(57)【要約】  本開示は、ヒトＯＸ４０（ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４又はＴＮＦＲＳＦ４）に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、この抗体を含む医薬組成物、及び癌等の疾患を治療するためのこの抗体の使用又は組成物を提供する。特に、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０リガンドのＯＸ４０受容体への結合を妨害しない。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ（重鎖相補性決定領域）１、（ｂ）配列番号２４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｄ）配列番号２５のＬＣＤＲ（軽鎖相補性決定領域）１、（ｅ）配列番号１９のＬＣＤＲ２、（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（ｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１８のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１９のＬＣＤＲ２、（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
（ｉｖ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
（ｉ）配列番号２６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｉ）配列番号２０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｉｉ）配列番号１４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
（ｉｖ）配列番号９と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１１と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号２６、２８、２０、２２、１４、１６、９及び／又は１１の中の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸が、挿入、削除又は置換されている、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
（ｉ）配列番号２６を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２８を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｉ）配列番号２０を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２２を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｉｉ）配列番号１４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
（ｉｖ）配列番号９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１１を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト遺伝子操作抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
ＯＸ４０アゴニスト活性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
ヒトＯＸ４０のＨ１５３〜Ｄ１７０からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基を含むエピトープでヒトＯＸ４０に結合する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ヒトＯＸ４０のＨ１５３、Ｔ１５４、Ｉ１６５、Ｅ１６７及びＤ１７０からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基を含むエピトープでヒトＯＸ４０に結合する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
ヒトＯＸ４０のＨ１５３、Ｉ１６５及びＥ１６７からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基を含むエピトープでヒトＯＸ４０に結合する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
配列番号３０で、又は配列番号３０の内部でヒトＯＸ４０に結合する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
グリコシル化が減少し、若しくはグリコシル化されていないか、又はフコシル化が低い、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ＦｃドメインがＩｇＧ１のものである、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
ＦｃドメインがＩｇＧ４のものである、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
ＩｇＧ４がＳ２２８Ｐ置換（ＥＵナンバリングシステムによる）を有する、請求項１５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
ＩｇＧ４がＳ２２８Ｐ置換及びＲ４０９Ｋ置換（ＥＵナンバリングシステムによる）を有する、請求項１６に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
（ｉ）ｃｙｎｏＯＸ４０と交差反応することができる、
（ｉｉ）ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌの相互作用を妨害しない、
（ｉｉｉ）Ｔ細胞を共刺激してＩＬ−２を産生することができる、
（ｉｖ）特に混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで測定した際、ＣＤ４＋Ｔ細胞を共活性化することができる、
（ｖ）特に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出ベースＡＤＣＣアッセイで測定した際、ＡＤＣＣを媒介することができる、
（ｖｉ）ＣＤ４＋Ｔｒｅｇを枯渇させることができる、
（ｖｉｉ）ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比率を増加させることができる、又は
（ｖｉｉｉ）動物腫瘍モデルで腫瘍の部分的退縮を媒介することができる、
特性の１以上を有する、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び薬学上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
有効量の請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項２１】
癌が、乳癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫又は肉腫である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
抗体又はその抗原結合フラグメントが他の治療剤と組合せて投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
治療剤がパクリタキセル又はパクリタキセル剤、ドセタキセル、カルボプラチン、トポテカン、シスプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、レナリドミド又は５−アザシチジンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
治療剤がパクリタキセル剤、レナリドマイド又は５−アザシチジンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２５の核酸を含むベクター。
【請求項２７】
請求項２５の核酸又は請求項２６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２７の宿主細胞を培養し、培養物から抗体又はその抗原結合フラグメントを回収することを含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを製造する方法。
【請求項２９】
乳癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫又は肉腫の治療又は可能性の低減に使用するための、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
ラベルされた、請求項１〜１８のいずれかの抗体又はその抗原結合フラグメントを含む診断薬。
【請求項３１】
ラベルが、放射標識、フルオロフォア、発色団、造影剤、及び金属イオンからなる群から選択される、請求項３０に記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、ヒトＯＸ４０に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、この抗体を含む組成物、及び癌の治療に使用する方法が開示される。
【背景技術】
【０００２】
ＯＸ４０（ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４又はＴＮＦＲＳＦ４とも呼ばれる）は、約５０ＫＤのＩ型膜貫通糖タンパク質であり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の一員である（Croft, 2010；Gough and Weinberg, 2009）。成熟したヒトＯＸ４０は、２４９アミノ酸（ＡＡ）残基で構成され、３７ＡＡの細胞質側末端と１８５ＡＡの細胞外領域を有する。ＯＸ４０の細胞外ドメインは、３つの完全なシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と１つの不完全なＣＲＤを含む。ＯＸ４０の細胞内ドメインは、１つの保存されたシグナル伝達関連ＱＥＥモチーフを含み、これは、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３及びＴＲＡＦ５を含むいくつかのＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）への結合を媒介し、ＯＸ４０が細胞内キナーゼに結合できるようにする（Arch and Thompson, 1998；Willoughby et al., 2017)。
【０００３】
ＯＸ４０は、活性化されたラットＣＤ４＋Ｔ細胞上で最初に発見され、その後、Ｔ細胞からネズミとヒトの相同体がクローン化された（al-Shamkhani et al., 1996；Calderhead et al., 1993）。Ｔヘルパー（Ｔｈ）１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞及び制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を含む、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の上での発現に加えて、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、好中球及びＮＫ細胞の表面上でも、ＯＸ４０発現が見られる（Croft, 2010）。対照的に、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、及びほとんどの休止メモリーＴ細胞の上で、低いＯＸ４０発現が見られる（Croft, 2010；Soroosh et al., 2007）。ナイーブＴ細胞上でのＯＸ４０の表面発現は一過性である。ＴＣＲの活性化後、Ｔ細胞上のＯＸ４０の発現は、２４時間以内に大幅に増加し、２〜３日でピークに達し、５〜６日間持続する（Gramaglia et al., 1998）。
【０００４】
ＯＸ４０のリガンド（ＯＸ４０Ｌ、ｇｐ３４、ＣＤ２５２又はＴＮＦＳＦ４とも呼ばれる）は、ＯＸ４０の唯一のリガンドである。ＴＮＦＳＦ（腫瘍壊死因子スーパーファミリー）の他のメンバーと同様に、ＯＸ４０ＬはＩＩ型糖タンパク質であり、１８３ＡＡを含み、２３ＡＡの細胞内ドメイン及び１３３ＡＡの細胞外ドメインを有する（Croft, 2010；Gough and Weinberg, 2009）。ＯＸ４０Ｌは、細胞表面上にホモマー三量体複合体を自然に形成する。リガンド三量体は、主に受容体のＣＲＤ１、ＣＲＤ２及び部分的なＣＲＤ３領域を介して、しかし、ＣＲＤ４の関与無しに、リガンドモノマー−モノマーの境界面でＯＸ４０の３つの複製物と相互作用する（Compaan and Hymowitz, 2006）。ＯＸ４０Ｌは、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で主に発現する。このＡＰＣには、活性化されたＢ細胞（Stuber et al., 1995）、成熟した従来の樹状細胞（ＤＣ）（Ohshima et al., 1997）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）（Ito et al., 2004）、マクロファージ（Weinberg et al., 1999）及びランゲルハンス細胞（Sato et al., 2002）が含まれる。更に、ＯＸ４０Ｌは、ＮＫ細胞、肥満細胞、活性化Ｔ細胞のサブセット、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等の他の細胞種の上でも発現することが分かっている（Croft, 2010；Croft et al., 2009）。
【０００５】
三量体のＯＸ４０Ｌによるライゲーション又はアゴニスト抗体による二量体化を経由するＯＸ４０の三量体化は、アダプター分子のＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３及び／又はＴＲＡＦ５のリクルート及び細胞内ＱＥＥモチーフへのドッキングに寄与する（Arch and Thompson, 1998；Willoughby et al., 2017）。ＴＲＡＦ２及びＴＲＡＦ３のリクルートとドッキングは、更に古典的ＮＦ−κＢ１経路及び非古典的ＮＦ−κＢ２経路の両方の活性化を導くことができる。これらの経路は、Ｔ細胞の生存、分化、増殖、サイトカイン産生及びエフェクター機能の調節に重要な役割を果たす（Croft, 2010；Gramaglia et al., 1998；Huddleston et al., 2006；Rogers et al., 2001；Ruby and Weinberg, 2009；Song et al., 2005a；Song et al., 2005b；Song et al., 2008）。
【０００６】
ＯＸ４０は正常組織では発現が低く、リンパ器官のリンパ球上で主に発現する（Durkop et al., 1995）。しかし、免疫細胞上でのＯＸ４０発現のアップレギュレーションが、動物モデルと、自己免疫疾患（Carboni et al., 2003；Jacquemin et al., 2015；Szypowska et al., 2014）及び癌（Kjaergaard et al., 2000；Vetto et al., 1997；Weinberg et al., 2000）等の病的状態（Redmond and Weinberg, 2007）のヒト患者の両方で頻繁に観察されている。特に、ＯＸ４０の発現増加は、結腸直腸癌及び皮膚黒色腫の患者の生存期間の延長に関連しており、遠隔転移及びより進行した腫瘍の特徴の発生と逆相関する（Ladanyi et al., 2004；Petty et al., 2002；Sarff et al., 2008）。抗ＯＸ４０抗体治療が、様々なマウスモデルで抗腫瘍効果を引き出すことができることも示され（Aspeslagh et al., 2016）、免疫療法のターゲットとしてのＯＸ４０の可能性が示された。Curti et alによって実施された最初の癌患者の臨床試験において、抗腫瘍効果及び腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化の証拠が、アゴニスト性の抗ＯＸ４０モノクローナル抗体を用いて観察され、ＯＸ４０抗体が抗腫瘍Ｔ細胞応答を高める有用性を有することが示された（Curti et al., 2013）。
【０００７】
抗腫瘍効果を媒介する際のアゴニスト性の抗ＯＸ４０抗体の作用機序は、主にマウス腫瘍モデルで研究された（Weinberg et al., 2000）。最近まで、腫瘍におけるアゴニスト性の抗ＯＸ４０抗体の作用機序は、エフェクターＴ細胞における共刺激シグナル伝達経路を誘発する能力、及びＴｒｅｇ細胞の分化と機能への抑制効果に帰された（Aspeslagh et al., 2016；Ito et al., 2006；St Rose et al., 2013；Voo et al., 2013）。最近の研究で、動物腫瘍モデルと癌患者の両方で、腫瘍浸潤性ＴｒｅｇがエフェクターＴ細胞（ＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方）及び末梢Ｔｒｅｇよりも高いレベルのＯＸ４０を発現することが示された（Lai et al., 2016；Marabelle et al., 2013b；Montler et al., 2016；Soroosh et al., 2007；Timperi et al., 2016）。従って、抗ＯＸ４０抗体が抗腫瘍応答を誘発する二次的効果は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して腫瘍内ＯＸ４０＋Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させる際のＦｃ媒介エフェクター機能に依存する（Aspeslagh et al., 2016；Bulliard et al., 2014；Marabelle et al., 2013a；Marabelle et al., 2013b；Smyth et al., 2014）。この研究によって、Ｆｃ媒介エフェクター機能を有するアゴニスト性の抗ＯＸ４０抗体が、腫瘍内Ｔｒｅｇを優先的に枯渇させ、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇに対するＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の比率を改善することができ、その結果、抗腫瘍免疫応答が改善し、腫瘍の退縮が増加し、生存率が改善されることが示される（Bulliard et al., 2014；Carboni et al., 2003；Jacquemin et al., 2015；Marabelle et al., 2013b）。これらの発見に基づいて、アゴニスト性の活性及びＦｃ媒介エフェクター機能の両方を備えるアゴニスト性の抗ＯＸ４０抗体を開発するアンメット・メディカル・ニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
