(57)【要約】  本発明は、スペーサードメイン、抗原結合ドメイン及びＴＮＦリガンドメンバーの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む２つの異なる融合ポリペプチドを含む新規ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、ここで、前記エクトドメインのうちの２つは、少なくとも２５アミノ酸を含むスペーサードメインによって互いに分離されており、２つの融合ポリペプチドは、スペーサードメインにおいて互いに共有結合している新規ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片、スペーサードメイン及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片を含む第１の融合ポリペプチドであって、ここで、
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第１のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＮ末端に融合され、
−  前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第２のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合される、
第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）抗原結合ドメインの第１の部分及びスペーサードメインを含む第２の融合ポリペプチドであって、ここで
スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、かつ
ここで、抗原結合ドメインの第２の部分が、直接又は第３のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合されるか、又は軽鎖の形態で存在する、
第２の融合ポリペプチド、及び
（ｃ）
−  第１の融合ポリペプチドにおける前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメインのＣ末端、又は第２の融合ポリペプチドにおけるスペーサードメインのＣ末端のいずれか、又は
−  抗原結合ドメインの第２の部分が第２の融合タンパク質のスペーサードメインのＣ末端に融合される場合、第１の融合ポリペプチドにおける前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメインのＣ末端に
直接又は第４のペプチドリンカーを介して融合される、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第３のエクトドメイン又はその断片
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインが、ジスルフィド結合により互いに共有結合している、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項２】
抗原結合ドメインの第１の部分が抗体重鎖可変ドメインを含み、抗原結合ドメインの第２の部分が抗体軽鎖可変ドメインを含み、又はその逆である、請求項１に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項３】
抗原結合ドメインの第１の部分が抗体重鎖Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分が抗体軽鎖Ｆａｂ断片であり、又はその逆である、請求項１又は２に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項４】
スペーサードメインが、抗体ヒンジ領域又はその断片、抗体ＣＨ２ドメイン、及び抗体ＣＨ３ドメイン又はその断片を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項５】
第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインが、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項６】
スペーサードメインが、抗体ヒンジ領域又はその断片及びＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項７】
ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項８】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが４−１ＢＢＬである、請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項９】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１０】
抗原結合ドメインが、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる、請求項１から９のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１１】
抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はＣＤ１９に特異的に結合することができる、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１２】
ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１３】
ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子と、薬学的に許容される添加剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
医薬としての使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
がんを治療することにおける使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
がんを治療するための医薬の製造における、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は請求項１６に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項２０】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は請求項１６に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、スペーサードメイン、抗原結合ドメイン及びＴＮＦリガンドメンバーの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む２つの異なる融合ポリペプチドを含む新規ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、ここで、前記エクトドメインのうちの２つは、少なくとも２５アミノ酸を含むスペーサードメインによって互いに分離されており、２つの融合ポリペプチドは、スペーサードメインにおいて互いに共有結合している新規ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のいくつかは、軽鎖をさらに含み得る。本発明はさらに、これらの分子を産生する方法及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体スーパーファミリーの分子と相互作用するリガンドは、免疫系の組織化及び機能において重要な役割を有している。免疫応答、造血、形態形成などの正常な機能を調節しながら、ＴＮＦファミリーリガンド（サイトカインとも呼ばれる）は、腫瘍形成、移植拒絶反応、敗血症性ショック、ウイルス複製、骨吸収、関節リウマチ、糖尿病に役割を果たしている（Aggarwal, Nat. Rev. Immunol. 2003, 3(9),745-56）。ＴＮＦリガンドファミリーは、１９のＩＩ型（すなわち、細胞内Ｎ末端及び細胞外Ｃ末端）膜貫通タンパク質をコードする１８の遺伝子を含み、「ＴＮＦホモロジードメイン」（ＴＨＤ）という造語の保存されたＣ末端ドメインの存在により特徴づけられる。このドメインは受容体の結合に関与しており、したがってＴＮＦリガンドファミリーメンバーの生物活性に重要である。ファミリー間の配列同一性は約２０〜３０％である（Bodmer et al., Trends in Biochemical Sciences 2002, 27(1), 19-26）。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、自己組織化非共有結合三量体として生物学的機能を発揮する（Banner et al., Cell 1993, 73, 431-445）。したがって、ＴＮＦファミリーリガンドは、ＴＮＦＲスーパーファミリーの対応する受容体に結合してそれを活性化することができる三量体を形成する。
【０００３】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、その発現がＴ細胞活性化によって誘導される分子として最初に同定されている（Kwon and Weissman, Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86, 1963-1967）。その後の研究は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球（Snell et al., Immunol Rev 2011, 244, 197-217；Zhang et al., J Immunol 2010, 184, 787-795）、ＮＫ細胞（Lin et al., Blood 2008, 112, 699-707）、ＮＫＴ細胞（Kim et al., J Immunol 2008, 180, 2062-2068）、単球（Kienzle and von Kempis, Int Immunol 2000, 12, 73-82；Schwarz et al., Blood 1995, 85, 1043-1052）、好中球（Heinisch et al., Eur J Immunol 2000, 30, 3441-3446）、肥満細胞（Nishimoto et al., Blood 2005, 106, 4241-4248）、及び樹状細胞、並びに非造血起源の細胞、例えば内皮細胞及び平滑筋細胞（Broll et al., Am J Clin Pathol 2001, 115, 543-549；Olofsson et al., Circulation 2008, 117, 1292-1301）における４−１ＢＢの発現を実証した。さまざまな細胞型の４−１ＢＢの発現は、多くが誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体トリガーといったさまざまな刺激シグナル、並びに炎症性サイトカインの共刺激分子又は受容体を通して誘導されるシグナル伝達によって駆動される（Diehl et al., J Immunol 2002, 168, 3755-3762；von Kempis et al., Osteoarthritis Cartilage 1997, 5, 394-406；Zhang et al., J Immunol 2010, 184, 787-795）。ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌及び増殖を刺激するだけでなく（Buechele et al., Eur J Immunol 2012, 42, 737-748；Lin et al., Blood 2008, 112, 699-707；Melero et al., Cell Immunol 2008, 190, 167-172）、それらの生存の増加、及びサイトカインを分泌し、共刺激分子を上方制御する能力によって示されるようにＤＣ活性化を促進することが知られている（Choi et al., J Immunol 2009, 182, 4107-4115；Futagawa et al., Int Immunol 2002, 14, 275-286；Wilcox et al., J Immunol 2002, 168, 4262-4267）。しかし、ＣＤ１３７は、Ｔ細胞のＣＤ４＋サブセット及びＣＤ８＋サブセットの両方においてＴＣＲ誘導活性化を調節する共刺激分子として最もよく特徴づけられる。ＴＣＲトリガーと組み合わせて、４−１ＢＢアゴニスト（アゴニスト４−１ＢＢ特異的抗体）は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させることが示されている（Snell et al., Immunol Rev 2011, 244, 197-217に概説される）。
【０００４】
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）の発現はより制限されており、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、及びマクロファージなどのプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）において観察される。４−１ＢＢの誘導性発現は、αβ及びγδ両方のＴ細胞サブセットを含むＴ細胞、並びに内皮細胞に特徴的である（Shao and Schwarz, J Leukoc Biol 2011, 89, 21-29に概説される）。異なるリンパ球サブセットへのそれらの直接的な影響に加えて、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍血管内皮における細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）と血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）の４−１ＢＢ媒介上方制御を通じて、腫瘍内の活性化Ｔ細胞の浸潤と保持を誘導することもできる（Palazon et al., Cancer Res 2011, 71, 801-811）。４−１ＢＢトリガーはまた、腫瘍微小環境における又は慢性感染症の間に免疫寛容の破壊に寄与する可能性がある可溶性抗原への曝露によって誘導されるＴ細胞アネルギーの状態を逆転させ得る（Wilcox et al., Blood 2004, 103, 177-184）。
【０００５】
利用可能な前臨床及び臨床データは、効果的な４−１ＢＢアゴニストに対する高い臨床的ニーズがあることを明確に示している。しかしながら、新世代の薬剤候補は、造血細胞及び内皮細胞の表面上の４−１ＢＢに効果的に係合するだけでなく、制御できない副作用を回避するためにＦｃ受容体への結合以外のメカニズムを通じてそれを達成することができる必要がある。後者は、腫瘍特異的又は腫瘍関連部分への優先的結合及びオリゴマー化を通じて達成され得る。
【０００６】
融合タンパク質は、４−１ＢＢリガンドの１つの細胞外ドメインと単鎖抗体断片からなる（Mueller et al., J. Immunother. 2008, 31, 714-722；Hornig et al., J. Immunother. 2012, 35, 418-429）。しかしながら、これらの分子は、技術的規模で産生することが困難であり、好ましくない薬物動態プロファイルを有する。
【０００７】
したがって、共刺激ＴＮＦリガンド三量体の安定した形成を可能にする方法で構成され、かつ薬学的に有用であるのに十分に安定である新しい抗原結合分子を開発する必要がある。
【０００８】
本発明は、三量体リガンドが正しく組み立てられ、完全に機能するように、三量体ＴＮＦリガンドを抗体構造に効率的に融合させることができる方法について説明する。抗体ベースの構造に焦点を当てることは、一般的に抗体の良好な薬物動態特性によって導かれる。抗体の構造は他のタンパク質と比較して安定している；それらの発現は、異なる細胞株を使用しても非常に堅牢である。それらのＦｃ部分はＦｃＲｎ受容体と相互作用し、したがって分子を細胞内分解による急速な排除から保護する。新規の構築物は、適度に良好な力価で発現可能であり、所望の産物の良好な比率を生み出す。
【発明の概要】
【０００９】
一態様では、本発明は、
（ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片、スペーサードメイン及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片を含む第１の融合ポリペプチドであって、ここで、
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第１のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＮ末端に融合され、
−  前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第２のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合される第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）抗原結合ドメインの第１の部分及びスペーサードメインを含む第２の融合ポリペプチドであって、ここで
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、かつ
ここで、抗原結合ドメインの第２の部分が、直接又は第３のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合されるか、又は軽鎖の形態で存在する第２の融合ポリペプチド、及び
（ｃ）
−  第１の融合ポリペプチドにおける前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメインのＣ末端、又は第２の融合ポリペプチドにおけるスペーサードメインのＣ末端のいずれか、又は
−抗原結合ドメインの第２の部分が第２の融合タンパク質のスペーサードメインのＣ末端に融合される場合、第１の融合ポリペプチドにおける前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメインのＣ末端に
直接又は第４のペプチドリンカーを介して融合される、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第３のエクトドメイン又はその断片
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインが、ジスルフィド結合により互いに共有結合している、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【００１０】
特定の態様では、本発明は、本明細書で前に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、抗原結合ドメインの第１の部分は抗体重鎖可変ドメインを含み、抗原結合ドメインの第２の部分は抗体軽鎖可変ドメインを含み、又はその逆である。より具体的には、抗原結合ドメインの第１の部分は抗体重鎖Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分は抗体軽鎖Ｆａｂ断片であり、又はその逆である。一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分と抗原結合ドメインの第２の部分は、ジスルフィド結合により互いに共有結合している。
【００１１】
上記のように、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、両方ともスペーサードメインを含む第１及び第２の融合ポリペプチドを含み、ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合している。
【００１２】
本発明の一態様では、スペーサードメインは、抗体ヒンジ領域又はその（Ｃ末端）断片及び抗体ＣＨ２ドメイン又はその（Ｎ末端）断片を含む。別の態様では、スペーサードメインは、抗体ヒンジ領域又はその断片、抗体ＣＨ２ドメイン、及び抗体ＣＨ３ドメイン又はその断片を含む。本発明のさらなる態様では、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。特定の態様では、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメインはホールを含み、第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインはノブを含む。さらなる態様では、本発明はＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を含み、ここでスペーサードメインは抗体ヒンジ領域又はその断片及びＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。特に、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、特にＦｃγ受容体に対するＦｃ受容体への結合を減少させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。より具体的には、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【００１３】
本発明のさらなる態様では、ＴＮＦファミリーリガンドは、ヒトＴ細胞活性化を共刺激するものである。したがって、本発明は、ヒトＴ細胞活性化を共刺激するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。本発明の特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドは４−１ＢＢＬである。
【００１４】
したがって、本発明の一態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバー（４−１ＢＢＬ）のエクトドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメインを含み、特に、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つすべてのエクトドメインは、同じアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、第１及び第２の部分からなる抗原結合ドメインをさらに含む。一態様では、抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる。さらなる態様では、抗原結合ドメインは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はＣＤ１９に特異的に結合することができる。
【００１６】
一態様では、抗原結合ドメインは、ＦＡＰに特異的に結合することができる。特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【００１７】
特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【００１８】
別の態様では、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合することができる。特に、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む。
【００１９】
特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
【００２０】
一態様では、本発明は、本明細書で前に記載されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、第１、第２、第３及び第４のペプチドリンカーが存在し、かつ、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。特に、ペプチドリンカーは、配列番号４２及び配列番号４４から選択されるアミノ酸配列からなる。より具体的には、ペプチドリンカーは、配列番号４２のアミノ酸配列からなる。
【００２１】
別の態様では、本発明は、本明細書で前に記載されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸に関する。本発明はさらに、本発明の単離された核酸を含むベクター、特に発現ベクター、又は本発明の単離された核酸若しくはベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【００２２】
別の態様では、抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を産生するための方法が提供される。さらなる態様では、方法は、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を宿主細胞から回収することをさらに含む。
【００２３】
本発明はさらに、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００２４】
医薬としての使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物も本発明に含まれる。一態様では、それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が提供される。特定の実施態様では、がんの治療における使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が提供される。
【００２５】
また、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の、それを必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造における、特に、がんを治療するための医薬の製造のため、並びに免疫応答を刺激するための医薬の製造における、使用も提供される。
【００２６】
さらに、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は薬学的組成物の有効量を前記個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法が提供される。方法は、追加の治療剤を個体に投与することをさらに含み得る。上記実施態様のいずれにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａは、実施例２．１でより詳細に記載される、ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子Ｐ１ＡＡ１１９９の模式図を示す。実施例２．２に記載されるＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子Ｐ１ＡＡ１２３５の模式図は、図１Ｂに提供される。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ｃにおいて、実施例２．３に記載される、ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子Ｐ１ＡＡ１２５９の模式図が示される。実施例２．４に記載されるＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子Ｐ１ＡＡ９６２６は、図１Ｄに示される。
【図１Ｅ−Ｆ】図１Ｅは、実施例２．６でより詳細に記載される、非標的化（ＤＰ４７生殖系列）４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子の模式図を示す。この分子は、本明細書において陰性対照Ｄとして使用される。図１Ｆにおいて、陽性対照分子構築物２．４、すなわち、ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子の模式図が提供される。両方の分子（対照Ｄ及び構築物２．４）は、実施例２．６においてより詳細に記載されている。
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａから２Ｃでは、異なるＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子によるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化が示される。ＦＡＰ発現細胞株ＷＭ−２６６−４が図２Ａにおいて使用され、図２ＢはＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞の存在下でのＮＦκＢ活性化を示し、図２Ｃは、ＦＡＰ発現細胞の非存在下（ｗ／ｏ）におけるＮＦκＢ活性化を示す。示されるのは、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬリガンド三量体含有抗原結合分子又は対照のｎＭでの添加濃度に対する、０．５秒／ウェルで測定された放出光の単位（ＵＲＬ）である。すべてのＵＲＬ値は、ベースラインの発光を差し引くことによってベースライン補正される。試験されたすべてのＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ構築物は、用量依存的のみならずＦＡＰ架橋依存的にＮＦκＢを活性化することができた。ＦＡＰ発現細胞の非存在下では（ｃ）、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ分子について、非標的化４−１ＢＢＬ（対照Ｄ）のベースラインを上回るわずかな活性しか見られなかった。これは、レポーター細胞自体による最小限のＦＡＰ発現に起因する。ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子Ｐ１ＡＡ１１９９、Ｐ１ＡＡ１２５９、Ｐ１ＡＡ１２３５及びＰ１ＡＡ９６２６は、すでに説明した構築物２．４と同様の活性を示した．Ｐ１ＡＡ１１９９は、他の試験されたＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子よりもわずかに低いＥＣ５０値及び低いプラトーを示した。標的化４−１ＢＢＬ分子（対照Ｄ）は、ＮＦκＢの活性化を誘導することができず、すべての設定においてベースラインに到達した。ＥＣ５０値は、実施例３において与えられる。
