(57)【要約】  本開示は、アデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質を調製するための組成物、方法、およびプロセス、それらの使用、ならびに／または製剤に関し、カプシドタンパク質は、標的組織に対する向性を増強するための標的指向性ペプチドインサートを含む。
2021534809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを生成するための方法であって、前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドが、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比べて、形質導入の向上または細胞もしくは組織特異性の増加の少なくとも１つを呈し、
（ａ）バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドのライブラリーを生成する工程であって、前記ライブラリーが、
（ｉ）２、３、４、５、６、７、８、もしくは９つの連続アミノ酸のランダム化配列の領域を有する複数のカプシドポリペプチド、または
（ｉｉ）１つよりも多くの親ＡＡＶカプシドポリペプチドに由来する複数のカプシドポリペプチド
を含む工程と；
（ｂ）ライブラリー（ｉ）または（ｉｉ）の前記カプシドポリペプチドをＡＡＶベクターへとクローニングすることによりＡＡＶベクターライブラリーを生成する工程であって、前記ＡＡＶベクターが、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターを含み、前記第２のプロモーターが、ヘルパーウイルス共感染の非存在下でカプシドｍＲＮＡ発現を駆動させる工程とを備える方法。
【請求項２】
前記第１のプロモーターが、ＡＡＶ２  Ｐ４０であり、前記第２のプロモーターが、ユビキタスプロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のプロモーターがＡＡＶ２  Ｐ４０であり、前記第２のプロモーターが細胞タイプ特異的プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プロモーターが、表３に列挙されているもののいずれかから選択される、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ユビキタスプロモーターまたは前記細胞特異的プロモーターが、前記カプシドポリペプチドをコードするＲＮＡの発現を可能にする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カプシドポリペプチドをコードする前記ＲＮＡを回収する工程および前記カプシドポリペプチドを配列決定する工程をさらに備える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
回収された前記カプシドポリペプチドが、親カプシドポリペプチドと比較して、標的細胞形質導入または標的細胞特異性（向性）の増加を呈する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的細胞が、神経細胞、神経幹細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア細胞、網膜細胞、腫瘍細胞、造血幹細胞、インスリン産生ベータ細胞、肺上皮細胞、内皮細胞、肝臟細胞、骨格筋細胞、筋幹細胞、筋サテライト細胞、または心筋細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＡＶベクターが、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターを含み、前記第２のプロモーターが、カプシド遺伝子の下流に位置し、ヘルパーウイルス共感染の非存在下でそのアンチセンスＲＮＡ発現を駆動させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のプロモーターが、ＡＡＶ２  Ｐ４０であり、前記第２のプロモーターが、ユビキタスプロモーターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のプロモーターが、ＡＡＶ２  Ｐ４０であり、前記第２のプロモーターが、細胞特異的プロモーターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ユビキタスプロモーターまたは前記細胞特異的プロモーターが、バリアントＡＡＶのカプシドポリペプチドをアンチセンス方向にコードする遺伝子の発現を可能にし、アンチセンスＲＮＡをもたらす、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドの配列を決定するために使用される前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードするＲＮＡへと変換することができる前記アンチセンスＲＮＡを回収する工程をさらに備える、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドが、親カプシドポリペプチドと比較して、標的細胞形質導入または標的細胞特異性（向性）の増加を呈する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的細胞が、神経細胞、神経幹細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア細胞、網膜細胞、腫瘍細胞、造血幹細胞、インスリン産生ベータ細胞、肺上皮細胞、内皮細胞、肝臟細胞、骨格筋細胞、筋幹細胞、筋サテライト細胞、または心筋細胞である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、アデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質を調製するための組成物、方法、およびプロセス、それらの使用、ならびに／または製剤に関し、カプシドタンパク質は、標的組織に対する向性を増強するための標的指向性ペプチドインサートを含む。
【背景技術】
【０００２】
成体中枢神経系（ＣＮＳ）への遺伝子送達は、依然として遺伝子療法における大きな課題であり、脳向性が向上された遺伝子操作ＡＡＶカプシドは、魅力的な解決策である。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来ベクターは、それらの性質が非病原性であり、それらの免疫原性プロファイルが低く、宿主ゲノムへの組込み率が低く、非分裂細胞での導入遺伝子発現が長期にわたるため、臨床遺伝子移入の有望なツールである。しかしながら、ある特定の臓器ではＡＡＶ天然バリアントの形質導入効率は低過ぎて、臨床に応用することができず、既存の中和抗体によるカプシド中和は、大部分の患者の治療を妨げる可能性がある。こうした理由から、特性が増強された新規カプシドバリアントを得るために多大な努力が捧げられている。これまでに試験された多くの手法の中でも、最も有意義な進歩は、エラープローンＰＣＲ、種々の親血清型のシャッフル、または規定の位置への完全ランダム化短鎖ペプチドの挿入のいずれかを用いたカプシド配列ランダム化により作出されるカプシドバリアントのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ選択を使用するＡＡＶカプシドの指向性進化からもたらされている。
【０００３】
ＡＡＶカプシドの指向性進化を実施するため、ウイルスカプシドをコードする配列は、それがそれ自体のカプシド外殻にパッケージングされ得るように、それ自体が逆位末端反復配列（ＩＴＲ）にフランキングされている。培養細胞または動物にカプシドの混合集団を感染させた後で、目的の組織への誘導に成功したカプシドバリアントをコードするＤＮＡをＰＣＲにより回収して、さらなるラウンドの選択に供する。この手法では、所与の組織に存在するすべてのウイルスＤＮＡ種が回収され、特定の細胞タイプが区別されることもなく、または完全な形質導入（細胞表面結合、エンドサイトーシス、輸送、核移行、脱外被、二本鎖合成、転写）を実施することができるベクターが区別されることもない。例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）など、複数の細胞タイプを含有する高度に複雑な組織の場合、ミクログリアまたは血管内皮細胞ではなくニューロンおよび／またはアストロサイトを形質導入することが可能なカプシドバリアントの回収を目的とした、よりストリンジェントな選択的圧力を適用することが高度に好ましいと予想される。
【０００４】
全身投与時のＡＡＶカプシドのＣＮＳ向性を向上させる試みは、限定的な成功しか収めていない。
この問題に対処するために、２つの以前の手法が使用されてきた。第１の戦略では、感染性ＡＡＶ  ＤＮＡの指数関数的複製の引き金を引くために、培養細胞（非特許文献１）またはｉｎ  ｓｉｔｕ動物組織（非特許文献２）にアデノウイルスと共に共感染させることが使用された。別の成功した手法には、細胞特異的ＣＲＥトランスジェニックマウス（非特許文献３）を使用して、アストロサイトでのウイルスＤＮＡ組換えを特異的に可能にし、続いてＣＲＥ組換えカプシドバリアントを回収することが伴っていた。両手法は成功であったことが証明され、標的細胞集団への形質導入が増強された幾つかのカプシドバリアントの単離が可能だった。
【０００５】
この知見は、細胞タイプ特異的ライブラリー選択が、指向性進化の結果を向上させることができることを示唆した。しかしながら、デバーマンら（Ｄｅｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）が使用したトランスジェニックＣＲＥ系は、他の動物種では扱い難く、マウス組織での指向性進化により選択されるＡＡＶバリアントは、大型動物では同様の特性を示していない。したがって、ヒト対象での翻訳可能性の確率を増加させるためには、指向性進化プロセス全体を、非ヒト霊長類にて直接実施する必要があると予想される。以前に記載されている形質導入特異的な手法はいずれも、以下の理由で、大型動物研究には適していない：１）目的の組織（例えば、ＣＮＳ）は多くが、アデノウイルス共感染のために利用することが容易ではないため；２）特異的なＡｄ向性それ自体が、ライブラリー分布にバイアスをかけることになるため；３）大型動物は典型的にはトランスジェネシスに適しておらず、規定の細胞タイプにてＣＲＥリコンビナーゼを発現するように遺伝子操作することができないため。
【０００６】
この問題に対処するため、本発明者らは、非トランスジェニック動物における細胞タイプ特異的バイオパニングのための幅広く適用可能な機能的ＡＡＶカプシドライブラリースクリーニングプラットフォームを開発した。ＴＲＡＣＥＲ（Ｔｒｏｐｉｓｍ  Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＡＶ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ；ＲＮＡの細胞タイプ特異的発現によるＡＡＶの向性再指向化）プラットフォーム系では、カプシド遺伝子は、ヘルパーウイルス共感染の非存在下でカプシドｍＲＮＡ発現が駆動するように、細胞タイプ特異的プロモーターの制御下に置かれている。このＲＮＡ駆動性スクリーニングは、特定の細胞タイプを形質導入するカプシドバリアントが有利になるような選択圧を増加させる。
【０００７】
ＴＲＡＣＥＲプラットフォームは、ＡＡＶカプシドライブラリーの生成を可能にし、形質導入細胞で発現されるカプシドｍＲＮＡの特異的回収およびサブクローニングは、トランスジェニック動物もヘルパーウイルス共感染も必要とせずに達成される。ｍＲＮＡ転写は、完全な形質導入の決定的特徴であるため、こうした方法は、完全に感染性であるＡＡＶカプシド突然変異体の識別を可能にする。この方法は、ストリンジェンシーがより高いことに加えて、これらに限定されないが、シナプシン−１プロモーター（ニューロン）、ＧＦＡＰプロモーター（アストロサイト）、ＴＢＧプロモーター（肝臓）、ＣＡＭＫプロモーター（骨格筋）、ＭＹＨ６プロモーター（心筋細胞）など、任意の細胞特異的プロモーターの制御下でＣＡＰ  ｍＲＮＡを発現するように設計されたライブラリーを使用して、特定の細胞タイプに対して高い向性を有するカプシドの識別を可能にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】グリムら（Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．），２００８
【非特許文献２】リソワスキーら（Ｌｉｓｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．），２０１４
【非特許文献３】デバーマンら（Ｄｅｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．），２０１６
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、ＡＡＶカプシドの向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を遺伝子操作および／または再指向化（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）するための組成物ならびに方法を提供する。本明細書には、ＡＡＶカプシド配列へと挿入して、特定の組織に対するカプシドの向性を増加させることができるペプチドも提供される。一態様では、こうしたペプチドを使用して、カプシドを、脳もしくは脳の領域または脊髄へと標的化することができる。
【００１０】
本開示は、１つまたは複数のバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを生成するための方法を提示する。ある特定の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、親ＡＡＶカプシドポリペプチドと比べて、形質導入の向上または細胞特異性もしくは組織特異性の増加の少なくとも１つを呈する。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドのライブラリーを生成する工程であって、前記ライブラリーは、（ｉ）２、３、４、５、６、７、８、もしくは９つの連続アミノ酸のランダム化配列の領域を有する複数のカプシドポリペプチド、または（ｉｉ）１つよりも多くの親ＡＡＶカプシドポリペプチドに由来する複数のカプシドポリペプチドを含む工程；（ｂ）ライブラリー（ａ）（ｉ）または（ａ）（ｉｉ）のカプシドポリペプチドをＡＡＶベクターへとクローニングすることによりＡＡＶベクターライブラリーを生成する工程であって、ＡＡＶベクターは、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターを含み、前記第２のプロモーターは、ヘルパーウイルス共感染の非存在下でカプシドｍＲＮＡ発現を駆動させる工程、を含む。
【００１１】
ある特定の実施形態では、第１のプロモーターは、ＡＡＶ２  Ｐ４０である。ある特定の実施形態では、第２のプロモーターは、ユビキタスプロモーターである。ある特定の実施形態では、第１のプロモーターはＡＡＶ２  Ｐ４０であり、第２のプロモーターはユビキタスプロモーターである。
【００１２】
ある特定の実施形態では、第１のプロモーターは、ＡＡＶ２  Ｐ４０である。ある特定の実施形態では、第２のプロモーターは、細胞タイプ特異的プロモーターである。ある特定の実施形態では、第１のプロモーターはＡＡＶ２  Ｐ４０であり、第２のプロモーターは細胞タイプ特異的プロモーターである。
【００１３】
ある特定の実施形態では、プロモーターは、表３に列挙されている任意のプロモーターから選択される。ある特定の実施形態では、ユビキタスプロモーターまたは細胞特異的プロモーターは、カプシドポリペプチドをコードするＲＮＡの発現を可能にする。
【００１４】
ある特定の実施形態では、本方法は、カプシドポリペプチドをコードするＲＮＡを回収する工程を含む。ある特定の実施形態では、本方法は、カプシドポリペプチドの配列を決定する工程を含む。ある特定の実施形態では、回収されたカプシドポリペプチドは、親カプシドポリペプチドと比較して、標的細胞形質導入または標的細胞特異性（向性）の増加を呈する。
【００１５】
ある特定の実施形態では、標的細胞は、神経細胞、神経幹細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア細胞、網膜細胞、腫瘍細胞、造血幹細胞、インスリン産生ベータ細胞、肺上皮細胞、内皮細胞、肝臟細胞、骨格筋細胞、筋幹細胞、筋サテライト細胞、または心筋細胞である。
【００１６】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターを含み、第２のプロモーターは、カプシド遺伝子の下流に位置し、ヘルパーウイルス共感染の非存在下でそのアンチセンスＲＮＡ発現を駆動させる。
【００１７】
ある特定の実施形態では、第１のプロモーターは、ＡＡＶ２  Ｐ４０であり、第２のプロモーターは、ユビキタスプロモーターである。ある特定の実施形態では、第１のプロモーターは、ＡＡＶ２  Ｐ４０であり、第２のプロモーターは、細胞特異的プロモーターである。ある特定の実施形態では、ユビキタスプロモーターまたは細胞特異的プロモーターは、バリアントＡＡＶのカプシドポリペプチドをアンチセンス方向にコードする遺伝子の発現を可能にし、アンチセンスＲＮＡをもたらす。ある特定の実施形態では、本方法は、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドの配列を決定するために使用される、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードするＲＮＡへと変換することができるアンチセンスＲＮＡを回収する工程を含んでいた。
【００１８】
ある特定の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、親カプシドポリペプチドと比較して、標的細胞形質導入または標的細胞特異性（向性）の増加を呈する。
上述のおよび他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に例示されているように、本開示の特定の実施形態に関する以下の説明から明らかになるであろう。図面は必ずしも縮尺通りではなく、むしろ、本開示の種々の実施形態の原理を例示することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】野生型ＡＡＶカプシド遺伝子転写およびＣＭＶ−ＣＡＰベクターのマップを示す図。図１Ａは、野生型ＡＡＶゲノムからのＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３  ＡＡＶの転写を示す。各ウイルスプロモーターの転写開始部位が示されている。ＳＤ、スプライスドナー、ＳＡ、スプライスアクセプター。各リーディングフレームの開始コドンの配列が示されている。ＡＡＰおよびＶＰ３の翻訳は、主要なｍＲＮＡのリーキーなスキャニングにより実施される。
【図１Ｂ】野生型ＡＡＶカプシド遺伝子転写およびＣＭＶ−ＣＡＰベクターのマップを示す図。図１Ｂは、効率的なウイルス産生に必要な最小調節配列を決定するために使用されるＣＭＶ−ｐ４０二重プロモーターベクターの構造を示す。最下段に示されているｐＲＥＰ２ΔＣＡＰベクターは、ほとんどのＣＡＰリーディングフレームを欠失させることにより得られるものであり、トランスでＲＥＰタンパク質を提供するために使用される。
【図２Ａ】データのヒストグラム表現であり、ウイルス収量およびＣＡＰ  ｍＲＮＡスプライシングに対するＣＭＶプロモーター位置の効果を示す図。図２Ａは、図１に記載されている構築物を使用して、Ａｄヘルパーベクターを共トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において産生させたＡＡＶ９の平均収量を示す。野生型ＡＡＶ９プラスミド（ｐＡＶ９）を陽性対照として使用する。Ｙ軸値には、各１５ｃｍプレートに由来する１ｕｌ当たりのＡＡＶ  ＤＮＡコピー数（合計で約１０００ｕｌ、左パネル）またはｗｔＡＡＶ９のパーセンテージ（右パネル）が示されている。
【図２Ｂ】データのヒストグラム表現であり、ウイルス収量およびＣＡＰ  ｍＲＮＡスプライシングに対するＣＭＶプロモーター位置の効果を示す図。図２Ｂは、トランスフェクト細胞でのＣＡＰ転写物の発現の証拠を示す。トランスフェクト２９３Ｔ細胞に由来するｍＲＮＡを、主スプライシングＣＡＰ転写物に特異的なプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲに供した。Ａｄヘルパーベクターの非存在下では、ｐ４０駆動性転写は欠如することに留意されたい（レーン２）。
【図３Ａ】ウイルス収量に対するＲＥＰヘルパープラスミド最適化の効果を示す図。図３Ａは、改良型ｐＲＥＰヘルパーベクターの設計を示す。ＭｓｃＩ断片の欠失は、カプシド形成に必要なＶＰタンパク質のＣ末端部分を除去する。星印は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３リーディングフレームがコードされる可能性を破壊するために導入された早期終止コドンを表す。
【図３Ｂ】ウイルス収量に対するＲＥＰヘルパープラスミド最適化の効果を示す図。図３Ｂは、種々のＲＥＰプラスミドアーキテクチャを用いて産生されたシナプシン−ｐ４０−ＣＡＰ９  ＡＡＶの収量を示す。Ｙ軸の値は、野生型ＡＡＶ９に対するＶＧのパーセンテージを表す。
【図３Ｃ】ウイルス収量に対するＲＥＰヘルパープラスミド最適化の効果を示す図。図３Ｃは、ｐＲＥＰプラスミドからの完全長ＲＥＰの組換えおよび／または非正統的パッケージングの定量化を示す。産生されたウイルスストックを、ＩＴＲ含有ベクターに存在しないＲＥＰのＮ末端部分に位置するＴａｑｍａｎプローブを使用してｑＰＣＲに供した。
【図４Ａ】第２世代ベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ分析が記載されている図。図４Ａは、Ｐｒｏ９ベクターの設計を示す。３つすべてのベクターのアーキテクチャは、ＢｓｔＥＩＩ構築物に基づく。ＡＡＶ９カプシドＲＮＡは、それぞれ、Ｐ４０プロモーター、およびＣＭＶ、ｈＳｙｎ１、またはＧＦＡＰプロモーターの制御下に置かれている。
【図４Ｂ】第２世代ベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ分析が記載されている図。図４Ｂは、二重のイオジキサノール精製後、１ｅ１０ＶＧの各ベクターを泳動することにより得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色を示す。
【図４Ｃ】第２世代ベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ分析が記載されている図。図４Ｃは、１マウス当たり１ｅ１２ＶＧの尾静脈注射後のマウス脳（皮質）、肝臓、および心臓におけるウイルスＤＮＡの生体内分布を示す。ＡＡＶ９  ＶＰ３  ＤＮＡは、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲで定量化され、マウストランスフェリン受容体遺伝子に対して正規化されている。
【図４Ｄ】第２世代ベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ分析が記載されている図。図４Ｄは、マウス組織からのカプシドＲＮＡ回収を示す。全ＲＮＡを逆転写し、カプシド特異的Ｔａｑｍａｎプライマーおよびプローブを用いてＴａｑｍａｎＰＣＲを実施した。値は、ＴＢＰハウスキーピング遺伝子に対して正規化したＶＰ３ｃ  ＤＮＡコピー数を表す。
【図５Ａ】イントロン第２世代ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析が記載されている図。図５Ａは、ハイブリッドＣＭＶ／グロビンイントロンを内包するイントロンＰｒｏ９ベクターの設計を示す。ＡＡＶ９カプシドＲＮＡは、タンデム構成（上）または逆位構成（下）で、Ｐ４０プロモーター、およびＣＢＡ、ｈＳｙｎ１、またはＧＦＡＰプロモーターの制御下に置かれている。逆位プロモーターベクターには、アンチセンスＣＡＰ９転写物のポリアデニル化を可能にするために、追加のＳＶ４０ポリアデニル化部位（オレンジ色）が３’末端部分に付加されている。
【図５Ｂ】イントロン第２世代ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析が記載されている図。図５Ｂは、ＡＡＶ９  ＣＡＰ  ｃＤＮＡ増幅を示す。ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＲＥＰ−３ｓｔｏｐｓによるトリプルトランスフェクションを使用して、図示されているすべてのベクターを産生し、得られたウイルスを使用して、１細胞当たり１ｅ４ＶＧのＭＯＩでＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に感染させた。感染の４８時間後にＲＮＡを抽出し、完全なカプシド（上）またはＣ末端断片（下）を増幅するプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲに供した。
【図５Ｃ】イントロン第２世代ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析が記載されている図。図５Ｃは、順方向のタンデムプロモーターを有する無イントロンウイルスまたはイントロンウイルスに感染させた細胞に由来するＡＡＶ９  ＶＰ３  ｃＤＮＡをＴａｑｍａｎ  ＰＣＲで定量化し、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対して正規化したことを示す。値は、ＶＰ３のＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡに対する比を示す。
【図５Ｄ】イントロン第２世代ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析が記載されている図。図５Ｄは、タンデム構築物または逆位構築物に感染させた細胞からのカプシドＲＮＡ回収のマッピングを示す。全ＲＮＡを逆転写し、カプシド遺伝子全体をフランキングするプライマーを使用してＰＣＲを実施した。白色矢印は、アンチセンスＣＡＰ  ｍＲＮＡの異常スプライシングに起因するＶＰ３サイズのバリアントを表す。
【図５Ｅ】イントロン第２世代ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析が記載されている図。図５Ｅは、グロビンイントロンスプライシングの分析を示す。ＣＡＧ９プラスミド（左）またはＣＡＧ９ウイルスにより形質導入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に由来するｃＤＮＡを、グロビンエクソン間接合部の前（Ｇｌｏ  ｅｘ１）または内部（ＧｌｏＳｐｌｉｃｅＦ４（配列番号２６）およびＧｌｏＳｐｌｉｃｅＦ６（配列番号１３））に位置する順方向プライマーを用いて、ＰＣＲにかけた。エクソン１（下線なし）とエクソン２（下線）との間の接合部にまたがるプライマーは、下段に記載されている。
【図６】シナプシンプロモーターまたはＧｆａｂｃ１Ｄプロモーターの下流におけるＰ４０プロモーターの存在は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞では、いずれのプロモーターの抑制も解除しないというｉｎ  ｖｉｔｒｏ証拠を提供する図。
【図７】ＴＲＡＣＥＲプラットフォームの基本的な仕組みを例示する図。
【図８】組織特異的プロモーターの使用およびＲＮＡ回収を含む、ＴＲＡＣＥＲプラットフォームの特徴を例示する図。
【図９】ＴＲＡＣＥＲ産生アーキテクチャの一実施形態を提供する図。
【図１０】従来型ｖＤＮＡ回収と第２世代ｖＲＮＡ回収との比較を提供する図。
【図１１】標的進化のための細胞特異的ＲＮＡ発現の使用の概要を提供する図。
【図１２Ａ】天然ＡＡＶ（図１２Ａ）およびＴＲＡＣＥＲライブラリー（図１２Ｂ）のカプシド遺伝子転写を表すダイヤグラムを提供する図。
【図１２Ｂ】天然ＡＡＶ（図１２Ａ）およびＴＲＡＣＥＲライブラリー（図１２Ｂ）のカプシド遺伝子転写を表すダイヤグラムを提供する図。
【図１３】ｉｎ  ｖｉｖｏ進化に使用されるＡＡＶ６、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ−ＤＪカプシドペプチドディスプレイライブラリーのダイヤグラムである図（それぞれ出現順に、配列番号２７〜３２）。
【図１４】ｉｎ  ｖｉｖｏ進化に使用されるＡＡＶ９カプシドペプチドディスプレイライブラリーのダイヤグラムである図（それぞれ出現順に、配列番号３３〜４２）。
【図１５Ａ】ライブラリー構築に使用される方法を提示する図。図１５Ａは、ランダムライブラリーを導入するために使用される挿入部位の配列を示す図（それぞれ出現順に、配列番号４３〜４６）。
【図１５Ｂ】ライブラリー構築に使用される方法を提示する図。図１５Ｂは、アセンブリ手順の説明を提供する。
【図１６】ライブラリー増幅に使用されるクローニングフリーローリングサークル（ｃｌｏｎｉｎｇ−ｆｒｅｅ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ）手順の代表的なダイヤグラムを提供する図（配列番号４７；ＮＮＫ７）。
【図１７】野生型の夾雑を最小化するように設計されたコドン突然変異体ＡＡＶ９ライブラリーシャトルの配列を提供する図（それぞれ出現順に、配列番号３３〜３４および４８〜５２）。
【図１８】ＡＡＶ９ペプチドライブラリーバイオパニングの説明を提供する図。
【図１９】初期プールからの５０％回収での回収プロセスを示す図。
【図２０】ＧＦＡＰ駆動性ライブラリー（Ｂ群およびＦ群）からのｃＤＮＡ回収および増幅の例を提供する図。
【図２１】バイオパニングプロセス全体にわたるＡＡＶ９ペプチドライブラリー多様性の進行を示す図。図２１Ａには、ＲＮＡライブラリー進化が記載されている。図２１Ｂおよび図２１Ｃは、Ｐ０ウイルスおよびＰ１ウイルスに対するＮＮＫマシンミックス（ｍａｃｈｉｎｅ  ｍｉｘ）調製物のアミノ酸分布を示す。
【図２２】Ｐ２におけるニューロン（ＳＹＮ）−ＡＡＶ９ペプチドライブラリー組成を提供する図。
【図２３】Ｐ２におけるアストロサイト（ＧＦＡＰ）−ＡＡＶ９ペプチドライブラリー組成を提供する図。
【図２４】ＧＦＡＰ−ＡＡＶ９ペプチドライブラリー候補における脳／肝臓特異性の推定を提供する図。
【図２５】ＧＦＡＰ−ＡＡＶ９ペプチドライブラリー候補における脳／肝臓特異性の推定を提供する図。
【図２６】バリアントの部分集団選択例を提供する図。
【図２７】ライブラリー生成およびクローニング手順の代表的な設計を提供する図。
【図２８】６６６個の配列バリアントの合成ライブラリー（ＧＦＡＰプロモーター）で産生されたＡＡＶのＮＮＫ／ＮＮＭコドン分布（コドン突然変異体の共分散）を提供する図。
【図２９】６６６個の配列バリアントの合成ライブラリー（ＳＹＮ９プロモーター）で産生されたＡＡＶのＮＮＫ／ＮＮＭコドン分布（コドン突然変異体の共分散）を提供する図。
【図３０】注射１か月後の脳パンチおよび肝臓パンチからの組織回収に由来するデータを提供する図。
【図３１Ａ】Ｓｙｎ駆動性合成ライブラリーＮＧＳ分析からの対照カプシドの結果を提供する図。図３１Ａは、内部ＡＡＶ９、ＰＨＰ．Ｂ、およびＰＨＰ．ｅＢ対照の富化分析を示す（それぞれ出現順に、配列番号５３〜５８および５３〜５８）。
【図３１Ｂ】Ｓｙｎ駆動性合成ライブラリーＮＧＳ分析からの対照カプシドの結果を提供する図。図３１Ｂ、図３１Ｃ、および図３１Ｄは、マウス脳組織に由来するｍＲＮＡにおけるＮＮＫ／ＮＮＭコドン分布を示す。
【図３１Ｃ】Ｓｙｎ駆動性合成ライブラリーＮＧＳ分析からの対照カプシドの結果を提供する図。図３１Ｂ、図３１Ｃ、および図３１Ｄは、マウス脳組織に由来するｍＲＮＡにおけるＮＮＫ／ＮＮＭコドン分布を示す。
【図３１Ｄ】Ｓｙｎ駆動性合成ライブラリーＮＧＳ分析からの対照カプシドの結果を提供する図。図３１Ｂ、図３１Ｃ、および図３１Ｄは、マウス脳組織に由来するｍＲＮＡにおけるＮＮＫ／ＮＮＭコドン分布を示す。
【図３２Ａ】ニューロン合成ライブラリーＮＧＳ分析の結果を提供する図（それぞれ出現順に、配列番号５９〜６０、５９〜６１、６１〜６３、６２、６４、６４、６３、６５〜６７、６７、６５、６８、６６、６９、７０〜７１、および７０〜７４）。
【図３２Ｂ】ニューロン合成ライブラリーＮＧＳ分析の結果を提供する図（それぞれ出現順に、配列番号５９〜６０、５９〜６１、６１〜６３、６２、６４、６４、６３、６５〜６７、６７、６５、６８、６６、６９、７０〜７１、および７０〜７４）。
【図３３】アストロサイト合成ライブラリーＮＧＳ分析の結果を提供する図（それぞれ出現順に、配列番号５３〜５８、５３〜５８、および５３〜５８）。
【図３４Ａ】アストロサイト合成ライブラリーコドン突然変異体共分散を提供する図。
【図３４Ｂ】アストロサイト合成ライブラリーコドン突然変異体共分散を提供する図。
