(57)【要約】  本発明は、試験化合物の選択性を決定する方法に関し、癌を罹患している対象が試験化合物又は１つ以上の試験化合物を含む組成物による治療に応答する又は応答性があるのかを決定する方法等の関連の方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物の選択性を決定する方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞の合計集団において、細胞の少なくとも２つの区別することができるサブ集団を含む試料を提供すること；
（ｂ）前記試料を少なくとも２つの部分に分けること；
（ｃ）試験化合物の非存在下の工程（ｂ）で得られる少なくとも１つの部分及び試験化合物の存在下の工程（ｂ）で得られる少なくとも１つの部分をインキュベートすること；
（ｄ）
（ｉ）前記試験化合物の存在下でインキュベートされた前記少なくとも１つの部分及び
（ｉｉ）前記試験化合物の非存在下でインキュベートされた前記少なくとも１つの部分
において、同じ表現型を示す細胞の合計集団の細胞数に対して、区別することができる表現型を示す前記少なくとも２つのサブ集団の１つにおける細胞の数を決定すること；並びに
（ｅ）前記試験化合物の選択性を決定して、（ｉ）を（ｉｉ）で割ることによって、全てのその他のサブ集団におけるステップ（ｄ）に参照される前記１つのサブ集団の（ｄ）において参照される前記表現型を誘導し、ここで（ｉ）を（ｉｉ）で割った値が１より大きい場合、好ましくは、１．０５、１．１、１．５、２、３より大きい、最も好ましくは５より大きい場合、前記試験化合物は、（ｄ）に参照される前記表現型を選択的に誘導し、及び（ｉ）を（ｉｉ）で割った値が１未満、好ましくは０．９５、０．９、０．７、０．５、０．３未満、最も好ましくは０．２未満である場合、（ｄ）に参照される前記表現型を選択的に阻害又は減少すること、
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ｄ）の前記区別することができる表現型が生存率であり、ここで
（ｉ）工程（ｅ）で決定される前記選択性が１未満である場合、前記試験化合物は、工程（ｄ）の前記１つのサブ集団の生細胞の数を選択的に減少することが決定され、及び
（ｉｉ）工程（ｅ）において決定される前記選択性が１より大きい場合、前記試験化合物は、前記１つのサブ集団の生存率を選択的に改善すること、及び／又は工程（ｄ）の前記１つのサブ集団以外の前記サブ集団（複数可）の１つ以上の生存率を選択的に減少することが決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌を罹患している対象が試験化合物による治療に応答する又は応答性があるかどうかを決定する方法であって、以下の工程：
（ａ）合計集団細胞において、細胞の少なくとも２つのサブ集団を含む対象から得られる試料を提供することであり、ここで少なくとも１つのサブ集団は、癌性細胞に対応し、かつ、少なくとも１つのサブ集団は非癌性細胞に対応する；
（ｂ）前記試料を少なくとも２つの部分に分けること；
（ｃ）試験化合物の非存在下の工程（ｂ）で得られる少なくとも１つの部分及び試験化合物の存在下の少なくとも１つの部分をインキュベートすること；
（ｄ）
（ｉ）前記試験化合物の存在下でインキュベートされた前記少なくとも１つの部分及び
（ｉｉ）前記試験化合物の非存在下でインキュベートされた前記少なくとも１つの部分
における細胞の前記合計集団の生細胞の数に対して、癌細胞に対応する前記サブ集団の少なくとも１つにおいて、生細胞の数を決定すること；並びに
（ｅ）（ｉ）を（ｉｉ）で割ることによって、前記対象が前記試験化合物による治療に応答する又は応答性があるかどうかを決定することであり、ここで前記対象は、前記得られる値が１未満、好ましくは０．９５、０．９、０．８、０．６、０．４、最も好ましくは０．２未満である場合、治療に応答する又は応答性があるかどうかを決定すること、
を含む、方法。
【請求項４】
前記方法は少なくとも２つの試験化合物について繰り返され、前記対象が前記少なくとも２つの試験化合物の組み合わせによる治療に応答する又は応答性であるかどうかは、１．０から少なくとも前記２つの試験化合物のそれぞれについての（ｅ）で得られる値を引き、前記少なくとも２つの試験化合物についての得られる値の和を出し、前記得られる和が−１より大きい場合、好ましくは−０．５、０、０．５より大きい、最も好ましくは１より大きい場合、前記対象は、前記少なくとも２つの試験化合物の組み合わせによる治療に応答する又は応答性であることが決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試験化合物（複数可）が１つ以上の化学物質を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）で得られる少なくとも１つの部分がさらに少なくとも２つの部分に分けられ、ここで前記少なくとも２つの部分のそれぞれが異なる濃度の前記試験化合物で工程（ｃ）においてインキュベートされ、工程（ｄ）及び（ｅ）は、独立して前記試験化合物の各濃度で繰り返されて、前記試験化合物の各濃度の選択性／値を決定し、それによって全ての濃度の平均選択性／値が工程（ｅ）の後に計算され、前記最終選択性／値を決定するために使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）において、前記試料が少なくとも３つの部分に分けられ、工程（ｃ）において、少なくとも２つの部分が試験化合物の非存在下でインキュベートされる及び／又は少なくとも２つの部分が試験化合物の存在下でインキュベートされ、それによって、前記試験化合物の存在下でインキュベートされる各部分が、同じ濃度の前記試験化合物の存在下でインキュベートされ、工程（ｄ）において、同区別することができる表現型を示す前記細胞の合計集団の数に対して、前記区別することができる表現型を示す前記少なくとも２つのサブ集団の１つの細胞数が、
（ｉ）独立して前記試験化合物の存在下でインキュベートされた各部分、及び／又は
（ｉｉ）独立して前記試験化合物の非存在下でインキュベートされた各部分について決定され、並びに（ｉ）で得られる前記相対数の平均及び／又は（ｉｉ）で得られる前記相対数の平均が使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）において、前記試料が少なくとも３つの部分に分けられ、工程（ｃ）において、少なくとも１つの部分が試験化合物の非存在下でインキュベートされ、及び／又は少なくとも２つの部分が前記試験化合物の少なくとも２つの異なる濃度の存在下でインキュベートされ、並びに工程（ｄ）において、同区別することができる表現型を示す細胞の前記合計集団の細胞数に対して前記区別することができる表現型を示す前記少なくとも２つのサブ集団の１つの細胞の数が、
（ｉ）前記試験化合物の存在下でインキュベートされた各部分について独立して決定され及び／又は
（ｉｉ）前記試験化合物の非存在下でインキュベートされた各部分について独立して決定され、ここで（ｉ）の平均が各濃度について独立して決定され、及び／又は前記（ｉｉ）の平均がさらなる工程のために決定され、及び使用され、ここで工程（ｅ）において、前記選択性／値が、各濃度について（ｉ）の平均を（ｉｉ）の平均で割ることによって、前記試験化合物のそれぞれの濃度について決定され、前記最終選択性／値が、各濃度についての前記選択性／値を平均することによって得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が少なくとも２つの試験化合物について繰り返され、工程（ｅ）で得られる最も低い値を有する前記試験化合物が癌を罹患している前記対象の治療に選択される、請求項３又は５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が少なくとも３つの試験化合物について繰り返され、前記組み合わせの少なくとも２つの試験化合物のそれぞれについて、（ｅ）で得られる値を１．０から引き、前記組み合わせの前記少なくとも２つの試験化合物についての得られる結果の値を足すことによって得られる最も高い値を有する前記少なくとも３つの試験化合物の少なくとも２つの組み合わせが、癌を罹患している前記対象の治療のために選択される、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌がＰＢＭＣ又は骨髄細胞又はＰＢＭＣ若しくは骨髄細胞に由来する細胞に関連する癌である、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が少なくとも１％の癌性細胞及び／又は少なくとも１％の非癌性細胞を含む組織試料である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織試料が非接着性細胞単層として培養される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生存癌性及び非癌性細胞が、自動顕微鏡を使用して決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生存細胞の数が断片化されていない核の数として決定される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験化合物の選択性を決定する方法、及び癌を罹患している対象が試験化合物による治療に応答するのか、又は応答性であるのかを決定する方法等の関連の方法に関する。特に、方法は、（ａ）細胞の合計集団において、細胞の少なくとも２つの区別することができるサブ集団を含む試料を提供し、（ｂ）試料を少なくとも２つの部分に分け、（ｃ）試験化合物の非存在下において（ｂ）で得られる少なくとも１つの部分、及び試験化合物の存在下において（ｂ）で得られる少なくとも１つの部分をインキュベートし、（ｄ）（ｉ）試験化合物の存在下でインキュベートされる少なくとも１つの部分、及び（ｉｉ）試験化合物の非存在下でインキュベートされる少なくとも１つの部分において同じ表現型を示す細胞の合計集団の細胞数に対して、区別することができる表現型を示す少なくとも２つのサブ集団の１つにおいて、細胞数を決定し、並びに（ｅ）試験化合物の選択性を決定して、（ｉ）を（ｉｉ）で割ることによって、全てのその他のサブ集団におけるステップ（ｄ）に参照される１つのサブ集団の（ｄ）において参照される表現型を誘導し、（ｉ）を（ｉｉ）で割った値が１より大きい場合、好ましくは、１．０５、１．１、１．５、２、３より大きい、最も好ましくは５未満である場合、試験化合物は、（ｄ）に参照される表現型を選択的に誘導し、及び（ｉ）を（ｉｉ）で割った値が１未満、好ましくは０．９５、０．９、０．７、０．５、０．３未満、最も好ましくは０．２未満である場合、（ｄ）に参照される表現型を選択的に阻害又は減少する工程を含む。本発明は、癌を罹患している対象が試験化合物による治療に応答する、又は応答性であるのかを決定する方法も提供し、方法は、（ａ）細胞の合計集団における少なくとも２つのサブ集団を含む対象から試料を提供し、少なくとも１つのサブ集団は、癌性細胞に対応し、少なくとも１つのサブ集団は、非癌性細胞に対応し、（ｂ）試料を少なくとも２つの部分に分け、（ｃ）試験化合物の非存在下で（ｂ）で得られる少なくとも１つの部分及び試験化合物の存在下の少なくとも１つの部分をインキュベートし、（ｄ）（ｉ）試験化合物の存在下でインキュベートされた少なくとも１つの部分及び（ｉｉ）試験化合物の非存在下でインキュベートされる少なくとも１つの部分における細胞の合計集団の生存細胞の数に対して、癌細胞に対応するサブ集団の少なくとも１つの生存細胞の数を決定し、並びに（ｅ）対象が（ｉ）を（ｉｉ）で割ることによって、試験化合物による治療に応答する、又は応答性であるのかを決定し、得られる値が１未満、好ましくは０．９５、０．９、０．８、０．６、０．４未満、最も好ましくは０．２未満である場合、対象が治療に応答する又は応答性であることを含む。
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び／又は動物の疾患の治療のための薬剤の識別は、その他の細胞に影響しない、すなわち望ましくない副作用を引き起こすことなく、特定の細胞種において、所望の生物学的効果を選択的に誘導する分子の同定が必要とされる。逆に、個別の患者の所望の細胞種において、所望の生物学的効果を選択的に誘導することができる薬剤は、患者に医学的利益を提供する可能性がある。より低い選択性しか有さない薬剤は、深刻な副作用をもたらし得、治療用量の減少を必要とし得、結果的に所望の医学的転帰を導くことができない。
【０００３】
過去において、薬剤の発見は、細胞株モデルシステムに大きく依存していた。しかしながら、これらの細胞株モデルシステムは、異なる細胞種の相互作用を伴うことが多いより高次の生物の複雑なプロセスを不完全に再現するだけであることが徐々に理解されている。特に、所望の標的細胞種にだけ効果を誘導する能力としての選択性は、このようなシステムにおいて研究することができない。技術分野で実施される可能な解決策は、異なる細胞株で独立して分子を試験することである。しかしながら、これは、異なる細胞種の可能な相互作用を考慮に入れていない。代替の解決策は、異なる細胞種を混合して、より現実的な環境を再現する共培養モデルシステムの確立である。さらに、ｅｘ  ｖｉｖｏの複数の細胞種から成るＰＢＭＣ又は骨髄等の一次材料において、化学物質を直接的に試験することもできる。そのため、薬の発見及び開発において、少なくとも２つの異なる細胞種を含む細胞の混合物において、化学物質がどのようにしてその他の細胞種より１つの細胞種に選択的に影響するのかを測定するために、効率的な方法が必要とされる。
【０００４】
同じ医学的病態を罹患している異なる患者が、同じ医薬品に大きく異なる応答を有し得ることが徐々に明らかになってきてもいる。全ての処方薬の最大９０％は、２５％の患者にしか利益をもたらさないことが推測される。効果のなさそうな医薬品で患者を治療することは、副作用及び医学的利益の欠如による不必要な苦しみを引き起こすだけでなく、貴重なヘルスケアの財源を無駄にすることでもある。したがって、臨床医が適した薬剤を適した患者に適した時期に与えることができるように、個別の患者の治療転帰を正確に予測する方法が必要とされる。
【０００５】
治療応答の個別的な予測について、技術分野の方法は、広義に、間接的なバイオマーカーから治療応答を推測する方法（例えば、患者がイマチニブに応答しそうにないＢＣＲ−ＡＢＬの変異から推測する）及び一次患者材料の薬剤の活性を直接測定して、治療転帰を予測する方法に分けることができる（すなわち、機能的ｅｘ  ｖｉｖｏ薬剤試験）。
【発明の概要】
【０００６】
技術分野で知られている機能的ｅｘ  ｖｉｖｏ薬剤の試験として、ＭｉＣＫアッセイ（Ｋｒａｖｔｓｏｖ等、Ｂｌｏｏｄ．９２（３）：９６８−８０）を含み、米国特許出願公開第２０１００２９８２５５（Ａ１）号明細書に記載の方法、又はＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎの細胞力価Ｇｌｏアッセイが挙げられる。これらの方法は、患者から抽出される標的細胞集団が、適切なｅｘ  ｖｉｖｏインキュベーション条件下で、特定の医薬品に応答性があるかどうかを試験することに焦点を置いている。ここで、我々は、この分野の先行の考えと異なり、標的細胞集団における薬剤応答を測定するだけでは不充分であるが、事実として、オフターゲット細胞と対照的な標的細胞に影響する薬剤の選択性は、治療転帰を予測するために欠かせないことの根拠を示す（実施例２〜４）。したがって、機能的ｅｘ  ｖｉｖｏ薬剤応答試験を使用して、臨床的な薬剤応答を予測するためにも、どのようにして化学物質（例えば、ＦＤＡ承認薬）が、少なくとも２つの細胞の異なるサブ集団を含む細胞の混合物において、他の細胞集団よりも１つの細胞集団に選択的に影響するのかを測定するための効率的な手段が必要とされる。
【０００７】
別の細胞集団よりも１つの細胞集団に影響する薬剤の選択性は、伝統的に、所望又はオンターゲット効果の５０％が目的の細胞集団で達成される濃度（ＥＣ５０）を、細胞のオフターゲット集団において同効果の５０％が達成される集団と比較することによって測定される。
【０００８】
技術分野で実施される１つの方法は、標的及びオフターゲット細胞集団を単離し、又は標的及びオフターゲット細胞集団を示す単離細胞株を提供し、これらの単離細胞集団の異なる濃度において、個別に薬剤応答を測定することである。この方法の不利な点は、標的細胞が自然環境で分析されず、様々な方法で転帰に影響し得ることである。さらに、標的細胞を複雑な細胞混合物（例えば、ＰＢＭＣ）から単離する必要がある場合、この操作は、測定転帰に影響し得るシステムに追加の摂動を導入する。さらに、可溶性メッセンジャー（例えば、損傷しているがアポトーシス性ではない癌細胞を除去する免疫システムの細胞）によって一定の距離で、直接的な物理相互作用又は活性によって、細胞間相互作用に依存する効果は、単離細胞モデルシステムにおいて再現することができない。
【０００９】
２つ以上の細胞種から成る複雑な混合物において、薬剤又はその他の化学試験化合物の選択性を決定するために、異なる細胞集団間を区別し、各細胞集団に対する薬剤効果を個別に選択的に測定する新規方法が必要とされる。複雑な細胞混合物を分析するために技術分野で実施されるこの標準的な方法は、フローサイトメトリーである。ここで、個別の細胞集団は、区別することができ、試験化合物の効果は、蛍光染色及びマーカーを使用して（例えば、蛍光標識された抗体、蛍光生−死染色によって）測定することができる。別の方法は、国際公開第２０１６／０４６３４６号に記載されている。
【００１０】
