(57)【要約】本発明は、安全性及び抗がん効果が改善した腫瘍溶解性ウイルス並びにその使用に関する。本発明の安全性及び抗がん効果が改善した腫瘍溶解性ウイルスは、ＨＳＶ−ＴＫ断片コード遺伝子をＴＫ遺伝子領域に挿入して、ワクシニアウイルスのＴＫを欠失させることによって得られる。さらに、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスを感染させたがん細胞及びそれらの近傍のがん細胞でさえも死滅させることができるようにＨＳＶ−ＴＫ断片を発現して、ＧＣＶをリン酸化する。さらに、ＧＣＶはウイルス増殖の抑制にも関与し、したがって、高用量のウイルスの投与時でさえもウイルスによって引き起こされる副作用を制御することができる。さらに、ウイルス増殖に対するＧＣＶの抑制によりウイルス粒子の数は低減されても、抗がん効果は増加する。したがって、本発明の安全性及び抗がん効果が改善した腫瘍溶解性ウイルスは、がんの治療に有効に使用され得る。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクター。
【請求項２】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片がＨＳＶ１−ＴＫ（単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ）断片である、請求項１に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項３】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１〜１９５アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から２４〜１４９アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項５】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から３０〜４６アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項６】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から４６アミノ酸残基が連続的に欠失されているものである、請求項２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項７】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する、請求項２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項８】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片のバリアントがＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントである、請求項１に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項９】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントが配列番号７又は８のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１０】
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、又はポックスウイルスに由来する、請求項１に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１１】
ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１２】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片がＨＳＶ１−ＴＫ断片である、請求項１１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１３】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１〜１９５アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１４】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から２４〜１４９アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１５】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から３０〜４６アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１６】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から４６アミノ酸残基が連続的に欠失されているものである、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１７】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１８】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片のバリアントがＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントである、請求項１１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１９】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントが配列番号７又は８のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２０】
アデノウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、レオウイルス、アデノ随伴ウイルス、粘液腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、コクサッキーウイルス、セネカウイルス、ワクシニアウイルス、又はポックスウイルスに由来する、請求項１１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２１】
ワクシニアウイルスに由来する、請求項１１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２２】
有効成分として請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２３】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、１×１０３ｐｆｕ〜１×１０１０ｐｆｕの用量で投与される、請求項２２に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２４】
前記がんが、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頚部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸がん、膣癌、外陰癌、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺癌、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、及び有効成分としてＧＣＶ（ガンシクロビル）又はＡＣＶ（アシクロビル）を含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍溶解性ウイルス及びＧＣＶ又はＡＣＶが、同時に又は順次投与される、請求項２５に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２７】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、１×１０３ｐｆｕ〜１×１０１０ｐｆｕの用量で投与される、請求項２５に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２８】
前記ＧＣＶ又はＡＣＶが、０．１μｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される、請求項２５に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２９】
前記がんが、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頚部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸がん、膣癌、外陰癌、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺癌、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２５に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス及びＧＣＶ又はＡＣＶを投与するステップを含む、がんを治療する方法。
【請求項３１】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、１×１０３ｐｆｕ〜１×１０１０ｐｆｕの用量で投与される、請求項３０に記載のがんを治療する方法。
【請求項３２】
前記ＧＣＶ又はＡＣＶが、０．１μｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される、請求項３０に記載のがんを治療する方法。
【請求項３３】
前記ＧＣＶ又はＡＣＶが、前記腫瘍溶解性ウイルスの投与中又は後に少なくとも１回投与される、請求項３０に記載のがんを治療する方法。
【請求項３４】
前記ＧＣＶ又はＡＣＶが、前記腫瘍溶解性ウイルスの投与の２４時間後から約２週間投与される、請求項３０に記載のがんを治療する方法。
【請求項３５】
前記ＧＣＶ又はＡＣＶが、５〜１８日間週に２回連続的に投与される、請求項３０に記載のがんを治療する方法。
【請求項３６】
前記がんが、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頚部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸がん、膣癌、外陰癌、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺癌、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３０に記載のがんを治療する方法。
【請求項３７】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与によって投与される、請求項３０に記載のがんを治療する方法。
【請求項３８】
ｉ）ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むシャトルプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし、宿主細胞を野生型ワクシニアウイルスによって処置するステップ；ｉｉ）生じる宿主細胞を培養するステップ；及びｉｉｉ）生じる培養物から組換えワクシニアウイルスを得るステップを含む、ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現する組換えワクシニアウイルスを調製する方法。
【請求項３９】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片が、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する、請求項３８に記載のＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現する組換えワクシニアウイルスを調製する方法。
【請求項４０】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号９のヌクレオチド配列である、請求項３８に記載のＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現する組換えワクシニアウイルスを調製する方法。
【請求項４１】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片のバリアントをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１０又は１１のヌクレオチド配列である、請求項３８に記載のＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現する組換えワクシニアウイルスを調製する方法。
【請求項４２】
がんを治療するための、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスの使用。
【請求項４３】
がんを治療するための、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４４】
がんを予防又は治療するための医薬品の製造のための、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスの使用。
【請求項４５】