【図３５】アストロサイト合成ライブラリーＮＧＳ分析の結果を提供する図（それぞれ出現順に、配列番号７５、７５〜７８、７６〜７７、７９〜８３、６５、７８、８４、８０、８５、７０、８６、８２、８１、７９、８７、６５、８５、８４、７０、８６、８８〜９０、８７、９１、８３、８８、６３、８９〜９０、９２〜９３、９１、９４〜９７、９３、９５、９８、９８、９７、６３、９２、９４、９９〜１０１、７５、７５〜７８、７６〜７７、７９〜８３、６５、７８、８４、８０、８５、７０、８６、８２、８１、７９、８７、６５、８５、８４、７０、８６、８８〜９０、８７、９１、８３、８８、６３、８９〜９０、９２〜９３、９１、９４〜９７、９３、９５、９８、９８、９７、６３、９２、９４、９９〜１０２、９９、１０３、１０３〜１０４、９６、１０５〜１０６、１０１、１００、１０２、１０７、１０４〜１０５、１０８〜１１３、１０６、６０、６６、１１４〜１１７、１０９、１１３、７２、１０８、１１０、６７、１１８〜１１９、１１６、１２０、１２０、１０７、１１２、１２１〜１２３、６６、１２４〜１２５、１１５、１１８、１２６、１２１、１２７〜１２８、６０、１２９、１１９、１３０〜１３２、７２、１３３、１２３、１２５、６９、１３４〜１３９、６２、１２４、６７、１１１、１１４、１２６、１４０〜１４１、１２２、１４２、１２８〜１２９、１４３、１３８、１４４、１３４、６２、１３６、１４５、１４１、１４６〜１５３、１２７、１５４、６９、１４４、１５５、７１、１５６、１３３、１３２、１３７、１４７、１５７〜１５８、１３５、１５９、１４０、１１７、１６０、１３９、１６１〜１６２、１３０、１６３、１４３、１６４、１５２、１５１、１６５〜１６７、１５５、１６８、７１、１６９、および１４６）。
【図３６】ＧＦＡＰ合成ライブラリーＮＧＳ分析を提供する図。
【図３７Ａ】合成ライブラリースクリーニングの上位３８個のバリアントを提供する図。図３７Ａは、９量体ペプチド配列の系統発生分析を示し、ペプチドバリアントの配列も示す（それぞれ出現順に、配列番号６７、５９、６４、６１、７７、８４、９６、６０、８０、８２、６６、６２、８３、８５、１０６、１３１、９４、９０、７６、６８〜６９、７９、７５、８１、８８、１３９、７８、１５５、１０２、６３、１４０、８７、７０、１０５、１２０、８９、６５、および１０９）。強調されている配列は、個々の形質導入アッセイのために選択されたペプチドを表す。
【図３７Ｂ】合成ライブラリースクリーニングの上位３８個のバリアントを提供する図。図３７Ｂは、各ペプチドのニューロン向性およびアストロサイト向性のグラフ表現を示し、両軸は、シナプシンスクリーニングおよびＧＦＡＰスクリーニングにおける逆順位を示す図。
【図３８】ＰＨＰ．ＮおよびＰＨＰ．Ｂと比較した上位コンセンサス配列を提供する図（それぞれ出現順に、配列番号１６８および７１）。
【図３９】ギブソンアセンブリライブラリクローニング手順のダイヤグラムである図。
【図４０】ＴＲＩＭ／ＮＮＫペプチド出現の例を提供する図（それぞれ出現順に、配列番号１７０〜１７１）。
【図４１】４２００万個の細菌形質転換体、８１００万個の配列リード、および１２００万個の配列バリアントを有するＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを使用した研究のペプチド多様性統計を提供する図（それぞれ出現順に、配列番号１７２〜１７３、４８〜４９、および１７４〜１７５）。
【図４２】ローリングサークル増幅によるクローニングフリーＤＮＡ増幅の代表的なダイヤグラムを提供する図。
【図４３】プロテロメラーゼ単量体プロセシングのダイヤグラムを提供する図（それぞれ出現順に、配列番号１７６〜１７８）。
【図４４】従来法とクローニングフリー法とを比較するダイヤグラムを提供する図。
【図４５Ａ】脳組織、脊髄組織、肝臓組織、および心臓組織におけるＳｙｎ駆動性（図４５Ａ）およびＧＦＡＰ駆動性（図４５Ｂ）の３３３個のバリアントの完全な順位付けを提供する図。カプシドバリアントは、それらの平均脳ＲＮＡ富化スコア（ＮＮＫコドンおよびＮＮＭコドンの平均）で順位付けられている。内部対照カプシドＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅＢ、およびＡＡＶ９の順位が示されている（図４５Ａおよび図４５Ｂ）。Ｓｙｎ駆動結果およびＧＦＡＰ駆動結果を組み合わせた比較が提供されている（図４５Ｃ）。６匹のうち２匹のマウスは、非常に異なる順位付けプロファイルを示し、外れ値とみなされたため、４匹の動物のみがＧＦＡＰ駆動性ライブラリーを表していた。
【図４５Ｂ】脳組織、脊髄組織、肝臓組織、および心臓組織におけるＳｙｎ駆動性（図４５Ａ）およびＧＦＡＰ駆動性（図４５Ｂ）の３３３個のバリアントの完全な順位付けを提供する図。カプシドバリアントは、それらの平均脳ＲＮＡ富化スコア（ＮＮＫコドンおよびＮＮＭコドンの平均）で順位付けられている。内部対照カプシドＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅＢ、およびＡＡＶ９の順位が示されている（図４５Ａおよび図４５Ｂ）。Ｓｙｎ駆動結果およびＧＦＡＰ駆動結果を組み合わせた比較が提供されている（図４５Ｃ）。６匹のうち２匹のマウスは、非常に異なる順位付けプロファイルを示し、外れ値とみなされたため、４匹の動物のみがＧＦＡＰ駆動性ライブラリーを表していた。
【図４５Ｃ】脳組織、脊髄組織、肝臓組織、および心臓組織におけるＳｙｎ駆動性（図４５Ａ）およびＧＦＡＰ駆動性（図４５Ｂ）の３３３個のバリアントの完全な順位付けを提供する図。カプシドバリアントは、それらの平均脳ＲＮＡ富化スコア（ＮＮＫコドンおよびＮＮＭコドンの平均）で順位付けられている。内部対照カプシドＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅＢ、およびＡＡＶ９の順位が示されている（図４５Ａおよび図４５Ｂ）。Ｓｙｎ駆動結果およびＧＦＡＰ駆動結果を組み合わせた比較が提供されている（図４５Ｃ）。６匹のうち２匹のマウスは、非常に異なる順位付けプロファイルを示し、外れ値とみなされたため、４匹の動物のみがＧＦＡＰ駆動性ライブラリーを表していた。
【図４６Ａ】ニューロンおよびアストロサイト合成ライブラリーＮＧＳ分析の結果の比較を提供する図。図４６Ａは、ＳＹＮプロモーターまたはＧＦＡＰプロモーターを使用したカプシドの順位付けを示す図。
【図４６Ｂ】ニューロンおよびアストロサイト合成ライブラリーＮＧＳ分析の結果の比較を提供する図。図４６Ｂは、Ｓｙｎ駆動性ライブラリー対ＧＦＡＰ駆動性ライブラリーの相関性を示す散布図を示す図。
【図４７】複数の種（例えば、げっ歯動物）で研究し、続いて次世代シーケンシング（ＮＧＳ）した一実施形態を例示する図。
【図４８Ａ】３３３個のカプシドバリアントの複数の系統／種を比較した結果を提供する図。図４８Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＢＡＬＢ／Ｃマウス、およびラットにおける、脳ＲＮＡ富化スコアによる３３３個のカプシドの順位付けを示す。カプシドは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＳｙｎ駆動性脳富化スコアに従って順位付けされている。
【図４８Ｂ】３３３個のカプシドバリアントの複数の系統／種を比較した結果を提供する図。図４８Ｂは、Ｓｙｎ駆動性プールおよびＧＦＡＰ駆動性プールに由来するＣ５７ＢＬ／６富化スコアとＢＡＬＢ／Ｃ富化スコアとの相関性を示す散布図を示す。
【図４８Ｃ】３３３個のカプシドバリアントの複数の系統／種を比較した結果を提供する図。図４８Ｃは、Ｃ５７ＢＬ／６系統およびＢＡＬＢ／Ｃ系統において、ＡＡＶ９（Ｓｙｎ駆動性またはＧＦＡＰ駆動性のいずれか）よりも＞１０倍高い脳富化スコアを有するカプシドの交差およびコンセンサス配列を示すベン図を示す。ラットでは、ＡＡＶ９に対して＞１０倍の富化スコアを示したカプシドはなかった。
【図４９Ａ】図４９Ａに示されている１０個のカプシドバリアント（それぞれ出現順に、配列番号１７９〜１８８）の形質導入（ＲＮＡ）および生体内分布（ＤＮＡ）分析を提供する図。個々のカプシドを使用して自己相補的ＣＢＡ−ＥＧＦＰゲノムをパッケージングし（図４９Ｂ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。
【図４９Ｂ】図４９Ａに示されている１０個のカプシドバリアント（それぞれ出現順に、配列番号１７９〜１８８）の形質導入（ＲＮＡ）および生体内分布（ＤＮＡ）分析を提供する図。個々のカプシドを使用して自己相補的ＣＢＡ−ＥＧＦＰゲノムをパッケージングし（図４９Ｂ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。
【図４９Ｃ】図４９Ａに示されている１０個のカプシドバリアント（それぞれ出現順に、配列番号１７９〜１８８）の形質導入（ＲＮＡ）および生体内分布（ＤＮＡ）分析を提供する図。個々のカプシドを使用して自己相補的ＣＢＡ−ＥＧＦＰゲノムをパッケージングし（図４９Ｂ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。図４９Ｃは、脳試料および脊髄試料におけるＲＮＡ発現を示す。
【図４９Ｄ】図４９Ａに示されている１０個のカプシドバリアント（それぞれ出現順に、配列番号１７９〜１８８）の形質導入（ＲＮＡ）および生体内分布（ＤＮＡ）分析を提供する図。個々のカプシドを使用して自己相補的ＣＢＡ−ＥＧＦＰゲノムをパッケージングし（図４９Ｂ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。図４９Ｄは、脳試料および脊髄試料におけるＤＮＡ分布を示す。
【図５０Ａ】脳、脊髄、および肝臓における個々のカプシドの試験ならびにそれらのｍＲＮＡ発現の結果を提供する図。ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現の結果は、脳（図５０Ａ）、脊髄（図５０Ｂ）、および肝臓（図５０Ｃ）について示されている。
【図５０Ｂ】脳、脊髄、および肝臓における個々のカプシドの試験ならびにそれらのｍＲＮＡ発現の結果を提供する図。ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現の結果は、脳（図５０Ａ）、脊髄（図５０Ｂ）、および肝臓（図５０Ｃ）について示されている。
【図５０Ｃ】脳、脊髄、および肝臓における個々のカプシドの試験ならびにそれらのｍＲＮＡ発現の結果を提供する図。ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現の結果は、脳（図５０Ａ）、脊髄（図５０Ｂ）、および肝臓（図５０Ｃ）について示されている。
【図５１】ＧＦＡＰスクリーニングおよびＳＹＮスクリーニングの両方についてニューロンＮｅｕＮマーカー（図５１）を使用したＮＧＳスクリーニングの結果を提供する図。
【図５２】全脳における個々のカプシドの試験結果を提供する図。
【図５３】全脳における追加の個々のカプシドの試験結果を提供する図。
【図５４】小脳における個々のカプシドの試験結果を提供する図。
【図５５】皮質における個々のカプシドの試験結果を提供する図。
【図５６】海馬における個々のカプシドの試験結果を提供する図。
【図５７Ａ】ＥＧＦＰ  ＲＮＡ発現により分析されたマウス肝臓における１０個のカプシドバリアントの形質導入データ（図５７Ｂ）および全組織蛍光（図５７Ａ）を提供する図。
【図５７Ｂ】ＥＧＦＰ  ＲＮＡ発現により分析されたマウス肝臓における１０個のカプシドバリアントの形質導入データ（図５７Ｂ）および全組織蛍光（図５７Ａ）を提供する図。
【図５８Ａ】Ｃ５７ＢＬ／６マウスＢＭＶＥＣ（図５８Ａ）およびヒトＢＭＶＥＣ（図５８Ｂ）に対する３３３個のカプシドバリアントのＣＮＳ形質導入の有効性に関する比較研究の結果を提供する図。
【図５８Ｂ】Ｃ５７ＢＬ／６マウスＢＭＶＥＣ（図５８Ａ）およびヒトＢＭＶＥＣ（図５８Ｂ）に対する３３３個のカプシドバリアントのＣＮＳ形質導入の有効性に関する比較研究の結果を提供する図。
【図５９Ａ】ＮＧＳ分析および完全長カプシドバリアント回収のための外部バーコード付与のダイヤグラムを提供する図。一般的なバーコード対が示されている（図５９Ｃ）。完全なＩＴＲからＩＴＲまでの構築物が、ＣＡＰ配列の５’（図５９Ａ）およびＣＡＰ配列の３’（図５９Ｂ）のバーコード対と共に示されている。
【図５９Ｂ】ＮＧＳ分析および完全長カプシドバリアント回収のための外部バーコード付与のダイヤグラムを提供する図。一般的なバーコード対が示されている（図５９Ｃ）。完全なＩＴＲからＩＴＲまでの構築物が、ＣＡＰ配列の５’（図５９Ａ）およびＣＡＰ配列の３’（図５９Ｂ）のバーコード対と共に示されている。
【図５９Ｃ】ＮＧＳ分析および完全長カプシドバリアント回収のための外部バーコード付与のダイヤグラムを提供する図。一般的なバーコード対が示されている（図５９Ｃ）。完全なＩＴＲからＩＴＲまでの構築物が、ＣＡＰ配列の５’（図５９Ａ）およびＣＡＰ配列の３’（図５９Ｂ）のバーコード対と共に示されている。
【図６０Ａ】イントロンバーコードプラットフォームの幾つかの構成を用いたウイルス産生およびＲＮＡスプライシングの詳細な分析を提供する図。イントロンバーコード収量（図６０Ｂ）ならびにＡＡＶイントロンスプライシングおよびグロビンイントロンスプライシングの結果を示すゲルカラム（図６０Ｃ）と共に、一般的なＩＴＲからＩＴＲまでの構築物が図６０Ａに示されている（それぞれ出現順に、配列番号１８９〜１９３）。
【図６０Ｂ】イントロンバーコードプラットフォームの幾つかの構成を用いたウイルス産生およびＲＮＡスプライシングの詳細な分析を提供する図。イントロンバーコード収量（図６０Ｂ）ならびにＡＡＶイントロンスプライシングおよびグロビンイントロンスプライシングの結果を示すゲルカラム（図６０Ｃ）と共に、一般的なＩＴＲからＩＴＲまでの構築物が図６０Ａに示されている（それぞれ出現順に、配列番号１８９〜１９３）。
【図６０Ｃ】イントロンバーコードプラットフォームの幾つかの構成を用いたウイルス産生およびＲＮＡスプライシングの詳細な分析を提供する図。イントロンバーコード収量（図６０Ｂ）ならびにＡＡＶイントロンスプライシングおよびグロビンイントロンスプライシングの結果を示すゲルカラム（図６０Ｃ）と共に、一般的なＩＴＲからＩＴＲまでの構築物が図６０Ａに示されている（それぞれ出現順に、配列番号１８９〜１９３）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、下記の添付の記載に示されている。本開示の実施または試験には、本明細書に記載のものと同様のまたは等価な任意の材料および方法を使用することができるが、ここでは好ましい材料および方法が記載される。本開示の他の特徴、目的、および利点は、本記載から明白になるであろう。本記載では、状況が別様であることを明確に指示しない限り、単数形は複数形も含む。別様の定義がない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、本記載が優先するものとする。
【００２１】
本開示によると、標的組織（例えば、ＣＮＳ）に対する向性が増強されたＡＡＶ粒子、ならびにそれらを標的指向化するための、調製するための、製剤化するための、および使用するための関連プロセスが提供される。標的指向性ペプチドおよび標的指向性ペプチドをコードする核酸配列が提供される。こうした標的指向性ペプチドをＡＡＶカプシドタンパク質配列へと挿入して、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、特定の細胞タイプ、組織、臓器、または生物への向性を変更することができる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ粒子」または「ＡＡＶベクター」は、カプシドタンパク質およびウイルスゲノムを含み、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのペイロード領域および少なくとも１つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶ粒子ならびに／またはその成分であるカプシドおよびウイルスゲノムは、特定の細胞タイプ、組織、臓器、または生物への向性を変更するように遺伝子操作されていてもよい。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ウイルスゲノム」または「ベクターゲノム」は、ＡＡＶ粒子に被包された核酸配列を指す。ウイルスゲノムは、ペイロードをコードする少なくとも１つのペイロード領域および少なくとも１つのＩＴＲを有する核酸配列を含む。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ペイロード領域」は、本開示の１つまたは複数の「ペイロード」をコードする任意の核酸分子である。非限定的な例として、ペイロード領域は、ＲＮＡｉ剤またはポリペプチドを含むペイロードをコードする核酸配列であってもよい。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「標的指向性ペプチド」は、３〜２０アミノ酸長のペプチドを指す。こうした標的指向性ペプチドを、親アミノ酸配列に挿入または付着させて、親タンパク質の特質（例えば、向性）を変更することができる。非限定的な例として、標的指向性ペプチドをＡＡＶカプシド配列へと挿入して、所望の細胞タイプ、組織、臓器、または生物に対する標的指向性を増強することができる。
【００２６】
本開示のＡＡＶ粒子およびペイロードを、１つまたは複数の標的細胞、組織、臓器、または生物に送達することができる。好ましい実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、標的細胞タイプ、組織、または臓器に対する向性の増強を実証する。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、中枢神経系または末梢神経系（それぞれＣＮＳおよびＰＮＳ）の細胞および組織に対する向性の増強を示すことができる。本開示のＡＡＶ粒子は、それに加えてまたはその代わりに、望ましくない標的細胞タイプ、組織、または臓器に対する向性の減少を示すことができる。
【００２７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一本鎖ＤＮＡゲノムにより特徴付けられる、パルボウイルス科の小型非エンベロープ二十面体カプシドウイルスである。パルボウイルス科ウイルスは、２つの亜科：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科および無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科で構成される。パルボウイルス科は、これらに限定されないが、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジ種を含む脊椎動物宿主において複製可能なＡＡＶを含むディペンドウイルス属を含む。
【００２８】
パルボウイルスおよびパルボウイルス科の他のメンバーは、ケネス  Ｉ．ベルン（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ），「パルボウイルス科：ウイルスおよびそれらの複製（Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」，ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ（３ｄ  Ｅｄ．１９９６）の第６９章に概説されている。この文献の内容は全体が参照により援用される。
【００２９】
ＡＡＶは、それらの構造が比較的単純であり、宿主ゲノムへと組み込まれずにおよび複製されることなく広範囲の細胞（静止細胞および分裂細胞を含む）に感染する能力があり、ならびにそれらの免疫原性プロファイルが比較的良性であるため、生物学的ツールとして有用であることが証明されている。ウイルスのゲノムは、所望のペイロードが負荷されているか、または特定の組織を標的とし、所望のペイロードを発現もしくは送達するように遺伝子操作されている機能的組換えウイルスまたはウイルス粒子をアセンブリするための最低限の成分を含有するように操作することができる。
【００３０】
野生型ＡＡＶウイルスゲノムは、およそ５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長の線形一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子である。逆位末端反復配列（ＩＴＲ）は、従来、５’末端および３’末端の両方にてウイルスゲノムをキャッピングし、ウイルスゲノムの複製起点を提供する。理論により束縛されることは望まないが、ＡＡＶウイルスゲノムは、典型的には、２つのＩＴＲ配列を含む。こうしたＩＴＲは、エネルギー的に安定した二本鎖領域を形成するｓｓＤＮＡの５’末端および３’末端にある自己相補性領域（野生型では１４５ｎｔ）により規定される特徴的なＴ形ヘアピン構造を有する。二本鎖ヘアピン構造は、これに限定されないが、宿主ウイルス複製細胞の内因性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして機能することによりＤＮＡ複製の起点として作用することを含む、複数の機能を含む。
【００３１】
野生型ＡＡＶウイルスゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム：１つは４つの非構造Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ遺伝子によりコードされるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）であり、１つは３つのカプシドすなわち構造タンパク質（カプシド遺伝子すなわちＣａｐ遺伝子によりコードされるＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）のヌクレオチド配列をさらに含む。Ｒｅｐタンパク質は、複製およびパッケージングに重要であり、カプシドタンパク質はアセンブリされて、ＡＡＶのタンパク質外殻、すなわちＡＡＶカプシドを作出する。選択的スプライシングならびに選択的開始コドンおよびプロモーターは、単一のオープンリーディングフレームから４つの異なるＲｅｐタンパク質の生成、および単一のオープンリーディングフレームから３つのカプシドタンパク質の生成をもたらす。ＡＡＶ血清型によって異なるが、非限定的な例として、ＡＡＶ９／ｈｕ．１４（米国特許第７，９０６，１１１号明細書の配列番号１２３。この文献の内容は、全体が参照により本明細書に援用される）の場合、ＶＰ１は、アミノ酸１〜７３６を指し、ＶＰ２は、アミノ酸１３８〜７３６を指し、ＶＰ３は、アミノ酸２０３〜７３６を指す。言い換えれば、ＶＰ１は完全長カプシド配列であり、ＶＰ２およびＶＰ３は、全体のより短い成分である。その結果、ＶＰ３領域における配列の変化は、ＶＰ１およびＶＰ２でも変化しているが、親配列と比較した場合の差異パーセントは、３つの中で最も短い配列であるためＶＰ３で最も大きくなる。ここではアミノ酸配列に関して記載されているが、こうしたタンパク質をコードする核酸配列も同様に記載することができる。３つのカプシドタンパク質が一緒にアセンブリして、ＡＡＶカプシドタンパク質が作出される。理論により束縛されることは望まないが、ＡＡＶカプシドタンパク質は、典型的には、１：１：１０のモル比のＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３を含む。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ血清型」は、主としてＡＡＶカプシドにより規定される。一部の場合では、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２／９）によっても特異的に記載される。
【００３２】
本開示のＡＡＶベクターは、組換え的に産生してもよく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親または参照配列に基づいてもよい。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、本明細書に記載されている核酸などの異種分子を輸送するか、形質導入するか、または別様に担体として作用する任意の分子または部分である。
【００３３】
本開示は、一本鎖ＡＡＶウイルスゲノム（例えば、ｓｓＡＡＶ）に加えて、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ウイルスゲノムも提供する。ｓｃＡＡＶベクターゲノムは、一緒にアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成するＤＮＡ鎖を含有する。ｓｃＡＡＶは、第二鎖合成をスキップすることにより、形質導入細胞での迅速な発現を可能にする。
【００３４】
一実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子はｓｃＡＡＶである。
一実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子はｓｓＡＡＶである。
ＡＡＶ粒子を産生および／または修飾するための方法は、シュードタイプＡＡＶベクターなど、当技術分野において開示されている（国際公開第２０００２８００４号パンフレット；国際公開第２００１２３００１号パンフレット；国際公開第２００４１１２７２７号パンフレット；国際公開第２００５００５６１０号パンフレット、および国際公開第２００５０７２３６４号パンフレット。これらの文献の各々の内容は全体が参照により本明細書に援用される）。
【００３５】
一実施形態では、標的指向性ペプチドが挿入されたカプシドおよびウイルスゲノムを含む本開示のＡＡＶ粒子は、ヒトＣＮＳの細胞タイプまたは組織に対する向性の増強を示すことができる。
【００３６】
ＡＡＶカプシド
本開示のＡＡＶ粒子は、任意の天然または組換えＡＡＶ血清型を含んでいてもよく、またはそれに由来してもよい。ＡＡＶ血清型は、これらに限定されないが、パッケージング、向性、形質導入、および免疫原性プロファイルなどの特質が異なる場合がある。理論により束縛されることは望まないが、ＡＡＶカプシドタンパク質は、特定の組織に対するＡＡＶ粒子向性を駆動させるものであるとみなされることが多い。
【００３７】
一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、同じ親血清型に由来するカプシドタンパク質およびＩＴＲ配列を有していてもよい（例えば、ＡＡＶ２カプシドおよびＡＡＶ２  ＩＴＲ）。別の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、シュードタイプＡＡＶ粒子であってもよく、その場合、カプシドタンパク質およびＩＴＲ配列は、異なる親血清型に由来する（例えば、ＡＡＶ９カプシドおよびＡＡＶ２  ＩＴＲ；ＡＡＶ２／９）。
【００３８】
本開示のＡＡＶ粒子は、標的指向性ペプチドが親配列へと挿入されているＡＡＶカプシドタンパク質を含んでいてもよい。親カプシドまたは血清型は、任意の天然または組換えＡＡＶ血清型を含むか、またはそれに由来してもよい。本明細書で使用される場合、「親」配列は、標的指向性配列が挿入される（つまり、核酸配列へのヌクレオチド挿入またはアミノ酸配列へのアミノ酸配列挿入）ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列である。
【００３９】
好ましい実施形態では、親ＡＡＶカプシドヌクレオチド配列は、配列番号１に示されている通りである。
別の実施形態では、親ＡＡＶカプシドヌクレオチド配列は、配列番号１のＫ４４９Ｒバリアントであり、このバリアントでは、アミノ酸配列（ヌクレオチド１３４５〜１３４７）の４４９位にリジン（例えば、ＡＡＡまたはＡＡＧ）をコードするコドンが、アルギニン（ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ）をコードするものと交換されている。Ｋ４４９Ｒバリアントは、野生型ＡＡＶ９と同じ機能を有する。
【００４０】
一実施形態では、親ＡＡＶカプシドアミノ酸配列は、配列番号２に示されている通りである。
別の実施形態では、親ＡＡＶカプシドアミノ酸配列は、配列番号３に示されている通りである。
【００４１】
一実施形態では、親ＡＡＶカプシド配列は、表１に示されているもののいずれかである。
【００４２】
【表１】
2021534809.tif 000003
【００４３】
表１に列挙されている特許、出願、および／または刊行物の各々は、参照により全体が本明細書に援用される。
