(57)【要約】  本開示は、バフィーコートのような細胞学的検体または組織学的検体を、顕微鏡用スライドのような基板に接着させるための方法および付着溶液を対象とする。付着溶液は、付着基剤、抗凝血剤、および非ステロイド性抗炎症薬を含む。付着基剤は、アルコール、酸、酸化剤、有機ハロゲン、ケトン、またはその任意の組合せであってもよい。検体を入手した時点で、検体を付着溶液に再懸濁するか、または付着溶液を検体に加えてもよい。次に、検体を分析プラットフォームに１滴または複数滴分注し、硬化させてもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール、および
最終濃度が１００〜１０００ｕｇ／ｍＬの非ステロイド性抗炎症薬
を含む溶液であって、前記最終濃度が、検体と混合した場合の前記非ステロイド性抗炎症薬の濃度である、前記溶液。
【請求項２】
前記アルコールがメタノールである、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
前記非ステロイド性抗炎症薬がアセチルサリチル酸である、請求項２に記載の溶液。
【請求項４】
緩衝剤をさらに含む、請求項３に記載の溶液。
【請求項５】
塩をさらに含み、前記検体と比較して低張である、請求項３に記載の溶液。
【請求項６】
前記検体と混合した場合の前記アルコールの最終濃度が、６０〜７０体積％である、請求項１に記載の溶液。
【請求項７】
水をさらに含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項８】
緩衝液をさらに含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項９】
抗凝血剤をさらに含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項１０】
前記抗凝血剤がヘパリンである、請求項９に記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月２日に出願された特許出願第１４／９５６，６２２号の一部継続出願であり、この特許出願第１４／９５６，６２２号は、２０１４年１２月２日に出願された特許仮出願第６２／０８６，３０９号の利益を主張するものであり、２０１４年６月２７日に出願された特許出願第１４／３１７，６８３号の一部継続出願であり、この特許出願第１４／３１７，６８３号は、２０１３年７月１９日に出願された特許仮出願第６１／８５６，４９８号および２０１３年７月１９日に出願された特許仮出願第６１／８５６，５０６号の利益を主張するものである。
本開示は、一般的に、懸濁液を分析すること、特に、懸濁液の構成成分を基板に付着させるための溶液および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現行の診断法および診断技術は、組織学的検体および細胞学的検体の解釈に依存している。顕微鏡用スライドのように、その上で検体を分析および処理する基板に、検体を接着させた状態を保つことは、これらの解釈において重要な面である。次に、検体の接着によって続く処理の際に、貴重な診断情報が、検体から得られることがある。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】実施例付着溶液を生成するための実施例方法のフローチャートを示す図である。
【図２】検体を基板に接着させるための実施例方法のフローチャートを示す図である。
【図３Ａ】実施例検体を実施例付着溶液で再懸濁したことを示す図である。
【図３Ｂ】実施例検体を付着溶液と混合して再懸濁された細胞学的検体を形成したことを示す図である。
【図３Ｃ】再懸濁された検体を、実施例分析プラットフォームにのせていることを示す図である。
【図３Ｄ】再懸濁された検体を、分析プラットフォームに広げて、接着させたことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本開示は、細胞学的検体または組織学的検体を基板に接着させるための方法および付着溶液を対象とする。付着溶液は、付着基剤および非ステロイド性抗炎症薬を含む。付着基剤は、アルコール、酸、酸化剤、有機ハロゲン、アセトンのようなケトン、またはカルノア液のようなその任意の組合せであってもよい。付着溶液は、抗凝血剤を含んでもよい。検体を入手した時点で、検体を付着溶液に再懸濁するか、または付着溶液を検体に加えてもよい。検体を分析プラットフォームに１滴または複数滴分注し、硬化させる。次に、検体を固定し、透過処理し、標識し、ブロックし、洗浄してもよい。次に、検体を画像化し、分析してもよい。
以下の記載において、「検体」という用語は、分析するための標本を記載するために使用される。標本は、懸濁液、懸濁液の一部、または懸濁液の構成成分であってもよい。例えば、懸濁液が抗凝固処理全血である場合、検体は、抗凝固処理全血（すなわち、懸濁液）、バフィーコート（すなわち、懸濁液の一部）、または循環腫瘍細胞（すなわち、懸濁液の構成成分）であってもよい。