フローサイトメトリーを使用して、細胞の複雑な混合物において特定の細胞サブ集団に作用する薬剤等の化学試験化合物のＥＣ５０を決定するために、当業者は、化学化合物で治療を行うときに、通常、４つ以上の化合物の濃度で、所望の表現型を示す目的のサブ集団の細胞を数え（すなわち、絶対細胞数を決定する）、化学化合物の濃度に対して、化学化合物で治療を行うときの所望の表現型を示す細胞数をプロットし、４パラメータロジスティック又はその他のシグモイドモデルを適合して、ＥＣ５０を決定する。あるいは、生存細胞の合計数について、ＡＴＰレベル等の表現型に直接的に比例する代理の尺度を使用することができる。これは、多くの先行技術文献及びＨｅｒｎａｎｄｅｚ等、ＳＬＡＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１７、Ｖｏｌ．２２（３）３２５−３３７（ここでは表現型は生きている白血病細胞である）又はＲｏｓｓ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９、３７７６−３７８２．１９８９年７月１５日等の出願ノート、並びにフローサイトメトリーを使用した細胞の絶対数を数える能力を検証し、最適化することに費やした多大な努力によって根拠付けられる。
【００１１】
細胞の複雑な混合物において別の細胞種よりも１つの細胞種に影響する試験化合物の選択性を決定するために、当業者は、結果として、両方の細胞集団に対して試験化合物のＥＣ５０を測定し、選択性の尺度として、ＥＣ５０値の比又はｌｏｇＥＣ５０値の差を有する（ＦＤＡによって使用される治療指数の定義を参照されたい）。
【００１２】
しかしながら、この方法は、多くの限界を有する。絶対細胞数は、本来、フローサイトメトリー及びまたその他の単細胞分析技術を使用して測定することが困難である。アッセイプレートに蒔かれる絶対細胞数は、自動細胞分注機械を使用する場合、特に、大きく変動し得る。続く染色及び洗浄工程の間、細胞は、異なるアッセイウェルから差示的に失われることがある。さらに、絶対細胞定量化は、通常、エラーの別の源を導入し、追加の試みを示すビーズ標準に対して評価される必要がある。最後に、選択性の決定は、試料の必要条件及びアッセイの時間を大きく増加させる異なる試験化合物の濃度での試験化合物の効果の測定を必要とする。
【００１３】
前述の観点において、複雑な細胞混合物における化合物の選択性を決定する方法が技術分野で必要である。
【００１４】
本発明によって解決される技術的課題は、１つ以上の試験化合物（複数可）の選択性を決定するための改善された方法及び改善された決定された選択性に基づく関係する方法を提供することである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
第１の実施形態において、本発明は、試験化合物の選択性を決定する方法に関し、方法は、以下の工程：
（ａ）細胞の合計集団において、細胞の少なくとも２つの区別することができるサブ集団を含む試料を提供すること、
（ｂ）試料を少なくとも２つの部分に分けること、
（ｃ）試験化合物の非存在下の工程（ｂ）で得られる少なくとも１つの部分及び試験化合物の存在下の工程（ｂ）で得られる少なくとも１つの部分をインキュベートすること、
（ｄ）
（ｉ）試験化合物の存在下でインキュベートされた少なくとも１つの部分及び
（ｉｉ）試験化合物の非存在下でインキュベートされた少なくとも１つの部分
において同じ表現型を示す細胞の合計集団の細胞数に対して、区別することができる表現型を示す少なくとも２つのサブ集団の１つにおける細胞の数を決定すること、
（ｅ）試験化合物の選択性を決定して、（ｉ）を（ｉｉ）で割ることによって、全てのその他のサブ集団におけるステップ（ｄ）に参照される１つのサブ集団の（ｄ）において参照される表現型を誘導し、（ｉ）を（ｉｉ）で割った値が１より大きい場合、好ましくは、１．０５、１．１、１．５、２、３より大きい、最も好ましくは５より大きい場合、試験化合物は、（ｄ）に参照される表現型を選択的に誘導し、及び（ｉ）を（ｉｉ）で割った値が１未満、好ましくは０．９５、０．９、０．７、０．５、０．３未満、最も好ましくは０．２未満である場合、（ｄ）に参照される表現型を選択的に阻害又は減少すること、を含む。
【００１６】
細胞の合計集団において、その他の細胞集団よりも１つの区別することができる細胞集団の表現型を誘導又は阻害する試験化合物の選択性を決定するために、技術分野で実施される方法と異なり、本発明の方法は、絶対細胞数を測定する必要がないが、同じ表現型を示す合計細胞集団の所望の表現型を有する細胞の画分の測定に依存する。結果として、本発明の方法は、自動細胞分注機械を使用する場合、特に大きく変化し得るアッセイプレートに蒔かれる厳密な細胞数の変化例に強固である。本発明の方法は、さらに、細胞が異なるアッセイウェルから差示的に失われ得る場合、続く染色及び洗浄工程の間に細胞の喪失に対して強固である。この方法は、さらに、エラーの別の源を導入し、追加の試みを示すビーズ標準に対して評価される必要がない。本発明の方法は、したがって、内部で制御される。また、本発明の方法は、測定される化合物のわずか１つの濃度点で、選択性情報を得ることができ、競合する方法は、例えば、複数の濃度点の測定を必要とし、例えば、実施例８を参照されたい。
【００１７】
さらに、本発明の方法は、技術分野で実施される方法と異なり、細胞の合計集団を含む細胞集団に関して、試験化合物の選択性を決定する前に、細胞の合計集団を含む細胞集団の分離を必要としない。そのため、本発明の方法は、その選択性を決定するために、分離された細胞集団に対する試験化合物の効果に依存するだけでなく、細胞の複合集団に含まれる細胞の相互作用にも考慮する。したがって、本発明の方法は驚くべきことに、細胞の混合物において試験化合物の選択性の測定を可能にすることができ、それにより得られる選択性は、異なる測定値間で細胞数の変化例に対して本質的に強固であり、本質的に制御され、細胞の合計集団に含まれる異なる細胞集団間の相互作用を考慮する。
【００１８】
さらに、本発明の方法は、用量−反応曲線からのＥＣ５０を決定することに依存しない。これは、選択性を測定するためにＥＣ５０の決定を必要とする先行技術の方法と対照的である。ＥＣ５０は、化合物によって誘導され、又は試験化合物によって阻害される最大半量効果が得られる化合物の濃度である。ＥＣ５０は、また、文脈に依存してＩＣ５０（「阻害濃度５０％」）又はＧＩ５０（「増殖阻害５０％」）とも呼ばれることが多い。あるいは、この効果のその他の割合が達成される、又は阻害される濃度も使用されることがある（例えば、ＥＣ９０、ＥＣ８０等）。ＥＣ５０は、通常、４つ以上の濃度で試験化合物に対する細胞の応答を測定することによって、及びデータにＳ字状曲線を適合させることによって得られる。別の細胞集団よりも１つの細胞集団に影響する化合物の選択性を決定するために、両方の細胞集団に影響する化合物のＥＣ５０は、独立して測定されなければならなく、ｌｏｇＥＣ５０の差は選択性の尺度として考えられる。ＥＣ５０を決定するために、特定の表現型又は効果の強度を有する細胞の数等の試験化合物に対する応答に直接的に比例する測定値が必要とされる。このような測定値は、所望の表現型の測定の前に試験化合物でインキュベートされる絶対細胞数の変化例に本質的に感受性である。むしろ、本発明の方法は、同じ表現型を有する細胞の合計数の特定の表現型を示す１つの集団の細胞の画分に依存して、選択性を決定する。したがって、本発明の方法は、絶対細胞数の定量化に依存せず、内部制御され、ＥＣ５０の決定、したがって完全な用量−反応曲線を必要とする技術分野における方法によって必要とされる濃度点よりも少ない濃度点で試験化合物に対する応答を測定することによって、試験化合物の選択性を定量化することができる（実施例１）。後者は、特に、一次患者試料のように、提供される試料の量が限定される場合に有利である。
【００１９】
ＥＣ５０値は、治療において実施される方法の選択性を決定する中心であり、実施例１２に示されるように、所望の表現型を示す細胞の合計数の表現型を示す細胞のサブセットの画分から決定することができる。したがって、同じ表現型を示す細胞の合計数の特定の表現型を示す細胞の画分を使用して、選択性についての情報を生み出すことが、当業者にとって明白ではない。
【００２０】
先行技術の方法と対照的に、本発明の方法において、別の細胞のサブ集団よりも１つの細胞のサブ集団に影響する試験化合物の選択性を評価するために、試験化合物の選択性は、同じ表現型を示す細胞の合計集団における細胞数に対して、目的の特定の表現型を示す細胞の特定のサブ集団の細胞数に基づいて決定される。得られる選択性は、したがって、実施例１３に示されるように、異なる測定値間の絶対細胞数の変化例に対して本質的に強固であり、内部制御され、細胞の合計集団に含まれる異なる細胞集団間の相互作用を考慮する。さらに、この選択性は、技術分野の方法によって必要とされる濃度点よりも少ない濃度点で試験化合物に対する細胞の応答を測定することによって決定することができる。
【００２１】
癌を罹患している対象が試験化合物による治療に応答する又は応答性があるかどうかを決定する先行技術の方法と異なり、本発明の方法は、全体として、細胞の同じ複合集団に対する同じ試験化合物の効果に対して、患者からの様々な細胞集団の複合集団に含まれる細胞の癌性細胞に対する試験化合物の効果と相関する。そのため、本発明の方法は、その選択性を決定し、試験化合物で治療を受ける患者が応答するのかしないのかを結論付けるために、標的の癌細胞集団に対する試験化合物の影響に依存するだけでなく、さらに、細胞の複合集団に含まれる代替の細胞に対する試験化合物の望ましくない影響を考慮する。言い換えれば、本発明の方法は、癌を罹患している対象が試験化合物又は薬剤による治療に応答する又は応答性があるかどうかを決定するために、非癌性細胞よりも癌性細胞を殺傷する抗癌剤の選択的能力を定量化する。癌細胞に対する試験化合物の効果を測定するだけである先行技術に記載の方法に比べて、本発明の方法は、癌を罹患している対象が実施例２〜４に示されるように、試験化合物による治療に応答する又は応答性があるかどうかについてのより正確な情報を与える。特に、添付の実施例に示されるように、ある方法が本発明の方法を使用して、２つのクラスを区別することができる品質の測定値としてのＲＯＣ曲線（ＡＵＲＯＣ）値下の面積は、０．９７であり、国際公開第２０１６／０４６３４６号に記載の方法を使用した場合はたったの０．９１のＡＵＲＯＣであり、細胞数に基づく場合は０．８６のＡＵＲＯＣであった（図５を参照されたい）。同様に、減少した分類精度は、実施例２及び３に観察され、結果的に図４をもたらした。このように、本発明の方法は、０．８５の分類精度となり、薬剤応答が癌細胞の感受性又は合計細胞集団のみに基づいて決定された場合、分類精度は０．６５以下であった（図４、それぞれ、中央及び下のパネル）。本出願において提供される比較データに基づいて、本発明の方法は、改善された精度を提供する。
【００２２】
さらに、癌を罹患している対象が試験化合物による治療に応答するか又は応答性があるのかを決定するための先行技術の方法と異なり、本発明の方法は、絶対細胞数の定量化に依存せず、細胞の合計集団を含む細胞集団の用量反応曲線又は単離は、異なる測定値、個別の測定値からの細胞の選択的喪失間の合計細胞数の変化例に対してより強固であり、試験化合物に対する細胞集団の応答に影響し得る異なる細胞集団の相互作用を考慮することができ（例えば、免疫系の細胞による損傷したが死んでいない癌細胞の認識）、より少ない濃度点での測定を必要とする。
【００２３】
本発明の方法は、工程（ａ）において、細胞の合計集団において、細胞の少なくとも２つの区別することができるサブ集団を含む試料を提供することを含む。本発明において、「区別することができるサブ集団」という用語は、より大きな集団の一部である細胞を指し、細胞マーカーによって、集団のその他の細胞と区別することができる。すなわち、２つの区別することができるサブグループの細胞は、細胞が細胞マーカーの異なる発現特性を示す限り、同じ又は異なる細胞種に属することができ、共焦点顕微鏡等のイメージング技術を使用してこれらを区別することができる。細胞が細胞のサブグループに属しているかどうかを容易に決定するために、単層の形態の細胞を提供することが好ましい。添付の実施例に示されるように、単層の形成は、技術分野で知られている方法を使用して実施することができる。非接着性細胞のみ、又は接着性及び非接着性細胞の混合物を含む試料について、単層の形成は、好ましくは、国際公開第２０１６／０４６３４６号に教示される方法によって行われる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法は、さらに、工程（ｂ）に続いて、さらなる分析の前に、使用される細胞試料の細胞を含む単層の形成をさらに含む。これに関して、本発明の方法で使用される細胞試料の種類は、細胞の少なくとも２つの区別することができるサブ集団を含む限り、特に限定されない。本発明の好ましい実施形態において、しかしながら、使用される細胞試料は、ＰＢＭＣ試料又は骨髄試料である。
【００２４】
細胞マーカーは、単独又はその他のタンパク質と組み合わせて、この種類の細胞を他の細胞種と区別することができる特定の種類の細胞によって発現されるタンパク質である。すなわち、細胞の表面又は本明細書で使用される細胞の合計集団に含まれる、例えば、ドナーから得られる試料に含まれるように、細胞の内部（細胞質又は内部の膜の内部を含む）に発現される細胞マーカーを使用することによって、区別することができ、そのため、区別することができるサブ集団に起因される。したがって、細胞の２つ以上の区別することができるサブグループは、異なる細胞種に属する細胞に限定されない。むしろ、２つ以上の区別することができるサブグループの細胞は、このサブグループが細胞マーカーを使用して区別することができる限り、例えば、それらの表面に発現される細胞、例えば、異なる病期の同じ細胞種の細胞、及び／又は同じ種類であるが異なる活性状態、及び／又は同じ種類であるが異なる分化ステージである限り、同じ細胞種であってもよい。
【００２５】
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）は、（浅裂の核とは対照的な）円形の核を有する血液細胞である。ＰＢＭＣは、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞（ＣＤ４又はＣＤ８陽性）、及びＮＫ細胞）、単球（樹状細胞及びマクロファージ前駆体）、マクロファージ及び樹状細胞を含む。これらの血液細胞は、感染と戦い、侵入者に適合するために免疫系において欠くことのできない成分である。本発明のいくつの実施形態において、本発明のＰＢＭＣ単層若しくはＰＢＭＣ単層を含む細胞培養装置を作製するために、又は本発明のいくつかの態様に提供される方法で使用するために、フィコール密度勾配精製ＰＢＭＣ、好ましくはヒトＰＢＭＣを使用することが好ましい。本発明は、任意の単核細胞と共に使用することができる。好ましい実施形態において、本発明は、限定されないが、ＰＢＭＣ又は骨髄細胞試料に含まれる標的細胞に関して試験化合物の選択性、すなわち、細胞の以下のグループの細胞、及び末端の細胞の状態を含む細胞系譜に対する選択性を決定することができ、造血幹細胞（限定されないが、リンパ球系共通前駆細胞、骨髄前駆細胞、及びそれらの成熟系譜及びプロＢ細胞、Ｂ細胞、二重陰性Ｔ細胞、血漿Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球（マクロファージ、樹状細胞）を含む）。これらは、限定されないが、末梢血、骨髄（局所化される扁平骨）、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ細胞、及び胸腔内液等の疾患の結果、形成される任意の流体に見つけることができる。細胞は、任意の健康又は疾患の状態にあってもよい。
【００２６】
本明細書に記載の方法に使用されるＰＢＭＣ細胞は、技術分野で知られている、又は本明細書に記載の任意の適切な方法を使用して全血から単離することができる。例えば、Ｐａｎｄａ等によって記載されたプロトコルを使用することができる（Ｐａｎｄａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｒａｖｉｎｄｒａｎ，Ｂ．（２０１３）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＰＢＭＣｓ．Ｂｉｏ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ３（３）：ｅ３２３）。好ましくは、密度勾配遠心分離が単離に使用される。このような密度勾配遠心分離は、全血を層によって分離される成分、例えば、血漿の上層、次にＰＢＭＣの層、及び多形核細胞の下部画分（好中球及び好酸球）及び赤血球に分離する。多形核細胞は、さらに、赤血球、すなわち無核細胞を溶解することによってさらに分離することができる。このような遠心分離に有用な共通の密度勾配は、限定されないが、フィコール（親水性多糖類、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン））及びＳｅｐＭａｔｅ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ、ケルン、ドイツ）が挙げられる。
【００２７】
本明細書に記載の方法に使用される骨髄細胞は、技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して骨髄から単離することができる。特に、密度勾配遠心分離及び磁気ビーズを使用して、このような試料のその他の成分から骨髄細胞を分離することができる。例えば、ＭＡＣＳ細胞分離試薬を使用してもよい（（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）。
【００２８】
技術分野で知られているように、このような単離された培養物は、少ない割合の別の細胞種、例えば、赤血球細胞等の無核細胞１つ以上の集団を含み得る。ＰＢＭＣは、さらに、技術分野で知られているように、及び／又は本明細書に記載のこのようなその他の細胞集団から単離及び／又は精製することができ、例えば、赤血球細胞を溶解する方法が、このような細胞を単離されたＰＢＭＣから取り除くために通常使用される。しかしながら、本発明の方法は、さらなる精製方法に頼ることなく、本明細書の単離された単離ＰＢＭＣが直接的に使用されてもよい。したがって、本明細書に開示される方法は、単離ＰＢＭＣの試料から赤血球細胞を溶解することを含んでも、含まなくてもよい。しかしながら、現在、無核細胞、例えば、赤血球細胞の存在は、概して、ＰＢＭＣより少なく、ＰＢＭＣの下及び間の培養表面に定着し、イメージングに適切な単層の形成を潜在的に干渉すると考えられている。そのため、ＰＭＢＣに対する無核細胞、例えば、赤血球細胞の濃度は、できるだけ低い好ましい濃度で、約５００〜１、より好ましくは約２５０〜１、最も好ましくは約１００〜１である。すなわち、本明細書に開示される方法に使用される単離されたＰＢＭＣ試料は、ＰＢＭＣにつき約１００未満の非核細胞、例えば、赤血球細胞を含む。