がんを予防又は治療するための医薬品の製造のための、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性及び抗がん効果が改善した腫瘍溶解性ウイルス、並びにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の本格的な使用により、腫瘍選択性及び抗がん有効性が増加した腫瘍溶解性ウイルスを使用する臨床試験が開始された。文献に報告された最初の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルスである。それ以来、他のウイルスを使用する腫瘍溶解性の研究が活発に行われた（Ｍａｒｔｕｚａら、１９９１年、Ｈｗａｎｇら、２０１１年；Ｋａｕｆａｍａｎら、２０１５年；Ｋｈｕｒｉら、２０００年；Ｐａｒｋら、２００８年）。
【０００３】
腫瘍溶解性ウイルスの有用性は、米国及び欧州における、進行性のメラノーマを治療するヘルペスウイルスベースのＴ−Ｖｅｃ（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）の近年の商業化の成功により熱い注目を集めている。一方、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を欠損するワクシニアウイルスは、大きな臨床的有用性を有するが、その治療域の狭さによりその臨床効果を最大にするには限界がある。ＴＫ欠損ワクシニアウイルスの治療域の狭さは、高用量のウイルスが優れた臨床的有効性を持つが、ウイルスの毒性により臨床的リスクを必然的に伴うことを意味する。
【０００４】
実際に、原発性肝臓がんの３０人の患者で行われたＰｅｘａ−Ｖｅｃ（ＪＸ−５９４；ＳｉｌｌａＪｅｎ  Ｉｎｃ．）のフェーズＩＩ臨床試験では、高用量群（１０９ｐｆｕ）の生存率が低用量群（１０８ｐｆｕ）と比較して増加したことが示された（Ｈｅｏら、２０１３年）。しかしながら、腫瘍内投与によって行われたフェーズＩ臨床試験において３×１０９ｐｆｕで用量制限毒性（ＤＬＴ）が観察され、それにより最大耐用量（ＭＴＤ）は１×１０９ｐｆｕに制限された。薬物との関係は無かったことが報告されている。しかしながら、腫瘍溶解性ウイルスによる治療直後の死の多くの症例が報告されており、望ましくないウイルス複製が予測不可能な結果をもたらし得ることを示している。有効性のこれらの用量依存的な増加及び用量制限毒性は、安全でより有効なワクシニアウイルスの開発が必要であることを示している。
【０００５】
一方、ガンシクロビル（ＧＣＶ）は、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び水痘帯状疱疹ウイルスに対して有効な抗ウイルス剤である。ＧＣＶの５’端は、単純ヘルペスウイルスのＴＫと結合するとリン酸化され、次いでガンシクロビル三リン酸に変換される（ＧＣＶ−ＴＰ）。ＧＣＶ−ＴＰは、ウイルスＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害し、ウイルスＤＮＡの３’端に接着し、それによりＤＮＡ伸長を終結させる。ＧＣＶ−ＴＰは非常に毒性の物質であり、細胞においてＤＮＡ合成をブロックすることにより細胞傷害性を示し得る。
【０００６】
今日、ＨＳＶ−ＴＫを腫瘍溶解性ウイルスに挿入して、ＧＣＶとの同時投与によりがん細胞アポトーシスを誘導することによる、腫瘍溶解性ウイルス療法でＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶシステムを使用する研究がある。この療法において、まず、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞に感染し、直接抗がん効果を誘導し、ＨＳＶ１−ＴＫ（自殺遺伝子）によってリン酸化されたＧＣＶは腫瘍細胞増殖を阻害し、それによりさらなる抗がん効果を示す（Ｏｌｉｖｅｒ  Ｗら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｖｏｌ．１０、Ｎｏ．１６、１９９９年）。ＨＳＶ１−ＴＫ／ＧＣＶシステムは、ベクターとしてアデノウイルスを用いる腫瘍溶解性ウイルス療法において主に使用された。しかしながら、ＧＣＶを同時投与することによって考えられるさらなる細胞傷害効果は、依然として議論の余地がある。
【０００７】
特に、グリオーマ細胞での細胞傷害効果は、ＨＳＶ−ＴＫを装備した複製可能アデノウイルスがＧＣＶと組み合わせて投与された場合に著しく増加したことが観察された。しかしながら、全ての研究が一致する結果を示すわけではなかった。（Ｌａｍｂｒｉｇｈｔ  ＥＳら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、８：９４６〜５３頁）。この理由は、ＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶシステムが、ウイルス複製だけでなく腫瘍細胞増殖においても、矛盾する効果により総合効果が相殺されることを含むためであった（Ｗｉｄｎｅｒ  Ｏ、Ｍｏｒｒｉｓ  ＪＣ、２０００年）。
【０００８】
したがって、腫瘍溶解性ウイルス療法へのＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶシステムの適用において、安全性を確保しながら同時に抗がん効果を強化する特定の方法を研究する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明者らは、安全性及び抗がん効果が改善した腫瘍溶解性ウイルスを開発する研究を行い、ＨＳＶ１−ＴＫのＣ末端の一部が切断されたＨＳＶ１−ＴＫ断片をコードする遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫｍｕｔ）、又はそのバリアントを含む組換えワクシニアウイルスを開発すること、及びＧＣＶと組み合わせて投与される場合、組換えワクシニアウイルスが優れた安全性及び抗がん効果を示すことを確認することによって本発明を達成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するため、本発明の一態様は、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターを提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、腫瘍溶解性ウイルスを含む、がんを治療するための医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明のよりさらなる態様は、腫瘍溶解性ウイルス、及び有効成分としてＧＣＶ（ガンシクロビル）又はＡＣＶ（アシクロビル）を含む、がんを治療するための医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明のよりさらなる態様は、腫瘍溶解性ウイルス、及びＧＣＶ又はＡＣＶを投与するステップを含む、がんを治療する方法を提供する。
【００１５】
本発明のよりさらなる態様は：ｉ）ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むシャトルプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし、宿主細胞を野生型ワクシニアウイルスによって処置するステップ；ｉｉ）宿主細胞を培養するステップ；及びｉｉｉ）培養から組換えワクシニアウイルスを得るステップを含む、組換えワクシニアウイルスを調製する方法を提供する。
【００１６】
本発明のよりさらなる態様は、がんを治療するための腫瘍溶解性ウイルスの使用を提供する。
【００１７】
本発明のよりさらなる態様は、がんを治療するための医薬組成物の使用を提供する。
【００１８】
本発明のよりさらなる態様は、がんを治療するための医薬品の製造のための腫瘍溶解性ウイルスの使用を提供する。
【００１９】
本発明のよりさらなる態様は、がんを治療するための医薬品の製造のための医薬組成物の使用を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
安全性及び抗がん効果が改善した本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスの天然ＴＫ遺伝子の欠失した領域に挿入されたコード遺伝子、ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントに起因する。さらに、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ＧＣＶをリン酸化し、それにより腫瘍溶解性ウイルスによって感染させたがん細胞及び周辺のがん細胞さえも死滅させるＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現することができる。さらに、高用量のウイルスが投与される場合、ウイルスによって引き起こされる有害な副作用を制御することができるように、ＧＣＶは、ウイルス複製の阻害にも関与する。さらに、ＧＣＶによるウイルス複製の抑制によりウイルス粒子の数が減少するが、抗がん効果は増加する。したがって、安全性及び抗がん効果が改善した本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、がんの治療に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】組換えワクシニアウイルスを調製するために使用されるＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を持つシャトルプラスミドベクターの概略図である。
【図２】ＨＳＶ１−ＴＫｍｕｔ遺伝子及びホタルルシフェラーゼ遺伝子がＴＫ遺伝子領域に挿入される組換えワクシニアウイルス、ＯＴＳ−４１２の例を示す概略図である。
【図３】ＨＳＶ１−ＴＫ断片を発現する組換えワクシニアウイルス（ＯＳＴ−４１２）を調製するプロセスを示す図である。
【図４】ＯＴＳ−４１２でのＨＳＶ１−ＴＫ断片の発現を確認するためのウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】ＯＴＳ−４１２  ＤＮＡ中のＨＳＶ１−ＴＫｍｕｔ遺伝子の挿入を確認するための制限酵素マッピングの結果を示す図である。
【図６】ＨＣＴ−１１６がん細胞株での感染２４時間及び４８時間後のＯＴＳ−４１２の複製能力を示すグラフである。
【図７】ＯＴＳ−４１２処置したＮＣＩ−Ｈ４６０及びＮＣＩ−Ｈ２３がん細胞株におけるＧＣＶによるウイルス複製の阻害を示すグラフである。
【図８】ＯＴＳ−４１２処置したＨＣＴ−１１６がん細胞株におけるＧＣＶによる細胞傷害性の増強を示すグラフである。
【図９】それぞれＯＴＳ−４１２単独又はＧＣＶと組み合わせての投与後の、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＨＴ−２９、及びＨＣＴ−１１６がん細胞株の細胞生存率を示すグラフである。
【図１０】それぞれＧＣＶ、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せの投与後、Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ４６０がん細胞株のアポトーシス及びネクローシスパターンを実証する図である。
【図１１】それぞれＧＣＶ、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せの投与後、Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ４６０がん細胞株の細胞生存率を示すグラフである。
【図１２】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せの、ＨＣＴ−１１６がん細胞株を移植したマウスへの投与後１２日間の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
【図１３】ＰＢＳ、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せのマウスへの投与後に撮られた、ＨＣＴ−１１６がん細胞株を移植したマウスにおけるＯＴＳ−４１２の分布を示す生物発光画像である。
【図１４】ＯＴＳ−４１２単独又はＧＣＶとの組合せのマウスへの投与後、ＨＣＴ−１１６がん細胞株を移植したマウスから得られた腫瘍組織中で計数したウイルスＤＮＡコピー数を示すグラフである。
【図１５】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せのＨＣＴ−１１６腫瘍担持マウスへの投与後１２日間の体重の変化を示すグラフである。
【図１６】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せのＲｅｎｃａ腫瘍担持マウスへの投与後２４日間の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
【図１７】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せの投与後、Ｒｅｎｃａ腫瘍担持マウスから得られた腫瘍組織における総ウイルス粒子の数を示すグラフである。
【図１８】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せのマウスへの投与後、Ｒｅｎｃａがん細胞株を移植したマウスから得られた腫瘍組織のＴＵＮＥＬ染色結果を示す図である。
【図１９】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せのマウスへの投与後、Ｒｅｎｃａがん細胞株を移植したマウスから得られた腫瘍組織のＴＵＮＥＬ染色で観察されたアポトーシス部分の定量を示すグラフである。
【図２０】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せのＨＣＴ−１１６腫瘍担持マウスへの投与後２１日間の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
【図２１】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せの投与後、ＨＣＴ−１１６がん細胞株を移植したマウスから得られた腫瘍組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）を示す図である。
