(57)【要約】  本発明は、亜鉛２＋塩およびα−ポリグルタミン酸担体、ならびに任意選択で腫瘍感受性化剤としてのＮＦ−κＢ阻害剤を含む医薬組成物と、かかる組成物を使用して患者における腫瘍を処置する方法とに関する。方法は、治療有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびα−ポリグルタミン酸担体の液体剤形または固体剤形を、それを必要とする患者に投与するステップを含む。開示された組成物を使用して、薬物耐性表現型を有する腫瘍を含めて、広域のヒト腫瘍を処置する方法が提供される。本明細書で開示される医薬組成物に応答する腫瘍としては、神経内分泌腫瘍（神経芽細胞腫）、胃腫瘍、子宮腫瘍および肺腫瘍が挙げられる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腫瘍においてＰＡＲＰ１媒介性腫瘍壊死を誘導する方法であって、剤形中の治療有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびα−ポリグルタミン酸担体を、腫瘍を有する患者に投与するステップを含み；
前記α−ポリグルタミン酸担体は、α−ポリグルタミン酸および／または腫瘍標的化α−ポリグルタミン酸誘導体および／または電荷修飾α−ポリグルタミン酸誘導体および／または腫瘍標的化電荷修飾α−ポリグルタミン酸誘導体を含む、方法。
【請求項２】
前記腫瘍は薬物耐性表現型を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬物耐性表現型は機能障害性ｐ５３である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬物耐性表現型はＭＤＲ１過剰発現である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記薬物耐性表現型はＭＲＰ１過剰発現である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記剤形中の前記Ｚｎ（ＩＩ）塩および前記α−ポリグルタミン酸担体は、治療量のＮＦ−κＢ阻害剤との組み合わせで、治療量で投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記剤形は固体剤形または液体剤形である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記剤形は固体剤形であり、錠剤、ミニタブ、硬カプセル、軟カプセル、カプレット、ジェルキャップ、口腔崩壊フィルム、顆粒、ペレット、ペーストおよびパウダー小袋から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記剤形は液体剤形であり、液体溶液、液体懸濁液、シロップおよび口腔スプレーから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与ステップは経口投与および注射投与から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）薬学的に許容されるＺｎ（ＩＩ）塩、ならびに（ｉｉ）腫瘍標的化部分および／または電荷修飾部分を含むα−ポリグルタミン酸担体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
前記腫瘍標的化部分は、葉酸、５Ｎ，１０Ｎ−ジメチルテトラヒドロフォレートおよびＲＧＤペプチドから選択され、前記部分の任意の組み合わせがα−ポリグルタミン酸に共有結合されている、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記電荷修飾部分は、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、１，４，７，１０−テトラシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−四酢酸、およびジエチレントリアミン五酢酸から選択され、前記部分の任意の組み合わせがα−ポリグルタミン酸に共有結合されている、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
（ｉｉｉ）α−ポリグルタミン酸をさらに含む、請求項１１〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記Ｚｎ（ＩＩ）塩の実質的な部分が、Ｚｎ（ＩＩ）イオンとα−ポリグルタミン酸および／または前記腫瘍標的化部分および／または前記電荷修飾部分との結合複合体である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
（ｉ）前記Ｚｎ（ＩＩ）塩および（ｉｉ）前記α−ポリグルタミン酸担体は、固体混合物中で一緒に混合される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＮＦ−κＢ阻害剤をさらに含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
固体剤形として製剤化される、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記固体剤形は、胃耐性結合剤および／または胃耐性外部コーティングをさらに含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
液体剤形として製剤化される、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記液体剤形は注射に適している、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記液体剤形は、胃耐性材料をさらに含む医薬組成物の懸濁液である、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
治療有効量の請求項１１〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物を、腫瘍を有する患者に投与するステップを含む、患者において腫瘍を処置する方法。
【請求項２４】
前記腫瘍は、機能障害性ｐ５３、ＭＤＲ１過剰発現およびＭＲＰ１過剰発現から選択される薬物耐性表現型を有する、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−ポリグルタミン酸（α−ＰＧＡ）担体および亜鉛塩、ならびに任意選択でＮＦ−κＢ阻害剤を含む組成物と、それらの医薬製剤と、抗腫瘍剤として組成物および製剤のいずれかを使用して患者においてがんを処置する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
がん薬物に対する先天性および後天性薬物耐性は、がん処置の失敗の主な原因である。耐性に関する一般な機構としては、ｐ５３アポトーシスタンパク質における機能障害および／またはＭＤＲ１遺伝子もしくはＭＲＰ１遺伝子によりコードされるエネルギー依存性薬物排出ポンプの過剰発現が挙げられる。薬物耐性問題を克服するための１つの殺腫瘍戦略は、個々に、機能障害性ｐ５３アポトーシス機能を修正することまたは薬物排出ポンプを阻害することである。代わりのアプローチは、ＰＡＲＰ１媒介性のエネルギー枯渇に誘導される壊死性細胞死機構（“ＰＡＲＰ１媒介性壊死”）を利用することであり、この機構は、ｐ５３媒介性アポトーシス機構を全体的に迂回する。
【０００３】
心臓組織または脳組織の虚血後壊死において最初に観察されるＰＡＲＰ１媒介性壊死は、ＰＡＲＰ１酵素による過剰なＤＮＡ修復活性に起因する細胞エネルギー（ＮＡＤ＋およびＡＴＰ）の枯渇により引き起こされる。遺伝子損傷に応答したＰＡＲＰ１／ＰＡＲＧの超活性化は、ＮＡＤ＋およびＡＴＰの細胞エネルギー物資の枯渇を誘発し、この枯渇は、続いて、ＭＰＴＰ活性化に起因するミトコンドリアによって開始される壊死を誘発する。この事象のセットが、図１に例示されている。その壊死機構がｐ５３媒介性アポトーシスを迂回するため、この機構はがんを標的とするのに使用され得ることが提唱された（ＮＰＬ３）。しかし、このアイデアを臨床的に有用な治療処置に橋渡しすることは、試みられた方法が毒性すぎることが判明したため、誰も成功しなかった。ＰＡＲＰ１媒介性壊死は、過剰な放射線曝露および／または高度に毒性の化学療法剤、例えばドキソルビシンの投与による実験腫瘍においてのみ誘導され得た。ＰＡＲＰ１媒介性壊死を活性化するための毒性薬剤の使用による別の問題は、薬剤がまた、ｐ５３タンパク質を亜臨界レベルで活性化して、ｐ５３誘導性のＰＡＲＰ１酵素の断片化によりＰＡＲＰ１媒介性壊死を効果的に不能とすることであった。腫瘍内の薬物分布が物理的および構造的制約のために異質であることを考慮すると、毒性薬剤は、がん腫瘤の大部分にＰＡＲＰ１を欠いた状態を、したがって、ＰＡＲＰ１媒介性壊死に対して非感受性の状態を、同時にもたらすであろうことが推察された。
【０００４】
多数の臨床がん症例において解決されるべき問題とは、一部のがんは従来の抗がん薬に先天的に耐性があり、その他のがんは全身性処置の過程にわたって多剤耐性を発現し、その結果、処置の失敗をもたらすことである。放射線および化学療法剤による過剰投与を通してＰＡＲＰ１媒介性腫瘍壊死を利用することが、がんを処置するのに使用され得るという理論的示唆が存在したが、この可能性のある結果を実現することは、処置にかかわる固有の毒性および上述の機構にかかわる固有の自己矛盾的性質により困難であった。したがって、ＰＡＲＰ１媒介性腫瘍壊死を活発に誘導することに基づいた組成物および／または処置法を見いだすためのアンメットニーズが依然として存在する。さらに、腫瘍壊死プロセスを妨害することも過度に毒性であることもなく、そのような誘導剤を腫瘍組織に特異的に送達することができる担体および標的化システムを含む組成物および／または処置法が、高度に所望されている。多種多様ながん種および／または薬物耐性特性に対して必要とされる殺腫瘍用量を低減すること、および健康な組織における望ましくない副作用を低減することも継続して望まれている。
