(57)【要約】ナノ沈殿技術を適用し、ナノ粒子を疎水性対イオンとイオン対化して、溶解度の変化を示す新しいＡＰＩ塩を生成することによって、水溶性の生物製剤および小分子活性医薬成分（ＡＰＩ）をナノ粒子にカプセル化するための方法が提示される。本発明は例えば、イオン対化（ＩＰ）試薬の疎水性対イオンとイオン対化した水溶性活性医薬成分（ＡＰＩ）を含む改質塩、および前記改質塩を実質的に取り囲むナノ粒子カプセル化材料を含むナノ粒子を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン対化（ＩＰ）試薬の疎水性対イオンとイオン対化した水溶性活性医薬成分（ＡＰＩ）を含む改質塩、および
前記改質塩を実質的に取り囲むナノ粒子カプセル化材料
を含むナノ粒子。
【請求項２】
前記ＡＰＩが、抗細菌薬である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ＡＰＩが、生物製剤である、請求項１および２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記ＡＰＩが、抗微生物小分子、ペプチド、タンパク質、およびアミノグリコシドからなる群から選択される、請求項１および２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記ＡＰＩが、１０ｍｇ／ｍｌを超える水溶性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記ＡＰＩが、ｐＨ７の水溶液中で−２未満のｌｏｇＰ値を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記ＡＰＩが、１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれよりも多いイオン基を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ＡＰＩが、オリゴヌクレオチドではない、請求項１、２、３および５〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ＡＰＩが、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢ、マストパラン７、ｓｕｂ５、ＬＬ３７、コリスチン、エクミシン、ＯＺ４３９、卵白アルブミン、およびリゾチームからなる群から選択される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記対イオンが、ｐＨ７で２またはそれを超えるｌｏｇＰ値を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記対イオンが、５を超えるｌｏｇＰ値を有し、
前記ＡＰＩの放出プロファイルが、時間と共に放出速度のプラトーを示す、
請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記対イオンが、１個、２個、またはそれよりも多いイオン部位を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記対イオンが、−２〜５のｐＫａ値を有するアニオン性対イオンである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記対イオンが、３を超えるｐＫｂ値を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記対イオンが、四級化カチオン種である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記対イオンが、カルボン酸、サルフェート、スルホネート、またはアミンからなる群から選択されるイオン部位を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記ＩＰ試薬が、ヘキサン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸一水和物、２−ナフタレンスルホン酸ナトリウム、（１Ｒ）−（−）−１０−カンファースルホン酸、１，２−エタンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム一水和物、１−デカンスルホン酸ナトリウム、およびデオキシコール酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
前記ＩＰ試薬が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デシル硫酸ナトリウム（ＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）、ミリスチン酸ナトリウム（ＭＡ）、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）、およびパモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
前記対イオンが、硫酸水素ドデシル、硫酸水素デシル、ドデシルベンゼンスルホン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、およびパモ酸からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
前記対イオンが、オレイン酸およびパルミチン酸からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
前記ナノ粒子カプセル化材料が、自己集合性材料である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、ポリスチレン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）、およびポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２３】
前記ナノ粒子カプセル化材料が、１．６ｋＤａのポリスチレン−ブロック−５ｋＤａのポリエチレングリコールおよび５ｋＤａのポリカプロラクトン−ブロック−５ｋＤａのポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２４】
前記ナノ粒子上に、ポリエチレングリコールコーティングをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２５】
１０ｎｍ〜１０００ｎｍの粒径を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２６】
１０ｎｍ〜１２００ｎｍ、２５ｎｍ〜１０００ｎｍ、５０ｎｍ〜５００ｎｍ、７５ｎｍ〜４００ｎｍ、１００ｎｍ〜３５０ｎｍ、１００ｎｍ〜２５０ｎｍ、または１００ｎｍ〜１５０ｎｍの粒径を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２７】
前記ＡＰＩおよび追加の疎水性化合物が、共カプセル化される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
前記追加の疎水性化合物が、治療薬、造影剤、および農薬化合物から選択される、請求項２７に記載のナノ粒子。
【請求項２９】
前記ＡＰＩが、ゲンタマイシンを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３０】
前記ＡＰＩが、ポリミキシンＢを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３１】
前記ＡＰＩが、マストパラン７を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３２】
前記ＡＰＩが、ｓｕｂ５を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３３】
前記ＡＰＩが、ＬＬ３７を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３４】
前記ＡＰＩが、コリスチンを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３５】
前記ＡＰＩが、エクミシンを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３６】
前記ＡＰＩが、ＯＺ４３９を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３７】
前記ＡＰＩが、卵白アルブミンを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３８】
前記ＡＰＩが、リゾチームを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３９】
前記ＡＰＩが、抗微生物小分子を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４０】
前記抗微生物小分子が、１０００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項３９に記載のナノ粒子。
【請求項４１】
前記ＡＰＩが、アミノグリコシドを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４２】
前記アミノグリコシドが、４，６−二置換デオキシストレプタミン三糖である、請求項４１に記載のナノ粒子。
【請求項４３】
前記ＡＰＩが、直鎖オリゴペプチドを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４４】
前記ＡＰＩが、環式オリゴペプチドを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４５】
前記ＡＰＩが、１０００Ｄａ〜２０００Ｄａの分子量を有する、請求項４３または４４に記載のナノ粒子。
【請求項４６】
前記ＡＰＩが、タンパク質を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４７】
前記タンパク質が、アニオン性タンパク質である、請求項４６に記載のナノ粒子。
【請求項４８】
前記タンパク質が、カチオン性タンパク質である、請求項４６に記載のナノ粒子。
【請求項４９】
前記タンパク質が、２０００Ｄａを超える分子量を有する、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５０】
前記ＩＰ試薬が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５１】
前記ＩＰ試薬が、デシル硫酸ナトリウム（ＤＳ）を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５２】
前記ＩＰ試薬が、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５３】
前記ＩＰ試薬が、ミリスチン酸ナトリウム（ＭＡ）を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５４】
前記ＩＰ試薬が、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５５】
前記ＩＰ試薬が、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５６】
前記ＩＰ試薬が、ビタミンＥコハク酸エステルを含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５７】
前記ＩＰ試薬が、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＸＳ）を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５８】
前記対イオンが、硫酸水素ドデシルを含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５９】
前記対イオンが、硫酸水素デシルを含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６０】
前記対イオンが、ドデシルベンゼンスルホン酸を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６１】
前記対イオンが、ミリスチン酸を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６２】
前記対イオンが、オレイン酸を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６３】
前記対イオンが、パモ酸を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６４】
前記対イオンが、ビタミンＥコハク酸を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６５】
前記対イオンが、硫酸水素デキストランを含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６６】
前記対イオンが、脂肪酸を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６７】
前記対イオンが、硫酸水素アルキルを含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６８】
前記対イオンが、アルキルスルホン酸を含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６９】
前記対イオンが、アルキル第四級アンモニウムカチオンを含む、請求項１および２９〜４９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７０】
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）を含む、請求項１および２９〜６９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７１】
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリスチレン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）を含む、請求項１および２９〜６９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７２】
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）を含む、請求項１および２９〜６９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７３】
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ブロックコポリマーを含む、請求項１および２９〜６９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７４】
前記ブロックコポリマーが、両親媒性ブロックコポリマーである、請求項７３に記載のナノ粒子。
【請求項７５】
前記ブロックコポリマーが、約１０ｋＤａまたはそれ未満の分子量を有する、請求項７３または７４に記載のナノ粒子。
【請求項７６】
前記活性医薬成分が、ゲンタマイシンであり、
前記イオン対化試薬が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項７７】
前記活性医薬成分が、ポリミキシンＢであり、
前記イオン対化試薬が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項７８】
前記活性医薬成分が、ポリミキシンＢであり、
前記イオン対化試薬が、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）であり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項７９】
前記活性医薬成分が、ポリミキシンＢであり、
前記イオン対化試薬が、オレイン酸ナトリウムであり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８０】
前記活性医薬成分が、マストパラン７であり、
前記イオン対化試薬が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８１】
前記活性医薬成分が、ｓｕｂ５であり、
前記イオン対化試薬が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８２】
前記活性医薬成分が、ＬＬ３７であり、
前記イオン対化試薬が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８３】
前記活性医薬成分が、コリスチンであり、
前記イオン対化試薬が、オレイン酸ナトリウムであり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８４】
前記活性医薬成分が、エクミシンであり、
前記イオン対化試薬が、ビタミンＥコハク酸エステルであり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８５】
前記活性医薬成分が、ＯＺ４３９であり、
前記イオン対化試薬が、オレイン酸ナトリウムであり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）である、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８６】
前記活性医薬成分が、卵白アルブミンであり、
前記イオン対化試薬が、第四級アンモニウム界面活性剤であり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８７】
前記活性医薬成分が、卵白アルブミンであり、
前記イオン対化試薬が、臭化セチルトリメチルアンモニウムであり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８８】
前記活性医薬成分が、リゾチームであり、
前記イオン対化試薬が、オレイン酸ナトリウムであり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８９】
前記活性医薬成分が、リゾチームであり、
前記イオン対化試薬が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項９０】
前記活性医薬成分が、リゾチームであり、
前記イオン対化試薬が、硫酸デキストラン（ＤＸＳ）ポリマーであり、
前記ナノ粒子カプセル化材料が、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである、
請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項９１】
活性医薬成分（ＡＰＩ）をカプセル化するための方法であって、
水溶性ＡＰＩ上の荷電官能基を、イオン対化（ＩＰ）試薬とイオン対化することによって、疎水性塩を生成するステップと、
前記ＡＰＩをカプセル化するために、前記疎水性塩の担体であるナノ粒子を形成するステップと
を含み、
前記ＩＰ試薬が、前記ＡＰＩの対イオンを含む、方法。
【請求項９２】
疎水性塩を生成するステップが、
水不溶性沈殿物を前記疎水性塩として形成するために、前記ＡＰＩおよび前記ＩＰを水中で混合すること、
前記水を除去すること、および
前記水不溶性沈殿物を有機溶媒に溶解させること
を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
ポリマーを前記有機溶媒に溶解させるステップをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記有機溶媒が、水混和性である、請求項９２および９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
フラッシュナノ沈殿によって前記ナノ粒子を形成するために、有機ストリーム中の溶解水不溶性沈殿物を使用するステップをさらに含む、請求項９２〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ナノ粒子が集合および沈殿する混合溶液を形成するために、前記有機溶媒に溶解した前記疎水性塩の溶液を、極性溶媒と継続的に混合するステップをさらに含む、請求項９２〜９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記疎水性塩を生成するステップが、
前記ＡＰＩを水ストリームに溶解させること、
前記ＩＰを有機ストリームに溶解させること、および
フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）プロセスにおいて、前記水ストリームに対して前記有機ストリームをマイクロ混合することによって、水不溶性沈殿物を前記疎水性塩として形成すること
を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９８】
ポリマーを、前記有機ストリームに溶解させるステップをさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記有機ストリームが、水混和性である、請求項９７および９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記ナノ粒子が、
極性溶液ストリームを形成するために、前記ＡＰＩを極性溶媒に溶解させること、
有機溶液ストリームを形成するために、前記ＩＰを有機溶媒に溶解させること、
前記ＡＰＩをカプセル化する前記ナノ粒子が集合および沈殿する混合溶液を形成するために、前記極性溶液ストリームを、前記有機溶液ストリームに対して継続的に混合すること、
によって形成され、
前記有機溶媒が、前記極性溶媒よりも極性が低い、
請求項９１に記載の方法。
【請求項１０１】
