(57)【要約】  本発明は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合してエクソンスキッピングを誘導する治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにＤＭＤの治療のためのそのコンジュゲートおよび組成物に関する。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０〜＋８９の間の領域内でその全体が起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
少なくとも２８塩基、少なくとも２９塩基、または少なくとも３０塩基を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
３０塩基からなる、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合が、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の０〜＋８８、０〜＋８７、０〜＋８６、０〜＋８５、０〜＋８４、０〜＋８３、０〜＋８２、０〜＋８１、０〜＋８０、０〜＋７９、または０〜＋７８の間の領域内でその全体が起こる、請求項１から３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合が、プレｍＲＮＡ配列の０〜＋７８の間の領域内でその全体が起こる、請求項１から４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記領域内にあるヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の配列に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的である、請求項１から５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記領域内にあるヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の配列とハイブリダイズ可能である、請求項１から６のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つの少なくとも２７塩基を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性および／または相同性を有する、請求項１から８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１（Ａｃ０）または配列番号５（Ａｃ４８）を含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび担体を含むコンジュゲートであって、担体が、アンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている、コンジュゲート。
【請求項１３】
担体が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に輸送するように作動可能である、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
担体が、ペプチド、低分子化学物質、ポリマー、ナノ粒子、脂質、リポソームまたはエクソソームから選択される、請求項１２または１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
担体が、細胞透過性ペプチドである、請求項１２から１４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
担体が、アルギニンリッチな細胞透過性ペプチドである、請求項１２から１５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１３から１６のいずれか１項に記載のコンジュゲートが負荷された細胞。
【請求項１８】
請求項１から１１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または請求項１２から１６のいずれか１項に記載のコンジュゲート、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
対象の筋障害の治療における使用のためのヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０〜＋８９の間の領域内でその全体が起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１から１１において定義される特徴のいずれかを含む、請求項１９に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
筋障害が、筋機能に関連する遺伝子の遺伝子変異に起因する障害である、請求項１９または２０に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
筋障害が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーである、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量と細胞を接触させることを含む、前記細胞におけるヒトジストロフィンタンパク質発現を増加させる方法であって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０〜＋８９の間の領域内でその全体が起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む、方法。
【請求項２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、請求項１から１１において定義される特徴のいずれかを含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は２０１７年７月２１日に提出された英国特許出願第１７１１８０９．２号の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合してエクソンスキッピングを誘導する治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにそのコンジュゲートおよび組成物に関する。本発明はさらに、筋障害、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
選択的スプライシングの破壊が多くの疾患の根底にあり、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたスプライシングの調節は治療的な意味を有しうる。スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、アンチセンス媒介エクソンスキッピングがオープンリーディングフレームを回復させ、非機能的タンパク質の代わりに部分的または完全に機能的なタンパク質の合成を可能にしうる、神経筋疾患の新進の治療法であり、現在、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）やデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）などの状態について、いくつかのＳＳＯで臨床試験が行われている。
【０００３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、世界中の男児において最も一般的な致死的遺伝性障害の１つであり、その発生率は、男性の出生数３，６００〜９，３３７人中、約１人である。ＤＭＤは、ジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子の変異によるジストロフィンタンパク質の欠如によって引き起こされる。タンパク質をコードする遺伝子は、２００万ヌクレオチド以上のＤＮＡにまたがる７９個のエクソンを含有する。エクソンのリーディングフレームを変更する、または終止コドンを導入する、または１つまたは複数のエクソンまたは１つ以上のエクソンの重複全てのフレームからの除去を特徴とする任意のエクソン変異が、機能的なジストロフィンの産生を破壊し、ＤＭＤを生じさせる可能性を持つ。より軽度の筋ジストロフィーであるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、通常１つ以上のエクソンの欠失などの変異が、ジストロフィン転写産物全体にわたって正しいリーディングフレームを生じ、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が早まって終結しない場合に生じることが見出されている。変異したジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセッシングにおける上流と下流のエクソンの結合が、遺伝子の正しいリーディングフレームを維持する場合、その結果は、ベッカー表現型をもたらす、活性をいくらか保持した短い内部欠失を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡである。ジストロフィンタンパク質のリーディングフレームを変えない１つまたは複数のエクソンの欠失は、ＢＭＤ表現型を引き起こす一方、フレームシフトを引き起こすエクソンの欠失は、ＤＭＤを引き起こすであろう（Monaco, Bertelson et al. 1988）。一般に、リーディングフレームを変更し、適切なタンパク質の翻訳を妨げる点変異やエクソン欠失を含むジストロフィン変異は、ＤＭＤをもたらす。
【０００４】
現在、最も有望な治療手段の１つは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）を用いたエクソンスキッピングである。エクソンスキッピングは、変異エクソンおよび／またはその隣接エクソンをＤＭＤプレｍＲＮＡから除去することでリーディングフレームを回復させ、短縮型であるが部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の生産を可能にする。ＤＭＤ患者の大多数は欠失変異を抱えており、これらの２０％はエクソン５１のスキッピングに適している。
２０１６年９月、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、変異ＤＭＤからエクソン５１を排除するために開発された、最初のＤＭＤアンチセンス薬であるエテプリルセン（エクソンディス５１）を条件付きで承認した。エテプリルセンは、その安全性と有効性の観点から定評のあるアンチセンス化学であるホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノまたはＰＭＯ）で修飾されたＡＯである。しかしながら、エテプリルセンは、ジストロフィンタンパク質を治療的に有益なレベルにまで回復すること、および臨床転帰を改善することの両方に関して、薬物の有効性を支持する弱い証拠しかないため、依然として議論の的となっている。ＦＤＡは以前に、ＤＭＤエクソン５１スキッピングに関する別の候補薬である２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートベースのＡＯ「ドリサペルセン」を拒絶している。治療薬は、最小限のリスクで最大限の利益を保証する必要があるが、ドリサペルセンによる治療では、筋機能の有意な改善が実証されず、その使用は安全性に対する懸念を導いた。
したがって、多くの動物試験において有意な治療効果が実証されているという事実にもかかわらず、エクソンスキッピング療法は現在、患者において観察される有効性が非常に低いという大きな課題に直面している。
【０００５】
エクソンスキッピングの効率は、ＡＯ標的配列に大きく依存する。しかしながら、エテプリルセンとドリサペルセンにより標的とされる配列が、エクソンスキッピング療法のための最適な選択肢ではないかもしれないという議論や考察はほとんどなかった。いくつかのグループが、効果的なＡＯ配列を計算的および経験的に決定するために、大規模なＡＯスクリーニングの取り組みを行ってきた。しかしながら、設計されたＡＯのエクソンスキッピング有効性は、定量的および統計的の両方で評価されていない。ジストロフィンタンパク質の発現を回復させることは、ジストロフィーの筋機能を改善するために必要であるが、ジストロフィンタンパク質の発現をレスキューするＡＯの能力は、以前のＡＯスクリーニング研究では十分な定量方法により報告されていない。他の研究は、初代ＤＭＤ筋細胞からのＲＴ−ＰＣＲに大きく依存していた。エテプリルセンとドリサペルセンのＡＯ配列が、この状況でしか決定されていないことは注目に値する。
したがって、エクソン５１スキッピング療法の有効性は、より最適なＡＯ配列を選択することにより、また臨床試験において進められるベストなアンチセンスオリゴヌクレオチドを検証するために、ＤＭＤにおいてレスキューされたジストロフィンタンパク質など、より信頼性が高く直接的な生物学的測定を使用して、より厳密なＡＯスクリーニングを実施することにより、改善されうる。
【０００６】
本発明の１つ以上の態様の目的は、当該技術分野における１つ以上のそのような課題に対処することである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供され、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０〜＋８９の間の領域内でその全体が（entirely）起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む。
本発明の第２の態様によれば、第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび担体を含むコンジュゲートが提供され、ここで、担体はアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。
