(57)【要約】  脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の治療または予防における使用で用いる式（I）の化合物、または前記化合物のN−オキシド、塩、水和物、溶媒和物、互変異性体もしくは立体異性体、または前記N−オキシド、互変異性体もしくは立体異性体の塩。
2021501178.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の治療または予防に使用するための、式（I）の化合物
【化１】
2021501178.tif 000073
｛式中、
Xは、CまたはNであり、
R1は、
【化２】
2021501178.tif 000074
（式中、＊は前記基と前記分子の残部との結合点を示し、R6、R6aは、互いに独立にフッ素、塩素、メトキシまたは水素を表す）を表し；
R2は、
【化３】
2021501178.tif 000075
または
【化４】
2021501178.tif 000076
（式中、＊は前記基と前記分子の残部との結合点を示し、前記基は場合により、互いに独立して同じであるかまたは異なるR11で1〜2回置換されており、
R11は、互いに独立して、ハロゲン、シアノ、C1〜C4−アルキル、C1〜C4−ハロアルキル、C1〜C4−ヒドロキシアルキル、C1〜C4−アルコキシ、C1〜C4−ハロアルコキシ、（C1〜C3−アルコキシ）−エチル−、メトキシ−エチル−、C3〜C6−シクロアルキルを表す）
を表す｝；
または前記化合物のN−オキシド、塩、水和物、溶媒和物、互変異性体もしくは立体異性体、または前記N−オキシド、互変異性体もしくは立体異性体の塩。
【請求項２】
脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の前記予防または治療のための、請求項1に記載の一般式Iの化合物の使用。
【請求項３】
脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の前記予防または治療のための医薬品の調製のための、請求項1に記載の一般式Iの化合物の使用。
【請求項４】
前記化合物が、
2−（2−クロロフェニル）−N−｛3−スルファモイル−4−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］フェニル｝アセトアミド；
2−（2−フルオロフェニル）−N−｛3−スルファモイル−4−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］フェニル｝−アセトアミド；
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（3−クロロ−1H−1，2，4−トリアゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］−アセトアミド；
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミド；
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−フルオロ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミド；
N−［4−（4−ブロモ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］−2−（2−クロロフェニル）アセトアミド；
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミド
N−［4−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］−2−（4−メトキシフェニル）アセトアミド；
N−｛6−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−5−スルファモイルピリジン−3−イル｝−2−（2−フルオロフェニル）アセトアミド；
2−（2−クロロフェニル）−N−｛4−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−3−スルファモイルフェニル｝アセトアミド；
2−（2−クロロフェニル）−N−｛3−スルファモイル−4−［5−（トリフルオロメチル）ピリジン−3−イル］フェニル｝−アセトアミド；
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（1−シクロプロピル−1H−ピラゾール−4−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミド；
2−（2−クロロフェニル）−N−｛5−スルファモイル−6−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ピリジン−3−イル｝アセトアミド；
2−（2−フルオロフェニル）−N−｛5−スルファモイル−6−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ピリジン−3−イル｝アセトアミド；
2−（2−クロロフェニル）−N−［6−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−5−スルファモイルピリジン−3−イル］アセトアミド
または前記化合物のN−オキシド、塩、水和物、溶媒和物、互変異性体もしくは立体異性体、または前記N−オキシド、互変異性体もしくは立体異性体の塩である、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記化合物が、脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の前記予防または治療のための医薬品の調製のための、2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミドまたはその立体異性体、互変異性体、N−オキシド、水和物、溶媒和物、もしくは薬学的に許容される塩、またはこれらの混合物である、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記化合物が、疾患の発症から最大約1カ月、または最大約3週間、または最大約2週間、または最大約10日間投与される、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記化合物が、抗血栓剤と組み合わせて、または併用薬として投与される、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記化合物が、ヘパリン、または低分子量ヘパリンまたはダナパロイド；またはアルガトロバン、またはアンチトロンビンまたはプロテインC；またはアスピリン、またはクロピドグレル、またはアブシキシマブ、またはエプチフィバチド（インテグリリン（登録商標））と組み合わせて、または併用薬として投与される、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
請求項1に定義される一般式Iの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、N−オキシド、水和物、溶媒和物、もしくは塩、特にその薬学的に許容される塩、またはこれらの混合物の非経口製剤。
【請求項１０】
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミドまたはその立体異性体、互変異性体、N−オキシド、水和物、溶媒和物、もしくは塩、特にその薬学的に許容される塩の非経口製剤。
【請求項１１】
静脈内投与用の非経口製剤であることを特徴とする、請求項9または10に記載の非経口製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本明細書に記載および定義される式（I）の置換芳香族スルホンアミド、前記化合物を含む医薬組成物および組合せ、ならびに脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷を治療または予防するための医薬組成物を製造するための前記化合物の使用に関する。本明細書に記載および定義される本発明は、脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷を治療または予防するための、P2X4のアンタゴニストまたは負のアロステリック調節因子である有効成分を含む医薬組成物および組合せに関する。疾患、特に哺乳動物における疾患、例えば、限定されるものではないが、脳または脊髄における神経損傷および炎症に関連する疾患、脊髄損傷または虚血性脳損傷などの治療または予防のための医薬組成物を製造するためのそのような化合物の、単独剤としてまたは他の有効成分との組合せとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノシン三リン酸ATPは、様々なサブタイプのプリン受容体を通して作用することにより種々の生理学的および病態生理学的役割に関与する重要な神経伝達物質として広く認識されている（Burnstock 1993、Drug Dev Res 28：196−206；Burnstock 2011、Prog Neurobiol 95：229−274）。今日まで、P2X1〜7を含むP2Xファミリーの7つのメンバーがクローニングされている（Burnstock 2013、Front Cell Neurosci 7：227）。P2X4受容体は、具体的には単球、マクロファージ、肥満細胞およびミクログリア細胞を含む炎症／免疫過程に関与することが大いに知られている種々の細胞型で発現するリガンド依存性イオンチャネルである（Wangら、2004、BMC Immunol 5：16；Broneら、2007 Immunol Lett 113：83−89）。細胞外ATPによるP2X4の活性化は、とりわけ、前炎症性サイトカインおよびプロスタグランジン（PGE2）の放出をもたらすことが知られている（Boら、2003 Cell Tissue Res 313：159〜165；Ulmannら、2010、EMBO Journal 29：2290−2300；de Ribero Vaccariら、2012、J Neurosci 32：3058−3066）。
【０００３】
グルコース／酸素の欠乏によって引き起こされる神経細胞死の発症における、選択されたP2X受容体の細胞外ATPへの関与が調査されている。海馬由来の器官型培養のインビトロ研究により、P2X2およびP2X4がグルコース／酸素の欠乏によってアップレギュレートされたことが証明された。さらに、虚血状態が、海馬だけでなく皮質および線条体の器官型培養でも特定のニューロンの喪失を引き起こすこと、およびP2受容体拮抗薬のバシレンブルーとスラミンがこれらの有害な影響を防ぐことが示された。さらに、低酸素誘発条件により、両側総頸動脈を閉塞させたインビボ実験でのスナネズミの海馬におけるP2X受容体の誘導が確認された。特に、P2X2およびP2X4タンパク質は大幅にアップレギュレートされたが、程度および細胞表現型は異なっていた。誘導は、CA1サブフィールドの錐体細胞層およびCA2サブフィールドの移行ゾーンに限局され、神経損傷の領域と一致した。P2X2は、CA1錐体細胞層の神経細胞体および線維と、多形細胞層および放線層で発現した。強いP2X4免疫蛍光はミクログリア細胞に局在していた。（F．Cavaliereら、Neuroscience 120（2003）85−98）。
【０００４】
生後3日目のラットの早期低酸素−虚血モデルにおいて、イオンチャネル型プリンP2X4受容体の発現が発作後の脳でどのように変化するかが特徴付けられている。低酸素虚血後に、P2X4受容体の発現は大幅に増加し、ミクログリア細胞の活性化を示すイオン化カルシウム結合アダプター分子−1タンパク質の遅い増加に関連していた。ミクログリアの強力な阻害剤であるミノサイクリンは、低酸素性虚血に誘導されたP2X4受容体発現の増加を弱めた。（Julie A．Wixeyら、Journal of Neuroimmunology 212（2009）35−43）CNSでのP2X4発現について知られていることの概要と、神経炎症および神経因性疼痛における病態生理学的役割の証拠は、「P2X4 Receptor Function in the Nervous System and Current Breakthroughs in Pharmacology」（L．Stokesら、Frontiers in Pharmacology、2017年5月、第8巻、論文291）に概説されている。
【０００５】
国際公開第2015／088564号パンフレットおよび国際公開第2015／088565号パンフレットは、P2X4受容体を調節する化合物、それらの合成方法、該化合物を含む医薬組成物、およびそれらの使用方法を提供する。前記P2X4受容体調節化合物は、限定されるものではないが、慢性疼痛、神経障害、炎症性疾患および中枢神経系障害を含む様々な障害の治療、予防、および／または管理に有用である。
【０００６】
脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の治療または予防のための医薬組成物を製造するために、単独剤としてまたは他の有効成分との組合せとして使用される、本明細書に記載および定義される一般式（I）の置換芳香族スルホンアミドについて、先行技術で言及されていない。
したがって、本発明のP2X4阻害剤は、単剤として、または他の薬物との組合せとしててのいずれかで、治療選択肢を補完するはずである価値ある化合物となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2015／088564号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2015／088565号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Burnstock著、Drug Development Research，1993，28：196−206
【非特許文献２】Burnstock著、Progress in Neurobiology，2011，95：229−274
【非特許文献３】Burnstock著、Frontiers in Cellular Neuroscience，2013，7：227
【非特許文献４】Wangら著、BMC Immunology，2004，5：16
【非特許文献５】Broneら著、Immunology Letters，2007，113：83−89
【非特許文献６】Boら著、Cell and Tissue Research，2003，313：159−165
【非特許文献７】Ulmannら著、EMBO Journal，2010，29：2290−2300
【非特許文献８】de Ribero Vaccariら著、Journal of Neuroscience，2012，32：3058−3066
【非特許文献９】F．Cavaliereら著、Neuroscience，2003，120，85−98
【非特許文献１０】Julie A．Wixeyら著、Journal of Neuroimmunology，2009，212，35−43
【非特許文献１１】L．Stokesら著、“P2X4 Receptor Function in the Nervous System and Current Breakthroughs in Pharmacology，”Frontiers in Pharmacology，May 2017，Volume 8，Article 291
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の治療または予防で用いる、式（I）の化合物
【化１】
2021501178.tif 000003
｛式中、
Xは、CまたはNであり、
R1は、
【化２】
2021501178.tif 000004
（式中、＊は前記基と分子の残部との結合点を示し、R6、R6aは、互いに独立にフッ素、塩素、メトキシまたは水素を表す）を表し、
R2は、
【化３】
2021501178.tif 000005
または
【化４】
2021501178.tif 000006
（式中、＊は前記基と分子の残部との結合点を示し、前記基は場合により、互いに独立して同じであるかまたは異なるR11で1〜2回置換されており、
R11は、互いに独立して、ハロゲン、シアノ、C1〜C4−アルキル、C1〜C4−ハロアルキル、C1〜C4−ヒドロキシアルキル、C1〜C4−アルコキシ、C1〜C4−ハロアルコキシ、（C1〜C3−アルコキシ）−エチル−、メトキシ−エチル−、C3〜C6−シクロアルキルを表す）を表す｝、
または前記化合物のN−オキシド、塩、水和物、溶媒和物、互変異性体もしくは立体異性体、または前記N−オキシド、互変異性体もしくは立体異性体の塩に関する。
【００１０】
本発明の一態様は、脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の予防または治療のための、一般式Iの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、N−オキシド、水和物、溶媒和物、もしくは塩、特にその薬学的に許容される塩、またはこれらの混合物の使用である。
【００１１】
本発明のもう1つの態様は、脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の予防または治療のための医薬品の調製のための、一般式Iの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、N−オキシド、水和物、溶媒和物、もしくは塩、特にその薬学的に許容される塩、またはこれらの混合物の使用に関する。
【００１２】
脳虚血は、胎児性アルコール症候群、周産期疾患、周産期低酸素症などの遺伝性または先天性障害の一部などの後天性でない脳損傷によって発生することがある。これらの種類の脳虚血は、通常、脳全体に影響する全体的な脳虚血をもたらす。
【００１３】
全体的な脳虚血のさらなる例は、新生児低酸素症などの様々なイベントによって引き起こされた、出生後に発生する損傷である後天性脳損傷、低酸素症（重度の肺疾患または心臓病によって誘発されるもの）、低酸素症（ダイビング中の酸素欠損などの事故によるもの）、強い脳浮腫と脳内での強い免疫反応とを引き起こす可能性がある脳の感染症（ウイルス、細菌、寄生虫）、自己免疫反応、脳浮腫（高山病、オピオイド薬物乱用、中毒、悪性高血圧、間質液経路の局所閉塞、または脳脊髄液流の閉塞（例、閉塞性水頭症）などの様々な理由によるもの）によって生じる脳虚血である。
【００１４】
脳虚血は、後天性脳損傷によっても引き起こされ、虚血イベントが脳の特定の領域に局在している局所性脳虚血をもたらす。虚血性脳卒中、出血性卒中および外傷性脳損傷は後天性脳損傷であり、一般に局所性脳虚血をもたらす。
【００１５】
特に、虚血性脳卒中は、一般に、組織の酸素およびグルコース欠乏（虚血）が引き起こされる、動脈硬化病変または塞栓イベントに起因する、脳動脈血の供給の全体的または部分的な中断の結果としての1個または複数の局所性脳梗塞に関連する脳の局所虚血である。脳虚血性脳卒中は、国際疾病分類（ICD）により、脳の単一または複数の部位での局所性梗塞によって引き起こされる急性局所性神経機能障害と定義されている。急性梗塞の証拠は、a）24時間以上続く症状持続期間、またはb）脳の臨床的に関連する領域における神経画像処理またはその他の技術のいずれかによってもたらされる。（WHO−ICD11：https：／／icd．who．int／browse11／l−m／en＃／http％3a％2f％2fid．who．int％2ficd％2fentity％2f636274910）
【００１６】
出血性脳卒中は、脳内またはくも膜下での脳動脈瘤の破裂または突然漏出する弱くなった血管が原因であり、脳の機能障害を伴う局所虚血を引き起こす。血液は、定義された脳領域の中または周囲に溢流し、腫脹、圧力および虚血を生じ、細胞および脳組織を損傷する。
【００１７】
最後に、外傷性脳損傷（TBI）は、外力が脳を傷つけたときに起こる局所虚血を主に引き起こす、さらなる疾患である。TBIは、重症度（軽度、中等度および重度）および機構（閉鎖性または貫通性頭部外傷）に基づいて分類することができる。軽度および中程度のTBIは、脳虚血に関連する浮腫を引き起こす様々な程度の脳挫傷を主に引き起こす。中等度および重度のTBI（閉鎖性および頭蓋骨貫通性）は、むしろ多発性外傷（例、血管破壊、頭蓋内出血、脳組織破壊）を引き起こし、これらは全て、影響を受ける脳領域の虚血状態と密接に関連している。
【００１８】
本発明の一態様は、実施例に記載される式（I）の化合物であり、表題中のそれらの名称およびそれらの構造、ならびに実施例の化合物に具体的に開示される全ての残基の部分的組合せを特徴とする。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、特に、脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の予防または治療のための医薬品の調製のための、2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミドまたはその立体異性体、互変異性体、N−オキシド、水和物、溶媒和物、もしくは塩、特にその薬学的に許容される塩、またはこれらの混合物の使用に関する。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、式（I）の化合物であり、これはその塩、特に薬学的に許容される塩として存在する。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、一般式Iの化合物、またはその立体異性体、互変異性体、N−オキシド、水和物、溶媒和物、もしくは塩、特にその薬学的に許容される塩、またはこれらの混合物の非経口製剤に関する。より特に、本発明は、2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミドまたはその立体異性体、互変異性体、N−オキシド、水和物、溶媒和物、もしくは塩、特にその薬学的に許容される塩の非経口製剤に関する。
【００２２】
本発明によれば、一般式Iの化合物、より特に、2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミドまたはその立体異性体、互変異性体、N−オキシド、水和物、溶媒和物、もしくは塩、特にその薬学的に許容される塩、またはこれらの混合物の非経口製剤は、静脈内投与用の非経口製剤である。
【００２３】
本発明が、上記一般式（I）の化合物の本発明の任意の実施形態または態様内の任意の部分的組合せに関することは、当然理解される。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、定義が、以下に開示される好ましいかまたはより好ましい定義に従って限定される、特許請求の範囲の節に開示される請求項に記載される化合物、あるいは例示された化合物の具体的に開示された残基およびその部分的組合せである。
【００２５】
定義
本明細書で明言される場合により置換されている構成要素は、別段の記載がない限り、いずれかの可能な位置で互いに独立に、1回または複数回置換されていてもよい。任意の構成要素で変数が複数回出現する場合、各定義は独立している。例えば、R1、R2、R6、R6a、R11、および／またはXが式（I）の化合物において複数回出現する場合、R1、R2、R6、R6a、R11、およびXの各定義は独立している。
【００２６】
構成要素が複数の部分、例えばC1〜C4−アルコキシ−C1〜C4−アルキル−で構成される場合、可能な置換基の位置は、これらの部分の任意の適切な位置であり得る。構成要素の先頭のハイフンは、分子の残部との結合点を示す。環が置換されている場合、置換基は環の任意の適切な位置にあってよく、適切であれば環窒素原子上にあってもよい。
【００２７】
さらに、複数の部分で構成され、いくつかの化学残基を含む構成要素、例えば、C1〜C4−アルコキシ−C1〜C4−アルキルまたはフェニル−C1〜C4−アルキルは、左から、最後の部分（前述の例ではC1〜C4−アルキル残基）の分子の残部との結合点を含む右へと読む必要がある。
【００２８】
「含む」という用語は、本明細書において使用される場合、「からなる」を含む。
【００２９】
説明内で「上述のように」または「上述の」と言及される場合、それは前の頁のいずれかの本明細書内で行われる開示のいずれかを指す。
【００３０】
本発明の意味の範囲内の「適切な」という用語は、当業者の知識の範囲内の方法によって化学的に可能であることを意味する。
【００３１】
本明細書で言及される用語は、好ましくは以下の意味を有する。
【００３２】
「ハロゲン、ハロゲン原子、ハロ−」または「Hal−」という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子、好ましくはフッ素または塩素原子を意味するものと理解される。
【００３３】
「C1〜C4−アルキル」という用語は、好ましくは、1、2、3または4個の炭素原子を有する直鎖または分岐の飽和一価炭化水素基、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソ−プロピル、イソ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル基、特に1、2または3個の炭素原子を有するもの（「C1〜C3−アルキル」）、例えばメチル、エチル、n−プロピルまたはイソ−プロピル基を意味すると理解されるべきである。
【００３４】
「C1〜C4−ハロアルキル」という用語は、好ましくは「C1〜C4−アルキル」という用語が上で定義されるものであり、1個または複数の水素原子が同一にまたは異なってハロゲン原子によって置き換えられている、すなわち、あるハロゲン原子は別のハロゲン原子から独立している、直鎖または分岐の飽和一価炭化水素基を意味すると理解される。特に、前記ハロゲン原子はFである。前記C1〜C4−ハロアルキル基は、例えば、−CF3、−CHF2、−CH2F、−CF2CF3または−CH2CF3である。
【００３５】
「C1〜C4−アルコキシ」という用語は、好ましくは「アルキル」という用語が上で定義されるものである式−O−アルキルの直鎖または分岐の飽和一価炭化水素基、例えば、メトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、イソ−プロポキシ、n−ブトキシ、イソ−ブトキシ、tert−ブトキシもしくはsec−ブトキシ基、またはこれらの異性体を意味するものと理解されるべきである。
【００３６】
「C1〜C4−ハロアルコキシ」という用語は、好ましくは水素原子の1個または複数が同一にまたは異なってハロゲン原子によって置き換えられている、上に定義される直鎖または分岐の飽和一価C1〜C4−アルコキシ基を意味するものと理解されるべきである。特に、前記ハロゲン原子はFである。前記C1〜C4−ハロアルコキシ基は、例えば、−OCF3、−OCHF2、−OCH2F、−OCF2CF3または−OCH2CF3である。
【００３７】
「C1〜C4−ヒドロキシアルキル」という用語は、「C1〜C4−アルキル」という用語が上で定義されるものであり、1個または複数の水素原子がヒドロキシ基によって置き換えられている直鎖または分岐の飽和一価炭化水素基、例えば、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1，2−ジヒドロキシエチル、3−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、2，3−ジヒドロキシプロピル、1，3−ジヒドロキシプロパン−2−イル、3−ヒドロキシ−2−メチル−プロピル、2−ヒドロキシ−2−メチル−プロピル、1−ヒドロキシ−2−メチル−プロピル基を意味するものと理解されるべきである。
