(57)【要約】Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体、その作製方法、並びにインフルエンザウイルスの感染及び／又は感染によって引き起こされる疾患（インフルエンザ等）を予防及び／又は治療するために上記突然変異体を使用する方法を提供する。ワクチン等の上記突然変異体を含有する医薬組成物を更に提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体であって、該突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を含まず、
好ましくは、該突然変異体が前記Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を含まないという点で異なり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表し、好ましくは、該突然変異体が前記野生型ヘマグルチニンタンパク質のＮ末端シグナルペプチド及び／又は膜貫通領域を含まず、
好ましくは、該突然変異体が前記Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）が独立して以下のもの：
（１）Ｎ残基が欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられる；
（２）（Ｓ又はＴ）残基が欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換えられる；
（３）Ｘ残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる；
（４）１つ以上のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）がＮ残基とＸ残基との間に付加される；及び、
（５）１つ以上のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）がＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加される；
からなる群から選択される１つ以上の突然変異を有することで、該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を有しないという点で異なり、
ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表し、したがって、該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を有さず、
好ましくは、該突然変異体が前記Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）が独立して以下のもの：
（１）Ｎ残基が欠失するか、又は別のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられる；
（２）（Ｓ又はＴ）残基が欠失するか、又は別のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換えられる；
（３）Ｘ残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる；
（４）１つ以上のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）がＮ残基とＸ残基との間に付加される；及び、
（５）１つ以上のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）がＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加される；及び、
（６）（１）〜（５）の任意の組合せ；
からなる群から選択される突然変異を有するという点で異なり、
好ましくは、該突然変異体が前記Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）が独立して以下のもの：
（１）Ｎ残基が欠失するか、又は保存的に置き換えられる；
（２）（Ｓ又はＴ）残基が欠失するか、又は保存的に置き換えられる；
（３）Ｘ残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる；
（４）非Ｎアミノ酸残基がＮ残基とＸ残基との間に付加される；
（５）非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基がＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加される；及び、
（６）（１）〜（５）の任意の組合せ；
からなる群から選択される突然変異を有するという点で異なり、
好ましくは、前記野生型ヘマグルチニンタンパク質がＡ／ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）及びＡ／ＨＯＮＧ＿ＫＯＮＧ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）等のＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスに由来し、
好ましくは、前記野生型ヘマグルチニンタンパク質が配列番号１及び６からなる群から選択される配列を有し、
好ましくは、前記野生型ヘマグルチニンタンパク質が配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、該突然変異体が配列番号１とは、少なくとも該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を含まないという点で異なり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表し、任意に、該突然変異体がシグナルペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１０）及び／又は膜貫通領域（例えば、配列番号１のアミノ酸５０４〜５５０）を含まず、
好ましくは、前記野生型ヘマグルチニンタンパク質が配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、該突然変異体が配列番号６とは、少なくとも該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を含まないという点で異なり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表し、任意に、該突然変異体がシグナルペプチド（例えば、配列番号６のアミノ酸１〜２５）及び／又は膜貫通領域（例えば、配列番号６のアミノ酸５１８〜５６５）を含まず、
好ましくは、該突然変異体が配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、又は該突然変異体が、配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％及び９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の同一性を有するが、但し、該突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まない（例えば、該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない）か、又は該突然変異体が配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を有するが、但し、該突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まない（例えば、該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない）、突然変異体。
【請求項２】
請求項１に記載の突然変異体と付加的なペプチド断片とを含む組換えタンパク質であって、前記付加的なペプチド断片が前記突然変異体に連結し、
好ましくは、前記付加的なペプチド断片が前記突然変異体に直接連結するか、又は該突然変異体にリンカーを介して連結し、
好ましくは、前記付加的なペプチド断片が前記突然変異体のＮ末端又はＣ末端に連結し、
好ましくは、該組換えタンパク質が少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ又はそれ以上の付加的なペプチド断片を含み、
好ましくは、前記付加的なペプチド断片がシグナルペプチド、タグペプチド、フォールディングモチーフ、検出可能な標識及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され、
好ましくは、前記シグナルペプチドが前記突然変異体のＮ末端に連結し、更に好ましくは、該シグナルペプチドが配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、
好ましくは、前記フォールディングモチーフが前記突然変異体のＣ末端に連結し、更に好ましくは、該フォールディングモチーフが配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する、組換えタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の突然変異体又は請求項２に記載の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸分子又は請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞又はウイルス（例えば、バキュロウイルス）。
【請求項６】
複数の請求項１に記載の突然変異体又は請求項２に記載の組換えタンパク質を含むか又はそれからなる多量体であって、好ましくは三量体である、多量体。
【請求項７】
請求項１に記載の突然変異体、又は請求項２に記載の組換えタンパク質、又は請求項３に記載の核酸分子、又は請求項４に記載のベクター、又は請求項５に記載の宿主細胞若しくはウイルス、又は請求項６に記載の多量体を含む組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の突然変異体又は請求項２に記載の組換えタンパク質又は請求項６に記載の多量体を含む医薬組成物（例えば、ワクチン）であって、任意に薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を更に含む、医薬組成物。
【請求項９】
被験体におけるインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防又は治療する方法であって、予防有効量又は治療有効量の請求項１に記載の突然変異体又は請求項２に記載の組換えタンパク質又は請求項６に記載の多量体又は請求項８に記載の医薬組成物を前記被験体に投与することを含み、
好ましくは、前記インフルエンザウイルスがＨ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及びＨ１Ｎ１亜型のインフルエンザウイルスから選択され、
好ましくは、前記インフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患がインフルエンザであり、
好ましくは、前記被験体がマウス及びヒト等の哺乳動物である、方法。
【請求項１０】
医薬組成物（例えば、ワクチン）の製造における請求項１に記載の突然変異体又は請求項２に記載の組換えタンパク質又は請求項６に記載の多量体の使用であって、前記医薬組成物（例えば、ワクチン）が被験体におけるインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防又は治療に使用され、
好ましくは、前記インフルエンザウイルスがＨ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及びＨ１Ｎ１亜型のインフルエンザウイルスから選択され、
好ましくは、前記インフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患がインフルエンザであり、
好ましくは、前記被験体がマウス及びヒト等の哺乳動物である、使用。
【請求項１１】
請求項１に記載の突然変異体又は請求項２に記載の組換えタンパク質を作製する方法であって、請求項５に記載の宿主細胞又はウイルスを前記突然変異体又は前記組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で培養することと、発現された前記突然変異体又は組換えタンパク質を回収することとを含む、方法。
【請求項１２】
ワクチンを作製する方法であって、請求項１に記載の突然変異体又は請求項２に記載の組換えタンパク質又は請求項６に記載の多量体を薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と混合することを含み、任意に、アルミニウムアジュバント等のアジュバント、及び／又はインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防又は治療することが可能な付加的な有効成分等の付加的な有効成分を混合することを更に含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に、本願は、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体及びその使用に関する。加えて、本願は、上記突然変異体を含む医薬組成物（ワクチン等）、該突然変異体を作製する方法、並びにインフルエンザウイルスの感染及び／又は感染によって引き起こされる疾患（インフルエンザ等）の予防及び／又は治療のために該突然変異体を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、ヒトの健康にとって大きな脅威であり、その継続的かつ急速な抗原連続変異により季節性インフルエンザが人々の間で広く蔓延する。一般的なヒト季節性インフルエンザウイルスとしては、季節性Ｈ１Ｎ１、季節性Ｈ３Ｎ２及びＢ型インフルエンザウイルスが挙げられる。ＷＨＯの統計によると、季節性インフルエンザは、毎年少なくとも２５００００人〜５０００００人の死者を出している（非特許文献１）。加えて、インフルエンザのパンデミックは、依然として人類にとって大きな脅威である。インフルエンザウイルスの発見以来、ヒトの歴史の中で５回の世界的なインフルエンザのパンデミックが起こり、数千万人が死亡した。そのうち、１９１８年のスペイン風邪のアウトブレイクでは、世界でおよそ２０００万人〜５０００万人が死亡した。２０世紀の他の主要なインフルエンザのアウトブレイクには、１９５７年のアジア風邪（Ｈ２Ｎ２）のアウトブレイク及び１９６８年のホンコン風邪（Ｈ３Ｎ２）のアウトブレイクが含まれ、どちらも深刻な公衆衛生上の脅威及び人々の大きなパニックを引き起こした（非特許文献２）。２１世紀でもインフルエンザのパンデミックは止まってはいない。２００９年にメキシコで発生し、急速に世界中に蔓延した新型のＡ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）のパンデミックは、再び人間社会に警鐘を鳴らした。ＷＨＯの統計によると、２０１０年８月６日の時点で世界中の２００を超える国及び地域で合計１８４４９件の死亡の確認が報告された（非特許文献３）。インフルエンザウイルスのパンデミックが収まると、そのインフルエンザウイルスは多くの場合、季節性インフルエンザへと進化し、蔓延し続け、流行過程での抗原連続変異により人間の健康を脅かし続ける。加えて、人類は、高病原性鳥インフルエンザの脅威に直面している。２００３年以降、世界中でＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスによる合計６００件のヒト感染例が報告されており、これは３５３件の死亡を含み、６０％に近い死亡率が示される（ＷＨＯ：http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_table_archives/en/index.html）。２０１３年以降、世界中でＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスによる合計１５５４件のヒト感染例が報告されており、２５％を超える死亡率が示される（ＷＨＯ：http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_table_archives/en/index.html）。インフルエンザウイルスが人々の間で蔓延すると、人間社会にとって致命的な打撃がもたらされることが人々に懸念されている。要するに、インフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザは、人間の前に立ちはだかる重大な感染性疾患である。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルス属に属し、一本鎖のマイナス鎖ＲＮＡを有するエンベロープウイルスである。インフルエンザウイルスのゲノムは、１０個を超えるウイルスタンパク質をコードする。ウイルス核タンパク質（ＮＰ）及びマトリックスタンパク質（Ｍ）の抗原性及び遺伝的特徴の違いにより、インフルエンザウイルスは３つの型、すなわちＡ型（Ａ）、Ｂ型（Ｂ）及びＣ型（Ｃ）に分類される（非特許文献４）。それらの中でも、Ａ型インフルエンザウイルス（略してＦｌｕ  Ａ）は、急速に突然変異し、強い病原性を有し、世界中でパンデミックを引き起こす可能性がある。Ｂ型インフルエンザウイルス（略してＦｌｕ  Ｂ）は、ゆっくりと突然変異し、局所的なパンデミックしか引き起こすことができない。Ｃ型インフルエンザウイルス（略してＦｌｕ  Ｃ）は、最も遅い突然変異及び弱い病原性を有し、通常は抵抗力の低い妊婦及び小児にしか感染することができない。Ｆｌｕ  Ａは、水鳥等の自然宿主に加えて、自然界に広範な宿主を有し、更にヒト、ウマ及びブタ等の様々な動物でも感染を引き起こす可能性がある。Ｆｌｕ  Ａは、違いの大きな多くの亜型を有し、インフルエンザの予防及び制御、並びにワクチン研究において大きな注目を集めている。
【０００４】
Ｆｌｕ  Ａウイルスは、表面抗原ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原性及び遺伝的特徴に応じて複数の亜型に分類することができる。現在、１８種のＨＡ亜型（Ｈ１〜Ｈ１８）及び１１種のＮＡ亜型（Ｎ１〜Ｎ１１）が発見されている（非特許文献５）。集団内で流行しているＦｌｕ  Ａウイルスは、主に２種のＨＡ亜型（Ｈ１、Ｈ３）及び２種のＮＡ亜型（Ｎ１、Ｎ２）を含む。一方で、高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１及びＨ７Ｎ９もヒトへの感染を引き起こす場合があり、より高い死亡率から多くの注目を集めている。
【０００５】
インフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルスと闘うために最も効果的な方法である。現在、インフルエンザワクチンによって誘導される抗ウイルス抗体の主要標的は、ウイルス表面上に位置するヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質である。ＨＡタンパク質は、ウイルス表面上で三量体構造を有し、各ＨＡ単量体がＨＡ１及びＨＡ２の２つのドメインからなる。ＨＡ１は、三量体の頭部に位置し、球状構造を構成し、受容体結合部位を含有し、宿主細胞におけるウイルス感染に重要な部位である。現在、ＨＡ１は、身体による防御中和抗体の産生を誘導することができる重要な抗原部位を含有することからワクチン設計にとって重要な標的である（非特許文献６）。ＨＡ２は、三量体の基部に位置し、茎状構造を有し、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合を媒介することができる融合ペプチドを含有する。ＨＡ２に対する幾つかのモノクローナル抗体がウイルス膜融合の阻害によってウイルスを中和し得ることが報告されている（非特許文献６）。
【０００６】
インフルエンザウイルスは、高い変動性を有し、中でも特にＨＡが最も急速に突然変異する。現在、従来のワクチンは、主にＨＡタンパク質を標的とする。ＨＡ遺伝子の高い変動性から、ワクチンが抗原連続変異のために効果がない可能性がある。インフルエンザウイルスの抗原性変異を克服するために、前年の流行ウイルス株の突然変異のモニタリングにより、ＷＨＯは、翌年の流行期のワクチン候補株として古いワクチン株を使用するか又は新たなワクチン株を確立する選択を行わなければならず、現在のパンデミック株に対する効果的な防御を確実にするために新たなワクチンを毎年接種しなければならない。言い換えると、現在のインフルエンザワクチンは、前年に流行したウイルス株の抗原性変異に応じて毎年調整する必要があり、これは時間及び労力を要する。したがって、ウイルスの突然変異による影響を受けない「広域ワクチン」の開発が新たなワクチンの研究のホットスポットになりつつある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Peter D.C. et al., J Clin Invest. 2008, 118: 3273-3275
【非特許文献２】Xu R. et al. Science. 2010, 328: 357-360
【非特許文献３】WHO Pandemic (h1n1) 2009-update 112. 6 Aug, 2010
【非特許文献４】Horimoto T. et al., Nat Rev Microbiol, 2005, 3 (8): 591-600
【非特許文献５】Tong S. et al., PLoS Pathog. 2013; 9 (10): e1003657
【非特許文献６】Wang T.T. et al., Nat Struct Mol Biol. 2009, 16: 233-234
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非修飾天然ＨＡタンパク質がワクチンとして狭域の免疫防御効果しか誘導することができないことから、ＨＡの急速な突然変異に起因する急速なワクチン不全を回避するために、天然ＨＡタンパク質を修飾して、広域免疫応答を誘導することができるワクチンを得ることが提案されている。しかしながら、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質が多くの亜型を有し、複雑な翻訳後グリコシル修飾を有するため、この分野における研究は、あまり進展を遂げていない。広域抗インフルエンザウイルス防御抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導し、広域抗インフルエンザウイルス防御をｉｎ  ｖｉｖｏで与えることが可能なＨＡ突然変異体を開発する必要性が依然として当該技術分野で存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＨＡは糖タンパク質であり、そのＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインは、どちらもグリコシル化部位を含み、Ｎ結合型グリコシル鎖を有する（Keil W et al. (1985) EMBO J 4: 2711-2720）。真核生物発現（例えば、昆虫−バキュロウイルス発現系を用いた真核生物発現）の場合、産生されるＨＡタンパク質は、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインの両方にＮ結合型グリコシル鎖を有し、したがって、生じるＨＡ三量体は、そのヘッド領域及びステム領域にＮ結合型グリコシル鎖を有する（図２Ａ）。徹底的な研究後に、本願の発明者らは、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質を修飾して、それが有するＮ結合型グリコシル鎖を完全に除去することで、修飾されたＨＡタンパク質が広域防御抗体を誘導する能力の増強を示し、それにより誘導された防御抗体がインフルエンザウイルスのより多くの亜型を認識することができ、より広域の防御効果を有することを見出した。これに基づいて、本願の発明者らは、Ｎ結合型グリコシル化部位を含まず（例えば、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を含まず）、広域抗インフルエンザウイルス防御抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導することができ、広域抗インフルエンザウイルス防御効果をｉｎ  ｖｉｖｏでもたらすことができる、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体を開発した。特に、本明細書で開示される突然変異体は、インフルエンザウイルスの種々の亜型に対して防御抗体を誘導することが可能であり、インフルエンザウイルスの種々の亜型に対する防御を達成し、したがって、インフルエンザウイルスの複数の亜型（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ又はそれ以上の亜型）の感染及び感染に関連する疾患（例えば、インフルエンザ）の予防及び／又は治療のためのインフルエンザウイルスの複数の亜型（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ又はそれ以上の亜型）に対抗することが可能な広域ワクチンとして使用することができる。
【００１０】
特に、本願で開示されるＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に由来する突然変異体は、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの複数の株（特に、異なる年代に流行しているＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの複数の株）に対する防御抗体を誘導し、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの複数の株に対する防御を達成することができるだけでなく、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスに対する防御抗体を誘導し、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスに対する防御を達成することもできる。したがって、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に由来する、かかる突然変異体は、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスの感染並びにそれに関連する疾患の予防及び／又は治療のための広域ワクチンとしての使用に特に適している。
