(57)【要約】本発明は、対象における骨髄細胞の保護に使用するためのアルファ−１−ミクログロブリン（Ａ１Ｍ）に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における骨髄細胞の保護に使用するためのアルファ１ミクログロブリン（Ａ１Ｍ）。
【請求項２】
対象の骨髄又は他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び前駆細胞の１以上の保護に使用するためのＡ１Ｍ。
【請求項３】
前記保護が、電離放射線、化学療法又は遺伝毒性物質への曝露によって引き起こされる損傷に対するものである、請求項１又は２に記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【請求項４】
前記放射線が、外部ビーム放射線療法又はＸ線検査などの体外の線源から発する電離放射線である、請求項３に記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【請求項５】
前記放射線が、非密封線源放射性核種療法（ＲＮＴ）；ペプチド受容体放射性核種療法（ＰＲＲＴ）；放射免疫療法（ＲＩＴ）又は近接照射療法などの体内に内在する線源から発する電離放射線である、請求項３に記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【請求項６】
前記保護が、診断目的で使用される電離放射線のためのものである、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【請求項７】
放射性核種で標識された化合物が、受容体リガンド、アフィボディ分子、ダイアボディ、抗体断片、及び／又は他の小分子からなる群から選択される、請求項５に記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【請求項８】
ソマトスタチン類似体が放射性核種で標識されている、請求項５〜７に記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【請求項９】
前記ソマトスタチン類似体が、オクトレオチド、ランレオチド、Ｔｙｒ３−オクトレオチド、Ｔｙｒ３−オクトロテート、ＤＯＴＡＤＯＣ、ＤＯＤＡＴＡＴＥ、ＤＯＴＡ−ランレオチド、パシレオチド、ドーパスタチン及びオクトレオチドＬＡＲからなる群から選択される、請求項８に記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【請求項１０】
Ａ１Ｍが、放射線への曝露の前、同時又は後に投与される、請求項４〜９のいずれかに記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【請求項１１】
Ａ１Ｍが、ある期間にわたって注入される、請求項１０に記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【請求項１２】
照射及びＡ１Ｍの投与が基本的に同時である、請求項４〜１１のいずれかに記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【請求項１３】
Ａ１Ｍが、照射の前又は後に２回以上投与される、請求項４〜１１のいずれかに記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【請求項１４】
骨髄細胞の損傷の治療に使用するためのＡ１Ｍ。
【請求項１５】
骨髄及び他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び前駆細胞のうちの１以上の治療に使用するためのＡ１Ｍ。
【請求項１６】
前記損傷が、対照と比較して、又は放射線、化学療法若しくは遺伝毒性物質に曝露される前に同じ対象から採取された試料と比較して、限定されないが、網状赤血球などの造血幹細胞及び造血前駆細胞のうちの１以上の生成の減少をもたらす、請求項３〜１５のいずれかに記載の使用のためのＡ１Ｍ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、骨髄細胞、特に、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞又は造血前駆細胞への損傷に対する保護のためのアルファ−１−ミクログロブリン（Ａ１Ｍ）の使用に関する。このような細胞への損傷は、放射線、化学療法又は他の遺伝毒性物質への曝露に関連して発生し得る。放射線は、例えば、原子力発電所、鉱業、核兵器などからの放射線への曝露などのように職業的、偶発的であり得るか、又は医療のスクリーニング、診断、及び治療に関連付けられる電離放射線であり得る。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血液細胞形成のプロセスである造血は、胚発生中及び成人期を通して起こり、血液系を生成及び補充する。血液は、最も高度に再生する組織の１つである。実際、体内の全ての細胞の９０％超が造血細胞であり、約１兆（１０１２）個の新しい血液細胞が毎日生成される。ヒトの造血についての我々の理解の多くは、マウスの造血の研究から、及びヒト−マウス異種移植研究を通して得られる。成人では、造血は、主に、骨髄に存在する造血幹細胞（ＨＳＣ）によって維持される。ＨＳＣは、生涯にわたる血液生成に重要であり、依然として分化細胞のプールに貢献しながら、永続的に自己再生する能力、又は娘幹細胞を作製する能力によって一意的に定義される。ＨＳＣは、いくつかの又は単一の系統に徐々に制限されるようになる前駆細胞の階層の頂上に位置する。これらの前駆細胞は、赤血球、巨核球、骨髄細胞（単球／マクロファージと好中球）、及びリンパ球を含む成熟血液細胞の単系統分化並びに生成を専門とする血液前駆体を産生する。小児では、造血は、大腿骨及び脛骨などの長骨の髄で起こる。成人では、主に、骨盤、頭蓋、脊椎、及び胸骨で起こる。しかしながら、特定の造血細胞の成熟、活性化、及び一部の増殖は、末梢血、脾臓、肝臓、胸腺、リンパ節などの髄外造血ニッチで起こる。
【０００３】
放射線は、様々な癌形態などの悪性腫瘍の治療によく使用される。しかしながら、電離放射線への曝露は、骨髄細胞集団に強烈な欠陥を引き起こし、亜致死量でさえも、骨髄及び他の造血ニッチに存在する造血幹細胞並びに造血前駆細胞の回復不能な組織損傷に繋がり得ることは十分に証明されている。放射線からの骨髄毒性は、ＨＳＣ及び骨微小環境への損傷に起因する。高線量の電離放射線又は化学療法への曝露は、骨髄不全につながり、最終的には死に至る可能性がある。しかしながら、高線量の電離放射線及び化学療法は、医学的治療を追求するのに有益である場合が多い。血液障害又は骨髄癌の患者の多くは、待機的放射線療法又は化学療法を受け、腫瘍のある患者は局所放射線療法を受ける場合もある。
【０００４】
放射線療法を受けているか、又はそうでなければ、放射線に曝露されている患者は、骨への長期的な影響に苦しむ場合がある。さらに、癌患者は全身又は局所放射線療法を受け続けるので、骨髄及び他の血液系ニッチに存在する造血細胞を救助又は保護するための手段を開発することが重要である。
【０００５】
ＷＯ  ２０１０／００６８０９は、Ａ１Ｍの幅広い抗酸化特性に関連し、感染及び炎症などの酸化ストレス、虚血関連疾患及び再灌流関連疾患、遊離ヘモグロビン、ヘム及び鉄イオンの結果としての酸化ストレス、環境及び食品由来の要因、皮膚、生殖、及び新生児医学の障害を伴う疾患におけるＡ１Ｍの使用を示唆している。
【０００６】
ＷＯ  ２０１６／１３５２１４は、急性及び／又は慢性腎傷害の治療、並びに放射性核種診断（ＲＤ）、放射性核種療法（ＲＮＴ）及び放射免疫療法（ＲＩＴ）で観察される腎臓関連副作用におけるＡ１Ｍの使用に関する。
【０００７】
Ｇｕｎｎａｒｓｓｏｎ  Ｒｏｌｆら．２０１６とＬｅｎａ  Ｗｅｓｔｅｒ−Ｒｏｓｅｎｌｏｅｆら．２０１４は両方とも、子癇前症の治療におけるＡ１Ｍに関する。Ｌｅｎａ  Ｗｅｓｔｅｒ−Ｒｏｓｅｎｌｏｅｆら．２０１４は、ＰＥ雌ヒツジモデルで血液、胎盤組織及び腎臓組織を研究している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本明細書の実施例で実証されるように、本発明者らは、電離放射線の間若しくはその後に、Ａ１Ｍが骨髄又は他の血液系ニッチに存在する細胞への損傷に対して保護することを見出した。例えば、骨髄中の造血細胞に対するＡ１Ｍの保護効果は、放射線曝露に限定されないが、他の状況において、例えば、骨髄及び例えば、脾臓のような他の血液系ニッチの細胞に悪影響を及ぼす化学療法剤、化学物質、ウイルス又は他の毒素への曝露後にも等しく保護的であり得ると考えられる。本実施例では、電離放射線後の骨髄への悪影響に焦点が当てられている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この新しい発見は、発明者がこれまでに持っていた知識からはまったく予想外である。以前の報告は、Ａ１Ｍの腎臓への生体内分布の結果としてＡ１Ｍが腎臓を保護することを示しているが、Ａ１Ｍが骨髄細胞に局在していることを支持又は示唆していなかったため、Ａ１Ｍが骨髄に存在する造血細胞を保護できることは予測できなかった。
【発明の効果】
【００１０】
より具体的には、本発明は以下に関する：
骨髄に存在する造血幹細胞及び／若しくは造血前駆細胞などの骨髄細胞の保護又は末梢血、脾臓、肝臓、胸腺及びリンパ節などの他の血液系ニッチに使用するためのアルファ−１−ミクログロブリン（Ａ１Ｍ）。ＨＳＣのある程度の増殖は、脾臓、肝臓、胸腺及びリンパ節（血液系ニッチ）で起こる；
損傷が、電離放射線、化学療法剤、ウイルス、又は他の毒性物質への曝露によって引き起こされる、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞の保護に使用するためのＡ１Ｍ。放射線は、医学的治療と関連しているか、又は原子力発電所、核兵器への曝露などに関連付けられる偶発的な放射線である場合がある；