【００３８】
「C3〜C6−シクロアルキル」という用語は、3、4、5または6個の炭素原子を含む飽和一価単環式または二環式炭化水素環（「C3〜C6−シクロアルキル」）を意味するものと理解されるべきである。前記C3〜C6−シクロアルキル基は、例えば、単環式炭化水素環、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルもしくはシクロヘキシルまたは二環式炭化水素環である。
【００３９】
本明細書全体を通して、例えば、「C1〜C4−アルキル」、「C1〜C4−ハロアルキル」、「C1〜C4−アルコキシ」または「C1〜C4−ハロアルコキシ」の定義の文脈で使用される「C1〜C4」という用語は、1〜4個、すなわち、1、2、3または4個の炭素原子という有限数の炭素原子を有するアルキル基を意味するものと理解されるべきである。前記「C1〜C4」という用語は、その中に含まれる任意の部分範囲、例えば、C1〜C4、C2〜C4、C3〜C4、C1〜C2、C1〜C3、特にC1〜C2、C1〜C3、C1〜C4、「C1〜C6−ハロアルキル」または「C1〜C4−ハロアルコキシ」の場合には一層さらに特にC1〜C2と解釈されるべきであることがさらに理解されるべきである。
【００４０】
さらに、本明細書で使用される場合、本文の全体にわたって、例えば、「C3〜C6−シクロアルキル」の定義の文脈で使用される「C3〜C6」という用語は、3〜6個、すなわち、3、4、5または6個の炭素原子という有限数の炭素原子を有するシクロアルキル基を意味するものと理解されるべきである。前記「C3〜C6」という用語は、その中に含まれる任意の部分範囲、例えば、C3〜C6、C4〜C5、C3〜C5、C3〜C4、C4〜C6、C5〜C6；特にC3〜C6と解釈されるべきであることがさらに理解されるべきである。
【００４１】
「置換されている」という用語は、指定された原子上の1個または複数の水素が指示される基から選択されるものによって置き換えられており、但し、存在している状況下での指定された原子の通常の結合価を超えず、その置換が安定な化合物をもたらすことを意味する。置換および／または変数の組合せは、このような組合せが安定な化合物をもたらす場合にのみ許容される。
【００４２】
「置換されていてもよい」という用語は、指定される基、ラジカルまたは部分による任意の置換を意味する。
【００４３】
環系置換基は、例えば、環系上の利用可能な水素に取って代わる、芳香族または非芳香族環系に結合した置換基を意味する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、例えば、本発明の一般式の化合物の置換基の定義における「1個または複数の」という用語は、「1、2、3、4または5個、特に1、2、3または4個、さらに特に1、2または3個、一層さらに特に1または2個」を意味するものと理解される。
【００４５】
本発明はまた、本発明の化合物の全ての適当な同位体変種も含む。本発明の化合物の同位体変種は、少なくとも1個の原子が同じ原子番号を有するが、自然状態で通常または主に見られる原子質量とは異なる原子質量を有する原子によって置き換えられているものとして定義される。本発明の化合物に組み込まれ得る同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素の同位体、例えば、それぞれ、2H（重水素）、3H（トリチウム）、11C、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、125I、129Iおよび131Iが挙げられる。本発明の化合物の特定の同位体変種、例えば、3Hまたは14Cなどの1種または複数の放射性同位体が組み込まれたものは、薬剤および／または基質組織分布研究に有用である。トリチウム標識、および炭素−14、すなわち14C同位体は、その調製の容易さおよび検出性のために特に好まれる。さらに、重水素などの同位体による置換は、大きな代謝安定性から生じる特定の治療利点、例えば、インビボ半減期の増加または投与必要量の減少を与え得るので、いくつかの状況で好まれ得る。本発明の化合物の同位体変種は一般的に、例示的方法などによって当業者により知られている従来手順によってまたは適当な試薬の適当な同位体変種を使用して以下の実施例に記載される調製によって調製することができる。
【００４６】
化合物、塩、多形、水和物、溶媒和物などの語の複数形が本明細書で使用される場合、これは、単一の化合物、塩、多形、異性体、水和物、溶媒和物なども意味するとみなされる。
【００４７】
「安定な化合物」または「安定な構造」により、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離、および有効な治療剤への製剤化を生き延びるのに十分に堅牢である化合物が意味される。
【００４８】
本発明の化合物は、種々の所望の置換基の位置および性質に応じて、1個または複数の不斉中心を含み得る。不斉炭素原子は、（R）または（S）配置で存在し得るので、単一の不斉中心の場合にはラセミ混合物、また複数の不斉中心の場合にはジアステレオマー混合物をもたらし得る。特定の例では、所与の結合、例えば、特定の化合物の2個の置換芳香環を接合する中心結合の周りの回転が制限されるために非対称が存在する場合もある。
【００４９】
環上の置換基はシス型またはトランス型のいずれで存在してもよい。全てのこのような配置（エナンチオマーおよびジアステレオマーを含む）が本発明の範囲に含まれることが意図されている。
【００５０】
好ましい化合物は、より望ましい生物学的活性をもたらすものである。本発明の化合物の分離された、純粋なまたは部分的に精製された異性体および立体異性体あるいはラセミまたはジアステレオマー混合物も本発明の範囲に含まれる。このような材料の精製および分離は、当技術分野で知られている標準的技術によって達成することができる。
【００５１】
光学異性体は、従来法によるラセミ混合物の分割、例えば、光学活性酸もしくは塩基を用いたジアステレオ異性体塩の形成または共有結合性ジアステレオマーの形成によって得ることができる。適当な酸の例には、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジトルオイル酒石酸およびカンファースルホン酸がある。ジアステレオ異性体の混合物は、当技術分野で知られている方法、例えば、クロマトグラフィーまたは分別結晶によって、その物理的および／または化学的違いに基づいて個々のジアステレオマーに分離することができる。その後、光学活性塩基または酸を分離したジアステレオマー塩から遊離させる。光学異性体の別の分離法は、エナンチオマーの分離を最大化するために選択してもよい、従来の誘導体化を用いるまたは用いない、キラルクロマトグラフィー（例えば、キラルHPLCカラム）の使用を含む。適当なキラルHPLCカラムは、Daicelによって製造されており、例えば、数ある中でも全て日常的に選択可能なChiracel ODおよびChiracel OJがある。誘導体化を用いるまたは用いない酵素分離も有用である。本発明の光学活性化合物はさらに、光学活性出発物質を利用したキラル合成によっても得ることができる。
【００５２】
異性体の異なる型を互いから限定するために、IUPAC Rules Section E（Pure Appl Chem 45、11〜30、1976）が参照される。
【００５３】
本発明は、単一の立体異性体として、または任意の比の前記立体異性体、例えば、R−もしくはS−異性体またはE−もしくはZ−異性体の任意の混合物として本発明の化合物の全ての可能な立体異性体を含む。本発明の化合物の単一の立体異性体、例えば、単一のエナンチオマーまたは単一のジアステレオマーの単離は、任意の適当な先行技術の方法、例えば、クロマトグラフィー、特にキラルクロマトグラフィーによって達成することができる。
【００５４】
さらに、本発明の化合物は互変異性体として存在し得る。例えば、ヘテロアリール基としてピラゾール部分を含む本発明の任意の化合物は、例えば、1H互変異性体もしくは2H互変異性体、または2種の互変異性体の任意の量の混合物としてさえ存在することができ、あるいはトリアゾール部分は、例えば、1H互変異性体、2H互変異性体もしくは4H互変異性体、または前記1H、2Hおよび4H互変異性体の任意の量の混合物、すなわち：
【化５】
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としてさえ存在することができる。
【００５５】
本発明は、単一の互変異性体として、または任意の比の互変異性体の任意の混合物として本発明の化合物の全ての可能な互変異性体を含む。
【００５６】
さらに、本発明の化合物は、本発明の化合物の少なくとも1個の窒素が酸化されているという点で定義されるN−オキシドとして存在することができる。本発明は、全てのこのような可能なN−オキシドを含む。
【００５７】
本発明はまた、本明細書に開示される化合物の有用な形態、例えば、代謝産物、水和物、溶媒和物、プロドラッグ、塩、特に薬学的に許容される塩、および共沈物に関する。
【００５８】
本発明の化合物は水和物または溶媒和物として存在することができ、本発明の化合物は例えば、化合物の結晶格子の構造要素として極性溶媒、特に水、メタノールまたはエタノールを含む。極性溶媒、特に水の量は、化学量論比または非化学量論比で存在し得る。化学量論的溶媒和物の場合、例えば、水和物、半−、（セミ−）、一−、セスキ−、二−、三−、四−、五−等溶媒和物、または水和物がそれぞれ可能である。本発明は、全てのこのような水和物または溶媒和物を含む。
【００５９】
さらに、本発明の化合物は、遊離型で、例えば、遊離塩基もしくは遊離酸もしくは双性イオンとして存在することができる、または塩型で存在することができる。前記塩は任意の塩、有機または無機付加塩のいずれか、特に薬学で習慣的に使用される任意の薬学的に許容される有機または無機付加塩であり得る。
【００６０】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機または有機酸付加塩を指す。例えば、S．M．Bergeら「Pharmaceutical Salts」、J．Pharm．Sci．1977、66、1〜19を参照されたい。
【００６１】
本発明の化合物の適当な薬学的に許容される塩は、例えば、十分に塩基性の、鎖中または環内に窒素原子を有する本発明の化合物の酸付加塩、例えば、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、重硫酸、リン酸または硝酸による酸付加塩、または有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、アセト酢酸、ピルビン酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、酪酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ウンデカン酸、ラウリル酸、安息香酸、サリチル酸、2−（4−ヒドロキシベンゾイル）−安息香酸、ショウノウ酸、ケイヒ酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジグルコン酸、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、ニコチン酸、パモ酸、ペクチニン酸、過硫酸、3−フェニルプロピオン酸、ピクリン酸、ピバル酸、2−ヒドロキシエタンスルホネート、イタコン酸、スルファミン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ドデシル硫酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、2−ナフタレンスルホン酸、ナフタリンジスルホン酸、カンファースルホン酸、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、アジピン酸、アルギン酸、マレイン酸、フマル酸、D−グルコン酸、マンデル酸、アスコルビン酸、グルコヘプタン酸、グリセロリン酸、アスパラギン酸、スルホサリチル酸、ヘミ硫酸またはチオシアン酸による酸付加塩であり得る。
【００６２】
さらに、十分に酸性の本発明の化合物の別の適当な薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウムもしくはカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウムもしくはマグネシウム塩、アンモニウム塩または生理学的に許容されるカチオンを与える有機塩基による塩、例えば、N−メチル−グルカミン、ジメチル−グルカミン、エチル−グルカミン、リジン、ジシクロヘキシルアミン、1，6−ヘキサジアミン、エタノールアミン、グルコサミン、サルコシン、セリノール、トリス−ヒドロキシ−メチル−アミノメタン、アミノプロパンジオール、sovak塩基、1−アミノ−2，3，4−ブタントリオールによる塩である。さらに、塩基性窒素含有基は、低級ハロゲン化アルキル（例えば、塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピルならびにブチル）、硫酸ジアルキル（例えば、硫酸ジメチル、ジエチルおよびジブチル）、ならびに硫酸ジアミル、長鎖ハロゲン化物（例えば、塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルならびにステアリル）、ハロゲン化アラルキル（例えば、臭化ベンジルおよびフェネチル）などの剤によって四級化され得る。
【００６３】
当業者であれば、特許請求される化合物の酸付加塩が、いくつかの既知の方法のいずれかを介する化合物と適当な無機酸または有機酸との反応によって調製され得ることをさらに認識するだろう。あるいは、本発明の酸性化合物のアルカリおよびアルカリ土類金属塩は、種々の既知の方法を介して本発明の化合物を適当な塩基と反応させることによって調製される。
【００６４】
本発明は、単一の塩として、または任意の比の前記塩の任意の混合物として本発明の化合物の全ての可能な塩を含む。
【００６５】
本文中、特に実験節において、本発明の中間体および実施例の合成について、化合物を相当する塩基または酸による塩型として言及する場合、それぞれの調製および／または精製工程によって得られる前記塩型の正確な化学量論的組成は、ほとんどの場合、未知である。
【００６６】
特に指定しない限り、例えば、「塩酸塩」、「トリフルオロアセテート」、「ナトリウム塩」または「xHCl」、「xCF3COOH」、「xNa＋」などの化学名または構造式の接尾辞は、化学量論的指定としてではなく、単なる塩型として理解されるべきである。
【００６７】
合成中間体もしくは実施例化合物またはこれらの塩を、（定義する場合）未知の化学量論的組成の水和物などの溶媒和物として、調製および／または精製工程によって得た場合にもこれが同様に当てはまる。
【００６８】
塩は、水不溶性塩および特に、水溶性塩を含む。
【００６９】
さらに、生物系において式（I）の化合物およびその塩に変換される式（I）の化合物およびその塩の誘導体（生物学的前駆体またはプロドラッグ）が本発明によって網羅される。前記生物系は、例えば、哺乳類生物、特にヒト対象である。生物学的前駆体は、例えば、代謝プロセスによって式（I）の化合物またはその塩に変換される。
【００７０】
さらに、本発明は、本発明の化合物の全ての可能な結晶型または多形を、単一多形としてまたは任意の比の2種以上の多形の混合物として含む。
【００７１】
本発明の化合物の特性の文脈において、「薬物動態プロファイル」という用語は、適切な実験で測定される、浸透性、生物学的利用能、曝露および薬力学パラメータ、例えば薬理学的効果の持続時間または大きさを含む、単一のパラメータまたはその組合せを意味する。改善された薬物動態プロファイルを有する化合物は、例えば、同じ効果を達成するために低用量で使用することができ、より長い作用時間を達成することができ、または両方の効果の組合せを達成することができる。
【００７２】
本発明の前記化合物が驚くべきかつ有利な特性を有することがここで分かり、このことが本発明の基礎を構成している。
【００７３】
特に、本発明による化合物は、驚くべきことに、虚血性脳卒中の治療において、P2X4のアンタゴニストまたは負のアロステリックモジュレーターとして有効に活性であることが分かった。
【００７４】
アロステリックモジュレーターは、標的タンパク質、例えば受容体でのアゴニストまたはインバースアゴニストの効果に間接的に影響を及ぼす（調節する）物質である。アロステリックモジュレーターは、オルソステリックアゴニスト結合部位とは異なる部位に結合する。通常、これらはタンパク質構造内の立体構造変化を誘導する。負のモジュレーター（NAM）は、オルソステリックリガンドの効果を減少させるが、オルソステリックリガンドの非存在下では不活性である。
【００７５】
商業的有用性および医学的適応症
・上記のように、本発明の化合物は、驚くべきことに、P2X4のアンタゴニストまたは負のアロステリックモジュレーターとして有効に活性であることが分かった。
【００７６】
本明細書に記載および定義される一般式（I）の化合物、または前記化合物のN−オキシド、塩、互変異性体もしくは立体異性体、または前記N−オキシド、互変異性体もしくは立体異性体の塩、特にその薬学的に許容される塩、またはこれらの混合物は、脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、または脊髄損傷の治療または予防における使用に適している。
【００７７】
本発明はさらに、疼痛および炎症に関連する哺乳類の障害および疾患を治療するための、一般式（I）の化合物または前記化合物のN−オキシド、塩、互変異性体もしくは立体異性体、または前記N−オキシド、互変異性体もしくは立体異性体の塩、特にその薬学的に許容される塩、またはこれらの混合物を使用するための方法に関する。
【００７８】
本文書の全体を通して述べられる「治療すること」または「治療」という用語は、疾患または障害の状態等と闘う、これを緩和する、低減する、軽減する、改善する目的で対象を管理または介護するために慣習的に使用される。
【００７９】
好ましくは、上述の疾患を治療する方法は、前記疾患の治療に限定されず、前記疾患に関連するかまたは付随する疼痛および炎症の治療も含む。
【００８０】
本発明の化合物の医薬組成物
本発明はまた、本発明の1種または複数の化合物を含む医薬組成物に関する。これらの組成物を利用して、それを必要とする患者に投与することによって所望の薬理学的効果を達成することができる。本発明の目的のために、患者は、特定の状態または疾患の治療を必要とする、ヒトを含む哺乳動物である。
【００８１】
そのため、本発明は、薬学的に許容される担体または補助剤と、薬学的有効量の本発明の化合物またはその塩とで構成される医薬組成物を含む。
【００８２】
本発明の別の態様は、上述の疾患を治療するための、薬学的有効量の式（I）の化合物と、薬学的に許容される補助剤とを含む医薬組成物である。
【００８３】
薬学的に許容される担体または補助剤は、好ましくは、担体に起因する副作用が有効成分の有益な効果を損なうことがないように、有効成分の有効な活性と一致した濃度で、患者に対して無毒で無害な担体である。担体および補助剤は、組成物が投与に適するよう助けるあらゆる種類の添加剤である。
【００８４】
化合物の薬学的有効量は、好ましくは、治療されている特定の状態に対して結果をもたらすまたは意図した影響を及ぼす量である。
【００８５】
本発明の化合物は、即時放出製剤、徐放性製剤および時限放出製剤を含む、任意の効果的な従来の投薬単位形を使用して、当技術分野で周知の薬剤的に許容される担体または補助剤と共に、経口的、非経口的、局所的、経鼻的、舌下、直腸、などの経路で投与できる。
【００８６】
経口投与のために、化合物を固体または液体製剤、例えば、カプセル剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤、メルト剤（melts）、散剤、液剤、懸濁剤または乳剤に製剤化することができ、医薬組成物を製造するための当技術分野で知られている方法により調製することができる。固体単位剤形は、補助剤、例えば、界面活性剤、潤滑剤および不活性賦形剤、例えば、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウムおよびコーンスターチを含む通常の硬または軟ゼラチン型であり得るカプセルであり得る。
【００８７】
別の実施形態では、本発明の化合物は、バインダー（アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなど）、投与後の錠剤の崩壊および溶解を補助することを意図した崩壊剤（ジャガイモデンプン、アルギン酸、コーンスターチおよびグアーガム、トラガントガム、アカシアなど）、錠剤顆粒の流動を改善し、錠剤材料が錠剤型および穿孔器の表面に付着するのを防ぐことを意図した潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸、またはステアリン酸マグネシウム、カルシウムもしくは亜鉛）、錠剤の審美的品質を向上させ、錠剤を患者にとってより許容可能なものにすることを意図した染料、着色剤ならびに香味剤（ペパーミント、ウィンターグリーン油またはチェリー香味剤など）と組み合わせた従来の錠剤基剤（乳糖、ショ糖およびコーンスターチなど）を用いて錠剤化され得る。経口液体剤形に使用するのに適した賦形剤には、薬学的に許容される界面活性剤、懸濁化剤または乳化剤を添加したまたは添加しないリン酸二カルシウムおよび希釈剤（水およびアルコール、例えば、エタノール、ベンジルアルコールおよびポリエチレンアルコールなど）が含まれる。種々の他の材料は、コーティングとしてまたは投薬単位の物理的形態を修正するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、シェラック、糖または両方でコーティングされ得る。
【００８８】
分散性粉末および顆粒が水性懸濁剤を調製するのに適している。これらは分散または湿潤剤、懸濁化剤、および1種または複数の保存剤と混和した有効成分を提供する。適当な分散または湿潤剤および懸濁化剤は、既に上で言及されているものによって示されている。追加の賦形剤、例えば、上記の甘味剤、香味剤および着色剤が存在してもよい。
【００８９】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油、例えば、流動パラフィンまたは植物油の混合物であり得る。適当な乳化剤は、（1）天然ガム、例えば、アラビアガムおよびトラガントガム、（2）天然ホスファチド、例えば、ダイズおよびレシチン、（3）脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られるエステルまたは部分エステル、例えば、モノオレイン酸ソルビタン、（4）前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであり得る。乳剤はまた、甘味剤および香味剤を含んでもよい。
【００９０】
油性懸濁剤は、有効成分を植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油、または鉱物油、例えば、流動パラフィンに懸濁することによって製剤化することができる。油性懸濁剤は、増稠剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含んでもよい。懸濁剤はまた、1種または複数の保存剤、例えば、p−ヒドロキシ安息香酸エチルもしくはn−プロピル；1種または複数の着色剤；1種または複数の香味剤；および1種または複数の甘味剤、例えば、ショ糖またはサッカリンを含んでもよい。
【００９１】
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはショ糖を用いて製剤化することができる。このような製剤は、粘滑剤、および保存剤、例えば、メチルおよびプロピルパラベン、ならびに香味剤および着色剤を含んでもよい。
【００９２】
本発明の化合物はまた、非経口的に、すなわち、例えば皮下に、静脈内に、眼内に、関節滑液嚢内に、筋肉内にまたは腹腔内に、薬学的に許容される界面活性剤（石鹸もしくは洗剤など）、懸濁化剤（ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロースなど）、または乳化剤および他の薬学的アジュバントを用いてまたは用いないで、好ましくは滅菌液体または液体の混合物、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖液および関連する糖液、アルコール（エタノール、イソプロパノールもしくはヘキサデシルアルコールなど）、グリコール（プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなど）、グリセロールケタノール（2，2−ジメチル−1，1−ジオキソラン−4−メタノールなど）、エーテル（ポリ（エチレングリコール）400など）、油、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは脂肪酸グリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドであり得る薬学的担体を含む生理学的に許容される希釈剤中の注射可能な投与量の化合物として投与されてもよい。
【００９３】
本発明の非経口製剤に使用することができる油の例には、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリンおよび鉱物油がある。適当な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸およびミリスチン酸が含まれる。適当な脂肪酸エステルには、例えば、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルがある。適当な石鹸には脂肪酸アルキル金属、アンモニウムおよびトリエタノールアミン塩が含まれ、適当な洗剤には陽イオン性洗剤、例えば、ハロゲン化ジメチルジアルキルアンモニウム、ハロゲン化アルキルピリジニウムおよび酢酸アルキルアミン；陰イオン性洗剤、例えば、スルホン酸アルキル、アリールおよびオレフィン、硫酸アルキル、オレフィン、エーテルおよびモノグリセリド、ならびにスルホサクシネート；非イオン性洗剤、例えば、脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミドおよびポリ（オキシエチレン−オキシプロピレン）またはエチレンオキシドもしくはプロピレンオキシド共重合体；ならびに両性洗剤、例えば、アルキル−β−アミノプロピオネートおよび2−アルキルイミダゾリン四級アンモニウム塩ならびに混合物が含まれる。
【００９４】
本発明の非経口組成物は、典型的には溶液中に約0．5重量％〜約25重量％の有効成分を含む。より具体的には、本発明による式（I）の化合物（copound）の非経口組成物は、一般に、約0．5％〜約20％、または約0．5％〜約15％、または約1％〜約12％、または約3％〜約12％、または約5％〜約10重量％の有効成分を溶液中に含み、前記化合物は、特に、2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミドまたはその立体異性体、互変異性体、N−オキシド、水和物、溶媒和物、もしくは塩である。
【００９５】