【図２２】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せの投与後、ＨＣＴ−１１６がん細胞株を移植したマウスから得られた腫瘍組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）で観察された染色された部分の定量を示すグラフである。
【図２３】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せの投与後、ＨＣＴ−１１６がん細胞株を移植したマウスから得られた腫瘍組織のＨ＆Ｅ染色で観察された壊死性部分の定量を示すグラフである。
【図２４】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せのマウスへの投与後、ＨＣＴ−１１６腫瘍担持マウスから得られた腫瘍組織のＨ＆Ｅ染色による生存腫瘍領域を示すグラフである。
【図２５】生理食塩水、ＯＴＳ−４１２、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せのＨＣＴ−１１６がん細胞株を移植したマウスへの投与後２１日間のＯＴＳ−４１２及びＧＣＶによって処置したマウスの各群の体重を示すグラフである。
【図２６】ＯＴＳ−４１２による処置後の１３の異なるがん細胞株の細胞生存率評価を示すグラフである。
【図２７】ＨＴＣ−１１６、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、及びＤＵ１４５がん細胞株に投与されたＯＴＳ−４１２のＩＣ５０を示すグラフである。
【図２８】ＨＣＴ−１１６腫瘍担持マウスに腹腔内注射したＯＴＳ−４１２の３日目及び７日目のウイルス分布を示す生物発光画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以降、本発明を詳細に記載する。
【００２３】
本発明は、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターを提供する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「ＴＫ（チミジンキナーゼ）」は、ヌクレオチドの生合成に関与する酵素、チミジンキナーゼを意味する。ＴＫは、細胞とウイルスの両方においてヌクレオチドの生合成のために使用される酵素である。ＴＫは、単純ヘルペスウイルスに由来し得る。この時、単純ヘルペスウイルスは単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）又は単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）であってもよい。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）」は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ酵素を意味する。特に、ＨＳＶ−ＴＫはＨＳＶ１−ＴＫ（単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ）であってもよい。ＨＳＶ１−ＴＫは、単純ヘルペスウイルスにおけるＤＮＡ合成プロセス中の最初のリン酸化反応に関与する酵素である。ＨＳＶ−ＴＫは、抗ウイルス剤、ＧＣＶ（ガンシクロビル）又はＡＣＶ（アシクロビル）のリン酸化にも関与する。特に、ＧＣＶ又はＡＣＶに対して、ＨＳＶ１−ＴＫは他の型のウイルスに存在する任意の他のＴＫよりもおよそ１０倍の感受性で反応する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「ＨＳＶ−ＴＫ断片」は、ＨＳＶ−ＴＫのいくつかのアミノ酸残基が欠失したものを意味する。特に、ＨＳＶ−ＴＫ断片は、ＨＳＶ−ＴＫのＮ末端又はＣ末端の一部が欠失したものであってもよい。好ましくは、ＨＳＶ−ＴＫ断片は、ＨＳＶ−ＴＫのＣ末端の一部が欠失したものであってもよい。一実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫ断片は、ＨＳＶ−ＴＫのＣ末端から１〜１９５アミノ酸残基が連続的に欠失したものであってもよい。ＨＳＶ−ＴＫ断片は、ＨＳＶ−ＴＫのＣ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は１９５アミノ酸残基が連続的に欠失したものであってもよい。
【００２７】
本発明のＨＳＶ１−ＴＫ断片又はそのバリアントは、適応進化を誘導することによって変異されるウイルスに由来し得る。最適化ＨＳＶ１−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現するワクシニアウイルスを開発するため、本発明者らは、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子、ＴＫの不在下で誘導された適応進化を含有する組換えワクシニアウイルスを調製した。生じる組換えワクシニアウイルスは、ルシフェラーゼ活性を確認するための実験、ゲノム分析、及びＧＣＶに対する感受性を確認するための実験に供され、ＨＳＶ１−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現するワクシニアウイルスＯＴＳ−４１２がスクリーニングされた。ＨＳＶ１−ＴＫ断片又はそのバリアントは、ＨＳＶ１−ＴＫのＣ末端の著しい切断にもかかわらず、ＧＣＶに対する感受性を保持した。さらに、ＨＳＶ１−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現するワクシニアウイルスがＧＣＶと組み合わせて投与された場合、抗がん効果が増加したことが確認された。
【００２８】
ＨＳＶ−ＴＫ断片はＨＳＶ１−ＴＫ断片であってもよい。ＨＳＶ１−ＴＫ断片の一実施形態は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１〜１９５、２４〜１４９、又は３０〜４６アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は１９５アミノ酸残基が連続的に欠失したものであってもよい。好ましくは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から２４、３０、７０、９９、１４９、又は１９５アミノ酸残基が連続的に欠失されているものであってもよい。ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、Ｃ末端のいくつかのアミノ酸残基の欠失によりＧＣＶへの低下した感受性を持ち得る。
【００２９】
ＨＳＶ１−ＴＫ断片の一例は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１９５、１４９、９９、７０、４６、３０、又は２４アミノ酸残基が連続的に欠失されているものであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有し得る。
【００３０】
ＨＳＶ１−ＴＫ断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１〜１９５、２４〜１４９、又は３０〜４６アミノ酸残基が連続的に欠失されているＨＳＶ１−ＴＫ断片のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列であってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列であってもよい。好ましくは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９のヌクレオチド配列であってもよい。
【００３１】
ＨＳＶ−ＴＫ断片のバリアントは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片を構成する少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されているものであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列の１番目から１４５番目のアミノ酸残基を含み得る。一実施形態では、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントは、配列番号７又は８のアミノ酸配列を有し得る。ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０又は１１のヌクレオチド配列であってもよい。
【００３２】
ウイルスベクターは、遺伝子を細胞に導入するための又はウイルスを産生するためのベクターである。ウイルスベクターは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、又はポックスウイルスに由来し得る。
【００３３】
本発明の別の態様は、ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、ウイルスの遺伝子ががん細胞で特異的に複製するように操作されている、がん細胞を破壊する組換えウイルスを意味する。腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、レオウイルス、アデノ随伴ウイルス、粘液腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、コクサッキーウイルス、セネカウイルス、ワクシニアウイルス、又はポックスウイルスに由来し得る。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスに由来し得る。
【００３５】
ワクシニアウイルスは、ウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）（ＷＲ）、ＮＹＶＡＣ（ニューヨークワクシニアウイルス（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ））、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）（ニューヨーク市衛生委員会；ＮＹＣＢＯＨ）、ＬＣ１６ｍ８、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、天壇（Ｔｉａｎ  Ｔａｎ）、ＵＳＳＲ、タシュケント（ＴａｓｈＫｅｎｔ）、エバンス（Ｅｖａｎｓ）、ＩＨＤ−Ｊ（国際保健課（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）−Ｊ）又はＩＨＤ−Ｗ（国際保健課−ホワイト（Ｗｈｉｔｅ））株であってもよいが、これらに限定されない。
【００３６】
ＨＳＶ−ＴＫ断片は、ＨＳＶ１−ＴＫ断片であってもよい。ＨＳＶ１−ＴＫ断片の一実施形態は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１〜１９５、２４〜１４９、又は３０〜４６アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は１９５アミノ酸残基が連続的に欠失したものであってもよい。好ましくは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から２４、３０、７０、９９、１４９、又は１９５アミノ酸残基が連続的に欠失されているものであってもよい。ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、Ｃ末端のいくつかのアミノ酸残基の欠失によりＧＣＶへの低下した感受性を持ち得る。
【００３７】
ＨＳＶ１−ＴＫ断片の一例は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１９５、１４９、９９、７０、４６、３０、又は２４アミノ酸残基が連続的に欠失されているものであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有し得る。
【００３８】
ＨＳＶ１−ＴＫ断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１〜１９５、２４〜１４９、又は３０〜４６アミノ酸残基が連続的に欠失されているＨＳＶ１−ＴＫ断片のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列であってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列であってもよい。好ましくは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９のヌクレオチド配列であってもよい。
【００３９】
ＨＳＶ−ＴＫ断片のバリアントは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片を構成する少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されているものであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列の１番目から１４５番目のアミノ酸残基を含み得る。一実施形態では、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントは、配列番号７又は８のアミノ酸配列を有し得る。ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０又は１１のヌクレオチド配列であってもよい。
【００４０】
腫瘍溶解性ウイルスは、欠失した天然のＴＫ遺伝子を有し得る。特に、腫瘍溶解性ウイルスは、天然のＴＫ遺伝子が、ＨＳＶ１−ＴＫ断片をコードするヌクレオチド配列を天然のＴＫ遺伝子領域に挿入又は置換することによって欠失されているものであってもよい。本発明の一実施形態では、ワクシニアウイルスの天然のＴＫ遺伝子は、ＨＳＶ１−ＴＫ断片をコードするヌクレオチド配列をワクシニアウイルスの天然のＴＫ遺伝子領域に挿入することによって欠失された。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子欠損」は、遺伝子の部分的な若しくは全体的な欠失又は遺伝子への外来遺伝子の挿入により、遺伝子が発現されないことを意味する。部分的な遺伝子欠失は、５’端又は３’端における部分的な欠失であり得る。すなわち、腫瘍溶解性ウイルスの天然のＴＫ遺伝子は部分的に又は全体的に欠失されてもよい。
