(57)【要約】本明細書で提供されるのは、細菌種Enterococcus faeciumにおいて同定された、Clostridial Botulinumニューロトキシン（ＢｏＮＴ）の新規ホモログ（ＢｏＮＴ／ＥＮ）である。ＢｏＮＴ／ＥＮバリアント、ならびに、ＢｏＮＴ／ＥＮおよび他のＢｏＮＴからのドメインを含むキメラトキシンはまた、提供される。さらに本明細書に提供されるのは、ＢｏＮＴ／ＥＮを生産する方法、および例として、治療適用におけるその使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％と同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたEnterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項４】
単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが、細胞に侵入する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項５】
単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが、細胞においてＳＮＡＲＥタンパク質を切断する、請求項４に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項６】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、シンタキシン１、およびシンタキシン４からなる群から選択される、請求項５に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項７】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ１である、請求項６に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項８】
単離されたＢｏＮＴ／ＥＮが、配列番号３１のＡ６９およびＤ７０に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項７に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項９】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ２である、請求項６に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項１０】
単離されたＢｏＮＴ／ＥＮが、配列番号３２のＡ６７およびＤ６８に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項９に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項１１】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ３である、請求項６に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項１２】
単離されたＢｏＮＴ／ＥＮが、配列番号３３のＡ５４およびＤ５５に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項１１に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項１３】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２３である、請求項６に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項１４】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２５である、請求項６に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項１５】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、シンタキシン１である、請求項６に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項１６】
単離されたＢｏＮＴ／ＥＮが、配列番号３７のＭ１８２およびＤ１８３に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項１５に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項１７】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、シンタキシン４である、請求項６に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項１８】
単離されたＢｏＮＴ／ＥＮが、配列番号３８のＫ１９１およびＤ１９２に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項１７に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項１９】
細胞が、分泌細胞である、請求項４〜１８のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項２０】
細胞が、神経細胞である、請求項１９に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項２１】
単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが、神経活動を抑制する、請求項２０に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項２２】
単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが、弛緩性麻痺を誘発する、請求項２０または２１に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項２３】
細胞が、免疫細胞である、請求項１９に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項２４】
細胞が、培養された細胞である、請求項４〜２３のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項２５】
細胞が、in vivoである、請求項４〜２４のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項２６】
細胞は、哺乳動物からのものである、請求項４〜２５のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項２７】
哺乳動物が、ヒトである、請求項２６に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項２８】
哺乳動物が、齧歯動物である、請求項２６に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項２９】
齧歯動物が、マウスである、請求項２８に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項３０】
齧歯動物が、ラットである、請求項２８に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮ。
【請求項３１】
細胞が、昆虫細胞である、請求項４〜２５のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮ。
【請求項３２】
単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸに対する抗体と交差反応をしない、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号４と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたEnterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）ポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号４のアミノ酸配列からなる、請求項３４に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項３６】
（ａ）プロテアーゼドメイン；
（ｂ）改変されたリンカー領域；および
（ｃ）転移ドメイン；
ここで改変されたリンカー領域は、プロテアーゼ切断部位を含む、
を含む、改変されたEnterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）ポリペプチド。
【請求項３７】
プロテアーゼが、トロンビン、ＴＥＶ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、ソルターゼ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２０、グランザイムＢ、エンテロキナーゼ、ＳＵＭＯプロテアーゼ、ＬｙｓＣ、およびトリプシンからなる群から選択される、請求項３６に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項３８】
改変されたリンカー領域が、配列番号４１〜４７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項３９】
改変されたリンカーが、Clostridium Botulinumニューロトキシンからのものである、請求項３６に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項４０】
改変されたリンカー領域が、配列番号４８〜５５のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項４１】
受容体結合ドメインをさらに含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号５〜２２のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号５〜２２のいずれか１のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号５〜２２のいずれか１のアミノ酸配列からなる、請求項４３に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項４５】
改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが、細胞に侵入する、請求項３６〜４４のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項４６】
改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが、細胞においてＳＮＡＲＥタンパク質を切断する、請求項４５に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項４７】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、シンタキシン１、およびシンタキシン４からなる群から選択される、請求項４６に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項４８】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ１である、請求項４６に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項４９】
改変されたＢｏＮＴ／ＥＮが、配列番号３１のＡ６９およびＤ７０に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項４８に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項５０】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ２である、請求項４６に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項５１】
改変されたＢｏＮＴ／ＥＮが、配列番号３２のＡ６７およびＤ６８に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項５０に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項５２】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ３である、請求項４６に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項５３】
改変されたＢｏＮＴ／ＥＮが、配列番号３３のＡ５４およびＤ５５に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項５２に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項５４】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２３である、請求項４６に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項５５】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２５である、請求項４６に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項５６】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、シンタキシン１Ｂである、請求項４６に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項５７】
改変されたＢｏＮＴ／ＥＮが、配列番号３７のＭ１８２およびＤ１８３に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項５６に記載の改変されたＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項５８】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、シンタキシン４である、請求項４６に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項５９】
改変されたＢｏＮＴ／ＥＮが、配列番号３８のＫ１９１およびＤ１９２に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項５８に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項６０】
細胞が、分泌細胞である、請求項４５〜５９のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項６１】
細胞が、神経細胞である、請求項６０に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項６２】
改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが、神経活動を抑制する、請求項６１に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項６３】
改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが、弛緩性麻痺を誘発する、請求項６２に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項６４】
細胞が、免疫細胞である、請求項６０に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項６５】
細胞が、培養された細胞である、請求項４５〜６４のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項６６】
細胞が、in vivoである、請求項４５〜６４のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項６７】
細胞が、哺乳動物からのものである、請求項４５〜６６のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項６８】
哺乳動物が、ヒトである、請求項６７に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項６９】
哺乳動物が、齧歯動物である、請求項６７に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項７０】
齧歯動物が、マウスである、請求項６９に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項７１】
齧歯動物が、ラットである、請求項６９に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮ。
【請求項７２】
細胞が、昆虫細胞である、請求項４５〜６６のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項７３】
改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸに対する抗体と交差反応をしない、請求項３６〜７２のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項７４】
（ａ）プロテアーゼドメイン；
（ｂ）転移ドメイン；および
（ｃ）受容体結合ドメイン；
ここでプロテアーゼドメインおよび転移ドメインは、Enterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）からのものであり、受容体結合ドメインは、Clostridial Botulinumニューロトキシン（ＢｏＮＴ）からのものである、
を含む、キメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項７５】
プロテアーゼドメインおよび転移が、リンカー領域を介して連結している、請求項７４に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項７６】
リンカー領域が、ＣＰＮＰＨＦＳＳＱＲＧＬＳＳＣ（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む、請求項７５に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項７７】
リンカー領域が、プロテアーゼ切断部位を含む、請求項７５に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項７８】
プロテアーゼが、トロンビン、ＴＥＶ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、ソルターゼ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２０、グランザイムＢ、エンテロキナーゼ、ＳＵＭＯプロテアーゼ、ＬｙｓＣ、およびトリプシンからなる群から選択される、請求項７７に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項７９】
リンカー領域が、配列番号４１〜４７のアミノ酸配列を含む、請求項７７または請求項７８に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項８０】
リンカー領域が、Clostridium Botulinumニューロトキシンからのものである、請求項７５に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項８１】
改変されたリンカー領域が、配列番号４８〜５５のアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド。
【請求項８２】
受容体結合ドメインが、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸ．からのものである、請求項７４〜８１のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項８３】
受容体結合ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、またはＢｏＮＴ／Ｘからのものである、請求項７４〜８１のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項８４】
配列番号２３〜３０のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７４〜８３のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項８５】
配列番号２３〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項８６】
配列番号２３〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項８５に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項８７】
キメラニューロトキシンポリペプチドが、細胞に侵入する、請求項７４〜８６のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項８８】
キメラニューロトキシンポリペプチドが、細胞においてＳＮＡＲＥタンパク質を切断する、請求項８７に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項８９】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、シンタキシン１、およびシンタキシン４からなる群から選択される、請求項８８に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項９０】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ１である、請求項８９に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項９１】
キメラニューロトキシンが、配列番号３１のＡ６９およびＤ７０に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項９０に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項９２】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ２である、請求項８９に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項９３】
キメラニューロトキシンが、配列番号３２のＡ６７およびＤ６８に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項９２に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項９４】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＶＡＭＰ３である、請求項８９に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項９５】
キメラニューロトキシンが、配列番号３３のＡ５４およびＤ５５に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項９４に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項９６】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２３である、請求項８９に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項９７】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２５である、請求項８９に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項９８】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、シンタキシン１である、請求項８９に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項９９】
キメラニューロトキシンが、配列番号３７のＭ１８２およびＤ１８３に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項９８に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１００】
ＳＮＡＲＥタンパク質が、シンタキシン４である、請求項８９に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１０１】
キメラニューロトキシンが、配列番号３８のＫ１９１およびＤ１９２に対応するアミノ酸残基の間で切断する、請求項１００に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１０２】
細胞が、分泌細胞である、請求項８７〜１０１のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１０３】
細胞が、神経細胞である、請求項１０２に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１０４】
キメラニューロトキシンポリペプチドが、神経活動を抑制する、請求項１０３に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１０５】
キメラニューロトキシンポリペプチドが、弛緩性麻痺を誘発する、請求項１０４に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１０６】
細胞が、免疫細胞である、請求項１０２に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１０７】
細胞が、培養された細胞である、請求項８７〜１０６のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１０８】
細胞が、in vivoである、請求項８７〜１０６のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１０９】
細胞は、哺乳動物からのものである、請求項８７〜１０８のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１１０】
哺乳動物が、ヒトである、請求項１０９に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１１１】
哺乳動物が、齧歯動物である、請求項１０９に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１１２】
齧歯動物が、マウスである、請求項１１１に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１１３】
齧歯動物が、ラットである、請求項１１１に記載のキメラニューロトキシン。
【請求項１１４】
細胞が、昆虫細胞である、請求項８７〜１０８のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１１５】
キメラニューロトキシンポリペプチドが、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸに対する抗体と交差反応をしない、請求項７４〜１１４のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド。
【請求項１１６】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、請求項３６〜７３のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、または請求項７４〜１１５のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチドと、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子。
【請求項１１７】
請求項１１６に記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項１１８】
請求項１１６に記載の核酸分子または請求項１１７に記載の核酸ベクターを含む細胞。
【請求項１１９】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、請求項３６〜７３のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、または請求項７４〜１１５のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１２０】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、請求項３６〜７３のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、または請求項７４〜１１５のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチドを生産する方法であって、該ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが生産される条件下で、請求項１１９に記載の細胞を培養するステップを含む、前記方法。
【請求項１２１】
ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、またはキメラニューロトキシンポリペプチドを培養物から回収することをさらに含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、請求項３６〜７３のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、または請求項７４〜１１５のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１２３】
