(57)【要約】  本発明は、毛乳頭及び／又は結合組織鞘からの線維芽細胞から毛乳頭同等物をインビトロで調製する方法；こうして得られた前記毛乳頭上で増殖性上皮細胞を培養することにより毛包同等物をインビトロで調製する方法；上記方法により産生される毛乳頭及び毛包のインビトロ同等物、脱毛症を治療するため、及び化粧用、医薬又は皮膚用製品の効果を評価するためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛乳頭同等物をインビトロで調製する方法であって、毛乳頭に及び／又は結合組織鞘に由来する線維芽細胞を、血清不含栄養培養培地Ｂを含む担体上で、前記担体から前記線維芽細胞が剥離し、一緒に群化して少なくとも１つのスフェロイドを形成することを可能とするために十分な一定期間培養する少なくとも１つのステップを含み；使用される前記担体の表面は細胞接着を許容せず；前記培養担体は、２Ｄ又は３Ｄ丸底マイクロプレート培養担体から選択される方法。
【請求項２】
前記線維芽細胞を、前記２Ｄ培養担体上に、少なくとも１４０００個の細胞／ｃｍ２の密度において、好ましくは、１４０００個の細胞／ｃｍ２〜４７６００個の細胞／ｃｍ２、いっそうより良好には、２３５００個の細胞／ｃｍ２〜２４５００個の細胞／ｃｍ２の密度において播種する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記線維芽細胞を、前記３Ｄ培養担体上に、少なくとも３０００個の細胞／ｃｍ２の、好ましくは、少なくとも９０００個の細胞／ｃｍ２の密度において、いっそうより良好には、９０００個の細胞／ｃｍ２〜２００００個の細胞／ｃｍ２の密度において播種する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記栄養培養培地Ｂは、５００〜１５００ｍｇ／ｌのアミノ酸、２〜１８ｍｇ／ｌのビタミン、１５００〜４５００ｍｇ／ｌのグルコース、８７５０〜１００００ｍｇ／ｌの無機塩、２〜２０μｇ／ｍｌのインスリン、２〜６０ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、並びに任意選択的に５０〜２００μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記線維芽細胞を、少なくとも３日間、好ましくは、少なくとも４日間、いっそうより良好には、４〜２１日間培養する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記担体の表面は、中性であり、疎水性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記線維芽細胞を培養するステップの前に、以下の予備ステップ
ａ．頭皮試料から成長期毛包を単離すること；
ｂ．毛乳頭の及び／又は結合組織鞘の線維芽細胞を、前記毛乳頭の及び／又は前記結合組織鞘の顕微解剖により回収すること；
ｃ．２０容量％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５０〜９０ｍｇ／ｌの非必須アミノ酸、並びに任意選択的に５０〜２００μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬が補給されたＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘからなる栄養培養培地Ａ中で前記毛乳頭線維芽細胞の及び／又は前記結合組織鞘線維芽細胞の増幅を実施すること
も含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により得ることができるインビトロ毛乳頭同等物。
【請求項９】
陽性アルカリホスファターゼ活性を有することを特徴とする、請求項８に記載のインビトロ毛乳頭同等物。
【請求項１０】
インビトロ毛包同等物を調製するための、請求項８又は９に記載のインビトロ毛乳頭同等物の、及び増殖性上皮細胞の使用。
【請求項１１】
毛包同等物をインビトロで調製する方法であって、少なくとも１つの請求項８又は９に記載の毛乳頭同等物の存在下で増殖性上皮細胞を、マーカーＫ８５及びＫ３５について陽性であるケラチノサイトへの前記増殖性上皮細胞の分化を可能とするために十分な期間培養する少なくとも１つのステップを含む方法。
【請求項１２】
前記増殖性上皮細胞を、少なくとも２０００個の細胞／ｃｍ２、好ましくは、少なくとも６０００個の細胞／ｃｍ２の密度において、いっそうより良好には、６０００〜１００００個の細胞／ｃｍ２の密度において播種する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増殖性上皮細胞を、少なくとも３日間、好ましくは、少なくとも５日間、いっそうより良好には、５〜２０日間培養する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
有効量のＲＯＣＫ阻害剤の存在下で前記増殖性上皮細胞を増殖させる予備ステップも含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法により得ることができるインビトロ毛包同等物。
【請求項１６】
陽性アルカリホスファターゼ活性を有する毛乳頭同等物と、マーカーＫ８５及びＫ３５について陽性であるケラチノサイトとから構成されることを特徴とする、請求項１５に記載のインビトロ毛包同等物。
【請求項１７】
１００〜２５０μｍの範囲の直径、及び５００〜２５００μｍの範囲の長さを有する中実管状構造を有することを特徴とする、請求項１５又は１６に記載のインビトロ毛包同等物。
【請求項１８】
毛量低減状態の予防的治療又は治療処置のための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のインビトロ毛包同等物。
【請求項１９】
脱毛症の治療のための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のインビトロ毛包同等物。
【請求項２０】
体毛及び／又は頭髪の成長を変調する化合物を同定するための、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のインビトロ毛包同等物の使用。
【請求項２１】
体毛及び／又は頭髪の成長を変調する少なくとも１つの化合物をスクリーニングする方法であって、前記試験化合物を請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のインビトロ毛包同等物と接触させるステップ（ａ）、次いで前記インビトロ毛包同等物の少なくとも１つのパラメータに対する前記化合物の効果を分析するステップ（ｂ）及び前記パラメータを改変する前記化合物を選択するステップ（ｃ）を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛乳頭に及び／又は結合組織鞘に由来する線維芽細胞から毛乳頭同等物をインビトロで調製する方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、こうして得られた前記毛乳頭上で増殖性上皮細胞を培養することにより毛包同等物をインビトロで調製する方法に関する。
【０００３】
同様に、本発明は上記方法により産生されるインビトロ毛乳頭及び毛包同等物に、並びに脱毛症を治療するための、及び化粧用、医薬又は皮膚用製品の効果を評価するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
個々の毛髪は、その生涯の間、極めて不均等な期間の発生の３つの期を経る：
−  成長期は、個々の毛髪の活性期であり、その間、毛髪は生存し、規則的に成長する。これは、４〜７年続く。個々の毛髪の毛根の毛球の毛乳頭を包囲する胚細胞は、個々の毛髪の生存及び成長を可能とする材料を継続的に産生する。次に、胚細胞の増大は、毛包の基部において停止する。次いで、個々の毛髪の活性期が終了し；別の期が開始し、それはかなり短期である。
−  退行期：わずか１５日後、個々の毛髪の毛球は消失し（それというのも、胚細胞の遮断のためそれはもはや栄養供給されないため）、加速速度において変形する。毛乳頭は消失し、すなわち、中空の毛球が中実になり；これは角化し、硬化し、角質化する。次いで、個々の毛髪は死滅し；毛包は、個々の死滅毛髪を放出するように縮む。
−  休止期は、約３ヵ月続く期であり、その間、個々の死滅毛髪は抜け落ちを待つ。抜け落ちのため、個々の毛髪は、次いで同一の毛包中で成長し、古い毛髪を放出する新たな個々の毛髪により押し出されなければならない。
