(57)【要約】  本発明はＶＥＧＦと特異的に結合可能な完全ヒト化単クローン抗体に関する。前記抗体はＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害でき、それによりＶＥＧＦの信号の伝導を抑制することができる。前記抗体はＶＥＧＦに対して強い親和力を有するとともに半減期が比較的に長く、硝子体注射後の安全性が比較的に高い。本発明の抗体はＶＥＧＦの過剰発現に関連する病患、特にＶＥＧＦの過剰発現による血管新生異常に関連する病患を効果的に治療できる。【選択図】図５
2021509813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化完全抗ＶＥＧＦのＩｇＧ１抗体であって、以下を含む：
（ａ）二個の免疫グロブリン軽鎖；
及び（ｂ）二個の免疫グロブリン重鎖；
前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％であり、少なくとも８５％又は少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む；好ましくは、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９１％であり、少なくとも９２％であり、少なくとも９３％であり、少なくとも９４％であり、少なくとも９５％であり、少なくとも９６％であり、少なくとも９７％又は少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９８．１％であり、少なくとも９８．２％であり、少なくとも９８．３％であり、少なくとも９８．４％であり、少なくとも９８．５％であり、少なくとも９８．６％であり、少なくとも９８．７％であり、少なくとも９８．８％又は少なくとも９８．９％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９９％であり、少なくとも９９．１％であり、少なくとも９９．２％であり、少なくとも９９．３％であり、少なくとも９９．４％であり、少なくとも９９．５％であり、少なくとも９９．６％であり、少なくとも９９．７％であり、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％であるアミノ酸配列を含む； 
前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％であり、少なくとも８５％又は少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む；好ましくは、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９１％であり、少なくとも９２％であり、少なくとも９３％であり、少なくとも９４％であり、少なくとも９５％であり、少なくとも９６％であり、少なくとも９７％又は少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９８．１％であり、少なくとも９８．２％であり、少なくとも９８．３％であり、少なくとも９８．４％であり、少なくとも９８．５％であり、少なくとも９８．６％であり、少なくとも９８．７％であり、少なくとも９８．８％又は少なくとも９８．９％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９９％であり、少なくとも９９．１％であり、少なくとも９９．２％であり、少なくとも９９．３％であり、少なくとも９９．４％であり、少なくとも９９．５％であり、少なくとも９９．６％であり、少なくとも９９．７％であり、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％であるアミノ酸配列を含む；
好ましくは、前記抗体はヒトＩｇＧ１である；
好ましくは、前記抗体はＶＥＧＦと結合する；さらに好ましくは、前記抗体はＶＥＧＦ−Ａと結合する；さらに好ましくは、前記抗体はＶＥＧＦ−Ａ１６５と結合する；
好ましくは、前記抗体はヒトＶＥＧＦと結合するときのＫＤ値が１０ｎＭ以下である；さらに好ましくは、前記抗体はヒトＶＥＧＦと結合するときのＫＤ値が１ｎＭ以下である；さらに好ましくは、前記抗体はヒトＶＥＧＦと結合するときのＫＤ値が５００ｐＭ以下である、抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体であって、ここにおいて前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体であって、ここにおいて前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項４】
核酸であって、前記核酸は請求項１−３のいずれかに記載の抗体をコードする、核酸。
【請求項５】
担体であって、前記担体は請求項４に記載の核酸を含む、担体。
【請求項６】
宿主細胞であって、前記宿主細胞は請求項５に記載の担体を含む、宿主細胞。
【請求項７】
請求項１−３のいずれかに記載の抗体を培養する方法であって、請求項６に記載の宿主細胞を培養し、それにより核酸が発現される工程を含む；
好ましくは、前記方法は宿主又は宿主培養物から抗体を回収する工程をさらに含む、方法。
【請求項８】
親和性精製試薬であって、前記試薬は請求項１−３のいずれかに記載の抗体を含む、親和性精製試薬。
【請求項９】
例えば、請求項１−３のいずれかに記載の抗体の、ＶＥＧＦタンパク質の診断解析に用いられる試薬の調製における適用。
【請求項１０】
ＶＥＧＦタンパク質の診断に用いられる試薬キットであって、前記試薬キットは請求項１−３のいずれかに記載の抗体を含む、試薬キット。
【請求項１１】
薬物製剤であって、前記薬物製剤は請求項１−３のいずれかに記載の抗体を含む；
好ましくは、前記薬物製剤は薬学的に許容される担体をさらに含む、薬物製剤。
【請求項１２】
例えば、請求項１−３のいずれかに記載の抗体の、哺乳動物体中におけるＶＥＧＦの過剰発現に関連する病患の薬物の調製における適用；
好ましくは、前記ＶＥＧＦの過剰発現に関連する病患はＶＥＧＦの過剰発現に関連する眼底疾患である；さらに好ましくは、前記ＶＥＧＦの過剰発現に関連する病患は加齢性黄斑変性、病的近視の続発性脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、網膜静脈分枝閉塞症又は網膜中心静脈閉塞症から選択される；
好ましくは、前記哺乳動物はヒトである、適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物医薬領域に属する；さらに詳しく、本発明はヒトの血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ/ＶＥＧＦ−Ａ）を低減させることに用いられる抗体に関し、さらに前記抗体の調製方法及びその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生とは血管内皮細胞により既存の血管網から増殖して再構築し、新生血管を形成ことである。血管新生は人体の正常な増殖過程にとって不可欠であり、その人体の正常な増殖過程は創傷治癒及び器官の発育と分化を含む。それと同時に、血管新生が多種類の疾患の形成にも関連し、例えば加齢性黄斑変性、腫瘍、リウマチ様関節炎及び乾癬である。重要な生理学と病理学上の重要性に鑑みて、血管新生の過程が血管新生因子と血管新生抑制因子との間のバランスにより調整され、且つ病症において異常な調整が出現すると思われる。血管新生はカスケード式の過程であって、下記過程を含む：プロテアーゼ放出後の局所における細胞外マトリックスの分解；毛細血管内皮細胞の増殖；細管毛細血管が血管新生刺激物への移動。
【０００３】
血管新生の過程は多要素を有し、非常に複雑であるが、ＶＥＧＦが生理学的及び病理学的血管新生の過程におけるもっとも重要な鍵因子であるとされている。ＶＥＧＦは胎芽の脈管新生及び血管新生にとって不可欠である。血管新生及び脈管新生における血管新生因子である上、ＶＥＧＦはさらに多指向性の増殖因子であり、内皮細胞生存、血管浸透性と血管拡張、単球走化性及びカルシウム流入において多種類の生物学的効果が表示され、例えば報告によりＶＥＧＦは網膜色素内皮細胞及びシュワン細胞に対して細胞分裂を促進する効果を有するという。血管新生は血管内皮細胞により増殖し、再構築して新たな血管を形成し、血管供給の発育が正常的な及び病理学的な増殖にとって不可欠であると示す証拠がある。大量のデータによると、ＶＥＧＦは病理学的血管新生の病患の発展過程において鍵となる役割を果たし、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは人類の大部分の腫瘍中に過剰発現され、ＶＥＧＦの房水における濃度は糖尿病又は他の虚血性網膜疾病に罹る患者から発現された血管活性化増殖と緊密に関連し、特に加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）患者の脈絡叢新生血管膜においてさらに顕著である。
【０００４】