有利には保存剤および緩衝剤を使用してもよい。注射部位での刺激を最小化するまたは排除するために、このような組成物は、好ましくは約12〜約17の親水性−親油性バランス（HLB）を有する非イオン界面活性剤を含んでもよい。このような製剤中の界面活性剤の量は、好ましくは約5％〜約15重量％に及ぶ。界面活性剤は上記HLBを有する単一成分であってもよいし、または所望のHLBを有する2種以上の成分の混合物であってもよい。
【００９６】
非経口製剤に使用される界面活性剤の例には、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステルのクラス、例えば、モノオレイン酸ソルビタン、およびプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合により形成されるエチレンオキシドと疎水性基剤の高分子量付加物がある。
【００９７】
医薬組成物は、滅菌注射水性懸濁剤の形態であってもよい。このような懸濁剤は、適当な分散または湿潤剤および懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガムおよびアラビアガム；天然ホスファチド、例えば、レシチン、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物、例えば、ヘプタデカ−エチレンオキシセタノール、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルの縮合物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンである得る分散または湿潤剤を用いて既知の方法により製剤化することができる。
【００９８】
滅菌注射製剤はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液であってもよい。使用され得る希釈剤および溶媒は、例えば、水、リンガー液、等張食塩水および等張グルコース溶液である。さらに、滅菌不揮発性油が溶媒または懸濁化媒体として慣用的に使用されている。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の無刺激不揮発性油を使用してもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製に使用することができる。
【００９９】
本発明の組成物を、薬剤の直腸投与のために坐剤の形態で投与してもよい。これらの組成物は、薬剤を、常温では固体であるが、直腸温度で液体であり、それゆえ直腸内で溶融して薬剤を放出する適当な非刺激賦形剤と混合することによって調製することができる。このような材料には、例えば、カカオ脂およびポリエチレングリコールがある。
【０１００】
非経口投与用の制御放出製剤には、当技術分野で知られているリポソーム、ポリマーミクロスフェアおよびポリマーゲル製剤が含まれる。
【０１０１】
医薬組成物を、機械送達装置を介して患者に導入することが望ましいかまたは必要となり得る。医薬剤を送達するための機械送達装置の構築および使用は当技術分野で周知である。投与、例えば、薬剤を脳に直接投与するための直接技術は、通常、薬剤送達カテーテルを患者の脳室系に配置して血液脳関門をバイパスすることを伴う。薬剤を体の特定の解剖学的領域に輸送するために使用される1つのこのような埋め込み型送達システムは、1991年4月30日に付与された米国特許第5011472号明細書に記載されている。
【０１０２】
本発明の組成物はまた、必要に応じてまたは所望の通り一般的に担体または希釈剤と呼ばれる他の従来の薬学的に許容される配合剤を含むこともできる。適当な剤形のこのような組成物を調製するための従来手順を利用することができる。
【０１０３】
このような成分および手順には、その各々が参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献に記載されているものが含まれる：Powell，M．F．ら、「Compendium of Excipients for Parenteral Formulations」PDA Journal of Pharmaceutical Science＆Technology 1998、52（5）、238〜311；Strickley，R．G「Parenteral Formulations of Small Molecule Therapeutics Marketed in United States（1999）−Part−1」PDA Journal of Pharmaceutical Science＆Technology 1999、53（6）、324〜349；およびNema，S．ら、「Excipients and Their Use in Injectable Products」PDA Journal of Pharmaceutical Science＆Technology 1997、51（4）、166〜171。
【０１０４】
その意図された投与経路のために組成物を製剤化するために適宜使用することができる一般的に使用される医薬成分には以下が含まれる。
酸性化剤（例としては、それだけに限らないが、酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、硝酸が挙げられる）、
アルカリ化剤（例としては、それだけに限らないが、アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン、トロラミンが挙げられる）、
吸着剤（例としては、それだけに限らないが、粉末セルロースおよび活性炭が挙げられる）、
エアゾール噴射剤（例としては、それだけに限らないが、二酸化炭素、CCl2F2、F2ClC−CClF2およびCClF3が挙げられる）、
空気置換剤（例としては、それだけに限らないが、窒素およびアルゴンが挙げられる）、
抗真菌防腐剤（例としては、それだけに限らないが、安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウムが挙げられる）、
抗菌防腐剤（例としては、それだけに限らないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀およびチメロサールが挙げられる）、
抗酸化剤（例としては、それだけに限らないが、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウムが挙げられる）、
結合材料（例としては、それだけに限らないが、ブロックポリマー、天然および合成ゴム、ポリアクリレート、ポリウレタン、シリコーン、ポリシロキサンおよびスチレン−ブタジエンコポリマーが挙げられる）、
緩衝剤（例としては、それだけに限らないが、メタリン酸カリウム、リン酸二カリウム、酢酸ナトリウム、無水クエン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム二水和物が挙げられる）、
担持剤（carrying agent）（例としては、それだけに限らないが、アカシアシロップ、芳香族シロップ、芳香族エリキシル、チェリーシロップ、ココアシロップ、オレンジシロップ、シロップ、トウモロコシ油、鉱油、ピーナッツ油、ゴマ油、静菌性塩化ナトリウム注射液および注射用静菌水が挙げられる）、
キレート剤（例としては、それだけに限らないが、エデト酸二ナトリウムおよびエデト酸が挙げられる）、
着色剤（例としては、それだけに限らないが、FD＆C赤色3号、FD＆C赤色20号、FD＆C黄色6号、FD＆C青色2号、D＆C緑色5号、D＆C橙色5号、D＆C赤色8号、カラメルおよび赤色酸化第二鉄が挙げられる）、
清澄化剤（例としては、それだけに限らないが、ベントナイトが挙げられる）、
乳化剤（例としてはそれだけに限らないが、アカシア、セトマクロゴール、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレン50が挙げられる）、
カプセル化剤（例としては、それだけに限らないが、ゼラチンおよび酢酸フタル酸セルロースが挙げられる）、
香味剤（例としては、それだけに限らないが、アニス油、シナモン油、ココア、メントール、オレンジ油、ペパーミント油およびバニリンが挙げられる）、
保湿剤（例としては、それだけに限らないが、グリセロール、プロピレングリコールおよびソルビトールが挙げられる）、
研和剤（例としては、それだけに限らないが、鉱油およびグリセリンが挙げられる）、
油（例としては、それだけに限らないが、ラッカセイ油、鉱油、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油および植物油が挙げられる）、
軟膏基剤（例としては、それだけに限らないが、ラノリン、親水性軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ワセリン、親水性ワセリン、白色軟膏、黄色軟膏およびバラ水軟膏が挙げられる）、
浸透促進剤（経皮送達）（例としては、それだけに限らないが、モノヒドロキシまたはポリヒドロキシアルコール、一価または多価アルコール、飽和または不飽和脂肪アルコール、飽和または不飽和脂肪酸エステル、飽和または不飽和ジカルボン酸、精油、ホスファチジル誘導体、セファリン、テルペン、アミド、エーテル、ケトンおよび尿素が挙げられる）、
可塑剤（例としては、それだけに限らないが、ジエチルフタレートおよびグリセロールが挙げられる）、
溶媒（例としては、それだけに限らないが、エタノール、コーン油、綿実油、グリセロール、イソプロパノール、鉱油、オレイン酸、ピーナッツ油、精製水、注射用水、注射用滅菌水および灌注用滅菌水が挙げられる）、
硬化剤（例としては、それだけに限らないが、セチルアルコール、セチルエステルワックス、ミクロクリスタリンワックス、パラフィン、ステアリルアルコール、白蝋および黄蝋が挙げられる）、
坐剤基剤（例としては、それだけに限らないが、カカオ脂およびポリエチレングリコール（混合物）が挙げられる）、
界面活性剤（例としては、それだけに限らないが、塩化ベンザルコニウム、ノノキシノール10、オクトキシノール9、ポリソルベート80、ラウリル硫酸ナトリウムおよびソルビタンモノパルミテートが挙げられる）、
懸濁化剤（例としては、それだけに限らないが、寒天、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カオリン、メチルセルロース、トラガカントおよびビーガムが挙げられる）、
甘味剤（例としては、それだけに限らないが、アスパルテーム、デキストロース、グリセロール、マンニトール、プロピレングリコール、サッカリンナトリウム、ソルビトールおよびスクロースが挙げられる）、
錠剤付着防止剤（例としては、それだけに限らないが、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクが挙げられる）、
錠剤結合剤（例としては、それだけに限らないが、アカシア、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、圧縮糖、エチルセルロース、ゼラチン、液状グルコース、メチルセルロース、非架橋ポリビニルピロリドンおよびα化デンプンが挙げられる）、
錠剤およびカプセル剤希釈剤（例としては、それだけに限らないが、リン酸水素カルシウム、カオリン、乳糖、マンニトール、微結晶セルロース、粉末セルロース、沈降炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ソルビトールおよびデンプンが挙げられる）、
錠剤コーティング剤（例としては、それだけに限らないが、液状グルコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースおよびシェラックが挙げられる）、
錠剤直接圧縮賦形剤（例としては、それだけに限らないが、リン酸水素カルシウムが挙げられる）、
錠剤崩壊剤（例としては、それだけに限らないが、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、微結晶セルロース、ポラクリリンカリウム、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、グリコール酸デンプンナトリウムおよびデンプンが挙げられる）、
錠剤滑剤（例としては、それだけに限らないが、コロイドシリカ、コーンスターチおよびタルクが挙げられる）、
錠剤潤滑剤（例としては、それだけに限らないが、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、ステアリン酸およびステアリン酸亜鉛が挙げられる）、
錠剤／カプセル不透明化剤（opaquant）（例としては、それだけに限らないが、二酸化チタンが挙げられる）、
錠剤光沢剤（例としては、それだけに限らないが、カルナウバロウおよび白蝋が挙げられる）、
粘稠化剤（例としては、それだけに限らないが、蜜蝋、セチルアルコールおよびパラフィンが挙げられる）、
等張化剤（例としては、それだけに限らないが、デキストロースおよび塩化ナトリウムが挙げられる）、
増粘剤（例としては、それだけに限らないが、アルギン酸、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウムおよびトラガカントが挙げられる）、および
湿潤剤（例としては、それだけに限らないが、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、レシチン、ソルビトールモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートおよびポリオキシエチレンステアレートが挙げられる）。
【０１０５】
本発明による医薬組成物は、以下の通り説明することができる：
滅菌静脈注射溶液：本発明の所望の化合物の5mg／ml溶液は、滅菌注射用水を用いて製造することができ、必要に応じてpHを調整する。この溶液を投与するために滅菌5％ブドウ糖を用いて1〜2mg／mlに希釈し、約60分間にわたって静脈内注入として投与する。
【０１０６】
静脈内投与用の凍結乾燥粉末：（i）凍結乾燥粉末としての本発明の所望の化合物100〜1000mg、（ii）32〜327mg／mlのクエン酸ナトリウムおよび（iii）Dextran 40 300〜3000mgを用いて滅菌製剤を調製することができる。製剤を滅菌注射用生理食塩水またはブドウ糖5％を用いて再構成して10〜20mg／mlの濃度にし、これをさらに生理食塩水またはブドウ糖5％を用いて希釈して0．2〜0．4mg／mlにし、15〜60分間にわたってIVボーラスまたはIV注入によって投与する。
【０１０７】
筋肉内懸濁剤：筋肉内注射用に以下の溶液または懸濁液を調製することができる：
50mg／mlの所望の本発明の水不溶性化合物
5mg／mlカルボキシメチルセルロースナトリウム
4mg／ml TWEEN 80
9mg／ml塩化ナトリウム
9mg／mlベンジルアルコール
【０１０８】
硬カプセル剤：それぞれ粉末有効成分100mgを含む標準的な2ピースの硬ゼラチン（galantine）カプセル、乳糖150mg、セルロース50mgおよびステアリン酸マグネシウム6mgを充填することによって多数の単位カプセル剤を調製する。
【０１０９】
軟ゼラチンカプセル剤：有効成分のダイズ油、綿実油またはオリーブ油などの可消化油中混合物を調製し、容量型ポンプを用いて溶融ゼラチンに注射して有効成分100mgを含む軟ゼラチンカプセル剤を形成する。カプセル剤を洗浄し、乾燥させる。有効成分を、ポリエチレングリコール、グリセリンおよびソルビトールの混合物に溶解して水混和性薬剤混合物を調製することができる。
【０１１０】
錠剤：投与単位が有効成分100mg、コロイド状二酸化ケイ素0．2mg、ステアリン酸マグネシウム5mg、微結晶セルロース275mg、デンプン11mgおよび乳糖98．8mgとなるように従来手順によって多数の錠剤を調製する。適当な水性および非水性コーティングを施して嗜好性を増加させ、優雅さおよび安定性を改善する、または吸収を遅らせることができる。
【０１１１】
即時放出錠剤／カプセル剤：これらは従来のおよび新規な方法によって製造される固体経口剤形である。これらの単位を、薬剤の即時溶解および送達のために水なしで経口的に服用させる。有効成分を、糖、ゼラチン、ペクチンおよび甘味剤などの成分を含む液体に混合する。これらの液体を、凍結乾燥および固相抽出技術によって固体錠剤またはカプレットに凝固する。薬剤化合物を粘弾性および熱弾性の糖およびポリマーまたは発泡性成分を用いて圧縮して、水を必要としない即時放出を意図した多孔質マトリックスを製造することができる。
【０１１２】
用量および投与
標準的な毒性試験による、哺乳動物において上で識別された状態の治療を決定するための標準的薬理学的アッセイによる、そしてこれらの結果とこれらの状態を治療するために使用される既知の医薬品の結果との比較による、P2X4の影響を受ける障害および／または疾患の治療に有用な化合物を評価するために公知の標準的実験室技術に基づいて、本発明の化合物の有効投与量は、それぞれの望ましい適応症の治療について容易に決定することができる。これらのうちのある状態の治療で投与されるべき有効成分の量は、使用される特定の化合物および投与量単位、投与様式、治療期間、治療される患者の年齢および性別、ならびに治療される状態の性質および程度などの考慮事項により広く変化し得る。
【０１１３】
投与される式Iの化合物の総量は、一般に、約0．1mg／kg〜約50mg／kg体重／日、より特に、約0．2mg／kg〜約30mg／kg体重／日、より特に、約0．5mg／kg〜約15mg／kg体重／日に及ぶ。
【０１１４】
臨床的に有用な投与スケジュールは、1日1回〜3回の投与から4週間に1回の投与に及ぶ。さらに、患者が一定期間薬剤を投与されない「休薬日」が、薬理学的効果と耐容性との間の全体的なバランスに有益となり得る。単位用量は、約5mg〜約500mgの有効成分、特に約25mg〜約150mgを含んでよく、1日1回もしくは複数回または1日1回未満投与されてよい。
【０１１５】
本発明の実施形態の特定の形態によれば、本発明の化合物の投与のための経口単位用量には、それだけに限らないが、1日1回〜3回から1週間に1回、0．5mg／kg〜約10mg／kg体重が含まれる。
【０１１６】
静脈内、筋肉内、皮下および非経口注射を含む注射による投与、ならびに注入技術の使用のための平均1日投与量は、本発明の実施形態の特定の形態によれば、0．5〜50mg／kg総体重であろう。
【０１１７】
平均1日直腸投与レジメンは、0．5〜50mg／kg総体重であることが好ましい。
【０１１８】
平均1日局所投与レジメンは、好ましくは1日1回〜4回投与される0．5〜50mg／kgであろう。
【０１１９】
平均1日吸入投与レジメンは、0．5〜30mg／kg総体重であることが好ましい。
【０１２０】
当然、各患者のための具体的な初期および継続投与レジメンは、主治診断医により決定される状態の性質および重症度、使用される具体的な化合物の活性、患者の年齢および全身状態、投与期間、投与経路、薬剤の排泄率、薬剤の組合せなどによって変化する。本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルもしくは組成物の所望の治療様式および投与回数は、従来の治療試験を用いて当業者によって確認され得る。
【０１２１】
血液脳関門（BBB）は、脳の毛細血管内皮によって形成され、神経治療薬として意図される大分子の約100％と全ての小分子の98％超を脳から除去するフィルターとして機能する。脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、および脊髄損傷の急性期には、BBBは危険にさらされ、除外機能を実行するそのジャンクションが弱められる。上記で識別された障害の発症から、ISの発症からBBBの閉鎖までの時間枠内で、脳の特定の領域に治療薬を送達することが特に好ましい。
【０１２２】
本明細書に記載および定義される一般式（I）の化合物、または前記化合物のN−オキシド、塩、互変異性体もしくは立体異性体、または前記N−オキシド、互変異性体もしくは立体異性体の塩、特にその薬学的に許容される塩、またはこれらの混合物は、有利には、化合物がBBBを適切な量で通過するように、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、および脊髄損傷、特にISの発症から、疾患の発症からBBBの回復に至るまで投与される。
【０１２３】
より詳細には、一般式（I）の化合物、例えば2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミドなどは、有利には、例えばISのような疾患の発症から、最大約1カ月、より詳細には最大約3週間、より詳細には最大約2週間、より詳細には最大約10日まで投与される。
【０１２４】
より詳細には、一般式（I）の化合物、例えば2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミドなどは、有利には、疾患の発症から6時間以内、より詳細には3時間以内に投与される。
【０１２５】
疾患の発症は、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、または脊髄損傷が起こる正確な時間だけでなく、そのような疾患の症状が確認された時間またはそのような疾患が、例えば、コンピュータ断層撮影法（CT）または磁気共鳴画像法（MRI）によって識別された時間と考えることができる。
【０１２６】
併用療法
本発明における「組合せ」という用語は、当業者に知られているように使用され、固定した組合せ、固定していない組合せまたはパーツキットとして存在し得る。
【０１２７】
本発明における「固定した組合せ」は、当業者に知られているように使用され、前記第1の有効成分および前記第2の有効成分が1つの単位投与量または単一実体中に一緒に存在する組合せとして定義される。「固定した組合せ」の1つの例は、前記第1の有効成分および前記第2の有効成分が同時投与用の混和物、例えば、製剤中に存在する医薬組成物である。「固定した組合せ」の別の例は、前記第1の有効成分および前記第2の有効成分が混和していないが一単位中に存在する医薬組合せである。
【０１２８】
本発明における固定していない組合せまたは「パーツキット」は、当業者に知られているように使用され、前記第1の有効成分および前記第2の有効成分が2つ以上の単位中に存在する組合せとして定義される。固定していない組合せまたはパーツキットの1つの例は、前記第1の有効成分および前記第2の有効成分が別々に存在する組合せである。固定していない組合せまたはパーツキットの成分は、別々に、順次、同時に、同時発生的にまたは時差的に交互に投与することができる。
【０１２９】
本発明の化合物は、唯一の医薬剤として、または組合せが許容できない有害効果をもたらさない1種以上の他の医薬剤との組合せで投与することができる。本発明はまた、このような組合せに関する。
【０１３０】
さらに、本発明の化合物を、P2X4に関連するかまたはP2X4によって媒介される疾患の治療および／または予防のために既に承認されているまたはまだ開発中の治療薬または有効成分と組み合わせることができる。
【０１３１】
脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の治療および／または予防のために、本発明の化合物は、それぞれの標準治療（SOC）、つまり血圧安定化（通常、BPの低下）を含む基本的な集中治療室治療、再開通（例えばrtPAによる薬理学的静脈溶解および／または動脈内血栓抽出による機械的再開通）、例えばグリセロール、マンニトールまたは高張食塩水による浸透圧療法による脳浮腫の治療、ならびに／あるいはグルココルチコイドによる治療に加えて、組み合わせて、または併用薬物として投与することができる。
【０１３２】
脳虚血、虚血性脳損傷、虚血性脳卒中（IS）、出血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷の治療および／または予防のために、本発明の化合物は、抗血栓剤として適用できる任意の物質、特にグリコサミノグリカン類などの抗凝固剤（ヘパリン、低分子量ヘパリン、ダナパロイドなど）、直接トロンビン阻害剤（例えばアルガトロバン、アンチトロンビンまたはプロテインCなど）、抗血小板薬アスピリン（登録商標）、またはクロピドグレル、糖タンパク質IIb／IIIa受容体遮断薬（アブシキシマブまたはエプチフィバチド（Integrilin（登録商標）））、線維素溶解薬（例えばストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼまたはアルテプラーゼなど）と組み合わせて、または併用薬物として投与することができる。非常に特定の例は、アスピリン（登録商標）と一緒の本発明の化合物の投与または併用薬物療法（comedicaton）である。
【０１３３】
本発明の化合物は、炎症性疾患、炎症性疼痛または全身疼痛状態を治療することを意図した他の薬理学的薬剤および化合物と組み合わせることができる。
【０１３４】
特定の薬理学的または薬学的特性について試験する方法は当業者に周知である。
【０１３５】
本明細書に記載される実施例の試験実験は本発明を説明するのに役立つが、本発明は示される例に限定されない。
【０１３６】
当業者に理解されるように、本発明は本明細書に記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲内にある前記実施形態の全ての修正を包含する。
【０１３７】
以下の実施例は、本発明を制限することなく、より詳細に説明する。その調製が明示的に記載されていない本発明によるさらなる化合物は、類似の方法で調製することができる。
【０１３８】
実施例で言及される化合物およびその塩は、本発明の好ましい実施形態ならびに具体的な実施例により開示される式（I）の化合物の残基の全てのサブコンビネーションを網羅する請求項を表す。
【０１３９】
実験節内の「により」という用語は、言及された手順が「に類似して」使用されるという意味で使用される。
【０１４０】
化合物の合成
以下のスキームおよび一般的手順は、本発明の一般式（I）の化合物への一般的な合成経路を示すが、限定的であることを意図していない。スキーム1〜5に例示されている変換の順序を様々に修正することができることが当業者に自明である。そのため、スキーム1〜5に例示されている変換の順序は限定的であることを意図していない。さらに、例示される変形の前および／または後で、置換基、例えば、残基R1、R2、またはR11の相互変換を行うことができる。これらの修飾は、例えば、保護基の導入、保護基の切断、官能基の還元もしくは酸化、ハロゲン化、金属化、置換または当業者に知られている他の反応などであり得る。これらの変換には、置換基のさらなる相互変換を可能にする官能基を導入するものが含まれる。適当な保護機ならびにその導入および切断は当業者に周知である（例えば、T．W．GreeneおよびP．G．M．WutsのProtective Groups in Organic Synthesis、第3版、Wiley 1999参照）。
【０１４１】
本発明の化合物を調製するために使用される全ての試薬は市販されている、文献で公知である、または記載されるように調製することができる。
【０１４２】
【化６】
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スキーム1：式6に相当する一般式（I）および（Ia）の化合物の調製のための一般的手順。R1は、本発明の明細書および特許請求の範囲に定義される通りであり、Wは、水素および／または保護基PG（例、（ジメチルアミノ）メチレン、2，4−ジメトキシベンジル）を含むいずれかのアミンに相当し、Vは、LG、塩化物または臭化物に相当し、LGは、脱離基（例、塩化物、フッ化物、トシル）に相当し、R2は、求核窒素を含む複素芳香族系（例、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール）であり、この窒素原子で求核芳香族置換を受ける。
