のＦＸＩの流れに供されたセンサーチップ上に捕捉されたｈ−４２Ａ５のセンサーグラムを示す。図１９Ｃは、Ａ１、Ａ２、Ａ３、またはＡ４ドメインがプレカリクレインの対応するドメインで置き換えられた等量の４つの突然変異体ＦＸＩで固定化されたセンサーチップを試験抗体（５μｇ／ｍＬ）が通過したときに捕捉された抗体を示す。報告されている抗ＦＸＩ抗体であるＯ１Ａ６も陽性対照として試験した。図１９Ｄは、ＦＸＩがセンサーチップに固定化されたことを示す。Ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５（５μｇ／ｍｌ）をセンサー表面のフローセルに３０μｌ／分の流速で連続して注入し、応答の変化を監視した。実験を２回実施し、代表的な結果を示す。
【図２０Ａ−２０Ｂ】ヒトＦＸＩａへのｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の結合特性を示す。図２０Ａは、示された濃度のＦＸＩａの流れに供されたセンサーチップ上に捕捉されたｈ−１９Ｆ６のセンサーグラムを示す。図２０Ｂは、示された濃度のＦＸＩａの流れに供されたセンサーチップ上に捕捉されたｈ−４２Ａ５のセンサーグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の以下の説明は、本発明の様々な実施形態を単に例示することを意図する。したがって、考察された特定の修正は、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。当業者には、本発明の範囲から逸脱せずに様々な均等物、変更、および修正が実現され得ることが明らかであり、そのような均等な実施形態は本明細書に含まれることが理解される。
【００１３】
内因性経路および外因性経路の両方が、インビボの血液凝固カスケードに関与する。接触活性化経路とも呼ばれる内因性経路は、表面界面との接触によって開始され、ＦＸＩＩの活性化をもたらす。内因性経路は、ＦＸＩ、ＦＩＸ、およびＦＶＩＩＩも伴う。組織因子（ＴＦ）経路とも呼ばれる外因性経路は、血管損傷によって開始され、ＴＦ−ＦＶＩＩａの活性化複合体の形成をもたらす。これらの２つの経路が交わり、共通の経路を活性化し、これは、プロトロンビンからトロンビンへの変換、および最終的には架橋フィブリン凝血の形成に繋がる。理想的な抗凝固剤は、止血を損なうことなく血栓症を予防するのに効果的でなければならない。いくつかの証拠は、内因性凝固経路が凝固の増幅段階にとって重要であるのに対し、外因性および一般的な経路は開始段階および増殖段階により深く関与していることを示唆する。５〜８これらの所見は、内因性経路が正常な止血中にわずかな役割を果たし、内因性経路の阻害が低出血リスクで抗血栓効果を提供し得ることを示す。内因性経路の構成要素であるＦＸＩは、出血に影響を与えることなく抗血栓効果を誘発する可能性を有し得るため、最近注目される標的になってきた。３、５、６
【００１４】
ＦＸＩは、ＦＸＩａへの内因性経路を介して第ＸＩＩａ因子によって活性化され、次に第ＩＸ因子を活性化する。疫学研究は、ヒトのＦＸＩ欠損症は静脈血栓塞栓症および脳卒中のリスクの低下に関連するのに対し、ＦＸＩレベルの増加はリスクの増加に関連することを示唆している。９〜１１さらに、ＦＸＩ欠損症のヒトは、非常に低い出血傾向を示す。１２、１３さらに、ＦＸＩを欠損しているマウスは、出血が増加することなく多くのタイプの血栓症から保護される。１４さらに、ＦＸＩを阻害する小分子阻害剤、抗体、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血栓症の多くの動物モデルで出血リスクのない抗血栓特性を示している。
【００１５】
本明細書に開示される抗体は、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａに結合し、血液凝固の内因性経路を標的とする。ＦＸＩの構造および血液凝固へのＦＸＩの関与は、様々な出版物で報告されている。３３
【００１６】
動物および臨床研究は、ＦＸＩと血栓症との間に強い関連があることを示唆している。ＦＸＩ欠損マウスは多くの研究チームによって研究されており、ＦｅＣｌ３誘発性の動脈および深部静脈血栓症モデル、肺塞栓症モデル、ならびに脳動脈閉塞モデルを含む、いくつかのモデルで顕著な抗血栓性表現型を示している。１４、１７、２２、２３ヒトの疫学研究では、先天性ＦＸＩ欠損症を有する患者は、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）のオリシェミック脳卒中の影響を受けにくく、ＦＸＩのレベルがより高い対象者は、より低いレベルの対象者よりもＶＴＥおよび虚血性脳卒中のリスクが高くなる。９〜１１生理学的止血に関して、ＦＸＩの役割は不可欠であるように思われる。ＦＸＩ欠損マウスは、尾部出血時間が野生型動物と同等であるため、過度の出血を示さない。２３、２４さらに、重度のＦＸＩ欠損患者は、外科手術中、様々な出血を示す傾向があり得るが、自然出血を示さない。１２、１３２つ以上の抗血栓薬の組み合わせが、臨床的に広く使用される。以前の研究は、アスピリンが野生型マウスおよびＦＸＩ欠損マウスで同様の出血傾向を引き起こしたことを示し、これは、他の抗血栓療法が存在する場合でもＦＸＩの標的化はなおも安全であるということが示唆されていた。１４
【００１７】
上記のすべての発見は、ＦＸＩ／ＦＸＩａが、止血を損なうことなく血栓症関連疾患を治療するための安全な薬物標的であることを示す。したがって、抗体、オリゴヌクレオチド、および小分子阻害剤など、血栓症を治療するための療法を開発するための標的ＦＸＩ／ＦＸＩａに多くの手法が適用されてきた。５本明細書に記載されるように、ＦＸＩ／ＦＸＩａの抗体タイプの遮断薬が生成された。抗体の利点には、即効特性および投薬頻度の低さが含まれ、抗体の主な弱点は、潜在的な免疫原性である。２５インビボ研究を実施する前に、少なくとも２つの試験抗体をヒト化した。２つのヒト化抗体、ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５は、ヒトＦＸＩ／ＦＸＩａに対して非常に高い親和性を示した。興味深いことに、それらは、異なる領域に結合するが、ＦＸＩの同じドメイン（Ａ３）に結合する。理論に拘束されることなく、抗体は、両方ともＦＸＩａ活性を阻害する可能性があるが、ＦＸＩＩａまたはトロンビンのいずれかによって媒介されるＦＸＩ活性化に対しては効果を有さない。
【００１８】
様々なタイプのＦＸＩ／ＦＸＩａ阻害剤は、ＡＰＴＴを延長し、異なるモデルで抗血栓効果を示した。抗ＦＸＩ抗体１４Ｅ１１は、ＡＰＴＴを約１．３倍増加させ、ヒヒの露出した大腿動静脈シャントの血栓症を低減した。１７ＦＸＩ発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血漿ＦＸＩレベルを約５０％低減し、ヒヒの血栓形成を減少させた。２６、２７さらに、経口で生物学的に利用可能な小分子ＦＸＩａ阻害剤であるＯＮＯ−５４５０５９８は、血栓症のサルモデルにおける血栓形成を著しく阻害した。２８さらに、ＦＸＩ／ＦＸＩａを標的とする療法薬の抗血栓効果は、マウスおよびウサギの血栓症モデルなどの多くの非霊長類動物モデルでも確認されている。１９、２９〜３１最近の臨床試験は、ＦＸＩを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが膝関節形成術を受けている患者の静脈血栓症を予防することを示した。３２実施例に示されているように、２つの特徴的な霊長類血栓症モデルを使用して、ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の抗血栓症効果を評価した。ＡＶシャント血栓症モデルでは、両方の抗体が、用量依存的な様態で血栓形成を減少させた。ＦｅＣｌ３誘発性血栓症モデルでは、両方の抗体が、血栓症によって引き起こされた血管閉塞の時間を引き延ばした。これらの結果は、ＦＸＩ／ＦＸＩａ阻害剤の抗血栓の役割のさらなる証拠を提供する。ＡＶシャント血栓症モデルにおけるｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の血栓形成の用量依存的な低減は、血栓形成がＦＸＩ阻害の程度と負の相関関係にあり得ることを示唆しており、これはＡＰＴＴ延長によって示され得る。ｈ−４２Ａ５はＡＰＴＴの延長においてｈ−１９Ｆ６よりも強力であるため、ＦｅＣｌ３誘発性血栓症モデルにおけるｈ−４２Ａ５とｈ−１９Ｆ６との間の抗血栓効果の比較もそのような兆候につながる可能性がある。したがって、より長いＡＰＴＴによって示されるように、ＦＸＩ／ＦＸＩａ阻害剤によるＦＸＩ／ＦＸＩａのより強力な阻害は、より良好な抗血栓の結果をもたらし得る。
【００１９】
出血のリスクは、抗血栓剤の開発において最も懸念される問題である。前に言及したように、ＦＸＩ欠損患者は、外科的設定の下で出血傾向を示し得る。血漿ＦＸＩ活性阻害が、出血リスクの観点からなおもどの程度安全であるかは不明である。実施例に示されるように、ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５によるＦＸＩ／ＦＸＩａの集中的阻害の出血リスクを血栓症実験で使用されたのと同じサルで試験した。ＡＶシャント血栓症動物では、ｈ−１９Ｆ６またはｈ−４２Ａ５の治療用量が高まるにつれても出血傾向は観察されず、出血リスクは、ＦＸＩ阻害の程度とは無関係であり得ることを示唆している。ＦｅＣｌ３誘発性血栓症動物では、ｈ−１９Ｆ６治療もｈ−４２Ａ５治療も過度の出血を引き起こさなかった。ｈ−４２Ａ５治療は、血漿ＡＰＴＴの約２倍の上昇をもたらし、これは、９９％を超えるＦＸＩ阻害を示した。これまでの研究では、そのような集中的なＡＰＴＴ延長および高ＦＸＩ阻害条件下での出血リスクを評価したことはない。アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ４１６８５６は、出血リスクを評価したときにＡＰＴＴの３０％の上昇のみを引き起こした。２６霊長類における他の出血リスク評価研究では、高強力な抗ＦＸＩ抗体であるａＸＩＭａｂがＡＰＴＴの約１倍の増加を引き起こした（３０．５秒〜６５．６秒）。２６したがって、本明細書に記載の結果は、ＦＸＩ／ＦＸＩａの集中的な阻害が霊長類の出血リスクを増加させないことを示す。したがって、ＦＸＩは、血栓症治療の薬物標的として使用され得る。
【００２０】
抗ＦＸＩまたは抗ＦＸＩａ抗体
