(57)【要約】哺乳動物における好酸球増加症のための組成物および方法が提供される。一態様では、該組成物はウイルス遺伝子療法ベクターであり、かつ、単回用量の該ベクターによって哺乳動物における好酸球の数の増加が低減される。2021508719.tif 000019
2021508719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において好酸球増加性の疾患または障害を抑制または治療する方法であって、
好酸球上のリガンドに結合する抗体、または
該哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体
をコードするオープンリーディングフレームを含むウイルス発現ベクターを含む組成物を、該哺乳動物において該好酸球増加性の疾患または障害を抑制または治療するために効果的なある量で該哺乳動物に投与する工程を含む、該方法。
【請求項２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患が、がん、喘息、食道炎、熱帯性肺好酸球増加症、感染性疾患、アレルギー性もしくはアトピー性疾患、胃腸炎、肝胆道系疾患、髄膜炎、心臓障害、泌尿生殖器障害、免疫不全、内分泌学的障害、肺障害、皮膚疾患、関節リウマチ、または血管炎である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記がんが白血病である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記量が、前記哺乳動物において好酸球の割合を少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも30％、少なくとも50％、または最大90％減少させるために効果的である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルス発現ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAVrh10である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、scFv、Fv、Fab'、1つのVLと1つのVH抗原結合ドメインと1つもしくは2つの定常ドメインとを含有する一本鎖分子、または完全ヒト抗体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が好酸球上のリガンドに結合する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記リガンドが炭水化物を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記リガンドがシアロアドヘシオン（sialoadhesion）ファミリーのメンバーである、請求項9または10に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体がシアル酸結合Ig様レクチン8に結合する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルス発現ベクターが抗体をコードし、該抗体が、SEQ ID NO:1または2によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチド、および任意で、SEQ ID NO:3もしくは4またはそれらの組合せに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現ベクターが、SEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、もしくは46〜51、または任意のそれらの組合せを含むポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む抗体をコードする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルス発現ベクターが、IgG定常領域を有する抗体をコードする、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルス発現ベクターが、λ軽鎖定常領域を含むポリペプチドを含む抗体をコードする、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現ベクターが、κ軽鎖定常領域を含むポリペプチドを含む抗体をコードする、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が全身投与される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が静脈内投与される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が中枢神経系または頭蓋内に投与される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
内因性のウイルスプロモーターから前記抗体が発現される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記内因性プロモーターが誘導性となるように改変されている、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記オープンリーディングフレームに機能的に連結された前記ウイルス発現ベクター中の外因性プロモーターから前記抗体が発現される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーターが誘導性である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルス発現ベクターが自殺遺伝子をさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
好酸球上のリガンドに結合する抗体、または
哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体
をコードするオープンリーディングフレームを含む発現ベクターを含む、哺乳動物において好酸球の数を減少させるために効果的な、ある量の単離された組換えのレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはAAVを含む、薬学的製剤。
【請求項２７】
前記抗体が、SEQ ID NO:1もしくは2によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチド、またはSEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、もしくは46〜51のうちの1つを含むポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、請求項26に記載の薬学的製剤。
【請求項２８】
前記抗体が、Siglec-8、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-9、IL-9R、IL-13、IL-13R、IL-17、IL-17R、IL-33、IL-33R、CD30、CD52、CCR3、IgE Fc、RADCP、またはTNF-αに結合する、請求項26に記載の薬学的製剤。
【請求項２９】
静脈内送達のために製剤化されている、請求項26、27、または28に記載の薬学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年12月29日に出願された米国特許出願第62/612,005号の出願日の恩典を主張し、該出願の開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
好酸球は、高度に専門化した骨髄由来の顆粒球性細胞であり、寄生虫および他の病原体との戦いにおいて役割を果たす（Young et al.,2006）。正常個体において、好酸球は白血球の＜5％であり、300〜500/μlの絶対数を有する（Young et al.,2006;Bridgen et al.,1997;Gotlieb et al.,2015;Rothenberg et al.,2006）。好酸球は、通常、循環中に8〜12時間存続し、8〜12日間組織中に生存し（Young et al.,2006）、主要塩基性タンパク質、陽イオン性タンパク質、ペルオキシダーゼ、および神経毒を含む様々な細胞傷害性メディエーターを細胞質顆粒中で運び、かつ活性酸素種、脂質メディエーター、破壊酵素、および様々なサイトカインを放出することができる（Rothenberg et al.,2006;Bandiera-Melo et al.,2002;Hogan et al.,2008;Horuichi et al.,1997;Kato et al.,2005;Lacy,2005;Park et al.,2010;Saito et al.,2004;Song et al.,2009;Song et al.,2009;Trulson et al.,2007）。好酸球が充分な数において組織に浸潤する場合には、それらは重大な臓器損傷および機能障害を引き起こすことができる（Rothenberg et al.,2006;Bandiera-Melo et al.,2002;Hogan et al.,2008;Horuichi et al.,1997;Kato et al.,2005;Lacy,2005;Saito et al.,2004;Song et al.,2009;Song et al.,2009;Trulson et al.,2007;Zimmermann et al.,2008;Bolus et al.,2015;Gleiche et al.,1986;Morgan et al.,2005;Slifman et al.,1986;Venge et al.,1999;Zheutlin et al.,1984）。血中好酸球レベルの慢性上昇、好酸球による臓器の浸潤、および関連付けられる臓器損傷により特徴付けられる様々な一次的および二次的な好酸球増加性障害が存在する（Curtis et al.,2016;Falchi et al.,2015;Gotlib et al.,2012;Helbing et al.,2012;Reiter et al.2017;Roufosse et al.,2012;Tefferi et al,2006;Valent et al.,2012）。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示は、好酸球性障害、例えば、効果的な療法を有しない医学上の必要性が満たされていない致死性悪性障害である非特定型慢性好酸球性白血病（chronic eosinophilic leukemia-not otherwise specified）（CEL-NOS）が挙げられるがそれに限定されるわけではない白血病などのがんを治療するためのインビボ遺伝子療法に関する。未知の原因の血中好酸球＞1.5×103個/μLの持続性上昇を伴うサブタイプ成人慢性好酸球性白血病であるCEL-NOSは、好酸球が浸潤した臓器の機能障害により特徴付けられる。CEL-NOSはいかなる療法にも応答しない。病理発生は未知であるため、CEL-NOSの最も直接的な療法は、血液中の好酸球の数を抑制することにより、好酸球の組織浸潤および臓器機能障害を抑制することである。一態様では、抗好酸球モノクローナルをコードするアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いるCEL-NOSなどの好酸球性障害に対する遺伝子療法が提供される。一態様では、AAVはAAVrh.10m抗Eos（LEXm03）であり、LEXm03は、一態様では、マウス好酸球アポトーシスを誘導するマウス特異的な抗好酸球モノクローナルを発現および分泌するように肝臓肝細胞などの細胞を遺伝的に改変するために静脈内投与される血清型rh.10 AAVベクターである。LEXm03の有効性を評価するために、別のAAVベクター（AAVrh.10mIL5）を使用してCEL-NOSマウスモデルを調製し、AAVrh.10mIL5を静脈内投与して、高レベルのマウスインターロイキン-5（IL5）を持続的に分泌するように肝臓を遺伝的に改変し、次いでIL5は骨髄を刺激して、高い血中レベルの好酸球（＞100,000個の好酸球/μL）を持続的に生成し、組織好酸球浸潤および最終的に死をもたらした。データは、LEXm03はインビトロおよびインビボにおいて好酸球のアポトーシスを誘導し、CEL-NOSマウスモデルにおいて血中好酸球レベルを著しく低下させることを実証する。CEL-NOSは希少であるが、本明細書に開示されるようにLEXm03戦略が応用可能である多くの好酸球増加性障害が存在する。さらに、好酸球アポトーシスを誘導する他の抗好酸球モノクローラルを用いる戦略が用いられてもよい。LEXm03などのベクターの静脈内投与を使用して肝細胞などの細胞を遺伝的に改変することにより抗好酸球モノクローナル抗体を分泌させることは、好酸球の組織浸潤の減少ならびに罹病率および死亡率の低減と共に、血中好酸球レベルの顕著な抑制を可能とする。
【０００４】
一態様では、本開示は、哺乳動物において好酸球増加性の疾患または障害を予防、抑制、または治療する方法を提供する。方法は、哺乳動物に、好酸球に結合する抗体、または好酸球の数を増加させる分子もしくはその成熟の速度を増進する分子に結合する抗体をコードする発現ベクターを含む組成物を、哺乳動物において好酸球増加性障害の1つまたは複数の症状を予防、抑制、または治療するために効果的なある量で投与する工程を含む。一態様では、哺乳動物はヒトである。一態様では、疾患はがんである。一態様では、発現ベクターはプラスミドである。一態様では、発現ベクターは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノ随伴ウイルスの部分である。一態様では、組成物は、発現ベクターを含むアデノ随伴ウイルスを含む。一態様では、AAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAVrh10である。一態様では、抗体は、キメラ抗体、scFv、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。一態様では、発現ベクターは、SEQ ID NO:1もしくは2によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有する抗体、または、SEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、もしくは46〜51、もしくはSEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、もしくは46〜51の可変領域中もしくはCDR中の配列の任意の組合せのいずれか1つに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有する抗体をコードする。一態様では、発現ベクターは、SEQ ID NO:1によりコードされるポリペプチド、またはSEQ ID NO:9〜22、33、36〜37、39、42、もしくは45〜48のいずれか1つを有するポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有する抗体をコードし、かつIgG定常領域を有する。一態様では、発現ベクターは、SEQ ID NO:2によりコードされるポリペプチド、またはSEQ ID NO:22〜32、34〜35、38、40〜41、43〜44、もしくは49〜51のいずれか1つを有するポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有する抗体をコードし、かつλ軽鎖定常領域を有する。一態様では、発現ベクターは、SEQ ID NO:2によりコードされるポリペプチド、またはSEQ ID NO:22〜32、34〜35、38、40〜41、43〜44、もしくは49〜51のいずれか1つを有するポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有する抗体をコードし、かつκ軽鎖定常領域を有する。一態様では、発現ベクターは、SEQ ID NO:5、6、もしくは8またはSEQ ID NO:5、6、もしくは8の任意の組合せを含むポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有する抗体をコードする。一態様では、発現ベクターは、SEQ ID NO:5、6、または8によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有する抗体をコードし、かつIgG定常領域を有する。一態様では、発現ベクターは、SEQ ID NO:5、6、または8によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有する抗体をコードし、かつλ軽鎖定常領域を有する。一態様では、発現ベクターは、SEQ ID NO:5、6、または8によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有する抗体をコードし、かつκ軽鎖定常領域を有する。一態様では、組成物は全身投与される。一態様では、ポリペプチドは、SEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、または46〜51のうちの1つにおけるフレームワーク配列、1つもしくは複数のCDR、または両方において1、2、3、4、または5つの置換、例えば、保存的もしくは非保存的置換またはそれらの組合せを有する。
【０００５】