【００２９】
試料を提供することに続いて、詳細に前述したように、試料、特に細胞の合計集団の少なくとも２つの区別することができる細胞のサブ集団を含む試料において、及び特にＰＢＭＣ又は骨髄細胞を含む試料を提供し、この試料は少なくとも２つの部分に分けられる。あるいは、（ａ）で提供される試料を分ける他に、同じ起源及び種類の少なくとも２つの試料、すなわち、さらなる分割を必要としない試料が提供されてもよい。この２つの部分は、等しいサイズであっても、異なるサイズであってもよい。しかしながら、少なくとも２つの部分のそれぞれが、それぞれの区別することができるサブ集団の同様の、好ましくは同一の細胞の比を含むことが好ましい。
【００３０】
試料を少なくとも２つの部分に分けることに続いて、部分の少なくとも１つは、試験化合物、すなわち、選択性が決定される試験化合物の非存在下でインキュベートされる。すなわち、この部分は、コントロール／参照部分として使用される。
【００３１】
工程（ｂ）で得られる残りの部分の少なくとも１つは、試験化合物の存在下でインキュベートされる。この点に関して、試験化合物又は複数の試験化合物は、概して医薬品としての使用に適している限り、特に限定されない。しかしながら、試験化合物（複数可）は、疾患、特に血液系腫瘍及び／又は骨髄及び／又はリンパ組織の腫瘍及炎症性及び自己免疫疾患の治療に効果的であることが知られている化合物から選択されることが好ましい。このような疾患の治療に効果的であることが知られている化合物は、化合物及び例えば抗体等の生物学的化合物を含む。このような疾患の治療に効果的であることが知られている化合物の例として、限定されないが、アレムツズマブ、アナグレリド、亜ヒ酸、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡ、アザシチジン、ベンダムスチン、ブリナツモマブ、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、セプレン、クロラムブシル、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキンジフチトクス、デキサメタゾン、ドキソルビシン、デュベリシブ、ＥＧＣＧ＝没食子酸エピガロカテキン、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ヒスタミン二塩酸塩、ホモハリントニン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ−２ａ、組み換え、インターフェロンアルファ−２ｂ、組み換え、静注用免疫グロブリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドミド、マシチニブ、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミドスタウリン、ミトキサントロン、ＭＫ−３４７５＝ペンブロリズマブ、ニロチニブ、ペグアスパルガーゼ、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、プレリキサホル、ポナチニブ、プレドニゾロン、プレドニゾン、Ｒ１１５７７７、ＲＡＤ００１（エベロリムス）、リツキシマブ、ルキソリチニブ、セリネクソール（ＫＰＴ−３３０）、ソラフェニブ、スニチニブ、サリドマイド、トポテカン、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ボリノスタット、ゾレドロネート、ＡＢＬ００１、ＡＢＴ−１９９＝ベネトクラクス、ＡＢＴ−２６３＝ナビトクラックス、ＡＢＴ−５１０、ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−８６９＝リニファニブ、ＡＣ２２０＝キザルチニブ、ＡＥ−９４１＝ネオバスタット、ＡＧ−８５８、ＡＧＲＯ１００、アミノプテリン、アスパラギナーゼエルウィニア・クリサンテミ、ＡＴ７５１９、ＡＴ９２８３、ＡＶＮ−９４４、バフェチニブ、ベクツモマブ、ベスタチン、βアレチン、ベキサロテン、ＢＥＺ２３５、ＢＩ２５３６、ブパルリシブ（ＢＫＭ１２０）、カーフィルゾミブ、カルムスチン、セリチニブ、ＣＧＣ−１１０４７、ＣＨＩＲ−２５８、ＣＨＲ−２７９７、ＣＭＣ−５４４＝イノツズマブオゾガマイシン、ＣＭＬＶＡＸ１００、ＣＮＦ１０１０、ＣＰ−４０５５、クレノラニブ、クリゾチニブ、エラグ酸、エルサミトルシン、エポエチンゼータ、エプラツズマブ、ＦＡＶ−２０１、ＦａｖＩｄ、フラボピリドール、Ｇ４５４４、ガリキシマブ、ガリウムマルトレート、硝酸ガリウム、ギビノスタット、ＧＭＸ１７７７、ＧＰＩ−���１００、Ｇｒｎ１６３ｌ、ＧＴＩ２０４０、ＩＤＭ−４、インターフェロンアルファコン−１、ＩＰＨ１１０１、ＩＳＳ−１０１８、イクサベピロン、ＪＱ１、レスタウルチニブ、メクロレタミン、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＧＣＤ−０１０３、ＭＬＮ−５１８＝タンデュチニブ、モテクサフィンガドリニウム、天然型インターフェロンアルファ、ネララビン、オバトクラックス、オビヌツズマブ、ＯＳＩ−４６１、パノビノスタット、ＰＦ−１１４、ＰＩ−８８、酪酸ピバロイルオキシメチル、ピクサントロン、ポマリドミド、ＰＰＩ−２４５８、プララトレキサート、アルデスロイキン（プロリュウキン）、ＰＵ−Ｈ７１、ラノラジン、レバスチニブ、サマリウム（１５３Ｓｍ）レキシドロナム、ＳＧＮ−３０、骨格放射線治療、タセジナリン、タミバロテン、テムシロリムス、チオグアニン、トロキサシタビン、ビンデシン、ＶＮＰ４０１０１Ｍ、ボラセルチブ、ＸＬ２２８、ヒドロキシクロロキン（プラケニル）、レフルノミド（アラバ）、メトトレキサート（トレキサル）、スルファサラジン（アザルフィジン）、ミノサイクリン（ミノシン）、アバタセプト（オレンシア）、リツキシマブ（リツキサン）、トシリズマブ（アクテムラ）、アナキンラ（キネレト）、アダリムマブ（ヒュミラ）、エタネルセプト（エンブレル）、インフリキシマブ（レミケード）、セルトリズマブ、ペゴル（シムジア）、ゴリムマブ（シンポニー）、トファシチニブ（ゼルヤンツ、ゼルヤンツＸＲ）、バリシチニブ、セレコキシブ（セレブレックス）、イブプロフェン（処方用量）、ナブメトン（レラフェン）、ナプロキセンナトリウム（アプラナックス）、ナプロキセン（ナプロシン）、ピロキシカム（フェルデン）、ジクロフェナク（ボルタレン、ジクロフェナクナトリウムＸＲ、カタフラム、カンビア）、ジフルニサル、インドメタシン（インドシン）、ケトプロフェン（オルヂス、ケトプロフェンＥＲ、オルバイル、アクトロン）、エトドラク（ロヂン）、フェノプロフェン（ナルフォン）、フルルビプロフェン、ケトロラク（トラドル）、メクロフェナム酸、メフェナム酸（ポンステル）、メロキシカム（モービック）、オキサプロジン（デイプロ）、スリンダク（クリノリル）、サルサラート（ジサルシド）、アミゲスシック、マルスリティック、サルフレックス、モノジェシック、アナフレックス、サルシタブ）、トルメチン（トレクチン）、ベタメタゾン、プレドニゾンデルタゾン、ステラプレド、リキッドプレド）、デキサメタゾン（Ｄｅｘｐａｋ、Ｔａｐｅｒｐａｋ、デカドロン、ヘキサドロール）、コルチゾン、ヒドロコルチゾン（コルテフ、Ａ−Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ）、メチルプレドニゾロン（メドロール、メサコート、Ｄｅｐｏｐｒｅｄ、Ｐｒｅｄａｃｏｒｔｅｎ）、プレドニゾロン、シクロホスファミド（シトキサン）、シクロスポリン（Ｇｅｎｇｒａｆ、ネオーラル、サンディミュン）、アザチオプリン（アザサン、イムラン）、及びヒドロキシクロロキン（プラケニル）が挙げられる。
【００３２】
したがって、本発明の方法において、細胞試料の少なくとも１つの部分は、試験化合物（複数可）の非存在下でインキュベートされ、少なくとも１つの試料は、試験化合物（複数可）の存在下でインキュベートされる。
【００３３】
この点に関して、本発明の方法のいくつかの実施形態において、細胞、特にＰＢＭＣは、インキュベートされて、続いて、約１００細胞／ｍｍ２の増殖面積〜３００００細胞／ｍｍ２の増殖面積の密度で単離される。好ましくは、細胞、特にＰＢＭＣは、約５００細胞／ｍｍ２の増殖面積〜約２００００細胞／ｍｍ２の増殖面積、約１０００細胞／ｍｍ２の増殖面積〜約１００００細胞／ｍｍ２の増殖面積、約１０００細胞／ｍｍ２の増殖面積〜約５０００細胞／ｍｍ２の増殖面積又は約１０００細胞／ｍｍ２の増殖面積〜約３０００細胞／ｍｍ２の増殖面積の密度でインキュベートされる。より好ましくは、細胞、特にＰＢＭＣは、約２０００細胞／ｍｍ２の増殖面積の密度でインキュベートされる。「約」という用語は、所与の値又は範囲の１０％以内、より好ましくは５％以内の意味を有する。したがって、細胞、特にＰＢＭＣは、いくつかの実施形態において、本発明の方法でインキュベートされて、約１００、すなわち、９０〜１１０細胞／ｍｍ２の増殖面積〜３００００、すなわち、２７０００〜３３０００細胞／ｍｍ２の増殖面積の密度を培養装置に有する。より好ましくは、細胞、特にＰＢＭＣは、約５００、すなわち４５０〜５５０細胞／ｍｍ２の増殖面積〜約２００００、すなわち１８０００〜２２０００細胞／ｍｍ２の増殖面積、約１０００、すなわち９００〜１１００細胞／ｍｍ２の増殖面積〜約１００００、すなわち９０００〜１１０００細胞／ｍｍ２の増殖面積、約１０００、すなわち９００〜１１００細胞／ｍｍ２の増殖面積〜約５０００、すなわち４５００〜５５００細胞／ｍｍ２の増殖面積又は約１０００、すなわち９００〜１１００細胞／ｍｍ２の増殖面積〜約３０００、すなわち２７００〜３３００細胞／ｍｍ２の増殖面積の密度でインキュベートされる。最も好ましくは、細胞、特にＰＢＭＣは、約２０００、すなわち１８００〜２２００細胞／ｍｍ２の増殖面積の密度でインキュベートされる。
【００３４】
細胞、特にＰＢＭＣの数は、技術分野で知られている標準的方法を使用して決定することができる。特に、ＰＢＭＣの数は、血球計数器、又はＣｈａｎ等（Ｃｈａｎ等（２０１３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３８８（１−２）、２５−３２）によって記載される方法を使用して細胞を数えることによって決定することができる。骨髄細胞の数は、また、技術分野で知られている方法を使用して決定することもできる。特に、骨髄細胞は、細胞を数えることを使用して決定することができる。その他の細胞は、また、技術分野で知られている方法を使用して数えることもできる。
【００３５】
インキュベーションは、培養培地で実施される。当業者は、細胞、特にＰＢＭＣ又は骨髄細胞の生存率を維持する適切な方法を認識している。しかしながら、本発明の方法で使用される培養培地は特に限定されない。この点に関して、細胞の培養に必要な栄養物及び物質を有する液体の略語である。真核細胞を培養するための液体培養培地は、当業者に知られている（例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等）。適切な培地は、細胞の種類に依存して選択され、培養することができる。例えば、ＰＢＭＣ又は骨髄細胞は、ＲＰＭＩ１６４０の１０％のＦＣＳで培養することができる。任意の適切な培地を選択することができるが、ＰＢＭＣ応答及び／又は骨髄細胞の応答に人工的に影響しないことが知られている培地の成分が選択されるべきである。栄養補助剤は、細胞機能を誘導又は修正するために、培養培地に加えられる物質を記載する（例えば、サイトカイン、増殖及び分化因子、マイトジェン、血清）。栄養補助剤は、当業者に知られている。真核細胞と共に通常使用される血清の一例は、ウシ胎仔血清である。培養培地は、さらに、ペニシリン、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン等の抗生物質で補充されてもよい。一実施形態において、試験物質及び／又は刺激剤が別々にそれぞれの個別の単位の生細胞材料に加えられてもよい。試験物質は、薬剤又は薬剤成分であってもよい。刺激因子は、細胞の維持、増殖又は分化を支持する任意の物質を含み得る。特定の実施形態において、刺激因子は、例えば、免疫細胞を活性化することによって、免疫細胞に作用する物質である。免疫細胞を活性化するための刺激因子は技術分野で知られている。このような薬剤は、ポリペプチド、ペプチド又は抗体及びその他の刺激因子であってもよい。例えば、ＯＫＴ−３、インターフェロン−α、インターフェロン−β及びインターフェロン−γ、マイトジェン（例えば、ＰＷＭ、ＰＨＡ、ＬＰＳ）等である。試験物質及び刺激因子は、細胞培養培地に注入することができる。好ましくは、ＰＢＭＣは、１０％でＦＢＳ／ＦＣＳで補充されたＲＰＭＩで培養される（好ましくは、活性化を最小にするために低いエンドトキシン評点を必ずしも有しない）。ＰＢＭＣ培養物は、さらに、ＰＢＭＣドナーからヒト血清を含んでもよい。
【００３６】
「増殖領域」という用語は、本発明の意味で使用される場合、細胞が静止する培養装置の内部の表面を指す。「密度」は、本発明の意味で使用される場合、細胞が静止する装置の内部の表面の単位面積当たりの細胞の量である。細胞培養、特に、非細胞毒性細胞培養試験材料と適合性の任意の材料の培養装置が製造され得る。材料の例は、プラスチック材料、例えば、熱可塑性又はデュロプラスチック（ｄｕｒｏｐｌａｓｔｉｃ）材料である。適切なプラスチックの例は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）又はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）である。特に、装置は、ＰＢＭＣの培養及び／又は維持に適している。技術分野で知られている、及び本発明で使用される典型的な培養装置は、培養フラスコ、皿、プレート及びマルチウェルプレートである。マルチウェルプレートが特に使用され、例えば、最小の材料必要条件、例えば、最小の培地必要条件を有する多重摂動（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）のために複数の培養物を別々に維持する能力を提供する。好ましい培養装置として、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート及び１５３６ウェルプレートが挙げられる。培養物のイメージング分析に関連して技術分野で知られているように、特に蛍光イメージングにおいて、最小の光散乱及び減少したクロストークで、背景の蛍光／背景の光学的干渉を減少させるイメージングのために特別に設計された黒色の壁板を使用することが特に好ましい。培養装置は殺菌されてもよい。最も好ましい実施形態において、マルチウェルイメージングプレートが使用され、プレートは、複数のウェルを含み、少なくともいくつかのウェルは、第１チャンバを含み、第１チャンバは１つ以上の第１側壁及び底壁によって形成され、第２チャンバを含み、第２チャンバは１つ以上の第２側壁によって形成され、液体を導入するための開口を含み、第２チャンバは、第１チャンバの上部に整列され、第１チャンバと妨害排除構造を形成する第２チャンバとの間に中間のフロアが提供され、中間フロアは、第１チャンバと第２チャンバとの間の液体の接続を提供する少なくとも１つのスルーホールが提供され、スルーホールは、ピペットの先端が第２チャンバから第１チャンバに挿入されて、スルーホールを通過するように構成される。
【００３７】
装置は、特に、自動イメージングシステム及び分析に使用される。そのため、装置／培養装置は、このようなシステムの使用に適している。非限定的な例において、培養装置は半透明であってもよい。イメージング、例えば、蛍光イメージングに使用される培養皿及びプレートは、技術分野で知られており、市販されている。本発明の実施に使用される市販されている培養プレートの非限定的な例は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４−ウェル、組織培養処理される黒色の蓋、透明な底板（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、米国）又はＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４Ｗｅｌｌ  Ｆｌａｔ  Ｃｌｅａｒ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｂｌａｃｋ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ＴＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ（製品番号＃３７１２）である。別の例は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｌｌｃａｒｒｉｅｒ（登録商標）である。
【００３８】
前述で示されるように、本発明の方法の１つの驚くべき技術的利点は、この方法が細胞の複合集団内の標的細胞の自然環境をより近く示す環境において決定される標的細胞に対する試験化合物の選択性を決定／依存することである。すなわち、本発明の方法では、自然発生の細胞間相互関係が好ましく維持される。この点に関して、当業者は、細胞間相互関係を決定／評価／追跡／検証する手段及び方法に気が付いている。特に、当業者は、自然発生の細胞間相互関係と細胞試料の調製の間に導入されるものとを区別することができる。このように、当業者は、同じ種類の細胞及び／又は異なる種類の細胞が生存生物において相互作用することを理解している。さらに、当業者は細胞の合計集団に含まれる細胞の区別することができるサブグループの細胞が、生存生物において相互作用することを理解している。本発明において、細胞試料に含まれる細胞の大部分が、これらの自然発生の細胞間相互関係を維持することが好ましい。すなわち、細胞の大部分、特に、細胞試料に含まれる細胞の少なくとも５０％、好ましくは、細胞試料に含まれる細胞の６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％が、同細胞又は同細胞種の細胞又はｉｎ  ｖｉｖｏとして同区別することができるサブグループの細胞と相互作用する。細胞間相互関係は、当業者に知られている方法を使用して、検証／評価／決定することができる。例えば、共焦点顕微鏡を使用して、細胞間相互関係が自然環境において相互作用する細胞間であるのか、又は自然環境において相互関係を示さない細胞間であるのかを評価／決定／検証することができる。このような非自然の細胞間相互関係は、とりわけ細胞クランピングによる場合がある。
