(57)【要約】本発明は、ベクターのキットを提供し、上記キットは、（ｉ）第１のマーカー構成要素をコードする核酸配列を含む第１のベクター；および（ｉｉ）第２のマーカー構成要素をコードする核酸配列を含む第２のベクター、を含み、ここで細胞が、上記第１のおよび第２のベクターの両方で形質導入される場合、上記第１のおよび第２のマーカー構成要素は、上記細胞によって発現され、会合して、細胞ソート試薬によって認識されるヘテロマルチマーマーカーを形成するのに対して、細胞が、上記第１のまたは第２のベクターのいずれか単独で形質導入される場合、上記第１のまたは第２のマーカー構成要素単独の発現は、上記細胞ソート試薬によって認識されない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターのキットであって、該キットは、
（ｉ）第１のマーカー構成要素をコードする核酸配列を含む第１のベクター；および
（ｉｉ）第２のマーカー構成要素をコードする核酸配列を含む第２のベクター、
を含み、ここで細胞が、該第１のおよび第２のベクターの両方で形質導入される場合、該第１のおよび第２のマーカー構成要素は、該細胞によって発現され、会合して、細胞ソート試薬によって認識されるヘテロマルチマーマーカーを形成するのに対して、
細胞が、該第１のまたは第２のベクターのいずれか単独で形質導入される場合、該第１のまたは第２のマーカー構成要素単独の発現は、該細胞ソート試薬によって認識されない、キット。
【請求項２】
前記第１のマーカー構成要素は、前記第２のマーカー構成要素と会合しなかった場合に不安定であり、前記細胞ソート試薬は、該第１のマーカー構成要素を認識する、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記第１のおよび第２のマーカー構成要素の両方は、会合しなかった場合に不安定であり、前記細胞ソート試薬は、前記第１のまたは第２のマーカー構成要素のいずれかを認識する、請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
前記第１のマーカー構成要素は、膜結合され、前記第２のマーカー構成要素は、該第１のマーカー構成要素の非存在下で分泌され、前記細胞ソート試薬は、該第２のマーカー構成要素を認識する、請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
【請求項５】
一方のマーカー構成要素は、κ定常ドメインを含み、他方のマーカー構成要素は、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを含む、前述の請求項のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
一方のマーカー構成要素は、ＣＤ７９ａエクトドメインを含み、他方のマーカー構成要素は、ＣＤ７９ｂエクトドメインを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
第３のマーカー構成要素をコードする核酸配列を含む第３のベクターを含み、
ここで細胞が、前記第１の、前記第２の、および該第３のベクターで形質導入される場合、該第１の、第２のおよび第３のマーカー構成要素は、該細胞によって発現され、会合して、細胞ソート試薬によって認識されるヘテロマルチマーマーカーを形成するのに対して、
細胞が該第１の、第２のまたは第３のベクターのうちの１つまたは２つで形質導入される場合、該第１の、第２のまたは第３のマーカー構成要素のうちの１つまたは２つの発現は、該細胞ソート試薬によって認識されない、
請求項１に記載のキット。
【請求項８】
前記第１の、第２のおよび／または第３のマーカー構成要素は、前記ヘテロマルチマーマーカーとして会合しなかった場合に不安定である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記第１のマーカー構成要素は膜結合され；前記第２のマーカー構成要素は、該第１のマーカー構成要素の非存在下で分泌され；前記第３のマーカー構成要素は、該第１のおよび第２のマーカー構成要素が同様に発現されなければ分泌され；前記細胞ソート試薬は、該第３のマーカー構成要素を認識する、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記第１のマーカー構成要素は、膜結合ＣＤ７９ａエクトドメインを含み、前記第２のマーカーは、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインおよびＣＤ７９ａエクトドメインを含み、前記第３のマーカーは、κ定常ドメインを含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記ベクターのうちの少なくとも１つは、キメラ抗原レセプターをコードする核酸配列をさらに含む、前述の請求項のいずれかに記載のベクターのキット。
【請求項１２】
一方のマーカー構成要素の前記細胞における発現レベルは、もう一方のマーカー構成要素の該細胞における発現レベルに対して異なる、前述の請求項のいずれかに記載のキット。
【請求項１３】
前記２つのマーカー構成要素をコードするベクターは、異なるシグナル配列を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
形質導入した細胞集団を検出することにおける使用のための細胞表面ヘテロマルチマーマーカーであって、ここで該ヘテロマルチマーマーカーは、少なくとも２つのマーカー構成要素を含み、その第１のマーカー構成要素は、第１のベクター中の核酸配列によってコードされ、その第２のマーカー構成要素は、第２のベクター中の核酸配列によってコードされ、該第１のマーカーおよび第２のマーカー構成要素は会合する、細胞表面ヘテロマルチマーマーカー。
【請求項１５】
前記第１のマーカーおよび／または第２のマーカー構成要素は、会合しなかった場合に不安定である、請求項１４に記載のヘテロマルチマーマーカー。
【請求項１６】
前記第２のマーカー構成要素は、前記第１のマーカー構成要素の非存在下で前記細胞によって分泌される、請求項１４に記載のヘテロマルチマーマーカー。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載のヘテロマルチマーマーカーを含む細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれかに記載のベクターのキットで形質導入された細胞。
【請求項１９】
免疫細胞である、請求項１７または１８に記載の細胞。
【請求項２０】
Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、該方法は、請求項１〜１３のいずれかに記載のベクターのキットで細胞を形質導入またはトランスフェクトする工程を包含する方法。
【請求項２２】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の細胞の組成物を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）細胞サンプルを、請求項１〜１３のいずれかに記載のベクターのキットで形質導入またはトランスフェクトする工程；
（ｉｉ）細胞ソート試薬を使用して、ヘテロマルチマーマーカーの発現を検出する工程；および
（ｉｉｉ）該検出した細胞を選択またはソートして、該ヘテロマルチマーマーカーを発現する細胞の組成物を調製する工程、
を包含する方法。
【請求項２３】
前記細胞ソート試薬は、可溶性組換えタンパク質であり、前記細胞は、該可溶性組換えタンパク質を認識するマトリクスを使用して、工程（ｉｉｉ）において選択またはソートされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞ソート試薬は、蛍光標識された可溶性組換えタンパク質であり、前記細胞は、フローサイトメトリーによって、工程（ｉｉｉ）において選択またはソートされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞ソート試薬は、ビーズに付着した可溶性組換えタンパク質であり、前記細胞は、前記形質導入／トランスフェクトされた細胞サンプルから該ビーズを分離することによって、工程（ｉｉｉ）において選択またはソートされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１７〜２０のいずれかに記載の複数の細胞を含む薬学的組成物。
【請求項２７】
疾患を処置および／または防止することにおける使用のための、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
疾患を処置および／または防止するための方法であって、該方法は、請求項２６に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程を包含する方法。
【請求項２９】
以下の工程：
Ｉ．細胞含有サンプルを被験体から単離する工程、
ＩＩ．該細胞含有サンプルを、請求項１〜１３のいずれかに記載のベクターのキットで形質導入またはトランスフェクトする工程、
ＩＩＩ．細胞ソート試薬を使用して、ヘテロマルチマーマーカーの発現を検出し、それによって、形質導入／トランスフェクトされた細胞集団を該サンプルから識別する工程、
ＩＶ．該（ＩＩＩ）の細胞集団を選択またはソートして、形質導入／トランスフェクトされた細胞の精製された亜集団を達成する工程、および
Ｖ．該ヘテロマルチマーマーカーを発現する該（ＩＶ）の亜集団を該被験体に投与する工程、
を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
疾患を処置および／または防止するための医薬の製造における請求項２６に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項３１】
前記疾患はがんである、請求項３０に記載の薬学的組成物または請求項２８もしくは２９に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベクター、例えば、細胞を形質導入するためのレトロウイルスベクターのキットに関する。
【０００２】
特に、本発明は、第１のマーカー構成要素をコードする核酸を含む第１のベクター、および第２のマーカー構成要素をコードする核酸を含む第２のベクターを含むキットに関する。細胞が両方のベクターで形質導入される場合、両方のマーカー構成要素は、その細胞において発現され、それらは会合して、検出可能なヘテロマルチマーマーカーを形成する。