組成物が、医薬組成物である、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２４】
薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項１２３に記載の組成物。
【請求項１２５】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、請求項３６〜７３のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、または請求項７４〜１１５のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド、請求項１１６に記載の核酸、請求項１１７に記載のベクター、請求項１１８に記載の細胞、または請求項１２２〜１２４のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
【請求項１２６】
状態を処置する方法であって、治療的に有効な量の、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、請求項３６〜７３のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、または請求項７４〜１１５のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド、請求項１１６に記載の核酸、請求項１１７に記載のベクター、または請求項１２２〜１２４のいずれか一項に記載の組成物を、状態を処置するために対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２７】
状態が、過活動のニューロンまたは腺に関連する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
状態が、痙攣性発声障害、痙性斜頚（spasmodic torticollis）、喉頭ジストニア、顎口腔性発声障害、舌ジストニア、頸部ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、限局性痙攣および他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス（anismus）、四肢痙攣、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラシア、嚥下障害、および他の筋緊張障害、および筋群の不随意運動により特徴づけられる他の障害、流涙、多汗症（hyperhydrosis）、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸管分泌、分泌障害、筋痙攣からの疼痛、頭痛、皮膚科学的または審美的／美容的状態、および肥満／食欲低下からなる群から選択される、請求項１２６または請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
状態が、不要な神経活動に関連する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
状態が、乾癬、アレルギー、血球貪食性リンパ組織球症、およびアルコール性膵疾患からなる群から選択される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
投与することが、不要な神経活動が存在する場所への注射を介するものである、請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
不要な神経活動に関連する状態の処置における使用のための、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、請求項３６〜７３のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、または請求項７４〜１１５のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド、請求項１１６に記載の核酸、請求項１１７に記載のベクター、または請求項１２２〜１２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３３】
医薬における使用のための、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、請求項３６〜７３のいずれか一項に記載の改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、または請求項７４〜１１５のいずれか一項に記載のキメラニューロトキシンポリペプチド、請求項１１６に記載の核酸、請求項１１７に記載のベクター、または請求項１２２〜１２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３４】
ニューロトキシンポリペプチドを生産する方法であって、
（ｉ）軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＮ）のＮ末端ドメインを含む第１のニューロトキシンフラグメントを得ること、ここで第１のニューロトキシンフラグメントは、Ｃ末端ＬＰＸＴＧＧ（配列番号５７）モチーフを含む；
（ｉｉ）重鎖（ＨＣ）のＣ末端ドメインを含む第２のニューロトキシンフラグメントを得ること；ここで第２のニューロトキシンフラグメントは、そのＮ末端において特定のプロテアーゼ切断部位を含む；
（ｉｉｉ）第２のニューロトキシンフラグメントを特定のプロテアーゼにより切断すること、ここで切断は、Ｎ末端において遊離のグリシン残基をもたらす；および
（ｉｖ）第１のニューロトキシンフラグメントと、（ｉｉｉ）からの第２のニューロトキシンフラグメントとを、トランスペプチダーゼの存在下で接触させ、それにより第１のニューロトキシンフラグメントと第２のＢｏＮＴ／ＥＮフラグメントとをライゲーションして、ライゲーションされたニューロトキシンを形成すること；
を含む、前記方法。
【請求項１３５】
第１のニューロトキシンフラグメントが、アフィニティータグをさらに含む、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
アフィニティータグが、Ｎ末端において第１のニューロトキシンフラグメントと融合している、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
アフィニティータグが、Ｃ末端において第１のニューロトキシンフラグメントと融合している、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３８】
アフィニティータグが、Ｈｉｓ６、ＧＳＴ、Ａｖｉ、Ｓｔｒｅｐ、Ｓ、ＭＢＰ、Ｓｕｍｏ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｅ、カルモジュリン、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、ＴＣ、Ｖ５、ＶＳＶ、Ｘｐｒｅｓｓ、Ｈａｌｏ、およびＦｃからなる群から選択される、請求項１３５〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
第２のニューロトキシンフラグメントが、アフィニティータグをさらに含む、請求項１３４〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
アフィニティータグが、Ｎ末端において第２のニューロトキシンフラグメントと融合している、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
アフィニティータグが、Ｃ末端において第２のニューロトキシンフラグメントと融合している、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
アフィニティータグが、Ｈｉｓ６、ＧＳＴ、Ａｖｉ、Ｓｔｒｅｐ、Ｓ、ＭＢＰ、Ｓｕｍｏ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｅ、カルモジュリン、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、ＴＣ、Ｖ５、ＶＳＶ、Ｘｐｒｅｓｓ、Ｈａｌｏ、およびＦｃからなる群から選択される、請求項１３９〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
プロテアーゼが、トロンビン、ＴＥＶ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（３Ｃプロテアーゼ）、エンテロキナーゼ、およびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群から選択される、請求項１３４〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
同族のプロテアーゼが、トロンビンである、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
第１のニューロトキシンフラグメントが、Enterococcus faeciumからのものである、請求項１３４〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
第２のニューロトキシンフラグメントが、Enterococcus faeciumからのものである、請求項１３４〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
第２のニューロトキシンフラグメントが、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸからのものである請求項１３４〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
トランスペプチダーゼが、ソルターゼである、請求項１３４〜１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
ソルターゼが、Staphylococcus aureus（ＳｒｔＡ）からのものである、請求項１４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年９月２９日に出願された「NEUROTOXIN-LIKE TOXIN AND USES THEREOF」と題する米国仮出願第６２／５６６，１７１号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の下で利益を主張し、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
政府の支援
この開示は、国立衛生研究所によって授与されたR01NS080833、R01AI132387の下で、政府の支援によってなされた。政府は本発明において所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
背景
Botulinumニューロトキシン（ＢｏＮＴ）は、最も強力な細菌トキシンのファミリーであり、潜在的なバイオテロリズム剤である。ＢｏＮＴはまた、筋肉の痙攣から慢性的な疼痛にわたる、拡大している医学的状態を処置するために、および化粧品への適用のためにも使用されている。ＢｏＮＴの適用が拡大するにつれ、制約と有害作用が報告されている。主な制約は、患者における中和抗体の生成であり、これは将来の処置を無効にする。ＢｏＮＴの使用を終了は、しばしば、患者の障害を処置／緩和するための他の有効な方法を彼らに残さない。ＢｏＮＴの使用に関連する有害作用は、眼瞼下垂や複視などの一過性の重篤でないイベントから、生命を脅かすようなイベント、さらには死に至るようなものまで多岐にわたる。ＢｏＮＴの制約および有害作用は、用量と大きく相関している。治療用トキシンとしての新規のＢｏＮＴタイプの開発には大きな関心が寄せられている。ＢｏＮＴ遺伝子クラスターは、Clostridium以外の細菌種において同定されていない。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本明細書において提供されるのは、いくつかの側面において、Enterococcus faecium株中のプラスミド上にコードされているＢｏＮＴファミリーの新規メンバーである（ＢｏＮＴ／ＥＮと称される）。ＢｏＮＴ／ＥＮは、ＶＡＭＰ１／２／３、ならびに、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、シンタキシン１Ｂおよびシンタキシン４を含むいくつかの他のＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。改変されたリンカー領域を有するＢｏＮＴ／ＥＮバリアントが提供される。さらに本明細書に提供されるのは、ＢｏＮＴ／ＥＮのプロテアーゼドメインおよび転移ドメイン、ならびに別のＢｏＮＴ（例として、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、またはＢｏＮＴ／Ｇ）からの受容体結合ドメインを含むキメラトキシンである。いくつかの側面において、新規ＢｏＮＴ／ＥＮを用いて疾患を処置するための組成物および方法が提供される。他の側面において、全長ＢｏＮＴ／ＥＮまたはキメラトキシンを生成する方法が提供される。
【０００４】
本開示のいくつかの側面は、配列番号１〜３のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたEnterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）ポリペプチドに関する。
いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【０００５】
いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、細胞に侵入する。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、細胞においてＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、シンタキシン１、およびシンタキシン４からなる群から選択される。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ１である。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮは、配列番号３１のＡ６９およびＤ７０に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ２である。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮは、配列番号３２のＡ６７およびＤ６８に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ３である。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮは、配列番号３３のＡ５４およびＤ５５に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＰ−２３である。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＰ−２５である。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、シンタキシン１である。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮは、配列番号３７のＭ１８２およびＤ１８３に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、シンタキシン４である。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮは、配列番号３８のＫ１９１およびＤ１９２に対応するアミノ酸残基の間で切断する。
【０００６】
いくつかの態様において、細胞は、分泌細胞である。いくつかの態様において、細胞は、神経細胞である。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、神経活動を抑制する。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、弛緩性麻痺を誘発する。いくつかの態様において、細胞は、免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞は、培養された細胞である。いくつかの態様において、細胞は、in vivoである。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物からのものである。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、齧歯動物である。いくつかの態様において、齧歯動物は、マウスである。いくつかの態様において、齧歯動物は、ラットである。いくつかの態様において、細胞は、昆虫細胞である。
いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸに対する抗体と交差反応をしない。
【０００７】
本開示の他の側面は、配列番号４と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたEnterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）を提供する。
いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。
【０００８】
本開示の他の側面は、（ａ）プロテアーゼドメイン；（ｂ）改変されたリンカー領域；および（ｃ）転移ドメイン；ここで改変されたリンカー領域は、プロテアーゼ切断部位を含む、を含む改変されたEnterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）ポリペプチドを提供する。
いくつかの態様において、プロテアーゼは、トロンビン、ＴＥＶ、PreScission、ソルターゼ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２０、グランザイムＢ、エンテロキナーゼ、ＳＵＭＯプロテアーゼ、ＬｙｓＣ、およびトリプシンからなる群から選択される。いくつかの態様において、改変されたリンカー領域は、配列番号４１〜４７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０００９】
いくつかの態様において、改変されたリンカーは、Clostridium Botulinumニューロトキシンからのものである。いくつかの態様において、改変されたリンカー領域は、配列番号４８〜５５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、受容体結合ドメインをさらに含む。
いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号５〜２２のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号５〜２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号５〜２２のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、細胞に侵入する。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、細胞において、ＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、シンタキシン１、およびシンタキシン４からなる群から選択される。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ１である。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮは、配列番号３１のＡ６９およびＤ７０に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ２である。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮは、配列番号３２のＡ６７およびＤ６８に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ３である。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮは、配列番号３３のＡ５４およびＤ５５に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＰ−２３である。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＰ−２５である。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、シンタキシン１Ｂである。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮは、配列番号３７のＭ１８２およびＤ１８３に対応するアミノ酸残基の間で切断するいくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、シンタキシン４である。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮは、配列番号３７のＫ１９１およびＤ１９２に対応するアミノ酸残基の間で切断する。
【００１１】
いくつかの態様において、細胞は、分泌細胞である。いくつかの態様において、細胞は、神経細胞である。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、神経活動を抑制する。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、弛緩性麻痺を誘発する。いくつかの態様において、細胞は、免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞は、培養された細胞である。いくつかの態様において、細胞は、in vivoである。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物からのものである。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、齧歯動物である。いくつかの態様において、齧歯動物は、マウスである。いくつかの態様において、齧歯動物は、ラットである。いくつかの態様において、細胞は、昆虫細胞である。
いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸに対する抗体と交差反応をしない。
【００１２】
さらに本明細書に提供されるのは、（ａ）プロテアーゼドメイン；（ｂ）転移ドメイン；および（ｃ）受容体結合ドメイン；ここでプロテアーゼドメインおよび転移ドメインは、Enterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）からのものであり、および受容体結合ドメインは、Clostridial Botulinumニューロトキシン（ＢｏＮＴ）からのものである、を含むキメラニューロトキシンポリペプチドである。
【００１３】
いくつかの態様において、プロテアーゼドメインおよび転移は、リンカー領域を介して連結している。いくつかの態様において、リンカー領域は、ＣＰＮＰＨＦＳＳＱＲＧＬＳＳＣ（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、リンカー領域は、プロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの態様において、プロテアーゼは、トロンビン、ＴＥＶ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、ソルターゼ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２０、グランザイムＢ、エンテロキナーゼ、ＳＵＭＯプロテアーゼ、ＬｙｓＣ、およびトリプシンからなる群から選択される。いくつかの態様において、リンカー領域は、配列番号４１〜４７のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、リンカー領域は、Clostridium Botulinumニューロトキシンからのものである。いくつかの態様において、リンカー領域は、配列番号４８〜５５のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、受容体結合ドメインは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸからのものである。いくつかの態様において、受容体結合ドメインは、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、またはＢｏＮＴ／Ｘからのものである。
【００１４】
いくつかの態様において、キメラニューロトキシンポリペプチドは、配列番号２３〜３０のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キメラニューロトキシンポリペプチドは、配列番号２３〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キメラニューロトキシンポリペプチドは、配列番号２３〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００１５】
いくつかの態様において、キメラニューロトキシンポリペプチドは、細胞に侵入する。いくつかの態様において、キメラニューロトキシンポリペプチドは、細胞においてＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、シンタキシン１、およびシンタキシン４からなる群から選択される。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ１である。いくつかの態様において、キメラニューロトキシンは、配列番号３１のＡ６９およびＤ７０に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ２である。いくつかの態様において、キメラニューロトキシンは、配列番号３２のＡ６７およびＤ６８に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＶＡＭＰ３である。いくつかの態様において、キメラニューロトキシンは、配列番号３３のＡ５４およびＤ５５に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２３である、いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２５である。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、シンタキシン１である。いくつかの態様において、キメラニューロトキシンは、配列番号３７のＭ１８２およびＤ１８３に対応するアミノ酸残基の間で切断する。いくつかの態様において、ＳＮＡＲＥタンパク質は、シンタキシン４である。いくつかの態様において、キメラのニューロトキシンは、配列番号３８のＫ１９１およびＤ１９２に対応するアミノ酸残基の間で切断する。
【００１６】
いくつかの態様において、細胞は、分泌細胞である。いくつかの態様において、細胞は、神経細胞である。いくつかの態様において、キメラニューロトキシンポリペプチドは、神経活動を抑制する。いくつかの態様において、キメラニューロトキシンポリペプチドは、弛緩性麻痺を誘発する。いくつかの態様において、細胞は、免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞は、培養された細胞である。いくつかの態様において、細胞は、in vivoである。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物からのものである。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、齧歯動物である。いくつかの態様において、齧歯動物は、マウスである。いくつかの態様において、齧歯動物は、ラットである。いくつかの態様において、細胞は、昆虫細胞である。
いくつかの態様において、キメラニューロトキシンポリペプチドは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸに対する抗体と交差反応をしない。
【００１７】
さらに本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、またはキメラニューロトキシンポリペプチドと、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子である。かかる核酸分子を含む核酸ベクターもまた、提供される。核酸分子または核酸ベクターを含む細胞は、提供される。いくつかの態様において、細胞は、本明細書に記載の、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、またはキメラニューロトキシンポリペプチドを発現する。
【００１８】
本開示の他の側面は、本明細書に記載の単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、またはキメラニューロトキシンポリペプチドを生産する方法であって、該ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドが生産される条件下で、これらのポリペプチドを発現する細胞を培養するステップを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、またはキメラニューロトキシンポリペプチドを培養物から回収することをさらに含む。
【００１９】
さらに本明細書において提供されるのは、本明細書に記載の、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、またはキメラニューロトキシンポリペプチドを含む組成物である。いくつかの態様において、組成物は、医薬組成物である。いくつかの態様において、医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
本明細書に記載の、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、もしくはキメラニューロトキシンポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする核酸、かかる核酸を含むベクター、細胞、または組成物を含む、キット。
【００２０】