一態様では、哺乳動物において好酸球増加性の疾患または障害を抑制または治療する、例えば、好酸球増加性の疾患または障害の1つまたは複数の症状を抑制または治療する方法が提供される。方法は、好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体をコードするオープンリーディングフレームを含むウイルス発現ベクターを含む組成物を、哺乳動物において好酸球増加性の疾患または障害を抑制または治療するために効果的なある量で哺乳動物に投与する工程を含む。一態様では、哺乳動物はヒトである。一態様では、疾患は、がん、喘息、食道炎、熱帯性肺好酸球増加症、感染性疾患、アレゴリック（allegoric）もしくはアトピー性疾患、胃腸炎（gasteroenteritis）、肝胆道系疾患、髄膜炎、心臓障害、泌尿生殖器障害、免疫不全、内分泌学的障害、肺障害、皮膚疾患、関節リウマチ、または血管炎である。一態様では、がんは白血病である。一態様では、投与される量、例えば、単回用量は、哺乳動物において好酸球の数を低減するが除去しない。一態様では、投与される量は、好酸球増加症を有する1つまたは複数の組織において好酸球の数を低減する。一態様では、該量は、哺乳動物において好酸球の割合を少なくとも0.01％、少なくとも0.05％、少なくとも0.l％、少なくとも0.5％、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または最大90％減少させるために効果的である。一態様では、ウイルス発現ベクターはアデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。一態様では、AAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAVrh10である。一態様では、抗体は、キメラ抗体、scFv、単一重鎖、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。一態様では、抗体は、好酸球上のリガンド、例えば、炭水化物を含むリガンドに結合する。一態様では、リガンドは、シアロアドヘシオン（sialoadhesion）ファミリーのメンバー、例えば、シアル酸結合Ig様レクチン8である。一態様では、ウイルス発現ベクターは、SEQ ID NO:1もしくは2によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチド、または、SEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、もしくは46〜51またはそれらの組合せに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、抗体をコードする。一態様では、ウイルス発現ベクターは、IgG定常領域を有する抗体をコードする。一態様では、ウイルス発現ベクターは、λ軽鎖定常領域を含むポリペプチドを含む抗体をコードする。一態様では、発現ベクターは、κ軽鎖定常領域を含むポリペプチドを含む抗体をコードする。一態様では、組成物は全身投与される。一態様では、組成物は静脈内投与される。一態様では、組成物は中枢神経系または頭蓋内に投与される。一態様では、抗体は内因性のウイルスプロモーターから発現される。一態様では、内因性プロモーターは、誘導性となるように改変されている。一態様では、抗体は、オープンリーディングフレームに機能的に連結されたウイルス発現ベクター中の外因性プロモーターから発現される。一態様では、抗体は外因���プロモーターから発現される。一態様では、外因性プロモーターは誘導性である。一態様では、プロモーターは、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン（例えば、Rodriguez-Garcia et al.,Nucl.Acids Res,33:e87（2005）におけるテトラサイクリン誘導性プロモーターを参照）、ビンクリスチン、リファミピシン（rifamipicin）、ドキシルビシン（doxyrubicin）、または5-アザシチジンを用いて誘導可能なプロモーター、例えば、Mdr-1プロモーター、リガンド結合ドメインとプロモーター配列もしくはプロモーターの上流の配列に特異的なDNA結合ドメインとを有する融合タンパク質、バルプロ酸、モルヒネ（例えば、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター）、またはキノロン（例えば、オステオポンチンプロモーター）を用いて誘導可能なプロモーターである。一態様では、ウイルス発現ベクターは自殺遺伝子をさらに含む。一態様では、ベクターからの発現は、単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ（HSV-tk）をコードする遺伝子およびガンシクロビルの投与、任意でウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼと組み合わせたシトシンデアミナーゼをコードする遺伝子および5-フルオロシトシンの投与、ニトロレダクターゼをコードする遺伝子および5-（アザリジン-1-イル）-2,4-ジニトロベンズアミドの投与を使用して減少または除去される。他のシステムとしては、水痘-帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（VZV-tk）、尿ヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP）、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼG2、リナマラーゼ、β-バラトシダーゼ、または肝臓シトクロムP450-2B1が挙げられる。
【０００６】
好酸球に対する抗体をコードする発現ベクターを含む単離された組換えウイルスもまた提供される。一態様では、抗体は、SEQ ID NO:1もしくは2、もしくは両方によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有するか、または、SEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、もしくは46〜51のうちの少なくとも1つもしくはそれらの組合せを含むポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するか、または、効果的な量の組換えウイルスを含む医薬を有する。一態様では、ウイルスは組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）である。一態様では、投与される組成物中、または一連の用量中のAAVの量は、約1×1010〜1×1020ゲノムコピー、例えば、約1×1012〜1×1015、約1×1014〜1×1016、約1×1016〜1×1018、または約1×1015〜1×1019ゲノムコピーである。
【０００７】
一態様では、組成物および方法において有用な抗体の例示的な標的としては、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、GM-CSF、IL-13、IL-16、IL-25、IL-27、IL-28、VEGF、アンジオポエチン-1、PDGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、IFN-α、IFN-γ、RANTES（CCL5）、MCP-3（CCL7）、MCP-4（CCL13）、エオタキシン（CCL11）、エオタキシン-2（CCL24）、エオタキシン-3（CCL26）、SDF-1（CXCL12）、PAF、補体因子C3aもしくはC5a、VIP、シアロアドヘシオン因子、もしくはGC、または受容体、したがって、Siglec 8、Toll様R受容体、もしくはCD33などのシアロアドヘシオン因子受容体が挙げられるがそれらに限定されるわけではない受容体が挙げられるがそれに限定されるわけではない。一態様では、抗好酸球モノクローナルは、CD33関連シアル酸結合Ig様レクチンファミリーのメンバーである、ヒト好酸球上に発現される細胞表面受容体であるヒトSiglec-8に対して作られる。モノクローナルとのSiglec-8のライゲーションは、好酸球アポトーシス、およびインビボでの好酸球クリアランスをもたらす。
【０００８】
好酸球に対する抗体をコードする発現ベクターを含む単離された組換えAAVを含む薬学的製剤であって、抗体が、SEQ ID NO:1もしくは2、もしくは両方によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有するか、またはSEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、もしくは46〜51のうちの少なくとも1つまたはそれらの組合せを含むポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する、薬学的製剤がさらに提供される。製剤は、がん、例えば、好酸球性がん、または他の好酸球増加性疾患を抑制または治療するために用いられてもよい。
【０００９】
好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体をコードするオープンリーディングフレームを含む発現ベクターを含む、哺乳動物において好酸球の数を減少させるために効果的な、ある量の単離された組換えのレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはAAVを含む、薬学的製剤もまた提供される。一態様では、抗体は、SEQ ID NO:1もしくは2によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチド、またはSEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、もしくは46〜51のうちの1つを含むポリペプチドに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。一態様では、抗体は、Siglec-8、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-9、IL-9R、IL-13、IL-13R、IL-17、IL-17R、IL-33、IL-33R、CD30、CD52、CCR3、IgE Fc、RADCP、またはTNF-αに結合する。一態様では、薬学的製剤は、静脈内送達のために製剤化される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図1A〜F。CEL-NOSのマウスモデルの生成。モデルは、好酸球を生成するように骨髄を誘導する主要なサイトカインであるマウスインターロイキン5（IL-5）を発現するAAVrh.10遺伝子療法ベクターの静脈内経路による野生型Balb/Cマウスへの投与に基づく。（A）AAVrh.10mIL-5ベクターの図式。（B）CEL-NOSのマウスモデルの図式。（C）AAVrh.10mIL-5の静脈内投与の8週間後のIL5の血清レベル。（D）血液スメア、ナイーブBalb/Cマウス。（E）好酸球増加を実証するAAVrh.10mIL5の投与の10週間後の血液スメア。（F）血中好酸球の高く持続性の負荷を示す2.5×1010gcのAAVrh.10mIL-5の静脈内投与後10週間までの血中好酸球の絶対数。
【図２】CEL-NOSの血液スメア。
【図３】図3A〜D。CEL-NOSマウスモデル（Balb/c）。AAVrh.10mIL-5を使用して6〜8週齢の雄Balb/cマウス（n＝4/群）に感染させた後、マウスIL-5レベル、血中好酸球増加、および好酸球臓器浸潤を評価した。（A）投与の8週間後の血清マウスIL-5レベル。（B）好酸球の絶対数。（C）血液スメア、PBSマウス。（D）感染の2週間後のAAVrh.10mIL-5感染マウスの血液スメア。
【図４】図4A〜F。CEL-NOSマウスモデル（H＆E Balb/c）。（A）ナイーブ、肺。（B）AAVrh.10mIL-5感染、肺。（C）ナイーブ、肝臓。（D）AAVrh.10mIL-5、肝臓。（E）ナイーブ、心臓。（F）AAVrh.10mIL-5、心臓。
【図５】図5A〜B。野生型マウス（Balb/c）におけるAAVrh.10m抗Eosの発現。AAVrh.10m抗Eos（1011gc、IV）を6〜8週齢のBalb/cマウス（4匹の雄および4匹の雌）に投与し、血清IgG2bレベルを評価した。（A）AAVrh.10m抗Eosのインビボ発現。（B）ベクターの生成物によるマウス好酸球のアポトーシスの誘導を実証するインビトロでの有効性。マウス好酸球のラクトアドヘリン（アポトーシスマーカー）染色のフローサイトメトリー評価を示す。
【図６】CEL-NOSマウスモデル（Balb/c）におけるAAVrh.10m抗Eos療法。
【図７】図7A〜D。AAVrh.10m抗EosはCEL-NOSマウスモデル（Balb/c）において好酸球数を低減する。（A）療法の10週間後の血中の好酸球の絶対数。（B）AAVrh.10m抗Eosにより媒介されるインビボでの好酸球アポトーシス。（C）〜（D）血液スメア。（C）10週時の対照、AAVrh.10mIL-5（2.5×1010gc）。（D）10週時のAAVrh.10m抗Eos（1011gc）。
【図８】AAVrh.10m抗EosはCEL-NOSマウスモデル（Balb/c）において死亡率を低減する。AAVrh.10mIL-5単独での生存期間中央値は184日間であり、AAVrh.10m抗Eosは347日であった。
【図９】図9A〜B。CEL-NOS（Balb/c（A）およびNSG（B））のマウスモデル。
【図１０】図10A〜D。CEL-NOSマウスモデル（NSG）。（A）AAVrh.10mIL-5を使用して6〜8週齢の雄Balb/cマウス（n＝5/群）に感染させた後、マウスIL-5レベルおよび血中好酸球増加を評価した。（B）好酸球の絶対数。（C）血液スメア、PBSマウス。（D）感染の2週間後のAAVrh.10mIL-5感染マウスの血液スメア。
【図１１】図11A〜B。免疫不全マウス（NSG）におけるAAVrh.10mIL-5の発現。（A）AAVrh.10mIL-5を使用して6〜8週齢のNSGマウス（n＝5/群）に感染させた後、マウスIL-5レベル（B）を評価した。
【図１２】CEL-NOSマウスモデル（NSG）におけるAAVrh.10m抗Eos療法。
【図１３】図13A〜B。NSGマウスにおけるAAVrh.10m抗Eosの発現。（A）6〜8週齢のNSGマウスに1011gcのAAVrh.10m抗Eosを与え、IgG2bの血清レベルを0〜12週間において評価した。（A）インビボ発現。（B）インビトロでのアポトーシス。
【図１４】図14A〜B。AAVrh.10m抗EosはCEL-NOSマウスモデル（NSG雌）において好酸球数を低減する。（A）モデル。（B）好酸球の絶対数。
【図１５】図15A〜B。AAVrh.10m抗EosはCEL-NOSマウスモデル（NSG雄）において好酸球数を低減する。（A）モデル。（B）好酸球の絶対数。
【図１６】図16A〜B。AAVrh.10m抗EosはCEL-NOSマウスモデル（雄NSG）において好酸球数を低減する。（A）対照血液スメア。（B）AAVrh.10m抗Eos処置血液スメア。
【図１７】図17A〜B。AAVrh.10m抗EosはCEL-NOSマウスモデル（NSG雄）において死亡率を低減する。（A）モデル。（B）生存プロット。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
以下の記載において、本出願の一部分を形成する添付の図面を参照し、該図面において、実施され得る特定の態様が実例として示される。これらの態様は、当業者が本発明を実施することを可能とするために詳細に記載されており、他の態様が用いられてもよいことおよび本発明の範囲から離れることなく論理的な変更が為され得ることが理解されるべきである。実施例の態様の以下の記載は、したがって、限定された意味において解釈されるべきではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により定義される。
【００１２】
定義
「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むかまたはポリヌクレオチドと会合し、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用され得る、高分子または高分子の会合を指す。実例的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。場合によっては「標的ポリヌクレオチド」または「導入遺伝子」と称される、送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子療法における関心対象のコーディング配列（例えば、治療的関心対象のタンパク質をコードする遺伝子）、ワクチン開発における関心対象のコーディング配列（例えば、哺乳動物において免疫応答を誘発するために好適なタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドを発現する、ポリヌクレオチド）、および/または選択可能もしくは検出可能なマーカーを含んでもよい。
【００１３】
本明細書において使用される「形質導入」、「トランスフェクション」、「形質転換」、または「導入する」は、細胞中でのポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子の発現をもたらす宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入のための方法を指す用語であり、組換えウイルスを使用して宿主細胞に外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む。細胞におけるポリヌクレオチドの形質導入、トランスフェクション、または形質転換は、当技術分野において周知の方法により決定されてもよく、該方法としては、例えば、ELISA、フローサイトメトリー、およびウエスタンブロットによる、タンパク質発現（定常状態レベルを含む）、異種化（heterologousization）アッセイ、例えば、ノーザンブロット、サザンブロット、およびゲルシフト移動度アッセイによるDNAおよびRNAの測定が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。外因性ポリヌクレオチドの導入のために使用される方法としては、ウイルス感染またはトランスフェクション、リポフェクション、形質転換、およびエレクトロポレーション、ならびに他の非ウイルス遺伝子送達技術などの周知の技術が挙げられる。導入されるポリヌクレオチドは、宿主細胞中で安定的または一過的に維持されてもよい。