電離放射線への曝露によって引き起こされる骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞への損傷の保護などの骨髄細胞の保護に使用するためのＡ１Ｍ；Ａ１Ｍは、放射線曝露の前、最中、及び／又は後に投与され得る；
電離放射線への曝露後に骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞への損傷の保護などの、骨髄細胞の保護に使用するためのＡ１Ｍであって、放射線への同時治療として使用されるＡ１Ｍ；
放射線療法を必要とする悪性腫瘍の同時治療に使用するためのＡ１Ｍ及び放射性核種で標識された化合物であって、電離放射線によって引き起こされる、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞への損傷を回避又は軽減するために使用されるＡ１Ｍ；
化学療法を必要とする悪性腫瘍の同時治療に使用するためのＡ１Ｍ及び化学療法物質であって、化学療法によって引き起こされる、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞への損傷を回避又は軽減するために使用されるＡ１Ｍ；
骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞への損傷の治療に使用するためのＡ１Ｍ；
骨髄傷害の治療に使用するためのＡ１Ｍ。傷害は、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞への損傷である；
例えば、単一又は複数の造影セッションでの放射性核種診断（核医学造影）中の、電離放射線による骨髄細胞への望ましくない生物学的影響の軽減に使用するためのＡ１Ｍ。Ａ１Ｍは、ＡＬＡＲＡ原理（合理的に達成可能な限り低い（Ａｓ  Ｌｏｗ  Ａｓ  Ｒｅａｓｏｎａｂｌｙ  Ａｃｈｉｅｖａｂｌｅ）を達成し、患者への電離放射線の望ましくない影響を軽減するために使用される。望ましくない影響は、骨髄又は他の血液系ニッチに存在する血液細胞に悪影響を及ぼす。
【００１１】
いずれにせよ、Ａ１Ｍは、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞に対して保護効果を有すると企図される。
【００１２】
本明細書の実験の節において、ＰＲＲＴ（ペプチド受容体放射性核種療法）をＡ１Ｍと併用し、ＰＲＲＴによって引き起こされる骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞への損傷の影響に対するＡ１Ｍの保護効果を実証した。Ａ１Ｍは、骨髄に存在する造血細胞に悪影響を与える他の種類の電離放射線、又は骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞に悪影響を与える他の種類の曝露、例えば、化学療法又は他の遺伝毒性物質に対して同様の保護効果をもたらすと考えられる。そのため、本発明は、以下に述べるものなどの特定のペプチド受容体放射性核種（ＰＲＲＮ）に限定されないが、外部ビーム放射を含むいかなる電離放射線源も本発明の範囲内である。そのため、本文脈に含まれるのは、放射性核種診断（ＲＤ）、放射性核種療法（ＲＮＴ）及び放射免疫療法（ＲＩＴ）でもあり、放射性核種で標識された小分子アフィボディ分子、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片及び他の免疫コンジュゲート又は他の受容体リガンドなどの、電離放射線を放出できる任意の適切な放射性核種で標識された分子も、本発明の範囲内にあることが意図される。放射線は、治療法又は医学的治療のためのものであり得るが、職業曝露などの偶発的なものでもあり得る。本文脈では、医療用の放射線が好ましい。放射線が職業的、偶発的又は医学的曝露である場合、Ａ１Ｍは、曝露前、最中又はその後のいずれかで投与され得る。本明細書で前述したように、また、本発明の範囲に含まれるのは、電離放射線、例えば、化学療法又は遺伝毒性物質よりも、他の種類の曝露によって引き起こされる、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞への損傷から保護するためのＡ１Ｍの使用である。
【００１３】
ＰＲＲＴは、放射線を放出する放射性核種にカップリングした小ペプチドを使用して行われる分子標的療法の一種である。発明者らによって本明細書に記載される例において、小ペプチドは、ソマトスタチン類似体である。しかしながら、これらのペプチドは、オクトレオチド、ランレオチド、Ｔｙｒ３−オクトレオチド（ＴＯＣ）、Ｔｙｒ３−オクトロテート（ＴＡＴＥ）及びＤＯＴＡ＋−キレートＤＯＴＡＤＯＣ、ＤＯＤＡＴＡＴＥ及びＤＯＴＡ−ランレオチドを含むこともできる。他のソマトスタチン類似体には、ＳＯＭ２３０（パシレオチド）、ドーパスタチン及びオクトレオチドＬＡＲが含まれる。ＰＲＲＴの場合には、ソマトスタチン類似体は、放射性核種放出媒体及び／又はイットリウム−９０（９０Ｙ）若しくはルテチウム−１７７（１７７Ｌｕ）などの高エネルギーベータ粒子で標識され、患者に静脈内（ｉ．ｖ．）投与される。しかしながら、放射性核種は、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）などの別の種類のものであってもよい。ソマトスタチン関連療法は、ソマトスタチン受容体陽性腫瘍を有する患者に対して行われる。神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）の全てではないが、多くの形態が、１以上のソマトスタチン受容体亜型を発現している。ＰＲＲＮの投与後、ＰＲＲＮは、腫瘍に局在するソマトスタチン受容体に結合し、ＰＲＲＮは腫瘍内に保持される。電離放射線を放出する放射性核種の崩壊により、組織にエネルギーが蓄積され、高線量が吸収される。
【００１４】
本文脈において、本発明は、上述のものなどの特定のＰＲＲＮに限定されない。本発明には、放射性核種で標識された小分子アフィボディ分子、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片及び他の免疫コンジュゲート又は他の受容体リガンドなどの、電離放射線を放出できる任意の適切な放射性核種で標識された任意の分子も含まれる。さらに、本明細書で前述したように、本発明の範囲には、他の種類の電離放射線と、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞への損傷の他の原因も含まれる。
【００１５】
本文脈において、「骨髄不全」、「骨髄損傷」、「造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞の機能の障害」又は「骨髄への悪影響」という用語は、互換的に使用され、正常な造血幹細胞及び／若しくは造血前駆細胞機能の急性又は慢性の障害として定義される。
【００１６】
ＮＥＴは、放射線が照射される腫瘍の例である。ＮＥＴは、ホルモン受容体の過剰発現によって特徴付けられる、神経内分泌系由来のゆっくり成長する新生物の大きなグループである。ほとんどのＮＥＴは、胃腸膵臓管（ＧＥＰ）及び気管支肺管で生じ、その発生率及び有病率は、過去３０年間で着実に増加している。米国の国立癌研究所の監視、疫学、及び最終結果（ＳＥＥＲ（Ｔｈｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏＧｙ，ａｎｄ  ｅｎｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ））プログラムは、おそらく造影の流行及び診断の改善の結果として、１９７３年の１００，０００人あたり１．０９人の症例から２００４年の１００，０００人あたり５．２５人の症例（ｎ＝３５８２５）への増加を報告した。女性及び男性は等しく影響を受け、ＮＥＴの有病率は１００，０００人あたり３５人であると報告されている。ＮＥＴ腫瘍は、増殖マーカーＫｉ−６７によって決定されるように、腫瘍内の増殖細胞の割合に基づいて分類される。Ｋｉ−６７インデックスが０〜２％のＮＥＴは、グレード１（Ｇ１）、３〜２０％のＮＥＴはグレード２（Ｇ２）、２０％を超えるＮＥＴはグレード３（Ｇ３）として分類される。全生存期間の中央値は７５ヶ月であるが、予後は、疾患の発症、病期及びグレードによって異なる。
【００１７】
ＮＥＴは、生物学的及び臨床的に不均一であり、転移の広がりの速度及び場所、ホルモン分泌のパターン並びに生存転帰は、異なる原発部位の腫瘍間で大きく異なる。例えば、小腸のＮＥＴは悪性度が比較的高いが、緩慢に進行する傾向がある一方で、胃又は直腸のＮＥＴは通常、低い悪性度を示すが、進行型の状況では積極的になる。転移性中腸ＮＥＴは、セロトニン及び他の血管作用物質を分泌することが多く、主に、紅潮、下痢、及び右側弁膜症によって特徴付けられる典型的なカルチノイド症候群を引き起こす。
【００１８】