【０１４３】
一般式6の化合物は、スキーム1に示されるように合成することができる。当業者は、塩化スルホニル1を保護されたスルホニルアミド2に変換することができ、そして以降のステップに適した保護基PGを選択することができるであろう。適した保護基PGの例は、2，4−ジメトキシベンジルまたは（ジメチルアミノ）メチレンである。Vが脱離基LG（例、フッ化物、塩化物、トシル）に相当する場合、化合物2は、適した溶媒（例、アセトニトリル）中、適した塩基（例、炭酸カリウム、炭酸セシウム、．．．）の存在下で、求核窒素（例、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、．．．）を含有する複素芳香族系R2Hとの求核芳香族置換反応で、新しいC−N−結合を形成すると同時に化合物3に変換されることができる。Vが塩化物または臭化物に相当する場合、化合物3は、窒素含有複素芳香族系（例、1，2，3−トリアゾール）による、適した触媒系（例、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム／ジ−tert−ブチル（2’，4’，6’−トリイソプロピル−3，4，5，6−テトラメチル−［1，1’−ビフェニル］−2−イル）ホスフィン／カリウムホスフェート／トルエン）の存在下での金属触媒C−Nカップリング反応で形成され得る。次のステップで、ニトロ化合物3は、例えばPd、Pt、FeまたはSn系触媒の存在下、エタノール、メタノール、ジオキサンまたはテトラヒドロフランなどの極性溶媒中、水素化条件下で還元することにより、相当するアニリン4に変換され得る。アニリン4は、塩化アシルとの反応によるか、または全て既知の手順、例えばカップリング試薬（例、HATU）の存在下での相当するカルボン酸の反応などを用いる標準的なペプチド結合形成によって、相当するアミド5に変換され得る。最後のステップで、アミド5は脱保護されて所望のスルホンアミド6となる。脱保護条件は、使用される保護基に依存する（例、2，4−ジメトキシベンジルの場合はTFA／ジクロロメタン、または（ジメチルアミノ）メチレンの場合はアンモニア水／メタノール）。
【化７】
2021501178.tif 000009
スキーム2：式13に相当する一般式（I）および（Ib）の化合物の調製のための一般的手順。R1は、本発明の明細書および特許請求の範囲に定義される通りであり、Wは、水素を有するアミンおよび／または保護基PG（例、（ジメチルアミノ）メチレン）のいずれかに相当し、Arは、アリールであり、R2は、求核窒素を含む複素芳香族系（例、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール）であり、この窒素原子で求核芳香族置換を受ける。
【０１４４】
一般式13の化合物は、スキーム2に示されるように合成することができる。当業者は、塩化スルホニル7を保護されたスルホニルアミド8に変換することができ、そして以降のステップに適した保護基PGを選択することができるであろう。適した保護基PGの例は、（ジメチルアミノ）メチレンである（スルホニルクロリド7とアンモニアの反応、次にDMF中1，1−ジメトキシ−N，N−ジメチルメタンアミンとの反応）。保護および脱保護戦略を用いて、適した触媒の存在下での8のバックワルドアミノ化（例えば国際公開第2011120026A1号パンフレットを参照）により、中間体9がもたらされる。適した溶媒（例、アセトニトリル）中、適した塩基（例、炭酸カリウム、．．．）の存在下での、求核窒素（例、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、．．．）を含有する複素芳香族系R2Hとの求核芳香族置換反応により、ピリジン10がもたらされる。10の脱保護（Y＝−N＝CAr2の例で酸性条件下）の後に、結果として生じるアニリン11のアミド12への変換、例えば塩化アシルとの反応によるか、または全ての既知の手順、例えばカップリング試薬（例、HATU）の存在下での相当するカルボン酸の反応などを用いる標準的なペプチド結合形成による変換が続く。最後のステップで、アミド12は脱保護されて所望のスルホンアミド13となる。脱保護条件は、使用される保護基に依存する（例、（ジメチルアミノ）メチレンの場合はアンモニア水／メタノール）。
【化８】
2021501178.tif 000010
スキーム4：式28に相当する一般式（I）および（Ia）の化合物を調製するための一般的な手順。R1およびR2は、本発明の明細書および特許請求の範囲に定義される通りであり、B（OZ）2は、B（OH）2またはB（O2C6H12）または両方の混合物に相当し、Wは水素を有するアミンおよび／または保護基PG（例、（ジメチルアミノ）メチレン、2，4−ジメトキシベンジル）のいずれかに相当する。
【０１４５】
一般式28の化合物は、スキーム4に示されるように合成することができる。相当する塩化スルホニル23（Vは臭化物または塩化物のいずれかである）から出発し、C−結合アリールおよびヘテロアリール誘導体を、例えば、当業者に公知の鈴木クロスカップリング反応を介して調製することができる。保護されたスルホンアミド24の一般式25をもつアリール／ヘテロアリール化合物への変換は、プロトン性（例、イソプロパノール）または非プロトン性溶媒中、パラジウム触媒作用下で、相当するボロン酸（またはそのエステルもしくは混合物）との反応によって達成することができる。相当するアミン26は、例えばPd、Pt、FeまたはSn系触媒の存在下、エタノールまたはテトラヒドロフランなどの極性溶媒中、水素化条件下での還元によって、中間体25から得ることができる。その後の相当するアミド27へのアシル化は、例えば塩化アシルとの反応によるか、または全ての既知の手順、例えばカップリング試薬（例、HATU）の存在下での相当するカルボン酸の反応などを用いる標準的なペプチド結合形成によって達成され得る。Wは保護基に等しいので、例えばトリフルオロ酢酸（TFA）によるその後の脱保護により、一般式28の化合物が得られる。
【０１４６】
あるいは、中間体24とV＝Brから出発し、例えばPt、FeまたはSn系触媒の存在下、エタノールまたはテトラヒドロフランなどの極性溶媒中、水素化条件下での還元によって、アミン29が得られる。相当するアミド30aは、塩化アシルとの反応によるか、または全ての既知の手順を用いる標準的なペプチド結合形成によって得ることができる。その後のアリール化／ヘテロアリール化（例えばパラジウム触媒クロスカップリングを使用）により、中間体27を得ることができる。あるいは臭化物30aを相当するボロン酸／エステル中間体31（B（OZ）2＝B（OH）2またはB（O2C6H12））に変換し、例えば当業者に公知のパラジウム触媒作用を用いてさらに反応させて中間体27を得ることができる。これは脱保護の後に一般式28をもつ最終生成物を生じる。
【化９】
2021501178.tif 000011
スキーム5：式35に相当する一般式（I）および（Ib）の化合物を調製するための一般的な手順。R1およびR2は、本発明の明細書および特許請求の範囲に定義される通りであり、Wは水素および／または保護基PG（例、（ジメチルアミノ）メチレン、2，4−ジメトキシベンジル）を含むいずれかのアミンに相当し、Arはアリールである。
【０１４７】
一般式35の化合物は、スキーム5に示されるように合成することができる。中間体9から出発し、C−結合アリールおよびヘテロアリール誘導体32を、例えば、当業者に公知のパラジウムクロスカップリング（例、鈴木反応）を介して調製することができる（例えば米国特許出願公開第20110281865号参照）。例えば酸性条件下での脱保護により、アミン33が得られる。その後の相当するアミドへのアシル化は、例えば塩化アシルとの反応によるか、または全ての既知の手順、例えばカップリング試薬（例、HATU）の存在下での相当するカルボン酸の反応などを用いる標準的なペプチド結合形成によって達成され得る。Wは保護されたアミノ官能基に等しいので、その後の脱保護（例えば（ジメチルアミノ）メチレンが保護基の場合にはアンモニア水を用いる）により、一般式35の化合物が得られる。
【化１０】
2021501178.tif 000012
スキーム6：式30aの化合物を調製するための一般的な手順。R1は、本発明の明細書および特許請求の範囲に定義される通りであり、Wは、水素および／または保護基PG（例、（ジメチルアミノ）メチレン、2，4−ジメトキシベンジル）を含むいずれかのアミンに相当する。
【０１４８】
一般式30aの化合物は、スキーム6に示されるように合成することができる。相当するアニリン36から出発し、臭素化（例、DMF中NBSによる）によってブロモアニリン37がもたらされる。その後の相当するアミド38へのアシル化は、例えば塩化アシルとの反応によるか、または全ての既知の手順、例えばカップリング試薬（例、HATU）の存在下での相当するカルボン酸の反応などを用いる標準的なペプチド結合形成によって達成され得る。その後のスルホンアミド部分の（例、DMF中1，1−ジメトキシ−N，N−ジメチルメタンアミンを用いる）保護により、例えばスキーム4に記載される鈴木の化学を使用してさらに変換することができる保護されたアミド30aがもたらされる。
【０１４９】
本発明による化合物は、それ自体公知の様式で、例えば、真空中で溶媒を留去し、適切な溶媒から得られた残渣を再結晶するか、またはこれを適切な支持材料上でのクロマトグラフィーなどの慣用的な精製方法の1つに供することによって単離および精製される。さらに、例えば、十分に塩基性または酸性の官能性を有する本発明の化合物の逆相分取HPLCによって、塩の形成、十分に塩基性の本発明の化合物の場合は例えばトリフルオロ酢酸塩またはギ酸塩を、あるいは、十分に酸性の本発明の化合物の場合は例えばアンモニウム塩を得ることができる。この種の塩を、当業者に知られている種々の方法によって、それぞれその遊離塩基もしくは遊離酸型に変換することができるし、後の生物学的アッセイに塩として使用することもできる。さらに、本発明の化合物の単離の間の乾燥工程は、特にギ酸またはトリフルオロ酢酸などの微量の共溶媒を完全に除去して溶媒和物または包接複合体を得ることはできない。当業者は、どの溶媒和物または包接複合体が、その後の生物学的アッセイにおいて使用するために許容されるかを認識するだろう。本明細書に記載される単離される本発明の化合物の具体的な形態（例、塩、遊離塩基、溶媒和物、抱接複合体）は必ずしも具体的な生物学的活性を定量化するために前記化合物を生物学的アッセイに適用することができる唯一の形態ではないことを理解すべきである。
【０１５０】
本発明による式（I）、（Ia）および（Ib）の化合物の塩は、遊離化合物を、所望の酸もしくは塩基を含有する、またはその後所望の酸もしくは塩基を添加する適切な溶媒（例えば、アセトン、メチルエチルケトンもしくはメチルイソブチルケトンなどのケトン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランもしくはジオキサンなどのエーテル、塩化メチレンもしくはクロロホルムなどの塩素化炭化水素、またはメタノール、エタノールもしくはイソプロパノールなどの低分子量脂肪族アルコール）に溶解することによって得ることができる。酸または塩基は、一塩基性または多塩基性の酸または塩基が関与するかどうか、あるいはどの塩が所望されるかに応じて、等モル量比またはそれとは異なる比で塩の調製に使用することができる。塩は、濾過、再沈殿、塩の非溶媒を用いる沈殿、または溶媒の蒸発によって得られる。得られた塩を、遊離化合物に変換し、今度はこれを塩に変換することができる。このようにして、例えば工業規模での製造においてプロセス生成物として得ることができる薬学的に許容されない塩を、当業者に公知の方法によって薬学的に許容される塩に変換することができる。特に好ましいのは、塩酸塩および実施例の節で使用される方法である。
【０１５１】
本発明による化合物および塩の純粋なジアステレオマーおよび純粋なエナンチオマーは、例えば、不斉合成、キラル出発化合物を合成に使用すること、ならびに合成で得られたエナンチオマーおよびジアステレオマーの混合物を分割することによって得ることができる。
【０１５２】
エナンチオマーおよびジアステレオマー混合物は、当業者に公知の方法によって純粋なエナンチオマーおよび純粋なジアステレオマーに分割することができる。好ましくは、ジアステレオマー混合物は、結晶化、特に分別結晶化またはクロマトグラフィーによって分離される。エナンチオマー混合物は、例えば、ジアステレオマーをキラル補助剤で形成し、得られたジアステレオマーを分離し、キラル補助剤を除去することによって分離することができる。キラル補助剤として、例えば、キラル酸を用いてエナンチオマー塩基を分離することができ、例えば、マンデル酸およびキラル塩基を用いてジアステレオマー塩の形成によってエナンチオマー酸を分離することができる。さらに、ジアステレオマー誘導体、例えばジアステレオマーエステルは、それぞれ、キラル補助剤として、キラル酸またはキラルアルコールを用いて、それぞれ、アルコールのエナンチオマー混合物または酸のエナンチオマー混合物から形成することができる。さらに、エナンチオマー混合物を分離するために、ジアステレオマー複合体またはジアステレオマー包接体を使用することができる。あるいは、クロマトグラフィーにおけるキラル分離カラムを用いてエナンチオマー混合物を分割することができる。エナンチオマーを単離するための別の適切な方法は、酵素分離である。
【０１５３】
本発明の好ましい一態様は、一般式（I）（Ia）もしくは（Ib）の化合物または前記化合物のN−オキシド、塩、互変異性体もしくは立体異性体、または実施例に記載の前記N−オキシド、互変異性体または立体異性体の塩、ならびにそれらの調製に使用される中間体の調製のためのプロセスである。
【０１５４】
場合により、式（I）、（Ia）および（Ib）の化合物をそれらの塩に変換することができる、または場合により、式（I）、（Ia）および（Ib）の化合物の塩を遊離化合物に変換することができる。相当するプロセスは当業者にとって慣用的である。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】QPatch16Xによるパッチクランプ分析における調査中の化合物の適用プロトコルを示す概略図である。
【図２ａ１】ドナー１における、ATP刺激後のヒト全血中でのIL−1βの生成への実施例19、28および39による化合物の効果を示す。
【図２ａ２】ドナー２における、ATP刺激後のヒト全血中でのIL−1βの生成への実施例19、28および39による化合物の効果を示す。
【図２ａ３】ドナー３における、ATP刺激後のヒト全血中でのIL−1βの生成への実施例19、28および3による化合物の効果を示す。
【図２ｂ１】ドナー１における、ATP刺激後のヒト全血中でのIL−1βの生成への実施例321、326および380による化合物の効果を示す。
【図２ｂ２】ドナー２における、ATP刺激後のヒト全血中でのIL−1βの生成への実施例321、326および380による化合物の効果を示す。
【図２ｂ３】ドナー３における、ATP刺激後のヒト全血中でのIL−1βの生成への実施例321、326および380による化合物の効果を示す。
【図３】ラットにおけるtMCAO誘発性虚血性脳卒中モデルの神経学的重症度スコア（mNSS）における、実施例39による化合物の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５６】
実験部
略語
以下の表は、この段落ならびに中間体実施例および実施例説で使用される略語が本文中で説明されていない限り、これらを列挙している。
【表１Ａ】
2021501178.tif 000013
【表１Ｂ】
2021501178.tif 000014
【０１５７】
他の略語は、それ自体当業者にとって慣例の意味を有する。
【０１５８】
本出願に記載される本発明の種々の態様を以下の実施例によって示すが、これらは本発明を限定することを何ら意図していない。
【０１５９】
具体的な実験の説明
以下の具体的な実験の説明中のNMRピーク形態はスペクトルに現れる通りに言及し、考えられる高次効果は考慮しなかった。マイクロ波照射を使用する反応は、場合によりロボット装置を備えたBiotage Initator（登録商標）マイクロ波オーブンで行うことができる。マイクロ波加熱を使用する報告反応時間は、示された反応温度に達した後の固定反応時間として理解することを意図している。本発明の方法により製造された化合物および中間体は精製を必要とし得る。有機化合物の精製は当業者に周知であり、同化合物を精製するいくつかの方法が存在し得る。いくつかの場合、精製は必要でない場合もある。いくつかの場合、結晶化によって化合物を精製することができる。いくつかの場合、適当な溶媒を用いて不純物を撹拌することができる。いくつかの場合、例えば、Separtis製の予備充填シリカゲルカートリッジ、例えば、Isolute（登録商標）FlashシリカゲルまたはIsolute（登録商標）Flash NH2シリカゲルをIsolera（登録商標）自動精製装置（Biotage）および溶離液、例えば、ヘキサン／酢酸エチルまたはDCM／メタノールの勾配と組み合わせて使用して、クロマトグラフィー、特にフラッシュカラムクロマトグラフィーによって化合物を精製することができる。いくつかの場合、例えば、ダイオードアレイ検出器および／またはオンラインエレクトロスプレーイオン化質量分析計を備えるWaters自動精製装置を適当な予備充填逆相カラムおよび溶離液、例えば、トリフルオロ酢酸、ギ酸またはアンモニア水などの添加剤を含み得る水およびアセトニトリルの勾配と組み合わせて使用して、分取HPLCによって化合物を精製することができる。一部の例では、上記のような精製方法によって、例えば、十分に塩基性または酸性の官能性を有する本発明の化合物を塩の形態で、十分に塩基性の本発明の化合物の場合は例えばトリフルオロ酢酸塩またはギ酸塩を、あるいは、十分に酸性の本発明の化合物の場合は例えばアンモニウム塩を得ることができる。この種の塩を、当業者に知られている種々の方法によって、それぞれその遊離塩基もしくは遊離酸型に変換することができるし、後の生物学的アッセイに塩として使用することもできる。本明細書に記載される単離される本発明の化合物の具体的な形態（例、塩、遊
離塩基など）は必ずしも具体的な生物学的活性を定量化するために前記化合物を生物学的アッセイに適用することができる唯一の形態ではないことを理解すべきである。
【０１６０】
以下の実施例で報告される百分率収率は、最低モル量で使用された出発成分に基づく。ほとんどの反応条件は収率のために最適化しなかった。空気および水分に敏感な液体および溶液を注射器またはカニューレを介して移し、ゴム隔壁を通して反応容器に導入した。市販グレードの試薬および溶媒を、さらに精製することなく使用した。「真空中で濃縮」という用語は、約15mmHgの最低圧力でBuchiロータリーエバポレーターを使用することを指す。全ての温度は摂氏（℃）で補正しないで報告する。
【０１６１】
本発明をより良く理解することができるようにするために、以下の例を示す。これらの例は単なる例示の目的のためのものであり、本発明の範囲をいかなる方法でも限定するものと解釈されるべきでない。本明細書で言及される全ての刊行物は、全体が参照により組み込まれる。
【０１６２】
分析用LC−MSおよびUPLC−MS条件
後の具体的な実験の説明において与えられるLC−MSおよびUPLC−MSデータは、（別段の記載がない限り）以下の条件を指す：
【０１６３】
方法A
機器：Waters Acquity UPLC MS SingleQuad；カラム：Acquity UPLC BEH C18 1．7μm、50x2．1mm；溶離液A：水＋0．1体積％ギ酸（99％）、溶離液B：アセトニトリル、勾配：0〜1．6分1〜99％B、1．6〜2．0分99％B；流量0．8ml／分；温度：60℃；DADスキャン：210〜400nm。
【０１６４】
方法B
機器：Waters Acquity UPLC MS SingleQuad；カラム：Acquity UPLC BEH C18 1．7μm、50x2．1mm；溶離液A：水＋0．2体積％アンモニア水（32％）、溶離液B：アセトニトリル、勾配：0〜1．6分1〜99％B、1．6〜2．0分99％B；流量0．8ml／分；温度：60℃；DADスキャン：210〜400nm。
【０１６５】
フラッシュカラムクロマトグラフィー条件
その後の具体的な実験の説明に記載されている「（フラッシュ）カラムクロマトグラフィーによる精製」とは、Biotage Isolera精製システムの使用を指す。技術仕様については、www．biotage．comの「Biotage製品カタログ」を参照されたい。
【０１６６】
一般的な実験手順
【化１１】
2021501178.tif 000015
一般的手順GP1．2
スルホンアミドA（例、1．29mmol）をアセトニトリル（1．29mmolスケールの例では15mL）に溶解し、微粉末炭酸カリウム（3．0当量）および相当するアゾール（1．5当量）を添加した。TLCが出発材料の消費を示すまで、撹拌を100〜110℃で継続した。溶媒を減圧下で除去し、引き続いて水およびジクロロメタンを添加した。その後、相を分離し、有機相を乾燥させ、これを真空中で濃縮した。粗生成物を、さらに精製することなく使用するか、または実施例に示されるように精製した。
【化１２】
2021501178.tif 000016
【０１６７】
一般的手順GP2．1
粗ニトロ化合物B（例、1．29mmol）を、ジオキサン（1．29mmolスケールの例では15mL）に溶解し、塩化スズ（II）二水和物（3．0当量）を添加し、反応混合物を70℃で2時間撹拌した。室温に冷却した後、反応混合物を濾過し、真空中で濃縮した。濾液は、さらに精製することなく使用するか、または実施例に示されるように精製した。
【０１６８】
一般的手順GP2．2
粗ニトロ化合物B（例、1．29mmol）を、ジオキサン（1．29mmolスケールの例では15 mL）に溶解し、塩化スズ（II）二水和物（5．0当量）を添加し、反応混合物を70℃で2時間撹拌した。室温に冷却した後、反応混合物を濾過し、真空中で濃縮した。濾液は、さらに精製することなく使用するか、または実施例に示されるように精製した。
【化１３】
2021501178.tif 000017
【０１６９】
一般的手順GP3．4
粗置換アニリンC（1．29mmol）を、ジメチルホルムアミド（1．29mmolスケールの例では10mL）に溶解し、続いて相当する酸（実施例で示される量）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン（酸に基づいて2．0当量）およびHATU（酸に基づいて1．0当量）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌するか、またはTLCが出発材料の消費を示すまで50℃で加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を真空中で濃縮した。酢酸エチルおよび水を添加し、有機相を乾燥させ、真空中で濃縮した。粗生成物をさらに精製することなく使用した。
【０１７０】
一般的手順GP3．5
粗置換アニリンC（1．29mmol）を、ジメチルホルムアミド（1．29mmolスケールの例では10mL）に溶解し、続いて相当する酸（実施例で示される量）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン（酸に基づいて4．0当量）およびHATU（酸に基づいて1．3当量）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌するか、またはTLCが出発材料の消費を示すまで50℃で加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を真空中で濃縮した。酢酸エチルおよび水を添加し、有機相を乾燥させ、真空中で濃縮した。粗生成物をさらに精製することなく使用した。
【化１４】
2021501178.tif 000018
【０１７１】
一般的手順GP4．1
粗アミドD（例、1．29mmol）をジクロロメタン（1．29mmolスケールの例では5〜10mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（50当量）を添加し、TLCが出発材料の消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチルおよび水を粗生成物に添加し、有機相を乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。得られた残渣を実施例に示されるように精製した。水抽出を用いない精製も可能であったが、HPLC精製をより困難にした。
【０１７２】
一般的手順GP4．2
粗アミドD（例、1．29mmol）をジクロロメタン／トリフルオロ酢酸2／1（1．29mmolスケールの例では6mL）に溶解し、TLCが出発材料の消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチルおよび水を粗生成物に添加し、有機相を乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。得られた残渣を実施例に示されるように精製した。水抽出を用いない精製も可能であったが、HPLC精製をより困難にした。
【化１５】
2021501178.tif 000019
【０１７３】
一般的手順GP5．1
置換アニリンCの溶液（1−メチル−2−ピロリドン0．4mL中0．20mmol）、相当する酸（1−メチル−2−ピロリドン0．8mL中0．40mmol）、HATU（1−メチル−2−ピロリドン0．8mL中0．40mmol）、N−メチルモルホリン（4−ジメチルアミノピリジン2．5％含有1−メチル−2−ピロリドン0．267mL中0．80mmol）を加え、一晩振盪した。次に、これを真空中で濃縮し、残渣をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン3／1（水5％含有、2mL）に再溶解した。反応混合物を再び一晩振盪し、続いて真空濃縮およびHPLCによる精製を行った。
【化１６】
2021501178.tif 000020
【０１７４】
一般的手順GP6．1
粗置換アニリンF（0．137mmol）を、ジメチルホルムアミド（0．137mmolスケールの例では2mL）に溶解し、続いて相当する酸（実施例で示される量）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン（酸に基づいて2．7当量）およびHATU（酸に基づいて1．0当量）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、続いて真空中で濃縮した。酢酸エチルおよび水を添加し、有機相を乾燥させ、真空中で濃縮した。
【０１７５】
粗生成物をメタノール（1mL）に再溶解し、濃アンモニア水（70μL）で処理し、一晩撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、実施例に示されるように精製した。
【０１７６】
中間体の合成
2−クロロ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド
【化１７】
2021501178.tif 000021