本発明の第３の態様によれば、第２の態様のコンジュゲートを負荷された細胞が提供される。
本発明の第４の態様によれば、第１の態様によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または第２の態様によるコンジュゲート、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【０００８】
本発明の第５の態様によれば、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができる有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象における筋障害を治療する方法が提供され、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０〜＋８９の間の領域内でその全体が起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む。
本発明の第６の態様によれば、対象の筋障害の治療における使用のためのヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供され、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０〜＋８９の間の領域内でその全体が起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む。
本発明の第７の態様によれば、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量と細胞を接触させることを含む、細胞におけるヒトジストロフィンタンパク質発現を増加させる方法が提供され、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０〜＋８９の間の領域内でその全体が起こり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２７塩基を含む。
本発明の特定の実施形態が、以下の図および表を参照して、これから説明される：
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】エクソン５２欠失ＤＭＤ骨格筋細胞不死化クローン（ＫＭ５７１）における、１０μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）ならびにエテプリルセン（ａＥｔｅ）およびドリサペルセン（ａＤｒｉ）のアナログＡＯのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを示す図である。分化した筋管をトランスフェクション後５日目に回収した。（Ａ）ワンステップＲＴ−ＰＣＲで測定したエクソン５１スキッピングの効率。代表的な画像が示される。Ｍ、１００ｂｐマーカー；ブランク、ＲＮＡテンプレートなし。（Ｂ）抗ジストロフィンＣ末端抗体を用いた定量的ウエスタンブロッティングで測定した短縮型ジストロフィンタンパク質の誘導効率。健常な８２２０細胞の検量線を使用して、レスキューされたジストロフィンタンパク質のレベルを計算する。データは３〜４回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。**ａＥｔｅに対しｐ＜０．０１、†ａＤｒｉに対しｐ＜０．０５および††ｐ＜０．０１、§§（Ａ）の全てのＡＯおよび（Ｂ）のＡｃ０に対しｐ＜０．０１。
【図２】５μＭのＡｃ０、Ａｃ４８、ならびにエテプリルセンおよびドリサペルセンのアナログＡＯをトランスフェクトしたエクソン５２欠失ＤＭＤ−ＫＭ５７１細胞株におけるジストロフィンのエクソン５１スキッピングおよびタンパク質の経時変化分析を示す図である。サンプルをトランスフェクション後２日目および１１日目に回収した。（Ａ）エクソン５１スキッピングのＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｍ、１００ｂｐマーカー；Ｒ、複製番号；ブランク、ＲＮＡテンプレートなし。（Ｂ）抗ジストロフィンＣ末端抗体を用いたウエスタンブロッティングによる誘導ジストロフィンタンパク質の定量。３回の独立した実験の代表的な複製が示される。
【図３】ワンステップＲＴ−ＰＣＲおよび定量的ウエスタンブロッティングで測定した、不死化ＤＭＤ骨格筋細胞におけるＡｃ０、Ａｃ４８、ならびにエテプリルセンおよびドリサペルセンのアナログＡＯの用量依存効果を示す図である。ＤＭＤ骨格筋細胞に１、３、および１０μＭのＡＯをトランスフェクトし、トランスフェクション後５日目に回収した。（Ａ）および（Ｂ）は、エクソン５２欠失変異を有するＤＭＤ筋細胞（ＩＤ  ＫＭ５７１）におけるエクソン５１のスキッピング効率と、レスキューされたジストロフィンタンパク質の発現レベルをそれぞれ示す。エクソン４８〜５０の欠失変異を有するＤＭＤ筋細胞（ＩＤ  ６５９４）においてエクソン５１をスキップし、ジストロフィンタンパク質の発現をレスキューする効率が（Ｃ）および（Ｄ）にそれぞれ示される。データは、ＫＭ５７１細胞株での３〜７回の独立した実験、および６５９４細胞株での３〜４回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。*ａＥｔｅに対しｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１；†Ａｃ４８に対しｐ＜０．０５および††ｐ＜０．０１；§同じ濃度のａＤｒｉに対しｐ＜０．０５、§§ｐ＜０．０１、ＮＳ、次の投与でのＡｃ０に対し有意性なし；ｎｓ、１０μＭでのＡｃ０に対し有意性なし。（Ｅ）回帰モデルによって分析されたＡＯに対する用量反応性。スキッピングとジストロフィンタンパク質の産生における回帰式の統計的妥当性は、それぞれｐ＜０．００８およびｐ＜０．０１４であった。プロットは、回帰分析で予測されたエクソンスキッピングまたはジストロフィンタンパク質レベルの値を示す。回帰スロープと９５％信頼区間（ＣＩ）が個々のＡＯにおいて示される。
【図４】エクソン５２（ＩＤ  ＫＭ５７１）およびエクソン４８〜５０の欠失変異（ＩＤ  ６５９４）を含む不死化ＤＭＤ患者由来骨格筋細胞の免疫細胞化学を示す図である。１０μＭのＡｃ０、Ａｃ４８、およびアナログエテプリルセン（ａＥｔｅ）によるトランスフェクション後５日目の細胞を抗ジストロフィンＣ末端抗体で染色した。灰色の線は、ジストロフィン陽性の筋管を示す。白い点は、ＤＡＰＩで対比染色された核を示す。＊は、収縮または培養プレートからの剥離による代表的な偽陽性筋管を示す。示される代表的な画像は、３回の独立した実験からのものである。スケールバー：１００μｍ。
【図５】Ａｃ０モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さの最適化を示す図である。不死化ＤＭＤ筋細胞に２５−、２６−、２７−、２８−、２９−、および３０−ｍｅｒの長さからなるＡｃ０モルホリノをトランスフェクトした。エクソン５２が欠失したＤＭＤ筋細胞（ＫＭ５７１）において１μＭ（ＡおよびＢ）および３μＭ（ＣおよびＤ）のＡｃ０モルホリノによって誘導されたエクソン５１のスキッピングの代表的な画像と定量がＲＴ−ＰＣＲにより表されるように示される。（Ｅ〜Ｈ）は、エクソン４８〜５０が欠失した不死化ＤＭＤ細胞の結果を示す。データは３回の独立した実験をもとに示される。
【図６】初代ＤＭＤ骨格筋細胞と健常な骨格筋細胞においてＡｃ０、Ａｃ４８、エテプリルセン（ａＥｔｅ）およびドリサペルセン（ａＤｒｉ）のアナログＡＯによって誘導されたエクソン５１のスキッピング効率を示す図である。分化した筋管に１０μＭのＡｃ０、Ａｃ４８、ならびにアナログエテプリルセンおよびドリサペルセンをトランスフェクトし、３日後に回収した。ワンステップＲＴ−ＰＣＲにより表されるエクソン５１のスキッピング効率が、エクソン４５〜５０（ＩＤ  ４５４６）（ＡおよびＢ）またはエクソン４９〜５０（ＩＤ  ４５５５）（ＣおよびＤ）の欠失変異を有する初代ＤＭＤ細胞、および健常な初代筋細胞（ＥおよびＦ）において示された。データは、各条件における少なくとも３連のウェルからの平均値±ＳＤを表す。Ｍ、１００ｂｐマーカー。*Ａｃ４８に対しｐ＜０．０５および**ｐ＜０．０１、††ａＥｔｅに対しｐ＜０．０１、§§ａＤｒｉに対し＜０．０１。
【図７】ｈＤＭＤ／Ｄｍｄ−ｎｕｌｌマウスモデルにおける３０−ｍｅｒのＡｃ０アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を示す図である。エクソンスキッピングの効率をＡｃ０モルホリノまたはアナログエテプリルセン、ａＥｔｅ（生理食塩水３０μＬ中５０μｇ）の筋肉内注射の２週間後に、前脛骨筋を用いたＲＴ−ＰＣＲによって分析した。（Ａ）マイクロチップベースのキャピラリー電気泳動システムで表されるエクソン５１スキッピングのデンシトメトリー分析。（Ｂ）エクソン５１スキッピング効率の平均割合（平均±ＳＥ）。各グループにおいてＮ＝７。Ｍ、マーカー；ＮＴ、未処置の筋肉、ＵＭ、上部マーカー色素；ＬＭ、下部マーカー色素。
【図８】ｈＤＭＤ／Ｄｍｄ−ｎｕｌｌマウスモデルにおける３０−ｍｅｒのＡｃ４８アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を示す図である。エクソンスキッピングの効率をＡｃ４８モルホリノまたはアナログドリサペルセンａＤｒｉ（生理食塩水３０μＬ中５０μｇ）の筋肉内注射の２週間後に、前脛骨筋を用いたＲＴ−ＰＣＲによって分析した。マイクロチップベースのキャピラリー電気泳動システムで表されるエクソン５１スキッピングのデンシトメトリー分析。Ｍ、マーカー；ＮＴ、未処置の筋肉、ＵＭ、上部マーカー色素；ＬＭ、下部マーカー色素。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者らは、ジストロフィンプレｍＲＮＡ配列のエクソン５１の０〜＋８９の初期領域内に結合し、少なくとも２７塩基の通常の長さよりも長い、それぞれが顕著な効率と有効性を有する一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するために、本発明者らはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏ試験を含む体系的なスクリーニング方法を使用して、エクソン５１スキッピングに対するモルホリノベースのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を定量的に評価する研究を行った。
本発明者らは、設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列のエクソンスキッピング効率を予測するための計算分析と、その後の不死化ＤＭＤ患者由来筋細胞株におけるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を使用した、組み合わせスクリーニングを実施した。この研究は、ヒトジストロフィンエクソン５１配列の冒頭、特に配列の０〜＋８９の領域が、エクソンスキッピングを誘導するための非常に有望な標的領域であることを明らかにした。これは、公知のエテプリルセンおよびドリサペルセンアンチセンス療法により標的とされる内部領域とは著しく異なる。
【００１１】
この領域から同定されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、筋細胞におけるジストロフィン産生の最も効果的な回復のために最適化された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さを含む、さまざまな因子が調査された。驚くべきことに、本発明者らは、この初期領域に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、エクソン５１に対する公知のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の多くよりも長い場合に、より効果的であることを発見した。具体的には、本発明者らは、２７塩基以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さと有効性を相関させる上昇傾向を同定した。本発明者らは、ほんの数塩基の違いが、アンチセンスオリゴヌクレオチドが有意に異なる効率を有することを意味することを示した。本明細書において実証されるように、３０−ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２５−ｍｅｒの同じ配列よりも最大１．５倍良好に機能する（４２％対６５％のスキッピング効率）。理論に縛られることを望まないが、これは、より長い配列は標的配列により特異的であり、オフターゲット効果を引き起こす可能性がより低いためでありうる。
【００１２】
本明細書では、これらの同定されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の本発明者らの最適化が、業界標準の「エテプリルセン」配列と比較して、エクソン５１スキッピングおよびジストロフィンタンパク質レスキューの効率をそれぞれ最大１２倍および７倍以上増加させることを可能したことが実証される。さらに、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを通して同定された最も効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、統計的に有意なｉｎ  ｖｉｖｏでのエクソン５１スキッピングが、エテプリルセンまたはドリサペルセンのアンチセンスオリゴヌクレオチドでは示されたことのないヒトＤＭＤ遺伝子を有するトランスジェニックマウスを使用して確認された。したがって、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、筋障害、特にＤＭＤの治療に効果的な療法および治療を提供することが示される。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのような薬剤が１つしか市場に承認されていない医学の分野に代替的な療法を提供するだけではない。それらはまた、ジストロフィンタンパク質発現の増加において、数倍より効果的な治療のための改善された選択肢も提供する。これは、療法の有効性を支持する強力な証拠と共に、ＤＭＤおよび他の筋障害を患う人々のために、治療のための実行可能な選択肢を提供することが期待される。
