(57)【要約】  ブタ細胞を含む合成の三次元（３Ｄ）バイオ印刷された組織構築物ならびにその産生および使用の方法が本明細書で提供される。合成の３Ｄバイオ印刷組織構築物は、遺伝子操作された細胞を含むブタ細胞を含むスフェロイドをマイクロニードル鋳型上でバイオ印刷し、スフェロイドを融合させて、操作された組織構築物を形成させることによって製造される。薬剤のスクリーニングおよび毒性のスクリーニングに関連する用途のための足場なし３Ｄバイオ印刷組織構築物を用いる方法も提供される。
2021500356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成の三次元（３Ｄ）ブタ組織構築物を製造する方法であって、
所定の配置のマイクロニードルを準備する工程、
コンピューターで制御された様式で細胞スフェロイドを前記マイクロニードルに添加する工程であって、前記細胞スフェロイドが２種以上の細胞型のブタ細胞を含み、前記ブタ細胞の少なくとも一部が遺伝子操作されている、工程、および
前記スフェロイドを前記マイクロニードル上で約５日間培養する工程であって、それにより前記スフェロイドが融合して、遺伝子操作されたブタ細胞を含む合成の３Ｄブタ組織構築物を形成する、工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記合成の３Ｄブタ組織構築物を前記マイクロニードル鋳型から取り出して、遺伝子操作されたブタ細胞を含む足場なし合成３Ｄブタ組織構築物を得る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞スフェロイドが、ブタ肝細胞、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）、星細胞、クッパー細胞、および線維芽細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含み、前記合成の３Ｄブタ組織構築物が、合成の３Ｄブタ肝組織構築物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞スフェロイドが、ブタ肺血管内皮細胞（ＣＤ３１陽性）、肺線維芽細胞、Ｉ型肺細胞、およびＩＩ型肺細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含み、前記合成の３Ｄブタ組織構築物が、合成の３Ｄブタ肺組織構築物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞スフェロイドが、ブタ角膜内皮細胞、間質細胞、および角膜上皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含み、前記合成の３Ｄブタ組織構築物が、合成の３Ｄブタ角膜組織構築物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞スフェロイドが、ブタ線維芽細胞およびブタ大動脈内皮細胞を含み、前記合成の３Ｄブタ組織構築物が、合成の３Ｄブタ大動脈弁組織構築物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞スフェロイドが、ブタアルファ細胞、ベータ（アイレット）細胞、線維芽細胞、および内皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含み、前記合成の３Ｄブタ組織構築物が、合成の３Ｄブタ膵臓組織構築物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞スフェロイドが、ブタ線維芽細胞、内皮細胞、および近位尿細管上皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含み、前記合成の３Ｄブタ組織構築物が、合成の３Ｄブタ腎組織構築物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法に従って得られる、合成の三次元（３Ｄ）ブタ組織構築物。
【請求項１０】
足場なし３Ｄブタ組織を含む組成物であって、
遺伝子操作されたブタ細胞を含む細胞スフェロイドを所定の配置のマイクロニードルの上にバイオ印刷する工程、
前記バイオ印刷された細胞スフェロイドを約５日間培養し、それにより前記バイオ印刷された細胞スフェロイドが融合して三次元のブタ組織構築物を形成する工程、および
前記マイクロニードルから前記ブタ組織構築物を取り出して、足場なし３Ｄブタ組織構築物を得る工程
に従って得られる、組成物。
【請求項１１】
前記細胞スフェロイドが、ブタ肝細胞、ブタ肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）、およびブタ線維芽細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型の複数のブタ細胞を含み、前記足場なし３Ｄブタ組織が、足場なし３Ｄブタ肝組織である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細胞スフェロイドが、ブタ肺血管内皮細胞（ＣＤ３１陽性）、肺線維芽細胞、Ｉ型肺細胞、およびＩＩ型肺細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型の複数のブタ細胞を含み、前記足場なし３Ｄブタ組織が、足場なし３Ｄブタ肺組織である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細胞スフェロイドが、ブタ角膜内皮細胞、間質細胞、および角膜上皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含み、前記合成の３Ｄブタ組織構築物が、合成の３Ｄブタ角膜組織構築物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞スフェロイドが、ブタ線維芽細胞およびブタ大動脈内皮細胞を含み、前記合成の３Ｄブタ組織構築物が、合成の３Ｄブタ大動脈弁組織構築物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞スフェロイドが、ブタアルファ細胞、ベータ（アイレット）細胞、線維芽細胞、および内皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含み、前記合成の３Ｄブタ組織構築物が、合成の３Ｄブタ膵臓組織構築物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞スフェロイドが、ブタ線維芽細胞、内皮細胞、および近位尿細管上皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含み、前記合成の３Ｄブタ組織構築物が、合成の３Ｄブタ腎組織構築物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
化合物を試験する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法に従って得られる足場なし３Ｄブタ組織構築物への前記化合物、および前記構築物内の細胞に対する前記化合物の影響を検討する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１７年１０月２０日に出願した米国仮特許出願第６２／５７４８０９号の優先権を主張する。
連邦政府によって補助された研究に関する声明
該当なし。
【背景技術】
【０００２】
米国においては、１１６，０００人を超える患者が臓器移植の順番を待っている。腎不全および心不全については、それぞれ透析デバイスおよび心室補助デバイス等のいくつかの代替治療が存在するが、終末期の肝疾患に関しては肝移植が唯一の治療選択肢として残されている。遺伝子操作されたブタの臓器を用いる、種を超えた移植、即ち「異種移植」によって、ドナー臓器の不足を低減しまたは解消できる可能性がある。しかし、異種移植のレシピエントは、種特異的な障害による強い免疫応答および生存を制限する血小板減少症を発現する。さらに、遺伝子操作が進歩し、２６を超える遺伝子操作されたブタが入手できるようになったにも関わらず、移植の後の免疫応答および凝血応答を低減させるためにどの遺伝子の組み合わせが最良であるかは未知である。これらの障害によって進歩には厳しい障壁があるため、当技術において異種移植に代わる効率的かつ費用効果の良い代替策に対するニーズが存在している。
【発明の概要】
【０００３】
