(57)【要約】  本発明は、銀ナノ粒子合成能を有するデイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）菌株を含む放射性ヨウ素除去用キット及びこれを用いた放射性ヨウ素除去方法に関するもので、本発明に係る銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を含む放射性ヨウ素除去用キットは、少量の菌体量でも、さまざまな種類の溶液に存在する放射性ヨウ素を98％以上の高効率で除去することができ、使用および使用後の管理が非常に簡単である。したがって、前記の放射性ヨウ素除去用キット及びこれを用いた放射性ヨウ素除去方法は、大規模病院、産業体、および原発事故などで発生する放射性ヨウ素の除去に非常に有用に用いることができる。
2021534431.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1）銀イオン（Ag+）を含む培地でデイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）菌株を培養して、菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を収得する工程、
2）半透過性膜の容器に培養培地と一緒に前記の菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を接種する工程、および
3）前記容器を、放射性ヨウ素汚染水と接触させ、放射性ヨウ素が半透過性膜を通過して菌株の表面の銀ナノ粒子と結合するようにして、放射性ヨウ素が結合した銀ナノ粒子が菌株の表面に付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を収得する工程を含む放射性ヨウ素除去方法。
【請求項２】
前記工程2）の菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株が、菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の凍結乾燥した菌体である、請求項１に記載の放射性ヨウ素除去方法。
【請求項３】
前記工程1）または2）の培養培地が、TGY培地、PGYM培地、栄養培地またはYPD培地である、請求項１に記載の放射性ヨウ素除去方法。
【請求項４】
前記半透過性膜が、空隙の大きさ（pore size）が1μm以下である、請求項１に記載の放射性ヨウ素除去方法。
【請求項５】
前記半透過性膜の容器を回収する工程をさらに含む、請求項１に記載の放射性ヨウ素除去方法。
【請求項６】
銀イオンを含む培地で培養し、菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株、前記菌株の培養培地および半透過性膜を含む放射性ヨウ素除去用キット。
【請求項７】
前記銀イオンを含む培地が、硝酸銀を含む培地である、請求項６に記載の放射性ヨウ素除去用キット。
【請求項８】
前記菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株が、菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を凍結乾燥した菌体である、請求項６に記載の放射性ヨウ素除去用キット。
【請求項９】
培養培地が、TGY培地、PGYM培地、栄養培地またはYPD培地である、請求項６に記載の放射性ヨウ素除去用キット。
【請求項１０】
前記半透過性膜が、空隙の大きさが1μm以下である、請求項６に記載の放射性ヨウ素除去用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銀ナノ粒子合成能を有するデイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）菌株を含む放射性ヨウ素除去用キット及びこれを用いた放射性ヨウ素除去方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
原子力発電所の事故および廃棄物による放射能流出の危険性が増大しており、2011年に日本の福島原子力発電所の爆発事故の発生よって周辺国である韓国でも、放射性ヨウ素およびセシウム（Cesium、Cs）などが検出されたことがある。また、甲状腺抗がん治療に放射性ヨウ素（I131）が用いられるに伴い、最近甲状腺がん患者の急速な増加により、放射性廃棄物の容量もまた増加している。放射性ヨウ素が自然環境に露出すると土壌、水系などの生態系に深刻な汚染を引き起こす可能性があり、人体に継続的に露出すると、がんまたはホルモン異常を誘発し得る。したがって、効率的な放射性ヨウ素の除去技術および放射性廃棄物の処理方法の技術開発が求められている。
【０００３】
ウラン（Uranium、U）、セシウム、およびテクネチウム（Technetium、Tc）などの金属放射性同位元素を除去する技術に比べて、放射性ヨウ素の除去方法に対しては、相対的に多くの研究が行われていない。現在、水溶液上に含まれた放射性ヨウ素の除去のためにゼオライトおよびアルミナのような吸着剤、活性炭（activated carbon）（非特許文献１）、活性炭繊維（activated carbon fiber）または陰イオン交換樹脂（anion exchange resin）などが活用されたことがあるが、新しい固体放射性廃棄物が蓄積されることがあり、その除去効率も低いという問題点がある。最近では、ナノ化合物を用いた放射性同位元素の除去に対する報告が増加している傾向にあり、微生物を利用する方法も報告されている。
