(57)【要約】  エクソソームを含む、ＰＥＧなどの親水性の中性ポリマーのコーティングを有する小胞は、コーティングされていない小胞と比較して、懸濁液またはコロイドを形成する能力が高い。これにより、コーティングされた小胞を使用してエアロゾル液滴を形成することができ、小胞を含む液体製剤をネブライザーでその吸入投与に使用することができる。そのようなコーティングされた小胞はまた、粘液を通過することができ、それらの積荷を肺細胞に送達することができる。間葉系幹細胞からのエクソソームは、追加のタンパク質、ｍｉＲ、ｍＲＮＡ、およびその他の核酸配列を肺細胞に送達し、ＣＦ、ＣＯＰＤ肺がんおよびその他の肺疾患の再生遺伝子治療を提供する。
2021534237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の表面コーティングを有する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からの細胞外小胞を含むエアロゾル化可能な組成物であって、該小胞が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンチｍｉＲ、ｍＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、環状ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ配列、前述の改変体、あるいは人工的に設計された核酸配列、タンパク質、サイトカインまたは脂質を含むカーゴを運搬する、組成物。
【請求項２】
前記小胞がエクソソームである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記親水性ポリマーがＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記表面コーティングが前記エクソソーム表面の少なくとも６５％を覆う、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記表面コーティングポリマーが、５ｋＤａ未満、好ましくは３ｋＤａ未満の分子量を有する、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記エクソソームがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）を含むカーゴを有する、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記ｍｉＲが、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１７から選択される、請求項６に記載の組成物。ステムループ（プレマイクロＲＮＡ）配列ｈｓａ−ｍｉｒ−１２５ｂ−１が過剰発現され、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐとｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐとの両方の成熟配列を含むＥＶを生成し得る。
【請求項８】
前記エクソソームが、ｍＲＮＡまたはその翻訳されたタンパク質を含むカーゴを有する、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記ｍＲＮＡが改変されたＣＦＴＲ  ｍＲＮＡである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記エクソソームの水性懸濁液またはコロイドを含む、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
治療に使用するための先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
肺疾患の治療に使用するための請求項１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
がん治療に使用するための、請求項１１または１２に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記エクソソームが治療用カーゴおよび親水性ポリマーの表面コーティングを有し、好ましくは実質的に中性の表面電荷を有する、治療に使用するためのエクソソームコロイドまたは懸濁液。
【請求項１５】
前記治療が嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、肺癌または他の別の肺状態の治療のためである、請求項１２または１４に記載の使用のためのエクソソームコロイドまたは懸濁液。
【請求項１６】
前記エクソソームが、少なくとも１つの外因性ｍＲＮＡ（例えば、インビトロ転写されたｍＲＮＡ）、タンパク質、ｍｉＲ、またはアンチｍｉＲを含む治療用カーゴを含む、請求項１４または請求項１５に記載の使用のためのエクソソームコロイドまたは懸濁液。
【請求項１７】
前記エクソソームが、特定のｍｉＲ、アンチｍｉＲ、ｍＲＮＡまたは他の核酸および成熟タンパク質治療用カーゴを過剰発現するように遺伝子改変された間葉系幹細胞に由来する、請求項１４〜１６のいずれかに記載の使用のためのエクソソームコロイドまたは懸濁液。
【請求項１８】
前記処理がコロイドまたは懸濁液のエアロゾル化を含む、請求項１４〜１７のいずれかに記載の使用のためのエクソソームコロイドまたは懸濁液。
【請求項１９】
肺疾患を有する患者を治療する方法であって、
請求項１から１０のいずれかに記載の組成物を提供する工程；
該組成物の小胞のエアロゾルを形成する工程； および
該患者に該エアロゾルを投与する工程；
を含む、方法。
【請求項２０】
ネブライザーを使用して前記エアロゾルを形成する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
振動メッシュネブライザーを使用して前記エアロゾルを形成する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外小胞（特にエクソソーム）、当該小胞を含む組成物、それらの使用、およびその使用および製造のための方法に関する。本発明はまた、治療および遺伝子治療、特に嚢胞性線維症（ＣＦ）、ＣＯＰＤおよび肺癌などの気道疾患の治療におけるそのような小胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞は、脂質二重層によってカプセル化され、ほとんどの原核細胞および真核細胞によって能動的に分泌されるナノサイズの膜小胞である。細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクルおよび膜小胞を包含する。
【０００３】
小胞は一般に、生細胞からのエキソサイトーシスによって形成される。エクソソームは、細胞内のエンドサイトーシス区画に由来し、多小胞体が原形質膜と融合するとエキソサイトーシスによって細胞から排出されるという点で、他の多くの細胞外小胞とは異なる。
【０００４】
多小胞体の形成は、初期エンドソームの形成から始まる段階的なプロセスである。これらの初期エンドソームは成熟して後期エンドソームになり、この過程で、リソソーム区画で破壊するか、または分泌される小さな小胞に分類されるかであるいくつかのカーゴが、膜の陥入によってエンドソームの内部に選択的に取り込まれ、徐々に多数の管腔内小胞を形成する。多数の管腔内小胞を有するこれらのエンドソームは、現在、後期エンドソームと呼ばれ、その後成熟してＭＶＢを形成し、最終的に原形質膜と融合してこれらの小胞をエクソソームとして放出する。
【０００５】
細胞外小胞は一般に最大約１０００ｎｍの範囲のサイズを有し、エクソソームは一般に３０〜１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。それらの特徴的な膜分子に加えて、小胞（エクソソームを含む）は、天然に、水溶液／懸濁液中に様々なタンパク質、ＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡを含むことができる小胞内カーゴを有する。
【０００６】
小胞、特にエクソソームは、細胞間コミュニケーションおよび細胞間シグナル伝達に関与している。その結果、エクソソームおよび他の小胞が、最近、実験的な疾患モデルで薬物または所望の分子を送達するために使用され始めている。エクソソームは、その天然起源のため、さまざまな核酸ベースの治療薬、高分子、および薬物を送達するための効率的で信頼性の高い手段として、リポソームベースの薬物送達よりも明確な利点を有する。
【０００７】
細胞質コア中のタンパク質、ＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡを運搬する小胞の能力によって、それらを便利なドラッグデリバリー媒体とする。さらに、脂質二重層の存在は、構造的完全性を提供し、核酸を分解から保護し、エクソソームが剪断応力に耐えることを可能にする。
【０００８】
エクソソームは、一部にはそのサイズのために、細胞膜に容易に浸透し、免疫系を回避することができることが知られている。エクソソームは天然に存在するナノ小胞であるため、リポソームまたは他のナノ粒子ベースの薬物担体にあるような細胞毒性効果はなく、循環半減期が長く、さまざまな生物学的障壁を通過する浸透性が高い。
【０００９】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、患者が嚢胞性線維症膜コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）タンパク質の遺伝子の両方のコピーに変異を受け継いでいる遺伝性疾患である。ＣＦＴＲは、さまざまな分泌物、特に粘液、消化液、汗の生成に関与する。そのような分泌物は通常薄いが、嚢胞性線維症患者の突然変異の結果として分泌物は濃厚である。肺では、そのような濃厚な分泌物は、著しい痰の生成、粘液のクリアランスの減少、粘液の蓄積による気道の詰まり、持続的な咳、頻繁な肺感染症、および呼吸困難をもたらす。
【００１０】
現時点ではＣＦの既知の治療法はないが、可能な治療法として遺伝子治療が検討されている。リポソームおよびウイルスベクターを含むさまざまなアプローチが、遺伝子治療のために試みられてきた。しかし、そのような治療は、主にベクターの非効率性および安全性の懸念のために、非効率的であることがわかっている。ウイルスベクターは、反復投与を妨げる望ましくない免疫応答を惹起し得、また、ウイルスＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込みを介して発がん性の可能性のある挿入型変異誘発を引き起こし得る。
【００１１】
ＣＦは肺に重大な問題を引き起こし、肺への遺伝子治療の効率的な送達が効果的な治療の要件であると考えられている。
【００１２】
エクソソームを含む小胞は、遺伝子治療、そして実際に他の種類の治療、例えば再生医療、タンパク質、抗体、または小分子ベースの治療のための肺への理想的な送達媒体であるようである。しかし、少なくとも２つの重大な問題がある。第一に、肺の粘液は、肺の細胞に到達する遺伝子導入媒体に対する重要な障壁を提供する。粘液は、目、鼻、肺、胃腸管、および女性の生殖管を含む体内へのさまざまな侵入点で病原体、毒素、および破片から保護する粘着性の粘弾性ゲルである。多くのナノ粒子は強力な粘膜付着性であり、急速に除去された末梢粘液層に効果的にトラップされ、粘膜全体への分布と下層組織への浸透を大幅に制限する。アデノウイルス（ＡｄＶ）およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２を含むウイルス遺伝子ベクターおよび吸入遺伝子治療用の非ウイルスリポソームベクターを試験する臨床試験は、気道上皮への非効率的な遺伝子導入、治療不活化宿主免疫応答の発生のために臨床的に顕著な利益を提供することができず、そしてリポソーム遺伝子治療の場合、十分な用量の送達が、別の認識された課題であった。さまざまな研究により、粘液の捕捉がこれらのベクターの下層上皮へのアクセスを妨げ、したがって遺伝子導入の成功を妨げることが示された。これらのトラップされた粒子の滞留時間は、末梢粘液層の代謝回転速度によって制限され、臓器に応じて、数秒から数時間の範囲である。粘液膜を介した医薬品を含む粒子の効果的な送達を確実にするために、そのような粒子は、粘液バリアを通って容易に拡散できなければならず、粘液付着を回避し、粘液線毛クリアランス防御を逃れる。さらに、粘液バリアを通過すると、細胞膜バリアも通過する必要がある。これは、特にウイルスおよび異物の場合、細胞へのアクセスを防ぐためのバリアを提供するようにも設計される。
【００１３】
ウイルスベクターはまた、既存の免疫応答によって、または反復投与時に獲得した免疫応答によって中和され得る。免疫特権のある幹細胞エクソソームまたはＥＶを使用すると、この問題を回避できる。ＰＥＧコーティングは、表面抗原を効果的に遮蔽することにより、幹細胞エクソソームのステルス特性をさらに高めることができる。
【００１４】
さらに、治療関連用量の小胞のエアロゾル送達は、多くの標準的なネブライザーにとって問題となる可能性がある。水性ナノ懸濁液またはコロイド中の小胞は、集合または凝集し得る。特に濃縮されたナノ流体における粒子間力は、粘度の増加をもたらし、それは次にエアロゾル化において非常に重大な困難を引き起こす。さらに、このような集合または凝集のために、小胞が流体全体に広がらずに一緒に凝集するか、またはナノ懸濁液またはコロイドが保持される容器の壁に付着するので、小胞が真の懸濁液またはコロイドを形成しないという結果をもたらす。
【００１５】
カーゴ、特にヌクレオチド配列およびタンパク質の肺気道上皮細胞への効率的な送達は、依然としてすべてのアプローチに共通の問題である。
【００１６】
Kooijmansら、「PEGylated and targeting extracellular vesicles display enhanced cell specificity and circulation time」、Journal of Controlled Release、vo.224、2016年1月7日、p77-85は、小胞の特異性を改善し、クリアランス前の循環系での時間を延長するために、ポリエチレングリコールに結合したターゲティングリガンドによる細胞外小胞の装飾について説明している。この論文は、マウス神経芽細胞腫細胞からの細胞外小胞の産生について説明しており、粘液浸透または細胞膜浸透の問題には取り組んでいない。実際、この論文は、ＰＥＧ化が細胞の取り込みに悪影響を与えることを示唆した。
【００１７】
Myung Soo Kim、「Engineered macrophage-derived exosomes for targeting paclitaxel delivery to pulmonary metastases: in vitro and in vivo evaluations」、Nanomedecine: Nanotechnology, Biology and Medicine、vol.14、no.1、2017年10月2日、195〜204ページもまた、細胞／受容体特異的リガンドと結合したＰＥＧで修飾されたエクソソームについて説明している。この文書もまた、肺への小胞の送達に関連する問題のいずれにも対処しておらず、粘液バリアまたは細胞膜を通過することについても言及していない。さらに、この文書はパクリタキセルのカーゴについて説明している。
【００１８】
US9901600は、Alexander Mitsialisの名義で、肺疾患の治療および／または予防のためのエクソソームの使用について説明している。エクソソームは、タンパク質または核酸のカーゴを含み得る。これらのエクソソームはコーティングされておらず、粘液バリアや細胞膜バリアの問題に対処していない。この文書は注射または吸入による投与を示唆しているが、吸入に必要なエクソソームのエアロゾル化をどのように達成できるかについての情報はない。
【００１９】
