(57)【要約】本発明は、複数の浮遊細胞マイクロコンパートメントを含む密閉チャンバを備えるバイオリアクター細胞培養システムに関する。マイクロコンパートメントはそれぞれ、自己組織化細胞のセットおよび細胞外マトリクスまたは細胞外マトリクス代替物を含む空洞を提供する外側ヒドロゲル層を含む。本発明はさらに、細胞および／またはオルガノイド、および／または分子および／または複雑な分子集合体を生成するためのこうしたバイオリアクターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の浮遊細胞マイクロコンパートメントを含む密閉チャンバを含むバイオリアクター細胞培養システム。マイクロコンパートメントはそれぞれ、自己組織化細胞のセットと細胞外マトリクスまたは細胞外マトリクス代替物を含む空洞を提供する外側ヒドロゲル層を含む。
【請求項２】
前記マイクロコンパートメントの内側の拡散体積に対するマイクロコンパートメントの外側の対流体積の比は、１から１０００の間で構成される、請求項１に記載のバイオリアクター細胞培養システム。
【請求項３】
マイクロコンパートメントの全部または一部が、嚢胞に自己組織化された細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のバイオリアクター細胞培養システム。
【請求項４】
マイクロコンパートメントの全部または一部が、オルガノイドに自己組織化された細胞を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のバイオリアクター細胞培養システム。
【請求項５】
バイオリアクターが、バッチモードバイオリアクター、流加モードバイオリアクター、および連続モードバイオリアクターから、優先的に連続（灌流）モードバイオリアクターから選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載のバイオリアクター細胞培養システム。
【請求項６】
チャンバが１ｍＬから１０，０００Ｌの間で構成される容積を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載のバイオリアクター細胞培養システム。
【請求項７】
マイクロコンパートメントが０．０１体積％から９８体積％の細胞を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のバイオリアクター細胞培養システム。
【請求項８】
マイクロコンパートメントの細胞がすべて同じ細胞型であるか、または逆に、少なくとも２つの異なる細胞型である、請求項１から６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９】
マイクロコンパートメントがすべて同じ細胞型を含むか、または逆に、少なくとも部分的に異なる細胞型を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０】
目的の細胞の産生および／または増幅のための、請求項１から９のいずれか一項に記載のバイオリアクター細胞培養システムの使用、好ましくは、各継代の間で２から１００，０００倍。
【請求項１１】
目的の分子または複雑な分子集合体の生成のための、請求項１から９のいずれか一項に記載のバイオリアクター細胞培養システムの使用、前記分子または集合体は、マイクロコンパートメントの細胞によって前記マイクロコンパートメントから培養物に排出される。  その後の収穫のために、中程度または逆にマイクロコンパートメント内に蓄積されます。
【請求項１２】
１２−オルガノイドまたは目的の細胞を製造するためのプロセスであり、以下のステップを含む：
−複数の細胞マイクロコンパートメントがバイオリアクターに導入され、前記マイクロコンパートメントはそれぞれ、細胞と細胞外マトリクスまたは細胞外マトリクス代替物をカプセル化する外側ヒドロゲル層を含む。
−マイクロコンパートメントは、マイクロコンパートメント内の細胞の増殖、および／または細胞のオルガノイドへの自己組織化を可能にする条件下で培養されます。
−細胞のマイクロコンパートメントが回収されます
−そして任意選択で、ヒドロゲル層を加水分解してオルガノイドまたは細胞を回収する。
【請求項１３】
導入された細胞マイクロコンパートメントが多能性細胞を含み、前記プロセスは、バイオリアクター内で、少なくとも１つの目的の細胞型への細胞分化のステップ、および任意選択で、前記分化した細胞の増殖のステップを含む、請求項１２に記載のプロセス。  マイクロコンパートメント。
【請求項１４】
導入された細胞マイクロコンパートメントがすでに分化した細胞または前駆細胞を含み、前記プロセスが、バイオリアクター内で、マイクロコンパートメント内の前記分化した細胞の増殖および／または成熟のステップを含む、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
バイオリアクターに導入されたマイクロコンパートメントが、マイクロコンパートメントの内部容積の１０％未満、優先的には１％未満、さらにより優先的にはより少ない初期細胞密度を有する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のプロセス。  ０．１％より。
【請求項１６】
バイオリアクターにおける培養ステップの終わりに回収されたマイクロコンパートメントが、マイクロコンパートメントの内部容積の１０％を超える細胞密度を有する、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオリアクターにおける細胞培養のためのシステムに関する。本発明に係るシステムは、目的の細胞、細胞集合体（オルガノイド、組織）および／または目的の分子の生成、または複雑な分子集合体（細胞外マトリクス、細胞小器官、抗体、ワクチン、エキソソーム、ウイロイド(viroids）の成分）、または細胞に由来し、またはこうしたシステムで成長した細胞によって生成される他の目的の材料の生成に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
バイオリアクター細胞培養システムは、とりわけ製薬業界にとってますます関心が高まっている。実際、真核細胞は、特に細胞および組織療法における治療ツールとして、またタンパク質画分（インスリン、抗体など）からタンパク質、脂質、細胞または細胞小器官、アポトーシス小胞およびエキソソームからウイルス誘導体に由来する糖の複合体を介して目的の分子の生物生産のためのツールとしてますます使用されています（特にワクチンの製造用）。  バイオリアクター細胞培養システムは、これらの細胞の大量培養を可能にし、したがって、工業規模で目的の細胞および／または分子のニーズを満たします。
【０００３】
現在、バイオリアクター細胞培養法には３つの主要なクラスがあります。