【図２Ｂ】図２Ａから２Ｃでは、異なるＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子によるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化が示される。ＦＡＰ発現細胞株ＷＭ−２６６−４が図２Ａにおいて使用され、図２ＢはＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞の存在下でのＮＦκＢ活性化を示し、図２Ｃは、ＦＡＰ発現細胞の非存在下（ｗ／ｏ）におけるＮＦκＢ活性化を示す。示されるのは、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬリガンド三量体含有抗原結合分子又は対照のｎＭでの添加濃度に対する、０．５秒／ウェルで測定された放出光の単位（ＵＲＬ）である。すべてのＵＲＬ値は、ベースラインの発光を差し引くことによってベースライン補正される。試験されたすべてのＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ構築物は、用量依存的のみならずＦＡＰ架橋依存的にＮＦκＢを活性化することができた。ＦＡＰ発現細胞の非存在下では（ｃ）、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ分子について、非標的化４−１ＢＢＬ（対照Ｄ）のベースラインを上回るわずかな活性しか見られなかった。これは、レポーター細胞自体による最小限のＦＡＰ発現に起因する。ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子Ｐ１ＡＡ１１９９、Ｐ１ＡＡ１２５９、Ｐ１ＡＡ１２３５及びＰ１ＡＡ９６２６は、すでに説明した構築物２．４と同様の活性を示した．Ｐ１ＡＡ１１９９は、他の試験されたＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子よりもわずかに低いＥＣ５０値及び低いプラトーを示した。標的化４−１ＢＢＬ分子（対照Ｄ）は、ＮＦκＢの活性化を誘導することができず、すべての設定においてベースラインに到達した。ＥＣ５０値は、実施例３において与えられる。
【図３Ａ−Ｄ】図３Ａから３Ｄは、準最適にＴＣＲトリガーされたＴＣＲ  ＰＢＭＣ及び細胞表面ＦＡＰによる過架橋の４−１ＢＢ媒介共刺激を参照する。示されているのは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図３Ａ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞集団（図３Ｂ）における陽性細胞のパーセンテージとして、表面に発現された低親和性ＩＬ−２受容体α鎖ＣＤ２５の上方制御である。ＣＤ２５は、Ｔ細胞の活性化後に上方制御され、ＩＬ−２の存在下でＴ細胞の増殖及び生存を増加させ、Ｔ細胞活性化マーカーとして機能する。図３Ｃ及び図３Ｄにおいて、細胞表面上の４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の発現は、それぞれＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＣＤ４＋  Ｔ細胞集団における陽性細胞の割合として示される。すべての測定値は、本発明のＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ構築物２．４又は非標的化４−１ＢＢＬ対照Ｄ又はＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子（Ｐ１ＡＡ１１９９）の濃度に対して表示される。Ｐ１ＡＡ１１９９は、ＨｅＬａヒト４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃレポーター細胞株アッセイ（図２Ａから２Ｃ）と同様に、同じ測定パラメーターについて、構築物２．４と比較して、低いＥＣ５０値（ＣＤ２５発現）又は表示された曲線において低いプラトーを示す傾向（ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）発現）を示した。示されるのは、各測定点の３つの技術的複製の平均＋／−ＳＤである。
【図４】図４は、本発明のＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子のＣＤ１９＋  Ｂ細胞への結合は、対照分子ＣＤ１９（２Ｂ１１）標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子構築物４．４（ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ  Ａｂ）の結合と同等であることを示している。
【図５Ａ−Ｂ】本発明の異なるＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子（Ｐ１ＡＡ１２３３、Ｐ１ＡＡ０７７６及びＰ１ＡＡ１２５８）の、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図５Ａ）、活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図５Ｂ）及びＮＫ細胞（図５Ｃ）上の４−１ＢＢへの結合が図５Ａから５Ｃに示される。データは、構築物４．４（ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ  Ａｂ）について得られたデータと同等である。
【図５Ｃ】本発明の異なるＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子（Ｐ１ＡＡ１２３３、Ｐ１ＡＡ０７７６及びＰ１ＡＡ１２５８）の、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図５Ａ）、活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図５Ｂ）及びＮＫ細胞（図５Ｃ）上の４−１ＢＢへの結合が図５Ａから５Ｃに示される。データは、構築物４．４（ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ  Ａｂ）について得られたデータと同等である。
【図６】図６において、本発明の異なるＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子（Ｐ１ＡＡ１２３３、Ｐ１ＡＡ０７７６及びＰ１ＡＡ１２５８）の生物活性が示される。分子の生物活性は、ＰＢＭＣにおける４−１ＢＢ共刺激Ｔ細胞及びＮＫ細胞によるエフェクター機能分子ＩＦＮγの放出に基づいて測定される。本発明の分子は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を活性化して、構築物４．４（ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ  Ａｂ）と比較して同様量のＩＦＮγを産生することができるが、非標的化対照ＤはＩＦＮγ放出を誘導することができなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な記載
定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆もまた同様である。
【００２９】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
【００３０】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原決定基に特異的に結合する抗原結合分子の一部を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合ドメインは、それが結合する実体（例えば、ＴＮＦファミリーリガンド三量体）を標的部位、例えば抗原決定基を有する特定の型の腫瘍細胞又は腫瘍間質に導くことができる。抗原結合ドメインは、抗原の一部又はすべてに特異的に結合し、かつ抗原の一部又はすべてに相補的である抗体の領域又は断片を含む。加えて抗原結合ドメインは、本明細書でさらに定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計反復タンパク質又は設計反復ドメインに基づく結合ドメインが含まれる（例えば国際公開第２００２／０２０５６５号を参照）。特に、抗原結合ドメインは、第１の部分及び第２の部分で構成され、ここで、第１の部分は抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、第２の部分は抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、又はその逆である。
【００３１】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、さまざまな抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００３２】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる突然変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００３３】
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体とは、それぞれが同一の抗原の同一のエピトープに結合する１つ又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、そのそれぞれは異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００３４】
本明細書において使用される用語「価」は、抗原結合分子内における特定数の抗原結合ドメインの存在を意味する。このように、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗原結合分子中、それぞれ２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在を意味する。したがって、「一価」とは、抗原に特異的に結合できる分子内に存在する抗原結合ドメインは１つだけであることを意味する。
【００３５】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然抗体」は、さまざまな構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの１つに割当てることができ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００３６】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられる。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134（2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds.,（Springer-Verlag, New York), pp. 269-315（1994)を参照のこと；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134（2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448（1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134（2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照のこと）。抗体断片はさまざまな技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００３７】
インタクトな抗体のパパイン消化は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）をそれぞれ含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。したがって、本明細書において使用される用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００３８】
用語「Ｆａｂ断片」には、「ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」も含まれる。この用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されている、Ｆａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。また一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバー分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００３９】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；ここで前記リンカーは、少なくとも３０のアミノ酸、好ましくは３２から５０の間のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。さらに、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさら安定化され得る。
【００４０】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；ここでＶＨ及びＶＬは、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、前記リンカーは少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。さらに、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化され得る。
【００４１】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０個から約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより連結された抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、かつ溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか、又はその逆に連結することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203（1991）46-96)に記載される。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特性、すなわちＶＬドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性、又はＶＬドメインの特性、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００４２】
「足場抗原結合タンパク質」は当該技術分野で公知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）が、抗原結合ドメインのための代替の足場として使用されている（例えば、Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeuticsを参照のこと）。Curr Opin Chem Biol 13:245-255（2009）and Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701（2008)。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）などのプロテインＡ由来分子、Ａ−ドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））；新規抗原受容体β−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ−クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ノッチンファミリー由来のタンパク質などのミクロボディ、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。
【００４３】
ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋  Ｔ細胞上に発現するＣＤ２８ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様のＩｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディ（Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）としても知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７（Ｂ１）号）。エビボディは、抗体の単離された可変領域（例えば、ドメイン抗体）とほぼ同じサイズである。さらなる詳細については、Journal of Immunological Methods 248（1-2), 31-45（2001)を参照のこと。
【００４４】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる円錐構造の開放端に多数のループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０−１８０アミノ酸のサイズであり、リポカリンに由来する。さらなる詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350（2000)、米国特許第７２５０２９７（Ｂ１）号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照のこと。
【００４５】
アフィボディは、抗原に結合するように操作することができる、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。そのドメインは、約５８個のアミノ酸の３つのヘリックスの束からなる。ライブラリーは表面残基の無作為化によって生成されている。さらなる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462（2004)及び欧州特許第１６４１８１８（Ａ１）号を参照のこと。
【００４６】
アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）は、Ａドメインスキャフォールドファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、定められたジスルフィド結合構造をとっている。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される自然変異のシャッフルによって生成される。さらなる詳細は、Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561（2005)及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917（June 2007)を参照のこと。
【００４７】
トランスフェリンは、単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容される表面ループにペプチド配列を挿入することによって、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリン足場の例にはトランスボディ（Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）が含まれる。さらなる詳細は、J. Biol. Chem 274, 24066-24073（1999)を参照のこと。
【００４８】
設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリン（Ａｎｋｙｒｉｎ）に由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックスとβターンとからなる３３残基のモチーフである。それらは、各リピートの第１のαヘリックス及びβターンの残基を無作為化することによって、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。それらの結合面は、モジュールの数を増加させることによって増大させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細は、J. Mol. Biol. 332, 489-503（2003), PNAS 100(4), 1700-1705（2003）及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028（2007）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８（Ａ１）号を参照のこと。
【００４９】
単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科動物由来の抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ又はＶＨＨ断片）に由来した。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。
【００５０】
フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作することができる足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５個の反復単位の第１０ドメインの天然のアミノ酸配列のバックボーンからなる。ベータサンドイッチの一端にある３つのループを操作して、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識できるようにすることができる。さらなる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444（2005)、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８（Ｂ１）号を参照のこと。
【００５１】
ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入された拘束可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）から成るコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細は、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797（2005)を参照のこと。
【００５２】
ミクロボディは、３〜４個のシステインブリッジを含有する、長さ２５〜５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質に由来する。微小タンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが含まれる。微小タンパク質は、その微小タンパク質の全体的な折り畳みに影響を与えることなく最大２５個のアミノ酸を含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインのさらなる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照のこと。
【００５３】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいて参照分子とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。
【００５４】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見いだすことができる。本明細書の抗原として有用なタンパク質は、他に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質、並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００５５】
「特異的結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置における解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329（2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229（2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００５６】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表され、この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比率が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当該技術分野で公知である一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００５７】
本明細書において使用される「腫瘍関連抗原」は、がん細胞、腫瘍間質の細胞又はＢ細胞などの腫瘍内の細胞である標的細胞の表面上に提示される抗原決定基を指す。特定の実施態様では、腫瘍関連抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はＣＤ１９である。
【００５８】
用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合できる」とは、抗原結合分子がＦＡＰを標的とする診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＦＡＰに結合できる抗原結合分子を指す。抗原結合分子には、限定されないが、抗体、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、及びＶＨ及び足場抗原結合タンパク質が含まれる。一態様では、抗ＦＡＰ抗原結合分子の無関係の非ＦＡＰタンパク質への結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される場合、抗原結合分子のＦＡＰへの結合の約１０％未満である。特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施態様では、抗ＦＡＰ抗原結合分子は、異なる種に由来するＦＡＰに結合する。特に、抗ＦＡＰ抗原結合分子は、ヒト、カニクイザル及びマウスＦＡＰに結合する。
【００５９】
特に断りのない限り、プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ  ３．４．２１）としても知られている用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＦＡＰを指す。その用語は、「完全長」の未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。この用語は、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号５７）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０に及ぶ。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号５８）、又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１に及ぶ。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＦＡＰ結合分子は、国際特許出願番号ＷＯ２０１２／０２０００６Ａ２に記載されている。
【００６０】
用語「ＣＤ１９に特異的に結合できる」とは、抗原結合分子が、ＣＤ１９を標的とする診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＣＤ１９に結合できる抗原結合分子を指す。抗原結合分子には、限定されないが、抗体、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、及びＶＨ及び足場抗原結合タンパク質が含まれる。一態様では、抗ＣＤ１９抗原結合分子の無関係の非ＣＤ１９タンパク質への結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される場合、抗原結合分子のＣＤ１９への結合の約１０％未満である。特に、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施態様では、抗ＣＤ１９抗原結合分子は、ヒトＣＤ１９に結合する。
【００６１】
特に断らない限り、用語「ＣＤ１９」は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ−１２としても知られるＢリンパ球抗原ＣＤ１９を指し、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号５９）に示されている。この用語は、「完全長」の未処理ヒトＣＤ１９並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のヒトＣＤ１９を、本明細書に報告される抗体がそれに結合する限りにおいて包含する。ＣＤ１９とは、プレＢ細胞、早期発達期のＢ細胞（すなわち、未成熟Ｂ細胞）、形質細胞への終末分化を経た成熟Ｂ細胞、及び悪性Ｂ細胞を含むがこれらに限定されない、ヒトＢ細胞の表面に発現される構造的に異なる細胞表面受容体である。ＣＤ１９は、殆どのプレＢ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、及び一部のＮｕｌｌ細胞型急性リンパ芽球性白血病によって発現される。形質細胞におけるＣＤ１９の発現は、それが多発性骨髄腫といった分化したＢ細胞腫瘍に発現され得ることをさらに示唆するものである。したがって、ＣＤ１９抗原は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び／又は急性リンパ芽球性白血病の治療において免疫療法の標的である。例示的な抗ＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＣＤ１９抗体は、国際特許出願番号ＷＯ２０１７／０５５３２８又はＷＯ２０１７／０５５５４１Ａ１に記載されている。
【００６２】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91（2007)を参照のこと。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
【００６３】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変である（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に定義されたループを形成する（「超可変ループ」）及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。本明細書において、例示的なＨＶＲは：
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917（1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745（1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。