親ＡＡＶ血清型および関連カプシド配列は、当技術分野で公知のもののいずれであってもよい。そのようなＡＡＶ血清型の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：ＡＡＶ９、ＡＡＶ９  Ｋ４４９Ｒ（またはＫ４４９Ｒ  ＡＡＶ９）、ＡＡＶ１、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶ５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ（ＰＨＰ．Ｂ）、ＡＡＶＰＨＰ．Ａ（ＰＨＰ．Ａ）、ＡＡＶＧ２Ｂ−２６、ＡＡＶＧ２Ｂ−１３、ＡＡＶＴＨ１．１−３２、ＡＡＶＴＨ１．１−３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２（ＰＨＰ．Ｂ２）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３（ＰＨＰ．Ｂ３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３（Ｇ２Ａ３）、ＡＡＶＧ２Ｂ４（Ｇ２Ｂ４）、ＡＡＶＧ２Ｂ５（Ｇ２Ｂ５）、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３−３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４−４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２−１ｂ、ＡＡＶ４２−２、ＡＡＶ４２−３ａ、ＡＡＶ４２−３ｂ、ＡＡＶ４２−４、ＡＡＶ４２−５ａ、ＡＡＶ４２−５ｂ、ＡＡＶ４２−６ｂ、ＡＡＶ４２−８、ＡＡＶ４２−１０、ＡＡＶ４２−１１、ＡＡＶ４２−１２、ＡＡＶ４２−１３、ＡＡＶ４２−１５、ＡＡＶ４２−ａａ、ＡＡＶ４３−１、ＡＡＶ４３−１２、ＡＡＶ４３−２０、ＡＡＶ４３−２１、ＡＡＶ４３−２３、ＡＡＶ４３−２５、ＡＡＶ４３−５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１−７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１−８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２−１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２−３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２−４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２−５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３−９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３−１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４−９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４−１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５−３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５−２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．��、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＨ−１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ−５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ−１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ−４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１−８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ  １９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ、ＡＡＶ−ＬＫ０１、ＡＡＶ−ＬＫ０２、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０４、ＡＡＶ−ＬＫ０５、ＡＡＶ−ＬＫ０６、ＡＡＶ−ＬＫ０７、ＡＡＶ−ＬＫ０８、ＡＡＶ−ＬＫ０９、ＡＡＶ−ＬＫ１０、ＡＡＶ−ＬＫ１１、ＡＡＶ−ＬＫ１２、ＡＡＶ−ＬＫ１３、ＡＡＶ−ＬＫ１４、ＡＡＶ−ＬＫ１５、ＡＡＶ−ＬＫ１６、ＡＡＶ−ＬＫ１７、ＡＡＶ−ＬＫ１８、ＡＡＶ−ＬＫ１９、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ−２−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１０１、ＡＡＶ−８ｈ、ＡＡＶ−８ｂ、ＡＡＶ−ｈ、ＡＡＶ−ｂ、ＡＡＶ  ＳＭ  １０−２、ＡＡＶシャッフル（ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ）１００−１、ＡＡＶシャッフル１００−３、ＡＡＶシャッフル１００−７、ＡＡＶシャッフル１０−２、ＡＡＶシャッフル１０−６、ＡＡＶシャッフル１０−８、ＡＡＶシャッフル１００−２、ＡＡＶ  ＳＭ  １０−１、ＡＡＶ  ＳＭ  １０−８、ＡＡＶ  ＳＭ  １００−３、ＡＡＶ  ＳＭ  １００−１０、ＢＮＰ６１  ＡＡＶ、ＢＮＰ６２  ＡＡＶ、ＢＮＰ６３  ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｒｕｅ  ｔｙｐｅ  ＡＡＶ）（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ  ＡＡＶ１０、ジャパニーズＡＡＶ���０血清型（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ＡＡＶ  １０  ｓｅｒｏｔｙｐｅ）、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．１、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．１０、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．２、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．７、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．８、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｂ７．３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｂ７．４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ１、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ２、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−ｅ５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ６、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ７、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−２、ＡＡＶ  ＣＨｔ−３、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．１０、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．５、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．６、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．７、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ２、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ５、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ９、ＡＡＶ  ＣＫｄ−１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−１０、ＡＡＶ  ＣＫｄ−２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−７、ＡＡＶ  ＣＫｄ−８、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ５、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ７、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ８、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ５、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ９、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ１、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ２、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ３、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ４、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ５、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ６、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ７、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−１、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−１０、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１２、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１３、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−４、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−７、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−８、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−９、ＡＡＶ  ＣＬｖ−２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ６、ＡＡ
Ｖ  ＣＬｖ−Ｄ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｅ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ１１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ９、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ９、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１０、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１１、ＡＡＶ  ＣＳｐ−２、ＡＡＶ  ＣＳｐ−３、ＡＡＶ  ＣＳｐ−４、ＡＡＶ  ＣＳｐ−６、ＡＡＶ  ＣＳｐ−７、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．１０、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．２、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．４、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．５、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．６、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．７、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．８、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．９、ＡＡＶ  ＣＳｐ−９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ−３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、および／またはＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ならびにそれらのバリアント。
【００４４】
一部の実施形態では、血清型は、グリムら（Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２（１２）：５８８７−５９１１（２００８）、米国特許出願公開第２０１４０３５９７９９号明細書、および米国特許第７，５８８，７７２号。これらの文献の各々は、全体が参照により本明細書に援用される）に記載のような、ＡＡＶＤＪ８（またはＡＡＶ−ＤＪ８）などのＡＡＶＤＪまたはそのバリアントであってもよい。ＡＡＶＤＪ８のアミノ酸配列は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を除去するために、２つまたはそれよりも多くの突然変異を含んでいてもよい。非限定的な例として、ＡＡＶ−ＤＪ配列は、米国特許第７，５８８，７７２号明細書（この文献の内容は、全体が参照により本明細書に援用される）の配列番号１に記載の通りであり、ＡＡＶ−ＤＪ８配列は、２つの突然変異：（１）アミノ酸５８７のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変化しているＲ５８７Ｑ、および（２）アミノ酸５９０のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変化しているＲ５９０Ｔを含んでいてもよい。別の非限定的な例として、ＡＡＶ−ＤＪ８配列は、３つの突然変異：（１）アミノ酸４０６のリジン（Ｋ；Ｌｙｓ）がアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）に変化しているＫ４０６Ｒ、（２）アミノ酸５８７のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変化しているＲ５８７Ｑ、および（３）アミノ酸５９０のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変化しているＲ５９０Ｔを含んでいてもよい。
【００４５】
一実施形態では、親ＡＡＶカプシド配列は、ＡＡＶ９配列を含む。
一実施形態では、親ＡＡＶカプシド配列は、Ｋ４４９Ｒ  ＡＡＶ９配列を含む。
一実施形態では、親ＡＡＶカプシド配列は、ＡＡＶＤＪ配列を含む。
【００４６】
一実施形態では、親ＡＡＶカプシド配列は、ＡＡＶＤＪ８配列を含む。
一実施形態では、親ＡＡＶカプシド配列は、ＡＡＶｒｈ１０配列を含む。
一実施形態では、親ＡＡＶカプシド配列は、ＡＡＶ１配列を含む。
【００４７】
一実施形態では、親ＡＡＶカプシド配列は、ＡＡＶ５配列を含む。
理論により束縛されることは望まないが、親ＡＡＶカプシド配列は、ＶＰ１領域を含むことが理解される。一実施形態では、親ＡＡＶカプシド配列は、ＶＰ１、ＶＰ２、および／もしくはＶＰ３領域、またはそれらの任意の組合せを含む。親ＶＰ１配列は、親ＡＡＶカプシド配列と同義であるとみなすことができる。
【００４８】
本開示は、カプシド（Ｃａｐ）遺伝子によりコードされる構造カプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む）を参照する。こうしたカプシドタンパク質は、ＡＡＶなどのウイルスベクターの外側タンパク質構造外殻（つまり、カプシド）を形成する。Ｃａｐポリヌクレオチドから合成されるＶＰカプシドタンパク質は、一般に、ペプチド配列の最初のアミノ酸としてメチオニン（Ｍｅｔ１）を含み、これは、対応するＣａｐヌクレオチド配列の開始コドン（ＡＵＧまたはＡＴＧ）に関連付けられる。しかしながら、最初のメチオニン（Ｍｅｔ１）残基または一般に任意の最初のアミノ酸（ＡＡ１）は、ポリペプチド合成後または合成中に、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼなどのタンパク質プロセシング酵素により切断されるのが一般的である。この「Ｍｅｔ／ＡＡクリッピング」プロセスは、ポリペプチド配列の２番目のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、セリン、スレオニンなど）の対応するアセチル化と相関することが多い。Ｍｅｔクリッピングは、一般的に、ＶＰ１およびＶＰ３カプシドタンパク質で生じるが、ＶＰ２カプシドタンパク質でも生じる場合がある。
【００４９】
Ｍｅｔ／ＡＡクリッピングが不完全であると、ウイルスカプシドを構成する１つまたは複数（１、２、または３つ）のＶＰカプシドタンパク質の混合物が産生される場合があり、それらの一部は、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を含み（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）、それらの一部は、Ｍｅｔ／ＡＡクリッピングの結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠如している場合がある（Ｍｅｔ−／ＡＡ−）。カプシドタンパク質のＭｅｔ／ＡＡクリッピングに関するさらなる考察は、以下の文献を参照されたい：ジンら（Ｊｉｎ，ｅｔ  ａｌ．）アデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質の完全特徴付けのための直接液体クロマトグラフィー／質量分析（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｃａｐｓｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７  Ｏｃｔ．２８（５）：２５５−２６７；ホワンら（Ｈｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．）細胞内タンパク質のＮ末端のアセチル化は特異的分解シグナルを作出する（Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃｒｅａｔｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｌｓ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９．３２７（５９６８）：９７３−９７７。これらの文献の内容は各々、全体が参照により本明細書に援用される。
【００５０】
本開示によると、カプシドタンパク質への言及は、クリッピングされているか（Ｍｅｔ−／ＡＡ−）またはクリッピングされていないか（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）のいずれかに限定される訳ではなく、状況によって、独立したカプシドタンパク質、カプシドタンパク質の混合物で構成されるウイルスカプシド、および／または本開示のカプシドタンパク質をコードする、記述する、産生する、もしくはもたらすポリヌクレオチド配列（もしくはそれらの断片）を指すことができる。また、「カプシドタンパク質」または「カプシドポリペプチド」（ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ２など）への直接的な参照は、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を含むＶＰカプシドタンパク質（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）ならびにＭｅｔ／ＡＡクリッピングの結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠如する対応するＶＰカプシドタンパク質（Ｍｅｔ−／ＡＡ−）を含んでいてもよい。
【００５１】
さらに、本開示によると、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を含む１つまたは複数のカプシドタンパク質（Ｍｅｔ＋／ＡＡ＋）をそれぞれ含むかまたはコードする具体的な配列番号（タンパク質であるかまたは核酸であるかに関わらず）への言及は、配列を精査した際に、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠如するＶＰカプシドタンパク質を教示すると理解されるべきであり、最初に挙げられているアミノ酸（Ｍｅｔ１／ＡＡ１であるか否かに関わらず）を欠如するに過ぎない配列はいずれも直ちに明らかである。
【００５２】
非限定的な例として、７３６アミノ酸長であり、ＡＵＧ／ＡＴＧ開始コドンによりコードされる「Ｍｅｔ１」アミノ酸を含む（Ｍｅｔ＋）ＶＰ１ポリペプチド配列への言及は、７３５アミノ酸長であり、７３６個アミノ酸Ｍｅｔ＋配列の「Ｍｅｔ１」アミノ酸を含まない（Ｍｅｔ−）ＶＰ１ポリペプチド配列も教示すると理解することができる。第２の非限定的な例として、７３６アミノ酸長であり、任意のＮＮＮ開始コドンによりコードされる「ＡＡ１」アミノ酸を含む（ＡＡ＋）ＶＰ１ポリペプチド配列への言及は、７３５アミノ酸長であり、７３６個アミノ酸ＡＡ＋配列の「ＡＡ１」アミノ酸を含まない（ＡＡ−）ＶＰ１ポリペプチド配列も教示すると理解することができる。
【００５３】
ＶＰカプシドタンパク質から形成されるウイルスカプシドへの言及（具体的なＡＡＶカプシド血清型への言及など）には、Ｍｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を含むＶＰカプシドタンパク質（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）、Ｍｅｔ／ＡＡ１クリッピングの結果としてＭｅｔ１／ＡＡ１アミノ酸を欠如する対応するＶＰカプシドタンパク質（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）、およびそれらの組合せ（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋およびＭｅｔ−／ＡＡ１−）が組み込まれていてもよい。
【００５４】
非限定的な例として、ＡＡＶカプシド血清型は、ＶＰ１（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）、ＶＰ１（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）、またはＶＰ１（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）およびＶＰ１（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）の組合せを含んでいてもよい。また、ＡＡＶカプシド血清型は、ＶＰ３（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）、ＶＰ３（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）、またはＶＰ３（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１＋）およびＶＰ３（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）の組合せを含んでいてもよく、また、ＶＰ２（Ｍｅｔ＋／ＡＡ１）およびＶＰ２（Ｍｅｔ−／ＡＡ１−）の同様の任意選択の組合せを含んでいてもよい。
【００５５】
一実施形態では、親ＡＡＶカプシド配列は、下記に記載のもののいずれかと、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００５６】
一実施形態では、親ＡＡＶカプシド配列は、下記に記載のもののいずれかと、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされていてもよい。
【００５７】
一実施形態では、親配列は、ＡＡＶカプシド配列ではなく、代わりに、異なるベクター（例えば、レンチウイルス、プラスミドなど）である。別の実施形態では、親配列は、送達ビヒクル（例えば、ナノ粒子）であり、標的指向性ペプチドはそれに付着されている。
【００５８】
標的指向性ペプチド
本明細書には、標的組織（例えば、ＣＮＳまたはＰＮＳの細胞）の形質導入を増強または向上させるための標的指向性ペプチド、および１つまたは複数の標的指向性ペプチドインサートを有するカプシドタンパク質を含む関連ＡＡＶ粒子が開示されている。
【００５９】
一実施形態では、標的指向性ペプチドは、ＡＡＶ粒子をＣＮＳの細胞または組織へと向けることができる。ＣＮＳの細胞は、これらに限定されないがニューロン（例えば、興奮性、抑制性、運動性、感覚性、自律神経性、交感神経性、副交感神経性、プルキンエ、ベッツなど）、グリア細胞（例えば、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドログリア）、および／または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）などの脳の支持細胞であってもよい。ＣＮＳの組織は、これらに限定されないが、皮質（例えば、前頭、頭頂、後頭、側頭）、視床、視床下部、線条体、被殻、尾状核、海馬、嗅内皮質、大脳基底核、または深部小脳核であってもよい。
【００６０】
一実施形態では、標的指向性ペプチドは、ＡＡＶ粒子をＰＮＳの細胞または組織へと向けることができる。ＰＮＳの細胞または組織は、これに限定されないが、後根神経節（ＤＲＧ）であってもよい。
【００６１】
標的指向性ペプチドは、静脈内投与後にＡＡＶ粒子をＣＮＳ（例えば、皮質）へと向けることができる。
標的指向性ペプチドは、静脈内投与後にＡＡＶ粒子をＰＮＳ（例えば、ＤＲＧ）に向けることができる。
【００６２】
標的指向性ペプチドは、長さが様々であってもよい。一実施形態では、標的指向性ペプチドは、３〜２０アミノ酸長である。非限定的な例として、標的指向性ペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または３〜５、３〜８、３〜１０、３〜１２、３〜１５、３〜１８、３〜２０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、１０〜１２、１０〜１５、１０〜２０、１２〜２０、もしくは１５〜２０アミノ酸長であってもよい。
【００６３】
本開示の標的指向性ペプチドは、当技術分野で公知の任意の方法により識別および／または設計することができる。非限定的な例として、デバーマンら（Ｄｅｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３４（２）：２０４−２０９（２０１６））、チャンら（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０（８）：１１７２−１１７９）（２０１７））に、ならびに国際公開第２０１５０３８９５８号パンフレットおよび国際公開第２０１７１００６７１号パンフレットに記載のようなＣＲＥＡＴＥ系を、これに限定されないが非ヒト霊長類などの、マウスまたは他の研究動物のいずれかにおいて標的指向性ペプチドを識別するための手段として使用することができる。これらの文献の各々の内容は、全体が参照により本明細書に援用される。
【００６４】
標的指向性ペプチドおよび関連ＡＡＶ粒子は、標的指向性ペプチドバリアントを含むＡＡＶカプシドのライブラリーから識別することができる。一実施形態では、標的指向性ペプチドは、７個アミノ酸の配列（７量体）であってもよい。別の実施形態では、標的指向性ペプチドは、９個アミノ酸の配列（９量体）であってもよい。また、標的指向性ペプチドは、非限定的な例では、ランダムペプチド選択、部位飽和突然変異誘発、および／またはペプチドの特定領域（例えば、フランキング領域または中心コア）の最適化を含む、それらを作出または設計するための方法が異なっていてもよい。
【００６５】
一実施形態では、標的指向性ペプチドライブラリーは、ＰＣＲによりランダムに生成された７アミノ酸長（７量体）の標的指向性ペプチドを含む。
一実施形態では、標的指向性ペプチドライブラリーは、３つの突然変異アミノ酸を有する標的指向性ペプチドを含む。一実施形態では、こうした３つの突然変異アミノ酸は、連続アミノ酸である。別の実施形態では、こうした３つの突然変異アミノ酸は、不連続アミノ酸である。一実施形態では、親標的指向性ペプチドは７量体である。別の実施形態では、親ペプチドは９量体である。
【００６６】
一実施形態では、標的指向性ペプチドライブラリーは、７量体の標的指向性ペプチドを含み、標的指向性ペプチドおよび／またはフランキング配列のアミノ酸は、３つの連続アミノ酸の部位飽和突然変異誘発による進化を受けている。一実施形態では、部位飽和突然変異配列は、ＮＮＫ（Ｎ＝任意の塩基；Ｋ＝ＧまたはＴ）コドンを使用して生成される。
【００６７】
標的指向性ペプチドインサートを有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を生成し、レポーター（例えば、ＧＦＰ）をコードするウイルスゲノムをその中に被包させる。次いで、こうしたＡＡＶ粒子（またはＡＡＶカプシドライブラリー）を、尾静脈への静脈内送達によりトランスジェニックマウスに投与する。こうしたカプシドライブラリーをｃｒｅ発現マウスに投与すると、Ｃｒｅが発現されるため標的組織におけるレポーターペイロードの発現がもたらされる。
【００６８】
標的組織の形質導入が増強されたことを示す、標的指向性ペプチドおよび関連ＡＡＶ粒子の富化を識別するために、標的組織からＡＡＶ粒子および／またはウイルスゲノムを回収してもよい。これらに限定されないが、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ウイルスゲノム定量化、生化学的アッセイ、免疫組織化学、および／または標的組織試料の画像化など、当技術分野の標準的方法を使用して、富化を決定することができる。
【００６９】
標的組織は、対象の任意の細胞、組織、または臓器であってもよい。非限定的な例として、試料は、脳、脊髄、後根神経節および関連根、肝臓、心臓、腓腹筋、ヒラメ筋、膵臓、腎臓、脾臓、肺、副腎、胃、坐骨神経、伏在神経、甲状腺、目（視神経の有無にかかわらず）、下垂体、骨格筋（大腿直筋）、結腸、十二指腸、回腸、空腸、脚の皮膚、上頸神経節、膀胱、卵巣、子宮、前立腺、精巣、ならびに／または病変を有すると識別された任意の部位もしくは目的の部位から選択することができる。
【００７０】
標的指向性ペプチド配列
一実施形態では、標的指向性ペプチドは、表２に示されている通りの配列を含んでいてもよい。表２において、「＿１」は、ＡまたはＣが３番目の位置に存在するＮＮＭコドンを指し、「＿２」は、ＧまたはＴが３番目の位置に存在するＮＮＫコドンを指す。加えて、ＭｅｔまたはＴｒｐは、それぞれコドンＡＴＧおよびＴＧＧでしかコードすることができないため、ＮＮＭコドンは、アミノ酸のレパートリー全体を網羅することはできない。したがって、一部の「ＮＮＭ」配列は、Ｇで終わる一部のコドンも含有する。
【００７１】
【表２−１】
2021534809.tif 000004
【００７２】
【表２−２】
2021534809.tif 000005
【００７３】
【表２−３】
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【００７４】
【表２−４】
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【００７５】
【表２−５】
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【００７６】
【表２−６】
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【００７７】
【表２−７】
2021534809.tif 000010
【００７８】
一実施形態では、標的指向性ペプチド配列は、表２に示されている配列のいずれかと、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００７９】
一実施形態では、標的指向性ペプチドは、本明細書に開示されている標的指向性ペプチドのいずれかの４つまたはそれよりも多くの連続したアミノ酸を含んでいてもよい。一実施形態では、標的指向性ペプチドは、表２に示されている通りの配列のいずれかの４つの連続したアミノ酸を含んでいてもよい。一実施形態では、標的ペプチドは、表２に示されている通りの配列のいずれかの５つの連続したアミノ酸を含んでいてもよい。一実施形態では、標的指向性ペプチドは、表２に示されている通りの配列のいずれかの６つの連続したアミノ酸を含んでいてもよい。
【００８０】
一実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、標的指向性ペプチドインサートを有するＡＡＶカプシドを含み、標的指向性ペプチドは、表２のいずれかに示されている通りのアミノ酸配列を有する。
【００８１】
一実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、標的指向性ペプチドインサートを有するＡＡＶカプシドを含み、標的指向性ペプチドは、表２のいずれかに示されている通りの配列のいずれかの少なくとも４つの連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。
【００８２】
一実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、標的指向性ペプチドインサートを有するＡＡＶカプシドを含み、標的指向性ペプチドは、表２のいずれかに示されている通りの配列のいずれかを実質的に含むアミノ酸配列を有する。
【００８３】
一実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、標的指向性核酸インサートを有するＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含み、標的指向性核酸インサートは、表２として示されているもののいずれかを実質的に含むヌクレオチド配列を有する。
【００８４】
標的指向性核酸インサートを含む本開示のＡＡＶ粒子は、親カプシド配列と、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するポリヌクレオチド配列を有してもよい。
【００８５】
標的指向性ペプチドインサートを含む本開示のＡＡＶ粒子は、親カプシド配列と、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。
【００８６】
本明細書に参照および／または記載されているＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列のいずれにおいても、一文字記号は、以下の説明を有する：Ａはアデニン；Ｃはシトシン；Ｇはグアニン；Ｔはチミン；Ｕはウラシル；Ｗは、アデニンまたはチミンなどの弱塩基；Ｓは、シトシンおよびグアニンなどの強ヌクレオチド（ｓｔｒｏｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；Ｍは、アデニンおよびシトシンなどのアミノヌクレオチド；Ｋは、グアニンおよびチミンなどのケトヌクレオチド；Ｒは、プリンであるアデニンおよびグアニン；Ｙは、ピリミジンであるシトシンおよびチミン；Ｂは、Ａではない任意の塩基（例えば、シトシン、グアニン、およびチミン）；Ｄは、Ｃではない任意の塩基（例えば、アデニン、グアニン、およびチミン）；Ｈは、Ｇではない任意の塩基（例えば、アデニン、シトシン、およびチミン）；Ｖは、Ｔではない任意の塩基（例えば、アデニン、シトシン、およびグアニン）；Ｎは任意のヌクレオチド（ギャップでない）；ならびにＺはゼロである。
【００８７】
本明細書に参照および／または記載されているアミノ酸配列のいずれにおいても、一文字記号は、以下の説明を有する：Ｇ（Ｇｌｙ）はグリシン；Ａ（Ａｌａ）はアラニン；Ｌ（Ｌｅｕ）はロイシン；Ｍ（Ｍｅｔ）はメチオニン；Ｆ（Ｐｈｅ）はフェニルアラニン；Ｗ（Ｔｒｐ）はトリプトファン；Ｋ（Ｌｙｓ）はリジン；Ｑ（Ｇｌｎ）はグルタミン；Ｅ（Ｇｌｕ）はグルタミン酸；Ｓ（Ｓｅｒ）はセリン；Ｐ（Ｐｒｏ）はプロリン；Ｖ（Ｖａｌ）はバリン；Ｉ（Ｉｌｅ）はイソロイシン；Ｃ（Ｃｙｓ）はシステイン；Ｙ（Ｔｙｒ）はチロシン；Ｈ（Ｈｉｓ）はヒスチジン；Ｒ（Ａｒｇ）はアルギニン；Ｎ（Ａｓｎ）はアスパラギン；Ｄ（Ａｓｐ）はアスパラギン酸；Ｔ（Ｔｈｒ）はトレオニン；Ｂ（Ａｓｘ）はアスパラギン酸またはアスパラギン；Ｊ（Ｘｌｅ）はロイシンまたはイソロイシン；Ｏ（Ｐｙｌ）はピロリジン；Ｕ（Ｓｅｃ）はセレノシステイン；Ｘ（Ｘａａ）は任意のアミノ酸；およびＺ（Ｇｌｘ）はグルタミンまたはグルタミン酸である。
