(57)【要約】本発明は、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患及び状態における、ｍｉＲＮＡ分子、等価物又はそれらの供給源の診断及び治療的使用に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
てんかんを、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための、ｍｉＲＮＡ−１３５のアンタゴミル又はそのようなアンタゴミルの供給源であって、
前記ｍｉＲＮＡ−１３５が、ｍｉＲＮＡ−１３５分子又はｍｉＲＮＡ−１３５のｉｓｏｍｉＲであり、配列番号１４〜１７、１９〜４２、５２〜５５によって表されるシード配列の７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、又はそれらの供給源である、
ｍｉＲＮＡ−１３５のアンタゴミル又はそのようなアンタゴミルの供給源。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡ−１３５が、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのｉｓｏｍｉＲ又はｍｉＲＮＡ−１３５ｂのｉｓｏｍｉＲである、請求項１に記載の使用のための、アンタゴミル又はその供給源。
【請求項３】
ｍｉＲＮＡの供給源が、ｍｉＲＮＡの前駆体であり、少なくとも５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の使用のための、アンタゴミル又はその供給源。
【請求項４】
前記ｍｉＲＮＡ−１３５が、配列番号１４７〜２１４のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、及び／或いは
前記アンタゴミルが、配列番号２４２〜２４５、２４７〜３１４のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、及び／或いは
前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、１５〜３０ヌクレオチド長である、及び／或いは
ｍｉＲＮＡの前記供給源が、前記ｍｉＲＮＡの前駆体であり、配列番号１〜３又は１０〜１２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための、アンタゴミル又はその供給源。
【請求項５】
前記使用が、筋細胞特異的エンハンサー因子２Ａ（Ｍｅｆ２ａ）の発現を修復するためである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための、アンタゴミル又はその供給源。
【請求項６】
前記使用が、てんかん発作の数及び／又はてんかん発作の期間を低減させるためである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための、アンタゴミル又はその供給源。
【請求項７】
前記使用が、異常なニューロンの棘突起の形成を予防、遅延又は回復させるためである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための、アンタゴミル又はその供給源。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に定義されるアンタゴミル又はその供給源を含む組成物。
【請求項９】
それを必要とする対象に、請求項１〜７のいずれか一項に定義されるｍｉＲＮＡ、アンタゴミル若しくはそれらの供給源、又は請求項８に定義される組成物を投与するステップによる、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する状態若しくは疾患を、処置、治癒、回復及び／又は遅延させるための方法。
【請求項１０】
対象におけるてんかん又はてんかんに関連する疾患若しくは状態を診断するための方法であって、
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に定義されるｍｉＲＮＡ又はその供給源の発現レベルを決定するステップ、及び任意選択で、
（ｂ）請求項１〜５のいずれか一項に定義される前記ｍｉＲＮＡ又はその供給源の前記発現レベルを、前記ｍｉＲＮＡ又はその供給源の前記発現レベルについての参照値と比較するステップであって、前記参照値が、好ましくは、健康な対象における前記ｍｉＲＮＡ又はその供給源の前記発現レベルについての平均値であるステップ
を含む、方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）において、
ｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂの両方、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源、或いは
ｉｉ）Ｍｅｆ２ａ、或いは
ｉｉｉ）Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３５ａ１、或いは
ｉｖ）Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３５ａ２、或いは
ｖ）Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３５ａ１及びＰｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３５ａ２の両方
の前記発現レベルを決定することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
てんかん又はてんかんに関連する疾患若しくは状態が、前記比較が、前記ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の前記発現レベルの増加の所見をもたらす場合に、診断される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記発現レベルが、前記対象から得られた試料においてエクスビボで決定される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象におけるてんかん又はてんかんに関連する状態若しくは疾患を、処置、回復、治癒及び／又は遅延させる能力がある物質を特定するための方法であって、
（ａ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源を発現する能力がある試験細胞集団を提供するステップであって、好ましくは、前記試験集団が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙなどのニューロン細胞を含み、より好ましくは、前記試験細胞集団が、哺乳動物細胞、さらにより好ましくは、ヒト細胞を含むステップ；
（ｂ）前記試験細胞集団を前記物質と接触又はインキュベートするステップ；
（ｃ）前記物質と接触又はインキュベートされた前記試験細胞集団において、前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の前記発現レベル、或いは前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の活性又は定常状態のレベルを決定するステップ；
（ｄ）（ｃ）において決定された前記発現、活性又は定常状態のレベルを、前記物質と接触していない試験細胞集団における前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の前記発現、活性又は定常状態のレベルと比較するステップ；並びに
（ｅ）前記物質と接触した前記試験細胞集団及び前記物質と接触していない前記試験細胞集団の間の、前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の発現レベル、活性又は定常状態のレベルにおける差を生じる物質を特定するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患及び／若しくは状態を、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、
前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらのミミックであり、配列番号１４〜５６によって表されるシード配列の７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、又はそれらのアンタゴミルであり、
前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、
ｍｉＲＮＡ−１３５、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はそのミミック、又はそのアンタゴミル、或いは
ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はそのミミック、又はそのアンタゴミルである、
ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューロンの欠損を処置及び／又は診断するため、或いはニューロンの再生／発生のための、ｍｉＲＮＡ分子、等価物、アンタゴミル、又はそれらの供給源に関する。
【背景技術】
【０００２】
欠損したニューロンの機能は、いくつかの疾患又は状態に関与する。例えば、認知の喪失、アルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性障害、又は外傷性脊髄損傷は、ニューロン及びそれらの結合の喪失によってすべて特徴付けられる。現在の治療選択肢は、依然として非常に限定されており、任意の有効性があったとしても限定を示す。
【０００３】
完全なニューロンの機能を暫定的に修復するために（神経修復）、異なる治療アプローチが検討されている（Ｅｎｃｉｕら、ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１１年、第１１巻：７５頁；Ｋｒａｅｖら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１１年８月１０日、第６巻、８号）。
【０００４】
神経可塑性は、改善される可能性がある。神経可塑性は、環境の増強に、構造的及び機能的に適合する脳の能力を説明する広義の用語である。神経可塑性は、学習及び記憶形成などの認知能力のために特に重要である。
【０００５】
ニューロンの再生は、改善される可能性がある。内因性の幹細胞／前駆細胞の増殖によるか、又は欠損組織を置換する可能性がある外因性の幹細胞／前駆細胞の投与によってのいずれかで発生した、新たなニューロン又は新たな突起は、分化、生存及び既存の神経ネットワークに統合されることを暗示している。神経保護は、成長因子（神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経因子（ＧＤＮＦ））及びニューロン細胞に対するそれらの生存促進効果を使用して、促進される可能性がある。
【０００６】
神経突起伸展又は神経突起伸長は、胚発生、ニューロン分化及び神経系機能における基礎的な役割を果たす。神経突起伸長はまた、一部の神経病理学的障害並びにニューロンの損傷及び再生において重大な意味を持つ。神経突起の長さ及び数を含むさまざまな神経突起のパラメーターは、細胞内又は細胞外の環境及び薬理作用のある薬剤に敏感である。レチノイン酸、プラネキシン及び神経ペプチドのガラニンは、ニューロン細胞の神経突起伸長を誘導することが可能なこれらの候補の例である。
【０００７】
しかしながら、神経損傷後の成人におけるニューロンの再生を制御する機構及び因子は、十分に理解されていないままである。末梢神経への損傷は、神経突起伸長を刺激すること、及び損傷を受けたニューロンの生存を増強することによって、再生を促進すると考えられる感覚ニューロンの細胞体内に主要な変化を引き起こす。
【０００８】
別の神経機能障害はてんかんである。てんかんは、慢性の神経障害であり、脳内の異常及び同調的なニューロンの放電に起因して引き起こされる、反復性の非挑発性のてんかん発作によって特徴付けられる（Ｃｈａｎｇ及びＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ、２００３年）。いくつかの場合において、てんかんは、主にイオンチャネルをコードする遺伝子の単一遺伝子の変異によって引き起こされるが、ほとんどのてんかんの理由は分かっていない。側頭葉てんかん（ＴＬＥ）は、てんかんのサブクラスであり、てんかんのすべての患者の約３分の１を占める（Ｅｎｇｅｌ、２００１年）。海馬硬化を伴う内側側頭葉てんかん（ＭＴＬＥ−ＨＳ）は、いくつかのサブグループで構成されており、最も重症である。ＭＴＬＥ−ＨＳは、診断的、臨床的及び病理学的な特性（ニューロンの喪失、グリオーシス及び軸索の出芽）の典型的なセットを示し、薬理学的な処置に最も抵抗性であることが知られている（Ｗｉｅｓｅｒ及びＥｐｉｌｅｐｓｙ、２００４年）。多くの患者について、海馬の外科的除去が、てんかん発作の調節を達成するための唯一の代替手段である（Ｓｅｍａｈら、１９９８年）。ＴＬＥの基本的な病理学的な機構は、大部分が知られていない。抗けいれん薬及び抗てんかん薬が、これらの患者を処置するために使用される。しかし、残念ながら、これらは、てんかん発作の出現を低減するのみであるが、基本的な病態生理学を処置しない。そのため、この能力が失われた状態に対する新規な処置戦略を開発する緊急の必要性が存在する。疾患修飾薬を開発する必要性は、研究コミュニティ及び臨床診療において次第に認識されている（Ｌｏｓｃｈｅｒら、２０１３年）。
【０００９】
ＭＴＬＥの基本的な病理学的な機構は、依然として大部分が知られていない。てんかんの動物モデル及びヒト組織の研究は、てんかん発生が、分子、細胞及び神経回路網の代替のカスケードを含むことを示唆している（Ｒａｋｈａｄｅ及びＪｅｎｓｅｎ、２００９年）。トランスクリプトームから出発するアプローチは、遺伝子発現のパターンがヒトＭＴＬＥにおいて（ｖａｎ  Ｇａｓｓｅｎら、２００８年）、ＴＬＥについての動物モデルにおけるてんかん発生の間に（Ｇｏｒｔｅｒら、２００６年；Ｐｉｔｋａｎｅｎ及びＬｕｋａｓｉｕｋ、２００９年；Ｒａｋｈａｄｅ及びＪｅｎｓｅｎ、２００９年）、有意に変化することを明らかにした。この調節不全は、炎症、グリオーシス、シナプス構造及びニューロンの機能を含む経路を制御する遺伝子発現を正常に調節する全遺伝子制御ネットワークに影響する。これらの機構が変化したか否か又はどのように変化したかについての洞察は、ＴＬＥの病態形成への重要な新たな洞察を提供し得るだけでなく、治療についての新規な標的をもたらす可能性がある。
【００１０】
てんかんを管理するための公知の薬物の例は、ラモトリジン、フェニトイン、カルバマゼピン、レベチラセタム、オクスカルバゼピン、クロバザム、ジアゼパム、ロラゼパム、セロクエル、プレガバリン及びレストリルである。これらの薬物は、一般に、抗てんかん発作剤又は抗けいれん剤である。例えば、ラモトリジンは、ＣＮＳの２つのドミナントな興奮性神経伝達物質である、グルタミン酸及びアスパラギン酸の放出を抑制し；フェニトインは、電位依存性ナトリウムチャネルの電位依存性遮断を引き起こすことによって、てんかん発作を防ぐと考えられる。カルバマゼピン及びオクスカルバゼピンは、ナトリウムチャネル遮断薬であり、レベチラセタムは、シナプス前カルシウムチャネルを阻害する。クロバザムは、ＧＡＢＡＡ受容体アゴニストであり、ナトリウムチャネル及び電位感受性カルシウムチャネルに影響を与え得る。これらの薬物は、一般に、それらが、例えば、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ５を介して代謝されるので、薬物-薬物相互作用を引き起こす傾向がある。また、これらは、主に症状を処置し、てんかんの根本原因を処置しない。
【００１１】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、およそ２０〜２２ヌクレオチド長の小さなＲＮＡ分子である。これらは、翻訳抑制因子として機能し、それによって、多くの細胞プロセスを調節する。ヒトにおいて、おおよそ１５００個のｍｉＲＮＡが特定されており、そのうち、およそ５０％が脳に存在する。これは、これらのｍｉＲＮＡがすべての種類のニューロンの発達及び維持の一部であり；しかしながら、ほとんどのｍｉＲＮＡの実際の機能は知られていないことを示唆する。いくつかの脳特異的ｍｉＲＮＡが、記載されており、そのうち、ｍｉＲ−１２４が最も一般的である。飼育ブタは、ヒトと比較した場合の脳の発達及び成長曲線の両方におけるその類似性に起因して、ヒトに関連する神経学的研究のための優れた代替の大型哺乳動物モデルであると考えられる。これらの類似性を考慮して、ブタの脳の発達の間のマイクロＲＮＡの発現を調べる研究が、ヒトの脳におけるマイクロＲＮＡの発現プロファイル及び役割を予測するために行われている（Ｐｏｄｏｌｓｋａら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１年１月６日；第６巻（１号）：ｅ１４４９４、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１４４９４）。多数の発達段階、又はｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−２２１及びｍｉＲ−２２２を含む組織特異的マイクロＲＮＡが、マイクロアレイ分析によって検出された。しかしながら、ニューロンの発達における生物学的機能は、今までのところ特定されていない。少なくとも２つのｍｉＲ−１３５、すなわち、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂが知られている。ｍｉＲ−１３５ファミリーの主な記載は、結腸直腸がんにおける大腸腺腫性ポリポーシス遺伝子の制御など、がん細胞において報告されている（Ｍｅｉｊｅｒ及びＡｇａｍｉ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８年；第６８巻（１４号）：５７９５〜８０２頁）。大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子の不活性化は、結腸直腸の腫瘍発生における主要な起因事象である。ＡＰＣにおけるほとんどの変異は、β−カテニン結合部位を喪失した短縮タンパク質をもたらす未成熟終止コドンを生じる。ＡＰＣフリーβ−カテニンは、Ｗｎｔシグナル伝達経路を刺激し、標的遺伝子の活性な転写をもたらす。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、ＡＰＣの３’非翻訳領域を標的にし、その発現を抑制し、下流のＷｎｔ経路の活性を誘導する。興味深いことに、結腸直腸腺腫及び結腸直腸癌腫におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのかなりの上方制御は、低いＡＰＣ  ｍＲＮＡレベルと有意に相関する。この遺伝的相互作用は、ＡＰＣの変異状態に関わらず、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを発現する成熟がん細胞株においても保たれる。ｍｉＲ−１３５ａは、腫瘍細胞における抗がん薬耐性に寄与することも報告されている（Ｈｏｌｌｅｍａｎら、２０１１年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）。ｍｉＲＮＡアレイを使用して、パクリタキセル耐性細胞株において異なって発現したｍｉＲＮＡについてスクリーニングされた。ｍｉＲＮＡ−１３５ａの役割は、パクリタキセル耐性のインビボモデルにおいて評価された。インビトロ又はインビボのいずれかで確立されたパクリタキセル耐性細胞株において、ｍｉＲ−１３５ａの妨害は、パクリタキセルに誘導される細胞死に対する細胞株の耐性を感作させた。ｍｉＲ−１３５ａの上方制御は、大腸腺腫性ポリポーシス遺伝子（ＡＰＣ）の発現の低減に関連した。ＡＰＣのノックダウンは、親細胞株におけるパクリタキセル耐性を増加させた。これらの結果は、パクリタキセル耐性が、インビトロ及びインビボの両方で、ｍｉＲ−１３５ａの上方制御に関連することを示す。
【００１２】
ｍｉＲＮＡ−１２４は、神経が損傷した運動ニューロンにおいて下方制御され、これは、潜在的にＫＬＦ６及びＳＴＡＴ３についてのｍＲＮＡを標的にする（Ｎａｇａｔａら、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３．１０．０５５）。また、ＨＤＡＣ５が神経突起の伸長の阻害剤としての機能を果たすこと、及びＨＤＡＣ５が脳で豊富なマイクロＲＮＡのｍｉＲ−１２４によって制御されることを実証した（Ｇｕら、ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｃｐ．２５９２７）。加えて、プラナリア（扁形動物）における脳の再生は、遺伝子発現の精密な時間空間的な調節によって媒介され、複数の態様のニューロン新生のために重要である。プラナリアの脳の再生におけるマイクロＲＡＮのｍｉＲ−１２４ファミリーの役割は、Ｓａｓｉｄｈａｒａｎら（ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１４４７５８）によって報告されている。ｍｉＲ−１２４ファミリー（ｍｉＲ−１２４）は、動物において高度に保存され、ニューロン新生を制御する。
【００１３】
ニューロン細胞の発生又は再生を評価するために良好な診断マーカー、及びニューロン細胞の発生、再生又は機能性を促進するための良好な戦略についての必要性が存在する。
【００１４】
〔発明の説明〕
本発明は、ニューロン細胞の発生又は再生を促進し、かつニューロン細胞の機能活性の修復を促進し、かつニューロンの欠損に関連する疾患及び／又は状態の治療及び診断活動において使用することができる、ｍｉＲＮＡのファミリーに注目した。
【００１５】
本発明は、本明細書において特定される、ｍｉＲＮＡ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ若しくはアンタゴミル、又はそれらの供給源のいくつかの使用を包含する。本発明は、新たに特定された、ｍｉＲＮＡ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ又はアンタゴミル自体のそれぞれ、及び本発明による使用のための、これらのｍｉＲＮＡ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ又はアンタゴミルも包含する。
第１の態様において、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患及び／若しくは状態を、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、
前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらのミミックであり、配列番号１４〜５６によって表されるシード配列の７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、又はそれらのアンタゴミルであり、
前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、
ｍｉＲＮＡ−１３５、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はそのミミック、又はそのアンタゴミル、或いは
ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はそのミミック、又はそのアンタゴミルである、
ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源が提供される。使用のためのこのようなｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源は、本明細書において、本発明による、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源と称される。好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源は、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患及び／若しくは状態を、処置、回復、治癒及び／又は遅延させるためのものである。
好ましい実施形態において、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患及び／若しくは状態を、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらのミミックであり、配列番号１４〜５６によって表されるシード配列の７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含むシード配列を有するオリゴヌクレオチド、又はそれらのアンタゴミルであり、
前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、
ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はそのミミック、又はそのアンタゴミル、或いは
ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はそのミミック、又はそのアンタゴミル、或いは
ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はそのミミック、又はそのアンタゴミルである、
ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源が提供される。
特に好ましい実施形態において、本発明は、てんかんを、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための、ｍｉＲＮＡ−１３５のアンタゴミル又はそのようなアンタゴミルの供給源であって、
前記ｍｉＲＮＡ−１３５が、ｍｉＲＮＡ−１３５分子又はｍｉＲＮＡ−１３５のｉｓｏｍｉＲであり、配列番号１４〜１７、１９〜４２、５２〜５６によって表されるシード配列の７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、又はそれらの供給源である、
ｍｉＲＮＡ−１３５のアンタゴミル又はそのようなアンタゴミルの供給源を提供する。
好ましい実施形態において、本発明は、本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのｉｓｏｍｉＲ若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子のｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ  ｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのアンタゴミル、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂのアンタゴミル、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのアンタゴミル、又はそれらのミミックである、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源を提供する。より詳細には、好ましい実施形態において、本発明は、本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、
ｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのアンタゴミル、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂのアンタゴミル、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのアンタゴミル、若しくはそれらのミミック、或いは
ｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのｉｓｏｍｉＲ、若しくはそれらのミミック、或いは
ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのｉｓｏｍｉＲ若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂのｉｓｏｍｉＲ、又は任意選択でそれらのミミック、或いは
ｉｖ）ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミック、或いは
ｖ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａのアンタゴミル、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂのアンタゴミル、又はそれらのミミック
である、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源を提供する。
【００１６】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、ｍｉＲＮＡの供給源が、ｍｉＲＮＡの前駆体であり、少なくとも５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、好ましくは、アンタゴミルの供給源が、少なくとも５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源を提供する。
この態様の好ましい実施形態において、好ましくは、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患及び／若しくは状態を、予防、処置、回復、治癒及び／又は遅延させるための医薬としての使用のための、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル又はそれらの供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡ分子であるｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、前記ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ又はそれらの前記供給源を含む組成物が提供される。さらに好ましい実施形態において、本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックであり、
ｍｉＲＮＡの供給源が、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、又はｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、又はｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐの前駆体であり、少なくとも５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、
本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源が提供される。
【００１７】
この態様の好ましい実施形態において、好ましくは、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患及び／若しくは状態を、予防、処置、回復、治癒及び／又は遅延させるための医薬としての使用のための、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル又はそれらの供給源、より好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル又はそれらの供給源、より好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源を含む組成物が提供される。さらに好ましい実施形態において、本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル又はそれらのミミックであり、及び／或いはｍｉＲＮＡの供給源が、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐの前駆体であり、少なくとも５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源が提供される。
【００１８】
この態様の好ましい実施形態において、好ましくは、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患及び／若しくは状態、好ましくはてんかんを、予防、処置、回復、治癒及び／又は遅延させるための医薬としての使用のための、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル、又はそれらの供給源、より好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂのアンタゴミル又はそれらの供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル又はそれらの供給源、より好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂのアンタゴミル又はそれらの供給源を含む組成物を提供する。さらに好ましい実施形態において、本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル又はそれらのミミックであり、並びに／或いはｍｉＲＮＡの供給源が、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子の前駆体であり、少なくとも５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源が提供される。
【００１９】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、真核生物における遺伝子発現の制御因子として機能する、１７〜２５個のヌクレオチドの小さなＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる長い一次転写物の部分として、核において最初に発現する。核の内部で、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、酵素ドローシャによって部分的に消化されて、活性な分子であるより短い成熟ｍｉＲＮＡに、ダイサーによってさらにプロセシングされるために細胞質に輸送される、６５〜１２０ヌクレオチド長のヘアピン前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を形成する。動物において、これらの短ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）への特異的対形成の一次決定因子であると思われる、５’近位の「シード」領域（一般に、２〜８個のヌクレオチド）を含む。より詳細な説明は、一般的定義に設けた部分において示す。
【００２０】
ｍｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡのミミック、若しくはｍｉＲＮＡのｉｓｏｍｉＲ、若しくはｍｉＲＮＡのアンタゴミル、又はこれらのいずれかの供給源に関して下記に示されるそれぞれの定義は、本出願の、特定された、ｍｉＲＮＡ、分子、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはアンタゴミル、又はそれらの供給源のそれぞれ：ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはミミック、若しくはアンタゴミル、又はそれらの供給源について使用される。好ましい成熟又はミミック配列（配列番号５〜９として表２に特定される）、シード配列（配列番号１４〜５６として表４及び５に特定される）、ｉｓｏｍｉＲ配列（配列番号５７〜２４１として表５及び６に特定される）、アンタゴミル配列（配列番号２４２〜３４１として表６に特定される）、又はそれぞれの前記ｍｉＲＮＡ分子又はそれらのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくはアンタゴミルの供給源配列（表１（配列番号１〜４のＲＮＡ前駆体）又は表３（配列番号１０〜１３のＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡ）において特定される）は、対応する表において特定される。
【００２１】
他の指示がない限り本出願の全文内で、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子、ｍｉＲ、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル若しくはミミック、又はそれらの供給源若しくは前駆体と名付けられることもある。本明細書において特定されるそれぞれの配列は、本出願の文章中で使用される配列番号として、又は配列表中の対応する配列番号として特定されることがある。本出願において特定される配列番号は、前記ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル、ミミック、又は前駆体などのそれらの供給源の塩基配列を指すことがある。
【００２２】
すべての配列番号について、当業者には、いくつかの塩基が交換可能であることは公知である。例えば、Ｔのそれぞれの例は、Ｕによって個々に置換することができ、逆もまた同様である。成熟ｍｉＲＮＡについて提供されるＲＮＡ配列は、例えば、ＲＮＡヌクレオチドの代わりにＤＮＡヌクレオチドを使用して、ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして合成することができる。このような場合において、チミン塩基は、ウラシル塩基の代わりに使用することができる。或いは、デオキシリボースのスキャフォールドにおけるチミン塩基を使用することができる。当業者は、塩基対形成の挙動が正確な配列よりも重要であること、並びにＴ及びＵがこのような目的のために一般に交換可能であることを理解する。したがって、アンタゴミルは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又は本明細書において後で定義されるさらに修飾されたオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。したがって、ミミックは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又は本明細書において後で定義されるさらに修飾されたオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。
【００２３】
ｍｉＲＮＡアンタゴミルも本発明において言及される。この用語は、本明細書において特定される治療適用において使用するために、その発現が上方制御／過剰発現／増加せず、及び／又はその活性が増加しない、本発明のｍｉＲＮＡ分子に関する。対照的に、これらのｍｉＲＮＡ分子の内因性発現は、下方制御／減少することを必要とし、及び／又はこのようなｍｉＲＮＡ分子の活性は、治療的に望ましい効果を得るために、減少又は低減又は阻害される必要がある。これは、好ましくは、アンタゴミルを使用して、本明細書において後で説明されるようにして行われる。したがって、本発明において、参照が治療的使用におけるこれらのｍｉＲＮＡ分子のいずれかについて行われる場合、これは、常に、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子のアンタゴミル、又はこれらのｍｉＲＮＡのアンタゴミルのミミック、又はこれらのｍｉＲＮＡのアンタゴミルの供給源の使用を指す。したがって、これがアンタゴミルを指す場合、これは、常に、本明細書において示される、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子のアンタゴミル、又はミミック、或いはそれらの供給源の使用を指す。ｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はこれらのいずれかの供給源に関して本明細書において示される定義のそれぞれは、本段落において定義されるアンタゴミルとして使用されるｍｉＲＮＡ分子のいずれかについても適用され得る。ｍｉＲＮＡ分子の所与のアンタゴミルに関して本明細書において示されるそれぞれの定義は、本明細書においてそれぞれ定義される、別個のｍｉＲＮＡ分子の他のアンタゴミルについても適用できる。アンタゴミルは、好ましくは、ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらのミミックに相補的又は逆相補的である。
【００２４】
本発明の文脈において、ｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのアンタゴミルは、一般的定義に設けた部分においてさらに定義される、合成ｍｉＲＮＡ、又は天然ｍｉＲＮＡ、又は組換えｍｉＲＮＡ、又は成熟ｍｉＲＮＡ、又は成熟ｍｉＲＮＡの部分、又はヒトｍｉＲＮＡであり得、又はヒトｍｉＲＮＡに由来し得る。ヒトｍｉＲＮＡ分子は、ヒトの細胞、組織、臓器又は体液において見られるｍｉＲＮＡ分子（すなわち、内因性ヒトｍｉＲＮＡ分子）である。ヒトｍｉＲＮＡ分子はまた、ヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加によって内因性ヒトｍｉＲＮＡ分子に由来する、ヒトｍｉＲＮＡ分子であってもよい。ｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのアンタゴミルは、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。
【００２５】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、又はそれらのｉｓｏｍｉＲは、６〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、１２〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、１５〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。
【００２６】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子のアンタゴミルは、８〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、１２〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。
【００２７】
好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子、又はミミック若しくはｉｓｏｍｉＲは、前記ｍｉＲＮＡ分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲのシード配列（表４及び５は、配列番号１４〜５６として本明細書において特定されているｍｉＲＮＡ分子のそれぞれの好ましいシード配列を示す）に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含むか、又はそれらのアンタゴミルである。好ましくは、この実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子、又はミミック若しくはｉｓｏｍｉＲは、６〜３０ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ分子、又はミミック、又はｉｓｏｍｉＲのシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含むか、或いは同じ長さのそれらのアンタゴミルである。さらにより好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、又はミミック若しくはｉｓｏｍｉＲは、１５〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、シード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、さらにより好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有するか、或いは同じ長さのそれらのアンタゴミルである。
【００２８】
この文脈において、シード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含むことは、最大で１つの位置においてシード配列と異なる７個のヌクレオチドの連続的な伸展を指すことを意図する。或いは、これは、単一のヌクレオチドの脱落によってのみシード配列と異なる６個のヌクレオチドの連続的な伸展を指すことができる。本出願全体にわたって、より好ましいｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、又はそれらの前駆体は、指示されたシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの７個すべてを含むか、或いは言い換えれば、前記シード配列と１００％の配列同一性を有する。好ましくは、ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ又はミミックに含まれる場合、シード配列は、ヌクレオチド番号１、２又は３で始まり、ヌクレオチド番号７、８、９、１０又は１１で終わり；最も好ましくは、このようなシード配列は、ヌクレオチド番号２で始まり、ヌクレオチド番号８で終わる。
【００２９】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１３５は、ｍｉＲＮＡ−１３５分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックであり、配列番号１４〜１７又は１９〜４２として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、アンタゴミルについて、配列番号１４〜１７又は１９〜４２として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個に逆相補的な配列が、代わりに含まれる。好ましいｍｉＲＮＡ−１３５のアンタゴミルは、上記のｍｉＲＮＡ−１３５分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックに相補的又は逆相補的である。
【００３０】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１３５ａは、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックであり、配列番号１４又は１５又は１９〜３１として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、アンタゴミルについて、配列番号１４又は１５又は１９〜３１として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個に逆相補的な配列が、代わりに含まれる。好ましいｍｉＲＮＡ−１３５ａのアンタゴミルは、上記のｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックに相補的又は逆相補的である。
【００３１】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１３５ｂは、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックであり、配列番号１６又は１７又は３２〜４２として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、アンタゴミルについて、配列番号１６又は１７又は３２〜４２として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個に逆相補的な配列が、代わりに含まれる。好ましいｍｉＲＮＡ−１３５ｂのアンタゴミルは、上記のｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックに相補的又は逆相補的である。
【００３２】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐは、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックであり、配列番号１８又は４３〜５１として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、アンタゴミルについて、配列番号１８又は４３〜５１として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個に逆相補的な配列が、代わりに含まれる。好ましいｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのアンタゴミルは、上記のｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックに相補的又は逆相補的である。
【００３３】
本発明者らは、ｍｉＲＮＡ−１２４分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックが本発明の部分として有利に使用することができることを見出した。したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１２４分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックは、配列番号３４９〜３５０として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、より好ましくは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、任意選択で配列番号３４７〜３４８のいずれか１つによって表される全成熟配列にわたって少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
【００３４】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、配列番号１４〜５６として表４及び５において特定される所与のシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、配列番号１４７〜２４１として表６において特定される全成熟配列にわたって少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
【００３５】
したがって、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個以下のヌクレオチドの長さを有し、配列番号１４〜５６として表４及び５において特定される所与のシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、配列番号１４７〜２４１として表６において特定される全成熟配列にわたって少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
【００３６】
別の好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子のｉｓｏｍｉＲは、全ｉｓｏｍｉＲ配列にわたって少なくとも７０％の同一性を有する（表５は、配列番号５７〜１４６として特定される成熟ｍｉＲＮＡのそれぞれの好ましいｉｓｏｍｉＲを示す）。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれよりも高い。好ましくは、この実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子のｉｓｏｍｉＲ又はそのミミックは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。
【００３７】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１３５分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックは、配列番号１４〜１７として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、及び／或いは配列番号１４７〜２１４にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、及び／或いは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。
【００３８】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックは、配列番号１４又は１５又は１９〜３１として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、及び／或いは配列番号１４７〜１８７にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、及び／或いは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。
【００３９】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックは、配列番号１６又は１７又は３２〜４２として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、及び／或いは配列番号１８８〜２１４にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、及び／或いは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。
【００４０】
したがって、好ましいｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックは、配列番号１８又は４３〜５１として特定されるシード配列に存在する７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含み、及び／或いは配列番号２１５〜２４１にわたって少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、及び／或いは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。
【００４１】
別の好ましいｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックは、シード配列（配列番号１４〜５６として表４及び５に特定される）、又は成熟配列（配列番号５〜９として表２に特定される）、又は前駆体配列（配列番号１〜４として表１に特定される）、又はＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡ（配列番号１０〜１３として表３に特定される）、又はｉｓｏｍｉＲ配列（配列番号５７〜１４６として表５に特定される）と、少なくとも６０％の同一性を有する。同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％であってもよい。同一性は、好ましくは、所与の表において特定される全配列番号について評価される。しかしながら、同一性は、所与の配列番号の部分について評価されてもよい。部分は、配列番号の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。
【００４２】
前駆体配列は、成熟プロセスに応じて２つ以上のｉｓｏｍｉＲ配列をもたらしてもよく、例えば、ある特定の組織において、複数のｉｓｏｍｉＲが特定されているｍｉＲＮＡ−１３５ａを参照されたい（表５）。同じ前駆体から生じるｍｉＲＮＡ分子ステムのｉｓｏｍｉＲ、及び逆に前駆体は、複数のｍｉＲＮＡ分子をもたらすことができ、その１つは、基準ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−１３５ａ−５ｐ、配列番号５など）と称され、他のものは、ｉｓｏｍｉＲ（配列番号５７〜８８によって表されるオリゴヌクレオチドなど）と称される。基準ｍｉＲＮＡ及びそのｉｓｏｍｉＲの間の差は、それらの普及のみにおいて存在すると言うことができ、一般に、最も普及している分子は、基準ｍｉＲＮＡと呼ばれる一方、他のものはｉｓｏｍｉＲである。細胞の種類、環境、そのライフサイクルにおける位置、又は病理学的状態に応じて、個々のｉｓｏｍｉＲ又はｍｉＲＮＡは、異なるレベルで発現することができ；発現は、集団の群又は性別の間でさらに異なり得る（Ｌｏｈｅｒら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１４年）ＤＯＩ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２４０５）。
【００４３】
ミミックは、ｍｉＲＮＡ分子と同様又は同一の活性を有する分子である。この文脈において、同様の活性は、活性の許容できるレベルと同じ意味が与えられる。ミミックは、機能的決定において、アンタゴミルとは逆である。好ましいミミックは、合成オリゴヌクレオチドであり、好ましくは、ロックド核酸モノマーなどの１つ又は複数のヌクレオチドアナログ、及び／又はスキャフォールド修飾を含むヌクレオチド、及び／又は塩基修飾を含むヌクレオチドを含む。ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック又はそれらの供給源のアンタゴミルは、したがって、それが由来する対応するｍｉＲＮＡ分子の１つと反対又は逆の活性を有する分子である。ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ又はミミックのアンタゴミルはまた、前記ｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはミミックの活性に拮抗し、又は静め、又は減少させることが可能な分子として定義されてもよい。それが由来する対応するｍｉＲＮＡ分子の１つと反対若しくは逆の活性、又はそれが由来する前記ｍｉＲＮＡ分子の活性に拮抗することが可能な活性は、好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくはミミック、又はそれらの供給源の活性を減少させることが可能な活性である。この文脈において、減少は、前記ｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはミミック、又はそれらの供給源の活性の、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の減少を意味する。アンタゴミルのミミックは、本明細書において後で定義されるような化学修飾を有する合成オリゴヌクレオチドであり得る。好ましい活性及び前記活性を評価するための好ましいアッセイは、本明細書において後で定義される。
【００４４】
ｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源のアンタゴミルは、核酸、好ましくは、対応するｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックの部分に相補的又は逆相補的であるＲＮＡであってもよい。アンタゴミルは、好ましくは、対応するｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックの部分とハイブリダイズする。好ましいアンタゴミルは、配列番号１４７〜２４１として表６において特定される成熟ｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲの配列の部分と相補的又は逆相補的である。部分は、配列番号の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。好ましい実施形態において、アンタゴミル又はそのミミックは、シード配列、或いはｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのミミックの前記シード配列の部分と相補的又は逆相補的である。部分は、シード配列の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。
【００４５】
好ましくは、アンタゴミルは、８〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、１２〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、表６（配列番号１４７〜２４１として）において特定された成熟ｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲの配列の部分と相補的又は逆相補的である。部分は、所与の配列の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。
【００４６】
好ましくは、アンタゴミルは、８〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、１２〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、シード配列（配列番号１４〜５６として表４及び５において特定される）の部分と相補的又は逆相補的である。部分は、シード配列の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。
【００４７】
好ましくは、アンタゴミル又はそのミミックは、アンタゴミル配列（配列番号２４２〜３４１として表６において特定される）と少なくとも６０％の同一性を有する。同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％であってもよい。同一性は、好ましくは、表６において特定される全配列番号について評価される。しかしながら、同一性は、所与の配列番号の部分について評価されてもよい。部分は、配列番号の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。
【００４８】
好ましくは、アンタゴミルは、８〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、１２〜２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは、前記分子は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、アンタゴミル配列（配列番号２４２〜３４１として表６において特定される）と少なくとも６０％の同一性を有する。同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％であってもよい。同一性は、好ましくは、表６において特定される全配列番号について評価される。しかしながら、同一性は、所与の配列番号の部分について評価されてもよい。部分は、配列番号の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を意味し得る。
【００４９】
ｍｉＲＮＡ分子のアンタゴミル、又はミミック、又はそれらの供給源のヌクレオチドの化学構造は、安定性、結合親和性及び／又は特異性を増加させるために修飾されてもよい。前記アンタゴミルは、ＲＮＡ分子若しくは好ましくは修飾ＲＮＡ分子を含んでいてもよく、又はこれらからなっていてもよい。好ましい修飾ＲＮＡ分子は、修飾糖を含む。このような修飾の一例は、ヌクレアーゼ耐性及びＲＮＡとの結合親和性を改善するための、核酸における２’−Ｏ−メチル若しくは２’−Ｏ−メトキシエチル基、又は２’フッ素基の導入である。このような修飾の別の例は、相補的な一本鎖ＲＮＡに対する親和性を改善するための、核酸の２’−Ｏ原子及び４’−Ｃ原子を連結して立体構造をロックするメチレン架橋の導入（ロックド核酸（ＬＮＡ））である。第３の例は、ヌクレアーゼの攻撃に対して安定性を改善するための、ＲＮＡ鎖における核酸の間のリンカーとしてのホスホロチオエート基の導入である。第４の修飾は、安定性及び細胞送達を改善するための、コレステロールなどの分子の３’末端における脂溶性部分のコンジュゲーションである。好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子のアンタゴミルは、Ｏｂａｄらに記載のタイニーＬＮＡと称される、完全ＬＮＡ修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドからなる。本明細書において定義されるアンタゴミルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の糖修飾を含んでいてもよい。１つのアンタゴミルに２つ以上の別個の糖修飾を導入することも本発明に包含される。好ましい実施形態において、アンタゴミルは、分子の３’末端におけるコレステロールなどのコンジュゲートされた脂溶性部分を有し、ＬＮＡなどの修飾糖を含む。
好ましい実施形態において、この態様は、本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、
前記ｍｉＲＮＡが、配列番号１４７〜２４１のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、
前記アンタゴミルが、配列番号２４２〜３４１のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、及び／或いは
前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、１５〜３０ヌクレオチド長である、及び／或いは
ｍｉＲＮＡの前記供給源が、前記ｍｉＲＮＡの前駆体であり、配列番号１〜４又は１０〜１３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、
ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はその供給源を提供する。
さらにより好ましくは、この態様は、本発明による使用のため、好ましくは、てんかんを、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための、アンタゴミル又はその供給源であって、
前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ−１３５であり、配列番号１４７〜２１４のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、及び／或いは
前記アンタゴミルが、配列番号２４２〜２４５、２４７〜３１４のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、及び／或いは
前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、１５〜３０ヌクレオチド長である、及び／或いは
ｍｉＲＮＡの前記供給源が、前記ｍｉＲＮＡの前駆体であり、配列番号１〜３又は１０〜１２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、
アンタゴミル又はその供給源を提供する。
【００５０】
本明細書において特定されるｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのアンタゴミルのそれぞれは、それらが由来する所与のｍｉＲＮＡの活性の許容できるレベルを有する。許容できるレベルの活性は、好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのアンタゴミルが、前記ｍｉＲＮＡの前記活性の許容できるレベルを依然として示すことが可能であることである。所与のｍｉＲＮＡ、又はミミック、又はｉｓｏｍｉＲ、又はアンタゴミルの活性は、例えば、ニューロン細胞の発生若しくは再生の検出可能な促進又は誘導を示すか、或いは本明細書において後で定義される、ニューロン細胞内又は脳において正常な帯電（放電）を修復する能力である。活性の許容できるレベルは、好ましくは、それらが由来するｍｉＲＮＡ、又はそれらが模倣するｍｉＲＮＡ、又はそれらがｉｓｏｍｉＲ若しくはアンタゴミルであるｍｉＲＮＡの活性の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％である。ｉｓｏｍｉＲは、ある特定の状況下で、基準ｍｉＲＮＡよりも活性であってもよい。ｉｓｏｍｉＲは、分解に対して耐性の増加を有していてもよい。
【００５１】
本明細書において定義される、ｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはアンタゴミル、又はそれらのミミックのいずれか（すなわち、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４）の好ましい活性は、本明細書において後で定義される対象におけるニューロン細胞の発生若しくは再生の検出可能な促進又は誘導を示すことである。この文脈において、好ましいｍｉＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、又はｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、又はｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐの、ｍｉＲＮＡ、又は等価物、又はｉｓｏｍｉＲ、又はミミックである。好ましい活性は、クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）の発現を抑制する能力である。この態様の好ましい実施形態において、本発明は、本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、前記使用が、クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）の発現を抑制するためである、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源を提供する。好ましい実施形態において、ＫＬＦ４は、実施例において使用される、例えば、ウエスタンブロットなどの手法によって、タンパク質として検出される。他の好ましい実施形態において、ＫＬＦ４は、ｍＲＮＡレベルの定量化によって、例えば、ｑＲＣＲによって、間接的に検出される。
【００５２】
本明細書において定義される、アンタゴミル、ｍｉＲＮＡ分子、異性体、若しくはそれらのミミック、又はそれらの供給源のいずれか（すなわち、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのアンタゴミル）の好ましい活性は、本明細書において後で定義される、対象におけるニューロン細胞の発生若しくは再生の検出可能な促進又は誘導を示すことである。本明細書において定義される、アンタゴミル、若しくはそれらのミミック、又はそれらの供給源のいずれか（すなわち、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ又はｍｉＲＮＡ−１３５ｂのアンタゴミル）の好ましい活性は、正しいニューロンの帯電（放電）の検出可能な促進を示すことである。
【００５３】
本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源のいずれかの好ましい活性は、ニューロン細胞内又は脳において正常な帯電（放電）を促進する能力である。これは、てんかんを、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるために有用である。このような促進は、好ましくは、正しいニューロンの帯電（放電）の増加をもたらし、これは、正しい若しくは改善されたニューロンの帯電（放電）を示す細胞の量の増加であり得るか、又は細胞の一組の集団における正しい帯電（放電）挙動の増加であり得る。この文脈において、好ましいｍｉＲＮＡ又はアンタゴミル分子は、ｍｉＲＮＡ−１３５の、ｍｉＲＮＡ、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはアンタゴミル、又はそれらの前駆体である。より好ましいのは、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのアンタゴミル、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのアンタゴミルのミミック、若しくはそれらの前駆体、又はｍｉＲＮＡ−１３５ｂのアンタゴミル、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂのアンタゴミルのミミック、若しくはそれらの前駆体などの、ｍｉＲＮＡ−１３５のアンタゴミル、又はそれらのミミック、又はそれらの前駆体である。
【００５４】
本明細書において使用される場合、てんかんは、てんかん発作によって特徴付けられる慢性の神経障害の多様なセットを有する状態を指す。このようなてんかん発作は、反復性及び非挑発性であり得る。これらは、代わりに、脳の変化と組み合わされた単一のてんかん発作を構成し、これにより、将来のてんかん発作の機会を増加させることがある。てんかんの発作は、例えば、脳における、異常、過剰又は過剰に同調的な、ニューロンの活性から生じ得る。てんかんは、てんかん発作の種類又は形態により、さらに分類され得る。てんかん発作の種類は、典型的には、脳内のてんかん発作源が局在型（部分的又は限局的なてんかん発作の発症）又は分散型（全般てんかん発作）であるか否かにより、整理される。部分てんかん発作を含むてんかんは、意識が影響を受ける程度でさらに分けることができる。意識が影響を受けない場合、その結果、これは、単純な部分てんかん発作を含むてんかんである。意識が影響を受ける場合、これは、複雑な、部分又は精神運動性てんかん発作を含むてんかんである。部分てんかん発作は、典型的には、脳内で広がってもよく、すなわち、二次性全般化をもたらしてもよい。全般てんかん発作は、典型的には、意識の喪失を含み、身体に対する影響により、さらに分けることができる。例としては、非存在（小発作）、ミオクローヌス性、間代性、強直性、強直間代性（大発作）及び緊張性のてんかん発作が挙げられる。
【００５５】
以下は、本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源のため；より好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１３５のアンタゴミル、又はそのようなアンタゴミルの供給源のためであって、前記ｍｉＲＮＡ−１３５が、ｍｉＲＮＡ−１３５分子又はｍｉＲＮＡ−１３５のｉｓｏｍｉＲであり、配列番号１４〜１７、１９〜４２、５２〜５６によって表されるシード配列の７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、又はそれらの供給源であり；より好ましくは、使用が、てんかんを、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための、好ましい指示及び使用である。
【００５６】
ｉ）本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、使用が、てんかん発作の伝搬を低減、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるためである、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源。このような使用は、単一のてんかん重積状態を超えるてんかんの処置のためである。この文脈において、てんかん重積状態は、３０分を超えて、好ましくは、５分を超えて持続する単一のてんかん発作のように、又は３０分以内、好ましくは、５分間の間に、対象がその間に正常に戻ることのない、２回以上のてんかん発作のように見られるものとする。このような処置は、それが、症状を抑制する代わりにてんかんの根本原因を除去することによって、必要な薬物レジメンを低減させるので、有益である。
【００５７】
ｉｉ）本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、使用が、てんかん発作の数を低減させるためである、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源。てんかん発作の頻度の低減は、１週間以内若しくは１日以内などの所与の期間内に複数のてんかん発作に苦しんでいるか、又は苦しむと予期される対象にとって、或いはチャネル遮断薬などの公知の医薬に応答しない対象にとって、有益であり得る。てんかん発作の数は、好ましくは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％まで、より好ましくは、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％まで、さらにより好ましくは、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は１００％まで、例えば少なくとも７５％まで低減される。このような低減は、好ましくは、投与の少なくとも１、２、３、４、５又は６日後、より好ましくは、投与の少なくとも３、４、５又は６日後、例えば、投与の６日後に評価される。
【００５８】
ｉｉｉ）本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、使用が、てんかん発作の期間を低減させるためである、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源。てんかん発作の期間は、好ましくは、２回以上のてんかん発作に対する平均のてんかん発作の期間である。てんかん発作の期間の低減は、てんかん発作の数の低減がより低い有効性の状態である、低頻度のてんかん発作に苦しんでいるか、又は苦しむと予期される対象にとって、或いはチャネル遮断薬などの公知の医薬に応答しない対象にとって、有益であり得る。てんかん発作の期間は、好ましくは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％まで、より好ましくは、少なくとも２０、２５、３０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％まで、さらにより好ましくは、少なくとも３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％まで、例えば少なくとも３６％まで低減される。このような低減は、好ましくは、投与の少なくとも１、２、３、４、５又は６日後、より好ましくは、投与の少なくとも３、４、５又は６日後、例えば、投与の６日後に評価される。
【００５９】
ｉｖ）本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、使用が、てんかん発作の総時間を低減させるためである、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源。これは、発作活動の総時間を低減させる、又は発作間欠期間の長さを増加させるとして見ることができる。てんかん発作における総時間の低減は、チャネル遮断薬などの公知の医薬に応答しない対象にとって、有益であり得る。好ましくは、てんかん発作の総時間は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％まで、より好ましくは、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％まで、さらにより好ましくは、少なくとも６０、７０、８０、９０又は１００％まで、例えば少なくとも７５％まで低減される。このような低減は、好ましくは、投与の少なくとも１、２、３、４、５又は６日後、より好ましくは、投与の少なくとも３、４、５又は６日後、例えば、投与の６日後に評価される。
【００６０】
ｖ）本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、使用が、筋細胞特異的エンハンサー因子２Ａ（Ｍｅｆ２ａ）の発現を修復するためである、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源。筋細胞特異的エンハンサー因子２Ａ（Ｍｅｆ２ａ）は、変異した場合に、冠動脈疾患又は心筋梗塞をもたらし得る、転写因子である。本発明者らは、Ｍｅｆ２ａの発現が、てんかんに苦しむ対象について低減されることを、驚くべきことに見出した。Ｍｅｆ２ａの発現を修復すると、てんかん発作の期間、てんかん発作の数、てんかん発作に費やされる総時間を低減し、かつニューロンの棘突起の成熟を改善し、ニューロンの棘突起の喪失を予防する。Ｍｅｆ２ａの発現の修復は、チャネル遮断薬などの公知の医薬に応答しない対象にとって、有益であり得；これは、症状を抑制する代わりにてんかんの根本原因を除去することによって、必要な薬物レジメンを低減させることができる。この文脈におけるＭｅｆ２ａの発現の修復は、好ましくは、処置の前の発現と比較して、Ｍｅｆ２ａの発現の増加である。好ましくは、この増加は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０％又はそれ以上までである。修復は、好ましくは、健康な対象についての平均のＭｅｆ２ａの発現とおおよそ同じＭｅｆ２ａの発現をもたらし、より好ましくは、修復は、健康な対象についての発現の２５、２０、１５、１０又は５％以内、最も好ましくは、１０％又は５％以内である。
【００６１】