2−クロロ−5−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（10．8g、42．2mmol）のジクロロメタン（108mL）中溶液に、重炭酸ナトリウム（7．09g、84．4mmol）および1−（2，4−ジメトキシフェニル）メタンアミン（7．05 g、42．2mmol）を添加した。混合物を一晩撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、引き続いて水（75mL）および酢酸エチル（75mL）を添加した。10分間撹拌した後、得られた沈殿を濾過により分離し、これを40℃で一晩真空中で乾燥させて、表題化合物（14．1g、36．5mmol、収率86％）を得た。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．17分；MS（ESIneg）：m／z＝385［M−H］−
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．56（s，3H），3．61（s，3H），4．08（s，2H），6．10（d，1H），6．26（dd，1H），7．04（d，1H），7．79（d，1H），8．19（d，1H），8．28（dd，1H），8．45（s，1H）．
【０１７７】
N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロ−2−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ベンゼンスルホンアミド
【化１８】
2021501178.tif 000022
2−クロロ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（5．69g、14．7mmol）のアセトニトリル（170mL）中溶液に、4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール（3．00g、22．1mmol）および粉末炭酸カリウム（6．09g、44．1mmol）を添加し、これを100℃で一晩撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をジクロロメタンおよび水で抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下で濃縮することにより、粗表題化合物がもたらされ（7．50g、定量的、純度約95％）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法B）：Rt＝1．31分；MS（ESIpos）：m／z＝487［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．52（s，3H），3．64（s，3H），4．15（d，2H），6．18（d，1H），6．29（dd，1H），7．08（d，1H），7．93（d，1H），8．03−8．09（m，1H），8．25（d，1H），8．39（s，1H），8．49（dd，1H），8．94（s，1H）．
【０１７８】
2−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド
【化１９】
2021501178.tif 000023
2−クロロ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（5．03g、13．0mmol）のアセトニトリル（150mL）中溶液に、4−クロロ−1H−ピラゾール（2．00g、19．5mmol）および粉末炭酸カリウム（5．39g、39．0mmol）を添加し、これを100℃で一晩撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をジクロロメタンおよび水で抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、乾燥させた。真空で濃縮することにより、粗表題化合物がもたらされ（6．27g、定量的、純度約95％）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．26分；MS（ESIpos）：m／z＝453［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．48（s，3H），3．62（s，3H），4．15（s，2H），6．14（d，1H），6．27（dd，1H），7．08（d，1H），7．84（d，1H），8．05（s，1H），8．09（d，1H），8．21（d，1H），8．45（dd，1H），8．57（s，1H）．
【０１７９】
N−（2，4−ジメトキシベンジル）−2−（4−フルオロ−1H−ピラゾール−1−イル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド
【化２０】
2021501178.tif 000024
2−クロロ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（5．00g、11．6mmol）のアセトニトリル（135mL）中溶液に、4−フルオロ−1H−ピラゾール（1．50g、17．4mmol）および粉末炭酸カリウム（4．82g、34．9mmol）を添加し、これを100℃で一晩撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をジクロロメタンおよび水で抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空で濃縮することにより、粗表題化合物がもたらされ（5．54g、定量的、純度約85％）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．23分；MS（ESIpos）：m／z＝437［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．48（s，3H），3．62（s，3H），4．13（s，2H），6．15（d，1H），6．28（dd，1H），7．09（d，1H），7．81（d，1H），8．00−8．10（m，2H），8．23（d，1H），8．43（dd，1H），8．59（s，1H）．
【０１８０】
2−（4−ブロモ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド
【化２１】
2021501178.tif 000025
2−クロロ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（1．75g、4．54mmol）のアセトニトリル（53mL）中溶液に、4−ブロモ−1H−ピラゾール（1．00g、6．80mmol）および粉末炭酸カリウム（1．88g、13．6mmol）を添加し、これを100℃で一晩撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をジクロロメタンおよび水で抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空で濃縮することにより、粗表題化合物がもたらされ（2．38g、定量的、純度約95％）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．29分；MS（ESIpos）：m／z＝497［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．48（s，3H），3．62（s，3H），4．13（s，2H），6．15（d，1H），6．28（dd，1H），7．09（d，1H），7．84（d，1H），8．00−8．10（m，2H），8．23（s，1H），8．43（dd，1H），8．65（s，1H）．
【０１８１】
2−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド
【化２２】
2021501178.tif 000026
2−クロロ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（15．0g、38．8mmol）のアセトニトリル（450mL）中溶液に、1H−ピラゾール−4−カルボニトリル（5．41g、93．1mmol）および粉末炭酸カリウム（16．1g、116mmol）を添加し、これを100℃で一晩撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を酢酸エチルおよび水で抽出した。純粋な表題化合物が沈殿し、これを濾別した（9．09g 20．5mmol、収率53％、純度97％）、有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空濃縮により、さらなる粗表題化合物がもたらされた（9．11g、純度約60％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝1．17分；MS（ESIneg）：m／z＝442［M−H］−
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．53（s，3H），3．64（s，3H），4．08（s，2H），6．20（d，1H），6．29（dd，1H），7．07（d，1H），7．89（d，1H），8．12（br s，1H），8．30（br s，1H），8．41−8．54（m，2H），9．17（br s，1H）．
【０１８２】
5−アミノ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−2−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ベンゼン−スルホンアミド
【化２３】
2021501178.tif 000027
Pd／C（10％負荷、750mg）を、N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロ−2−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ベンゼンスルホンアミド（7．50g、14．7mmol）のメタノール（120mL）溶液に添加し、室温で4時間、水素雰囲気下で撹拌した。一部の酢酸エチルを添加して沈殿生成物を溶解し、続いて濾過し、洗浄し、真空濃縮して粗表題化合物を得（6．50g、定量的、純度約95％）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．20分；MS（ESIpos）：m／z＝457［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．70（s，3H），3．73（s，3H），3．94（d，2H），6．01（s，2H），6．41−6．48（m，2H），6．78（dd，1H），7．09−7．14（m，2H），7．18−7．27（m，2H），8．12（s，1H），8．56（s，1H）．
【０１８３】
5−アミノ−2−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−（2，4−ジメトキシベンジル）ベンゼンスルホンアミド
【化２４】
2021501178.tif 000028
Pt／C（10％負荷、600mg）を、粗2−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（6．27g、13．9mmol）のエタノール（100mL）溶液に添加し、室温で24時間、水素雰囲気下で撹拌した。触媒を濾別し、酢酸エチルで洗浄し、濾液を真空中で濃縮して粗表題化合物を得（5．99g、定量的、純度約90％）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．23分；MS（ESIpos）：m／z＝423［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．69（s，3H），3．72（s，3H），3．92（d，2H），5．95（s，2H），6．41−6．47（m，2H），6．76（dd，1H），7．08−7．12（m，2H），7．15（d，1H），7．19（t，1H），7．78（d，1H），8．15（d，1H）．
【０１８４】
5−アミノ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−2−（4−フルオロ−1H−ピラゾール−1−イル）ベンゼンスルホンアミド
【化２５】
2021501178.tif 000029
Pt／C（10％負荷、1．76 g）を、粗N−（2，4−ジメトキシベンジル）−2−（4−フルオロ−1H−ピラゾール−1−イル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（5．50g、12．6mmol）の、エタノール（125mL）とジオキサン（200mL）の混合物中溶液に添加し、室温で8時間、水素雰囲気下で撹拌した。触媒を濾別し、酢酸エチルで洗浄し、濾液を真空中で濃縮して粗表題化合物を得（5．07g、定量的、純度約90％）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．10分
MS（ESIpos）：m／z＝407［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．69（s，3H），3．72（s，3H），3．92（d，2H），5．93（s，2H），6．42−6．47（m，2H），6．78（dd，1H），7．08−7．19（m，4H），7．74（dd，1H），8．07（dd，1H）．
【０１８５】
5−アミノ−2−（4−ブロモ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−（2，4−ジメトキシベンジル）ベンゼンスルホンアミド
【化２６】
2021501178.tif 000030
Pt／C（10％負荷、1．76g）を、粗2−（4−ブロモ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（5．60g、12．8mmol）のエタノール（140mL）溶液に添加し、室温で14時間、水素雰囲気下で撹拌した。触媒を濾別し、酢酸エチルで洗浄し、濾液を真空中で濃縮して粗表題化合物を得（1．87g、定量的、純度約90％）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．18分；MS（ESIpos）：m／z＝467［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．69（s，3H），3．72（s，3H），3．92（d，2H），5．95（s，2H），6．39−6．48（m，2H），6．77（dd，1H），7．08−7．23（m，4H），7．79（d，1H），8．15（d，1H）．
【０１８６】
2−クロロ−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−5−ニトロベンゼンスルホンアミド
【化２７】
2021501178.tif 000031
1，1−ジメトキシ−N，N−ジメチルメタンアミン（3．02g、25．4mmol）を、2−クロロ−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（3．00g、12．7mmol）のN，N−ジメチルホルムアミド（43mL）中溶液に添加し、室温で2日間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をジクロロメタン／水で抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、乾燥させた。真空で濃縮することにより、粗表題化合物が得られ（4．18g、定量的、純度約90％）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法A）：Rt＝0．86分；MS（ESIpos）：m／z＝292［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］2．94−2．96（m，3H），3．20（s，3H），7．91（d，1H），8．31−8．33（m，1H），8．39（dd，1H），8．69（d，1H）．
【０１８７】
N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−5−ニトロ−2−［5−（トリフルオロメチル）ピリジン−3−イル］ベンゼン−スルホンアミド
【化２８】
2021501178.tif 000032
2−クロロ−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（1．10g、3．77mmol）を、脱気したn−プロパノール（33mL）に溶解し、［5−（トリフルオロメチル）ピリジン−3−イル］ボロン酸（1．08g、5．68mmol）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）ジクロリド（132mg、0．189mmol）およびトリフェニルホスフィン（49．5mg、0．189mmol）で処理した。脱気した2M炭酸カリウム水溶液（5．65mL）を添加し、バイアルを密封し、100℃で16時間撹拌した。室温に冷却した後、水を添加し、これを酢酸エチルで3回抽出し、続いて真空中で濃縮した。
【０１８８】
部分的に脱保護した標的分子を、NDMF中1，1−ジメトキシ−N，N−ジメチルメタンアミンとともに室温で撹拌することによって、以前に記載されるように再び保護した。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を分取HPLCによって精製し（Chromatorex C−18 10μm、125x30mm、アセトニトリル／水＋0．1％アンモニア水（32％））、表題化合物を得た（174mg、0．432mmol、収率11％、純度95％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝1．08分；MS（ESIpos）：m／z＝403［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］2．76（s，3H），2．99（s，3H），7．76（s，1H），7．81（d，1H），8．33−8．36（m，1H），8．52（dd，1H），8．76（d，1H），8．88（d，1H），9．09（dd，1H）．
【０１８９】
5−アミノ−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−2−［5−（トリフルオロメチル）ピリジン−3−イル］ベンゼン−スルホンアミド
【化２９】
2021501178.tif 000033
Pd／C（10％負荷、21mg）を、N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−5−ニトロ−2−［5−（トリフルオロメチル）ピリジン−3−イル］ベンゼンスルホンアミド（174mg、0．39mmol）の、メタノール（10mL）とジオキサン（10mL）の混合物中溶液に添加し、水素雰囲気下で室温で一晩撹拌した。触媒を濾別し、酢酸エチルで洗浄し、濾液を真空中で濃縮して表題化合物を得（140mg、定量的、純度95％）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法A）：Rt＝0．90分；MS（ESIpos）：m／z＝373［M＋H］＋
【０１９０】
2−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−5−ニトロベンゼンスルホンアミド
【化３０】
2021501178.tif 000034
2−クロロ−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（1．00g、3．43mmol）を、脱気したn−プロパノール（30mL）に溶解し、1−（ジフルオロメチル）−4−（4，4，5，5−テトラメチル−1，3，2−ジオキサボロラン−2−イル）−1H−ピラゾール（1．25g、5．14mmol）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）ジクロリド（121mg、0．171mmol）およびトリフェニルホスフィン（45．0mg、0．171mmol）で処理した。脱気した2M炭酸カリウム水溶液（5．14mL）を添加し、バイアルを密封し、100℃で16時間撹拌した。室温に冷却した後、水を添加し、これを酢酸エチルで3回抽出し、続いて真空中で濃縮した。
【０１９１】
残渣をメタノール（25mL）とn−プロパノール（25mL）の混合物に再溶解し、精製をより容易にするために、濃アンモニア水（50mL）を添加して標的分子を完全に脱保護した。反応混合物をジクロロメタンおよび酢酸エチルで抽出した。有機相を乾燥させ、それに続いて真空中で濃縮し、分取HPLC（Chromatorex C−18 10μm、125x30mm、アセトニトリル／水＋0．1％アンモニア水（32％））により精製して、2−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−5−ニトロベンゼンスルホンアミドを得た（383mg）。
【０１９２】
次に、脱保護した標的分子を、DMF中1，1−ジメトキシ−N，N−ジメチルメタンアミンとともに室温で撹拌することによって、以前に記載されるように再び保護した。真空濃縮により表題化合物を得（418mg）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．98分；MS（ESIpos）：m／z＝374［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］2．76（d，3H），3．02（s，3H），7．85（d，1H），7．91−7．93（m，2H），7．95（t，1H），8．19−8．21（m，1H），8．43（dd，1H），8．72（d，1H），8．77（d，1H）．
【０１９３】
5−アミノ−2−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−ベンゼンスルホンアミド
【化３１】
2021501178.tif 000035
Pd／C（10％負荷、54mg）を、2−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（418mg、1．01mmol）の、メタノール（10mL）とジオキサン（10mL）の混合物中溶液に添加し、水素雰囲気下で室温で一晩撹拌した。触媒を濾別し、酢酸エチルで洗浄し、濾液を真空中で濃縮して粗表題化合物を得（370mg、定量的、純度90％）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法A）：Rt＝0．74分；MS（ESIpos）：m／z＝344［M＋H］＋
【０１９４】
2−ブロモ−5−ニトロベンゼンスルホンアミド
【化３２】
2021501178.tif 000036
2−ブロモ−5−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（20．0g、66．6mmol）を、1，4−ジオキサン（100ml）に溶解し、0℃に冷却した。アンモニア水（400ml、0．50M、200mmol）をゆっくり添加し、反応が完了するまで室温で撹拌を継続した。溶媒を減圧下で除去し、ジクロロメタンを添加した。有機相を水で3回洗浄した。懸濁液を濾過し（固体が生成物である）、有機相を食塩水で洗浄した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗物質をジエチルエーテルから再結晶化させて、16．4gを得た（純度93％、収率88％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．45分；MS（ESIpos）：m／z＝281［M＋H］＋
【０１９５】
2−ブロモ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−5−ニトロベンゼンスルホンアミド
【化３３】
2021501178.tif 000037
2−ブロモ−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（16．4g、58．3mmol）を、室温でDMF（200ml）に溶解しおよび1，1−ジメトキシ−N，N−ジメチルメタンアミン（15ml、120mmol）を添加した。反応が完了するまで、撹拌を継続した。溶媒を減圧下で除去し、粗物質をジクロロメタンと食塩水に分配した。有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。この粗物質を、さらなる精製を行わずに次のステップで使用した（19．2g、純度78％、収率98％）。
LC−MS（方法A）：Rt＝0．92分；MS（ESIpos）：m／z＝336［M＋H］＋
【０１９６】
5−アミノ−2−ブロモ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］ベンゼンスルホンアミド
【化３４】
2021501178.tif 000038
2−ブロモ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（12．7g、37．8mmol）を、メタノール（170ml）に溶解し、フラスコを窒素でフラッシした。白金担持炭（5％負荷、1．61g、8．26mmol）を添加し、フラスコを排気し、その後水素（1bar）でフラッシした。反応が完了するまで、室温で撹拌を継続した。反応混合物をセライトで濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をさらに精製することなく次のステップに使用した（5．5g、純度76％、収率59％）。
LC−MS（方法A）：Rt＝0．75分；MS（ESIpos）：m／z＝306［M＋H］＋
【０１９７】
N−（4−ブロモ−3−｛［（ジメチルアミノ）メチリデン］スルファモイル｝フェニル）−2−（2−クロロフェニル）アセトアミド
【化３５】
2021501178.tif 000039
5−アミノ−2−ブロモ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］ベンゼンスルホンアミド（4．85g、15．8mmol）を、DMF（100ml）に溶解し、（2−クロロフェニル）酢酸（3．24g、19．0mmol）を添加し、続いてN，N−ジイソプロピルエチルアミン（13ml、79mmol）およびHATU（9．64g、25．3mmol）を添加した。反応混合物を50℃で3時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、酢酸エチルおよび水を添加した。相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出した。合した有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗物質をジクロロメタンに懸濁し、濾過し、溶媒を除去し、粗物質をさらに精製することなく次のステップに使用した（15．7g）。
LC−MS（方法B）：Rt＝1．08分；MS（ESIpos）：m／z＝458［M＋H］＋
【０１９８】
この中間体はHCl塩としても使用することができる。
【０１９９】
5−アミノ−2−（1−シクロプロピル−1H−ピラゾール−4−イル）−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］ベンゼンスルホンアミド
【化３６】
2021501178.tif 000040