【０００４】
特に、デイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）菌株は、生物のDNAまたはタンパク質に直接損傷を受け得るイオン化放射線に対して耐性を有しており、酵素的または非酵素的システムによって、細胞内に生成された活性酸素種（ROS）を効果的に除去することができる能力を有している。このような特性のため、前記の菌株は、放射性廃棄物の浄化に用いることができ、医薬、保健、バイオテクノロジーなどの様々な分野で活用することができる。
【０００５】
しかし、従来のデイノコッカス・ラディオデュランス菌株のような微生物を活用した放射性同位元素の除去技術は、除去効率が非常に高く、新しい二次汚染物質を発生させず、汚染された環境および現場にすぐに適用が可能であるという利点がある反面、放射性同位元素が吸着した微生物の回収が容易ではないという限界がある。そこで、本発明者らは半透過性膜を用いて、放射性ヨウ素が吸着した微生物の回収が容易な放射性ヨウ素除去方法を考案し、これをキット化することにより、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】E Chmielewska-Horvatova et al,J Radioanal Nucl Chem 200：351,1995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、銀ナノ粒子合成能を有するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を含む放射性ヨウ素除去用キット及びこれを用いた放射性ヨウ素除去方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、1）銀イオン（Ag+）を含む培地でデイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）菌株を培養して、菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を収得する工程; 2）半透過性膜の容器に培養培地と一緒に前記の菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を接種する工程;および3）前記容器を、放射性ヨウ素汚染水と接触させ、放射性ヨウ素が半透過性膜を通過して菌株の表面の銀ナノ粒子と結合するようにして、放射性ヨウ素が結合した銀ナノ粒子が菌株の表面に付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を収得する工程を含む放射性ヨウ素除去方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、銀イオンを含む培地で培養し、菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株、前記菌株の培養培地および半透過性膜を含む放射性ヨウ素除去用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を含む放射性ヨウ素除去用キットは、少量の菌体量でも、さまざまな種類の溶液に存在する放射性ヨウ素を98％以上の高効率で除去することができ、使用及び使用後の管理が非常に簡単である。したがって、前記の放射性ヨウ素除去用キット及びこれを用いた放射性ヨウ素除去方法は、大規模病院、産業体、および原発事故などで発生する放射性ヨウ素の除去に非常に有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】硝酸銀が含まれていないTGY培地および硝酸銀を含むTGY培地でそれぞれ培養したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の培養液を示した図である。
【図１ｂ】図1aの培養液を遠心分離して上澄み液を除去した沈殿物を示した図である。
【図２】銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の培養液の吸光度をUV-Vis分光光度計で測定した結果のグラフである。
【図３】デイノコッカス・ラディオデュランス菌株から合成した銀ナノ粒子の大きさの分布を示した結果のグラフである。
【図４ａ】野生型デイノコッカス・ラディオデュランス菌株の細胞表面を示した図である。
【図４ｂ】銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の細胞表面を示した図である（X50k）。
【図４ｃ】銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の細胞表面を示した図である（X100k）。
【図４ｄ】銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株培養液のエネルギー分散型X-線分析の結果を示した図である。
【図５ａ】銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の放射性ヨウ素除去率を測定した結果のグラフである。
【図５ｂ】銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の時間に伴う放射性ヨウ素除去率を測定した結果のグラフである。
【図６ａ】デイノコッカス・ラディオデュランス菌株から分離及び精製した銀ナノ粒子をろ過および吸着させたセルロース膜濾過紙を示した図である。