【００８８】
ＡＡＶ粒子における標的指向性ペプチドの使用
標的指向性ペプチドは、独立したペプチドであってもよく、または親配列へと挿入されているかもしくはコンジュゲートされていてもよい。一実施形態では、標的指向性ペプチドは、ＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質へと挿入されている。
【００８９】
１つまたは複数の標的指向性ペプチドを親ＡＡＶカプシド配列へと挿入して、本開示のＡＡＶ粒子を生成してもよい。
標的指向性ペプチドは、完全な機能性ＡＡＶ粒子をもたらす任意の位置において親ＡＡＶカプシド配列へと挿入されてもよい。標的指向性ペプチドは、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３に挿入してもよい。アミノ酸残基の付番は、ＡＡＶ血清型にわたって異なるため、標的指向性ペプチド挿入の正確なアミノ酸位置は重要ではない場合がある。本明細書で使用される場合、親ＡＡＶカプシド配列のアミノ酸位置は、ＡＡＶ９（配列番号２）を参照として使用して記載されている。
【００９０】
一実施形態では、標的指向性ペプチドは、ＡＡＶカプシド配列の超可変領域に挿入される。そのような超可変領域の非限定的な例としては、親ＡＡＶカプシドのループＩＶおよびループＶＩＩＩが挙げられる。理論により束縛されることは望まないが、こうした表面露出ループは構造化されておらず、保存が不良であるため、標的指向性ペプチドの挿入に理想的な領域である。
【００９１】
一実施形態では、標的指向性ペプチドは、ループＩＶに挿入される。別の実施形態では、標的指向性ペプチドを使用して、ループＩＶの部分またはすべてを置き換える。非限定的な例として、親ＡＡＶカプシド配列への標的指向性ペプチドの付加は、親ＡＡＶカプシドの少なくとも１つのアミノ酸の置換えまたは突然変異をもたらす場合がある。
【００９２】
一実施形態では、標的指向性ペプチドは、ループＶＩＩＩに挿入される。別の実施形態では、標的指向性ペプチドを使用して、ループＶＩＩＩの部分またはすべてを置き換える。非限定的な例として、親ＡＡＶカプシド配列への標的指向性ペプチドの付加は、親ＡＡＶカプシドの少なくとも１つのアミノ酸の置換えまたは突然変異をもたらす場合がある。
【００９３】
一実施形態では、１つよりも多くの標的指向性ペプチドが、親ＡＡＶカプシド配列へと挿入されている。非限定的な例として、標的指向性ペプチドは、同じ親ＡＡＶカプシド配列のループＩＶおよびループＶＩＩＩの両方に挿入されていてもよい。
【００９４】
標的指向性ペプチドは、これらに限定されないが、５８６〜５９２位、５８８〜５８９位、５８６〜５８９位、４５２〜４５８位、２６２〜２６９位、４６４〜４７３位、４９１〜４９５位、５４６〜５５７位、および／または６５９〜６６８位のアミノ酸間など、親ＡＡＶカプシド配列の任意のアミノ酸位置に挿入されていてもよい。
【００９５】
好ましい実施形態では、標的指向性ペプチドは、５８８位および５８９位（ループＶＩＩＩ）のアミノ酸間において親ＡＡＶカプシド配列へと挿入される。一実施形態では、親ＡＡＶカプシドはＡＡＶ９（配列番号２）である。第２の実施形態では、親ＡＡＶカプシドは、Ｋ４４９Ｒ  ＡＡＶ９（配列番号３）である。
【００９６】
本明細書に記載の標的指向性ペプチドは、標的指向性ペプチドインサートを欠如する親ＡＡＶ粒子と比較して、本開示のＡＡＶ粒子の標的組織への形質導入を増加させることができる。一実施形態では、標的指向性ペプチドは、標的組織へのＡＡＶ粒子の形質導入を、標的指向性ペプチドインサートを欠如する親ＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれよりも大きく増加させる。
【００９７】
一実施形態では、標的指向性ペプチドは、ＣＮＳの細胞または組織へのＡＡＶ粒子の形質導入を、標的指向性ペプチドインサートを欠如する親ＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれよりも大きく増加させる。
【００９８】
一実施形態では、標的指向性ペプチドは、ＰＮＳの細胞または組織へのＡＡＶ粒子の形質導入を、標的指向性ペプチドインサートを欠如する親ＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれよりも大きく増加させる。
【００９９】
一実施形態では、標的指向性ペプチドは、ＤＲＧの細胞または組織へのＡＡＶ粒子の形質導入を、標的指向性ペプチドインサートを欠如する親ＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれよりも大きく増加させる。
【０１００】
ＡＡＶ産生
本明細書で開示されているウイルス産生では、標的細胞と接触させてペイロードを送達するために使用することができるＡＡＶ粒子（標的組織に対する向性が増強、向上、および／または増加されている）を産生するためのプロセスおよび方法が記載される。
【０１０１】
本開示は、標的指向性ペプチドを含むＡＡＶ粒子を生成するための方法を提供する。一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ウイルス複製細胞におけるウイルスゲノム複製により調製される。当技術分野で公知の任意の方法を、ＡＡＶ粒子の調製に使用することができる。一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）で産生される。別の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）で産生される。
【０１０２】
ＡＡＶ粒子を製作するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、以下の文献に記載されている：米国特許第６２０４０５９号明細書、第５７５６２８３号明細書、第６２５８５９５号明細書、第６２６１５５１号明細書、第６２７０９９６号明細書、第６２８１０１０号明細書、第６３６５３９４号明細書、第６４７５７６９号明細書、第６４８２６３４号明細書、第６４８５９６６号明細書、第６９４３０１９号明細書、第６９５３６９０号明細書、第７０２２５１９号明細書、第７２３８５２６号明細書、第７２９１４９８、および第７４９１５０８号明細書、第５０６４７６４号明細書、第６１９４１９１号明細書、第６５６６１１８号明細書、第８１３７９４８；または国際公開第１９９６０３９５３０号パンフレット、国際公開第１９９８０１００８８号パンフレット、国際公開第１９９９０１４３５４号パンフレット、国際公開第１９９９０１５６８５号パンフレット、国際公開第１９９９０４７６９１号パンフレット、国際公開第２００００５５３４２号パンフレット、国際公開第２００００７５３５３号パンフレット、および国際公開第２００１０２３５９７号パンフレット；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，リチャード編（ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９５）；オライリーら（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；サムルスキら（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２−８（１９８９）；カジガヤら（Ｋａｊｉｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４６４６−５０（１９９１）；ラフィングら（Ｒｕｆｆｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２−３０（１９９２）；キムバウアーら（Ｋｉｍｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｖｉｒ．，２１９：３７−４４（１９９６）；チャオら（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．），Ｖｉｒ．２７２：３８２−９３（２０００）。これらの文献の各々の内容は、全体が参照により本明細書に援用される。一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、国際公開第２０１５１９１５０８号パンフレットに記載の方法を使用して製作される。この文献の内容は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０１０３】
療法応用
本開示は、ヒト対象を含む哺乳動物対象の疾患、障害、および／または状態を治療するための方法であって、本開示により規定される新規カプシド（「ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子」）を含む本明細書に記載のＡＡＶ粒子を対象に投与する工程、または本明細書に記載の医薬組成物を含む本記載の組成物のいずれかを対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【０１０４】
一実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、疾患の発症を防止するために予防的に対象に投与される。別の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、疾患またはその症状を治療する（その影響を軽減する）ために投与される。さらに別の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、疾患を治癒する（消失させる）ために投与される。別の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、疾患の進行を防止または遅延するために投与される。さらに別の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、疾患の有害効果を逆行させるために使用される。病状および／または進行は、当技術分野で公知の標準的な方法により決定またはモニターすることができる。
【０１０５】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、神経学的疾患および／または障害を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、タウオパシーを治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
【０１０６】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、アルツハイマー病を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、フリードライヒ運動失調症、またはフラタキシンタンパク質の喪失もしくは部分的喪失がその根幹にある任意の疾患を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
【０１０７】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、パーキンソン病を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、筋萎縮性側索硬化症を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
【０１０８】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、ハンチントン病を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、神経障害性疼痛を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
【０１０９】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、中枢神経系に関連付けられる疾患を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、末梢神経系に関連付けられる疾患を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
【０１１０】
一実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、本明細書に記載の疾患または症状の少なくとも１つを有する対象に投与される。
本明細書で使用される場合、中枢神経系または末梢神経系およびそれらの成分（例えば、ニューロン）に関連付けられる任意の疾患は、「神経学的疾患」とみなすことができる。
【０１１１】
以下のものを含む任意の神経疾患を、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子またはその医薬組成物で治療することができる：これらに限定されないが、透明中隔欠損、酸性リパーゼ病、酸性マルターゼ欠損症、後天性てんかん様失語症、急性散在性脳脊髄炎、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、アディー瞳孔、アディー症候群、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、失認症、アイカルディ症候群、アイカルディ−グティエール症候群障害、ＡＩＤＳ−神経学的合併症、アレキサンダー病、アルパーズ病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、無脳症、動脈瘤、アンジェルマン症候群、血管腫症、酸素欠乏症、抗リン脂質抗体症候群、失語症、失行症、クモ膜嚢胞、クモ膜炎、アーノルド−キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、運動失調症、毛細血管拡張性運動失調症、運動失調および小脳または脊髄小脳変性症、心房細動および脳卒中、注意欠陥多動性障害、自閉症スペクトラム障害、自律神経機能異常、背部痛、バース症候群、バッテン病、ベッカー型ミオトニア、ベーチェット病、ベル麻痺、良性特発性眼瞼痙攣、良性局所性筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進、ベルンハルト−ロート症候群、ビンスワンゲル病、眼瞼痙攣、ブロッホ−サルズバーガー症候群、腕神経叢分娩外傷、腕神経叢損傷、ブラッドベリー−エグルストン症候群、脳脊髄腫瘍、脳動脈瘤、脳損傷、ブラウン−セカール症候群、球麻痺、球脊髄性筋萎縮症、皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）、カナバン病、手根管症候群、灼熱痛、海綿腫、海綿状血管腫、海綿状奇形、頚髄中心症候群、脊髄中心症候群、中枢痛症候群、橋中心髄鞘崩壊症、頭部障害、セラミダーゼ欠損症、小脳変性症、小脳低形成、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、脳萎縮症、脳性脚気、脳海綿状奇形、脳性巨人症、脳低酸素症、脳性小児麻痺、脳−眼−顔−骨格症候群（ＣＯＦＳ）、シャルコー−マリー−ツース病、キアリ奇形、コレステロールエステル貯蔵病、舞踏病、有棘赤血球舞踏病（Ｃｈｏｒｅｏａｃａｎｔｈｏｃｙｔｏｓｉｓ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、慢性起立不耐症、慢性疼痛、コケーン症候群ＩＩ型、コフィン−ローリー症候群、コルポセファリー、昏睡、複合性局所疼痛症候群、同心円性硬化症（バロー病）、先天性両側顔面神経麻痺、先天性筋無力症、先天性ミオパシー、先天性血管海綿状奇形、大脳皮質基底核変性症、頭部動脈炎、頭蓋骨早期癒合症、クリー脳炎、クロイツフェルト−ヤコブ病、慢性進行性外眼筋麻痺、蓄積外傷性傷害、クッシング症候群、巨細胞性封入体症、サイトメガロウイルス感染症、眼震足震症候群（Ｄａｎｃｉｎｇ  Ｅｙｅｓ−Ｄａｎｃｉｎｇ  Ｆｅｅｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ダンディー−ウォーカー症候群、ドーソン疾患、ドモルシア症候群、ドゥジュリーヌ−クルンプケ麻痺、認知症、多発脳梗塞性認知症、意味的認知症、皮質下認知症、レビー小体型認知症、脱髄疾患、歯状小脳性運動失調症、歯状核赤核萎縮症、皮膚筋炎、発達性統合運動障害、デビック症候群、糖尿病性ニューロパシー、びまん性硬化症、遠位遺伝性運動ニューロパシー、ドラベ症候群、自律神経異常症、書字障害、難読症、嚥下困難、統合運動障害、ミオク���ーヌス性小脳性共同運動障害、進行性小脳性共同運動障害、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、脳炎、嗜眠性脳炎、脳ヘルニア、脳脊髄炎、脳症、脳症（家族性乳児型）、脳３叉神経領域血管腫、てんかん、てんかん性片麻痺、発作性運動失調症、エルブ麻痺、エルブ−デュシェンヌおよびデジェリーヌ−クルンプケ麻痺、本態性振戦、橋外髄鞘崩壊症（Ｅｘｔｒａｐｏｎｔｉｎｅ  Ｍｙｅｌｉｎｏｌｙｓｉｓ）、ファーバー病（Ｆａｂｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）ファブリ病、ファール症候群、気絶、家族性自律神経失調症、家族性血管腫、家族性特発性基底核石灰化症、家族性周期性四肢麻痺、家族性痙性麻痺、ファーバー病、熱性痙攣、線維筋性形成異常、フィッシャー症候群、筋緊張低下児症候群、下垂足、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（ＧＭ１、ＧＭ２）、ゲルストマン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、巨大軸索ニューロパシー、巨細胞性動脈炎、巨細胞性封入体病、グロボイド細胞性白質ジストロフィー、舌咽神経痛、糖原病、ギラン−バレー症候群、ハレルフォルデン−スパッツ病、頭部外傷、頭痛、持続性片頭痛、片側顔面痙攣、交代性片麻痺（Ｈｅｍｉｐｌｅｇｉａ  Ａｌｔｅｒａｎｓ）、遺伝性ニューロパシー、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性多発神経炎性失調症、帯状疱疹、耳性帯状疱疹、平山症候群、ホルムズ−アーディー症候群、全前脳症、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症、ヒューズ症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、水頭性無脳症、水頭症、正常圧水頭症、水脊髄症、コルチゾン過剰症、過眠症、筋緊張亢進、筋緊張低下、低酸素症、免疫媒介性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、乳児筋緊張低下、乳児神経軸索性ジストロフィー、乳児フィタン酸蓄積症、乳児レフサム病、点頭痙攣、炎症性ミオパシー、後頭孔脳脱出症、腸性脂肪異栄養症、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進、アイザクス症候群、ジュベール症候群、カーンズ−セイヤ症候群、ケネディー病、キンズボーン症候群、クライネ−レビン症候群、クリッペル−フェイル症候群、クリッペル−トレノーネイ症候群（ＫＴＳ）、クリューバー−ビューシー症候群、コルサコフ健忘症候群、クラッベ病、クーゲルバーグ−ヴェランダー病、クールー病、ランバート−イートン筋無力症候群、ランドウ−クレフナー症候群、外側大腿皮神経絞扼、外側髄症候群、学習障害、リー病、レノックス−ガストー症候群、レッシュ−ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レバイン−クリッチュリー症候群、レビー小体認知症、リヒトハイム病、脂質蓄積症、類脂質性タンパク症、脳回欠損、閉込め症候群、ルー−ゲーリッグ病、狼瘡−神経学的後遺症、ライム病−神経学的合併症、リソソーム蓄積障害、マシャド−ジョゼフ病、大脳症、巨脳症、メルカーソン−ローゼンタール症候群、脳膜炎、脳膜炎および脳炎、メンケス疾患、知覚異常性神経痛、異染性白質ジストロフィー、小頭症、偏頭痛、ミラーフィッシャー症候群、軽度脳卒中、ミトコンドリアミオパシー、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、メビウス症候群、単肢筋萎縮症、モーバン症候群、運動ニューロン疾患、モヤモヤ病、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、多発梗塞性認知症、���巣性運動ニューロパシー、多発性硬化症、多系統萎縮症、起立性低血圧症を伴う多系統萎縮症、筋ジストロフィー、先天性筋無力症、重症筋無力症、ミエリン破壊性びまん性硬化症（Ｍｙｅｌｉｎｏｃｌａｓｔｉｃ  Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、脊髄炎、乳児期ミオクロニー脳症、ミオクローヌス、ミオクローヌスてんかん、ミオパシー、先天性ミオパシー、甲状腺中毒性ミオパシー、ミオトニー、先天性ミオトニー、ナルコレプシー、ＮＡＲＰ（ニューロパシー、運動失調症、および網膜色素変性症）、神経有棘赤血球症、脳鉄蓄積を伴う神経変性、神経変性疾患、神経線維腫症、神経弛緩薬悪性症候群、ＡＩＤＳの神経学的合併症、ライム病の神経学的合併症、サイトメガロウイルス感染症の神経学的帰結、ポンペ病の神経学的所見、狼瘡の神経学的続発症、視神経脊髄炎、神経ミオトニー、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、神経障害性疼痛、遺伝性ニューロパシー、ニューロパシー、神経サルコイドーシス、神経梅毒、神経毒性、海綿状母斑、ニーマン−ピック病、オサリバン−マクラウド症候群、後頭神経痛、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、眼球クローヌスミオクローヌス、起立性低血圧症、濫用症候群、慢性疼痛、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、傍腫瘍性症候群、感覚異常、パーキンソン病、発作性舞踏病アテトーゼ、発作性偏頭痛、パリー−ロンベルグ、ペリツェウス−メルツバッハー病、ペナーショッカーＩＩ症候群、神経周囲嚢胞、腓骨筋萎縮症、周期性麻痺、末梢性ニューロパシー、脳室周囲白質軟化症、持続的植物状態、広汎性発達障害、フィタン酸蓄積症、ピック病、神経圧迫（Ｐｉｎｃｈｅｄ  Ｎｅｒｖｅ）、梨状筋症候群、下垂体部腫瘍、多発性筋炎、ポンペ病、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛、後感染性脳脊髄炎、体位性低血圧症、体位性起立性頻脈症候群、体位性起立性頻拍症候群、原発性歯状核萎縮症（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎｔａｔｕｍ  Ａｔｒｏｐｈｙ）、原発性側索硬化症、原発性進行性失語症、プリオン病、進行性球麻痺、進行性顔面片側萎縮症、進行性歩行運動失調症、進行性多巣性白質脳症、進行性筋萎縮症、進行性硬化性ポリオジストロフィー、進行性核上麻痺、顔貌失認、偽性球麻痺、偽Ｔｏｒｃｈ症候群（Ｐｓｅｕｄｏ−Ｔｏｒｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、偽トキソプラズマ症候群（Ｐｓｅｕｄｏｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、偽脳腫瘍、心因性運動、ラムゼイハント症候群Ｉ、ラムゼイハント症候群ＩＩ、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、レフサム病、乳児レフサム病、反復運動障害、運動反復運動過多損傷、下肢静止不能症候群、レトロウイルス関連脊髄症、レット症候群、ライエ症候群、リューマチ脳炎、ライリー−デイ症候群、仙骨神経根嚢胞、舞踏病、唾液腺疾患、サンドホフ病、シルダー病、脳裂症、ザイテルベルガー病、発作性障害、意味性認知症、中隔視神経形成異常症、乳児重症ミオクローヌスてんかん（ＳＭＥＩ）、揺さぶられっ子症候群、帯状ヘルペス、シャイ−ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、ソトス症候群、痙性、二分脊椎、脊髄梗塞、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症、脊髄小脳萎縮��、脊髄小脳変性症、散発性運動失調症、スティール−リチャードソン−オルスゼフスキー症候群、全身硬直症候群、線条体黒質変性症、脳卒中、スタージ−ウェーバー症候群、亜急性硬化性汎脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、短時間持続性片側神経痛様（ＳＵＮＣＴ、Ｓｈｏｒｔ−ｌａｓｔｉｎｇ，  Ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ，  Ｎｅｕｒａｌｇｉｆｏｒｍ）頭痛、嚥下障害、シデナム舞踏病、失神、梅毒性脊髄硬化症、脊髄水空洞症、脊髄空洞症、全身性エリテマトーデス、脊髄ろう、遅発性ジスキネジア、ターロブ嚢胞、テイ−サックス病、側頭動脈炎、脊髄係留症候群、トムセンミオトニー、胸郭出口症候群、甲状腺中毒性ミオパシー、有痛性チェック、トッド麻痺、トゥーレット症候群、一過性脳虚血発作、伝達性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺、トロイアー症候群、結節硬化症、血管勃起腫瘍（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｒｅｃｔｉｌｅ  Ｔｕｍｏｒ）、中枢および末梢神経系の血管炎症候群、ビタミンＢ１２欠乏症、フォン−エコーノモ病、フォンヒッペル−リンダウ疾患（ＶＨＬ）、フォンレックリングハウゼン病、ワレンベルグ症候群、ウェルトニッヒ−ホフマン病、ウェルニッケ−コルサコフ症候群、ウェスト症候群、むち打ち症、ウィップル病、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウォールマン病、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症。
【０１１２】
神経学的疾患の治療法
タンパク質ペイロードをコードするＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子
本開示では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を細胞へと導入するための方法であって、ベクターのいずれかを、標的ｍＲＮＡおよびタンパク質の産生の増加が生じるのに十分な量で前記細胞へと導入する工程を備える方法が提供される。一部の態様では、細胞は、これらに限定されないが、運動ニューロン、海馬ニューロン、嗅内ニューロン、視床ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、交感神経ニューロン、または副交感神経ニューロンなどのニューロン、ならびにアストロサイト、ミクログリア、および／またはオリゴデンドロサイトなどのグリア細胞であってもよい。
【０１１３】
本開示には、治療を必要とする対象の、標的タンパク質（例えば、ＡｐｏＥ、ＦＸＮ）の不十分な機能／存在に関連付けられる神経学的疾患を治療するための方法が開示されている。この方法は、任意選択で、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む治療有効量の組成物を対象に投与する工程を備える。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的遺伝子発現を増加させ、標的タンパク質産生を増加させ、したがって対象の神経学的疾患の１つまたは複数の症状を低減することができ、対象が療法的に治療される。
【０１１４】
一実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む組成物は、全身性投与により対象の中枢神経系へと投与される。一実施形態では、全身性投与は静脈内注射である。
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む組成物は、対象の中枢神経系へと投与される。他の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む組成物は、対象のＣＮＳ組織（例えば、対象の被殻、視床、または皮質）へと投与される。
【０１１５】
一実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む組成物は、実質内注射により対象の中枢神経系へと投与される。実質内注射の非限定的な例としては、被殻内、皮質内、視床内、線条体内、海馬内、または嗅内皮質内が挙げられる。
【０１１６】
一実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む組成物は、実質内注射および静脈内注射により対象の中枢神経系へと投与される。
一実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、これらに限定されないが、視床ニューロン、海馬ニューロン、嗅内ニューロン、皮質ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、交感神経ニューロン、もしくは副交感神経ニューロン；オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびミクログリアを含むグリア細胞；ならびに／またはＴ細胞などのニューロンを取り囲む他の細胞を含む、特定のタイプの標的とされている細胞へと送達することができる。
【０１１７】
一実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、被殻、視床、および／または皮質のニューロンへと送達することができる。
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、神経学的疾患の療法として使用することができる。
【０１１８】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、タウオパシーの療法として使用することができる。
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、アルツハイマー病の療法として使用することができる。
【０１１９】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、筋萎縮性側索硬化症の療法として使用することができる。
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、ハンチントン病の療法として使用することができる。
【０１２０】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、パーキンソン病の療法として使用することができる。
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、フリードライヒ運動失調症の療法として使用することができる。
【０１２１】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、慢性疼痛または神経障害性疼痛の療法として使用することができる。
一実施形態では、本明細書に記載のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子の対象への投与は、対象の標的タンパク質レベルを増加させることができる。標的タンパク質レベルは、これらに限定されないが、対象のＣＮＳ、ＣＮＳの領域、またはＣＮＳの特定の細胞など、対象において、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％、もしくは９５〜１００％増加させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質のタンパク質レベルを少なくとも５０％増加させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質のタンパク質レベルを少なくとも４０％増加させることができる。非限定的な例として、対象は、標的タンパク質の１０％増加を示すことができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質のタンパク質レベルを、基線からの倍増で増加させることができる。一実施形態では、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、５〜６倍のより高いレベルの標的タンパク質に結び付く。
【０１２２】