局在化したＮＥＴの根治治療は手術のみである。しかしながら、患者の４０％超が、診断時に転移性疾患を有しており、そのため、全身治療が必要である。ここ数年にわたって、進行型のＮＥＴの治療展望は、目覚ましい拡大を遂げており、ソマトスタチンアナログ（ＳＳＡ）、エベロリムス、及びスニチニブを含む標的薬剤は安全性と有効性が実証されている。高レベルのソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）を発現する腫瘍細胞への放射性核種の標的化送達を可能にする全身放射線療法の一形態であるＰＲＲＴは、進行型の低グレードから中程度のグレードのＮＥＴの治療に大きな見込みを示している。ＰＲＲＴの効果は、５種のＳＳＴＲ（ＳＳＴＲ１〜５）との相互作用によって仲介される。ＮＥＴは、ＳＳＴＲの高密度発現が特徴である。受容体が結合すると、放射性標識ＳＳＡは内部移行し、放射性標識ペプチドの分解産物はリソソームに保存されるため、腫瘍細胞内部への放射能の送達及び保持が可能になる。放射性標識ＳＳＡは、放射性核種同位体、担体分子（オクトレオチド誘導体）、及びそれらを結合して複合体を安定化させるキレート剤からなる。一般的に使用されるキレート剤には、ＤＯＴＡ（テトラアザシクロドデカン四酢酸）及びＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）が含まれるが、ＳＳＴＲ２への親和性が強化された類似体であるオクトレオチド及びオクトレオテートは、担体として一般的に使用される。３種の放射性核種（１１１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１７７Ｌｕ）は、ＳＳＡにコンジュゲートし、それらの異なる物理的特性が放射線送達に特定の利点を与える。そのようなＳＳＡには、オクトレオチド、ランレオチド、Ｔｙｒ３−オクトレオチド（ＴＯＣ）、Ｔｙｒ３−オクトロテート（ＴＡＴＥ）及びＤＯＴＡ＋−キレートＤＯＴＡＤＯＣ、ＤＯＤＡＴＡＴＥ及びＤＯＴＡ−ランレオチドが含まれる。他のソマトスタチン類似体には、ＳＯＭ２３０（パシレオチド）、ドーパスタチン及びオクトレオチドＬＡＲが含まれる。ソマトスタチン類似体は、放射性核種放出媒体及び／又は９０Ｙ１７７Ｌｕなどの高エネルギーベータ粒子で標識され、患者にｉ．ｖ．投与される。無作為化第ＩＩＩ相ＮＥＴＴＥＲ−１試験を含む臨床試験では、１７７Ｌｕが最も一般的に使用される。
【００１９】
ＰＲＲＴは、明確な予測バイオマーカーであるＳＳＴＲ発現を伴うＮＥＴの唯一の治療選択である。応答率の増加は、ＳＳＴＲシンチグラフィー（オクトレオスキャン）での放射性トレーサーの取り込み率がより高い患者で実証されており、約６０％の全体的な応答率（ＯＲＲ）が、Ｋｒｅｎｎｉｎｇスコアによるグレード４の取り込み（脾臓又は腎臓の取り込みよりも高い腫瘍の取り込み）の患者について報告されている。ＰＲＲＴの活性は、原発腫瘍の部位及び腫瘍負荷にも影響される。放射性標識ＳＳＡの意図された累積線量は、連続サイクル（通常は４〜５回）で分割され、６〜９週間ごとに全身的に送達される。重要なのは、骨髄及び腎臓の照射によって課せられる制限のために、治療は限られた範囲でしか繰り返すことができないということである。放射線毒性に関しては、ＰＲＲＴに関連付けられる副作用は、急性及び遅延型として分類することができる。急性の影響には、吐き気、嘔吐及び腹痛が含まれる。これらの反応は多くの場合、治療終了後に正常化する。治療後に観察することができる骨髄及び血液学的影響も急性と見なされる。その結果、放射線誘発損傷から正常組織を、特に骨髄を保護する薬物の開発が成功すれば、より効果的な癌治療及び患者の健康の改善が可能になる。
【００２０】
アルファ−１−ミクログロブリン−  全般的な背景
Ａ１Ｍは、肝臓で高速で合成され、血流に分泌され、血管壁を越えて全ての臓器の血管外コンパートメントに輸送される。該タンパク質は、他の組織（血液細胞、脳、腎臓、皮膚）でも合成されるが、速度はより低い。サイズが小さいため、遊離Ａ１Ｍは、腎臓で血液から急速にろ過される。
【００２１】
Ａ１Ｍは、保存された３次元構造であるが、非常に多様な機能を有する動物、植物及び細菌からのタンパク質のグループであるリポカリンスーパーファミリーのメンバーである。各リポカリンは、疎水性の内部を有するβバレルポケットに折りたたまれた１６０〜１９０個のアミノ酸鎖からなる。少なくとも１２種のヒトリポカリン遺伝子が知られている。Ａ１Ｍは、２６ｋＤａの血漿及び組織のタンパク質で、これまでに哺乳類、鳥類、魚類及びカエルで確認されている。Ｘ線結晶学によって決定されるＡ１Ｍの３次元構造を図１に示す。Ａ１Ｍは、肝臓で高速で合成され、血流に分泌され、急速に（Ｔ１／２＝２〜３分）血管壁を越えて全ての臓器の血管外コンパートメントに輸送される。Ａ１Ｍは、血液及び間質組織において遊離の単量体型と、より大きな分子（ＩｇＡ、アルブミン及びプロトロンビン）との共有複合体としての両方で見出される。サイズが小さいため、遊離Ａ１Ｍは、腎臓で血液から急速にろ過される。その後、大部分は再吸収されるが、かなりの量が尿に排出される。
【００２２】
Ａ１Ｍのシーケンス及び構造特性
ヒトＡ１Ｍの全配列は既知である。該タンパク質は、１８３個のアミノ酸残基のポリペプチドからなる。他の哺乳類、鳥類、両生類、及び魚類からの、多くの追加のＡ１Ｍ  ｃＤＮＡ及び／又はタンパク質が、検出、単離及び／又は配列決定されている。Ａ１Ｍのペプチド鎖の長さは、主にＣ末端の変動により、種間でわずかに異なる。異なる推定アミノ酸配列のアライメント比較により、同一性の割合が、げっ歯類又は肉蹄類（ｆｅｒｕｎｇｕｌａｔｅ）と人間の間での約７５〜８０％から、魚類と哺乳類の間での約４５％まで変化することが示される。３４位の遊離システイン側鎖は保存されている。このグループは、酸化還元反応（下記参照）、他の血漿タンパク質との複合体形成及び黄褐色の発色団への結合に関与していることが示されている。Ａ１Ｍの３次元構造により、Ｃ３４が、溶媒にさらされ、リポカリンポケットの開口部の近くに位置していることが示される（図１を参照）。
【００２３】
本文脈において、用語「アルファ−１−ミクログロブリン」又は対応する略語「Ａ１Ｍ」は、配列番号１（野生型ヒトＡ１Ｍ）及び配列番号２（ヒト組換えＡ１Ｍ）の中で特定されるアルファ−１−ミクログロブリン、並びに同様の治療活性を有するその任意の相同体、断片又は変異体を含むことを意図する。そのため、本明細書で使用されるＡ１Ｍは、配列番号１又は配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、又はその断片を意味することを意図する。本明細書で使用されるＡ１Ｍは、配列番号１又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有することが好ましい。本明細書で使用されるＡ１Ｍは、配列番号１又は配列番号２と少なくとも９５％、例えば、９９％又は１００％の配列同一性を有することがさらにより好ましい。好ましい態様において、Ａ１Ｍは、本明細書で特定される配列番号１又は２に従う。配列表には、ヒトＡ１Ｍ及びヒト組換えＡ１Ｍ（それぞれ配列番号１及び２）のアミノ酸配列並びに対応するヌクレオチド配列（それぞれ配列番号３及び４）の配列表が示されている。しかしながら、以下で特定されるようなタンパク質の重要な部分を有するＡ１Ｍの相同体、変異体及び断片もまた、本明細書で使用されるＡ１Ｍという用語に含まれる。
【００２４】
アライメント／同一性の詳細
本明細書におけるアミノ酸残基の位置は、ヒト血漿中に見出されるヒトＡ１Ｍ（配列番号１）における位置を指す。Ａ１Ｍ（配列番号２）、又は変異ヒトＡ１Ｍ又は他の種のＡ１Ｍの最初の残基であるグリシン残基にＮ末端で連結されたメチオニン又はＮ−ホルミルメチオニン残基を有する組換えＡ１Ｍのアミノ酸残基を参照する場合、当業者なら、例えば、欠失又は挿入により位置がシフトした場合でも、ヒトＡ１Ｍ（配列番号１）の残基に対応する残基を特定する方法を理解するであろう。
【００２５】
組換えタンパク質が生成される場合、それらはほとんどの場合、最初のＭｅｔ残基から始まり、これは、例えば、メチオニンアミノペプチダーゼ又は類似の活性を有する別の酵素を使用して除去され得る。本明細書に提示されるＡ１Ｍ変異体は、最初のＭｅｔ残基をもつものと、もたないものが存在し得る。
【００２６】
Ａ１Ｍの相同体
上述のように、Ａ１Ｍの相同体も、本明細書の説明に従って使用することができる。理論的には、これまでに見つかった、魚（カレイ）由来の最も原始的なものを含む全ての種由来のＡ１Ｍを、本明細書に記載の目的に使用できる。ヒト、オランウータン、リスザル、ラット、ハダカデバネズミ（ｎａｋｅｄ  ｍｏｌｅ  ｒａｔ）、マウス、ウサギ、モルモット、ウシ、カエル、ニワトリ、セイウチ、マナティー及びカレイから単離された形態のＡ１Ｍも利用可能である。
【００２７】
Ａ１Ｍの相同体、変異体、及び断片を考慮すると、以下のものは、該タンパク質の重要な部分として特定されている：
Ｙ２２（チロシン、２２位、塩基対６４〜６６）
Ｃ３４（システイン、３４位、塩基対１００〜１０２）
Ｋ６９（リジン、６９位、塩基対２０５〜２０７）
Ｋ９２（リジン、９２位、塩基対２７４〜２７６）
Ｋ１１８（リジン、１１８位、塩基対３５２〜３５４）
Ｋ１３０（リジン、１３０位、塩基対３８８〜３９０）
Ｙ１３２（チロシン、１３２位、塩基対３９４〜３９６）
Ｌ１８０（ロイシン、１８０位、塩基対５３８〜５４０）
Ｉ１８１（イソロイシン、１８１位、塩基対５４１〜５４３）
Ｐ１８２（プロリン、１８２位、塩基対５４４〜５４６）
Ｒ１８３（アルギニン、１８３位、塩基対５４７〜５４９）
（文書全体でアミノ酸及びヌクレオチドの番号付けは、配列番号１及び３を指す。他の種に由来する他のＡ１Ｍ、Ａ１Ｍ類似体又はその組換え配列が使用される場合、当業者は、活性部位（複数可）又は酵素活性に関与する部位（複数可）のアミノ酸を特定する方法を知っている）。
【００２８】
そのため、Ａ１Ｍが、例えば、配列番号１又は２の１つと８０％（又は９０％又は９５％）の配列同一性を有する場合、上記のアミノ酸は、分子中の適切な場所に存在することが好ましい。
【００２９】
Ａ１Ｍ変異
上記のように、Ａ１Ｍは、野生型又はヒト組換えＡ１Ｍ、又はそれらの相同体として使用され得る。さらに、Ａ１Ｍ遺伝子における以下の点変異は、本発明において特に興味深い：
−６６位（Ｒ６６Ｈ）のＡｒｇの代わりにＨｉｓの発現をもたらすＡ１Ｍ遺伝子の点変異
−１７位と９６位（Ｎ１７，９６Ｄ）のＡｓｎの代わりにＡｓｐの発現をもたらすＡ１Ｍ遺伝子の点変異、
−４１位（Ｍ４１Ｋ）のＬｙｓの代わりにＭｅｔの発現をもたらすＡ１Ｍ遺伝子の点変異。
【００３０】