【図６ｂ】デイノコッカス・ラディオデュランス菌株から分離及び精製した銀ナノ粒子をろ過および吸着させたセルロースの走査電子顕微鏡写真を示した図である（X50k）。
【図６ｃ】デイノコッカス・ラディオデュランス菌株から分離及び精製した銀ナノ粒子をろ過および吸着させたセルロースの走査電子顕微鏡写真を示した図である（X100k）。
【図６ｄ】図6aのエネルギー分散型X-線分析の結果を示した図である。
【図７ａ】計量したTGY培地粉末を示した図である。
【図７ｂ】図7aの粉末を滅菌蒸留水に溶解させる写真を示した図である。
【図７ｃ】銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の凍結乾燥された菌体を示した図である。
【図７ｄ】図7bに図7cを追加した写真を示す図である。
【図７ｅ】図7dを12時間反応させた後、活性化した放射性ヨウ素除去用キットを示した図である。
【図７ｆ】図7eを用いて、放射性ヨウ素を除去する方法を示した図である。
【図８】銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を含むキットの放射性ヨウ素除去率を測定した結果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、1）銀イオン（Ag+）を含む培地でデイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）菌株を培養して、菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を収得する工程; 2）半透過性膜の容器に培養培地と一緒に前記の菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を接種する工程;および3）前記容器を、放射性ヨウ素汚染水と接触させ、放射性ヨウ素が半透過性膜を通過して菌株の表面の銀ナノ粒子と結合するようにして、放射性ヨウ素が結合した銀ナノ粒子が菌株の表面に付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を収得する工程を含む放射性ヨウ素除去方法を提供する。
【００１４】
前記の工程1）の銀イオンを含む培地は、銀イオンが分離される塩を含む培地で、具体的には硝酸銀（AgNO3）を含む培地であり得る。
【００１５】
前記の工程2）の菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株は、菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の凍結乾燥した菌体であり得る。
【００１６】
前記の工程1）または2）の培地は、TGY培地、PGYM培地（10g/Lペプトン、2g/Lグルコース、4g/L酵母抽出物、10g/L肉（meat）抽出物および2g/L塩化ナトリウム）、栄養培地（3g/L牛肉（beef）抽出物および5g/Lペプトン）またはYPD培地（5g/L酵母抽出物、10g/Lペプトンおよび10g/Lデキストロース）であり得るが、これらに制限されるものではない。
【００１７】
前記半透過性膜、放射性ヨウ素は、自由に通過が可能であるが、デイノコッカス・ラディオデュランス菌株、および放射性ヨウ素と銀の反応沈殿物が通過できないもので、空隙の大きさ（pore size）が1μm以下であり得る。
【００１８】
前記銀（Ag）は、その形態が制限されるものではないが、平均粒径が1nm〜1μmの粒子形態であり得、好ましくは、平均粒径が10nm〜100nmである粒子形態であり得るが、これに限定される訳ではない。
【００１９】
前記放射性ヨウ素除去方法は、半透過性膜容器を回収する工程をさらに含むことができる。既存の微生物を活用した放射性同位元素の除去技術は、放射性同位元素を削除した後、放射性同位元素が吸着した微生物の回収が容易ではないという問題があるが、本発明の方法は、前記半透過性膜容器を回収する工程をさらに含み、放射性ヨウ素除去後の処理を容易にすることができる。
【００２０】
前記ヨウ素は、水溶液中でヨウ素陰イオン（I-）、ヨウ素陽イオン（I+）、ヨウ素酸イオン（IO3-）またはヨウ素（I2）などの形態で存在することができるが、これに限定されるものではない。
【００２１】
本発明において、「ヨウ素」とは、前記のようなすべての可能な形態のヨウ素を含むことを意味する。
【００２２】
本発明の放射性ヨウ素除去方法で、前記のヨウ素汚染水はヨウ素を含んだ溶液であり、水溶液、有機溶媒溶液、またはこれらの組み合わせであり得るが、これに限定されるものではない。
【００２３】
前記水溶液は、酸性溶液、中性溶液または塩基性溶液であり得、前記有機溶媒は、エタノールまたはジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide、DMSO）などを含む有機溶媒またはこれらの混合物であり得るが、これに限定されない。
【００２４】
また、前記ヨウ素を含んだ溶液は、液体または気体の状態であり得るが、これに限定されない。