一実施形態では、本明細書に記載のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子の対象への投与は、対象における標的タンパク質の発現を増加させることができる。標的タンパク質の発現は、これらに限定されないが、対象のＣＮＳ、ＣＮＳの領域、またはＣＮＳの特定の細胞など、対象において、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％、もしくは９５〜１００％増加させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質の発現を少なくとも５０％増加させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質の発現を少なくとも４０％増加させることができる。
【０１２３】
一実施形態では、本明細書に記載のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子の対象への静脈内投与は、対象における標的タンパク質のＣＮＳ発現を増加させることができる。標的タンパク質の発現は、これらに限定されないが、対象のＣＮＳ、ＣＮＳの領域、またはＣＮＳの特定の細胞など、対象において、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％、もしくは９５〜１００％増加させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、ＣＮＳにおける標的タンパク質の発現を少なくとも５０％増加させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、ＣＮＳにおける標的タンパク質の発現を少なくとも４０％増加させることができる。
【０１２４】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を使用して、神経学的疾患を治療するためにアストロサイトにおける標的タンパク質発現を増加させることができる。アストロサイトにおける標的タンパク質は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％増加させることができる。
【０１２５】
一部の実施形態では、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、ミクログリアにおける標的タンパク質を増加させるために使用することができる。ミクログリアにおける標的タンパク質の増加は、独立して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％増加させることができる。
【０１２６】
一部の実施形態では、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、皮質ニューロンにおける標的タンパク質を増加させるために使用することができる。皮質ニューロンにおける標的タンパク質の増加は、独立して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％増加させることができる。
【０１２７】
一部の実施形態では、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、海馬ニューロンにおける標的タンパク質を増加させるために使用することができる。海馬ニューロンにおける標的タンパク質の増加は、独立して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％増加させることができる。
【０１２８】
一部の実施形態では、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、ＤＲＧおよび／または交感神経ニューロンにおける標的タンパク質を増加させるために使用することができる。ＤＲＧおよび／または交感神経ニューロンにおける標的タンパク質の増加は、独立して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％増加させることができる。
【０１２９】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を使用して、神経学的疾患を治療するために、感覚ニューロンにおける標的タンパク質を増加させることができる。感覚ニューロンにおける標的タンパク質は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％増加させることができる。
【０１３０】
一部の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質を増加させ、対象の神経学的疾患の症状を低減させるために使用することができる。標的タンパク質の増加および／または神経学的疾患の症状の低減は、独立して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％変更する（標的タンパク質の産生の場合は増加させる、神経学的疾患の症状の場合は低減させる）ことができる。
【０１３１】
一実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を使用して、これに限定されないが、全機能的能力（ＴＦＣ：ｔｏｔａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃａｐａｃｉｔｙ）尺度などの標準的な評価方式により測定される通りの機能的能力および日常生活活動の減退を低減させることができる。
【０１３２】
一実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、神経学的疾患の症状を測定するために使用される任意の判定における能力を向上させるために使用することができる。そのような判定としては、これらに限定されないが、ＡＤＡＳ−ｃｏｇ（アルツハイマー病判定尺度−認知）、ＭＭＳＥ（ミニメンタルステート検査）、ＧＤＳ（老年期うつ病尺度）、ＦＡＱ（機能活性質問票）、ＡＤＬ（日常生活活動）、ＧＰＣＯＧ（一般開業医認知判定）、Ｍｉｎｉ−Ｃｏｇ、ＡＭＴＳ（簡易メンタル検査スコア）、時計描画検査、６−ＣＩＴ（６項目認知障害検査）、ＴＹＭ（自己記入式認知機能検査（Ｔｅｓｔ  Ｙｏｕｒ  Ｍｅｍｏｒｙ））、ＭｏＣａ（モントリオール認知判定）、ＡＣＥ−Ｒ（アデンブルックズ認知判定）、ＭＩＳ（記憶障害スクリーニング）、ＢＡＤＬＳ（ブリストル日常生活活動尺度）、バーセル指数、機能的自立度評価法、手段的日常生活動作能力、ＩＱＣＯＤＥ（Ｉｎｆｏｒｍａｎｔ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ  ｏｎ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｄｅｃｌｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｌｄｅｒｌｙ、高齢者の認知機能低下に関する情報提供者質問票）、神経精神症状評価、コーエン−マンスフィールド激越症状評価（Ｔｈｅ  Ｃｏｈｅｎ−Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ  Ａｇｉｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）、ＢＥＨＡＶＥ−ＡＤ、ＥｕｒｏＱｏｌ、ショートフォーム−３６（Ｓｈｏｒｔ  Ｆｏｒｍ−３６）、および／またはＭＢＲ介護者緊張度指数（ＭＢＲ  Ｃａｒｅｇｉｖｅｒ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、またはシーハン  Ｂ（Ｓｈｅｅｈａｎ  Ｂ）（Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｄｉｓｏｒｄ．５（６）：３４９−３５８（２０１２））に記載のような他の検査のいずれかが挙げられる。この文献の内容は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０１３３】
一部の実施形態では、本組成物は、神経学的疾患を治療するための単独療法薬または併用療法薬として投与される。
標的タンパク質をコードするＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、１つまたは複数の他の療法剤と組み合わせて使用してもよい。「と組み合わせて」は、その作用剤が同じ時点で投与されなければならないこと、および／または一緒に送達されるように製剤化されていなければならないことを示唆するものではないが、そうした送達方法は本開示の範囲内にある。組成物は、１つまたは複数の他の所望の治療薬または医学的手順と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各作用剤は、その作用剤について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与されることになる。
【０１３４】
本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子と組み合わせて使用することができる療法剤は、酸化防止剤、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、カルシウム調節剤、抗グルタミン作動剤（ａｎｔｉｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ  ａｇｅｎｔ）、構造タンパク質阻害剤、筋肉機能に関与する化合物、および金属イオン調節に関与する化合物である小分子化合物であってもよい。非限定的な例として、併用療法は、運動ニューロン変性に対する神経保護効果が試験されている、小分子化合物、成長因子、およびホルモンなどの１つまたは複数の神経保護剤との組合せであってもよい。
【０１３５】
本明細書に記載のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子と組み合わせて使用することができる、神経学的疾患を治療するために試験された化合物としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：コリンエステラーゼ阻害剤（ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン）；メマンチンなどのＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト；抗精神病剤；抗うつ剤；抗痙攣剤（例えば、ミオクローヌスに対するバルプロ酸ナトリウムおよびレベチラセタム）；セクレターゼ阻害剤；アミロイド凝集阻害剤；銅または亜鉛モジュレーター；ＢＡＣＥ阻害剤；メチレンブルー、フェノチアジン、アントラキノン、ｎ−フェニルアミン、またはローダミンなどのタウ凝集の阻害剤；ＮＡＰ、タキソール、またはパクリタキセルなどの微小管安定化剤；ＧＳＫ３β（リチウム）またはＰＰ２Ａを標的とするものなどのキナーゼまたはホスファターゼ阻害剤；Ａβペプチドまたはタウホスホエピトープによる免疫；抗タウまたは抗アミロイド抗体；ドーパミン枯渇剤（例えば、舞踏病に対するテトラベナジン）、ベンゾジアゼピン（例えば、ミオクローヌス、舞踏病、ジストニア、こわばり、および／または痙縮に対するクロナゼパム）、ドーパミンのアミノ酸前駆体（例えば、こわばりに対するレボドーパ）、骨格筋弛緩剤（例えば、こわばりおよび／または痙縮に対するバクロフェン、チザニジン）；筋肉麻痺を引き起こす神経筋接合部でのアセチルコリン放出の阻害剤（例えば、歯ぎしりおよび／またはジストニアに対するボツリヌス毒素）；非典型神経遮断剤（例えば、精神病および／または被刺激性に対するオランザピンおよびクエチアピン、精神病、舞踏病、および／または被刺激性に対するリスペリドン、スルピリド、およびハロペリドール、治療抵抗性精神病に対するクロザピン、顕著な否定的症状を有する精神病に対するアリピプラゾール）；選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）（例えば、うつ、不安、妄想強迫行動、および／または被刺激性に対するシタロプラム、フルオキセチン、パロキセチン、セルトラリン、ミルタザピン、ベンラファキシン）；催眠剤（例えば、睡眠−覚醒サイクルの変更に対するキソピクロン（ｘｏｐｉｃｌｏｎｅ）および／またはゾルピデム）；抗痙攣剤（例えば、躁病または軽躁病に対するバルプロ酸ナトリウムおよびカルバマゼピン）；ならびに気分安定剤（例えば、躁病または軽躁病に対するリチウム）。
【０１３６】
神経学的疾患を治療するために、神経栄養因子を、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子との併用療法に使用することができる。一般に、神経栄養因子は、ニューロンの生存、成長、分化、増殖、および／もしくは成熟を促進するか、またはニューロンの活性増加を刺激する物質であると規定される。一部の実施形態では、本方法は、１つまたは複数の栄養因子を、治療を必要とする対象へと送達する工程をさらに備える。栄養因子としては、これらに限定されないが、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＴＮＦ、ＶＥＧＦ、コリベリン、キサリプロデン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、およびＡＤＮＦ、およびこれらのバリアントを挙げることができる。
【０１３７】
一態様では、本明細書に記載のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ（例えば、ビンセントら（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００４，６，７９−８５を参照；この文献の内容は全体が参照により本明細書に援用される）およびＡＡＶ−ＧＤＮＦ（例えば、ワンら（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２，２２，６９２０−６９２８を参照；この文献の内容は全体が参照により本明細書に援用される）などの、神経栄養因子を発現するＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子と共に共投与することができる。
【０１３８】
一実施形態では、対象へのＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子の投与は、対象における標的タンパク質の発現を増加させることになり、標的タンパク質の発現増加は、対象の神経学的疾患の影響および／または症状を低減することになる。
【０１３９】
非限定的な例として、標的タンパク質は、抗体またはその断片であってもよい。
ＲＮＡｉ剤または調節性ポリヌクレオチドを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子
本開示には、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含む本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を細胞へと導入するための方法であって、ベクターのいずれかを標的ｍＲＮＡの分解が生じるのに十分な量で前記細胞へと導入して、それにより細胞での標的特異的ＲＮＡｉを活性化する工程を備える方法が提供される。一部の態様では、細胞は、これらに限定されないが、運動ニューロン、海馬ニューロン、嗅内ニューロン、視床ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、交感神経ニューロン、または副交感神経ニューロンなどのニューロン、ならびにアストロサイト、ミクログリア、および／またはオリゴデンドロサイトなどのグリア細胞であってもよい。
【０１４０】
本開示には、治療を必要とする対象における標的タンパク質の機能障害に関連付けられる神経学的疾患を治療するための方法が開示されている。この方法は、任意選択で、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む治療有効量の組成物を対象へと投与する工程を備える。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子発現をサイレンシングし、標的タンパク質産生を阻害し、対象の神経学的疾患の１つまたは複数の症状を低減することができ、対象が療法的に治療される。
【０１４１】
一部の実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードするウイルスゲノムを含む本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む組成物は、静脈内投与後にＣＮＳ細胞および／またはＰＮＳ細胞の形質導入増強を可能にするＡＡＶカプシドを含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子をコードするウイルスゲノムを有する本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む組成物は、対象の中枢神経系へと投与される。他の実施形態では、本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む組成物は、対象の組織（例えば、対象の被殻、視床、または皮質）へと投与される。
【０１４３】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含む本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む組成物は、全身投与により対象の中枢神経系へと投与される。一実施形態では、全身性投与は、静脈内注射である。
【０１４４】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含む本開示のＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む組成物は、実質内注射により対象の中枢神経系へと投与される。実質内注射の非限定的な例としては、被殻内、皮質内、視床内、線条体内、海馬内、または嗅内皮質内が挙げられる。
【０１４５】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を含む組成物は、実質内注射および静脈内注射により対象の中枢神経系へと投与される。
【０１４６】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、これらに限定されないが、視床ニューロン、海馬ニューロン、嗅内ニューロン、皮質ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、交感神経ニューロン、もしくは副交感神経ニューロン；オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびミクログリアを含むグリア細胞；ならびに／またはＴ細胞などのニューロンを取り囲む他の細胞を含む、特定のタイプのまたは標的とされている細胞へと送達することができる。
【０１４７】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、被殻、視床、および／または皮質のニューロンへと送達することができる。
【０１４８】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、神経学的疾患の療法として使用することができる。
【０１４９】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、タウオパシーの療法として使用することができる。
【０１５０】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、アルツハイマー病の療法として使用することができる。
【０１５１】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、筋萎縮性側索硬化症の療法として使用することができる。
【０１５２】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、ハンチントン病の療法として使用することができる。
【０１５３】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、パーキンソン病の療法として使用することができる。
【０１５４】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、フリードライヒ運動失調症の療法として使用することができる。
【０１５５】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子の対象への投与は、対象における標的タンパク質レベルを低下させることができる。標的タンパク質レベルは、これらに限定されないが、対象のＣＮＳ、ＣＮＳの領域、またはＣＮＳの特定の細胞など、対象において、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％、もしくは９５〜１００％低下させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質のタンパク質レベルを少なくとも５０％低下させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質のタンパク質レベルを少なくとも４０％低下させることができる。
【０１５６】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子の対象への投与は、対象における標的タンパク質の発現を低下させることができる。標的タンパク質の発現は、これらに限定されないが、対象のＣＮＳ、ＣＮＳの領域、またはＣＮＳの特定の細胞など、対象において、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％、もしくは９５〜１００％低下させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質の発現を少なくとも５０％低下させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質の発現を少なくとも４０％低下させることができる。
【０１５７】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子の対象への投与は、対象のＣＮＳにおける標的タンパク質の発現を低下させることができる。標的タンパク質の発現は、これらに限定されないが、対象のＣＮＳ、ＣＮＳの領域、またはＣＮＳの特定の細胞など、対象において、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％、もしくは９５〜１００％低下させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質の発現を少なくとも５０％低下させることができる。非限定的な例として、ＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質の発現を少なくとも４０％低下させることができる。
【０１５８】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を使用して、神経学的疾患を治療するためにアストロサイトにおける標的タンパク質を抑制することができる。アストロサイトにおける標的タンパク質は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％抑制することができる。アストロサイトにおける標的タンパク質は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０���、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％低減することができる。
【０１５９】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、ミクログリアにおける標的タンパク質を抑制するために使用することができる。ミクログリアにおける標的タンパク質の抑制は、独立して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％抑制することができる。低減は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よ���も大幅であってもよく、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％であってもよい。
【０１６０】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、皮質ニューロンにおける標的タンパク質を抑制するために使用することができる。皮質ニューロンにおける標的タンパク質の抑制は、独立して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％抑制することができる。低減は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５���よりも大幅であってもよく、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％であってもよい。
【０１６１】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、海馬ニューロンにおける標的タンパク質を抑制するために使用することができる。海馬ニューロンにおける標的タンパク質の抑制は、独立して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％抑制することができる。低減は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５���よりも大幅であってもよく、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％であってもよい。
【０１６２】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、ＤＲＧおよび／または交感神経ニューロンにおける標的タンパク質を抑制するために使用することができる。ＤＧＲおよび／または交感神経ニューロンにおける標的タンパク質の抑制は、独立して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％抑制することができる。低減は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７���％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅であってもよく、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％であってもよい。
【０１６３】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を使用して、神経学的疾患を治療するために感覚ニューロンにおける標的タンパク質を抑制することができる。感覚ニューロンにおける標的タンパク質は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％抑制することができる。感覚ニューロンにおける標的タンパク質は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０���、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％抑制することができる。
【０１６４】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、標的タンパク質を抑制し、対象の神経学的疾患の症状を低減させるために使用することができる。標的タンパク質の抑制および／または神経学的疾患の症状の低減は、独立して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％よりも大幅に、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜３５％、５〜４０％、５〜４５％、５〜５０％、５〜５５％、５〜６０％、５〜６５％、５〜７０％、５〜７５％、５〜８０％、５〜８５％、５〜９０％、５〜９５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１０〜５０％、１０〜５５％、１０〜６０％、１０〜６５％、１０〜７０％、１０〜７５％、１０〜８０％、１０〜８５％、１０〜９０％、１０〜９５％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、１５〜５０％、１５〜５５％、１５〜６０％、１５〜６５％、１５〜７０％、１５〜７５％、１５〜８０％、１５〜８５％、１５〜９０％、１５〜９５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２０〜５０％、２０〜５５％、２０〜６０％、２０〜６５％、２０〜７０％、２０〜７５％、２０〜８０％、２０〜８５％、２０〜９０％、２０〜９５％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、２５〜５０％、２５〜５５％、２５〜６０％、２５〜６５％、２５〜７０％、２５〜７５％、２５〜８０％、２５〜８５％、２５〜９０％、２５〜９５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜５５％、３０〜６０％、３０〜６５％、３０〜７０％、３０〜７５％、３０〜８０％、３０〜８５％、３０〜９０％、３０〜９５％、３５〜４５％、３５〜５０％、３５〜５５％、３５〜６０％、３５〜６５％、３５〜７０％、３５〜７５％、３５〜８０％、３５〜８５％、３５〜９０％、３５〜９５％、４０〜５０％、４０〜５５％、４０〜６０％、４０〜６５％、４０〜７０％、４０〜７５％、４０〜８０％、４０〜８５％、４０〜９０％、４０〜９５％、４５〜５５％、４５〜６０％、４５〜６５％、４５〜７０％、４５〜７５％、４５〜８０％、４５〜８５％、４５〜９０％、４５〜９５％、５０〜６０％、５０〜６５％、５０〜７０％、５０〜７５％、５０〜８０％、５０〜８５％、５０〜９０％、５０〜９５％、５５〜６５％、５５〜７０％、５５〜７５％、５５〜８０％、５５〜８５％、５５〜９０％、５５〜９５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、８０〜９０％、８０〜９５％、または９０〜９５％低減または抑制することができる。
【０１６５】
一実施形態では、１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子を使用して、これに限定されないが、全機能的能力（ＴＦＣ）尺度などの標準的な評価方式により測定される通りの機能的能力および日常生活活動の減退を低減させることができる。
【０１６６】
一部の実施形態では、本組成物は、神経学的疾患を治療するための単独療法薬または併用療法薬として投与される。
１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、１つまたは複数の他の療法剤と組み合わせて使用することができる。「と組み合わせて」は、その作用剤が同じ時点で投与されなければならないこと、および／または一緒に送達されるように製剤化されていなければならないことを示唆するものではないが、そうした送達方法は本開示の範囲内にある。組成物は、１つまたは複数の他の所望の治療薬または医学的手順と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各作用剤は、その作用剤について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与されることになる。
【０１６７】
１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子と組み合わせて使用することができる療法剤は、酸化防止剤、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、カルシウム調節剤、抗グルタミン作動剤、構造タンパク質阻害剤、筋肉機能に関与する化合物、および金属イオン調節に関与する化合物である小分子化合物であってもよい。
【０１６８】