【０００５】
付着溶液
付着溶液は、検体を基板に接着させることができる。検体は、血液検体のバフィーコートであってよく、基板は、顕微鏡用スライドの表面であってよい。付着溶液は、付着基剤および非ステロイド性抗炎症薬を含む。付着溶液は、水を含んでもよい。緩衝剤を含んでもよく、または緩衝液を水の代わりに、もしくは水に加えて使用してもよい。緩衝剤または緩衝液の緩衝剤には、以下に限定されないが、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ビシン、ビス−トリス、ビス−トリスプロパン、ＣＡＢＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＤＴＡ、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム（一塩基性および／または二塩基性）、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、トリシン、トリス、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）、およびその組合せが含まれてもよい。緩衝剤または緩衝液のｐＨは、５〜１２まで変動することがある。
第１の実施形態において、付着溶液は、生理食塩液中の塩のような塩を含み、付着溶液が等張または高張であると、乾燥または硬化中に検体がひび割れる原因となることがあるため、付着溶液は、検体と比較して低張を保つことは、留意されるべきである。或いは、塩は、乾燥または硬化中に検体がひび割れる原因となることがあるため、付着溶液は、生理食塩液中の塩のような塩を含まない。
付着基剤には、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールのようなアルコール、酸、酸化剤、有機ハロゲン、アセトンのようなケトン、またはカルノア液のような任意のその組合せが含まれてもよい。付着基剤は、タンパク質のような検体の他の構成成分を架橋することなく、細胞のような検体の構成成分を固定する能力を有することがある。タンパク質のような検体の他の構成成分の架橋を防ぐことは、抗原賦活化のような追加の処理ステップを回避し得る。言い換えると、付着基剤を用いて検体の構成成分を基板に固定することによって、抗原賦活化の工程が排除される。付着基剤は、硬化時間が速い（すなわち、１時間未満の）場合もある。付着溶液および検体を混合した場合のような、付着基剤の最終濃度は、６０〜７０体積％であってもよく、より具体的には６３〜６８体積％であってもよい。付着基剤の濃度が望ましい範囲の外であると、溶解、凝集、基板への接着不能、または同様のことなどによって、検体またはその一部に影響を及ぼすことがある。付着基剤の最終濃度は、以下に限定されないが、検体の体積、血中血球容積（ｐａｃｋｅｄ  ｃｅｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）、ヘマトクリットレベル、血液型、検体の種類（すなわち、血液、尿、バフィーコート、単細胞など）、または同様のものを含む接着させる検体の測定された性状によって決定され得る。
【０００６】
非ステロイド性抗炎症薬は、以下に限定されないが、アセチルサリチル酸、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）、ジクロフェナク（Ｖｏｌｔａｒｅｎ）、ジフルニサール（Ｄｏｌｏｂｉｄ）、エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ）、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ）、インドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ）、ケトプロフェン（Ｏｒｕｄｉｓ）、ケトロラック（Ｔｏｒａｄｏｌ）、ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ）、ナプロキセン（Ａｌｅｖｅ、Ｎａｐｒｏｓｙｎ）、オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ）、ピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ）、サルサレート（Ａｍｉｇｅｓｉｃ）、スリンダク（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ）、トルメチン（Ｔｏｌｅｃｔｉｎ）、または同様のものであってもよい。非ステロイド性抗炎症薬は、抗血栓剤として作用することがある（すなわち、様々な血液成分の血液凝固機能を低下させることなどによって、血液凝固を減少させる）。非ステロイド性抗炎症薬の最終濃度は、１００〜１０００ｕｇ／ｍＬであり得る。
【０００７】