【０００５】
亜鉛塩の神経毒性を評価する報告は、単純な亜鉛塩からの高濃度の亜鉛イオン（４００μＭまたは２６μｇ／ｍＬ）が、培養皮質細胞においてＰＡＲＰ／ＰＡＲＧ媒介性のＮＡＤ＋枯渇およびＡＴＰ枯渇ならびにそれに続く壊死を誘導することを記載している（ＮＰＬ６）。しかし、報告は、亜鉛塩の殺腫瘍活性またはがんに対するそれらの治療上の使用について研究しなかった。
【０００６】
免疫細胞に対するピリチオン亜鉛の毒性を評価する報告は、ナノモル濃度のピリチオン亜鉛が、マウス胸腺細胞、マウス脾臓リンパ球、ヒトＲａｍｏｓ  Ｂ細胞およびヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を含めて、種々の白血球由来細胞において亜鉛特異的アポトーシスを誘導することを示した（ＮＰＬ７）。報告は、ピリチオン亜鉛が、壊死性細胞死を妨げる効果を有するカスパーゼ９の活性化を介してアポトーシスを誘導することを開示した（ＮＰＬ１１）。まとめると、これらの報告は、研究された免疫細胞において、ナノモル用量のピリチオン亜鉛がアポトーシス性細胞死を誘導し、壊死性細胞死を誘導しないことを指摘する。
【０００７】
後に、マイクロモル濃度のピリチオン亜鉛（１〜１０μＭ）はアンドロゲン依存性ＬＮＣａＰおよびアンドロゲン非依存性ＰＣ３、ＤＵ１４５前立腺がん細胞株においてＡＴＰ枯渇ならびに、最終的にＥＲＫおよびＰＫＣ依存性壊死を誘発することが、実証された（ＮＰＬ２）。しかし、壊死を誘発するためにＮＰＬ２において使用されたピリチオン亜鉛の用量は、９〜１４日の食餌性投与（２４０ｐｐｍ）後のラットにおいて、進行性後肢虚弱、協調運動障害、筋萎縮を伴う脊柱後弯および陰茎脱の臨床症状がある急性神経毒性を引き起こすことが、以前に示されていた（ＮＰＬ１０）。
【０００８】
したがって、ピリチオン亜鉛が前立腺がん細胞株に対して選択的壊死性細胞死を引き起こすことができるという報告は存在したが、これは高（μＭ）濃度の薬剤を必要とした（ＮＰＬ２）。しかし、ピリチオン亜鉛は、かかる濃度では重度かつ永続的な神経毒性を引き起こすことが示されていたものであり（ＮＰＬ１２）、このことが、ピリチオン亜鉛を抗腫瘍治療剤へと開発する試みを断念させることとなった。さらに、ＮＰＬ２は、多数のがん細胞型に対して広域の抗がん活性を実証しておらず、ＭＤＲ１またはＭＲＰ１多剤耐性遺伝子の過剰発現に由来する薬物耐性の逆転へ向けた効力を示さず、または、いずれの動物がんモデルにおいても壊死性の効力を実証しなかった。
【０００９】
ＮＰＬ５は、インスリン模倣亜鉛（２＋）複合体を開発し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏインスリン模倣活性ならびに亜鉛（ガンマ−ポリグルタミン酸）複合体の２型糖尿病ＫＫＡｙマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗糖尿病効果について調べた。具体的には、研究は、ガンマ−ポリグルタミン酸複合体化亜鉛を用いて、１ｋｇ体質量当たりＺｎ１０〜２０ｍｇを３０日間経口投与することが、ＺｎＳＯ４を用いる処置と比較して、ＫＫＡｙマウスにおいて高血糖症を正常化するとともに、耐糖能障害、ＨｂＡ（１ｃ）高レベルおよびメタボリックシンドロームを改善すること、を示した（ＮＰＬ５）。ＮＰＬ５において、著者らは、亜鉛（ガンマ−ポリグルタミン酸）複合体は、その高血糖降下作用とインスリンのβ細胞分泌における撹乱および２型糖尿病性ＫＫＡｙマウスにおいてインスリン抵抗性を減弱するその能力とを通して抗糖尿病効能を有すると結論したが、彼らは、複合体のインスリン模倣活性の原因となる作用の機構を理解しておらず、そして、彼らは、亜鉛（ガンマ−ポリグルタミン酸）複合体による抗腫瘍活性と薬物抵抗性のがん種の処置に対するその有効性の両方とも全く示唆することはなかった。
【００１０】
要約すると、上記技術は、重要な薬物耐性特性を有するがんを含めて、ｉｎ  ｖｉｖｏで広域のがんを効果的に処置するという上述のゴールを達成するために、さらに、重度な毒性の危険を冒さずにそうするために、亜鉛化合物を使用することについて示唆すらしておらず、ましてやこのことに成功してもいなかった。したがって、毒性の問題がなく、多くのがん種、さらに薬物耐性表現型（例えば、機能障害性ｐ５３、ＭＤＲ１過剰発現、ＭＲＰ１過剰発現）を有するものにわたって作用する、がんを処置するための、臨床的に活性でありかつ安全な亜鉛組成物に対するアンメットニーズが存在する。さらに、生物系（例えば、細胞、組織、動物等）でのほとんどの研究は、ポリ（グルタミン酸）のガンマ型を使用している。言及された問題を解決するため、我々は、当分野において体系的な研究を実施し、ポリ（α−グルタミン酸）またはα−ＰＧＡとも呼ばれる、アルファ型のポリ（グルタミン酸）との亜鉛複合体の製剤を開発し、これらのニーズを満たし、したがって本明細書で記載される我々の発明を完成させた。
引用
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本明細書で開示される組成物、医薬製剤および方法は、亜鉛およびα−ポリグルタミン酸（α−ＰＧＡ）の複合体が種々のヒトおよびマウスのがん細胞株において壊死性細胞死を誘導することができるという驚くべき観察に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＰＡＲＰ１媒介性壊死性細胞死の機構を誘発する亜鉛含有α−ポリグルタミン酸組成物に関する。理論に制限されるわけではないが、亜鉛は、ＰＡＲＰ１を過剰に活性化し、次いで、これが細胞中のＡＴＰおよびＮＡＤ＋の枯渇につながる。結果として、細胞は、エネルギー源を枯渇し、次いで壊死性細胞死経路に入る。
【００１３】
壊死を誘導するこの機構は、ほとんどのがん細胞型にとって同様に利用可能であると期待され、したがって、亜鉛含有α−ポリグルタミン酸組成物は、広域の殺腫瘍活性を実証している。さらに、この機構は、様々な殺腫瘍機構に対して薬物耐性表現型を有する腫瘍もこのＰＡＲＰ１媒介性機構に応答する可能性を示唆する。
【００１４】
本発明による組成物は、（ｉ）有効成分としての亜鉛（ＩＩ）種（等価に、Ｚｎ２＋）ならびに（ｉｉ）未修飾形態および／または修飾形態での担体としてのα−ＰＧＡを含み、ここで、葉酸および／またはＲＧＤ腫瘍標的化ペプチドがα−ＰＧＡに共有結合されている。組成物は、ＮＦ−κＢ阻害剤またはＮＦ−κＢシグナル伝達カスケード阻害剤をさらに含んで、Ｚｎ（ＩＩ）およびα−ＰＧＡの殺腫瘍効果に対して腫瘍細胞を感受性化する（これらをより感受性にする）ことができる。
【００１５】
組成物は、経口投与向けに製剤化され得る。一部の実施形態では、胃の強酸性環境中での複合体からの亜鉛イオンの解離を防ぎ、遅らせ、または減じるために胃耐性材料、例えば腸溶結合剤およびコーティング、またはワックスコーティングを含む経口製剤が提供される。
【００１６】
本発明はまた、上述の組成物および医薬製剤を調製する方法ならびにそれらの治療上の使用にも関する。
ＰＡＲＰ１媒介性腫瘍壊死を活発に誘導することができる組成物を提供することは、本発明の一目的であり、かつ、患者に毒性ではない組成物および製剤を使用してそのようにするすることは、さらなる目的である。
【００１７】
患者において薬物耐性表現型を有する多種多様な腫瘍およびがん細胞を処置するのに使用するための医薬製剤を提供することは、本発明の別の目的である。
腫瘍細胞へのＺｎ（ＩＩ）の送達を標的とすることができるα−ＰＧＡ担体を含む組成物を提供することは、本発明の別の目的である。また、用量要件が低減している、または健康な組織における望ましくない副作用の低減したプロファイルを伴う、強力な殺腫瘍剤を提供することは、本発明の一目的である。
【００１８】
患者の腫瘍においてＰＡＲＰ１媒介性腫瘍壊死を誘導する方法の一実施形態は、治療有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびα−ポリグルタミン酸担体を、腫瘍を有する患者に投与するステップを含み、ここで、前記α−ポリグルタミン酸担体は、α−ポリグルタミン酸および／または腫瘍標的化α−ポリグルタミン酸誘導体および／または電荷修飾α−ポリグルタミン酸誘導体および／または腫瘍標的化電荷修飾α−ポリグルタミン酸誘導体を含む。方法の別の実施形態では、治療有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびα−ポリグルタミン酸担体（別途示されない限り、α−ポリグルタミン酸担体または組成物への言及は、上で列挙の種々の種類のα−ポリグルタミン酸の誘導体を含む組成物を含む）が、薬物耐性表現型を有する腫瘍を有する患者に投与される。
【００１９】
方法の別の実施形態では、治療有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびα−ポリグルタミン酸担体が、治療量のＮＦ−κＢ阻害剤および／またはＮＦ−κＢシグナル伝達カスケード阻害剤との組み合わせで投与される。
【００２０】
一実施形態では、治療量のＺｎ（ＩＩ）塩およびα−ポリグルタミン酸担体が、固体剤形でまたは液体剤形で一緒に投与される。いくつかの実施形態では、固体剤形は、錠剤、ミニタブ（ｍｉｎｉｔａｂ）、硬カプセル、軟カプセル、カプレット、ジェルキャップ（ｇｅｌｃａｐ）、口腔崩壊フィルム、顆粒、ペレット、ペーストおよびパウダー小袋から選択される。いくつかの実施形態では、液体剤形は、液体溶液、液体懸濁液、シロップおよび口腔スプレーから選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、治療量のＺｎ（ＩＩ）塩およびα−ポリグルタミン酸担体が、経口投与または注射投与により一緒に投与される。