【００６４】
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ（例えばＣＤＲ）残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
【００６５】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest”（1983)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００６６】
本明細書において抗原結合分子（例えば抗体）の文脈で使用される用語「親和性成熟」は、参照抗原結合分子に由来し、例えば変異により、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し、抗原に対して、参照抗原結合分子より高い親和性を有する抗原結合分子を指す。親和性成熟は通常、抗原結合分子の１つ又は複数のＣＤＲにおいて１つ又は複数のアミノ酸残基の修飾を伴う。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【００６７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）において以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００６８】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００６９】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００７０】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００７１】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を生成するように定常領域が追加的に修飾されているもの又は元の抗体から変更されているものである。
【００７２】
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【００７３】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異型Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基にまで及ぶ（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けシステム）。一実施態様では、糖鎖がＣＨ２ドメインに結合している。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであり得る。一態様では、ＣＨ２ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでひと続きの残基を含む（すなわちＩｇＧのおよそ３４１位のアミノ酸残基からおよそ４４７位のアミノ酸残基まで）。一態様では、ＣＨ３ドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列（Ｃ末端リジンを含まない）を含む。本明細書のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインであり得る（例えば、１つの鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）を有するＣＨ３ドメイン及び他の鎖に導入された対応する「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン；参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５８２１３３３号を参照のこと）。そのような変異体ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載の２つの同一でない抗体重鎖のヘテロ二量化を促進するために使用され得る。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００７４】
用語「野生型Ｆｃドメイン」は、自然界に見られるＦｃドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指す。野生型ヒトＦｃドメインには、天然のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然のヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然のヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域、天然のヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、及びその天然に存在する変異体が含まれる。野生型Ｆｃ領域は、配列番号１０６（ＩｇＧ１、白人アロタイプ）、配列番号１０７（ＩｇＧ１、アフリカ系アメリカ人アロタイプ）、配列番号１０８（ＩｇＧ２）、配列番号１０９（ＩｇＧ３）及び配列番号１１０（ＩｇＧ４）に示される。
【００７５】
用語「変異体（ヒト）Ｆｃドメイン」は、少なくとも１つの「アミノ酸変異」によって「野生型」（ヒト）Ｆｃドメインのアミノ酸配列のものとは異なるアミノ酸配列を意味する。一態様では、変異体Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸変異、例えば、約１から約１０個のアミノ酸変異、一態様では、天然のＦｃ領域における約１から約５個のアミノ酸変異を有する。一態様では、（変異体）Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と少なくとも約９５％の相同性を有する。
【００７６】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621（1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15（2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、したがって二量体をさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15（2001)）。番号付けは、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991のＥＵインデックスによる。
【００７７】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加、又は欠失を生成するが、免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害性）の媒介能を実質的に低下させない変更を有する変異体を含むことを意図している。例えば、１つ又は複数のアミノ酸を、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から、生物学的機能を実質的に失うことなく欠失させることができる。そのような変異体は、活性に対する影響が最小限であるように、当該技術分野で公知の一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10（1990)を参照のこと）。
【００７８】
用語「ＣＨ１ドメイン」は、おおよそＥＵ位置１１８からＥＵ位置２１５（ＥＵ番号付けシステム）に及ぶ抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一実施態様では、ＣＨ１ドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。通常、ＥＰＫＳＣのアミノ酸配列（配列番号９９）を有するセグメントが、ＣＨ１ドメインをヒンジ領域に連結するために続いている。
【００７９】
用語「ヒンジ領域」は、野生型抗体重鎖においてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインを結合する抗体重鎖ポリペプチドの部分、例えば、ＫａｂａｔのＥＵ番号システムによる約２１６から約２３０の位置、又はＫａｂａｔのＥＵ番号システムによる約２２６から約２３０の位置までを示す。他のＩｇＧサブクラスのヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基と整列させることにより決定できる。ヒンジ領域は通常、同一のアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は一般に２５個までのアミノ酸残基を含み、柔軟であり、結合した標的結合部位が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、上部、中間、下部の３つのドメインに細分化することができる（例えば、Roux, et al., J. Immunol. 161（1998）4083を参照）。一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号１００）を有し、ここでＸはＳ又はＰのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号６４）を有し、ここでＸはＳ又はＰのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＣＰＸＣＰ（配列番号６５）を有し、ここでＸはＳ又はＰのいずれかである。
【００８０】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００８１】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照）。
【００８２】
用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「ＴＮＦファミリーリガンド」とは、炎症誘発性サイトカインを指す。サイトカインは一般に、特にＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、免疫系の刺激と協調において重要な役割を果たす。現在、配列、機能、及び構造の類似性に基づいて、１９個のサイトカインがＴＮＦ（腫瘍壊死因子）リガンドスーパーファミリーのメンバーとして同定されている。これらのリガンドはすべて、Ｃ末端の細胞外ドメイン（エクトドメイン）、Ｎ末端の細胞内ドメイン、及び単一の膜貫通ドメインを持つＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＮＦホモロジードメイン（ＴＨＤ）として知られるＣ末端の細胞外ドメインは、スーパーファミリーメンバー間で２０〜３０％のアミノ酸同一性を有し、受容体への結合に関与している。ＴＮＦエクトドメインは、ＴＮＦリガンドがその特定の受容体によって認識される三量体複合体を形成することにも関与している。
【００８３】
ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、リンホトキシンα（ＬＴＡ又はＴＮＦＳＦ１としても知られる）、ＴＮＦ（ＴＮＦＳＦ２としても知られる）、ＬＴβ（ＴＮＦＳＦ３としても知られる）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４としても知られる）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４又はＴＮＦＳＦ５としても知られる）、ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ１７８又はＴＮＦＳＦ６としても知られる）、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０又はＴＮＦＳＦ７としても知られる）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３又はＴＮＦＳＦ８としても知られる）、４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９としても知られる）、ＴＲＡＩＬ（ＡＰＯ２Ｌ、ＣＤ２５３又はＴＮＦＳＦ１０としても知られる）、ＲＡＮＫＬ（ＣＤ２５４又はＴＮＦＳＦ１１としても知られる）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２としても知られる）、ＡＰＲＩＬ（ＣＤ２５６又はＴＮＦＳＦ１３としても知られる）、ＢＡＦＦ（ＣＤ２５７又はＴＮＦＳＦ１３Ｂとしても知られる）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８又はＴＮＦＳＦ１４としても知られる）、ＴＬ１Ａ（ＶＥＧＩ又はＴＮＦＳＦ１５としても知られる）、ＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８としても知られる）、ＥＤＡ−Ａ１（エクトジスプラシンＡ１としても知られる）及びＥＤＡ−Ａ２（エクトジスプラシンＡ２としても知られる）からなる群から選択される。この用語は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＴＮＦファミリーリガンドを指す。本発明の特定の実施態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ＯＸ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＴＲＡＩＬ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬからなる群から選択される。特定の実施態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４−１ＢＢＬである。
【００８４】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの、特定の配列におけるさらなる情報が、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）などの一般にアクセス可能なデータベースから取得できる。例えば、ヒトＴＮＦリガンドは以下のアミノ酸配列を有する：ヒトリンホトキシンα（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１３７４、配列番号６６）、ヒトＴＮＦ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１３７５、配列番号６７）、ヒトリンホトキシンβ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０６６４３、配列番号６８）、ヒトＯＸ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２３５１０、配列番号６９）、ヒトＣＤ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９９６５、配列番号７０）、ヒトＦａｓＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４８０２３、配列番号７１）、ヒトＣＤ２７Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３２９７０、配列番号７２）、ヒトＣＤ３０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３２９７１、配列番号７３、４−１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４１２７３、配列番号７４）、ＴＲＡＩＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ５０５９１、配列番号７５）、ＲＡＮＫＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ１４７８８、配列番号７６）、ＴＷＥＡＫ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ４３５０８、配列番号７７）、ＡＰＲＩＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ７５８８８、配列番号７８）、ＢＡＦＦ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｙ２７５、配列番号７９）、ＬＩＧＨＴ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ４３５５７、配列番号８０）、ＴＬ１Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ９５１５０、配列番号８１）、ＧＩＴＲＬ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＵＮＧ２、配列番号８２）及びエクトジスプラシンＡ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９２８３８、配列番号８３）。
【００８５】
「エクトドメイン」は、細胞外空間（すなわち標的細胞外の空間）中に延びる膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは通常、表面との接触を開始するタンパク質の部分であり、シグナル伝達をもたらす。したがって、本明細書で定義されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、細胞外空間（細胞外ドメイン）に延びるＴＮＦリガンドタンパク質の部分を指すが、三量体化及び対応するＴＮＦ受容体への結合に関与するそのより短い部分又は断片も含む。したがって、用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片」は、細胞外ドメインを形成するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの細胞外ドメイン又は受容体に依然として結合することができるその部分（受容体結合ドメイン）を指す。
【００８６】
用語「共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦファミリーリガンド」は、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのサブグループを指す。これらのＴＮＦファミリーリガンドは、対応するＴＮＦ受容体と相互作用すると、ＴＣＲ  シグナルを同時刺激することができ、その受容体との相互作用はＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）の動員をもたらし、それによりシグナル伝達カスケードが開始されてＴ細胞活性化をもたらす。共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ及びＬＩＧＨＴからなる群から選択され、より具体的には、共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
【００８７】
本明細書で前に記載されるように、４−１ＢＢＬはＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦリガンドファミリーの１つのメンバーである。配列番号７４のアミノ酸配列を有する完全又は完全長４−１ＢＢＬは、細胞の表面上に三量体を形成することが記載されている。三量体の形成は、４−１ＢＢＬのエクトドメインの特定のモチーフにより可能になる。前記モチーフは、本明細書では、「三量体化領域」と命名される。ヒト４−１ＢＢＬ配列（配列番号８４）のアミノ酸５０−２５４は、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するが、その断片も三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号４（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２５４）、配列番号１（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２５４）、配列番号３（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２５４）、及び配列番号２（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２５４）から選択されるアミノ酸を有するポリペプチド、又は配列番号５（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２４８）、配列番号８（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２４８）、配列番号７（４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２４８）及び配列番号６（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２４８）から選択されるアミノ酸を有するポリペプチドを指すが、本明細書には三量体化能を有するエクトドメインの他の断片も含まれる。
【００８８】
用語「ペプチドリンカー」は、１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当該技術分野において公知であるか、又は本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎのペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は、一般に１から１０の数、典型的には１から４の間の数、特に２であり、すなわち、ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４３）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４），（Ｇ４Ｓ）３又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ又はＧ４（ＳＧ４）２（配列番号４６）、及び（Ｇ４Ｓ）４又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号４８）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号４９）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号５０）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号５１）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号５２）、ＧＧＳＧ（配列番号５３）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号５４）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号５５）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号５６）も含む。特に興味のあるペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）１又はＧＧＧＧＳ（配列番号４１），（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）及びＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）、より具体的には（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）である。
【００８９】
本発明による「スペーサードメイン」は、折り畳み後に構造ドメインを形成するポリペプチドである。したがって、スペーサードメインは１００アミノ酸残基よりも小さくすることができるが、結合モチーフを固定するために構造的に限定される必要がある。例示的なスペーサードメインは、五量体コイルコイル、抗体ヒンジ領域又は抗体Ｆｃ領域又はその断片である。スペーサードメインは二量体化ドメインであり、すなわち、スペーサードメインは二量体化機能を提供できるアミノ酸を含む。
【００９０】
本出願の中で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【００９１】
本明細書で使用される「融合ポリペプチド」又は「単一融合ポリペプチド」は、直接又はペプチドリンカーを介してそれぞれに融合される、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインなどの、異なる構成要素から構成される単鎖ポリペプチドを指す。「融合された」又は「連結された」とは、構成要素（例えば、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及びエクトドメイン）が、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。
【００９２】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ．ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムで使用するためにコンパイルする必要がある。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡとＢとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【００９３】
特定の実施態様では、本明細書で提供されるＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終構築物が所望の特性、例えば抗原結合を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを最終構築物に到達させることができる。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。表Ｂの「好ましい置換」という項目で保存的置換が示されており、その後にアミノ酸側鎖の分類（１）から（６）がさらに記載されている。アミノ酸置換を目的の分子に導入することができ、その生成物を、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
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【００９４】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【００９５】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とするであろう。
【００９６】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的変異体を含む。一般に、さらなる研究のために選択された得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載のものなどファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して簡便に生成することができる。簡潔には、１つ又は複数のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗原結合分子がファージ上に提示され、特定の生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、そのような改変が抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ又は複数のＨＶＲ内で生じてもよい。例えば、実質的に結合親和性を低減させない保存的改変（例えば本明細書において提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいてなされ得る。突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells（1989）Science, 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは又はさらに、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【００９７】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体には、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
【００９８】
特定の態様では、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、１つ又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に得ることができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合した糖は改変され得る。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって通常結合される分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32（1997)を参照。オリゴ糖には、さまざまな糖、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子におけるオリゴ糖の修飾が、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために行われ得る。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠く糖鎖構造を有する本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の変異体が提供される。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照のこと。本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のさらなる変異体は、二分されたオリゴ糖を含むもの、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているものを含む。そのような変異体は、フコシル化が低減されている可能性があり、かつ／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有してもよく、例えば
国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【００９９】