【０００５】
次いで、毛包は、「毛隆起」中に位置する胚細胞として公知の幹細胞から出発して再生する。
【０００６】
「毛隆起」は、毛包の中央部分中に、より正確には立毛筋挿入区域中に位置する胚細胞として公知の外上皮鞘の細胞下位集団により形成される。これらの細胞は、毛包の恒常的部分の最下部に相当する。
【０００７】
「毛隆起」のレベルにおいて、ケラチノサイトは、生化学的及び超微細構造的に比較的未分化である。
【０００８】
この「毛隆起」は、後期休止期の間に、上昇する毛乳頭と相互作用して新たな毛包の成長期を開始させるための極めて重要な場所である。したがって、胚細胞は、個々の毛髪の再発生に不可欠な細胞である。個々の休止期毛髪の胚細胞（胚芽細胞又は多能性細胞又は幹細胞）は、休眠期からの毛包の抜け出し及びしたがって個々の毛髪の再成長に関与する。
【０００９】
毛球は洋ナシ形状であり、それは、以下のものから構成される：
−  皮膚由来の出芽物であり、毛包の基部に位置する毛乳頭。これは成長因子及び細胞外毛母体タンパク質のその貯蔵を介する個々の毛髪の栄養摂取及びその成長の調節に関与する血管の多い部位である。この情報は毛母体中で産生される毛母細胞に伝達され、その分化が可能となる（（非特許文献１））。
−  毛乳頭を包み込む区域であり、それほど分化していない毛母細胞の集塊から構成される毛母体。これは、強力な有糸分裂活性の部位である。毛球中に位置し、毛乳頭周囲の小細胞集塊を形成する毛母細胞は、主として、胚芽層を構成し、急激に増殖して分化して毛幹を形成するケラチノサイトの前駆体から構成され、したがって、毛周期における不可欠な役割を担う。成長期の開始から前記期の終了まで、それらの毛母細胞は退行期まで増殖し、次いで休止期において消失する。（（非特許文献２）、（非特許文献３））。細胞分化は、外上皮鞘（ｏｕｔｅｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｈｅａｔｈ）（ＯＲＳ）の、内上皮鞘（ｉｎｎｅｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｈｅａｔｈ）（ＩＲＳ）の、及び次いで毛幹の種々の細胞タイプの形成を可能とする。個々の毛髪の形状を調整するのも、この毛母体である。毛母体は、直毛についてはほぼ対称軸で均一に分布する一方、縮毛については片側で大きく分布する（（非特許文献４））。毛母体は、毛髪の色素沈着を担う毛包メラノサイトも含む。これらの毛母細胞の増殖及び分化は、毛乳頭により制御される（（非特許文献５））；
−  角化区域としても公知の毛球の上方毛母体により産生される外及び内上皮鞘。外上皮鞘は毛包の外殻を構成し：これは表皮の陥入である。これは特に、毛包が周期的に再生される幹細胞を包む。内上皮鞘は、外上皮鞘を毛幹から離隔する。この鞘は、個々の毛髪の成長を伴う同心円状の角化層において組織化される３つの細胞タイプから構成される。ヘンレ層、ハックスレー層及び扁平細胞から形成され、毛母体に方向付けされる毛小皮が区別される；
−  部分的に可視的である毛幹、すなわち毛髪。毛幹の構造は、外側から内側まで３つの区別される層から構成される。毛小皮、毛皮質及び毛髄質が存在し、全て、角化細胞の全てを構成する。
【００１０】
脱毛症は、種々の因子：遺伝子、ホルモン及び環境因子を、食事を、並びに身体活動を条件として発症する。毛髪は、不可欠な美容及びアイデンティティの役割を有する。
【００１１】
したがって、ほとんどの女性及び男性において、生涯にわたる健康で強靭な毛髪及び稠密な頭髪が熱望される。
【００１２】
脱毛症を治療するための多くの技術、例えば、細胞療法、レーザ療法又は手術を伴わないインプラントが公知である。後者は即効的結果を与え、手術よりもはるかに侵襲性が低い。
【００１３】
インプラントを得るため、ヒト毛包は、毛球中に存在する種々の細胞タイプを培養することにより得られる。
【００１４】
数年間にわたり、当業者は、毛球を構成する種々のコンパートメントからの毛包細胞を２Ｄ又は３Ｄでインビトロで培養している。
【００１５】
Ｃ．Ｈｉｇｇｉｎｓは、インビトロ２Ｄ培養物中で、毛乳頭細胞が、最初に培養され、増幅されるとすぐにその誘導能を損失することを示している。Ｈｉｇｇｉｎｓにより記載される２Ｄ及び３Ｄ培養物中で得られたスフェロイドは、インビボ毛乳頭の機能的特徴を有さず；特にそれらのスフェロイドは、以下の実施例６に示されるとおり、アルカリホスファターゼ、バーシカン、及びＳＦＲＰ２（分泌型フリズルド関連タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）２）に関する低い活性を有する。
【００１６】
他のチーム、例えば、韓国のＰａｒｋは、アミノ酸及びビタミンリッチの培地を使用してＤＰＬＴ（毛乳頭様組織）を形成している。特に、臍帯に由来する間葉系幹細胞から及び毛乳頭に由来する線維芽細胞から調製されるインビトロ毛乳頭同等物が、以下の文献（特許文献１）及び（特許文献２）にそれぞれ記載されている。しかしながら、（特許文献１）に記載の臍帯の生物試料から生じる間葉系幹細胞の使用、及び（特許文献２）に記載の細胞接着を防止しない細胞培養のために処理された２Ｄ培養担体の使用は、特に形態的及び／又は機能的見地からのインビボ毛乳頭の不可欠な特徴及び特に陽性アルカリホスファターゼ酵素活性を有するインビトロ毛乳頭同等物の取得を可能としない。
【００１７】
さらに、上記モデルは、存在及び量が毛包構造の形成に不可欠である増殖性上皮細胞、例えば、毛母細胞も胚細胞も含有しない。
【００１８】
（特許文献３）は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で微小毛包を再生させる毛母細胞の能力を開示している。しかしながら、これらの毛母細胞は、増殖能を損失した線維芽細胞（放射線照射され、又はマイトマイシンにより処理されたヒト線維芽細胞の３Ｔ３線維芽細胞）上に播種され、毛乳頭上に播種されない。したがって、これは、以下の図１０に示されるとおり、機能的及び形態的差異を伴う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第２００９／０１４２７２号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／０１４５９２９号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１７／０５５３５８号パンフレット
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｒｅｅｓ  ＪＬ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈａｉｒ  ａｎｄ  ｓｋｉｎ  ｃｏｌｏｒ
【非特許文献２】Ｅｂｌｉｎｇ  ＦＪ．Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈａｉｒ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．１９８７  Ｊｕｌ；５（３）：４６７−８１．Ｒｅｖｉｅｗ
【非特許文献３】Ｓａｉｔｏｈ  Ｍ，Ｕｚｕｋａ  Ｍ，Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｍ．Ｈｕｍａｎ  ｈａｉｒ  ｃｙｃｌｅ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９７０  Ｊａｎ；５４（１）：６５−８１
【非特許文献４】Ｍｅｌｉｓｓｏｐｏｕｌｏｓ  Ａ．ａｎｄ  Ｌｅｖａｃｈｅｒ  Ｃ．Ｌｅｓ  ａｎｎｅｘｅｓ  ｃｕｔａｎｅｅｓ［Ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｉｎｔｅｇｕｍｅｎｔｓ］．Ｉｎ：Ｌａ  ｐｅａｕ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｅｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ［Ｔｈｅ  ｓｋｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ］，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｌａｖｏｉｓｉｅｒ；１９９８．ｐａｇｅｓ５７−９９
【非特許文献５】Ｂｏｔｃｈｋａｒｅｖ  ＶＡ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．２００３  Ｊｕｎ；８（１）：４６−５５．Ｒｅｖｉｅｗ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