ポリマーを前記有機溶媒に溶解させるステップをさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記有機溶媒が、水混和性である、請求項１００および１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ナノ粒子が、エマルション／ストリッピングプロセスによって形成される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＡＰＩが、抗細菌薬である、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＡＰＩが、生物製剤である、請求項９１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＡＰＩが、抗微生物小分子、ペプチド、カチオン性ペプチド、アニオン性ペプチド、タンパク質、カチオン性タンパク質、アニオン性タンパク質、およびアミノグリコシドからなる群から選択される、請求項９１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＡＰＩが、１０ｍｇ／ｍｌを超える水溶性を有する、請求項９１〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＡＰＩが、ｐＨ７の水溶液中で−２未満のｌｏｇＰ値を有する、請求項９１〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＡＰＩが、１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれよりも多いイオン基を有する、請求項９１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＡＰＩが、オリゴヌクレオチドではない、請求項９１〜１０５および１０７〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＡＰＩが、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢ、マストパラン７、ｓｕｂ５、ＬＬ３７、コリスチン、エクミシン、ＯＺ４３９、卵白アルブミン、およびリゾチームからなる群から選択される、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＡＰＩが、ポリミキシンＢ、コリスチン、マストパラン７、ｓｕｂ５、卵白アルブミン、およびゲンタマイシンからなる群から選択される、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記対イオンが、ｐＨ７で２またはそれを超えるｌｏｇＰ値を有する、請求項９１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記対イオンが、５を超えるｌｏｇＰ値を有し、前記ＡＰＩの放出プロファイルが、時間と共に放出速度または放出されたフラクションのプラトーを示す、請求項９１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記対イオンが、１、２、またはそれよりも多いイオン部位を有する、請求項９１〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記対イオンが、−２〜５のｐＫａ値を有するアニオン性対イオンである、請求項９１〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記対イオンが、３を超えるｐＫｂ値を有する、請求項９１〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記対イオンが、永久的にカチオン性である四級化カチオン種である、請求項９１〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記対イオンが、カルボン酸、サルフェート、スルホネート、またはアミンからなる群から選択されるイオン部位を有する、請求項９１〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ＩＰ試薬が、ヘキサン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム（ＭＡ）、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）、ベンゼンスルホン酸一水和物、２−ナフタレンスルホン酸ナトリウム、（１Ｒ）−（−）−１０−カンファースルホン酸、１，２−エタンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム一水和物、１−デカンスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）、およびデオキシコール酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項９１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ＩＰ試薬が、デシル硫酸ナトリウム（ＤＳ）である、請求項９１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記対イオンが、硫酸水素ドデシル、硫酸水素デシル、ドデシルベンゼンスルホン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、およびパモ酸からなる群から選択される、請求項９１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記対イオンが、オレイン酸およびパルミチン酸からなる群から選択される、請求項９１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ポリマーが、自己集合性である、請求項９３〜９６、９８〜９９、１０１〜１０２、および１０４〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ポリマーが、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、ポリスチレン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）、およびポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）からなる群から選択される、請求項９３〜９６、９８〜９９、１０１〜１０２、および１０４〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ポリマーが、１．６ｋＤａのポリスチレン−ブロック−５ｋＤａのポリエチレングリコールおよび５ｋＤａのポリカプロラクトン−ブロック−５ｋＤａのポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項９３〜９６、９８〜９９、１０１〜１０２、および１０４〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ナノ粒子上にポリエチレングリコールコーティングをさらに含む、請求項９１〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ナノ粒子が、１０ｎｍ〜１０００ｎｍのＺ平均粒径を有する、請求項９１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ナノ粒子が、２５ｎｍ〜１２００ｎｍのＺ平均粒径を有する、請求項９１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ナノ粒子が、５０ｎｍ〜５００ｎｍのＺ平均粒径を有する、請求項９１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ナノ粒子が、７５ｎｍ〜４００ｎｍのＺ平均粒径を有する、請求項９１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ナノ粒子が、１００ｎｍ〜３５０ｎｍのＺ平均粒径を有する、請求項９１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ナノ粒子が、１００ｎｍ〜２５０ｎｍのＺ平均粒径を有する、請求項９１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ナノ粒子が、１００ｎｍ〜１５０ｎｍのＺ平均粒径を有する、請求項９１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記ナノ粒子が、０．０６〜０．５の多分散指数（ＰＤＩ）を有する、請求項９１〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ナノ粒子が、０．０７〜０．３４の多分散指数（ＰＤＩ）を有する、請求項９１〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ナノ粒子が、０．０８〜０．２７の多分散指数（ＰＤＩ）を有する、請求項９１〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記ナノ粒子が、０．１〜０．２の多分散指数（ＰＤＩ）を有する、請求項９１〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記ナノ粒子が、０．１２〜０．１８の多分散指数（ＰＤＩ）を有する、請求項９１〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記ＡＰＩおよび追加の疎水性化合物が、共カプセル化される、請求項９１〜１３９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４１】
前記追加の疎水性化合物が、治療薬、造影剤、および農薬化合物から選択される、請求項１４０に記載のナノ粒子。
【請求項１４２】
前記ＡＰＩが、ゲンタマイシンを含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４３】
前記ＡＰＩが、ポリミキシンＢを含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４４】
前記ＡＰＩが、マストパラン７を含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４５】
前記ＡＰＩが、ｓｕｂ５を含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４６】
前記ＡＰＩが、ＬＬ３７を含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４７】
前記ＡＰＩが、コリスチンを含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４８】
前記ＡＰＩが、エクミシンを含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４９】
前記ＡＰＩが、ＯＺ４３９を含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１５０】
前記ＡＰＩが、卵白アルブミンを含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１５１】
前記ＡＰＩが、リゾチームを含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１５２】
前記ＡＰＩが、抗微生物小分子を含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１５３】
前記抗微生物小分子が、１０００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項１５２に記載のナノ粒子。
【請求項１５４】
前記ＡＰＩが、アミノグリコシドを含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１５５】
前記アミノグリコシドが、４，６−二置換デオキシストレプタミン三糖である、請求項１５４に記載のナノ粒子。
【請求項１５６】
前記ＡＰＩが、直鎖オリゴペプチドを含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１５７】
前記ＡＰＩが、環式オリゴペプチドを含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１５８】
前記ＡＰＩが、１０００Ｄａ〜２０００Ｄａの分子量を有する、請求項１５６または１５７に記載のナノ粒子。
【請求項１５９】
前記ＡＰＩが、タンパク質を含む、請求項９１〜１０３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６０】
前記タンパク質が、アニオン性タンパク質である、請求項１５９に記載のナノ粒子。
【請求項１６１】
前記タンパク質が、カチオン性タンパク質である、請求項１５９に記載のナノ粒子。
【請求項１６２】
前記タンパク質が、２０００Ｄａを超える分子量を有する、請求項１５９〜１６１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６３】
前記ＩＰ試薬が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６４】
前記ＩＰ試薬が、デシル硫酸ナトリウム（ＤＳ）を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６５】
前記ＩＰ試薬が、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６６】
前記ＩＰ試薬が、ミリスチン酸ナトリウム（ＭＡ）を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６７】
前記ＩＰ試薬が、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６８】
前記ＩＰ試薬が、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６９】
前記ＩＰ試薬が、ビタミンＥコハク酸エステルを含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７０】
前記ＩＰ試薬が、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＸＳ）を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７１】
前記対イオンが、硫酸水素ドデシルを含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７２】
前記対イオンが、硫酸水素デシルを含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７３】
前記対イオンが、ドデシルベンゼンスルホン酸を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７４】
前記対イオンが、ミリスチン酸を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７５】
前記対イオンが、オレイン酸を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７６】
前記対イオンが、パモ酸を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７７】
前記対イオンが、ビタミンＥコハク酸を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７８】
前記対イオンが、硫酸水素デキストランを含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７９】
前記対イオンが、脂肪酸を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１８０】
前記対イオンが、硫酸水素アルキルを含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１８１】
前記対イオンが、アルキルスルホン酸を含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１８２】
前記対イオンが、アルキル第四級アンモニウムカチオンを含む、請求項９１〜１０３および１４２〜１６２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１８３】
前記ポリマーが、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）を含む、請求項９３〜９６、９８〜９９、１０１〜１０２、および１４２〜１８２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１８４】
前記ポリマーが、ポリスチレン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）を含む、請求項９３〜９６、９８〜９９、１０１〜１０２、および１４２〜１８２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１８５】
前記ポリマーが、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）を含む、請求項９３〜９６、９８〜９９、１０１〜１０２、および１４２〜１８２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１８６】
前記ポリマーが、ブロックコポリマーを含む、請求項９３〜９６、９８〜９９、１０１〜１０２、および１４２〜１８２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１８７】
前記ブロックコポリマーが、両親媒性ブロックコポリマーである、請求項１８６に記載のナノ粒子。
【請求項１８８】
前記ブロックコポリマーが、約１０ｋＤａまたはそれ未満の分子量を有する、請求項１８６または１８７に記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この国際出願は、２０１７年１１月３日出願の米国仮出願第６２／５８１，３９４号の出願日における利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された認可番号ＧＭ−０６６１３４およびアメリカ国立科学財団によって授与された認可番号ＣＮＳ−０６１２３４５の下で、政府の支援を得て行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
生物学的有効性を有する製剤を生成するために、活性医薬成分（ＡＰＩ）の薬物担体への封鎖が考慮されてきた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明の一実施形態では、ナノ粒子は、イオン対化（ＩＰ）試薬の疎水性対イオンとイオン対化した水溶性活性医薬成分（ＡＰＩ）を含む改質塩、およびその改質塩を実質的に取り囲むナノ粒子カプセル化材料を含む。ＡＰＩは、抗細菌薬および／または生物製剤であり得る。ＡＰＩは、抗微生物小分子、ペプチド、タンパク質、またはアミノグリコシドであり得る。ＡＰＩは、１０ｍｇ／ｍｌを超える水溶性、ｐＨ７の水溶液中で−２未満のｌｏｇＰ値、および／または１個、２個、３個、４個、５個、６個もしくはそれよりも多いイオン基を有することができる。ＡＰＩは、オリゴヌクレオチド以外であり得る。ＡＰＩは、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢ、マストパラン７、ｓｕｂ５、ＬＬ３７、コリスチン、エクミシン、ＯＺ４３９、卵白アルブミン、またはリゾチームであり得る。
【０００５】
対イオンは、ｐＨ７で２またはそれを超えるｌｏｇＰ値を有することができる。対イオンは、５を超えるｌｏｇＰ値を有することができ、ＡＰＩの放出プロファイルは、時間と共に放出速度のプラトーを示すことができる。対イオンは、１個、２個、またはそれよりも多いイオン部位を有することができる。対イオンは、−２〜５のｐＫａ値を有するアニオン性対イオンであり得る。対イオンは、３を超えるｐＫｂ値を有することができる。対イオンは、四級化カチオン種であり得る。対イオンは、カルボン（ｃａｒｂｏｘｌｉｃ）酸、サルフェート、スルホネート、またはアミンからなる群から選択されるイオン部位を有することができる。ＩＰ試薬は、ヘキサン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸一水和物、２−ナフタレンスルホン酸ナトリウム、（１Ｒ）−（−）−１０−カンファースルホン酸、１，２−エタンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム一水和物、１−デカンスルホン酸ナトリウム、またはデオキシコール酸ナトリウムであり得る。ＩＰ試薬は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デシル硫酸ナトリウム（ＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）、ミリスチン酸ナトリウム（ＭＡ）、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）、またはパモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）であり得る。対イオンは、硫酸水素ドデシル、硫酸水素デシル、ドデシルベンゼンスルホン酸、またはミリスチン酸であり得る。対イオンは、オレイン酸またはパモ酸であり得る。
【０００６】
ナノ粒子カプセル化材料は、自己集合性材料であり得る。ナノ粒子カプセル化材料は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、ポリスチレン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）、またはポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）であり得る。例えば、ナノ粒子カプセル化材料は、１．６ｋＤａのポリスチレン−ブロック−５ｋＤａのポリエチレングリコールまたは５ｋＤａのポリカプロラクトン−ブロック−５ｋＤａのポリエチレングリコールであり得る。
【０００７】