【００１１】
突然変異体について
このため、一態様では、本願は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含まないＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体に関する。Ｎ結合型グリコシル化部位がないことから、かかる突然変異体は、Ｎ結合型グリコシル化鎖を含まない。或る特定の好ましい実施の形態では、本願は、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体を提供するが、ここで、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質と比較して、突然変異体は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含まず、任意に、突然変異体は、野生型ヘマグルチニンタンパク質のＮ末端シグナルペプチド及び／又は膜貫通領域を含まない。
【００１２】
Ｎ結合型グリコシル化は、ポリペプチドの翻訳後修飾であり、グリコシル鎖がポリペプチド鎖中の特定のアスパラギン残基上の遊離−ＮＨ２基に連結していることを意味する。Ｎ結合型グリコシル化は通常、小胞体（ＥＲ）及びゴルジ体（ＧＡ）において行われる。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質のＮ結合型グリコシル化部位の各々のアスパラギン残基が独立して欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）で置換されるという点で異なる。
【００１３】
インフルエンザウイルスＨＡタンパク質中のＮ結合型グリコシル化部位は、様々な既知の方法によって決定することができる（Tate MD. Et al., Viruses. 6(3): 1294-316を参照されたい）。例えば、コンピュータプログラム又はソフトウェア（例えば、タンパク質配列分析ソフトウェアパッケージＡｎｔｈｅｐｒｏｔ  ５．０）を用いてＮ結合型グリコシル化部位を予測し、決定することができる。インフルエンザウイルスの天然ＨＡタンパク質では、Ｎ結合型グリコシル化を受けるアミノ酸は通常、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）のアスパラギン（Ｎ）であり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表す。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を含まないという点で異なり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表す。或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）が独立して以下のもの：
（１）Ｎ残基が欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられる；
（２）（Ｓ又はＴ）残基が欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換えられる；
（３）Ｘ残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる；
（４）１つ以上のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）がＮ残基とＸ残基との間に付加される；及び、
（５）１つ以上のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）がＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加される；
からなる群から選択される１つ以上の突然変異を有し、
ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表す；
したがって、該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く有しない。
【００１４】
野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、生じる突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まないように独立して様々な既知の方法で修飾することができる。
【００１５】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、Ｎ残基を欠失させるか、又はＮ残基を１つ以上の他のアミノ酸残基で置き換え、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、Ｎ残基を欠失させ、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、Ｎ残基を非Ｎアミノ酸残基で置き換え、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、Ｎ残基を少なくとも２つ又はそれ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）のアミノ酸残基で置き換え、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができるが、但し、少なくとも２つ又はそれ以上のアミノ酸残基の最後のアミノ酸残基が非Ｎアミノ酸残基である。
【００１６】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、（Ｓ又はＴ）残基を欠失させるか、又は（Ｓ又はＴ）残基を１つ以上の他のアミノ酸残基で置き換え、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、（Ｓ又はＴ）残基を欠失させ、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、（Ｓ又はＴ）残基を非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基で置き換え、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、（Ｓ又はＴ）残基を少なくとも２つ又はそれ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）のアミノ酸残基で置き換え、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができるが、但し、少なくとも２つ又はそれ以上のアミノ酸残基の最初のアミノ酸残基が非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基である。
【００１７】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、Ｘ残基を欠失させるか、又はＸ残基をプロリン残基で置き換え、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、Ｘ残基を欠失させ、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、Ｘ残基をプロリン残基で置き換え、それによりＮ−グリコシル化部位点を除去することで修飾することができる。
【００１８】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、１つ以上のアミノ酸残基をＮ残基とＸ残基との間に付加し、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、非Ｎアミノ酸残基をＮ残基とＸ残基との間に付加し、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、少なくとも２つ又はそれ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）のアミノ酸残基をＮ残基とＸ残基との間に付加し、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができるが、但し、少なくとも２つ又はそれ以上のアミノ酸残基の最後のアミノ酸残基が非Ｎアミノ酸残基である。
【００１９】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、１つ以上のアミノ酸残基をＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加し、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基をＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加し、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質中の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）は、少なくとも２つ又はそれ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）のアミノ酸残基をＮ残基とＸ残基との間に付加し、それによりＮ−グリコシル化部位を除去することで修飾することができるが、但し、少なくとも２つ又はそれ以上のアミノ酸残基の最初のアミノ酸残基が非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基である。
【００２０】
或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）のＮ残基及び／又は（Ｓ又はＴ）残基が独立して欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、別のアミノ酸残基）に置き換えられるという点で異なり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表し、したがって、突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない。
【００２１】
或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）のＮ残基が独立して欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられるという点で異なる。
【００２２】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質は、各々のＮ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基を欠失させることで修飾することができ、これにより、生じる突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まなくなり、Ｎ結合型グリコシル化鎖を全く有しなくなる。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）のアスパラギン残基が欠失するという点で異なる。
【００２３】
或る特定の好ましい実施の形態では、各々のＮ結合型グリコシル化部位（特に、各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基を独立して１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換え、野生型ヘマグルチニンタンパク質を修飾することができ、これにより、生じる突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まなくなり、Ｎ結合型グリコシル鎖を全く有しなくなる。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の各々のアスパラギン残基が独立して１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられるという点で異なる。
【００２４】
或る特定の好ましい実施の形態では、幾つかのＮ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基を欠失させることができ、残りのＮ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基を各々独立して１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換え、野生型ヘマグルチニンタンパク質を修飾する。これにより、生じる突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まなくなり、Ｎ結合型グリコシル化鎖を全く有しなくなる。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の幾つかの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）のアスパラギン残基が欠失し、残りの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）のアスパラギン残基が各々独立して１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられるという点で異なる。
【００２５】
或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基が各々独立して欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換えられるという点で異なる。
【００２６】
或る特定の好ましい実施の形態では、各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基を欠失させ、野生型ヘマグルチニンタンパク質を修飾することができ、これにより、生じる突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まなくなり、Ｎ結合型グリコシル化鎖を全く有しなくなる。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基が欠失するという点で異なる。
【００２７】
或る特定の好ましい実施の形態では、各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基を各々独立して１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換え、野生型ヘマグルチニンタンパク質を修飾することができ、これにより、生じる突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まなくなり、Ｎ結合型グリコシル鎖を全く有しなくなる。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基が各々独立して１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換えられるという点で異なる。
【００２８】
或る特定の好ましい実施の形態では、幾つかの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基を欠失させることができ、残りの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基を各々独立して１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換え、野生型ヘマグルチニンタンパク質を修飾する。これにより、生じる突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まなくなり、Ｎ結合型グリコシル鎖を全く有しなくなる。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の幾つかの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基が欠失し、残りの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基が各々独立して１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換えられるという点で異なる。
【００２９】
或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の幾つかの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）のＮ残基が各々独立して欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられ、残りの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基が各々独立して欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換えられるという点で異なる。
【００３０】
或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）が独立して以下のもの：
（１）Ｎ残基が欠失するか、又は別のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられる；
（２）（Ｓ又はＴ）残基が欠失するか、又は別のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換えられる；
（３）Ｘ残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる；
（４）１つ以上のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）がＮ残基とＸ残基との間に付加される；及び、
（５）１つ以上のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）がＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加される；及び、
（６）（１）〜（５）の任意の組合せ；
からなる群から選択される突然変異を有するという点で異なる。
【００３１】
ポリペプチド鎖中の或る特定のアミノ酸残基を欠失させるか、又は別のアミノ酸残基で置き換える方法が当業者によく知られている。例えば、ポリペプチド鎖中の任意のアミノ酸残基を、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発等の当該技術分野で既知の標準的な技法によって修飾する（例えば、欠失させる又は置き換える）ことができる。
【００３２】
或る特定の好ましい実施の形態では、Ｎ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基を置き換えるためのアミノ酸残基は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、グルタミン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基であり得る。或る特定の好ましい実施の形態では、Ｎ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基を置き換えるためのアミノ酸残基は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、グルタミン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基であり得る。或る特定の好ましい実施の形態では、Ｎ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基を置き換えるためのアミノ酸残基は、アラニン残基であり得る。或る特定の好ましい実施の形態では、各々のＮ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基がアラニンに置き換えられる。或る特定の好ましい実施の形態では、Ｎ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基を置き換えるためのアミノ酸残基は、グルタミン残基であり得る。或る特定の好ましい実施の形態では、各々のＮ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基がグルタミンに置き換えられる。
【００３３】
或る特定の好ましい実施の形態では、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基を置き換えるためのアミノ酸残基は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、システイン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基であり得る。或る特定の好ましい実施の形態では、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基を置き換えるためのアミノ酸残基は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、システイン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基であり得る。
【００３４】
加えて、タンパク質結晶化及び構造分析技術の発達に伴い、ＨＡタンパク質の機能及び特性の研究及び理解がますます深まっている。したがって、コンピュータプログラム又はソフトウェア（例えば、ＰｙＭｏｌ）を用いることで、ＨＡ三量体中の各々のＮ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基及び（Ｓ又はＴ）残基の位置及び立体配座を決定することができる。これに基づいて、アミノ酸残基の物理化学的特性（例えば、大きさ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力等）を組み合わせることで、アスパラギン残基及び（Ｓ又はＴ）残基を置き換えるのに適切なアミノ酸残基を選択することができる。例えば、タンパク質又はポリペプチドの機能及び特性に大きな影響又は変化を与えることなく、保存的置換をタンパク質又はポリペプチドに行うことができることが当該技術分野で知られている。
【００３５】
したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々のＮ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基が各々独立して保存的に置き換えられるという点で異なる。或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々のＮ結合型グリコシル化部位（特に、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中）のアスパラギン残基が各々独立してアラニン、グリシン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸残基に保存的に置き換えられるという点で異なる。
【００３６】
或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基が各々独立して非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基で保存的に置き換えられるという点で異なる。或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基が各々独立してアラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン及びトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸残基に保存的に置き換えられるという点で異なる。
【００３７】
或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）が独立して以下のもの：
（１）Ｎ残基が欠失するか、又は保存的に置き換えられる；
（２）（Ｓ又はＴ）残基が欠失するか、又は保存的に置き換えられる；
（３）Ｘ残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる；
（４）非Ｎアミノ酸残基がＮ残基とＸ残基との間に付加される；
（５）非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基がＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加される；及び、
（６）（１）〜（５）の任意の組合せ；
からなる群から選択される突然変異を有するという点で異なる。
【００３８】
或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の幾つかの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）のＮ残基が各々独立して保存的に置き換えられ、残りの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基が各々独立して非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基に保存的に置き換えられるという点で異なる。或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも野生型ヘマグルチニンタンパク質中の幾つかの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）のＮ残基が各々独立してアラニン、グリシン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン及びトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸残基に保存的に置き換えられ、残りの特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）の（Ｓ又はＴ）残基が各々独立してアラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、トリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸残基に保存的に置き換えられるという点で異なる。