吸入送達システムを使用して、肺の細胞に遺伝子治療を送達するためのビヒクルを提供することが望ましい。粘液の層を通過して細胞膜を貫通することができる送達ビヒクルを提供することも望ましい。さらに、送達ビヒクルは、エアロゾル化することができる製剤で運ばれるべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、エアロゾル化され、粘液層を通過して肺細胞に浸透することができる小胞、特にエクソソームを提供することである。本発明のさらなる目的は、治療、特に肺疾患の治療に使用するための小胞、特にエクソソームを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明によれば、親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の表面コーティングを有する間葉幹細胞（ＭＳＣ）からの細胞外小胞を含むエアロゾル化可能な組成物が提供され、小胞は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンチＭＩＲ、ｍＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、環状ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ配列、前述のまたは人工的に設計された核酸配列の改変物、タンパク質、サイトカインまたは脂質の１つまたはそれ以上を含むカーゴを運搬する。
【００２２】
そのような組成物は、コロイドまたは懸濁液の形態の表面コーティングされた小胞を適切に含む。親水性ポリマーのコーティングは、一般に、水性製剤中で懸濁液またはコロイドを形成することができ、粘液に浸透して細胞に入り、治療用カーゴを送達することができる小胞をもたらす。
【００２３】
本発明はまた、小胞それ自体、および治療に使用するためのそのような小胞含有組成物（例えば、コロイドまたは懸濁液として）を提供し、小胞は、治療用カーゴおよび親水性ポリマーの表面コーティングを有する。
【００２４】
このようなカーゴは、標的細胞への送達用に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンチｍｉＲ／アンタゴミールなどのマイクロＲＮＡ調節核酸配列、または標的疾患細胞における遺伝子発現を変化させ得る他の非コード核酸配列（例えば、長鎖非コードＲＮＡまたは環状ＲＮＡ（これらは、マイクロＲＮＡスポンジとして機能し、アンチｍｉＲ効果を発揮し得る）；特定の遺伝子ノックダウンのための低分子干渉ＲＮＡまたは短鎖ヘアピンＲＮＡ；疾患関係遺伝子またはトランスポゾンサイレンシングのためのｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡなど）、ｍＲＮＡ、脂質、タンパク質、サイトカインまたは小分子を含み得る。すべての核酸は、改変された効果のために変更または配列操作され得る。このようなカーゴは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、ｍＲＮＡ、アンチｍｉＲ、その他の天然または人工的に生成された核酸配列、脂質、タンパク質、サイトカイン、および小分子治療薬の１つまたはそれ以上、あるいは２つまたはそれ以上、あるいはすべてを含み得る。このようなカーゴが、（例えば産生細胞タイプの遺伝子改変によるマイクロＲＮＡの過剰発現によって）、例えば親細胞による生合成中に、エクソソームに導入され得るか、または治療用分子が、（例えばエレクトロポレーション、熱ショック、トランスファー溶液／試薬、または小分子、タンパク質、または核酸配列（アンチマイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡなど）を導入する他の方法を使用して）、培地から分離された後にエクソソームに導入され得る。小胞（例えばエクソソーム）が標的肺細胞の細胞質に導入されたとき、それらは、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性閉塞肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺癌、特発性肺線維症、閉塞性肺疾患、喘息、肺高血圧症、気管支肺異形成症およびその他の肺の状態および疾患に対する治療を提供できる。
【００２５】
本発明はまた、治療に使用するための上記のような組成物を提供する。
【００２６】
本発明によれば、肺疾患を有する患者を治療する方法も提供され、以下を含む：
上記のような組成物を提供する工程；
組成物の小胞のエアロゾルを形成する工程；および
エアロゾルを患者に投与する工程。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】図１Ａは、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）における、非ＰＥＧ化およびＰＥＧ化エクソソームの濃度対サイズのグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）における、非ＰＥＧ化およびＰＥＧ化エクソソームの濃度対サイズのグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化エクソソームのゼータ電位分布を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化エクソソームのゼータ電位分布を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｆは、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化エクソソームの一連の透過型電子顕微鏡画像である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＦａｒＲｅｄ色素によるＭＳＣおよびエクソソームの標識を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＦａｒＲｅｄ色素によるＭＳＣおよびエクソソームの標識を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＦａｒＲｅｄ色素によるＭＳＣおよびエクソソームの標識を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＦａｒＲｅｄ色素によるＭＳＣおよびエクソソームの標識を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＦａｒＲｅｄ色素によるＭＳＣおよびエクソソームの標識を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、気液界面培養で最初に粘液層に浸透した嚢胞性線維症気管支上皮細胞に入った、処理済みおよび未処理のエクソソームの共焦点顕微鏡画像である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、気液界面培養で最初に粘液層に浸透した嚢胞性線維症気管支上皮細胞に入った、処理済みおよび未処理のエクソソームの共焦点顕微鏡画像である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、気液界面培養で最初に粘液層に浸透した嚢胞性線維症気管支上皮細胞に入った、処理済みおよび未処理のエクソソームの共焦点顕微鏡画像である。
【図６ａ】図６ａは、コントロールとしてのｄＰＢＳおよび３０ｎｍの金（Ａｕ）ナノ粒子のナノ粒子トラッキング分析の読取値である。
【図６ｂ】図６ｂは、コントロールとしてのｄＰＢＳおよび３０ｎｍの金（Ａｕ）ナノ粒子のナノ粒子トラッキング分析の読取値である。
【図７ａ】図７ａは、サンプル１のナノ粒子トラッキング分析の読取値である。
【図７ｂ】図７ｂは、サンプル１のナノ粒子トラッキング分析の読取値である。
【図８ａ】図８ａは、サンプル２のナノ粒子トラッキング分析の読取値である。
【図８ｂ】図８ｂは、サンプル２のナノ粒子トラッキング分析の読取値である。
【図９】図９は、サンプル３のナノ粒子トラッキング分析分布である。
【図１０】図１０は、サンプル４のナノ粒子トラッキング分析の分布である。
【図１１】図１１は、サンプル５のナノ粒子トラッキング分析の分布である。
【図１２ａ】図１２ａは、サンプル６のナノ粒子トラッキング分析の分布である。
【図１２ｂ】図１２ｂは、サンプル６のナノ粒子トラッキング分析の分布である。
【図１３】図１３は、サンプル７のナノ粒子トラッキング分析の分布である。
【図１４ａ】図１４ａは、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化サンプル１のゼータ電位測定値を示すプロットである。
【図１４ｂ】図１４ｂは、ＰＥＧ化サンプル１のツリー個別測定のゼータ電位強度分布のプロットである。
【図１５ａ】図１５ａは、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化サンプル２のゼータ電位測定値を示すプロットである。
【図１５ｂ】図１５ｂは、ＰＥＧ化サンプル２のツリー個別測定のゼータ電位強度分布のプロットである。
【図１６】図１６は、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化サンプル４の平均ゼータ電位値を示すプロットである。
【図１７】図１７は、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化サンプル５の平均ゼータ電位値を示すプロットである。
【図１８ａ】図１８ａは、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化サンプル６のゼータ電位測定値を示すプロットである。
【図１８ｂ】図１８ｂは、ＰＥＧ化サンプル６のツリー個別測定のゼータ電位強度分布のプロットである。
【図１９】図１９は、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化サンプル７の平均ゼータ電位値を示すプロットである。
【図２０】図２０は、ＥＧＦＰ−ＣＦＴＲ形質導入を用いたｈＭＳＣ細胞のＧＦＰ蛍光を示す。
【図２１】図２１は、ＥＧＦＰ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎを用いたｈＭＳＣ細胞のＧＦＰ蛍光を示す。
【図２２】図２２は、スライド上に細胞を播種し、核をＤＡＰＩ（青）で固定および染色した後、１０倍の倍率で蛍光顕微鏡撮影したＣＦＴＲ−ＥＧＦＰ陽性ＭＳＣを示す。
【図２３】図２３は、スライドに細胞を播種した後に１０倍の倍率で蛍光顕微鏡撮影したＣＦＴＲ−ＥＧＦＰ陽性ＭＳＣを示す。
【図２４】図２４は、スライド上に細胞を播種し、核をＤＡＰＩ（青）で固定および染色した後、２０倍の倍率で蛍光顕微鏡撮影したＣＦＴＲ−ＥＧＦＰ陽性ＭＳＣを示す。
【図２５】図２５は、スライドに細胞を播種した後、２０倍の倍率で蛍光顕微鏡撮影したＣＦＴＲ−ＥＧＦＰ陽性ＭＳＣを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
小胞上に親水性ポリマーの表面コーティングを施すことにより、集合または凝集する傾向が低下する。これにより、コーティングされた小胞のコロイドまたは懸濁液をもたらす。このコーティングされた小胞は、エアロゾル化することができ、そして粘液を通過して細胞に浸透しかつもし存在する場合、ＥＶ産生細胞の遺伝子改変の結果としてＥＶに組み込まれた追加の治療用カーゴ、またはその他の方法で組み込まれた外因性カーゴを沈着させることができる。
【００２９】
好ましくは、小胞は、例えば、以下の実施例において使用されるようなエクソソームである。あるいは、小胞は、マイクロベシクル、膜小胞または膜粒子であり得る。
【００３０】
好ましくは、小胞、特にエクソソームは、動物細胞、より好ましくはヒト細胞に由来する。細胞は、体細胞または幹細胞であり得る。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、エクソソームは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、特にヒトＭＳＣに由来する。このような小胞は、生来の治療特性を示し、これらの標的細胞への送達は、線維症、炎症、組織再生、および生存促進効果を調節することが示されている。より好ましくは、小胞、特にエクソソームは、ｈＴＥＲＴ不死化脂肪または骨髄由来間葉系幹細胞に由来する。ＭＳＣは、特定のｍｉＲを過剰発現するように遺伝子組換えすることができる。マイクロＲＮＡおよびアンチｍｉＲ用の市販の過剰発現構築物がある（例えば、Systems BiosciencesのXMIRXpress Lentivectorsは、ＸＭｏｔｉｆが高濃度のｍｉＲＮＡをエクソソームに誘導しながら細胞を形質転換して選択したｍｉＲ／アンチｍｉＲを過剰発現することができる）。ＭＳＣは、これらのｍｉＲをエクソソームまたは他の小胞にパッケージングし得、これらは、記載の使用のための標準的手法を使用して、収集および精製され得る。不死化ＭＳＣは理想的なソースセルバンクであり、生物学的に操作された核酸カーゴの安定した過剰発現と拡張のための巨大な能力を備えており、商業規模の小胞（特にエクソソーム）の治療薬を生産するのに理想的である。
【００３２】
小胞、特にエクソソームは、多くの病状の治療に使用され得る。親水性ポリマーコーティングを施した小胞はエアロゾル化することができ、肺の適切な領域に沈着すると、粘液をよりよく通過することができ、予期せぬことに、表面修飾にもかかわらず、それらは細胞膜を容易に通過する保持能力を示す。したがって、本発明の小胞は、肺状態（例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺癌、喘息、肺高血圧症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、特発性肺線維症、および肺を罹患するその他の状態などであるがこれらに限定されない）の治療に使用するように調整するのに特に適している。
【００３３】
曝露した臓器、特に気道は、外来病原体および超微粒子を捕捉して排除するために、粘弾性粘液を分泌する。結果として、粘液は、肺に送達される治療薬の浸透に対する重要なバリアを提供する。小分子薬は一般に粘液バリアに浸透することができ、その結果、そのような治療薬のエアロゾル送達は送達方法として成功しているが、粘液バリアは、遺伝子導入剤または遺伝子治療で使用するためのベクターなどの生物学的分子の送達にとって非常に問題があることが証明されている。
【００３４】
本発明の小胞、特にエクソソームは、親水性ポリマーのコーティングを含む。これらのコーティングされた小胞は、エアロゾル形成の改善された特性を有することが有利に見出されている。コーティングされた小胞が肺粘液により容易に浸透し、肺疾患の治療または活性物質が肺組織にまたは肺組織を介して送達される他の治療用途における肺組織へのアクセスを容易にすることが別途見出されている。
【００３５】
本発明のコーティングされた小胞、特にエクソソームは、コーティングされていないエクソソームと比較して粘度が低下した懸濁液および／またはコロイドを形成することが見出され、この効果は、ナノ懸濁液／コロイド中のエクソソームの立体安定化の結果であると考えられる。分散粒子またはコロイドを有する懸濁液の形成は、肺への送達に適切なサイズ範囲であり、有用な濃度の小胞を含むエアロゾル粒子を伴うエアロゾルの形成を容易にする。これらの組成物は、小胞、例えばエクソソーム自体の送達に有用であり、また、小胞への送達を介した、または小胞内または小胞上に取り込まれた治療用途用の追加の成分を含む小胞の送達にも有用である。そのようなエクソソームは、（例えばクリックケミストリーを介して）付着したか、または遺伝子工学の結果として発現されたもののいずれかで、追加の細胞特異的標的化部分を提示し得る。そのような標的化リガンドは、特定の細胞型（例えば、線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞または上皮細胞）へのエクソソームの取り込みを増強し得る。