ナノ粒子は、ナノ粒子上に、ポリエチレングリコールコーティングを含むことができる。
【０００８】
ナノ粒子は、１０ｎｍ〜１０００ｎｍ、１０ｎｍ〜１２００ｎｍ、２５ｎｍ〜１０００ｎｍ、５０ｎｍ〜５００ｎｍ、７５ｎｍ〜４００ｎｍ、１００ｎｍ〜３５０ｎｍ、１００ｎｍ〜２５０ｎｍ、または１００ｎｍ〜１５０ｎｍの粒径を有することができる。
【０００９】
ＡＰＩおよび追加の疎水性化合物は、ナノ粒子に共カプセル化（ｃｏ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）され得る。例えば、追加の疎水性化合物は、治療薬、造影剤、または農薬化合物であり得る。
【００１０】
ＡＰＩには、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢ、マストパラン（ｍａｓｔｏｐｏｒａｎ）７、ｓｕｂ５、ＬＬ３７、コリスチン、エクミシン、ＯＺ４３９、卵白アルブミン、またはリゾチームが含まれ得る。ＡＰＩには、抗微生物小分子、例えば１０００Ｄａ未満の分子量を有する抗微生物小分子が含まれ得る。ＡＰＩには、アミノグリコシド、例えば４，６−二置換デオキシストレプタミン三糖が含まれ得る。ＡＰＩには、１０００Ｄａ〜２０００Ｄａの分子量を有することができるオリゴペプチド、例えば直鎖オリゴペプチドまたは環式オリゴペプチドが含まれ得る。ＡＰＩには、２０００Ｄａを超える分子量を有することができるタンパク質、例えばアニオン性タンパク質またはカチオン性タンパク質が含まれ得る。
【００１１】
ＩＰ試薬には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デシル硫酸ナトリウム（ＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）、ミリスチン酸ナトリウム（ＭＡ）、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）、ビタミンＥコハク酸エステル、またはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＸＳ）が含まれ得る。対イオンには、硫酸水素ドデシル、硫酸水素デシル、ドデシルベンゼンスルホン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パモ酸、ビタミンＥコハク酸もしくは硫酸水素デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、またはこれらのいずれかの塩、例えばアルカリ金属（例えば、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、ルビジウム（Ｒｂ）、またはセシウム（Ｃｓ））塩が含まれ得る。対イオンには、脂肪酸、硫酸水素アルキル、アルキルスルホン酸、アルキル第四級アンモニウムカチオン、またはこれらのいずれかの塩、例えばアルカリ金属塩が含まれ得る。
【００１２】
ナノ粒子カプセル化材料には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、ポリスチレン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）、またはポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）が含まれ得る。ナノ粒子カプセル化材料には、約１０ｋＤａまたはそれ未満の分子量を有することができるブロックコポリマー、例えば両親媒性ブロックコポリマーが含まれ得る。
【００１３】
一実施形態では、活性医薬成分は、ゲンタマイシンであり、イオン対化試薬は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、ポリミキシンＢであり、イオン対化試薬は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、ポリミキシンＢであり、イオン対化試薬は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）であり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、ポリミキシンＢであり、イオン対化試薬は、オレイン酸ナトリウムであり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、マストパラン７であり、イオン対化試薬は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、ｓｕｂ５であり、イオン対化試薬は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、ＬＬ３７であり、イオン対化試薬は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、コリスチンであり、イオン対化試薬は、オレイン酸ナトリウムであり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、エクミシンであり、イオン対化試薬は、ビタミンＥコハク酸エステルであり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、ＯＺ４３９であり、イオン対化試薬は、オレイン酸ナトリウムであり、ナノ粒子カプセル化材料は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）である。一実施形態では、活性医薬成分は、卵白アルブミンであり、イオン対化試薬は、第四級アンモニウム界面活性剤であり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、卵白アルブミンであり、イオン対化試薬は、臭化セチルトリメチルアンモニウムであり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、リゾチームであり、イオン対化試薬は、オレイン酸ナトリウムであり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、リゾチームであり、イオン対化試薬は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。一実施形態では、活性医薬成分は、リゾチームであり、イオン対化試薬は、硫酸デキストラン（ＤＸＳ）ポリマーであり、ナノ粒子カプセル化材料は、ポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコールブロックコポリマーである。
【００１４】
活性医薬成分（ＡＰＩ）をカプセル化するための本発明の方法は、水溶性ＡＰＩ上の荷電官能基を、イオン対化（ＩＰ）試薬とイオン対化することによって、疎水性塩を生成するステップと、ＡＰＩをカプセル化するために、疎水性塩の担体であるナノ粒子を形成するステップとを含み、ＩＰ試薬は、ＡＰＩの対イオンを含む。疎水性塩を生成するステップは、ＡＰＩおよびＩＰを水中で混合して、水不溶性沈殿物を疎水性塩として形成すること、水を除去すること、および水不溶性沈殿物を有機溶媒に溶解させることを含むことができる。ポリマーは、有機溶媒に溶解させることができる。有機溶媒は、水混和性であり得る。
【００１５】
溶解した水不溶性沈殿物を、有機ストリーム中で使用して、フラッシュナノ沈殿によってナノ粒子を形成することができる。
【００１６】
有機溶媒に溶解した疎水性塩の溶液を、極性溶媒と継続的に混合して、ナノ粒子が集合および沈殿する混合溶液を形成することができる。
【００１７】
疎水性塩を生成するステップは、ＡＰＩを水ストリームに溶解させること、ＩＰを有機ストリームに溶解させること、およびフラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）プロセスにおいて、水ストリームに対して有機ストリームをマイクロ混合することによって、水不溶性沈殿物を疎水性塩として形成することを含むことができる。ポリマーは、有機ストリームに溶解させることができる。有機ストリームは、水混和性であり得る。
【００１８】
ナノ粒子は、ＡＰＩを極性溶媒に溶解させて、極性溶液ストリームを形成し、ＩＰを有機溶媒に溶解させて、有機溶液ストリームを形成し、極性溶液ストリームを、有機溶液ストリームに対して継続的に混合して、ＡＰＩをカプセル化するナノ粒子が集合および沈殿する混合溶液を形成することによって形成することができ、有機溶媒は、極性溶媒よりも極性が低くてよい。ポリマーは、有機溶媒に溶解させることができる。有機溶媒は、水混和性であり得る。
【００１９】
ナノ粒子は、エマルション／ストリッピングプロセスによって形成することができる。
【００２０】
ＡＰＩは、抗細菌薬および／または生物製剤であり得る。ＡＰＩは、抗微生物小分子、ペプチド、カチオン性ペプチド、アニオン性ペプチド、タンパク質、カチオン性タンパク質、アニオン性タンパク質、またはアミノグリコシドであり得る。ＡＰＩは、１０ｍｇ／ｍｌを超える水溶性を有することができ、ｐＨ７の水溶液中で−２未満のｌｏｇＰ値を有することができ、かつ／または１個、２個、３個、４個、５個、６個もしくはそれよりも多いイオン基を有することができる。ＡＰＩは、オリゴヌクレオチド以外であり得る。ＡＰＩは、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢ、マストパラン７、ｓｕｂ５、ＬＬ３７、コリスチン、エクミシン、ＯＺ４３９、卵白アルブミン、またはリゾチームであり得る。ＡＰＩは、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢ、マストパラン７、ｓｕｂ５、コリスチン、または卵白アルブミンであり得る。
【００２１】
対イオンは、ｐＨ７で２またはそれを超えるｌｏｇＰ値を有することができる。対イオンは、５を超えるｌｏｇＰ値を有することができる。ＡＰＩの放出プロファイルは、時間と共に放出速度（または放出されたフラクション）のプラトーを示すことができる。対イオンは、１個、２個、またはそれよりも多いイオン部位を有することができる。対イオンは、−２〜５のｐＫａ値を有するアニオン性対イオンであり得る。対イオンは、３を超えるｐＫｂ値を有することができる。対イオンは、四級化カチオン種、例えば永久的にカチオン性である四級化カチオン種であり得る。対イオンは、カルボン酸、サルフェート、スルホネート、またはアミンからなる群から選択されるイオン部位を有することができる。ＩＰ試薬は、ヘキサン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム（ＭＡ）、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）、ベンゼンスルホン酸一水和物、２−ナフタレンスルホン酸ナトリウム、（１Ｒ）−（−）−１０−カンファースルホン酸、１，２−エタンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム一水和物、１−デカンスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）、デオキシコール酸ナトリウム、またはデシル硫酸ナトリウム（ＤＳ）であり得る。対イオンは、硫酸水素ドデシル、硫酸水素デシル、ドデシルベンゼンスルホン酸、またはミリスチン酸であり得る。対イオンは、オレイン酸またはパモ酸であり得る。
【００２２】
ポリマーは、自己集合性であり得る。ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、ポリスチレン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）、またはポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）であり得る。例えば、ポリマーは、１．６ｋＤａのポリスチレン−ブロック−５ｋＤａのポリエチレングリコールまたは５ｋＤａのポリカプロラクトン−ブロック−５ｋＤａのポリエチレングリコールであり得る。
【００２３】
ナノ粒子は、ポリエチレングリコールコーティングを含むことができる。
【００２４】
ナノ粒子は、１０ｎｍ〜１０００ｎｍ、２５ｎｍ〜１２００ｎｍ、５０ｎｍ〜５００ｎｍ、７５ｎｍ〜４００ｎｍ、１００ｎｍ〜３５０ｎｍ、１００ｎｍ〜２５０ｎｍ、または１００ｎｍ〜１５０ｎｍのＺ平均粒径を有することができる。ナノ粒子は、０．０６〜０．５、０．０７〜０．３４、０．０８〜０．２７、０．１〜０．２、または０．１２〜０．１８の多分散指数（ＰＤＩ）を有することができる。
【００２５】
ＡＰＩおよび追加の疎水性化合物は、ナノ粒子に共カプセル化され得る。例えば、追加の疎水性化合物は、治療薬、造影剤、または農薬化合物であり得る。
【００２６】
ＡＰＩには、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢ、マストパラン７、ｓｕｂ５、ＬＬ３７、コリスチン、エクミシン、ＯＺ４３９、卵白アルブミン、またはリゾチームが含まれ得る。ＡＰＩには、抗微生物小分子、例えば１０００Ｄａ未満の分子量を有する抗微生物小分子が含まれ得る。ＡＰＩには、アミノグリコシド、例えば４，６−二置換デオキシストレプタミン三糖が含まれ得る。ＡＰＩには、１０００Ｄａ〜２０００Ｄａの分子量を有することができるオリゴペプチド、例えば直鎖オリゴペプチドまたは環式オリゴペプチドが含まれ得る。ＡＰＩには、２０００Ｄａを超える分子量を有することができるタンパク質、例えばアニオン性タンパク質またはカチオン性タンパク質が含まれ得る。
【００２７】
ＩＰ試薬には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デシル硫酸ナトリウム（ＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）、ミリスチン酸ナトリウム（ＭＡ）、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）、ビタミンＥコハク酸エステル、またはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＸＳ）が含まれ得る。対イオンには、硫酸水素ドデシル、硫酸水素デシル、ドデシルベンゼンスルホン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パモ酸、ビタミンＥコハク酸、または硫酸水素デキストランが含まれ得る。対イオンには、脂肪酸、硫酸水素アルキル、アルキルスルホン酸、またはアルキル第四級アンモニウムカチオンが含まれ得る。
【００２８】
ポリマーには、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、ポリスチレン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ）、またはポリカプロラクトン−ブロック−ポリエチレングリコール（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ）が含まれ得る。ポリマーには、ブロックコポリマー、例えば両親媒性ブロックコポリマーが含まれ得る。ブロックコポリマーは、約１０ｋＤａまたはそれ未満の分子量を有することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、イオン対化をベースとするフラッシュナノ沈殿の機構の例示である。事前イオン対化ＡＰＩのＦＮＰ。親水性活性医薬成分は、ＡＰＩを疎水性対イオンと事前対化することにより疎水性塩として生成される。事前イオン対化ＡＰＩは、両親媒性ブロックコポリマーと同時に有機溶媒に溶解し、水に迅速にマイクロ混合する。疎水性ＡＰＩのイオン対は、ＮＣへと沈殿し、ＮＣへと自己集合する。ｉｎ  ｓｉｔｕでのイオン対化を伴うＦＮＰ。親水性ＡＰＩを水に溶解し、疎水性ＡＰＩ対イオンおよび両親媒性ブロックコポリマーを含有する有機溶媒に迅速にマイクロ混合する。ＡＰＩのイオン対化は、混合の間に起こり、両親媒性ブロックコポリマーの存在下で沈殿する疎水性ＡＰＩイオン対を生成し、ＮＣが形成される。
【００３０】
【図２】図２は、本明細書において提示されている検討において試験した、親水性活性医薬成分である、ゲンタマイシン（上部）およびポリミキシンＢ（下部）の化学構造を示す図である。ゲンタマイシン（ＬｏｇＰ＝−４．２１）は、タンパク質合成の阻害により機能する、分子量４７８Ｄａを有するアミノグリコシドである。ポリミキシンＢ（ＬｏｇＰ＝−５．６２）は、細胞膜表面に細孔を形成することにより機能する、分子量１３０２Ｄａを有する、マクロ環式カチオン性ペプチドである。ゲンタマイシンとポリミキシンＢのどちらも、グラム陰性細菌に対して活性がある。
【００３１】
【図３】図３は、本明細書において提示されている検討においてスクリーニングして試験したイオン対を示す図である。幅広いアニオン性塩が使用され、ゲンタマイシンおよびポリミキシンＢと対を形成した。ＦＮＣプロセスにおいて、ＮＣへとＡＰＩを沈殿させることができる塩は、太字で命名されている。ＦＮＣプロセスにおいて、水からＡＰＩを沈殿させるが、ＮＣにはならない塩はイタリック体で記載されている。
【００３２】
【図４】図４は、ポリミキシンとのＦＮＰをベースとするＮＣ集合体の場合の、イオン対（ＩＰ）特性のスクリーニングの結果を示すグラフである。ＡＰＩを沈殿しないイオン対（ダイヤモンド形）、ＡＰＩを沈殿させたが、ＮＣを生成しないイオン対（丸）、およびＡＰＩを沈殿させて、ＮＣを生成したイオン対（正方形）の物理特性（ｐＫａおよびｃＬｏｇＰ）を示している。ＡＰＩを沈殿させて、ＮＣを生成した以下のＩＰ：オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に印がつけられている。
【００３３】
【図５Ａ】図５Ａは、式（１０）の利用によるＡＰＩ沈殿条件のモデル化を例示するグラフである。ＡＰＩ：ＩＰ複合体の様々な飽和溶解度、および複合体形成の様々な傾向（複合体形成強度）とともに、沈殿したＡＰＩのフラクションが示されている。飽和溶解度は、［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓａｔと記載され、ｍｏｌ  Ｌ−１という単位を有する。複合体形成強度は、Ｋｓと記載され、ｍｏｌ−１  Ｌ−１という次元を有する。反応に含まれるＡＰＩおよびＩＰの量は、１Ｍにおいて、１対１の比である。
【００３４】
【図５Ｂ】図５Ｂは、式（１０）の利用によるＡＰＩ沈殿条件のモデル化を例示するグラフである。ＡＰＩ：ＩＰ複合体の様々な飽和溶解度とともに、および反応におけるＡＰＩの量を変えることによる、沈殿したＡＰＩのフラクション。反応に含まれるＡＰＩおよびＩＰの量は、１対１の比である。［ＡＰＩ］０は、Ｍの次元を有する。沈殿収率は、複合体の飽和溶解度を低下させることにより、複合体形成強度を増大させることにより、または反応の濃度を高くすることにより増加させることができる。
【００３５】
【図６Ａ】図６Ａは、ＩＰにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、硫酸デシル（ＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）およびパモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）を使用して事前に形成したＡＰＩ：ＩＰ複合体としてゲンタマイシンを使用して形成されたＮＰのサイズ分布のグラフである。ＮＣ製剤の組成が、表１に示されている。
【００３６】
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＩＰにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、硫酸デシル（ＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）およびパモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）を使用して事前に形成した、ＡＰＩ：ＩＰ複合体としてポリミキシンＢを使用して形成されたＮＰのサイズ分布のグラフである。ＮＣ製剤の組成が、表１に示されている。
【００３７】
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＩＰにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）およびオレイン酸ナトリウム（ＯＡ）を使用する、ポリミキシンＢのｉｎ  ｓｉｔｕでのイオン対化により形成されたＮＰのサイズ分布を示すグラフである。ＮＣ製剤の組成が、表１に示されている。
【００３８】
【図７Ａ】図７Ａは、ＩＰにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）およびオレイン酸ナトリウム（ＯＡ）の場合のＡＰＩ対ＩＰの電荷比に１：１を使用した場合のポリミキシンＢのＮＣの放出速度（時間の関数として放出されたフラクション）を示すグラフである。
【００３９】
【図７Ｂ】図７Ｂは、いくつかのＡＰＩ：ＩＰ比に関して、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ＩＰを使用した場合のポリミキシンＢのＮＣの放出速度（時間の関数として放出されたフラクション）を示すグラフである。電荷比は、１：ｘとして示されており、ｘは、正の電荷を帯びたＡＰＩのイオン対（ＩＰ）電荷当量数である。
【００４０】
【図７Ｃ】図７Ｃは、いくつかのＡＰＩ：ＩＰ比に関する、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）ＩＰを使用した場合のポリミキシンＢのＮＣの放出速度（時間の関数として放出されたフラクション）を示すグラフである。電荷比は、１：ｘとして示されており、ｘは、正の電荷を帯びたＡＰＩのイオン対（ＩＰ）電荷当量数である。
【００４１】
【図８】図８は、ＭＰ７を含まない対照ＮＰを注射した場合、およびＮＰ７を含有するＮＰを注射した場合の、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに感染したマウスの背部の病変の経時的なサイズの低下を示すグラフである。
【００４２】
【図９】図９は、ポリミキシンＢ硫酸塩およびコリスチン（「ポリミキシンＥ」）の化学構造の比較を示す図である。
【００４３】