【００３９】
タンパク質のシグナルペプチド（通常はタンパク質のＮ末端に位置する）がタンパク質の分泌を誘導／促進することができ、シグナルペプチドをタンパク質の機能に影響を与えることなく分泌中又は分泌後に除去し得ることが容易に理解される。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質と比較して、突然変異体は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含まず、野生型ヘマグルチニンタンパク質のシグナルペプチド（例えば、Ｎ末端シグナルペプチド）を含まない。
【００４０】
タンパク質の膜貫通領域が一般に膜（例えば、細胞膜又はウイルスエンベロープ）へのタンパク質の固定を指向／促進することも容易に理解される。場合によっては、タンパク質の膜貫通領域の欠失は、タンパク質の生物活性（例えば、免疫原性及び免疫防御特性）に悪影響を与えない。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質と比較して、突然変異体は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含まず、野生型ヘマグルチニンタンパク質の膜貫通領域を含まない。
【００４１】
多くの既知の方法を用いて、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質におけるシグナルペプチドの位置及び配列並びに膜貫通領域の位置及び配列を決定することができる（例えば、TM Tumpey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 13849 (2002)を参照されたい）。加えて、様々なＨＡタンパク質のシグナルペプチド及び膜貫通領域が報告されている（例えば、James Stevens et al. Science 312, 404 (2006)を参照されたい）。したがって、様々なＨＡタンパク質のシグナルペプチド及び膜貫通領域の位置及び配列を容易に決定し、修飾する（例えば、欠失させる）ことができる。
【００４２】
或る特定の好ましい実施の形態では、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質と比較して、突然変異体は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含まず、野生型ヘマグルチニンタンパク質のシグナルペプチド（例えば、Ｎ末端シグナルペプチド）及び膜貫通領域を含まない。
【００４３】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２亜型、例えばＡ／ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）及びＡ／ＨＯＮＧ＿ＫＯＮＧ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）等の２００５年以降に流行したＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスに由来する。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質は、配列番号１及び６からなる群から選択される配列を有する。
【００４４】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示され、突然変異体は、配列番号１とは少なくとも突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を含まないという点で異なり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表す。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示され、突然変異体は、配列番号１とは少なくとも配列番号１中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）が独立して以下のもの：（１）Ｎ残基が欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられる；（２）（Ｓ又はＴ）残基が欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換えられる；（３）Ｘ残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる；（４）非Ｎアミノ酸残基がＮ残基とＸ残基との間に付加される；（５）非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基がＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加される；及び（６）（１）〜（５）の任意の組合せからなる群から選択される突然変異を有するという点で異なる。或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、配列番号１とは突然変異体がシグナルペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１０）を含まないという点で更に異なる。或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、配列番号１とは突然変異体が膜貫通領域（例えば、配列番号１のアミノ酸５０４〜５５０）を含まないという点で更に異なる。或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、配列番号１とは突然変異体がシグナルペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１０）及び膜貫通領域（例えば、配列番号１のアミノ酸５０４〜５５０）を含まないという点で更に異なる。
【００４５】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示され、突然変異体は、配列番号１とは少なくとも配列番号１のアミノ酸１〜１０及び５０４〜５５０が欠失し、配列番号１の２２位、３８位、６３位、１２６位、１３３位、１４４位、１６５位、２４６位、２８５位及び４８３位のアスパラギン残基が各々独立して欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、アラニン残基又はグルタミン残基等の非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられるという点で異なる。
【００４６】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６に示され、突然変異体は、配列番号６とは少なくとも突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を含まないという点で異なり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表す。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６に示され、突然変異体は、配列番号６とは少なくとも配列番号６中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）が独立して以下のもの：（１）Ｎ残基が欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられる；（２）（Ｓ又はＴ）残基が欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基）に置き換えられる；（３）Ｘ残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる；（４）非Ｎアミノ酸残基がＮ残基とＸ残基との間に付加される；（５）非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基がＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加される；及び（６）（１）〜（５）の任意の組合せからなる群から選択される突然変異を有するという点で異なる。或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、配列番号６とは突然変異体がシグナルペプチド（例えば、配列番号６のアミノ酸１〜２５）を含まないという点で更に異なる。或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、配列番号６とは突然変異体が膜貫通領域（例えば、配列番号６のアミノ酸５１８〜５６５）を含まないという点で更に異なる。或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、配列番号１とは突然変異体がシグナルペプチド（例えば、配列番号６のアミノ酸１〜２５）及び膜貫通領域（例えば、配列番号６のアミノ酸５１８〜５６５）を含まないという点で更に異なる。
【００４７】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６に示され、突然変異体は、配列番号６とは少なくとも配列番号６のアミノ酸１〜２５及び５１８〜５６５が欠失し、配列番号６の３７位、５３位、６０位、７８位、１３７位、１４１位、１４８位、１８０位、２６１位、３００位及び４９８位のアスパラギン残基が各々独立して欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、アラニン残基又はグルタミン残基等の非Ｎアミノ酸残基）に置き換えられるという点で異なる。
【００４８】
或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体は、配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４９】
タンパク質又はポリペプチドの機能及び特性に大きな影響を与えることなく、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列を（例えば、アミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換によって）適切に修飾し得ることが当業者には知られている。したがって、場合によっては、上記の突然変異体のアミノ酸配列を更に修飾することによって、インフルエンザウイルスの種々の亜型に対する防御抗体を誘導する能力を保持し、インフルエンザウイルスの種々の亜型に対する防御効果を有する付加的な突然変異体を得ることができる。
【００５０】
したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の突然変異体は、配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するが、但し、突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まない（例えば、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない）。
【００５１】
或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の突然変異体は、配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を有するが、但し、突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まない（例えば、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない）。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の突然変異体は、配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１つ又は幾つか（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ）のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を有するが、但し、突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まない（例えば、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない）。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の突然変異体は、配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１つ又は幾つか（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ）のアミノ酸残基の置換（特に、保存的置換）を有するが、但し、突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まない（例えば、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない）。
【００５２】
本願で開示されるＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に由来する突然変異体は、グリコシル化部位を含まず（例えば、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を含まず）、インフルエンザウイルスに対する広域防御抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導することができ、インフルエンザウイルスに対する広域防御をｉｎ  ｖｉｖｏで与えることができる。特に、本明細書で開示される突然変異体は、種々の亜型（例えば、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型）のインフルエンザウイルスに対する防御抗体を誘導し、種々の亜型（例えば、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型）のインフルエンザウイルスに対する防御を達成することが可能であり、したがってインフルエンザウイルスの様々な亜型（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ又はそれ以上の亜型；例えば、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型）の感染及び感染に関連する疾患（例えば、インフルエンザ）の予防及び／又は治療のためのインフルエンザウイルスの様々な亜型（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ又はそれ以上の亜型；例えば、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型）に対抗することが可能な広域ワクチンとして使用することができる。したがって、本明細書で開示される突然変異体は、特に有利である。
【００５３】
組換えタンパク質について
一態様では、本願は、本発明によるＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体と、突然変異体に連結した付加的なペプチド断片とを含む組換えタンパク質に関する。
【００５４】
本願の組換えタンパク質では、付加的なペプチド断片は、突然変異体に様々な方法で連結することができる。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、付加的なペプチド断片は、突然変異体に直接連結する。言い換えると、付加的なペプチド断片は、ペプチド結合を介して突然変異体に直接連結する。或る特定の好ましい実施の形態では、付加的なペプチド断片は、リンカーを介して突然変異体に連結する。従来技術の適切なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はその変異体からなり得る。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を有するリンカーを使用することができるが、その変異体を使用することもできる（Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448）。加えて、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731、Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106、Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061、Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56及びRoovers et al. (2001), Cancer Immunolに記載されているリンカー等の他のリンカーも使用することができる。
【００５５】
本願の組換えタンパク質では、付加的なペプチド断片は、突然変異体のいずれの末端に連結していてもよい。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、付加的なペプチド断片は、突然変異体のＮ末端に連結する。或る特定の好ましい実施の形態では、付加的なペプチド断片は、突然変異体のＣ末端に連結する。
【００５６】
本発明による組換えタンパク質は、１つ以上の付加的なペプチド断片を含み得る。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、本発明による組換えタンパク質は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ又はそれ以上の付加的なペプチド断片を含み得る。これらのペプチド断片を各々独立して突然変異体のいずれかの末端（Ｎ末端又はＣ末端）に様々な方法で連結し得ることが容易に理解される。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の組換えタンパク質は、２つの付加的なペプチド断片を含むことができ、１つの付加的なペプチド断片が突然変異体のＮ末端にリンカーを用いて又は用いずに連結し、別の付加的なペプチド断片が突然変異体のＣ末端にリンカーを用いて又は用いずに連結する。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の組換えタンパク質は、２つ以上の付加的なペプチド断片を含むことができ、２つ以上の付加的なペプチド断片が各々独立して突然変異体のＮ末端又はＣ末端にリンカーを用いて又は用いずに連結する。或る特定の好ましい実施の形態では、２つ以上の付加的なペプチド断片が突然変異体のＮ末端に連結する場合、２つ以上の付加的なペプチド断片は、任意の順序でタンデムであり、突然変異体のＮ末端にリンカーを用いて又は用いずに連結することができる。同様に、或る特定の好ましい実施の形態では、２つ以上の付加的なペプチド断片が突然変異体のＣ末端に連結される場合、２つ以上の付加的なペプチド断片は、任意の順序でタンデムであり、突然変異体のＣ末端にリンカーを用いて又は用いずに連結することができる。
【００５７】
適切な付加的なペプチド断片を実際の要求に応じて選択することができる。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、付加的なペプチド断片は、シグナルペプチド（例えば、配列番号９に示されるシグナルペプチド）であり得る。いかなる理論にも束縛されるものではないが、シグナルペプチドの使用が組換えタンパク質の分泌を促進し、それにより組換えタンパク質の回収を容易にし得ると一般に考えられている。概して、かかるシグナルペプチドは、突然変異体のＮ末端に連結することができる。加えて、分泌中又は分泌後にシグナルペプチドを除去して、所望の突然変異体又は組換えタンパク質を生成することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、付加的なペプチド断片は、タグペプチド、例えば配列番号１１に示される６×Ｈｉｓタグであり得る。いかなる理論にも束縛されるものではないが、タグペプチドの使用が組換えタンパク質の検出、回収及び精製を容易にし得ると一般に考えられている。例えば、ニッケルイオンを用いて６×Ｈｉｓタグ付きタンパク質を精製することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、付加的なペプチド断片は、突然変異体の三量体形成を促進するフォールディングモチーフであり得る。かかるフォールディングモチーフとしては、配列番号１０に示されるフォールディングモチーフが挙げられるが、これに限定されない。或る特定の好ましい実施の形態では、付加的なペプチド断片は、蛍光タンパク質等の検出可能な標識であり得る。
【００５８】
このため、或る特定の好ましい実施の形態では、付加的なペプチド断片は、シグナルペプチド、タグペプチド、フォールディングモチーフ、検出可能な標識及びそれらの任意の組合せから選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、シグナルペプチドは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、シグナルペプチドは、突然変異体のＮ末端に連結する。或る特定の好ましい実施の形態では、フォールディングモチーフは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、フォールディングモチーフは、突然変異体のＣ末端に連結する。或る特定の好ましい実施の形態では、タグペプチドは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、タグペプチドは、突然変異体のＮ末端又はＣ末端に連結する。
【００５９】
或る特定の好ましい実施の形態では、組換えタンパク質は、配列番号３及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。
【００６０】
タンパク質又はポリペプチドの機能及び特性に大きな影響を与えることなく、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列を（例えば、アミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換によって）適切に修飾し得ることが当業者には知られている。したがって、場合によっては、上記の組換えタンパク質のアミノ酸配列を更に修飾することによって、インフルエンザウイルスの種々の亜型に対する防御抗体を誘導する能力を保持し、インフルエンザウイルスの種々の亜型に対する防御効果を有する付加的な組換えタンパク質を得ることができる。
【００６１】
したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号３及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するが、但し、組換えタンパク質又は突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まない（例えば、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない）。
【００６２】
或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号３及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を有するが、但し、組換えタンパク質又は突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まない（例えば、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない）。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号３及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１つ又は幾つか（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ）のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を有するが、但し、組換えタンパク質又は突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まない（例えば、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない）。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号３及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１つ又は幾つか（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ）のアミノ酸残基の置換（特に、保存的置換）を有するが、但し、組換えタンパク質又は突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を全く含まない（例えば、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない）。
【００６３】
核酸分子、ベクター、ウイルス及び宿主細胞について
別の態様では、本願は、本発明の突然変異体又は本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる核酸分子に関する。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の核酸分子は、単離又は精製されている。
【００６４】