１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子と組み合わせて使用することができる、神経学的疾患を治療するために試験された化合物としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：コリンエステラーゼ阻害剤（ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン）；メマンチンなどのＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト；抗精神病剤；抗うつ剤；抗けいれん剤（例えば、ミオクローヌスに対するバルプロ酸ナトリウムおよびレベチラセタム）；セクレターゼ阻害剤；アミロイド凝集阻害剤；銅または亜鉛モジュレーター；ＢＡＣＥ阻害剤；メチレンブルー、フェノチアジン、アントラキノン、ｎ−フェニルアミン、またはローダミンなどのタウ凝集の阻害剤；ＮＡＰ、タキソール、またはパクリタキセルなどの微小管安定化剤；ＧＳＫ３β（リチウム）またはＰＰ２Ａを標的とするものなどのキナーゼまたはホスファターゼ阻害剤；Ａβペプチドまたはタウホスホエピトープによる免疫；抗タウまたは抗アミロイド抗体；ドーパミン枯渇剤（例えば、舞踏病に対するテトラベナジン）；ベンゾジアゼピン（例えば、ミオクローヌス、舞踏病、ジストニア、こわばり、および／または痙縮に対するクロナゼパム）；ドーパミンのアミノ酸前駆体（例えば、こわばりに対するレボドーパ）；骨格筋弛緩剤（例えば、こわばりおよび／または痙縮に対するバクロフェン、チザニジン）；筋肉麻痺を引き起こす神経筋接合部でのアセチルコリン放出の阻害剤（例えば、歯ぎしりおよび／またはジストニアに対するボツリヌス毒素）；非典型神経遮断剤（例えば、精神病および／または被刺激性に対するオランザピンおよびクエチアピン、精神病、舞踏病、および／または被刺激性に対するリスペリドン、スルピリド、およびハロペリドール、治療抵抗性精神病に対するクロザピン、顕著な否定的症状を有する精神病に対するアリピプラゾール）；選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）（例えば、うつ、不安、妄想強迫行動、および／または被刺激性に対するシタロプラム、フルオキセチン、パロキセチン、セルトラリン、ミルタザピン、ベンラファキシン）；催眠剤（例えば、睡眠−覚醒サイクルの変更に対するキソピクロンおよび／またはゾルピデム）；抗痙攣剤（例えば、躁病または軽躁病に対するバルプロ酸ナトリウムおよびカルバマゼピン）；ならびに気分安定剤（例えば、躁病または軽躁病に対するリチウム）。
【０１６９】
神経学的疾患を治療するための１つまたは複数のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を有するウイルスゲノムを含むＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子との併用療法には、神経栄養因子を使用することができる。一般に、神経栄養因子は、ニューロンの生存、成長、分化、増殖、および／もしくは成熟を促進するか、またはニューロンの活性増加を刺激する物質であると規定される。一部の実施形態では、本方法は、１つまたは複数の栄養因子を、治療を必要とする対象へと送達する工程をさらに備える。栄養因子としては、これらに限定されないが、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＴＮＦ、ＶＥＧＦ、コリベリン、キサリプロデン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、およびＡＤＮＦ、およびこれらのバリアントを挙げることができる。
【０１７０】
一態様では、目的の遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖の核酸配列をコードするＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ（例えば、ビンセントら（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００４，６，７９−８５を参照；この文献の内容は全体が参照により本明細書に援用される）およびＡＡＶ−ＧＤＮＦ（例えば、ワンら（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２，２２，６９２０−６９２８を参照；この文献の内容は全体が参照により本明細書に援用される）などの神経栄養因子を発現するＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子と共に共投与することができる。
【０１７１】
一実施形態では、対象へのＴＲＡＣＥＲ  ＡＡＶ粒子の投与は、対象における標的タンパク質の発現を低減することになり、標的タンパク質の発現低減は、対象の神経学的疾患の影響および／または症状を低減することになる。
【０１７２】
定義
アデノ随伴ウイルス：本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」という用語は、任意の粒子、配列、遺伝子、タンパク質、またはそれらに由来する成分を含むディペンドウイルス属のメンバーを指す。
【０１７３】
ＡＡＶ粒子：本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ粒子」は、カプシド、ならびに少なくとも１つのペイロード領域および少なくとも１つのＩＴＲを有するウイルスゲノムを含むウイルスである。本明細書で使用される場合、「本開示のＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つの標的指向性ペプチドインサートを有する親カプシド配列を含むＡＡＶ粒子である。本開示のＡＡＶ粒子は、組換え的に産生されてもよく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親または参照配列に基づいてもよい。ＡＡＶ粒子は、血清型の組合せを含む、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の任意の血清型に由来してもよく（つまり、「シュードタイプ」ＡＡＶ）、または種々のゲノムに由来してもよい（例えば、一本鎖のまたは自己相補的な）。加えて、ＡＡＶ粒子は、複製欠損であってもよく、および／または標的とされていてもよい。一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、所望の標的組織に対する向性を増強するためにカプシドへと挿入された標的指向性ペプチドを有してもよい。本開示のＡＡＶ粒子への言及は、明示的に表記されていない場合であっても、その医薬組成物も含むことが理解されるべきである。
【０１７４】
投与する：本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、医薬作用剤または組成物を対象に提供することを指す。
改善：本明細書で使用される場合、「改善」または「改善する」という用語は、状態または疾患の少なくとも１つの指標の重症度を軽減することを指す。例えば、神経変性障害の状況では、改善は、ニューロン喪失の低減を含む。
【０１７５】
動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」は、発生の任意の段階におけるヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」は、発生の任意の段階における非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯動物、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。一部の実施形態では、動物としては、これらに限定されないが、哺乳動物、トリ、爬虫類、両生類、魚、および線虫が挙げられる。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子改変動物、またはクローンである。
【０１７６】
アンチセンス鎖：本明細書で使用される場合、ｓｉＲＮＡ分子の「アンチセンス鎖」または「第一鎖」または「ガイド鎖」という用語は、サイレンシングの標的とされている遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０個のヌクレオチド、例えば、約１５〜３０、１６〜２５、１８〜２３、または１９〜２２個のヌクレオチドの区画と実質的に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖または第一鎖は、所望の標的ｍＲＮＡ配列と、標的特異的サイレンシングを指図するのに十分な程度に相補的である配列、例えば、ＲＮＡｉ機序またはプロセスによる所望の標的ｍＲＮＡの破壊の引き金を引くのに十分な相補性を有する。
【０１７７】
およそ：本明細書で使用される場合、目的の１つまたは複数の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、明記されている参照値と同様である値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別様の明記がない限りまたは状況から別様であることが明らかでない限り（そのような数が、考え得る値の１００％を超えることになる場合を除いて）、いずれかの方向において（それよりも大きなまたはそれよりも小さな）、明記されている参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれよりも低いパーセント内に入る値の範囲を指す。
【０１７８】
カプシド：本明細書で使用される場合、「カプシド」という用語は、ウイルス粒子のタンパク質外殻を指す。
相補的および実質的に相補的：本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、ポリヌクレオチドが互いに塩基対を形成する能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合により形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン−クリック様式で（例えば、Ａ対Ｔ、Ａ対Ｕ、Ｃ対Ｇ）、または二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式で塩基対を形成することができる。当業者であれば認識しているように、ＤＮＡではなくＲＮＡが使用される場合、チミンではなくウラシルが、アデニンに対して相補的であるとみなされる塩基である。しかしながら、本開示の状況でＵが明示されている場合、別様の明記がない限り、Ｔを置換する能力が示唆されている。完全な相補性または１００％相補性は、１つのポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド単位が、第２のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合を形成することができる状況を指す。完全ではない相補性は、２つの鎖のすべてではないものの一部のヌクレオチド単位が互いに水素結合を形成することができる状況を指す。例えば、２つの２０量体では、各鎖の２つの塩基対のみが互いに水素結合を形成することができる場合、このポリヌクレオチド鎖は１０％の相補性を呈する。同じ例において、各鎖の１８個の塩基対が互いに水素結合を形成することができる場合、このポリヌクレオチド鎖は９０％相補性を呈する。本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」という用語は、ｓｉＲＮＡが、所望の標的ｍＲＮＡに結合し、標的ｍＲＮＡのＲＮＡサイレンシングの引き金を引くのに十分な配列（例えば、アンチセンス鎖における）を有することを意味する。
【０１７９】
制御エレメント：本明細書で使用される場合、「制御エレメント」、「調節性制御エレメント」、または「調節配列」は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、およびエンハンサーなどを指す。これらは、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、および翻訳を提供する。こうした制御エレメントは、選択されたコード配列が適切な宿主細胞にて複製、転写、および／または翻訳されることが可能である限り、すべてが常に存在する必要がある訳ではない。
【０１８０】
送達：本明細書で使用される場合、「送達」は、ＡＡＶ粒子、化合物、物質、実体、部分、積荷、またはペイロードを送達する行為または様式を指す。
エレメント：本明細書で使用される場合、「エレメント」という用語は、実体の別個の部分を指す。一部の実施形態では、エレメントは、より長いポリヌクレオチド配列に組み込まれている、特定の目的を有するポリヌクレオチド配列であってもよい。
【０１８１】
被包する：本明細書で使用される場合、「被包する」という用語は、封入する、取り囲む、または包み込むことを意味する。一例として、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムを被包する。
【０１８２】
遺伝子操作された：本明細書で使用される場合、本開示の実施形態は、構造的であるかまたは化学的であるかに関わらず、出発点、野生型、または天然分子から変化した特徴または特性を有するように設計されている場合、「遺伝子操作」されている。
【０１８３】
有効量：本明細書で使用される場合、作用剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果を実現させるために十分な量であり、そのため「有効量」は、それが適用される状況に依存する。例えば、がんを治療する作用剤を投与する状況では、作用剤の有効量は、例えば、その作用剤を投与せずに得られる応答と比較して、本明細書に規定されている通りのがん治療を達成するのに十分な量である。
【０１８４】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象の１つまたは複数を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【０１８５】
特徴：本明細書で使用される場合、「特徴」は、特質、特性、または特有の要素を指す。
製剤：本明細書で使用される場合、「製剤」は、少なくとも１つのＡＡＶ粒子（有効成分）および賦形剤および／または不活性成分を含む。
【０１８６】
断片：「断片」は、本明細書で使用される場合、部分を指す。例えば、抗体断片は、ＣＤＲ、または重鎖可変領域、またはｓｃＦｖなどを含んでいてもよい。
機能的：本明細書で使用される場合、「機能的」な生物学的分子は、それが特徴付けられる特性および／または活性を呈する形態の生物学的分子である。
【０１８７】
遺伝子発現：「遺伝子発現」という用語は、核酸配列の転写が成功し、ほとんどの場合で翻訳を起こしてタンパク質またはペプチドが産生されるプロセスを指す。明瞭性のため、「遺伝子発現」の測定に言及がなされる場合、これは、測定が、核酸転写産物、例えばＲＮＡもしくはｍＲＮＡの測定であってもよく、またはアミノ酸翻訳産物、例えばポリペプチドもしくはペプチドの測定であってもよいことを意味するものと理解されるべきである。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、およびペプチドの量またはレベルを測定するための方法は、当技術分野で周知である。
【０１８８】
相同性：本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えばポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。一部の実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるかまたは類似している場合、互いに「相同性」であるとみなされる。「相同性」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列）間の比較を指す。本開示によると、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくともひと続きの少なくとも約２０個アミノ酸について、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％でさえある場合、相同性であるとみなされる。一部の実施形態では、相同性ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５つの一意的に指定されるひと続きのアミノ酸をコードする能力により特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、少なくとも４〜５つの一意的に指定されるひと続きのアミノ酸をコードする能力により決定される。本開示によると、２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも１つのひと続きの少なくとも約２０個アミノ酸について、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合、相同性であるとみなされる。
【０１８９】
同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えばポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。例えば、２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、最適な比較目的のために２つの配列をアラインすることにより実施することができる（例えば、最適なアラインメントのために、第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、比較の目的で非同一配列を無視してもよい）。ある特定の実施形態では、比較目的でアラインされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチドで占められている場合、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して成し遂げることができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，レスク，Ａ．Ｍ．編（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，スミス，Ｄ．Ｗ．編（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．  Ｗ．，ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，フォンハインジ，Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，グリフィン，Ａ．Ｍ．およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．編（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，１９９４；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，グリブスコフ，Ｍ．およびデベロー，Ｊ．編（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１に記載のものなどの方法を使用して決定することができる。これらの文献は、全体が参照により本明細書に援用される。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．マイヤーズ（Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ）およびＷ．ミラー（Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ）（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いて決定することができる。その代わりに、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いて決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に使用される方法としては、これらに限定されないが、カリージョ、Ｈおよびリプマン，Ｄ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．），ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されているものが挙げられる。この文献は、参照により本明細書に援用される。同一性を決定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコードされている。２つの配列間の相同性を決定するための代表的なコンピュータソフトウェアとしては、これらに限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（デベロー，Ｊ．ら（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（アルトシュル，Ｓ．Ｆ．ら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が挙げられる。
【０１９０】
遺伝子の発現を阻害する：本明細書で使用される場合、「遺伝子の発現を阻害する」という語句は、遺伝子の発現産物の量の低減を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよく、または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであってもよい。典型的には、ｍＲＮＡレベルの低減は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的な技法を使用して決定することができる。
【０１９１】
インサート：本明細書で使用される場合、「インサート」という用語は、標的指向性ペプチド配列を親ＡＡＶカプシド配列へと付加することを指すことができる。「挿入」は、親ＡＡＶカプシド配列の１つまたは複数のアミノ酸の置き換えをもたらしてもよい。その代わりに、挿入は、標的指向性ペプチド配列の追加を除いて、親ＡＡＶカプシド配列に対して変化をもたらさなくともよい。
【０１９２】
逆位末端反復配列：本明細書で使用される場合、「逆位末端反復配列」または「ＩＴＲ」という用語は、ポリヌクレオチド配列をウイルスカプシドへとパッケージングするためのシス調節性エレメントを指す。
【０１９３】
ライブラリー：本明細書で使用される場合、「ライブラリー」という用語は、線形ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、またはウイルスベクターの多様なコレクションを指す。例として、ライブラリーは、ＤＮＡライブラリーであってもよく、またはＡＡＶカプシドライブラリーであってもよい。
【０１９４】
神経学的疾患：本明細書で使用される場合、「神経学的疾患」は、中枢神経系または末梢神経系およびそれらの成分（例えば、ニューロン）に関連付けられる任意の疾患である。
【０１９５】
天然に存在する：本明細書で使用される場合、「天然に存在する」または「野生型」は、人工的な支援または人の手が関与せずに、自然界に存在することを意味する。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレーム中に終止コドンを含有しない配列を指す。
【０１９６】
親配列：本明細書で使用される場合、「親配列」は、バリアントが由来する核酸配列またはアミノ酸配列である。一実施形態では、親配列は、異種配列が挿入される配列である。言い換えると、親配列は、アクセプター配列またはレシピエント配列とみなすことができる。一実施形態では、親配列は、標的指向性配列が挿入されるＡＡＶカプシド配列である。
【０１９７】
粒子：本明細書で使用される場合、「粒子」は、少なくとも２つの成分：タンパク質カプシドおよびカプシド内に封入されているポリヌクレオチド配列で構成されるウイルスである。
【０１９８】
患者：本明細書で使用される場合、「患者」は、治療を求めるかもしくは必要とする可能性があるか、治療を必要とするか、治療を受けているか、治療を受けることになる対象、または熟練の専門家による特定の疾患もしくは状態のケアを受けている対象を指す。
【０１９９】
ペイロード領域：本明細書で使用される場合、「ペイロード領域」は、本開示の１つまたは複数の「ペイロード」をコードする任意の核酸配列（例えば、ウイルスゲノム内）である。非限定的な例として、ペイロード領域は、ペイロードをコードする、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノム内にある核酸配列であってもよく、ペイロードは、ＲＮＡｉ剤またはポリペプチドである。本開示のペイロードは、これらに限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ＲＮＡｉ剤などであってもよい。
【０２００】
ペプチド：本明細書で使用される場合、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。
【０２０１】
薬学的に許容される：「薬学的に許容される」という語句は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症がなく、合理的なリスク対効果比に見合う、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために使用される。
【０２０２】
防止する：本明細書で使用される場合、「防止する」または「防止」という用語は、感染症、疾患、障害、および／もしくは状態の発症を部分的にもしくは完全に遅延させること；特定の感染症、疾患、障害、および／もしくは状態の１つもしくは複数の症状、特徴、もしくは臨床所見の発症を部分的にもしくは完全に遅延させること；特定の感染症、疾患、障害、および／もしくは状態の１つもしくは複数の症状、特徴、もしくは所見の発症を部分的にもしくは完全に遅延させること；感染症、特定の疾患、障害、および／もしくは状態からの進行を部分的にもしくは完全に遅延させること；ならびに／または感染症、疾患、障害、および／もしくは状態に関連付けられる病理を発生させるリスクを減少させることを指す。
【０２０３】
予防的：本明細書で使用される場合、「予防的」は、疾患の広がりを防止するために使用される療法的なまたは一連の行為を指す。
予防：本明細書で使用される場合、「予防」は、健康を維持し、疾患の広がりを防止するためにとられる措置を指す。
【０２０４】
領域：本明細書で使用される場合、「領域」という用語は、帯域または一般の区域を指す。一部の実施形態では、タンパク質またはタンパク質モジュールに言及がなされる場合、領域は、タンパク質もしくはタンパク質モジュールに沿ったアミノ酸の線形配列を含んでいてもよく、または三次元区域、エピトープ、および／もしくはエピトープのクラスターを含んでいてもよい。一部の実施形態では、領域は、末端領域を含む。本明細書で使用される場合、「末端領域」という用語は、所与の作用剤の端部または末端に位置する領域を指す。タンパク質に言及がなされる場合、末端領域は、Ｎ末端および／またはＣ末端を含んでいてもよい。
【０２０５】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに言及がなされる場合、領域は、ポリヌクレオチドに沿った核酸の線形配列を含んでいてもよく、または三次元区域、二次構造、もしくは三次構造を含んでいてもよい。一部の実施形態では、領域は、末端領域を含む。本明細書で使用される場合、「末端領域」という用語は、所与の作用剤の端部または末端に位置する領域を指す。ポリヌクレオチドに言及がなされる場合、末端領域は、５’末端および／または３’末端を含んでいてもよい。
【０２０６】
ＲＮＡまたはＲＮＡ分子：本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語は、リボヌクレオチドのポリマーを指し、「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」または「デオキシリボ核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡおよびＲＮＡは、例えば、それぞれＤＮＡ複製およびＤＮＡの転写により天然に合成されてもよく、または化学的に合成してもよい。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖（つまり、それぞれｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）であってもよく、または多重鎖（例えば、二本鎖、つまりそれぞれｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）であってもよい。「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数のポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする一本鎖ＲＮＡを指す。
【０２０７】
ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ：本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または干渉または「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子により媒介される配列特異的調節機序を指す。ＲＮＡｉは、植物、動物、および真菌を含む多くのタイプの生物で観察されている。ＲＮＡｉは、外来性ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を除去するために、細胞において天然で生じる。天然ＲＮＡｉは、遊離ｄｓＲＮＡから切断された断片であって、分解機序を他の類似するＲＮＡ配列へと向ける断片を介して進行する。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）により制御され、触媒性ＲＩＳＣ成分アルゴノートと相互作用する短鎖／低分子ｄｓＲＮＡ分子により、細胞質において開始される。ｄｓＲＮＡ分子は、細胞へと外因的に導入することができる。外因性ｄｓＲＮＡは、リボヌクレアーゼタンパク質ダイサーを活性化させることによりＲＮＡｉを開始させ、ダイサーは、ｄｓＲＮＡに結合してそれを切断することにより、少数の非対合突出塩基を各末端に有する２１〜２５塩基対の二本鎖断片を産生する。こうした短鎖二本鎖断片は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。
【０２０８】
ＲＮＡｉ剤：本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ剤」という用語は、標的遺伝子および／またはそのタンパク質産物の発現の阻害、干渉、または「サイレンシング」を誘導することができるＲＮＡ分子またはその誘導体を指す。ＲＮＡｉ剤は、発現をノックアウトすることができるか（事実上消失させることができるかまたは消失させることができる）、または発現をノックダウンすることができる（軽減することができるかまたは減少させることができる）。ＲＮＡｉ剤は、これらに限定されないが、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、またはｓｎｏＲＮＡであってもよい。
【０２０９】
試料：本明細書で使用される場合、「試料」または「生物学的試料」という用語は、その組織、細胞、または成分部分（例えば、これらに限定されないが、血液、血清、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜内臍帯血、尿、膣液、および精液を含む体液）のサブセットを指す。試料は、これらに限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外側区画、呼吸器、腸管、および尿生殖器、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、臓器を含む、生物全体、またはその組織、細胞、もしくは成分部分のサブセットから調製されるホモジネート、溶解物、または抽出物、あるいはその画分または部分をさらに含んでいてもよい。さらに、試料は、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含有してもよい栄養ブロスまたはゲルなどの培地を指す。
【０２１０】
自己相補的ウイルス粒子：本明細書で使用される場合、「自己相補的ウイルス粒子」は、少なくとも２つの成分：タンパク質カプシドおよびカプシド内に封入された自己相補的ウイルスゲノムで構成される粒子である。
【０２１１】
センス鎖：本明細書で使用される場合、ｓｉＲＮＡ分子の「センス鎖」または「第二鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、アンチセンス鎖または第一鎖と相補的な鎖を指す。ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ二重鎖」は、サイレンシングの標的とされている遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０個ヌクレオチドの区画に対して十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖、および他方のｓｉＲＮＡ鎖と二重鎖を形成するのに十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖を含む。