ブタ細胞を含む合成の三次元（３Ｄ）バイオ印刷された組織構築物ならびにその産生および使用の方法が本明細書で提供される。合成の３Ｄバイオ印刷組織構築物は、ブタ細胞を含むスフェロイドをマイクロニードル鋳型上でバイオ印刷し、スフェロイドを融合させて、操作された組織構築物を形成させることによって製造される。いくつかの例では、ブタ細胞の少なくとも一部は遺伝子操作された細胞である。薬剤のスクリーニングおよび毒性のスクリーニングに関連する用途のための足場なし３Ｄバイオ印刷組織構築物を用いる方法も提供される。
【０００４】
第１の態様では、合成の三次元（３Ｄ）ブタ組織構築物を製造する方法が本明細書で提供される。本方法は、所定の配置のマイクロニードルを準備するステップ、コンピューターで制御された様式で細胞スフェロイドをマイクロニードルに添加するステップであって細胞スフェロイドが２種以上の細胞型のブタ細胞を含み、ブタ細胞の少なくとも一部が遺伝子操作されている、ステップ、およびスフェロイドをマイクロニードル上で約５日間培養するステップであってそれによりスフェロイドが融合して、遺伝子操作されたブタ細胞を含む合成の３Ｄブタ組織構築物を形成する、ステップを含むか、または本質的にこれらのステップからなることができる。いくつかの例では、本方法は、合成の３Ｄブタ組織構築物をマイクロニードル鋳型から取り出して、遺伝子操作されたブタ細胞を含む足場なし合成３Ｄブタ組織構築物を得るステップをさらに含む。細胞スフェロイドは、ブタ肝細胞、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）、星細胞、クッパー細胞、および線維芽細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含んでよく、その場合には合成の３Ｄブタ組織構築物は、合成の３Ｄブタ肝組織構築物である。細胞スフェロイドは、ブタ肺血管内皮細胞（ＣＤ３１陽性）、肺線維芽細胞、Ｉ型肺細胞、およびＩＩ型肺細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含んでよく、その場合には合成の３Ｄブタ組織構築物は、合成の３Ｄブタ肺組織構築物である。細胞スフェロイドは、ブタ角膜内皮細胞、間質細胞、および角膜上皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含んでよく、その場合には合成の３Ｄブタ組織構築物は、合成の３Ｄブタ角膜組織構築物である。細胞スフェロイドは、ブタ線維芽細胞およびブタ大動脈内皮細胞を含んでよく、いくつかの例では、合成の３Ｄブタ組織構築物は、合成の３Ｄブタ大動脈弁組織構築物である。細胞スフェロイドは、ブタアルファ細胞、ベータ（アイレット）細胞、線維芽細胞、および内皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含んでよく、その場合には合成の３Ｄブタ組織構築物は、合成の３Ｄブタ膵臓組織構築物である。細胞スフェロイドは、ブタ線維芽細胞、内皮細胞、および近位尿細管上皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含み、合成の３Ｄブタ組織構築物は、合成の３Ｄブタ腎組織構築物である。
別の態様では、本開示の方法のいずれか１つに従って得られる合成の３Ｄブタ組織構築物が本明細書で提供される。
【０００５】
さらなる態様では、足場なし３Ｄブタ組織を含む組成物であって、遺伝子操作されたブタ細胞を含む細胞スフェロイドを所定の配置のマイクロニードルの上にバイオ印刷するステップ、バイオ印刷された細胞スフェロイドを約５日間培養し、それによりバイオ印刷された細胞スフェロイドが融合して三次元のブタ組織構築物を形成するステップ、およびマイクロニードルからブタ組織構築物を取り出して足場なし３Ｄブタ組織構築物を得るステップに従って得られる、組成物が本明細書で提供される。細胞スフェロイドは、ブタ肝細胞、ブタ肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）、およびブタ線維芽細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型の複数のブタ細胞を含んでよく、その場合には足場なし３Ｄブタ組織は、足場なし３Ｄブタ肝組織である。細胞スフェロイドは、ブタ肺血管内皮細胞（ＣＤ３１陽性）、肺線維芽細胞、Ｉ型肺細胞、およびＩＩ型肺細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含んでよく、その場合には合成の３Ｄブタ組織構築物は、合成の３Ｄブタ肺組織構築物である。細胞スフェロイドは、ブタ角膜内皮細胞、間質細胞、および角膜上皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含んでよく、その場合には合成の３Ｄブタ組織構築物は、合成の３Ｄブタ角膜組織構築物である。細胞スフェロイドは、ブタ線維芽細胞およびブタ大動脈内皮細胞を含み、合成の３Ｄブタ組織構築物は、合成の３Ｄブタ大動脈弁組織構築物である。細胞スフェロイドは、ブタアルファ細胞、ベータ（アイレット）細胞、線維芽細胞、および内皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含んでよく、その場合には合成の３Ｄブタ組織構築物は、合成の３Ｄブタ膵臓組織構築物である。細胞スフェロイドは、ブタ線維芽細胞、内皮細胞、および近位尿細管上皮細胞からなる群から選択される２種以上の細胞型のブタ細胞を含んでよく、合成の３Ｄブタ組織構築物は、合成の３Ｄブタ腎組織構築物である。
【０００６】
別の態様では、化合物を試験する方法が本明細書で提供され、本方法は、本開示の方法のいずれか１つに従って得られる足場なし３Ｄブタ組織構築物への化合物、および構築物内の細胞に対する化合物の影響を検討するステップを含む。
本特許出願ファイルには、少なくとも１つのカラー図面が含まれている。カラー図面を含む本特許または本特許出願公開の複製は、要望により、また必要な費用を支払うことによって、特許庁から提供される。
以下の詳細な説明を考慮することにより、本発明はよりよく理解され、上で説明したもの以外の特徴、態様、および利点が明白になる。そのような詳細な説明については、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ−１Ｅ】例示的なバイオ印刷方法およびＲｅｇｅｎｏｖａバイオプリンターを示す図である。Ａ：Ｒｅｇｅｎｏｖａロボット（Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｐｕｒｄｕｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの３Ｄバイオ印刷コア）を含む無菌キャビネット。Ｂ：装置のロボットアームおよびマイクロニードルホルダーの実際の画像（Ｂの挿入図：例として多層化された細胞チューブの構築を説明する３Ｄ設計プログラム）。Ｃ：スフェロイドを斜めにするために用いるマイクロニードルアレイ（２つの構造で）。Ｄ：印刷前におけるスフェロイドの大きさおよびコアにおけるアポトーシスのチェック（緑色蛍光基質）。Ｅ：バイオ印刷されたチューブ状組織構築物（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂでｃｙｆｕｓｅｂｉｏ．ｃｏｍを参照されたい）。
【図２Ａ−２Ｊ】足場なし３Ｄバイオ印刷線維芽細胞および肝由来細胞（ＣＤ３１陽性）を示す図である。（Ａ〜Ｅ）それぞれ１日目から５日目までの、スフェロイドを含むバイオ印刷された野生型ブタ線維芽細胞／肝由来細胞の組み合わせおよびマイクロニードル上で３Ｄ構築物を形成するスフェロイドの融合を示す。（Ｆ）マイクロニードル上でバイオ印刷した２つの構築物の５日目。（Ｇ）マイクロニードルから取り出した足場なし３Ｄバイオ印刷構築物の顕微鏡写真。（Ｈ）裸眼で見た画像Ｇと同じ構築物。（Ｉ）５日目の終わりにマイクロニードルから取り出した画像Ｆで示す２つの３Ｄ構築物。構築物中に小孔が見える。（Ｊ）画像Ｉの２つの３Ｄ構築物の裸眼での外観。
【図３−１】細胞スフェロイドの形成および解析を示す図である。Ａ：非付着性プレートにおける細胞凝集の原理、およびスフェロイドの例。Ｂ：スフェロイドの動態を解析することができるＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ顕微鏡。Ｃ：スフェロイドで部分的に占められた９６ウェルプレート中の蛍光および位相差におけるスフェロイドの実際の画像ならびに１週間にわたる記録（右カラム：空のウェルの画像）。
【図３−２】細胞スフェロイドの形成および解析を示す図である。Ｄ：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で染色した肝由来細胞の３Ｄ画像および線維芽細胞とのスフェロイドの形成におけるアラインメント。