本発明の一実施形態は、（ｉ）薬学的に許容されるＺｎ（ＩＩ）塩、（ｉｉ）腫瘍標的化部分および／または電荷修飾部分を含有するα−ポリグルタミン酸を含み、（ｉｉｉ）任意選択でα−ポリグルタミン酸をさらに含む、医薬組成物である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍標的化部分は、葉酸、ジメチルテトラヒドロフォレート（ＤＭＴＨＦ）およびＲＧＤペプチドから選択され、前記部分の任意の組み合わせが、α−ポリグルタミン酸に共有結合されている。いくつかの実施形態では、前記の電荷修飾部分は、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、１，４，７，１０−テトラシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸から選択され、前記部分の任意の組み合わせが、α−ポリグルタミン酸に共有結合されている。
【００２３】
別の実施形態では、医薬組成物はα−ポリグルタミン酸をさらに含む。別の実施形態では、医薬組成物において、前記Ｚｎ（ＩＩ）塩の実質的な部分が、Ｚｎ（ＩＩ）イオンとα−ポリグルタミン酸および／または前記腫瘍標的化部分および／または前記電荷修飾部分との結合複合体である。別の実施形態では、医薬組成物において、Ｚｎ（ＩＩ）塩および（ｉｉ）前記α−ポリグルタミン酸ポリマーは、固体混合物中で一緒に混合される。
【００２４】
別の実施形態では、医薬組成物は、ＮＦ−κＢ阻害剤および／またはＮＦ−κＢシグナル伝達カスケード阻害剤をさらに含む。
他の実施形態では、上の医薬組成物のいずれもが、固体剤形として製剤化される。いくつかのさらなる実施形態では、固体剤形は、胃耐性結合剤および／または胃耐性外部コーティングをさらに含む。他の実施形態では、上の医薬組成物のいずれもが、液体剤形として製剤化される。一部の実施形態では、液体剤形は注射向けに製剤化される。さらなる実施形態では、液体剤形は、胃耐性材料をさらに含む医薬組成物の懸濁液である。さらなる実施形態では、液体剤形は、上の医薬組成物のいずれかおよび、任意選択で胃耐性材料を含むワックスでコーティングされた微粒子の懸濁液である。
【００２５】
患者において腫瘍を処置する方法の一実施形態は、医薬組成物に関する前述の実施形態のいずれか１つによる治療有効量の医薬組成物を、腫瘍を有する患者に投与するステップを含む。方法のさらなる実施形態では、治療有効量の前述の医薬組成物が、薬物耐性表現型を有する腫瘍を有する患者に投与される。
【００２６】
本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、以下の発明を実施するための形態および特許請求の範囲から、当業者であれば明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＰＡＲＰ１媒介性壊死の模式的概要の図である。
【図２】ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ７細胞およびＡ５４９細胞をＺｎ（ＩＩ）／α−ＰＧＡ組成物で処置した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書で記載される組成物、製剤および方法において使用される成分は、医薬的使用に関して、または食品における使用に関して、またはヒトの消費向けの製品における使用に関して規制当局により認可されている等級のものである。場合によって、成分は、医薬等級または医学等級の化合物または物質である。
【００２９】
本明細書で使用される略語の意味は、以下の通りである：「ｋＤａ」とは、キロダルトンを意味し；「ｗｔ％」とは、重量パーセントを意味する。
亜鉛は、亜鉛（ＩＩ）塩（等価に、Ｚｎ２＋塩）として提供され、ここで、対イオン（アニオン）は、適切な任意の無機または有機のアニオンであり得る。適切なアニオンは、毒性ではないアニオンを含めて、人体に忍容されるアニオンである。一般に、亜鉛塩は、式Ｚｎ２＋Ｘ２−もしくはＺｎ２＋（Ｘ−）２またはさらにはＺｎ２＋（Ｘ−）（Ｙ−）により表されることができ、式中、ＸおよびＹは、適切なアニオンである。アニオンは、認可医薬品の成分であるアニオンの群から選択され得る。一部の実施形態では、亜鉛（ＩＩ）塩は、薬学的に許容される亜鉛塩であり、ここで、前記亜鉛（ＩＩ）塩は、医薬組成物における使用に関して認可されている亜鉛（ＩＩ）塩の群から選択される。アニオンは、ＦＤＡに認可された医薬製品の成分であるアニオンの群から選択され得る。アニオンは、ＦＤＡ認可医薬品の成分であるアニオンの群から選択され得る。一部の実施形態では、亜鉛（ＩＩ）塩は、薬学的に許容される亜鉛塩である。他の実施形態では、アニオンは、認可された食品添加剤または栄養補助食品の成分であるアニオンの群から選択され得る。亜鉛塩の例としては、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、クエン酸亜鉛、酢酸亜鉛、ピコリン酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、グリシン亜鉛または当技術分野で既知でありかつ使用されているその他のアミノ酸などのアミノ酸−亜鉛キレート類、を挙げることができる。２種類以上の様々な亜鉛塩が、組成物または製剤のいずれかにおいてＺｎ（ＩＩ）を提供するために任意の割合で一緒に使用され得る。
【００３０】
一部の実施形態では、Ｚｎ（ＩＩ）が、組成物または製剤においてα−ポリグルタミン酸化合物に対して複合体化されて提供される。典型的には、Ｚｎ（ＩＩ）およびα−ＰＧＡの複合形態（「ＺｎＰＧＡ」）が提供される場合、ＺｎＰＧＡは、精製され、遊離のＺｎ（ＩＩ）イオンならびにＺｎカチオンに対する当初の対イオンは、プロセスにおいて実質的に除去される。
【００３１】
単一の固体剤形中に含まれる亜鉛の量は一般に、約１〜約１００ｍｇの亜鉛（亜鉛（ＩＩ）イオン）の範囲である。したがって、製剤化組成物中で使用される亜鉛塩（複数可）の特定の量は、塩の量が対イオンの重量を考慮に入れる必要があるので、より高いことになる。亜鉛（ＩＩ）のみを考慮すると、剤形中で提供される量は、約１００ｍｇまで、約７５ｍｇまで、約５０ｍｇまで、約２５ｍｇまで、約１０ｍｇまでの亜鉛、または約５ｍｇまでであり得る。固体剤形中で提供される亜鉛（ＩＩ）の量は一般に、少なくとも約１ｍｇである。比較として、通常利用可能なサプリメントは、例えば２０、２５、３０、５０、７５およびさらには１００ｍｇの亜鉛を提供する。この範囲における亜鉛の任意の量またはさらにより高い量が、提供される量は生理的に過剰なレベルの亜鉛が吸収されるのを引き起こさない限り、許容可能である。しかし、過剰なレベルおよびそれ由来のリスクと考慮される可能性があるところのものは、腫瘍を処置することにより得られる治療上の恩恵に対してバランスをとられるべきであるということである。ほとんどの成人における亜鉛の許容上限摂取量は約４０ｍｇ／日である（子供についてはそれはより低い）が、経口で摂取される固体剤形中の亜鉛の全てが吸収される可能性は低く；その一部は吸収されずに体を通過することになると認識しなければならない。吸収される亜鉛の量は製剤と共に変化することにもなるので、特定の製剤中の亜鉛含有量の上限は、製剤により提供される取込みのレベルを確認するのに当技術分野で既知の方法により試験され得る。次いで、製剤を投与するステップにより得られた、処置におけるあらゆる治療上の恩恵に鑑みて、適宜、所与の剤形または製剤について投与される量を調整することができる。
【００３２】
液体剤形での組成物または製剤中に提供される亜鉛の濃度は一般に、約１ｍｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの亜鉛（亜鉛（ＩＩ）イオン）の範囲である。これは、約０．０００１ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の亜鉛の範囲に相当する。Ｚｎ（ＩＩ）の濃度は、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、もしくは少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ、もしくは少なくとも約１ｇ／Ｌ、もしくは少なくとも約１０ｇ／Ｌであり得、またはＺｎ（ＩＩ）の濃度に関する範囲は、これらの例示的濃度のうちのいずれか２つの範囲内に入り得る。一実施形態では、濃度は約１００ｍｇ／Ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌの範囲であり得る。剤形中で提供される液体の量は、総投与量を決定することになる。例えば、１００ｍＬの量の液体は、例示的な範囲として約１０ｍｇ〜約５０ｍｇのＺｎ（ＩＩ）を提供するであろう。別の実施形態では、濃度は約１０００ｍｇ／Ｌ（１ｍｇ／ｍＬ）であり得、したがって１ミリリットルあたり約１ｍｇを提供することができる。固体剤形中の亜鉛の投与量に関する本開示は、液体投与量として提供するために、Ｚｎ（ＩＩ）溶液の量に関する手引きとして使用され得る。
【００３３】
亜鉛はまた、液体中に懸濁された固体の一部として提供され得る。提供される亜鉛（ＩＩ）の量および懸濁液の容量は、固体剤形および液体剤形に関して上に記載される手引きに従う。
【００３４】