ｖｉ）本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、使用が、ニューロンの棘突起の喪失を予防、回復、治癒及び／又は遅延させるためである、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源。ニューロンの棘突起は、樹状突起棘としても公知であり、ニューロンの樹状突起からの小さな膜状の突起である。ニューロンの棘突起は、典型的には、シナプスで軸索から入力を受け取る。ニューロンの棘突起は、シナプスの強さについての貯蔵部位としての機能を果たし、ニューロンの細胞体への電気シグナルの伝達を助ける。てんかんに関連するｍｉＲＮＡ−１３５の（過剰）発現は、ニューロンの棘突起の喪失をもたらすことが見出された。ニューロンの棘突起の喪失の予防は、チャネル遮断薬などの公知の医薬に応答しない対象にとって、有益であり得；これは、症状を抑制する代わりにてんかんの根本原因を除去することによって、必要な薬物レジメンを低減させることができる。ニューロンの棘突起の喪失は、好ましくは全体的に予防され、ここで、健康な個体若しくは健康な個体の集団、又はそのような集団に基づく設定値との比較を行うことができる。棘突起の喪失は、好ましくは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％予防される。棘突起の喪失の予防は、棘突起の密度の増加としても表され得る。
【００６２】
ｖｉｉ）本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、使用が、ニューロンの棘突起の成熟を増加させるためである、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源。ニューロンの棘突起の成熟の増加は、チャネル遮断薬などの公知の医薬に応答しない対象にとって、有益であり得；これは、症状を抑制する代わりにてんかんの根本原因を除去することによって、必要な薬物レジメンを低減させることができる。ニューロンの棘突起は、糸状仮足として始まり、次いで成熟して薄くなり、次いで太く短くなり、次いでキノコ状になり、最後にカップ状の棘突起になる。成熟した棘突起は、カップ状で、キノコ状で、太く短いと考えられ；未成熟の棘突起は、薄く糸状仮足であると考えられる。増加は、好ましくは、処置前の棘突起の種類のパーセンテージと比較して、処置後の棘突起の種類のパーセンテージの増加として表される。したがって、使用は、好ましくは、太く短く、キノコ状でカップ状の棘突起の量を増加させるため、より好ましくは、キノコ状でカップ状の棘突起の量を増加させるため、最も好ましくは、カップ状の棘突起の量を増加させるためである。好ましくは、成熟棘突起の量は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０％又はそれ以上まで、より好ましくは、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０％又はそれ以上まで、最も好ましくは、少なくとも５０、５５、６０％又はそれ以上まで増加する。好ましい実施形態において、カップ状の棘突起の量は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００％又はそれ以上まで、より好ましくは、少なくとも３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００％又はそれ以上まで、最も好ましくは、少なくとも８０、９０若しくは１００％又はそれ以上まで、例えば少なくとも１００％まで増加する。好ましい実施形態において、キノコ状の棘突起の量は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００％又はそれ以上まで、より好ましくは、少なくとも３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００％又はそれ以上まで、最も好ましくは、少なくとも８０、９０若しくは１００％又はそれ以上まで、例えば少なくとも９０％まで増加する。
【００６３】
ｖｉｉｉ）本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、使用が、異常なニューロンの棘突起の形成を予防、遅延、治癒及び／又は回復させるためである、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源。これは、チャネル遮断薬などの公知の医薬に応答しない対象にとって、有益であり得；これは、症状を抑制する代わりにてんかんの根本原因を除去することによって、必要な薬物レジメンを低減させることができる。
【００６４】
ｉｘ）本発明による使用のための、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、使用が、チャネル遮断薬に応答しないことが分かっているか、又はチャネル遮断薬による処置に応答しないと疑われる対象を処置するためである、ｍｉＲＮＡ分子、アンタゴミル又はそれらの供給源。チャネル遮断薬への応答の不全は、チャネル遮断薬への部分的な応答、又はチャネル遮断薬への応答の非存在であり得る。好ましい実施形態において、対象は、チャネル遮断薬の公知の有効性と比較して、最大で９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５％又はそれよりも低く応答する。
【００６５】
ｍｉＲＮＡ分子の供給源、又はミミック、又はｉｓｏｍｉＲの供給源は、本明細書において特定される、ｍｉＲＮＡ分子、又はミミック、又はｉｓｏｍｉＲの産生を誘導することが可能な任意の分子であってもよく、これは、好ましくは、ヘアピン様構造及び／又は二本鎖核酸分子を含む。ヘアピン様構造の存在は、８０、１００及び１２０ｎｔ又はそれ以上のスライドウィンドウを使用するＲＮＡｓｈａｐｅｓプログラム（Ｓｔｅｆｆｅｎ  Ｐ．ら、２００６年）を使用して評価してもよい。ヘアピン様構造は、通常、ｍｉＲＮＡ分子の天然若しくは内因性供給源に存在するが、二本鎖核酸分子は、通常、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ若しくはミミックの、組換え或いは合成供給源に存在する。
【００６６】
ｍｉＲＮＡ分子のアンタゴミルの供給源、又はｍｉＲＮＡ分子のアンタゴミルのミミックの供給源は、適切なベクターなどの前記アンタゴミルの産生を誘導することが可能な任意の分子であってもよい。
【００６７】
ｍｉＲＮＡ分子、又はそのミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはアンタゴミルの供給源は、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、又は部分的に二本鎖ＲＮＡであってもよく、或いは三本鎖を含んでいてもよく、その例は、国際公開第２００８／１０５５８号に記載されている。本明細書において使用される場合、部分的な二本鎖は、５’末端及び／又は３’末端で一本鎖構造も含む二本鎖構造を指す。これは、ｍｉＲＮＡ分子のそれぞれの鎖が同じ長さを有していない場合に生じ得る。一般に、このような部分的な二本鎖ｍｉＲＮＡ分子は、７５％未満の二本鎖構造及び２５％を超える一本鎖構造、又は５０％未満の二本鎖構造及び５０％を超える一本鎖構造、又はより好ましくは、２５％、２０％若しくは１５％未満の二本鎖構造及び７５％、８０％若しくは８５％を超える一本鎖構造を有していてもよい。
【００６８】
或いは、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲの供給源は、ｍｉＲＮＡ分子、若しくは、ミミック、又はそれらのｉｓｏｍｉＲの前駆体をコードするＤＮＡ分子である。この文脈における好ましいＤＮＡ分子は、配列番号１０〜１３として表３において特定される。本発明は、表３において特定された前記配列と少なくとも７０％の同一性を有するｍｉＲＮＡ分子の前駆体をコードするＤＮＡ分子の使用を包含する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。好ましくは、この実施形態において、ＤＮＡ分子は、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、配列番号１０〜１３として表３において特定されるＤＮＡ配列と少なくとも７０％の同一性を有する。
【００６９】
所与のｍｉＲＮＡ分子、又はミミック若しくはｉｓｏｍｉＲの産生の誘導、或いはその所与のアンタゴミルの産生の誘導は、前記供給源が下記に定義される１つのアッセイを使用して細胞に導入される場合に、好ましく得られる。本発明に包含される細胞は後で定義する。
【００７０】
ｍｉＲＮＡ分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲの好ましい供給源は、それらの前駆体、より好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲをコードする核酸である。好ましい前駆体は、天然に存在する前駆体である。前駆体は、合成又は組換え前駆体であってもよい。合成又は組換え前駆体は、天然に存在する前駆体を発現することができるベクターであってもよい。
【００７１】
所与のｍｉＲＮＡ分子の好ましい前駆体は、配列番号１〜４として表１において特定される。本発明は、前記配列と少なくとも７０％の同一性を有するｍｉＲＮＡ分子の前駆体、又はそのｉｓｏｍｉＲ若しくはミミックの前駆体の使用を包含する。好ましくは、同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。好ましくは、この実施形態において、ＤＮＡ分子は、少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、配列番号１〜４として表１において特定される配列と少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、この実施形態において、前駆体は、配列番号１４〜５６によって表される群から選択されるシード配列と７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を共有するシード配列を含む。より好ましくは、前駆体は、配列番号１４〜５６によって表される群から選択されるシード配列を含む。
【００７２】
したがって、ｍｉＲＮＡ−１３５分子の好ましい供給源は、配列番号１〜３又は１０〜１２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、及び／或いは少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、及び／或いは配列番号１４〜１７又は１９〜４２のいずれか１つの７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を共有するシード配列を含む。このような供給源は、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子及びｍｉＲＮＡ−１３５ａのｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
【００７３】
したがって、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子の好ましい供給源は、配列番号１又は２又は１０又は１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、及び／或いは少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、及び／或いは配列番号１４又は１５又は１９〜３１のいずれか１つの７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を共有するシード配列を含む。このような供給源は、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子及びｍｉＲＮＡ−１３５ａのｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
【００７４】
したがって、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子の好ましい供給源は、配列番号３又は１２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、及び／或いは少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、及び／或いは配列番号１６又は１７又は３２〜４２のいずれか１つの７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を共有するシード配列を含む。このような供給源は、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂのｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
【００７５】
したがって、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子の好ましい供給源は、配列番号４又は１３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、及び／或いは少なくとも５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し、及び／或いは配列番号１８又は４３〜５１のいずれか１つの７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を共有するシード配列を含む。このような供給源は、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのｉｓｏｍｉＲの前駆体である。
【００７６】
この文脈において、所与の成熟ｍｉＲＮＡ分子のいくつかの前駆体が、同一のｍｉＲＮＡ分子をもたらし得ることを指摘する。例えば、ｍｉＲＮＡ−１３５ａは、前駆体のｍｉＲＮＡ−１３５ａ−１又はｍｉＲＮＡ−１３５ａ−２（好ましくは、それぞれ、配列番号１又は配列番号２であるとして特定される）が起源であってもよい。好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ−１、或いはｍｉＲＮＡ−１３５ａ−１若しくは配列番号１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する分子は、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ−５ｐ分子の前駆体として使用される。
【００７７】
この文脈においても、所与の成熟ｍｉＲＮＡ分子のいくつかのｉｓｏｍｉｒが、同一のシード配列を有するｍｉＲＮＡ分子をもたらし得ることを指摘する。例えば、成熟ｍｉＲＮＡ−１３５ａ−５ｐ（配列番号５）及び配列番号５８〜６７又は９６〜９８を有する少なくともｉｓｏｍｉｒはすべて、同じシード配列（好ましくは、配列番号１９であるとして特定される）を共有する。
【００７８】
好ましい供給源又は前駆体は、本明細書の後で定義する。好ましい供給源は、核酸、すなわち、前記ｍｉＲＮＡの前記前駆体をコードするＤＮＡ又は前記アンタゴミルをコードするＤＮＡを含む、発現コンストラクトを含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）か、又は含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、より好ましくは、前記発現コンストラクトは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びレトロウイルスに基づく遺伝子治療ベクターから選択される、ウイルス遺伝子治療ベクターである。好ましいウイルス遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクターである。他の好ましいベクターは、腫瘍溶解性ウイルスベクターである。このようなベクターは、本明細書の下記でさらに記載する。
【００７９】
或いは、供給源は、一般的定義に設けた部分においてさらに定義される、合成ｍｉＲＮＡ分子又は化学ミミックであってもよい。
【００８０】
ｍｉＲＮＡ分子、又はミミック若しくはｉｓｏｍｉＲの存在、或いはｍｉＲＮＡ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルの存在の検出は、当業者に公知に任意の手法を使用して行ってもよい。このような分子の発現レベル又は存在の評価は、好ましくは、（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、ビーズアレイ、ＲＮＡｓｅ保護分析若しくはノーザンブロット分析、又はクローニング及びシークエンシングなどの古典的な分子生物学的手法を使用して行われる。当業者は、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲの定量化の代わりに或いはこれらと組み合わせて、前記ｍｉＲＮＡ分子、又はその前記ｉｓｏｍｉＲ若しくはミミックの機能に関連することが公知の任意の化合物の、対応するｍｉＲＮＡ分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲの基質の定量化、或いは特異的なアッセイを使用する、前記ｍｉＲＮＡ分子、又はその前記ｉｓｏｍｉＲ若しくはミミックの機能又は活性の定量化は、本発明の範囲内に包含されることを理解する。同じことは、ｍｉＲＮＡ分子のアンタゴミルについて適用できる。
【００８１】
好ましい組成物及び製剤は、本明細書の後ですべて定義される。ｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのアンタゴミルは、ネイキッド分子などとして、化学修飾あり又はなしで、又は粒子に封入され、若しくは部分にコンジュゲートされて、使用されてもよい。好ましい組成物は、ナノ粒子若しくはリポソーム構造に封入された、ｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのアンタゴミルを含む。ｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのアンタゴミルは、アプタマー−ｍｉＲＮＡのハイブリッドであってもよい。アプタマー−ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ（又はＤＮＡ）オリゴヌクレオチドに連結されたｍｉＲＮＡとして定義され、後者は、細胞表面タンパク質（例えば、環状ＲＧＤペプチド（環状のアルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）ペプチド））に対して、アプタマー−ｍｉＲＮＡのハイブリッド分子を標的にする立体構造に適合する。アダプター−タグ化ｍｉＲＮＡは、例えば、ポリエチレングリコールに連結され得、これは、キメラの循環する半減期を増加させる（Ｄａｓｓｉｅ，Ｊ．Ｐ．ら、２００９年）。
【００８２】
本明細書においてすべて定義される、所与のｍｉＲＮＡ、若しくはミミック、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの対応する供給源の活性、或いはｍｉＲＮＡ分子、若しくはそのミミック、又はそれらの対応する供給源の所与のアンタゴミルの活性は、好ましくは、ニューロン細胞の発生若しくは再生の検出可能な促進又は誘導を示す能力である。「ニューロン細胞の発生若しくは再生の検出可能な促進又は誘導を示すこと」は、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態を、回復、拮抗、遅延、治癒及び／或いは処置することによって置き換えてもよい。「ニューロン細胞の発生若しくは再生の検出可能な促進又は誘導を示すこと」は、
対象におけるニューロン細胞の数の検出可能な増加を誘導又は促進すること
ニューロン細胞の機能障害、活性及び／若しくは３Ｄの外観の改善を誘導又は促進すること、並びに
ニューロンの伸長の増加、ニューロンの移動の増加及び／又はニューロンの結合性若しくは可塑性の増加を誘導又は促進すること
のうちの少なくとも１つと等価である。
【００８３】
これらの特徴のそれぞれは、下記でさらに定義する。
【００８４】
したがって、ニューロン細胞の発生若しくは再生のこのような検出可能な促進又は誘導を示すことは、任意のニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する任意の疾患若しくは状態を、予防、遅延、治癒、回復及び／又は処置することを可能にするために、本発明において重要である。
【００８５】
ニューロンの欠損は、対象において、局所的に評価及び検出されてもよい。この文脈において、「局所的に」とは、例えば、眼及び脳の間の視神経において、又は脳及び海馬においてなどの、前記対象のヒト身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは所与の体積若しくは面積又は場所を意味し得る。このような前記身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは体積若しくは面積又は場所は、ニューロン細胞を含むか、又はニューロン細胞からなる。このような前記身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは体積若しくは面積又は場所は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のニューロン細胞を含むことができる。
【００８６】
ニューロン細胞は、ニューロン又は神経細胞としても公知である。これは、電気的及び化学的シグナルを通して情報を受信、処理及び伝達する、電気的な興奮細胞である。ニューロン細胞の間のこれらのシグナルは、シナプスと呼ばれる特殊な結合を介して生じる。ニューロン細胞は、互いに接続して、神経ネットワークを形成することができる。ニューロンは、中枢神経系の脳及び脊髄、並びに末梢神経系の自律神経節の主要な構成成分である。視神経損傷において、眼及び脳の間の神経ネットワークは、損なわれているか、又は完全に破壊すらされることがある。
【００８７】
ニューロンの欠損は、定量的なニューロンの欠損及び／又は質的なニューロンの欠損のいずれかを包含することを意図する。
【００８８】
定量的なニューロンの欠損は、対象における局所的なニューロン細胞の数の低減を意味し得る。ニューロン細胞の数の低減は、同じ若しくは同様の場所での対照の対象の対応するニューロン細胞の数と比較することによって、又は同じ対象であるがその身体の別個の場所における対応するニューロン細胞の数と比較することによって、評価されてもよい。この文脈において、低減は、１％少ない、５％少ない、１０％少ない、１５％少ない、２０％少ない、２５％少ない、３０％少ない、３５％少ない、４０％少ない、４５％少ない、５０％少ない、５５％少ない、６０％少ない、６５％少ない、７０％少ない、７５％少ない、８０％少ない、８５％少ない、９０％少ない、９５％少ない、１００％少ない、１５０％少ない、２００％少ない、又は２００％未満少ないことを意味し得る。ニューロン細胞の数の評価は、細胞をカウントすることによって、例えば、（トランスフェクション又は子宮内エレクトロポレーション（ＩＵＥ）の後）特異的なレポータープラスミドを発現する細胞をカウントすることによって、行ってもよい。レポータープラスミドは、本発明による核酸でタグ化され得るか、若しくは本発明による核酸と共導入され得、又は同じベクター中に存在し得る。好適なレポーターは、ＧＦＰ又はＲＦＰである。好ましくは、ニューロン細胞は、インビトロでトランスフェクトされるか、又はインビボ細胞についてＩＵＥを使用してトランスフェクトされる。トランスフェクト又はＩＵＥの後、細胞又は脳の薄片は、固定され、蛍光タンパク質などのマーカーを発現する特異的タグについて免疫染色される。次いで、顕微鏡で画像を取得することができ、特異的タグを発現する細胞を、当技術分野において公知の画像処理ソフトウェアを使用してカウントすることができる。対照の対象は、健康な対象であり得る。
【００８９】
ニューロン細胞の発生又は再生の検出可能な促進又は誘導を示すことは、好ましくは、対象におけるニューロン細胞の数の検出可能な増加を誘導又は促進することである。或いは、これは、例えば、ニューロンの欠損に関連する疾患において健康なニューロン細胞の数の減少若しくは予期される減少を止めることによって、又は健康なニューロン細胞の変性を予防することによって、同じ数のニューロン細胞を維持することを意味する。例えば、脳内で異常及び同調的なニューロンの放電を示す細胞の量を低減させると、ニューロン細胞の発生又は再生をもたらさないが、てんかんの症状を低減する。言い換えれば、この好ましい効果は、脳内で正常なニューロンの放電を示す細胞の量の増加である。
【００９０】
対象におけるニューロン細胞の数の検出可能な増加は、対象において、局所的に評価及び検出されてもよい。この文脈において、「局所的に」とは、上記に定義されるように、前記対象のヒト身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは所与の体積若しくは面積又は場所を意味し得る。このような前記身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは体積若しくは面積又は場所は、ニューロン細胞を含むか、又はニューロン細胞からなる。このような前記身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは体積若しくは面積又は場所は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のニューロン細胞を含むことができる。
【００９１】
ニューロン細胞の数の検出可能な増加は、同じ若しくは同様の場所での対照の対象の対応するニューロン細胞の数と比較することによって、又は同じ対象であるがその身体の別個の場所における対応するニューロン細胞の数と比較することによって、評価されてもよい。この文脈において、増加は、１％多く、５％多く、１０％多く、１５％多く、２０％多く、２５％多く、３０％多く、３５％多く、４０％多く、４５％多く、５０％多く、５５％多く、６０％多く、６５％多く、７０％多く、７５％多く、８０％多く、８５％多く、９０％多く、９５％多く、１００％多く、１５０％多く、２００％多く、又は２００％より多いことを意味し得る。ニューロン細胞の数の評価は、検出可能な減少又は低減を評価するために特定された同じ手法を使用して行ってもよい。対照の対象は、健康な対象であり得る。
【００９２】
質的なニューロンの欠損は、ニューロン細胞が、機能及び／又は活性及び／又は３Ｄの態様の観点から損なわれることを包含することを意味する。機能及び／又は活性及び／又は３Ｄの態様の観点から損なわれているニューロン細胞は、ニューロンの伸長の欠損、ニューロンの移動の欠損、ニューロンの接続性若しくは可塑性の攪乱、及び／又はニューロンの帯電（放電）の欠損を示し得る。したがって、本発明の分子は、それが質的なニューロンの欠損を、回復、遅延、予防、処置、治癒又は停止する場合に、ニューロン細胞の発生若しくは再生の検出可能な促進又は誘導を示すと考えることができる。本発明の分子は、好ましくは、それが損なわれた機能及び／又は活性、例えば、ニューロン細胞の機能障害性の帯電（放電）及び／又は３Ｄの態様の改善を誘発又は促進する場合、並びに／或いはそれがニューロンの伸長の増加、ニューロンの移動の増加、及び／又はニューロンの接続性若しくは可塑性の増加を誘導又は促進する場合に、ニューロン細胞の発生若しくは再生の検出可能な促進又は誘導を示すと考えることができる。
【００９３】
神経突起伸長は、対象中若しくは対象からの平均の神経突起の長さの検出可能な増加の誘導又は促進として定義され得る。
【００９４】
損なわれた神経突起伸長又は神経突起伸長の欠損若しくは減少は、ニューロンの欠損若しくはニューロンの欠損に関連する状態において存在又は検出可能であり得る。このような損なわれた、欠損した又は減少した神経突起伸長は、対象において、局所的に評価及び検出されてもよい。この文脈において、「局所的に」とは、前記対象のヒト身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは所与の体積若しくは面積又は場所を意味し得る。このような前記身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは体積若しくは面積又は場所は、ニューロン細胞を含むか、又はニューロン細胞からなる。このような前記身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは体積若しくは面積又は場所は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のニューロン細胞を含むことができる。好ましい体積は、脳の体積であり、好ましくは、約１０５０〜１３５０ｃｍ３、より好ましくは、約１１００〜１３００ｃｍ３である。この体積は、処置又は予防される状態がてんかんである場合に、特に関係がある。このような損なわれた、欠損した又は減少した神経突起伸長は、同じ若しくは同様の場所での対照の対象の対応する神経突起伸長の能力と比較することによって、又は同じ対象であるがその身体の別個の場所におけるニューロン細胞の対応する神経突起伸長の能力と比較することによって、評価されてもよい。このような損なわれた、欠損した又は減少した神経突起伸長は、対象から単離された神経突起において、評価及び検出されてもよい。好ましくは、損なわれた、欠損した又は減少した神経突起伸長は、インビトロでの初代ニューロンの培養物において、例えば、Ｖａｎ  Ｓｐｒｏｎｓｅｎら、２０１３年（ＰＭＩＤ：２４０９８３５７）によって行われたように、培養物中のニューロンを、ｍｉＲＮＡミミックでトランスフェクトし、トランスフェクション後の最も長い神経突起の長さを測定することにより神経突起伸長に対するミミックの効果を評価することによって、評価することができる。
【００９５】
この場合において、このような損なわれた、欠損した又は減少した神経突起伸長は、同じ若しくは同様の場所での対照の対象からの対照の神経突起の対応する神経突起伸長の能力と比較することによって、又は同じ対象からであるがその身体の別個の場所におけるニューロン細胞の対応する神経突起伸長の能力と比較することによって、評価されてもよい。この文脈において、損なわれた、欠損した又は減少したとは、少ない又は１％少ない、５％少ない、１０％少ない、１５％少ない、２０％少ない、２５％少ない、３０％少ない、３５％少ない、４０％少ない、４５％少ない、５０％少ない、５５％少ない、６０％少ない、６５％少ない、７０％少ない、７５％少ない、８０％少ない、８５％少ない、９０％少ない、９５％少ない、１００％少ない、１５０％少ない、２００％少ない、又は２００％未満少ないことを意味し得る。神経突起伸長の評価は、実施例において実証されたような手法を使用して、例えば、顕微鏡スクリーニングによって行ってもよい。対照の対象は、健康な対象であり得る。
【００９６】
神経突起伸長の検出可能な増加は、好ましくは、実験データ（実施例２）において行われるようにして評価される。検出可能な増加は、好ましくは、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上の増加、より好ましくは、実験データにおいて評価されたような増加である。神経突起伸長は、対象において、局所的に評価されてもよい。「局所的に」の意味は、本明細書において既に定義されている。
【００９７】
ニューロンの移動は、ニューロンの欠損に関連する状態において存在又は検出可能であり得る、損なわれたニューロンの移動、又は欠損若しくは減少したニューロンの移動として定義され得る。皮質の発達において、錐体ニューロンは、脳室帯（ＶＺ）から表面の皮質板（ＣＰ）に移動して、分化し、機能的結合を確立する。損なわれた又は欠損したニューロンの移動は、好ましくは、その標的領域に達するためのニューロン細胞の不能として定義される。任意選択で、これは、細胞内の特異的タンパク質／経路の機能の喪失に起因し得るか、又は環境における外部刺激の非存在に起因し得る。
【００９８】
このような損なわれた、欠損した又は減少したニューロンの移動は、対象において、局所的に評価及び検出されてもよい。この文脈において、「局所的に」とは、前記対象のヒト身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは所与の体積若しくは面積又は場所を意味し得る。このような前記身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは体積若しくは面積又は場所は、ニューロン細胞を含むか、又はニューロン細胞からなる。このような前記身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは体積若しくは面積又は場所は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のニューロン細胞を含むことができる。このような損なわれた、欠損した又は減少したニューロンの移動は、同じ若しくは同様の場所での対照の対象の対応する移動の能力と比較することによって、又は同じ対象であるがその身体の別個の場所におけるニューロン細胞の対応する移動の能力と比較することによって、評価されてもよい。このような損なわれた、欠損した又は減少したニューロンの移動は、対象から単離されたニューロン細胞において、評価及び検出してもよい。この場合において、このような損なわれた、欠損した又は減少したニューロンの移動は、同じ若しくは同様の場所での対照の対象からの対照のニューロン細胞の対応するニューロンの移動の能力と比較することによって、又は同じ対象からであるがその身体の別個の場所におけるニューロン細胞の対応するニューロンの移動の能力と比較することによって、評価されてもよい。この文脈において、損なわれた、欠損した又は減少したとは、１％少ない、５％少ない、１０％少ない、１５％少ない、２０％少ない、２５％少ない、３０％少ない、３５％少ない、４０％少ない、４５％少ない、５０％少ない、５５％少ない、６０％少ない、６５％少ない、７０％少ない、７５％少ない、８０％少ない、８５％少ない、９０％少ない、９５％少ない、１００％少ない、１５０％少ない、２００％少ない、又は２００％未満少ないことを意味し得る。
【００９９】
インビボのニューロンの移動の効果を評価するために、好ましくは、目的の脳の区域のニューロンの前駆細胞を、マイクロインジェクションによるプラスミドＤＮＡ溶液によって、脳室系のルーメンにトランスフェクトし、続いて、手動で電気パルスを関係のある神経組織に向かわせることができる（ｄａｌ  Ｍａｓｃｈｉｏら、２０１２年、ＰＭＩＤ：２２８０５５６７）。或いは、ｖａｎ  Ｅｒｐら、２０１５年、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ．ＰＭＩＤ：２６６５１２９１によって記載されている方法を使用することができ、これは、ＩＵＥを用いる。そこでは、胚の側脳室は、レポータープラスミドｐＣＡＧ−ＧＦＰ（ＤＮＡを取り込む細胞をマークするレポーターとして）と一緒に、ｍｉＲＮＡ又はその供給源が注射される。運動皮質は、好ましくは、頭を保持する白金ピンセット電極（負極）及び頭頂部において３つ目の金メッキ電極（正極）を使用して、３０Ｖ（９５０ミリ秒間隔）で、５０ｍｓの５単極パルスに設定されたエレクトロポレーションによって標的にされる。エレクトロポレーションの後、胚を腹部に戻すことができ、その後、腹部の筋肉及び皮膚は縫合される。次いで、胚は、好ましくは、定義されている年齢で（例えば、Ｅ１６．５〜ｐ１０で）採取され、頭部をホルムアルデヒドを使用して固定し、凍結切片を作成し、免疫組織化学的検査が、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源を取り込んだ細胞を検出するために行われる。画像を、従来の共焦点顕微鏡を使用して取得することができる。次いで、ＧＦＰ陽性細胞の移動を分析し、他の移動と、又は他の対象若しくは対照の対象における同様の移動と比較することができる。対照の対象は、健康な対象であり得る。
【０１００】
神経突起の移動の検出可能な増加は、好ましくは、実験データ（実施例２）において行われるようにして評価される。検出可能な増加は、好ましくは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上の増加、より好ましくは、実験データにおいて評価されたような増加である。神経突起移動は、対象において、局所的に評価されてもよい。「局所的に」の意味は、本明細書において既に定義されている。
【０１０１】
ニューロンの接続性又は可塑性は、環境の増強に構造的及び機能的に適合する脳の能力を説明する広義の用語として定義され得る。神経可塑性は、学習及び記憶形成などの認知能力のために特に重要である。
【０１０２】
損なわれた、又は欠損した又は減少したニューロンの接続性又は可塑性は、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する状態において存在又は検出可能であり得る。このような損なわれた、欠損した若しくは減少したニューロンの接続性又は可塑性は、対象において、局所的に評価及び検出されてもよい。この文脈において、「局所的に」とは、本明細書の前で定義されるように、前記対象のヒト身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは所与の体積若しくは面積又は場所を意味し得る。このような前記身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは体積若しくは面積又は場所は、ニューロン細胞を含むか、又はニューロン細胞からなる。このような前記身体の臓器、組織、細胞、及び／或いは体積若しくは面積又は場所は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のニューロン細胞を含むことができる。このような損なわれた、欠損した若しくは減少したニューロンの接続性又は可塑性は、同じ若しくは同様の場所での対照の対象の対応するニューロンの接続性又は可塑性の能力と比較することによって、或いは同じ対象であるがその身体の別個の場所におけるニューロン細胞の対応するニューロンの接続性又は可塑性の能力の能力と比較することによって、評価されてもよい。この文脈において、損なわれた、欠損した又は減少したとは、１％少ない、５％少ない、１０％少ない、１５％少ない、２０％少ない、２５％少ない、３０％少ない、３５％少ない、４０％少ない、４５％少ない、５０％少ない、５５％少ない、６０％少ない、６５％少ない、７０％少ない、７５％少ない、８０％少ない、８５％少ない、９０％少ない、９５％少ない、１００％少ない、１５０％少ない、２００％少ない、又は２００％未満より少ないことを意味し得る。ニューロンの接続性又は可塑性の評価は、行動学的研究（例えば、記憶機能試験、モリス水迷路、新規物体認識）若しくは電気生理学的試験（例えば、長期増強（ＬＴＰ）誘導研究）などの手法を使用して、又はこのような研究の組み合わせを使用して、行ってもよい。好適な方法は、Ｃｏｌｅら、２０１２年（ＰＭＩＤ：２２８８５８４９）に記載されている。別の好適な方法は、Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓら、２０１１年（ＰＭＩＤ：２２１５３０７９）に記載されている。対照の対象は、健康な対象であり得る。
【０１０３】
ニューロンの接続性又は可塑性の検出可能な増加は、好ましくは、未処置若しくは偽物で処置された試料又は対象と比較して、接続性又は可塑性の相対的増加として評価される。検出可能な増加は、好ましくは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上の増加、より好ましくは、実施例２において評価されたような増加である。ニューロンの接続性又は可塑性は、対象において、局所的に評価されてもよい。「局所的に」の意味は、本明細書において既に定義されている。
【０１０４】
正しいニューロンの帯電（放電）の検出可能な増加、又は正しくないニューロンの帯電（放電）の検出可能な減少は、好ましくは、未処置若しくは偽物で処置された試料又は対象と比較して、対象又は対象から以前に得られた試料における相対的増加として評価される。検出可能な増加は、好ましくは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上の増加、より好ましくは、実施例３において評価されたような増加である。正しいニューロンの帯電（放電）は、対象において、局所的に評価されてもよい。「局所的に」の意味は、本明細書において既に定義されている。
【０１０５】
クルッペル様因子４（ＫＬＦ４、又は腸で豊富なクルッペル様因子、若しくはＧＫＬＦ）は、亜鉛フィンガー転写因子である。これは、軸索の成長及び再生の公知の内在性の阻害剤である。ＫＬＦ４は、非分裂細胞において高度に発現され、その過剰発現は、細胞周期停止を誘導する（Ｙｏｏｎ  ＨＳ及びＹａｎｇ  ＶＷ（２００４年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７９巻（６号）：５０３５〜４１頁、ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ３０７６３１２００）。ニューロンにおけるＫＬＦ４のノックダウンは、軸索の成長、リーディングプロセスの長さ及びニューロンの移動を増強する（Ｍｏｏｒｅら、２００９年；Ｑｉｎ及びＺｈａｎｇ、２０１２年）。ＫＬＦ４を欠くノックアウトマウスは、視神経損傷の後、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の軸索の再生の有意な増強を示した（Ｍｏｏｒｅら、２００９年；Ｑｉｎら、２０１３年）。このＫＬＦ４の効果は、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）−シグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）経路を介した下流のシグナル伝達を必要とするが（Ｑｉｎら、２０１３年）、この経路の上流の制御機構は、当技術分野において知られていない。本発明者らは、ここに、本発明による使用のためのｍｉＲＮＡが、ＫＬＦ４の発現を抑制することができ、ニューロンの発生若しくは再生、又は神経可塑性若しくは神経接続性を促進することを見出した。
【０１０６】
本発明の疾患又は状態において、ニューロンの欠損は、疾患又は状態の発症の前、すなわち、前記疾患又は状態の症状の出現の前に検出可能であり得る。ニューロンの欠損が、前記疾患又は状態の発生の間、すなわち、前記疾患又は状態の症状の出現の後に検出可能であり得ることは、本発明によってさらに包含される。ニューロンの欠損は、処置の開始の前及び／又は処置の開始の後に、対象において、評価及び検出されてもよい。ニューロンの欠損は、対象において、好ましくは、前記対象の身体の区域において、評価及び検出されてもよい。
【０１０７】
ニューロンの発生若しくは再生の検出可能な促進又は誘導が、本明細書において特定される、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、又はそれらの供給源を使用して評価される場合、そのようなｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、又はそれらの供給源は、ニューロンの欠損、又はそのようなニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態を、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための医薬として使用されると言われる。
【０１０８】
ニューロンの発生又は再生の評価は、定期的に、例えば、毎週、毎月、行われてもよい。この評価は、好ましくは、所与の対象についていくつかの時点で、又は所与の対象及び健康な対照について、１回又はいくつかの時点で、行われる。評価は、定期的な時間間隔、例えば、毎週、毎月、行われてもよい。ニューロンの発生又は再生の１つの評価が、ニューロンの発生若しくは再生の検出可能な増加又は促進又は誘導の所見が導かれる場合、ｍｉＲＮＡ分子、ミミック、それらのｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源、或いはアンタゴミル、若しくはミミック、又はそれらの供給源は、ニューロンの発生又は再生の検出可能な促進を示すと言われる。
【０１０９】
ニューロンの発生若しくは再生の検出可能な増加又は誘導又は促進は、好ましくは、少なくとも１つの時点で、ニューロンの発生若しくは再生の検出可能な増加又は誘導又は促進が検出された場合に、検出される。好ましくは、ニューロンの発生若しくは再生の検出可能な増加又は誘導又は促進は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つの時点で、検出される。
【０１１０】
本発明は、好ましくは、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態を、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための医薬としての使用のための、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル、又はそれらの供給源、及び任意選択でｍｉＲＮＡ−１２４分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル又はそれらの供給源の組み合わせ、或いは前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル、又はそれらの供給源、及び任意選択でｍｉＲＮＡ−１２４分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル又はそれらの供給源を含む組成物を提供する。
【０１１１】
ｍｉＲＮＡ−１３５分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲが、本明細書において記載される実施例２において実証されるように、ニューロンの発生若しくは再生の検出可能な促進を示すことが可能であることを、驚くべきことに見出された。
【０１１２】
特に、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲが、本明細書において記載される実施例２において実証されるように、ニューロンの発生若しくは再生の検出可能な促進を示すことが可能であることを、驚くべきことに見出された。
【０１１３】
特に、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲが、本明細書において記載される実施例２において実証されるように、ニューロンの発生若しくは再生の検出可能な促進を示すことが可能であることを、驚くべきことに見出された。
【０１１４】
ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲが、本明細書において記載される実施例２において実証されるように、ニューロンの発生若しくは再生の検出可能な促進を示すことが可能であることを、驚くべきことに見出された。
【０１１５】
ｍｉＲＮＡ−１３５分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくはアンタゴミル、好ましくはそのアンタゴミルが、本明細書において記載される実施例３において実証されるように、ニューロン細胞の正しくない帯電（放電）の検出可能な減少を示すことが可能であることを、驚くべきことに見出された。
【０１１６】
特に、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくはアンタゴミル、好ましくはそのアンタゴミルが、本明細書において記載される実施例３において実証されるように、ニューロン細胞の正しくない帯電（放電）の検出可能な減少を示すことが可能であることを、驚くべきことに見出された。
【０１１７】
特に、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、又はそのミミック若しくはｉｓｏｍｉＲ若しくはアンタゴミル、好ましくはそのアンタゴミルが、本明細書において記載される実施例３において実証されるように、ニューロン細胞の正しくない帯電（放電）の検出可能な減少を示すことが可能であることを、驚くべきことに見出された。
【０１１８】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１２４分子、又はミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはアンタゴミル、若しくはそれらの供給源は、前記分子がニューロンの発生又は再生の検出可能な促進を示す場合、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態を、予防、処置、回復、治癒及び／又は遅延させることが可能である。
【０１１９】
ニューロンの欠損、或いはニューロンの欠損が関与若しくは関連する疾患又は状態は、ニューロン細胞の数の低減、及び／又は機能若しくは活性若しくは３Ｄの態様に関して損なわれたニューロン細胞が、疾患若しくは状態の発症の前、又は前記疾患若しくは状態の発生の間のいずれかで検出される、任意の疾患又は状態である。例えば、疾患又は状態は、脳血管発作（ＣＶＡ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、パーキンソン病（ＰＤ）、脳外傷、（進行性）多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ−ルーゲーリック病）、腸の神経変性、視神経損傷、老化に起因する認知機能の減少、及びハンチントン舞踏病などの任意の神経変性障害であってもよい。疾患又は状態は、外傷性挫傷、裂離、圧迫及び／若しくは切断、又は他の物理的傷害から起こったか、或いは外科的手順から、出血性若しくは虚血性の損傷を含む血管の薬理学的又は他の侵襲、又は他の神経疾患によって引き起こされたか、又は生じるかのいずれかの組織の損傷から起こった、神経系の病変であり得る。疾患又は状態は、緑内障であってもよい。疾患又は状態は、てんかんであってもよい。
【０１２０】
対象におけるニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態を、特異的に処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるために使用することができる現在公知の医薬が存在する。しかしながら、これらの処置のそれぞれは、患者において使用するために十分ではない治療活性を示す可能性がある。この不十分さは、毒性、不十分な取り込み若しくは生体内分布をもたらす劣った薬物動態、血液脳関門を通過できない、又は一般的に低い有効性から生じることがある。そのような治療活性は、好ましくは、そのような公知の医薬が、ニューロンの発生又は再生の検出可能な促進を示すことができない場合に、患者において使用するために十分ではない。これらの特徴のそれぞれは、本明細書の前で定義されている。本発明は、そのような欠点を有さないと予期される新しい医薬を提供する。本発明は、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル、又はそれらの供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル、又はそれらの供給源を含む組成物を使用することを包含する。この使用は、対象において、前記対象の細胞において、前記対象の組織において、又は前記対象の体液において、前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの前記供給源の活性或いは定常状態のレベルを、増加させること、好ましくは、薬理学的に増加させることを含む。
【０１２１】
本発明の文脈内で、「アンタゴミル若しくはそのミミック、又はそれらの前記供給源の活性又は定常状態のレベルを増加させること」は、「ｍｉＲＮＡ分子又はそのｉｓｏｍｏＲの活性又は定常状態のレベルを減少させること」と置き換えることができる。同じことは、本明細書において特定される他のアンタゴミルについて適用できる。
【０１２２】
この使用において、前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、又はミミック、或いはそれらの供給源の活性又は定常状態のレベルは、ニューロンの発生又は再生の検出可能な促進を示すために、増加する。対象におけるニューロンの発生又は再生のそのような検出可能な促進の評価は、本明細書の前で定義されている。
【０１２３】
前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の活性又は定常状態のレベルは、例えば、前記ｍｉＲＮＡ分子、ミミック若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源を、対象に、好ましくは、対象の細胞に、又は前記対象の組織に、又は前記対象の臓器に、或いは外因性供給源からの前記対象、前記ｍｉＲＮＡ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源に、提供することによって、前記ｍｉＲＮＡ分子（又はそのｉｓｏｍｉＲ）自体のレベルで増加してもよい。外因性供給源からの、ｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、又はそれらのｉｓｏｍｉＲの提供のために、前記分子は、下記に記載される好適な宿主細胞における、前記分子をコードするか、若しくは前記分子の供給源をコードする、核酸の発現によって、又は化学合成による完全な合成分子として、好都合に生成され得る。ｍｉＲＮＡ−１３５ａの供給源をコードする核酸分子の例は、ｍｉＲＮＡ−１３５ａの前駆体をコードする核酸分子である。前記核酸分子は、それ自体もｍｉＲＮＡ−１３５ａの供給源である。
【０１２４】
好ましい対象の細胞は、脳細胞、又は脊髄細胞、又は末梢神経系からの細胞である。好ましい神経細胞は、遠心性神経細胞及び／又は運動神経細胞である。
【０１２５】
しかしながら、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子若しくはそのｉｓｏｍｉＲの活性又は定常状態のレベルは、前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはそのｉｓｏｍｉＲをコードするか、又は前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはそのｉｓｏｍｉＲの供給源をコードするヌクレオチド配列の発現レベルを制御することによって、増加又は減少する。好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルは、前記対象の細胞において、又は前記対象の組織において、又は対象において、制御される。ｍｉＲＮＡ分子若しくはそのｉｓｏｍｉＲ、又は前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはそのｉｓｏｍｉＲの供給源の発現レベルは、前記対象の細胞、組織、臓器若しくは体液への、ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル、ミミック若しくはそれらの供給源、又は発現コンストラクト（又はベクター）の導入によって、或いは、対象において、ｍｉＲＮＡ分子若しくはミミック若しくはｉｓｏｍｉＲ又はそれらのアンタゴミルを含むか、或いは前記ｍｉＲＮＡ分子若しくはミミック若しくはｉｓｏｍｉＲ又はそれらのアンタゴミルの供給源を含むヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって、及び核酸配列が、前記細胞、組織、臓器、対象におけるヌクレオチド配列の発現を進める能力があるプロモーターの調節下にあることによって、増加又は減少してもよい。一般に、発現は、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、又はそれらの前駆体を使用することによって増加させることができる。一般に、発現は、アンタゴミル若しくはそのミミック、又はそれらの前駆体を使用することによって減少させることができる。ｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはアンタゴミル、又はそれらの供給源の発現レベルもまた、コンストラクトが、ｍｉＲＮＡ分子、若しくはミミック、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらのアンタゴミルをコードする内因性ヌクレオチド配列のトランス活性化の能力がある因子をコードするヌクレオチド配列を含むことによって、細胞、組織、臓器、対象への発現コンストラクトの導入によって、増加させてもよい。
【０１２６】
本発明の使用は、好ましくは、対象に、本明細書において定義される、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、又はｉｓｏｍｉＲの、活性又は定常状態のレベルを増加させるため、或いは本明細書において定義される、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、又はｉｓｏｍｉＲの、活性又は定常状態のレベルを減少させるための、核酸コンストラクトを含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む。減少は、アンタゴミル又はその供給源を使用して有利に達成することができる。核酸コンストラクトは、本明細書においてさらに述べられる発現コンストラクトであってもよい。好ましくは、発現コンストラクトは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、腫瘍溶解ウイルスベクター及びレトロウイルスに基づく遺伝子治療ベクターから選択される、ウイルス遺伝子治療ベクターである。好ましいウイルス遺伝子治療ベクターは、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター又はレンチウイルスベクターである。ウイルスベクターは、センスアプローチにおいて好ましい供給源又は前駆体である。アンチセンスアプローチにおいて、使用は、短ヘアピン遮断薬又はアンチセンス分子で行われて、ｍｉＲＮＡの機構を遮断する。或いは、本発明の使用は、好ましくは、対象に、本明細書において定義される、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、又はそれらの供給源を含む医薬組成物、或いは本明細書において定義される、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、又はそれらの供給源含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む。
【０１２７】
本発明の使用において、細胞、組織、臓器又は体液は、好ましくは、ニューロンの欠損を示すか、或いは例えば対象の年齢若しくは対象の遺伝的背景に起因してニューロンの欠損に関連する疾患又は状態を有する、高い危険性を有すると疑われる対象由来である。或いは、別の好ましい実施形態において、本発明の使用は、予測される危険性を有するか、又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態が後で発生するかのいずれかを有するとして診断された対象からの、細胞、組織、臓器又は体液に対して適用される。使用される診断方法は、好ましくは、本明細書において記載される本発明のものである。或いは、処置される細胞、組織又は臓器は、ニューロンの欠損に関連する疾患又は状態の進行の危険性に基づいて選択されてもよい。そのような進行の危険性は、当業者に公知の伝統的な臨床病理学的基準又はバイオマーカーに基づく予後診断を使用して、評価されてもよい。ｍｉＲＮＡ−１３５及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子のｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、又はそれらの前駆体、或いは前記ｍｉＲＮＡ−１３５及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子のｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、又はそれらの前駆体を含む組成物を、前記対象の組織又は臓器に投与することも本発明に包含される。臓器又は組織は、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態が診断された臓器或いは組織に対応していてもよい。本発明において、好ましい組織は、ニューロン組織に関連するか、又はニューロン組織を含むか、又はニューロン組織を含有するか、又はニューロン組織からなる組織である。本発明において、好ましい臓器は、ニューロン細胞を含むか、又はニューロン細胞からなる任意の臓器である。好ましい臓器の例としては、脳、海馬及び視神経が挙げられる。ニューロン細胞に関連する組織は、そのような細胞の近辺に位置していてもよく、ニューロン細胞に作用してもよい。この文脈における近辺とは、最大で数センチメートルを意味し得る。本発明において、好ましい細胞は、ニューロン細胞である。それぞれの場合において、ｍｉＲＮＡ−１３５及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、又はそれらの供給源は、好ましくは、前記臓器、組織に存在するニューロン細胞に投与される。前記ｍｉＲＮＡ−１３５及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、又はそれらの供給源は、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％のニューロン細胞を含む組織に投与される。前記ｍｉＲＮＡ−１３５及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、又はそれらの供給源は、ニューロン細胞に標的にされてもよい。ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態の処置は、ニューロンを含有する組織におけるニューロンの欠損を予防する処置、又はニューロンの欠損であると既に診断されているニューロン細胞の周囲のニューロンの欠損を減少させる処置を含み得る。ニューロン細胞は、前記ｍｉＲＮＡ−１３５及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル又はそれらの供給源が、標的部分又は自動誘導装置に、連結又はコンジュゲートされることによって、標的にされてもよい。好ましい標的部分は、ニューロン細胞において発現する分子を認識又は結合することが公知の任意の分子である。本発明の文脈において、ｍｉＲＮＡ−１３５若しくはｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、又はそれらの供給源が投与される場合はいつでも、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはミミック、若しくはアンタゴミル、又はそれらの供給源の個々の投与、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはミミック、若しくはアンタゴミル、又はそれらの供給源の個々の投与、或いはｍｉＲＮＡ−１３５ａ及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂの両方、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはミミック、若しくはアンタゴミル、又はそれらの供給源の組み合わせ投与に対して参照される。
【０１２８】
別の使用において、本明細書において言及される本発明は、記憶力の訓練又はＣＮＳに作用する公知の医薬品の使用などの、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態の標準処置と、組み合わせてもよい。
【０１２９】
遺伝子治療は、ニューロンの欠損に関連する状態又は疾患を、処置、回復、予防及び／又は遅延させるための可能性があるが、他の可能な処置も想定することができる。例えば、ある特定の分子経路を所望の方向に進める「低分子」薬物による処置も好ましい。これらの低分子は、好ましくは、本明細書の後で定義される本発明のスクリーニング方法によって、特定される。
【０１３０】
本発明の文脈において、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態を、処置する、回復させる、予防する、治癒する及び／又は遅延させるとは、以下を意味し得る。
−  この疾患又は状態の少なくとも１つの症状の重症度が低減される、及び／或いは
−  この疾患又は状態に関連する少なくとも１つのパラメーターが改善され、好ましくは、そのようなパラメーターは、ニューロンの欠損であるか、若しくはニューロンの欠損に関連し、並びに／或いは本明細書の前にすべて記載の、ニューロン細胞の数、及び／又はニューロン細胞の機能、若しくは活性、若しくは３Ｄの態様を含む。
パラメーターは、本明細書の前で説明されたニューロンの欠損の評価であってもよい。本発明の文脈において、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態を、処置すること、回復させること、予防すること、治癒すること及び／又は遅延させることは、ニューロンの発生若しくは再生を達成すること、又は促進すること、又は誘導することによって置き換えてもよい。他の指示がない限り、ニューロンの発生若しくは再生を達成すること、又は促進すること、又は誘導することは、好ましくは、処置された対象において、少なくとも１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、１か月後、２か月後、３か月後、４か月後、５か月後、６か月後又はそれよりも後に、評価又は検出される。ニューロンの発生若しくは再生を達成すること、又は促進すること、又は誘導することは、好ましくは、対象において
−  少なくとも１か月、数か月以上の患者の生存の延長（処置されていないか若しくは対照で処置されたものと比較、又は処置の開始の際の対象と比較）、並びに／或いは
−  クオリティオブライフ及び観察された痛みの軽減の改善
として特定される。
【０１３１】
本発明の文脈において、患者は、生存することができ、及び／又は疾患無であると考えることができる。或いは、疾患又は状態は、停止又は遅延されていてもよい。本発明の文脈において、クオリティオブライフ及び観察された痛みの軽減の改善は、患者が、処置の開始の際よりも少ない鎮痛薬を必要とし得ることを意味し得る。より少ない鎮痛薬に代えて、又はより少ない鎮痛薬の摂取と組み合わせて、患者は、処置の開始の際よりも便秘が少なくなってもよい。この文脈における「少ない」とは、５％少ない、１０％少ない、２０％少ない、３０％少ない、４０％少ない、５０％少ない、６０％少ない、７０％少ない、８０％少ない、９０％少ないを意味し得る。患者は、もはや任意の鎮痛薬を必要としなくてもよい。クオリティオブライフ及び観察された痛みの軽減のこの改善は、前記患者の処置の開始の際のクオリティオブライフ及び観察された痛みの軽減と比較して、患者において、処置の少なくとも１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、１か月後、２か月後、３か月後、４か月後、５か月後、６か月後又はそれよりも後に、見られ、検出又は評価されてもよい。
【０１３２】
組成物
本発明の態様において、本発明による、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル、又はそれらの供給源を含む組成物が提供される。そのような組成物は、好ましくは、上記に定義される使用のためである。したがって、この態様の好ましい実施形態は、本発明による使用のための、本発明による、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル、又はそれらの供給源を含む組成物を提供する。そのような使用のための組成物は、本明細書において、本発明による使用のための組成物と称される。本発明による使用のためのそのような組成物の好ましいさらなる成分は、薬学的に許容できる賦形剤である。
好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、若しくはｉｓｏｍｉＲ、ミミック、又はこれらのいずれかの供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡのアンタゴミルは、組成物に含まれる。したがって、この態様内のより好ましい実施形態は、以下を含む、本発明による使用のための組成物を提供する：
ｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル若しくは供給源、及び／或いは
ｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル若しくは供給源、及び／或いは
ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル若しくは供給源。
この態様内のさらにより好ましい実施形態は、以下を提供する：
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１３３】
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１３４】
−  ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１３５】
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源、及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１３６】
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源、及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１３７】
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源、及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１３８】
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源、及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源、及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、若しくは供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくは供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１３９】
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１４０】
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１４１】
−  ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１４２】
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含み、及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１４３】
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含み、及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１４４】
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含み、及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１４５】
−  ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含み、及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含み、及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子若しくはそのミミックのアンタゴミルを含むか、又はそれらの供給源を含む、本発明による使用のための組成物。
【０１４６】
本明細書において記載されるすべての組成物は、好ましくは、薬学的に許容できる賦形剤も含む。含まれるとして記載される成分から本質的になる、本明細書において記載される組成物も本発明に包含される。含まれるとして記載される成分からなる、本明細書において記載される組成物も本発明に包含される。
【０１４７】
さらに好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ−１２４分子、ｍｉＲＮＡ−１２４のミミック、ｍｉＲＮＡ−１２４のｉｓｏｍｉＲ、ｉｓｏｍｉＲのアンタゴミル、又はそれらの供給源をさらに含み、好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１２４分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源を含む、好ましくは上記に定義される、本発明による使用のための組成物が提供される。
【０１４８】
本発明が、２つ以上のｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、若しくはそれらの供給源、又はそれらのアンタゴミルを含む組成物に関する場合、それぞれのｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル若しくはそれらの供給源、又はそれらのアンタゴミルが、それぞれ別々の組成物中に存在してもよく、それぞれの組成物が、対象に、連続して又は同時に投与されることを包含する。或いは、２つ以上のｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、若しくはそれらの供給源、又はそれらのアンタゴミルが、本明細書に定義される組成物中に存在することも包含する。
【０１４９】
したがって、本発明は、ｍｉＲＮＡ−１２４分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル若しくはそれらの供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル、又はそれらの供給源、及び／又はｍｉＲＮＡ−１２４分子の追加のアンタゴミルを含む組成物を追加として使用することをさらに包含する。
この好ましい使用は、対象において、前記対象の細胞において、前記対象の組織において、又は前記対象の体液において、前記ｍｉＲＮＡ−１２４分子、ｉｓｏｍｉＲ、若しくはそれらの前記供給源の、活性又は定常状態のレベルを、増加させること、好ましくは、薬理学的に増加させることを含む。
【０１５０】
この好ましい使用において、上記に定義される、ｍｉＲＮＡ−１２４分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又は前駆体の、活性又は定常状態のレベルは、ニューロンの発生又は再生の検出可能な促進を示すために、増加してもよい。
【０１５１】
アンタゴミルの活性又は定常状態のレベルを増加させる方法は、本明細書の前で既に定義されている。対象におけるニューロンの発生又は再生の促進の評価は、本明細書の前で定義されている。
【０１５２】
さらなる態様において、好ましくは、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患及び／若しくは状態を、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための医薬の製造のための、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル又はそれらの供給源、或いは前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル又はそれらの供給源を含む組成物の使用が提供される。このさらなる態様のそれぞれの特徴は、本明細書において既に記載されている。
【０１５３】
さらなる態様において、それを必要とする対象に、本明細書の前で定義される、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック若しくはそれらの供給源、又はそれらのアンタゴミル、又は組成物を投与するステップによる、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する状態若しくは疾患を、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための方法が提供される。このさらなる態様のそれぞれの特徴は、本明細書において既に記載されている。本発明による使用は、好ましくは、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態を、処置、治癒、回復、予防及び／又は遅延させるための方法において実行するために低減される。したがって、本発明は、それを必要とする対象に、本発明による、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル若しくはそれらの供給源、又は本発明による組成物を投与するステップによる、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する状態若しくは疾患を、処置、治癒、回復、予防及び／又は遅延させるための方法を提供する。追加の特徴は、本明細書の他の箇所に記載される。
さらなる態様において、対象におけるニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態を診断するための方法であって、
（ａ）本発明による、ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルを決定するステップ、及び任意選択で
（ｂ）本発明による、前記ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルを、前記ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルについての参照値と比較するステップであって、参照値が、好ましくは、健康な対象における前記ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルについての平均値であるステップ
を含む、方法が提供される。本発明の文脈において、診断は、ニューロンの欠損の発生について、又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態の発生について、対象の予測される危険性の評価のいずれかを意味する。本発明の文脈において、対象は、動物又は人間であってもよい。好ましくは、対象は人間である。本発明の文脈において、（ｂ）において評価される参照値、並びに（ａ）において評価されるｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／又はｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／又はｍｉＲＮＡ１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の発現レベルは、両方の対象の対応する又は同様の組織において評価される。
好ましい実施形態において、この態様は、対象におけるてんかん又はてんかんに関連する疾患若しくは状態を診断するための方法であって、
（ａ）上記に定義されるｍｉＲＮＡ又はその供給源、好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１３５分子又はｍｉＲＮＡ−１３５のｉｓｏｍｉＲの発現レベルを決定するステップ、及び任意選択で
（ｂ）前記ｍｉＲＮＡ又はその供給源の発現レベルを、前記ｍｉＲＮＡ又はその供給源の発現レベルについての参照値と比較するステップであって、参照値が、好ましくは、健康な対象における前記ｍｉＲＮＡ又はその供給源の発現レベルについての平均値であるステップ
を含む、方法を提供する。
【０１５４】
これらのヌクレオチド配列の発現レベル、及び／或いは対応するｍｉＲＮＡ分子若しくはｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の量は、対象において測定することが困難であることがあるので、対象からの試料が、好ましく使用される。別の好ましい実施形態によれば、（ヌクレオチド配列、若しくはｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の）発現レベルは、対象から得られた試料においてエクスビボで決定される。そのため、好ましい実施形態において、本発明は、本明細書において記載される診断するための方法であって、発現レベルが、対象から得られた試料においてエクスビボで決定される、方法を提供する。試料は、対象の体液を含んでいてもよい。試料は、対象の組織生検であってもよい。好ましい組織は、ニューロン細胞を含むか、又はニューロン細胞からなるか、又はニューロン細胞に関連する。体液は、血液、血清、痰、血漿、ＣＳＦ（脳脊髄液）、便、尿を含んでいてもよく、又はこれらに由来していてもよい。本発明は、ニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態の段階の間の差を評価又は診断するために使用することができることが、特に企図される。
【０１５５】