したがって、インビボ毛乳頭又は毛包、好ましくは、ヒト毛包、特に再生し得るもの機能的及び形態的特徴のほとんどをそれぞれ有するインビトロ毛乳頭及び毛包同等物が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
驚くべきことに、本出願人は、丸底マイクロプレートタイプの特定の２Ｄ又は３Ｄ培養担体（これらの担体は細胞接着を許容しない）上の血清不含培地中の毛乳頭に及び／又は結合組織鞘に由来する線維芽細胞の培養により、インビボ毛乳頭の機能的及び形態的特徴のほとんどを有するインビトロ毛乳頭同等物を得ることが可能となることを最初に実証した。
【００２３】
第２に、得られた前記インビトロ毛乳頭同等物上の増殖性上皮細胞、例えば、毛母細胞及び／又は胚細胞の播種により、インビボヒト毛包、特に再生し得るものの機能的及び形態的特徴のほとんどを有するインビトロ毛包同等物を得ることが可能となる。
【００２４】
結果的に、このような毛乳頭及び毛包同等物は、毛包の形態発生の研究に、化粧用及び／又は医薬活性剤の活性の予測試験に、並びにさらには毛量低減状態の予防的治療又は治療処置、及び脱毛症の治療に特に有利であることが証明される。
【００２５】
したがって、本発明の第１の主題によれば、本発明は、毛乳頭同等物をインビトロで調製する方法であって、毛乳頭に及び／又は結合組織鞘に由来する線維芽細胞を、血清不含栄養培養培地Ｂを含む担体上で、前記担体から前記線維芽細胞が剥離し、一緒に群化して少なくとも１つのスフェロイドを形成することを可能とするために十分な期間培養する少なくとも１つのステップを含み；使用される前記担体の表面は細胞接着を許容せず；前記培養担体は、２Ｄ又は３Ｄ丸底マイクロプレート培養担体から選択される方法に関する。
【００２６】
本発明の第２の主題は、上記方法により得ることができるインビトロ毛乳頭同等物に関する。
【００２７】
本発明の第３の主題は、インビトロ毛包同等物を調製するための、本発明による毛乳頭同等物の、並びに増殖性上皮細胞、例えば、毛母細胞及び／又は胚細胞の使用に関する。
【００２８】
本発明の別の主題によれば、本発明は、毛包同等物をインビトロで調製する方法であって、少なくとも１つの本発明による毛乳頭同等物の存在下で増殖性上皮細胞を、マーカーＫ８５及びＫ３５について陽性であるケラチノサイトへの前記増殖性上皮細胞の分化を可能とするために十分な期間培養する少なくとも１つのステップを含む方法に関する。
【００２９】
本発明はまた、上記方法により得ることができるインビトロ毛包同等物に関する。
【００３０】
本発明はまた、毛量低減状態の予防的治療又は治療処置、及び脱毛症の治療における、本発明による毛包同等物の治療的使用に関する。
【００３１】
本発明の別の主題によれば、本発明は、毛髪特性に対する活性剤の効果のインビトロ試験のための、特に体毛及び／又は頭髪の成長を変調する化合物を同定するための、本発明による毛包同等物の使用に関する。
【００３２】
本発明はまた、本発明による毛包同等物を使用して体毛及び／又は頭髪の成長を変調する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明に関して使用された毛母細胞及び線維芽細胞の局在化。
【図２】胚細胞の局在化。
【図３】栄養培養培地Ａ中の毛乳頭に由来する線維芽細胞の増幅。
【図４】血清不含栄養培養培地Ｂ中の増幅線維芽細胞の培養後の毛乳頭同等物の産生。
【図５】毛乳頭同等物上の毛母細胞の播種のＴ＋１日後。
【図６】毛包同等物の形成を担う管状構造の形成（毛乳頭同等物上の毛母細胞の播種から出発してＴ＋４日）。
【図７】毛包同等物の成長（毛乳頭同等物上の毛母細胞の播種から出発してＴ＋１０日）。
【図８】本発明による毛乳頭同等物の強力に陽性のアルカリホスファターゼ活性。
【図９】マーカーＫ３５、Ｋ８５及びＫｉ６７について陽性標識を示す毛包。
【図１０】比較例の国際公開第２０１７／０５５３５８号パンフレット：毛母細胞の播種から出発してＴ＋１０日。
【図１１】本発明外の比較例：国際公開第２００９／１１８２８３号パンフレットの実施例２に記載の方法により得られた毛乳頭（倍率×１０、６日目）。
【図１２】２Ｄ培養担体上の実施例１により得られた本発明による毛乳頭同等物（倍率×１０、６日目）。
【図１３】本発明外の比較例：国際公開第２００９／１１８２８３号パンフレットの実施例３に記載の方法により得られた嚢胞形態の毛包（３日目）。
【図１４】本発明外の比較例：細胞培養のための２Ｄ培養担体（すなわち、細胞接着を許容する担体）上の毛乳頭から得られた線維芽細胞の培養物。
【図１５】３Ｄ丸底マイクロプレート培養担体上の実施例１により得られた本発明による毛乳頭同等物（２日目）。
【図１６】本発明外の比較例：コラーゲンゲル上の３Ｄ培養において得られた毛包。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
線維芽細胞
本発明の目的のため、用語「毛乳頭に由来する線維芽細胞」は、毛包の基部に位置する皮膚由来の出芽物上の成長期の毛包の顕微解剖から採取される線維芽細胞を意味する。
【００３５】
同様に、用語「結合組織鞘に由来する線維芽細胞」は、毛乳頭下の毛包の基部における成長期の毛包の顕微解剖から採取される線維芽細胞を意味する。
【００３６】
毛乳頭に又は結合組織鞘に由来する線維芽細胞は、好ましくは、手術廃棄物又は生検物、例えば、フェイスリフト廃棄物又は頭皮試料により採取する。それというのも、個々の毛髪の単なる引き抜きによってはそれらの細胞を回収することが可能でないためである。
【００３７】
特に、本発明に関して使用される線維芽細胞は、好ましくは、既に放射線照射（例えば、ガンマ線による）されたことにより、又はマイトマイシンにより既に処理されたことにより増殖が既に停止された線維芽細胞でない。好ましくは、本発明による線維芽細胞は、３Ｔ３線維芽細胞でない。
【００３８】
増殖性上皮細胞
用語「増殖性上皮細胞」は、毛包中に存在し、個々の毛髪中に存在する全ての細胞タイプを生じさせ得る上皮細胞を意味する。増殖性上皮細胞は、好ましくは、毛母細胞及び／又は胚細胞から選択される。
【００３９】
用語「毛母細胞」は、毛球中に位置し、毛乳頭周辺で小さな細胞集塊を形成する細胞を意味する（Ｅｂｌｉｎｇ  Ｆ．Ｊ．Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈａｉｒ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．１９８７  Ｊｕｌ；５（３）：４６７−８１．Ｒｅｖｉｅｗ；Ｓａｉｔｏｈ  Ｍ，Ｕｚｕｋａ  Ｍ，Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｍ．Ｈｕｍａｎ  ｈａｉｒ  ｃｙｃｌｅ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９７０  Ｊａｎ；５４（１）：６５−８１）。これらの細胞の試料は採取することができ、それらは、増幅させ、後続の使用の目的のために組織ライブラリー中で貯蔵することができる。
【００４０】
毛母細胞の統合性を保存するため、それらの細胞は、以下の方法によりサンプリングすることができる：毛包を、２％の抗生物質及び非必須アミノ酸が補給された最小培養培地を含有するペトリ皿中に配置する。
【００４１】
毛球領域を毛乳頭の上部において切断し、したがって、毛球の上皮を毛乳頭から及び結合組織鞘から分離する。
【００４２】
本発明の目的のため、用語「胚細胞」は、「毛隆起」中に存在する幹細胞を意味する。好ましくは、胚細胞は、休止期にサンプリングする。
【００４３】
本発明の目的で、用語「休止」は、休止期の個々の毛髪を含有した毛包を意味する。
【００４４】
胚細胞は、以下の方法によりサンプリングすることができる：休止期の毛包を、２％の抗生物質及び非必須アミノ酸が補給された最小培養培地を含有するペトリ皿中に配置する。
【００４５】
胚細胞の領域は、毛隆起としても公知であり、結合組織鞘から抽出し、続いて３Ｔ３ｉ線維芽細胞のフィーダー層を含有するペトリ皿中に配置する。
【００４６】
したがって、この顕微解剖技術により、細胞の量及び統合性を保存することが可能となる。それというのも、細胞が互いに分離されないためである。
【００４７】
毛乳頭同等物を調製する方法