これらの点変異は、Ａ１Ｍの機能維持で安定性を改善することが判明しており、骨髄細胞、造血幹細胞、及び／又は造血前駆細胞の保護に役立ち得る。
【００３１】
変異（Ｍ４１Ｋ＋Ｒ６６Ｈ）、（Ｍ４１Ｋ＋Ｎ１７，９６Ｄ）、（Ｒ６６Ｈ＋Ｎ１７，９６Ｄ）、及び／又は（Ｍ４１Ｋ＋Ｒ６６Ｈ＋Ｎ１７，９６Ｄ）は、溶解度の増加及び／又は機能の維持による安定性を示している。変異（Ｒ６６Ｈ＋Ｎ１７，９６Ｄ）は、全体的に良好な性能を示した。
【００３２】
他のＡ１Ｍ変異体
さらに、Ｃ末端テトラペプチド配列ＬＩＰＲがタンパク質の部分を形成しないため、Ａ１ＭのＣ末端の切断により、ヘムの結合及び分解が改善されるようである。
【００３３】
加えて、Ｎ末端の、帯電した親水性の伸長の影響は、Ａ１Ｍ変異体中で変更できる。Ｎ末端の伸長は、Ａ１Ｍの生理学的機能を損なうことなく、水溶液中での最大の安定性及び溶解性を得るために、１）精製用タグ（例えば、Ｈｉｓタグ）、２）Ａ１Ｍタンパク質のコアからタグを分離するリンカー、３）該タンパク質に親水性を付与するいくつか（１〜５個）の荷電アミノ酸側基によって修飾することができる。
【００３４】
以下の初期配列（ペプチド）の有無にかかわらず、Ａ１Ｍを使用することができる：
−Ｍ８Ｈ５ＧＩＥＧＲ：アミノ酸配列ＭＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＧＧＧＩＥＧＲ又は別の関連タグ（ＨＨＨＨＨＨＨＨ）及びリンカー（ＧＧＧＧＧＩＥＧＲ）を有するペプチド
−Ｍ８Ｈ４ＤＫ：アミノ酸配列ＭＨＨＨＨＨＨＨＨＤＤＤＤＫ又は別の関連タグ（ＨＨＨＨＨＨＨＨ）又はリンカー（ＤＤＤＤＫ）を有するペプチド
−Ｍ６Ｈ４ＤＫ：アミノ酸配列ＭＨＨＨＨＨＨＤＤＤＤＫ又は別の関連タグ（ＨＨＨＨＨＨ）又はリンカー（ＤＤＤＤＫ）を有するペプチド
−Ｍ８Ｈ：アミノ酸配列ＭＨＨＨＨＨＨＨＨを有するペプチド
【００３５】
これらの観察に基づいて、上に示した一線に沿ったＡ１Ｍタンパク質の変形は、Ａ１Ｍ機能を有するが、安定性及び／又は溶解性に関して特徴が改善されているタンパク質を提供することが企図される。
【００３６】
そのため、本発明はまた、Ｎ末端への修飾、例えばＨｉｓタグを含有し、Ｃ末端が切断された、すなわちＬＩＰＲなしのＡ１Ｍと、点変異Ｍ４１Ｋ、Ｒ６６Ｈ、Ｎ１７，９６Ｄの任意の組み合わせとの全ての可能な組み合わせに関する。
【００３７】
以下に、配列のリストを示す。本発明は、例えば、本明細書に示されるものなどの全ての可能な変形を包含する。
配列番号１：ｗｔ  ｈＡ１Ｍ（タンパク質）
配列番号２：ｒｈＡ１Ｍ（すなわち、Ｍｅｔ−Ａ１Ｍ）（タンパク質）
配列番号３：ｗｔ  ｈＡ１Ｍ（ヌクレオチド配列）
配列番号４：ｒｈＡ１Ｍ（すなわち、Ｍｅｔ−Ａ１Ｍ）（ヌクレオチド配列）
配列番号５：伸長なしの好ましい変異−Ｎ１７，９６Ｄ、Ｒ６６Ｈ
配列番号６：伸長なし、Ｍ４１Ｋ
配列番号７：６個のＨｉｓ、Ｎ１７，９６Ｄ、Ｒ６６Ｈを有する好ましい変異
配列番号８：６個のＨｉｓ、Ｍ４１Ｋ
配列番号９：８個のＨｉｓ伸長、Ｎ１７，９６Ｄ、Ｒ６６Ｈを有する好ましい変異
配列番号１０：８個のＨｉｓ、Ｍ４１Ｋ
配列番号１１：伸長＋ｗｔ  ｈＡ１Ｍ
配列番号１２：伸長なしの好ましい変異−Ｎ１７，９６Ｄ、Ｒ６６；Ｃ末端が切断されている
配列番号１３：伸長なし、Ｍ４１Ｋ；Ｃ末端が切断されている
配列番号１４：６個のＨｉｓ、Ｎ１７，９６Ｄ、Ｒ６６Ｈを有する好ましい変異；Ｃ末端が切断されている
配列番号１５：６個のＨｉｓ、Ｍ４１Ｋ；Ｃ末端が切断されている
配列番号１６：８個のＨｉｓ伸長、Ｎ１７，９６Ｄ、Ｒ６６Ｈを有する好ましい変異；Ｃ末端が切断されている
配列番号１７：８個のＨｉｓ、Ｍ４１Ｋ；Ｃ末端が切断されている
【００３８】
Ｎ末端タグ（６又は８個のＨｉｓ）は、調製又は単離の目的で、他の任意の適切なタグで置き換えられ得ることが企図される。さらに、Ｎ末端タグとコアＡ１Ｍ分子の間のリンカーも、数が変わり、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇから個別に選択され得る。
【００３９】
Ａ１Ｍについての追加
ヒトＡ１Ｍは、３つの位置でオリゴ糖と置換されており、２つは、おそらくＮ１７及びＮ９６に連結された二分岐炭水化物のシアリル化された複合型であり、１つは、Ｔ５に連結されたより単純なオリゴ糖である。アフリカツメガエルではグリコシル化がまったくないが、異なるグリコシル化パターンのスペクトルにわたって、異なる種のＡ１Ｍタンパク質の炭水化物含有量は大きく異なる。しかしながら、ヒトのＮ９６に対応する１つのグリコシル化部位は、哺乳類で保存されており、この特定の炭水化物が機能的に重要である可能性があることを示唆している。
【００４０】
Ａ１Ｍは、血漿又は尿から精製されると黄褐色になる。色は、主にポケットの入り口に位置する様々なアミノ酸側基に共有結合した不均一な化合物によってもたらされる。これらの修飾は、生体内でＡ１Ｍによって共有結合で捕捉された有機酸化剤の酸化分解生成物例えば、ヘム、キヌレニン及びチロシルラジカルを表す。
【００４１】
Ａ１Ｍはまた、電荷及びサイズが不均一であり、より濃い茶色のＡ１Ｍ分子はより負に帯電している。不均一性のほぼ確実な説明は、異なる側基が、異なるラジカルで様々な程度に修飾されること、及びその修飾がタンパク質の正味の電荷を変えることである。共有結合された着色物質は、Ｃ３４、及びＫ９２、Ｋ１１８及びＫ１３０に局在し、後者の分子量は１００〜３００Ｄａである。トリプトファン代謝産物のキヌレニンは、血液透析患者の尿からのＡ１Ｍ中のリシル残基に共有結合していることが判明し、この場合、該タンパク質の褐色の供給源であると思われる［６］。合成ラジカルＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸）の酸化断片は、Ｙ２２及びＹ１３２の側鎖に結合した。
【００４２】
Ｃ３４は、Ａ１Ｍの反応中心である。これは、非常に電気陰性になり、硫黄原子の酸化の前提条件であるＣ３４チオール基の脱プロトン化を誘発するＫ６９、Ｋ９２、Ｋ１１８及びＫ１３０の正に帯電した側鎖の近接により、電子を放出する可能性が高いことを意味する。予備データは、Ｃ３４が既知の最も電気陰性の基の１つであることを示している。
【００４３】
理論的には、以下でより詳細に説明するＡ１Ｍ（Ｃ３４、Ｙ２２、Ｋ９２、Ｋ１１８、Ｋ１３０、Ｙ１３２、Ｌ１８０、Ｉ１８１、Ｐ１８２、Ｒ１８３）の特性を特徴付けるアミノ酸は、別のフレームワーク、例えば、同じグローバルフォールディング（別のリポカリン）を有するタンパク質、又はプラスチックポリマー、ナノ粒子若しくは金属ポリマーなどの完全に人工の有機分子又は無機分子上に同様の３次元構成で配置することができる。
【００４４】
これらのアミノ酸のいくつかの３次元配置（青い楕円、リジンは「＋」で示されている）、Ａ１Ｍフレームワーク（バレル）、電子フロー及びラジカル捕捉を図１に示す。
【００４５】
したがって、上記の反応中心及びその周囲を含む構造を含む相同体、断片又は変異体が好ましい。
【００４６】
本開示のポリペプチドの構造に修飾及び変更を加えることができ、なお、ポリペプチドと同様の特徴（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する分子が得られる。例えば、特定のアミノ酸は、かなりの活性を損失することなく、配列中の他のアミノ酸と置換することができる。なぜなら、それは、そのポリペプチドの生物学的機能活性を定義するポリペプチドの相互作用能力及び性質であるため、特定のアミノ酸配列置換をポリペプチド配列内で行うことができ、それにもかかわらず、同様の特性を有するポリペプチドを得ることができる。
【００４７】
このような変更を行う際には、アミノ酸の疎水性親水性指数を考慮することができる。ポリペプチドに相互作用的生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指数の重要性は、当技術分野で一般に理解されている。特定のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指数又はスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、それでも類似の生物学的活性を有するポリペプチドが得られることが知られている。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指数が割り当てられている。それらの指数は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【００４８】
アミノ酸の相対的な疎水性親水性特性が、得られるポリペプチドの二次構造を決定し、それが次に、酵素、基質、受容体、抗体、及び抗原などの他の分子と該ポリペプチドとの相互作用を定義すると考えられている。アミノ酸は、類似の疎水性親水性指数を有する別のアミノ酸で置換され、それでも機能的に同等なポリペプチドを得ることができることは、当技術分野で知られている。そのような変更では、疎水性親水性指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものは特に好ましく、±０．５以内のものはさらにより特に好ましい。
【００４９】
同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて行うこともでき、特に、それによって作製された生物学的機能が同等のポリペプチド又はペプチドは免疫学的実施形態での使用が意図される。以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；スレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸で置換することができ、それでも生物学的に同等、特に免疫学的に同等のポリペプチドを得ることができると理解されている。そのような変更では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸の置換がさらにより特に好ましい。