ヌクレオチド配列の発現レベル（又はコードされるｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉ、又はそれらの供給源の定常状態のレベル）の増加又は減少は、健康な対象における対応するヌクレオチド配列の発現レベル（或いは対応するコードされるｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の定常状態のレベル）との比較において、前に定義される方法を使用する、好ましくは、ヌクレオチドの発現レベルの検出可能な変化（或いはコードされるｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の定常状態のレベル、或いはｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の生物活性における検出可能な任意の変化）であるとして定義される。好ましいヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ分子又はそのｉｓｏｍｉＲの前駆体をコードする配列である。好ましい実施形態によれば、ｍｉＲＮＡの活性の増加又は減少は、ｍｉＲＮＡの活性についての特異的アッセイを使用して、定量化される。好ましいアッセイは、本明細書の前で定義された、ニューロンの欠損又はニューロンの発生若しくは再生の促進の評価である。
【０１５６】
好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルの減少は、アレイを使用する、ヌクレオチド配列の少なくとも１０％の発現レベルの減少を意味する。より好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルの減少は、少なくとも１５％、さらにより好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％又は１００％の減少を意味する。この場合において、検出可能な発現はない。
【０１５７】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルの減少は、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、又はノーザンブロット分析を使用する、ｍｉＲＮＡの少なくとも１０％の発現レベルの減少を意味する。好ましくは、ｑＰＣＲは、ステムループＲＴ  ｑＰＣＲである。より好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子若しくはｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の発現レベルの減少は、少なくとも１５％、さらにより好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％又は１００％の減少を意味する。この場合において、検出可能な発現はない。
【０１５８】
好ましくは、ｍｉＲＮＡの活性の減少は、好適なアッセイを使用する、ｍｉＲＮＡの活性の少なくとも５％の減少を意味する。より好ましくは、ｍｉＲＮＡの活性の減少は、少なくとも１０％、さらにより好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％又は１００％の減少を意味する。この場合において、検出可能な活性はない。
【０１５９】
好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルの増加は、本明細書において言及される任意の手法を使用する、ヌクレオチド配列の少なくとも１０％の発現レベルの増加を意味する。より好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルの増加は、少なくとも１５％、さらにより好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％又はそれ以上の増加を意味する。
【０１６０】
好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルの増加は、ＲＴ−ｑＰＣＲ、好ましくはステムループＲＴ  ｑＰＣＲを使用する、ｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の少なくとも１０％の発現レベルの増加を意味する。より好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子若しくはｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の発現レベルの増加は、少なくとも１５％、さらにより好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％又はそれ以上の増加を意味する。
【０１６１】
好ましくは、ｍｉＲＮＡの活性の増加は、好適なアッセイを使用する、ｍｉＲＮＡの活性の少なくとも５％の増加を意味する。より好ましくは、ｍｉＲＮＡの活性の増加は、少なくとも１０％、さらにより好ましくは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％又はそれ以上の増加を意味する。
【０１６２】
好ましくは、発現レベルは、対象から得られた試料においてエクスビボで決定される。より好ましくは、試料は、本明細書において前に定義された通りであり、その後、所与のヌクレオチド配列、及び／或いはｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源は、当業者に公知の方法を使用して抽出及び精製される。より好ましくは、試料は、生検、血液、痰、便若しくは尿であるか、これらを含むか、又はこれらに由来する。
【０１６３】
本発明の診断方法において、好ましくは、２つ以上、より好ましくは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個のｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベル、及び／或いは対応するｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の定常状態のレベルが決定される。
【０１６４】
好ましい方法によれば、ステップ（ａ）において、
ｉ）ｍｉＲＮＡ−１２４分子、ｍｉＲＮＡ−１２４のｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１２４の前駆体、或いは
ｉｉ）ＫＬＦ４、或いは
ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂの両方、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源、或いは
ｉｖ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐの両方、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源、或いは
ｖ）ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐの両方、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源、或いは
ｖｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのそれぞれ、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源
から選択される、別のｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルを決定する。
【０１６５】
さらに好ましい方法において、ステップ（ａ）において、
ｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂの両方、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源、或いは
ｉｉ）Ｍｅｆ２ａ、或いは
ｉｉｉ）Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３５ａ１、或いは
ｉｖ）Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３５ａ２、或いは
ｖ）Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３５ａ１及びＰｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３５ａ２の両方
の発現レベルが決定される。
【０１６６】
Ｍｅｆ２ａの発現は、タンパク質の含量を決定することによって、又はｍＲＮＡを決定することによって、決定することができる。
【０１６７】
好ましくは、てんかんは、Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３５ａ２の発現の増加が見られる場合に、より好ましくは、Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１３５ａ１の増加が見られないヒト対象について、診断される。ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ１及びｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ２の間の比率が決定される場合、診断されたてんかんは、好ましくは、側頭葉てんかんである。ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ１及びｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ２の間の相対発現比率が決定される場合、てんかんは、好ましくは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ２の相対発現が、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ１の相対発現よりも、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０％又はそれよりも高い、より好ましくは、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０％又はそれよりも高い場合に、診断される。好ましくは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ１の相対発現は、健康な対象などの参照値、又は健康な対象についての平均値よりも、最大で２０、１５、１０、５又は０％高い。好ましい実施形態において、てんかんは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ１の発現が、参照値と比較して増加していないか、又は最大で１５、１０若しくは５％まで増加しているが、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ２の発現が増加しているか、又は参照値と比較して、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００％又はそれ以上まで増加している場合に、診断される。好ましい参照値は、健康な対象における発現、又は健康な対象における平均発現であり、この文脈において、発現レベルは、好ましくは、正規化され、例えば、ＧＡＰＤＨの発現に対して正規化される。Ｐｒｅ−ｍｉＲは、公知の手法、例えば、ｑＰＣＲによって決定することができる。
【０１６８】
さらに好ましい方法において、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態は、比較が、前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルの減少の所見をもたらす場合に、診断される。より好ましくは、てんかん又はてんかんに関連する疾患若しくは状態は、比較が、前記ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルの増加の所見をもたらす場合に、診断される。
【０１６９】
さらに好ましい方法において、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態は、比較が、前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルの減少、及びｍｉＲＮＡ−１２４分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルの減少の所見をもたらす場合に、診断される。
【０１７０】
さらに好ましい実施形態において、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態は、比較が、前記ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルの減少、及び／或いはｍｉＲＮＡ−１２４分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルの減少の所見をもたらす場合に、診断される。
【０１７１】
さらなる態様において、対象におけるニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する状態若しくは疾患を、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させる能力がある物質又は分子の特定のための方法であって、
（ａ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源を発現する能力がある試験細胞集団を提供するステップであって、好ましくは、試験集団が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙなどのニューロン細胞を含み、より好ましくは、試験細胞集団が、哺乳動物細胞、さらにより好ましくは、ヒト細胞を含むステップ；
（ｂ）試験細胞集団を物質と接触又はインキュベートするステップ；
（ｃ）物質と接触又はインキュベートされた試験細胞集団において、前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の発現レベル、或いは前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の活性又は定常状態のレベルを決定するステップ；
（ｄ）（ｃ）において決定された発現、活性又は定常状態のレベルを、物質と接触していない試験細胞集団における前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の発現、活性又は定常状態のレベルと比較するステップ；並びに
（ｅ）物質と接触した試験細胞集団及び物質と接触していない試験細胞集団の間の、前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の発現レベル、活性又は定常状態のレベルにおける差を生じる物質を特定するステップ
を含む、方法が提供される。
【０１７２】
好ましい試験細胞集団は、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／又はｍｉＲＮＡ−１３５ｂを発現する能力がある試験細胞集団であり；そのような試験細胞集団が使用される場合、ステップ（ｃ）及び（ｄ）及び（ｅ）は、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／又はｍｉＲＮＡ−１３５ｂにのみ関連する。好ましくは、ステップ（ａ）において、試験細胞は、本明細書の前で定義された、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、若しくはそのｉｓｏｍｉＲの供給源又は前駆体、或いはそれらの前駆体を含む核酸コンストラクトを含む。好ましくは、方法において、２つ以上のヌクレオチド配列、又は２つ以上のｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ若しくはそれらの供給源の発現レベル、活性又は定常状態のレベルが比較される。好ましくは、方法において、試験細胞集団は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞を含む。より好ましくは、試験細胞はニューロン細胞である。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株も使用することができる。好ましい試験細胞集団は、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、又はｉｓｏｍｉＲ、或いはそれらの供給源を発現しないか、或いは正常な対応物と比較して、発現の低減を有する。より好ましくは、試験細胞集団はニューロン細胞を含む。より好ましくは、試験細胞集団は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のニューロン細胞を含む。ニューロン細胞は、それらのマーカーの発現によって特定され得る。以前に言及した細胞に代えて、又は加えて、１つの態様において、本発明は、前述の方法において特定された物質にも関係する。
【０１７３】
好ましい方法において、ｍｉＲＮＡ−１２４分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベル、活性或いは定常状態のレベルが比較される。
【０１７４】
さらなる態様において、ニューロンの発生若しくは再生を促進するためのインビボ、インビトロ又はエクスビボの方法であって、細胞を、本発明によるｍｉＲＮＡ、アンタゴミル、又はそれらの供給源と、或いは本発明による組成物と接触させるステップを少なくとも含む、方法が提供される。そのような方法は、本明細書の他の箇所で記載されるような、方法のステップを含んでいてもよい。本発明の文脈において、細胞を化合物又は組成物と接触させることは、そのような化合物又は組成物を、細胞が培養される培地に添加することを含むことができる。細胞を化合物又は組成物と接触させることは、そのような化合物又は組成物を、細胞が懸濁されるか、若しくは細胞を覆う、培地、緩衝液又は溶液に添加することを含むこともできる。細胞を接触させる他の好ましい方法は、細胞に化合物若しくは組成物を注射すること、又は本発明による化合物若しくは組成物を含む材料に細胞を曝露することを含む。この態様の実施形態において、方法は、インビトロの方法である。この態様のさらなる実施形態において、方法は、エクスビボの方法である。この態様のさらなる実施形態において、方法は、インビボの方法であり；そのような場合において、本明細書の他の箇所に定義される投与は、細胞を接触させる好ましい様式である。この態様の好ましい実施形態において、方法は、インビトロ又はエクスビボの方法である。
【０１７５】
この態様の実施形態内で、細胞は、対象から得られた試料からの細胞であり得る。そのような試料は、対象から以前に得られた試料であり得る。この態様の実施形態内で、試料は、ヒト対象から以前に得ることができる。この態様の実施形態内で、試料は、非ヒト対象から得ることができる。この態様の好ましい実施形態において、試料を得ることは、本発明による方法の部分ではない。本発明による方法又は使用の好ましい実施形態において、本発明による方法又は使用は、本発明による生成物を使用する。
本明細書において参照する一般的定義及び一般的技術
マイクロＲＮＡ分子（「ｍｉＲＮＡ」）は、一般に、２１〜２２ヌクレオチド長であり、１７個から最大で２５個までの長さのヌクレオチドが報告されている。したがって、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５の任意の長さが本発明内に包含される。ｍｉＲＮＡは、より長い前駆体ＲＮＡ分子（「前駆体ｍｉＲＮＡ」）からそれぞれプロセシングされる。前駆体ｍｉＲＮＡは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体は、少なくとも５０、７０、７５、８０、８５、１００、１５０、２００個又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。前駆体ｍｉＲＮＡは、ステムループ又はフォールドバック様構造を形成することを可能にする、相補的な２つの領域を有し、これは、動物において、ダイサー及びドローシャと呼ばれる酵素によって切断される。ダイサー及びドローシャは、リボヌクレアーゼＩＩＩ様ヌクレアーゼである。プロセシングされたｍｉＲＮＡは、典型的には、ステムの一部である。
【０１７６】
プロセシングされたｍｉＲＮＡ（「成熟ｍｉＲＮＡ」とも称される）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知の大きな複合体の一部分になり、特定の標的遺伝子を（下方）制御する。動物のｍｉＲＮＡの例としては、ｍＲＮＡ標的と完全又は不完全に塩基対化し、それぞれ、ｍＲＮＡ分解又は翻訳の阻害のいずれかをもたらすものが挙げられる（Ｏｌｓｅｎら、１９９９年；Ｓｅｇｇｅｒｓｏｎら、２００２年）。ｓｉＲＮＡ分子もまた、長い二本鎖ＲＮＡ分子からであるが、ダイサーによってプロセシングされる。ｓｉＲＮＡは、動物細胞中において天然には見られないが、これらは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）においてそのような細胞中で機能して、ｍＲＮＡ標的の配列特異的な切断を方向づけることができる（Ｄｅｎｌｉら、２００３年）。
【０１７７】
ＳＩＲＯＣＣＯは、真核生物における複雑性のオーガナイザー及びコーディネーターとしてＲＮＡのサイレンシングを調べるＥＵのコンソーシアムである（例えば、ウェブサイトｃｏｒｄｉｓ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｐｕｂ／ｌｉｆｅｓｃｉｈｅａｌｔｈ／ｄｏｃｓ／ｓｉｒｏｃｃｏ．ｐｄｆ及びｗｗｗ．ｓｉｒｏｃｃｏ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｅｕを参照されたい）。コンソーシアムとして、ＳＩＲＯＣＣＯは、ｍｉＲＮＡ配列情報のデータベースを維持する。ＳＩＲＯＣＣＯのデータベースにリストされたそれぞれのｍｉＲＮＡのエントリーは、前記ｍｉＲＮＡの観察及び検証された発現に基づく。
【０１７８】
内因性ｍｉＲＮＡ分子の研究は、米国特許出願第６０／５７５，７４３号に記載され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。成熟した一本鎖ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡにハイブリダイズするｍＲＮＡの翻訳を制御するタンパク質複合体によって結合する場合、ｍｉＲＮＡは、細胞中で明らかに活性である。内因的に発現するｍｉＲＮＡと同じ方法で細胞に影響を与える外因性ＲＮＡ分子の導入は、内因性の成熟ｍｉＲＮＡと同じ配列の一本鎖ＲＮＡ分子が、翻訳の調節を推進するタンパク質複合体によって取り込まれることを必要とする。さまざまなＲＮＡ分子の設計が評価されている。ｍｉＲＮＡ経路による所望の一本鎖ｍｉＲＮＡの取り込みを最大化する３つの遺伝子設計が特定されている。３つの設計のうちの少なくとも１つを有するｍｉＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子は、合成ｍｉＲＮＡとして称されてもよい。
【０１７９】
本発明のｍｉＲＮＡ分子は、内因性ｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を置き換え又は補完することができる。そのような分子の例、そのような分子及びそのような分子を含む組成物の好ましい特性並びに修飾は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／０９１９８２号に記載されている。
【０１８０】
本発明のｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはミミック、又はそれらの供給源は、いくつかの実施形態において、２つのＲＮＡ分子を含み、ここで、１つのＲＮＡは、天然に存在する成熟ｍｉＲＮＡと同一である。成熟ｍｉＲＮＡと同一であるＲＮＡ分子は、活性鎖と称する。相補鎖又はパッセンジャー鎖と称される第２のＲＮＡ分子は、活性鎖に対して少なくとも部分的に相補的である。活性鎖及び相補鎖は、ハイブリダイズされて、二本鎖ＲＮＡを作成し、これは、細胞中でのｍｉＲＮＡの活性化の直前にタンパク質複合体によって結合される、天然に存在するｍｉＲＮＡ前駆体と同様である。前記ｍｉＲＮＡの活性を最大化するには、翻訳のレベルで遺伝子発現を制御するｍｉＲＮＡタンパク質複合体によって、活性鎖の取り込みを最大化すること、及び相補鎖の取り込みを最小化することを必要とする。最適のｍｉＲＮＡの活性を提供する分子の設計は、相補鎖の修飾を含む。
【０１８１】
２つの設計は、相補鎖の化学修飾を組み入れる。
【０１８２】
第１の修飾は、その５’末端でホスフェート又はヒドロキシル以外の基で相補的ＲＮＡを作成することを含む。５’の修飾の存在は、相補鎖の取り込みを明らかに排除し、その後、ｍｉＲＮＡタンパク質複合体による活性鎖の取り込みに有利に働く。５’修飾は、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、ビオチンなどを含むさまざまな分子のいずれかであり得る。
【０１８３】
ｍｉＲＮＡ経路による相補鎖の取り込みを有意に低減させる第２の化学修飾の戦略は、相補鎖の最初の２〜６ヌクレオチドにおいて、糖修飾を有するヌクレオチドを組み込むことである。第２の設計戦略と一致する糖修飾を、第１の設計戦略と一致する５’末端修飾と組み合わせて、ｍｉＲＮＡの活性をさらに増強することができることに留意すべきである。
【０１８４】
第３のｍｉＲＮＡの設計は、活性鎖に相補的ではない相補鎖の３’末端にヌクレオチドを組み込むことを含む。
【０１８５】
生じる活性及び相補的ＲＮＡのハイブリッドは、活性鎖の３’末端で非常に安定であるが、活性鎖の５’末端では比較的不安定である。ｓｉＲＮＡを用いる研究は、５’ハイブリッドの安定性は、ＲＮＡ干渉を支援するタンパク質複合体によるＲＮＡ取り込みの重要な指標であり、これは、細胞中でのｍｉＲＮＡ経路に少なくとも関連する。本発明者らは、相補的ＲＮＡ鎖におけるミスマッチの賢明な使用が前記ｍｉＲＮＡの活性を有意に増強することを見出した。
【０１８６】
ｍｉＲＮＡライブラリー
本明細書において特定されるｍｉＲＮＡについての重要な適用は、試料中のｍｉＲＮＡの１個体又は群の存在の評価又は診断である。異なるｍｉＲＮＡのそれぞれを有する細胞集団は、次いで、アッセイして、その存在が細胞表現型（すなわち、ニューロンの欠損）に影響を与えるｍｉＲＮＡを特定することができる。ライブラリー中の異なるｍｉＲＮＡの数は変動可能である。ライブラリー中において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくはそれ以上、又はそれらにおいて導かれる任意の範囲の異なるｍｉＲＮＡ特異的分子であり得るか、或いは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくはそれ以上、又はそれらにおいて導かれる任意の範囲の異なるｍｉＲＮＡ特異的分子であり得るか、或いは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくはそれ以上、又はそれらにおいて導かれる任意の範囲の異なるｍｉＲＮＡ特異的分子であり得ることが企図される。特定の実施形態において、ライブラリーは、１〜２０個の異なるｍｉＲＮＡ特異的分子、又は５〜２０個の異なるｍｉＲＮＡ特異的分子を有する。「異なる」ｍｉＲＮＡ特異的分子は、異なる配列を有するｍｉＲＮＡを特異的にコードする核酸を指す。
【０１８７】
ｍｉＲＮＡは、主にＲＮＡから作られるように企図されるが、いくつかの実施形態において、それらは、ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）若しくはアンロックド核酸（ＵＮＡ）などのヌクレオチドアナログ、ＤＮＡ、又はＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログ及びＰＮＡ（ペプチド核酸）の任意の組み合わせであってもよい。したがって、ライブラリーはこれらの異なるｍｉＲＮＡに対する１つ又は複数の核酸を含有することが理解される。特定の実施形態において、ライブラリーは、ヒトｍｉＲＮＡに特異的であるが、複数の生物体についてのライブラリーも企図される。
【０１８８】
本発明のＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ領域を有するか、又はｍｉＲＮＡ領域を含むか、又はｍｉＲＮＡ領域からなる。特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはミミック、若しくはアンタゴミル、又はそれらの前駆体は、配列番号５７〜３４１のいずれかに由来する配列を有する。本発明の核酸分子は、配列番号５〜９における成熟ｍｉＲＮＡ配列のいずれかに由来していてもよいことが特に企図される。
【０１８９】
ｍｉＲＮＡ分子、若しくはｉｓｏｍｉＲ、若しくはミミック、又はそれらの前駆体は、予測されるｍｉＲＮＡ配列の上流及び／又は下流のコード配列のうちの少なくとも１〜５個のヌクレオチドが伸びた配列を含む。いくつかの実施形態において、分子は、最大で１、２、３、４、５、６、７若しくはそれ以上、又はそれらにおいて導かれる任意の範囲の連続的なヌクレオチドを有し、これは、片側若しくは両側（５’及び／又は３’末端）において主にプロセシングされたｍｉＲＮＡをコードする配列に隣接する。
【０１９０】
本発明のライブラリーは、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ラット及びマウスなどの哺乳動物を特に含む、ｍｉＲＮＡを有する任意の生物体からのｍｉＲＮＡ配列を含有することができる。特に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の異なるｍｉＲＮＡ（すなわち、異なるｍｉＲＮＡ遺伝子に由来する異なる配列を有するｍｉＲＮＡ特異的分子）を有するか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の異なるｍｉＲＮＡ（すなわち、異なるｍｉＲＮＡ遺伝子に由来する異なる配列を有するｍｉＲＮＡ特異的分子）を有するか、又は最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の異なるｍｉＲＮＡ（すなわち、異なるｍｉＲＮＡ遺伝子に由来する異なる配列を有するｍｉＲＮＡ特異的分子）を有するライブラリーが、企図される。配列番号１〜４又は１０〜１３又は１４７〜２４１のいずれかに関する前の文章に記載されているそのようなライブラリー、特にこれらの対応するｍｉＲＮＡ配列（成熟配列）が、特に企図される。
【０１９１】
核酸
本発明は、ｍｉＲＮＡを培養細胞若しくは対象に導入することができる、ｍｉＲＮＡの供給源又は前駆体とも呼ばれる核酸分子に関係する。核酸は、精製された酵素によって細胞又はインビトロで産生され得るが、これらは、化学合成によって好ましく生成される。これらは、粗製物であってもよく、又は精製されていてもよい。「ｍｉＲＮＡ」という用語は、他の指示がない限り、それがその前駆体から切断された後のプロセシングされたｍｉＲＮＡを指す。表１は、どの配列番号がｍｉＲＮＡの特定の前駆体配列（配列番号１〜４）に相当するかを示し、表６は、どの配列番号がｍｉＲＮＡの成熟又はミミック配列（配列番号１４７〜２４１）に相当するかを示す。表３は、実施例において記載される機能的スクリーニングにおいて使用されたレンチウイルスベクターにクローニングされたＤＮＡ配列（配列番号１０〜１３）を特定する。表４及び５は、表２の成熟ｍｉＲＮＡのそれぞれの好ましいシード配列（配列番号１４〜５６）を特定する。ｍｉＲＮＡの名称は、多くの場合、省略され、かつ接頭辞なしで言及され、文脈に応じてそのように理解される。他の指示がない限り、本出願において言及されるｍｉＲＮＡは、ｍｉｒ−Ｘ又はｌｅｔ−Ｘ（ここで、Ｘは、数字及び／又は文字である）として特定されるヒト配列である。
【０１９２】
ｍｉＲＮＡは、ゲノム配列又は非コード配列に由来することが理解される。この点において、「遺伝子」という用語は、所与のｍｉＲＮＡのための前駆体ｍｉＲＮＡをコードするゲノム配列を単に指すために使用される。しかしながら、本発明の実施形態は、プロモーター又は他の制御配列などの、その発現に関与するｍｉＲＮＡのゲノム配列を含んでいてもよい。
【０１９３】
「組換え」という用語が使用されてもよく、これは、一般に、インビトロで操作された分子、又は、そのような分子の複製若しくは発現産物を指す。
【０１９４】
「核酸」という用語は、当技術分野において周知である。本明細書において使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの誘導体若しくはアナログの分子（１つ又は複数の鎖）を指す。核酸塩基としては、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」又はシトシン「Ｃ」）若しくはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」又はＣ）において見られる、天然に存在するプリン又はピリミジン塩基が挙げられる。「核酸」という用語は、「核酸」という用語のそれぞれ下位属の「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語を包含する。
【０１９５】
「ｍｉＲＮＡ」という用語は、一般に、一本鎖分子を指すが、特定の実施形態において、本発明において実行される分子は、同じ一本鎖分子の別の領域又は別の核酸と、部分的に（鎖の長さにわたって１０〜５０％相補的）、実質的に（鎖の長さにわたって５０％を超えるが１００％未満相補的な）又は完全に相補的である、領域又は追加の鎖も包含する。このように、核酸は、１つ又は複数の相補的若しくは自己相補的な鎖（複数可）を含む分子、又は分子を含む特定の配列の「相補体（複数可）」を包含し得る。例えば、前駆体ｍｉＲＮＡは、最大で１００％相補的な自己相補領域を有していてもよい。
【０１９６】
本明細書において使用される場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイズすることができる」は、サザンブロット手順などの当業者に公知の手法を使用して、二本鎖若しくは三本鎖分子、又は部分的に二本鎖若しくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解される。本明細書において使用される「アニールする」という用語は、「ハイブリダイズする」と同義である。「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイズすることができる」という用語は、下記に定義される「低」、「中」又は「高」ハイブリダイゼーション条件を意味し得る。
【０１９７】
低〜中〜高ストリンジェンシー条件は、４２℃での、５Ｘ  ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００ｐｇ／ｍｌの剪断及び変性サケ精子ＤＮＡ、及びそれぞれ、低〜中〜高ストリンジェンシーに対して２５％、３５％又は５０％のホルムアミドのいずれかでのプレハイブリダイゼーション並びにハイブリダイゼーションを意味する。その後、ハイブリダイゼーション反応物は、２ＸＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ、及び低〜中〜高ストリンジェンシーに対して、５５℃、６５℃又は７５℃のいずれかをそれぞれ使用して、３０分間にわたって３回洗浄される。
【０１９８】
本発明の核酸又はその誘導体は、いくつかの実施形態において、配列番号１〜４又は１４７〜３４１に記載のいずれかのｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ配列を含む。配列番号１〜４又は１４７〜３４１に由来する本発明の核酸配列は、配列番号１〜４又は１４７〜３４１からの、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個の連続的なヌクレオチド（又はそれらにおいて導かれる任意の範囲）を有するか、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個の連続的なヌクレオチド（又はそれらにおいて導かれる任意の範囲）を有するか、或いは最大で５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個の連続的なヌクレオチド（又はそれらにおいて導かれる任意の範囲）を有し得ることが企図される。他の実施形態において、核酸は、配列番号１〜４又は１４７〜３４１のｍｉＲＮＡ配列と、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％同一であるか、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％同一であるか、又は最大で８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％同一である。
【０１９９】
核酸塩基
本明細書において使用される場合、「核酸塩基」は、例えば、少なくとも１つの天然に存在する核酸（すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡ）中で見られる天然に存在する核酸塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵ）、並びにそのような核酸塩基の天然に存在するか、又は天然に存在しない誘導体（複数可）及びアナログなどの複素環塩基を指す。核酸塩基は、一般に、天然に存在する核酸塩基の対形成（例えば、Ａ及びＴ、Ｇ及びＣ、並びにＡ及びＵの間の水素結合）と置換し得る様式で、少なくとも１つの天然に存在する核酸塩基と１つ又は複数の水素結合を形成する（「アニールする」又は「ハイブリダイズする」）ことができる。
【０２００】
「プリン」及び／又は「ピリミジン」核酸塩基（複数可）は、天然に存在するプリン及び／又はピリミジン核酸塩基、並びに限定されるものではないが、プリン又はピリミジンが、アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）、チオール若しくはアルキルチオール部分のうちの１つ又は複数によって置換されたものを含む、それらの誘導体（複数可）及びアナログ（複数可）を包含する。好ましいアルキル（例えば、アルキル、カルボキシアルキルなど）部分は、約１個から、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個までの炭素原子で構成される。プリン又はピリミジンの他の非限定的な例としては、デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、ブロモチミン、８−アミノグアニン、８−ヒドロキシグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、アザグアニン、２−アミノプリン、５−エチルシトシン、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシル、５−エチルウラシル、５−ヨードウラシル、５−クロロウラシル、５−プロピルウラシル、チオウラシル、２−メチルアデニン、メチルチオアデニン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアデニン、アザアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヒドロキシアデニン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、４−（６−アミノヘキシル／シトシン）などが挙げられる。他の例は、当業者に周知である。
【０２０１】
核酸塩基は、本明細書において記載の、又は当業者に公知の、任意の化学的又は天然合成方法を使用して、ヌクレオシド又はヌクレオチドに含まれていてもよい。そのような核酸塩基は、標識されていてもよく、又はこれは、標識及び核酸塩基に含有される分子の一部であってもよい。
【０２０２】
ヌクレオシド
本明細書において使用される場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基のリンカー部分に共有結合した核酸塩基を含む個々の化学単位を指す。「核酸塩基のリンカー部分」の非限定的な例は、限定されないが、デオキシリボース、リボース、アラビノースを含む、５個の炭素原子を含む糖（すなわち、「五炭糖」）、又は五単糖の誘導体若しくはアナログである。五単糖の誘導体又はアナログの非限定的な例としては、２’−フルオロ−２’−デオキシリボース、又は炭素が糖の環中の酸素原子で置換された炭素環式の糖が挙げられる。
【０２０３】
核酸塩基の核酸塩基のリンカー部分への共有結合（複数可）の異なる種類は、当技術分野において公知である。非限定的な例として、プリン（すなわち、Ａ又はＧ）又は７−デアザプリン核酸塩基を含むヌクレオシドは、典型的には、プリン又は７−デアザプリンの９位が五単糖の１’位に共有結合する。別の非限定的な例において、ピリミジン核酸塩基（すなわち、Ｃ、Ｔ又はＵ）を含むヌクレオシドは、典型的には、ピリミジンの１位が五単糖の１’位に共有結合する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒ、１９９２年）。
【０２０４】
ヌクレオチド
本明細書において使用される場合、「ヌクレオチド」は、「主鎖部分」をさらに含むヌクレオシドを指す。主鎖部分は、一般に、ヌクレオチドが、ヌクレオチドを含む別の分子と、又は別のヌクレオチドと、共有結合して、核酸を形成する。天然に存在するヌクレオチドにおける「主鎖部分」は、典型的には、リン部分を含み、これは、五単糖に共有結合する。主鎖部分の結合は、典型的には、五単糖の３’位又は５’位のいずれかで生じる。しかしながら、特に、ヌクレオチドが天然に存在する五単糖の誘導体若しくはアナログ又はリン部分を含む場合、他の種類の結合が、当技術分野において公知である。
【０２０５】
核酸アナログ
核酸は、天然に存在する核酸に存在し得る、核酸塩基、核酸塩基のリンカー部分及び／若しくは主鎖部分の誘導体又はアナログを含んでいてもよく、或いはすべてこれらで構成されていてもよい。核酸アナログを有するＲＮＡはまた、本発明の方法に従って、標識されていてもよい。本明細書において使用される場合、「誘導体」は、化学的に修飾又は変化した形態の天然に存在する分子を指すが、「ミミック」又は「アナログ」という用語は、天然に存在する分子若しくは部分と構造的に共通点があってもよく、又はなくてもよいが、同様の機能を有する分子を指す。本明細書において使用される場合、「部分」は、一般に、より大きな化学又は分子の構造の、より小さな化学又は分子の成分を指す。核酸塩基、ヌクレオシド及びヌクレオチドのアナログ又は誘導体は、当技術分野において周知であり、記載されている（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｅｉｔ、１９８０年を参照されたい）。
【０２０６】
五炭糖及び／又は主鎖部分の誘導体若しくはアナログを含むヌクレオシド、ヌクレオチド或いは核酸の追加の非限定的な例としては、ｄｓＤＮＡを有する三重らせんの形成及び／又はｄｓＤＮＡの発現を妨げるプリン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第５，６８１，９４７号；特に、蛍光核酸プローブとしての使用のための、ＤＮＡ又はＲＮＡにおいて見られるヌクレオシドの蛍光アナログが組み込まれた核酸を記載している米国特許第５，６５２，０９９号及び米国特許第５，７６３，１６７号；増強されたヌクレアーゼ安定性を有するピリミジン環上に置換基を有するオリゴヌクレオチドアナログを記載している米国特許第５，６１４，６１７号；核酸検出において使用される修飾された五炭糖（すなわち、修飾されたＴ−デオキシフラノシル部分）を有するオリゴヌクレオチドアナログを記載している米国特許第５，６７０，６６３号、米国特許第５，８７２，２３２号及び米国特許第５，８５９，２２１号；ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用することができる、水素以外の置換基で４’位が置換された少なくとも１つの五炭糖部分を含むオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第５，４４６，１３７号；デオキシリボヌクレオチドと３’−５’インターヌクレオチド結合、及びリボヌクレオチドと２’−５’インターヌクレオチド結合の両方を有するオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第５，８８６，１６５号；インターヌクレオチド結合の３’位の酸素が炭素によって置き換えられて、核酸のヌクレアーゼ耐性が増強される、修飾インターヌクレオチド結合を記載している米国特許第５，７１４，６０６号；ヌクレアーゼ耐性を増強する、１つ又は複数の５’メチレンホスホネートインターヌクレオチド結合を含有するオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第５，６７２，６９７号；オリゴヌクレオチドの２’炭素に薬物又は標識を含めて、ヌクレアーゼ安定性、及び薬物又は検出部分を送達する能力の増強を提供することができる、置換基部分の結合を記載している米国特許第５，４６６，７８６号及び米国特許第５，７９２，８４７号；細胞の取り込み、ヌクレアーゼに対する耐性及び標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションを増強する、隣接する五炭糖部分の４’位及び３’位に結合した２’又は３’炭素主鎖結合を有するオリゴヌクレオチドアナログを記載している米国特許第５，２２３，６１８号；核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用な、少なくとも１つのスルファメート又はスルファミドインターヌクレオチド結合を含むオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第５，４７０，９６７号；ヌクレアーゼ耐性、細胞の取り込み及びＲＮＡ発現の制御の改善のために使用される、ホスホジエステル主鎖部分を置き換える３又は４個の原子のリンカー部分を有するオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第５，３７８，８２５号、米国特許第５，７７７，０９２号、米国特許第５，６２３，０７０号、米国特許第５，６１０，２８９号及び米国特許第５，６０２，２４０号；それらの膜透過性及び安定性を増強する、オリゴヌクレオチドの２’−０位に結合した疎水性キャリア剤を記載している米国特許第５，８５８，９８８号；ＤＮＡ又はＲＮＡへのハイブリダイゼーションの増強、ヌクレアーゼに対する安定性の増強を有する、５’末端でアントラキノンにコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第５，２１４，１３６号；ＤＮＡが、ヌクレアーゼ耐性、結合親和性及びＲＮａｓｅＨを活性化する能力の増強のために、２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオチドを含む、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラを記載している米国特許第５，７００，９２２号；並びにリボース部分が、２’酸素及び４’炭素を連結する余分な架橋で修飾された、修飾ＲＮＡヌクレオチドを記載している、国際公開第９８／３９３５２号、国際公開第９９／１４２２６号、国際公開第２００３／９５４６７号及び国際公開第２００７／０８５４８５号におけるものが挙げられる。ロックドリボースは、結合親和性及び特異性を有意に増加させ；国際公開第２００８／１４７８２４号は、ＵＮＡ（アンロックド核酸）と称される修飾ＲＮＡヌクレオチドを記載している。ＵＮＡは、Ｃ２’及びＣ３’原子の間の結合が切断され、相補鎖に対する結合親和性が減少した、ＲＮＡの非環式アナログである。ＵＮＡは、ＲＮａｓｅ  Ｈ認識及びＲＮＡ切断に適合し、ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを改善する；国際公開第２００８／０３６１２７号は、無電荷及びカチオン性の両方のインターサブユニット結合を含有するモルホリノ核酸アナログを記載している；国際公開第２００７／０６９０９２号及び欧州特許出願公開第２０７５３４２号は、オリゴヌクレオチドにカチオン性部分（Ｚユニット）としてスペルミン誘導体のコンジュゲートすることを含むＺｉｐ核酸（ＺＮＡ）を記載している；米国特許第５，７０８，１５４号は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成するためにＤＮＡに連結されたＲＮＡを記載している；米国特許第５，７２８，５２５号は、普遍的な蛍光標識を有するヌクレオシドアナログの標識化を記載している。
【０２０７】
ヌクレオシドアナログ及び核酸アナログについての追加の教示は、末端が標識されたヌクレオシドアナログを記載している米国特許第５，７２８，５２５号；米国特許第５，６３７，６８３号、米国特許第６，２５１，６６６号（Ｌ−ヌクレオチド置換）及び米国特許第５，４８０，９８０号（７−デアザ−２’−デオキシグアノシンヌクレオチド及びその核酸アナログ）である。
【０２０８】
他のアナログの使用は、本発明の文脈における使用のために特に企図される。そのようなアナログは、分子又は選択されたヌクレオチドの両方の全体にわたって、本発明の合成核酸分子において使用されてもよい。それらは、限定されないが、以下が挙げられる：
１）リボース修飾（２’Ｆ、２’ＮＨ２、２’Ｎ３，４’チオ又は２’Ｏ−ＣＨ３など）、及び
２）ホスフェート修飾（ホスホロチオエート、メチルホスホネート及びホスホロボレートにおいて見られるものなど）。
【０２０９】
そのようなアナログは、リボヌクレアーゼによって切断されるそれらの能力を低減又は除くことによって、ＲＮＡに安定性を付与するために作成される。これらのヌクレオチドアナログがＲＮＡ中に存在する場合、それらは、動物におけるＲＮＡの安定性に対して極めて肯定的な効果を有することができる。ヌクレオチドアナログの使用は、単独で、又は本発明の任意の核酸に対する合成ｍｉＲＮＡの任意の設計修飾と組み合わせて、使用することができることが企図される。
【０２１０】
修飾ヌクレオチド
本発明のｍｉＲＮＡは、それらの活性を増強するために修飾されたヌクレオチドの使用を特に企図する。そのようなヌクレオチドとしては、ＲＮＡの５’又は３’末端にあるもの、及び分子内の内部にあるものが挙げられる。前記ｍｉＲＮＡの相補鎖において使用される修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡの５’ＯＨ若しくはホスフェートをブロックするか、又はｍｉＲＮＡの活性鎖の取り込みを増強する内部糖修飾を導入するかのいずれかである。ｍｉＲＮＡについての修飾としては、ハイブリダイゼーションを増強する、及び細胞中で分子を安定化する、内部糖修飾、並びに細胞中で核酸をさらに安定化する末端修飾が挙げられる。さらに、顕微鏡又は他の方法によって検出して、合成ｍｉＲＮＡを含有する細胞を特定することができる、修飾が企図される。
【０２１１】
核酸の調製
核酸は、例えば、化学合成、酵素生成又は生物学的な産生などの当業者に公知の任意の手法によって作製してもよい。本発明によるｍｉＲＮＡは、組換え法を使用して生成することができるが、化学合成又は酵素生成によってｍｉＲＮＡを生成することが好ましい。ｍｉＲＮＡは、組換えＤＮＡ技術が関わる方法を含む、多数の方法によって生成することができる。
【０２１２】
核酸合成は、標準的な方法に従って、行われる。例えば、Ｉｔａｋｕｒａ及びＲｉｇｇｓ（１９８０年）を参照されたい。加えて、米国特許第４，７０４，３６２号、米国特許第５，２２１，６１９号及び米国特許第５，５８３，０１３号は、それぞれ、核酸を調製する各種の方法を記載している。核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の非限定的な例としては、参照によって本明細書に組み込まれる欧州特許出願公開第２６６，０３２号に記載されているような、ホスホトリエステル、ホスファイト又はホスホラミダイト化学及び固相を使用したインビトロでの化学合成によって、或いは参照によって本明細書にそれぞれ組み込まれるＦｒｏｅｈｌｅｒら、１９８６年及び米国特許第５，７０５，６２９号に記載されているような、デオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して、作製される核酸が挙げられる。本発明の方法において、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを使用してもよい。オリゴヌクレオチド合成の各種の異なる機構は、例えば、米国特許第４，６５９，７７４号、米国特許第第４，８１６，５７１号、米国特許第第５，１４１，８１３号、米国特許第第５，２６４，５６６号、米国特許第第４，９５９，４６３号、米国特許第第５，４２８，１４８号、米国特許第第５，５５４，７４４号、米国特許第第５，５７４，１４６号、米国特許第第５，６０２，２４４号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
酵素的に生成される核酸の非限定的な例としては、ＰＣＲ（商標）（例えば、参照によって本明細書にそれぞれ組み込まれる、米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第４，６８２，１９５号を参照されたい）などの増幅反応において酵素によって、又は参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，６４５，８９７号に記載のオリゴヌクレオチドの合成によって生成される核酸が挙げられる。
【０２１４】
オリゴヌクレオチド合成は、当業者に周知である。オリゴヌクレオチド合成の各種の異なる機構は、例えば、米国特許第４，６５９，７７４号、米国特許第第４，８１６，５７１号、米国特許第第５，１４１，８１３号、米国特許第第５，２６４，５６６号、米国特許第第４，９５９，４６３号、米国特許第第５，４２８，１４８号、米国特許第第５，５５４，７４４号、米国特許第第５，５７４，１４６号、米国特許第第５，６０２，２４４号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１５】
基本的に、化学合成は、ジエステル法、トリエステル法、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ方法によって、及び固相化学によって達成され得る。これらの方法は、下記でさらに詳細に議論される。
ジエステル法
ジエステル法は、主にＫｈｏｒａｎａ及びその共同研究者らによって、使用可能な状態に開発された最初の方法であった（Ｋｈｏｒａｎａ、１９７９年）。基本ステップは、２つの好適に保護されたデオキシヌクレオチドをつないで、ホスホジエステル結合を含有するジデオキシヌクレオチドを形成することである。ジエステル法は、十分に確立されており、ＤＮＡ分子を合成するために使用されている（Ｋｈｏｒａｎａ、１９７９年）。
【０２１６】
トリエステル法
ジエステル法及びトリエステル法の間の主な差は、後者における、反応物及び生成物のホスフェート原子上の余分な保護基の存在である（Ｉｔａｋｕｒａら、１９７５年）。ホスフェート保護基は、通常、クロロフェニル基であり、これは、有機溶媒にヌクレオチド及びポリヌクレオチド中間体を可溶性にする。したがって、精製はクロロホルム溶液中で行われる。この方法における他の改善としては、（ｉ）三量体及びより大きなオリゴマーのブロックカップリング、（ｉｉ）中間体及び最終生成物の両方の精製のための高速液体クロマトグラフィーの広範囲の使用、並びに（ｉｉｉ）固相合成が挙げられる。
ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法
これは、多くの有用なオリゴヌクレオチドを合成するために使用することができる、ＤＮＡ合成の酵素的方法である（Ｇｉｌｌａｍら、１９７８年；Ｇｉｌｌａｍら、１９７９年）。調節された条件下、ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、主に、単一のヌクレオチドを短オリゴヌクレオチドに付加する。
【０２１７】
クロマトグラフィー精製は、所望の単一の付加体を得ることを可能にする。少なくとも三量体が、手順を開始するために必要であり、このプライマーは、いくつかの他の方法によって入手しなければならない。ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法は、機能し、関わる手順がほとんどの生化学者に精通されているという利点を有する。
【０２１８】
固相法
ポリペプチドの固相合成のために開発された技術を利用して、最初のヌクレオチドを固体支持材料に結合させ、ヌクレオチドの段階的付加を進めることが可能である。すべての混合及び洗浄ステップは、簡易化され、手順は、自動化に適するものになる。これらの合成は、現在、自動核酸合成機を使用して、日常的に行われている。
【０２１９】
ホスホラミダイト化学（Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＬｙｅｒ、１９９２年）は、オリゴヌクレオチドの合成のために間違いなく最も広く使用されているカップリング化学になっている。当業者に周知であるように、オリゴヌクレオチドのホスホラミダイト合成は、活性化中間体を形成するための活性化剤との反応によるヌクレオシドホスホラミダイトモノマー前駆体の活性化、続いて、成長するオリゴヌクレオチド鎖（一般に、一端が適切な固体支持体で固定される）に活性化中間体を連続的に付加して、オリゴヌクレオチド生成物を形成することを含む。
【０２２０】
組換え法
細胞中で核酸を産生させるための組換え法は、当業者に周知である。これらは、核酸を細胞に運ぶための、ベクター、プラスミド、コスミド及び他の媒体の使用を含み、これは、標的細胞、又は単に宿主細胞（所望のＲＮＡ分子を大量に産生させるため）であってもよい。或いは、そのような媒体は、ＲＮＡ分子を生じさせるための試薬が存在する限り、無細胞系の文脈において使用することができる。そのような方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２００３年、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２００１年及びＳａｍｂｒｏｏｋ、１９８９年に記載される方法が挙げられ、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、本発明は、合成物ではない核酸分子に関する。いくつかの実施形態において、核酸分子は、一本鎖の一次ｍｉＲＮＡ（Ｌｅｅ、２００２年を参照されたい）、一本鎖の前駆体ｍｉＲＮＡ、又は一本鎖の成熟ｍｉＲＮＡの正確な全配列などの、天然に存在する核酸の化学構造及び天然に存在する核酸の配列を有する。組換え技術の使用に加えて、そのような非合成核酸を、オリゴヌクレオチドを作成するために使用される技術を用いることによってなどで、化学的に生じさせてもよい。
【０２２１】
ｍｉＲＮＡの設計
ｍｉＲＮＡは、典型的には、研究されている成熟ｍｉＲＮＡと配列が同一の活性鎖、及び活性鎖に少なくとも部分的相補的な相補鎖の、２つの鎖を含む。活性鎖は、生物学的に関連する分子であり、ｍＲＮＡ分解又は翻訳の調節のいずれかにより翻訳をモジュレートする細胞中で、複合体によって優先的に取り込まれなければならない。活性鎖の優先的な取り込みは、２つの著明な結果を有する：（１）前記ｍｉＲＮＡの観察された活性が劇的に増加する、及び（２）相補鎖の取り込み及び活性化によって誘導される非意図的効果が実質的に除かれる。本発明によれば、いくつかのｍｉＲＮＡの設計を、活性鎖の優先的な取り込みを確実にするために使用することができる。
【０２２２】
５’ブロッキング剤
相補鎖の５’末端でのホスホネート又はヒドロキシル以外の安定な部分の導入は、ｍｉＲＮＡ経路におけるその活性を損なう。これは、ｍｉＲＮＡの活性鎖のみを使用して、細胞において翻訳を制御することを確実にする。５’修飾としては、限定されるものではないが、ＮＨ２、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、２’Ｏ−Ｍｅ、ＤＭＴＯ、フルオレセイン、チオール若しくはアクリジン、又はこの種類の官能性を有する任意の他の基が挙げられる。
【０２２３】
他のセンス鎖の修飾。ｍｉＲＮＡの相補鎖における、２’−ＯＭｅ、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）若しくは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＮＨ２、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、ＤＭＴＯ、フルオレセイン、チオール若しくはアクリジン、又はこの種類の官能性を有する任意の他の基のようなヌクレオチド修飾の導入は、相補鎖の活性を除き、ｍｉＲＮＡの活性鎖の取り込みを増強することができる。
【０２２４】
センス鎖における塩基のミスマッチ。ｓｉＲＮＡ（Ｓｃｈｗａｒｚ、２００３年）のように、ｍｉＲＮＡの活性鎖の５’及び３’末端の相対的安定性は、ｍｉＲＮＡ経路による活性物の取り込み及び活性化を明らかに決定する。合成ｍｉＲＮＡの相補鎖の３’末端における塩基のミスマッチの戦略的配置によるｍｉＲＮＡの活性鎖の５’末端の不安定化は、活性鎖の活性を増強し、相補鎖の活性を実質的に除く。
【０２２５】
宿主細胞及び標的細胞
ｍｉＲＮＡ若しくはその供給源が導入される細胞、又はｍｉＲＮＡの存在が評価される細胞は、任意の生物体に由来していてもよく、又は任意の生物体に含有されていてもよい。好ましくは、細胞は、脊椎動物細胞である。より好ましくは、細胞は、哺乳動物細胞である。さらにより好ましくは、細胞は、ヒト細胞である。
【０２２６】
哺乳動物細胞は、生殖系列、或いは体細胞、全能性若しくは多能性、分裂又は非分裂、上皮、不死化又は形質転換などに由来していてもよい。細胞は、幹細胞などの未分化細胞、又は臓器若しくは組織の細胞由来などの分化細胞であってもよい。或いは、細胞は、上皮若しくは内皮細胞、間質細胞、脳、乳房、子宮頸部、結腸、消化管、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、卵巣、膵臓、心臓、前立腺、膀胱、小腸、胃、睾丸又は子宮として適格であってもよい。
【０２２７】
本明細書において使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という用語は、互換可能に使用され得る。これらの用語のすべては、それらの子孫も含み、これは、細胞分裂によって形成されるありとあらゆるその後の世代である。計画的又は偶発性の突然変異に起因するすべての子孫が、同一ではないことがあると理解される。宿主細胞は、「トランスフェクト」又は「形質転換」されてもよく、これは、外因性核酸が宿主細胞に移行又は導入されることによるプロセスを指す。形質転換細胞は、初代の対象の細胞及びその子孫を含む。本明細書において使用される場合、「遺伝子操作」及び「組換え」細胞又は宿主細胞という用語は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ、又はレポーター遺伝子をコードするテンプレートコンストラクトなどの外因性核酸配列が導入された細胞を指すことを意図する。したがって、組換え細胞は、組換え的に導入された核酸を含有しない天然に存在する細胞と区別される。
【０２２８】
組織は、核酸送達組成物及び／若しくは追加剤で形質転換されるか、又はこれらと接触される、宿主細胞或いは細胞を含んでいてもよい。組織は、生物体の部分であってもよく、又は生物体から分離されてもよい。ある特定の実施形態において、組織及びその構成細胞は、限定されるものではないが、脳、小脳、脊髄、上腕神経、肋間神経、筋皮神経、肋下神経、腰神経叢、仙骨神経叢、大腿神経、陰部神経、坐骨神経、大腿神経の筋枝、伏在神経、脛骨神経、橈骨神経、正中神経、腸骨下腹神経、陰部大腿神経、閉鎖神経、尺骨神経、総腓骨神経、深腓骨神経、浅腓骨神経、神経節、視神経、神経細胞、幹細胞を含んでいてもよい。
【０２２９】
ある特定の実施形態において、宿主細胞又は組織は、少なくとも１つの生物体に含まれていてもよい。ある特定の実施形態において、生物体は、哺乳動物、ヒト、霊長類又はマウスであってもよい。当業者は、上記の宿主細胞のすべてをインキュベートしてそれらを維持し、それらの分裂が子孫の形成を可能にする条件をさらに理解するであろう。
送達方法
本発明は、いくつかの実施形態において、核酸を細胞に送達することを含む。これは、スクリーニング方法の部分として行われてもよく、又はこれは、治療若しくは診断の適用に関連していてもよい。
【０２３０】
ＲＮＡ分子は、ベクターに含まれる核酸分子によってコードされ得る。「ベクター」という用語は、核酸配列が、それが複製され得る細胞への導入のために挿入され得る、キャリア核酸分子を指すために使用される。核酸配列は、「外因性」であり得、これは、ベクターが導入される細胞に対して外来性であること、又は配列が細胞内の配列と相同であるが、配列が通常見られない宿主細胞の核酸内の位置にあることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、レンチウイルス及び植物ウイルス）及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。当業者は、標準的な組換え技術により、ベクターを構築する態勢が整っており、これは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９９６年に記載されており、両方とも参照によって本明細書に組み込まれる。修飾ゲロニンなどの修飾ポリペプチドをコードすることに加えて、ベクターは、タグ又は標的分子などの非修飾ポリペプチド配列をコードしてもよい。標的分子は、所望の核酸を、特定の臓器、組織、細胞又は対象の身体中の他の場所に向けるものである。
【０２３１】
「発現ベクター」という用語は、転写される能力がある遺伝子産物のうちの少なくとも一部についてコードする核酸配列を含有するベクターを指す。発現ベクターは、さまざまな「制御配列」を含有することができ、これは、転写、及び場合により特定の宿主生物体中で作動可能に連結されたコード配列の翻訳のために必要な核酸配列を指す。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、同様に他の機能を果たし、記載される核酸配列を含有していてもよい。
【０２３２】
発現ベクターを細胞に導入することができる多数の方法がある。本発明のある特定の実施形態において、発現ベクターは、ウイルス、又はウイルスゲノムに由来する遺伝子操作されたベクターを含む。受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に入り、宿主細胞のゲノムに統合し、ウイルス遺伝子を安定的及び効果的に発現するためのある特定のウイルスの能力は、これらを、哺乳動物細胞への外来遺伝子の移入のための魅力的な候補にしている（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６年；Ｔｅｍｉｎ、１９８６年）。遺伝子ベクターとして使用された最初のウイルスは、パポーバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシパピローマウイルス及びポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６年）及びアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６年）を含むＤＮＡウイルスであった。これらは、外来ＤＮＡ配列に対して相対的に低い能力を有し、限定された宿主のスペクトルを有する。さらにまた、許容細胞におけるそれらの発癌可能性及び細胞変性効果は、安全性の懸念を引き起こす。これらは、最大で８ｋｂの外来遺伝物質しか適合し得ないが、さまざまな細胞株及び実験動物に容易に導入することができる（Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年；Ｔｅｍｉｎ、１９８６年）。発現ベクターは、１つのプロモーター、及び１つ又は複数のスペーサー領域によって分離された１つ又は複数のステムループ構造を含む、ＲＮＡｉ発現カセットを含有していてもよい（国際公開第２００６／０８４２０９号）。
【０２３３】
アビジン融合タンパク質を使用して発現ベクターを細胞に導入する別の方法は、米国特許第６，２８７，７９２号に記載されている。
【０２３４】
レトロウイルスは、それらのＲＮＡを感染細胞の二本鎖ＤＮＡに変換する能力によって特徴付けられる、一本鎖ＲＮＡウイルスのグループであり；これらは、ベクターとして使用することもできる。他のウイルスベクターは、本発明において、発現コンストラクトとして用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６年；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８年）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６年；Ｈｅｒｍｏｎａｔ及びＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４年）、レンチウイルス（国際公開第２００８／０７１９５９号、国際公開第２００４／０５４５１２号）、センダイウイルス（国際公開第２００４／０３５７７９号）、バキュロウイルス（国際公開第２００６／０４８６６２号）及びヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを用いてもよい。これらは、各種の哺乳動物細胞に対して、いくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９年；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６年；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８年；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０年）。
【０２３５】
本発明の組成物の発現に影響を与える核酸の送達のための他の好適な方法は、本明細書において記載されるような又は当業者に公知であるような、核酸（例えば、ウイルス及び非ウイルスベクターを含む、ＤＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織又は生物体に導入することができる、実質的にあらゆる方法を含むと考えられる。そのような方法としては、限定されるものではないが、マイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５年；米国特許第５，７８９，２１５号、参照によって本明細書に組み込まれる）を含む、注射による（米国特許第５，９９４，６２４号、米国特許第５，９８１，２７４号、米国特許第５，９４５，１００号、米国特許第５，７８０，４４８号、米国特許第５，７３６，５２４号、米国特許第５，７０２，９３２号、米国特許第５，６５６，６１０号、米国特許第５，５８９，４６６号及び米国特許第５，５８０，８５９号、参照によって本明細書にそれぞれ組み込まれる）；エレクトロポレーションによる（米国特許第５，３８４，２５３、参照によって本明細書に組み込まれる）；リン酸カルシウム沈殿による（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３年；Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ、１９８７年；Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）；ＤＥＡＥ−デキストラン、続いてポリエチレングリコールの使用による（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）；直接超音波負荷による（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）；リポソーム媒介トランスフェクションによる（Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年；Ｗｏｎｇら、１９８０年；Ｋａｎｅｄａら、１９８９年；Ｋａｔｏら、１９９１年）；光化学内在化による（国際公開第２００８／００７０７３号）；微粒子銃による（ＰＣＴ出願の国際公開第９４／０９６９９号及び国際公開第９５／０６１２８号；米国特許第５，６１０，０４２号；米国特許第５，３２２，７８３号、米国特許第５，５６３，０５５号、米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８７７号及び米国特許第５，５３８，８８０号、参照によって本明細書にそれぞれ組み込まれる）；炭化ケイ素繊維を用いる撹拌により（Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９０年；米国特許第５，３０２，５２３号及び米国特許第５，４６４，７６５号、参照によって本明細書にそれぞれ組み込まれる）；アグロバクテリウム媒介形質転換による（米国特許第５，５９１，６１６号及び米国特許第５，５６３，０５５号、参照によって本明細書にそれぞれ組み込まれる）；又はプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換による（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら、１９９３年；米国特許第４，６８４，６１１号及び米国特許第４，９５２，５００号、参照によって本明細書にそれぞれ組み込まれる）；乾燥／阻害が媒介するＤＮＡ取り込みによる（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５年）などの、ＤＮＡの直接送達が挙げられる。これらのような手法の適用により、細胞小器官（複数可）、細胞（複数可）、組織（複数可）又は生物体（複数可）は、安定的又は一過的に形質転換されてもよい。
【０２３６】
概説は、細胞へのＲＮＡ分子の内部移行を最適化するために、ＲＮＡ分子を製剤化するいくつかの方法を提供する（Ｋｉｍ  ＳＳ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、２００９年、第１５巻：４９１〜５００頁）。以下の他の刊行物は、細胞へのＲＮＡ分子の内部移行を改善するために、ＲＮＡ分子を製剤化する代替方法を開示しており、参照によって本明細書にそれぞれ組み込まれる。オリゴヌクレオチドの送達のためのＰＴＤ−ＤＲＢＤ（二本鎖結合ドメインに連結されたペプチド伝達ドメイン）の使用が記載されている国際公開第２００７／０９５１５２号、粒子の核酸ペイロードの細胞取り込み及びエンドソーム放出を可能にするカチオン性脂質及び融合性脂質の混合物を含むＳＮＡＬＰ（安定な核酸脂質粒子）粒子の使用が記載されている国際公開第２００９／０８６５５８号、中性リン脂質−油−ＲＮＡｉエマルジョンが記載されている国際公開第２００９／１４９４１８号、リポプレックスに基づく送達媒体の使用が記載されている国際公開第２００７／１２１９４７号、効率的なカプセル化及びカプセル化核酸の細胞への効率的な送達を提供する、新規脂質及び核酸−脂質粒子の使用が記載されている国際公開第２００９／１３２１３１号、核酸分子の周囲でらせん状になる脂質の交互層の渦巻技術が記載されている国際公開第２００４／０９１５７８号及び国際公開第２００４／０６４８０５号、経口及び粘膜送達のための核酸が組み込まれた逆ミセルが記載されている国際公開第２００３／０４７４９４号及び国際公開第２００３／０４７４９３号、細胞への送達媒体としてのオリゴヌクレオチドを含む、細菌及び細菌治療粒子（ＢＴＰ）が記載されている国際公開第２００８／１５６７０２号。これらの刊行物に参照されるか、又は開示される製剤のそれぞれは、本発明に包含される。
【０２３７】
さまざまな化合物が、オリゴヌクレオチドの末端に結合して、細胞膜を通過するそれらの輸送を容易にしている。ＨＩＶ  ＴＡＴ、ＨＳＶ  ＶＰ２２、ショウジョウバエアンテナペディア及び他のタンパク質において見られる短シグナルペプチドは、膜を通過する生体分子の迅速な移動を可能にすることが見出されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ、２０００年により概説される）。タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）と称されるこれらのシグナルペプチドは、オリゴヌクレオチドに結合して、培養細胞へのそれらの送達を容易にしている（Ｅｇｕｃｈｉ  Ａ、Ｄｏｗｄｙ  ＳＦ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．、２００９年、第７巻：３４１〜５頁）。コレステロールは、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートして、動物における細胞へのそれらの取り込みを改善している（ＭａｃＫｅｌｌａｒ、１９９２年）。末端のコレステロール基は、細胞の表面上の受容体又は脂質と明らかに相互作用し、修飾オリゴヌクレオチドの内部移行を容易にする。同様に、ポリ−Ｌ−リジンは、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートして、正味の負電荷を減少させ、細胞への取り込みを改善している（Ｌｅｏｎｅｔｔｉ、１９９０年）。
【０２３８】
核酸と複合体化し、細胞の表面にそれらを送達し、並びにそれらの取り込みを容易にし、及びエンドソームから放出する、さまざまな化合物が開発されている。なかでも、以下がある：（１）ＤＯＴＡＰ（又は他のカチオン性脂質）、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ及びＤＯＰＥなどのさまざまな脂質、並びに（２）ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン、並びにこれら及び他のポリマーのデンドリマーのような非脂質系ポリマー。ある特定のこれらの実施形態において、ＤＯＴＡＰ及びコレステロール又はコレステロール誘導体などの脂質の組み合わせが用いられる（米国特許第６，７７０，２９１号、これは、参照によって本明細書に組み込まれる）。これらの試薬のいくつかは、動物において核酸の取り込みを容易にすることが示されている。
【０２３９】
ｍｉＲＮＡ経路に関与する細胞成分は、公知になっている。細胞内でｍｉＲＮＡを安定化及び／又は輸送するタンパク質は、それらが細胞内にあると、それらが結合ｍｉＲＮＡを保護及び導くはずなので、ｍｉＲＮＡの安定性及び活性を増強する可能性がある。ｍｉＲＮＡ−トランスポータータンパク質及びｍｉＲＮＡの混合物は、ｍｉＲＮＡに基づく治療学の有効性を増強するかもしれない。ＲＮＡは、それらのアニオン性ホスフェート及び糖主鎖のために、親水性分子である。核酸塩基は疎水性であるが、ホスフェート及び糖残基から生じる広範な水素結合により、親水性が支配する。親水性の特性及びアニオン性の主鎖は、細胞の浸透を低減させる。コレステロール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ、２００２年）、並びにＣ３２官能基を有するラウリン酸及びリトコール酸誘導体（Ｌｏｒｅｎｚら、２００４年）のような脂溶性基のコンジュゲーションは、細胞取り込みを改善することが示されている。さらに、血流中での異なるリポタンパク質、例えばＬＤＬと、ステロイドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドとの結合は、それらの完全性を保護し、それらの生体内分布を支配する（Ｒｕｍｐら、２０００年）。アンチセンス分子（Ｂｉｊｓｔｅｒｂｏｓｃｈら、２００１年）及びアプタマー（Ｒｕｓｃｏｎｉら、２００４年）に結合したコレステロールは、リポタンパク質への結合を可能にすることによって、オリゴヌクレオチドを安定化することも示されている。コレステロールは、インビトロ（Ｌｏｒｅｎｚら、２００４年）及びインビボ（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、２００４年）で、ｓｉＲＮＡの取り込み及び血清安定性を増強することが実証されている加えて、ＳＢ−４３５４９５（Ｂｌａｃｋｉｅら、（２００２年）、イスラジピン（Ｏｒａｖｃｏｖａら、１９９４年）、アムロジピン（Ｏｒａｖｃｏｖａら、１９９４年）及び２，２’，４，４’，５，５’−ヘキサクロロビフェニル（Ｂｏｒｌａｋｏｇｌｕら、１９９０年）のような多数の低分子は、細胞取り込みを増強し、リポタンパク質の会合を促進することによってヌクレアーゼ耐性を改善することができた。
【０２４０】
ｍｉＲＮＡライブラリーを用いるスクリーニング
本出願において使用される場合、スクリーニングは、複数のｍｉＲＮＡ特異的試薬が個々の細胞集団又は動物に別々に送達されるプロセスである。送達の１つ又は複数の指定された時間の後、細胞集団又は動物は、１つ又は複数の表現型についてアッセイされる。陰性対照群の細胞又は動物よりも有意な表現型の差を有するこれらの細胞又は動物は、陽性に分類される。試料中で操作されているｍｉＲＮＡは、ヒットとして定義される。ヒットは、追加の検討及び可能性がある治療学の開発のための標的である。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、スクリーニングのための複数ステップのプロセスがあり、ある特定の実施形態において、４つの一般的なステップがある。
【０２４２】
（１）研究されている細胞プロセスをモニターする定量的アッセイを開発する。
細胞のサイズ、細胞周期の状態又は抗体染色をモニターする顕微鏡アッセイから、溶解物、細胞若しくは培地中の生体分子又は低分子の測定に対処する細胞溶解物中の特定の基質の代謝回転を評価する酵素アッセイまでの範囲の、細胞表現型の強度を測定するアッセイ。
【０２４３】