別の態様では、本願は、上記の核酸分子を含むベクターに関する。本発明のベクターは、クローニングベクター、トランスファーベクター又は発現ベクターであり得る。好ましい実施の形態では、本発明のベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージ等である。好ましい実施の形態では、ベクターは、真核細胞（例えば、昆虫細胞）において本発明の突然変異体又は本発明の組換えタンパク質を発現することが可能である。好ましい実施の形態では、ベクターは、昆虫細胞における本発明の突然変異体又は本発明の組換えタンパク質の発現を達成するためにバキュロウイルスゲノムＤＮＡと共に使用することができるバキュロウイルストランスファーベクターである。好ましい実施の形態では、バキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカマルチカプシド核多角体病ウイルス（autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus；ＡｃＭＮＰＶ）である。
【００６５】
別の態様では、本発明は、上記の核酸分子又はベクターを含む宿主細胞にも関する。かかる宿主細胞としては、大腸菌（E. coli）細胞等の原核細胞、並びに酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞（例えば、マウス細胞、ヒト細胞等の哺乳動物細胞等）等の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の宿主細胞は、２９３Ｔ細胞等の細胞株であってもよい。いかなる理論にも束縛されるものではないが、真核細胞の使用がタンパク質の正確な立体配座を維持するのに役立ち、タンパク質フォールディングを促進すると一般に考えられている。このため、或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の宿主細胞は、昆虫細胞等の真核細胞である。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の宿主細胞は、上述の核酸分子とバキュロウイルスゲノムＤＮＡとを含むバキュロウイルストランスファーベクターを含む昆虫細胞である。好ましい実施の形態では、バキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカマルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）である。
【００６６】
別の態様では、本発明は、上記の核酸分子又はベクターを含むウイルス（例えば、バキュロウイルス）にも関する。或る特定の好ましい実施の形態では、ウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカマルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）等のバキュロウイルスである。
【００６７】
多量体について
一態様では、本願は、本発明の複数の突然変異体又は本発明の複数の組換えタンパク質を含むか又はそれからなる多量体に関する。或る特定の好ましい実施の形態では、多量体は三量体である。言い換えると、多量体は、本発明の３つの突然変異体又は組換えタンパク質を含むか又はそれからなる。或る特定の好ましい実施の形態では、三量体は、天然ＨＡタンパク質から形成される三量体と同じ又は同様の立体配座を有する。
【００６８】
組成物について
別の態様では、本願は、上述の突然変異体、又は上述の組換えタンパク質、又は上述の核酸分子、又は上述のベクター、又は上述の宿主細胞、又は上述のウイルス、又は上述の多量体を含む組成物にも関する。或る特定の好ましい実施の形態では、組成物は、本発明の突然変異体又は組換えタンパク質を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組成物は、本発明の多量体を含む。
【００６９】
医薬組成物、治療方法及び使用について
別の態様では、本発明は、本発明の突然変異体又は組換えタンパク質又は多量体を含み、任意に薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を更に含む医薬組成物（例えば、ワクチン）にも関する。本発明の医薬組成物（例えば、ワクチン）は、インフルエンザウイルスの感染、又はインフルエンザ等のインフルエンザウイルスの感染によって引き起こされる疾患を予防又は治療するために使用することができる。
【００７０】
或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の突然変異体又は組換えタンパク質又は多量体は、インフルエンザウイルスの感染又はインフルエンザウイルスの感染によって引き起こされる疾患の予防又は治療に有効な量で存在する。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の医薬組成物（例えば、ワクチン）は、付加的な有効成分を更に含む。付加的な有効成分は、インフルエンザウイルスの感染又はインフルエンザウイルスの感染によって引き起こされる疾患を予防又は治療することが可能であるのが好ましい。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の医薬組成物（例えば、ワクチン）は、アルミニウムアジュバント等のアジュバントを更に含む。
【００７１】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、安定化剤、又は医薬組成物の投与（例えば、ヒト被験体への投与）に有利な特性を与えることが可能な他の試薬を更に含む。適切な医薬担体としては、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、ヒマシ油とエチレンオキシドとの縮合生成物、液体酸、低級アルコール（例えば、Ｃ１〜４アルコール）、油（例えば、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ゴマ油；任意に脂肪酸のモノグリセリド若しくはジグリセリド等の乳化剤、又はレシチン等のリン脂質を更に含む）、エチレングリコール、ポリアルキレングリコール、アルギン酸ナトリウム、ポリ（ビニルピロリドン）等が挙げられる。担体は、任意にアジュバント、保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透促進剤等を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は滅菌されている。加えて、適切な溶媒又は賦形剤を選択することによって医薬組成物の粘度を制御及び維持することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は４．５〜９．０、５．０〜８．０、６．５〜７．５又は６．５〜７．０のｐＨを有するように配合される。
【００７２】
本発明の医薬組成物（例えば、ワクチン）は、限定されるものではないが、経口投与又は注射等の当該技術分野で既知の方法によって投与することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の医薬組成物（例えば、ワクチン）は、単位剤形で投与される。
【００７３】
特定の病態の予防又は治療に必要とされる本発明の医薬組成物（例えば、ワクチン）の量は、投与経路、治療すべき病態の重症度、患者の性別、年齢、体重及び全身健康状態等によって異なり、医師が実際の状況に応じて合理的に決定することができる。
【００７４】
或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の医薬組成物（例えば、ワクチン）は、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスに対する防御抗体を誘導することが可能であり、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスに対する防御を達成し、したがって、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスの感染及びそれに関連する疾患（例えば、インフルエンザ）を予防及び／又は治療するために使用することができる、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に由来する突然変異体、又は該突然変異体を含む組換えタンパク質若しくは多量体を含む。
【００７５】
別の態様では、本発明は、予防有効量又は治療有効量の本発明による突然変異体若しくは組換えタンパク質若しくは多量体、又は本発明の医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体におけるインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防又は治療する方法に関する。或る特定の好ましい実施の形態では、インフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患は、インフルエンザである。或る特定の好ましい実施の形態では、被験体は、マウス及びヒト等の哺乳動物である。
【００７６】
或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の方法は、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスの感染及びそれに関連する疾患（例えば、インフルエンザ）の予防及び／又は治療に使用することができる。
【００７７】
別の態様では、本発明は、医薬組成物（例えば、ワクチン）の製造における本発明の突然変異体又は組換えタンパク質又は多量体の使用にも関し、ここで、医薬組成物（例えば、ワクチン）は、被験体におけるインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防又は治療に使用される。或る特定の好ましい実施の形態では、インフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患は、インフルエンザである。或る特定の好ましい実施の形態では、被験体は、マウス及びヒト等の哺乳動物である。
【００７８】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物（例えば、ワクチン）は、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に由来する突然変異体、又は該突然変異体を含む組換えタンパク質若しくは多量体を含み、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスの感染及びそれに関連する疾患（例えば、インフルエンザ）の予防及び／又は治療に使用される。
【００７９】
別の態様では、本発明は、被験体におけるインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防又は治療に使用される、上記の突然変異体又は組換えタンパク質又は多量体にも関する。或る特定の好ましい実施の形態では、インフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患は、インフルエンザである。或る特定の好ましい実施の形態では、被験体は、マウス及びヒト等の哺乳動物である。或る特定の好ましい実施の形態では、突然変異体又は組換えタンパク質又は多量体は、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスの感染及びそれに関連する疾患（例えば、インフルエンザ）の予防及び／又は治療に使用される。
【００８０】
作製方法について
別の態様では、本発明は、本発明の宿主細胞又はウイルスを突然変異体又は組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で培養することと、発現された突然変異体又は組換えタンパク質を回収することとを含む、上述の突然変異体又は組換えタンパク質を作製する方法に関する。
【００８１】
或る特定の好ましい実施の形態では、方法は、本発明のベクター（例えば、発現ベクター）を宿主細胞（例えば、真核細胞）に導入することで、突然変異体又は組換えタンパク質を宿主細胞において発現させることと、発現された突然変異体又は組換えタンパク質を回収することとを含む。或る特定の好ましい実施の形態では、方法は、上述の核酸分子及びバキュロウイルスゲノムＤＮＡを含むバキュロウイルストランスファーベクターを昆虫細胞に導入し、それにより突然変異体又は組換えタンパク質を昆虫細胞において発現させることと、発現された突然変異体又は組換えタンパク質を回収することとを含む。好ましい実施の形態では、バキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカマルチカプシド核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）である。
【００８２】
別の態様では、本発明は、本発明の突然変異体又は組換えタンパク質又は多量体を薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と混合し、任意にアルミニウムアジュバント等のアジュバント、及び／又はインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防又は治療することが可能な付加的な有効成分等の付加的な有効成分と更に混合することを含む、ワクチンを作製する方法にも関する。或る特定の好ましい実施の形態では、ワクチンを作製する方法は、本発明の突然変異体又は組換えタンパク質又は多量体をアルミニウムアジュバント等のアジュバントと混合する工程を含む。
【００８３】
上記で論考されるように、得られるワクチンは、インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患（例えば、インフルエンザ）の予防又は治療に使用することができる。
【００８４】
本願における関連用語の例示及び説明
本願では、特に明記しない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。加えて、本明細書で用いられる細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及び免疫学の研究所操作工程は全て、対応する分野で広く用いられている日常手順である。一方、本発明をより良く理解するために、関連用語の定義及び説明を下記に与える。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間での配列の一致を指す。比較される２つの配列中の或る特定の位置が同じ塩基又はアミノ酸単量体サブユニットによって占められる（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占められるか、又は２つのポリペプチドの各々の位置がリシンによって占められる）場合、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の「同一率（percent identity）」は、２つの配列で共通して一致する位置の数を比較される位置の数で除算し、１００を乗算した関数である。例えば、２つの配列の１０個の位置に６個の一致が見られる場合、２つの配列は６０％同一である。例えば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴ及びＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を有する（６個の位置のうち３個の一致）。概して、２つの配列が最大の同一性を生じるようにアラインメントされる場合に比較が行われる。かかるアラインメントは、例えばＡｌｉｇｎプログラム（DNAstar, Inc.）等のコンピュータプログラムによって都合よく行うことができる、Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453の方法を用いて達成することができる。ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl Biosci., 4: 11-17 (1988))のアルゴリズムを用いることもでき、この場合、２つのアミノ酸配列間の同一率を決定するためにＰＡＭ１２０重み付き残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４が用いられる。さらに、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたNeedleman and Wunsch (J MoI Biol. 48: 444-453 (1970))のアルゴリズムを用いることができ、この場合、２つのアミノ酸配列間の同一率を決定するためにＢｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６又は４、及び長さ重み１、２、３、４、５又は６が用いられる。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「保存的置換」又は「保存的置換え」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの生物活性に悪影響を与えない又は変更しないアミノ酸の置換又は置換えを指す。例えば、保存的置換は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発等の当該技術分野で既知の標準的な技法によって導入することができる。保存的アミノ酸置換には、対応するアミノ酸残基と物理的又は機能的に同様の残基（例えば、同様の大きさ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力等を含む化学的特性を有する）による置換等の同様の側鎖を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が含まれる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えることが好ましい。アミノ酸の保存的置換を特定する方法が当該技術分野で既知である（例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993)、Kobayashi et al. Protein Eng. 12 (10): 879-884 (1999)及びBurks et al. Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997)（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸ビヒクルを指す。挿入されるポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の発現がベクターによって可能となる場合、ベクターは、発現ベクターと称される。ベクターを形質転換、形質導入又はトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができ、それによりベクターが保有する遺伝物質要素を宿主細胞内で発現させることができる。ベクターは、当業者によく知られており、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体、λファージ又はＭ１３ファージ等のファージ、及び動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用することができる動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス等）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス及びパポーバウイルス（ＳＶ４０等）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素及びレポーター遺伝子を含むが、これらに限定されない、発現を制御する様々な要素を含み得る。加えて、ベクターは、複製開始点を含んでいてもよい。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターを導入するために使用することができる細胞を指し、大腸菌若しくは枯草菌（Bacillus subtilis）等の原核細胞、酵母細胞若しくはアスペルギルス等の真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞若しくはＳｆ９等の昆虫細胞、又は線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞若しくはヒト細胞等の動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「対応する配列フラグメント」又は「対応するフラグメント」という表現は、配列が最適にアラインメントされた場合、すなわち、最高の同一率が得られるように配列がアラインメントされた場合に、比較される配列中の同等の位置の断片を指す。本発明によると、「対応するアミノ酸位置」という表現は、配列が最適にアラインメントされた場合、すなわち、最高の同一率が得られるように配列がアラインメントされた場合に、比較される配列中の同等の位置のアミノ酸部位／残基を指す。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部分を指す。「エピトープ」は、当該技術分野で「抗原決定基」としても知られる。エピトープ又は抗原決定基は通常、分子のアミノ酸又は炭水化物又は糖側鎖等の化学活性表面基からなり、通常は特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。例えば、エピトープは通例、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個の連続した又は不連続なアミノ酸を「直線状」又は「立体構造」であり得る独自の空間的立体配座で含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい。直線状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（抗体等）との間の全ての相互作用点がタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線状に存在する。立体構造エピトープでは、相互作用点は、互いに離れたタンパク質アミノ酸残基全体に存在する。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「多量体」という用語は、概して少なくとも２つ（例えば、３つ、４つ、５つ以上）のポリペプチド単量体（例えば、本発明の突然変異体又は組換えタンパク質）を含み得る、単量体としてのポリペプチド分子（例えば、本発明の突然変異体又は組換えタンパク質）から形成される重合体を指す。かかる多量体では、単量体分子が分子間相互作用（水素結合、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用等）によって重合して、多量体が形成される。本発明の或る特定の実施の形態では、多量体は、３つの単量体を含む三量体である。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「単離された」又は「単離される」という用語は、自然状態の供給源から人工的な手段によって得られることを指す。或る特定の「単離された」物質又は構成要素が自然に生じる場合、物質は、それが存在する自然環境の変化、若しくは自然環境からの分離、又はその両方によって単離される。例えば、単離されていないポリヌクレオチド又はポリペプチドが生きている動物内に自然に存在する場合、かかる自然状態から高純度で単離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されたと称される。「単離された」又は「単離される」という用語は、人工又は合成物質との混合を除外するものでも、物質の活性に影響を与えない他の不純物の存在を除外するものでもない。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）」は、Ｎ結合型グリコシル化を生じることが可能な特徴的モチーフを指し、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表す。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「防御抗体」という用語は、ウイルスに対する防御効果を有する抗体を指す。防御抗体としては、ウイルス毒性を中和することが可能な抗体、ウイルスが宿主細胞を認識し、それに結合するのを阻害することが可能な抗体、及びウイルスと宿主細胞との融合を阻害することが可能な抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤」という用語は、被験体及び有効成分に薬理学的及び／又は生理学的に適合する担体及び／又は賦形剤を指し、当該技術分野で既知であり（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照されたい）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤（ionic strength enhancer）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤としては、リン酸緩衝液が挙げられるが、これに限定されず、界面活性剤としては、陽イオン性、陰イオン性又は非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ−８０が挙げられるが、これらに限定されず、アジュバントとしては、アルミニウムアジュバント（水酸化アルミニウム等）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント）が挙げられるが、これらに限定されず、イオン強度増強剤としては、塩化ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、抗原と共に又は抗原より前に体内に送達した場合に、抗原に対する身体の免疫応答を増強するか、又は免疫応答のタイプを変更することができる非特異的免疫増強剤（immune enhancer）を指す。アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・パルヴム（Corynebacterium parvum）、リポ多糖、サイトカイン等を含むが、これらに限定されない、多くの種類のアジュバントが存在する。フロイントアジュバントは、動物実験において最も一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験においてより多く使用されている。本発明では、アジュバントがアルミニウムアジュバントであることが特に好ましい。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、意図された目的を達成するのに効果的な量を指す。例えば、疾患（インフルエンザウイルス感染等）の予防又は治療のための有効量は、それが疾患（インフルエンザウイルス感染等）の発生を予防、阻止若しくは遅らせるか、又は既存の疾患（インフルエンザウイルスの感染によって引き起こされる疾患等）の重症度を軽減、緩和若しくは治療するのに効果的であることを意味する。かかる有効量を決定することは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、治療的使用のための有効量は、治療すべき疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、年齢、体重及び性別等の患者の一般的な状況、薬物の投与方法、並びに同時に適用される他の治療等によって異なる。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、特異抗体又は感作リンパ球を生成するように身体を刺激する能力を指す。これは、免疫細胞を活性化、増殖及び分化させ、最終的に抗体及び感作リンパ球等の免疫エフェクターを産生するように特定の免疫細胞を刺激する抗原の特性だけでなく、抗原が身体を刺激した後に、身体の免疫系が抗体又は感作Ｔリンパ球を生成する特定の免疫応答も指す。免疫原性は、抗原の最も重要な特性である。抗原が免疫応答を生じるように宿主を首尾よく誘導し得るかは、抗原の性質、宿主の反応性及び免疫化方法の３つの要因によって決まる。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、同じ意味を有し、区別なく使用される。また、本発明では、アミノ酸は概して、当該技術分野で既知の一文字及び三文字の略語で表される。例えば、アラニンは、Ａ又はＡｌａで表すことができる。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「被験体」は、脊椎動物等の動物を指す。被験体はヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯類又は霊長類等の哺乳動物であるのが好ましい。特に好ましくは、被験体はヒトである。この用語は、本明細書で「患者」と区別なく使用される。
