(57)【要約】  本発明は、結腸直腸癌の予後及び治療に関する。特に、本発明は、アポトーシスに屈した回腸腸細胞により誘発される抗原免疫応答における腸内微生物相の役割に関し、そして結腸直腸癌（ＣＲＣ）を治療するための免疫原性組成物、並びにＣＲＣ進行を予測するためのシグネチャを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Solobacterium属以外のErysilotrichaceae科の細菌、Rikenellaceae科の細菌、Negativicutes網の細菌、Selenomonadales目の細菌、Lactobacillales目の細菌、Bacteroides fragilis種の細菌、及びそれらの混合物から成る群から選択された、生細菌の結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療への使用のための組成物であって、生きた細菌を回腸に送達出来る方法で投与される、組成物。
【請求項２】
Erysipelothrix tonsillarum、Erysipelatoclostridium ramosum、Alistipes onderdonkii、及びそれらの混合物から成る群から選択された生細菌を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Prevotella copri、Bacteroides fragilis、Faecalibacterium prauznitzii、及びそれらの混合物から成る群から選択された細菌をさらに含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
オキサリプラチンベースの治療を受ける患者に投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
術前補助キサリプラチンベースの治療を受ける患者に投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
化学療法と組み合せて、又は組み合せずに、免疫治療法、好ましくはＰＤ−1／ＰＤＬ1遮断又は抗−Ｌａｇ３  Ａｂを受ける患者に投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ＣＲＣの治療のために有用な免疫原性エンテロイドを得るための方法であって、下記工程：
（i）請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物と共に回腸エンテロイドをインキュベートする工程、及び
（ii）前記回腸エンテロイドと、細胞死誘導剤とをインキュベートする工程、を含む方法。
【請求項８】
請求項7に記載の方法により得られた免疫原性エンテロイドを含むことを特徴とする、ＣＲＣを有するか、又はＣＲＣを発症する危険性を有する患者を治療するための抗癌ワクチン。
【請求項９】
患者におけるＣＲＣの治療のために有用なＴ濾胞ヘルパー細胞及び／又はＴｈ１細胞を得るための方法であって、請求項７に記載の方法により得られた自己又は同種免疫原性エンテロイドにより充填された樹状細胞と共に自己Ｔヘルパー細胞をインキュベートする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法により得られた、ＣＲＣの治療への使用のための、養子移入されるＴ濾胞ヘルパー細胞及び／又はＴｈ１細胞。
【請求項１１】
ＣＲＣの患者についての予後及び／又はサブタイプシグネチャを生成するための方法であって、
（i）患者の回腸粘膜から得られたサンプル、又は患者からの糞便サンプルにおけるErysipelatoclostridium、Erysipelothrix及びTuricibacter属のErysipelotrichaceae、Rikenellaceae、Prevotella copri、Bacteroides fragilis、Faecalibacterium prausnitzii、Negativicutes、Selenomonadales及び Lactobacillalesから選択された１又は２以上の細菌の存在についてインビトロで評価し、そして
（ii）未分類のＹＳ２、clostridium neonatale、未分類のLachnospiraceae, 未分類のRuminococcaceae、Blautia、Christensenella minuta、Bacteroides caccae、Corynebacterium amycolatum、Streptococcus gallolyticus、Bacillus circulans、Ruminococcus gnavus、未分類のPhascolarctobacterium、Bacteroides uniformis、Catabacter hongkongensis、Fusobacteriaceae、Bacteroides fragilis を除くBacteroidaceae 、Tannerellaceae 及びPrevotellaceaeから成る群から選択された１又は２以上の細菌の存在をインビトロで評価し、ここで（i）に記載される細菌の存在が良好な予後を示し、そして（ii）に記載される細菌の存在が不良な予後を示すことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結腸直腸癌の予後及び治療に関する。特に、本発明は、アポトーシスに屈した回腸腸細胞により誘発される抗原免疫応答における腸内微生物相の役割に関し、そして結腸直腸癌（ＣＲＣ）を治療するための免疫原性組成物、並びにＣＲＣ進行を予測するためのシグネチャを提供する。
【背景技術】
【０００２】
腸粘膜は、腸上皮細胞（ＩＥＣ）、局所免疫及び微生物生態系の間の動物インターフェースである（１）。持続的な腸内細胞症は、明白な発癌につながる結腸直腸の炎症性病変の悪化の危険因子であり得る（２，３）。結腸直腸癌（ＣＲＣ）の発生の主要段階にわたる微生物群集の分類学的足跡の変動は、発癌における腸生態系の異なる群集の役割を示している（４−６）。ＣＲＣは、食事、環境及び微生物暴露、及び宿主免疫性により影響された体細胞分子変化から生じる多因子工程の結果である（７）。腫瘍床内の腫瘍浸潤性Ｔリンパ球（ＴＩＬ）の豊富さ、機能的能力及び地理的分布が、ＣＲＣの予後を決定する（８）。従って、エフェクター及びメモリーＴｈ１／Ｔｃ１  Ｔリンパ球の活性化をもたらす自発的又は化学療法誘発性適応免疫応答が腫瘍の進行を抑制する（９−１１）。ＣＸＣＬ１３及びＩＬ−２１は、生存率と相関するＴ濾胞ヘルパー（ＴＦＨ）／Ｂ細胞軸のための重要な要素である（１２）。オキサリプラチン（ＯＸＡ）は、ＣＲＣのために定期的に使用され、そして免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を誘発し、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）（例えば、カルレテイキュリン、ＨＭＧＢ１、ＡＴＰ、アネキシンＡ１及びＣＸＣＬ１０を放出し（１３−１６）、従って、適応性免疫応答を誘発する。ＣＲＣにおけるＴＩＬの蓄積をもたらす腫瘍、宿主又は環境的手がかりはまだ解明されていない。以前の研究は、リンパ球浸潤がマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）に関連し、フレームシフト変異により生成される切断されたペプチドの生成をもたらすことを示している（１７−２０）。それらのネオ抗原は、免疫チェックポイント阻害剤と応答して、ＭＳＩhighＣＲＣの患者の素因であり得る（２１）。しかしながら、ＭＳＩ陰性ＣＲＣ患者の大多数の相対的免疫原性を説明するメカニズムは、オープンな難問のままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、腸を減菌する広範囲の抗生物質が、結腸癌マウスモデルに対するＯＸＡの効力を低め、抗菌ペプチドの糞便への放出を妨げることを観察し、このことは、ＯＸＡが同時に、腸及び腫瘍の両区画に影響を及ぼすことを示唆する。従って、彼らは、腸の微生物組成がＣＲＣの治療におけるＯＸＡの有効性に影響を及ぼすかどうかを決定した。
【０００４】
彼らは、回腸の微生物相が死にかけている腸上皮細胞の寛容原性活性と免疫原性活性との間のバランスを決定することを見出した。結腸癌から保護する抗癌免疫応答は、Erysipelotrichaceae 及び Rikenellaceae科の回腸での存在に関連している。彼らはまた、低められた回腸免疫緊張が、Erysipelotrichaceae科の高レベル、腸間膜及び腫瘍リンパ節におけるＴＦＨ活性化、及び近位結腸癌患者における延長された無増悪生存と相関していることを示した。それらの発現は、腸内細菌相、局所免疫応答、及び結腸癌治療及び予後の間の新規関連性を明らかにし、そして本発明の基礎を形成する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の側面によれば、本発明は、ソロバクテリウム（Solobacterium）属以外のエリシペロトリクス（Erysilotrichaceae）科の細菌、Rikenellaceae科の細菌、Negativicutes網（特に、の細菌、Selenomonadales及びAcidaminococales目）の細菌、Lactobacillales目の細菌、Bacteroides fragilis種の細菌、及びそれらの混合物から成る群から選択された、生細菌の結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療への使用のための組成物に関する。それらの「免疫原性」細菌／共生菌は、免疫原性化学療法及び／又は免疫チェックポイント遮断薬と組合して、ＣＲＣの治療において経口アジュバントとして投与され得る。
【０００６】
別の側面によれば、本発明は、
（i）上記のような「免疫原性共生菌」（すなわち、いくつかのErysipelotrichaceae、Rikenellaceae、Negativicutes、Lacotacillales、Bacteroides fragilis）を含む組成物と共に回腸エンテロイドをインキュベートする工程、及び（ii）前記回腸エンテロイドと、細胞死誘導剤とをインキュベートする工程を含む、ＣＲＣの治療のために有用な免疫原性エンテロイドを得るための方法に関する。
【０００７】
ＣＲＣを有するか、又はＣＲＣを発症する危険性を有する患者を治療するための抗癌ワクチンもまた、本発明の一部であり；そのようなワクチンは上記方法により得られる免疫原性エンテロイドを含む。
【０００８】
本発明はまた、上記方法により得られた自己又は同種免疫原性エンテロイドにより充填された樹状細胞、又は免疫原性共生菌に暴露された自己又は同種一次腸上皮細胞と共に自己Ｔヘルパー細胞をインキュベートする、患者におけるＣＲＣの治療のために有用なＴ濾胞ヘルパー細胞及び／又はＴｈ１細胞を得るための方法にも関する。
【０００９】
この方法により得られたＴ濾胞ヘルパー/ Ｔｈ1細胞もまた、本発明の一部であり、患者における前記Ｔ濾胞ヘルパー/ Ｔｈ1細胞の養子移入によるＣＲＣ治療へのそれらの使用も同様である。
【００１０】
別の重要な観点によれば、本発明は、
（i）患者の回腸末端粘膜から得られたサンプルにおけるＣＤ３Ｅ、ＡＨＲ、ＧＡＴＡ３、ＴＢＸ２１、ＢＣＬ６、ＣＤ４、ＲＯＲＣ、ＦＯＸＰ３、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ２７、ＩＬ１０、ＩＬ２３Ａ及び ＩＦＮＧから成る群から選択された１又は２以上の遺伝子についての発現レベルを評価し、そし、そして
（ii）前記患者における発現レベルと、対照の発現レベルとを比較することを含む、ＣＲＣ患者の予後及び／又はサブタイプシグネチャを生成するための方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、
（i）患者の回腸粘膜から得られたサンプル、又は少なくとも、患者からの糞便サンプルにおけるErysipelatoclostridium、Rikenellaceae、Bacteroides fragilis、Prevotella copri、Faecalibacterium prausnitzii、Negativicutes、Lactobacillales（特に、Enterococcus hirae）、及びSelenomonadalesから選択された１又は２以上の「免疫原性」細菌の存在についてインビトロで評価し、そして
（ii）Fusobacteriaceae科、Bacteroidaceae（前のBacteroides fragilisとわ異なる）、Tannerellaceae、Prevotellaceae、未分類のＹＳ２、clostridium neonatale、未分類のLachnospiraceae, 未分類のRuminococcaceae、Blautia、Christensenella minuta、Bacteroides caccae、Corynebacterium amycolatum、Streptococcus gallolyticus、Bacillus circulans、Ruminococcus gnavus、未分類のPhascolarctobacterium、Bacteroides uniformis、及びCatabacter hongkongensisから成る群から選択された１又は２以上の「寛容原菌」の存在をインビトロで評価し、ここで（i）に記載される細菌の存在が良好な予後を示し、そして（ii）に記載される細菌の存在が不良な予後を示すことを含む、ＣＲＣの患者についての予後及び／又はサブタイプシグネチャを生成するための方法にも関する。
【００１２】