スクリーニングの成功に重要なことは、細胞表現型を正確に測定するアッセイを作り出し、アッセイのシグナルとノイズの比率を最大化することである。シグナルとノイズの最大化は、アッセイ時間、アッセイ成分、細胞型、並びにトランスフェクション及びアッセイの間の時間の長さのような変数を試験することを含む。陽性表現型及び陰性対照表現型の間のアッセイ結果の差が大きくなると、スクリーニング結果における広がりが大きくなり、興味深い遺伝子を特定する機会が向上する。バッチ感染を使用する代替のスクリーニング法が存在する。
【０２４４】
（２）所望の細胞のためのトランスフェクション条件を最適化する。
このプロセスの第１ステップは、高い細胞生存率を維持しながら、合成ｍｉＲＮＡの取り込みを最大化する、トランスフェクション試薬及びプレーティング条件を特定することである。発明者らは、細胞株を使用する場合に２〜５の異なるトランスフェクション試薬を、又は初代細胞若しくは浮遊細胞を使用する場合に５〜１０のエレクトロポレーション条件を、試験することが有用であることを見出している。トランスフェクションは、試験された条件の中で最も良く機能する試薬又はエレクトロポレーション条件について、最適化することができる。ｍｉＲＮＡ特異的ライブラリーのスクリーニングは、高スループットトランスフェクションのための条件を必要とする。この種類のスクリーニングにおいて、トランスフェクションよりもむしろレンチウイルス導入が使用された。これは、代替の最適化手法が必要なことがある。
【０２４５】
（３）スクリーニングする。
アッセイ及びトランスフェクションプロセスが開発されたら、合成ｍｉＲＮＡ、又はウイルスによって発現されたｍｉＲＮＡのライブラリーを、２４又は９６ウェルプレートにおいて細胞に連続的に導入することができる。それぞれの試薬についての二反復又は三反復のトランスフェクションは、合理的な統計分析のための十分なデータを提供する。実験の部分において行われるＭＴＳアッセイは、そのようなスクリーニングの例である。
【０２４６】
（４）ヒットを検証する。
ヒットを検証することには、観察された表現型が、標的であるｍｉＲＮＡに起因することを示すことを含む。ヒットは、典型的には、ヒットとして登録されたｍｉＲＮＡ阻害剤又は合成ｍｉＲＮＡの希釈系列を、最初にアッセイされた細胞に、送達することによって確認される。確認は、検証とは若干の差がある。確認は、ｍｉＲＮＡが誘導する表現型の繰り返しである一方、検証は、ｍｉＲＮＡが媒介する表現型に拮抗することによる表現型の逆転も含み得る。
【０２４７】
標識化及び標識手法
いくつかの実施形態において、本発明は、特定のｍｉＲＮＡ種の治療又は診断の関連性を評価するために、例えば、スクリーニングアッセイのために標識化されるｍｉＲＮＡに関わる。ｍｉＲＮＡは、最初に単離されてもよく（ｍｉＲＮＡが細胞に対して内因性である細胞から、又はｍｉＲＮＡが細胞に対して外因性である細胞からのいずれか）、及び／又は標識化の前に精製されてもよいことが企図される。これは、ｍｉＲＮＡが標識化の前に単離又は精製されていない試料中で、他のＲＮＡとは対照的に、より効果的にｍｉＲＮＡを標識化する反応を達成し得る。本発明の多くの実施形態において、標識は、非放射性である。一般に、核酸は、標識化されたヌクレオチドを添加することによって（１ステッププロセス）、又はヌクレオチドを添加し、及び添加されたヌクレオチドを標識することによって（２ステッププロセス）、標識化され得る。
【０２４８】
また、ｍｉＲＮＡは、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第６０／６４９，５８４号に記載されるようにして標識化されてもよい。そのようなヌクレオチドとしては、蛍光色素を含む色素で、又はビオチンなどの分子で、標識化することができるものが挙げられる。標識化ヌクレオチドは、容易に入手可能であり；それらは、商業的に入手することができ、又はそれらは、当業者に公知の反応によって合成することができる。
【０２４９】
標識化のためのヌクレオチド
標識化のためのヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドではないが、代わりに、それらに反応部分を有する調製されたヌクレオチドを指す。目的の特異的反応性の官能基としては、アミノ、スルフヒドリル、スルホキシル、アミノスルフヒドリル、アジド、エポキシド、イソチオシアネート、イソシアネート、無水物、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ又はジハロゲン置換ピリジン、モノ又はジ置換ジアジン、マレイミド、エポキシド、アジリジン、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アルキルスルホネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド、グリオキサール、アルデヒド、ヨードアセチル、シアノメチルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ｏ−ニトロフェニルエステル、ヒドロキシピリジンエステル、カルボニルイミダゾール、及び他のそのような化学基が挙げられる。いくつかの実施形態において、反応性の官能基は、ヌクレオチドに直接結合してもよく、又はこれは、連結基を通してヌクレオチドに結合してもよい。官能基部分及び任意のリンカーは、ｍｉＲＮＡに添加又は標識されるヌクレオチドの能力を実質的に損なうことができない。代表的な連結基としては、典型的には約２〜１８個、通常は約２〜８個の炭素原子の範囲の炭素含有連結基が挙げられ、炭素含有連結基は、１つ若しくは複数のヘテロ原子、例えば、Ｓ、Ｏ、Ｎなどを含んでいてもよく、又は含まなくてもよく、１つ若しくは複数の不飽和部位を含んでいてもよく、又は含まなくてもよい。多くの実施形態における特定の目的において、アルキル連結基、典型的には、１〜１６個、通常１〜４個の炭素原子の低級アルキル連結基であり、連結基は、１つ又は複数の不飽和の部位を含んでいてもよい。官能化標的の生成の上記の方法において使用される官能化ヌクレオチド（又はプライマー）は、公知のプロトコールを使用して製造されてもよく、又は商業的供給業者、例えば、Ｓｉｇｍａ、Ｒｏｃｈｅ、Ａｍｂｉｏｎ及びＩＤＴから購入してもよい。官能基は、参照によってすべて組み込まれる、米国特許第４，４０４，２８９号；米国特許第４，４０５，７１１号；米国特許第４，３３７，０６３号及び米国特許第５，２６８，４８６号、並びにＢｒ特許第１，５２９，２０２号において見られる代表的な情報を含む、当業者に公知の方法に従って、調製してもよい。
【０２５０】
アミン修飾ヌクレオチドは、本発明のいくつかの実施形態において使用される。アミン修飾ヌクレオチドは、標識の結合のための反応性アミン基を有するヌクレオチドである。任意のリボヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｕ又はＣ）又はデオキシリボヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣ）が、標識化のために修飾することができることが企図される。例としては、限定されるものではないが、以下の修飾リボ及びデオキシリボヌクレオチド：５−（３−アミノアリル）−ＵＴＰ；８−［（４−アミノ）ブチル］−アミノ−ＡＴＰ及び８−［（６−アミノ）ブチル］−アミノ−ＡＴＰ；Ｎ６−（４−アミノ）ブチル−ＡＴＰ、Ｎ６−（６−アミノ）ブチル−ＡＴＰ、Ｎ４−［２，２−オキシ−ビス−（エチルアミン）］−ＣＴＰ；Ｎ６−（６−アミノ）ヘキシル−ＡＴＰ；８−［（６−アミノ）ヘキシル］−アミノ−ＡＴＰ；５−プロパルギルアミノ−ＣＴＰ、５−プロパルギルアミノ−ＵＴＰ；５−（３−アミノアリル）−ｄＵＴＰ；８−［（４−アミノ）ブチル］−アミノ−ｄＡＴＰ及び８−［（６−アミノ）ブチル］−アミノ−ｄＡＴＰ；Ｎ−（４−アミノ）ブチル−ｄＡＴＰ、Ｎ６−（６−アミノ）ブチル−ｄＡＴＰ、Ｎ４−［２，２−オキシ−ｔｏ−（エチルアミン）］−ｄＣＴＰ；Ｎ６−（６−アミノ）ヘキシル−ｄＡＴＰ；８−［（６−アミノ）ヘキシル］−アミノ−ｄＡＴＰ；５−プロパルギルアミノ−ｄＣＴＰ、並びに５−プロパルギルアミノ−ｄＵＴＰが挙げられる。そのようなヌクレオチドは、当業者に公知の方法に従って、調製することができる。また、当業者は、５−（３−アミノアリル）−ＵＴＰの代わりに、５−（３−アミノアリル）−ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、又はｄＵＴＰなどの同じアミン修飾を有する他のヌクレオチド体を調製することができる。
【０２５１】
標識化手法
いくつかの実施形態において、核酸は、既に標識化された１つのヌクレオチド又は複数のヌクレオチドを、核酸に触媒的に付加することによって、標識化される。１つ又は複数の標識化ヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ分子に付加することができる。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，７２３，５０９号を参照されたい。
【０２５２】
他の実施形態において、標識化されていない１つのヌクレオチド又は複数のヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡに触媒的に付加され、非標識化ヌクレオチドは、その後に標識化することを可能にする化学部分で修飾され、本発明の実施形態において、化学部分は、ヌクレオチドがアミン修飾ヌクレオチドであるような、反応性アミンである。アミン修飾ヌクレオチドの例は、当業者に周知であり、多くは、Ａｍｂｉｏｎ、Ｓｉｇｍａ、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ及びＴｒｉＬｉｎｋなどから商業的に入手可能である。
【０２５３】
その合成の間のｃＤＮＡの標識化と対照的に、標識化ｍｉＲＮＡについての問題は、既存の分子をどのようにして標識化するかである。この目的で、発明者らは、小さなＲＮＡ分子であるｍｉＲＮＡへのその付加のための基質として、ジ若しくはトリ−ホスフェートリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの使用を可能にする酵素を使用し得る。また、特定の実施形態において、これは、ｍｉＲＮＡの３’末端に付加される修飾ジ若しくはトリホスフェートリボヌクレオチドを使用することを含む。酵素の供給源は限定されない。酵素についての供給源の例としては、酵母、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのグラム陰性菌、ラクトコッカス・ラクティス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）及びヒツジポックスウイルスが挙げられる。
【０２５４】
そのようなヌクレオチドに付加する能力がある酵素としては、限定されるものではないが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ及びポリヌクレオチドホスホリラーゼが挙げられる。本発明の特定の実施形態において、リガーゼは、標識を付加するために使用される酵素ではなく、代わりに、非リガーゼ酵素を用いることが企図される。
【０２５５】
ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、植物から人間までの多数の生物体からクローニングされている。これは、ＲＮＡへのホモポリマートラクトの付加を触媒することが示されている（Ｍａｒｔｉｎら、ＲＮＡ、第４巻（２号）：２２６〜３０頁、１９９８年）。
【０２５６】
ターミナルトランスフェラーゼは、核酸の３’末端へのヌクレオチドの付加を触媒する。
【０２５７】
ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、プライマーについての必要性がなく、ヌクレオチドジホスフェートを重合することができる。
【０２５８】
標識及びタグ
本発明による方法の好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ又はその供給源の発現レベルは、核酸配列の量を定量化することによって、間接的に決定される。適切な定量化法は、本明細書の他の箇所に記載される。或いは、複数のｍｉＲＮＡ又は１つのｍｉＲＮＡのプローブは、検出又は単離の目的のために、陽電子放出（放射性を含む）、酵素、比色（可視、及び蛍光を含むＵＶスペクトルを含む）、発光又は他の標識若しくはタグで標識されてもよい。標識は、直接又は間接的に検出され得る。放射性標識としては、１２５Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ及び３５Ｓが挙げられる。酵素標識の例としては、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。標識はまた、発光性を有するタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質及びフィコエリトリンであり得る。
【０２５９】
コンジュゲートとしての使用のために企図される比色分析及び蛍光標識としては、限定されるものではないが、ＡＭＣＡ、アレクサフルオール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）色素、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰ  Ｙ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸなどのＢＯＤＩＰＹ色素；カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ）；カスケードイエロー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ）；７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリン及びヒドロキシクマリンなどのクマリン及びその誘導体；Ｃｙ３及びＣｙ５などのシアニン色素；エオシン及びエリスロシン；フルオレセインイソチオシアネートなどのフルオレセイン及びその誘導体；クアンタムダイ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｙｅ）（商標）などのランタニドイオンの大環状キレート；マリーナブルー（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ）；オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）；ローダミンレッド、テトラメチルローダミン及びローダミン６Ｇなどのローダミン色素；テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）が挙げられる。
【０２６０】
色素の具体例としては、限定されるものではないが、上記及び以下で特定されるものが挙げられる：アレクサフルオール３５０、アレクサフルオール４０５、アレクサフルオール４３０、アレクサフルオール４８８、アレクサフルオール５００、アレクサフルオール５１４、アレクサフルオール５３２、アレクサフルオール５４６、アレクサフルオール５５５、アレクサフルオール５６８、アレクサフルオール５９４、アレクサフルオール６１０、アレクサフルオール６３３、アレクサフルオール６４７、アレクサフルオール６６０、アレクサフルオール６８０、アレクサフルオール７００及びアレクサフルオール７５０；ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＥＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＥＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＤＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＥＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６５５、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＥＰＹ  ＴＭＲ及びＢＯＤＩＰＹ−ＴＲなどのアミン反応性ＢＯＤＩＰＹ染料；Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン（Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ）、ＲＯＸ、ＳＹＰＲＯ、ＴＡＭＲＡ、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、並びにＴＥＴ。
【０２６１】
蛍光標識リボヌクレオチドの具体例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手可能であり、これらとしては、アレクサフルオール４８８−５−ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、ＢＯＤＥＰＹ  ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、アレクサフルオール５４６−１４−ＵＴＰ、テキサスレッド−５−ＵＴＰ及びＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−１４−ＵＴＰが挙げられる。他の蛍光リボヌクレオチドは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能であり、例えば、Ｃｙ３−ＵＴＰ及びＣｙ５−ＵＴＰである。蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチドの例としては、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）−１１−ｄＵＴＰ、カスケードブルー−７−ｄＵＴＰ、アレクサフルオール４８８−５−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＥＰＹ  ＦＬ−１４−ｄＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ｄＵＴＰ、アレクサフルオール５３２−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＥＰＹ  ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、アレクサフルオール５４６−１４−ｄＵＴＰ、アレクサフルオール５６８−５−ｄＵＴＰ、テキサスレッド−１２−ｄＵＴＰ、テキサスレッド−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＥＰＹ  ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、アレクサフルオール５９４−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＥＰＹ  ６３０／６５０−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５−１４−ｄＵＴＰ；アレクサフルオール４８８−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、アレクサフルオール５４６−１６−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、アレクサフルオール５９４−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、アレクサフルオール６４７−１２−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰが挙げられる。
【０２６２】
核酸を２つの異なる標識で標識してもよいことが企図される。さらにまた、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を、本発明の方法において用いてもよい（例えば、Ｋｌｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、２００２年；Ｅｍｐｔａｇｅ、２００１年；Ｄｉｄｅｎｋｏ、２００１年、参照によりそれぞれ組み込まれる）。チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロダイマー；及びＴＯＴＡＢなどの蛍光エネルギー移動色素を使用してもよい。
【０２６３】
或いは、標識は、それ自体を検出することができなくてもよいが、間接的に検出可能であるか、又は標的核酸の単離若しくは分離を可能にしてもよい。例えば、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、多価カチオン、キレーター基、及び抗体に対するリガンドを含む他のリガンドであり得る。
【０２６４】
可視化手法
標識化核酸を可視化又は検出するための多数の手法は容易に利用可能である。Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ、２０００年による参照文献には、そのような手法の議論があり（第６章）、これは参照により組み込まれる。そのような手法としては、顕微鏡法、アレイ、蛍光光度法、ライトサイクラー又は他のリアルタイムＰＣＲ（商標）装置、ＦＡＣＳ解析、シンチレーションカウンター、ホスフォイメージャー、ガイガーカウンター、ＭＲＩ、ＣＡＴ、抗体に基づく検出法（ウェスタン、免疫蛍光法、免疫組織化学）、組織化学的手法、ＨＰＬＣ（Ｇｒｉｆｆｅｙら、１９９７年）、分光法、キャピラリーゲル電気泳動（Ｃｕｍｍｉｎｓら、１９９６年）、分光法；質量分析；放射線学的手法；及び質量収支手法が挙げられる。或いは、核酸は、それらの効率の良い単離を可能にするように、標識化又はタグ化されていてもよい。本発明の他の実施形態において、核酸はビオチニル化される。
【０２６５】
２つ以上の異なる色の標識を用いる場合、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）手法を用いて、ｄｓＲＮＡを特徴付けてもよい。さらにまた、当業者は、標識化核酸を可視化、特定及び特徴付ける方法を十分に承知しており、したがって、そのようなプロトコールを本発明の一部として使用してもよい。使用され得るツールの例としては、蛍光顕微鏡法、バイオアナライザー（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）、プレートリーダー、ストーム（Ｓｔｏｒｍ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、アレイスキャナー（Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ）、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分別機）、又は蛍光分子を励起及び検出する能力を有するあらゆる装置（例えば、アキュメン（Ａｃｕｍｅｎ）［ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ］プレートサイトメーター）が挙げられる。
【０２６６】
アレイの調製
本発明は、ｍｉＲＮＡアレイを用いることができ、これは、複数のｍｉＲＮＡ分子若しくは前駆体ｍｉＲＮＡ分子と、完全若しくはほぼ相補的又は同一であり、かつ空間的に分離された組織において支持材料上に配置された、正しく並べられたマクロアレイ又はマイクロアレイの核酸分子（プローブ）である。マイクロアレイは、典型的には、プローブがその上にスポットされている、ニトロセルロース又はナイロンのシートである。マイクロアレイは、最大で１０，０００個の核酸分子が典型的には１〜４平方センチメートルの領域に収まることができるように、より高密度で核酸プローブが配置される。マイクロアレイは、核酸分子、例えば、遺伝子、オリゴヌクレオチドなどを基材上にスポットすることによって、又は基材上でインサイチュでオリゴヌクレオチド配列を製造することによって、製造することができる。スポット又は製造された核酸分子は、非特定核酸分子が、平方センチメートルあたり最大で約３０個、又はより高い、例えば、平方センチメートルあたり最大で１００個又はさらに１０００個の高密度マトリックスパターンで適用することができる。マイクロアレイは、フィルターアレイのニトロセルロース系材料と対照的に、典型的には、固体支持体としてコーティングされたガラスを使用する。ｍｉＲＮＡ相補的核酸試料の正しく並べられたアレイを有することにより、それぞれの試料の位置を追跡し、元の試料と結び付けることができる。複数の個別の核酸プローブが固体支持体の表面に安定的に会合したさまざまな異なるアレイ装置は、当業者に公知である。アレイのための有用な基材としては、ナイロン、ガラス及びシリコンが挙げられる。そのようなアレイは、平均プローブ長、プローブの配列又は種類、プローブ及びアレイ表面の間の結合の性質、例えば、共有又は非共有などを含む、多くの異なる方法で変更してもよい。
【０２６７】
マイクロアレイを調製するための代表的な方法及び装置は、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号；米国特許第５，２０２，２３１号；米国特許第５，２４２，９７４号；米国特許第５，２８８，６４４号；米国特許第５，３２４，６３３号；米国特許第５，３８４，２６１号；米国特許第５，４０５，７８３号；米国特許第５，４１２，０８７号；米国特許第５，４２４，１８６号；米国特許第５，４２９，８０７号；米国特許第５，４３２，０４９号；米国特許第５，４３６，３２７号；米国特許第５，４４５，９３４号；米国特許第５，４６８，６１３号；米国特許第５，４７０，７１０号；米国特許第５，４７２，６７２号；米国特許第８０６号；米国特許第５，５２５，４６４号；米国特許第５，５０３，９８０号；米国特許第５，５１０，２７０号；米国特許第５，５２５，４６４号；米国特許第５，５２７，６８１号；米国特許第５，５２９，７５６号；米国特許第５，５３２，１２８号；米国特許第５，５４５，５３１号；米国特許第５，５４７，８３９号；米国特許第５，５５４，５０１号；米国特許第５，５５６，７５２号；米国特許第５，５６１，０７１号；米国特許第５，５７１，６３９号；米国特許第５，５８０，７２６号；米国特許第５，５８０，７３２号；米国特許第５，５９３，８３９号；米国特許第５，５９９，６９５号；米国特許第５，５９９，６７２号；米国特許第５，６１０；２８７号；米国特許第５，６２４，７１１号；米国特許第５，６３１，１３４号；米国特許第５，６３９，６０３号；米国特許第５，６５４，４１３号；米国特許第５，６５８，７３４号；米国特許第５，６６１，０２８号；米国特許第５，６６５，５４７号；米国特許第５，６６７，９７２号；米国特許第５，６９５，９４０号；米国特許第５，７００，６３７号；米国特許第５，７４４，３０５号；米国特許第５，８００，９９２号；米国特許第５，８０７，５２２号；米国特許第５，８３０，６４５号；米国特許第５，８３７，１９６号；米国特許第５，８７１，９２８号；米国特許第５，８４７，２１９号；米国特許第５，８７６，９３２号；米国特許第５，９１９，６２６号；米国特許第６，００４，７５５号；米国特許第６，０８７，１０２号；米国特許第６，３６８，７９９号；米国特許第６，３８３，７４９号；米国特許第６，６１７，１１２号；米国特許第６，６３８，７１７号；米国特許第６，７２０，１３８号、並びに国際公開第９３／１７１２６号；国際公開第９５／１１９９５号；国際公開第９５／２１２６５号；国際公開第９５／２１９４４号；国際公開第９５／３５５０５号；国際公開第９６／３１６２２号；国際公開第９７／１０３６５号；国際公開第９７／２７３１７号；国際公開第９９／３５５０５号；国際公開第０９９２３２５６号；国際公開第０９９３６７６０号；国際公開第０１３８５８０号；国際公開第０１６８２５５号；国際公開第０３０２０８９８号；国際公開第０３０４０４１０号；国際公開第０３０５３５８６号；国際公開第０３０８７２９７号；国際公開第０３０９１４２６号；国際公開第０３１０００１２号；国際公開第０４０２００８５号；国際公開第０４０２７０９３号；欧州特許出願公開第３７３２０３号；欧州特許出願公開第７８５２８０号；欧州特許出願公開第７９９８９７号及び英国特許出願公開第８８０３０００号に記載されており、これらの開示はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる。アレイは、それらが１００個又はそれ以上の異なるプローブを含有するような、高密度アレイであり得ることが企図される。それらが、１０００、１６，０００、６５，０００、２５０，０００若しくは１，０００，０００個又はそれ以上の異なるプローブを含有していてもよいことが企図される。プローブは、１つ又は複数の異なる生物体において標的に対するものであり得る。オリゴヌクレオチドプローブは、いくつかの実施形態において、５〜５０、５〜４５、１０〜４０又は１５〜４０のヌクレオチド長の範囲であり、ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、２０〜２５ヌクレオチド長である。
【０２６８】
アレイ中のそれぞれ異なるプローブ配列の位置及び配列は、一般に公知である。また、多くの数の異なるプローブは、比較的小さな面積を占めることができ、一般に、１ｃｍ２あたり約６０、１００、６００、１０００、５，０００、１０，０００、４０，０００、１００，０００又は４００，０００個の異なるオリゴヌクレオチドプローブよりも高いプローブ密度を有する高密度アレイを提供する。アレイの表面積は、約１、１．６、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｃｍ２、又はこれら未満であり得る。
【０２６９】
また、当業者は、アレイを使用して生成されたデータを容易に分析することができる。そのようなプロトコールは、上記で開示されており、国際公開第９７４３４５０号；国際公開第０３０２３０５８号；国際公開第０３０２２４２１号；国際公開第０３０２９４８５号；国際公開第０３０６７２１７号；国際公開第０３０６６９０６号；国際公開第０３０７６９２８号；国際公開第０３０９３８１０号；国際公開第０３１００４４８号において見られる情報を含み、これらのすべては、参照によって具体的に組み込まれる。
【０２７０】
最近、溶液ハイブリダイゼーション並びにその後の固定化及び特定、例えば、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）プラットフォームに基づく、代替のプロファイリング法が利用可能になっている。
【０２７１】
試料の調製
広範囲の試料のｍｉＲＮＡを、本明細書において記載されるアッセイを使用して、分析することができることが企図される。内因性ｍｉＲＮＡは、いくつかの実施形態による使用のために企図されるが、内因性ｍｉＲＮＡ又は前駆体ｍｉＲＮＡと同一の核酸を含む組換え又は合成ｍｉＲＮＡは、本明細書において記載されるようにして、取り扱い、分析することもできる。試料は、生体試料であってもよく、この場合において、それらは、血液、ＣＳＦ、組織、臓器、腫瘍、精液、痰、便、尿、唾液、涙液、他の体液、毛包、皮膚、又は生体細胞を含有する若しくは構成する任意の試料からであってもよい。或いは、試料は、生体試料でなくてもよいが、無細胞反応混合物（１つ又は複数の生体酵素を含有していてもよい）などの化学混合物であってもよい。
【０２７２】
疾患とつながりがあるｍｉＲＮＡを特定するための細胞アッセイ
特に企図される適用には、それ自体が疾患若しくは状態の一部であるか、又はそうでなければ特定の疾患状態に関連する可能性がある、ニューロンの欠損の促進に寄与するｍｉＲＮＡを特定することを含む。加えて、企図される適用には、ニューロンの発生又は再生を促進することが可能なｍｉＲＮＡの特定を含む。また、ｍｉＲＮＡの機能は、ニューロンの欠損に関連する特定の疾患若しくは状態の影響を受けやすいと考えられる試料、及びその疾患若しくは状態の影響を受けにくいか、又は耐性であると考えられる試料の間で比較されてもよい。本発明のＲＮＡ分子は、前項で議論された疾患若しくは状態のいずれかを処置するため、又は前項で議論された細胞経路のいずれかをモジュレートするために使用することができることが特に企図される。特に企図される適用には、それ自体が疾患の一部であるか、又はそうでなければ特定の疾患状態に関連する可能性がある、ニューロンの欠損の細胞プロセスに寄与する、及び／又はニューロンの発生若しくは再生を誘導する、ｍｉＲＮＡを特定することを含む。また、ｍｉＲＮＡの機能は、ニューロンの欠損に関連する特定の疾患若しくは状態の影響を受けやすいと考えられる試料、及びその疾患若しくは状態の影響を受けにくいか、又は耐性であると考えられる試料の間で比較されてもよい。
【０２７３】
異なる治療薬物の有効性は、本発明によって定義及び使用されるｍｉＲＮＡによって変化してもよい。ニューロンの発生又は再生を促進するｍｉＲＮＡ分子、ミミック、ｉｓｏｍｉＲ、アンタゴミル又はそれらの供給源は、他の薬物に対する感受性を増強することがある。
【０２７４】
他のアッセイ
アレイ及びマイクロアレイの使用に加えて、多数の異なるアッセイを用いて、ｍｉＲＮＡ、それらの活性及びそれらの効果を分析することができることが企図される。そのようなアッセイとしては、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ法（ＨＰＡ）（ＧｅｎＰｒｏｂｅ）、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ．ら（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２５巻：２９７９〜２９８４頁）、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）、単一分子ハイブリダイゼーション検出（ＵＳ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）アッセイ（ＴｈｉｒｄＷａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びブリッジリチゲーションアッセイ（Ｂｒｉｄｇｅ  Ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられる。そのような方法は、アレイの文脈において、及び診断アッセイの文脈において使用し得ることが企図される。
【０２７５】
治療及び診断適用
表現型形質に影響を与えるｍｉＲＮＡは、（特定のｍｉＲＮＡの存在又は非存在についてスクリーニングすることによって）治療適用及び診断適用のための介入ポイントを提供する。本発明のＲＮＡ分子は、前項で議論された疾患若しくは状態のいずれかを処置するために使用することができることが特に企図される。また、上記の方法のいずれかは、本発明の治療及び診断の態様に関して、用いることもできる。例えば、ｍｉＲＮＡを検出すること又はそれらについてスクリーニングすることに関する方法は、診断の文脈において用いることもできる。治療適用において、本発明のｍｉＲＮＡの有効量は、動物中にあってもよく、又はなくてもよい、細胞に投与される。いくつかの実施形態において、本発明のｍｉＲＮＡの治療有効量は、疾患又は状態の処置のために個体に投与される。本明細書において使用される「有効量」という用語は、それが投与された細胞又は組織において、所望の生理学的変化をもたらすために必要な本発明の分子の量として定義される。本明細書において使用される「治療有効量」という用語は、本明細書の前で定義される血管新生に関連する疾患又は状態に関する所望の効果を達成する本発明の分子の量として定義される。当業者は、多くの場合において、分子は、治癒を提供しなくてもよいが、少なくとも１つの症状の緩和又は改善などの部分的な利益を提供し得ることを容易に認識する。いくつかの実施形態において、いくつかの利益を有する生理学的変化はまた、治療的に有益であると考えられる。このように、いくつかの実施形態において、生理学的変化を提供する物質の量は、「有効量」又は「治療有効量」と考えられる。
【０２７６】
いくつかの実施形態において、分子は、別の動物からとは対照的に、特定の動物からのｍｉＲＮＡ配列に相当する配列を有する。このように、いくつかの実施形態において、ヒト配列は、本発明のＲＮＡ分子において利用される。インビボの実験において、ｍｉＲＮＡ配列は、ヒト配列と比較して、試験動物において異なっていてもよい。この場合において、ヒト配列と異なるｍｉＲＮＡは、動物における治療効果を実証するために使用してもよい。動物において試験された配列を用いて得られた結果は、相当するｍｉＲＮＡ分子を用いてヒトにおいて予期される結果を推定することができる。
【０２７７】
投与及び製剤の様式
本発明の核酸分子は、状態若しくは疾患の処置のために、単独で、又は医薬組成物の形態で、対象に投与してもよい。医薬組成物は、薬学的に使用することができる調製物にｍｉＲＮＡを処理することを容易にする、１つ又は複数の生理学的に許容できる、担体、希釈剤、賦形剤、又は補助剤を使用して、従来の様式で製剤化することができる。適した製剤は、選択される投与の経路に依存する。局所投与のために、本発明のｍｉＲＮＡは、当技術分野において周知であるような、液剤、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁剤などとして製剤化することができる。全身製剤としては、注射、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、脳室内又は腹腔内の注射による投与用に設計されたもの、並びに経皮、経粘膜、吸入、経口又は肺投与用に設計されたものが挙げられる。てんかんを処置する文脈におけるアンタゴミルの投与のために、脳室内投与が非常に好ましく、脳室内注射が特に好ましい。注射のために、本発明の核酸は、水溶液中で、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液又は生理食塩緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液中で、製剤化することができる。溶液は、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤補助剤を含有していてもよい。或いは、核酸分子は、使用前に、適切な媒体、例えば、無菌のパイロジェンフリーの水で再構成するための粉末形態であってもよい。経粘膜投与のために、浸透する障壁に適した浸透剤が製剤において使用される。そのような浸透剤は、一般に、当技術分野において公知である。経口投与のために、核酸は、分子を、当技術分野において周知の薬学的に許容できる担体と組み合わせることによって、容易に製剤化することができる。そのような担体は、本発明の核酸を、処置される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。例えば、散剤、カプセル剤及び錠剤などの経口固体製剤のために、適切な賦形剤としては、糖、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトールなどの増量剤；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物；造粒剤；並びに結合剤が挙げられる。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸若しくはその塩などの崩壊剤を添加してもよい。所望により、固体剤形は、標準的な手法を使用して、糖コーティング又は腸溶コーティングしてもよい。例えば、懸濁剤、エリキシル剤及び液剤などの経口液体調製物のために、適切な担体、賦形剤又は希釈剤としては、水、グリコール、油、アルコールなどが挙げられる。加えて、香味剤、保存剤、着色剤などを添加してもよい。バッカル投与のために、分子は、従来の様式で製剤化された、錠剤、ロゼンジ剤などの形態をとってもよい。吸入による投与のために、本発明による使用のための分子は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガスを使用することで、加圧パック又は噴霧器からエアゾールスプレーの形態で好都合に送達される。加圧エアゾールの場合において、投薬単位は、計量された量を送達するためにバルブを提供することによって決定されてもよい。吸入具又は吸入器における使用のためのゼラチンのカプセル及びカートリッジは、核酸、及びラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有して、製剤化されてもよい。ＲＮＡ分子はまた、例えば、カカオバター又は他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する、坐剤若しくは停留浣腸などの直腸又は膣組成物に製剤化されてもよい。
【０２７８】
先に記載の製剤に加えて、分子はまた、デポー調製物として製剤化されてもよい。そのような長時間作用型製剤は、インプラント術によって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって、投与されてもよい。このように、例えば、分子は、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容できる油中のエマルジョンとして）、又はイオン交換樹脂と、或いは難溶性誘導体として、例えば、難溶性の塩として製剤化されてもよい。或いは、他の薬学的送達システムを用いてもよい。
【０２７９】
リポソーム及びエマルジョンは、本発明の核酸を送達するために使用し得る、送達媒体の周知の例である。
【０２８０】
本発明の核酸は、細胞の取り込みを増加させるために、担体又は脂質と組み合わせて投与されてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、カチオン性脂質と組み合わせて投与されてもよい。カチオン性脂質の例としては、限定されないが、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＯＴＡＰが挙げられる。参照によって具体的に組み込まれる国際公開第００７１０９６号の刊行物は、遺伝子治療に対して有効に使用することができる、ＤＯＴＡＰ：コレステロール又はコレステロール誘導体製剤などの異なる製剤を記載している。他の開示は、ナノ粒子を含む異なる脂質又はリポソーム製剤及び投与の方法も議論しており；これらとしては、限定されるものではないが、米国特許出願公開第２００３０２０３８６５号、米国特許出願公開第２００２０１５０６２６号、米国特許出願公開第２００３００３２６１５号及び米国特許出願公開第２００４００４８７８７号が挙げられ、これらは、これらが製剤並びに核酸の投与及び送達の他の関連する態様を開示する程度に、参照によって具体的に組み込まれる。粒子を形成するために使用される方法は、米国特許第５，８４４，１０７号、米国特許第５，８７７，３０２号、米国特許第６，００８，３３６号、米国特許第６，０７７，８３５号、米国特許第５，９７２，９０１号、米国特許第６，２００，８０１号及び米国特許第５，９７２，９００号においても開示され、これらは、それらの態様について参照によって組み込まれる。核酸はまた、ポリ−Ｌ−リジンなどのカチオン性アミンと組みわせて投与されてもよい。
【０２８１】
核酸はまた、トランスフェリン及びコレステリルなどの化学的部分にコンジュゲートされてもよい。加えて、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに特定の化学基を連結することによって、ある特定の臓器又は組織を標的にしてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドをマンノース残基の適切なアレイに連結することによって、オリゴヌクレオチドは肝臓を標的にする。他の標的リガンドは、Ｌｉｕ  Ｂ．、Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  第６巻：１１２〜１１９頁、２００７年に記載されている。追加の例は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノースなどの炭水化物糖；葉酸などのビタミン；ナプロキセン、イブプロフェン若しくは他の公知のタンパク質結合分子を含む低分子、トランスフェリン受容体を標的にするトランスフェリン修飾シクロデキストリンとも呼ばれるシクロデキストリン（Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎら、２００５年）、ＰＥＩ（ＲＧＤ標的化ＰＥＧ−ＰＥＩ、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓら、２００４年）、アニスアミド、ＲＧＤ−ペプチド若しくはＲＧＤミミック、ポリアルギニン、抗ＴｆＲ単鎖抗体断片／ＴｆＲｓｃＦｖ、アネキシンＡ５（ホスファチジルセリン露出膜を標的にする、Ｇａｒｎｉｅｒ  Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．、２００９年、第１１巻：２１１４〜２２頁）、標的リガンド及びエンドソーム溶解性成分と組み合わせることによる核酸の部位特異的送達のための組成物及び方法を記載している国際公開第２００９／１２６９３３号）である。優先的に適切な標的化リガンドは、内皮関連細胞表面タンパク質である。核酸の標的化はまた、国際公開第２００５／１１１２３８号に記載のアプタマー技術を使用することによって、達成されてもよい。また、ＰＥＧ−脂質、コレステロール、エンドソーム溶解性ヘルパー脂質若しくはペプチド（国際公開第２００９／０４６２２０号）などの追加の脂質部分、又は上記で述べた送達媒体に対する、生じるナノ粒子の全体的な形態（電荷及び粒子径によって特徴付けられる）は、がん細胞及び／又は腫瘍脈管構造のいずれかへの標的化特異性を付与し得る。
【０２８２】
加えて、分子は、治療剤を含有する固体ポリマーの半透過性マトリックスなどの持続放出システムを使用して送達されてもよい。各種の持続放出材料は、確立されており、当業者に周知である。持続放出カプセル剤は、それらの化学的性質に応じて、分子を、数週間から、最大で１００日を超える間、放出し得る。キメラ分子の化学的性質及び生物学的安定性に応じて、分子安定化のための追加戦略を用いてもよい。
【０２８３】
或いは、分子は、参照によって本明細書に具体的に組み込まれる国際公開第２００７０１１２１７号に記載の送達システムに基づく配位化学を使用して、送達されてもよい。
【０２８４】
上記に加えて、本発明の分子は、局所処置又は標的化処置のために、エレクトロポレーションを使用して送達されてもよい。エレクトロポレーション法は、当業者に公知であり、例えば、Ｄａｕｄら（２００８年）又はＢｏｄｌｅｓ−Ｂｒａｋｈｏｐ（２００９年）に記載されている。これらの刊行物のそれぞれは、参照によって組み込まれる。
【０２８５】
核酸は、遊離酸若しくは塩基、又は薬学的に許容できる塩として、上記の製剤のいずれに含まれてもよい。薬学的に許容できる塩は、遊離塩基の生物活性を実質的に保持し、無機酸との反応によって調製される、それらの塩である。薬学的な塩は、対応する遊離塩基の形態よりも、水性溶媒及び他のプロトン性溶媒に、より可溶性である傾向がある。
【０２８６】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる担体に溶解若しくは分散された、有効量の１つ又は複数のｍｉＲＮＡ分子を含む。「薬学的又は薬理学的に許容できる」という語句は、必要に応じて、例えば、ヒトなどの動物に投与された場合に、有害、アレルギー又は他の不都合な反応を生じないか、又は許容できるこれらの反応を生じる、分子体及び組成物を指す。ある特定の有害作用が許容できるか否かは、疾患の重症度に基づいて決定される。少なくとも１つのキメラポリペプチド又は追加の活性成分を含有する医薬組成物の調製は、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年に例示されるように、本開示を考慮すると、当業者に公知である。また、動物（例えば、ヒト）の投与のために、調製が、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって必要とされる、無菌性、発熱性、全体的な安全性及び純度の基準を満たさなければならないことが理解される。
【０２８７】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容できる担体」としては、当業者に公知であるような、ありとあらゆる、溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素などのような材料及びそれらの組み合わせが挙げられる（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年、１２８９〜１３２９頁を参照されたい）。任意の従来の担体が活性成分と不適合である場合を除いて、治療又は医薬組成物におけるその使用が企図される。
【０２８８】
ｍｉＲＮＡは、それが、固体、液体又はエアゾールの形態で投与されるか否か、及びそれが、注射などの投与の経路のために無菌にする必要があるか否かに応じて、異なる種類の担体を含んでいてもよい。本発明は、当業者に公知であるように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、経鼻、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局所、局在、吸入（例えば、エアゾール吸入）、注射、注入、持続注入、局所灌流、標的細胞を浴に直接入れる、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、若しくは他の方法によって、又は先述の任意の組み合わせで投与することができる（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年を参照されたい）。
【０２８９】
動物又は患者に投与される本発明の組成物の実際の投薬量は、体重、状態の重症度、処置される疾患の種類、以前の又は併用の治療的介入、患者の特発性疾患及び投与の経路などの、身体的並びに生理的因子によって決定することができる。投与について責任がある医師が、いずれにしても、個々の対象についての組成物中の活性成分（複数可）の濃度及び適切な用量（複数可）を決定する。
【０２９０】
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含んでいてもよい。他の実施形態において、活性化合物は、単位の重量の２％〜７５％、又は例えば、２５％〜６０％、及びその中で導かれる任意の範囲で含まれていてもよい。他の非限定的な例において、用量は、投与あたり、１マイクログラム／ｋｇ／体重未満、又は１マイクログラム／ｋｇ／体重、５マイクログラム／ｋｇ／体重から、１０マイクログラム／ｋｇ／体重、５０マイクログラム／ｋｇ／体重、１００マイクログラム／ｋｇ／体重、２００マイクログラム／ｋｇ／体重、３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、５００マイクログラム／ｋｇ／体重、１ミリグラム／ｋｇ／体重、５ミリグラム／ｋｇ／体重、１０ミリグラム／ｋｇ／体重、５０ミリグラム／ｋｇ／体重、１００ミリグラム／ｋｇ／体重、２００ミリグラム／ｋｇ／体重、３５０ミリグラム／ｋｇ／体重若しくは５００ミリグラム／ｋｇ／体重、１０００ｍｇ／ｋｇ／体重又はそれ以上まで、及びその中で導かれる任意の範囲を含んでいてもよい。本明細書において列挙される数から導かれる範囲の非限定的な例において、５ｍｇ／ｋｇ／体重〜１００ｍｇ／ｋｇ／体重、５マイクログラム／ｋｇ／体重〜５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を、上記の数に基づいて、投与することができる。
【０２９１】
任意の場合において、本組成物は、１つ又は複数の成分の酸化を遅らせるために、各種の抗酸化剤を含んでいてもよい。加えて、微生物の作用の防止は、限定されるものではないが、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール又はそれらの組み合わせを含む、各種の抗菌剤及び抗真菌剤などの保存剤によってもたらされ得る。
【０２９２】
分子は、遊離塩基、中和又は塩の形態で、組成物中に製剤化されてもよい。薬学的に許容できる塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク性組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、或いは例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸などの有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは鉄の水酸化物などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインなどの有機塩基に由来し得る。
【０２９３】
本組成物が液体の形態である実施形態において、担体は、限定されるものではないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）及びそれらの組み合わせを含む、溶媒又は分散媒であり得る。適度な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって；例えば、液体ポリオール若しくは脂質などの担体中への分散による、必要とされる粒子径の維持によって；例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用によって；又はそのような方法の組み合わせによって、維持することができる。多くの場合において、例えば、糖、塩化ナトリウム又はそれらの組み合わせなどの等張剤を含むことが好ましい。
【０２９４】
他の実施形態において、本発明において、点眼剤、点鼻溶液若しくは点鼻スプレー、エアゾール又は吸入剤を使用してもよい。このような組成物は、一般に、標的組織の種類に適合するように設計される。非限定的な例において、点鼻溶液は、通常、液滴又はスプレーで鼻の中に投与されるように設計された水溶液である。点鼻溶液は、それらが鼻分泌物と多くの点で類似するように調製され、その結果、通常の線毛の作用が維持される。このため、好ましい実施形態において、水性点鼻溶液は、通常、等張であるか又はわずかに緩衝して、ｐＨを約５．５〜約６．５に維持する。加えて、眼科用調製物において使用されるものと同様の抗菌保存剤、薬物、又は適切な薬物安定化剤を、必要により、製剤に含めてもよい。例えば、各種の商業的な点鼻用調製物が公知であり、抗生物質及び抗ヒスタミン薬などの薬物を含む。ある特定の実施形態において、分子は、経口摂取などの経路による投与のために調製される。これらの実施形態において、固体組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤（例えば、ハード又はソフトゼラチンカプセル剤）、持続放出製剤、バッカル組成物、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート剤、又はそれらの組み合わせを含んでいてもよい。経口組成物は、食餌の食物に直接組み込んでもよい。経口投与のための好ましい担体は、不活性希釈剤、吸収可能な食用担体又はそれらの組み合わせを含む。本発明の他の態様において、経口組成物は、シロップ剤又はエリキシル剤として調製されてもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、例えば、少なくとも１つの活性剤、甘味剤、保存剤、香味剤、色素、保存剤又はそれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【０２９５】
ある特定の好ましい実施形態において、経口組成物は、１つ又は複数の結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、香味剤及びそれらの組み合わせを含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、組成物は、以下の１つ又は複数を含んでいてもよい：例えば、トラガカントガム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン若しくはそれらの組み合わせなどの結合剤；例えば、第二リン酸カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム若しくはそれらの組み合わせなどの賦形剤；例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸若しくはそれらの組み合わせなどの崩壊剤；例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；例えば、スクロース、ラクトース、サッカリン若しくはそれらの組み合わせなどの甘味剤；例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、サクランボ香味剤、オレンジ香味剤などの香味剤など、又は上記の組み合わせ。投薬単位形態がカプセル剤である場合、これは、上記の種類の材料に加えて、液体担体などの担体を含有していてもよい。コーティングのような各種の他の材料が存在していてもよいか、又はそうでなければ投薬単位の物理的形態を変更してもよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤は、セラック、糖又は両方でコーティングされてもよい。
【０２９６】
本組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用に対して保存されなければならない。エンドトキシンの混入は、安全なレベル、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で、最小限に保たれなければならないことが認識される。
【０２９７】
特定の実施形態において、注射用組成物の吸収の延長は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなどの吸収を遅延させる剤を組成物中において使用することによって、もたらされ得る。
【０２９８】
細胞への送達又は輸送に関して上記で論じられた任意の実施形態は、この項で論じられた医薬化合物の送達を実行することに関して用いることもできる。
【０２９９】
有効投薬量
本発明の分子は、一般に、意図する目的を達成するための有効な量で使用される。疾患状態を処置又は予防する使用のために、本発明の分子又はその医薬組成物は、治療有効量で投与又は適用される。治療有効量は、症状を改善若しくは予防するため、又は処置される患者の生存を延長するために有効な量である。治療有効量の決定は、特に、本明細書において提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３００】
全身投与のために、治療有効用量は、インビトロアッセイから最初に推定することができる。例えば、用量を、動物モデルにおいて処方して、細胞培養において決定されたＥＣ５０を含む循環濃度範囲を達成することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０３０１】
初期投薬量は、本技術分野において周知の手法を使用して、インビボのデータ、例えば、動物モデルから、推定することもできる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができる。
【０３０２】
投薬量及び間隔を個々に調整して、治療効果を維持するために十分な分子の血漿レベルを提供することができる。注射による投与についての通常の患者投薬量は、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日又は０．１〜５ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日又はそれ以上の範囲である。治療有効血清レベルは、それぞれの日に複数の用量を投与することによって達成してもよい。
【０３０３】
局所投与又は選択的取り込みの場合において、タンパク質の有効局所濃度は、血漿濃度と関連しないことがある。当業者は、過度の実験をせずに、治療有効局所投薬量を最適化することが可能である。
【０３０４】
投与される分子の量は、当然ながら、処置される対象、対象の体重、病気の重症度、投与の様式及び処方医師の判断に依存する。
【０３０５】
治療は、症状が検出可能である間、又は症状が検出可能ではない場合であっても、断続的に繰り返してもよい。治療は、単独で、又は他の薬物若しくは処置（外科手術を含む）と組み合わせて、提供されてもよい。
【０３０６】
毒性
好ましくは、本明細書において記載される分子の治療有効用量は、実質的な毒性を引き起こすことなく、治療の有益性を提供する。本明細書において記載される分子の毒性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）又はＬＤ１００（集団の１００％にとって致死的な用量）を決定することによって、決定することができる。毒性及び治療効果の間の用量比は、治療指数である。高い治療指数を示すタンパク質が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のために毒性ではない投薬量の範囲を処方するのに使用することができる。本明細書において記載されるタンパク質の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんど又はない有効用量を含む、循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与の経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。正確な処方、投与の経路及び投薬量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５年、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ中の第１章、１頁を参照されたい）。
【０３０７】
ペンダント基
「ペンダント基」は、核酸に結合又はコンジュゲートされてもよい。ペンダント基は、核酸の細胞取り込みを増加させることがある。ペンダント基は、核酸の任意の部分に連結され得るが、通常、オリゴヌクレオチド鎖の末端（複数可）に連結される。ペンダント基の例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：アクリジン誘導体（すなわち、２−メトキシ−６−クロロ−９−アミノアクリジン）；プソラレン誘導体、アジドフェナシル、プロフラビン及びアジドプロフラビンなどの架橋剤；人工エンドヌクレアーゼ；ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）、ｏ−フェナントロリン−Ｃｕ（Ｉ）及びポルフィリン−Ｆｅ（ＩＩ）などの金属錯体；アルキル化部分；アミノ−１−ヘキサノールブドウ球菌ヌクレアーゼ及びアルカリホスファターゼなどのヌクレアーゼ；ターミナルトランスフェラーゼ；抗体酵素；コレステリル部分；脂溶性担体；ペプチドコンジュゲート；長鎖アルコール；リン酸エステル；アミノ；メルカプト基；放射性マーカー；色素などの非放射性マーカー；並びにポリリジン又は他のポリアミン。一例において、核酸は、炭水化物、硫酸化炭水化物又はグリカンにコンジュゲートされる。
【０３０８】
キット
本明細書において記載される任意の組成物は、キットに含まれていてもよい。非限定的な例において、個々のｍｉＲＮＡが、キットに含まれる。キットは、合成ｍｉＲＮＡ送達の効果について調節するために使用することができる１つ又は複数の陰性対照の合成ｍｉＲＮＡをさらに含んでいてもよい。キットは、水及びハイブリダイゼーション緩衝液をさらに含んで、合成ｍｉＲＮＡの２つの鎖のハイブリダイゼーションを容易にしてもよい。キットは、１つ又は複数のトランスフェクション試薬（複数可）も含んで、細胞へのｍｉＲＮＡの送達を容易にしてもよい。
【０３０９】
別の非限定的な例において、複数の合成ｍｉＲＮＡが、キットに含まれる。キットは、合成ｍｉＲＮＡ送達の効果について調節するために使用することができる１つ又は複数の陰性対照の合成ｍｉＲＮＡをさらに含んでいてもよい。キットは、１つ又は複数のトランスフェクション試薬も含んで、細胞への送達を容易にしてもよい。
【０３１０】
キットの成分は、水性媒体中又は凍結乾燥の形態のいずれかで包装されてもよい。キットの容器手段は、成分を配置することができ、好ましくは、適切に分割できる、少なくとも１つの、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段を一般に含む。キット中に２つ以上の成分が存在する場合（標識化試薬及び標識は一緒に包装してもよい）、キットは、一般に、追加の成分を別々に配置し得る、第２、第３又は他の追加の容器も含有する。しかしながら、成分の各種の組み合わせが、１つのバイアルに含まれていてもよい。本発明のキットは、典型的には、核酸を含有するための手段、及び商業的な販売のために密接に封じ込められた任意の他の試薬容器を含む。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出又はブロー成型プラスチック容器を含んでいてもよい。
【０３１１】
キットの成分が１つ及び／又は複数の液体溶液で提供される場合、液体溶液は、水溶液であり、無菌水溶液が特に好ましい。
【０３１２】
しかしながら、キットの成分は、乾燥粉末（複数可）として提供されてもよい。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって、再構成され得る。溶媒も別の容器手段において提供され得ることが構想される。
【０３１３】
容器手段は、核酸製剤を配置し、好ましくは適切に配分する、少なくとも１つの、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ及び／又は他の容器手段を一般に含む。キットはまた、無菌の薬学的に許容できる緩衝液及び／又は他の希釈剤を含有するための第２の容器手段を含んでいてもよい。本発明のキットは、典型的には、例えば、所望のバイアルが保持される射出及び／又はブロー成型プラスチック容器などの、商業的な販売のために密接に封じ込められたバイアルを含有するための手段も含む。
【０３１４】
そのようなキットはまた、ｍｉＲＮＡを保存若しくは維持するか、又はｍｉＲＮＡの分解に対して保護する成分を含んでいてもよい。そのような成分は、ＲＮＡｓｅを含まなくてもよく、又はＲＮＡｓｅに対して保護されていてもよい。そのようなキットは、一般に、適切な手段で、それぞれ個々の試薬又は溶液のための別個の容器を含む。
【０３１５】
キットは、キット成分を用いるため及びキットに含まれていない任意の他の試薬の使用についての使用説明書も含む。使用説明書は、実行することができる改変を含んでいてもよい。
【０３１６】
本発明のキットはまた、以下の１つ又は複数を含んでいてもよい：ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡのライブラリー、ｍｉＲＮＡの組み合わせライブラリー、陰性対照ｍｉＲＮＡ、ヌクレアーゼを含まない水；１．５ｍｌチューブなどのＲＮａｓｅを含まないの容器；ハイブリダイゼーション緩衝液；及びトランスフェクション試薬（複数可）。
【０３１７】
そのような試薬は、本発明のキットの実施形態であることが企図される。しかしながら、そのようなキットは、上記で特定される特定の項目に限定されず、ｍｉＲＮＡの操作及び特徴付けのために使用される任意の試薬を含んでいてもよい。
【０３１８】
配列同一性
「配列同一性」は、本明細書において、配列を比較することによって決定される、２つ以上の核酸（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ）配列の間の関係として定義される。本技術分野において、「同一性」は、場合によっては、そのような配列の列の間の一致によって決定される、核酸配列の間の配列の関係性の程度も意味する。「同一性」及び「類似性」は、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ及びＧｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年；並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、第４８巻：１０７３頁（１９８８年）に記載されるものを含む、公知の方法によって容易に算出することができる。実施形態において、同一性は、所与の配列番号の長さ全体にわたって評価される。
【０３１９】
同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列の間で最大の一致を与えるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、公共で利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。２つの配列の間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法としては、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１２巻（１号）：３８７頁（１９８４年））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）が挙げられる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給源から公共で利用可能である（ＢＬＡＳＴマニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年））。周知のスミスウォーターマンアルゴリズムも同一性を決定するために使用され得る。
【０３２０】
核酸比較のための好ましいパラメーターは、以下を含む：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８巻：４４３〜４５３頁（１９７０年）；比較行列：一致＝＋１０、不一致＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長さペナルティ：３。Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．にあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして利用可能。上記は、核酸比較のためのデフォルトパラメータを与える。
【０３２１】
本文書及びその特許請求の範囲において、「含むこと（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用形は、この語の後に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が除外されないことを意味する、非限定的な意味で使用される。加えて、「からなる（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ）」という動詞は、本明細書において定義される、ｍｉＲＮＡ、ｉｓｏｍｉＲ、ミミック若しくは供給源、又はそれらのアンタゴミル、或いは組成物が、具体的に特定されるもの以外の追加成分（複数可）を含んでいてもよく、前記追加成分（複数可）は、本発明の固有の特性を変更しないことを意味する「から本質的になる（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」によって置き換えられ得る。加えて、不定冠詞の「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、１つ及び１つのみの要素が存在することを文脈が明らかに要求しない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。このため、不定冠詞の「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【０３２２】
本明細書において引用されるすべての特許及び論文の参照文献は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。以下の実施例は、例示の目的のみのために提供され、任意の方法で本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０３２３】
本発明の好ましい実施形態：
１．ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患及び／若しくは状態を、処置、回復、予防、治癒及び／又は遅延させるための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源であって、
前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらのミミックであり、配列番号１４〜５６によって表されるシード配列の７個のヌクレオチドのうちの少なくとも６個を含むシード配列を有するオリゴヌクレオチドであるか、又はそれらのアンタゴミルであり、
前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、
ｍｉＲＮＡ−１３５、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はそのミミック、又はそのアンタゴミル、或いは
ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ、又はそのｉｓｏｍｉＲ、又はそのミミック、又はそのアンタゴミルである、
ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源。
２．前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂのｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子のｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１３５ａのアンタゴミル、ｍｉＲＮＡ−１３５ｂのアンタゴミル、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのアンタゴミル、又はそれらのミミックである、実施形態１に記載の使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源。
３．ｍｉＲＮＡの供給源が、ｍｉＲＮＡの前駆体であり、少なくとも５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、実施形態１又は２に記載の使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源。
４．前記ｍｉＲＮＡが、配列番号１４７〜２４１のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、
前記アンタゴミルが、配列番号２４２〜３４1のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、及び／或いは
前記ｍｉＲＮＡ又はアンタゴミルが、１５〜３０ヌクレオチド長である、及び／或いは
ｍｉＲＮＡの前記供給源が、前記ｍｉＲＮＡの前駆体であり、配列番号１〜４又は１０〜１３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を共有する、
実施形態１〜３のいずれか１つに記載の使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給
５．前記使用が、クルッペル様因子４の発現を抑制するためである、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の使用のための、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源。
６．実施形態１〜５のいずれか１つに記載の使用のための、実施形態１〜５のいずれか一項に定義されるｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源を含む組成物。
７．ｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル若しくは供給源、及び／或いは
ｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル若しくは供給源、及び／或いは
ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、又はそのｉｓｏｍｉＲ、ミミック、アンタゴミル若しくは供給源
を含む、実施形態５に記載の使用のための組成物。
８．ｍｉＲＮＡ−１２４分子、ｍｉＲＮＡ−１２４のミミック、ｍｉＲＮＡ−１２４のｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１２４のアンタゴミル、又はそれらの供給源をさらに含む、実施形態６又は７に記載の使用のための組成物。
９．それを必要とする対象に、実施形態１〜５のいずれか１つに定義されるｍｉＲＮＡ、アンタゴミル若しくはそれらの供給源、又は実施形態６〜８のいずれか１つに定義される組成物を投与するステップによる、ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する状態若しくは疾患を、処置、治癒、回復及び／又は遅延させるための方法。
１０．対象におけるニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態を診断するための方法であって、
（ａ）実施形態１〜５のいずれか１つに定義されるｍｉＲＮＡ又はその供給源の発現レベルを決定するステップ、及び任意選択で、
（ｂ）実施形態１〜５のいずれか１つに定義される前記ｍｉＲＮＡ又はその供給源の発現レベルを、前記ｍｉＲＮＡ又はその供給源の発現レベルについての参照値と比較するステップであって、参照値が、好ましくは、健康な対象における前記ｍｉＲＮＡ又はその供給源の発現レベルについての平均値であるステップ
を含む、方法。
１１．ステップ（ａ）において、
ｉ）ｍｉＲＮＡ−１２４分子、ｍｉＲＮＡ−１２４のｉｓｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ−１２４の前駆体、或いは
ｉｉ）ＫＬＦ４、或いは
ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂの両方、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源、或いは
ｉｖ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐの両方、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源、或いは
ｖ）ｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐの両方、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源、或いは
ｖｉ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及びｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐのそれぞれ、若しくはｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源
発現レベルを決定することを含む、実施形態１０に記載の方法。
１２．ニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する疾患若しくは状態が、比較が、前記ｍｉＲＮＡ分子、ｉｓｏｍｉＲ、又はそれらの供給源の発現レベルの減少、及び／或いはｍｉＲＮＡ−１２４分子、ｍｉＲＮＡ−１２４又はそれらの供給源の発現レベルの減少の所見をもたらす場合に、診断される、実施形態１０又は１１に記載の方法。
１３．発現レベルが、対象から得られた試料においてエクスビボで決定される、実施形態９〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．対象におけるニューロンの欠損又はニューロンの欠損に関連する状態若しくは疾患を、処置、修復、治癒及び／或いは遅延させる能力がある物質を特定するための方法であって、
（ａ）ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源を発現する能力がある試験細胞集団を提供するステップであって、好ましくは、試験集団が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙなどのニューロン細胞を含み、より好ましくは、試験細胞集団が、哺乳動物細胞、さらにより好ましくは、ヒト細胞を含むステップ；
（ｂ）試験細胞集団を物質と接触又はインキュベートするステップ；
（ｃ）物質と接触又はインキュベートされた試験細胞集団において、前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の発現レベル、或いは前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の活性又は定常状態のレベルを決定するステップ；
（ｄ）（ｃ）において決定された発現、活性又は定常状態のレベルを、物質と接触していない試験細胞集団における前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の発現、活性又は定常状態のレベルと比較するステップ；並びに
（ｅ）物質と接触した試験細胞集団及び物質と接触していない試験細胞集団の間の、前記ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１３５ｂ及び／若しくはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−５ｐ分子、ｉｓｏｍｉＲ又はそれらの供給源の発現レベル、活性又は定常状態のレベルにおける差を生じる物質を特定するステップ
を含む、方法。
１５．ニューロンの発生若しくは再生を促進するためのインビボ、インビトロ又はエクスビボの方法であって、細胞を、実施形態１〜５のいずれか１つに定義されるｍｉＲＮＡ、アンタゴミル又はそれらの供給源と、又は実施形態６〜８のいずれか１つに定義される組成物と接触させるステップを少なくとも含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【０３２４】