【０２１２】
類似性：本明細書で使用される場合、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えばポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いに対する類似性パーセントの計算は、類似性パーセントの計算が、当技術分野で理解されているような保存的置換を考慮することを除いて、同一性パーセントの計算と同じ様式で実施することができる。
【０２１３】
短鎖干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ：本明細書で使用されるとき、「短鎖干渉ＲＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、または「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡｉを指図または媒介することが可能な約５〜６０個のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）を含むＲＮＡ分子（またはＲＮＡアナログ）を指す。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５〜３０個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、約１６〜２５個のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）、約１８〜２３個のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）、約１９〜２２個のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）（例えば、１９、２０、２１、または２２個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ）、約１９〜２５個のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）、および約１９〜２４個のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）を含む。「短鎖」ｓｉＲＮＡという用語は、５〜２３個のヌクレオチド、好ましくは２１個のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）、例えば、１９、２０、２１、または２２個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。「長鎖」ｓｉＲＮＡという用語は、２４〜６０個のヌクレオチド、好ましくは約２４〜２５個のヌクレオチド、例えば、２３、２４、２５、または２６個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。短鎖ｓｉＲＮＡは、一部の例では、１９個未満のヌクレオチド、例えば、１６、１７、もしくは１８個のヌクレオチドを含んでいてもよく、またはわずか５個のヌクレオチドを含んでもよい。ただし、こうしたより短鎖のｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を保持するものとする。同様に、長鎖ｓｉＲＮＡは、一部の例では、２６個よりも多くのヌクレオチド、例えば、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、またはさらには６０個のヌクレオチドを含んでもよい。ただしこうしたより長鎖のｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉまたは翻訳抑制を媒介する能力を保持し、短鎖ｓｉＲＮＡへのさらなるプロセシング、例えば酵素的プロセシングがないものとする。ｓｉＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓ−ｓｉＲＮＡ）であってもよく、またはハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二重鎖と呼ばれる二重鎖構造を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓ−ｓｉＲＮＡ）であってもよい。
【０２１４】
対象：本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」という用語は、例えば、実験的、診断的、予防的、および／または療法的な目的で、本開示による組成物を投与することができる任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトなどの哺乳動物）および／または植物が挙げられる。
【０２１５】
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特質または特性の全部のまたはほぼ全部の程度または度合いを呈する定性的状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的現象は、皆無ではないとして、完全に完了することはほとんど無く、および／または完了するまで進行することはほとんど無く、または絶対的な結果を達成もしくは回避することはほとんど無いことを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的および化学的現象には完了性の潜在的な欠如が本来的に存在することを含意するために使用される。
【０２１６】
標的指向性ペプチド：本明細書で使用される場合、「標的指向性ペプチド」は、３〜２０アミノ酸長のペプチドを指す。こうした標的指向性ペプチドを、親アミノ酸配列へと挿入してまたは付着させて、親タンパク質の特質（例えば、向性）を変更することができる。非限定的な例として、標的指向性ペプチドをＡＡＶカプシド配列へと挿入して、所望の細胞タイプ、組織、臓器、または生物に対する標的指向性を増強することができる。標的指向性ペプチドは、同様に親ポリヌクレオチド配列へと挿入することができる標的指向性ポリヌクレオチドによりコードされることが理解されるべきである。したがって、「標的指向性配列」は、適切な親配列（それぞれ、アミノ酸またはポリヌクレオチド）へと挿入するためのペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を指す。
【０２１７】
標的細胞：本明細書で使用される場合、「標的細胞」または「標的組織」は、任意の１つまたは複数の目的の細胞を指す。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、または生物の組織もしくは臓器に見出すことができる。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であってもよい。
【０２１８】
療法剤：「療法剤」という用語は、対象に投与すると、療法的、診断的、および／または予防的効果を示し、ならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を誘発する任意の作用剤を指す。
【０２１９】
治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、送達しようとする作用剤（例えば、核酸、薬物、療法剤、診断剤、予防剤など）の量であって、感染症、疾患、障害、および／または状態に罹患しているかまたは感受性である対象に投与すると、感染症、疾患、障害、および／または状態を治療し、それらの症状を向上させ、それらを診断し、それらを防止し、および／またはそれらの発症を遅延させるのに十分な量を意味する。一部の実施形態では、治療有効量は、単一用量で提供される。
【０２２０】
治療有効転帰：本明細書で使用される場合、「治療有効転帰」という用語は、感染症、疾患、障害、および／または状態に罹患しているかまたは感受性である対象において、感染症、疾患、障害、および／または状態を治療し、それらの症状を向上させ、それらを診断し、それらを防止し、および／またはそれらの発症を遅延させるのに十分な転帰を意味する。
【０２２１】
治療する：本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状または特徴の部分的なまたは完全な緩和、改善、向上、縮減、それらの発症の遅延、それらの進行の阻害、それらの重症度の低減、および／または発生率の低減を指す。例えば、がんを「治療する」ことは、腫瘍の生存、成長、および／または広がりを阻害することを指すことができる。治療は、疾患、障害、および／もしくは状態に関連付けられる病理の発生リスクを減少させる目的で、疾患、障害、および／もしくは状態の兆候を呈していない対象に、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の初期兆候のみを呈する対象に投与することができる。
【０２２２】
ベクター：本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、異種分子を輸送するか、形質導入するか、または別様に担体として作用する任意の分子または部分を指す。一部の実施形態では、ベクターはプラスミドであってもよい。一部の実施形態では、ベクターはウイルスであってもよい。ＡＡＶ粒子は、ベクターの例である。本開示のベクターは、組換え的に産生されてもよく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親もしくは参照配列に基づいていてもよく、および／またはそれらを含んでいてもよい。異種分子は、ポリヌクレオチドであってもよく、および／またはポリペプチドであってもよい。
【０２２３】
ウイルスゲノム：本明細書で使用される場合、「ウイルスゲノム」または「ベクターゲノム」という用語は、ＡＡＶ粒子に被包された核酸配列を指す。ウイルスゲノムは、ペイロードをコードする少なくとも１つのペイロード領域および少なくとも１つのＩＴＲを有する核酸配列を含む。
【０２２４】
均等物および範囲
当業者であれば、本明細書に記載の本開示による具体的な実施形態には多くの均等物があることを認識することになるか、または日常的に過ぎない実験作業を用いて確かめることができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることは意図されておらず、むしろ添付の特許請求の範囲に示されている通りである。
【０２２５】
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、矛盾することが示されていない限り、または状況から別様であることが明らかでない限り、１つまたは１つよりも多くを意味することができる。ある群の１つまたは複数のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、矛盾することが示されていない限り、または状況から別様であることが明らかでない限り、その群メンバーの１つ、１つよりも多く、またはすべてが、所与の産物またはプロセスに存在するか、それらに使用されているか、または別様に関連する場合に満たされるとみなされる。本開示は、その群の正確に１つのメンバーが、所与の産物またはプロセスに存在するか、それらに使用されているか、または別様に関連する実施形態を含む。本開示は、１つよりも多くのまたは全部の群メンバーが、所与の産物またはプロセスに存在するか、それらに使用されているか、または別様に関連する実施形態を含む。
【０２２６】
また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることが意図されており、追加の要素または工程の包含を許容するが必要ではないことに留意されたい。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語も包含および開示される。
【０２２７】
範囲が示されている場合、端点は含まれる。さらに、別様であることが示されていない限り、または状況および当業者の理解から別様であることが明らかでない限り、範囲として表されている値は、状況が別様であることを明確に指示しない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１に至るまでの、本開示の様々な実施形態において明記されている範囲内にある任意の具体的な値または部分的範囲を想定することができることが理解されるべきである。
【０２２８】
加えて、先行技術内に入る本開示の任意の特定の実施形態は、請求項の任意の１つまたは複数から明示的に除外することができることが理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者にとって公知であるとみなされるため、除外が本明細書に明示的に示されないとしても、それらを除外することができる。本開示の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、療法薬、または活性成分；任意の産生方法；任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関するか否かに関わらず、何らかの理由で任意の１つまたは複数の請求項から除外される場合がある。
【０２２９】
使用されている文言は、限定でなくむしろ説明の文言であること、およびそのより広義の態様における本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更をなし得ることが理解されるべきである。
【０２３０】
本開示をある程度詳しく、幾つかの記載されている実施形態に関してある程度の具体性をもって説明したが、本開示は、任意のそのような具体例もしくは実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきであることを意図するものではなく、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の最も広義の考え得る解釈を提供するように、したがって本開示の意図されている範囲を有効に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
【０２３１】
本開示は、以下の非限定的な例によりさらに例示される。
【実施例】
【０２３２】
実施例１．ＴＲＡＣＥＲの概念実証：プロモーター選択
ＡＡＶ９ペプチドディスプレイカプシドライブラリーをコードする遺伝子を、ニューロン特異的シナプシンプロモーター（ＳＹＮ）またはアストロサイト特異的ＧＦＡＰプロモーターのいずれかの制御下に置くことにより、概念実証実験を実行した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内投与した後、脳組織からＲＮＡを回収し、さらなるライブラリー進化のために使用した。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、わずか２ラウンドの選択後に動物間で配列収束を示した。興味深いことに、ＰＨＰ．ｅＢカプシドと高度に類似する幾つかのバリアントが回収された。これは、本発明者らの方法が、高性能カプシドの迅速な選択を可能にしたことを示唆する。高いＣＮＳ富化を示すペプチド配列を有するカプシドのサブセットを、さらなる研究のために選択した。所望の向性に応じて、任意のプロモーターを選択できることが理解される。そのようなプロモーターの例は、表３に見出される。
【０２３３】
【表３−１】
2021534809.tif 000011
【０２３４】
【表３−２】
2021534809.tif 000012
【０２３５】
【表３−３】
2021534809.tif 000013
【０２３６】
カプシドプールを３つのげっ歯動物種に注射し、続いてニューロンまたはアストロサイトにおける形質導入効率および種間性能を特徴付けるためのＲＮＡ富化分析を行った。次いで、順位が上位のカプシドを個々に試験したところ、幾つかのバリアントは、ＰＨＰ．ｅＢベンチマークと同様のまたはそれよりも高いＣＮＳ形質導入を示した。こうした結果は、ＴＲＡＣＥＲプラットフォームが、高度な向性向上を伴う、非トランスジェニック動物におけるＡＡＶカプシドの迅速なｉｎ  ｖｉｖｏ進化を可能にすることを示唆する。以下の例は、こうした知見をより詳細に例示する。
【０２３７】
実施例２．ヘルパーウイルスの非存在下でカプシドｍＲＮＡ発現が可能であるＡＡＶベクターの生成
ＡＡＶカプシドライブラリーの細胞タイプ限定的および形質導入限定的ｉｎ  ｖｉｖｏ進化を実施するため、カプシド突然変異体遺伝子を特定の細胞タイプにおいてヘルパーウイルスの非存在下で転写することができるカプシドライブラリー系を遺伝子操作した。野生型ＡＡＶウイルスでは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、ならびにＡＡＰアクセサリータンパク質をコードするｍＲＮＡを、ＲＥＰタンパク質ならびにヘルパーウイルス機能の存在下でのみ活性である、ＲＥＰ遺伝子の３’領域に位置するＰ４０プロモーター（ベルンら（Ｂｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．），１９９６）により発現させる（図１Ａ）。動物組織または培養細胞にてカプシドｍＲＮＡの発現を可能にするためには、ＣＡＰ遺伝子の上流または下流に別のプロモーターを挿入しなければならない。ＡＡＶカプシドのパッケージング容量は限定されているため、追加のプロモーター挿入を収容するためにＲＥＰ遺伝子の部分を欠失させなければならず、ウイルス産生を可能にするためには、ＲＥＰ遺伝子を別のプラスミドによりトランスで提供しなければならない。ＡＡＶ９のＣＡＰ遺伝子の上流の種々の位置にＣＭＶプロモーターを導入することにより、高力価ＡＡＶ産生に必要な最小ウイルス配列を決定した（図１Ｂ）。ＲＥＰタンパク質は、ＥｃｏＮＩおよびＣｌａＩを使用してＲＥＰ２−ＣＡＰ２パッケージングベクターからＣＡＰ遺伝子を欠失させることにより得られたｐＲＥＰ２プラスミドによりトランスで提供した（配列番号４）。小規模ウイルス産生試験において、５％ＦＢＳおよび１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐが補充されたＤＭＥＭ中で成長させたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、１５ｕｇのｐＨｅｌｐｅｒ（ｐＦｄｅｌｔａ６）プラスミド、１０ｕｇのｐＲＥＰ２プラスミド、および１ｕｇのＩＴＲ−ＣＭＶ−ＣＡＰプラスミドを、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用して共トランスフェクトし、１５ｃｍ皿にプレーティングした。７２時間後、細胞を擦過することにより回収し、短時間の遠心分離でペレット化し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する１ｍｌの緩衝液に懸濁した。ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を終濃度が０．１％になるように添加することにより細胞を溶解し、５０Ｕのベンゾナーゼで１時間処理した。上清に由来するウイルスを、８％ポリエチレングリコールおよび０．５Ｍ  ＮａＣｌで沈殿させ、１ｍｌの１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−２ｍＭ  ＭｇＣｌ２に懸濁し、細胞溶解物と組み合わせた。プールしたウイルスを、０．５Ｍ  ＮａＣｌになるように調整し、４，０００×ｇで１５分間遠心分離することにより清澄化し、１５％、２５％、４０％、および６０％の段階的イオジキサノール勾配で４０，０００ｐｒｍで３時間分画した（ゾロトキンら（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．），１９９９）。精製したＡＡＶ粒子を含有する４０％画分を回収し、すべての構築物で共有されているＲＥＰの３’末端に特異的なＴａｑｍａｎプライマー／プローブミックスを使用したリアルタイムＰＣＲによりウイルス力価を測定した。ウイルス収量は、参照として使用した完全野生型ＩＴＲ−ＲＥＰ２−ＣＡＰ９−ＩＴＲよりも有意に低かったが（１．７％〜８．８％）、ＣＭＶ−ＢｓｔＥＩＩ構��物は、３つすべてのＣＭＶ構築物の中で最も高い収量を可能にした。図２を参照されたい。Ｐ４０プロモーター配列のほとんどが欠失されているＣＭＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ構築物は、最も低い収量をもたらした（ｗｔＡＡＶ９の１．７％）。これは、強力なＣＭＶプロモーターでさえ、ウイルス収量の深刻な低下を引き起こさずにＰ４０プロモーターに取って代わることができないことを示す。こうした観察に従って、最小Ｐ４０配列およびＣＡＰ  ｍＲＮＡスプライスドナーが保存されているＢｓｔＥＩＩアーキテクチャ（配列番号５）を、すべてのさらなる実験で使用した。
【０２３８】
次いで、ＡＡＰリーディングフレームを、ＣＡＰ転写および／またはスプライシングの調節に必要な配列を含有していてもよいＲＥＰ２−ＣＡＰ９ヘルパーベクターに由来するカプシド遺伝子の大部分と共に保存することにより、ＲＥＰ発現プラスミドを向上させた。ベクターのカプシドコード化可能性を消失させるため、カプシド遺伝子のＣ末端断片を、ＭｓｃＩ制限酵素で三重切断することにより欠失させ、続いてｐＲＥＰ−ＡＡＰプラスミドを得るために自己ライゲーションさせた（図３Ａ、配列番号６）。
【０２３９】
同一鎖上にあるＡＡＰリーディングフレームのアミノ酸配列を乱すことなく、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の開始コドン直後に中途終止コドンを導入することにより、この構築物の反復部分を遺伝子操作した（図３Ａ）。この構築物を、ｐＲＥＰ−３ｓｔｏｐ（配列番号７）と名付けた。ＣＭＶプロモーターをニューロン特異的ヒトシナプシン１プロモーターと交換することにより、ニューロン特異的ｓｙｎ−ＣＡＰ９ベクター（配列番号８）をＣＭＶ９−ＢｓｔＥＩＩプラスミドから導出した。
【０２４０】
このＳｙｎ−ＣＡＰ９の産生効率を、ＲＥＰをトランスで供給するためのｐＲＥＰプラスミド、ｐＲＥＰ−ＡＡＰプラスミド、またはｐＲＥＰ−３ｓｔｏｐプラスミドを使用して、前述のように試験した。図３Ｂに示されているように、より長いカプシド配列ならびにＡＡＰを内包するＲＥＰプラスミドは、ｐＲＥＰプラスミドと比較して、ウイルス収量をおよそ３倍増加させた。ｐＲＥＰ−ＡＡＰまたはｐＲＥＰ−３ｓｔｏｐベクターで得られたウイルス力価は、野生型ＡＡＶ９の約３０％に達した。長い相同性領域を内包するプラスミドに関する重要な懸念は、野生型ＩＴＲ−ＲＥＰ−ＣＡＰベクターを再構成し、コンビナトリアルライブラリーを夾雑することになる、ＩＴＲ−ＣＡＰベクターとの望ましくない組換えの可能性である。
【０２４１】
野生型ウイルス再構成のリスクを評価するために、図３Ｂで得られたウイルス調製物を、ＲＥＰのＮ末端に位置するＴａｑｍａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲに供した。検出可能な完全長ＲＥＰを含有するカプシドのパーセンテージは、野生型ウイルスの０．０３％未満であり（図３Ｃ）、これは、２９３Ｔ細胞トランスフェクションから得られたほとんどの組換えＡＡＶ調製物で生じた日常的に検出される０．１％非正統ＲＥＰ−ＣＡＰパッケージングよりもさらに低かった（図３Ｃ、本発明者らの未発表観察）。ｐＲＥＰ−３ｓｔｏｐベクターの中途終止コドンは、野生型カプシド再構成の可能性に対するさらなる層の安全性を提供し、短縮カプシドタンパク質の翻訳を防止するため、３ｓｔｏｐプラスミドを、その後のすべての研究に使用した。
【０２４２】
これに続いて、ＡＡＶ９カプシド遺伝子が、ＣＭＶプロモーター、シナプシンプロモーター、またはその後はＧＦＡＰプロモーターと呼ばれている（ブレンナーら（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）アストロサイト特異的ＧＦａｂｃ１Ｄプロモーター（配列番号９）により駆動されるＡＡＶ９パッケージング化ベクターを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＲＮＡ駆動性バイオパニングの実施可能性を試験した（図４Ａ）。この３つのベクターを、前述のようにＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で産生し、ＰＡＧＥ−銀染色で分析した。図４Ｂに示されているように、すべてのベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を通常の比で示した。これは、この特定のプロモーターアーキテクチャが、カプシドタンパク質発現のバランスを破壊しないことを示す。６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１マウス当たり１ｅ１２ＶＧを静脈内注射し、２８日後に犠牲にした。ＤＮＡ生体内分布およびカプシドｍＲＮＡ発現を、脳組織、肝臓組織、および心臓組織で試験した。
【０２４３】
Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ血液および組織カラムを使用して、脳組織、肝臓組織、および心臓組織から全ＤＮＡを抽出し、ＶＰ３  Ｎ末端領域に位置するＴａｑｍａｎプローブを使用したリアルタイムＰＣＲにより、ウイルスＤＮＡを定量化した。単一コピートランスフェリン受容体遺伝子を検出する事前設計のプローブを使用してＤＮＡ存在量を正規化した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｒｅｆ．４４５８３６６）。ウイルスＤＮＡは、肝臓では存在量が高かったが、心臓では程度がより低かった。ＤＮＡ分布は、３つのベクター間で顕著な違いを一切示さなかった（図４Ｃ）。ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｐｌｕｓユニバーサルキットで抽出し、ｅｚＤＮＡｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）で処理して残留ＤＮＡを除去し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で逆転写した。
【０２４４】
ウイルスＤＮＡを定量化するために使用したものと同じＶＰ３プローブを使用してＲＮＡ発現を評価し、ＴＢＰを参照ＲＮＡとして使用して正規化した（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｍ０１２７７０４２＿ｍ１）。脳では、ＧＦＡＰプロモーターが最も強力な発現レベルを可能にし、シナプシンプロモーターは、強力なＣＭＶプロモーターと同等の発現を可能にした。肝臓では、すべてのプロモーターが同様の発現レベルをもたらした。これは、漏出性発現が非常に高いコピー数だった結果であると考えられる（図４Ｄ）。心臓では、ＳｙｎプロモーターおよびＧＦＡＰプロモーターの細胞タイプ特異性は、それらのＤＮＡ生体内分布が同様であるにも関わらず、ＣＭＶ発現のそれぞれ約３％および１０％しか可能にしなかったため、明らかだった。
【０２４５】
全体として、この実験は、形質導入コンピテントカプシドに由来するｍＲＮＡを、脳などの形質導入が弱い組織を含む種々の動物臓器から回収することができたことを示した。
実施例３．ＡＡＶベクター構成
ＲＮＡ発現を増加させてライブラリー回収を最大化するために、種々のベクター構成を探究した。ＣＭＶプロモーターを、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター配列に置き換え（ニワら（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．），１９９１）、イントロンは、ｍＲＮＡのプロセシングおよび安定性を増加させることが示されているため（パウエルら（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．），２０１５）、ＡＡＶ−ＭＣＳクローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に由来する強力なサイトメガロウイルスベータグロビンハイブリッドイントロンを、プロモーター配列とカプシド遺伝子との間に挿入した。これにより、構築物ＣＡＧ９（配列番号１０）、ＳＹＮＧ９（配列番号１１）、およびＧＦＡＰＧ（配列番号１２）がもたらされた。
【０２４６】
Ｐ４０プロモーターとの干渉可能性を回避するために、ヘルパー非依存性プロモーターをカプシド遺伝子の下流に逆方向に配置した逆位ベクター配置も試験した（図５Ａ）。この構成は、動物組織におけるアンチセンスカプシド転写物の発現を可能にする。ほとんどのポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）は方向依存性であるため、逆方向に配置すると、天然ＡＡＶカプシドポリＡは、転写を中途終結させないと仮定した。すべての構築物に、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミドおよびｐＲＥＰ−３ｓｔｏｐプラスミドを共トランスフェクトして、ＡＡＶ９パッケージング化ビリオンを生成し、それらを使用して１細胞当たり１ｅ４ＶＧのＭＯＩでＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に形質導入した。トランスフェクションの４８時間後にＲＮＡを抽出し、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して逆転写した。
【０２４７】
完全長カプシドまたはＣ末端付近に局在する部分配列の増幅を可能にするプライマーを用いて、ＰＣＲを実施した（図５Ｂ）。全体として、イントロンの存在は、低活性プロモーターであるＳｙｎおよびＧＦＡＰからの発現にほとんど影響を及ぼさなかった。これは、ｍＲＮＡスプライシングが、非許容細胞でのプロモーター抑制を緩和しなかったことを示す。ＣＭＶエンハンサーとニワトリベータアクチンプロモーターおよびハイブリッドイントロンとの組合せは、ＣＭＶプロモーター単独と比較して有意により高い（＞１０倍）ｍＲＮＡ発現を可能にした（図５Ｂ、Ｃ）。
【０２４８】
順方向イントロンベクターと逆位イントロンベクターとのエンドポイントＰＣＲ増幅を比較すると、完全長カプシドアンプリコンと部分カプシドアンプリコンとの間に不一致があることが明らかであり（図５Ｂ、右側レーン）、カプシドＲＮＡの完全性に疑問が生じた。完全長カプシドをフランキングするプライマーを使用して、逆位ｉＣＡＧ９ゲノムに由来するｃＤＮＡを増幅した場合、複数の低分子量バンドが検出されたが、順方向ベクターでは、予想される長さを有する単一産物の増幅が可能だった（図５Ｄ）。低分子量アンプリコンをサンガー配列決定すると、各バンドは、アンチセンスカプシドＲＮＡからの非正統的スプライシング産物に対応することが示された。
【０２４９】
こうした結果に照らして、順方向タンデムプロモーターをその後の実験のためのアーキテクチャとした。
ＲＮＡ調製物中に存在する残留ＤＮＡの増幅を回避するために、スプライス特異的ＰＣＲ増幅を試験した。ＣＭＶ／グロビンエクソン間接合部と重複する２つの候補ＰＣＲプライマーを設計し、ｃＤＮＡ（スプライシング）またはプラスミドＤＮＡ（依然としてイントロン配列を含有する）の増幅を試験した。図５Ｅに示されているように、ＧｌｏＳｐｌｉｃｅＦ６プライマー（配列番号１３）は、検出可能なアンプリコンをプラスミドＤＮＡ配列から産生することなく、ｃＤＮＡからの完全に特異的な増幅を可能にした。このプライマーを、その後のアッセイに使用して、夾雑ＤＮＡによる増幅が存在しないことを確認した。
【０２５０】
次いで、タンデム構築物を、Ｐ４０プロモーターが、上流に配置されている細胞特異的プロモーターと干渉する可能性について試験した。そのために、２つの一連のＡＡＶゲノムを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞における導入遺伝子ｍＲＮＡ発現について試験した。ＣＡＧ、ＳＹＮＧ、またはＧＦＡＰＧプロモーターのすぐ下流にＧＦＰ遺伝子が配置されておりＰ４０配列を有していなかった一連の導入遺伝子を試験し、ＡＡＶ９カプシドがＰ４０プロモーターの下流に配置されていたライブラリー構築物と比較した（図６Ａ）。すべてのゲノムがＡＡＶ９カプシドへとパッケージングされた。それらを、１細胞当たり１ｅ４ＶＧのＭＯＩでのＨＥＫ−２９３Ｔ感染に使用した。感染の４８時間後にＲＮＡを抽出し、スプライシングされたグロビンエクソン間接合部に特異的なＴａｑｍａｎプライマー／プローブミックスを使用することにより導入遺伝子ＲＮＡを定量した。図６Ｂに示されているように、ＣＡＧプロモーターからの発現は、ＧＦＰ構築物とＰ４０−ＣＡＰ９構築物とで類似していた（ｐ４０−ＣＡＰ９の方が２分の１であるが、ＡＡＶ滴定の許容誤差内である）。シナプシンプロモーターからの発現は、両構築物で劇的により低く、ＧＦＡＰ駆動性ｍＲＮＡではさらにより低かった（図６Ｂ）。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、シナプシンプロモーター発現またはＧＦＡＰプロモーター発現に対して許容性ではないため、これは予想通りだった。全体として、この実験により、Ｐ４０配列の存在は、シナプシンプロモーターまたはＧＦＡＰプロモーターの細胞タイプ特異性を変更しないことが確認された。