ＣＲＣ患者の予後及び／又はサブタイプシグネチャを生成するための他の方法もまた、回腸の免疫緊張（切断されたカスパーゼ３腸性腸上皮細胞の数、又は回腸の腸固有層又は回腸の腸固有層及び上皮内リンパ球における免疫細胞の数により決定される）に基づいて、又は患者からの血液サンプルにおけるB．fragilis特異的記憶ＣＤ４＋Ｔｈ１応答の分析に基づいて、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】図１は、回腸の免疫緊張がマウス及び患者における結腸癌の予後と相関することを示す。Ａ．アバター応答者（ａＲ）及びアバター非応答者（ａＮＲ）についての代表的な腫瘍成長曲線。時間の経過に伴って腫瘍サイズは、自然な腫瘍の成長（ＰＢＳ、灰色）又はＯＸＡ処理後（黒色）についての平均±ＳＥＭとして表される。特定の病原体のない（ＳＰＦ）対照の代表的な腫瘍増殖もまた示される。Ｂ．グラフは、ＯＸＡ処理の１日当たりの腫瘍サイズの減少率として、ＯＸＡ及びＰＢＳグループを対比している。ａＲ、ａＮＲ及びＳＰＦは、それぞれ赤、青及び灰色のバーで表される。Ｃ．殺害時でのＰＢＳ及びＯＸＡ処理されたアバターにおける回腸及び結腸粘膜における免疫遺伝子転写体のｑＲＴ−ＰＣＲ（２１日目）。ＡＮＯＶＡ *ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。
【００１４】
【図１−２】Ｄ．ＯＸＡ処理されたアバターグループの腫瘍排出リンパ（ｔｄＬＮ）における殺害時でのフローサイトメトリーにより決定された、回腸免疫遺伝子転写体とＴＨ１７及びＴＦＨの割合との間のスピアマン相関。Ｅ．ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化されたＡＨＲ及びＢＣＬ６の相対的発現。１つのドッドは１人の患者を表し、中央値及び四分位範囲が示されている。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｐ値は、ステージＩ−IIとIII−IVとの間の有意的な差異を決定することが示されている。Ｆ．４２のステージIII−ＩＶ近位結腸腺癌（ＰＣＡＣ）患者（初期分析からのコホート１及び２）におけるＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒの進行までの時間（ＴＴＰ）曲線及びログランクの単変量分析。コホートの中央値を適用すると、最良なカットオフ値を用いてのＡＨＲについての結果が確認された。
【００１５】
【図１−３】Ｇ．手術時での回腸及び結腸免疫遺伝子転写（行）に応じたＰＣＣ患者（拡大されたコホート  ｎ＝８３、列）の凝集型階層クラスタリングを示すヒートマット及び樹状図。距離は、１−Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数及びＷａｒｄ方法による凝集により測定された。臨床変数及び起源の組織は、それぞれ、上部及び側面境界のカラーコードにより示される。
【００１６】
【図１−４】Ｈ．回腸及び結腸における遺伝子発現のパターンを、クラスター１とクラスター２の個人間のＬｏｇ２倍比として示すヒートマップ。Ｗｈｉｔｎｅｇ  Ｕテスト：＊ｐ＜０．０５; ＊＊ｐ＜０．０１; ＊＊＊ｐ＜０．００１; ＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。I−Ｊ．８３のＰＣＣ患者（Ｉ）又はステージＩＶ転移性ＰＣＣ患者（Ｊ）のみにおけるＭａｎｔｅｌ  Ｃｏｘ回帰テストにより分析されたパネルＧからのクラスタリングに従って分離された、治療失敗までの時間（進行又は癌関連死）についてのＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ曲線。
【００１７】
【図２−１】図２は、結腸癌に対する回腸腸細胞の免疫原性細胞死における腸カスパーゼ３及び７の保護的役割を示す。  Ａ−Ｂ．それぞれ、同系移植可能結腸癌、ＭＣ３８（Ａ）又はＣＴ２６（Ｂ）から保護するためにＯＸＡに暴露されたか又は暴露されなかった、回腸又は結腸ＩＥＣを用いてのナイーブＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ａ）又はＢＡＬＢ／ｃ（Ｂ）マウスのワクチン接種。２〜３のプールされた実験（右のパネル）の２１日目での１つの代表的な実験及び腫瘍サイズを示す腫瘍成長曲線（左のパネル）。Ｃ．ＷＴ宿主を免疫化するための回腸ＩＥＣドナーとして、ＷＴ同腹子又は遺伝的変異体、Ｃａｓｐ３／７デルタＩＥＣ（左）又はＲｉｐｋデルタＩＥＣ（左）を用いてのワクチン接種実験。代表的な実験からの腫瘍成長曲線が示されている。Ｄ．ＯＸＡ（又はＰＢＳ）のi.p.処理の６時間後、結腸及び回腸粘膜における切断されたカスパーゼ３の陽性免疫組織化学染色の自動定量化。
【００１８】
【図２−２】Ｅ−Ｆ．ＷＴ宿主を免疫化するために中和抗体又は薬理学的阻害剤（Ｆ）により処理された回腸ＩＥＣドナー（Ｅ）又はＷＴ回腸ＩＥＣとしてＷＴ又は遺伝的変異体（パターン認識受容体［ＰＲＲ］シグナル伝達経路又はＤＡＭＰが欠けている）を用いてのワクチン接種実験。プールされたいくつかの独立した実験の２１日目での腫瘍サイズが示されている。Ｇ．Ｇａｓｐ３／７デルタＩＥＣのＷＴ同腹子又は遺伝的変異体におけるＯＸＡ  i.p. (又はＰＢＳ)により処理された腫瘍保有体における殺害時での腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）における生細胞のＣＤ３＋ＣＤ４＋間のＴＦＨ細胞のフローサイトメトリー分析。１つの代表的な実験が示されている。ＡＮＯＶＡ及びｔ検定の統計学的分析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００１９】
【図２−３】Ｈ．ＯＸＡ又はＰＢＳにより処理されたＶｉｌｌｉｎ駆動カスパーゼ３／７遺伝子欠損（Ｃａｓｐ３／７デルタＩＥＣ）又はカスパーゼ３／７フロックス対照同腹子における体表的実験でのＭＣ３８の腫瘍増殖動態。特定のソフトウェアによる双方向ＡＮＯＶＡ（詳細については、方法を参照のこと）。Ｉ．Ｖｉｌｌｉｎ駆動カスパーゼ３／７遺伝子欠損（Ｃａｓｐ３／７デルタＩＥＣ）又はカスパーゼ３／７フロックス対照同腹子における殺害での腫瘍床における種々のＴ細胞サブセット（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）のフローサイトメトリーによる決定。２つの実験のうち、１つの代表的な実験が同様の結果を示している。ＡＮＯＶＡ及びｔ−検定統計学的分析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【００２０】
【図２−４】Ｊ．術前補助化学療法なしで、又はその後のＰＣＣ回腸検体における切断されたカスパーゼ３についての免疫組織化学の代表的顕微鏡写真。スケールバーは５０μｍである。Ｋ．術前補助化学療法により処理された１２人の患者と３３人の未処理の患者の陰窩を選択するためのアルゴリズムを用いて、切断されたカスパーゼ３細胞の自動定量化の統計学的分析。中央値±６〜９５％が示されている。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定のｐ値が示されている。Ｌ．回腸陰窩切断カスパーゼ３（Ｋで決定された）の中央値に従って分離された、術前補助化学療法を受けたＰＰＣ患者における全生存のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線。
【００２１】
【図３−１】図３は、結腸癌に対する回腸腸細胞の免疫原性細胞死における回腸微生物相の補助的役割を示す。  Ａ．ＷＴ宿主を免疫化するために回腸ＩＥＣドナーとしてＷＴ  ＳＰＦ又は無菌（ＧＦ）マウスを用いてのワクチン接種実験。３つのうち１つの代表的実験（６匹のマウス／グレープ）の平均腫瘍増殖曲線、類似する結果が得られる。Ｂ．致死量のＭＣ３８細胞に対して免疫化するためにＰＢＳ又はＯＸＡに暴露された陰窩幹細胞由来のエンテロイドを用いてのナイーブＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのワクチン接種実験、それぞれ６〜１０匹のマウスを含む４つのプールされた実験の２１日目での腫瘍サイズ。各ドットは１匹のマウスを表す。Ｃ．Ｂにおけるのと同じ実験設定であるが、しかしＰＣＡＣ患者から採取された回腸粘膜微生物相を追加して、ナイーブ宿主をワクチン接種する。回腸粘膜由来の微生物相のみ（左）及びＯＸＡ−ＩＥＣ＋同じ患者からの回腸粘膜由来の微生物相（右）により免疫化された動物における代表的な腫瘍増殖曲線（５匹／グループ）（Ｃ）。２１日目での免疫化されたマウスと免疫化されていないマウスとの間の腫瘍サイズ減少率を示す１０の試験されたサンプルからの結果（Ｄ）。
【００２２】
【図３−２】Ｄ．Ｂにおけるのと同じ実験設定であるが、しかしＰＣＡＣ患者から採取された回腸粘膜微生物相を追加して、ナイーブ宿主をワクチン接種する。回腸粘膜由来の微生物相のみ（左）及びＯＸＡ−ＩＥＣ＋同じ患者からの回腸粘膜由来の微生物相（右）により免疫化された動物における代表的な腫瘍増殖曲線（５匹／グループ）（Ｃ）。２１日目での免疫化されたマウスと免疫化されていないマウスとの間の腫瘍サイズ減少率を示す１０の試験されたサンプルからの結果（Ｄ）。Ｅ．Ｄにおいて試験された患者からの回腸微生物相の培養分析による、応答者と非応答者との間の強化された細菌種の有意な差異。Ｆ．コホート１におけるそれらの免疫スコア（ＩＳ）に従ってのＰＣＡＣ患者からの回腸微生物相におけるＯＴＵ１０４０の相対量。スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５。
【００２３】
【図３−３】Ｇ．細菌ファミリーと、回腸における転写因子の発現レベルとの間の有意なスピアマン相関（絶対ｒｈｏ＞０．３）のｒｈｏ値のヒートマップ、及びコホート１におけるErysipelotrichaceaeの相対的表現及びＡＨＲの回腸発現の相関。Ｈ．図３Ｇに示されるコホート１と同じ設定であるが、コホート２（初期コホート２  ｎ＝２０）については、細菌ファミリーと、回腸における転写因子の発現レベルとの間の有意なスピアマン相関（絶対ｔｈｏ＞０．３）についてのｒｈｏ値のヒートマップ、及びコホート２におけるＡＨＲの低い回腸発現に関連するErysipelotrichaceaeについての代表的なドットブロット。
【００２４】
【図３−４】Ｉ．この研究において「免疫原性回腸アポトーシス」に関連する３つの基準に見いだされる一般的な細菌分類ランクのＶｅｎｎ図（免疫スコア＞２、中央値を下回るＡＨＲ回腸発現レベル、インビボ免疫特性［Ｒ］）。Ｊ．患者の２つのコホートを用いて評価されるように、この研究の非「免疫原性回腸アポトーシス」に関連する３つの基準に見いだされる一般的な細菌分類ランクのＶｅｎｎ図（ワクチン接種実験におけるＩＳ＜２、中央値を超えるＡＨＲ回腸発現レベル、インビボでの非免疫化特性［ＮＲ］）。
【００２５】
【図３−５】Ｋ−Ｌ．図１Ｇに定義されるように、クラスター１とクラスター２のＰＣＣ患者に一致する科（Ｋ）及び種（Ｌ）レベルでの微生物相組成の違いを示すＶｏｌｃａｎｏプロット。Ｖｏｌｃａｎｏプロットは、８３人の（拡大されたコホート）ＰＣＣ患者の回腸粘膜に存在する各細菌ファミリー（Ａ）又は種（Ｂ）について計算することで生成される：ｉ）クラスター１とクラスター２における平均相対量（ｘ軸）間の倍率（ＦＲ）のｌｏｇ２：ｉｉ）相対量（ｙ軸）に基づいて計算されたＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定から得られるｐ値のｃｏ−ｌｏｇ１０。緑色のドットは、ｐ＜０．０５で有意であるとみなされる（灰色のドット、ｐ＞０．０５）。Ｍ．浸潤マージン（Ｍ）又は腫瘍の中心（ＣＴ）のＣＤ３＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞により定義される回腸細菌ファミリーとＴＩＬ組成との間のスピアマン相関係数を示すヒートマップ。有意な相関（＊ｐ＜０．０５）が示されている。Ｎ．切断されたアポトーシスカスパーゼ３（ｃＣａｓｐ３）の密度は、クラスター１又はクラスター２におけるそれらの分離に従って、術前補助化学療法により処理されたＰＣＣ患者の回腸陰窩の下部で計算される（図１Ｇ）。各クラスターに属する患者のパーセンテージは、ｃＣＡｓｐ３が図２Ｋに定義されるカットオフ値以上か又は以下である条件で示される。Ｏ−Ｐ．回腸陰窩におけるｃＣａｓｐ３＋密度と、自己回腸における細菌ファミリーとの間のＳｐｅａｒｍａｎ相関。各ドットは１人のＰＣＣ患者を表す。実線及び点線は、それぞれ、回帰線及び９５％の信頼区間を示す。
【００２６】
【図３−６】Ｑ．免疫スコアグループ間で異なって存在する回腸種を表すために、効果サイズ測定と組合された線形判別分析（ＬＤＡ）（１＝不良な予後;３＝良好な予後）。ＬｅｆＳｅｐｌｏｔｓは、Ｐｙｔｈｏｎ２．７により生成され、そしてＬＤＡスコア≧２を有するすべての種が示されている。Ｒ．Ｍａｎｔｅｌ  Ｃｏｘ回帰分析を用いて分析され、及びＣｕｔｏｆｆ  Ｆｉｎｄｅｒ法を用いて最良なカットオフ値で分析された、７０人のＰＣＣ患者における手術時での回腸粘膜におけるBacteroides  fragilisの相対量に従って分離された、治療失敗までの時間（進行又は癌関連死）についてのKaplan  Meier曲線。
【００２７】
【図４】図４は、糞便微生物相のシグネチャが回腸微生物のシグネチャと相関することを示す。  Ａ．クラスター１とクラスター２との間で異なって存在する糞便種を表すために効果サイズ測定と結合された線形判別分析（ＬＤＡ）。LEｆSeplotsがＰｙｔｈｏｎ２．７により生成され、そしてＬＤＡスコア≧２を有する全での種が示されている。回腸種との共通点は、矢印で示されている。Ｂ．糞便細菌ファミリーと、浸潤マージン（ＩＭ）又は腫瘍の中心（ＣＴ）のＣＤ３＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞により定義されるＴＩＬ組成との間のSpearman相関係数を示すヒートマップ。有意な相関（＊ｐ＜０．０５）が示されている。回腸ファミリーとの共通点は矢印で示されている。
【００２８】