【００３９】
さらに、本発明の方法において、細胞の大部分が、好ましくは、生理学的に関連する状態に見つけられ、これは、好ましくは、細胞の６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％が生理学的に関連する状態にあることを意味する。本発明の方法で使用される生理学的に関連する状態の細胞の前述の割合は、技術分野で知られている方法を使用して決定／測定／評価される。特に、細胞試料が生理学的に関連する状態で見つけられる細胞に含まれるかどうかは、細胞試料に含まれる細胞の定量化によって決定される。これは、技術分野で知られている方法を使用してなされてもよい。特に、定量化は、参照試料、例えば、参照個体又は複数の参照個体の末梢血又は骨髄の細胞、例えば、特に、ＰＢＭＣ又は骨髄細胞試料の細胞試料が疾患を有するドナーに由来される場合、１名以上の健康なドナー（複数可）と比較されるイメージ分析によってなされてもよい。細胞の定量化は、標準的な診断ツールである。細胞試料、特にＰＢＭＣ及び／又は骨髄細胞に含まれる細胞サブ集団の閾値は、健康なドナー及び疾患を有するドナーについて良好に記載される。したがって、本発明の手段及び方法を使用して評価される試料の差に基づいて、生理学的な関連性を決定することができる。造血細胞に含まれる細胞サブ集団の記述は、例えば、Ｈａｌｌｅｋ等（２００８）Ｂｌｏｏｄ１１１（１２）に見つけることができる。したがって、定量化並びにさらなる手段及び方法、例えば、顕微鏡を使用した細胞間相互作用の決定は、細胞試料が生理学的に関連する状態を示すのかどうかを決定することができる。
【００４０】
本発明の発明者は、自然発生の細胞間相互作用を維持し、生理学的に関連する状態に主に見つけられる細胞を含む試料の分析を可能にする方法を提供した。そのため、本発明の好ましい実施形態において、細胞は、単層の形態で分析される。この点に関して、前述に開示される細胞密度のインキュベーションが、特にＰＢＭＣ又は骨髄細胞において、細胞の画像化可能な単層を形成する。単層は、さらなる分析の前に、試料を少なくとも２つの部分、すなわち、ステップ（ｂ）に分けた後に形成される。そのため、本発明の方法は、特にＰＢＭＣ集団及び／又は骨髄集団において、とりわけ、細胞集団のイメージング及び／又は顕微鏡的分析を可能にする。本明細書で使用される単層は、イメージング装置、例えば、技術分野で知られている、又は本明細書に記載の顕微鏡又は自動カメラの同焦平面に優勢に見られる細胞の単一の層を意味する。単一の層という用語は、この層の細胞が優勢に２次元である培養物を形成する、すなわち、培養物は優勢に単細胞の層であることを意味するために使用される。すなわち、培養物において、細胞の大部分は、その他の細胞に、又はその上に静止していることが見つけられない、及び（例えば、その他の細胞に、又はその上に静止する細胞を含むことによって、単細胞の層の上で伸長する細胞の集団から成る）凝集物に見つけられない。そのため、本発明の意味において、細胞単層、特にＰＢＭＣ単層は、好ましくは、とりわけ、特にＰＢＭＣの１つの単細胞の高さの厚みを有するＰＢＭＣ細胞において、細胞の水平層を含む。同様に、本発明の意味において、骨髄細胞の単層は、好ましくは、１つの骨髄細胞の高さの厚みを有する骨髄細胞の水平層を含む。本明細書で使用される場合、単層という用語は、培養容器の細胞凝集物又は多層構築物（すなわち、それぞれ、特にＰＢＭＣ細胞又は１つの骨髄細胞において、１つの細胞より大きい高さを有する細胞培養物を有する領域）又は細胞のない領域が見つけられ得ることを除外しない。むしろ、この用語は、本発明の培養物が、（例えば、顕微鏡的な方法によって）細胞の単一層から成る画像化可能又は可視化可能な領域の大部分を有することを意味するために使用される。これは、細胞培養面において、細胞の単一層を提供するものとして、最も容易に達成される。しかしながら、当業者が認識するように、細胞試料のその他のフォーマットも本発明の方法で使用することもできる。
【００４１】
使用される非接着性細胞、例えば、ＰＢＭＣ又は骨髄細胞の場合、このような細胞が、通常、細胞培養面との強い接触又は強い細胞間接触とを形成しないことが知られている。したがって、本発明で使用される細胞単層、特に、本発明の様々な態様で使用されるＰＢＭＣ単層は、すなわち、しっかりと付着し、均一に拡散し、培養面の大部分を覆う細胞の層を含む技術分野で理解されている接着性細胞の単層と必ずしも等価であると予想されていない。むしろ、いくつかの実施形態において、細胞単層、特に、本発明で使用されるＰＢＭＣ単層は、１つ以上のその他の細胞と直接的に接触するが、培養面に必ずしも接着しない細胞の大部分を含む高密度の培養物を含み得、細胞は、単層に存在するが、培養物の任意のその他の細胞との（直接物理的に）接触を有しない。本発明の特定の態様で使用される細胞単層は、また、中間の密度の培養物も含み得、分離した領域を有し、細胞がその他の細胞に接触を示さない場合、細胞は１つ以上の細胞及びその他の領域と接触する。
【００４２】
本発明の方法で使用するための細胞、特にＰＢＭＣ、骨髄細胞、又はその他の接着性及び非接着性一次細胞は、健康な対象、すなわち、疾患を罹患していると思われない、若しくは疾患になりやすいと思われない対象から得られる試料から単離することができ、又は疾患を罹患していることが知られている、若しくは疾患を罹患していることが疑われる対象から得られる試料から単離することができる。対象の疾患状態の診断は、当業者、例えば、臨床医によって日常的に実施される標準的な方法によって行うことができる。このような伝統的な方法は、補充される、又は本発明の方法に置き換えることができる。例えば、対象が疾患を罹患している又は罹患している可能性があるかどうかを決定するために、疾患を罹患していることが知られている対象からの試料を使用して、個別の疾患に特徴的な細胞間相互関係のパターンが決定される。さらに、又はあるいは、健康なドナーの細胞間相互関係のパターンは、個別の疾患によるものと思われる差を決定するために使用することができる。ここでの細胞間相互関係のパターンは、本発明に従って決定される互いに相互作用する１つ以上の異なる細胞種又は細胞集団の傾向を指す。
【００４３】
インキュベーションの後、（ｉ）試験化合物の存在下でインキュベートされる少なくとも１つの部分、及び（ｉｉ）試験化合物の非存在下でインキュベートされる少なくとも１つの部分の同じ表現型を示す細胞の合計集団の細胞数に対して、区別することができる表現型を示す少なくとも２つのサブ集団の１つにおける細胞数が決定される。当業者は、特定の表現型の細胞を数えるための利用可能な様々な方法に気が付いている。この点に関して、「表現型」は、細胞の観察することができる特徴又は形質を指す。表現型は、生物の遺伝子コード、その遺伝子型の発現、並びに環境要因及びその２つの間の相互作用の影響から生じる。細胞の表現型として、限定されないが、特定の細胞の形態、大きさ、全体としての細胞又は細胞内の部分の両方、細胞生存率、タンパク質の発現、特定の位置における特定のタンパク質の位置、タンパク質の共存、リン酸化、栄養摂取及び消費及びその他等のタンパク質の翻訳後修飾が挙げられる。表現型は、また、特定の形質が、サイトカイン、病原体又はいくつのかのその他の細胞外若しくは細胞内刺激による刺激等の特定の刺激に応答して示されるだけである点において、本質的に機能的であり得る。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、工程（ｄ）の区別することができる表現型は、生存率であり、（ｉ）工程（ｅ）で決定される選択性が１未満である場合、試験化合物は工程（ｄ）の１つのサブ集団の生存細胞の数を選択的に減少させることが決定され、及び（ｉｉ）工程（ｅ）で決定される選択性が１より大きい場合、試験化合物は、１つのサブ集団の生存率を選択的に改善し、及び／又は工程（ｄ）の１つのサブ集団以外のサブ集団（複数可）の１つ以上の生存率を選択的に減少させることが決定される。
【００４５】
続いて、サブ集団の１つの部分として、前の工程で数えられた細胞の表現型を誘導する試験化合物（複数可）の選択性が決定される。本発明において、これは、直ぐ上の（ｉ）を直ぐ上の（ｉｉ）で割ることによって行われ、試験化合物は、（ｉｉ）で割られた（ｉ）が１より大きい場合、好ましくは１．０５、１．１、１．５、２、３より大きい、最も好ましくは５より大きい場合、（ｄ）において示される表現型を選択的に誘導し、（ｉｉ）で割られた（ｉ）が１未満である場合、好ましくは０．９５、０．９、０．７、０．５、０．３未満、最も好ましくは０．２未満である場合、（ｄ）に示される表現型を選択的に阻害又は減少する。
【００４６】
添付の実施例に示されるように、標的細胞集団に対する試験化合物（複数可）の得られる選択性は、方法の過程で実施される異なる測定値の合計細胞数の変化例に対してより強固であり、より低い濃度で測定することを必要とし、細胞の合計集団を含む異なる細胞集団の相互作用を考慮する。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態において、癌を罹患している対象が試験化合物による治療に応答するのか、又は応答性であるのかを決定する方法が提供され、方法は、（ａ）細胞の合計集団における細胞の少なくとも２つのサブ集団を含む対象から得られる試料を提供し、少なくとも１つのサブ集団は、癌性細胞に対応し、少なくとも１つのサブ集団は、非癌性細胞に対応し、（ｂ）試料を少なくとも２つの部分に分け、（ｃ）試験化合物の非存在下で工程（ｂ）で得られる少なくとも１つの部分及び試験化合物の存在下の少なくとも１つの部分をインキュベートし、（ｄ）（ｉ）試験化合物の存在下でインキュベートされた少なくとも１つの部分及び（ｉｉ）試験化合物の非存在下でインキュベートされる少なくとも１つの部分における細胞の合計集団の生存細胞の数に対して、癌細胞に対応するサブ集団の少なくとも１つの生存細胞の数を決定し、並びに（ｅ）対象が（ｉ）を（ｉｉ）で割ることによって、試験化合物による治療に応答するか、又は応答性であるのかを決定し、得られる値が１未満、好ましくは０．９５、０．９、０．８、０．６、０．４未満、最も好ましくは０．２未満である場合、対象が治療に応答する又は応答性である、工程を含む。
【００４８】
したがって、本発明は、対象が試験化合物、特に治療薬による治療に応答する、又は応答性であるかどうかを決定する診断方法に使用される方法を提供する。前述のように、特定の治療薬、例えば、前述においてさらに列挙される治療薬の１つにおいて、所与の試験化合物が、同じ又は類似の疾患、例えば、癌を罹患している個別の対象について、異なる治療効果を示し得る。したがって、試験化合物、特に治療薬の選択性を所与の対象に個別に決定することが有利である。本発明の前述の方法において、試験化合物、特に治療薬の選択性は、先行技術の方法に比べて、改善された確率を有する非常に信頼できる方法で、決定することができ、１つ以上の代替の試験化合物（複数可）、特に治療薬（複数可）に比べて、改善された選択性を有することが決定され、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて有利な効果を示す。
【００４９】
すなわち、本明細書に提供される方法を使用して、試料／画像の細胞のサブ集団に対する試験化合物の選択性の分析は、ドナーにおいて試験が行われた治療に対する疾患の状態の応答を予測し、この点に関して、本発明の方法は、技術分野で使用することができる現在の方法を上回る利点を提供する。
【００５０】
一実施形態において、癌を罹患している対象が試験化合物による治療に応答する又は応答性があるかどうかを決定する方法は、少なくとも２つの試験化合物について繰り返され、この対象が少なくとも２つの試験化合物の組み合わせによる治療に応答する又は応答性であるかどうかは、１．０から少なくとも２つの試験化合物のそれぞれについての（ｅ）で得られる値を引き、少なくとも２つの試験化合物についての得られる値の和を出し、得られる和が−１より大きい場合、好ましくは−０．５、０、０．５より大きい、最も好ましくは１より大きい場合、対象は、少なくとも２つの試験化合物の組み合わせによる治療に応答する又は応答性であることが決定される。
【００５１】
本発明の一実施形態において、本発明の方法で使用される試験化合物は、１つ以上の化学物質を含み得る。すなわち、本発明は、一実施形態において、本明細書に開示される本発明の方法に関し、試験化合物（複数可）は、１つ以上の化学物質を含む。本発明の方法に使用される試験化合物における１つ以上の化学物質の存在は、例えば、少なくとも２つの化学物質間の相乗効果について有用な情報を提供し得る。すなわち、化学物質は、所与の標的細胞についてのそれらの選択性について互いに影響し得る。本発明の方法において、選択性を確実に決定し、及び／又は決定された選択性を使用するために、１つ以上の化学物質を含む試験化合物（複数可）を使用することは有利である。
【００５２】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の方法の工程（ｂ）で得られる少なくとも１つの部分は、さらに、少なくとも２つの部分に分けられ、少なくとも２つの部分のそれぞれは異なる濃度で試験化合物でインキュベートされる。異なる濃度の試験化合物における試験化合物の選択性を決定すること、及び／又は癌を罹患している対象が異なる濃度の試験化合物の試験化合物による治療に応答する又は応答性であるかどうかを決定することは、ｉｎ  ｖｉｖｏの効果的な濃度が投与される試験化合物の用量及び投与のタイミングに依存して変化し得るため、さらなる改善された結果を提供し得る。すなわち、試験化合物の濃度に関連する潜在的な効果を考慮に入れるために、試験化合物（複数可）は、本発明の一実施形態において、異なる濃度で、本発明の方法の工程（ｂ）で得られる少なくとも２つの部分でインキュベートされ得る。当業者は、試験化合物の選択性を決定するために、技術分野で知られている方法で使用される典型的な濃度に気が付いている。すなわち、通常、１００μＭ〜１００ｐＭ、好ましくは１０μＭ〜１μＭ、より好ましくは１０μＭ、１μＭ〜１００ｎＭの濃度が使用される。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、特に試験化合物が本発明の方法の工程（ｂ）で得られる１つ以上の部分（複数可）を有する異なる濃度でインキュベートされる本発明の方法において、平均選択性は、工程（ｅ）で計算され、最終的な選択性を決定するために使用することができる。平均選択性は、技術分野で知られている方法によって決定される選択性よりもさらに改善されるより信頼性のある尺度を提供することができる。
【００５４】
同様に、本発明の一実施形態において、本発明の方法は、少なくとも２つの部分が試験化合物の非存在下でインキュベートされる及び／又は少なくとも２つの部分が試験化合物の存在下でインキュベートされる工程（ｃ）、（ｉ）試験化合物の存在下でインキュベートされる少なくとも２つの部分、及び／又は試験化合物の非存在下でインキュベートされる少なくとも２つの部分において、細胞の合計集団の細胞数に対して少なくとも２つのサブ集団の１つが決定される工程（ｄ）を含む。複数の測定値を平均することは、自然の試料の変化例による１つの測定値に生じ得る潜在的な望ましくない効果を減少する。すなわち、平均することは、得られる結果の予想されるエラーをかなり減少させることができ、そのため、本発明の方法のより信頼性のある転帰が生じ得る。
【００５５】
したがって、一実施形態において、本発明は本発明に記載の方法に関し、工程（ｂ）に得られる少なくとも１つの部分がさらに少なくとも２つの部分に分けられ、少なくとも２つの部分のそれぞれが異なる濃度の試験化合物で工程（ｃ）においてインキュベートされ、工程（ｄ）及び（ｅ）は、独立して試験化合物の各濃度で繰り返されて、試験化合物の各濃度の選択性／値を決定し、それによって全ての濃度の平均値が工程（ｅ）の後に計算され、最終選択性／値を決定するために使用される。
【００５６】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の方法に関し、工程（ｂ）において、試料は少なくとも３つの部分に分けられ、工程（ｃ）において、少なくとも２つの部分は、試験化合物の非存在下でインキュベートされ、及び／又は少なくとも２つの部分は、試験化合物の存在下でインキュベートされ、それによって、試験化合物の存在下でインキュベートされる各部分は、試験化合物の同じ濃度の存在下でインキュベートされ、工程（ｄ）において、同区別することができる表現型を示す細胞の合計集団における細胞数に対して区別することができる表現型を示す少なくとも２つのサブ集団の１つにおける細胞数は、（ｉ）独立して試験化合物の存在下でインキュベートされる各部分及び／又は（ｉｉ）独立して試験化合物の非存在下でインキュベートされる各部分について決定され、並びに／又は（ｉ）で得られる相対的な数の平均及び／又は（ｉｉ）で得られる相対的な数の平均が使用される。
【００５７】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の方法に関し、工程（ｂ）において、試料は少なくとも３つの部分に分けられ、工程（ｃ）において、少なくとも１つの部分は、試験化合物の非存在下でインキュベートされ、及び／又は少なくとも２つの部分は、試験化合物の少なくとも２つの異なる濃度の存在下でインキュベートされ、工程（ｄ）において、同区別することができる表現型を示す細胞の合計集団における細胞数に対して区別することができる表現型を示す少なくとも２つのサブ集団の１つにおける細胞数は、（ｉ）独立して試験化合物の存在下でインキュベートされる各部分及び／又は（ｉｉ）独立して試験化合物の非存在下でインキュベートされる各部分について決定され、（ｉ）の平均は、独立して各濃度について決定され、及び／又は（ｉｉ）の平均はさらなる工程のために決定され、使用され、並びに工程（ｅ）において、選択性／値は、各濃度について（ｉ）の平均を（ｉｉ）の平均で割ることによって各濃度について決定され、最終的な選択性／値は、各濃度についての選択性／値を平均化することによって得られる。
