(57)【要約】  本発明は、コクヌストモドキ、トリボリウム・カスタネウム（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）のディフェンシン−３から誘導したペプチド、同ペプチドを含む医薬組成物、および、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌および真菌によって引き起こされる感染症の処置における、それらの抗菌剤としての使用に関連する。本発明は、また、癌、特に乳癌の処置における、前記ペプチドおよび同ペプチドを含む医薬組成物の使用に関連する。記載された化合物は、コクヌストモドキ（トリボリウム・カスタネウム）のディフェンシン３から誘導したペプチドである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から成るペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤または担体を含む、医薬組成物。
【請求項３】
前記担体が、脂質、ナノ乳剤、ポリマーミセル、ＳＣＫナノ粒子、リポソーム、ナノゲル、ヒドロゲル、リポプレックス、ポリプレックスからなる群から選択される、有機ナノ粒子；アルブミン、セルロース、キトサン、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ；ＭＥＡ）、ポリグリコラート（ＰＧＡ）、ポリ−（乳酸−グリコリド共重合体）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ｄ，１−ラクチド−グリコリド共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ポリ（ＨＰＭＡ）；ＰＨＰＭＡ）、およびデキストランからなる群から選択される、ポリマー；ポリエーテル−ヒドロキシルアミン（ＰＥＨＡＭ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエステルアミン、ポリプロピレンアミン、およびポリグリセロールからなる群から選択される、デンドリマー；カーボンナノチューブ、ポリ（ｄ，１−ラクチド−グリコリド共重合体）（ＰＬＧＡ）のナノファイバー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のナノファイバー、キトサンのナノファイバー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）のナノファイバー、ポリラクチド（ＰＬＡ）のナノファイバー；ＰＨＰＭＡ）、ポリエチレンオキシドのナノファイバー、およびポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）のナノファイバーからなる群から選択される、ナノファイバー；および、金ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、酸化チタンナノ粒子、酸化白金ナノ粒子、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ−ＮＰｓ）、ダイヤモンド・ベースのナノ粒子およびＱＤナノ粒子、からなる群から選択される、無機ナノ粒子、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
さらに抗生剤を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
上記抗生剤が、フシジン酸、アルスフェナミン、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、エタンブトール、ホスホマイシン、フラゾリドン、イソニアジド、リンコマイシン、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、ピラジナミド、プラテンシマイシン、キヌプリスチン、リファンピシン、およびチニダゾールからなる群、または、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェネム、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド、およびテトラサイクリンから選択される、抗生物質のクラスから選択されることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
薬剤として使用するための、請求項１に記載のペプチド、または請求項２から５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
抗菌性薬剤として使用するための、請求項６に記載のペプチドまたは医薬組成物。
【請求項８】
グラム陽性細菌、グラム陰性細菌および真菌によって引き起こされた感染症の処置において抗菌性薬剤として使用するための、請求項７に記載のペプチドまたは医薬組成物。
【請求項９】
前記グラム陽性細菌が黄色ブドウ球菌であることを特徴とする、請求項８に記載のペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１０】
前記グラム陰性細菌が大腸菌であることを特徴とする、請求項８に記載のペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１１】
前記真菌が鵞口瘡カンジダであることを特徴とする、請求項８に記載のペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１２】
癌の処置において使用される、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むペプチド、または配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むペプチドと少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤または担体等を含む医薬組成物。
【請求項１３】
癌が、乳癌、抗ＨＥＲ２耐療法性の乳癌、乳癌腫、乳腺腺癌、胃癌、胃腺癌、結腸癌、結腸腺癌、膵臓癌、膵臓腺癌、腎細胞癌、明細胞の腎細胞癌、卵巣癌、卵巣腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、肺癌、肺腺癌、非小赤血球の肺癌、小細胞肺癌、甲状腺癌、転移性乳頭甲状腺癌、甲状腺濾胞腺癌、膀胱癌、膀胱の移行上皮癌、前立腺細胞腫、中枢神経系グリア系譜癌（神経膠腫）、肉腫、線維肉腫、悪性の線維性組織球腫、ヒト・ユーイング肉腫、子宮内膜間質肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、黒色腫、胎児性癌、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、腎芽細胞腫、肝芽腫、血液癌、Ｂ細胞またはＴ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞またはＴ細胞非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、Ｂ細胞またはＴ細胞リンパ腫および多発性骨髄腫、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１４】
前記癌が乳癌であることを特徴とする、請求項１３に記載のペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１５】
前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌であることを特徴とする、請求項１４に記載のペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１６】
癌の処置において、化学療法剤による処置、免疫療法剤による処置、または放射線療法による処置と組み合わせて使用される、請求項１２〜１５のいずれかに記載のペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１７】
前記化学療法剤が、アナストロゾール、カペシタビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、シスプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エリブリン、フルベストラント、イミキモド、レトロゾール、パクリタキセル、ロミデプシン、トリシリビン、エキセメスタン、５−フルオロウラシルおよびゲムシタビンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載のペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１８】
前記免疫療法剤が、ドヴィチニブ、イピリムマブ、ラパチニブ、マルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、ネラチニブ、ニボルマブ、オラパリブ、パルボシクリブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ルキソリチニブ、トラスツズマブおよびベリパリブからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載のペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１９】
担体が、脂質、ナノ乳剤、ポリマーミセル、ＳＣＫナノ粒子、リポソーム、ナノゲル、ヒドロゲル、リポプレックス、ポリプレックスからなる群から選択される、有機ナノ粒子；アルブミン、セルロース、キトサン、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ；ＭＥＡ）、ポリグリコラート（ＰＧＡ）、ポリ−（乳酸−グリコリド共重合体）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ｄ，１−ラクチド−グリコリド共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ポリ（ＨＰＭＡ）；ＰＨＰＭＡ）、およびデキストランからなる群から選択される、ポリマー；ポリエーテル−ヒドロキシルアミン（ＰＥＨＡＭ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエステルアミン、ポリプロピレンアミン、およびポリグリセロールからなる群から選択される、デンドリマー；カーボンナノチューブ、ポリ（ｄ，１−ラクチド−グリコリド共重合体）（ＰＬＧＡ）のナノファイバー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のナノファイバー、キトサンのナノファイバー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）のナノファイバー、ポリラクチド（ＰＬＡ）のナノファイバー；ＰＨＰＭＡ）、ポリエチレンオキシドのナノファイバー、およびポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）のナノファイバーからなる群から選択される、ナノファイバー；および、金ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、酸化チタンナノ粒子、酸化白金ナノ粒子、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ−ＮＰｓ）、ダイヤモンド・ベースのナノ粒子およびＱＤナノ粒子、からなる群から選択される、無機ナノ粒子、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２から１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
化学療法剤または免疫療法剤をさらに含む、請求項１２〜１９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記化学療法剤が、アナストロゾール、カペシタビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、シスプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エリブリン、フルベストラント、イミキモド、レトロゾール、パクリタキセル、ロミデプシン、トリシリビン、エキセメスタン、５−フルオロウラシルおよびゲムシタビンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記免疫療法剤が、ドヴィチニブ、イピリムマブ、ラパチニブ、マルゲツキシマブ、ネラチニブ、ニボルマブ、オラパリブ、パルボシクリブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ルキソリチニブ、トラスツズマブおよびベリパリブからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陽性またはグラム陰性の細菌および真菌によって生じる感染症の処置において、抗菌剤として使用するための化合物および医薬組成物に関する。本発明は、さらに癌、具体的には乳癌の処置おいて使用される、化合物および医薬組成物に関する。開示された化合物は、コクヌストモドキ、トリボリウム・カスタネウム（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）のディフェンシン３から誘導したペプチドである。
【背景技術】
【０００２】
抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）は、従来の抗生剤とは異なる作用機序をもつため、新しい抗生剤に対する有望な候補である。それらは、抗生剤抵抗性の発達を妨げるための優れた薬剤である。抗菌性ペプチドが細胞死を促進する割合は、抵抗性を発達させる可能性の減少に寄与する付加的な要素である。加えて、これらのペプチドは従来の抗生剤と共に、それらの治療活性を強化および改善しつつ、相乗的に作用することもできる。
【０００３】
抗菌性ペプチドは、小さなサイズ、全体的に存在する正電荷、および、それらに対して両親媒性の特性を与える、疎水性の残基と親水性の残基との比率を持つ。疎水性とカチオンの性質の組み合わせは、それらが、一般的に脂質に富んだアニオンの表面をもつ微生物の細胞膜と静電気的に相互作用することを可能にする。
【０００４】