【００３６】
したがって、本発明で使用される親水性ポリマーは、コロイドおよび懸濁液を形成する溶液中での集合または凝集の減少を示す小胞をもたらす。適切には、ポリマーは実質的に非イオン性であり、実質的に非荷電である。１つの結果は、本発明のコーティングされたエクソソームは、一般に、コーティングされていないエクソソームと比較して減少した表面電荷を有し、実質的に中性の正味表面電荷に向かう傾向があるということである。
【００３７】
親水性ポリマーのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の表面コーティングは、その機能が利用できるように、ＰＥＧが細胞外小胞の外表面にあることを示している。これにより、ＰＥＧの特性が細胞外小胞の特性、例えば、親水性に影響を与えることができる。そのため、ＰＥＧは別のコーティングの内側部分ではなく、そのＰＥＧ上に重要なコーティングを有さない。ＰＥＧコーティングは、細胞外小胞の最も外側のコーティングである。追加のリガンドまたは他の要素は、ＰＥＧの遠位端に結合されない。ＰＥＧは実質的に細胞外小胞上に唯一のコーティングを形成する。
【００３８】
低分子量のＰＥＧは、分子量が３ｋＤａ未満であり、好ましくは６５％以上の高密度表面コーティングをＥＶに提供する（これは、ＥＶの表面電荷を実質的に中和するのに十分である（すなわち、−８ｍＶから０ｍＶの間））。
【００３９】
好ましくは、表面コーティングは、小胞表面の少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも７５％を覆い、エクソソームの凝集および集合を最小限に抑えるのに十分な立体安定化および表面電荷中和を提供する。以下に示す特定の実施例では、エアロゾルを生成して粘液に浸透したコーティングされたエクソソームにおいて、約７０％またはそれ以上の表面被覆率が見られた。
【００４０】
表面コーティングポリマーは、一般に、低分子量、好ましくは＜５ｋＤａ、より好ましくは＜４ｋＤａ、より好ましくは＜３ｋＤａ、最も好ましくは２ｋＤａと３ｋＤａとの間を有する。以下に示す特定の実施例では、コーティングは、小胞の表面への約２ｋＤａのポリマー鎖の付着から形成された。結果として、鎖は、肺粘液層で遭遇し得るムチン鎖との立体干渉または障害を提供しない。ポリマーは、小胞の表面電荷を実質的に中和し、凝集または集合を防ぐのに十分な濃度で適切に組み込まれる。そのような緻密なコーティングは、最適な「ブラシ」配向／コンフォメーションでの親水性鎖のコンフォメーションを可能にする。必要なポリマーの濃度は、選択したポリマーの鎖長、小胞表面へのポリマーの結合効率、ならびに分離された小胞サンプルのモル濃度および粒子サイズ分布のような多くの可変要因に依存する。例えば、１００ｎｍのエクソソームとインキュベートしたポリマーは、高密度の被覆と適切な修飾後小胞特性を確保するために、約８ｍｏｌ％またはそれ以上で使用され得る。しかし、過度に高いポリマー濃度を回避するように注意が必要である。濃度が高くなると、界面活性剤を介した破壊的影響によって小胞膜が損傷する可能性があるためである。
【００４１】
本発明の小胞は、典型的には、２０〜１０００ｎｍの範囲のサイズを有し、より適切には、３００ｎｍまでの範囲にある。エクソソームは通常３０〜１５０ｎｍの範囲のサイズを有し、マイクロベシクルは通常１００〜１０００ｎｍの範囲のサイズを有する。典型的には、表面コーティングを有する本発明のエクソソームは、最大２００ｎｍ、好ましくは２０〜２００ｎｍ、最も好ましくは３０〜１８０ｎｍの範囲のサイズを有する。サイズは、動的光散乱法（Degiorgio、V.ら、１９７９）またはナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ、以下の実施例で使用）を使用して測定され得る。
【００４２】
示されるように、好ましくは、小胞は間葉系幹細胞に由来し、それ自体、生来の再生および治療特性を有するという主要な利点を有する。研究によると、未修飾のＭＳＣエクソソームとＭＳＣ自体が、さまざまな因子（例えば、マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＴＩＭＰ３）を介して、また一連のメカニズム（例えば、炎症誘発性Ｍ１表現型から抗炎症性Ｍ２表現型へのマクロファージの極性化、抗原提示の調節、サイトカイン放出の調節、ＡＴＰ生成酵素転移を介した糖分解の増強、および生存キナーゼの活性化（例えば、ＣＤ７３を介したＥＲＫおよびＡＫＴ）、ならびにＣＤ５９を介した補体活性化の低減による）によって、抗アポトーシス、血管新生促進および抗炎症効果を呈示することが示されている。
【００４３】
これらの有益な効果は、小胞、例えばエクソソームに関連のカーゴを付加することによって増強され得る。確かに、小胞の供給源が何であれ、カーゴは有益な治療効果を提供し得る。
【００４４】
小胞、特にエクソソームはまた、標的細胞に送達されるカーゴを運搬し得る。好ましくは、このカーゴは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）またはアンチ−マイクロＲＮＡ（アンチｍｉＲ）である。あるいは、カーゴは、ｍＲＮＡ、または別の内因性または外因性の核酸構築物、前述の配列操作された、化学的に修飾された、または合成されたバージョン、タンパク質または医薬小分子であり得る。核酸は、配列操作されるか、または改変された塩基対を使用し、そして様々なメカニズムを介してエクソソームにロードされ得る。
【００４５】
小胞はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のインビボ肺送達または他の遺伝子編集モードにも有用である。粘液バリアの下にある細胞への細胞内送達は、呼吸器疾患の場合に遺伝子編集の成功のために克服する必要がある問題である。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態において、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡおよびｈＴＥＲＴ酵素触媒サブユニットは、ＥＶ産生幹細胞のレンチウイルスｈＴＥＲＴ不死化の結果としてエクソソームに組み込まれ得、これらの活性部分は、標的疾患細胞（例えば、ＡＥＣ２肺胞上皮前駆細胞：ＣＯＰＤ、ＩＰＦの特徴であり、他の肺疾患にますます関与するようになっている）における細胞老化と戦うのに有用である。同様に、テロメラーゼ酵素の他の主要成分であるＴＥＲＣ（ｈＴＲ）は、ＲＮＡ分子としてＥＶに組み込まれ得る。これらのカーゴは、標的細胞内で作用して、幹細胞ＥＶの再生医療能力を強化する。重要なことに、これらの効果は細胞質で作用し、標的細胞のゲノムに組み込まれないため、本質的に一過性で可逆的である。これは、標的細胞または実際には標的細胞によって生成される娘細胞では永続的な効果が実証されないため、重要な規制上の検討事項である。
【００４７】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、植物、動物、および一部のウイルスに見られる、通常２０〜２５ヌクレオチドのオーダーを含む低分子非コードＲＮＡ分子であり、主にＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後調節で機能する。ｍｉＲは、ｍＲＮＡ分子内の相補配列との塩基対形成を介して機能し、遺伝子発現の重要な調節因子である。カーゴはまた、アンチｍｉＲまたはアンタゴｍｉＲであり得る。カーゴは、治療される状態への適用性または特定の標的細胞タイプにおける遺伝子発現の調節のためにカスタマイズされる。通常、状態または疾患状態は、特定のｍｉＲのアップレギュレーション、および他のｍｉＲのダウンレギュレーションをもたらす。ｍｉＲがダウンレギュレートされてそのｍｉＲを置き換える治療が有効であり得る一方で、ｍｉＲがアップレギュレートされている場合、アンチｍｉＲまたはアンタゴｍｉＲの提供が有効であり得る。
【００４８】
ＥＶのカーゴは、標的となる疾患細胞の遺伝子発現を変化させ得る他の非コード核酸配列であり得る。例えば、マイクロＲＮＡの「スポンジ」または「モップ」として機能し、アンチｍｉＲ効果を発揮し得る長鎖非コードＲＮＡまたは環状ＲＮＡ（内因性または人工的に構築されたもの）；特定の遺伝子ノックダウンのための低分子干渉ＲＮＡまたは短鎖ヘアピンＲＮＡ；ならびに疾患関係遺伝子またはトランスポゾンサイレンシングのためのｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ。
【００４９】
カーゴがｍｉＲであり、かつ治療がＣＯＰＤである場合、好ましくは、カーゴはｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−４５２、ｍｉＲ−１４６ａ、Ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−５７６−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２３、ｍｉＲ−９３７、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−２４およびｍｉＲ−１８７の１つまたはそれ以上から選択される。より好ましくは、ｍｉＲは、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐおよびｍｉＲ−５１３ａ−５ｐから選択され、これらは、疾患逆転の新しい遺伝的標的を表す。選択されたマイクロＲＮＡ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐは、ＣＯＰＤの病因に関与する重要な遺伝子を標的とする、ＣＯＰＤの主要な調節因子である。これらのｍｉＲは、ＣＯＰＤのない喫煙者と比較して、ＣＯＰＤのある喫煙者では過少発現しており、疾患の病因に関与する機能的なマイクロＲＮＡ−標的相互作用（ＭＴＩ）を介していくつかの重要なｍＲＮＡを標的としダウンレギュレートすることが知られている。
【００５０】
具体的には、マイクロＲＮＡ  １２５ｂ−５ｐは適切なカーゴであり、次の重要なＣＯＰＤ関連遺伝子を標的にしてダウンレギュレートすることが示されている：
［１］ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）（ヒト変形性関節症軟骨細胞に関する研究における）。ＡＤＡＭＴＳ４は、細胞外マトリックスの分解に関与するタンパク質分解酵素であり、ＣＯＰＤのない喫煙者に対してＣＯＰＤのある喫煙者で最も過剰発現しているｍＲＮＡ（８．９１倍の増加）である。さらに、ＡＤＡＭＴＳ４はＶＥＧＦに結合することにより抗血管新生であることが示されているため、ＡＤＡＭＴＳ４のダウンレギュレーションは、肺胞コンパートメントの血管新生再生に役立ち得る；
［２］ＳＦＲＰ５。ＷＮＴアンタゴニストであり、そのレベルが健常者コントロールと比較してＣＯＰＤで有意に高いことがわかった；
［３］ＤＫＫ３。ノッチアンタゴニストであり、そのダウンレギュレーションは肺胞の再生を助け得る；
［４］ＥＧＦＲ気管支上皮細胞の発現は、健常者コントロールと比較して喫煙者で有意に高く、ＣＯＰＤのない喫煙者と比較してＣＯＰＤのある喫煙者でも高い。ＥＧＦＲは、気道上皮における粘液産生と杯細胞過形成の調節に重要な役割を果たす；
［５］ＩＬ−６（ＩＬ６Ｒ）の受容体。ＣＯＰＤでよく認識されている重要な炎症経路；
［６］ＭＭＰ１３。ＣＯＰＤ肺胞マクロファージおよび肺胞ＩＩ型細胞でアップレギュレートされることが示されているコラゲナーゼＭＭＰサブファミリーメンバー。ＭＭＰ１３は、ＣＯＰＤ増悪の動物モデルにおいて、タバコの煙とＰＲ８インフルエンザウイルスへの曝露に応答した疾患の病因の重要なメディエーターとして関係している；
［７］ＡＮＧＰＴ２。ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン）アンタゴニストである。ＡＮＧＰＴＬ１が、進行したＣＯＰＤのレベルでは安定期／正常レベルと比較して低下している（血管の退行に関連して、レベルは肺機能の喪失と強く相関している）；
［８］ＡＰＣ。ＷＮＴシグナル伝達経路レギュレーター。ＡＰＣはベータカテニン破壊複合体の成分であるため抑制性である；
［９］ＭＡＰＫ１４（Ｐ３８阻害はＣＯＰＤ臨床試験で有望である）；ならびに
［１０］ＣＯＰＤに強く関連する他のさまざまな標的：ＳＧＰＬ１、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＴＧ２、ＣＥＢＰＡ、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ２、ＦＺＤ６、ＧＬＩ１、ＨＫ２、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ２６、ＭＵＣ１、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＰ５３およびＢＣＬ２（それぞれアポトーシス促進および抗アポトーシスメディエーターであるが、ＢＡＫ１、ＢＣＬ２アンタゴニスト／キラー１も標的である）。ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＶＤＲ、ＥＲＢＢ２、ならびにＥＲＢＢ３。
【００５１】
さらに、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐの強制発現は、マウスにおけるＬＰＳ誘発性の急性肺損傷および炎症の減弱を示している。
【００５２】
ＭｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐは適切なカーゴであり、ＣＯＰＤ関連遺伝子を標的とすることが示されている：
［１］気道基底細胞におけるＴＡＣＳＴＤ２（別名ＴＲＯＰ２）の発現増加は、ＣＯＰＤにおける気道リモデリングおよび基底細胞過形成の増加を介した気道リモデリングに寄与している可能性がある；
［２］ＳＧＰＬ１。スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）分解酵素で、コントロールに対してＣＯＰＤ肺胞マクロファージにおいて発現が４．５倍に増加している。ＣＯＰＤのアポトーシス細胞食作用（エフェロサイトーシス）における肺胞マクロファージの欠陥に寄与している；
［３］ＦＲＺＢ。ＷＮＴアンタゴニストである。そのダウンレギュレーションは再生効果を示すと期待される；
［４］ＴＰ５３。ＣＯＰＤの肺胞ＩＩ型細胞におけるアポトーシス促進性Ｐ５３の発現増加する。したがって、ダウンレギュレーションは生存促進効果があると期待される。１２５ｂ−５ｐもＰ５３の標的であることも留意；
［５］Ｓ１ＰＲ１（細胞接着、免疫調節）；
［６］ＢＩＫ。プログラム細胞死を加速する；
［７］ＭＴＦＰ１；
［８］ＭＡＰ２Ｋ７。環境／細胞応答に関与；
［９］ＢＧＬＡＰ、ならびに
［１０］ＩＴＧＡ９。
【００５３】
ＭｉＲ−５１３ａ−５ｐもまた、ＣＯＰＤ遺伝子発現に対するその関連する効果のために、本発明の小胞に適したカーゴである：
［１］ＣＢＬ−ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐはＣＢＬを標的とし、その下流遺伝子である脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）および上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を介してホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−ＡＫＴおよび核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）経路にネガティブな影響を与えることが示されている。したがって、５１３ａ−５ｐの増加は、サイトカイン因子であるインターロイキン（ＩＬ）−１０、γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびＩＬ−１２の分泌を減少させた；