疑念を避けるために、また、本開示が解釈される方法を明確化するために、本発明に従って使用される特定の用語がここでさらに定義されるであろう。
本発明は、そのような組み合わせが明らかに許されない場合または明示的に回避される場合を除き、記載された態様および特徴の任意の組み合わせを含む。
【００１３】
本発明の態様がアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む方法または使用に言及する場合、これは、本明細書で定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートまたは医薬組成物も含みうることに留意されたい。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、説明される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、筋障害を治療するために用いられうる０〜＋８９の領域内のヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に結合する少なくとも２７塩基の長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
適当には、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書では「ＡＯ」または「オリゴ」または「オリゴマー」と呼ばれる場合がある。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１のスキッピングを誘導する。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１のスキッピングを増加させる。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、機能的なヒトジストロフィンタンパク質の発現を可能にする。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、機能的なヒトジストロフィンタンパク質の発現を増加させる。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２８塩基、適当には少なくとも２９塩基、適当には少なくとも３０塩基を含む。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは２７〜３０塩基を含む。
【００１５】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは３０塩基を含む。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは３０塩基からなる。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０〜＋８８、０〜＋８７、０〜＋８６、０〜＋８５、０〜＋８４、０〜＋８３、０〜＋８２、０〜＋８１、０〜＋８０、０〜＋７９、０〜＋７８の間の領域内でその全体が起こる。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、プレｍＲＮＡ配列の０〜＋７８の間の領域内でその全体が起こる。
【００１６】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つの少なくとも２７塩基を含む。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つの少なくとも２８塩基を含む。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つの少なくとも２９塩基を含む。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つの少なくとも２７個の連続する塩基を含む。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つの少なくとも２８個の連続する塩基を含む。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つの少なくとも２９個の連続する塩基を含む。
【００１７】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つと９０％〜１００％の間の同一性を有する。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つと９０％〜１００％の間の相同性を有する。
【００１８】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つとは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基異なるバリアントアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つとは最大３塩基異なるバリアントアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つとは最大２塩基異なるバリアントアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００１９】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つとは１塩基異なるバリアントアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００２０】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つを含む。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：配列番号１（Ａｃ０）、配列番号２（Ａｃ５）、配列番号３（Ａｃ２６）、配列番号４（Ａｃ３０）、または配列番号５（Ａｃ４８）のうちの１つからなる。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１（Ａｃ０）または配列番号５（Ａｃ４８）を含む。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号１（Ａｃ０）を含む。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１（Ａｃ０）または配列番号５（Ａｃ４８）からなる。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１（Ａｃ０）からなる。
【００２１】
本発明は、表３に列挙される個々のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列のそれぞれ、すなわち、表３に列挙される配列のいずれかを含む、またはいずれかからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれに向けられた態様をさらに含みうることが理解されよう。さらに、本発明の第２の態様によれば、表３に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートが想定される。さらに、表３に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートを含む、本発明の第４の態様による医薬組成物が想定される。さらに、筋障害の治療のための表３に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、本発明の第５の態様による医学的使用が想定される。さらに、表３に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、第６の態様による治療方法が想定される。さらに、表３に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、第７の態様による細胞におけるヒトジストロフィンタンパク質発現を増加させる方法が想定される。
【００２２】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは合成的であり、非天然である。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知技術により日常的に作製されうる。そのような合成のための機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティ、カリフォルニア州）を含む、いくつかのメーカーによって販売されている。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための１つの方法は、米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。当該分野で公知のそのような合成のための任意の他の手段が、追加的または代替的に使用されうる。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドアナログである。
適当には、「オリゴヌクレオチドアナログ」および「ヌクレオチドアナログ」という用語は、それぞれ当該技術分野で公知のオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドの任意の修飾合成アナログを指す。
オリゴヌクレオチドアナログの適当な例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ホスホロジチオエートオリゴヌクレオチド、アルキルホスホネートオリゴヌクレオチド、アシルホスホネートオリゴヌクレオチドおよびホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドを含む。
【００２３】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノサブユニットを含む。したがって、適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン含有結合によって一緒に連結されたモルホリノサブユニットを含む。したがって、適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミデートまたはホスホロジアミデートモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２４】
「モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＰＭＯ」（ホスホルアミデートまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド）という用語は、モルホリノサブユニット構造で構成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドアナログを指し、ここで、（ｉ）前記構造は、適当には１〜３原子長、適当には２原子長、そして適当には非荷電またはカチオン性であり、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合するリン含有結合により一緒に連結されており、そして（ｉｉ）各モルホリノ環は、塩基特異的な水素結合により、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに効果的なプリンまたはピリミジン塩基対合部分を有する。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合するリン含有サブユニット間結合を含む。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の構造（Ｉ）に従うリン含有サブユニット間結合を含む：
【００２５】
【化１】
2021500064.tif 000003
式中：
Ｙ１は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−ＣＨ２−であり；
ＺはＯまたはＳであり；
Ｐｊは、塩基特異的な水素結合によりポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに効果的なプリンまたはピリミジン塩基対合部分であり；そして
Ｘは、フルオロ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいチオアルコキシ、アミノ、置換されていてもよいアルキルアミノ、または置換されていてもよいヘテロシクリルである。
【００２６】
バリエーションが結合または活性を妨げない限り、サブユニット間結合にバリエーションが設けられてもよい。例えば、リンに結合した酸素は、硫黄で置換されてもよい（チオホスホロジアミデート）。５’酸素は、アミノまたは低級アルキル置換アミノで置換されていてもよい。リンに結合したペンダント窒素は、非置換であるか、（置換されていてもよい）低級アルキルにより一置換または二置換されていてもよい。
適当には、モルホリノオリゴヌクレオチドの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、第５，２１７，８６６号、第５，１４２，０４７号、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，５２１，０６３号、および第５，５０６，３３７号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／１１４３５号に詳述されている。
【００２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合
本発明は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の０〜＋８９の領域内に結合可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