−細胞を一定量の培地に接種するバッチ培養を可能にする方法。十分な成長を可能にするための適切な培養時間の後、分子および／または細胞が収集される。これらの方法の主な問題は、培地に存在する栄養素が時間の経過とともに枯渇し、有毒な代謝物が蓄積することです。
−許容可能な細胞密度を維持しながら細胞を供給するために必要に応じて培地を添加する、流加培養を可能にする方法。これらのシステムの主な問題は、代謝廃棄物が除去されず、バイオリアクターに蓄積され、最終的に収量に影響を与えることです。
−細胞に栄養を与え、老廃物を除去するために培地を継続的に交換する灌流培養を可能にする方法。このようなシステムはより高い収量を可能にしますが、培地の迅速かつ継続的な変更は、細胞を損傷することなく細胞を保持する必要があります（流れによって生成される機械的ストレス）。
【０００４】
従来技術において、これらの大量生物生産方法は、脆弱な細胞または脆弱な細胞集合体への適用性をほとんどまたは全く持たない。  実際、懸濁液中、凝集体中、またはマイクロキャリア上で、細胞および細胞集合体は、培養培地中で機械的ストレス（衝撃、剪断応力、圧力など）に直接さらされる。  体積が大きくなると、媒体を攪拌または循環させるために使用される機械的な力が、特に液体の流れによって加えられるせん断応力または媒体を攪拌する可動要素との衝突によって、セルまたはセルアセンブリを破壊する可能性があります。
【発明の概要】
【０００５】
（発明の要旨）
バイオリアクターでの細胞培養のこれらの問題に取り組むことにより、本発明者らは、外側のヒドロゲル層によって区切られたマイクロコンパートメント内に培養空間を作成して、バイオリアクター内で多数の細胞を培養することが可能であることを発見した。したがって、目的の細胞ニッチは、栄養素が浸透し、タンパク質および代謝産物が浸透することを有利に可能にするが、サイズが１５０  ｋＤａを超える要素（細胞外マトリクス、エクソソーム、ウイルス粒子、細胞）を保持するヒドロゲルシェルに囲まれている。さらに、細胞はヒドロゲルシェルによって反応器内に存在する可能性のある応力から保護されているため、バイオリアクターを通る流れは、ヒドロゲルシェルがサポートできるのと同じくらい強くなる可能性があります。さらに、細胞マイクロコンパートメントのハイドロゲルシェルは、既存の培養システムとは異なり、衝突に関連する機械的ストレスから細胞を保護し、液体懸濁液培養中に存在する多細胞要素（凝集体、マイクロキャリア）の融合を防ぎます。細胞が経験する局所的な状態（培地中の拡散距離、機械的ストレス）。マイクロコンパートメントはバイオリアクターに浮遊しているため、培地への均一なアクセスとマイクロコンパートメントへの拡散、および良好な対流が可能になります。さらに、細胞ニッチはヒドロゲルシェルによって保護されているため、細胞死が少なく、表現型が十分に制御された最適な収量条件下で、最も壊れやすい細胞タイプを培養できます。ゲルに包まれた単純なスフェロイドとは異なり、カプセル内の空洞は、細胞外マトリクス上で増殖および／または自己組織化する余地を細胞に残します。有利なことに、各マイクロコンパートメントは、固有の細胞ニッチを含む。言い換えれば、特定のヒドロゲルシェルが単一の細胞ニッチを取り囲んでいます。マイクロコンパートメントの外層はヒドロゲルでできているため、製造終了時に簡単に溶解して細胞を回収できます。これらのマイクロコンパートメントは３Ｄであるため、マイクロコンパートメント内で最大１０００００倍の細胞増幅が有利に可能になります。
【０００６】
したがって、本発明は、その目的として、複数の細胞マイクロコンパートメントを含む密閉チャンバを含むバイオリアクター細胞培養システムを有し、マイクロコンパートメントはそれぞれ、自己組織化細胞および細胞外マトリクスのセットを含む空洞を提供する外側ヒドロゲル層を含む。  細胞外マトリクス代替物。
【０００７】
本発明によれば、外側のヒドロゲル層が一組の細胞を取り囲んでいる。  ヒドロゲル層は中空のカプセルを形成し、細胞のセットを含む空洞を提供します。
【０００８】
有利なことに、ヒドロゲルカプセルは、独特の細胞のセットを含む。
【０００９】
本発明によれば、複数の細胞マイクロコンパートメントは、バイオリアクターチャンバ内に懸濁されている。より具体的には、マイクロコンパートメントは、バイオリアクターチャンバに含まれる培地に浮かんでいる。
【００１０】
本発明はまた、その目的として、目的の細胞の産生および／または増幅のための、閉鎖チャンバを含むこうしたバイオリアクター細胞培養システムの使用を有する。増幅は、有利には、各継代の間で２から１００，０００倍である。この増幅率は、増幅の最後に採取された生細胞の数を、接種された生細胞の数で割ったものに対応します。
【００１１】
本発明はまた、その目的として、細胞外マトリクス、細胞小器官、抗体、ワクチン、エクソソーム、ビロイドの成分などの、目的の分子および／または複雑な分子集合体の産生のためのこうしたバイオリアクター細胞培養システムの使用を有する。  等々、前記分子および／または集合体は、マイクロコンパートメントの細胞によって前記マイクロコンパートメントから培養培地に排出されるか、または逆に、その後の収穫のためにマイクロコンパートメント内に蓄積される。
【００１２】
本発明はまた、その目的として、以下を行うステップを含む、目的のオルガノイドまたは細胞を生成するためのプロセスを有する。
−複数の細胞マイクロコンパートメントが、密閉チャンバを含むバイオリアクターに導入され、前記マイクロコンパートメントは、それぞれ、細胞と細胞外マトリクスまたは細胞外マトリクス代替物をカプセル化する外側ヒドロゲル層を含む。
−マイクロコンパートメントは、マイクロコンパートメント内の細胞の増殖、および／または細胞のオルガノイドへの自己組織化を可能にする条件下で培養されます。
−細胞のマイクロコンパートメントが回収されます
−および任意選択で、ヒドロゲル層を加水分解して、目的のオルガノイドまたは細胞を回収します。
【００１３】
本発明はまた、その目的として、多能性、多能性、または全能性細胞から分化した細胞を産生するためのプロセスを有し、以下のステップを含む。
−複数の細胞マイクロコンパートメントがバイオリアクターに導入され、前記マイクロコンパートメントはそれぞれ、多能性、多能性または全能性細胞および細胞外マトリクスまたは細胞外マトリクス代替物をカプセル化する外側ヒドロゲル層を含む。
−マイクロコンパートメントは、マイクロコンパートメント内の細胞の増殖、および／または目的の１つまたは複数の細胞タイプへの分化を可能にする条件下で培養されます。
−細胞のマイクロコンパートメントが回収されます
−および任意選択で、ヒドロゲル層を加水分解して、目的の細胞タイプを回収します。
【００１４】
詳細な説明