これらのペプチドは、細菌から脊椎動物まで、また真菌、昆虫および植物も同様に、すべての生物の生得免疫の一部を形成するが、同じ程度までではない。無脊椎動物において、それらが免疫系の主要な防御ツールを構成する一方、脊椎動物において、それらはさらに、走化活性、炎症誘発性シグナル伝達、および治癒経過における補助を通じて適応免疫を調整する。
【０００５】
トリボリウム・カスタネウム、すなわちコクヌストモドキは保存食糧への食害の原因である昆虫であり、および、発生生物学、進化、免疫、などの研究に対するモデル生物である。
【０００６】
文献Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂｔ）に対する甲虫類トリボリウム・カスタネウム（Ｔｃ）のディフェンシンの断片の抗菌効果を開示する。この細菌の昆虫病原性の毒素Ｃｒｙ３ＡａおよびＣｒｙ３Ｂａが存在する状態で、昆虫の幼虫は、トリボリウム・カスタネウムのディフェンシン２およびディフェンシン３（ＴｃＤｅｆ２およびＴｃＤｅｆ３）の発現を誘発する免疫反応を発達させる。前記文献は、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ、２９のアミノ酸を備えたＴｃＤｅｆ２のペプチド断片が、大腸菌、黄色ブドウ球菌および鵞口瘡カンジダに対する抗菌活性を持ち、特に著しいのは、黄色ブドウ球菌の感受性であることを開示している。ペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐは、本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として特定された配列に相当する。
【０００７】
文献Ｒａｊａｍｕｔｈｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５は、黄色ブドウ球菌に対する活性を備えた抗菌性ペプチドを開示する。著者は、トリボリウム・カスタネウム（ＸＭ＿９６８４８２、ペプチドのコードはＸＰ＿９７３５７５．３）から得られた抗菌活性を備えたペプチドを開示する。この論文の著者たちはディフェンシン１に言及するが、図１Ａにおいて示されるアミノ酸配列はトリボリウム・カスタネウムのディフェンシン３に相当する。
【０００８】
文献Ｔｏｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５は、グラム陽性細菌に対するトリボリウム・カスタネウムのディフェンシンの抗菌活性を開示する。３つのディフェンシン（Ｄｅｆ１、Ｄｅｆ２およびＤｅｆ３）はミクロコッカス・ルテウスおよびバチルス・チューリンゲンシスに対する活性を持ち、一方、Ｄｅｆ１およびＤｅｆ２のみが表皮ブドウ球菌に対する活性を持つ。著者たちは、黄色ブドウ球菌に対するディフェンシンの活性をテストして、この生体に対する抗菌活性の不足を認めた（上記文献における図２）。
【０００９】
死亡率が最も高い５つのタイプの癌は、肺癌、肝臓癌、大腸癌、胃癌、および乳癌である。具体的には、乳癌はヨーロッパにおいて発生率が最も高く（４５８，７１８件、全体の１３％）、および世界的は２番目に発生率が高く（１７０万件、ケース全体の１２％）、死亡率に関してそれぞれ第３位および第５位の位置を占める。
【００１０】
乳癌種は、組織学、分子マーカー、および機能的といった異なる分類システムへのニーズを生じさせる幅広い異質性を備えた新生物を示す。臨床の見地から最も広く用いられている分類は、分子マーカーに関連したものであり、それはエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびヒト上皮成長因子２（ＨＥＲ２）を含む。これらのマーカーの存在または不在に応じて、乳房の腫瘍は４つの基本的な亜型へ分類することができる：ＥＲ陽性またはＰＲ陽性およびＨＥＲ２陰性（［ＥＲ＋｜ＰＲ＋］ＨＥＲ２−）、ＥＲ陽性またはＰＲ陽性およびＨＥＲ２陽性（［ＥＲ＋｜ＰＲ＋］ＨＥＲ２＋）、ＨＥＲ２陽性としても知られる、ＥＲ陽性およびＰＲ陰性およびＨＥＲ２陽性（［ＥＲ−｜ＰＲ−］ＨＥＲ２＋）、および最後に、最悪の予後を伴う最も攻撃的な形態であるトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）としても知られるＥＲ陰性およびＰＲ陰性およびＨＥＲ２陰性（［ＥＲ−｜ＰＲ−］ＨＥＲ２−）がある。
【００１１】
乳癌の処置は、各被験体対して個別化されたマルチ・ディシプリナリー・アプローチを必要とし、それは手術、放射線療法、化学療法およびホルモン療法を併用する。トリプルネガティブ乳癌は、受容体の欠如によりホルモン療法に反応しないので、いくつかの付加的な問題を引き起こし、それは、他の乳房の腫瘍の４倍の転移リスクに関連し、および、再発のピーク・リスクは１年目および３年目の間で認められ、およびほとんどの死亡は最初の５年に起きる。化学療法はＴＮＢＣにおける結果を改善するただ一つの処置であるが、正常細胞に対するその高い細胞毒性および化学療法抵抗性の出現は、分子標的療法などの他の処置オプションについての研究へとつながっている。不運にも、これらの療法のほとんどは腫瘍細胞による抵抗性獲得に関連し、それは処置の効能を制限する。興味深い改善策としては、選択的に腫瘍細胞を死滅させるか、またはそれらの増殖を制限し、および、既知の抵抗性メカニズムによる影響を受けないトリプルネガティブ乳癌に対する新薬の開発であろう。
【発明の概要】
【００１２】
抗菌活性を備えた生成物のコンテキストでは、当該技術分野における問題は、当該技術分野において記載されるトリボリウム・カスタネウムのディフェンシン３から誘導されたペプチドに対する抗菌活性が改善された、トリボリウム・カスタネウムのディフェンシン３から誘導した抗菌活性を備えたペプチドを見つけることである。
【００１３】
本発明は、当該技術分野において記載されていないペプチドおよびその医薬組成物を提供して上記問題を解決する。この新しいペプチドおよびその医薬組成物には予期しない効果があり、および当該技術分野において開示された抗菌活性を備えたトリボリウム・カスタネウムのディフェンシン３から誘導した他のペプチドに対して、黄色ブドウ球菌に対する活性の増加が示される。
【００１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を備えたペプチドには、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５において開示されたペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐと比較して各末端に付加的なアミノ酸、３１のアミノ酸があり、り、このことが２つのペプチド間の構造の違いとなっている。
【００１５】
Ｒａｊａｍｕｔｈｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５に開示されたＴｃａ１と名付けられたペプチドは、黄色ブドウ球菌に対する活性を示すが、その配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の３１のアミノ酸の代わりに４４のアミノ酸を持っている。
【００１６】
癌に対する活性をもつ生成物のコンテキストでは、当該技術分野の問題は、癌の処置に使用するための有効な化合物の提供にある。
【００１７】
本発明は、癌の処置に使用するのに有効な、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むペプチドおよびその医薬組成物を提供して上記問題を解決する。癌の処置におけるこの新規用途は、当該技術分野において従来記載されていない。
【００１８】
本明細書において、用語「ＰａＳＫ」は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によって特定されるペプチドを指す。従って、本明細書において、用語および語句「ＰａＳＫ」、「配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から成るペプチド」および「配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１」は交換可能である。
【００１９】
本明細書において、用語「ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ」は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によって特定されるペプチドを指す。従って、本明細書において、用語および語句「ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ」、「配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２から成るペプチド」および「配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２」は交換可能である。
【００２０】
ペプチドおよびペプチドを含む医薬組成物
本発明は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から成るペプチドを提供する。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤または担体から成る医薬組成物を提供する。
【００２２】
一実施形態において、担体は、脂質、ナノエマルジョン、ポリマーミセル、ＳＣＫナノ粒子、リポソーム、ナノゲル、ヒドロゲル、リポプレックス、ポリプレックスからなる群から選択される、有機ナノ粒子；アルブミン、セルロース、キトサン、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ；ＭＥＡ）、ポリグリコラート（ＰＧＡ）、ポリ−（乳酸−グリコリド共重合体）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ｄ，１−ラクチド−グリコリド共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ポリ（ＨＰＭＡ）；ＰＨＰＭＡ）、およびデキストランからなる群から選択されるポリマー；ポリエーテル−ヒドロキシルアミン（ＰＥＨＡＭ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエステルアミン（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒａｍｉｎｅ）、ポリプロピレンアミン、およびポリグリセロールからなる群から選択される、デンドリマー；カーボンナノチューブ、ポリ（ｄ，１−ラクチド−グリコリド共重合体）（ＰＬＧＡ）のナノファイバー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のナノファイバー、キトサンのナノファイバー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）のナノファイバー、ポリラクチド（ＰＬＡ）のナノファイバー；ＰＨＰＭＡ）、ポリエチレンオキシドのナノファイバー、およびポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）のナノファイバーからなる群から選択される、ナノファイバー；および、金ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、酸化チタンナノ粒子、酸化白金ナノ粒子、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ−ＮＰｓ）、ダイヤモンド・ベースのナノ粒子およびＱＤナノ粒子、からなる群から選択される、無機ナノ粒子、からなる群から選択される。
【００２３】
本明細書において、用語「ナノエマルジョン」は、２種の相互不溶性液体と飛散した滴剤を安定させる乳化剤との不均質混合物を指す。
【００２４】
本明細書において、用語「ポリマーミセル」は、水性媒体において自己構築する両親媒性のコポリマー鎖を指し、それは親水性の冠に囲まれた疎水性の核を示す。ポリマーミセルはポリイオン複合体（ＰＩＣ）および高分子金属錯体ミセルを含む。
【００２５】
頭字語「ＳＣＫ」は「架橋性クネーデル様殻」を指す。本明細書において、用語「ＳＣＫナノ粒子」は、ポリマーミセルにおいて自己構築する両親媒性のコポリマー鎖を指し、そこでは外殻の中に選択的な架橋がある。
【００２６】
本明細書において、用語「リポプレックス」は、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）とカチオン脂質によって形成される複合体を指し、ペグ化リポプレックスを含む。
【００２７】
本明細書において、用語「ポリプレックス」は、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）およびポリマーによって形成される複合体を指し、ペグ化ポリプレックスを含む。
【００２８】
本明細書において、用語「カーボンナノチューブ」は単層壁または多重壁を備えた円筒状のグラファイト・シートを指す。
【００２９】
頭字語「ＳＰＩＯ−ＮＰ」は「超常磁性酸化鉄ナノ粒子」を指す。
【００３０】
頭字語「ＱＤ」は「量子ドット」を指す。本明細書において、用語「ＱＤナノ粒子」は、撮像において蛍光体として広く使用される、半導体の無機のナノ粒子を指す。
【００３１】
一実施形態において、医薬組成物は、有効な量の配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１からなるペプチドを含む。
【００３２】
本発明のために、有効な量は、熟練した観察者によって認識されるように、被験体の状態において客観的に識別可能な改善を提供する化合物の量として定義され、および、その場合、上記被験体は上記量の化合物を含む医薬組成物により処置される。
【００３３】