本明細書で提供されるのは、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／またはＦＸＩもしくはＦＸＩａのフラグメントに結合し、血餅の形成を阻害する抗体である。これらの抗体は、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／またはＦＸＩもしくはＦＸＩａのフラグメント（例えば、Ａ３ドメインを含むフラグメント）に結合し、最大安全用量よりもはるかに低い濃度で阻害効果を示すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、０．１ｍｇ／ｋｇの静脈注射と３ｍｇ／ｋｇの静脈注射との間の抗体の用量は、カニクイザルにおけるＦＸＩからＦＸＩａへの変換に対して阻害効果を示す。さらに、本明細書に開示される抗体は、ヘパリンなどの従来の抗凝固剤に対して出血を引き起こすリスクが最小限であるため、優れた安全性を備える抗凝固剤として使用され得る。
【００２１】
実施例に示されているように、抗凝固特性を有する抗体を特定するためにヒトＦＸＩでラットを免疫することによって、多くの抗ヒトＦＸＩ抗体を生成した。そのような抗体が１２個特定され、そのうちのいくつかをさらなる開発のためにヒト化した。ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５抗体などのヒト化ラット抗ヒトＦＸＩ抗体をインビトロおよびインビボで特徴付けた。インビトロ研究では、ヒト化抗体は、第ＩＸ因子の活性化ＦＸＩ（ＦＸＩａ）媒介性加水分解を阻害したが、第ＸＩＩａ因子誘発性ＦＸＩ活性化は阻害しなかった。ＦＸＩへの抗体の結合特性を決定し、ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の解離定数（ＫＤ）はそれぞれ２２ｐＭおよび３５ｐＭであった。これらの２つの抗体は、ＦＸＩのＡ３ドメインの異なる部位に結合する。インビボ研究では、２つの異なる霊長類血栓症モデルを使用して、ヒト化抗体の抗血栓効果および出血リスクを評価した。動静脈（ＡＶ）シャント血栓症モデルでは、両方の抗体が、出血を引き起こすことなく、血栓形成を用量依存的に減少させた。ＦｅＣｌ３誘発性血栓症モデルでは、両方の抗体が、血栓症媒介性血管閉塞までの時間を引き延ばし、どちらの抗体も出血を増加させなかった。２つの抗体は、霊長類の止血を損なうことなく抗血栓の有効性を示し、ＦＸＩの標的化が血栓症の治療に使用され得ることをさらに確認した。
【００２２】
本明細書において使用される場合、組成物または方法に関する「含む」という用語は、組成物または方法が少なくとも列挙された要素を含むことを意味する。「から本質的になる」という用語は、組成物または方法が列挙された要素を含み、組成物または方法の新規および基本的な特徴に実質的に影響を与えない１つ以上の追加の要素をさらに含み得ることを意味する。例えば、列挙された要素から本質的になる組成物は、それらの列挙された要素に加えて、単離および精製方法からの１つ以上の微量汚染物質、リン酸緩衝生理食塩水等の薬学的に許容される担体、保存剤等を含み得る。「からなる」という用語は、組成物または方法が、列挙された要素のみを含むことを意味する。これらの移行句の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原、例えば、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、またはＦＸＩもしくはＦＸＩａの特定のドメインもしくはフラグメント、例えば、Ａ３ドメインに特異的に結合するか、またはそれらと免疫学的に反応する免疫グロブリン分子またはその免疫学的に活性な部分を指す。特定の実施形態では、本方法、本組成物、および本キットで使用するための抗体は、全長免疫グロブリン分子であり、これは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含み、各重鎖および軽鎖は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。天然抗体に加えて、「抗体」という用語はまた、合成抗体、イントラボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ペプチドボディ、およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、ダイアボディ、トライアボディ、およびテトラボディ）などの免疫グロブリンの遺伝子組み換え形態またはそうでない場合は修飾形態を含む。本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体が免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分であるこれらの実施形態では、抗体は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド連結Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、またはダイアボディであり得る。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分であるものを含む、本明細書に開示される抗体は、特定の抗原、例えば、ＦＸＩもしくはＦＸＩａに結合する能力、またはＦＸＩもしくはＦＸＩａの特定のフラグメント、例えば、Ａ３ドメインに結合する能力を保持する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体は、リン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、ニトロシル化、グリコシル化、またはヒトもしくは非ヒト宿主細胞を含む哺乳動物細胞株における発現に関連する脂質化などの翻訳後修飾を受けている。組換え抗体を産生するための、ならびに組換え抗体のインビトロおよびインビボ修飾のための技法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ６（５）：１１４５−１１５４（２０１４）を参照されたく、その内容は参照によって組み込まれる。
【００２５】
本明細書に開示される抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体をコードするポリヌクレオチドまたは核酸もまた開示される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む。本明細書に開示される抗体またはその機能的フラグメントをコードする核酸は、ｐＴＴ５哺乳動物発現ベクターなどのベクターにクローニングすることができ、これは、核酸が抗体またはその機能的フラグメントを産生するために発現され得るようにプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御要素をさらに含み得る。
【００２６】
本明細書に開示される抗体のいくつかの例の、ＶＨおよびＶＬならびにＣＤＲの配列を含む、核酸（ＤＮＡ）および／またはアミノ酸（ＰＲＴ）配列は、以下の表１に列挙される。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【００２７】
本明細書の特定の実施形態では、ヒト化抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体が提供される。抗体が修飾されて、ヒトにおいて天然に発生する抗体との類似性が高まるように、非ヒト種からの抗体をヒト化するための様々な技法が当技術分野で知られている。天然抗体の各抗原結合ドメインには６つのＣＤＲが存在する。これらのＣＤＲは、抗体が３次元構成をとるときに、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置された短い非連続のアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる抗原結合ドメインの残りのアミノ酸は、分子間変動が少なく、ＣＤＲの正しい配置を可能にする足場を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体またはフラグメントは、ＣＤＲ３領域の保存された配列を有する。
【００２８】
例えば、本明細書に開示される抗体のヒト化は、マウスまたはラットを免疫化することによって産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲグラフトによって達成され得る。マウスモノクローナル抗体のＣＤＲは、ヒトフレームワークにグラフトすることができ、その後、ヒト定常領域に結合して、ヒト化抗体を得る。簡単に説明すると、ヒト生殖系列抗体配列データベース、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）、ＩＮＮ（国際一般名）データベース、および他の好適なデータベースを検索することが可能であり、抗体に最も類似したフレームワークを検索によって特定することができる。さらに、ドナー残基へのいくつかの逆突然変異は、ヒトアクセプターフレームワークで行われる。いくつかの実施形態では、可変領域は、ヒトＩｇＧ定常領域に連結している。例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４Ｆｃドメインが使用され得る。既存の技術に基づいて非ヒト種によって産生されたモノクローナル抗体をヒト化することは、当業者の範囲内である。
【００２９】
ヒト化抗体のいくつかの例の可変領域の配列は、以下の表２に示される。
【表２】
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【００３０】
本明細書で提供される抗体は、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／またはそれらのフラグメント（例えば、Ａ３ドメインを含むフラグメント）に対する結合親和性を保持しながら、アミノ酸配列に１つ以上の突然変異を含む本明細書に開示される配列のバリアントを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９、１０、２５、２６、４１、４２、５７、５８、７３、７４、８９、９０、１０５、１０６、１２１、１２２、１３７、１３８、１５３、１５４、１６９、１７０、１８５、１８６、および１９７〜２０９、からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、またはＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／もしくはそれらのフラグメントに対する結合親和性を保持するそれらのフラグメントを有する可変領域を含む。
【００３１】