［２］ＣＤ２７４（プログラムされた細胞死リガンド１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ  １））気腫性水疱（ＥＢ）に関連する肺腺癌は、ＥＢのないものよりも頻繁にＰＤ−Ｌ１タンパク質を発現する。ＰＤ−Ｌ１−免疫チェックポイントは完全には理解されていないが、ＣＯＰＤでは調節不全である。ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、炎症性サイトカインに応答して、上皮、内皮、平滑筋細胞を含むさまざまな非リンパ組織細胞で誘導される。よく認識されているＣＯＰＤ−肺がんの併存疾患により、ＣＤ２７４は特に興味深い標的になっている；
［３］ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐには、調査のための多くの追加の興味深いインシリコ予測ターゲットがある（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ  ７．２）：ＡＧＥＲ（ＲＡＧＥをコードし、ＣＯＰＤでアップレギュレートされる−ＲＡＧＥ  ＫＯマウスは炎症反応の低下を示し、ＲＡＧＥのアップレギュレーションは肺胞細胞アポトーシスの増加を引き起こす）；ＡＤＡＭ９およびＩＮＨＢＡ（別名アクチビンＡ、ＴＧＦＢスーパーファミリーはＣＯＰＤで増加し、気流制限に関連している）。
【００５４】
さらに、本発明に適切であると本明細書で同定されたｍｉＲは、多くのＣＯＰＤにより関連した遺伝子に対して機能的ＭＴＩ（弱い）を示した。
【００５５】
肺がんは、ＣＯＰＤの非常に重要で致命的な併存疾患である。ＣＯＰＤを伴う個体により示される肺がんのリスクの増加は、喫煙歴とは無関係である。今後の実験では、ＣＯＰＤの罹患および周囲の肺組織におけるｍｉＲ−２１−５ｐの調節により、肺がんのリスクを低減することを目指している。このようなｍｉＲ−２１の低減は、ＣＯＰＤ患者の肺がん発症リスクを低減できると考えられ、そしてＥＶにロードされるｍｉＲ−２１（ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ）に対するアンチｍｉＲ配列を過剰発現するように幹細胞を遺伝子改変することによって達成される。ｍｉＲ−２１−５ｐ阻害剤は、ｍｉＲＮＡの逆相補配列を持つ短いＲＮＡであるか、いくつかのｍｉＲ−２１−５ｐ結合部位と環状化を促進するイントロン末端配列を使用して環状ＲＮＡ配列の形をとり得る。あるいは、天然に存在するまたは改変された長鎖非コードＲＮＡ配列を利用して、ｍｉＲ−２１の減少を達成することができる。
【００５６】
カーゴがｍｉＲであり、かつ治療がＣＦである場合、ＣＦ肺の過炎症を軽減するために、カーゴはｍｉＲ−１７を含むことが好ましい。ＣＦは多系統性疾患であるが、合併症と死亡の大部分は肺関連疾患が原因で発生する。マイクロＲＮＡカーゴを伴う本発明の抗炎症性ＭＳＣエクソソームの投与は、肺機能を劇的に改善するのに適している。さらに、肺に送達されるエクソソームは、肺の表面積が高いことと血管系のため、ある程度の全身吸収と効果があると予想される。
【００５７】
カーゴは、追加的または代替的に、ｍＲＮＡを含み得る。治療がＣＦである場合、カーゴは改変されたＣＦＴＲ  ｍＲＮＡであり得る。例えば、改変されたＣＦＴＲ  ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４９４、および／またはｍｉＲ−５０９−３ｐの変異または削除されたｍｉＲ結合部位を含み得、これらはＣＦでアップレギュレートされ、ＣＦＴＲ発現を抑制する。あるいは、導入されたＣＦＴＲ  ｍＲＮＡは、大部分の細胞タイプで自由に発現するように設計された合成３’および５’ＵＴＲを組み込み得、また、注目される疾患のアップレギュレートされたｍｉＲ結合部位を欠く。最近の研究は、これらの部位でのｍｉＲ標的部位の遮断または部位の突然変異誘発がＣＦＴＲ発現の増加をもたらしたことを示している。さらに、改変されたＣＦＴＲ  ｍＲＮＡは、インビボでの細胞内ｍｉＲＮＡ分解に耐性があり、よって、インビボでのＣＦＴＲ発現を延長するための半減期が長くなる。さらに、機能的なＣＦＴＲタンパク質は、折りたたまれていないタンパク質応答による細胞ストレスを誘発する可能性のある内因性変異型ＣＦＴＲ  ｍＲＮＡ発現のレスキューとは対照的に、野生型タンパク質コード配列から翻訳されるため、標的部位ブロッカーと比較して有効性の向上が達成され得る。
【００５８】
エクソソームが肺癌、特に腺癌の治療に使用される場合、カーゴは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−１−３ｐおよびｍｉＲ−１３３ａ−３ｐの１つまたはそれ以上であり得る。追加的または代替的に、カーゴは、ｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−９−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−７０８−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐのアンチｍｉＲの１つまたはそれ以上であり得る。
【００５９】
他の適切なカーゴには、他の肺疾患（例えば、特発性肺線維症）の治療のために選択されたマイクロＲＮＡまたはアンチｍｉＲを含み得る。
【００６０】
組成物は、ネブライザーを使用するエアロゾル化を介して肺に送達するための懸濁液またはコロイドとして適切に提供される。好ましくは、懸濁液またはコロイドは水性ベースである。組成物はまた、塩、界面活性剤、安定剤、防腐剤、凍結防止剤、緩衝剤およびｐＨ調整剤などであるがこれらに限定されない、他の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。
【００６１】
本発明の組成物は、患者の肺に送達され得る液滴を含むエアロゾルの生成のためのものである。この分野では、適切なサイズとエアロゾル生成装置が知られており、エアロゾルは通常、１０μｍおよびそれ以下のサイズの液滴を含む。５μｍを超えるエアロゾル化された液滴は、通常の呼吸条件下での呼吸送達には大きすぎると一般に考えられる。気管支細胞および肺胞細胞に到達して付着するために、エアロゾル液滴は非常に適切には１〜５μｍの範囲にあり、つまり、エアロゾルはこの範囲の液滴を含む。当技術分野に精通している人々は、吸気流量およびエアロゾル速度に適切な制限が課せられると、直径が５μｍを超える液滴が所望の肺領域に沈着し得ると認識する。より大きな液滴（球形である）は、より小さい液滴よりもはるかに大きな体積を運搬する。例えば、直径１０μｍの液滴は、直径１μｍの液滴の１０００倍の体積（したがって、用量負荷容量）を有する。所望の肺領域におけるエアロゾル沈着の標的化は、エアロゾル液滴サイズおよび吸入流量に適切に影響を与えるように、エアロゾル送達デバイスおよび製剤パラメータの変化によって効果的に制御され得る。エアロゾル液滴サイズは、例えば、空気力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）値によって測定され得、これは、質量基準で粒子の５０％がより大きく、５０％がより小さいエアロゾル直径として定義される。
【００６２】
エアロゾル化を成功させるためには、コロイドまたは懸濁液の粘度が高すぎないことが一般的に好ましい。ただし、これらのパラメータはまたデバイスタイプおよびモデルに依存する。好ましくは、粘度は、６ｃＰ未満、例えば４ｃＰ未満、より好ましくは３ｃＰ未満、そして最も好ましくは２ｃＰ未満であるべきである。コロイドまたは懸濁液が粘性が高すぎる場合、エアロゾル化のプロセスは発泡および飛散を引き起こし、これによりエアロゾル化を大幅に減少させ得るか、またはエアロゾル生成が可能な場合、生成される液滴は、肺の意図された領域のために有用な沈着を有するには小さすぎるものとなり得る。同様に、懸濁液またはコロイド中の粒子が集合または凝集する傾向がある場合、集合した粒子はエアロゾル化されず、代わりにネブライザーのリザーバー内の濃度が増加したコロイドまたは懸濁液中にとどまり得る。これにより、懸濁液またはコロイドの粘度が上昇し、エアロゾル化が失敗するか、送達量が減少する。エクソソームを含む遊離小胞は、集合または凝集する傾向が強く、粘性のコロイドまたは懸濁液を形成するため、効率的にエアロゾル化することができない。しかしながら、親水性ポリマーコーティングを有する本発明の小胞は、集合および凝集する傾向が著しく低下していることが見出された。結果として、適切な粘度のコロイドまたは懸濁液を形成することができ、本明細書で提供されるコーティングされた小胞を首尾よくエアロゾル化することができる。
【００６３】
形成されるエアロゾル液滴のサイズは、一般に、噴霧される製剤の粘度に反比例する。エクソソーム製剤などのナノスケールコロイド系の粘度は、エクソソームの体積分率が増加するにつれて急激に増加する。前に述べたように、本発明の小胞の立体安定化は、この効果を著しく軽減することができる。この効果は、肺の標的領域に形成されたエアロゾルのエアロゾル沈着に寄与するために使用でき、より小さい液滴（一定の速度と吸気流量）は小さい気道および肺の末梢／遠位領域に沈着し、より大きい液滴は、より中心的な堆積パターンを有する。例えば、嚢胞性線維症の場合、気管支領域および大きい伝導性気道を標的とする中央エアロゾル沈着パターンが望ましい。逆に、肺気腫の場合、遠位肺胞領域と小さな気道が主要な関心領域であり、より小さな液滴サイズ分布が好ましい。
【００６４】
エアロゾル化は、ネブライザーを使用して実施し得る。ネブライザーは、酸素、圧縮空気またはガス、および／またはノズルまたは超音波パワーを使用して、溶液、懸濁液、およびコロイドを小さな液滴に分解し、吸入可能なミストを形成する。ネブライザーは小分子をエアロゾル化するように以前に設計されたところ、薬剤が溶液中にある場合、すべての市販タイプがこれで成功している。しかし、使用するネブライザーのタイプはより大きな生物剤にとってより重要である。これは、溶液、懸濁液、またはコロイドに過剰なエネルギーを与え、生体分子を剪断するのに十分な流体力学的応力を生じるネブライザーによって損傷し、活性を失い得る。例えば、超音波ネブライザーは、ナノ懸濁液の送達に完全に不向きであり、圧縮ネブライザーは、エアロゾルの継続的な再循環を引き起こし、生物学的分子に損傷を与え得る繰り返しの剪断応力をもたらす。そのようなネブライザーはまた、水性担体を優先的にエアロゾル化し、リザーバー内の製剤の濃縮をもたらす。エアロゾル化されずにリザーバーに残っている製剤の「デッドボリューム」は、通常、圧縮ネブライザーでは１ｍｌであり、これは、エクソソーム製剤などの高度な治療法に関して、商品原価の観点から完全に受け入れられず、商業的に利用不能である。
【００６５】
規制で承認されたネブライザータイプのうち、振動メッシュネブライザーは、以下について、小胞の送達に特に適している：
１．液滴は、液滴の生成時に一度だけ液体から空気に相変化する（圧縮ネブライザーでの「リサイクル」および繰り返しの剪断応力と比較して）；
２．超音波ネブライザーはナノ懸濁液の送達に適していない；
３．振動メッシュネブライザーは、最小の残留デッドボリュームで少容量の製剤を効率的に送達するように適合させ得る；そして
４．圧縮ネブライザーは、溶媒を優先的にエアロゾル化し、残りの製剤をリザーバーに濃縮させ得る。
【００６６】
圧電チップ上に弾性表面波を生成する弾性表面波（ＳＡＷ）ネブライザーは、プラスミドＤＮＡワクチンおよび幹細胞などの壊れやすい核酸分子の懸濁液をエアロゾル化することが示されている。ＳＡＷ噴霧の高周波、低電力メカニズムは、核酸を含む生体分子への損傷を最小限に抑えるのに役立つ。ＳＡＷネブライザーは、他の多くのタイプのネブライザーよりも粘稠な溶液および懸濁液のエアロゾル化に成功し、エクソソーム、特に親水性ポリマーの表面コーティングを有するエクソソームの水性混合物から形成される懸濁液およびコロイドのエアロゾル化に理想的である。液体の粘度は、ＳＡＷネブライザーによって生成される液滴のサイズを部分的に決定する。しかし、これらのタイプのネブライザーは、これまで、規制機関による臨床試験での使用が承認されていない。
【実施例】
【００６７】
本発明の理解を助けるために、その変形を伴う特定の実施形態を、例として、添付の図面を参照して説明する。
【００６８】
（実施例１）
本実施例の目的は、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）からエクソソームを分離し、低分子量脂質修飾ポリエチレングリコール（ｌｉｐｉｄ−ＰＥＧ）で表面を効果的に修飾して、エアロゾル化と粘液浸透のエクソソーム特性を改善することであった。
【００６９】
（ｈＭＳＣの蛍光標識）
凍結した骨髄ＭＳＣ（Ｄｏｎｏｒ＃１６３）を解凍してから、１０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むＥＶ枯渇完全培地（ＣＣＭ）の１５個のＴ−１７５フラスコ（各フラスコに１×１０６個の細胞）に直接播種し、８０〜８５％のコンフルエンシーに達したときに継代した。細胞を一緒にプールしてからペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、暗所で２μｇ／１×１０６細胞のＦａｒＲｅｄ色素（励起／発光  約６３０／６６１ｎｍ）（Cell Trace）とともに室温で２０分間インキュベートした（これは、ＦａｒＲｅｄ色素が細胞質ゾルタンパク質を標識するように、エクソソームを標識する）。インキュベーション後、ＭＳＣ培地を添加して反応を停止し、さらに５分間インキュベートした後、細胞をペレット化し、ＥＶが枯渇したＣＣＭに再懸濁した。
【００７０】
（エクソソーム分離のためのｈＭＳＣ培養）
ＦａｒＲｅｄ標識ｈＭＳＣ（Ｄｏｎｏｒ＃１６３）を完全馴化培地（ＣＣＭ）で培養し、以前に公開されたデータ（Theryら、2006）に従ってエクソソームを分離した。簡単に説明すると、標識されたＭＳＣを、１０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を有するＣＣＭ内に、３０個のＴ−１７５フラスコ（各フラスコに１×１０６個の細胞）に直接播種した。２４時間後、すべてのフラスコの培地を廃棄し、新しい培地と交換した。３〜４日以内に細胞が８０％の集密度に達した後、各フラスコから馴化培地を収集し、ランダムに選択した５つのフラスコから細胞をカウントした。エクソソームを分離する前に、すべてのフラスコからの馴化培地を一緒にプールした。エクソソームを分離するために、培地を４００×ｇで１０分間、２０００×ｇで３０分間遠心分離して、細胞破片とアポトーシス小体をそれぞれ除去した。各スピンの後、ペレットを廃棄し、上清を使用した。次に、さらに精製するために上清を２２０ｎｍ真空フィルターを使用して濾過し、超遠心分離（Sorvall Discovery 100SE、Hitachi）まで４０℃で保存した。最後に、上清を１２００００×ｇで７５分間超遠心分離して、エクソソームをペレット化した。ペレットをＰＢＳに再懸濁してエクソソームを洗浄し、同じ高速で再度回転させ、得られたペレットを１００μｌのＰＢＳに再懸濁し、さらなる実験まで−８０℃で保存した。すべての遠心分離工程を４℃で実施し、滅菌チューブを使用した。
【００７１】
（ＤＳＰＥ−ＰＥＧによるエクソソームの分離後修飾）
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）アミン（Avanti Polar Lipids、Inc）を、Sigma Aldrich（Wicklow、Ireland）から購入した。ＰＥＧ化リポソーム調製に関する以前に発表されたデータ（LiおよびHuangら、2009)に基づいて、ＰＥＧ化エクソソームを調製した。５０μｌの濃縮エクソソームをＰＢＳおよび３７．８μｌの水溶液ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）と混合することにより、最終容量３００μｌのエクソソーム懸濁液を調製した（最終濃度はエクソソーム１ｍＬ中のＰＥＧ１．２６ｍｇ）。次に、サンプルを３７℃で１時間インキュベートし、１０分ごとにボルテックスにかけ、ＰＥＧ分子またはエクソソームの凝集を防いだ。インキュベーション後、サンプルをさらにＰＢＳに懸濁し、最後に１２００００×ｇで７５分間超遠心分離して、結合していないＰＥＧ分子を洗い流した。次に、エクソソームペレットを５０μｌのＰＢＳに再懸濁し、−８０℃で保存した。