【図４Ａ−４Ｇ】足場なし３Ｄバイオ印刷構築物の組織病理画像である。（ａ〜ｂ）バイオ印刷の１週間後。３Ｄ構築物および増殖細胞を伴う各スフェロイドを取り囲むカプセルがそれぞれ５倍および１０倍の拡大で見られる。黒いバーは１００μｍを示す。（ｃ〜ｄ）バイオ印刷の２週間後。増殖し生存している細胞を伴うより厚いカプセルがそれぞれ１０倍および２０倍の拡大で見られる。黒いバーはそれぞれ１００μｍおよび５０μｍを示す。（Ｅ〜Ｆ）バイオ印刷の３週間後の３Ｄ構築物の組織病理。１０倍および２０倍の拡大により、２週間後の３Ｄ構築物よりも厚く、増殖細胞を伴うカプセルおよび中央部に移動している細胞が示されている。（４Ｇ）バイオ印刷の１週間後の３つの細胞株（線維芽細胞、肝細胞、および肝内皮細胞）の３Ｄ印刷肝構築物の組織。中央部の壊死が存在するが、生存細胞が３Ｄ構築物の約８０％を占めている。１０倍拡大。
【図５】（上）９６ウェルプレート内で良好に形成したスフェロイド、および（下）スフェロイドを形成できなかった細胞の凝集の画像である。本実施例では、細胞はマウス肝細胞である。
【図６】線維芽細胞と肝由来細胞を異なった比で用いて調製した際のスフェロイドの特性を示すグラフである。
【図７】バイオ印刷したスフェロイドを含む組織構築物の画像を示す図である。（上）３２，０００個の細胞を用い、線維芽細胞と肝由来細胞の比を４：１として印刷したスフェロイド。（下）４０，０００個の細胞を用い、線維芽細胞と肝由来細胞の比を１０：１として印刷したスフェロイド。
【図８】１日目、２日目、および５日目のスフェロイド形成（線維芽細胞、肝細胞、および肝由来細胞を２：１：０．１の比で含む）の画像を示す図である。
【図９】１日目、２日目、および５日目のバイオ印刷した３細胞スフェロイド（線維芽細胞、肝細胞、および肝由来細胞を２：１：０．１の比で含む）の画像を示す図である。
【図１０Ａ−１０Ｂ】バイオ印刷の１週間後の足場なし３Ｄバイオ印刷した遺伝子操作ブタ肝モデルを示す図である。（Ａ）裸眼観察。（Ｂ）顕微鏡観察。３Ｄ構築物上の小孔はマイクロニードルの孔を表す。
【図１１】（上）５０倍に拡大した単離されたブタ肝細胞、および（下）５０倍に拡大したブタ肝星細胞を表す図である。
【図１２】Ａ：低親和性Ｕ底プレート、遠心分離、および時間を用いて遊離細胞からスフェロイドを形成させる例示的なプロセスを示す図である。スフェロイドは（ｉ）肝細胞（ＨＣ）単独、（ｉｉ）肝星細胞（ＨＳＣ）単独、または（ｉｉｉ）ＨＣとＨＳＣの組み合わせを用いて形成させ、低親和性Ｕ底プレートの中で培養した。Ｂ：細胞４０，０００個のＨＣ、ＨＳＣ、またはこれらの組み合わせを用いた経時的なスフェロイドの形成を示す図である。ＨＳＣ単独のスフェロイドは一様に円形で平滑であった。ＨＣ単独のスフェロイドは合体して特徴解析可能なスフェロイドになることができなかった。
【図１３】肝細胞とＨＳＣの組み合わせスフェロイド（比２：１）を特徴付ける画像およびデータを示す図である。画像は、各ウェルの周辺に位置する多数の小さなスフェロイドを有するスフェロイドの形成を示している。スフェロイドの特徴解析は６日目に行った。小さなスフェロイドは全てのパラメーターで生存率が低かった。
【図１４Ａ−１４Ｂ】肝細胞とＨＳＣ（比２．５：１）およびＨＳＣのみの４０，０００個の細胞のスフェロイドの４８時間における予備的印刷を示す図である。ＨＳＣスフェロイドは階段状パターンで印刷され、その結果、大きな寸法（ほぼ５５０μｍ）になった（ａ）。スフェロイドが針に付着したことからも明らかなように、組み合わせスフェロイドは印刷全体で緩く、円形でも規則的でもなかった（ｂ）。プリンターアームの内側でノズルが部分的にスフェロイドを吸い込んだ結果、両方の構築物は上部に突起を有している。印刷を停止し、機能性解析のためにスフェロイドを確保しておいた。
【図１５】印刷の後の肝細胞とＨＳＣの組み合わせ構築物（比２：１）を示す図である。明瞭なスフェロイドが０日目に見られた。１日目から開始して、スフェロイドは相互に融合し、それ自体の細胞外マトリックスを作った。１日目に構築物に空隙が現れ、スフェロイド間の境界は不明確になった。個別のスフェロイドは３日目までに融合し、１つの連続した組織を創成した。
【図１６Ａ】スフェロイド中のＨＳＣの補助によって肝細胞の代謝活性が保たれていることを示す図である。ＨＣ：ＨＳＣ（比２．５：１）、ＨＳＣの１４日間の培地試料中の尿素濃度（ａ）。
【図１６Ｂ】スフェロイド中のＨＳＣの補助によって肝細胞の代謝活性が保たれていることを示す図である。スフェロイド中のｍＲＮＡの転写のリアルタイムＰＣＲ解析。組み合わせスフェロイドはより高いレベルで両方のマーカー遺伝子を発現した（ｂ）。
【図１７】バイオ印刷直後の足場なしバイオ印刷肺スフェロイドを示す画像である。
【図１８】印刷後１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目の肺スフェロイドの足場なしバイオ印刷を示す画像である。
【図１９】印刷後５日目（左の画像）および支持体から取り出した後（右の画像）の足場なしバイオ印刷肺構築物の画像である。
【図２０】印刷後７日目および支持体から取り出して２日後の足場なしバイオ印刷肺構築物の画像である。
【図２１】Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色したバイオ印刷肺構築物の画像である。
【図２２】Ｈ＆Ｅ染色したバイオ印刷肺構築物の画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は種々の改変および代替形態を受け入れることができ、その例示的な実施形態は図面において例として示され、本明細書により詳細に記載されている。しかし、例示的な実施形態の記載は開示した特定の形態に本発明を限定することを意図しておらず、逆に添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲の中に含まれる全ての改変、等価物、および代替物を包含することを意図している。
【０００９】
特許および特許出願を含むがこれらに限定されない本明細書で引用した全ての出版物は、本出願において全体として説明されたと同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供する方法およびシステムは、ブタ細胞を用いて生成された多細胞三次元（３Ｄ）構造であるバイオ印刷ブタ組織構造の発明者による開発に少なくとも部分的に基づいている。バイオ印刷組織構造はブタ細胞を含むスフェロイドを３Ｄバイオ印刷し、スフェロイドを融合させて足場なし操作構造を形成させることによって製造される。
本明細書で提供する方法およびシステムの利点の中で、本開示の足場なし３Ｄバイオ印刷構築物は、標準的なインビトロモデルよりも信頼性の高いモデルを提供し、それぞれの遺伝子改変のためのブタのクローニングの必要性を排除し、それにより標準的なブタからヒトへの異種移植のインビボモデルに対してより速くより安価な代替策を提供する。まさに、本明細書に記載したバイオ印刷方法は、時間および費用の面で効率的な様式で遺伝子の改変および組み合わせを研究するための改善されたモデルを提供する。本明細書で提供する３Ｄバイオ印刷組織構築物の例示的な使用には、それだけに限らないが、ブタからヒトへの異種移植に対するヒトの免疫応答および凝血応答を研究するためのモデルとしてブタ組織を概括することが含まれる。
【００１０】
したがって、第１の態様では、遺伝子操作されたブタ細胞を含む合成の三次元（３Ｄ）足場なしブタ組織構築物をバイオ印刷する方法が本明細書で提供される。本明細書で用いる場合、用語「バイオ印刷」は、自動化されたまたは半自動化されたコンピューター援用三次元プロトタイプデバイス（たとえばバイオプリンター）に適合する方法によって、三次元で正確な細胞の堆積（たとえば細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁液、細胞濃縮物、多細胞凝集物、多細胞体、その他）を使用することを意味する。本明細書で用いる用語「足場なし」は、除去されていようと、またはバイオ印刷された組織の不活性な成分として残存していようと、使用の際に足場（たとえば合成の足場、非合成の足場、または任意の型の予め形成された足場）が操作された組織の不可欠の一部を形成していないことを暗示することを意図している。用語「足場なし」は本明細書において「足場なし（ｓｃａｆｆｏｌｄｌｅｓｓ）」および「予め形成された足場なし（ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と相互交換可能に用いられる。好適なバイオプリンターとしては、限定しないが株式会社サイフューズ（東京、日本）のＲｅｇｅｎｏｖａ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ−Ｆｒｅｅ  ３Ｄ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒが挙げられる。その他の好適なバイオプリンターとしては、Ｃｅｌｌｉｎｋ社（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）のＢｉｏＸ  ３Ｄ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ等が市販されている。