今まで、病院で用いられるアゴニスト性の抗ＯＸ４０抗体はほとんど、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌの相互作用を遮断するリガンド競合性の抗体である（例えば、ＷＯ２０１６／１９６２２８Ａ１）。ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌの相互作用は効果的な抗腫瘍免疫を高めるために不可欠であるため、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌの遮断によって、これらのリガンド競合性の抗体の有効性が制限される。従って、ＯＸ４０のＯＸ４０Ｌとの相互作用を妨害せずに、ＯＸ４０に特異的に結合するＯＸ４０アゴニスト抗体は、癌及び自己免疫疾患の治療において有用性を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、ＯＸ４０を活性化し、免疫細胞中のシグナル伝達を誘導し、従って抗腫瘍免疫を促進する、アゴニスト性の抗ＯＸ４０抗体及びその抗原結合フラグメントに向けられる。
【００１０】
１つの実施態様において、本開示は、ヒトＯＸ４０に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。１つの側面において、本開示の抗体は、ＯＸ４０Ｌと競合しないか、又はＯＸ４０のそのリガンドＯＸ４０Ｌへの結合を妨害しない。
【００１１】
本明細書には、以下の実施態様が含まれる。
（ｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ（重鎖相補性決定領域）１、（ｂ）配列番号２４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｄ）配列番号２５のＬＣＤＲ（軽鎖相補性決定領域）１、（ｅ）配列番号１９のＬＣＤＲ２、（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（ｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１８のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１９のＬＣＤＲ２、（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
（ｉｖ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｄ）配列番号６のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７のＬＣＤＲ２、（ｆ）配列番号８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００１２】
（ｉ）配列番号２６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｉ）配列番号２０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｉｉ）配列番号１４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
（ｉｖ）配列番号９と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１１と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、
前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００１３】
配列番号２６、２８、２０、２２、１４、１６、９及び／又は１１の中の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸が、挿入、削除又は置換されている、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００１４】
（ｉ）配列番号２６を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２８を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｉ）配列番号２０を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号２２を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｉｉ）配列番号１４を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
（ｉｖ）配列番号９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号１１を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００１５】
モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト遺伝子操作（engineered）抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００１６】
ＯＸ４０アゴニスト活性を有する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
ヒトＯＸ４０のＨ１５３〜Ｄ１７０からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基を含むエピトープでヒトＯＸ４０に結合する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
ヒトＯＸ４０のＨ１５３、Ｔ１５４、Ｉ１６５、Ｅ１６７及びＤ１７０からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基を含むエピトープでヒトＯＸ４０に結合する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００１７】
ヒトＯＸ４０のＨ１５３、Ｉ１６５及びＥ１６７からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基を含むエピトープでヒトＯＸ４０に結合する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。ヒトＯＸ４０のＨ１５３、Ｉ１６５及びＥ１６７からなる群から選択される１つのアミノ酸残基を含むエピトープでヒトＯＸ４０に結合する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００１８】
配列番号３０で、又は配列番号３０の内部でヒトＯＸ４０に結合する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した際、７．２８ｎＭ以上、９．４７ｎＭ以上、１３．５ｎＭ以上又は１７．１ｎＭ以上の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＯＸ４０に結合する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００１９】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
グリコシル化が減少し、若しくはグリコシル化されていないか、又はフコシル化が低い、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
増加した二分（bisecting）ＧｌｃＮａｃ構造を含む、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００２０】
ＦｃドメインがＩｇＧ１のものである、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
ＦｃドメインがＩｇＧ４のものである、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
ＩｇＧ４がＳ２２８Ｐ置換（ＥＵナンバリングシステムによる）を有する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
ＩｇＧ４がＳ２２８Ｐ置換及びＲ４０９Ｋ置換（ＥＵナンバリングシステムによる）を有する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００２１】
（ｉ）ｃｙｎｏＯＸ４０と交差反応することができる、
（ｉｉ）ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌの相互作用を妨害しない、
（ｉｉｉ）Ｔ細胞を刺激して、特に０．０６ｎｇ／ｍｌ以上のＥＣ５０で刺激できる、
（ｉｖ）特に混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで測定した際、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することができる、
（ｖ）特に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出ベースＡＤＣＣアッセイで測定した際、ＡＤＣＣを媒介することができる、
（ｖｉ）ＣＤ４＋Ｔｒｅｇを枯渇させることができる、
（ｖｉｉ）ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比率を増加させることができる、又は
（ｖｉｉｉ）動物腫瘍モデルで腫瘍の部分的退縮を媒介することができる、
特性の１以上を有する、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００２２】
前記抗体又はその抗原結合フラグメント、及び薬学上許容される担体を含む医薬組成物。
【００２３】
有効量の抗体又はその抗原結合フラグメントを、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
癌が、乳癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫及び肉腫等が含まれるが、これらに限定されない、前記方法。
【００２４】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが他の治療剤と組合せて投与される、前記方法。
前記治療剤がパクリタキセル又はパクリタキセル剤、ドセタキセル、カルボプラチン、トポテカン、シスプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、レナリドミド又は５−アザシチジンである、前記方法。
前記治療剤がパクリタキセル剤、レナリドマイド又は５−アザシチジンである、前記方法。
【００２５】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸。
前記核酸を含むベクター。
前記核酸を含む宿主細胞。
【００２６】
前記宿主細胞を培養し、培養物から抗体又はその抗原結合フラグメントを回収することを含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを製造する方法。
【００２７】
乳癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫又は肉腫の治療又は可能性の低減に使用するための、前記抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００２８】
ラベルされた、前記抗体又はその抗原結合フラグメントを含む診断薬。
ラベルが、放射標識、フルオロフォア、発色団、造影剤、及び金属イオンからなる群から選択される、前記診断薬。
【００２９】
１つの実施態様において、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００３０】
他の実施態様において、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２４及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１以上の相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｂ）配列番号６、配列番号２５、配列番号７，配列番号１９及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１以上の相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３１】
他の実施態様において、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１；配列番号４，配列番号１３，配列番号１８又は配列番号２４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２；配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３である３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｂ）配列番号６又は配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１；配列番号７又は配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２；配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３である３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３２】
他の実施態様において、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；若しくは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；若しくは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３；若しくは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３である３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３；若しくは、配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３；若しくは、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３である３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３３】
他の実施態様において、本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに、配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３４】
１つの実施態様において、本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに、配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３５】
他の実施態様において、本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに、配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３６】
他の実施態様において、本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３７】
１つの実施態様において、本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号９、配列番号１４、配列番号２０若しくは配列番号２６のアミノ酸配列、又は配列番号９、配列番号１４、配列番号２０若しくは配列番号２６の何れかと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又は（ｂ）配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２若しくは配列番号２８のアミノ酸配列、又は配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２若しくは配列番号２８の何れかと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３８】
他の実施態様において、本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号９、配列番号１４、配列番号２０若しくは配列番号２６のアミノ酸配列、又は配列番号９、配列番号１４、配列番号２０若しくは配列番号２６のアミノ酸配列に１、２又は３個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又は（ｂ）配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２若しくは配列番号２８のアミノ酸配列、又は配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２若しくは配列番号２８のアミノ酸配列に１、２又は３個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。他の実施態様において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００３９】
１つの実施態様において、本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；又は
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；又は
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；又は
（ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４０】
１つの実施態様において、本開示の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のアイソタイプのものである。より具体的な実施態様において、本開示の抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１（ヒトＩｇＧ１ｗｔ又はｈｕＩｇＧ１とも呼ばれる）又は野生型ヒトＩｇＧ２のＦｃドメインを含む。他の実施態様において、本開示の抗体は、Ｓ２２８Ｐ及び／又はＲ４０９Ｋ置換（ＥＵ番号付けシステムによる）を有するヒトＩｇＧ４のＦｃドメインを含む。
【００４１】
１つの実施態様において、本開示の抗体は、１×１０−６Ｍ〜１×１０−１０Ｍの結合親和性（ＫＤ）でＯＸ４０に結合する。他の実施態様において、本開示の抗体は、約１×１０−６Ｍ、約１×１０−７Ｍ、約１×１０−８Ｍ、約１×１０−９Ｍ又は約１×１０−１０Ｍの結合親和性（ＫＤ）でＯＸ４０に結合する。
【００４２】
他の実施態様において、本発明の抗ヒトＯＸ４０抗体は、カニクイザルＯＸ４０に対して種間結合活性を示す。
【００４３】
１つの実施態様において、本開示の抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ相互作用の境界面の外側のヒトＯＸ４０のエピトープに結合する。他の実施態様において、本開示の抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０に結合するＯＸ４０リガンドと競合しない。更に他の実施態様において、本開示の抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０とそのリガンドＯＸ４０Ｌとの間の相互作用を遮断しない。
【００４４】