【図１０】図１０は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のオレイン酸ナトリウム（ＯＡ）ＩＰを使用して形成したＮＣからのポリミキシンＢ（ポリ）、および擬似肺流体（ＳＬＦ３）中のオレイン酸ナトリウム（ＯＡ）ＩＰを使用して形成したＮＣからのコリスチンの放出速度（時間の関数として放出されたフラクション）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明の実施形態を、以下に詳細に論じる。記載される実施形態では、明確にするために特定の用語が用いられる。しかし、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されるものではない。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他の等価な部分を用いることができ、他の方法を開発できることを認識されよう。本明細書に引用されるすべての参考文献は、あたかもそれぞれが個々に組み込まれているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
例えば、ナノキャリア（ＮＣ）、例えばナノ粒子（ＮＰ）を形成するために、薬物担体への活性医薬成分（ＡＰＩ）のナノ沈殿を使用して、安定なナノ粒子および生物学的有効性を有する製剤を生成することができる（この文脈では、別段指定されない限り、用語「ナノキャリア」（ＮＣ）および「ナノ粒子」（ＮＰ）は、交換可能に使用される）。しかし、多くのナノ沈殿技術は、疎水性ＡＰＩおよび水不溶性ＡＰＩのためにしか適用することができず、高度に可溶性の治療薬については実証されていない。ここでは、ナノ沈殿技術を使用してＡＰＩ塩形態を操ることによって、水溶性ＡＰＩをカプセル化するためのモデルおよび技術が提示される。ＡＰＩを、疎水性対イオンとイオン対化して、ナノ沈殿処理に適した溶解度の変化を示す新しいＡＰＩ塩を生成する。安定性および放出速度などのナノキャリアの特性は、イオン対（ＩＰ）分子構造およびイオン対のＡＰＩに対するモル比を変えることによって調節することができる。本明細書に記載されるツールを使用して親水性ＡＰＩをナノキャリア系へと処理することができる。イオン対の識別の管理規則、およびカプセル化を成功させるために必要な処理条件は、実験によって決定され、理論的モデルを用いてアセスメントされる。抗生物質であるポリミキシンＢのためのＮＣ、例えばナノ粒子の形成の成功は、強酸についてはｌｏｇＰ＝２を超え、弱酸についてはｌｏｇＰ＝８を超えるイオン対酸の疎水性を用いることにより容易になり得る。ｌｏｇＰ＝８およびｐＫａ＝５を有するオレイン酸は、生体適合性があり、イオン対複合体を形成するので、イオン対剤（ｉｏｎ  ｐａｉｒ  ａｇｅｎｔ）として適している場合がある。事前に形成された有機可溶性イオン対からのＮＣの形成は、ＮＣが単一沈殿ステップで作製されるｉｎ  ｓｉｔｕでのイオン対化と比較することができる。安定性および放出速度などのＮＣの特性は、イオン対分子構造およびイオン対のＡＰＩに対するモル比を変えることによって調節することができる。ポリミキシンＢについては、約１００〜２００ｎｍのサイズおよび３日にわたる特徴的なＡＰＩ放出速度を有するＮＣが生成された。本明細書に記載される本発明の実施形態は、新しいツールとなり、予め処理が困難な化合物からナノ粒子を形成することができ、例えばナノキャリア系に親水性ＡＰＩを処理することができる新しい手法を実証する。
【００４６】
したがって、本明細書では、疎水性イオン対化によって親水性活性物質をナノキャリア内にカプセル化することが記載される。この手法は、中でも、細菌、真菌、ウイルス、および寄生虫感染などの感染疾患の処置において用いることができる。さらに具体的には、ナノキャリアによる活性治療成分（ＡＰＩ）の制御された送達は、バイオアベイラビリティの改善、毒性の低減、活性の持続、投与レジメンの簡素化、患者のアドヒアランスの改善、および全体的な有効性の増強をもたらすことができる。
【００４７】
本発明の一実施形態であるプロセスでは、ＡＰＩ上の荷電官能基を、対イオンとイオン対化して、過渡的に溶解度が変わるＡＰＩを生成する。フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）を使用して、カプセル化ＡＰＩ−ＩＰ複合体を含有するナノ粒子（ＮＰ）を自己集合させた。（１）ＦＮＰの間のＡＰＩと疎水性対イオンの複合体化（「ｉｎ  ｓｉｔｕでのイオン対化」と呼ぶ）、および（２）ＦＮＰの前の複合体化（「事前イオン対化」と呼ぶ）の２つの集合経路を探索した。事前イオン対化方法では、粒子を、密閉衝突ジェット（ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｉｍｐｉｎｇｅｍｅｎｔ  ｊｅｔ）（ＣＩＪ）ミキサーによって、有機溶媒に溶解した疎水性−親水性ブロックコポリマーおよびＡＰＩ−ＩＰ複合体を脱イオン（ＤＩ）水に対して急速にマイクロ混合することによって形成した。ｉｎ  ｓｉｔｕでのイオン対化法では、有機溶媒に溶解させたブロックコポリマーおよびアニオン性ＩＰを含有する有機ストリームを、ＣＩＪミキサーによって、水に溶解させたカチオン性親水性ＡＰＩを含有する水ストリームと急速にマイクロ混合した。両方の方法について、有機ストリームおよび水ストリームを１：１の体積比で混合し、その後、得られた混合ストリームを水で１０倍希釈した。
【００４８】
ナノ沈殿プロセスでは、ＡＰＩを有機溶媒に溶解させ、逆溶媒（ａｎｔｉｓｏｌｖｅｎｔ）としての水と混合して、沈殿およびナノキャリア自己集合を誘導することができる。しかし、このような直接沈殿方法は、水不溶性化合物（ｃＬｏｇＰ＞４）に対してのみ実行可能であり、親水性生物製剤をナノキャリアにカプセル化するためには実行不可能である。水溶性生物製剤は、代替の水中油中水エマルション（Ｗ／Ｏ／Ｗ）またはリポソームプロセスによってカプセル化することができるが、それらのプロセスは、複数のステップを必要とし、カプセル化効率が低いという欠点があり、または低い薬物質量担持を示す。
【００４９】
実験的な検証により、本発明の手法は、疎水性イオン対化を介するフラッシュナノ沈殿を使用して、親水性ＡＰＩをカプセル化することができると示された。例えば、以下のＡＰＩをカプセル化した。抗微生物小分子であるポリミキシンＢおよびコリスチン、ペプチドであるマストパラン７およびｓｕｂ５、タンパク質である卵白アルブミン、ならびにアミノグリコシドであるゲンタマイシン。
【００５０】
ＦＮＰプロセスを用いるトブラマイシン、ゲンタマイシン、およびポリミキシンＢのＮＰへの製剤化が成功すると、これらの治療薬の適用性を拡大することができる。例えば、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細菌性の肺嚢胞性線維症感染を管理するために使用されるこれらのＡＰＩは、薬物投与後に肺粘液に付着し、感染部位には有効に到達しない。これまで、ナノ粒子製剤では、可溶性ＡＰＩをカプセル化し、放出を制御する能力は、リポソーム製剤に限定されており、一部のリポソームは、リポソーム二層を通る移動およびリポソーム内の沈殿の機序を備えることができるが、この技術は、本明細書で考慮される抗生物質などの高度にイオン性のＡＰＩのリポソームには利用不可能である。したがって、本明細書に提示されるイオン対化手法は、これまで利用不可能であったＡＰＩリポソームのカプセル化のための強力な新しいツールを提供する。
【００５１】
製薬会社は、既に販売されている薬物ベースの治療を増強するために、開示される技術を適用することができる。また製薬会社は、薬物治療が、普通なら満たされていないはずの臨床試験の目的を満たすことができるように、この技術を適用することができる。
【００５２】
ナノキャリアからの活性治療成分の制御された送達は、バイオアベイラビリティの改善、毒性の低減、活性の持続、投与レジメンの簡素化、患者のアドヒアランスの改善、および全体的な有効性の増強をもたらすことができる［Ｓｏｌａｒｏ，  Ｒ．，  Ｆ．  Ｃｈｉｅｌｌｉｎｉ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｂａｔｔｉｓｔｉ，  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇｓ  ｂｙ  Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ．  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２０１０．  ３（３）：  ｐ．  １９２８−１９８０］。ＮＣ製剤（例えば、ナノ粒子）は、送達を標的化し、次に所望の部位に積荷を放出するために使用することができる。直接沈殿方法は、フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）の場合のように高い質量担持で、拡張可能かつ継続的な方式でＮＣを形成し、例えば活性医薬成分（ＡＰＩ）ナノ粒子を急速に形成するので、これらの直接沈殿方法によるＮＣの形成は、魅力的である［Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｆ．  Ｄｏｓｉｏ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｃａｔｔｅｌ，  Ｓｔｅａｌｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｃ  ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｒａｔｉｏｎａｌｅ，  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２００６．  １（３）：  ｐ．  ２９７−３１５、Ｓｔｅｉｃｈｅｎ，  Ｓ．Ｄ．，  Ｍ．  Ｃａｌｄｏｒｅｒａ−Ｍｏｏｒｅ，  ａｎｄ  Ｎ．Ａ．  Ｐｅｐｐａｓ，  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２０１３．  ４８（３）：  ｐ．  ４１６−４２７、Ｇａｌｉｎｄｏ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｓ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ２００５．  ２２（５）：  ｐ．  ４１９−４６４］。ナノ沈殿プロセスでは、ＡＰＩ、例えば疎水性ＡＰＩを有機溶媒に溶解させ、逆溶媒としての水と混合して、沈殿およびＮＣ自己集合を誘導することができる。しかし、このような直接沈殿方法は、水不溶性化合物（ＬｏｇＰ＞４）に対してのみ実行可能であり、親水性ペプチドおよび生物製剤をＮＣ形態にカプセル化するためには使用することができない。水溶性生物製剤は、水中油中水エマルション（Ｗ／Ｏ／Ｗ）またはリポソームプロセスによってカプセル化することができるが、それらのプロセスは、複数のステップを必要とし、カプセル化効率が低いという欠点があり、または低い薬物質量担持を示す［Ｌｉ，  Ｓ．−Ｄ．  ａｎｄ  Ｌ．  Ｈｕａｎｇ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  ２００８．  ５（４）：  ｐ．  ４９６−５０４、Ｏｗｅｎｓ  Ｉｉｉ，  Ｄ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｎ．Ａ．  Ｐｅｐｐａｓ，  Ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ，  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  ２００６．  ３０７（１）：  ｐ．  ９３−１０２、Ｐａｔｔｎｉ，  Ｂ．Ｓ．，  Ｖ．Ｖ．  Ｃｈｕｐｉｎ，  ａｎｄ  Ｖ．Ｐ．  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，  Ｎｅｗ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２０１５．  １１５（１９）：  ｐ．  １０９３８−１０９６６］。直接水沈殿方法を使用して親水性ＡＰＩをナノキャリアに効率的にカプセル化する、本明細書に記載される新しい方法は、達成され得るナノキャリアＡＰＩの薬物動態（ＰＫ）および／または薬力学（ＰＤ）特性を拡大することができる。
【００５３】
ＡＰＩの水溶性を操作することにより、ナノキャリアカプセル化のための新しい処理方法を可能にすることができる。これは、ＡＰＩと疎水性分子の可逆的な共有結合性コンジュゲーションによって実施することができ、それによって、疎水性プロドラッグが生成される。カプセル化および送達の後、共有結合性の連結は切断され、それにより、治療活性のための本来のＡＰＩが生成される。しかし、共有結合によるＡＰＩの修飾では、新しい分子実体が創出され、それによって、食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認のための追加の包括的で高価な、時間のかかる試験が必要になる。ＡＰＩ塩形態の操作は、ＡＰＩの水溶度を調整するための代替経路である。このプロセスでは、ＡＰＩ上の荷電官能基を対イオンとイオン対化して、過渡的に溶解度が変わるＡＰＩを生成する。塩形態を操作する利点は、得られる生成物が、新しい分子実体とみなされず、ＦＤＡの完全な再承認を必要としないことである。しかしほとんどの場合、ＡＰＩ塩形態は、水溶度の増強のためにスクリーニングされ、操作される。疎水性塩形態を創出するための疎水性イオン対の代替使用は、ＡＰＩの疎水性を増大するための、従来にはない方法である。この技術は、弱疎水性の小分子（ｃＬｏｇＰ＝２〜５）をナノキャリアとして沈殿させるために使用されてきたが、高度水溶性（ｃＬｏｇＰ＞０）および正電荷の生物製剤には使用されていない。この文脈では、ゲンタマイシン（ｃＬｏｇＰ＝−４．２１）およびポリミキシンＢ（ｃＬｏｇＰ＝−５．６）などの高度に可溶性の正電荷の抗生物質生物製剤をカプセル化するための疎水性イオン対化が実証される。イオン対（ＩＰ）は、継続的かつ拡張可能な水沈殿プロセスであるフラッシュナノ沈殿によって、安定なナノキャリアへと処理される。先験的に、このような生物製剤は、それらの高いＡＰＩ水溶性のせいで、予測通り、疎水性イオン対を用いて水中で沈殿させることができなかった。イオン対の化学的識別、沈殿を管理する法則、およびカプセル化にとって望ましい溶解度を有するＡＰＩ塩を生じることができる処理方法は、これまで知られていなかった。
【００５４】
これまで、イオン対化は、疎水性化合物からナノ粒子を製剤化するために使用されてきた。これらは、中性ｐＨで１、２、３、４、または５を超えるｌｏｇＰ値を有することによって定義される［Ｐｉｎｋｅｒｔｏｎ，  Ｎ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ  ｂｙ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｉｏｎ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ−ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  ２０１３．  １０（１）：  ｐ．３１９−３２８］。例えば、Ｓｏｎｇら［Ｓｏｎｇ，  Ｙ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｏｎ  ｐａｉｒｉｎｇ  （ＨＩＰ）  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１６．  ２２９：  ｐ．  １０６−１１９］は、ＡＺＤ２８１のためのイオン対化を使用しており、これは中性ｐＨ７で２のｌｏｇＰを有していた。別のグループの研究者は、タンパク質およびポリマー荷電種を、高溶解度を有する逆荷電ポリマー化合物と複合体化した。高溶解度とは、ｐＨ＝７で−２未満のｌｏｇＰ値および／または１０ｍｇ／ｍｌを上回る水性媒体への溶解度を意味し得る。ＰａｔｅｌおよびＧｕａｄａｎａ［Ｇａｕｄａｎａ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ａ  ＨＩＰ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２０１３．  １８（３）：  ｐ．  ７５２−７５９、Ｐａｔｅｌ，  Ａ．，  Ｒ．  Ｇａｕｄａｎａ，  ａｎｄ  Ａ．Ｋ．  Ｍｉｔｒａ，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｏｎ−ｐａｉｒｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，  ２０１４．  ３１（６）：  ｐ．  ５４２−５５０］は、可溶性抗体またはリゾチームタンパク質を、逆荷電硫酸デキストランと複合体化し得ることを示した。硫酸デキストランは、水溶性ポリマーである。得られる沈殿物は、疎水性複合体ではなく、むしろ一般にポリマーのコミュニティで定義される通り「コアセルベート」である［Ａｎｔｏｎｏｖ，  Ｍ．，  Ｍ．  Ｍａｚｚａｗｉ，  ａｎｄ  Ｐ．Ｌ．  Ｄｕｂｉｎ，  Ｅｎｔｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｃｏａｃｅｒｖａｔｅ  ｐｈａｓｅ  ｖｉａ  ｎｏｎｍｏｎｏｔｏｎｉｃ  ｓａｌｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２００９．  １１（１）：  ｐ．  ５１−５９、Ｏｖｅｒｂｅｅｋ，  Ｊ．Ｔ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ｖｏｏｒｎ，  Ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  １９５７．  ４９（Ｓ１）：  ｐ．  ７−２６］。コアセルベートは、反対の電荷を有する２つの可溶性ポリマー種の間のイオン性相互反応から生じる沈殿物である。
【００５５】
可溶性の、または相対的に可溶性の化合物は、疎水性プロドラッグを創出するために、共有結合性コンジュゲーションによってカプセル化されている［Ｂｒｕｎｏ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｇ．Ｄ．  Ｍｉｌｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｃ．Ｓ．  Ｌｉｍ，  Ｂａｓｉｃｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  ２０１３．  ４（１１）：  ｐ．  １４４３−１４６７、Ｊａｉｎ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  ２０１３．  ３０（４）：  ｐ．  ２９３−３２９］。カプセル化および送達の後、共有結合性の連結は切断され、それにより、治療活性のための本来のＡＰＩが生成される。しかし、共有結合によるＡＰＩの修飾では、新しい分子実体が創出され、それによって、ＦＤＡによる追加承認が必要になる。ＡＰＩの水溶度を低減するための代替経路は、活性物質を疎水性対イオンとイオン対化することである［Ｍｕｈｅｅｍ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．  Ｓａｕｄｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２０１６．  ２４（４）：  ｐ．  ４１３−４２８、Ｓｏｈｎ，  Ｊ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１０．  １（６）：  ｐ．  ７７８−７９２、Ａｎｓｅｌｌ，  Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｂｙ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００８．  ５１（１１）：  ｐ．  ３２８８−３２９６．；  Ｍａｒｃｕｓ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｇ．  Ｈｅｆｔｅｒ，  Ｉｏｎ  Ｐａｉｒｉｎｇ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２００６．  １０６（１１）：  ｐ．  ４５８５−４６２１、Ｍａｔｓｃｈｉｎｅｒ，  Ｓ．，  Ｒ．  Ｎｅｕｂｅｒｔ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｗｏｈｌｒａｂ，  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｉｏｎ  ｐａｉｒｉｎｇ．  Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １９９５．  ８（６）：  ｐ．  ３１９−３２５］。この手法を用いて得られた生成物は、新しい分子実体とみなされず、ＦＤＡの完全な再承認を必要としない。ほとんどの場合、ＡＰＩ塩形態は、水溶度または結晶安定性を増強するために操作されており、すなわちその技術は、��来、疎水性小分子（ＬｏｇＰ＝２〜５）をＮＣとして沈殿させるために使用されてきた［Ｓｅｒａｊｕｄｄｉｎ，  Ａ．Ｔ．Ｍ．，  Ｓａｌｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｄｒｕｇ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２００７．  ５９（７）：  ｐ．  ６０３−６１６．；  Ｍｅｙｅｒ，  Ｊ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．  Ｍａｎｎｉｎｇ，  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｏｎ  Ｐａｉｒｉｎｇ：  Ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９８．  １５（２）：  ｐ．  １８８−１９３］。それに対して、可溶性が低い薬物形態を創出するための疎水性イオン対の使用は、従来にはないものである。
【００５６】
この文脈では、ゲンタマイシン（ｃＬｏｇＰ＝−４．２１）およびポリミキシンＢ（ｃＬｏｇＰ＝−５．６）モデルを使用して、高度に可溶性の正電荷の抗生物質生物製剤をカプセル化するための疎水性イオン対化が実証される。イオン対は、継続的かつ拡張可能な水沈殿プロセスであるフラッシュナノ沈殿によって、安定なナノキャリアへと処理される。先験的に、このような生物製剤は、それらの高い水溶性のせいで、予測通り、疎水性イオン対を用いて水中で沈殿させることができない。イオン対の化学的識別、沈殿を管理する法則、およびカプセル化にとって望ましい溶解度を有するＡＰＩ塩を生じることができる処理方法は、これまで知られていなかった。