「結合可能」により、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、指定された領域でヒトジストロフィンプレｍＲＮＡに結合できる配列を含むことが意味される。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、指定された領域のヒトジストロフィンプレｍＲＮＡの配列に相補的である。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、指定された領域のヒトジストロフィンプレｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。
【００２８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の０〜＋８９の領域内の配列は、各分子中の十分な数の対応する位置が互いに水素結合でき、それによりエクソンスキッピング、適当にはエクソン５１のエクソンスキッピングを引き起こすヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。したがって、「ハイブリダイズ可能」および「相補的」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の領域０〜＋８９内の配列との間に安定した特異的結合が生じるような十分な程度の相補性または対合を示すために使用される用語である。適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソンスキッピング、適当にはエクソン５１のエクソンスキッピングを誘導するのに十分に、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の領域０〜＋８９内の配列にハイブリダイズ可能であり、かつ／または相補的である。
【００２９】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の０〜＋８９の領域内の配列に１００％相補的ではない場合がある。しかしながら、適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非特異的な結合を回避するのに十分に相補的である。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の領域０〜＋８９内の配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的である。
【００３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合できるためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全長が、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡに結合することを必要としないことが理解される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの一部、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’または３’末端は、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡに結合しない場合があることが理解されよう。しかしながら、第１の態様によれば、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡに結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドの部分は、エクソン５１の０〜＋８９の領域内になければならない。
したがって、適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の０〜＋８９の領域内の配列にハイブリダイズ可能である。適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン５１のエクソンスキッピングを引き起こすのに十分に、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１の０〜＋８９の領域内の配列にハイブリダイズ可能である。
【００３１】
ヒトジストロフィン
本発明は、筋障害、特にＤＭＤなどのジストロフィン障害の治療における使用のための治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
ジストロフィンは、ロッド状の細胞質タンパク質であり、筋繊維の細胞骨格を細胞膜を通して周囲の細胞外マトリックスに連結するタンパク質複合体の重要な部分である。
ジストロフィンタンパク質は、複数の機能ドメインを含有する。ジストロフィンタンパク質をコードするＤＭＤ遺伝子は、遺伝子座Ｘｐ２１にある２．３メガベース（ヒトゲノムの０．０８％）をカバーする最も長い公知のヒト遺伝子の１つである。筋肉における一次転写産物の長さは約２，１００キロベースであり、転写するのに１６時間を要する；成熟ｍＲＮＡの長さは１４．０キロベースである。エクソン７９個の筋転写産物は、３６８５アミノ酸残基のタンパク質をコードする。ジストロフィンタンパク質は、アクチン結合ドメインと中央ロッドドメインを含有する。この大きな中央ドメインは、アルファ−アクチニンおよびスペクトリンに対して相同性を有する約１０９アミノ酸の２４個のスペクトリン様三重らせん要素により形成される。リピートは通常、ヒンジ領域とも呼ばれる４つのプロリンリッチな非リピートセグメントによって中断される。各リピートは２つのエクソンによってコードされ、通常、アルファヘリックス２の最初の部分のアミノ酸４７と４８の間のイントロンによって中断される。もう１つのイントロンは、リピート中のさまざまな位置に見出され、通常はヘリックス３上に散在する。また、ジストロフィンは、システインリッチなセグメント（つまり、２８０アミノ酸中に１５個のシステイン）を含むシステインリッチドメインも含有する。
【００３２】
正常な場合、ジストロフィンのアミノ末端がＦ−アクチンに結合し、カルボキシ末端が筋細胞膜のジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に結合する。ＤＡＰＣは、ジストログリカン、サルコグリカン、インテグリン、およびカベオリンを含んでおり、これらの成分のいずれかにおける変異は、常染色体遺伝性の筋ジストロフィーを引き起こす。正常な骨格筋組織は、わずかな量のジストロフィン（総筋肉タンパク質の約０．００２％）のみを含有するが、その非存在（または異常な発現）は、いくつかの異常な細胞内シグナル伝達経路によって最も容易に特徴付けられ、最終的に顕著な筋線維壊死ならびに進行性の筋力低下および疲労性をもたらす重度で現在不治の症状の発症につながる。ジストロフィンが存在しない場合、ＤＡＰＣは不安定化され、その結果、構成要素のタンパク質量が低下し、ひいては進行性の繊維の損傷と膜の漏出へとつながる。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）やベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）などのさまざまな形態の筋ジストロフィーにおいては、主に正しくないスプライシングを導く遺伝子配列の変異のため、筋細胞は、変化した機能的に欠陥のある形態のジストロフィンを産生するか、またはジストロフィンをまったく産生しない。欠陥のあるジストロフィンタンパク質の優勢な発現、またはジストロフィンもしくはジストロフィン様タンパク質の完全な欠如は、筋変性の急速な進行をもたらす。
【００３３】
筋ジストロフィー患者のジストロフィンをコードするｍＲＮＡは通常、フレームがずれる変異（例えば、欠失、挿入、またはスプライス部位の変異）を含有し、その結果、フレームシフトまたは翻訳プロセスの早期終結が生じるため、ほとんどの筋線維において機能的なジストロフィンが産生されない。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソンスキッピングを誘発して、ジストロフィンｍＲＮＡのリーディングフレームを回復させる。適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エクソン５１のエクソンスキッピングを誘発して、ジストロフィンｍＲＮＡのリーディングフレームを回復させる。適当には、リーディングフレームの回復は、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の生産を回復させる。
適当には、部分的に機能的なジストロフィンは、短縮型ジストロフィンタンパク質である。
適当には、短縮型ジストロフィンタンパク質は、重症度がより低い筋障害；ＢＭＤを患っている患者で生産されるのと同じジストロフィンタンパク質である。
【００３４】
筋障害
本発明は、筋障害の治療における治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。
適当には、筋障害は、遺伝的変異に起因する任意の筋障害から選択される。
適当には、筋障害は、筋機能に関連する遺伝子の遺伝的変異に起因する任意の筋障害から選択される。
適当には、筋障害は、ヒトジストロフィン遺伝子の遺伝的変異に起因する任意の筋障害から選択される。
適当には、筋障害は、任意の筋ジストロフィー障害から選択される。
適当には、筋障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィーから選択される。
適当には、筋障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である。
一実施形態では、筋障害はＤＭＤである。
【００３５】
担体およびコンジュゲート
本発明はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドと担体とのコンジュゲートにも関する。
適当には、担体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に、適当には筋細胞に輸送するように作動可能な任意の分子を含みうる。
適当な担体は、ペプチド、低分子化学物質、ポリマー、ナノ粒子、脂質、リポソーム、エクソソームなどを含みうる。
適当には、担体はペプチドである。ペプチドは、例えば、ＶＰ２２（ヘルペスウイルステグメントタンパク質由来）などのウイルスタンパク質、ＣｙＬＯＰ−１（クロタミン由来）などのヘビ毒タンパク質、ｐＶＥＣ（マウス血管内皮カドヘリンタンパク質由来）などの細胞接着糖タンパク質、ペネトラチン（アンテナペディアホメオドメイン）、Ｔａｔ（ヒト免疫不全ウイルスのトランス活性化調節タンパク質）またはリバースＴａｔから選択されうる。
適当には、ペプチドは、細胞透過性ペプチドである。
適当には、ペプチドは、アルギニンリッチな細胞透過性ペプチドである。
【００３６】
アルギニンリッチなペプチド担体の使用は、特に有用である。特定のアルギニンベースのペプチド担体は、筋細胞を含む初代細胞へのアンチセンス化合物の送達に非常に効果的であることが示されている（Marshall, Oda et al. 2007; Jearawiriyapaisarn, Moulton et al. 2008; Wu, Moulton et al. 2008）。さらに、アルギニンペプチド担体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートした場合、他のペプチドに比べて、いくつかの遺伝子転写産物のスプライシングを変更する能力の増大を示す（Marshall, Oda et al. 2007）。
適当には、アルギニンリッチな細胞透過性ペプチドは、例えば、国際公開パンフレット第２０１５０７５７４７号、国際公開パンフレット第２０１３０３０５６９号、国際公開パンフレット第２００９１４７３６８号、米国特許出願公開第２０１２０２８９４５７号、または米国特許出願公開第２０１６０２３７４２６号に記載される担体ペプチドから選択されうる。
一実施形態では、アルギニンリッチな細胞透過性ペプチドは、国際公開パンフレット第２０１３０３０５６９号または国際公開パンフレット第２００９１４７３６８号に記載されるものから選択される。
適当には、担体は、所与の細胞培養集団の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内においてアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞浸透を誘導する能力を有する。適当には、担体は、筋細胞培養物中の筋細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内においてアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞浸透を誘導する能力を有する。
【００３７】
適当には、担体のアンチセンスオリゴヌクレオチドとのコンジュゲーションは、担体とアンチセンスオリゴヌクレオチド間またはリンカー部分とアンチセンスオリゴヌクレオチド間の共有結合を形成するのに適した任意の位置においてでありうる。例えば、担体のコンジュゲーションは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端においてでありうる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドへの担体のコンジュゲーションは、オリゴヌクレオチドの５’末端においてでありうる。あるいは、担体は、サブユニット間結合のいずれかを介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされていてもよい。
【００３８】
適当には、担体は、そのＮ末端またはＣ末端の残基でアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’または５’末端に共有結合している。