【図５−１】図５は、腸内細菌症の状態でオキサリプラチン抗癌効果を回復するAlistipes  sp．及びErysipelotrichaceaeの補償効果を示す。Ａ−Ｃ．ＭＣ３８を注射され、そして枯渇抗ＣＤ４＋及び抗−ＣＤ８＋Ａｂｓの不在（Ｂ）又は存在（Ｃ）下で、ＯＸＡ  ｉｐ．処理の前後１日（Ａ）で１０９ｃｆｕの生存Erysipelothrix tonsillarum 又は Solobacterium mooreiの経口強制により処理されたＡＴＢ治療ＳＰＦマウス。２１日目での腫瘍サイズ（２つの実験プール）（Ｂ）及び腫瘍増殖（１つの代表的な実験の）（Ｃ）。Ｄ−Ｅ．ａＮＲにおいて実行された細菌補償。ＡＮＯＶＡ統計学：＊ｐ＜０．０５。Ｆ−Ｇ．エンテロイドを用いてのナイーブマウスの免疫化（３Ａにおけるのと同じ設定）、これにより、ＯＸＡ処理されたエンテロイドが同時に、生存（又は低温殺菌された）細菌に暴露され、そしてｓ．ｃ．免疫化の前、ＡＴＢにより中和されている。グラフは、腫瘍増殖（１つの実験の）を示す（Ｇ）。
【００２９】
【図５−２】Ｈ．コホート１における診断時での転移発生に従っての主要な細菌ファミリーのヒートマップ。有意なファミリーはスチューデントｔ検定のラベル（＊）が付けられる。Ｉ．転移を伴うか又は伴わないＰＣＡＣ患者における回腸内容物におけるErysipelotrichaceaeの相対量。＊ｐ＜０．０５スチューデントｔ検定。
【００３０】
【図６】図６は、ＰＣＡＣ患者（コホート１）における癌免疫スコアに従っての回腸微生物相を示す。  回腸微生物相のＭｉＳｅｑ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子分析による、高免疫スコア（ＩＳ  ２−４）と低免疫スコア（ＩＳ  ０−１）の腫瘍を有する患者からの回腸粘膜における富化された細菌種の有意な差。カイ二乗検定のｐ値が示されている。
【００３１】
【図７】図７は、オキサリプラチン及び抗−ＰＤ−１抗体により構成される組み合わせレジメンの抗癌効果を改善するＢ．fragilis及びErysipelotrichaceaeに属する細菌の免疫原性効果を示す。  Ａ．実験設定：抗−ＰＤ−１抗体と組合してのＯＸＡ腹腔内治療の１日前及び後、ｓｃＭＣ３８を注射され、そして１０９ｃｆｕの生存細菌の経口強制投与により処理されたＳＰＦマウス（グラフに列挙される：Ａ. onder: Alistipes onderdonkii、Ｂ. frag: Bacteroides fragilis、Ｃ. ramosum: Erysipelatoclostridium ramosum、Ｄ. invisus: Dialister invisus、Ｐ. clara: Prevotella clara）。Ｂ．経時的な腫瘍サイズの平均±ＳＥＭとして表される腫瘍増殖曲線、６匹のマウス／グループ、１つの代表的実験が示される。Ａｎｏｖａ統計：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。Ｃ．実験終了時での腫瘍のないマウスの割合（１つの代表的な実験が示されている）。
【００３２】
【図８】図８は、免疫原性細菌及び細胞死誘導剤OXALIPLATINUMにより処理されたＨＩＥＣに暴露された樹状細胞を用いてのＣＤ４ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を示す。Ａ−Ｃ．単球由来のＤＣが、ＰＢＳ又はＯＸＡ（Ａ）及びＢ．fragilis（Ｂ）又はＰ．clara（Ｃ）に暴露されたＨＩＥＣ−６を負荷され、そしてその後、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共に７日間、共インキュベートされた。インキュベーションの最後で、上清液を、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γの存在について評価した。６人の健康なボランティアのＷｉｌｃｘｏｎ対比較、各ドットは１人のドナーを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
現テキストにおいては、以下の一般的な定義が使用される：
結腸直腸癌：
本明細書において、結腸癌又は腸癌としても知られている結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、結腸又は直腸（大腸の一部）からの任意の種類及び任意の段階の癌を指す。近位結腸癌又は近位結腸腺癌（ＰＣＡＣ）は、その解剖学的位置により定義されるＣＲＣの特定の形である。
【００３４】
治療：
本明細書において使用される場合、用語「治療する（treat）」、「治療（treatment）」及び「治療する（treating）」とは、癌の進行の遅延、重症度の低下及び／又は期間を指し；例えば、ＣＲＣの場合、１又は２以上の治療薬の投与に起因する、生活の質の改善及び／又は生存性の増加を指す。この用語はまた、本明細書においては、ＣＲＣを有さないが、しかしこの病状を発症するリスクがある個体（ＭＳＩhigh個体）に投与される予防的治療を指す。
【００３５】
抗癌ワクチン：
本明細書において、「抗癌ワクチン（anticancer vaccine）」とは、たぶん、他の治療、例えばオキサリプラチンによる治療に関連して、癌に対する免疫応答を誘発するためにＣＲＣを有する患者（治療ワクチン）、又はＣＲＣを有さないが、しかしこの病理の発症のリスクがある個人（予防ワクチン）のいずれかに投与され得る免疫原性組成物を指す。
【００３６】
他の定義が、必要に応じて以下に特定されるであろう。
【００３７】
以下の実験部分において記載されるように、本発明者らは、特定の細菌の投与が腸内毒素症を補償し、そして結腸直腸癌の動物モデルにおいて化学療法の抗癌効果を改善できることを実証した。従って第１の側面によれば、本発明は、以下から成る群から選択された生細菌を含む組成物の結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療への使用に関する：
（i）Solobacterium属のものを除く、Erysipelotrichaceae科の細菌、
（ii）Rikenellaceae科の細菌、
（iii）Negativicutes網の細菌
（iv）Selenomonadales及びLactobacillales目の細菌
（v）Bacteroides fragilis種の細菌。
【００３８】
特定の実施形態によれば、本発明は、以下から成る群から選択された細菌を含む組成物の結腸直腸癌、（ＣＲＣ）の治療への使用に関する：
（i）Solobacterium属のものを除く、Erysipelotrichaceae科の細菌、
（ii）Rikenellaceae科の細菌、及び
それらの混合物.]
【００３９】
本発明の特定の実施形態によれば、組成物は、Erysipelatoclostridium、 Erysipelothrix 及び/又は Turicibacter属からの生細菌を含む。
【００４０】
別の特定の実施形態によれば、組成物は、Erysipelothrix tonsillarum、Erysipelatoclostridium ramosum、Alistipes onderdonkii、及びそれらの混合物から成る群から選択された生細菌を含む。
【００４１】
本発明を実施する場合、組成物はまた、Prevotella copri、Bacteroides (特に Bacteroides fragilis)、Faecalibacterium (特にFaecalibacterium prauznitzii)、及びそれらの混合物から成る群から選択された細菌も含むことができる。組成物に都合良く含まれ得る他の細菌は、Propionibacterium acnes、Eggerthella lenta及びStreptococcus anginosusを含む。組成物に都合良く含まれ得るさらなる他の細菌は、S. dentisani (図３Ｑを参照のこと)、Enterococcus hirae 及び Ruminococcus faecis（図４Ａにおけるクラスター１に関連する）を含む。
【００４２】
本発明によれば、組成物は好ましくは、抗癌化学療法、例えばオキサリプラチンベースの療法及び／又は免疫療法、例えばＰＤ−１封鎖及び抗−Ｌａｇ３  Ａｂをまた受ける患者に投与される。好ましい実施形態によれば、患者は、術前補助化学療法及び／又は免疫療法、例えば術前補助キサリプラチンベースの療法及び／又はＰＤ−１封鎖及び／又は抗−Ｌａｇ３  Ａｂを受ける。他方では、患者は、アジュバントオキサリプラチンベースの治療及び／又はＰＤ−１封鎖及び／又は抗−Ｌａｇ３  Ａｂを受けることができる。従って、本発明はまた、免疫原性化学療法及び／又は免疫チェックポイント遮断薬、例えば抗−ＰＤ１  Ａｂ、抗―ＰＤＬ１  Ａｂ及び抗−Ｌａｇ３  Ａｂと組合して、ＣＲＣの治療におけるアジュバントとして免疫原性細菌（例えば、上記に列挙されたもの）を投与するためにも関する。
【００４３】
下記実験部分に示されるように、本発明者らは、回腸の腸区画に存在する細菌が、結腸直腸癌の進行及び化学療法に対するＣＲＣ患者の応答において重要な役割を果たすことを実証した。従って、上記方法を実施する場合、組成物は好ましくは、生細菌の回腸への送達を可能にする手段で処方され、そして／又は投与される。例えば、カプセル封入された凍結乾燥細菌が経口投与され得る。
【００４４】
以下の実験部分に示される別の側面によれば、本発明は、下記工程：
（i）上記のような細菌組成物と回腸エンテロイドとをインキュベートする工程、及び、
（ii）前記回腸エンテロイドを、細胞死誘発剤（ＣＤＩ）と共にインキュベートする工程、
を含む、ＣＲＣの治療のために有用な免疫原性エンテロイドを得るための方法に関する。
【００４５】
上記方法は、自己又は異種回腸エンテロイドを用いて実施され得る。そのようなエンテロイドは、例えばＳａｔｏなど．（Nature  2009）により記載されるように、末端の回腸の新鮮な（最良）又は凍結された回腸生検から出発して、腸幹細胞に由来することができる。この方法に使用され得るＣＤＩの例は、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、又はＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＯＬＦＯＸなどの当業者に周知の任意の他の免疫原性細胞死誘発剤又は組み合わせである。
【００４６】
より正確には、上記方法は、オキサリプラチン又は別のＩＣＤ誘発剤の添加の前１時間、生存共生体（上記組成物に存在する）と共に、自己又は同種回腸エントロイドをまずインキュベートすることにより実施され得；次に、抗生物質が、生菌を殺し、そしてワクチンの皮下又は皮内接種を可能にするために１時間、添加される。
【００４７】
本発明によれば、ＣＲＣを治療するために有用な免疫原性エンテロイドはまた、以下の工程：
（i）ＴＬＲ２ / ＴＬＲ４アゴニスト、ＩＬ−１Ｒアゴニスト、抗ＣＤ７３抗体及び抗ＣＤ３９抗体から成る群から選択された少なくとも１つの化合物と共に回腸エンテロイオをインキュベートする工程、及び
（ii）前記回腸エンテロイド又は腸細胞を、細胞死誘発剤（ＣＤＩ）と共にインキュベートする工程、を含む方法によっても入手され得る。
【００４８】
上記方法を実施する場合、当業者は、工程（i）に使用される化合物を選択し、それにより、それらはエンテロイドによるＩＬ−１及び／又はＡＴＰ放出を高める。
【００４９】
本発明はまた、上記方法のいずれかにより得られた免疫原性エンテロイドを含む、ＣＲＣを有するか、又はＣＲＣの発症のリスクのある患者を治療するための抗癌ワクチンにも関する。そのような抗癌ワクチンは、好ましくは皮下又は皮内投与のために処方され、そして自己又は同種免疫原性エンテロイドを含むことができる。
【００５０】
本発明の抗癌ワクチンの特定の実施形態によれば、ワクチンはＤＮＡ修復機構に変異を有するエンテロイドを含む。実際、そのようなエンテロイド（自己由来又は異種由来のいずれかで使用される）は、有利な免疫原性特性を有する。本発明の抗癌ワクチンの特定の実施形態によれば、ワクチンはまた、ＤＮＡ修復機構に変異を有さないエンテロイドを含む。実際、そのようなエンテロイド（自己由来又は異種由来のいずれかで使用される）は、ＭＳＳ腫瘍（低い変異負荷を有する）に対して有利な免疫原性特性を有する。
【００５１】
先行して、臨床検査が疑わしいＲＣＲの初期徴候を示す場合、及び／又は個人の遺伝的背景又は家族歴が、この個人がマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を有することを示唆する場合、その個人は「ＣＲＣの発症のリスクがある」と見なされる。（ＣＲＣを有する患者のための）治療的ワクチン接種に加えて、予防的抗癌ワクチン接種は、ＭＳＩhigh個人、すなわち遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）症候群（３−５％）、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＥＰＣＡＭなど）における変異、家族性大腸腺腫症（ＡＰＣ又はＭＹＨ２遺伝子変異）、例えばGardner又はTurcot症候群（１％）、及びｈＭＬＨ１  ＭＭＲ遺伝子メチル化を伴う散発性ＣＲＣを有する個人に確かに有利に提案され得る。
【００５２】
本発明はまた、患者におけるＣＲＣの治療のために有用である、Ｔ濾胞ヘルパー細胞及び／又はＴｈ１細胞へのナイーブＴ細胞のエクスビボ分化の方法にも関する。本発明のこの側面によれば、この方法は、自己又は同種免疫原性エンテロイド、例えば上記方法の１つにより得られたそれらにより充填された樹状細胞、又は自己又は同種一次腸上皮細胞と共に、自己Ｔヘルパー細胞をインキュベートすることを含む。
【００５３】
上記方法により得られたＴ濾胞ヘルパー細胞及び／又はＴｈ１細胞は、ＣＲＣの治療又は予防のために有利に使用され得る。本発明のこの側面によれば、それらのＴ濾胞ヘルパー細胞及び／又はＴｈ１細胞は、患者に養子移入される。本発明のこの側面は、ＭＳＩhigh個人、すなわち遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）症候群（３−５％）、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＥＰＣＡＭなど）における変異、家族性大腸腺腫症（ＡＰＣ又はＭＹＨ２遺伝子変異）、例えばGardner又はTurcot症候群（１％）、及びｈＭＬＨ１  ＭＭＲ遺伝子メチル化を伴う散発性ＣＲＣを有する個人、並びにＭＳＳ腫瘍を有する患者（低い突然変異負担の）におけるＣＲＣの治療又は予防のために特に有用である。