【図１Ａ】神経突起の成長に関与するｍｉＲＮＡを特定する、画像に基づくハイコンテントスクリーニング。（Ａ）セロミクスアレイスキャン（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ）スクリーニングの略図。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を播種し、レチノイン酸を使用して分化させた。ウイルスライブラリーを添加し、３日後、細胞を固定及び免疫染色した。ウェルの表面全体をカバーする画像を、サーモアレイスキャン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ａｒｒａｙｓｃａｎ）自動顕微鏡を使用して取得し、ニューロナルプロファイリング（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）アルゴリズムを使用して分析して、神経突起の数、神経突起の長さ及び分岐点の数などの一般的なニューロン様特徴に対するｍｉＲＮＡの効果を評価した。それぞれのパラメーターに対するｍｉＲＮＡの効果を、２値（０又は１）でスコア化した。正のスコア（１）は、パラメーターに対する効果が、すべてのｍｉＲＮＡについての中央値の標準偏差が２倍を超えて逸脱した場合に与えた。三反復のプレートのそれぞれについてのスコアを組み合わせ、ｍｉＲＮＡが３つのプレートのうちの最低２つで正にスコア化された場合に、ある特定のパラメーターについてのスコアを考慮した（効果は「真」である）。これは、最終（累積的）「ヒットスコア」をもたらし、これをニューロンの形態に対する効果について、レンチウイルスのクローンをランク付けするために使用した。（Ｂ）未処置のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（左パネル）及びレチノイン酸で処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（中央パネル）の代表的な画像。右パネルは、ニューロナルプロファイリングアルゴリズムによって生成された追跡の結果を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｃ）ウイルスで形質導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のニューロンの特徴に対して陽性の効果を有する、注釈付きｍｉＲＮＡの上位のリストについてのニューロナルプロファイリングアルゴリズムのすべてのパラメーターの累積スコアを示すグラフ。（Ｄ）指示されたｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉＲＮＡミミックでエレクトロポレーションされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の、平均総ヒットスコア（左）、神経突起の長さを記載するパラメーターに基づくヒットスコア（中央）、及び神経突起の分岐を記載するパラメーターに基づくヒットスコア（右）を示すグラフ。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、チューキー多重比較検定による一元配置分散分析。スケールバー：２００μｍ。
【図１Ｂ】神経突起の成長に関与するｍｉＲＮＡを特定する、画像に基づくハイコンテントスクリーニング。（Ａ）セロミクスアレイスキャン（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ）スクリーニングの略図。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を播種し、レチノイン酸を使用して分化させた。ウイルスライブラリーを添加し、３日後、細胞を固定及び免疫染色した。ウェルの表面全体をカバーする画像を、サーモアレイスキャン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ａｒｒａｙｓｃａｎ）自動顕微鏡を使用して取得し、ニューロナルプロファイリング（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）アルゴリズムを使用して分析して、神経突起の数、神経突起の長さ及び分岐点の数などの一般的なニューロン様特徴に対するｍｉＲＮＡの効果を評価した。それぞれのパラメーターに対するｍｉＲＮＡの効果を、２値（０又は１）でスコア化した。正のスコア（１）は、パラメーターに対する効果が、すべてのｍｉＲＮＡについての中央値の標準偏差が２倍を超えて逸脱した場合に与えた。三反復のプレートのそれぞれについてのスコアを組み合わせ、ｍｉＲＮＡが３つのプレートのうちの最低２つで正にスコア化された場合に、ある特定のパラメーターについてのスコアを考慮した（効果は「真」である）。これは、最終（累積的）「ヒットスコア」をもたらし、これをニューロンの形態に対する効果について、レンチウイルスのクローンをランク付けするために使用した。（Ｂ）未処置のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（左パネル）及びレチノイン酸で処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（中央パネル）の代表的な画像。右パネルは、ニューロナルプロファイリングアルゴリズムによって生成された追跡の結果を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｃ）ウイルスで形質導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のニューロンの特徴に対して陽性の効果を有する、注釈付きｍｉＲＮＡの上位のリストについてのニューロナルプロファイリングアルゴリズムのすべてのパラメーターの累積スコアを示すグラフ。（Ｄ）指示されたｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉＲＮＡミミックでエレクトロポレーションされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の、平均総ヒットスコア（左）、神経突起の長さを記載するパラメーターに基づくヒットスコア（中央）、及び神経突起の分岐を記載するパラメーターに基づくヒットスコア（右）を示すグラフ。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、チューキー多重比較検定による一元配置分散分析。スケールバー：２００μｍ。
【図１Ｃ】神経突起の成長に関与するｍｉＲＮＡを特定する、画像に基づくハイコンテントスクリーニング。（Ａ）セロミクスアレイスキャン（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ）スクリーニングの略図。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を播種し、レチノイン酸を使用して分化させた。ウイルスライブラリーを添加し、３日後、細胞を固定及び免疫染色した。ウェルの表面全体をカバーする画像を、サーモアレイスキャン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ａｒｒａｙｓｃａｎ）自動顕微鏡を使用して取得し、ニューロナルプロファイリング（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）アルゴリズムを使用して分析して、神経突起の数、神経突起の長さ及び分岐点の数などの一般的なニューロン様特徴に対するｍｉＲＮＡの効果を評価した。それぞれのパラメーターに対するｍｉＲＮＡの効果を、２値（０又は１）でスコア化した。正のスコア（１）は、パラメーターに対する効果が、すべてのｍｉＲＮＡについての中央値の標準偏差が２倍を超えて逸脱した場合に与えた。三反復のプレートのそれぞれについてのスコアを組み合わせ、ｍｉＲＮＡが３つのプレートのうちの最低２つで正にスコア化された場合に、ある特定のパラメーターについてのスコアを考慮した（効果は「真」である）。これは、最終（累積的）「ヒットスコア」をもたらし、これをニューロンの形態に対する効果について、レンチウイルスのクローンをランク付けするために使用した。（Ｂ）未処置のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（左パネル）及びレチノイン酸で処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（中央パネル）の代表的な画像。右パネルは、ニューロナルプロファイリングアルゴリズムによって生成された追跡の結果を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｃ）ウイルスで形質導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のニューロンの特徴に対して陽性の効果を有する、注釈付きｍｉＲＮＡの上位のリストについてのニューロナルプロファイリングアルゴリズムのすべてのパラメーターの累積スコアを示すグラフ。（Ｄ）指示されたｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉＲＮＡミミックでエレクトロポレーションされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の、平均総ヒットスコア（左）、神経突起の長さを記載するパラメーターに基づくヒットスコア（中央）、及び神経突起の分岐を記載するパラメーターに基づくヒットスコア（右）を示すグラフ。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、チューキー多重比較検定による一元配置分散分析。スケールバー：２００μｍ。
【図１Ｄ】神経突起の成長に関与するｍｉＲＮＡを特定する、画像に基づくハイコンテントスクリーニング。（Ａ）セロミクスアレイスキャン（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ）スクリーニングの略図。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を播種し、レチノイン酸を使用して分化させた。ウイルスライブラリーを添加し、３日後、細胞を固定及び免疫染色した。ウェルの表面全体をカバーする画像を、サーモアレイスキャン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ａｒｒａｙｓｃａｎ）自動顕微鏡を使用して取得し、ニューロナルプロファイリング（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）アルゴリズムを使用して分析して、神経突起の数、神経突起の長さ及び分岐点の数などの一般的なニューロン様特徴に対するｍｉＲＮＡの効果を評価した。それぞれのパラメーターに対するｍｉＲＮＡの効果を、２値（０又は１）でスコア化した。正のスコア（１）は、パラメーターに対する効果が、すべてのｍｉＲＮＡについての中央値の標準偏差が２倍を超えて逸脱した場合に与えた。三反復のプレートのそれぞれについてのスコアを組み合わせ、ｍｉＲＮＡが３つのプレートのうちの最低２つで正にスコア化された場合に、ある特定のパラメーターについてのスコアを考慮した（効果は「真」である）。これは、最終（累積的）「ヒットスコア」をもたらし、これをニューロンの形態に対する効果について、レンチウイルスのクローンをランク付けするために使用した。（Ｂ）未処置のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（左パネル）及びレチノイン酸で処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（中央パネル）の代表的な画像。右パネルは、ニューロナルプロファイリングアルゴリズムによって生成された追跡の結果を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｃ）ウイルスで形質導入されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のニューロンの特徴に対して陽性の効果を有する、注釈付きｍｉＲＮＡの上位のリストについてのニューロナルプロファイリングアルゴリズムのすべてのパラメーターの累積スコアを示すグラフ。（Ｄ）指示されたｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉＲＮＡミミックでエレクトロポレーションされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の、平均総ヒットスコア（左）、神経突起の長さを記載するパラメーターに基づくヒットスコア（中央）、及び神経突起の分岐を記載するパラメーターに基づくヒットスコア（右）を示すグラフ。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、チューキー多重比較検定による一元配置分散分析。スケールバー：２００μｍ。
【図２Ａ】ニューロンの発達の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現。（Ａ、Ｃ）グラフは、５つの異なる胚及び出生後の段階からの単離されたマウス皮質（Ａ）又は海馬（Ｃ）からのＲＮＡにおける定量的ＰＣＲ実験の結果を示す。異なる同腹仔由来の３頭の異なるマウスからの組織を分析のために使用した。試料は二反復で行った。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）ロックド核酸（ＬＮＡ）のインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｅ１４、Ｐ１０及び成体の皮質におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、皮質板（ｃｐ）及び成体の皮質の上層で発現する。スクランブル化されたＬＮＡ−インサイチュプローブで処理された切片は、特異的染色がなかった。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）ロックド核酸（ＬＮＡ）のインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｅ１６、Ｐ０、Ｐ１０及び成体の海馬におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を示す。海馬において、歯状回（ＤＧ）及びＣＡ３領域は、強いｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ染色を特異的に示す。スクランブル化されたＬＮＡ−インサイチュプローブで処理された切片は、特異的染色がなかった。スケールバー：２００μｍ。
【図２Ｂ】ニューロンの発達の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現。（Ａ、Ｃ）グラフは、５つの異なる胚及び出生後の段階からの単離されたマウス皮質（Ａ）又は海馬（Ｃ）からのＲＮＡにおける定量的ＰＣＲ実験の結果を示す。異なる同腹仔由来の３頭の異なるマウスからの組織を分析のために使用した。試料は二反復で行った。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）ロックド核酸（ＬＮＡ）のインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｅ１４、Ｐ１０及び成体の皮質におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、皮質板（ｃｐ）及び成体の皮質の上層で発現する。スクランブル化されたＬＮＡ−インサイチュプローブで処理された切片は、特異的染色がなかった。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）ロックド核酸（ＬＮＡ）のインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｅ１６、Ｐ０、Ｐ１０及び成体の海馬におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を示す。海馬において、歯状回（ＤＧ）及びＣＡ３領域は、強いｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ染色を特異的に示す。スクランブル化されたＬＮＡ−インサイチュプローブで処理された切片は、特異的染色がなかった。スケールバー：２００μｍ。
【図２Ｃ】ニューロンの発達の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現。（Ａ、Ｃ）グラフは、５つの異なる胚及び出生後の段階からの単離されたマウス皮質（Ａ）又は海馬（Ｃ）からのＲＮＡにおける定量的ＰＣＲ実験の結果を示す。異なる同腹仔由来の３頭の異なるマウスからの組織を分析のために使用した。試料は二反復で行った。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）ロックド核酸（ＬＮＡ）のインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｅ１４、Ｐ１０及び成体の皮質におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、皮質板（ｃｐ）及び成体の皮質の上層で発現する。スクランブル化されたＬＮＡ−インサイチュプローブで処理された切片は、特異的染色がなかった。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）ロックド核酸（ＬＮＡ）のインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｅ１６、Ｐ０、Ｐ１０及び成体の海馬におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を示す。海馬において、歯状回（ＤＧ）及びＣＡ３領域は、強いｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ染色を特異的に示す。スクランブル化されたＬＮＡ−インサイチュプローブで処理された切片は、特異的染色がなかった。スケールバー：２００μｍ。
【図２Ｄ】ニューロンの発達の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現。（Ａ、Ｃ）グラフは、５つの異なる胚及び出生後の段階からの単離されたマウス皮質（Ａ）又は海馬（Ｃ）からのＲＮＡにおける定量的ＰＣＲ実験の結果を示す。異なる同腹仔由来の３頭の異なるマウスからの組織を分析のために使用した。試料は二反復で行った。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）ロックド核酸（ＬＮＡ）のインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｅ１４、Ｐ１０及び成体の皮質におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、皮質板（ｃｐ）及び成体の皮質の上層で発現する。スクランブル化されたＬＮＡ−インサイチュプローブで処理された切片は、特異的染色がなかった。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）ロックド核酸（ＬＮＡ）のインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｅ１６、Ｐ０、Ｐ１０及び成体の海馬におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を示す。海馬において、歯状回（ＤＧ）及びＣＡ３領域は、強いｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ染色を特異的に示す。スクランブル化されたＬＮＡ−インサイチュプローブで処理された切片は、特異的染色がなかった。スケールバー：２００μｍ。
【図３Ａ】ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは神経突起伸長及び分岐を増加させる。（Ａ）グラフは、インビトロで異なる日（ＤＩＶ）での初代海馬ニューロンおける定量的ＰＣＲの結果を示す。ＲＮＡを２つの異なる培養物の３〜４枚のカバースリップから収集した。試料は二反復で行った。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ及びｍｉＲ−１３５ａ／ｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後のインビトロで４日目（ＤＩＶ）での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｃ）グラフは、Ａなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１７３のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｄ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターでのトランスフェクション後のＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の定量化。スポンジは、「ｓｐ」と標識を付けられ、それらの指示されたｍｉＲＮＡのアンタゴミルである。少なくとも１００のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照スポンジベクター又はｍｉＲ−１３５ａｂスポンジベクターでトランスフェクション後のＤＩＶ４での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｆ）ニューロンを過剰発現する、３１の対照−１（暗灰色）、１５のｍｉＲ−１３５ａ（薄灰色）、１６のｍｉＲ−１３５ｂ（黒色）、又は２３のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ（黒色輪郭の薄灰色）からのＳｈｏｌｌ分析は、近位の神経突起及びその遠位の軸索における分岐の増加を明らかにする。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、多重Ｔ−検定。輪郭において、近位の神経突起は主な細胞体が起源であり、遠位の分岐は長いニューロンが起源であり、両方とも灰色で網掛けする。（Ｇ）ｓｈｏｌｌサークル（Ｄなどで）による、対照−１又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでトランスフェクトされたニューロンからの神経突起の累積交差。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。
【図３Ｂ】ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは神経突起伸長及び分岐を増加させる。（Ａ）グラフは、インビトロで異なる日（ＤＩＶ）での初代海馬ニューロンおける定量的ＰＣＲの結果を示す。ＲＮＡを２つの異なる培養物の３〜４枚のカバースリップから収集した。試料は二反復で行った。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ及びｍｉＲ−１３５ａ／ｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後のインビトロで４日目（ＤＩＶ）での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｃ）グラフは、Ａなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１７３のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｄ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターでのトランスフェクション後のＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の定量化。スポンジは、「ｓｐ」と標識を付けられ、それらの指示されたｍｉＲＮＡのアンタゴミルである。少なくとも１００のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照スポンジベクター又はｍｉＲ−１３５ａｂスポンジベクターでトランスフェクション後のＤＩＶ４での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｆ）ニューロンを過剰発現する、３１の対照−１（暗灰色）、１５のｍｉＲ−１３５ａ（薄灰色）、１６のｍｉＲ−１３５ｂ（黒色）、又は２３のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ（黒色輪郭の薄灰色）からのＳｈｏｌｌ分析は、近位の神経突起及びその遠位の軸索における分岐の増加を明らかにする。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、多重Ｔ−検定。輪郭において、近位の神経突起は主な細胞体が起源であり、遠位の分岐は長いニューロンが起源であり、両方とも灰色で網掛けする。（Ｇ）ｓｈｏｌｌサークル（Ｄなどで）による、対照−１又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでトランスフェクトされたニューロンからの神経突起の累積交差。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。
【図３Ｃ】ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは神経突起伸長及び分岐を増加させる。（Ａ）グラフは、インビトロで異なる日（ＤＩＶ）での初代海馬ニューロンおける定量的ＰＣＲの結果を示す。ＲＮＡを２つの異なる培養物の３〜４枚のカバースリップから収集した。試料は二反復で行った。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ及びｍｉＲ−１３５ａ／ｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後のインビトロで４日目（ＤＩＶ）での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｃ）グラフは、Ａなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１７３のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｄ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターでのトランスフェクション後のＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の定量化。スポンジは、「ｓｐ」と標識を付けられ、それらの指示されたｍｉＲＮＡのアンタゴミルである。少なくとも１００のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照スポンジベクター又はｍｉＲ−１３５ａｂスポンジベクターでトランスフェクション後のＤＩＶ４での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｆ）ニューロンを過剰発現する、３１の対照−１（暗灰色）、１５のｍｉＲ−１３５ａ（薄灰色）、１６のｍｉＲ−１３５ｂ（黒色）、又は２３のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ（黒色輪郭の薄灰色）からのＳｈｏｌｌ分析は、近位の神経突起及びその遠位の軸索における分岐の増加を明らかにする。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、多重Ｔ−検定。輪郭において、近位の神経突起は主な細胞体が起源であり、遠位の分岐は長いニューロンが起源であり、両方とも灰色で網掛けする。（Ｇ）ｓｈｏｌｌサークル（Ｄなどで）による、対照−１又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでトランスフェクトされたニューロンからの神経突起の累積交差。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。
【図３Ｄ】ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは神経突起伸長及び分岐を増加させる。（Ａ）グラフは、インビトロで異なる日（ＤＩＶ）での初代海馬ニューロンおける定量的ＰＣＲの結果を示す。ＲＮＡを２つの異なる培養物の３〜４枚のカバースリップから収集した。試料は二反復で行った。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ及びｍｉＲ−１３５ａ／ｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後のインビトロで４日目（ＤＩＶ）での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｃ）グラフは、Ａなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１７３のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｄ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターでのトランスフェクション後のＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の定量化。スポンジは、「ｓｐ」と標識を付けられ、それらの指示されたｍｉＲＮＡのアンタゴミルである。少なくとも１００のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照スポンジベクター又はｍｉＲ−１３５ａｂスポンジベクターでトランスフェクション後のＤＩＶ４での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｆ）ニューロンを過剰発現する、３１の対照−１（暗灰色）、１５のｍｉＲ−１３５ａ（薄灰色）、１６のｍｉＲ−１３５ｂ（黒色）、又は２３のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ（黒色輪郭の薄灰色）からのＳｈｏｌｌ分析は、近位の神経突起及びその遠位の軸索における分岐の増加を明らかにする。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、多重Ｔ−検定。輪郭において、近位の神経突起は主な細胞体が起源であり、遠位の分岐は長いニューロンが起源であり、両方とも灰色で網掛けする。（Ｇ）ｓｈｏｌｌサークル（Ｄなどで）による、対照−１又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでトランスフェクトされたニューロンからの神経突起の累積交差。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。
【図３Ｅ】ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは神経突起伸長及び分岐を増加させる。（Ａ）グラフは、インビトロで異なる日（ＤＩＶ）での初代海馬ニューロンおける定量的ＰＣＲの結果を示す。ＲＮＡを２つの異なる培養物の３〜４枚のカバースリップから収集した。試料は二反復で行った。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ及びｍｉＲ−１３５ａ／ｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後のインビトロで４日目（ＤＩＶ）での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｃ）グラフは、Ａなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１７３のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｄ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターでのトランスフェクション後のＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の定量化。スポンジは、「ｓｐ」と標識を付けられ、それらの指示されたｍｉＲＮＡのアンタゴミルである。少なくとも１００のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照スポンジベクター又はｍｉＲ−１３５ａｂスポンジベクターでトランスフェクション後のＤＩＶ４での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｆ）ニューロンを過剰発現する、３１の対照−１（暗灰色）、１５のｍｉＲ−１３５ａ（薄灰色）、１６のｍｉＲ−１３５ｂ（黒色）、又は２３のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ（黒色輪郭の薄灰色）からのＳｈｏｌｌ分析は、近位の神経突起及びその遠位の軸索における分岐の増加を明らかにする。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、多重Ｔ−検定。輪郭において、近位の神経突起は主な細胞体が起源であり、遠位の分岐は長いニューロンが起源であり、両方とも灰色で網掛けする。（Ｇ）ｓｈｏｌｌサークル（Ｄなどで）による、対照−１又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでトランスフェクトされたニューロンからの神経突起の累積交差。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。
【図３Ｆ】ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは神経突起伸長及び分岐を増加させる。（Ａ）グラフは、インビトロで異なる日（ＤＩＶ）での初代海馬ニューロンおける定量的ＰＣＲの結果を示す。ＲＮＡを２つの異なる培養物の３〜４枚のカバースリップから収集した。試料は二反復で行った。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ及びｍｉＲ−１３５ａ／ｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後のインビトロで４日目（ＤＩＶ）での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｃ）グラフは、Ａなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１７３のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｄ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターでのトランスフェクション後のＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の定量化。スポンジは、「ｓｐ」と標識を付けられ、それらの指示されたｍｉＲＮＡのアンタゴミルである。少なくとも１００のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照スポンジベクター又はｍｉＲ−１３５ａｂスポンジベクターでトランスフェクション後のＤＩＶ４での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｆ）ニューロンを過剰発現する、３１の対照−１（暗灰色）、１５のｍｉＲ−１３５ａ（薄灰色）、１６のｍｉＲ−１３５ｂ（黒色）、又は２３のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ（黒色輪郭の薄灰色）からのＳｈｏｌｌ分析は、近位の神経突起及びその遠位の軸索における分岐の増加を明らかにする。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、多重Ｔ−検定。輪郭において、近位の神経突起は主な細胞体が起源であり、遠位の分岐は長いニューロンが起源であり、両方とも灰色で網掛けする。（Ｇ）ｓｈｏｌｌサークル（Ｄなどで）による、対照−１又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでトランスフェクトされたニューロンからの神経突起の累積交差。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。
【図３Ｇ】ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは神経突起伸長及び分岐を増加させる。（Ａ）グラフは、インビトロで異なる日（ＤＩＶ）での初代海馬ニューロンおける定量的ＰＣＲの結果を示す。ＲＮＡを２つの異なる培養物の３〜４枚のカバースリップから収集した。試料は二反復で行った。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ及びｍｉＲ−１３５ａ／ｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後のインビトロで４日目（ＤＩＶ）での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｃ）グラフは、Ａなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１７３のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｄ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターでのトランスフェクション後のＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の定量化。スポンジは、「ｓｐ」と標識を付けられ、それらの指示されたｍｉＲＮＡのアンタゴミルである。少なくとも１００のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照スポンジベクター又はｍｉＲ−１３５ａｂスポンジベクターでトランスフェクション後のＤＩＶ４での初代ニューロンの代表的な輪郭。最も長い神経突起を、灰色で網掛けする。（Ｆ）ニューロンを過剰発現する、３１の対照−１（暗灰色）、１５のｍｉＲ−１３５ａ（薄灰色）、１６のｍｉＲ−１３５ｂ（黒色）、又は２３のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ（黒色輪郭の薄灰色）からのＳｈｏｌｌ分析は、近位の神経突起及びその遠位の軸索における分岐の増加を明らかにする。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、多重Ｔ−検定。輪郭において、近位の神経突起は主な細胞体が起源であり、遠位の分岐は長いニューロンが起源であり、両方とも灰色で網掛けする。（Ｇ）ｓｈｏｌｌサークル（Ｄなどで）による、対照−１又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでトランスフェクトされたニューロンからの神経突起の累積交差。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。
【図４Ａ】ｍｉＲ−１３５は皮質ニューロンの移動のために必要である。（Ａ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ又はｍｉＲ−１３５ａのミミックでエクスビボでエレクトロポレーションされた皮質の代表的な画像。ニューロンの移動は、皮質において垂直の８つの正方形の瓶を含有する長方形を配置することによって、定量化した。それぞれの瓶における細胞をカウントし、長方形内の細胞の総数のパーセンテージとして表した。瓶は、皮質の層と完全に整列する：脳室帯（ｖｚ）、脳室下帯（ｓｖｚ）、中間帯（ｉｚ）、皮質板（ｃｐ）及び周辺帯（ｍｚ）。切片あたり２つ〜３つの長方形の細胞カウントを比較のために使用した。異なる同腹仔由来の≧３頭の動物からの少なくとも２〜３の切片を使用した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。赤色＊＊  瓶７の対照−１対ｍｉＲ−１３５ａ：ＭＷＵ＝２４、ｐ＝０．００４２；青色＊  瓶４の対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ＭＷＵ＝３２、ｐ＝０．０１９５；青色＊＊  瓶７の対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ＭＷＵ＝２５、ｐ＝０．００５１、マンホイットニーＵ検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｂ）対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ｆ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶３：ＭＷＵ＝１９８、ｐ＜０．０００１；瓶６  ＭＷＵ＝２８２、ｐ＜０．００５３；瓶７：ＭＷＵ＝１６１、ｐ＜０．０００１；瓶８：ＭＷＵ＝１６４、ｐ＜０．０００１。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  Ｔ−検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｃ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ｍＣｈｅｒｒｙシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶２：ＭＷＵ＝７０、ｐ＝０．０１８；瓶５：ＭＷＵ＝６９、ｐ＝０．０１６；瓶６：ＭＷＵ＝７５、ｐ＝０．０３０；瓶８：ＭＷＵ＝６９、ｐ＝０．０１６１、マンホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  Ｔ−検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｄ）Ｅ１４．５で、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかでエレクトロポレーションされた、マウス仔の子宮内エレクトロポレーションされたＰ４の皮質における、ニューロンの移動の代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶３：ＭＷＵ＝４７５、ｐ＝０．０１１４；瓶４：ＭＷＵ＝３９２．５、ｐ＝０．００１６；瓶５：ＭＷＵ＝１４８、ｐ＜０．０００１；瓶６：ＭＷＵ＝３１９．���、ｐ＝０．０００４；瓶７：ＭＷＵ＝１９４．５、ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー：２００μｍ。（Ｅ）Ｅ１４．５で、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかでエレクトロポレーションされた、マウス仔の子宮内エレクトロポレーションされたＰ１０の皮質における、ニューロンの移動の代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶６：ＭＷＵ＝７８３．５、ｐ＝０．０３２、マンホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５。スケールバー：２００μｍ。
【図４Ｂ】ｍｉＲ−１３５は皮質ニューロンの移動のために必要である。（Ａ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ又はｍｉＲ−１３５ａのミミックでエクスビボでエレクトロポレーションされた皮質の代表的な画像。ニューロンの移動は、皮質において垂直の８つの正方形の瓶を含有する長方形を配置することによって、定量化した。それぞれの瓶における細胞をカウントし、長方形内の細胞の総数のパーセンテージとして表した。瓶は、皮質の層と完全に整列する：脳室帯（ｖｚ）、脳室下帯（ｓｖｚ）、中間帯（ｉｚ）、皮質板（ｃｐ）及び周辺帯（ｍｚ）。切片あたり２つ〜３つの長方形の細胞カウントを比較のために使用した。異なる同腹仔由来の≧３頭の動物からの少なくとも２〜３の切片を使用した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。赤色＊＊  瓶７の対照−１対ｍｉＲ−１３５ａ：ＭＷＵ＝２４、ｐ＝０．００４２；青色＊  瓶４の対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ＭＷＵ＝３２、ｐ＝０．０１９５；青色＊＊  瓶７の対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ＭＷＵ＝２５、ｐ＝０．００５１、マンホイットニーＵ検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｂ）対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ｆ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶３：ＭＷＵ＝１９８、ｐ＜０．０００１；瓶６  ＭＷＵ＝２８２、ｐ＜０．００５３；瓶７：ＭＷＵ＝１６１、ｐ＜０．０００１；瓶８：ＭＷＵ＝１６４、ｐ＜０．０００１。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  Ｔ−検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｃ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ｍＣｈｅｒｒｙシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶２：ＭＷＵ＝７０、ｐ＝０．０１８；瓶５：ＭＷＵ＝６９、ｐ＝０．０１６；瓶６：ＭＷＵ＝７５、ｐ＝０．０３０；瓶８：ＭＷＵ＝６９、ｐ＝０．０１６１、マンホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  Ｔ−検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｄ）Ｅ１４．５で、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかでエレクトロポレーションされた、マウス仔の子宮内エレクトロポレーションされたＰ４の皮質における、ニューロンの移動の代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶３：ＭＷＵ＝４７５、ｐ＝０．０１１４；瓶４：ＭＷＵ＝３９２．５、ｐ＝０．００１６；瓶５：ＭＷＵ＝１４８、ｐ＜０．０００１；瓶６：ＭＷＵ＝３１９．���、ｐ＝０．０００４；瓶７：ＭＷＵ＝１９４．５、ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー：２００μｍ。（Ｅ）Ｅ１４．５で、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかでエレクトロポレーションされた、マウス仔の子宮内エレクトロポレーションされたＰ１０の皮質における、ニューロンの移動の代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶６：ＭＷＵ＝７８３．５、ｐ＝０．０３２、マンホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５。スケールバー：２００μｍ。
【図４Ｃ】ｍｉＲ−１３５は皮質ニューロンの移動のために必要である。（Ａ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ又はｍｉＲ−１３５ａのミミックでエクスビボでエレクトロポレーションされた皮質の代表的な画像。ニューロンの移動は、皮質において垂直の８つの正方形の瓶を含有する長方形を配置することによって、定量化した。それぞれの瓶における細胞をカウントし、長方形内の細胞の総数のパーセンテージとして表した。瓶は、皮質の層と完全に整列する：脳室帯（ｖｚ）、脳室下帯（ｓｖｚ）、中間帯（ｉｚ）、皮質板（ｃｐ）及び周辺帯（ｍｚ）。切片あたり２つ〜３つの長方形の細胞カウントを比較のために使用した。異なる同腹仔由来の≧３頭の動物からの少なくとも２〜３の切片を使用した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。赤色＊＊  瓶７の対照−１対ｍｉＲ−１３５ａ：ＭＷＵ＝２４、ｐ＝０．００４２；青色＊  瓶４の対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ＭＷＵ＝３２、ｐ＝０．０１９５；青色＊＊  瓶７の対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ＭＷＵ＝２５、ｐ＝０．００５１、マンホイットニーＵ検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｂ）対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ｆ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶３：ＭＷＵ＝１９８、ｐ＜０．０００１；瓶６  ＭＷＵ＝２８２、ｐ＜０．００５３；瓶７：ＭＷＵ＝１６１、ｐ＜０．０００１；瓶８：ＭＷＵ＝１６４、ｐ＜０．０００１。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  Ｔ−検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｃ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ｍＣｈｅｒｒｙシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶２：ＭＷＵ＝７０、ｐ＝０．０１８；瓶５：ＭＷＵ＝６９、ｐ＝０．０１６；瓶６：ＭＷＵ＝７５、ｐ＝０．０３０；瓶８：ＭＷＵ＝６９、ｐ＝０．０１６１、マンホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  Ｔ−検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｄ）Ｅ１４．５で、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかでエレクトロポレーションされた、マウス仔の子宮内エレクトロポレーションされたＰ４の皮質における、ニューロンの移動の代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶３：ＭＷＵ＝４７５、ｐ＝０．０１１４；瓶４：ＭＷＵ＝３９２．５、ｐ＝０．００１６；瓶５：ＭＷＵ＝１４８、ｐ＜０．０００１；瓶６：ＭＷＵ＝３１９．���、ｐ＝０．０００４；瓶７：ＭＷＵ＝１９４．５、ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー：２００μｍ。（Ｅ）Ｅ１４．５で、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかでエレクトロポレーションされた、マウス仔の子宮内エレクトロポレーションされたＰ１０の皮質における、ニューロンの移動の代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶６：ＭＷＵ＝７８３．５、ｐ＝０．０３２、マンホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５。スケールバー：２００μｍ。
【図４Ｄ】ｍｉＲ−１３５は皮質ニューロンの移動のために必要である。（Ａ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ又はｍｉＲ−１３５ａのミミックでエクスビボでエレクトロポレーションされた皮質の代表的な画像。ニューロンの移動は、皮質において垂直の８つの正方形の瓶を含有する長方形を配置することによって、定量化した。それぞれの瓶における細胞をカウントし、長方形内の細胞の総数のパーセンテージとして表した。瓶は、皮質の層と完全に整列する：脳室帯（ｖｚ）、脳室下帯（ｓｖｚ）、中間帯（ｉｚ）、皮質板（ｃｐ）及び周辺帯（ｍｚ）。切片あたり２つ〜３つの長方形の細胞カウントを比較のために使用した。異なる同腹仔由来の≧３頭の動物からの少なくとも２〜３の切片を使用した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。赤色＊＊  瓶７の対照−１対ｍｉＲ−１３５ａ：ＭＷＵ＝２４、ｐ＝０．００４２；青色＊  瓶４の対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ＭＷＵ＝３２、ｐ＝０．０１９５；青色＊＊  瓶７の対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ＭＷＵ＝２５、ｐ＝０．００５１、マンホイットニーＵ検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｂ）対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ｆ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶３：ＭＷＵ＝１９８、ｐ＜０．０００１；瓶６  ＭＷＵ＝２８２、ｐ＜０．００５３；瓶７：ＭＷＵ＝１６１、ｐ＜０．０００１；瓶８：ＭＷＵ＝１６４、ｐ＜０．０００１。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  Ｔ−検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｃ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ｍＣｈｅｒｒｙシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶２：ＭＷＵ＝７０、ｐ＝０．０１８；瓶５：ＭＷＵ＝６９、ｐ＝０．０１６；瓶６：ＭＷＵ＝７５、ｐ＝０．０３０；瓶８：ＭＷＵ＝６９、ｐ＝０．０１６１、マンホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  Ｔ−検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｄ）Ｅ１４．５で、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかでエレクトロポレーションされた、マウス仔の子宮内エレクトロポレーションされたＰ４の皮質における、ニューロンの移動の代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶３：ＭＷＵ＝４７５、ｐ＝０．０１１４；瓶４：ＭＷＵ＝３９２．５、ｐ＝０．００１６；瓶５：ＭＷＵ＝１４８、ｐ＜０．０００１；瓶６：ＭＷＵ＝３１９．���、ｐ＝０．０００４；瓶７：ＭＷＵ＝１９４．５、ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー：２００μｍ。（Ｅ）Ｅ１４．５で、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかでエレクトロポレーションされた、マウス仔の子宮内エレクトロポレーションされたＰ１０の皮質における、ニューロンの移動の代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶６：ＭＷＵ＝７８３．５、ｐ＝０．０３２、マンホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５。スケールバー：２００μｍ。
【図４Ｅ】ｍｉＲ−１３５は皮質ニューロンの移動のために必要である。（Ａ）対照−１、ｍｉＲ−１３５ａ又はｍｉＲ−１３５ａのミミックでエクスビボでエレクトロポレーションされた皮質の代表的な画像。ニューロンの移動は、皮質において垂直の８つの正方形の瓶を含有する長方形を配置することによって、定量化した。それぞれの瓶における細胞をカウントし、長方形内の細胞の総数のパーセンテージとして表した。瓶は、皮質の層と完全に整列する：脳室帯（ｖｚ）、脳室下帯（ｓｖｚ）、中間帯（ｉｚ）、皮質板（ｃｐ）及び周辺帯（ｍｚ）。切片あたり２つ〜３つの長方形の細胞カウントを比較のために使用した。異なる同腹仔由来の≧３頭の動物からの少なくとも２〜３の切片を使用した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。赤色＊＊  瓶７の対照−１対ｍｉＲ−１３５ａ：ＭＷＵ＝２４、ｐ＝０．００４２；青色＊  瓶４の対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ＭＷＵ＝３２、ｐ＝０．０１９５；青色＊＊  瓶７の対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ＭＷＵ＝２５、ｐ＝０．００５１、マンホイットニーＵ検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｂ）対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ｆ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶３：ＭＷＵ＝１９８、ｐ＜０．０００１；瓶６  ＭＷＵ＝２８２、ｐ＜０．００５３；瓶７：ＭＷＵ＝１６１、ｐ＜０．０００１；瓶８：ＭＷＵ＝１６４、ｐ＜０．０００１。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  Ｔ−検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｃ）スクランブル化されたか、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクターのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ｍＣｈｅｒｒｙシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶２：ＭＷＵ＝７０、ｐ＝０．０１８；瓶５：ＭＷＵ＝６９、ｐ＝０．０１６；瓶６：ＭＷＵ＝７５、ｐ＝０．０３０；瓶８：ＭＷＵ＝６９、ｐ＝０．０１６１、マンホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  Ｔ−検定。スケールバー：１００μｍ。（Ｄ）Ｅ１４．５で、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかでエレクトロポレーションされた、マウス仔の子宮内エレクトロポレーションされたＰ４の皮質における、ニューロンの移動の代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶３：ＭＷＵ＝４７５、ｐ＝０．０１１４；瓶４：ＭＷＵ＝３９２．５、ｐ＝０．００１６；瓶５：ＭＷＵ＝１４８、ｐ＜０．０００１；瓶６：ＭＷＵ＝３１９．���、ｐ＝０．０００４；瓶７：ＭＷＵ＝１９４．５、ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー：２００μｍ。（Ｅ）Ｅ１４．５で、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかでエレクトロポレーションされた、マウス仔の子宮内エレクトロポレーションされたＰ１０の皮質における、ニューロンの移動の代表的な画像及び定量化。ＧＦＰシグナル（白色）。ニューロンの移動を（Ａ）に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶６：ＭＷＵ＝７８３．５、ｐ＝０．０３２、マンホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５。スケールバー：２００μｍ。
【図５Ａ】クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）は、軸索の発達及びニューロンの移動の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂについての機能的標的である。（Ａ）ＫＬＦ４  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにおいて予測されるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの結合部位の略図。部位３９４は、最も強い結合を媒介すると予測される（矢印によってマークする）。（Ｂ）ＫＦＬ４の３’−ＵＴＲを、ｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ２ベクターにクローニングし、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックによるウミシイタケルシフェラーゼアッセイのために使用した。その後、部位３９４内の３つのヌクレオチドが変異したＫＬＦ４  ３’−ＵＴＲを有するｐｓｉ−ＣＨＥＣＫベクターを使用して、ｍｉＲＮＡ−１３５−ＫＬＦ４結合の特異性を確認した。ルシフェラーゼ活性を、野生型又は変異した３’−ＵＴＲ（ＵＴＲ）のいずれかの３’−ＵＴＲのみの条件に対して正規化した。実験を３回繰り返した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、Ｔ−検定。（Ｃ）Ｅ１６．５及び成体のマウス皮質及び海馬の切片におけるＫＬＦ４の免疫組織化学的検査。ＫＬＦ４は、皮質板（ｃｐ）において、中間帯（ｉｚ）を通り抜ける軸索において、及び歯状回（ＤＧ）における海馬の顆粒細胞において、並びにＣＡ３の錐体細胞において、高度に発現する。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞における、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのトランスフェクション後のＫＬＦ４タンパク質レベルのウエスタンブロット分析。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照−１ミミック、ｍｉＲＮＡ結合に対して無反応のＫＬＦ４  ｃＤＮＡと組み合わせた対照−１のミミック（ＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰ）、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、並びにＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後、インビトロで４日目（ＤＩＶ  ４）での初代海馬ニューロンの代表的な輪郭。（Ｆ）グラフは、Ｅなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１８２のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｇ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、ｍｉＲ−１３５制御に対して無反応のｐＣＡＧ−ＫＬＦ４ベクターと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ニューロンの移動を図４に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶１：ＭＷＵ＝４２２、ｐ＝０．０１７１；瓶２：ＭＷＵ＝３３２、ｐ＝０．０００５；瓶３：ＭＷＵ＝２９３、ｐ＜０．０００１；瓶４：ＭＷＵ＝３９５、ｐ＝０．００６８；瓶５：ＭＷＵ＝３５７、ｐ＝０．００１６；瓶６：ＭＷＵ＝２６１、ｐ＜０．０００１；瓶７：ＭＷＵ＝２１９、ｐ＜０．０００１、及び瓶８：ＭＷＵ＝２１１．５、ｐ＜０．０００１。マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。対照−１の条件は、図４Ｂに記載される通りである。スケールバー：１００μｍ。
【図５Ｂ】クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）は、軸索の発達及びニューロンの移動の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂについての機能的標的である。（Ａ）ＫＬＦ４  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにおいて予測されるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの結合部位の略図。部位３９４は、最も強い結合を媒介すると予測される（矢印によってマークする）。（Ｂ）ＫＦＬ４の３’−ＵＴＲを、ｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ２ベクターにクローニングし、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックによるウミシイタケルシフェラーゼアッセイのために使用した。その後、部位３９４内の３つのヌクレオチドが変異したＫＬＦ４  ３’−ＵＴＲを有するｐｓｉ−ＣＨＥＣＫベクターを使用して、ｍｉＲＮＡ−１３５−ＫＬＦ４結合の特異性を確認した。ルシフェラーゼ活性を、野生型又は変異した３’−ＵＴＲ（ＵＴＲ）のいずれかの３’−ＵＴＲのみの条件に対して正規化した。実験を３回繰り返した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、Ｔ−検定。（Ｃ）Ｅ１６．５及び成体のマウス皮質及び海馬の切片におけるＫＬＦ４の免疫組織化学的検査。ＫＬＦ４は、皮質板（ｃｐ）において、中間帯（ｉｚ）を通り抜ける軸索において、及び歯状回（ＤＧ）における海馬の顆粒細胞において、並びにＣＡ３の錐体細胞において、高度に発現する。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞における、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのトランスフェクション後のＫＬＦ４タンパク質レベルのウエスタンブロット分析。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照−１ミミック、ｍｉＲＮＡ結合に対して無反応のＫＬＦ４  ｃＤＮＡと組み合わせた対照−１のミミック（ＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰ）、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、並びにＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後、インビトロで４日目（ＤＩＶ  ４）での初代海馬ニューロンの代表的な輪郭。（Ｆ）グラフは、Ｅなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１８２のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｇ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、ｍｉＲ−１３５制御に対して無反応のｐＣＡＧ−ＫＬＦ４ベクターと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ニューロンの移動を図４に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶１：ＭＷＵ＝４２２、ｐ＝０．０１７１；瓶２：ＭＷＵ＝３３２、ｐ＝０．０００５；瓶３：ＭＷＵ＝２９３、ｐ＜０．０００１；瓶４：ＭＷＵ＝３９５、ｐ＝０．００６８；瓶５：ＭＷＵ＝３５７、ｐ＝０．００１６；瓶６：ＭＷＵ＝２６１、ｐ＜０．０００１；瓶７：ＭＷＵ＝２１９、ｐ＜０．０００１、及び瓶８：ＭＷＵ＝２１１．５、ｐ＜０．０００１。マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。対照−１の条件は、図４Ｂに記載される通りである。スケールバー：１００μｍ。
【図５Ｃ】クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）は、軸索の発達及びニューロンの移動の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂについての機能的標的である。（Ａ）ＫＬＦ４  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにおいて予測されるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの結合部位の略図。部位３９４は、最も強い結合を媒介すると予測される（矢印によってマークする）。（Ｂ）ＫＦＬ４の３’−ＵＴＲを、ｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ２ベクターにクローニングし、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックによるウミシイタケルシフェラーゼアッセイのために使用した。その後、部位３９４内の３つのヌクレオチドが変異したＫＬＦ４  ３’−ＵＴＲを有するｐｓｉ−ＣＨＥＣＫベクターを使用して、ｍｉＲＮＡ−１３５−ＫＬＦ４結合の特異性を確認した。ルシフェラーゼ活性を、野生型又は変異した３’−ＵＴＲ（ＵＴＲ）のいずれかの３’−ＵＴＲのみの条件に対して正規化した。実験を３回繰り返した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、Ｔ−検定。（Ｃ）Ｅ１６．５及び成体のマウス皮質及び海馬の切片におけるＫＬＦ４の免疫組織化学的検査。ＫＬＦ４は、皮質板（ｃｐ）において、中間帯（ｉｚ）を通り抜ける軸索において、及び歯状回（ＤＧ）における海馬の顆粒細胞において、並びにＣＡ３の錐体細胞において、高度に発現する。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞における、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのトランスフェクション後のＫＬＦ４タンパク質レベルのウエスタンブロット分析。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照−１ミミック、ｍｉＲＮＡ結合に対して無反応のＫＬＦ４  ｃＤＮＡと組み合わせた対照−１のミミック（ＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰ）、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、並びにＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後、インビトロで４日目（ＤＩＶ  ４）での初代海馬ニューロンの代表的な輪郭。（Ｆ）グラフは、Ｅなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１８２のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｇ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、ｍｉＲ−１３５制御に対して無反応のｐＣＡＧ−ＫＬＦ４ベクターと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ニューロンの移動を図４に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶１：ＭＷＵ＝４２２、ｐ＝０．０１７１；瓶２：ＭＷＵ＝３３２、ｐ＝０．０００５；瓶３：ＭＷＵ＝２９３、ｐ＜０．０００１；瓶４：ＭＷＵ＝３９５、ｐ＝０．００６８；瓶５：ＭＷＵ＝３５７、ｐ＝０．００１６；瓶６：ＭＷＵ＝２６１、ｐ＜０．０００１；瓶７：ＭＷＵ＝２１９、ｐ＜０．０００１、及び瓶８：ＭＷＵ＝２１１．５、ｐ＜０．０００１。マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。対照−１の条件は、図４Ｂに記載される通りである。スケールバー：１００μｍ。
【図５Ｄ】クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）は、軸索の発達及びニューロンの移動の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂについての機能的標的である。（Ａ）ＫＬＦ４  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにおいて予測されるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの結合部位の略図。部位３９４は、最も強い結合を媒介すると予測される（矢印によってマークする）。（Ｂ）ＫＦＬ４の３’−ＵＴＲを、ｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ２ベクターにクローニングし、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックによるウミシイタケルシフェラーゼアッセイのために使用した。その後、部位３９４内の３つのヌクレオチドが変異したＫＬＦ４  ３’−ＵＴＲを有するｐｓｉ−ＣＨＥＣＫベクターを使用して、ｍｉＲＮＡ−１３５−ＫＬＦ４結合の特異性を確認した。ルシフェラーゼ活性を、野生型又は変異した３’−ＵＴＲ（ＵＴＲ）のいずれかの３’−ＵＴＲのみの条件に対して正規化した。実験を３回繰り返した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、Ｔ−検定。（Ｃ）Ｅ１６．５及び成体のマウス皮質及び海馬の切片におけるＫＬＦ４の免疫組織化学的検査。ＫＬＦ４は、皮質板（ｃｐ）において、中間帯（ｉｚ）を通り抜ける軸索において、及び歯状回（ＤＧ）における海馬の顆粒細胞において、並びにＣＡ３の錐体細胞において、高度に発現する。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞における、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのトランスフェクション後のＫＬＦ４タンパク質レベルのウエスタンブロット分析。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照−１ミミック、ｍｉＲＮＡ結合に対して無反応のＫＬＦ４  ｃＤＮＡと組み合わせた対照−１のミミック（ＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰ）、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、並びにＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後、インビトロで４日目（ＤＩＶ  ４）での初代海馬ニューロンの代表的な輪郭。（Ｆ）グラフは、Ｅなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１８２のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｇ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、ｍｉＲ−１３５制御に対して無反応のｐＣＡＧ−ＫＬＦ４ベクターと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ニューロンの移動を図４に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶１：ＭＷＵ＝４２２、ｐ＝０．０１７１；瓶２：ＭＷＵ＝３３２、ｐ＝０．０００５；瓶３：ＭＷＵ＝２９３、ｐ＜０．０００１；瓶４：ＭＷＵ＝３９５、ｐ＝０．００６８；瓶５：ＭＷＵ＝３５７、ｐ＝０．００１６；瓶６：ＭＷＵ＝２６１、ｐ＜０．０００１；瓶７：ＭＷＵ＝２１９、ｐ＜０．０００１、及び瓶８：ＭＷＵ＝２１１．５、ｐ＜０．０００１。マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。対照−１の条件は、図４Ｂに記載される通りである。スケールバー：１００μｍ。
【図５Ｅ】クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）は、軸索の発達及びニューロンの移動の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂについての機能的標的である。（Ａ）ＫＬＦ４  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにおいて予測されるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの結合部位の略図。部位３９４は、最も強い結合を媒介すると予測される（矢印によってマークする）。（Ｂ）ＫＦＬ４の３’−ＵＴＲを、ｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ２ベクターにクローニングし、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックによるウミシイタケルシフェラーゼアッセイのために使用した。その後、部位３９４内の３つのヌクレオチドが変異したＫＬＦ４  ３’−ＵＴＲを有するｐｓｉ−ＣＨＥＣＫベクターを使用して、ｍｉＲＮＡ−１３５−ＫＬＦ４結合の特異性を確認した。ルシフェラーゼ活性を、野生型又は変異した３’−ＵＴＲ（ＵＴＲ）のいずれかの３’−ＵＴＲのみの条件に対して正規化した。実験を３回繰り返した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、Ｔ−検定。（Ｃ）Ｅ１６．５及び成体のマウス皮質及び海馬の切片におけるＫＬＦ４の免疫組織化学的検査。ＫＬＦ４は、皮質板（ｃｐ）において、中間帯（ｉｚ）を通り抜ける軸索において、及び歯状回（ＤＧ）における海馬の顆粒細胞において、並びにＣＡ３の錐体細胞において、高度に発現する。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞における、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのトランスフェクション後のＫＬＦ４タンパク質レベルのウエスタンブロット分析。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照−１ミミック、ｍｉＲＮＡ結合に対して無反応のＫＬＦ４  ｃＤＮＡと組み合わせた対照−１のミミック（ＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰ）、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、並びにＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後、インビトロで４日目（ＤＩＶ  ４）での初代海馬ニューロンの代表的な輪郭。（Ｆ）グラフは、Ｅなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１８２のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｇ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、ｍｉＲ−１３５制御に対して無反応のｐＣＡＧ−ＫＬＦ４ベクターと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ニューロンの移動を図４に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶１：ＭＷＵ＝４２２、ｐ＝０．０１７１；瓶２：ＭＷＵ＝３３２、ｐ＝０．０００５；瓶３：ＭＷＵ＝２９３、ｐ＜０．０００１；瓶４：ＭＷＵ＝３９５、ｐ＝０．００６８；瓶５：ＭＷＵ＝３５７、ｐ＝０．００１６；瓶６：ＭＷＵ＝２６１、ｐ＜０．０００１；瓶７：ＭＷＵ＝２１９、ｐ＜０．０００１、及び瓶８：ＭＷＵ＝２１１．５、ｐ＜０．０００１。マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。対照−１の条件は、図４Ｂに記載される通りである。スケールバー：１００μｍ。