【００５７】
この文脈は、ＡＰＩをカプセル化するための高ＡＰＩ質量担持（＞５０〜９０％）を有するＮＣを形成する、継続的かつ拡張可能な方法であるフラッシュナノ沈殿の使用を記載する。ＦＮＰプロセスは、高い過飽和物を創出するために溶媒および逆溶媒ストリームの急速なマイクロ混合（Ｏ（ｍｓ））に依存し、それによって、核形成速度を上昇させる。疎水性ＡＰＩは、ＮＣとして沈殿するが、安定化ポリマーの疎水性ブロックは、ＮＣ表面上に吸収されて、粒子の成長を停止させる。これにより、狭いサイズ分布を有する、担持量が高いＮＣが得られる。本発明者らは、そのプロセスを他所で詳説している［Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｂ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｋ．  Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ，  Ｆｌａｓｈ  ＮａｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｃｏｎｆｉｎｅｄ  Ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ  Ｊｅｔｓ  Ｍｉｘｅｒ．  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００３．  ５６（１０）：  ｐ．  １０２１−１０２４、Ｄ’Ａｄｄｉｏ，  Ｓ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｋ．  Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ，  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２０１１．  ６３（６）：  ｐ．  ４１７−４２６、Ｓａａｄ，  Ｗ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｋ．  Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｌａｓｈ  ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ．  Ｎａｎｏ  Ｔｏｄａｙ，  ２０１６．  １１（２）：  ｐ．  ２１２−２２７］。
【００５８】
ある特定の研究では、逆荷電の疎水性脂質を用いるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ）の沈殿が考慮されている［Ｇｉｎｄｙ，  Ｍ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  ２０１４．  ３０（１６）：  ｐ．  ４６１３−４６２２、Ｌｕｏ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｗ．Ｍ．  Ｓａｌｔｚｍａｎ，  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２０００．  １８（１）：  ｐ．  ３３−３７、Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｒ．Ｈ．，  Ｋ．  Ｍａｅｄｅｒ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｇｏｈｌａ，  Ｓｏｌｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  （ＳＬＮ）  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  ２０００．  ５０（１）：  ｐ．  １６１−１７７、Ｒａｄｌｅｒ，  Ｊ．Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：  ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｉｎ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｉｎｔｅｒｈｅｌｉｃａｌ  ｐａｃｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９７．  ２７５（５３０１）：  ｐ．  ８１０−８１４］。これらの例は、イオン化亜リン酸単位の間の結合６個分である３．４Åの電荷空間を有する、高度に負電荷のオリゴヌクレオチドとの複合体化についてのみ実証している。本願における本発明以前には、オリゴヌクレオチドよりも低い電荷密度を有する材料を、疎水性化合物を用いて沈殿させて、ナノ粒子を生成することができたことを示すものはなかった。
【００５９】
高度に可溶性の活性種（ＡＰＩ）と対イオン種の間のイオン対化では、フラッシュナノ沈殿技術、または乳化およびストリッピング技術のいずれかを使用してナノ粒子を形成することができる［Ｓｏｎｇ，  Ｙ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｏｎ  ｐａｉｒｉｎｇ  （ＨＩＰ）  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１６．  ２２９：  ｐ．  １０６−１１９］。形成されたナノ粒子は、例えば２５ｎｍ〜１００ｎｍの間、または２５ｎｍ〜４００ｎｍの間、または２５ｎｍ〜１０００ｎｍの間、または２５ｎｍ〜１２００ｎｍの間、または２５ｎｍ〜６０００ｎｍの間のサイズを有することができる。サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ動的光散乱機器を使用し、通常モードの分析ソフトウェアを使用して測定することができる。強度平均としても公知のＺ平均の直径を記録する。
【００６０】
本明細書に記載されるイオン対化プロセスは、抗菌活性物質を調製するために有用となり得る。ペプチド単位に基づく抗菌剤は、このイオン対化技術に適することができる。
【００６１】
本発明による実施形態は、高度に可溶性の活性物質の複合体化、すなわちカプセル化される目的の種と逆荷電の疎水性種の複合体化を含むことができる。
【００６２】
本発明の一実施形態は、高度に可溶性の活性物質の複合体化、すなわちカプセル化される目的の種と逆荷電の疎水性種の複合体化を含む。例えば、活性物質は、ｐＨ７の水溶液中で１０ｍｇ／ｍｌを超える溶解度、あるいは−２もしくはそれ未満または−３もしくはそれ未満のｌｏｇＰ値を有することができる。活性物質（ＡＰＩ）は、それらを水溶性にする２個、３個、４個、５個、６個、またはそれよりも多いイオン基を有することができる。一実施形態では、活性物質は、オリゴヌクレオチド以外であり得る。
【００６３】
本発明の一実施形態では、中間溶解度、例えば−２＜ｌｏｇＰ＜５の活性物質は、疎水性対イオンとイオン対化することができ、したがって、形成された複合体は、ＦＮＰの混合ステップで沈殿し、ＮＰにカプセル化される。
【００６４】
５を超えるｌｏｇＰ値を有するイオン対化剤の使用は、放出速度のプラトーを含む（経時的に放出する）放出プロファイルを有するカプセル化活性物質を作製するのに有用であり得る。
【００６５】
一実施形態では、沈殿を引き起こす対イオンは、ｐＨ＝７で２またはそれを超えるｌｏｇＰ値を有することができる。一実施形態では、対イオンは、１個、２個、またはそれよりも多いイオン部位を有することができる。一実施形態では、アニオン性対イオンは、−２〜５のｐＫａ値を有することができる。一実施形態では、対イオンは、３を超えるｐＫｂ値を有することができ、または永久的にカチオン性である四級化カチオン種であってよい。一実施形態では、イオン部位は、カルボン酸、サルフェート、スルホネート、サルフェート、またはアミンであり得る。
【００６６】
オレイン酸およびパルミチン酸は、本発明の一実施形態に有用なイオン対化剤または対イオンであり得る。
【００６７】
イオン対化された親水性活性物質は、治療薬、造影剤、または農薬化合物などの疎水性化合物と共に共カプセル化され得る。
【００６８】
ＦＮＰプロセスを用いるトブラマイシンおよびポリミキシンＢなどの治療薬のＮＰへの製剤化が成功すると、それらの適用性を拡大することができる。Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細菌性の肺嚢胞性線維症感染を管理するために使用されるこれらのＡＰＩは、薬物投与後に肺粘液に付着し、感染部位には有効に到達しない［Ｄａｖｉｅｓ，  Ｊ．Ｃ．，  Ａ．−Ｍ．  Ｅｂｄｏｎ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｏｒｃｈａｒｄ，  Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ，  ２０１４．  ９９（１１）：  ｐ．  １０３３−１０３６、Ｌａｉ，  Ｓ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｆｒｅｓｈ  ｕｎｄｉｌｕｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｃｕｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２００７．  １０４（５）：  ｐ．  １４８２−１４８７］。この作用を軽減するために、ＡＰＩを、送達のための粘液浸透性ビヒクルにカプセル化することができる［Ｍｕｈｅｅｍ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．  Ｓａｕｄｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２０１６．  ２４（４）：  ｐ．  ４１３−４２８、Ｓｏｈｎ，  Ｊ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１０．  １（６）：  ｐ．  ７７８−７９２、Ｅｎｓｉｇｎ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｒ．  Ｃｏｎｅ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｈａｎｅｓ，  Ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｕｓ  ｂａｒｒｉｅｒｓ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２０１２．  ６４（６）：  ｐ．５５７−５７０、Ｌａｉ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｙ．−Ｙ．  Ｗａｎｇ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｈａｎｅｓ，  Ｍｕｃｕｓ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２００９．  ６１（２）：  ｐ．  １５８−１７１、Ｋｈａｎｖｉｌｋａｒ，  Ｋ．，  Ｍ．Ｄ．  Ｄｏｎｏｖａｎ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．  Ｆｌａｎａｇａｎ，  Ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｕｃｕｓ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２００１．  ４８（２−３）：  ｐ．  １７３−１９３、Ｃｕ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｗ．Ｍ．  Ｓａｌｔｚｍａｎ，  Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  Ｓｔｅａｌｔｈ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｇｉｖｅ  ｍｕｃｕｓ  ｔｈｅ  ｓｌｉｐ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２００９．  ８（１）：  ｐ．  １１−１３、Ｌ���ｖｒａｇｈｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．  Ｒａｎｄｅｌｌ，  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｍｕｃｕｓ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２００７．  ３５（１）：  ｐ．  １１６−１２９］。しかし、薬物は、構築物内部の水中に制限されるので、リポソーム製剤には、薬物担持が低いという欠点がある。リポソーム製剤を利用するがん治療と比較して抗生物質治療は低価格なので、薬物担持が低く、リポソーム抗生物質製剤プロセスが高額であるということは、幅広い採用には著しい障壁となる。それとは対照的に、ＦＮＰは、動態が制御された自己集合を使用して高ＡＰＩ質量担持（＞５０〜９０％）のＮＰを形成する、継続的かつ拡張可能な方法である［Ｈｏｉｂｙ，  Ｎ．，  Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  ＢＭＣ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２０１１．  ９：  ｐ．  ３２−３２、Ｄａｖｉｅｓ，  Ｊ．Ｃ．，  Ａ．−Ｍ．  Ｅｂｄｏｎ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｏｒｃｈａｒｄ，  Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ，  ２０１４．  ９９（１１）：  ｐ．  １０３３−１０３６、Ｌａｉ，  Ｓ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｆｒｅｓｈ  ｕｎｄｉｌｕｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｃｕｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２００７．  １０４（５）：  ｐ．  １４８２−１４８７］。疎水性ＡＰＩおよび両親媒性ブロックコポリマーは、水混和性有機ストリームに溶解させ、密閉衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサー内で水と急速に混合することができる。疎水性ＡＰＩは、ナノ粒子として沈殿するが、ポリマーの疎水性ブロックは、ＡＰＩのＮＰ上に吸収されて、粒子の成長を、規定された直径および狭いサイズ分布に抑える。ブロックコポリマーの親水性構成成分は、立体安定化層を提供し、水分散度をもたらす。ＦＮＰの間に、親水性官能化ブロックコポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が使用される場合、粒子は、粘液浸透特性を示すことができる［Ｃｒａｔｅｒ，  Ｊ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．  Ｃａｒｒｉｅｒ，  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｕｃｕｓ  ｔｏ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１０．  １０（１２）：  ｐ．  １４７３−１４８３］。抗生物質などの生物製剤を含めた、親水性ＡＰＩをカプセル化するための新しいＦＮＰベースのプロセスの開発は、このような親水性生物製剤を使用することができる適用の種類を拡大するはずである。
【００６９】
イオン対（ＩＰ）は、フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）によって安定なＮＣへと処理され得る。イオン対化技術は、極めて一般的であるが、本発明者らは、例としてゲンタマイシン（ＬｏｇＰ＝−４．２１）およびポリミキシンＢ（ＬｏｇＰ＝−５．６）を示す。Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細菌性の肺嚢胞性線維症感染を管理するために使用されるこれらのカチオン性ＡＰＩは、薬物投与後に肺粘液に付着し、感染部位には有効に到達しない［Ｌａｎｇｅｒ，  Ｒ．，  Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ，  １９９８．  ３９２（６６７９）：  ｐ．  ５−１０、Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１０．  １７（６）：  ｐ．  ５８５−５９４］。特に粘膜拡散性ＰＥＧのＮＣへのカプセル化は、有効性を増大するはずである。
【実施例】
【００７０】
実験実施例
ヘキサン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）、ベンゼンスルホン酸一水和物、２−ナフタレンスルホン酸ナトリウム、（１Ｒ）−（−）−１０−カンファースルホン酸、１，２−エタンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム一水和物、１−デカンスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸（ｄｏｄｅｃｙｌｂｅｎｅｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）ナトリウム（ＤＢＳ）、およびデオキシコール酸ナトリウムを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から得、イオン対化試薬として使用した。ゲンタマイシン硫酸塩（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）およびポリミキシンＢ硫酸塩（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、カプセル化のための親水性およびカチオン性の抗生物質ＡＰＩとして使用した。ブロックコポリマーである１．６ｋＤａのポリスチレン（ｐｏｌｓｔｙｒｅｎｅ）−ブロック−５ｋＤａのポリエチレングリコール（本明細書ではＰＳ−ＰＥＧ、ＰＳ−ｂ−ＰＥＧ、またはＰＳ１．６ｋ−ｂ−ＰＥＧ５ｋと略される）および５ｋＤａのポリカプロラクトン−ブロック−５ｋＤａのポリエチレングリコール（本明細書ではＰＣＬ−ＰＥＧ、ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧ、またはＰＣＬ５ｋ−ｂ−ＰＥＧ５ｋと略される）を、Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｕｒｃｅ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）から得、ＮＣ形成剤、カプセル化剤、および安定化剤として使用した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ試薬を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、ＵＳＡ）から得、タンパク質濃度を定量するために使用した。ＢＣＡアッセイのために、Ｃｏｒｎｉｎｇの９６ウェルの透明な円形平底のハーフエリアマイクロプレートを使用した。Ａｍｉｃｏｎ  ５０ｋＤａ遠心限外濾過膜（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、カプセル化薬物をカプセル化されなかった薬物から分離した。
イオン対化スクリーニング
【００７１】
先に列挙した１５種のイオン対化（ＩＰ）試薬を、疎水性ＡＰＩ塩形態が形成され得るかどうか、および溶液から沈殿し得るかどうかをアセスメントするためにスクリーニングした。イオン対およびＡＰＩ薬物の特性を、Ｍｏｌｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎソフトウェア（Ｍｏｌｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、スロバキア）を用いて算出した。ＡＰＩを５ｍｇ  ｍＬ−１の濃度で水に溶解させ、水に溶解させたＩＰと様々な濃度で混合して、様々なＡＰＩ対ＩＰ比を得た。この比を、ＡＰＩの正電荷とＩＰ上の負電荷に基づいて定義し、正確な組成を表１に示す。スクリーニングプロセスにより、特定のＩＰが、ＮＣ形成のための所与のＡＰＩと共に使用され得るかどうかを決定する。
【表１】
2021501753.tif 000003
表１．フラッシュナノ沈殿に基づくイオン対化を用いて形成されたナノ粒子の概要。ナノ粒子の特性は、動的光散乱分析を用いて決定される。値は平均であり、エラーバーは３つの測定値の標準偏差である。
【００７２】
ＩＰプロセスは、フラッシュナノ沈殿の前またはその最中のいずれかに実施することができる。後者の場合、「ｉｎ  ｓｉｔｕでのイオン対化」または「事前イオン対化」と呼ばれる。これらの２つのイオン対化方法を、図１に記載する。ＩＰおよびＡＰＩを水中で混合して、水不溶性沈殿物（ＡＰＩ：ＩＰ複合体と呼ばれる）を形成する。次に水を除去し、ＩＰ−ＡＰＩ複合体を、ＦＮＰの有機ストリームにおいて使用するために、有機溶媒に溶解させる（ブロックコポリマーと共に）。「ｉｎ  ｓｉｔｕでのイオン対化」と呼ばれる後者の場合、ＡＰＩおよびＩＰを、ＦＮＰの水ストリームおよび有機ストリームにそれぞれ溶解させ、ＦＮＰの急速マイクロ混合ステップ中にＡＰＩ：ＩＰ複合体を形成する。これらの２つのイオン対化方法を、以下に詳細に記載し、比較する。
事前にイオン対化されたＡＰＩ
【００７３】
事前イオン対化の場合、ＡＰＩおよびＩＰを水中で混合して、水不溶性沈殿物（ＡＰＩ：ＩＰ複合体と呼ばれる）を形成する。次に水を除去し、ＡＰＩ：ＩＰ複合体を、ＦＮＰの有機ストリームにおいて使用するために、有機溶媒に溶解させる（ブロックコポリマーと共に）。この場合、ＡＰＩ：ＩＰ複合体を、通常のＦＮＰの有機ストリーム中の構成成分として処理する。事前イオン対化方法であるＦＮＰのスクリーニングプロセスは、４つの逐次的な試験を含む。