【００１１】
ある実施形態では、操作された三次元（３Ｄ）ブタ組織構築物を製造するためのバイオ印刷方法は、操作された三次元ブタ組織を形成するための鋳型として所定の配置のマイクロニードルを準備するステップ、コンピューターで制御された様式でブタ細胞スフェロイドをマイクロニードルに添加するステップであってブタ細胞スフェロイドが２種以上の細胞型を含むステップ、およびスフェロイドをマイクロニードル鋳型上で約５日間培養するステップであってそれによりスフェロイドが融合して、三次元の足場なしブタ肝組織を形成するステップを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのブタ細胞型は遺伝子操作されたブタ細胞である。
いくつかの例では、本方法は三次元ブタ組織をマイクロニードルから取り出して操作された足場なし３Ｄブタ組織構築物を得るステップをさらに含む。いくつかの例では、ロボットプラットフォームによってスフェロイドを「バイオ印刷」し、予め設計された連続的な構造にする。マイクロニードルは、スフェロイドが融合して細胞凝集物になり、それ自体の細胞外マトリックスを合成する際の一時的な支持を提供し、それにより、足場なし組織構築物としてマイクロニードルから取り出すために必要な構造的強靭性を実現する。
【００１２】
スフェロイドはブタ細胞を含む。いくつかの例では、スフェロイドは異種のブタ細胞の混合物を含む。いくつかの例では、ブタ細胞スフェロイドは２つ以上の細胞型を含む。いくつかの例では、スフェロイドは２つのブタ細胞型を含む。他の例では、スフェロイドは３つ以上のブタ細胞型を含む。スフェロイドに適した細胞型は本開示の方法に従って産生される組織型によって異なることになる。たとえば、合成３Ｄブタ肝組織を産生するためには、細胞スフェロイドは好ましくは肝細胞、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）、肝星細胞（ＨＳＣ）、胆管細胞、および線維芽細胞等のブタ肝細胞型を含む。合成３Ｄ角膜様組織を産生するためには、細胞スフェロイドは好ましくは角膜内皮細胞、間質細胞、および角膜上皮細胞等のブタ細胞を含む。合成３Ｄ大動脈弁様組織を産生するためには、細胞スフェロイドは、ブタ線維芽細胞およびブタ大動脈内皮細胞等の細胞型を含む。合成３Ｄ膵臓様組織を産生するためには、細胞スフェロイドは、好ましくは、ブタアルファ細胞、ベータ（アイレット）細胞、線維芽細胞、および内皮細胞等の細胞を含む。合成３Ｄ腎臓様組織を産生するためには、細胞スフェロイドは、好ましくはブタ線維芽細胞、内皮細胞、近位尿細管上皮細胞、およびその他の腎細胞等の細胞を含む。合成３Ｄ肺様組織を産生するためには、細胞スフェロイドは、好ましくはブタ肺血管内皮細胞（ＣＤ３１陽性）、肺線維芽細胞、および肺細胞を含む。
【００１３】
本明細書で提供する方法に従う使用のためのスフェロイドは、培養細胞を凝集させる任意の適切な方法によって産生することができる。ある実施形態では、スフェロイドへの自発的な凝集を促進する条件下で、低付着性または非付着性のプレートの上で細胞を培養する。スフェロイドの大きさは、少なくとも部分的には細胞数および培養時間によって決まる。いくつかの例では、約４００〜６００μｍの直径を有するスフェロイドを調製するために、約１０，０００〜５０，０００個（たとえば約１０，０００個、約２０，０００個、約３０，０００個、約４０，０００個、約５０，０００個）のそれぞれの型の細胞を用いる。いくつかの例では、スフェロイドへの自発的な凝集を促進する条件下で、非付着性の培養プレートに全部で３５，０００〜４０，０００個の細胞を播種する。他の例では、約２日〜約３日の培養で約４００〜６００μｍ（たとえば約４００、４５０、５００、５５０、６００μｍを含む）の直径を有するスフェロイドを生成するために、それぞれの型の細胞の数を必要に応じて増加または減少させることができる。
【００１４】
スフェロイドは、種々の比率の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の細胞型を用いて作成される。たとえば図６を参照して、４：１、５：１、または１０：１の比の線維芽細胞：ＬＳＥＣを用いることができる。図８および図９を参照して、線維芽細胞、肝細胞、および肝由来細胞を２：１：０．１の比で播種することによって、３つのブタ肝細胞型を含むスフェロイドを産生することができる。細胞型の比がブタ細胞型の数、培養条件、スフェロイドの大きさ、細胞の生存率、およびその他の変数に基づいて変動し得ることは、当業者には理解されよう。２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の細胞型を培養プレートに播種した後、バイオ印刷に適した強靭で円形のスフェロイドを形成させるために約４８〜約７２時間のインキュベーションが必要である。たとえば図５および図８の例示的なスフェロイドを参照されたい。
【００１５】
本明細書で用いる場合、用語「合成の」および「操作された」は相互交換可能に用いられ、人の手によって創成されもしくは改変された（たとえば、所定の配置のバイオ印刷細胞）非天然産生の組織材料、またはそのような材料を用いて得られた（たとえば移植組織または合成材料を含むその他のデバイス）非天然産生の組織材料を意味する。いくつかの例では、合成の組織材料を産生するために用いられる細胞または細胞スフェロイドは野生型細胞であるか、または１つもしくは複数の合成のまたは遺伝子操作された核酸（たとえば天然産生の同等物に見られる配列に対して少なくとも１つの人工的に創成された挿入、欠失、逆転、または置換を含む核酸）を含んでもよい。１つまたは複数の、合成のまたは操作された核酸を含む細胞は、操作された細胞と考えられる。本明細書で用いる場合、用語「組織」および「組織構築物」は、細胞の凝集物を意味する。
いくつかの例では、本明細書に記載した方法に従って産生された３Ｄブタ組織構築物は、未改変のまたは野生型の（「正常な」）細胞の代わりに、またはそれに加えて、組み換えのまたは遺伝子改変された細胞を含んでよい。たとえば、いくつかの例では、たとえば培養中に存在する条件によって生物学的、化学的、または熱的にシグナルを受けた場合等に、連続的な時間の間、または必要に応じて、組み換え細胞産生物、増殖因子、ホルモン、ぺプチド、またはタンパク質（たとえば検出可能なレポータータンパク質）を産生する組み換え／遺伝子改変された細胞を含ませることが有利なことがある。遺伝子改変された細胞を産生するための手順は当技術で一般に公知であり、参照により本明細書に組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。
【００１６】
いくつかの例では、ブタ細胞スフェロイドを形成するために用いられるブタ細胞の少なくとも一部は遺伝子改変された（遺伝子操作された）ブタ細胞である。本明細書で用いる場合、用語「遺伝子改変」およびその文法的等価物は、核酸、たとえば生命体またはその細胞のゲノムの中の核酸の１つまたは複数の変化を意味し得る。たとえば、遺伝子改変は遺伝子の変化、付加、および／または欠失を意味し得る。遺伝子改変された細胞は付加された、欠失された、および／または変化された遺伝子を有する細胞とも称し得る。いくつかの例では、ブタまたは別の哺乳類等の野生型の（遺伝子改変されていない）非ヒト動物から単離された細胞は、本明細書で提供される方法に従う使用のために遺伝子改変される。いくつかの例では、遺伝子改変された細胞は遺伝子改変された非ヒト動物（たとえば遺伝子改変されたブタ）から単離された細胞である。遺伝子改変された非ヒト動物からの遺伝子改変された細胞は、そのような遺伝子改変された非ヒト動物から単離された細胞であってよい。いくつかの例では、非ヒト動物の遺伝子改変された細胞は、遺伝子改変されていない同等動物と比較して１つまたは複数の遺伝子の発現が低下していることがある。遺伝子改変されていない同等動物は遺伝子改変された動物と実質的に同一であるが、ゲノムに遺伝子改変を受けていない動物であってよい。たとえば、遺伝子改変されていない同等動物は遺伝子改変された動物と同じ種の野生型動物であってよい。
【００１７】