本開示の抗体はアゴニスト性であり、免疫応答を著しく高める。本発明は、抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト能力を試験する方法を提供する。１つの実施態様において、本開示の抗体は、一次Ｔ細胞を著しく刺激し、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）試験でＩＬ−２を産生させることができる。
【００４５】
１つの実施態様において、本開示の抗体は、強力なＦｃ媒介エフェクター機能を有する。抗体は、ＮＫ細胞による制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）等のＯＸ４０Ｈｉ標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。１つの側面において、本開示は、異なるＯＸ４０発現レベルに基づいて、特定のＴ細胞サブセットのインビトロでの抗ＯＸ４０抗体媒介性枯渇を評価する方法を提供する。
【００４６】
本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ相互作用を遮断しない。更に、ＯＸ４０抗体は、動物モデルに示されているように、生体内で用量依存的な抗腫瘍活性を示す。用量依存的な活性は、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ相互作用を遮断する抗ＯＸ４０抗体の活性プロファイルと区別される。
【００４７】
本開示は、前記抗体又はその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。１つの実施態様において、前記単離された核酸は、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１若しくは配列番号２７のＶＨヌクレオチド配列、又は配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１若しくは配列番号２７の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含み、本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＨ領域をコードする。あるいは、又は更に、前記単離された核酸は、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３若しくは配列番号２９のＶＬヌクレオチド配列、又は配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３若しくは配列番号２９の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含み、本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＬ領域をコードする。
【００４８】
他の側面において、本開示は、ＯＸ４０抗体又はその抗原結合フラグメント、及び任意に薬学上許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００４９】
更に他の側面において、本開示は、前記ＯＸ４０抗体、その抗原結合フラグメント又はＯＸ４０抗体医薬組成物を治療有効量でそれを必要とする対象に投与することを含む、対象の疾患を治療する方法に関する。他の実施態様において、前記抗体又はその抗原結合フラグメントによって治療される疾患は、癌又は自己免疫疾患である。
【００５０】
本開示は、癌又は自己免疫疾患等の疾患を治療するための、前記抗体、その抗原結合フラグメント又はＯＸ４０抗体医薬組成物の使用に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＯＸ４０−ｍＩｇＧ２ａ、ＯＸ４０−ｈｕＩｇＧ１及びＯＸ４０−Ｈｉｓコンストラクトの概略図である。ＯＸ４０ ＥＣＤ：ＯＸ４０細胞外ドメイン。Ｎ：Ｎ末端。Ｃ：Ｃ末端。
【図２】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、精製されたキメラ抗ＯＸ４０抗体（ｃｈ４４５）及びヒト化抗ＯＸ４０抗体（４４５−１、４４５−２、４４５−３及び４４５−３ ＩｇＧ４）の親和性の決定を示す。
【図３】フローサイトメトリーによるＯＸ４０結合の決定を示す。ＯＸ４０陽性のＨｕＴ７８／ＯＸ４０細胞を、様々な抗ＯＸ４０抗体（抗体ｃｈ４４５、４４５−１、４４５−２、４４５−３及び４４５−３ ＩｇＧ４）とインキュベートし、ＦＡＣＳ分析を行った。その結果が平均蛍光強度（ＭＦＩ，Ｙ軸）で示される。
【図４】フローサイトメトリーによるＯＸ４０抗体の結合を示す。ＨｕＴ７８／ＯＸ４０及びＨｕＴ７８／ｃｙｎｏＯＸ４０細胞を、抗体４４５−３で染色し、平均蛍光強度（ＭＦＩ，Ｙ軸に表示）がフローサイトメトリーによって決定された。
【図５】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、ＯＸ４０野生型及び点変異体に対する４４５−３Ｆａｂの親和性の決定を示す。
【図６】抗体４４５−３とＯＸ４０上のエピトープとの間の詳細な相互作用を示す。抗体４４５−３及びＯＸ４０が、それぞれ淡灰色と黒色で示される。水素結合又は塩橋、π−πスタッキング及びファンデルワールス（ＶＤＷ）の相互作用が、それぞれ破線、二重破線及び実線で示される。
【図７】抗体４４５−３がＯＸ４０Ｌ結合を妨害しないことを示す。ＨＥＫ２９３／ＯＸ４０Ｌ細胞を染色する前に、ＯＸ４０−マウスＩｇＧ２ａ（ＯＸ４０−ｍＩｇＧ２ａ）融合タンパク質を、ヒトＩｇＧ（＋ＨｕＩｇＧ）、抗体４４５−３（＋４４５−３）又は抗体１Ａ７．ｇｒ１（＋１Ａ７．ｇｒ１、参照ＵＳ２０１５／０３０７６１７）とモル比１：１でプレインキュベートした。ＨＥＫ２９３／ＯＸ４０Ｌ細胞及びＯＸ４０−ｍＩｇＧ２ａ／抗ＯＸ４０抗体複合体を共培養し、続いて抗マウスＩｇＧ二次抗体と反応させ、フローサイトメトリーを行って、ＯＸ４０ＬのＯＸ４０−ｍＩｇＧ２ａ／抗ＯＸ４０抗体複合体への結合が決定された。その結果が２回の平均±ＳＤで示される。統計的有意性：＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。
【図８】ＯＸ４０／４４５−３Ｆａｂ及び報告されたＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ複合体（ＰＤＢコード：２ＨＥＶ）の構造アラインメントを示す。ＯＸ４０Ｌは白色で、４４５−３Ｆａｂは灰色で、ＯＸ４０は黒色で示される。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、抗ＯＸ４０抗体４４５−３がＴＣＲ刺激と組合せてＩＬ−２産生を誘導することを示す。ＯＸ４０陽性のＨｕＴ７８／ＯＸ４０細胞（図９Ａ）を、抗ＯＸ４０抗体の存在下、人工的抗原提示細胞（ＡＰＣ）株（ＨＥＫ２９３／ＯＳ８Ｌｏｗ−ＦｃγＲＩ）と一晩、共培養した。ＩＬ−２産生をＴ細胞刺激の読み出しとして用いた（図９Ｂ）。培養上清中のＩＬ−２をＥＬＩＳＡで検出した。その結果が３回の平均±ＳＤで示される。
【図１０】抗ＯＸ４０抗体がＭＬＲ応答を増強することを示す。インビトロで分化した樹状細胞（ＤＣ）を、抗ＯＸ４０抗体（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）の存在下、同種のＣＤ４＋Ｔ細胞と２日間、共培養した。上清中のＩＬ−２をＥＬＩＳＡで検出した。すべての試験が４回、行われた。その結果が平均±ＳＤで示される。統計的有意性：＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。
【図１１】抗ＯＸ４０抗体４４５−３がＡＤＣＣを誘導することを示す。ＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞をエフェクター細胞として用い、ＨｕＴ７８／ＯＸ４０細胞を標的細胞として用いて、抗ＯＸ４０抗体（０．００４〜３μｇ／ｍｌ）又はコントロールの存在下、ＡＤＣＣアッセイを行った。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を検出する前に、同数のエフェクター細胞と標的細胞を５時間、共培養した。実施例１２に記載された製造者のプロトコルに基づいて、細胞毒性のパーセンテージ（Ｙ軸）を計算した。その結果が３回の平均±ＳＤで示される。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＮＫ細胞と組合せた抗ＯＸ４０抗体４４５−３が、インビトロで活性化されたＰＢＭＣ中のＴｒｅｇに対するＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の比率を増加させることを示す。ヒトＰＢＭＣをＰＨＡ−Ｌ（１μｇ／ｍｌ）で事前に活性化し、抗ＯＸ４０抗体又はコントロールの存在下、ＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞と共培養した。異なるＴ細胞サブセットの割合をフローサイトメトリーで決定した。Ｔｒｅｇに対するＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の比率を更に計算した。図１２ＡはＣＤ８＋Ｔ細胞／全Ｔ細胞の比率を示す。図１２ＢはＴｒｅｇ／全Ｔ細胞の比率を示す。図１２ＣはＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇの比率を示す。データが２回の平均±ＳＤで示される。表示された濃度での４４５−３と１Ａ７．ｇｒ１の間の統計的有意性を示す。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１。
【図１３Ａ】図１３Ａ及び図１３Ｂは、抗ＯＸ４０抗体４４５−３が、ＯＸ４０ヒト化マウスのＭＣ３８結腸直腸癌同系モデルにおける用量依存的抗腫瘍活性を示すが、１Ａ７．ｇｒｌは示さないことを示す。ＭＣ３８ネズミ結腸直腸癌細胞（２×１０７）を雌のヒトＯＸ４０トランスジェニックマウスに皮下移植した。腫瘍体積に応じてランダム化した後、表示の通り、１週間に１回で抗ＯＸ４０抗体又はアイソタイプコントロールのいずれかを３回、マウスに腹腔内注射した。図１３Ａは、４４５−３抗体の増加する投与量及び１Ａ７.ｇｒｌ抗体の増加する投与量と腫瘍増殖の減少とを比較する。データが６匹／群のマウスでの平均腫瘍体積±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で示される。統計的有意性：＊：Ｐ＜０．０５ｖｓアイソタイプコントロール。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、その特定の投与量で治療されたすべてのマウスのデータを示す。データが６匹／群のマウスでの平均腫瘍体積±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で示される。統計的有意性：＊：Ｐ＜０．０５ｖｓアイソタイプコントロール。
【図１４Ａ】ＯＸ４０抗体で行われたアミノ酸の変更の表である。
【図１４Ｂ】ＯＸ４０抗体で行われたアミノ酸の変更の表である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
定義
本明細書の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書で用いられる他のすべての技術用語及び科学用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。
【００５３】
本明細書の記載が明確に指定しない限り、本明細書及び特許請求の範囲で用いられる「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」等の単数形の単語は、それらの対応する複数のものも含む。
【００５４】
本明細書の記載が明確に指定しない限り、用語「又は」は、用語「及び／又は」を意味するように用いられ、それと互換的に用いられる。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「抗癌剤」は、癌等の細胞増殖性疾患を治療するために用いることができる任意の薬剤を意味し、細胞毒性剤、化学療法剤、放射線療法、放射線療法剤、標的抗癌剤、及び免疫療法剤を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
用語「ＯＸ４０」は、約５０ＫＤのＩ型膜貫通型糖タンパク質であり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの一員を意味する。ＯＸ４０は、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、又はＴＮＦＲＳＦ４とも呼ばれる。ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列（配列番号１）は、アクセッション番号ＮＰ＿００３３１８でも見ることができ、ＯＸ４０タンパク質をコードするヌクレオチド配列はアクセッション番号Ｘ７５９６２．１である。用語「ＯＸ４０リガンド」又は「ＯＸ４０Ｌ」は、ＯＸ４０の唯一のリガンドを意味し、ｇｐ３４、ＣＤ２５２、又はＴＮＦＳＦ４と交換可能である。
【００５７】
本明細書における用語「投与」、「投与する」、「治療する」及び「治療」は、動物、ヒト、実験の対象、細胞、組織、臓器、又は生物学的流体に適用される場合、外因性医薬、治療剤、診断剤又は組成物の、その動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、又は生物学的流体への接触を意味する。細胞の治療は、試薬のその細胞への接触、及び試薬のその細胞が接触している流体への接触を含む。用語「投与」又は「治療」はまた、例えば、試薬、診断化合物、結合化合物、又は他の細胞によるインビトロ及びエクソビボの治療を含む。本明細書における用語「対象」は、全ての生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを意味する。任意の病気又は疾患を治療することは、１つの側面において、病気又は疾患を改善すること（すなわち、病気の進展若しくはその少なくとも１つの臨床症状を遅らせるか、又は停止させるか、又は減らすこと）を意味する。他の側面において、「治療する」、「治療すること」又は「治療」とは、患者が識別できない可能性のあるものを含む、少なくとも１つの物理的パラメータを緩和又は改善することを意味する。更に他の側面において、「治療する」、「治療すること」又は「治療」とは、物理的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）、又はその両方で、病気又は疾患を調節することを意味する。更に他の側面において、「治療する」、「治療すること」又は「治療」とは、病気又は疾患の発症、進展又は進行を予防又は遅延させることを意味する。
【００５８】
本明細書の記載の文脈における「対象」は、霊長類等の哺乳動物、好ましくはヒト等のより高等な霊長類（例えば、本明細書に記載の疾患を有する、又は疾患を有する可能性のある患者）である。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「親和性」は、抗体と抗原の間の相互作用の強さを意味する。抗原中で、抗体の「アーム」の可変領域が、非共有結合力を介して多数の箇所で抗原と相互作用する。相互作用が強いほど、親和性が強い。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、非共有結合的に、可逆的に、そして特定の方法で対応抗原に結合することができる免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを意味する。例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）鎖及び２つの軽鎖（Ｌ）からなる四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略す）と重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つの領域で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略す）と軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つの領域ＣＬで構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は更に、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の最初の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００６１】
用語「抗体」には、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ等）、又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等）であることができる。
【００６２】
いくつかの実施態様において、抗ＯＸ４０抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位、又は少なくとも可変領域を含む。いくつかの実施態様において、抗ＯＸ４０抗体は、本明細書に記載のＯＸ４０抗体からの抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施態様において、抗ＯＸ４０抗体は単離されたもの又は組換体である。
【００６３】
用語「モノクローナル抗体」、「ｍＡｂ」又は「Ｍａｂ」は、本明細書において、実質的に同種の抗体の集団を意味する。すなわち、その集団に含まれる抗体分子は、少量存在しうる天然に存在する可能性がある変異を除いて、アミノ酸配列が同一である。一方、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は、通常、異なるエピトープに対してしばしば特異的である、それらの可変領域が、特にそれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）が異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に同種の集団から得られるという抗体の特徴を示し、いずれか特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は当業者に周知の方法によって取得することができる。参照、例えば、Kohler G et al., Nature 1975 256:495-497；ＵＳ４３７６１１０；Ausubel FM et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992；Harlow E et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988；及びColligan JE et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993。本明細書に開示された抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びそれらのいずれかのサブクラスを含む、いかなる免疫グロブリンクラスのものであることができる。モノクローナル抗体を製造するハイブリドーマを、インビトロ又はインビボで培養してもよい。個々のハイブリドーマからの細胞をプリスティンプライム化Ｂａｌｂ／ｃマウス等のマウスに腹腔内注射し、高濃度で所望の抗体を含む腹水液を製造するインビボの製造によって、高い力価のｍＡｂを取得することができる。当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を用いて、上記の腹水液又は培養物の上清から、アイソタイプＩｇＭ又はＩｇＧのモノクローナル抗体を精製することができる。
【００６４】