本発明の目的のために、薬学的に許容可能な賦形剤は、共溶媒、界面活性剤、油、湿潤剤、皮膚軟化剤、保存剤、安定剤、および抗酸化剤などの不活性成分であるが、これらに限定されない。例えば、上記賦形剤またはビヒクルは希釈剤でありえる。医薬組成物は、結晶質、粉末、粒状、圧縮された固体、液体、溶液、懸濁液、エリキシル、シロップ、エマルジョン、クリーム、ゲル、ドロップ、ミスト、蒸気、または砕かれた形態であり得る。従来の技術は医薬組成物を調製するために使用することができる。例えば、医薬組成物はカプセル、錠剤、丸剤、長方形の丸剤、ブリスタ、エンベロープ、注射器、カートリッジ、噴霧剤または他の包装容器において含むことができる。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、単独で、または他の有効成分と組み合わせて投与することができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、処置が局所的か全身的かにより、および、処置する領域により、様々な方法で被験体に投与することができる。従って、例えば、本発明の医薬組成物は、被験体に対して、目、膣、直腸、鼻腔、口腔の経路で、および、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、直腸内、動脈内、リンパ管内、静脈内、脊髄腔内、眼内、頭蓋内、または気管内の経路で吸入により、または非経口的に、投与することができる。非経口投与は、使用される場合、一般的に注射によって実行される。注射のための溶液は、液体溶液または懸濁液、注射の前に溶解させる又は懸濁液に入れられるのに適した固体形態またはエマルジョンなどの様々な方法で調製することができる。非経口投与の他の形態は、持続的な投与量を得るために長時間放出システム、または徐放性システムを使用する。非経口投与のための調製は、水性または非水性の無菌液、懸濁液、およびエマルジョンを含み、緩衝液、希釈剤または他の添加物含み得る。非水溶媒の例は次のとおりである：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびエチルオレエートなどの注射のための有機エステル。水溶媒の例は、常水、生理食塩水および緩衝液を含む、水溶液、エマルジョンまたは懸濁液である。非経口のビヒクルの例は次のとおりである：塩化ナトリウム溶液、リンゲル液デキストロース、塩化ナトリウムおよびデキストロース、など。抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤および他の添加物も存在し得る。局所投与のための製剤はクリーム剤、ローション剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、エアゾール剤、液体および粉末剤を含むことができる。特定の従来の医薬担体、水性基剤、油性基剤、増粘剤もまた必要とされ得る。経口投与のための組成物は粉末剤または果粒剤、水または非水性媒体のなかの懸濁液または、カプセル剤または錠剤を含み得る。粘稠化剤、芳香、賦形剤、乳化剤、分散剤などを含むことは望ましい場合がある。
【００３６】
本発明の医薬組成物は一回の、または複数回の投与量において投与することができる。
【００３７】
一実施形態において、医薬組成物は抗生剤も含む。
【００３８】
一実施形態において、上記抗生剤は、フシジン酸、アルスフェナミン、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、エタンブトール、ホスホマイシン、フラゾリドン、イソニアジド、リンコマイシン、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、ピラジナミド、プラテンシマイシン、キヌプリスチン、リファンピシン、およびチニダゾールからなる群、または、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェネム、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、マクロライド、モノバクタム（ｍｏｎｏｂａｃｔａｍｉｃｓ）、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド、およびテトラサイクリンから選択される、抗生物質のクラスから選択される。
【００３９】
薬剤および抗菌剤として使用される、ペプチドまたは医薬組成物
一実施形態において、本発明は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から成るペプチドまたは薬剤として使用される医薬組成物を提供する。
【００４０】
一実施形態において、本発明は抗菌薬として使用するためのペプチドまたは医薬組成物に関する。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌および真菌によって生じる感染症の処置における抗菌薬として使用するための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から成るペプチド、または同じものを含む医薬組成物に関する。
【００４２】
好ましい実施形態において、上記グラム陽性細菌は黄色ブドウ球菌である。
【００４３】
好ましい実施形態において、上記グラム陰性細菌は大腸菌である。
【００４４】
好ましい実施形態において、上記真菌は鵞口瘡カンジダである。
【００４５】
癌の処置で使用される、ペプチドまたは医薬組成物
一実施形態において、本発明は、癌の処置において使用するための、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むペプチド、または上記ペプチドおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
一実施形態において、医薬組成物は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む有効な量のペプチドを含む。
【００４７】
薬学的に許容可能な賦形剤は：共溶媒、界面活性剤、油、湿潤剤、皮膚軟化剤、保存剤、安定剤、および抗酸化剤などの、しかし限定されない、不活性成分である。例えば、上記賦形剤またはビヒクルは希釈剤であり得る。医薬組成物は、結晶質、粉末、粒状、圧縮された固体、液体、溶液、懸濁液、エリキシル、シロップ、エマルジョン、クリーム、ゲル、ドロップ、ミスト、蒸気、または砕かれた形態であり得る。従来の技術は医薬組成物を調製するために使用することができる。例えば、医薬組成物は次のものに含まれ得る：カプセル剤、錠剤、丸剤、長方形の丸剤、ブリスタ、エンベロープ、注射器、カートリッジ、噴霧剤または他の容器。
【００４８】
医薬組成物は、単独で、または他の有効成分と組み合わせて投与することができる。
【００４９】
医薬組成物は、処置が局所的か全身的かにより、および、処置する領域により、様々な方法で被験体に投与することができる。従って、例えば、医薬組成物は、被験体に対して、目、膣、直腸、鼻腔、口腔の経路で、吸入により、または非経口的に、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、直腸内、動脈内、リンパ管内、静脈内、脊髄腔内、眼内、頭蓋内、または気管内の経路によって、投与することができる。非経口投与は、使用される場合、一般的に注射によって実行される。注射のための溶液は、液体溶液または懸濁液、注射の前に溶解させる又は懸濁液に入れられるのに適した固体形態またはエマルジョンなどの様々な方法で調製することができる。非経口投与の他の形態は、持続的な投与量を得るために長時間放出システム、または徐放性システムを使用する。非経口投与のために調製は水性か非水性の無菌液、懸濁液およびエマルジョンを含み、緩衝液、希釈液または他の添加物をまた内蔵することができる。非水溶媒の例は次のとおりである:プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびエチルオレエートなどの注射のための有機エステル。水溶媒の例は、常水、生理食塩水および緩衝液を含む、水溶液、エマルジョンまたは懸濁液である。非経口のビヒクルの例は次のとおりである:塩化ナトリウム溶液、リンゲル液デキストロース、塩化ナトリウムおよびデキストロース、など。抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤および他の添加物も存在し得る。局所投与のための製剤はクリーム剤、ローション剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、エアゾール剤、液体および粉末剤を含むことができる。特定の従来の医薬担体、水性基剤、油性基剤、増粘剤もまた必要とされ得る。経口投与のための組成物は粉末剤または果粒剤、水または非水性媒体の中の懸濁液、または、カプセル剤または錠剤を含み得る。粘稠化剤、芳香、賦形剤、乳化剤、分散剤などを含むことは望ましい場合がある。
【００５０】
医薬品組成物は単一か複数回投与において投与することができる。
【００５１】
ある具体的な実施形態において、本発明は、癌の処置において使用するための、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１からなるペプチド、またはペプチドおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００５２】
一実施形態において、癌は、乳癌、抗ＨＥＲ２耐療法性の乳癌、乳癌腫、乳腺腺癌、胃癌、胃腺癌、結腸癌、結腸腺癌、膵臓癌、膵臓腺癌、腎細胞癌、明細胞の腎細胞癌、卵巣癌、卵巣腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、肺癌、肺腺癌、非小赤血球の肺癌、小細胞肺癌、甲状腺癌、転移性乳頭甲状腺癌、甲状腺濾胞腺癌、膀胱癌、膀胱の移行上皮癌、前立腺細胞腫、中枢神経系グリア系譜癌（神経膠腫）、肉腫、線維肉腫、悪性の線維性組織球腫、ヒト・ユーイング肉腫、子宮内膜間質肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、黒色腫、胎児性癌、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、腎芽細胞腫、肝芽腫、血液癌、Ｂ細胞またはＴ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞またはＴ細胞非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、Ｂ細胞またはＴ細胞リンパ腫および多発性骨髄腫、からなる群から選択される。
【００５３】
好適な実施形態では、癌は乳癌である。
【００５４】
さらに好適な実施形態では、乳癌は、化学療法抵抗性のトリプルネガティブ乳癌である。
【００５５】
本発明のペプチドは、それらの固有の抗発癌活性を働かせることを可能にして、または、他の治療剤との相乗作用において、異種の腫瘍細胞に対して効率的に相互に作用し、および抵抗性の発達について他の治療剤よりも低い見込みをもたらす。
【００５６】
一実施形態において、ペプチドまたは医薬組成物は、化学療法剤、免疫療法剤、または放射線療法を伴う処置と組み合わせて、癌を処置するために使用される。
【００５７】
一実施形態において、上記化学療法剤は、以下からなる群から選択される：アナストロゾール、カペシタビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、シスプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エリブリン、フルベストラント、イミキモド、レトロゾール、パクリタキセル、ロミデプシン、トリシリビン、エキセメスタン、５−フルオロウラシル、およびゲムシタビン。
【００５８】
一実施形態において、上記免疫療法剤は、以下からなる群から選択される：ドヴィチニブ（ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ）、イピリムマブ、ラパチニブ、マルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、ネラチニブ、ニボルマブ、オラパリブ、パルボシクリブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ルキソリチニブ、トラスツズマブおよびベリパリブ（ｖｅｌｉｐａｒｉｂ）。
【００５９】
癌の処置のために使用される医薬組成物の一実施形態において、前記担体は、脂質、ナノエマルジョン、ポリマーミセル、ＳＣＫナノ粒子、リポソーム、ナノゲル、ヒドロゲル、リポプレックス、ポリプレックスからなる群から選択される、有機ナノ粒子；アルブミン、セルロース、キトサン、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ；  ＭＥＡ）、ポリグリコラート（ＰＧＡ）、ポリ−（乳酸−グリコリド共重合体）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ｄ，１−ラクチド−グリコリド共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ポリ（ＨＰＭＡ）；ＰＨＰＭＡ）、およびデキストランからなる群から選択される、ポリマー；ポリエーテル−ヒドロキシルアミン（ＰＥＨＡＭ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエステルアミン（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒａｍｉｎｅ）、ポリプロピレンアミン、およびポリグリセロールからなる群から選択される、デンドリマー；カーボンナノチューブ、ポリ（ｄ，１−ラクチド−グリコリド共重合体）（ＰＬＧＡ）のナノファイバー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のナノファイバー、キトサンのナノファイバー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）のナノファイバー、ポリラクチド（ＰＬＡ）のナノファイバー；ＰＨＰＭＡ）、ポリエチレンオキシドのナノファイバー、およびポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）のナノファイバーからなる群から選択される、ナノファイバー；および、金ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、酸化チタンナノ粒子、酸化白金ナノ粒子、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ−ＮＰｓ）、ダイヤモンド・ベースのナノ粒子およびＱＤナノ粒子、からなる群から選択される、無機ナノ粒子、からなる群から選択される。
【００６０】
一実施形態において、癌の処置のために使用される医薬組成物はさらに化学療法剤または免疫療法剤を含む。
【００６１】
好ましい実施形態において、ペプチドおよび化学療法剤または免疫療法剤の組み合わせは、前記組み合わせの各メンバーの個別の投与と比較して、改良された癌の処置を達成する。
【００６２】