ＶＥＧＦはグリコシル化分泌型ポリペプチドの増殖因子であり、相同ダイマー糖タンパク質であり、分子量が４６〜４８ｋＤａであり、それが直接に血管内皮細胞に作用し、血管内皮細胞の増殖及び血管新生を誘導できる。ＶＥＧＦのファミリーメンバーには６つのタイプがあり、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ及び胎盤増殖因子を含み、そのうちにＶＥＧＦ−Ａが目の中でもっとも重要である。ＶＥＧＦ−Ａの遺伝子は６号染色体のｐ１２〜ｐ２１に位置を決め、８個のエクソン及び７個のイントロンからなる。ｍＲＮＡの剪断方式により、ＶＥＧＦ-Ａ１２１、ＶＥＧＦ-Ａ１４５、ＶＥＧＦ-Ａ１４８、ＶＥＧＦ-Ａ１６５、ＶＥＧＦ-Ａ１８３、ＶＥＧＦ-Ａ１８９及びＶＥＧＦ-Ａ２０６等という７種類のタンパク質の形式を生成する。そのうちに５種類のタンパク質の形式は血管透過性を向上させ、血管内皮細胞の増殖を促進し、新生血管の生成を誘導できる。血管内皮増殖因子の受容体（ＶＥＧＦＲ）はＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）及びＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ−４）という三種類があり、ＶＥＧＦはその受容体と結合することにより、その生物学的効果を果たす。実験モデルにおいても湿性ＡＭＤの病理学的血管新生においても、いずれもレベルの高いＶＥＧＦ発現があると発見される。それとともに相当の数量の文献によると、ＶＥＧＦを中和することにより、血管新生及び血管浸出を阻害できるという。
【０００５】
ＶＥＧＦが病理的状況下の血管新生において重要な役割を果たすことを了解した上で、当業者は多くの措置を用いてＶＥＧＦの活性を阻害しようとする。阻害性の抗ＶＥＧＦ受容体の抗体、可溶性受容体構築物、アンチセンス法及び低分子量ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害物を用いてＶＥＧＦの経路等を妨害する。関連する文献によると、抗ＶＥＧＦの中和性抗体は人類の多種類の腫瘍細胞株のヌードマウス体中における増殖を阻害し、虚血性網膜症モデルにおける眼内血管新生も阻害する。だから抗ＶＥＧＦ単クローン抗体又はＶＥＧＦ作用阻害物は固形腫瘍及び多種類の眼内血管新生病患を治療するための効果的な候補物である。
【０００６】
黄斑変性は主に高齢者中から発見される医学的病患であり、ここにおいて既知なのは網膜黄斑部の目のライナー中心が薄くなり、萎縮し、且つ場合によって出血するということである。それは中心視野の喪失をもたらし、それにより患者により詳細な内容が見られないことをもたらす可能性がある。アメリカ眼科学会の報告によると、黄斑変性は高齢者の中心視野喪失（失明）の主因である。若者に影響を与える幾つかの黄斑ジストロフィー（ｍａｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ）が黄斑変性と呼ばれることもあるが、該専門語は一般的に加齢性黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＡＭＤ）を指す。
【０００７】
加齢性黄斑変性は網膜色素上皮とその下部の脈絡膜との間に位置する黄斑（詳細な中心視野を提供する網膜中心領域、カベオラと言われる）の中の特徴性のある黄色沈殿（硝子疣と言われる）から始まる。硝子疣に罹った患者は続いて末期ＡＭＤに発展する。硝子疣が大きくなるとともに多くなり、且つ黄斑下部に位置する色素細胞層における紊乱と関連する場合、危険性が相当に高い。
【０００８】
深刻な視覚喪失をもたらす末期ＡＭＤは乾性及び湿性という二種類の形式がある。中心萎縮は、即ち乾性形式の末期ＡＭＤであり、網膜下部に位置する網膜色素上皮層の萎縮によりもたらされ、それが目中心部分にある光受容体（棒状及び円錐体）の喪失により視覚喪失をもたらす。
【０００９】
加齢性黄斑変性は網膜色素上皮細胞及び神経網膜の退化によりもたらされる不可逆的な視力低下又は喪失の病患である。５０歳以上の患者が多発し、相次いで又は同時に両眼に発症し、且つ進行性的に視力を損害し、高齢者の視力機能に深刻に脅威する眼底疾患である。人口高齢化と伴い、欧米諸国において失明をもたらす第一位の眼疾患になり、アジアにおいてその発病率もますます向上する傾向がある。
【００１０】
現代生物学的技術の発展により我々はＤＮＡ組換え技術を用いて抗ＶＥＧＦ単クローン抗体を調製でき、このような技術が大幅に多種類の単クローン抗体の調製に適用されている。選択可能に齧歯類動物の抗体の残基を用いてヒトの抗体中のＣＤＲ領域又はフレームワーク領域の幾つかの部位を取替し、組換えでヒト化単クローン抗体を生成し、それにより抗原性を軽減させる。現在では多種類のヒト化抗ＶＥＧＦ単クローン抗体が成功に調製され、体内及び体外で顕著なｈＶＥＧＦ親和力及び阻害活性を示した。例えば固形腫瘍を治療する臨床試験において特異的なヒト化抗ＶＥＧＦ抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、さらにほかのヒト化抗ＶＥＧＦ抗体のラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）及びアフリバーセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）を使用して強い親和力により脈絡叢血管新生に関連する加齢性黄斑変性を治療する。
【００１１】
人体に治療性抗体を使用する前、非ヒト哺乳動物における前臨床研究を行い、使用される単クローン抗体の有効性及び毒性を評価する必要がある。理想的な状況は、これらの前臨床研究が行われる抗体は宿主動物（マウス、ウサギ及び非ヒト霊長類動物）のターゲット抗原を識別でき且つ効率的にそれと反応できる。
【００１２】
ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ａｖａｓｔｉｎ）はジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）により開発されるもう一つのヒト化ＩｇＧ１抗ＶＥＧＦ単クローン抗体であり、組換えＤＮＡ技術を用いて哺乳動物細胞発現システムにおけるチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）において調製し、ウィルス不活性化及び除去というステップを含むプロセスを用いて精製されるヒト用抗腫瘍単クローン抗体である。
【００１３】
ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）はアメリカのジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）により開発されて、組換えＤＮＡ技術を用いて大腸菌において調製されるヒト化単クローン抗体Ｆａｂ断片であり、ターゲットがＶＥＧＦ−Ａであり、強い親和力でＶＥＧＦ−Ａの各亜型、例えばＶＥＧＦ-Ａ１２１、ＶＥＧＦ-Ａ１６５、ＶＥＧＦ-Ａ１１０と結合できる。ラニビズマブはＶＥＧＦ−Ａと結合することによりＶＥＧＦ−Ａと内皮細胞表面に位置する受容体（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２）との結合を阻害し、血管内皮増殖を阻害し、血管浸出を低減させ、網膜新生血管（ＣＮＶ）の生成を阻害する。
【００１４】
ラニビズマブ及びベバシズマブはいずれも同様なマウス母本抗体Ａ４．６．１から由来する。Ａ４．６．１はヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５タンパク質免疫マウスから生成されるハイブリドーマ細胞株により調製されるマウス抗ＶＥＧＦ単クローン抗体である。マウス化抗体が人類の病患を治療する場合に発生する免疫原性を軽減させるため、Ａ４．６．１抗体遺伝子については組換えＤＮＡ技術を用いてヒト化改造が行われる。ヒト化Ｆａｂ断片はマウスＣＤＲ配列を保持し、ヒト化Ｆｃ断片と組み合わせて完全抗体、即ちベバシズマブを得る。ベバシズマブはその母体抗体と同様な抗原親和力を有するが、免疫原性がさらに低く、体内半減期がさらに長い。
【００１５】
ラニビズマブはベバシズマブのＦａｂ領域に基づいてアミノ酸部位特異的変異導入によりスクリーニングして得た親和力の強い抗体である。ラニビズマブとベバシズマブのＦａｂ領域とは総計で６個のアミノ酸が異なり、この６個のアミノ酸の変異によりラニビズマブのＶＥＧＦ−Ａに対する親和力がベバシズマブより５〜２０倍向上され、体外実験により検証された、ラニビズマブがＨＵＶＥＣ増殖を阻害する強度が、ベバシズマブの５．２倍である。ラニビズマブはＦａｂ断片であり、分子量が小さく、１ｈ以内に網膜全層に浸透でき、硝子体内の薬物の半減期が３．２日間であるが、ベバシズマブはサルの網膜の内境界膜を透過できない。他に、ラニビズマブは比較的に小さい抗原結合断片であり、Ｆｃ領域を含まず、補体媒介の免疫反応をトリガせず、全身半減期が短いため、全身の不良反応が弱い。
【００１６】
眼疾患に対し、一般的に硝子体内に適用される比較的に小さい抗体断片、例えばＦａｂ又は（Ｆａｂ）２を使用する。原因はそれが低い血清半減期を有し、且つ全身毒性のリスクが比較的に低いということにある。それにしても、このような比較的に小さい抗体断片は比較的に短い硝子体内半減期（比較的に速く血清に拡散するためである）をもたらし、且つさらに頻繁に投薬しなければならず、患者に治療中の精神及び体の負担をもたらす。その故に比較的に長い半減期を有してＦｃ構造領域を含む抗体も眼疾患の治療に適用され、例えばバイエル社に調製されるＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔというＦｃ融合タンパク質である。
【発明の概要】
【００１７】
本発明の目的は親和力が強い抗−ＶＥＧＦ抗体を提供することである。
【００１８】
本発明の目的はさらに体内半減期が長い抗−ＶＥＧＦ抗体を提供することである。
【００１９】
本発明の目的はさらに免疫原性がさらに低い抗−ＶＥＧＦ抗体を提供することである。
【００２０】