【００７２】
（ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ））
ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化の両エクソソームサンプルを、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）（Malvem， 英国）によって、最適化および検証されたプロトコル（Maguireら、2017、Holeら、2013、Gerlachら、2017）を用いるＮＴＡバージョン３．２を実行するＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ  ５００システムを用いて分析した。すべてのサンプルを、４０５ｎｍレーザーと４３０ｎｍロングパスフィルターを備えたＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ  ５００を使用して分析した。すべてのサンプルを、分析前にドライアイス上に保管した。ＮＴＡの希釈液を、測定直前にＮＴＡによって粒子フリーと認定されたＤＰＢＳバッファー（Ｇｉｂｃｏ）で作製した。十分な混合と、弱く結合したエクソソームクラスターの分解を確実にするために、ロードする前にサンプルを短時間ボルテックスにかけた。各サンプルをＰＢＳにて手動で希釈して、ＮＴＡに適した最適な粒子濃度（視野あたり２０〜７０エクソソーム）を取得し、各希釈係数を自動生成レポートに記録した。エクソソームサンプルごとに合計６×６０秒のビデオを記録し、分析中の検出閾値を選択し、個別のナノオブジェクトのみを分析し、アーティファクトを確実に除去した。
【００７３】
（ゼータ電位測定）
エクソソームのゼータ電位を、粒子分析用の光散乱装置であるLitesizer 500（LitesizerＴＭ 500、Anton Paar Ltd、英国）を使用して測定した。ゼータ電位をエクソソーム小胞の滑り面（１５°）で測定し、各希釈液の粒子濃度を、＞２０ｋカウント／秒の平均検出光強度を生成することにより、意味のある測定を提供するのに十分高いことを確認した。
【００７４】
（エクソソームサンプルのフローサイトメトリー分析（ビーズカップリングあり））
フローサイトメトリー分析では、ＦａｒＲｅｄ標識ＭＳＣから分離したエクソソーム（総粒子数２×１０９）を、ＰＢＳ中の１０μｌのアルデヒドラテックスビーズ（φ＝４μｍ）とともに、室温で１５分間回転させずにインキュベートした。次に、サンプルを９５０μｌのＰＢＳと混合し、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。次に、エクソソームビーズの残りの結合部位を、ＰＢＳ中の１Ｍグリシンを室温で３０分間添加することによってブロックした。次に、エクソソームでコーティングされたビーズサンプルを１７００ＲＣＦで５分間遠心分離し、ペレットをＰＢＳ溶液中の０．５％ＢＳＡに再懸濁した。サンプルを同様の方法で３回洗浄し、最終容量１ｍｌの０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁した。次に、エクソソームでコーティングされたビーズサンプルをＰＥ結合マウス抗ヒト抗体と結合させてＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ  ８１を検出するか、コントロールとして未処理のままとした。アイソタイプコントロールを、エクソソームでコーティングされたビーズをＰＥ結合マウスＩｇＧ１κ、アイソタイプ１または２とインキュベートすることによっても行った。次に、すべてのサンプルをＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯを使用して分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
【００７５】
（透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ））
ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化エクソソームの両方の形態学的検査を、電子顕微鏡（ＥＭ）を使用して実行した。エクソソームを２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、ＰＢＳで３回洗浄してから、Ｆｏｒｍｖａｒ／Ｃａｒｂｏｎ２００メッシュゴールドＥＭグリッドに吸着させた。次に、ＥＭグリッドをＰＢＳ／５０ｍＭグリシンおよびＰＢＳ／５％ＢＳＡでブロックしてから、ＣＤ６３（カタログ番号sc5275、Santa Cruz）またはＴＳＧ−１０１（カタログ番号sc7964、Santa Cruz）（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡでの二次のみのコントロール）に対するマウス抗ヒト一次抗体で一晩、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ−金二次抗体（ｃａｔ＃Ｇ７６５２、Ｓｉｇｍａ）で３０分処理した。次に、グリッドを１％グルタルアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の２％リン酸タングステン酸でインキュベートして、エクソソーム膜にコントラストを追加した。次に、エクソソームグリッドをＰＢＳで洗浄し、空気乾燥させてから、ＴＥＭ顕微鏡で分析した。
【００７６】
（気液界面で培養された嚢胞性線維症上皮細胞を用いた粘液浸透および細胞内在化実験）
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、先天性の宿主防御が損なわれると、重度の気道感染が繰り返される遺伝性疾患である。気液界面での気道上皮細胞培養（ＡＥＣＣ）は、気管支上皮で通常遭遇する細胞（繊毛上皮および杯細胞）に分化し、空気にさらされる頂端表面に厚くて粘稠な脱水粘液を生成する。したがって、気液界面モデルは、エアロゾルで送達された遺伝子治療が実際のＣＦ肺で遭遇する状態の正確な要約である。驚いたことに、粘液の浸透と細胞の内在化は、ＡＬＩ培養物の粘液表面に高濃度の未処理のエクソソームを適用することによって達成されることがわかった。次に、２５μｌの処理済みエクソソームと未処理エクソソームをＡＬＩ培養物の頂端粘液表面に適用し、処理済みエクソソームの用量は未処理エクソソームの約半分であった。（未処理の対照のマイクロリットルあたり２．６５Ｅ＋０７エクソソーム、および処理された試験製剤のマイクロリットルあたり１．２２Ｅ＋０７エクソソーム）。８時間のインキュベーション後、サンプルをＰＢＳで３回洗浄し、４％ＰＦＡで固定し、ファロイジン（密着結合）とヘキスト（核(nuceli)）で染色した。
【００７７】
Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０Ｃｏｎｆｏｃａｌによる共焦点蛍光顕微鏡分析。処理済みおよび未処理のサンプルの上皮細胞のｘｙｚ画像分析のためのスキャン。
【００７８】
（結果）
ヒト骨髄ＭＳＣから分離したエクソソームを、サイズを定量化し、表面電荷を測定し、いくつかの表面マーカーの存在でそれらを識別するために、さまざまな方法を使用して特徴付けた。ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化エクソソームの両方を特性評価に使用した（フローサイトメトリーを除く）。この方法は、さまざまな体液または細胞培養上清からエクソソームを分離するために最も広く使用されている標準的な方法であるため（Ｃｈｉａら、２０１７、Ｃｈｉａら、２０１６、Ｔｈｅｒｙら、２００６）、超遠心分離を使用してエクソソームを分離した。非ＰＥＧ化およびＰＥＧ化エクソソームの両方のナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）は、それらの平均サイズがそれぞれ１４３．２±３．５ｎｍおよび１６５．６±６．０ｎｍであることを明らかにした（図１ＡおよびＢ）。一方、ＰＢＳに懸濁されたＰＥＧ分子のみをＮＴＡで分析した場合、品質管理基準を認定できなかった。これは、ＰＥＧ化されたエクソソームサンプルに示された粒子の数が、ＰＥＧ分子によって引き起こされたアーティファクトではなかったことを示している。ＮＴＡは粒子の流体力学的直径を測定するため、ＴＥＭによって得られた両方のエクソソームサンプルの測定直径は、ＮＴＡ分析測定値よりも小さかった。
【００７９】
ＮＴＡ分析で示されているように、ＰＥＧ化されたエクソソームの平均サイズは、ＰＥＧ化されていないエクソソームよりもわずかに大きかった。このサイズの違いは、エクソソームの表面へのＰＥＧ分子の取り込みに起因している。さらに、Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ  ５００を使用してゼータ電位分布を測定した。表面電荷を複数回測定し、ＰＥＧ化されていないエクソソームのゼータ電位は約−１６．５ｍＶ、ＰＥＧ化されたものは約−２．６ｍＶであった（図２ＡおよびＢ）。ｙ軸は、特定の期間に記録された特定の電荷の確率を示す相対度数を示す。この場合、エクソソーム電荷を１分あたり１０００フレームで記録した。これは、エクソソームが効果的にＰＥＧ化されており、エクソソームの膜上のＰＥＧ分子の存在が表面電荷をほぼ中和したことを明確に示している。さらに、エクソソームサンプルは過剰なＰＥＧ分子を除去するために追加の超遠心分離ステップを必要としたため、エクソソームの分離後の実際の粒子数は、ＰＥＧ化手順後に得られた数よりも多いものとなり得る。イムノゴールドで標識されたエクソソームサンプルのＴＥＭ分析により、ＣＤ６３およびＴＳＧ−１０１マーカーの存在が確認され（図３）、ほとんどのエクソソームは１００ｎｍ未満のサイズであった。図３Ａ〜３Ｆは、イムノゴールド標識（ＣＤ６３＆ＴＳＧ  １０１）エクソソーム（ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す（黒い線、１００ｎｍ）。図３Ａおよび図３Ｂの両図は、それぞれ非ＰＥＧ化およびＰＥＧ化された、対照群の二次のみのエクソソームを表す。図３Ｃは、ＰＥＧ化されたＣＤ６３エクソソームを表す。図３Ｄは、ＰＥＧ化されていないＣＤ６３エクソソームを表す。図３Ｅは、ＰＥＧ化されたＴＳＧ  １０１エクソソームを表す。図３Ｆは、ＴＳＧ  １０１非ＰＥＧ化エクソソームを表す。しかし、ＣＤ６３およびＴＳＧ−１０１で標識されたＰＥＧ化エクソソームの数は非ＰＥＧ化エクソソームよりも著しく少なかったが、形態に観察可能な変化は見られなかった。これは、抗体がそれぞれの抗原に結合するのを妨げたエクソソーム表面の効果的なＰＥＧ化の指標であり得る。さらに、ＭＳＣとエクソソームの両方のＦａｒＲｅｄ色素による標識状態を、フローサイトメトリー分析によって確認した（図４）。図４Ａ〜Ｅは、フローサイトメトリーによるＦａｒＲｅｄ＋ＭＳＣおよびビーズ結合エクソソームの検出を示す。図４Ａ〜４Ｃは、ＦａｒＲｅｄ＋エクソソームでコーティングされたビーズの画像を示す。図４Ｄおよび４Ｅは、ＦａｒＲｅｄ陽性のＭＳＣ（ゲート集団）を示す。図４Ａはビーズ集団（ゲート集団）を示し、図４Ｂおよび４ＣはＦａｒＲｅｄ＋エクソソームでコーティングされたビーズのゲート集団を示す。
【００８０】
このように、低分子量ＤＳＰＥ−ＰＥＧを用いた簡単なインキュベーション法により、ヒト骨髄由来のエクソソームの表面を効果的に修飾した。この実験では、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（つまり、架橋脂質を有するＰＥＧ）を使用して、脂質部分をエクソソームの２層に組み込み、ポリマーを固定した。
【００８１】
この例では、超遠心分離によってエクソソームを分離した後、ポリマーをエクソソーム表面に固定するために、事前に形成されたリポソームをＰＥＧ化するために使用される「挿入後」法を採用した（Ｎａｇら、２０１３）。この方法では、蛍光標識されたエクソソーム懸濁液を特定の濃度のＤＳＰＥ−ＰＥＧと混合して、エクソソーム膜へのＰＥＧの取り込みを可能にした。リポソーム製剤では、ＰＥＧのより速い最大の挿入を達成するために、通常、サンプルをより高い温度でインキュベートする。ただし、高温条件はエクソソーム調製物と互換性がないため、３７℃でＰＥＧ化手順を実行した。ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化エクソソームは異なる方法で特徴づけられ、我々の結果は、ＰＥＧ化されていないエクソソームに比較して、平均流体力学的直径の増加、ほぼ中和された表面電荷、および比較したＴＳＧ１０１およびＣＤ６３陽性エクソソームの減少によって示されるように、エクソソーム表面がＰＥＧ化サンプルのＰＥＧによって修飾されたことを示している。
【００８２】
サンプルの共焦点蛍光顕微鏡分析は、ＦａｒＲｅｄ蛍光染色されたＰＥＧ化エクソソームが、非ＰＥＧ化対照エクソソームの半分未満の用量で粘液層の下にある上皮細胞に内在化できたことを明確に示している。これは非常に重要な改善であり、効率の改善により、エクソソーム処理を行うために必要な幹細胞培養量が大幅に削減される。エクソソームが細胞核の周囲の領域に局在していることも明らかである。これは、細胞のタンパク質翻訳機構が配置されている場所、つまり小胞体の内側を覆うリボソーム上にある。小さいサイズのウイルスベクターがこれらの粘液層に完全に閉じ込められる可能性があることを考えると、細胞取り込みの程度は注目に値する。したがって、本発明は、修飾されたエクソソームが遺伝子発現を調節することができることを想定している。細胞に検出可能な変化をもたらすには、１００個のマイクロＲＮＡ分子が必要である。同様に、細胞内でタンパク質を産生するｍＲＮＡ転写物は、ＣＦＴＲタンパク質の場合は平均して約４０の転写産物であり、これもまた、本発明によって実証された標的細胞へのエクソソームの内在化によっても容易に得られ得る。
【００８３】
図５を参照すると、粘液浸透および細胞内在化実験は、表面調節された細胞外小胞、特にエクソソームが粘液を通過して頂端細胞に入る能力を示している。細胞の核は紫色に着色され、細胞膜は密着結合（緑色に着色）から識別され得る。赤い点、すなわちエクソソームが細胞に浸透し、核の周りに集まっていることは明らかである。したがって、ＰＥＧ化されたエクソソームのこの能力が実証された。
【００８４】
図５Ａ〜５Ｃは、高分化型嚢胞性線維症の気管支上皮細胞培養物の共焦点顕微鏡画像である。サンプルの洗浄、固定および染色の前に、２５μｌのエクソソームを頂端細胞表面を覆う粘液層の表面に塗布した。図５Ａでは、２５μｌのＰＳＢ中の３．０５×１０８のエクソソーム（エクソソームは、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００および−２．５ｍＶの表面電荷で高密度にコーティングされるように処理した）を粘液層の表面に適用した。図５Ｂでは、２５μｌのＰＳＢ中の６．６３×１０８のエクソソーム（エクソソームは未処理のエクソソームであり、表面修飾がなく、表面電荷が−１９．５ｍＶである）を粘液層の表面に適用した。見られるように、処理されたエクソソームの同等の粘液浸透および細胞内在化は、適用されたエクソソームの半分未満で達成された。図５Ｃは、上皮細胞の頂端区画にあり、核周辺（小胞体およびリボソームタンパク質翻訳機構）に局在するエクソソームを示す標識されたクローズアップ画像である。
【００８５】