【０１０１】
本発明の有益な効果
本願は、種々の亜型（例えば、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型）のインフルエンザウイルスに対する防御抗体を誘導し、種々の亜型のインフルエンザウイルスに対する防御を達成することが可能であり、したがって、インフルエンザウイルスの複数の亜型（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ又はそれ以上の亜型）の感染及び感染に関連する疾患（例えば、インフルエンザ）の予防及び／又は治療のためのインフルエンザウイルスの複数の亜型（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ又はそれ以上の亜型）に対する広域ワクチンとして使用することができる、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体を提供する。
【０１０２】
特に、本願で開示されるＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に由来する突然変異体は、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの複数の株（特に、異なる年代に流行しているＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの複数の株）に対する防御抗体を誘導し、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの複数の株に対する防御を達成することができるだけでなく、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスに対する防御抗体を誘導し、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスに対する防御を達成することもできる。
【０１０３】
したがって、本願は、複数の亜型（例えば、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及び／又はＨ１Ｎ１亜型）のインフルエンザウイルスに対する交差防御を与えることができる広域インフルエンザワクチンを提供するが、その免疫効果は理想的であり、インフルエンザウイルスの変異によりすぐに容易に不全に陥ることがなく、インフルエンザウイルスの頻繁な変異に起因する免疫効力の喪失及び不十分な免疫効果等の既存のインフルエンザワクチンの欠点が克服される。特に、本願の広域インフルエンザワクチンは、既存のインフルエンザワクチンを毎年変更し、毎年注射する必要があるという不利点を解決する。加えて、本願の広域インフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルスの複数の亜型の蔓延を効果的に防ぎ、インフルエンザウイルスに起因する経済的損失及び社会的パニックを抑えることができる。したがって、本願の広域インフルエンザワクチンは、既存のインフルエンザワクチンと比べて特に重要な利点を有する。
【０１０４】
本発明の実施形態を、図面及び実施例を参照して下記で詳細に説明するが、以下の図面及び実施例が本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を例示するためにのみ用いられることが当業者には理解される。本発明の様々な目的及び有利な態様が添付の図面及び以下の好ましい実施形態の詳細な説明から当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】実施例１で使用される天然ＨＡタンパク質（ＷＩ２００５−ＷＴ−ＨＡ）、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質及びＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質の配列突然変異及びＮ結合型グリコシル化を概略的に示す図である。
【図２】それぞれ実施例１で使用される天然ＨＡタンパク質（図２Ａ）、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質（図２Ｂ）、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質（図２Ｃ）及びＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質（図２Ｄ）によって形成される三量体の概略構造図を概略的に示す図である。ここで、図２Ａは、天然ＨＡタンパク質によって形成される三量体がヘッド領域及びステム領域の両方にＮ結合型グリコシル鎖を含有することを示し、図２Ｂは、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質によって形成される三量体がヘッド領域及びステム領域の両方にＮ結合型グリコシル鎖を含まないことを示し、図２Ｃは、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質によって形成される三量体がヘッド領域にＮ結合型グリコシル鎖を含まないが、ステム領域にＮ結合型グリコシル鎖を依然として含んでいることを示し、図２Ｄは、ＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質によって形成される三量体がステム領域にＮ結合型グリコシル鎖を含まないが、ヘッド領域にＮ結合型グリコシル鎖を依然として含んでいることを示す。
【図３】実施例１で作製された６つのタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。ここで、図３Ａは天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ３、ＨＡ−ｍｕｔ２及びＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示し、図３Ｂは天然ＨＡタンパク質、ＨＡｍｇタンパク質及びＨＡｕｇタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図４】天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１、ＨＡ−ｍｕｔ２、ＨＡ−ｍｕｔ３及びＰＢＳ（陰性対照として使用される）をそれぞれ免疫原として用いてマウスを免疫化することによって得られるマウス血清のインフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２亜型）（図４Ａ）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２亜型）（図４Ｂ）、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２（Ｈ３Ｎ２亜型）（図４Ｃ）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２亜型）（図４Ｄ）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９亜型）（図４Ｅ）及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１亜型）（図４Ｆ）に対する中和活性を示す図である。
【図５】天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１、ＨＡｍｇ、ＨＡｕｇ及びＰＢＳ（陰性対照として使用される）をそれぞれ免疫原として用いてマウスを免疫化することによって得られるマウス血清のインフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２亜型）（図５Ａ）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２亜型）（図５Ｂ）、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２（Ｈ３Ｎ２亜型）（図５Ｃ）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２亜型）（図５Ｄ）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９亜型）（図５Ｅ）及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１亜型）（図５Ｆ）に対する中和活性を示す図である。
【図６】以前に（at early ages）流行したＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２（Ｈ３Ｎ２）（図６Ａ及び図６Ｂ）及びＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）（図６Ｃ及び図６Ｄ）による感染後の天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質又はＰＢＳ（陰性対照）で免疫化したマウスの体重変化及び生存を示す図である。ここで、図６Ａ及び図６Ｃは、各群の実験マウスの体重変化を示し、図６Ｂ及び図６Ｄは、各群の実験マウスの生存率を示す。
【図７】以前に流行したＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２（Ｈ３Ｎ２）（図７Ａ及び図７Ｂ）及びＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）（図７Ｃ及び図７Ｄ）による感染後の天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡｍｇタンパク質、ＨＡｕｇタンパク質又はＰＢＳ（陰性対照）で免疫化したマウスの体重変化及び生存を示す図である。ここで、図７Ａ及び図７Ｃは、各群の実験マウスの体重変化を示し、図７Ｂ及び図７Ｄは、各群の実験マウスの生存率を示す。
【図８】非Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）（図８Ａ及び図８Ｂ）及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）（図８Ｃ及び図８Ｄ）による感染後の天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質又はＰＢＳ（陰性対照）で免疫化したマウスの体重変化及び生存を示す図である。ここで、図８Ａ及び図８Ｃは、各群の実験マウスの体重変化を示し、図８Ｂ及び図８Ｄは、各群の実験マウスの生存率を示す。
【図９】非Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）（図９Ａ及び図９Ｂ）及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）（図９Ｃ及び図９Ｄ）による感染後の天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡｍｇタンパク質、ＨＡｕｇタンパク質又はＰＢＳ（陰性対照）で免疫化したマウスの体重変化及び生存を示す図である。ここで、図９Ａ及び図９Ｃは、各群の実験マウスの体重変化を示し、図９Ｂ及び図９Ｄは、各群の実験マウスの生存率を示す。
【図１０】ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（左パネル）及びウエスタンブロット分析（右パネル）の結果を示す図である。レーンＭ：分子量マーカー；レーン１：Ｎｉ−ＮＴＡニッケルイオンクロマトグラフィーカラムによって精製していないサンプル；レーン２：Ｎｉ−ＮＴＡニッケルイオンクロマトグラフィーカラムに流した画分；レーン３：５０ｍＭイミダゾールで溶出させた画分；レーン４：５０ｍＭイミダゾールで溶出させた画分；レーン５：２５０ｍＭイミダゾールで溶出させた画分；矢印は、関心のタンパク質ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡの位置を示す。
【図１１】ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（左パネル）及びウエスタンブロット分析（右パネル）の結果を示す図である。レーンＭ：分子量マーカー；レーン１：Ｎｉ−ＮＴＡニッケルイオンクロマトグラフィーカラムによって精製していないサンプル；レーン２：Ｎｉ−ＮＴＡニッケルイオンクロマトグラフィーカラムに流した画分；レーン３：５０ｍＭイミダゾールで溶出させた画分；レーン４：２５０ｍＭイミダゾールで溶出させた画分；矢印は、関心のタンパク質ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡの位置を示す。
【図１２】天然ＨＡタンパク質ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及び脱グリコシル化タンパク質ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。レーンＭ：分子量マーカー；レーン１：精製されたＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ；レーン２：ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇ（ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡをエンドグリコシダーゼＦで３時間消化することによって得られた）。
【図１３】ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ及びＰＢＳ（陰性対照として使用される）をそれぞれ免疫原として用いてマウスを免疫化することによって得られるマウス血清のインフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｘｉａｍｅｎ／Ｎ７９４／２０１３（Ｈ３Ｎ２）及びＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に対する結合活性を評価するＥＬＩＳＡ分析の結果を示す図である。
【図１４】ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇ及びＰＢＳ（陰性対照として使用される）をそれぞれ免疫原として用いてマウスを免疫化することによって得られるマウス血清のインフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｘｉａｍｅｎ／Ｎ７９４／２０１３（Ｈ３Ｎ２）及びＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に対する結合活性を評価するＥＬＩＳＡ分析の結果を示す図である。
【図１５】Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）による感染後のＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ又はＰＢＳ（陰性対照として使用される）で免疫化した各群のマウス（３匹／群）の体重変化（左パネル）及び生存（右パネル）を示す図である。
【図１６】Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０５９／２０１３（Ｈ７Ｎ９）による感染後のＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ又はＰＢＳ（陰性対照として使用される）で免疫化した各群のマウス（３匹／群）の体重変化（左パネル）及び生存（右パネル）を示す図である。
【図１７】Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０５９／２０１３（Ｈ７Ｎ９）による感染後のＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇ又はＰＢＳ（陰性対照として使用される）で免疫化した各群のマウス（４匹／群）の体重変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
配列情報
本発明に関わる配列の情報を下記表１に提示する。
【０１０７】
表１：配列情報
【表１−１】
2021509254.tif 000002
【０１０８】
【表１−２】
2021509254.tif 000003
【０１０９】
【表１−３】
2021509254.tif 000004
【０１１０】
本発明を行うための具体的なモデル
ここで、本発明を説明することを意図するが、本発明を限定しない以下の実施例を参照して本発明を説明する。
【０１１１】
他に規定のない限り、本願で用いられる分子生物学の実験方法及び免疫測定法は、実質的にJ. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989及びFM Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995を参照することによって行った。制限酵素は、製品の製造業者が推奨する条件に従って使用した。特定の条件が実施例中に示されない場合、従来の条件又は製造業者が推奨する条件を用いた。使用する試薬又は機器が製造業者によって指定されない場合、全て市販される従来の製品とした。実施例が実例として本発明を説明し、特許請求される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが当業者には知られている。
【実施例】
【０１１２】
実施例１：Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質及びその突然変異体の作製
（Ａ）ＨＡタンパク質突然変異体の設計及び構造
インフルエンザウイルスの天然ＨＡタンパク質では、Ｎ結合型グリコシル化を受けるアミノ酸は通常、特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中のアスパラギン（Ｎ）であり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表す。本実施例では、天然ＨＡタンパク質の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中のアスパラギン（Ｎ）をアラニン（Ａ）へと突然変異させることによってＨＡタンパク質のＮ結合型グリコシル化部位を除去した。
【０１１３】
本実施例に使用した天然ＨＡタンパク質（ＷＩ２００５−ＷＴ−ＨＡ）は、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルス株Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５のＨＡタンパク質であった。この株のＨＡタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、配列番号１のアミノ酸１〜１０は、シグナルペプチドのものであり、アミノ酸５０４〜５５０は、膜貫通領域のものであり、１０個の潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位、すなわち２２位、３８位、６３位、１２６位、１３３位、１４４位、１６５位、２４６位、２８５位及び４８３位のアスパラギン（Ｎ）が存在していた。これらのＮ結合型グリコシル化部位の中でも、ＨＡタンパク質のＨＡ２サブユニットに位置する４８３位のアスパラギンを除いて、他の位置の全てのアスパラギンがＨＡタンパク質のＨＡ１サブユニットに位置していた。加えて、空間的構造の点では、２２位、３８位、２８５位及び４８３位のアスパラギンがＨＡタンパク質三量体のステム領域に位置する一方で、６３位、１２６位、１３３位、１４４位、１６５位及び２４６位のアスパラギンは、ＨＡタンパク質三量体のヘッド領域に位置していた。
【０１１４】
上記の構造情報に基づいて、本実施例では以下の天然ＨＡタンパク質及び３つのＨＡタンパク質突然変異体を設計した（図１）：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１のアミノ酸１〜１０及び５０４〜５５０が欠失しており、トロンビン切断部位、フォールディングモチーフ及び６×Ｈｉｓタグを含むペプチド断片（タンパク質の精製及び三量体形成を容易にするために配列番号１０及び１１の配列を有する）が配列番号１のＣ末端に導入されているという点で配列番号１とは異なる天然ＨＡタンパク質（ＷＩ２００５−ＷＴ−ＨＡ）。したがって、天然ＨＡタンパク質（ＷＩ２００５−ＷＴ−ＨＡ）から形成される三量体は、ヘッド領域及びステム領域の両方にＮ結合型グリコシル鎖を含んでいた（図２Ａ）。
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、上述の１０個のＮ結合型グリコシル化部位の各々のアスパラギンがアラニンに突然変異しているという点で天然ＨＡタンパク質（ＷＩ２００５−ＷＴ−ＨＡ；配列番号２）とは異なるＨＡ−ｍｕｔ１。したがって、ＨＡ−ｍｕｔ１によって形成される三量体は、ヘッド領域及びステム領域にＮ結合型グリコシル鎖を含まなかった（図２Ｂ）。
（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、ヘッド領域に（すなわち、配列番号１の６３位、１２６位、１３３位、１４４位、１６５位及び２４６位に）位置するアスパラギンの各々がアラニンに突然変異しているという点で天然ＨＡタンパク質（ＷＩ２００５−ＷＴ−ＨＡ；配列番号２）とは異なるＨＡ−ｍｕｔ２。したがって、ＨＡ−ｍｕｔ２によって形成される三量体は、ヘッド領域にＮ結合型グリコシル鎖を含まないが、ステム領域にＮ結合型グリコシル鎖を依然として含んでいた（図２Ｃ）。
（４）配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、ステム領域に（すなわち、配列番号１の２２位、３８位、２８５位及び４８３位に）位置するアスパラギンの各々がアラニンに突然変異しているという点で天然ＨＡタンパク質（ＷＩ２００５−ＷＴ−ＨＡ；配列番号２）とは異なるＨＡ−ｍｕｔ３。したがって、ＨＡ−ｍｕｔ３によって形成される三量体は、ステム領域にＮ結合型グリコシル鎖を含まないが、ヘッド領域にＮ結合型グリコシル鎖を依然として含んでいた（図２Ｄ）。
【０１１５】
加えて、タンパク質の分泌を容易にするために、シグナルペプチド（配列番号９）をコードするヌクレオチド配列を天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質及びＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端に導入した。発現されたシグナルペプチドをタンパク質分泌中に切除した。したがって、最終的に得られる天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質及びＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質は、シグナルペプチドを含まず、それらのアミノ酸配列を配列番号２〜５に示した。
【０１１６】
図１は、実施例１で使用される天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質及びＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質の配列突然変異及びＮ結合型グリコシル化を概略的に示す（注：シグナルペプチドは、タンパク質分泌中に切除される）。具体的には、天然ＨＡタンパク質は、配列番号１の２２位、３８位、６３位、１２６位、１３３位、１４４位、１６５位、２４６位、２８５位及び４８３位に対応する位置にアスパラギンを有するため、これらの位置にＮ結合型グリコシル鎖を有することができた。ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質は、配列番号１の２２位、３８位、６３位、１２６位、１３３位、１４４位、１６５位、２４６位、２８５位及び４８３位に対応する位置にアラニンを有し、したがってＮ結合型グリコシル鎖を有することはなかった。ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質は、配列番号１の２２位、３８位、２８５位及び４８３位に対応する位置にアスパラギンを有し、したがってこれらの位置にＮ結合型グリコシル鎖を有することができたが、配列番号１の６３位、１２６位、１３３位、１４４位、１６５位及び２４６位に対応する位置にアラニンを有し、したがってこれらの位置にＮ結合型グリコシル鎖を有することはなかった。ＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質は、配列番号１の６３位、１２６位、１３３位、１４４位、１６５位及び２４６位に対応する位置にアスパラギンを有し、したがってこれらの位置にＮ結合型グリコシル鎖を有することができたが、配列番号１の２２位、３８位、２８５位及び４８３位に対応する位置にアラニンを有し、したがってＮ結合型グリコシル鎖をこれらの位置に有することはなかった。加えて、タンパク質の分泌、精製及び三量体形成を容易にするために、シグナルペプチド（配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、タンパク質分泌中に切除される）を天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質及びＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質のＮ末端のそれぞれに導入し、トロンビン切断部位、フォールディングモチーフ及び６×Ｈｉｓタグを含むペプチド断片（配列番号１０及び１１に示されるアミノ酸配列を有する）をそれらのＣ末端のそれぞれに導入した。