【００１４】
「遺伝子送達」は、遺伝子療法のための細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指し、標的化、結合、取込み、輸送、局在化、レプリコン組込み、および発現を包含してもよい。
【００１５】
「遺伝子療法」は、標的化、結合、取込み、輸送、局在化、およびレプリコン組込みを包含してもよいが、遺伝子のその後の発現とは別個でありかつ該発現を含意しない、細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指す。
【００１６】
「遺伝子発現」または「発現」は、遺伝子転写、翻訳、および翻訳後修飾のプロセスを指す。
【００１７】
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、ポリヌクレオチド成分を含み、ウイルス種が栄養性である細胞に該ポリヌクレオチド成分を送達できる、ウイルスまたはウイルス粒子である。該用語は、ウイルスの任意の複製能力を必ずしも含意しない。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオシドもしくはリボヌクレオチド、またはそのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化またはキャップ付加ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよく、非ヌクレオチド成分により割り込まれていてもよい。ヌクレオチド構造への修飾が存在する場合、該修飾は、ポリマーの組立ての前または後に付与されてもよい。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書において使用される場合、二本鎖および一本鎖分子を交換可能に指す。他に指定または必要とされなければ、ポリヌクレオチドである本明細書に記載の発明の任意の態様は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが既知であるまたは予測される2つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。
【００１９】
「単離された」ポリヌクレオチド、例えば、プラスミド、ウイルス、ポリペプチド、または他の物質は、物質または類似の物質が天然に存在するまたは最初に調製される場合に共に存在し得る他の成分の少なくとも一部を欠いている物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、供給源混合物からそれを濃縮するための精製技術を使用することにより調製されてもよい。単離された核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、それが天然に見出される形態または状況とは異なる形態または状況において存在する。例えば、所与のDNA配列（例えば、遺伝子）は、隣接する遺伝子に近接して宿主細胞染色体上に見出され、特定のタンパク質をコードする特定のmRNA配列などのRNA配列は、数多くのタンパク質をコードする多数の他のmRNAとの混合物として細胞中に見出される。単離された核酸分子は、一本鎖または二本鎖の形態において存在してもよい。単離された核酸分子がタンパク質を発現するために用いられる場合、分子は最小限にセンスまたはコーディング鎖を含有する（すなわち、分子は一本鎖であってもよい）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有してもよい（すなわち、分子は二本鎖であってもよい）。濃縮は、溶液の体積当たりの重量など、絶対基準において測定され得、または、それは、供給源混合物中に存在する第2の潜在的に干渉性の物質と比べて測定され得る。態様の増加性の濃縮が想定される。したがって、例えば、2倍濃縮、10倍濃縮、100倍濃縮、または1000倍濃縮。
【００２０】
「転写調節配列」は、それが機能的に連結された遺伝子またはコーディング配列の転写を制御するゲノム領域を指す。使用される転写調節配列は、概して、少なくとも1つの転写プロモーターを含み、転写に関する1つまたは複数のエンハンサーおよび/またはターミネーターも含んでもよい。
【００２１】
「機能的に連結された」は、2つまたはそれ以上の成分の構成を指し、ここで、そのように記載される成分は協調的な様式で機能することを可能とする関係性にある。実例として、転写調節配列またはプロモーターは、TRSまたはプロモーターがコーディング配列の転写を促進する場合にコーディング配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたTRSは、概して、コーディング配列とシスで連結しているが、それに必ずしも直接的に隣接しない。
【００２２】
「異種」は、それが比較される実体とは遺伝子型が別個である実体に由来することを意味する。例えば、異なる細胞種に遺伝子操作技術により導入されるポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである（かつ、発現される場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、その天然のコーディング配列から除去されており、かつ異なるコーディング配列に機能的に連結されたプロモーターなどの転写調節エレメントは異種転写調節エレメントである。
【００２３】
「ターミネーター」は、リードスルー転写を減少または防止する傾向があるポリヌクレオチド配列を指す（すなわち、それは、ターミネーターの片側を起源とする転写がターミネーターの他の側まで続くことを減少または防止する）。転写が妨害される程度は、典型的には、ターミネーター配列の塩基配列および/または長さに依存するものである。特に、多数の分子生物学的システムにおいて周知のように、一般に「転写終結配列」と称される特定のDNA配列は、恐らくは、RNAポリメラーゼ分子の停止および/または転写されているDNAからの脱離を引き起こすことにより、RNAポリメラーゼによるリードスルー転写を妨害する傾向がある特定の配列である。そのような配列特異的ターミネーターの典型的な例としては、ポリアデニル化（「ポリA」）配列、例えば、SV40ポリAが挙げられる。そのような配列特異的ターミネーターに加えてまたはその代わりに、プロモーターとコーディング領域との間の比較的長いDNA配列の挿入もまた、概して介在配列の長さに比例して、コーディング領域の転写を妨害する傾向がある。この効果は、RNAポリメラーゼ分子が転写されているDNAから脱離するある程度の傾向が常に存在するために生じると推定され、コーディング領域に達する前に通過される配列の長さを増加させることは、概して、コーディング領域の転写が完了する前または場合によっては開始される前にさえ脱離が起こる可能性を増加させる。ターミネーターは、したがって、1方向のみから（「1方向性」ターミネーター）または両方向から（「2方向性」ターミネーター）の転写を防止してもよく、配列特異的終結配列または配列非特異的ターミネーターまたは両方を含んでもよい。様々なそのようなターミネーター配列は当技術分野において公知であり、本開示の文脈内のそのような配列の実例的な使用は以下において提供される。
【００２４】
「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞株」、および他のそのような用語は、例えば、組換えウイルスまたは組換え融合ポリペプチドを作製するために本開示において有用な、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの高等真核細胞を表す。これらの細胞には、形質導入された元々の細胞の子孫が含まれる。単一細胞の子孫は元々の親細胞に必ずしも完全に同一（形態またはゲノム相補体において）でなくてもよいことが理解される。
【００２５】
「組換え」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、および/またはライゲーション工程、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドとは別個の構築物を結果としてもたらす他の手法の様々な組合せの生成物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。この用語は、元々のポリヌクレオチド構築物の複製物および元々のウイルス構築物の子孫をそれぞれ含む。
【００２６】
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複化、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含むポリヌクレオチドの機能的な調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響することがあり、増進性または阻害性であってもよい。当技術分野において公知の制御エレメントとしては、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、ある特定の条件下においてRNAポリメラーゼに結合してプロモーターの下流（3'方向）に通常位置するコーディング領域の転写を開始させることができるDNA領域である。プロモーターとしては、AAVプロモーター、例えば、P5、P19、P40、およびAAV ITRプロモーターの他に、異種プロモーターが挙げられる。
【００２７】
「発現ベクター」は、関心対象の遺伝子産物をコードし、意図する標的細胞における遺伝子産物の発現をもたらすために使用される領域を含むベクターである。発現ベクターはまた、標的中のタンパク質の発現を促進するためにコーディング領域に機能的に連結された制御エレメントを含む。制御エレメントとそれらが発現のために機能的に連結された1つまたは複数の遺伝子との組合せは「発現カセット」と称されることがあり、多数の発現カセットが当技術分野において公知かつ使用可能であるか、または当技術分野において使用可能な成分から容易に構築され得る。
【００２８】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書において交換可能に使用される。該用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、ホスホニル化、脂質化、または標識化成分との共役といった修飾が為されたアミノ酸ポリマーを包含する。
【００２９】
「外因性」という用語は、細胞中または生物中のタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドに関して使用される場合、人工的なまたは天然の手段により細胞または生物に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを指す。外因性核酸は異なる生物もしくは細胞からのものであってもよいか、または、それは、生物もしくは細胞内に天然に存在する核酸の追加の1コピーもしくは複数コピーであってもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、天然細胞のそれとは異なる染色体位置に存在するか、またはそれ以外の場合では、天然に見出される異なる核酸配列、例えば、1つの遺伝子からのプロモーターを異なる遺伝子からの遺伝子産物のためのオープンリーディングフレームに連結する発現カセットにより隣接されている。
【００３０】
「形質転換された」または「トランスジェニック」は、少なくとも1つの組換えDNA配列の存在により変更または強化された任意の宿主細胞または細胞株を含めるために本明細書において使用される。宿主細胞は、典型的には、単離された直鎖状DNA配列としての、プラスミド発現ベクター中のDNA配列のトランスフェクション、または組換えウイルスベクターを用いる感染により作製される。
【００３１】
「配列相同性」という用語は、2つの核酸配列の間の塩基マッチの割合または2つのアミノ酸配列の間の割合のアミノ酸マッチを意味する。配列相同性がパーセンテージ、例えば、50％として表される場合、パーセンテージは、何らかの他の配列に対して比較される選択される配列の長さにわたるマッチの割合を表す。（2つの配列のいずれかにおける）ギャップがマッチングを最大化することを可能にし、15塩基またはそれ未満のギャップ長さが通常使用され、6塩基またはそれ未満が好ましく、2塩基またはそれ未満がより好ましい。プローブまたは治療としてオリゴヌクレオチドを使用する場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列相同性は、概して、20個の可能なオリゴヌクレオチド塩基対マッチのうちの17個以上の標的塩基マッチ（85％）、10個の可能な塩基対マッチのうちの9個以上のマッチ（90％）、または20個の可能な塩基対マッチのうちの19個以上のマッチ（95％）である。
【００３２】
2つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的または完全な同一性がある場合に相同的である。例えば、85％の相同性は、2つの配列を最大マッチングのためにアライメントした場合に85％のアミノ酸が同一であることを意味する。（マッチングされている2つの配列のいずれかにおける）ギャップがマッチングの最大化を可能にし、5つまたはそれ未満のギャップ長さが好ましく、2つまたはそれ未満がより好ましい。代替的に、2つのタンパク質配列（または少なくとも30アミノ酸の長さの2つのタンパク質配列に由来するポリペプチド配列）は、この用語が本明細書において使用される場合、変異データマトリックスおよび6またはより大きいギャップペナルティを用いてプログラムALIGNを使用して（標準偏差単位において）5より大きいアライメントスコアを有する場合に相同的である。2つの配列またはその部分は、それらのアミノ酸がALIGNプログラムを使用して最適にアライメントされた場合に50％超または50％同一である場合により相同的である。
【００３３】
「対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体もしくは部分に構造的に関連すること、またはポリペプチド配列が（例えば、フレームワーク配列もしくはCDR配列の）参照ポリペプチド配列の全体もしくは部分に構造的に関連することを意味するために本明細書において使用され、例えば、それらは、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％の配列同一性を有する。対比的に、「相補的」という用語は、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体または部分に相同的であることを意味するために本明細書において使用される。実例のために、ヌクレオチド配列「TATAC」は参照配列「TATAC」に対応し、かつ参照配列「GTATA」に相補的である。
【００３４】
「配列同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにわたり同一（すなわち、ヌクレオチド1つ毎を基準にして）であることを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにわたり同一（すなわち、ヌクレオチド1つ毎を基準にして）であることを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、比較のウィンドウにわたり2つの最適にアライメントされた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、U、またはI）が両方の配列において存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、かつ結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。本明細書において使用される「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも20ヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたり、頻繁には少なくとも20〜50ヌクレオチドのウィンドウにわたり、参照配列と比較して少なくとも85パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95パーセントの配列同一性、より通常は少なくとも99パーセントの配列同一性を有する配列を含み、配列同一性のパーセンテージが、比較のウィンドウにわたり参照配列の合計20パーセントまたはそれ未満である欠失または付加を含んでもよいポリヌクレオチド配列に対して参照配列を比較することにより算出される、ポリヌクレオチド配列の特徴を表す。
【００３５】