アルファ−ポリグルタミン酸（あるいはα−ポリグルタミン酸またはα−ＰＧＡ）は、アミノ酸であるグルタミン酸のポリマーであり、ここで、ポリマー骨格は、アミノ酸側鎖中のカルボキシル基ではなく、α−炭素でアミノ基とカルボキシル基とを結合しているペプチド結合（タンパク質中に形成されている典型的なペプチド結合）により形成されている。α−ＰＧＡは、グルタミン酸のＬ異性体、Ｄ異性体またはＤＬラセミ体から形成され得る。これらの形態のいずれもが使用され得、２種類以上の様々な形態が、任意の割合で一緒に使用され得る。α−ＰＧＡの種々の異性体形態は、合成であっても、天然源に由来してもよい。生物は通常はＬ異性体だけからポリ（アミノ酸）を産生し、一方、α−ＰＧＡを産生するある特定の細菌性酵素は、どちらかの異性体または両方の異性体からポリマーを産生することができる。
【００３５】
種々の大きさおよび種々のポリマー分散度のα−ＰＧＡが使用され得る。α−ＰＧＡのポリマー分子量は一般に、少なくとも約１ｋＤａ、最大で約１０００ｋＤａである。一部の実施形態では、α−ＰＧＡのポリマー分子量は、少なくとも約１ｋＤａ、または少なくとも約５ｋＤａ、または少なくとも約１０ｋＤａ、または少なくとも約２０ｋＤａ、または少なくとも約３０ｋＤａ、または少なくとも約３５ｋＤａ、または少なくとも約４０ｋＤａ、または少なくとも約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、α−ＰＧＡのポリマー分子量は、最大で約７００ｋＤａ、または最大で約５００ｋＤａ、または最大で約３００ｋＤａ、または最大で約２００ｋＤａ、または最大で約１００ｋＤａである。許容されるポリマー分子量範囲は、上で指示されたポリマー分子量の値のいずれから選択され得る。一実施形態では、ポリマー分子量は約５ｋＤａ〜約５００ｋＤａの範囲である。別の実施形態では、ポリマー分子量は約５ｋＤａ〜約３００ｋＤａの範囲である。一実施形態では、ポリマー分子量は約５０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲である。一実施形態では、ポリマー分子量は約１００ｋＤａである。一実施形態では、ポリマー分子量は約５０ｋＤＡである。組成物または製剤は、α−ＰＧＡの１つまたは複数のポリマー分子量形態を含むことができる。
【００３６】
ポリマー分子量は通常は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による測定に基づく数平均分子量（Ｍｎ）として与えられる。上のポリマー質量は、Ｍｎとして引用される；他の測定技法が、例えば、質量（重量）平均分子量（Ｍｗ）を決定するのに使用され得、所与の任意のポリマーに関する仕様は、種々のポリマーの質量表示の内で変換され得る。
【００３７】
固体剤形中に含まれるα−ＰＧＡの量は一般に、約１０ｗｔ％〜約４０ｗｔ％の範囲である。一部の実施形態では、量は約２０ｗｔ％または約３０ｗｔ％である。使用される量は全体的に、亜鉛とポリグルタミン酸モノマー単位との間の所望のモル比、亜鉛塩の質量（対イオンの重量を考慮に入れて）、および許容される製剤化された剤形を提供するのに必要とされる賦形剤の量、に基づく。例えば、使用されるα−ＰＧＡおよび亜鉛塩の量が大きいほど、所与の剤形全体の大きさにとって添加され得る賦形剤の量は少ない。当業者であれば、有効成分の量と必要とされる賦形剤の量および種類との関係のバランスをとって、安定な剤形を容易に得ることができる。亜鉛とα−ＰＧＡの間の所望の比はまた、剤形あたりの亜鉛のミリグラムとα−ＰＧＡのｗｔ％との比として表され得る。例示的な比としては、５ｍｇ：１０ｗｔ％；５ｍｇ：２０ｗｔ％；５ｍｇ：４０ｗｔ％；３０ｍｇ：１０ｗｔ％；３０ｍｇ：２０ｗｔ％；３０ｍｇ：４０ｗｔ％；もしくはさらには１００ｍｇ：１０ｗｔ％；１００ｍｇ：２０ｗｔ％；１００ｍｇ：４０ｗｔ％；あるいはこれらの例示的な比により記載される範囲内の、または本明細書においてそれぞれの成分に関して引用される値から明らかである、その他のセットの値が挙げられる。
【００３８】
液体剤形中に含まれるα−ＰＧＡの量は一般に、約０．０１ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の範囲である。一部の実施形態では、量は約０．１ｗｔ％〜約１ｗｔ％である。
使用される量は全体的に、亜鉛とアルファ−ポリグルタミン酸モノマー単位との間の所望のモル比、α−ＰＧＡ担体の性質（すなわちそれが未修飾であるか、または腫瘍標的化部分および／もしくは電荷修飾部分で修飾されているかどうか）、ならびにα−ＰＧＡ担体とのＺｎ（ＩＩ）複合体の形成の程度、に基づく。例えば、実施例１および２において例示のように、ＺｎＰＧＡ複合体は、おおよそ４００μｇ／ｍＬ（ｍｇ／Ｌ）の複合体化亜鉛と共におおよそ１ｗｔ％のα−ＰＧＡを含む溶液として得られる。理論にとらわれるわけではないが、液体剤形を調製する際、溶液中で亜鉛塩をα−ＰＧＡ担体と組み合わせることは一般に、結果として亜鉛イオンおよびα−ＰＧＡ担体の複合体の形成をもたらすことになり、したがって形成された複合体を単離または精製する個別のステップはかならずしも必要ではない場合もあることが、理解されるべきである。他の例示的な比は、液体剤形中に含まれるα−ＰＧＡの量との組み合わせで、液体剤形での組成物または製剤中に提供される亜鉛の濃度に関する上の開示に基づく範囲を含む。
【００３９】
有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびα−ポリグルタミン酸担体を有する適切な固体または液体組成物および液体製剤に到達するため、α−ＰＧＡ担体および亜鉛の相対量およびそれぞれの濃度は、本開示にしたがって当業者によって容易に調整され得る。本明細書で開示される組成物では、α−ＰＧＡ成分は、α−ＰＧＡとまたはα−ＰＧＡ担体と呼ばれる場合もある。述べたように、α−ＰＧＡの誘導体も企図されており、これは修飾α−ＰＧＡまたはα−ＰＧＡコンジュゲート等と多様に呼ばれる場合もある。
【００４０】
α−ＰＧＡは、腫瘍標的化部分を含むことができる。かかる部分は、葉酸、Ｎ５，Ｎ１０−ジメチルテトラヒドロフォレート（ＤＭＴＨＦ）およびＲＧＤペプチドから選択され得る。前記部分のいずれかまたは全部がα−ポリグルタミン酸に共有結合されて、α−ＰＧＡのフォレートコンジュゲートおよび／またはＤＭＴＨＦコンジュゲートおよび／またはＲＧＤペプチドコンジュゲートを形成することができる。葉酸受容体タンパク質は、多くのヒト腫瘍において発現していることが多い。
【００４１】
フォレート類は当然、葉酸受容体に対して高親和性を有し、さらに、結合すると、フォレートおよびこの結合コンジュゲートは、エンドサイトーシスにより細胞中に輸送され得る。この方式で、葉酸で修飾されたＺｎＰＧＡは、腫瘍細胞を標的としてそこで蓄積し、亜鉛（ＩＩ）を腫瘍細胞の内部へと送達することができる。ＤＭＴＨＦも、葉酸受容体に対して高親和性を有すると知られている。ＤＭＴＨＦの調製がＮＰＬ１３に記載されている。さらに、葉酸受容体（ＦＲ）の主な２つのアイソフォームであるＦＲ−αおよびＦＲ−βが存在し、ＤＭＴＨＦは、ＦＲ−βと比較してＦＲ−αに対してより高親和性を有すると示されている（ＮＰＬ１２）。これは腫瘍細胞を標的化するのに有益であるが、その理由は、ＦＲ−αは多くの悪性細胞型において過剰発現しており、一方、ＦＲ−βは炎症性疾患に関連するマクロファージで過剰発現しているためである。したがって、ＤＭＴＨＦをα−ＰＧＡにコンジュゲートすることは、腫瘍細胞により発現している葉酸受容体に選択的に結合することができるコンジュゲートを提供する。同様に、ＲＧＤペプチドは、腫瘍性内皮細胞でならびに一部の腫瘍細胞で発現しているα（Ｖ）β（３）インテグリン類に強く結合すると知られている。したがって、ＲＧＤコンジュゲートは、抗腫瘍剤をその部位に標的化および送達するための戦略である。本発明において企図されているように、α−ＰＧＡは、これらの腫瘍標的化剤のいずれか１種類または２種類または全部でコンジュゲートされ（すなわち修飾され）得る。２種類以上が存在する場合、これらの薬剤の相対的な比は、特に限定されない。例えば、α−ＰＧＡ担体は、α−ＰＧＡの、（ａ）葉酸、（ｂ）ＤＭＴＨＦ、（ｃ）ＲＧＤ、（ｄ）葉酸およびＤＭＴＨＦ、（ｅ）葉酸およびＲＧＤ、（ｆ）ＤＭＴＨＦおよびＲＧＤ、または（ｇ）葉酸、ＤＭＴＨＦおよびＲＧＤとのコンジュゲートを含むことができる。他の類似の腫瘍標的化部分も、本発明の範囲内である。
【００４２】
α−ＰＧＡは、各グルタミン酸単位のγ炭素に遊離のカルボン酸基を有し、これは、葉酸と、ＤＭＴＨＦと、およびＲＧＤペプチドとコンジュゲートを形成するのに使用され得る。葉酸は環外アミン基を有し、これは、グルタミン酸のγ炭素のカルボン酸基と一体となって、上記２つの基を結合するアミド結合を形成することができる。葉酸におけるのと同じ環外アミン基が、ＤＭＴＨＦにおいてアミド結合形成のために利用可能である。ＲＧＤコンジュゲートも当技術分野でよく知られており、やはり、例えば、ＲＧＤ中の遊離のαアミノ基を介してγ炭素カルボン酸基に同様に共有結合され得る。あるいは、いずれの部分も、例えばポリエチレングリコールアミンなどのスペーサー基を介してα−ＰＧＡにコンジュゲートされ得る。α−ＰＧＡのγ炭素カルボキシレート基とアミノ基との間のコンジュゲーション反応の例が、Ｂａｉらに付与された米国特許第９，６３６，４１１号に記載されており、アミノおよび水酸基によるコンジュゲーション反応の例が、Ｖａｎらによる米国付与前公表第２００８／０２７９７７８号に記載されている。葉酸およびクエン酸の関連ポリマー、γ−ＰＧＡへのコンジュゲーション反応の例は、ＷＯ２０１４／１５５１４２に記載されている。
【００４３】