【００５０】
上記で概説したように、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、及びサイズなどに基づく。前述の特徴の１以上を考慮に入れる例示的な置換は、当業者に周知であり、（元の残基：例示的な置換）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ１  Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｒｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、及び（Ｖａｌ：Ｌｌｅ、Ｌｅｕ）を含むが、これらに限定されない。そのため、本開示の実施形態は、上記のポリペプチドの機能的又は生物学的同等物を企図する。特に、ポリペプチドの実施形態は、目的のポリペプチドに対して約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び９５％の配列同一性を有する変異体を含むことができる。
【００５１】
本文脈において、２つのアミノ酸配列間又は２つの核酸配列間の相同性は、パラメーター「同一性」により説明される。配列のアライメント及び相同性スコアの計算は、タンパク質とＤＮＡの両方のアライメントに役立つ完全なＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントを使用して実行され得る。デフォルトスコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ５０及び同一性マトリックスは、それぞれタンパク質及びＤＮＡのアライメントに使用される。ギャップの最初の残基のペナルティは、タンパク質では−１２であり、ＤＮＡでは−１６であるが、ギャップ内のさらなる残基のペナルティは、タンパク質では−２、ＤＮＡでは−４である。アライメントは、ＦＡＳＴＡパッケージバージョンｖ２０ｕ６を用いて行われ得る。
【００５２】
「ＣｌｕｓｔａｌＷ」を使用して、タンパク質配列の複数のアライメントが行われ得る。ＤＮＡ配列の複数のアライメントは、テンプレートとしてタンパク質アライメントを用い、アミノ酸をＤＮＡ配列からの対応するコドンで置換することで行われ得る。
【００５３】
あるいは、アミノ酸配列及びＤＮＡ配列を整列させるために、異なるソフトウェアを使用することができる。２つのアミノ酸配列のアライメントは、例えば、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）バージョン２．８．０のＮｅｅｄｌｅプログラムを使用して決定される。Ｎｅｅｄｌｅプログラムは、説明されているグローバルアライメントアルゴリズムを実装する。使用される置換マトリクスはＢＬＯＳＵＭ６２であり、ギャップ開始ペナルティは１０で、ギャップ伸長（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルティは０．５である。
【００５４】
アミノ酸配列；例えば、配列番号１と異なるアミノ酸配列（例えば、配列番号２）の間の同一性の程度は、２つの配列のアライメントにおける完全一致の数を、「配列番号１」の長さ又は「配列番号２」の長さのいずれか短い方で割ったものとして計算される。結果はパーセント同一性で表される。
【００５５】
２つの配列がオーバーラップの同じ位置に同一のアミノ酸残基を有する場合に、正確な一致が生じる。
【００５６】
関連する場合、２つのヌクレオチド配列間の同一性の程度は、同一性の表及び次の複数のアライメントパラメーター：ギャップペナルティ１０及びギャップ長ペナルティ１０と共に、ＬＡＳＥＲ−ＧＥＮＥ（商標）ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、Ｗｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎ法により決定することができる。ペアワイズアライメントパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝３、ギャップペナルティ＝３、及びｗｉｎｄｏｗｓ＝２０である。
【００５７】
配列番号１のアミノ酸と、又は配列番号１のアミノ酸に対するポリペプチドのアミノ酸配列の同一性の割合は、ｉ）ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックス、ギャップ開始ペナルティ１０、及びギャップ伸長ペナルティ０．５と共にＮｅｅｄｌｅプログラムを使用して、２つのアミノ酸配列を整列させること、ｉｉ）アライメントの完全一致の数を数えること；ｉｉｉ）完全一致の数を２つのアミノ酸配列の短い方の長さで除すること、及びｉｖ）ｉｉｉ）の除算の結果をパーセンテージに変換すること、によって決定され得る。本発明の他の配列に対する、又はそれとの同一性の割合は、類似の方法で計算される。
【００５８】
例として、ポリペプチド配列は、参照配列と同一であり得る、すなわち、１００％同一であるか、又は％同一性が１００％未満になるように、参照配列と比較して、特定の整数までのアミノ酸変更を含み得る。そのような改変は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換（保存的及び非保存的置換を含む）、又は挿入から選択され、前記変更は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端位置若しくはカルボキシ末端位置、又は参照配列内のアミノ酸間で個別に、又は参照配列内の１以上の隣接グループ内のいずれかに散在するそれらの末端位置の間のどこかで生じ得る。
【００５９】
保存的アミノ酸変異体はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る。非天然アミノ酸には、限定されないが、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−メチルプロリン及び４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンが含まれる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むためのいくつかの方法が当技術分野で知られている。例えば、ナンセンス変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを使用して抑制されるインビトロ系を使用することができる。アミノ酸を合成する方法及びｔＲＮＡをアミノアシル化する方法は、当技術分野で知られている。ナンセンス変異を含有するプラスミドの転写及び翻訳は、大腸菌Ｓ３０抽出物及び市販の酵素及び他の試薬を含む無細胞系で行われる。タンパク質はクロマトグラフィーによって精製される。２番目の方法では、変異ｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡをマイクロインジェクションすることにより、アフリカツメガエルの卵母細胞で翻訳が行われる。３番目の方法では、大腸菌細胞を、置換される予定の天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の非存在下で、かつ所望の非天然アミノ酸（複数可）（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養する。天然に存在しないアミノ酸は、天然のアミノ酸の代わりにタンパク質に組み込まれる。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロの化学修飾により、天然に存在しない種に変換することができる。化学修飾を部位特異的変異誘発と組み合わせて、置換の範囲をさらに拡大することができる。Ａ１Ｍの特性を支持するのに十分である３次元構造を提供する代替化学構造は、他の技術、例えば、人工骨格、及びアミノ酸置換などによって提供され得る。さらに、上記のＡ１Ｍの活性部位を模倣する構造は、Ａ１Ｍと同じ機能を有するものとして企図される。
【００６０】
医薬組成物及び投与量
本発明はまた、
ｉ）骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞の保護のためのＡ１Ｍを含む医薬組成物の使用；
ｉｉ）損傷が電離放射線によって引き起こされる、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞の保護のためのＡ１Ｍを含む医薬組成物の使用；
ｉｉｉ）損傷が化学療法剤によって引き起こされる、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞の保護のためのＡ１Ｍを含む医薬組成物の使用；
ｉｖ）損傷が毒性物質によって引き起こされる、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞の保護のためのＡ１Ｍを含む医薬組成物の使用；
ｖ）上記の骨髄細胞への損傷を防止するためのＡ１Ｍを含む医薬組成物の使用であって、Ａ１Ｍを含む組成物は、電離放射線又は化学療法剤による任意の治療の前に投与される、医薬組成物の使用；
ｖｉ）電離放射線によって引き起こされる、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞の保護のための
ａ）放射線療法の手段、及び
ｂ）Ａ１Ｍを含む医薬組成物
を含むキット；
ｖｉｉ）電離放射線によって引き起こされる、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞の保護のためで、放射線療法の手段がＰＲＲＮを含む医薬組成物である上記のキット；