【００４２】
本発明の一例では、ＨＳＶ−ＴＫ断片をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスＯＴＳ−４１２をＨＣＴ−１１６がん細胞株に感染させ、感染及び複製効率が確認された（図６）。さらに、ＯＴＳ−４１２は、１３の異なるがん細胞株に投与され、７２時間の培養後、細胞生存率を測定し、ＯＴＳ−４１２の細胞傷害性を示した（図２６）。したがって、ＨＳＶ−ＴＫ断片をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、がんの治療に便利に用いられ得る。
【００４３】
本発明のよりさらなる態様は、有効成分としてＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスを含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００４４】
有効成分として医薬組成物に含有される腫瘍溶解性ウイルスは上記の通りである。
【００４５】
腫瘍溶解性ウイルスの投与量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物のタイプ、投与の経路及び期間によって変わり、当業者によって適切に選択され得る。投与量は、１×１０３〜１×１０１８のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ５０）、又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）を患者が受けるような投与量であってもよい。特に、投与量は、１×１０３、２×１０３、５×１０３、１×１０４、２×１０４、５×１０４、１×１０５、２×１０５、５×１０５、１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、１×１０１８又はそれ以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ５０）又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）であってもよく、その間の様々な値及び範囲が含まれ得る。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０３〜１×１０１０ｐｆｕの投与量で投与され得る。本発明の一例では、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０６、１×１０７、及び１×１０８ｐｆｕの投与量で投与された。
【００４６】
がんは、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頚部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸がん、膣癌、外陰癌、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺癌、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択され得る。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、生理学的に許容できる担体をさらに含み得る。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の調製に従来から使用される好適な賦形剤及び希釈剤をさらに含み得る。さらに、それは従来法に従って注射の形態で製剤化され得る。
【００４８】
医薬組成物は、滅菌水溶液、非水溶液、懸濁液、乳剤、凍結乾燥調製物、非経口投与用の坐薬等に製剤化され得る。非水溶液及び懸濁液としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能エステル等が使用され得る。坐剤基剤としては、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ（商標）、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ（商標）６１、カカオバター、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用され得る。
【００４９】
医薬組成物は、患者の状態、及び副作用の有無によって様々な方法及び量で対象に投与され、最適な方法、投与量、及び投与の頻度は、好適な範囲内で当業者によって選択され得る。さらに、医薬組成物は、他の薬物、又は治療される疾患に対するその治療効果が公知である生理学的に有効な物質と組み合わせて投与されてもよく、又は他の薬物と組み合わせて製剤化されてもよい。
【００５０】
医薬組成物は、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、こぶ内、及び静脈内投与等を含む、非経口的に投与され得る。好ましくは、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与であってもよい。一方、医薬組成物の投与量は、投与スケジュール、投与量、及び患者の健康状態によって決定され得る。
【００５１】
本発明者らは、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＨＴ−２９、及びＨＣＴ−１１６がん細胞株においてＧＣＶと組み合わせてＯＴＳ−４１２を投与し、がん細胞株の生存率を評価し、併用治療によって増加した抗がん効果を確認した（図９）。さらに、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶが組み合わせてがん細胞株に投与された場合でさえも、ウイルスは一定のレベルの複製能力を維持したことが確認された（図１４）。したがって、ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルスとＧＣＶの組合せは、がんの治療に便利に使用され得る。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルス、及び有効成分としてＧＣＶ（ガンシクロビル）又はＡＣＶ（アシクロビル）を含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００５３】
医薬組成物に含有される腫瘍溶解性ウイルス及びＧＣＶ又はＡＣＶは、同時に、順次、又は反対の順序で投与されてもよい。特に、医薬組成物に含有される腫瘍溶解性ウイルス及びＧＣＶ又はＡＣＶは同時に投与されてもよい。さらに、腫瘍溶解性ウイルスがまず投与され、ＧＣＶ又はＡＣＶ投与が続いてもよい。さらに、腫瘍溶解性ウイルスがまず投与され、ＧＣＶ又はＡＣＶ、及び腫瘍溶解性ウイルスが再び続いてもよい。
【００５４】
有効成分として医薬組成物に含有される腫瘍溶解性ウイルスは上記の通りである。
【００５５】
腫瘍溶解性ウイルスの投与量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物のタイプ、投与の経路及び期間によって変わり、当業者によって適切に選択され得る。投与量は、１×１０３〜１×１０１８のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ５０）、又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）を患者が受けるような投与量であってもよい。特に、投与量は、１×１０３、２×１０３、５×１０３、１×１０４、２×１０４、５×１０４、１×１０５、２×１０５、５×１０５、１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、１×１０１８又はそれ以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ５０）又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）であってもよく、その間の様々な値及び範囲が含まれ得る。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０３〜１×１０１０ｐｆｕの投与量で投与され得る。本発明の一例では、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０６、１×１０７、及び１×１０８ｐｆｕの投与量で投与された。
【００５６】
本明細書で使用する用語「ＧＣＶ」は、ガンシクロビルと呼ばれ、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び水痘帯状疱疹ウイルスに対して有効な抗ウイルス剤を意味する。ＧＣＶは、ウイルスのＴＫによって５’端でリン酸化され、次いでガンシクロビル三リン酸に変換される（ＧＣＶ−ＴＰ）。ＧＣＶ−ＴＰは、ウイルスＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害し、ウイルスＤＮＡの３’端に接着し、それによりＤＮＡ伸長を終結させる。さらに、リン酸化ＧＣＶは細胞のＤＮＡ複製を停止し、それにより細胞増殖を阻害する。ＧＣＶは、以下の式１によって表される。
【化１】
2021509015.tif 000003
【００５７】
本明細書で使用する用語「ＡＣＶ」は、アシクロビルと呼ばれ、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、及びエプスタイン−バーウイルスに対して有効な抗ウイルス剤を意味する。ＡＣＶは、ウイルスのＴＫによってリン酸化され、次いでアシクロビル三リン酸に変換される（ＡＣＶ−ＴＰ）。ＡＣＶ−ＴＰは、ウイルスＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害し、ウイルスＤＮＡの３’端に接着し、それによりＤＮＡ伸長を終結させる。ＡＣＶは、以下の式２によって表される。
【化２】
2021509015.tif 000004
【００５８】
さらに、ＧＣＶ又はＡＣＶは、０．１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの一日用量で投与され得る。特に、ＧＣＶ又はＡＣＶの一日用量は、０．１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、又は１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであってもよい。本発明の一例では、ＧＣＶは５０ｍｇ／ｋｇの一日用量で投与された。
【００５９】
がんは、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頚部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸がん、膣癌、外陰癌、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺癌、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択され得る。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、生理学的に許容できる担体をさらに含み得る。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の調製に従来から使用される好適な賦形剤及び希釈剤をさらに含み得る。さらに、それは従来法に従って注射の形態で製剤化され得る。
【００６１】
医薬組成物は、滅菌水溶液、非水溶液、懸濁液、乳剤、凍結乾燥調製物、非経口投与用の坐薬等に製剤化され得る。非水溶液及び懸濁液としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能エステル等が使用され得る。坐剤基剤としては、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ（商標）、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ（商標）６１、カカオバター、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用され得る。
【００６２】
医薬組成物は、患者の状態、及び副作用の有無によって様々な方法及び量で対象に投与され、最適な方法、投与量、及び投与の頻度は、好適な範囲内で当業者によって選択され得る。さらに、医薬組成物は、他の薬物、又は治療される疾患に対するその治療効果が公知である生理学的に有効な物質と組み合わせて投与されてもよく、又は他の薬物との組合せ調製物の形態で製剤化されてもよい。
【００６３】
医薬組成物は、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、こぶ内、及び静脈内投与等を含む、非経口的に投与され得る。好ましくは、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与であってもよい。一方、医薬組成物の投与量は、投与スケジュール、投与量、及び患者の健康状態によって決定され得る。
【００６４】
本発明のよりさらなる態様は、ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルス、及びＧＣＶ又はＡＣＶを、それを必要とする個体に投与するステップを含む、がんを治療する方法を提供する。
【００６５】
腫瘍溶解性ウイルス、ＧＣＶ及びＡＣＶは上記の通りである。
【００６６】