また、本開示には、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／またはそれらのフラグメント（例えば、Ａ３ドメインを含むフラグメント）に結合する抗体をコードする核酸のバリアントが含まれる。いくつかの実施形態では、抗体をコードする核酸は、配列番号１、２、１７、１８、３３、３４、４９、５０、６５、６６、８１、８２、９７、９８、１１３、１１４、１２９、１３０、１４５、１４６、１６１、１６２、１７７、および１７８、からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である核酸配列、またはＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／もしくはそれらのフラグメントに対して結合親和性を有するポリペプチドをコードするそれらのフラグメントを有する可変領域を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に開示されるモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体などの新規抗体が発見からヒト臨床試験へ、次に医薬品市場に進んでいくように、戦略的化学、製造、および品質管理（ＣＭＣ）開発にさらに供される。修飾は、抗体の免疫学的機能を損なうことなく、抗体の特性をさらに改善する。特定の実施形態では、ＣＭＣ修飾抗体は、未修飾抗体と比較して、様々な温度（例えば、４℃、２５℃、および３７℃）下で長期間（例えば、３日、７日、１４日、および２８日）および反復的な凍結／解凍サイクル下（例えば、−４０℃／２５℃で最大５サイクル）でより安定する。さらに、ＣＭＣ修飾抗体は、許容できる溶解度を有する。例えば、軽鎖または重鎖の所与の配列について、特定のアミノ酸は、潜在的な酸化およびグリコシル化部位であり得る。潜在的な酸化、脱アミド化、またはグリコシル化部位のこれらのアミノ酸残基は突然変異する可能性があり、特定の抗体の３Ｄ構造および機能を維持するために、近接する追加の残基も突然変異および／または最適化され得る。いくつかの実施形態では、酸化、脱アミド化、またはグリコシル化の可能性を有するＣＤＲ領域の１つ以上のアミノ酸残基は、免疫学的機能を損なうことなく抗体またはそのフラグメントの安定性を改善するために突然変異される。いくつかの実施形態では、酸化の可能性を有するＣＤＲ領域内の１つ以上のＭｅｔ残基が突然変異される。いくつかの実施形態では、脱アミド化の可能性を有するＣＤＲ領域内の１つ以上のＡｓｎ残基が突然変異される。
【００３３】
ＣＭＣ最適化ヒト化抗体のいくつかの例の可変領域の配列は、以下の表３に示される。
【表３】
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【００３４】
医薬組成物
本明細書に開示される抗体は、医薬組成物に処方され得る。医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、防腐剤、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。医薬組成物は、様々な製剤、例えば、注射可能な製剤、凍結乾燥製剤、液体製剤などを有し得る。製剤および投与経路に応じて、アジュバント、担体、賦形剤、防腐剤などの好適な添加剤を選択する。３４
【００３５】
医薬組成物は、本組成物を使用するための説明書と共にキットに含まれ得る。
【００３６】
治療方法
本明細書で提供されるのは、血栓症を患っている対象、および／または血栓症を発症するリスクが高い対象における血栓症を治療および／または予防する方法である。対象における血餅の形成を阻害する方法も提供される。これらの方法は、内因性経路に介入するために、本明細書で提供される治療有効量の抗ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａ抗体を投与することを必然的に伴う。いくつかの実施形態では、これらの方法は、本明細書で提供されるような抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００３７】
本明細書に開示される方法は、それを必要とする対象における血栓症に関連する合併症または状態を予防および／または治療するために使用され得る。血栓症は、塞栓性脳卒中、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、および肺塞栓症（ＰＥ）などの静脈血栓症、急性冠症候群、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）などの動脈血栓症（ＡＣＳ）などのいくつかの合併症または状態を引き起こすか、またはそれらに関連する。血栓症に関連する他の状態には、例えば、外科患者、身体の不自由な患者、癌患者、心不全患者、妊娠中の患者、または血栓症を引き起こし得る他の病状を有する患者におけるＶＴＥの高リスクが含まれる。本明細書に開示される方法は、予防的抗凝固療法、すなわち血栓予防に関する。これらの方法は、本明細書に開示されるような治療有効量の抗ＦＸＩおよび／もしくはＦＸＩａ抗体、または抗ＦＸＩおよび／もしくはＦＸＩａ抗体を含む治療有効量の医薬組成物を、上に開示される血栓症関連合併症を患う対象に投与することを必然的に伴う。抗体または医薬組成物は、単独で、または血栓症関連合併症もしくは状態を治療または予防するための任意の他の療法と組み合わせて投与され得る。
【００３８】
治療および／または予防を必要とする対象における敗血症を治療および／または予防する方法も提供される。死亡率または罹患率を改善するために、敗血症患者に抗凝固剤を投与することが試みられた。しかし、抗凝固剤によって引き起こされた望ましくない出血のため、試みは失敗した。本明細書に開示される抗体は、抗生物質などの敗血症を治療するための他の療法剤と組み合わせた二次療法として使用され得る。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物対象、好ましくはヒトを指す。「それを必要とする対象」は、血栓症または血栓症に関連する合併症もしくは状態と診断された対象か、あるいは血栓症または血栓症に関連する合併症もしくは状態を発症するリスクが高い対象を指す。「対象」および「患者」という語句は、本明細書では互換的に使用され得る。
【００４０】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、状態に関して本明細書において使用される場合、状態を部分的または完全に緩和する、状態を防止する、状態の発生もしくは再発の可能性を低下させる、状態の進行もしくは発達を遅延させる、または病状に関連する１つ以上の症状の発達を排除、軽減もしくは遅延させることを指す。血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態に関して、「治療する」は、既存の血餅が大きくなるのを防止もしくは遅らせること、および／または血餅の形成を防止もしくは遅らせることを指す場合がある。いくつかの実施形態では、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、抗体またはその機能的フラグメントを投与されない対象と比較して、対象の血餅の数またはサイズが低減していることを意味する。いくつかの実施形態では、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、血栓症および／または血栓症関連の状態もしくは合併症の１つ以上の症状が、本明細書に開示されるような抗体または医薬組成物を受ける対象において、そのような治療を受けていない対象と比較して軽減されることを意味する。
【００４１】
本明細書において使用される場合、抗体または医薬組成物の「治療有効量」は、血栓症の治療および／または予防など、対象において所望の治療効果を生み出す抗体または医薬組成物の量である。特定の実施形態では、治療有効量は、最大の治療効果をもたらす抗体または医薬組成物の量である。他の実施形態では、治療有効量は、最大治療効果よりも少ない治療効果をもたらす。例えば、治療有効量は、最大の治療効果をもたらす投薬量に関連する１つ以上の副作用を回避しながら治療効果を生み出す量であってもよい。特定の組成物の治療有効量は、治療組成物の特徴（例えば、活性、薬物動態、薬力学、および生物学的利用能）、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、性別、疾患のタイプおよび病期、病歴、一般的な体調、所定の投薬量に対する反応性、ならびにその他の現在の投薬）、組成物中の任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、および保存剤の性質、ならびに投与経路を含むがそれらに限定されない、様々な因子に基づいて変動する。臨床および薬理学分野の当業者は、日常的な実験によって、すなわち、抗体または医薬組成物の投与に対する対象の応答を監視し、それに応じて投薬量を調整することによって、治療有効量を決定することができる。追加のガイダンスについては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０１２、およびＧｏｏｄｍａｎ  ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０１１を参照されたく、その開示全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体の治療有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００４３】
皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、髄腔内投与、または腹腔内投与などの好適な投与経路を選択することは、当業者の範囲内である。治療を必要とする対象を治療するために、抗体または医薬組成物は、即時放出、制御放出、または持続放出のために、連続的または断続的に投与され得る。さらに、抗体または医薬組成物は、１日３回、１日２回、または１日１回で、３日間、５日間、７日間、１０日間、２週間、３週間、または４週間の期間投与され得る。抗体または医薬組成物は、所定の期間にわたって投与され得る。あるいは、抗体または医薬組成物は、特定の治療ベンチマークが達成されるまで投与され得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、抗体または医薬組成物の投与を継続するかどうかを決定するために、１つ以上の治療ベンチマークを評価するステップを含む。
【００４４】
抗体の産生方法