本発明は、毛乳頭同等物をインビトロで調製する方法であって、毛乳頭に及び／又は結合組織鞘に由来する線維芽細胞を、血清不含栄養培養培地Ｂを含む担体上で、前記担体から前記線維芽細胞が剥離し、一緒に群化して少なくとも１つのスフェロイドを形成することを可能とするために十分な期間培養する少なくとも１つのステップを含み；使用される前記担体の表面は細胞接着を許容せず；前記培養担体は、２Ｄ又は３Ｄ丸底マイクロプレート培養担体から選択される方法に関する。
【００４８】
用語「スフェロイド」は、細胞が組織化し、細胞外マトリックスを合成するスフィアの形態の３Ｄ微小組織を意味する。本発明による方法を実施した後に少なくとも１つのスフェロイドの出現が見られる場合に前記毛乳頭同等物が得られることが考えられる。
【００４９】
本発明の目的のため、用語「血清不含」は、培養培地の総容量に対して５容量％未満、４容量％未満、３容量％未満、２容量％未満、１容量％未満、好ましくは、０容量％の血清を含む培養培地を指す。
【００５０】
用語「血清」は、血清中に含有される血清タンパク質、特にアルブミン、グロブリン、例えば、アルファ−１−グロブリン、アルファ−２−グロブリン、ベータ−グロブリン、ガンマ−グロブリン、及びそれらの混合物から選択される少なくとも１つの血清タンパク質を意味する。
【００５１】
毛乳頭に及び／又は結合組織鞘に由来する線維芽細胞を培養する前記ステップの間、クラスタの形成が少なくとも１日において観察され、次いで、前記クラスタは、少なくとも２日において集合体を形成する。最終的に、少なくとも３日においてスフェロイドの出現が観察される。
【００５２】
本発明の目的のため、用語「クラスタ」は、細胞の２Ｄコレクションを意味する。本発明の目的のため、用語「集合体」又は「早期スフェロイド」は、組織化されず、依然として細胞外マトリックスを合成しない不規則形状の細胞の３Ｄ集塊を意味する。
【００５３】
好ましい実施形態において、前記栄養培養培地Ｂは、５００〜１５００ｍｇ／ｌのアミノ酸、２〜１８ｍｇ／ｌのビタミン、１５００〜４５００ｍｇ／ｌのグルコース、８７５０〜１００００ｍｇ／ｌの無機塩、２〜２０μｇ／ｍｌのインスリン、２〜６０ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、並びに任意選択的に、５０〜２００μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬を含む。
【００５４】
有利には、前記栄養培養培地Ｂは、６００〜１２５０ｍｇ／ｌのアミノ酸、５〜１５ｍｇ／ｌのビタミン、１７５０〜２２５０ｍｇ／ｌのグルコース、９０００〜９７５０ｍｇ／ｌの無機塩、５〜１５μｇ／ｍｌのインスリン、５〜５０ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、並びに任意選択的に、５０〜２００μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬を含む。
【００５５】
いっそうより良好には、前記栄養培養培地Ｂは、７００〜１１５０ｍｇ／ｌのアミノ酸、５〜１５ｍｇ／ｌのビタミン、１７５０〜２２５０ｍｇ／ｌのグルコース、９０００〜９７５０ｍｇ／ｌの無機塩、５〜１５μｇ／ｍｌのインスリン、５〜５０ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、並びに任意選択的に、１００〜１８０μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬を含む。
【００５６】
前記培地Ｂ中に存在するアミノ酸は、好ましくは、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン水和物、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン二塩酸塩、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二水和物ナトリウム塩、Ｌ−バリン、及びそれらの混合物から選択される。
【００５７】
前記培地Ｂ中に存在するビタミンは、好ましくは、アスコルビン酸、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、エルゴカルシフェロール、葉酸、メナジオン重硫酸ナトリウム、ナイアシンアミド、ピリドキサール塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、酢酸レチニル、ビタミンＢ１２、リン酸アルファ−トコフェロール二ナトリウム塩、ｉ−イノシトール、及びそれらの混合物から選択される。
【００５８】
前記培地Ｂ中に存在する無機塩は、好ましくは、無水塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、硫酸鉄七水和物（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硫酸マンガン一水和物（ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、無水リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、及びそれらの混合物から選択される。
【００５９】
挙げることができる前記培地Ｂ中に存在する抗生物質の例としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びそれらの混合物が挙げられる。
【００６０】
特に挙げることができる前記培地Ｂ中に存在する抗真菌薬の一例は、アムホテリシンＢである。
【００６１】
使用される前記血清不含栄養培養培地Ｂは、好ましくは、１５μｇ／ｍｌ未満の成長因子、好ましくは、１２μｇ／ｍｌ未満の成長因子を含む。特に前記栄養培地Ｂ中に存在する成長因子は、インスリン及び／又はヒドロコルチゾンから選択される。
【００６２】
特に好ましい実施形態において、前記栄養培養培地Ｂは、８０容量％〜９９容量％のウィリアムス培地Ｅ、２５０〜３５０ｍｇ／ｌのグルタミン、２〜２０μｇ／ｍｌのインスリン、２〜６０ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、並びに任意選択的に、５０〜２００μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬を含む。いっそうより良好には、前記栄養培養培地Ｂは、９５容量％〜９８容量％のウィリアムス培地Ｅ、２８０〜３２０ｍｇ／ｌのグルタミン、５〜１５μｇ／ｍｌのインスリン、５〜５０ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、並びに任意選択的に、１００〜１８０μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬を含む。
【００６３】
ウィリアムス培地Ｅは、特にグルタミンを有さない。
【００６４】
線維芽細胞は、好ましくは、少なくとも３日間、いっそうより良好には、４〜２１日間培養する。
【００６５】
線維芽細胞は、好ましくは、高密度において、特に少なくとも３０００個の細胞／ｃｍ２、好ましくは、少なくとも９０００個の細胞／ｃｍ２、いっそうより良好には、少なくとも１４０００個の細胞／ｃｍ２の密度において、いっそうより好ましくは、１４０００個の細胞／ｃｍ２〜４７６００個の細胞／ｃｍ２の密度において播種する。
【００６６】
好ましい実施形態において、線維芽細胞は、２３５００個の細胞／ｃｍ２〜２４５００個の細胞／ｃｍ２の密度において、いっそうより良好には、２３８００個の細胞／ｃｍ２の密度において播種する。
【００６７】
細胞、特に線維芽細胞の接着を許容しない担体は、２Ｄ及び３Ｄ丸底マイクロプレート培養担体から選択される。
【００６８】
有利には、本発明に関して使用される２Ｄ及び３Ｄ担体は、コラーゲンコーティングされていない。
【００６９】
２Ｄ培養担体のうち、特に細胞培養のために処理されていない、特にプラスチック製の細胞接着を許容しない細菌ペトリ皿を挙げることができる。
【００７０】
前記担体の表面は、好ましくは、中性である。本発明の目的のため、用語「中性表面」は、非荷電表面を意味する。
【００７１】
前記担体の表面は、疎水性でも親水性でもよく、好ましくは、疎水性である。
【００７２】
前記表面が親水性である場合、それは、いかなる細胞接着も妨害するような物質により被覆され；特にそのような物質は、前記担体の表面に共有結合しているヒドロゲルから選択することができる。
【００７３】
特に好ましい実施形態において、前記担体の表面は、中性であり、疎水性である。
【００７４】
Ｃｏｒｎｉｎｇ社によりＦａｌｃｏｎ（登録商標）の名称のもと販売されている細菌ペトリ皿（参照番号：３５１００７）を２Ｄ培養担体として使用することができる。