【０１１７】
図２は、それぞれ実施例１で使用される天然ＨＡタンパク質（図２Ａ）、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質（図２Ｂ）、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質（図２Ｃ）及びＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質（図２Ｄ）によって形成される三量体の概略構造図を概略的に示す。ここで、図２Ａは、天然ＨＡタンパク質によって形成される三量体がヘッド領域及びステム領域の両方にＮ結合型グリコシル鎖を含んでいたことを示し、図２Ｂは、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質によって形成される三量体がヘッド領域及びステム領域の両方にＮ結合型グリコシル鎖を含まなかったことを示し、図２Ｃは、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質によって形成される三量体がヘッド領域にＮ結合型グリコシル鎖を含まなかったが、ステム領域にＮ結合型グリコシル鎖を依然として含んでいたことを示し、図２Ｄは、ＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質によって形成される三量体がステム領域にＮ結合型グリコシル鎖を含まなかったが、ヘッド領域にＮ結合型グリコシル鎖を依然として含んでいたことを示す。
【０１１８】
（Ｂ）トランスファープラスミドの作製
天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質及びＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質（それらの各々について、シグナルペプチド（配列番号９）をＮ末端に導入し、トロンビン切断部位、フォールディングモチーフ及び６×Ｈｉｓタグを含むペプチド断片（配列番号１０及び１１）をＣ末端に導入した）を別個にコードするＤＮＡ配列がShanghai Sangon Biotechnology Co., Ltdによって合成され、続いてこれらのＤＮＡ配列をバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＧＰ６７−Ｂ（BD Company、カタログ番号：５５４７５７）にそれぞれクローニングした。続いて、関心のＤＮＡ配列を有するトランスファーベクターを大腸菌ＤＨ５ａのコンピテント細胞に別個に形質転換し、増幅させた。プラスミドミニプレップキット（ＴＩＡＮｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ；TianGen Corporation、カタログ番号：ＤＰ１０３−０３）を用いて、関心のＤＮＡ配列を有するトランスファープラスミドを形質転換大腸菌から後に使用するために抽出した。
【０１１９】
（Ｃ）共トランスフェクション
トランスフェクションの１時間前に、１×１０６個の昆虫細胞（Ｓｆ９細胞、Invitrogen）を６ウェル培養プレートにプレーティングし、血清添加培地中で培養した。１μｇの工程（Ｂ）で作製したトランスファープラスミド、０．１μｇのバキュロウイルス線状ＤＮＡ（BD）、１μｌのリポソーム（Sigma）及び１００μｌの無血清細胞培養培地を混合し、室温で３０分間静置して、トランスフェクション混合物を得た。血清含有培地を各ウェルから除去し、トランスフェクション混合物を添加した。２７℃で６時間のインキュベーション後に、トランスフェクション混合物を各ウェルから除去し、２ｍｌのＣＣＭ３含有培地を各ウェルに添加して、細胞を培養し続けた。結果として、関心のＤＮＡ配列を有するトランスファープラスミド及びバキュロウイルス線状ＤＮＡが昆虫細胞にトランスフェクトされ、組み換えバキュロウイルスが生成した。
【０１２０】
（Ｄ）標的タンパク質の作製及び精製
得られた組み換えバキュロウイルスを継代して、２代目の組み換えバキュロウイルスを得た。２代目の組み換えバキュロウイルス１５ｍｌを１２００ｍｌのＳｆ９昆虫細胞に添加し、２７℃で４８時間培養した。細胞及び培養上清を回収し、１１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。遠心分離後に、組換えにより生成した標的タンパク質を含有する上清を回収した。
【０１２１】
Milliporeの限外濾過濃縮遠心管を用いて関心のタンパク質を含有する上清を３５ｍｌまで濃縮し、ｐＨ７．４に調整した後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を回収し、Ｎｉ−ＮＴＡニッケルイオンクロマトグラフィーカラム（ＮＩ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、GE、カタログ番号：１７−５３１８−０４）を用いて、上清中の関心のタンパク質を富化及び精製した。ここで、溶離液は、２５０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳとした。関心のタンパク質を含有する溶出液を１ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳ緩衝液中で透析し、後に使用するために４℃で保管した。これにより、精製された天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質及びＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質が得られた（Ｎ末端シグナルペプチドが分泌過程中に切除されたため、得られるタンパク質はフォールディングモチーフ及び６×Ｈｉｓタグを保持していたが、Ｎ末端シグナルペプチドを含まなかった）。
【０１２２】
（Ｅ）ＨＡｍｇ及びＨＡｕｇタンパク質の作製
加えて、Juine-Ruey Chen et al. (Proc Natl Acad Sci, USA. 2014 Feb 18; 111 (7): 2476-81)に記載の方法を参照することで、天然ＨＡタンパク質（ＷＩ２００５−ＷＴ−ＨＡ）を、エンドグリコシダーゼＨ及びエンドグリコシダーゼＦを用いる酵素処理に供し、Ｎ結合型グリコシル化部位に単一グリコシル基を有するＨＡタンパク質（以下、ＨＡｍｇと称する）及びＮ結合型グリコシル化部位にグリコシル基を実質的に有しないＨＡタンパク質（以下、ＨＡｕｇと称する）を作製した。
【０１２３】
酵素作用の制限及び幾つかのグリコシル化部位の接近不可能性のために、ＨＡｕｇが必然的に依然として少量のグリコシル基をＮ結合型グリコシル化部位に有していることに留意されたい。このことは、Juine-Ruey Chen et al.（同上）の表Ｓ１に提示されるデータによっても確認することができる。対照的に、全てのＮ結合型グリコシル化部位の各々のアスパラギンがアラニンに置き換えられているため、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質は、Ｎ結合型グリコシル基を全く有しなくなる。
【０１２４】
実施例２：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、実施例１で作製した６つのタンパク質（天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１、ＨＡ−ｍｕｔ２、ＨＡ−ｍｕｔ３、ＨＡｍｇ及びＨＡｕｇ）を分析した。使用した上層ゲルは、５％濃縮ゲル（以下のように調製した：８３０μｌの３０％アクリルアミド、６３０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、５０μｌの１０％ＳＤＳ、５０μｌの１０％過硫酸アンモニウム及び５μｌのＴＥＭＥＤを３．４ｍｌの水に添加した）であった。使用した下層ゲルは、１２％分離ゲル（以下のように調製した：４ｍｌの３０％アクリルアミド、２．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）、１００μｌの１０％ＳＤＳ、１００μｌの１０％過硫酸アンモニウム及び１０μｌのＴＥＭＥＤを３．３ｍｌの水に添加した）であった。使用した電気泳動条件は、電気泳動を１５０Ｖで２時間行うというものであった。電気泳動後に、ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー（Sigma）で染色した。実験結果を図３に示す。
【０１２５】
図３は、実施例１で作製した６つのタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図３Ａは天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ３、ＨＡ−ｍｕｔ２及びＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示し、図３Ｂは天然ＨＡタンパク質、ＨＡｍｇタンパク質及びＨＡｕｇタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図３の結果から、天然ＨＡタンパク質の分子量が７０ｋＤを超える一方で、ＨＡ−ｍｕｔ３、ＨＡ−ｍｕｔ２、ＨＡ−ｍｕｔ１、ＨＡｍｇ及びＨＡｕｇタンパク質の分子量が全て大幅に低下し、全て７０ｋＤ未満であり、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質が最も小さい分子量を有することが示される。
【０１２６】
実施例３：抗血清の中和活性の評価
（Ａ）免疫実験
６週齢のＳＰＦグレードの雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、厦門大学の実験動物センターによって提供され、体重はおよそ２０ｇであった。実施例１で作製した６つのタンパク質（天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１、ＨＡ−ｍｕｔ２、ＨＡ−ｍｕｔ３、ＨＡｍｇ及びＨＡｕｇ）、並びにＰＢＳ（陰性対照として使用される）を別個にアルミニウムアジュバントと１：１の体積比で混合し、マウスの免疫化に使用した。免疫化スケジュールは、以下の通りであった。各群６匹のマウスを使用した。免疫化方法は、筋肉内注射とした。免疫化用量は、マウス１匹当たり５μｇのタンパク質であった。注射量は、マウス１匹当たり１００μｌであった。免疫化を１４日間隔で２回行った。２回目の免疫化の１４日後に、血清を各マウスから採取した。採取した血清サンプルを５６℃で３０分間不活性化した後、後に使用するために−２０℃で保管した。
【０１２７】
（Ｂ）血清サンプルの中和価の評価
中和価は、血清サンプルが疾患を予防及び治療する可能性があるかを評価するための重要な指標である。本実験では、プラーク減少中和試験（plaque reduction neutralization test；ＰＲＮＴ）を用いて、採取した血清サンプルの中和抗体価を分析した。使用したインフルエンザウイルスは、異なる時点で異なる地域から単離され、異なる亜型（Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及びＨ１Ｎ１）を表すインフルエンザウイルスの代表的な株であり、特定のウイルス株は、以下の通りであった：Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２亜型）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２亜型）、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２（Ｈ３Ｎ２亜型）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２亜型）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９亜型）及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１亜型）。
【０１２８】
６×１０５個のＭＤＣＫ細胞を６ウェル細胞培養プレートに播種した。使用されるインフルエンザウイルスを、０．５μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫトリプシンを含有するＭＥＭ培地中で５０ＰＦＵ／５０μｌに希釈した。次いで、段階希釈した血清サンプルをインフルエンザウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、ＭＤＣＫ細胞を播種した６ウェル細胞培養プレートに添加し、３７℃で１時間、インキュベーションを継続した。インキュベーション後に、細胞培養液を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、０．５％アガロースを含有するＭＥＭ培地で細胞表面を覆い、細胞を５％ＣＯ２及び３７℃で２日間、恒温インキュベーター内に入れた。その後、細胞を２％クリスタルバイオレットで染色し、プラーク数を計数することによってインフルエンザウイルスの力価を決定した後、各血清サンプルの中和活性を算出した。結果を図４及び図５に示す。
【０１２９】
図４は、天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１、ＨＡ−ｍｕｔ２、ＨＡ−ｍｕｔ３及びＰＢＳ（陰性対照として使用される）をそれぞれ免疫原として用いてマウスを免疫化することによって得られるマウス血清のインフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２亜型）（図４Ａ）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２亜型）（図４Ｂ）、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２（Ｈ３Ｎ２亜型）（図４Ｃ）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２亜型）（図４Ｄ）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９亜型）（図４Ｅ）及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１亜型）（図４Ｆ）に対する中和活性を示す。
【０１３０】
図４Ａに示されるように、本実験に使用されるＨＡタンパク質が由来するインフルエンザウイルス株Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５について、天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１、ＨＡ−ｍｕｔ２又はＨＡ−ｍｕｔ３で免疫化したマウスから得られたマウス血清は全て強い中和活性を有し、中でも天然ＨＡタンパク質及びＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清が最も高い中和価を有し、ＨＡ−ｍｕｔ３で免疫化したマウスから得られた血清が最も低い中和価を有していた。
【０１３１】
図４Ｂに示されるように、本実験に使用されるＨＡタンパク質と近い進化的関係を有するＨ３Ｎ２亜型ウイルス株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１について、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清が最も高い中和価を有し（天然ＨＡタンパク質で免疫化したマウスから得られた血清よりも更に高い）、ＨＡ−ｍｕｔ３で免疫化したマウスから得られた血清が最も低い中和価を有していた。
【０１３２】
図４Ｃに示されるように、本実験に使用されるＨＡタンパク質とより遠い進化的関係を有するＨ３Ｎ２亜型ウイルス株Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２について、ＨＡ−ｍｕｔ３で免疫化したマウスから得られた血清が最も高い中和価を有し、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清が２番目に高い中和価を有し（どちらも天然ＨＡタンパク質で免疫化したマウスから得られた血清より高かった）、ＨＡ−ｍｕｔ２で免疫化したマウスから得られた血清が最も低い中和価を有していた。
【０１３３】
図４Ｄに示されるように、本実験に使用されるＨＡタンパク質と最も遠い進化的関係を有するＨ３Ｎ２亜型ウイルス株Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８について、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清が最も高い中和価を有し、ＨＡ−ｍｕｔ３で免疫化したマウスから得られた血清が２番目に高い中和価を有し、天然ＨＡタンパク質又はＨＡ−ｍｕｔ２で免疫化したマウスから得られた血清は、実質的に中和活性を有しなかった（陰性対照との有意差なし）。
【０１３４】
図４Ｅ及び図４Ｆに示されるように、本実験に使用されるＨＡタンパク質とは異なる亜型に属するウイルス株Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９亜型）及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１亜型）について、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清のみが中和活性を有し、他のタンパク質で免疫化したマウスから得られた血清は、実質的に中和活性を有しなかった（陰性対照との有意差なし）。
【０１３５】
図４の結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清が最も広域の中和活性を有し、Ｈ３Ｎ２亜型の複数のウイルス株を（進化的関係の距離に関わらず）効果的に中和することができるだけでなく、他の亜型の株（例えば、Ｈ７Ｎ９及びＨ１Ｎ１亜型の株））も中和することができることが示される。対照的に、天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２及びＨＡ−ｍｕｔ３で免疫化したマウスから得られた血清は、Ｈ３Ｎ２亜型の幾つかの株に対してのみ中和活性を有し、他の亜型の株に対して中和活性を有しなかった。このため、ＨＡ−ｍｕｔ１がｉｎ  ｖｉｖｏで広域中和活性を有する防御抗体を誘導するための広域ワクチンとして特に適切である。
【０１３６】
図５は、天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１、ＨＡｍｇ、ＨＡｕｇ及びＰＢＳ（陰性対照として使用される）をそれぞれ免疫原として用いてマウスを免疫化することによって得られるマウス血清のインフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２亜型）（図５Ａ）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２亜型）（図５Ｂ）、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２（Ｈ３Ｎ２亜型）（図５Ｃ）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２亜型）（図５Ｄ）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９亜型）（図５Ｅ）及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１亜型）（図５Ｆ）に対する中和活性を示す。
【０１３７】
図５Ａに示されるように、本実験に使用されるＨＡタンパク質が由来するインフルエンザウイルス株Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５について、天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１、ＨＡｍｇ又はＨＡｕｇで免疫化したマウスから得られた血清は、強い中和活性を有し、効力が同等であった。
【０１３８】
図５Ｂに示されるように、本実験に使用されるＨＡタンパク質と近い進化的関係を有するＨ３Ｎ２亜型ウイルス株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１について、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清が最も高い中和価を有し、天然ＨＡタンパク質で免疫化したマウスから得られた血清が最も低い中和価を有していた。
【０１３９】
図５Ｃに示されるように、本実験に使用されるＨＡタンパク質とより遠い進化的関係を有するＨ３Ｎ２亜型ウイルス株Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２について、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清が最も高い中和価を有し、他のタンパク質で免疫化したマウスから得られた血清は、より低く、互いに同等の中和価を有していた。
【０１４０】
図５Ｄに示されるように、本実験に使用されるＨＡタンパク質と最も遠い進化的関係を有するＨ３Ｎ２亜型ウイルス株Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８について、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清が最も高い中和価を有し、ＨＡｍｇ又はＨＡｕｇで免疫化したマウスから得られた血清が２番目に高い中和価を有していたが（これら２つは同等であった）、天然ＨＡタンパク質を用いてマウスから得られた血清は、実質的に中和活性を有しなかった（陰性対照との有意差なし）。
【０１４１】
図５Ｅに示されるように、本実験に使用されるＨＡタンパク質とは異なる亜型に属するウイルス株Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９亜型）について、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清が最も高い中和価を有し、ＨＡｍｇ又はＨＡｕｇで免疫化したマウスから得られた血清が２番目に高い中和価を有していたが（これら２つは同等であった）、天然ＨＡタンパク質を用いてマウスから得られた血清は、実質的に中和活性を有しなかった（陰性対照との有意差なし）。
【０１４２】
図５Ｆに示されるように、本実験に使用されるＨＡタンパク質とは異なる亜型に属するウイルス株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１亜型）について、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清のみが中和活性を有し、他のタンパク質で免疫化したマウスから得られた血清は、実質的に中和活性を有しなかった（陰性対照との有意差なし）。
【０１４３】
図５の結果から、天然ＨＡタンパク質で免疫化したマウスから得られた血清がＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスに対してのみ中和活性を有し、ＨＡｍｇ及びＨＡｕｇで免疫化したマウスから得られた血清が、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスを中和することができるだけでなく、複数のＨＡ亜型にまたがって弱い中和活性を示し（Ｈ７Ｎ９亜型を中和することが可能であるが、Ｈ１Ｎ１亜型を中和することは可能でない）、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスから得られた血清が最も広域の中和活性及び最も高い中和価を有し、Ｈ３Ｎ２亜型の複数のウイルス株を（進化的関係の距離に関わらず）効果的に中和することができるだけでなく、複数のＨＡ亜型にまたがって強い中和活性を有する（例えば、Ｈ７Ｎ９及びＨ１Ｎ１亜型の株を中和することが可能である）ことが示される。ＨＡ−ｍｕｔ１がｉｎ  ｖｉｖｏで広域中和活性を有する防御抗体を誘導するための広域ワクチンとして特に適切であることが分かる。
【０１４４】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｖｏ防御活性の評価
実施例３におけるＰＲＮＴ実験から、実施例１で作製した６つのタンパク質によって誘導される抗血清のＨ３Ｎ２亜型、Ｈ７Ｎ９亜型及びＨ１Ｎ１亜型ウイルス株に対する中和価が異なり、中でもＨＡ−ｍｕｔ１によって誘導される抗血清が最も広域の中和活性を有することが確認された。動物におけるインフルエンザウイルスに対する免疫防御の誘導におけるこれら６つのタンパク質の効果を更に検証するために、本発明者らは、インフルエンザウイルスＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２（Ｈ３Ｎ２亜型）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／０２／１９６８（Ｈ３Ｎ２亜型）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９亜型）及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１亜型）を感染させたマウス動物モデルに基づいて、これらの６つのタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ抗ウイルス効果をバイオセーフティー研究所において評価した。具体的なスキームは、以下の通りである。
【０１４５】
材料及び方法