【００５８】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明に記載の方法に関し、この方法は、少なくとも２つの試験化合物について繰り返され、工程（ｅ）で得られる最も低い値を有する試験化合物は、癌を罹患している対象の治療に選択される。
【００５９】
さらなる実施形態において、本発明は本発明に記載の方法に関し、この方法は、少なくとも３つの試験化合物について繰り返され、組み合わせの少なくとも２つの試験化合物のそれぞれについて、（ｅ）で得られる値を１．０から引き、組み合わせの少なくとも２つの試験化合物についての得られる結果を足すことによって得られる最も高い値を有する少なくとも３つの試験化合物の少なくとも２つの組み合わせが、癌を罹患している対象の治療のために選択される。
【００６０】
したがって、本発明は、また、いくつかの試験化合物のどれが癌を罹患している患者に最高の臨床利益を与える可能性が最も高いのかを決定する方法に関し、それによって、本発明の方法は、２つ以上の試験化合物について繰り返され、本発明の方法の工程（ｅ）において決定される最も低い値を有する試験化合物は、癌を罹患している患者に最も大きい臨床的利益を与える可能性が最も高い試験化合物になる。したがって、本発明は、また、得られる試験化合物の癌治療における使用、及び癌治療に使用するための医薬組成物の製造における試験化合物の使用に関する。
【００６１】
さらなる実施形態において、本発明は、それぞれ２つ以上の試験化合物を含む試験化合物の２つ以上の固有の組み合わせのどれが癌を罹患している患者に最も大きい臨床的利益を柄ら得る可能性が最も高いのかを決定する方法に関し、それによって、本発明に記載の方法がそれぞれの試験化合物の２つ以上の固有の組み合わせを含む２つ以上の試験化合物について繰り返される。それぞれの組み合わせを含む少なくとも２つの試験化合物のそれぞれについて、（ｅ）で得られる選択性の値を１．０から引き、少なくとも２つの試験化合物について得られる値を足すことから得られる最も高い和を有する２つ以上の試験化合物の組み合わせが、癌を罹患している患者に最も高い臨床利益を与える可能性が最も高い試験化合物の組み合わせである。したがって、本発明は、また、癌治療のための試験化合物の組み合わせの使用に関する。
【００６２】
前述で詳細に記載したように、本発明の方法は、細胞の合計集団に含まれる細胞に対する試験化合物の選択性を決定するために使用することができ、細胞の合計集団は、少なくとも２つの区別することができる細胞のサブグループを含む。原則として、細胞の任意の集団は、本発明の方法で使用することができる。しかしながら、ＰＢＭＣ又は骨髄細胞を使用することが好まれる。ＰＢＭＣ又は骨髄細胞試料に含まれる細胞に関連する様々な疾患が、特に癌等の増殖疾患にある。そのため、本発明の方法において、特に癌を罹患している対象が試験化合物による治療に応答する又は応答性があるのかどうかを決定する方法において、癌は、好ましくは、ＰＢＭＣ若しくは骨髄細胞又はＰＢＭＣ若しくは骨髄細胞に由来する細胞に関連する癌である。当業者は、この定義に入る癌性疾患、すなわちＰＢＭＣ若しくは骨髄細胞又はＰＢＭＣ若しくは骨髄細胞に由来する細胞に関連する癌を知っている。しかしながら、本発明の方法は、癌に限定されない。すなわち、本発明の方法は、対象が、以下のＩＣＤ−１０コード（これに限定されない）Ａ００−Ｂ９９−特性の感染性及び病原性疾患、Ｃ００−Ｃ９７悪性腫瘍；Ｄ７０−７７−血液形成系のその他の疾患、Ｄ８０−８９−他に分類されない免疫機構に関与する特定の障害；Ｄ８２−その他の主要な欠損に関連する免疫不全；Ｄ８３−分類不能型免疫不全症、Ｄ８４−その他の免疫不全、Ｇ３５−３７−中枢神経系の疾患、Ｉ００−Ｉ０３−急性リウマチ熱、Ｉ０５−Ｉ０９−慢性リウマチ性心疾患、Ｉ０１−心臓合併症を有するリウマチ熱、Ｉ０６−リウマチ性大動脈弁疾患、Ｉ０９−リウマチ性心筋炎、Ｉ７０−粥状動脈硬化、Ｋ５０−クローン病、Ｋ５１−大腸炎、Ｋ５２−その他の非感染性胃腸炎及び大腸炎、Ｍ００−Ｍ１９関節症、Ｍ０５−血清反応陽性関節リウマチ、Ｍ０６−その他の関節リウマチ；Ｍ１０−痛風、Ｍ１１−その他の結晶性関節症、Ｍ３５−乾燥症候群、Ｍ３２−全身性エリテマトーデス、Ｎ７０−７７−女性の骨盤内器官の炎症性疾患、Ｐ３５−３９−周産期特定の感染症、Ｐ５０−Ｐ６１−胎児及び新生児の出血性及び血液学的障害、Ｚ２２−感染性疾患のキャリア、Ｚ２３−特定の１つの細菌疾患に対する免疫化の必要性、及び／又はＺ２４−特定の１つのウイルス疾患に対する免疫化の必要性の以下の疾患の治療に反応する又は反応性であるかどうかを決定するために使用することができる。
【００６３】
試験化合物の選択性のさらにより信頼性のある決定を行う及び／又は対象が治療に応答する、応答性があるかどうかを決定するために、本発明の方法は、好ましい実施形態において、少なくとも１％の癌性細胞及び／又は少なくとも１％の非癌性細胞を含む組織試料である試料を使用する。より好ましくは、組織試料は、少なくとも２％の癌性細胞、及び／又は少なくとも２％の非癌性細胞、さらにより好ましくは少なくとも５％の癌性細胞及び／又は少なくとも５％の非癌性細胞を含む。最も好ましくは、組織試料は、少なくとも１０％の癌性細胞及び／又は少なくとも１０％の非癌性細胞を含む。
【００６４】
前述により開示されるように、試料、特に組織試料は、単層として培養されることが本発明の方法において好まれる。試料が非接着性細胞を含むＰＢＭＣ又は骨髄に含まれる細胞に由来する場合、組織試料は好ましくは非接着性細胞単層として培養される。本発明は、そのため、イメージング研究における特に一次造血試料において、生理学的に関連のある、多集団細胞試料を使用する方法を提供してハイスループットな方法：１）試験化合物、例えば、化学療法／免疫療法／免疫抑制療法に使用される試験化合物のｅｘ  ｖｉｖｏ細胞集団診断又はその他の単細胞分析に基づくグローバルレベルのマーカーに対する効果、２）患者の試料のｅｘ  ｖｉｖｏ測定値に基づいて、どの患者にどの化学療法が利益があるのかについての予想を提供するこの技術の能力、３）免疫機能に対する多くの刺激（例えば、薬剤）の効果を決定する本技術の能力、及び４）治療評価におけるパターンを決定するために、経時的な多くの患者データの統合で決定する。原則として、任意の細胞試料は、血液、骨髄、胸水、脾臓ホモジネート、リンパ組織ホモジネート、皮膚ホモジネート等からの単核細胞等を本発明の方法に使用することができる。しかしながら、単核細胞が使用されることが好まれる。当業者は、本発明の方法で使用される単核細胞試料がとりわけ、ＰＢＭＣ及び骨髄細胞並びにその他を含むことに気が付いている。したがって、細胞試料、好ましくは、本発明の方法で使用される一次単核細胞の単層は、ＰＢＭＣ及び／又は骨髄細胞を含むことができる。すなわち、本明細書で提供される方法は、概して細胞又はＰＢＭＣについて記載されるが、当業者は、方法が骨髄細胞又はさらなる細胞に提供されることを理解している。したがって、本明細書では、骨髄細胞を使用する方法、骨髄試料に含まれる細胞に対する試験化合物の選択性を決定する方法、及び疾患を罹患している又は罹患しやすい対象が骨髄細胞の使用を含む試験化合物による治療に応答する又は応答性があるのかどうかを決定する方法が提供される。
【００６５】
この点に関して、骨髄は、骨の内部で柔軟な組織である。ヒトにおいて、造血発生として知られる過程において、長管骨の上部の骨髄のコアによって赤血球細胞が産生される。骨髄移植は、白血病等の癌の特定の形態を含む骨髄の重度の疾患を治療するために実施される。さらに、骨髄幹細胞は、機能的神経細胞に形質転換されることに成功し、また、炎症性腸疾患等の病気を治療するために使用することができる。したがって、骨髄細胞は、様々な疾患、例えば、癌性疾患又は延長性腸疾患等の炎症性疾患の治療において価値のある標的を示す。このように、ドナーから得られる骨髄試料を使用した本明細書に提供される方法は、ドナーがこのような疾患を罹患している又は疾患を罹患しやすいかどうかを評価／決定する場合に非常に有用である。さらに、骨髄細胞を使用する本明細書に提供される方法は、ハイスループット薬剤スクリーニング等において様々な利点を提供する。
【００６６】
染色可能で画像化することができる単層を形成するために接着性細胞（マクロファージ、ＨｅＬａ等）を必要とする定説は、国際公開第２０１６／０４６３４６号の単層を提供することによって克服される。本明細書に記載の単層の前に、研究者グループは、例えば、リンパ腫及び白血病等の血液系疾患又は病態において、特に、疾患状態が非接着性細胞に示される又は反映される場合において、イメージベースの単細胞スクリーニング技術を、化学療法誘導分子（バイオマーカー）の変化、癌性芽細胞生存能評価及び細胞間接触のハイスループット決定について、一次患者試料に実施することができなかった。この問題を解決するために、国際公開第２０１６／０４６３４６号の発明者は、本明細書に「ファーマコスコピー」として参照される手段、及び方法、並びに方法論及び画像分析パイプラインを提供し、１つの画像において、接着性及び非接着性細胞の視覚化を可能にし、通常、技術分野で知られている方法に比べて、摂動につき必要とされる材料の１／１０thしか必要とせず、スループット及び速度を最大化する。ファーマコスコピーは、知られている方法、例えば、フローサイトメトリーによって集められた同情報を提供することができるが、細胞内表現型（タンパク質の局所化／共局所化）、及び細胞微小環境／隣接する関係の測定等の追加の有利な情報を提供する。さらに、国際公開第２０１６／０４６３４６号の記載の方法は、細胞をほとんど必要とせず、したがって、より少ない患者の試料、より少ない液体量しか必要とせず、ほぼヒトの介入がなく、ファーマコスコピーは、したがって並行して試験を行うことができる分子摂動の数がかなり増加し、より詳細な評価を作り出す。さらに、生来の健康な集団から疾患細胞を選別する必要がなく、ファーマコスコピーは、オフターゲット薬剤効果を並行して制御しながら、薬剤媒介性表現型の変化を追跡することができる。これらの重要な制御は、に対する標的細胞（例えば、癌性細胞）の試験化合物を同ウェル及び同イメージング領域に存在する同ドナーからの全体の細胞（例えば、健康な細胞）に関係することによってなされる。本発明の方法は、国際公開第２０１６／０４６３４６号の方法論を使用するが、さらなる驚くべき及び予期しない利点を含む。特に、より信頼性を有して、試験化合物の選択性を決定し、及び／又は疾患、特に癌を罹患している対象が試験化合物による治療に応答する又は応答性があるかどうかを決定することが可能である。このことは、試料の提示、特に単層に含まれるオフターゲットに対する試験化合物の特別ではない効果を考慮することによって達成される。
【００６７】
本発明の方法を使用して、多数の試験化合物が効率的に、迅速に分析することができ、すなわち、これらの選択性は、例えば、患者／対象、特にＰＢＭＣ試料又は骨髄試料から得られる１つの試料に由来し得る多数の単層を使用して決定される。通常、少なくとも１０００、少なくとも４０００、少なくとも８０００、少なくとも１２０００、少なくとも１６０００、少なくとも２００００、少なくとも２４０００少なくとも５００００、少なくとも７５０００又は最大９００００個以上の試験化合物がこのような１つの試料から得られる複数の単層において調査することができる。特定の実施形態において、本明細書で提供される単層は、複数のチャンネルを使用して、高含有量データと同時に画像にし、分析することができる。使用可能なデータのチャンネル数は、特定のイメージングソフトウェア及び使用可能な染色方法論にのみ依存し、この分野は急速に進歩している。現在使用可能な方法論は、少なくとも２つのチャンネル、及びより一般的に高含有量データの４、５、又は８つのチャンネルの同時のイメージング、処理及び分析を可能にする。
【００６８】
本発明の方法において、好ましくは単層の形態の細胞は、技術分野で知られている及び／又は本明細書に記載される任意の方法に従って画像化することができ、本明細書に提供される方法は、技術分野で知られている任意のイメージング技術を使用することができる。特定のイメージング方法は、必須ではなく、当業者の知識に従って決定されてもよい。イメージングは、染料又は染色の使用を必要としても、又は必要としなくてもよく、染色及び非染色成分の両方のイメージングを備えてもよく、及び／又は染色が可視化される若しくは可視化されない条件下（例えば、明るい領域のイメージングであり、蛍光染色は可視化されない）、及び紫外線（蛍光染色は可視化される）、又はその組み合わせである条件下でのイメージングを備えてもよい。明るい領域の条件下でのイメージングは、知られており、技術分野で通常使用され、標準的な方法に従って及び／又は本明細書に記載されるように実施されてもよい。さらに、又はあるいは任意の他の標識のないイメージングは本発明に従って使用されてもよい。このような標識のない方法は、知られており、例えば、ＰｈａｓｅＦｏｃｕｓイメージング（Ｐｈａｓｅ  Ｆｏｃｕｓ  Ｌｔｄ、シェフィールド、イングランド）が挙げられる。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態において、生存癌性及び非癌性細胞の数は、自動顕微鏡を使用して決定される。よりさらに好ましい実施形態において、生存細胞の数は、断片化されていない核の数として決定される。核の断片化を決定する方法として、限定されないが、ＤＡＰＩ、又は核染料のＨｏｅｃｈｓｔシリーズの染料による核の染色及び蛍光顕微鏡下のそれらの形態の評価が挙げられる。
【００７０】
本発明の実施は、また、細胞、好ましくは単層、特にＰＢＭＣ単層（無標識方法に関連して又は独立してのいずれか）に検出可能な標識を加えることを含み、標識は、区別することができるサブ集団の生存率及び／又は細胞等の特定の表現型の細胞を選択的に標識するために、顕微鏡的方法を使用して検出することができる。検出可能な標識は、技術分野で知られている別々の細胞構造、成分又はタンパク質を標識することができる。標識は、また、抗体に付着して、特異的に標識し、抗体抗原を検出することもできる。好ましい実施形態において、検出可能な標識は、可視化又は紫外線光下で標識を可視化することができる。そのため、検出可能な標識は、蛍光であってもよい。可視化標識の多数は、本発明に適している。標識は、さらなる活性が無くても検出することができ、又は二次工程、例えば、基質の添加、酵素反応への暴露、又は特定の光波長への暴露の実施後にのみ検出することができる。
【００７１】
細胞サブ集団、すなわち、特定のＰＢＭＣサブ集団又は骨髄細胞サブ集団において、本明細書で使用される区別することができるサブ集団は、標的細胞の表面又は細胞の内部における１つ以上のマーカーの発現を介して、検出することができる標識によって識別することができる。あるいは、又はさらにサブ集団は、標的細胞の表面又は標的細胞の内部における１つ以上のマーカーの発現の欠損によって定義することができる。１つ以上のマーカー（例えば、２つのマーカー、３つのマーカー、４つのマーカー等）の発現又は発現の欠損について試験を行って、マーカーを発現する又は発現しない細胞が、実際に、標的細胞、例えば、所望の細胞のサブ集団のメンバーであることのさらなる保証を提供することが望ましい場合がある。例えば、異なるマーカーに対する抗体の「カクテル」は、それぞれ、同じ標識又は異なる標識に（直接的又は間接的のいずれか）に結合することができる。一例として、異なるマーカーに対する抗体のカクテルは、それぞれ、同標識に結合する結合モチーフを含み得る（例えば、それぞれ、同二次抗体によって認識される同じ種類のＦｃを含み得る、又はそれぞれが同アビジン結合標識によってビオチン化及び特異的に結合し得る）。任意に、抗体の２つ以上の異なる抗体又はカクテルを使用することができる。好ましくは、細胞は、互いに区別することができる少なくとも２つの標識を使用して染色され、それによって、標的細胞種の少なくとも２つの異なるマーカーを発現する細胞の識別を可能にする。細胞は、また、互いに区別することができる少なくとも３、４、５個以上の異なる標識を使用して染色され、それによって、標的細胞種のより多くの数のマーカーを発現する細胞の検出を可能にする。任意に、細胞は、前選択した数のマーカー若しくは特定の前選択したマーカーの組み合わせを発現する場合、標的種の細胞として識別することができ、又は前選択したマーカーを発現しない場合、細胞は標的種の細胞として識別することができる。さらに、標的細胞種のマーカー（複数可）は、集団において、標的細胞を他の細胞と区別することができる限り、標的細胞に固有である必要はない。ＰＢＭＣの場合、ＰＢＭＣ細胞集団の主要成分は、樹状細胞についてのＣＤ１１Ｃ、マクロファージについてのＣＤ１４、Ｔ細胞についてのＣＤ３（ＣＤ４又はＣＤ３を有するＣＤ８）及びＢ細胞についてのＣＤ１９によって示される。前述のマーカーがＰＢＭＣのこれらの主要クラスのサブセットで重なり、ＰＢＭＣのサブ集団を識別するためにこれらのマーカーによる染色は、この分野で広く受け入れられる。本発明の方法の使用に適したさらなるマーカーは、ＣＤマーカーハンドブック（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．２０１０、ＣＡ、ＵＳＡ）に見つけることができる。骨髄細胞に含まれる主要な細胞サブ集団は、好中性後骨髄球、好中骨髄球、分葉核好中球、正赤芽球及びリンパ球である。
【００７２】