本発明者らは、細胞を架橋ヒドロゲルの外側カプセル内に保持することにより、密閉チャンバを含む反応器内で細胞を培養することが可能であり、特に有利であることを発見した。より正確には、本発明者らは、それぞれが自己組織化細胞のセットおよび細胞外マトリクスまたは細胞外マトリクス代替物をカプセル化する外側ヒドロゲル層を含む細胞マイクロコンパートメントを開発した。本発明によれば、細胞マイクロコンパートメントは、バイオリアクターに懸濁されている。
【００１５】
本発明によれば、自己組織化細胞とは、細胞の相互作用および通信を作成し、関心のある三次元微細構造を形成するために、互いに対して一意に配置される細胞のセットを意味する。したがって、各マイクロコンパートメントは、自己組織化細胞のセットを含む、外側のヒドロゲル層、またはヒドロゲルカプセルを含む。細胞は、ヒドロゲルカプセル内で増殖、組織化、および／または分化できます。
【００１６】
一実施形態では、ヒドロゲルカプセルは、自己組織化された細胞の独特のセットを含む。ユニークとは、カプセルに含まれる細胞のグループが１つだけであることを意味します。これは、多かれ少なかれ凝集している可能性があります。特に、固有のセルのセットは、前記セットの各セルが前記セットの他の少なくとも１つのセルと物理的に接触している３次元セル構造を意味する。
【００１７】
本発明によれば、すべての種類の真核細胞、より具体的には哺乳動物細胞をカプセル化することが可能である。特に、細胞は、分化細胞、前駆細胞、幹細胞、多能性細胞、多能性細胞、全能性細胞、遺伝子改変細胞、およびそれらの混合物などから選択される。一実施形態では、カプセル化された細胞は、特に選択される多能性幹細胞である。胚性幹細胞および／または人工多能性細胞（ＩＰＳ）から。一実施形態では、カプセル化された細胞は、胚性幹細胞、特に多能性胚性幹細胞である。一実施形態では、カプセル化された細胞は、ヒト胚の破壊を必要としたヒト胚性幹細胞を除いて、胚性幹細胞である。別の実施形態では、カプセル化された細胞は、その時点で施行されている生命倫理法に従って、もはや親プロジェクトの対象ではない、医学的に支援された生殖の文脈で考案された過剰なヒト胚に由来するヒト胚性幹細胞である。上記の胚性幹細胞が得られた国。別の実施形態では、カプセル化された細胞は、人工多能性細胞（ＩＰＳ）、特にヒト人工多能性細胞（ｈＩＰＳ）である。別の実施形態では、カプセル化された細胞は、胚性幹細胞および人工多能性細胞である。一実施形態では、カプセル化された細胞は、胚性幹細胞と人工多能性細胞の混合物を含む。
【００１８】
本発明の文脈において、「外側ヒドロゲル層」または「ヒドロゲルシェル」は、液体、優先的には水によって膨潤したポリマー鎖のマトリクスから形成された三次元構造を意味する。こうした外側のヒドロゲル層は、ヒドロゲル溶液を架橋することによって得られる。有利には、ヒドロゲル溶液のポリマーは、温度、ｐＨ、イオンなどの刺激にさらされたときに架橋可能なポリマーである。有利には、使用されるヒドロゲル溶液は、細胞に対して毒性がないという意味で生体適合性である。ヒドロゲル層は、溶解ガス（および特に酸素および／または二酸化炭素）、栄養素、および代謝廃棄物の拡散を有利に可能にし、細胞の生存、増殖、分化、成熟、および／または分子または分子集合体の生成を可能にする。関心および／または関心のある細胞行動の要約。ヒドロゲル溶液のポリマーは、天然または合成起源のものであり得る。例えば、ヒドロゲル溶液は、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムなどのスルホン酸塩ベースのポリマー、ポリアクリル酸ナトリウムなどのアクリレートベースのポリマー、ポリアクリル酸ジアクリレート、メタクリル酸ゼラチン化合物、多糖類、特に細菌の多糖類のうちの１つまたは複数のポリマーを含む。ジェランガムなどの起源、またはペクチンやアルギン酸塩などの植物起源。一実施形態では、ヒドロゲル溶液は、少なくともアルギン酸塩を含む。優先的に、ヒドロゲル溶液はアルギン酸塩のみを含む。本発明の文脈において、「アルギン酸塩」は、β−Ｄ−マンヌロン酸塩（Ｍ）およびα−Ｌ−グルロネート（Ｇ）、それらの塩および誘導体から形成される線状多糖類を意味する。有利なことに、アルギン酸塩は、８０％を超え２０％未満のＭで構成され、平均分子量が１００から４００ｋＤａ（例えば、ＰＲＯＮＯＶＡ（登録商標）ＳＬＧ１００）であり、総濃度が０．５％から密度で５％（重量／体積）。
【００１９】
本発明によれば、細胞マイクロコンパートメントは閉じられている。  細胞のマイクロコンパートメントにそのサイズと形状を与えるのは、外側のヒドロゲル層です。  マイクロコンパートメントは、細胞のカプセル化と互換性のある任意の形状をとることができます。
【００２０】
優先的に、細胞外マトリクス層はゲルを形成する。  細胞外マトリクス層は、細胞培養に必要なタンパク質と細胞外化合物、例えば多能性細胞の混合物を含む。  優先的に、細胞外マトリクスは、ラミニン５２１、５１１または４２１、エンタクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲンなどの構造タンパク質、ならびにＴＧＦ−ベータおよび／またはＥＧＦなどの成長因子を含む。  一実施形態では、細胞外マトリクス層は、マトリゲル（登録商標）および／またはゲルトレックス（登録商標）からなるか、またはそれらを含む。
【００２１】
本発明によれば、マイクロコンパートメントは、細胞外マトリクスの代わりに、細胞外マトリクス代替物を含み得る。  細胞外マトリクス代替物は、膜タンパク質および／または細胞外シグナル伝達経路と相互作用することによって細胞接着および／または生存を促進できる化合物を意味する。  例えば、こうした代替物は、タンパク質（ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチンおよびコラーゲン）、非硫酸化グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸）または硫酸化グリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸）、および合成ポリマーを含む生物学的ポリマーおよびそのフラグメントを含む。  生物学的ポリマーに由来するユニットまたはそれらの特性を再現するユニット（ＲＧＤユニット）および基質への付着を模倣する小分子（Ｙ−２７６３２またはチアゾビビンなどのＲｈｏ−Ａキナーゼ阻害剤）を含む。
【００２２】