【図５Ｆ】クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）は、軸索の発達及びニューロンの移動の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂについての機能的標的である。（Ａ）ＫＬＦ４  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにおいて予測されるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの結合部位の略図。部位３９４は、最も強い結合を媒介すると予測される（矢印によってマークする）。（Ｂ）ＫＦＬ４の３’−ＵＴＲを、ｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ２ベクターにクローニングし、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックによるウミシイタケルシフェラーゼアッセイのために使用した。その後、部位３９４内の３つのヌクレオチドが変異したＫＬＦ４  ３’−ＵＴＲを有するｐｓｉ−ＣＨＥＣＫベクターを使用して、ｍｉＲＮＡ−１３５−ＫＬＦ４結合の特異性を確認した。ルシフェラーゼ活性を、野生型又は変異した３’−ＵＴＲ（ＵＴＲ）のいずれかの３’−ＵＴＲのみの条件に対して正規化した。実験を３回繰り返した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、Ｔ−検定。（Ｃ）Ｅ１６．５及び成体のマウス皮質及び海馬の切片におけるＫＬＦ４の免疫組織化学的検査。ＫＬＦ４は、皮質板（ｃｐ）において、中間帯（ｉｚ）を通り抜ける軸索において、及び歯状回（ＤＧ）における海馬の顆粒細胞において、並びにＣＡ３の錐体細胞において、高度に発現する。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞における、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのトランスフェクション後のＫＬＦ４タンパク質レベルのウエスタンブロット分析。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照−１ミミック、ｍｉＲＮＡ結合に対して無反応のＫＬＦ４  ｃＤＮＡと組み合わせた対照−１のミミック（ＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰ）、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、並びにＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後、インビトロで４日目（ＤＩＶ  ４）での初代海馬ニューロンの代表的な輪郭。（Ｆ）グラフは、Ｅなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１８２のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｇ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、ｍｉＲ−１３５制御に対して無反応のｐＣＡＧ−ＫＬＦ４ベクターと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ニューロンの移動を図４に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶１：ＭＷＵ＝４２２、ｐ＝０．０１７１；瓶２：ＭＷＵ＝３３２、ｐ＝０．０００５；瓶３：ＭＷＵ＝２９３、ｐ＜０．０００１；瓶４：ＭＷＵ＝３９５、ｐ＝０．００６８；瓶５：ＭＷＵ＝３５７、ｐ＝０．００１６；瓶６：ＭＷＵ＝２６１、ｐ＜０．０００１；瓶７：ＭＷＵ＝２１９、ｐ＜０．０００１、及び瓶８：ＭＷＵ＝２１１．５、ｐ＜０．０００１。マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。対照−１の条件は、図４Ｂに記載される通りである。スケールバー：１００μｍ。
【図５Ｇ】クルッペル様因子４（ＫＬＦ４）は、軸索の発達及びニューロンの移動の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂについての機能的標的である。（Ａ）ＫＬＦ４  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにおいて予測されるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの結合部位の略図。部位３９４は、最も強い結合を媒介すると予測される（矢印によってマークする）。（Ｂ）ＫＦＬ４の３’−ＵＴＲを、ｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ２ベクターにクローニングし、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックによるウミシイタケルシフェラーゼアッセイのために使用した。その後、部位３９４内の３つのヌクレオチドが変異したＫＬＦ４  ３’−ＵＴＲを有するｐｓｉ−ＣＨＥＣＫベクターを使用して、ｍｉＲＮＡ−１３５−ＫＬＦ４結合の特異性を確認した。ルシフェラーゼ活性を、野生型又は変異した３’−ＵＴＲ（ＵＴＲ）のいずれかの３’−ＵＴＲのみの条件に対して正規化した。実験を３回繰り返した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、Ｔ−検定。（Ｃ）Ｅ１６．５及び成体のマウス皮質及び海馬の切片におけるＫＬＦ４の免疫組織化学的検査。ＫＬＦ４は、皮質板（ｃｐ）において、中間帯（ｉｚ）を通り抜ける軸索において、及び歯状回（ＤＧ）における海馬の顆粒細胞において、並びにＣＡ３の錐体細胞において、高度に発現する。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞における、対照−１、又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのトランスフェクション後のＫＬＦ４タンパク質レベルのウエスタンブロット分析。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、Ｔ−検定。（Ｅ）対照−１ミミック、ｍｉＲＮＡ結合に対して無反応のＫＬＦ４  ｃＤＮＡと組み合わせた対照−１のミミック（ＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰ）、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、並びにＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＧＦＰと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックでのトランスフェクション後、インビトロで４日目（ＤＩＶ  ４）での初代海馬ニューロンの代表的な輪郭。（Ｆ）グラフは、Ｅなどでの実験におけるＤＩＶ４の海馬ニューロンの最も長い神経突起の追跡の結果を示す。少なくとも１８２のニューロンを≧３の個々の実験から追跡した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｔ−検定。（Ｇ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミック、ｍｉＲ−１３５制御に対して無反応のｐＣＡＧ−ＫＬＦ４ベクターと組み合わせたｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのミミックのいずれかで処理された、マウス胚の子宮内エレクトロポレーションされたＥ１６．５の皮質における、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さの代表的な画像及び定量化。ニューロンの移動を図４に記載されるようにして定量化した。データは、平均±ＳＥＭとして表される。瓶１：ＭＷＵ＝４２２、ｐ＝０．０１７１；瓶２：ＭＷＵ＝３３２、ｐ＝０．０００５；瓶３：ＭＷＵ＝２９３、ｐ＜０．０００１；瓶４：ＭＷＵ＝３９５、ｐ＝０．００６８；瓶５：ＭＷＵ＝３５７、ｐ＝０．００１６；瓶６：ＭＷＵ＝２６１、ｐ＜０．０００１；瓶７：ＭＷＵ＝２１９、ｐ＜０．０００１、及び瓶８：ＭＷＵ＝２１１．５、ｐ＜０．０００１。マンホイットニーＵ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。対照−１の条件は、図４Ｂに記載される通りである。スケールバー：１００μｍ。
【図６Ａ】外因性ｍｉＲ−１３５は、視神経損傷後の軸索の再生を増強する。（Ａ）視神経の挫滅研究の実験設定。（Ｂ、Ｃ）グラフは、ミミックの注射後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのレベルは、ｍｉＲＮＡミミックの２回の注射後に増加するが、ＫＬＦ４のレベルは減少する（Ｃ）。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、デルタＣｔ値におけるＴ−検定。（Ｄ）視神経の挫滅の１４日後にアレクサ（Ａｌｅｘａ）−５５５とコンジュゲートされたコレラ毒素Ｂについて染色された視神経の代表的な画像。ｍｉＲ−１３５のミミックの注射後、軸索は、損傷部位に、及びそれを超えて成長する（点線は、損傷の近位及び遠位の境界部位を示す）。ボックスは右側に示されるより高倍率の画像を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｅ）グラフは、（Ｄ）において示される条件について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝９マウス。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（Ｆ）グラフは、ｍｉＲ−１３５のミミック、及びＧＦＰ又はＫＬＦ４ベクターの共トランスフェクション後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ＧＦＰ又はＫＬＦ４でトランスフェクトされた群の間で、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現において差はない。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｇ）ＡＡＶ２−ＧＦＰウイルスを硝子体内に注射した。注射の１週間後、強いＧＦＰシグナルがＲＧＣにおいて検出されるが、網膜における他の細胞型では検出されない。スケールバー１００μｍ。（Ｈ）グラフは、（ＧＦＰに加えて）対照ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを発現するＡＡＶ２の硝子体内注射（病変の７日後）を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（I）グラフは、対照又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのスポンジベクターの硝子体内注射を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、相対的な軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊ｐ＜０．０１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図６Ｂ】外因性ｍｉＲ−１３５は、視神経損傷後の軸索の再生を増強する。（Ａ）視神経の挫滅研究の実験設定。（Ｂ、Ｃ）グラフは、ミミックの注射後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのレベルは、ｍｉＲＮＡミミックの２回の注射後に増加するが、ＫＬＦ４のレベルは減少する（Ｃ）。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、デルタＣｔ値におけるＴ−検定。（Ｄ）視神経の挫滅の１４日後にアレクサ（Ａｌｅｘａ）−５５５とコンジュゲートされたコレラ毒素Ｂについて染色された視神経の代表的な画像。ｍｉＲ−１３５のミミックの注射後、軸索は、損傷部位に、及びそれを超えて成長する（点線は、損傷の近位及び遠位の境界部位を示す）。ボックスは右側に示されるより高倍率の画像を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｅ）グラフは、（Ｄ）において示される条件について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝９マウス。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（Ｆ）グラフは、ｍｉＲ−１３５のミミック、及びＧＦＰ又はＫＬＦ４ベクターの共トランスフェクション後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ＧＦＰ又はＫＬＦ４でトランスフェクトされた群の間で、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現において差はない。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｇ）ＡＡＶ２−ＧＦＰウイルスを硝子体内に注射した。注射の１週間後、強いＧＦＰシグナルがＲＧＣにおいて検出されるが、網膜における他の細胞型では検出されない。スケールバー１００μｍ。（Ｈ）グラフは、（ＧＦＰに加えて）対照ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを発現するＡＡＶ２の硝子体内注射（病変の７日後）を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（I）グラフは、対照又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのスポンジベクターの硝子体内注射を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、相対的な軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊ｐ＜０．０１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図６Ｃ】外因性ｍｉＲ−１３５は、視神経損傷後の軸索の再生を増強する。（Ａ）視神経の挫滅研究の実験設定。（Ｂ、Ｃ）グラフは、ミミックの注射後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのレベルは、ｍｉＲＮＡミミックの２回の注射後に増加するが、ＫＬＦ４のレベルは減少する（Ｃ）。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、デルタＣｔ値におけるＴ−検定。（Ｄ）視神経の挫滅の１４日後にアレクサ（Ａｌｅｘａ）−５５５とコンジュゲートされたコレラ毒素Ｂについて染色された視神経の代表的な画像。ｍｉＲ−１３５のミミックの注射後、軸索は、損傷部位に、及びそれを超えて成長する（点線は、損傷の近位及び遠位の境界部位を示す）。ボックスは右側に示されるより高倍率の画像を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｅ）グラフは、（Ｄ）において示される条件について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝９マウス。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（Ｆ）グラフは、ｍｉＲ−１３５のミミック、及びＧＦＰ又はＫＬＦ４ベクターの共トランスフェクション後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ＧＦＰ又はＫＬＦ４でトランスフェクトされた群の間で、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現において差はない。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｇ）ＡＡＶ２−ＧＦＰウイルスを硝子体内に注射した。注射の１週間後、強いＧＦＰシグナルがＲＧＣにおいて検出されるが、網膜における他の細胞型では検出されない。スケールバー１００μｍ。（Ｈ）グラフは、（ＧＦＰに加えて）対照ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを発現するＡＡＶ２の硝子体内注射（病変の７日後）を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（I）グラフは、対照又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのスポンジベクターの硝子体内注射を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、相対的な軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊ｐ＜０．０１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図６Ｄ】外因性ｍｉＲ−１３５は、視神経損傷後の軸索の再生を増強する。（Ａ）視神経の挫滅研究の実験設定。（Ｂ、Ｃ）グラフは、ミミックの注射後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのレベルは、ｍｉＲＮＡミミックの２回の注射後に増加するが、ＫＬＦ４のレベルは減少する（Ｃ）。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、デルタＣｔ値におけるＴ−検定。（Ｄ）視神経の挫滅の１４日後にアレクサ（Ａｌｅｘａ）−５５５とコンジュゲートされたコレラ毒素Ｂについて染色された視神経の代表的な画像。ｍｉＲ−１３５のミミックの注射後、軸索は、損傷部位に、及びそれを超えて成長する（点線は、損傷の近位及び遠位の境界部位を示す）。ボックスは右側に示されるより高倍率の画像を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｅ）グラフは、（Ｄ）において示される条件について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝９マウス。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（Ｆ）グラフは、ｍｉＲ−１３５のミミック、及びＧＦＰ又はＫＬＦ４ベクターの共トランスフェクション後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ＧＦＰ又はＫＬＦ４でトランスフェクトされた群の間で、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現において差はない。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｇ）ＡＡＶ２−ＧＦＰウイルスを硝子体内に注射した。注射の１週間後、強いＧＦＰシグナルがＲＧＣにおいて検出されるが、網膜における他の細胞型では検出されない。スケールバー１００μｍ。（Ｈ）グラフは、（ＧＦＰに加えて）対照ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを発現するＡＡＶ２の硝子体内注射（病変の７日後）を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（I）グラフは、対照又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのスポンジベクターの硝子体内注射を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、相対的な軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊ｐ＜０．０１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図６Ｅ】外因性ｍｉＲ−１３５は、視神経損傷後の軸索の再生を増強する。（Ａ）視神経の挫滅研究の実験設定。（Ｂ、Ｃ）グラフは、ミミックの注射後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのレベルは、ｍｉＲＮＡミミックの２回の注射後に増加するが、ＫＬＦ４のレベルは減少する（Ｃ）。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、デルタＣｔ値におけるＴ−検定。（Ｄ）視神経の挫滅の１４日後にアレクサ（Ａｌｅｘａ）−５５５とコンジュゲートされたコレラ毒素Ｂについて染色された視神経の代表的な画像。ｍｉＲ−１３５のミミックの注射後、軸索は、損傷部位に、及びそれを超えて成長する（点線は、損傷の近位及び遠位の境界部位を示す）。ボックスは右側に示されるより高倍率の画像を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｅ）グラフは、（Ｄ）において示される条件について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝９マウス。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（Ｆ）グラフは、ｍｉＲ−１３５のミミック、及びＧＦＰ又はＫＬＦ４ベクターの共トランスフェクション後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ＧＦＰ又はＫＬＦ４でトランスフェクトされた群の間で、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現において差はない。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｇ）ＡＡＶ２−ＧＦＰウイルスを硝子体内に注射した。注射の１週間後、強いＧＦＰシグナルがＲＧＣにおいて検出されるが、網膜における他の細胞型では検出されない。スケールバー１００μｍ。（Ｈ）グラフは、（ＧＦＰに加えて）対照ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを発現するＡＡＶ２の硝子体内注射（病変の７日後）を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（I）グラフは、対照又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのスポンジベクターの硝子体内注射を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、相対的な軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊ｐ＜０．０１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図６Ｆ】外因性ｍｉＲ−１３５は、視神経損傷後の軸索の再生を増強する。（Ａ）視神経の挫滅研究の実験設定。（Ｂ、Ｃ）グラフは、ミミックの注射後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのレベルは、ｍｉＲＮＡミミックの２回の注射後に増加するが、ＫＬＦ４のレベルは減少する（Ｃ）。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、デルタＣｔ値におけるＴ−検定。（Ｄ）視神経の挫滅の１４日後にアレクサ（Ａｌｅｘａ）−５５５とコンジュゲートされたコレラ毒素Ｂについて染色された視神経の代表的な画像。ｍｉＲ−１３５のミミックの注射後、軸索は、損傷部位に、及びそれを超えて成長する（点線は、損傷の近位及び遠位の境界部位を示す）。ボックスは右側に示されるより高倍率の画像を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｅ）グラフは、（Ｄ）において示される条件について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝９マウス。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（Ｆ）グラフは、ｍｉＲ−１３５のミミック、及びＧＦＰ又はＫＬＦ４ベクターの共トランスフェクション後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ＧＦＰ又はＫＬＦ４でトランスフェクトされた群の間で、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現において差はない。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｇ）ＡＡＶ２−ＧＦＰウイルスを硝子体内に注射した。注射の１週間後、強いＧＦＰシグナルがＲＧＣにおいて検出されるが、網膜における他の細胞型では検出されない。スケールバー１００μｍ。（Ｈ）グラフは、（ＧＦＰに加えて）対照ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを発現するＡＡＶ２の硝子体内注射（病変の７日後）を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（I）グラフは、対照又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのスポンジベクターの硝子体内注射を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、相対的な軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊ｐ＜０．０１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図６Ｇ】外因性ｍｉＲ−１３５は、視神経損傷後の軸索の再生を増強する。（Ａ）視神経の挫滅研究の実験設定。（Ｂ、Ｃ）グラフは、ミミックの注射後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのレベルは、ｍｉＲＮＡミミックの２回の注射後に増加するが、ＫＬＦ４のレベルは減少する（Ｃ）。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、デルタＣｔ値におけるＴ−検定。（Ｄ）視神経の挫滅の１４日後にアレクサ（Ａｌｅｘａ）−５５５とコンジュゲートされたコレラ毒素Ｂについて染色された視神経の代表的な画像。ｍｉＲ−１３５のミミックの注射後、軸索は、損傷部位に、及びそれを超えて成長する（点線は、損傷の近位及び遠位の境界部位を示す）。ボックスは右側に示されるより高倍率の画像を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｅ）グラフは、（Ｄ）において示される条件について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝９マウス。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（Ｆ）グラフは、ｍｉＲ−１３５のミミック、及びＧＦＰ又はＫＬＦ４ベクターの共トランスフェクション後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ＧＦＰ又はＫＬＦ４でトランスフェクトされた群の間で、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現において差はない。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｇ）ＡＡＶ２−ＧＦＰウイルスを硝子体内に注射した。注射の１週間後、強いＧＦＰシグナルがＲＧＣにおいて検出されるが、網膜における他の細胞型では検出されない。スケールバー１００μｍ。（Ｈ）グラフは、（ＧＦＰに加えて）対照ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを発現するＡＡＶ２の硝子体内注射（病変の７日後）を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（I）グラフは、対照又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのスポンジベクターの硝子体内注射を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、相対的な軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊ｐ＜０．０１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図６Ｈ】外因性ｍｉＲ−１３５は、視神経損傷後の軸索の再生を増強する。（Ａ）視神経の挫滅研究の実験設定。（Ｂ、Ｃ）グラフは、ミミックの注射後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのレベルは、ｍｉＲＮＡミミックの２回の注射後に増加するが、ＫＬＦ４のレベルは減少する（Ｃ）。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、デルタＣｔ値におけるＴ−検定。（Ｄ）視神経の挫滅の１４日後にアレクサ（Ａｌｅｘａ）−５５５とコンジュゲートされたコレラ毒素Ｂについて染色された視神経の代表的な画像。ｍｉＲ−１３５のミミックの注射後、軸索は、損傷部位に、及びそれを超えて成長する（点線は、損傷の近位及び遠位の境界部位を示す）。ボックスは右側に示されるより高倍率の画像を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｅ）グラフは、（Ｄ）において示される条件について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝９マウス。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（Ｆ）グラフは、ｍｉＲ−１３５のミミック、及びＧＦＰ又はＫＬＦ４ベクターの共トランスフェクション後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ＧＦＰ又はＫＬＦ４でトランスフェクトされた群の間で、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現において差はない。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｇ）ＡＡＶ２−ＧＦＰウイルスを硝子体内に注射した。注射の１週間後、強いＧＦＰシグナルがＲＧＣにおいて検出されるが、網膜における他の細胞型では検出されない。スケールバー１００μｍ。（Ｈ）グラフは、（ＧＦＰに加えて）対照ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを発現するＡＡＶ２の硝子体内注射（病変の７日後）を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（I）グラフは、対照又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのスポンジベクターの硝子体内注射を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、相対的な軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊ｐ＜０．０１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図６Ｉ】外因性ｍｉＲ−１３５は、視神経損傷後の軸索の再生を増強する。（Ａ）視神経の挫滅研究の実験設定。（Ｂ、Ｃ）グラフは、ミミックの注射後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのレベルは、ｍｉＲＮＡミミックの２回の注射後に増加するが、ＫＬＦ４のレベルは減少する（Ｃ）。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、デルタＣｔ値におけるＴ−検定。（Ｄ）視神経の挫滅の１４日後にアレクサ（Ａｌｅｘａ）−５５５とコンジュゲートされたコレラ毒素Ｂについて染色された視神経の代表的な画像。ｍｉＲ−１３５のミミックの注射後、軸索は、損傷部位に、及びそれを超えて成長する（点線は、損傷の近位及び遠位の境界部位を示す）。ボックスは右側に示されるより高倍率の画像を示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｅ）グラフは、（Ｄ）において示される条件について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝９マウス。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（Ｆ）グラフは、ｍｉＲ−１３５のミミック、及びＧＦＰ又はＫＬＦ４ベクターの共トランスフェクション後の眼組織における定量的ＰＣＲの結果を示す。ＧＦＰ又はＫＬＦ４でトランスフェクトされた群の間で、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現において差はない。倍数変化は、５ＳハウスキーピングｒＲＮＡ発現に関連する。データは、平均±ＳＥＭとして表される。（Ｇ）ＡＡＶ２−ＧＦＰウイルスを硝子体内に注射した。注射の１週間後、強いＧＦＰシグナルがＲＧＣにおいて検出されるが、網膜における他の細胞型では検出されない。スケールバー１００μｍ。（Ｈ）グラフは、（ＧＦＰに加えて）対照ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを発現するＡＡＶ２の硝子体内注射（病変の７日後）を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。（I）グラフは、対照又はｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのスポンジベクターの硝子体内注射を使用して行った実験について、損傷の１４日後での挫滅部位の遠位末端に対する、相対的な軸索の再生の数の定量化を示す。条件あたりｎ＝６マウス。＊＊ｐ＜０．０１、分散分析に続いてシダックの検定。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図７Ａ】ｍｉＲ−１３５ａのヒトのデータ。Ａ）定量的ＰＣＲによって決定されたヒトＴＬＥ患者におけるｍｉＲ−１３５ａの発現レベル。Ｃ−対照、ｍＴＬＥ−ＨＳ、ｍＴＬＥ＋ＨＳ。ｎ＝６患者／群。スチューデントのｔ検定。Ｕ６及び５ｓｒＲＮＡに対して正規化。スチューデントのＴ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。Ｂ）異なる群の中でのｍｉＲ−１３５ａのインサイチュ局在化の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。
【図７Ｂ】ｍｉＲ−１３５ａのヒトのデータ。Ａ）定量的ＰＣＲによって決定されたヒトＴＬＥ患者におけるｍｉＲ−１３５ａの発現レベル。Ｃ−対照、ｍＴＬＥ−ＨＳ、ｍＴＬＥ＋ＨＳ。ｎ＝６患者／群。スチューデントのｔ検定。Ｕ６及び５ｓｒＲＮＡに対して正規化。スチューデントのＴ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。Ｂ）異なる群の中でのｍｉＲ−１３５ａのインサイチュ局在化の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。
【図８】ｍｉＲ−１３５ａの細胞型特異的局在化。ニューロンのマーカーであるＮｅｕＮによる共局在化。ｍｉＲ−１３５ａの特異的局在化は、異なる群の中で、ＣＡ領域におけるＮｅｕＮによるニューロン神経細胞体の共染色において観察された。スケールバー２５μｍ。
【図９Ａ】ｍｉＲ−１３５ａの発現は扁桃内動物モデルにおいて上方制御された。（Ａ）ｍｉＲ−１３５ａの発現レベルは、てんかん重積状態の２週間後に有意に上方制御されることが見出される。５ｓｒＲＮＡに対して正規化、ｎ＝４のＰＢＳが注射されたマウス、ｎ＝３のＫＡが注射されたマウス。スチューデントのｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＩＳＨ、２４時間と比較して２週目でのｍｉＲ−１３５ａの上方制御を示す代表的な画像。スケールバー３００μｍ。
【図９Ｂ】ｍｉＲ−１３５ａの発現は扁桃内動物モデルにおいて上方制御された。（Ａ）ｍｉＲ−１３５ａの発現レベルは、てんかん重積状態の２週間後に有意に上方制御されることが見出される。５ｓｒＲＮＡに対して正規化、ｎ＝４のＰＢＳが注射されたマウス、ｎ＝３のＫＡが注射されたマウス。スチューデントのｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＩＳＨ、２４時間と比較して２週目でのｍｉＲ−１３５ａの上方制御を示す代表的な画像。スケールバー３００μｍ。
【図１０Ａ】インビトロのデータ；アンタゴミル投与及びカイニン酸誘導後のマウスの表現型。Ａ）アンタゴミルの投与２４時間後のｍｉＲ−１３５ａの発現、３用量を試験した（０．５、１．０、１．５ｎｍｏｌ）。任意のオフターゲット効果なしに最大ノックダウンがあったので、１ｎｍｏｌの濃度をさらに使用した。ｍｉＲ−１２４の発現は、この濃度で変化しなかった、ｎ＝３マウス／群。ＲＮＵ６Ｂに対して正規化、一元配置分散分析。＊ｐ＜０．０５。Ｂ）アンタゴミルの実験計画の概要。Ｃ）ＥＥＧテレメトリーを使用して、アンタゴミル注射の２週間後に記録された自発性てんかん発作の数を示すグラフ。７日間のウォッシュアウト期間中のてんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった（ｐ＝０．７４３）。処置の後、処置された動物及び対照動物においててんかん発作の頻度の分布のほぼ完全な分離があり、ウィルコクソンマンホイットニーの統計量が０．９０、９５％のＣＩが０．６５〜０．９７で、処理された動物よりも高いてんかん発作の頻度を有する対照動物の確率が９０％であることを示した（Ｐ＜０．００１）。Ｎ＝５の対照及びＮ＝５のＡｎｔ−１３５が注射されたＫＡマウス。てんかん発作は、対照と比較してアンタゴミルを注射されたマウスにおいて有意に低減した。
【図１０Ｂ】インビトロのデータ；アンタゴミル投与及びカイニン酸誘導後のマウスの表現型。Ａ）アンタゴミルの投与２４時間後のｍｉＲ−１３５ａの発現、３用量を試験した（０．５、１．０、１．５ｎｍｏｌ）。任意のオフターゲット効果なしに最大ノックダウンがあったので、１ｎｍｏｌの濃度をさらに使用した。ｍｉＲ−１２４の発現は、この濃度で変化しなかった、ｎ＝３マウス／群。ＲＮＵ６Ｂに対して正規化、一元配置分散分析。＊ｐ＜０．０５。Ｂ）アンタゴミルの実験計画の概要。Ｃ）ＥＥＧテレメトリーを使用して、アンタゴミル注射の２週間後に記録された自発性てんかん発作の数を示すグラフ。７日間のウォッシュアウト期間中のてんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった（ｐ＝０．７４３）。処置の後、処置された動物及び対照動物においててんかん発作の頻度の分布のほぼ完全な分離があり、ウィルコクソンマンホイットニーの統計量が０．９０、９５％のＣＩが０．６５〜０．９７で、処理された動物よりも高いてんかん発作の頻度を有する対照動物の確率が９０％であることを示した（Ｐ＜０．００１）。Ｎ＝５の対照及びＮ＝５のＡｎｔ−１３５が注射されたＫＡマウス。てんかん発作は、対照と比較してアンタゴミルを注射されたマウスにおいて有意に低減した。
【図１０Ｃ】インビトロのデータ；アンタゴミル投与及びカイニン酸誘導後のマウスの表現型。Ａ）アンタゴミルの投与２４時間後のｍｉＲ−１３５ａの発現、３用量を試験した（０．５、１．０、１．５ｎｍｏｌ）。任意のオフターゲット効果なしに最大ノックダウンがあったので、１ｎｍｏｌの濃度をさらに使用した。ｍｉＲ−１２４の発現は、この濃度で変化しなかった、ｎ＝３マウス／群。ＲＮＵ６Ｂに対して正規化、一元配置分散分析。＊ｐ＜０．０５。Ｂ）アンタゴミルの実験計画の概要。Ｃ）ＥＥＧテレメトリーを使用して、アンタゴミル注射の２週間後に記録された自発性てんかん発作の数を示すグラフ。７日間のウォッシュアウト期間中のてんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった（ｐ＝０．７４３）。処置の後、処置された動物及び対照動物においててんかん発作の頻度の分布のほぼ完全な分離があり、ウィルコクソンマンホイットニーの統計量が０．９０、９５％のＣＩが０．６５〜０．９７で、処理された動物よりも高いてんかん発作の頻度を有する対照動物の確率が９０％であることを示した（Ｐ＜０．００１）。Ｎ＝５の対照及びＮ＝５のＡｎｔ−１３５が注射されたＫＡマウス。てんかん発作は、対照と比較してアンタゴミルを注射されたマウスにおいて有意に低減した。
【図１１Ａ】ヒトＴＬＥにおけるｍｉＲ−１３５ａの発現の増加。Ａ）定量的ＰＣＲによって決定されたヒトＴＬＥ患者におけるｍｉＲ−１３５ａの発現レベル。対照（ｎ＝８）、ｍＴＬＥ＋ＨＳ（ｎ＝７）。５ｓｒＲＮＡに対して正規化。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。マンホイットニーＵ検定。Ｂ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ群において、ｍｉＲ−１３５ａの局在化を示すＬＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション。スケールバー２００μｍ。Ｃ）ｍｉＲ−１３５ａの細胞型特異的局在化。ニューロンのマーカーであるＮｅｕＮによる共局在化。ｍｉＲ−１３５ａの特異的局在化は、ＣＡ領域におけるニューロン神経細胞体において観察された。矢印は共標識化された細胞を示す。アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰによる共局在化は観察されなかった。スケールバー２５μｍ。
【図１１Ｂ】ヒトＴＬＥにおけるｍｉＲ−１３５ａの発現の増加。Ａ）定量的ＰＣＲによって決定されたヒトＴＬＥ患者におけるｍｉＲ−１３５ａの発現レベル。対照（ｎ＝８）、ｍＴＬＥ＋ＨＳ（ｎ＝７）。５ｓｒＲＮＡに対して正規化。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。マンホイットニーＵ検定。Ｂ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ群において、ｍｉＲ−１３５ａの局在化を示すＬＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション。スケールバー２００μｍ。Ｃ）ｍｉＲ−１３５ａの細胞型特異的局在化。ニューロンのマーカーであるＮｅｕＮによる共局在化。ｍｉＲ−１３５ａの特異的局在化は、ＣＡ領域におけるニューロン神経細胞体において観察された。矢印は共標識化された細胞を示す。アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰによる共局在化は観察されなかった。スケールバー２５μｍ。
【図１１Ｃ】ヒトＴＬＥにおけるｍｉＲ−１３５ａの発現の増加。Ａ）定量的ＰＣＲによって決定されたヒトＴＬＥ患者におけるｍｉＲ−１３５ａの発現レベル。対照（ｎ＝８）、ｍＴＬＥ＋ＨＳ（ｎ＝７）。５ｓｒＲＮＡに対して正規化。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。マンホイットニーＵ検定。Ｂ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ群において、ｍｉＲ−１３５ａの局在化を示すＬＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション。スケールバー２００μｍ。Ｃ）ｍｉＲ−１３５ａの細胞型特異的局在化。ニューロンのマーカーであるＮｅｕＮによる共局在化。ｍｉＲ−１３５ａの特異的局在化は、ＣＡ領域におけるニューロン神経細胞体において観察された。矢印は共標識化された細胞を示す。アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰによる共局在化は観察されなかった。スケールバー２５μｍ。
【図１２Ａ】ＴＬＥのマウスモデルにおけるｍｉＲ−１３５ａの増加。Ａ）ＳＥの２週間後のＩＡＫマウスの海馬におけるｍｉＲ−１３５ａレベルの増加。Ｎ＝４のＰＢＳ及びＮ＝３のＫＡマウス。５ｓｒＲＮＡに対して正規化。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。Ｂ）２４時間及びＰＢＳ注射と比較して、ＳＥの誘導の２週間後で、海馬及び扁桃体領域における強いｍｉＲ−１３５ａの発現を示すＩＳＨの代表的な画像。スクランブルで染色された画像はシグナルがなかった。スケールバー３００μｍ。Ｃ）ＦＩＳＨ、観察される特異的な共局在化がない、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰによるｍｉＲ−１３５ａの共標識化。歯状回ＭＬ−分子層、ＧＣＬ−顆粒細胞層、門、アンモン角領域ＣＡ２、ＣＡ３及びＣＡ４。スケールバー１００μｍ。Ｄ）ｍＴＬＥ＋ＨＳ条件におけるｍｉＲ−１３５ａ−２のレベルの増加、しかし、ｍｉＲ−１３５ａ−１の変化はない。ｎ＝８の対照及びｎ＝７のｍＴＬＥ＋ＨＳ試料。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。Ｅ）ｍｉＲ−１３５ａ−１及びｍｉＲ−１３５ａ−２のレベルは両方とも、ＰＢＳが注射された対照と比較して、ＫＡマウスにおいて増加する。Ｎ＝４のＰＢＳ及びＮ＝３のＫＡマウス。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。
【図１２Ｂ】ＴＬＥのマウスモデルにおけるｍｉＲ−１３５ａの増加。Ａ）ＳＥの２週間後のＩＡＫマウスの海馬におけるｍｉＲ−１３５ａレベルの増加。Ｎ＝４のＰＢＳ及びＮ＝３のＫＡマウス。５ｓｒＲＮＡに対して正規化。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。Ｂ）２４時間及びＰＢＳ注射と比較して、ＳＥの誘導の２週間後で、海馬及び扁桃体領域における強いｍｉＲ−１３５ａの発現を示すＩＳＨの代表的な画像。スクランブルで染色された画像はシグナルがなかった。スケールバー３００μｍ。Ｃ）ＦＩＳＨ、観察される特異的な共局在化がない、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰによるｍｉＲ−１３５ａの共標識化。歯状回ＭＬ−分子層、ＧＣＬ−顆粒細胞層、門、アンモン角領域ＣＡ２、ＣＡ３及びＣＡ４。スケールバー１００μｍ。Ｄ）ｍＴＬＥ＋ＨＳ条件におけるｍｉＲ−１３５ａ−２のレベルの増加、しかし、ｍｉＲ−１３５ａ−１の変化はない。ｎ＝８の対照及びｎ＝７のｍＴＬＥ＋ＨＳ試料。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。Ｅ）ｍｉＲ−１３５ａ−１及びｍｉＲ−１３５ａ−２のレベルは両方とも、ＰＢＳが注射された対照と比較して、ＫＡマウスにおいて増加する。Ｎ＝４のＰＢＳ及びＮ＝３のＫＡマウス。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。
【図１２Ｃ】ＴＬＥのマウスモデルにおけるｍｉＲ−１３５ａの増加。Ａ）ＳＥの２週間後のＩＡＫマウスの海馬におけるｍｉＲ−１３５ａレベルの増加。Ｎ＝４のＰＢＳ及びＮ＝３のＫＡマウス。５ｓｒＲＮＡに対して正規化。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。Ｂ）２４時間及びＰＢＳ注射と比較して、ＳＥの誘導の２週間後で、海馬及び扁桃体領域における強いｍｉＲ−１３５ａの発現を示すＩＳＨの代表的な画像。スクランブルで染色された画像はシグナルがなかった。スケールバー３００μｍ。Ｃ）ＦＩＳＨ、観察される特異的な共局在化がない、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰによるｍｉＲ−１３５ａの共標識化。歯状回ＭＬ−分子層、ＧＣＬ−顆粒細胞層、門、アンモン角領域ＣＡ２、ＣＡ３及びＣＡ４。スケールバー１００μｍ。Ｄ）ｍＴＬＥ＋ＨＳ条件におけるｍｉＲ−１３５ａ−２のレベルの増加、しかし、ｍｉＲ−１３５ａ−１の変化はない。ｎ＝８の対照及びｎ＝７のｍＴＬＥ＋ＨＳ試料。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。Ｅ）ｍｉＲ−１３５ａ−１及びｍｉＲ−１３５ａ−２のレベルは両方とも、ＰＢＳが注射された対照と比較して、ＫＡマウスにおいて増加する。Ｎ＝４のＰＢＳ及びＮ＝３のＫＡマウス。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。
【図１２Ｄ】ＴＬＥのマウスモデルにおけるｍｉＲ−１３５ａの増加。Ａ）ＳＥの２週間後のＩＡＫマウスの海馬におけるｍｉＲ−１３５ａレベルの増加。Ｎ＝４のＰＢＳ及びＮ＝３のＫＡマウス。５ｓｒＲＮＡに対して正規化。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。Ｂ）２４時間及びＰＢＳ注射と比較して、ＳＥの誘導の２週間後で、海馬及び扁桃体領域における強いｍｉＲ−１３５ａの発現を示すＩＳＨの代表的な画像。スクランブルで染色された画像はシグナルがなかった。スケールバー３００μｍ。Ｃ）ＦＩＳＨ、観察される特異的な共局在化がない、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰによるｍｉＲ−１３５ａの共標識化。歯状回ＭＬ−分子層、ＧＣＬ−顆粒細胞層、門、アンモン角領域ＣＡ２、ＣＡ３及びＣＡ４。スケールバー１００μｍ。Ｄ）ｍＴＬＥ＋ＨＳ条件におけるｍｉＲ−１３５ａ−２のレベルの増加、しかし、ｍｉＲ−１３５ａ−１の変化はない。ｎ＝８の対照及びｎ＝７のｍＴＬＥ＋ＨＳ試料。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。Ｅ）ｍｉＲ−１３５ａ−１及びｍｉＲ−１３５ａ−２のレベルは両方とも、ＰＢＳが注射された対照と比較して、ＫＡマウスにおいて増加する。Ｎ＝４のＰＢＳ及びＮ＝３のＫＡマウス。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。
【図１２Ｅ】ＴＬＥのマウスモデルにおけるｍｉＲ−１３５ａの増加。Ａ）ＳＥの２週間後のＩＡＫマウスの海馬におけるｍｉＲ−１３５ａレベルの増加。Ｎ＝４のＰＢＳ及びＮ＝３のＫＡマウス。５ｓｒＲＮＡに対して正規化。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。Ｂ）２４時間及びＰＢＳ注射と比較して、ＳＥの誘導の２週間後で、海馬及び扁桃体領域における強いｍｉＲ−１３５ａの発現を示すＩＳＨの代表的な画像。スクランブルで染色された画像はシグナルがなかった。スケールバー３００μｍ。Ｃ）ＦＩＳＨ、観察される特異的な共局在化がない、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰによるｍｉＲ−１３５ａの共標識化。歯状回ＭＬ−分子層、ＧＣＬ−顆粒細胞層、門、アンモン角領域ＣＡ２、ＣＡ３及びＣＡ４。スケールバー１００μｍ。Ｄ）ｍＴＬＥ＋ＨＳ条件におけるｍｉＲ−１３５ａ−２のレベルの増加、しかし、ｍｉＲ−１３５ａ−１の変化はない。ｎ＝８の対照及びｎ＝７のｍＴＬＥ＋ＨＳ試料。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。Ｅ）ｍｉＲ−１３５ａ−１及びｍｉＲ−１３５ａ−２のレベルは両方とも、ＰＢＳが注射された対照と比較して、ＫＡマウスにおいて増加する。Ｎ＝４のＰＢＳ及びＮ＝３のＫＡマウス。データは、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。
【図１３Ａ】Ａｎｔ−１３５ａは、てんかんのマウス扁桃内カイニン酸モデルにおいててんかん発作の数を低減する。Ａ）ａｎｔ−１３５ａが注射されたマウスにおける、ｍｉＲ−１３５ａ阻害剤プローブについてのＬＮＡ  ＩＳＨ。ｍｉＲ−１３５ａについての強いシグナルが、画像１、２において、同側に（注射された）海馬において観察され、対照は任意のシグナルがなかった。スケールバー２００μｍ。Ａｎｔ−１３５ａは、海馬のＣＡ１、ＣＡ４及びＤＧ領域において、ニューロン細胞によって主に取り込まれた。スケールバー５０μｍ。Ｂ）雄Ｃ５７ＢＬ６成体マウス（約２５ｇ）に、ＥＥＧの記録のために、皮質電極（脳半球の両方）に接続されたＤＳＩ遠隔測定装置を埋め込んだ。適切な術後の回復の後、マウスをＥＥＧに接続し、０日目（Ｄ０）において、扁桃内カイニン酸誘導てんかん重積（ＳＥ）を受けた。遠隔測定装置を切り、７日目（Ｄ０７）に再活動させて、７日の「てんかんベースライン」を記録した。１４日目（Ｄ１４）に、マウスにＡｎｔ−１３５ａ又はそのスクランブル対照を脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）注射し、６日間継続的にモニターした（Ｄ１４〜Ｄ２０；「ｍｉＲ処置期間後」）。Ｃ）てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７４３）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ｄ１５から開始する処置された動物及び対照動物において、てんかん発作の数においてほぼ強い減少があった。Ｄ）７日目（点線）でのａｎｔ−１３５ａの適用は、時間に関して、てんかん発作の数の有意な減少をもたらした。対照及びａｎｔ−１３５ａについてＮ＝５。＊＊＊−混合設計反復測定一般線形モデル；ｄａｙ＊処置の相互作用；Ｆ統計量−５．８３４（α＝０．０５についてＦ（２０，６０）＝１．７５）；ｐ＜０．００１。Ｅ）平均てんかん発作期間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の期間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．４７２１）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群よりも有意に短いてんかん発作を示した、スチューデントのｔ検定解析（Ｐ＝０．０００６）による。群あたりｎ＝５。Ｆ）添加発作活動に費やされた時間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作において費やされた総時間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７５４６）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群のマウスよりも、てんかん発作の時間は有意に少ない、スチューデントのｔ検定の分析（Ｐ＝０．００２１）による。ｎ＝５／群。Ｇ）Ａｎｔ−１３５ａ（下部）又は対照（上部）による処置の３日後の自発性てんかん発作の代表的なＥＥＧの追跡。Ｈ）てんかん発作に費やされる総時間−マウスあたり、１日あたりのてんかん発作の総時間（秒）。
【図１３Ｂ】Ａｎｔ−１３５ａは、てんかんのマウス扁桃内カイニン酸モデルにおいててんかん発作の数を低減する。Ａ）ａｎｔ−１３５ａが注射されたマウスにおける、ｍｉＲ−１３５ａ阻害剤プローブについてのＬＮＡ  ＩＳＨ。ｍｉＲ−１３５ａについての強いシグナルが、画像１、２において、同側に（注射された）海馬において観察され、対照は任意のシグナルがなかった。スケールバー２００μｍ。Ａｎｔ−１３５ａは、海馬のＣＡ１、ＣＡ４及びＤＧ領域において、ニューロン細胞によって主に取り込まれた。スケールバー５０μｍ。Ｂ）雄Ｃ５７ＢＬ６成体マウス（約２５ｇ）に、ＥＥＧの記録のために、皮質電極（脳半球の両方）に接続されたＤＳＩ遠隔測定装置を埋め込んだ。適切な術後の回復の後、マウスをＥＥＧに接続し、０日目（Ｄ０）において、扁桃内カイニン酸誘導てんかん重積（ＳＥ）を受けた。遠隔測定装置を切り、７日目（Ｄ０７）に再活動させて、７日の「てんかんベースライン」を記録した。１４日目（Ｄ１４）に、マウスにＡｎｔ−１３５ａ又はそのスクランブル対照を脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）注射し、６日間継続的にモニターした（Ｄ１４〜Ｄ２０；「ｍｉＲ処置期間後」）。Ｃ）てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７４３）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ｄ１５から開始する処置された動物及び対照動物において、てんかん発作の数においてほぼ強い減少があった。Ｄ）７日目（点線）でのａｎｔ−１３５ａの適用は、時間に関して、てんかん発作の数の有意な減少をもたらした。対照及びａｎｔ−１３５ａについてＮ＝５。＊＊＊−混合設計反復測定一般線形モデル；ｄａｙ＊処置の相互作用；Ｆ統計量−５．８３４（α＝０．０５についてＦ（２０，６０）＝１．７５）；ｐ＜０．００１。Ｅ）平均てんかん発作期間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の期間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．４７２１）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群よりも有意に短いてんかん発作を示した、スチューデントのｔ検定解析（Ｐ＝０．０００６）による。群あたりｎ＝５。Ｆ）添加発作活動に費やされた時間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作において費やされた総時間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７５４６）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群のマウスよりも、てんかん発作の時間は有意に少ない、スチューデントのｔ検定の分析（Ｐ＝０．００２１）による。ｎ＝５／群。Ｇ）Ａｎｔ−１３５ａ（下部）又は対照（上部）による処置の３日後の自発性てんかん発作の代表的なＥＥＧの追跡。Ｈ）てんかん発作に費やされる総時間−マウスあたり、１日あたりのてんかん発作の総時間（秒）。
【図１３Ｃ】Ａｎｔ−１３５ａは、てんかんのマウス扁桃内カイニン酸モデルにおいててんかん発作の数を低減する。Ａ）ａｎｔ−１３５ａが注射されたマウスにおける、ｍｉＲ−１３５ａ阻害剤プローブについてのＬＮＡ  ＩＳＨ。ｍｉＲ−１３５ａについての強いシグナルが、画像１、２において、同側に（注射された）海馬において観察され、対照は任意のシグナルがなかった。スケールバー２００μｍ。Ａｎｔ−１３５ａは、海馬のＣＡ１、ＣＡ４及びＤＧ領域において、ニューロン細胞によって主に取り込まれた。スケールバー５０μｍ。Ｂ）雄Ｃ５７ＢＬ６成体マウス（約２５ｇ）に、ＥＥＧの記録のために、皮質電極（脳半球の両方）に接続されたＤＳＩ遠隔測定装置を埋め込んだ。適切な術後の回復の後、マウスをＥＥＧに接続し、０日目（Ｄ０）において、扁桃内カイニン酸誘導てんかん重積（ＳＥ）を受けた。遠隔測定装置を切り、７日目（Ｄ０７）に再活動させて、７日の「てんかんベースライン」を記録した。１４日目（Ｄ１４）に、マウスにＡｎｔ−１３５ａ又はそのスクランブル対照を脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）注射し、６日間継続的にモニターした（Ｄ１４〜Ｄ２０；「ｍｉＲ処置期間後」）。Ｃ）てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７４３）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ｄ１５から開始する処置された動物及び対照動物において、てんかん発作の数においてほぼ強い減少があった。Ｄ）７日目（点線）でのａｎｔ−１３５ａの適用は、時間に関して、てんかん発作の数の有意な減少をもたらした。対照及びａｎｔ−１３５ａについてＮ＝５。＊＊＊−混合設計反復測定一般線形モデル；ｄａｙ＊処置の相互作用；Ｆ統計量−５．８３４（α＝０．０５についてＦ（２０，６０）＝１．７５）；ｐ＜０．００１。Ｅ）平均てんかん発作期間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の期間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．４７２１）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群よりも有意に短いてんかん発作を示した、スチューデントのｔ検定解析（Ｐ＝０．０００６）による。群あたりｎ＝５。Ｆ）添加発作活動に費やされた時間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作において費やされた総時間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７５４６）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群のマウスよりも、てんかん発作の時間は有意に少ない、スチューデントのｔ検定の分析（Ｐ＝０．００２１）による。ｎ＝５／群。Ｇ）Ａｎｔ−１３５ａ（下部）又は対照（上部）による処置の３日後の自発性てんかん発作の代表的なＥＥＧの追跡。Ｈ）てんかん発作に費やされる総時間−マウスあたり、１日あたりのてんかん発作の総時間（秒）。
【図１３Ｄ】Ａｎｔ−１３５ａは、てんかんのマウス扁桃内カイニン酸モデルにおいててんかん発作の数を低減する。Ａ）ａｎｔ−１３５ａが注射されたマウスにおける、ｍｉＲ−１３５ａ阻害剤プローブについてのＬＮＡ  ＩＳＨ。ｍｉＲ−１３５ａについての強いシグナルが、画像１、２において、同側に（注射された）海馬において観察され、対照は任意のシグナルがなかった。スケールバー２００μｍ。Ａｎｔ−１３５ａは、海馬のＣＡ１、ＣＡ４及びＤＧ領域において、ニューロン細胞によって主に取り込まれた。スケールバー５０μｍ。Ｂ）雄Ｃ５７ＢＬ６成体マウス（約２５ｇ）に、ＥＥＧの記録のために、皮質電極（脳半球の両方）に接続されたＤＳＩ遠隔測定装置を埋め込んだ。適切な術後の回復の後、マウスをＥＥＧに接続し、０日目（Ｄ０）において、扁桃内カイニン酸誘導てんかん重積（ＳＥ）を受けた。遠隔測定装置を切り、７日目（Ｄ０７）に再活動させて、７日の「てんかんベースライン」を記録した。１４日目（Ｄ１４）に、マウスにＡｎｔ−１３５ａ又はそのスクランブル対照を脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）注射し、６日間継続的にモニターした（Ｄ１４〜Ｄ２０；「ｍｉＲ処置期間後」）。Ｃ）てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７４３）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ｄ１５から開始する処置された動物及び対照動物において、てんかん発作の数においてほぼ強い減少があった。Ｄ）７日目（点線）でのａｎｔ−１３５ａの適用は、時間に関して、てんかん発作の数の有意な減少をもたらした。対照及びａｎｔ−１３５ａについてＮ＝５。＊＊＊−混合設計反復測定一般線形モデル；ｄａｙ＊処置の相互作用；Ｆ統計量−５．８３４（α＝０．０５についてＦ（２０，６０）＝１．７５）；ｐ＜０．００１。Ｅ）平均てんかん発作期間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の期間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．４７２１）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群よりも有意に短いてんかん発作を示した、スチューデントのｔ検定解析（Ｐ＝０．０００６）による。群あたりｎ＝５。Ｆ）添加発作活動に費やされた時間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作において費やされた総時間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７５４６）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群のマウスよりも、てんかん発作の時間は有意に少ない、スチューデントのｔ検定の分析（Ｐ＝０．００２１）による。ｎ＝５／群。Ｇ）Ａｎｔ−１３５ａ（下部）又は対照（上部）による処置の３日後の自発性てんかん発作の代表的なＥＥＧの追跡。Ｈ）てんかん発作に費やされる総時間−マウスあたり、１日あたりのてんかん発作の総時間（秒）。
【図１３Ｅ】Ａｎｔ−１３５ａは、てんかんのマウス扁桃内カイニン酸モデルにおいててんかん発作の数を低減する。Ａ）ａｎｔ−１３５ａが注射されたマウスにおける、ｍｉＲ−１３５ａ阻害剤プローブについてのＬＮＡ  ＩＳＨ。ｍｉＲ−１３５ａについての強いシグナルが、画像１、２において、同側に（注射された）海馬において観察され、対照は任意のシグナルがなかった。スケールバー２００μｍ。Ａｎｔ−１３５ａは、海馬のＣＡ１、ＣＡ４及びＤＧ領域において、ニューロン細胞によって主に取り込まれた。スケールバー５０μｍ。Ｂ）雄Ｃ５７ＢＬ６成体マウス（約２５ｇ）に、ＥＥＧの記録のために、皮質電極（脳半球の両方）に接続されたＤＳＩ遠隔測定装置を埋め込んだ。適切な術後の回復の後、マウスをＥＥＧに接続し、０日目（Ｄ０）において、扁桃内カイニン酸誘導てんかん重積（ＳＥ）を受けた。遠隔測定装置を切り、７日目（Ｄ０７）に再活動させて、７日の「てんかんベースライン」を記録した。１４日目（Ｄ１４）に、マウスにＡｎｔ−１３５ａ又はそのスクランブル対照を脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）注射し、６日間継続的にモニターした（Ｄ１４〜Ｄ２０；「ｍｉＲ処置期間後」）。Ｃ）てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７４３）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ｄ１５から開始する処置された動物及び対照動物において、てんかん発作の数においてほぼ強い減少があった。Ｄ）７日目（点線）でのａｎｔ−１３５ａの適用は、時間に関して、てんかん発作の数の有意な減少をもたらした。対照及びａｎｔ−１３５ａについてＮ＝５。＊＊＊−混合設計反復測定一般線形モデル；ｄａｙ＊処置の相互作用；Ｆ統計量−５．８３４（α＝０．０５についてＦ（２０，６０）＝１．７５）；ｐ＜０．００１。Ｅ）平均てんかん発作期間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の期間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．４７２１）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群よりも有意に短いてんかん発作を示した、スチューデントのｔ検定解析（Ｐ＝０．０００６）による。群あたりｎ＝５。Ｆ）添加発作活動に費やされた時間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作において費やされた総時間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７５４６）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群のマウスよりも、てんかん発作の時間は有意に少ない、スチューデントのｔ検定の分析（Ｐ＝０．００２１）による。ｎ＝５／群。Ｇ）Ａｎｔ−１３５ａ（下部）又は対照（上部）による処置の３日後の自発性てんかん発作の代表的なＥＥＧの追跡。Ｈ）てんかん発作に費やされる総時間−マウスあたり、１日あたりのてんかん発作の総時間（秒）。
【図１３Ｆ】Ａｎｔ−１３５ａは、てんかんのマウス扁桃内カイニン酸モデルにおいててんかん発作の数を低減する。Ａ）ａｎｔ−１３５ａが注射されたマウスにおける、ｍｉＲ−１３５ａ阻害剤プローブについてのＬＮＡ  ＩＳＨ。ｍｉＲ−１３５ａについての強いシグナルが、画像１、２において、同側に（注射された）海馬において観察され、対照は任意のシグナルがなかった。スケールバー２００μｍ。Ａｎｔ−１３５ａは、海馬のＣＡ１、ＣＡ４及びＤＧ領域において、ニューロン細胞によって主に取り込まれた。スケールバー５０μｍ。Ｂ）雄Ｃ５７ＢＬ６成体マウス（約２５ｇ）に、ＥＥＧの記録のために、皮質電極（脳半球の両方）に接続されたＤＳＩ遠隔測定装置を埋め込んだ。適切な術後の回復の後、マウスをＥＥＧに接続し、０日目（Ｄ０）において、扁桃内カイニン酸誘導てんかん重積（ＳＥ）を受けた。遠隔測定装置を切り、７日目（Ｄ０７）に再活動させて、７日の「てんかんベースライン」を記録した。１４日目（Ｄ１４）に、マウスにＡｎｔ−１３５ａ又はそのスクランブル対照を脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）注射し、６日間継続的にモニターした（Ｄ１４〜Ｄ２０；「ｍｉＲ処置期間後」）。Ｃ）てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７４３）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ｄ１５から開始する処置された動物及び対照動物において、てんかん発作の数においてほぼ強い減少があった。Ｄ）７日目（点線）でのａｎｔ−１３５ａの適用は、時間に関して、てんかん発作の数の有意な減少をもたらした。対照及びａｎｔ−１３５ａについてＮ＝５。＊＊＊−混合設計反復測定一般線形モデル；ｄａｙ＊処置の相互作用；Ｆ統計量−５．８３４（α＝０．０５についてＦ（２０，６０）＝１．７５）；ｐ＜０．００１。Ｅ）平均てんかん発作期間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の期間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．４７２１）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群よりも有意に短いてんかん発作を示した、スチューデントのｔ検定解析（Ｐ＝０．０００６）による。群あたりｎ＝５。Ｆ）添加発作活動に費やされた時間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作において費やされた総時間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７５４６）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群のマウスよりも、てんかん発作の時間は有意に少ない、スチューデントのｔ検定の分析（Ｐ＝０．００２１）による。ｎ＝５／群。Ｇ）Ａｎｔ−１３５ａ（下部）又は対照（上部）による処置の３日後の自発性てんかん発作の代表的なＥＥＧの追跡。Ｈ）てんかん発作に費やされる総時間−マウスあたり、１日あたりのてんかん発作の総時間（秒）。
【図１３Ｇ】Ａｎｔ−１３５ａは、てんかんのマウス扁桃内カイニン酸モデルにおいててんかん発作の数を低減する。Ａ）ａｎｔ−１３５ａが注射されたマウスにおける、ｍｉＲ−１３５ａ阻害剤プローブについてのＬＮＡ  ＩＳＨ。ｍｉＲ−１３５ａについての強いシグナルが、画像１、２において、同側に（注射された）海馬において観察され、対照は任意のシグナルがなかった。スケールバー２００μｍ。Ａｎｔ−１３５ａは、海馬のＣＡ１、ＣＡ４及びＤＧ領域において、ニューロン細胞によって主に取り込まれた。スケールバー５０μｍ。Ｂ）雄Ｃ５７ＢＬ６成体マウス（約２５ｇ）に、ＥＥＧの記録のために、皮質電極（脳半球の両方）に接続されたＤＳＩ遠隔測定装置を埋め込んだ。適切な術後の回復の後、マウスをＥＥＧに接続し、０日目（Ｄ０）において、扁桃内カイニン酸誘導てんかん重積（ＳＥ）を受けた。遠隔測定装置を切り、７日目（Ｄ０７）に再活動させて、７日の「てんかんベースライン」を記録した。１４日目（Ｄ１４）に、マウスにＡｎｔ−１３５ａ又はそのスクランブル対照を脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）注射し、６日間継続的にモニターした（Ｄ１４〜Ｄ２０；「ｍｉＲ処置期間後」）。Ｃ）てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７４３）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ｄ１５から開始する処置された動物及び対照動物において、てんかん発作の数においてほぼ強い減少があった。Ｄ）７日目（点線）でのａｎｔ−１３５ａの適用は、時間に関して、てんかん発作の数の有意な減少をもたらした。対照及びａｎｔ−１３５ａについてＮ＝５。＊＊＊−混合設計反復測定一般線形モデル；ｄａｙ＊処置の相互作用；Ｆ統計量−５．８３４（α＝０．０５についてＦ（２０，６０）＝１．７５）；ｐ＜０．００１。Ｅ）平均てんかん発作期間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の期間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．４７２１）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群よりも有意に短いてんかん発作を示した、スチューデントのｔ検定解析（Ｐ＝０．０００６）による。群あたりｎ＝５。Ｆ）添加発作活動に費やされた時間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作において費やされた総時間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７５４６）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群のマウスよりも、てんかん発作の時間は有意に少ない、スチューデントのｔ検定の分析（Ｐ＝０．００２１）による。ｎ＝５／群。Ｇ）Ａｎｔ−１３５ａ（下部）又は対照（上部）による処置の３日後の自発性てんかん発作の代表的なＥＥＧの追跡。Ｈ）てんかん発作に費やされる総時間−マウスあたり、１日あたりのてんかん発作の総時間（秒）。
【図１３Ｈ】Ａｎｔ−１３５ａは、てんかんのマウス扁桃内カイニン酸モデルにおいててんかん発作の数を低減する。Ａ）ａｎｔ−１３５ａが注射されたマウスにおける、ｍｉＲ−１３５ａ阻害剤プローブについてのＬＮＡ  ＩＳＨ。ｍｉＲ−１３５ａについての強いシグナルが、画像１、２において、同側に（注射された）海馬において観察され、対照は任意のシグナルがなかった。スケールバー２００μｍ。Ａｎｔ−１３５ａは、海馬のＣＡ１、ＣＡ４及びＤＧ領域において、ニューロン細胞によって主に取り込まれた。スケールバー５０μｍ。Ｂ）雄Ｃ５７ＢＬ６成体マウス（約２５ｇ）に、ＥＥＧの記録のために、皮質電極（脳半球の両方）に接続されたＤＳＩ遠隔測定装置を埋め込んだ。適切な術後の回復の後、マウスをＥＥＧに接続し、０日目（Ｄ０）において、扁桃内カイニン酸誘導てんかん重積（ＳＥ）を受けた。遠隔測定装置を切り、７日目（Ｄ０７）に再活動させて、７日の「てんかんベースライン」を記録した。１４日目（Ｄ１４）に、マウスにＡｎｔ−１３５ａ又はそのスクランブル対照を脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）注射し、６日間継続的にモニターした（Ｄ１４〜Ｄ２０；「ｍｉＲ処置期間後」）。Ｃ）てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７４３）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ｄ１５から開始する処置された動物及び対照動物において、てんかん発作の数においてほぼ強い減少があった。Ｄ）７日目（点線）でのａｎｔ−１３５ａの適用は、時間に関して、てんかん発作の数の有意な減少をもたらした。対照及びａｎｔ−１３５ａについてＮ＝５。＊＊＊−混合設計反復測定一般線形モデル；ｄａｙ＊処置の相互作用；Ｆ統計量−５．８３４（α＝０．０５についてＦ（２０，６０）＝１．７５）；ｐ＜０．００１。Ｅ）平均てんかん発作期間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作の期間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．４７２１）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群よりも有意に短いてんかん発作を示した、スチューデントのｔ検定解析（Ｐ＝０．０００６）による。群あたりｎ＝５。Ｆ）添加発作活動に費やされた時間：てんかんベースライン−７日目のてんかんベースラインの間、てんかん発作において費やされた総時間において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった−ｍｉＲ処置前（ｐ＝０．７５４６）。ｍｉＲ処置後−処置の後（Ｄ１４）、Ａｎｔ−１３５ａで処置されたマウスは、対照群のマウスよりも、てんかん発作の時間は有意に少ない、スチューデントのｔ検定の分析（Ｐ＝０．００２１）による。ｎ＝５／群。Ｇ）Ａｎｔ−１３５ａ（下部）又は対照（上部）による処置の３日後の自発性てんかん発作の代表的なＥＥＧの追跡。Ｈ）てんかん発作に費やされる総時間−マウスあたり、１日あたりのてんかん発作の総時間（秒）。
【図１４Ａ】ビオチニル化プローブを使用する、ｍｉＲ−１３５ａのための標的の特定。Ａ）ｍｉＲＮＡ二重設計の概要。成熟鎖（配列番号５）はＣ６リンカーを介して３’ヒドロキシル基にてビオチン分子で標識化される。Ｂ）免疫沈降（ＩＰ）手順を示す図。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をビオチンタグ化プローブでトランスフェクトし、ＩＰをストレプトアビジンビーズを使用して行った。総ＲＮＡを抽出し、ディープＲＮＡをシークエンシングした。Ｎ＝３の生物学的複製／群。Ｃ）ｍｉＲ−１３５ａ及びＳｃｒ  ＩＰ試料におけるＡｇｏ２バンドを示す代表的なＷＢ。ローディング対照としてのベータ−アクチンのみが、インプット試料中に存在する。Ｄ）差次的遺伝子発現を示すインプット及びＩＰのヒートマップ。Ｅ）それらの差次的遺伝子発現に基づく試料のクラスタリングを示すインプット及びＩＰの主成分分析（ＰＣＡ）のプロット。
【図１４Ｂ】ビオチニル化プローブを使用する、ｍｉＲ−１３５ａのための標的の特定。Ａ）ｍｉＲＮＡ二重設計の概要。成熟鎖（配列番号５）はＣ６リンカーを介して３’ヒドロキシル基にてビオチン分子で標識化される。Ｂ）免疫沈降（ＩＰ）手順を示す図。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をビオチンタグ化プローブでトランスフェクトし、ＩＰをストレプトアビジンビーズを使用して行った。総ＲＮＡを抽出し、ディープＲＮＡをシークエンシングした。Ｎ＝３の生物学的複製／群。Ｃ）ｍｉＲ−１３５ａ及びＳｃｒ  ＩＰ試料におけるＡｇｏ２バンドを示す代表的なＷＢ。ローディング対照としてのベータ−アクチンのみが、インプット試料中に存在する。Ｄ）差次的遺伝子発現を示すインプット及びＩＰのヒートマップ。Ｅ）それらの差次的遺伝子発現に基づく試料のクラスタリングを示すインプット及びＩＰの主成分分析（ＰＣＡ）のプロット。
【図１４Ｃ】ビオチニル化プローブを使用する、ｍｉＲ−１３５ａのための標的の特定。Ａ）ｍｉＲＮＡ二重設計の概要。成熟鎖（配列番号５）はＣ６リンカーを介して３’ヒドロキシル基にてビオチン分子で標識化される。Ｂ）免疫沈降（ＩＰ）手順を示す図。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をビオチンタグ化プローブでトランスフェクトし、ＩＰをストレプトアビジンビーズを使用して行った。総ＲＮＡを抽出し、ディープＲＮＡをシークエンシングした。Ｎ＝３の生物学的複製／群。Ｃ）ｍｉＲ−１３５ａ及びＳｃｒ  ＩＰ試料におけるＡｇｏ２バンドを示す代表的なＷＢ。ローディング対照としてのベータ−アクチンのみが、インプット試料中に存在する。Ｄ）差次的遺伝子発現を示すインプット及びＩＰのヒートマップ。Ｅ）それらの差次的遺伝子発現に基づく試料のクラスタリングを示すインプット及びＩＰの主成分分析（ＰＣＡ）のプロット。
【図１４Ｄ】ビオチニル化プローブを使用する、ｍｉＲ−１３５ａのための標的の特定。Ａ）ｍｉＲＮＡ二重設計の概要。成熟鎖（配列番号５）はＣ６リンカーを介して３’ヒドロキシル基にてビオチン分子で標識化される。Ｂ）免疫沈降（ＩＰ）手順を示す図。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をビオチンタグ化プローブでトランスフェクトし、ＩＰをストレプトアビジンビーズを使用して行った。総ＲＮＡを抽出し、ディープＲＮＡをシークエンシングした。Ｎ＝３の生物学的複製／群。Ｃ）ｍｉＲ−１３５ａ及びＳｃｒ  ＩＰ試料におけるＡｇｏ２バンドを示す代表的なＷＢ。ローディング対照としてのベータ−アクチンのみが、インプット試料中に存在する。Ｄ）差次的遺伝子発現を示すインプット及びＩＰのヒートマップ。Ｅ）それらの差次的遺伝子発現に基づく試料のクラスタリングを示すインプット及びＩＰの主成分分析（ＰＣＡ）のプロット。
【図１４Ｅ】ビオチニル化プローブを使用する、ｍｉＲ−１３５ａのための標的の特定。Ａ）ｍｉＲＮＡ二重設計の概要。成熟鎖（配列番号５）はＣ６リンカーを介して３’ヒドロキシル基にてビオチン分子で標識化される。Ｂ）免疫沈降（ＩＰ）手順を示す図。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をビオチンタグ化プローブでトランスフェクトし、ＩＰをストレプトアビジンビーズを使用して行った。総ＲＮＡを抽出し、ディープＲＮＡをシークエンシングした。Ｎ＝３の生物学的複製／群。Ｃ）ｍｉＲ−１３５ａ及びＳｃｒ  ＩＰ試料におけるＡｇｏ２バンドを示す代表的なＷＢ。ローディング対照としてのベータ−アクチンのみが、インプット試料中に存在する。Ｄ）差次的遺伝子発現を示すインプット及びＩＰのヒートマップ。Ｅ）それらの差次的遺伝子発現に基づく試料のクラスタリングを示すインプット及びＩＰの主成分分析（ＰＣＡ）のプロット。