【０００３】
本発明はまた、このようなベクターで形質導入された細胞を作製および検出するための方法、ならびにこのような細胞の組成物を投与する工程を包含する、疾患を処置／防止するための薬学的組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
ウイルスベクターは、Ｔ細胞を形質導入して、目的のポリペプチドを発現させるために数十年にわたって使用されてきた。これらベクターは、ウイルスにおいて進化した特殊な分子機構を利用して、これらベクターが感染する細胞の内部にゲノムを効率的に移入する。しかし、それらの移入物収容能力は有限であり、その収容能力は、一般に、およそ８〜１０キロベース（ｋｂ）であると考えられる。その制限は、挿入物サイズに反比例しているパッケージング効率に起因する。
【０００５】
より高い挿入物収容能力を有するＴ細胞ベースの遺伝子治療の他の潜在的な非ウイルス機構は公知であるが、これらはしばしば、低い形質導入効率および／または低いＴ細胞数を生じる毒性効果によって妨げられる。
【０００６】
高効率を維持しながら大きな挿入物サイズのものをＴ細胞へと形質導入するために、ウイルスベクター上にコードされる遺伝子は、２またはより多くの別個のベクターへと分割され得る。各ベクターは、上記ウイルスを作製するために使用され、次いで、全てのベクターは、上記細胞を形質導入するためにプールされる。しかし、この多数の形質導入アプローチはしばしば、所望されるベクターのうちのいくつかではあるが全てではないベクターで形質導入された細胞を生じる。これは、種々のベクター組み込み体を含む不均一な細胞集団をもたらし、その集団は、所望の遺伝子のうちの全てを発現するわけではない。
【０００７】
大きな挿入物サイズのものでＴ細胞を形質導入およびトランスフェクトする改善された方法を提供することが必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明者らは、核酸配列を含むベクターのキットであって、上記ベクターの各々がマーカー構成要素をコードするベクターのキットを開発した。上記マーカー構成要素は、会合した際に安定であり、検出可能なヘテロマルチマーマーカーを形成する。
【０００９】
従って、第１の局面において、本発明は、
（ｉ）第１のマーカー構成要素をコードする核酸配列を含む第１のベクター；および
（ｉｉ）第２のマーカー構成要素をコードする核酸配列を含む第２のベクター、
を含むベクターのキットを提供する。
【００１０】
細胞が、上記第１のおよび第２のベクターの両方で形質導入される場合、上記第１のおよび第２のマーカー構成要素は、上記細胞によって発現され、会合して、細胞ソート試薬のような薬剤で認識可能なヘテロマルチマーマーカーを形成する。
【００１１】
細胞が、上記第１のまたは第２のベクターのいずれか単独で形質導入される場合、上記第１のまたは第２のマーカー構成要素単独の発現は、上記細胞ソート試薬によって認識されない。
【００１２】
上記第１のマーカー構成要素は、上記第２のマーカー構成要素と会合しなかった場合に不安定であり得る。この取り合わせにおいて、上記薬剤または細胞ソート試薬は、上記第１のマーカー構成要素を認識し得る。
【００１３】
あるいは、上記第１のおよび第２のマーカー構成要素の両方は、会合しなかった場合に不安定であり得る。この取り合わせにおいて、上記薬剤または細胞ソート試薬は、上記第１のまたは第２のマーカー構成要素のいずれかを認識し得る。
【００１４】
上記第１のマーカー構成要素は、膜結合されていてもよく、上記第２のマーカー構成要素は、上記第１のマーカー構成要素の非存在下で分泌され得る。この取り合わせにおいて、上記薬剤または細胞ソート試薬は、上記第２のマーカー構成要素を認識し得る。
【００１５】
一方のマーカー構成要素は、κ定常ドメインを含み得、他方のマーカー構成要素は、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを含み得る。
【００１６】
一方のマーカー構成要素は、ＣＤ７９ａエクトドメインを含み得、他方のマーカー構成要素は、ＣＤ７９ｂエクトドメインを含み得る。
【００１７】
上記キットは、第３のマーカーをコードする核酸配列を含む第３のベクターを含み得る。
【００１８】
細胞が、上記第１の、第２のおよび第３のベクターで形質導入される場合、上記第１の、第２のおよび第３のマーカー構成要素は、上記細胞によって発現され、会合して、細胞ソート試薬によって認識されるヘテロマルチマーマーカーを形成し得る；
細胞が、上記第１の、第２のまたは第３のベクターのうちの１つまたは２つで形質導入される場合、上記第１の、第２のまたは第３のマーカー構成要素のうちの１つまたは２つの発現は、上記細胞ソート試薬によって認識されないことがある。
【００１９】
上記第１の、第２のおよび／または第３のマーカー構成要素は、上記ヘテロマルチマーマーカーとして会合しなかった場合に不安定であり得る。
【００２０】
上記第１のマーカー構成要素は、膜結合され得る；上記第２のマーカー構成要素は、上記第１のマーカー構成要素の非存在下で分泌され得る；上記第３のマーカー構成要素は、上記第１のおよび第２のマーカー構成要素が同じく発現されなければ分泌され得る。この取り合わせにおいて、上記薬剤または細胞ソート試薬は、上記第３のマーカー構成要素を認識し得る。
【００２１】
上記第１のマーカー構成要素は、膜結合ＣＤ７９ａエクトドメインを含み得る；上記第２のマーカーは、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインおよびＣＤ７９ａエクトドメインを含み得、上記第３のマーカーは、κ定常ドメインを含み得る。
【００２２】
本発明の第１の局面のキット中のベクターのうちの少なくとも１つはまた、キメラ抗原レセプターまたはＴ細胞レセプターをコードする核酸配列を含み得る。
【００２３】
上記キット中のベクターが、上記細胞の内部で発現される場合、一方のマーカー構成要素の発現レベルは、もう一方のマーカー構成要素の上記細胞における発現レベルに対して異なり得る。
【００２４】
上記２つのマーカー構成要素をコードするベクターは、異なるシグナル配列を含み得る。
【００２５】
第２の局面において、本発明はまた、形質導入した細胞集団を検出することにおける使用のための細胞表面ヘテロマルチマーマーカーを提供し、ここで上記ヘテロマルチマーマーカーは、少なくとも２つのマーカー構成要素を含み、その第１のマーカー構成要素は、第１のベクター中の核酸配列によってコードされ、その第２のマーカー構成要素は、第２のベクター中の核酸配列によってコードされ、上記第１のマーカーおよび第２のマーカー構成要素は会合する。
【００２６】
上記第１のおよび／または第２のマーカー構成要素は、会合しなかった場合に不安定であり得る。
【００２７】
上記第２のマーカー構成要素は、上記第１のマーカー構成要素の非存在下で上記細胞によって分泌され得る。
【００２８】
第３の局面において、本発明は、本発明の第２の局面に従うヘテロマルチマーマーカーを含む細胞および／または本発明の第１の局面に従うベクターのキットで形質導入された細胞を提供する。
【００２９】
上記細胞は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）であり得る。
【００３０】
第４の局面において、本発明は、本発明の第３の局面に従う細胞を作製するための方法を提供し、上記方法は、本発明の第１の局面に従うベクターのキットで細胞を形質導入またはトランスフェクトする工程を包含する。
【００３１】
第５の局面において、本発明は、本発明の第３の局面に従う細胞の組成物を調製するための方法を提供し、上記方法は、以下の工程：
（ｉ）細胞サンプルを、本発明の第１の局面に従うベクターのキットで形質導入またはトランスフェクトする工程；
（ｉｉ）細胞ソート試薬のような薬剤を使用して、上記ヘテロマルチマーマーカーの発現を検出する工程；および
（ｉｉｉ）上記検出した細胞を選択またはソートして、上記ヘテロマルチマーマーカーを発現する細胞の組成物を調製する工程、
を包含する。
【００３２】
上記細胞ソート試薬は、可溶性組換えタンパク質であり得、上記細胞は、上記可溶性組換えタンパク質を認識するマトリクスを使用して、工程（ｉｉｉ）において選択またはソートされ得る。
【００３３】
上記細胞ソート試薬は、蛍光標識された可溶性組換えタンパク質であり得、上記細胞は、フローサイトメトリーによって、工程（ｉｉｉ）において選択またはソートされ得る。
【００３４】
上記細胞ソート試薬は、ビーズに付着した可溶性組換えタンパク質であり得、上記細胞は、上記形質導入／トランスフェクトされた細胞サンプルから上記ビーズを分離することによって、工程（ｉｉｉ）において選択またはソートされる。
【００３５】
第６の局面において、本発明は、本発明の第３の局面に従う複数の細胞を含む薬学的組成物を提供する。
【００３６】
第７の局面において、本発明は、疾患を処置および／または防止することにおける使用のための、本発明の第６の局面に従う薬学的組成物を提供する。
【００３７】
第８の局面において、本発明は、疾患を処置および／または防止するための方法を提供し、上記方法は、本発明の第６の局面に従う薬学的組成物を被験体に投与する工程を包含する。
【００３８】
上記方法は、以下の工程を包含し得る：
Ｉ．細胞含有サンプルを被験体から単離する工程、
ＩＩ．上記細胞含有サンプルを、本発明の第１の局面に従うベクターのキットで形質導入またはトランスフェクトする工程、
ＩＩＩ．細胞ソート試薬を使用して、ヘテロマルチマーマーカーの発現を検出し、それによって、形質導入／トランスフェクトされた細胞集団を上記サンプルから識別する工程、
ＩＶ．上記（ＩＩＩ）の細胞集団を選択またはソートして、形質導入／トランスフェクトされた細胞の精製された亜集団を達成する工程、および
Ｖ．上記ヘテロマルチマーマーカーを発現する上記（ＩＶ）の亜集団を上記被験体に投与する工程。
【００３９】
第９の局面において、本発明は、疾患を処置および／または防止するための医薬の製造における、本発明の第６の局面に従う薬学的組成物の使用を提供する。
【００４０】
上記疾患は、がんであり得る。
【００４１】
本発明は、会合すると安定して、細胞表面発現が可能な検出可能なヘテロマルチマーマーカーを形成するマーカー構成要素をコードするベクターのキットを提供する。細胞が、上記キットの両方のまたは全てのベクターで形質導入される場合、上記ヘテロマルチマーマーカーは、細胞ソート試薬のような薬剤で検出可能である細胞表面において発現される。しかし、細胞が、上記ベクターの部分セット（例えば、一方のベクター単独、または３つのベクターのうちの２つ）で形質導入される場合、マーカーは上記薬剤によって検出可能な細胞表面で発現されない。