本発明の抗体は専門的に設計されて眼底疾患治療に用いられるヒト化完全抗ＶＥＧＦのＩｇＧ１抗体である。本発明の抗体はラニビズマブと類似する抗原親和力を有するが、本発明の抗体にはＣＤＣ及びＡＤＣＣ効果がなく、硝子体内注射の安全性がさらに高く、硝子体内注射後の硝子体内における半減期がさらに長く、期待治療効果がさらに良好である。
【００２１】
一方で、本発明は完全ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、前記抗体は（ａ）二個の免疫グロブリン軽鎖；及び（ｂ）二個の免疫グロブリン重鎖を備え、前記重鎖はＮ末端からＣ末端までいずれも可変領域及び定常領域を含む；前記抗体は特異的にＶＥＧＦの抗原結合部位を識別する。
【００２２】
さらに、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％であり、少なくとも８５％又は少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む；好ましくは、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９１％であり、少なくとも９２％であり、少なくとも９３％であり、少なくとも９４％であり、少なくとも９５％であり、少なくとも９６％であり、少なくとも９７％又は少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９８．１％であり、少なくとも９８．２％であり、少なくとも９８．３％であり、少なくとも９８．４％であり、少なくとも９８．５％であり、少なくとも９８．６％であり、少なくとも９８．７％であり、少なくとも９８．８％又は少なくとも９８．９％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９９％であり、少なくとも９９．１％であり、少なくとも９９．２％であり、少なくとも９９．３％であり、少なくとも９９．４％であり、少なくとも９９．５％であり、少なくとも９９．６％であり、少なくとも９９．７％であり、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％であるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％であり、少なくとも８５％又は少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む；好ましくは、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９１％であり、少なくとも９２％であり、少なくとも９３％であり、少なくとも９４％であり、少なくとも９５％であり、少なくとも９６％であり、少なくとも９７％又は少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９８．１％であり、少なくとも９８．２％であり、少なくとも９８．３％であり、少なくとも９８．４％であり、少なくとも９８．５％であり、少なくとも９８．６％であり、少なくとも９８．７％であり、少なくとも９８．８％又は少なくとも９８．９％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９９％であり、少なくとも９９．１％であり、少なくとも９９．２％であり、少なくとも９９．３％であり、少なくとも９９．４％であり、少なくとも９９．５％であり、少なくとも９９．６％であり、少なくとも９９．７％であり、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％であるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は単クローン抗体であり、さらに、前記抗体はヒトＩｇＧ１である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明により提供される抗体は、ベバシズマブと類似するＫＤ値でヒトＶＥＧＦと結合できるとともにＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との結合を阻害できる。さらに具体的に、３０℃で１０ｎＭ又はさらに低いＫＤ値でヒトＶＥＧＦと結合できるとともにＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との結合を阻害できる。もう一つの実施形態により、ＫＤ値は１ｎＭであり又はさらに低い。もう一つの実施形態により、本発明の抗体は約５００ｐＭ以下のＫＤ値でＶＥＧＦと結合できる。
【００２７】
一つの実施形態により、本発明の抗体は１．０又はさらに高い（１０Ｍ−１Ｓ-１）結合レート（ｏｎ  ｒａｔｅ）（ｋｏｎ）でヒト及び/又はマウスＶＥＧＦと結合できる。もう一つの実施形態により、該結合レートは４．０又はさらに高い（１０Ｍ−１Ｓ-１）。
【００２８】
もう一つの実施形態により、本発明の抗体は理想的な親和力でヒトＶＥＧＦと結合し、さらにＶＥＧＦ−Ａと結合し、さらに、ＶＥＧＦ−Ａ１６５と結合するが、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ及びヒトＶＥＧＦ−Ｄからなるいずれか又はＶＥＧＦに関連する全ての同族体と結合しない。
【００２９】
ＶＥＧＦとの結合が阻害されるＶＥＧＦ受容体はＶＥＧＦ受容体１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ受容体２（Ｆｌｔ−１）、又はその両者であってもよい。
【００３０】
一つの実施形態により、本発明の単クローン抗体は２０ｓ螺旋状（ｈｅｌｉｘ）のＶＥＧＦに接触する。もう一つの実施形態により、本発明の単クローン抗体は８０ｓ環状（ｌｏｏｐ）のＶＥＧＦに接触する。もう一つの実施形態により、本発明の単クローン抗体は２０ｓ螺旋状（ｈｅｌｉｘ）及び８０ｓ環状（ｌｏｏｐ）のヒトＶＥＧＦに接触する。
【００３１】
もう一方、本発明では本発明に記載の抗体の重鎖及び/又は軽鎖をコードするための核酸を提供する。
【００３２】
本発明は本発明に記載の核酸を含む発現担体をさらに提供し、前記発現担体は原核又は真核宿主細胞において前記核酸を発現できる。
【００３３】
本発明は前記担体を含む宿主細胞をさらに提供し、前記宿主細胞は本発明に記載の抗体を調製することに用いられる。
【００３４】
前記宿主細胞は真核細胞であっても原核細胞であってもよい。
【００３５】
本発明は抗体を調製する方法をさらに含み、その特徴は以下のとおりである：原核又は真核宿主細胞において本発明に記載の核酸を発現させるとともに、前記宿主細胞又は宿主細胞培養物から前記抗体を回収すること。
【００３６】
そのうちに一つの実施形態は下記ステップを含む：
ａ） 前記抗体をコードする核酸分子を含む担体を用いて宿主細胞を形質転換する；
ｂ） 前記抗体分子の合成可能な条件で前記宿主細胞を培養する；及び
ｃ） 前記培養物から前記抗体分子を回収する。
【００３７】
本発明は完全抗体を調製する前記方法を用いて得る抗体をさらに含む。
【００３８】
本発明はさらに親和性精製試薬を提供する。前記親和性精製試薬は上記抗体を含み、上記抗体はＶＥＧＦタンパク質の診断的分析に用いられる試薬を調製することに適用できる。前記抗体は標識分子を用いて標識できる。例えば放射性同位体、蛍光標識、又は酵素等を用いて標識する。
【００３９】
本発明はＶＥＧＦタンパク質診断に用いられる試薬キットをさらに提供し、前記試薬キットは上記抗体又はポリペプチドを含む。
【００４０】
本発明は前記抗体を含む薬物製剤をさらに提供する。前記薬物製剤は薬学上で許容可能な担体をさらに含む。
【００４１】
本発明は前記抗体又はポリペプチドが含まれて哺乳動物におけるＶＥＧＦ過剰発現に関連する病患を治療する薬物の調製における適用も提供する。
【００４２】
本発明に記載の哺乳動物の治療は有効量の前記抗体を前記哺乳動物に投与することを含む。抗体の投薬量は前記病患を治療するための有効量である。薬剤用量増加に関連する研究において、多種類の薬剤用量の抗体を前記哺乳動物に投与できる。もう一つの実施形態において、有効量の前記抗体を人類患者に投与し、病患を治療する。
【００４３】
前記哺乳動物はヒトであってもよく、非ヒトの哺乳動物であってもよく、例えば前臨床データを生成することに適する霊長類動物又は齧歯類動物（例えばマウス、ラット又はウサギ）である。好ましくは、前記哺乳動物はヒトである。
【００４４】
前記哺乳動物は健康であってもよく、前記抗体を用いて治療する必要のある病患に罹ってもよい。
【００４５】
発明において、前記ＶＥＧＦ過剰発現に関連する病患又は前記病患はＶＥＧＦ過剰発現による血管新生異常に関連する病患である；さらにＶＥＧＦ過剰発現による眼底疾患である。
【００４６】
好ましい実施形態として、本発明に記載の抗体は湿性（新生血管性）加齢性黄斑変性（ｗｅｔ−ＡＭＤ）、病的近視（ＰＭ）の続発性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜変性（ＤＲ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）等という眼底疾患を治療することに用いられる。
【００４７】
これらの抗体はレーザを用いて脈絡膜血管新生をもたらすアカゲザルモデルに適用でき、これらの抗体は本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を用いて黄斑変性を治療する過程における黄斑面積の変化状況を観察又は監視することにより、抗ＶＥＧＦ抗体を用いて加齢性黄斑変性を治療する方法を判定することに適用できる。本発明に記載の抗体は本発明の抗ＶＥＧＦ抗体及び他の治療薬剤の連合治療方法を研究及び評価することに適用できる。本発明に記載の抗体は前記抗体又はポリペプチドを類似する病患に罹っている動物に投与するとともに前記病患の一種類又は多種類の症状が軽減するかどうかを確認することにより、ＶＥＧＦが他の病患に対する作用を研究することに用いられる。