適当には、担体は、そのＣ末端の残基でアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端に結合している。
アンチセンスオリゴヌクレオチドがリン含有サブユニット間結合を含み、担体がペプチドである場合には、ペプチドは任意に、末端結合基のリンへの共有結合を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされていてもよい。
あるいは、担体がペプチドであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドがモルホリノである場合には、ペプチドは、オリゴマーの３’末端モルホリノ基の窒素原子にコンジュゲートされていてもよい。
【００３９】
担体は任意に、リンカー部分を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされてもよい。リンカー部分は任意に、置換されていてもよいピペラジニル部分、ベータアラニン、グリシン、プロリン、および／または６−アミノヘキサン酸残基の１つ以上を任意の組み合わせで含んでいてもよい。
あるいは、担体は、リンカー部分を伴わずにアンチセンスオリゴヌクレオチドに直接コンジュゲートされていてもよい。
適当には、コンジュゲートは、ホーミング部分をさらに含んでいてもよい。
適当には、ホーミング部分は、選択された哺乳類組織、すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となる同組織に対して選択的である。適当には、ホーミング部分は筋組織に対して選択的である。
適当には、ホーミング部分はホーミングペプチドである。
【００４０】
適当なホーミングペプチドは、例えば、「Effective Dystrophin Restoration by a Novel Muscle-Homing Peptide-Morpholino Conjugate in Dystrophin-Deficient mdx Mice」 Gao et al. Mol Ther. 2014 Jul; 22(7): 1333-1341に開示されている。
適当には、担体ペプチドおよびホーミングペプチドは、キメラ融合タンパク質として形成されうる。
適当には、コンジュゲートは、細胞透過性ペプチドおよび筋特異的ホーミングペプチドから形成されるキメラペプチドを含みうる。
コンジュゲートは任意に、担体ペプチド−ホーミングペプチド−アンチセンスオリゴヌクレオチドの形態、またはホーミングペプチド−担体ペプチド−アンチセンスオリゴヌクレオチドの形態であってもよい。適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの溶解性を高める担体にコンジュゲートされうる。適当には、水性媒体への溶解性である。適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドを輸送するように作動可能な担体に加えて、溶解性を高める担体が、アンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされてもよい。適当には、溶解性を高める担体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを輸送する担体は、キメラ融合タンパク質として形成されうる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの溶解性を高める適切な担体は、ポリエチレングリコールまたはトリエチレングリコールなどといったポリマーである。
【００４１】
薬学的に許容される賦形剤
本発明はさらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートを含み、さらに１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
適当には、医薬組成物は、薬学的に不活性な無機および／または有機賦形剤を用いて、（Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA (1985)に記載されるような）当技術分野で公知の方法で調製される。「薬学的に許容される」という用語は、生理学的に耐容性があり、患者に投与されたときに典型的にアレルギー反応または同様に有害な反応を引き起こさない分子および組成物を指す。
適当には、医薬組成物は、丸剤、錠剤、被覆錠剤、硬ゼラチンカプセル、軟ゼラチンカプセルおよび／または坐剤、液剤および／またはシロップ、注射液、マイクロカプセル、インプラントおよび／またはロッドなどとして製剤化されうる。
一実施形態では、医薬組成物は、注射液として製剤化されうる。
適当には、丸剤、錠剤、被覆錠剤、および硬ゼラチンカプセルを調製するための薬学的に許容される賦形剤は、乳糖、コーンスターチおよび／またはその誘導体、タルク、ステアリン酸および／またはその塩などのいずれかから選択されうる。
【００４２】
適当には、軟ゼラチンカプセルおよび／または坐剤を調製するための薬学的に許容される賦形剤は、脂肪、ワックス、半固体および液体ポリオール、天然および／または硬化油などから選択されうる。
適当には、液剤および／またはシロップを調製するための薬学的に許容される賦形剤は、水、スクロース、転化糖、グルコース、ポリオールなどから選択されうる。
適当には、注射液を調製するための薬学的に許容される賦形剤は、水、生理食塩水、アルコール、グリセロール、ポリオール、植物油などから選択されうる。
適当には、マイクロカプセル、インプラントおよび／またはロッドを調製するための薬学的に許容される賦形剤は、グリコール酸および乳酸などの混合ポリマーから選択されうる。
さらに、医薬組成物は、N.Weiner（Drug Develop Ind Pharm 15(1989)1523）、「Liposome Dermatics」（Springer Verlag 1992）、およびHayashi（Gene Therapy 3(1996)878）に記載されるリポソーム製剤を含んでいてもよい。
【００４３】
医薬組成物は任意に、２つ以上の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートを含んでいてもよい。医薬組成物は任意に、異なるエクソン、適当にはヒトジストロフィンプレｍＲＮＡの異なるエクソンを標的とする１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートをさらに含んでいてもよい。１つ以上のさらなるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートは任意に、エクソン５１に隣接するエクソン、例えば、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５０またはエクソン５２を標的としてもよい。適当には、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡの異なるエクソンを標的とする１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に、ジストロフィンｍＲＮＡのリーディングフレームを回復するように作動可能である。
【００４４】
医薬組成物は任意に、異なる遺伝子を標的とする１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートをさらに含んでいてもよい。例えば、１つ以上のさらなるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートは、ミオスタチンを標的としうる。このような二重標的化は、「Dual exon skipping in myostatin and dystrophin for Duchenne muscular dystrophy」 Kemaladewi et al. BMC Med Genomics. 2011 Apr 20;4:36に記載されている。
１つ以上のさらなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは任意に、共に結合されていてもよく、および／または第１の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合されていてもよい。
【００４５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはコンジュゲートは任意に、生理学的に許容される塩として医薬組成物中に存在してもよい。適当には、生理学的に許容される塩は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはそのコンジュゲートの所望の生物活性を保持し、望ましくない毒物学的効果を与えない。アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、薬学的に許容される塩の適当な例は、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどといったカチオン、スペルミンやスペルミジンなどといったポリアミンなどと形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などと形成される酸付加塩；（ｃ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸と形成される塩；ならびに（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩を含む。
【００４６】
医薬組成物は任意に、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはコンジュゲートに加えて、１つ以上の異なる治療活性成分を含んでいてもよい。１つ以上の治療活性成分は、例えば、コルチコステロイド、ユートロフィンアップレギュレーター、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびミオスタチン阻害剤から選択されうる。
適当には、活性成分および賦形剤に加えて、医薬組成物は、充填剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、防腐剤、甘味料、色素、香料または芳香剤、増粘剤、希釈剤または緩衝物質などといった添加剤、さらに、溶媒および／または可溶化剤および／または徐放効果を達成するための薬剤、ならびに浸透圧を変化させるための塩、コーティング剤および／または酸化防止剤も含みうる。適当な添加剤は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩、ツイーン８０、ポリソルベート８０、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、チメルソール、ベンジルアルコール、乳糖、マンニトールなどを含みうる。
【００４７】
投与
本発明は、治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド、および対象への投与用である治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、局所投与、経腸投与または非経口投与用でありうる。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、経口、経皮、静脈内、くも膜下腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、経粘膜などの投与用でありうる。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、筋肉内投与用である。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または医薬組成物は、注射による筋肉内投与用である。
【００４８】
「有効量」または「治療有効量」は、所望の生理学的反応または治療効果を対象において生じるのに効果的な、単回投与または一連の投与の一部として対象に投与されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの量を指す。
適当には、所望の生理学的反応は、適当には欠陥のあるジストロフィンタンパク質を含有する、またはジストロフィンを含有しない筋組織または筋細胞における、ジストロフィンタンパク質の比較的機能的または生物学的に活性な形態の発現の増加を含む。
適当には、所望の治療効果は、筋障害の症状または病状の改善、筋障害の症状または病状の進行の緩和、および筋障害の症状または病状の発症の遅延を含む。そのような症状の例は、疲労、精神遅滞、筋力低下、運動能力（例えば、ランニング、ホッピング、ジャンプ）の障害、頻繁な転倒、および歩行困難を含む。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートは、体重１キログラム／日あたり約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲の用量で投与される。
【００４９】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートは毎日、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日ごとに１回、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週間ごとに１回、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月ごとに１回投与される。
適当には、投与の用量および頻度は、機能的ジストロフィンタンパク質の所望の発現を維持するために、医師によって必要に応じて決定されうる。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートは、２、３、４、５、６またはそれ以上の部分用量として、任意に単位剤形において、１日を通して適切な間隔で別々に投与されてもよい。
【００５０】
対象