【００４２】
従って、細胞表面における単一のマーカーの発現の検出によって、上記キットにおける全てのベクターで形質転換された細胞を識別することは可能である。これは、低減した複雑さおよび細胞ソート後のより良好な細胞収量に関して、多数のマーカー（すなわち、各ベクターにつき１つ）の検出を要する方法を超えるかなりの利点を提供する。
【００４３】
本発明の原理を使用して、多数のベクターの間で大きな挿入物を分割し、全てのベクターで形質導入された細胞を選択する（これは、単一のヘテロマルチマーマーカーの検出を要する）ことは可能である。従って、その方法の複雑さを増大させることなく細胞へと形質導入され得る全体の挿入物サイズを増大させて、その挿入物の全てを含む細胞に関して識別およびソートすることは、可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１−ヘテロダイマーマーカーを図示する模式的ダイアグラム。その第１のマーカー構成要素は、ＣＤ７９ａエクトドメインであり、その第２のマーカー構成要素は、ＣＤ７９ｂエクトドメインと、ＣＤ１９の膜貫通ドメインおよび短縮型エクトドメインとの間の融合物である。その第１のおよび第２のマーカー構成要素は、ジスルフィド結合を介して会合する。
【図２】図２−別のヘテロダイマーマーカーを図示する模式的ダイアグラム。その第１のマーカー構成要素は、κ定常ドメインであり、その第２のマーカー構成要素は、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインとＣＤ１９の膜貫通ドメインおよび短縮型エンドドメインとの間の融合物である。その第１のおよび第２のマーカーは、ジスルフィド結合を介して会合する。
【図３】図３−ヘテロトリマーマーカーを図示する模式的ダイアグラム。その第１のマーカー構成要素は、κ定常ドメインである；その第２のマーカー構成要素は、ＣＤ７９ｂエクトドメインとＣＤ１９の膜貫通ドメインおよび短縮型エンドドメインとの間の融合物である；その第３のマーカーは、ＣＤ７９ａエクトドメインとＩｇＧ１のＣＨ１ドメインとの間の融合物である。その第１の、第２のおよび第３のマーカー構成要素は、２個のジスルフィド結合を介して会合して、ヘテロトリマーマーカーを形成する。
【図４】図４−キットの第１のおよび第２のベクターによってコードされるアミノ酸配列。そのベクターは、図２に示されるように会合して、ヘテロダイマーマーカーを形成する、第１のおよび第２のマーカー構成要素をコードする。
【図５】図５−キットの第１の、第２のおよび第３のベクターによってコードされるアミノ酸配列。そのベクターは、図３に示されるように会合して、ヘテロトリマーマーカーを形成する第１の、第２のおよび第３のマーカー構成要素をコードする。
【図６Ａ】図６Ａ：第１のベクターおよび第２のベクターを図示する模式的ダイアグラム。その第１のベクターは第１のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、２Ａペプチド切断部位および第１のマーカー（ＣＡＲ１−２Ａ−Ｍα）をコードする；その第２のベクターは、第２のＣＡＲ、２Ａペプチド切断部位および第２のマーカー（ＣＡＲ２−２Ａ−Ｍβ）をコードする。その２Ａペプチド切断部位は、各ベクターに関してそのマーカーとそのＣＡＲとの間に位置する。
【図６Ｂ】Ｂ：図６Ａに図示されるいずれかまたは両方のベクターで細胞を形質導入した効果を図示する模式的ダイアグラム。その細胞が、その第１のまたは第２のベクターのいずれか単独で形質導入される場合、その導入遺伝子は発現される（ＣＡＲ１またはＣＡＲ２のいずれか）が、検出可能なマーカーは、その細胞表面において発現されない。その細胞が、第１のおよび第２のベクターの両方で形質導入される場合、両方のＣＡＲが発現され、その第１のおよび第２のマーカー構成要素の会合は、安定なヘテロダイマーマーカーを形成し、これはまた、細胞表面で発現される。
【図７Ａ】図７Ａ：第１のベクター、第２のベクターおよび第３のベクターの模式的ダイアグラム。その第１のベクターは、第１のＣＡＲ、２Ａペプチド切断部位および第１のマーカー（ＣＡＲ１−２Ａ−Ｍα）をコードする；その第２のベクターは、第２のＣＡＲ、２Ａペプチド切断部位および第２のマーカー（ＣＡＲ２−２Ａ−Ｍβ）をコードする；その第３のベクターは、第３のＣＡＲ、２Ａペプチド切断部位および第３のマーカー（ＣＡＲ３−２Ａ−Ｍγ）をコードする。その２Ａペプチド切断部位は、各ベクターに関してそのマーカーとそのＣＡＲとの間に位置する。
【図７Ｂ】Ｂ：図７Ａに示される１つ、２つ、または３つ全てのベクターで細胞を形質導入した効果を図示する模式的ダイアグラム。その細胞が、そのベクターの１つまたは２つで形質導入される場合、その関連導入遺伝子（すなわち、ＣＡＲ）は発現されるが、検出可能なマーカーは細胞表面で発現されない。それらベクターの３つ全てが、マーカー発現のために形質導入されなければならない。その第１の、第２のおよび第３のベクターの形質導入の際には、３つ全てのＣＡＲが発現され、その第１の、第２の、および第３のマーカー構成要素が会合すると、その細胞表面で発現される安定なヘテロトリマーマーカーが形成される。
【図８】図８−キットにおけるマーカー構成要素の発現の相対的関係を質変化させるために使用に適した野生型および変異したシグナル配列。一方のベクターは、野生型シグナルペプチド配列をコードし得、他方のベクターは、「変異１」から「変異７」として示されるその質変化した配列のうちの１つをコードし得る。その質変化した配列は、余り効率的でないシグナルペプチドであるので、その質変化したシグナルペプチドとともにそのベクターによってコードされるマーカー構成要素は、その野生型シグナルペプチドとともにそのベクターによってコードされるマーカー構成要素より低いレベルでその細胞において発現される。そのマーカーと同じ構築物上の他の導入遺伝子の相対的発現は、同様に影響を及ぼされるので、その質変化したシグナルペプチドとともにそのベクターによってコードされる目的のポリペプチドは、その野生型シグナルペプチドとともにベクターによってコードされるその目的のポリペプチドより低いレベルでその細胞において発現される。
【図９−１】図９（Ａ．およびＢ．）−２９３  Ｔ細胞（Ａ．）および初代ヒトＴ細胞（Ｂ．）におけるヘテロダイマーマーカーの、ならびに２９３Ｔ細胞におけるヘテロトリマーマーカー（Ｃ．）の表面発現。ＡおよびＢ：２９３Ｔ細胞は、そのヘテロダイマーマーカーの各鎖（ベクター１およびベクター２）で単一トランスフェクトしたか、または両方（ベクター１＋ベクター２）で二重トランスフェクトしたかのいずれかであった。二重トランスフェクトした細胞におけるそのヘテロダイマーマーカーの成功裡のアセンブリを、抗ヒトκ鎖抗体、抗ヒトＦａｂ抗体で染色し、可溶性ＣＤ１９を使用することによって、フローサイトメトリーによって評価した。そのヘテロダイマーマーカーの両方の鎖をコードするプラスミドを、陽性コントロールとして使用した。その２９３Ｋ  Ｔ細胞およびその初代ヒトＴ細胞両方の形質導入結果（４名の健康なドナーのサンプルを使用）は、最小のバックグラウンドが単一形質導入したＴ細胞において検出されるとともに、そのヘテロダイマーマーカーの選択的発現が二重形質導入したＴ細胞においてのみ起こることを示す。
【図９−２】Ｃ：２９３Ｔ細胞は、ヘテロトリマーマーカーの各鎖（ベクター１、ベクター２およびベクター３）で単一トランスフェクトしたか、またはベクター１およびベクター２（ベクター１＋ベクター２）で二重トランスフェクトしたか、またはヘテロトリマーマーカーの３つ全ての鎖（ベクター１＋ベクター２＋ベクター３）で三重トランスフェクトした。そのヘテロトリマーマーカーの成功裡のアセンブリを、フローサイトメトリーを使用して可溶性ＣＤ１９に関して染色することによって評価した。その結果は、細胞が、それらベクターのうちの１つまたは２つで形質導入される場合、検出可能なマーカーは細胞表面で発現されないことを示す。それらベクターのうちの３つ全てが、マーカー発現のために形質導入されなければならない。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細な説明
ベクターのキット
本発明の第１の局面は、ベクターのキットを提供する。そのベクターのキットは、１つより多くのベクターを含む。そのベクターのキットは、少なくとも第１のベクターおよび第２のベクターを含み、一実施形態において、そのベクターのキットは、第１のベクター、第２のベクターおよび第３のベクターを含む。そのキットは、２つ、３つ、４つまたは５つのベクターを含み得る。本発明のキットにおけるベクターの数は、宿主細胞へと形質導入されることが望まれる挿入物の全体のサイズに関連する：その全体の挿入物サイズが大きい場合、それは多数のベクターへと分割され得る。
【００４６】
本発明のキットにおける別個のベクターは、別個の核酸配列をその宿主細胞へと送達し、その結果、細胞がそのキットのベクターのうちの全てで形質導入される場合、その所望される目的のポリペプチド（ＰＯＩ）の全てがその細胞によって発現される。例えば、そのキットは、３種のＰＯＩ（例えば、第１のＣＡＲ、第２のＣＡＲおよび自殺遺伝子）をその宿主細胞において発現し得る。
【００４７】
多数のベクター間でその完全な挿入物を分割することは、同じカセット内に多数の目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを超える利点を提供する。その単一のベクター取り合わせは、例えば、「プロモーター干渉（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）」に起因し、それによって１つのプロモーターが優位になり、第２のプロモーターのサイレンシングを引き起こす、翻訳および転写の効率に伴う問題を生じる。さらに、異なるプロモーターが異なる細胞状況において異なって働くので、これは、各導入遺伝子の相対的発現の一貫した「調整」を達成しづらくする。
【００４８】
ベクター
そのベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）であり得る。
【００４９】
そのベクターは、プラスミドであり得る。
【００５０】
そのベクターはまた、トランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。そのベクターは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）をトランスフェクトまたは形質導入し得る。
【００５１】
レトロウイルスベクター