特定の実施態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のシステイン操作変異体（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）、例えば分子の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換された「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換される残基は分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、その反応性チオール基を使用して抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分に結合させ、イムノコンジュゲートを作成することができる。特定の実施態様では、以下の残基のうちのいずれかの１つ又は複数がシステインで置換される：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗原結合分子は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１００】
特定の態様では、本明細書に提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量のものであってよく、分枝鎖又は非分枝鎖であってよい。抗体に結合しているポリマーの数は変化してよく、１つを超えるポリマーが結合している場合、それらは同じ分子でも又は異なる分子でもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が限定条件下での治療に使用されるかどうかなどを含むが、これらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線への曝露により選択的に加熱することのできる抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102（2005）11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、限定しないが、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質部分の近位細胞を死滅させる温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含む。
【０１０１】
別の態様では、本明細書に提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のイムノコンジュゲートを得ることができる。「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１つ又は複数の異種分子に結合した抗体である。
【０１０２】
用語「核酸」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。核酸は、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１０３】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換え核酸を、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離された核酸のさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離された核酸は、通常そのポリヌクレオチド分子を含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は染色体外に、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖型及びマイナス鎖型、及び二重鎖型を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった調節エレメントであり得るか又はそれらを含み得る。
【０１０４】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチド配列がその参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに５個までの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がその参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除され又は別のヌクレオチドで置換されても良く、又は参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％までの複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はそれらの末端位置の間の任意の場所で、参照配列中の残基の間に個別に散在して、又は参照配列内部の１つ又は複数の連続する群において散在して生じ得る。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に判定することができる。
【０１０５】
用語「発現カセット」は、標的細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え的又は合成的に生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、数ある配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１０６】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１０７】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する突然変異型子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するのに使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞等の哺乳動物の培養細胞、又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれるだけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。
【０１０８】
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１０９】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、減少させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１１０】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１１１】
用語「薬学的組成物」は、その中に含まれる活性成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である付加的成分を含まない調製物を指す。
【０１１２】
「薬学的に許容される添加剤」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される添加剤には、限定されないが、バッファー、安定剤又は保存剤が含まれる。
【０１１３】
用語「添付文書」は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１１４】
本明細書で用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１１５】
本明細書で使用する用語「がん」は、例えば、リンパ腫、カルシノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、Ｂ細胞がん（リンパ腫）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病などの増殖性疾患を意味し、上記がんの任意の難治性のもの、又は上記がんのうちの１つ又は複数の組み合わせを含む。
【０１１６】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
本発明は、生産可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、及び低い毒性などの特に有利な特性を有する新規のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１１７】
特に、本発明は、三量体リガンドが正しく組み立てられ、完全に機能するように、三量体ＴＮＦリガンドを抗体に効率的に融合させることができる方法について説明する。臨床応用に向けて開発することを目的とする分子の場合、機能的に活性な分子の凝集体を避ける必要があり、天然のリガンド融合物の純度と安定性が非常に重要であることを意味する。重要なことに、本発明の抗原結合分子において、３つのＴＮＦリガンドすべてが抗体の重鎖に融合している。したがって、重鎖と軽鎖の正しいペアリングの問題を回避することができる。
【０１１８】
抗体ベースの構造に焦点を当てることは、一般的に抗体の良好な薬物動態特性によって導かれる。抗体の構造は他のタンパク質と比較して安定している；それらの発現は、異なる細胞株を使用しても非常に堅牢である。それらのＦｃ部分はＦｃＲｎ受容体と相互作用し、したがって分子を細胞内分解による急速な排除から保護する。重要なことは、構築物が適度に良好な力価で発現可能であり、所望の産物の良好な比率を生み出すことである。抗体の構造は他のタンパク質と比較して安定している；それらの発現は、異なる細胞株を使用しても非常に堅牢である。
【０１１９】
ここでは、コントースボディの原理と組み合わせて抗体構造を使用する利点を示す。最新のものは、抗原結合ドメインの一部、例えば、二量体化又は多量体化スペーサードメイン（この場合、単量体のＦｃ部分）のＮ末端にＦａｂ分子の重鎖部分を、及び他の部分、例えば、同じ二量体化又は多量体化スペーサードメインのＣ末端へＦａｂ分子の軽鎖部分を融合させることで構成される。
【０１２０】
三量体ＴＮＦリガンドの場合、リガンドの二量体をＦｃのＣ末端部分に融合させることができ、一方、第３のリガンドはＦｃのＮ末端部分に融合して、完全な抗原結合分子の第１の半分を形成することができる。鎖のペアリングの別の標準セットは、抗原結合分子の第２の半分として「標準」Ｆａｂ−Ｆｃの組み合わせを形成する。又は、分子の第２の半分は、Ｆａｂの重鎖がＦｃのＮ末端に融合され、Ｆａｂの軽鎖がＦｃのＣ末端に融合された単一の環状融合ポリペプチドで構成される（「コントースボディ」）。Ｆｃの「ノブ・イントゥー・ホール」技術を使用して２つの重鎖を区別するため、２つの異なるＦｃ部分間でヘテロ二量体化が生じ、最終的な分子が形成される。３つのリガンドすべてを１つの鎖上に配置すると、同じ鎖から単量体を結合させることを促す；ポリペプチドが構築され、各サブドメインのフォールディングが達成されるとすぐに、別のポリペプチドからのドメインと比較して最新のものが比較的高濃度であるため、異なる部分は、好ましくは同じポリペプチドからのパートナーと組み立てられる。分子の不完全な三量体化が、融合したＴＮＦリガンドの別の一価又は二価の形態と複合体を形成することができる場合、これはリガンドの高分子量種又は非三量体形態のいずれかである副産物をもたらす。別の選択肢では、１つのＴＮＦリガンドをＦｃのＮ末端部分に融合させることができ、一方、第２のリガンドは同じＦｃのＣ末端部分に融合させることができ、第３のリガンドは第２のＦｃのＣ末端部分に融合させることができる。また、この場合、３つのリガンドはすべて、ジスルフィド結合によって互いに密接に連結されたＦｃ部分にすべて融合されるため、好ましくは互いに組み立てられる。
【０１２１】
異なるポリペプチド鎖の発現速度はさらなる会合を誘発するための重要な要素であるため、本発明は、短いポリペプチド鎖が長いポリペプチド鎖よりもはるかに速く発現する可能性があるため、ＴＮＦリガンドの短いポリペプチド鎖（すなわち、軽鎖）への融合を回避することを提案する。そのような場合、短いポリペプチド鎖はそれ自体と会合して、最終分子のＦｃ部分と抗原結合ドメインを欠いた三量体ＴＮＦリガンドである主な副産物を生成する可能性がある。短鎖を枯渇させることは、Ｆｃ部分を介した重鎖の会合を妨げない。したがって、それ自体で三量体化する傾向があるＴＮＦリガンドが短鎖に融合されていないか、又は短鎖（軽鎖）が欠けている場合でも、不完全な分子の凝集を回避することができる。
【０１２２】
本発明の別の焦点は、類似の長さの第１の融合ポリペプチド及び第２の融合ポリペプチドの両方を維持することである。これは、１つのＴＮＦリガンドが「通常の」抗体重鎖のＣ末端に融合され、他の２つのＴＮＦリガンドが相補的Ｆｃ部分の両側において融合される場合に特に満たされる。両方のＦｃ含有鎖は約６５ｋＤの分子量を有し、次いでプロセシングされ、同様に高速で折りたたまれて、培地中で１：１の化学量論を得ると考えられる。ノブを含むＦｃ部分とホールを含むＦｃ部分との間の予想される会合は、次いで２つのポリペプチド鎖によって提供される三量体リガンドの会合を促進している。
【０１２３】
したがって、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、それらの生産可能性（調製中に凝集生成物を構築する傾向が低い）及びそれらの安定性によって特に特徴付けられる。これらの分子は「ＴＮＦリガンドコントースボディ」とも呼ばれる。
【０１２４】
第１の態様では、本発明は、
（ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片、スペーサードメイン及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片を含む第１の融合ポリペプチドであって、ここで、
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第１のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＮ末端に融合され、
−  前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第２のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合される第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）抗原結合ドメインの第１の部分及びスペーサードメインを含む第２の融合ポリペプチドであって、ここで
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、かつ
ここで、抗原結合ドメインの第２の部分が、直接又は第３のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合されるか、又は軽鎖の形態で存在する第２の融合ポリペプチド、及び
（ｃ）
−  第１の融合ポリペプチドにおける前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメインのＣ末端、又は第２の融合ポリペプチドにおけるスペーサードメインのＣ末端のいずれか、又は
−抗原結合ドメインの第２の部分が第２の融合タンパク質のスペーサードメインのＣ末端に融合される場合、第１の融合ポリペプチドにおける前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメインのＣ末端に
直接又は第４のペプチドリンカーを介して融合される、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第３のエクトドメイン又はその断片
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインが、ジスルフィド結合により互いに共有結合している、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１２５】
一態様では、本発明は、
（ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片、スペーサードメイン及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片を含む第１の融合ポリペプチドであって、ここで、
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第１のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＮ末端に融合され、
−  前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン及び第３のエクトドメイン又はその断片が互いに融合され、直接又は第２のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合される第１の融合ポリペプチド、及び
（ｂ）抗原結合ドメインの第１の部分及びスペーサードメインを含む第２の融合ポリペプチドであって、ここで
スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、かつ
ここで、抗原結合ドメインの第２の部分が軽鎖の形態で存在する第２の融合ポリペプチド
を含み、
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインが、ジスルフィド結合により互いに共有結合している、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１２６】
第２の態様では、本発明は、
（ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片、スペーサードメイン及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片を含む第１の融合ポリペプチドであって、ここで、
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第１のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＮ末端に融合され、
−  前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン及び第３のエクトドメイン又はその断片が互いに融合され、直接又は第２のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合される第１の融合ポリペプチド、及び
（ｂ）抗原結合ドメインの第１の部分及びスペーサードメインを含む第２の融合ポリペプチドであって、
ここでスペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、かつ
ここで、抗原結合ドメインの第２の部分が、直接又は第３のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合される第２の融合ポリペプチド
を含み、
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインが、ジスルフィド結合により互いに共有結合している、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１２７】
第３の態様では、本発明は、
（ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片、スペーサードメイン及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片を含む第１の融合ポリペプチドであって、ここで、
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第１のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＮ末端に融合され、
−  前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第２のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合される第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）抗原結合ドメインの第１の部分及びスペーサードメインを含む第２の融合ポリペプチドであって、ここで
スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、かつ
ここで、抗原結合ドメインの第２の部分は軽鎖の形態で存在し、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第３のエクトドメイン又はその断片は、直接又は第４のペプチドリンカーを介してスペーサードメインのＣ末端に融合される第２の融合ポリペプチド
を含み、
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインが、ジスルフィド結合により互いに共有結合している、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１２８】
特定の態様では、本発明は、本明細書で前に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、抗原結合ドメインの第１の部分は抗体重鎖可変ドメインを含み、抗原結合ドメインの第２の部分は抗体軽鎖可変ドメインを含み、又はその逆である。特定の一態様では、抗体重鎖可変ドメインはスペーサードメインのＮ末端に融合され、抗体軽鎖可変ドメインは同じスペーサードメインのＣ末端に融合される。別の態様では、抗体重鎖可変ドメインはスペーサードメインのＣ末端に融合され、抗体軽鎖可変ドメインは異なる鎖、特に軽鎖上に存在する。特定の態様では、本発明は、本明細書で前に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、抗原結合ドメインの第１の部分は抗体重鎖Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分は抗体軽鎖Ｆａｂ断片であり、又はその逆である。特定の一態様では、抗体重鎖Ｆａｂ断片はスペーサードメインのＮ末端に融合され、抗体軽鎖Ｆａｂ断片は同じスペーサードメインのＣ末端に融合される。一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分と抗原結合ドメインの第２の部分は、ジスルフィド結合により互いに共有結合している。
【０１２９】
上記のように、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、両方ともスペーサードメインを含む第１及び第２の融合ポリペプチドを含み、ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合している。
【０１３０】
本発明の一態様では、スペーサードメインは、抗体ヒンジ領域又はその（Ｃ末端）断片及び抗体ＣＨ２ドメイン又はその（Ｎ末端）断片を含む。別の態様では、スペーサードメインは、抗体ヒンジ領域又はその断片、抗体ＣＨ２ドメイン、及び抗体ＣＨ３ドメイン又はその断片を含む。さらなる態様では、本発明はＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を含み、ここでスペーサードメインは抗体ヒンジ領域又はその断片及びヒトＦｃ領域（ドメイン）を含む。特に、ヒトＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインであり、より具体的には、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のスペーサードメインは、ヒトＩｇＧ１ドメインを含む。
【０１３１】
一態様では、本発明は、本明細書で前に記載されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、第１、第２、第３及び第４のペプチドリンカーが存在し、かつ、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。特に、ペプチドリンカーは、配列番号４２及び配列番号４４から選択されるアミノ酸配列からなる。より具体的には、ペプチドリンカーは、配列番号４２のアミノ酸配列からなる。
【０１３２】
本発明のさらなる態様では、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。特定の態様では、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメインはホールを含み、第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインはノブを含む。
【０１３３】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）本明細書で前に定義された第１の融合ポリペプチド及び本明細書で前に定義された第２の融合ポリペプチドを含み、ここで、第１及び第２の融合ポリペプチドは、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。通常、これらの修飾はＦｃドメインに導入される。２つの構造的に異なる融合ポリペプチドの組換え共発現、及びその後の二量体化は、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせをもたらすであろう。したがって、組換え産生におけるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。
【０１３４】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、前記修飾は特にＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０１３５】
特定の態様では、前記修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含む。したがって、特定の態様では、本発明は、ＩｇＧ分子を含む、本明細書で前に記載されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、第１の重鎖のＦｃ部分は第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分はＩｇＧ分子の２つの重鎖のヘテロ二量体化を可能にする第２の二量体化モジュールを含み、ノブ・イントゥー・ホールに従って、第１の二量体化モジュールはノブを含み、第２の二量体化モジュールはホールを含む。
【０１３６】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621（1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15（2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０１３７】
本明細書において報告される第１及び第２の融合ポリペプチドにおけるＣＨ３ドメインは、「ノブ・イントゥー・ホール」技術により改変することができ、これは、例えば国際公開第９６／０２７０１１号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9（1996）617-621；及びMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16（1998）677-681のいくつかの例で詳細に説明される。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面が改変され、これら２つのＣＨ３ドメインを含む両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれが「ノブ」になることができ、もう一方が「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入により、ヘテロ二量体がさらに安定化され（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681；Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35）、収率を向上させる。
【０１３８】
したがって、特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内において、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
【０１３９】
特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ鎖」）のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。より具体的には、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール鎖」）においてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。より具体的には、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成される。ジスルフィド架橋はさらに二量体を安定化させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15（2001)）。
【０１４０】
しかし、ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されている他のノブ・イン・ホール技術も、代替的又は追加的に使用することができる。一実施態様では、本明細書において報告される多環式融合ポリペプチドは、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ変異、並びに「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ変異を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１４１】
さらなる態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を含み、又は、本明細書において報告されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を含み、さらに、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ変異、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ変異（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１４２】
別の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促す修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にて、荷電したアミノ酸残基による１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
【０１４３】