【００７５】
丸底３Ｄマイクロプレート培養担体のうち、特にＣｏｒｎｉｎｇ社によりＣｏｓｔａｒ（登録商標）の名称のもと販売されている丸底９６ウェルマイクロプレート（参照番号：７００７）を使用することができる。
【００７６】
好ましくは、３Ｄ培養担体は、平底マイクロプレートでない。
【００７７】
第１の実施形態において、毛乳頭に及び／又は鞘に由来する前記線維芽細胞を、細胞接着を許容しない２Ｄ培養担体上で、少なくとも１４０００個の細胞／ｃｍ２の密度において、好ましくは、１４０００個の細胞／ｃｍ２〜４７６００個の細胞／ｃｍ２、いっそうより良好には、２３５００個の細胞／ｃｍ２〜２４５００個の細胞／ｃｍ２の密度において播種する。
【００７８】
第２の好ましい実施形態において、毛乳頭に及び／又は鞘に由来する前記線維芽細胞を、細胞接着を許容しない丸底３Ｄマイクロプレート培養担体上で、少なくとも３０００個の細胞／ｃｍ２、好ましくは、少なくとも９０００個の細胞／ｃｍ２の密度において、いっそうより良好には、９０００個の細胞／ｃｍ２〜２００００個の細胞／ｃｍ２の密度において播種する。
【００７９】
本発明による毛乳頭同等物をインビトロで調製する方法は、毛乳頭に由来する前記線維芽細胞及び／又は結合組織鞘に由来する線維芽細胞を栄養培養培地Ａ中で増幅させる予備ステップも含み得；前記栄養培養培地Ａは、少なくとも血清、特にウシ胎児血清を含む。
【００８０】
好ましくは、この増幅ステップに使用される培養培地は、細胞接着を許容するように処理された担体である。これらの担体は、細胞培養に慣用的に使用され、したがって、当業者に周知のものである。
【００８１】
好ましくは、前記増幅ステップにおいて使用される前記栄養培養培地Ａは、５００〜２０００ｍｇ／ｌのアミノ酸、１５〜３５ｍｇ／ｌのビタミン、２５００〜４５００ｍｇ／ｌのグルコース、７５００〜９５００ｍｇ／ｌの無機塩、５容量％〜３０容量％のウシ胎児血清、並びに任意選択的に、５０〜２００μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬を含む。
【００８２】
好ましくは、前記増幅ステップにおいて使用される前記栄養培養培地Ａは、７５０〜１８００ｍｇ／ｌのアミノ酸、２０〜３０ｍｇ／ｌのビタミン、３０００〜４０００ｍｇ／ｌのグルコース、８０００〜９０００ｍｇ／ｌの無機塩、１０容量％〜２５容量％のウシ胎児血清、並びに任意選択的に、１００〜１８０μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬を含む。
【００８３】
前記増幅ステップにおいて使用される前記培養培地Ａ中に存在するアミノ酸は、好ましくは、グリシン、Ｌ−アラニル−グルタミン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチン二塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩水和物、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−プロリン、並びにそれらの混合物から選択される。
【００８４】
前記増幅ステップにおいて使用される前記培養培地Ａ中に存在するビタミンは、好ましくは、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ｉ−イノシトール、及びそれらの混合物から選択される。
【００８５】
前記増幅ステップにおいて使用される前記培養培地Ａ中に存在する無機塩は、好ましくは、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硝酸鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）・９Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・４Ｈ２Ｏ）、及びそれらの混合物から選択される。
【００８６】
挙げることができる前記培地Ａ中に存在する抗生物質の例としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びそれらの混合物が挙げられる。
【００８７】
特に挙げることができる前記培地Ａ中に存在する抗真菌薬の一例は、アムホテリシンＢである。
【００８８】
特に好ましい実施形態において、前記増幅ステップにおいて使用される前記栄養培養培地Ａは、７０容量％〜８０容量％のＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ培地、５％〜２５％のウシ胎児血清、５０〜９０ｍｇ／ｌの非必須アミノ酸、並びに任意選択的に、５０〜２００μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬を含む。いっそうより良好には、前記栄養培養培地Ａは、７８容量％のＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ培地、２０％のウシ胎児血清、６０〜８０ｍｇ／ｌの非必須アミノ酸、並びに任意選択的に、１００〜１８０μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬を含む。
【００８９】
前記増幅ステップにおいて使用される前記培養培地Ａ中に存在する非必須アミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン及びＬ−セリン、及びそれらの混合物から選択される。
【００９０】
特に好ましい実施形態において、本発明によるインビトロ毛乳頭同等物を調製する方法は、前記線維芽細胞を培養するステップ前に、以下の予備ステップ：
ａ．頭皮試料から成長期毛包を単離すること；
ｂ．毛乳頭の及び／又は結合組織鞘の線維芽細胞を、毛乳頭の及び／又は結合組織鞘の顕微解剖により回収すること；
ｃ．２０容量％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５０〜９０ｍｇ／ｌの非必須アミノ酸、並びに任意選択的に５０〜２００μｇ／ｍｌの抗生物質及び／又は抗真菌薬が補給されたＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘからなる栄養培養培地Ａ中で前記毛乳頭線維芽細胞の及び／又は前記結合組織鞘線維芽細胞の増幅を実施すること
も含む。
【００９１】
本発明はまた、上記の本発明による方法により得ることができるインビトロ毛乳頭同等物に関する。
【００９２】
好ましくは、本発明による毛乳頭同等物は、陽性アルカリホスファターゼ活性、並びに任意選択的に、ＢＭＰ２（骨形態発生タンパク質２）、ＳＦＲＰ２（分泌型フリズルド関連タンパク質２）、ＣＯＲＩＮ、ＳＯＸ２、ＶＣＡＮ（バーシカン）及び／又はＰＬＣ（パールカン）から選択されるタンパク質の陽性発現を有することを特徴とする。
【００９３】
本発明による毛乳頭同等物は、好ましくは、毛乳頭に及び／又は結合組織鞘に由来する線維芽細胞を、血清不含栄養培養培地Ｂを含む担体上で、前記担体から前記線維芽細胞が剥離し、一緒に群化して少なくとも１つのスフェロイドを形成することを可能とするために十分な期間培養するステップから得られる細胞から構成されることを特徴とし；前記担体は細胞接着を許容せず；前記培養担体は、２Ｄ又は３Ｄ丸底マイクロプレート培養担体から選択される。
【００９４】
本発明による毛乳頭同等物は、特に１００μｍ〜２５０μｍの範囲の直径を有するスフィアである。好ましくは、本発明による毛乳頭同等物は、約２００μｍの直径のスフィアである。
【００９５】
アルカリホスファターゼの酵素活性は、例えば、最初にアルカリホスファターゼ基質ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸トルイジン塩）を脱リン酸化し、次いで酸化して青色産物を生じさせるＲｏｃｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより販売されているＮＢＴ／ＢＣＩＰアルカリホスファターゼキット（参照番号１１６８１４５１００１  ２０１７年１０月３０日）を使用して計測することができる。
【００９６】
マーカーＢＭＰ２、ＳＦＲＰ２、ＣＯＲＩＮ、ＳＯＸ２、ＶＣＡＮ及びＰＬＣのタンパク質発現は、例えば、免疫蛍光技術により計測することができ、さらにこの技術は当業者に周知である。
【００９７】
毛包同等物を調製する方法
本発明はまた、インビトロ毛包同等物を調製するための、本発明によるインビトロ毛乳頭同等物の、及び増殖性上皮細胞の使用に関する。
【００９８】