本発明の実施において、検出可能な標識に結合される抗体を使用することが好ましい。このような抗体は、個別の細胞構造の標的化を可能にし、そのため、このような抗体のカクテル（それぞれが異なる標識を有する）を使用して、複数の標的／細胞構造／細胞成分を同時に可視化することができる。単層の崩壊を回避するために、染色の間、ケアを行わなければならない。当業者が理解するように、これは、抗体ベースの標識の使用に特に問題であり、その理由は、抗体ベースの標識の使用は、正確な可視化を妨害し得る、すなわち非特異的染色及び／又はアッセイ「ノイズ」が生じ得る非結合標識を削除するために、通常、１つ以上の洗浄工程を必要とするためである。したがって、本発明は、検出可能な標識、特に、抗体ベースの標識で細胞の単層を染色する方法を含み、染色後の洗浄要件を最小限にし、又は無くす。本発明の方法は、洗浄がない状態で、ノイズシグナルの生成を回避する濃度で、検出可能な標識（複数可）を含み得、技術分野で知られている及び／又は本明細書に記載の方法によって決定することができる。そのため、本発明は、抗体の製造者によって推奨される前述又は以下の濃度で標識抗体の使用を含む。
【００７３】
いくつかの例示的な細胞集団について、細胞は、マーカーが細胞内で特徴的な局所化又はパターンを示す場合、所与のマーカーに陽性であると考えられるだけであり得る。例えば、細胞は、細胞骨格マーカーが細胞骨格に存在する場合、「陽性」であると考えられ得、いくつかの拡散性細胞質染色である場合、「陰性」であると考えられ得る。このような場合、細胞は、適切な条件下で培養して（例えば、接着性培養物として）、細胞内の特徴的な局所化又はパターンを確立することができる。所与のマーカーの強固な検出に必要とされ得る細胞骨格アセンブリ（又は細胞内組織化を確立するためのその他の工程）適切な培養条件及び時間は、当業者によって容易に決定される。さらに、マーカーは、強固な染色に対する前提条件として接着性培養についての必要性を減少する、又は無くすマーカーを容易に選択することができる。
【００７４】
標識タンパク質に有用な染料は、技術分野で知られている。概して、染料は、比色分析、発光、生物発光、化学発光、リン光又は蛍光シグナル等の光学的に検出可能なシグナルを提供することができる分子、化合物又は物質である。本発明の好ましい実施形態において、染料は、蛍光染料である。染料の非限定的な例は、そのいくつかは市販されており、ＣＦ染料（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤｙＬｉｇｈｔ染料（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｃｙ染料（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＲＤｙｅｓ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）及びＨｉＬｙｔｅ染料（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。いくつかの実施形態において、染料の励起及び／又は放出波長は、３５０ｎｍ〜９００ｎｍ又は４００ｎｍ〜７００ｎｍ又は４５０〜６５０ｎｍである。
【００７５】
例えば、染色は、複数の検出可能な標識、例えば、抗体、自己抗体又は患者血清を使用することを含み得る。染色は、可視光及び紫外線光の下で検出することができる。染色は、着色試薬又は着色試薬を作製することができる酵素に直接的又は間接的に結合される抗体を含み得る。抗体が染色の成分として使用される場合、マーカーは、抗体に直接的又は間接的に結合することができる。間接的な結合の例として、アビジン／ビオチン結合、二次抗体及びその組み合わせを介した結合を含む。例えば、細胞は、標的特異的抗体を結合する維持、及び一次抗体若しくは一次抗体に結合される分子を結合する二次抗体で染色することができる細胞は、検出可能なマーカーに結合することができる。間接的な結合の使用は、例えば、バックグラウンド結合を減少し、及び／又はシグナル増幅を提供することによってノイズに対するシグナルの比を改善することができる。
【００７６】
染色は、また、蛍光標識に直接的又は間接的に結合される（前述で説明したように）一次又は二次抗体を含み得る。蛍光標識は、以下から成る群：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７９０、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｓ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、テキサスレッド染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ＴＥＴ（６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン）、Ｊｏｅ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、Ｔａｍｒａ（テトラメチルローダミン）、６−カルボキシローダミン、Ｒｏｘ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、Ｒ６Ｇローダミン６Ｇ）、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５）、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−（５’−アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン、アミノアクリジン、及び量子ドットから選択することができる。
【００７７】
本発明のさらなる例示的な実施形態は、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｓ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、テキサスレッド染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ＴＥＴ（６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン）、Ｊｏｅ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、Ｔａｍｒａ（テトラメチルローダミン）、６−カルボキシローダミン、Ｒｏｘ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、Ｒ６Ｇローダミン６Ｇ）、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５）、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−（５’−アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン、アミノアクリジン等の蛍光分子に直接的又は間接的に結合される抗体を使用する。その他の例示的な蛍光分子として、量子ドットが挙げられ、特許明細書［例えば、米国特許出願第６，２０７，２９９号明細書、第６，３２２，９０１号明細書、第６，５７６，２９１号明細書、第６，６４９，１３８号明細書（混合された疎水性／親水性ポリマー移動剤が量子ドットの表面に結合される表面改質方法）、米国特許出願第６，６８２，５９６号明細書、第６，８１５，０６４号明細書（合金又は混合シェルについて）が挙げられ、特許のそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる）］、技術文献［例えば、「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｒｏｕｔｅｓ  ｔｏｗａｒｄ  Ｈｉｇｈ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ＣｄＳｅ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ」、（Ｑｕ等、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ、１（６）：３３３−３３７（２００１）」］が挙げられる。様々な表面化学及び蛍光特徴を有する量子ドットは、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ、Ｅｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｒｏｙ、Ｎ．Ｙ．）及びＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。量子ドットは、合金量子ドット、ＺｎＳＳｅ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＳＴｅ、ＣｄＳＳｅ、ＣｄＳｅＴｅ、ＳｃＳＴｅ、ＨｇＳＳｅ、ＨｇＳｅＴｅ、ＨｇＳＴｅ、ＺｎＣｄＳ、ＺｎＣｄＳｅ、ＺｎＣｄＴｅ、ＺｎＨｇＳ、ＺｎＨｇＳｅ、ＺｎＨｇＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＳｅ、ＣｄＨｇＴｅ、ＺｎＣｄＳＳｅ、ＺｎＨｇＳＳｅ、ＺｎＣｄＳｅＴｅ、ＺｎＨｇＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳＳｅ、ＣｄＨｇＳｅＴｅ、ＩｎＧａＡｓ、ＧａＡｌＡｓ及びＩｎＧａＮ等を含む。合金量子ドット及びその作製方法は���例えば、米国特許出願第２００５／００１２１８２号明細書及び国際出願ＰＣＴ国際公開２００５／００１８８９号に開示される。
【００７８】
本発明の方法で使用される細胞を標識化することに続いて、好ましくは、単層の形態で、この方法は、さらに、検出可能な標識のシグナルを検出することを含む。検出可能な標識によって放出されるシグナルの種類に依存して、検出方法は、適切に適合することができる。蛍光放出標識を検出するのに適した検出方法を使用することが好まれる。検出方法は、また、技術分野で知られている標準的な方法に従って自動化することもできる。例えば、当業者が細胞の顕微鏡画像を分析し、解釈する、又はこれらの分析について自動プロトコルを確立することができる様々な計算法が存在する。一次画像の分析について、顕微鏡画像における照明のバイアス、顕微鏡画像から個別の細胞の同定、及びマーカー及びテキスチャー並びに核及び細胞サイズの測定、並びに形態及び位置パラメーターを修正することを含み、オープンソースソフトウェアＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ（例えば、ｖｅｒｓｉｏｎ２．１．１）を使用することができる。マーカー陽性細胞（ＣＤ３４＋前駆体細胞又は生存能染料陽性細胞）は、オープンソースソフトウェアＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ａｎａｌｙｓｔ（例えば、バージョン２．０）を使用したマシーンラーニングによって実施することができ、連続ゲート戦略によって二重又は三重陽性細胞を同定することができる。さらなる分析及びヒット選択についてのプレートの概要は、同様にＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ  Ａｎａｌｙｓｔを使用して作製することができる。
【００７９】
Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（例えば、バージョン２．１４）、又はＰｉｐｅｌｉｎｅ  Ｐｉｌｏｔ（例えば、バージョン９．０；Ａｃｃｅｌｒｙｓ）のｃｅｌｌＨＴＳパッケージは、両者ともにデータ分析、続く一次画像分析に使用することができ、プレート効果正規化、コントロールベース正規化及びヒット選択を含む。
【００８０】
市販の自動顕微鏡システムも本発明の実施に使用することができ、例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｏｐｅｒｅｔｔａ自動顕微鏡（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｗａｌｌｕｆ、ドイツ）があり、このシステムは、対応する画像分析ソフトウェア、例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ’ｓ  Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェア（例えば、バージョン３．１．１）を含み得る。このような自動及び／又は市販のシステムを使用して、本発明の方法に従って、顕微鏡画像から一次画像分析、陽性細胞の選択、及びヒット選択を実施することができる。
【００８１】
この一次画像分析に続いて、本発明の方法は、細胞の少なくとも２つの区別することができるサブ集団を含む試料に含まれる特定の表現型を有する細胞集団に対する試験化合物の選択性を決定し、又は疾患、特に癌を罹患している対象が試験化合物による治療に応答する、又は応答性があるのかどうかを決定するために実施され、この方法は、前述の表現型、特に細胞生存能を誘導する能力に基づく試験化合物の選択性を決定することを示す。
【００８２】
癌を罹患している対象が本発明の試験化合物による治療に応答する又は応答性があるのかどうかを決定する方法に基づいて、治療決定がなされ得、すなわち、対象が試験化合物による治療に応答する又は応答性があるのかどうかについて最も有利な結果を有することが決定された試験化合物を対象の治療に選択することができる。
【００８３】
本発明の方法における数の「平均」（「ｍｅａｎ」又は「ａｖｅｒａｇｅ」）を計算する場合、これは、算術的方法、幾何学的方法、及び／又はランダムエラーに関連する反復される測定値に基づいて変数の真の値を推測する目的を有する関連の統計学的方法を指すことが理解される。さらに、いくつかの場合において、平均値の代わりに中央値を使用することが有利な場合がある（例えば、異常値は存在するが、根底のランダム変数が通常に分布される場合において）ことが当業者には理解される。好ましい実施形態において、算術的方法は、本発明の方法が「平均」を指す場合はいつでも使用される。
【００８４】
試験化合物が１つ以上の化学物質を含む場合、試験化合物の濃度は、異なる濃度の化学物質の特定の組み合わせを指し、試験化合物の異なる濃度は、異なる濃度を有する試験化合物を含む少なくとも１つの化学物質を指す。特定の濃度を有する１つ以上の化学物質を含む試験化合物は、試験化合物を含む全ての化学物質は１つの特定の濃度を有するが、同じ濃度を有する必要はないことを意味する。
【００８５】
「治療」又は「治療すること」は、治療的治療及び予防的（「ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ」又は「ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ」）手段の両方を指し、この目的は、標的とされる病態若しくは障害、又はそれに関連する１つ以上の症状を予防、軽減又は遅延（少なくする）ことである。同様に、「応答性のある」又は「応答する」及び類似の用語は、標的とされる病態又はそれに関連する１つ以上の症状が予防、軽減、少なくするという効能を指す。この用語は、また、疾患、特に骨髄増殖性疾患の発症を遅延し、抑制し（例えば、その増殖を減少、又は静止する）、影響を軽減する、又は疾患を罹患している患者の寿命を延長する、又はこのようなマーカーが達成される効能を示す。治療を必要とする対象として、障害があると診断された対象、障害を有すると思われる対象、障害に罹患しやすい並びに障害が予防される対象が挙げられる。したがって、本明細書で治療を受ける哺乳動物は、障害を有すると診断され得、又は障害を罹患しやすい、又は罹患していると思われ得る。
【００８６】
「応答」又は「応答性のある」は、治療後の少なくとも１つの変化した特徴を示す対象を指す。対象の変化した特徴は、標的とされる病態又は障害の軽減又は遅延であってもよい。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防すること」及び「予防」は、対象の癌疾患の１つ以上の症状の発生及び／又は再発又は発症の予防を指し、予防又は治療薬の投与から生じる。
【００８８】
本明細書で提供される手段及び方法は、一次造血細胞又は全ての単球細胞について多くが記載される。当業者に理解されるように、一次造血細胞は、特にＰＢＭＣ及び骨髄細胞を含む。したがって、ＰＢＭＣについて記載される本明細書で提供される手段及び方法は、また、骨髄細胞及び任意のその他の単核性細胞について記載される。
【００８９】
本発明の方法で使用される試験化合物（複数可）は、疾患、特に癌の治療について承認された治療で使用される治療薬（複数可）であってもよい。この点に関して、本発明の意味の範囲における「試験化合物」として、限定されないが、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、核酸、合成及び天然薬剤、ペプトイド、ポリエン、マクロサイクル、グリコシド、テルペン、テルペノイド、脂肪族及び芳香族化合物及びそれらの誘導体が挙げられる。好ましい実施形態において、試験化合物は、合成及び天然薬剤等の化学化合物である。別の好ましい実施形態において、試験化合物は、疾患、障害、病理、及び／又はそれに関連する症状の軽減及び／又は治癒に影響する。ポリマーは、本発明の方法に使用される１つ以上の試験化合物を含み得る。
【００９０】
直ぐ前に詳述したように、試験化合物は、知られている治療薬から選択することもできる。この点に関して、適切な治療薬として、限定されないが、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｏｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（例えば、第９版）又はＴｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（例えば、第１２版）に示される治療薬が挙げられる。治療薬の属として、限定されないが、炎症応答に影響する薬剤、体液の組成に影響する薬剤、電解質代謝に影響する薬剤、化学療法薬（例えば、過剰増殖性疾患、特に癌、寄生虫感染症、及び微生物病のための）、抗悪性腫瘍薬、免疫抑制薬、血液及び造血臓器に影響する薬剤、ホルモン薬及びホルモンアンタゴニスト、ビタミン及び栄養剤、ワクチン、オリゴヌクレオチド及び遺伝子治療薬が挙げられる。組み合わせ、例えば、２剤等の２つ以上の薬剤の混合物又はブレンドを含む組成物が、また、本発明によっても含まれることが理解される。
【００９１】