【００２５】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らはデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を硝酸銀を含むTGY培地で培養することにより、銀ナノ粒子の合成を誘導し、デイノコッカス・ラディオデュランス菌株から合成された銀ナノ粒子の特性を確認した（図1a〜4cを参照）。また、前記銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランスの放射性ヨウ素除去効果を確認し、前記菌株をセルロース膜濾過紙（cellulose membrane filter）にろ過および吸着させ、銀ナノ粒子を膜濾過紙に固定することができることを確認した（図5aおよび6cを参照）。また、銀ナノ粒子を合成する菌株の凍結乾燥した菌体と、これを活性化させることができる培養培地をセルロース透過膜（cellulose dialysis membrane）に入れて携帯が容易な放射性ヨウ素除去用キットを製造して、前記キットの放射性ヨウ素除去効果を確認した（図7aおよび8を参照）。したがって、前記のナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株および半透過性膜を活用した放射性ヨウ素除去方法は、大規模病院、産業体、および原発事故などで発生する放射性ヨウ素の除去に有用に用いることができる。
【００２６】
本発明は、銀イオンを含む培地で培養し、菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株、前記菌株の培養培地および半透過性膜を含む放射性ヨウ素除去用キットを提供する。
【００２７】
前記銀イオンを含む培地は、硝酸銀を含む培地であり得る。
【００２８】
前記菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株は、菌株の表面に生合成された銀ナノ粒子が付着したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の凍結乾燥された菌体であり得る。
【００２９】
前記培養培地は、TGY培地、PGYM培地、栄養培地またはYPD培地であり得るが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
前記半透過性膜は、放射性ヨウ素は自由に通過が可能であるが、デイノコッカス・ラディオデュランス菌株、および放射性ヨウ素と銀の反応沈殿物が通過できないもので、空隙の大きさ（pore size）が1μm以下であり得る。
【００３１】
前記ヨウ素は、水溶液中でヨウ素陰イオン（I-）、ヨウ素陽イオン（I+）、ヨウ素酸イオン（IO3-）またはヨウ素（I2）などの形態で存在することができるが、これに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の具体的な実施例で、本発明者らはデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を硝酸銀を含むTGY培地で培養することにより、銀ナノ粒子の合成を誘導して、前記銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランスの放射性ヨウ素除去効果を確認し（図1a〜5bを参照）、銀ナノ粒子を合成する菌株の凍結乾燥した菌体と、これを活性化させることができる培養培地をセルロース透過膜に入れて携帯が容易な放射性ヨウ素除去用キットを製造し、前記キットの放射性ヨウ素除去効果を確認した（図6a〜8を参照）。したがって、前記の放射性ヨウ素除去用キットは、大規模病院、産業体、および原発事故などで発生する放射性ヨウ素の除去に有用に用いることができる。
【００３３】
（発明を実施するための形態）
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【００３４】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
実施例1．デイノコッカス・ラディオデュランス菌株の銀ナノ粒子の合成誘導
野生型のデイノコッカス・ラディオデュランス菌株（ATCC 13939、農業遺伝資源情報センター、大韓民国）を、TGY液体培地（0.5％（w/v）のトリプトン、0.1％（w/v）のグルコース及び0.3％（w/v）の酵母抽出物）5mlで前培養した。250mlのフラスコに50mlのTGY培地を入れ、500μlの前記前培養液を添加して、30℃、200rpmで培養液の吸光度が1になるまで培養した。以後、硝酸銀（AgNO3）溶液を最終濃度1mMで培養液に処理し、2時間適応させた後、50mlのコニカルチューブに移し、4,000rpmで20分間遠心分離した。沈殿した細胞を滅菌蒸留水で2回洗浄し、50mlのTGY培地に再懸濁した後、硝酸銀溶液を最終濃度2.5mMで添加して、24時間培養して、デイノコッカス・ラディオデュランス菌株が銀ナノ粒子を合成できるようにした。
【００３６】
比較例1．野生型デイノコッカス・ラディオデュランス菌株の培養
野生型のデイノコッカス・ラディオデュランス菌株（ATCC 13939）を、硝酸銀溶液が添加されていないTGY培地で培養したことを除いては、前記実施例1に記載されたものと同じ方法で培養した。
【００３７】
実験例1．デイノコッカス・ラディオデュランス菌株から合成された銀ナノ粒子の特性確認
デイノコッカス・ラディオデュランス菌株から合成された銀ナノ粒子の特性を確認するために、前記実施例1および比較例1で培養した各菌株の培養液で下記のような実験を行った。
【００３８】
1-1．培養液の色の違いを通じた銀ナノ粒子の存在確認
前記実施例1および比較例1で培養した各菌株の培養液の色を比較した結果、野生型デイノコッカス・ラディオデュランス菌株の培養液は、黄色であるのに対し、硝酸銀溶液を添加した培地で培養したデイノコッカス・ラディオデュランスの培養液は、ダークブラウンであることを確認することによって、銀ナノ粒子が合成されたことを確認した（図1aおよび図1b）。
【００３９】
1-2．銀ナノ粒子の最大吸収波長を確認