一実施形態において、前記化学療法剤は以下のものからなる群から選択される：アナストロゾール、カペシタビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、シスプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エリブリン、フルベストラント、イミキモド、レトロゾール、パクリタキセル、ロミデプシン、トリシリビン、エキセメスタン、５−フルオロウラシル、およびゲムシタビン。
【００６３】
一実施形態において、前記免疫療法剤は以下のものからなる群から選択される：ドヴィチニブ、イピリムマブ、ラパチニブ、マルゲツキシマブ、ネラチニブ、ニボルマブ、オラパリブ、パルボシクリブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ルキソリチニブ、トラスツズマブ、およびベリパリブ。
【００６４】
実施例３および４の結果は、ＰａＳＫ（配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１からなるペプチド）が、腫瘍の成長および増殖を阻害して細胞周期の進行を制御し、トリプルネガティブ乳癌細胞のＧ１／Ｓ遷移に影響を与えることを示す。ｐ５３腫瘍抑制タンパク質は、一般的に遺伝毒性ストレスに応じて細胞周期の中断およびアポトーシスを媒介する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はｐ５３を非機能性にする特定の変異を内に有する。従って、ｐ５３に左右されないＰａＳＫによるトリプルネガティブ乳癌細胞の成長および増殖の阻害は、ｐ５３がしばしば突然変異する乳房の腫瘍における治療用途にとってペプチドＰａＳＫを重要なものたらしめている。
【００６５】
定義
本明細書において、用語「癌」は、すべてのタイプの腫瘍形成性のおよび／または癌性の成長過程を包含し得る。いくつかの実施形態において、癌は、転移性の組織、または、悪性形質転換を伴う細胞、組織または器官と同様に、原発腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、癌は、癌のすべての病理組織学の、および侵襲性／重篤度などの段階を包含する。いくつかの実施形態において、癌は、再発癌および／または耐性癌を含む。用語「癌」および「腫瘍」は、同義語として用いることができる。
【００６６】
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似している、および同等である方法および材料は、本発明の実施において使用され得る。
【００６７】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｔｈａｔ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」およびそれらの変形は、非限定的な性質であって、および従って、他の技術的特徴を除外するものではない。
【００６８】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｉｎ）」または「からなる（ｔｈａｔ  ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｉｎ）」は、特に生物学的配列に関する時、本発明の化合物が、正確な方法において、規定された配列によって特定された断片に限定されることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１Ａ】ペプチドｈＢＤ−３、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＰａＳＫの黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性。陰性対照（Ａ）および陽性対照ｈＢＤ−３（Ｂ）のフローサイトメーター・ウィンドウにおいて得られた蛍光グラフ。ペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ（Ｃ）およびＰａＳＫ（Ｄ）のフローサイトメーター・ウィンドウにおいて得られた蛍光グラフ。縦軸において、ＦＩＴＣはフルオレセインを指し、ＳＹＢＲグリーンを組込んだ細胞を示す。横軸において、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−Ａはペリジニン−クロロフィル・タンパク質を指し、ヨウ化プロピジウムを取り込んだ細胞に対応する。ウィンドウＰ２は生細胞を示し、および、Ｐ３は死細胞を示す。
【図１Ｂ】ペプチドｈＢＤ−３、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＰａＳＫの黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性。陰性対照（Ａ）および陽性対照ｈＢＤ−３（Ｂ）のフローサイトメーター・ウィンドウにおいて得られた蛍光グラフ。ペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ（Ｃ）およびＰａＳＫ（Ｄ）のフローサイトメーター・ウィンドウにおいて得られた蛍光グラフ。縦軸において、ＦＩＴＣはフルオレセインを指し、ＳＹＢＲグリーンを組込んだ細胞を示す。横軸において、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−Ａはペリジニン−クロロフィル・タンパク質を指し、ヨウ化プロピジウムを取り込んだ細胞に対応する。ウィンドウＰ２は生細胞を示し、および、Ｐ３は死細胞を示す。
【図１Ｃ】ペプチドｈＢＤ−３、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＰａＳＫの黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性。陰性対照（Ａ）および陽性対照ｈＢＤ−３（Ｂ）のフローサイトメーター・ウィンドウにおいて得られた蛍光グラフ。ペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ（Ｃ）およびＰａＳＫ（Ｄ）のフローサイトメーター・ウィンドウにおいて得られた蛍光グラフ。縦軸において、ＦＩＴＣはフルオレセインを指し、ＳＹＢＲグリーンを組込んだ細胞を示す。横軸において、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−Ａはペリジニン−クロロフィル・タンパク質を指し、ヨウ化プロピジウムを取り込んだ細胞に対応する。ウィンドウＰ２は生細胞を示し、および、Ｐ３は死細胞を示す。
【図１Ｄ】ペプチドｈＢＤ−３、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＰａＳＫの黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性。陰性対照（Ａ）および陽性対照ｈＢＤ−３（Ｂ）のフローサイトメーター・ウィンドウにおいて得られた蛍光グラフ。ペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ（Ｃ）およびＰａＳＫ（Ｄ）のフローサイトメーター・ウィンドウにおいて得られた蛍光グラフ。縦軸において、ＦＩＴＣはフルオレセインを指し、ＳＹＢＲグリーンを組込んだ細胞を示す。横軸において、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−Ａはペリジニン−クロロフィル・タンパク質を指し、ヨウ化プロピジウムを取り込んだ細胞に対応する。ウィンドウＰ２は生細胞を示し、および、Ｐ３は死細胞を示す。
【図２】ペプチドｈＢＤ−３、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＰａＳＫの間における、黄色ブドウ球菌に対する細胞毒性の比較。活性は２つの複製において２５μｇ／ｍＬの濃度で測定された。示されているのは、陰性対照（対照）、陽性対照ｈＢＤ−３、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＰａＳＫの活性である。グラフは、対応する標準偏差を備えた２つの複製に対する平均値を示す。
【図３】黄色ブドウ球菌に対するペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＰａＳＫの抗菌活性。点は、対応する標準偏差を備えた２つの複製の平均値を表わす。ペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐに関するデータはＣｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５から得た。
【図４】走査電子顕微鏡法によって得られた、黄色ブドウ球菌においてペプチドによって生じた損傷の画像。ペプチドにより処置されなかった細胞（Ａ−Ｂ）、および、ｈＢＤ−３（Ｃ−Ｄ）、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ（Ｅ−Ｆ）およびＰａＳＫ（Ｇ−Ｈ）により、２５μｇ／ｍＬの濃度で１時間処置された細胞が示される。実線の矢印は、細胞膜における破裂および膨張を示す。破線の矢印は細胞質破片を示す。目盛りを表わす数は、３μｍ（Ａ）、２μｍ（Ｂ）、４μｍ（Ｃ）、２μｍ（Ｄ）、４μｍ（Ｅ）、５００ｎｍ（Ｆ）、２μｍ（Ｇ）および２μｍ（Ｈ）である。
【図５Ａ】走査電子顕微鏡法によって得られた、２５μｇ／ｍＬの濃度のＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ（Ａ）およびＰａＳＫ（Ｂ）により１時間処置された黄色ブドウ球菌の細胞によって生成されたバイオフィルムの画像。目盛りにおいて表わされた数は、１μｍ（Ａ、上の画像）、２μｍ（Ａ、中央の画像）、４μｍ（Ａ、下の画像）、４μｍ（Ｂ、上の画像）、２μｍ（中央の画像）および３μｍ（下の画像）である。
【図５Ｂ】走査電子顕微鏡法によって得られた、２５μｇ／ｍＬの濃度のＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ（Ａ）およびＰａＳＫ（Ｂ）により１時間処置された黄色ブドウ球菌の細胞によって生成されたバイオフィルムの画像。目盛りにおいて表わされた数は、１μｍ（Ａ、上の画像）、２μｍ（Ａ、中央の画像）、４μｍ（Ａ、下の画像）、４μｍ（Ｂ、上の画像）、２μｍ（中央の画像）および３μｍ（下の画像）である。
【図６】透過型電子顕微鏡によって得られた、黄色ブドウ球菌においてペプチドによって生じた損傷の画像。ペプチドにより処置されなかった細胞（Ａ−Ｂ）、および、ｈＢＤ−３（Ｃ−Ｄ）、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ（Ｅ−Ｆ）およびＰａＳＫ（Ｇ−Ｈ）により、２５μｇ／ｍＬの濃度で１時間処置された細胞が示される。細胞質および細胞壁破片（６）、ペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎｅ）の奇形、細胞膜剥離および菲薄化（４）、細胞溶解（５）、細胞質空胞化（７）、分裂中隔の奇形（８）およびペプチドＰａＳＫにより処置された細胞（９）においてのみ現われる高電子密度の構造が示される。目盛りを表わす数は、２００ｎｍ（Ａ）、１００ｎｍ（Ｂ）、６００ｎｍ（Ｃ）、２００ｎｍ（Ｄ）、４００ｎｍ（Ｅ）、２００ｎｍ（Ｆ）、６００ｎｍ（Ｇ）および２００ｎｍ（Ｈ）である。
【図７】透過型電子顕微鏡法によって得られた、２５μｇ／ｍＬの濃度にあるペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ（Ａ）およびＰａＳＫ（Ｂ）により１時間処置された黄色ブドウ球菌の細胞によって生成されたバイオフィルムの画像である。目盛りを表わす数は、４００ｎｍ（Ａ、左）、４００ｎｍ（Ａ、右）、４００ｎｍ（Ｂ、左）４００ｎｍ（Ｂ、右）である。
【図８】ＭＴＳ試験による、２つの細胞株、１つはヒト（ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１）および１つはマウス（４Ｔ１）のトリプルネガティブ乳癌細胞、および正常なマウスの乳房上皮細胞（ＨＣ‐１１）の株における、ペプチドＰａＳＫの細胞毒性効果の測定。結果は、０．５％のウシ胎児血清で２４時間インキュベートした場合が示される。ペプチドＰａＳＫは、３つの事例において、およそ２００μＭ（７００μｇ／ｍＬ）の濃度で約５０％の細胞死を引き起こす。
【図９】ペプチドＰａＳＫは、ヒトのトリプルネガティブ乳癌細胞（ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１）における細胞増殖を阻害する。細胞はＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎを用いてインキュベートされた。細胞増殖分析は、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ蛍光体でマークされた腫瘍細胞に対してフローサイトメトリーによって実行された。非増殖の対照（黒色の領域を備えたピーク）、ペプチドで処置されない細胞（白色の領域を備えたピーク）および５０μＭ（２００μｇ／ｍＬ）のペプチドＰａＳＫで処置された細胞（灰色の領域を備えたピーク）の結果が示される。
【図１０】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞に対するペプチドＰａＳＫの細胞毒性活性。フローサイトメーターにおいて得られた生細胞および死細胞のグラフ、対照（Ａ）およびＰａＳＫで処置（Ｂ）。縦軸において、ＳＳＣ−Ａ（側方散乱）は、選択された集団における細胞の粒状度を指す。横軸において、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−Ａはペリジニン−クロロフィル・タンパク質を指し、ヨウ化プロピジウムを取り込んだ細胞に対応する。活性は２つの複製において２００μｇ／ｍＬ濃度のＰａＳＫで測定された。２つの複製の平均値およびそれらに対応する標準偏差を示す生存率のグラフ（Ｃ）。
【図１１Ａ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞に対するペプチドＰａＳＫの抗増殖活性。ソフトウェアＭｏｄＦｉｔ  ＬＴを使用した細胞周期進行の分析、（Ａ）対照、（Ｂ）ＰａＳＫ（１００μｇ／ｍＬ）。細胞分布は２つの複製において細胞周期の異なる段階について検出された。（Ｃ）２つの複製の平均値およびそれらの対応する標準偏差を示す、細胞周期の各段階において観測された細胞のパーセンテージのグラフである。星印は処置の間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定，  ｐ  ≦  ０．０５）。（Ｄ）ペプチドＰａＳＫの作用によって影響を受けた段階を示す細胞周期の模式図である。