本開示の他の側面は、状態を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書において記載される、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、もしくはキメラニューロトキシンポリペプチド、核酸、ベクター、または組成物の治療有効量を、状態を処置するために対象に投与することを含む。
いくつかの態様において、状態は、過活動の神経細胞または腺と関連する。いくつかの態様において、状態は、痙攣性発声障害、痙性斜頚（spasmodic torticollis）、喉頭ジストニア、顎口腔性発声障害、舌ジストニア、頸部ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、限局性痙攣および他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス（anismus）、四肢痙攣、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラシア、嚥下障害、および他の筋緊張障害、および筋群の不随意運動により特徴づけられる他の障害、流涙、多汗症（hyperhydrosis）、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸管分泌、分泌障害、筋痙攣からの疼痛、頭痛、皮膚科学的または審美的／美容的状態、肥満／食欲低下からなる群より選択される。いくつかの態様において、状態は、望ましくない神経活動に関連しない。いくつかの態様において、状態は、乾癬、アレルギー、血球貪食性リンパ組織球症、およびアルコール性膵疾患からなる群より選択される。いくつかの態様において、投与することは、望ましくない神経活動が存在する場所への注射を介するものである。
【００２１】
本開示の他の側面は、不要な神経活動に関連する状態の処置における使用のための、または医薬における使用のための、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、キメラニューロトキシンポリペプチド、核酸、ベクター、または組成物を提供する。
【００２２】
本開示のさらに別の側面は、ニューロトキシンポリペプチドを生産する方法を提供し、該方法は、（ｉ）軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＮ）のＮ末端ドメインを含む第１のニューロトキシンフラグメントを得ること、ここで、第１のニューロトキシンフラグメントは、Ｃ末端ＬＰＸＴＧＧ（配列番号５７）モチーフを含む；（ｉｉ）重鎖（ＨＣ）のＣ末端ドメインを含む第２のニューロトキシンフラグメントを得ること、ここで、第２のニューロトキシンフラグメントは、そのＮ末端において、特異的なプロテアーゼ切断部位を含む；（ｉｉｉ）第２のニューロトキシンフラグメントを、特異的プロテアーゼにより切断すること、ここで、切断は、Ｎ末端において遊離のグリシン残基をもたらす；ならびに（ｉｖ）第１のニューロトキシンフラグメントと（ｉｉｉ）からの第２のニューロトキシンフラグメントとを、トランスペプチダーゼの存在下において接触させ、それにより、第１のニューロトキシンフラグメントと第２のＢｏＮＴ／ＥＮフラグメントとをライゲーションして、ライゲーションされたニューロトキシンを形成すること；
を含む。
【００２３】
いくつかの態様において、第１のニューロトキシンフラグメントは、アフィニティータグをさらに含む。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｎ末端において第１のニューロトキシンフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｃ末端において第１のニューロトキシンフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｈｉｓ６、ＧＳＴ、Ａｖｉ、Ｓｔｒｅｐ、Ｓ、ＭＢＰ、Ｓｕｍｏ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｅ、カルモジュリン、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、ＴＣ、Ｖ５、ＶＳＶ、Ｘｐｒｅｓｓ、Ｈａｌｏ、およびＦｃからなる群より選択される。いくつかの態様において、第２のニューロトキシンフラグメントは、アフィニティータグをさらに含む。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｎ末端において第２のニューロトキシンフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｃ末端において第２のニューロトキシンフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｈｉｓ６、ＧＳＴ、Ａｖｉ、Ｓｔｒｅｐ、Ｓ、ＭＢＰ、Ｓｕｍｏ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｅ、カルモジュリン、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、ＴＣ、Ｖ５、ＶＳＶ、Ｘｐｒｅｓｓ、Ｈａｌｏ、およびＦｃからなる群より選択される。いくつかの態様において、プロテアーゼは、トロンビン、ＴＥＶ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（３Ｃプロテアーゼ）、エンテロキナーゼ、およびＳＵＭＯプロテアーゼからなる群より選択される。いくつかの態様において、同族のプロテアーゼは、トロンビンである。いくつかの態様において、第１のニューロトキシンフラグメントは、Enterococcus faeciumからのものである。いくつかの態様において、第２のニューロトキシンフラグメントは、Enterococcus faeciumからのものである。いくつかの態様において、第２のニューロトキシンフラグメントは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＸからのものである。いくつかの態様において、トランスペプチダーゼは、ソルターゼである。いくつかの態様において、ソルターゼは、Staphylococcus aureus（ＳｒｔＡ）からのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
図面の簡単な説明
添付の図面は、縮尺とおりに描かれることを意図していない。図面において、様々な図面に示されている同一またはほぼ同一の各構成要素は、同様の数字で表される。明確性のために、すべての構成要素がすべての図面においてラベル付けされているとは限らない。
【００２５】
【図１】図１Ａ〜１Ｃ。ＢｏＮＴ／ＥＮと、知られているＢｏＮＴ血清型との比較。（図１Ａ）ＢｏＮＴ血清型の最尤系統は、ＢｏＮＴ／ＥＮがＢｏＮＴ／Ｘと最も密接にグループ化された別個の系統を形成していることを示している。（図１Ｂ）上のパネル：ＢｏＮＴ／ＥＮの３つのドメインの概略図。下のパネル：ＢｏＮＴ／ＥＮと他のＢｏＮＴの間の同一性のパーセンテージを示すスライディング配列比較ウィンドウ。（図１Ｃ）ＢｏＮＴ／ＥＮ遺伝子クラスターは、隣接するｎｔｎｈ様遺伝子および上流のｏｒｆＸ様遺伝子を含むＢｏＮＴ遺伝子クラスターの他の特徴を含有する。領域は、他のＢｏＮＴ遺伝子クラスターと同様に、推定トランスポザーゼが隣接している。
【００２６】
【図２】図２Ａ〜２Ｇ。ＢｏＮＴ／ＥＮのＬＣは、独特な部位においてＶＡＭＰ１／２／３を切断する。（図２Ａ）ＥＤＴＡ有りまたは無しで、ＥＮ−ＬＣを、ＢＤＥとインキュベートする。シンタキシン１（Ｓｙｘ  １）、ＳＮＡＰ−２５、およびＶＡＭＰ２を検出するために、イムノブロット分析を行った。Ａ−ＬＣおよびＸ−ＬＣを並行して分析した。Ｘ−ＬＣによるＶＡＭＰ２の切断は、イムノブロットシグナルの喪失をもたらす一方で、Ａ−ＬＣによるＳＮＡＰ−２５の切断は、イムノブロットでなおも検出され得るＳＮＡＰ−２５の小さいフラグメントを生成する。ＥＮ−ＬＣとのインキュベーションは、ＶＡＭＰ２イムノブロットシグナルの喪失をもたらす。また、Ｓｙｘ  １のシグナルも減少させた。ＥＤＴＡは、ＥＮ−、Ａ−、およびＸ−ＬＣの活性をブロックした。（図２Ｂ）ＶＡＭＰ２（残基１〜９３）をＨｉｓ６タグ付き組み換えタンパク質として精製し、ＥＮ−ＬＣとインキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色により分析した。ＥＮ−ＬＣはＶＡＭＰ２（１〜９３）を２つの小さいフラグメントに変換し、これは、ＥＮ−ＬＣがＶＡＭＰ２を切断したことを示す。（図２Ｃ）ＶＡＭＰ２（１〜９３）をＥＮ−ＬＣとインキュベートした。次に、全タンパク質試料を質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により分析して、切断されたフラグメントの正確な分子量を決定した。２つの切断産物の質量分析データはそれぞれ色分けされ、各シグナルの質量電荷比（ｍ／ｚ）が付記された。分子量は、ｍにｚを掛け、これに続いてｚを引くことで差し引かれる。
【００２７】
（図２Ｄ）ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｘ、破傷風ニューロトキシン（ＴｅＮＴ）およびＥｎについての切断部位を含む、ＶＡＭＰファミリーメンバー間の配列アライメントは、明るい灰色でマークされた。（図２Ｅ）ＨＡタグ付きＶＡＭＰ１、３、７、および８、およびＭｙｃタグ付きＳｅｃ２２ｂおよびＹｋｔ６を、一過性トランスフェクションを介してＨＥＫ２９３細胞において発現させた。細胞溶解物をＥＮ−ＬＣとインキュベートし、イムノブロット分析に供し、ＨＡまたはＭｙｃタグを検出した。アクチンはローディング対照として役割を果たした。ＥＮ−ＬＣは、ＶＡＭＰ１および３を切断したが、他のアイソフォームを切断しなかった。（図２Ｆおよび２Ｇ）Ｓｙｘ  １Ａ、１Ｂ、２、３、４、ＳＮＡＰ−２３、ＳＮＡＰ−２５、およびＳＮＡＰ−２９を、ＨＥＫ２９３細胞において発現させた。細胞溶解物をＥＮ−ＬＣとインキュベートし、イムノブロット分析に供した。ＥＮ−ＬＣは、Ｓｙｘ  １Ｂ、Ｓｙｘ  ４、ＳＮＡＰ−２３およびＳＮＡＰ−２５を切断した。
【００２８】
【図３】図３Ａ〜３Ｇ。ＢｏＮＴ／ＥＮは、鎖間ジスルフィド結合を含有し、ニューロンにおいてＶＡＭＰ２とＳＮＡＰ−２５の両方を切断する。（図３Ａ）８つのＢｏＮＴとＢｏＮＴ／ＥＮのＬＣとＨＣの間のリンカー領域の配列アラインメント。ＢｏＮＴ／ＥＮのＬＣ−ＨＮドメインのより優れたタンパク質分解活性化を達成するために、トロンビン切断部位をそのリンカー領域に挿入した。（図３Ｂ）ＢｏＮＴ／ＥＮのＬＣ−ＨＮをトロンビンで処理し、次いでＤＴＴ有りまたは無しで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色により分析した。（図３Ｃ）培養されたラット皮質ニューロンを、ＢｏＮＴ／ＥＮのＬＣ−ＨＮに１２時間曝露した。細胞溶解物を収集し、Ｓｙｘ  １、ＳＮＡＰ−２５、およびＶＡＭＰ２を検出するためにイムノブロット分析を行った。アクチンはローディング対照として役割を果たした。トロンビン活性化ＥＮ−ＬＣ−ＨＮは、非活性化タンパク質よりもより効率的にＳＮＡＰ−２５およびＶＡＭＰ２を切断した。ＳＮＡＰ−２５は、Ｎ末領域を認識するＣＩ７１．１（ＳＮＡＰ−Ｎ）で検出された、いずれの切断産物も検出しなかった。ＳＮＡＰ−２５の切断をさらに確認するために、ＳＮＡＰ−２５のＣ末端を認識する第２の抗体（残基１９５〜２０６、ＳＮＡＰ−Ｃ）を使用して、Ｃ末端切断フラグメントを検出した（下のパネル）。
【００２９】
【図４】図４Ａ〜４Ｈ。培養されたニューロンとin vivoでのマウスに対する全長ＢｏＮＴ／ＥＮの試験。（図４Ａ）ソルターゼライゲーション法を用いた全長ＢｏＮＴ／ＥＮの合成の概略図。（図４Ｂ）ソルターゼライゲーション反応混合物および指定された対照構成要素を、ＤＴＴ有りまたは無しで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色により分析した。分子量マーカーはレーン１にある（左側から開始）。全長ＢｏＮＴ／ＥＮ（ＥＮ−ＦＬ）はマークされた。それは、ＤＴＴの存在下で２つの小さなバンドに分離し、それが活性化されていることを確認した。（図４Ｃ）培養されたラット皮質ニューロンを、同じ量（１５μｌ）のソルターゼライゲーション混合物または指定された対照構成要素に培地中で１２時間曝露した。細胞溶解物をイムノブロットにより分析した。ソルターゼによるＥＮ−ＬＣ−ＨＮおよびＥＮ−ＨＣの一緒のライゲーションは、ソルターゼなしのＥＮ−ＬＣ−ＨＮ／ＥＮ−ＨＣ混合物およびＥＮ−ＬＣ−ＨＮ単独と比較して、ＶＡＭＰ２とＳＮＡＰ−２５の切断をわずかに増強し、１：１．７５のみによるソルターゼライゲーションされた混合物の滴定は、いずれの増強効果も消失させた。（図４Ｄ）ソルターゼ反応によって連結されたＥＮ−ＦＬ（１μｇ）をマウスの右後肢の腓腹筋に注射した（Ｎ＝４）。麻痺は観察されなかった。左肢はトキシンを注射せず、対照として役割を果たした。
【００３０】
（図４Ｅ）ＥＮ−Ａキメラトキシンを、ＥＮ−ＦＬを生成するのと同様に、ソルターゼによってＥＮ−ＬＣ−ＨＮをＡ−ＨＣとライゲーションすることによって生成した。ソルターゼライゲーション混合物および指定された対照構成要素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色により分析した。（図４Ｆ）ラット皮質ニューロンを、指定された対照構成要素またはソルターゼライゲーションＥＮ−Ａ混合物に培地中で１２時間曝露した。細胞溶解物をイムノブロットにより分析した。ライゲーションされたＥＮ−Ａは、ソルターゼなしでＥＮ−ＬＣ−ＨＮとＡ−ＨＣとをライゲーションした混合物と比較して、約１，０００倍の、ＶＡＭＰ２およびＳＮＡＰ−２５の大幅に増強された切断をもたらした。（図４Ｇ）ソルターゼ反応によって連結されたＥＮ−Ａ（１ｎｇ）をマウスの右後肢の腓腹筋に注射した（Ｎ＝４）。注射された肢は典型的な弛緩性麻痺を発症し、足指を１２時間以内に広げることはできなかった。（図４Ｈ）ＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｘ、およびＢｏＮＴ／ＥＮを、４つのウマ抗血清（３価の抗ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、およびＥ、抗ＢｏＮＴ／Ｃ、抗ＢｏＮＴ／ＤＣ、および抗ＢｏＮＴ／Ｆ）、２つのヤギ抗血清（抗ＢｏＮＴ／Ｇおよび抗ＢｏＮＴ／Ｄ）、およびＢｏＮＴ／Ｘに対するウサギポリクローナル抗血清を使用して、ドットブロット分析（トキシン当たり０．２μｇ、ニトロセルロース膜にスポット）に供した。ＢｏＮＴ／ＥＮは、１：１の比率の精製されたＥＮ−ＬＣ−ＨＮおよびＥＮ−ＨＣから構成された。これらの抗血清はそれらの対応する標的トキシンを認識したが、それらのうちのいずれもＢｏＮＴ／ＥＮを認識しなかった。
【００３１】
【図５】図５Ａ〜５Ｃ。ＥＮ−ＬＣによるＧＳＴ−ＶＡＭＰ２（３３〜８６）の切断部位の同定。（図５Ａ）ＧＳＴタグ付きＶＡＭＰ２（３３〜８６）を、ＥＮ−ＬＣ有りまたは無しでインキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色により分析した。（図５Ｂおよび５Ｃ）ＧＳＴタグ付きＶＡＭＰ２（３３〜８６）をＥＮ−ＬＣとインキュベートした。次いで、試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析により分析した。パネルＢにおいてＥＮ−ＬＣによって生成されたＣ末端フラグメント、およびパネルＣにおいてＮ末端フラグメントの質量分析データ。
【００３２】
【図６】図６Ａ〜６Ｆ。ＥＮ−ＬＣは保存された部位においてＳｙｘ  １ＢおよびＳｙｘ  ４を切断するが、非効率的である。（図６Ａおよび６Ｂ）組み換えＧＳＴ−ＶＡＭＰ２、Ｓｙｘ  １Ｂ、およびＳｙｘ  ４を精製し、指定された時間、ＥＮ−ＬＣとインキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色によって分析した。（図６Ｃ）組み換えＳｙｘ  １Ａ、Ｓｙｘ  １Ｂ、およびＳｙｘ  ４を指定された時間、高濃度のＥＮ−ＬＣとインキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色によって分析した。切断産物はアスタリスクでマークされた。（図６Ｄおよび６Ｅ）パネルＣに記載されている切断産物は、Ｓｙｘ  １Ｂ（図６Ｄ）およびＳｙｘ  ４（図６Ｅ）についてＭＳ−ＬＳ／ＬＳによって分析した。（図６Ｆ）ＢｏＮＴ／ＥＮ切断部位におけるＳｙｘ  １Ａ、１ＢおよびＳｙｘ  ４の配列アライメント。ＢｏＮＴ／Ｃ切断部位はまた、ラベル付けされる。
【００３３】
【図７】図７Ａ〜７Ｃ。ＥＮ−ＬＣは、in vitroにおいて、組み換えＳＮＡＰ−２５およびＳＮＡＰ−２３を非効率に切断する。（図７Ａおよび７Ｂ）組み換えＳＮＡＰ−２５およびＳＮＡＰ−２３を、低レベルまたは高レベルのＥＮ−ＬＣと指定された時間インキュベートした。低レベルのＥＮ−ＬＣはＳＮＡＰ−２５のみを切断する一方で、高レベルのＥＮ−ＬＣは、複数の切断バンドをもたらした。（図７Ｃ）そのＮ末端においてＨＡを有するＳＮＡＰ−２５をＨＥＫ２９３細胞で発現させた。細胞溶解物を、ＥＮ−ＬＣとインキュベートし、その後、３つの抗体：ＳＮＡＰ−Ｎ  Ａｂ、ＳＮＡＰ−Ｃ  Ａｂ、および抗ＨＡを使用して、イムノブロット分析に供した。ＳＮＡＰ−Ｃ  Ａｂのみが、切断産物を検出することができ、これは、ＥＮ−ＬＣによって生成されたＳＮＡＰ−２５のＣ末端フラグメントを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
ある態様の詳細な説明
Clostridium Botulinumニューロトキシン（ＢｏＮＴ）は、最も強力な細菌トキシンのファミリーであり、潜在的なバイオテロリズム剤である。ＢｏＮＴはClostridium種内でのみ同定されており、その進化の起源は謎のままである。最近の研究は、グラム陽性菌であるWeissella oryzaeにおけるＢｏＮＴのホモログを明らかにした２２，２３。このホモログのＬＣは活性なメタロプロテアーゼであり、in vitro条件下で組み換えＶＡＭＰ２を切断することが示されている。よって、このホモログは、暫定的に、ＢｏＮＴ／Ｗｏと称されている２２。しかしながら、ＢｏＮＴ／ＷｏはＢｏＮＴとはかなり離れている。第１に、ＢｏＮＴ／Ｗｏと他のＢｏＮＴとの間の配列同一性はわずか約１４〜１６％であり、これはＢｏＮＴファミリーのメンバーの通常の範囲（約３０〜６３％）をはるかに下回っている。第２に、ＢｏＮＴにおいて不可欠なジスルフィド結合を形成する２つのシステインは、ＢｏＮＴ／Ｗｏでは保存されておらず、これは作用の別個の様式を有する可能性を示唆している。第３に、ＢｏＮＴ／Ｗｏ遺伝子は、いずれの典型的なＢｏＮＴアクセサリータンパク質とも関連しておらず、それはＢｏＮＴ遺伝子クラスターには存在しない。
【００３５】
本明細書に記載されるのは、いくつかの側面において、Enterococcus faecium細菌株のプラスミド上に存在するＢｏＮＴファミリーの新規メンバーである。この株は、最初に米国のCape Cod地域の牛糞から単離された。２０１７年５月にそのゲノムが配列決定され、それは、ＢｏＮＴ遺伝子クラスターに存在する新規のＢｏＮＴを明らかにした。これは、E. faeciumにおいて同定された最初のタンパク質トキシンを表し、Clostridium以外の細菌種における最初のＢｏＮＴ遺伝子クラスターである。新規のトキシンポリペプチドは、Clostridial Botulinumニューロトキシン（ＢｏＮＴ）ファミリーと配列相同性を共有し、本明細書において「ＢｏＮＴ／ＥＮ」と称される。本明細書で実証されるように、ＢｏＮＴ／ＥＮは、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、ＧおよびＸの同じ基質であるＶＡＭＰ１／２／３を切断するが、新規な部位（ＶＡＭＰ２のＤ６８〜Ｌ９３）で切断する。加えて、ＢｏＮＴ／ＥＮは、in vitro条件下でＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、シンタキシン１Ｂ、シンタキシン４を含む他の複数のＳＮＡＲＥタンパク質を切断し、ニューロン内でＳＮＡＰ−２５を効率的に切断する。ＢｏＮＴ／ＥＮによって天然に標的とされる宿主の種／細胞型の種類は決定されていないままであるが、ＢｏＮＴ／ＥＮはE. faeciumにおいて同定された最初にタンパク質トキシンである。これらの知見は、E. faeciumのＢｏＮＴ遺伝子クラスターを獲得する能力を示しており、ヒトや動物に十分に適応したこのような片利共生生物にとって、生物学的安全性上の重大な脅威となり得、院内多剤耐性感染症の主要な原因となり得る。
【００３６】
用語「Enterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）ポリペプチド」は、本明細書に記載のEnterococcus faeciumニューロトキシンからのものである任意のポリペプチドまたはフラグメントを包含する。いくつかの態様において、用語ＢｏＮＴ／ＥＮは、全長のＢｏＮＴ／ＥＮを指す。いくつかの態様において、用語ＢｏＮＴ／ＥＮは、全体的な細胞メカニズムを実行することができ、それによりＢｏＮＴ／ＥＮがニューロンに侵入し、および／または神経伝達物質放出を阻害する、ＢｏＮＴ／ＥＮのフラグメントを指す。いくつかの態様において、用語ＢｏＮＴ／ＥＮは、フラグメントまたはバリアントに任意の特定の機能または活性を有することを要求することなく、全長のＢｏＮＴ／ＥＮのフラグメントまたはバリアント、またはＢｏＮＴ／ＥＮフラグメントを単に指す。例えば、いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ／ＥＮの軽鎖（ＬＣ）を指す。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ／ＥＮの重鎖（ＨＣ）を指す。
【００３７】
他のＢｏＮＴのように、ＢｏＮＴ／ＥＮは、ＢｏＮＴ／ＥＮがその成熟した形態にプロセッシングされる際にタンパク分解的切断が生じるリンカー領域（例として、図１Ａにおいて）により連結された重鎖（ＨＣ、本明細書において「ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＨＣ」と名付けられる）および軽鎖（ＬＣ、「ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ」と名付けられる）を含む、１つのポリペプチドとして合成される。ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣが、ＢｏＮＴ／ＥＮの基質を切断するプロテアーゼドメインを含む一方でＢｏＮＴ／ＥＮ−ＨＣは、ＢｏＮＴ／ＥＮの細胞への侵入を媒介する、転移ドメインおよび受容体結合ドメインを含む。
【００３８】
本明細書に使用されるとき、用語「Enterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）プロテアーゼドメイン」は、「ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ」の同意語である。用語は、中毒プロセスの酵素的標的改変ステップを実行することができるＢｏＮＴドメインを意味する。ＢｏＮＴ／ＥＮプロテアーゼドメインは、具体的に言うと、ＢｏＮＴ／ＥＮ基質を標的とし、例として、ＳＮＡＲＥタンパク質を含むC. Botulinumトキシン基質のタンパク分解的切断を行う。ＢｏＮＴ／ＥＮにおいて、プロテアーゼドメインまたはＬＣは、ＢｏＮＴ／ＥＮのアミノ酸約１〜４３３に対応する。ドメイン境界は、約２５アミノ酸により変更されてもよい。例えば、プロテアーゼドメインは、ＢｏＮＴ／ＥＮのアミノ酸１〜４０８または１〜４５８に対応していてもよい。いくつかの態様において、プロテアーゼドメインは、ＢｏＮＴ／ＥＮのアミノ酸１〜４３３、１〜４３２、１〜４３１、１〜４３０、１〜４２９、１〜４２８、１〜４２７、１〜４２６、１〜４２５、１〜４２４、１〜４３４、１〜４３５、１〜４３６、１〜４３７、１〜４３８、１〜４３９、１〜４４０、１〜４４１、１〜４４２、１〜４４３、または１〜４４４に対応する。
【００３９】
本明細書に使用されるとき、用語「Enterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）転移ドメイン」は、「ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＨＮドメイン」の同意語であり、ＢｏＮＴ軽鎖転移を媒介する、中毒プロセスの転移ステップを実行することができるＢｏＮＴ／ＥＮドメインを意味する。「ＨＮ」は、ＢｏＮＴ／ＥＮの重鎖のＮ末端を指す。ＨＮドメインは、膜を横切っての細胞の細胞質への、ＢｏＮＴ／ＥＮ軽鎖の移動を促進する。
【００４０】
本明細書に使用されるとき、用語「リンカー領域」は、ＢｏＮＴ／ＥＮプロテアーゼドメイン（ＬＣ）と転移ドメイン（ＨＮ）との間のアミノ酸配列を指す。ＢｏＮＴ／ＥＮリンカー領域は、ＢｏＮＴ／ＥＮ活性に要求されるＢｏＮＴ／ＥＮの成熟した形態におけるＬＣとＨＣとの間の分子内ジスルフィド結合を形成する位置４２４および４３８における２つのシステインを含む。他のＢｏＮＴ（例として、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、またはＢｏＮＴ／Ｘ）のリンカー領域と異なり、ＢｏＮＴ／ＥＮのリンカー領域はリシンを含有しない。プロテアーゼ切断部位がそのプロセシングを促進するためにＢｏＮＴ／ＥＮリンカー領域に挿入される、ＢｏＮＴ／ＥＮリンカー領域の改変はまた、本明細書において企図される。
【００４１】
本明細書に使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮ」は、プロテアーゼドメイン、リンカー領域、および転移ドメインを包含するＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドを指す。ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ／ＥＮのアミノ酸約１−８６２に対応すると考えられる。ドメイン境界は、約２５アミノ酸により変更されてもよい。例えば、ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ／ＥＮのアミノ酸約１−８３７または１−８８７に対応していてもよい。いくつかの態様において、ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ／ＥＮのアミノ酸１〜８６２、１〜８６３、１〜８６４、１〜８６５、１〜８６６、１〜８６７、１〜８６８、１〜８６９、１〜８７０、１〜８７１、１〜８６１、１〜８６０、１〜８５９、１〜８５８、１〜８５７、１〜８５６、１〜８５５、１〜８５４、１〜８５３、または１〜８５２に対応していてもよい。
【００４２】
本明細書に使用されるとき、用語「Enterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）受容体結合ドメイン」は、「ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＨＣドメイン」と同意語であり、例として、標的細胞の形質膜表面に位置するＢｏＮＴ／ＥＮ特異的受容体系へのＢｏＮＴ−ＥＮの結合を含む、中毒プロセスの細胞結合ステップを実行するドメインを意味する。受容体結合ドメインまたはＨＣは、ＢｏＮＴ／ＥＮのアミノ酸約８６３〜１２７９に対応すると考えられている。ドメイン境界は、約２５アミノ酸により変更されてもよい。例えば、受容体結合ドメインまたはＨＣは、ＢｏＮＴ／ＥＮのアミノ酸８３８〜１２７９または８８８〜１２７９に対応していてもよい。いくつかの態様において、受容体結合ドメインまたはＨＣは、ＢｏＮＴ／ＥＮのアミノ酸８６３〜１２７９、８６４〜１２７９、８６５〜１２７９、８６６〜１２７９、８６７〜１２７９、８６８〜１２７９、８６９〜１２７９、７００〜１２７９、７０１〜１２７９、７０２〜１２７９、８６２〜１２７９、８６１〜１２７９、８６０〜１２７９、８５９〜１２７９、８５８〜１２７９、８５７〜１２７９、８５６〜１２７９、８５５〜１２７９、８５４〜１２７９、または８５３〜１２７９に対応していてもよい。
【００４３】
いくつかの側面において、本開示は、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドを提供する。「単離された」は、そのネイティブな状態において見出されるような、通常それに伴う構成要素から様々な程度まで遊離している材料（例として、核酸またはタンパク質）を意味する。「単離する」は、元の供給源または環境から、例として、細胞から、または材料（例として、核酸またはタンパク質）の自然の供給源からの、ある程度の分離を指す。単離されたポリペプチドは、調製の他の構成要素（例として、他のポリペプチド）に対して「実質的に純粋」であるポリペプチドを指す。例えば、いくつかの態様において、それは、他の構成要素に対して少なくとも約５０％、６０％＞、７０％＞、または７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％純粋であるポリペプチドを指す。いくつかの態様において、単離されたポリペプチドは、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、１０％、８％、７％、最も好ましくは約５％未満、４％、３％、２％、１％、または１％未満の１以上の他の構成要素（例として、他のポリペプチドまたは細胞構成要素）を含有するポリペプチドの調製を指す。
【００４４】
いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドであり、配列番号１（表１を参照のこと）と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号１と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【００４５】
いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ／ＥＮ軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドであり、配列番号２（表１を参照のこと）と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号２と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【００４６】
ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣポリペプチドは、当該技術分野における外来性タンパク質の発現の任意の公知の技法、例として、レンチウイルスのベクターを介したもしくはＡＡＶベクターを介した細胞への直接的なＬＣコーディング配列のトランスフェクション、またはＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣの細胞透過性ペプチドとの融合により、ＢｏＮＴ基質（例として、ＳＮＡＲＥタンパク質）の切断が研究または治療目的のために望まれる細胞に単独で導入されてもよい。
【００４７】
いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ／ＥＮの軽鎖および転移ドメインを含有するＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドである。転移ドメインは、重鎖のＮ末端の半分である。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号３（表１を参照のこと）と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号３と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【００４８】
いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ／ＥＮ重鎖ポリペプチドのＣ末端の半分である、ＢｏＮＴ／ＥＮの受容体結合ドメインである。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号４（表１を参照のこと）と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号４と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。
【００４９】
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993のとおり改変されたKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを用いて決定される。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれる。XBLASTプログラムを用いて、スコア＝５０、ワードレングス＝３で、BLASTタンパク質検索を行って、目的のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997において記載されるように、Gapped BLASTを利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター（例えば、XBLASTおよびNBLAST）を用いることができる。
【００５０】
本開示の他の側面は、（ａ）プロテアーゼドメイン；（ｂ）改変されたリンカー領域；および（ｃ）転移ドメイン；ここで改変されたリンカー領域は、プロテアーゼ切断部位を含む、を含む改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドを提供する。「改変されたＢｏＮＴ／ＥＮ」は、アミノ酸配列における任意の改変、例として、先端切断、付加、アミノ酸置換、およびそれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴを包含する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮの軽鎖および重鎖を接続するリンカー領域は、改変されている。
【００５１】
本明細書に記載されるように、ＢｏＮＴ／ＥＮの自然のリンカー領域は、２つのシステインを含み、２つのシステイン間に、他のＢｏＮＴ中のリンカー領域と同様の長さである１３残基が存在する。しかしながら、他のＢｏＮＴとは異なり、ＢｏＮＴ／ＥＮリンカーは、いずれのリシンも含有しない。効率的にＢｏＮＴ／ＥＮを活性化することができる内在性のプロテアーゼは未知のままであるので、部位特異的プロテアーゼ（例として、トロンビン）のための切断部位は、ＥＮ−ＬＣとＨＮとをタンパク質分解的に分離する方法として、ＢｏＮＴ／ＥＮリンカー領域中に挿入され得る（例として、図３Ａを参照のこと）。改変されたＢｏＮＴ／ＥＮは、部位特異的プロテアーゼにより、タンパク質分解的に活性化され得、その切断部位はリンカー領域に挿入される。本開示に従って用いられてもよい部位特異的プロテアーゼの非限定例は、トロンビン、ＴＥＶ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、ソルターゼ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２０、グランザイムＢ、エンテロキナーゼ、ＳＵＭＯプロテアーゼ、ＬｙｓＣ、およびトリプシンを含む。部位特異的プロテアーゼの切断部位配列は、表２に提供される。そのようなものとして、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮの改変されたリンカー領域は、配列番号４１〜４７のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮのリンカー領域は、Clostridial Botulinumニューロトキシン（ＢｏＮＴ）例として、ＢｏＮＴ血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）、ＢｏＮＴ血清型Ｂ（ＢｏＮＴ／Ｂ）、またはＢｏＮＴ血清型Ｘ（Zhang et al., Nature Communications, 8, Artucle number:14130 (2017)（参照により、本明細書に組み込まれる）に記載されるようなＢｏＮＴ／Ｘ）からのものであるリンカー領域で置き換えられる。他のＢｏＮＴの天然に存在するリンカー領域は、表２に提供される。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮの改変されたリンカー領域は、配列番号４８〜５５のアミノ酸配列を含む。
【００５３】
いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮは、ＬＣとＨＮとの間の改変されたリンカー領域を有する、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドである。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、配列番号５〜１３（表３を参照のこと）のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、配列番号５〜１３のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、配列番号５〜１３のいずれか１つと、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、配列番号５〜１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、配列番号５〜１３のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００５４】
いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、受容体結合ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、受容体結合ドメインはまた、ＢｏＮＴ／ＥＮからのものである。そのようなものとして、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮは、本明細書に記載の改変されたリンカー領域を含む改変された全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドである。いくつかの態様において、改変された全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号１４〜２２（表３を参照のこと）のいずれか１つと、少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、改変された全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号１４〜２２のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの態様において、改変された全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号１４〜２２のいずれか１つと、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変された全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号１４〜２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変された全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号１４〜２２のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００５５】
本開示の他の側面は、（ａ）プロテアーゼドメイン；（ｂ）転移ドメイン；および（ｃ）受容体結合ドメイン；ここでプロテアーゼドメインおよび転移ドメインは、Enterococcus faeciumニューロトキシン（ＢｏＮＴ／ＥＮ）からのものであり、ここで受容体結合ドメインは、Clostridial Botulinumニューロトキシン（ＢｏＮＴ）からのものである、を含むキメラトキシンを提供する。例えば、本明細書に記載のキメラトキシンは、ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドおよび、限定せずに、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、およびＢｏＮＴ／Ｘから選択されるＢｏＮＴからのものである受容体結合ドメイン（ＨＣ）を含んでいてもよい。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドは、改変されていなくても、改変されていてもよい（例として、本明細書に記載の改変されたリンカー領域を含むもの）。例えば、いくつかの態様において、改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮは、ＰＮＰＨＦＳＳＱＲＧＬＳＳ（配列番号５６）のアミノ酸配列を含むリンカー領域を含む。いくつかの態様において、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮは、配列番号４１〜５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むリンカー領域を含む。
【００５６】
いくつかの態様において、キメラトキシンは、配列番号２３〜３０（表４を参照のこと）のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、改変された全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号２３〜３０のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの態様において、改変された全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号２３〜３０のいずれか１つと、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変された全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号２３〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、改変された全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、配列番号２３〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００５７】
キメラトキシン、例として、ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮ−Ａ１−ＨＣトキシンを生成するために、ＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮフラグメント（改変されたリンカー領域の有無にかかわらず）は、ＢｏＮＴ／Ａ（例として、ＢｏＮＴ／Ａ１またはＢｏＮＴ／Ａ２）、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、およびＢｏＮＴ／Ｇのいずれか１つの受容体結合ドメイン（ＨＣ）と融合される。当業者は、例として、組み換えＤＮＡ技術を用いる、融合タンパク質を生成する方法に精通している。
【００５８】
本開示の他の側面は、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドの機能的特徴づけを提供する。本開示のＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、およびキメラＢｏＮＴポリペプチドは、標的細胞、例えば神経細胞に結合してこれに侵入し、その基質タンパク質、例えばＳＮＡＲＥタンパク質を切断することができる。用語「ＳＮＡＲＥタンパク質」とは、本明細書において用いられる場合、ＳＮＡＰ（Soluble NSF Attachment Protein）受容体を指し、これは、酵母および哺乳動物細胞における６０を超えるメンバーからなる大きなタンパク質スーパーファミリーである。ＳＮＡＲＥタンパク質の主な役割は、小胞融合、すなわち、小胞とそれらの標的膜結合コンパートメント（リソソームなど）との融合を媒介することである。最もよく研究されているＳＮＡＲＥタンパク質は、シナプス小胞と神経細胞におけるシナプス前膜とのドッキングを媒介するもの、例えばＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５、ＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、シンタキシン１、およびＹｋｔ６である。これらのＳＮＡＲＥタンパク質のうちのいくつかは、ＢｏＮＴの基質である。例えば、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ−２５、およびシンタキシン１は、既知のＢｏＮＴ、例えばＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂにより切断されることが示されている。ＢｏＮＴ／ＥＮが、少なくともＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ３、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、シンタキシン１、およびシンタキシン４を切断することは、本明細書において示されている。
【００５９】
ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドの作用を記載するために用いられる場合、用語「細胞に侵入する」は、ＢｏＮＴ／ＥＮの細胞への結合、トキシンの内部移行、トキシン軽鎖の細胞質への転移およびＢｏＮＴ基質、例として、ＳＮＡＲＥタンパク質の酵素的改変を包含する。
【００６０】
本開示の別の驚くべき知見は、ＢｏＮＴ／ＥＮが、これまでに記載されていなかった新規部位において、ＶＡＭＰタンパク質（例として、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２、またはＶＡＭＰ３）を切断することである。ＢｏＮＴ／ＥＮは、本明細書において、ＶＡＭＰ１（配列番号３１）のアミノ酸Ａ６９とＤ７０との間で、ＶＡＭＰ２（配列番号３２）のアミノ酸Ａ６７とＤ６８との間で、ＶＡＭＰ３（配列番号３３）のアミノ酸Ａ５４とＤ５５との間で切断することが見出された。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮは、シンタキシン１Ｂ（配列番号３７）のアミノ酸Ｍ１８２とＤ１８３との間を切断し、シンタキシン４（配列番号３８）のアミノ酸Ｋ１９１とＤ１９２との間を切断する。
【００６１】
いくつかの態様において、本開示のＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、標的細胞中のＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。本明細書において用いられる場合、「標的細胞」とは、天然に存在する細胞であって、ＢｏＮＴ／ＥＮが侵入するかまたは中毒させることができる細胞を意味する。いくつかの態様において、標的細胞は、分泌細胞、例えば神経細胞または分泌型免疫細胞である。ＢｏＮＴの標的細胞となり得る神経細胞の例として、限定することなく、運動神経細胞；感覚神経細胞；自律神経細胞、例えば交感神経細胞および副交感神経細胞など；非ペプチド作動性神経細胞、例えばコリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、ノルアドレナリン作動性神経細胞、セロトニン作動性神経細胞、ＧＡＢＡ作動性神経細胞など；ならびにペプチド作動性神経細胞、例えばサブスタンスＰ神経細胞、カルシトニン遺伝子関連ペプチド神経細胞、血管作用性腸管ペプチド神経細胞、ニューロペプチドＹ神経細胞、コレシストキニン神経細胞などが挙げられる。
【００６２】
本開示のＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、神経細胞以外の他の型の分泌細胞をターゲティングすることができる。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドによりターゲティングされる分泌細胞は、分泌型免疫細胞である。「分泌型免疫細胞」とは、本明細書において用いられる場合、サイトカイン、ケモカインまたは抗体を分泌する免疫細胞を指す。かかる分泌型免疫細胞は、限定することなく、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージ、好中球および樹状細胞を含む、自然免疫細胞であってよい。抗体を分泌する分泌型免疫細胞（例えば白血球）もまた、本開示のＢｏＮＴポリペプチドによりターゲティングされ得る。抗体分泌細胞の非限定的な例として、限定することなく、プラズマＢ細胞、プラズマ細胞（plasmocyte）、プラズマ細胞（plasmacyte）、およびエフェクターＢ細胞が挙げられる。いくつかの態様において、標的細胞は、培養細胞、例えば培養神経細胞または培養分泌型免疫細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は、in vivoのものである。いくつかの態様において、標的細胞は、哺乳動物からのものである。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。態様において、哺乳動物は、げっ歯類、例えばマウスまたはラットである。いくつかの態様において、標的細胞は、昆虫細胞である。
【００６３】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、神経活動を抑制する。「神経活動を抑制する」は、神経細胞（ＢｏＮＴ／ＥＮにより標的とされる細胞型の１つ）がＢｏＮＴ／ＥＮと接触した場合に、その活動（例として、神経シグナルを伝達する活動）が、ＢｏＮＴ／ＥＮと接触していない場合と比較して、少なくとも２０％減少することを意味する。例えば、神経細胞の活動は、ＢｏＮＴ／ＥＮと接触した場合に、ＢｏＮＴ／ＥＮと接触していない場合と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上減少してもよい。いくつかの態様において、神経細胞の活動は、ＢｏＮＴ／ＥＮと接触した場合に、ＢｏＮＴ／ＥＮと接触していない場合と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％減少する。
【００６４】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、弛緩性麻痺を誘発する。「弛緩性麻痺」とは、他の明らかな原因（例えば外傷）が存在しない脱力または麻痺、および低下した筋緊張により特徴づけられる臨床的徴候を指す。
いくつかの態様において、ＢｏＮＴポリペプチドは、免疫応答を調節する。「免疫応答を調節する」は、分泌免疫細胞がＢｏＮＴ／ＥＮと接触した場合に、その活性（例として、免疫応答を産生する活性）が、ＢｏＮＴ／ＥＮと接触していない場合と比較して少なくとも２０％変化（例として、減少）することを意味する。例えば、分泌免疫細胞の活性は、ＢｏＮＴ／ＥＮと接触した場合に、ＢｏＮＴ／ＥＮと接触していない場合と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上、変化（例として、減少）してもよい。いくつかの態様において、分泌免疫細胞の活性は、ＢｏＮＴ／ＥＮと接触した場合に、ＢｏＮＴ／ＥＮと接触していない場合と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％変化（例として、減少）する。
【００６５】
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸに対する抗体との減少した反応性を有する。「減少した反応性を有する」は、ＢｏＮＴ／ＥＮとＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸに対する抗体との反応性が、ＢｏＮＴ（例として、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸ）とそのようなＢｏＮＴに対する抗体との反応性と比較して、少なくとも２０％減少していることを意味する。例えば、ＢｏＮＴ／ＥＮとＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧに対する抗体との反応性は、ＢｏＮＴ（例として、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸ）とそのようなＢｏＮＴに対する抗体との反応性と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上減少していてもよい。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮとＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸに対する抗体との反応性が、ＢｏＮＴ（例として、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸ）とそのようなＢｏＮＴに対する抗体との反応性と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上減少する。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＸに対する抗体と交差反応をしない。
【００６６】
本開示の他の側面は、本明細書に記載の、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、およびキメラトキシンをコードする核酸を提供する。本開示の単離ポリペプチドフラグメントをコードする核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。ある側面において、単離ポリペプチドフラグメントをコードする対象の核酸は、本明細書において記載される改変ＢｏＮＴポリペプチドのうちのいずれかのバリアントであるポリペプチドをコードする核酸を含むものと、さらに理解される。
【００６７】
バリアントヌクレオチド配列は、対立遺伝子バリアントなどの、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、およびキメラトキシンに対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、本開示の単離された核酸分子は、配列番号１〜３０のいずれか１つに対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６８】
いくつかの態様において、そのような核酸は、ベクター（例として、クローニングベクターまたは発現ベクター）に組み込まれていてもよい。いくつかの態様において、ベクターは、細胞（例として、細菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞）においてコードされたポリペプチドを発現さえるために適応される。
いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、またはキメラトキシンをコードするポリヌクレオチドはプロモーターに作動可能に連結されている。本明細書において記載されるポリペプチドの発現のために多様なプロモーターを用いることができ、これは、これらに限定されないが、以下を含む：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中初期（intermediate early）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１  ＬＴＲなどのウイルスＬＴＲ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、E. coliのｌａｃ  ＵＶ５プロモーター、および単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーター。制御可能プロモーターもまた用いることができる。かかる制御可能プロモーターとして、ｌａｃオペレーターを有する哺乳動物細胞プロモーターからの転写を制御するための転写調節因子としてE. coliからのｌａｃリプレッサーを用いるもの、［Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)］、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を用いるもの［Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)；Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998)；Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)］が挙げられる。
【００６９】
他の系として、ＦＫ５０６二量体、アストラジオール（astradiol）を用いるＶＰ１６またはｐ６５、ＲＵ４８６、ジフェノールムリスレロン（diphenol murislerone）、またはラパマイシンが挙げられる。誘導可能な系は、Invitrogen、ClontechおよびAriadから入手可能である。オペロンによるリプレッサーを含む制御可能プロモーターを用いることができる。一態様において、Escherichia coliからのｌａｃリプレッサーは、転写調節因子として機能して、ｌａｃオペレーターを有する哺乳動物細胞プロモーターからの転写を制御することができる［M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)］；Gossen and Bujard (1992)［M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)］は、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を、転写活性化因子（ＶＰ１６）と組み合わせて、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）主要最初期プロモーターを由来とするｔｅｔＯを有するミニマルプロモーターを有するｔｅｔＲ−哺乳動物細胞転写活性化因子融合タンパク質、ｔＴａ（ｔｅｔＲ−ＶＰ１６）を作出し、哺乳動物細胞における遺伝子発現を制御するためのｔｅｔＲ−ｔｅｔオペレーター系を作出した。一態様において、テトラサイクリン誘導型のスイッチが用いられる（Yao et al., Human Gene Therapy; Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)；Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)）。
【００７０】
加えて、ベクターは、例えば以下のうちのいくつかまたは全てを含んでもよい：選択可能マーカー遺伝子、例えば哺乳動物細胞における安定型または一過型の形質移入体の選択のためのネオマイシン遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写終結およびＲＮＡプロセッシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳｅｓ）、万能多重クローニング部位；ならびにセンスおよびアンチセンスＲＮＡのin vitro 転写のためのＴ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーター。導入遺伝子を含有する好適なベクターおよびベクターを生成するための方法は、当該分野において周知であり、入手可能である。
【００７１】
核酸を含む発現ベクターは、従来技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈降法）により宿主細胞に導入することができ、遺伝子導入された細胞を、次いで、従来技術により培養して、本明細書において記載されるポリペプチドを産生させる。いくつかの態様において、本明細書において記載されるポリペプチドの発現は、構成的、誘導性または組織特異的プロモーターにより制御される。
さらに提供されるのは、核酸または核酸ベクターを含む細胞、および、明細書に記載の、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、およびキメラトキシンを発現する細胞である。本明細書に記載の、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、およびキメラトキシンは、一般に適切な細胞（例として、E. coli、昆虫細胞、または哺乳動物細胞）において発現形態組み換え核酸により産生され、単離される。
【００７２】
本明細書において記載される単離ポリペプチドを発現させるために用いられる宿主細胞は、Escherichia coliなどの細菌細胞、または好ましくは真核生物細胞のいずれかであってよい。特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせて、免疫グロブリンのための効果的な発現系である（Foecking et al. (1986)「Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors」、Gene 45:101-106; Cockett et al. (1990)「High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification」、Biotechnology 8:662-667）。本明細書において記載される単離ポリペプチドを発現させるために、多様な宿主−発現ベクター系を利用することができる。かかる宿主−発現系は、本明細書において記載される単離ポリペプチドのコード配列を産生させてその後に精製することができるビヒクルを代表するが、また、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換または遺伝子導入された場合には、本明細書において記載される単離ポリペプチドをin situで発現する細胞をも代表する。