【図１４Ｆ】ビオチニル化プローブを使用する、ｍｉＲ−１３５ａのための標的の特定。Ａ）ｍｉＲＮＡ二重設計の概要。成熟鎖（配列番号５）はＣ６リンカーを介して３’ヒドロキシル基にてビオチン分子で標識化される。Ｂ）免疫沈降（ＩＰ）手順を示す図。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をビオチンタグ化プローブでトランスフェクトし、ＩＰをストレプトアビジンビーズを使用して行った。総ＲＮＡを抽出し、ディープＲＮＡをシークエンシングした。Ｎ＝３の生物学的複製／群。Ｃ）ｍｉＲ−１３５ａ及びＳｃｒ  ＩＰ試料におけるＡｇｏ２バンドを示す代表的なＷＢ。ローディング対照としてのベータ−アクチンのみが、インプット試料中に存在する。Ｄ）差次的遺伝子発現を示すインプット及びＩＰのヒートマップ。Ｅ）それらの差次的遺伝子発現に基づく試料のクラスタリングを示すインプット及びＩＰの主成分分析（ＰＣＡ）のプロット。
【図１５Ａ】ｍｉＲ−１３５ａによって潜在的に制御され得る、各種のプロセスを示すＩＰのための遺伝子オントロジーの用語（Ａ．生物学的プロセス、Ｂ．細胞区画、Ｃ．分子機能）。点線はｐ＝０．０５を示す。Ｄ）転写物の各種セグメントにおいて予測されるシード配列の位置（ｍｉＲ−１３５ａのための標的部位）の重複を示すベン図。Ｅ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの一般的な標的（５０．４％）及び固有の標的を示すベン図。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、シード領域の外側に１つのみ不一致を有する同じ成熟配列を含有し、そのようにしてそれらは、類似の標的を実質的に標的にすることができる。
【図１５Ｂ】ｍｉＲ−１３５ａによって潜在的に制御され得る、各種のプロセスを示すＩＰのための遺伝子オントロジーの用語（Ａ．生物学的プロセス、Ｂ．細胞区画、Ｃ．分子機能）。点線はｐ＝０．０５を示す。Ｄ）転写物の各種セグメントにおいて予測されるシード配列の位置（ｍｉＲ−１３５ａのための標的部位）の重複を示すベン図。Ｅ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの一般的な標的（５０．４％）及び固有の標的を示すベン図。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、シード領域の外側に１つのみ不一致を有する同じ成熟配列を含有し、そのようにしてそれらは、類似の標的を実質的に標的にすることができる。
【図１５Ｃ】ｍｉＲ−１３５ａによって潜在的に制御され得る、各種のプロセスを示すＩＰのための遺伝子オントロジーの用語（Ａ．生物学的プロセス、Ｂ．細胞区画、Ｃ．分子機能）。点線はｐ＝０．０５を示す。Ｄ）転写物の各種セグメントにおいて予測されるシード配列の位置（ｍｉＲ−１３５ａのための標的部位）の重複を示すベン図。Ｅ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの一般的な標的（５０．４％）及び固有の標的を示すベン図。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、シード領域の外側に１つのみ不一致を有する同じ成熟配列を含有し、そのようにしてそれらは、類似の標的を実質的に標的にすることができる。
【図１５Ｄ】ｍｉＲ−１３５ａによって潜在的に制御され得る、各種のプロセスを示すＩＰのための遺伝子オントロジーの用語（Ａ．生物学的プロセス、Ｂ．細胞区画、Ｃ．分子機能）。点線はｐ＝０．０５を示す。Ｄ）転写物の各種セグメントにおいて予測されるシード配列の位置（ｍｉＲ−１３５ａのための標的部位）の重複を示すベン図。Ｅ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの一般的な標的（５０．４％）及び固有の標的を示すベン図。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、シード領域の外側に１つのみ不一致を有する同じ成熟配列を含有し、そのようにしてそれらは、類似の標的を実質的に標的にすることができる。
【図１５Ｅ】ｍｉＲ−１３５ａによって潜在的に制御され得る、各種のプロセスを示すＩＰのための遺伝子オントロジーの用語（Ａ．生物学的プロセス、Ｂ．細胞区画、Ｃ．分子機能）。点線はｐ＝０．０５を示す。Ｄ）転写物の各種セグメントにおいて予測されるシード配列の位置（ｍｉＲ−１３５ａのための標的部位）の重複を示すベン図。Ｅ）ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの一般的な標的（５０．４％）及び固有の標的を示すベン図。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、シード領域の外側に１つのみ不一致を有する同じ成熟配列を含有し、そのようにしてそれらは、類似の標的を実質的に標的にすることができる。
【図１６Ａ】Ｂｉｏ−ＩＰ標的の検証。Ａ）少数の選択された標的を、ｑＰＣＲによって試験し、インプットと比較してＩＰ試料中で有意な濃縮を見出した。Ｎ２Ａ細胞中でのｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後、β−アクチンに対して正規化されたＧＲ（Ｂ−Ｂ１）、ＰｌｘｎＡ４（Ｃ−Ｃ１）及びＭｅｆ２ａ（Ｄ−Ｄ１）のタンパク質レベルを示す棒グラフ及び代表的なブロット画像。すべての検証された標的は、スクランブル条件と比較して、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に有意に下方制御された。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。
【図１６Ｂ】Ｂｉｏ−ＩＰ標的の検証。Ａ）少数の選択された標的を、ｑＰＣＲによって試験し、インプットと比較してＩＰ試料中で有意な濃縮を見出した。Ｎ２Ａ細胞中でのｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後、β−アクチンに対して正規化されたＧＲ（Ｂ−Ｂ１）、ＰｌｘｎＡ４（Ｃ−Ｃ１）及びＭｅｆ２ａ（Ｄ−Ｄ１）のタンパク質レベルを示す棒グラフ及び代表的なブロット画像。すべての検証された標的は、スクランブル条件と比較して、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に有意に下方制御された。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。
【図１６Ｃ】Ｂｉｏ−ＩＰ標的の検証。Ａ）少数の選択された標的を、ｑＰＣＲによって試験し、インプットと比較してＩＰ試料中で有意な濃縮を見出した。Ｎ２Ａ細胞中でのｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後、β−アクチンに対して正規化されたＧＲ（Ｂ−Ｂ１）、ＰｌｘｎＡ４（Ｃ−Ｃ１）及びＭｅｆ２ａ（Ｄ−Ｄ１）のタンパク質レベルを示す棒グラフ及び代表的なブロット画像。すべての検証された標的は、スクランブル条件と比較して、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に有意に下方制御された。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。
【図１６Ｄ】Ｂｉｏ−ＩＰ標的の検証。Ａ）少数の選択された標的を、ｑＰＣＲによって試験し、インプットと比較してＩＰ試料中で有意な濃縮を見出した。Ｎ２Ａ細胞中でのｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後、β−アクチンに対して正規化されたＧＲ（Ｂ−Ｂ１）、ＰｌｘｎＡ４（Ｃ−Ｃ１）及びＭｅｆ２ａ（Ｄ−Ｄ１）のタンパク質レベルを示す棒グラフ及び代表的なブロット画像。すべての検証された標的は、スクランブル条件と比較して、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に有意に下方制御された。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊ｐ＜０．０５。ｔ検定。
【図１７Ａ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｂ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｃ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｄ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｅ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｆ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｇ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｈ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｉ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｊ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｋ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｌ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【図１７Ｍ】ＴＬＥにおけるＭｅｆ２ａ。Ａ）高度に保存されたｍｉＲ−１３５ａ標的部位を有するＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲの概要。Ｂ）ｍｉＲ−１３５ａの標的部位を、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２ベクターの複数のクローニング部位にライゲーションし、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを用いて結合について試験した。ｍｉＲ−１３５ａ  ＷＴ、並びにｍｉＲ−１３５ａミミックあり及びなしで共トランスフェクトされたＭｅｆ２ａの３’−ＵＴＲから単離された成熟結合部位を運ぶコンストラクトでトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。Ｎ＝３の独立したトランスフェクションを、各回４ウェル／条件で行った。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される、＊＊ｐ＜０．０１。ｔ検定。Ｃ）棘突起密度について定量化された二次尖端樹状突起を示す代表的な画像。解離したニューロンを、ｄｉｖ１３に、ｍｉＲ−１３５ａ（Ｍｅｆ２あり又はなし）又は対照ベクターでトランスフェクトし、固定し、ｄｉｖ１７に分析した。Ｄ）定量化された異なる種類の棘突起を示す図。Ｅ）定量化を示すヒストグラム、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後の棘突起の密度の低減が観察され、この効果はＭｅｆ２による共トランスフェクションによってレスキューされた。ｎ＝１２〜２２のニューロンを３回の独立したトランスフェクションから分析した。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析複数群比較。Ｆ）異なる棘突起の種類のパーセンテージを示すグラフ。未成熟型の棘突起の増加は、Ｍｅｆ２共発現後にレスキューされたｍｉＲ−１３５ａの過剰発現後に観察された。Ｇ）強い低減が見出された、ＳＥの２週間後での対照及びＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｈ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝５の対照、Ｎ＝４のＫＡマウスの海馬。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｉ）ＩＡＫマウスにおけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。Ｊ）対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ患者の海馬におけるＭｅｆ２ａの代表的なＷＢ画像。Ｋ）β−アクチンに対して正規化された総タンパク質レベルの定量化。Ｎ＝６の対照、Ｎ＝４のｍＴＬＥ＋ＨＳ。データは、平均、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５。マンホイットニー検定。Ｌ）対照並びにｍＴＬＥ＋ＨＳの歯状回（ＤＧ）及びＣＡ領域におけるＭｅｆ２ａ染色の代表的な画像。スケール５０μｍ。Ｍ）対照及びａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスにおけるＭｅｆ２ａの免疫染色。スケールバー１００μｍ。
【実施例】
【０３２５】
実施例１．ｍｉＲＮＡをコードするレンチウイルスライブラリーの生成
ヒトｍｉＲＮＡを、公共のｍｉＲＮＡリポジトリ（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）及び独占所有物の小ＲＮＡディープシークエンシングデータベースＳＩＲＯＣＣＯ（国際公開第２００７／０８１２０４号を参照されたい）の両方から選択した。ｍｉＲＮＡ配列を、全長ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピン及び両側に５０〜１５０塩基対のフランキング配列を含有するアンプリコンを用いて、それらのゲノム位置から増幅した。アンプリコンについてのプライマーは、プライマー３（Ｐｒｉｍｅｒ３）ソフトウェア（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ）のカスタム実行を用いて設計した。プライマー設計プログラムが、指定した配列中に適当なプライマーを見つけることができない場合、フランキング配列についての要件を０〜２００塩基対に調整した。設計したプライマーは、５’ＧＣＧＣオーバーハング及び定方向クローニングのための制限酵素部位で補った。デフォルトとして、ｍｉＲＮＡの上流のプライマーは、ＢａｍＨＩ制限酵素部位（ＧＧＡＴＣＣ）で補い、ｍｉＲＮＡの下流のプライマーは、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位（ＧＡＡＴＴＣ）で補った。内部にＢａｍＨＩ又はＥｃｏＲＩ制限酵素部位を有する（すなわち、ゲノム配列中に出現する）アンプリコンのプライマーは、それぞれ、ＢｇｌＩＩ部位（ＡＧＡＴＣＴ）又はＸｂａＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ）のいずれかで補った。ｍｉＲＮＡを、上述のプライマーを使用して、単一の個体のヒトゲノムＤＮＡから、以下のＰＣＲ反応で増幅した。
【０３２６】
【表１】
2021501594.tif 000002
【０３２７】
全てのｍｉＲＮＡ遺伝子座を、別々の１０μｌのＰＣＲ反応において増幅した。生成物を、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップ（Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ）緩衝液セット及びＷｈａｔｍａｎユニフィルター（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ）ＧＦ／Ｃフィルタープレート（カタログ番号７７００−１１０１）を使用して、精製した。ＤＮＡを、ウェル当たり１７μｌのＨ２Ｏを用いて溶出した。別々の溶出物を、以下の制限反応において使用した。
【０３２８】
【表２】
2021501594.tif 000003
【０３２９】
【表３】
2021501594.tif 000004
【０３３０】
得られたライゲートを、細菌（Ｐｒｏｍｅｇａシングルステップ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｅｐ）（ＫＲＸ）コンピテント細胞、カタログ番号Ｌ３００２）に別々に形質転換した。５０μｌのコンピテント細胞を、９５０μｌの形質転換緩衝液ＩＩ（１０ｍＭのＭＯＰＳ、７５ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＲｂＣｌ、１５％のグリセロール、フィルター滅菌済み）で希釈した。２０μｌのライゲートあたり、２０μｌの希釈コンピテント細胞を添加した。混合物を氷上で１５分間インキュベートし、３７℃で３０秒間、熱ショックを与え、氷上に戻した。２分後、形質転換された細菌を、１５０μｌのルリア培地（ＬＢ）で再構成した。細菌を、３７℃で２０分間回復させ、その後、それらを、アンピシリン含有（５０μｇ／ｍＬ）ＬＢ−寒天プレート上に別々に蒔き、３７℃で終夜成長させた。
【０３３１】
それぞれのプレートの単一コロニーを採取し、４００μｌのアンピシリン含有（５０μｇ／ｍＬ）ＬＢ中において、終夜、継代培養する。１μｌの継代培養物を、シークエンシングの目的のために、１００μｌの水に溶解する。細菌溶解物を、以下のＰＣＲ反応において使用する。
【０３３２】
【表４】
2021501594.tif 000005
【０３３３】
ＰＣＲ生成物を、２５倍希釈した。１μｌの希釈ＰＣＲ生成物を、以下のサンガーシークエンシング反応において使用した。
【０３３４】
【表５】
2021501594.tif 000006
【０３３５】
３０μｌの沈殿物の混合物（８０％のエタノール、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）を、それぞれのシークエンシング反応生成物に添加した。混合物を１０秒間ボルテックスし、５０００ｒｃｆ（相対的遠心力）で、４℃で４５分間、スピンダウンした。上清を吸引し、ＤＮＡペレットを３０μｌの氷冷した８０の％エタノールで洗浄し、５０００ｒｃｆで、４℃で５分間、スピンした。上清を吸引し、ＤＮＡペレットをヒートブロック上で、１０分間、乾燥した。乾燥ＤＮＡペレットを１０μｌのＨ２Ｏに溶解した。得られたＤＮＡ溶液を、ＡＢＩ  ３７３０ＸＬ  ＤＮＡアナライザーでシークエンシングした。配列を、予期されるゲノム配列と比較した。正しいクローンをライブラリーに加えた。正しくないクローンについて、追加の４つの細菌のコロニーを採取し、挿入配列について分析した。
【０３３６】
ライブラリーコンストラクトを、５０ｍＬのアンピシリン含有（１００μｇ／ｍＬ）ＬＢで、終夜、継代培養し、Ｑｉａｇｅｎエンドフリー（ＥｎｄｏＦｒｅｅ）プラスミド緩衝液セット（カタログ番号１９０４８）で補ったＱｉａｇｅｎキアフィルター（ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ）プラスミドミディキット（カタログ番号１２２４５）を用いて、製造者の使用説明書に従って、単離した。ＤＮＡを、供給されたＴＥ緩衝液に溶解し、５００ｎｇ／μｌの最終濃度にした。
【０３３７】
発明者らは、自身でクローニングできなかったコンストラクトを、ミニ遺伝子として、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文した。これらの場合において、それぞれの部位に隣接する全長ヘアピンプラス２０塩基対を、ＩＤＴによるサービスとして、発明者らのベクターにクローニングした。
【０３３８】
パッケージング及びウイルス生成を、ＣＤ−５００Ｂ１−ＣＤ５２３−Ａ１のユーザマニュアルに記載されるようにして、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって行った。
【０３３９】
実施例２．ＣＮＳ軸索成長の制御因子としてｍｉＲＮＡ−１３５を特定する画像に基づくｍｉＲＮＡスクリーニング及びクルッペル様因子４の標的化による再生
材料及び方法
動物
すべての動物の使用及びケアは、組織のガイドラインに従って行い、地域の動物実験倫理委員会（ＤＥＣ）によって承認された。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ＿ＪＡＸ：０００６６４、雄及び雌）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。指定の時点で妊娠した雌を使用した場合、腟栓が検出された朝を胎生０．５日（Ｅ０．５）と考えた。仔について、生まれた日を出生日（Ｐ０）と考えた。
【０３４０】
レンチウイルスヒト全ｍｉＲｎｏｍｅライブラリーのハイコンテントスクリーニング及びヒットの確認
ＤＳＭＺから入手したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Ａｃｃ  ２０９、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００１９）を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％のＦＣＳ＋Ｌ−グルタミン＋ペニシリン／ストレプトマイシン中で成長させ、１２及び２１の継代の間で使用した。細胞を、６０００細胞／ウェルで、自動細胞播種機マルチドロップ  コンビ  リージェント  ディスペンサー（Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、９６ウェルプレートに播種した。播種の１日後、細胞を６０μＭのレチノイン酸で処理し、平均７．３４＊１０５ＩＦＵ／ウェル（ＩｎｔｅＲＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、レンチウイルスヒトゲノム−ワイドｍｉＲＮＡライブラリーを用いて形質導入した。それぞれのライブラリーのプレートを三反復で評価した。レンチウイルスライブラリーは、６４０個の注釈付きのヒトｍｉＲＮＡ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  １２）、及びディープシークエンシングの試みからの４００個の候補ｍｉＲＮＡを含有し、ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−Ｐｕｒｏベクター（Ｎｏ  ＣＤ５１０Ｂ−１、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｐｏｅｌｌら、２０１１年）に基づいていた。Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅが行ったレンチウイルスのパッケージ及びライブラリーは、平均１．２２＊１０９のＩＦＵ／ｍｌを有していた。ライブラリーを１４個の９６ウェルプレート中で保管した。インビトロで４日目（ＤＩＶ）に、細胞を１：１のＰＢＳ中の８％のパラホルムアルデヒドの添加によって固定し、ＰＢＳ中の０．４％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５％のヤギ血清、１％のＢＳＡ、１％のグリシン及び０．１％のリジン中でブロッキングした。細胞を、アレクサ４８８コンジュゲート二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてβＩＩＩ−チューブリン（１：３０００、マウスモノクローナルＴ８６６０、Ｓｉｇｍａ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７７５９０）について免疫染色し、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。細胞を、アクアマックス（ＡｑｕａＭａｘ）２０００（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、２回の洗浄サイクルによって完全に自動で洗浄した。自動顕微鏡法を、サーモアレイスキャンＶＴＩ  ＨＣＳリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行い、形態学的特徴を、セロミクスニューロナルプロファイリングＶ３バイオアプリケーション（Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）アルゴリズムを用いて抽出した。生データ（．ｍｄｂファイル）を、カスタムスクリプト（Ｒｏｎａｌｄ  ｖａｎ  Ｋｅｓｔｅｒｅｎ、Ｖｒｉｊｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍの厚意）を使用して、エクセル形式に変換した。有効な核のカウントが１００を下回るすべてのウェルを除いた。非ニューロン特質及び細胞数に依存する特質をデータセットからトリミングした。すべての他の特質について、プレートの中央値を算出した。それぞれのウェルのそれぞれの特質を、対照の中央値の標準偏差から２倍を超えて逸脱した場合に、正のスコア（１）で、２値（０又は１）でスコア化した。ほとんどのｍｉＲＮＡが細胞形態に影響を与えないであろうと仮定して、すべてのｍｉＲＮＡの中央値���、対照として使用した。それぞれのプレートの三反復を組み合わせ、ウェルの特質を、３つのプレートのうちの最低２つで正にスコア化された場合に、「真」とした。これは、最終（累積的）「ヒットスコア」をもたらし、これを、ニューロンの形態に対する効果を有するレンチウイルスのクローンをランク付けするために使用した。
【０３４１】
ヒットの確認のために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、トリプシン処理によって収集し、ＰＢＳで洗浄し、ＩＮＢ緩衝液（１３５ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．３）に、８＊１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。次いで、細胞を、２０ｐｍｏｌのｍｉＲＩＤＩＡＮミミック（常にヒト（ｈｓａ）アイソフォーム、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、ＰＥＰキュベットモジュール（すべてＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を備えたＥＣＭ  ８３０方形波発生器において、１ｍｍのギャップサイズのキュベットで、９００マイクロ秒の３回の１２０Ｖパルス及び２秒のパルス間隔でエレクトロポレーションした。この方法において、９８％を上回る細胞がエレクトロポレーションされる。それぞれのエレクトロポレーションを、分け、２４ウェルプレートの４ウェルにわたって均等に分配し、可能性があるエッジウェル効果を考慮に入れるために、外側の左及び右のウェル細胞なしのままにした。エレクトロポレーションの１日後、細胞を６０μＭのレチノイン酸で処理して、ニューロン様特徴の発達を誘導した。エレクトロポレーションの４日後、細胞を、上記のようにして、固定及び免疫染色した。形態学的な細胞の特徴の分析を、上記で概要を述べたセロミクスソフトウェアを使用して行った。
【０３４２】
ロックド核酸（ＬＮＡ）のインサイチュハイブリダイゼーション
Ｅ１６．５のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胚を収集し、断頭した。脳を、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡで固定し、ＰＢＳ中の３０％のスクロース中で凍結保護した。２０μｍ厚さの冠状の脳の凍結切片を作製した。ＬＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションを、以前に記載されているようにして（Ｋａｎら、２０１２年）、行った。簡潔には、切片を風乾し、４％のＰＦＡ中で１０分間、後固定し、アセチル化し（室温で１０分）、プロテイナーゼＫ（５μｇ／ｍｌ、室温で５分間）で処理し、プレハイブリダイズ（室温で１時間、５５℃で３０分）した後、１５ｎＭのＬＮＡを含有する二重ＤＩＧで標識化された、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ又は対照のインサイチュプローブ（Ｅｘｉｑｏｎ）とともに、インキュベートした（５５℃で２時間）。ハイブリダイゼーションの後、スライドを、０．２×ＳＳＣ中、５５℃で１時間洗浄した。スライドを、ＰＢＳ中の１０％のＦＣＳで１時間ブロッキングし、ブロッキング緩衝液中において、抗ジゴキシゲニンＡＰ  Ｆａｂ断片（１：２５００、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とともに、４℃でインキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、スライドを、ニトロブルー及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）基質とともに、室温で２〜２０時間インキュベートした。染色を、ＰＢＳ中でのスライドの洗浄によって終了させた。スライドを、ＰＢＳ中の９０％のグリセロールにマウントした。スクランブル化ＬＮＡ−ＤＩＧプローブで染色された切片は、特異的染色がなかった。
【０３４３】
定量的ＰＣＲ
Ｅ１４．５及びＥ１６．５のＣ５７ＢＬ／６胚、Ｐ０及びＰ１０の仔、並びに成体マウスを断頭し、脳を取り出した。海馬及び皮質を、解離し、ドライアイス上で直ぐに凍結した。総ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者のプロトコールに従って、３頭の異なる同腹仔からの少なくとも３頭の動物から単離した。加えて、総ＲＮＡを、ＤＩＶ２、７、１４及び２１にて、２つの異なる培養物の３〜４枚のカバースリップからの初代海馬ニューロンから単離した。さらにまた、総ＲＮＡを、視神経の挫滅実験及びｍｉＲＮＡミミックの硝子体内注射の１４日後の網膜から単離した（視神経損傷実験を記載する段落を参照されたい）。ＲＮＡ量をナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定し、等量のそれぞれの試料を、一般的なｃＤＮＡ合成キット（Ｅｘｉｑｏｎ）を使用するファーストストランドｃＤＮＡ合成のために使用した。定量的ＰＣＲ反応を、マイクロＲＮＡ  ＬＮＡ（商標）ＰＣＲプライマーセット及びＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ）（Ｅｘｉｑｏｎ）を使用して、クオントスタジオ（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ）６フレックスリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。すべての試料は二反復で行った。Ｃｔ値をクオントスタジオリアルタイムｐｃｒソフトウェアｖ１．１を使用して決定した。異なるｍｉＲＮＡの発現レベルを、５５ｒＲＮＡに対する正規化によって推定し、統計学的有意性を、単一因子分散分析で分析した。ｐ＜０．０５を有意であるとして評価した。
マウス海馬及び皮質ニューロンの培養及びトランスフェクション
海馬及び皮質培養物を、以前に記載のようにして（Ｖａｎ  Ｂａｔｔｕｍら、２０１４年）、生成した。簡潔には、Ｐ０〜Ｐ１のＣ５７ＢＬ／６マウスの仔を断頭し、脳を氷冷した解離培地に素早く取り出した。海馬又は皮質を解離し、トリプシン処理し、単一細胞に分離した。それらを、１２ウェルプレートにおいて、Ｂ−２７、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン及びβ−メルカプトエタノールで補充されたｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中、酸洗浄されたポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ、２０μｇ／ｍｌ）及びラミニン（４０μｇ／ｍｌ）でコーティングされたガラスカバースリップ上で、３７℃＋５％のＣＯ２で、培養した。ＤＩＶ１に、ニューロンを、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ若しくは対照−１ミミック（陰性対照−Ａとしても公知、すべてＤｈａｒｍａｃｏｎから入手）について、ウェルあたり、０．５μｇのＣＡＧ−ＧＦＰベクター及び５０ｐｍｏｌのｍｉＲＩＤＩＡＮミミックで、又はｍｉＲ−１３５ａ若しくはｍｉＲ−１３５ｂ（Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ）について、ウェルあたり、０．５μｇのｍｉＲＮＡ  Ｈ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−スポンジベクターで、共トランスフェクトした。レスキュー実験のために、ｐＣＭＶ−ＫＬＦ４−ＥＧＦＰベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用した。ＤＩＶ４に、ニューロンをＰＢＳ中の４％のＰＦＡ及び４％のスクロースで固定した。免疫細胞化学のために、ニューロンを、ＰＢＳ中の３％の正常ウマ血清、０．１％のＢＳＡ及び０．１％のｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００に溶解した、ウサギ抗ＧＦＰ（１：１０００、Ａ−１１１２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２１５６９）又はウサギ抗ＲＦＰ（１：１０００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１１１８２８０７）及びマウス抗βＩＩＩチューブリン（１：３０００、Ｔ８６６０、Ｓｉｇｍａ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７７５９０）と共にインキュベートした。画像をアクシオスコップ（Ａｘｉｏｓｋｏｐ）２  ＥＰＩ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して取得した。最も長い神経突起を、イメージＪ（ＩｍａｇｅＪ）のニューロンＪ（ＮｅｕｒｏｎＪ）プラグイン（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００２０７４）を使用して、半手動で追跡し、ｓｈｏｌｌ分析を、イメージＪソフトウェア（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００３０７０）を使用して行った。少なくとも３つの独立した実験からの１００を超えるトランスフェクトされたニューロンを追跡した。対応のないパラメトリックＴ検定を、プリズム６（Ｐｒｉｓｍ６）（Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００２７９８）で行って、データを統計的に分析した。
【０３４４】
ｍｉＲＮＡ標的の所見及び検証
ＭｉＲｅｃｏｒｄｓデータベースを使用して、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの共有ｍＲＮＡ標的について調べ、少なくとも６つの標的予測プログラムによって予測した（Ｘｉａｏら、２００９年）。
【０３４５】
ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂによって共有される予測された標的は、ニューロンの発達における可能性のある関与に基づいて事後選択した。標的の検証のために、ＫＬＦ４からの全３’−ＵＴＲを、ｃＤＮＡから回収し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。ＫＬＦ４  ３’−ＵＴＲのＰＣＲ媒介変異生成を、ＫＬＦ４  ３’−ＵＴＲの３９４ｎｔに位置する結合部位を変更するために行った（図５Ａ、矢印）。ＨＥＫ２９３細胞（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００４５）を、リポフェクタミンを使用して、２５０ｎｇのベクター及び２０ｐｍｏｌのｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉＲＮＡミミック（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）でトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの２４時間後、溶解し、分光光度計においてデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｅ１９６０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて調べた。Ｔ検定を行って、プリズム６（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００２７９８）においてルシフェラーゼ活性を比較した。
【０３４６】
タンパク質分析のために、ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉＲＮＡミミック（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を、リポフェクタミン２０００を使用して、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞（ＡＴＣＣ、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿０４７０）にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を、溶解緩衝液（ＭＱ中の、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ８．０、１５０ｍＭのＫＣＬ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））に溶解した。試料を、８％のＳＤＳ−ｐａｇｅゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上でブロットした。非特異的結合を、ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ中の５％のミルクで、室温で１時間ブロッキングした。ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ中の１％のミルク中のウサギ抗ＫＬＦ４（１：５００、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿６６９５６７）及びマウス抗β−アクチン（１：５０００、Ｓｉｇｍａ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７６７４３）とのインキュベーションの後、ブロットを、ペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（Ａｂｃａｍ）で染色した。シグナルを、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＥＣＬウェスタン検出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して検出し、画像を、フルオロケム（ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ）Ｍイメージングシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）を使用して作製した。イメージＪを使用して、個々のバンド中のタンパク質レベルを決定し、ＫＬＦ４の発現を、同じ試料中のβ−アクチンレベルに対して正規化した。Ｔ検定を行って、条件の間で、相対ＫＬＦ４の発現を比較した（Ｇｒａｐｈｐａｄプリズム６ソフトウェア、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００２７９８）。
【０３４７】
免疫組織化学的検査
Ｅ１６．５のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胚又は生体マウスを収集し、断頭した。脳を、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡで固定し、ＰＢＳ中の３０％のスクロース中で凍結保護した。２０μｍ厚さの冠状の脳の凍結切片を作製した。切片を、ＰＢＳ中の３％のＢＳＡ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で希釈されたウサギ抗ＫＬＦ４（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、１：５００（もはや入手可能ではない）又はＬａｂＮｅｄ  ＬＮ２０２３８８０  １：１００、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６８７５５７）と共にインキュベートし、アレクサフルオールコンジュゲート二次抗体で染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。画像を、アクシオスコープ（ＡｘｉｏＳｃｏｐｅ）ＥＰＩ−蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）及び共焦点走査型顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して作製した。
【０３４８】
エクスビボエレクトロポレーション
エクスビボエレクトロポレーションを、以前に記載のようにして（Ｙａｕら、２０１４年）、行った。簡潔には、妊娠したＣ５７Ｂｌ／６マウスを頸椎脱臼によって屠殺し、Ｅ１４．５の胚を素早く取り出し、断頭した。０．４μｇ／μｌのｐＣＡＧ−ＧＦＰベクターと組み合わされたｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ又は対照−１について、３０μＭのｍｉＲＩＤＩＡＮミミック（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を、ＭＱ中の０．１％のファストグリーン（Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ）に溶解し、１．７μｌのこの混合物を、ガラスマイクロピペット（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）及びマイクロインジェクターを使用して、側脳室に注射した。頭部を、金メッキ遺伝子パドル電極及び８３０方形波発生器（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、１００ミリ秒のパルス間隔で、３０Ｖの３回の１００ミリ秒のパルスに付した。次いで、脳を単離し、ｃＨＢＳＳ中で収集し、ｃＨＢＳＳ中の３％のＬＭＰ−アガロース（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に包埋し、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して２５０μｍ厚さの薄片に冠状の切片を作った。切片を、ポリ−Ｄ−リジン−ラミニンでコーティングされた培養膜インサート（Ｆａｌｃｏｎ）上で収集し、スライス培養培地（７０％ｖ／ｖの基本イーグル培地、２６％ｖ／ｖのｃＨＢＳＳ、２０ｍＭのＤ−グルコース、１ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン）の上に置き、４日間培養して、移動の程度を評価した。培養物を、４％のＰＦＡで固定し、ＰＢＳ中の３％のＢＳＡ及び０．１％のｔｒｉｔｏｎ中でブロッキングし、ウサギ抗ＧＦＰ（１：１０００、Ａ−１１１２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２１５６９）及びマウス抗ＭＡＰ２  ＳＭＩ  ５２（１：１０００、Ａｂｃａｍ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿７７６１７３）抗体で染色した。Ｚ−スタック画像を、共焦点レーザー走査性顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して取得した。ＧＦＰ陽性細胞の移動を以下のようにして分析した：瓶１は脳室帯（ｖｚ）を含み、瓶８は周辺帯（ｍｚ、図４Ａに概略的に示す）をカバーするように、Ａｄｏｂｅフォトショップ（登録商標）（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）を使用して、８つの等しい瓶に分けられた一貫性のある長方形を画像の上に配置した。それぞれの瓶における細胞をカウントし、長方形中の細胞の総量によって割った。それぞれの画像の少なくとも２つの長方形の平均を比較のために使用した。それぞれの条件について、少なくとも３つの異なる実験からの１２個の皮質薄片を使用した。非パラメトリックマンホイットニーＵ検定をプリズム６（Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００２７９８）で行って、対照及びｍｉＲＮＡ過剰発現の間で、移動を比較した。
【０３４９】
子宮内エレクトロポレーション
子宮内エレクトロポレーションを、以前に記載のようにして（ｖａｎ  Ｅｒｐら、２０１５年）、行った。Ｅ１４．５の妊娠したＣ５７Ｂｌ／６マウスを、イソフルレン（導入：３〜４％、外科手術：１．５〜２％）で深く麻酔し、生理食塩水中の０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィン塩酸塩を注射し、その後、腹腔を、無菌外科手術条件下で開いた。子宮角を露出させ、０．０５％のファストグリーン（Ｓｉｇｍａ）を有するＭＱに溶解された、０．４μｇ／μｌのｐＣＡＧ−ＧＦＰ、並びに１５μＭのｍｉＲ−１３５ａ及び１５μＭのｍｉＲ−１３５ｂミミック、又は３０ｐｍｏｌの対照−１ミミック、又は０．６μｇ／μｌのスクランブル化スポンジベクター、又は０．３μｇ／μｌのｍｉＲ−１３５ａスポンジベクター及び０．３μｇ／μｌのｍｉＲ−１３５ｂスポンジベクター（Ｈ１−ｍＣｈｅｒｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ）を含有する、１．７μｌのＤＮＡ混合物を、ガラスマイクロピペット（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）及びＰＬＩ−１００ピコインジェクター（Ｐｉｃｏ−ｉｎｊｅｃｔｏｒ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、胚の側脳室に注射した。レスキュー実験のために、０．２μｇ／μｌのｐＣＡＧ−ＧＦＰを、０．２μｇ／μｌのｐＣＡＧ−ＫＬＦ４、並びに１５μＭのｍｉＲ−１３５ａ及び１５μＭのｍｉＲ−１３５ｂミミックと組み合わせた。脳を、３０Ｖ（５０ミリ秒のパルス長間隔及び９５０ミリ秒のパルス長）での５単極性パルスに設定したＥＣＭ  ８３０エレクトロ−スクエア−ポレーター（Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｓｑｕａｒｅ−Ｐｏｒａｔｏｒ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、エレクトロポレーションした。運動皮質を、第３の金メッキされたジーンパドル（Ｇｅｎｅｐａｄｄｌｅ）（正極、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を頭部の上に配置しながら、白金ピンセット電極（負極）で頭部を支えることによって、標的にした。胚を腹部に戻し、腹筋及び皮膚を別々に縫合した。イソフルレンから解放し、親マウスを目覚めさせた。胚をＥ１６．５で、仔をＥ４又はＰ１０で、収集した。頭部を、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡで固定し、３０％のスクロースに浸漬した。２０μｍ厚さの皮質凍結切片を作製し、免疫組織化学的検査及び皮質の移動分析を、エクスビボエレクトロポレーションの薄片について記載のようにして行った。インビボの神経突起伸長を測定するために、リーディングプロセスの長さをイメージＪを使用して追跡した。脳をＨ１−ｍＣｈｅｒｒｙスポンジベクター（Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ）を用いてエレクトロポレーションした内因性ｍｉＲ−１３５の下方制御の場合において、ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さを、ウサギ抗ＲＦＰ（１：１０００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１１１８２８０７）による染色の際に分析した。対照及びｍｉＲＮＡの試験条件は、子宮中での胚の間で常に均等に割り振った。分析は、常に、脳梁が最初に完成した薄片、及び１つ又は２つの連続的な薄片で行った。少なくとも２つの別々の実験からの少なくとも５つの胚を比較のために使用した。
視神経損傷及びインビボ遺伝子トランスフェクション
３週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＳＬＣ  ｃｏｍｐａｎｙ（浜松、日本）から入手した。視神経損傷を、以前に詳細に記載されているようにして（ｖａｎ  Ｅｒｐら、２０１５年）、行った。左視神経を、視神経乳頭の後方およそ１ｍｍを１０秒間精密鉗子で挫滅した。５０ｐｍｏｌ／μｌのｍｉＲ−１３５ａ及び５０ｐｍｏｌ／μｌのｍｉＲ−１３５ｂ又は１００ｐｍｏｌ／μｌの対照−１ミミックを、損傷の直後及び軸索切断の７日後に、（リポフェクタミンを用いて）硝子体内に注射した。インビボ遺伝子トランスフェクションを、以前に記載されているようにして（ｖａｎ  Ｅｒｐら、２０１５年）、行った。簡潔には、ｐＣＡＧ−ＧＦＰ又はｐＣＡＧ−ＫＬＦ４を、ｍｉＲＮＡミミック及びリポフェクタミン２０００と混合した。２μｌの複合体を、損傷の直後及び軸索切断の７日後に、硝子体内に注射した。各群について９頭のマウスを使用した。同様に、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを特異的に標的にする４μｇのスポンジベクター、又は対照スポンジ（Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ）を、（リポフェクタミンを用いて）硝子体内に注射した。群あたり６頭のマウスを使用した。ＡＡＶウイルス（ＡＡＶ−ｍｉＲ−ＧＦＰ−ブランク対照ウイルス、カタログ番号：Ａｍ００１０２、ＧＦＰ  ｍｍｕ−ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ  ＡＡＶ  ｍｉＲＮＡウイルス、カタログ番号：Ａｍｍ１００６８０２、ＧＦＰ  ｍｍｕ−ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ  ＡＡＶ  ｍｉＲＮＡウイルス、カタログ番号：Ａｍｍ１００７００２、ａｂｍ）を、視神経の挫滅損傷の７日前に注射した。ＲＧＣ軸索を可視化するために、アレクサフルオール５５５（２μｇ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とコンジュゲートした１μｌのコレラ毒素βサブユニットを、損傷の１２日後に、ガラス針を用いて硝子体に注射した。軸索切断の１４日後に、動物を４％のＰＦＡで灌流した。付着した神経セグメントを有する眼杯を後固定し、３０％のスクロースに４℃で終夜浸漬した。組織を、ティシューテク（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ）に包埋し、クリオスタットを使用して、連続断面（１６μｍ）を調製し、ＭＡＳでコーティングされたスライドガラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ、大阪、日本）上で収集した。軸索の再生を、５つのセクションにおいて、病変部位の遠位端から０．２、０．５、及び１．０ｍｍ伸展したＣＴＢ標識化線維の数をカウントすることによって定量化した。視神経の横断面の幅をカウントを行った時点で測定し、神経の幅１ミリメートルあたりの軸索の数を算出するために使用した。次いで、１ミリメートルあたりの軸索の数を、５つの切片にわたって平均した。半径ｒを有する神経において距離ｄが伸展した軸索の総数であるΣａｄを、厚さｔ（１６μｍ）を有するすべての切片を合計することによって推定した：Σａｄ＝πｒ２×［平均軸索／ｍｍ］／ｔ。統計分析を一元配置分散分析を使用して行った。ｐ＜０．０５を有意であると考えた。
【０３５０】
実験設計及び統計分析
この研究において、雌及び雄のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを、それらの性別にかかわらず使用した。統計分析のために、プリズム６ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用した。ニューロンの移動の分析（非パラメトリックマンホイットニーＵ検定）及びｑ−ＰＣＲ分析（単一因子分散分析）を除いて、一般に、対応のないＴ検定を使用して、２群の平均を比較した。すべての統計試験について、有意性をｐ＜０．０５に設定した。正確なｐ値、ｔ値及び自由度を、結果において提供し、Ｎを、図面の凡例に提供した。
【０３５１】
この研究の開始の際に、１１４０個の固有のヒトｍｉＲＮＡを含有するレンチウイルスライブラリー（Ｐｏｅｌｌら、２０１１年）で形質導入された、レチノイン酸処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の自動形態学的セロミクススクリーニングを行って、ニューロンの特徴に（正の）影響を及ぼすｍｉＲＮＡを特定した（図１Ａ）。スクリーニングを三連で実施し、形態学的パラメーターをニューロプロファイリングアルゴリズムを用いてスコア化した。最も強いｍｉＲＮＡの効果を確認するために、セロミクス分析を、ヒットの選択のために、ｍｉＲＮＡミミックでエレクトロポレーションされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において繰り返した。この実験を四連で３回行い（すなわち、４枚のカバースリップで３回、図１Ｄ）、スチューデントのＴ検定を使用して統計分析した。
【０３５２】
異なる年齢でのマウス脳におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を、ＬＮＡインサイチュハイブリダイゼーション及びｑ−ＰＣＲ実験によって試験した（年齢あたり少なくとも３頭の異なるマウスの組織（図２））。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現も、培養された初代海馬ニューロンにおいて決定した（図３Ａ）。ｑ−ＰＣＲ実験を、単一因子分散分析を使用して統計分析した。
【０３５３】
次に、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの過剰発現及び下方制御の効果を、初代ニューロン培養物において調べた。リポフェクタミン系トランスフェクションを、三連で少なくとも３回（すなわち、３枚のカバースリップで３回）反復した。ｍｉＲＮＡミミックをＧＦＰベクターを用いて共トランスフェクトし、スポンジベクターの場合において、内部ＲＦＰを活用して、イメージＪのニューロンＪプラグインを使用して、神経突起の長さを追跡した（図３Ｂ〜Ｆ）。スチューデントのＴ検定を行って、それぞれの群の平均を対照条件と比較した。
【０３５４】
ニューロンの発達の間のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの内因性効果を評価するために、ＧＦＰベクターと組み合わせたｍｉＲＮＡミミックのエクスビボエレクトロポレーション、及びその後、マウス胚皮質の器官型薄片培養を行った（Ｅ１４、図４Ａ）。１頭の母親の胚を３つの条件の中で分け、同腹仔を比較し、実験を３回繰り返した。３頭の異なる母親からの少なくとも６つの胚の同様の皮質薄片を比較のために使用した。次に、子宮内エレクトロポレーション実験を、Ｅ１４マウス胚において行って、インビボでｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを過剰発現及び下方制御させた。胚の分析のために、３つの条件を、常に同腹仔を比較するように、子宮に存在した胚について分けた。出生後の組織の単離に充てる子宮内エレクトロポレーションを、母親あたり１条件で行った。エレクトロポレーションされた皮質ニューロンの移動及び神経突起伸長の分析のために、脳梁を示す３つの連続的な凍結切片を使用し、少なくとも３頭の異なる母親に由来する少なくとも９頭の仔から得た。エクスビボ及び子宮内エレクトロポレーション分析の両方について、発明者らは、マンホイットニーＵ検定を行って、移動する細胞の分布を比較した。これらを、心室の境界（胚の脳について）又は前交連の軸索（出生後の脳について）に接する瓶１の下部、及び皮質表面に達する瓶８の上部で、移動の方向に正確に垂直に配置された薄片あたり８つの皮質「瓶」を含有する２〜３のラスターにおいて手作業でカウントした（図４Ａ）。
【０３５５】
次に、可能なｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのｍＲＮＡ標的を、生物情報学的ツールのｍｉＲｅｃｏｒｄｓ（Ｘｉａｏら、２００９年）を使用して特定した。ＫＬＦ４を、神経突起伸長及びニューロンの移動に対するその報告された効果に基づいて、選択した。ＫＬＦ４  ３’−ＵＴＲ中のｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの最も強い予測される結合部位を選択し、直接標的結合を確認するためにＨＥＫ２９３細胞で３回行うルシフェラーゼアッセイのために使用した（図５Ａ、Ｂ）。次いで、免疫組織化学的検査を使用して、ＫＬＦ４並びにｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂが同様の脳の区域で発現するか否かを評価した（図５Ｃ）。次に、発明者らは、Ｎ２Ａ細胞中での内因性ＫＬＦ４の発現がｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの投与の際に下方制御されたか否かを試験した。ｍｉＲ−１３５−ＫＬＦ４シグナル伝達についての内因性の役割を決定するために、レスキュー実験を、前に記載されている同じ実験手順及び反復を使用し、ＫＬＦ４  ｃＤＮＡ（ｍｉＲＮＡ制御に対して無反応）を使用して、初代海馬ニューロン培養物及び子宮内エレクトロポレーションにおいて行った。
【０３５６】
ＫＬＦ４は軸索再生を相殺する最も重要なシグナルの１つであるので、発明者らは、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを使用して、特定の細胞自律的な方法で不十分に再生するニューロンにおいて、ＫＬＦ４の発現が減少するか否かを調査した。発明者らは、最初にｍｉＲＮＡミミックを硝子体内に注射して（０日目及び７日目）、これが、視神経にｍｉＲＮＡを送達し、ＫＬＦ４の発現を下方制御するために十分であったか否かを学んだ。ｑ-ＰＣＲを、最初のミミックの注射の１４日後に、条件あたり３視神経で行った。次いで、ミミックをＧＦＰベクター及び／又はＫＬＦ４  ｃＤＮＡと組み合わせて、視神経損傷の１４日後の軸索の再生を決定した。これを条件あたり９頭のマウスで繰り返した。ｑ-ＰＣＲ実験は、条件の間でトランスフェクションの効率における差を明らかにしなかった。ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ又は対照ｍｉＲＮＡを含有するＡＡＶ２ウイルスを注射して、視神経の挫滅の７日前に６頭のマウスにおいてのみＲＧＣを形質導入し、ミミックの注射で観察される効果の細胞自律性を評価した。最後に、発明者らは、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂが、６頭のマウスにおいて、０日目及び７日目でのスポンジベクターの注射による、視神経挫滅の１４日後に測定された視神経の再生における内因性の役割を有していたか否かを決定した。軸索の再生を分散分析、続くシダックの事後検定によって、統計的に試験した。
【０３５７】
結果
神経突起の成長を制御するｍｉＲＮＡについてのｍｉＲｏｍｅワイドスクリーニング
神経突起の成長を促進することができるｍｉＲＮＡを特定するために、画像に基づくｍｉＲＮＡのスクリーニングを、細胞スクリーニングのために通常使用される細胞株であるニューロンＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において行った。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のニューロン分化を、レチノイン酸処理、続く１１４０個の固有のヒトｍｉＲＮＡを含有するレンチウイルスライブラリー（Ｐｏｅｌｌら、２０１１年）の形質導入によって誘導した（図１Ａ、Ｂ）。セロミクスアレイスキャンプラットフォームを使用して、それぞれの条件における数千の細胞を、ニューロンの形態に関するパラメーターについて分析した。このマルチパラメトリックな分析は、神経突起の長さ及び分岐などのパラメーターに基づいた累積ヒットスコアをもたらした。ヒットを特定するために、それぞれの個々のｍｉＲＮＡのスコアを、すべてのｍｉＲＮＡの中央値のスコアと比較した。このアプローチは、主なｍｉＲＮＡがニューロンの形態に影響を与えないと仮定する。このアプローチは、分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の特異的な形態学的性質（例えば、神経突起の長さ）に対する明白な効果を有する１３個の注釈付きのｍｉＲＮＡを特定した。これらのｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲ−１３５ｂは最も大きい効果を有していた（図１Ｃ）。ｍｉＲＮＡ−１３５ａは、後に、同様に機能することが示された−このスクリーニングにおいて、ｍｉＲＮＡ−１３５ａは、プレートの角にあり、エッジウェルのアーチファクトを被った。
【０３５８】
ｍｉＲ−１３５ｂの効果を確認するために、レチノイン酸処理ＳＨ−ＳＹ５Ｙを、過剰発現を刺激するために、ｍｉＲ−１３５ｂミミックでエレクトロポレーションした。ｍｉＲ−１３５ｂの近接したホモログであるｍｉＲ−１３５ａ（表７）も、それがｍｉＲ−１３５ｂと多くのｍＲＮＡ標的を共有するので、及び発明者らが、ｍｉＲ−１３５ａが技術的な問題（培養プレートにおけるエッジウェル効果）の理由で初期スクリーニングで特定されなかったとことに疑いを持ったので、含めた。スクリーニングにおいて特定された周知の脳で豊富なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２４も、２つの対照ｍｉＲＮＡミミック（両方とも線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）に由来し、特定の哺乳動物のｍＲＮＡを標的にしないことが判明している（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、独自観察））と同様に含めた（図１Ｄ）。スクリーニングの結果と一致して、ｍｉＲ−１３５ｂミミックは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の一般的な形態に影響を与えた（６．５８±１．１１対１．２４±０．５０、ｔ（１８８）＝４．６４、ｐ＜０．０００１（対照−１）、又は対１．６７±０．５２、ｔ（１８８）＝４．１９、ｐ＜０．０００１（対照−２）、一元配置分散分析、シダックの事後検定；図１Ｄ、左パネル）。さらにまた、ｍｉＲ−１３５ｂは神経突起伸長で豊富であった（３．５３±０．６９、ｔ（１８９）＝４．４６、ｐ＜０．０００１対０．５５±０．２８（対照−１）、又は対０．９０±０．３５ｔ（１８９）＝３．８７、ｐ＝０．０００６（対照−２）、一元配置分散分析、シダックの事後検定；図１Ｄ、中央パネル）。総ヒットスコア及び神経突起の長さに関するヒットスコアは、ｍｉＲ−１３５ａによって影響されたように見えたが、これらの効果は統計学的有意性に達しなかった。神経突起の分岐は、対照ミミック（０．１４±０．１２（対照−１）、又は０．１５±０．１１（対照−２）；図１Ｄ、右パネル）と比較して、ｍｉＲ−１３５ａ（２．００±０．７１、ｔ（１８９）＝３．６２、ｐ＝０．００１５、対対照−１、及びｔ（１８９）＝３．５４；ｐ＝０．００２０対対照−２）及びｍｉＲ−１３５ｂ（１．５３±０．３６、ｔ（１８９）＝３．１１、ｐ＝０．００８５、対対照−１及びｔ（１８９）＝３．０３、ｐ＝０．０１１対対照−２、一元配置分散分析、シダックの事後検定）ミミックによって有意に増加した。一緒に、これらのデータは、ｍｉＲ−１３５ｂ及びｍｉＲ−１３５ａが神経突起の成長及び錯体形成を増加させることを確認する。
【０３５９】
マウス及び海馬の発達におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現
ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの配列は、種にわたって保存され、マウスの脳組織において検出されるが（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２年；Ｓｅｍｐｅｒｅら、２００４年；Ｚｉａｔｓ及びＲｅｎｎｅｒｔ、２０１４年；Ｃａｒｏｎｉａ−Ｂｒｏｗｎら、２０１６年）、ニューロンにおけるこれらのｍｉＲＮＡの発現の正確な時空間パターン及び機能的役割は、不十分な理解のままであった。発明者らは、発達中（神経突起の成長及び分岐が出現する間の、Ｅ１４、Ｅ１６、Ｐ０及びＰ１０）並びに成体マウスの皮質及び海馬において、定量的ＰＣＡ（ｑＰＣＲ）によってｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を分析した。ｑＰＣＲ分析は、胚並びに出生後の皮質及び海馬において、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍＲ−１３５ｂを検出した。両方のｍｉＲＮＡの発現は、皮質の発達の進行につれて低下し、成体において増加した。対照的に、海馬のｍｉＲ−１３５ａの発現は、Ｐ１０に向けて減少し、成体では増加し、ｍｉＲ−１３５ｂのレベルは未変化のままであった（図２Ａ、Ｃ）。ロックド核酸（ＬＮＡ）に基づくインサイチュハイブリダイゼーションは、皮質（Ｅ１４、Ｐ１０及び成体、図２Ｂ）及び海馬（Ｅ１４、Ｐ０、Ｐ１０及び成体、図２Ｄ）において、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を明らかにすることによって、これらの結果を裏付けた。特異的なシグナルが、海馬の歯状回（ＤＧ）及びＣＡ３錐体細胞層において、及び皮質の発達の皮質板において、観察された。さらにまた、両方のｍｉＲＮＡは、成体マウスの脳において大量に発現した（図２Ｂ、Ｄ）。このため、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、マウスの脳の発達において、発現の特異的な時空間パターンを示す。
【０３６０】
ｍｉＲ−１３５対照の軸索の成長及び分岐
ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは両方とも顕著な海馬の発現を示し、ニューロンにおけるそれらの機能的役割を調査するために、海馬ニューロンを解離し、ｍｉＲＮＡミミックでトランスフェクトし、インビトロで４日目（ＤＩＶ）で軸索の成長について分析した。最初に、ｑＰＣＲを使用して、初代海馬培養物におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの内因性発現を確認した（図３Ａ）。ＤＩＶ４にて、軸索であると確認された最も長い神経突起は、対照（２７１．７±７．１８μｍ、ｔ（７７６）＝４．４４３（対照−１対ｍｉＲ−１３５ａ）、ｔ（９００）＝８．１８１（対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ）、両方ともｐ＜０．０００１、対応のないＴ検定；図３Ｂ及びＣ）と比較して、ｍｉＲ−１３５ａ（３５４．９±２４．４１μｍ）又はｍｉＲ−１３５ｂ（３９２．８±１５．２４μｍ）でトランスフェクトされたニューロンにおいて有意に長かった。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの両方の共トランスフェクトは、軸索の長さをさらに増加させた（４２８．７±１４．９７μｍ、対対照−１  ｔ（１０２２）＝１０．３６、ｐ＜０．０００１；対ｍｉＲ−１３５ａ  ｔ（５９０）＝２．６２８、ｐ＝０．００８８、対応のないＴ検定）。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの内因性の役割を評価するために、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを隔絶するように設計された特異的なｍｉＲＮＡスポンジを海馬ニューロンに共トランスフェクトした。ｍｉＲＮＡの利用能の減少は、スクランブル化対照スポンジトランスフェクション（３４０．１±１８．０９μｍ、ｔ（２１１）＝３．０５３、ｐ＝０．００２６、対応のないＴ検定；図３Ｄ）と比較して、軸索の長さが有意に減少した（２０７．０±１３．６３μｍ）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における初期スクリーニングは神経突起の成長及び分岐の両方に対する効果を示したので、Ｓｈｏｌｌ分析を、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ及び２つのミミックの組み合わせでトランスフェクトされた初代海馬ニューロンにおいて行った。ｍｉＲＮＡ単独及び組み合わせの両方での過剰発現は、より遠位領域における神経突起の分岐の著しい増加をもたらした（図３Ｅ）。興味深いことに、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ又はｍｉＲ−１３５ｂ単独の過剰発現の組み合わせも、細胞体に近い区域における分岐の増加をもたらした。これらのデータは、初代神経突起（の分岐）の数の増加及び軸索の分岐の増加を示唆する（対照−１対ｍｉＲ−１３５ａ：ｔ（１２８００）は３．７２８〜８．５２の範囲、対照−１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ｔ（１３１４４）は３．７３５〜６．４２６の範囲；対照−１対ｍｉＲ−１３５ａｂ：ｔ（１２１６４）は３．８４〜７．４９６の範囲；すべてについてｐ＜０．００１；対応のないＴ検定）。Ｓｈｏｌｌサークルによる神経突起の累積交差の数は、対照（３８．６９±２．６７、ｔ（３７）＝２．４１４、ｐ＝０．０２１、対応のないＴ検定；図３Ｆ）と比較して、ｍｉＲ−１３５ａｂで処理されたニューロンにおいても高かった（５３．９±４．９１）。一緒に、これらの発現は、ｍｉＲ−１３５（ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ）が軸索の成長及び分岐を制御することを示す。
【０３６１】
皮質ニューロンの移動は、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを必要とする
ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、それらが神経系の発達及び神経突起の伸展において移動するので、海馬及び皮質のニューロンにおいて発現し（図２）、これらのｍｉＲＮＡの操作は、培養された海馬だけでなく皮質ニューロンにおいても、ニューロンの形態に影響を与える（図３；データは示さない）。次に、胚脳の複雑な環境でのニューロンにおけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの役割を評価するために、発明者らは、エクスビボ及び子宮内エレクトロポレーションを行った（ｖａｎ  Ｅｒｐら、２０１５年）。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂミミックによるマウス皮質のエクスビボエレクトロポレーションをＥ１４．５で行い、脳を、薄片化し、培養し、ＤＩＶ４で分析した。ｍｉＲ−１３５ａ又はｍｉＲ−１３５ｂミミックのエレクトロポレーションは、対照ミミック条件（図４Ａ、統計学的結果について図面の凡例を参照されたい）と比較して、ＣＰにおける多数のエレクトロポレーションされたＧＦＰ陽性ニューロン、及び中間帯（ＩＺ）におけるより少ない細胞によって例示される、脳室帯（ＶＺ）から皮質板（ＣＰ）への皮質ニューロンの移動を著しい増加を誘導した。これらのインビボの効果を確認するために、発明者らは、ｍｉＲＮＡミミック又はスポンジを、子宮内エレクトロポレーションによってＥ１４．５の皮質に送達し、Ｅ１６．５でニューロンの移動を分析した。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂについてのミミックを組み合わせて、短期間で有意な表現型を導いた。エクスビボエレクトロポレーションのデータと一致して、ｍｉＲ−１３５ａｂミミックの皮質への送達は、軟膜表面に向かうニューロンの移動を増強し、ＳＶＺなどのより深い層における付随する現象を誘導した（図４Ｂ、統計学的結果について図面の凡例を参照されたい）。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂスポンジのエレクトロポレーションは、小さいが、正反対の効果、すなわち、皮質ニューロンの移動の遅延を有し、皮質ニューロンの移動におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂに対する内因性の要件を確認する（図４Ｃ、統計学的結果について図面の凡例を参照されたい）。インビボの神経突起伸長についての測定のように、発明者らは、子宮内エレクトロポレーション後のニューロンの移動のリーディングプロセスの長さを定量化した。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂミミックはリーディングプロセスの長さの増加を誘導するが（３０．６５±１．０９対２３．９１±１．０１、ｔ（３６４）＝４．４９７、ｐ＜０．０００１、対応のないＴ検定；図４Ｂ）、リーディングプロセスは、ｍｉＲ−１３５スポンジの適用後、より短かった（２５．２３±０．８０対３３．７８±１．２８、ｔ（３２５）＝５．７１２、ｐ＜０．０００１、対応のないＴ検定；図４Ｃ）。インビボのｍｉＲ−１３５の過剰発現の長期間の効果を評価するために、発明者らは、Ｅ１４．５、Ｐ４（図４Ｄ）及びＰ１０（図４Ｅ）で、子宮内エレクトロポレーションされた胚から脳を単離した。興味深いことに、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＰ４エレクトロポレーションは、ニューロンの移動を有意に増強し、皮質の上側の区域においてより多くの数のニューロンをもたらし��（図４Ｄ、統計学的結果について図面の凡例を参照されたい）。Ｐ１０にて、小さいが、皮質の上側層における細胞の分布における有意差は、対照又はｍｉＲ１３５ミミックでエレクトロポレーションされた胚の間で維持された（図４Ｅ、統計学的結果について図面の凡例を参照されたい）。全体として、これらのデータは、培養されたニューロンにおけるそれらの効果と一致して、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂが、インビボで神経突起の長さ及びニューロンの移動を調節することを示唆する。
【０３６２】
ｍｉＲＮＡ−１３５は、ＫＬＦ４によって、軸索の成長及びニューロンの移動を調節する
ｍｉＲ−１３５（ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの両方）はどのようにしてニューロンの形態及び移動を調節するのか。ニューロンにおける高い配列類似性及び比較可能な生物学的効果に基づいて、発明者らは、ｍｉＲＮＡ−１３５（ｍｉＲＮＡ−１３５ａ及びｍｉＲＮＡ−１３５ｂ）が、それらのｍＲＮＡ標的の多くを共有し得ると仮説を立てた。これらの標的を特定するために、発明者らは、ｍｉＲｅｃｏｒｄｓ（Ｘｉａｏら、２００９年）を使用して、標的予測分析を行った。ｍｉＲｅｃｏｒｄｓ中の少なくとも６つのデータベースからのデータを組み合わせることによって、５７個の重複する標的を、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂについて見出した。これらの標的のいくつかは、神経突起の成長及びニューロンの形態における役割を確認した。しかしながら、これらの標的（例えば、ＰＴＫ２、ＴＡＦ４）の多くについて、ノックダウンが、神経突起の成長又はニューロンの移動を低減することが報告されている（データは示さない）。ｍｉＲ−１３５の過剰発現と類似して、ニューロンにおけるＫＬＦ４のノックダウンが、軸索の成長、リーディングプロセスの長さ及びニューロンの移動を増強するので、ＫＬＦ４を特に調査した（Ｍｏｏｒｅら、２００９年；Ｑｉｎ及びＺｈａｎｇ、２０１２年）。さらにまた、血管平滑筋及び肝細胞癌細胞における最近の研究は、ｍｉＲＮＡ−１３５ａをＫＬＦ４と結びつける（Ｌｉｎら、２０１６年；Ｙａｏら、２０１６年）。最後に、ＫＬＦ４は、発明者らの初期スクリーニングの上位のリストにおいて、いくつかのｍｉＲＮＡについての予測される結合部位を含有する（ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−４４９、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−４９９；図１Ｃ）。ＫＬＦ４の３’−ＵＴＲは、２つの予測されたｍｉＲ−１３５結合部位を持ち（図５Ａ）、ＫＬＦ４がｍｉＲ−１３５のための真正な標的であることを確認するために、発明者らは、最初に、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＬＦ４  ３’−ＵＴＲ並びにｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂミミックをＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトすることによって、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂミミックは、単独又は組み合わせてトランスフェクトした場合の両方で、ルシフェラーゼ活性を有意に減少させた（図５Ｂ）。直接及び特異的結合を確認するために、最も強い会合を有すると予測される（ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇによる）ｍｉＲＮＡ−１３５結合部位を変異させた（部位３９４；図５Ａ）。この変異は、ルシフェラーゼ活性に対するｍｉＲ−１３５が媒介する効果を完全に無効にし、部位３９４がＫＬＦ４における主なｍｉＲ−１３５結合部位であることを示唆する（ＫＬＦ４  ＷＴ  ｍｉＲ−１３５ａ対ＫＬＦ４変異ｍｉＲ−１３５ａ、ｔ（４）＝４．７１５、ｐ＝０．００９２；ＫＬＦ  ＷＴ  ｍｉＲ−１３５ｂ対ＫＬＦ４変異ｍｉＲ−１３５ｂ、ｔ（４）＝２．９３３、ｐ＝０．０４２７；ＫＬＦ４  ＷＴ  ｍｉＲ−１３５ａｂ対ＫＬＦ４変異ｍｉＲ−１３５ａｂ、ｔ（４）＝４．７３５、ｐ＝０．００９１、対応のないＴ検定）（図５Ｂ）。次に、発明者らは、ｍｉＲ−１３５及びＫＬＦ４が同じ脳の領域で発現するか否か���評価するために、ＫＬＦ４について免疫組織化学的検査を行った。実際に、発明者らのｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂについてのインサイチュハイブリダイゼーションデータと一致して、顕著なＫＬＦ４の発現を、Ｅ１６．５のＣＰ及び成体の皮質において、並びに海馬の発達及び成体の海馬において、ニューロン中で検出した（図５Ｃ）。ｍｉＲ−１３５及びＫＬＦ４の間の関係をさらに検証するために、内因性ＫＬＦ４タンパク質レベルを、トランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞において、ウエスタンブロットによって分析した。ＫＬＦ４の発現の低減が、対照ミミックのトランスフェクションと比較して、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂミミックによるトランスフェクション後に観察された（ｍｉＲ−１３５ａｂ対対照−１：０．３７８±０．０３２対０．６４３±０．０１、ｔ（１０）＝３．１７０、ｐ＝０．０１０、対応のないＴ検定；図５Ｄ）。一緒に、これらのデータは、ＫＬＦ４がｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのための標的であることを示す。
【０３６３】
次に、発明者らは、軸索の成長及びニューロンの移動に対するｍｉＲ−１３５（ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ）の効果が、ＫＬＦ４を必要とするか否かを評価した。初代海馬ニューロンにおいて、３’−ＵＴＲを欠くＫＬＦ４  ｃＤＮＡの共トランスフェクション（ＫＬＦ４Δ３’−ＵＴＲ）、したがってｍｉＲ−１３５結合部位は、ｍｉＲ−１３５ミミックのトランスフェクションによる軸索の成長の増加を著しく低減させた（図５Ｅ、対照−１対対照−１＋ＫＬＦ４：２７１．１±７．１７８対２３９．９＋９．７０１、ｔ（７８５）＝２．２５０、ｐ＝０．０２５；対照−１対ｍｉＲ−１３５ａｂ＋ＫＬＦ４：２７１．１±７．１７８対３３１．７±１０．９２、ｔ（９８０）＝４．７８７、ｐ＜０．０００１；ｍｉＲ−１３５ａｂ＋ＫＬＦ４対ｍｉＲ−１３５ａｂ：３３１．７±１０．９２対４２８．７±１４．９７、ｔ（７９４）＝５．１３９、ｐ＜０．０００１、対応のないＴ検定、図５Ｆ）。同様に、皮質ニューロンの移動及びリーディングプロセスの長さに対するｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの過剰発現の正の効果は、ＫＬＦ４Δ３’−ＵＴＲの共エレクトロポレーションによって正規化された（ニューロンの移動の統計学的結果について図面の凡例を参照されたい、リーディングプロセスの長さについて：ｍｉＲ−１３５ａｂ：３２．３４±１．０８４、ｍｉＲ−１３５ａｂ＋ＫＬＦ４：２０．４２±０．７９、ｔ（２４０）＝８．８５１、ｐ＜０．０００１、対応のないＴ検定；図５Ｇ）。一緒に、これらの実験は、ｍｉＲＮＡ−１３５が、ＫＬＦ４タンパク質の発現のリプレッシングによって、軸索の成長及びニューロンの移動を増強することを示す。