【００７４】
１．第１の試験では、ＩＰ薬剤の溶解度を調査する。ＩＰを、ＡＰＩが５ｍｇ  ｍＬ−１で溶解した場合の１：１のＡＰＩ：ＩＰ電荷比に必要とされ得る濃度で、ＤＩ水に添加する（この文脈では、それらの比は、ＡＰＩ：ＩＰの電荷比として表される）。イオン対化の成功には、水への実質的な難溶性が必要である。
【００７５】
２．第２の試験では、ｉｎ  ｓｉｔｕでのＡＰＩ：ＩＰ複合体が、単一ステップで形成され得るかどうかを調査する。例えば、第２の試験は、ＩＰ水溶液をＡＰＩ水溶液と混合すると固体が沈殿するかどうかを調査する。あるいは、有機であるが水混和性の溶液中のＩＰを、ＡＰＩ水溶液に対して混合する。最終的な溶液を、沈殿が生じたかどうかを見るために視覚的にチェックする。この試験では、ＩＰ溶液は、同体積のＩＰ溶液およびＡＰＩ溶液を混合して、１：１のＡＰＩ対ＩＰ電荷比が形成されるような濃度である。以下の４つのＡＰＩ：ＩＰ比を精査する。１：０．５電荷比については、ＡＰＩ溶液２００μＬをＩＰ溶液１００μＬと混合し、１：１電荷比については、ＡＰＩ溶液２００μＬをＩＰ溶液２００μＬと混合し、１：２電荷比については、ＡＰＩ溶液２００μＬをＩＰ溶液４００μＬと混合し、１：４電荷比については、ＡＰＩ溶液２００μＬをＩＰ溶液８００μＬと混合する。
【００７６】
３．第３の試験では、ＡＰＩ：ＩＰ複合体が、その後のＦＮＰのＮＣ形成のために有機相に可溶化され得るかどうかを調査する。第２の試験で形成した沈殿物のペレットを、水混和性有機溶媒、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはより極性が高い溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）もしくはメタノール（ＭｅＯＨ）に可溶性であるかどうかを見るために試験する。例えば、沈殿物が第２の試験で形成された場合、混合物を２０８００ｒｃｆで２０分間遠心分離することができ、ペレット化沈殿物を回収するために、水性上清を除去することができる。有機溶媒２００μＬをペレットに添加することができ、次に、その溶液を混合して、ペレットが溶解するかどうかを決定することができる。
【００７７】
４．最終的な（第４の）試験では、疎水性ＡＰＩ：ＩＰ複合体が、水と混合される場合、例えば逆溶媒としての水とＦＮＰで混合されると再沈殿するかどうかをアセスメントする。第３の試験からのＡＰＩ：ＩＰを含有する有機溶媒を、水で１０倍希釈し、沈殿物の形成を調査する。沈殿物が形成されたら、その構築物は、ＦＮＰにおいて使用するのに適している。
ｉｎ  ｓｉｔｕでのイオン対化
【００７８】
この経路では、イオン対化複合体化を、ＦＮＰの間にｉｎ  ｓｉｔｕで行う。親水性ＡＰＩを水性ストリームに入れ、安定化ブロックコポリマーおよび疎水性ＩＰを、水混和性有機ストリームを介して入れる。溶解度スクリーニングの結果は、６つのＩＰについて３つの異なる溶媒組成物を示す。パモ酸（ＰＡ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびデシル硫酸ナトリウム（ＤＳ）を、５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解させ、オレイン酸（ＯＡ）およびミリスチン酸（ＭＡ）を、５０％メタノール（ＭｅＯＨ）／ＴＨＦに溶解させ、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）を、２０％水／ＴＨＦに溶解させる。
フラッシュナノ沈殿によるナノキャリア形成（ＰＥＧでコーティングされたＮＰへのＡＰＩ：ＩＰのイオン対化）
【００７９】
フラッシュナノ沈殿を使用して、カプセル化ＡＰＩ：ＩＰ複合体を含有するＰＥＧでコーティングされたＮＣを自己集合させた。事前イオン対化方法では、粒子を、密閉衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサーによって、有機溶媒に溶解した疎水性−親水性ブロックコポリマーであるＰＣＬ−ＰＥＧおよびＡＰＩ：ＩＰ複合体を脱イオン（ＤＩ）水に対して急速にマイクロ混合することによって形成した。ｉｎ  ｓｉｔｕでのイオン対化方法では、有機溶媒に溶解させたＰＣＬ−ＰＥＧおよびアニオン性ＩＰを含有する有機ストリームを、ＣＩＪミキサー内で、水に溶解させたカチオン性親水性ＡＰＩを含有する水ストリームに対して急速にマイクロ混合した。両方の方法について、有機ストリームおよび水ストリームを１：１の体積比で混合し、その後、得られた混合ストリームを水で１０倍希釈した。ＰＣＬ−ＰＥＧ安定剤および親水性ＡＰＩ（ゲンタマイシンおよびポリミキシンＢ）の濃度を一定に保ちながら、ＩＰ濃度を変えて、様々な薬物（ＡＰＩ）：ＩＰ比を有するＮＣ、例えばナノ粒子を形成した。この比は、ＡＰＩ中のカチオン性官能基のモル濃度と、ＩＰ中のアニオン性官能基のモル濃度の比である。使用した安定剤であるブロックコポリマー、ＡＰＩ、およびＩＰの正確な組成は、表１に示される（上）。
ナノキャリアの特徴付け
【００８０】
粒径および多分散性を、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって特徴付けた。サイズを、後方散乱測定を用いて決定し、Ｚ平均および強度−重量分布として記録した。本明細書で記録された多分散指数（ＰＤＩ）を、自己相関関数のテイラー展開から得、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｚｅｒデータ分析ソフトウェアに実装する。一次モーメントに対する二次モーメントの比をＰＤＩとして定義し、ここで単分散系粒子については、一般に０．１の値が得られる。
【００８１】
粒子を、サイズ測定およびＮＣ、例えばナノ粒子の安定性アセスメントのために、脱イオン（ＤＩ）水および１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の２つの異なる収集緩衝液で１０倍希釈した。ＰＢＳは、著しく高い塩濃度を含有し、イオン強度１６３ｍＭを有しており、血清のイオン強度を模倣する。ＰＢＳ中でのインキュベーションにより、例えば生理的荷電種とのイオン交換が、ＮＣイオン対化複合体を不安定にし得る条件下で、ＮＣの安定性をアセスメントする。ＮＣの安定性を、ｔ＝０、３時間、２４時間、および７２時間の４つの時点で粒子のＤＬＳを測定することによってアセスメントした。安定性の測定は、室温で実施した。
【００８２】
ＮＣ薬物カプセル化効率を、５０ｋＤａ膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通す限外濾過によって、ＮＣ試料中の溶解した／カプセル化されていない薬物からカプセル化ＡＰＩを分離し、限外濾過フロースルー中の溶解した／カプセル化されていないＡＰＩの濃度を決定することによって求めた。カプセル化効率は、フロースルー画分内のＡＰＩの濃度を、非分離ＮＣ試料内のＡＰＩの濃度で割り、次にこの比を１から引くことによって算出する（等式１）。
【００８３】
薬物濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｉ３ｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、５６２ｎｍの吸光度を測定し、参照として同じ薬物（カプセル化されていない）の標準曲線を使用して決定した。ＡＰＩ放出のフラクションを、１００倍の１×ＰＢＳ中でＮＣ試料を透析することによって決定した。一定分量を、ｔ＝０、１日、２日、３日、５日、および７日目の異なる時点で透析バッグ内から取り出した。各一定分量中の薬物濃度を、ＢＣＡアッセイによって５６２ｎｍにおいて決定した。放出されたフラクションは、各時点のＡＰＩ濃度を、透析前の初期ＡＰＩ濃度で割ったものである（等式２）。
【数１】
2021501753.tif 000004
【数２】
2021501753.tif 000005
（実施例１）
イオン対剤によりゲンタマイシンおよびポリミキシンＢをカプセル化するナノ粒子
疎水性イオン対のスクリーニング
【００８４】
ナノ沈殿法により成功したカプセル化の場合、ＡＰＩ：ＩＰ複合体は、逆溶媒ストリーム（この場合、水溶液である）と混合した場合、速やかに沈殿しなければならない。しかし、図１に示されている通り、ＡＰＩ：ＩＰ複合体は、事前に形成されてもよく、次に、水混和性の有機溶媒相に溶解するか、またはこの複合体はｉｎ  ｓｉｔｕで作製されてもよく、この場合、疎水性ＩＰは、安定化ポリマーを含む有機相に溶解されて、水溶性ＡＰＩが水相に導入される。ＡＰＩであるゲンタマイシンおよびポリミキシンＢ（図２）は、高度に電荷を帯びた親水性化合物であり、それぞれ、水溶解度は、＞１００ｍｇ  ｍＬ−１および＞５０ｍｇ  ｍＬ−１であり、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの極性有機溶媒での溶解度は最低限である。
【００８５】
本発明者らは、まず、以下の検討順序によって事前に形成されたＡＰＩ：ＩＰ複合体を検討した：（１）水溶性の高いＡＰＩであるゲンタマイシンおよびポリミキシンＢを水不溶性塩形態に変換するために使用することができるイオン対（ＩＰ）がどれかの決定、および（２）ＴＨＦを含有する非常に非極性の溶媒に溶解することができ、かつ過剰の水と混合するとＴＨＦから再沈殿する複合体を生成することができる塩形態の生成。
【００８６】
複合体形成の成功に必要な対イオンの物理特性を決定するためのこのような検討に、いくつかの水溶性対イオン塩ＩＰを選択した（図３）。それらの酸形態が５〜−１．９の範囲のｐＫａを有するある範囲のカルボン酸塩およびスルホン酸塩ＩＰ、および幅広い範囲の溶解度、および７．６と高いまたは−４．９２と低いＬｏｇＰ値を有する塩を試験した。ＡＰＩを１ｘ体積の水中に５ｍｇ  ｍＬ−１で溶解し、１ｘ体積の溶解したＩＰと速やかに混合して、１：１のＡＰＩ：ＩＰ電荷比を含有する最終混合物を得た。沈殿物が速やかに形成されたかどうかを評価するため、混合物を目視で観察した。ポリミキシンＢを用いて試験した１５のＩＰのうち、１１のＩＰが沈殿物を形成した。４つのＩＰは、観察可能な沈殿物を生成しなかった（図４、表１および２）。ＡＰＩまたはＩＰが単独で混合された対照実験は沈殿を生じず、これにより、ＡＰＩ：ＩＰ相互作用は、相形成（相変化）の原因であることが実証された。一般的傾向として、沈殿を引き起こしたＩＰは、沈殿を引き起こさなかったＩＰと比べて、ＭＷがより高い、疎水性がより高い、および酸性がより強力な形態である。これらの効果は、疎水性がより強いＩＰは、疎水性のより高いＡＰＩ：ＩＰ複合体を生成すること、およびＡＰＩとより強くイオン性相互作用するＩＰは、より強いＡＰＩ：ＩＰ複合体を生成するという事実により説明することができる。定量の別の方法では、沈殿を引き起こしたＩＰは、より高いｃＬｏｇＰを有しており、より低いｐＫａを有する酸形態を有する。沈殿を引き起こしたＩＰはすべて、０．１１より大きなｃＬｏｇＰを有する。しかし、試験した１つのＩＰである、ヘキサン酸ナトリウムは、２．０１のｃＬｏｇＰを有するが、沈殿を引き起こさなかった。ヘキサン酸ナトリウムの酸形態は、４．８８のｐＫａを有する弱酸である。酸の脱プロトン化は、ＡＰＩのアミンと必要な強力な静電相互作用に必要とされるので、溶液中で酸形態がイオン化する能力に比較的乏しいことにより、ＡＰＩとイオン対を形成するその能力は限られる。これらの結果は、ＩＰの疎水性が高いことは必要であるが、ＡＰＩの沈殿の十分な判断基準にはならないことを実証している。疎水性であること、および強力なイオン性相互作用があることの両方が必要である。
【表２】
2021501753.tif 000006
表２．ポリミキシンＢ  ＡＰＩを使用するイオン対化スクリーニングの要約。沈殿工程では、＋は、形成された固体の量の定性的な観察を詳述している一方、−は、固体が形成されないことを詳述している。有機溶解試験では、＋＋は、完全な溶解を詳述している一方、＋は、非完全な溶解を詳述している。再沈殿試験では、＋は、再沈殿が観察されたことを詳述しており、−は、再沈殿が観察されなかったことを詳述している。
【００８７】
ゲンタマイシンを用いて試験した１５のＩＰのうち、９つのＩＰが沈殿物を形成した。６つのＩＰは、観察可能な沈殿物を生成しなかった（表１および３）。
【表３】
2021501753.tif 000007
表３．ゲンタマイシンＡＰＩを使用するイオン対化スクリーニングの要約。沈殿工程では、＋は、形成された固体の量の定性的な観察を詳述している一方、−は、固体が形成されないことを詳述している。有機溶解試験では、＋＋は、完全な溶解を詳述している一方、＋は、非完全な溶解を詳述している。再沈殿試験では、＋は、再沈殿が観察されたことを詳述しており、−は、再沈殿が観察されなかったことを詳述している。
【００８８】
水不溶性ＡＰＩ：ＩＰ複合体の特定に成功した後、これらの新規な塩形態が、ＮＣ処理するために、ＴＨＦ中に溶解することができるかどうかを決定した。前の工程から形成されたペレットを、水中のＡＰＩの開始体積に等しい１ｘ体積でＴＨＦとインキュベートした。試験した１１のＡＰＩ：ＩＰ複合体のうち、デカン酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムを除くすべての複合体がＴＨＦに溶解した。疎水性の８個の炭素鎖ペンダント基を有するＩＰであるオクタンスルホン酸ナトリウムは、ＡＰＩ：ＩＰのＴＨＦへの溶解に十分である一方、疎水性の９個の炭鎖ペンダント基を有するデカン酸ナトリウムは、ＴＨＦへの溶解に十分ではなかった。オクタンスルホン酸ナトリウムの酸形態のｐＫａは−０．４０である一方、デカン酸ナトリウムのｐＫａは４．０である。ｐＫａのこのような影響は、これらの２つのＩＰが、ＡＰＩと電荷相互作用する能力の差異を強調するものである。したがって、デカン酸ナトリウムは、２．０１のＬｏｇＰを有する、より疎水性の高いＩＰであるが、０．８５のＬｏｇＰを有するオクタンスルホン酸ナトリウムは、ＡＰＩとイオン性複合体を形成する能力がより高いために、良好なＩＰ剤となる。対照として、ＩＰ複合体形成なしに調製したＡＰＩは、ＴＨＦには可溶性ではなく、このことは、有機溶媒への溶解に疎水性ＩＰとの会合が必要であることを強調するものである。これらの結果は、疎水性がより高いＩＰ試薬は、ＡＰＩ：ＩＰ複合体形成に必ずしも良好ではないこと、およびより低い酸形態のｐＫａを有するＩＰは、疎水性塩の形成に良好となり得ることを実証している。
【００８９】
ＦＮＰプロセスでは、有機溶媒に溶解しているＡＰＩ：ＩＰ複合体は、逆溶媒である水と混合すると、速やかに沈殿するはずである。９つの残りのＡＰＩ：ＩＰ塩複合体が、適切に挙動するかどうかを評価するため、前の工程から溶解した複合体を速やかに混合し、水に十倍希釈した。
【００９０】
試験の結果が図４に示されており、ここでは、軸は、ＩＰ剤のｐＫａおよび化合物の計算したＬｏｇＰである。試験したＩＰのうちの４つは、混合時に観察可能な沈殿をもたらさなかった（図４中のダイヤモンド形）。試験したＩＰのうちの４つは、速やかに沈殿し、ＮＣ形成に成功した（正方形）。それらのＩＰは、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であった。この段階で沈殿物が生成しなかったＩＰは、これらの群のなかで、最も疎水性が低く、ＬｏｇＰは、０．８５またはそれ未満である一方、ＬｏｇＰが１．８６またはそれより高いＩＰは、首尾よく沈殿物を形成する。
【００９１】
最低の疎水性であり、最低の酸性であるイオン対は、最初のスクリーニング試験に失敗した一方、中間の疎水性および酸性度を有するイオン対は、最初および３回目のスクリーニング試験の間、不成功に終わった（図４）。成功したＩＰ剤は、ｌｏｇＰ＞２によって表される疎水性を有した。
【００９２】
ｐＫａの増加により表される脱プロトン化の困難さの増加により、ＮＣ形成の成功のためにより高い疎水性が必要とされる。ポリミキシンの最初のイオン化は、ｐＨ＝１０．２３で起こる。したがって、オレイン酸とポリミキシンとの間のΔｐＫａのギャップは、５単位より大きい。疎水性ＡＰＩの以前の検討では、ΔｐＫａ＞２値が、安定なＮＣ形成に必要であった。非常に塩基性の強いポリミキシンＢおよびゲンタマイシンの場合、ΔｐＫａ＞２という判断基準が、ＩＰ対イオンのすべてによって満たされる。これらの結果は、疎水性イオン対化に対する候補ＩＰ選択に関する一般的な実験的洞察をもたらす。
ＩＰ複合体平衡のモデル
【００９３】
理論によって拘泥されないが、ＩＰ選択および複合体形成手順に関するさらなる洞察を得るため、塩基性および酸性ＡＰＩとＩＰとの複合体形成および沈殿の定量的モデルを開発して、実験結果と比較した。この目的は、成功を収めるＩＰ剤の特性を予測することができる規則を得ること、およびＦＮＰ  ＮＣ形成に成功するための濃度比を決定することであった。イオン化した塩基性ＡＰＩおよび酸性ＩＰの複合体形成の場合：
【数３】
2021501753.tif 000008
【数４】
2021501753.tif 000009
角括弧中の濃度は、アニオン性またはカチオン性の電荷の当量で与えられ、したがって、［ＡＰＩ＋］は、モル濃度の単位のＡＰＩを示し、その化合物は、単一のカチオン性電荷を有する。イオン対化複合体の飽和時、またはそれより高い場合、水性ＡＰＩ：ＩＰの濃度は、ＡＰＩ：ＩＰの水性飽和濃度に等しい。
【数５】
2021501753.tif 000010
これに応じて、飽和時またはそれより高いと、水性ＡＰＩ、ＩＰおよびＡＰＩ：ＩＰ複合体の濃度は、Ｋｓの平衡関係、および［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓａｔの平衡関係によって記載される。この式は、飽和濃度とＫｓの項とを組み合わせることにより一般に簡単にされて溶解度積をもたらすが、沈殿収率を評価する際に、これらの項を分離するのが有用である。
【数６】
2021501753.tif 000011
強力に解離しており、完全にイオン化したＡＰＩならびにＩＰの場合、イオン化した化合物の開始濃度は、添加した塩形態の初期濃度に等しいと思われる。
【数７】
2021501753.tif 000012
【数８】
2021501753.tif 000013
ＡＰＩ：ＩＰ複合体の溶解度を超過した後、沈殿物が形成される。形成された沈殿物の量は、Ｖ×［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓｌｄとして表され、Ｖは、この系の体積であり、［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓｌｄは、沈殿前のその飽和濃度よりも高いＡＰＩ：ＩＰ複合体の濃度である。沈殿した固相の体積が、反応の初期体積のそれよりもかなり小さい場合、この関係が当てはまり、こうして、液相の体積は、実質的に一定となる。物質収支および式（７−８）を組み合わせることによって、水溶性イオン化ＡＰＩおよびＩＰの濃度は、以下の通りとなる：
【数９】
2021501753.tif 000014
【数１０】
2021501753.tif 000015
（９−１０）の（６）への置換により、水性ＡＰＩおよびＩＰの開始濃度と固体の沈殿したＡＰＩ：ＩＰ複合体のモル数とを関係付ける一般的な式が得られる。
【数１１】
2021501753.tif 000016
沈殿したＡＰＩ：ＩＰ複合体の解を求めると、固体沈殿物に関する式が得られる。
【数１２】
2021501753.tif 000017
【００９４】
この式は、ＡＰＩ：ＩＰ飽和濃度より高い濃度となる場合に当てはまる。中性のｐＨ約７および沈殿物が形成される濃度における、強力な塩基性のポリミキシンＢおよびゲンタマイシンの複合体形成の場合、これらの条件が満たされる。したがって、これらの仮定および条件下では、沈殿したＡＰＩ：ＩＰのバルク濃度は、ＡＰＩおよびＩＰの開始濃度、平衡定数Ｋｓおよび水性飽和溶解度［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓａｔの関数となり、これらはすべて、容易に求められる。項Ｋｓ［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓａｔは、通常、Ｋｓｐ溶解度積に単純化される一方、これらの２つの項を分離すると、沈殿収率に関する機構的洞察が得られる。Ｋｓｐは、複合体形成強度、およびＡＰＩとＩＰとの間の分子作用（ＡＰＩとＩＰとの間の電荷を帯びた基）の関数となる一方、［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓａｔは、ＩＰ上の疎水性尾部基による、ＩＰ複合体の疎水性の関数、例えば、複合体の疎水性、および水との相互作用の関数となる。
【００９５】
図５Ａおよび５Ｂに示されている通り、式１２を精査すると、ＮＣ処理に関する沈殿反応の設計方法に関する洞察が得られる。Ｋｓ、ならびに初期ＡＰＩ濃度およびＩＰ濃度を有する系の場合、図５Ａに示されている通り、［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓａｔの値が低下するにつれて、沈殿する初期ＡＰＩのフラクションが増加する。以下の条件を使用して、図５Ａを生成した：［ＡＰＩ］０＝１Ｍ；［ＩＰ］０＝１Ｍ；１０−６Ｍ＜［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓａｔ＜１Ｍ；および１０−２Ｍ−１＜Ｋｓ＜１０４Ｍ−１。複合体が、臨界［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓａｔ値未満の場合、固体は形成されない。疎水性が高いＩＰにより、一層低い飽和溶解度を有するＡＰＩ：ＩＰ複合体が形成され、このことは、より高いＬｏｇＰの複合体は、より優れた沈殿物形成体になるという本発明者らの実験結果と一致する。定義した［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓａｔおよび一定の開始ＡＰＩおよびＩＰ初期濃度を有する系の場合、複合体のＫｓが低下するにつれて、沈殿する初期ＡＰＩのフラクションが増加する（図５Ａ）。複合体が、臨界値より高いＫｓを示す場合、固体は形成されない。これらの結果は、ＡＰＩとの強力な対イオン相互作用を有するＩＰは、複合体形成を最大化することを強調するものであり、このことは、観察された実験結果に反映されており、この場合、より低い酸形態のｐＫａを有するＩＰは、ＩＰ自体がそれほど疎水性ではない場合でさえも、沈殿物形成に効果が高い。
【００９６】