【００４８】
いくつかの方面において、本発明はさらに抗体誘導体を提供し、本発明の抗体をさらに修飾することにより当分野公知の他の非タンパク質の部分を含むようになり、例えば水溶性ポリマーである。
【００４９】
いくつかの方面において、本発明はさらに免疫結合体（抗体−薬物結合体又はＡＤＣ）を提供し、それは本発明に記載の抗体が一種類又は多種類の細胞毒性試薬と結合する抗体を含み、該細胞毒性試薬は例えば化学療法薬剤、薬物、調製阻害剤、毒素又は放射性同位体である。
【００５０】
本発明に記載の抗体はそのＦｃ部分の存在により、網膜黄斑変性に罹っている患者にさらに有益である。定常重鎖領域を有せずに比較的に小さい抗体断片と比較して、それは硝子体内の環境中において高い安定性及び硝子体から緩やかに拡散する特性を有し、即ち半減期が延長し、薬物の作用時間が延長され、ここにおいて実際の病患がこの部位にあり且つこの部位で治療される。その故に、非ＩｇＧ状の抗体、例えば、Ｆａｂ及び（Ｆａｂ）２断片と比較して、治療周期が延長でき、患者の生理学的及び心理学的状況を改善できる。
【００５１】
本発明に記載の抗体は完全ヒト化抗体である。完全ヒト化抗体はマウス抗体、キメラ抗体と比較して、安全性及び治療効果において複数の潜在的利点がある。他の抗体種類と比較して、完全ヒト化抗体については一般的に比較的に低い除去率を示す。比較的に低い除去率は比較的に低い用量及び投薬頻度を許容できる。
【００５２】
一つの好ましい実施形態により、本発明の抗体は組換え方法を用いて合成されるもので、直接にハイブリドーマから生成するもの又はハイブリドーマによる抗体配列から誘導されるものではない。一つの好ましい実施形態において、前記抗体は約２ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約５００ｐＭ以下のＫＤ値でｈＶＥＧＦ−Ａ１６５と結合する。本発明に記載の完全抗体が眼底疾患、特に脈絡膜血管新生を阻害するという良好な効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１はＢＡＴ５９０６の異なる構造とＲａｎｉｂｉｚｕｍａｂ血管新生阻害効果との比較試験であり、前記単クローン抗体ＢＡＴ５９０６の完全分子の血管新生を阻害する効果が最も良好であり、発売される薬物Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂより良好であるということを示す。
【図２】図２は前記単クローン抗体ＢＡＴ５９０６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（非還元）の結果を示し、Ｍ：２５０ｋＤａ染色済みタンパク質Ｍａｒｋｅｒであり、レーン１：ＢＡＴ５９０６非還元サンプルである。
【図３】図３は前記単クローン抗体ＢＡＴ５９０６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（還元）の結果を示す。Ｍ：２５０ｋＤａ染色済みタンパク質Ｍａｒｋｅｒであり、レーン１：ＢＡＴ５９０６還元サンプルであり、図２及び図３の結果により前記単クローン抗体分子のサイズが還元と非還元条件でいずれも設計のサイズと一致するということを示す。
【図４】図４は投薬後に各群のサルの眼底レーザ斑のフルオレセインの浸出面積改善率（％）であり、前記単クローン抗体ＢＡＴ５９０６がアカゲザルの薬効試験において作用を果たし、フルオレセインの浸出面積を効果的に低減するということを示し、発売される薬物Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂを対照として、モデル対照群と比較した結果、平均数の差が統計学的意義（Ｐ≦０．０５）を有する。
【図５】図５は投薬前後に各群のサルの眼球の４級蛍光斑数（個）であり、前記単クローン抗体ＢＡＴ５９０６がアカゲザルの薬効試験において作用を果たし、４級蛍光斑数を効果的に低減するということを示し、発売される薬物Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂを陽性対照とする。
【図６】図６は投薬後に各群のサルの病患による網膜病変損傷最大部位の網膜厚さ改善率（％）であり、前記単クローン抗体ＢＡＴ５９０６がサルの薬効試験において作用を果たし、眼底網膜の肥厚を効果的に抑制するということを示し、発売される薬物Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂを陽性対照として、モデル対照群と比較して、平均数の差が統計学的意義（Ｐ≦０．０５）を有する。
【図７】図７はアカゲザルの急性毒性実験においてサルの眼球の蛍光造影図であり、投薬前及び眼の硝子体注射後の１４日目にそれぞれ一回検査する。眼底蛍光造影検査により造影後に早期（約１分間以内）及び末期（約５分間後）網膜血管の灌流が均一であり、動、静脈の充填時間が正常であると示し、網膜静脈の拡張、浸出を示せず、網膜に灌流領域がなく、蛍光遮断及び血管新生形成等の発現も示さず、本発明の抗体の硝子体内における注射安全性が比較的に高いということを示す。
【図８】図８はＢＡＴ５９０６と対照の眼科薬物とを希釈して３７℃の条件での細胞生物学的活性変化であり、前記単クローン抗体ＢＡＴ５９０６がヒト硝子体注射濃度を模擬する条件で依然として安定な細胞生物学的活性を保持し、眼底疾患部位においてＶＥＧＦを阻害する機能を示す。
【図９】図９はＢＡＴ５９０６と対照の眼科薬物とを希釈して３７℃の条件でのＳＥＣピークの変化であり、前記単クローン抗体ＢＡＴ５９０６がヒト硝子体注射濃度を模擬する条件で依然として安定な構造を保持し、眼底疾患部位においてＶＥＧＦを阻害する機能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下では、具体的な実施例によって本願の技術提案についてさらに説明するが、具体的な実施例は本願の保護範囲を限定するものではない。第三者が本願の趣旨を基に行われる本質的でない補正や調整は本願の保護範囲にある。
【００５５】
Ｉ．定義
【００５６】
特別に明示しない場合、本発明に関連する記述及び要求が下記のとおりに定義される。
【００５７】
説明すべきなのは、特別に明示しなければ、本願に記載の単数形式は複数の意味を含む。例えば、ある種の「複合物」と記述する場合、同時に複合物の複数形式を含む。
【００５８】
本願における「約」は本領域の一般的な技術者が理解できるとともにその適用を容易に拡張できるということを意味する。専門語の適用が本領域の一般的な技術者にとって不明瞭であれば、適用の文脈を出す必要がある。「約」とは特定値の＋１０％乃至−１０％であり、＋５％乃至−５％又は＋１％乃至−１％である。
【００５９】
本願に記載の専門語については、「含む」とは構成及び方法が前記物質を含み、それと同時に他の物質を除外しないことである。「主に含む」が構成及び方法を定義することに用いられる場合、他のいずれかの重要な成分を含まないということを意味する。例えば、一つの複合物は前記重要な成分を含むが他の重要な成分を除外する。例えば、一つの複合物は前記定義の重要な成分からなり、本発明の基礎的特徴及び新規性に重要な影響を与えない成分を除外しない。「……からなる」とは微量以上の成分及び重要な方法ステップを除外するということである。これらの専門語に定義される実施形態は本発明の範囲に限定される。
【００６０】
本願において、「抗体（Ａｂ）」又は「抗原結合単位（Ａｂｕ）」は、それが一つ又は複数の抗原結合部位のタンパク質又は分子を含むということを意味する。該専門語は完全抗体及び抗体断片を含むが、これに限定されない。ある方面において、抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び/又は抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は一組のＶＨ/ＶＬを含み、そして完全抗体又は抗体断片であってもよく、例えば単鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン及び/又はＶＬドメイン、Ｆａｂ、又は（Ｆａｂ）２である。ある方面において、各抗原結合部位は抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び/又は抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、または一組の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のポリペプチドからなってもよい。
【００６１】
本願において、専門語「組換えヒト化抗体」とは組換え方法によって調製、発現、創造又は分離される全てのヒト化抗体であり、例えば、ＮＳＯ又はＣＨＯ宿主細胞から分離される抗体、又はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる遺伝子を用いた組み換え動物（例えばマウス）から得る抗体、又は組換え発現担体を用いて、宿主細胞にトランスフェクトさせて発現される抗体である。
【００６２】