α−ＰＧＡは、電荷修飾部分を含むことができる。かかる部分は、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）から選択され得る。前記部分の任意の組み合わせが、α−ポリグルタミン酸に、やはりγ炭素のカルボン酸にて共有結合されている。クエン酸は、α−ＰＧＡのγ炭素のカルボン酸基に、エステルリンケージを形成することによりコンジュゲートされ得る。（例えば、類似のコンジュゲーション反応に関するＷＯ２０１４／１５５１４２を参照。）ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡおよびＤＴＰＡは、例えば、これらの部分のアミンをα−ＰＧＡのγ炭素のカルボン酸基に結合するためのスペーサー基を使用して、α−ＰＧＡに結合され得る。数多くの選択肢が当業者に利用可能である。電荷修飾部分は、Ｚｎ（ＩＩ）イオンをキレートするための部位として使用され得、電荷修飾はまた、ＺｎＰＧＡ複合体の輸送および可溶性に影響を及ぼすことになり、したがって、担体およびＺｎＰＧＡ複合体の医薬効果を調整するのに使用され得る。
【００４４】
α−ＰＧＡは腫瘍標的化部分および電荷修飾部分の両方を含むことができ、その結果、部分に関して両方の種類の利益および機能性がα−ＰＧＡ担体に付与され得る。腫瘍標的化部分および電荷修飾部分の任意の組み合わせが、α−ＰＧＡにコンジュゲートされ得、両部分の相対的比は特に制限されない。
【００４５】
本発明による組成物および製剤はまた、ＮＦ−κＢ阻害剤を含むこともできる。本明細書で使用される場合、ＮＦ−κＢ阻害剤としては、直接的な阻害剤ならびにシグナル伝達カスケードを阻害することができる化合物、またはＮＦ−κＢの効果を抑制し、それにより腫瘍細胞の増殖もしくは生存を制限する任意の化合物、を挙げることができる。本明細書で定義のＮＦ−κＢ阻害剤として使用され得る例示的な化合物としては、ピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）（ＮＰＬ４）、テルミサルタン（ＮＰＬ９）、オルメサルタン（ＮＰＬ１）、バルサルタン（ＮＰＬ８）、ジスルフィラム（ＮＰＬ４）またはそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。これらの阻害剤は、腫瘍細胞の生存度を制限し、それによりその他の殺腫瘍剤、例えば本発明の組成物および製剤の効果に対して腫瘍細胞を感受性化するので、感受性化物質とも呼ばれる場合もある。
液体製剤
亜鉛（ＩＩ）およびα−ＰＧＡ担体成分は液体として製剤化され得る。適切な液体製剤としては、液体溶液、液体懸濁液、シロップおよび口腔スプレーが挙げられる。液体溶液は、経口で摂取され得、または注射により、例えば、静脈内、皮内、筋内、髄腔内、もしくは皮下に、または直接腫瘍中もしくは腫瘍付近に投与され得るが、一方、液体懸濁液、シロップおよびスプレーは一般に、経口投与に適している。
液体剤形を調製する方法
液体剤形を調製する方法は、所望の量の（ｉ）亜鉛塩（複数可）およびα−ＰＧＡ担体を一緒に混合するステップ、ならびに／または（ｉｉ）ＺｎＰＧＡ複合体を、適切な賦形剤と共に一緒に混合するステップを含む。一部の実施形態は、製剤中に胃耐性結合剤および／または胃耐性コーティングをさらに含む。
【００４６】
液体溶液製剤は、適切な担体、希釈剤、緩衝剤、保存剤または投与の形態に関して適切に選択されるその他の賦形剤と共に調製され得る。例えば、静脈内製剤は、適切なｐＨで緩衝化され、等張剤と共に調製され得る。
【００４７】
注射または経口送達に適した液体製剤の一実施形態は、亜鉛（ＩＩ）塩、α−ＰＧＡ担体（上記の、未修飾α−ＰＧＡおよび／または任意の形態の修飾α−ＰＧＡ）および水を含む。さらなる実施形態では、液体製剤は、緩衝剤および／または塩化ナトリウムなどの塩をさらに含むことができる。緩衝剤が含まれる場合、好ましい緩衝ｐＨは、約ｐＨ４〜約ｐＨ９の範囲である。注射される場合、好ましくは、溶液は、これが注射される予定の溶液と等張であり、適切なｐＨである。一実施形態では、硫酸亜鉛七水和物、α−ＰＧＡおよび塩化ナトリウムが、水中で組み合わせられ、ここで、亜鉛（ＩＩ）の濃度は１ｍｇ／ｍＬであり、α−ＰＧＡの濃度は１０ｍｇ／ｍＬである。α−ＰＧＡのポリマー分子量は上記の範囲のいずれかから選択され得る。一実施形態では、それは約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲であり、他の実施形態では、それは約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲である。任意の実施形態では、α−ＰＧＡの１つまたは複数のポリマー分子量形態が含まれ得る。
【００４８】
一部の実施形態では、亜鉛塩（複数可）およびα−ＰＧＡ担体は、ＺｎＰＧＡ複合体として調製され得る。全体として、ＺｎＰＧＡ複合体を形成するため、亜鉛塩（複数可）およびα−ＰＧＡ担体は、例えば、実施例１および２において記載されるように組み合わせられ、精製される。得られたＺｎＰＧＡ複合体の溶液は、希釈され、または実質的に乾燥され、液体剤形を調製する手順に使用するためのより濃縮された形態で再構成され得る。ＺｎＰＧＡ複合体は、注射用溶液として、または液体懸濁液、シロップもしくはスプレーとして製剤化され得る。
【００４９】
亜鉛塩およびα−ＰＧＡ組成物は、本発明の方法において使用するための液体懸濁液として製剤化され得る。例えば、まず、Ｚｎ（ＩＩ）塩およびα−ＰＧＡ担体（α−ＰＧＡの未修飾形態および／または任意の修飾形態を含む）の混合物を含む顆粒化組成物が、顆粒化固体中に含まれる胃耐性結合剤と共に調製される。（固体製剤を調製する方法に関する下の考察を参照。）α−ＰＧＡ担体は、約５ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、または約１ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、または約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、または約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲の平均分子量を有するα−ＰＧＡから調製され得る。次いで、顆粒化固体は経口摂取に適した酸性液体中に懸濁される。溶液のｐＨは約ｐＨ６未満であり得、その結果、顆粒化固体が胃耐性結合剤の結果として安定なままである。一実施形態では、液体懸濁液製剤はまた増粘剤または粘度増強剤も含有し、その結果、顆粒化固体が十分に懸濁されたままでありコンテナから効率的に経口摂取され得る。
【００５０】
液体懸濁液の別の実施形態では、顆粒化固体は、まずＺｎＰＧＡ複合体を調製することにより調製され、ここで、Ｚｎ（ＩＩ）がα−ＰＧＡ担体と複合体化される。そのような調製の例が、例えば、実施例１および２に提供されている。その後、ＺｎＰＧＡは、胃耐性結合剤およびその他の適切な賦形剤と共に顆粒化され得る。次いで、この顆粒化混合物は、すぐ上に記載される液体懸濁液として調製され得る。
【００５１】
液体製剤の別の実施形態は、亜鉛塩およびα−ＰＧＡ複合体の粒子、例えばマイクロスフェア、微粒子、顆粒またはその他の適切な固体形態を形成するステップ、およびその粒子をワックスの薄層でコーティングするステップを含む。好ましい実施形態では、粒子は胃耐性結合剤をさらに含む。コーティングされた粒子は、液体懸濁液製剤として製剤化される。粒子上のワックスコーティングは、粒子の物理的完全性を促進し、透過性を低減するが、コーティングは、それにもかかわらず、亜鉛およびα−ＰＧＡ複合体の腸への送達を可能にする。
【００５２】
コーティングに適した顆粒は、前記方法のいずれかにしたがって調製され得る。亜鉛塩、α−ＰＧＡおよび胃耐性結合剤のマイクロスフェアまたは微粒子は、当技術分野で既知の多数の方法のいずれかにより調製され得、この方法には、分散相の、シングルエマルジョン法、ダブルエマルジョン法、重合、界面重合、相分離およびコアセルベーション、噴霧乾燥、噴霧凝結、溶媒抽出、凍結乾燥が挙げられる。そのようなマイクロスフェアまたは微粒子の寸法は、数１０ミクロンから数１０００ミクロンまでの範囲に及ぶことができる。例として、マイクロスフェア粒子を調製する一方法は、亜鉛塩およびα−ＰＧＡを含む微細（例えば粉末化された）固体混合物をパラフィン油などの懸濁媒体中で撹拌するステップ、およびポリマー性胃耐性結合剤の溶液を撹拌懸濁液に添加するステップを伴う。マイクロスフェアが形成されたら、クロロホルムなどの非溶媒が添加されてマイクロスフェアを沈殿させ、このマイクロスフェアは収集され、乾燥され、続いてワックスでコーティングされる。
【００５３】
ワックスコーティングは、生体適合性かつ非免疫原性であり、腸管への薬物の取込みおよび送達に適していると認められている。粒子（マイクロスフェア、微粒子、顆粒等）は、当技術分野で既知の方法にしたがって、ワックスで、例えばカルナウバワックス、みつろう、セトステアリルアルコール、鯨ろうおよびその他のワックスでコーティングされ得る。例えば、粒子は、ワックスを白色パラフィン油中に溶かし、この溶液を４５℃未満に冷却し、次いで、粒子を機械的に撹拌されたワックス／パラフィン油溶液に、粒子がコーティングされるまで添加することにより、カルナウバワックスでコーティングされ得る。ワックス溶液の撹拌速度および時間ならびに温度は調整されて、ワックスコーティングの厚さを改変することができる。
【００５４】
ワックスでコーティングされた亜鉛塩およびα−ＰＧＡ粒子は、投与向けに液体懸濁液として製剤化される。コーティングされた亜鉛／α−ＰＧＡ粒子は、最終的な製剤化懸濁液中に約５ｗｔ％〜３０ｗｔ％で存在する。典型的には、液体懸濁液製剤は、懸濁ポリマー、増粘剤および緩衝剤を含む。製剤はまた、甘味料、香味料および／または保存剤のうちの１つまたは複数をさらに含んでよい。
【００５５】