【００５４】
別のその側面によれば、本発明は、
（i）患者の回腸末端粘膜から得られたサンプルにおけるＣＤ３Ｅ、ＡＨＲ、ＧＡＴＡ３、ＴＢＸ２１、ＢＣＬ６、ＣＤ４、ＲＯＲＣ、ＦＯＸＰ３、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ２７、ＩＬ１０、ＩＬ２３Ａ及び ＩＦＮＧから成る群から選択された１又は２以上の遺伝子についての発現レベルを評価し、そし、そして
（ii）前記患者における発現レベルと、対照の発現レベルとを比較し、ここでその結果が患者についての予後及び／又はサブタイプシグネチャを提供することを含む、ＣＲＣ患者の予後及び／又はサブタイプシグネチャを生成するための方法（回腸免疫スコアに基づく）に関する。
【００５５】
本発明の特定の実施形態によれば、ＣＤ３Ｅ、ＡＨＲ、ＧＡＴＡ３、ＴＢＸ２１、ＢＣＬ６から成る群から選択された１又は２以上の遺伝子についての発現レベルは、工程（i）において評価される。
【００５６】
この方法は、浸潤マージン又は腫瘍コアにおけるＣＤ３、ＣＤ８  Ｔリンパ球による腫瘍浸潤が中間である場合、腫瘍免疫スコアＩＳ２（Galen／Pages）の場合に予後の生成のために特に役立つ。
【００５７】
上記方法の実施の場合、当業者は、同じ技術を用いて、列挙された遺伝子の発現レベルを評価することを条件に、以下の実験部分に記載されるカットオフ値を使用することができる。そのような閾値の例（下記表２に示される）は、以下の通りである：
ＣＤ３Ｅ: ６３．７７;
ＴＢＸ２１: ０．７１４９;
ＧＡＴＡ３: ４０．３８
ＡＨＲ:３４９．１
ＲＯＲＣ: ４４．３８
ＩＬ１７Ａ: ０．５２０２
ＦＯＸＰ３: ０．３８７１
ＩＬ２７: ０．３５２
ＦＯＳ: １０．５４。
【００５８】
上記方法においては、対照の発現レベル以上のＣＤ３Ｅ、ＡＨＲ、ＧＡＴＡ３、ＴＢＸ２１、ＲＯＲＣ、ＩＬ１７Ａ、ＦＯＸＰ３、ＩＬ２７ 及び/又は ＦＯＳの発現レベルは、予後不良（進行までの時間が短い）を示す。
【００５９】
他方では、全てのそれらの遺伝子の発現レベルを用いて、全体的な分子シグネチャを生成し、ここで対照の発現レベル以上の全体的な遺伝子発現は、予後不良（進行までの時間が短い）を示す。そのような場合、熟練した生物統計学者は、関連する閾値を決定するために、日常的な分析を実施するであろう。
【００６０】
特定の実施形態によれば、上記方法は、術前補助キサリプラチンベースの治療の後に収集されたサンプル中の列挙された遺伝子の少なくとも１つの発現レベルを評価することにより実施される。
【００６１】
さらに別の側面によれば、本発明は、
（i）患者の回腸粘膜から得られたサンプルにおけるErysipelotrichaceae（特に、Erysipelatoclostridium、Erysipelothrix及びTuricibacter属の）、Rikenellaceae（特に、Alistipes onderdonkiiの）、Prevotella copri、Bacteroides（特に、Bacteroides fragilis）、Faecalibacterium （特に、Faecalibacterium prausnitzii）、Negativicutes、Selenomonadales及び Lactobacillalesから選択された１又は２以上の細菌の存在について評価し、そして
（ii）患者の回腸粘膜から得られたサンプルにおける未分類のＹＳ２、clostridium neonatale、未分類のLachnospiraceae、未分類のRuminococcaceae、Blautia、Christensenella minuta、Bacteroides caccae、Corynebacterium amycolatum、Streptococcus gallolyticus、Bacillus circulans、Ruminococcus gnavus、未分類のPhascolarctobacterium、Bacteroides uniformis、Catabacter hongkongensis、Fusobacteriaceae、Bacteroides fragilis を除くBacteroidaceae 、Tannerellaceae 及びPrevotellaceaeから成る群から選択された１又は２以上の細菌の存在を評価し、ここで（i）に記載される細菌の存在が良好な予後を示し、そして（ii）に記載される細菌の存在が不良な予後を示すことを含む、ＣＲＣの患者についての予後及び／又はサブタイプシグネチャを生成するための方法に関する。
【００６２】
他方では、上記方法は、患者から糞便における列挙される細菌の存在を評価することにより実施され得る。
【００６３】
上記方法の特定の実施形態によれば、Erysipelotrichaceae（特に、Erysipelatoclostridium、Erysipelothrix及びTuricibacter属の）、Rikenellaceae（特に、Alistipes onderdonkiiの）、Prevotella copri、未分類のBacteroides、及び未分類のFaecalibacteriumから成る群から選択された１又は２以上の細菌の存在は、工程（i）において評価され、そして未分類のＹＳ２、clostridium neonatale、未分類のLachnospiraceae、未分類のRuminococcaceae、Blautia、Christensenella minuta、Bacteroides caccae、Corynebacterium amycolatum、Streptococcus gallolyticus、Bacillus circulans、Ruminococcus gnavus、未分類のPhascolarctobacterium、Bacteroides uniformis及びCatabacter hongkongensisから成る群から選択された１又は２以上の細菌の存在は、工程（ii）において評価される。
【００６４】
近位結腸癌の場合、（i）に列挙された細菌の存在がＴＩＬ富化近位結腸癌（ＩＳ  ２−３−４）を示し、そして（ii）に列挙された細菌の存在がＴＩＬ陰性近位結腸癌（ＩＳ  ０−１）を示す。
【００６５】
上記方法を実施するために使用され得るサンプルの例は、回腸粘膜の政権、回腸の新鮮な粘膜関連細菌バイオフィルム生検又は回腸粘液、並びに回腸組成の代用マーカーそして使用され得る糞便微生物相である。
【００６６】
下記実験部分に開示されるように、本発明はまた、
（i）免疫組織化学により回腸陰窩の切断カスパーゼ３陽性腸上皮細胞（Ｃａｓｐ３＋ＩＥＣ）の数をインビトロで評価し、そして
（ii）前記患者の回腸陰窩におけるＣａｓｐ３＋ＩＥＣの数と、回腸陰窩におけるＣａｓｐ３＋ＩＥＣの対照数とを比較し、ここで前記患者の回腸陰窩における多数のＣａｓｐ３＋ＩＥＣの存在が良好な予後を示すことを含む、ＣＲＣを有する患者についての予後及び／又はサブタイプシグネチャを生成するための方法にも関する。
【００６７】
本発明はまた、
（i）マーカーＣＤ３、ＣＤ４及びＢＣＬ６についての免疫組織化学による回腸腸固有層及び上皮内リンパ球におけるの免疫細胞をインビトロ定量分析し、そして
（ii）前記患者の回腸腸固有層及び上皮内リンパ球における免疫細胞の数と、対照数とを比較し、ここで回腸における高い数の免疫細胞の存在が悪い予後を示すことを含む、ＣＲＣを有する患者についての予後及び／又はサブタイプシグネチャを生成するための方法にも関する。
【００６８】
本発明の別の側面は、患者からの血液サンプル中のB. fragilis特異的記憶ＣＤ４＋Ｔｈ１応答をインビトロ分析し、そしてそれを対照に比較し、ここでB. Fragilisに対する高い記憶Ｔｈ１応答の存在が良好な予後を示すことを含む、ＣＲＣを有する患者についての予後及び／又はサブタイプシグネチャを生成するための方法にも関する。
【００６９】
本発明の他の特徴はまた、本発明の枠内で実施され、そしてその範囲を制限することなく、必要とされる実験支持を提供する生物学的アッセイに続く説明の過程で明らかになるであろう。
【実施例】
【００７０】
材料及び方法
マウス：
全てのマウス実験は、Gustave Roussy Cancer Campusの動物設置で実施され、ここで動物は特定の無菌状態で飼育されるか、又は無菌及びＦＭＴ実験のためにアイソレーターに維持された。
【００７１】
全ての動物実験を、フランス及びヨーロッパの法規制に準じて実施した。地元の制度委員会は、すべてのマウス実験を承認しました（許可番号：２０１４−０７１−１１２４ 及び２０１７−０２０−８９６４）。雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃを、それぞれ、Harlan (France)及びJanvier (France)から購入した。生後７〜１４週のマウスを使用した。無菌Ｃ５７ＢＬ / ６Ｊマウス及びＩｌ１ａｂ−/−、Ｉｌ１８−/−、Ｃｄ３９−/−、Ｍｙｄ８８−/−、Ｔｌｒ２ / ４−/−及びＴｌｒ９−/−（すべてＣ５７ＢＬ / ６Ｊの遺伝的背景）、及び同じ繁殖区域からＷＴ同胞子をＣＤＴＡ（Cryopreservation、Distribution、Typage et Archivage、Orleans、France）での施設から得た。
【００７２】
Ｃａｓｐ３ＦＬ/ＦＬ; Ｃａｓｐ７ＦＬ/ＦＬ; Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ Ｔｇ (カスパーゼ３/カスパーゼ７ ＩＥＣ ｄｏｕｂｌｅ ＫＯ) 及び ＲＩＰＫ３−/−; ＮｎｔＭｕｔ/Ｍｕｔ (Ｒｉｐ３ｋ ＫＯ)をDr. Peter Vandenabeeleから購入し、そしていくつかの実験は、VIB-UGent Center for Inflammation Research, Ghent, Belgiumの動物施設で行われた。カスパーゼ−３FL/FL及びカスパーゼ−７FL/FLマウスはそれぞれ、International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC)からのＥＳクローンＨＥＰＤＯ７１６＿４_Ｇ０５及びＥＰＤ０３９８＿５＿Ｅ０２ (Ｃ５７ＢＬ/６Ｎ)を用いて生成された。ネオマイシン選択カセットは、ＦＬＰｅ削除マウスを用いて除いた（２２）。腸管特異的標的化は、Ｖｉｌｌｉｎ  Ｃｒｅマウスとの交配により達成された（２３）。
【００７３】
抗生物質治療：
マウスの減菌飲料水に加えられるバンコマイシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を伴って又は伴わないで、アンピシリン（１ｍｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５ｍｇ／ｍｌ）及びコリスチン（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む抗生物質溶液（ＡＴＢ）により、マウスを処理した。溶液及びボトルはそれぞれ、３回及び週当たり１度、交換された。抗生物質の活性を、ＣＯＳ（５％羊血液を含むコロンビア寒天）プレート上で０．１ｇ／ｍｌで、ＢＨＩ＋１５％グリセロール再懸濁された糞便ペレットを、好気性及び嫌気性条件下で３７℃で４８時間、培養することにより毎週確認した。ＡＴＢ治療の期間は、実験設定に基づいてわずかに異なった。手短に言えば、ＡＴＢによりオキサリプラチンの有効性を妥協するためには、マウスを、腫瘍移植の前２週間、そして実験を通して継続的に処理した。ＡＴＢ治療を、代償実験においては、オキサリプラチン注射の４８時間前に中断した。
【００７４】
腫瘍チャレンジ及び腫瘍モデルの治療：
ＭＣ３８の皮下モデル：
同系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１ × １０６個の ＭＣ３８細胞を皮下移植し、そして腫瘍サイズが２０〜３０ｍｍ２である場合、１０ｍｇ／ｋｇのオキサリプラチン又はビークル（ＰＢＳ）により腹腔内処理した。処理グループ及び非処理グループにおける共生腸内細菌相の組成は、同時収容により共同で維持された。腫瘍サイズは、キャリパーを用いて３日ごとに定期的にモニターされた。
【００７５】
示された実験においては、Ｔ細胞枯渇を、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８  ｍＡｂ（ＧＫ１．５及び５３−６．７２；２０μｇ／マウス）、又はそれぞれのアイソタイプ対照（ＬＴＦ−２Ａ３）（すべての抗体はBioxcellからである）による腹腔内処理により行った。枯渇処理は、ＯＸＡの４日前に開始され、そして７日ごとに同じ用量で反復された。
【００７６】
ＰＤ−１封鎖を、抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＲＭＰ１−１４、２００μｇ／マウス）又はそれぞれのアイソタイプ対照（２Ａ３）（すべての抗体はBioxcellからである）による腹腔内処理により実証した。
【００７７】
ＩＥＣ収穫のための腸の解離：
回腸及び/又は結腸を収集し、脂肪組織、パイエル板および糞便を除去した。腸を縦方向に切り、次に横方向に細かく切ってチューブにした。断片を20 mlのIEC培地（PBS、５％のＦＣＳ、５ ｍＭの ＥＤＴＡ及び１ ｍＭの ＤＴＴ）が入った新しい５０ ｍｌチューブに移し、ボルテックスし、３７℃で１５分間振とうした。細胞懸濁液を新しいチューブに収集し、細胞ストレーナー（１００μm）で濾過し、遠心分離してＰＢＳに再懸濁し、使用するまで氷上で保存しました。
【００７８】
エンテロイド培養：