ヒドロゲルカプセル内に細胞外マトリクスおよび細胞を含む細胞マイクロコンパートメントを製造するための任意の方法を、本発明に係る調製プロセスを実施するために使用できる。  特に、Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ。に記載されている方法およびマイクロ流体デバイスを適合させることにより、マイクロコンパートメントを調製することが可能である。  ２０１６（「ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）の培養および分化のための機能化ヒドロゲルマイクロカプセルの製造のための３Ｄプリントマイクロ流体デバイス」、Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ、２０１６年、第１６巻、第９号、１５９３−１６０４ページ）。
【００２３】
有利には、細胞マイクロコンパートメントの寸法が制御される。  一実施形態では、本発明に係る細胞マイクロコンパートメントは球形を有する。  好ましくは、こうしたマイクロコンパートメントの直径は、１０μｍから１ｍｍの間、より優先的には５０μｍから５００μｍの間、さらにより優先的には５００μｍ未満、好ましくは４００μｍ未満で構成される。  別の実施形態では、本発明に係る細胞マイクロコンパートメントは、細長い形状を有する。  特に、マイクロコンパートメントは、卵形または管状の形状を有し得る。  有利には、こうした卵形または管状のマイクロコンパートメントの最小寸法は、１０μｍから１ｍｍの間、より優先的には５０μｍから５００μｍの間、さらにより優先的には５００μｍ未満、好ましくは４００μｍ未満で構成される。  「最小寸法」とは、ヒドロゲル層の外面にある点とマイクロコンパートメントの中心との間の最小距離の２倍を意味します。
【００２４】
特定の実施形態では、外側ヒドロゲル層の厚さは、マイクロコンパートメントの半径の５から４０％を表す。  細胞外マトリクス層の厚さは、マイクロコンパートメントの半径の５〜８０％に相当し、ヒドロゲルシェルの内面に有利に吊るされています。  このマトリクス層は、細胞とヒドロゲルシェルの間のスペースを埋めることができます。  本発明の文脈において、層の「厚さ」は、マイクロコンパートメントの中心から半径方向に延びる前記層の寸法である。
【００２５】
本発明の一実施形態では、バイオリアクターは、細胞が自己組織化されて嚢胞となるマイクロコンパートメントを含む。
【００２６】
本発明の文脈において、嚢胞は、中央管腔の周りに組織化された多能性または全能性細胞の少なくとも１つの層として定義される。  したがって、本発明によれば、こうしたマイクロコンパートメントは、中央管腔の周りに、多能性細胞の前記層、細胞外マトリクスの層、または細胞外マトリクス代替物の層、および外側のヒドロゲル層を連続して含む。  内腔は、嚢胞形成の瞬間に、細胞外マトリクス層上の層で増殖および発達する細胞によって生成されます。  有利なことに、管腔は液体、より具体的には培地を含む。
【００２７】
本発明によれば、嚢胞は、ヒトまたは非ヒトの哺乳動物の多能性幹細胞の１つまたは複数の層を有利に含む。  多能性幹細胞、または多能性細胞とは、生物全体を形成することはできずに、起源の生物全体に存在するすべての組織を形成する能力を有する細胞を意味します。  特に、嚢胞には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹（ＩＰＳ）細胞、または成体の哺乳類の皮膚や骨髄に見られる多系統分化ストレス持続（ＭＵＳＥ）細胞が含まれている場合があります。
【００２８】
有利には、外側ヒドロゲル層の厚さは、マイクロコンパートメントの半径の５から４０％を表し、細胞外マトリクス層の厚さは、マイクロコンパートメントの半径の５から８０％を表し、多能性細胞層の厚さを表す。  マイクロコンパートメントの半径の約１０％に相当します。  多能性細胞層は、細胞外マトリクス層と少なくとも一点で接触しており、培養培地で満たされた空間が、マトリクス層と嚢胞との間に存在し得る。  その場合、内腔はマイクロコンパートメントの半径の５〜３０％に相当します。  特定の例では、細胞のマイクロコンパートメントは、半径が１００  μｍに等しい球形をしています。  ヒドロゲル層の厚さは５μｍから４０  μｍです。  細胞外マトリクス層の厚さは５μｍから約８０μｍです。  多能性細胞層の厚さは１０〜３０μｍで、内腔の半径はおよそ５〜３０μｍです。
【００２９】
本発明の例示的な実施形態によれば、以下のステップに従って、細胞が嚢胞を形成する、例えば１５０ｍＬのこうしたマイクロコンパートメントのバイオリアクターで培養することが可能である。
（ａ）ＲＨＯ  ／  ＲＯＣＫ経路の阻害剤を含む培地で６０万から２００万の哺乳類多能性幹細胞をインキュベートします。
（ｂ）ステップ（ａ）に由来するこれらの多能性幹細胞を細胞外マトリクスと混合します。
（ｃ）ステップ（ｂ）の混合物をヒドロゲル層にカプセル化する。
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたカプセルを、ＲＨＯ  ／  ＲＯＣＫ経路の阻害剤を含む培地で培養します。
（ｅ）ＲＨＯ  ／  ＲＯＣＫ経路の阻害剤を除去するために、ステップ（ｄ）から得られたカプセルをすすいでください。
（ｆ）流加型生産モードで、ステップ（ｅ）から得られたカプセルを、多能性細胞培養で１日２倍に培地の量を希釈することにより、３〜２０日間、優先的には５〜１０日間培養します。  ＲＨＯ  ／  ＲＯＣＫ経路の阻害剤を含まないＭＴＥＳＲ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの培地で、必要に応じて得られた細胞マイクロコンパートメントを回収します。
【００３０】
当業者は、必要に応じて細胞の数およびバイオリアクターの容量を適合させる方法を知っているであろう。
【００３１】
チアゾビビン（Ｃ１５Ｈ１３Ｎ５ＯＳ）および／またはＹなどのＲＨＯ  ／  ＲＯＣＫ（「Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ」）経路の１つまたは複数の阻害剤を含む培地でのインキュベーションのステップ（ａ）および培養のステップ（ｄ）  −２７６３２（Ｃ１４Ｈ２１Ｎ３Ｏ）は、多能性幹細胞の生存と、細胞外マトリクスの周囲に外側のヒドロゲル層が形成された瞬間の細胞外マトリクスへの細胞の接着を促進します。  しかしながら、ＲＨＯ  ／  ＲＯＣＫ経路の阻害剤が嚢胞の形成を妨げないように、これらのステップは時間的に制限されることが望ましい。
【００３２】
したがって、優先的に、ステップ（ａ）のインキュベーションは、数分から数時間、優先的には２分から２時間、より優先的には１０分から１時間からなる期間にわたって行われる。
【００３３】
同様に、優先的に、培養ステップ（ｄ）は、２から４８時間の期間、優先的には６から２４時間の期間、より優先的には１２から１８の期間にわたって実施される。  時間。
【００３４】
ステップ（ｅ）は、ＲＨＯ  ／  ＲＯＣＫ経路の阻害剤の痕跡を確実に除去するために必要である。  ステップ（ｅ）は、例えば、ＲＨＯ  ／  ＲＯＣＫ経路の阻害剤を含まない連続培地で、すすぎ、優先的には数回のすすぎによって実行されます。