【図１１Ｂ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞に対するペプチドＰａＳＫの抗増殖活性。ソフトウェアＭｏｄＦｉｔ  ＬＴを使用した細胞周期進行の分析、（Ａ）対照、（Ｂ）ＰａＳＫ（１００μｇ／ｍＬ）。細胞分布は２つの複製において細胞周期の異なる段階について検出された。（Ｃ）２つの複製の平均値およびそれらの対応する標準偏差を示す、細胞周期の各段階において観測された細胞のパーセンテージのグラフである。星印は処置の間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定，  ｐ  ≦  ０．０５）。（Ｄ）ペプチドＰａＳＫの作用によって影響を受けた段階を示す細胞周期の模式図である。
【図１１Ｃ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞に対するペプチドＰａＳＫの抗増殖活性。ソフトウェアＭｏｄＦｉｔ  ＬＴを使用した細胞周期進行の分析、（Ａ）対照、（Ｂ）ＰａＳＫ（１００μｇ／ｍＬ）。細胞分布は２つの複製において細胞周期の異なる段階について検出された。（Ｃ）２つの複製の平均値およびそれらの対応する標準偏差を示す、細胞周期の各段階において観測された細胞のパーセンテージのグラフである。星印は処置の間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定，  ｐ  ≦  ０．０５）。（Ｄ）ペプチドＰａＳＫの作用によって影響を受けた段階を示す細胞周期の模式図である。
【図１１Ｄ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞に対するペプチドＰａＳＫの抗増殖活性。ソフトウェアＭｏｄＦｉｔ  ＬＴを使用した細胞周期進行の分析、（Ａ）対照、（Ｂ）ＰａＳＫ（１００μｇ／ｍＬ）。細胞分布は２つの複製において細胞周期の異なる段階について検出された。（Ｃ）２つの複製の平均値およびそれらの対応する標準偏差を示す、細胞周期の各段階において観測された細胞のパーセンテージのグラフである。星印は処置の間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定，  ｐ  ≦  ０．０５）。（Ｄ）ペプチドＰａＳＫの作用によって影響を受けた段階を示す細胞周期の模式図である。
【図１２】ソフトウェアＭａｒｋｅｒ  Ｖｉｅｗ  １．３を用いた、対照および処置の複製のディファレンシャル・プロテオーム解析において得られた、タンパク質の定量的測度の判別分析。８つのサンプルが分析された（対照（サンプルＣ１−Ｃ４）の４つの複製、およびＰａＳＫ（サンプルＰ１−Ｐ４）を用いた処置の４つの複製）。
【図１３】分子の機能によるディファレンシャルなタンパク質のクラスターを示す。処置／対照比における、存在度が減少したタンパク質のクラスター（Ａ）。分子の機能による特異タンパク質のクラスターを示す。存在度が増加したタンパク質のクラスター（Ｂ）。Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）において実行された。
【図１４】走査電子顕微鏡法によって得られた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞においてＰａＳＫによって生じた損傷の画像。ペプチドＰａＳＫで処置されなかった細胞（Ａ−Ｂ）、および１００μｇ／ｍＬの濃度にあるＰａＳＫで７２時間処置された細胞（Ｄ−Ｆ）が示される。処置されていない細胞における細胞膜（１）およびその膨脹（５）が示される。ＰａＳＫで処置された細胞の細胞膜（２）および陥入および隆起（３）が示される。目盛りにおいて表わされた数は、１０μｍ（Ａ）、５μｍ（Ｂ）、１０μｍ（Ｃ）、５０μｍ（Ｄ）、１０μｍ（Ｅ）および１０μｍ（Ｆ）である。
【図１５】透過型電子顕微鏡法によって得られた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞においてＰａＳＫによって生じた損傷の画像。ペプチドＰａＳＫで処置されなかった細胞（Ａ−Ｂ）、および１００μｇ／ｍＬの濃度にあるＰａＳＫで７２時間処置された細胞（Ｄ−Ｆ）が示される。処置されていない細胞における細胞膜（１）およびその膨脹（５）が示される。ＰａＳＫで処置された細胞の細胞膜（２）、陥入および隆起（３）および細胞膜破裂および細胞質破片を伴う小胞（４）が示される。目盛りにおいて表わされた数は、２μｍ（Ａ）、２μｍ（Ｂ）、２μｍ（Ｃ）、２μｍ（Ｄ）、１μｍ（Ｅ）、２μｍ（Ｆ）である。
【図１６Ａ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ペプチドＰａＳＫとドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチンおよび５−フルオロウラシルの併用療法の細胞毒性効果を示す。１００μｇ／ｍＬの濃度にあるＰａＳＫと様々な化学療法剤とを組み合わせた、７２時間の処置後にＭＴＳ試験によって得られた細胞の生存率のグラフ。Ａ）  ドキソルビシン（０．１０、０．２５、０．５０、１、および２μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。Ｂ）  パクリタキセル（０．０００１、０．００１、０．０１、１、１０、１００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。Ｃ）  シスプラチン（５、１０、２０、３０、４０、５０、６５、および１００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う３つの複製の平均値。Ｄ）  ５−フルオロウラシル（２、８、２０、４０、８０、４００、１０００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。星印は、処置間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定、＊ｐ≦０．０５および＊＊ｐ≦  ０．０１）。
【図１６Ｂ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ペプチドＰａＳＫとドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチンおよび５−フルオロウラシルの併用療法の細胞毒性効果を示す。１００μｇ／ｍＬの濃度にあるＰａＳＫと様々な化学療法剤とを組み合わせた、７２時間の処置後にＭＴＳ試験によって得られた細胞の生存率のグラフ。Ａ）  ドキソルビシン（０．１０、０．２５、０．５０、１、および２μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。Ｂ）  パクリタキセル（０．０００１、０．００１、０．０１、１、１０、１００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。Ｃ）  シスプラチン（５、１０、２０、３０、４０、５０、６５、および１００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う３つの複製の平均値。Ｄ）  ５−フルオロウラシル（２、８、２０、４０、８０、４００、１０００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。星印は、処置間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定、＊ｐ≦０．０５および＊＊ｐ≦  ０．０１）。
【図１６Ｃ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ペプチドＰａＳＫとドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチンおよび５−フルオロウラシルの併用療法の細胞毒性効果を示す。１００μｇ／ｍＬの濃度にあるＰａＳＫと様々な化学療法剤とを組み合わせた、７２時間の処置後にＭＴＳ試験によって得られた細胞の生存率のグラフ。Ａ）  ドキソルビシン（０．１０、０．２５、０．５０、１、および２μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。Ｂ）  パクリタキセル（０．０００１、０．００１、０．０１、１、１０、１００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。Ｃ）  シスプラチン（５、１０、２０、３０、４０、５０、６５、および１００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う３つの複製の平均値。Ｄ）  ５−フルオロウラシル（２、８、２０、４０、８０、４００、１０００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。星印は、処置間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定、＊ｐ≦０．０５および＊＊ｐ≦  ０．０１）。
【図１６Ｄ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ペプチドＰａＳＫとドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチンおよび５−フルオロウラシルの併用療法の細胞毒性効果を示す。１００μｇ／ｍＬの濃度にあるＰａＳＫと様々な化学療法剤とを組み合わせた、７２時間の処置後にＭＴＳ試験によって得られた細胞の生存率のグラフ。Ａ）  ドキソルビシン（０．１０、０．２５、０．５０、１、および２μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。Ｂ）  パクリタキセル（０．０００１、０．００１、０．０１、１、１０、１００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。Ｃ）  シスプラチン（５、１０、２０、３０、４０、５０、６５、および１００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う３つの複製の平均値。Ｄ）  ５−フルオロウラシル（２、８、２０、４０、８０、４００、１０００μＭ）との組み合わせ：対応する標準偏差を伴う４つの複製の平均値。星印は、処置間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定、＊ｐ≦０．０５および＊＊ｐ≦  ０．０１）。
【図１７Ａ】ＰａＳＫとドキソルビシンおよびシスプラチン、およびその両方との組み合わせにより処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＥＣ５０の比較を示す。Ａ）  ドキソルビシンによる処置の、およびドキソルビシンとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｂ）  パクリタキセルによる処置の、およびパクリタキセルとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｃ）  シスプラチンによる処置の、およびシスプラチンとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｄ）  ５−フルオロウラシルによる処置の、および５−フルオロウラシルとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。対応する標準偏差を伴う３つの複製の平均値。星印は、ＥＣ５０における処置間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定、＊ｐ≦０．０５  ＊＊ｐ≦０．０１）。ＥＣ５０はオンライン・ソフトウェアｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａａｔｂｉｏ．ｃｏｍで得た。
【図１７Ｂ】ＰａＳＫとドキソルビシンおよびシスプラチン、およびその両方との組み合わせにより処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＥＣ５０の比較を示す。Ａ）  ドキソルビシンによる処置の、およびドキソルビシンとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｂ）  パクリタキセルによる処置の、およびパクリタキセルとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｃ）  シスプラチンによる処置の、およびシスプラチンとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｄ）  ５−フルオロウラシルによる処置の、および５−フルオロウラシルとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。対応する標準偏差を伴う３つの複製の平均値。星印は、ＥＣ５０における処置間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定、＊ｐ≦０．０５  ＊＊ｐ≦０．０１）。ＥＣ５０はオンライン・ソフトウェアｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａａｔｂｉｏ．ｃｏｍで得た。
【図１７Ｃ】ＰａＳＫとドキソルビシンおよびシスプラチン、およびその両方との組み合わせにより処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＥＣ５０の比較を示す。Ａ）  ドキソルビシンによる処置の、およびドキソルビシンとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｂ）  パクリタキセルによる処置の、およびパクリタキセルとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｃ）  シスプラチンによる処置の、およびシスプラチンとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｄ）  ５−フルオロウラシルによる処置の、および５−フルオロウラシルとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。対応する標準偏差を伴う３つの複製の平均値。星印は、ＥＣ５０における処置間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定、＊ｐ≦０．０５  ＊＊ｐ≦０．０１）。ＥＣ５０はオンライン・ソフトウェアｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａａｔｂｉｏ．ｃｏｍで得た。