レトロウイルスおよびレンチウイルスは、目的のポリペプチド（ＰＯＩ）または複数のＰＯＩを標的細胞に移入するためのベクターまたは送達システムとして使用され得る。その移入は、インビトロ、エキソビボまたはインビボで起こり得る。この様式で使用される場合、そのウイルスは、代表的には、ウイルスベクターといわれる。
【００５２】
そのＰＯＩは、例えば、Ｔ細胞レセプターもしくはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）および／または自殺遺伝子をコードし得る。
【００５３】
ガンマレトロウイルスベクター（一般には、レトロウイルスベクターと称される）は、１９９０年代に遺伝子治療臨床試験において使用された最初のベクターであり、今なお最も使用されるもののうちの１つである。
【００５４】
より近年になって、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のような複雑なレトロウイルスに由来する、レンチウイルスベクターにおいて、非分裂細胞を形質導入するそれらの能力に起因して興味が高まってきている。
【００５５】
遺伝子移入ツールとしてのレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターの最も魅力的な特徴としては、大きな遺伝子ペイロード（約８〜１０ｋｂまで）の収容能力、最小限の患者の免疫応答、インビボおよびインビトロでの高い形質導入効率、ならびにその標的細胞の遺伝的内容物を永久的に改変し、その送達された遺伝子の長期間の発現を持続する能力が挙げられる。
【００５６】
そのレトロウイルスベクターは、遺伝的情報を真核生物細胞に送達し得る任意の適切なレトロウイルスに基づき得る。例えば、そのレトロウイルスベクターは、アルファレトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはスプマレトロウイルスベクターであり得る。このようなベクターは、遺伝子治療処置および他の遺伝子送達適用において広範に使用されている。
【００５７】
本発明のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスベクター）であり得る。そのウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスに基づき得る。
【００５８】
本発明のウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。そのベクターは、非霊長類レンチウイルス（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ））に基づき得る。
【００５９】
マーカー構成要素およびヘテロダイマーマーカー
本発明のキットの各ベクターは、マーカー構成要素をコードする核酸配列を含む。その第１のベクターは、第１のマーカー構成要素をコードする核酸配列を含み、その第２のベクターは、第２のマーカー構成要素をコードする核酸配列を含む。
【００６０】
そのマーカー構成要素は、別個のベクターから発現される第２の相互的マーカー構成要素への会合なしでは、不安定であり得かつその形質導入された宿主細胞によって細胞表面において発現され得ない。その相互的マーカー構成要素はまた、会合なしでは不安定であり得る。
【００６１】
会合すると、その第１のマーカー構成要素およびその第２のマーカー構成要素（その第１のマーカーに対して相互的）は、その宿主細胞の細胞表面で発現される安定なヘテロマルチマー複合体を形成する。
【００６２】
以下は、会合して、安定かつ細胞表面発現が可能な、検出可能なヘテロダイマーマーカーを形成する、第１のおよび第２のマーカー構成要素の例である。会合の非存在下では、その第１のおよび第２のマーカー構成要素は不安定であり、かつその細胞の表面において発現されない。
【００６３】
ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ
ＣＤ７９（分化抗原７９）は、Ｂ細胞レセプターとともに複合体を形成しかつ抗原認識後にシグナルを生成するタンパク質である。
【００６４】
ＣＤ７９は、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂ（以前はＩｇ−αおよびＩｇ−βとして公知）といわれる２つの別個の鎖から構成される；これらは、ジスルフィド結合によって安定化されたＢ細胞の表面上でヘテロダイマーを形成する。ＣＤ７９ａ  （ＵｎｉＰｒｏｔ：  Ｐ１１９１２）およびＣＤ７９ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔ：  Ｐ４０２５９）はともに、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。
【００６５】
両方のＣＤ７９鎖は、Ｔ細胞上でのＴ細胞レセプター活性化の間に観察されるＣＤ３生成シグナル伝達に類似の様式で、Ｂ細胞においてシグナルを伝えるためにそれらが使用する、それらの細胞内テールの中にイムノレセプターチロシンベースの活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を含む。
【００６６】
マーカー構成要素は、ＣＤ７９ａまたはＣＤ７９ｂのエクトドメインを含み得る。これらドメインのアミノ酸配列は、図５に示される。ベクターのキットは、ＣＤ７９ａのエクトドメインを含むマーカー構成要素をコードする一方のベクター、およびＣＤ７９ｂのエクトドメインを含むマーカー構成要素をコードするもう一方のベクターを含み得る。一方のまたは他方のマーカーは、例えば、膜貫通配列を有することによって、膜結合され得る。
【００６７】
ヘテロダイマーマーカー取り合わせは、図１に示される。ここでは、その第１のマーカー構成要素は、ＣＤ７９ａエクトドメインを含み、その第２のマーカー構成要素は、膜貫通ドメインに融合されるＣＤ７９ｂエクトドメインを含む。
【００６８】
両方のベクターでの細胞形質導入が成功すると、そのＣＤ７９ａエクトドメインマーカー構成要素およびそのＣＤ７９ｂエクトドメインマーカー構成要素（ＣＤ１９膜貫通ドメインを含む）のマーカーは発現され、会合して、その細胞の表面上で発現される安定なヘテロダイマーマーカーを形成する。
【００６９】
そのＣＤ７９ａマーカー構成要素またはそのＣＤ７９ｂマーカー構成要素のいずれかが、その細胞において単独で発現される場合、それらは不安定であり、細胞表面で発現されない。
【００７０】
ＩｇＧ１のＣＨ１／κ定常ドメインＩｇＧ１
ＩｇＧ抗体は、複雑なドメイン間相互作用を有するマルチドメインタンパク質である。ヒトＩｇＧ重鎖は、軽鎖と会合して、抗原を結合し得る成熟抗体を形成する。軽鎖は、κアイソタイプのものであってもよいし、γアイソタイプのものであってもよい。
【００７１】
重鎖および軽鎖の定常ドメインの会合は、安定なヘテロダイマーを形成する。マーカー構成要素は、重鎖または軽鎖の定常領域を含み得る。κ鎖定常領域のおよびＩｇＧ１のＣＨ１領域のアミノ酸配列は、図４に示されるが、他の抗体の多くの他の適切な配列が公知である。
【００７２】
ベクターのキットは、重鎖定常領域を含むマーカー構成要素をコードする一方のベクターおよび軽鎖定常領域を含むマーカー構成要素をコードするもう一方のベクターを含み得る。一方のまたは他方のマーカーは、例えば、膜貫通配列を有することによって、膜結合され得る。
【００７３】
ヘテロダイマーマーカー取り合わせは、図２に示される。ここでその第１のマーカー構成要素は、κ定常ドメインを含み、その第２のマーカー構成要素は、膜貫通ドメインに融合されるＩｇＧ１のＣＨ１ドメインをコードする核酸配列を含む。
【００７４】
両方のベクターでの細胞形質導入が成功すると、そのκ定常ドメインマーカー構成要素およびそのＣＨ１マーカー構成要素（ＣＤ１９膜貫通ドメインを含む）のマーカーは発現され、会合して、その細胞の表面上で発現される安定なヘテロダイマーマーカーを形成する。
【００７５】
κ定常ドメインマーカー構成要素またはそのＣＨ１マーカー構成要素のいずれかが、その細胞において単独で発現される場合、それらは不安定であり、細胞表面で発現されない。
【００７６】
表１は、上記で記載されていないさらなるマーカー対を含め、第１のおよび第２のマーカー構成要素の非限定的なリストを提供する。以下の第１のおよび第２のマーカー構成要素の対は、自然発生的に会合して、本発明のヘテロダイマーマーカーを形成し得る。
【表１】
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【００７７】
ヘテロトリマーマーカー
そのベクターのキットは、第１の、第２のおよび第３のマーカー構成要素をそれぞれコードする、第１の、第２のおよび第３のベクターを含み得る。
【００７８】
そのマーカー構成要素のうちの１つは、例えば、膜貫通ドメインを有することによって、膜結合され得る。
【００７９】
ヘテロトリマーマーカー取り合わせは、図３に示される。この取り合わせにおいて、その第１のマーカー構成要素は、κ定常ドメインを含み、その第２のマーカー構成要素は、ＣＤ１９膜貫通ドメインを有するＣＤ７９ｂエクトドメインを含み、その第３のマーカー構成要素は、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインに融合されるＣＤ７９ａエクトドメインを含む。
【００８０】
その第１のマーカー構成要素上のκ定常ドメインマーカーは、その第３のマーカー構成要素上のＩｇＧ１のＣＨ１ドメインと会合する。その第３のマーカー構成要素のＣＤ７９ａエクトドメインは、その第２のマーカー構成要素上のＣＤ７９ｂエクトドメインと会合する。３つ全てのマーカー構成要素が細胞において発現される場合、安定なヘテロトリマー複合体が形成され、これは、その細胞表面においてそのκ定常ドメインを認識する薬剤で検出可能である。そのマーカー構成要素のうちの一方またはいずれか２つのみが、その細胞において発現される場合、そのκ定常ドメインを認識する薬剤で検出され得る細胞表面では複合体は形成されない。
【００８１】
そのヘテロトリマーマーカーは、いずれか２つの自然発生的に会合するマーカー対（例えば、表１に記載されるマーカー）から形成され得る。そのヘテロトリマーマーカーの形成は、上記の対に限定されず、他の自然発生的に会合するマーカーが想定される。
【００８２】
この取り合わせは、単一のヘテロトリマーマーカーの検出のせいで、３つの別個のベクター上の３つのマーカー構成要素の検出を効果的に可能にする。
【００８３】