表面操作されたエクソソームは、その内容物の遺伝子改変なしで送達される場合、または親細胞の遺伝子改変が標的細胞への送達および特定の疾患の治療のためにエクソソーム内容物を最適化できる場合、有益な治療用途になり得る。送達速度はインビボでの細胞内送達の程度に影響を与える重要な検討事項であるため、粘液拡散および細胞内在化の動態のさらなる研究を計画している。表面修飾されたエクソソームは、粘液線毛クリアランスメカニズムを回避するために重要な利点である加速された取り込みを示し、そしてこれは、リアルタイム共焦点顕微鏡ビデオ分析を用いて、粘膜表面に適用された表面修飾されたエクソソームと修飾されていないエクソソームの等しい「用量」の透過動態を比較することによって実証され得る。
【００８６】
エアロゾルによって送達される必要があるエクソソームの必要な用量はまた、インビトロ粘液浸透実験からほぼ推定することができる。既知の数のエクソソームを粘液で覆われた上皮細胞の既知の表面積（６０ｍｍ２）に適用し、非常に有意な上皮細胞の取り込みを実証した。いくつかの重要な仮定は次のとおりである：
１．所定の濃度のエクソソーム製剤の粘度と、この粘度で達成可能なエアロゾル出力；
２．表面操作されたエクソソームは粘液層を比較的速く浸透する。これは、濃度が濃度駆動拡散を介してこれに大きく影響し、パイロット研究で比較的非常に希薄なエクソソーム製剤が使用されたこと（０．０００６３９２８％ｖ／ｖの表面修飾エクソソーム）を考えると合理的である。
【００８７】
次の表は、さまざまなサイズのエアロゾル液滴のエクソソーム負荷容量を１％ｗ／ｖ濃度のエクソソームで示している：
【００８８】
【表１−１】
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【００８９】
例えば、嚢胞性線維症の場合、対象となる肺の面積は、気管から細気管支までの気道の総表面積であり、成人の肺では約２，４７１＋／−３２０ｃｍ２である。この表面積は、約７０マイクロリットルの１％ｗ／ｖエクソソーム製剤のエアロゾル沈着体積を介して処理され得る。
【００９０】
遠位肺の表面積ははるかにより大きく、気管支上皮細胞の約１８倍多い肺胞細胞であり、この領域を標的とすることは、例えば、肺気腫または特発性肺線維症の治療に望ましい。エクソソームの細胞への取り込みは、粘液バリアがないため、肺のこれらの領域ではるかに高いと予想される。
【００９１】
結論として、我々は、エクソソームが脂質結合ＰＥＧを使用して単純なインキュベーション法によって効果的にＰＥＧ化され、得られたエクソソームが粘液性ＣＦ粘液に浸透し、上皮細胞に内在化されたことを示した。このことは、肺エクソソームベースの遺伝子治療プラットフォームまたは単に炎症性肺疾患を治療するための治療上有用なエクソソームであることを示す。
【００９２】
ＰＥＧ化はまた、非ＰＥＧ化製剤と比較して粘度が顕著に低下した、エクソソームの立体的に安定化された製剤をもたらす。したがって、疎水性相互作用によって誘発される凝集から保護するための高密度の親水性コロナを有するそのようなエクソソームを含むエアロゾルの生成が容易になり、このことは、許容可能かつ有用な濃度でのエクソソームの送達のためのエアロゾルが容易になり、より高い濃度で可能になることを意味する。ＰＥＧ化されたエクソソームは粘液浸透の改善を示し、この特性はそれらエクソソームの肺粘液から肺組織への通過を促進し、肺疾患に対する治療的適用におけるＰＥＧ化されたエクソソームの有効性をさらに高める。最後に、ＰＥＧ化モノクローナル抗体およびナノ粒子は、炎症性肺疾患に増大した数で存在する肺胞マクロファージなどの食細胞による取り込みとクリアランスを回避するのに役立つ、強化された「ステルス」特性も示し得る。
【００９３】
したがって、本発明は、コーティングされた小胞、例えば、ＣＦ、ＣＯＰＤ、腺癌および他の肺の状態の遺伝子治療で使用され得るエクソソームを提供する。
【００９４】
（実施例２）
この実施例の目的は、エクソソームの表面修飾が効果的に達成され、CFTR遺伝子を過剰発現するバイオエンジニアリング細胞の遺伝子改変された間葉系幹細胞集団を首尾よく確立できることを示すことであった。
【００９５】
（ＢＴ−２０およびｈＭＳＣ細胞株培養技術）
ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１９ＴＭからＢＴ−２０ヒト上皮細胞として供給されたＢＴ−２０細胞を、完全条件培地（ＣＣＭ）として１０％ＦＢＳおよび１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地で培養した。ヒト間葉系幹細胞ドナーＮｏ．０９６を使用し、細胞を１０％ＦＢＳおよび１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンと１ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含むギブコのＭＥＭアルファ培地で培養した。
【００９６】
細胞の供給を、ピペットで培養フラスコから使用済み培地を除去し、廃液ボトルに追加し、続いて培養フラスコに適切な量の新鮮な培地（補充物を含む）を培養フラスコの天井に補充するという無菌技術を用いて１週間あたり３日行い、細胞培養（単層）が流れによって妨げられないようにした。次いで、フラスコをフードから取り出し、その蓋が内側を向くように傾け、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に配置した。細胞を、濁り、懸濁液中の細胞、培地の色の変化、大きな塊または粒子などの汚染の兆候について光学顕微鏡で定期的に検査した。
【００９７】
７〜１０日ごとに細胞を分割するため、細胞が８０〜９０％のコンフルエンスに達する前に、細胞を３〜５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、細胞を乱さないようにフラスコの反対側に確実に送達し、続いて５ｍｌのＴ／Ｅ（適切な濃度、３７℃）で加温した。次いで、フラスコを軸を中心に３０秒間穏やかに揺り動かし、すべての細胞が確実に覆われるように、（フラスコ中約１ｍｌを残して）過剰のＴ／Ｅをピペットで捨てボトルに廃棄した。細胞がフラスコの床から剥がれるように、細胞を残りの微量のＴ／Ｅとともに３７℃で３〜５分間インキュベートした。剥離した細胞を４〜６ｍｌの完全培地に再懸濁した（容量は予想される細胞数に依存する）。次いで、細胞懸濁液を１０ｍｌピペットで上下にピペッティングして均一性を確保し、１５ｍｌのファルコンに移した。このフラスコを３７℃でインキュベートした。
【００９８】
（ＥＶ非含有培地の調製）
ＥＶ非含有培地は、培養中の細胞からＥＶの精製収量を得るためのＥＶ分離プロトコルの前提条件である。これは、実験装置外のマイクロ小胞から培養細胞のＥＶ分離株の汚染を排除するためである。
【００９９】
オートクレーブ滅菌ガラス瓶に入った１３０〜１４０ｍｌの２０％ＦＢＳ＋基本培地（１：５）を調製し、上記の適切な量を１１０，０００×ｇで１８時間、４℃にて超遠心分離した。超遠心分離後、上清を、ペレットを乱さないように注意しながら、新しい５０ｍｌファルコンチューブに注意深く吸引した。５０ｍｌのファルコンからの上清を新しいオートクレーブ処理したガラス容器で濾過した。これに基本培地を等量加えて、１：１の比率にし、上記の溶液の総ＦＢＳ濃度を１０％にした。これにより、ＥＶ分離細胞培養に使用する１０％のＥＶ非含有培地を得た。条件培地を、ＥＶ分離プロトコルに使用する前に、１００ＩＵ／ｍｌのＰ／Ｓ（または他の補充物）を補充して４℃で最大４週間保存した。
【０１００】
（ＥＶの分離とＥＶリッチ条件培地の調製のための細胞培養）
ＥＶを、MISEV2018ガイドラインとさらに洗練されたプロトコルに従って分離した(Theryら、2006)。ＢＴ−２０細胞を、ＥＶ非含有培地に１２個のＴ−１７５ｃｍ２Ｔフラスコを播種するのに十分な数の３〜４個のＴ−１７５ｃｍ２フラスコに運んだ（２×１０６細胞／フラスコ）。細胞をトリプシン処理し、ＥＶ枯渇培地に再懸濁し、１０ｍｌのＥＶ枯渇培地において１２個のＴ−１７５ｃｍ２Ｔフラスコ上に２４時間播種して、細胞をフラスコの床に付着させた。次いで、培地を同量の新しいＥＶ非含有培地（条件培地）に交換した。このフラスコを４８時間インキュベートした。
【０１０１】
４８時間後、次いで、条件培地を各フラスコから収集し、５０ｍｌのファルコンにプールし、フラスコ内の細胞をトリプシン処理し、全細胞溶解物から細胞数を取得した（適切な数の細胞を継代／凍結／廃棄した）。ＥＶ非含有培地培養上清をＴフラスコから５０ｍｌファルコンに注いだ（５０ｍｌファルコンあたり４フラスコ）。次いで、上清を含む５０ｍｌのファルコンを遠心分離に供し、３００×ｇで１０分間、−２１℃の温度で細胞破片を除去した。次いで、２５ｍｌピペットを使用して上清を吸引し、下部の２〜３ｍｌの残渣をそのままにして、それぞれ新鮮な５０ｍｌファルコンに入れた。次いで、上清を２０００×ｇで１０分間、−２１℃の温度で遠心分離した。遠心分離後、上清を回収し、底部の２〜３ｍｌの残渣内に死細胞ペレットを残した。次いで、０．２μｍのポアサイズの滅菌フィルターとシリンジとを使用して、上部の２５ｍｌの上清を吸引し、新しいオートクレーブ処理した超遠心チューブに収集した。次いで、ろ過した条件培地を、日立マイクロ超遠心機で４℃にて１１０，０００×ｇで７０分間超遠心分離した。超遠心分離後、１ｍｌの上清をチューブの１つから１．５ｍｌチューブに取り、−８０℃で保存した（上清分析１）。残りの上清を、ペレットをこすらずに廃棄物容器に廃棄した。ＥＶを含むペレットを各ＵＣＴに１ｍｌのＰＢＳで再懸濁させ、１つのＵＣＴに一緒にプールした。これを４℃で７０分間１１０，０００×ｇで超遠心分離した。超遠心分離後、１ｍｌの上清をＵＣＴから１．５ｍｌエッペンドルフに取り、−８０℃で保存した（上清分析２）。残りの上清を、ペレットをこすらずに廃棄物容器に廃棄した。８５μｌの滅菌ＰＢＳをＵＣＴを含むＥＶにピペットで移し、マークされた側を１００μｌのピペットチップで約５分間こすり落とした。５〜８分間のこすり落としの後、すべてのＰＢＳ再懸濁物を収集した。気泡を含むすべての残渣を、将来のＰＥＧ化のためにテーパーチューブに回収した。これを１０秒間パルス遠心分離して気泡を取り除き、上清をピペットでＬＦＨに混合した。１５〜２０μｌをピペットでチューブ（ＮＴＡ／ゼータ）に入れ、１０μｌをタンパク質分析チューブにピペットで入れた。分離されたＥＶサンプルをすべて−８０℃で保管した。すべての工程を無菌技術を用いて行い、すべての遠心分離工程を−４℃で行った。
【０１０２】
（DSPE-PEG 2000（AMINE）によるＥＶの分離後改変）
DSPE-PEG(2000)アミン(Avanti Polar Lipids、Inc)を、Sigma Aldrich(Wicklow、Ireland)から購入した。ＰＥＧ化リポソーム調製に関する以前に発表されたデータ(Kooijmansら、2016)に基づいて、ＰＥＧ化エクソソームを調製した。サンプル１、２、６およびサンプル４、５、７について、プラスチックまたはガラス管内で濃縮ＥＶ懸濁液をＰＢＳと混合することにより、最終容量を１：４の比率の分離ＥＶ懸濁液（５０μｌ）を調製した。これに、１：１（μｇタンパク質：μｇタンパク質）の等比率（または所望のパーセント）のDSPE-PEG 2000アミン（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、ＰＥＧ分子またはエクソソームの凝集を防ぐために、低速で揺動するロッカーの上の温度制御チューブホルダー内にＥＶサンプルを配置することにより３７℃で１時間のインキュベーションを保持した。インキュベーション後、ＥＶ−ＰＥＧ懸濁液を超遠心管内の１６〜２０ｍｌのＰＢＳに導入した。未結合のＰＥＧ分子を洗い流すために、１１００００×ｇで７０分間超遠心分離を行った。次いで、ＥＶペレットを７５μｌのＰＢＳに再懸濁し、蓋付きの適切なサイズのガラス容器に保管し、このアリコートから２０μｌを別の容器でゼータ分析用に保管した。これを、サンプル１、２、６およびサンプル４、５、７について、それぞれ−８０℃または−２０℃で保存した。
【０１０３】
（ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ））
ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化エクソソームの両サンプルを、最適化および検証されたプロトコル(Maguireら、2017、Holeら、2013、Gerlachら、2017)を使用するＮＴＡバージョン３．２を実行するNanoSightNS500システムを使用して、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）(Malvern、英国)を介して、分析した。すべてのサンプルを、４０５ｎｍレーザーと４３０ｎｍロングパスフィルターとを備えたNanoSightNS500を使用して分析した。すべてのサンプルを、分析前に湿った氷上に保管した。ＮＴＡの希釈液を、測定直前にＮＴＡによって粒子フリーと認定されたＤ−ＰＢＳ［-MgCl2、-CaCl2］(Gibco)で作製した。十分な混合と弱く結合したＥＶクラスターの分解を確実にするために、ロードする前にサンプルをピペッティングした。各サンプルをＤ−ＰＢＳで手動で希釈して、ＮＴＡに適した最適な粒子濃度（視野あたり１０粒子と１００粒子との間）を取得し、各希釈係数を自動生成されたレポートに記録した。ＥＶサンプルごとに合計６×６０秒間のビデオを記録し、分析中の検出閾値をオペレーターによって選択して、別個のナノオブジェクトのみを分析し、アーティファクトを確実に除去した。ＮＴＡは粒子の流体力学的直径、つまり球形として近似される溶媒和粒子のサイズを測定するため、測定された直径は、電子顕微鏡（ＥＭ）ベースの手法で得られる直径よりも大きくなる可能性がある。一般に、エクソソームは３０〜１５０ｎｍのサイズ範囲の直径を有する。すべてのサンプルを、分析前にドライアイス上に保管した。ＮＴＡの希釈液を、測定直前にＮＴＡによって粒子フリーと認定されたＤＰＢＳバッファー(Gibco)で作製した。十分な混合と弱く結合したエクソソームクラスターの分解を確実にするために、ロードする前にサンプルを短時間ボルテックスにかけた。各サンプルをＰＢＳにて手動で希釈して、ＮＴＡに適した最適な粒子濃度（視野あたり２０エクソソームと７０エクソソームとの間）を取得し、各希釈係数を自動生成されたレポートに記録した。エクソソームサンプルごとに合計６×６０秒間のビデオを記録し、分析中の検出閾値を選択して、個別のナノオブジェクトのみを分析し、アーティファクトを確実に除去した。
【０１０４】
（ゼータ電位測定）
ＥＶのゼータ電位を、粒子分析用の光散乱装置であるLitesizer 500(LitesizerTM 500、Anton Paar Ltd、英国)を使用して測定した。分散媒体としてＰＢＳのオプションがなかったため、ゼータ電位を、ソフトウェアで選択された分散媒体として水を使用して、１分間の平衡時間と２５℃の目標温度とでDebeye Factor 1.5のSmoluchowski近似を用いるAnton Paar Calliope Core Omega Cuvetteで、ＰＢＳでＰＥＧ化／非ＰＥＧ化ＥＶサンプルを１：１００または１：１６（ＥＶサンプル−ＰＢＳ）で希釈することによって測定した。ゼータ分析用のサンプルをアイスボックス／コンテナで解凍し、ゼータ分析ラボに供した。そこでサンプルを４℃で保管し、分析に使用する際に取り出した。希釈を、サンプルがキュベットに追加される直前に、ＰＥＧ化ＥＶまたはＰＥＧ化されていないＥＶを含むオリジナルのチューブ内で行った。キュベットを、シリンジを使用して最初にＤＩ水で洗浄し、次いで滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、次いでサンプルを、滅菌シリンジを用いて添加した。各キュベットの最大および最小負荷容量は、それぞれ３５０μｌおよび３００μｌであった。各希釈液中の粒子の濃度は、粒子のゼータ電位分布のほとんど（結果に含まれる外れ値）のピーク強度を生成することにより、意味のある測定を提供するのに十分な高さであった。
【０１０５】
（ＥＧＦＰ遺伝子構築物によるｈＭＳＣのレンチウイルス形質導入）