本明細書に開示される抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を産生する方法も本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらの方法は、抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体をコードする核酸をベクターにクローニングし、ベクターで宿主細胞を形質転換し、抗体を発現するように宿主細胞を培養するステップを必然的に伴う。発現された抗体は、任意の既知の技法を使用して宿主細胞から精製され得る。ｐＴＴ５ベクター、およびｐｃＤＮＡ３ベクターなどの様々な発現ベクター、ならびにＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１およびＥｘｐｉＣＨＯ）およびＨＥＫ１９３Ｔ細胞などの様々な宿主細胞株が使用され得る。
【００４５】
上に開示された方法によって産生された抗体もまた、本開示に含有される。抗体は、１つ以上の翻訳後修飾に供されている可能性がある。
【００４６】
以下の実施例は、実施形態をより良く例示するために提供されるものであり、いかなる特許請求される実施形態の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特定の材料が言及される場合、それは単に例示を目的としており、本発明を限定することを意図しない。当業者は、発明の法的能力を行使することなく、また本発明の範囲から逸脱することなく、均等の手段または反応物質を開発することができる。本発明の境界内であることを維持しながら、本明細書に記載の手順に多くの変更を行うことができることが理解される。本発明者らは、そのような変更が本発明の範囲内に含まれることを意図する。
【実施例】
【００４７】
実施例１：材料および方法
材料。ヒトＦＸＩ（カタログ番号ＨＦＸＩ１１１１）、ＦＸＩａ（カタログ番号ＨＦＸＩａ１１１１ａ）、ＦＸＩＩａ（ＨＦＸＩＩａ１２１２ａ）、およびＦＩＸ（カタログ番号ＨＦＩＸ１００９）をＥｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＩＮ，ＵＳＡ）から購入した。
【００４８】
抗体の調製。動物の免疫化およびハイブリドーマのスクリーニングをＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ_（中国、南京）で実施し、このプロトコルで動物に適用した手順は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。承認されたガイドラインに従って、実験を実施した。ＷｉｓｔａｒラットをヒトＦＸＩで免疫化し、免疫応答が良好な動物の脾細胞をハイブリドーマの調製のために収集し、これを限界希釈によるサブクローニングに供した。最後に、１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、および４２Ａ５を含む、所望の抗ＦＸＩ抗体を発現するいくつかのモノクローナルハイブリドーマクローンが、ＥＬＩＳＡおよび機能的スクリーニングを使用することによって得られた。それらの可変領域のアミノ酸配列を決定した後、１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、および４２Ａ５をヒト化に供し、ＩｇＧ４形態の３つのヒト化抗体、ｈ−１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、およびｈ−４２Ａ５をもたらした。これらの３つのヒト化抗体を一過性の哺乳動物発現システムで産生し、タンパク質Ｇクロマトグラフィーによって精製した。
【００４９】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）。Ｓｙｍｅｎｓ  Ｉｎｃ．から購入した標準的なヒト血漿を、０〜４００ｎＭの様々な濃度の等量の様々な抗体と５分間混合した後、ＣＡ６００分析装置で試験した。ＡＰＴＴアッセイでは、５０μＬの血漿−抗体混合物と２５μＬのＡＰＴＴ試薬（ＳＭＮ１０４４５７０９、Ｓｙｍｅｎｓ  Ｉｎｃ．）とを３７℃で４分間混合した。次に、２５μＬのＣａＣｌ２溶液（２５ｍＭ、ＳＭＮ１０４４６２３２、Ｓｙｍｅｎｓ  Ｉｎｃ．）を添加し、凝血形成までの時間を決定した。ＰＴアッセイでは、５０μＬの血漿−抗体混合物を等量のＰＴ試薬（ＳＭＮ１０４４６４４２、Ｓｙｍｅｎｓ  Ｉｎｃ．）と３７℃で混合し、凝血形成までの時間を決定した。
【００５０】
サル血漿中のＡＰＴＴおよびＰＴに対する抗体の効果も、ヒト血漿に適用されたのと同じ方法を使用して評価した。これらのアッセイでは、上記のヒト血漿−抗体混合物の代わりに、等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈したサル血漿を使用した。
【００５１】
ＦＸＩＩａによるＦＸＩ活性化。ヒトＦＸＩ（５００ｎＭ）を、ＰＢＳ中の１μＭの対照ＩｇＧ４またはｈ−１９Ｆ６またはｈ−３４Ｆ８またはｈ−４２Ａ５と共に室温で５分間事前インキュベートした。時間ゼロで、ＦＸＩＩａ、ＨＫ、およびカオリンを添加して、最終濃度がＦＸＩ（２５０ｎＭ）、ＦＸＩＩａ（５０ｎＭ）、ＨＫ（１００ｎＭ）、およびカオリン（０．５ｍｇ／ｍＬ）になるようにした。０、３０、６０、１２０分間隔で、５０μＬのサンプルを硫酸ドデシルサンプルバッファーに収集した。サンプルを１０％非還元ゲルでサイズ分画し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。ウエスタンブロッティングを実施して、マウス抗ヒトＦＸＩ  ＩｇＧ（１Ｃ５、ＦＸＩのＣ末端に結合する自社製抗体）を使用し、ＦＸＩ、ならびにＦＸＩａ−軽鎖レベルを決定した。画像の結果は、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を備えるＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して取得した。
【００５２】
ＦＸＩａ媒介性ＦＩＸ活性化。ヒトＦＩＸ（２００ｎＭ）を、１μＭの対照ｌｇＧ４、ｈ−１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、またはｈ−４２Ａ５の存在下で、室温で５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＰＢＳ中のＦＸＩａ（５ｎＭ）と共にインキュベートした。０、１５、３０、４５、および６０分間隔で、５０μＬのサンプルを硫酸ドデシルサンプルバッファーに収集した。サンプルを１０％非還元ゲルでサイズ分画し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。ウエスタンブロッティングを実施して、ヤギ抗ヒトＦＩＸ  ＩｇＧ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用し、ＦＩＸ、ならびにＦＩＸａレベルを決定した。画像の結果は、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を備えるＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して取得した。
【００５３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）。抗体とＦＸＩとの相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＳＰＲアッセイによって決定した。簡単に説明すると、ヒトＩｇＧ捕捉抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に事前に固定化し、チップに流すことによって試験抗体を捕捉した。捕捉された試験抗体の最終量を、捕捉時間を調整することによって等量の１５応答単位（ＲＵ）に調整した。次に、抗原ＦＸＩを、会合のために１８０秒間、次に解離のために１２００秒間チップに流した。ＦＸＩを０．０６３、０．３１３、０．６２５、１．２５、３．１２５、および６．２５ｎＭの濃度で試験した。データを収集し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して試験抗体とＦＸＩとの間の親和性を分析した。
【００５４】
ＦＸＩ上の試験抗体の結合部位を決定するために、Ｃ末端に６×Ｈｉｓでタグ付けされたＦＸＩの４つの突然変異体を、各アップルドメイン（Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４）をヒトプレカリクレインの対応するドメインで置き換えることによって最初に生成した。等量の各突然変異体をＣＭ５センサーチップに固定化し、試験抗体（３３．３ｎＭ）を会合のために１８０秒間、次に解離のために１２００秒間チップに流した。捕捉された各抗体の量を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して応答ユニット（ＲＵ）で記録した。
【００５５】
試験抗体のエピトープ結合結果も、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００システムを使用して分析した。簡単に説明すると、６×Ｈｉｓタグ付きの野生型ＦＸＩをＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に事前に固定化し、ｈ−１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、またはｈ−４２Ａ５（５μｇ／ｍｌ）をセンサー表面のフローセルに３０μｌ／分の流速で連続して注入して、応答の変化を監視した。
【００５６】
カニクイザルにおける薬力学。この動物実験およびそれに続くＡＶ血栓症実験をＷｉｎｃｏｎ  Ｉｎｃ．（中国、南寧市）で実施し、このプロトコルで動物に適用した手順は、Ｗｉｎｃｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。承認されたガイドラインに従って、実験を実施した。動物は、異なる用量のｈ−１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、またはｈ−４２Ａ５の静脈内ボーラス注射を受けた。上肢の表在静脈からの２ｍＬの血液を、投薬前（時間０）、ならびに投薬後０．５時間、１時間、３時間、６時間、１２時間、および２４時間に３．２％クエン酸ナトリウムを含有する収集チューブに収集した。次に、チューブを室温で１０回穏やかに反転させて混合した。血漿を標識チューブに収集し、凝血時間分析まで−２０℃で保存した。血漿サンプルを等量のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈し、次に自動分析装置（ＣＡ６６０、Ｓｙｓｍｅｘ  Ｉｎｃ．）でＡＰＴＴおよびＰＴ分析に供した。