本発明はまた、治療有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートをそれを必要とする対象に投与することによる筋障害の治療にも関する。
適当には、対象は上で定義された筋障害を有する。
適当には、対象は哺乳類である。適当には、対象はヒトである。
適当には、対象は男性または女性でありうる。しかしながら、適当には、対象は男性である。
適当には、対象は任意の年齢である。しかしながら、適当には、対象は、生後１か月から５０歳、適当には１歳から３０歳、適当には２歳から２７歳、適当には４歳から２５歳の間である。
【００５１】
エクソンスキッピングとジストロフィン発現の増加
本発明は、機能的ジストロフィンタンパク質発現を回復させるためにヒトジストロフィンプレｍＲＮＡにおいてエクソンスキッピングを誘導することによる、筋障害の治療に使用するための治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
適当には、「機能的」ジストロフィンタンパク質は、ＤＭＤなどの筋障害を有する対象に存在するジストロフィンタンパク質の欠陥のある形態と比較した場合に、他の状況では筋ジストロフィーに特徴的な筋組織の進行性の分解を低減するのに十分な生物活性を有するジストロフィンタンパク質を指す。
適当には、機能的なジストロフィンタンパク質は、野生型ジストロフィンの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの生物活性を有しうる。
適当には、機能的なジストロフィンタンパク質は、野生型ジストロフィンの少なくとも１０％〜２０％のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの生物活性を有する。
適当には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの筋肉培養におけるジストロフィンの活性は、筋管のサイズ、筋原線維の組織、収縮活性、およびアセチルコリン受容体の自発的なクラスタリングに従って測定されうる（例えば、Brown et al., Journal of Cell Science. 112:209-216, 1999を参照）。
【００５２】
動物モデルもまた、疾患の病因を研究するための貴重なリソースであり、ジストロフィン関連の活性を試験する手段を提供する。ＤＭＤ研究のために最も広く使用される２つの動物モデルは、ｍｄｘマウスとゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）犬であり、どちらもジストロフィン陰性である（例えば、Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003を参照）。これらおよび他の動物モデルを使用して、さまざまなジストロフィンタンパク質の機能的活性が測定されうる。
適当には、「エクソンスキッピング」は、エクソン全体またはその一部が所与のプロセッシング前のＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）から除去され、それによってタンパク質へと翻訳される成熟ＲＮＡから排除されるプロセスを指す。
適当には、他の状況ではスキップされたエクソンによってコードされるタンパク質の部分は、タンパク質の発現形態には存在しない。
【００５３】
したがって、適当には、エクソンスキッピングは、上で定義されたように、短縮型であるがそれでもなお機能性を有するタンパク質を作り出す。
適当には、スキップされるエクソンは、他の状況で異常なスプライシングを引き起こす、その配列中の変異または他の変化を含有しうるヒトジストロフィン遺伝子のエクソンである。
適当には、スキップされるエクソンは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１である。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソンスキッピングを誘導するように作動可能である。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡにおけるエクソン５１のエクソンスキッピングを誘導するように作動可能である。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、筋組織におけるジストロフィンタンパク質の機能的形態の発現を増加させるように作動可能であり、筋組織における筋機能を増加させるように作動可能である。
【００５４】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与されていないＤＭＤなどの筋障害を有する対象の筋機能と比較して、筋機能を少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％増加させるように作動可能である。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与されていないＤＭＤなどの筋障害を有する対象と比較して、機能的なジストロフィンタンパク質を発現する筋線維の割合の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の筋線維の増加がもたらされるように作動可能である。
【００５５】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、野生型の細胞および／または対象におけるジストロフィンタンパク質の発現の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、または５０％のレベルにまで、ジストロフィンタンパク質の機能的形態の発現を誘導するように作動可能である。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、野生型の細胞および／または対象におけるジストロフィンタンパク質の発現の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０％のレベルにまで、ジストロフィンタンパク質の機能的形態の発現を誘導するように作動可能である。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、野生型の細胞および／または対象におけるジストロフィンタンパク質の発現の少なくとも１０、１５、または２０％のレベルにまで、ジストロフィンタンパク質の機能的形態の発現を誘導するように作動可能である。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のレベルにまで、ジストロフィンプレｍＲＮＡにおけるエクソン５１のスキッピングを誘導するように作動可能である。
【００５６】
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のレベルにまで、ジストロフィンプレｍＲＮＡにおけるエクソン５１のスキッピングを誘導するように作動可能である。
適当には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１スキッピングを６０％〜８０％のレベルにまで誘導するように作動可能である。
「増加」または「強化」された量は、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物なし（薬剤の非存在）または対照化合物が同じ状況下で投与される場合に生産される量の１．１、１．２、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍またはそれ以上の増加を含みうる。
適当には、「増加」または「強化」された量は、統計的に有意な量である。
【００５７】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、「含む」および「含有する」という語およびそれらの変形は「含むが、それらに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、成分、整数または工程を除外することを意図しない（除外しない）。本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈がそうでないことを要求しない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈がそうでないことを要求しない限り、明細書は複数性と単数性を意図していると理解されるべきである。
【００５８】
本発明の特定の態様、実施形態または例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物、化学部分または化学基は、それと矛盾しない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態または例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書に開示されている全ての特徴（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）、および／またはそのように開示されている方法または２７プロセスの全ての工程は、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせられうる。
本発明は、前述の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせ、またはそのように開示された任意の方法またはプロセスの工程の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせに及ぶ。読者の注意は、本願に関連して本明細書と同時にまたは以前に提出され、本明細書と共に公の閲覧に供される全ての論文および文献に向けられ、そのような全ての論文および文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００５９】
１．材料および方法
１．１  ＡＯの設計およびｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング。
最近開発されたＡＯ予測アルゴリズムを使用して、エクソン５１を標的とする４１３個の３０−ｍｅｒおよび２５−ｍｅｒのＡＯを設計および分析した（表３を参照）。表３は列中、左から右に、エクソンの番号、アクセプタースプライス部位からの距離、ＡＯの配列（５’から３’）、予測されるスキッピング％、およびスクリーニング内のランキングを示す。左側のＡＯは３０ｍｅｒ、右側のＡＯは２５−ｍｅｒである。予測されたエクソンスキッピング効率に基づき、少なくとも４塩基離れた８つのＡＯをｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング用に選択した（表２）。カリフォルニア大学サンタクルーズ校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）ゲノムブラウザ（http://genome.ucsc.edu/index.html）を使用して、選択したＡＯ、エテプリルセン、およびドリサペルセンの標的配列特異性を分析し、ＡＯ配列が理論上、標的でないＲＮＡ配列には１００％の同一性で結合しないことを確認した。
【００６０】
１．２  アンチセンスモルホリノ。
エテプリルセンおよびドリサペルセンのアナログＡＯを含む全てのアンチセンス配列は、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ（フィロマス、オレゴン州）によりモルホリノの化学反応で合成された。
【００６１】
１．３  細胞。
３人の健常な対象（ＩＤ  ８２２０、ＣＨＱ、およびＫＭ１５５）と、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２（ＩＤ  ＫＭ５７１）およびエクソン４８〜５０（ＩＤ  ６５９４）の欠失変異を有する２人のＤＭＤ患者に由来する不死化ヒト骨格筋細胞をそれぞれ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｙｏｌｏｇｙヒト細胞不死化プラットフォームのヒトテロメラーゼ発現ベクターとサイクリン依存性キナーゼ４発現ベクターによる形質導入によって、以前に記載されたようにして生成した３３。３つの不死化された健常筋細胞株を特徴付け、最高のジストロフィン発現を示したクローン株８２２０を、不死化されたＤＭＤ細胞においてレスキューされたジストロフィン発現の過大評価を防ぐための陽性対照として選択した。ｅｘ４５−５０（ＩＤ  ４５４６）およびｅｘ４９−５０（ＩＤ  ４５５５）の欠失変異を有するＤＭＤ患者および健常な対象に由来する初代骨格筋細胞は、骨格筋、神経組織、ＤＮＡおよび細胞株のバイオバンクによって用意された。
【００６２】
１．４  ＡＯのトランスフェクション。
ＡＯ媒介エクソンスキッピング療法のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を可能な限り模倣するために、十分なレベルのＤＭＤ  ｍＲＮＡを発現する成熟した分化筋管をｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのために使用した。細胞を増殖培地（ＧＭ）により増殖条件で培養した：骨格筋サプリメントミックスを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、ハイデルベルク、ドイツ）、２０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、および抗生物質（５０単位のペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウォルサム、マサチューセッツ州）。不死化および初代ＤＭＤ骨格筋細胞を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた１２または２４ウェル培養プレートにそれぞれ１．７ｘ１０4／ｃｍ2および２．２ｘ１０4／ｃｍ2で播種した。播種の２日後、約８０〜９０％のコンフルエンスで、ＧＭを分化培地（ＤＭ）に置き換えた：２％ウマ血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、シカゴ、イリノイ州）、１×ＩＴＳ溶液（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）、および抗生物質。ＤＭ中で３日後、６μＭのＥｎｄｏ−ｐｏｒｔｅｒトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ、フィロマス、オレゴン州）を含有する１、３、５または１０μＭのＡＯを細胞にトランスフェクトした（ＤＭで希釈する直前に１ｍＭの濃縮ＡＯを６５℃で１０分間インキュベートした）。ＡＯトランスフェクションの２日後、ＡＯ含有ＤＭを通常のＤＭに置き換えた。ＡＯトランスフェクション後、２、５、または１１日目（分化後５、８、または１４日目）に細胞を回収した。