一般に、基本的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体はポリペプチド鎖の２つの同一の組を含み、各組は１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識に本質的に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能に本質的に関与する定常領域を規定してもよい。通常、ヒト軽鎖はκ軽鎖及びλ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、一般にα、δ、ε、γ又はμとして分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプがＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭとして定義される。軽鎖及び重鎖内で、可変領域及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は更に約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。
【００６５】
各重鎖／軽鎖（ＶＬ／ＶＨ）の組の可変領域は抗体結合部位を形成する。従って、一般に、完全な状態の抗体は２つの結合部位を有する。二官能性抗体又は二重特異性抗体を除くと、上記の２つの結合部位は通常、同一である。
【００６６】
通常、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の間に配置される「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とも呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、順次、ＦＲ−１（又はＦＲ１）、ＣＤＲ−１（又はＣＤＲ１）、ＦＲ−２（ＦＲ２）、ＣＤＲ−２（ＣＤＲ２）、ＦＲ−３（又はＦＲ３）、ＣＤＲ−３（ＣＤＲ３）、及びＦＲ−４（又はＦＲ４）を含む。ＣＤＲとフレームワーク領域の位置は、当技術分野でよく知られている様々な定義、例えばKabat、Chothia、ＡｂＭ等を用いて決定することができる（例えば、Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001)；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)；Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989)；Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992)；Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997)）。抗原結合部位の定義は、以下にも記載されている：Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000)；Lefranc, M. P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001)；MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)；Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989)；Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991)；及び Rees et al., In Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。KabatとChothiaの組合せた番号付けスキームで、いくつかの実施態様において、ＣＤＲは、KabatＣＤＲ、ChothiaＣＤＲ又はその両方の一部であるアミノ酸残基に対応する。例えば、ＣＤＲは、ＶＨ（例えば、哺乳動物ＶＨ、ヒトＶＨ）のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣ ＣＤＲ１）、アミノ酸残基５０〜６５（ＨＣ ＣＤＲ２）及びアミノ酸残基９５〜１０２（ＨＣ ＣＤＲ３）；並びにＶＬ（例えば、哺乳動物ＶＬ、ヒトＶＬ）のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣ ＣＤＲ１）、アミノ酸残基５０〜５６（ＬＣ ＣＤＲ２）及びアミノ酸残基８９〜９７（ＬＣ ＣＤＲ３）に対応する。
【００６７】
用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン中のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３、並びに重鎖可変ドメイン中のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３）からのアミノ酸残基を含む。参照、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.（抗体のＣＤＲ領域を配列によって定義）。参照、Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917（抗体のＣＤＲ領域を構造によって定義）。用語「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書でＣＤＲ残基として定義された超可変領域残基以外の可変領域残基を意味する。
【００６８】
特に明示されない限り、「抗原結合フラグメント」は、抗体の抗原結合フラグメント、すなわち、全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント、例えば１以上のＣＤＲ領域を保持するフラグメントを意味する。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線形抗体；単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）等の単鎖抗体分子；抗体フラグメントから形成されたナノボディ及び多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
抗体が標的タンパク質に「特異的に結合」するとは、抗体が他のタンパク質に比べて標的タンパク質に優先的に結合を示すことを意味するが、この特異性は絶対的な結合特異性を必要とするものではない。例えば、偽陽性等の望ましくない結果を生じることなく、抗体の結合がサンプル中の標的タンパク質の存在を決定する場合、該抗体はその意図した標的に対して「特異的」であると見なされる。本開示に記載の有用な抗体又はその抗原結合フラグメントは、非標的タンパク質との親和性の少なくとも２倍以上、好ましくは少なくとも１０倍以上、より好ましくは少なくとも２０倍以上、最も好ましくは少なくとも１００倍以上の親和性で標的タンパク質に結合する。本明細書に記載の抗体は、所与のアミノ酸配列、例えば、ヒトＯＸ４０分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合し、その配列を欠くタンパク質に結合しない場合に、所与のアミノ酸配列、例えば、ヒトＯＸ４０分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合すると記載される。
【００７０】
本明細書における用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。ヒト抗体は、マウス中で、マウス細胞又はマウス細胞に由来するハイブリドーマ中で製造されれば、ネズミ糖鎖を含むかもしれない。同様に、「マウス抗体」又は「ラット抗体」は、それぞれマウス又はラットの免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。
【００７１】
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えば、ネズミ）抗体からの配列、及びヒト抗体からの配列を含む抗体の形態を意味する。その抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限度の配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的に全てを含む。必要に応じて、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部を含む。ヒト化抗体を親のげっ歯類の抗体と区別するために必要である場合、抗体クローンの名称に接頭後「ｈｕｍ」、「ｈｕ」、「Ｈｕ」又は「ｈ」を加える。一般に、げっ歯類の抗体のヒト化された形態は、親のげっ歯類の抗体と同一のＣＤＲ配列を含むが、親和性を高めるため、ヒト化抗体の安定性を高めるため、又は他の理由のために特定のアミノ酸置換を含むことができる。
【００７２】
用語「対応するヒト生殖細胞系配列」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン可変領域配列によってコードされた他のすべての既知の可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列又はサブ配列と決定された最高の配列同一性を共有する、ヒト可変領域アミノ酸配列又はサブ配列をコードする核酸配列を意味する。対応するヒト生殖細胞系配列は、評価された他のすべての可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列又はサブ配列と最高のアミノ酸配列同一性を有する、ヒト可変領域アミノ酸配列又は部分配列を意味することもできる。対応するヒト生殖細胞系配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワーク及び相補性決定領域、可変セグメント（先に定義）、又は可変領域を含む配列又はサブ配列の他の組合せのいずれかであることができる。配列同一性は、本明細書に記載された方法を用いて、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又は当技術分野で知られる他のアラインメントアルゴリズムを用いて２つの配列を整列させて決定することができる。対応するヒト生殖細胞系の核酸又はアミノ酸配列は、参照可変領域の核酸配列又はアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有することができる。
【００７３】
用語「平衡解離定数（ＫＤ，Ｍ）」は、解離速度定数（ｋｄ，時間−１）を結合速度定数（ｋａ，時間−１，Ｍ−１）で割ったものを意味する。平衡解離定数は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて測定することができる。本開示の抗体は、一般に、約１０−７又は１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９Ｍ又は１０−１０Ｍ未満、いくつかの側面において約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ又は１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数を有する。
【００７４】
本明細書における用語「癌」又は「腫瘍」は、当技術分野で理解される最も広い意味を有し、通常、無秩序な細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を意味し又は表現する。本開示の文脈において、癌は特定の種類又は場所に限定されない。
【００７５】
用語「併用療法」は、本開示に記載される治療状態又は疾患を治療するための２以上の治療剤の投与を意味する。その投与には、実質的に同時に行われるこれらの治療剤の同時投与が含まれる。その投与には、有効成分ごとに複数の又は別々の容器（例えば、カプセル、粉末及び液体）での同時投与も含まれる。粉末及び／又は液体は、投与前に所望の投与量に再構成又は希釈することができる。加えて、その投与には、連続してほぼ同時に又は異なる時間のいずれかでの各々の種類の治療剤の使用も含まれる。いずれの場合でも、治療計画は、本明細書に記載される治療状態又は疾患を治療する際、治療剤の組合せの有益な効果を提供する。
【００７６】
本開示の文脈において、アミノ酸配列に言及する場合、用語「保存的置換」は、抗体若しくはフラグメントの化学的、物理的及び／又は機能的性質、例えばＯＸ４０への結合親和性を実質的に変化させない新たなアミノ酸による、元のアミノ酸の置換を意味する。具体的には、アミノ酸の一般的な保存的置換が下表に示される。これらは当技術分野でよく知られている。
【００７７】
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【００７８】
配列同一性及び配列類似性の割合を決定するのに適したアルゴリズムの例は、それぞれAltschul et al, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；及びAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センターを通じて入手可能である。このアルゴリズムは、最初にデータベース中の同じ長さの単語（word）で整列させたときに、いくつかの正の値の閾値スコア（positive-valued threshold score）Ｔと一致するか、又はそれを満たす、クエリ配列中の長さＷの短い単語を特定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、近隣の単語スコア閾値と呼ばれる。これらの最初の近隣単語ヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための値として機能する。累積アラインメントスコアを増やすことができる限り、単語ヒットが各配列に沿って両方向に延長される。ヌクレオチド配列の場合、パラメーターＭ（一致する残基のペアの報酬スコア；常に＞０）及びパラメーターＮ（不一致の残基のペナルティスコア；常に＜０）を用いて、累積スコアが計算される。アミノ酸配列の場合、スコアマトリックスを用いて累積スコアが計算される。各方向への単語ヒットの延長は、累積アラインメントスコアが、その達成された最大値から数量Ｘだけ減る場合；１以上の負のスコアの残基アラインメントが蓄積されたため、累積スコアがゼロ以下になる場合；又は、いずれかの配列の終点に到達する場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸによって、アラインメントの感度及び速度が決定される。ヌクレオチド配列の場合、ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、単語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方のストランドの比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、単語長３、期待値（Ｅ）１０を用い、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915）は、アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方のストランドの比較を用いる。
【００７９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も実行する（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの基準は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較で最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、その核酸は参照配列に類似すると考えられる。
【００８０】
２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17, (1988)のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０重量残差テーブル、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを用いて、決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, (1970)を用いて、そのアルゴリズムをＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用いるＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込み、１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重量、及び１、２、３、４、５又は６の長さ重量で、決定することができる。
【００８１】
用語「核酸」は、本明細書で用語「ポリヌクレオチド」と交換可能に用いられ、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを意味する。この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様に代謝される、合成され、天然に存在し、及び天然に存在しない既知のヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基若しくは結合を含む核酸が含まれる。その類似体の例には、限定されることなく、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。
【００８２】
核酸の文脈における用語「作動可能に連結された」は、２以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を意味する。典型的には、これは、転写調節配列と転写される配列の機能的関係を意味する。例えば、適切な宿主細胞又は他の発現システムでコード配列の転写を刺激又は調節する場合、プロモーター又はエンハンサー配列はコード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されているプロモーター転写調節配列は、転写された配列に物理的に隣接しており、すなわち、それらはシス作動性である。しかし、エンハンサー等のいくつかの転写調節配列は、物理的に隣接している必要はなく、また転写を増強するコード配列に近接して配置されている必要はない。
【００８３】
いくつかの態様において、本開示は、組成物、例えば、少なくとも１つの薬学上許容される賦形剤と共に製剤化される、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体を含む薬学上許容される組成物を提供する。本明細書で用いられる用語「薬学上許容される賦形剤」は、生理学的に適合性のある全ての溶媒、分散媒、等張及び吸収遅延剤等を含む。賦形剤は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与、又は経皮投与（例えば、注射又は注入による）に適している。
【００８４】
本明細書の組成物は、多様な形態にすることができる。これらの形態は、例えば、液体、半固体、及び固体剤の形態、例えば、液体溶液（例えば、注射可能な溶液及び点滴溶液）、分散液又は懸濁液、リポソーム、及び坐剤等を含む。適切な形態は、意図した投与の様式及び治療用途によって異なる。典型的な適切な組成物は、注射可能な溶液又は点滴溶液の形態である。１つの適切な投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。いくつかの態様において、抗体は、静脈内点滴又は注射によって投与される。特定の態様において、抗体は、筋肉内注射又は皮下注射によって投与される。
【００８５】