レンチウイルス形質導入を、ｈＭＳＣドナー＃０９６で実施した。ＥＧＦＰ−ＣＦＴＲおよびＥＧＦＰ−ＮＥＧコントロールの導入を、ＣＦＴＲ遺伝子およびｍＲＮＡカプセル化ＲＮＡの生成のために、ＥＧＦＰ−ＣＦＴＲ形質導入細胞で増幅されたＣＦＴＲタンパク質を発現させるために行った。一旦生存可能な集団が達成されればさらに特徴付を行う。形質導入を、スピンプロトコルを使用して完了した。
【０１０６】
ｈＭＳＣは通常通りに分割し、５ｍｌの完全培地に再懸濁した。再懸濁されたＭＳＣを、１０００×ｇで４分間遠心分離することによりペレット化し、その後、完全培地上清を廃棄した。細胞を５ｍｌの基本培地（ＦＢＳなし、抗生物質なし）に穏やかに再懸濁させ、細胞数を数えた。
【０１０７】
１×１０６（または概算）の細胞を、さらにＥＧＦＰレンチウイルス、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロール（レンチウイルスを含まない）ごとに別々の５０ｍｌファルコンチューブに入った約５ｍｌの基本培地に希釈した。各実験およびポジティブコントロールに、３〜４のＭＯＩ（約１８μｌ）のレンチウイルスを加えた。ネガティブコントロールはレンチウイルスを受け取らず、遠心分離により培地を廃棄し、細胞ペレットを完全培地に再懸濁した後、すべての５０ｍｌファルコンチューブを２０００×ｇ、３７℃で９０分間遠心分離した。次いで、形質導入された細胞の数に応じて適切なサイズのＴフラスコ（Ｔ１７５またはＴ−７５）に細胞を播種し、ｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）を添加した完全培地でインキュベートした。４８時間のインキュベーションの後、培地をｂＦＧＦを含む完全培地に交換し、４μｇ／ｍｌピューロマイシンを添加して形質導入細胞を７〜１４日間選択し、その後、細胞をピューロマイシンを含まない通常の完全培地に交換した。形質導入を行った後、細胞を７〜１０日ごとに分割した。
【０１０８】
（結果）
最初の実験では、高い増殖能と培養の容易さのためにＢＴ−２０ヒト乳癌細胞株を使用した。細胞を１２個のＴ−１７５ｃｍ２Ｔフラスコに入れた。ＥＶを、最も広く使用されかつ実績のある方法に従って、ＭＩＳＥＶガイドラインに従って分画遠心後に２つの超遠心分離工程を使用して上記から分離し、次いで、ナノ粒子トラッキング分析によるサイズ分布や、LitesizerTM 500機器を使用したゼータ電位研究による表面電荷分析など、ＥＶの特性評価にさまざまな方法を行った。ＰＥＧ化されたＥＶとＰＥＧ化されていないＥＶとの両方を、確立されたプロトコルと技術を使用して、最もよく知られている方法で特徴付けた。
【０１０９】
ＢＴ−２０細胞から分離されたＥＶを、さまざまな方法を使用して特性評価し、サイズを定量化し、表面電荷を測定した。この方法は、さまざまな体液または細胞培養上清からエクソソームを分離するために最も広く使用されている標準的な方法である(Chiaら、2017、Theryら、2006)ため、分画超遠心分離を使用してエクソソームを分離した。ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化エクソソームの両方のナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）は、ＮＴＡ分析がＰＥＧ化ＥＶの希釈画分に対して実行可能なオプションではないことを明らかにした。ＰＥＧ化ＥＶは、超遠心チューブのプラスチック表面との相互作用またはプラスチック容器の劣化により、表面が修飾される可能性がある。このため、サンプル４、５、および７のＰＥＧ化ＥＶ画分を保存するためにガラス容器を使用し、ＮＴＡ分析の代わりにそれらのサンプルの特性評価のためにゼータ分析を行った。
【０１１０】
（ＢＴ−２０細胞培養の概要）
細胞培養に関連するすべてのパラメータを以下の表１ａおよび１ｂに簡単に示し、細胞数、ＥＶ分離株のタンパク質濃度、ＰＥＧ処理のＤＳＰＥ  ＰＥＧ：タンパク質パーセント、ゼータ電位、および分離ＥＶ画分のＮＴＡ読取値を示す。ＮＴＡ分析の読取値の場合、フレームあたりの粒子数が少ないため（すなわち、フレームあたり３粒子未満）、サンプル１の値は信頼性がない。これは、サンプル２および６のモードＮＴＡ  Ａｆｔｅｒ  ＰＥＧにも当てはまる。サンプル３、４、および７のモードＮＴＡ  Ｂｅｆｏｒｅ  ＰＥＧについても、フレームあたり１０未満の粒子数を記録した。しかし、これらの結果は品質評価基準を満たす。すべてのデータを、ＮＴＡ分析結果の細胞数の場合は細胞／ｍｌ、容量の場合はμｌ、ゼータ電位の場合はｍＶ、モードサイズ分布の場合はｎＭとして表す。
【０１１１】
【表１−２】
2021534237.tif 000004
【０１１２】
（ＮＴＡ分析）
以下に示す表２ａおよび２ｂは、ＮＴＡ分析の反復読取値を次のように示す：モード粒子サイズ分布（ｎｍ）、ＥＶ分離プロトコル（ＭＩＳＥＶ）に従って１２個のＴ−１７５ｃｍＴ−フラスコで培養したＢＴ−２０細胞からの分離したＥＶ画分での総粒子濃度および３０〜１５０ｎｍ範囲の粒子濃度（ＮＰ／ｍＬ）。データを平均および標準誤差として表す。フレームあたり３未満の粒子数として信頼性の低いデータを提供したサンプル１およびすべてのＰＥＧ化サンプルを記録した。これは、ＮＴＡ品質評価基準を満たしていない。１０未満の粒子数を提供したサンプル２および３は、それらの測定が品質評価基準に合格するフレームであった。サンプル７も標準誤差で１フレームあたりの粒子数が１０未満であるが、品質評価基準に合格する。
【０１１３】
【表２】
2021534237.tif 000005
【０１１４】
１．分析の各日の前のシステムのキャリブレーションを、１００ｎｍのＮＩＳＴポリスチレンナノスフェアサイズ標準（１００ｎｍ  ＮＩＳＴ）および３０ｎｍのクエン酸金ナノ粒子（３０ｎｍ  ＡｕＮＰ）を使用して検証した。
２．以下の表のすべてのサンプルは、説明したように品質評価基準に合格した。
３．サンプル番号１、ＰＥＧ化サンプル番号１、ＰＥＧ化サンプル番号２、およびＰＥＧ化サンプル番号６は、１フレームあたりの粒子数が少ないため、信頼性の低い結果をもたらした（すなわち、１フレームあたり３粒子未満、「粒子なし」として分類される）。このため、それらは品質評価基準に合格しなかった。
４．サンプル番号３および番号４は、１フレームあたりの粒子数が少ない（すなわち、＜１０）。しかし、それらは品質評価基準に合格した。
５．サンプル番号７は、１フレームあたりのそれぞれの粒子数が１０未満に達する標準誤差を提供した。それらの測定値は品質評価基準に合格したが、これはそれらの濃度測定でのマイナーな考慮の原因となる可能性があり、報告されるべきである。
【０１１５】
（コントロール）
図６ａおよび６ｂは、Ｘ軸の粒子サイズ（ｎｍ）およびＹ軸の粒子濃度分布（粒子／ｍｌ）のコントロールとしてのｄＰＢＳおよび３０ｎｍ金（Ａｕ）ナノ粒子のナノトラッキング分析（ＮＴＡ）の読取値を示す。ｄＰＢＳは１フレームあたり１カウント未満、すなわち予想通り粒子のない溶液を示し、ＡｕＮＰは平均サイズ３４±０．５ｎｍの明確なピークを示し、品質管理テストに合格する。以下の表３は、平均値と標準誤差それぞれの値を示す。
【０１１６】
【表３】
2021534237.tif 000006
【０１１７】
（サンプル１）
図７ａおよび７ｂは、サンプル１のナノ粒子トラッキング分析の分布を示す。Ｘ軸の粒子サイズ（ｎｍ）とＹ軸の粒子濃度分布（粒子／ｍｌ）のＥＶサンプル。非ＰＥＧ化サンプルとＰＥＧ化サンプルとはどちらも１フレームあたりの３カウント未満であり、ＮＴＡ分析の品質管理テストに合格しなかった（すなわち粒子を含まない溶液）。平均サイズ分布と粒子濃度を以下の表４ａに示し、ソース細胞溶解物の総細胞数と粒子分布を表４ｂに示す。データを、それぞれ平均標準誤差、粒子／細胞、および粒子／所定の体積で表す。
【０１１８】
【表４】
2021534237.tif 000007
【０１１９】
（サンプル２）
図８ａおよび８ｂは、サンプル２のナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）分布を示す。ｘ軸の粒子サイズ（ｎｍ）およびｙ軸の粒子濃度分布（粒子／ｍｌ）のＥＶサンプル。非ＰＥＧ化サンプルは１１０．５±５ｎｍに明確なピークを示し、ＮＴＡ分析の品質テストに合格したが、ＰＥＧ化サンプルは１フレームあたり３カウント未満であり、ＮＴＡ分析の品質管理テストに合格しなかった（すなわち粒子を含まない溶液）。平均サイズ分布および粒子濃度を表５ａに示し、ソース細胞溶解物の総細胞数および粒子分布を表５ｂに示す。データは、それぞれ平均、標準誤差、粒子／細胞、粒子／サンプルの体積として表す。
【０１２０】
【表５】
2021534237.tif 000008
【０１２１】
（サンプル３）
図９は、ｘ軸の粒子サイズ（ｎｍ）とｙ軸の粒子濃度分布（粒子／ｍｌ）のサンプル３  ＥＶサンプルのナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）分布を示す。示されている非ＰＥＧ化サンプルの平均サイズ分布は１．５６±４３．５ｎｍであり、ＮＴＡ分析の品質テストに合格したが、ＮＴＡ分析の１フレームあたりの１０カウント未満であった。平均サイズ分布および粒子濃度を以下の表６ａに示し、ソース細胞溶解物の総細胞数および粒子分布を表６ｂに示す。データを、それぞれ平均、標準誤差、粒子／細胞、粒子／サンプルの体積として表す。
【０１２２】
【表６】
2021534237.tif 000009
【０１２３】
（サンプル４）
図１０は、サンプル４のナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）分布を示す。ｘ軸の粒子サイズ（ｎｍ）とｙ軸の粒子濃度分布（粒子／ｍｌ）のＥＶサンプル。示されている非ＰＥＧ化サンプルは、１２０±２６ｎｍで平均サイズ分布を示し、ＮＴＡ分析の品質テストに合格したが、ＮＴＡ分析の１フレームあたり１０カウント未満であった。平均サイズ分布および粒子濃度を以下の表７ａに示し、ソース細胞溶解物の総細胞数および粒子分布を表７ｂに示す。データを、それぞれ平均、標準誤差、粒子／細胞、粒子／サンプルの体積として表す。
【０１２４】
【表７】
2021534237.tif 000010
【０１２５】
（サンプル５）
図１１は、サンプル５のナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）分布を示す。ｘ軸の粒子サイズ（ｎｍ）とｙ軸の粒子濃度分布（粒子／ｍｌ）のＥＶサンプル。示されている非ＰＥＧ化サンプルは、９６±３．５ｎｍで平均サイズ分布を示し、ＮＴＡ分析の品質テストに合格したが、ＮＴＡ分析の１フレームあたり１０カウント未満であった。平均サイズ分布および粒子濃度を以下の表８ａに示し、ソース細胞溶解物の総細胞数および粒子分布を表８ｂに示す。データを、それぞれ平均、標準誤差、粒子／細胞、粒子／サンプルの体積として表す。
【０１２６】
【表８】
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【０１２７】
（サンプル６）
図１２ａおよび１２ｂは、サンプル５のナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）分布を示す。ｘ軸の粒子サイズ（ｎｍ）およびｙ軸の粒子濃度分布（粒子／ｍｌ）のＥＶサンプル。示されている非ＰＥＧ化サンプルは１１２±５ｎｍに明確なピークがあり、ＮＴＡ分析の品質テストに合格したが、ＰＥＧ化サンプルは１フレームあたり３カウント未満であり、ＮＴＡ分析の品質管理テストに合格しなかった（すなわち、粒子を含まない溶液）。平均サイズ分布および粒子濃度を以下の表９ａに示し、ソース細胞溶解物の総細胞数および粒子分布を表９ｂに示す。データを、それぞれ平均、標準誤差、粒子／細胞、粒子／サンプルの体積として表す。
【０１２８】
【表９】
2021534237.tif 000012
【０１２９】
（サンプル７）
図１３は、サンプル７のナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）分布を示す。ｘ軸の粒子サイズ（ｎｍ）とｙ軸の粒子濃度分布（粒子／ｍｌ）のＥＶサンプル。示されている非ＰＥＧ化サンプルは、９３．５±６ｎｍで平均サイズ分布を有し、精製ＥＶサンプルの基準を満たすＮＴＡ分析の品質テストに合格したが、標準誤差について１フレームあたり１０カウント未満である。平均サイズ分布および粒子濃度を以下の表１０ａに示し、ソース細胞溶解物の総細胞数および粒子分布を表１０ｂに示す。データを、それぞれ平均、標準誤差、粒子／細胞、粒子／サンプルの体積として表す。
【０１３０】
【表１０】
2021534237.tif 000013
【０１３１】
（ゼータ分析）
（サンプル１（ＰＥＧ１００％））
図１４ａおよび１４ｂは、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプル１（ＰＥＧ１００％）の平均ゼータ電位値を示す。図１４ａは、各実行の平均ゼータ電位と分布ピーク（モード）値（粒子濃度；ＰＢＳ中１：１００）を使用したＰＥＧ化ＥＶ分離サンプルの一連の測定読取値を示すプロットである。図１４ｂは、ｙ＝軸に相対度数（％）、ｘ軸にゼータ電位（ｍＶ）を用いて、ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプル１（粒子濃度：ＰＢＳ中１：１００）の３つの別々の測定読取値のゼータ電位強度分布を示す。異なる曲線が、同じＥＶ分離株からの別々のサンプル希釈の３つの連続した測定値を表す。ゼータ電位を、Ｓｍｏｌｕｓｃｈｏｗｓｋｉ近似を使用して決定した。データを平均および標準偏差として表す。すべてのデータはｍＶ単位である。
【０１３２】
（サンプル２（ＰＥＧ５０％））
図１５ａおよび１５ｂは、サンプル２に関して図１４ａおよび１４ｂと同等である。
【０１３３】
（サンプル４（ＰＥＧ５０％））
図１６は、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプル４（ＰＥＧ５０％）の平均ゼータ電位値を示す。ｙ軸に相対度数（％）、ｘ軸にゼータ電位（ｍＶ）を用いる、ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプル４（粒子濃度：ＰＢＳ中１：１６）の３つの別々の測定読取値のゼータ電位強度分布。異なる曲線は、同じＰＥＧ化ＥＶ分離物の３回の連続測定を表す。以下の表１１ａおよび１１ｂは、平均ゼータ電位を伴う非ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプルのシングルラン測定読取値と、それに続くＰＥＧ化後の同じサンプルの特定値を示す。各実施のＳＤおよび分布ピーク（モード）値（粒子濃度  ＰＢＳ中の１：１００）。ゼータ電位を、Ｓｍｏｌｕｓｃｈｏｗｓｋｉ近似を使用して決定した。データを平均および標準偏差として表す。すべてのデータはｍＶ単位である。
【０１３４】
【表１１】
2021534237.tif 000014
【０１３５】
（サンプル５（ＰＥＧ１００％））
図１７は、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプル５（ＰＥＧ１００％）の平均ゼータ電位値を示す。ｙ軸に相対度数（％）、ｘ軸にゼータ電位（ｍＶ）を用いる、ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプル４（粒子濃度：ＰＢＳ中１：１６）の３つの別々の測定読取り値のゼータ電位強度分布。異なる曲線は、同じＰＥＧ化ＥＶ分離物の３回の連続測定を表す。以下の表１２ａおよび１２ｂは、平均ゼータ電位を伴う非ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプルのシングルラン測定読取値と、それに続くＰＥＧ化後の同じサンプルの特定値を示す。各実施の標準偏差および分布ピーク（モード）値（粒子濃度  ＰＢＳ中１：１００）。ゼータ電位を、Ｓｍｏｌｕｓｃｈｏｗｓｋｉ近似を使用して決定した。データを平均および標準偏差として表す。  すべてのデータはｍＶ単位である。
【０１３６】
【表１２】
2021534237.tif 000015
【０１３７】
（サンプル６（ＰＥＧ７５％））