【００６３】
１．５  マウス。
動物試験は、アルバータ大学、チルドレンズ・ナショナル・メディカルセンター、および国立精神神経センター（ＮＣＮＰ）の動物実験委員会によって承認された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有する雄および雌のＤｍｄエクソン５２欠失ｍｄｘ５２４２および野生型マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、バーハーバー、メイン州）を４〜８週齢で用意した。罹患したマウスのＤｍｄ変異は、ＰＣＲによるジェノタイピングによって確認した。ヒトのＤＭＤ遺伝子を有し、マウスのＤｍｄ遺伝子を持たないトランスジェニックマウスモデル（ｈＤＭＤ／Ｄｍｄ−ｎｕｌｌマウス）を、雄のｈＤＭＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、バーハーバー、メイン州）と雌のＤｍｄ−ｎｕｌｌマウスを交配することによって作製した。
【００６４】
１．６  筋肉内注射。
４０μＬの生理食塩水中５または２０μｇのＡｃ０、Ａｃ４８、エテプリルセンまたはドリサペルセンのマウス版モルホリノを、以前に記載されたようにして、イソフルランによる吸入麻酔の下、前脛骨筋（ＴＡ）筋肉に筋肉内注射した４３。３０μＬの生理食塩水中５０μｇのＡｃ０モルホリノおよびアナログエテプリルセンをｈＤＭＤ／Ｄｍｄ−ｎｕｌｌマウスのＴＡ筋肉に注射した。筋サンプルは全て、筋肉内注射の２週間後に回収した。
【００６５】
１．７  ＲＴ−ＰＣＲによるエクソンスキッピングの分析。
以前に記載されたようにして、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。ジストロフィンｍＲＮＡを検出するためのＲＴ−ＰＣＲは、不死化骨格筋細胞と初代骨格筋細胞において、それぞれ２００ｎｇおよび３２０ｎｇのトータルＲＮＡについて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ウォルサム、マサチューセッツ州）と０．２μＭのフォワードおよびリバースプライマー（表１を参照）を使用して行った。プライマーはＰｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して設計し、その特異性は健常なヒト骨格筋細胞（８２２０株）で確認した。ＲＴ−ＰＣＲの条件は以下のとおりである：５０℃で５分間；９４℃で２分間；９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、および６８℃で３５秒間を３５サイクル；そして６８℃で５分間。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで分離し、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ウォルサム、マサチューセッツ州）で可視化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）またはＭＣＥ−２０２  ＭｕｌｔｉＮＡシステム（島津、京都、日本）を使用し、次の式を用いてエクソン５１スキッピングの効率を計算した：
〔式１〕
2021500064.tif 000004
おそらく予期しないスプライシング事象に起因する天然バンドの上の未知のトップバンドは、スキッピング効率の定量から除外した。ＰＣＲ産物の配列は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウォルサム、マサチューセッツ州）で確認した。ＧＡＰＤＨまたは１８ＳリボソームＲＮＡを内部対照として使用した。
【００６６】
【表１】
2021500064.tif 000005
【００６７】
１．８  ウエスタンブロッティング
細胞をｃＯｍｐｌｅｔｅ、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、バーゼル、スイス）を含有するＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて回収し、それから、２１ゲージの針に１０回通してホモジナイズした。ローディングサンプルとして、上清を４℃で１５分間、１４，０００ｇで遠心分離することにより調製した。筋組織からのタンパク質を以前に記載されたようにして調製した。ブラッドフォードアッセイを用いて、蒸留水で１００倍に希釈した上清によりタンパク質濃度を調整した。１０％のＳＤＳ、７０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５  ｍＭのＥＤＴＡ、２０％のグリセロール、０．００４％のブロモフェノールブルー、および５％の２−メルカプトエタノールを含有するサンプルバッファー中のタンパク質を７０℃で１０分間加熱した。次に、以前に記載されたようにして、ウエスタンブロッティングを行った３２，４３，４４。細胞および組織からそれぞれ１２μｇおよび３０μｇをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のために使用した。ブロットは、ブロッキング溶液中、ジストロフィンＣ末端に対するウサギポリクローナル抗体（１：２５００、ａｂ１５２７８、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、イギリス）またはジストロフィンロッドドメインに対するＤＹＳ１抗体（１：４００、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、バッファローグローブ、イリノイ州）と共に室温で１時間インキュベートした。一次抗体をＨＲＰコンジュゲート抗ウサギまたはマウスＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ抗体（１：１０，０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）と反応させた。ＡＯによって誘導されたジストロフィンタンパク質の発現レベルは、未処置のＤＭＤ細胞または野生型マウスのタンパク質で希釈した健常８２２０骨格筋細胞のジストロフィンタンパク質の検量線（Ｒ２＝０．９３〜０．９９）を用いて、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して定量した。ローディング対照として、α−チューブリンを同じメンブレン上で検出した。ローディング対照／分化マーカーとして、転写後のゲル上のミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）をクーマシーブリリアントブルー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）で染色した。
【００６８】
１．９  免疫細胞化学。
細胞を室温で５分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで洗浄した後、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ中の１０％ヤギ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウォルサム、マサチューセッツ州）で２０分間細胞をブロックし、それから、ブロッキング溶液中で１：５０希釈した抗ジストロフィンＣ末端（ａｂ１５２７８）またはロッドドメイン（ＤＹＳ１）抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ジストロフィンのシグナルは、Ａｌｅｘａ  ４８８または５９４コンジュゲート二次抗体（１：５００）で検出した。デスミン（１：８０、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、イギリス）および速筋型ＭｙＨＣ（１：３０、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、バッファローグローブ、イリノイ州）が検出され、細胞の筋原性分化が確認された。細胞は、分析まで４℃でＤＡＰＩを含むＳｌｏｗＦａｄｅ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ウォルサム、マサチューセッツ州）中で保存した。
【００６９】
１．１０  免疫組織化学。
未処置および処置ｍｄｘ５２マウスのＴＡ筋の凍結切片において、以前に記載されたようにして、ａｂ１５２７８抗体でジストロフィン陽性筋線維を検出した。ニュートラルデンシティフィルター（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ  ２０００−Ｕ、ニコン、東京、日本）を使用して、処置マウスのジストロフィンのシグナル強度を野生型のシグナル強度と比較した。
【００７０】
１．１１  統計分析。
エクソンスキッピングの効率とジストロフィンタンパク質のレスキューの有意性を決定するために、不死化細胞での少なくとも３回の独立した実験、初代細胞での３連のウェル、および３〜７匹のマウスからデータセットを用意した。ＡＯ処置群間の統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡと、それに続く事後テューキー−クレーマー多重比較検定によって行った。ＡＯに対する用量反応性については、単回帰分析を実施した。統計的有意性は全ての分析でｐ＜０．０５に設定した。
【００７１】
２．  結果
２．１  エクソン５１スキッピングのためのＡＯのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング。
本発明者らは、ＤＭＤエクソン５１の全ての可能な標的部位をカバーする、それぞれ３０−ｍｅｒおよび２５−ｍｅｒの長さの２０４個および２０９個のＡＯ、合計４１３個のＡＯを設計した（表３を参照）。本発明者らのエクソンスキッピング効率アルゴリズム（「In Silico Screening Based on Predictive Algorithms as a Design Tool for Exon Skipping Oligonucleotides in Duchenne Muscular Dystrophy」 Echigoya et al. PLOS ONE March 2015）は、３０−ｍｅｒのＡＯについては、エクソン５１の最初の５’部位におけるエクソン５１スキッピングの最高効率が８０．５％であり、２５−ｍｅｒのＡＯについては、４１．２％であると予測した。Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングは、エテプリルセンにより標的とされる３０塩基の領域のエクソンスキッピング効率が非常に低いこと（２３．７％）を示し、これは、試験した４１３個の全ＡＯ候補の中で９２位にランクされた。ドリサペルセンの標的部位は、３０−ｍｅｒのエテプリルセンのものに完全に包含されることが留意される。
【００７２】
２．２  健常およびＤＭＤ骨格筋細胞株の不死化クローンの特徴付け。
初代ＤＭＤ筋細胞を用いた前臨床試験における重要な課題は、筋細胞の純度が低いこと、および変異ジストロフィンｍＲＮＡの量が不十分であることを含み、これらはＡＯの有効性を試験しようとする際に問題を呈する。これらのハードルを克服するために、３人の健常な対象と、エクソン５２（ｅｘ５２）およびｅｘ４８−５０の欠失（ｄｅｌ．）変異（それぞれＩＤ  ＫＭ５７１および６５９４）を有する２人のＤＭＤ患者の骨格筋細胞の不死化クローンを作製した。試験した全ての不死化骨格筋細胞株は、分化誘導後３日目から容易に検出可能なジストロフィンｍＲＮＡを発現した。ＤＭＤ細胞においてＡＯによって誘導されるジストロフィンタンパク質レベルの過大評価を回避するために、本発明者らは、ウエスタンブロッティングにより陽性対照として働くと決定された３つの不死化健常骨格筋細胞株のうち、最高レベルのジストロフィンタンパク質を含む細胞株（ＩＤ  ８２２０）を選択した。８２２０細胞株におけるジストロフィンタンパク質の発現は、免疫細胞化学によっても確認された。
【００７３】
２．３  エクソン５１スキッピングＡＯのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング。
本発明者らはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングの結果に基づき、少なくとも互いに４塩基離れた高ランクと低ランクの両方の配列を含む３０−ｍｅｒのＡＯを８個、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングのために選択した（表２）。本試験においては、エテプリルセンおよびドリサペルセンの配列を含む、試験したＡＯは全て、臨床試験に登録された患者での耐容性が実証されているモルホリノ化学を使用して合成した。ここで、本発明者らは、エテプリルセンおよびドリサペルセンと同じ配列を持つ対照のモルホリノオリゴヌクレオチド（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓで生成）を「アナログエテプリルセン」および「アナログドリサペルセン」と名付けた。ＲＴ−ＰＣＲにおいては１０μＭの本発明者らのモルホリノＡＯ（Ａｃ０、Ａｃ５、Ａｃ２６、Ａｃ３０、およびＡｃ４８）のうち５つが、ｅｘ５２ｄｅｌ．を有する不死化ＤＭＤ骨格筋細胞において、アナログエテプリルセンおよびドリサペルセンと比較して、有意に高いスキッピング効率を示した（図１Ａ）。試験したＡＯのうち、特にＡｃ０は最高のスキッピング効率を有し、７２％にまで達したが、これは、エテプリルセンおよびドリサペルセンのアナログよりもそれぞれ４倍および２５倍高い効率であった。ウエスタンブロッティングにおいて、Ａｃ０は最高レベルのジストロフィンタンパク質も誘導して、健常対照細胞株のレベルの１６％までに達し、その後に１３％のＡｃ４８が続いた（図１Ｂ）。興味深いことに、試験時に最高のスキッピング効率を示した２つのＡＯ、Ａｃ０およびＡｃ４８は、アルゴリズムから最良と予測されたものではなかった。