専門語「超可変領域」又は「抗体の抗原結合部分」の本願における意味について、抗原結合を担当する抗体のアミノ酸残基をご参照ください。超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」アミノ酸残基を含む。「フレーム」又は「ＦＲ」領域とは本願に定義される超可変領域残基以外の可変ドメインの領域である。その故に、抗体の軽鎖及び重鎖はＮ−からＣ−末端までのドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。このようなフレームアミノ酸により分割される各チェーンのＣＤＲである。各チェーンのＣＤＲはこのようなフレームアミノ酸により分割される。特に、重鎖ＣＤＲ３は抗原結合を担当する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域の確定はＫａｂａｔ等の標準定義（Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，１５  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．  （１９９１））による。
【００６３】
本願において、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は相互に交換使用可能であり、且つこのような名称はいずれも子世代を含む。その故に、言葉「形質転換体」及び「形質転換される細胞」は初代被験細胞及びそれに由来する培養物を含み、移動の回数を考慮に入れない。さらに全ての子世代のＤＮＡ含量が精確に一致するではない可能性があり、それは意図的又は非意図的変異に帰因する。最初に形質転換される細胞からスクリーニングされて同様な機能又は生物学的活性を有する変異子世代を含む。異なる名称を指す場合、文脈によりそれが明瞭になる。
【００６４】
専門語「形質転換」が本願において、担体/核酸を宿主細胞に移動する過程を意味する。容易に突破できない細胞壁障壁のない細胞を宿主細胞とすれば、トランスフェクトは例えばＧｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ウィルス学）５２（１９７３）５４６−４６７に記載の燐酸カルシウム沈殿法により行われる。それにしても、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法を用いることができ、例えば核注射又はプロトプラスト融合による方法である。原核細胞又は実質である細胞壁構造を含む細胞を用いれば、例えば、一種類のトランスフェクト方法は塩化カルシウムを用いてカルシウム処理し、例えばＣｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，等、ＰＮＡＳ（米国科学アカデミー紀要）．６９（１９７２）２１１０−２１１４のとおりである。
【００６５】
本願において、「発現」とは核酸をｍＲＮＡに転写する過程及び/又は転写されるｍＲＮＡ（転写物とも言う）をその後にペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳する過程である。転写物とコードされるポリペプチドとは共に遺伝子産物と言われる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから由来するものであれば、真核細胞における発現はｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。
【００６６】
「担体」とは核酸分子であり、特に自己増殖のものであり、それにより挿入される核酸分子を宿主細胞内及び/または宿主細胞間に移動させる。該専門語は主な機能がＤＮＡ又はＲＮＡを細胞（例えば、染色体統合）に挿入する担体、主な機能がＤＮＡ又はＲＮＡを複写する複写担体、及び機能がＤＮＡ又はＲＮＡを転写和/又は翻訳する発現担体を含む。一種類以上の上記機能を提供する担体をさらに含む。
【００６７】
「発現担体」とはポリヌクレオチドであり、それが適切な宿主細胞内に導入される場合にポリペプチドに転写され、翻訳される。「発現システム」とは一般的に発現担体を含む適切な宿主細胞であり、前記発現担体は作用を果たすために必要な発現産物を生成できる。
【００６８】
本発明について理解されやすくするために、下記実施例、配列表及び図面を提供するが、その本当な目的は添付の特許請求の範囲に列記される。理解すべきなのは、本発明の趣旨から逸れないことを前提として、前記方法において修正を行うことができる。
【００６９】
患者の病患の「治療」とは（１）傾向性のある又は病患の症状がまだ出ていない患者における病患の出現を阻止する；（２）病患を抑制し又はその発展を阻害する；又は（３）病患を緩和させ又は退化させるということである。
【００７０】
「有効量」とは活性化合物又は薬剤の量であり、それは研究者、獣医、医者又は他の臨床医者に求められている組織、システム、動物、個体及びヒトの生物学的又は薬学的応答をもたらし、これは一種類の病患の治療を含む。
【００７１】
ＩＩ．完全抗体
【００７２】
一つの実施例において、本発明は一種類の新型完全抗体を提供し、該抗体は強い親和力及び黄斑変性病患に対する治療効果を有する。
【００７３】
「完全抗体」又は「完整抗体」とは少なくとも二個の軽鎖及び二個の重鎖を含む抗体又は抗体部分であり、且つ各重鎖は少なくとも一個の可変領域（ＶＨ）及び三個の定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。
【００７４】
いくつかの方面において、各軽鎖、可変領域、ＩｇＧ１の定常領域、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ領域はいずれもヒト配列であり、任意的に修正することができる。
【００７５】
いくつかの方面において、完全抗体における各重鎖はいずれもＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％であり、少なくとも８５％又は少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む；好ましくは、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９１％であり、少なくとも９２％であり、少なくとも９３％であり、少なくとも９４％であり、少なくとも９５％であり、少なくとも９６％であり、少なくとも９７％又は少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９８．１％であり、少なくとも９８．２％であり、少なくとも９８．３％であり、少なくとも９８．４％であり、少なくとも９８．５％であり、少なくとも９８．６％であり、少なくとも９８．７％であり、少なくとも９８．８％又は少なくとも９８．９％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９９％であり、少なくとも９９．１％であり、少なくとも９９．２％であり、少なくとも９９．３％であり、少なくとも９９．４％であり、少なくとも９９．５％であり、少なくとも９９．６％であり、少なくとも９９．７％であり、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％であるアミノ酸配列を含む。
【００７６】
いくつかの方面において、完全抗体における各軽鎖はいずれもＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％であり、少なくとも８５％又は少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む；好ましくは、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９１％であり、少なくとも９２％であり、少なくとも９３％であり、少なくとも９４％であり、少なくとも９５％であり、少なくとも９６％であり、少なくとも９７％又は少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９８．１％であり、少なくとも９８．２％であり、少なくとも９８．３％であり、少なくとも９８．４％であり、少なくとも９８．５％であり、少なくとも９８．６％であり、少なくとも９８．７％であり、少なくとも９８．８％又は少なくとも９８．９％であるアミノ酸配列を含む；さらに好ましくは、前記軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも９９％であり、少なくとも９９．１％であり、少なくとも９９．２％であり、少なくとも９９．３％であり、少なくとも９９．４％であり、少なくとも９９．５％であり、少なくとも９９．６％であり、少なくとも９９．７％であり、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％であるアミノ酸配列を含む。
【００７７】
いくつかの方面において、完全抗体における各重鎖はいずれもＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む。
【００７８】
いくつかの方面において、完全抗体における各軽鎖はいずれもＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む。
【００７９】
重鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【００８０】
軽鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【００８１】
ＩＩＩ．治療方法
【００８２】