特定の［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓａｔおよびＫｓを有する系の場合、図５Ｂに示されている通り、ＡＰＩおよびＩＰの初期濃度を高めるにつれて、沈殿する初期ＡＰＩのフラクションが増加する。以下の条件を使用して、図５Ｂを生成した：１０−２Ｍ＜［ＡＰＩ］０＜１０２Ｍ；［ＡＰＩ］０＝［ＩＰ］０；１０−６Ｍ＜［ＡＰＩ：ＩＰ］ｓａｔ＜１Ｍ；およびＫｓ＝１Ｍ−１。臨界開始ＡＰＩおよびＩＰ初期濃度未満では、沈殿は形成されない。複合体は、ＩＰ濃度を高めることによりＡＰＩのほぼ完全な複合体形成へと推進され得、このことは、ルシャトリエの原理に相当する。しかし、これは、化学種が個々に可溶性である場合にしか起こらない。化学種の１つが沈殿するまたはミセルを形成する場合、その化学種をさらに加えても、この反応をさらに推進することはない。そのような場合、式３における個々のイオン濃度は、不溶性固相の溶解度積によって、またはミセル形成性化学種のＣＭＣによって与えられると思われる。そのような場合、式３−１２によって与えられる収支に、さらなる一組の溶解度積および物質収支が追加されなければならない。形成され得る固相が２つ、すなわち不溶性イオン対複合体（ＡＰＩ：ＩＰ）、およびＩＰの固相が存在する場合、ＮＣは形成され得るが、ＮＣのコアの化学量論は、イオン対の化学量論によって決まらず、複合体と不溶性ＩＰとのモル比によって決まる。これらの結果は、ＮＣ処理のためのＩＰの選択および沈殿反応条件を案内するモデルをもたらし、このモデルは、観察された実験結果を支持する。
ＡＰＩ：ＩＰ複合体のフラッシュナノ沈殿
【００９７】
スクリーニング過程に合格した４つのＩＰ候補（ＯＡ、ＳＤＳ、ＤＢＳ、ＰＡ）を使用して、ＦＮＰプロセスによりＮＣを形成した。ゲンタマイシンおよびポリミキシンＢをＩＰと共に沈殿させて、上記の通り、ＴＨＦに溶解し、ＴＨＦに溶解したＰＣＬ−ＰＥＧと混合してポリマー安定剤およびＡＰＩ：ＩＰ複合体の両方を含有する有機ＴＨＦストリームを得た。このストリームを、両親媒性ＰＣＬ−ＰＥＧの存在下で、密閉衝突ジェット内で水と速やかに混合し、ＡＰＩ：ＩＰ複合体を沈殿させて、ＮＣを形成した。得られた試料のＤＬＳ分析により、狭い多分散性を有する５０〜２００ｎｍのＮＣが形成されたことが実証された（図６Ａおよび６Ｂ、表１）。
【００９８】
安定剤およびＡＰＩのみ、または安定剤およびＩＰのみをこのＦＮＣプロセスに使用した場合、ＯＡを除いて、粒子は形成されず、ＰＣＬ−ＰＥＧミセルしか形成されなかった（表１）。ＦＮＣプロセス中に、ＡＰＩおよびＩＰしか含まれない場合、大きな凝集物が形成され、安定剤、ＡＰＩおよびＩＰという構成成分の３つがすべて含まれることが、ＮＣ形成に同時に必要となることを実証している。これらの結果は、水溶性ＡＰＩは、ＮＣへと製剤化され得ないが、疎水性ＡＰＩ：ＩＰ複合体は、水−沈殿プロセスによりＮＣを形成することができることを実証している。
【００９９】
したがって、事前に形成されたＡＰＩ：ＩＰ複合体を使用するＮＣ形成が実証される。しかし、ＮＣ形成は、単一工程で行うことができるので、ｉｎ  ｓｉｔｕでのＡＰＩ：ＩＰ  ＮＣ複合体形成に有利である。この単一工程は、処理を単純化すると思われる。すなわち、ＡＰＩは、ＦＮＰの前に回分法を使用して、疎水性ＡＰＩ：ＩＰ複合体へと事前に形成され得るが、ＡＰＩ複合体形成とＮＰ形成の両方をもたらすことができる単一連続処理工程は、生成手順を単純化し、生産コストを削減することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ複合体形成およびＮＣ形成を試験するため、およびＡＰＩがｉｎ  ｓｉｔｕでの複合体形成によって単一連続工程でカプセル化し得るかどうかを評価するため、ＦＮＰプロセスにおいて、ＩＰおよびＰＣＬ−ＰＥＧを含有する有機溶媒に、水に溶解したポリミキシンＢを衝突させた。この方法を使用し、事前に形成した複合体を使用してＮＣを形成することが可能であると既に特定したＩＰを検討した。評価したＩＰのうち、すべてが、混合中にｉｎ  ｓｉｔｕで、ポリミキシンＢを疎水性形態に変換し、狭いサイズ分布を有する安定なＮＣを生じた（図６Ｃ）。図６Ｂおよび６Ｃを比較することによって（図６Ｂは、事前に形成したＩＰの場合であり、図６Ｃは、ｉｎ  ｓｉｔｕでイオン対化したポリミキシンである）、いずれかのプロセスによって生成するＮＣのサイズは、実質的に等しいことがわかる。ＰＣＬ−ＰＥＧおよびＩＰのみ、またはＰＣＬ−ＰＥＧおよびポリミキシンＢのみを使用した対照実験は、ミセルが空となり、ＮＣを形成しなかった。ＩＰおよびポリミキシンＢのみを使用した対照実験は、凝集物が形成され、まとめると、ｉｎ  ｓｉｔｕでの複合体形成およびＮＣ形成に、３つの構成成分、すなわち、安定剤、ＡＰＩおよびＩＰのすべてが必要であることを実証している。
【０１００】
ポリミキシンＢのカプセル化効率を測定するため、遊離の非カプセル化薬物を、１００ｋＤａの膜を通過させる限外濾過によって、ＮＣにカプセル化したものから分離し、ＢＣＡ分析を用いて特徴づけを行った。カプセル化効率は、ＦＮＣ系に含まれた薬物の総量と比較した、遊離薬物の相対比に基づく。
【数１３】
2021501753.tif 000018
ＡＰＩに対するＩＰの電荷比が１：１では、ポリミキシンＢは、試験したすべてのＩＰに対して９５％効率を超える効率でカプセル化された。ＩＰが過剰では、高いカプセル化効率は保持されたが、ＡＰＩに対するＩＰ電荷比が０．５：１では、カプセル化効率は、オレイン酸ナトリウムの場合、約７０％へと著しく低下した。これらの結果は、存在するＡＰＩに対するＩＰの量を低下させると、イオン対化によってコア内に保持されない溶解したＡＰＩの相対量が増加することによって、カプセル化効率の低下を引き起こし得ることを実証している。
ＮＣ安定性
【０１０１】
ＮＣ安定性は、水またはＰＢＳの密封体積に希釈した場合の、ＮＣのサイズ分布を測定することにより評価した（すべて、室温）。密封体積中のＮＰの特徴付けは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在していると思われる、シンク条件を捉えないが、密閉系の挙動は、ＮＰ特性に関する洞察をもたらすことができる。試験した４つの対イオンの場合、少なくとも一電荷当量の対イオンと対を形成する場合、ナノ粒子サイズは、わずかな成熟または膨潤があるにもかかわらず、水中では、ほとんど一定を維持した。しかし、ＰＢＳに１０倍で希釈すると、粒子は、ＰＢＳ中のアニオン性ＩＰ、およびＣｌ−、およびＰＯ４−３イオン間のイオン交換により推進される、経時的なサイズ変化を示した。イオン交換によって、外部相に可溶性の結合したＡＰＩを放出する。パモ酸ＩＰの場合、粒子サイズは縮小し、このことは、ＮＣコアからカプセル化したＡＰＩの単純な溶解があることを示唆している（表４Ａ）（数回での多分散性指数は、表４Ｂ中に示されている）。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびオレイン酸ナトリウム（ＯＡ）の場合、粒子サイズは経時的に増大した。これらの結果は、複合体およびＡＰＩが、溶液中に放出されるが、続いて、より大きなサイズの粒子表面に再堆積して、経時的な粒子サイズの成長をもたらす、粒子のオストワルト熟成と一致している［Ｌｉｕ  Ｙ，  Ｋａｔｈａｎ  Ｋ，  Ｓａａｄ  Ｗ，  Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ  ＲＫ．  Ｏｓｔｗａｌｄ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｐｈｙｓ  Ｒｅｖ  Ｌｅｔｔ．  ２００７  Ｊａｎ  １９；９８（３）：０３６１０２］。これらのＩＰのうちの疎水性が最も低いドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、経時的に最も大きなサイズ変化率となるが、より大きな疎水性およびより小さなｐＫａを有するそのようなＩＰは、より遅いおよびより小さな（より少ない）程度のサイズ変化を示したことを実証した。ＩＰ比を１：１より高く増加させると、安定性が向上した。１：４より高いＩＰ比の場合、ＰＢＳ中でさえ、７２時間にわたり、ＮＣはサイズ変化をもたらさなかった。これは、ＩＰの増加はより高い複合体形成を推進するということを示すモデルと一致する。これらの結果は、ＮＰは、溶液中では経時的に、および脱イオン水中での保管の間、安定である一方、イオン強度が高いＰＢＳに移すと、最初に使用したＩＰの構造に依存する程度に、ＮＰ構造の変化を開始し得ることを実証している。
【表４Ａ】
2021501753.tif 000019
表４Ａ．ＰＢＳに希釈した場合の経時的なＮＣの安定性。ＦＮＰ処理によりＮＣを形成するために使用したイオン対（ＩＰ）は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であった。４８〜７２時間までのＤＬＳの有効な測定範囲を超えて増大した粒子に関するサイズデータは示されていない。
【表４Ｂ】
2021501753.tif 000020
表４Ｂ．ＰＢＳに希釈した場合の経時的なＮＣのＰＤＩ。ＦＮＰ処理によりＮＣを形成するために使用したイオン対（ＩＰ）は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＢＳ）、パモ酸二ナトリウム塩（ＰＡ）、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であった。
【０１０２】
カプセル化効率は、ＮＰ処理の間に含まれるＩＰの量の関数となるので、本発明者らは、粒子サイズの安定性がＮＰ処理に含まれるＩＰの量によってどのように影響を受けるかをやはり検討しようとした。ＮＰは、ＩＰとしてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびオレイン酸ナトリウム（ＯＡ）を使用して、ＡＰＩに対するＩＰの電荷比を０．５〜４の間で作製した。これらのＮＰは、ＰＢＳの密封体積に希釈すると、幅広い安定性プロファイルを示し、３時間での迅速な成熟から、数日にわたる小さなサイズ変化までの範囲に及ぶか、または数日にわたりサイズ変化がなかった。重要な留意点として、サイズ変化は、オストワルト熟成の場合に起こると思われる、平均ピーク径のシフトとして示され、ＡＰＩ放出および沈殿／再結晶化がある場合に起こると思われる凝集物の形成ではない。凝集は、多分散性であるＰＤＩの有意な増加として観察されると思われる。系中に含まれるＩＰの量が増加するにつれてＮＰ安定性が増大した。この結果は、ＡＰＩ濃度が一定で、ＮＰ処理の間にＩＰの濃度を高めることによって、ＡＰＩ：ＩＰ複合体の形成がさらに有利となるという現象と一致する。このことは、ＡＰＩに対するイオン対化のための複数の部位が存在するので、とりわけ、ポリミキシンＢの場合には関連性がある。概念実験のこの本論証の範囲外となるが、興味深い将来的な研究には、形成された物質の正確な固体状態組成を決定して、これらのＮＰの挙動に関する洞察を得ることが含まれる。まとめると、これらの結果は、ＮＰ処理中のＡＰＩに対するＩＰの比は、ＮＰ特性および安定性を調節するための追加の手段であることを強調するものである。
ＮＣからのＡＰＩ放出
【０１０３】
ＮＣからのＡＰＩ放出速度は、投与頻度、ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性濃度および総合的な治療有効性の重要な決定因子である。ポリミキシンＢの放出速度は、８ｋＤａのＭＷＣＯ透析用バッグ中にＮＣを封入し、数千倍過剰の体積のＰＢＳに希釈して、室温において、「開放シンク」状態を模擬することによって評価した。透析用バッグ内にカプセル化したポリミキシンは、ＢＣＡアッセイを使用して経時的に測定し、放出されたＡＰＩの量を決定した（図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃ）。図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、検討した３つのアニオン性基ＳＤＳ、ＤＢＳおよびＯＡに関する放出結果を示しており、それらは、１：０．５〜１：４のＳＤＳおよびＯＡの場合のＡＰＩ：ＩＰ比を示している。
【０１０４】
ＡＰＩに対するＩＰの電荷比が１：１の一定の場合、ＮＰ（ＮＣ）の放出速度プロファイルは、使用したＩＰの種類（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅ）に応じて、様々であった。より疎水性の高いペンダント側鎖、およびより低い酸形態のｐＫａを有する電荷基を有するＩＰは、より遅い放出速度で粒子を形成した。デカンスルホン酸ナトリウムおよびオレイン酸ナトリウムを用いて作製されたＮＰは、１日以内にほぼ完全な溶解で、速やかに放出した。この結果は、最初は、乳白色をしているが、透析の１日後に濁りがないように見える、ＮＰ構築物の目視観察と一致する。ドデシル硫酸ナトリウムおよびドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの場合、ＮＰは、透析して最大５日目まででさえも、経時的に目視で乳白色のままであった。これは、ＢＣＡ分析によって決定される、経時的な保持ポリミキシンＢのより遅い放出速度およびより高い濃度と一致した。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムＩＰにより作製されたＮＰは、３日という遅い特徴的な放出速度を示した。留意すべきことに、最も遅い放出速度を示すＮＰ構築物もまた、密閉系において、最大のサイズ安定性プロファイルを示した。疎水性の増大、およびＩＰとＡＰＩとの間のより強力な相互作用は、ＩＰ：ＡＰＩ脱複合体形成速度の低下をもたらし、これにより、ＮＰの安定性の改善と放出の延長の両方がもたらされる。
【０１０５】
ＳＤＳおよびＯＡに関する放出プロファイルは、異なる特徴を有する。ＳＤＳは、高い水溶解度を有しており、「ソフトな」硫酸アニオンは、ポリミキシンＢアミンと良好に結合する。この放出は、ＳＤＳ−ポリミキシン比に応じて、３〜９日間にわたり、ほとんど直線的（すなわち、一次放出）に調節可能である。このことは、ＳＤＳとＡＰＩとの間に、強力ではあるが可動性のイオン性相互作用があることを示している。ＮＣコア中の高い濃度では、ＳＤＳ疎水性基は、複合体の安定性の一因となる。疎水性界面活性剤の鎖の尾部は、イオン対化を弱める水および対イオンの進入を阻止する。これは、タンパク質の疎水性コアにおける「塩架橋」と等価である。塩架橋は、外部水相にさらされると、迅速にイオン交換する単なるイオン対であるが、タンパク質の疎水性コア中では、塩架橋は、タンパク質の安定性に実質的に寄与する。ミセル形成性ＩＰの放出過程は以下：（ｉ）イオン対を不安定化するイオン交換、（ｉｉ）親水性ＡＰＩの放出、（ｉｉｉ）ミセル形成性ＩＰ剤の溶解、（ｉｖ）残存するＩＰ：ＡＰＩの交換への曝露を含む。
【０１０６】
オレイン酸の放出は、異なるパターンに従う。連続放出ではなく、初期放出があるが、次に、さらなる放出なしに封じ込められる。やはり、ＮＣは、ポリミキシンＢと、オレイン酸分子のカルボン酸頭部基との間のイオン性相互作用によって生成する。図７Ｃのデータは、初日に比較的迅速な放出があり、次に、実質的にＡＰＩをこれ以上放出しないプラトーとなることを示している。疎水性ＩＰ（オレイン酸）の濃度が増加するにつれて、このプラトーは減少し、放出されるＡＰＩの量はますます少なくなる。１：１のＩＰ：ＡＰＩ比では、ＡＰＩの９０％が、１日で放出され、４：１の比では、１日に２５％が放出され、その量は、７日間にわたり一定値を維持する。放出機構は、以下と思われる：（ｉ）ＮＣの表面にあるＡＰＩは、放出媒体中の対イオンによって交換され、ＡＰＩは自由になるが、疎水性ＩＰ剤は、ＮＣ表面に留まる、（ｉｉ）ＮＣ表面の不溶性オレイン酸（またはオレイン酸塩）の蓄積は、さらなるＡＰＩ放出への障壁を生成する。
【０１０７】
周囲温度の水へのオレイン酸の溶解度は、約０．３ｘ１０−６ｇ／ｇである。ＮＣの表面に残る水：オレイン酸塩は、液晶相を形成する。液晶相のラメラ構造、すなわち、積層Ｃ１８二重層は、親水性ポリミキシンＢの放出に対する障壁をもたらす。これは、親水性の高分子量化学種をカプセル化し、その放出を防止する、リポソームにおける脂質二重層の障壁特性に類似している。図７Ｃは、オレイン酸濃度が高い範囲内では、残存オレイン酸相が非透過性液晶相を形成することができるようになるまで、ポリミキシンＢの放出は少ないことを示している。
【０１０８】
オレイン酸による恒久的なカプセル化は、課題があるように思われ得るが、新規な送達経路となり得る。Ｓａｌｅｎｔｉｎｉｇらは、生理的ｐＨにおいて、オレイン酸は、多層ラメラ層形成を支持するイオン化の程度は限られていることに言及している［Ｓ．  Ｓａｌｅｎｔｉｎｉｇ，  Ｌ．  Ｓａｇａｌｏｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｏ  Ｇｌａｔｔｅｒ，  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｐＫａ  Ｖａｌｕｅ  ｏｆ  Ｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  ２０１０，  ２６  （１４），  ｐｐ  １１６７０−１１６７９  ＤＯＩ：  １０．１０２１／ｌａ１０１０１２ａ］。Ｓａｌｅｎｔｉｎｉｇらは、小角Ｘ線散乱法（ＳＡＸＳ）を使用して、６．８未満のｐＨでは、液晶構造がなくなり、非構造化流体相が存在することを示している。このｐＨ依存性は、より低いｐＨでは、エンドソーム内、または局所炎症組織では、液晶相が撹乱され得、カプセル化ポリミキシンＢが放出され得ることを示している。これにより、一部の薬物施用にとってかなりの有利点をもたらすことができる、炎症部位またはエンドソームへの標的化放出が可能となることがある。
【０１０９】
まとめると、ＳＤＳおよびオレイン酸イオン対化の結果は、イオン対化剤の相挙動が、可溶性化合物の放出特徴を変化させることができることを示している。数分から１週間の連続放出からの放出プロファイルを調節することが可能である。オレイン酸の液晶挙動は、高い効率および高い担持量でカプセル化する機構、およびｐＨのシフトまたは可能性として酵素作用により放出をもたらす機構を実現する。
【０１１０】
複合体形成、ＦＮＰ中の有機溶媒への曝露、および脱複合体形成後に放出されたポリミキシンＢの生物活性は、重要な考慮点である。この場合、ポリミキシンＢは、固定されたマクロ環であり、大きな構造変化を受けず、したがって、本発明者らは、生物学的有効性が維持されていると予測していることに留意すべきである。可逆性疎水性イオン対化（ＨＩＰ）複合体形成は、複合体構造を有するペプチドまたはタンパク質などのマクロ分子を分解および機能の喪失から保護することができる。
【０１１１】
放出プロファイルは、ＩＰ剤に依存する。ミセル形成性ＳＤＳまたはドデシルベンゼンスルホン酸塩ＩＰの場合、放出は、均質な放出で、７日間の期間にわたり調節され得る。理論によって拘泥されないが、より高い疎水性のオレイン酸の場合、ＮＣ表面を封止する過程が起こり、これにより、コア中への可溶性ＡＰＩの閉じ込めがもたらされる。すなわち、これが、二次封じ込めの機構であり、これは、駆動された放出に使用され得る。
【０１１２】
ＮＰ形成中にＩＰ：ＡＰＩの比が、放出プロファイルに影響を及ぼすかどうかを評価するため、１：０．５、１：１および１：４となるＩＰ対ＡＰＩ比を使用してＮＰを作製した（図７Ｂおよび７Ｃを参照されたい）。ドデシル硫酸ナトリウムおよびオレイン酸ナトリウムの場合の両方で、ＮＰ形成の間に存在するＩＰの量を増加することにより、ポリミキシンＢの放出速度が低下した。これは、ＮＰ放出速度は、上で観察された通り、ＩＰ自体を変えるだけではなく、ＩＰ：ＡＰＩ沈殿条件を変えることによっても、調節可能であることを実証している。ＦＮＰの間に添加されたＩＰ量を増加すると、ＮＰサイズが増大する。
【０１１３】
溶液中のＳＤＳの溶解度が高いことを考慮すると、ＳＤＳを用いた安定性は興味深い：ＳＤＳは、ミセル化前に、最大８ｍＭの水溶液に可溶である。単一イオン性部位を有する低分子ＡＰＩを用いた検討では、イオン対化は、１：１であることが示された。ポリミキシンＢは、４つの二級アミンおよび１１個のアミド窒素を有する。理論によって拘泥されないが、ＳＤＳとの相互作用は、非化学量論的会合を含むことがある。このＳＤＳ相互作用は、ＳＤＳ電気泳動の基礎である、ＳＤＳ：タンパク質相互作用に類似し得る。変性タンパク質の主鎖は、ポリミキシンＢ中のペプチド主鎖に類似しているように思われる。タンパク質へのＳＤＳの結合は協調的なものであり、Ｔｕｒｒｏらによる論文において解明されている通り、主鎖と会合したＳＤＳ分子間での、イオン性相互作用と協調的なアルキル鎖相互作用との両方に起因する［Ｔｕｒｒｏ，  Ｎ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  ｔｈｅ  ＢＳＡ／ＳＤＳ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  １９９５．  １１（７）：  ｐ．  ２５２５−２５３３］。イオン性相互作用および界面活性剤の尾部の会合を組み合わせると、Ｘ線回折によってイオン性ポリマーおよびＤＮＡに関して実証された複雑な構造に至り得る［Ａｎｔｏｎｉｅｔｔｉ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｒａｄ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｔｈｕｅｎｅｍａｎｎ，  Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ−Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ，  Ｍｅｓｏｍｏｒｐｈｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  １９９４．  ２７（２１）：  ｐ．  ６００７−６０１１］。これらの一層複雑な構造は、厳密な化学量論ではないが、幾何学的配置により決定される。本明細書において議論されているペプチドイオン対化複合体は、類似した構造的特徴を示すことができる。
【０１１４】
非常に疎水性の高い脂質およびアルキル酸および不飽和酸は、ｐＨ＝７において、３より大きいｌｏｇＰ値を有するものである。同様に、同じＬｏｇＰ値を有する、非常に疎水性の高いカチオン性対イオンを使用することができる。ＬｏｇＰ値は、Ｍｏｌ  Ｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎソフトウェアを使用して計算することができる。非常に疎水性の高い対イオンを使用して、表面層からの可溶性活性種の放出により、内部活性種のカプセル化をもたらすことができる。このカプセル化は、オレイン酸の場合、図７Ｃに実証されており、これは、１：２または１：４の活性種対オレイン酸比では、放出量のプラトーをもたらす。