懸濁ポリマーは、キサンタンガム、カルボマー、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムから選択され得、これらは、単独でまたは任意の組み合わせで使用され得る。当技術分野で既知の他の類似の薬剤も使用され得る。合計で、懸濁ポリマー成分は、最終製剤中に約０．０２ｗｔ％〜約５ｗｔ％で存在する。
【００５６】
増粘剤は、グリセリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン、グアーガムおよびローカストビーンガムから選択され得、これらは、単独で、または任意の組み合わせで使用され得る。当技術分野で既知の他の類似の薬剤も、使用され得る。合計で、増粘剤成分は、最終製剤中に約０．０５ｗｔ％〜約５０ｗｔ％で存在する。
【００５７】
緩衝剤は、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、乳酸緩衝剤およびクエン酸緩衝剤または所定の範囲で緩衝能力を有するその他の薬学的に許容される緩衝剤から選択され得る。緩衝剤は、約６以下のｐＨを有するように調整される。一部の実施形態では、ｐＨは約３から約６の間である。一部の実施形態では、ｐＨは４．５から５の間であり、他の実施形態では、ｐＨは４から５の間であり、さらに他の実施形態では、ｐＨは３から５の間である。
【００５８】
甘味料は、スクロース、転化スクロース、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、アスパルテーム、サッカリンおよびスクラロースから選択され得、これらは、単独でまたは任意の組み合わせで使用され得る。当技術分野で既知の他の類似の薬剤も、使用され得る。合計で、甘味料成分は、最終製剤中に約５ｗｔ％〜約４０ｗｔ％で存在することができる。
【００５９】
香味料は、薬学的に許容される任意の香味料または当技術分野で既知の食品もしくはサプリメント中で使用されている任意の薬剤から選択され得るとともに、業界の慣行と一致する量で最終製剤中に添加され得る。
【００６０】
保存剤は、安息香酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、ソルビン酸カリウムおよびクエン酸から選択され得、これらは、単独でまたは任意の組み合わせで使用され得るとともに、業界の慣行と一致する量で最終製剤中に添加され得る。当技術分野で既知の他の類似の薬剤も、使用され得る。
【００６１】
一部の実施形態による液体剤形を調製する製剤および方法が、実施例５において下に提供されている。
液体懸濁液製剤に関するこれらの実施形態のいずれかでは、α−ＰＧＡ担体は一般に、約０．０１ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の濃度で存在し、一部の実施形態では、その量は、約０．１ｗｔ％または約１ｗｔ％である。Ｚｎ（ＩＩ）は一般に、約０．００１ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の濃度で存在する。
【００６２】
液体投与製剤はまた、ＮＦ−κＢ阻害剤を含むように調製され得る。かかるＮＦ−κＢ阻害剤を製剤中に含まない実施形態では、ＮＦ−κＢ阻害剤は、他の適切な任意の製剤および投与の形態を使用して、同時投与され得る。
固体製剤
亜鉛塩およびα−ＰＧＡ担体は、経口投与向けの経口固体剤形中に、例えば、錠剤、硬カプセル、軟カプセルまたはミニタブレットなどの関連形態、カプレット、ジェルキャップ、口腔崩壊フィルム等中に、製剤化され得る。剤形は、胃耐性結合剤および／または胃耐性コーティングを含むようにさらに製剤化される。
【００６３】
亜鉛塩およびα−ＰＧＡ担体は、医薬品中での使用に適しているとともに、錠剤またはカプセル等などの特定の剤形を作製するのに適した賦形剤と組み合わせられる。典型的な賦形剤としては、フィラー、結合剤、崩壊剤、滑剤、潤滑剤ならびに緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、香味料、甘味料、着色剤等が挙げられる。添加される賦形剤の量および種類は、種々の目的、例えば、剤形の完全性の改善、生物学的利用能、安定性、製造、コーティング、外観および／またはコンプライアンスの各改善に対して、選択され得る。一部の賦形剤は、２つ以上の目的にかなう場合もあり、かつ／または２つ以上の特徴の改善を提供することができる。
【００６４】
フィラーは、水溶性であっても水に不溶性であってもよく、各種類のうち１つまたは複数が、組み合わせられ得る。水溶性フィラーの例としては、限定することなく、当技術分野で既知である、糖類、例えばグルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、デキストロース、ガラクトース等、および糖アルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、キシリトール等が挙げられる。水不溶性のフィラーの例としては、限定することなく、当技術分野で既知である、ワックス、長鎖脂肪酸、タルク、カオリン、二酸化ケイ素、二酸化チタン、アルミナ、デンプン、粉末状セルロース、微結晶性セルロース等が挙げられる。
【００６５】
結合剤は、限定することなく、当技術分野で既知である、セルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、ならびにデンプン類、部分的に加水分解されたデンプン、例えばマルトデキストリンなどの加工デンプン類、糖類、ゼラチン、天然または合成ガム等が挙げられる。
【００６６】
上記の通り、一部の実施形態では、胃耐性材料は、胃耐性結合剤としておよび／または胃耐性外部コーティングとして含まれる。胃耐性の結合剤または外部コーティングを構成する材料は、剤形からの亜鉛塩およびα−ＰＧＡの放出を、それが胃を通過し腸に入るまで、遅らせる機能を果たす。胃耐性の結合剤またはコーティングが使用される場合、これは、その他の（非胃耐性）結合剤またはコーティングとの組み合わせで使用され得る。
【００６７】
一般に、胃耐性材料はマトリックス障壁またはポリマー障壁またはその他の障壁であるが、これは、胃の酸性環境（ｐＨ約３）中では目に見えるほどに溶解または膨潤しないが、腸の中性〜微アルカリ性の環境（ｐＨ７〜９）中では内容物が放出される程に溶解または膨潤することになる。腸溶コーティングおよび腸溶結合剤は、胃耐性材料の例である。
【００６８】
胃耐性材料の例としては、酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、酢酸トリメリト酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース−フタレート、（ｉ）アクリル酸エステル、（ｉｉ）アクリル酸メチルエステルおよび（ｉｉｉ）メタクリル酸から選択される２つ以上のモノマーのコポリマー、ポリビニルアセテートフタレート、ヒプロメロースアセテートサクシネート、ヒプロメロースフタレート、アルギン酸ナトリウム、シェラックならびにゼインが挙げられる。
【００６９】
多数の等級および薬局方標準が胃耐性材料に関して存在し、それらは、亜鉛およびα−ＰＧＡを腸に送達する機能を提供するのに適切な材料を選択するための有用な手引きを提供する。外部コーティングにおけるコーティング厚さおよびポリマー組成物、または結合剤およびポリマー組成物の量を制御することにより、放出点は、より早くもしくはより遅く、または腸のある特定のおおよその領域内で起こるように調整され得る。達成され得る制御の程度の例は、種々の薬局方標準を満たすＣｏｒｅｌ  Ｐｈａｒｍａ  Ｃｈｅｍ（インド）から商品名Ａｃｒｙｃｏａｔ（登録商標）の下で利用可能なメタクリル酸コポリマーの系列、例えば：ＵＳＰ／ＮＦメタクリル酸コポリマー、タイプＡ−ＮＦ、４〜５％で使用され、典型的には剤形の内容物を空腸に送達する；ＵＳＰ／ＮＦメタクリル酸コポリマー、タイプＣ−ＮＦ、４〜５％で使用され、典型的には剤形の内容物を十二指腸に送達する；およびＵＳＰ／ＮＦメタクリル酸コポリマー、タイプＢ−ＮＦ、１０〜２０％で使用され、典型的には剤形の内容物を結腸に送達する、において見いだされ得る。後者（タイプＢ−ＮＦ）は、ｐＨ依存性ポリマーにより送達を達成するが、ｐＨ非依存性ポリマーも、同様に結腸または腸への送達に使用され得る。
【００７０】
崩壊剤としては、限定することなく、当技術分野で既知である、カルメロース、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、アルギネート類、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、部分アルファ化デンプン等が挙げられる。
【００７１】
滑剤としては、限定することなく、当技術分野で既知である、シリカ類、シリケート類、タルク、リン酸カルシウム等が挙げられる。
潤滑剤としては、限定することなく、当技術分野で既知である、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のステアリン酸塩、オレイン酸塩、安息香酸塩、酢酸塩、塩化物等が挙げられる。
【００７２】
他の種類の賦形剤、例えば緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、香味料、甘味料、着色剤がよく知られており、当業者であれば、かかる成分を容易に選択し、製剤に適用することができる。
【００７３】
固体投与製剤はまた、ＮＦ−κＢ阻害剤を含むように調製され得る。固体製剤中にこのようなＮＦ−κＢ阻害剤を含まない実施形態では、ＮＦ−κＢ阻害剤は、他の適切な任意の製剤および投与の形態を使用して、同時投与され得る。
【００７４】
他の種類の有効成分、例えば、ビタミン類、ミネラル類、栄養素、および腸での吸収に適合するその他の栄養補助食品または健康補助食品もまた、別途記載されない限り、本発明の範囲から逸脱することなく本明細書に記載の液体または固体の組成物および製剤に添加され得る。