「ノブ・イントゥー・ホール技術」とは別に、ヘテロ二量体化を実施するために重鎖のＣＨ３ドメインを修飾する他の技術が当該技術分野で公知である。これらの技術、特に、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４及び国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されるものは、本明細書に記載されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子と組み合わせた「ノブ・イントゥー・ホール」の代替物として本明細書で企図される。
【０１４４】
一態様では、所望のポリペプチドの会合をさらに促進するために、第１及び第２の重鎖間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸が導入される。したがって、この態様は、本明細書に開示される抗原結合分子に関し、ここで、抗体の三次構造において、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、それぞれの抗体のＣＨ３ドメインの間に位置する界面が形成され、ここで、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインのそれぞれのアミノ酸配列はそれぞれ、環状融合ポリペプチドの三次構造において前記界面内に位置するアミノ酸のセットを含み、ここで、１つの重鎖のＣＨ３ドメインの界面に位置するアミノ酸のセットから、第１のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸で置換され、かつ、他の重鎖のＣＨ３ドメインの界面に位置するアミノ酸のセットから、第２のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸で置換される。この態様によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、本明細書では「ＣＨ３（＋／−）操作ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子」とも呼ばれる（ここで、略語「＋／−」は、それぞれのＣＨ３ドメインに導入された反対に荷電したアミノ酸を表す）。本明細書において報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の一態様では、正に荷電したアミノ酸はＫ、Ｒ及びＨから選択され、負に荷電したアミノ酸はＥ又はＤから選択される。本明細書において報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の別の態様では、正に荷電したアミノ酸はＫ及びＲから選択され、負に荷電したアミノ酸はＥ又はＤから選択される。さらなる態様では、本明細書において報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子において、正に荷電したアミノ酸はＫであり、負に荷電したアミノ酸はＥである。一態様では、本明細書において報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子において、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４０９のアミノ酸ＲはＤに置換され、位置のアミノ酸ＫはＥに置換され、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９９位のアミノ酸ＤはＫに置換され、３５７位のアミノ酸ＥはＫに置換される（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１４５】
本発明のさらなる態様では、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、特にＦｃγ受容体に対するＦｃ受容体への結合を減少させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
【０１４６】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメインの修飾
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、スペーサードメインとして免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含み得る。例えば、免疫グロブリン  Ｇ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に、好ましい薬物動態特性、例えば標的組織内への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び好ましい組織−血液分布比などを付与する。
【０１４７】
特定の態様では、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、これらの機能は、そのＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は重要であっても、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）は不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣの活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、環状融合ポリペプチドがＦｃγＲ結合を欠くが（したがって、恐らくはＡＤＣＣ活性が欠くが）、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確認することができる。
【０１４８】
したがって、特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示す。一態様では、Ｆｃは、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、かつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１つ又は複数を含むことができる。
【０１４９】
特定の態様では、本明細書に提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃ領域に１つ又は複数のアミノ酸修飾が導入され、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１５０】
特定の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、スペーサードメインは、特にＦｃγ受容体に対するＦｃ受容体への結合を低減する１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。
【０１５１】
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より具体的には、ＩｇＧ重鎖においてアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組み合わせは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させるもので、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載があり、同文献には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定するための方法も記載されている。「ＥＵ番号付け」は、Kabat et al、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載のＥＵインデックスに従った番号付けを指す。
【０１５２】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を伴うものも含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含めた、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１５３】
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低下を呈する。さらに詳細な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異及びそのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
【０１５４】
変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の削除、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０１５５】
Ｆｃ受容体への結合は、例えばＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、及び組換え発現によって得ることができるＦｃ受容体を使用して、容易に決定することができる。適切なそのような結合アッセイが本明細書に記載される。あるいは、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価してもよい。
【０１５６】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で公知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063（1986）及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502（1985)；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361（1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656（1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０１５７】
いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを判定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイが実施され得る。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163（1996)；Cragg, et al., Blood 101:1045-1052（2003)；及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743（2004)を参照）。
【０１５８】
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるすべての位置を含み、
ｉ）任意で変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は
ｉｉ）任意で変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は
ｉｉｉ）任意で変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａを有する、又は任意で変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は
ｉｖ）
ａ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、又は
ｂ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＳ３５４Ｃを含み、又は
ｃ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＹ３４９Ｃを含む
ヘテロ二量体Ｆｃ領域、
又は
ｖ）Ｆｃ領域ポリペプチドの両方が変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含み、かつ
ａ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、又は
ｂ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＳ３５４Ｃを含み、又は
ｃ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＹ３４９Ｃを含む
ヒトＩｇＧ１サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域、
又は
ｖｉ）Ｆｃ領域ポリペプチドの両方が変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを含み、かつ
ａ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、又は
ｂ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＳ３５４Ｃを含み、又は
ｃ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＹ３４９Ｃを含む
ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域、
又は
ｖｉｉ）ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）のいずれかとｖｉ）、ｖ）、及びｖｉ）のいずれかとの組み合わせ
を含む。
【０１５９】
本明細書において報告されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に含まれる融合ポリペプチドのＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。Ｃ末端は、Ｃ−末端アミノ酸残基の１つ又は２つが除去された短縮されたＣ末端であり得る。好ましい一実施態様では、Ｃ末端はアミノ酸残基ＰＧで終わる短縮されたＣ末端である。
【０１６０】
特定のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
別の態様では、本発明は、
（ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片、スペーサードメイン及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片を含む第１の融合ポリペプチドであって、ここで、
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第１のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＮ末端に融合され、
−  前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第２のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合される第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）抗原結合ドメインの第１の部分及びスペーサードメインを含む第２の融合ポリペプチドであって、
ここで、スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、かつ
ここで、抗原結合ドメインの第２の部分が、直接又は第３のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合されるか、又は軽鎖の形態で存在する第２の融合ポリペプチド、及び
（ｃ）
−  第１の融合ポリペプチドにおける前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメインのＣ末端、又は第２の融合ポリペプチドにおけるスペーサードメインのＣ末端のいずれか、又は
−  可変抗原結合ドメインと定常ドメインからなるＦａｂ分子の第２の部分が第２の融合タンパク質のスペーサードメインのＣ末端に融合される場合、第１の融合ポリペプチドにおける前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメインのＣ末端に
直接又は第４のペプチドリンカーを介して融合される、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第３のエクトドメイン又はその断片
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合しており、ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ヒトＴ細胞活性化を共刺激するものである、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１６１】
したがって、本発明は、ヒトＴ細胞活性化を共刺激するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。本発明の特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドは４−１ＢＢＬである。４−１ＢＢＬ三量体を含む本発明の抗原結合分子は、本明細書では４−１ＢＢＬコントースボディと呼ばれる。
【０１６２】
さらなる態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。より具体的には、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【０１６３】
さらに別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、該分子は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つのエクトドメインを含み、特に、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの３つすべてのエクトドメインは、同じアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、第１及び第２の部分からなる抗原結合ドメインをさらに含む。一態様では、抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる。さらなる態様では、抗原結合ドメインは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はＣＤ１９に特異的に結合することができる。
【０１６５】
一態様では、抗原結合ドメインは、ＦＡＰに特異的に結合することができる。抗原結合ドメインがＦＡＰに特異的に結合することができ、ＴＮＦファミリーリガンドが４−１ＢＢＬである分子は、本明細書ではＦＡＰ−４−１ＢＢＬコントースボディと呼ばれる。
【０１６６】
特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【０１６７】
特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１６８】
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号８６のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【０１６９】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号８８のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【０１７０】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【０１７１】
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び
（ｂ）配列番号９１のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、又は
（ａ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び
（ｂ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド
を含む。
【０１７２】
別の態様では、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合することができる。抗原結合ドメインがＣＤ１９に特異的に結合することができ、ＴＮＦファミリーリガンドが４−１ＢＢＬである分子は、本明細書ではＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディと呼ばれる。
【０１７３】
特に、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む。
【０１７４】
特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
【０１７５】
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号８８のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号９９のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【０１７６】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【０１７７】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
【０１７８】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はその断片をコードする単離された核酸を提供する。
【０１７９】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸は、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。同時発現される核酸によってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して結合して、機能的抗原結合分子を形成し得る。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成するであろう。
【０１８０】
いくつかの態様では、単離された核酸は、本明細書に記載される本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子全体をコードする。特に、単離された核酸は、本明細書に記載される本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０１８１】
一態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸を対象とし、ここで、核酸は、（ａ）本明細書で前に記載される第１の融合ポリペプチドをコードする配列、（ｂ）本明細書で前に記載される第２の融合ポリペプチドをコードする配列、及び任意で（ｃ）軽鎖をコードする配列を含む。
【０１８２】
特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であり得る。
【０１８３】
組換え法
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え法及び組成物を使用して産生され得る。組換え産生のために、例えば上述したように、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明の核酸を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともにＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.（1989)；及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.（1989)に記載される技術を参照のこと。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターには、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片（すなわちコード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットが含まれる。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド若しくはそのポリペプチド断片又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか、又は融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、１つ又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるであろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０１８４】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連結した最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写調節領域には、脊椎動物遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギαグロビンに由来するもの、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写調節領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンを誘導可能なプロモーター）が含まれる。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、内部リボソーム侵入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０１８５】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合させることができる。例えば、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、成長中のタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る排出輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、それが翻訳されたポリペプチドから切断されて分泌又は「成熟」型のポリペプチドを産生することを知っている。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド（例えば免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖シグナルペプチド）、又はその配列と作動可能に結合している、ポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０１８６】
（例えばヒスチジンタグなど）後の精製を容易にするため又は融合タンパク質の標識化の補助のために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片の中又は両末端に含まれ得る。
【０１８７】
本発明のさらなる態様では、本発明の核酸を含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当該技術分野で周知である。このような細胞は、特定の発現ベクターを適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、臨床応用に十分な量の抗原結合分子を得るために大規模発酵槽に播種するために大量のベクター含有細胞を増殖させることができる。適切な宿主細胞には、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は種々の真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でない場合、細菌で産生され得る。発現後、可溶性画分中の細菌細胞ペーストからポリペプチドを単離し、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌などの真核微生物は、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生を結果として生じる菌類及び酵母菌株を含む、ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414（2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215（2006)を参照。
【０１８８】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁状態で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59（1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251（1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68（1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216（1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248（B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268（2003)を参照。
【０１８９】
宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれ、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。一態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【０１９０】
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を産生する方法が提供され、ここで、方法は、本明細書で提供される、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸を含む宿主細胞を、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で培養すること、及び本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することを含む。
【０１９１】