ｖｉｉｉ）化学療法によって引き起こされる、骨髄若しくは他の血液系ニッチに存在する造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞などの骨髄細胞の保護のための、
ａ）化学療法の手段、及び
ｂ）Ａ１Ｍを含む医薬組成物
を含むキット、
に関する。
【００６１】
該キットは、上記の２つの組成物を含有する１つのパッケージの形態であり得る。
【００６２】
ＰＲＲＮなどの放射線療法のための手段を含むか、又は化学療法のための手段を含む医薬組成物は、典型的には、すでに市場に出ている組成物である。
【００６３】
Ａ１Ｍ（又は本明細書で定義されるその類似体、断片若しくは変異体）を含む医薬組成物は、ｉ．ｖ．投与又は皮下投与などの非経口投与を含む任意の適切な投与経路を意図している。したがって、Ａ１Ｍは、液体、例えば、溶液、分散液、乳濁液、懸濁液などで製剤化することができる。ｉ．ｖ．投与に適するビヒクルは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び０．１２５ＭのＮａＣｌで構成され得る。ｉ．ｖ．投与に適する別のビヒクルは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ及び２ｍｇ／ｍＬのヒスチジンで構成され得る。
【００６４】
非経口使用に適する溶媒には、水、植物油、プロピレングリコール及びそのような目的で一般に承認されている有機溶媒が含まれる。一般に、当業者は、Ｒｏｗｅらが編集した「医薬用賦形剤のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）」（ＰｈＰ  Ｐｒｅｓｓ）の中のＧｅｎｎａｒｏらが編集した「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の中及び特定の製剤の種類のための関連賦形剤及び特定の製剤を調製する方法に関する公式モノグラフ（例えば、Ｐｈ．Ｅｕｒ又はＵＳＰ）の中でガイダンスを見つけることができる。
【００６５】
Ａ１Ｍが放射線曝露、放射線療法、化学療法、又は他の遺伝毒性物質への曝露と組み合わせて使用される場合、Ａ１Ｍは、曝露又は治療法に関連して１回用量又は数回用量で投与される。好ましくは、各用量は、単回用量又は複数回用量のいずれかとして、例えば、ｉ．ｖ．若しくは皮下に、又は任意の他の利用可能な経路を介して投与される。最初の用量は、曝露又は治療法と同時に、曝露若しくは治療の前又は後に投与される。曝露又は治療後に、さらなるＡ１Ｍ用量を追加することはできるが、必要でない場合がある。各用量は、患者の体重に関連するＡ１Ｍの量を含有する：患者１ｋｇあたり０．１〜１００ｍｇのＡ１Ｍ。本明細書の実施例に記載の研究では、２０ｍｇ／ｋｇの用量（マウスモデルに皮下投与される）を採用する。
【００６６】
骨髄内の造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞がすでに損傷していて、放射線療法又は化学療法が不要な場合は、Ａ１Ｍは、上記のように、又は複数回用量で投与することができる。
【００６７】
Ａ１Ｍでの治療の効果には、例えば、限定されないが、同じ患者の末梢血中の網状赤血球の割合と比較した末梢血中の網状赤血球の割合の測定が続く場合があるが、該血液試料は治療前に採取され、割合の増加は骨髄に対して正の効果を示す。あるいは、健康なボランティアからの対照試料と比較することができる。
【００６８】
配列表フリーテキスト
配列番号１
＜２２３＞野生型ヒトＡ１Ｍ、変異なし
配列番号２
＜２２３＞ｒｈＡ１Ｍ、すなわち、Ｎ末端Ｍｅｔ
配列番号３
＜２２３＞野生型ヒトＡ１Ｍ、変異なし（ヌクレオチド配列）
配列番号４
＜２２３＞ｒｈＡ１Ｍ、すなわち、Ｎ末端Ｍｅｔ（ヌクレオチド配列）
配列番号５
＜２２３＞ｈＡ１Ｍ、タグなし、Ｎ末端Ｍｅｔ、Ｎ１７，９６Ｄ；Ｒ６６Ｈ
配列番号６
＜２２３＞ｈＡ１Ｍ、タグなし、Ｎ末端Ｍｅｔ、Ｍ４１Ｋ
配列番号７
＜２２３＞６個のＨｉｓ、Ｎ１７，９６Ｄ；Ｒ６６Ｈ
配列番号８
＜２２３＞ｈＡ１Ｍ、６個のＨｉｓ、Ｍ４１Ｋ
配列番号９
＜２２３＞８個のＨｉｓ、Ｎ１７，９６Ｄ；Ｒ６６Ｈ
配列番号１０
＜２２３＞ｈＡ１Ｍ、８個のＨｉｓ、Ｍ４１Ｋ
配列番号１１
＜２２３＞ｈＡ１Ｍ、８個のＨｉｓ、変異なし
配列番号１２
＜２２３＞ｈＡ１Ｍ、タグなし、Ｎ末端Ｍｅｔ、Ｎ１７，９６Ｄ；Ｒ６６Ｈ；切断型
配列番号１３
＜２２３＞ｈＡ１Ｍ、タグなし、Ｎ末端Ｍｅｔ、Ｍ４１Ｋ、切断型
配列番号１４
＜２２３＞６個のＨｉｓ、Ｎ１７，９６Ｄ、Ｒ６６Ｈ、切断型
配列番号１５
＜２２３＞ｈＡ１Ｍ、６個のＨｉｓ、Ｍ４１Ｋ、切断型
配列番号１６
＜２２３＞８個のＨｉｓ、Ｎ１７，９６Ｄ、Ｒ６６Ｈ、切断型
配列番号１７
＜２２３＞ｈＡ１Ｍ、８個のＨｉｓ、Ｍ４１Ｋ、切断型
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】強調されたＣ３４残基及びマークされたＮ末端とＣ末端を有するＡ１Ｍの３次元構造。
【図２】Ａ１Ｍは、１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥへの曝露後に、骨髄及び末梢血細胞内の網状赤血球に保護を与える。Ａ．骨髄からの単一細胞懸濁液を、単一細胞懸濁液を得るために、２％ＦＣＳを含有するＰＢＳで大腿骨を破砕し、７０uｍのセルストレーナーに通すことで得た。細胞を、マウスＦｃ受容体結合阻害剤とのインキュベーションによりブロックし、次いで、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４４、ＣＤ７１及びＣＤ４５に対するモノクローナル抗体で染色した。死んだ細胞を排除するために、ＤＡＰＩを用いた。Ｂ．末梢血を大伏在静脈から収集し、網状赤血球を、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ又はＲｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔを用いるＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメトリーを用いて決定した。データを、平均値±標準偏差及び個別のデータポイントとして提示する。グループ内の違いを、ポストホックテューキー（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｔｕｋｅｙ）と共に一元配置分散分析を用いて分析した。
【図３】Ａ１Ｍは、１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥ後の前赤芽球の保護を付与する。Ａ．骨髄からの単一細胞懸濁液を、単一細胞懸濁液を得るために、２％ＦＣＳを含有するＰＢＳで大腿骨を破砕し、７０uｍのセルストレーナーに通すことで得た。細胞を、マウスＦｃ受容体結合阻害剤とのインキュベーションによりブロックし、次いで、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４４、ＣＤ７１及びＣＤ４５に対するモノクローナル抗体で染色した。死んだ細胞を排除するために、ＤＡＰＩを用いた。データを平均値±標準偏差として提示する。グループ内の違いを、ポストホックテューキーと共に一元配置分散分析を用いて分析した。
【図４】Ａ１Ｍ処理は、マウスＤＢＡモデル及び患者の赤血球細胞の増殖を改善する。ＣＤ１１７（Ｋｉｔ）＋骨髄細胞をドキシサイクリンで処理して、Ｒｐｓ１９欠損症を誘発した。ドキシサイクリン投与の２４時間後に、細胞を、鉄又はヘムの利用能を妨げる薬物で処理した。ＡＴＰ測定プラットフォームＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏを用いて、増殖５日後の生細胞を監視した。Ａ）薬物スクリーニングの概略図を示す。Ｂ）鉄又はヘムの利用能を妨げるそれぞれの薬物化合物で処理したＲｐｓ１９誘導性マウスからの骨髄細胞（Ａに記載のとおり）の増殖を提示する。Ａ１Ｍが、赤芽球の非結合ヘムを減少させることにより細胞内効果を有することを示す薬物活性の概略図も示されている。細胞を、赤血球促進培地で５日間培養した。ダンの多重比較検定と共にクラスカル・ウォリスのノンパラメトリック検定を統計解析のために用い、遺伝子型をそれぞれの対照と別々に比較した。ｐ値：＊≦００５、＊＊≦００１、＊＊＊≦０００１、＊＊＊＊≦００００１。Ｃ）Ａ１Ｍ又はビヒクルとの７２時間の赤血球培養で増えた、Ｒｐｓ１９欠損マウスからのｋｉｔ＋骨髄細胞中の遊離非結合細胞内ヘム濃度。マンホイットニーのノンパラメトリック分析を、各遺伝子型内の統計分析に採用した。Ｄ）ＲＰＳ１９、ＲＰＬ３５ａ及びＲＰＳ２６に変異を有するＤＢＡ患者又は赤血球促進培地中でＡ１Ｍ又はビヒクルで７日間処理した健常対照者の末梢血からのＣＤ３４＋赤血球前駆細胞の増殖。各ドナーからのＡ１Ｍ処置値又はビヒクル処置値を一対で提示する。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
実験
実施例１−Ａ１Ｍは骨髄及び末梢血細胞への放射線による損傷に対して保護する
この研究で、発明者らは、ヒト組換えＡ１Ｍ（Ａ１Ｍ）がＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥ（１５０ＭＢｑ）曝露後に、骨髄及び末梢血細胞への放射線による損傷に対して保護を与えることを示す。
【００７１】
方法
組換えヒトＡ１Ｍ
組換えヒトＡ１Ｍ（Ａ１Ｍ、Ａ１Ｍ（Ｒ６６Ｈ＋Ｎ１７，９６Ｄ）に対応する変異体ＲＭＣ−０３５））は、Ａ１Ｍ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＢ（Ｌｕｎｄ、スウェーデン）によって提供された。
【００７２】
放射性医薬品