類似の取り合わせは、３つより多くのマーカー構成要素を有するヘテロマルチマーマーカーについても可能である。例えば、そのヘテロマルチマーマーカーは、４つ、５つまたはより多くのマーカー構成要素を含み得る。そのヘテロマルチマーマーカーは、全てのマーカー構成要素がその細胞において発現される場合に、そのヘテロマルチマーマーカーの一部を形成するに過ぎない一方のマーカー構成要素を認識する薬剤によって検出可能であり得る。
【００８４】
可溶性の、分泌されかつ膜結合されるマーカー
マーカー構成要素は、その細胞のサイトゾル中で自由に拡散し得るという意味において、単独で発現される場合に可溶性であり得る。
【００８５】
マーカー構成要素は、そのマーカー構成要素が他のマーカー構成要素の非存在下で細胞によって発現される場合に、そのマーカー構成要素が細胞によって分泌されるという意味において、分泌され得る。
【００８６】
マーカー構成要素は、膜に効果的に繋留されるという意味において、膜結合され得る。
【００８７】
膜結合したマーカーは、例えば、膜貫通ドメイン、輸送停止配列（ｓｔｏｐ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＧＰＩアンカーまたはミリストイル化／プレニル化／パルミトイル化部位を含み得る。
【００８８】
膜貫通ドメインは、マーカー構成要素（例えば、ＣＤ７９ａまたはＣＤ７９ｂの膜貫通ドメイン）の中のタンパク質に由来してもよいし、膜貫通ドメインをコードする配列は、そのマーカー構成要素をコードするベクターへと操作されてもよい。
【００８９】
検出可能なヘテロマルチマーマーカー
第１の局面において、本発明は、ベクター（各々が、マーカー構成要素をコードする）のキットを提供する。細胞が、そのキットのベクターのうちの全てで形質導入される場合、その発現されるマーカー構成要素は会合して、検出可能なヘテロマルチマーマーカーを形成する。
【００９０】
第２の局面において、本発明は、形質導入された細胞集団を検出することにおける使用のための、検出可能なヘテロマルチマーマーカーを提供し、ここでそのヘテロマルチマーマーカーは、会合する、少なくとも２つのマーカー構成要素を含む。
【００９１】
そのヘテロマルチマーマーカーは、少なくとも２つのマーカー構成要素を含むが、一緒に会合して、安定な検出可能なヘテロマルチマーマーカーを形成する、３つ、４つ、またはより多くのマーカー構成要素を含み得る。そのヘテロマルチマーマーカーを形成するマーカー構成要素のうちの１またはこれより多くは、一緒に会合しなかった場合に不安定であり得る。例えば、ＣＤ７９ａのエクトドメインを含むマーカー構成要素およびＣＤ７９ｂのエクトドメインを含むマーカー構成要素は、そのＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂのドメインが一緒に会合されない場合に不安定であり得る。
【００９２】
用語、会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）または会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）もしくは会合される（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）は、ダイマー化する（ｄｉｍｅｒｉｚｅ）、ダイマー化（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）またはダイマー化される（ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ）、および／または結合する（ｂｉｎｄ）、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）もしくは結合される（ｂｏｕｎｄ）と同意語である。会合は、一方のマーカーと他方のマーカーとの間で共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を形成し得る。
【００９３】
そのヘテロマルチマーマーカーは、多数のマーカー構成要素を含み得、これら構成要素は、そのヘテロマルチマーマーカーの全ての残りの他のマーカー構成要素と会合しなければ、細胞表面発現の能力がない。
【００９４】
あるいは、そのキットによってコードされるマーカー構成要素のうちの１つまたはいくつかは、単独で細胞表面発現が可能であり得るのに対して、一方のマーカー構成要素は、他方のマーカーと会合しなかった場合に細胞表面で発現されるのみである。この場合には、この後者のマーカー構成要素を特異的に認識する薬剤を使用すると、その細胞が、そのキットの中のベクター全てで形質導入されていることが示される。
【００９５】
その検出可能なヘテロマルチマーマーカーは、そのマーカー構成要素のうちのいずれか１つに特異的な薬剤の使用によって検出可能である。その薬剤は、そのキットの他方のマーカー構成要素と共発現される、すなわち、そのヘテロトリマー複合体の一部として細胞表面で発現されるのみである場合に、その細胞表面で発現されるのみであるマーカー構成要素に特異的である。
【００９６】
薬剤
本発明のヘテロマルチマーマーカーは、薬剤（例えば、細胞検出薬剤または細胞ソート薬剤）を使用して検出可能である。本発明の目的のために、用語「細胞ソート試薬（ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）」は、そのヘテロマルチマーマーカーを発現する細胞を識別し得る薬剤を含む：それは、そのヘテロマルチマーマーカーを発現する細胞を識別およびソートし得る薬剤に限定されない。
【００９７】
その薬剤は、例えば、リガンド、低分子または抗体に由来し得る。
【００９８】
その薬剤は、そのヘテロマルチマーマーカーのマーカー構成要素のうちのいずれか１つに特異的に結合し得る。
【００９９】
その薬剤は、可溶性または分泌されたマーカー構成要素に結合し得る。その薬剤は、安定な細胞表面発現に関して、そのマーカー構成要素または各他のマーカー構成要素の存在に依存する場合に、膜貫通マーカー構成要素に結合し得る。
【０１００】
その薬剤は、そのＣＤ７９ａエクトドメインに特異的に結合し得る（図１に図示される取り合わせを参照のこと）。
【０１０１】
その薬剤は、そのκ定常ドメインに特異的に結合し得る（図２および３に図示される取り合わせを参照のこと）。
【０１０２】
本発明のヘテロダイマーマーカーを検出するための低分子薬剤の例は、ストレプトアビジンである。この場合、検出されるべきマーカー構成要素は、ＳｔｒｅｐＴａｇペプチドを含むように操作され得る。そのＳｔｒｅｐＴａｇは、その検出されるべきマーカー構成要素に付着され得る、８アミノ酸（ＹＳＨＰＱＦＥＫ  −  配列番号１）からなる合成ペプチドである。このペプチド配列は、ストレプトアビジンに対して固有の親和性を示す。
【０１０３】
そのＳｔｅｐＴａｇペプチドの検出は、アフィニティークロマトグラフィーによる検出を可能にするＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）システムを要し得る。
【０１０４】
ヘテロマルチマーマーカーを検出するための薬剤の他の例としては、以下が挙げられる：
１．その検出可能なマーカー上のＣＨ２−ＣＨ２を検出するプロテインＡ；
２．その検出可能なマーカー上のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を検出するグルタチオン；または
３．ニッケルＮＴＡ（これは、その検出可能なマーカー上のＨｉｓタグを検出する）。
【０１０５】
形質導入された細胞集団の細胞ソートおよび精製
その薬剤は、その形質導入された細胞集団を選択またはソートするために使用され得る。これは、被験体への投与の前に、例えば、状態または疾患の処置のために、その形質導入された細胞を精製する状況で使用され得る。
【０１０６】
上記のように、抗体、リガンドまたは低分子である薬剤に結合体化された磁性ナノ粒子は、その薬剤が結合したマーカーを発現する細胞を強磁場に付着させる。この工程では、そのナノ粒子に付着した細胞は、カラム上に留まる一方で、他の細胞（そのマーカーを発現しない）は、素通りする。このようにして、その細胞は、その特定のマーカーに関して陽性または陰性に分離され得る。
【０１０７】
あるいは、その目的のマーカーに蛍光標識した薬剤は、そのヘテロマルチマーマーカーを発現する細胞に関して、細胞分離のために働き得る。
【０１０８】
膜貫通ドメイン
その膜貫通ドメインは、膜にまたがるポリペプチドのドメインである。本発明のマーカー構成要素は、そのヘテロマルチマーマーカーが膜結合されるように、膜貫通ドメインを含み得る。
【０１０９】
膜貫通ドメインは、膜において熱力学的に安定である任意のタンパク質構造であり得る。これは、代表的には、いくつかの疎水性残基を含むαヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインは、本発明の膜貫通部分を供給するために使用され得る。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および拡がり（ｓｐａｎ）は、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を使用して当業者によって決定され得る。人工的にデザインされたＴＭドメインもまた、使用され得る。
【０１１０】
その膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ１９またはＣＤ２８に由来し得る。
【０１１１】
シグナル配列
本発明の核酸配列によってコードされるマーカーは、そのマーカーが会合され、細胞内部で発現される場合に、その新生タンパク質が小胞体（ＥＲ）に指向されるように、シグナル配列を含み得る。
【０１１２】
用語「シグナル配列（ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、「シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」と同意語である。
【０１１３】
シグナル配列は、一般に５〜３０アミノ酸の長さであり、分泌経路に向かうように定められた多くの新たに合成されるタンパク質のＮ末端に存在する短いペプチドである。これらのタンパク質は、ある種のオルガネラ（例えば、小胞体、ゴルジまたはエンドソーム）内部にある、その細胞から分泌される、および膜貫通タンパク質であるもののいずれも含む。
【０１１４】