動物：Ｂａｌｂ／Ｃマウス、ＳＰＦグレード、６週齢〜８週齢、雌性、体重約２０ｇ。
ワクチン：天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質、ＨＡｍｇタンパク質、ＨＡｕｇタンパク質及びＰＢＳ（陰性対照として使用される）。
免疫化スキーム：天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質、ＨＡｍｇタンパク質、ＨＡｕｇタンパク質及びＰＢＳ陰性対照を別個にアルミニウムアジュバントと１：１の体積比で混合し、マウスの免疫化に使用した。各群６匹のマウスを使用し、筋肉内注射によって免疫化した。免疫化用量は、マウス１匹当たり５μｇのタンパク質であり、注射量は、マウス１匹当たり１００μｌであった。免疫化を２回行い、２回の免疫化の間に１４日間の間隔を開けた。２回目の免疫化の１４日後に、マウスをウイルスでチャレンジした。以下のインフルエンザウイルス株を使用した：
Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのマウス適応株：Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２；
Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのマウス適応株：Ａ／Ａｉｃｈｉ／０２／１９６８；
Ｈ７Ｎ９亜型インフルエンザウイルスのマウス適応株：Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３；
Ｈ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスのマウス適応株：Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９。
麻酔薬：イソフルラン（Isoflorane）。
動物のグループ分け：マウスを前日にバイオセーフティー研究所に送り、１つのケージに６匹のマウスでグループ分けし、各マウスの体重を記録した。
ウイルス感染：各ウイルスのチャレンジ用量は、５０％致死量（ＬＤ５０）の２５倍とし、ウイルス接種量は、マウス１匹当たり５０μｌとした。接種前に、マウスにイソフルランで麻酔をかけ、続いてマウスに鼻腔からウイルスを接種した。
観察：ウイルス感染の１日後〜１４日後にマウスの体重変化及び生存を毎日記録した。実験結果を図６〜図９に示す。
【０１４６】
図６は、以前に流行したＨ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２（Ｈ３Ｎ２）（図６Ａ及び図６Ｂ）及びＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）（図６Ｃ及び図６Ｄ）による感染後の天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質又はＰＢＳ（陰性対照）で免疫化したマウスの体重変化及び生存を示す。ここで、図６Ａ及び図６Ｃは、各群の実験マウスの体重変化を示し、図６Ｂ及び図６Ｄは、各群の実験マウスの生存率を示す。図６Ａ及び図６Ｂの結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１又はＨＡ−ｍｕｔ３で免疫化したマウスは、致死量のウイルスＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２を感染させた後に、７日目から体重を回復し始め、マウスの生存率は、実験の終了時に１００％であったが、天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２又はＰＢＳで免疫化したマウスは、全て体重が減少し続け、全て実験の終了前に死亡したことが示される。この結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１及びＨＡ−ｍｕｔ３が完全な防御を有し、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２に対するワクチンとして使用することができることが示される。図６Ｃ及び図６Ｄの結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８を感染させた後、それらの体重が４日目から回復し始め、マウスの生存率は、実験の終了時に１００％であり、ＨＡ−ｍｕｔ３は、致死量のウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８を感染させたマウスに対して部分的な防御を有し、マウスの生存率は、実験の終了時に３３．３％であったが、天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２又はＰＢＳで免疫化したマウスは、全て体重が減少し続け、全て実験の終了前に死亡したことが示される。この結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１が完全な防御を有し、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８に対するワクチンとして使用することができることが示される。
【０１４７】
図７は、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２（Ｈ３Ｎ２）（図７Ａ及び図７Ｂ）及びＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）（図７Ｃ及び図７Ｄ）による感染後の天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡｍｇタンパク質、ＨＡｕｇタンパク質又はＰＢＳ（陰性対照）で免疫化したマウスの体重変化及び生存を示す。ここで、図７Ａ及び図７Ｃは、各群の実験マウスの体重変化を示し、図７Ｂ及び図７Ｄは、各群の実験マウスの生存率を示す。図７Ａ及び図７Ｂの結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡｍｇタンパク質又はＨＡｕｇタンパク質で免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２を感染させた後、それらの体重が７日目から回復し始め（ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスが最良の体重回復効果を示した）、マウスの生存率は、実験の終了時に１００％であったが、天然ＨＡタンパク質又はＰＢＳで免疫化したマウスは、全て体重が減少し続け、全て実験の終了前に死亡したことが示される。この結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡｍｇタンパク質及びＨＡｕｇタンパク質が完全な防御を有し、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２に対するワクチンとして使用することができることが示される。図７Ｃ及び図７Ｄの結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１、ＨＡｍｇ又はＨＡｕｇで免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８を感染させた後、それらの体重が４日目又は５日目から回復し始め（ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスが最良の体重回復効果を示した）、マウスの生存率は、実験の終了時に１００％であったが、天然ＨＡタンパク質又はＰＢＳで免疫化したマウスは、全て体重が減少し続け、全て実験の終了前に死亡したことが示される。この結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡｍｇタンパク質及びＨＡｕｇタンパク質が完全な防御を有し、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８に対するワクチンとして使用することができることが示される。
【０１４８】
図８は、非Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）（図８Ａ及び図８Ｂ）及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）（図８Ｃ及び図８Ｄ）による感染後の天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２タンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ３タンパク質又はＰＢＳ（陰性対照）で免疫化したマウスの体重変化及び生存を示す。ここで、図８Ａ及び図８Ｃは、各群の実験マウスの体重変化を示し、図８Ｂ及び図８Ｄは、各群の実験マウスの生存率を示す。図８Ａ及び図８Ｂの結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）を感染させた後、それらの体重が６日目から回復し始め、マウスの生存率は、実験の終了時に１００％であったが、天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２、ＨＡ−ｍｕｔ３又はＰＢＳで免疫化したマウスは、全て体重が減少し続け、全て実験の終了前に死亡したことが示される。この結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１が完全な防御を有し、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３に対するワクチンとして使用することができることが示される。図８Ｃ及び図８Ｄの結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）を感染させた後、それらの体重は、８日目から安定したままであり、それ以上減少せず、マウスの生存率は、実験の終了時に６６．７％であったが、天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ２、ＨＡ−ｍｕｔ３又はＰＢＳで免疫化したマウスは、全て体重が減少し続け、全て実験の終了前に死亡したことが示される。この結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１がインフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）に対して強いｉｎ  ｖｉｖｏ防御効果を有することが示される。
【０１４９】
図９は、非Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）（図９Ａ及び図９Ｂ）及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）（図９Ｃ及び図９Ｄ）による感染後の天然ＨＡタンパク質、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質、ＨＡｍｇタンパク質、ＨＡｕｇタンパク質又はＰＢＳ（陰性対照）で免疫化したマウスの体重変化及び生存を示す。ここで、図９Ａ及び図９Ｃは、各群の実験マウスの体重変化を示し、図９Ｂ及び図９Ｄは、各群の実験マウスの生存率を示す。図９Ａ及び図９Ｂの結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質又はＨＡｕｇタンパク質で免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）を感染させた後、それらの体重が６日目又は７日目から回復し始め（ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスが最良の体重回復効果を示した）、マウスの生存率は、実験の終了時に１００％であったが、天然ＨＡタンパク質、ＨＡｍｇタンパク質又はＰＢＳで免疫化したマウスは、全て体重が減少し続け、全て実験の終了前に死亡したことが示される。この結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質及びＨＡｕｇタンパク質が完全な防御を有し、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に対するワクチンとして使用することができることが示される。図９Ｃ及び図９Ｄの結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１で免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）を感染させた後、それらの体重は、８日目から安定したままであり、それ以上減少せず、マウスの生存率は、実験の終了時に６６．７％であったが、天然ＨＡタンパク質、ＨＡｍｇ、ＨＡｕｇ又はＰＢＳで免疫化したマウスは、全て体重が減少し続け、全て実験の終了前に死亡したことが示される。この結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１がインフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）に対して強いｉｎ  ｖｉｖｏ防御効果を有することが示される。
【０１５０】
上記の実験結果から、ＨＡ−ｍｕｔ１タンパク質がワクチンとしてＨ３Ｎ２亜型（進化的関係の距離に関わらず）、Ｈ７Ｎ９亜型及びＨ１Ｎ１亜型のインフルエンザウイルスの感染、並びにそれによって引き起こされる疾患を効果的に予防することができ、したがってインフルエンザウイルスの複数の亜型に対する効果的な広域ワクチンとして使用することができることが示される。
【０１５１】
実施例５：Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質及びその突然変異体の作製及び分析
本実施例では、天然ＨＡタンパク質の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）中のアスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）へと突然変異させることによってＨＡタンパク質のＮ結合型グリコシル化部位を除去した。
【０１５２】
本実施例に使用した天然ＨＡタンパク質（ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ）は、Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルス株Ａ／ＨＯＮＧ＿ＫＯＮＧ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）のＨＡタンパク質であった。この株のＨＡタンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、配列番号６のアミノ酸１〜２５は、シグナルペプチドのものであり、アミノ酸５１８〜５６５は、膜貫通領域のものであり、１１個の潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位、すなわち３７位、５３位、６０位、７８位、１３７位、１４１位、１４８位、１８０位、２６１位、３００位及び４９８位のアスパラギン（Ｎ）を有していた。
【０１５３】
上記の構造情報に基づいて、本実施例では以下の天然ＨＡタンパク質ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及びその突然変異体ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡを設計した：
（１）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号６のアミノ酸１〜２５及び５１８〜５６５が欠失しており、トロンビン切断部位、フォールディングモチーフ及び６×Ｈｉｓタグを含むペプチド断片（タンパク質の精製及び三量体形成を容易にするために配列番号１０及び１１の配列を有する）が配列番号６のＣ末端に導入されているという点で配列番号６とは異なる天然ＨＡタンパク質（ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ）。したがって、天然ＨＡタンパク質（ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ）によって形成される三量体は、ヘッド領域及びステム領域の両方にＮ結合型グリコシル鎖を含んでいた。
（２）配列番号８に示されるアミノ酸配列を有し、上述の１１個のＮ結合型グリコシル化部位の各々のアスパラギン（Ｎ）がグルタミン（Ｑ）に突然変異しているという点で天然ＨＡタンパク質（ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ；配列番号７）とは異なる突然変異体ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ。したがって、突然変異体ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡによって形成される三量体は、ヘッド領域及びステム領域の両方にＮ結合型グリコシル鎖を含まなかった。
【０１５４】
加えて、タンパク質の分泌を容易にするために、シグナルペプチド（配列番号９）をコードするヌクレオシド配列を、天然ＨＡタンパク質ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及び突然変異体タンパク質ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡをコードするヌクレオチド配列の５’末端に導入した。発現されたシグナルペプチドは、タンパク質分泌中に切除される。したがって、最終的に得られる天然ＨＡタンパク質ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡも、その突然変異体ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡもシグナルペプチドを含まず、それらのアミノ酸配列を配列番号７及び８に示した。
【０１５５】
天然タンパク質ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及び突然変異体タンパク質ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ（それらの各々について、シグナルペプチド（配列番号９）をＮ末端に導入し、トロンビン切断部位、フォールディングモチーフ及び６×Ｈｉｓタグを含むペプチド断片（配列番号１０及び１１）をＣ末端に導入した）を別個にコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＧＰ６７−Ｂ（BD Company、カタログ番号：５５４７５７）にそれぞれクローニングした。続いて、関心のＤＮＡ配列を有するトランスファーベクターを大腸菌ＤＨ５ａのコンピテント細胞に形質転換し、増幅させた。プラスミドミニプレップキット（ＴＩＡＮｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ；TianGen Corporation、カタログ番号：ＤＰ１０３−０３）を用いて、関心のＤＮＡ配列を有するトランスファープラスミドを形質転換大腸菌から後に使用するために抽出した。
【０１５６】
続いて、実施例１に記載のように、関心のＤＮＡ配列を有する組み換えバキュロウイルスを、上記のように作製したトランスファープラスミドを用いて構築し、Ｓｆ９昆虫細胞中で培養した。培養後に、細胞及び培養上清を回収し、１１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。遠心分離後に、組換えにより生成した標的タンパク質を含有する上清を回収した。次いで、実施例１に記載のように、上清中の関心のタンパク質、すなわちＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及びＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ（Ｎ末端シグナルペプチドが分泌過程中に切除されたため、得られるタンパク質はフォールディングモチーフ及び６×Ｈｉｓタグを保持していたが、Ｎ末端シグナルペプチドを含まなかった）を、イミダゾール（５０ｍＭ又は２５０ｍＭ）を含有するＰＢＳを溶離液として用いるＮｉ−ＮＴＡニッケルイオンクロマトグラフィーカラム（ＮＩ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、GE、カタログ番号：１７−５３１８−０４）によって富化及び精製した。
【０１５７】
加えて、Juine-Ruey Chen et al. (Proc Natl Acad Sci, USA. 2014 Feb 18; 111 (7): 2476-81)に記載の方法を参照することで、上記のように得られた天然ＨＡタンパク質（ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ）を、エンドグリコシダーゼＦを用いることによる酵素処理に供し、全てのＮ結合型グリコシル化部位にグリコシル基を実質的に有しない脱グリコシル化ＨＡタンパク質（以下、ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇと称する）を作製した。
【０１５８】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロット（使用した抗体は、ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ６＊Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Proteintech、カタログ番号：ＨＲＰ−６６００５であった）を用いて、上記で作製した３つのタンパク質（ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ及びＨＫ２０１４−ＨＡｕｇ）を分析した。実験結果を図１０〜図１２に示す。
【０１５９】
図１０は、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（左パネル）及びウエスタンブロット分析（右パネル）の結果を示す。レーンＭ：分子量マーカー；レーン１：Ｎｉ−ＮＴＡニッケルイオンクロマトグラフィーカラムによって精製していないサンプル；レーン２：Ｎｉ−ＮＴＡニッケルイオンクロマトグラフィーカラムに流した画分；レーン３：５０ｍＭイミダゾールで溶出させた画分；レーン４：５０ｍＭイミダゾールで溶出させた画分；レーン５：２５０ｍＭイミダゾールで溶出させた画分；矢印は、関心のタンパク質ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡの位置を示す。
【０１６０】
図１１は、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（左パネル）及びウエスタンブロット分析（右パネル）の結果を示す。レーンＭ：分子量マーカー；レーン１：Ｎｉ−ＮＴＡニッケルイオンクロマトグラフィーカラムによって精製していないサンプル；レーン２：Ｎｉ−ＮＴＡニッケルイオンクロマトグラフィーカラムに流した画分；レーン３：５０ｍＭイミダゾールで溶出させた画分；レーン４：２５０ｍＭイミダゾールで溶出させた画分；矢印は、関心のタンパク質ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡの位置を示す。
【０１６１】
図１０及び図１１の結果から、タンパク質ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及びＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡが主に２５０ｍＭイミダゾールで溶出した各分中に含まれ、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡの分子量が７０ＫＤを超え、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡの分子量が或る程度減少したことが示される。これらの結果から、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ中のグリコシル化修飾が効果的に除去されたことが示される。
【０１６２】
図１２は、天然ＨＡタンパク質ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及び脱グリコシル化タンパク質ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーンＭ：分子量マーカー；レーン１：精製されたＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ；レーン２：ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇ（ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡをエンドグリコシダーゼＦで３時間消化することによって得られた）。
【０１６３】
図１２の結果から、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡの分子量が７０ＫＤを超え、ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇの分子量が或る程度減少したことが示される。これらの結果から、ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇ中のグリコシル化修飾が効果的に除去されたことが示される。
【０１６４】
実施例６：Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質及びその突然変異体の免疫原性の評価
実施例５で作製したタンパク質ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ及びＨＫ２０１４−ＨＡｕｇを別個にフロイントアジュバントと混合して免疫原を調製し、これを続いて６週齢〜８週齢のＢａｌｂ／Ｃ雌性マウス（体重約２０ｇ）の免疫化に使用した。免疫化手順は、以下の通りであった：各免疫化について１４日間の間隔を開けた３回の皮下免疫化。３回目の免疫化の１４日後に、マウス血清を採取し、採取した血清サンプルを５６℃で３０分間不活性化した後、後に使用するために−２０℃で保管した。
【０１６５】