放射性医薬品の前駆体のルテチウム（１７７Ｌｕ）クロリド（ＬｕＭａｒｋ、ＩＤＢ、オランダ）と１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥと表記されるＤＯＴＡ−（Ｔｙｒ３）−オクトレオテート（ＡＮＭＩ、ベルギー）のコンジュゲーションは、ルンド大学病院（Ｌｕｎｄ、スウェーデン）で行われた。１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥコンジュゲートの品質管理は、ルンド大学放射性核種センター（Ｌｕｎｄ、スウェーデン）で行われた。
【００７３】
動物研究
１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、デンマーク）をこの研究で使用した。２つのグループ（ｎ＝５〜１０）に、Ａ１Ｍ（２０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４＋０．１５ＭのＮａＣｌ＋１２ｍＭのヒスチジン）のいずれかを皮下投与し、その３０分後に、１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥ（１５０ＭＢｑ）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。対照群（ｎ＝５〜１０）には、ビヒクルを皮下投与し、その３０分後に、ＮａＣｌをｉ．ｖ．注射した。注射の４日後に、動物を屠殺した。
【００７４】
４日後（１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥ投与後の）、麻酔していない動物の大静脈から、末梢血球及び網状赤血球の計数用の血液をＥＤＴＡプレコートバイアル（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ  ＣＢ  ３００  Ｋ２Ｅ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ、ドイツ）に採取し、室温でロッキングミキサーにかけ、以下に記載の分析を行った。その後、イソフルランを使用して動物を麻酔し、頸椎脱臼によって屠殺し、大腿骨（左及び右）を採取し、湿った氷の上に立てた２４ウェルプレート中のＰＢＳ、ｐＨ７．４に入れた。
【００７５】
全ての動物実験を、実験動物の保護に関する国内法及び動物研究倫理委員会（Ｌｕｎｄ、スウェーデン）の承認に従って実施した。
【００７６】
骨髄フローサイトメトリー分析：
２％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を含有するＰＢＳ中で大腿骨を破砕することによって、骨髄細胞を単離し、７０uｍのセルストレーナーに通して、単一細胞懸濁液を得た。単一細胞懸濁液を、マウスＦｃ受容体結合阻害剤（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）とのインキュベーションによってブロックし、次いで、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、スウェーデン）から購入した以下の特異的マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＴｅｒ１１９、ＣＤ４４、ＣＤ７１及びＣＤ４５で染色した。死んだ細胞を排除するために、４，６−ジアミジン−２’−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を使用した。全ての実験を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメトリーで行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
【００７７】
単一細胞懸濁液からの骨髄細胞型を、血液分析装置ＳＹＳＭＥＸ  ＫＸ−２１Ｎを用いて計数した。
【００７８】
血液分析
末梢血の採取後、血液パラメーターを決定するためにＳＹＳＭＥＸ  ＫＸ−２１Ｎ血液分析装置を用いた。網状赤血球数を、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ又はＲｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔを用いるＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて決定した。
【００７９】
統計分析
分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて全ての実験グループの比較によって結果を評価した。全ての統計計算をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０；Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）で行った。
【００８０】
結果
骨髄及び末梢血における造血細胞の分析
骨髄及び末梢血細胞に対する放射線の影響を、フローサイトメトリー及びＳｙｓｍｅｘ血液分析装置を用いて、１５０ＭＢｑの１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥの注射後４日目に評価した。１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥへの曝露後、生存している網状赤血球の割合が骨髄と末梢血の両方で著しく減少したことが観察された（図２）。１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥ投与の３０分前に行うＡ１Ｍの皮下同時投与は、完全に保存された網状赤血球集団を非放射線曝露対照動物のレベルで維持した（図２）。
【００８１】
末期赤血球分化に対する放射線の影響
骨髄内の最終的な赤血球分化を、１５０ＭＢｑの１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥの注射後４日目に評価した。網状赤血球に見られる影響（図２の影響と一致）に加えて、統計的に有意ではないが、明らかな影響が前赤芽球集団にも見られた（図３、Ｉと表記される集団）。放射線の影響は、他の前駆細胞集団（集団ＩＩ〜ＩＶと表記）のいずれにも観察されなかった。１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡＴＡＴＥ投与の３０分前に行うＡ１Ｍの皮下同時投与は、網状赤血球に加えて前赤芽球集団の保護を示し、それらを非放射線曝露対照動物のレベルで維持した（図３）。
【００８２】
実施例２−Ａ１Ｍは過剰な細胞内ヘムを減少させ、Ｄｉａｍｏｎｄ−Ｂｌａｃｋｆａｎ貧血の増殖を改善する
この研究で、発明者らは、ヒト組み換えＡ１Ｍ（Ａ１Ｍ）が、非結合ヘムのレベルを低下させる能力と共に、マウスＲｐｓ１９欠損赤血球前駆体の増殖の増加をもたらす唯一の試験化合物であることを示す。
【００８３】
序論
ダイヤモンドブラックファン貧血（ＤＢＡ）は、患者が骨髄に大赤血球性貧血及び赤血球前駆体の欠損を示す先天性障害である。全ての患者の約７０％は、リボソームタンパク質に、最も一般的にはＲＰＳ１９に変異を有する。一般的にタンパク質の翻訳及び特に特定のｍＲＮＡの翻訳はＤＢＡ内で変更され、疾患の発現型の一因となる。腫瘍抑制因子ｐ５３は、ＤＢＡで過剰に活性化され、赤血球前駆細胞の増殖の低下及びアポトーシスの増加をもたらす。ＤＢＡの現在の治療法は、グルココルチコイド、輸血、又は同種骨髄移植である。残念ながら、利用可能な全ての治療法は、患者の生活の質を損なう副作用を有する。このため、ＤＢＡ用の疾患特異的治療が早急に必要とされている。
【００８４】
ＤＢＡ患者の赤血球前駆細胞には、病理学的に高い細胞内ヘムレベルが含まれていることがすでに実証されており、赤血球細胞の増殖の不良を説明し得る。結合していないヘムは有毒であるため、細胞内ヘムの増加は、赤血球の必須酸素運搬分子であるヘモグロビンを生成するために、等量のグロビンによって満たされる必要がある。しかしながら、ＤＢＡでは翻訳が損なわれ、赤血球細胞では主な合成タンパク質はグロビンである。この発見は、ヘム毒性を低下させる薬物が、ロイシンを用いた進行中の臨床試験の背後にある理論的根拠であるグロビンｍＲＮＡ翻訳の強化によって、又は細胞内ヘムレベルを低下させることによって、ＤＢＡの潜在的な治療戦略であることを示唆している。
【００８５】
この実施例では、ＤＢＡの有毒な非結合細胞内ヘムを低下させるための新規治療戦略についてスクリーニングした。ヘム合成を阻害する薬物は、Ｒｐｓ１９欠損赤血球前駆細胞の増殖を改善できなかったが、ヘムスカベンジャーＡ１Ｍでの処置は、向上した細胞内ヘムレベルの低下及びＤＢＡのマウスモデルとＤＢＡ患者の両方の赤血球細胞の増殖の増加をもたらした。
【００８６】
方法
マウス骨髄細胞の薬物処理
倫理的な許可は、全ての動物研究に対して地元の倫理委員会によって付与された。製造元の指示に従って、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ドイツ）を用いて、８〜１４週齢の誘導性Ｒｐｓ１９欠損マウスの骨髄をＣＤ１１７（Ｋｉｔ）発現について濃縮した。細胞を、０．２μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に、ＳｔｅｍＳｐａｎ無血清増殖培地（ＳＦＥＭ）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）、１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、１００ｎｇ／ｍｌのｍＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  、米国）、３００μｇ／ｍｌのｈ−ホロ−トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、及び２Ｕ／ｍｌのｈＥｐｏ（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ、米国）中で培養した。