本発明は黄斑変性病患又は関連する病患を治療する方法を提供し、該方法については有効量で本願に記載の完全抗体を使用する必要がある。いくつかの方面において、このような病患は湿性（新生血管性）加齢性黄斑変性（ｗｅｔ−ＡＭＤ）、病的近視（ＰＭ）の継発性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜変性（ＤＲ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）等という眼底変性である。
【００８３】
以下の実施例は本発明のいくつかの方面をさらに説明するとともに該技術領域に詳しい技術者が本発明を実施できるように支援を提供する。これらの実施例は絶対に本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８４】
実施例１  組換え型ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体の血管新生に対する阻害メカニズムの研究
【００８５】
組換え型抗ＶＥＧＦヒト化単クローン抗体（抗体ＢＡＴ５９０６）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のとおりである。
【００８６】
マウスの両眼にレーザ光凝固を行い、脈絡膜構造を破壊し、血管新生モデルを形成する。該モデルにヒトＶＥＧＦＡ抗原を注射した後、脈絡膜血管新生が強くなる；その後に組換え型ヒト化抗ＶＥＧＦ単クローン抗体ＢＡＴ５９０６、Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ（Ｒａｎ）、ＢＡＴ５９０６抗体のＦａｂドメイン（ＢＡＴ５９０６−Ｆａｂ）、Ｆｃドメイン（ＢＡＴ５９０６−Ｆｃ）及びヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）をそれぞれ注射した後、対照群（ＰＢＳ）と比較して、脈絡膜血管新生がいずれも阻害され、両種類の異なる血管新生阻害メカニズムがあると推測する。ここにおいてＢＡＴ５９０６−Ｆｃ及びヒトＩｇＧ１はターゲット非依存性の阻害作用を示し、Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ及びＢＡＴ５９０６−ＦａｂはＶＥＧＦターゲット依存性阻害であり、ＢＡＴ５９０６は完全分子であって阻害程度が最高であり、同時に両種類の阻害作用を有する。試験結果は図１のとおりである。
【００８７】
ＢＡＴ５９０６はＶＥＧＦと特異的に結合するＦａｂドメインを通じてＶＥＧＦ経路を阻害することにより血管新生を阻害でき、又はＦｃドメインとＦｃｇＲＩの結合により血管新生を阻害できる。ヒトＩｇＧ１はＦｃドメインを含むため、ＶＥＧＦと特異的に結合するＦａｂドメインがなくて、ＦａｂドメインによりＶＥＧＦ経路を阻害できなくても、ＦｃｇＲＩ経路により血管新生を阻害でき、ＦｃｇＲＩ経路も血管新生を阻害する方式であるということを示す。ＶＥＧＦと特異的に結合するＦａｂドメインのみ備えるＲａｎｉｂｉｚｕｍａｂと比較して、ＲａｎｉｂｉｚｕｍａｂはＶＥＧＦ経路を阻害することのみにより血管新生を阻害する；ＢＡＴ５９０６は同時にＶＥＧＦと特異的に結合するＦａｂドメイン及びＦｃドメインを備え、ＶＥＧＦ経路及びＦｃｇＲＩ経路の両方を阻害でき、血管新生阻害効果はさらに良好である。
【００８８】
実施例２  組換え型抗ＶＥＧＦ単クローン抗体（抗体ＢＡＴ５９０６）の組換えプラスミド及び安定な細胞株の構築
【００８９】
アミノ酸配列に基づいて組換え発現プラスミドｐＢＡＴ５９０６を構築し、それはＧＳ  ｃＤＮＡを含み、グルタミン合成酵素遺伝子を合成することに用いられ、安定な細胞株の拡張スクリーニング対象として、それにより培地に一定のＬ−メチオニンスルホキシド（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ、ＭＳＸ）を添加することにより安定細胞株のスクリーニングを行うことができる。構築される組換え発現プラスミドｐＢＡＴ５９０６に対して制限性エンドヌクレアーゼＰｖｕ  Ｉ/Ｎｏｔ  Ｉ酵素切断試験を行い、予想設計結果と一致であり、ｐＢＡＴ５９０６組換え発現担体の構築が成功であると示す。
【００９０】
抗体発現に用いられる宿主細胞株はＣＨＯ−Ｋ１細胞の誘導細胞株であり、ＣＤ−ＣＨＯ培地に懸濁して増殖する。ＢＡＴ５９０６抗体に発現される安定細胞株の構築過程は以下のとおりである：対数増殖期である宿主細胞を遠心分離するとともに、新鮮なＣＤ−ＣＨＯ培地（細胞密度が１．４３×１０７個/ミリリットルである）に再懸濁させる。上記細胞懸濁液６００μＬと線形化されるプラスミド４０μｇとを均一に混合し、電気変換カップに入れてエレクトロポレーションし、Ｂｉｏ−ｒａｄエレクトロポレーション装置のパラメータが以下のとおりに設定される：電気容量：９６０μＦＤであり、電圧：３００Ｖであり、感電時間：１５−２０ｍｓである。電撃された細胞を迅速に５００ｍＬ ３７℃の予熱されるＣＤ−ＣＨＯ培地に懸濁させ、各ウェルに１００μＬで９６ウェル板にそれぞれ入れ、２−３日間後に１００μＬのスクリーニング培地を補充する。２−３週後に９６ウェル板の細胞培養上清中の抗体濃度を検出するとともに、発現レベルが比較的に高いクローンを９６ウェル板から２４ウェル板に移動し、細胞が一定の数量に増殖するまで、再び抗体発現量が高い細胞を６ウェル板に移動し、最後に２０−３０個の発現が高い細胞株を保留して振とうフラスコに移動してさらに評価する。最後に得る完全単クローンの抗体発現細胞株の生成量が３ｇ/Ｌ前後に達する。
【００９１】
実施例３  単クローン抗体の発現及び精製
【００９２】
単クローン抗体の発現及び精製過程は以下のとおりである：細胞を大規模に２週培養した後、低速遠心分離により細胞を培地から分離させ、得る上清をさらに高速遠心分離して清澄の溶液を得る。組換え型抗体は親和クロマトグラフィー法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）及び２段階イオン交換法により精製され、精製において使用される媒介はそれぞれＧＥ社のＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ、ＴＯＳＯＨ社のＧｉｇａ  Ｃａｐ  Ｑ−６５０Ｍ及びＡＢＩ社のＰＯＲＯＳ  ＸＳである。分離精製後の抗体はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりそのサイズ正確性（図２及び図３）を検証され、結果はＢＡＴ５９０６ストリップが還元及び非還元の状況でいずれもサイズが正確であるということを示す。
【００９３】
実施例４  アカゲザルの眼部血管新生を阻害する有効性実験
【００９４】
サルのレーザー誘発脈絡膜新生血管モデルはｗｅｔ−ＡＭＤの理想的なモデルであり、本発明の抗体と発売される薬品のＲａｎｉｂｉｚｕｍａｂ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）との薬効を効果的に評価するために、レーザを用いてアカゲザルに脈絡膜血管新生をもたらし、硝子体の薬物注射試験を行って薬効を評価する。成功にモデルを構築した後に群を分け、各群に４頭のアカゲザルがいる。一回で両眼の硝子体に０．２５ｍｇ/目（１．６７ｎｍｏｌ/目）、０．５ｍｇ/目（３．３３ｎｍｏｌ/目）、１．２５ｍｇ/目（８．３３ｎｍｏｌ/目）のＢＡＴ５９０６を注射で投薬し、モデル対照群に対しては硝子体に０．９％の塩化ナトリウム注射液を注射し、また発売される薬物の対照薬群を設置し、各眼球に０．５ｍｇ/目のＲａｎｉｂｉｚｕｍａｂ（モル用量が１０ｎｍｏｌ/目である）を注射し、上記注射体積がいずれも５０μＬである。２８日間投薬後、フルオレセイン浸出面積改善率、眼底網膜厚さ改善率、房水ＶＥＧＦ含量及び眼底３級及び４級蛍光斑個数を検出し、結果は表１のとおりである：
【００９５】
【表１】
2021509813.tif 000003
【００９６】
本発明の単クローン抗体ＢＡＴ５９０６の０．２５、０．５、１．２５ｍｇ/目の用量群のサルに対して２８日間の両眼投薬した後に、フルオレセイン浸出面積改善率（改善率平均数がそれぞれ８９．３３％、８５．２８％、８６．４６％である）はいずれもモデル対照より顕著に高い。  
【００９７】
表１及び図４により、０．２５、０．５、１．２５ｍｇ/目の用量のＢＡＴ５９０６群においてサルの眼底レーザ斑のフルオレセイン浸出面積に対する改善率はいずれも０．５ｍｇ/目のＲａｎｉｂｉｚｕｍａｂ群（８３．６９％）よりやや良好であり、且つ低用量のＢＡＴ５９０６はさらに良好なフルオレセイン浸出面積改善率を有する。
【００９８】
本発明の単クローン抗体ＢＡＴ５９０６の０．２５、０．５、１．２５ｍｇ/目の用量群のサルに対して２８日間の両眼投薬した後、全ての眼球病変損傷最大部位における網膜の厚さがいずれも低減し、一部の眼球色素上皮が比較的に規則的であり、連続的であり、一部の眼球網膜の厚さがモデル構築前のレベルに接近し又は達し、さらに低くなることもある。その病変損傷最大部位における網膜厚さ改善率及び低減量（２８日間の投薬後に、改善率平均数がそれぞれ１０６．６１％、１１５．１７％、１１３．４５％である）はいずれもモデル対照群より顕著に高い。表１及び図６により、０．２５、０．５、１．２５ｍｇ/目の用量のＢＡＴ５９０６群においてサルの眼底網膜肥厚に対する改善率が０．５ｍｇ/目のＲａｎｉｂｉｚｕｍａｂ群よりやや良好であることと示す。
【００９９】