本明細書で用いられる用語「治療上有効な量」は、病気若しくは疾患、又は病気若しくは疾患の臨床症状の少なくとも１つを治療するために対象に投与する際、病気、疾患又は症状に対する治療が有効であるのに十分な抗体の量を意味する。「治療上有効な量」は、抗体、病気、疾患、及び／又は、病気若しくは疾患の症状、病気若しくは疾患及び／又は病気若しくは疾患の症状の重症度、治療を受ける対象の年齢、及び／又は治療を受ける対象の体重によって、変更することができる。所与の事例における適切な量は、当業者に明白であるか、又はルーチンの実験で決定することができる。併用療法の場合、「治療上有効な量」は、病気、疾患又は状態の有効な治療のために組合せに含まれる活性成分の総量を意味する。
【００８６】
詳細な説明
本開示は、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗体及び抗原結合フラグメントを提供する。更に、本開示は、望ましい薬物動態特性及び他の望ましい属性を有する抗体を提供し、従って、癌の可能性を低減させ、又は癌を治療するために使用することができる。本開示は更に、本抗体を含む医薬組成物、癌及び関連する疾患の予防及び治療のためのその医薬組成物を製造及び使用する方法を提供する。
【００８７】
抗ＯＸ４０抗体
本開示は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントには、以下に記載のように製造される抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
本開示は、配列番号１４、２０又は２６（表３）のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）を提供する。本開示はまた、表３に記載のＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。１つの側面において、本開示は、表３に記載のＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３又はそれ以上のＶＨ ＣＤＲを含む（又は代わりに、からなる）、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００８９】
本開示は、配列番号１６、２２又は２８（表３）のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。本開示はまた、表３に記載のＶＬ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。特に、本開示は、表３に記載のＶＬ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３又はそれ以上のＶＬ ＣＤＲを含む（又は代わりに、からなる）、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００９０】
本開示の他の抗体又はその抗原結合フラグメントは、変異しているが、表３に記載される配列に示されるＣＤＲ領域とＣＤＲ領域中で少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの側面において、他の抗体又はその抗原結合フラグメントは、表３に記載される配列に示されるＣＤＲ領域と比較したとき、ＣＤＲ領域中で１、２、３、４又は５以下のアミノ酸が変異している変異アミノ酸配列を含む。
【００９１】
本開示の他の抗体は、アミノ酸又はアミノ酸をコードする核酸が変異しているが、表３に記載される配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有する抗体を含む。いくつかの側面において、他の抗体は、実質的に同じ治療活性を維持しつつ、表３に記載される配列に示される可変領域と比較したとき、可変領域中で１、２、３、４又は５以下のアミノ酸が変異している変異アミノ酸配列を含む。
【００９２】
本開示はまた、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖及び全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。その核酸配列は、哺乳動物細胞中の発現のために最適化することができる。
【００９３】
エピトープの特定及び同エピトープに結合する抗体
本開示は、ヒトＯＸ４０のエピトープに結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。特定の側面において、抗体と抗原結合フラグメントはＯＸ４０の同エピトープに結合することができる。
【００９４】
本開示はまた、表３に記載されている抗ＯＸ４０抗体と同じエピトープに結合する抗体及びその抗原結合フラグメントも提供する。従って、追加の抗体及びその抗原結合フラグメントは、結合アッセイで他の抗体と交差競合する（例えば、統計的に有意な方法で他の抗体の結合を競合的に阻害する）能力に基づいて特定することができる。本開示の抗体及び抗原結合フラグメントのＯＸ４０への結合を阻害する試験抗体の能力があれば、試験抗体が抗体又はその抗原結合フラグメントのＯＸ４０への結合で競合することができることが示される。抗体は、いずれかの理論に拘束されることなく、それが競合する抗体又はその抗原結合フラグメントと同じＯＸ４０上のエピトープ又は関連する（例えば、構造的に類似した、又は空間的に近接した）エピトープに結合することができる。特定の側面において、本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントと同じＯＸ４０上のエピトープに結合する抗体は、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。そのヒト又はヒト化モノクローナル抗体は、本明細書に記載のように調製及び単離することができる。
【００９５】
Ｆｃ領域のフレームワークの更なる変更
更に他の側面において、抗体のエフェクター機能を変更するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることで、Ｆｃ領域が変更される。例えば、抗体のエフェクターリガンドに対する親和性が変更するが、親抗体の抗原結合能力が保持されるように、１以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基に置き換えることができる。親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体のＣ１成分であることができる。このアプローチが、例えば、Winter et alによるＵＳ５６２４８２１及びＵＳ５６４８２６０に記載される。
【００９６】
他の側面において、抗体のＣ１ｑ結合を変更し、及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低下又は消失させるように、１以上のアミノ酸残基を１以上の異なるアミノ酸残基に置き換えることができる。このアプローチが、例えば、Idusogie et alによるＵＳ６１９４５５１に記載される。
【００９７】
更に他の側面において、１以上のアミノ酸残基を変更して、それによって、補体を固定する抗体の能力を変更する。このアプローチは、例えば、Bodmer et alによるＷＯ９４／２９３５１に記載される。特定の側面において、ＩｇＧ１サブクラス及びκアイソタイプの場合、本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントの１以上のアミノ酸を１以上のアロタイプのアミノ酸残基に置き換える。アロタイプのアミノ酸残基には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３サブクラスの重鎖の定常領域、並びにJefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)に記載のκアイソタイプの軽鎖の定常領域も含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
他の側面において、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を高めるために、及び／又はＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を高めるために、１以上のアミノ酸を変更することで、Ｆｃ領域が改変される。このアプローチは、例えば、PrestaによるＷＯ００／４２０７２に記載される。更に、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎのヒトＩｇＧ１の結合部位がマッピングされ、改善された結合を有する変異体が記載される（Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001）。
【００９９】
更に他の側面において、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、非グリコシル化抗体（すなわち、抗体がグリコシル化を欠くか、グリコシル化が減少する）を作成することができる。例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を高めるために、グリコシル化を変更することができる。その炭水化物の改変は、例えば、抗体配列内の１以上のグリコシル化部位を変更することで達成することができる。例えば、１以上のアミノ酸置換を行うことで、１以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去し、それによってその部位でのグリコシル化を除去することができる。その非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。そのアプローチが、例えば、Co et alによるＵＳ５７１４３５０及びＵＳ６３５０８６１に記載される。
【０１００】
付加的に又は代わりに、グリコシル化のタイプが変更された抗体、例えば、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体、又は増加した二分（bisecting）ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を製造することができる。その変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが実証された。その炭水化物の改変は、例えば、変更されたグリコシル化機構を用いて宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構が変更された細胞は、当技術分野で記載され、宿主細胞として用いることで、組換抗体が発現され、それによってグリコシル化が変更された抗体を製造することができる。例えば、Hang et alによるＥＰ１１７６１９５は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株を記載し、その細胞株で発現する抗体は低フコシル化を示すことになる。PrestaによるＷＯ０３／０３５８３５は、Ａｓｎ（２９７）に連結された炭水化物にフコースを付着させる能力が低下した、変異体ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃｌ３細胞を記載し、それによって宿主細胞で発現された抗体の低フコシル化が起こることになる（Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740）。Umana et alによるＷＯ９９／５４３４２は、糖タンパク質修飾型グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように設計された細胞株を記載し、それによって設計された細胞株中で発現される抗体が増加した二分（bisecting）ＧｌｃＮａｃ構造を提示し、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性が増加することになる（Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999）。
【０１０１】
他の側面において、ＡＤＣＣの減少が望まれる場合、ヒト抗体サブクラスＩｇＧ４が、あまり高くないＡＤＣＣのみを持ち、ＣＤＣエフェクター機能をほとんど持たないことが、以前の多くの報告で示された（Moore G L, et al. 2010 MAbs, 2:181-189）。一方、天然のＩｇＧ４は、酸性緩衝液中又は上昇した温度下等のストレス状態で安定性が低いことが見られた（Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108；Dall'Acqua, W. et al, 1998 Biochemistry, 37:9266-9273；Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19）。ＦｃγＲ結合又はＣ１ｑ結合活性を低下又は無くすための変更を組合せて設計されたＩｇＧ４に抗体を作動可能に連結することで、ＡＤＣＣの低下を達成することができ、それによって、ＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター機能が低下又は除去されることになる。生物学的薬剤としての抗体の物理化学的特性を考慮すると、ＩｇＧ４のあまり望ましくない固有の特性の１つは、溶液中で２つの重鎖が動的に分離して、半抗体（half antibody）が形成され、それによって「Ｆａｂアーム交換」と呼ばれるプロセスを経由してインビボで二重特異性の抗体が生成されることである（Van der Neut Kolfschoten M, et al. 2007 Science, 317:1554-157）。２２８位（ＥＵナンバリングシステム）でのセリンからプロリンへの変異は、ＩｇＧ４重鎖の分離を阻害するように思われた（Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108；Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19）。ヒンジ及びγＦｃ領域のアミノ酸残基のいくつかは、Ｆｃγ受容体との抗体の相互作用に影響を与えることが報告されている（Chappel S M, et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9036-9040；Mukherjee, J. et al., 1995 FASEB J, 9:115-119；Armour, K. L. et al. 1999 Eur J Immunol, 29:2613-2624；Clynes, R. A. et al, 2000 Nature Medicine, 6:443-446；Arnold J. N., 2007 Annu Rev immunol, 25:21-50）。更に、ヒト集団でまれにしか発生しないいくつかのＩｇＧ４アイソフォームが、異なる物理化学的特性を誘発することもできる（Brusco, A. et al. 1998 Eur J Immunogenet, 25:349-55；Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19）。ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び不安定性が低いＯＸ４０抗体を製造するために、ヒトＩｇＧ４のヒンジ及びＦｃ領域を改変し、多数の変更を導入することができる。これらの改変されたＩｇＧ４Ｆｃ分子は、Li et alによるＵＳ８７３５５５３に配列番号８３〜８８に見出すことができる。
【０１０２】
ＯＸ４０抗体の製造
抗ＯＸ４０抗体及びその抗原結合フラグメントは、当技術分野で知られている任意の方法で製造することができる。その方法には、組換発現、化学合成、及び抗体テトラマーの酵素的消化が含まれるが、これらに限定されない。また、全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ又は組換製造によって製造することができる。組換発現は、当技術分野で知られている任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞等から成すことができる。
【０１０３】
本開示は更に、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載の相補性決定領域を含む重鎖又は軽鎖可変領域又はセグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの側面において、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５、２１又は２７からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの側面において、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７、２３又は２９からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。
【０１０４】
本開示のポリヌクレオチドは、抗ＯＸ４０抗体の可変領域配列をコードすることができる。また、抗体の可変領域及び定常領域の両方をコードすることもできる。いくつかのポリヌクレオチド配列は、例示された抗ＯＸ４０抗体の１つの重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。いくつかの他のポリヌクレオチドは、ネズミ抗体の１つの重鎖及び軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である２つのポリペプチドセグメントをコードする。
【０１０５】
本開示中で、抗ＯＸ４０抗体を製造するための発現ベクター及び宿主細胞も提供される。発現ベクターの選択は、ベクターが発現されことが意図された宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターには、抗ＯＸ４０抗体鎖又は抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーター及び他の調節配列（例えば、エンハンサー）が含まれる。いくつかの側面において、誘導性プロモーターが、誘導条件の制御下の場合を除いて、挿入された配列の発現を防ぐために用いられる。誘導性プロモーターには、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、又は熱ショックプロモーターが含まれる。宿主細胞がその発現生成物によく耐性であるコード配列のための集団を偏らせることなく、非誘導条件下で、形質転換された細胞の培養物を増殖させることができる。プロモーターに加えて、他の調節要素もまた、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合フラグメントの効率的発現のために、必要であり、又は望まれることがある。これらの要素には、典型的には、ＡＴＧ開始コドン及び隣接するリボソーム結合部位又はその他の配列が含まれる。加えて、用いる細胞システムに適したエンハンサーを含めることで、発現効率を高めることができる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987）。例えば、哺乳動物宿主細胞での発現を増加させるために、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーを用いることができる。
【０１０６】