【図１７Ｄ】ＰａＳＫとドキソルビシンおよびシスプラチン、およびその両方との組み合わせにより処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＥＣ５０の比較を示す。Ａ）  ドキソルビシンによる処置の、およびドキソルビシンとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｂ）  パクリタキセルによる処置の、およびパクリタキセルとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｃ）  シスプラチンによる処置の、およびシスプラチンとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。Ｄ）  ５−フルオロウラシルによる処置の、および５−フルオロウラシルとＰａＳＫを組み合わせた処置のＥＣ５０。対応する標準偏差を伴う３つの複製の平均値。星印は、ＥＣ５０における処置間の統計的有意差を示す（スチューデントのｔ検定、＊ｐ≦０．０５  ＊＊ｐ≦０．０１）。ＥＣ５０はオンライン・ソフトウェアｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａａｔｂｉｏ．ｃｏｍで得た。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
材料と方法
使用されたペプチド
この研究において使用された合成ペプチドは、トリボリウム・カスタネウムのディフェンシン３の断片、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＰａＳＫ、およびヒト・ディフェンシンｈＢＤ−３（ＰｅｐｔａＮｏｖａ）であった。
【００７１】
黄色ブドウ球菌亜種の菌株
使用された菌株は、スペインの標準培養収集（ＣＥＣＴ）に供託され、公に入手可能な黄色ブドウ球菌亜種のＣＥＣＴ  ４０１３であった。
【００７２】
ヒト乳腺腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ）に供託され、公に入手可能な細胞株であり、ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２６（商標）として特定されている、ヒト乳腺腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１が使用された。細胞は、ウシ胎児血清１０％、ペニシリンとストレプトマイシン１％、およびファンギゾン０．１％を補足され、５％のＣＯ２を含んでいる雰囲気において３７℃で維持された７５ｃｍ２フラスコにおいて培養された。
【００７３】
サンプルの調製
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、６ウェルのディッシュにおいて、ウェルにつき５×１０４細胞の密度で培養され、そこに２００μＬまたは４００μＬのＰａＳＫ（終濃度１００μｇ／ｍＬおよび２００μｇ／ｍＬ）が加えられ、または対応する対照に同じ体積の培地（ペプチドを希釈するために使用される溶媒）が加えられた。細胞は３７℃で７２時間インキュベートされた。
【００７４】
黄色ブドウ球菌細胞に対するフローサイトメトリー
液体培地ＬＢ（ペプトン１％、酵母抽出物０．５％およびＮａＣｌ  １％）において３７℃で夜通し培養された黄色ブドウ球菌の細胞を撹拌することから始め、アリコートは新しい液媒において得られ、フローサイトメーターにおける検出に最適な６００ｎｍ（ＯＤ６００）で０．５の光学密度に達するまで成長することを許された。アリコートは、５×１０６  ｃｆｕ／１００μＬの濃度黄色ブドウ球菌で調整し、１０、１５、２０および２５μｇ／ｍＬのＰａＳＫ、２５μｇ／ｍＬのＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＨ２Ｏ（陰性対照）、ペプチドを希釈するため溶媒を加えた。混合物は８時間３７℃でインキュベートされ、すべての細胞を染色する蛍光色素ＳＹＢＲグリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｈ２Ｏの中の２５μＬのＳＹＢＲグリーン２５Ｘ溶液）、および、死細胞を染色するヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）（１０μＬのヨウ化プロピジウム１ｍｇ／ｍＬ）でマークされた。最後に、ペプチドによって生じた細胞死は、ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖａｌｅｎｃｉａの細胞培養およびフローサイトメトリー・セクションからの装置ＢＤ  Ｆａｃｓ  Ｖｅｒｓｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い、フローサイトメトリーによって分析された。実験は繰り返し行われた。
【００７５】
フローサイトメーターは細胞がひとつずつ針を通るように強いて液体の細線を生成し、およびレーザー光線（使用される装置における４８８ｎｍのアルゴン発光レーザー）が細胞とどのように相互作用するかを、入射光が逸れる具合、および蛍光が励起された蛍光色素によって放出される具合に応じて、検知する。結果は、分析プログラムＢＤ  Ｆａｃｓ  ｓｕｉｔｅ  ｖ１．０．５．３８４１（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で得られたグラフとして提示される。第１に、細胞の事象をすべて見つけるために、パラメーターＦＳＣ（前方散乱）およびＳＳＣ（側方散乱）を用いて対照グラフが得られる。これらのパラメーターはセルサイズと粒状度をそれぞれ提供する。その後、細胞をサンプルの中に存在するかもしれない他の粒子と区別するために、パラメーターＳＳＣおよびＦＩＴＣ（ＳＹＢＲグリーンを含んでいる細胞を示す蛍光パラメーター）を用いて第２のグラフが得られる。最後に、ＳＹＢＲグリーンによってのみ染色された細胞をヨウ化プロピジウムで染色されたもの、つまり死滅したとみなされるものから見分けるために、蛍光パラメーターＦＩＴＣおよびＰｅｒＣＰＣｙ５．５（ヨウ化プロピジウムで染色された細胞を示す）を用いて第３のグラフが得られる。
【００７６】
ヒト乳腺腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のためのフローサイトメトリー
細胞の生存率を評価するために、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞は、蛍光色素ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）１  ｍｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の１：１０００稀釈液０．５μＬを用いてインキュベートされ、それにより死細胞は染色された。
【００７７】
細胞株分析のために、ＣｙｃｌｅＴＥＳＴ（商標）ＰＬＵＳ  ＤＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が使用された。２回の洗浄がクエン酸塩緩衝液（クエン酸ナトリウム、サッカロースおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む）を使用して行われ、各サンプルが３００ｘｇで５分間遠心分離機にかけられ、最後の１回の洗浄が行なわれ、それにおいて細胞の数が５×１０５まで調整され、および４００ｘｇで５分間遠心分離機にかけられ、そして、その後、２５０μＬの溶液Ａ（スペルミン・テトラヒドロクロリドを伴う洗浄性の緩衝液においてトリプシンを含む）、２００μＬの溶液Ｂ（スペルミン・テトラヒドロクロリドを伴うクエン酸塩の安定化緩衝液において、トリプシンとリボヌクレアーゼＡの阻害剤を含む）および２００μＬの溶液Ｃ（ＰＩおよびスペルミン・テトラヒドロクロリドを伴う安定化緩衝液を含む）を加え、各溶液を追加する間に１０分間隔で室温で放置し、濾過する前に、残りの１つを保冷された暗所において濾過した。ペプチドによって生じた細胞死および細胞の細胞周期の段階の分析は、装置ＢＤ  Ｆａｃｓ  Ｖｅｒｓｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実行された。細胞周期モデリングはソフトウェアＭｏｄｆｉｔ  ＬＴ，ｖｅｒｓｉｏｎ３．３．１１を用いて実行された。実験は繰り返し行われた。
【００７８】
ＭＴＳ法
細胞の生存率を、ＭＴＳ法により判定した。１０％のＣＯ２で湿らされた雰囲気にて３７℃で９６ウェルのプレートにおいて５×１０３細胞／ウェルの密度になるまで培養されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、２４時間異なる濃度のペプチドＰａＳＫを用いてインキュベートされた。その後、溶液ＭＴＳ／ＰＭＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾール／フェナジンメトサルフェート）２０μＬが、各ウェルに加えられ、および、暗所において２時間インキュベートした後に、４９０ｎｍの吸収率がプレート・リーダに読み込まれた。細胞の数の減少率は化学式（１−  Ｅ／Ｃ）×１００に従って計算され、式中、Ｅはペプチドを用いて処置された細胞の吸収率、およびＣが対照細胞のサンプルの吸収率である。
【００７９】
黄色ブドウ球菌細胞の走査電子顕微鏡法
細胞はフローサイトメトリー手法に対する場合と同様に調製され、同じアリコートおよび同じ処置が実行された。サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。細菌は４℃で２時間、Ｋａｒｎｏｓｋｙ（２．５％のパラホルムアルデヒドおよび０．５のグルタルアルデヒド）を用いて固定された。洗浄（上澄みを遠心分離機にかけて除去）した後、それらはさらに２時間２％の四酸化オスミウムを用いて固定され、再び洗浄され、および０．２μｍフィルターでろ過された。その後、細胞は段階づけられた一連のエタノール（３０°、５０°、７０°、９０°、１００°）の中で各段階において１０分間脱水された。臨界点乾燥を行なうために、エタノールは液体ＣＯ２と取り替えられ、温度は蒸発を速めるために上げられ、および、圧力は細菌の正確な形を保存するためにゆっくり下げられた。最後に、金パラジウムで２分間シェーディングが実行され、装置ＦＥＧ−ＳＥＭ  ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｓ４８００において１０ｋｖで結果を観測した。
【００８０】
ヒト乳腺腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の走査電子顕微鏡法
対照または１００μｇ／ｍＬのＰａＳＫで処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、「サンプルの調製」セクションにおいて示されたように調製された。細胞は４℃で２時間、Ｋａｒｎｏｓｋｙ（２．５％のパラホルムアルデヒドおよび０．５％のグルタルアルデヒド）を用いて固定された。洗浄（上澄みを遠心分離機にかけて除去）した後、それらはさらに２時間２％の四酸化オスミウムを用いて固定され、再び洗浄され、および０．２μｍフィルターでろ過された。その後、細胞は段階づけられた一連のエタノール（３０°、５０°、７０°、９０°、１００°）の中で各段階において１０分間脱水された。臨界点乾燥を行なうために、エタノールは液体ＣＯ２と取り替えられ、温度は蒸発を速めるために上げられ、および、圧力は細胞の正確な形を保存するためにゆっくり下げられた。最後に、金パラジウムで２分間シェーディングが実行され、装置ＦＥＧ−ＳＥＭ  ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｓ４８００において１０ｋｖにて結果を観測した。
【００８１】
黄色ブドウ球菌細胞およびヒト乳腺腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の透過型電子顕微鏡法
サンプルは、一連の段階づけられたエタノールでの脱水を除き、走査電子顕微鏡法に対する場合と同様に調製され、そこで９０°の段階のみが達成された。その後、サンプルは４つの工程において樹脂に含まれていた：エタノール９６°−樹脂ＬＲ−Ｗｈｉｔｅ２：１（２０時間）、エタノール１００°−樹脂２：１（２０時間）、エタノール１００°−樹脂１：２（２０時間）および１００％の樹脂（６０℃で２４時間）。サンプルが樹脂に含められた後、ブロックは装置Ｌｅｉｃａ  ＵＣ６  Ｕｌｔｒａｃｕｔｔ  Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅにおける６０ｎｍの極薄の切片のために調製された。最後に、その切片が鉛でコントラストをつけられ、および、結果は装置ＴＥＭ  ＪＥＯＬ−ＪＥＭ１０１０において７０ｋＶで観測された。
【実施例】
【００８２】
実施例１．黄色ブドウ球菌に対するペプチドＰａＳＫの抗菌活性の分析
この実施例において、ペプチドＰａＳＫの抗菌活性はペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐの抗菌活性と比較された。黄色ブドウ球菌に対するペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐの抗菌活性はＣｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５において記載されている。
【００８３】
ペプチドＰａＳＫの抗菌活性はフローサイトメトリーによって測定された。上記手法は、細胞の光散乱および生細胞と死細胞を区別するための蛍光色素の使用に基づく。すべての細胞は蛍光色素ＳＹＢＲグリーンに対して透過性がある一方で、ヨウ化プロピジウムは細胞に入り込むために細菌の細胞膜が破損されること必要とするため、死細胞だけがヨウ化プロピジウムに対して透過性がある。従って、これらの２つの蛍光色素の使用は、死細胞の内部のヨウ化プロピジウムの増加から細胞の生存率の減少を定量して、生細胞を測定する方法を提供する。
【００８４】