【００５７】
ＡＶシャント血栓症および出血時間試験。カニクイザルに、試験後３０分の抗体治療を静脈内ボーラス投与した。次に、尾静脈出血時間試験を実施し、続いて血栓症を誘発した。血栓症は、大腿動脈カニューレと大腿静脈カニューレとの間に事前に計量した長さ１０ｃｍの糸を含むシャントデバイスを接続することによって誘発した。血液をシャントに１０分間流した。糸に形成された血栓の重さを計量した。シャントを取り除いた直後に血液サンプルを収集し、次により高レベルの試験抗体を投与した。この出血／血栓症プロセスを４回実行して、同じ動物にビヒクルおよび３つの漸増レベル（０．１、０．３、１ｍｇ／ｋｇ）の試験抗体を投薬した。
【００５８】
出血時間の評価のために、２ｍＬの注射器を動物の尾静脈に挿入した。注射器内の血液量の増加が止まったとき、経過時間を出血時間として手動で記録した。
【００５９】
塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）誘発性血栓症および出血時間の試験。この動物実験をＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（上海、中国）で実施し、このプロトコルで動物に適用した手順は、ＰｈａｒｍａＬｅｇａｃｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。承認されたガイドラインに従って、実験を実施した。カニクイザルに１．５ｍｇ／ｋｇのゾレチルで事前に麻酔し、挿管し、人工呼吸器で人工呼吸を行った。麻酔をイソフルランで維持した。手順全体を通して、血圧、心拍数、および体温を監視した。ビヒクル、または０．３ｍｇ／ｋｇのｈ−１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、もしくはｈ−４２Ａ５を、ＦｅＣｌ３適用の２時間前に四肢静脈から投与した。左大腿動脈を露出させ、鈍的切開によって隔離した。ドップラーフロープローブを動脈に設置し、血流を継続的に記録した。ＦｅＣｌ３を適用する前に、血流を少なくとも５分間測定した。次に、４０％のＦｅＣｌ３をあらかじめ浸した２枚の濾紙を、プローブの上流の血管の外膜表面に１０分間適用した。濾紙を取り除いた後、適用部位を生理食塩水で洗浄した。血流が０に減少するまで継続的に測定した。８０％閉塞までの時間（血流がベースライン血流の２０％まで低減）および１００％閉塞までの時間（血流が０まで低減）を記録した。同じ動物において、サージカットデバイスを使用して止血を評価し、出血時間を投薬前および投薬後１時間において手動で記録した。研究の終わり（投薬後約３時間）に、血液サンプルを収集した。
【００６０】
血漿中のヒトＦＸＩに対する試験抗体の結合特異性。試験抗体（ｈ−１９Ｆ６、ｈ−４２Ａ５、および１４Ｅ１１）を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（カタログ番号２１４３５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｉｎｃ．）を使用して最初にビオチン化した。これらの抗体（各２５μｇ）を２００μＬのヒト標準血漿（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｉｎｃ．）またはＦＸＩ欠損血漿（Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｉｎｃ．）と共に１時間インキュベートした。次に、５０μＬのストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｉｎｃ．）を混合物に添加して、ビオチン含有抗原−抗体複合体を抽出した。ＰＢＳで３回洗浄した後、次に抗原−抗体複合体を溶出し、マウス抗ヒトＦＸＩ  ＩｇＧ（１Ｃ５、ＦＸＩのＣ末端に結合する自社製抗体）を一次抗体としてウエスタンブロッティングに供した。画像の結果は、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を備えたＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して取得した。ウエスタンブロッティングでは、１０μＬのヒト標準血漿およびＦＸＩ欠損血漿がそれぞれ、ＦＸＩ陽性およびＦＸＩ陰性対照として機能した。
【００６１】
統計分析複数の実験からの数値データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。ＡＶシャント実験および両方の出血時間試験における血栓重量の統計分析のために、一元配置分散分析およびそれに続くダネットの多重比較試験を使用した。ＦｅＣｌ３誘発性血栓症実験における閉塞時間の統計分析のために、クラスカル・ワリス順位試験を実施した。Ｐ＜０．０５の値を統計的に有意であると見なした。
【００６２】
実施例２：抗ＦＸＩ抗体の生成および配列決定
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＷｉｓｔａｒラットをヒトＦＸＩで免疫化し、免疫応答が良好な動物の脾細胞をハイブリドーマの調製のために収集し、これを限界希釈によるサブクローニングに供した。捕捉ＥＬＩＳＡおよび機能的スクリーニングを使用することによって、所望の抗ＦＸＩ抗体３Ｇ１２、５Ｂ２、７Ｃ９、７Ｆ１、１３Ｆ４、１９Ｆ６、２１Ｆ１２、３４Ｆ８、３８Ｅ４、４２Ａ５、４２Ｆ４、および４５Ｈ１を発現する１２のモノクローナルハイブリドーマクローンを得た。
【００６３】
これらの抗体のアミノ酸、ならびに軽鎖（ＶＬ）の可変領域および重鎖（ＶＨ）の可変領域のヌクレオチド配列を決定するために、ＶＬおよびＶＨをコードするｃＤＮＡを標準的なＲＴ−ＰＣＲ手順によって、対応するハイブリドーマ細胞からクローニングした。ＣＤＲの配列を含む代表的な抗体のＶＬおよびＶＨ配列を表１に示す。
【００６４】
実施例３：活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイおよびプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイを使用したヒト血漿中の抗凝固活性の決定。
ＡＰＴＴアッセイは、凝固の内因性および一般的な経路の活性を測定し、ＰＴアッセイは、凝固の外因性および一般的な経路の活性を測定する。これらの実験で試験された抗体は、１９Ｆ６、３４Ｆ８、４２Ａ５、１Ａ６、および１４Ｅ１１であった。この実験では、抗体１Ａ６および１４Ｅ１１を陽性対照として使用した。対照抗体の可変領域の配列を米国特許第８，３８８，９５９号および米国特許出願公開第２０１３／０１７１１４４号から得て、ＩｇＧ４に再フォーマットした。次に、これらの抗体をＥｘｐｉＣＨＯ細胞システムを使用して発現させた。ＡＰＴＴアッセイおよびＰＴアッセイを上記のように実施した。
【００６５】
図１に示すように、試験したすべての抗体は、比較的低濃度、例えば、最大１００ｎＭ（または、１４Ｅ１１の場合は最大２００ｎＭ）で濃度依存的な様態でＡＰＴＴを増加させたが、これらの抗体はいずれも、ＰＴに対して有意な効果を有さなかった（データの提示無し）。これらの結果は、試験した抗体のすべてが凝固の内因性経路を阻害したが、外因性経路は阻害しなかったことを示す。
【００６６】
実施例４：活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイを使用した非ヒト種の血漿中の抗凝固活性の決定
凝固に対する１９Ｆ６、３４Ｆ８、および４２Ａ５を含む様々な抗体の効果を、実施例３に記載されたのと同じ方法を使用して、マウス、ラット、およびサルの血漿で評価した。試験した抗体はいずれもマウスおよびラット血漿のＡＰＴＴに対して一切の効果を有さなかったが、それらのすべては、図２に示すように、比較的低濃度で濃度依存的にサル血漿中のＡＰＴＴを増加させ、これは、試験した抗体がサルＦＸＩ／ＦＸＩａとの交差活性を有したが、マウスまたはラットＦＸＩ／ＦＸＩａとの交差活性を有さなかったことを示した。
【００６７】
実施例５：抗ＦＸＩ抗体のヒト化
療法薬としてのマウスモノクローナル抗体の直接使用は、短い半減期およびヒト抗マウス抗体応答の誘因によって妨げられてきた。この問題の１つの解決策は、マウス抗体をヒト化することである。一部の抗体をＣＤＲグラフト化によるヒト化に供した。各マウス抗体のＶＬおよびＶＨの両方のための好適なヒトアクセプターフレームワークを特定し、様々な数の逆突然変異を、得られた抗体の構造および／または機能を維持するように選択されたヒトフレームワークに導入した。これらのヒト化抗体の親和性および機能が対応する非修飾抗体よりも実質的に劣っていない場合、修飾抗体は正常にヒト化されたと見なした。それぞれｈ−１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、およびｈ−４２Ａ５として記載される１９Ｆ６、３４Ｆ８、および４２Ａ５の３つのヒト化ＶＨおよびＶＬ配列を表２に示す。
【００６８】
実施例６：ヒトＦＸＩに対する抗ＦＸＩ抗体の親和性の決定。
ＦＸＩ／ＦＸＩａに対する抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器で実施した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して決定した。ヒト化抗体を、本明細書に開示される抗体の可変領域をヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインに連結することによって構築し、組換え体をＣＨＯ細胞で発現した。これらの抗体を、抗ヒトＩｇＧ抗体で事前に固定化したＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップに捕捉した。
【００６９】
次に、異なる濃度の精製抗原ＦＸＩまたはＦＸＩａ（０．００５〜１μｇ／ｍＬ）を、抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体との会合のために１８０秒間、その後解離のために１８００秒間ＣＭ５チップに流した。結合データを収集し、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって提供されるＢｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、ＦＸＩ／ＦＸＩａと試験抗体との間の親和性を分析した。固定化されたｈ−１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、およびｈ−４２Ａ５に結合するＦＸＩ／ＦＸＩａのＳＰＲセンサーグラムを図３に示す。図３に示すように、各抗体の応答（ＲＵ）は、ＦＸＩまたはＦＸＩａの濃度が高くなるにつれて高くなった。ＦＸＩおよびＦＸＩａに対するｈ−１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、およびｈ−４２Ａ５の解離定数（ＫＤ）を計算し、表４に詳細を示した。ＦＸＩとＦＸＩａに対する各抗体の親和性は、それらの差が１０倍未満であるため、同じであると見なされる。