【００８７】
ドキシサイクリン投与の２４時間後に投与された薬物は、Ａ１Ｍ（Ａ１Ｍ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＢ、スウェーデンから提供）、Ｎ−メチルメソポルフィリンＩＸ（ＡＨ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、デンマーク）、スクシニルアセトン、ヘミン、デフェロキサミン、フェロスタチン及びＮ−アセチル−Ｌ−システイン及びヘモペキシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。薬物投与の５日後の細胞増殖を、存在するＡＴＰの定量に基づいて培養中の生存可能で代謝的に活性のある細胞の数を測定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて測定した。プレートを、ビクター３マルチラベルカウンター（Ｖｉｃｔｏｒ  ３  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国）で読み取った。
【００８８】
ヒト試料のＡ１Ｍ処理
末梢血試料を、スウェーデンの倫理審査委員会によって与えられた倫理的許可に従って、インフォームドコンセントを用いてルンド大学病院で収集した。３人のＤＢＡ患者は、それぞれＲＰＳ１９、ＲＰＳ２６及びＲＰＬ３５ａに変異があり、全員がキレート療法による輸血を受けた。ＤＢＡ患者及び健康な対象からの単核細胞を、製造業者の指示に従ってｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ、ドイツ）を用いて取得し、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ドイツ）を用いてＣＤ３４発現について濃縮した。細胞をＳＦＥＭ（幹細胞技術）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２Ｕ／ｍｌのＥｐｏ（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ）中で培養した。５μＭのＡ１Ｍ又はビヒクル（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌ）を２〜３日ごとに、合計７〜８日間追加した。血球計算盤を用いて手動で細胞数を計測した。
【００８９】
結果と考察
Ａ１Ｍは赤血球Ｒｐｓ１９欠損細胞の増殖を増加させる
細胞内ヘムレベルの増加は、ＤＢＡ患者において赤血球前駆細胞増殖の障害の一因となる可能性があるため、ＤＢＡマウスモデルからの赤血球細胞中の鉄又はヘムの可用性に影響を与える化合物の薬物スクリーニングを実行した（図４Ａ）。ヘム合成又は鉄の可用性に影響を与える化合物のどれもが、Ｒｐｓ１９欠損細胞の増殖を改善しなかった。驚くべきことに、Ａ１Ｍ（５及び１０μＭ）は、Ｒｐｓ１９欠損赤血球前駆細胞増殖の増加を示す唯一の試験化合物であった。ＷＴ細胞では増殖への影響は見られなかったため、Ｒｐｓ１９欠損赤血球前駆細胞でのみＡ１Ｍの特異的影響を示した（図４Ｂ）。
【００９０】
Ａ１ＭはＲｐｓ１９欠損細胞内で上昇したヘムレベルを下げる
Ａ１Ｍは、ヘムを除去及び分解することにより、ヘムによる細胞及び組織の損傷に対して保護する。Ｒｐｓ１９欠損赤血球細胞では、Ａ１Ｍは非結合の細胞内ヘムのレベルをＷＴレベルに大幅に戻すことが示された（図４Ｃ）。主に細胞外のヘムスカベンジャーヘモペキシンによる治療は、ＤＢＡ細胞に影響を及ぼさなかったため（図４Ｂ）、Ａ１Ｍは、おそらく赤血球ＤＢＡ細胞上で細胞内機能を発揮する。
【００９１】
ＤＢＡ患者からの初期の赤血球細胞はＡ１Ｍ処理で増殖が増加する
５μΜのＡ１Ｍと培養した３人のＤＢＡ患者からの精製赤血球前駆細胞は全て、増殖の改善を示したが、健康な対象からの細胞ではそのような傾向は観察されなかった（図４Ｄ）。
【００９２】
要約すると、この研究は、非結合細胞内ヘムのレベルを正規化することにより、ＤＢＡ患者からの赤血球細胞の増殖を増加させるヘム結合タンパク質Ａ１Ｍを特定する。発明者らの発見は、Ａ１Ｍが、ｄｅｌ  ５ｑ骨髄異形成症候群などのリボソームタンパク質欠損によって引き起こされる貧血状態でのヘム毒性を低下させる能力を有することを示唆している。まとめると、この研究から、Ａ１Ｍを用いてＤＢＡ患者からの細胞を治療できることが特定された。この研究はまた、ヘムレベルを標的にすることは、より疾患特異的なＤＢＡ治療法を開発するのに使用できる概念実証研究として役立つ。
【００９３】
実施例３−いくつかの異なる誘導物質による骨髄損傷後の造血回復の評価
全身照射、遺伝毒性分子及び細胞毒性分子（５−ＦＵ、シスプラチンなど）への曝露、フェニルヒドラジンなどの薬剤によって誘発される溶血又はダイヤモンドブラックファン貧血におけるＲＰＳ１９欠損症などの遺伝的欠陥によって引き起こされる損傷を含む、いくつかの異なる損傷後の骨髄回復に対するＡ１Ｍ治療の効果の研究。
【００９４】
上記を、以下の方法で評価する：
１．幹／前駆細胞の回復を評価するためのマウスにおける連続移植
ゴールドスタンダードの実験は、連続移植と限界希釈実験を行うことである（Ｆｒｉｓｃｈら、２０１４、Ｒｕｎｄｂｅｒｇ  Ｎｉｌｓｓｏｎら、２０１５）。連続移植とは、Ａ１Ｍで処置した損傷マウス又は処置していない損傷マウス（上記の異なる損傷を参照）からの骨髄を、競合細胞と共に少なくとも２回、照射を受けたマウスへ再移植することを意味する。これは、長期の幹細胞がＡ１Ｍ処置マウスで保存されていることを実証するためである。
【００９５】
２．マウスでの限界希釈実験
限界希釈実験は、幹細胞を機能的に定量化するために使用される（Ｂｏｎｎｅｆｏｉｘら、２０１０）。Ａ１Ｍ処置マウス及び非処置マウスからの異なる数の骨髄細胞を、照射マウスに、健康な競合細胞と共に再移植する。健康な細胞と比較した、処置マウスからの造血再構成のレベルに基づいて、損傷を生き延びた幹細胞の数を推定することが可能である。
【００９６】
３．マウスでの処置後のＦＡＣＳ及びコロニーアッセイ
前駆細胞の数を評価するために行われる標準的な実験。ＦＡＣＳ分析は、Ａ１Ｍ療法が造血前駆細胞と幹細胞の生存率の増加につながるかどうかを判断する。
【００９７】
４．幹細胞／前駆細胞におけるＡ１Ｍの取り込み
Ａ１Ｍを、健康なマウスと損傷した（上記を参照）マウスに注射する。次に、ＦＡＣＳを用いて、動物から幹細胞と前駆細胞を選別し、Ａ１Ｍの取り込みを決定する。
【００９８】
５．Ａ１Ｍノックアウトマウス
上記の実験を、Ａ１Ｍが通常の内因性レベルである動物で行い、Ａ１Ｍの薬物としての能力を評価するために行う。骨髄損傷時の造血幹細胞／前駆細胞の保護におけるＡ１Ｍのメカニズムをより明確に決定するために、上記の実験を、Ａ１Ｍを欠くＡ１Ｍノックアウトマウスで行う。
参考文献
Ｂｏｎｎｅｆｏｉｘ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ｃａｌｌａｎａｎ  （２０１０）．  “Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｂｙ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌ  Ｐｏｉｓｓｏｎ  ｍｏｄｅｌｓ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｈｉｔ  Ｐｏｉｓｓｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ．”  Ｂｌｏｏｄ  １１６（１４）：  ２４７２−２４７５．
Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｂ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｌ．  Ｍ．  Ｃａｌｖｉ  （２０１４）．  “Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ａｓｓａｙｓ．”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１３０：  ３１５−３２４．
Ｒｕｎｄｂｅｒｇ  Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ａ．，  Ｃ．  Ｊ．  Ｐｒｏｎｋ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｂｒｙｄｅｒ  （２０１５）．  “Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  Ｓｅｅｄｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ４３（９）：  ８１２−８１７  ｅ８１１
【図１】
2021501750.tif 000003
【図２】
2021501750.tif 000004
【図３】
2021501750.tif 000005
【図４】
2021501750.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月29日(2020.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021501750000001.app
【国際調査報告】
2021501750.tif 000007
2021501750.tif 000008
2021501750.tif 000009