２５μｇ／ｍＬのペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＰａＳＫで黄色ブドウ球菌の菌株ＣＥＣＴ  ４０１３の細胞をインキュベートした後、死細胞のパーセンテージは測定された。陽性対照として、同じ濃度のヒト・ディフェンシンｈＢＤ−３が使用された。それは黄色ブドウ球菌を含むいくつかのタイプの微生物に対する抗菌活性を持っている。図１Ａ−Ｄはフローサイトメーターのウィンドウにおいて得られた蛍光に対応するグラフを示す。ウィンドウＰ２は生細胞を示し、および、ウィンドウＰ３は死細胞を示す。
【００８５】
図２は、各ペプチドによる処置および対照細胞について分析された、２つの複製の死細胞のパーセンテージおよび標準偏差（ＳＤ）を示す。ｈＢＤ−３およびＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐの細胞毒性はそれぞれ約７０％および５５％だった。しかしながら、ペプチドＰａＳＫは、ほぼ１００％の細胞死パーセンテージを出した。死亡率は、両側スチューデントのｔ検定により統計的に有意であることが判明し、３つのペプチドにおいて陰性対照に対して、および、ペプチドＰａＳＫにおいてはＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびｈＢＤ−３に対しても、ｐ≦０．０５であった（図２）。
【００８６】
より低い濃度（１０、１５および２０μｇ／ｍＬ）にあるペプチドＰａＳＫの抗菌活性も、先の実験と同じ条件において、分析された。図３は、前記濃度における細胞死のパーセンテージを示す。１０μｇ／ｍＬの濃度では、ペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐが９．２％の死亡率を示しているが（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、ペプチドＰａＳＫが既に１００％に近い細胞毒性を示していることが見て取れよう。
【００８７】
実施例２．黄色ブドウ球菌の形態に対するペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＰａＳＫの効果
走査型電子顕微鏡法
走査電子顕微鏡法は、ペプチドによって生じた細菌の細胞膜に対する損傷を見るために使用される高解像度画像を提供する。黄色ブドウ球菌ＣＥＣＴ  ４０１３の細胞は２５μｇ／ｍＬの濃度にあるペプチドｈＢＤ−３、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐおよびＰａＳＫにより１時間処置され、および走査電子顕微鏡法を使用して分析された（図４）。処置なしの細胞において、完全な細胞膜を有する、黄色ブドウ球菌の典型的な環状および均質な形態が観察され、一方、処置された細胞において、様々なタイプの形態上の変化を見ることができる。ｈＢＤ−３を用いて処置された細胞の画像は、細胞膜の構造的な損傷および溶解（実線の矢印）、さらに細胞質内容物の顕著な放出（破線の矢印）も示す。ペプチドＴｃＤｅｆ３を用いて処置された細胞において、細菌の細胞膜における隆起（実線の矢印）およびいくらかの細胞質破片（破線の矢印）が観察されたが、ｈＢＤ−３による処置におけるより小さい範囲であった。最後に、ペプチドＰａＳＫを用いて処置された細胞は、細胞膜の不規則な形態（実線の矢印）および完全な細胞崩壊、続いて起こる細胞質破片の放出（破線の矢印）を示す。この処置によって、黄色ブドウ球菌の細胞よりも小さな円形の構造が観察される。
【００８８】
走査電子顕微鏡法によって得られた、ペプチドにより処置された細胞の画像は、細菌においてバイオフィルムの形成を示す（図５）。ｈＢＤ−３により処置されたサンプル（陽性対照）およびＨ２Ｏを維持するサンプル（陰性対照）が、同じ培地で成長し、バイオフィルムを形成しなかったので、エキソポリサッカライドの形成はその培地の栄養または他の特徴の不足によって生じた可能性はないものとして切り捨てられた（図４）。
【００８９】
透過型電子顕微鏡法
透過型電子顕微鏡法は、細菌の内部でペプチドによって生じた超微細構造の損傷を見るために使用される高解像度画像を提供する。黄色ブドウ球菌ＣＥＣＴ  ４０１３の細胞は２５μｇ／ｍＬの濃度で、ペプチドｈＢＤ−３、ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ、およびＰａＳＫにより１時間処置され、および透過型電子顕微鏡法を使用して分析された（図６）。処置なしの細胞において、完全な細胞質細胞膜（３）、および、黄色ブドウ球菌のようなグラム陽性細菌に典型的なペプチドグリカン壁（２）、さらに奇形なしの分裂中隔（１）が観察され、一方、処置された細胞において、異なるタイプの変化が観察された。ｈＢＤ−３により処置された細胞の画像は、奇形（４）および細胞膜の溶解（５）、さらには細胞質内容物の顕著な放出、分離した細胞壁の残遺物（６）および細胞質の空胞化（７）を示す。ペプチドＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐにより処置された細胞は、細菌細胞膜の奇形および隆起（４）、いくらかの細胞質破片、および分離した細胞壁の残遺物（６）を示す。最後に、ペプチドＰａＳＫにより処置された細胞は、細胞膜の分離、奇形、および菲薄化（４）、細胞質破片の逸脱（６）、および分裂中隔の奇形および阻害（８）を示す。小サイズの円形構造が観察される（９）。これらの構造は、細胞とは異なる電子密度を示し、および、細胞質膜およびペプチドグリカン壁を欠く。ペプチドにより処置された細胞によって形成されたバイオフィルムも、透過型電子顕微鏡法によって得られた画像において観察され（図７）、および、それはヒト・ディフェンシンｈＢＤ−３により処置された細胞においては観察されなかった（図６）。
【００９０】
実施例３．ペプチドＰａＳＫの細胞毒性および抗増殖活性の分析
ペプチドＰａＳＫの細胞毒性効果は、２つの細胞株、１つはヒト（ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１）および１つはマウス（４Ｔ１）のトリプルネガティブ乳癌細胞、および正常なマウスの乳房上皮細胞（ＨＣ‐１１）において研究された。この目的のために、細胞の生存率ＭＴＳアッセイは、溶解可能な有色の生成物を形成するために、生きている細胞において減少させられるテトラゾリウムから誘導した化合物を使用することによって実行された。
【００９１】
ウシ胎児血清が抗菌性ペプチドの活性に影響することが記載されているように、様々な濃度（５μｇ／ｍＬから７００μｇ／ｍＬ）のペプチドが、異なる時間（３時間、２４時間および４８時間）、および検定における異なる濃度（０．５％および１０％）のウシ胎児血清の存在下においてテストされた。得られた結果は、０．５％の検定および２４時間インキュベーションにおけるウシ胎児血清濃度について、ペプチドＰａＳＫは、２つの細胞株における、研究されているトリプルネガティブ癌細胞、さらに正常な乳房上皮細胞の株において、その３つの事例において、用量依存的な細胞毒性活性を呈し、およそ２００μＭ（７００μｇ／ｍＬ）の濃度で約５０％の細胞において死率を引き起こすことを示した（図８）。これらのデータは、ペプチドＰａＳＫが高濃度で哺乳動物細胞における細胞毒性活性を呈することを確証する。しかしながら、１００μＭ（４００μｇ／ｍＬ）前後のペプチド濃度において、ＰａＳＫはヒト・トリプルネガティブ乳癌細胞（ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１）に対してより著しく高い細胞毒性を生じた。
【００９２】
細胞増殖分析は、蛍光体Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎによりマークされ、続いて濃度５０μＭ（２００μｇ／ｍＬ）のペプチドＰａＳＫ、または対照としてのＨ２Ｏで処置された腫瘍細胞に対するフローサイトメトリーによって実行された。この分析は、組み合わせられた治療のアプローチにおけるＰａＳＫの使用を探究することを可能にした。腫瘍の成長および扶養を阻害するのが目的の治療剤、および被験体の癌の処置における免疫反応を促すことができる薬剤を組み合わせた使用は、癌治療に細胞毒性薬のみを使用することに関連する２つの主な問題（非特異性の毒性および抵抗性の出現）のインパクトを減少させるために、細胞毒性薬にのみ依存する従来のアプローチに対する別の選択肢となる治療のアプローチである。
【００９３】
試薬Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎは、細胞の遊離したアミン基に共有結合で結合され、各細胞分裂における娘細胞中に同じ均質の蛍光を与えて分配される。細胞の蛍光強度が各細胞分裂によりほぼ半減するため、ペプチドによる処置の後および処置されていない対照細胞における最終蛍光強度は、細胞の最初の蛍光強度と比較され、どれだけの細胞分裂周期が各ケースに生じたかについての情報を提供する。図９は、得られた結果を示す。ペプチドＰａＳＫにより処置された細胞は、処置されていない細胞より大きな蛍光強度を見せ、ペプチドがヒト・トリプルネガティブ乳癌細胞の増殖を抑制することを示す。
【００９４】
実施例４．ペプチドＰａＳＫの細胞毒性および抗増殖活性の分析
この実施例において、ペプチドＰａＳＫの細胞毒性および抗増殖活性はフローサイトメトリーによって評価され、細胞の生存率の分析および細胞周期の分析が実行される。２００μｇ／ｍＬ（細胞の生存率実験）および１００μｇ／ｍＬ（細胞周期の分析）のＰａＳＫによる腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の処置の後、生細胞のパーセンテージ、さらに増殖が止められた細胞周期の段階が測定された。
【００９５】
図１０Ａおよび図１０Ｂは、フローサイトメトリーから得られ、グラフにおいて示された、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の蛍光の観点から、細胞の生存率に対応するグラフを示す（領域Ｐ３は死細胞に対応する）。対照実験（図１０Ａ）において、細胞生存率９８％が得られた一方、ＰａＳＫによる処置（図１０Ｂ）において、細胞生存率は９３％であった。
【００９６】
図１０Ｃは、ＰａＳＫによる処置および対照細胞について分析された、２つの複製の生存細胞のパーセンテージおよび標準偏差（ＳＤ）を示す。２００μｇ／ｍＬの濃度のペプチドＰａＳＫにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞死率は約５％であり、対照に対して統計的に有意であった。
【００９７】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、フローサイトメトリーによりヨウ化プロピジウムの蛍光を検出して得られた、細胞周期の各段階で見つかった細胞分布のグラフを示す。対照細胞については、およびＰａＳＫにより処置された細胞において、以下の分布が観察された：それぞれ、Ｇ１期（統一）において５２．０％および５７．９％、Ｓ期において４０．０％および３３．２％、およびＧ２期において８．０％および９．０％。
【００９８】
図１１Ｃは、細胞周期のＧ１、ＳおよびＧ２各段階における細胞のパーセンテージを示し、およびＰａＳＫによる処置および対照細胞について分析された２つの複製の標準偏差（ＳＤ）を示す。細胞周期の各段階において、両側スチューデントのｔ検定において使用された、ペプチドにより処置された細胞と対照細胞との間に統計的有意差があったかどうかを確かめるため、比較がなされた。図１１Ｄは、ペプチドＰａＳＫの作用によって影響を受けた細胞周期の段階を示す模式図である。
【００９９】
ペプチドＰａＳＫは、処置された細胞がＳ期細胞のパーセンテージにおける統計的に有意な減少、およびＧ１期における増加を呈するように、後者は統計的有意差を欠くものの、抗増殖活性を示す（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）。
【０１００】
実施例５．ペプチドＰａＳＫにより処置されたトリプルネガティブ乳癌細胞のディファレンシャル・プロテオーム解析
ディファレンシャル・プロテオーム解析は、ペプチドがトリプルネガティブ乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する抗増殖活性を働かせる分子のメカニズムを細胞を死滅させずに究明するために、ＳＷＡＴＨによって実行された。
【０１０１】
８つのサンプル（対照の４つの複製、およびＰａＳＫによる処置の４つの複製）が分析され、合計１，５７１のタンパク質（ＦＤＲ  １％）を同定した。定量的データにより、判別分析は、ソフトウェアＭａｒｋｅｒ  Ｖｉｅｗ  １．３を使用して行なわれ、対照の複製および処置の複製について、２つの明白に見分けられる群を得た（図１２）。
【０１０２】
スチューデントのｔ検定（ｐ≦０．０５）が２つの条件（対照と処置）について行なわれ、および、合計１，５７１の定量されたタンパク質（ＦＤＲ  １％）のうち３１は差別的に示された。これらのうち、処置において、対照に比較して、２４は存在度を減少させ、および、７は増加させた（表１において、それぞれ網掛けなし、および、網掛けあり）。
【０１０３】
【表１−１】
2021509106.tif 000002
【０１０４】
【表１−２】
2021509106.tif 000003
【０１０５】
加えて、ディファレンシャルなタンパク質はＵｎｉｐｒｏｔの機能的なクラスターへグループ化され、そこでクラスターは、処置／対照比において存在度が減少したタンパク質と増加したタンパク質の両方について記述的な方法で示された。図１３は、分子の機能別の分布を示す。存在度が減少したタンパク質の中で、大多数の機能は、結合タンパク質（９１．７％）、触媒活性を示すもの（３３．３％）、構造的分子活性を有するもの（１６．７％）、分子機能レギュレーター（１２．５％）、および、最後に転写コアクチベーター、輸送体および翻訳開始因子（４．２％）に対応する（図１３Ａ）。他方、存在度が増加したタンパク質の中で、大多数は、また結合タンパク質（８５．７％）であり、触媒活性を備えたもの（７１．４％）、抗酸化活性および酵素調節活性を備えたもの、それぞれ（２８．６％）、および、最後に、電子伝達活性を備えたもの（１４．３％）である（図１３Ｂ）。
【０１０６】
ディファレンシャル・プロテオーム解析の結果は、ペプチドＰａＳＫが細胞内の標的に作用することを確証する。統計的に有意な特異な発現を伴う３１のタンパク質のうち、２４は、ペプチドにより処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、それらの発現を減少させ、および、７は増加させた（表１）。これらは腫瘍形成性の能力を伴うタンパク質であり、そのうちいくらかは様々なタイプの腫瘍細胞において過剰発現すると記載されており、および、それらは例えば、小胞の転位に、情報伝達およびアポトーシス、代謝経路の変化に、ＤＮＡ修復、転写または転写後調節および翻訳過程、細胞接着と転移に関連する能動性、および酸化ストレスに対する反応に、関係する。