【００３５】
有利には、ステップ（ｆ）は、細胞外マトリクスおよび多能性細胞の層が、外側のヒドロゲル層の厚さの５０から１００％に等しい累積厚さを有する細胞マイクロコンパートメントを得るために十分な時間行われる。  多能性幹細胞の培養に適した任意の培地を使用できる。
【００３６】
一実施形態では、本発明に係るプロセスは、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）の前に、優先的に酵素を含まない試薬によって誘導される多能性幹細胞を解離することからなる中間ステップ（ａ’）を含む。  有利なことに、前記試薬は、特に多能性細胞のための特定の培地での連続的なすすぎによって、カプセル化ステップの前に阻害またはすすがれる。  たとえば、使用される試薬はＲｅＬｅＳＲ（登録商標）です。  もちろん、トリプシンや酵素を含む試薬を使用することも可能ですが、このステップ後の多能性細胞の生存率は、酵素を含まない試薬を使用した場合と比較して低くなる可能性があります。
【００３７】
あるいは、こうしたマイクロコンパートメントは、以下のステップに従って得ることができる：
（Ａ）哺乳類の分化細胞を細胞外マトリクスおよび細胞再プログラミング剤と混合する。
（Ｂ）ステップ（Ａ）からの混合物をヒドロゲル層にカプセル化する。
（Ｃ）ステップ（Ｂ）から得られたカプセルを少なくとも３日間培養し、必要に応じて、得られた細胞マイクロコンパートメントを回収します。
【００３８】
例えば、使用される分化細胞は、線維芽細胞、末梢血単核細胞、上皮細胞、およびより一般的には、ヒト組織の液体または固体生検に由来する細胞である。
【００３９】
当業者は、特定の因子によって胚期に関連する遺伝子の発現を再活性化することにより、分化した細胞を幹細胞に再プログラムする方法を知っている。  例として、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ。、２００６（「定義された因子によるマウス胚性および成体線維芽細胞培養物からの多能性幹細胞の誘導」Ｃｅｌｌ、２００６  Ｖｏｌ  １２６、ページ６６３−６７６）に記載されている方法について言及できる。  「再プログラムされた多能性細胞の産生」と題された国際出願ＷＯ２０１０  ／  １０５３１１において。
【００４０】
再プログラミング剤は、生成物を濃縮し、細胞のセットとの接触を促進するために、分化した細胞と有利に同時カプセル化される。
【００４１】
再プログラミング剤は、多能性段階までの表現型変化の連続を細胞に課すことを可能にする。  有利なことに、再プログラミングステップ（Ａ）は、特定の培地を使用して実行され、これらの表現型の変化を促進する。  例えば、細胞は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ受容体阻害剤（製品ＳＢ−４３１５４２（Ｃ２２Ｈ１６Ｎ４Ｏ３）など）を補充した最小必須イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の１０％ヒトまたはウシ血清を含む第１の培地で培養されます。  チアゾビビンおよび／またはＹ−２７６３２などのＲＨＯ  ／  ＲＯＣＫ（「Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ」）経路の１つまたは複数の阻害剤、ＦＧＦ−２などの線維芽細胞成長因子、アスコルビン酸、およびトリコスタチンＡなどの抗生物質（  Ｃ１７Ｈ２２Ｎ２Ｏ３）。  次に、培地を、培地ｍＴｅＳＲ（登録商標）１などの多能性細胞の増殖を促進する培地と交換します。
【００４２】
次に、こうした嚢胞は、特に目的の分子の生成、または目的のオルガノイドの生成のために、関心のある１つまたは複数の細胞型を含むマイクロコンパートメントを得るために、関心のある分化経路に強制され得る。
【００４３】
一実施形態では、バイオリアクターは、オルガノイドに自己組織化された細胞を含むマイクロコンパートメントを含む。
【００４４】
本発明の文脈において、オルガノイドは、器官の少なくとも一部の微細構造を再現するように３次元で組織化された多細胞構造として定義される。  したがって、本発明によれば、こうしたマイクロコンパートメントは、細胞外マトリクスに囲まれた三次元多細胞構造を含み、全体が外側のヒドロゲル層にカプセル化されている。
【００４５】
本発明によれば、オルガノイドは、ヒドロゲルカプセル内で次に分化する多能性または前駆細胞をカプセル化することによって、または分化細胞または成熟細胞を直接カプセル化することによって得ることができる。
【００４６】
一実施形態では、バイオリアクターに導入された細胞マイクロコンパートメントは、多能性細胞を含む。  次に、目的の少なくとも１つの細胞型への細胞分化のステップが、バイオリアクター内で実行され、任意選択で、マイクロコンパートメント内の前記分化した細胞の増殖のステップが実行される。
【００４７】
一実施形態では、バイオリアクターに導入された細胞マイクロコンパートメントは、すでに分化した細胞または前駆細胞を含む。  次に、マイクロコンパートメント内の前記分化した細胞の増殖および／または成熟のステップが、バイオリアクター内で実行される。
【００４８】
有利には、バイオリアクターに導入されたマイクロコンパートメントは、マイクロコンパートメントの内部容積の１０％未満、優先的には１％未満、さらにより優先的には０．１％未満の初期細胞密度を有する。
【００４９】
有利には、バイオリアクターにおける培養ステップの終わりに回収されたマイクロコンパートメントは、マイクロコンパートメントの内部容積の１０％を超える細胞密度を有する。
【００５０】
本発明によれば、ヒドロゲルカプセルに含まれる細胞は、バイオリアクターに含まれ、ヒドロゲル層を通過する培地の流れにさらされる。
【００５１】
有利には、マイクロコンパートメントの外側の対流体積とマイクロコンパートメントの内側の拡散体積との比は、１から１０，０００の間、優先的には１から１０００の間、より優先的には１から１００の間で構成される。
【００５２】
本発明によれば、対流体積は、マイクロコンパートメント間の反応器チャンバ内の培養培地の体積を示す。  したがって、マイクロコンパートメントはバイオリアクターに懸濁されており、対流体積はマイクロコンパートメント間を循環する媒体を表します。  逆に、拡散体積は、マイクロコンパートメント内、すなわち、自己組織化された細胞の周囲／間／によって作成された空間／ボイド内で拡散する培地の体積を示します。
【００５３】
したがって、嚢胞を含むマイクロコンパートメントの場合、拡散容積は、主に中央管腔と、嚢胞の成長の開始時に、カプセル壁と嚢胞との間の空間によって構成される。  オルガノイドを含むマイクロコンパートメントの場合、拡散ボリュームは主に、３次元の多細胞構造内に作成されたスペースで構成されます。