付着溶液は、抗凝血剤を含んでもよく、この抗凝血剤は、以下に限定されないが、ヘパリン、ヘパリンナトリウム、ヘパリン／デキストロース、エチレンジアミン四酢酸、ダルテパリンナトリウム、アルガトロバン、ビバリルジン、レピルジン、または同様のものであってもよい。抗凝血剤は、検体の凝結（すなわち、凝集、凝固、または固化）を防ぐ。抗凝血剤の最終濃度は、１０〜１０００ｕｇ／ｍＬであり得る。
付着溶液は、検体と基板の間の接着力を増強するために、生物学的ポリマーを含んでもよい。生物学的ポリマーには、以下に限定されないが、生体模倣型接着性ポリマー（海洋生物由来のポリフェノール性タンパク質など；３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）、フィブリン接着剤、ゼラチン−レゾルシノール−ホルムアルデヒド、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、または同様のものが含まれてもよい。
【０００８】
付着溶液を生成する方法
以下は、付着溶液を生成するために使用される実施例試薬である：
１．ヘパリン２０００μｇ／ｍＬ：ヘパリンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３３９３）２０ｍｇを、水１０ｍＬに溶解して調製する
２．ＢＤ  Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ：ＢＤ  Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（登録商標）細胞および組織接着剤（ＢＤ３５４２４１）−約１５００μｇ／ｍＬの原液濃度
３．Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ緩衝剤５Ｘ：炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）２１ｇを、水５００ｍＬに溶解して調製する
４．Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ緩衝剤１Ｘ：炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）４．２ｇを、水５００ｍＬに溶解し、１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）２．５ｍＬを加えて調製する
５．Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ４９４４３７：メタノール（約９９．９３体積％）
【０００９】
以下は、図１に示される付着溶液のための実施例処方である：
１．７０体積％のメタノール、１００ｕｇ／ｍＬのヘパリン、３００ｕｇ／ｍＬのアセチルサリチル酸、５０ｕｇ／ｍＬのＣｅｌｌ−Ｔａｋ（登録商標）：
Ａ．Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（登録商標）３５０ｕＬを、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ緩衝剤１Ｘ  ６５０ｕＬと混合する
Ｂ．十分に混合する
Ｃ．水１．５ｍＬを加える
Ｄ．２０００ｕｇ／ｍＬのヘパリン５００ｕＬを加える
Ｅ．メタノール７．０ｍＬを加える
Ｆ．アセチルサリチル酸３０００ｕｇを加える
Ｇ．十分に混合する
２．６０体積％のメタノール、３００ｕｇ／ｍＬのアセチルサリチル酸：
Ａ．メタノール６０００ｕＬを、水４０００ｕＬに加える
Ｂ．アセチルサリチル酸３０００ｕｇを加える
Ｃ．十分に混合する
【００１０】
付着溶液を使用する方法
図２は、検体を基板に接着させるための実施例方法を示す。ブロック２０２では、検体を得る。検体を得るために、検体を対象から直接採取するか、または検体を濃縮する、かつ／もしくは懸濁液から分離してもよい。検体を、以下に限定されないが、逐次的密度分画、磁気活性化細胞選別、蛍光活性化細胞選別、差次的溶解、除去フィルター、または同様のものを含む、任意の適切な濃縮工程によって濃縮してもよい。逐次的密度分画は、段階的または逐次的工程で、懸濁液を画分に分けるか、または懸濁液の画分を細画分に分けることによって、各ステップまたはシークエンスが、先行するステップおよび連続するステップまたはシークエンスから、異なる画分または細画分を収集するか、または分離することになる工程である。細胞採取装置（ｃｅｌｌ  ｐｉｃｋｅｒ）、ピペット、シリンジ、または同様のもののような、採取のための道具を用いて検体を選択することによって、検体を、他の懸濁液の構成成分から得てもよい。