図１８ａおよび１８ｂは、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプル６（ＰＥＧ１００％）の平均ゼータ電位値を示す。図１８ａは、各実行の平均ゼータ電位と分布ピーク（モード）値（粒子濃度；ＰＢＳ中１：１００）を使用したＰＥＧ化ＥＶ分離サンプルの一連の測定読取値を示すプロットである。図１８ｂは、ｙ＝軸に相対度数（％）、ｘ軸にゼータ電位（ｍＶ）を用いる、ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプル６（粒子濃度：ＰＢＳ中１：１００）の３つの別々の測定読取り値のゼータ電位強度分布を示す。異なる曲線は、同じＥＶ分離物からの別々のサンプル希釈の３つの連続した測定値を表す。ゼータ電位を、Ｓｍｏｌｕｓｃｈｏｗｓｋｉ近似を使用して決定した。データを平均と標準偏差として表す。すべてのデータはｍＶ単位である。
【０１３８】
（サンプル７（ＰＥＧ１５０％））
図１９は、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプル７（ＰＥＧ１００％）の平均ゼータ電位値を示す。ｙ軸に相対度数（％）、ｘ軸にゼータ電位（ｍＶ）を用いる、ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプル７（粒子濃度：ＰＢＳ中１：１６）の３つの別々の測定読取り値のゼータ電位強度分布。異なる曲線は、同じＰＥＧ化ＥＶ分離物の３回の連続測定を表す。以下の表１３ａおよび１３ｂは、平均ゼータ電位を伴う非ＰＥＧ化ＥＶ分離サンプルのシングルラン測定読取値と、それに続くＰＥＧ化後の同じサンプルの特定の値を示す。各実施の標準偏差および分布ピーク（モード）値（粒子濃度  ＰＢＳ中１：１００）。ゼータ電位を、Ｓｍｏｌｕｓｃｈｏｗｓｋｉ近似を使用して決定した。データを平均および標準偏差として表す。すべてのデータはｍＶ単位である。
【０１３９】
【表１３】
2021534237.tif 000016
【０１４０】
（ＭＳＣの形質導入）
hMSCドナー＃096の形質導入を、確立されたプロトコルを使用して完了した。レンチウイルス粒子をGenecopoeia Ltdから供給した。
【０１４１】
現在、以下にリストされている形質導入されたhMSC細胞の４つのバッチがあるが、hMSCを形質導入するためのＭＯＩが１から２の最初の試みのいくつかは失敗であったので、含まれていない。
【０１４２】
（レンチウイルス滴定量）
【０１４３】
【表１４】
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【０１４４】
（ｈＭＳＣ形質導入の形質導入容量）
【０１４５】
【表１５】
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１５  
【０１４６】
蛍光画像を図２０および２１に示す。
【０１４７】
（検討）
本研究では、細胞によって生成されたＥＶ画分の修飾を研究した。先の研究のＮＴＡ分析で示されているように、ＰＥＧ化エクソソームの平均サイズはＰＥＧ化エクソソームよりもわずかに大きかったが、これらの実験では、ＰＥＧ化ＥＶと非ＰＥＧ化ＥＶの流体力学的サイズの違いの間に特定の相関関係を確立できなかった。これは、１）ＥＶの表面にＰＥＧ分子が組み込まれているため、懸濁液中でのそれらの挙動の変化；２）保管／インキュベーションに使用されるプラスチックチューブの使用によるＰＥＧ化ＥＶからの浸出；３）ＰＥＧ化が行われた後の超遠心洗浄工程中に超遠心チューブからのＥＶの浸出；４）プラスチック／シリコンピペットの使用によるＰＥＧ化ＥＶの沈殿；であり得る。さらに、Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒを使用して測定されたゼータ電位は、相品質管理の設定アルゴリズムが到達したか、または平均１０００回の実行がマシンによって自動的に考慮されるまで、Anton Paar Softwareによって最大１０００回の実行がなされるシリーズ読取りのために非ＰＥＧ化ＥＶの表面電荷が−６．６５〜−１８．６ｍＶの範囲内であったことを示したのに対し、サンプル１、２、および６の上記と同様の直列実行のＰＥＧ化ＥＶの場合、最大平均ゼータ電位値−０．４０ｍＶから最小−２３．６ｍＶを観察した。連続したゼータ電位の読取値は、最初の読取値よりも大幅に低い値である目に見える傾向があることを観察したが、印加電圧とＥＶのＰＥＧ化によるＰＥＧ化ＥＶの表面特性の改変が、ＥＶの表面電荷を効果的に中性値に近づけることを示唆している。この現象は確かに、エクソソームの表面修飾が可逆的であることを説明するのに役立つ可能性がある。これは、低分子量ＰＥＧによる表面修飾が、予想どおりエクソソームの細胞膜貫通取り込みを妨げなかったという観察結果の説明となる可能性がある。
【０１４８】
同じサンプルの複製による別のゼータ試験を、単一の実行試験で実行した。結果は決定的ではないが、ストレージ容量またはプラスチックとのＰＥＧ相互作用が原因である可能性がある。ガラスバイアルを使用することにより、ＰＥＧ化インキュベーション工程中にプラスチックチューブとＰＥＧ粒子との相互作用の可能性をさらに減らすため、ただし、プラスチック超遠心チューブを使用する超遠心工程はスキップできず、ＤＳＰＥ−ＰＥＧまたはＰＥＧ化ＥＶの転送中にプラスチック／シリコンピペットを使用することもできなかった。将来的には、ピペットなどのガラス器具の容器や機器を使用し、ＳＥＣクロマトグラフィーに変更することにより、ＰＥＧ化後のＥＶ精製技術を変更することにより、実験技術を適宜変更する予定である。一部のサンプルではモードで正の値が観察されたが、これらの実験の一部を実行すると、ＤＳＰＥ−ＰＥＧが劣化する可能性があることも観察された。これは、より多くのＰＥＧを使用して効果的なＰＥＧ化が可能であることを示す。これは、ＰＢＳ自体が分布ピークを正の値にシフトさせないため、一部のＥＶがＰＥＧ化されたこと、およびエクソソームの膜上のＰＥＧ分子の存在が表面電荷をほぼ中和したことを明確に示す。さらに、エクソソームサンプルは過剰なＰＥＧ分子を除去するために追加の超遠心分離工程を必要としたため、エクソソームの分離後の実際の粒子数は、ＰＥＧ化手順後に得られた数よりも多い場合があり得る。
【０１４９】
hMSCも形質導入されたが、初期に失敗があったが、スピンプロトコルを使用して約ＭＯＩ＝４以上で安定した形質導入を達成した。形質導入細胞から生成された蛍光画像は、ＣＦＴＲ−ＥＧＦＰ融合タンパク質とＥＧＦＰコントロールレンチウイルスの結果である、すべての形質導入細胞におけるＧＦＰ蛍光を示す。これを図２２〜２５に示す。これらはスライドに細胞を播種し、核をＤＡＰＩ（青）で固定および染色した後、蛍光顕微鏡で撮影したＧＦＰ陽性ＭＳＣを示す。これにより、自己蛍光だけでなく、細胞の存在が確認される。すべての細胞におけるＧＦＰ発現を示す２つの倍率が提供される。
【０１５０】
結論として、ＥＶは、ＥＶの細胞内輸送に影響を与えることなく、粘液浸透能力を付与するためにＰＥＧ化できることが示された。提案されているように、洗練された特定のツールを使用してＰＥＧ化のさらなる調査が可能である。そしてＥＶを特徴付けることができる。大規模生産のためにさらに探索することも可能である。ＲＮＡ、遺伝子およびタンパク質分析を使用するＣＦＴＲタンパク質の過剰発現のためのＣＦＴＲ過剰発現細胞からのＥＶおよびタンパク質の特性評価は、効果的な形質導入および概念実証をさらに示すであろう。これらのエクソソームによって媒介されるＣＦＴＲ発現の機能的伝達（ネガティブコントロールと比較して）は、ＣＦ上皮細胞の気液界面モデルで評価される。このモデルは、吸入エアロゾルが一度遭遇する粘液バリアを含む条件を再現するためである。エアロゾル液滴はＣＦ肺に沈着する。これらの実験は、最先端のウイルスベクターおよびナノ粒子を介した遺伝子導入アプローチ、すなわち、より優れた形質導入効率、培養中の実質的にすべての細胞へのＣＦＴＲタンパク質およびｍＲＮＡの機能的移行、および形質導入細胞培養のＵｓｓｉｎｇチャンバー実験における塩化物イオン輸送の評価による細胞によって、ＣＦ上皮細胞に導入された活性物質の機能性の実証に対して有意な改善を示すことが期待される。
【０１５１】
また、高細胞密度バイオリアクター技術を使用し、タンジェンシャルフローろ過やサイズ排除クロマトグラフィーなどのより効率的で商業的にスケーラブルなＥＶ分離方法を使用して、ＥＶ分離をスケールアップすると、ＥＶの収量が上がる可能性がある。ＣＦＴＲ過剰発現レンチウイルスで形質導入された不死化幹細胞を使用して、長期継代にわたって過剰発現された組換え核酸を確実に生産できるマスター細胞バンクを作成することも、ＥＶの商業規模の生産に非常に有益である。ＰＥＧ化プロトコルのさらなる最適化は、ＣＦＴＲ形質導入間葉系幹細胞から分離されたＥＶの電荷を、特に有機溶液安全装置を使用したＤＳＰＥ−ＰＥＧおよびＰＥＧ化サンプルの保存と転送を大幅に失うことなく中和する可能性がある。
【０１５２】
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【図１Ａ】
2021534237.tif 000019
【図１Ｂ】
2021534237.tif 000020
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2021534237.tif 000022
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021534237.tif 000025
【図４Ｃ】
2021534237.tif 000026
【図４Ｄ】
2021534237.tif 000027
【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2021534237.tif 000031
【図６ａ】
2021534237.tif 000032
【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月9日(2020.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の表面コーティングを有する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からのエクソソームを含むエアロゾル化可能な組成物であって、該小胞が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンチｍｉＲ、ｍＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、環状ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ配列、前述の改変体、あるいは人工的に設計された核酸配列、タンパク質、サイトカインまたは脂質を含むカーゴを運搬し、該ＰＥＧが５ｋＤａ未満の分子量を有し、該表面コーティングが該エクソソーム表面の少なくとも６５％を覆い、該エクソソームの表面電荷を実質的に中和する、組成物。
【請求項２】
前記親水性ポリマーがＤＳＰＥ−ＰＥＧを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記表面コーティングポリマーが、３ｋＤａ未満の分子量を有する、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
前記エクソソームがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）を含むカーゴを有する、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記ｍｉＲが、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐおよびｍｉＲ−１７から選択される、請求項４に記載の組成物。ステムループ（プレマイクロＲＮＡ）配列ｈｓａ−ｍｉｒ−１２５ｂ−１が過剰発現され、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐとｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐとの両方の成熟配列を含むＥＶを生成し得る。
【請求項６】
前記エクソソームが、ｍＲＮＡまたはその翻訳されたタンパク質を含むカーゴを有する、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記ｍＲＮＡが改変されたＣＦＴＲ  ｍＲＮＡである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記エクソソームの水性懸濁液またはコロイドを含む、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
治療に使用するための先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
肺疾患の治療に使用するための請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
がん治療に使用するための、請求項９または１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記エクソソームが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンチｍｉＲ、ｍＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、環状ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ配列、前述の改変体、あるいは人工的に設計された核酸配列、タンパク質、サイトカインまたは脂質を含む治療用カーゴ、および前記親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の表面コーティングを有し、該ＰＥＧが５ｋＤａ未満の分子量を有し、該表面コーティングが該エクソソーム表面の少なくとも６５％を覆い、該エクソソームの表面電荷を実質的に中和する、治療に使用するためのエクソソームコロイドまたは懸濁液。
【請求項１３】
前記治療が嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、肺癌または他の別の肺状態の治療のためである、請求項１０または１２に記載の使用のためのエクソソームコロイドまたは懸濁液。
【請求項１４】
前記エクソソームが、少なくとも１つの外因性ｍＲＮＡ（例えば、インビトロ転写されたｍＲＮＡ）、タンパク質、ｍｉＲ、またはアンチｍｉＲを含む治療用カーゴを含む、請求項１２または請求項１３に記載の使用のためのエクソソームコロイドまたは懸濁液。
【請求項１５】
前記エクソソームが、特定のｍｉＲ、アンチｍｉＲ、ｍＲＮＡまたは他の核酸および成熟タンパク質治療用カーゴを過剰発現するように遺伝子改変された間葉系幹細胞に由来する、請求項１２〜１４のいずれかに記載の使用のためのエクソソームコロイドまたは懸濁液。
【請求項１６】
前記処理がコロイドまたは懸濁液のエアロゾル化を含む、請求項１２〜１５のいずれかに記載の使用のためのエクソソームコロイドまたは懸濁液。
【請求項１７】
肺疾患を有する患者を治療する方法であって、
請求項１から８のいずれかに記載の組成物を提供する工程；
該組成物の小胞のエアロゾルを形成する工程； および
該患者に該エアロゾルを投与する工程；
を含む、方法。
【請求項１８】
ネブライザーを使用して前記エアロゾルを形成する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
振動メッシュネブライザーを使用して前記エアロゾルを形成する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【国際調査報告】
2021534237.tif 000059
2021534237.tif 000060
2021534237.tif 000061