以前に説明されているように（２４）、以下の変更を伴って、生後８〜１２週のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの回腸から陰窩を単離し、そして富化した。手短に言えば、洗浄された回腸片を、陰窩キレート化緩衝液（ＰＢＳ中、２ｍＭのＥＤＴＡ）において氷上で３０分間、インキュベートした。陰窩キレート化緩衝液の除去に続いて、断片を、１０％ＦＣＳを含むＰＢＳにより３度、激しくすすぎ、そして７０μｍの細胞ストレーナー（BD  Bioscience）を通してろ過した。陰窩をペレット化し、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ/Ｆ１２ (ＡＤＦ) (Invitrogen)により洗浄し、１ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌ成長因子還元基底膜マトリックス（Corning）に再懸濁し、そして５０μｌの液滴を２４ウェルプレートにピペットで移した。陰窩を、以下を含むＡＤＦによりオーバーレイした：１００  Ｕ / ｍＬのペニシリンGナトリウム、１００μg/ ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、２ ｍＭの Ｌ−グルタミン、１０ ｍＭ のＨＥＰＥＳ、１ｘ Ｎ２サプリメント、１ｘ Ｂ２７サプリメント、５０ ｎｇ / ｍＬ のｍＥＧＦ、１００ ｎｇ / ｍＬの ｍＮｏｇｇｉｎ (Peprotech, Hamburg, Germany)、Ｎ−アセチルシステイン（Sigma）（特に指定のない限り、Invitrogenの試薬）、及びＲ−Ｓｐｏｎｄｉｎ−１トランスフェクトＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の１０％ならし培地。
【００７９】
腸から単離されたＩＥＣによる免疫化：
ドナーマウスを、オキサリプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ）により６時間、腹腔内処理し、腸細胞死を誘発した。対照動物を、ビークル（ＰＢＳ）のみにより処理した。処理グループ及び非処理グループにおける共生腸内微生物相の組成は、同時収容により同期維持された。治療の最後で、マウスを安楽死させ、そして回腸を採取し、ＩＥＣを単離した。次に、１００万個のＩＥＣを、受容体マウスの左側腹に皮下注射した。この手段は、７日後に１度、反復された。腫瘍チャレンジを、最後の免疫化の７日後に右側腹部に行い、この用量により、ナイーブマウス、ＭＣ３８ (１ × １０６個の 細胞)、 ＭＣＡ２０５ (０．８×１０６個の 細胞)、 ＣＴ２６ (１ × １０６個の 細胞)及び４Ｔ１ (０．３ × １０６ 個の 細胞)において１００％の腫瘍発生率を得る。
【００８０】
示される実験において、ＩＥＣを、１００ｍＭのピリドキサールリン酸−６−アゾ（ベンゼン−２,４−ジスルホン酸）四ナトリウム塩水和物（ＰＰＡＤＳ、Ｓｉｇｍａ）、２００ μＭの ２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ、Ｓｉｇｍａ）、又はビークルにより、４℃で２０分間、前処理した。処理された細胞を、注射の前、冷ＰＢＣにより３度、洗浄し、又はＩＥＣを、中和抗ＨＭＧＢ１ Ａｂ（ａｂ１８２５６、Ａｂｃａｍ）、抗カルレティキュリンＡｂ（ＮＢ６００−１０１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）又はウサギＩｇＧアイソタイプコントロール（ＮＢＰ２−２４８９１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と共に、注射当たり１０μｇで共注射した。
【００８１】
エンテロイドからのＩＥＣによる免疫化：
エンテロイドを、１０μｇ／ｍｌのオキサリプラチンにより３時間、処理した。ＩＥＣを、アジュバントとしての患者サンプルから収穫された低温殺菌回腸粘液と共に混合し、受容体マウスの左側腹部に皮下注射した（１０６個の細胞）。この手順は、７日後、１度反復された。腫瘍チャレンジが、最後の免疫化の７日後、右側腹部上に行った。
【００８２】
Alistipes onderdonkii, Erysipelatoclostridium ramosum単離物を、ワクチン接種実験に使用される患者からの回腸粘液から当研究所で単離した。エンテロイドを、１０６個の細菌／ｍｌの存在下で、１０μｇ／ｍｌのオキサリプラチンにより３時間、処理した。細菌を、１時間のゲンタマイシン処理により殺し、そして免疫化を上記のようにして実施した。
【００８３】
ＦＭＴ実験：
凍結された糞便サンプルを解凍し、そして十分にボルテックスした。大きな粒状物質を、重力により沈降した。２００μｌの上清液を、強制経口投与により単回投与した。さらに、追加の１００μｌを、各動物の毛に局所的に適用した。得られるノトバイオートマウスを、照射された食物及びオートクレーブ処理された水を備えた陽圧式アイソレーターで維持した。ＦＭＴの２週間後、腫瘍細胞を皮下注射し、そしてマウスを上記のようにして、オキサリブラチン又はビークル（ＰＢＳ）により処理した。
【００８４】
専用の共生種による腸内コロニー形成：
Erysipelothrix tonsillarum 及びSolobacterium mooreiは、Prof. Ivo Gomperts Boneca, Institut Pasteur, Franceにより提供された。Bacteroides fragilis、Alistipes onderdonkii、Erysipelatoclostridium ramosum、Dialister invisus、 Paraprevotella clara単離物を、ワクチン接種実験で使用される患者からの回腸粘液から当実験室において単離した。嫌気性ジュネレーター（Biomeriux）を用いて創造された好気性又は嫌気性雰囲気下で３７℃で２４〜７２時間、ＣＯＳプレート上で、種を増殖した。ＡＴＢ前処理マウス又はＧＦ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのコロニー形成を、ＰＢＳに１×１０９個の細菌を含む懸濁液１００μｌを強制経口投与することにより実施した。強制細菌飼養の場合、１０９個のＣＦＵ／ｍｌの懸濁液が、蛍光分光光度計（Eppendorf）を用いて、６００ｎｍの波長で測定された１の光学密度で得られた。最初に、オキサリプラチンによる治療の２４時間前、及び次に、治療の２４時間後及び７２時間後、３回の細菌強制経口投与を各マウスに対して行った、コロニー形成の有効性を、糞便を培養することにより確認した。
【００８５】
最初の強制経口投与の４８時間後、糞便ペレットを収穫し、そしてＢＨＩ＋１５％グリセロールに０．１ｇ／ｍｌで再懸濁した。糞便の連続希釈液をＣＯＳプレート上にプレートし、そして好気性及び嫌気性条件下で３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、単一のコロニーを分離し、そしてグラム染色を実施した。特定細菌の同定を、Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight (ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ)質量分析計（Andromas, Beckman Coulter, France）を用いて行った。
【００８６】
培養学的分析：
ワクチン接種実験のために使用される回腸粘液の細菌多様性を、培養学アプローチを用いて調査した（２５，２６）。
【００８７】
各サンプルを、好気性及び嫌気性培養ボトルに接種した。続いて、液体培養物の１０倍連続希釈液を、５％羊血液富化コロンビア寒天培地（bioMerieux, Marcy l’Etoile, France）上にプレートし、そして好気性条件下で４８時間、好気性条件下で１週間、それぞれインキュベートした。得られたコロニーを、継代培養し、そしてMatrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight質量分析計 (ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ)質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ, Microflex, Bruker Daltonics, Bremen, Germany）も用いて定期的に同定した（２７）。
【００８８】
失敗した定期同定の場合、コロニーを、１６Ｓ  ｒＲＮＡを配列決定することにより同定した。
【００８９】
リアルタイム定量的ＰＣＲ分析による腸管免疫遺伝子発現の特徴付け：
腸管生検からの生ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ (Qiagen)により抽出し、そして次に、ランダムプライマー（Promega, Charbonnieres, France）及びデオキシヌクレオシド三リン酸組、ＰＣＲグレード（Roche Diagnostics, Meylan, France）の存在下でSuperScript III Reverse Transcriptase and the RNaseOUT(登録商標) Recombinant Ribonuclease Inhibitor (Life Technologies, Saint Aubin, France)を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを、7500 Fast Real Time PCR system (Applied Biosystems)を用いて、Universal Master Mix II (Invitrogen)を用いたＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙによるリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって分析した。２-デルタCt法により、ベータ２ミクログロブリンのハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化した。
【００９０】
全てのプライマーは、aqMan（登録商標） Gene Expression Assay (Thermo Fischer)からであった。マウスプライマー：Ｂ２ｍ （Ｍｍ００４３７７６２＿ｍ１）、 Ｍｕｃ２ （Ｍｍ００４５８２９９＿ｍ１）、Ｃｄ３ｅ （Ｍｍ０１１７９１９４＿ｍ１）、 Ｃｄ４ （Ｍｍ００４４２７５４＿ｍ１）、 Ｔｂx２１（Ｍｍ００４５０９６０＿ｍ１）、Ｉｆｎｇ（Ｍｍ Ｍｍ０１１６８１３４＿ｍ１）、 Ｒｏｒｃ （Ｍｍ０１２６１０２２＿ｍ１）、Ｉｌ１７ａ （Ｍｍ００４３９６１８＿ｍ１）、Ｆｏｘｐ３ （Ｍｍ００４７５１６２＿ｍ１）、ｉｌ１０ （Ｍｍ０１２８８３８６＿ｍ１）、 Ｇａｔａ３ （Ｍｍ００４８４６８３＿ｍ１）、 Ｉｌ２７ （Ｍｍ００４６１１６２＿ｍ１）、Ｉｌ２３ａ （Ｍｍ００５１８９８４＿ｍ１）、 Ｂｃｌ６ （Ｍｍ００４７７６３３＿ｍ１）,Ａｈｒ （Ｍｍ００４７８９３２＿ｍ１）、 Ｆｏｓ （Ｍｍ００４８７４２５＿ｍ１）,ＪＵＮ （Ｍｍ００４９５０６２＿ｓ１）。ヒトプライマー：Ｂ２Ｍプライマー  : Ｂ２Ｍ 順方向: ５‘−ＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴ−３’ (配列番号 １); Ｂ２Ｍ 逆方向 ５‘−ＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＧ−３’ (配列番号 ２); Ｂ２Ｍ プローブ ５‘−（６ＦＡＭ）ＡＡＣＣＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＡ（ＴＡＭ）−３’ (配列番号  ３)、 ＣＤ３Ｅ （Ｈｓ０１０６２２４１＿ｍ１）、 ＣＤ４ （Ｈｓ０１０５８４０７＿ｍ１）、 ＴＢＸ２１ （Ｈｓ００８９４３９２＿ｍ１）、 ＩＦＮＧ (Ｈｓ００９８９２９１＿ｍ１)、 ＲＯＲＣ （Ｈｓ０１０７６１１２＿ｍ１）、ＩＬ１７Ａ （Ｈｓ００１７４３８３＿ｍ１）、 ＦＯＸＰ３ （Ｈｓ０１０８５８３４＿ｍ１）、 ＩＬ１０ （Ｈｓ００９６１６２２＿ｍ１）、ＧＡＴＡ３ （Ｈｓ００２３１１２２＿ｍ１）、ＩＬ２７ （Ｈｓ００３７７３６６＿ｍ１）、ＩＬ２３Ａ （Ｈｓ００３７２３２４＿ｍ１）、ＢＣＬ６ （Ｈｓ００１５３３６８＿ｍ１）、 ＡＨＲ （Ｈｓ００１６９２３３＿ｍ１）、 ＦＯＳ （Ｈｓ０４１９４１８６＿ｓ１）、 ＪＵＮ （Ｈｓ０１１０３５８２＿ｓ１）。
【００９１】
フローサイトメトリー分析：
腫瘍排出リンパ節（ｔｄＬＮ）及び脾臓を、ＦＭＴモデルについて実験の最後に収穫した。腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）を、腸管免疫学分析ために、オキサリプラチン治療の３日後は収穫した。リンパ節及び脾臓を、ＲＰＭＩ培地下で破砕し、そしてその後、１００μｍの細胞ストレーナーを通して濾過した。
【００９２】
ＩＥＣ懸濁液を、上記のようにして、３洗浄解離方法によりエンテロイドから入手した。
【００９３】
全ての場合、２００個の細胞を、膜染色の前、精製された抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン９３；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に４℃で２０分間、プレインキュベートした。
【００９４】
細胞内染色に関して、Ｆｏｘｐ３染色キット（eBioscience）を使用した。死細胞は、Live / Dead Fixable Yellow死細胞染色キット（Life Technologies）を使用して除外した。
【００９５】