【００７３】
これらは、限定されないが、本明細書において記載される単離ポリペプチドについてのコード配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えばE. coliおよびB. subtilis）などの微生物；本明細書において記載される単離ポリペプチドをコードする配列を含む組み換え酵母発現ベクターを遺伝子導入された酵母（例えばSaccharomyces pichia）；本明細書において記載される単離ポリペプチドをコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；本明細書において記載される単離ポリペプチドをコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に感染した、または本明細書において記載される単離ポリペプチドをコードする配列を含む組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノムを由来とするプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスを由来とするプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組み換え発現コンストラクトを有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ系細胞（米国特許第5,807,715号を参照）、ＰｅｒＣ．６細胞（Crucellにより開発されたヒト網膜細胞）を含む。
【００７４】
細菌の系において、発現されているポリペプチドについての意図される用途に依存して、多数の発現ベクターを、有利に選択することができる。例えば、本明細書において記載されるポリペプチドの医薬組成物の生成のために大量のかかるタンパク質を産生させる場合、高レベルの融合タンパク質生成物の発現を指揮する、容易に精製されるベクターが、望ましい場合がある。かかるベクターとして、これらに限定されないが、コード配列を、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃＺコード領域と共に、個々にベクター中にインフレームでライゲーションすることができるE. coli 発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruether et al. (1983)「Easy Identification Of cDNA Clones」、EMBO J. 2:1791-1794）；ｐＩＮベクター（Inouye et al. (1985)「Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli」、Nucleic Acids Res. 13:3101-3110；Van Heeke et al. (1989)「Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli」、J. Biol. Chem. 24:5503-5509）などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターはまた、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために用いてもよい。一般的に、かかる融合タンパク質は、可溶性であり、溶解された細胞から、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合と、その後の遊離グルタチオンの存在下における溶離とにより、容易に精製することができる。
【００７５】
ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子の生成物をＧＳＴ部分から放出させることができるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子のプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。昆虫の系において、オートグラファカリフォルニア（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いる。ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の細胞中で増殖する。コード配列は、ウイルスの非必須の領域（例えば、多核体タンパク質（polyhedrin）の遺伝子）中に個々にクローニングして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば多核体タンパク質プロモーター）の制御下においてもよい。
【００７６】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三要素（tripartite）リーダー配列にライゲーションしてもよい。このキメラ遺伝子を、次いで、in vitroまたはin vivoでの組み換えにより、アデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須の領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、感染した宿主中で生存可能であり、免疫グロブリン分子を発現することができる組み換えウイルスをもたらすであろう（例えば、Loganら（1984年）「Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照）。特異的な開始シグナルもまた、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要とされる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を保証するために、所望されるコード配列のリーディングフレームと同相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の多様な起源のものであってよい。
【００７７】
発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含により増強することができる（Bitter et al. (1987)「Expression And Secretion Vectors For Yeast」、Methods in Enzymol. 153:516-544を参照）。加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、遺伝子生成物を所望される特定の様式において修飾およびプロセッシングするものを選択してもよい。タンパク質生成物のかかる修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要である場合がある。例えば、ある態様において、本明細書において記載されるポリペプチドは、本明細書において記載される別々のポリペプチドを形成するために、ネイティブまたは組み換えの細胞機構によるタンパク質分解による切断を必要とする、単一遺伝子生成物（例えば、単一のポリペプチド鎖として、すなわち、ポリタンパク質前駆体として）発現されてもよい。
【００７８】
本開示は、したがって、本明細書において記載されるポリペプチドを含むポリタンパク質前駆体分子をコードする核酸配列を操作することを包含し、これは、前記ポリタンパク質前駆体の翻訳後切断を指揮することができるコード配列を含む。ポリタンパク質前駆体の翻訳後切断は、本明細書において記載されるポリペプチドをもたらす。本明細書において記載されるポリペプチドを含む前駆体分子の翻訳後切断は、in vivoで起きても（すなわち、宿主細胞内で、ネイティブのまたは組み換えの細胞系／機構、例えば適切な部位におけるフューリン切断による）、in vitroで起きてもよい（例えば、既知の活性のプロテアーゼまたはペプチダーゼを含む組成物中で、および／または、所望されるタンパク質分解作用を促進することが知られている条件または試薬を含む組成物中での、前記ポリペプチド鎖のインキュベーション）。
【００７９】
組み換えタンパク質の精製および修飾は、当該分野において周知であり、したがって、ポリタンパク質前駆体の設計は、当業者により容易に理解される多数の態様を含む。記載される前駆体分子の修飾のために、当該分野において公知の任意の既知のプロテアーゼまたはペプチダーゼ、例えば、トロンビンまたは第Ｘａ因子（Nagaiら（1985年）「Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli」、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:7252-7255、およびJennyら（2003年）「A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa」、Protein Expr. Purif. 31:1-11において概説される；これらの各々は、本明細書においてその全体において参考として援用される））、エンテロキナーゼ（Collins-Racieら（1995年）「Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA」、Biotechnology 13:982-987；本明細書によりその全体において参考として援用される））、フューリン、およびAcTEV（Parksら（1994年）「Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase」、Anal. Biochem. 216:413-417；本明細書によりその全体において参考として援用される））、ならびに口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３を用いることができる。
【００８０】
異なる宿主細胞は、翻訳後のタンパク質および遺伝子生成物のプロセッシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な機序を有する。発現された外来タンパク質の正確な修飾およびプロセッシングを保証するために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセッシング、遺伝子生成物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を用いることができる。かかる哺乳動物宿主細胞として、これらに限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔが挙げられる。
【００８１】
長期の、高収率での組み換えタンパク質の産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、本明細書において記載されるポリペプチドを安定して発現する細胞株を、設計することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、むしろ、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択可能マーカーにより形質転換してもよい。外来ＤＮＡの導入の後で、設計された細胞を、１〜２日間にわたり富栄養培地中で増殖させて、次いで、選択培地に切り替えてもよい。組み換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体中に安定に組み込んで、コロニー（foci）を形成することを可能にし、これを次いでクローニングして、細胞株に増やすことができる。この方法は、本明細書において記載されるポリペプチドを発現する細胞株を操作するために、有利に用いることができ、このように設計された細胞株は、本明細書において記載されるポリペプチドと直接的にまたは間接的に相互作用するポリペプチドのスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【００８２】
多数の選択系を用いることができ、これは、限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら（1977）「Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells」、Cell 11: 223-232）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalskaら（1992）「Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells 第１の Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy」、Bioessays 14: 495-500）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら（1980）「Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster aprt Gene」、Cell 22: 817-823）を含み、遺伝子は、それぞれ、tk、hgprtまたはaprt細胞において使用することができる。また、代謝拮抗薬耐性も、以下の遺伝子についての選択の基礎として用いることができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr（Wiglerら（1980）「Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570；O'Hareら（1981）「Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（Mulliganら（1981）「Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076）；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo（Tolstoshev（1993）「Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions」、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan（1993）「The Basic Science Of Gene Therapy」、Science 260:926-932；およびMorganら（1993）「Human Gene Therapy」、Ann. Rev. Biochem. 62:191-217）ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Santerreら（1984）「Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells」、Gene 30:147-156）。組み換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法であって用いることができるものは、Ausubelら（編）、1993年、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley & Sons, NY）；Kriegler、1990年、Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual（Stockton Press, NY）において；およびDracopoliら（編）、1994年、Current Protocols in Human Genetics（John Wiley & Sons, NY.）の第１２章および１３章；Colberre-Garapinら（1981）「A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells」、J. Mol. Biol. 150:1-14において記載される。
【００８３】
本明細書において記載されるポリペプチドの発現レベルは、ベクターの増幅により増大させることができる（概説については、Bebbington and Hentschel、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning、第３巻（Academic Press, New York, 1987年）を参照）。本明細書において記載されるポリペプチドを発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養において存在するインヒビターのレベルの増大は、マーカー遺伝子のコピー数を増大させるであろう。増幅される領域は、本明細書において記載されるポリペプチドのヌクレオチド配列または本明細書において記載されるポリペプチドに関連するので、ポリペプチドの産生もまた増大するであろう（Crouseら（1983年）「Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes」、Mol. Cell. Biol. 3:257-266）。
【００８４】
本明細書において記載されるポリペプチドは、組み換えにより発現された後、ポリペプチド、ポリタンパク質または抗体の精製の分野において公知の任意の方法（例えば、抗原選択性に基づく抗体精製スキームに類似のもの）により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に特異的抗原に対するアフィニティーによるもの（任意に、ポリペプチドがＦｃドメイン（またはその部分）を含む場合にはタンパク質Ａ選択の後で）により、およびサイジングカラム（sizing column）クロマトグラフィー）、遠心分離、較差溶解度（differential solubility）により、またはポリペプチドまたは抗体の精製のための任意の他の標準的技術により、精製することができる。本開示の他の側面は、本明細書において記載される核酸または本明細書において記載されるベクターを含む細胞に関する。
【００８５】
細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物細胞である。例示的な細胞型は、本明細書において記載される。本開示の他の側面は、本明細書において記載される改変ＢｏＮＴポリペプチドを発現する細胞に関する。細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物細胞である。例示的な細胞型は、本明細書において記載される。細胞は、核酸の伝播のため、または核酸の発現のため、または両方のためのものであってよい。かかる細胞として、限定することなく、好気性、微好気性、二酸化炭素志向性（capnophilic）、通性、嫌気性、グラム陰性およびグラム陽性の細菌細胞の株、例えば、限定することなくEscherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacteroides fragilis、Clostridia perfringens、Clostridia difficile、Caulobacter crescentus、Lactococcus lactis、Methylobacterium extorquens、Neisseria meningirulls、Neisseria meningitidis、Pseudomonas fluorescensおよびSalmonella typhimuriumに由来するものなど；ならびに、限定することなく、酵母株、例えばPichia pastoris、Pichia methanolica、Pichia angusta、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomyces cerevisiaeおよびYarrowia lipolyticaに由来するものなどを含む真核生物細胞；昆虫細胞および昆虫に由来する細胞株、例えばSpodoptera frugiperda、Trichoplusia ni、Drosophila melanogasterおよびManduca sextaに由来するものなど；ならびに哺乳動物細胞および哺乳動物細胞に由来する細胞株、例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類およびヒトに由来するものなどを含む原核細胞が挙げられる。細胞株は、American Type Culture Collection、European Collection of Cell CulturesおよびGerman Collection of Microorganisms and Cell Culturesから得てもよい。適切な細胞株の選択、作製および使用のための具体的なプロトコルの非限定的例は、例えば、INSECT CELL CULTURE ENGINEERING（Mattheus F. A. Goosenら編、Marcel Dekker、1993年）；INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS（J. M. Vlakら編、Kluwer Academic Publishers、1996年）；Maureen A. Harrison & Ian F. Rae、GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE（Cambridge University Press、1997年）；CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES（Alan Doyleら編、John Wiley and Sons、1998年）；R. Ian Freshney、CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE（Wiley-Liss、第４版、2000年）；ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH（John R. W. Masters ed., Oxford University Press、第３版、2000）；MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL、上記（2001年）；BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH（John M. Davis, Oxford Press、第２版、2002年）；およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、上記（2004年）において記載される。
【００８６】
これらのプロトコルは、当業者の範囲において、および本明細書における教示から、慣用的な手順である。本開示のさらに他の側面は、本明細書において記載されるポリペプチドを生成する方法に関し、該方法は、本明細書において記載される細胞を得ること、および前記細胞において本明細書において記載される核酸を発現することを含む。いくつかの態様において、方法は、本明細書において記載されるポリペプチドを単離および精製することをさらに含む。
【００８７】
いくつかの態様において、ボツリヌスニューロトキシンは、発酵槽においてClostridium botulinumの培養を確立してこれを増殖させ、次いで発酵させた混合物を公知の手順に従って採取および精製することにより、得られることができる。全てのボツリヌストキシン血清型は、不活性な単鎖タンパク質として最初に合成され、これは、向神経活性となるために、プロテアーゼにより切断するかまたはニックを入れなければならない。
【００８８】
ボツリヌストキシン血清型ＡおよびＧを産生する細菌株は、内因性プロテアーゼを有し、したがって、血清型ＡおよびＧは、細菌培養物から、主にそれらの活性な形態において回収することができる。対照的に、ボツリヌストキシン血清型Ｃ、ＤおよびＥは、非タンパク質分解株により合成され、したがって、典型的には、培養物から回収された時点では不活性である。血清型ＢおよびＦは、タンパク質分解株と非タンパク質分解株との両方により産生され、したがって、活性または不活性な形態のいずれかにおいて回収することができる。例えばボツリヌストキシン血清型Ｂ型を産生するタンパク質分解株は、産生されるトキシンの一部のみを切断する場合がある。これらの菌株を用いるＢｏＮＴ／ＥＸポリペプチドの産生は、本明細書において企図される。
【００８９】
ニックを入れた分子のニックがない分子に対する正確な比率は、インキュベーションの長さおよび培養の温度に依存する。したがって、例えばボツリヌストキシンＢ型トキシンの調製物のうちの一定のパーセンテージは、不活性であってもよい。一態様において、本開示のニューロトキシンは、活性な状態にある。一態様において、ニューロトキシンは、不活性な状態にある。一態様において、活性および不活性なニューロトキシンの組み合わせが企図される。
【００９０】
本開示の一側面は、ＢｏＮＴの２つの非毒性のフラグメントをライゲーションするin vitroトランスペプチダーゼ反応を介して全長ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド（リンカー領域における改変の有無にかかわらず）またはキメラトキシンを生成する、代替の方法を提供する。かかる方法は、以下のステップを含む：（ｉ）軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＮ）のＮ末端ドメインを含む第１のＢｏＮＴフラグメントを得ること、ここで、第１のＢｏＮＴフラグメントは、Ｃ末端ＬＰＸＴＧＧモチーフを含む；（ｉｉ）重鎖（ＨＣ）のＣ末端ドメインを含む第２のＢｏＮＴフラグメントを得ること；ここで、第２のＢｏＮＴフラグメントは、そのＮ末端において、特異的なプロテアーゼ切断部位を含む；（ｉｉｉ）第２のＢｏＮＴフラグメントを、特異的プロテアーゼにより切断すること、ここで、切断は、Ｎ末端において遊離のグリシン残基をもたらす；ならびに（ｉｖ）第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとを、トランスペプチダーゼの存在下において接触させ、それにより、第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとをライゲーションして、ライゲーションされたＢｏＮＴを形成させること。
【００９１】
いくつかの態様において、第１のＢｏＮＴフラグメントは、Ｃ末端ＬＰＸＴＧＧモチーフ（例えば、配列番号５７）、またはその任意のバリアントに融合した、本明細書において記載されるＢｏＮＴ／ＥＮ−ＬＣ−ＨＮポリペプチドを含む。いくつかの態様において、第２のＢｏＮＴフラグメントは、本明細書において記載されるＨＣポリペプチド、またはその任意のバリアント（例えば、配列番号４）を含む。本明細書において記載される方法を用いて、任意のＢｏＮＴフラグメントまたはドメインをライゲーションすることができることが、理解されるべきである。
【００９２】
本明細書において記載される方法はまた、キメラトキシンを作製するために用いてもよい。例えば、第１のＢｏＮＴフラグメントは、ＢｏＮＴ／ＥＮからのものであってよい一方で、第２のＢｏＮＴフラグメントは、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＸからのものであってよい。当業者は、作製することができる組み合わせを識別することができるであろう。
いくつかの態様において、トランスペプチダーゼは、ソルターゼである。いくつかの態様において、ソルターゼは、黄色ブドウ球菌からのものである（ＳｒｔＡ）。
【００９３】
当該分野において利用可能な他のペプチドライゲーション系もまた、２つの非毒性のＢｏＮＴフラグメントをライゲーションするために用いることができる。例えば、インテインにより媒介されるタンパク質ライゲーション反応は、Ｎ末端システイン残基を有する合成ペプチドまたはタンパク質の、細菌により発現されるタンパク質のＣ末端への、ネイティブのペプチド結合を通してのライゲーションを可能にする（Evans et al., (1998) Protein Sci.7, 2256-2264；Dawson et al.,(1994) Science266, 776-779；Tam et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA92, 12485-12489；Muir et al.,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA95,6705-6710；Severinov and Muir (1998) J. Biol. Chem.273, 16205-16209：これらの全内容は、本明細書において参考として援用される）。インテインにより媒介されるタンパク質ライゲーション反応のためのキットは、市販されている（例えばNew England Biolabsから）。
【００９４】
いくつかの態様において、第１のＢｏＮＴフラグメントは、アフィニティータグをさらに含む。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｎ末端において第１のＢｏＮＴフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｃ末端において第１のＢｏＮＴフラグメントに融合している。アフィニティータグが第１のＢｏＮＴフラグメントのＣ末端に融合している場合、トランスペプチダーゼは、ＬＰＸＴＧＧモチーフにおけるＴとＧとの間を切断し、第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとをライゲーションする前に、アフィニティータグを取り除く。
【００９５】
いくつかの態様において、第２のＢｏＮＴフラグメントは、アフィニティータグをさらに含む。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｎ末端において第１のＢｏＮＴフラグメントに融合している。いくつかの態様において、アフィニティータグは、Ｃ末端において第２のＢｏＮＴフラグメントに融合している。アフィニティータグが第１のＢｏＮＴフラグメントのＮ末端に融合している場合、特異的プロテアーゼは、特異的プロテアーゼにおける切断部位を切断し、トランスペプチダーゼにより、第１のＢｏＮＴフラグメントと第２のＢｏＮＴフラグメントとをライゲーションする前に、アフィニティータグを取り除く。
【００９６】
「アフィニティータグ」とは、本明細書において用いられる場合、基質または部分に特異的に結合することができるポリペプチド配列を指す。例えば、６個のヒスチジンを含むタグは、Ｎｉ２＋に特異的に結合する。アフィニティータグは、タンパク質の単離を容易にするために、タンパク質に付加してもよい。アフィニティータグは、典型的には、当業者に公知の組み換えＤＮＡ技術を介してタンパク質に融合させる。タンパク質の単離を容易にするためのアフィニティータグの使用もまた、当該分野において周知である。本開示に従って用いることができる好適なアフィニティータグとして、限定することなく、Ｈｉｓ６、ＧＳＴ、Ａｖｉ、Ｓｔｒｅｐ、Ｓ、ＭＢＰ、Ｓｕｍｏ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｅ、カルモジュリン、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、ＴＣ、Ｖ５、ＶＳＶ、Ｘｐｒｅｓｓ、Ｈａｌｏ、およびＦｃが挙げられる。