本明細書で記載のように調製される本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子は、当該技術分野で公知の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスが使用され得る。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを、本質的に実施例に記載されるように抗原結合分子を単離するために使用することができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む任意のさまざまな周知の分析方法によって決定され得る。例えば、実施例に記載されるように発現されたＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されるようにインタクトであり、正しく組み立てられていることが示された。
【０１９２】
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子は、当該技術分野で公知のさまざまなアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物活性について同定、スクリーニング又は特徴づけすることができる。生物活性には、例えば、異なる免疫細胞、特にＴ細胞の活性化及び／又は増殖を増強する能力が含まれ得る。例えば、それらは免疫調節サイトカイン（例えば、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）及び／又は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ））の分泌を高める。増強されるか、又は増強され得る他の免疫調節サイトカインは、例えば、ＩＬ１２、グランザイムＢなどである。生物活性はまた、カニクイザル結合交差反応性、並びに異なる細胞型への結合を含み得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのような生物活性を有する抗原結合分子も提供される。
【０１９３】
１．親和性アッセイ
本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の対応するＴＮＦ受容体に対する親和性は、実施例に記載の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。ＦＡＰ又はＣＤ１９に対するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の親和性もまた、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、実施例４に記載される。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥヘルスケア）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０１９４】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の、その対応する受容体発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することができる。一態様では、ＴＮＦ受容体を発現する新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が結合アッセイで使用される。これらの細胞は、単離直後（ナイーブＰＭＢＣ）又は刺激後（活性化ＰＭＢＣ）に使用される。別の態様では、活性化マウス脾細胞（ＴＮＦ受容体分子を発現する）を使用して、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の対応するＴＮＦ受容体発現細胞への結合を実証した。
【０１９５】
さらなる態様では、ＦＡＰ又はＣＤ１９を発現する細胞株を使用して、この標的細胞抗原への抗原結合分子の結合を実証した。
【０１９６】
別の態様では、競合アッセイを使用して、特異的抗体又は抗原結合分子と、標的又はＴＮＦ受容体のそれぞれへの結合について競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合する抗原結合分子は特異的抗標的抗体又は特異的抗ＴＮＦ受容体抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための代表的な方法が、Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)に掲載のMorris（1996）”Epitope Mapping Protocols,”に詳細に示されている。
【０１９７】
３．活性のアッセイ
一態様では、特異的標的細胞抗原、及び生物活性を有する特異的ＴＮＦ受容体に結合するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上のＴＮＦ受容体を介したアゴニストシグナル伝達が含まれ得る。アッセイによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのような生物活性を有すると同定されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子も提供される。
【０１９８】
特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、このような生物活性について試験される。本発明の分子の生物活性を検出するためのアッセイの例は、実施例４と５に記載されているものである。生物活性は、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はγδＴ細胞などのさまざまなリンパ球サブセットの生存、増殖及びリンホカイン分泌に対するそれらの効果を評価することによって、又は樹状細胞、単球／マクロファージ若しくはＢ細胞などの抗原提示細胞の表現型、及び機能を調節するそれらの能力を評価することによって評価することができる。
【０１９９】
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のいずれかと、例えば後述するような少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
【０２００】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加剤中に溶解又は分散された１つ又は複数のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という句は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも１つのＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990（参照により本明細書に包含される）によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される添加剤」には、当業者に既知であるように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【０２０１】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーなどの生理的に適合性のバッファー中において製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。あるいは、融合タンパク質は、使用前に適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水で構成するための粉末形態であってもよい。滅菌注射溶液は、本発明の融合タンパク質を、必要に応じて、以下に列挙するさまざまな他の成分と共に適切な溶媒中に必要量で組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又は乳濁液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過されたその液体媒質から、活性成分に加えて任意の追加の所望の成分の粉末を得る真空乾燥又は凍結乾燥技術である。場合によっては、液体媒質を適切に緩衝し、注射前にまず、その液体希釈剤を十分な生理食塩水又はグルコースで等張にする必要がある。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染は、安全なレベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれるべきであることが理解されよう。薬学的に許容される適切な添加剤には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン等の懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ  ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２０２】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル、ポリ−（メチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなど）を組成物に使用することによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
本明細書における例示的な薬学的に許容される添加剤には、介在性薬物分散剤、例えば水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２０３】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝剤を含む。
【０２０４】
上記の組成物に加えて、融合タンパク質はデポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性又は疎水性材料を用いて（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤化することができる。
【０２０５】
本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、１つ又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、添加剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる従来の方式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０２０６】
ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、中性又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基の形態よりも水性溶媒及び他のプロトン性溶媒に溶解しやすい傾向がある。
【０２０７】
本明細書中の組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な１つを超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含み得る。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２０８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。
【０２０９】
治療方法及び組成物
本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のいずれかが、治療方法において使用され得る。
【０２１０】
治療方法において使用される場合、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、医療実施基準に一致した様式で製剤化、調薬及び投与され得る。この観点において考慮すべき要素には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者が知るその他の要素が含まれる。
【０２１１】
一態様では、医薬として使用のための本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、疾患を治療することおける使用のための、特にがんの治療における使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。特定の態様では、治療方法における使用のための本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。一態様では、本発明は、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、それを必要とする個体における疾患の治療における使用のためのＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様では、本発明は、融合タンパク質の治療的有効量を疾患を有する個体に投与することを含む、該個体を治療する方法における使用のためのＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様では、治療される疾患は、がんである。がんの例には、固形腫瘍、膀胱がん、腎細胞癌、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がん、メラノーマ、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、及び急性リンパ芽球性白血病が含まれる。したがって、がんの治療における使用のための、本明細書に記載されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。治療を必要とする対象、患者又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【０２１２】
別の態様では、感染症の治療、特にウイルス感染の治療における使用のための、本明細書に記載されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０２１３】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製におけるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用に関する。一態様では、医薬は、疾患を有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用のためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害、特にがんである。したがって、一態様では、本発明は、がんの治療のための医薬の製造又は調製における、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用に関する。がんの例には、固形腫瘍、膀胱がん、腎細胞癌、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がん、メラノーマ、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、及び急性リンパ芽球性白血病が含まれる。本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性障害には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、（中枢及び末梢）神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんから成る群より選択される。当業者は、いくつかの場合において、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は治癒をもたらさないかもしれないが、部分的恩恵をもたらすだけかもしれないことを認識し得る。いくつかの態様では、何らかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの態様では、生理的変化をもたらすＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。
【０２１４】
さらなる態様では、本発明は、感染症の治療、特にウイルス感染症の治療、又は自己免疫疾患、例えばループス病の治療のための、医薬の製造又は調製における、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用に関する。
【０２１５】
さらなる態様では、本発明は、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物が前記個体に投与される。特定の態様では、治療される疾患は増殖性障害である。特定の態様では、疾患はがんである。別の態様では、疾患は感染症又は自己免疫疾患である。特定の態様では、方法は、個体に治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合には抗がん剤を投与することをさらに含む。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【０２１６】
疾患の予防又は治療のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の（単独で使用されるか、あるいは１つ又は複数の他の追加の治療剤との組み合わせで使用されるときの）適切な用量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、融合タンパク質が予防目的又は治療目的のために投与されるのかどうか、以前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴、及び融合タンパク質に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。いずれの場合にも、投与の責任を負う施術者は、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象のための適切な用量を決定するであろう。限定されないが、単回又はさまざまな時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むさまざまな投与スケジュールが本明細書において考慮される。
【０２１７】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、単回又は一連の治療にわたって患者へ適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な１日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで一般に持続されるであろう。融合タンパク質の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の例では、用量は、投与１回につき、体重１ｋｇあたり約１μｇから、体重１ｋｇあたり約５μｇから、体重１ｋｇあたり約１０μｇから、体重１ｋｇあたり約５０μｇから、体重１ｋｇあたり約１００μｇから、体重１ｋｇあたり約２００μｇから、体重１ｋｇあたり約３５０μｇから、体重１ｋｇあたり約５００μｇから、体重１ｋｇあたり約１ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約２００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約３５０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇまで、又はそれ以上の範囲、及びそこから導き出せる範囲を含む。本明細書に挙げた数字から導き出せる範囲の例では、上記の数字に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇから体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇから体重１ｋｇあたり約５００ｍｇ等の範囲が投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１つ又は複数の用量を患者に投与することができる。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２〜約２０用量、又は例えば約６用量の融合タンパク質を受けるように）投与され得る。初回の高負荷用量の後、１つ又は複数の低用量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２１８】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるであろう。疾患の状態を治療又は予防するための使用のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２１９】
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。その後、細胞培養で決定したＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて用量を定式化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。
【０２２０】
初期投与量は、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を使用して推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づくヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０２２１】
投与の量及び間隔は、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の、治療効果を維持するのに十分な血漿レベルを提供するために個別に調整され得る。注射による投与のための患者への通常の投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数回投与を行うことにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０２２２】
局所投与又は選択的取り込みの場合、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０２２３】
本明細書に記載されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の治療的に有効な用量は一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療的効果を提供するであろう。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物試験を用いて、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。大きな治療指数を示すＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを用いて、ヒトにおける使用に適した投与量の範囲を定式化することができる。投与量は、好ましくは、毒性がほどんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1を参照のこと。この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２２４】
本発明の融合タンパク質を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合、治療をより高いレベルに調整する（毒性は予め排除）ことも知っているであろう。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。状態の重篤度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価され得る。さらに、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変動するであろう。
【０２２５】
その他の薬剤及び治療
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、治療において１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与され得る。用語「治療剤」は、このような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与され得る任意の薬剤を包含する。そのような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。特定の実施態様では、追加の治療剤は別の抗がん剤である。
【０２２６】
このような他の薬剤は、意図される目的に対して効果的な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の要因に依存する。ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載された用量の１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路によって使用される。
【０２２７】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起き得る分離投与を包含する。
【０２２８】
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上又は容器に付属するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどのさまざまな材料から形成され得る。容器は、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子である。
【０２２９】
ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態を治療するために使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子を含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。
【０２３０】
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液）を収容する第２（又は第３）の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
表Ｂ（配列）：
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2021500902.tif 000005
2021500902.tif 000006
2021500902.tif 000007
2021500902.tif 000008
2021500902.tif 000009
2021500902.tif 000010
【０２３１】
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991)に与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、上で定義されたＫａｂａｔによるＥＵ番号付けシステム（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991)）に従って番号が付けられ、参照される。
【０２３２】
以下の番号の付いた項（ｐａｒａｓ）が、本発明の態様を説明する。
１．
（ａ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片、スペーサードメイン及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片を含む第１の融合ポリペプチドであって、ここで、
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第１のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第１のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＮ末端に融合され、
−  前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメイン又はその断片が、直接又は第２のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合される第１の融合ポリペプチド、
（ｂ）抗原結合ドメインの第１の部分及びスペーサードメインを含む第２の融合ポリペプチドであって、ここで、
スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、かつ
ここで、抗原結合ドメインの第２の部分が、直接又は第３のペプチドリンカーを介して、スペーサードメインのＣ末端に融合されるか、又は軽鎖の形態で存在する第２の融合ポリペプチド、及び
（ｃ）
−  第１の融合ポリペプチドにおける前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメインのＣ末端、又は第２の融合ポリペプチドにおけるスペーサードメインのＣ末端のいずれか、又は
−  抗原結合ドメインの第２の部分が第２の融合タンパク質のスペーサードメインのＣ末端に融合される場合、第１の融合ポリペプチドにおける前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第２のエクトドメインのＣ末端に
直接又は第４のペプチドリンカーを介して融合される、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの第３のエクトドメイン又はその断片
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインが、ジスルフィド結合により互いに共有結合している、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２３３】
２．  抗原結合ドメインの第１の部分が抗体重鎖可変ドメインを含み、抗原結合ドメインの第２の部分が抗体軽鎖可変ドメインを含み、又はその逆である、第１項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２３４】
３．  抗原結合ドメインの第１の部分が抗体重鎖Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分が抗体軽鎖Ｆａｂ断片であり、又はその逆である、第１項又は第２項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２３５】
４．  抗原結合ドメインの第１の部分と抗原結合ドメインの第２の部分が、ジスルフィド結合により互いに共有結合している、第１項から第３項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２３６】
５．  スペーサードメインが、抗体ヒンジ領域又はその（Ｃ末端）断片及び抗体ＣＨ２ドメイン又はその（Ｎ末端）断片を含む、第１項から第４項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２３７】