いくつかの例では、遺伝子改変は一形態の遺伝子編集を用いて産生される。本明細書で用いる用語「遺伝子編集」およびその文法的等価物は、１つまたは複数のヌクレオチドがゲノムに挿入され、置換され、またはゲノムから除去される遺伝子操作を意味し得る。たとえば、遺伝子編集はヌクレアーゼ（たとえば天然に存在するヌクレアーゼまたは人工的に操作したヌクレアーゼ）を用いて実施することができる。いくつかの例では、遺伝子編集はＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓシステム（たとえばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓシステム）を用いて実施される。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓシステムはスフェロイドの細胞の中の１つまたは複数の遺伝子の発現を低減させるために用いることができる。いくつかの例では、１つまたは複数の内因性遺伝子のタンパク質発現は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓシステムを用いることによって低減される。他の例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは部位特異的挿入を実施するために用いることができる。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓによってゲノムの挿入部位に切れ目を作成し、挿入部位におけるトランスジーンの挿入を容易にすることができる。本明細書で提供される方法に従う使用に適した遺伝子改変を行う他の方法としては、これだけに限らないが体細胞核移植（ＳＣＮＴ）およびトランスジーンの導入が挙げられる。本明細書で用いる場合、用語「トランスジーン」は、生命体またはその細胞の中に移植することができる遺伝子または遺伝物質を意味する。組み換えまたは遺伝子改変された細胞を得るための手順は当技術で一般に公知であり、参照により本明細書に組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。
【００１８】
ブタ組織移植へのヒトの応答に対する種々の遺伝子改変の影響を研究するため、異種反応性抗原の発現を低減させるように細胞が改変された遺伝子改変細胞を用いることが、いくつかの例では有利である。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いてブタ肝細胞型（たとえば肝細胞、線維芽細胞、ＨＳＣ、肝類洞内皮細胞、胆管細胞）を遺伝子改変し、遺伝子改変されていない細胞と比較してブタテトラスパニンｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１の発現を選択的に低減させることができる。いくつかの例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを用いて細胞を遺伝子改変し、遺伝子改変されていない同等動物と比較して１つまたは複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（たとえばＭＨＣ  Ｉ分子および／またはＭＨＣ  ＩＩ分子）の発現を低減させる。いくつかの例では、ブタ細胞を操作して、ｐＧＧＴＡ１、ｐＣＭＡＨ、ｐＢ４ＧａｌＮＴ２、ブタテトラスパニンｐＣＤ３７、ブタテトラスパニンｐＣＤ８１、ヒト（ｈ）ＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ヒトスロンボモジュリン、ＣＤ４６（メンブレンコファクタープロテイン）、ＣＤ５５（減衰促進因子）、ＣＤ５９（プロテクチンまたは反応性溶解のメンブレンインヒビター）、ヒトＨ−トランスフェラーゼ（たとえば血液型Ｏ抗原の発現のため）、エンド−β−ガラクトシダーゼＣ（たとえばＧａｌ抗原の発現の低減のため）、α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、シチジン一リン酸−Ｎ−アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β４ＧａｌＮＴ２）（たとえばβ４ＧａｌＮＴ２ノックアウト）、ＣＩＩＴＡ−ＤＮ（たとえばブタ白血球抗原クラスＩＩノックダウンをもたらすＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーターノックダウン）、クラスＩ  ＭＨＣノックアウト（ＭＨＣ−ＩＫＯ）、ＨＬＡ−Ｅ／ヒトβ２−ミクログロブリン（たとえばヒトナチュラルキラー細胞の細胞毒性を阻害するための）、ヒトＦＡＳリガンド（ＣＤ９５Ｌ）、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）遺伝子、ブタＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞毒性Ｔリンパ球抗原４またはＣＤ１５２）、ヒトＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子α関連アポトーシス誘起リガンド）、フォンウィレブランド因子（ｖＷＦ）、ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）、ヒト内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、ヒトエクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ−１（ＣＤ３９）、ヒト腫瘍壊死因子−α−誘起プロテイン３（Ａ２０）、ヒトヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、ヒトＣＤ４７（ＳＩＲＰ−αとの種特異的相互作用によりファゴサイトーシスが阻害される）、ブタアシアログリコプロテイン受容体１（ＡＳＧＲ１）（たとえば血小板ファゴサイトーシスを低減させる）、ヒトシグナル規制プロテイン−α（ＳＩＲＰα）（たとえば「自己」認識によって血小板ファゴサイトーシスを低減させる）等の遺伝子の発現を遺伝子改変（たとえば変異）し、または調節（たとえば増大、低減）する。
【００１９】
スフェロイドのための細胞は、任意の適切なプロトコールに従って生成し、収穫し、および／または培養することができる。いくつかの例では、スフェロイドのための細胞は、酵素によって分離された（たとえばトリプシン処理された）および／または機械的に分離された目的の組織から、細胞株から、または幹細胞から（たとえば目的の細胞型への幹細胞の指向された分化）、生成することができる。成熟ブタ肝由来細胞（ＬＤＣ）は、ＷＯ第２０１４／０６６５０５号に記載されているように、単離しおよび／または培養することができる。
【００２０】
スフェロイドおよび足場なし３Ｄブタ組織構築物の生存率および組織特異的代謝活性を分析するために、任意の適切な方法を用いることができる。たとえば、肝組織構築物および肝細胞を含むスフェロイドの尿素およびアルブミンの産生を試験することができる。
【００２１】
本明細書で提供する３Ｄブタ組織構築物中のある成分の均一性および存在または非存在を確認するために、任意の適切な方法を用いることができる。生物学的マーカーの存在または非存在を検出するための好適な方法は当技術で公知であり、免疫組織化学法、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡシーケンシング、およびＲＮＡレベルで遺伝子発現を評価するための同様の方法が限定なしに挙げられる。いくつかの例では、３Ｄブタ肝組織構築物中の細胞型または生体分子を検出し同定するために、免疫組織化学法等の方法が用いられる。たとえば、ブタ肝組織構築物の全体またはその部分を、特定の分化マーカーについて免疫組織化学法によって染色することができる。いくつかの例では、個別のマーカータンパク質の相対的発現を評価し、または構築物中の複数の前駆細胞もしくは分化細胞の型を検出するために、二重ラベル免疫蛍光法を実施することが有利となる。適切な一次抗体および二次抗体は当業者には公知で、入手可能である。さらに、合成３Ｄブタ肝組織構築物のための遺伝子発現プロファイルを得るために、マイクロアレイ技術または核酸シーケンシング（たとえばＲＮＡシーケンシング）を用いることができる。細胞集団におけるタンパク質レベルのマーカーの発現を評価するための定量的方法も、当技術で公知である。たとえば、目的の生物学的マーカーを発現し、または発現していない、所与の細胞集団中の細胞の分画を決定するために、フローサイトメトリーが用いられる。
【００２２】