抗ＯＸ４０抗体鎖を保持及び発現するための宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであることができる。大腸菌は、本開示のポリヌクレオチドをクローニングして発現するのに有用な原核生物宿主の１つである。使用に適した他の微生物宿主には、枯草菌（Bacillus subtilis）等の桿菌、及びサルモネラ菌（Salmonella）、セラチア菌（Serratia）及び様々なPseudomonas（シュードモナス）種等の他の腸内細菌科菌が含まれる。これらの原核生物の宿主では、典型的には、宿主細胞と互換性のある発現制御配列（複製起点等）を含む発現ベクターを作成することもできる。加えて、ラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β−ラクタマーゼプロモーターシステム、又はλファージからのプロモーターシステム等の多数の様々な有名なプロモーターが存在する。プロモーターは典型的には、任意にオペレーター配列と共に発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完結するために、リボソーム結合サイト配列等を有する。抗ＯＸ４０ポリペプチドを発現するために、酵母等の他の微生物も用いることができる。バキュロウイルスベクターと組合せて昆虫細胞も用いることができる。
【０１０７】
他の側面において、哺乳動物宿主細胞が、本開示の抗ＯＸ４０ポリペプチドを発現及び製造するために用いられる。哺乳動物宿主細胞は、例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、又は外因性の発現ベクターを保持する哺乳動物細胞株のいずれかである。これらには、正常な死を免れない（motal）又は正常若しくは異常な不死の動物又はヒト細胞が含まれる。例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨＥＫ２９３細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞株及びハイブリドーマを含む、完全な免疫グロブリンを分泌できる適切な宿主細胞株が数多く開発されている。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養物の使用は、広く、例えば、Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, N.Y., 1987で議論されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサー等の発現制御配列（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986）、及びリボソーム結合サイト、ＲＮＡスプライスサイト、ポリアデニル化サイト、転写ターミネーター配列等の必要なプロセス情報サイトを含むことができる。これらの発現ベクターには通常、哺乳動物の遺伝子又は哺乳動物のウイルスに由来するプロモーターが含まれる。適切なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、及び／又は調節可能若しくは制御可能であることができる。有用なプロモーターには、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト最初期ＣＭＶプロモーター等）、構成的ＣＭＶプロモーター、及び当技術分野で知られているプロモーターとエンハンサーの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
検出方法及び診断方法
本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０の検出方法を含む様々な適用に有用であるが、これらに限定されない。１つの側面において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、生物学的試料中のＯＸ４０の存在を検出するのに有用である。本明細書で用いられる用語「検出」には、定量的検出又は定性的検出が含まれる。特定の側面において、生物学的試料は細胞又は組織を含む。他の側面において、その組織には、他の組織と比較してより高いレベルでＯＸ４０を発現する正常及び／又は癌性組織が含まれる。
【０１０９】
１つの側面において、本開示は、生物学的試料中のＯＸ４０の存在を検出する方法を提供する。特定の側面において、検出方法は、抗体の抗原への結合を許容する条件下、生物学的試料を抗ＯＸ４０抗体と接触させ、抗体と抗原との間で複合体が形成されるを検出することを含む。生物学的試料は、尿又は血液の試料を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１１０】
また、ＯＸ４０の発現に関連する疾患を診断する方法も含まれる。特定の側面において、診断方法は、試験細胞を抗ＯＸ４０抗体と接触させること；ＯＸ４０ポリペプチドへの抗ＯＸ４０抗体の結合を検出することによって、試験細胞内のＯＸ４０の発現レベル（定量的又は定性的に）を決定すること；及び、試験細胞内の発現レベルをコントロール細胞（例えば、試験細胞又はＯＸ４０を発現しない細胞と同じ組織起源の通常細胞レベル）内のＯＸ４０の発現のレベルと比較し、コントロール細胞と比較してより高い試験細胞でのＯＸ４０発現が、ＯＸ４０の発現に関連する疾患の存在を示すことを含む。
【０１１１】
治療方法
本開示の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＯＸ４０関連疾患又は病気の治療方法を含む様々な適用に有用であるが、これらに限定されない。１つの側面において、ＯＸ４０関連疾患又は病気は癌である。
【０１１２】
１つの側面において、本開示は、癌を治療する方法を提供する。特定の側面において、治療方法は、有効量の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合フラグメントをそれを必要とする患者に投与することを含む。癌は、乳癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫及び肉腫を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１１３】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを、非経口投与、肺内投与、鼻腔内投与、及び局所治療が望まれる場合は、病変内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹膜内投与又は皮下投与が含まれる。投与は、投与が短時間であるか慢性であるかに部分的に応じて、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射又は皮下注射等の注射によることができる。本明細書中で、様々な時点での単回投与又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む、様々な投与スケジュールが企図されているが、これらに限定されない。
【０１１４】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、適切な医療行為と一致する方法で、製剤化され、服用され、及び投与される。この文脈で考慮すべき要素には、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の放出部位、投与方法、投与スケジュール及び医療従事者に知られているその他の要因が含まれる。抗体は、必要では無いが、任意に、対象の疾患を予防又は治療するために現在用いられている１以上の薬剤と共に製剤化される。その他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の配合量、疾患又は治療の種類、及び上記で説明した他の要因による。これらは一般に、本明細書に記載されているのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載される投与量の約１〜９９％で、又は経験的／臨床的に決定された任意の投与量及び任意の経路で用いられる。
【０１１５】
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの適切な投与量は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴と抗体への応答、及び対応する医師の裁量に依存する。抗体は、一回で、又は一連の治療を経て、患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μg／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの抗体が、例えば、一回若しくはそれ以上の分離した投与で、又は連続注入で、患者への投与の最初の候補用量とすることができる。上記の要因に応じて、１つの典型的な１日の投与量は、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲でありうる。数日以上の繰り返し投与の場合、状態に応じて、治療は一般に、望ましい症状の抑制が発生するまで継続される。その投与量は、断続的に、例えば、毎週又は３週間ごとに（例えば、患者が約２〜約２０回、又は例えば約６回の抗体を受けるように）投与することができる。最初のより高い負荷投与量に続いて、１以上の低投与量を投与することができる。しかし、他の投与計画が有用でありうる。この治療の進行は、従来の技術とアッセイによって簡単に監視される。
【０１１６】
併用療法
１つの側面において、本開示のＯＸ４０抗体は、他の治療剤と組合せて用いることができる。本開示のＯＸ４０抗体と共に用いることができる他の治療剤には、化学療法剤（例えば、パクリタキセル、パクリタキセル剤、アブラキサン（登録商標）、ドセタキセル、カルボプラチン、トポテカン、シスプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、レナリドマイド、５−アザシチジン、イフォスファミド、オキサリプラチン、ペメトレキセド二ナトリウム、シクロホスファミド、エトポシド、デシタビン、フルダラビン、ビンクリスチン、ベンダムスチン、クロランブシル、ブスルファン、ゲムシタビン、メルファラン、ペントスタチン、ミトキサントロン）；チロシンキナーズ阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ））；マルチキナーゼ阻害剤（例えば、ＭＧＣＤ２６５、ＲＧＢ−２８６６３８）；ＣＤ−２０ターゲティング剤（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、ＲＯ５０７２７５９、ＬＦＢ−Ｒ６０３）；ＣＤ５２ターゲティング剤（例えば、アレムツズマブ）；プレドニゾロン、ダルベポエチンアルファ、レナリドマイド；Ｂｃｌ−２阻害剤（例えば、オブリメルセンナトリウム）；オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、ＭＬＮ８２３７、ＴＡＫ−９０１）；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）；ＣＤ−１９ターゲティング剤（例えば、ＭＥＤＩ−５５１、ＭＯＲ２０８）；ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＡＢＴ−３４８）；ＪＡＫ−２阻害剤（例えば、ＩＮＣＢ０１８４２４）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、テムシロリムス、エベロリムス）；ＢＣＲ／ＡＢＬ阻害剤（例えば、イマチニブ）；ＥＴ−Ａ受容体アンタゴニスト（例えば、ＺＤ４０５４）；ＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲ−２）アゴニスト（例えば、ＣＳ−１００８）；ＨＧＦ／ＳＦ阻害剤（例えば、ＡＭＧ １０２）；ＥＧＥＮ−００１；ポロ様キナーゼ１阻害剤（例えば、ＢＩ ６７２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
医薬組成物及び医薬製剤
また、抗ＯＸ４０抗体若しくは抗原結合フラグメント、又は抗ＯＸ４０抗体若しくは抗原結合フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬製剤を含む組成物が提供される。特定の実施態様において、組成物は、ＯＸ４０に結合する１以上の抗体若しくは抗原結合フラグメント、又はＯＸ４０に結合する１以上の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む１以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、更に当技術分野でよく知られている緩衝液を含む薬学上許容される賦形剤等の適切な担体を含むことができる。
【０１１８】
本明細書に記載されるＯＸ４０抗体又はその抗原結合フラグメントの医薬製剤は、所望の程度の純度を有する抗体又はその抗原結合フラグメントを、１以上の任意の薬学上許容される担体と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）。薬学上許容される担体は一般に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無毒である。薬学上許容される担体には、リン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニン等の抗酸化物質；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛タンパク質複合体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。本明細書の例示的な薬学上許容される担体には、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）等の侵入型薬物分散剤、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標），Baxter International, Inc.）等のヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が更に含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ＵＳ７８７１６０７及びＵＳ２００６／０１０４９６８に記載される。１つの側面において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の１以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組合される。
【０１１９】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が、ＵＳ６２６７９５８に記載されている。水性抗体製剤には、ＵＳ６１７１５８６及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されているものが含まれ、後者の製剤にはヒスチジン−酢酸緩衝液が含まれる。
【０１２０】
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含む、フィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形状である半透性マトリックスの固体疎水性ポリマーが含まれる。
【０１２１】
インビボ投与に用いられる製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、無菌ろ過膜を介したろ過によって、容易に達成することができる。
【実施例】
【０１２２】
実施例１  抗ＯＸ４０モノクローナル抗体の生成
従来のハイブリドーマ融合技術（de StGroth and Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35:1; Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378:1）に基づいて、小さな変更を行って、抗ＯＸ４０モノクローナル抗体を生成させた。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイで高い結合活性を持つ抗体を、更なる特性評価のために選択された。
【０１２３】
免疫化及び結合アッセイのためのＯＸ４０組換タンパク質
完全長のヒトＯＸ４０（配列番号１）をコードするｃＤＮＡを、ＧｅｎＢａｎｋ配列（アクセッション番号：Ｘ７５９６２．１）に基づいて、Sino Biological（中国，北京）で合成した。シグナルペプチド及びＯＸ４０のアミノ酸（ＡＡ）１〜２１６（配列番号２）からなる細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のコード領域をＰＣＲ増幅し、マウスＩｇＧ２ａのＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ１野生型重鎖のＦｃドメイン又はＨｉｓタグにＣ−末端を融合した社内で開発された発現ベクターにクローニングした。その結果、３つの組換融合タンパク質発現プラスミドＯＸ４０−ｍＩｇＧ２ａ、ＯＸ４０−ｈｕＩｇＧ１及びＯＸ４０−Ｈｉｓが生成された。ＯＸ４０融合タンパク質の概略図を図１に示す。組換融合タンパク質の製造のために、ＯＸ４０−ｍＩｇＧ２ａ、ＯＸ４０−ｈｕＩｇＧ１及びＯＸ４０−Ｈｉｓの発現プラスミドを２９３Ｇ細胞に一過性に形質転換し、回転式撹拌器を備えたＣＯ２インキュベーターで７日間培養した。組換タンパク質を含む上清を集め、遠心分離で透明にした。プロテインＡカラム（Cat：17-5438-02，GE Life Sciences）を用いて、ＯＸ４０−ｍＩｇＧ２ａ及びＯＸ４０−ｈｕＩｇＧ１を精製した。Ｎｉセファロースカラム（Cat：17-5318-02，GE Life Science）を用いて、ＯＸ４０−Ｈｉｓを精製した。ＯＸ４０−ｍＩｇＧ２ａ、ＯＸ４０−ｈｕＩｇＧ１及びＯＸ４０−Ｈｉｓタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、少量のアリコートで−８０℃の冷凍庫内に保存した。
【０１２４】
安定な発現細胞株
完全長のヒトＯＸ４０（ＯＸ４０）又はカニクイザルＯＸ４０（ｃｙｎｏＯＸ４０）を発現する安定な細胞株を生成させるために、これらの遺伝子をレトロウイルスベクターｐＦＢ−Ｎｅｏ（Cat：217561，Agilent，米国）にクローニングした。レトロウイルスの形質導入は、先に記載されたプロトコール（Zhang et al., 2005）に基づいて実行された。ＨｕＴ７８及びＨＥＫ２９３細胞を、それぞれヒトＯＸ４０又はｃｙｎｏＯＸ４０を含むウイルスでレトロウイルス的に形質導入し、ＨｕＴ７８／ＯＸ４０、ＨＥＫ２９３／ＯＸ４０及びＨｕＴ７８／ｃｙｎｏＯＸ４０細胞株を生成させた。
【０１２５】
免疫化、ハイブリドーマ融合及びクローニング
８〜１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（HFK BIOSCIENCE CO., LTD，中国，北京）を、１０μｇのＯＸ４０−ｍＩｇＧ２ａ及びＱｕｉｃｋ−Ａｎｔｉ Ｉｍｍｕｎｏ−Ａｄｊｕｖａｎｔ（Cat：KX0210041，KangBiQuan，中国，北京）を含む２００μＬの混合抗原で腹腔内で免疫した。この手順を３週間、繰り返した。２回目の免疫から２週間後、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳでマウス血清のＯＸ４０結合を評価した。血清スクリーニングから１０日後、抗ＯＸ４０抗体の血清力価が最も高いマウスを、１０μｇのＯＸ４０−ｍＩｇＧ２ａの腹腔内注射を介して追加免疫した。追加免疫から３日後、脾細胞を単離し、標準的手法（Somat Cell Genet, 1977 3:231）を用いて、ネズミ骨髄腫細胞株のＳＰ２／０細胞（ATCC，バージニア州マナッサス）に融合させた。
【０１２６】
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによる抗体のＯＸ４０結合活性の評価