表現型検査のために使用される抗マウス抗体（及びクローン）は、以下の通りである：CD３e （１４５-２Ｃ１１）、ＣＤ４ （ＧＫ１．５）、ＣＤ８a （５３-６．７）、ＣＤ４５ （３０-F１１）、ＦＯＸＰ３ （ＦＪＫ-１６s）、 ＣＸＣＲ３ （ＦＡＢ１６８５P）、 ＣＣＲ６ （１４０７０６）、 ＣＣＲ９ （W-１．２）、 ＰＤ-１ （２９F.１A１２）、ＩＣＯＳ （１１-９９４２-８２） 、ＣＸＣＲ５ （２Ｇ８）、 ＣＤ１９ （１Ｄ３）、iＡ/iＥ （２Ｇ９）、ＣＤ１１(登録商標) （Ｎ４１８）、 ＣＤ１０３ （２Ｅ７）、 ＣＤ８６ （ＧＬ１）、 ＦＯＸＰ３ （ＦＪＫ-１６ｓ）、ＴＮＦａ （ＭＰ６-ＸＴ２２）、 (BD Pharmingen, BioLegend, R&D and eBioscienceから)。ストレプタビジンＰＥ、アネキシンＶ−ＡＰＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、BD  Pharmingenからのものである。
【００９６】
サンプルを、Ｃｙａｎ  ＡＤＰ９色サイトメーカー（Beckman  Coulter）又は１３色Cytoflex（Beckman   Coulter）に基づいて取得し、そして分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア (Tree Star, Ashland, OR, USA)により実施した。
【００９７】
切断されたカスパーゼ３発現の免疫組織化学的染色：
ＦＦＰＥ腸切片を脱パラフィンし、そして一連の段階的アルコール及び蒸留水により再水和した。抗原回復を、９８℃の水浴において０．０１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０ｇ、Ｄｉａｐａｔｈ）により３０分間、切片を前処理することにより実施した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、切片を、３％水素ペルオキシダーゼ（シャープＳ２０２３８６, ＤＡＫＯ）により１０分間、処理することにより阻害した。切片を、ＩＨＣ/ＩＳＨ Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ (シャープＰＶ６１２２, ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍ)により１０分間、ブロックした。一次ポリクローナルウサギ抗体（Ａｂ）、すなわち切断されたカスパーゼ３（Ａｓｐ  １７５）（シャープ９６６１, Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ, １μｇ/ｍＬ）を、１時間インキュベートし、続いて二次Ａｂ、すなわちＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ Ｐｏｌｙ-ＨＲＰ ａｎｔｉ-Ｒａｂｂｉｔ ＩＨＣ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ (シャープＰＶ６１１４, ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍ)を２０分間インキュベートした。ペルオキシダーゼを、Ｄｉ Ａｍｉｎｏ Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ-ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ (ＤＡＫＯ)により検出し、そしてＭａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色した。
【００９８】
画像を、スライドスキャナZeiss Axio Scan.Z1 (対物 Plan-Apochromat 20x/0.8, 3CCD camera Hitachi HV-F202SCL)により全体のスライド画像として取得し、そしてＺｅｉｓｓ  Zｅｎ  ２ ｌｉｔｅソフトウェアからＦＩＦＦ画像としてエクスポートした。ＷＳＩを、Visiopharm Integrator System (VIS) (Visiopharm A/S, Denmark)において開発されたアルゴリズムを用いて処理した。
【００９９】
ヒト組織分析に関して、ＱｕＰａｔｈソフトウェアを用いた（３７）。関心領域（ＲＯＩ）は、各ＷＳＩにおけるアルゴリズムと手の両方によって陰窩において定義された。それらのＲＯＩ内の全細胞及び切断されたカスパーゼ３陽性細胞を定量化し、そして陽性の切断されたカスパーゼ３細胞の比率、及び切断されたカスパーゼ３陽性細胞の細胞密度を計算した。
【０１００】
回腸におけるＡＨＲ、ＣＤ４及びＣＤ３発現についての免疫蛍光染色、スキャン及び分析：
多重染色に関しては、ホルマリン固定された、パラフィン包埋回腸組織の厚さ３μｍの切片を、自動免疫染色装置（DISCOVERY ULTRA, Ventana, IGR）により染色した。９５℃で６４分間のＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）における熱誘発抗原回復を実施しを実施した。一次モノクローナルマウス抗−ヒトＡＨＲ抗体（SantaCruz, A-3, 0.5μg/mL）を、ＲＴで１時間、スライド上に適用し、続いて、ビオチンを含まないペルオキシダーゼ検出システムのDiscovery UltraMap抗マウスHRP (Ventana, #760-4313)を用いて検出した。ＡＨＲの可視化を、ＴＳＡ蛍光団システムDiscovery Rhodamine 6G キット (Ventana, #760-244)を用いて達成した。１００℃での１０分間のクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）における熱誘発抗原回復を実施した。次に、スライドを、一次モノクローナルウサギ抗ヒトＣＤ抗体（Spring, SP35, 0.5μg/mL）上で３７℃で１時間インキュベートし、Discovery UltraMap 抗ウサギ HRP (Ventana, #760-4315)により検出し、そしてDiscovery Cy5キット (Ventana, #760-238)により可視化した。上記のようにして、クエン酸緩衝液を用いての加熱工程を実施した。次に、スライドを、一次ポリクローナル抗体ヒトＣＤ３抗体（DAKO, #A0452, 3μg/mL）上で３７℃で１０時間インキュベートし、Discovery UltraMap 抗ウサギ HRP (Ventana, # 760-4315)により検出し、そしてDiscovery FAM キット (Ventana, # 760-243)により可視化した。クエン酸緩衝液を用いての加熱工程の後、次に核を、Spectral DAPI (Perkin Elmer, FP1490, 1:10)により可視化した。
【０１０１】
蛍光分析：
図に示される画像は、スライドスキャナーZeiss Axio Scan.Z1 (対物 Plan-Apochromat 20x/0.8, 3CCD camera Hitachi HV-F202SCL)を用いてスライド全体の画像（ＷＳＩ）として得、そしてＴＩＦＦ画像として、Zeiss Zen 2 liteソフトウェアからエクスポートした。ＷＳＩのいくつかを、Visiopharm Integrator System (VIS) (Visiopharm A/S, Denmark)により開発されたアルゴリズムを用いて処理した。ＤＡＰＩ強度に閾値を適用することにより、各ＷＳＩについてのＲＯＩを定義し、そして次に、ＡＨＲ平均蛍光強度を、それらのＲＯＩにおいて測定した。
【０１０２】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定及び分析：
配列決定：メタゲノムコミュニティの特徴付けを、超可変領域の増幅及び配列決定を通して実施した。ｇＤＮＡ抽出、ライブラリー調製及び配列決定を、コホート１についてはＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ (Konstanz, Germany)及びコホート２についてはＧｅｎｏｓｃｒｅｅｎ（Lille、France）で行われた。増幅を、コホート１及び２について可変領域Ｖ３−Ｖ５及びＶ３−Ｖ４をそれぞれ両端に有する保存領域を標的とする領域特徴的プライマーを用いて実施した。配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ技法により実施した。
【０１０３】
分析：全読み取りを、長さ（コホート１については最小長＝２５０ｂｐ及びコホート２については３００ｂｐ）及び品質（両コホートについては最小品質＝２０）についてフィルター処理し、そしてキメラについて調べた。コホート１については合計７，９５１，７７２の読み取り（平均５４、８３９の読み取り／サンプル；ｎ＝１４５のサンプル）及びコホート２については、１，６９１，５４９の読み取り（平均１４、８３８の読み取り／サンプル；ｎ＝１１４のサンプル）を得た。高品質の読み取りをプールし、そしてＱＩＩＭＥからのＵＣＬＵＳＴソフトウェアによる９７％類似性閾値に基づいて、運用分類単位（ＯＴＵ）にグループ分けした。ファイロタイプ富化性及び多様性の推定値を、希薄化されたＯＴＵ表（コホート１についてｎ＝４，０００の読み取り及びコホート２についてｎ＝２，０００の読み取り）に基づいてＳｈａｎｎｏｎ及びＳｉｍｐｓｏｎ指数を用いて計算した。シングルトンを除去し、そして各ＯＴＵの系統分類を、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ分類法を用いて行い、そして門レベルから種レベルまで実行した。
【０１０４】
１５の新規の事例が追加された拡張コホートの分析に関しては、上記のように、コホート１と同じ方法で、コホート２からの全てのサンプルの配列決定及び分析を再実行した。
【０１０５】
統計言語Ｒバージョン３．１．３を、データの可視化のために、及び細菌属（ａｄｅ４ライブラリー）でのＭｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏランク検定に関連する存在量ベースの主成分分析（ＰＣＡ）及びクラス間ＰＣＡを実行するために使用した。微生物相の組成に対する異なる臨床パラメーターの影響を解読するために、機器変数として異なる臨床因子を用いての主成分分析を、各個人についての異なる細菌の分類群の存在量に基づいて計算した。それらのクラス間ＰＣＡは、個人の微生物相間の多様性を表示する類型を表し、そして定性的変数（例えば、臨床パラメーター）間で観察される変動を最大化する変数（細菌ファイロタイプ、又は属など）の組み合わせの強調を可能にするのに適切である。それらのクラス間ＰＣＡに基づいて、微生物相プロファイルの異なる臨床因子間のリンクの統計学的ｐ値を、Ｍｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏランク検定（１０００回の反復）を用いて評価した。
【０１０６】
培養学及び１６Ｓデータ分析：
各細菌分類群に関して、平均頻度を、所定の変動（ワクチン接種実験に対応する応答、免疫スコア、ＡｈＲレベル）に従って定義された２つのグループにおいて計算した。相対的頻度差を、種を富化するか、又は枯渇するかを決定するために、各種について計算した。相対的頻度差の統計学的有意性を、補正されていないカイ２乗検定を用いて、異なるグループにおける各分類群の割合を比較して決定した。
【０１０７】
ＯＸＡ及び共生生物に暴露されたヒト腸上皮細胞で満たされた自己ＤＣによるＴナイーブ細胞分化の誘発：
ＣＤ１４＋細胞を、健康なドナーから得られたＰＢＭＣから単離した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｋｉｔ）。単球を、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を６日間、加えることによりＤＣに分化した。６日目、未成熟ＤＣを収集し、そしてアポトーシス性腸上皮細胞で満たした。
【０１０８】
アポトーシスＩＥＣ細胞の調製に関して、ＨＩＥＣ−６細胞（ＡＴＣＣ）を、細菌により１時間、ＯＸＡにより３時間、及びＡＴＢにより１時間処理し、そして次に、ＯＮのままにした。次の朝、アポトーシス細胞を収穫し、ＰＢＳにより３度、洗浄し、そしてＤＣ培養液に添加した。
【０１０９】
ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞を、各実験（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｋｉｔ）で一致したドナーから単離し、そしてＤＣ−ＩＥＣ培養物に１０：１の比で添加した。最終共培養物を、６日間インキュベートした。６日目に、抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８  ｍＡｂを培養物に添加した。２４時間のインキュベーションの後、上清液を、ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎ）によりＩＦＮｇについてアッセイした。
【０１１０】
統計学：
データ分析及び表現を、統計環境Ｒ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ (Microsoft Co., Redmont, WA, USA) 又はＰｒｉｓｍ ５ (GraphPad, San Diego, CA, USA)のいずれかにより実施した。腫瘍増殖を、専用ソフトウェア（https://kroemerlab.shinyapps.io/TumGrowth）を用いて分析した。手短に言えば、データを、前処理された腫瘍表面を記録するために適用される線形混合効果モデリングにゆだねた。ｐ値を、腫瘍の成長勾配及び切断（対数スケール）の両者が対象グループ間で異なるかどうかを試験することにより計算した。ＦＭＴ実験においては、各ＦＭＴのＯＸＡの有効性間の比較は、各ＦＭＴ処理マウスのＯＸＡ−ＰＢＳと対照的な処理間の推定勾配から誘導される。コントラストを、治療日当たりの腫瘍サイズの％改善率として解釈されるように変換した。全ての報告された検定は両側検定であり、そしてｐ値＜０．０５で有意であるとみなされた。生存曲線を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生成物制限法を用いて推定した。一変量又は多変量分析を、Ｃｏｘ回帰モデルで実行し、ｐ値＜０．０５は、有意であるとみなされる。