６．  スペーサードメインが、抗体ヒンジ領域又はその断片、抗体ＣＨ２ドメイン、及び抗体ＣＨ３ドメイン又はその断片を含む、第１項から第５項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２３８】
７．  第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインが、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む、第１項から第６項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２３９】
８．  ノブ・イントゥー・ホール法に従って、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメインがホールを含み、第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインがノブを含む、第１項から第７項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２４０】
９．  スペーサードメインが、抗体ヒンジ領域又はその断片及びＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、第１項から第８項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２４１】
１０．  ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、第１項から第９項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２４２】
１１．  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが４−１ＢＢＬである、第１項から第１０項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２４３】
１２．  ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、第１項から第１１項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２４４】
１３．  抗原結合ドメインが、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる、第１項から第１２項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２４５】
１４．  抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はＣＤ１９に特異的に結合することができる、第１項から第１３項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２４６】
１５．  ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、第１項から第１４項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２４７】
１６．  ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、第１項から第１５項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２４８】
１７．  ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、第１項から第１４項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２４９】
１８．  ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、及び配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、第１項から第１５項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２５０】
１９．  第１、第２、第３及び第４のペプチドリンカーが存在し、かつ、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５及び配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、第１項から第１８項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【０２５１】
２０．  第１項から第１９項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸。
【０２５２】
２１．  第２０項に記載の核酸を含む宿主細胞。
【０２５３】
２２．  ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の発現に適した条件下で、第２１項に記載の宿主細胞を培養することを含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を産生する方法。
【０２５４】
２３．  ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を宿主細胞から回収することをさらに含む、第２２項に記載の方法。
【０２５５】
２４．  第１項から第１９項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子と、薬学的に許容される添加剤とを含む、薬学的組成物。
【０２５６】
２５．  医薬としての使用のための、第１項から第１９項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は第２４項に記載の薬学的組成物。
【０２５７】
２６．  がんを治療することにおける使用のための、第１項から第１９項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は第２４項に記載の薬学的組成物。
【０２５８】
２７．  がんを治療するための医薬の製造における、第１項から第１９項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は第２４項に記載の薬学的組成物の使用。
【０２５９】
２８．  免疫応答を刺激するための医薬の製造における、第１項から第１９項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は第２４項に記載の薬学的組成物の使用。
【０２６０】
２９．  第１項から第１９項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は第２４項に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法。
【０２６１】
３０．  追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む、第２９項に記載の方法。
【０２６２】
３１．  第１項から第１９項のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又は第２４項に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体における免疫応答を刺激する方法。
【実施例】
【０２６３】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他のさまざまな実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２６４】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al.,（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられている。
【０２６５】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０２６６】
遺伝子及びオリゴヌクレオチドの合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチドからＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での化学合成によって調製された。合成された遺伝子断片を、増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。あるいは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、又はＰＣＲを介して、短い合成ＤＮＡ断片を組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドはｍｅｔａｂｉｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ−Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製された。
【０２６７】
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology（2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M.（eds.), John Wiley & Sons, Incに記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
【０２６８】
試薬
特に明記しない限り、すべての市販の化学薬品、抗体、及びキットは、製造者のプロトコルに従って提供されたとおりに使用された。
【０２６９】
実施例１
４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子（４−１ＢＢＬコントースボディ）の生成
１．１  ４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子（４−１ＢＢＬコントースボディ）のための発現プラスミドの構築
本明細書で報告される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の発現のために、以下の機能的要素を含む転写ユニットが使用された：
−イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−それぞれの環状融合ポリペプチドをコードする核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットの他に、基本的な／標準の哺乳動物発現プラスミドは、
−大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、及び
−大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【０２７０】
１．２  ４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子（４−１ＢＢＬコントースボディ）の発現
４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の一過性発現は、トランスフェクション試薬２９３フリー（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、懸濁液に適合したＨＥＫ２９３Ｆ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞で行われた。
【０２７１】
細胞は、１２５ｍｌの振とうフラスコ（３７℃、７％のＣＯ２、８５％湿度、１３５ｒｐｍでインキュベート／振とう）中で解凍した後、希釈により少なくとも４回（容量３０ｍｌ）継代した。細胞を２５０ｍｌの容量中に３×１０５細胞／ｍｌまで増殖させた。３日後、細胞を分割し、１リットルの振とうフラスコに２５０ｍｌの容量中に７＊１０５細胞／ｍｌの密度で新たに播種した。トランスフェクションは、２４時間後に約１．４ー２．０ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度になるであろう。
【０２７２】
トランスフェクション前に、２５０μｇのプラスミドＤＮＡを予熱した（水浴；３７℃）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で最終容量１０ｍｌに希釈した。溶液を穏やかに混合し、室温で５分を超えない間インキュベートした。次いで、２９３−フリートランスフェクション試薬３３３．３μｌをＤＮＡ−ＯｐｔｉＭＥＭ溶液に加えた。その後、溶液を穏やかに混合し、室温で１５ー２０分間インキュベートした。混合物の全量を、２５０ｍｌのＨＥＫ細胞培養容量を含む１Ｌの振とうフラスコに加えた。
【０２７３】
３７℃、７％のＣＯ２、８５％湿度、１３５ｒｐｍで６又は７日間インキュベート／振とうする。
【０２７４】
２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の最初の遠心分離工程により上清を回収した。次いで、上清を新しい遠心フラスコに移し、２回目の遠心分離を４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間行った。その後、無細胞上清を０．２２μｍのボトルトップフィルターを介してろ過し、冷凍庫（−２０℃）で保存した。
【０２７５】
１．３  ４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子（４−１ＢＢＬコントースボディ）の精製
抗原結合分子を含む培養上清をろ過し、２つのクロマトグラフィー工程により精製した。抗体は、ＰＢＳ（１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ）、ｐＨ７．４により平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって捕捉した。未結合のタンパク質を平衡化バッファーにより洗浄することにより除去し、抗原結合分子を５０ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ２．８により回収し、溶出直後に１ＭのＴｒｉｓ−ｂａｓｅ、ｐＨ９．０によりｐＨ６．０に中和した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーを第２の精製工程として使用した。サイズ排除クロマトグラフィーは、２０ｍＭヒスチジンバッファー、０．１４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０において行った。４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を含む溶液を、Ｂｉｏｍａｘ−ＳＫメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を備えたＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ遠心フィルターユニットを用いて濃縮し、−８０℃で保存した。
【０２７６】
１．４  ４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子（４−１ＢＢＬコントースボディ）の質量分析
ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨから入手した（１４．３Ｕ／μｌ；リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ及びグリセロール溶液）。ＩｇＧ抗体のヒンジ領域を特異的に切断するプロテアーゼは、消化前に凍結乾燥物から新たに再構成された。
【０２７７】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる酵素的脱グリコシル化
５０μｇの抗原結合分子を１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．１により最終濃度０．６ｍｇ／ｍｌに希釈し、１μｌのＰＮＧａｓｅ  Ｆにより３７℃で１６時間脱グリコシル化した。
【０２７８】
酵素的切断
脱グリコシル化した試料を２００ｍＭのＴｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０により最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、続いてＩｇＧ特異的プロテアーゼを用いて３７℃で１時間消化した。
【０２７９】
ＥＳＩ−ＱＴＯＦ質量分析
試料は、２％ギ酸（ｖ／ｖ）を含む４０％アセトニトリルを使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（Ｋｒｏｎｌａｂ、５ｘ２５０ｍｍ、ＴＡＣ０５／２５０Ｇ０−ＳＲ）上でのＨＰＬＣにより脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）上でＥＳＩ−ＭＳによって総質量を決定した。キャリブレーションはヨウ化ナトリウムを用いて実行された（Ｗａｔｅｒｓ  ＴｏＦ  Ｇ２−Ｓａｍｐｌｅ  Ｋｉｔ  ２  Ｐａｒｔ：７００００８８９２−１）。消化された抗原結合分子の場合、データ収集は１０００ー４０００ｍ／ｚで行われた（ＩＳＣＩＤ：３０ｅＶ）。生の質量スペクトルが評価され、個々の相対モル質量に変換された。結果を視覚化するために、プロプライエタリ・ソフトウェアを使用して、デコンボリューションされた質量スペクトルを生成した。
【０２８０】
実施例２
ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＦＡＰ−４−１ＢＢＬコントースボディ）の調製
２．１  ＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）コントースボディＰ１ＡＡ１１９９の調製
２つの融合ポリペプチドと軽鎖を含む抗原結合分子を図１Ａに示されるようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＦＡＰ）、ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、及び軽鎖（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
【０２８１】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15（2001)）。
【０２８２】
表１は、ＦＡＰ（４Ｂ９）−ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子Ｐ１ＡＡ１１９９のアミノ酸配列を示す。
2021500902.tif 000011
【０２８３】
２．２  ＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）コントースボディＰ１ＡＡ１２３５の調製
２つの融合ポリペプチドと軽鎖を含む抗原結合分子を図１Ｂに示されるようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＦＡＰ）、ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、及び軽鎖（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
【０２８４】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15（2001)）。
【０２８５】
表２は、ＦＡＰ（４Ｂ９）−ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子Ｐ１ＡＡ１２３５のアミノ酸配列を示す。
2021500902.tif 000012
【０２８６】
２．３  ＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）コントースボディＰ１ＡＡ１２５９の調製
２つの融合ポリペプチドと軽鎖を含む抗原結合分子を図１Ｃに示されるようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＦＡＰ）、ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、及び軽鎖（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
【０２８７】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15（2001)）。
【０２８８】
表３は、ＦＡＰ（４Ｂ９）−ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子Ｐ１ＡＡ１２５９のアミノ酸配列を示す。
2021500902.tif 000013
【０２８９】
２．４  ＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）コントースボディＰ１ＡＡ９６２６の調製
２つの融合ポリペプチドを含む抗原結合分子を図１Ｄに示されるようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＦＡＰ）、ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）、Ｃｋａｐｐａ。
【０２９０】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15（2001)）。
【０２９１】
表４は、ＦＡＰ（４Ｂ９）−ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子Ｐ１ＡＡ９６２６のアミノ酸配列を示す。
2021500902.tif 000014
【０２９２】
あるいは、第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）は、ＶＨ（ＦＡＰ）、ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）、Ｃｋａｐｐａを含む。対応する分子の配列を表５に示す。
2021500902.tif 000015
【０２９３】
２．５  精製後の分子の生化学分析
表６は、ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の収率と最終的な単量体含有量をまとめている。
2021500902.tif 000016
【０２９４】
２．６  ＦＡＰ標的化及び非標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有対照分子の調製  
国際公開第２０１６／０７５２７８号、実施例２．１．４に記載されている陽性対照構築物２．４を使用した。この分子は、荷電残基を有するＣＨ−ＣＬクロスオーバーを含む、一価ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子である。ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドは、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングされた（Merchant, Zhu et al., Nature Biotechnol. 1998, 16, 677-681）。４−１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合させた。構築物２．４において、正しいペアリングを改善するために、以下の突然変異が交差ＣＨ−ＣＬ（荷電変異体）に追加で導入された。ヒトＣＬに融合された二量体４−１ＢＢリガンドでは、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、ヒトＣＨ１に融合された単量体４−１ＢＢリガンドでは、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【０２９５】
ＦＡＰクローン４Ｂ９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせは、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンドとＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図１Ｆ）。それに基づいて、非標的化バージョンは、ＦＡＰバインダーを生殖系列ＤＰ４７によって置換することにより調製された（図１Ｅ）。
2021500902.tif 000017
【０２９６】
実施例３
ＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディ）の調製
３．１  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）コントースボディＰ１ＡＡ１２３３の調製
２つの融合ポリペプチドと軽鎖を含む抗原結合分子を図１Ｂに示されるようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＣＤ１９）、ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、及び軽鎖（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＣＤ１９）−Ｃｋａｐｐａ。
【０２９７】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15（2001)）。
【０２９８】
表８は、ＣＤ１９（４Ｂ９）−ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子Ｐ１ＡＡ１２３３のアミノ酸配列を示す。
2021500902.tif 000018
【０２９９】
３．２  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）コントースボディＰ１ＡＡ１２５８の調製
２つの融合ポリペプチドと軽鎖を含む抗原結合分子を図１Ｃに示されるようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＣＤ１９）、ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、及び軽鎖（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＣＤ１９）−Ｃｋａｐｐａ。
【０３００】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15（2001)）。
【０３０１】
表９は、ＣＤ１９（２Ｂ１１）−ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子Ｐ１ＡＡ１２５９のアミノ酸配列を示す。
2021500902.tif 000019
【０３０２】
３．３  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）コントースボディＰ１ＡＡ０７７６の調製
２つの融合ポリペプチドと軽鎖を含む抗原結合分子を図１Ａに示されるようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、４−１ＢＢＬ（７１−２４８）、
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＣＤ１９）、ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、及び軽鎖（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＣＤ１９）−Ｃｋａｐｐａ。
【０３０３】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15（2001)）。
【０３０４】
表１０は、ＣＤ１９（２Ｂ１１）−ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有抗原結合分子Ｐ１ＡＡ１０７７６のアミノ酸配列を示す。
2021500902.tif 000020
【０３０５】
３．４  精製後の分子の生化学分析
表１１は、ＣＤ１９（２Ｂ１１）標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の収率と最終的な単量体含有量をまとめている。
2021500902.tif 000021
【０３０６】
３．５  ＣＤ１９標的化及び非標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有対照分子の調製
国際公開第２０１６／０７５２７８号、実施例７．２．６に記載されている陽性対照構築物４．４を使用した。この分子は、荷電残基を有するＣＨ−ＣＬクロスオーバーを含む、一価ＣＤ１９（２Ｂ１１）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子である。ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドは、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングされた（Merchant, Zhu et al., Nature Biotechnol. 1998, 16, 677-681）。４−１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合させた。構築物２．４において、正しいペアリングを改善するために、以下の突然変異が交差ＣＨ−ＣＬ（荷電変異体）に追加で導入された。ヒトＣＬに融合された二量体４−１ＢＢリガンドでは、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、ヒトＣＨ１に融合された単量体４−１ＢＢリガンドでは、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【０３０７】
ＣＤ１９クローン８Ｂ８−２Ｂ１１に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的化抗ＣＤ１９−Ｆｃホール鎖及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせは、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンドとＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図１Ｆ）。それに基づいて、非標的化バージョンは、ＦＡＰバインダーを生殖系列ＤＰ４７によって置換することにより調製された（図１Ｅ）。
2021500902.tif 000022
【０３０８】
実施例４
本発明のＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の機能的特性