いくつかの例では、本発明の３Ｄブタ組織構築物は、単離された生物学的成分をさらに含む。本明細書で用いる場合、「単離された」生物学的成分（タンパク質またはオルガネラ等）は、その成分が天然に存在する生命体の細胞の中の他の生物学的成分、たとえば他の染色体内もしくは染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、およびオルガネラから実質的に分離されまたは精製されたものである。本明細書で用いる場合、用語「単離されたタンパク質」には、標準的な精製法によって精製されたタンパク質が含まれる。この用語には、宿主細胞中で組み換え発現によって調製されたタンパク質、ならびに化学合成されたタンパク質、またはその断片も包含される。
【００２３】
別の態様では、薬剤のスクリーニング、薬剤の発見、または薬剤への応答のための本明細書に記載した足場なし３Ｄブタ組織の使用が、本明細書で提供される。特に、試験化合物の既知および未知の毒性をスクリーニングするために本明細書に記載したようにして得られる３Ｄブタ組織構築物を用いる方法が、本明細書で提供される。たとえば、３Ｄブタ肝組織構築物を試験化合物と接触させ、その中に含まれる細胞型（たとえば肝細胞、ＬＳＥＣ、線維芽細胞）のいずれかに対する何らかの影響を分析することができる。ある実施形態では、スクリーニング法には、本明細書に記載したようにして得られる３Ｄブタ組織構築物に１つまたは複数の試験化合物を接触させるステップ、ならびに限定しないが遺伝子発現、タンパク質発現、細胞生存率、および細胞の増殖等の生物学的特性または活性の陽性または陰性の変化を検出するステップが含まれる。試験化合物が本発明の構築物の特定の生物学的活性に対してどのように影響を及ぼすかは、試験化合物の性質、組織構築物の組成、および分析する特定の生物学的活性による。しかし、本開示の方法は一般に、（ａ）得られた３Ｄブタ組織構築物を試験化合物とともに培養するステップ、（ｂ）合成３Ｄブタ組織構築物の選択された生物学的活性を分析するステップ、および（ｃ）分析で決定された値を、試験化合物と接触させた構築物と同じ組成を有するが、試験化合物の非存在下に（または対照の存在下に）培養した合成３Ｄブタ組織構築物を用いて実施した同じ分析の値と比較するステップを含むことになる。合成３Ｄブタ組織構築物の細胞の生物学的特性または活性の陽性または陰性の変化を検出するステップは、接触した組織構築物の中の細胞または組織の形態または寿命に対する試験化合物の少なくとも１つの影響を検出するステップを含んでよく、それにより、細胞もしくは組織の寿命を短くし、または細胞もしくは組織の形態に不利な影響を有する試験化合物は、その組織に対して有毒であると識別される。いくつかの例では、検出するステップには、ＲＮＡシーケンシング、遺伝子発現プロファイリング、トランスクリプトーム解析、メタボローム解析、レポーターもしくはセンサーの検出、タンパク質発現プロファイリング、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、代謝プロファイリング、およびミクロ透析等の方法を実施するステップが含まれる。試験化合物は接触した合成３Ｄブタ組織構築物中の遺伝子発現に対する影響についてスクリーニングすることができ、接触していない合成組織構築物と比較して異なる遺伝子発現が検出される。
【００２４】
いくつかの例では、合成３Ｄブタ組織構築物の試験化合物への曝露（たとえば接触）の後の少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルにおける陽性または陰性の変化を検出しおよび／または測定するステップには、たとえばＲＮＡシーケンシングを用いる全トランスクリプトーム解析が含まれる。その場合には、遺伝子解析はたとえばＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅ、ＲＳＥＭ（ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｂｙ  Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ−Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ）、Ｅｘｃｅｌ、およびＰｒｉｓｍ等のデータ処理ソフトウェアプログラムを用いて計算する。Stewart et al., PLoS Comput. Biol. 9:e1002936 (2013)を参照されたい。適切な場合には、統計的比較はＡＮＯＶＡ解析、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの補正を加えた分散分析、または２テールＳｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を用いて行うことができ、Ｐ＜０．０５であれば値は有意であると判定される。合成ブタ肝組織構築物からＲＮＡまたはタンパク質を単離するために任意の適切な方法を用いることができる。たとえば、シーケンシングのためのｃＤＮＡを得るために、全ＲＮＡを単離して逆転写することができる。
別の態様では、本明細書で提供する方法を実施するため、またはその実施の助けとするために有用なキットとして、上述の材料ならびに他の材料を任意の好適な組み合わせで一緒に包装することができる。所与のキットの中のキット部品が開示した方法において一緒に用いるために設計されおよび適合していれば、有用である。たとえば、開示した方法によって産生された足場なし３Ｄ合成ブタ組織を含むキットが、本明細書で開示される。別の例として、遺伝子操作されたブタ細胞、遺伝子操作されたブタ細胞を含むスフェロイド、および本明細書で提供するブタ組織のバイオ印刷のためのマイクロニードル鋳型の１つまたは複数を含むキットが開示される。いくつかの実施形態では、キットは、１つまたは複数の培地、ラベル、および／または得られる足場なし３Ｄ合成ブタ組織の中の目的の生物学的マーカー、ポリペプチド、または核酸の検出のためのその他の試薬を含んでもよい。
【００２５】
本明細書で用いる「核酸」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸分子」を含み、一般的にはＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、これらは一本鎖でも二本鎖でもよく、合成物でも天然から得られた（たとえば単離されおよび／または精製された）ものでもよく、天然の、非天然の、もしくは変化したヌクレオチドを含んでもよく、改変されていないオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの間に見られるホスホジエステルの代わりにホスホロアミデート結合またはホスホロチオエート結合等の天然の、非天然の、もしくは変化したヌクレオチド間結合を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸は挿入、欠失、逆転、および／または置換を何ら含んでいない。しかし、いくつかの場合には本明細書で論じたように、核酸が１つまたは複数の挿入、欠失、逆転、および／または置換を含むことが好適な場合がある。
【００２６】
核酸は、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 280-281 (1982)に記載されたものを含む任意の好適な方法を用いて得ることができる。いくつかの態様では、核酸は米国特許出願公開第２００２／０１９０６６３号に記載されたようにして得られる。生物学的試料から得られた核酸は、典型的には分析に適した断片を産生するように断片化される。
本発明の核酸および／またはその他の部分は、単離され得る。本明細書で用いる場合、「単離された」は、核酸が天然産生の供給源に由来しようと合成的に製造されようと、全体としてもしくは部分的に、核酸が通常会合している成分の少なくともいくらかから分離されることを意味する。本発明の核酸および／またはその他の部分は、精製され得る。本明細書で用いる場合、「精製された」は、他の化合物または実体の大部分から分離されることを意味する。化合物または部分は、部分的に精製され、または実質的に精製され得る。純度は質量比を尺度として表され、それだけに限らないがマススペクトル、ＨＰＬＣ、その他の種々の分析手法を用いて決定される。
【００２７】
本出願で引用した出版物のそれぞれは、あらゆる目的のため参照により全体として組み込まれる。開示した主題の特定の実施形態および実施例を本明細書で論じたが、これらの実施例は説明的であって制限的ではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を概観することによって、当業者には多くの変更が明白になる。本開示に記載した本発明のある種の適合化は当業者にとっては日常の最適化の事柄であり、本発明の精神または添付した特許請求の範囲から逸脱することなく実施可能であることが理解される。
本明細書で提供する方法およびシステムがより容易に理解されるよう、いくつかの用語を定義する。