一実施形態において、治療薬は、薬剤、又はプロドラッグ、抗体又はワクチンであってもよい。本発明の方法を使用して、治療薬の患者への投与が、治療薬、又は治療薬と共に投与される送達ビヒクルの成分、担体等に対する応答を誘引するかどうかを評価することができる。
【００９２】
治療薬の正確な性質は、本発明に限定しない。非限定的な実施形態において、本発明の方法は、任意に賦形剤、担体又は送達ビヒクルを組み合わせて、合成小分子、天然物質、天然又は合成して製造された生物学的製剤、又は前述の２つ以上の任意の組み合わせに対する応答を評価するために使用することができる。
【００９３】
特に単層における分析される試料に含まれる細胞の生存率は、技術分野で知られている方法を使用して、決定／評価／検証することができる。すなわち、当業者は、例えば、細胞は生存可能、生きている、死んでいる又はその期を変化する工程を経ている、例えば、アポトーシス又は壊死において死んでいるかどうかについて、細胞の期を決定／評価／検証する方法を良く知っている。したがって、細胞を特異的に認識／標識することが知られているマーカー／染料が特定の期におり、本発明の方法に使用することができる。後期の細胞死又は初期アポトーシスについて選択的な無傷ではない膜又は染料／標識を有する細胞に選択的である染料／標識を含む。例えば、固定することができる、生きている／死んでいるグリーンを使用することができ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｌ−２３１０１）、チトクロムＣに対する抗体は、染料の使用によってＤＮＡターンオーバー又は細胞増殖を決定する。特に、当業者に知られている単層の形態において、本発明で使用される細胞試料に含まれる細胞の生存率を決定／評価／検証するさらなる手段及び方法は当業者に知られている。
【００９４】
細胞試料特に単層、特にＰＢＭＣ単層又は骨髄細胞単層に含まれる２つ以上の区別することができるサブ集団（複数可）の生存率の変化及び／又は細胞間相互作用を決定／追跡／評価／検証は、技術分野で知られている方法を使用して行うことができる。例えば、顕微鏡を使用して、変化は、光学的知覚によって決定／追跡／評価／検証することができる。しかしながら、ハイスループット適用について、単層に含まれる個別のサブ集団の生存率及び／又は細胞間相互作用の変化を決定／追跡／評価／検証する自動化された方法が使用されることが好まれる。このような方法は、細胞試料、好ましくは単層に含まれるサブ集団を、例えば、検出可能な標識によって識別することを備える。その後、標識された／検出されたサブ集団が細胞間相互作用を示すかどうかを決定することができ、細胞間相互作用は、（前述のように）血漿膜を介した直接的接触又は間接的接触を含み得る。したがって、距離パラメーター、すなわち、標識された細胞間の前に定義された閾値が導入され、相互作用の全体数、すなわち、どれくらいの数の細胞間相互作用が標識された細胞間で観察されるのかを決定する。この手順において、区別することができるサブグループの標識された細胞は、第２の区別することができるサブグループの１つ以上の細胞と相互作用し得、それぞれの相互作用が数えられる。得られる数は、ランダム分布機能、すなわち、ランダム細胞間相互作用によって予想されるものと比較される。相互作用の傾向は、その後、本発明の方法、すなわち、相互作用スコアを使用して計算することができ、相互作用がランダム又は方向性を有するものなのかを決定する。１つ以上の試験物質（複数可）が本発明の細胞試料に加えられた前後にこのようなプロトコルに従うことによって、１つ以上の試験化合物（複数可）による細胞間相互作用の変化を決定／追跡／評価／検証することができる。
【００９５】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって共通して理解される意味と同じ意味を有する。本明細書の記載と同様又は等価な方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料が以下に記載される。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が管理する。さらに、材料、方法及び実施例は、例示するためにあり、限定することを意図しない。
【００９６】
本明細書に記載の一般的な方法及び技術は、技術分野で知られる通常の方法、他に指示されない限り、本明細書全体で記載され、検討される様々な一般的及びより詳細な参考文献に記載されるように、実施することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。
【００９７】
本発明の態様は図及び以下の記述に詳細に説明及び記載されるが、このような図及び記述は、説明又は例示であると考えられ、制限するものではない。変化及び修正は、以下の請求項の範囲及び趣旨の範囲で当業者によってなされ得ることが理解される。特に、本発明は、前述及び以下に記載の異なる実施形態からの特徴の任意の組み合わせでさらなる実施形態を網羅する。
【００９８】
本発明は、また、個別に図に示される全てのさらなる特徴を全て網羅するが、これらの特徴は以前の又は以下の記述に記載されていない場合がある。また、図及び記述に記載される実施形態及びその特徴の１つの代替例は、本発明のその他の態様の主題から否定することができる。
【００９９】
さらに、請求項において、「含む」という用語は、その他の要素又は工程を除外せず、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、複数のものを除外しない。１つの単位は、請求項に記載されるいくつかの特徴の機能を満たすことができる。属性又は値と共に「本質的に」、「約」、「大体」等のという用語は、特に、個別に属性を厳密に規定し、又は値を厳密に規定もする。請求項における任意の符号は、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１００】
特許又は出願書類は、色で作成される少なくとも１つの図を含む。色付きの図（複数可）を有するこの特許又は特許出願公開のコピーは、要望及び必要費用の支払いによって、特許庁によって提供される。
【０１０１】
本発明はまた、以下の図によるいくつかの態様でも説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１Ａは、細胞毒性試験化合物の薬剤濃度を関数として、癌性Ａ細胞及び非癌性Ｂ細胞の生存率を示す２つの仮説の用量反応曲線である。図１Ｂは、試験化合物の濃度を関数として、合計の生存細胞の生存Ａ細胞の合計細胞生存率及び画分を示す。ここで、合計細胞生存率が開始値の５％以下である場合、細胞の少数を定量化することが大きなエラーに関連するという事実により、生存Ａ細胞の画分は０．８に設定された（すなわち、ゼロの試験化合物の濃度の画分）。この方法に従って、１の選択性は、本発明の方法の工程に従う場合、確実に、試験化合物を強い全体の細胞毒性に割り当てる。
【図２】図２Ａは、３つの濃度点で測定する癌Ａ細胞及び非癌性Ｂ細胞に対する試験化合物のｌｏｇＥＣ５０の差を関数として、本発明に記載されるように決定された癌細胞を殺傷する細胞毒性試験化合物の選択性／値である（図１Ｂを参照されたい）。図２Ｂは、４００の濃度点で測定する癌細胞及び非癌性細胞に対する試験化合物のｌｏｇＥＣ５０の差を関数として、本発明に記載されるように決定される選択性／値である。３つの濃度点で既に測定された値は、本発明を使用して選択性の情報を得るのに充分である。しかしながら、濃度点が多いほど、選択性／値がｌｏｇＥＣ５０の差をより正確に反映する。
【図３】ダウノルビシンの濃度を関数として示される本発明を使用して、個別のダウノルビシンの濃度について決定されるＣＤ３４＋、ＣＤ１１７＋又はＣＤ３４＋／ＣＤ１１７＋のいずれかとして規定されるＡＭＬ芽細胞を殺傷するダウノルビシンの選択性／値である。ダウノルビシン含有治療に応答する患者は、異なるダウノルビシンの濃度にわたるダウノルビシンベースの３＋５＋７導入療法に応答しない患者よりも、本発明を使用して決定された低い選択性／値を有した。
【図４】上パネル：３つの前述の薬から成る「３＋５＋７」導入療法に対する応答者及び非応答者について、本発明に従って決定されるＡＭＬ患者の骨髄細胞における癌細胞（ここではＣＤ３４又はＣＤ１１７発現細胞として規定される）ダウノルビシン＋シタラビン＋エトポシドの選択性／値である。０．９２のカットオフ値は、０．８５の合計分類精度で、患者を応答者及び非応答者に分類することができる。中央パネル：全ての薬剤濃度及び組み合わせで平均されたゼロの薬剤濃度における癌性細胞の数に対する癌性細胞の数である。この計量のみが、０．６５の合計分類精度で、患者を応答者及び非応答者に分類することができる。下パネル：中央パネルと同様であるが、合計細胞数に基づく。この計量の使用では、正確な分類はできない。
【図５】本発明に従って、及び下流データ処理について実施例４に記載される方法を使用して決定されるＡＭＬ芽細胞を殺傷するダウノルビシンの選択性に基づく、３＋５＋７誘導療法を含むダウノルビシンに対するＡＭＬ患者の応答性を予測する場合、受診者動作曲線下の面積が最も高かった（ＡＵＲＯＣ＝０．９７）。これは、本発明に従って殺傷選択性／値を測定することが、例えば、応答の予測を癌性細胞の数に基づくよりも有利であることを実証する（ＡＵＲＯＣ＝０．９１）。ＡＭＬ芽細胞はここでは図２に規定される。
【図６】左：血液癌の患者は、２つ以上のＦＤＡ承認薬の組み合わせで治療を受けた。各患者について、複合の選択性は、本発明に従って決定されるように、１−患者に与えられる薬剤の個別の選択性の和として計算された。複合の選択性は、応答に対してプロットされ（ＰＤ＝進行性疾患、ＳＤ＝安定した疾患、ＰＲ＝部分寛解、ＣＲ＝完全寛解）、応答に相関する。統合された選択性に基づいて、患者は、応答者（ＣＲ及びＰＲ）及び非応答者（ＰＤ及びＳＤ）に、９２％の精度及び０．８４のＡＵＲＯＣに分類することができた。
【図７】本発明に従って決定されるびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の患者のＣＤ２０−細胞を上回るＣＤ２０＋細胞を殺傷するＦＤＡ承認薬の選択性／値である。患者は、イブルチニブによる治療に応答した。
【図８】本発明に従って決定されるＢ細胞リンパ芽球性リンパ腫の患者のＣＤ２０−細胞を上回るＣＤ２０＋細胞を殺傷するＦＤＡ承認薬の選択性／値である。患者は、ボルテゾミブ及び６−メルカプトプリンの組み合わせによる治療に応答した。
【図９】本発明に従って決定されるびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の患者のＣＤ７９ａ−細胞を上回るＣＤ７９ａ＋細胞を殺傷するＦＤＡ承認薬の選択性／値である。患者は、ボルテゾミブ、クラドリビン及びデキサメタゾンの組み合わせによる治療に応答した。
【図１０】異なる濃度での化合物Ｘ［Ｘ］（任意濃度スケールにおいて、Ａに対するｌｏｇＥＣ５０＝−２及びＢに対するｌｏｇＥＣ５０＝３）による治療後の集団Ａ及び集団Ｂの細胞の生存率が計算された。したがって、合計の生存細胞（集団Ａ＋Ｂ）の画分として、集団Ａの生存細胞の数は、Ａ生存細胞／（Ａ生存細胞＋Ｂ生存細胞）として決定された。ロジスティック用量反応曲線は、濃度［Ｘ］（黒い線）及び屈曲点として決定されるｌｏｇＥＣ５０の関数として、Ａ生存細胞／（Ａ生存細胞＋Ｂ生存細胞）から生じるＳ字状曲線に適合された。ｌｏｇＥＣ５０ＡもｌｏｇＥＣ５０Ｂも、曲線適合（すなわち、黒い線のＳ字状曲線ｌｏｇＥＣ５０）から得られるｌｏｇＥＣ５０に対応し、これは、ＥＣ５０Ａ又はＥＣ５０Ｂの生存率がＡ生存細胞／（Ａ生存細胞＋Ｂ生存細胞）に対するロジスティック曲線を適合することから得ることができなかったことを実証する。
【実施例】
【０１０３】
実施例１
細胞毒性薬剤Ｘに対する細胞集団Ａ及びＢから成る細胞の混合物の応答をシミュレートする合成データが提供された。Ｘは、任意濃度スケールにおいて、ＥＣ５０ＡのｌｏｇＥＣ５０（例えば、図１Ａの２．５）及びｌｏｇＥＣ５０Ｂ（例えば、図１Ｂの３）を有するＢで影響された。これらのパラメーターに基づいて、生存細胞の数及びＡ及びＢ細胞の混合物の各種の細胞の合計数は、標準４パラメータロジスティック（すなわちＳ字状）用量反応曲線を想定して計算することができた。［Ｘ］の濃度＝０である場合、Ａ：Ｂの比＝０．８：０．２である場合、１０，０００個の細胞の合計数が想定された。たった３つの薬剤濃度の合計数のＢを上回るＡを殺傷するＸの選択性の測定値がシミュレートされた。
【０１０４】
薬剤の選択性は、本発明を使用して計算された。特に、それぞれの測定された薬剤濃度について、生存Ａ細胞の数及び生存Ｂ細胞の数が計算された。本発明の方法の工程（ｄ）に従って、（ｉ）Ｒｘ＝Ａｘ／（Ａｘ＋Ｂｘ）として３つの異なる濃度のＸの存在下で同じ表現型を示す細胞の合計集団の細胞数（ここではｖｉａｂｌｅＡ＋ｖｉａｂｌｅＢ）に対する区別することができる表現型（ここでは生存率）を示す少なくとも２つのサブ集団の１つにおける生存細胞の数、Ａｘ及びＢｘは、３つの異なる濃度［Ｘ］の生存Ａ及びＢ細胞の数を示す、並びに（ｉｉ）［Ｘ］の濃度＝０について、Ｒ０＝Ａ０／（Ａ０＋Ｂ０）が決定された。その後、Ｓｘ＝Ｒｘ／Ｒ０として［Ｘ］の各濃度における選択性が決定され、全てのＳｘについて平均化されて、Ｓｆｉｎａｌ＝（Ｓ１＋Ｓ２＋Ｓ３）／３の最終選択性を得た。
【０１０５】
本発明を使用して異なる対のＥＣ５０Ａ及びＥＣ５０Ｂの薬剤選択性を決定する場合、驚くべきことに、Ａに対するＸのｌｏｇＥＣ５０及びＢに対するＸのｌｏｇＥＣ５０の差に線形に比例した（図２）。
【０１０６】
実施例２
Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離を使用して急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であると新たに診断された治療が初めての患者の２０個の骨髄細胞の試料から単核細胞が抽出された。骨髄試料を採取した後に、２０名の全患者は、「３＋５＋７」スケジュールに従ってダウノルビシン、エトポシド及びシタラビンによる治療を受け、それによって１０名の患者が応答し、１０名の患者は応答しなかった。
【０１０７】
単核細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシンに懸濁され、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｒｉｅｒ３８４ウェル細胞培養プレートに、ウェルあたり５０μＬの培地に、２０，０００個の細胞の濃度で蒔かれ、それによって以前に、異なる濃度でシタラビン、ダウノルビシン及びエトポシドの組み合わせで充填された。全ての可能な薬剤及び濃度の組み合わせが０、１、３、１０及び２０μＭの濃度のシタラビン、０、０．１、１、３及び１０μＭの濃度のダウノルビシン及び０、１、３、１０及び２０μＭの濃度のエトポシドを有するプレートに示され、３次元薬剤滴定マトリックスを提供する。細胞は、国際公開第２０１６／０４６３４６号に記載の単層を形成し、単層は、１８時間インキュベートされ、０．５％のＴｒｉｔｏｘ  Ｘ１１４を含有するＰＢＳ中、１５μＬの４％のホルムアルデヒド溶液を加えることによって固定され、フリックされ、ＤＡＰＩで染色され、並びに抗体を蛍光標識して、ＣＤ３４及びＣＤ１１７陽性細胞をマークした。インキュベーションから１時間後、各ウェルの画像がＯｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ自動共焦点顕微鏡（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して撮影された。
【０１０８】
マーカー陽性細胞は、癌性細胞と考えられ、マーカー陰性細胞は非癌性細胞として考えられた。生存細胞の合計数は、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ計算画像分析ソフトウェアを使用してインタクトなＤＡＰＩ染色された核を数えることによって定量化され、断片化された核は、死んだ又は死んでいるものとして処分された。同様に、生きている癌性細胞の数は、インタクトなＤＡＰＩ染色された核を有する抗体染色された細胞として決定された。
【０１０９】
癌性集団を殺傷する各薬剤の選択性は、異なる濃度のダウノルビシンのみについて、コントロールのウェル（薬剤なし、ＤＭＳＯのみ）の生きている全ての細胞の生きている癌性細胞の画分に対して、生きている合計の細胞の生きている癌性細胞の画分を取ることによって、本発明に従って決定された（図３）。驚くべきことに、この尺度は単独で応答者及び非応答者を分けることができた。
【０１１０】
全ての薬剤の分布を考慮するために、癌性集団を殺傷する各薬剤の選択性は、コントロールのウェル（薬剤なし、ＤＭＳＯのみ）の生きている全ての細胞の生きている癌性細胞の画分に対して、それぞれの薬剤の組み合わせ及び濃度で、生きている合計の細胞の生きている癌性細胞の画分を取ることによって、並びに薬剤の全ての濃度及び組み合わせを平均することによって、本発明に従って決定された。０．９２のカットオフ値を使用して、薬剤の組み合わせに臨床的に応答した患者は、０．８５の合計の分類精度で応答しなかった（図４、上パネル）患者と区別することができた。
【０１１１】
実施例３
実施例２と同様に、薬剤応答が癌細胞（ここではＣＤ３４又はＣＤ１１７陽性細胞）の感受性又は合計細胞集団の感受性に基づいてのみ決定される場合、０．６５以下の分類精度が得られた（図４、それぞれ中央及び下パネル）。
【０１１２】
実施例４
実施例２及び３と同様に、この例は、本発明に従って決定された選択性がどのようにして、下流分析に使用されて、さらにより正確に患者を応答者及び非応答者に分類することができる薬剤応答スコアを得ることができるのかを示す。各患者の試料及び異なる濃度の薬剤の組み合わせについて、選択性は、本発明に従って計算され、応答者及び非応答者にわたる各濃度で平均化された。得られるデータ点は、応答者についての１つの表面及び非応答者についての１つの表面を与える４次元用量反応空間における用量反応表面に及ぶ。２つの用量反応表面を最適に分ける表面は、特定の薬剤用量の組み合わせにおいて、応答者及び非応答者に最適に分類することを可能にした用量反応空間の各点で、カットオフ点を決定することによって決定された。反応スコアは、用量反応空間の各点に対して１を割り当てることによって、各患者について計算され、１は、分離表面の応答者側にあり、−１は反対側にあった。濃度空間における各点で、合計の分類精度によって重み付けされたこれらのインジケーターの和が最終的な薬剤応答スコアとなった。例えば、この応答スコアは、３＋５＋７導入治療を受けているＡＭＬ患者を９０％より高い分類精度で応答者及び非応答者に分けることができ（図５）、０．９７の受診者動作曲線下の面積は、同モデルを、ゼロの薬剤濃度のみで癌性細胞の数に正規化される癌性細胞の数に基づく場合、たった０．９１のＡＵＲＯＣを提供し、同モデルを細胞数に基づく場合は０．８６のＡＵＲＯＣを提供した。