「保存的」アミノ酸置換は、例えば、極性酸性アミノ酸としてのアスパラギン酸-グルタミン酸、極性塩基性アミノ酸としてのリジン/アルギニン/ヒスチジン、非極性または疎水性アミノ酸としてのロイシン/イソロイシン/メチオニン/バリン/アラニン/グリシン/プロリン、極性または非荷電性親水性アミノ酸としてのセリン/スレオニンである。保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づくグループ分けを含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、スレオニンのセリンによる置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸による類似の置換は、結果として生じるポリペプチドの特性に対して大きな効果を有しないと予測することが合理的である。アミノ酸の変更が機能的なポリペプチドを結果としてもたらすかどうかは、ポリペプチドの比活性をアッセイすることにより容易に判定され得る。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる:（1）疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;（2）中性親水性:cys、ser、thr;（3）酸性:asp、glu;（4）塩基性:asn、gln、his、lys、arg;（5）鎖配向に影響を及ぼす残基:gly、pro;および（6）芳香族;trp、tyr、phe。
【００３６】
本開示はまた、非保存的置換を有するポリペプチドを想定する。非保存的置換は、上記のクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスのメンバーに交換することを要する。
【００３７】
「核酸配列」は、DNAまたはRNAのポリマー、すなわち、一本鎖または二本鎖であり得、かつ非天然のまたは変更されたヌクレオチドを含有し得るポリヌクレオチドを包含することが意図される。本明細書において使用される「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド（RNA）またはデオキシリボヌクレオシド（DNA）のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は、分子の一次構造を指し、したがって、二本鎖および一本鎖DNAならびに二本鎖および一本鎖RNAを含む。この用語は、等価物として、ヌクレオチドアナログから作製されたRNAまたはDNAのいずれかのアナログならびに限定されないがメチル化および/またはキャップ付加ポリヌクレオチドなどの修飾ポリヌクレオチドを含む。
【００３８】
好酸球または好酸球数を増加させる分子に対する抗体を形成するポリペプチドをコードする核酸配列
抗体は4つのポリペプチド、すなわち、重（H）鎖ポリペプチドの2つの同一コピーおよび軽（L）鎖ポリペプチドの2コピーからなることを当業者は理解する。各重鎖は、1つのN末端可変（VH）領域および3つのC末端定常（CH1、CH2、およびCH3）領域を含有し、各軽鎖は、1つのN末端可変（VL）領域および1つのC末端定常（CL）領域を含有する。軽鎖および重鎖の各ペアの可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体（「抗好酸球」抗体）をコードする核酸配列は、そのそれぞれが抗好酸球抗体の重鎖および/または軽鎖ポリペプチドのうちの1つまたは複数をコードする1つまたは複数の核酸配列を含み得る。これに関して、好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体をコードする核酸配列は、抗好酸球抗体の2つの重鎖ポリペプチドおよび2つの軽鎖ポリペプチドをコードする単一の核酸配列を含み得る。代替的に、好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体をコードする核酸配列は、抗好酸球抗体の両方の重鎖ポリペプチドをコードする第1の核酸配列、および抗好酸球抗体の両方の軽鎖ポリペプチドをコードする第2の核酸配列を含み得る。さらに別の態様では、好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体をコードする核酸配列は、抗好酸球抗体の第1の重鎖ポリペプチドをコードする第1の核酸配列、抗好酸球抗体の第2の重鎖ポリペプチドをコードする第2の核酸配列、抗好酸球抗体の第1の軽鎖ポリペプチドをコードする第3の核酸配列、および抗好酸球抗体の第2の軽鎖ポリペプチドをコードする第4の核酸配列を含み得る。
【００３９】
別の態様では、好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体をコードする核酸配列は、抗好酸球抗体の抗原結合断片（「抗体断片」とも称される）をコードする。「抗原結合断片」という用語は、抗原（例えば、好酸球）に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数の断片を指す。抗原結合断片の例としては、（i）VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価断片であるFab断片;（ii）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF（ab'）2断片;ならびに（iii）抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。一態様では、好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体をコードする核酸配列は、抗好酸球抗体のFab断片をコードする核酸配列を含み得る。
【００４０】
抗体またはその抗原結合断片は、インビトロの供給源（例えば、組換えにより抗体を産生するハイブリドーマまたは細胞株）およびインビボの供給源（例えば、齧歯動物）を介するものを含む、任意の手段により得られ得る。抗体を生成する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Kohler and Milstein,Eur.J.Immunol.,5:511（1976）;Harlow and Lane（eds.）,Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press（1988）;およびC.A.Janeway et al.（eds.）,Immunobiology,5th Ed.,Garland Publishing,New York,NY（2001）において記載されている。ある特定の態様では、ヒト抗体またはキメラ抗体は、1つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子が1つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子により置換されているトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して生成され得る。内因性の抗体遺伝子がヒト抗体遺伝子により効果的に置換されているトランスジェニックマウスの例としては、HUMAB-MOUSE（商標）、Kirin TC MOUSE（商標）、およびKM-MOUSE（商標）が挙げられるがそれらに限定されるわけではない（例えば、Lonberg,Nat.Biotechnol.,23（9）:1117（2005）、およびLonberg,Handb.Exp.Pharmacol.,181:69（2008）を参照）。
【００４１】
好酸球上のリガンドに結合する抗体もしくは哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸配列は、当技術分野において公知の方法を使用して生成され得る。例えば、核酸配列、ポリペプチド、およびタンパク質は、標準的な組換えDNA方法論を使用して組換えにより作製され得る（例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,2001;およびAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley＆Sons,NY,1994を参照）。さらに、合成により作製される、好酸球上のリガンドに結合する抗体もしくは哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸配列は、細菌、昆虫、または哺乳動物など、例えば、ラット、ヒトなどの供給源から単離および/または精製され得る。単離および精製の方法は当技術分野において周知である。代替的に、本明細書に記載の核酸配列は商業的に合成され得る。これに関して、核酸配列は、合成、組換え、単離、および/または精製されたものであり得る。
【００４２】
好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体をコードする核酸配列は、使用可能な抗体産生ハイブリドーマ細胞からRNAを抽出することにより同定されてもよい。cDNAは逆転写ならびに軽鎖および重鎖のPCR増幅により作製され、定常ドメイン中の保存領域のための特定のプライマーと組み合わせてcDNA末端迅速増幅（RACE）戦略を使用して実行される。
【００４３】
好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体をコードする核酸配列はまた、当技術分野において公知の手段により全体的または部分的にヒト化されてもよい。例えば、抗体キメラは、抗体のマウスFc領域をコードするDNAをヒト用にコードするcDNAのそれと置換することにより作製されてもよい。
【００４４】
前記分子のFab部分はまた、適切な個々のアミノ酸について配列を交換することによりヒトにおけるものとは異なるFab配列の非CDR部分のDNAを選択的に変更することによりヒト化されてもよい。
【００４５】
代替的に、ヒト化は、ヒト抗体「スキャフォールド」への適切なCDRコーティングセグメントの挿入により達成されてもよい。
【００４６】
結果として生じる抗体DNA配列は、RNA不安定性要素の除去を通じて哺乳動物細胞中での高い発現レベルのために最適化されてもよく、当技術分野において公知である。
【００４７】
一態様では、抗体を形成するポリペプチド、例えば、好酸球上のリガンドに結合するかまたは哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する2つの軽鎖と2つの重鎖とを有する抗体、scFV、キメラ抗体、および単一重鎖などを形成するポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば、重鎖と軽鎖との間の2A（Chysel）自己切断可能配列を使用して、単一のプロモーターの制御下において発現されてもよい。2A配列はタンパク質の翻訳の間に自己切断し、上流タンパク質のC末端においてアミノ酸の短いテイルを残す。フューリン切断認識部位を2A配列と上流遺伝子との間に付加して残留アミノ酸の除去を確実にしてもよい。正しい挿入物を発現するプラスミドは、DNAシークエンシングによりならびにウエスタン分析およびELISAアッセイを使用する抗体特異的結合により同定されてもよい。
【００４８】
一態様では、好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体を形成するポリペプチドをコードする核酸配列は、異種シグナルペプチド、例えば、IL-2、IL-6、CD5、トリプシノーゲン、血清アルブミン、プロラクチン、エラスチン、キモトリプシン、IL-2、トリプシノーゲン-2、もしくはアバスチン
2021508719.tif 000003
由来のシグナルペプチドもしくは別の免疫グロブリン由来のシグナルペプチド（例えば、参照により本明細書に組み入れられるHaryadi et al.,PloS One,10:e0116878（2015）の表1を参照）もしくは単一のプロモーターの制御下において発現される免疫グロブリン由来の同種シグナルペプチドに機能的に連結されてもよいか、または軽鎖および重鎖は、異なるプロモーターから発現されてもよく、かつ、同じもしくは異なるシグナルペプチドを有してもよい。正しい挿入物を発現するプラスミドは、DNAシークエンシングによりならびにウエスタン分析およびELISAアッセイを使用する抗体特異的結合により同定されてもよい。
【００４９】
抗好酸球ベースの療法
好酸球は骨髄由来の顆粒球性細胞である。それらの発生はインターロイキン-5（IL-5）により調節される。好酸球は、寄生虫病原体との戦いならびにアレルギー性および喘息性障害の病理発生において役割を有する。それらは循環中で約8〜12時間存続し、組織中で約8〜12日間生存する。正常な哺乳動物において、好酸球は＜5％の血中白血球（300〜500個/μl）である。それらは、細胞質顆粒から様々な細胞傷害性メディエーターを放出し得る。
【００５０】
末梢血中の正常な好酸球数は50〜500×109個/lの範囲内である。血中好酸球増加症は、軽度の好酸球増加（最大1500×109個/l）および著明な好酸球増加（＞1500×109個/l）に分けることができる。「組織HE」において、BMおよびリンパ臓器の他に、腸管、特に、胃、小腸、および結腸の粘膜内壁において実質的な数の好酸球が観察される。しかしながら、ほとんどの他の組織および臓器において、いっそう低い好酸球の数が「好酸球増加症」とみなされ得る。組織HEは、好酸球の局所的な著明な増加および/またはMBPなどの好酸球由来タンパク質の著明な沈着により特徴付けられる。基礎となる状態および病因に基づいて、HEのいくつかの変種形態が存在する:遺伝性（家族性）形態（HEF）、（臨床的）意義不明のHE（HEUS）、好酸球がクローン細胞であると考えられる原発性（新生物性）HE（HEN）および好酸球が反応性プロセスにより増大増殖（および活性化）される非クローン細胞であると考えられる二次性（反応性）HE（HER）。まれに、HERは、ホジキンリンパ腫または肺腺癌などのクローンプロセスにより誘発される。
【００５１】
CEL-NOSは、未知の原因の成人慢性好酸球性白血病のサブタイプである。それは、好酸球が浸潤した臓器の機能障害を結果としてもたらす血中好酸球の持続性の上昇（＞1.5×103個/μl）により特徴付けられる。CEL-NOSの症状としては、咳、虚弱、下痢、肝脾腫、心臓障害、および肺機能障害が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。CEL-NOSを有する個体は療法に応答せず、かつ、2年間の、診断からの生存期間中央値を有する。
【００５２】
好酸球増加症に対する遺伝子療法ベースのアプローチは、一態様では、抗好酸球モノクローナルの持続発現を提供してインビボで血中および組織好酸球レベルを低下させかつ死亡率を減少させるための、抗好酸球モノクローナル抗体（例えば、AAVrh.10m抗Eos）をコードするウイルスベクターの使用、例えばAAVベクターの単回投与を含む。以下において記載されるように、好酸球を生成するための骨髄の持続性の刺激を結果としてもたらす高い持続的なレベルのIL-5を発現するマウスIL-5をコードするAAVベクターを使用してCEL-NOSのマウスモデルを生成した。例えば、AAVrh.10m抗Eos）、好酸球細胞表面免疫グロブリン様レクチンに特異的な抗Siglec-F、ラットIgG2bモノクローナル抗体をコードするAAVベクターといった、AAVベースの遺伝子療法ベクターを調製した。本明細書に開示されるように、AAVrh.10mIL-5およびAAVrh.10m抗Eosを0日目に同時にBalb/cマウスに投与した。ベクターに対する既存の免疫を回避するために、免疫不全NOD-scid IL2 Rgammanull（NSG）マウスを使用した。NSGマウスに0日目にAAVrh.10mIL-5を注射した。28日目（表現型の確立後）に、AAVrh.10m抗Eosを注射した。加えて、ヒトにおけるCEL-NOSと関連付けられる特徴を有するCEL-NOSのマウスモデルを生成した。表現型は獲得免疫とは独立していた。CEL-NOSマウスへのAAVrh.10m抗Eosの1回の投与は持続的な抗Siglec-Fレベルを結果としてもたらし、罹患マウスにおける血液中の好酸球の長期抑制を提供した。したがって、AAVrh.10m抗Eosは、CEL-NOSマウスモデルにおいて好酸球数を抑制し、かつ死亡率を低減した。
【００５３】
高レベルの好酸球の慢性持続から保護する戦略は、他の好酸球増加性障害、例えば、他の治療オプションを有しないものに応用可能である。
【００５４】
遺伝子療法ベクター
本開示は、好酸球上のリガンドに結合するモノクローナル抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合するモノクローナル抗体をコードする核酸配列を含む遺伝子療法ベクターを提供する。本開示は、哺乳動物において好酸球に対する免疫応答を生じさせる方法であって、哺乳動物に上記の遺伝子療法ベクターを投与する工程を含む、方法をさらに提供する。遺伝子療法ベクターおよび方法の様々な局面は以下において議論される。各パラメーターは別々に議論されるが、遺伝子療法ベクターおよび方法は、好酸球に関連付けられる病理に対して保護を喚起するための以下において示されるパラメーターの組合せを含む。したがって、パラメーターの任意の組合せは遺伝子療法ベクターおよび方法にしたがって使用され得る。
【００５５】
「遺伝子療法ベクター」は、すなわち、コードされるタンパク質の合成が起こる好適な宿主細胞に異種核酸配列を運ぶ能力を有する任意の分子または組成物である。典型的には、遺伝子療法ベクターは、異種核酸配列を組み込むように当技術分野において公知の組換えDNA技術を使用して操作された核酸分子である。望ましくは、遺伝子療法ベクターはDNAを含む。好適なDNAベースの遺伝子療法ベクターの例としては、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。しかしながら、リポソームなどの核酸に基づかない遺伝子療法ベクターもまた当技術分野において公知であり、使用されている。遺伝子療法ベクターは、単一の種類の核酸（例えば、プラスミド）または非核酸分子（例えば、脂質もしくはポリマー）に基づき得る。遺伝子療法ベクターは宿主細胞ゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームの形態で宿主細胞中に存在し得る。