シグナル配列は一般に、単一のαヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチであるコア配列を含む。そのシグナル配列は、短い正に荷電したアミノ酸のストレッチで始まり得、転移の間にそのポリペプチドの適切なトポロジーを強化する一助になる。そのシグナル配列の末端には、代表的には、シグナルペプチドによって認識および切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転移の間または完了後のいずれかに切断して、遊離シグナル配列および成熟タンパク質を生成し得る。次いで、その遊離シグナル配列は、特異的プロテアーゼによって消化される。
【０１１５】
そのシグナル配列は一般に、その分子のアミノ末端に位置するが、いくつかのカルボキシ末端シグナルペプチドが公知である。
【０１１６】
シグナル配列は、疎水性コア領域（ｈ領域）、これに隣接したｎ領域およびｃ領域からなる３つに分かれた構造を有する。その後者は、シグナルペプチダーゼ（ＳＰａｓｅ）コンセンサス切断部位を含む。通常、シグナル配列は、翻訳と同時に切断され、その得られる切断されたシグナル配列は、シグナルペプチドといわれる。
【０１１７】
マウスＩｇκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域に由来するシグナルペプチドには、配列
【化１】
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がある（そのｎ領域は、配列ＭＥＴＤを有し；そのｈ領域（太字で示される）は、配列ＴＬＩＬＷＶＬＬＬＶを有し；そのｃ領域は、配列ＰＧＳＴＧを有する）。
【０１１８】
変異したシグナル配列
変異したシグナル配列は、そのｈ領域において野生型シグナル配列とは異なり得る。一方のポリペプチド（これは、より高い相対的発現を有する）は、ｈ領域において、他方のポリペプチド（これは、より低い相対的発現を有する）より多数の疎水性アミノ酸を有する。より低い相対的発現を有するそのポリペプチドのシグナルペプチドは、より低い相対的発現を有するそのポリペプチドのシグナルペプチドより、ｈ領域における疎水性アミノ酸の１またはこれより多くの変異（例えば、置換または欠失）を含み得る。
【０１１９】
その第１のシグナルペプチドおよび第２のシグナルペプチドは、実質的に同じｎ領域およびｃ領域を有し得るが、上記で説明されるようにｈ領域において異なり得る。「実質的に同じ（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ）」とは、そのｎ領域およびｃ領域が、その第１のシグナルペプチドと第２のシグナルペプチドとの間で同一であり得るか、またはそのシグナルペプチドの機能に影響を及ぼすことなしに、そのｎ鎖またはｃ鎖において１個、２個または３個のアミノ酸が異なり得ることを示す。
【０１２０】
そのコアにおける疎水性アミノ酸は、例えば、以下であり得る：アラニン（Ａ）；バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐ）；チロシン（Ｙ）；またはトリプトファン（Ｗ）。
【０１２１】
シグナルペプチド効率を質変化させるために変異した疎水性アミノ酸は、上記リストからのいずれかであり得、特に、以下であり得る：バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；およびトリプトファン（Ｗ）。
【０１２２】
そのｈ領域における残基のうち、一方のシグナルペプチド（例えば、その質変化したシグナルペプチド）は、他方のシグナルペプチド（例えば、その質変化していないシグナルペプチド）より少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％少ない疎水性アミノ酸残基を含み得る。
【０１２３】
そのｈ領域が５〜１５アミノ酸を含む場合、一方のシグナルペプチドは、他方のシグナルペプチドより１個、２個、３個、４個または５個多くの疎水性アミノ酸を含み得る。
【０１２４】
その質変化したシグナルペプチドは、疎水性アミノ酸残基の１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸欠失または置換を含み得る。疎水性アミノ酸は、非疎水性アミノ酸（例えば、親水性または中性のアミノ酸）で置き換えられ得る。
【０１２５】
マウスＩｇκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域に由来するシグナルペプチドに基づくマーカー構成要素の適切に変異したシグナル配列の例は、図８に列挙される。
【０１２６】
シグナル配列は、ソフトウェア技術を使用して検出または推測され得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｓｉ．ｄｅ／を参照のこと）。
【０１２７】
非常に多数のシグナル配列が公知であり、データベースにおいて利用可能である。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅは、２１０９の確認された哺乳動物シグナルペプチドをそのデータベースの中に列挙する。
【０１２８】
第１のマーカーの発現レベルおよび第２のマーカーの発現レベル
一方のマーカー構成要素の発現レベルは、もう一方のマーカー構成要素の発現レベルに対して異なり得る。これは、ＷＯ２０１６／１７４４０８に記載されるように１またはこれより多くの細胞内保持シグナルを使用して、または本明細書およびＷＯ２０１６／１７４４０９で記載されるように代替のシグナルペプチドを使用することによって達成され得る。
【０１２９】
そのベクターのキットが、可溶性または分泌される１またはこれより多くのマーカー構成要素および膜結合される１つのマーカー構成要素をコードする場合、その相対的発現は、その膜結合されるマーカー構成要素が、その可溶性／分泌されるマーカー構成要素より低いレベルで発現されるように調整され得る。
【０１３０】
異なるシグナルペプチドは、その第１のベクターにおける一方の目的のポリペプチドの発現レベルを、第２のベクターにおけるもう一方の目的のポリペプチドと比較して制御する方法を提供する。ここでその目的のポリペプチドは、細胞において異なるレベルで発現されることが望ましい。一方の目的のポリペプチド配列の発現がもう一方より高い、形質導入された細胞集団を選択することは有利であり得る。
【０１３１】
細胞において発現される２つのポリペプチドの差次的発現が有用である例は、一方の目的のポリペプチドがキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）でありかつもう一方の目的のポリペプチドが自殺遺伝子である場合である。自殺遺伝子は、例えば、毒性に直面して、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を殺滅するための機構を提供する「オフスイッチ（ｏｆｆ−ｓｗｉｔｃｈ）」として作用する。自殺遺伝子は、その自殺遺伝子がその形質導入された細胞においてそのＣＡＲまたはＴＣＲより高いレベルで存在する場合に、その自殺遺伝子が発現される細胞を殺滅することにおいてより有効であり得る。
【０１３２】
その目的のポリペプチドと同じ構築物上で発現されるマーカー構成要素の発現のレベルを質変化させることによって、細胞の識別またはソートを、その同じ構築物から発現されるＰＯＩのより高いレベルの発現を示す、マーカー構成要素のより高いレベルを発現する形質導入された細胞へとゆがめることは可能である。
【０１３３】
目的のポリペプチド（ＰＯＩ）
本発明のＰＯＩは、その形質導入された細胞集団において発現されることが望ましい任意のポリペプチドであり得る。そのＰＯＩは、例えば、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）であり得る。そのＰＯＩは、自殺遺伝子をコードするポリペプチドであり得る。
【０１３４】
細胞
本発明のベクターのキットで形質導入またはトランスフェクトされた細胞が提供される。
【０１３５】
その細胞は、細胞溶解性免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）であり得る。
【０１３６】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的役割を果たすリンパ球の１タイプである。それらは、その細胞表面上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の存在によって、他のリンパ球（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞））から区別され得る。以下でまとめられるように、Ｔ細胞には種々のタイプが存在する。
【０１３７】
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞を形質細胞および記憶Ｂ細胞へと成熟させること、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージを活性化することを含め、免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、それらが抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原とともに提示される場合に活性化される。これらの細胞は、いくつかのサブタイプ（ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨが挙げられる）のうちの１つへと分化し得、これらは、異なるサイトカインを分泌して、異なるタイプの免疫応答を促進し得る。
【０１３８】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染した細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関わる。ＣＴＬは、それらの表面にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩと会合した抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。ＩＬ−１０、アデノシンおよび調節性Ｔ細胞によって分泌される他の分子を介して、そのＣＤ８＋細胞は、実験的自己免疫性脳脊髄炎のような自己免疫疾患を防止するアネルギー状態へと不活性化され得る。
【０１３９】