【００７５】
本明細書に記載の組成物および製剤は、亜鉛塩（複数可）およびα−ＰＧＡ担体、ならびに、本明細書と一致さえすれば胃耐性外部コーティングおよび／または胃耐性結合剤を含む、あるいは、これらからなる、または本質的にこれらからなることができる。組成物および製剤はまた、任意の成分（複数可）、例えば、先行技術の組成物中に見いだされる、または開示された本発明に通常なら必要ではない有効成分および／または賦形剤を、欠いてもよく、実質的に含まなくてもよい。
固体剤形を調製する方法
亜鉛塩およびα−ＰＧＡならびに選択される賦形剤は、個々に、または組み合わせで大きさ決めされても、解凝集されても、または粉末化されてもよい。種々の成分は、空練りにより組み合わせられても、または湿式もしくは乾式造粒、噴霧、押出成形、圧延、または流動造粒によって顆粒化されてもよく、その後に任意選択で製粉されてもよく、あるいは当技術分野で既知の他のかかる技法により顆粒化されてもよい。
【００７６】
一部の実施形態では、亜鉛塩（複数可）およびα−ＰＧＡ担体（上記の、未修飾α−ＰＧＡおよび／または修飾α−ＰＧＡの任意の形態）が、ＺｎＰＧＡ複合体として調製され得る。全体として、亜鉛塩（複数可）およびα−ＰＧＡ担体は、例えば、実施例１および２において記載されるように組み合わせられ、精製される。便宜上、得られたＺｎＰＧＡ複合体の溶液は、実質的に乾燥され、固体剤形を調製する手順において乾燥したまたは実質的に粉末として使用され得る。
【００７７】
固体剤形を調製する方法は、所望の量の（ｉ）亜鉛塩（複数可）およびα−ＰＧＡ担体を一緒に混合するステップ、ならびに／または（ｉｉ）ＺｎＰＧＡ複合体および賦形剤を一緒に混合するステップ、を伴い、この賦形剤は、１つまたは複数のフィラーおよび／または１つまたは複数の結合剤および／または１つまたは複数の崩壊剤および／または１つまたは複数の潤滑剤および／または１つまたは複数の滑剤を含む。上記の通り、一部の実施形態では、前記１つまたは複数の結合剤は、胃耐性結合剤であり得、これは、他の（非胃耐性）結合剤との組み合わせで使用され得る。顆粒化ステップが含まれる場合、次いで、賦形剤のいずれもが、顆粒化ステップの前、間または後に、全てまたは部分的に添加され得る。一部の実施形態では、潤滑剤の一部または全部が、顆粒化ステップの後に混入される。これらの実施形態の一部では、滑剤も顆粒化ステップの後に混入される。
【００７８】
顆粒化ステップが、水などの溶媒または有機溶媒または水性有機溶液を使用して成分が顆粒化される際に成分のブレンドを湿らせるステップを伴う場合、結果として得られる製品は通常は、残留溶媒を除去するために乾燥される。有機溶媒の例としては、当技術分野で既知である、エタノールおよびイソプロパノール等が挙げられる。好ましくは、有機溶媒の十つ的に全部が乾燥ステップにおいて除去される。水が顆粒化ステップにおいて使用される溶媒の一部である場合、好ましくは、１０ｗｔ％以下、または５ｗｔ％以下、または２ｗｔ％以下の水が、乾燥後に残存し、次のステップへと進む。
【００７９】
混合固体または顆粒化固体は、圧縮、締固めまたは成型を使用して固体を錠剤化することにより錠剤へと形成され得る。その後、一部の実施形態では、錠剤は、上記の通り、胃耐性コーティングでコーティングされる。一般に、胃耐性物質および任意選択でその他の賦形剤（例えば可塑剤、乳化剤）は、水性溶媒または有機溶媒中に溶かされまたは分散され、次いで噴霧コーティング、流動床コーティング、パンコーティング等を含めて、当技術分野で既知の多数の方法のいずれかを使用して塗布される。一部の実施形態では、錠剤は、コーティング中に胃耐性材料が含まれない状態で、外観、機械的安定性、化学的安定性等の目的のためにコーティングされる。
【００８０】
あるいは、混合固体または顆粒化固体は、カプセルまたはカプレット中に充填され、内部に封入され得る。カプセルという用語は、軟カプセル、硬カプセル、ジェルキャップ、ベジタブルカプセルを含み、ワンピースカプセルであってもツーピースカプセルであってもよい。腸溶コーティングカプセルが利用可能であり（例えば、腸溶カプセル薬物送達技術）、またはカプセルは、物質の溶液もしくは分散物を任意選択で他の賦形剤と共に使用して上述の方法により、充填され、封入され、次いで、胃耐性コーティングでコーティングされ得る。他の実施形態では、混合固体または顆粒化固体は胃耐性結合剤材料を含み、かかる固体は、腸溶コーティングと共にまたはなしでカプセル中に装填され得る。
【００８１】
大きさおよび形状は錠剤またはカプセルいずれも特に制限されない。亜鉛塩およびα−ＰＧＡの所望の投与量は、過度に大きくない錠剤またはカプセル中に製剤化され得ることが期待される。
【００８２】
本発明の実施形態による錠剤剤形を調製する例示的な方法が、実施例６および７に下で提供されている。
投薬および投与
本明細書に記載の剤形は投与されて、治療有効量の亜鉛を提供し、その結果、対象において所望の生物学的応答を達成することができる。治療有効量とは、Ｚｎ、α−ＰＧＡ、α−ＰＧＡに対する任意の修飾、任意のＺｎＰＧＡ複合体の形態、ＮＦ−κＢ阻害剤の有無、ならびに／または剤形の送達効率の組み合わせ効果を通して、処置を必要とする患者に送達される亜鉛の量が所望の生物学的応答を達成することになる、ことを意味する。
【００８３】
所望の生物学的応答としては、哺乳類などの対象における、例えばヒト（患者とも呼ばれる場合もある）における、腫瘍もしくはがんの発病もしくは発症の予防、腫瘍もしくはがんの進行の部分的もしくは完全な予防、遅延もしくは阻害、または腫瘍もしくはがんの再発の予防、遅延もしくは阻害が挙げられる。
【００８４】
ＰＡＲＰ１媒介性壊死に影響されやすい全ての腫瘍種は、本明細書で開示される処置の方法にしたがって処置され得る適応症であることが企図されている。
治療有効量を達成することは、製剤の特徴に依存することになり、いずれも、個体それぞれの性別、年齢、状態および遺伝子構造により異なることになる。例えば遺伝的原因または吸収障害もしくは重度の食事制限に関するその他の原因により亜鉛が不十分である個体は、全体として亜鉛レベルが十分である個体と比較して、治療効果に関して異なる量を必要とする場合もある。
【００８５】
対象は一般に、１日あたり亜鉛約１ｍｇから約３００ｍｇまでの亜鉛の量を投与される。例えば、１日あたり亜鉛約２５ｍｇ、または５０ｍｇ、または７５ｍｇ、または１００ｍｇ、または１５０ｍｇ、または２００ｍｇ。複数の剤形が、当日中に一緒にまたは別々に摂取されてもよい。経口剤形は一般に、食事時間にかかわらず投与されてもよい。処置は一般に、所望の治療効果が達成されるまで継続する。本明細書に記載の組成物および製剤の低い投与量レベルが、腫瘍の再発を予防する、遅らせる、または阻害する目的で、腫瘍が退縮するまたは阻害されている場合、本発明の一実施形態による処置として継続されても、あるいは予防的処置として使用されてもよい。
【実施例】
【００８６】
実施例１
未結合の過剰な亜鉛を除去するためにリン酸沈殿法を使用するｐＨ７．０でのＺｎＰＧＡの調製および特徴付け。
【００８７】
ＺｎＰＧＡを調製するため、α−ＰＧＡ  ５５ｍｇ、ナトリウム塩、６０ｋＤａ平均分子量（単分散）（Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を、１０ｍＭ  ＺｎＳＯ４を含有する１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．０、５ｍＬ中に室温で溶かし、次いで氷上に置きながら１０分間超音波処理する。次いで、２００ｍＭリン酸緩衝剤、ｐＨ７．０、０．５ｍＬを溶液に添加して遊離亜鉛イオンを沈殿させ、混合物を、０．２μｍシリンジ滅菌フィルターを通して濾過する。亜鉛含有量を、ＩＣＰ−ＭＳを使用して、４−（２−ピリジルアゾ）−レゾルシノールアッセイにより測定する。例えば、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＧＡおよび結合亜鉛イオン４００μｇ／ｍＬを含有するＺｎＰＧＡのストック溶液を調製し、経口投与向けに使用してもよい。
【００８８】
実施例２
未結合の過剰な亜鉛を除去するために透析法を使用するｐＨ７．０でのＺｎＰＧＡの調製および特徴付け。
【００８９】
ＺｎＰＧＡを調製するため、α−ＰＧＡ５５ｍｇ、ナトリウム塩、６０ｋＤａ平均分子量（単分散）（Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を、１０ｍＭ  ＺｎＳＯ４を含有する１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．０、５ｍＬに室温で溶かし、次いで氷上に置きながら１０分間超音波処理する。次いで、溶液を、１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ７．０、１Ｌに対して２時間、連続的に３回、６時間にわたって計３回の容量について、氷上で透析する。回収された溶液を、０．２μｍシリンジ滅菌フィルターを通して濾過する。亜鉛含有量を、ＩＣＰ−ＭＳを使用して、４−（２−ピリジルアゾ）−レゾルシノールアッセイにより測定する。例えば、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＧＡおよび結合亜鉛イオン４００μｇ／ｍＬを含有するＺｎＰＧＡのストック溶液を調製し、経口投与向けに使用してもよい。
【００９０】
実施例３
液体製剤