【０３６４】
外因性ｍｉＲ−１３５の適用は、ＫＬＦ４による視神経の再生を促進する
ニューロンのＫＬＦ４の発現の低下は、ニューロンの発達における軸索の成長を促進するだけでなく、ＣＮＳ損傷後の再生的な軸索の成長を推進する少数の実験的処理の１つでもある。ＫＬＦ４を欠くノックアウトマウスは、視神経損傷の後、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の軸索の再生の有意な増強を示した（Ｍｏｏｒｅら、２００９年；Ｑｉｎら、２０１３年）。このＫＬＦ４の効果は、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）−シグナル伝達性転写因子４（ＳＴＡＴ３）経路を介した下流のシグナル伝達を必要とするが（Ｑｉｎら、２０１３年）、この経路の上流の制御機構は、未知のままである。これらの結果、及びｍｉＲ−１３５ミミックがＫＬＦ４の発現を低減することによって軸索の成長を促進することができることを示す発明者らのデータのため、発明者らは、次に、ｍｉＲ−１３５ミミックの適用がＣＮＳにおける再生的な軸索の成長を推進することができるか否かを求めた。この仮説を試験するために、発明者らは、視神経挫滅モデルを使用した。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡミミックは、成体のＲＧＣに効率よく標的化され得、視神経の再生を確実に定量化することができる（Ｄｉｃｋｅｎｄｅｓｈｅｒら、２０１２年；ｖａｎ  Ｅｒｐら、２０１５年）。さらに、ＫＬＦ４及びｍｉＲ−１３５の両方とも成体マウスのＲＧＣにおいて発現し、ＫＬＦ４の発現の低減は、視神経の再生を増強する（Ｍｏｏｒｅら、２００９年；Ｑｉｎら、２０１３年）。最初に、発明者らは、ｍｉＲ−１３５ミミックの硝子体内注射がｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのレベルの上昇をもたらすことを確認した（図６Ａ、Ｂ）。ｍｉＲ−１３５の内因性発現が検出されたが、ミミックの硝子体内注射は、スクランブル化対照による注射と比較して、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの発現を著しく増加させた（対照１対ｍｉＲ−１３５ａ：ｔ（４）＝２．４６２、ｐ＝０．０３４８；対照１対ｍｉＲ−１３５ｂ：ｔ（４）＝４．３０９、ｐ＝０．００６３、対応のないＴ検定）。ｍｉＲ−１３５標的としてＫＬＦ４を特定する発明者らのデータと一致して（図５）、眼へのｍｉＲ−１３５ミミックの注射は、ＫＬＦ４の発現の減少をもたらした（対照１対ｍｉＲ−１３５ａｂ：ｔ（３）＝２．９０１、ｐ＝０．０３１２、対応のないＴ検定、図６Ｃ）。次に、発明者らは視神経の再生に対するｍｉＲ−１３５の注射の効果を評価した。スクランブル化対照ミミックの投与の後、ほとんどのＣＴＢ標識化ＲＧＣ軸索は、挫滅部位で急に停止し、少数の線維のみが遠位神経に病変を通過した（図６Ｄ、Ｅ）。対照的に、ｍｉＲ−１３５ミミックは、病変部位を越える有意な再生（０．２ｍｍ、対照−１＋ＧＦＰ対ｍｉＲ−１３５ａｂ＋ＧＦＰ：４６．８９±６．８１６対２０８．４±３５．１１、ｔ（９６）＝７．３７４、ｐ＜０．０００１、シダックの事後検定による一元配置分散分析）及び神経の遠位セグメントにおけるより明白な出芽を誘導した（図６Ｄ、Ｅ）この効果がＫＬＦ４の発現を低減させるｍｉＲ−１３５の能力によって引き起こされたか否かを調べるために、発明者らは、ｍｉＲ−１３５ミミックの硝子体内注射を、ＧＦＰを発現するベクター（ｐＣＡＧ−ＧＦＰ）又はｍｉＲ−１３５によって標的にされないＫＬＦ４  ���ＤＮＡ（ｐＣＡＧ−ＫＬＦ４）の共トランスフェクションを組み合わせた（ｖａｎ  Ｅｒｐら、２０１５年）。ＫＬＦ４の過剰発現は、ＲＧＣの軸索の再生に影響を与えなかったが、ＯＮＩの後に、ｍｉＲ−１３５ミミックの注射の効果を促進する再生を部分的に正規化した（０．２ｍｍ、対照−１＋ＧＦＰ対ｍｉＲ−１３５ａｂ＋ＫＬＦ４：４６．８９±６．８１６対１１５．４±２４．６３、ｔ（９６）＝３．１２８、ｐ＝０．０２８、シダックの事後検定による一元配置分散分析）（図６Ｄ、Ｅ）。重要なことには、このＫＬＦ４の効果は、網膜におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのレベルが、ｍｉＲ−１３５ａｂ＋ＧＦＰ及びｍｉＲ−１３５ａｂ＋ＫＬＦ４の投与の後に類似していたので、ｍｉＲ−１３５の発現を制御するその能力に起因しなかった（図６Ｆ）。
【０３６５】
硝子体内注射は、ｍｉＲＮＡミミックをマウス網膜における異なる細胞型に対する標的にし得る。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂが軸索の再生に対するＲＧＣにおける正の細胞の自律的効果を有し得ることを確実にするために、両方のｍｉＲＮＡの過剰発現を、ＲＧＣを特異的に標的にすることが公知のウイルス血清型のＡＡＶの硝子体内注射によって誘導した（図６Ａ、Ｇ）（Ｗｅｉｔｚら、２０１３年）。実際に、ＲＧＣへのｍｉＲ−１３５の標的化は、ミミックの注射後に観察されたものと比較可能なレベルで、ＲＧＣの軸索の再生を誘導した（０．２ｍｍ、ＡＡＶ２−対照対ＡＡＶ２−ｍｉＲ−１３５ａｂ：５３．７６±１０．６２対２４３．６±２３．５９、ｔ（３０）＝１０．９８、ｐ＜０．０００１、シダックの事後検定による一元配置分散分析）（図６Ｈ）。最後に、ＲＧＣの軸索の再生におけるｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂの可能性のある内因性の役割を評価するために、ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂを隔絶するように設計された特異的なｍｉＲＮＡスポンジを硝子体内に注射した。ｍｉＲＮＡの利用能の減少は、スクランブル化対照スポンジのトランスフェクションと比較して、損傷部位に近い軸索の再生の数において、小さいが、有意な減少をもたらした（０．２ｍｍ、対照スポンジ対ｍｉＲ−１３５ａ／ｂスポンジ：４９．６±４．５６６対２８．４６±７．５９３、ｔ（１８）＝３．５８９、ｐ＝０．００６３、シダックの事後検定による一元配置分散分析）（図６Ｉ）。一緒に、これらの結果は、ｍｉＲ−１３５の過剰発現が、ＫＬＦ４の発現を減少させることによって、ある程度ＣＮＳの軸索の再生を推進するが、機能的ｍｉＲ−１３５レベルの減少は、成体ＲＧＣの潜在的な再生をさらに低減することを示す。
【０３６６】
胚発生の間、軸索は、長距離にわたって伸展して、機能的接続を確立する。対照的に、成体の哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）における軸索の再生は、軸索の成長のための固有の能力の低下によって、ある程度、限定される。したがって、軸索の成長の固有のコントールへの洞察は、ＣＮＳの再生を増強するための新たな手段を提供し得る。ここで、発明者らは、最初のｍｉＲＮｏｍｅの広範囲の機能的ｍｉＲＮＡのスクリーニングの１つを行って、軸索の成長に対して強い効果を有するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を特定した。ハイコンテントスクリーニングは、雄及び雌マウスにおいて、インビトロ及びインビボで、軸索の成長及び皮質のニューロンの移動の強力な刺激因子として、ｍｉＲＮＡ−１３５（ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂ）を特定した。興味深いことに、これらのｍｉＲ−１３５の発達上の効果は両方とも、軸索の成長及び再生の固有の阻害剤であるＫＬＦ４のサイレンシングに一部依拠していた。これらの結果は、発明者らに、損傷後の軸索の再生に対するｍｉＲ−１３５の効果を試験することを促した。発明者らの研究は、ｍｉＲ−１３５の硝子体内適用が、ある程度、ＫＬＦ４をリプレッシングすることによって、成体マウスにおける視神経損傷（ＯＮＩ）後に網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の軸索の再生を推進することを示す。対照的に、ｍｉＲ−１３５の枯渇は、ＲＧＣの軸索の再生をさらに低減した。一緒に、これらのデータは、ｍｉＲ−１３５及びｍｉＲ−１３５−ＫＬＦ−４経路についての新たなニューロンの役割を特定し、ＣＮＳの軸索の再生を増強するためのツールとしてのｍｉＲＮＡの可能性を強調する。
【０３６７】
実施例３：側頭葉てんかんにおけるｍｉＲ−１３５ａの役割
てんかんは、全世界で６５００万人に影響をもたらす慢性の神経障害であり、主要な社会経済的な負担である（Ｍｏｓｈｅら、２０１５年）。これは、脳内の異常及び同調的なニューロンの放電に起因して引き起こされる、反復性の非挑発性のてんかん発作によって特徴付けられる（Ｃｈａｎｇ及びＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ、２００３年）。いくつかの場合において、てんかんは、イオンチャネルをコードする主な遺伝子の単一遺伝子の変異によって引き起こされるが、ほとんどのてんかんの理由は分かっていない。側頭葉てんかん（ＴＬＥ）は、てんかんのサブクラスであり、てんかんのすべての患者の約３分の１を占める（Ｅｎｇｅｌ、２００１年）。これは、海馬硬化を伴う内側側頭葉てんかん（ＭＴＬＥ−ＨＳ）が最も重症であるいくつかのサブグループで構成される。ＭＴＬＥ−ＨＳは、診断的、臨床的及び病理学的な特性（ニューロンの喪失、グリオーシス及び軸索の出芽）の典型的なセットを示し、薬理学的な処置に最も抵抗性であることが知られている（Ｗｉｅｓｅｒ及びＥｐｉｌｅｐｓｙ、２００４年）。多くの患者について、海馬の外科的除去が、てんかん発作の調節を達成するための唯一の代替手段である（Ｓｅｍａｈら、１９９８年）。ＴＬＥの基本的な病理学的な機構は、大部分が知られていない。抗けいれん薬及び抗てんかん薬が、これらの患者を処置するために使用される。しかし、残念ながら、これらは、てんかん発作の出現を低減するのみであるが、基本的な病態生理学を処置しない。そのため、この能力が失われた状態に対する新規な処置戦略を開発する緊急の必要性が存在する。疾患修飾薬を開発する必要性は、研究コミュニティ及び臨床診療において次第に認識されている（Ｌｏｓｃｈｅｒら、２０１３年）。
【０３６８】
ＭＴＬＥの基本的な病理学的な機構は、依然として大部分が知られていない。てんかんの動物モデル及びヒト組織の研究は、てんかん発生が、分子、細胞及び神経回路網の代替のカスケードを含むことを示唆している（Ｒａｋｈａｄｅ及びＪｅｎｓｅｎ、２００９年）。トランスクリプトームから出発するアプローチは、遺伝子発現のパターンがヒトＭＴＬＥにおいて（ｖａｎ  Ｇａｓｓｅｎら、２００８年）、ＴＬＥについての動物モデルにおけるてんかん発生の間に（Ｇｏｒｔｅｒら、２００６年；Ｐｉｔｋａｎｅｎ及びＬｕｋａｓｉｕｋ、２００９年；Ｒａｋｈａｄｅ及びＪｅｎｓｅｎ、２００９年）、有意に変化することを明らかにした。この調節不全は、炎症、グリオーシス、シナプス構造及びニューロンの機能を含む経路を制御する遺伝子発現を正常に調節する全遺伝子制御ネットワークに影響する。これらの機構が変化したか否か又はどのように変化したかについての洞察は、ＴＬＥの病態形成への重要な新たな洞察を提供し得るだけでなく、治療についての新規な標的をもたらす可能性がある。
【０３６９】
過去数年間、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現の重要な転写後制御因子として浮上しており、大きな遺伝子群の完全に新しいレベルの調節を提供する。ｍｉＲＮＡは、ゲノムから転写されたより長いＲＮＡ前駆体からの一連の切断事象によって生じる、小さな非コードＲＮＡ（１８〜２５ヌクレオチド長）である。ｍｉＲＮＡは、同族のｍＲＮＡ中の部分的に相補的な標的配列を認識し、それらのｍＲＮＡ標的を不安定化することによって、又はタンパク質の翻訳を阻害することによってのいずれかで、タンパク質の発現を阻害する（Ｋｏｓｉｋ、２００６年）。単一のｍｉＲＮＡは、多くの異なる標的を有することができ、これは、複数の経路におけるいくつかの遺伝子、又は複数の経路における単一の遺伝子を制御することができる（Ｅｂｅｒｔ及びＳｈａｒｐ、２０１２年）。脳で発現するｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２８の欠失は、１０００個を超える転写物の上方制御をもたらし、そのうちの１５４個はｍｉＲ−１２８の直接の標的であり、２５個はキナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）ネットワークを制御する細胞外シグナルキナーゼからのものである（Ｔａｎら、２０１３年）。複数の標的化のこの性質は、遺伝子を標的にし、複数の経路を破壊することができるので有利であるが、同時に、ｍｉＲＮＡに基づく治療の望まない副作用の可能性に起因して不利である（Ｈｅｎｓｈａｌｌら、２０１６年）。全ｍｉＲＮＡは、細胞生理学の異なる態様を調節することができ、治療のための新規標的と考えられる（Ｃｚｅｃｈ、２００６年）。
【０３７０】
ｍｉＲＮＡの調節解除は、ＴＬＥにおいて観察されるいくつかの病理学的機構に関連している（Ｇｏｒｔｅｒら、２０１４年；Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓら、２０１２年；Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓ及びＨｅｎｓｈａｌｌ、２０１３年；Ｋａｎら、２０１２年）。マウスにおける研究は、てんかん重積状態後のｍｉＲ−１３４の阻害が自発性てんかん発作の発生を抑制し（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓら、２０１２年）、ｍｉＲ−１２８の完全な喪失が致命的なてんかんをもたらす（Ｔａｎら、２０１３年）ことを示す。同様に、ｍｉＲ−３２４−５ｐは、てんかんにおけるＫｖ４．２の発現を阻害することが見出され（脳における過分極Ａ型電流の主要なメディエーター、これは、ニューロンの興奮性の重要な制御因子である）、ｍｉＲ−３２４の拮抗は、てんかん発作の抑制及び神経保護である（Ｇｒｏｓｓら、２０１６年）。これらのいくつかだけでなく、より多くのｍｉＲＮＡの機能は、てんかんの各種の動物モデルにおいて、ｍｉＲＮＡ阻害剤（アンタゴミル：ｍｉＲＮＡ標的化アンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれる）及びミミック（アゴミル）を使用して調査されている（Ｈｅｎｓｈａｌｌら、２０１６年において概説）。機能的に検証されたこれらのｍｉＲＮＡ（１４個のうち１２個）のうち、脳波（ＥＥＧ）、てんかん発作又は組織病理学レベルにおける有益な効果を有することが見出されている。それ故、ｍｉＲＮＡは、てんかん発作の処置のための柔軟で広範囲の標的のクラスであり得る（Ｈｅｎｓｈａｌｌら、２０１６年）。
【０３７１】
材料及び方法
ＲＮＡ単離及び定量的ＰＣＲ
ｍＴＬＥ−ＨＳ（海馬硬化なし）、ｍＴＬＥ＋ＨＳ（海馬硬化あり）の２つの患者群（それぞれ６人）及び６人の死後の対照を使用した。すべての海馬領域を表す患者組織を、ニッスル染色後に選択した。およそ２０ｍｇの組織を、クリオスタット上において、２５μｍ厚さの切片を薄片化することによって収集し、−８０℃で保管した。総ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者の使用説明書に従って、単離した。ＲＮＡ量をナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定し、ファーストストランドｃＤＮＡ合成を、一般的なｃＤＮＡ合成キット（Ｅｘｉｑｏｎ）を使用して行った。定量的ＰＣＲ反応を、マイクロＲＮＡ  ＬＮＡ（商標）ＰＣＲプライマーセット及びＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ｅｘｉｑｏｎ）を使用して、クオントスタジオ６フレックスリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。すべての試料は二反復で行った。Ｃｔ値をクオントスタジオリアルタイムｐｃｒソフトウェアｖ１．１を使用して決定した。異なるｍｉＲＮＡの発現レベルを、５ｓｒＲＮＡに対する正規化によって推定し、統計学的有意性を、単一因子分散分析で分析し、ｐ＜０．０５を有意であると考えた。
【０３７２】
非放射性インサイチュハイブリダイゼーション
非放射性インサイチュハイブリダイゼーションを、以前に記載されているようにして（Ｏｂｅｒｎｏｓｔｅｒｅｒら、２００７年）、行った。患者あたり２〜３切片を有するそれぞれの患者群（対照、ｍＴＬＥ−ＨＳ及びｍＴＬＥ＋ＨＳ）からの３人の患者を、インサイチュで行うために使用した。簡潔には、新鮮な凍結ヒト海馬組織からの１６μｍ厚さの切片をガラススライド上で収集し、使用まで−８０℃で保管した。インサイチュの日に、切片を固定し（４％のＰＦＡで室温（ＲＴ）で１０分間）、アセチル化し（ＲＴで１０分）、プロテイナーゼＫ（５μｇ／ｍｌ、ＲＴで５分）で処理した。プレハイブリダイゼーションをＲＴで１時間行った。ハイブリダイゼーションを、ヒトｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ（Ｅｘｉｑｏｎ）について１０ｎＭのダブル−ＤＩＧ（３’及び５’）−標識化ロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ、又はＬＮＡ−ＤＩＧスクランブルプローブを用いて、５０℃で終夜行った。スライドを、５５℃で、０．２×ＳＳＣ中、１時間洗浄し、続いて、Ｂ１緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ７．５／０．１５ＭのＮａＣｌ）中の１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を用いてＲＴで１時間ブロッキングした。切片を、Ｂ１緩衝液中の１０％のＦＣＳ中において、抗ジゴキシゲニンＡＰ  Ｆａｂ断片（１：２，５００、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をともに４℃で終夜インキュベートした。スライドを、Ｂ３（０．１ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ９．５／０．１ＭのＮａＣｌ／５０ｍＭのＭｇＣｌ２）中の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰストック溶液、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ＲＴで５〜２０時間処理した。染色を、ＰＢＳ中で洗浄することによって停止し、スライドを、ベクタシールド（ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）を使用してマウントした。染色は、スクランブルプローブでハイブリダイズされた切片において観察されなかった。画像を、明視野顕微鏡で取得し、イメージＪで処理した。
【０３７３】
ＦＩＳＨ
ハイブリダイゼーションを５５℃で行い、６０℃で洗浄して、背景染色を低減した以外は、同様のプロトコールをＦＩＳＨのために使用した。ブロッキングの後、スライドを、抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤ（１；５００、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及びＮｅｕＮ（１；４００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又はＧＦＡＰ（１；１０００、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）抗体とともに、４℃で終夜共インキュベートした。シグナルを、ＴＳＡ（商標）シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）３システム（増幅希釈物中１；５０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ＲＴで１０分間増幅した。ＰＢＳで洗浄後、スライドを、一次抗体に対して特異的な二次抗体（アレクサフルオール４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、ＲＴで１．５時間インキュベートした。核をＤＡＰＩを用いて染色し（ＲＴで１０分）、スライドをプロロングゴールド（ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してマウントした。画像を共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ８８０、Ｚｅｉｓｓ）を使用して取得した。
【０３７４】
扁桃内カイニン酸マウス
てんかん重積状態（ＳＥ）誘導、ＥＥＧ記録及び分析を、以前の研究におけるようにして（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓら、２０１２年；Ｍｏｕｒｉら、２００８年）、行った。簡潔には、マウスに遠隔測定のＥＥＧ伝達装置（Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を埋め込んだ。手術の２日後、ＳＥを、カイニン酸（０．２μｌのＰＢＳ中０．３μｇ）の投与によって４０分間誘導した。対照動物は同じ容量のＰＢＳを受けた。マイクロインジェクションの４０分後、マウスは、ＳＥを停止するために、ロラゼパム（６ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を受けた。マウスは、注射後１時間、ＥＥＧをモニターして、すべてのてんかん発作活動が低減することを確認した。ＳＥ誘導の７日後から、ベースラインＥＥＧを記録した。
【０３７５】
脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）注射
アンタゴミルについて、ｉ．ｃ．ｖ注射を定位的に行った。ＳＥの１４日後、マウスは、ＰＢＳ中の１．０ｎｍｏｌ／２μｌのアンタゴミル−１３５ａ  ＬＮＡ修飾及び３’−コレステロール−修飾オリゴヌクレオチド（Ｅｘｉｑｏｎ）の注入を受けた。対照は同じ容量のＰＢＳを受けた。この期間の間、マウスを、さらに２週間、連続的にＥＥＧ及びビデオでモニターした。ＥＥＧのデータ分析を、ラボチャート（ＬａｂＣｈａｒｔ）８ソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）を使用して行った。この実験において使用されるアンタゴミルは、Ｅｘｉｑｏｎ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ（製品番号１９９９００、バッチ番号１８２４８２−ＥｘｉｑｏｎはＱｉｕａｇｅｎ  ｃｏｍｐａｎｙである）から入手可能であり、ホスホジエステル主鎖結合の代わりに、ホスホロチオエート主鎖結合が特徴のオリゴヌクレオチドで構成され、ＣＡＣＡＴＡＧＧＡＡＴＡＡＡＡＡＧＣＣＡＴ（配列番号２６１）によって表される配列を有する。アンタゴミルは、テトラエチレングリコールが連結されたコレステロールで３’修飾された。
【０３７６】
結果
ヒト及びマウスのＴＬＥのモデルにおけるｍｉＲ−１３５ａの発現の増加
ｍｉＲ−１３５ａの発現の増加を、マイクロＲＮＡアレイ（Ｋａｎら、２０１２年）を使用して、ヒトＴＬＥにおいて観察した。２つの患者群（ｍＴＬＥ＋ＨＳ、ｍＴＬＥ−ＨＳ）と対照における発現を比較するヒトＴＬＥ組織における定量的ＰＣＲによるｍｉＲ−１３５ａの発現を検証する際に、ｍｉＲ−１３５ａレベルの有意な低減が、ｍＴＬＥ−ＨＳ条件において観察されたが、ｍｉＲ−１３５ａの発現が、ｍＴＬＥ＋ＨＳ条件において増加した（図７Ａ）。インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって、ｍｉＲ−１３５ａの局在化をチェックし、ｍＴＬＥ＋ＨＳ条件においてより強いシグナルを見出した（図７Ｂ）。細胞型特異的局在化を確認するために、蛍光ＩＳＨを行い、ニューロンのマーカーであるＮｅｕＮと主に共局在化するｍｉＲ−１３５ａを見出した（図８）。
【０３７７】
次に、発明者らは、グルタミン酸受容体アゴニストであるカイニン酸（Ｍｏｕｒｉら、２００８年）の扁桃内マイクロインジェクションによるＴＬＥの実験モデルにおけるてんかん発作の誘導（てんかん重積状態）が、ヒト患者組織において見出されるｍｉＲ−１３５ａのレベルの増加を模倣するかをチェックした。ｑＰＣＲによって、ｍｉＲ−１３５ａのレベルの有意な増加が、海馬のＣＡ３及びＤＧ領域における特異的なＳＥ誘導の２週間後に観察された（図９Ａ）。同様に、ｍｉＲ−１３５ａについてのより強いシグナルが、海馬の錐体ニューロンの神経細胞体において、並びに皮質のニューロン細胞、視床及び扁桃体の領域においても、ＳＥの２週間後に、ＩＳＨによって検出され、２４時間で発現の変化はなかった（図９Ｂ）。
ｍｉＲ−１３５ａのサイレンシングの際の自発性てんかん発作の低減
ＴＬＥにおけるｍｉＲ−１３５ａの発現の増加のインビボの効果をさらに理解するため、及びそれが自発性てんかん発作の再発に寄与するかをチェックするために、発明者らは、アンタゴミルによってそれを標的にした。ｍｉＲ−１３５ａを標的にするアンタゴミルを、ＳＥの２週間後に投与して、ｍｉＲ−１３５ａのレベルの増加を低減させた。ＳＥ誘導マウスに、ＳＥの２週間後にｍｉＲ−１３５ａ又はＰＢＳ（脳室内）に対する抗ｍｉＲを注射し、注射後の２週間、連続的にＥＥＧをモニターした（図１０Ｂ）。ＳＥのベースライン記録後７日目〜１４日目のてんかん発作の頻度において、処置された動物及び対照動物の間に有意差はなかった（ｐ＝０．７４３）。１４日目のｍｉＲ−１３５ａでの処置の後、処置された動物及び対照動物においててんかん発作の頻度の分布のほぼ完全な分離があり、ウィルコクソンマンホイットニーの統計量が０．９０、９５％のＣＩが０．６５〜０．９７で、処理された動物よりも高いてんかん発作の頻度を有する対照動物の確率が９０％であることを示した（Ｐ＜０．００１）。ｍｉＲ−１３５ａの発現のサイレンシングは、ＰＢＳ注射と比較して、自発性のてんかん発作からマウスを保護した。自発性のてんかん発作の数は有意に低減され、てんかん発作の間に費やされる総時間は低減されたが、てんかん発作の重症度において差は観察されなかった（図１０Ｃ）。これらのデータは、ＳＥの２週間後のｍｉＲ−１３５ａの発現の増加がてんかん発作活動の増加に寄与することを示唆し、これは、ｍｉＲ−１３５ａのインビボの枯渇によってレスキューすることができる。さらなる組織学的分析は、ＴＬＥの病理学的特徴（ニューロンの喪失、グリオーシス、苔状線維の再配列）がレスキューされるかを評価するために、ａｎｔｉｍｉＲが注射された脳において行うべきである。抗ｍｉＲのオフターゲット効果は観察されず、ａｎｔ−１３５ａは、ｍｉＲ−１２４のレベルが１ｎｍｏｌで不変であるので、ｍｉＲ−１３５ａを特異的に標的にした（図１０Ａ）。
【０３７８】
要約
この研究において、発明者らは、扁桃内カイニン酸マウスにおけるｍｉＲ−１３５ａレベルの増加（ＳＥの２週間後）、及びアンタゴミルを使用するｍｉＲ−１３５ａの発現のサイレンシングが自発性のてんかん発作からマウスを保護したことをを見出した。これは、てんかん発生後、既に確立されたてんかんにおいてｍｉＲ−１３５ａをサイレンシングすると、自発性てんかん発作の再発を有意に低減することができる初めての例である。ＴＬＥにおいてｍｉＲ−１３５ａの機能を媒介する新たな標的を特定するために、発明者らは、ビオチンタグ化ｍｉＲＮＡミミックを使用して免疫沈降を行い、いくつかの興味深い標的（データは示さない）、例えば、可能性のある標的としてＭＥＦ２を見出した。ＭＥＦ２タンパク質は、活動依存性シナプス発生を媒介する転写因子のファミリーである。ＭＥＦタンパク質は、シナプスでの神経伝達物質放出の増加から生じる、ニューロトロフィン刺激及びカルシウム流入によって活性化される（Ｆｌａｖｅｌｌら、２００８年）。ＭＥＦ２は、興奮性シナプスを負に制御し（Ｆｌａｖｅｌｌら、２００６年）、ｍＴＬＥにおけるＭＥＦ２の喪失は、異常な棘突起の形成をもたらし、てんかんにおいて観察される異常な発火パターン及び細胞死に寄与した。
【０３７９】
【表６】
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【０３８０】
【表７】
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【０３８１】
【表８】
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【０３８２】
【表９】
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【０３８３】
【表１０】
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【０３８４】
【表１１】
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【０３８５】
【表１２】
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【０３８６】
【表１３】
2021501594.tif 000019
【０３８７】
実施例４：ｍｉＲＮＡ−１３５ａはＭＥＦ２ａの発現を低減する
方法：
動物：Ｃ５７ｂｌ６Ｊマウス（雄及び雌）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。
標的の検証：ウエスタンブロット及びルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００４５）及びＮ２Ａ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿０４７０）細胞は、ＡＴＣＣによって提供されたガイドラインに従って、培養した。ルシフェラーゼアッセイは、ＨＥＫ２９３細胞において行い、ウエスタンブロットによる標的の検証は、Ｎ２Ａ細胞において行った。
【０３８８】
ルシフェラーゼアッセイのために、Ｍｅｆ２ａの３’−ＵＴＲに存在するｍｉＲ−１３５ａのためのｍｉＲＮＡ認識エレメント（ＭＲＥ）を、ＲＮＡ配列データにおいて特定し、またターゲットスキャン（Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ）によって予測した。これらの部位を有するオリゴヌクレオチドを、ｐｓｉ−Ｃｈｅｃｋ２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。Ｍｅｆ２ａ  ３’  ＵＴＲ上にＷＴ（ＭＥＦ２Ａ−１３５ａ−ｆｗ：ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣ（配列番号３５１）、Ｒｖ−ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣ（配列番号３５２））及びＭＵＴ（ＭＥＦ２Ａ−１３５ａＭ−ｆｗ：ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＧＣ（配列番号３５３）；Ｒｖ−  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＣＡＡ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣ（配列番号３５４））ｍｉＲ−１３５ａ結合部位を有するオリゴヌクレオチドを、リン酸化し、アニールし、複数のクローニング部位のＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ部位にライゲーションした。細胞（８×１０４）を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２５ｐｍｏｌのｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉＲＮＡミミック又はスクランブル対照（ＮＣ−１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）と一緒に、２５０ｎｇのレポーターコンストラクトでトランスフェクトした。細胞を２４時間後に回収し、ルシフェラーゼアッセイを、発光光度計において、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Ｅ１９６０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、行った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対する正規化を使用して、相対ルシフェラーゼ活性を決定した。
【０３８９】
タンパク質分析のために、ウエスタンブロットを行った。Ｎ２Ａ細胞を、リポフェクタミン２０００を使用して、ｍｉＲ−１３５ａ又はスクランブル化対照について、ｍｉＲＩＤＩＡＮミミックでトランスフェクトした。４８時間後、細胞を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液（ＭｉｌｌｉＱ（ＭＱ）中に、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ．７．５、１５０ｍＭのＮａｃｌ、０．５％のＮＰ−４０、０．５％のＮａＤｏｃ、１％のＴｒｉｔｏｎ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））に溶解した。等量のタンパク質試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（８％）上で分離し、ニトロセルロースブロッティング膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に移し、続いてブロットを、１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％ミルク粉末中において、ＲＴで１時間ブロッキングした。ブロットを、ウサギ抗ＮＲ３Ｃ１（ＧＲ）（１；１０００、Ｓａｎｔａ−ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２１５５７８６）、ウサギ抗ＰｌｘｎＡ４（１；２５０、Ａｂｃａｍ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿９４４８９０）、マウス抗βアクチン（１；２０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７６７４３）とともに、４℃で終夜インキュベートした。ブロットを、ペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を用いてＲＴで１時間染色し、シグナルを、ピアスＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とのブロットのインキュベートによって検出した。画像を、フルオロケムＭイメージングシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）を使用して取得した。イメージＪを使用して、それぞれの試料についての個々のバンドの強度を測定し、対応するβ−アクチンのレベルに対して正規化した。それぞれのタンパク質の条件の間の相対発現を、ｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄプリズムバージョン６ソフトウェア、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００２７９８）によって推定した。Ｍｅｆ２ａを除き、ブロットを、スーパーミックス（Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）ブロッキング溶液（ＭＱ中の、Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、Ｎａｃｌ  １５４ｍＭ、０．２５％のゼラチン、０，５％のＴｒｉｔｏｎ−ｘ−１００、ｐＨ−７．４）中において、ＲＴで１時間ブロッキングし、ウサギ抗Ｍｅｆ２ａ（１；５０，０００、Ａｂｃａｍ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０８６２６５６）及びマウス抗βアクチン（１；２０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７６７４３）とともに、４℃で終夜インキュベートした。ブロットを、１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で洗浄し、ＩＲ色素（１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の抗ウサギＩＲｄｙｅ  ８００  １；５０００及び抗マウスＩＲｄｙｅ７００  １；２０００）とカップリングした二次抗体とともに、ＲＴで１時間インキュベートした。最後に、ブロットを、１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で洗浄し、Ｌｉ−ＣＯＲイメージスタジオ（Ｉｍａｇｅ  ｓｔｕｄｉｏ）ｖ３．１ソフトウェア（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿０１５７９５）を使用するオデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）Ｃｌｘイメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｅｓｔｂｕｒｇ）においてスキャンし、バンドの強度を測定し、条件の間の相対発現を、ｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄプリズムバージョン６ソフトウェア、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００２７９８）によって推定した。
【０３９０】
初代マウス海馬ニューロンの培養及びトランスフェクション
解離した海馬ニューロンを培養した。簡潔には、Ｃ５７ｂｌ６Ｊ（Ｐ０〜１）マウス仔を断頭し、脳を氷冷した解離培地（７ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充されたライボビッツＬ−１５）中で素早く単離した。海馬を単離し、Ｌ１５−ＨＥＰＥＳ培地中の０．２５％トリプシン中において、３７℃で２０分間トリプシン処理し、続いて、成長培地（Ｂ２７、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン及びβ−メルカプトエタノールで補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）中において、磨かれたパスツールピペットを使用して粉砕した。解離細胞を、成長培地中のＰＤＬ（２０μｇｍｌ−１）及びラミニン（４０μｇｍｌ−１）でコーティングされたガラスカバースリップ上に蒔き、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。成長培地の半分を、週に２回新しくした。インビトロで１４日目（ＤＩＶ）に、ニューロンを、０．５μｇのｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ１（ＧＦＰレポーターを含有するＣＭＶプロモーターでｐＪＥＢＢベクターにクローニング）又はｐＪＥＢＢベクターのみでトランスフェクトした。レスキュー実験のために、ｐＪＥＢＢ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ１及び構成的活性変異体Ｍｅｆ２−ｖｐ１６（Ｆｉｏｒｅら、２００９年）を共トランスフェクトした。トランスフェクトされたニューロンを、ＤＩＶ１６に、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡ及び４％のスクロースで２０分間固定した。免疫細胞化学を、ブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ（ｐＨ−７．４）中の、４％のＮＧＳ、０．１％のＢＳＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）中において、ＲＴで１時間ニューロンをブロッキングし、続いて、ブロッキング緩衝液に希釈された一次抗体のトリ抗ＧＦＰ（１；１０００、Ａｂｃａｍ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３００７９８）とともにインキュベートすることによって、行った。翌日、１×ＰＢＳ中での洗浄を行い、続いて、ブロッキング緩衝液中において、適切な二次抗体とともにＲＴで１時間インキュベートした。切片を、プロロングゴールド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してマウントした。高分解能の画像を、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ８８０、Ｚｅｉｓｓ）の６３倍の油浸対物レンズを使用して取得した。神経細胞体に近接するそれぞれの尖端樹状突起の６〜７のＺスタック画像をキャプチャーした。細胞計数プラグインを有するイメージＪソフトウェア（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００３０７０）を使用して、未成熟から成熟：二次樹状突起上の、糸状仮足、薄い、太く短い、キノコ状及びカップ状として分類される、異なる種類の棘突起を、特定及びカウントした。棘突起の密度を、分岐上の棘突起の数を分岐の長さで割ることによって決定した。
【０３９１】
ＲＮＡ単離及び定量的ＰＣＲ
ｍＴＬＥ＋ＨＳ（海馬硬化あり）を有する７人の患者からの試料及び８つの死後の対照試料を使用した（患者の詳細については表８を参照されたい）。すべての海馬領域を表す患者組織を、ニッスル染色を使用して選択した。およそ２０ｍｇの組織を、クリオスタット上において、２５μｍ厚さの切片を薄片化することによって収集した。扁桃内カイニン酸（ＩＡＫ）マウスについて、海馬を解剖し、凍結し、−８０℃で保管した。総ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者の使用説明書に従って、単離した。ＲＮＡ量を、ナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。ｍｉＲＮＡの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のために、ファーストストランドｃＤＮＡ合成を、一般的なｃＤＮＡ合成キット（Ｅｘｉｑｏｎ）を使用して、製造者の推奨に従って、行った。ｑＰＣＲ反応を、マイクロＲＮＡ  ＬＮＡ（商標）ＰＣＲプライマーセット（ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１２４）及びＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ｅｘｉｑｏｎ）を使用して、クオントスタジオ６フレックスリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのｑＰＣＲのために、プライマー配列（ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ１及びａ２）を、プライマー３ソフトウェアを使用して設計した。それぞれの標的のためのプライマー配列を表１１に提供する。１００ｎｇのＲＮＡを、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩＩファーストストランド合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、逆転写した。同様に、ｂｉｏ−ＩＰ標的の検証のために、等量のインプット及びＩＰ  ＲＮＡを、上記のようにして逆転写した。それぞれの標的のためのプライマー配列を表１１に提供する。ｑＰＣＲ反応を、ファストスタートユニバーサル（Ｆａｓｔ  ｓｔａｒｔ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、クオントスタジオ６フレックスリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。すべての試料は二反復で行った。Ｃｔ値をクオントスタジオリアルタイムＰＣＲソフトウェアｖ１．１を使用して決定した。ｍｉＲＮＡについて、発現レベルを、５ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化することによって推定した。Ｐｒｅ−ｍｉＲを、ＧＡＰＤＨ（ヒト）及びベータ−アクチン（マウス）に対して正規化した。Ｂｉｏ−ｉｐのために、ＩＰ試料中の標的遺伝子の倍数濃縮を、インプットのデルタＣｔに対して正規化した後、推定した。デルタＣｔ及び倍数変化を算出し、統計学的有意性を、マンホイットニーＵ検定及びスチューデントのｔ検定によって分析した。Ｐ＜０．０５を有意であると考えた。
【０３９２】
非放射性インサイチュハイブリダイゼーション
非放射性インサイチュハイブリダイゼーションを、以前に記載のようにして（Ｋａｎら、２０１２年）、行った。それぞれの群（対照及びｍＴＬＥ＋ＨＳ）から３人の患者を、インサイチュハイブリダイゼーションのために使用した。同様に、ＩＡＫマウスの切片のために、群あたり３頭のマウスを使用した。簡潔には、新鮮な凍結海馬組織からの１６μｍ厚さの切片をガラススライド上で収集し、使用まで−８０℃で保管した。切片を固定し（４％のＰＦＡでＲＴで１０分間）、アセチル化し（ＲＴで１０分）、プロテイナーゼＫ（５μｇ、ＲＴで５分）で処理した。プレハイブリダイゼーションをＲＴで１時間行った。ハイブリダイゼーションを、ヒトｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ（Ｅｘｉｑｏｎ）について１０ｎＭのダブル−ＤＩＧ（３’及び５’）−標識化ロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ、又はＬＮＡ−ＤＩＧスクランブルプローブを用いて、５０℃で終夜行った。スライドを、５５℃で、０．２×ＳＳＣ中、１時間洗浄し、続いて、Ｂ１緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ７．５／０．１５ＭのＮａＣｌ）中の１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を用いてＲＴで１時間ブロッキングした。切片を、Ｂ１緩衝液中の１０％のＦＣＳ中において、抗ジゴキシゲニンＡＰ  Ｆａｂ断片（１；２，５００、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をともに４℃で終夜インキュベートした。スライドを、Ｂ３（０．１ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ９．５／０．１ＭのＮａＣｌ／５０ｍＭのＭｇＣｌ２）中の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰストック溶液、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ＲＴで５〜２０時間処理した。染色を、ＰＢＳ中での洗浄によって停止し、スライドを、ベクタシールド（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）を使用してマウントした。染色は、スクランブルプローブでハイブリダイズされた切片において観察されなかった。画像を、明視野顕微鏡で取得し、イメージＪを使用して処理した。
【０３９３】
ハイブリダイゼーションを５５℃で行い、６０℃で洗浄した以外は、同様のプロトコールをＦＩＳＨのために使用した。ブロッキングの後、スライドを、抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤ（１；５００、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及びマウス抗ＮｅｕＮ（１；４００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２９８７７２）又はウサギ抗ＧＦＡＰ（１；１０００、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１００１３４８２）抗体とともに、４℃で終夜共インキュベートした。シグナルを、ＴＳＡ（商標）シアニン３システム（増幅希釈物中１；５０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ＲＴで１０分間増幅した。ＰＢＳで洗浄後、スライドを、一次抗体に対する二次抗体（アレクサフルオール４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、ＲＴで１．５時間インキュベートした。核をＤＡＰＩを用いて染色し（ＲＴで１０分）、スライドをプロロングゴールド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してマウントした。画像を共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ８８０、Ｚｅｉｓｓ）を使用して取得した。
【０３９４】
ビオチニル化ｍｉＲＩＤＩＡＮミミックによるＲＮＡ免疫沈降
Ｎ２Ａ細胞を、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ、１００Ｕ／ｍｌ及び１００ｍｇ／ｍｌ）及び１０％のＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充された低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。それぞれの条件（ｍｉＲ−１３５ａ、スクランブル化及びトランスフェクションなし）について、３つの１０ｃｍのディッシュに２×１０６細胞／ディッシュで蒔き、ハイパーフェクト（ＨｉｇｈＰｅｒｆｅｃｔ）トランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、３７．５ｎＭの３’ビオチニル化ｍｉＲＮＡミミック（ｍｉＲ−１３５ａ及びスクランブル：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）でトランスフェクトした。ＲＮＡ免疫沈降を、以前に記載のようにして（Ｗａｎｉ及びＣｌｏｏｎａｎ、２０１４年）、いくつかの改変とともに、行った。簡潔には、トランスフェクションの２４時間後、細胞を、回収し、溶解緩衝液（ＭＱ中の、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ７．５、１０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、０．５％のＮＰ−４０、６０Ｕ／ｍｌのＳＵＰＥＲａｓｅ−ｉｎ  ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ））に溶解し、澄明な細胞溶解物を、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ−２８０ストレプトアビジンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、ＲＴで３０分間インキュベートした。ビーズを、洗浄緩衝液（１ＭのＮａＣｌを含有する溶解緩衝液）で３回洗浄し、キアゾール（Ｑｉａｚｏｌ）中において、−８０℃で保管した。総ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ビーズの一部を、４×Ｎｕ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（ＭＱ中に１０％のβ−メルカプトエタノール）とともに７０℃で１０分間インキュベートして、結合したタンパク質を抽出した。次いで、タンパク質を、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、その後、タンパク質が移動したブロットを、ブロッキング溶液（１×ＴＢＳ−Ｔ中の５％のミルク）中、ウサギ抗Ａｇｏ２抗体（１；１０００、Ｃｅｌｌ−ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０９６２９１）及びマウス抗βアクチン（１；２０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７６７４３）とともに、４℃で終夜インキュベートし、最後に、シグナルを上記のようにして検出した。
【０３９５】
ライブラリーの調製及び総ＲＮＡシークエンシング
インプット試料について、総ＲＮＡシークエンシングのためのライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ標準総ＲＮＡ（ｗ／リボ−ゼロゴールド（ＲｉｂｏＺｅｒｏ  Ｇｏｌｄ））試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して調製した。総ＲＮＡの出発物質（１００ｎｇ）を、リボ−ゼロゴールド（細胞質及びミトコンドリアｒＲＮＡの両方を除去する）磁気ビーズに基づくキャプチャープローブシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ｒＲＮＡを枯渇させた。ｍＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ及び他のＲＮＡ種を含む残ったＲＮＡを、その後、精製し（ＲＮＡｃｌｅａｎＸＰ）、酵素的に断片化した。ＩＰ試料のために、ライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ標準ｍＲＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、製造者の使用説明書に従い、いくつかの改変：出発材料（３７．５〜５０．０ｎｇ）の総ＲＮＡはｍＲＮＡ豊富ではなく、ライブラリー合成前に断片化しない、とともに、調製した。ファーストストランド合成及びセカンドストランド合成を行い、二本鎖ｃＤＮＡを精製した（アジェンコート（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。ｃＤＮＡを、末端修復し、３’アデニル化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプターを断片の末端にライゲーションし、ライブラリーを精製した（アジェンコートＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ）。ポリＡ＋ＲＮＡストランドのライブラリーを、ＰＣＲでプレ増幅し、精製した（アジェンコートＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ）。ライブラリーのサイズ分布を検証し、品質を２１００バイオアナライザー（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）（高感度ＤＮＡチップ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して調査した。高品質のライブラリーをキュービット（Ｑｕｂｉｔ）蛍光光度計（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量化した。シングルエンドシークエンシングを、ＮｅｘｔＳｅｑ５００装置を使用して、製造者の使用説明書（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って、行った。
【０３９６】
リードマッピング及び差次的発現分析
ＦＡＳＴＱ−ＭＣＦ（バージョン０．０．１３）を用いる低品質の塩基及びアダプター配列のトリミングの後、処理されたリードを、ＴｏｐＨａｔ２（バージョン２．０．１３）を用いて、ＧＲＣｍ３８．ｐ６参照マウスゲノム（Ｅｎｓｅｍｂｌ）にマッピングした（Ｋｉｍら、２０１３年）。「ｆｒ−セカンドストランド」オプションを、総ＲＮＡシークエンシングデータの整列のために選択した。マッピングされたカウントを、ｐｙｔｈｏｎスクリプトｈｔｓｅｑ−カウント（ｓｃｒｉｐｔ  ｈｔｓｅｑ−ｃｏｕｎｔ）（Ａｎｄｅｒｓら、２０１５年）を使用して、それぞれの遺伝子について要約した。
【０３９７】
差次的発現分析のために、遺伝子及び転写物についてのカウントデータを、ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＥｄｇｅＲバージョン３．１２．１（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、２０１０年）とともにＭ−値のトリミング手段（ＴＭＭ）正規化法（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＯｓｈｌａｃｋ、２０１０年）を使用して、Ｒにおける差次的発現について分析した。遺伝子発現のレベルを、一連のシークエンシングラウンドを含めることによって、バッチ効果について訂正した。複数の試験について調整されたＰ値を、ベンジャミーニホッホベルク偽発見率（ＦＤＲ）を使用して算出し、ＦＤＲ＜０．０５を有する遺伝子のみを有意に差次的発現したと考えた。データの可視化を、ｇｇｐｌｏｔ２ライブラリーを使用して、Ｒにおいて行った。発現プロファイルの階層的クラスタリングによる遺伝子発現ヒートマップを、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐｈｅａｔｍａｐパッケージを用いて、Ｒにおいて作成した。濃縮分析を、Ｒパッケージｇｏｓｅｑ（Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｇｏｓｅｑ）（Ｙｏｕｎｇら、２０１０年）を使用して行って、転写物の長さに起因するバイアスについて訂正した。
【０３９８】
ｍｉＲＮＡ結合部位のインシリコ予測
ｍｉＲａｎｄａソフトウェアバージョン３．３ａを使用して、マイクロＲＮＡの特徴的性質を予測した。以下のパラメーターをこの研究において使用した：最小閾値との一致  １５０；標的ｍＲＮＡの二本鎖との最小フォールディング自由エネルギー閾値  −７ｋｃａｌ／ｍｏｌ；ギャップオープニングペナルティ  −８；ギャップエクステンションペナルティ  −２；相補的ヌクレオチドのマッチスコアについて、スケーリングパラメーター  ４。
【０３９９】
Ｍｅｆ２ａについての免疫組織化学的検査及びウエスタンブロット
Ｍｅｆ２ａ免疫染色を、切除されたヒト海馬切片及び２週齢のＩＡＫマウス組織において行った。１６μｍの切片を、１×ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中の１０％のＮＧＳ、０．４％のＴｒｉｔｏｎ中において、ＲＴで１時間ブロッキングし、続いて、ブロッキング溶液中の抗Ｍｅｆ２ａ抗体（１；１５０、Ａｂｃａｍ）及び抗ＮｅｕＮ抗体（１；４００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中において、４℃で終夜インキュベートした。切片を、洗浄し、対応するアレクサフルオールコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）二次抗体とともに、ＲＴで１．５時間インキュベートし、続いて、１×ＰＢＳ中で洗浄し、ＤＡＰＩ（４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を用いて核について染色し、プロロングゴールド（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してマウントした。高分解の画像を、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ８８０、Ｚｅｉｓｓ）を使用して取得し、イメージＪを使用して処理した。
【０４００】
ヒトＴＬＥ及びＩＡＫマウスの海馬組織中のＭｅｆ２ａタンパク質レベルを分析するために、タンパク質溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液中で調製し、等量のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（マウス試料について８％ゲル、及びヒト試料について１０％ゲル）上で分離し、ニトロセルロース膜上に移し、ブロッキングし、ウサギ抗Ｍｅｆ２ａ（ヒトについて１；２０，０００、マウスについて１；５０，０００、Ａｂｃａｍ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０８６２６５６）及びマウス抗βアクチン（１；２０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７６７４３）とともに、４℃で終夜インキュベートした。ブロットを、上記のようにして、染色し、展開し、定量化した。
【０４０１】
扁桃内カイニン酸マウス
てんかん重積状態（ＳＥ）誘導、ＥＥＧ記録及び分析を、以前に記載のようにして（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓら、２０１２年；Ｍｏｕｒｉら、２００８年）、行った。簡潔には、マウスに遠隔測定のＥＥＧ伝達装置（Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を埋め込んだ。手術の２日後、ＳＥを、カイニン酸（０．２μｌのＰＢＳ中０．３μｇ）の投与によって４０分間誘導した。対照動物は同じ容量のスクランブル化ミミック又はＰＢＳを受けた。マイクロインジェクションの４０分後、マウスは、ＳＥを停止するために、ロラゼパム（６ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を受けた。マウスは、注射後１時間、ＥＥＧをモニターして、すべてのてんかん発作活動が低減したことを確認した。
【０４０２】
脳室内注射
アンタゴミルについて、脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）注射を、記載のようにして（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓら、２０１２年）（Ｒｅｓｃｈｋｅら、２０１７年）、行った。ＳＥ誘導の７日後から、ベースラインＥＥＧを記録した。１４日目に、マウスは、ＰＢＳ中の１．０ｎｍｏｌ／２μｌのアンタゴミル−１３５ａ  ＬＮＡ修飾及び３’−コレステロール−修飾オリゴヌクレオチド（Ｅｘｉｑｏｎ）の注入を受けた。対照は同じ容量のＰＢＳを受けた。この期間の間、マウスを、さらに２週間、連続的にＥＥＧ及びビデオでモニターした。ＥＥＧのデータ分析を、ラボチャート８ソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）を使用して行った。
【０４０３】
統計分析
統計分析を、Ｇｒａｐｈｐａｄプリズムを使用して行い、ｐ値＜０．０５を有意であると考えた。Ａｎｔ−１３５ａの前（ベースライン）及び後のてんかん発作の頻度を、対応のあるt検定を使用して分析し、１日あたりのてんかん発作の数を、Ｆ統計混合設計反復測定一般線形モデルを使用して分析した。てんかん発作の期間及びてんかん発作に費やされる総時間を、ｔ検定を使用して分析した。２群の間の差を、両側のスチューデントのｔ検定又はマンホイットニー検定のいずれかを使用して試験した。比較のために、２群超の一元配置分散分析を使用した。
【０４０４】
【表１４】
2021501594.tif 000020
【０４０５】
結果
ヒト及び実験的ＴＬＥにおけるｍｉＲ−１３５ａの発現の増加
ＴＬＥの病態生理学におけるｍｉＲ−１３５ａについての可能性のある役割の特徴付けを開始するために、ｍｉＲ−１３５ａの発現を、ヒトＴＬＥの海馬（ｍＴＬＥ＋ＨＳ）及び対照において評価した。ｍｉＲ−１３５ａの発現レベルは、対照と比較して、ｍＴＬＥの海馬において増加した（図１１Ａ）。ヒト海馬組織におけるｍｉＲ−１３５ａの空間分布を検証するために、発明者らは、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を行った。ｑＰＣＲデータと一致して、ｍｉＲ−１３５ａについてのより強いシグナルが、対照と比較して、ｍＴＬＥ＋ＨＳの海馬において観察された。シグナルは、ＣＡ及びＤＧ領域におけるニューロンに主に限定された（図１１Ｂ）。この細胞型特異的局在化を確認するために、蛍光ＩＳＨ（ＦＩＳＨ）を、ＮｅｕＮ（ニューロン）及びＧＦＡＰ（アストロサイト）についての免疫組織化学的検査と組み合わせて行った。ｍｉＲ−１３５ａはＮｅｕＮと特異的に共局在化したが、ＧＦＡＰとは共局在化しなかった（図１１Ｃ）。
【０４０６】
次に、発明者らは、グルタミン酸受容体アゴニストであるカイニン酸（Ｍｏｕｒｉら、２００８年）の扁桃内マイクロインジェクションによるＴＬＥの実験モデルにおけるてんかん発作の誘導（てんかん重積状態、ＳＥ）も、ｍｉＲ−１３５ａのレベルの増加をもたらすか否かをチェックした。実際に、発明者らは、ｑＰＣＲ及び／又はＩＳＨによって、ＳＥの１４日後（Ｄ１４）に、ｍｉＲ−１３５ａの発現の強い増加を観察した（図１２Ａ、１２Ｂ）。ＩＳＨは、海馬において、またＤ１４での皮質、視床及び扁桃体におけるニューロンにおいて、錐体ニューロンの神経細胞体におけるｍｉＲ−１３５ａについての強いシグナルを明らかにした（図１２Ｂ）。ヒトｍＴＬＥの海馬における発明者らの観察と同様に、ｍｉＲ−１３５ａは、ニューロンに主に局在化し、アストロサイトには局在化しなかった（図１２Ｃ）。ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐの成熟型は、染色体上の異なる遺伝子座から生じるヒト及びマウスの両方における２つの異なるプレ転写から、スプライスされる。特異的遺伝子座が、ＴＬＥにおけるｍｉＲ−１３５ａの発現の増加の原因であったか否かを調べるために、ｐｒｅ−ｍｉＲレベルを、ヒト及びマウスにおいて研究した。ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５Ａ２は、ヒトＴＬＥにおいて有意に増加したが（図１２Ｄ）、マウスにおいては、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ１及びｐｒｅ−ｍｉＲ−１３５ａ２の両方とも、有意に増加した（図１２Ｅ）。全体として、発明者らは、ＴＬＥにおけるｍｉＲ−１３５ａの発現の増加、及び増加したｍｉＲＮＡは、主にニューロン細胞に局在化することを見出した。
【０４０７】
【表１５】
2021501594.tif 000021
【０４０８】
ｍｉＲ−１３５ａのサイレンシングは自発性の反復性てんかん発作からマウスをレスキューする
発明者らのデータは、ｍｉＲ−１３５ａレベルが、反復性の自発性てんかん発作が検出される時に高いことを示す。ｍｉＲ−１３５ａの発現の増加と自発性てんかん発作を関連付けるために、このｍｉＲＮＡを、アンタゴミル（この場合において、ロックド核酸（ＬＮＡ）３’コレステロールコンジュゲートオリゴヌクレオチド（Ｅｘｉｑｏｎ））によって標的にした。いくつかの研究は、アンタゴミルが、てんかん重積状態の前（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｍａｔｅｏｓら、２０１２年）（Ｇｒｏｓｓら、２０１６年）、又はＳＥの直後（Ｒｅｓｃｈｋｅら、２０１７年）のいずれかに投与された場合に、自発性てんかん発作を効果的に低減することができることを示している。しかしながら、自発性の反復性てんかん発作の段階におけるアンタゴミルの投与がてんかん発作の伝搬に影響を及ぼし得るか否かは未知のままである。アンタゴミルは、ｍｉＲ−１３５ａに対するそれらの特異的な効果について試験するために、異なる濃度で投与された（脳室内、ｉ．ｃ．ｖ）。注射の２４時間後、ｍｉＲ−１３５ａのレベルは、１．０ｎｍｏｌのアンタゴミルで有意に低減したが、別の、無関係のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１２４の発現は影響を受けなかった。１．５ｎｍｏｌの注射は、ｍｉＲ１２４の発現に対して、小さいが、有意な効果を有していた（データは示さない）。これらのデータに基づいて、発明者らは、１．０ｎｍｏｌの注射をその後の実験で使用することを決定した。しかしながら、最初のＩＳＨは、アンタゴミル又は対照の注射後に、内因性のｍｉＲ−１３５ａ及びａｎｔ−ｍｉＲ−１３５ａを検出するために使用した。この分析は、ａｎｔ−ｍｉＲ−１３５ａが、ＣＡ及びＤＧ領域における海馬ニューロン細胞によって主に取り込まれることを示した（図１３Ａ）。
【０４０９】
自発性てんかん発作の出現に対するｍｉＲ−１３５をブロッキングする効果を評価するために、ＳＥ誘導マウスに、ｍｉＲ−１３５ａについてアンタゴミル、又は対照を、Ｄ１４に注射し、注射後６日間、ＥＥＧによって連続的にモニターした（図１３Ｂ）。注射の１週間前（ＳＥ後Ｄ７〜Ｄ１４）に、ベースラインＥＥＧの記録を行い、処置された動物及び対照動物の間でてんかん発作の頻度における有意差は観察されなかった（図１３Ｃ〜１３Ｄ）。発明者らは、独立した実験において、ＰＢＳ又は修飾されたスクランブル（アンタゴミルと同じ）の注射が、ＳＥ後の類似のてんかん発作のパターンを生じることを検証した(データは示さない）。Ｄ１４での抗ｍｉＲ−１３５ａの注射後、１日あたりのてんかん発作の数の有意な減少が検出された（図１３Ｃ）。てんかん発作の数の有意差及び強い低減が、対照マウスと比較して、ａｎｔ−ｍｉＲ−１３５ａにおいて観察された（図１３Ｄ（ｎ＝５  対照及びａｎｔ−ｍｉＲ−１３５ａ注射；混合設計反復測定一般線形モデル；Ｆ統計量−５．８３４（α＝０．０５についてＦ（２０，６０）＝１．７５）；Ｐ＜０．００１）。てんかん発作の平均期間は、ａｎｔ−１３５ａの注射の前に、群の間で差はなかったが（ｐ＝０．４７２１）、注射後、有意に低下した（Ｐ＝０．０００６、スチューデントのｔ検定）（図１３Ｅ）。同様に、てんかん発作の間に費やされる総時間量は、ａｎｔ−ｍｉＲ−１３５ａの注射後の最初の６日において低減した（Ｐ＝０．００２１、スチューデントのｔ検定）（図１３Ｆ）。平均で、ａｎｔ−１３５ａを注射されたマウスは、対照を注射されたマウスと比較して（＞３００秒）、１日あたりのてんかん発作に費やす時間が少なかった（＜３００秒）（図１３Ｈ）。一緒に、これらのデータは、反復性の自発性てんかん発作の期間の間のｍｉＲ−１３５ａの発現の上昇を阻止すると、急性のてんかん発作抑制効果を有することを示す。
【０４１０】
ｍｉＲ−１３５ａ標的の特定
ｍｉＲ−１３５ａは、ＫＬＦ４の発現を調節することによって、軸索の成長及び再生に影響を与えることができる。しかしながら、インビボでのてんかん発作活動に対するａｎｔ−ｍｉＲ−１３５ａ注射の効果の急性の性質は、細胞内シグナル伝達、シナプス伝達又はシナプス形態などのニューロン活動を制御する細胞プロセスとの干渉を暗示する。ｍｉＲＮＡは、標的の転写物の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるｍｉＲＮＡ認識エレメント（ＭＲＥ）として公知の結合特異的配列によって機能する。結合の際に、ｍｉＲＮＡは、翻訳を抑制するか、又は標的ＲＮＡの分解を誘導する。実験的に導かれた少数の経験的ルールに基づいて標的を予測する予測ツールが利用可能であるが（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら、２００５年）（Ｌｅｗｉｓら、２００５年）、これらのコンピューターによる予測ツールの多くは、高い偽陽性率に起因して、実験的な検証の成績が悪い（Ｋｒｅｋら、２００５年）。ｍｉＲ−１３５ａと物理的に相互作用する標的を特定するために、発明者らは、ビオチンタグ化ミミックを使用して、ニューロンのマウスＮｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるｍｉＲＮＡ免疫沈降を行った。３’分子のタグ化は、シード認識及びｍｉＲＮＡ結合と干渉しないことが報告されているので（Ｗａｎｉ及びＣｌｏｏｎａｎ、２０１４年）、ｍｉＲ−１３５ａ及びスクランブル化ミミックを、それらの３’末端でビオチン分子でタグ化した（図１４Ａ、１４Ｂ）。ｂｉｏ−ｍｉＲ  ＩＰについて以前に報告されているプロトコールを適用するが（Ｗａｎｉ及びＣｌｏｏｎａｎ、２０１４年）、発明者らは、ｍｉＲ−１３５のＩＰ及びスクランブル化ミミックの後、Ａｇｏ２（ＲＩＳＣ複合体の主成分）についての免疫ブロットによるＩＰの手順を確認した。Ａｇｏ２は、インプット及びＩＰ試料の両方で検出されたが、細胞骨格タンパク質のβ−アクチンは、インプット試料においてのみ検出された（図１４Ｃ）。Ａｇｏ２の存在は、ｂｉｏ−ｍｉＲＮＡミミックが、ＲＩＳＣ複合体と免疫沈降し、おそらくＲＮＡ標的と結合することを確認する。ｓｃｒ対照の配列は、ヒト、マウス及びラットと最低限の配列同一性を有するエレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）のマイクロＲＮＡに基づく。ｓｃｒ  ＩＰ試料中のＡｇｏ２の存在は、アルゴノートタンパク質が種の間で非常に保存されている事実によって多分説明することができる（Ｈｏｃｋ及びＭｅｉｓｔｅｒ、２００８年）。
【０４１１】
ＩＰの後、総ＲＮＡシークエンシングを行った。インプット試料について平均で５８５０万、及びＩＰ試料について平均で４８７０万の高品質のリードを得た。インプット試料について、これらのリードのほとんどをマウス参照ゲノムと整列させることができたが、ＩＰ試料については、リードの３９．７％を参照ゲノムと整列させることができた。ポリＡ＋濃縮又はリボソームＲＮＡ枯渇を行わなかったので、整列した配列の多くの部分はリボソームＲＮＡに由来した。それぞれの試料について、遺伝子レベルのリードカウント及びＫＰＫＭ値（１００万リードあたりのエクソンのキロベースあたりのＫ−ｍｅｒ）を、Ｓａｉｌｆｉｓｈ（Ｐａｔｒｏら、２０１４年）を用いて作成した。インプット試料の分析は、コンプレキシン（Ｃｐｌｘ１及びＣｐｌｘ２）などの検証されたｍｉＲ−１３５ａ標的を含む、わずかに有意に変化した転写物を明らかにした（Ｈｕら、２０１４年）。ＩＰ試料において、５８７個の転写物のレベルは、有意に変わった（ＦＤＲ＜０．０５及びＰ＜０．０１のカットオフを使用する）（図１４Ｄ）。これらの観察は、ＩＰ試料についての遺伝子発現プロファイルの明らかな分離を示すが（Ｓｃｒ対ｍｉＲ−１３５ａ  ＩＰ）、インプットについて明らかな分離を示さない、主成分分析（ＰＣＡ）によって裏付けられた（図１４Ｅ、Ｆ）。さらにまた、ＩＰ試料は、転移抑制タンパク質（Ｍｔｓｓ）１（Ｚｈｏｕら、２０１２年）、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）４（Ｄａｎｇら、２０１４年）、プロテオグリカンのバーシカン（Ｖｃａｎ）（Ｚｈａｏら、２０１７年）、亜鉛フィンガータンパク質（Ｚｆｐ）２１７（Ｘｉａｎｇら、２０１７年）などの多くの以前に報告されたｍｉＲ−１３５ａ標的を含有していた。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析は、ＩＰ試料中で見出された差次的に発現する転写物が、セマフォリン−プレキシンのシグナル伝達、セマフォリン受容体の活性、イオン輸送及びｃＡＭＰ応答要素の結合として、ニューロン関連機能に関与することを実証した（図１５Ａ〜Ｃ）。インビボでのａｎｔ−ｍｉＲ−１３５ａ処置の観察された効果について関係のあるｍｉＲ−１３５ａの標的を特定するための第１ステップとして、発明者らは、ｍｉＲａｎｄａソフトウェアを使用して、予測されたｍｉＲ−１３５ａ  ＭＲＥを有するＩＰ試料から転写物を選択した。ＭＲＥは、３’−ＵＴＲ（２５８）だけでなく、５７８個の転写物の５’ＵＴＲ（３３）及びコード配列（ＣＤＳ）（２７９）にも存在することが見出された。１７７個の推定標的は、予測された標的部位を有さなかった（図１５Ｄ）。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂは、非常に類似し、同一のシード領域を有し、そのため、原理上は、これらのｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの類似セットを標的にするはずである。ｍｉＲ−１３５ａ及びｍｉＲ−１３５ｂのＩＰ試料中の標的の比較（示さない）は、５０％の重複を明らかにしたが、標的の２５．８％は、ｍｉＲ−１３５ａに固有で、２３．８％はｍｉＲ−１３５ｂに固有であった（図１５Ｅ）。
【０４１２】
上記に概要を述べたアプローチを使用して、発明者らは、ニューロンの発達及び機能の制御における報告された役割を有するｍｉＲ−１３５ａのいくつかの新たな標的を特定した（表１０）。さらなる検証のために、７個の標的を、ニューロンにおけるそれらの機能、及び／又はてんかんにおける影響（結節性硬化症（ＴＳＣ）１、カルシウムチャネル（Ｃａｃｎａｃ１ｃ））に基づいて選択した。試験したすべての標的は、インプット試料と比較して、ＩＰ中で豊富であった（図１６Ａ）。選択された少数の標的の発現に対するＮ２Ａ細胞におけるｍｉＲ−１３５ａミミックの過剰発現の効果を試験し、ＮＲ３Ｃ１（ＧＲ）、ＰｌｘｎＡ４及びＭｅｆ２ａのタンパク質発現の有意な下方制御を示した（図１６Ｂ〜Ｄ）。この実験は、ＩＰによって特定された標的を、ｍｉＲ−１３５ａによって制御することができることを確認する。
【０４１３】
【表１６】
2021501594.tif 000022
【０４１４】
ｍｉＲ−１３５標的のＭｅｆ２ａはＴＬＥにおいて制御される
ＭＥＦ２タンパク質（ＭＥＦ２Ａ〜Ｄ）は、ＭＥＦ２Ａ、２Ｃ及び２Ｄについて最も顕著な発現を伴う、脳において空間的及び時間的に発現する転写因子のファミリーを形成する（Ｌｙｏｎｓら、１９９５年）。ＭＥＦ２は、活動依存性のシナプスの発達を媒介し、シナプスでの神経伝達物質放出の増加から生じる、ニューロトロフィン刺激及びカルシウム流入によって活性化される（Ｆｌａｖｅｌｌら、２００８年）。ＭＥＦ２Ｃにおける変異は、重度精神遅滞及びてんかんを有する患者において記載されている（Ｂｉｅｎｖｅｎｕら、２０１３年）（Ｎｏｗａｋｏｗｓｋａら、２０１０年）。加えて、Ｍｅｆ２ａは、ヒトの側頭葉及び実験的なＴＬＥにおいて調節解除される（Ｈｕａｎｇら、２０１６年）。ａｎｔ−ｍｉＲ−１３５ａ実験（図１３）及びｍｉＲ−１３５ａ  ＩＰによるその特異的濃縮に基づいて、発明者らは、その後の実験をＭｅｆ２ａに集中した。Ｍｅｆ２ａ  ３’−ＵＴＲは、ｍｉＲ−１３５ａに対する１つの特異的に保存された結合部位を含有する（１０２４〜１０３０ｎｔからのシード配列）（図１７Ａ）。この部位は、ルシフェラーゼアッセイによって示されたように、ｍｉＲ−１３５ａによって標的にされる。ｍｉＲ−１３５ａミミックと、ルシフェラーゼレポーターベクター中のｍｉＲ−１３５ａ結合部位との共発現は、ルシフェラーゼ活性の低減をもたらした。この部位の変異は、ｍｉＲ−１３５ａの効果を無効にした（図１７Ｂ）。
【０４１５】
ｍｉＲ−１３５ａも棘突起の数を制御するかを検証するために、ｍｉＲ−１３５ａを、マウス初代海馬ニューロンにおいて過剰発現させた。棘突起の密度を、尖端樹状突起における最初の二次樹状分岐から１００μｍの距離で測定し（図１７Ｃ）、５つの異なる棘突起の種類（カップ状、キノコ状、太く短い、薄い、及び糸状仮足）をカウントした（図１７Ｄ）。ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現は、対照と比較して（０．５５±０．０６棘突起／μｍ）、棘突起の数の有意な低減（０．３４±０．１３棘突起／μｍ）をもたらした。インビトロでのｍｉＲ−１３５ａの過剰発現は、ＴＬＥにおいてインビボで観察された病理学的なニューロン細胞と共通点があり、そのため、てんかんの脳におけるｍｉＲ−１３５ａの増加は、正確な機構は明らかではないが、観察されたニューロンの棘突起の喪失に直接又は間接的に寄与し得る。この効果は、３’−ＵＴＲを欠くＭｅｆ２ベクターがｍｉＲ−１３５ａと共発現した場合に、レスキューされて、レベルを調節した（０．４９±０．０８棘突起／μｍ）（図１７Ｅ）。興味深いことに、ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現は、対照と比較して（カップ状：６．６０％、キノコ状：３４．５１％、太く短い：２６．５３％、薄い：２３．１６％、糸状仮足：９．２％）、成熟棘突起の数の特異的な低減：カップ状（３．３２％）、キノコ状（１８．０５％）、太く短い（２０．８１％）をもたらしたが、未成熟型の棘突起の増加：薄い（３１．００％）及び糸状仮足（２６．８２％）をもたらした。ｍｉＲ−１３５ａの過剰発現に起因する、成熟棘突起の低減及び未成熟棘突起型の増加を、ｍｉＲ−１３５ａをＭｅｆ２と共発現させた場合の対照レベル（カップ状：５．４９％、キノコ状：３２．７７％、太く短い：２５．００％、薄い：２１．１２％、糸状仮足：１５．６３％）に対して正規化した（図１７Ｆ）。このように、ｍｉＲ−１３５ａの発現の増加は、棘突起の数及び種類におけるＭＥＦ２依存性の増加をもたらす。
【０４１６】
ｍｉＲ−１３５ａがＴＬＥにおいて相互作用することができるか否かを調べるために、発明者らは、マウス及びヒトＴＬＥの海馬におけるＭｅｆ２ａの発現を試験した。発明者らのモデルと一致して、Ｍｅｆ２ａタンパク質の発現は、ＩＡＫマウスのＤ１４の海馬において有意に低減し（図１７Ｇ〜Ｈ）、より弱い免疫シグナルが観察された（図１７Ｉ）。同様に、ｍＴＬＥを有する患者において、ＭＥＦ２Ａの発現は、対照と比較して、ｍＴＬＥ＋ＨＳの海馬試料において強く低減され（図１７Ｊ〜Ｋ）、より弱い免疫染色が、歯状回及びＣＡ領域において、対象と比較して、ｍＴＬＥ＋ＨＳ状態において観察された（図１７Ｌ）。最後に、アンタゴミルを使用するインビボでのｍｉＲ−１３５ａの遮断は、免疫組織化学的検査によって検出されるように、Ｍｅｆ２ａの発現の増加をもたらした（図１７Ｍ）。一緒に、これらの結果は、ｍＴＬＥの海馬ニューロンにおけるｍｉＲ−１３５ａの発現の増加がＭＥＦ２Ａのレベルの減少をもたらしたことを示す。ｍＴＬＥにおけるＭＥＦ２Ａの喪失は、異常な棘突起の形成をもたらし、それによって、てんかんにおいて観察される異常な発火パターン及び細胞死に寄与する。
【０４１７】
【表１７】
2021501594.tif 000023
【０４１８】
【表１８】
2021501594.tif 000024
【０４１９】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【配列表】
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