（実施例２）
イオン対剤を用いてマストパラン７およびマストパラン１７をカプセル化するナノ粒子
【０１１５】
マストパラン７（ＭＰ７）は、配列ＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＡＬＬ−ＮＨ２（従来の一文字によるアミノ酸略語を使用した）の分子量１４２２Ｄａを有するカチオン性抗生物質ペプチドである。その１４個のアミノ酸のうち１１個（７９％）は、疎水性（非極性）であり、その１４個のアミノ酸のうち２個（１４％）は、塩基性である。マストパラン７は、＋３の電荷を有する。マストパラン１７は、活性試験のために対照として使用される、ＭＰ７の非活性な誘導体である。
【０１１６】
ＭＰ７を、イオン対化およびフラッシュナノ沈殿手法を使用してイオン対化し、カプセル化した。ナノ粒子からのその放出を測定すると、使用した対イオンに依存して変わることが見出された。この知見は、ポリミキシンＢの実験の結果と一致している。次に、カプセル化ＭＰ７を含有するナノ粒子を、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験して、薬物が、イオン対化、カプセル化、および放出のステップを通して、その活性を保持していることを実証した。
【０１１７】
ＭＰ７を、イオン対化およびフラッシュナノ沈殿を使用してナノ粒子にカプセル化した。最初に、ＭＰ７（５ｍｇ／ｍｌ）を、水中１：１の電荷比でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とイオン対化した。イオン対化された不溶性複合体の形成を示す沈殿物が観察された。複合体を、凍結乾燥によって凍結させ、乾燥させ、次に溶液としてのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の混合物に再懸濁させ、次に、その溶液を、ポリカプロラクトン（５ｋＤａ）−ブロック−ポリエチレングリコール（５ｋＤａ）（ＰＣＬ５ｋ−ｂ−ＰＥＧ５ｋ）ブロックコポリマーを含有する有機（ＴＨＦ）供給ストリームにロードした。その有機供給ストリームを、密閉衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサー内で水に対して衝突させた。直径約１２０ｎｍおよびＰＤＩ＜０．２のＮＰを、このフラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）技術によって形成した。
【０１１８】
カプセル化効率およびＭＰ７放出を、前述の通り測定した。カプセル化効率は、９５％を超えると測定された。遊離ＭＰ７およびＮＰ中ＭＰ７からの放出を測定した。ＮＰからのカプセル化ＭＰ７の特徴的な放出時間（５０％の放出にかかる時間）は、３０時間であり、これはカプセル化されていないＭＰ７からの特徴的な放出時間である２．９時間よりも著しく長かった。したがって、ＮＰ内へのカプセル化によって放出が延長された。このＮＰ製剤は、７日までにそのＭＰ７をすべて放出した。
【０１１９】
この「１週間放出」製剤を、皮膚壊死性ｓ．  ａｕｒｅｕｓ創傷モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。手短には、マウスの背中に創傷を作り、次にｓ．  ａｕｒｅｕｓに感染させた。創傷に、ＭＰ７を含むまたはＭＰ７を含まないＮＰを単回注射し、病変サイズを経時的に測定した。図８に示されている結果は、遅延放出製剤により、創傷治癒が改善されたことを実証している（Ｍ．Ａｒｉｆｕｚｚａｍａｎによって実施された実験）。
【０１２０】
放出は、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）を製剤に添加することによってさらに延長された。ＳＤＳに加えてオレイン酸ナトリウムを添加した場合、完全な放出は２週まで緩徐した。この知見は、オレイン酸塩を含有するイオン対化製剤が、ＳＤＳ含有製剤よりも緩慢に放出されるポリミキシンＢの結果と一致している。
【０１２１】
ＭＰ１７は、先の実験の反復において対照として使用される、ＭＰ７の不活性バージョンである。ＭＰ１７は、ＭＰ７と同じ対イオン（ＳＤＳ）とイオン対化し、ＮＰにカプセル化することに成功した。疎水性色素であるＥＴＴＰ５をＭＰ１７と共カプセル化して、従来のＦＮＰを用いてイオン対化手法の適合性を実証した。イオン対化ＦＮＰと通常のＦＮＰを組み合わせることによって、親水性材料および疎水性材料の共カプセル化が可能である。
（実施例３）
イオン対剤を用いてＳｕｂ５をカプセル化するナノ粒子
【０１２２】
Ｓｕｂ５は、配列ＲＲＷＫＩＶＶＩＲＷＲＲ−ＮＨ２を有するカチオン性抗生物質ペプチドである。Ｓｕｂ５は、１２個のアミノ酸残基を含有し、分子量１７２３Ｄａ（ダルトン、ｇ／ｍｏｌ）を有する。その１２個のアミノ酸のうち６個（５０％）は、疎水性（非極性）であり、その１２個のアミノ酸のうち６個（５０％）は、塩基性である。Ｓｕｂ５は、＋７の電荷を有する。Ｓｕｂ５を、イオン対化およびフラッシュナノ沈殿手法を使用してイオン対化し、カプセル化した。ナノ粒子からのその放出を測定すると、同じイオン対化条件下でもＭＰ７の放出とは異なることが見出された。これにより、イオン対化された親水性活性物質の放出は、（１）使用される対イオン、（２）対イオンに対する活性物質の電荷比、および（３）活性物質自体に応じて変わることが実証された。
【０１２３】
Ｓｕｂ５を、イオン対化およびフラッシュナノ沈殿を使用してナノ粒子にカプセル化した。最初に、Ｓｕｂ５（５ｍｇ／ｍｌ）を、水中１：１の電荷比でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とイオン対化した。イオン対化された不溶性複合体の形成を示す沈殿物が観察された。複合体を、凍結乾燥によって凍結させ、乾燥させ、次に溶液としてのＴＨＦおよびＤＭＳＯの混合物に再懸濁させ、次に、その溶液を、ＰＣＬ５ｋ−ｂ−ＰＥＧ５ｋブロックコポリマーを含有する有機（ＴＨＦ）供給ストリームにロードした。その有機供給ストリームを、密閉衝突ジェット（ＣＩＪ）ミキサー内で水に対して衝突させた。直径約１２０ｎｍおよびＰＤＩ＜０．２のＮＰを、このＦＮＰ技術によって形成した。
【０１２４】
カプセル化効率およびＳｕｂ５放出を、前述の通り測定した。カプセル化効率は、９５％を超えると測定された。遊離Ｓｕｂ５およびＮＰ中Ｓｕｂ５からの放出を測定した。ＮＰからのＳｕｂ５の特徴的な放出時間（５０％の放出にかかる時間）は、６．９日であり、これはカプセル化されていないＳｕｂ５からの特徴的な放出時間である２．１時間よりも著しく長かった。したがって、ＮＰ内へのカプセル化によって放出が延長された。
（実施例４）
イオン対剤を用いてＬＬ３７をカプセル化するナノ粒子
【０１２５】
ＬＬ３７は、配列ＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲを有するカチオン性抗生物質ペプチドである。ＬＬ３７は、１３個のアミノ酸残基を含有し、分子量１７１９Ｄａを有する。その１３個のアミノ酸のうち６個（４６％）は、疎水性である。ＬＬ３７は、＋４の電荷を有する。ＬＬ３７を、イオン対化およびフラッシュナノ沈殿手法を使用してイオン対化し、カプセル化した。
【０１２６】
ＬＬ３７を、水中１：１の電荷比でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とイオン対化した。得られた複合体を、凍結乾燥によって乾燥させ、次にＴＨＦおよびＤＭＳＯの混合物に再懸濁させた。この有機溶液を、ＰＣＬ５ｋ−ｂ−ＰＥＧ５ｋブロックコポリマーを含有するＴＨＦ溶液と混合して、ＦＮＰのための有機供給ストリームを作り出した。そのストリームを水に対して衝突させて、直径約１２０ｎｍのＮＰを形成した。カプセル化効率は、前述の通り９５％を超えると測定された。
（実施例５）
イオン対剤を用いてコリスチンをカプセル化するナノ粒子
【０１２７】
コリスチン（「ポリミキシンＥ」）は、分子量１１５５Ｄａを有する環式ペプチドである。コリスチンとポリミキシンＢ硫酸塩の構造的比較は、図９に示されている。ポリミキシンＢは芳香族環を有しているが、コリスチンは有していないという差がある。
【０１２８】
コリスチンを、オレイン酸ナトリウム（ＯＡ）とｉｎ  ｓｉｔｕでイオン対化し、カプセル化した。コリスチンを、水に５ｍｇ／ｍＬで溶解させた。このストリームを、５０／５０ｖ／ｖ％のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびメタノール（ＭｅＯＨ）の有機ストリームに対して衝突させた。この有機溶液は、ＰＣＬ５ｋ−ｂ−ＰＥＧ５ｋブロックコポリマーおよびオレイン酸ナトリウムを含有していた。直径約１００ｎｍのＮＰが形成された。これらのＮＰからのコリスチンの放出を測定し、ポリミキシンＢの放出と比較した。コリスチンの放出は、ポリミキシンＢの放出に類似していた（図１０を参照されたい）。
（実施例６）
イオン対剤を用いてエクミシンをカプセル化するナノ粒子
【０１２９】
エクミシンは、１個の第二級アミンおよび１個の第三級アミンを有する、分子量１５９９Ｄａを有するカチオン性環式ペプチドである。エクミシンは、＋２の電荷を有する。エクミシンは、結核菌に対してｉｎ  ｖｉｖｏで活性である。エクミシンを、イオン対化およびフラッシュナノ沈殿手法を使用してイオン対化し、カプセル化した。ビタミンＥコハク酸エステルを、対イオン（イオン対剤）として使用した。
【０１３０】
エクミシンを、イオン対化フラッシュナノ沈殿手法によってＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧナノ粒子内にカプセル化した。エクミシンを、ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧおよびビタミンＥコハク酸エステル（ｖｉｔＥコハク酸エステル）と共に５０／５０ｖ／ｖ％のＴＨＦおよびＭｅＯＨの有機ストリームにロードし、ＣＩＪミキサー内で水ストリームに対して衝突させた。１：１および１：２の電荷比のエクミシン：ｖｉｔＥコハク酸エステルを試験し、両方によって、直径約７０ｎｍおよびＰＤＩ＜０．２を有するＮＰが得られた。カプセル化効率を前述の通り測定すると、９５％を超えていた。
【０１３１】
エクミシン：ｖｉｔＥコハク酸エステルも、ＰＣＬ−ＰＥＧの特定化バージョンによって安定化したＮＰにカプセル化した。これらには、ＰＥＧ鎖の末端上にコンジュゲートしたａｌｅｘａｆｌｕｏｒ蛍光タグを有するＰＣＬ−ＰＥＧ、およびＰＥＧ鎖の末端上にコンジュゲートしたヘキサマンノースを有するＰＣＬ−ＰＥＧが含まれる。これらの製剤は、制御された送達の他の使用に加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ追跡、マクロファージ取込み、および標的化試験、例えば器官標的化試験のために使用することができる。
【０１３２】
エクミシンのＮＰも、瞬間凍結させ、凍結乾燥させた。次に、このやり方で生成した乾燥粉末を、水を添加して再分散させてナノサイズに戻した。
（実施例７）
イオン対剤を用いてＯＺ４３９をカプセル化するナノ粒子
【０１３３】
ＯＺ４３９（ａｒｔｅｆｅｎｏｍｅｌ）は、分子量４７０Ｄａを有する合成トリオキソラン小分子抗マラリア薬である。ＯＺ４３９は、マラリアのための単回用量の経口治癒薬として有望である。ＯＺ４３９は、中程度の溶解度を有しており、ナノ粒子として沈殿するのに十分には疎水性ではない。ＯＺ４３９は、オレイン酸ナトリウムとイオン対化した後、ＮＰにカプセル化することに成功した。使用した安定剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳであった）。形成された粒子は、１５０ｎｍであり、ＰＤＩ＜０．２を有していた。ＯＺ４３９は、イオン対化ＦＮＰ手法によってカプセル化することができる中程度の溶解度（ｌｏｇＰ約４．６）の荷電小分子の一例である。さらに、この実験では、ブロックコポリマー以外の安定剤を使用して、イオン対化ＦＮＰ戦略によって生成されたナノ粒子を安定化することができることが実証された。
【０１３４】
ＯＺ４３９を、イオン対化フラッシュナノ沈殿手法によってＨＰＭＣＡＳナノ粒子内にカプセル化した。ＯＺ４３９を、ＨＰＭＣＡＳおよびオレイン酸ナトリウムと共に６７／３３ｖ／ｖ％のＴＨＦおよびＭｅＯＨの有機ストリームにロードし、ＣＩＪミキサー内で水ストリームに対して衝突させた。１：１および１：２の電荷比のＯＺ４３９：オレイン酸塩を試験し、両方によって、直径約１５０ｎｍおよびＰＤＩ＜０．２を有するＮＰが得られた。カプセル化効率は、９５％を超えると測定された。
（実施例８）
イオン対剤を用いて卵白アルブミンをカプセル化するナノ粒子
【０１３５】
卵白アルブミン（ＯＶＡ）は、アニオン性タンパク質であり、これを、イオン対化フラッシュナノ沈殿戦略によってＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧのＮＰにカプセル化した。卵白アルブミンは、３８５個のアミノ酸残基を有しており、その分子量は、４３，０００Ｄａであり、生理的ｐＨにおけるその電荷は、−４８である。卵白アルブミンはアニオン性なので、第四級アンモニウム界面活性剤をイオン対化剤として使用した。卵白アルブミンのカプセル化により、イオン対化フラッシュナノ沈殿手法は、ペプチドおよび小分子に限定されず、より大きいタンパク質にも同様に有効であることが実証される。
【０１３６】
ＯＶＡを、イオン対化フラッシュナノ沈殿手法によってナノ粒子にカプセル化した。手短には、ＯＶＡを、水に５ｍｇ／ｍＬで溶解した。このストリームを、ＰＣＬ５ｋ−ｂ−ＰＥＧ５ｋおよび第四級アンモニウム界面活性剤を含有する５０／５０ｖ／ｖ％のＴＨＦおよびＭｅＯＨの有機ストリームに対して衝突させた。少なくとも１電荷当量の界面活性剤が含まれていた場合、ＯＶＡは、直径約１５０ｎｍおよびＰＤＩ＜０．２を有する安定なＮＰにカプセル化することに成功した。ナノ粒子は、以下の第四級アンモニウム界面活性剤のそれぞれを用いて形成することに成功した。臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化テトラオクチルアンモニウム、臭化テトラキス（デシル）アンモニウム、臭化テトラドデシルアンモニウム、臭化テトラヘキサデシルアンモニウム、臭化ジドデシルジメチルアンモニウム、臭化ジメチルジテトラデシルアンモニウム、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、および臭化ジメチルジヘキサデシルアンモニウム。他のカチオン性界面活性剤を使用することもできる。ＯＶＡナノ粒子は、ワクチンとして、また他の免疫学研究のために潜在的に有用である。
（実施例９）
イオン対剤を用いてリゾチームをカプセル化するナノ粒子
【０１３７】
リゾチーム（ＬＹＺ）は、カチオン性タンパク質であり、これを、イオン対化フラッシュナノ沈殿戦略によってＰＣＬ−ｂ−ＰＥＧのＮＰにカプセル化した。リゾチームは、１２９個のアミノ酸残基を有しており、その分子量は、１４，３００Ｄａであり、生理的ｐＨにおけるその電荷は、＋８である。まとめると、ＬＹＺおよびＯＶＡカプセル化により、イオン対化フラッシュナノ沈殿手法は、カチオン性およびアニオン性タンパク質の両方に適用することができる頑強な手法であることが実証される。ＬＹＺは、ＮＰから放出された後も、活性なタンパク質であることが示された。
【０１３８】
ＬＹＺを、ｉｎ  ｓｉｔｕでのイオン対化フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）手法によってナノ粒子にカプセル化した。ＬＹＺを、水に５ｍｇ／ｍＬで溶解した。このストリームを、ＰＣＬ５ｋ−ｂ−ＰＥＧ５ｋおよびオレイン酸ナトリウムなどの対イオンを含有する５０／５０ｖ／ｖ％のＴＨＦおよびＭｅＯＨの有機ストリームに対して衝突させた。
【０１３９】
事前に形成する手法も、対イオンであるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および硫酸デキストラン（ＤＸＳ）と共に使用した。ＩＰおよびＬＹＺを水中で混合した。得られた複合体を、凍結乾燥によって乾燥させ、次にＴＨＦおよびＤＭＳＯの混合物に再懸濁させた。この有機溶液を、ＰＣＬ５ｋ−ｂ−ＰＥＧ５ｋブロックコポリマーを含有するＴＨＦ溶液と混合して、ＦＮＰのための有機供給ストリームを作り出した。ＬＹＺは、直径約１５０ｎｍおよびＰＤＩ＜０．２を有する安定なＮＰにカプセル化することに成功した。
【０１４０】
改変された事前形成方法では、ＩＰおよびＬＹＺを水中で混合した。得られた複合体を遠心分離して、不溶性複合体をペレット化し、上清を除去し、次に、ペレットを凍結乾燥によって乾燥させ、次に、ペレットをＴＨＦおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の混合物に再懸濁させた。次に、この有機溶液を、ＰＣＬ５ｋ−ｂ−ＰＥＧ５ｋブロックコポリマーを含有するＴＨＦ溶液と混合して、フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）のための有機供給ストリームを作り出した。
【０１４１】
ｉｎ  ｓｉｔｕ、事前形成、および改変事前形成方法のそれぞれを使用してＨＩＰ−ＦＮＰによってリゾチームをカプセル化したＮＰを形成した結果を、表５に示す。
【表５】
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＊ＮＰにおけるリゾチームの理論的担持質量、すなわち質量ｌｙｓ／質量ＮＰ
【０１４２】
ＬＹＺカプセル化効率は、＞９０％であると測定された。ＮＰからのＬＹＺの放出を測定すると、先のポリミキシンについての本来の知見と一致する方式で、対イオンおよび電荷比に依存することが見出された。
【０１４３】
ＬＹＺのためのイオン対化剤としてＳＤＳを使用して集合させたＮＰは、１：１の電荷比で１４日までにＬＹＺの５０％を放出した。放出は、ＬＹＺ：ＳＤＳ電荷比が高いほど緩慢であった。ＬＹＺのためのイオン対化剤としてＯＡを使用して集合させたＮＰは、１：１の電荷比で１４日までにＬＹＺの３０％を放出した。１：２の電荷比では、１４日までに２０％が放出され、１：４の電荷比では、１４日までに１０％が放出された。したがって、（１）所与の対イオンでは、ＬＹＺの放出は、電荷比が高いほど緩慢であり、（２）同じ電荷比では、ＯＡと対化したＬＹＺは、ＳＤＳと対化したＬＹＺよりも緩慢に放出された。
【０１４４】
細胞を溶解するその能力によって測定されるリゾチームの活性を、放出後に測定した。放出後、放出されたＬＹＺの１００％までが、カプセル化しなかったＬＹＺと等しい活性を実証した。
【０１４５】
ＯＡと１：１または１：２で対化した場合、およびＤＸＳと１：１で対化した場合、放出されたＬＹＺの１００％が生理的に活性であった。ＯＡと１：４で対化した場合、およびＤＸＳと１：２または１：４で対化した場合、およびＳＤＳと１：１で対化した場合、放出されたＬＹＺのおよそ６０％が生理的に活性であった。ＳＤＳと１：２または１：４で対化した場合、放出されたＬＹＺのわずか（＜１０％）が生理的に活性であった。
【０１４６】
これらの結果は、イオン対化フラッシュナノ沈殿手法を使用して、タンパク質を変性させずにカプセル化することができることを示している。
【０１４７】
本発明による実施形態は、細菌、真菌、ウイルス、および寄生虫感染などの感染疾患の処置、ならびに遺伝子治療、遺伝子送達または遺伝子編集のための核酸の送達において有用となり得る。例えば、ナノキャリアによる活性治療成分（ＡＰＩ）の制御された送達は、バイオアベイラビリティの改善、毒性の低減、活性の持続、投与レジメンの簡素化、患者のアドヒアランスの改善、および全体的な有効性の増強をもたらすことができる。例えば、本発明による実施形態は、腫瘍、組織、器官、胃腸管領域、エンドソーム、または身体もしくは細胞の他の領域を標的化する徐放に有用となり得る。本発明による実施形態は、荷電親水性小分子、ペプチド、タンパク質、および核酸をカプセル化するのに有用となり得る。
【０１４８】
本発明は、ナノ沈殿方法を用いてＡＰＩの処理を可能にするためにＡＰＩの水溶度を過渡的に変えるための方法を含む。理論に拘泥するものではないが、処理条件を最適化するための理論的骨格は、本明細書に提示される。ナノ粒子の安定性のためのイオン対を選択する規則は、ＩＰの疎水性およびｐＫａに基づいて決まる。２つの処理経路が存在する。第１の経路として、ＩＰ：ＡＰＩ複合体は、単一構成成分として事前に形成し、単離し、次にフラッシュナノ沈殿によってＮＣに集合させることができる。第２の経路として、ＩＰ：ＡＰＩ複合体は、沈殿で形成することができ、ここで、疎水性ＩＰ薬剤、安定化ポリマー、および親水性ＡＰＩは、単一沈殿ステップ中に最終的なＮＣに集合させることができる。前者（第１）の経路は、ＩＰ：ＡＰＩの化学量論量を先験的に知ることができるという利点を有する。後者（第２）の経路は、簡単な単一の沈殿であるという利点を有する。
【０１４９】
フラッシュナノ沈殿を使用する親水性ＡＰＩは、疎水性イオン対化を用いてカプセル化することができる。例えば、以下のＡＰＩをカプセル化することができる。抗微生物小分子であるＯＺ４３９、シンナリジン、クロザピン、α−リポ酸、ペプチドであるポリミキシンＢ、コリスチン、マストパラン７、マストパラン１７、ｓｕｂ５、ＬＬ３７、エクミシン、ストレプトマイシン、タンパク質である卵白アルブミンおよびリゾチーム、アミノグリコシドであるゲンタマイシン、ならびに核酸、例えばサケ精巣由来直鎖ＤＮＡまたはコイルプラスミドＤＮＡ。
【０１５０】
ナノ沈殿に基づく方法は、活性医薬成分（ＡＰＩ）を、高いＡＰＩ担持で、拡張可能かつ継続的な方式で製剤化することができる。
【０１５１】
本明細書に提示されるイオン対化手法は、ＡＰＩのカプセル化のための強力な新しいツールを提供する。
【０１５２】
本明細書に例示され、論じられる実施形態は、本発明を実施し使用するための、本発明者らに公知の最良の方法を、当業者に単に教示することを企図される。本明細書には、本発明の範囲を制限するとみなされるべきものはない。提示されるすべての例は、代表的なものであり、非限定的である。本発明の前述の実施形態は、当業者によって理解される通り、先の教示に照らして本発明から逸脱することなく改変または変更することができる。したがって、本発明は、特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内で、具体的に記載されるもの以外のやり方で実施され得ることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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