【表４】
2021534098.tif 000018
【００７０】
実施例７：ＦＸＩ上の抗ＦＸＩ抗体の結合部位の決定
ＦＸＩ上の１９Ｆ６および４２Ａ５の結合部位を、ＳＰＲ技術を使用して決定した。簡単に説明すると、ヒトＩｇＧ捕捉抗体をＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップに事前に固定化し、チップに流すことによって組換えｈ−１９Ｆ６またはｈ−４２Ａ５を捕捉した。抗体の流動時間を調整することによって、等量（１５相対単位）のｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５を捕捉した。次に、個々のアップルドメインがヒトプレカリクレイン（ＦＸＩ／ＰＫキメラ）からの対応するドメインで置き換えられた野生型ＦＸＩまたはキメラＦＸＩを、ｈ−１９Ｆ６またはｈ−４２Ａ５と会合のために１８０秒間、その後解離のために１８００秒間チップに流した。１つの濃度の野生型またはキメラのＦＸＩのみをＳＰＲアッセイで試験したため、結合データを高性能速度論モードで分析した。結果は、ＦＸＩのＡ３ドメインが対応するＰＫドメインで置き換えられた場合を除いて、ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の両方がＦＸＩ、ならびにＦＸＩ／ＰＫキメラに結合することを示し、これは、ＦＸＩ上のｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の部分的または完全なエピトープがＡ３ドメインにあることを示した。
【００７１】
実施例８：抗体によるＦＸＩａの機能的中和
ヒトＦＸＩａ活性を、特定の発色基質であるＳ−２３６６（Ｄｉａｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．）の切断を測定することによって決定した。抗体の阻害活性を試験するために、抗体ｈ−１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、およびｈ−４２Ａ５を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の５ｎＭのＦＸＩａの最終濃度において室温で５分間事前インキュベートした。次に、等量の１ｍＭのＳ−２３６６を添加して、ＦＸＩａ切断反応を開始し、Ｍ５ｅプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して４０５ｎｍでの吸光度の変化を継続的に監視した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、図４に示す。ｈ−１９Ｆ６、ｈ−３４Ｆ８、およびｈ−４２Ａ５の計算された見かけのＫｉは、それぞれ０．６７、２．０８、および１．４３ｎＭである。したがって、試験した３つの抗体はすべて、比較的低濃度でＦＸＩａに対して満足のいく阻害効果を示した。
【００７２】
実施例９：抗体によるＦＸＩａ媒介性ＦＩＸ活性化の阻害
ＦＸＩａ媒介性ＦＩＸ活性化を上記のように実施した。抗ＦＸＩ抗体は、ＦＸＩ活性化を阻害することによって、および／またはＦＸＩａ活性を阻害することによって、内因性経路を調節し得る。最初に、ＦＸＩＩａ媒介性ＦＸＩの活性化に対する２つの抗体ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の効果を試験すると、ｈ−１９Ｆ６もｈ−４２Ａ５もＦＸＩＩａによって媒介されたＦＸＩからＦＸＩａへの変換を妨げないことがわかった（図５Ｃおよび５Ｄ）。次に、ＦＸＩａ活性に対するこれらの２つの抗体の効果を、ＦＩＸを基質として使用して試験した。図５Ａおよび５Ｂに示すように、ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の両方が濃度依存的な様態でＦＩＸ活性化を低減した。ＦＸＩａ活性に対するこれらの２つの抗体の阻害効果は、ＦＸＩａの発色基質であるＳ−２３６６を使用してさらに確認された。両方の抗体は、Ｓ−２３６６の加水分解を濃度依存的に阻害した（図４）。
【００７３】
実施例１０：カニクイザルにおける凝血時間に対する抗ＦＸＩ抗体の効果の評価
インビボ実験に適切な動物種を見つけるために、マウス、ラット、およびサルのＦＸＩに対する抗体の交差反応性をＡＰＴＴアッセイによって試験した。抗体はサル血漿ではＡＰＴＴを延長したが、マウスまたはラット血漿では延長しなかった（データの提示無し）。したがって、インビボでの血栓症に関する有効性研究の前に、凝血時間に対する３つの抗体の薬力学的効果を評価するために、サルモデルを選択した。カニクイザルに、指示された用量の様々な抗体を静脈内投与した。上肢の表在静脈からの血液を投薬前、ならびに投薬後０．５、１、３、６、１２、および２４時間に収集し、クエン酸血漿をＡＰＴＴおよびＰＴ決定のために調製した。ＡＰＴＴ試験では、５０μＬの希釈血漿サンプルと２５μＬのＡＰＴＴ試薬（ＳＭＮ１０４４５７０９、Ｓｙｍｅｎｓ  Ｉｎｃ．）とを混合し、３７℃で４分間インキュベートした。次に、２５μＬのＣａＣｌ２溶液（２５ｍＭ、ＳＭＮ１０４４６２３２、Ｓｙｍｅｎｓ  Ｉｎｃ．）を添加し、凝血形成までの時間を決定した。ＰＴ試験では、５０μＬの希釈血漿サンプルを等量のＰＴ試薬（ＳＭＮ１０４４６４４２、Ｓｙｍｅｎｓ  Ｉｎｃ．）と混合し、３７℃でインキュベートし、凝血形成までの時間を決定した。試験した３つの抗体はすべて、図６に示すようにＡＰＴＴを用量依存的に増加させ、図７に示すようにＰＴに影響を与えなかったことを示した。
【００７４】
ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の両方が、ＡＰＴＴを用量依存的に延長した（図６Ｂおよび６Ｃ）。特に、ｈ−４２Ａ５は同じ用量レベル（０．３および１ｍｇ／ｋｇ）でＡＰＴＴをｈ−１９Ｆ６よりも強力に増加させ、ヒトＡＰＴＴに対する抗体のインビトロ効果と一致した（図１６Ａ）。さらに、どちらの抗体も、インビボでＰＴに影響を与えなかった（図７Ｂおよび７Ｃ）。
【００７５】
実施例１１：カニクイザルの動静脈（ＡＶ）シャント血栓症および尾静脈出血モデルにおける抗ＦＸＩ抗体の効果の評価
試験した各抗体の複数回投薬について、同じ動物で血栓症および出血時間の両方を評価した。この実験に含まれる抗体は、ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ４２Ａ５であった。簡単に説明すると、出血時間および血栓症を投薬前および抗体の各投薬後３０分で連続的に評価した。出血／血栓症の評価を４回実施した：３つの漸増用量レベル（０．１、０．３、および１ｍｇ／ｋｇ）での投薬前および投薬後。
【００７６】
ＡＶシャント血栓症の場合、大腿動脈および大腿静脈のカニューレの接続に、あらかじめ計量した長さ１０ｃｍの絹糸を含むシャントデバイスを適用し、血液をシャントに１０分間流した。次に糸をシャントから取り外し、再度計量した。糸の凝血重量を血流前後の糸重量の差として計算した。
【００７７】
出血時間の評価のために、２ｍＬの注射器を動物の尾静脈に挿入した。注射器内の血液量の増加が止まったとき、経過時間を出血時間として手動で記録した。
【００７８】
図８に示すように、すべての抗体は血栓重量を用量依存的に低減し、それらのいずれも、図９に示すように尾静脈出血時間を延長しなかった。血栓症および止血に対するｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の効果を、ＡＶシャント血栓症および尾静脈出血のサルモデルで評価した。ｈ−１９Ｆ６の静脈内注射は、凝血重量の用量依存的な低減をもたらし、１ｍｇ／ｋｇの用量で有意な低減が観察された（図８Ｂ）。ｈ−４２Ａ５で治療した動物に関しては、凝血重量はすべての試験用量レベルで用量依存的な様態で有意に低減した（図８Ｃ）。ｈ−１９Ｆ６またはｈ−４２Ａ５による治療後、出血時間に有意な変化は認められなかった（図９Ｂおよび９Ｃ）。
【００７９】
実施例１２：カニクイザルにおける塩化第二鉄-誘発性動脈血栓症およびテンプレート出血時間に対する抗ＦＸＩ抗体の効果の評価
カニクイザルに１．５ｍｇ／ｋｇのゾレチルで事前に麻酔し、挿管し、人工呼吸器で人工呼吸を行った。麻酔をイソフルランで維持した。手順全体を通して、血圧、心拍数、および体温を監視した。ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ−４２Ａ５を含む試験された抗体、またはビヒクル対照を、ＦｅＣｌ３適用の２時間前に注射によって四肢静脈を通して投与した。左大腿動脈を露出させ、鈍的切開によって隔離した。ドップラーフロープローブを動脈に設置し、血流を継続的に記録した。ＦｅＣｌ３を適用する前に、血流を少なくとも５分間測定した。次に、ＦｅＣｌ３をあらかじめ浸した２枚の濾紙を、プローブの上流の血管の外膜表面に１０分間適用した。濾紙を取り除いた後、適用部位を生理食塩水で洗浄した。血流が０に減少するまで継続的に測定した。８０％閉塞までの時間（血流がベースライン血流の２０％まで低減）および１００％閉塞までの時間（血流が０まで低減）を記録した。同じ動物で、テンプレートの出血時間を投薬前および投薬後１時間で評価した。
【００８０】
ＦｅＣｌ３誘発性動脈血栓症に対するすべての３つの抗体の効果を調べた。サルの４つの群を、２時間、それぞれビヒクル対照、ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、またはｈ−４２Ａ５で治療し、ＦｅＣｌ３を各動物の左大腿動脈に適用して、血栓症を誘発した。下流の血流速度を監視した。ビヒクル対照群における８０％および１００％の血栓性閉塞までの時間は、それぞれ１４．６６±１．３０分および１８．５０±１．７６分であった。図１０に示すように、０．３ｍｇ／ｋｇのｈ−３４Ｆ８またはｈ−４２Ａ５による前治療は、それぞれ、８０％閉塞までの時間を５９．５３±１６．９５分および４０．８０±７．９４分に、１００％閉塞までの時間を７０．４０±２０．７６分および５０．６１±９．４８分に大幅に遅らせた。図１０に示すように、ビヒクル対照群と比較した場合、統計的に有意な差はなかったが、８０％閉塞（２６．４３±５．７２分）および１００％閉塞（３２．７８±５．０９分）までの時間の延長もｈ−１９Ｆ６で治療されたサルで観察された。