【００５４】
本発明に係るマイクロコンパートメントは、細胞を含まず、マイクロコンパートメント内の細胞の正確な増殖または自己組織化を可能にする、１つまたは複数の管腔または１つまたは複数の空間のヒドロゲルカプセル内の存在によって有利に特徴付けられる。  熟練した人は、この状況での最適な空間の特定のレベルの飽和に対応する増幅または分化プロセスに最も適切な瞬間に細胞を採取する方法を知っています。
【００５５】
一実施形態では、マイクロコンパートメントは、バイオリアクターチャンバの容積の０．０１％から７４％の間を占める。
【００５６】
細胞マイクロコンパートメントの使用は、密閉チャンバを備えた任意のタイプのバイオリアクター、特にバッチ、流加または連続供給（灌流）モードのバイオリアクターで細胞を培養することを可能にする。  これらのマイクロコンパートメントの使用は、連続飼料培養の場合に特に有利です。  確かに、細胞はヒドロゲルシェルによって保護されているので、細胞を弱めるリスクなしに連続的な流れにさらすことが可能です。
【００５７】
一実施形態では、バイオリアクターは、密閉できるチャンバを含む。  これにより、バイオリアクター内の雰囲気を制御したり、不活性雰囲気下でマイクロコンパートメントを培養したりすることが可能になります。
【００５８】
本発明に係る細胞培養システムは、１ｍＬから１０，０００Ｌの間、好ましくは５ｍＬから１０，０００Ｌの間、１０ｍＬから１０，０００Ｌの間、１００ｍＬから１０，０００Ｌの間、２００の間からなる容積を有するチャンバを含み得る。  ｍＬから１０，０００Ｌ、５００ｍＬから１０，０００Ｌの間。一実施形態では、チャンバは、少なくとも１ｍＬの容積を有する。  一実施形態では、チャンバは、少なくとも１０ｍＬの容積を有する。  一実施形態では、チャンバは、少なくとも１００ｍＬの容量を有する。  一実施形態では、チャンバは、少なくとも５００ｍＬの容量を有する。  一実施形態では、チャンバは、少なくとも１Ｌの容積を有する。一実施形態では、チャンバは、少なくとも１０Ｌの容積を有する。一実施形態では、チャンバは、１００Ｌ以上の容積を有する。  有利には、密閉チャンバを含み、細胞、オルガノイド、分子および／または複雑な分子集合体の工業規模の生産が可能な任意のバイオリアクターを使用できる。
【００５９】
一般に、密閉チャンバの使用は、外部環境による妨害のリスクなしに、培養環境の微調整を可能にする。  さらに、無菌製品を簡単に入手できます。  また、体積収率も向上します。
【００６０】
一実施形態では、マイクロコンパートメントは、収穫時の細胞の１０体積％から９８体積％、すなわち、関係するコンパートメントの直径および生成される細胞のサイズに応じて１００から１０，００００，０００の細胞を含み、これは計算できる。生成された細胞の総数（Ｍａｌａｓｓｅｚセルまたは自動セルカウンターを使用して熟練者が測定）と得られたカプセルの数（熟練者が手動でカウントしてカプセルの体積を特徴付けることによって測定）の比率によって光学顕微鏡または自動画像解析による）。もちろん、開始時に少数の細胞を含むマイクロコンパートメント、特に１〜１，０００個の細胞、すなわち直径に応じてマイクロコンパートメント内の細胞が占める体積の０．０１％〜１０％で細胞培養を開始することは可能です。関係するコンパートメントのサイズと生成されたセルのサイズ。より一般的には、本発明に係るマイクロコンパートメントは、０．０１体積％から９８体積％の間の細胞を含む。
【００６１】
次に、細胞は、マイクロコンパートメント内で増殖し、特にオルガノイドに自己組織化できる。
【００６２】
一実施形態では、マイクロコンパートメントの細胞はすべて同じ細胞型である。  本発明によれば、同じマイクロコンパートメントの細胞は、前記マイクロコンパートメントの細胞の少なくとも５０％、優先的には７０％、より優先的には９０％、さらにより優先的には９８％以上が有する場合、すべて同じ細胞型であると見なされる。  当業者の知識によれば、この細胞型を特徴づけることを可能にする同じ表現型。  別の実施形態では、マイクロコンパートメントの細胞は、少なくとも２つの異なる細胞型である。  有利なことに、コンパートメントの細胞の２０〜１００％が同じ表現型を持っています。
【００６３】
本発明によれば、すべて同じ細胞型を含むか、または逆に異なる細胞型を有する同じバイオリアクターマイクロコンパートメント内で培養することが可能である。  例えば、バイオリアクターは、それぞれが特定の細胞タイプを含む２つのタイプのマイクロコンパートメントを含み得る。
【００６４】
本発明に係る培養システムは、目的の細胞の産生および／または増幅に特に有利である。  実際、ヒドロゲルカプセル内の細胞の組織化は、細胞外マトリクスとともに、各継代の間に２〜１００，０００倍の増殖を可能にします。
【００６５】
継代とは、増幅を継続するため、またはオルガノイドへの分化または自己組織化を開始するために、空間または培養表面を追加するための細胞の操作を意味する。  この操作により、マイクロキャリアの例では、バイオリアクターに新しいマイクロキャリアをリロードする必要が生じる場合があります。  付着性の多能性幹細胞の標準的な二次元培養の場合、この操作は、より大きな表面積を持つ新しい培地に再接種するために、古い培地から細胞を分離することからなる。  熟練した人にとって、この操作は細胞の５０％の損失をもたらすかもしれません。  本発明に係るマイクロコンパートメントでの培養の場合、これは、マイクロコンパートメントの解離、自己組織化細胞セットの解離、または新しいマイクロコンパートメントに再びカプセル化されるのに十分小さい細胞セットへのそれらの分散に対応する。
【００６６】
本発明は、特に、その目的として、多能性細胞の大量生産のためのこうしたバイオリアクター細胞培養システムの使用を有する。
【００６７】
本発明はまた、その目的として、多能性細胞から単能性または多能性前駆細胞を産生するためのこうしたバイオリアクター細胞培養システムの使用を有する。
【００６８】
本発明はまた、その目的として、多能性細胞および／または単能性または多能性前駆細胞および／または組み合わせ物から最終分化細胞（すなわち、１つ以上の特定の機能に対応する）を産生するためのこうしたバイオリアクター細胞培養システムの使用を有する。  これらの前駆細胞の。
【００６９】
本発明は、特に、その目的として、以下を行うステップを含む、目的のオルガノイドまたは細胞を生成するためのプロセスを有する。
−複数の細胞マイクロコンパートメントが、密閉チャンバを含むバイオリアクターに導入され、前記マイクロコンパートメントは、それぞれ、細胞と細胞外マトリクスまたは細胞外マトリクス代替物をカプセル化する外側ヒドロゲル層を含む。