UV-Vis分光光度計を用いて、TGY培地に硝酸銀溶液を最終濃度2.5mMで添加した溶液、比較例1の培養液および実施例1の培養液の吸光度を400nm〜800nmの範囲の波長で測定した。
【００４０】
その結果、銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の培養液のみ400nm〜800nmの範囲内で最大吸収波長を示し、約440nmで最大吸収波長を示した（図2）。これは、デイノコッカス・ラディオデュランス菌株から合成された銀ナノ粒子の最大吸収波長が約440nmであることを提示する。
【００４１】
1-3．銀ナノ粒子の大きさ確認
動的光散乱（dynamic light scattering）分析機を用いて、実施例1で培養したデイノコッカス・ラディオデュランスの培養液内での銀ナノ粒子の大きさを測定した。
【００４２】
その結果、銀ナノ粒子の大きさは、18nm〜68.1nmの分布を示し、28.2nmの大きさの銀ナノ粒子が最も多く分布することを確認した（図3）。
【００４３】
1-4．銀ナノ粒子の形態確認
前記実施例1および比較例1で培養した各菌株の培養液を走査型電子顕微鏡（scanning electron microscope、SEM）で観察した。
【００４４】
その結果、野生型デイノコッカス・ラディオデュランス菌株の細胞表面は滑らかなのに対し、銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の細胞表面には、球形の銀ナノ粒子が多数存在することを確認した（図4a〜4c）。
【００４５】
1-5．銀ナノ粒子の構成元素確認
前記実施例1の培養液をエネルギー分散型X線分析装置（energy dispersive X-ray spectrometer、EDX）で分析した。
【００４６】
その結果、3keV付近で強い銀（Ag）信号が検出されることを確認し、前記実験例1-4で観察されたデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の細胞表面に吸着した粒子が銀ナノ粒子であることを再確認した（図4d）。
【００４７】
実験例2．銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の放射性ヨウ素除去効果確認
前記実施例1で培養した銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の放射性ヨウ素除去効果をラジオ-薄層クロマトグラフィー（radio-thin layer chromatography、ラジオ-TLC）分析で調査した。
【００４８】
具体的には、実施例1および比較例1の培養液をそれぞれ50mlのコニカルチューブに移し、4,000rpmで20分間遠心分離した後、沈殿した細胞を滅菌蒸留水で3回洗浄し、滅菌蒸留水5mlに再懸濁した。各懸濁液1mlを100μCi[125I] NaIを含んだ5mlの蒸留水と混合して、室温で反応させて、ラジオ-TLC分析で反応時間（1分、5分または15分）によるヨウ素除去率（％）を測定した。デイノコッカス・ラディオデュランス菌株の細胞濃度による比較のために、前記実施例1に記載された培養液の吸光度が1になるまで培養した培養液の代わりに、前記培養液を滅菌蒸留水で2倍（OD 0.5）または100倍（OD 0.01）希釈した培養液を用いたことを除いては、実施例1に記載したのと同じ方法で製造したデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の培養液を用いた。
【００４９】
その結果、野生型デイノコッカス・ラディオデュランス菌株は15分間、約9.5％の放射性ヨウ素を除去することができるが、銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株は、同じ条件で約97.5％の放射性ヨウ素除去能を示した（図5a）。また、デイノコッカス・ラディオデュランス菌株の細胞濃度による比較結果、培養液の吸光度が1になるまで培養した場合（約2.5×105個の細胞）に5分間、約97.6％の放射性ヨウ素除去能で最も高い効果を示した（図5b）。
【００５０】
実施例2．銀ナノ粒子がコーティングされた膜濾過紙（membrane filter）の製造
2-1．デイノコッカス・ラディオデュランス菌株から銀ナノ粒子の分離及び精製
前記実施例1で培養した銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株から銀ナノ粒子を分離した。
【００５１】
具体的には、実施例1の培養液を4,000rpmで20分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、滅菌蒸留水で沈殿物を3回洗浄し、0.9％塩化ナトリウム5mlを添加して再懸濁した。前記懸濁液内の細胞を超音波破砕機で3分間破砕した後、遠心分離して上澄み液を除去した。沈殿物に25mlの0.5M塩化ナトリウムおよび0.5Mスクロースを含む水溶液を順に添加して懸濁し、4,000rpmで20分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。沈殿物に35mlの完全塩溶液（complete salt solution; 0.3M塩化ナトリウム、10mM塩化カリウム、50mM硫酸マグネシウム水溶液（MgSO4・7H2O）および1mMトリス（Tris）（pH7.5））を入れて再懸濁した後、20mgのリゾチーム（lysozyme）を処理し、37℃で22時間反応させた。反応が完了した溶液を遠心分離して上澄み液を除去した後、沈殿物を完全塩溶液で2回洗浄した後、完全塩溶液5mlを添加して懸濁し、最終的にデイノコッカス・ラディオデュランス菌株から分離及び精製されたナノ粒子を得た。