腫瘍溶解性ウイルスの投与量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物のタイプ、投与の経路及び期間によって変わり、当業者によって適切に選択され得る。投与量は、１×１０３〜１×１０１８のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ５０）、又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）を患者が受けるような投与量であってもよい。特に、投与量は、１×１０３、２×１０３、５×１０３、１×１０４、２×１０４、５×１０４、１×１０５、２×１０５、５×１０５、１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、１×１０１８又はそれ以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ５０）又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）であってもよく、その間の様々な値及び範囲が含まれ得る。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０３〜１×１０１０ｐｆｕの投与量で投与され得る。本発明の一例では、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０６、１×１０７、及び１×１０８ｐｆｕの投与量で投与された。
【００６７】
さらに、ＧＣＶ又はＡＣＶは、０．１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの一日用量で投与され得る。特に、ＧＣＶ又はＡＣＶの一日用量は、０．１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、又は１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであってもよい。本発明の一例では、ＧＣＶは５０ｍｇ／ｋｇの一日用量で投与された。
【００６８】
ＧＣＶ又はＡＣＶは、腫瘍溶解性ウイルスの投与中又は後に少なくとも１回投与され得る。特に、ＧＣＶ又はＡＣＶは、腫瘍溶解性ウイルスの投与の２４時間後から約２週間投与され得る。ＧＣＶ又はＡＣＶは、腫瘍溶解性ウイルスの投与後、５〜１８日間週に２回連続的に投与され得る。
【００６９】
がんは、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頚部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸がん、膣癌、外陰癌、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺癌、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択され得る。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、生理学的に許容できる担体をさらに含み得る。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の調製に従来から使用される好適な賦形剤及び希釈剤をさらに含み得る。さらに、それは従来法に従って注射の形態で製剤化され得る。
【００７１】
医薬組成物は、滅菌水溶液、非水溶液、懸濁液、乳剤、凍結乾燥調製物、非経口投与用の坐薬等に製剤化され得る。非水溶液及び懸濁液としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能エステル等が使用され得る。坐剤基剤としては、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ（商標）、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ（商標）６１、カカオバター、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用され得る。
【００７２】
医薬組成物は、患者の状態、及び副作用の有無によって様々な方法及び量で対象に投与され、最適な方法、投与量、及び投与の頻度は、好適な範囲内で当業者によって選択され得る。さらに、医薬組成物は、他の薬物、又は治療される疾患に対するその治療効果が公知である生理学的に有効な物質と組み合わせて投与されてもよく、又は他の薬物と組み合わせて製剤化されてもよい。
【００７３】
医薬組成物は、腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、こぶ内、及び静脈内投与等を含む、非経口的に投与され得る。好ましくは、腫瘍内、腹腔内、又は静脈内投与であってもよい。一方、医薬組成物の投与量は、投与スケジュール、投与量、及び患者の健康状態によって決定され得る。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「個体」は、疾患が本発明のがん細胞標的化組成物の投与によって緩和、抑制又は治療され得る状態のヒト、又は疾患を患っているヒトを意味する。
【００７５】
さらに、腫瘍溶解性ウイルス及びＧＣＶは、他の薬物又は治療される疾患に対するその治療効果が公知の生理学的に活性な物質と組み合わせて投与され、又は他の薬物との組合せ調製物の形態で製剤化されてもよい。
【００７６】
本発明のよりさらなる態様は、ｉ）ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むシャトルプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし、野生型ワクシニアウイルスによって宿主細胞を処置するステップ；ｉｉ）生じる宿主細胞を培養するステップ；及びｉｉｉ）生じる培養から組換えワクシニアウイルスを得るステップを含む、ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現する組換えワクシニアウイルスを調製するための方法を提供する。
【００７７】
ＨＳＶ−ＴＫ断片はＨＳＶ１−ＴＫ断片であってもよい。ＨＳＶ１−ＴＫ断片の一実施形態は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１〜１９５、２４〜１４９、又は３０〜４６アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は１９５アミノ酸残基が連続的に欠失したものであってもよい。好ましくは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から２４、３０、７０、９９、１４９、又は１９５アミノ酸残基が連続的に欠失されているものであってもよい。ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、Ｃ末端のいくつかのアミノ酸残基の欠失によりＧＣＶへの低下した感受性を持ち得る。
【００７８】
ＨＳＶ１−ＴＫ断片の一例は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１９５、１４９、９９、７０、４６、３０、又は２４アミノ酸残基が連続的に欠失されているものであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片は、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有し得る。
【００７９】
ＨＳＶ１−ＴＫ断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１〜１９５、２４〜１４９、又は３０〜４６アミノ酸残基が連続的に欠失されているＨＳＶ１−ＴＫ断片のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列であってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列であってもよい。好ましくは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９のヌクレオチド配列であってもよい。
【００８０】
ＨＳＶ−ＴＫ断片のバリアントは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントは、ＨＳＶ１−ＴＫ断片を構成する少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されているものであってもよい。特に、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列の１番目から１４５番目のアミノ酸残基を含み得る。一実施形態では、ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントは、配列番号７又は８のアミノ酸配列を有し得る。ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０又は１１のヌクレオチド配列であってもよい。
【００８１】
トランスフェクションは様々な方法で実施され得る。特に、ＣａＣｌ２沈殿、ＣａＣｌ２沈殿でＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を使用することによって効率が増強されたＨａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、原形質融合、炭化ケイ素線維による攪拌、アグロバクテリウム媒介トランスフェクション、ＰＥＧを使用するトランスフェクション、デキストラン硫酸、リポフェクタミン、及び乾燥／阻害媒介トランスフェクションのようなトランスフェクション法が使用され得る。
【００８２】
さらに、宿主細胞は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などのような酵母細胞；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、２９３細胞、及びｂｏｗメラノーマ細胞のような動物細胞；又は植物細胞であってもよい。一実施形態では、宿主細胞は、ＨｅＬａ細胞であってもよい。
【００８３】
野生型ワクシニアウイルスは、ウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）（ＷＲ）、ＮＹＶＡＣ（ニューヨークワクシニアウイルス（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ））、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）（ニューヨーク市衛生委員会；ＮＹＣＢＯＨ）、ＬＣ１６ｍ８、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、天壇（Ｔｉａｎ  Ｔａｎ）、ＵＳＳＲ、タシュケント（ＴａｓｈＫｅｎｔ）、エバンス（Ｅｖａｎｓ）、ＩＨＤ−Ｊ（国際保健課（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）−Ｊ）又はＩＨＤ−Ｗ（国際保健課−ホワイト（Ｗｈｉｔｅ））株であってもよいが、これらに限定されない。
【００８４】
シャトルプラスミド及び野生型ワクシニアウイルスは、同じワクシニアウイルス遺伝子の相同領域を含み得る。シャトルプラスミド及び野生型ワクシニアウイルスは、各エレメントがスクリーニングされ得るように好ましくは異なる複製オリジン及び／又はマーカーを含み得る。
【００８５】
宿主細胞は、当技術分野で公知の方法を使用して培養され得る。特に、培養方法は、本発明のＨＳＶ１−ＴＫ断片を発現する組換えワクシニアウイルスを産生することができる限り、特に限定されない。特に、フェドバッチ又は繰り返しフェドバッチプロセスで連続的に実行され得る。
【００８６】
培養のために使用される培養培地は、特定の株の必要性が好気条件下で温度、ｐＨ等を調節することによって適切な方法で満たされ得る、適切な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミン等を含有する従来の培養培地であってもよい。炭素源として、グルコース及びキシロースの混合された糖が主要な炭素源として使用され得る。他の炭素源は、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、及びセルロースのような糖及び炭水化物；大豆油、ひまわり油、ひまし油、及びココナツ油のような油及び脂；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール及びエタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸を含み得る。さらに、炭素源は、単独で又は混合物として使用され得る。一実施形態では、培養培地はウシ胎仔血清を含有するＥＭＥＭ培地であってもよい。
【００８７】
さらに、好適な前駆体は、培養培地で使用され得る。原材料は、培養中にバッチ、フェドバッチ、又は連続的な方法で好適な方法によって培養物に添加され得るが、特にこれらに限定されない。培養のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩基性化合物、又はリン酸若しくは硫酸のような酸化合物を好適な方法で使用することによって調整され得る。
【００８８】
さらに、気泡形成は、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用することによって抑制され得る。好気性条件を維持するため、酸素又は酸素含有ガス（例えば空気）が培養に注入される。培養の温度は、通常２７℃〜３７℃、好ましくは３０℃〜３５℃の範囲であり得る。培養時間は、２時間〜８０時間の範囲であり得る。好ましくは、培養時間は４時間〜７６時間の範囲であり得る。
【００８９】
培養からウイルスを得る方法は：宿主細胞を回収するステップ、細胞を繰り返し凍結／融解に供し細胞ライセートを得るステップ、細胞ライセートを繰り返し凍結／融解サイクルに供し、粗ウイルスを得るステップ、粗ウイルスを使用することによってプラーク単離を繰り返し、純粋な組換えワクシニアウイルスを得るステップを含む。しかしながら、方法はこれらに限定されない。