【００８１】
止血に対する抗体の効果を、テンプレートの出血時間の観点から評価した。各試験品について、投薬前および投薬後１時間の間に有意差は認められなかった（図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃ）。ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ−４２Ａ５治療後の出血時間の変化は、ビヒクル対照治療後の出血時間の変化と異ならなかった（図１１Ｄ）。
【００８２】
止血に対するｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５抗体の効果を、ＦｅＣｌ３誘発性動脈血栓症を有する同じ動物での皮膚裂傷による出血試験によって評価した（群あたりｎ＝５）。出血時間を投薬前および投薬後１時間で記録した。いずれの抗体についても、投薬前および投薬後１時間の間、または投薬後１時間の３つの群の間で、出血時間に有意差は観察されなかった（図１８）。
【００８３】
サル血漿のエクスビボ凝血時間に対する抗体の効果も評価した。予想通り、図１２Ａに示すように、０．３ｍｇ／ｋｇのｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、およびｈ−４２Ａ５による治療は、ＡＰＴＴをそれぞれ３．２９±０．２０、１．６７±０．０９、および２．８７±０．１０倍有意に延長したが、ビヒクル対照治療においては、ＡＰＴＴの増加は観察されなかった。さらに、図１２Ｂに示すように、ｈ−３４Ｆ８、ｈ−１９Ｆ６、またはｈ−４２Ａ５による治療は、ＰＴに対する効果を有さなかった。
【００８４】
したがって、本明細書に開示される抗体は、凝固の内因性経路を効果的に阻害しながら、長期の出血の悪影響を一切有さないことが予期せず発見された。
【００８５】
実施例１３：長期間にわたるカニクイザルの凝血時間に対する修飾抗ＦＸＩ抗体の効果の評価
図１４および１５に「修飾ｈ−１９Ｆ６」および「修飾ｈ−４２Ａ５」として示される２つの追加のＣＭＣ最適化ヒト化抗ＦＸＩ抗体を、実施例１０に記載されるようなＡＰＴＴおよびＰＴアッセイによって、長期間（例えば、最大１４日間）にわたってカニクイザルの凝血時間に対するそれらの効果について評価した。これらの２つの抗体の重鎖および軽鎖配列を表３に示す。カニクイザルに、０．６ｍｇ／ｋｇまたは２．０ｍｇ／ｋｇの試験抗体を静脈内投与した。上肢の表在静脈からの血液を投薬前および投薬後０．５時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、９６時間、１６８時間、２４０時間、３３６時間に収集した。試験した両方の修飾抗体は、図１４に示すようにＡＰＴＴを用量依存的に増加させ、図１５に示すようにＰＴに影響を与えなかったことを示した。両方の修飾抗体は、最大７日、最大１０日、または最大１４日の長期間にわたって有効性を示した。
【００８６】
したがって、本明細書に開示される修飾抗体は、長期間（最大１４日）にわたって凝固の内因性経路を効果的に阻害しながら、長期の出血の悪影響を一切示さないことが予期せず発見された。
【００８７】
実施例１４：標準的なヒト血漿の凝血時間に対する効果
抗体ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５を正常なヒト血漿に添加した後、ＡＰＴＴ（図１６Ａ）およびＰＴ（図１６Ｂ）を測定した（Ｎ＝３）。ｈ−１９Ｆ６抗体およびｈ−４２Ａ５抗体の両方は、標準的なヒト血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を濃度依存的な様態で延長した（図１６Ａ）。ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の血漿中のＦＸＩ活性の阻害の最大レベルは、血漿ＦＸＩレベルと確立されたＡＰＴＴとの間の相関曲線に基づいて、それぞれ約９７％および９９．５％であった（データの提示無し）。どちらの抗体も、ヒト血漿のＰＴに影響を与えなかった（図１６Ｂ）。
【００８８】
実施例１５：ＦＸＩへのｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の結合特性
ＦＸＩへのｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の結合特異性は、標準的なヒト血漿中でＦＸＩと反応し、ヒトＦＸＩ欠損血漿中では反応が検出されなかったため、最初に検証された（図１７）。ビオチン化試験抗体をヒト正常血漿またはＦＸＩ欠損血漿と共にインキュベートした。血漿中のＦＸＩ−抗体複合体を溶出し、一次抗体としてマウス抗ヒトＦＸＩ  ＩｇＧを使用したウエスタンブロッティングに供した。ウエスタンブロッティングでは、１０μＬのヒト標準血漿またはＦＸＩ欠損血漿がＦＸＩ陽性およびＦＸＩ陰性対照として機能した。以前に報告された抗ＦＸＩ抗体である１４Ｅ１１１７は、２つの抗体と同じ結合プロファイルを示した（図１７）。
【００８９】
ＦＸＩに対するｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して決定した。試験抗体をセンサーチップ上で捕捉し、次に示された濃度のＦＸＩをチップに流した。ｈ−１９Ｆ６（図１９Ａ）およびｈ−４２Ａ５（図１９Ｂ）のセンサーグラムが得られた。ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の解離定数は、それぞれ２２および３６ｐＭであった（図１９Ａおよび１９Ｂ）。
【００９０】
次に、ＦＸＩ上のこれらの２つの抗体の結合部位を決定した。ＦＸＩは、４つのタンデムアップルドメイン（Ａ１〜４）および触媒ドメインからなるホモダイマーである。ＦＸＩの４つの突然変異体を、各アップルドメインをヒトプレカリクレインの対応するドメインで置き換えることによって生成し、ＳＰＲを使用してＦＸＩの４つの突然変異体に対するｈ−１９Ｆ６またはｈ−４２Ａ５の結合特性を試験した。Ａ１、Ａ２、Ａ３、またはＡ４ドメインがプレカリクレインの対応するドメインで置き換えられた等量の４つの突然変異体ＦＸＩをセンサーチップに固定化し、試験抗体（５μｇ／ｍＬ）を会合のためにチップに流した。捕捉した各抗体の量を記録した。実験を２回実施し、代表的な結果を示す。予期せぬことに、Ａ３ドメインの置換によって、他の３つのアップルドメインの置換と比較していずれかの抗体の結合がはるかに少なくなったため、両方の抗体が主にＦＸＩのＡ３ドメインに結合した（図１９Ｃ）。別の抗体であるＯ１Ａ６は、陽性対照として使用されたと報告されている抗ＦＸＩ抗体であり、これも、以前の研究と一致して、ＦＸＩのＡ３ドメインに特異的に結合した。２１しかしながら、ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５はＦＸＩの異なる部位に結合すると仮定されたが、それは、図１６に示すように、それらがＦＸＩと同等の親和性を有するが、ＦＸＩ活性に関してはまったく異なる阻害効力を有するためである。この仮説を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システムを使用したエピトープ結合によって試験した。実際、ＦＸＩへのｈ−１９Ｆ６の結合は、次のＦＸＩへのｈ−４２Ａ５の結合を妨げず、これは、２つの抗体がＦＸＩのＡ３ドメインの異なる部位に結合することを示す（図１９Ｄ）。次に、これらの２つの抗体が流れる順序を変更すると、ＦＸＩへのｈ−４２Ａ５の結合が次のＦＸＩへのｈ−１９Ｆ６の結合を妨げないことがわかった（データの提示無し）。
【００９１】
実施例１６：ＦＸＩａへのｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の結合特性
抗体は、ＦＸＩに結合した良好な親和性でＦＸＩａに結合した（図２０Ａおよび２０Ｂ）。ＦＸＩに対するｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して決定した。ｈ−１９Ｆ６およびｈ−４２Ａ５の解離定数は、それぞれ２６および８１ｐＭであった（図２０Ａおよび２０Ｂ）。試験抗体をセンサーチップ上で捕捉し、次に示された濃度のＦＸＩａをチップに流した。ｈ−１９Ｆ６（図２０Ａ）およびｈ−４２Ａ５（図２０Ｂ）のセンサーグラムが得られた。
【００９２】
参考文献
以下に列挙される参考文献、特許、および公開特許出願、ならびに上の明細書に引用されているすべての参考文献は、本明細書に完全に記載されているかのように、参照によってそれらの全体が組み込まれる。
１  Ｒａｓｋｏｂ，Ｇ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：ａ  ｍａｊｏｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ  ｔｏ  ｇｌｏｂａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｕｒｄｅｎ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  ＶａｓｃＢｉｏｌ  ３４，２３６３−２３７１（２０１４）。
２  Ｇｏｍｅｚ−Ｏｕｔｅｓ，Ａ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｆｕｅｎｔｅｓ，Ｍ．＆Ｓｕａｒｅｚ−Ｇｅａ，Ｍ．Ｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １２，１１９５−１２０５（２０１７）。
３  Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．＆Ｆｒｅｄｅｎｂｕｒｇｈ，Ｊ．Ｃ．Ｆａｃｔｏｒｓ  ＸＩ  ａｎｄ  ＸＩＩ  ａｓ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｗ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｍｅｄ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）４，１９（２０１７）。
４  Ｍｕｌｌｅｒ，Ｆ．，Ｇａｉｌａｎｉ，Ｄ．＆Ｒｅｎｎｅ，Ｔ．Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ａｎｄ  ＸＩＩ  ａｓ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １８，３４９−３５５（２０１１）。