2−クロロ−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（674mg、2．85mmol）および1−シクロプロピル−4−（4，4，5，5−テトラメチル−1，3，2−ジオキサボロラン−2−イル）−1H−ピラゾール（1．00g、4．27mmol）を、n−プロパノール（34ml）に溶解し、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）ジクロリド（CAS 13965−03−2）（100mg、142μmol）およびトリフェニルホスフィン（37．3mg、142μmol）を添加した。反応物をアルゴンで5分間パージし、炭酸カリウム水溶液（5．7ml、1．0M、5．7mmol）を添加した。反応物を100℃で3時間加熱した。その後、混合物をセライトで濾過し、溶媒を減圧下で除去した。酢酸エチルおよび水を添加した。相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出した。合した有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。この粗物質を、さらなる精製を行わずに次のステップで使用した。
【０２００】
2−（1−シクロプロピル−1H−ピラゾール−4−イル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（1．17g、3．79mmol）および1，1−ジメトキシ−N，N−ジメチルメタンアミン（1．0ml、7．6mmol）を、DMF（25ml）に溶解し、反応が完了するまで反応物を室温でを撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗物質をさらに精製することなく次のステップに使用した。
【０２０１】
2−（1−シクロプロピル−1H−ピラゾール−4−イル）−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（1．84g、5．06mmol）を、THF（30ml）に溶解し、フラスコを窒素でフラッシした。パラジウム担持炭（10％負荷、53．9g、506μmol）を添加し、フラスコを排気し、その後水素（1bar）でフラッシした。反応が完了するまで、室温で撹拌を継続した。反応混合物をセライトで濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をさらに精製することなく次のステップに使用した（1．3g、純度53％、3ステップでの収率75％）。
LC−MS（方法A）：Rt＝0．70分；MS（ESIpos）：m／z＝334［M＋H］＋
【０２０２】
5−アミノ−2−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］ベンゼンスルホンアミド
【化３７】
2021501178.tif 000041
2−ブロモ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（800mg、2．3mmol）および1−（ジフルオロメチル）−4−（4，4，5，5−テトラメチル−1，3，2−ジオキサボロラン−2−イル）−1H−ピラゾール（700mg、2．87mmol）を、n−プロパノール（15ml）に溶解し、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）ジクロリド（CAS 13965−03−2）（84mg、119μmol）およびトリフェニルホスフィン（31mg、119μmol）を添加した。溶液をアルゴンで5分間パージし、炭酸カリウム水溶液（3．6ml、2．0 M、7．2mmol）を添加した。反応物を100℃で16時間加熱した。水および酢酸エチルを添加した。相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出した。合した有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。この粗物質を、さらなる精製を行わずに次のステップで使用した。
【０２０３】
2−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（2．16g、5．79mmol）を、テトラヒドロフラン（50ml）に溶解し、白金担持炭（5％負荷、307mg、1．57mmol）を添加した。フラスコを3回排気し、水素（1bar）でフラッシした。反応物を室温で4時間撹拌した。UPLC−MSによれば反応は完了していなかったので、同じ量の白金担持炭を添加し、反応物を水素雰囲気下でさらに16時間撹拌した。その後、混合物をセライトで濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗物質をさらに精製することなく次のステップに送った。
【０２０４】
5−アミノ−2−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］ベンゼンスルホンアミド（670mg、1．95mmol）を、メタノール（25ml）に溶解し、反応が完了するまで室温で25％アンモニア水溶液（25ml）によって処理した。溶媒を減圧下で除去し、粗物質をシリカゲルでのクロマトグラフィーにより精製し（Biotage、勾配  ジクロロメタン／酢酸エチル）、その後のHPLC精製（（Waters XBrigde C18 5μ  100x30mm、アセトニトリル／水＋0．1％ギ酸）によって53mgを得た（純度99％、3ステップでの収率9％）。反応を繰り返し、粗物質をこの中間体を用いる次のステップに使用した。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．58分；MS（ESIpos）：m／z＝289［M＋H］＋
【０２０５】
5−ブロモ−2−クロロ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］ピリジン−3−スルホンアミド
【化３８】
2021501178.tif 000042
5−ブロモ−2−クロロピリジン−3−スルホンアミド（3．86g、14．2mmol）および1，1−ジメトキシ−N，N−ジメチルメタンアミン（3．8ml、28mmol）を、DMF（40ml）に溶解し、室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、ジクロロメタンおよび食塩水を添加した。相を分離し、有機相を水で洗浄した。合した有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。この粗物質を、さらなる精製を行わずに次のステップで使用した（5．12g）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．89分；MS（ESIpos）：m／z＝326［M＋H］＋
【０２０６】
2−クロロ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−5−［（ジフェニルメチリデン）アミノ］ピリジン−3−スルホンアミド
【化３９】
2021501178.tif 000043
5−ブロモ−2−クロロ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］ピリジン−3−スルホンアミド（5．00g、15．3mmol）、1，1−ジフェニルメタンイミン（3．9ml、23mmol）、キサントホス（886mg、1．53mmol）および酢酸パラジウム（II）（172mg、765μmol）を、ジオキサン（150ml）に溶解した。溶液をアルゴンで5分間パージし、炭酸セシウム（15．0g、45．9mmol）を添加した。反応物を100℃で1時間加熱し、その後、溶媒を減圧下で除去し、水および酢酸エチルを添加した。相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出した。合した有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗物質の半分をさらなる精製を行わずに使用し、3gをアンモニアでコートしたシリカゲルでのクロマトグラフィー（Biotage、ヘキサン／酢酸エチル）によって精製して、1．00gを得た（純度78％、出発物質の総量に基づく収率15％）
LC−MS（方法B）：Rt＝1．26分；MS（ESIpos）：m／z＝427［M＋H］＋
【０２０７】
2−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−5−［（ジフェニル−メチリデン）アミノ］ピリジン−3−スルホンアミド
【化４０】
2021501178.tif 000044
2−クロロ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−5−［（ジフェニルメチリデン）アミノ］ピリジン−3−スルホンアミド（1．50g、3．51mmol、粗物質）および1−（ジフルオロメチル）−4−（4，4，5，5−テトラメチル−1，3，2−ジオキサボロラン−2−イル）−1H−ピラゾール（1．71g、7．03mmol）を、n−プロパノール（30ml）／DMF（15ml）に溶解し、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）ジクロリド（CAS 13965−03−2）（371mg、527μmol）、トリフェニルホスフィン（225mg、0．85mmol）、フッ化カリウム（408mg、7．03mmol）およびリン酸カリウム水溶液（1．8ml、2．0M、3．5mmol）を添加した。溶液をアルゴンで5分間パージし、反応物をマイクロ波中100℃で1時間加熱した（1bar／30W）。溶媒を減圧下で除去し、水および酢酸エチルを添加した。相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出した。合した有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗物質を、アンモニアをコートしたシリカゲルでのクロマトグラフィー（Biotage、ヘキサン／酢酸エチル）によって精製した（1．54g、純度65％、収率86％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝1．26分；MS（ESIpos）：m／z＝509［M＋H］＋
【０２０８】
5−アミノ−2−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］ピリジン−3−スルホンアミド
【化４１】
2021501178.tif 000045
2−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−5−［（ジフェニルメチリデン）アミノ］ピリジン−3−スルホンアミド（1．54g、3．03mmol）を、ジオキサン（15ml）に溶解し、HCl水溶液（2．0ml、3．0M、6．1mmol）を添加した。反応物を室温で1時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗物質をさらに精製することなく次のステップに使用した（2．45g）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．66分；MS（ESIpos）：m／z＝345［M＋H］＋
【０２０９】
5−アミノ−2−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］ピリジン−3−スルホンアミド
【化４２】
2021501178.tif 000046
2−クロロ−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−5−［（ジフェニルメチレン）アミノ］ピリジン−3−スルホンアミド（1．00g、2．34mmol）を、DMSO（18mL）に溶解した。4−クロロ−1H−ピラゾール（480mg、4．69mmol）、ヨウ化カリウム（389mg、2．34mmol）およびリン酸カリウム（746mg、3．51mmol）を添加し、反応混合物を100℃で一晩撹拌した。その後、これを真空中で濃縮し、ジクロロメタン／水で抽出し、有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、続いて真空中で濃縮した。
【０２１０】
部分的に脱保護されたため、材料をDMF（2mL）に再溶解し、1，1−ジメトキシ−N，N−ジメチルメタンアミン（0．5mL）とともに一晩撹拌した。一晩撹拌すると沈殿が生じ、これを濾過により除去した（229mgの純粋な2−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−5−［（ジフェニルメチレン）アミノ］ピリジン−3−スルホンアミド）。濾液を真空中で濃縮し、ジクロロメタン／水で抽出し、有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、続いて真空中で濃縮することにより、粗2−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］−5−［（ジフェニルメチレン）アミノ］ピリジン−3−スルホンアミド（549mg）を得た。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．31分；MS（ESIpos）：m／z＝493［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］2．80（s，3H），3．09（s，3H），7．27−7．33（m，2H），7．38−7．44（m，3H），7．49−7．56（m，2H），7．58−7．64（m，1H），7．67（s，1H），7．69−7．76（m，2H），7．79−7．83（m，2H），8．17（d，1H），8．32（d，1H）．
【０２１１】
前のステップで得た純粋な材料（229mg）を、ジオキサン（2．0mL）に溶解し、ジオキサン中2M HCl（1．00mL、2．00mmol）を添加し、続いて一晩撹拌した。これを真空中で濃縮し、酢酸エチル／水で抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮して、粗表題化合物を得（200mg）、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法A）：Rt＝0．71分；MS（ESIpos）：m／z＝329［M＋H］＋
【０２１２】
5−アミノ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−2−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］−ピリジン−3−スルホンアミド
【化４３】
2021501178.tif 000047
反応を1gのスケールで3回実行した。2−クロロ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−5−［（ジフェニルメチリデン）アミノ］ピリジン−3−スルホンアミド（3．00g、7．03mmol）および4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール（1．43g、10．5mmol）を、DMSO（110ml、1．6mol）に溶解し、ヨウ化カリウム（583mg、3．51mmol）およびリン酸カリウム（2．24g、10．5mmol）を添加した。反応物を100℃のマイクロ波中で5時間加熱した。その後、固体を濾別し、濾液に酢酸エチルおよび水を添加した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、粗物質をシリカゲルでのクロマトグラフィー（Biotage、酢酸エチル／ヘキサン）により精製して、15．7gを得た（収率424％）。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．40分；MS（ESIpos）：m／z＝472［M＋H］＋
【０２１３】
5−［（ジフェニルメチリデン）アミノ］−2−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ピリジン−3−スルホンアミド（3．50g、7．42mmol）を、1，4−ジオキサン（100ml）に溶解し、HCl（4．9ml、3．0M、15mmol）を添加した。反応物を室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗物質を酢酸エチルと水に分配した。その後、有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗物質をアセトニトリルおよび水に溶解し、一晩凍結乾燥させた。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．56分；MS（ESIpos）：m／z＝307［M＋H］＋
【０２１４】
2−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド
【化４４】
2021501178.tif 000048
2−クロロ−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（250mg、1．06mmol）を、アセトニトリル（10mL）に溶解し、それに続いて1H−ピラゾール−4−カルボニトリル（148mg、1．59mmol）および微粉末炭酸カリウム（438mg、3．17mmol）を添加した。反応混合物を100℃で一晩撹拌した。室温に冷却した後、ジクロロメタンおよび水を添加し、有機相を食塩水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。分取HPLCによる精製（Chromatorex C−18 10μm、125x30mm、アセトニトリル／水＋0．1％ギ酸）により、表題化合物を得た（128mg、0．436mmol、収率41％、純度70％）。
LC−MS（方法A）：Rt＝0．78分；MS（ESIpos）：m／z＝294［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：7．94（br d，2H），7．98（d，1H），8．42（d，1H），8．61（dd，1H），8．83（d，1H），9．04（d，1H）．
【０２１５】
5−アミノ−2−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）ベンゼンスルホンアミド
【化４５】
2021501178.tif 000049
2−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（128mg、0．44mmol）を、メタノール（17mL）およびジオキサン（3mL）に溶解した。フラスコを排気し、窒素でフラッシし、続いてパラジウム炭素（13mg、10％負荷）を添加した。これを再び排気し、次に水素でフラッシし、続いて水素雰囲気下室温で5時間撹拌した。水素を除去し、触媒を濾別し、濾液を真空中で濃縮した。これをジクロロメタンに再溶解し、再び真空中で濃縮して表題化合物を得た（81mg、0．308mmol、収率70％、純度79％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．46分；MS（ESIpos）：m／z＝264［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：6．06（s，2H），6．77（dd，1H），7．17−7．23（m，4H），8．23（d，1H），8．71（d，1H）．
【０２１６】
実施例の合成
実施例19
2−（2−クロロフェニル）−N−｛3−スルファモイル−4−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］フェニル｝アセトアミド
【化４６】
2021501178.tif 000050
5−アミノ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−2−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ベンゼンスルホンアミド（22．3g、48．9mmol）を、DMF（460mL）に溶解し、続いて（2−クロロフェニル）酢酸（12．5g、73．3mmol）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン（25．3g、195mmol）およびHATU（27．9g、73．3mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。次にそれを真空中で濃縮し、ジクロロメタンおよび水で抽出した。有機相を重炭酸ナトリウム溶液、食塩水および塩化アンモニウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、再び真空中で濃縮した。保護された生成物は、塩化アンモニウムでの洗浄中に既に部分的に沈殿していたので、硫酸ナトリウムでの乾燥の前に除去された。
両方、つまり残渣と沈殿をジクロロメタン（150mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（75mL）で処理し、続いて室温で一晩撹拌した。
この場合も、生成物は既に部分的に沈殿していたので、除去された。残りの溶液を真空中で濃縮し、ジクロロメタンおよび水で抽出した。有機相を重炭酸塩溶液および食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、最後に真空中で濃縮した。水系後処理の間、生成物は再び部分的に沈殿した。合した沈殿画分と有機相の濃縮画分を合し、還流酢酸エチルからの結晶化により精製して、表題化合物を得た（12．3g、26．8mmol、2ステップでの収率55％、純度98％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝1．06分；MS（ESIpos）：m／z＝459［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］3．92（s，2H），7．30−7．37（m，2H），7．42−7．48（m，4H），7．60（d，1H），7．98（dd，1H），8．18（s，1H），8．39（d，1H），8．74（s，1H），10．83（s，1H）．
【０２１７】
実施例20
2−（2−フルオロフェニル）−N−｛3−スルファモイル−4−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］フェニル｝−アセトアミド
【化４７】
2021501178.tif 000051
5−アミノ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−2−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ベンゼンスルホンアミド（350mg、0．767mmol）を、DMF（15mL）に溶解し、続いて（2−フルオロフェニル）酢酸（130mg、0．843mmol）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン（496mg、3．83mmol）およびHATU（466mg、1．23mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。次にそれを真空中で濃縮し、ジクロロメタンおよび水で抽出した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で再び濃縮した。
残渣をジクロロメタン（10mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（4．37g、38．3mmol）で処理し、続いて室温で一晩撹拌した。これを真空中で濃縮し、分取HPLC（Chromatorex C−18 10μm、125x30mm、アセトニトリル／水＋0．1％ギ酸）により精製して、表題化合物を得た（60．5mg、0．137mmol、2ステップでの収率18％、純度98％）。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．10分；MS（ESIpos）：m／z＝443［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］3．82（s，2H），7．17−7．23（m，2H），7．31−7．49（m，4H），7．60（d，1H），7．98（dd，1H），8．18（s，1H），8．39（d，1H），8．74（s，1H），10．82（s，1H）．
【０２１８】
実施例24
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（3−クロロ−1H−1，2，4−トリアゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミド
【化４８】
2021501178.tif 000052
一般的手順GP1．2、GP2．1、GP3．4およびGP4．2に従って、2−クロロ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（500mg、1．29mmol）、3−クロロ−1H−1，2，4−トリアゾール（201mg、1．94mmol）および（2−クロロフェニル）酢酸（203mg、1．19mmol）を、中間体を精製することなく表題化合物に変換し、最後に分取HPLC（Waters XBridge C18 5μ  100×30mm、アセトニトリル／水＋0．2％アンモニア水（32％））によって精製した（9mg、0．0211mmol、4ステップでの収率2％、純度97％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．70分；MS（ESIpos）：m／z＝426［M＋H］＋
1H−NMR（600MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．92（s，2H），7．31−7．35（m，2H），7．43−7．49（m，2H），7．60（s，2H），7．62（d，1H），7．95（dd，1H），8．42（d，1H），8．81（s，１Ｈ），10．87（s，1H）．
【０２１９】
実施例25
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミド
【化４９】
2021501178.tif 000053
一般的手順GP1．2、GP2．1、GP3．4およびGP4．2に従って、2−クロロ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（500mg、1．29mmol）、4−クロロ−1H−ピラゾール（199mg、1．94mmol）および（2−クロロフェニル）酢酸（313mg、1．83mmol）を、中間体を精製することなく表題化合物に変換し、最後に分取HPLC（Waters XBridge C18 5μ  100×30mm、アセトニトリル／水＋0．2％アンモニア水（32％））によって精製した（55mg、0．129mmol、4ステップでの収率10％、純度99％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．95分；MS（ESIpos）：m／z＝425［M＋H］＋
1H−NMR（500MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．91（s，2H），7．31−7．37（m，2H），7．41（s，2H），7．44−7．49（m，2H），7．55（d，1H），7．87（s，1H），7．97（dd，1H），8．35（d，1H），8．38（d，1H），10．81（s，1H）．