【００５２】
2-2．銀ナノ粒子がコーティングされた膜濾過紙の製造
前記実施例2-1で精製した銀ナノ粒子を0.22μmの空隙（pore）を有するセルロース膜濾過紙に真空（vacuum）装置を用いてろ過吸着させて、室温で自然乾燥させ、銀ナノ粒子がコーティングされた膜濾過紙を製造した（図6a）。
【００５３】
2-3．銀ナノ粒子がコーティングされた膜濾過紙の特性確認
前記実施例2-2で製造した銀ナノ粒子がコーティングされた膜濾過紙をエネルギー分散型X線分析装置を装着した走査電子顕微鏡（SEM/EDX）で観察し、その特性を分析した。
【００５４】
その結果、膜濾過紙の表面に球状の粒子が均一にコーティングされていることを確認し（図6b及び6c）、3 keV付近で強い銀（Ag）信号が検出されることを確認して、前記濾過紙表面に吸着した粒子が銀ナノ粒子であることを確認した（図6d）。
【００５５】
実施例3．放射性ヨウ素除去用キットの製造
3-1．凍結乾燥した菌体の製造
銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の培養液は、銀の酸化によって長時間の保管が難しく、毎回菌体を培養しなければならない煩わしさがあるので、最適化した条件で計量を容易にしてキットの性能維持のために凍結乾燥した菌体を使用するために、下記のような実験を行った。
【００５６】
具体的には、前記実施例1で培養した銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の培養液50mlを4,000rpmで30分間遠心分離して上澄み液を除去し、沈殿物を滅菌蒸留水で2回洗浄した後、同一条件で遠心分離して上澄み液を除去した。以後、-80℃で1時間凍結させ、凍結乾燥機で24時間菌体を完全に乾燥させて残存水分を除去した。粉状の菌体を乳鉢でつぶし、精密秤でこれを計量してキットの製造に用いた。
【００５７】
3-2．使い捨て放射性ヨウ素除去用キットの製造
前記実施例1で用いたTGY培地と同じ組成の培地を製造するために、培地の総容量1Lを基準に、0.5gのトリプトン、0.1gのグルコースおよび0.3gの酵母抽出物を50mlのチューブに入れ、混合して十分に混ざるようにした（TGY培地粉末）。12〜14kDaの大きさ以下の物質のみ透過が可能なセルロース透過膜（平断面（flat width）25mm、直径16mm、Spectrum Laboratories,Inc.,米国）を10cmの長さに切った後、両端をクリップで固定して内容物が下に落ちないようにした。マイクロピペットを用いて前記膜中に10mlの滅菌蒸留水を添加し、TGY培地粉末を9mg添加して完全に溶解するまで混合した（図7aおよび7b）。溶解したTGY培地に、前記実施例3-1で製造した銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の凍結乾燥した菌体を5、10、50または100mg添加し、常温で12時間活性化させた（図7c〜7e）。
【００５８】
比較例2．野生型デイノコッカス・ラディオデュランス菌株の凍結乾燥した菌体を含む対照群キットの製造 
【００５９】
前記実施例1で培養した銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株の培養液の代わりに比較例1で培養した野生型デイノコッカス・ラディオデュランス菌株の培養液を用いて凍結乾燥した菌体を製造し、膜内溶解したTGY培地に凍結乾燥した菌体を、100mg添加したことを除いては、実施例3に記載したのと同じ方法で、対照群のキットを製造した。
【００６０】
実験例3．銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を含むキットの放射性ヨウ素除去効果確認
前記実施例3で製造したキットの放射性ヨウ素除去効果を確認するために、ラジオTLC分析を行った。
【００６１】
具体的には、100μCi[125I] NaIを含んだ500mlの滅菌蒸留水をビーカーに入れ、前記実施例3および比較例2で製造した各キットをビーカーに入れて室温で反応させ、ラジオTLC分析で反応時間（1分、5分または15分）によるヨウ素除去率（％）を測定した（図7f）。
【００６２】
その結果、野生型デイノコッカス・ラディオデュランス菌株を含んだキットは、約3％の放射性ヨウ素除去率を示したのに対し、銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を含んだキットは、15分以内に最大98 ％の高い除去率を示し、凍結乾燥した菌体5mgを含有したキットが100mgを含有したキットと大きな違いなしに高い放射性ヨウ素除去率を示すことを確認した（図8）。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明に係る銀ナノ粒子を合成するデイノコッカス・ラディオデュランス菌株を含む放射性ヨウ素を除去用キットは、少量の菌体量でも、さまざまな種類の溶液に存在する放射性ヨウ素を98％以上の高効率で除去することができ、使用及び使用後の管理が非常に簡単である。したがって、前記の放射性ヨウ素除去用キット及びこれを用いた放射性ヨウ素除去方法は、大規模病院、産業体、および原発事故などで発生する放射性ヨウ素の除去に非常に有用に用いることができる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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