【００７４】
【表２】
2021500064.tif 000006
【００７５】
２．４  Ａｃ０、Ａｃ４８、ならびにエテプリルセンおよびドリサペルセンのアナログＡＯを用いた経時変化分析。
５μＭのＡｃ０、Ａｃ４８、ならびにエテプリルセンおよびドリサペルセンのアナログの持続的な影響をｅｘ５２ｄｅｌ．ＫＭ５７１細胞で調べた。エクソンスキッピングの効率およびジストロフィンタンパク質のレスキューに関して、本発明のオリゴヌクレオチドＡｃ０およびＡｃ４８の優位性が、エテプリルセンおよびドリサペルセンのアナログＡＯと比較して、トランスフェクション後２日目および１１日目に観察された（図２）。
【００７６】
２．５  Ａｃ０、Ａｃ４８、ならびにアナログエテプリルセンおよびドリサペルセンの用量依存効果。
ＲＴ−ＰＣＲは、最高濃度の１０μＭにおいてＡｃ０が、ＤＭＤ  ＫＭ５７１（ｅｘ５２ｄｅｌ．）および６５９４細胞（ｅｘ４８−５０ｄｅｌ．）において、エテプリルセンおよびドリサペルセンのアナログよりも有意に高い、それぞれ最大７４％および６４％のエクソン５１スキッピングを誘導することを示した（図３）。最低濃度（１μＭ）では、Ａｃ０はＫＭ５７１および６５９４細胞において、それぞれアナログエテプリルセンと比較して１２倍および１０倍高いエクソンスキッピング効率を示した。興味深いことに、１μＭの濃度でさえも、Ａｃ０は１０μＭのアナログエテプリルセンよりも高いレベルのエクソン５１スキッピングを誘導した（それぞれ、ＫＭ５７１で２４％と１５％の効率、６５９４で２４％と２１％の効率）。定量的ウエスタンブロッティングは、１０μＭのＡｃ０が、ＤＭＤ細胞株のジストロフィンタンパク質発現を健常細胞株レベルの２１％にまでレスキューすることを明らかにした（図３Ａ〜Ｄ）。１μＭでさえ、Ａｃ０のアナログエテプリルセンに対する相対比は、ＫＭ５７１および６５９４細胞株でジストロフィンタンパク質の生産効率がそれぞれ７．１倍および３．３倍高いことを示した。１μＭのＡｃ０は、１０μＭのアナログエテプリルセンよりも高い、または同等のレベルでのレスキューされたジストロフィンタンパク質の生産を可能にし（それぞれ、ＫＭ５７１で１０％と６％、６５９４で１１％と１０％）、これは、Ａｃ０が濃度に関してアナログエテプリルセンと比較して、ジストロフィンタンパク質の生産において１０倍以上効果的であることを確認している。アナログドリサペルセンは、ＤＭＤ筋細胞株でのエクソンスキッピングまたはジストロフィン産生のいずれに対しても効果的に働かなかった。Ａｃ０およびＡｃ４８に対するエクソンスキッピング反応は、アナログエテプリルセンおよびアナログドリサペルセンのいずれよりも大きく用量依存的に生じていた（図３ＡおよびＣ）。また、ジストロフィンタンパク質の生産に関するＡｃ０の用量反応性は、いずれのＤＭＤ細胞株においても対照アナログよりも高かった（図３Ｅ）。
【００７７】
２．６  ジストロフィンタンパク質のレスキューの免疫細胞化学的評価。
免疫細胞化学は、１０μＭのＡｃ０およびＡｃ４８が、ｅｘ５２およびｅｘ４８−５０ｄｅｌ．変異を有するＤＭＤ骨格筋細胞株において、アナログエテプリルセンと比較して、より多くのジストロフィン陽性筋管を産生し、より強いシグナル強度を示すことを明らかにした（図４）。
【００７８】
２．７  Ａｃ０モルホリノの長さの最適化。
Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニングは、０〜＋８９の間にあるエクソン５１の最初の５’領域が、エクソン５１のスキッピングに影響を与える重要な領域であることを明らかにした。この領域を標的とするＡｃ０の配列長を最適化するために、本発明者らは、５’部位のヌクレオチドを１つずつ系統的に除去して、異なる長さ（２５〜３０−ｍｅｒ）のＡｃ０モルホリノのスキッピング効率を比較した（表２を参照）。１μＭのこれらのＡＯで処置した不死化ＤＭＤ筋細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、２５〜３０−ｍｅｒのＡｃ０モルホリノが効率的なエクソンスキッピング（＞２０％）を生じることを示したが（図５）、これは同じ用量のアナログエテプリルセンおよびアナログドリサペルセンでは観察されなかった効果である（図３）。しかしながら、ＡＯの長さが長くなると、エクソンスキッピングの効率が向上した。３０−ｍｅｒのＡｃ０の統計的に有意な有効性が、両方の細胞株において、より短いＡｃ０モルホリノと比較して、１または２塩基だけ短いＡＯに対してさえも、１および３μＭの用量で確認された。
【００７９】
２．８  初代ＤＭＤ患者由来骨格筋細胞に対するＡｃ０、Ａｃ４８、ならびにアナログエテプリルセンおよびドリサペルセンの効果。
本発明者らはまた、エクソン４５〜５０（ＩＤ  ４５４６）またはエクソン４９〜５０ｄｅｌ．変異（ＩＤ  ４５５５）を有する初代ＤＭＤ骨格筋細胞においてもＡＯを試験して、３０−ｍｅｒのＡｃ０の優れた有効性が他の筋細胞種と欠失変異パターンでも一貫しているかどうかを検証した。ＲＴ−ＰＣＲは、Ａｃ０がアナログエテプリルセンまたはアナログドリサペルセンと比較して、両方の初代ＤＭＤ筋細胞において有意に高いエクソンスキッピング効率を達成することを示した（図６Ａ〜Ｄ）：アナログエテプリルセンおよびドリサペルセンと比較して、それぞれ最大５倍および７倍の効率が観察された。Ａｃ０媒介エクソン５１スキッピングの著しい効率は、初代健常骨格筋細胞においても確認された（図６ＥおよびＦ）。興味深いことに、エクソン５１スキッピング効率の増加に伴い、リーディングフレームを乱さない自発的なエクソン５２のスキッピングが、初代健常およびＤＭＤ筋細胞、およびｅｘ４８−５０ｄｅｌ．（６５９４）の不死化ＤＭＤ筋細胞株において観察された。
【００８０】
２．１０  ｈＤＭＤ／Ｄｍｄ−ｎｕｌｌマウスにおけるＡｃ０モルホリノおよびアナログエテプリルセンのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性。
エクソンスキッピング療法の開発における主要なハードルは、適切な動物モデルでヒト特異的なＡＯを常に試験できるとは限らないことである。これは、患者のために設計されたＡＯのｉｎ  ｖｉｖｏ効果の評価を制限する。ここで、本発明者らは、ヒトＡＯのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を試験するために、完全長のヒトＤＭＤ遺伝子を有し、マウスのＤｍｄ遺伝子全体を欠いた新しいマウスモデル（ｈＤＭＤ／Ｄｍｄ−ｎｕｌｌ）を開発した。このマウスモデルは、ヒト配列とマウス配列の間の交差反応を避けるために採用され（従来のｍｄｘマウスはマウスのジストロフィンｍＲＮＡをまだ有しており、これはヒトを標的とするＡＯと交差反応しうる点に留意）、ｈＤＭＤマウス３４とＤｍｄ−ｎｕｌｌマウスの間の交配によって得られた３５。Ａｃ０、Ａｃ４８、アナログエテプリルセンまたはアナログドリサペルセンをこれらのマウスのＴＡ筋に注射し、注射の２週間後にｉｎ  ｖｉｖｏでのエクソン５１スキッピングの有効性を分析した。結果は、アナログエテプリルセンと比較して、Ａｃ０で処置したマウスのエクソンスキッピング効率が有意に高いことを示した（図７）。目に見えるエクソン５１スキップバンドがＡｃ４８処置マウスにおいて見られ、平均エクソンスキッピング効率は１．１１％（±０．４６％、ＳＥ）であった。一方、アナログドリサペルセンで処置したマウスでは、定量可能なエクソン５１スキップバンドは観察されなかった（図８）。
【００８１】
配列
ＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＧ    Ａｃ０（配列番号１）
ＡＧＧＴＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴ    Ａｃ５（配列番号２）
ＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＡＧＴＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＴＧＴＧＴ    Ａｃ２６（配列番号３）
ＡＧＡＴＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＡＧＴＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＴ    Ａｃ３０（配列番号４）
ＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＡＧＴＴＴ    Ａｃ４８（配列番号５）
ＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＧ    エテプリルセン（配列番号６）
ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴ    ドリサペルセン（配列番号７）
ＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＧ    ｈＥｘ５１＿Ａｃ０−２９ｍｅｒ（配列番号８）
ＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＧ    ｈＥｘ５１＿Ａｃ０−２８ｍｅｒ（配列番号９）
ＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＧ    ｈＥｘ５１＿Ａｃ０−２７ｍｅｒ（配列番号１０）
ＣＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＧ    ｈＥｘ５１＿Ａｃ０−２６ｍｅｒ（配列番号１１）
ＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＧ    ｈＥｘ５１＿Ａｃ０−２５ｍｅｒ（配列番号１２）
ＣＣＡＣＡＧＧＴＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴ    Ａｃ９（配列番号１３）
ＴＴＡＴＡＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＴ    Ａｃ１４１（配列番号１４）
ａｔａｃＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＣＴＣＧＴＴＧＡ    Ａｃ２０７（配列番号１５）
ＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＴＡＧ    Ｅｘ４９／５０＿９４−１０＿ｈＤＭＤ＿Ｆｗｄ（配列番号１６）
ＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＣＣ    Ｅｘ５３＿８０−９９＿ｈＤＭＤ＿Ｒｖ（配列番号１７）
ＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＴＡＡＧＴＧ    Ｅｘ４７＿６０−７９＿ｈＤＭＤ＿Ｆｗｄ（配列番号１８）
ＧＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡＴＴＧＣ    Ｅｘ５２＿８３−１０５＿ｈＤＭＤ＿Ｒｖ（配列番号１９）
ＧＡＣＡＡＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＡＣＡＧ    Ｅｘ４３／４４＿１６７−１２＿ｈＤＭＤ＿Ｆｗｄ（配列番号２０）
ＣＡＡＧＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧ    ｍＤｍｄ＿ｅｘ４９＿８３−１０２＿Ｆｗｄ（配列番号２１）
ＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＣ    欠失  ｍＤｍｄ＿ｅｘ５３＿８１−１００＿Ｒｖ（配列番号２２）
ＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧ    ｈＧＡＰＤＨ＿６６２−８１＿Ｆｗｄ（配列番号２３）
ＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＣ    対照  ｈＧＡＰＤＨ＿８６０−７９＿Ｒｖ（配列番号２４）
ＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴＴＡＧＣＴＧＡＧＴＧＴＣＣ    ｈ１８Ｓ＿７６０−８２＿Ｆｗｄ（配列番号２５）
ＴＧＡＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧ    対照  ｈ１８Ｓ＿１０３９−５８＿Ｒｖ（配列番号２６）
【００８２】
【表３−１】
2021500064.tif 000007
【表３−２】
2021500064.tif 000008
【表３−３】
2021500064.tif 000009
【図１】
2021500064.tif 000010
【図２】
2021500064.tif 000011
【図３】
2021500064.tif 000012
【図４】
2021500064.tif 000013
【図５】
2021500064.tif 000014
【図６】
2021500064.tif 000015
【図７】
2021500064.tif 000016
【図８】
2021500064.tif 000017
【国際調査報告】
2021500064.tif 000018
2021500064.tif 000019
2021500064.tif 000020
2021500064.tif 000021
2021500064.tif 000022
2021500064.tif 000023