【０２２０】
実施例26
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−フルオロ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミド
【化５０】
2021501178.tif 000054
一般的手順GP1．2、GP2．1、GP3．4およびGP4．2に従って、2−クロロ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（500mg、1．29mmol）、4−フルオロ−1H−ピラゾール（167mg、1．94mmol）および（2−クロロフェニル）酢酸（151mg、1．89mmol）を、中間体を精製することなく表題化合物に変換し、最後に分取HPLC（Waters XBridge C18 5μ100×30mm、アセトニトリル／水＋0．2％アンモニア水（32％））によって精製した（43mg、0．105mmol、4ステップでの収率8％、純度97％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．88分；MS（ESIpos）：m／z＝409［M＋H］＋
1H−NMR（500MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．91（s，2H），7．30−7．37（m，2H），7．39（s，2H），7．43−7．50（m，2H），7．53（d，1H），7．84（d，1H），7．97（dd，1H），8．26（d，1H），8．37（d，1H），10．79（s，1H）．
【０２２１】
実施例28
N−［4−（4−ブロモ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］−2−（2−クロロフェニル）アセトアミド
【化５１】
2021501178.tif 000055
一般的手順GP1．2、GP2．2、GP3．5およびGP4．1に従って、2−クロロ−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（400mg、1．03mmol）、4−ブロモ−1H−ピラゾール（228mg、1．55mmol）および（2−クロロフェニル）酢酸（264mg、1．55mmol）を、中間体を精製することなく表題化合物に変換し、最後に分取HPLC（Waters XBridge C18 5μ  100×30mm、アセトニトリル／水＋0．1％ギ酸）によって精製した（27mg、0．0575mmol、4ステップでの収率6％、純度95％）。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．10分；MS（ESIpos）：m／z＝469／471［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．90（s，2H），7．29−7．36（m，2H），7．41（s，2H），7．42−7．48（m，2H），7．54（d，1H），7．87（d，1H），7．96（dd，1H），8．34（d，1H），8．37（d，1H），10．80（s，1H）．
【０２２２】
実施例39
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミド
【化５２】
2021501178.tif 000056
方法1：Pd／C（10％負荷、350mg）を、2−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−（2，4−ジメトキシベンジル）−5−ニトロベンゼンスルホンアミド（9．09g、20．5mmol）のメタノール（120mL）とテトラヒドロフラン（250mL）との混合物中溶液に添加し、水素流通下、室温で3時間撹拌した。触媒を濾過により除去し、続いてテトラヒドロフランで洗浄し、濾液を真空中で濃縮した。これを酢酸エチル／水で抽出した。炭酸ナトリウム溶液を添加し、これを一晩撹拌した。得られる沈殿を濾過によって除去し、廃棄した。有機相を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮して、粗5−アミノ−2−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−（2，4−ジメトキシベンジル）ベンゼンスルホンアミド（6．37g）を得、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法B）：Rt＝1．06分；MS（ESIpos）：m／z＝414［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．69（s，3H），3．72（s，3H），3．92（br d，2H），6．04（s，2H），6．40−6．48（m，2H），6．78（dd，1H），7．08−7．14（m，2H），7．19（d，1H），7．27（br t，1H），8．25（s，1H），8．70（s，1H）．
前のステップで得た粗材料（6．37g）を、DMF（87mL）に溶解し、続いて（2−クロロフェニル）酢酸（3．94g、23．1mmol）、N，N−ジイソプロピルエチルアミン（5．97g、46．2mmol）およびHATU（8．78g、23．1mmol）を添加した。反応混合物を週末にわたって室温で撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチル／水で抽出した。有機相を塩化アンモニウム、重炭酸ナトリウム溶液および食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、再び真空中で濃縮して、粗2−（2−クロロフェニル）−N−｛4−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−［（2，4−ジメトキシベンジル）−スルファモイル］フェニル｝アセトアミド（9．77g）を得、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
LC−MS（方法B）：Rt＝1．27分；MS（ESIpos）：m／z＝566［M＋H］＋
前のステップで得た粗材料（9．77g）を、ジクロロメタン（30mL）とトリフルオロ酢酸（15mL）との混合物に溶解し、室温で一晩撹拌した。これを真空中で濃縮し、ジクロロメタンに溶解し、真空中で再び濃縮して、残っているトリフルオロ酢酸を除去した。次にこれをジクロロメタン／水の混合物中で週末にわたって撹拌した。得られる沈殿を濾過により除去し、純粋な表題化合物を得た（5．40g、13．0mmol、3ステップでの収率63％、純度97％）。純度は、酢酸エチル／ヘキサンからの再結晶化によってさらに改善させることができた。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．84分、MS（ESIpos）：m／z＝416［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．91（s，2H），7．29−7．36（m，2H），7．42−7．49（m，4H），7．58（d，1H），7．97（dd，1H），8．31（d，1H），8．39（d，1H），8．86（d，1H），10．84（br s，1H）．
方法2：5−アミノ−2−（4−シアノ−1H−ピラゾール−1−イル）ベンゼンスルホンアミド（81mg、0．31mmol）を、ジメチルホルムアミド（1mL）に溶解し、続いてN，N−ジイソプロピルエチルアミン（119mg、0．92mmol）、（2−クロロフェニル）酢酸（63mg、0．37mmol）およびHATU（1−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−1H−1，2，3−トリアゾロ［4，5−b］ピリジニウム3−オキシドヘキサフルオロホスフェート、140mg、0．37mmol）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。次にこれを真空中で濃縮し、酢酸エチルおよび水を添加し、有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。分取HPLCによる精製（Chromatorex C−18 10μm、125x30mm、アセトニトリル／水＋0．1％アンモニア水（32％））により、表題化合物を得た（33mg、0．0794mmol、収率26％、純度50％）。
【０２２３】
実施例170
N−［4−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−3−スルファモイルフェニル］−2−（4−メトキシフェニル）アセトアミド
【化５３】
2021501178.tif 000057
一般的手順GP5．1に従って、5−アミノ−2−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−（2，4−ジメトキシベンジル）ベンゼンスルホンアミド（0．20mmol）および（4−メトキシフェニル）酢酸（0．40mmol）を表題化合物に変換した（12．2mg、0．0290mmol、収率14％、純度100％）。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．07分；MS（ESIpos）：m／z＝421［M＋H］＋
【０２２４】
実施例321
N−｛6−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−5−スルファモイルピリジン−3−イル｝−2−（2−フルオロフェニル）アセトアミド
【化５４】
2021501178.tif 000058
5−アミノ−2−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］ピリジン−3−スルホンアミド（400mg、1．16mmol）を、DMF（10ml）に溶解し、（2−フルオロフェニル）酢酸（179mg、1．16mmol）を添加し、続いてN，N−ジイソプロピルエチルアミン（1．0ml、5．8mmol）およびHATU（530mg、1．39mmol）を添加した。反応物を室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、酢酸エチルおよび水を添加した。相を分離し、水相を酢酸エチルで洗浄した。合した有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗物質をHPLC（Chromatorex C−18 10μm、125x30mm、アセトニトリル／水＋0．2％アンモニア水（32％））によって精製して、30．0mgを得た（収率5％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．99分、MS（ESIpos）：m／z＝481［M＋H］＋
N−（6−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−5−｛［（ジメチルアミノ）メチリデン］スルファモイル｝−ピリジン−3−イル）−2−（2−フルオロフェニル）アセトアミド（30．0mg、62．4μmol）を、メタノール中アンモニア（10ml、7M）に溶解し、室温で撹拌した。その後、溶媒を減圧下で除去し、粗物質をHPLC（Chromatorex C−18 10μm、125x30mm、アセトニトリル／水＋0．2％アンモニア水（32％））により精製して、表題化合物を得た（10．1mg、純度99％、収率38％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．66分、MS（ESIpos）：m／z＝426［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝3．83（s，2H），7．15−7．24（m，2H），7．31−7．38（m，1H），7．42（td，1H），7．71−8．07（m，3H），8．29（s，1H），8．70（s，1H），8．78（d，1H），8．93（d，1H），10．86（s，1H）．
【０２２５】
実施例326
2−（2−クロロフェニル）−N−｛4−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−3−スルファモイルフェニル｝アセトアミド
【化５５】
2021501178.tif 000059
N−（4−ブロモ−3−｛［（ジメチルアミノ）メチリデン］スルファモイル｝フェニル）−2−（2−クロロフェニル）アセトアミド（1．50g、3．27mmol）、1−（ジフルオロメチル）−4−（4，4，5，5−テトラメチル−1，3，2−ジオキサボロラン−2−イル）−1H−ピラゾール（958mg、3．92mmol）およびフッ化カリウム（418mg、7．19mmol）を、DMF（36ml）に溶解した。混合物をアルゴンで5分間パージし、続いてビス（トリ−tert−ブチルホスフィン）パラジウム（0）（CAS 53199−31−8）（83．5mg、163μmol）を添加した。反応物を100℃で1時間加熱し、ガラス繊維濾紙で濾過し、手順を繰り返した。その後、溶媒を減圧下で除去し、酢酸エチルおよび水を添加した。相を分離し、水相を酢酸エチルで洗浄した。合した有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。この粗物質を、さらなる精製を行わずに次のステップで使用した（2．78g）。
【０２２６】
2−（2−クロロフェニル）−N−（4−［1−（ジフルオロメチル）−1H−ピラゾール−4−イル］−3−｛［（ジメチルアミノ）−メチリデン］スルファモイル｝フェニル）アセトアミド（2．78g、5．61mmol）を、メタノール（90ml）に溶解し、反応が完了するまで室温で25％アンモニア水溶液（90ml）によって処理した。溶媒を減圧下で除去し、粗物質をシリカゲルでのクロマトグラフィー（Biotage、ジクロロメタン中8％エタノール）により精製し、その後HPLC（Chromatorex C−18 10μm、125x30mm、アセトニトリル／水＋0．2％アンモニア水（32％））により精製して、表題化合物を得た（1．09g、純度99％、2ステップで34％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．94分、MS（ESIpos）：m／z＝441［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝3．89（s，2H），7．31−7．35（m，2H），7．41（s，2H），7．43−7．50（m，3H），7．69−8．00（m，2H），8．02（m，1H），8．36（d，1H），8．43（m，1H），10．65（s，1H）．
【０２２７】
実施例331
2−（2−クロロフェニル）−N−｛3−スルファモイル−4−［5−（トリフルオロメチル）ピリジン−3−イル］フェニル｝アセトアミド
【化５６】
2021501178.tif 000060
N−（4−ブロモ−3−｛［（ジメチルアミノ）メチリデン］スルファモイル｝フェニル）−2−（2−クロロフェニル）アセトアミド（500mg、1．09mmol）および［5−（トリフルオロメチル）ピリジン−3−イル］ボロン酸（520mg、2．72mmol）を、n−プロパノール（15ml）に溶解し、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）ジクロリド（CAS 13965−03−2）（38．4mg、54．5μmol）、トリフェニルホスフィン（14．3mg、54．5μmol）、フッ化カリウム（23．1mg、270μmol）および炭酸カリウム水溶液（1．4ml、2．0M、2．7mmol）を添加した。反応物をマイクロ波中100℃で1時間加熱した加熱した（1bar／15W）。その後、混合物をセライトで濾過し、溶媒を減圧下で除去し、粗物質をTHFとともに共蒸留し、さらなる精製を行わずに次のステップで使用した。
2−（2−クロロフェニル）−N−（3−｛［（ジメチルアミノ）メチリデン］スルファモイル｝−4−［5−（トリフルオロメチル）−ピリジン−3−イル］フェニル）アセトアミド（1．50g、2．86mmol）を、メタノール（29ml）に溶解し、反応が完了するまで80℃で32％水酸化ナトリウム水溶液（1．6ml）によって処理した。溶媒を減圧下で除去し、粗物質をジクロロメタンに溶解し、水で洗浄した。相を分離し、合した有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗物質をシリカゲルでのクロマトグラフィー（Biotage、ヘキサン中40％酢酸エチル）によって精製し、その後HPLC（Chromatorex C−18 10μm、125x30mm、アセトニトリル／水＋0．1％ギ酸）によって精製して、表題化合物を得た（562mg、純度95％、2ステップでの収率40％）。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．13分；MS（ESIneg）：m／z＝468［M−H］−
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝3．91（s，2H），7．28−7．37（m，2H），7．39（d，1H），7．42−7．51（m，4H），7．88（dd，1H），8．10−8．16（m，1H），8．40（d，1H），8．81（d，1H），8．96（d，1H），10．73（s，1H）．
【０２２８】
実施例349
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（1−シクロプロピル−1H−ピラゾール−4−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミド
【化５７】
2021501178.tif 000061
N−（4−ブロモ−3−｛［（ジメチルアミノ）メチリデン］スルファモイル｝フェニル）−2−（2−クロロフェニル）アセトアミド（500mg、1．09mmol）、1−シクロプロピル−4−（4，4，5，5−テトラメチル−1，3，2−ジオキサボロラン−2−イル）−1H−ピラゾール（510mg、2．18mmol）およびフッ化カリウム（139mg、2．4mmol）を、無水および脱気したDMF（30ml）に溶解し、溶液を再びアルゴンで5分間パージし、続いてビス（トリ−tert−ブチルホスフィン）パラジウム（0）（CAS 53199−31−8）（28mg、54μmol）を添加した。反応物を100℃で2時間加熱した。その後、混合物をセライトで濾過し、溶媒を減圧下で除去し、粗物質をさらに精製することなく次のステップに使用した。
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（1−シクロプロピル−1H−ピラゾール−4−イル）−3−｛［（ジメチルアミノ）メチリデン］−スルファモイル｝フェニル］アセトアミド（560mg、1．15mmol）を、メタノール（54ml）に溶解し、反応が完了するまで80℃で32％水酸化ナトリウム水溶液（560μl）によって処理した。溶媒を減圧下で除去し、シリカゲルでのクロマトグラフィー（Biotage、酢酸エチル／ヘキサン）によって、その後HPLC（Waters XBrigde C18 5μ  100x30mm、アセトニトリル／水＋0．2％アンモニア水（32％））によって精製して、表題化合物を得た（192mg、純度95％、2ステップでの収率37％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．96分；MS（ESIneg）：m／z＝429［M−H］−
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．94−1．01（m，2H），1．05−1．10（m，2H），3．67−3．80（m，1H），3．88（s，2H），7．19（s，2H），7．30−7．35（m，2H），7．40−7．48（m，3H），7．67（d，1H），7．81（dd，1H），8．04（s，1H），8．31（d，1H），10．57（s，1H）．
【０２２９】
実施例360
2−（2−クロロフェニル）−N−［4−（1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル）−3−スルファモイルフェニル］アセトアミド
【化５８】
2021501178.tif 000062
N−（4−ブロモ−3−｛［（ジメチルアミノ）メチリデン］スルファモイル｝フェニル）−2−（2−クロロフェニル）アセトアミド（900mg、1．96mmol）および1−メチル−4−（4，4，5，5−テトラメチル−1，3，2−ジオキサボロラン−2−イル）−1H−ピラゾール（490mg、2．35mmol）を、DMF（25ml）に溶解し、続いてフッ化カリウム（251mg、4．32mmol）を添加した。溶液をアルゴンで5分間パージし、ビス（トリ−tert−ブチルホスフィン）パラジウム（0）（CAS 53199−31−8）（50．1mg、98．1μmol）を添加した。反応物を100℃で1時間加熱した。混合物をガラス繊維濾紙によって濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗物質をもう一度上記の反応手順に供した。その後、溶媒を減圧下で除去し、酢酸エチルおよび水を添加した。相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出した。合した有機相をワットマン濾紙で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。この粗物質を、さらなる精製を行わずに次のステップで使用した（2．39g）。
2−（2−クロロフェニル）−N−［3−｛［（ジメチルアミノ）メチリデン］スルファモイル｝−4−（1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル）フェニル］アセトアミド（2．39g、5．20mmol）を、メタノール（80ml）に溶解し、室温で25％アンモニア水溶液（80ml）によって処理した。UPLCにより不完全な反応が示され、25％アンモニア水溶液（80ml）を添加し、反応が完了するまで撹拌を継続した。溶媒を減圧下で除去し、粗物質をシリカゲルでのクロマトグラフィー（Biotage、ジクロロメタン中10％エタノール）とそれに続くHPLC（Waters XBrigde C18 5μ  100x30mm、アセトニトリル／水＋0．2％アンモニア水（32％））によって精製して、表題化合物を得た（327mg、純度98％、2ステップでの収率15％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．86分；MS（ESIneg）：m／z＝403［M−H］−
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝3．78−3．96（m，5H），7．17（s，2H），7．28−7．37（m，2H），7．38−7．52（m，3H），7．66（d，1H），7．82（dd，1H），7．96（s，1H），8．32（d，1H），10．57（s，1H）．
【０２３０】
実施例380
2−（2−クロロフェニル）−N−｛5−スルファモイル−6−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ピリジン−3−イル｝アセトアミド
【化５９】
2021501178.tif 000063
5−アミノ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−2−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ピリジン−3−スルホンアミド（250mg、690μmol）および（2−クロロフェニル）酢酸（177mg、1．03mmol）を、DMF（10ml）に溶解し、N，N−ジイソプロピルエチルアミン（600μl、3．4mmol）および2，4，6−トリプロピル−1，3，5，2，4，6−トリオキサトリホスフィナン2，4，6−トリオキシド（310μl、1．0mmol）を連続して添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。その後、溶媒を減圧下で除去し、酢酸エチルおよび水を添加した。相を分離し、有機相をワットマン濾紙で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、粗物質をさらに精製することなく次のステップに使用した（400mg）。
2−（2−クロロフェニル）−N−（5−｛［（ジメチルアミノ）メチリデン］スルファモイル｝−6−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ピリジン−3−イル）アセトアミド（400mg、777μmol）を、メタノール（37ml）に溶解し、50℃で1時間、40％水酸化ナトリウム水溶液（24μl、1．9mmol）によって処理した。その後、溶媒を減圧下で除去し、粗物質をHPLCクロマトグラフィー（Chromatorex C−18 10μm、125x30mm、アセトニトリル／水＋0．2％アンモニア水（32％））により精製して、3．8mgの表題化合物を得た（純度95％、2ステップでの収率1％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．93分、MS（ESIpos）：m／z＝460［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝3．95（s，2H），7．29−7．39（m，2H），7．43−7．52（m，2H），7．61（s，2H），8．24（s，1H），8．86（d，1H），8．91（d，1H），8．97（d，1H），11．06（s，1H）．
【０２３１】
実施例381
2−（2−フルオロフェニル）−N−｛5−スルファモイル−6−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ピリジン−3−イル｝アセトアミド
【化６０】
2021501178.tif 000064
表題化合物は、5−アミノ−N−［（ジメチルアミノ）メチリデン］−2−［4−（トリフルオロメチル）−1H−ピラゾール−1−イル］ピリジン−3−スルホンアミド（250mg、690μmol）から出発する実施例380と同様に、HPLC精製（Chromatorex C−18 10μm、125x30mm、アセトニトリル／水＋0．2％アンモニア水（32％））の後に2ステップで得た（12．8mg、純度90％、収率4％）。
LC−MS（方法B）：Rt＝0．90分、MS（ESIpos）：m／z＝444［M＋H］＋
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝3．85（s，2H），7．13−7．26（m，2H），7．29−7．47（m，2H），7．61（s，2H），8．23（s，1H），8．86（d，1H），8．91（d，1H），8．97（s，1H），11．04（s，1H）．
【０２３２】
実施例387
2−（2−クロロフェニル）−N−［6−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−5−スルファモイルピリジン−3−イル］アセトアミド
【化６１】
2021501178.tif 000065