本開示を解釈するにあたって、全ての用語は文脈に一致する最も広い可能な様式で解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の変化は、要素、成分、またはステップを非限定的な様式で意味していると解釈すべきであり、したがって参照した要素、成分、またはステップは、明示的に参照していない他の要素、成分、またはステップと組み合わせられる。本明細書および特許請求の範囲において、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は非限定的な用語で、「〜を含むがそれに限らない」ことを意味すると解釈すべきである。これらの用語はより制限的な用語である「から実質的になる」および「からなる」を包含する。
【００２８】
用語「約」および「ほぼ」は一般に、測定の性質または精度を考慮して、測定された量について許容できる誤差の程度を意味する。典型的で例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の１０％以内、好ましくは５％以内である。あるいは、および特に生物学的システムにおいては、用語「約」および「ほぼ」は、所与の値の１桁分以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味する。本明細書で提示する数値は、他に述べない限り概略値であり、用語「約」または「ほぼ」は、明示的に述べなくても暗示され得ることを意味している。
他に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されると同じ意味を有している。本明細書および添付した特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によって他が明確に指示されない限り、複数の言及を含む。本明細書における「または」に対するいかなる言及も、他に述べない限り、「および／または」を包含することを意図している。
【００２９】
本発明の実施には、他に指示しない限り、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来手法が採用され、これらは当技術の範囲内である。これらの手法は文献で完全に説明されている。たとえばMolecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)、DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985)、Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)、Mullis et al. 米国特許第４６８３１９５号、Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)、Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)、Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)、Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)、B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)、the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)、Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)、Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.)、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)、およびHandbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)を参照されたい。
ここで本発明による組成物および方法の例示的な種々の実施形態を、以下の非限定的な実施例によって説明する。実施例は説明の目的のみに提供され、いかなる方式でも本発明の範囲を限定することを意図していない。まさに、本明細書に示して説明するものに追加する本発明の種々の改変は、上記の説明および以下の実施例から当業者には明白になり、添付した特許請求の範囲に含まれる。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）足場なし３Ｄバイオアセンブル遺伝子操作ブタ組織／肝の生成
スフェロイドを正確に組み立てることができる高スループットの装置、株式会社サイフューズ（日本）のＲｅｇｅｎｏｖａバイオプリンター（図１）が最近開発された。一般には、支持体としてマイクロニードルの配置を用い、ロボットプラットフォームによって、細胞スフェロイドから数ｍｍ以下のレベルの三次元（３Ｄ）精度を有する予め設計された連続的な構造を組み立てることができる。Ｒｅｇｅｎｏｖａバイオプリンターを用いて、野生型（ＷＴ）および遺伝子操作されたブタ細胞から、Ｋｅｎｚａｎマイクロニードルの上に足場なし３Ｄ構築物を印刷した。図２Ａ〜２Ｊを参照して、野生型ブタ線維芽細胞および肝由来細胞（ＬＤＣ）を含むスフェロイドをバイオ印刷した。バイオ印刷したスフェロイドは、印刷後、最初の５日以内に融合してマイクロニードルの上で細胞凝集物の三次元構築物を形成した。５日目に、マイクロニードルから３Ｄ構築物を取り出した。取り出した３Ｄ構築物において小孔が見られた（図２Ｉ）。
【００３１】
均一な３Ｄバイオ印刷ブタ組織構築物が再現性よく得られる細胞スフェロイドの大きさおよび含量を決定するため、４つの変数、即ち（ｉ）スフェロイドの直径、（ｉｉ）各ウェルの中心からのスフェロイド間の距離、（ｉｉｉ）スフェロイドの平滑度、および（ｉｖ）スフェロイドの円形度を検討した。野生型および遺伝子操作したブタ細胞を用いてほぼ４００〜６００μｍの細胞スフェロイドを調製し、プレート播種の２日、３日、５日、および７日後にスフェロイドの大きさを評価した（図３Ｃ）。スフェロイド形成の効率は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生存細胞イメージングおよび解析システムを用いて、細胞によって覆われた面積の百分率の動態を測定することによって評価した。
ヘマトキシリン／エオシン染色、免疫組織化学法、および共焦点顕微鏡法も実施した。組織病理解析によって、バイオ印刷の１週間後にカプセルがそれぞれの３Ｄ構築物を取り囲んでおり、それぞれのスフェロイドが増殖細胞を含んでいることが明らかになった（図４Ａ〜４Ｂ）。バイオ印刷の２週間後、増殖している生存細胞を含むより厚いカプセルが見られた（図４Ｃ〜４Ｄ）。バイオ印刷の３週間後の３Ｄ構築物の組織病理により、増殖している細胞を含むより厚いカプセル（２週間後の３Ｄ構築物と比較して）および細胞が中心に移動していることが明らかになった（図４Ｅ〜４Ｆ）。バイオ印刷の１週間後の３つの細胞株（線維芽細胞、肝細胞、および肝内皮細胞）の３Ｄバイオ印刷肝構築物の組織より、中央部にいくらかの壊死が観察されたが、合成構築物の約８０％を占める生存細胞も観察された（図４Ｇ）。
【００３２】
スフェロイドの形成：低結合性マイクロウェル中の細胞は互いに結合して細胞凝集スフェロイドを形成する。スフェロイドの大きさは部分的に、細胞数および培養時間によって決まる。スフェロイド１個あたりそれぞれの型の細胞１０，０００〜５０，０００個から直径４００〜５００μｍの細胞スフェロイドが生成することが観察された。約５００μｍがＫｅｎｚａｎ上のＲｅｇｅｎｏｖａバイオプリンターアセンブリーに適切な大きさである。この大きさは最大栄養拡散距離（スフェロイドの周辺から中央部までの約２００〜２５０μｍ）とも近似しており、スフェロイドのコアにおける細胞の呼吸が維持できることを意味している。スフェロイドは細胞の型に応じて２〜３日で形成された。
印刷：野生型（ＷＴ）皮膚線維芽細胞を、上述のように細胞を播種した２〜３日後に形成された４００〜５００μｍのスフェロイドとともに印刷した。３Ｄバイオ印刷には中空円筒形デザインが好ましいが、ＷＴ皮膚線維芽細胞は融合する傾向があり、そのため潅流することなく中央部の孔を迅速に塞いだ。次に線維芽細胞、肝細胞、および肝由来細胞（ＣＤ３１陽性）の組み合わせを用いてスフェロイドを形成させ、印刷してブタ肝モデルを得た（図３）。３Ｄバイオ印刷肝構築物は培地中、１週、２週、および３週で成熟させた。１つの３Ｄバイオ印刷肝構築物は、プロトタイプのバイオリアクターを用いて１週間、所定の流量で連続的に潅流した。生存細胞を検出するため、３Ｄバイオ印刷肝構築物についてヘマトキシリン／エオシン（Ｈ／Ｅ）染色を実施した（図４Ａ−４Ｇ）。
【００３３】