【００５６】
本開示の範囲内の遺伝子送達ベクターとしては、単離された核酸、例えば、染色体外に維持され得るプラスミドベースのベクター、ならびに、リポソーム中、例えば、中性もしくは陽イオン性リポソーム中、例えば、DOSPA/DOPE、DOGS/DOPEもしくはDMRIE/DOPEリポソーム中に存在する、かつ/またはDNA-抗DNA抗体-陽イオン性脂質（DOTMA/DOPE）複合体などの他の分子と会合したウイルスおよび非ウイルスベクターを含む、ウイルスベクター、例えば、組換えアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パピローマウイルス、もしくはアデノ随伴ウイルスが挙げられるがそれらに限定されるわけではない。例示的なウイルス遺伝子送達ベクターは以下に記載される。遺伝子送達ベクターは、任意の経路を介して投与されてもよく、該経路としては、頭蓋内、髄腔内、筋肉内、頬側、直腸、静脈内、または冠内投与が挙げられるがそれらに限定されるわけではなく、細胞への移入は、エレクトロポレーションおよび/もしくはイオントフォレーシス、ならびに/または細胞外マトリックスもしくはハイドロゲル、例えば、ハイドロゲルパッチなどのスキャフォールド形成を使用して増進されてもよい。
【００５７】
一態様では、遺伝子療法ベクターはウイルスベクターである。好適なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（HSV）ベースのベクター、パルボウイルスベースのベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベースのベクター、AAV-アデノウイルスキメラベクター、およびアデノウイルスベースのベクターが挙げられる。これらのウイルスベクターは、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.（2001）、およびAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley＆Sons,New York,N.Y.（1994）に記載されている標準的な組換えDNA技術を使用して調製され得る。
【００５８】
レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターは、宿主ゲノムに安定的かつ精密に組み込まれて長期導入遺伝子発現を提供する能力を含むいくつかの確固とした特徴を呈する。これらのベクターは、全身性感染および患者間伝染のリスクを最小化するために感染性遺伝子粒子を除去するようにエクスビボでマニピュレートされ得る。シュードタイプのレトロウイルスベクターは宿主細胞のトロピズムを変化させ得る。
【００５９】
レンチウイルス
レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスおよびネコ免疫不全ウイルスを含むレトロウイルスのファミリーに由来する。しかしながら、分裂細胞にのみ感染するレトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し得る。例えば、ヒト免疫不全ウイルスゲノムに基づくレンチウイルスベクターは、インビボでの心筋細胞の効率的な形質導入が可能である。レンチウイルスは特定のトロピズムを有するが、水胞性口内炎ウイルスを用いてウイルスエンベロープをシュードタイプ化することは、より広い範囲を有するウイルスをもたらす（Schnepp et al.,Meth.Mol.Med.,69:427（2002））。
【００６０】
アデノウイルスベクター
アデノウイルスベクターは、ゲノムからのウイルス遺伝子発現に関与する初期（E1AおよびE1B）遺伝子を欠失させることにより複製インコンピテントにされてもよく、染色体外形態で宿主細胞中に安定的に維持される。これらのベクターは、複製細胞および非複製細胞の両方にトランスフェクトする能力を有し、特に、これらのベクターは、例えば、方向注入または灌流後に、インビボで心筋細胞に効率的に感染することが示されている。アデノウイルスベクターは、7日時にピークとなり約4週間続く、インビボでの治療遺伝子の一過性発現を結果としてもたらすことが示されている。導入遺伝子発現の継続期間は、神経特異的プロモーターを用いるシステムにおいて向上されてもよい。加えて、アデノウイルスベクターは、非常に高い力価において作製されて、小容量のウイルスを用いる効率的な遺伝子療法を可能とし得る。
【００６１】
アデノ随伴ウイルスベクター
組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）は、非病原性パルボウイルスに由来し、細胞性免疫応答を本質的に喚起せず、かつほとんどの系において数か月続く導入遺伝子発現を生じさせる。さらに、アデノウイルスのように、アデノ随伴ウイルスベクターはまた、複製細胞および非複製細胞に感染する能力を有し、ヒトにとって非病原性であると考えられている。さらに、それらは、持続的な心臓遺伝子療法のために有望であると思われる（Hoshijima et al,.Nat.Med.,8:864（2002）;Lynch et al.,Circ.Res.,80:197（1997））。
【００６２】
プラスミドDNAベクター
プラスミドDNAは、より手の込んだパッケージングシステムの非存在を指し示すために多くの場合に「ネイキッドDNA」と称される。インビボでの心筋細胞へのプラスミドDNAの直接注射が達成されている。プラスミドベースのベクターは、比較的非免疫原性かつ非病原性であり、細胞ゲノム中に安定的に組み込まれて、インビボで有糸分裂後細胞において長期の遺伝子発現を結果としてもたらす潜在能力を有する。例えば、プラスミドDNAの筋肉注射後の分泌性血管新生因子の発現は、比較的低いレベルの限局性導入遺伝子発現にもかかわらず、動物モデルにおいて顕著な生物学的効果を実証しており、臨床的に有望であると思われる（Isner,Nature,415:234（2002））。さらには、プラスミドDNAは血流中で急速に分解され（wdegraded）、したがって、遠位の臓器系における導入遺伝子発現の可能性はごくわずかである。プラスミドDNAは、高分子複合体、例えば、リポソームまたはDNA-タンパク質複合体の部分として細胞に送達されてもよく、送達は、エレクトロポレーションを含む技術を使用して増進されてもよい。
【００６３】
例示的なAAVベクター
一態様では、本開示は、好酸球に結合する抗体、またはその抗原結合断片をコードする核酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを提供する。AAVベクターが、好酸球に結合する抗体をコードする核酸配列から本質的になる場合、AAVベクターに実質的に影響しない追加の成分（例えば、インビトロでのベクターのマニピュレーションを促進するポリ（A）配列または制限酵素部位などの遺伝子エレメント）が含まれ得る。AAVベクターが、好酸球上のリガンドに結合するモノクローナル抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合するモノクローナル抗体をコードする核酸配列からなる場合、AAVベクターは、いかなる追加の成分（すなわち、AAVにとって内因性でなく、かつ核酸配列の発現をもたらすことにより抗体を提供するために必要とされない成分）も含まない。
【００６４】
アデノ随伴ウイルスは、パルボウイルスファミリーのメンバーであり、約5,000ヌクレオチド未満の直鎖状の一本鎖DNAゲノムを含む。AAVは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（すなわち、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス）を用いる共感染、またはヘルパー遺伝子の発現を必要とする。治療用核酸の投与のために使用されるAAVベクターは、典型的には、DNA複製およびパッケージングのための認識シグナルを含有する末端反復（ITR）のみが残るように親のゲノムの約96％が欠失している。これは、ウイルス遺伝子の発現に起因する免疫学的または毒性副作用を除去する。加えて、産生性細胞への特定のAAVタンパク質の送達は、所望の場合、細胞ゲノムの特定の領域へのAAV ITRを含むAAVベクターの組込みを可能とする（例えば、米国特許第6,342,390号および同第6,821,511号を参照）。組み込まれたAAVゲノムを含む宿主細胞は、細胞の成長または形態において変化を示さない（例えば、米国特許第4,797,368号を参照）。
【００６５】
AAV ITRは、非構造的な複製（Rep）タンパク質および構造的なキャプシド（Cap）タンパク質（ビリオンタンパク質（VP）としても公知）のための特有のコーディングヌクレオチド配列に隣接する。末端の145ヌクレオチドは自己相補的であり、T字形ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内デュプレックスが形成され得るように編成されている。これらのヘアピン構造は、細胞DNAポリメラーゼ複合体のためのプライマーとして働くことによりウイルスDNA複製のための起点として機能する。Rep遺伝子は、Repタンパク質Rep78、Rep68、Rep52、およびRep40をコードする。Rep78およびRep68はp5プロモーターから転写され、Rep 52およびRep40はp19プロモーターから転写される。Rep78およびRep68タンパク質は、AAV末端の分解を可能とするために産生性複製の間にヘリカーゼおよびニッカーゼ機能を行う多機能性DNA結合タンパク質である（例えば、Im et al.,Cell,61:447（1990）を参照）。これらのタンパク質はまた、内因性AAVプロモーターおよびヘルパーウイルス内のプロモーターからの転写を調節する（例えば、Pereira et al.,J.Virol.,71:1079（1997）を参照）。他のRepタンパク質は、Rep78およびRep68の機能を修飾する。cap遺伝子は、キャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3をコードする。cap遺伝子はp40プロモーターから転写される。
【００６６】
AAVベクターは、当技術分野において公知の任意のAAV血清型を使用して生成されてもよい。いくつかのAAV血清型および100種類を超えるAAV変種がアデノウイルスストックからまたはヒトもしくは非ヒト霊長動物組織から単離されている（例えば、Wu et al.,Molecular Therapy,14（3）:316（2006）において総説されている）。概して、AAV血清型は、核酸配列およびアミノ酸配列レベルにおいて顕著な相同性のゲノム配列を有し、それにより、異なる血清型は、同一のセットの遺伝学的機能を有し、本質的に物理的および機能的に同等のビリオンを産生し、かつこのビリオンは実際的に同一の機序により複製およびアセンブルする。AAV血清型1〜5および7〜9は、全ての他の既存の特徴決定された血清型に特異的な中和血清と効率的に交差反応しないという点において、「真の」血清型として定義される。対照的に、AAV血清型6、10（Rh10とも称される）、および11は、「真の」血清型の定義に当てはまらないため「変種」血清型と考えられる。AAV血清型2（AAV2）は、病原性の欠如、広範囲の感染力、および長期の導入遺伝子発現を確立する能力に起因して遺伝子療法応用のために大規模に使用されてきた（例えば、Carter,Hum.Gene Ther.,16:541（2005）;およびWu et al.、前記を参照）。様々なAAV血清型のゲノム配列およびその比較は、例えば、GenBankアクセッション番号U89790、J01901、AF043303、およびAF085716;Chiorini et al.,J.Virol.,71:6823（1997）;Srivastava et al.,J.Virol.,45:555（1983）;Chiorini et al.,J.Virol.,73:1309（1999）;Rutledge et al.,J.Virol.,72:309（1998）;およびWu et al.,J.Virol.,74:8635（2000）において開示されている。
【００６７】
AAV repおよびITR配列は、ほとんどのAAV血清型にわたり特に保存されている。例えば、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、およびAAV6のRep78タンパク質は、約89〜93％同一であると報告されている（Bantel-Schaal et al.,J.Virol.,73（2）:939（1999）を参照）。AAV血清型2、3A、3B、および6は、ゲノムレベルにおいて約82％の合計ヌクレオチド配列同一性を共有することが報告されている（Bantel-Schaal et al.、前記）。さらに、多くのAAV血清型のrep配列およびITRは、哺乳動物細胞におけるAAV粒子の産生の間に他の血清型からの対応する配列を効率的に相互補完（例えば、機能的に代替）することが公知である。
【００６８】
概して、AAV粒子の細胞トロピシティーを決定するcapタンパク質、および関連するcapタンパク質コーディング配列は、異なるAAV血清型にわたりRep遺伝子より著しく保存度が低い。他の血清型の対応する配列を相互補完する能力のRepおよびITR配列を考慮して、AAVベクターは、血清型の混合物を含み得、それにより、「キメラ」または「シュードタイプ」AAVベクターであり得る。キメラAAVベクターは、典型的には、2つまたはそれ以上（例えば、2つ、3つ、4つなど）の異なるAAV血清型に由来するAAVキャプシドタンパク質を含む。対照的に、シュードタイプAAVベクターは、別のAAV血清型のキャプシド中にパッケージングされた1つのAAV血清型の1つまたは複数のITRを含む。キメラおよびシュードタイプAAVベクターは、例えば、米国特許第6,723,551号;Flotte,Mol.Ther.,13（1）:1（2006）;Gao et al.,J.Virol.,78:6381（2004）;Gao et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:11854（2002）;De et al.,Mol.Ther.,13:67（2006）;およびGao et al.,Mol.Ther.,13:77（2006）においてさらに記載されている。
【００６９】
一態様では、AAVベクターは、ヒトに感染するAAV（例えば、AAV2）を使用して生成される。代替的に、AAVベクターは、例えば、大型類人猿（例えば、チンパンジー）、旧世界ザル（例えば、マカク）、および新世界ザル（例えば、マーモセット）などの非ヒト霊長動物に感染するAAVを使用して生成される。一態様では、AAVベクターは、ヒトに感染するAAVを用いてシュードタイプ化された非ヒト霊長動物に感染するAAVを使用して生成される。そのようなシュードタイプAAVベクターの例は、例えば、Cearley et al.,Molecular Therapy,13:528（2006）において開示されている。一態様では、AAV2逆位末端反復（ITR）を用いてシュードタイプ化されたアカゲザルに感染するAAVからのキャプシドタンパク質を含むAAVベクターが生成され得る。特定の態様では、AAVベクターは、AAV2 ITRを用いてシュードタイプ化されたアカゲザルに感染するAAV10（「AAVrh.10」とも称される）からのキャプシドタンパク質を含む（例えば、Watanabe et al.,Gene Ther.,17（8）:1042（2010）;およびMao et al.,Hum.Gene Therapy,22:1525（2011）を参照）。
【００７０】
好酸球に対する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸配列に加えて、AAVベクターは、宿主細胞中での核酸配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、および内部リボソーム進入部位（IRES）などの発現制御配列を含んでもよい。例示的な発現制御配列は当技術分野において公知であり、例えば、Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,CA.（1990）において記載されている。
【００７１】
様々な異なる供給源からの、構成的、誘導性、および抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターが当技術分野において周知である。プロモーターの代表的な供給源としては、例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母、および細菌が挙げられ、これらの供給源からの好適なプロモーターは容易に入手可能であるか、または、例えば、ATCCなどの寄託機関の他に、他の市販供給元または個人的な供給元からの、公開されている配列に基づいて合成により作製され得る。プロモーターは、1方向性（すなわち、1つの方向において転写を開始させる）または2方向性（すなわち、3'もしくは5'方向のいずれかにおいて転写を開始させる）であり得る。プロモーターの非限定的な例としては、例えば、T7細菌発現系、pBAD（araA）細菌発現系、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、SV40プロモーター、およびRSVプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、例えば、Tetシステム（米国特許第5,464,758号および同第5,814,618号）、エクジソン誘導性システム（No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,93:3346（1996））、T-REXTMシステム（Invitrogen、Carlsbad、CA）、LACSWITCH（商標）システム（Stratagene、San Diego、CA）、ならびにCre-ERTタモキシフェン誘導性リコンビナーゼシステム（Indra et al.,Nuc.Acid.Res.,27:4324（1999）;Nuc.Acid.Res.,28:e99（2000）;米国特許第7,112,715号;およびKramer＆Fussenegger,Methods Mol.Biol.,308:123（2005））が挙げられる。