【０１１３】
実施例５
ＰＢＭＣ又は骨髄に通常見られる骨髄液、末梢血、胸水、腹水又は切除されたリンパ節の試料は、Ｆｉｃｏｌｌ勾配（骨髄、末梢血、供水、腹水）（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製され、又は均質化及びろ過され（リンパ組織）、ＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンに再懸濁された。通常ＰＢＭＣに見つけられる単核細胞の得られる単一の細胞懸濁液は、国際公開第２０１６／０４６３４６号にしたがって、ウェルプレートあたり５０μＬの培地中の２０，０００個の細胞の濃度で、３８４ウェルＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｒｉｅｒイメージングプレートに蒔かれて、非接着性細胞単層を形成した。５０ｎＬのＤＭＳＯ又はコントロールとしての５０ｎＬのＤＭＳＯに１４０個の異なる臨床的に使用される抗癌剤がプレートに以前に充填され、５０μＬの培地及び細胞を加えた後の各薬剤が、薬剤につき少なくとも３つの技術的複製物において１又は１０μＭの最終濃度で存在し、並びに濃度及びＤＭＳＯ濃度は、０．１％ｖ／ｖになった。
【０１１４】
単層は一晩（１８時間）インキュベートされた。研究に使用される生検は、全て新鮮な状態で獲得され、凍結保存はされていなかった。免疫蛍光染色、自動顕微鏡によるイメージング（Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、イメージ分析（ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ）及びデータ分析（Ｍａｔｌａｂ）は、Ｖｌａｄｉｍｅｒ等、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ２０１７に以前に記載されたように実施された。標的癌性細胞集団を識別するために使用される抗体は、臨床病理学のレポート及び抗体反応性評価に基づいて選択され、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＣＤ３（ＨＩＴ３ａ）、ＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、ＣＤ２０（２Ｈ７）、ＣＤ７９ａ（ＨＭ４７）、ＣＤ３４（４Ｈ１１）、ＣＤ１１７（１０４ＥＤ２）及びＣＤ１３８（ＤＬ−１０１）を含んだ。非染色細胞は、非癌性細胞と考えられた。
【０１１５】
非癌性細胞よりも癌細胞を殺傷する薬剤の選択性は、コントロールのウェル（薬剤なし、ＤＭＳＯのみ）の生きている全ての細胞の生きている癌性細胞の平均の画分に対して、各薬剤及び濃度について、生きている合計の細胞の生きている癌性細胞の平均の画分を取ることによって、本発明に従って決定された。各薬剤について、２つの濃度の平均の画分のこれらの商が決定された。
【０１１６】
本発明に従って決定されるように、１未満の値／選択性を示した薬剤で治療を受けた患者は、本発明に従って決定される値を考慮せずに選択された薬剤又は本発明に従って決定されるように１より大きい値／選択性を有した薬剤で治療を受けた患者よりも高い応答機会（すなわち、完全寛解又は部分寛解の達成）を有した。
【０１１７】
さらに、薬剤の組み合わせが患者に与えられた場合、１−患者に与えられる薬剤の個別の値（図６）の和が大きいほど、患者が応答する機会が高いものと思われる。
【０１１８】
実施例６
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有する６９歳男性は、これまでに７つのラインの治療の後、再発した。試料のリンパ腫細胞は、１より大きい薬剤の選択性によって示されるように、試験を行った１０４個の薬剤の大部分に抵抗性があって、本発明に従って決定されるように、非癌性細胞よりも癌性細胞を殺傷し、６つの化合物だけが重要なｅｘ  ｖｉｖｏのオンターゲット効果を示した（図７）。患者の病歴、年齢及び併存症からシスプラチン及びオキサリプラチンは実行可能であるとは考えられなかったが、ＢＴＫ阻害剤のイブルチニブは、２番目に強力なｅｘ  ｖｉｖｏ有効性（本発明に記載の値／選択性＝０．６１、Ｐ＜０．０００４８；図７）を示した。イブルチニブ治療の４９日目に実施されたＰＥＴ−ＣＴは、患者について完全寛解を確認した。
【０１１９】
実施例７
前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫（Ｂ−ＬＢＬ）を有する５１歳女性は、これまでに３つのラインの治療を受けたことがあり、二重特異的ＣＤ３−ＣＤ１９抗体ブリナツモマブによる免疫療法の後、進行した。ＰＢＭＣに通常見つけられる細胞を含む細胞混合物が、女性の胸水から単離された。細胞混合物に含まれる癌性対非癌性細胞を選択的に殺傷する２６６個の化合物の能力は、本発明を使用して決定された。プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブが、癌細胞を選択的に殺傷することができ（本発明に従って決定された選択性＝０．５０、Ｐ＜０．００１；図８）及びチオプリン６−メルカプトプリン、６−ＭＰ（本発明に従って決定された値／選択性０．５８、Ｐ＜０．００１；図８）であることが明らかとなった。６−ＭＰ及びボルテゾミブは、抗ＣＤ２０オビヌツズマブと併用された。２８日後、ＰＥＴ−ＣＴは、部分緩解を確認した。
【０１２０】
実施例８
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を有する患者の切除されたリンパ節は、１つの細胞に分離され、ＰＢＭＣに通常見つけられる細胞を含む複雑な細胞混合物を与えた。細胞混合物に含まれる癌性対非癌性細胞を選択的に殺傷する２６６個の化合物の能力は、本発明に従って決定された。患者は、１つの最も強力なｅｘ  ｖｉｖｏ作用薬ボルテゾミブ（選択性＝０．５９、Ｐ＜０．０００１）、クラドリビン（選択性＝０．７３；Ｐ＜０．０００３）及びデキサメタゾン（値／選択性＝０．８７；Ｐ＜０．０５；図９）との組み合わせに完全寛解を達成した（図９）。
【０１２１】
実施例９
本実施例は、請求項（１）以降、特に請求項（１）及び（２）に記載される方法の実用的適用を記載する。４０，０００個の細胞から成る血液癌患者の組織試料が提供される。２０，０００個の細胞は、癌性細胞であり、細胞表面マーカーＣＤ１９に陽性に染色する。残りの細胞は、ＣＤ３、４、８、１１ｃ、１４、５６及びその他を含むその他の細胞表面マーカーに陽性に染色する。試料は、それぞれ２０，０００個の細胞の２つの部分に分けられる。第１試料は、ＤＭＳＯ（０．１％の最終ＤＭＳＯ濃度）の１０μＭのボルテゾミブの存在下でＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳにインキュベートされ、第２試料は、ＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳ＋０．１％のＤＭＳＯでインキュベートされる。２４時間のインキュベーションの後、各試料の各細胞の生存率が決定され、それによって、本明細書における生存率は、請求項１及び従属する請求項の工程（ｄ）に参照される「区別することができる表現型」である。ボルテゾミブで処理された試料において、ＣＤ１９について５，０００個の生細胞の染色が見つけられ、ＣＤ１９染色に陰性の１０，０００個の生細胞が見つけられる。ＤＭＳＯで処理された試料において、ＣＤ１９に陽性の１０，０００個の生細胞染色及びＣＤ１９に陰性の染色がそれぞれ見つけられる。本発明に従って、ＣＤ１９陽性細胞の生存率を減少するボルテゾミブの選択性が計算される。
【０１２２】
以下の工程（ｄ）に従って、（ｉ）試験化合物としてボルテゾミブの存在下でインキュベートされた少なくとも１つの部分（本明細書では５，０００／１５，０００＝０．３３）及び（ｉｉ）試験化合物の非存在下でインキュベートされた少なくとも１つの部分（本明細書では１０，０００／２０，０００＝０．５）において、同じ表現型を示す（すなわち、生存率）細胞の合計集団（ＣＤ１９陽性＋ＣＤ１９陰性細胞）の細胞の数に対して、区別することができる表現型（本明細書では生存率）を示す少なくとも２つのサブ集団の１つにおける細胞数が計算される。
【０１２３】
工程（ｅ）に従って、全てのその他のサブ集団にわたって、工程（ｄ）（本明細書ではＣＤ１９陽性細胞）において参照される表現型を誘導する試験化合物（本明細書ではボルテゾミブ）の選択性は、（ｉ）（本明細書では０．３３）を（ｉｉ）（本明細書では０．５０）によって割ることによって決定される。０．３３／０．５０＝０．６６は、すなわち、１未満であるため、試験化合物（本明細書ではボルテゾミブ）は、工程（ｄ）（本明細書ではＣＤ１９陽性細胞）に明示的に参照される１つの集団において、工程（ｄ）（本明細書では生存率）の表現型を選択的に阻害する。そのため、本発明に従って、我々は、所与の例におけるＣＤ１９陽性細胞の生存率を選択的に減少したと結論付けることができる。
【０１２４】
実施例１０
本実施例は、本発明の方法のさらに実用的適用を記載する。６０，０００個の細胞から成る血液癌患者の組織試料が提供される。３０，０００個の細胞は、癌性細胞であり、細胞表面マーカーＣＤ７９ａに陽性に染色する。残りの細胞は、ＣＤ３、４、８、１１ｃ、１４、５６及びその他を含むその他の細胞表面マーカーに陽性に染色する。適切に標識された抗体は、染色試薬として使用される。この試料は、４０，０００個の細胞及び２０，０００個の細胞の２つの部分に分けられる。４０，０００個の細胞の第一部分は、さらに、本明細書ではそれぞれ［１ａ］及び［１ｂ］と記載される２０，０００個の細胞の２つの部分に分けられる。部分［１ａ］及び［１ｂ］は、それぞれ、ＤＭＳＯ（０．１％の最終ＤＭＳＯ濃度）の１０μＭ及び１μＭのボルテゾミブの存在下でＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳにインキュベートされ、第２試料は、ＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳ＋０．１％のＤＭＳＯでインキュベートされる。本明細書におけるＣＤ７９ａは、明白にするために、仮説の例として選択されるだけで、任意のその他の表面マーカーに置き換えることができる。
【０１２５】
２４時間のインキュベーションの後、各試料の各細胞の生存率が決定され、それによって、本明細書における生存率は、本発明で使用される「区別することができる表現型」である。ボルテゾミブで処理された試料［１ａ］において、ＣＤ７９ａについて５，０００個の生細胞の染色が見つけられ、ＣＤ７９ａ染色に陰性の１０，０００個の生細胞が見つけられる。ボルテゾミブで処理された試料［１ｂ］において、ＣＤ７９ａについて８，０００個の生細胞の染色が見つけられ、ＣＤ７９ａ染色に陰性の１０，０００個の生細胞が見つけられる。ＤＭＳＯで処理された試料において、ＣＤ７９ａに陽性の１０，０００個の生細胞染色及びＣＤ７９ａに陰性の染色がそれぞれ見つけられる。ＣＤ７９ａ陽性細胞の生存率を減少するボルテゾミブの選択性が本発明の方法に従って計算される。
【０１２６】
工程［１ａ］及び［１ｂ］の両方について、（ｉ）試験化合物としてそれぞれの濃度で、ボルテゾミブの存在下でインキュベートされた少なくとも１つの部分（本明細書では、［１ａ］について５，０００／１５，０００＝０．３３、及び［１ｂ］について８，０００／１８，０００＝０．４４）及び（ｉｉ）試験化合物の非存在下でインキュベートされた少なくとも１つの部分（本明細書では、１０，０００／２０，０００＝０．５）において、同じ表現型（すなわち、生存率）を示す細胞の合計集団の細胞（ＣＤ７９ａ陽性＋ＣＤ７９ａ陰性細胞）の数に対して、区別することができる表現型（本明細書では、生存率）を示す少なくとも２つのサブ集団（本明細書では、ＣＤ７９ａ陽性細胞）の１つにおける細胞数が計算される。
【０１２７】
以下の工程（ｅ）に従って、全てのその他のサブ集団にわたって、工程（ｄ）（本明細書ではＣＤ７９ａ陽性細胞）において参照される表現型を誘導する試験化合物（本明細書ではボルテゾミブ）の選択性は、（ｉ）（本明細書：［１ａ］については０．３３、［１ｂ］については０．４４）を（ｉｉ）（本明細書０．５０）によって割ることによって決定され、平均選択性は、（０．３３／０．５０＋０．４４／０．５０）／  ２＝０．７７として最終値／選択性として計算される。０．７７は１未満であるため、試験化合物（本明細書ではボルテゾミブ）は、工程（ｄ）（本明細書ではＣＤ７９ａ陽性細胞）に明示的に参照される１つの集団において、工程（ｄ）の表現型（本明細書では生存率）を選択的に阻害する。そのため、本発明に従って、所与の例におけるＣＤ７９ａ陽性細胞の生存率を選択的に減少したと結論付けることができる。
【０１２８】
試料の由来とされる患者は、ボルテゾミブによる治療に応答したと思われる。本明細書におけるＣＤ７９ａは、明白にするために、仮説の例として選択されるだけで、任意のその他の表面マーカーに置き換えることができる。また、細胞数は、例示の目的で恣意的に選択されるだけである。
【０１２９】
実施例１１
６０，０００個の細胞から成る血液癌患者の組織試料が提供される。３０，０００個の細胞は、癌性細胞であり、細胞表面マーカーＣＤ２０に陽性に染色する。残りの細胞は、ＣＤ３、４、８、１１ｃ、１４、５６及びその他を含むその他の細胞表面マーカーに陽性に染色する。適切に標識された抗体は、染色試薬として使用される。試料は、それぞれ２０，０００個の細胞の３つの部分に分けられる。２０，０００の２つの部分は、それぞれ、ＤＭＳＯ（０．１％の最終ＤＭＳＯ濃度）の１０μＭのボルテゾミブの存在下でそれぞれＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳにインキュベートされ、第３部分は、ＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳ＋０．１％のＤＭＳＯでインキュベートされる。本明細書におけるＣＤ２０ａは、明白にするために、仮説の例として選択されるだけで、任意のその他の表面マーカーに置き換えることができる。
【０１３０】
２４時間のインキュベーションの後、各試料の各細胞の生存率が決定され、それによって、本明細書における生存率は、「区別することができる表現型」である。１０μＭのボルテゾミブで処理された２つの試料において、ＣＤ２０ａについて５，０００個の生細胞の染色が見つけられ、ＣＤ２０ａ染色に陰性の１０，０００個の生細胞がそれぞれ見つけられる。ＤＭＳＯで処理された試料において、ＣＤ２０に陽性の１０，０００個の生細胞染色及びＣＤ２０に陰性の染色がそれぞれ見つけられる。ＣＤ７９ａ陽性細胞の生存率を減少するボルテゾミブの選択性が決定される。
【０１３１】
１０μＭのボルテゾミブの存在下でインキュベートされた両方の部分について、（ｉ）ボルテゾミブの存在下でインキュベートされたそれぞれの部分（すなわち、５，０００／１５，０００＝０．３３及び５，０００／１５，０００＝０．３３）及び（ｉｉ）試験化合物の非存在下でインキュベートされたそれぞれの部分（本明細書では、１０，０００／２０，０００＝０．５）において、同じ表現型を示す（すなわち、生存率）細胞の合計集団の細胞（ＣＤ２０陽性＋ＣＤ２０陰性細胞）の数に対して、区別することができる表現型（本明細書では、生存率）を示す少なくとも２つのサブ集団（本明細書では、ＣＤ２０陽性）の１つにおける細胞数が独立して決定される。その後、（ｉ）及び（ｉｉ）の平均が形成され、（ｉ）については０．３３及び（ｉｉ）については０．５が与えられ、さらなる工程のために使用され、すなわち、工程（ｅ）において、値／選択性は、（ｉ）の平均を（ｉｉ）の平均で割って、最終の値／選択性として０．３３／０．５＝０．６６が得られる。
【０１３２】
実施例１２
本実施例は、正確なＥＣ５０値が同じ表現型を示す合計の細胞の表現型を示す細胞の画分に対する用量反応曲線を適合することから得ることができないことを説明する。Ａ：Ｂ＝０．２：０．８の比のタイプＡ及びＢの細胞の混合物が推定された。細胞混合物は、細胞毒性化合物Ｘで処理された。恣意的な濃度スケールにおいて、化合物ＸのＡ細胞を殺傷する能力は、３のｌｏｇＥＣ５０で定量化され、化合物ＸのＢ細胞を殺傷する能力は、−２のｌｏｇＥＣ５０で定量化された。生細胞の合計数（すなわち、生細胞Ａ＋生細胞Ｂ）の生細胞のＡの数の画分を計算して、図１０に示されるＳ字状曲線が得られた。この曲線（実線）の屈曲点は、ＡのＸ活性の用量反応曲線のＥＣ５０、ＢのＸ活性の用量反応曲線のＥＣ５０のどちらも情報価値がないことが明白に分かるであろう。
【０１３３】
実施例１３
本実施例は、試験化合物ＸのＢ細胞よりもＡ細胞を殺傷する選択性を決定するために、Ａ及びＢ細胞の細胞混合物をマイクロタイタープレートに導入する場合、合計細胞数の１０％の標準偏差の効果を説明する。濃度［Ｘ］の関数として、Ａ及びＢ細胞の合計数を測定する古典的な方法を使用して選択性を決定して、Ｓ字状用量反応曲線を適合し、Ａ及びＢに対するＸのＥＣ５０を測定する場合、それぞれの測定点は、１０％の標準偏差を有する。本発明を使用して、合計細胞数の１０％の変化は、生細胞の合計数のＡ生細胞の画分に影響しない。本発明は、したがって、細胞をアッセイプレートに蒔く場合の変化、又は操作の間の細胞の喪失に対してより強固である選択性の決定を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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