一般的手順GP6．1に従って、粗5−アミノ−2−（4−クロロ−1H−ピラゾール−1−イル）−N−［（ジメチルアミノ）メチレン］ピリジン−3−スルホンアミド（100mg）および（2−クロロフェニル）酢酸（77．8mg、0．46mmol）を、中間体を精製することなく2表題化合物に変換した。表題化合物は反応の間に沈殿したので濾過によって得られ、さらなる精製は必要なかった（38mg、0．0891mmol、5ステップでの収率27％、純度99％）。
LC−MS（方法A）：Rt＝1．13分、MS（ESIpos）：m／z＝426［M＋H］＋
1H−NMR（400 MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：3．94（s，2H），7．30−7．37（m，2H），7．43−7．49（m，2H），7．60（s，2H），7．94（d，1H），8．58（d，1H），8．84（d，1H），8．89（d，1H），11．01（s，1H）．
【０２３３】
生物学的アッセイ
以下のアッセイを用いて、本発明による化合物の商業的有用性を説明することができる。
【０２３４】
実施例を選択された生物学的アッセイで1回または複数回試験した。2回以上試験した場合、データは平均値（avg）または中央値のいずれかとして報告される、この際
平均値は、算術平均値とも呼ばれ、得られた値の合計÷得られた値の数を表し、
中央値は、昇順または降順で並べた場合の得られた値の群の中央の数を表す。設定されたデータの値の数が奇数の場合、中央値は中央の値になる。設定されたデータの値の数が偶数の場合、中央値は2つの中央の値の算術的平均となる。
【０２３５】
アッセイの検出範囲外の測定値（以下の表中で＜または＞で示される）が存在するため平均値または中央値の有意な計算ができない場合、全ての個々の測定値が示される。
【０２３６】
実施例を1回または複数回合成した。2回以上合成した場合、生物学的アッセイのデータは、1つまたは複数の合成バッチの試験から得られたデータセットを利用して計算される平均値または中央値を表す。
【０２３７】
インビトロ試験
ヒトP2X4 HEK細胞FLIPRアッセイ
ヒトP2X4を安定に発現するHEK293細胞を、ポリ−D−リジンでコートした384ウェルプレートに30000細胞／ウェルの播種密度で播種し、一晩インキュベートした。P2X4機能は、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX／FLIPRステーション；Molecular Devices）でカルシウムキレート染料Fluo8−AM（Molecular Devices）を用いて細胞内カルシウム変化を測定することによって評価した。アッセイ当日、培地を取り出し、37℃および30μLの染料バッファー（ハンクス平衡塩溶液、10mM HEPES、1．8mM CaCl2、1mM MgCl2、2mMプロベネシド、5mM D−グルコース一水和物、5μM Fluo8−AM、pH＝7．4）中5％CO2で細胞を30分間インキュベートした。プロベネシド緩衝液（ハンクス平衡塩溶液、10mM HEPES、1．8mM CaCl2、1mM MgCl2、2mMプロベネシド、5mM D−グルコース一水和物、pH＝7．4）に希釈した化合物を10μLの体積で添加し、室温で30分間インキュベートさせた。最終アッセイDMSO濃度は0．5％であった。アゴニストBz−ATP（Tocris）を、EC80値に相当する濃度で10μlの体積で添加した。Bz−ATPのEC80値は、各アッセイ日に化合物プロファイリングの前に求めた。蛍光は、2秒間隔で120秒間測定した。蛍光をモニターするために使用した励起波長および発光波長は、それぞれ470〜495nmおよび515〜575nmであった。基底蛍光と比較したピーク相対蛍光単位（RFU）の増加に基づいてデータを分析し、このデータをアゴニスト対照に対して正規化した。化合物を1プレートにつき3連試験し、平均値をExcel XLFitにプロットして、IC50値、最大阻止率およびヒル係数を決定した。
【０２３８】
【表２】
2021501178.tif 000066
【０２３９】
h／m／r P2X4 1321N1星状細胞腫細胞のFLIPR法
ヒトP2X4またはラットP2X4またはマウスP2X4を安定に発現する1321N1星状細胞腫細胞を、コラーゲンI TC処理したマイクロプレートに10000細胞／ウェルの播種密度で播種し、一晩インキュベートした。P2X4機能は、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX／FLIPRステーション；Molecular Devices）でカルシウムキレート染料Fluo8−AM（Molecular Devices）を用いて細胞内カルシウム変化を測定することによって評価した。アッセイ当日、培地を取り出し、細胞を37℃で、30μLの染料バッファー（ハンクス平衡塩溶液、10mM HEPES、1．8mM CaCl2、1mM MgCl2、2mMプロベネシド、5mM D−グルコース一水和物、5μM Fluo8−AM、pH＝7．4）中5％CO2で30分間インキュベートした。プロベネシド緩衝液（ハンクス平衡塩溶液、10mM HEPES、1．8mM CaCl2、1mM MgCl2、2mMプロベネシド、5mM D−グルコース一水和物、pH＝7．4）に希釈した化合物を10μLの体積で添加し、室温で30分間インキュベートさせた。最終アッセイDMSO濃度は0．25％であった。アゴニストMg−ATP（Sigma）を、EC80値に相当する濃度で10μlの体積で添加した。EC80は、ヒトおよびマウスP2X4について0．5μM、ラットP2X4について5μMであると求められた。蛍光は、2秒間隔で120秒間測定した。蛍光をモニターするために使用した励起波長および発光波長は、それぞれ470〜495nmおよび515〜575nmであった。基底蛍光と比較したピーク相対蛍光単位（RFU）の増加に基づいてデータを分析し、このデータをアゴニスト対照に対して正規化した。化合物を1プレートにつき3連試験し、平均値をExcel XLFit（登録商標）でプロットして、IC50値、最大阻害率およびヒル係数を決定した。
【０２４０】
【表３】
2021501178.tif 000067
【０２４１】
【表４】
2021501178.tif 000068
【０２４２】
【表５】
2021501178.tif 000069
【０２４３】
ヒトP2X4 HEK細胞電気生理学アッセイ
電気生理学アッセイA
ヒトP2X4を安定に発現するHEK293細胞を、T75細胞培養フラスコに7＊106細胞の密度で播種し、一晩インキュベートした。自動パッチクランププラットフォーム、PatchLiner（登録商標）（Nanion）をシングルホールモードで使用してP2X4機能を検定した。細胞外緩衝液の組成は、NaCl 145、KCl 4、HEPES 10、CaCl2 1、MgCl2 0．5、D−グルコース一水和物  10（mMで表示）、pH＝7．4であった。細胞内緩衝液は、：CsF 135、EGTA 1、HEPES 10、NaCl 10（mMで表示）、pH 7．2を含んだ。アッセイ当日、Accumax（Sigma）を用いて細胞を回収し、細胞外緩衝液に再懸濁した。リガンドアゴニストであるアデノシン5’−三リン酸（ATP、5μM）を5μLの体積で添加し、細胞外緩衝液（40μL）によって直接洗い落とした。細胞を−80mVで電位固定し、リガンドを5分毎に20分間適用した。この期間の間、アゴニスト応答は安定していたので、化合物をウェルモードにつき1つの濃度で測定した。細胞外緩衝液（最終アッセイDMSO濃度0．3％）に希釈した化合物を40μLの体積で添加し、室温で8分間インキュベートさせた。データは、ピーク電流振幅の低下に基づいて分析し、アゴニスト対照に対して正規化した。平均値をExcel XLFit（登録商標）でプロットして、IC50値、最大阻害率およびヒル係数を決定した。
【０２４４】
【表６】
2021501178.tif 000070
【０２４５】
電気生理学アッセイB
細胞培養条件：HEK−293 mito−Photina pcDNA3（neo−）／pPURO N／pcDNA3＿P2RX4、クローン2a／4（HEK−293 mito−Photina／hP2RX4）細胞を、5mLの200mM Ultraglutamine1（BioWhittakerカタログBE17−605E／U1）、5mLの100Xペニシリン／ストレプトマイシン（BioWhittakerカタログDE17−602E、最終濃度1％）、4mLの50mg／mL G418（SigmaカタログG8168−100mL；最終濃度400μg／mL）、10μLの10mg／mLピューロマイシン（InvivoGenカタログant−pr−1；最終濃度0，2μg／mL）および50mLのウシ胎児血清（SigmaカタログF7524；最終濃度10％）を補足した、アール塩平衡塩溶液（BioWhittakerカタログBE12−125F）を含むEMEMイーグル最小必須培地で培養した。
【０２４６】
実験プロトコル：HEK−293細胞株を、実験の72時間または96時間前に、500万または250万個の細胞濃度で、それぞれT225フラスコに播種する。実験の直前に、細胞をCa2＋／Mg2＋を含まないD−PBS（EurocloneカタログECB4004L）で2回洗浄し、トリプシン−EDTA（Sigma、カタログT4174、1／10希釈）によってフラスコから剥離する。次に、細胞を懸濁溶液：25 mL EX−CELL ACF CHO培地（Sigma、カタログC5467）；0．625mL HEPES（BioWhittaker、カタログBE17−737E）；0．25mLの100×ペニシリン／ストレプトマイシン（BioWhittaker、カタログDE17−602E）、0．1mLの大豆トリプシン阻害剤10mg／mL（Sigma、カタログT6522）に再懸濁し、QPatch 16X上に置く。
【０２４７】
化合物調製および保存：化合物ストック溶液（10mM；100％DMSO；−20℃で保存）を使用した。新鮮な溶液は、ストック（1または3mM、100％DMSO）から実験の直前に調製した（最終DMSO濃度0．1％）。
【０２４８】
DMSO溶液をSIGMA（カタログ番号D−5879）から入手し、室温で保存した。
【０２４９】
QPatch16Xによるパッチクランプ分析（図1）：標準的な細胞全膜電位固定実験をマルチホール技術を用いて室温で行う。
【０２５０】
hP2X4での電位固定実験には、データは2KHzでサンプリングする。ホールセル構成で密封および通過を確立した後、細胞を−90mVで保持し、hP2X4電流を、調査中の化合物の不在下（ビヒクル期間、すなわち0．1％DMSO）または増加する濃度の調査中の化合物の存在下でアゴニストによって誘発する；図1の適用プロトコルを参照されたい。
【０２５１】
出力：アゴニストによって誘導される最大内向き電流（ATP 5μM）。
【０２５２】
細胞内溶液は、CsF 135、NaCl 10、EGTA 1、HEPES 10（mM）を含み（CsOHによりpH7．2）、細胞外溶液は、NaCl 145、KCl 4、MgCl2 0．5、CaCl2 1、HEPES 10、グルコース10（mM）を含んでいた（NaOHによりpH7．4）。
【０２５３】
データ収集のために、Sophionソフトウェアを使用し、分析をExcelおよびGraphPad Prismを用いてオフラインで行った。
【０２５４】
可能な場合、すなわち試験した最大濃度による阻害％が50％を超えた場合、用量反応曲線データを次式にフィットさせた：
Y＝100／（1＋10＾（（LogIC50−X）＊HillSlope））
［Xは濃度の対数であり；Yは正規化された応答であり（100％から0％へ、Xが増加するにつれて減少）；LogIC50はXと同じ対数単位であり；HillSlopeは単位のないスロープファクタまたは傾きである］
【０２５５】
【表７】
2021501178.tif 000071
【０２５６】
エクスビボ試験
ヒト単球P2X4アッセイ
アッセイの原理は、2’，3’−O−（4−ベンゾイル−ベンゾイル）−ATP（Bz−ATP）による活性化の後、内因性P2X4チャネルを通る初代ヒト単球へのカルシウム流入を測定することである。細胞内カルシウム濃度変化は、Flipr（商標）（Molecular Devices）装置でカルシウム感受性染料（Fluo−8）を用いて測定した。初代単球では、P2X4はリソソーム膜に位置するので、細胞膜でP2X4を露出させるためにエキソサイトーシスが引き起こされなければならない。
【０２５７】
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、抗凝固処置された血液（血液細胞、BC）から密度勾配遠心分離によって単離した。全血をPBSで1：3に希釈した。試料30mLを、50mL遠心管（Falcon）中で15mL Biocoll（BIOCHROM）の上部に注意深く層状に重ねた。管を、室温で25分間中断することなく914xgで遠心した。PBMC層を10mLピペットで取り出し、氷冷PBSを含む管に50mLの全体積で移した。細胞を、それぞれ10分間と5分間、4℃で300xgでペレット化することによって2回洗浄した。PBMCを10mL培地（X−vivo、Biozym Scientific）に再懸濁し、ノイバウアーチャンバで計数した。
【０２５８】
Miltenyi製単球単離キットII（＃130−091−153）を説明書に従って用いて、ネガティヴ選択によって単球を単離した。単離は速く行われなければならず、細胞および溶液はいつでも氷上で保持されなければならない。10exp8細胞のバッチ中のPBMCは、50mL Falcon管中で、ペレット化され（300xg、10分）、300μL MACS緩衝液によって再懸濁された。FcRブロッキング試薬（100μl）およびビオチン抗体（100μl）を添加し、混合し、氷上で10分間インキュベートした。MACS緩衝液（300μL）および抗ビオチンマイクロビーズ（100μL）を添加し、混合し、氷上で15分間インキュベートした。細胞をペレット化すること（300xg、10分間）によって洗浄し、500μL MACS緩衝液に再懸濁した。各バッチに1本の分離カラムをMACSセパレータに設置し、3mLのMACS緩衝液ですすいだ。細胞懸濁液をカラムに添加し、続いて洗浄用の3×3mLのMACS緩衝液を添加し、単球を含有する溶離剤を回収した。細胞をペレット化し（300xg、10分間）、X−vivo培地に再懸濁し、計数した。フィブロネクチンをコートしたマイクロプレート（384ウェル、ブラック、透明平底；Corning  ＃3848）に50μL中30，000細胞／ウェルの密度で単球を播種し、一晩培養した（37℃、5％CO2）。
【０２５９】
試験物質を、100％DMSOに10mMのストック濃度で溶解し、−20℃で一定分量で保存した。段階希釈（2x）をDMSO中で調製し、アッセイ緩衝液で500倍希釈してアンタゴニストプレートを生成した。Flipr測定では、1ウェルにつき10μLを移し（4倍希釈）、最終最高濃度の5μMおよび0．05％DMSOがアッセイで得られた。アゴニストBzATPを一定量中10mMで保存し、15μMの中間体濃度に希釈して、アゴニストプレートを生成した。Flipr測定では、3μMの最終アッセイ濃度が得られるように、1ウェルにつき10μLを移した（5倍希釈）。
【０２６０】
実験のために、細胞プレートの培地を手作業で廃棄し、70μL／ウェルの負荷緩衝液を添加し、1時間インキュベートした（37℃、5％CO2）。負荷緩衝液は、エキソサイトーシスを引き起こすために、HBSS（カルシウム／マグネシウムを含まない）、10mM Hepes pH7．4、5μM Fluo−8（AM）（Tebu−bio）および50mMメエチルアミン（Sigma）を含んでいた。負荷緩衝液を手作業で廃棄し、30μL／ウェルの低カルシウムアッセイ緩衝液（KCl 5mM、NaCl 145mM、CaCl2 0．5mM、グルコース  13mM、Hepes 10mM pH7．4）を添加した。アンタゴニストプレートを移し（10μL／ウェル）、15分後に室温でアゴニストプレート（10μL／ウェル）を移した。
【０２６１】
アゴニストの添加は、10秒ベースラインの後に240秒間記録された。分析のために、ベースライン補正を適用し、曲線の最大値を抽出した。データを0％阻害（3μM BzATPでのシグナル）および100％阻害（BzATP刺激なし）に対して正規化し、Prism GraphPadを用いて4パラメータのシグモイド阻害曲線にフィットさせてIC50値を得た。
【０２６２】
【表８】
2021501178.tif 000072
【０２６３】
ヒト全血P2X4アッセイ
このアッセイでは、生体外で、健康な女性ボランティアの血液を最初にリポ多糖（lipopolysacharide）（LPS）で感作させ、その後ATPで刺激してインターロイキン1ベータ（IL−1β）を放出させる。この系では、全血中でのIL−1βの産生へのP2X4アンタゴニストの効力を試験した。細胞を最初に100ng／mlのLPSで2時間で処理し、次に3mMのATPで刺激し、異なる濃度の実施例19、28、39、321、326および380で3連処理した。1時間のインキュベーションの後、上清を取り、遠心分離後に上清中のIL−1βを標準的なELISAキットを用いて検定した。アッセイは、3名の異なるドナーの血液で実施した（図2aおよび2b参照）。
【０２６４】
図2aおよび2bは、本発明による化合物の拘束力のない説明的な例として、リポ多糖（lipopolysacaride）による2時間の細胞のプライミングおよび指定された処置の後の、ATP刺激後のヒト全血中でのIL−1βの生成への実施例19、28、39、321、326および380による化合物の効果を表す。データは、3名のドナーの血液の上清中のIL−1βの絶対量（pg／ml）をy軸に示し、対照の処置および異なる濃度による実施例の処置がx軸に示される。各バーについて、3つの技術的反復の平均およびSDが示される。データは、試験した実施例の全てではないがいくつかによる、IL−1β放出の阻害を示す。
【０２６５】
インビボ試験
ラットにおけるtMCAO誘発性虚血性脳卒中モデル−化合物実施例39
一過性中大脳動脈閉塞（tMCAO）を、Schmid−Elsaesserら、［Stroke．1998；29（10）：2162−2170］に記載されている方法に従って、約3カ月の雄Sprague Dawley（SD）ラットに実施した。特に、右総頸動脈（CCA）を、正中線頸部切開によって露出させ、周囲の神経および筋膜から（その分岐部から頭蓋底まで）注意深く切除した。外頸動脈（ECA）の後頭動脈枝および上甲状腺動脈枝を分離し、これらの枝を凝固させた。ECAをさらに遠位側で解剖し、分岐の直前に、舌動脈および顎動脈の終末枝とともに凝固させた。内頸動脈（ICA）を孤立させ、隣接する迷走神経から注意深く分離し、蝶口蓋動脈を5−0ナイロン縫合糸でその起源の近くに結紮した。その後、動員されたECA断端の周りに4−0絹縫合糸を緩く結び、長さ4cmのDoccol 4−0モノフィラメント縫合糸（シリコーンコーティング済）を近位ECAからICAに挿入し、そこからウィリス動脈輪に挿入してMCAを効果的に閉塞した。手術創を閉じ、動物を麻酔から回復させるためにケージに戻した。閉塞の2時間後、ラットを再び麻酔し、モノフィラメントを引き抜いて再灌流させた。創を再び閉じ、ラットをケージに戻した。
【０２６６】
1群あたり12〜15匹のラットを有する4つの群のラットが研究に含まれた。2つの群にtMCAOを受けさせ、2つの群は偽手術された動物とした（群1＝処置を行わない偽、群2＝ビヒクル処置した偽、群3＝ビヒクル処置したtMCAO、群4＝P2X4アンタゴニスト処置したtMCAO）。群2、3、および4を、手術の1時間前に開始するビヒクルまたはP2X4アンタゴニストの経口投与により、1日2回、7日間処置した。修正された神経学的重症度スコア（mNSS）を使用して、神経学的機能を等級付けし、評価した［Liら、Neurology 2001，56：1666−1672］。mNSSは、運動、感覚、反射およびバランスの試験からなる複合物であり、0〜18のスケールで等級付けされた（通常のスコアは0であり、最大障害スコアは18で表される）。正常なmNSSの動物のみを含めるために、手術前に全てのラットにmNSS試験を受けさせた。tMCAOの2時間後に、mNSSが10以上のラットのみを研究に含めた。mNSS試験は、手術後1日目、2日目、8日目、15日目、22日目および29日目にも実施された。
【０２６７】
P2X4アンタゴニスト処理tMCAO群で8日目から、ビヒクル処理されたtMCAO群よりも有意に小さいmNSSが得られた（p＜5％、二元配置ANOVA統計分析とそれに続くボンフェローニの事後比較）。両方の偽群は、各時点で0のmNSSを示した（図3を参照）。
【０２６８】
マウスにおけるtMCAO誘発性虚血性脳卒中モデル
一過性中大脳動脈閉塞（tMCAO）を、Hataら［J Cereb Blood Flow Metab．2000；20（6）：937−946］に記載されている方法に従って、8〜10週齢の雄C57BL／6Nマウスで実施した。特に、麻酔したマウスにおいて、左総頸動脈（CCA）を正中線頸部切開によって露出させ、周囲の神経および筋膜から注意深く切除し、結紮した。次に、同じ側の左外頸動脈（ECA）を分離し、同様に結紮した。解剖された内頸動脈（ICA）および蝶口蓋動脈（PA）の良好な視野を得た後、両方の動脈をクリップした。その後、シリコン樹脂（キサントプレン（Xantopren）；バイエルデンタル、大阪、日本）でコーティングされた8−0ナイロンモノフィラメント（エチロン（登録商標）；エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を小切開から総頸動脈に導入し、MCAの閉塞のために頸動脈分岐部から9mm遠位に進めた。糸の先端径（0．15〜0．20mm）は、動物の体重に合わせて選択された。手術創を閉じ、動物を麻酔から回復させるためにケージに戻した。閉塞の45分後、マウスを再び麻酔し、モノフィラメントを引き抜いて再灌流させた。創を閉じ、マウスをケージに戻した。
【０２６９】
1群あたり10〜15匹のマウスを有する4つの群のマウスが研究に含まれた。3つの群にtMCAOを受けさせ、1つの群は偽手術された動物とした（群1＝処置を行わない偽、群2＝対照化合物MK−801によるtMCAO、群3＝ビヒクル処置したtMCAO、群4＝P2X4アンタゴニスト処置したtMCAO）。群2は、対照化合物MK−801で動物あたり1回だけ、脳卒中手術の15分前に腹腔内に3mg／kg体重の用量で5ml／kg体重の用量で処置した。群3および4は、手術の1時間前に開始するビヒクルまたはP2X4アンタゴニスト（60mg／kg体重）の経口投与により、両方とも5ml／kg体重の用量で、1日2回、14日間処置した。
【０２７０】
薬物治療効果を測定するための読み取りパラメータとして、4つの異なる感覚運動性テスト［修正された神経学的重症度スコア（mNSS）、接着剤除去試験（ART）、コーナーテスト（CoT）、およびシリンダーテスト（CT）］が含まれた。
【０２７１】
修正された神経学的重症度スコア（mNSS）は、手術前と、tMCAOまたは偽手術の後の1、7、14、21および28日目に実施した。この研究で用いたmNSSは、Orsiniら［Circulation．2012；126（12）：1484−1494］およびDe Simoniら［J Cereb Blood Flow Metab．2003；23（2）：232−239］で発表されたニューロスコアに従って修正されていた。このmNSSを使用して、tMCAO後の全身状態および限局性神経機能障害を評価した。スコアの範囲は0（障害なし）から39（全ての項目で最低の成績となる）であり、全身性障害と限局性障害の合計として計算される。mNSSの結果は、以下の全身性障害（スコア）：髪（0〜2）、耳（0〜2）、眼（0〜3）、姿勢（0〜3）、自発活性（0〜3）と、以下の局所性障害（スコア）：体の対称性（0〜2）、歩行（0〜4）、45度傾斜した表面の登坂（0〜3）、旋回行動（0〜3）、前肢の対称性（0〜4）、旋回行動（0〜3）、髭への軽い接触への応答（0〜4）、および前肢のグリップテスト（0〜3）、を含んだ複合神経学的スコアとして表された。
【０２７２】
正常なmNSSの動物のみを含めるために、手術前に全てのマウスにmNSS試験を受けさせた。tMCAOの24時間後に、mNSSが8以上のマウスのみを研究に含めた。
【０２７３】
接着剤除去試験（ART）を用いて体性感覚障害を測定した。接着剤付きの紙のドット（直径約2mm）を触覚刺激として使用し、右前肢の足底領域に固定した。tMCAO手術の1週間前に、各動物に1日あたり3つのART試験を2日行った。条件付けの2日目に動物が平均時間60秒以上で刺激を取り除くことができなかった場合、さらなる条件付けの日を追加した。さらに試験日を追加しても動物が60秒以内に刺激を取り除くことができなかった場合、その動物を研究から除外した。ARTは、手術前と、手術後7日目、14日目、21日目および28日目に実施された。各試験日に、試験は動物ごとに3回行われた。右前肢の接着剤刺激を検知して取り除くために必要な3つの試験の時間を記録し、評価した。
【０２７４】
コーナーテスト（CoT）は、脳卒中に関連する前肢の無動を測定するために使用された。コーナーテストシステムは、2つの向かい合ったコーナーを30度の角度で形成するように接着された、4枚のボードを使用して作成された。これらのコーナーの1つには、マウスがこのそれぞれのコーナーを見つけるように促す小さな隙間が含まれている。このコーナーテストシステムを、標準的な寝具を備えたケージに入れた。CoTを実行するため、カメラを起動し、マウスを長方形の中央に置き、10分間記録した。マウスは隙間のあるコーナーに到達しようとした。しかし、脳卒中のマウスは真っ直ぐ進むことができない。そのため、マウスはむしろ左に、または右側に向きを変えた。そして、左および右を向いた数を評価用の記録から数えた。CoTは、手術前と、手術後14日目および28日目に実施された。
【０２７５】
シリンダーテスト（CT）は、自発的な前肢の使用を数えることによって探索行動を調査するために使用された。このテストを実行するため、マウスを透明なシリンダー（直径12cmおよび高さ20cm）に5分間入れた。動物が観察者に背を向けてもいつでも前肢の動きを記録できるように、鏡をシリンダーの後ろに斜めに鏡を置いた。シリンダーは、動物が後ろ足で立つことにより上端に達するのを防ぐのに十分な高さであった。観察前のシリンダーへの馴化は許可されなかった。左前肢および右前肢で独立して実行された壁接触と、両方の前肢による平行接触の数を、セッションごとにマウスごとに数えた。支持接触、すなわち、指を開いた前肢のシリンダーの壁への完全な並置のみを数えた。CTは、手術後14日目および28日目に実施された。
【図１】
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【図２ａ１】
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【図２ａ２】
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【図２ａ３】
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【図２ｂ１】
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【図２ｂ２】
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【図２ｂ３】
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【図３】
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【国際調査報告】
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