【０１１１】
階層的クラスターリングが、距離１−Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数及びＷａｒｄの凝集法により行われた。統計及びグラフィックスを、Ｒソフトウェア及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ７．０３を用いて実施した。全ての検定は両面であり、そしてｐ値＜０．０５が統計学的に有意であると見なされた。
【０１１２】
実施例１：進行ＰＣＡＣ患者の予後における回腸粘膜の免疫及び微生物状態の重要性：
腸を殺菌する広範囲の抗生物質は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに皮下（Ｓ．Ｃ．）移植されたＭＣ３８結腸癌に対するＯＸＡの効果を低め（２８）（ゲータを示されていない）、そして抗菌ペプチドの糞中への放出を妨げる（データは示されていない）、このことは、ＯＸＡが付随して、腸及び腫瘍の両区画に影響を与えたことを示唆している。それらの観察に基づいて、大腸の微生物組成がＭＣ３８腫瘍の治療におけるＯＸＡの効果に影響を及ぼすかどうかを分析した。我々は、１２人の近位結腸腺癌（ＰＣＡＣ）患者から収集されたヒト結腸内容物を、無菌（ＧＦ）マウスの腸に定着させ、そして３週間後、ＭＣ３８  s．c．接種した。患者の糞便の大部分（８／１２）は、特定の病原菌のない（ＳＰＦ）条件下で飼育された通常のマウスに観察される効力（以降、「アバター応答者（ａＲ）」と呼ばれる）に匹敵するＯＸＡの抗腫瘍効果をもたらしたが、４人の患者の糞便はこの免疫原性化学療法に対する完全な耐性を誘発した（「アバター非応答者（ａＮＲ）」）（図１Ａ−Ｂ）。さらにＯＸＡに応答して、ａＲは、ａＮＲに比較して（データは示されていない）、Ｔｂｘ２１、Ｂｃｌ６、Ｉｌ２７、Ｇａｔａ３及び Ａｈｒの低発現により定義される回腸ＴＨ１／ＴＦＨ免疫トーンの低下を示したが、しかしＩｌ１７、Ｒｏｒｃ、Ｉｌ１０及びＦｏｘｐ３ ｍＲＮＡｓでは示さなかった。逆に、ａＲとａＮＲとの間の結腸粘膜におけるそれらの免疫遺伝子の発現パターンに有意な差は存在しなかった（データは示されていない）。並行して、ＴＨ１７細胞（ＣＤ４＋ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３−として定義される）に有意な低下が存在し、ところが活性化されたＴＦＨ細胞（ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５ｈｉＰＤ１ｈｉとして定義される）は、腫瘍排出リンパ節（ｔｄＬＮ）に選択的に蓄積し、ａＲにおけるＣＤ８／Ｔｒｅｇ脾臓比率は上昇したが、しかしａＲＮにおいてはそうではなかったことが付随された（データは示されていない）。重要なことには、ｔｄＬＮ  ＴＨ１７細胞は、回腸Ａｈｒ遺伝子発現と正に相関し（そして、他の回腸免疫マーカーとは相関しない）、ところがｔｄＬＮ  ＴＦＨはＯＸＡ後の回腸Ｂｃｌ６遺伝子発現と負の相関が存在した（図１Ｄ）。
【０１１３】
このデータの可能な臨床関連性を調査するために、健康な回腸及び結腸粘膜（癌の部位から離れている）における免疫遺伝子の発現と、２人の独立したコホートにおいてＰＣＡＣの手術を受けた１３８人の抗生物質ナイーブ患者から収集された回腸、結腸及び糞便の検体の微生物群とを関連付けた。臨床的に関連するパラメーターと微生物分類群との間のクラスター化ロバスト性のクラス間主成分分析及びＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏランク検定ｐ値は、回腸微生物相が結腸粘膜又は結腸内容物からの微生物相よりも診断での転移と密接して関連していることを明らかにした（データは示されていない）。この分析は、２つの独立した患者シリーズ（ｎ＝６３及びｎ＝２０）で実施された。アバターマウスに示されるように、ＡＨＲ及びＢＣＬ６（及びある程度、ＣＤ４）のより高い回腸（大腸ではない）発現が、初期段階と比較して、予後不良（ステージIII−IVのＰＣＡＣ患者に観察された（図１Ｅ）。抗生物質ナイーブステージIII−IVのＰＣＡＣ患者のコホートに対する分析に集中する場合、ＡＨＲ、ＴＢＸ２１、ＣＤ３Ｅ及び ＧＡＴＡ３の高い回腸（しかし、結腸ではない）の個々の発現レベルが、進行までの短い時間と関連していた（図１Ｆ，表１）。
【０１１４】
【表１】
2021501167.tif 000002
ＰＣＡＣ：近位結腸腺癌；ＴＴＰ：進行までの時間
【０１１５】
この最初の分析は、進行した疾患（ステージIII−IV）を有する患者の分離を可能にした。
【０１１６】
次に、研究に１５の新しい事例（拡張コホート）を追加し、すべての患者（ステージIII〜IVだけではない）に、現在適用され得る、パラメーターの分類の増加をもたらした（表２）。
【０１１７】
【表２】
2021501167.tif 000003
ＰＣＡＣ：近位結腸腺癌；ＴＴＰ：進行までの時間
【０１１８】
さらに、グローバルな遺伝子シグネチャの分析が、監視されていない階層的なクラスタリングにより、患者の良好な（クラスター１）又は不良な（クラスター２）予後への分離を可能にした（図１Ｇ）。クラスター１においては、免疫関連のｍＲＮＡ（ＦＯＳ、ＲＯＲＣ、ＩＬＡ１７Ａ、ＩＮＦＧ、ＩＬ２３Ａ、ＦＯＸＰ３、ＣＤ３Ｅ、ＩＬ２７、ＧＡＴＡ３、ＢＬＣ６、ＣＤ４、ＡＨＲ、ＴＢＸ２１、ＩＬ１０ 及びＪＵＮ）は、回腸においては一般的に発現は少なく、ところがクラスター２においては、それらの回腸ｍＲＮＡはより高いレベルで発現される傾向があった（図１Ｇ）。驚くべきことには、健康な回腸及び結腸粘膜における免疫遺伝子の転写プロファイルの鏡像が存在した（図１Ｈ）。クラスター１の患者は、回腸シグネチャがクラスター２に分類された個人よりも、治療が失敗するまでの良好な時間（進行又は癌関連死亡）を示した（図１Ｉ）。このリスクの層別化は、ステージＩＶのＰＣＣ転移患者の生存を予測したので（図１Ｊ）、分析されたコホート（コホート２が２０の新しい事例により拡大された）、化学療法による前処理の有無、治療センター、腫瘍ステージ及びＭＳＩステータスとは無関係であった（図１Ｇ）。
【０１１９】
患者の予後に影響を及ぼす回腸における局所免疫パラメーターを、さらに、回腸上皮（ＥＰ）又は固有相（ＬＰ）内の全（ＣＤ３＋）及びＣＤ４＋Ｔリンパ球、並びに切断された腫瘍の湿潤性辺縁におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫蛍光に基づく検出により検証した。この分析は、圧倒的な反相関の驚くべき観察を明らかにした（データは示されていない）。特に、ＴＩＬとＬＰ細胞との間の反相関は、ＴＦＨ細胞に対して特に協力であった。従って、重度のＴ細胞湿潤腫瘍は、その回腸がＴ細胞をほとんど含まない傾向がある患者において発生する。
【０１２０】
それらの相関的な多面的分析（（i）腸の位置、（ii）微生物の組成、及び（iii）免疫関連遺伝子発現プロファイルを含む）に基づいて、回腸粘膜は進行したＰＣＡＣ患者の予後を厳密に決定する（その免疫状態を及び微生物状態の両者が非常に重要である）、腸の区画を表すことができることが推定された。
【０１２１】
実施例２：結腸癌に対する回腸腸細胞の免疫原性細胞死における腸カスパーゼ−３及び−７の保護的役割−回腸ＩＥＣによるワクチン接種：
次に、ＯＸＡ−（又はＰＢＳ−）処理された同系同腹子から収穫された正常（非悪性）回腸ＩＥＣにより構成されたワクチンを用いて、ナイーブＣ５７ＢＬ／６Ｊ又はＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。７日間間隔での２回のｓ．ｃ.免疫化の後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、同系ＭＣ３８結腸癌細胞（又は結腸癌とは抗原的に異なる無関係なＭＣＡ２０５肉腫）の致死量で対側横腹部に注射し、そしてＢＡＬＢ／ｃマウスの対側横腹部に同系のＣＴ２６結腸癌細胞（又は同系の４Ｔ１乳房腫瘍）を注射した。
【０１２２】
最初に、回腸（結腸ではない）ＩＥＣが、肉腫又は乳癌細胞ではなく、結腸癌による腫瘍攻撃に対する部分的保護を与えたことが観察された（図２Ａ−Ｂ）。
【０１２３】
第二に、ＯＸＡによりインビボ前処理されたマウスからのＩＥＣは、未処理のＩＥＣよりも結腸癌増殖に対する保護においてより効率的であった（図２Ａ−Ｂ）。
【０１２４】
第三に、ＯＡに暴露された回腸粘膜が、アポトーシスを廃止する条件付きのＩＥＣ特異的カスパーゼ３／カスパーゼ７ノックアウトマウス（ＩＥＣ特異的ビリンプロモーターの制御下で発現されたＣｒｅリコビナーゼにより駆動されるＣａｓｐ３/７ΔＩＥＣ）から単離された場合、ＭＣ３８細胞に対するそれらの免疫力は失われた（図２Ｃ）。対照的に、Ｒｉｐｋ３（Ｒｉｐｋ３ΔIEC）の欠乏は、ＷＸＡ処理された回腸腸細胞の免疫原性に影響を及ぼさず（図２Ｃ）、回腸ＩＥＣの免疫原性におけるＲＩＰＫ３依存性ネクロートシスの役割ではなく、アポトーシスの役割を強調している。
【０１２５】
興味深いことには、インビボでのカスパーゼ３のアポトーシス関連の切断を引き起こすＯＸＡの能力は結腸ＩＥＣよりも回腸においてより顕著であった（図２Ｄ）。さらに、結腸ＩＥＣは、細胞周期への進入を刺激した、ムチン生成杯細胞及びＭｕｃ２  ｍＲＮＡ発現の匹敵する損失にもかかわらず、ＤＸＡ後の低められた増殖を示す傾向があった（回腸ＩＥＣは高いＫｉ６７発現を維持した）（データは示されていない）。
【０１２６】
ＯＸＡによる幹細胞由来の小腸エンテロイドの処理が、カルレティキュリン細胞表面暴露で頂点に達する用量依存性アポトーシスを誘発したことがインビボで確認された（２９）（データは示されていない）。次に、回腸ＩＥＣのＯＸＡ誘発細胞死中に放出される種々のＤＡＭＰの生物学的関連性を試験するためにＣｄ３９、 Ｍｙｄ８８、 Ｔｌｒ２/Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ９、 Il1αβ 又はＩｌ１８欠損同系動物に由来する回腸ＯＸＡ暴露ＩＥＣ、又は免疫原性細胞死（ＡＴＰ、カルレティキュリン及びＨＭＧＢ１）に通常関連するＤＡＭＰが抗体又は薬理ブロッカーにより中和されている回腸ＯＸＡ暴露ｗｔ  ＩＥＣにより、ナイーブ野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを免疫化した。ＴＬＲ２／４又はＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路が抑制された場合、又はＡＴＰ放出が阻害されるか、又はプリン作動性Ｐ２受容体がブロックされた場合、野生型回腸ＩＥＣの免疫原性が損なわれたか（図２Ｅ−Ｆ）、まだカルレティキュリン又はＨＭＧＢ１には依存しなかった。注目すべきことには、有糸分裂的に活性なＬｇｒ５＋腸幹細胞は、ＩＥＣの免疫原性には不要であった（データは示されていない）。
【０１２７】
さらに、腸のカスパーゼ３及び７の欠如は、天然の腫瘍進行加速の最高潮に達する、ｔｄＬＮにおける低められたＣＤ３＋  Ｔ細胞をもたらした（データは示されていない）。腸カスパーゼ３及び７は、樹状細胞のＯＸＡ誘発トラッフィッキング（データは示されていない）及びＯＸＡ後の腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）における活性化されたＴＨＦ（図２Ｇ）、並びにＯＸＡの抗腫瘍効果（図２Ｈ）及び腫瘍床におけるＴＩＬ蓄積（図２Ｉ）のために必要とされた。
【０１２８】
局所的に進行した患者においては、術前補助化学療法が手術の前に行われ、腫瘍又は健康組織の種々のパラメーターに対する細胞毒性物質の効果の推定を可能にする。近位結腸癌患者の回腸における活性化されたカスパーゼ３の免疫組織化学的検出が、主に陰窩において、ＯＸＡベースの術前補助化学療法が、局所ＩＥＣアポトーシスを誘発したことを確認した（図２Ｊ、Ｋ）。中央値を越える回腸陰窩カスパーゼ３活性化は、術前補助化学療法の恩恵を受けている患者における全生存率の向上に関連する傾向があり、このことは、このパラメーターが正の予後値を有することを示唆している（図２Ｌ）。
【０１２９】
実施例３：結腸癌に対する回腸腸細胞の免疫原性細胞死における回腸微生物相の補助的役割：
アバターマウスにおける回腸微生物相の潜在的な関連性及び患者における転移の進行に興味がそそられるので（図１）、特定の無菌条件（ＳＰＦ）下で発生されたマウスから収穫された回腸ＩＥＣの相対的免疫原性を、無菌（ＧＦ）の施設での飼育されたそれらの相対的免疫原性とを比較することにより、微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）の役割を分析した。注目すべきことには、ＯＸＡに暴露された回腸ＧＦ−ＩＥＣは、回腸ＳＰＦ−ＩＥＣに比較して、ＭＣ３８に対する免疫化に失敗した（図３Ａ）。ＯＸＡ処理された幹細胞由来の小腸エンテロイド（微生物の生体系を欠いている）は、未処理のエンテロイドに比較して、ＭＣ３８の進行を実際に加速し、このことは、それらが寛容原性であったことを示唆する（図３Ｂ）。全体として、それらの発現は、従来の化学療法に暴露された回腸ＩＥＣが、広範囲の抗生物質がＭＣ３８に対するＯＸＡの有効性を重度に影響を及ぼしたという事実と一致して、好ましい微生物相の不在下で保護的な抗癌免疫応答を誘発できなかったことを示唆している（２８）。回腸微生物相が局所ＩＥＣの免疫原性の特性を回復できることを直接的に示すために、ＰＣＡＣ患者から収穫された１０の異なる回腸粘膜生態系により、寛容性ＯＸＡ感作回腸エンテロイドを補足した（図３Ｃ−Ｄ）。それらの１０の回腸生態系のうち６つのみが、負の対照、すなわちナイーブな非免疫マウス、ＯＸＡ処理されたエンテロイドによってのみ免疫化されたマウス、又はエンテロイドを含まない回腸粘膜微生物相により免疫化されたマウスに対して、相対的な抗癌保護を回復できた（図３Ｄ）。
【０１３０】