硝子体に３種類の用量で本発明の抗体ＢＡＴ５９０６を２９日間注射した後、アカゲザルの房水ＶＥＧＦ濃度がいずれもモデル対照群及び陽性対照Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ群より低く、該結果は本発明の抗体が眼組織ＶＥＧＦ陽性対照薬物Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂよりさらに良好な阻害効果を有するということを示す。
【０１００】
表１及び図５により、程度のもっとも深刻である３級＋４級の蛍光斑（顕著なフルオレセイン浸出、浸出が光斑の縁を超える）の数量変化比較において、０．５ｍｇ/目のＲａｎｉｂｉｚｕｍａｂ群において２８日間の投薬後に３級＋４級の蛍光斑数量がいずれも６個であり、投薬前（３９個）と比較して顕著に低減するが、０．２５ｍｇ/目のＢＡＴ５９０６群の３級＋４級の蛍光斑数量が５個であり、０．５、１．２５ｍｇ/目のＢＡＴ５９０６群の３級＋４級の蛍光斑数量がそれぞれ２個と３個であり、蛍光斑数量が陽性対照群Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂより少ない。
【０１０１】
上記薬効学試験結果により、Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂと比較して、本発明の単クローン抗体ＢＡＴ５９０６はフルオレセイン浸出に対する阻害程度がさらに強く、薬効がＲａｎｉｂｉｚｕｍａｂよりやや良好であると示す。
【０１０２】
実施例５  ＣＤＣ効果検出実験とＡＤＣＣ効果検出実験
【０１０３】
１．ＣＤＣ効果検出実験
【０１０４】
２４時間前に内皮細胞完全培地ＥＣＭを用いてターゲット細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）を再懸濁し、細胞濃度を２×１０５個/ｍＬに調整し、底が平らな透明９６ウェル板に、各ウェルに５０μＬの細胞混合懸濁液を入れる。２％のＦＢＳ及び５％の補体を含むＤＭＥＭ/Ｆ１２培地を用いて抗体（開始濃度が４０μｇ/ｍＬであり、１/５倍の希釈倍数で順次に希釈し、各濃度に３個の重複ウェルを設置し、共に８個の勾配を設置する）を希釈する。ピペットを用いて上記ステップにおける培地を完全に吸取り、その後に前のステップにおいて希釈されるターゲット細胞を入れ、各ウェルに５０μＬであり、試験設計に基づいて、９６ウェル板に入れ、３７℃、５％ ＣＯ２の培養器に入れて続いて少なくとも４時間培養する。
【０１０５】
各濃度勾配の抗体をいずれも５０μＬ/ウェルで９６ウェル板に入れ、サンプルの最後濃度が１０、２、０．４、０．０８、０．０１６、０．００３２、０．０００６４、０μｇ/ｍＬであり、その後に３７℃、５％ ＣＯ２の培養器において３０ｍｉｎ培養する。ターゲット細胞最大ＬＤＨ放出、ターゲット細胞自発ＬＤＨ放出ウェル、体積調整対照ウェル及び培地バックグラウンドウェル（最大ＬＤＨ放出ウェル及び体積調整対照ウェルが検出の４５分間前に１０μＬ溶解バッファーを入れる）、各３個の重複ウェルを設置する。３７℃、５％ ＣＯ２の培養器に入れて少なくとも４ｈインキュベートする。４ｈ後に９６ウェル板を遠心分離し、２５０ｇで４分間遠心分離し、ピペットを用いて慎重に上清を他の９６ウェル板に吸取り、各ウェルに５０μＬのＬＤＨ検出試薬を入れ、室温で遮光で２０−３０分間インキュベートし、その後に各ウェルに５０μＬの停止液を入れる。
【０１０６】
４９０ｎｍを検出波長として、マイクロプレートリーダにおいてその吸収値を検出する。試験結果の算出は以下のとおりである：全ての実験ウェル、ターゲット細胞自発ＬＤＨ放出ウェルの吸光値から培地バックグラウンド吸光値の平均値を引き、ターゲット細胞最大ＬＤＨ放出に対する対照吸光値から体積調整の対照吸光値の平均値を引く。その後に上記調整後の値を以下の算式に導入し、各ＥＴ比による細胞毒性の百分率を算出する。
【０１０７】
％細胞毒性＝（実験−ターゲット細胞自発）/（ターゲット細胞最大−ターゲット細胞自発）ｘ１００％
【０１０８】
以上の結果により、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂサンプル、ＢＡＴ５９０６サンプルは同様な試験条件、補体の作用の下でターゲット細胞に対する毒性作用には顕著な区別がなく、且つターゲット細胞に対する相対的毒性作用が約０％であり、ＢＡＴ５９０６抗体にＣＤＣ効果がないということを示す。以上の結果により、本発明の抗体は細胞内において補体依存性細胞毒性をもたらさないことを示す（表２）。
【０１０９】
２．ＡＤＣＣ効果検出実験
【０１１０】
２４時間前に１６４０培地を用いてターゲット細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）を再懸濁し、細胞濃度を２×１０５個/ｍＬに調整し、底が平らな透明９６ウェル板に、各ウェルに５０μＬの細胞混合懸濁液を入れる。
【０１１１】
２％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２培地を用いて抗体（開始濃度が４０μｇ/ｍＬであり、１/５倍の希釈倍数で順次に希釈し、各濃度に３個の重複ウェルを設置し、共に８個の濃度勾配を設置する）を希釈する。
【０１１２】
各濃度勾配の抗体をいずれも５０μＬ/ウェルでサンプルウェルに入れ、サンプルの最後濃度が１０、２、０．４、０．０８、０．０１６、０．００３２、０．０００６４、０μｇ/ｍＬであり、その後３７℃、５％ ＣＯ２の培養器において３０ｍｉｎ培養する。
【０１１３】
対数増殖期の効果細胞ＰＢＭＣを、８００回転数で５分間遠心分離して上清を除去する。２％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２培地を入れ、８００回転数で５分間遠心分離して２回上清を除去し、数を計算し、効果細胞の密度を２×１０５個/ｍＬに調整する。
【０１１４】
ピペットを用いてサンプルウェルに前のステップにおいて希釈される効果細胞を入れ、各ウェルに５０μＬであり、その後に３７℃、５％ ＣＯ２の培養器に入れて続いて少なくとも４時間培養する。
【０１１５】
ターゲット細胞最大ＬＤＨ放出、ターゲット細胞自発ＬＤＨ放出ウェル、体積調整対照ウェル及び培地バックグラウンドウェル（最大ＬＤＨ放出ウェル及び体積調整対照ウェルが検出の４５分間前に１０μＬの検出試薬キット中の溶解バッファーを入れる）、各３個の重複ウェルを設置する。３７℃、５％ ＣＯ２の培養器に入れて少なくとも４ｈインキュベートする。
【０１１６】
４ｈ培養後に９６ウェル板を遠心分離し、２５０ｇで４分間遠心分離し、ピペットを用いて慎重に上清を他の９６ウェル板に吸取り、各ウェルに５０μＬのＬＤＨ検出試薬を入れ、室温で遮光で２０-３０分間インキュベートし、その後に各ウェルに５０μＬの停止液を入れる。４９０ｎｍを検出波長として、マイクロプレートリーダにおいてその吸収値を検出する。
【０１１７】
以上の試験結果により、本発明の抗体ＢＡＴ５９０６とＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂは同様な試験条件、抗体の作用の下でターゲット細胞に対する毒性作用には顕著な区別がなく、且つターゲット細胞に対する相対的毒性作用が約０％であり、ＢＡＴ５９０６抗体にはＡＤＣＣ効果がないということを示す（表２）。
【０１１８】
以上のＣＤＣ、ＡＤＣＣ両試験結果により、本発明の抗体は体内において補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）をもたらさず、体内に使用する場合免疫システムの正常な作用に影響しないことを示す。本発明の抗体は病巣部位において正常にその抗ＶＥＧＦ機能を果たして、なおかつ不良毒性反応をもたらさず、人体内に使用すれば安全性が比較的に高く、毒性が低い抗ＶＥＧＦ単クローン抗体である。
【０１１９】
【表２】
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【０１２０】
実施例６  アカゲザルの眼硝子体に単クローン抗体を注射する急性毒性試験
【０１２１】
本試験は２群を設置され、それぞれ陰性対照群、組換え型抗ＶＥＧＦヒト化単クローン抗体（ＢＡＴ５９０６）注射液８．０ｍｇ/目群であり、各群に３頭のアカゲザルからなり、メスもオスもいる。各群のアカゲザルは１００μＬ/目の体積で一回で両眼の硝子体に陰性対照品（０．９％塩化ナトリウム注射液）及び８０ｍｇ/ｍＬの組換え型抗ＶＥＧＦヒト化単クローン抗体の注射液を注射で投薬する。投薬の日を試験第１日と定義する。
【０１２２】
投薬後に連続的に１４日間で毎日各群のサルの一般状況を観察する；試験の第８、１４日目に体重を検出する；試験の第１（投薬前）、２、４、８、１４日目に倒像検眼鏡及びスリットランプを用いて検査する；投薬前及び投薬投薬後の約１０〜１５分間、１時間、２４時間及び試験第１４日目に眼圧を検査する；投薬前及び試験第１４日目に眼底カラー写真及び蛍光造影検査を行う；試験第２、１４日目に血液学、血生化学検査を行う；試験第１５日目に全てのアカゲザルを麻酔して放血安楽死を行い、解剖学観察を行う。
【０１２３】
試験結果により、本試験条件で、アカゲザルの両眼の硝子体に一回で８．０ｍｇ/目の用量の組換え型抗ＶＥＧＦヒト化単クローン抗体注射液を注射するとともに１４日間観察し、眼部毒性及び全身毒性が発生せず、最大耐性用量（ＭＴＤ）が８．０ｍｇ/目である。急性毒性試験における眼底蛍光造影検査は図７のとおりである。
【０１２４】
実施例７  アカゲザルの眼硝子体に単クローン抗体を注射する眼組織分布試験
【０１２５】