【００９０】
本発明のよりさらなる態様は、がんを治療するための腫瘍溶解性ウイルスの使用を提供する。
【００９１】
本発明のよりさらなる態様は、がんを治療するための医薬組成物の使用を提供する。
【００９２】
本発明のよりさらなる態様は、がんを治療するための医薬品の製造のための腫瘍溶解性ウイルスの使用を提供する。
【００９３】
本発明のよりさらなる態様は、がんを治療するための医薬品の製造のための医薬組成物の使用を提供する。
【００９４】
［本発明の形態］
以降、本発明は実施例を参照して詳細に記載する。しかしながら、以下の実施例は例示の目的のためだけであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００９５】
実施例１．組換えワクシニアウイルスの調製（ＯＴＳ−４１２）
実施例１．１．シャトルプラスミドベクターの構築
野生型ワクシニアウイルス（ＮＹＣ保健省株、ＶＲ−１５３６）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入された。組換えのため、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子（ｐＳＥ／Ｌプロモーター）及びホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐ７．５プロモーター）を含むｐＵＣ５７ａｍｐ＋（Ｇｅｎｅｗｉｚ，ＵＳＡ）が、シャトルプラスミドベクターとして使用された（図１）。
【００９６】
実施例１．２．組換えワクシニアウイルスの調製
組換えウイルスを確保するため、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）は、４×１０５個の細胞／ウェルの条件、及び１０％ウシ胎仔血清を含有するＥＭＥＭ培地の状態で、６ウェルプレート中で調製された。次いで、細胞は０．０５ＭＯＩの野生型ワクシニアウイルスによって処置された。２時間後、培地は２％ウシ胎仔血清を含有するＥＭＥＭ培地で置き換えられ、次いで細胞は、Ｘｆｅｃｔ（商標）ポリマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ６３１３１７，ＵＳＡ）を用いることによって実施例１．１で構築されたように４μｇの線状化シャトルプラスミドベクターによってトランスフェクトされた。４時間のインキュベーション後、培地は、２％ウシ胎仔血清を含有する新しいＥＭＥＭ培地で置き換えられ、次いで細胞は７２時間さらにインキュベートされた。ＨｅＬａ細胞でのルシフェラーゼ活性が確認され、ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルスを得たことが確認された。
【００９７】
以降、ＨＳＶ１−ＴＫ変異体は、ＴＫ−骨肉腫細胞株（骨肉腫１４３ＴＫ−）の１０回の継代培養から、ＢｒｄＵ（チミジン類似体、１５μｇ／ｍｌ）の存在下で、ＴＫ機能を欠損する細胞を選択する生化学環境を適用する条件下で（ＴＫ−選択圧）得られた。変異したワクシニアウイルスのアミノ酸配列決定は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．に委託された。結果として、変異したワクシニアウイルスでは、ＨＳＶ１−ＴＫのＣ末端の４６番目のアミノ酸であるグルタミン（Ｇｌｎ）をコードするコドン（ｃａａ）は、停止コドンによって点変異されたことが確認された。さらに、ＨＳＶ１−ＴＫの４６番目より後のＣ末端アミノ酸残基は、変異したワクシニアウイルスにおいて欠失されたことが確認された。最終的に、遺伝的に安定なＨＳＶ１−ＴＫ断片を発現する変異したワクシニアウイルスＯＴＳ−４１２が得られた（図２及び図３）。
【００９８】
さらに、いくつかの変異体のＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子が分析され、２４、３０、７０、９９、１４９、又は１９５アミノ酸がＨＳＶ１−ＴＫのＣ末端から欠失されたことが確認された。さらに、他の変異体のＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子の分析は、ＨＳＶ１−ＴＫのＮ末端から１番目〜１４５番目のアミノ酸残基を含む、１８１又は２２７アミノ酸からなるＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントを明らかにした。
【００９９】
実施例２．ＯＴＳ−４１２におけるＨＳＶ１−ＴＫ断片発現の同定
実施例１．２で調製されたＯＴＳ−４１２がＨＳＶ１−ＴＫ断片を発現することを確認するため、ＯＴＳ−４１２をＨｅＬａ細胞に感染させ、生じる細胞は２４時間後に回収され、溶解されてタンパク質を抽出された。抽出されたタンパク質は、変性され、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードされた（試料当たり４０μｇ）。電気泳動後、タンパク質のバンドはＰＶＤＦ膜に移され、一次抗体、抗ＨＳＶ１−ＴＫ抗体と反応させた。ＰＢＳＴによる洗浄後、タンパク質のバンドは二次抗体、ＨＲＰ標識抗ヤギ抗体と反応させた。ＰＢＳＴによる洗浄後、タンパク質のバンドは化学発光試薬によって処置され、化学発光画像システム（Ｄａｖｉｎｃｈ  Ｋ）によって検出された。結果として、ＨＳＶ１−ＴＫ断片タンパク質は、ウイルスで発現されたことが確認された（図４）。
【０１００】
実施例３．ＯＴＳ−４１２におけるＨＳＶ１−ＴＫｍｕｔ遺伝子発現の確認
ＯＴＳ−４１２におけるＨＳＶ１−ＴＫｍｕｔ遺伝子発現の導入を確認するため、野生型ワクシニアウイルス及びＯＴＳ−４１２は制限酵素マッピングによって同定された。それぞれ野生型ワクシニアウイルス及びＯＴＳ−４１２をヒト骨肉腫細胞に感染させた後、ウイルスが単離され、ウイルスゲノムＤＮＡが抽出され、陰性対照（野生型−ＶＶ）及び陽性対照（ＯＴＳ−４１２）が得られた。
【０１０１】
得られたウイルスＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（１０ユニット／２．５μｇ）によって消化され、ＤＮＡ電気泳動装置を使用してサイズによって分けられた（図５）。結果として、陰性対照群と陽性対照群を比較する場合、４ｋｂと８ｋｂの間で４つの相当するバンド（矢印）及び１つのミスマッチのバンド（点線矢印）が同定された。ミスマッチのバンドは大きい遺伝子サイズを有し、ＨＳＶ１−ＴＫｍｕｔ遺伝子及びホタルルシフェラーゼ遺伝子がワクシニアウイルスのＴＫ領域に挿入されたことを示した。それは、野生型ワクシニアウイルスのものとは異なるＯＴＳ−４１２のユニークなバンドパターンとして確認された。数回継代後の野生型ワクシニアウイルス及びＯＴＳ−４１２が対照群と比較された場合、それぞれの対照群のものと同じバンドパターンが観察され、ＯＴＳ−４１２でのＨＳＶ１−ＴＫｍｕｔ遺伝子が遺伝的安定性を有することを確認した。
【０１０２】
実施例４．ＧＣＶ投与によるＯＴＳ−４１２の複製能力の低減の確認（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
実施例１．２で調製されたＯＴＳ−４１２のがん細胞に感染し増殖する能力は以下のように確認された。ＨＣＴ−１１６がん細胞株は、１ＭＯＩ（１ｐｆｕ／細胞）のＯＴＳ−４１２によって処置され、それぞれ２４時間及び４８時間後、ウイルス力価はプラークアッセイによって測定された。
【０１０３】
結果として、２４時間後、がん細胞株はＯＴＳ−４１２によって感染されたことが確認された。４８時間後、ウイルス複製は感染後２４時間のものと比較して約２．５倍増加したことが確認された（図６）。
【０１０４】
ＯＴＳ−４１２複製におけるＧＣＶの効果を確認するため、定量的ＰＣＲ分析（ｑＰＣＲ）が、ワクシニアウイルスにおいてのみ特別に発現されるＥ９Ｌに基づいて実施された。
【０１０５】
特に、Ｅ９Ｌ遺伝子を認識するが２つの相補的なＤＮＡ鎖の１つのみに結合するプローブが調製された。調製されたプローブは、１度ウイルスが複製すると１蛍光を測定することができる。ＮＣＩ−Ｈ４６０及びＮＣＩ−Ｈ２３がん細胞は、１又は０．１ＭＯＩ（１又は０．１ｐｆｕ／細胞）のいずれかのＯＴＳ−４１２単独によって、又はＧＣＶとの組合せによって２時間処置され、生じる感染細胞は４８時間培養された。次いで、ウイルスＤＮＡは、ウイルスＤＮＡ抽出キットを使用して抽出され、１ｎｇ／５μｌの濃度に希釈され、次いでｑＰＣＲが同じものを使用して実施された。
【０１０６】
結果として、ＮＣＩ−Ｈ４６０とＮＣＩ−Ｈ２３がん細胞株の両方において、ＯＴＳ４１２単独が投与された場合と比較して、ＯＴＳ−４１２がＧＣＶと組み合わせて投与された場合にＯＴＳ−４１２の複製能力は約４５％減少した（図７）。この結果は、ＯＴＳ−４１２におけるＨＳＶ１−ＴＫ断片がＧＣＶに対して感受性であることを実証した。
【０１０７】
実施例５．ＯＴＳ−４１２の細胞傷害性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
ＧＣＶによるＯＴＳ−４１２ウイルス複製の阻害にもかかわらず、ＯＴＳ−４１２の細胞傷害性が維持されたかどうか決定するため、以下の群間の細胞傷害性が比較された：野生型ＨＳＶ１−ＴＫ発現ワクシニアウイルスによって、単独又はＧＣＶと組み合わせて処置された群、及びＯＴＳ−４１２によって、単独又はＧＣＶと組み合わせて処置された群。特に、ＨＣＴ−１１６がん細胞は、０．０５ＭＯＩ（０．０５ｐｆｕ／細胞）の野生型ＨＳＶ１−ＴＫ発現ワクシニアウイルス又はＯＴＳ−４１２によって、単独又はＧＣＶ（５０μｇ）と組み合わせて処置された。生じる細胞は、７２時間培養され、ＣＣＫ８を使用して細胞傷害性を分析した（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８）。
【０１０８】
結果として、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せ処置の細胞傷害性がＯＴＳ−４１２単独処置された群の９５％又はそれ以上で維持されたが、野生型ＨＳＶ１−ＴＫを発現するワクシニアウイルスはほとんど細胞傷害性を示さなかった（図８）。野生型ＨＳＶ１−ＴＫを発現するワクシニアウイルスは、ＯＴＳ−４１２に挿入したＨＳＶ１−ＴＫｍｕｔよりもＧＣＶに対して強い感受性を有し、がん細胞死滅効果はウイルス複製の完全な阻害によりほぼ観察されなかったことが確認された。
【０１０９】
実施例６．ＧＣＶと組み合わせたＯＴＳ−４１２の投与時の抗がん効果の確認（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せ投与の抗がん効果を確認するため、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの投与による細胞傷害性が、２つのヒト肺がん細胞株、Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ４６０がん細胞株、並びに２つのヒト結腸直腸がん細胞株、ＨＴ−２９及びＨＣＴ−１１６がん細胞株で評価された。
【０１１０】
特に、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＨＴ−２９、及びＨＣＴ−１１６がん細胞株は、０．０１、０．１、又は１ＭＯＩでＯＴＳ−４１２によって感染させた。３つの感染したがん細胞株（Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、及びＨＴ−２９）は、１００μＭ  ＧＣＶによって処置され、感染したＨＣＴ−１１６がん細胞株は５０μＭ  ＧＣＶによって処置された。細胞は７２時間培養され、ＣＣＫ８を使用して細胞傷害性を分析した（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８）。
【０１１１】
結果として、ＮＣＩ−Ｈ４６０及びＨＣＴ−１１６がん細胞株では、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せによって処置されたがん細胞の生存率は、ＯＴＳ−４１２単独によって処置されたがん細胞の生存率よりも著しく低かった。一方、Ａ５４９及びＨＴ−２９がん細胞株では、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せによって処置されたがん細胞の生存率とＯＴＳ−４１２単独によって処置されたがん細胞の生存率の間に著しい差は観察されなかった。この結果は、ＧＣＶによるさらなる細胞傷害効果並びにＯＴＳ−４１２による直接がん細胞死を実証する（図９）。
【０１１２】
さらに、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せ投与によるアポトーシス及びネクローシスは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって確認された。特に、Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ４６０細胞株は、それぞれＧＣＶ単独、ＯＴＳ−４１２単独、又はＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せによって処置され、細胞はＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ／ＰＩ染色後フローサイトメトリーに供された。この時、細胞の生存率は、以下の事実に基づき決定された：Ａｎｎｅｘｉｎ  ＶとＰＩの両方は生細胞で陰性である；Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖはアポトーシスの初期段階で陽性であり、細胞膜の透過性が変化する；及びＡｎｎｅｘｉｎ  ＶとＰＩの両方はアポトーシスの終わりに陽性であり、核は細胞膜の破壊によって曝露される。
【０１１３】