４．１  ヒト４−１ＢＢ及びレポーター遺伝子ＮＦκＢルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞
４−１ＢＢとそのリガンドとのアゴニスト結合は、核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化を介して下流のシグナル伝達を誘導し、ＣＤ８  Ｔ細胞の生存と活性を促進する（Lee HW, Park SJ, Choi BK, Kim HH, Nam KO, Kwon BS. 4-1BB promotes the survival of CD8（+）T lymphocytes by increasing expression of Bcl-x(L）and Bfl-1. J Immunol 2002；169:4882-4888）。組換えレポーター細胞株ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃクローン２６が、その表面にヒト４−１ＢＢを発現させるために生成された。加えて、それはＮＦκＢ感受性エンハンサーセグメントの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を保持しており、迅速かつ簡単な方法で４−１ＢＢの活性化のモニタリングを可能にする。４−１ＢＢトリガーはＮＦκＢの用量依存的活性化を誘導し、その後ＮＦκＢは核に移行し、そこでレポータープラスミドのＮＦκＢ感受性エンハンサーに結合してルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させる。ルシフェラーゼは、ルシフェリン酸化を触媒し、オキシルシフェリンを生成し、それが発光する。これは、ルミノメーターによって定量化可能である。
【０３０９】
したがって、ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃクローン２６レポーター細胞においてＮＦκＢ活性化を誘導するさまざまな４−１ＢＢＬ含有分子の能力を、生物活性の指標として分析した。異なるＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子ベースの分子のＮＦκＢ活性化能力を、以前に記載されている（国際公開第２０１６／０７５２７８号）構築物２．４及びその対照Ｄに対して試験した。試験されたすべてのＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子ベースの分子は、過架橋を媒介するＦＡＰ発現細胞の非存在下又は非存在下において、レポーター細胞株ＨｅＬａ＿ｈｕ４−１ＢＢ＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃクローン２６細胞株とともにさまざまな濃度でインキュベートされた。ＦＡＰ発現細胞として、ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ−２６６−４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６７６）又はＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）によりトランスフェクトされたマウス胚線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）が加えられた。
【０３１０】
接着性ＨｅＬａ＿ｈｕ４−１ＢＢ＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃクローン２６細胞を、アッセイ培地（１０％ＦＢＳ及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉが供給されたＤＭＥＭ培養液）で組織培養処理された白色平底９６ウェルプレートのウェルあたり０．２＊１０５細胞の細胞密度で一晩培養した。翌日、滴定されたＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子（４つの異なるコントースボディ、構築物２．４及び対照Ｄ）が、レポーター細胞株とＦＡＰ発現細胞の比率が１：５のＦＡＰ発現細胞ＷＭ−２６６−４又はＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９の非存在下又は存在下で加えられた。
【０３１１】
インキュベーション後、アッセイ上清を吸引し、プレートをＤＰＢＳで洗浄した。ルシフェラーゼ１００アッセイシステムとレポーター溶解バッファー（双方ともＰｒｏｍｅｇａ製、カタログ番号Ｅ４５５０及びＥ３９７１）を製造元の指示書に従って使用して発光の定量化を行った。簡潔にいうと、細胞を、ウェルあたり５０ｕＬの１×溶解バッファーを加えることにより、−２０℃で一晩溶解させた。細胞を３７℃で２０分間解凍した後、ウェルあたり１００ｕＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を加えた。発光は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダーを使用して、すべての波長を収集するためにフィルターを使用せずに、５００ｍｓの積分時間を用いて直ちに定量化された。放出された相対光単位（ＵＲＬ）は、ＨｅＬａ＿ｈｕ４−１ＢＢ＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃクローン２６細胞の基底発光によって補正され、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して対数の一次抗体濃度に対してブロットされた。組み込みのシグモイド用量反応（４つのパラメーター、ロバストフィット）を使用して、曲線をフィッティングさせた。
【０３１２】
試験された分子について測定された活性が図２Ａから２Ｃに示され、ｎＭでの対応する測定されたＥＣ５０値（上）及び活性化曲線の曲線下面積（下）が以下の表１３に提供される。
2021500902.tif 000023
【０３１３】
図２Ａから２Ｃに示すように、すべてのＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子（構築物２．４及びコントースボディ）の存在は、ヒト４−１ＢＢ発現レポーター細胞株ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃクローン２６においてＮＦκＢ活性化を誘導した。ＦＡＰ発現細胞（ＷＭ−２６６−４又はＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ）を介した過架橋は、ＦＡＰ非依存的様式ですべての分子のＮＦκＢ活性化を増加させた。ＦＡＰ発現細胞の非存在下で（図２Ｃ）、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ（構築物２．４及びコントースボディ）によって誘導されたが、非標的化４−１ＢＢＬ（対照Ｄ）を加えることによっては誘導されないベースライン活性が見られた。これは、ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃクローン２６レポーター細胞株によるＦＡＰの特定のベースライン発現によって説明することができる。すべての構築物は、ＷＭ−２６６−４又はＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ細胞の存在下で濃度依存的な活性を示し、活性化曲線のプラトーが約０．５−１ｎＭに達した。ＥＣ５０値は、ＦＡＰ発現細胞の存在下で０．０１から０．１３ｎＭの間である（表１３）。異なるＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ構築物の間に有意差を観察することはできず、Ｐ１ＡＡ１１９９コントースボディのみが、より低いＥＣ５０及びより低い最大プラトー値への傾向を示した。より低いＥＣ５０値のため、このプラトーの違いは、曲線下面積値を著しくは減少させなかった（表１３）。
【０３１４】
４．２  準最適にＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣ及び細胞表面ＦＡＰによる過架橋のＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ媒介共刺激
実施例４．１では、ＦＡＰ＋腫瘍細胞の追加は、４−１ＢＢ受容体の強力なオリゴマー化を提供することにより、ヒト４−１ＢＢ陽性レポーター細胞株におけるＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子（構築物２．４及び本出願の分子）によって誘導されるＮＦκＢ活性を強く増加させることができることが示された。同様に、我々は、休止ヒトＰＢＭＣ細胞の準最適なＣＤ３刺激を促進及び増加させる能力について、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞の存在下で、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ（構築物２．４及び本出願の分子）を試験した。
【０３１５】
ヒトＰＢＭＣ調製物には、（１）休止、４−１ＢＢ陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞、並びに（２）細胞表面に種々なＦｃγ受容体分子を有する抗原提示細胞（例えばＢ細胞及び単球）が含まれている。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ヒトＣＤ３抗体は、そのＦｃ部分により、存在するＦｃγ受容体分子に結合し、休止４−１ＢＢ陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上での長期ＣＤ３活性化を媒介することができる。これらの細胞は、数時間以内に４−１ＢＢを発現し始める。４−１ＢＢに対する機能的アゴニスト化合物は、活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞に存在する４−１ＢＢ受容体を介してシグナルを伝達し、ＴＣＲ媒介刺激をサポートすることができる。
【０３１６】
休止ＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣを、照射されたＦＡＰ＋  ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞及び滴定されたＦＡＰ標的化抗４−１ＢＢＬ分子の存在下で、準最適濃度の抗ＣＤ３抗体により５日間刺激した。増殖（ＣＦＳＥ希釈）、ＣＤ２５及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）などのＴ細胞への影響は、蛍光標識抗体とフローサイトメトリーを使用してモニターされた。
【０３１７】
マウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を、細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を使用して３７℃で１０分間回収した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄した。５０Ｇｙ照射（ｘＲａｙ照射器）ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）内で３７℃及び５％ＣＯ２で、滅菌９６ウェル丸底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）に入れたＴ細胞培地中１ウェルあたり０．２ｘ１０５細胞の密度で一晩培養した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９のｘ線照射は、線維芽細胞株によるヒトＰＢＭＣのその後の異常増殖を防ぐ。
【０３１８】
ヒトＰＢＭＣは、フィコール遠心分離により単離された。細胞を各ウェルに０．７５ｘ１０５細胞／ウェルの密度で加えた。［２ｎＭ］の最終濃度の抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＶ９、ヒトＩｇＧ１）及びＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子（４つの異なるコントースボディ、構築物２．４及び対照Ｄ）を指定の濃度で加えた。細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）内で３７℃、５％ＣＯ２で４日間活性化させた。
【０３１９】
次いで、ＤＰＢＳ中のＬＩＶＥ／ＤＥＡＴＨ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ細胞染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｌ３４９５７）を使用して、細胞を暗所で４℃で３０分間表面染色した。細胞をＤＰＢＳにより洗浄した後、２％ＦＢＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡ（ＦＡＣＳバッファー）、蛍光色素標識抗体抗ヒトＣＤ４−ＢＶ４２１（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０１６）、ＣＤ２５−ＡＰＣ（クローンＢＣ９６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３０２６１０）及びＣＤ１３７（４−１ＢＢ）−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（クローン４Ｂ４−１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）が供給されたＰＢＳ中で、暗所で４℃で３０分間、細胞をさらにインキュベートした。細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、ＤＰＢＳ中の４％ＰＦＡにより染色を固定した。最後に、プレートを１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、Ｃｙｔｏｍａｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に接続されたＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０を使用して取得した。フローサイトメトリーのデータは、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ、ＵＳＡ）及びＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して分析した。組み込みのシグモイド用量反応（４つのパラメーター、ロバストフィット）を使用して、曲線をフィッティングさせた。
【０３２０】
図３Ａ及び３Ｂでは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図３Ａ）及びＣＤ４＋  Ｔ細胞集団（図３Ｂ）における陽性細胞のパーセンテージとして、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子によって引き起こされる、表面発現された低親和性ＩＬ−２受容体α鎖ＣＤ２５の上方制御が示される。ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＣＤ４＋  Ｔ細胞集団における陽性細胞のパーセンテージとして示される、細胞表面上の４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の発現に対する影響は、それぞれ図３Ｃ及び３Ｄに示される。ｎＭでの対応する測定ＥＣ５０値（上）及び活性化曲線の曲線下面積（下）を以下の表１４に示す。
2021500902.tif 000024
【０３２１】
図３Ａ及び３Ｂに示すように、非標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子の対照Ｄ（白抜きの黒ひし形、点線）との共刺激は、準最適にＴＣＲ刺激されたＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞を救出しなかった。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞の存在によるＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子（構築物２．４又はコントースボディＰ１ＡＡ１１９９）の過架橋は、ＣＤ２５及びＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の発現の増加として示されるヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の増強された活性化表現型を強く促進した。しかし、コントースボディＰ１ＡＡ１１９９は、より低いＥＣ５０値でＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２５発現の増加を引き起こした。一方、コントースボディＰ１ＡＡ１１９９は、ＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞上の４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）発現のより低い頻度を示した（図３Ｃ及び３Ｄ）。これは、構築物２．４と比較して、異なるＴ細胞の活性化動力学又は効力を反映し得る。Ｔ細胞増殖の違いは見られなかった（非表示）。
【０３２２】
４．３  結果のまとめ
本発明のＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子は、前に記載された構築物２．４と同様の活性化能力を示し、したがって機能的であることが示され得る。Ｐ１ＡＡ１１９９は、２つの異なる機能アッセイで表示されるわずかに異なる活性化特性を示した。ＨｅＬａ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃレポーター細胞株Ｐ１ＡＡ１１９９では、特にＷＭ−２６６−４の存在下で、用量依存的なＮＦκＢ−ルシフェラーゼ活性化のより低いＥＣ５０値（図２Ａ）、並びにより低い最大プラトー活性化を示した。両方の違いは傾向にすぎず、活性化曲線の曲線下総面積にはほとんど影響を及ぼさなかった（表１３）。休止ヒトＰＢＭＣを用いた活性化アッセイでは、Ｐ１ＡＡ１１９９は再び活性の違いを示した。ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞上でのＣＤ２５発現の用量依存的な増加は、構築物２．４と比較して、Ｐ１ＡＡ１１９９を加えることによって誘導された場合、より低いＥＣ５０値を示した。一方、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞上での４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）発現の増加は、構築物２．４と比較して、Ｐ１ＡＡ１１９９を加えることによって誘導された場合、パーセンテージが低かった。違いは、異なる活性潜在力又は異なるＴ細胞活性化動力学によって説明することができる。
【０３２３】
実施例５
本発明のＣＤ１９標的化４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の機能的特性
５．１  ＣＤ１９−４−１ＢＢＬはＣＤ１９に結合する
ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディＰ１ＡＡ１２３３、Ｐ１ＡＡ１２５８及びＰ１ＡＡ０７７６のＣＤ１９への結合特性を、初代ヒトＢ細胞において測定した。簡潔には、総ＰＢＭＣは健康なドナーからのバフィーコートから精製された。ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０３２６）に再懸濁した細胞を、丸底浮遊細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに加えた。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄した。細胞を１：５０００に希釈したＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６４−１８）を含む１００μＬ／ウェルの４℃の冷ＤＰＢＳバッファーに再懸濁し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃の冷ＤＰＢＳバッファーで１回洗浄し、５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳバッファー（２％のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）を供給されたＤＰＢＳ）及び一連の濃度の構築物（ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディＰ１ＡＡ１２３３、Ｐ１ＡＡ１２５８及びＰ１ＡＡ０７７６）を含む７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２））に再懸濁し、その後、４℃で１時間インキュベートした。対照は、国際公開第２０１６／０７５２７８号（ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ  Ａｂ）からの構築物４．４又は対照Ｄ（非標的化４−１ＢＢＬ  Ａｂ、実施例３．５を参照）であった。十分に洗浄した後、細胞をさらに５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片特異的ヤギＦ（ａｂ｀）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９１１６０９８）を含む４℃の冷ＦＡＣＳバッファー５０μＬ／ウェルにより、及びＡＰＣ−Ｈ７結合ＣＤ２０  Ａｂ（ＢＤ、カタログ番号５６０７３４）、ＡＰＣ結合抗ＣＤ３  Ａｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３１２）、及び／又はＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１９  Ａｂ（ＢＤ）により４℃で３０分間染色した。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、細胞を１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中で固定した。細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を使用して分析した。
細胞は、ＣＤ３−ＣＤ２０＋生存集団においてゲートされ、ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  ＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の幾何平均が、構築物の滴定濃度に対してプロットされた。図４に示すように、すべてのコントースボディは、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ  Ａｂ（コンストラクト４．４）と同様のパターンで、用量依存的様式でヒトＢ細胞に結合するが、非標的化４−１ＢＢＬ（対照Ｄ）はＢ細胞に結合しなかった。これらのデータは、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディがＣＤ１９への特異的結合を示すことを示している。
【０３２４】
５．２  ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディは活性化Ｔ細胞及びＮＫ細胞上の４−１ＢＢに結合する
ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディＰ１ＡＡ１２３３、Ｐ１ＡＡ１２５８及びＰ１ＡＡ０７７６の４−１ＢＢ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞への結合を確認するために、ヒトＰＢＭＣは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞における４−１ＢＢの上方制御のためのＴＣＲ刺激によって、４８時間事前に活性化された。精製したＰＢＭＣを２．８ｘ１０６／ｍｌの濃度に希釈し、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号７２４００−０５４）＋１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２００１２−０６８）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１３５０−０１０）に再懸濁した。丸底９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに９０μｌの細胞を加えた。次いで、追加の５０μｌの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１１３１Ｄ）を８ｘ１０５ビーズ／ｍｌでウェルに加えた。２日後、細胞を冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、２００１２−０６８）で１回洗浄し、９０μｌの冷ＰＢＳにより再懸濁し、ＣＤ１９標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子（ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディＰ１ＡＡ１２３３、Ｐ１ＡＡ１２５８及びＰ１ＡＡ０７７６、構築物４．４、非標的化対照Ｄ）を含む１０μｌの溶液とともに４℃で１時間インキュベートした。十分に洗浄した後、細胞を５μｇ／ｍＬのＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片特異的ヤギＦ（ａｂ｀）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９１１６０９８）を含む５０μＬ／ウェルの冷ＦＡＣＳバッファーにより、さらに、抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３１２）、ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）、ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４７１０）、ＣＤ５６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３６２５０４）抗体により４℃で３０分間染色した。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、細胞を１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中で固定した。細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を使用して分析した。
【０３２５】
特異的結合は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞、及びＣＤ５６＋  ＮＫ細胞の純粋な集団でゲートされた。図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃにそれぞれ示されるように、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディは、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ  Ａｂ（構築物４．４）による結合親和性と同様に、４−１ＢＢ発現ＣＤ４＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、及びＣＤ５６＋  ＮＫ細胞への良好な結合を用量依存的様式で示した。
【０３２６】
５．３  ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディは生物活性を示す
生理学的設定における生物活性を測定するために、活性化ヒトＰＢＭＣを使用して、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディによりＴ細胞とＮＫ細胞を共刺激することにより、エフェクター機能分子ＩＦＮγの放出を確認した。簡潔には、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディＰ１ＡＡ１２３３、Ｐ１ＡＡ１２５８及びＰ１ＡＡ０７７６と共培養された精製されたＰＢＭＣを一連の濃度でウェルに添加し、さらに、５０μｌの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８マイクロビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１１３１Ｄ）が８ｘ１０５ビーズ／ｍｌで提供された。４８時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ２８５）によるＩＦＮ−γの測定のために上清を収集した。図６は、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコントースボディＰ１ＡＡ１２３３とＰ１ＡＡ１２５８の両方がＰＢＭＣを刺激して、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ  Ａｂ（構築物４．４）によって誘導されるのと同様の量のＩＦＮγを用量依存的に産生し、一方、非標的４−１ＢＢＬ構築物（陰性対照Ｄ）は、過架橋の欠如に起因して、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を活性化しなかったことを示している。これらの中でも、構築物Ｐ１ＡＡ０７７６は、４−１ＢＢ＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞を活性化する能力が低かった。
【図１Ａ−Ｂ】
2021500902.tif 000025
【図１Ｃ−Ｄ】
2021500902.tif 000026
【図１Ｅ−Ｆ】
2021500902.tif 000027
【図２Ａ−Ｃ】
2021500902.tif 000028
【図２Ｂ】
2021500902.tif 000029
【図３Ａ−Ｄ】
2021500902.tif 000030
【図４】
2021500902.tif 000031
【図５Ａ−Ｂ】
2021500902.tif 000032
【図５Ｃ】
2021500902.tif 000033
【図６】
2021500902.tif 000034
【配列表】
2021500902000001.app
【国際調査報告】
2021500902.tif 000035
2021500902.tif 000036
2021500902.tif 000037
2021500902.tif 000038
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