【００９７】
第２のＢｏＮＴフラグメントは、Ｎ末端において特異的なプロテアーゼ切断を有する。特異的プロテアーゼによる部位の切断は、第２のＢｏＮＴフラグメントのＮ末端において遊離のグリシン残基を生じる。本開示に従って用いることができる好適な特異的プロテアーゼとして、限定することなく、トロンビン、ＴＥＶ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、エンテロキナーゼ、およびＳＵＭＯプロテアーゼが挙げられる。いくつかの態様において、特異的プロテアーゼは、トロンビンであり、切断部位は、ＬＶＰＲ｜ＧＳ（配列番号４１）である。
【００９８】
本明細書において記載される、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、またはキメラトキシンは、治療的使用のための潜在能力を提供する。例えば、いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮは、他のＢｏＮＴ血清型と比較して、より強力であり得る。いくつかの態様において、ＢｏＮＴ／ＥＮは、他のＢｏＮＴ血清型よりも多くの基質を切断するその能力に起因して、より多用途であり、広範な細胞においてより有効であり得る。
したがって、本開示はまた、本明細書に記載の、ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、またはキメラトキシンを含む医薬組成物を提供する。本開示においてまたのちに明らかとなり得るとおり、医薬組成物は、かかる組成物が処置するように設計される特定の疾患のために好適な他の治療剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
【００９９】
用語「薬学的に許容し得る担体」とは、本明細書において用いられる場合、ポリペプチドを身体の１つの部位（例えば送達部位）から別の部位（例えば、臓器、組織または身体の部分）へと運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、またはステアリン酸）、あるいは溶媒封入材料を意味する。
【０１００】
薬学的に許容し得る担体は、処方物の他の成分と適合性であって対象の組織に対して傷害性ではない（例えば、生理学的に適合性、無菌、生理学的ｐＨなど）という意味において「許容し得る」である。薬学的に許容し得る担体として使用することができる材料のいくつかの例として、以下が挙げられる：（１）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えばコーンスターチおよび馬鈴薯デンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末状トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えばカカオバターおよび坐剤用ワックス；（９）油脂、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油。ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；
【０１０１】
（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝化剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）嵩高剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸（２３）血清構成成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；（２２）Ｃ２〜Ｃ１２アルコール、例えばエタノール；ならびに（２３）医薬処方物において使用される他の非毒性の適合性の物質。湿潤化剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤もまた、処方物中に存在することができる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容し得る担体」などの用語は、本明細書において交換可能に用いられる。いくつかの態様において、組成物中の本開示のＢｏＮＴポリペプチドは、注射により、カテーテルにより、坐剤により、または移植片により投与され、移植片は、多孔質、無孔質、またはゼラチン状の材料であり、これはシラスティック（Sialastic）メンブレンなどの膜または繊維を含む。
【０１０２】
典型的には、組成物を投与する場合、本開示のポリペプチドが吸収されない材料を用いる。他の態様において、本開示のポリペプチドは、徐放系において送達される。投与のためのかかる組成物および方法は、米国特許公開番号No. 2007/0020295において提供され、その内容は、本明細書において参考として援用される。一態様において、ポンプを用いてもよい（例えば、Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照）。別の態様において、ポリマー材料を用いることができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release（LangerおよびWise編、CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974年）；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance（SmolenおよびBall編、Wiley, New York, 1984年）；Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照。また、Levy et al., 1985, Science 228:190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105を参照）。他の徐放系は、例えば上記のLangerにおいて議論される。
【０１０３】
本開示のポリペプチドは、結合剤の治療有効量および１つ以上の薬剤的に適合性の材料を含む医薬組成物として、投与することができる。典型的な態様において、医薬組成物は、慣用的な手順に従って、対象、例えばヒトへの静脈内または皮下投与のために適応させた医薬組成物として、処方される。
【０１０４】
典型的には、注射による投与のための組成物は、無菌の等張水性バッファー中の溶液である。必要である場合は、医薬はまた、注射の部位における疼痛を緩和するために、可溶化剤およびリグノカインなどの局所麻酔剤を含むことができる。一般に、成分は、単位投与形態において、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ（sachette）などの気密密封容器中の乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、別々に、または一緒に混合して、供給される。医薬が注入により投与されるべき場合、それは、無菌の医薬グレードの水または食塩水を含有する注入ボトルにより分配される。医薬が注射により投与される場合、成分を投与の前に混合することができるように、注射用の無菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。全身投与のための医薬組成物は、液体、例えば無菌の食塩水、乳酸リンガーまたはハンクス溶液であってよい。加えて、医薬組成物は、固体の形態であってもよく、使用の直前に再溶解または懸濁されてもよい。凍結乾燥形態もまた企図される。医薬組成物は、リポソームまたは微結晶などの脂質粒子または小胞中に含有されていてもよく、これもまた、非経口投与のために好適である。粒子は、組成物がその中に含有される限り、単層または複層などの任意の好適な構造のものであってよい。
【０１０５】
本開示のポリペプチドを、膜融合性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベル（５〜１０ｍｏｌ％）のカチオン性脂質を含有する「安定化されたプラスミド−脂質粒子」（ＳＰＬＰ）中に封入して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングにより安定化させることができる（Zhang Y. P. et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47）。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェートまたは「ＤＯＴＡＰ」などの正に荷電した脂質が、かかる粒子および小胞のために特に好ましい。かかる脂質粒子の調製は、周知である。例えば、米国特許第4,880,635号；同第4,906,477号；同第4,911,928号；同第4,917,951号；同第4,920,016号；および同第4,921,757号を参照。本開示の医薬組成物は、例えば単位用量として投与または包装してもよい。
【０１０６】
用語「単位用量」とは、本開示の医薬組成物に関して用いられる場合、対象のための単位投与量として好適な物理的に別々の単位を指し、各単位が、所望される治療効果をもたらすために計算された予め決定された量の活性材料を、必要とされる希釈剤；すなわち担体またはビヒクルと組み合わせて含有する。いくつかの態様において、本明細書において記載されるポリペプチド（例として、改変された、または改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチドまたはキメラトキシン）を、治療用部分、例えば抗生物質と抱合させてもよい。かかる治療用部分を例えばＦｃドメインを含むポリペプチドに抱合させるための技術は、周知である；例えば、Amonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中、Reisfeldら（編）、1985年、pp. 243-56、Alan R. Liss, Inc.）；Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery（第２版）中、Robinsonら（編）、1987年、pp. 623-53、Marcel Dekker, Inc.）；Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications中、Pincheraら（編）、1985年、pp. 475-506）；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy中、Baldwinら（編）、1985年、pp. 303-16、Academic Press；およびThorpeら（1982）「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-トキシン Conjugates」、Immunol. Rev., 62:119-158を参照。さらに、医薬組成物は、（ａ）本開示のポリペプチドを凍結乾燥形態において含有する容器、および（ｂ）注射のための薬学的に許容し得る希釈剤（例えば無菌水）を含有する第２の容器、を含む医薬キットとして提供することができる。薬学的に許容し得る希釈剤は、本開示の凍結乾燥ポリペプチドの再構成または希釈のために用いることができる。任意にかかる容器に付随するのは、医薬または生物由来物質の製造、使用または販売を規制する政府の機関により処方される形式の通知であってもよく、この通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映する。別の側面において、上記の疾患の処置に役立つ材料を含有する製品が含まれる。いくつかの態様において、製品は、容器およびラベルを含む。
【０１０７】
好適な容器として、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。いくつかの態様において、容器は、本明細書において記載される疾患を処置するために有効である組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有していてもよい。例えば、容器は、皮下注射針により穿通可能な静脈内溶液バッグまたはストッパーを有するバイアルであってもよい。組成物中の活性剤は、本開示の単離ポリペプチドである。いくつかの態様において、容器に付随するラベルは、組成物が、選択される疾患を処置するために用いられることを示す。製品は、リン酸緩衝化食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容し得るバッファーを含む、第２の容器をさらに含んでもよい。それは、商業上のおよび使用者の視点から望ましい他の材料（他のバッファー、希釈剤、充填剤、針、シリンジおよび使用のための説明を含むパッケージ挿入物を含む）を、さらに含んでもよい。
【０１０８】
（改変されたまたは改変されていない）ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、キメラトキシン、これらのポリペプチドをコードする核酸、またはかかるポリペプチドを含む組成物の使用は、医薬において用いられてもよい。いくつかの態様において、（改変されたまたは改変されていない）ＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、キメラトキシン、これらのポリペプチドをコードする核酸、またはかかるポリペプチドを含む組成物は、不要な神経活動に関連する状態を処置するために用いられる。
【０１０９】
よって、さらに本明細書に提供されるのは、治療的に有効な量の改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、もしくはキメラトキシンポリペプチド、またはそのようなものを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、それらにより状態を処置する、不要な神経活動に関連する状態を処置する方法である。いくつかの態様において、本開示の。改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、またはキメラトキシンポリペプチド、または医薬組成物は、不要な神経活動を示す１以上のニューロン（単数または複数）と接触する。
【０１１０】
典型的にニューロトキシンにより処置される状態（例えば、骨格筋の状態、平滑筋の状態、腺の状態、神経筋障害、自律神経系障害、疼痛または審美的／美容的状態）は、当業者により決定されるように、望ましくない神経活動に関連する。投与は、組成物の有効量を、望ましくない活動を示している神経細胞に接触させる経路により行われる。いくつかの態様において、状態は、過活動の神経細胞または腺に関連するものであってもよい。本明細書において議論される方法による処置について想起される具体的な状態として、限定することなく、痙攣性発声障害、痙性斜頚（spasmodic torticollis）、喉頭ジストニア、顎口腔性発声障害、舌ジストニア、頸部ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼障害、脳性麻痺、限局性痙攣および他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、四肢痙攣、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラシア、嚥下障害、および他の筋緊張障害、および筋群の不随意運動により特徴づけられる他の障害、流涙、多汗症、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸管分泌、ならびに他の分泌障害、筋痙攣からの疼痛、頭痛が挙げられる。加えて、本開示は、皮膚科学的または審美的／美容的状態を処置するために、例えば眉間のしわの軽減、皮膚の小じわの軽減のために用いることができる。
【０１１１】
いくつかの態様において、改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、キメラトキシンポリペプチド、またはそのようなものを含む医薬組成物は、広範な細胞における望ましくない分泌活性に関連する状態の処置において使用される。いくつかの態様において、望ましくない分泌は免疫分泌である。望ましくない免疫分泌と関連する状態として、限定することなく、炎症、乾癬、アレルギー、血球貪食性リンパ組織球症、およびアルコール性膵疾患が挙げられる。
【０１１２】
改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、キメラトキシンポリペプチド、またはそのようなものを含む医薬組成物は、スポーツ外傷の処置において用いることができる。Borodic、米国特許第5,053,005号は、ボツリヌスＡ型を用いる若年性脊柱弯曲症（spinal curvature）、すなわち、脊柱側弯症（scoliosis）を処置するための方法を開示する。Borodicの開示は、その全体において本明細書において参考として援用される。一態様において、Borodicにより開示されるものと実質的に類似の方法を用いて、ＢｏＮＴポリペプチドを、脊柱弯曲症を処置するために、哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。
【０１１３】
いくつかの態様において、改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、キメラトキシンポリペプチド、またはそのようなものを含む医薬組成物は、ボツリヌスＡ型により一般に行われる周知の技術を用いて、神経筋障害を処置するために、投与することができる。例えば、本開示は、疼痛、例えば、頭痛、筋痙攣からの疼痛、および多様な形態の炎症性疼痛を処置するために用いることができる。例えば、Aoki、米国特許第5,721,215号およびAoki、米国特許第6,113,915号は、疼痛を処置するためにボツリヌストキシンＡ型を用いる方法を開示する。これら２つの特許の開示は、その全体において本明細書において参考として援用される。
【０１１４】
自律神経系障害もまた、改変ニューロトキシンにより処置することができる。例えば、腺の機能不全は自律神経系障害である。腺の機能不全として、過剰発汗および過剰唾液分泌が挙げられる。呼吸器機能不全は、自律神経系障害の別の例である。呼吸器機能不全として、慢性閉塞性肺疾患および喘息が挙げられる。Sandersらは、自律神経系を処置する；例えば、過剰発汗、過剰唾液分泌、喘息などの自律神経系障害を、天然に存在するボツリヌストキシンを用いて処置するための方法を開示する。Sanderらの開示は、その全体において本明細書において参考として援用される。
【０１１５】
一態様において、上記のものなどの自律神経系障害を処置するために、改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、キメラトキシンポリペプチド、またはそのようなものを含む医薬組成物を用いて、Sandersらのものと実質的に類似の方法を使用することができる。例えば、改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、キメラトキシンポリペプチド、またはそのようなものを含む医薬組成物は、鼻腔内の粘膜の分泌を制御する自律神経系のコリン作動性神経細胞を変性させるために十分な量で、哺乳動物の鼻腔に局所的に適用することができる。改変ニューロトキシンにより処置することができる疼痛として、筋張力、または攣縮により引き起こされる疼痛、または筋肉の攣縮と関連しない疼痛が挙げられる。例えば、Binderは、米国特許第5,714,468号において、血管障害、筋張力、神経痛およびニューロパシーにより引き起こされる頭痛を、天然に存在するボツリヌストキシン、例えばボツリヌスＡ型で処置することができることを開示する。Binderの開示は、その全体において本明細書において参考として援用される。
【０１１６】
一態様において、頭痛、特に血管障害、筋張力、神経痛およびニューロパシーにより引き起こされるものを処置するために、本明細書において記載される、改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、キメラトキシンポリペプチド、またはそのようなものを含む医薬組成物を用いて、Binderのものと実質的に類似の方法を使用することができる。筋張力により引き起こされる疼痛もまた、本明細書において記載される、改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、キメラトキシンポリペプチド、またはそのようなものを含む医薬組成物の投与により処置することができる。例えば、好ましくはボツリヌスＥ型軽鎖のカルボキシル末端においてロイシンベースのモチーフと融合したボツリヌスＥ型を、疼痛／攣縮の位置において、疼痛を軽減するために、筋肉内投与することができる。さらに、改変ニューロトキシンは、攣縮などの筋肉障害に関連しない疼痛を処置するために、哺乳動物に投与することができる。
【０１１７】
一つの広範な態様において、非攣縮関連疼痛を処置するための本開示の方法は、改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、キメラトキシンポリペプチド、またはそのようなものを含む医薬組成物の中枢投与または末梢投与を含む。例えば、Fosterらは、米国特許第5,989,545号において、疼痛を緩和するために、ターゲティング部分に抱合したボツリヌストキシンを中枢に（くも膜下腔内に）投与することができることを開示する。Fosterらの開示は、その全体において本明細書において参考として援用される。
【０１１８】
一態様において、疼痛を処置するために、本明細書において記載される組成物を用いて、Fosterらのものと実質的に類似の方法を使用することができる。処置されるべき疼痛は、急性疼痛であっても慢性疼痛であってもよい。筋攣縮に関連しない急性または慢性の疼痛はまた、哺乳動物における実際のまたは知覚される疼痛の位置への改変ニューロトキシンの局所的な末梢投与により軽減することができる。
【０１１９】
一態様において、改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、キメラトキシンポリペプチド、またはそのようなものを含む医薬組成物は、疼痛の位置においてまたはその近傍において、例えば切り傷においてまたはその近傍において、皮下投与される。いくつかの態様において、改変ニューロトキシンは、疼痛の位置においてまたはその近傍において、例えば哺乳動物における挫傷の位置においてまたはその近傍において、筋肉内投与される。いくつかの態様において、改変されたまたは改変されていないＢｏＮＴ／ＥＮ、キメラトキシンポリペプチド、またはそのようなものを含む医薬組成物は、関節炎の状態により引き起こされる疼痛を処置または軽減するために、哺乳動物の関節中に直接注射される。また、頻繁に繰り返される改変ニューロトキシンの末梢の疼痛の位置への注射または注入は、本開示の範囲内である。かかる方法のための投与の経路は、当該分野において公知であり、当業者により、本明細書において記載される方法に容易に適用される（例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine（1998年）、Anthony Fauciら編、第14版、McGraw Hill発行を参照）。
【０１２０】
非限定的な例として、神経筋障害の処置は、有効量の分子を筋肉または筋群に局所投与するステップを含んでもよく、自律神経系障害の処置は、有効量の分子を腺に局所投与するステップを含んでもよく、および疼痛の処置は、有効量の分子を疼痛の部位に投与するステップを含んでもよい。加えて、疼痛の処置は、有効量の改変ニューロトキシンを脊髄に投与するステップを含んでもよい。
【０１２１】
「治療有効量」とは、本明細書において用いられる場合、本開示の各治療剤が、単独で、または１つ以上の他の治療剤と組み合わせて、対象に対して治療効果を与えるために必要とされる量を指す。有効量は、当業者により認識されるとおり、保健の実務家の知識および専門的意見の範囲内において、処置されている特定の状態、状態の重篤度、個々の対象のパラメーター（年齢、身体的状態、サイズ、性別および体重を含む）、処置の期間、併用治療の性質（ある場合は）、投与の具体的な経路などの要因に依存して変化する。これらの要因は、当業者には周知であり、慣用的な実験のみを用いて取り組むことができる。個々の構成成分またはその組み合わせの最大用量、健全な医学的判断に従った最大の安全な用量が用いられることが一般に好ましい。しかし、当業者は、対象が医学的理由、精神的理由、または実質的にあらゆる他の理由のために、より低い用量または耐容可能な用量を主張する場合があることを理解するであろう。半減期などの経験的配慮は、一般に、投与量の決定に寄与するであろう。例えば、ポリペプチドの半減期を延長するために、およびポリペプチドが宿主の免疫系により攻撃されることを防ぐために、ヒト化抗体または完全ヒト抗体からの領域を含むポリペプチドなどの、ヒト免疫系に適合可能な治療剤を用いてもよい。
【０１２２】
投与の頻度は、治療の過程にわたって決定および調整することができ、一般に、必ずしもではないが、疾患の処置および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づく。あるいは、ポリペプチドの持続的徐放処方物が適切である場合がある。持続的放出を達成するための多様な処方物およびデバイスは、当該分野において公知である。いくつかの態様において、投与は、毎日、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、または６日に１回である。いくつかの態様において、投与頻度は、１週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、または１０週間に１回；または１か月に１回、２か月に１回、または３か月に１回、またはそれより長い。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイにより、容易にモニタリングされる。
【０１２３】
投与レジメン（用いられるポリペプチドを含む）は、経時的に変化してもよい。いくつかの態様において、正常な体重の成人の対象に対して、約０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を投与することができる。いくつかの態様において、用量は、１〜２００ｍｇである。特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の対象およびその対象の病歴、ならびにポリペプチドの特性（ポリペプチドの半減期、および当該分野において周知の他の考慮事項など）に依存するであろう。
【０１２４】
本開示の目的のために、本明細書において記載されるような治療剤の適切な投与量は、使用される具体的な剤（またはその組成物）、処方および投与の経路、疾患の型および重篤度、ポリペプチドが予防または治療のいずれの目的のために投与されるのか、先行する治療、対象の臨床歴およびアンタゴニストに対する応答、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。典型的には、臨床医は、投与が、所望される結果を達成するに至るまで、ポリペプチドを投与するであろう。
【０１２５】
１つ以上のポリペプチドの投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療または予防のいずれであるのか、および当業者に公知の他の要因に依存して、連続的であっても断続的であってもよい。ポリペプチドの投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的であっても、一連の間隔を空けた用量、例えば、疾患を発症する前、その間、またはその後であってもよい。本明細書において用いられる場合、用語「処置すること」とは、ポリペプチドまたは組成物の適用または投与を指し、それを必要とする対象へのポリペプチドを含む。
【０１２６】
「それを必要とする対象」とは、疾患、疾患の症状、または疾患に向かう素因を有する個人であって、当該疾患、疾患の症状、または疾患に向かう素因を、治癒（cure）、治癒（heal）、軽減、緩和、変更、加療、寛解、改善またはこれに影響を及ぼす目的を有するものを指す。いくつかの態様において、対象は、ＣＤＩを有する。いくつかの態様において、対象は癌を有する。いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象はヒトである。疾患を軽減することとは、疾患の発症または進行を遅延させること、または疾患の重篤度を低下させることを含む。疾患を軽減することとは、必ずしも治癒的な結果を必要としない。
【０１２７】
本明細書において用いられる場合、疾患の発症を「遅延させること（delaying）」とは、疾患の進行を延期すること、妨害すること、減速させる（slow）こと、遅らせる（retard）こと、安定化させること、および／または延期することを意味する。この遅延は、処置されている疾患および／または個人の病歴に依存して、異なる長さの時間であってよい。疾患の進行を「遅延させる」かまたはこれを軽減する、または疾患の発症を遅延させる方法とは、当該方法を用いない場合と比較して、所与の時間枠において、疾患の１つ以上の症状を発症する可能性を低下させるか、および／または、所与の時間枠において症状の程度を軽減する方法である。かかる比較は、典型的には、統計学的に有意な結果を得るために十分に多数の対象を用いる臨床研究に基づく。
【０１２８】
疾患の「発症」または「進行」とは、疾患の初期症状および／または後に続く進行を意味する。疾患の発症は、検出可能であり得、当該分野において周知のとおりの標準的な臨床技術を用いて評価することができる。しかし、発症はまた、検出不可能であり得る進行をも指す。本開示の目的のために、発症または進行とは、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生（occurrence）、再発（recurrence）、開始（onset）を含む。
【０１２９】
本明細書において用いられる場合、疾患の「開始」または「発生」は、最初の開始および／または再発を含む。単離ポリペプチドまたは医薬組成物を対象に投与するために、処置されるべき疾患の型または疾患の部位に依存して、医学の分野における当業者に公知の従来の方法を用いることができる。この組成物はまた、他の従来の経路を介して投与することができ、例えば経口で、非経口で、吸入スプレーにより、局所で、直腸で、鼻で、頬側で、膣で、または移植されたリザーバを介して投与することができる。
【０１３０】
用語「非経口」とは、本明細書において用いられる場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。加えて、それは、注射可能なデポー型の投与の経路を介して、例えば１、３または６か月デポー型の注射可能または生分解性の材料および方法を用いて、対象に投与することができる。
【０１３１】