【００７２】
本明細書において使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが機能的に連結された核酸配列の、転写を増加させるDNA配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコーディング領域から多くのキロ塩基だけ離れて位置することができ、調節因子の結合、DNAメチル化のパターン、またはDNA構造の変化を媒介し得る。様々な異なる供給源からの多数のエンハンサーが当技術分野において周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとしてまたは該ポリヌクレオチド内において（例えば、ATCCなどの寄託機関の他に、他の市販供給元または個人的な供給元から）入手可能である。プロモーター（例えば、一般的に使用されるCMVプロモーター）を含む多数のポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列を含む。エンハンサーは、コーディング配列の上流、内部、または下流に位置し得る。一態様では、好酸球に対する抗体、またはその抗原結合断片をコードする核酸配列は、CMVエンハンサー/ニワトリβアクチンプロモーター（「CAGプロモーター」とも称される）に機能的に連結されている（例えば、Niwa et al.,Gene,108:193（1991）;Daly et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96:2296（1999）;およびSondhi et al.,Mol.Ther.,15:481（2007）を参照）。
【００７３】
典型的には、AAVベクターは、充分に特徴決定されたプラスミドを使用して作製される。例えば、ヒト胎児腎臓293T細胞に複数の導入遺伝子特異的プラスミドのうちの1つ、ならびにアデノウイルスヘルパーおよびAAV repおよびcap遺伝子（必要に応じてAAVrh.10、8、または9に特異的）を含有する別のプラスミドがトランスフェクトされる。72時間後に、細胞が回収され、ベクターが5回の凍結/解凍サイクルにより細胞から放出される。その後の遠心分離およびベンゾナーゼ処理により細胞細片および非キャプシド化DNAが除去される。各AAVベクターをさらに精製するためにイオジキサノール勾配およびイオン交換カラムが使用されてもよい。次に、精製されたベクターは、サイズ排除遠心分離スピンカラムにより必要とされる濃度まで濃縮される。最後に、緩衝液が交換されて、（例えば）1×のリン酸緩衝生理食塩水中に配合された最終ベクター生成物が作製される。ウイルス価がTaqMan（登録商標）リアルタイムPCRにより測定されてもよく、ウイルス純度がSDS-PAGEにより評価されてもよい。
【００７４】
薬学的組成物および送達
本開示は、上記の遺伝子療法ベクターおよび薬学的に許容される（例えば、生理学的に許容される）担体を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる組成物を提供する。組成物が遺伝子療法ベクターおよび薬学的に許容される担体から本質的になる場合、組成物に実質的に影響しない追加の成分（例えば、佐剤、緩衝剤、安定化剤、抗炎症剤、可溶化剤、防腐剤など）が含まれ得る。組成物が遺伝子療法ベクターおよび薬学的に許容される担体からなる場合、組成物はいかなる追加の成分も含まない。任意の好適な担体を本開示の文脈内において使用することができ、そのような担体は当技術分野において周知である。担体の選択は、部分的には、組成物が投与され得る特定の部位および組成物を投与するために使用される特定の方法により決定される。組成物は、任意で、本明細書に記載の遺伝子療法ベクターの例外と共に無菌であり得る。組成物は、貯蔵のために凍結または凍結乾燥および使用前に好適な無菌の担体中に再構成され得る。組成物は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Lippincott Williams＆Wilkins,Philadelphia,PA（2001）において記載される従来技術にしたがって生成され得る。
【００７５】
組成物のための好適な製剤としては、水性および非水性溶液、抗酸化剤、緩衝剤、および静菌剤を含有し得る等張無菌溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単回用量または複数用量の密閉容器中で提供され得、使用の直前に無菌の液体担体、例えば、水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態において貯蔵され得る。即席溶液および懸濁液が、以前に記載された種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。一態様では、担体は緩衝生理食塩水溶液である。一態様では、遺伝子療法ベクターは、投与前の損傷から遺伝子療法ベクターを保護するために製剤化された組成物中で投与される。例えば、組成物は、ガラス製品、シリンジ、または針などの遺伝子療法ベクターを調製、貯蔵、または投与するために使用されるデバイス上での遺伝子療法ベクターの損失を低減するために製剤化され得る。組成物は、遺伝子療法ベクターの光感受性および/または温度感受性を減少させるために製剤化され得る。この目的のために、組成物は、例えば、上記のものなどの薬学的に許容される液体担体、ならびにポリソルベート80、L-アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびそれらの組合せからなる群より選択される安定化剤を含んでもよい。そのような組成物の使用は、遺伝子療法ベクターの貯蔵寿命を延長させ、投与を促進し、かつ方法の効率を増加させる。遺伝子療法ベクター含有組成物のための製剤は、例えば、Wright et al.,Curr.Opin.Drug Discov.Devel.,6（2）:174-178（2003）およびWright et al.,Molecular Therapy,12:171-178（2005）においてさらに記載されている。
【００７６】
前記組成物はまた、形質導入効率を増進するために製剤化され得る。加えて、遺伝子療法ベクターは、他の治療用物質または生物学的活性物質と共に組成物中に存在し得ることを当業者は理解する。例えば、イブプロフェンまたはステロイドなどの炎症を制御する因子は、遺伝子療法ベクターのインビボ投与と関連付けられる腫脹および炎症を低減するために組成物の部分であり得る。免疫系刺激因子またはアジュバント、例えば、インターロイキン、リポ多糖、および二本鎖RNAは、抗好酸球免疫応答を増進または修飾するために投与され得る。抗生物質、すなわち、殺菌剤および殺真菌剤は、既存の感染症を治療するためおよび/または遺伝子療法手法と関連付けられる感染症などの将来の感染症のリスクを低減するために存在し得る。
【００７７】
注射可能なデポー形態は、ポリラクチド-ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に対象化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製される。薬物対ポリマーの比、および用いられる特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射可能な製剤はまた、身体組織と適合性であるリポソーム中またはマイクロエマルション中に薬物を捕捉させることにより調製される。
【００７８】
ある特定の態様では、製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリル酸およびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）（poly（butic acid））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド-コ-カプロラクトン）、多糖、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリレート、ならびにそのブレンド物、混合物、またはコポリマーからなる群より選択される生体適合性ポリマーを含む。
【００７９】
前記組成物は、スポンジ、生体適合性の網細工、機械的なリザーバー、または機械的なインプラントなどの制御または持続放出を可能とするデバイス中または該デバイス上で投与され得る。インプラント（例えば、米国特許第5,443,505号を参照）、デバイス（例えば、米国特許第4,863,457号を参照）、例えば、埋込み可能なデバイス、例えば、機械的なリザーバーまたはインプラントまたはポリマー組成物を含むデバイスは、遺伝子療法ベクターの投与のために特に有用である。組成物はまた、例えば、ゲルフォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポリホスホエステル、例えば、ビス-2-ヒドロキシエチル-テレフタレート（BHET）、および/またはポリ乳酸-グリコール酸を含む持続放出製剤の形態（例えば、米国特許第5,378,475号を参照）で投与され得る。
【００８０】
遺伝子療法ベクターを含む組成物の送達は、当技術分野において公知のデバイスを使用して、脳内（実質内、脳室内、もしくは槽内が挙げられるがそれらに限定されるわけではない）、髄腔内（腰部もしくは大槽が挙げられるがそれらに限定されるわけではない）、もしくは静脈内が挙げられるがそれに限定されるわけではない全身性、またはそれらの任意の組合せであってもよい。送達はまた、埋込みデバイスの外科的移植を介するものであってもよい。
【００８１】
哺乳動物に投与される組成物中の遺伝子療法ベクターの用量は多数の要因に依存し、該要因としては、哺乳動物のサイズ（質量）、任意の副作用の程度、および特定の投与経路などが挙げられる。一態様では、方法は、本明細書に記載の遺伝子療法ベクターを含む「治療に効果的な量」の組成物を投与する工程を含む。「治療に効果的な量」は、所望の治療結果を達成するために必要な、投与量および時間的期間についての効果的なある量を指す。治療に効果的な量は、個体の好酸球関連病理の程度、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する遺伝子療法ベクターの能力などの要因にしたがって変化してもよい。特定の治療効果を達成するために必要とされる組成物中の遺伝子療法ベクターの用量は、典型的には、ベクターゲノムコピー/細胞（gc/細胞）またはベクターゲノムコピー/体重キログラム（gc/kg）の単位において投与される。当業者は、これらおよび当技術分野において周知の他の要因に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を治療するための適切な遺伝子療法ベクター用量範囲を容易に決定することができる。治療に効果的な量は1×1010ゲノムコピー〜1×1013ゲノムコピーであってもよい。治療に効果的な量は1×1011ゲノムコピー〜1×1014ゲノムコピーであってもよい。治療に効果的な量は1×1012ゲノムコピー〜1×1015ゲノムコピーであってもよい。治療に効果的な量は1×1013ゲノムコピー〜1×1016ゲノムコピーであってもよい。
【００８２】
一態様では、組成物は、哺乳動物に1回投与される。組成物の単回投与は、最小の副作用と共に哺乳動物において抗好酸球抗体の持続性の発現を結果としてもたらすと考えられる。しかしながら、ある特定の場合には、組成物への細胞の充分な曝露を確実にするために治療的な期間中に組成物を複数回投与することが適切であり得る。例えば、組成物は、治療期間中に2回またはそれ以上の回数（例えば、2、3、4、5、6、6、8、9、もしくは10回またはそれ以上の回数）哺乳動物に投与されてもよい。
【００８３】
本開示は、上記の通り、好酸球上のリガンドに結合する抗体、または哺乳動物におけるその存在が好酸球の数を増加させる分子に結合する抗体をコードする核酸配列を含む治療に効果的な量の遺伝子療法ベクターを含む薬学的に許容される組成物を提供する。
【００８４】
抗好酸球遺伝子療法に適する疾患および障害
本明細書に記載の遺伝子療法ベクターは、内因性または外因性の好酸球性障害、例えば、概して好酸球系列における遺伝子突然変異の結果である好酸球性障害またはT細胞もしくは腫瘍細胞に由来する好酸球産生因子（eosinopoietic factor）の産生に起因する好酸球性障害を予防、抑制、または治療するために用いられてもよい。外因性の疾患または障害としては、T細胞媒介性好酸球増加症、例えば、アレルギー性鼻結膜炎、気管支喘息、およびアトピー性皮膚炎を含むアレルギー性疾患、薬物過敏症、例えば、好酸球増加症および全身症状を伴う薬物性発疹（DRESS）、スティーブン-ジョンソン症候群（SJS）、ならびに毒性表皮壊死症（TEN）、急性細菌またはウイルス感染症、例えば、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、寄生蠕虫感染症およびアスペルギルス症およびコクシジオイデス症、自己免疫疾患、例えば、原発性胆汁性肝硬変、全身性硬化症、皮膚筋炎、全身性ループス、およびシェーグレン症候群が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。類天疱瘡、天疱瘡、表皮溶解、および自己免疫性プロゲステロン皮膚炎などの皮膚科的状態、免疫不全、移植片対宿主病、肥胖細胞症、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎および胃腸炎、好酸球性大腸炎;肺好酸球増加症、例えば、単純性肺好酸球増加症、慢性好酸球性肺炎、急性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症およびチャーグ・ストラウス症候群と関連付けられる肺好酸球増加症および好酸球増加症候群;T細胞由来腫瘍は、好酸球増加症と関連付けられている。これらには、セザリー症候群、T細胞リンパ芽球性リンパ腫、およびT細胞白血病/リンパ腫、ランゲルハンス細胞組織球増加症が含まれ、B細胞腫瘍もまた好酸球増加症と関連付けられている。実際、ホジキンリンパ腫において存在する特徴的なリード-ステルンベルグ細胞;および好酸球増加症のリンパ増殖性形態は、IL-5を同化するCD4＋Th2様リンパ球のクローン性増大増殖に起因することが記載されている。
【００８５】
一態様では、疾患または障害は、好酸球産生因子の内因性産生と関連付けられ、該疾患または障害としては、慢性好酸球性白血病、好酸球増加を伴う慢性骨髄性白血病、真性多血症と関連付けられる骨髄増殖性障害、または本態性血小板血症、染色体組換えが見出されていない特発性好酸球増加症候群が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。他の障害としては、X連鎖性好酸球増加症候群、家族性好酸球増加症および好酸球増加を伴う偶発性血管性浮腫、好酸球性脂肪織炎、木村病、および好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、好酸球性筋膜炎、ウェルズ症候群または好酸球性蜂巣炎、好酸球性膿疱性毛包炎、および再発性皮膚壊死性好酸球性血管炎が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。
【００８６】
一態様では、疾患または障害は、感染性疾患、例えば、蠕虫感染症などの寄生虫感染症もしくはコクシジオミセス感染症およびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症などの真菌感染症、または疥癬もしくはハエウジ症を結果としてもたらす外寄生、アレルギー性もしくはアトピー性疾患、例えば、薬物過敏症、胃腸炎、食道炎、肝胆道系疾患、髄膜炎、心臓障害、泌尿生殖器障害、免疫不全、内分泌学的障害、肺障害、皮膚疾患、関節リウマチ、血管炎、もしくはがんと関連付けられるもの、例えば、好酸球増加症候群である。一態様では、疾患または障害は、感染性疾患、例えば、寄生虫感染症、真菌感染症（例えば、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症もしくはコクシジオイデス症）、血液学的もしくは新生物性障害、例えば、慢性好酸球性白血病を含む好酸球増加症候群（HES）、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、最も一般的にはB細胞ALL）、リンパ腫（例えば、ホジキン、TおよびB細胞リンパ腫）、CML、AML、ASM、MDS、JAK2 V617F、PDGFRA、PDGRFBもしくはFGFR1における異常を伴う骨髄新生物、または腫瘍随伴腺癌（tumor associated adenocarcinoma）、扁平癌、大細胞肺癌、膀胱の移行上皮癌、もしくは全身性肥胖細胞症、免疫学的障害、例えば、原発性免疫不全疾患（例えば、高IgE症候群、オーメン症候群、Dock8欠損症、IPEX、もしくはZap70欠損症）もしくは移植片対宿主病、内分泌学的障害、例えば、副腎機能低下症、または照射、アテローム塞栓性障害もしくはサルコイドーシスと関連付けられる好酸球増加症である。好酸球増加症と関連付けられる蠕虫感染症としては、住血線虫症（angiostrongyloidiasis）、回虫症、肝吸虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア感染症、リンパフィラリア症、ブルギア属虫（Brugia）、ウケレリア属虫（Wuchereria）、ロア糸状虫（Loa loa）、マンソネラ・オザルディ（Mansonella ozzardi）、マンソネラ・ペルスタンス（Mansonella perstans）、マンソネラ・ストレプトセルカ（Mansonella streptocerca）、オンコセルカ・ボルブルス（Onchocerca volvulus）、熱帯性肺好酸球増加症、顎口虫症、鉤虫、オピストルキス症、肺吸虫症、住血吸虫症、住血吸虫ヘマトビウム（Schistosoma haematobium）、住血吸虫インテルカラーツム（Schistosoma intercalatum）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、住血吸虫マンソニ（Schistosoma mansoni）、住血吸虫メコンギ（Schistosoma mekongi）、糞線虫症、旋毛虫症、内臓幼虫移行症、トキソカラ・カニス（Toxocara canis）;Tカチス（T catis）、またはバイリサスカリス・プロシオニス（Baylisascaris procyonis）が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。