本発明はまた、毛包同等物をインビトロで調製する方法であって、少なくとも１つの本発明による毛乳頭同等物の存在下で増殖性上皮細胞を、マーカーＫ８５及びＫ３５について陽性であるケラチノサイトへの前記増殖性上皮細胞の分化を可能とするために十分な期間培養する少なくとも１つのステップを含む方法に関する。
【００９９】
増殖性上皮細胞は、好ましくは、上記定義の毛母細胞及び胚細胞、並びにそれらの混合物から選択される。
【０１００】
特に好ましい実施形態において、本発明に関して使用される増殖性上皮細胞は、毛母細胞である。
【０１０１】
少なくとも１つのインビトロ毛乳頭同等物の存在下で増殖性上皮細胞を培養するステップ
少なくとも１つの本発明による毛乳頭同等物中に播種される増殖性上皮細胞を、３７℃及び５％のＣＯ２において、合成培地、例えば、Ｐｈｉｌｐｏｔｔ（１９９３）により記載される培地中で培養する。
【０１０２】
特に、増殖性上皮細胞を本発明による毛乳頭同等物の調製に使用されるものと同一の栄養培養培地、特に血清不含栄養培養培地Ｂ中で培地する。
【０１０３】
特に好ましい実施形態において、前記毛乳頭同等物は、セクション「毛乳頭同等物を調製する方法」における上記の毛乳頭同等物を調製する方法により得る。
【０１０４】
少なくとも１つの本発明による毛乳頭同等物の存在下で前記増殖性上皮細胞を培養するステップは、好ましくは、表面が細胞接着を許容しない上記定義の２Ｄ又は３Ｄ担体上で実施する。
【０１０５】
増殖性上皮細胞は、好ましくは、高密度において播種する。好ましくは、増殖性上皮細胞は、少なくとも２０００個の細胞／ｃｍ２、好ましくは、少なくとも６０００個の細胞／ｃｍ２の密度において、いっそうより良好には、６０００〜１００００個の細胞／ｃｍ２の密度において播種する。
【０１０６】
好ましくは、前記増殖性上皮細胞は、毛包性オルガノイドとしても公知の少なくとも１つの管状構造の形成を許容するために十分な期間培養する。
【０１０７】
本発明の目的のため、用語「管状構造」又は「毛包性オルガノイド」は、毛母細胞及び／又は胚細胞から選択される増殖性上皮細胞と合わせた少なくとも１つの本発明による毛乳頭同等物の培養後に観察される出芽物を意味する。
【０１０８】
前記増殖性上皮細胞は、毛乳頭同等物の存在下で少なくとも３日間、好ましくは、少なくとも５日間、いっそうより良好には、５〜２０日間、好ましくは、５〜１５日間培養する。
【０１０９】
特定の実施形態において、本発明による毛包同等物を調製する方法は、栄養培養培地Ｂに、ＷＮＴファミリーのタンパク質、特にＷＮＴ３Ａタンパク質、ＢＭＰファミリーのタンパク質、特にＢＭＰ２及びＢＭＰ４タンパク質、並びにそれらの混合物から選択される成長因子を添加するステップを含む。前記成長因子の添加は、増殖性上皮細胞の播種から出発して１日目と５日目との間に実施する。
【０１１０】
本発明はまた、上記方法により得ることができるインビトロ毛包同等物に関する。
【０１１１】
より特定すると、インビトロ毛包同等物は、陽性アルカリホスファターゼ活性を有する毛乳頭同等物と、マーカーについてＫ８５及びＫ３５並びに任意選択的にＫｉ６７について陽性であるケラチノサイトとから構成されることを特徴とする。
【０１１２】
アルカリホスファターゼ活性は、セクション「毛乳頭同等物を調製する方法」における上記の方法により計測する。
【０１１３】
毛髪特異的ケラチンＫ８５及びＫ３５並びに細胞増殖マーカーであるＫｉ６７タンパク質の標識は、免疫蛍光法により実施する。
【０１１４】
毛包同等物は、特に１００μｍ〜２５０μｍの直径、少なくとも５００μｍの長さ、好ましくは、５００μｍ〜２５００μｍ、いっそうより良好には、１５００μｍ〜２５００μｍの範囲の長さを有する中実管状構造を有する。
【０１１５】
予備増幅ステップ
本発明による毛包同等物をインビトロで調製する方法は、少なくとも１つの本発明による毛乳頭同等物の存在下で増殖性上皮細胞を培養するステップ前に、有効量のＲＯＣＫ阻害剤の存在下で増殖性上皮細胞を増幅させる予備ステップを含み得る。
【０１１６】
増殖性上皮細胞、例えば、毛母細胞及び胚細胞は、毛包の顕微解剖により抽出し、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ及びＧｒｅｅｎ（Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．６，３３１−３４４，１９７５）の技術により、成長因子、特にアミノ酸、血清、コレラ毒素、インスリン、トリヨードサイロニン及びｐＨ緩衝溶液の存在下で当業者に公知の好適な培地中で線維芽細胞から構成されるフィーダー担体上で培養することにより増幅させる。特に、このような培養培地は、特に、ＲＯＣＫ阻害剤が添加された、ケラチノサイトのための少なくとも１つの細胞分裂成長因子（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）及び／又はケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、特にＫＧＦ）、インスリン、ヒドロコルチゾン及び任意選択的に抗生物質（例えば、ゲンタマイシン、アンホテリシンＢ）を含有し得る。
【０１１７】
ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２、リパスジル、ファスジル、チアゾビビン、及びそれらの混合物から選択することができる。
【０１１８】
有利には、前記培地は、例えば、ウシ由来の血清若しくは下垂体抽出物、エピネフリン、トランスフェリン及び／又は非必須アミノ酸も含み得る。
【０１１９】
この培養に使用される線維芽細胞は、より好ましくは、３Ｔ３線維芽細胞である。３Ｔ３線維芽細胞は当業者に周知である。これは、１９６２年から公知である線維芽細胞系である。「３Ｔ３」は、「３日毎の継代、３×１０５個の細胞の接種材料」を意味する。
【０１２０】
増殖性上皮細胞培養は、好ましくは、線維芽細胞（好ましくは、３Ｔ３線維芽細胞）上での培養であり、その増殖は、好ましくは、既にそれを放射線照射（例えば、ガンマ線照射による）することにより、又は既にそれをマイトマイシンにより処理することにより事前に停止されている。マイトマイシン（特にマイトマイシンＣ）はそれらの細胞の増殖を遮断するが、線維芽細胞がケラチノサイト増殖に有用な栄養物質を産生するのを妨害しない。
【０１２１】
本発明によれば、ＲＯＣＫ阻害剤、特にＹ２７６３２の有効量は、１〜１００μＭであり、好ましくは、５〜２５μＭであり、好ましくは、１０μＭである。
【０１２２】
本発明によれば、上皮細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤、特にＹ２７６３２の存在下で少なくとも２日間、好ましくは、少なくとも３日間培養する。
【０１２３】
好ましくは、細胞は、１ｃｍ２当たり１０００〜４０００個の細胞密度で、好ましくは、１ｃｍ２当たり３０００個の細胞密度で培養物中に配置する。
【０１２４】
使用
インビトロ毛乳頭及び毛包同等物がそれぞれ、インビボの毛乳頭の、及び毛包の特徴のほとんどを有することを考慮すると、それらを任意選択的に、代用皮膚と組み合わせたインプラントとして使用することができる。
【０１２５】
したがって、本発明によるインビトロ毛乳頭及び毛包同等物は、皮膚障害、例えば、火傷、治癒不全又は白髪を治療するためのインプラント及び／又は代用皮膚を調製するための用途も有する。
【０１２６】
治療効果は、全体的か部分的かにかかわらず、正常な毛量状態への復帰として定義される。
【０１２７】
本発明の目的のため、予防的治療は、対象が脱毛についての条件、例えば、家族性素因を有する場合に推奨される。
【０１２８】
毛髪量低減の病態は、脱毛症、遺伝性禿頭、瘢痕、火傷又は突発的損傷による結果であり得る。
【０１２９】
したがって、本発明の主題はまた、毛量低減状態の予防的治療又は治療処置のための本発明による毛包同等物である。
【０１３０】
本発明の別の主題は、脱毛症の治療のための本発明による毛包同等物である。
【０１３１】
さらに、本発明はまた、毛量低減状態又は脱毛症の予防的治療又は治療処置のための毛乳頭同等物に関する。
【０１３２】
新たな活性剤をスクリーニングする方法
本発明による毛乳頭及び毛包同等物により、特に体毛又は頭髪についての成長キネティクスを確立すること、したがって、インビボ状況で生存し、可能な限り完全な多数の毛髪を要求する任意の試験、例えば、毛周期の、及びこの周期に影響し得る因子の試験（毛髪成長を促進する活性剤の試験まで及ぶ）、抜け毛の撲滅を可能とする活性剤の、又は体毛成長を減速させる活性剤の試験を実施することが可能となる。
【０１３３】