本明細書において用いられる場合、「対象」とは、ヒトまたは動物を指す。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜動物または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類として、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが挙げられる。げっ歯類として、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが挙げられる。家畜および狩猟動物として、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコの種、例えば飼いネコ、イヌの種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、トリの種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、例えばマス、ナマズおよびサケが挙げられる。患者または対象として、前述のものの任意のサブセット、例えば上のものの全てを含むが、１つ以上の群または種、例えばヒト、霊長類またはげっ歯類を除く。本明細書において記載される側面のある態様において、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。
【０１３２】
用語「患者」および「対象」は、本明細書において交換可能に用いられる。対象は、雄性であっても雌性であってもよい。対象は、完全に発達した対象（例えば成体）であっても、発達のプロセスを経験している対象（例えば小児、乳児または胎児）であってもよい。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであってよいが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、望ましくない神経活動に関連する障害の動物モデルを表す対象として、有利に用いることができる。加えて、本明細書において記載される方法および組成物は、家畜化された動物および／またはペットを処置するために用いることができる。
【０１３３】
本明細書に記載の、単離されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、改変されたＢｏＮＴ／ＥＮポリペプチド、またはキメラニューロトキシンポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする核酸、かかる核酸を含むベクター、細胞、または組成物を含むキットはまた、提供される。本明細書に記載のキットは、構成要素を格納する１以上の容器を含んでいてもよい。具体的に言うと、かかるキットは、意図される適用およびこれらの剤の適切な使用を記載する指示とともに、本明細書に記載の１以上の剤（例えば、ポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、または組成物）を含んでいてもよい。ある態様において、キットは、治療目的に好適であってもよい。キットは、剤の使用に必要な構成要素をさらに含んでいてもよい。
【０１３４】
キットの各構成要素は、適用される場合、液体形態で（例として、溶液で）、または固体形態（例として、乾燥粉末）で提供されてもよい。ある場合において、構成要素のいくつかは、例えば、好適な溶媒または他の種（例えば、水またはある有機溶媒）を添加することにより、構成可能または他の方法で（例えば、活性形態に）加工可能であってもよく、それは、キットで提供されても、されなくてもよい。
【０１３５】
いくつかの態様において、キットは、提供される構成要素の使用のための指示および／または販売促進を任意で含んでいてもよい。本明細書に使用されるとき、「指示」は、指示および／または販売促進の構成要素を定義することができ、典型的には、本開示のパッケージング上またはそれに関連する記載された指示を含む。指示はまた、指示がキットに関連付けられるべきであることをユーザーが明確に認識するように、あらゆる様式で提供される、口頭または電子的指示、例えば、オーディオビジュアル（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤ等々）、インターネット、および／またはウェブベースコミュニケーション等々を含み得る。記載された指示は、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式である場合があり、それは、動物投与のための製造、使用、または販売の機関による承認を反映することもできる。本明細書に使用されるとき、「販売促進された」は、教育、病院およびその他の臨床指導、科学的調査、創薬または開発、学術研究、製薬販売を含む製薬業界の活動、および広告、または本発明に関連するあらゆる形態の記載された、口頭のおよび電子的コミュニケーションを含むその他の販売促進活動を含む、ビジネスを行うすべての方法が含まれる。加えて、キットは、本明細書に記載されているように、特定の適用に応じて他の構成要素を含んでいてもよい。
【０１３６】
キットは、本明細書に記載の任意の１以上の構成要素を１以上の容器に含有していてもよい。構成要素は、無菌で調製され、シリンジに包装され、冷蔵輸送されてもよい。あるいは、保管のためにバイアルまたは他の容器に格納されてもよい。第２の容器は、無菌で調製された他の構成要素に格納されていてもよい。あるいは、キットは、事前に混合され、バイアル、チューブ、または他の容器で輸送される、活性剤を含んでいてもよい。
【０１３７】
キットは、ブリスターポーチ、シュリンクラップポーチ、真空シール可能なポーチ、シール可能な熱成形トレイ、またはポーチ、１以上のチューブ、容器、ボックスまたはバッグ内に付属品がゆったりと詰められている同様のポーチまたはトレイ形態などのさまざまな形態を有していてもよい。キットは付属品を追加した後に滅菌することができ、それにより、容器内の個々の付属品を別の方法で開梱することができる。キットは、放射線滅菌、加熱滅菌、または当技術分野において知られている他の滅菌方法などの任意の適切な滅菌技法を使用して滅菌され得る。キットはまた、特定の適用に応じて、例えば、容器、細胞培地、塩、バッファー、試薬、シリンジ、ニードル、消毒剤を適用または除去するためのガーゼなどの布地、使い捨て手袋、投与前の薬剤のサポートなどの他の構成要素を含んでいてもよい。
【０１３８】
さらに詳述することなく、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の態様は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる形であれ、本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用されるすべての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。
【０１３９】
本明細書に記載のタンパク質およびポリペプチド配列は、表１〜５に提供される。
【表１−１】
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【表１−２】
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【０１４０】
【表２】
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【０１４１】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【０１４２】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
本明細書に開示の技術の態様、利点、特色、および使用のいくつかは、以下の例からより完全に理解される。例は、本開示のいくつかの利益を例証し、特定の態様を説明することを意図するが、本開示の全範囲を例示することを意図しておらず、したがって、開示の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１４５】
例
Enterococcus faeciumにおけるbotulinumニューロトキシン様トキシンの同定および特徴付け
botulinumニューロトキシン（ＢｏＮＴ）は、既知の最も強力な細菌毒素であり、疾患、ボツリヌス中毒症の原因物質である１〜３。他の多くの致命的なトキシンとは異なり、ボツリヌス中毒症はまれな疾患であるため、一般的な集団はＢｏＮＴに対して免疫されていない。この免疫の欠如は、ＢｏＮＴの極端な効力と相まって、ＢｏＮＴが米国の疾病予防管理センターにより、６つの最も危険な潜在的なバイオテロリズム剤（カテゴリＡおよびＴｉｅｒ  １）の１つと見なされている理由である４。他方、免疫力の欠如はまた、筋肉の痙攣から慢性疼痛までにわたる広範な医学的状態の処置や、化粧品的適用へのＢｏＮＴの利用を可能にする５、６。
【０１４６】
ＢｏＮＴは、約１５０ｋＤａの単一のポリペプチドとして合成され、それを２つの鎖：Ｎ末端軽鎖（ＬＣ、約５０ｋＤａ）およびＣ末端重鎖（ＨＣ、約１００ｋＤａ）に分離するために、さらなるタンパク質分解的切断を要求する１〜３。２つの鎖は、ＢｏＮＴの活性に不可欠な単一の鎖間ジスルフィド結合を介して接続されているままである。ＬＣは亜鉛依存性メタロプロテアーゼとして機能する。ＨＣは、２つの機能ドメイン：Ｎ末端転移ドメイン（ＨＮ、約５０ｋＤａ）およびＣ末端受容体結合ドメイン（ＨＣ、約５０ｋＤａ）を含有する。ＢｏＮＴはまず、そのＨＣを介してそれらの特定のニューロン受容体に結合し、受容体介エンドサイトーシスを介してニューロンに侵入し、これに続いてＨＮを通じて、ＬＣを、エンドソーム膜を横切ってサイトゾルに送達することにより作用する。ジスルフィド結合はサイトゾルの還元環境下で還元され、ＬＣは放出され、その細胞標的タンパク質は切断される。
【０１４７】
それらの特定の抗血清による交差中和の欠如に基づいて、ＢｏＮＴ（ＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇ）の十分に確立された主要な７つの血清型が存在する。それらは、同じ作用様式を共有する１〜３。ＢｏＮＴ／Ａ、Ｃ、およびＥのＬＣは、末梢膜タンパク質ＳＮＡＰ−２５を切断する。ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＧのＬＣは、相同小胞膜タンパク質ＶＡＭＰ１、２、および３を切断する。加えて、ＢｏＮＴ／ＣのＬＣはまた、形質膜タンパク質シンタキシン１（Ｓｙｘ  １）も切断する。これらの３セットのタンパク質は、シナプス小胞膜の形質膜への融合を媒介するコア機構を形成し、真核細胞における様々な膜融合イベントを媒介するＳＮＡＲＥタンパク質ファミリー（可溶性ＮＳＦ付着タンパク質受容体）のプロトタイプである７、８。これらの３つのタンパク質のいずれか１つの切断は、神経伝達物質の放出に必要なシナプス小胞のエキソサイトーシスを十分にブロックする。これら７つの血清型の他に、ＢｏＮＴ／Ｘと仮称される新規の血清型が最近同定された９。それはまた、ＶＡＭＰ１、２、および３だけでなく、ＳＮＡＲＥタンパク質ＶＡＭＰ４、ＶＡＭＰ５、およびＹｋｔ６の追加のメンバーをも切断する。これらの追加のＳＮＡＲＥタンパク質を切断することの生理学的影響は、いまだ決定されていない。
【０１４８】
ＢｏＮＴ遺伝子は２種類の保存された遺伝子クラスター内に常に存在し、アクセサリータンパク質と一緒に共発現する１０。両方のクラスターは、トキシンに先行する約１５０ｋＤａのタンパク質ＮＴＮＨＡ（非毒性非血球凝集素タンパク質）を発現し、これは、ＢｏＮＴとｐＨ依存性の複合体を形成し、胃腸（ＧＩ）管においてプロテアーゼからそれらを保護する１１。１つの遺伝子クラスターは、ＨＡ１７、ＨＡ３３、およびＨＡ７０として知られている追加のタンパク質を含有し、これらはＢｏＮＴ／ＮＴＮＨＡとの複合体を形成し、上皮障壁を横切るトキシンの吸収を促進する１２〜１４。他の種類の遺伝子クラスターは、ＯｒｆＸ１、ＯｒｆＸ２、ＯｒｆＸ３、およびＰ４７と称される未知の機能を持ついくつかのタンパク質をコードする１０。
【０１４９】
ＢｏＮＴクラスターは、Clostridium内のグラム陽性胞子形成細菌の多様なグループに存在する１０。多くは、トキシンを産生するそれらの能力に基づいてC. Botulinumとして知られているが、これらの株は系統発生学的に異なっている場合があり得る。加えて、ＢｏＮＴ／Ｅは、C. butyricumとして知られている株にも見出され、ＢｏＮＴ／Ｆは、C. baratiiに分類される株に見出され得る。複数のメカニズムが、プラスミドまたはファージ上に位置していること、およびトランスポザーゼまたは挿入配列（ＩＳ）の存在を含む、さまざまな株間のＢｏＮＴクラスターの水平遺伝子導入および組み換えに寄与している。ＢｏＮＴ遺伝子の移動性は、トキシン遺伝子が異なる遺伝的背景と生態学的ニッチで多様化し進化する機会を提供する。最近のゲノム研究は、サブタイプとモザイクトキシンの数が増加していることを明らかにしている１５〜２１。
【０１５０】
ＢｏＮＴはClostridium種内でのみ同定されており、その進化の起源は謎のままである。最近の研究は、グラム陽性菌であるWeissella oryzaeにおけるＢｏＮＴのホモログを明らかにしている２２、２３。このホモログのＬＣは活性メタロプロテアーゼであり、in vitro条件下で組み換えＶＡＭＰ２を切断することが示されている。よって、このホモログはＢｏＮＴ／Ｗｏと仮称されている２２。しかしながら、ＢｏＮＴ／ＷｏはＢｏＮＴからかなり離れている。第１に、ＢｏＮＴ／Ｗｏと他のＢｏＮＴの間の配列同一性は、わずか約１４〜１６％であり、これは、ＢｏＮＴファミリーのメンバーについての通常の範囲（約３０〜６３％）をはるかに下回っている。第２に、ＢｏＮＴにおいて不可欠なジスルフィド結合を形成する２つのシステインがＢｏＮＴ／Ｗｏにおいて保存されておらず、これは作用の異なる様式を有する可能性があることを示唆している。第３に、ＢｏＮＴ／Ｗｏ遺伝子は典型的なＢｏＮＴアクセサリータンパク質とはいずれとも関連がなく、それは、ＢｏＮＴ遺伝子クラスターにはない。
【０１５１】
ＢｏＮＴの新規のメンバーがEnterococcus faecium株のプラスミド上に存在することが本明細書において報告されている。この株は、米国のCape Cod地域の牛糞から最初に単離された。そのゲノムは、２０１７年５月に配列決定され、ＢｏＮＴ遺伝子クラスターに存在する新規のＢｏＮＴが明らかになった。このトキシンは、他のＢｏＮＴの既知の切断部位とは異なる新規の部位でＶＡＭＰ２を切断することが見出された。また、ニューロンにおいてＳＮＡＰ−２５を効率的に切断することも見出された。それはE. faeciumで同定された最初のタンパク質トキシン、およびClostridium以外の細菌種における最初のＢｏＮＴ遺伝子クラスターを表す。
【０１５２】
結果
E. faecium株は、新規ＢｏＮＴ遺伝子を含有する
新規のＢｏＮＴの出現をモニタリングするために、既知のＢｏＮＴ配列をプローブとして使用して、公開されている配列スデータベースは定期的に調査した。２０１７年５月の最近の検索は、ＢｏＮＴ／ＥＮと仮称する、E. faecium株（ＤＩＶ０６２９株、GenBank:OTO22244.1）のドラフトゲノム中の新規のＢｏＮＴ遺伝子を明らかにした。ＢｏＮＴ／ＥＮのタンパク質配列は、他のＢｏＮＴに対して２９％〜３８．７％の同一性を示し、系統解析においてＢｏＮＴ／Ｘと最も密接に関連している（図１Ａ）。低レベルの同一性は、ＢｏＮＴ／ＥＮの長さわたって分布しており、これは、モザイクトキシンではないことを示している（図１Ｂ）。全体的なＢｏＮＴドメインの配置とすべての重要な機能モチーフは、ＬＣ中の亜鉛依存性プロテアーゼモチーフＨＥｘｘＨ（残基Ｈ２２５〜Ｈ２２９）２４、鎖間ジスルフィド結合を形成する可能性のある２つのシステイン（Ｃ４２４およびＣ４３８）およびＨＣ中のガングリオシド結合モチーフＳｘＷＹ（残基Ｓ１２５０〜Ｙ１２５３）２５を含む、ＢｏＮＴ／ＥＮで保存されている（図１Ｂ）。
【０１５３】
他のＢｏＮＴと同様に、ＢｏＮＴ／ＥＮ遺伝子は遺伝子クラスター内に位置し、潜在的なＮＴＮＨＡ遺伝子により先行されている（図１Ｃ）。ＢｏＮＴ／ＥＮクラスターは、ＢｏＮＴ／Ｘ、Ｅ、Ｆ、およびＢｏＮＴ／ＡのメンバーのＯｒｆＸクラスターに類似しており、潜在的にｏｒｆＸ２、ｏｒｆＸ３、およびｐ４７遺伝子を含む（図１Ｄ）。ｏｒｆＸ２のＮ末端に位置する遺伝子は、ｏｒｆＸ１とある程度の類似性を示すが、相同性は低く、それはｏｒｆＸ１様遺伝子と称されている。興味深いことに、３つのｏｒｆＸ遺伝子のリーディングフレームは、ＮＴＮＨＡおよびＢｏＮＴ／ＥＮ遺伝子と同じ方向にある。この方向の配置はＢｏＮＴ／Ｘクラスターで同じである９一方で、それは、他のＯｒｆＸクラスターのＮＴＮＨＡ／ＢｏＮＴ遺伝子と通常反対である。
【０１５４】
ＢｏＮＴ／ＥＮのＬＣは、新規部位においてＶＡＭＰ１／２／３を切断する
ＢｏＮＴ／ＥＮの機能を実験的に特徴付けるために、まずそのＬＣ（ＥＮ−ＬＣ）がニューロンのＳＮＡＲＥタンパク質を切断できるかどうかを調べた。組み換えＥＮ−ＬＣ（残基１〜４３４）を、Ｈｉｓ６タグ付き組み換えタンパク質として生産し、ラット脳界面活性剤抽出物（ＢＤＥ）とインキュベートした。ＶＡＭＰ２を切断するＢｏＮＴ／ＸのＬＣ（Ｘ−ＬＣ）と、ＳＮＡＰ−２５を切断するＢｏＮＴ／ＡのＬＣ（Ａ−ＬＣ）を、対照として並行して分析した。Ｘ−ＬＣと同様に、ＢＤＥのＥＮ−ＬＣとのインキュベーションは、ＶＡＭＰ２イムノブロットシグナルの消失をもたらした（図２Ａ）。ＥＮ−ＬＣのメタロプロテアーゼ活性を阻害するＥＤＴＡとのプレインキュベーションは、ＶＡＭＰ２を保護した２４。ＶＡＭＰ２に加えて、ＥＮ−ＬＣは、Ｓｙｘ  １のイムノブロットシグナルもまた低減させ、ＥＮ−ＬＣが追加のＳＮＡＲＥタンパク質を切断できる可能性があることを示唆した。
【０１５５】
次に、ＥＮ−ＬＣによるＶＡＭＰ２の切断を、組み換え生産したＨｉｓ６タグ付きＶＡＭＰ２フラグメント（残基１〜９３）を使用して分析した。図２Ｂに示すように、ＥＮ−ＬＣとのインキュベーションは、２つの小さなフラグメントを生成し、ＶＡＭＰ２が切断されたことが確認された。切断部位を同定するために、サンプルを脂質クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、図２Ｃ）で分析した。ＥＮ−ＬＣとのインキュベーション後に単一の支配的なペプチドピークが現れ、これはＤ６８〜Ｌ９３の配列と一致した（図２Ｃ、下のパネル）。対応するＮ末端フラグメントも同定された（図２Ｃ、上のパネル）。これらの知見をさらに確認するために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、異なるＶＡＭＰ２組み換えタンパク質：グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付けされたＶＡＭＰ２（残基３３〜８６）をを分析した。ＥＮ−ＬＣとのインキュベーションは、Ｄ６８〜Ｒ８６と一致する単一の支配的なペプチドを生成し、一方で対応するＮ末端フラグメントも同定した（図５）。一緒にすると、これらの知見はＥＮ−ＬＣがＶＡＭＰ２をＡ６７とＤ６８との間で一度切断することを実証している。
【０１５６】
Ａ６７〜Ｄ６８は、既知のＢｏＮＴにより標的とされる他のすべての部位と異なる新規の切断部位である（図２Ｄ）。これは、ＢｏＮＴ／Ｘの切断部位の右の１つのアミノ酸である９。また、ＶＡＭＰ１、３、４、５、７、８、Ｓｅｃ２２ｂおよびＹｋｔ６を含むＶＡＭＰファミリーの他のメンバーがＥＮ−ＬＣにより切断できるかどうかも調べた。これらのＶＡＭＰメンバーを、一過性トランスフェクションを介してＨＥＫ２９３細胞で発現させた。細胞溶解物をＥＮ−ＬＣとインキュベートした。ＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ３はＶＡＭＰ２と高度に相同であり、それらの両者はＥＮ−ＬＣによって切断された（図２Ｅ）。他のＶＡＭＰメンバーのいずれも切断されず、ＥＮ−ＬＣのある程度の特異性が実証された。
【０１５７】
ＥＮ−ＬＣは、追加のＳＮＡＲＥタンパク質をin vitroで切断することができる
次に、ＥＮ−ＬＣが、Ｓｙｘ  １ＡとＳｙｘ  １Ｂの２つの相同アイソフォームを含むＳｙｘ  １を切断できるかどうかを調べた。図２Ａで利用される抗体は、両方のアイソフォームを認識する。Ｓｙｘ  １ＡおよびＳｙｘ  １Ｂを、それぞれＨＥＫ２９３細胞で発現させた。次いで、細胞溶解物をＥＮ−ＬＣとインキュベートした。Ｓｙｘ  ２、３、および４を含む、他の密接に関連するＳｙｘファミリーメンバーも調べた。図２Ｆに示すように、Ｓｙｘ  １Ａ、２、および３は、現在のアッセイ条件下では切断されなかった一方で、Ｓｙｘ  １ＢおよびＳｙｘ  ４は切断された。さらに、ＳＮＡＰ−２５ならびにその密接に関連する２つのファミリーメンバーであるＳＮＡＰ−２３およびＳＮＡＰ−２９を、同じアプローチを使用してＥＮ−ＬＣによって切断できるかどうか調べた。図２Ｇに示すように、ＳＮＡＰ−２５とＳＮＡＰ−２３の両方はＥＮ−ＬＣによって切断された一方で、ＳＮＡＰ−２９は切断されなかった。ＥＮ−ＬＣとのインキュベーション後にＢＤＥにおけるＳＮＡＰ−２５の有意な減少が観察されなかったので、ＳＮＡＰ−２５がＥＮ−ＬＣによって切断されたという知見は驚くべきものであった（図２Ａ）。ＢＤＥとＨＥＫ２９３細胞溶解物との間のこの不一致の理由は不明である。
【０１５８】
様々なＳＮＡＲＥタンパク質に対するＥＮ−ＬＣの切断効率を直接比較するために、Ｓｙｘ  １ＢおよびＳｙｘ  ４のＨｉｓ６タグ付きサイトゾルフラグメント、および全長ＳＮＡＰ−２５とＳＮＡＰ−２３を生産した。同じ量のこれらの組み換えタンパク質を同一の量のＥＮ−ＬＣとインキュベートした。経時的なこれらのタンパク質の切断を、クーマシーブルー染色とともにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでモニタリングした。ＧＳＴ−ＶＡＭＰ２（３３〜８６）を対照として、並行して分析した。ＶＡＭＰ２が数分以内に切断された一方で、Ｓｙｘ  １ＢおよびＳＮＡＰ−２５のマイナーな切断のみが観察され、Ｓｙｘ  ４およびＳＮＡＰ−２３の切断は２０分以内に検出されなかった（図５Ａ、５Ｂ、および７Ａ）。これらの結果は、ＥＮ−ＬＣがin vitroで他のＳＮＡＲＥよりもはるかに効率的に組み換えＶＡＭＰ２を切断することを示唆している。
【０１５９】
ＥＮ−ＬＣの濃度およびインキュベーション時間を増加させると、Ｓｙｘ  １Ｂの切断が増強され、Ｓｙｘ  ４の検出可能な切断ももたらされた（図６Ｃ）。無傷のタンパク質とＥＮ−ＬＣによって生成されたそれらのフラグメントとの質量分析により、切断部位はＳｙｘ  １ＢのＭ１８２〜Ｄ１８３とＳｙｘ  ４のＫ１９１〜Ｄ１９２の間でマッピングされた（図６Ｄおよび６Ｅ）。これらの２つの部位は、Ｓｙｘ  １ＢとＳｙｘ  ４との間の相同的な位置にあり、これは、切断イベントに対するある程度の特異性を示唆している（図６Ｆ）。すべてのＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＲＥ複合体の４ヘリカルバンドルを形成するために必要なＳＮＡＲＥドメインを含有する。ＢｏＮＴの切断部位は、通常ＳＮＡＲＥドメイン内に位置するが２６、Ｓｙｘ  １ＢおよびＳｙｘ  ４のＢｏＮＴ／ＥＮ切断部位はＳｙｘのＮ末端ドメイン（Ｈａｂｃドメインとして知られている）とそのＣ末端ＳＮＡＲＥドメインの間に位置する。
【０１６０】
ＥＮ−ＬＣ濃度とインキュベーション時間の増加は、複数のスメアバンドが生じさせ、質量分析による明確な切断部位が得られなかったため、ＳＮＡＰ−２５およびＳＮＡＰ−２３における切断部位の同定には問題があることが判明した（図７Ａ〜７Ｃ）。高レベルのＥＮ−ＬＣがin vitroでＳＮＡＰ−２５に複数の切断イベントをもたらしたか、または、切断産物が分解を受けやすい可能性がある。ＳＮＡＰ−２３、ＳＮＡＰ−２５、Ｓｙｘ  １Ｂ、およびＳｙｘ  ４を切断するために、高いレベルのＥＮ−ＬＣおよび長いインキュベーション時間を利用したので、in vitroで観察されたこれらの低効率切断イベントの生理学的関連性を細胞中で検証する必要がある。
【０１６１】
ＢｏＮＴ／ＥＮにおける鎖間ジスルフィド結合
次に、ＥＮ−ＬＣが鎖間ジスルフィド結合を介してそのＨＣに接続されているかどうかを調べた。配列アラインメントは、一方がＥＮ−ＬＣのＣ末端に、他方がＥＮ−ＨＮのＮ末端にある、予測される位置における２つのシステイン残基を示す（図３Ａ）。２つのシステイン間のリンカー領域は、他のＢｏＮＴのリンカー領域と同様の長さである１３残基を含有するが、ＢｏＮＴ／ＥＮリンカーは、単一のリジンを含まない唯一のものである。ＢｏＮＴ／ＥＮを効率的に活性化できる内因性プロテアーゼは未知のままであるので、トロンビン切断部位は、ＥＮ−ＬＣとＨＮとをタンパク質分解的に分離する方法として、ＢｏＮＴ／ＥＮリンカー領域に挿入された（図３Ａ）。この改変されたＥＮ−ＬＣ−ＨＮは、トロンビンとのインキュベーション後に予測されるように作用する：還元剤なし（−ＤＴＴ）では単一のバンドとして残り、ＤＴＴの存在下で２つのバンドに分離し（図３Ｂ）、鎖間ジスルフィド結合の存在が確認された。
【０１６２】
ＢｏＮＴ／ＥＮは、ニューロンにおいてＶＡＭＰ２とＳＮＡＰ−２５の両者を切断する
培地中のＢｏＮＴのＬＣ−ＨＮのナノモル濃度のインキュベーションは、しばしば、いくらかのＬＣ−ＨＮのニューロンへの非特異的に侵入をもたらし９、２７、これは、in vitroアッセイよりもより生理学的に関連性の高い様式において、ニューロン内のＥＮ−ＬＣの作用を調べる簡便な方法を提供する。初代培養ラット皮質ニューロンをモデルとして使用した。ニューロンのＥＮ−ＬＣ−ＨＮへの曝露は、濃度依存的な様式でＶＡＭＰ２とＳＮＡＰ−２５の両方のイムノブロットシグナルの喪失をもたらし（図３Ｃ）、これは、これらの２つのＳＮＡＲＥタンパク質が効率的に切断されたことを示唆する。トロンビンによるＥＮ−ＬＣ−ＨＮのタンパク質分解的活性化は、予測されるようにＥＮ−ＬＣ−ＨＮの効力を増加させた（図３Ｃ）。
【０１６３】
本明細書で使用されるＳＮＡＰ−２５抗体（ＣＩ  ７１．１）のエピトープは、いずれの切断産物も検出されなかったＮ末端残基２０〜４０（ＳＮＡＰ−Ｎと称される）内に位置する（図３Ｃ）。ニューロンにおけるＳＮＡＰ−２５の切断をさらに評価するために、そのＣ末端配列に対して生成された異なるＳＮＡＰ−２５抗体（残基１９５〜２０６、ＳＮＡＰ−Ｃ  Ａｂと称される）を次に利用した。この抗体は、全長ＳＮＡＰ−２５と、より小さな分子量を有する切断産物の両方を検出した（図３Ｃ）。この切断産物のイムノブロットの強度は、最終的には、いずれのトキシンにも曝露されていないニューロンの内因性ＳＮＡＰ−２５と同様のレベルに達し、これは、このフラグメントが安定的であり、ニューロンにおいてさらにプロセシングされなかったことを示唆している。このフラグメントの分子量は約１２〜１３ｋＤａであり、これは、切断部位がＳＮＡＰ−２５の中央付近に位置することを示唆している。
【０１６４】
ＳＮＡＰ−Ｎ  Ａｂによって検出可能な対応するＮ末端フラグメントが存在しなかったことは不可解である。この知見をさらに確認するために、そのＮ末端にＨＡタグを含有するＨＥＫ２９３細胞で発現されたＳＮＡＰ−２５を、３つの異なる抗体：ＳＮＡＰ−Ｎ  Ａｂ、抗ＨＡタグ、ＳＮＡＰ−Ｃ  Ａｂで再分析した。ＳＮＡＰ−Ｃ  Ａｂは予測されるとおり、ＳＮＡＰ−２５のＣ末端フラグメントを認識した一方で、７１．１も抗ＨＡもイムノブロット分析においてＮ末端切断フラグメントを検出しなかった（図７Ｃ）。Ｎ末端領域は、より小さな小片に分解されている可能性がある。
【０１６５】
興味深いことに、組み換えＳＮＡＰ−２５はＥＮ−ＬＣによってほとんど切断されないにもかかわらず（図７Ａ）、ＳＮＡＰ−２５はニューロンにおいてＶＡＭＰ２と同様の割合でＢｏＮＴ／ＥＮにより切断された（図３Ｃ）。これには前例がないわけではない：ＢｏＮＴ／Ｃはまた、細胞においてＳＮＡＰ−２５を効率的に切断するが、in vitroにおいて非効率的に切断する２８。ＢｏＮＴ／ＣによるＳＮＡＰ−２５の最適な切断は、適切な膜環境の存在を要求し、これはＢｏＮＴ／ＥＮのための要件でもあり得ることが提案されてる２８。ＳＮＡＰ−２５とは対照的に、Ｓｙｘ  １（Ｓｙｘ  １Ａと１Ｂの両方を含む）はニューロンにおいてＢｏＮＴ／ＥＮによって切断されなかった（図３Ｃ）。もっともＳｙｘ  １の切断の最適な条件が、皮質ニューロンにおいて欠落しているという可能性は排除できないが、Ｓｙｘ  １の切断が非効率的であり、in vitroインキュベーション下でのみ達成され得る高レベルのＥＮ−ＬＣを要求するためである可能性が高い（図６Ａ〜６Ｆ）。要約すると、Ｓｙｘ  １ではなくＶＡＭＰ２とＳＮＡＰ−２５が、皮質ニューロンにおいてＢｏＮＴ／ＥＮについての生理学的に関連のある標的である。
【０１６６】
ラットおよびマウスニューロンにおけるライゲーションされたＢｏＮＴ／ＥＮの試験
次に、全長ＢｏＮＴ／ＥＮの活性を評価することを求めた。生物学的安全性を考慮して、全長のトキシン遺伝子をクローニングしないことが決定された。代わりに、限定された量の全長ＢｏＮＴ／ＥＮを、これまでに記載しているように９、２９、３０、ソルターゼ媒介ライゲーション法を利用して試験チューブ内で生産した。簡単に言えば、ＢｏＮＴ／ＥＮの２つの非毒性フラグメントである、ＥＮ−ＬＣ−ＨＮおよびＥｎのＨＣ（ＥＮ−ＨＣ）をE. coliにおいて別々に生産した。ＥＮ−ＬＣ−ＨＮは、そのＣ末端に、ＬＰＥＴＧＧモチーフおよびＨｉｓ６タグを含有する。ＥＮ−ＨＣは、そのＮ末端にＧＳＴタグおよびトロンビン切断部位を含有する（図４Ａ）。トロンビンとのインキュベーションは、そのＮ末端に遊離のグリシンを含むＥＮ−ＨＣを放出させ、次いで、それは、トランスペプチダーゼソルターゼによってＥＮ−ＬＣ−ＨＮにおいてＬＰＥＴＧＧモチーフにライゲーションされ得る（図４Ａ）。反応における前駆体タンパク質のレベルを制御することにより、ライゲーションされた全長トキシンの量を厳密に制限して、生物学的安全性を確保することができる。このアプローチの欠点は、単離されたトキシンドメインがフォールディングの問題に遭遇する可能性があるため、ライゲーションされたトキシンの毒性がネイティブのトキシンの効力を正確に反映しないかもしれないことである。実際、ＥＮ−ＨＣは、ＧＳＴタグから切断されると可溶性が低くなることが示されており、それは、ソルターゼ媒介ライゲーションの効率を制限した。それにもかかわらず、低レベルの全長ＢｏＮＴ／ＥＮをこのアプローチを使用して生成することができる（図４Ｂ）。
【０１６７】
培養されたラット皮質ニューロンへのライゲーションされたトキシンをまず評価した。ニューロンを、ソルターゼ媒介ライゲーション混合物、およびＥＮ−ＨＣ、ＥＮ−ＬＣ−ＨＮ、またはソルターゼをそれぞれ欠く３つの対照混合物に曝露した。ＶＡＭＰ２とＳＮＡＰ−２５の切断をイムノブロットにより分析した。図４Ｃに示すように、ＥＮ−ＬＣ−ＨＮの存在は、反応混合物中のその高濃度のために、ニューロンにおけるＶＡＭＰ２のいくらかの切断をもたらした。ソルターゼによるライゲーションは、ソルターゼを含まない混合物と比較して、ニューロンにおけるＶＡＭＰ２およびＳＮＡＰ−２５の切断をわずかにのみ増加させ、２倍未満の推定された増強を有した（図４Ｃ）。これらの結果は、ラット皮質ニューロンにおいて発現されるＢｏＮＴ／ＥＮに対する特異的な高親和性受容体が存在するかどうかという疑問を提起する。
【０１６８】