【００８７】
本明細書に記載の遺伝子療法ベクターを用いて予防、抑制、または治療され得る、臓器制約的関与と著明な末梢好酸球増加とを伴う疾患または障害としては、皮膚および皮下疾患、例えば、好酸球増加を伴う突発性血管性浮腫、好酸球性蜂巣炎（ウェルズ症候群）、好酸球性脂肪織炎、好酸球増加症随伴性血管類リンパ組織増殖症（および木村病）、好酸球性膿疱性皮膚炎または皮膚壊死性好酸球性血管炎、肺疾患、例えば、薬物および毒素誘導性好酸球性肺疾患、蠕虫関連症（レフレル症候群;熱帯性肺好酸球増加症）、慢性好酸球性肺炎、急性好酸球性肺炎、チャーグ・ストラウス症候群、または他の血管炎、胃腸疾患、例えば、非限定的に好酸球性食道炎（EE）および好酸球性胃腸炎（EG）を含む好酸球性胃腸障害（EGID）、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、好酸球性胆管炎、もしくは好酸球性胆嚢炎、非限定的に好酸球性髄膜炎、脳室腹腔シャント、白血病もしくはCNS関与を伴うリンパ腫（ホジキン）を含む神経学的疾患、非ステロイド抗炎症性薬物、抗生物質、造影剤、リウマチ学的疾患、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球増加症-筋肉痛症候群、非限定的に過敏性心筋炎もしくはチャーグ・ストラウス症候群を含む心臓疾患、または泌尿生殖器疾患、例えば、薬物誘導性間質性腎炎もしくは好酸球性膀胱炎が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。
【００８８】
一態様では、疾患または障害は、寄生性蠕虫、腸コクシジウム戦争イソスポーラ（Isospora belli）、二核アメーバ（Dientamoeba fragilis）、サルコシスチス・ホミニス（Sarcocystis hominis）、外寄生生物、例えば、疥癬、ハエ幼虫（fly larvae）（ハエウジ症）、HIV、真菌（例えば、コクシジオイデス症（coccidiomyocosis）およびアスペルギルス症）による感染症が挙げられるがそれらに限定されるわけではない感染性疾患である。
【００８９】
一態様では、疾患または障害は、アトピー性/アレルギー性疾患、例えば、アレルギー性鼻炎、好酸球増加症候群を伴う非アレルギー性鼻炎（NARESもしくはBENAR）、または喘息（アレルギー性および非アレルギー性の両方）である。
【００９０】
一態様では、疾患または障害は、医薬関連末梢血好酸球増加症、例えば、キニーネ、ペニシリン、セファロスポリン、キノロン、NSAID、サルファ剤、ニトロフラントイン、テトラサイクリン、半合成ペニシリン、アミオダロン、ニトロフラントイン、メトトレキサート、SSRIまたはSNRIセファロスポリン（例えば、セフォタキシム、セフォキシチン、セフォペラゾン、もしくはセフォトリアキソン（cefotriaxone））、スルファサラジン、ヒダントイン、カルバマゼピン、d-ペニシラミン、アロプリノール、ヒドロクロロチアジド、サイクロスポリン、ラニチジン、GM-CSF、IL-2、フェニトイン、アロプリノール、アスピリン、ネバリピン（nevaripine）、またはスルファサラジンと関連付けられるものである。
【００９１】
一態様では、疾患または障害は、血液学的/新生物性疾患であり、該疾患としては、リンパ性悪性腫瘍、例えば、ホジキン病、原発性皮膚T細胞リンパ腫もしくはセザリー症候群、固形腫瘍、例えば、リンパ腫、大細胞非角化型子宮頸部腫瘍、大細胞未分化肺癌、肺、膣、陰茎、皮膚、もしくは鼻咽頭の扁平癌、胃、大腸、もしくは子宮体の腺癌、または膀胱の移行上皮癌、または肥胖細胞症が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。
【００９２】
一態様では、疾患または障害は、免疫不全、例えば、オーメン症候群高IgE（ジョブズ）症候群、Dock8欠損症、IPEX、もしくはZap70欠損症、または移植片対宿主病（GVHD）、例えば、同種幹細胞移植後のGVHDである。
【００９３】
一態様では、疾患または障害は、例えば、アジソン病における内因性副腎グルココルチコステロイド（adrenoglucocorticosteroid）の喪失、副腎出血、または下垂体機能低下症の結果としての内分泌の疾患または障害である。
【００９４】
一態様では、疾患または障害は、コレステロール塞栓、放射線療法と関連付けられる好酸球性多型性掻痒性発疹（eosinophilic,polymorphic,and pruritic eruption associated with radiotherapy;EPPER）、サルコイドーシス、炎症性腸疾患、または免疫調節異常と関連付けられる他の障害と関連付けられる。
【００９５】
一態様では、疾患または障害は、臓器制約的関与を伴う好酸球増加症、例えば、皮膚および皮下組織疾患、例えば、アトピー性および水疱性疾患、例えば、アトピー性皮膚炎水疱性疾患、例えば、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、疱疹状皮膚炎、妊娠ヘルペス、小結節、好酸球増加、リウマチ、皮膚炎、および腫脹（NERDS）の共同により特徴付けられる障害、好酸球性脂肪織炎、例えば、接触性皮膚炎、好酸球性蜂巣炎、節足動物咬傷、トキソカラ症、結節性多発性動脈炎、注射肉芽腫、ループス脂肪織炎、悪性腫瘍、糖尿病、慢性再発性耳下腺炎、好酸球増加を伴う突発性血管性浮腫、木村病、好酸球増加症随伴性血管類リンパ組織増殖症、好酸性筋膜炎、ウェルズ症候群（好酸球性蜂巣炎）、または好酸球性膿疱性毛包炎である。
【００９６】
臓器制約的関与を伴う他の好酸球増加症としては、肺疾患または肺障害、例えば、慢性好酸球性肺炎または急性好酸球性肺炎;胃腸疾患、例えば、好酸球性胃腸疾患（EGID）、例えば、好酸球性食道炎（EoE）または好酸球性胃腸炎;肝胆道系疾患、例えば、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、好酸球性胆管炎または好酸球性胆嚢炎;神経学的疾患、例えば、好酸球性髄膜炎、例えば、真菌から蠕虫（例えば、コクシジオイデス症または広東住血線虫（Angiostrongylus cantonensis）感染症）に及ぶ中枢神経系感染症の他に、NSAIDまたは抗生物質に対する有害な薬物反応に起因するもの;リウマチ学的疾患、例えば、皮膚筋炎、関節リウマチ、全身性硬化症、またはシェーグレン症候群、好酸球増加症-筋肉痛症候群または毒性油症候群、血管炎、例えば、チャーグ・ストラウス症候群（CSS）、皮膚壊死性血管炎、側頭動脈炎の好酸球増加を伴う閉塞性血栓血管炎;過敏性心筋炎と共に、好酸球性白血病、肉腫、癌腫、もしくはリンパ腫と関連付けられる好酸球増加症と共に、GM-CSFもしくはIL-2投与と共に、長期薬物誘導性好酸球増加症と共に、または寄生虫感染症と共に起こり得る心筋内層への損傷を結果としてもたらす心臓疾患;泌尿生殖器疾患、例えば、好酸球増加を伴う間質性腎炎、典型的には、薬物誘導性の半合成ペニシリン、セファロスポリン、NSAID、アロプリノール、リファンピン、およびシプロフロキサシン、頻度、血尿、排尿障害、または恥骨上疼痛が挙げられる。
【００９７】
表1は、好酸球増加症と関連付けられる例示的な疾患または障害を提供する。
【００９８】
（表１）
2021508719.tif 000004
2021508719.tif 000005
2021508719.tif 000006
【００９９】
例示的な抗体
遺伝子療法ベクターは、1つまたは複数の抗体配列をコードしてもよく、該抗体配列としては、抗IL-5もしくはIL-5R抗体、例えば、メポリズマブ、レスリズマブ、ベンラリズマブ、もしくはMEDI-563、抗CD52抗体、例えば、アレムツズマブ、抗IL-4R抗体、抗CCR3抗体、抗IL-13もしくはIL-13R抗体、抗CD30抗体、抗IL-17もしくはIL-17R抗体、抗RADCP抗体（US20030099995を参照）、抗IgE抗体、例えば、オマリズマブ、抗CD52抗体、抗IL-4抗体、抗IL-33もしくはIL-33R抗体、抗IL-9もしくはIL-9R抗体、抗TNF-α抗体、例えば、インフリキシマブ、抗エオタキシン抗体、または抗シアロアドヘシオン因子もしくは抗シアロアドヘシオン因子受容体抗体の配列が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。
【０１００】
例示的な抗体配列、例えば、可変領域配列としては、SEQ ID NO:1もしくは2の一方によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチド、または、例えば、SEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、もしくは46〜51の1つにおけるフレームワーク領域、1つもしくは複数のCDR、もしくは両方において、SEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、もしくは46〜51のうちのいずれか1つに対して少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む抗体が挙げられるがそれに限定されるわけではない（以下を参照）。
【０１０１】
抗Siglec-F
2021508719.tif 000007
2021508719.tif 000008
【０１０２】
SEQ ID NO:3〜4は以下の通りである。
2021508719.tif 000009
【０１０３】
SEQ ID NO:52〜59のいずれか1つに特異的な抗体を含む、SEQ ID NO:7、33〜39、42、または45のいずれか1つからの重鎖または軽鎖配列を含んでもよい、表2における抗Siglec抗体配列、例えば、SEQ ID NO:9〜32、40〜41、4〜44、または46〜51。
2021508719.tif 000010
2021508719.tif 000011
2021508719.tif 000012
2021508719.tif 000013
2021508719.tif 000014
2021508719.tif 000015
【０１０４】
対象
対象は、ヒトおよび非ヒト動物を含む任意の動物であってもよい。非ヒト動物としては、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が挙げられるが、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、およびウマなどの哺乳動物が対象として想定される。対象はまた、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽、およびウマなどの家畜類、またはイヌおよびネコなどの愛玩動物であってもよい。
【０１０５】
一態様では、対象としては、本明細書に記載の医学的疾患および障害を患っているまたはそのリスクのあるヒト対象が挙げられる。対象は、概して、医師などの技術を有する専門家により状態を診断される。
【０１０６】
本明細書に記載の方法は、任意の種、性別、年齢、民族集団、または遺伝子型の対象のために用いられ得る。したがって、対象という用語は男性および女性を含み、かつそれは、熟年、熟年から成人までの年齢の対象成人、成人から成人前までの年齢の対象、ならびに若者、子供、および乳児を含む未成年を含む。
【０１０７】
ヒトの民族集団の例としては、カフカス人、アジア人、ヒスパニック、アフリカン、アフリカンアメリカン、ネイティブアメリカン、セマイト、およびパシフィックアイランダーズが挙げられる。前記方法は、一部の民族集団、例えば、カフカス人、特に北欧集団、ならびにアジア人集団により適切であり得る。
【０１０８】
対象という用語はまた、上記のような治療を必要とする限り、任意の遺伝子型または表現型の対象を含む。加えて、対象は、任意の髪の色、目の色、皮膚の色、またはそれらの任意の組合せの遺伝子型または表現型を有し得る。対象という用語は、任意の身長、体重、または任意の臓器もしくは身体部分のサイズもしくは形状の対象を含む。
【０１０９】
本発明を以下の非限定的な例により説明する。
【実施例】
【０１１０】
実施例I
抗Siglec F、マウスベース抗マウス好酸球特異的モノクローナルをコードするrh.10 AAV血清型（Song et al.,2009;Zimmermann et al.,2008;Bochner et al.,2009）を調製した。抗Siglec8、ヒト化ヒト好酸球特異的モノクローナルの配列により置換された抗SiglecFマウス抗好酸球モノクローナル配列を有する同一のベクター（Croker et al.,2007;Varki et al.,2006;Natku et al.,2003）もまた調製する。LEXm03の有効性を評価するために、マウスモデルを用い、該マウスモデルにおいて、別のAAVベクターであるAAVrh.10mIL5を静脈内投与して高レベルのマウスインターロイキン5（IL5）を持続的に発現および分泌するように肝臓を遺伝的に改変し、次いでIL5は骨髄を刺激して、高い血中レベルの好酸球（＞100,000個の好酸球/μL3）を持続的に生成し、好酸球による組織浸潤および最終的に死をもたらした。データは、LEXm03はインビトロおよびインビボにおいて好酸球のアポトーシスを誘導し、CEL-NOSのマウスモデルにおいて血中好酸球レベルを著しく低下させることを実証する（図5を参照）。この療法の1つの成果は、好酸球の永久的な、完全な抑制である。これはヒト症例報告において観察されており、臨床的に管理され得る（Franklin et al.,1981）。
【０１１１】
CEL-NOSは希少であり、慢性好酸球増加症の症例の約1％の症例を表し（Reuter et al.2017）、したがって希少なオーファン障害である。希少なオーファン遺伝性障害の例として、CEL-NOSの効果的な療法を開発するいくつかの理由がある。第1に、CEL-NOSは、使用可能な療法を有しない致死性障害である。それは希少であるため効果的な療法がなく、表現型（好酸球増加）は容易に測定され、小さな有効性試験（初期安全性研究後）は登録のために充分なはずである。第2に、希少な遺伝性障害のように、有効な場合、数十万ドル範囲の価格設定が実現可能なはずである。第3に、rAAVは、様々なはるかにより一般的な好酸球増加性障害のためのプラットフォーム戦略である。
【０１１２】
CEL-NOSは、効果的な療法を有しない満たされていない医学上の必要性を表す致死性悪性障害である。チロシンキナーゼ阻害物質、ヒドロキシウレア、インターフェロン-αまたはコルチコステロイドなどの療法を用いる試みは全て失敗してきた（Gotlieb et al.,2015;Helbing et al.,2012）。CEL-NOSの病理発生は未知であり、臓器機能の喪失および最終的な死は、高レベルの血中好酸球、および組織への好酸球の結果的な浸潤に直接的に関連付けられ、CEL-NOSを治療するための論理的な戦略は、持続的に血中の好酸球の数を抑制することである。CEL-NOSの効果的な療法を開発するための本戦略は、好酸球に結合するモノクローナル抗体を発現および分泌してアポトーシスを開始させるように肝臓肝細胞を遺伝的に改変するためにアデノ随伴遺伝子療法ベクターを使用する遺伝子療法アプローチである。第1に、CEL-NOSを特徴付ける好酸球増加症の基礎となる機序とは独立して、戦略は、好酸球臓器浸潤の原因である好酸球増加と、それゆえ、臓器機能障害および最終的な死に至る臓器毒性の抑制とを直接的に標的とする。第2に、高いピークおよびトラフと関連付けられ、かつモノクローナルの半減期に依存して2〜4週間毎の投与を必要とするモノクローナル自体の投与とは対照的に、肝臓によるモノクローナルのAAV媒介性の遺伝子発現は、単回投与で、持続的なレベルの高力価の治療的なモノクローナルを提供する。第3に、CEL-NOSは比較的希少な形態の好酸球増加症であるが、CEL-NOSのための戦略は、安全性プロファイルに対する高いリスクを有する、致死性の現在治療不可能な障害のための最初に開発されたプラットフォーム戦略である。CEL-NOSのために安全かつ有効な場合、遺伝子再構成により引き起こされる好酸球性白血病ならびに様々な非悪性好酸球増加性障害、例えば、好酸球増加性血管炎および他の自己免疫障害、好酸球増加症候群、熱帯性肺好酸球増加症および好酸球性食道炎および喘息を含むアトピー性障害を含む他のより一般的な好酸球増加症候群のために療法が開発され得る。
【０１１３】
データは、（1）LEXm03（マウスシステムにおいて使用される治療ベクター）およびAAVrh.10mIL-5（マウスCEL-NOSモデルを生成するために使用されるマウスインターロイキン-5ベクター）の生成および特徴決定（図1および図3）;（2）マウスCEL-NOSモデルの特徴決定（図3および図4）;ならびに（3）マウスCEL-NOSマウスモデルにおけるLEXm03の有効性（図7〜8）を含む。
【０１１４】