【０１０７】
細胞周期の調節に関して、その発現がＰａＳＫにより処置された細胞において減少した２４のタンパク質のうち、真核生物の翻訳開始因子３Ｂ（ＥＩＦ３Ｂ）、リボソームタンパク質Ｓ１３およびＬ５（それぞれＲＰＳ１３およびＲＰＳＬ５）、およびＬａ関連タンパク質１（ＬＡＲＰ１）が目立つ。ＥＩＦ３は、サブユニット４０Ｓに関連する、いくつかの真核生物の形質導入翻訳開始因子間の相互作用のネットワークを組織するタンパク質複合体であり、翻訳に関係する様々な反応に参加する。それにはまた、ポリシストロニックｍＲＮＡの翻訳を再開すること、およびタンパク質合成を制御するキナーゼ・タンパク質に対する受容体として働くことなどの、他の制御的機能がある。ＥＩＦ３Ｂの発現の下向き調節がＧ０期／Ｇ１期の細胞の蓄積を引き起こし、Ｓ期の腫瘍細胞の数を著しく減らすことが示されており、ＥＩＦ３Ｂが、より低い細胞成長率に帰結するＤＮＡ複製の阻害に関連づけられること示唆している。
【０１０８】
リボソームタンパク質Ｓ１３およびＬ５は、リボソームのサブユニット４０Ｓおよび６０Ｓの一部をそれぞれ形成する。細胞周期の１Ｇ期からＳ期まで胃癌細胞のＲＰＳ１３の過剰発現が成長と転移を促進することは従来記載されており、一方、前記細胞において、ＲＰＳ１３がＧ１期に下向き調節される時、Ｇ１期に止められた細胞の数が増加する。ＲＰＬ５の損失がリボソームとタンパク質合成の生物発生を妨害することが記載されている。この欠損は、結果的に細胞周期の全面的休止をもたらさないが、強くその進行を阻害する。従って、ＥＩＦ３ＢおよびＲＰＬ５の両方の減少は、ｐ５３から独立して細胞周期のための標定点を生じさせるだろう。これらの結果は、実施例４におけるペプチドＰａＳＫの抗増殖活性の分析において得られたものに一致し、それは、Ｓ期にあるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における重大な減少を示し（図１１Ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は上に示されるような突然変異した非機能性のｐ５３遺伝子を持つことからｐ５３と無関係の細胞周期の制御を示唆している。
【０１０９】
ペプチドＰａＳＫで処置された細胞において存在度が増加したタンパク質の３つは、グルタチオン・ペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）、チオレドキシン還元酵素１（ＴＸＮＲＤ１）および硫化物：キノン・オキシドレダクターゼ（ＳＱＲＤＬ）である。３つのタンパク質は、酸化ストレスに対する反応に関与し、および腫瘍細胞において一般的に過剰発現する。酸化からの保護が生存遺伝子を活性化し、およびアポトーシスを阻害するため、前記タンパク質の過剰発現は、ペプチドＰａＳＫの抗発癌活性に対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の反応であり得る。
【０１１０】
実施例６．トリプルネガティブ乳癌細胞の形態に対するペプチドＰａＳＫの影響
走査電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡の両方は高解像度イメージを提供し、それらは腫瘍細胞の細胞膜および細胞内部における、ペプチドＰａＳＫによって生じた形態上の、および超微細構造の変化を見るために使用された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は濃度１００μｇ／ｍＬのペプチドＰａＳＫで７２時間処置され、走査型電子顕微鏡法（図１４）および透過型電子顕微鏡法（図１５）を使用して分析された。画像は、ペプチドＰａＳＫがＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞において重大な形態的変化を誘発したことを示す。処置されていない細胞の走査型電子顕微鏡法および透過型電子顕微鏡法の両方は、連続的で完全な細胞膜、およびヒト細胞に典型的な絨毛を伴う円弧形状を示す（１）。しかしながら、ＰａＳＫにより処置された細胞において、絨毛が分解して崩壊する構造をなすように見える、不規則な細胞膜が観察された（２）。さらに、細胞膜の非常に顕著な陥入（３）および完全な破損が観察され、それはいくつかの場合において再び円形化し、細胞質の残留物で小胞を形成した（４）。処置されていない細胞は細胞膜膨脹のように見えるものを示したが、細胞膜は、処置された細胞におけるように寸断されるのではなく、連続的である（５）。これらの結果は、ペプチドＰａＳＫが膜分解性（ｍｅｍｂｒａｎｏｌｉｔｉｃ）の作用機序を持っていることを明らかにする。
【０１１１】
実施例７．トリプルネガティブ乳癌細胞における、ペプチドＰａＳＫと化学療法剤による併用処置の細胞毒性の分析
この実施例において、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳癌細胞が９６ウェルのプレート上にウェルごとに７．５×１０３の細胞の密度で播種され、５０μＬのＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地が１０％ウシ胎児血清で補足され、および、細胞接着を促進するため、５％のＣＯ２を含んだ雰囲気において３７℃で２４時間インキュベートされた。血清プロテアーゼによるペプチドの分解を制限するために、化学療法剤またはＰａＳＫとの組み合わせによる処置は、５％のウシ胎児血清を伴って１つのウェル当たり１００μＬの全容積で実行された。細胞は３７℃で７２時間インキュベートされた。
【０１１２】
ＭＴＳ検定については、１０μＬのＭＴＳ溶液のが、各ウェルに加えられ、３７℃で３時間インキュベートされた。４９０ｎｍの吸収率は装置Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  １４２０  Ｖｉｃｔｏｒ２Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒで測定された。
【０１１３】
ペプチドＰａＳＫで処置された、および処置されなかったＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳癌細胞に対するディファレンシャル・プロテオーム解析は、タンパク質ＵＲＯＤ、ＡＳＮＡ１、ＴＭ９ＳＦ４およびＬＡＲＰ１における著しい減少を明らかにした。前記タンパク質の発現の減少が様々な化学療法剤に対する腫瘍細胞の感応性を増加させることは当該技術分野において記載されている。ＰａＳＫがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を化学療法剤に対して敏感にするかどうかを判断するために、濃度１００μｇ／ｍＬのペプチドＰａＳＫ（そこにおいてペプチド自体は３％から１０％の統計的に有意な細胞毒性を持っている）と、ドキソルビシン（０．１０、０．２５、０．５０、１および２μＭ）、パクリタキセル（０．０００１、０．００１、０．０１、１、１０、１００μＭ）、シスプラチン（５、１０、２０、３０、４０、５０、６５および１００μＭ）および５−フルオロウラシル（２、８、２０、４０、８０、４００、１０００μＭ）といった様々な濃度の化学療法剤との併用処置について、ＭＴＳの比色定量の手法によって細胞の生存率を分析し、細胞毒性が分析された。
【０１１４】
図１６Ａは、ドキソルビシンと、ドキソルビシンとＰａＳＫの組み合わせにより細胞を処置した後に分析された４つの複製について得られた細胞生存率のパーセンテージと標準偏差（ＳＤ）を示す。テストされたすべてのドキソルビシンの濃度について、ドキソルビシンだけによる処置の細胞に対比して、ドキソルビシンとＰａＳＫを組み合わせた処置の細胞毒性に統計的に有意な増加が観察された。
【０１１５】
図１６Ｂは、パクリタキセルおよびパクリタキセルとＰａＳＫの組み合わせによって細胞を処置した後に分析された４つの複製について得られた細胞生存率のパーセンテージと標準偏差（ＳＤ）を示す。この場合、パクリタキセル濃度が０．００１μＭだった時、細胞毒性における統計的有意差はパクリタキセルだけによる処置に対してパクリタキセルとＰａＳＫの併用処置についてのみ観察された。
【０１１６】
図１６Ｃは、シスプラチンおよびシスプラチンとＰａＳＫの組み合わせにより細胞を処置した後に分析された３つの複製について得られた細胞生存率のパーセンテージと標準偏差（ＳＤ）を示す。テストされたすべてのシスプラチン濃度について、シスプラチンだけによる処置の細胞に対比して、シスプラチンとＰａＳＫを組み合わせた処置の細胞毒性に統計的に有意な増加が観察された。
【０１１７】
図１６Ｄは、５−フルオロウラシルおよび５−フルオロウラシルとＰａＳＫの組み合わせによって細胞を処置した後に分析された４つの複製について得られた細胞生存率のパーセンテージと標準偏差（ＳＤ）を示す。この場合、５−フルオロウラシルの３つの濃度（８、２０および４０μＭ）について、５−フルオロウラシルだけによる処置に対比して、５−フルオロウラシルとＰａＳＫを組み合わせた処置において、細胞毒性における統計的有意差は観察された。
【０１１８】
図１７Ａにおいて、ドキソルビシンによる処置についてＥＣ５０  ＝  ０．４０７±０．０３３μＭが観察され、一方、ＰａＳＫと組み合わせたドキソルビシンによる処置についてはＥＣ５０  ＝  ０．０７７±０．０２６μＭが観察された。分析された３つの複製の平均値は、標準偏差（ＳＤ）と同様に示され、ドキソルビシンとＰａＳＫを組み合わせた処置について、ＥＣ５０における減少が、ドキソルビシンのみによる処置と対比して、統計的に有意であることを結論づけている。
【０１１９】
図１７Ｂにおいて、パクリタキセルによる処置についてＥＣ５０  ＝  ０．００８±０．００５μＭが観察され、一方、ＰａＳＫと組み合わせたパクリタキセルによる処置についてはＥＣ５０  ＝  ０．００３±０．００２μＭが観察されたことが示される。分析された３つの複製の平均値は、標準偏差（ＳＤ）と同様に示され、パクリタキセルとＰａＳＫを組み合わせた処置について、ＥＣ５０における減少が、パクリタキセルのみによる処置と対比して、統計的に有意であることを結論づけている。
【０１２０】
図１７Ｃにおいて、シスプラチンによる処置についてＥＣ５０  ＝  １６８．１６±５３．８９μＭが観察され、一方、ＰａＳＫと組み合わせたシスプラチンによる処置についてはＥＣ５０  ＝  ２２．５０±４．２９μＭが観察されたことが示される。分析された３つの複製の平均値は、標準偏差（ＳＤ）と同様に示され、シスプラチンとＰａＳＫを組み合わせた処置について、ＥＣ５０における減少が、シスプラチンのみによる処理と対比して、統計的に有意であることを結論づけている。
【０１２１】
最後に、図１７Ｄにおいて、５−フルオロウラシルによる処理についてＥＣ５０  ＝  ２５．３４±４．３３  μＭが観察され、一方、ＰａＳＫと組み合わせた５−フルオロウラシルによる処理についてはＥＣ５０  ＝  １２．２２±２．７２μＭが観察されたことが示される。分析された３つの複製の平均値は、標準偏差（ＳＤ）と同様に示され、５−フルオロウラシルとＰａＳＫを組み合わせた処置について、ＥＣ５０における減少が、５−フルオロウラシルのみによる処理と対比して、統計的に有意であることを結論づけている。
【０１２２】
配列表フリーテキスト
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
トリボリウム・カスタネウム  ディフェンシン３；断片  ＰａＳＫ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
トリボリウム・カスタネウム  ディフェンシン３；断片  ＴｃＤｅｆ３−ｐｅｐ
【０１２３】
参考文献
−  Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，  Ｅ．，  Ｂｅｎｉｔｏ−Ｊａｒｄｏｎ，  Ｍ．，  Ｌｏｐｅｚ−Ｇａｌｉａｎｏ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｒｅａｌ，  Ｍ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｒａｕｓｅｌｌ，  Ｃ．  （２０１５）．  Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｔｏｘｉｎｓ  ｓｈａｒｉｎｇ  ｃｏｍｍｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｄｉｓｐａｒａｔｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ５０，  １３９−１４５．
−  Ｒａｊａｍｕｔｈｉａｈ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）．  Ａ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｏｄｅｌ  ｂｅｅｔｌｅ  Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ  ａｃｔｓ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｗｉｔｈ  ｔｅｌａｖａｃｉｎ  ａｎｄ  ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ．  １０（６）：１−１４．
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
2021509106.tif 000014
【図４Ｈ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６Ａ】
2021509106.tif 000018
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
2021509106.tif 000049
【図１６Ｂ】
2021509106.tif 000050
【図１６Ｃ】
2021509106.tif 000051
【図１６Ｄ】
2021509106.tif 000052
【図１７Ａ】
2021509106.tif 000053
【図１７Ｂ】
2021509106.tif 000054
【図１７Ｃ】
2021509106.tif 000055
【図１７Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021509106.tif 000058
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