記憶Ｔ細胞は、感染が解決した後に長期間持続する、抗原特異的Ｔ細胞の部分セットである。それらは、それらのコグネート抗原に再曝露されると、多数のエフェクターＴ細胞へと迅速に拡大し、従って、免疫系に過去の感染に対する「記憶（ｍｅｍｏｒｙ）」を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプを含む：中心記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２つのタイプのエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は代表的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０１４０】
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）（以前は、サプレッサーＴ細胞として公知）は、免疫学的寛容性の維持にとって極めて重要である。それらの主要な役割は、免疫反応の最後へと向かってＴ細胞媒介性免疫を停止させることおよび胸腺における負の選択のプロセスから逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０１４１】
ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラスが、記載されている  -  天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応性Ｔｒｅｇ細胞。
【０１４２】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺において生じ、発生中のＴ細胞とＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方との間の相互作用に関連している。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３といわれる細胞内分子の存在によって、他のＴ細胞から区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞発生を妨げ、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。
【０１４３】
適応性Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、通常の免疫応答の間に起こり得る。
【０１４４】
その細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存性様式で、ウイルス感染した細胞からの生来のシグナルへの迅速な応答を提供する。
【０１４５】
ＮＫ細胞（生来のリンパ系細胞の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する一般的リンパ系前駆体から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ系、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟し、次いで、この場所でそれらが循環へと入っていくことが公知である。
【０１４６】
本発明の細胞は、上記で言及した細胞タイプのうちのいずれかであり得る。
【０１４７】
形質導入される細胞は、患者自体の末梢血（当事者）から、またはドナー末梢血（供与者）もしくは無関係のドナー（第三者）の末梢血からの造血幹細胞移植片の状況において、いずれかでエキソビボで作り出され得る。
【０１４８】
あるいは、細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞を、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞へとエキソビボ分化させることから得られ得る。あるいは、その溶解機能を保持しかつ治療剤として作用できた不死化Ｔ細胞株が、使用され得る。
【０１４９】
全てのこれらの実施形態において、マーカーおよびＰＯＩ発現細胞は、多くの手段のうちの１つ（ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションが挙げられる）によって、そのマーカーおよびＰＯＩをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【０１５０】
本発明の細胞は、被験体に由来するエキソビボ細胞であり得る。その細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルに由来し得る。このような細胞は、本発明の第１の局面に従うベクターのキットを提供する分子をコードする核酸で形質導入する前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理によって活性化および／または拡大され得る。
【０１５１】
本発明の細胞は、以下によって作製され得る：
（ｉ）細胞含有サンプルを、被験体または上記で列挙した他の供給源から単離すること；および
（ｉｉ）その細胞を、本発明の第１の局面に従うベクターのキットで形質導入またはトランスフェクトすること。
【０１５２】
薬学的組成物
本発明はまた、本発明に従う複数の細胞を含む薬学的組成物に関する。
【０１５３】
その薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。その薬学的組成物は必要に応じて、１またはこれより多くのさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。このような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態にあり得る。
【０１５４】
処置方法
本発明は、本発明の細胞（例えば、上記に記載されるとおりの薬学的組成物中の）を被験体に投与する工程を包含する、疾患を処置および／または防止するための方法を提供する。
【０１５５】
疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書では、その細胞は、既存の疾患または状態を有する被験体に、その疾患と関連する少なくとも１つの症状を減らす、低減させるもしくは改善する、および／またはその疾患の進行を遅らせる、低減するもしくは遮断するために、投与され得る。
【０１５６】
疾患を防止するための方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書では、このような細胞は、その疾患に未だ罹っていない、および／またはその疾患のいかなる症状をも示していない被験体に、その疾患の原因を防止もしくは減らすために、またはその疾患と関連する少なくとも１つの症状の発生を低減もしくは防止するために、投与され得る。その被験体は、疾患の素因を有していてもよいし、その疾患を発生させるリスクにあると考えられていてもよい。
【０１５７】
その方法は、以下の工程を包含し得る：
Ｉ．細胞含有サンプルを被験体から単離する工程、
ＩＩ．その細胞含有サンプルを、本発明のベクターのキットで形質導入またはトランスフェクトする工程、
ＩＩＩ．そのヘテロマルチマーマーカーの発現を、薬剤を使用して検出し、それによって、形質導入された細胞集団をそのサンプルから識別する工程、
ＩＶ．（ＩＩＩ）の細胞集団を選択またはソートして、精製された亜集団を達成する工程、および
Ｖ．そのヘテロマルチマーマーカーを発現する（ＩＶ）の亜集団を、その被験体に投与する工程。
【０１５８】
本発明は、疾患を処置および／または防止することにおける使用のための細胞組成物を提供する。
【０１５９】
本発明はまた、疾患を処置および／または防止するための医薬の製造における上記のとおりの形質導入された細胞の集団を含む薬学的組成物の使用に関する。
【０１６０】
本発明の方法によって処置および／または防止されるべき疾患は、がん疾患（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がんおよび甲状腺がん）であり得る。
【０１６１】
本発明の細胞は、標的細胞（例えば、がん細胞）を殺滅し得る。その標的細胞は、その標的細胞の近傍での腫瘍分泌リガンドまたはケモカインリガンドの存在によって特徴づけられ得る。その標的細胞は、標的細胞表面での腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現と一緒に、可溶性リガンドが存在することによって特徴づけられ得る。
【０１６２】
本発明の細胞および薬学的組成物は、上記の疾患の処置および／または防止における使用のためのものであり得る。
【０１６３】
本発明の細胞および薬学的組成物は、上記の方法のうちのいずれかにおける使用のためのものであり得る。
【０１６４】
本発明はここで、実施例によってさらに記載され、この実施例は、発明を実施するにあたって当業者を補助するように働くことが意味され、本発明の範囲を限定するとは如何様にも意図されない。
【実施例】
【０１６５】
実施例１：二重形質導入したＴ細胞上でのヘテロダイマーマーカーの表面発現
κ定常ドメインマーカー構成要素、２Ａペプチド切断部位および強化型緑色蛍光タンパク質（Ｋａｐｐａ−２Ａ−ｅＧＦＰ）をコードする第１のベクターを、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインとＣＤ１９膜貫通ドメインとの融合物；２Ａペプチド切断部位およびｍＴａｇＢＦＰ２遺伝子（ＣＨ１ＣＤ１９ＴＭ−２Ａ−ｍＴａｇＢＦＰ２）であるマーカー構成要素をコードする第２のベクターと１：１比で混合し、Ｔ細胞を形質導入するために使用する。その得られる形質導入されたＴ細胞は、その第１のベクター単独で形質導入した細胞（ｅＧＦＰ陽性）もしくはその第２のベクター単独で形質導入した細胞（ｍＴａｇＢＦＰ２陽性）、または両方のベクターで二重形質導入した細胞（ｅＧＦＰおよびｍＴａｇＢＦＰ２に関して陽性）の混合物である。
【０１６６】
その細胞混合物を、ＡＰＣに結合体化した抗κ抗体で染色して、そのヘテロダイマーマーカーの表面発現が、二重形質導入したＴ細胞（例えば、ｅＧＦＰおよびｍＴａｇＢＦＰ２に関して二重陽性である細胞）上にのみ存在することを示す。その得られる安定なヘテロダイマーマーカーは、図２に示されるとおりである。
【０１６７】
その二重形質導入した細胞を、抗κ磁性ビーズを使用して精製し、その純度を、フローサイトメトリー（ＦＡＣｓ分析）によって、ｅＧＦＰおよびｍＴａｇＢＦＰ２に関して二重陽性の細胞のパーセンテージを観察することによって分析する。
【０１６８】
陰性コントロールとして、Ｔ細胞を、一方のベクターのみ（その第１のまたは第２のベクターにいずれか）で形質導入し、ＡＰＣに結合体化した抗κ抗体で染色する。その単一のベクターのマーカーが会合および安定化できないことから、そのＴ細胞のうちのいずれも、不安定なκマーカーを発現できない。コントロール実験では、そのＡＰＣに結合体化した抗κ抗体は、それら細胞がマーカーを発現できないことから、それら細胞のうちのいずれとも結合できない。