例えば注射に適した液体製剤の例示的な実施形態の組成物は、亜鉛（ＩＩ）塩、α−ＰＧＡ、塩化ナトリウムおよび水を含む。組成物は、硫酸亜鉛七水和物、α−ＰＧＡナトリウム塩、６０ｋＤａ平均分子量（単分散）（Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）、塩化ナトリウムを組み合わせ、水を容量まで添加することにより調製され、ここで、各成分の濃度は、亜鉛（ＩＩ）  １ｍｇ／ｍＬ、α−ＰＧＡ  １０ｍｇ／ｍＬおよび塩化ナトリウム  ６．５ｍｇ／ｍＬである。おおよそ２７６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度およびｐＨ５．６８である結果として得られる組成物は、ヒト患者における注射に適している。
【００９１】
実施例４
４種の細胞型に対する、Ｚｎ（ＩＩ）／α−ＰＧＡ溶液、すなわち、異なるＺｎ（ＩＩ）濃度、６０ｋＤａのα−ＰＧＡポリマー、で処置した場合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存アッセイ。
【００９２】
Ａ．  Ｚｎ／α−ＰＧＡ溶液の調製。α−ＰＧＡ、ナトリウム塩、６０ｋＤａ平均分子量（単分散）（Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を調達し、Ｚｎ／α−ＰＧＡ溶液を、以下の通りにＺｎ（ＩＩ）の７つの濃度で調製した。α−ＰＧＡを水に溶かし、トリス−ＨＣｌを添加し、溶液をｐＨ７．０に緩衝化し、次いでＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを添加して、１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、および１００μｇ／ｍＬの亜鉛（ｉｉ）濃度を有する溶液を作製したが、ここで、亜鉛：グルタメートモノマーの比は、１：８であった。これらの溶液を、次に記載されるＭＴＴ細胞生存アッセイにおいて使用した。
【００９３】
Ｂ．  ＭＴＴアッセイ。ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、ＭＣＦ７、およびＡ５４９の各細胞について、Ｚｎ／α−ＰＧＡの細胞生存度への効果を、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］アッセイを使用して決定した。要約すると、密度４×１０４細胞／ウェルでの培養細胞（下を参照）を、９６ウェルプレート中に分注した。異なるＺｎ（ＩＩ）濃度を有するＺｎ／α−ＰＧＡの溶液を添加し（各条件は、４回繰返しでランした（Ｎ＝４））、２４時間インキュベーション後、ウェル内容物を遠心分離して細胞を収集し、培地を除去した。ＭＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍＬ標準液１５０μＬ）を、各ウェルに添加し、３時間インキュベートして結晶ホルマザン発色を可能とし、遠心分離して細胞および結晶ホルマザンを収集した。形成された結晶ホルマザンをＤＭＳＯ  ２００μＬに溶かし、５４０ｎｍで光学吸光度を測定することにより、細胞生存度を決定した。
【００９４】
Ｃ．  細胞培養。ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、ＭＣＦ７、およびＡ５４９の各細胞を、９６ウェル細胞培養プレート中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％抗生物質を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および（ＲＰＭＩ）２００μＬ中で、３７℃で９５％空気および５．０％ＣＯ２の加湿雰囲気下で２４時間培養した。
【００９５】
Ｄ．  アッセイの結果。アッセイの結果を図２に示す。その結果から、Ｚｎ／α−ＰＧＡが細胞毒性であり、６０ｋＤＡα−ＰＧＡポリマーに対してＺｎ（ＩＩ）濃度を高めると効果が高まることは、明らかである。
【００９６】
実施例５
α−ポリグルタミン酸−亜鉛液体組成物。
一実施形態にしたがって本発明を実施するのに有用な組成物を、表１に示す。組成物は、ワックスでコーティングされた粒子を含む液体懸濁液製剤として、１００ｇあたりＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）０．６８ｍｇを提供する。製剤を調製する方法は、表に従う。この組成物は、本発明に有用な多くの組成物のうちの１つの例示にすぎない。
【００９７】
【表１】
2021501143.tif 000003
【００９８】
Ａ．  コーティングされたＺｎＰＧＡマイクロスフェア（ｃＺＰＭ）の調製。スクロース１０ｇ（５％  ｗ／ｖ）、α−ＰＧＡ  ４５ｍｇおよび硫酸亜鉛七水和物１９．７９ｍｇ（元素のＺｎとして４．５ｍｇ）を含有する水２００ｍＬを調製し、凍結乾燥した。結果として得られる粉末を、コーンスターチ５％までを含有する微細スクロースと１：４の比で摩砕し、Ｎｏ．５０米国標準ステンレス鋼篩（４８メッシュ）を通して押圧する。この粉末を、４００ｍＬビーカー中の白色パラフィン油２００ｍＬに懸濁させる。混合物を、高トルク撹拌機（Ｔｙｐｅ  ＲＸＲ１、Ｃａｆｒａｍｏ、Ｗｉａｒｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ）に取り付けた４４ｍｍポリエチレン三枚刃パドルによる２６０ｒｐｍでの撹拌により分散させる。懸濁液に、１０％（ｗ／ｖ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース−フタレート（ＨＰＭＣ−Ｐ）を含むアセトン−９５％エタノール（９：１）２０ｍＬを添加する。撹拌を５分間継続し、それによりマイクロスフェアが形成し、次いで、クロロホルム７５ｍＬを添加する。懸濁媒体をデカントし、マイクロスフェアをクロロホルム７５ｍＬに短時間で再懸濁し、周囲温度で風乾する。乾燥したら、マイクロスフェアを、カルナウバワックスでコーティングする。具体的には、カルナウバワックス１ｇを、白色パラフィン油２００ｍＬに７０℃で溶かし、４５℃未満に冷却する。この冷却ワックス−パラフィン溶液に、調製したマイクロスフェアを添加し、一定の撹拌により１５分間懸濁させる。ワックス溶液をデカントし、マイクロスフェアを濾紙上で収集して、過剰なワックス溶液を吸収し、その結果、コーティングしたＺｎＰＧＡマイクロスフェア（ｃＺＰＭ）を得る。
【００９９】
Ｂ．  コーティングしたＺｎＰＧＡマイクロスフェア（ｃＺＰＭ）の液体懸濁液溶液の調製。以下の成分：キサンタンガム（例えば懸濁ポリマーとして）０．３ｇ；グアーガム（例えば増粘剤として）０．３ｇ；キシリトール（例えば甘味料として）１０ｇ；クエン酸緩衝剤（例えば緩衝剤として）０．５ｇ；リモネン（例えば香味料として）０．１ｇ；ソルビン酸カリウム（例えば保存剤として）０．０２５ｇを、水７８．７ｍＬに溶かす。水溶液のｐＨをｐＨ４．５に調整し、ｃＺＰＭ１０ｇを水溶液に懸濁させてｃＺＰＭの液体懸濁液を得る。
【０１００】
実施例６
α−ポリグルタミン酸−亜鉛組成物。
一実施形態にしたがって本発明を実施するのに有用な組成物を、表２に示す。組成物は錠剤あたりＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）２５ｍｇを提供する。製剤を調製する方法は、表に従う。この組成物は、本発明に有用な多くの組成物のうちの１つの例示にすぎない。
【０１０１】
【表２】
2021501143.tif 000004
【０１０２】
表２に示す組成物を用いるコーティングされた錠剤は、湿式造粒技法を使用して調製することができる。まず、硫酸亜鉛およびα−ポリグルタミン酸を、乾燥状態で一緒に混合する。微結晶性セルロース、デンプンおよび二酸化ケイ素をさらに添加し、乾燥成分を一緒に全てさらに混合する。混合成分を造粒機に移し、適切な量の水性エタノールを添加し、顆粒化を実施する。得られた顆粒化混合物を５０〜７０℃で乾燥して含水率約５％未満を有する顆粒化組成物を生じる。ステアリン酸マグネシウムを顆粒化組成物に添加し、これと混合する。得られた混合物を錠剤へと圧縮する。最後に、錠剤を、当業者であれば知っている、標準技法を使用して酢酸フタル酸セルロースでコーティングする。
【０１０３】
実施例７
α−ポリグルタミン酸−亜鉛組成物。
一実施形態にしたがって本発明を実施するのに有用な組成物を、表３に示す。組成物は錠剤あたりＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）３０ｍｇを提供する。製剤を調製する方法は、表に従う。この組成物は、本発明に有用な多くの組成物のうちの１つの例示にすぎない。
【０１０４】
【表３】
2021501143.tif 000005
【０１０５】
表３に示す組成物を用いるコーティングされた錠剤は、以下の通りに調製することができる。まず、硫酸亜鉛、α−ポリグルタミン酸、微結晶性セルロース、ＨＰＭＣ−Ｐ（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、マルトデキストリンおよびカルボキシメチルセルロース−カルシウムを、乾燥状態で一緒に混合する。混合成分を造粒機に移し、適切な量の７０％水性エタノールを添加し、湿式顆粒を実施した。得られた顆粒化混合物を約６０℃までで乾燥してＬＯＤ（乾燥減量）約３％未満を有する顆粒化組成物を生じる。シリカ（例えばＡｅｒｏｓｉｌ（登録商標））およびステアリン酸マグネシウムを、顆粒化組成物に添加し、これと混合する。得られた混合物を錠剤へと圧縮する。錠剤を、当業者であれば知っている、標準技法を使用して、ＨＰＭＣ−Ｐのイソプロピルアルコール溶液を使用してまずコーティングし、次いで第２のステップにおいてＨＰＭＣの水溶液を使用してコーティングする。
【図１】
2021501143.tif 000006
【図２】
2021501143.tif 000007
【国際調査報告】
2021501143.tif 000008
2021501143.tif 000009
2021501143.tif 000010