−マイクロコンパートメントは、マイクロコンパートメント内の細胞の増殖、および／または細胞のオルガノイドへの自己組織化を可能にする条件下で培養されます。
−細胞のマイクロコンパートメントが回収されます
−および任意選択で、ヒドロゲル層を加水分解して、目的のオルガノイドまたは細胞を回収します。
【００７０】
当業者は、それらの増殖および／または自己組織化を促進するために、培養条件をマイクロコンパートメントの細胞型に適合させることができる。
【００７１】
一実施形態では、導入された細胞マイクロコンパートメントは、多能性細胞を含み、前記プロセスは、バイオリアクター内で、少なくとも１つの目的の細胞型への細胞分化のステップおよびマイクロコンパートメントにおける前記分化細胞の増殖のステップを含む。  例えば、ヒト内胚葉組織における分化の研究のための原始内胚葉オルガノイドの生成は、以下のプロトコルに従って実施できる：
−培養２〜３日で上記のマイクロコンパートメントを取得するステップｆ）から：
−ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから販売されているＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓前駆細胞キットのＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓ステージ１培地で、１５０  ｍＬの密閉型バイオリアクターで３〜６日間培養します。
−発達研究のために得られた原始内胚葉の使用。
【００７２】
別の実施形態では、導入された細胞マイクロコンパートメントは、すでに分化した細胞または前駆細胞を含み、前記プロセスは、バイオリアクター内で、マイクロコンパートメント内の前記分化細胞の増殖のステップを含む。
【００７３】
増殖および／または成熟ステップの間、細胞は、前記細胞型に特異的な組織化に従って、有利に特定のオルガノイドに自己組織化するであろう。
【００７４】
増幅に関する一実施形態では、バイオリアクターに導入されたマイクロコンパートメントは、マイクロコンパートメントの内部容積の１０％未満の占有率、優先的には１％、さらにより優先的には０．１％の細胞密度を有する。  その後、培養ステップ中に、細胞はマイクロコンパートメント内で増殖します。
【００７５】
増幅を伴わない分化および／または成熟に関する一実施形態では、バイオリアクターに導入されたマイクロコンパートメントは、マイクロコンパートメントの内部容積の１％を超える細胞密度を有する。次に、細胞は、培養ステップ中に、マイクロコンパートメント内で分化および／または成熟および／または自己組織化する。たとえば、パーキンソン病の細胞療法との関連で、神経移植用の神経オルガノイドの最初のタイプの生産は、次のプロトコルに従って実行されました。
−Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ｉＣｅｌｌ（登録商標）ＤｏｐａＮｅｕｒｏｎｓ）が販売しているような５００万のドーパミン作動性前駆細胞の解凍、
−Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉ  ｅｔａｌ。に記載されているプロトコルに従った前分化神経前駆細胞のカプセル化。  ２０１６年。
−ＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓが提供する培地で１５０ｍＬの密閉型バイオリアクターで培養します。
−バイオリアクター内での２週間のドーパミン作動性神経オルガノイドの成熟と構造化。
−１  ｍＬのＲｅＬｅＳＲ（登録商標）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３０秒間２回リンスしてヒドロゲルカプセルを解離させた後、ニューロン培地に７０  ｋＤａデキストランを１１質量％溶解した溶液に再懸濁することによる移植片の調製、分布自社製のガラスカニューレで。
−パーキンソン病の動物モデルへの移植。
【００７６】
増幅および分化／成熟を組み合わせた実施形態において、バイオリアクターに導入されたマイクロコンパートメントは、有利には、マイクロコンパートメントの内部容積の１０％未満の占有率、優先的には１％、さらにより優先的には０．１％の細胞密度を有する。次に、細胞は、培養ステップ中、次に分化ステップ中に、マイクロコンパートメント内で増殖します。次に、細胞は、栄養培地の性質の変化または物理的トリガー（温度、照明）によってトリガーされる可能性がある第２の培養ステップ中に、マイクロコンパートメント内で自己組織化されます。たとえば、パーキンソン病の細胞療法との関連で、ニューロン移植のための２番目のタイプの神経オルガノイド生成が次のプロトコルに従って実行されました。
−培養２〜３日で上記のマイクロコンパートメントを取得するステップｆ）から：
−ＢＭＰ２（２  μｍドルソモルフィンまたは０．５  μｍ  ＬＤＮ  １９３１８９）およびＴＧＦｂｅｔａ（１０  μｍ  ＋  ＳＢ  ４３１５４２）シグナル伝達経路、１０  μｍ  ２４（Ｓ）、２５−エポキシコレステロールの阻害剤を含む神経誘導培地での１５０ｍＬクローズドバイオリアクターでの培養Ｎ２およびＢ２７を補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ／  ＤＭＥＭ−Ｆ１２ベースで１〜２日間。
−ＢＭＰ２（２  μｍドルソモルフィンまたは０．５  μｍ  ＬＤＮ  １９３１８９）およびＴＧＦｂｅｔａ（１０  μｍ  ＋  ＳＢ  ４３１５４２）シグナル伝達経路の阻害剤、ＳＨＨ経路の２つの活性化因子（２００  ｎｇ  ／  ｍＬ  ＳＨＨ；  １  μｍプルモルファミン）およびＦＧＦ８（１００  ｎｇ  ／  ｍＬ）、ＷＮＴ経路の阻害剤（３  μｍ  Ｃｈｉｒ９９０２１）、１０  μｍ  ２４（Ｓ）、２５−エポキシコレステロール、Ｎ２およびＮ２を添加した神経基底／  ＤＭＥＭ−Ｆ１２ベース６日間のＢ２７。
−ＢＭＰ２シグナル伝達経路の阻害剤（２  μｍドルソモルフィンまたは０．５  μｍ  ＬＤＮ  １９３１８９）、ＷＮＴ経路の阻害剤（３  μｍ  Ｃｈｉｒ９９０２１）、１０  μＭ  ２４（Ｓ）を含む２番目の神経領域化培地での１５０ｍＬクローズドバイオリアクターでの培養）、Ｎ２およびＢ２７を１日間補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ／  ＤＭＥＭ−Ｆ１２ベースの２５−エポキシコレステロール。
−サイクリックＡＭＰ（５００  μＭ）＋アスコルビン酸（２００  μＭ）＋  ＧＤＮＦ（２０  ｎｇ  ／  ｍＬ）＋  ＢＤＮＦ（２０  ｎｇ  ／  ｍＬ）＋  ＢＤＮＦ（２０  ｎｇ  ／  ｍＬ）＋  ＢＤＮＦ（２００  μＭ）＋アスコルビン酸（２００  μＭ）＋  ＢＤＮＦ（  ２０  ｎｇ  ／  ｍＬ）＋  ＦＧＦ−２０（５  ｎｇ  ／  ｍＬ）＋  ＴＧＦｂｅｔａ（１  ｎｇ  ／  ｍＬ）＋トリコスタチン（１０  ｎＭ）＋化合物Ｅ（１  μＭ）。