回腸ＩＥＣの免疫原性の終焉に関与する細菌分類群を同定するために、種々の技術的アプローチ（Ｍｉ−Ｓｅｑ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコン配列決定及び培養学）、及び３つの戦略（回腸の免疫トーン、腫瘍免疫スコア及びインビボワクチン接種の調査）を使用した。最初に、６つの応答（Ｒ）及び４つの非応答（ＮＲ）回腸粘膜における回腸粘膜関連微生物相の遺伝子アンプリコンの１６Ｓアンプリコン配列決定に結合された培養学分析（２５）（図３Ｄ）は、Ｒ間での共有される特性、例えばErysipelotrichaceae、（Erysipelatoclostridium属、図３Ｅ）及びRikenellaceae（Alistipes onderdonkii、図３Ｅ）科メンバーの過剰表現を表した。注目すべきことには、Faecalibacteriumはまた、それらの１０の患者由来の粘膜における１６Sアンプリコン配列決定により確認されるように、（寛容原性に対して）回腸粘膜の免疫化においても過剰に存在した（データは示されていない）。第二に、ＰＣＡＣ患者の免疫スコアと、回腸粘膜関連微生物相の１６Ｓアンプリコン配列決定とを整列する相関研究は、好ましい（ＩＳ＞２）対陰惨な（ＩＳ０−１）免疫スコアを表すＰＣＡＣ患者の回腸微生物相を比較する非常に少数の分類学的単位を明らかにした（１０）。それらの分類群は、Bacteroidales目からの種、Rikenellaceae科、コホート１（ｎ＝３３  ＰＣＡＣ、図３Ｆ及び図６）におけるAlistipes shahii、及びコホート２（ｎ＝１７  ＰＣＡＣ、ｐ＝０．０３）における未分類のBacteroidalesと＜９３％の相同性を示すＯＴＵ１０４０を含んだ（データは示されていない）。最後に、１６Ｓアンプリコン配列決定における細菌組成についてのクラスター形成の堅牢性のクラス間主成分分析、Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏランク検定ｐ値は、ＡＨＲｌｏｗの回腸粘膜とＡＨＲｈｉｇｈの回腸粘膜との間に有意な変異を明らかにしたので（データは示されていない）、未分類の Erysipelotrichaceae、未分類の Rikenellaceae 及び未分類の  Faecalibacteriumが、低ＡＨＲ  ｍＲＮＡ発現と関連していたことを再び見出した（図３Ｇ、及びデータは示されていない）。注目すべきことには、寛容原性回腸粘膜に関連する両基準、すなわち高いＡＨＲ発現レベル及び低い免疫スコアを用いて回復された一般的な細菌種はBacteroides uniformis、 Ruminococcus gnavus及び未分類の Pharscolarctobacteriumであり（図３Ｉ−Ｊ）；それらの共生体は良好な予後と負の相関があった。回腸粘膜におけるErysipelotrichaceae, Rikenellaceae 及びFaecalibacteriumの相対的優勢が、低い局所免疫トーン及び腫瘍床における細胞毒性Ｔリンパ球の豊富さを予測し、両ともＰＣＡＣ予後に影響を及ぼすと結論付けている（図３Ｈ）。
【０１３１】
次に、回腸微生物相がそれらの回腸免疫遺伝子発現（拡大されたコホート）に従って分類された患者を分離できるかどうかを試験した。科の細菌のレベルで、Ｖｏｌｃａｎｏプロットは、クラスター１の患者（クラスター２の患者よりも良好な予後を有する）における、Erysipelotrichaceaeの過剰、及びNegativicutes網（例えば、Acidaminococcaceae、Selenomonadales unclass.）の科／目の過剰を強調する傾向があった（図３Ｋ）。種レベルで、クラスター１と比較して、不良な予後を有するクラスター２患者のおける経口Prevotella spp. （P.oralis、 P・oryzae)に有意な富化が存在した（図３L）。逆に、好ましいクラスター１（クラスター２と比較して）において富化された唯一の細菌は、Bacteroides fragilis であった（図３L）。
【０１３２】
Spearman相関マトリックスは、特定の細菌科と、浸潤性辺縁（ＩＭ）で又は腫瘍の中心部（ＣＴ）においてＣＤ３＋及びＣＤ８＋  Ｔリンパ球による腫瘍の浸潤との関連を示唆している（図３Ｍ）。ここでも、Negativicutes網（例えば、Veillonellaceae）に属する科はまた、腫瘍の浸潤性辺縁におけるＣＤ３＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤物の密度と正の関係があり、ところがFusobacteraceaeの回腸における比率は、腫瘍の中心部におけるＣＤ３＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤物の密度と負の相関があった。
【０１３３】
興味深いことには、回腸陰窩における切断されたカスパーゼ３陽性ＩＥＣの頻度は、術前補助化学療法の後のクラスター患者においてよりもクラスター１において有意に高かった（図３Ｎ）。非術前補助患者の回腸微生物相において、アポトーシス陰窩細胞の頻度は、Erysipelotrichaceaeの比率と正の関係を示したが（図３Ｏ）、しかしFusobacteriaceaeとは負の関係を示した（図３Ｐ）。従来の術前補助療法を伴っての患者（ｎ＝１２）又はそれを伴わないでの患者（ｎ＝３０）の両方において得られたそれらの関連性は微生物相、ＩＥＣアポトーシス、及び回腸内の局所免疫性間の機能的関連を示唆している。免疫スコアとの関連での回腸細菌のさらなる分析は、Lactobacillales目（Streptococci及びEnteroccoci）からのいくつかの種及び免疫スコアグループ３（良好な予後）間の正の関連性を明らかにした（図３Ｑ）。治療失敗までの時間に対しての最良なリスク層別化の細菌は、Bacteroides fragilisであった（図３Ｒ）。
【０１３４】
注目すべきことには、糞便の微生物相が分析される場に見いだされたいくつかの共通点（図４Ａ−Ｂ）は、回腸免疫性にとって重要ないくつかの微生物バイオマーカーが結腸区画に見出され得ることを示唆する。同様に、糞便微生物組成物は、回腸組成物の代用物として使用され得る。
【０１３５】
実施例４：Alistipes sp.及びErysipelotrichaceaeの投与が腸内細菌症の状態でオキサリプラチン抗癌効果を回復する
その後、それらの科のいくつかの代表的な単離物の強制経口投与によりａＮＲマウスにおける腸内細菌相を補償することにより、応答患者におけるErysipelotrichaceae 及びRikenellaceaeの相対的過剰発現と、回腸粘膜の免疫原性アポトーシスとの間の因果関係を確立しようとした。これは、治療設定でのＯＸＡ投与の前、又は予防実験でのワクチンによる免疫化の前に行われた。注目すべきことには、Erysipelothrix tonsillarum（Erysipelotirichaceae科からの別の細菌であるSolobacterium mooreiを除く）は、ＡＴＢ−（図５Ａ−Ｃ）又はＦＭＴ−誘発された腸内毒素症（図５Ｄ−Ｅ）の状況下で、Ｔ細胞依存性態様での確立されたＭＣ３８癌に対するＯＸＡ介在性抗癌効果を改善した。さらに、免疫原性回腸粘膜から培養された、Alistipes onderdonkii (Rikenellaceae 科に属する)及びErysipelatoclostridium ramosum（図３Ｅ）は、ＯＸＡ処理されたエンテロイドを免疫原性にするのに効果的であり、従ってそれらのＭＣ３８癌増殖制御効果を増強し（図５Ｆ−Ｇ）、ところが、同じ（及び混合された）低温殺菌された細菌はそうすることができなかった。最後に、回腸粘膜におけるErysipelotrichaceaeの低い相対量は、４８人のＰＣＡＣ患者のコホートにおいて診断での転移を示すリスクの増加と関連した（図５Ｈ−Ｉ、データは示されていない）。
【０１３６】
実施例５：Bacteroides fragilis 及びErysipelotrichaceaeの投与は、腸内エビオシスの状態におけるＯＸＡ及び抗ＰＤ−１の組み合わせの抗癌効果を改善する
次に、ＰＤ１遮断（単独で又はＯＸＡと併用）に対して応答しなかった結腸癌が、上記で特定された適切な「免疫原性回腸共生体」への暴露の後、応答体になることができたかどうかを検討した。従って、それらの科のいくつかの代表的な単離物の強制経口投与によるマウスにおける完全な（ＳＰＦ）微生物相を補償することにより、良好な予後患者におけるErysipelotrichaceae 及び Bacteroides fragilisの相対的過剰発現と、回腸粘膜の免疫原性アポトーシスとの間の因果関係を確立した。これは、治療設定におけるＯＸＡ投与の前に行われた。注目すべきことには、Erysipelatoclostridium ramosum及び Bacteroides fragilisは、確立されたＭＣ３８癌に対するＯＸＡ＋抗ＰＤ−１  Ａｂ介在性抗癌効果を改善し、ところがPrevotella clareは、そうすることができず、ＯＸＡ＋ＰＤ１  Ａｂの効果を悪化さえさせた（図７Ａ−Ｂ）。
【０１３７】
実施例６：腸上皮細胞に対するＴｈ１細胞のエクスビボ生成
次に、いくつかの個体が、ＣＲＣから保護することができるそれらの陰窩及び／又は共生体の自己幹細胞に対する記憶及び保護Ｔｈ１免疫応答をすでに有するかどうかの分析を試みた。ＤＣが、Ｔ細胞をＴｈ１細胞に分化させるために、免疫原性ＩＥＣ＋／−細菌を負荷した後、ナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞に暴露されるエクスビボ共培養工程を確立した。これは、以前にBacteroides Fragilis及びＯＸＡに暴露された場合にのみ免疫原性にされた同種ＩＥＣ（ヒト細胞系ＨＩＥＣ−６からの）を充填された樹状細胞と、自己Ｔヘルパー細胞とをインキュベートすることにより行われたが、しかしそれらはＯＸＡのみで、又は寛容性細菌Paraprevotella charaにより処理された場合は異なります（図８）。この方法により得られたＴｈ１細胞は、ＣＲＣの治療又は予防のために有利に使用され得る。
【０１３８】
議論：
全体として、それらの発見は、微生物相が回腸免疫トーンを指示し、そしてアポトーシスに屈した回腸腸細胞により誘発された抗癌免疫応答を形作ることを説明している。回腸ＩＥＣのカスパーゼ３／７依存性アポトーシス細胞死、ＴＦＨ／ＴＨ１（免疫原性）免疫応答に対してＴＨ１７（寛容原性）のバランスをとるＭＡＭＰを生成する細菌生態系の局所存在においてのみ、いくつかのＤＡＭＰ（ＡＴＰ、ＩＬ−１）及び機能的ＴＬＲ２／４細胞自律的シグナル伝達の放出に結び付く、腸間膜ＬＮにおける一般的な腸細胞抗原に対する免疫応答を誘発する。注目すべきことには、抗癌免疫応答を誘発するために必要とされる腸のアポトーシスは、ＣＡＬＲ及びＨＭＧＢ１を必要としないので、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）（腫瘍内で発生する）とは機構的に異なる。回腸アポトーシスに応答して、ＣＤ１０３− ＣＤ１１ｃ＋ ＭＨＣ クラス ＩＩ＋ ＤＣが、腸間膜及び腫瘍排出ＬＮにおいて活性化されたＴＦＨを拡張するために動員される。ＯＸＡ後の回腸のＣＣＬ２５発現レベルの平行減少に関連する回腸粘膜の低められた免疫トーンを考慮すると（示されていない）、ｍＬＮ化学療法の後に活性化されたＴＦＨが、腫瘍微小環境へのそれらの移行を好む、炎症を起こした腸に由来したと推測するのは魅力的である。それらの発見は、化学療法により処理されたいくつかの癌患者に観察されたように、自己免疫性大腸炎に関連し、そして抗生物質により都合よく抑制され得る自己反応性Ｔ細胞依存性抗癌免疫性の理論的可能性を高める（３０−３２）。腸又は腸間膜ＬＮにおける抗原提示細胞による共生体及びそれらのＴＬＲリガンドと共にアポトーシス細胞の潜在的な同時食細胞区分化が、自己及び非自己ペプチドの両方がＭＨＣクラスII分子に同時に負荷される機会を提供する（３３）。
【０１３９】
この研究は、回腸微生物相を利用し、そして結腸癌抗原に対する自己寛容を破壊する新規の細菌アジュバントを考案するための新規の道を切り開く。
【０１４０】
それらの発見は、腸内微生物相、局所免疫応答及び結腸癌予後の間の新規関連性を明らかにする。それらのデータに基づいて、いくつかの前提を議論することができる。最初に、外科医は、消化管の最も抗原性の高い部分、すなわち回腸の最後の１０ｃｍ部分、それ以外の場合、免疫原性アポトーシスを受け、そして高い免疫原性の自然の住民／アジュバント（回腸粘膜関連微生物相）でコロニー形成する部分を切除するために、右側結腸癌は、より悪い予後を有することが推測できる。結果的に及び第二に、自己反応性、及び／又は結腸腫瘍幹細胞との分子模倣が、長期保護免疫性の誘発を可能にするので、右側結腸癌の術前補助化学療法が、アジュバント設定で投与される化学療法よりもより有益であり得る。弟三に、ＤＮＡミスマッチ修腹に遺伝的欠陥を有する患者からのilei （例えば、Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer (ＨＮＰＣＣ)に記載されていもの）は、アポトーシス（少なくとも、特定の化合物で）を受ける傾向が高い可能性があり（３４−３５）、そして従って、ＩＥＣ由来の自己抗原に対するより強い保護免疫応答を誘発する。弟四に、原核生物のＤＮＡミスッチ修復機構（例えば、ＭｕｔＳ及びＭｕｔＬ）及びＭＳＨ１の相同体（３６）も有する回腸粘膜関連の細菌は、回腸ＩＥＣの免疫原性の調節に役割を果たす可能性がある。
【０１４１】
従って、定義された遺伝子マップを用いて結腸癌患者からの回腸エンテロイドのバイオバンクを生成することは有用である。原核生物と真核生物のミスマッチ修復機構、粘膜免疫性及び発癌の間の生物学的リンクを確立することが、将来の鍵となるであろう。
【０１４２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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