５  Ａｌ−Ｈｏｒａｎｉ，Ｒ．Ａ．＆Ｄｅｓａｉ，Ｕ．Ｒ．Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｅｎｔ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｐａｔ  ２６，３２３−３４５（２０１６）。
６  Ｃｈｅｎ，Ｚ．，Ｓｅｉｆｆｅｒｔ，Ｄ．＆Ｈａｗｅｓ，Ｂ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １９，１４３５−１４３９（２０１４）。
７  Ｇａｉｌａｎｉ，Ｄ．＆Ｇｒｕｂｅｒ，Ａ．Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ａｓ  ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ３６，１３１６−１３２２（２０１６）。
８  Ｐｕｙ，Ｃ．，Ｒｉｇｇ，Ｒ．Ａ．＆ＭｃＣａｒｔｙ，Ｏ．Ｊ．Ｔｈｅ  ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  １４１  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ８−Ｓ１１（２０１６）。
９  Ｓｅｌｉｇｓｏｈｎ，Ｕ．Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ７  Ｓｕｐｐｌ  １，８４−８７（２００９）。
１０  Ｐｒｅｉｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗｅｒ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ  ｅｖｅｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １２９，１２１０−１２１５（２０１７）。
１１  Ｍｅｉｊｅｒｓ  Ｊ．Ｃ．，Ｔｅｋｅｌｅｎｂｕｒｇ  Ｗ．Ｌ．，Ｂｏｕｍａ  Ｂ．Ｎ．，Ｂｅｒｔｉｎａ  Ｒ．Ｍ．，Ｒｏｓｅｎｄａａｌ  Ｆ．Ｒ．Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ａｓ  ａ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４２，６９６-７０１（２０００）。
１２  Ｐｅｙｖａｎｄｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｒｅ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  Ｒａｒｅ  Ｂｌｅｅｄｉｎｇ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １０，６１５−６２１（２０１２）。
１３  Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｏ．＆Ｓｅｌｉｇｓｏｈｎ，Ｕ．Ｎｅｗ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １０  Ｓｕｐｐｌ  ４，１８４−１８７（２００４）。
１４  Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｏｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｎ  ｆｅｒｒｉｃ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ３，６９５−７０２（２００５）。
１５  Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｅｍｂｏｌｉｃ  Ｓｉｇｎａｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３６０，４７６−４８３（２０１７）。
１６  Ｗｏｎｇ，Ｐ．Ｃ．，Ｃｒａｉｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．Ａ．＆Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｗ．Ａ．Ａ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｗｉｔｈ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｔｉｍｅ  ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ３２，１２９−１３７（２０１１）。
１７  Ｃｈｅｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ  １１６，３９８１−３９８９（２０１０）。
１８  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｊｕｇｕｌａｒ  ｖｅｉｎ  ｕｎｄｅｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｅｎｕｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔａｓｉｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  １２５，４６４−４７０（２０１０）。
１９  Ｙａｕ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｏｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｃａｔｈｅｔｅｒ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １２３，２１０２−２１０７（２０１４）。
２０  Ｃｒｏｓｂｙ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ３３，１６７０−１６７８（２０１３）。
２１  Ｋｒａｖｔｓｏｖ  Ｄ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩ．Ｂｌｏｏｄ  １１４，４５２−４５８（２００９）。
２２  Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｎ  ｆｅｒｒｉｃ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖｅｎａ  ｃａｖａ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ４，１９８２−１９８８（２００６）。
２３  Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｔｚ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３，５１３−５１８（２００６）。
２４  Ｇａｉｌａｎｉ，Ｄ．，Ｌａｓｋｙ，Ｎ．Ｍ．＆Ｂｒｏｚｅ，Ｇ．Ｊ．，Ｊｒ．Ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ８，１３４−１４４（１９９７）。
２５  Ｂｅｃｋ，Ａ．，Ｗｕｒｃｈ，Ｔ．，Ｂａｉｌｌｙ，Ｃ．＆Ｃｏｒｖａｉａ，Ｎ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０，３４５−３５２（２０１０）。
２６  Ｔｕｃｋｅｒ，Ｅ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｇｒａｆｔ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ．Ｂｌｏｏｄ  １１３，９３６−９４４（２００９）。
２７  Ｙｏｕｎｉｓ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｐｒｏｌｏｎｇｓ  ＡＰＴＴ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１９，２４０１−２４０８（２０１２）。
２８  Ｋｏｕｙａｍａ  Ｓ，Ｏ．Ｔ．，Ｈａｇｉｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＯＮＯ−５４５０５９８，ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｏｒａｌｌｙ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｌｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １  Ｓｕｐｐｌ  １：ＰＢ  ２１３９（２０１７）。
２９  Ｗｏｎｇ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｔｉｍｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ＢＭＳ−６５４４５７，ａ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ  ４０，４１６−４２３（２０１５）。
３０  Ｄａｖｉｄ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ａ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ａｇｅｎｔ  ｔｏ  ｐｒｏｂｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ８，３５３ｒａ１１２（２０１６）。
３１  ｖａｎ  Ｍｏｎｔｆｏｏｒｔ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １１０，１０６５−１０７３（２０１３）。
３２  Ｂｕｌｌｅｒ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７２，２３２−２４０（２０１５）。
３３．Ｅｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１５（１３）：２５６９−２５７７（２０１０）。
３４．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９６（１）：１−２６（２００７）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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