図２に戻ると、ブロック２０４では、検体３０４を、図３Ａに示される容器３０２中で、付着溶液３０６に再懸濁する。或いは、付着溶液を、検体に加えるか、または検体と混合してもよい。ブロック２０６では、図３Ｂに示されるように、少なくとも付着溶液の一部を含む、再懸濁された検体３０８を、ピペットまたは反復式ピペットのような、ディスペンサーによって、分析プラットフォーム３１０上または分析プラットフォーム３１０中に分注し、検体を、分析プラットフォームに広げる。図３Ｃでは、検体３０８が、スキージー、ピペットチップ、ブレード、ならびにブレードおよび基部を含む２部品型スプレッダーのような、スプレッダー３１２によって、分析プラットフォーム３１０に広げられている。或いは、分析プラットフォーム３１０に遠心力をかけるか、分析プラットフォーム３１０を湿潤させるか、または分析プラットフォーム３１０を傾けることによって、検体３０８を、分析プラットフォーム３１０に広げてもよい。図３Ｄに示されるように、再懸濁された検体３０８を硬化させ、再懸濁された検体３０８を、分析プラットフォーム３１０に接着させる。或いは、再懸濁された検体３０８を、分析プラットフォーム３１０上に分注し、分析プラットフォーム３１０に広げることなく硬化させてもよい。室温のような空気中、３７℃のような環境的に管理された室内、または同様の環境で、硬化することもある。さらに、硬化ステップの完了後、ホルマリンまたは任意の適切な固定液に入れるような、追加の固定ステップを検体に施してもよい。
【００１１】
付着溶液は、任意の適切な分析法または分析技術であって、より具体的には、免疫蛍光標識化および画像化；細胞内タンパク質標識化；発色性染色；分子分析；を含む細胞外および細胞内分析、以下に限定されないが、ゲノム塩基配列決定、ＤＮＡアレイ、発現アレイ、タンパク質アレイ、およびＤＮＡハイブリダイゼーションアレイ、；ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＩＳＨ」−遺伝子コピー数変化のような、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを分析する手段）；ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）；逆転写ＰＣＲ；または分枝ＤＮＡ（「ｂＤＮＡ」−ｍＲＮＡ発現レベルのような、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを分析する手段）分析を含むゲノム分析または核酸分析に適合し得る。標識され得る細胞内タンパク質のいくつかには、以下に限定されないが、サイトケラチン（「ＣＫ」）、アクチン、Ａｒｐ２／３、コロニン、ジストロフィン、ＦｔｓＺ、ミオシン、スペクトリン、チューブリン、コラーゲン、カテプシンＤ、ＡＬＤＨ、ＰＢＧＤ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、ｃ−ｍｙｃ、カスパーゼ、サバイビン、ｐ２７kip、ＦＯＸＣ２、ＢＲＡＦ、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ１および２、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ１／２、Ｅｒｋ１／２、Ｐ３８ＭＡＰＫ、ビメンチン、ＥＲ、ＰｇＲ、ＰＩ３Ｋ、ｐＦＡＫ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫＨ１、Ｔｗｉｓｔ１、Ｓｎａｉｌ１、ＺＥＢ１、フィブロネクチン、Ｓｌｕｇ、Ｋｉ−６７、Ｍ３０、ＭＡＧＥＡ３、リン酸化受容体キナーゼ、修飾ヒストン、クロマチン関連タンパク質、ならびにＭＡＧＥが含まれる。
【００１２】
分析プラットフォーム３１０は、顕微鏡用スライド、正荷電顕微鏡用スライド、被覆顕微鏡用スライド、多孔質スライド、マイクロウェルスライド、ウェルプレート、カバーガラス、細胞マイクロアレイ、または同様のものであってもよい。分析プラットフォーム３１０は、以下に限定されないが、ガラス、合成樹脂、セラミック、金属、または同様のものを含む、任意の適切な物質であってもよい。
【００１３】
前述の説明は、本開示の詳細な理解を得るために、解説の目的で、特定の命名法を使用した。しかし、特定の詳細が、本明細書に記載されるシステムおよび方法を実施するために必要とされないことは、当業者には明白であろう。特定の実施形態の前述の記載は、例えとして、例示および説明の目的で提示されている。それらは、本開示を網羅すること、または本開示を記載されたそのままの形態に限定することを意図するものではない。上記の教示からみて、多くの修正および変形が考えられる。実施形態は、本開示の原理および実際的な用途を最も良く説明し、それによって、他の当業者が、企図される特定の使用に適するように様々な修正を行った本開示および様々な実施形態を最も良く利用できるようにするために示され、記載されている。本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲およびそれに相当するものによって定義されることが意図されている：
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2021500553.tif 000007
【図３Ｄ】
2021500553.tif 000008
【国際調査報告】
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