したがって、本発明はまた、体毛及び／又は頭髪の成長を変調する化合物を同定するための、本発明によるインビトロ毛包同等物の使用に関する。
【０１３４】
さらに、本発明はまた、体毛及び／又は頭髪の成長を変調する少なくとも１つの化合物をスクリーニングする方法であって、前記試験化合物を本発明によるインビトロ毛包同等物と接触させるステップ（ａ）、次いでインビトロ毛包同等物の少なくとも１つのパラメータに対する前記化合物の効果を分析するステップ（ｂ）及び前記パラメータを改変する化合物を選択するステップ（ｃ）を含む方法に関する。
【０１３５】
好ましくは、ステップ（ａ）を実施するため、変調試験化合物を局所的に施与し、例えば、慣用の局所配合物に配合し、又は培養培地中に導入する。
【０１３６】
ステップ（ｂ）は、特に、毛包の品質と、及び／又はそのホメオスタシスと関連するマーカー、例えば、構造タンパク質などについて上皮及び／又は真皮マーカーの発現、産生及び／又は活性を分析することにより実施することができる。構造タンパク質の一例としては、毛髪ケラチンを挙げることができる。
【０１３７】
このため、毛幹の成長に対する産物の効果をスクリーニングプロセスのステップ（ｂ）において分析する。
【０１３８】
産物の効果を分析するステップ（ｂ）は、好ましくは、試験産物と接触させた毛包同等物に対して計測された少なくとも１つのパラメータと、同一条件下で培養されたが試験産物を受けなかった対照毛包同等物に対して計測されたものとの比較である。
【０１３９】
毛包同等物のパラメータを改変する産物を選択するステップ（ｃ）は、事前に決定された基準に応じて実施する。
【０１４０】
このパラメータの改変は、前記マーカーの発現の、産生の、及び／若しくは活性の、並びに／又は毛幹の成長の刺激、減少又は全体若しくは部分阻害であり得る。
【０１４１】
前記産物を選択する基準は、例えば、この産物が計測パラメータに対する刺激又は阻害効果を有することである。
【０１４２】
本発明による毛包同等物は、新規活性剤の同定のために化粧用、医薬又は皮膚用化合物をスクリーニングする自動化プロセスにおいても使用し得る。
【０１４３】
さらに、本発明はまた、体毛及び／又は頭髪の成長を変調する少なくとも１つの化合物をスクリーニングする方法であって、前記試験化合物を本発明によるインビトロ毛乳頭同等物と接触させるステップ（ａ）、次いでインビトロ毛乳頭同等物の少なくとも１つのパラメータに対する前記化合物の効果を分析するステップ（ｂ）及び前記パラメータを改変する化合物を選択するステップ（ｃ）を含む方法に関する。
【０１４４】
詳細な説明及び以下の実施例において、特に示されない限り、「〜」の形で記載される値の範囲には、記述される下限及び上限が含まれる。
【０１４５】
本発明の目的のため、用語「少なくとも１つ」は、特に示されない限り、「１つ以上」を意味するものと理解すべきである。
【０１４６】
以下に挙げる実施例は、本発明の非限定的な説明として提示する。
【実施例】
【０１４７】
実施例１−本発明による毛乳頭同等物の調製
実験プロトコル
ｉ．毛乳頭線維芽細胞の顕微解剖
毛乳頭に由来する線維芽細胞を、以下の方法によりサンプリングした：フェイスリフトから切除された成長期毛包を、２％の抗生物質及び非必須アミノ酸が補給された最小培養培地を含有するペトリ皿中に配置する（図１）。
【０１４８】
ｉｉ．培養条件：
・線維芽細胞増殖のための栄養培養培地Ａ：
線維芽細胞増幅のための栄養培養培地Ａは以下の組成を有する：
【０１４９】
【表１】
2021500897.tif 000002
【０１５０】
【表２】
2021500897.tif 000003
【０１５１】
【表３】
2021500897.tif 000004
【０１５２】
【表４】
2021500897.tif 000005
【０１５３】
【表５】
2021500897.tif 000006
【０１５４】
・毛乳頭同等物を調製するための栄養培養培地Ｂ
毛乳頭同等物を調製するための栄養培養培地Ｂは、以下の組成を有する：
【０１５５】
【表６】
2021500897.tif 000007
【０１５６】
【表７】
2021500897.tif 000008
【０１５７】
【表８】
2021500897.tif 000009
【０１５８】
【表９】
2021500897.tif 000010
【０１５９】
【表１０】
2021500897.tif 000011
【０１６０】
抗生物質／抗真菌薬Ｇｉｂｃｏ番号１５２４０−０６２（上記参照）
【０１６１】
培養−毛乳頭線維芽細胞の増幅
毛包の毛球領域中に位置する毛乳頭を、顕微鏡下で特定する。
【０１６２】
外科用メス及び針を使用して毛乳頭を顕微解剖し、次いで上記の栄養培養培地Ａを含有する培養皿中に配置する（図３）。
【０１６３】
培養−毛乳頭同等物の調製
単層培養物中の線維芽細胞の増幅後、線維芽細胞をトリプシン処理し、次いで細胞培養のために処理されていないペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）細菌ペトリ皿、Ｃｏｒｎｉｎｇ、参照番号：３５１００７）中に、高密度（例えば、１ｃｍ２当たり２３８００個の細胞）において上記の血清不含栄養培養培地Ｂ中で堆積させる。
【０１６４】
線維芽細胞はペトリ皿中で移動し、一緒に群化してクラスタを形成し、次いで細胞集合体を形成し、最終的に担体から剥離して培養５日後に毛乳頭スフェロイド又は同等物を形成する（図４及び１２）。
【０１６５】
得られた毛乳頭は、約２００μｍの直径を有する球状形態である。
【０１６６】
アルカリホスファターゼ酵素活性の標識は、最初にアルカリホスファターゼ基質ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸トルイジン塩）を脱リン酸化し、次いで酸化して青色産物を生じさせるＮＢＴ／ＢＣＩＰアルカリホスファターゼキット（Ｒｏｃｈｅ参照番号：１１６８１４５１）を使用して実施する。
【０１６７】
鮮暗紫色は、強力に陽性のアルカリホスファターゼ酵素活性を示す（図８）。
【０１６８】
実施例１と同一の方法により、
−  ２Ｄ担体（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）細菌ペトリ皿、Ｃｏｒｎｉｎｇ）をＣｏｒｎｉｎｇ社により名称Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）のもと販売されている丸底９６ウェル３Ｄマイクロプレート担体に代え；
−  線維芽細胞播種密度２３８００個の細胞／ｃｍ２を９３７５個の細胞／ｃｍ２に代えて、
得られた本発明による毛乳頭同等物も調製した。
【０１６９】
得られた毛乳頭も、約２００μｍの直径を有する球状形状のものであり（図１５参照）、高度に陽性のアルカリホスファターゼ酵素活性を有する。
【０１７０】
結論：こうして得られた本発明による毛乳頭は、事実上、インビボ毛乳頭の形態的及び機能的特徴を有する。
【０１７１】
実施例２−本発明による毛包同等物の調製
実験プロトコル
ｉ．毛母細胞の顕微解剖
毛包を頭皮の手術残渣から抽出する。前記残渣を最初に５ｍｍ２片に切断し、次いで外科用メスを真皮及び皮下組織間で使用して分割する。
【０１７２】
毛包は、眼科手術用鉗子を使用して抽出し、次いで外科用メスにより毛乳頭真上で分割する。次いで、毛球を回収する。この段階において、毛球は２つのコンパートメント：真皮コンパートメント（毛乳頭及び結合組織鞘）及び細胞塊を形成する毛母細胞を含む。（図１。）
【０１７３】
上皮部分は、灌流針を使用して真皮部分から分離する。
【０１７４】
ｉｉ．培養条件
培養条件は、３つの主要な構成要素を有する：
・基礎培地：
特に示されない限り、本実施例において使用される培地及び緩衝液の全ては、Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９７９，（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，７６，１２７４−１２７８）、Ａｓｓｅｌｉｎｅａｕ  ａｎｄ  Ｐｒｕｎｉｅｒａｓ，１９８４，（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｄｅｒｍ．，１１１，２１９−２２２）又はＡｓｓｅｌｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，（Ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  ｄｅｒｍａｔｏ．，ｖｏｌ．ＩＩＩ，Ｅｄ．Ｌｏｗｅ  ＆  Ｍａｉｂａｃｈ，１−７）に記載されている。
【０１７５】