ハイブリドーマクローンの上清を、（Methods in Molecular Biology (2007) 378:33-52）に記載されたＥＬＩＳＡによって、いくつかの変更を行って、最初にスクリーニングした。簡単に説明すると、ＯＸ４０−Ｈｉｓタンパク質を９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した後、プレートをＰＢＳ／３％ＢＳＡで室温で２時間ブロックした。続いて、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、細胞上清と共に室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Cat：115035-008，Jackson ImmunoResearch Inc，Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG，Fcγ fragment specific）及び基質（Cat：00-4201-56，eBioscience，米国）を用いて、４５０ｎｍの波長での色吸光度シグナルを発現させた。色吸光度シグナルをプレートリーダー（SpectraMax Paradigm，Molecular Devices／PHERAstar，BMG LABTECH）を用いて測定した。陽性親クローンを間接ＥＬＩＳＡを用いる融合スクリーニングから拾い上げた。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを更に、上記のＨｕＴ７８／ＯＸ４０及びＨｕＴ７８／ｃｙｎｏＯＸ４０細胞を用いてＦＡＣＳで検証した。ＯＸ４０発現細胞（１０５細胞／ウェル）をＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマ上清とインキュベートし、続いてＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０抗体（Cat：50-4010-82，eBioscience，米国）と結合させた。細胞の蛍光を、フローサイトメーター（Guava easyCyte 8HT，Merck-Millipore，米国）を用いて定量した。
【０１２７】
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳの両方のスクリーニングで陽性シグナルを示したハイブリドーマからの馴化培地を、ヒト免疫細胞ベースアッセイで良好な機能的活性を持つ抗体を特定するための機能的アッセイに付した（参照：下記セクション）。望ましい機能的活性を有する抗体を更にサブクローン化し、特徴付けした。
【０１２８】
ハイブリドーマの無血清又は低血清培地へのサブクローニング及び適応
上記のＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及び機能的アッセイによる一次スクリーニングの後、陽性ハイブリドーマクローンを、クローン性を確保するために限界希釈でサブクローン化した。トップの抗体サブクローンを機能的アッセイで検証し、３％ＦＢＳを含むＣＤＭ４ＭＡｂ培地（Cat：SH30801.02，Hyclone，米国）中で増殖のために適応させた。
【０１２９】
モノクローナル抗体の発現及び精製
トップの抗体クローンを発現するハイブリドーマ細胞を、ＣＤＭ４ＭＡｂ培地（Cat：SH30801.02，Hyclone，米国）中で培養し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で５〜７日間インキュベートした。馴化培地を、遠心分離で収集し、精製前に０．２２μｍメンブレンを通過させてろ過した。上清中のネズミ抗体を、製造者のガイドに従って、プロテインＡカラム（Cat：17-5438-02，GE Life Sciences）にかけて、結合させた。この手順で、通常、９０％を超える純度の抗体が得られる。プロテインＡアフィニティー精製抗体を、ＰＢＳに対して透析し、又は必要に応じて、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（Cat：28-9893-35，GE Life Sciences）を用いて更に精製して、凝集体を除去した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することで決定した。最終抗体調製物を、−８０℃の冷凍庫にアリコートで保存した。
【０１３０】
実施例２  抗ＯＸ４０抗体のクローニング及び配列分析
ネズミハイブリドーマクローンを採取し、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＲＮＡキット（Cat：74104，QIAGEN，ドイツ）を用いて、製造者のプロトコルに従って全細胞ＲＮＡを調製した。第１鎖ｃＤＮＡを、InvitrogenのｃＤＮＡ合成キット（Cat：18080-051）を用いて合成した。ＰＣＲキット（Cat：CWBio，中国，北京）を用いて、ハイブリドーマ抗体のＶＨ及びＶＬのＰＣＲ増幅を行った。重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗体ｃＤＮＡクローニングに用いられるオリゴプライマーを、先に報告された配列（Brocks et al. 2001 Mol Med 7:461）に基づいて、Invitrogen（北京、中国）で合成した。ＰＣＲ産物を直接用いて、ｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（Cat：CB101 TransGen、中国）にサブクローニングを行い、続いて、Genewiz（北京、中国）で配列決定した。ＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列決定の結果から推定した。
【０１３１】
ネズミ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、Kabat（Wu and Kabat 1970 J.Exp.Med. 132:211-250）システムに基づいて、配列アノテーションによって、及びコンピュータプログラム配列分析によって定義した。代表的なトップクローンＭｕ４４５（ＶＨ及びＶＬ）のアミノ酸配列を、表１（配列番号９及び１１）に記載する。Ｍｕ４４５のＣＤＲ配列を、表２（配列番号３〜８）に記載する。
【０１３２】
【表１】
2021524256.tif 000003
【０１３３】
【表２】
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【０１３４】
実施例３  ネズミ抗ヒトＯＸ４０抗体４４５のヒト化
抗体のヒト化及び設計
Ｍｕ４４５のヒト化のために、ＩＭＧＴのヒト免疫グロブリン遺伝子データベースとの配列比較によって、Ｍｕ４４５可変領域のｃＤＮＡ配列に高い相同性を共有する配列をヒト生殖細胞系ＩｇＧ遺伝子で検索した。高い頻度（Glanville et al., 2009 PNAS 106:20216-20221）及びＭｕ４４５に高い相同性をを有するヒト抗体レパートリーに存在する、ヒトＩＧＨＶ及びＩＧＫＶ遺伝子を、ヒト化のテンプレートとして選択した。
【０１３５】
ＣＤＲ移植（Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering, Methods and Protocols, Vol 248: Humana Press）によってヒト化を実施した。社内で開発された発現ベクターを用いることで、ヒトＩｇＧ１野生型フォーマットとしてヒト化抗体を設計した。ヒト化の最初のラウンドにおいて、フレームワーク領域でのネズミのアミノ酸残基からヒトのアミノ酸残基への変異は、シミュレーションされた３Ｄ構造分析で導かれた。ＣＤＲの標準的構造を維持するために構造的重要性を有するネズミのフレームワーク残基は、最初のバージョンのヒト化抗体４４５（参照：４４５−１，表３）に保持された。４４５−１の６つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ1（配列番号３）、ＨＣＤＲ２（配列番号１３）、ＨＣＤＲ３（配列番号５）、ＬＣＤＲ１（配列番号６）、ＬＣＤＲ２（配列番号７）及びＬＣＤＲ３（配列番号８）のアミノ酸配列を有する。４４５−１の重鎖可変領域は、配列番号１５のヌクレオチド配列でコードされる（ＶＨ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する。軽鎖可変領域は、配列番号１７のヌクレオチド配列でコードされる（ＶＬ）配列番号１６のアミノ酸配列を有する。具体的には、Ｍｕ４４５（配列番号６〜８）のＬＣＤＲが、２つのマウスフレームワーク残基（Ｉ４４及びＹ７１）が保持されたヒト生殖細胞系可変遺伝子ＩＧＶＫ１〜３９のフレームワーク（配列番号１６）に移植された。ＨＣＤＲ１（配列番号３）、ＨＣＤＲ２（配列番号１３）及びＨＣＤＲ３（配列番号５）が、２つのマウスのフレームワーク残基（Ｌ７０及びＳ７２）が保持されたヒト生殖細胞系可変遺伝子ＩＧＶＫ１〜６９のフレームワーク（配列番号１４）に移植された。４４５のヒト化変異体（４４５−１）において、シミュレーションされた３Ｄ構造に従って、Kabat ＨＣＤＲ２のＮ末端の半分のみが抗原結合にとって重要であると予測されたため、Kabat ＨＣＤＲ２のＮ末端の半分のみが移植された。
【０１３６】
ヒト野生型ＩｇＧ１（ＩｇＧ１ｗｔ）及びκ鎖の定常領域のそれぞれ、並びに簡単に適応するサブクローニングサイトを含む社内で開発された発現ベクターを用いて、４４５−１をヒト化された全長抗体として構築した。上記の２つのコンストラクトを２９３Ｇ細胞に同時形質転換することで、４４５−１抗体を発現させ、プロテインＡカラム（Cat：17-5438-02，GE Life Sciences）を用いて精製した。精製した抗体をＰＢＳ中で０．５〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃の冷凍庫にアリコートで保存した。
【０１３７】
４４５−１抗体を用いて、ＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域に保持されるネズミの残基をヒトの生殖細胞系の残基に変換して、例えば、ＶＬ中のＩ４４Ｐ及びＹ７１Ｆ並びにＶＨ中のＬ７０Ｉ及びＳ７２Ａなどで、いくつかの単一アミノ酸の変更が行われた。加えて、潜在的な異性化リスクを軽減し、ヒト化レベルを向上させるために、ＣＤＲ中にいくつかの単一アミノ酸の変更が行われた。例えば、ＬＣＤＲ２中でＴ５１Ａ及びＤ５０Ｅの変更が行われ、ＨＣＤＲ２中でＤ５６Ｅ、Ｇ５７Ａ及びＮ６１Ａの変更が行われた。すべてのヒト化の変更は、特定の位置での変異を含むプライマーと、部位特異的変異誘発キット（Cat：AP231-11，TransGen，中国，北京）を用いて行われた。所望の変更を配列決定で確認した。
【０１３８】
４４５−１抗体のアミノ酸の変更が、ＯＸ４０への結合及び熱安定性について評価された。上記の特定の変更の組合せから、配列番号３のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、配列番号５のＨＣＤＲ３、配列番号６のＬＣＤＲ１、配列番号１９のＬＣＤＲ２及び配列番号８のＬＣＤＲ３を含む抗体４４５−２（参照：表３）を構築した。その結果、２つの抗体を比較したところ、抗体４４５−２及び４４５−１の両方が類似の結合親和性を示すことが示された（参照：表４及び表５）。
【０１３９】
４４５−２抗体から始めて、結合親和性／動態を更に改善するために、ＶＬのフレームワーク領域中でいくつかの追加のアミノ酸の変更、例えば、アミノ酸Ｇ４１Ｄ及びＫ４２Ｇの変更が行われた。加えて、免疫原性のリスクを低減し、熱安定性を高めるために、ＶＨ及びＶＬの両方のＣＤＲ中のいくつかの単一アミノ酸の変更、例えば、ＬＣＤＲ１中のＳ２４Ｒ及びＨＣＤＲ２中のＡ６１Ｎの変更が加えられた。結果として得られた変更は、４４５−２と比較して、改善された結合活性又は熱安定性のいずれかを示した。
【０１４０】
ヒトでの治療用途のための分子及び生物物理学的特性を改善するために、ＣＤＲ及びフレームワーク領域中に特定のアミノ酸の変更を導入することで、ヒト化４４５抗体を更に設計した。考慮事項には、結合活性を維持しながら、有害な翻訳後の変更の除去、改善された熱安定性（Ｔｍ）、表面の疎水性及び等電子点（ｐＩ）が含まれた。
【０１４１】
上記の成熟化プロセスから、配列番号３のＨＣＤＲ１、配列番号２４のＨＣＤＲ２、配列番号５のＨＣＤＲ３、配列番号２５のＬＣＤＲ１、配列番号１９のＬＣＤＲ２及び配列番号８のＬＣＤＲ３を含むヒト化モノクローナル抗体４４５−３（参照：表３）を構築し、詳細に特徴付けをした。抗体４４５−３は、ヒトＩｇＧ２の野生型重鎖のＦｃドメインを含むＩｇＧ２バージョン（４４５−３ ＩｇＧ２）、及びヒトＩｇＧ４のＦｃドメインを含み、Ｓ２２８Ｐ及びＲ４０９Ｋの変異を含むＩｇＧ４バージョン（４４５−３ ＩｇＧ４）でも作られた。その結果、抗体４４５−３及び４４５−２が類似の結合親和性を示すことが示された（参照：表４及び表５）。
【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
実施例４  ＳＰＲによる抗ＯＸ４０抗体の結合速度及び親和性の決定
抗ＯＸ４０抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ Ｔ−２００（GE Life Sciences）を用いてＳＰＲアッセイによって、結合速度及び親和性について特徴付けした。簡単に説明すると、抗ヒトＩｇＧ抗体を、活性化ＣＭ５バイオセンサーチップ（Cat：BR100530，GE Life Sciences）に固定した。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有する抗体をチップ表面上に流し、抗ヒトＩｇＧ抗体で捕捉した。次に、Ｈｉｓタグ（Cat：10481-H08H，Sino Biological）を有する組換ＯＸ４０タンパク質の段階希釈を、チップ表面に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化を分析して、１対１のラングミュア結合モデル（BIA Evaluation Software，GE life Sciences）を用いて、結合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）を計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を比率ｋｄ／ｋａとして計算した。抗ＯＸ４０抗体のＳＰＲで決定された結合プロファイルの結果を、図２及び表４に要約する。抗体４４５−３の平均ＫＤ（９．４７ｎＭ）の結合プロファイルは、抗体４４５−２（１３．５ｎＭ）及び４４５−１（１７．１ｎＭ）よりもわずかに優れ、ｃｈ４４５のプロファイルと類似した。４４５−３ ＩｇＧ４の結合プロファイルは、４４５−３（ＩｇＧ１ Ｆｃを有する）と類似し、ＩｇＧ４とＩｇＧ１の間のＦｃの変化が、４４５−３抗体の特定の結合を変更しないことを示した。
【０１４４】
【表４】
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【０１４５】
実施例５  ＨｕＴ７８細胞上に発現したＯＸ４０に対する抗ＯＸ４０抗体の結合親和性の決定
生細胞の表面に発現したＯＸ４０に結合する抗ＯＸ４０抗体の結合活性を評価するために、実施例１に記載されたようにＨｕＴ７８細胞をヒトＯＸ４０で形質転換して、ＯＸ４０発現株を作成した。生きたＨｕＴ７８／ＯＸ４０細胞を９６ウェルプレートに播種し、様々な抗ＯＸ４０抗体の段階希釈液とインキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Cat：A0556，Beyotime）を二次抗体として用いて、細胞表面への抗体の結合を検出した。用量反応データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを有する４パラメーターロジスティックモデルに適合させることで、ヒトＯＸ４０への用量依存的結合のＥＣ５０値を決定した。図３及び表５に示すように、ＯＸ４０抗体はＯＸ４０に対して高い親和性を示した。本開示のＯＸ４０抗体がフローサイトメトリーで測定された比較的高いトップレベルの蛍光強度（参照：表５の右端列）を持つことも見出された。これは、より望ましい結合プロファイルであるＯＸ４０からの抗体のより遅い解離を示す。
【０１４６】
【表５】
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【０１４７】
実施例６  抗ＯＸ４０抗体の交差反応性の決定
ヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）サルＯＸ４０への抗体４４５−３の交差反応性を評価するために、ヒトＯＸ４０発現細胞（ＨｕＴ７８／ＯＸ４０）及びカニクイザルＯＸ４０発現細胞（ＨｕＴ７８／ｃｙｎｏＯＸ４０）を９６ウェルプレートに播種し、ＯＸ４０抗体の段階希釈液とインキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Cat：A0556，Beyotime）を検出用二次抗体として用した。用量反応データをＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを有する４パラメーターロジスティックモデルに適合させることで、ヒト及びカニクイザルのネイティブＯＸ４０への用量依存的結合のＥＣ５０値を決定した。その結果を、以下の図４及び表６に示す。抗体４４５−３は、ヒトとカニクイザルの両方のＯＸ４０と交差反応し、以下に示すように類似するＥＣ５０値を有する。
【０１４８】
【表６】
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【０１４９】
実施例７  ＯＸ４０の４４５−３Ｆａｂとの共結晶化と構造決定
本開示の抗体に対するＯＸ４０の結合メカニズムを理解するために、ＯＸ４０と４４５−３のＦａｂの共結晶構造を解析した。ＯＸ４０のグリコシル化を遮断し、タンパク質の均一性を改善するために、残基Ｔ１４８及びＮ１６０の変異を導入した。変異型ヒトＯＸ４０（２つの変異部位Ｔ１４８Ａ及びＮ１６０Ａを含む残基Ｍ１〜Ｄ１７０）をコードするＤＮＡを、ｈｅｘａ−Ｈｉｓタグを含む発現ベクターにクローニングし、このコンストラクトをタンパク質発現のために２９３Ｇ細胞に３７℃で７日間、一過性に形質転換した。細胞を採取し、上清を回収して、Ｈｉｓタグアフィニティーレジンと共に４℃で１時間インキュベートした。樹脂を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び３０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液で３回洗浄した。次に、ＯＸ４０タンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液で溶出し、続いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（GE Healthcare）を用いて精製した。
【０１５０】
４４５−３Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のコード配列を、重鎖のＣ末端にｈｅｘａ−Ｈｉｓタグが含む発現ベクターにクローニングし、これらをタンパク質発現のために２９３Ｇ細胞に３７℃で７日間、一過性に同時形質転換した。４４５−３Ｆａｂの精製手順は、上記の変異型ＯＸ４０タンパク質に用いものと同じであった。
【０１５１】
精製したＯＸ４０及び４４５−３Ｆａｂをモル比１：１で混合し、氷上で３０分間インキュベートし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（GE Healthcare）を用いて更に精製した。複合体ピークを収集し、約３０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０１５２】
タンパク質複合体をリザーバー溶液と１：１の体積比で混合することで、共結晶スクリーンを行った。０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１％ＰＥＧ、２，０００ＭＭＥ及び０．９５Ｍコハク酸ナトリウムを含むリザーバー溶液を用いた蒸気拡散によって２０℃で成長させた懸滴から、共結晶を得た。