用量範囲研究は、LEXm03はマウス好酸球のアポトーシスを誘導することを実証する。LEXm03によりインビトロおよびインビボで生成される抗好酸球モノクローナルを好酸球アポトーシスの誘導について評価する。LEXm03ベクターが生成され、インビトロおよびインビボで機能することが示されており、かつ全てのアッセイが確立されているという文脈において、インビトロおよびインビボでマウス好酸球のアポトーシスを効果的に誘導するLEXm03の用量が決定される。インビボ評価のために、CEL-NOSマウスモデルにおけるAAVrh.10mIL5の用量の増加の関数としての用量範囲研究を、フローラクトアドヘリンアッセイを使用してLEXm03の用量の増加の関数として評価する。
【０１１５】
（表２）CEL-NOSのマウスモデルにおいて好酸球アポトーシスを誘導するLEXm03の能力の用量範囲評価
2021508719.tif 000016
1AAVrh.10mIL-5およびLEXm03を同時にBALB/cマウスの尾静脈により静脈内投与する。異なる用量のAAVrh.10mIL5を使用して、異なるレベルの血中好酸球増加を誘導する。AAVrh.10mIL5の各用量について、例えば9つの異なる組合せで、3つの用量のLEXm03を試験する。2つのベクターの各ペアにおいて、2つの時点（4週間および8週間）のそれぞれにおいて、n＝5のマウスを評価する。
【０１１６】
フローサイトメトリーラクトアドヘリンアッセイ。図5を参照。
【０１１７】
LEXm03を使用して、拡張予備的マウス有効性試験は、用量範囲量のLEXm03の静脈内投与は、好酸球の組織浸潤の減少ならびに罹病率および死亡率の低減を伴って、CEL-NOSのAAVrh.10mIL5マウスモデルにおいて血中好酸球レベルを有意に抑制するために充分な抗好酸球モノクローナル抗体を分泌するように、肝細胞を遺伝的に改変することを実証する。
【０１１８】
詳細な方法
LEXm03（AAVrh.10m抗Eos）。ベクターは、抗Siglec-F発現カセットを取り囲むAAV2逆位末端反復を有してシュードタイプ化された非ヒト霊長動物由来のrh.10キャプシドを含む。発現カセットは、サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサーニワトリ-β-アクチンプロモーター（CAGプロモーター）、抗Siglec-F cDNA配列（クローン9C7、ラットIgG2b）、およびウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナルからなる。マウスバイアスのコドンおよびmRNA不安定性要素の除去、低い（＜30％）またはリッチな（＞80％）GC領域、コーディング領域内の翻訳開始配列および潜在的なスプライシングシグナルを使用してmRNAの安定性を増加させかつ突然変異体mRNAによるトランス阻害の可能性を低減するために抗Siglec-F cDNA配列を最適化した。最適化された全長抗Siglec-F cDNA配列を合成し、CAGプロモーターの制御下のpAAVプラスミドにクローニングした。ベクター複製のために必要とされるAAV2に由来するAAV Repタンパク質、AAVrh.10ウイルス構造（Cap）タンパク質VP1、2、および3（作製されるrh.10 AAVベクターの血清型を定義する）ならびにE2、E4、およびVA RNAのアデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミドと共にpAAVプラスミドのヒト胎児腎臓293T細胞（HEK 293T;American Type Culture Collection）への共トランスフェクションによりAAVrh.10m.抗Eosベクターを作製した。以前に記載されたようにイオジキサノール勾配およびQHP陰イオン交換クロマトグラフィーによりAAVrh.10m.抗Eosベクターを精製した。ベクターゲノム力価を定量的TaqManリアルタイムPCR分析により測定した。抗炭疽菌保護抗原抗体（AAVrh.10mIgG対照）をコードするベクターをインビボ研究のための対照として使用した。
【０１１９】
AAVrh.10mIL-5。マウスIL-5の配列をGenbank（NM_010558.1）から得た。AAVrh.10mIL-5ベクターは、マウスIL-5発現カセットを取り囲むAAV2逆位末端反復を有してシュードタイプ化された非ヒト霊長動物由来のrh.10キャプシドを含む。発現カセットは、サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサーニワトリ-β-アクチンプロモーター（CAGプロモーター）、IL-5 cDNA配列、およびウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナルからなる。マウスバイアスのコドンおよびmRNA不安定性要素の除去、低い（＜30％）またはリッチな（＞80％）GC領域、コーディング領域内の翻訳開始配列および潜在的なスプライシングシグナルを使用してmRNAの安定性を増加させかつ突然変異体mRNAによるトランス阻害の可能性を低減するためにmIL-5 cDNA配列を最適化した。最適化された全長mIL-5 cDNA配列を合成し、CAGプロモーターの制御下のpAAVプラスミドにクローニングした。LEXm03について記載したようにヒト胎児腎臓293T細胞への共トランスフェクションによりAAVrh.10mIL-5ベクターを作製した。
【０１２０】
BALB/CマウスにおけるAAVrh.10m.抗SiglecFのインビボ発現。インビボでの抗EosのLEXm03推進性発現を評価するために、6〜8週齢の雄および雌Balb/Cマウスに、1回用量のAAVrh.10m.抗Eos（用量について表2を参照）、またはAAVrh.10mIgG対照および100μlのPBS対照を注射（静脈内に100μL）した。血液（100μL）を尾静脈から収集し、23℃で凝固させた後、5,000RPMで10分間遠心分離して血清を収集した。製造者のプロトコールにしたがって実行したELISA（Abcam）により0週時、および8週間にわたった時点において抗SiglecFを測定した。
【０１２１】
IL-5マウスモデル。ベクター有効性を試験するためのCEL-NOSのマウスモデルを迅速かつロバストに誘導するために、マウスIL-5をAAVrh.10ベクター（AAVrh.10m.IL-5）から過剰発現させた。増加用量のAAVrh.10mIL-5（108、109、1010gc）の静脈内投与後に、ELISA（Abcam）により測定した場合に血清中のmIL-5レベルは用量依存的な様式で高度に上昇した。
【０１２２】
ラクトアドヘリンアッセイ。AAVrh.10mIL-5（2.5×1010gc）±LEXm03またはAAVrh.10mIgG対照（1011gc）を用いて並行して処置したマウスから単離した白血球（WBC）を、抗CCR3を用いて染色して、好酸球を同定し、露出されたホスファチジルセリンに結合するラクトアドヘリンと共にインキュベートして、アポトーシスの初期段階における細胞を同定し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１２３】
好酸球数。ADVIA hematology system細胞計数器ならびにヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した血液スメアを使用して末梢血の好酸球の絶対数を2週間毎にモニターした。
【０１２４】
生存。健康の悪化の徴候についてマウスをベクター注射後に1日毎に観察した。瀕死（重篤な震え、努力性呼吸、喘鳴音、チアノーゼ、および突いた後の活動なし;いずれも回復なし）とみなされた場合、マウスを屠殺し、死亡日を記録した。
【０１２５】
臓器損傷/機能。屠殺の時点における心臓穿刺による血液の収集後に臓器損傷バイオマーカーの血中レベルを評価した。試料を遠心分離（15分、4℃、500g）し、血清を収集した。複数の臓器傷害または機能障害のマーカーとして血清中の以下の生化学的なパラメーターを測定した:肝臓-血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）;腎臓-血尿窒素（BUN）;心臓-クレアチンキナーゼMBアイソエンザイム（CK-MB）;内皮-血清エンドカン（ELISA、mouse Endocan DuoSet、R＆D Systems）;全身炎症-腫瘍壊死因子-α（TNF-α）。
【０１２６】
組織中の好酸球浸潤（免疫蛍光）。マウスから収集した臓器を直ちにカルノア溶液（60％のEtOH、30％のクロロホルム、および10％の酢酸）に2時間の後、100％のEtOHに1時間、および長期貯蔵のために70％のEtOH中に置いた。臓器パラフィン包埋および組織構造/スライドマウンティングはHistoserv（Germantown、MD）により行った。Histoclear（Fisher-Scientific）を用いてスライドを脱パラフィンし、再水和させ、抗原賦活化のために88℃の蒸気浴に20分入れた。組織切片を次にSuper Block Buffer（Thermo Fisher Scientific）を4℃で1時間用いて遮断した後、3％のFBS中20μg/mlの一次抗体のウサギ抗マウスMBPポリクローナルAb（Mybiosource）、PBS中の0.1％のサポニンと4℃で終夜インキュベートした。組織切片を次に3％のFBS中の6μg/mlの二次Abのロバ抗ウサギIgG-Alexa fluor 647（Invitrogen）、PBS中の0.1％のサポニンと4℃で1時間インキュベートした。組織切片を次にDAPIと共にProlong Gold抗褪色試薬（Thermo Fisher Scientific）を用いてマウントし、Zeiss Axiovert 200M蛍光顕微鏡を使用して蛍光顕微鏡法により評価した。
【０１２７】
統計。2つの研究はアッセイパラメーター亜群当たりn＝5のマウスを有し、この数は、実質的な効果を見ることができる合理的な可能性を与えながら外れ値の結果を可能とする有効性試験のための検定力を提供する。例えば、単一の変数を成果測定値として主張する場合、n＝5/群の使用は治療の効果を観察する良好な可能性を与えることを示すことができる。測定の変動係数が両群について60％であると主張する場合、n＝5/群は95％の検定力においてp＜0.05で2群間の平均スコアの3.2倍の差異を見る能力を提供する。全てのデータは、他に記載されなければ平均±平均の標準誤差（SEM）として提示する。Studentの両側t検定を使用して群間の差異を解析する。
【０１２８】
実施例II
好酸球は、高度に専門化した骨髄由来の顆粒球性細胞であり、寄生虫および他の病原体との戦いにおいて役割を果たす。正常個体において、好酸球は白血球の＜5％を表し、循環中で8〜12時間存続し、組織中で8〜12日間生存する。好酸球が充分な数において組織に浸潤した場合、それらは細胞傷害性メディエーターの放出に起因して臓器損傷および機能障害を引き起こす。
【０１２９】
非特定型慢性好酸球性白血病（CEL-NOS）は、効果的な療法がない致死性障害である。哺乳動物中、例えば、肝臓中の細胞を遺伝的に改変して、好酸球のプログラム細胞死を誘導する持続的なレベルの抗好酸球モノクローナル抗体を生成するためにアデノ随伴ウイルス遺伝子療法ベクターを用いるCEL-NOSの他に他の好酸球障害のための療法が本明細書に記載される。
【０１３０】
CEL-NOSは、血中好酸球＞1.5×103個/μLの持続性の上昇を伴う慢性好酸球性白血病のサブタイプであり、フィラデルフィア染色体について陰性の髄中の骨髄芽球の増加、BCR-ABL、PD6FRBの再構成、FIP1L1-PDGFRA融合、PDGF2AまたはPGFR1、他のクローン性細胞遺伝学的異常の骨髄増殖性新生物と関連付けられる。病因は未知である。それは、典型的には、年齢中央値62歳で個体に影響し、好酸球浸潤と関連付けられる臓器の機能障害、体重損失、咳、虚弱、下痢、脾腫、肝腫大、心臓障害および肺機能障害、ならびに約2年間の生存により特徴付けられる。CEL-NOSは、チロシンキナーゼ阻害物質、ヒドロキシウレア、インターフェロン-α、またはコルチコステロイドに応答しない。
【０１３１】
CEL-NOSの病理発生は未知であるため、最も直接的な療法は、血液中の好酸球の数を抑制することにより、好酸球の組織浸潤および臓器機能障害を抑制することである。抗好酸球モノクローナルをコードするアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを使用する例示的な好酸球障害、例えば、CEL-NOSのための遺伝子療法の有効性を判定した。AAVrh.10m抗Eos（LEXm03）を静脈内投与して細胞、例えば、肝臓肝細胞を遺伝的に改変することにより、マウス好酸球アポトーシスを誘導するマウス特異的な抗好酸球モノクローナル、例えば、SEQ ID NO:1もしくは2または両方によりコードされる配列を有するモノクローナルを発現および分泌させた。LEXh03は、例えば、SEQ ID NO:5、6、もしくは8またはそれらの組合せによりコードされる配列を有する、ヒト好酸球に特異的なヒト化抗好酸球モノクローナルをコードする。他の抗体配列を用いてもよく、該配列は、例えば、SEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、もしくは46〜51のいずれか、または、例えば、そのフレームワーク配列もしくは1つもしくは複数のCDRにおいて、それに対して少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有する配列である。一態様では、抗体は、1つもしくは複数のフレームワーク配列または1つもしくは複数のCDRにおいてまたはそれらの任意の組合せにおいて、SEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、または46〜51に対して1、2、3、4、または5つの置換を有する配列などの、SEQ ID NO:3〜6、8〜32、40〜41、43〜44、または46〜51に対して少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有する可変領域配列を有する。
【０１３２】
LEXm03の有効性を評価するために、別のAAVベクター（AAVrh.10mIL5）を使用してCEL-NOSマウスモデルを調製し、AAVrh.10mIL5を静脈内投与して、高レベルのマウスインターロイキン-5（IL5）を発現および持続的に分泌するように肝臓を遺伝的に改変し、次いでIL5は骨髄を刺激して、高い血中レベルの好酸球（＞100,000個の好酸球/μL）を持続的に生成し、好酸球による組織浸潤および最終的に死をもたらした。データは、LEXm03はインビトロおよびインビボにおいて好酸球のアポトーシスを誘導し、血中好酸球レベルを著しく低下させることを実証する。
【０１３３】
参照文献
2021508719.tif 000017
2021508719.tif 000018
【０１３４】
全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。以上の明細書において本発明をそのある特定の好ましい態様に関して記載し、多くの詳細を実例の目的のために示してきたが、本発明は追加の態様を受け入れること、および本明細書に記載のある特定の詳細を本発明の基本原理から離れることなく大幅に変更してもよいことは当業者に明らかであろう。
【図１Ａ】
2021508719.tif 000020
【図１Ｂ】
2021508719.tif 000021
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
2021508719.tif 000025
【図２】
2021508719.tif 000026
【図３Ａ】
2021508719.tif 000027
【図３Ｂ】
2021508719.tif 000028
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2021508719.tif 000030
【図４】
2021508719.tif 000031
【図５Ａ】
2021508719.tif 000032
【図５Ｂ】
2021508719.tif 000033
【図６】
2021508719.tif 000034
【図７Ａ】
2021508719.tif 000035
【図７Ｂ】
2021508719.tif 000036
【図７Ｃ】
2021508719.tif 000037
【図７Ｄ】
2021508719.tif 000038
【図８】
2021508719.tif 000039
【図９】
2021508719.tif 000040
【図１０Ａ】
2021508719.tif 000041
【図１０Ｂ】
2021508719.tif 000042
【図１０Ｃ】
2021508719.tif 000043
【図１０Ｄ】
2021508719.tif 000044
【図１１Ａ】
2021508719.tif 000045
【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2021508719.tif 000049
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
2021508719.tif 000052
【図１５Ｂ】
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【図１６】
2021508719.tif 000054
【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月9日(2020.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021508719000001.app
【国際調査報告】
2021508719.tif 000056
2021508719.tif 000057
2021508719.tif 000058
2021508719.tif 000059