−１  ｍＬのＲｅＬｅＳＲ（登録商標）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３０秒間２回リンスしてヒドロゲルカプセルを解離させた後、ニューロン培養液に７０  ｋＤａデキストランを１１質量％溶解した溶液に再懸濁することによる移植片の調製、分布自社製のガラスカニューレで。
−パーキンソン病の動物モデルへの移植。
【００７７】
増幅および分化／成熟を組み合わせた別の実施形態では、バイオリアクターに導入されたマイクロコンパートメントは、有利には、マイクロコンパートメントの内部容積の１０％未満の占有率、優先的には１％、さらにより優先的には０．１％の細胞密度を有する。その後、細胞はマイクロコンパートメント内で増殖します。次に、細胞はカプセルの溶解によって回収され、次に第２のカプセル化ステップ、続いて分化ステップにかけられ、次に細胞は、性質の変化によって引き起こされ得る第２の培養ステップの間に、マイクロコンパートメント内で自己組織化する。栄養培地または物理的トリガー（温度、照明）の。例えば、ヒト膵臓組織移植のためのヒト膵臓オルガノイドの産生は、以下のプロトコルに従って実施された：
−培養２〜３日で上記のマイクロコンパートメントを取得するステップｆ）から：
−ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが販売しているＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓前駆細胞キットのサプリメント１Ａおよびサプリメント１Ｂを添加したＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓ステージ１培地で１５０ｍＬの密閉型バイオリアクターで１日間培養します。
−ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが販売しているＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓前駆細胞キットのサプリメント１Ｂを添加したＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓ステージ１培地で１５０ｍＬの密閉型バイオリアクターで１日間培養します。
−ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが販売しているＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓前駆細胞キットのサプリメント２Ａおよびサプリメント２Ｂを添加したＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓ステージ２−４培地で１５０ｍＬの密閉型バイオリアクターで１日間培養します。
−ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが販売しているＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓前駆細胞キットのサプリメント２Ａおよびサプリメント２Ｂを添加したＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓ステージ２−４培地で１５０ｍＬの密閉型バイオリアクターで２日間培養します。
−ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが販売しているＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓前駆細胞キットのサプリメント３を添加したＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓ステージ２−４培地で１５０ｍＬの密閉型バイオリアクターで３日間培養します。
−ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが販売しているＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓前駆細胞キットのサプリメント３を添加したＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ膵臓ステージ２−４培地で１５０ｍＬの密閉型バイオリアクターで５日間培養します。
−１  ｍＬのＲｅＬｅＳＲ（登録商標）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３０秒間２回リンスしてヒドロゲルカプセルを解離し、前の培地に１１質量％の７０  ｋＤａデキストランを溶解した溶液に再懸濁することによる移植片の調製、自社製のガラスカニューレ。
−１型糖尿病の動物モデルへの移植。
【００７８】
有利には、バイオリアクターの培養ステップの終わりに回収されたマイクロコンパートメントは、マイクロコンパートメントの内部容積の１０％を超える細胞密度、好ましくは５０％を超える細胞密度を有し、これはオルガノイドの場合に行くことができる。  最大９８％の占有率。
【００７９】
本発明に係る培養システムはまた、目的の分子および／または複雑な分子集合体の生成にとって特に魅力的であり、前記分子および／または複雑な分子集合体は、マイクロコンパートメントの細胞によって前記マイクロコンパートメントから  培地、または逆にその後の収穫のためにマイクロコンパートメント内に蓄積されます。  この製造方法は、特に細胞要素をマイクロコンパートメント内に集中させることにより、それらの濾過ステップを制限することを可能にする。  この方法は、カプセルによる対流および拡散体積のバイオリアクターでの分離のおかげで、不溶性またはカプセルのヒドロゲルのメッシュサイズよりも大きい要素からの溶解要素を含む媒体のより容易な分離を可能にする。  （通常、アルギン酸塩の場合は１５０〜２５０  ｋＤａ）。
【００８０】
次に、本発明によれば、マイクロコンパートメントは、連続供給モードの反応器で有利に使用される。  上で説明したように、保護ヒドロゲルシェルの存在は、細胞を損傷するリスクなしに、流速で培地を灌流することを可能にする。  特に、バイオリアクターに含まれる１日あたり０．００１から１００容量の細胞からなる流速で、リアクターの内部を培養培地で灌流することが可能である。
【国際調査報告】
2021524253.tif 000002
2021524253.tif 000003
2021524253.tif 000004
2021524253.tif 000005