【０１５３】
ナイロンループを用いて共結晶を採取し、結晶を２０％グリセロールを添加したリザーバー溶液に１０秒間浸漬した。上海シンクロトロン放射施設のビームラインＢｌ１７Ｕ１で回折データを収集し、ＸＤＳプログラムで処理した。ＩｇＧ Ｆａｂの構造（ＰＤＢのＣ鎖及びＤ鎖：５ＣＺＸ）及びＯＸ４０の構造（ＰＤＢのＲ鎖：２ＨＥＶ）を分子置換検索モデルとして用いてプログラムＰＨＡＳＥＲで、このフェーズを解析した。Ｐｈｅｎｉｘ ｒｅｆｉｎｅグラフィカルインターフェースを用いて、Ｘ線データに対して剛体（rigid body）、ＴＬＳ及び抑制された精密化を行い、その後、ＣＯＯＴプログラムで調節し、Ｐｈｅｎｉｘ ｒｅｆｉｎｅプログラムで更に精密化を行った。Ｘ線データ収集と精密化統計を、表７に要約する。
【０１５４】
【表７】
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【０１５５】
実施例８  ＳＰＲによる抗体４４５−３のエピトープの特定
ＯＸ４０及び抗体４４５−３Ｆａｂの共結晶構造に基づいて、ヒトＯＸ４０タンパク質の一連の単一変異を選択し、生成し、更に本開示の抗ＯＸ４０抗体の主要なエピトープを特定した。部位特異的変異誘発キット（Cat：AP231-11，TransGen）を用いてヒトＯＸ４０／ＩｇＧ１融合コンストラクトに単一点変異を行った。所望の変異を、配列決定で検証した。２９３Ｇ細胞への形質転換によって、ＯＸ４０変異体の発現と調製を行い、プロテインＡカラム（Cat：17-5438-02，GE Life Sciences）を用いて精製した。
【０１５６】
ＢＩＡｃｏｒｅ８Ｋ（GE Life Sciences）を用いてＳＰＲアッセイで、ＯＸ４０点変異体の４４５−３Ｆａｂへの結合親和性を特徴付けた。簡単に説明すると、ＥＤＣとＮＨＳを用いて、ＯＸ４０変異体と野生型ＯＸ４０をＣＭ５バイオセンサーチップ（Cat：BR100530，GE Life Sciences）に固定した。次に、３０μｌ／分で１８０秒の接触時間と６００秒の解離時間を用いて、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（Cat：BR-1008-26，GE Life Sciences）中、４４５−３Ｆａｂの段階希釈をチップ表面に流した。表面プラズモン共鳴シグナルの変化を分析して、１対１のラングミュア結合モデル（BIA Evaluation Software，GE life Sciences）を用いて、結合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）を計算した。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｄ／ｋａの比率として計算した。変異体のＫＤシフトフォールドを変異体のＫＤ／ＷＴのＫＤの比率として計算した。ＳＰＲで決定されたエピトープ特定のプロファイルを図５及び表８に要約する。その結果、ＯＸ４０中の残基Ｈ１５３、Ｉ１６５及びＥ１６７のアラニンへの変異によって、抗体４４５−３のＯＸ４０への結合が大きく減少し、残基Ｔ１５４及びＤ１７０のアラニンへの変異によって、抗体４４５−３のＯＸ４０への結合が軽度に減少することが示された。
【０１５７】
抗体４４５−３とＯＸ４０の残基Ｈ１５３、Ｔ１５４、Ｉ１６５、Ｅ１６７及びＤ１７０との間の詳細な相互作用を図６に示す。ＯＸ４０上のＨ１５３の側鎖が、相互作用の境界面上の４４５−３の小さなポケットに囲まれ、重鎖Ｓ３１及び重鎖Ｇ１０２と水素結合を形成し、重鎖Ｙ１０１とπ−πスタッキングを形成した。Ｅ１６７の側鎖が重鎖Ｙ５０と重鎖Ｎ５２と水素結合を形成し、Ｄ１７０が重鎖Ｓ３１と重鎖Ｋ２８とそれぞれ水素結合と塩橋を形成し、これらが複合体を更に安定化させることができる。Ｔ１５４と重鎖Ｙ１０５の間、及びＩ１６５と重鎖Ｒ５９の間のファンデルワールス（ＶＤＷ）相互作用が、抗体４４５−３のＯＸ４０への高い親和性に貢献した。
【０１５８】
結論として、ＯＸ４０の残基Ｈ１５３、Ｉ１６５及びＥ１６７を、抗体４４５−３と相互作用する重要な残基として特定した。加えて、ＯＸ４０のアミノ酸Ｔ１５４及びＤ１７０も、抗体４４５−３に重要な接触残基である。このデータから、抗体４４５−３のエピトープがＯＸ４０の残基Ｈ１５３、Ｔ１５４、Ｉ１６５、Ｅ１６７及びＤ１７０であることが示された。これらのエピトープは下記配列中に存在し、その重要な接触残基に下線を引く。
HTLQPASNSSDAICEDRD（配列番号３０）
【０１５９】
【表８】
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【０１６０】
実施例９  抗ＯＸ４０抗体４４５−３はＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌの相互作用を遮断しない
抗体４４５−３がＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌの相互作用を妨害するかを判断するために、細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイを用いた。このアッセイで、抗体４４５−３、参照抗体１Ａ７．ｇｒｌ、コントロールｈｕＩｇＧ又は培地のみを、ネズミＩｇＧ２ａ Ｆｃを含むヒトＯＸ４０融合タンパク質（ＯＸ４０−ｍＩｇＧ２ａ）とプレインキュベートした。次に、抗体と融合タンパク質の複合体を、ＯＸ４０Ｌ発現ＨＥＫ２９３細胞に加えた。ＯＸ４０抗体がＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ相互作用を妨害しない場合は、ＯＸ４０抗体−ＯＸ４０ ｍＩｇＧ２ａ複合体は依然として表面ＯＸ４０Ｌに結合し、この相互作用は抗マウスＦｃ二次抗体を用いて検出可能である。
【０１６１】
図７に示すように、抗体４４５−３は、高濃度であっても、ＯＸ４０のＯＸ４０Ｌへの結合を減少させず、４４５−３がＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌの相互作用を妨害しないことが示された。これは、４４５−３がＯＸ４０Ｌの結合部位で結合しないか、ＯＸ４０Ｌの結合を立体的に妨ぐに十分なほど近くに結合しないことを示す。対照的に、陽性コントロール抗体１Ａ７．ｇｒｌは、図７に示すように、ＯＸ４０ＬへのＯＸ４０の結合を完全に遮断する。
【０１６２】
加えて、４４５−３Ｆａｂと複合体を形成したＯＸ４０の共結晶構造を解析し、図８に示すようにＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ複合体（ＰＤＢコード：２ＨＥＶ）と整列させた。ＯＸ４０リガンド三量体は、主にＯＸ４０のＣＲＤ１（システインリッチドメイン）、ＣＲＤ２及び部分的なＣＲＤ３領域を介してＯＸ４０と相互作用する（Compaan and Hymowitz, 2006）。他方、抗体４４５−３はＣＲＤ４を介してのみＯＸ４０と相互作用する。要約すると、４４５−３抗体及びＯＸ４０Ｌ三量体は、ＯＸ４０のそれぞれの異なる領域で結合し、抗体４４５−３はＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌの相互作用を妨害しない。この結果は、上記実施例に記載したエピトープマッピングデータと相関している。ＯＸ４０のＣＲＤ４はアミノ酸１２７〜１６７にあり、抗体４４５−３のエピトープはこの領域と部分的に重複している。ＯＸ４０ ＣＲＤ４（アミノ酸１２７〜１６７）の配列を以下に示し、４４５−３エピトープの部分的な重複に下線を引く。
PCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICE（配列番号３１）
【０１６３】
実施例１０  抗ＯＸ４０抗体４４５−３のアゴニスト活性
抗体４４５−３のアゴニスト機能を調べるために、４４５−３若しくは１Ａ７．ｇｒｌの存在下又は非存在下、一晩、ＯＸ４０陽性Ｔ細胞株ＨｕＴ７８／ＯＸ４０を人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）株（ＨＥＫ２９３／ＯＳ８ｌｏｗ−ＦｃγＲＩ）と共培養した。ＩＬ−２産生をＴ細胞刺激の読み出しとして用いた。ＨＥＫ２９３／ＯＳ８Ｌｏｗ−ＦｃγＲＩ細胞において、膜結合抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（ＯＳ８）（ＵＳ８７３５５５３に記載）及びヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）をコードする遺伝子を、ＨＥＫ２９３細胞に安定的に共形質導入した。抗ＯＸ４０抗体誘発免疫活性化は抗体の架橋に依存する（Voo et a. 2013）ため、ＨＥＫ２９３／ＯＳ８Ｌｏｗ−ＦｃγＲＩ上のＦｃγＲＩは、ＯＸ４０とＦｃγＲＩの両方への抗ＯＸ４０抗体の結合における、抗ＯＸ４０抗体媒介のＯＸ４０の架橋の基礎を提供する。図９に示すように、抗ＯＸ４０抗体４４５−３は、０．０６ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で用量依存的にＴＣＲシグナル伝達の増強に非常に強力であった。参照抗体１Ａ７．ｇｒｌの僅かに弱い活性も観察された。対照的に、コントロールのヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）又はブランクは、ＩＬ−２産生に影響が無いことが示された。
【０１６４】
実施例１１  混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて抗ＯＸ４０抗体４４５−３が免疫反応を促進した
抗体４４５−３がＴ細胞活性化を刺激できるかを決定するために、以前の記載（Tourkova et al., 2001）の通り、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを設定した。簡単に説明すると、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と培養し、続いてＬＰＳ刺激を行って、ヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ１４＋骨髄細胞から成熟したＤＣを誘導した。次に、抗ＯＸ４０ ４４５−３抗体（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）の存在下、マイトマイシンＣ処理ＤＣを、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞と２日間共培養した。共培養中のＩＬ−２産生を、ＭＬＲ応答の読み出しとしてＥＬＩＳＡで検出した。
【０１６５】
図１０に示すように、抗体４４５−３はＩＬ−２産生を有意に促進し、４４５−３のＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する能力が示された。対照的に、参照抗体１ａ７．ｇｒｌは、ＭＬＲアッセイで有意に（Ｐ＜０．０５）弱い活性を示した。
【０１６６】
実施例１２  抗ＯＸ４０抗体４４５−３がＡＤＣＣ活性を示した
抗体４４５−３がＯＸ４０Ｈｉ発現標的細胞を殺すことができるかを調査するために、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出ベースＡＤＣＣアッセイが設定された。ＣＤ１６ｖ１５８（Ｖ１５８対立遺伝子）及びＦｃＲγ遺伝子をＮＫ細胞株ＮＫ９２ＭＩ（ATCC，バージニア州マナッサス）に同時形質導入することで、ＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞株がエフェクター細胞として生成された。ＯＸ４０発現Ｔ細胞株ＨｕＴ７８／ＯＸ４０を標的細胞として用いた。抗ＯＸ４０抗体（０．００４〜３μｇ／ｍｌ）又はコントロール抗体の存在下、同数（３×１０４）の標的細胞及びエフェクター細胞を５時間共培養した。ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（Promega，ウィスコンシン州マディソン）を用いたＬＤＨ放出で、細胞毒性を評価した。特異的溶解を下式で計算した。
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【０１６７】
図１１に示すように、抗体４４５−３は、用量依存的に（ＥＣ５０：０．０２７μｇ／ｍＬ）でＡＤＣＣを介してＯＸ４０Ｈｉ標的細胞を殺す高い能力を示した。抗体４４５−３のＡＤＣＣ効果は、１Ａ７．ｇｒｌコントロール抗体の効果と同様であった。対照的に、Ｓ２２８Ｐ及びＲ４０９Ｋ変異を伴うＩｇＧ４ Ｆｃフォーマットの４４５−３（４４５−３ ＩｇＧ４）は、コントロールのヒトＩｇＧ又はブランクと比較して、有意なＡＤＣＣ効果を示さなかった。その結果は、ＩｇＧ４ ＦｃがＡＤＣＣに対して弱い、又はサイレントであるという先の知見（An Z, et al. mAbs 2009）と一致する。
【０１６８】
実施例１３  抗ＯＸ４０抗体４４５−３はＣＤ４＋Ｔｒｅｇを優先的に枯渇させ、インビトロでＣＤ８＋Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比率を増加させる
抗ＯＸ４０抗体が腫瘍浸潤性ＯＸ４０Ｈｉ Ｔｒｅｇを枯渇させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇに対する比率を増加させることができることが、いくつかの動物腫瘍モデルで示されている（Bulliard et al., 2014；Carboni et al., 2003；Jacquemin et al., 2015；Marabelle et al., 2013b）。その結果、免疫反応が強化され、腫瘍の退縮及び生存率の向上が導かれる。
【０１６９】
インビトロで活性化された、又は腫瘍内のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが他のＴ細胞サブセットよりも優先的にＯＸ４０を発現するという（Lai et al., 2016；Marabelle et al., 2013b；Montler et al., 2016；Soroosh et al., 2007；Timperi et al., 2016）事実を考慮すると、ＯＸ４０Ｈｉ細胞、特にＴｒｅｇを殺す抗体４４５−３の能力を調査するために、ヒトＰＢＭＣベースのアッセイを設定した。簡単に説明すると、ＯＸ４０発現を誘導するために、ＰＢＭＣをＰＨＡ−Ｌ（１μｇ／ｍＬ）で１日間、事前に活性化させ、標的細胞として用した。次に、抗ＯＸ４０抗体（０．００１〜１０μｇ／ｍＬ）又はプラセボの存在下、エフェクターＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞（実施例１２に記載；５×１０４）を同数の標的細胞と一晩共培養した。各Ｔ細胞サブセットの割合は、フローサイトメトリーで決定した。図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、抗体４４５−３による治療で、用量依存的なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の増加、及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの割合の減少が誘発された。その結果、Ｔｒｅｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率が大幅に改善された（図１２Ｃ）。１Ａ７．ｇｒｌ治療では、より弱い結果が得られた。この結果から、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能を増強することで抗腫瘍免疫を誘導するが、Ｔｒｅｇ媒介免疫寛容を制限する４４５−３の治療応用が示される。
【０１７０】
実施例１４  抗ＯＸ４０抗体４４５−３はマウス腫瘍モデルで用量依存的な抗腫瘍活性を発揮する
抗ＯＸ４０抗体４４５−３の有効性がマウス腫瘍モデルで示された。ネズミＭＣ３８結腸腫瘍細胞をヒトＯＸ４０のトランスジェニックＣ５７マウス（Biocytogen、Beijing China）に皮下移植した。腫瘍細胞の移植後、腫瘍体積を週２回測定し、式：Ｖ＝０．５（ａ×ｂ２）〔式中、ａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径である〕を用いてｍｍ３で計算した。平均腫瘍体積が約１９０ｍｍ３の大きさに達したとき、マウスを７つの群にランダムに割り当て、４４５−３又は１Ａ７．ｇｒｌ抗体のいずれかを、３週間、週１回で腹腔内注射した。ヒトＩｇＧをアイソタイプコントロールとして投与した。部分的退縮（ＰＲ）は３回の連続測定で、腫瘍体積が投与初日の開始腫瘍体積の５０％未満の腫瘍体積と定義された。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は下式を用いて計算された。
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【０１７１】
その結果から、４４５−３が０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内注射として用量依存的な抗腫瘍効果を有することが示された。４４５−３の投与で、５３％（０．４ｍｇ／ｋｇ）、６９％（２ｍｇ／ｋｇ）及び９４％（１０ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍増殖阻害が得られ、ベースラインからの０％（０．４ｍｇ／ｋｇ）、１７％（２ｍｇ／ｋｇ）及び３３％（１０ｍｇ／ｋｇ）の部分的退縮が得られた。対照的に、抗体１Ａ７．ｇｒｌでは部分的退縮は観察されなかった。インビボデータから、リガンド非遮断抗体４４５−３がＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ遮断抗体１Ａ７．ｇｒｌよりも抗腫瘍療法に適することが示された（図１３Ａ及び図１３Ｂ、表９）。
【０１７２】
【表９】
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【０１７３】
実施例１５  抗ＯＸ４０抗体のアミノ酸変化
ＯＸ４０抗体の改善のための変更のために、いくつかのアミノ酸を選択した。親和性の改善、又はヒト化の向上のために、アミノ酸の変更を行った。適切なアミノ酸の変更のために、ＰＣＲプライマーセットを設計し、合成し、抗ＯＸ４０抗体を改変するために用いた。例えば、重鎖中のＫ２８Ｔ及び軽鎖中のＳ２４Ｒの変更によって、ＦＡＣＳで決定されたＥＣ５０が元の４４５−２抗体よりも１．７倍に増加した。重鎖中のＹ２７Ｇ及び軽鎖中のＳ２４Ｒの変更によって、Ｂｉａｃｏｒｅで決定されたＫＤが元の４４５−２抗体よりも１．７倍に増加した。これらの変更を、図１４Ａ〜１４Ｂに要約する。
【０１７４】
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【０１８４】
【図１】
2021524256.tif 000014
【図２】
2021524256.tif 000015
【図３】
2021524256.tif 000016
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021524256.tif 000020
【図８】
2021524256.tif 000021
【図９】
2021524256.tif 000022
【図１０】
2021524256.tif 000023
【図１１】
2021524256.tif 000024
【図１２】
2021524256.tif 000025
【図１３Ａ】
2021524256.tif 000026
【図１３Ｂ】
2021524256.tif 000027
【図１４Ａ】
2021524256.tif 000028
【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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