（実施例２）肝モデルの足場なし３Ｄバイオ印刷
本実施例は、ＳＦ３ＤＢＰ肝モデルを創成するための肝細胞と肝星細胞（ＨＳＣ）とのスフェロイドの産生および印刷を示す。簡単には、新たに解凍したブタ一次肝細胞および不死化したブタＨＳＣを用いて、（ｉ）肝細胞単独、（ｉｉ）ＨＳＣ単独、および（ｉｉｉ）肝細胞とＨＳＣの組み合わせでスフェロイドを生成させた。低付着性プレートを用いてスフェロイドを形成させ、ウェル中心からの距離、直径、円形度、および平滑度について特徴解析した。Ｒｅｇｅｎｏｖａ３Ｄバイオプリンターを用いて円柱状のスフェロイドを印刷した。残った緩いスフェロイドを、機能性分析（アルブミンの分泌、ｍＲＮＡの転写、尿素のクリアランス）のために２週間にわたってインキュベートした。
【００３４】
材料および方法
細胞培養：月齢４か月の健常な雄ブタの肝から肝細胞およびＨＳＣを単離した（図１１）。ＨＳＣはＳＶ４０Ｔレンチウイルスを用いて不死化した。不死化したＨＳＣの培養は成功した。
スフェロイドの形成：予め単離し、新たに解凍した肝細胞および不死化したＨＳＣ（６〜９継代）を用いてスフェロイドを作成した。Ｓｂｉｏ低付着性９６ウェルＵ底プレート（Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、ＵＳＡ）に細胞を播種した。
スフェロイドの特徴解析および３Ｄバイオ印刷：株式会社サイフューズ（東京、日本）のＲｅｇｅｎｏｖａ足場なし３Ｄバイオプリンターを用いて、スフェロイドの直径、円形度、および平滑度を特徴解析した。３×３×６パターンの９×９Ｋｅｎｚａｎニードルアレイを用いてＳＦ３ＤＢＰを行った。
【００３５】
試料の採取：培地試料を採取し、３日目、７日目、１１日目、および１４日目にｍＲＮＡのために試験群あたり少なくとも３個のスフェロイドをサンプリングした。免疫組織化学的試験用に固定化するために、スフェロイド全体も７日目および１５日目に採取した。
アルブミンおよび尿素の試験：アルブミン（ブタアルブミンＥｌｉｓａキット、ａｂｃａｍ社）および尿素（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）ＵｒｅａＡｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｆｉｓｈｅｒ社）の濃度を試験した。
リアルタイムＰＣＲ分析：Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットを用いてスフェロイドのｍＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡはｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて合成した。リアルタイムＰＣＲはＢｉｏｒａｄ  ＣＦＸ９５Ｔｏｕｃｈ（商標）で実施した。
【００３６】
結果および考察
図１２Ａ〜１２Ｂに示すように、肝細胞とＨＳＣの組み合わせ（比２．５：１）により、印刷可能な大きさ（４５０〜５５０μｍ）の円形で平滑なスフェロイドが６日後に産生された。サイズ滴定により、４０，０００個未満の細胞を含むスフェロイドは小さすぎて印刷できないことが示された。線維芽細胞のみまたはＨＳＣのみのスフェロイドは４８時間後に一様に円形で平滑なスフェロイドになった。直径は２日目の６２６．４５±６６．６２μｍから６日目までに５００．４７±８０．１４μｍに減少した。肝細胞のみの細胞は合体して特徴解析可能なスフェロイドになることができなかったが、いくかのウェルでは３日目および６日目に緩い細胞の凝集が見られた。組み合わせのウェルでは、９６ウェル中４２ウェルで２日目までに緩いスフェロイドが形成され、３日目までにより堅い「卵焼き状」のスフェロイドが形成された。組み合わせのスフェロイドは６日目までに円形になり、周辺部が凝集していくつかのより小さなスフェロイドが形成された。直径は２日目の８８０．５７±１００．１５μｍから６日目までに５０６．０９±１１８．９０μｍに減少した。スフェロイドの遠心分離およびインキュベーションの時間を変更することによって、肝細胞とＨＳＣ（２：１）を含むＳＦ３ＤＢＰ構築物が４日目に産生された。６日目と比較して４日目にスフェロイドを印刷することが可能であるので、薬理学的、免疫学的、および肝毒性試験のための将来の構築物の有用性が増大する。４８時間における肝細胞とＨＳＣ（比２．５：１）およびＨＳＣのみの４０，０００個の細胞のスフェロイドの予備的印刷。
図１４Ａ〜１４Ｂに示すように、ＨＳＣスフェロイドは階段状パターンで印刷され、その結果、大きな寸法（５５０μｍ）になった（ａ）。スフェロイドが針に付着したことからも明らかなように、組み合わせスフェロイドは印刷全体で緩く、円形でも規則的でもなかった（ｂ）。プリンターアームの内側でノズルが部分的にスフェロイドを吸い込んだ結果、両方の構築物は上部に突起を有している。印刷を停止し、機能性解析のためにスフェロイドを確保しておいた。
図１５に示すように、組み合わせスフェロイドを含む３Ｄ肝構築物を、０日目から３日目まで、一時的マイクロニードル支持体の上でバイオ印刷した。３日目までにスフェロイドは相互に融合し、それ自体の細胞外マトリックスを形成した。
【００３７】
図１６Ａ〜１６Ｂに示すように、肝細胞はスフェロイド中のＨＳＣの補助によって代謝活性を保っている。７２時間の培地試料の尿素の試験により、２週間にわたって肝細胞とＨＳＣの組み合わせ（比２．５：１）の尿素濃度に顕著な低下が示された（図１６Ａ）。組み合わせスフェロイドは１４日目までに最小の尿素クリアランス値を有していた。
リアルタイムＰＣＲは組み合わせスフェロイドでアルブミンｍＲＮＡの発現の増大を示し、機能性が維持されていることが示された（図１６Ｂ）。組み合わせスフェロイドではＣＲＢＰ−１の発現も増大した。肝細胞試料は高いＣｑ値を有しており、転写が制限されていることを示した（図１６Ｂ）。
【００３８】
ＨＳＣ単独で形成されたスフェロイドは４８時間では大きすぎて印刷できないことが分かった。スフェロイドのＳＦ３ＤＢＰ（肝細胞：ＨＳＣの比２．５：１で形成）は、６日目まで生存していると考えられる。遠心分離およびインキュベーションの時間を最適化することにより、組み合わせスフェロイド（比２：１）をより早期に印刷することが可能になった。６日目と比較して４日目にスフェロイドを印刷することが可能であるので、薬学的、免疫学的、および肝毒性試験のための将来の構築物の有用性が増大する。遺伝子発現およびアルブミン分泌の機能性の維持により、１４日間にわたる３Ｄバイオ印刷モデルの有用性が重視される。ＨＳＣ、肝細胞、肝類洞内皮細胞、胆管細胞、および線維芽細胞を含む種々の細胞の比を用いたスフェロイドのさらなる最適化によって、生理学的により正確な肝モデルを産生し印刷することが可能になる。
【００３９】
（実施例３）肺の足場なし３Ｄバイオ印刷
３種類のブタ肺細胞、即ち肺血管内皮細胞（ＣＤ３１陽性）、肺線維芽細胞、およびＩＩ型肺細胞を用いてスフェロイドを形成した。スフェロイドを形成するために種々の比の肺血管内皮細胞、肺線維芽細胞、およびＩＩ型肺細胞を試験した。１：１：１／２の比の肺血管内皮細胞、肺線維芽細胞、およびＩＩ型肺細胞をそれぞれ用いて、最も好適なスフェロイドが形成された。スフェロイドあたりの全細胞数は約４０，０００個であった。９６ウェルのＵ底プレート内でスフェロイドが成熟した２〜３日後にスフェロイドをバイオ印刷した。図１７に示す特別の中空モデルコンピューターデザインを選び、一時的マイクロニードルの上でスフェロイドをバイオ印刷した（図１７）。バイオ印刷の１日後から始めて、スフェロイドは融合を開始し、それ自体の細胞外マトリックスを作った（図１８）。バイオ印刷の５日後までに中実の融合した３Ｄ肺構築物が形成され、これをマイクロニードル支持体から取り出し、自立した足場なし３Ｄバイオ印刷肺モデルとした（図１８〜１９）。
図２０、図２１、および図２２は、支持体を除去した２日後（バイオ印刷の７日後）の自立した足場なし３Ｄバイオ印刷肺モデルの組織画像（Ｈ＆Ｅで染色）である。
【図１Ａ−１Ｅ】
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【図２Ａ−２Ｊ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ−４Ｇ−１】
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【図４Ａ−４Ｇ−２】
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【図４Ａ−４Ｇ−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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