ＤＭＥＭ培地＋１０％のＦＣＳ＋７Ｆ（Ｇ７Ｆ培地と称する）は、以下の組成を有する。
【０１７６】
【表１１】
2021500897.tif 000012
【０１７７】
・培養補給物：１０μＭのＹ２７６３２。
・接着表面：毛母細胞は、マイトマイシン処理により細胞周期を停止させたネズミ３Ｔ３線維芽細胞のフィーダー層の存在下でＧｒｅｅｎベース培地中で接着及び増殖する。
【０１７８】
培養−毛母細胞の増幅
顕微解剖後、毛母細胞集塊を、事前にフィーダー層が、好ましくは、４００００個の放射線照射３Ｔ３細胞／ｃｍ２が播種され、完全培養培地、例えば、Ｇ７Ｆ培地＋１０μＭのＹ２７６３２により被覆された直径６０ｍｍのペトリ皿中に堆積させ；７０％のコンフルエンスにおける毛母細胞の培養物を得る。
【０１７９】
培養−毛包同等物の調製
インビトロ毛包同等物を生成するため、細胞をサブコンフルエント段階において酵素処理により回収する。次いで、細胞を、事前に毛乳頭同等物を６０００個の細胞／ｃｍ２の密度において含有する細胞培養のために処理されていない細菌ペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）細菌ペトリ皿、Ｃｏｒｎｉｎｇ参照番号：３５１００７）中に、実施例１に記載の血清不含栄養培養培地Ｂ中で播種する。
【０１８０】
毛母細胞は、毛乳頭スフェロイドのレベルにおいてのみ接着し、増殖する（図５及び６）。
【０１８１】
共培養６日後、特に以下の形態的特徴：直径約２５００マイクロメートルの中実管状構造を有する毛包同等物の出現が見られる（図６及び７）。
【０１８２】
毛髪特異的ケラチンＫ８５及びＫ３５、並びにさらには細胞増殖マーカー、例えば、Ｋｉ６７の標識を、蛍光免疫標識により実施する（図９）。
【０１８３】
結論：こうして得られた本発明による毛包は、事実上、インビボ毛包の形態的及び機能的特徴を有する。
【０１８４】
実施例３：本発明外の比較例：国際公開第２００９／１１８２８３号パンフレットの実施例２に記載の方法により得られた毛乳頭
１）材料及び方法：
毛乳頭同等物の調製を、国際公開第２００９／１１８２８３号パンフレットの実施例２に記載の調製プロトコルにより実施した。
【０１８５】
ＤＭＥＭ（＋）培地の調製：
−  ５００ｍｌのＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号３１９６６）
−  ５ｍｌの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｇｉｂｃｏ番号１１１４０−０３５）
−  １００ｍＭにおける５０μｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ番号Ａ８９６０）、すなわち、最終２．９ｍｇ／ｌ
−  ５ｍｌのインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１０５２４２３３）
−  ４００ｍｇ／ｌのＢＳＡ
培養担体：平底６ウェルＵＬＡ（超低接着）３Ｄプレート。
細胞密度：６６６０個の細胞／ｃｍ２。
細胞：毛乳頭から得られた線維芽細胞（継代Ｐ６）。
【０１８６】
２）結果：（図１１参照）
結論：不規則な縁部を有する異なるサイズの極めて不均一な細胞集合体が観察される。
【０１８７】
実施例４：本発明外の比較例：国際公開第２００９／１１８２８３号パンフレットの実施例３に記載の方法により得られた毛乳頭
１）材料及び方法：
毛包同等物の調製を、国際公開第２００９／１１８２８３号パンフレットの実施例３に記載の調製プロトコルにより実施した。
【０１８８】
培養培地：
−  毛乳頭同等物のためのＤＭＥＭ（＋）（ＤＭＥＭ＋２％のＢＳＡ＋ＩＴＳ＋ビタミンＣ）
−  次いで、ＤＰ／ＭＨＮ／ＯＲＳ混合培養のためのＫＳＦＭ
培養担体：平底６ウェルＵＬＡ（超低接着）プレート。
細胞密度：
−  毛乳頭の調製のため：毛乳頭から得られた線維芽細胞：５０００００個のＤＰ／Ｆ７５、すなわち、６６６０個のＤＰ／ｃｍ２；
−  毛包の調製のため：２５００００個のＯＲＳ／６ウェル、すなわち、２６３００個のＯＲＳ／ｃｍ２＋２５０００ＭＨＮ／６ウェル、すなわち、２６３０個のＭＨＮ／ｃｍ２。
細胞：
−  毛乳頭から得られた線維芽細胞（継代Ｐ６）。
−  メラノサイトＭ５９７（継代Ｐ４）
−  ＯＲＳ  ＩＢからのケラチノサイト（継代Ｐ３）
【０１８９】
２）結果（図１３参照）
結論：細胞集合体（嚢胞）が、毛包に向かう進化なしで観察される。
【０１９０】
実施例５：本発明外の比較例：細胞培養のための２Ｄ培養担体（すなわち、細胞接着を許容する担体）上の毛乳頭から得られた線維芽細胞の培養。
１）材料及び方法：
毛乳頭同等物の調製を、実施例１に記載の調製プロトコルにより実施し、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）細菌ペトリ皿培養担体、Ｃｏｒｎｉｎｇ、参照番号３５１００７を細胞培養のための（すなわち、細胞接着を許容する）ペトリ皿培養担体に代えた。
【０１９１】
２）結果（図１４参照）
結論：細胞接着を許容する培養担体を使用すると毛乳頭の形成は観察されない。
【０１９２】
実施例６：本発明外の比較例：Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｕｓｉｎｇ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ」）に記載の血清を含有する培養培地中で得られた毛乳頭
１）材料及び方法：
本発明外の比較例：
−  ３Ｄ培養担体：Ｕ字底９６ウェルＵＬＡプレート
−  培養培地：ＤＭＥＭ培地＋１０％のＦＣＳ
−  細胞密度：９３７５個の細胞／ｃｍ２
本発明による毛乳頭同等物：
−  ３Ｄ培養担体：Ｕ字底９６ウェルＵＬＡプレート
−  培養培地：ウィリアムス培地（血清不含）
−  細胞密度：９３７５個の細胞／ｃｍ２
【０１９３】
毛乳頭の酵素活性のマーカーであるアルカリホスファターゼ、バーシカン、及びＳＦＲＰ２分泌型フリズルド関連タンパク質２のＲＮＡ発現を計測するため、プローブＡＬＰＬ−Ｈｓ０１０２９１４４＿ｍ１、ＶＣＡＮ−Ｈｓ００１７１６４２＿ｍ１、及びＳＦＲＰ２−Ｈｓ００２９３２５８＿ｍ１を使用した。
【０１９４】
【表１２】
2021500897.tif 000013
【０１９５】
結論：
−  本発明による毛乳頭同等物について、毛乳頭の酵素活性の誘導性のマーカーとして公知のマーカーＡＬＰＬ（アルカリホスファターゼ）、ＶＣＡＮ（バーシカン）及びＳＦＲＰ２（分泌型フリズルド関連タンパク質２）について過剰発現が観察される。
−  本発明外の比較例について、毛乳頭の酵素活性の誘導性のマーカーとして公知のマーカーＡＬＰＬ（アルカリホスファターゼ）、ＶＣＡＮ（バーシカン）及びＳＦＲＰ２（分泌型フリズルド関連タンパク質２）について過小発現が観察される。
【０１９６】
実施例７：本発明外の比較例：コラーゲンゲル上の３Ｄ培養において得られた毛包
１）材料及び方法：
毛乳頭から及び増殖性上皮細胞（毛母細胞）から得られた線維芽細胞を含むスフェロイドを製造する第１のステップを、ＤＭＥＭ培地＋１０％の血清中でＵ字底９６ウェルＵＬＡプレート中で実施した。
【０１９７】
次いで、スフェロイドをコラーゲンゲル（格子）中に統合することからなる第２のステップを実施し、観察を１４日目に実施した。
【０１９８】
２）結果：（図１６参照）
結論：毛包の形成はコラーゲンゲル中で観察されず；嚢胞は先端構造形成なしで観察される。
【図１】
2021500897.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021500897.tif 000020
【図８】
2021500897.tif 000021
【図９】
2021500897.tif 000022
【図１０】
2021500897.tif 000023
【図１１−１２】
2021500897.tif 000024
【図１３】
2021500897.tif 000025
【図１４】
2021500897.tif 000026
【図１５】
2021500897.tif 000027
【図１６】
2021500897.tif 000028
【国際調査報告】
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2021500897.tif 000030
2021500897.tif 000031
2021500897.tif 000032
2021500897.tif 000033
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