【０１６９】
実施例２：三重形質導入されたＴ細胞上のヘテロトリマーマーカーの表面発現
第１のベクター、第２のベクターおよび第３のベクターを、１：１：１比において一緒に混合し、Ｔ細胞を形質導入するために使用する。その第１のベクターは、κ定常ドメインおよびＩｇＧ１のＣＨ１ドメインの融合物、２Ａ切断部位、ならびにｅＧＦＰ（Ｋａｐｐａ−２Ａ−ｅＧＦＰ）であるマーカー構成要素をコードする。その第２のベクターは、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインとＣＤ１９膜貫通ドメインとの融合物、２Ａ切断部位およびｍＴａｇＢＦＰ２遺伝子（ＣＤ７９ｂ−ＣＤ１９ＴＭ−２Ａ−ｍＴａｇＢＦＰ２）であるマーカー構成要素をコードする。その第３のベクターは、κ定常ドメイン、２Ａペプチド切断部位およびｍＫａｔｅ２（ＣＨ１−ＣＤ７９ａ−２Ａ−ｍＫａｔｅ２）であるマーカー構成要素をコードする。
【０１７０】
その得られる形質導入されたＴ細胞は、その第１のベクター単独で形質導入された細胞（ｅＧＦＰ陽性）、第２のベクター単独で形質導入された細胞（ｍＴａｇＢＦＰ２陽性）、第３のベクター単独で形質導入された細胞（ｍＫａｔｅ２）またはその３つの利用可能なベクターのうちの２つで形質導入された細胞（例えば、ｅＧＦＰおよびｍＴａｇＢＦＰ２に関して陽性；またはｍＫａｔｅ２およびｍＴａｇＢＦＰ２に関して陽性）の混合物である。
【０１７１】
Ｔ細胞の混合物を、ＡＰＣに結合体化した抗κ抗体で染色して、そのヘテロトリマーマーカーの表面発現が、三重形質導入されたＴ細胞（例えば、ｅＧＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２およびｍＫａｔｅ２に関して三重陽性である細胞）上でのみ存在することを示す。その得られる安定なヘテロトリマーマーカーは、図３に示されるマーカーである。
【０１７２】
次いで、この三重形質導入された細胞集団を、抗κ磁性ビーズを使用して、細胞の亜集団を形成するために精製し、その純度を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ分析）によって、ｅＧＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２およびｍＫａｔｅ２に関して三重陽性の細胞のパーセンテージを観察することによって分析する。
【０１７３】
陰性コントロールとして、そのＴ細胞を、上記のベクターのうちのいずれか１つまたは２つで形質転換する。これは、その第１のもしくは第２のベクターまたはその第１のおよび第２のベクターのいずれかであり得るが、これらに限定されない。そのコントロール混合物を、ＡＰＣに結合体化した抗κ抗体で染色する。
【０１７４】
その三重形質導入された細胞とは対照的に、そのＴ細胞のうちのいずれも、その単一のもしくは二重のベクターのマーカーが完全に会合できないので、その細胞において安定化または発現できないことから、その不安定なκマーカーを発現できない。コントロール実験において、そのＡＰＣに結合体化した抗κ抗体は、その細胞のうちのいずれとも結合できない。
【０１７５】
実施例３：一方のポリペプチド配列の、もう一方のポリペプチド配列に対して差次的発現レベルを有する細胞の優先的選択
細胞サンプルを、マーカー構成要素およびキメラ抗原レセプター（Ｋａｐｐａ−２Ａ−ＣＡＲ）をコードする第１のベクターならびにマーカー構成要素および自殺遺伝子、ＲａｐＣａｓｐ９（ＣＨ１ＣＤ１９ＴＭ−２Ａ−Ｒａｐｃａｓｐ９）をコードする第２のベクターを有するキットで形質導入する。そのＲａｐＣａｓｐ９自殺遺伝子は、ＷＯ２０１６／１５１３１５に記載される。その第２のベクターは、そのマーカー構成要素配列、例えば、ＣＨ１ＣＤ１９ＴＭの上流に、変異したシグナル配列を含む。その変異したシグナル配列は、図８に列挙される最適未満のシグナル配列のうちのいずれか１つであり得る。
【０１７６】
その変異したシグナル配列は、細胞において、その第２のベクターによってコードされる下流のＣＨ１ＣＤ１９ＴＭマーカーの発現レベルを、その第１のベクターによってコードされるκマーカーの発現レベルと比較して減少させる。その第１のおよび第２のマーカーの会合は、１：１比になければならないので、選択は、そのＣＡＲの発現のレベルと比較して、高レベルの自殺遺伝子Ｒａｐｃａｓｐ９を発現する細胞に向かってゆがめられる。これは、自殺遺伝子（例えば、ＲａｐＣａｓｐ９）が、それらの発現レベルがその細胞においてそのＣＡＲの発現レベルより高い場合により有効であり得ることが理由で有用である。
【０１７７】
実施例４：２９３Ｔ細胞および初代ヒトＴ細胞におけるヘテロダイマーマーカーおよびヘテロトリマーマーカーの表面発現
【表２】
2021500905.tif 000004
【０１７８】
２９３Ｔ細胞を、そのヘテロダイマーマーカーの各鎖（ベクター１またはベクター２）で単一でトランスフェクトし、両方（ベクター１およびベクター２）で二重トランスフェクトした。そのベクター構築物に関しては、表２を参照のこと。
【０１７９】
その２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションを、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ｇａｇ−ｐｏｌをコードするプラスミド（ｐＥＱ−Ｐａｍ３−Ｅ３６）、ＲＤ１１４エンベロープをコードするプラスミド（ＲＤＦ３７）、および所望のレトロウイルス移入ベクタープラスミドを用いて行った。ウイルス上清を、４８時間および７２時間で集め、２９３Ｔ細胞を、トランスフェクション効率に関して染色した。その共培養物を設定した場合、その２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの４８時間後にカウントし、そのヘテロダイマーマーカーに関して染色する前に、さらに２４時間にわたって１：１比でプレートした。
【０１８０】
二重トランスフェクトされた細胞におけるそのヘテロダイマーマーカーの成功裡のアセンブリを、標準的な表面染色プロトコールを使用して、抗ヒトκ鎖抗体、抗ヒトＦａｂ抗体での染色によって、および可溶性ＣＤ１９を使用して、フローサイトメトリーによって評価した（図９Ａに示される）。１×１０５  細胞を、丸底９６ウェルプレートにおいて染色した。表面抗体を染色緩衝液（ＰＢＳ中１％  ＦＢＳ）で希釈し、１００μｌ／サンプルにおいて細胞に添加した。以下の抗体を、製造業者のプロトコールに従って使用した：  抗ＣＤ３４  ＡＰＣまたはＰＥ（クローンＱＢＥｎｄ１０、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗κ  ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ヒトＦａｂ  ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、抗Ｈｉｓ  ＰＥ（Ａｂｃａｍ）。
【０１８１】
そのヘテロダイマーマーカーの両方の鎖をコードするプラスミドを、陽性コントロールとして使用した。
【０１８２】
同様に、初代ヒトＴ細胞形質導入実験（４名の健康なドナーサンプルを使用）では、そのヘテロダイマーマーカーの選択的発現は、最小のバックグラウンドが単一形質導入されたＴ細胞において検出されるとともに、二重形質導入したＴ細胞においてのみ起こることが示された。図９Ｂを参照のこと。
【０１８３】
末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配遠心分離によって単離し、５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３／２８抗体で刺激した。インターロイキン−２（ＩＬ−２）補充物（１００  ＩＵ／ｍＬ）を、一晩刺激した後に添加した。３日目に、Ｔ細胞を採取し、レトロネクチンおよびレトロウイルス上清に対してプレートし、１０００ｇにおいて４０分間遠心分離した。形質導入効率を、上記のように、フローサイトメトリーを使用して５日後に評価した。
【０１８４】
図９Ｃは、上記のトランスフェクション法を使用して、ヘテロトリマーマーカーの各鎖の各鎖で単一トランスフェクトした２９３Ｔ細胞（ベクター１、ベクター２およびベクター３）、二重トランスフェクトした２９３Ｔ細胞（ベクター１およびベクター２）、およびそのヘテロトリマーマーカーの３つ全ての鎖で三重トランスフェクトした２９３Ｔ細胞（ベクター１およびベクター２およびベクター３）を示す。表２に示されるとおりのベクター１、ベクター２およびベクター３構築物を使用した。そのヘテロトリマーマーカーの成功裡のアセンブリを、上記のように、可溶性ＣＤ１９について染色することによって、フローサイトメトリーを使用して評価した。
【０１８５】
上記の明細書で言及される全ての刊行物は、本明細書に参考として援用される。本発明の記載される方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、請求項に記載されるとおりの発明が、このような具体的実施形態に過度に限定されるべきではないことは、理解されるべきである。実際に、分子生物学または関連分野の当業者に自明である、発明を実施するために記載される態様の種々の改変は、以下の請求項の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2021500905.tif 000005
【図２】
2021500905.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
2021500905.tif 000009
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2021500905.tif 000012
【図７Ｂ】
2021500905.tif 000013
【図８】
2021500905.tif 000014
【図９−１】
2021500905.tif 000015
【図９−２】
2021500905.tif 000016
【配列表】
2021500905000001.app
【国際調査報告】
2021500905.tif 000017
2021500905.tif 000018
2021500905.tif 000019
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