結果として、ＧＣＶ単独による処置によるアポトーシスは確認されなかった。しかしながら、Ａ５４９細胞がＯＴＳ−４１２単独によって処置された場合、アポトーシス率は１９．６４％、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せ処置によっては３５．０６％として観察された。さらに、ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞がＯＴＳ−４１２単独によって処置された場合、アポトーシス率は６．５８％、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せ処置によっては１２．７８％として観察された（図１０）。さらに、ＦＡＣＳ結果は定量され、互いに比較された。結果として、ＯＴＳ−４１２単独によって処置された群と比較して、ＧＣＶによるさらなる毒性効果が確認された（図１１）。
【０１１４】
実施例７．ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せ投与時の抗がん効果の確認（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
実施例７．１．ＨＣＴ−１１６がん細胞株移植マウスモデル（腫瘍内投与）を使用するＯＴＣ−４１２とＧＣＶの組合せ投与時の抗がん効果の確認
Ｏｒｉｅｎｔ  Ｂｉｏ（Ｂｕｓａｎ）から得たＢａｌｂ／ｃマウス（雌、８週齢）は、１週間順応させ、ＨＣＴ−１１６ヒト結腸がん細胞株（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）の５×１０６個の細胞を異種移植した。腫瘍サイズが１００ｍｍ３〜１５０ｍｍ３に達すると、ＯＴＳ−４１２が、単独で又はＧＣＶと組み合わせて腫瘍内に投与された。
【０１１５】
そのように調製されたヒト結腸がん細胞移植マウスは、３つの群に分けられた。腫瘍に生理食塩水を受ける群は陰性対照として設定され、腫瘍内に腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、１×１０６ｐｆｕ）を受ける群は陽性対照として設定された。さらに、腫瘍内に腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、１×１０６ｐｆｕ）とＧＣＶ（２５ｍｇ／ｋｇ）の組合せを受ける群は実験群として設定された。各薬物は１日目に１回投与された。
【０１１６】
投与後１２日目に、各群のマウスの腫瘍サイズが測定された。陰性対照マウスの腫瘍サイズは６００ｍｍ３と測定され、陽性対照の腫瘍サイズは２００ｍｍ３と測定され、それは陰性対照マウスのものより約６６％小さかった。一方、実験群マウスの腫瘍サイズは１５０ｍｍ３と測定され、それは陰性対照マウスのものより約７５％小さかった（図１２）。ヒト結腸がん細胞株へのＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せ投与は、抗がん効果を増加することが確認された。
【０１１７】
ウイルス分布を確認するため、７日目に各群について生物発光画像分析が実施された。マウスは、ＯＰＴＩＸ  ＭＸ３装置上に固定され、麻酔下でＤ−ルシフェリンが注射され、生物発光画像が得られた。ＯＴＳ−４１２単独又はＧＣＶと組み合わせて投与された群の蛍光強度を比較すると、ＧＣＶとの組合せ時にウイルス複製が阻害されたことが確認された（図１３）。
【０１１８】
ウイルス複製の阻害を確認するため、１２日目に屠殺されたマウスから腫瘍組織が単離され、そこからゲノムＤＮＡが抽出された。定量的ＰＣＲ分析（ｑＰＣＲ）が、ワクシニアウイルスにおいてのみ特異的に発現されるＥ９Ｌに基づいて実施された。
【０１１９】
結果として、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶが組み合わせて投与された場合、ＯＴＳ−４１２ウイルスのＤＮＡコピー数は、ＯＴＳ−４１２単独で投与された群より約５０％低く検出され、統計的に有利な差も確認された。したがって、ウイルス複製がＧＣＶによって阻害されたことが確認された（図１４）。
【０１２０】
さらに、ＯＴＳ−４１２単独及びＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せによる投与の安全性を確認するため、対照群と実験群は各薬物を投与され、次いでマウスは投与日（０日目）、３日目、６日目、９日目、及び１２日目に計量された。マウスの体重は、測定された体重から腫瘍重量を引くことによって算出された。
【０１２１】
結果として、３つの群全てのマウスは体重の増加を示し、群間の差がほとんどみられなかった（図１５）。したがって、ＧＣＶと組み合わせたＯＴＳ−４１２投与の安全性が確認された。
【０１２２】
上記のＨＣＴ−１１６移植マウス実験は、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せ投与がウイルス複製を有効に制御するが、抗がん効果を維持することを示した。
【０１２３】
実施例７．２．Ｒｅｎｃａがん細胞株移植マウスモデルを使用するＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せ投与時の抗がん効果の確認
Ｏｒｉｅｎｔ  Ｂｉｏ（Ｂｕｓａｎ）から得たＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）は、１週間順応させ、Ｒｅｎｃａがん細胞株（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）の５×１０７個の細胞を同種移植した。腫瘍のサイズが３００ｍｍ３〜５００ｍｍ３に達すると、腫瘍溶解性ウイルスの投与が開始された。マウスがん細胞におけるウイルス複製は制限される事実にもかかわらず、実験が実施され、同種移植マウスモデルにおいてＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せの抗腫瘍効果を示した。
【０１２４】
そのように調製されたマウス腎細胞癌細胞株移植マウスは、３つの群に分けられた。腫瘍に生理食塩水を受ける群は陰性対照として設定され、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、１×１０７ｐｆｕ）の週１回の投与を受ける群は陽性対照として設定された。さらに、ＧＣＶ（２５ｍｇ／ｋｇ）の投与と共に週２回腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、５×１０６ｐｆｕ）を受ける群は実験群として設定された。腫瘍溶解性ウイルスは、マウス腎細胞癌細胞株移植マウスの腫瘍内に投与され、ＧＣＶは腹腔内に投与された。この時、腫瘍溶解性ウイルスが投与されない日に、陰性対照群及び実験群に、それぞれＰＢＳ及びＧＣＶが投与された。
【０１２５】
２４日目に、各群のマウスの腫瘍サイズが測定された。陰性対照マウスの腫瘍サイズは１，３５０ｍｍ３と測定され、陽性対照の腫瘍サイズは１，２００ｍｍ３と測定され、それは陰性対照マウスのものより約１０％小さかった。一方、実験群マウスの腫瘍サイズは７００ｍｍ３と測定され、それは陰性対照マウスのものより約４５％小さかった。したがって、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せ投与は、ウイルス単独の投与と比較して、腫瘍溶解性ウイルスに耐性のがん細胞株でさえも、抗がん効果を著しく増加したことが確認された（図１６）。
【０１２６】
ＯＴＳ４１２の投与後２３日目に屠殺されたマウスから腫瘍組織が単離され、そこからゲノムＤＮＡが抽出された。定量的ＰＣＲ分析が、ワクシニアウイルスにおいてのみ特異的に発現されるＥ９Ｌに基づいて実施された。
【０１２７】
結果として、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶが組み合わせて投与された場合、ＯＴＳ−４１２ウイルス粒子は、ＯＴＳ−４１２単独で投与された群より約５０％低く検出され、統計的に有意であった。したがって、ウイルス複製がＧＣＶによって有効に制御されたことが確認された（図１７）。
【０１２８】
ＯＴＳ−４１２の投与後２４日目に、マウスは屠殺され、そこから単離された腫瘍組織はＴＵＮＥＬアッセイに供された。組織はパラホルムアルデヒドによって固定され、次いで切片にされた。その後、切片にされた組織は１５分間プロテイナーゼＫによる抗原賦活に供され、次いでアポトーシス検出キットを用いることによってｄＵＴＰ−標識ＦＩＴＣで処置され腫瘍組織のアポトーシスを観察した。
【０１２９】
結果として、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せによって処置した群でアポトーシスが増加したことが確認された（図１８）。この時、死細胞は赤い蛍光（ＴＲＩＴＣ）によって示され、細胞の核は青い蛍光（ＤＡＰＩ）によって染色された。ＴＵＮＥＬアッセイで得られた画像の統計処理のため、アポトーシスの領域が定量された。結果として、ＧＣＶと組み合わせてＯＴＳ−４１２を投与された群は、ＯＴＳ−４１２単独で投与された群の２倍高いアポトーシス率を示したことが確認された（図１９）。
【０１３０】
実施例７．３．ＨＣＴ−１１６がん細胞株移植マウスモデル（腹腔内投与）を使用するＯＴＣ−４１２とＧＣＶの組合せ投与時の抗がん効果の確認
Ｏｒｉｅｎｔ  Ｂｉｏ（Ｂｕｓａｎ）から得たＢａｌｂ／ｃマウス（雌、８週齢）は、１週間順応させ、ＨＣＴ−１１６ヒト結腸がん細胞株（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）の２．５×１０６個の細胞を異種移植した。腫瘍のサイズが１００ｍｍ３〜１５０ｍｍ３に達するまでの観察後、ＯＴＳ−４１２が、単独で又はＧＣＶと組み合わせて腹腔内に投与された。
【０１３１】
そのように調製されたヒト結腸がん細胞移植マウスは、３つの群に分けられた。腫瘍に生理食塩水を受ける群は陰性対照として設定され、腫瘍内に腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、１×１０８ｐｆｕ）を受ける群は陽性対照として設定された。さらに、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＴＳ−４１２、１×１０８ｐｆｕ）とＧＣＶ（５０ｍｇ／ｋｇ）の組合せを受ける群は実験群として設定された。この時、ＨＣＴ−１１６移植マウスに腹腔内に投与された全ての薬物、及びＧＣＶは腹腔内に投与された。腫瘍溶解性ウイルスは週２回投与され、腫瘍溶解性ウイルスが投与されない日に、陰性対照群及び実験群に、それぞれＰＢＳ及びＧＣＶが投与された。
【０１３２】
２１日目に、マウスの屠殺時に腫瘍のサイズが測定された場合、腫瘍のサイズは陰性対照群で約８倍増加したが、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せを投与された群は陰性対照群の腫瘍のサイズより約４０％小さかった（図２０）。
【０１３３】
さらに、免疫組織化学（ＩＨＣ）も実施され、腫瘍組織でのウイルス感染の程度が決定された。腫瘍組織は、単離され、パラフィンブロックに処理され、次いで切片にされた。キシレン及びエチルアルコールを使用することによって、パラフィンは組織切片から除去された。組織は、デクローキングチャンバー（ｄｅｃｌｏａｃｋｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ）を使用して抗原賦活に供され、一次抗体（ワクシニアウイルス抗体、ａｂ３５２１９）及びＦＩＴＣ−コンジュゲート二次抗体と順次反応させ、次いで蛍光顕微鏡下で観察した。
【０１３４】
結果として、腫瘍溶解性ウイルスはＰＢＳ処置した陰性対照群の腫瘍組織では観察されなかったが、ＯＴＳ−４１２を投与された群の腫瘍組織では観察された。腫瘍溶解性ウイルスは、ＧＣＶと組み合わせてＯＴＳ−４１２を投与した群でも検出されたが、ＯＴＳ−４１２単独で投与された群より少なかった（図２１及び図２２）。
【０１３５】
さらに、マウス腫瘍組織が単離され、Ｈ＆Ｅ染色が実施された。特に、マウスは２１日目に屠殺され、腫瘍組織が単離され、パラフィンブロックに処理され、次いで切片にされた。パラフィンが組織切片から除去され、次いで組織切片はヘマトキシリン及びエオシンに順次浸され、乾燥され、マウントされ、次いでスライドスキャナーを使用して観察された。腫瘍ネクローシスのパーセンテージはＨ＆Ｅ染色によって測定され、生存腫瘍サイズは全腫瘍のサイズからネクローシス部分を除外することによって測定された。結果として、対照群と比較した場合、実験群の腫瘍ネクローシスの程度は陰性対照群のものより著しく高いことが確認された（図２３）。
【０１３６】
さらに、各群の全てのマウスの腫瘍組織はＨ＆Ｅ染色に供され、ネクローシス部分を除く腫瘍領域のサイズが測定された。結果として、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶの組合せを投与された実験群マウスの腫瘍組織領域は、対照マウスのものより約４０％小さいことが確認された（図２４）。
【０１３７】
マウスは、３日目、７日目、１０日目、１４日目、１７日目、及び２１日目に計量され、薬物の毒性が評価された。ウイルスを投与された両群では、体重はウイルス注射後３日目に減少したが、７日目には約９５％に回復された。その後、ＯＴＳ−４１２とＧＣＶを組み合わせて投与された群は、２１日目まで体重の維持を示し、薬物投与の安全性を確認した（図２５）。
【０１３８】
実施例８．様々ながん細胞株のＯＴＳ−４１２の細胞傷害性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
様々ながん細胞株でのＯＴＳ−４１２の抗がん効果を確認するため、ＯＴＳ−４１２の毒性がＨｅＬａ、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１１６、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、４Ｔ１、Ｒｅｎｃａ、及びＢ１６Ｆ１０がん細胞株で評価された。ＨｅＬａ、Ａ５４９、４Ｔ１、及びＢ１６Ｆ１０がん細胞株はＡＴＣＣ（ＵＳＡ）から得て、残りの９つのがん細胞株はＫｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ）から得た。
【０１３９】