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、上記で採取したマウス血清サンプルが３つのインフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｘｉａｍｅｎ／Ｎ７９４／２０１３（Ｈ３Ｎ２）及びＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に対して特異的結合活性を有するかを評価した。簡潔に述べると、Ｅｌｉｓａプレートを１００μｌの異なるタイプのインフルエンザウイルス（１２８ＨＡ）でコーティングした後、勾配希釈した（gradient-diluted）マウス血清をウイルスコーティングプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、５０００倍希釈したＧＡＭ−ＨＲＰ（厦門大学の国立工学センターによって提供される）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、プレートを洗浄し、発色液Ａ＆Ｂ（Beijing Wantai Companyによって提供される）を添加し、１５分間発色させた後、停止液で発色反応を停止させた。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を読み取り、ウイルスに対するマウス血清の特異的結合活性を算出した。ＥＬＩＳＡの結果を図１３及び図１４に示す。
【０１６６】
図１３は、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ及びＰＢＳ（陰性対照として使用される）をそれぞれ免疫原として用いてマウスを免疫化することによって得られるマウス血清のインフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｘｉａｍｅｎ／Ｎ７９４／２０１３（Ｈ３Ｎ２）及びＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に対する結合活性を評価するＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。
【０１６７】
図１３の結果から、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及びＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡで免疫化したマウスから得られたマウス血清が全て、３つのインフルエンザウイルス（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｘｉａｍｅｎ／Ｎ７９４／２０１３（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９））に対して同等のレベルの反応力価を示したことが示される。この結果から、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及びＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡがどちらも良好な免疫原性を有し、マウスにおいて正常な免疫応答を誘発し、身体による特異抗体の産生を誘導することができ、これらの特異抗体が様々なインフルエンザウイルスを認識し、結合することができることが示される。
【０１６８】
図１４は、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇ及びＰＢＳ（陰性対照として使用される）をそれぞれ免疫原として用いてマウスを免疫化することによって得られるマウス血清のインフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｘｉａｍｅｎ／Ｎ７９４／２０１３（Ｈ３Ｎ２）及びＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に対する結合活性を評価するＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。
【０１６９】
図１４の結果から、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及びＨＫ２０１４−ＨＡｕｇで免疫化したマウスから得られたマウス血清が全て、３つのインフルエンザウイルス（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｘｉａｍｅｎ／Ｎ７９４／２０１３（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９））に対して同等のレベルの反応力価を示したことが示される。この結果から、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及びＨＫ２０１４−ＨＡｕｇがどちらも良好な免疫原性を有し、マウスにおいて正常な免疫応答を誘発し、身体による特異抗体の産生を誘導することができ、これらの特異抗体が様々なインフルエンザウイルスを認識し、結合することができることが示される。
【０１７０】
実施例７：Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスＨＡタンパク質及びその突然変異体の免疫防御特性の評価
動物におけるインフルエンザウイルスに対する実施例５で作製したタンパク質の免疫防御効果を更に検証するために、以下の実験を行った。
【０１７１】
実施例５で作製したタンパク質ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ及びＨＫ２０１４−ＨＡｕｇをフロイントアジュバントと混合して免疫原を調製し、これを続いて６週齢〜８週齢のＢａｌｂ／Ｃ雌性マウス（体重約２０ｇ）の免疫化に使用した。免疫化手順は、以下の通りであった：各免疫化について１４日間の間隔を開けた３回の皮下免疫化。３回目の免疫化の１４日後に、各群のマウスをインフルエンザウイルスでチャレンジした。使用したインフルエンザウイルス株は、免疫原の流行年から遠く離れた時点で流行したＨ３Ｎ２ウイルス株Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）及び近年流行したＨ７Ｎ９ウイルス株Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０５９／２０１３（Ｈ７Ｎ９）であり、どちらも致死性株であった。チャレンジ後に、各群のマウスの体重及び生存率を観察及び記録し、致死性ウイルスの感染に対するマウスの防御における作製したタンパク質の効力を評価した。実験結果を図１５〜図１７に示す。
【０１７２】
図１５は、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）による感染後のＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ又はＰＢＳ（陰性対照として使用される）で免疫化した各群のマウス（３匹／群）の体重変化（左パネル）及び生存（右パネル）を示す。図１５の実験結果から、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡで免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）を感染させた後、１匹のマウスが５日目に死亡し、残りのマウスの体重が６日目に回復し始め、マウスの生存率は、実験の終了時に６６％であり、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡで免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）を感染させた後、全てのマウスの体重が５日目に回復し始め、マウスの生存率は、実験の終了時に１００％であった一方で、陰性対照群の全てのマウスがウイルスによる感染後８日目に死亡したことが示される。この結果から、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡと比較して、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡがウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）に対してより良好な防御効果を有することが示される。
【０１７３】
図１６は、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０５９／２０１３（Ｈ７Ｎ９）による感染後のＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡ又はＰＢＳ（陰性対照として使用される）で免疫化した各群のマウス（３匹／群）の体重変化（左パネル）及び生存（右パネル）を示す。図１６の実験結果から、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡで免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０５９／２０１３（Ｈ７Ｎ９）を感染させた後、全てのマウスの体重が減少し続け、チャレンジ後９日目のマウスの生存率が０％であり、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡで免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０５９／２０１３（Ｈ７Ｎ９）を感染させた後、１匹のマウスが８日目に体重を回復し始め、マウスの生存率が実験の終了時に３３％であったことが示される。この結果から、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡがインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０５９／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に対して防御効果を有さず、対照的に、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡがウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０５９／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に対して或る特定の防御効果（複数の亜型にまたがる広域防御）を有することが示される。
【０１７４】
図１７は、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０５９／２０１３（Ｈ７Ｎ９）による感染後のＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇ又はＰＢＳ（陰性対照として使用される）で免疫化した各群のマウス（４匹／群）の体重変化を示す。図１７の実験結果から、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ、ＨＫ２０１４−ＨＡｕｇ又はＰＢＳで免疫化したマウスに致死量のウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０５９／２０１３（Ｈ７Ｎ９）を感染させた後、全てのマウスの体重が減少し続け、マウスの生存率がチャレンジ後９日目に全て０％であったことが示される。この結果から、ＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡもＨＫ２０１４−ＨＡｕｇもウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０５９／２０１３（Ｈ７Ｎ９）に対する防御効果を有しないことが示される。
【０１７５】
上記の結果から、ＨＫ２０１４−ＤＧ−ＨＡがインフルエンザワクチンとしてＨＫ２０１４−ＷＴ−ＨＡ及びＨＫ２０１４−ＨＡｕｇよりも適切であり、Ｈ３Ｎ２亜型（進化的関係の距離に関わらず）及びＨ７Ｎ９亜型のインフルエンザウイルスの感染に抵抗することができ、複数の亜型にまたがる広域防御及びより良好な防御を示すことが分かる。
【０１７６】
本発明の特定の実施形態を詳細に説明したが、開示した全ての教示に従い、細部に様々な修正及び変更を加えることができ、これらの変更が全て本発明の保護範囲内であることが当業者には理解される。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物によって与えられる。
【図１】
2021509254.tif 000005
【図２】
2021509254.tif 000006
【図３】
2021509254.tif 000007
【図４】
2021509254.tif 000008
【図５】
2021509254.tif 000009
【図６】
2021509254.tif 000010
【図７】
2021509254.tif 000011
【図８】
2021509254.tif 000012
【図９】
2021509254.tif 000013
【図１０】
2021509254.tif 000014
【図１１】
2021509254.tif 000015
【図１２】
2021509254.tif 000016
【図１３】
2021509254.tif 000017
【図１４】
2021509254.tif 000018
【図１５】
2021509254.tif 000019
【図１６】
2021509254.tif 000020
【図１７】
2021509254.tif 000021
【配列表】
2021509254000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月18日(2020.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体であって、該突然変異体がＮ結合型グリコシル化部位を含まず、
該突然変異体が前記Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を含まないという点で異なり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表す、突然変異体。
【請求項２】
請求項１に記載の突然変異体であって、該突然変異体が前記Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）が独立して以下のもの：
（１）Ｎ残基が欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基に置き換えられる；
（２）（Ｓ又はＴ）残基が欠失するか、又は１つ以上の他のアミノ酸残基に置き換えられる；
（３）Ｘ残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる；
（４）１つ以上のアミノ酸残基がＮ残基とＸ残基との間に付加される；及び、
（５）１つ以上のアミノ酸残基がＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加される；及び
（６）（１）〜（５）の任意の組合せ
からなる群から選択される１つの突然変異を有するという点で異なり、
ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表し、したがって、該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を有さない、突然変異体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の突然変異体であって、該突然変異体が前記Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）が独立して以下のもの：
（１）Ｎ残基が欠失するか、又は別のアミノ酸残基に置き換えられる；
（２）（Ｓ又はＴ）残基が欠失するか、又は別のアミノ酸残基に置き換えられる；
（３）Ｘ残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる；
（４）非Ｎアミノ酸残基がＮ残基とＸ残基との間に付加される；及び、
（５）非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基がＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加される；及び、
（６）（１）〜（５）の任意の組合せ；
からなる群から選択される突然変異を有するという点で異なるか、又は
該突然変異体が前記Ｈ３Ｎ２亜型インフルエンザウイルスの野生型ヘマグルチニンタンパク質とは、少なくとも該野生型ヘマグルチニンタンパク質中の各々の特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）が独立して以下のもの：
（１）Ｎ残基が欠失するか、又は保存的に置き換えられる；
（２）（Ｓ又はＴ）残基が欠失するか、又は保存的に置き換えられる；
（３）Ｘ残基が欠失するか、又はプロリン残基に置き換えられる；
（４）非Ｎアミノ酸残基がＮ残基とＸ残基との間に付加される；
（５）非Ｓ及び非Ｔアミノ酸残基がＸ残基と（Ｓ又はＴ）残基との間に付加される；及び、
（６）（１）〜（５）の任意の組合せ：
からなる群から選択される突然変異を有するという点で異なり、
ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表し、したがって、該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を有さない、突然変異体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の突然変異体であって、以下の項目；
（ａ）前記野生型ヘマグルチニンタンパク質がＡ／ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）及びＡ／ＨＯＮＧ＿ＫＯＮＧ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）に由来する；
（ｂ）前記野生型ヘマグルチニンタンパク質が配列番号１及び６からなる群から選択される配列を有する；
（ｃ）前記野生型ヘマグルチニンタンパク質が配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、該突然変異体が配列番号１とは、少なくとも該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を含まないという点で異なり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表し、任意に、該突然変異体が、配列番号１のアミノ酸１〜１０及び／又は、配列番号１のアミノ酸５０４〜５５０を含まない；
（ｄ）前記野生型ヘマグルチニンタンパク質が配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、該突然変異体が配列番号６とは、少なくとも該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を含まないという点で異なり、ここで、Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはプロリン以外の任意の１つのアミノ酸を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはトレオニンを表し、任意に、該突然変異体が、配列番号６のアミノ酸１〜２５及び／又は、配列番号６のアミノ酸５１８〜５６５を含まない；
（ｅ）該突然変異体が配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、又は該突然変異体が、配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％及び９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の同一性を有するが、但し、該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まないか、又は該突然変異体が配列番号１２及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換を有するが、但し、該突然変異体が特徴的配列Ｎ−Ｘ−（Ｓ又はＴ）を全く含まない；及び、
（ｆ）該突然変異体が前記野生型ヘマグルチニンタンパク質のＮ末端シグナルペプチド及び／又は膜貫通領域を含まない；
の１以上によって特徴付けられる、突然変異体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の突然変異体と付加的なペプチド断片とを含む組換えタンパク質であって、前記付加的なペプチド断片が前記突然変異体に連結する、組み換えタンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えタンパク質であって、以下の項目：
（ａ）前記付加的なペプチド断片が前記突然変異体に直接連結するか、又は該突然変異体にリンカーを介して連結する；
（ｂ）前記付加的なペプチド断片が前記突然変異体のＮ末端又はＣ末端に連結する；
（ｃ）前記組換えタンパク質が少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ又はそれ以上の付加的なペプチド断片を含む；
（ｄ）前記付加的なペプチド断片がシグナルペプチド、タグペプチド、フォールディングモチーフ、検出可能な標識及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される；
の１以上により特徴付けられる、組換えタンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えタンパク質であって、以下の項目：
（ａ）前記シグナルペプチドが前記突然変異体のＮ末端に連結する；
（ｂ）前記シグナルペプチドが配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する；
（ｃ）前記フォールディングモチーフが前記突然変異体のＣ末端に連結する；及び
（ｄ）前記フォールディングモチーフが配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する；の１つ以上により特徴付けられる、組換えタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の突然変異体又は請求項５〜７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸分子又は請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞又はウイルス。
【請求項１１】
前記ウイルスがバキュロウイルスである、請求項１０に記載の宿主細胞又はウイルス。
【請求項１２】
複数の請求項１〜４のいずれか１項に記載の突然変異体又は複数の請求項５〜７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質を含むか又はそれからなる多量体。
【請求項１３】
前記多量体が三量体である、請求項１２に記載の多量体。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の突然変異体又は請求項５〜７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質又は請求項１２又は１３に記載の多量体を含み、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を更に含む、医薬組成物。
【請求項１５】
前記医薬組成物がワクチンである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
医薬組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１項に記載の突然変異体又は請求項５〜７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質又は請求項１２又は１３に記載の多量体の使用であって、前記医薬組成物が被験体におけるインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防又は治療に使用される、使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用であって、以下の項目：
（ａ）前記インフルエンザウイルスがＨ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９及びＨ１Ｎ１亜型のインフルエンザウイルスから選択される；
（ｂ）前記インフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患がインフルエンザである；
（ｃ）前記被験体が哺乳動物である；
（ｄ）前記被験者がマウス及びヒトから選択される；及び
（ｅ）前記医薬組成物がワクチンである；、
の１つ以上により特徴付けられる、使用。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の突然変異体又は請求項５〜７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質を作製する方法であって、請求項１０又は１１に記載の宿主細胞又はウイルスを前記突然変異体又は前記組換えタンパク質の発現を可能にする条件下で培養することと、発現された前記突然変異体又は組換えタンパク質を回収することとを含む、方法。
【請求項１９】
ワクチンを作製する方法であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の突然変異体又は請求項５〜７のいずれか１項に記載の組換えタンパク質又は請求項１２又は１３に記載の多量体を薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と混合することを含む、方法。
【請求項２０】
アジュバント及び／又は付加的な有効成分を混合することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アジュバントがアルミニウムアジュバントである、及び／又は前記付加的な有効成分が、インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防又は治療することが可能な付加的な有効成分である、請求項２０に記載の方法。
【国際調査報告】
2021509254.tif 000022
2021509254.tif 000023
2021509254.tif 000024
2021509254.tif 000025
2021509254.tif 000026
2021509254.tif 000027