次に、指外転スコア（Digit Abduction Score）（ＤＡＳ）アッセイとして知られている、十分に確立された非致死アッセイ３１を利用して、ライゲーションされたＢｏＮＴ／ＥＮが、in vivoでマウスにおいて毒性であるかどうかを評価した。このアッセイは、マウス後肢の腓腹筋にトキシンを注射した後の局所麻痺の程度を測定する。典型的なボツリヌス中毒型弛緩性麻痺は、驚愕反応において、足指を広げられないことによって検出することができる。ライゲーションされたＢｏＮＴ／ＥＮの１μｇもの高さでの注射は、マウスにおいて何らかの麻痺も誘発しなかったことが見出され、これは、ライゲーションされたＢｏＮＴ／ＥＮはこのレベルではマウスにおいて毒性がないことを示唆する（図４Ｄ）。
【０１６９】
ライゲーションされたＢｏＮＴ／ＥＮの活性の欠如がそのＬＣ−ＨＮ部分またはＨＣに起因するものであるかを決定するために、ソーターゼ媒介ライゲーションを使用して、ＥＮ−ＬＣ−ＨＮをＢｏＮＴ／ＡのＨＣ（Ａ−ＨＣ）とライゲーションすることにより、次に、キメラトキシンを生成し、それはニューロンにおいてＶＡＭＰ２およびＳＮＡＰ−２５を切断した（図４Ｅおよび４Ｆ）。ＢｏＮＴ／Ａは、そのタンパク質受容体としてシナプス小胞タンパク質ＳＶ２を、および共受容体として複合体ガングリオシドを利用しており、これらは皮質ニューロンにおいて豊富に発現している３２、３３。このキメラトキシンにおけるＡ−ＨＣの存在は、培養されたラット皮質ニューロンへの侵入を少なくとも１，０００倍促進し：キメラトキシン混合物の推定１：１０００希釈は、ソルターゼなしのＥＮ−ＬＣ−ＨＮおよびＡ−ＨＣの未希釈混合物と同様のレベルのＶＡＭＰ２およびＳＮＡＰ−２５を切断した（図４Ｆ）。一貫して、１ｎｇ程度の低いキメラトキシンの注射は、ＤＡＳアッセイにおいてマウスの四肢の筋肉を麻痺させた（図４Ｇ）。これらの結果は、単離において精製されたＥＮ−ＨＣにフォールディングの問題があるか、ＢｏＮＴ／ＥＮについての高親和性受容体がラット皮質ニューロンおよびマウス運動神経に存在しないかのいずれかを示唆する。
【０１７０】
ＢｏＮＴ／ＥＮは他のＢｏＮＴに対する抗血清によって認識されなかった
ＢｏＮＴ／ＥＮをＢｏＮＴの新規の血清型としてさらに確立するために、７つのすべての主要な血清型（ＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇ）と新たに同定されたＢｏＮＴ／Ｘを含む他のＢｏＮＴに対して生じた抗血清を使用して、ドットブロットアッセイを行った。これまでに検証済みである４つのウマ抗血清（三価抗ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、およびＥ、抗ＢｏＮＴ／Ｃ、抗ＢｏＮＴ／Ｆ）と２つのヤギ抗血清（抗ＢｏＮＴ／Ｄおよび抗ＢｏＮＴ／Ｇ）を利用した９。ＢｏＮＴ／Ｘに対するウサギポリクローナル抗体もまた、抗原として不活性な全長ＢｏＮＴ／Ｘを使用して開発された。図４Ｈに示すように、これらの抗血清は、それらの対応するＢｏＮＴを認識したが、ＢｏＮＴ／ＥＮ（ＥＮ−ＬＣ−ＨＮとＥＮ−ＨＣの混合物）を認識せず、ＢｏＮＴ／ＥＮが新規のＢｏＮＴ血清型であることが確認された。
【０１７１】
考察
ＢｏＮＴ／ＥＮは、ＢｏＮＴクラスターがClostridium以外の細菌種に存在する最初のケースを表わす。ＢｏＮＴ／ＥＮは、C. Botulinum  １１１株において最近同定されたＢｏＮＴ／Ｘに最も類似している９。ＢｏＮＴ／ＥＮとＢｏＮＴ／Ｘの遺伝子クラスターもまた、これら２つのトキシンに特有の同じ方向の配置を共有しており、ＢｏＮＴ／ＥＮとＢｏＮＴ／Ｘは、ＢｏＮＴファミリー内で特有の分岐を形成しているかもしれないことがさらに示唆される。この分岐の追加のメンバーは、天然に存在している可能性がある。
【０１７２】
ＢｏＮＴ／ＥＮはニューロンにおいて、ＶＡＭＰ２とＳＮＡＰ−２５を同様の速度で切断し、これは、ＶＡＭＰ２とＳＮＡＰ−２５の両方が関連するトキシン標的であることを示唆する。この二重基質現象は、ＳＮＡＰ−２５とＳｙｘ  １の両方を切断するＢｏＮＴ／Ｃと同様である２８、３４、３５。ＢｏＮＴ／ＥＮは、in vitroで組み換えＳＮＡＰ−２５の切断に低い効率を示した。これもまた、細胞においてのみＳＮＡＰ−２５を効率的に切断することができるが、in vitroでは切断しない、ＢｏＮＴ／Ｃと同様である２８。この違いについてのメカニズムはいまだ完全に確立されていないが、ＳＮＡＰ−２５のニューロン膜への適切な局在化が、ＢｏＮＴ／ＥＮおよびＢｏＮＴ／Ｃに、最適な認識／切断条件を提供するために要求される可能性がある。
【０１７３】
In vitroアッセイ条件下で、ＢｏＮＴ／ＥＮは、細胞溶解物においてＳｙｘ  １ＢおよびＳｙｘ  ４を切断することができる。これは、Ｓｙｘ  １ＢとＳｙｘ  ４の間で空間的に保存されている部位でＳｙｘ  １ＢとＳｙｘ  ４の組み換え細胞質ドメインを切断し、これは、ある程度の特異性を示唆する。しかしながらＳｙｘ  １Ｂは、、ニューロンにおいてＢｏＮＴ／ＥＮによって切断されなかった。これは、ニューロンに正常に移行した低レベルのトキシンが、Ｓｙｘ  １Ｂを切断するのに十分ではないためである可能性がある。他方で、皮質ニューロンにおけるＳｙｘ  １Ｂの細胞環境がＢｏＮＴ／ＥＮによるその切断を妨いでいる可能性を排除することはできない。in vitro条件下とニューロンにおいて観察されたＳＮＡＰ−２５とＳｙｘ  １Ｂの両者の劇的な違いは、高レベルのトキシンＬＣタンパク質を用いたin vitro分析のみに頼るよりもむしろ、生きているニューロンにトキシンをロードすることにより任意のトキシン媒介切断イベントを検証することの重要性を実証する。ＳＮＡＰ−２３とＳｙｘ  ４は、ラット皮質ニューロンにおいて検出可能なレベルで発現されない３６。それらと他のＳＮＡＲＥタンパク質が関連する細胞型において効率的に切断できるかどうかは、いまだ決定されていない。
【０１７４】
ライゲーションされたＢｏＮＴ／ＥＮの皮質ニューロンへの増強された侵入の程度は、ＥＮ−ＬＣ−ＨＮと比較してかなり最小限である。対照的に、ＥＮ−ＬＣ−ＨＮのＡ−ＨＣとのライゲーションは、皮質ニューロンへの効力の少なくとも１，０００倍の増加をもたらした。一貫して、ソルターゼ媒介ライゲーションによって生成された全長ＢｏＮＴ／ＥＮは、１μｇの高い用量ではいずれの麻痺も誘発しなかった一方で、Ａ−ＨＣを含有するキメラトキシンは１ｎｇで弛緩性麻痺を誘発した。これらのデータは、ラット／マウスのニューロンがＢｏＮＴ／ＥＮの適切な高親和性受容体を含有しない可能性を示唆している。しかしながら、単離において精製されたＥＮ−ＨＣは、フォールディングの問題を有している可能性を排除することができない。その潜在的な毒性と生物学的安全性のリスクを完全に評価するために、ネイティブの全長ＢｏＮＴ／ＥＮを生産することが重要である。ほとんどのＢｏＮＴは、二重受容体モデルにおいて、低親和性付着因子としてのガングリオシドと特定のタンパク質受容体の両方を必要とする３７、３８。ＢｏＮＴ／ＥＮは、ラット／マウスニューロンへの低親和性付着を媒介する可能性がある、そのＨＣ内に典型的なガングリオシド結合モチーフ（ＳｘＷＹ）を有する。ガングリオシドの他に、ＢｏＮＴ／ＥＮは、ラット／マウスニューロンで発現していないか、変更された配列を有する、追加の高親和性受容体を必要とする場合がある。
【０１７５】
ＶＡＭＰ２とＳＮＡＰ−２５はまた多くの非神経細胞における分泌イベントにも関与しており、ＶＡＭＰ２とＳＮＡＰ−２５のホモログは真核生物種全体に存在し、ＢｏＮＴ／ＥＮが、その特有のＨＣを介して、皮質ニューロンと運動ニューロン以外の細胞型、または哺乳動物以外の種でさえも標的とする可能性がある。Enterococciは自然界に広く存在し、昆虫や他の無脊椎動物を含むほとんどの陸上動物のＧＩ管に定住する３９〜４２。ＢｏＮＴ／ＥＮの受容体結合特性を理解することは、ＢｏＮＴ／ＥＮの正確な種と細胞型の特異性を確立するために重要である。
【０１７６】
ＢｏＮＴ／ＥＮはまた、E. faeciumで同定された最初のタンパク質トキシンを表す４０。可動要素に対して新規の特性を迅速に取得する能力を備えているenterococciは、様々な抗生物質耐性を獲得して、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に伝播する４０。enterococciが致命的なトキシンを獲得／伝播することは常に理論的に可能である。ＢｏＮＴ／ＥＮの発見は、この可能性を実証する最初の例を位置付ける。ＢｏＮＴ／ＥＮの進化的起源やＢｏＮＴ／ＥＮにより標的とされる特定の宿主種／細胞型を含む疑問は依然として不明である。機能的なＢｏＮＴ遺伝子クラスターを獲得するE. faeciumの能力は、このようなよく適応された片利共生生物に望ましくない結果をもたらし、多抗生物質耐性感染の主な原因となる、新たに生ずる株を生み出し得る４０、４３。
【０１７７】
方法
材料：Ｓｙｘ１（ＨＰＣ−１）、ＳＮＡＰ−２５（Ｃ１７１．２）、ＶＡＭＰ２（Ｃ１６９．１）についてのマウスモノクローナル抗体は、E. Chapman（Madison, WI）により寛大にも提供されたものであり、Synaptic Systems（Goettingen, Germany）から入手可能である。ＶＡＭＰ４、Ｓｅｃ２２ｂ、Ｓｙｘ  ２、Ｓｙｘ  ３およびＳｙｘ  ４に対するウサギポリクローナル抗体は、Synaptic Systems（夫々、Cat. No. 136002、No. 186003、No. 110022、No. 110032およびNo. 110042）から購入した。以下のマウスモノクローナル抗体は、示されるベンダーから購入した：アクチン（Sigma、AC-15）；抗ＨＡ（Covance、16B12）；抗Ｍｙｃ（Millipore、9E10）；抗ＳＮＡＰ−２５（Abcam、ab5666）。ＢｏＮＴ／Ａ／Ｂ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／Ｆに対するウマポリクローナル抗血清およびＢｏＮＴ／Ｇに対するヤギポリクローナル抗血清は、S. Sharma（FDA）により寛大にも提供されたものである。ＢｏＮＴ／Ｄに対するヤギポリクローナル抗体は、Fisher Scientific（NB10062469）から購入した。ＢｏＮＴは、Metabiologics（Madison, WI）から購入した。
【０１７８】
ｃＤＮＡおよびコンストラクト：ＥＮ−ＬＣ（残基１〜４３４）、ＥＮ−ＨＣ（残基８６３〜１１２７９）、ＥＮ−ＨＮ（残基４３６〜８６２）、およびＸ−ＬＣ（残基１〜４３９、GenBank No. WP045538952.1）をコードするｃＤＮＡは、GenScript（New Brunswick, NJ）よって合成された。ＥＮ−ＬＣ−ＨＮをコードするｃＤＮＡは、ギブソンアセンブリー法を使用して社内で生成され、Ｑ４３２およびＬ４３５の間にトロンビンプロテアーゼ切断部位が挿入された。ＥＮ−ＬＣ、Ｘ−ＬＣ、Ａ−ＬＣ（残基１〜４２５）を、それらのＮ末端上に、Ｈｉｓ６タグを含むｐＥＴ２８ベクターにクローニングした。ＥＮ−ＨＣおよびＡ−ＨＣ（残基８７５〜１２９７、GenBank No. AF488749）をｐＧＥＸ４Ｔにクローニングして、ＧＳＴタグ付きタンパク質として発現させた。ＥＮ−ＬＣ−ＨＮを、それらのＣ末端上に、融合されたペプチド配列ＬＰＥＴＧＧおよび続いてＨｉｓ６タグを含むをｐＥＴ２２ｂベクターにクローニングして、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質として精製した。ＶＡＭＰ２（１〜９３）を、Ｎ末端にＨｉｓ６タグを含むｐＥＴ２８ベクターおよびｐＧＥＸ４Ｔベクターにクローニングし、ＧＳＴタグ付きタンパク質として発現させた。全長マウスＶＡＭＰ１、３、およびラットＶＡＭＰ７、８を、それらのＣ末端に融合されたＨＡタグを含む改変されたｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。Ｎ末端Ｍｙｃタグを含むｐｃＤＮＡ３．１  ３．１ベクターにおいて、全長ラットＹｋｔ６およびマウスＳｅｃ２２ｂを発現するコンストラクトは、寛大なことにJ. Hay（Missoula, MT）により提供された。全長Ｓｙｘ  １Ａ、Ｓｙｘ  １Ｂ、Ｓｙｘ  ２、Ｓｙｘ  ３、Ｓｙｘ  ４、ＳＮＡＰ−２３およびＳＮＡＰ−２９を、シンタキシン１Ｂは、それらのＮ末端にＨＡタグが融合されていることを除いて、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ間で、Ｓｙｎ−ｌｏｘベクターにクローニングした。全長ＳＮＡＰ−２５を、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩの間でそれらのＮ末端に融合されたＨＡタグを含む、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。Ｓｙｘ  １Ａ（１〜２６５）、Ｓｙｘ  １Ｂ（１〜２５１）、Ｓｙｘ  ４（１〜２７３）、ＳＮＡＰ−２３およびＳＮＡＰ−２５を、ｐＥＴ２８ａにおいて、ＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ部位の間にクローニングし、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質として発現させた。Ｈｉｓ６タグ付きソルターゼ（ＳｒｔＡ＊）をコードするコンストラクトは、B. Pentelute（Boston, MA）により寛大なことに提供され、これまでに記載されている３０。
【０１７９】
バイオインフォマティクス分析：ＢｏＮＴ／ＥＮは、デフォルトパラメーター（ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップの存在＝１１、ギャップの伸長＝１、条件付き組成スコアマトリックス調整を含む）を含む、ｎｒデータベースに対するクエリシーケンスとしてＢｏＮＴ／Ｘを用いたｂｌａｓｔｐを使用して発見された。２０１７年４月の時点で、この検索スペースは合計２３１，８２７，６５１，５５２塩基および２００，８７７，８８４配列を網羅していた。ドメインは、Ｐｆａｍデータベース（ｖ３１．０、引用）に対してＨＭＭＥＲパッケージのhmmsearchコマンドを使用して注釈が付けられた。ゲノムアーキテクチャを、Ｒ（ｖ３．４．１）においてgenoplotR（ｖ０．８．６、引用）を使用して視覚化した。すべての主要系統（Ａ〜Ｇ、Ｆ５Ａ、およびＸ）を表すＢｏＮＴ配列は、ClustalO（ｖ１．２．１）を使用してマルチプルアラインメントでアラインされ、次いでＢｏＮＴ／ＥＮと他のものとのペアワイズ同一性を、１のステップで、マルチプルアラインメントの長さにわたって５０アミノ酸スライディングウィンドウで計算した。回帰スプラインを、Ｒにおいてスプラインベースパッケージを使用して計算した。
【０１８０】
ＢｏＮＴ／Ｘポリクローナル抗体の生産：不活性な全長ＢｏＮＴ／Ｘ変異体（Ｒ３６０Ａ／Ｙ３６３Ｆ、ＢｏＮＴ／ＸＲＹ）を、E. coli  ＢＬ２１（ＤＥ３）における発現のために、そのＣ末端にＨｉｓ６タグを含むＢｏＮＴ／ＸＲＹをコードするｐＥＴ２２ｂベクターを使用して、これまでに記載されるように９発現および精製した。抗体の生産は、EZBiolab Inc.（USA）により行った。免疫原（ＢｏＮＴ／ＸＲＹ）を生理食塩水で希釈し、次いで、対応するアジュバント（フロイントの完全アジュバント）と１：１で混合した。抗原とアジュバントとを完全に混合して安定したエマルションを形成し、次いで、１ポイントあたり０．１ｍｌのバックマルチポイント注射法を使用して、エマルションをニュージーランドホワイトウサギに注射した。２週間の間隔の後、その後の免疫付与を、フロイントの不完全アジュバントで様々なポイントで行った。免疫付与当たりの抗原量は１００μｇであった。免疫付与の数は４回であった。力価を、４回の免疫付与後にＥＬＩＳＡで試験した。ウサギの血液を頸動脈から回収した。血清をプロテインＡクロマトグラフィーにより精製し、次いでＰＢＳバッファーで透析し、次いで凍結乾燥した。
【０１８１】
タンパク質精製：タンパク質発現のために、E.coli BL21（DE3）を利用した。発現の誘導は、０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて２２℃で一晩行った。細菌のペレットを、溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で超音波処理により破壊し、２０，０００ｇで３０分間にわたる４℃での遠心分離の後で、上清を回収した。タンパク質精製は、AKTA Prime FPLC系（GE）を用いて行い、精製されたタンパク質を、PD-10カラム（GE、17-0851-01）でさらに脱塩した。
【０１８２】
ラット脳界面活性剤抽出物（ＢＤＥ）におけるＳＮＡＲＥタンパク質の切断：ラット脳を、１５ｍｌの３２０ｍＭのスクロースバッファー中でホモジェナイズし、その後、５０００ｒｐｍで２分間にわたり４℃で遠心分離した。上清を回収し、１１，０００ｒｐｍで１２分間遠心分離した。ペレットを回収して、１５ｍｌのＴｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ：２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に２％のTriton X-100およびプロテアーゼインヒビターのカクテル（Roche、ＣＡ）を添加したものの中で、３０分間にわたり可溶化した。試料を、その後、１７，０００ｒｐｍで２０分にわたり遠心分離して、不溶性の材料を取り除いた。ＢＤＥの最終タンパク質濃度は、約２ｍｇ／ｍｌであった。ＢＤＥ（６０μｌ）を、それぞれ、１時間にわたり３７℃でＥＮ−ＬＣ（２μＭ）、Ｘ−ＬＣ（２μＭ）、またはＡ−ＬＣ（２μＭ）と共にインキュベートし、次いで、増強した化学発光（ＥＣＬ）法（Pierce）を用いるイムノブロットにより分析した。対照として、ＬＣを、ＢＤＥ中に添加する前に、２０ｍＭのＥＤＴＡと共に２０分間にわたり室温（ＲＴ）でプレインキュベートした。
【０１８３】
ＥＮ−ＬＣによる組み換えＶＡＭＰ、シンタキシンおよびＳＮＡＰの切断：ＶＡＭＰ２（１〜９３）を、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質およびまたＧＳＴタグ付きタンパク質として発現させて精製した。Ｓｙｘ  １Ａ（１〜２６５）、Ｓｙｘ  １Ｂ（１〜２５１）、Ｓｙｘ  ４（１〜２７３）、ＳＮＡＰ−２３およびＳＮＡＰ−２５をＨｉｓ６タグ付きタンパク質として発現させて精製した。これらのタンパク質（０．３ｍｇ／ｍｌ）を、０．１または６μＭのＥＮ−ＬＣのＸ−ＬＣと、ＴＢＳバッファー中で所定の時間にわたり３７℃でインキュベートした。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびクーマシーブルー染色により分析するか、または質量分析した。
【０１８４】
細胞溶解物におけるＶＡＭＰ、シンタキシンおよびＳＮＡＰの切断：全長のＨＡタグ付きＶＡＭＰ１、３、７、８、Ｓｙｘ  １Ｂ、ＳＮＡＰ−２５およびＭｙｃタグ付きＳｅｃ２２ｂ、およびＹｋｔ６およびＳｙｘ  １Ａ、Ｓｙｘ  ２、Ｓｙｘ  ３、Ｓｙｘ  ４、ＳＮＡＰ−２３およびＳＮＡＰ−２９を、いずれのタグも含まないｓｙｎ−ｌｏｘベクターにおいて、製造者の指示に従ってPolyJet遺伝子導入試薬（SignaGen, MD）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入した。４８時間後に、ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＮＰ４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１０ｃｍディッシュあたり４００μｌ）にプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma-Aldrich）を加えたものの中で、細胞溶解物を収集した。細胞溶解物（２５０μｌ）を、Ｘ−ＬＣ（２μＭ）と共に１時間、３７℃でインキュベートした。試料を、次いで、イムノブロットにより分析した。
【０１８５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＶＡＭＰにおける切断部位の同定：Harvard Medical SchoolにおけるTaplin Biological Mass Spectrometry Core Facilityにおいて、試料を分析した。ＶＡＭＰ２について、全タンパク質試料を、３ｃｍのビーズをオフラインで圧力セルを用いて充填した１００μｍの内径のＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム上にロードした。カラムを、Accela 600ポンプ（Thermo Fisher Scientific）に再取り付けした。漸加するアセトニトリルの迅速勾配を用いて、タンパク質／ペプチドをＨＰＬＣカラムから溶離させた。ペプチドは、溶離するにつれて、エレクトロスプレーイオン化に供され、次いで、LTQ Orbitrap Velos Proイオントラップ質量分析計中に置き、６０，０００の解像度において高解像度ＦＴＭＳスキャンを得、イオントラップにおいて低い解像度において第２のスキャンを得、最終スキャンを得てデータ依存的ＭＳ／ＭＳを行う。電荷の状態のエンベロープに対して、デコンヴォルーションを手動で行い、可能な場合にはタンパク質についてのモノアイソトピック質量を得るか、平均質量を得た。ソフトウェアプログラム、Sequest（Thermo Fisher Scientific）により、タンパク質データベースを得られた断片化パターンとマッチングさせることにより、ペプチドおよびタンパク質のアイデンティティーを決定した。全データベースは、全ての配列の逆向きのバージョンを含み、データに、１〜２％のペプチド偽発見率までフィルタをかけた。Ｓｙｘ  １Ｂ、Ｓｙｘ  ４、ＳＮＡＰ−２３およびＳＮＡＰ−２５について、試料をまずＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質のバンドを切り取り、およそ１ｍｍ３の小片に切った。ゲル片を、１２．５ｎｇ／μｌの改変されたシーケンスグレードのキモトリプシンまたはトリプシン（Roche Diagnostics）を含有する５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液とインキュベートした。試料を室温にて一晩消化した。次いでペプチドを抽出し、逆相ＨＰＬＣで分離した。ペプチドが溶出すると、それらはエレクトロスプレーイオン化に供され、LTQ Orbitrap Velos Proイオントラップ質量分析計（Thermo Fisher Scientific）に移された。溶出したペプチドを検出、単離、フラグメント化して、各ペプチドの特定のフラグメントイオンのタンデムマススペクトルを生成させた。
【０１８６】
ニューロンの培養およびイムノブロット分析：初代ラット皮質神経細胞を、Ｅ１８〜１９胚から、これまでに記載されるようにパパイン解離キット（Worthington Biochemical）を用いて調製した４４。ニューロンを、ＢｏＮＴ／ＥＮフラグメントまたはソルターゼライゲーション混合物に１２時間にわたり培養培地中で暴露した。ニューロンを、次いでＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＮＰ４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）にプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma-Aldrich）を加えたもので溶解した。溶解物を、１０分間、微量遠心機を用いて最大速度で４℃にて遠心分離した。上清をＳＤＳ−ＰＡＧEおよびイムノブロット分析に供した。
【０１８７】
ドットブロット：ＢｏＮＴ（１μｌ中０．２μｇ）をニトロセルロース膜上にスポットし、（１０分間ＲＴで）乾燥させた。膜を、ＴＢＳＴ（ＴＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えたもの）中５％のミルクで３０分間ブロッキングして、次いで、適切な抗血清（１：５００希釈）と共に３０分間インキュベートした。膜を、次いで、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）共役二次抗体と３０分間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄して、ＥＣＬ法により分析した。ＢｏＮＴ／ＥＮ試料が、１：１の比のＥＮ−ＬＣ−ＨＮおよびＧＳＴ−ＥＮ−ＨＣから構成されたことは留意される。
【０１８８】
ソルターゼ媒介ライゲーション：ＧＳＴ−ＥＮ−ＨＣまたはＧＳＴ−Ａ−ＨＣを、ライゲーション反応混合物中に添加される前に、トロンビンにより一晩４℃で切断した。ライゲーション反応を、トロンビンにより前処理されたまたはされていないＥＮ−ＬＣ−ＨＮ（５μＭ）、ＥＮ−ＨＣ（１５μＭ）またはＡ−ＨＣ（１５μＭ）、Ｃａ２＋（１０ｍＭ）、およびソルターゼ（２μＭ）を含む５０μｌ  ＴＢＳバッファー中で、４０分間ＲＴでセットアップした。
【０１８９】
ＤＡＳアッセイ：ＥＮ−ＦＬおよびＥＮ−Ａキメラトキシン（ＥＮ−ＬＣ−ＨＮ−Ａ−ＨＣ）をソルターゼ媒介ライゲーションにより生成した。マウス（ＣＤ−１株、２１〜２５ｇ、ｎ＝４）をイソフルラン（３〜４％）で麻酔し、滅菌されたHamiltonシリンジに取り付けた３０ゲージの針を用いて、右後肢の腓腹筋中に、ＥＮ−ＦＬ（１μｇ）およびＥＮ−Ａ（１ｎｇ）を注射した。筋肉麻痺および驚愕反応における後足の広がりを注射の２４時間後に調べた。
【０１９０】
参考文献
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【０１９１】
本明細書、例として、背景、概要、詳細な説明、例、および／または参考文献の欄で言及されたすべての刊行物、特許、特許出願、刊行物、およびデータベースエントリ（例として、配列データベースエントリ）は、個々の刊行物、特許、特許出願、刊行物、およびデータベースエントリのそれぞれが、参照により具体的かつ個別に本明細書に組み込まれたかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書でのあらゆる定義を含む本出願が優先される。
【０１９２】
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載の態様の通常の実験法、多くの均等物のみを使用して認識または確認することができる。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図しておらず、むしろ添付のクレームに記載されているとおりである。
「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、１以上を意味し得るが、ただし反対の定めがあるかまたは文脈から別様に明らかである場合を除く。１つの群の２以上のメンバーの間に「または」を含むクレームまたは記載は、群のメンバーの１つ、１つより多く、または全てが存在する場合、満たされていると見なされるが、ただし反対の定めがあるかまたは文脈から別様に明らかである場合を除く。２以上のメンバーの群の間に「または」を含む群の開示は、群の正確に１つのメンバーが存在する態様、群の１より多くのメンバーが存在する態様、および群の全てのメンバーが存在する態様を提供する。簡潔にするために、これらの態様は、本明細書では個別に詳述されていないが、これらの態様のそれぞれが本明細書で提供され、具体的に請求または放棄されてもよいことが理解される。
【０１９３】
本開示が、1つ以上の限定、要素、節、または説明的用語、1以上のクレーム、または説明の1つ以上の関連する部分が、別のクレームに導入される、すべての変形、組み合わせ、および置換を包含することは理解されるべきである。例えば、別のクレームに従属しているクレームは、同じ基本クレームに従属している任意の他のクレームで見出された1つ以上の限定を含むように改変され得る。さらに、クレームが組成物を記載する場合、本明細書に開示される製造または使用する方法のいずれかに従って、または当技術分野で既知の方法に従って、組成物を製造または使用する方法が、もしあるのならば含まれることを理解すべきであるが、他に示されない場合、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかである場合を除く。
【０１９４】
要素がリストとして、例として、マーカッシュグループ形式で提示される場合、要素のすべての可能なサブグループも開示され、任意の要素または要素のサブグループをグループから排除できることは理解されるべきである。また、「含むこと（comprising）」という用語は、オープンであることを意図しており、追加の要素またはステップの包含を許容することにも留意されたい。一般に、態様、生成物または方法が、特定の要素、特色またはステップを含むものとして言及される場合、そのような要素、特色またはステップからなる、または本質的にそれらからなる、態様、生成物または方法も提供されることは理解されるべきである。簡潔にするために、これらの態様は、本明細書では個別に詳述されていないが、これらの態様のそれぞれが本明細書で提供され、具体的に請求または放棄されてもよいことは理解される。
【０１９５】
範囲が与えられている場合、終点は含まれる。さらに、別段の指示がない限り、または当業者の文脈および／または理解から明白でない限り、範囲として表される値は、いくつかの態様において、文脈で明確に指示されていない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、述べられた範囲内の任意の特定の値をとることができることは理解されたい。簡潔にするために、各範囲の値は本明細書では個別に詳述されていないが、これらの値の各々は本明細書で提供され、具体的に請求または放棄されてもよいことは理解される。また、別段の指示がない限り、または文脈および／または当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意のサブ範囲をとることができることも理解されるべきであり、ここでサブ範囲の終点は、範囲の下限の単位の１０分の１と同じ程度の精度で表わされる。
【０１９６】
ウェブサイトが提供される場合、ＵＲＬアドレスは、括弧内に夫々のウェブアドレスのピリオドを含む、ブラウザで実行できないコードとして提供される。実際のウェブアドレスには括弧が含まれない。
加えて、本開示の任意の特定の態様は、１以上のクレームから明示的に除外される場合があることは理解されるべきである。範囲が与えられている場合、範囲内の任意の値は、１以上のクレームから明示的に除外されてもよい。任意の態様、要素、特色、適用、または組成物の側面および／または本開示の方法は、任意の１以上のクレームから除外され得る。簡潔にするために、１以上の要素、特色、目的、または側面が除外される態様の全ては、本明細書に明示的に説明されない。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図２Ｅ−Ｇ】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｆ】
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【図４Ｇ−Ｈ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ−Ｆ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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