特に、がん細胞株はそれぞれ０．５ＭＯＩ（１ｐｆｕ／細胞）のＯＴＳ−４１２によって感染させ、細胞は４８時間及び７２時間培養された。その後、ＣＣＫ８を使用することによって細胞傷害性が分析された（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８）。
【０１４０】
子宮頸がん細胞株（ＨｅＬａ）、肺がん細胞株（Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、及びＨＣＩ−Ｈ４６０）、前立腺がん細胞株（ＰＣ−３及びＤＵ１４５）、直腸がん細胞株（ＨＴ−２９及びＨＣＴ−１１６）、乳がん細胞株（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及び４Ｔ１）、メラノーマ細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）、及びラット腎細胞癌細胞株（Ｒｅｎｃａ）を含む１３種のがん細胞株の分析は、４Ｔ１、Ｒｅｎｃａ、及びＢ１６Ｆ１０細胞株が、８０％又はそれ以上の生存率を示し、比較的高い耐性を示すことを明らかにした。しかしながら、残りのがん細胞株は、７２時間後におよそ４０％又はそれ以下の生存率を示し、ＯＴＳ−４１２がこれらの細胞に対して高い細胞傷害性を示すことを示した（図２６）。
【０１４１】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性を測定するため、がん細胞の生存率が５０％阻害される濃度であるＩＣ５０が測定された。この時、０．１、０．３、０．６、及び１．０ＭＯＩ（ｐｆｕ／細胞）のＯＴＳ−４１２が、それぞれＨＣＴ−１１６、ＳＫ−ＭＥＬ−２９、及びＤＵ１４５細胞に投与された。細胞傷害性は、製造業者の手順に従ってＣＣＫ−８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８）を使用して測定された。結果として、ＨＣＴ−１１６、ＳＫ−ＭＥＬ−２９、及びＤＵ１４５細胞におけるＯＴＳ−４１２のＩＣ５０値は、それぞれ０．２４ｐｆｕ、０．３７ｐｆｕ、０．０８ｐｆｕであった（図２７）。
【０１４２】
実施例９．ＯＴＳ−４１２の腹腔内投与後のウイルス分布の確認（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
高用量のＯＴＳ−４１２ウイルス（１×１０７ｐｆｕ／マウス）が、ＨＣＴ−１１６がん細胞移植マウスに腹腔内投与され、全身に注射されたウイルスが腫瘍に標的化及び送達されるかどうか確認された。
【０１４３】
生物発光画像分析の結果から、ウイルスが腫瘍を標的化したことが確認された。７日目に、ウイルスが３日目よりも複製され、シグナルが高かったことも確認された（図２８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月12日(2020.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクター。
【請求項２】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片がＨＳＶ１−ＴＫ（単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ）断片である、請求項１に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項３】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１〜１９５アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から２４〜１４９アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項５】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から３０〜４６アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項６】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から４６アミノ酸残基が連続的に欠失されているものである、請求項２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項７】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する、請求項２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項８】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片のバリアントがＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントである、請求項１に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項９】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントが配列番号７又は８のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１０】
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、又はポックスウイルスに由来する、請求項１に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１１】
ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１２】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片がＨＳＶ１−ＴＫ断片である、請求項１１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１３】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から１〜１９５アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１４】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から２４〜１４９アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１５】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から３０〜４６アミノ酸残基が連続的に欠失されている断片のいずれか１つである、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１６】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列のＣ末端から４６アミノ酸残基が連続的に欠失されているものである、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１７】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片が、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する、請求項１２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１８】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片のバリアントがＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントである、請求項１１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１９】
前記ＨＳＶ１−ＴＫ断片のバリアントが配列番号７又は８のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２０】
アデノウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、バキュロウイルス、レオウイルス、アデノ随伴ウイルス、粘液腫ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、コクサッキーウイルス、セネカウイルス、ワクシニアウイルス、又はポックスウイルスに由来する、請求項１１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２１】
ワクシニアウイルスに由来する、請求項１１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２２】
有効成分として請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２３】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、１×１０３ｐｆｕ〜１×１０１０ｐｆｕの用量で投与される、請求項２２に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２４】
前記がんが、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頚部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸がん、膣癌、外陰癌、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺癌、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、及び有効成分としてＧＣＶ（ガンシクロビル）又はＡＣＶ（アシクロビル）を含む、がんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍溶解性ウイルス及びＧＣＶ又はＡＣＶが、同時に又は順次投与される、請求項２５に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２７】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、１×１０３ｐｆｕ〜１×１０１０ｐｆｕの用量で投与される、請求項２５に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２８】
前記ＧＣＶ又はＡＣＶが、０．１μｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される、請求項２５に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項２９】
前記がんが、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頚部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、骨がん、眼球内黒色腫、肛門周囲がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸がん、膣癌、外陰癌、ホジキン病、小腸がん、内分泌腺癌、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、腎臓がん、尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２５に記載のがんを予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項３０】
ｉ）ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むシャトルプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし、宿主細胞を野生型ワクシニアウイルスによって処置するステップ；ｉｉ）生じる宿主細胞を培養するステップ；及びｉｉｉ）生じる培養物から組換えワクシニアウイルスを得るステップを含む、ＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現する組換えワクシニアウイルスを調製する方法。
【請求項３１】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片が、配列番号２〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する、請求項３０に記載のＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現する組換えワクシニアウイルスを調製する方法。
【請求項３２】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号９のヌクレオチド配列である、請求項３０に記載のＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現する組換えワクシニアウイルスを調製する方法。
【請求項３３】
前記ＨＳＶ−ＴＫ断片のバリアントをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１０又は１１のヌクレオチド配列である、請求項３０に記載のＨＳＶ−ＴＫ断片又はそのバリアントを発現する組換えワクシニアウイルスを調製する方法。
【請求項３４】
がんを予防又は治療するための医薬品の製造のための、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスの使用。
【請求項３５】
がんを予防又は治療するための医薬品の製造のための、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【国際調査報告】
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