本試験では硝子体に８．３３ｎｍｏｌ/目（即ち１．２５ｍｇ/目）群を設置し、２１頭のアカゲザルを用い、メスが１０頭でありオスが１１頭である。硝子体注射群のサルは５０μＬ/目の体積で両眼から硝子体に一回で２５ｍｇ/ｍＬの組換え型抗ＶＥＧＦヒト化単クローン抗体（ＢＡＴ５９０６）の注射液を注射で投薬する。硝子体注射群への投薬後の第４、１０、２４、７２、１６８、３３６、６７２時間目にそれぞれ３頭のサルを取り出して安楽死（ペントバルビタールナトリウム３０ｍｇ/ｋｇを用いて麻酔し、大腿動脈から放血する）を行って解剖し、両眼の眼球及び視神経を取り出し、眼球の房水、角膜、虹彩、硝子体、水晶体、網膜、脈絡膜、視神経を分離する。硝子体注射群への投薬後の第３３６、６７２時間目に解剖される６頭のサルから、投薬前及び投薬後の第３０分間、１時間、２時間、４時間、１０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間、３３６時間、６７２時間目に採血して血清を分離する。ＥＬＩＳＡ法により各眼組織、血清における薬物濃度を検出し、血清及び眼組織における薬物の代謝パラメータを算出する。
【０１２６】
主な結果は以下のとおりである：
アカゲザルの両眼に一回で硝子体に１．２５ｍｇ/目（８．３３ｎｍｏｌ/目）の用量で組換え型抗ＶＥＧＦヒト化単クローン抗体の注射液を注射し、薬物は各眼部組織において迅速に拡散分布でき、注射後４時間から眼内の各組織のいずれにおいても薬物を検出でき、角膜及び視神経以外の全ての眼組織の薬物濃度はいずれも投薬後の４〜２４時間でピークに達する。薬物が眼内各組織における暴露水準（ＡＵＣｌａｓｔ）は高から低まで順次に：硝子体、網膜、角膜、房水、脈絡膜、虹彩、水晶体、視神経である。硝子体、房水、網膜、脈絡膜、虹彩、水晶体等の主な眼組織における除去半減期は７３．７４〜１４３．８１時間であり、硝子体における半減期は８４．２時間である。
【０１２７】
両種類の抗ＶＥＧＦ治療薬物とＢＡＴ５９０６との比較状況は表３のとおりであり、ＢＡＴ５９０６の半減期は目前で発売される両種類の抗ＶＥＧＦ治療薬物より顕著に良好である。
【０１２８】
【表３】
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【０１２９】
表３により、アカゲザルは両眼の硝子体に８．３３ｎｍｏｌ/目で本発明の単クローン抗体を注射され、薬物がサルの硝子体における主な薬物代謝パラメータの除去半減期（ｔ１/２）が８４．２時間である。発売される陽性対照薬物Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂは硝子体注射後にサルの硝子体における半減期が５５．７時間であり、Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔは硝子体注射後にサルの硝子体における半減期が４０−６０時間である。上記両種類の発売される陽性対照薬物と比較して、本発明の単クローン抗体は硝子体における薬物半減期がさらに長く、眼部においてさらに長く薬効を果たすことができ、眼底血管新生を阻害する作用がさらに良好である。
【０１３０】
実施例８  示差走査熱量装置（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＣ）による検出
【０１３１】
本発明の抗体の熱転換温度を研究するために、毛細管示差走査熱量装置を用いてＢＡＴ５９０６分子の各ドメインの熱アンフォールディング温度を検出する。装置型番がＮａｎｏ  ＤＳＣであり、毛細管試料セル及び比較セルの体積がいずれも０．３００ｍＬであり、加熱レートが１℃/ｍｉｎであり、前平衡時間が１０ｍｉｎであり、濾過周期が１０秒である。表４の実験結果によりＢＡＴ５９０６分子は２個の融解ピークがあり、第１個のピークはＣＨ２融解ピークであり、Ｔｍ値が７６．０７℃である；第２個のピークはＦａｂ/ＣＨ３融解ピークであり、Ｔｍ値が８３．６８℃である。以上のデータによりＢＡＴ５９０６分子は全体構造が比較的に安定であり、各ドメインにおける最低のＴｍ値が７６．０７℃であり、ＢＡＴ５９０６の熱アンフォールディング温度がＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂより高く、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂよりさらに安定であると示す。
【０１３２】
【表４】
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【０１３３】
実施例９  細胞生物学的活性検出試験
【０１３４】
ＶＥＧＦはＨＵＶＥＣ細胞の増殖を促進させる活性を有し、本発明の単クローン抗体はＶＥＧＦを阻害する機能を有し、その故に本試験の検出ではＨＵＶＥＣを用いて細胞生物学的活性の比較を行う。
【０１３５】
まず２％のＦＢＳを含むＥＣＭ培地を用いてＨＵＶＥＣ細胞（ＨＵＶＥＣ細胞の世代数が第５世代である）を９×１０４ｃｅｌｌｓ/ｍＬの濃度に再懸濁し、各ウェルに１００μＬで９６ウェル細胞培養板に接種し、（５±１）ｈインキュベートして細胞接着させる。試験培地を用いてＢＡＴ５９０６単クローン抗体及びＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂをいずれも事前に１０００ｎｇ/ｍＬに希釈し、その後に１：１．５で下向きに９個の勾配（共に１０個の勾配）を系列希釈し、系列希釈サンプルと試験培地に希釈される等体積の８０ｎｇ/ｍＬのＶＥＧＦ−Ａ１６５とを混合し、３７℃で（６０±１０）ｍｉｎインキュベートする。インキュベート後、各ウェルに１００μＬの抗体ＶＥＧＦ−Ａ１６５混合物をＨＵＶＥＣ接種細胞培養板の対応するウェルに入れ、５％ ＣＯ２の培養器に入れて（６６±３）ｈインキュベートする。インキュベート後、ＣＣＫ８を各ウェルに２０μＬ入れて、続いて（４±０．５）ｈインキュベートして発色する。発色後に細胞培養板を室温に置いて３０ｍｉｎ平衡させ、マイクロプレートリーダが４５０ｎｍになる場合に吸収値結果を読取りする。実験結果は表５のとおりであり、ＢＡＴ５９０６の細胞生物学的活性が約Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの３．８倍である。
【０１３６】
【表５】
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【０１３７】
実施例１０  抗体希釈後３７℃条件下での５週間安定性試験
【０１３８】
体外試験によりヒト硝子体内に抗ＶＥＧＦ単クローン抗体の薬物を注射した後の眼球部位における安定性変化状況をシミュレーションする。薬物を臨床用の濃度に基づいて希釈して３７℃に置き、その安定性を研究する。具体的な操作は以下のとおりである：本発明の抗体ＢＡＴ５９０６、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）及びアフリバーセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）の濃度をそれぞれ０．３１２５ｍｇ/ｍＬ、０．１２５ｍｇ/ｍＬ、０．３１２５ｍｇ/ｍＬ及び０．５ｍｇ/ｍＬに希釈し、３７℃の恒温培養器に入れて連続的な５週間の安定性試験を行い、最初回の希釈後にサンプルを保留し、その後に毎週に定時にサンプルを保留して使用に備える。第５週に全ての６個の時点のサンプルに対して単クローン抗体の細胞生物学的活性及びＳＥＣ（分子排除クロマトグラフィー）ピーク百分率変化の検出を行う。
【０１３９】
細胞生物学的活性の試験方法は実施例９のとおりである。ＳＥＣの検出方法は以下のとおりである：クロマトグラフカラムがＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬ（カラム仕様が７．８×３００ｍｍ、５μｍである）であり、１０％のアセトニトリルを含む１００ｍＭのリン酸カリウム、及び１２５ｍＭの塩化カリウム緩衝液を移動相として用い、カラム温度が３０℃であり、流速が０．５ｍＬ/ｍｉｎである；検出波長が２８０ｎｍである。対照品を取り、水を用いて２ｍｇ/ｍＬのサンプリング溶液に希釈し、５０μＬ取って液体クロマトグラフ装置に入れ、クロマトグラフを記録し、３回平行測定し、３回の結果のピークの理論段数がいずれも２０００より低下することができなく、テーリング係数が２．０より向上することができなく、ピークとポリマーとの分離度が２．０より低下することができない。同様な方法により供試品を検出し、相対面積比較法に基づいて算出し、３回の検出結果の平均値を最後の検出結果とする。試験結果は図８及び図９のとおりである。
【０１４０】
試験結果により、本発明の抗体に対してはヒトの硝子体内に注射する希釈濃度で３７℃に置いて研究を行い、細胞生物学的活性が比較的に安定であり、ＳＥＣピークの百分率変化が小さく、本発明の抗体は本試験条件で安定性が比較的に良好であり、硝子体内注射後に眼底部位において安定な生物学的機能を果たす抗ＶＥＧＦ単クローン抗体である。
【０１４１】
具体的な実施例を用いて、またその実施例により本発明について説明するが、明らかなことに、本領域の技術者は多くの置換方案、修正及び変更を見出すことができる。それに応じて、添付の請求項の趣旨及び幅広い範囲に該当する全てのこのような置換方案、修正及び変更を含むことを目的とする。
【０１４２】
本明細書に関連する全ての出版物、特許及び特許出願はいずれも全文で引用により本明細書に組み込まれ、各出版物、特許又は特許出願が専門的且つ一々に提示されて引用により本明細書に組み込まれることと同様である。
【図１】
2021509813.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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