【０２５１】
この新規プラットフォームを、ＴＲＡＣＥＲ（Ｔｒｏｐｉｓｍ  Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＡＶ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ；ＲＮＡ細胞タイプ特異的発現によるＡＡＶの向性再指向化）と名付けた。ＴＲＡＣＥＲプラットフォームは、形質導入および細胞タイプ限定性を含む、標準的方法の問題を解決する。（図７）。ＴＲＡＣＥＲ系の使用は、標的指向性ペプチドライブラリーが使用されるカプシド発見に良好に適している。そのようなライブラリーのスクリーニングは、図８に概説されている通りに実行することができる。
【０２５２】
カプシドをペイロードとしてコードするＡＡＶベクターの幾つかの変異型が本明細書で教示されているが、１つの基準設計が、図９Ｂならびに図１２Ａおよび図１２Ｂに示されている。
【０２５３】
ＴＲＡＣＥＲプラットフォームのさらなる利点は、ウイルスプールの性質、および完全に形質導入された細胞からのみＲＮＡが回収されることに関する（図１０）。結果的に、カプシド発見を、細胞および／または組織特異的な向性をもたらすように加速させることができる（図１１）。
【０２５４】
実施例４．ペプチドディスプレイライブラリーの生成およびクローニングフリー増幅
７つの連続したランダム化アミノ酸を、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ−ＤＪ８カプシド（図１３および図３９）ならびにＡＡＶ９（図１４）の表面露出超可変ループＶＩＩＩ領域へと挿入することにより、幾つかのペプチドディスプレイカプシドライブラリーを生成した。ＡＡＶ９ライブラリーの場合、２つの追加のライブラリーは、高度に神経組織栄養性であるＰＨＰ．ｅＢベクター（チャンら（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．），２０１８）のフランキング配列と一致するように、インサートの−２位、−１位、および＋１位の残基が修飾されていた。種々のループの挿入を容易にし、野生型のカプシドによる夾雑を防止するために、ループＶＩＩＩと終止コドンとの間に含まれているカプシド遺伝子のＣ末端領域が欠失されており、固有のＢｓｒＧＩ制限部位に置き換えられていた欠損シャトルベクターを生成した（図１５Ａ、Ｂ）。すべてのアミノ酸をコードすることができるランダム化ＮＮＫ（Ｋ＝ＴまたはＧ）配列を含有する縮重プライマーはＩＤＴが合成し、それらを使用し、ｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）二本鎖線形ＤＮＡを鋳型として使用して、欠けているカプシド断片を増幅した（配列番号１４、１５、１６、１７）。ＰＣＲ反応でのプラスミド持ち越し夾雑の可能性を完全に防止するためには、プラスミドよりも線形ＰＣＲ鋳型が好ましかった。ランダムライブラリー配列（５００ｎｇ）を含有するアンプリコンを、１００ｕｌのＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ）を使用して５０℃で３０分間にわたってＢｓｒＧＩ（２ｕｇ）により線形化したシャトルプラスミドに挿入した。５ｕｌのＴ５エキソヌクレアーゼを反応物に添加し、３７℃で３０分間消化することにより、アセンブリされなかった線形鋳型を消失させた。反応全体を、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５で精製し、ｎａｎｏｄｒｏｐで定量化して、アセンブリの効率を推定した。この方法は、０．５〜１ｕｇのアセンブリ材料の回収を日常的に可能にする。
【０２５５】
固有の制限部位を除去するためにサイレント突然変異を導入することによりｇＢｌｏｃｋ鋳型を遺伝子操作して、制限酵素処理によるライブラリーからの野生型ウイルス夾雑物の選択的消失を可能にした。例として、親配列に存在するＢａｍＨＩおよびＡｆｅＩ部位を除去するようにＡＡＶ９  ｇＢｌｏｃｋを遺伝子操作した（配列番号１７）。
【０２５６】
実施例５．クローニングフリー増幅
アセンブリされたライブラリーＤＮＡのコンピテント細菌への形質転換は、高度にコンピテントな菌株でさえ、１形質転換当たり１ｅ７〜１ｅ８個のコロニーを超えることは希であるため、ライブラリー多様性における主なボトルネックを表す。比較すると、１００ナノグラムの６キロベースのプラスミドは、１．５ｅ１０個のＤＮＡ分子を含有する。したがって、細菌形質転換は、所与のプール内の９９％よりも多くのＤＮＡ種を無作為に消失させる。したがって、細菌形質転換のボトルネックを迂回しつつ、ギブソンアセンブリＤＮＡの＞１００倍の増幅を可能にするクローニングフリー法を作出した（図１６）。ローリングサークル増幅に基づくプロトコールを最適化し、それにより、環状ＤＮＡ鋳型の無バイアスの指数関数的増幅が、極めて低いエラー率で可能になった（ハッチンソンら（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．），２００５）。ローリングサークル増幅の１つ問題は、効率的な細胞トランスフェクションのためには単量体へと切断しなければならない非常に大きな（平均で約７０キロベースの）重度分岐コンカテマーが産生されることである。このプロセスは、幾つかの方法により、例えば、制限酵素を使用してオープンエンド線形鋳型を生成することにより（ハッチンソンら（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．），２００５、フオビネン（Ｈｕｏｖｉｎｅｎ），２０１２）、またはＣＲＥ−Ｌｏｘ組換えを使用して自己ライゲートした環状鋳型を生成することにより（フオビネンら（Ｈｕｏｖｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．），２０１１）、成し遂げることができる。しかしながら、オープンエンドＤＮＡは、細胞質エキソヌクレアーゼによる分解に感受性であり、ＣＲＥ組換え法は、比較的低い効率性を示した（本発明者らの未発表の観察）。したがって、哺乳動物細胞トランスフェクションに高度に適したクローズドエンド線形「ｄｏｇｂｏｎｅ」ＤＮＡ単量体（ハインリッヒら（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．），２００２）の形成を触媒する酵素であるＴｅｌＮプロテロメラーゼ（リブキンら（Ｒｙｂｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．），１９９９）の使用に基づく代替的な単量体分解法を選択した。
【０２５７】
そのため、以下のプラスミドを得るために、プロテロメラーゼ認識配列ＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＧＣＣＣＡＴＴＡＴＡＣＧＣ＊ＧＣＧＴＡＴＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＴＡ（配列番号１７６）を、カプシドライブラリー挿入に使用されるすべてのＢｓｒＧＩシャトルベクターの両ＩＴＲの外側に導入した（星印は、２つの相補鎖が互いに共有結合で連結される位置を図示する）：ＴｅｌＮ−Ｓｙｎ９−ＢｓｒＧＩ（配列番号１８）、ＴｅｌＮ−ＧＦＡＰ９−ＢｓｒＧＩ（配列番号１９）、ＴｅｌＮ−Ｓｙｎ５−ＢｓｒＧＩ（配列番号２０）、ＴｅｌＮ−ＧＦＡＰ５−ＢｓｒＧＩ（配列番号２１）、ＴｅｌＮ−Ｓｙｎ６−ＢｓｒＧＩ（配列番号２２）、ＴｅｌＮ−ＧＦＡＰ６−ＢｓｒＧＩ（配列番号２３）、ＴｅｌＮ−ＳｙｎＤＪ８−ＢｓｒＧＩ（配列番号２４）、ＴｅｌＮ−ＧＦＡＰＤＪ８−ＢｓｒＧＩ（配列番号２５）。ローリングサークル増幅のための幾つかの方法を試験し、無プライマー増幅（ピッチャーら（Ｐｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），２０１６）に依存するＴｒｕｅＰｒｉｍｅ技術（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で、最も良好な結果（高収量および低非特異的増幅）が得られた。
【０２５８】
手短に言えば、カラム精製アセンブリ反応物全体を、製造業者の使用説明書に従って９００ｕｌのＴｒｕｅＰｒｉｍｅ反応に使用し、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、ローリングサークル反応産物を６５℃で１０分間インキュベートして酵素を不活化し、５０ｕｌのプロテロメラーゼ（ＮＥＢ）を有する１×ｔｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液で５倍希釈して４．５ｍｌの反応液にした。３０℃で１時間後、反応物を７０℃で１０分間加熱処理してプロテロメラーゼを不活化し、４．５ｕｌのアリコートをアガロースゲルで泳動した。次いで、反応物全体を、製造業者の使用説明書に従って、複数の（１０〜１２個の）Ｑｉａｇｅｎ  ＱｉａＰｒｅｐ２．０カラムで精製した。この方法で得られた典型的な収量は、１６０〜１８０ｕｇのＤＮＡだった。これは、出発物質（典型的には０．５〜１ｕｇ）の＞１００倍の増幅を示し、２００個の細胞培養皿のトランスフェクションに十分なＤＮＡを提供する（図１６）。
【０２５９】
すべてのライブラリーの組成を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ配列決定プラットフォームを用いた次世代シーケンシングにより試験して、バリアントの数および野生型ウイルスによる最終的な夾雑を推定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑアダプターおよびインデックスバーコードを含有するプライマーを使用したＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）によるＰＣＲで、アンプリコンを生成した。低サイクルＰＣＲ増幅（１５サイクル）によりアンプリコンを得た。それらを３％アガロースゲルで泳動し、Ｚｙｍｏゲル抽出試薬を使用して精製した。ライブラリーを、ナノドロップを使用して定量化し、等モルミックスへとプールし、製造業者の使用説明書に従ってＫＡＰＡライブラリー定量化キットを用いて再定量化した。ライブラリーを、２０〜４０％のＰｈｉＸ対照ライブラリーと混合して、配列多様性を増加させた。
【０２６０】
ローリングサークルにより生成されたすべてのＤＮＡライブラリーは、高い配列多様性を示した（典型的には、＞１ｅ８個の固有バリアント、これはＮｅｘｔＳｅｑ配列決定の限界を超える）。比較すると、細菌形質転換により生成されるプラスミドライブラリーは、１〜２ｅ７個のバリアントを超えることは希である。
【０２６１】
実施例６．夾雑の防止および／または低減
別の実施形態では、環境夾雑物または自然感染霊長動物組織から回収される可能性がある野生型ウイルスによるＡＡＶ９ライブラリーの夾雑を完全に防止することを目的としたプライマー／ベクター系を作出した。これは、ライブラリー挿入部位を取り囲む配列、ならびにＰＣＲ増幅に使用されるＣＡＰ終止コドン直前の配列に、最大数のサイレント突然変異を導入することにより達成した（図１７）。こうしたライブラリーでは、ＮＧＳによる野生型ＡＡＶ９検出数が極めて低いことが示された（５ｅ７個の総リート当たり＜２つのＡＡＶ９リード）。これは、ライブラリー増幅およびクローニング部位を取り囲むコドンの変更が、環境的または実験的な夾雑物からライブラリーを保存するための非常に効率的な様式であることを示唆する。
【０２６２】
ライブラリーを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のリン酸カルシウムトランスフェクション、二重イオジキサノール勾配分画、および１００，０００Ｄａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ−１５膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した膜限外濾過により以前に記載の通りに産生し、リアルタイムＰＣＲにより定量化し、アリコートを、ＮＧＳアンプリコン生成およびＮｅｘｔＳｅｑ配列決定のために使用した。ウイルスライブラリーの多様性は、ＤＮＡライブラリーの多様性よりも著しく低く（典型的には、約１〜２ｅ７個の固有なバリアント）、終止コドンを含有するバリアントの非常に強力な対抗選択を示した（ＤＮＡライブラリーでの２０％からウイルスライブラリーでの約１％への）。これは、以前の研究（ノンネンマケルら（Ｎｏｎｎｅｎｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），２０１４）で観察されているように、非常に高い割合のシスパッケージングを明らかに示した。
【０２６３】
実施例７．マウス脳形質導入用のＡＡＶ９ライブラリーのｉｎ  ｖｉｖｏ選択
次いで、マウスモデルにおける脳形質導入を増加させるためのＲＮＡ駆動性ライブラリー選択を開発した。上記に記載の通りに生成したＡＡＶ９ライブラリーを、１マウス当たり２ｅ１２ＶＧの用量で雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。２つの群のマウスに、野生型ＡＡＶ９フランキング配列に由来する単一のＳＹＮ駆動性またはＧＦＡＰ駆動性ライブラリーを注射し、２つの他の群は、野生型およびＰＨＰ．ｅＢ由来のフランキング配列を含有するプールされたライブラリーを受け取った（図１８）。１か月後に、ＲＮｅａｓｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｌｕｓ手順（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、半球全体に対応する２００ｍｇの脳組織からＲＮＡを抽出した。試料採取下におけるＲＮＡの可能性を最小限に抑えるため、Ｏｌｉｇｏｔｅｘビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の推奨の通りに使用して、ＲＮＡ調製物全体（約２００ｕｇ）をｍＲＮＡ富化に供した。次いで、富化ｍＲＮＡの調製物全体（約５ｕｇ、全ＲＮＡの２％に相当）を、以下の配列：
【０２６４】
【化１】
2021534809.tif 000014
【０２６５】
（ＣＡＰ終止コドンには下線が引かれている）を有するライブラリー特異的プライマーを使用して、４０ｕｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＶ反応（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で逆転写した（図１９）。次いで、ｃＤＮＡのプール全体を、５００ｕｌのＰＣＲ反応にて、５５℃のアニーリング温度および２分間伸長の３０サイクルで増幅し、Ｑ５マスターミックス、ＧｌｏＳｐｌｉｃｅＦ６順方向プライマー、およびＣＡＰ９特異的逆方向プライマー：
【０２６６】
【化２】
2021534809.tif 000015
【０２６７】
（ＣＡＰ終止コドンには下線が引かれている）を用いてアセンブリした。この方法により、すべての脳試料から大量のアンプリコンを回収することが可能だった（図２０）。
次いで、完全長カプシドアンプリコンを、ＮＧＳライブラリー生成のための鋳型として使用し、ならびに次のラウンドのバイオパニングのために、まったく同じアセンブリおよびクローニングフリー手順を使用してＰ１  ＤＮＡライブラリーへとクローニングした。ＰＣＲアンプリコンに対して実施されたＮＧＳ分析は、Ｓｙｎ駆動性ライブラリーおよびＧＦＡＰ駆動性ライブラリーの両方で、第１ラウンドのバイオパニング後に、ライブラリー多様性が約２５分の１に（１ｅ７から４ｅ５へと）低下したことを示した（図２１）。回収した第１継代バリアント（Ｐ１）の数は多過ぎて、この時点では有意な配列収束性を一切示さず、個々の動物から回収したプールの組成間には重複がほとんど存在しなかった。したがって、第２ラウンドの選択を実施した。第２のバイオパニング（Ｐ２）後、固有なバリアントの総数は、さらに４分の１〜５分の１低下し、＜１ｅ５個のペプチドへと減少した。重要なことには、第１ラウンドのバイオパニング後に回収した一部のライブラリーは、おそらく環境夾雑物に由来する著しい計数の野生型ＡＡＶ９配列およびＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ配列を示した。これらは、後に第２ラウンドの富化における有用なベンチマークとなった。
【０２６８】
ＲＮＡを回収しＰＣＲ増幅した後、Ｐ２／Ｐ１リードの比を計算し、それをＡＡＶ９またはＰＨＰｅＢのＰ２／Ｐ１比と比較することにより、ＮＧＳによる体系的な富化分析を実施した。図２２、表４、図２３、および表５に示されているように、幾つかのカプシドは、Ｓｙｎ駆動性ライブラリーおよびＧＦＡＰ駆動性ライブラリーの両方で、ベンチマークＰＨＰ．ｅＢよりも高い富化比を示し、コンセンサス配列生成により表されている通り、配列収束性は明らかだった。
【０２６９】
【表４−１】
2021534809.tif 000016
【０２７０】
【表４−２】
2021534809.tif 000017
【０２７１】
【表５−１】
2021534809.tif 000018
【０２７２】
【表５−２】
2021534809.tif 000019
【０２７３】
【表５−３】
2021534809.tif 000020
【０２７４】
重要なことには、異なる動物間にも強力な配列収束性が存在し、わずか２回の継代後で選択が効率的だったことを示唆する。図２４および図２５は、ＧＦＡＰ−ＡＡＶ９ペプチドライブラリー候補における脳／肝臓特異性の推定を提供する。
【０２７５】
実施例８．多重化選択
個々のバリアントを等モルライブラリーにプールすることによる最終多重化ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングのために、有望な特性（これらに限定されないが、１匹よりも多くのマウスにおける富化係数、肝臓標的解除、高計数など）を有するバリアントの部分集団を、図２６に示されている通りに選択することができ、次いで７量体をすべてコードする等モルのプライマープールを合成することができる（マイクロチップ固相合成、１チップ当たり最大３，８００個のプライマー）。これらに限定されないが、ＰＨＰ．Ｎ、ＰＨＰ．Ｂ、野生型ＡＡＶ９（ｗｔＡＡＶ９）、および／または本明細書で教示されているものを含む任意の他の血清型などの内部対照を含む限定的多様性ライブラリーを産生することができる。マウスに注射し、次いでＲＮＡ富化を、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されているバーコード付与研究と同様の様式で内部対照と比較する。
【０２７６】
実施例９．コドン最適化
コドンバリアントを使用して、合成したライブラリーを使用する場合のデータ強度を向上させることができる。種々のアミノ酸のＮＮＫコドン、ＮＮＭコドン、および哺乳動物において最も好ましいＮＮＭコドンのリストは、表６に提供されている。表６では、＊は、ＮＮＭコドンが利用可能ではないことを意味し、＊＊は、「可能であればホモポリマー的な伸長を回避する」ことを意味する。
【０２７７】
【表６】
2021534809.tif 000021
【０２７８】
バランスの取れたライブラリーを有するためには、潜在的候補のリストを確立し、次いで、表６を使用して、ＮＮＫコドン（ライブラリーに由来するオリジナル）および非ＮＮＫコドン（最大の変動性）によりコードされるすべてのペプチドバリアントを含有するプールされたプライマーライブラリーを確立することが推奨される。同様の挙動が同じペプチドの２つのバリアント間で見られる場合、これは、そのペプチドの分析を強化することになる。加えて、最も好ましいＮＮＭコドン（Ｍ＝ＡまたはＣ）を選択することが推奨される。
【０２７９】
実施例１０．ライブラリー生成
親ＡＡＶ９と比べて性能の増強を示したＳＹＮ駆動性ライブラリーおよびＧＦＡＰ駆動性ライブラリーに由来する上位３３０個のペプチドバリアントを選択した。３３０個のペプチド配列すべてに加えてＡＡＶ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、およびＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ対照のプールされたプライマー合成によるｄｅ  ｎｏｖｏライブラリーを生成した（表７）。ＤＮＡ配列に起因する潜在的なアーティファクトを排除し、アッセイのロバストネスを増加させるために、各ペプチドバリアントを、２つの異なるＤＮＡ配列によりコードし、１つでは、すべてのアミノ酸をＮＮＫコドンでコードし（元のライブラリーと同一）、もう１つでは、可能な限りＮＮＭコドン（Ｍ＝ＣまたはＡ、表６）を使用した。
【０２８０】
【表７−１】
2021534809.tif 000022
【０２８１】
【表７−２】
2021534809.tif 000023
【０２８２】
【表７−３】
2021534809.tif 000024
【０２８３】
【表７−４】
2021534809.tif 000025
【０２８４】
【表７−５】
2021534809.tif 000026
【０２８５】
【表７−６】
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【０２８６】
【表７−７】
2021534809.tif 000028
【０２８７】
【表７−８】
2021534809.tif 000029
【０２８８】
【表７−９】
2021534809.tif 000030
【０２８９】
【表７−１０】
2021534809.tif 000031
【０２９０】
【表７−１１】
2021534809.tif 000032
【０２９１】
【表７−１２】
2021534809.tif 000033
【０２９２】
【表７−１３】
2021534809.tif 000034
【０２９３】
【表７−１４】
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【０２９４】
【表７−１５】
2021534809.tif 000036
【０２９５】
【表７−１６】
2021534809.tif 000037
【０２９６】
【表７−１７】
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【０２９７】
【表７−１８】
2021534809.tif 000039
【０２９８】
【表７−１９】
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【０２９９】
【表７−２０】
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【０３００】
【表７−２１】
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【０３０１】
【表７−２２】
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【０３０２】
【表７−２３】
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【０３０３】
プライマープールは、Ｔｗｉｓｔ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓが固相合成を使用して産生した。それらを使用して、図２７に記載の通りにＣＡＰ  Ｃ末端およびギブソンアセンブリのＰＣＲ増幅により６６６個のヌクレオチドバリアントのバランスのとれたライブラリーを生成した。６６６個のプライマーは、各々が１ｆｍｏｌｅで提供され、全体で０．６ｐｍｏｌｅだった（通常のＰＣＲには、約２５ｐｍｏｌｅのプライマーが必要である）。カプシドｇＢｌｏｃｋ鋳型に対する無プライマー増幅を、１０サイクルにわたって実施した。順方向プライマーおよび逆方向プライマーを添加し、続いて追加の１０、１５、または２０回のＰＣＲサイクルを行った。次いで、構築物を、ギブソン／ＲＣＡによりＡＡＶ９骨格プラスミドへとクローニングした（通常のライブラリーと同様に）。
【０３０４】
プールしたＤＮＡで産生されたＳＹＮ駆動性およびＧＦＡＰ駆動性ＡＡＶライブラリーのＮＧＳ分析は、各ペプチドのコドンバリアント間に良好な相関性があることを示し、これは、ＤＮＡ配列それ自体は、ウイルス産生に対してほとんど影響を及ぼさなかったことを示唆する（図２８および図２９）。プールした合成ライブラリーを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１マウス当たり５ｅ１１ＶＧ、Ｎ＝９）、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（１マウス当たり５ｅ１１ＶＧ、Ｎ＝６）、およびラット（１ラット当たり５ｅ１２ＶＧ、Ｎ＝６）に静脈内注射し、生存中の１か月後、生体内分布分析のために、脳および脊髄からＲＮＡを抽出し、肝臓および心臓の組織試料からＤＮＡを抽出した（図３０）。シナプシンプロモーターおよびＧＦＡＰプロモーターは、非ＣＮＳ組織では十分に活性ではないため、末梢臓器ではＲＮＡの代わりにＤＮＡを分析した。ライブラリー進化が実施されたマウス系統はこの系統だったため、Ｃ５７ＢＬ／６マウス分析が初期の焦点だった。
【０３０５】
各カプシドの富化スコアを、ＮＧＳ分析により決定し、標的組織における１００万当たりのリード数（ＲＰＭ）の、接種物におけるＲＰＭに対する比として規定した。対照カプシドで実施した分析の例は、図３１Ａに示されている。公開されているデータから予想される通り、ＰＨＰ．ＢおよびＰＨＰ．ｅＢ（別名、ＰＨＰ．Ｎ）カプシドは、ＡＡＶ９親カプシドと比較して、ニューロンにおいて有意により高いＲＮＡ発現を可能にした（それぞれ、８倍および２５倍）。各動物の各ペプチド種のコドンバリアント間には非常に高い相関が存在し（ｒ＝０．９２、０．９３、および０．９５）、ＮＧＳアッセイのロバストネスが確認された（図３１Ｂ〜図３１Ｄ）。
【０３０６】
富化分析の例は、図３２Ａ〜図３６に表されている。３３３個のカプシドバリアントをすべての動物の平均脳富化スコアにより順位付けし、個々の富化値をカラースケールで示す。参照カプシドの位置により示されているように、新規バリアントの群は、ニューロン（Ｓｙｎ駆動性）およびアストロサイト（ＧＦＡＰ駆動性）の両方において、ＰＨＰ．ｅＢベンチマークカプシドよりも高い富化スコアを示した。興味深いことに、Ｓｙｎ駆動性ＲＮＡとＧＦＡＰ駆動性ＲＮＡとの間の相関性が中程度のレベルであることにより示されるように、多くのバリアントが、ニューロンとアストロサイトとで異なる富化スコアを示した。これは、ある特定のカプシドがニューロンに対する向性の増強を表示し、他のカプシドがアストロサイトに対する向性の増強を表示することを示唆する（図３３）。
【０３０７】
３８個のカプシドの群は、ニューロン、アストロサイト、またはその両方に対するそれらの向性に基づくと、潜在的に興味深い特性を示し（表８Ａおよび表８Ｂ）（図３８）、強力なコンセンサスペプチド配列類似性を示し、類似性は、ニューロン標的指向性バリアントとアストロサイト標的指向性バリアントとの間で異なっていた（図４５〜図４５Ｃおよび図４６Ａ〜図４６Ｂ）。
【０３０８】
【表８】
2021534809.tif 000045
【０３０９】
【表９−１】
2021534809.tif 000046
【０３１０】
【表９−２】
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【０３１１】
【表９−３】
2021534809.tif 000048
【０３１２】
実施例１１．系統発生的グループ化
ペプチド配列の系統発生的グループ化は、配列相同性クラスターとカプシド表現型との間に明白な相関性があることを示した（図３７）。例えば、配列ＤＧＴｘｘｘＰＦＫ／Ｒ（配列番号１１８１）を有する９量体バリアントは、ＰＨＰ．ｅＢカプシドと同様の挙動を提示したが（ニューロンおよびアストロサイトの形質導入が両方とも高い）、配列ＤＧＴｘｘｘＹＤＳ／Ａ（配列番号１１８２）を内包するバリアントは、ニューロン形質導入に対して優先性を示した。対照的に、コンセンサスＤＧＴｘｘｘｘＧＷ（配列番号１１８３）またはＣＧＴｘｘｘＰＰＲ／Ｋ（配列番号１１８４）を有するペプチドは、アストロサイトに対してより高い向性を提示した。
【０３１３】
実施例１２．カプシド試験
別個の配列クラスターを表すカプシドバリアント（図３７Ｂにて強調されている）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの個々の形質導入分析のために選択した。各カプシドを、ユビキタスプロモーターにより駆動される自己相補的ＥＧＦＰ導入遺伝子をパッケージングする組換えＡＡＶとして産生した（図４９Ａ、Ｂ）。マウス群（Ｎ＝３）に、６ｅ１０ＶＧを静脈内注射し、１か月後に、脳組織、脊髄組織、および肝臓組織でのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを定量化することにより形質導入効率を評価した。マウスＴＢＰをハウスキーピング遺伝子として使用してＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現を正規化し、ＤＮＡ生体内分布を単一コピーマウスＴｆＲ遺伝子に対して正規化した（図５０Ａ〜図５０Ｃ）。逆転写は、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔキットを使用して実施し、ＤＮＡ除去処理を含んでいた。すべてのカプシドバリアントが、親ＡＡＶ９カプシドと比較して、脳ｍＲＮＡ発現および脊髄ｍＲＮＡ発現の有意な向上を示し、７つのバリアントのうち３つ（９Ｐ１６、９Ｐ３１、および９Ｐ３５）は、ＰＨＰ．ｅＢベンチマークカプシドと同様のまたはそれよりも高い形質導入を示した（図４９Ｃ、表１０）。ウイルスＤＮＡ生体内分布は、脳および脊髄に対する９Ｐ３１および９Ｐ３５の非常に強力な向性を示したが、すべてのバリアントが、ＡＡＶ９と比較して４０〜２６０倍の生体内分布の増加を示した（図４９Ｄ、表１０）。
【０３１４】
ニューロンＮｅｕＮマーカーを標識することにより、予想される細胞向性を、ＮＧＳスクリーニングを使用して試験した（図５１）。皮質内では、ＧＦＡＰスクリーニングの上位カプシドは、グリア形態学的特徴を有するＮｅｕＮ陰性細胞において主にＧＦＰ発現を示した。逆に、ＳＹＮスクリーニングでの上位カプシドは、ＮｅｕＮ陽性細胞の非常に高い形質導入を示し、両アッセイで順位が高かった二重特異性カプシド９Ｐ０８および９Ｐ１６は、複数のＮｅｕＮ＋細胞およびグリア細胞との混合細胞優先性を示した。
【０３１５】
また、ＡＡＶ９に対するマウス脳微小血管ＥＣ（ｍＢＭＶＥＣ）結合を使用して、細胞向性を試験した。結果は、表９に示されている。
【０３１６】
【表１０】
2021534809.tif 000049
【０３１７】
全脳、小脳、皮質、および海馬の組織における蛍光ＥＧＦＰ発現は、スペクトル全体にわたる形質導入パターンを明らかにし、組織特異的カプシドの識別を実証する（図５２〜図５６）。
【０３１８】
ｍＲＮＡ発現によりおよび全組織ＧＦＰ発現により測定した肝臓形質導入は、幾つかのバリアントがＡＡＶ９よりも優れていたことを示した。これはＮＧＳの結果に照らして予想外だった。９Ｐ０８または９Ｐ２３などの一部のバリアントは、ＡＡＶ９と比較して相対的肝臓標的解除を示した（図５７Ａ〜図５７Ｂ）。
【０３１９】
【表１１】
2021534809.tif 000050
【０３２０】
実施例１３．多げっ歯動物試験（異種間）
３３３個のカプシドバリアントのＣＮＳ形質導入の有効性を、他のげっ歯動物系統または種で試験した（図４７）。Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＢＡＬＢ／Ｃマウス、およびラットにおけるニューロンおよびアストロサイトの形質導入の対照比較は、複数バリアントの富化スコアに２つのマウス系統間で大きな違いがあり、マウスとラットとの間にはさらにより顕著な違いがあることを示した（図４８Ａ〜図４８Ｃ）。驚くべきことに、ラット脳形質導入に最も効率的なカプシドは親ＡＡＶ９だった。これは、指向性進化「ボトルネック」カプシドバリアントが、野生型ＡＡＶカプシドの多用途性とは対照的に、１つの所与の種において性能が高いことを示唆する。
【０３２１】
相関分析により、一部のカプシドは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＢＡＬＢ／Ｃマウスとの間で高いＣＮＳ形質導入を共有したが、他のカプシドは、１つの系統のみに限定されていたことが示された（図４８Ｂ）。
【０３２２】
興味深いことに、ＰＨＰ．ＢカプシドおよびＰＨＰ．ｅＢカプシドは、最近の刊行物（ホルデアウキスら（Ｈｏｒｄｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．），２０１８）と一致して、ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおいて不良な脳形質導入を示した。脳形質導入の＞１０倍増加を示したカプシドに焦点を当てると、６２個のバリアントがＣ５７ＢＬ／６マウスでのみ向上を示し、２８個のバリアントがＢＡＬＢ／Ｃマウスでのみ向上を示し、３０個のバリアントが、両系統において脳形質導入の向上を示した（表１１）。コンセンサス配列分析は、ＰＨＰ．ｅＢペプチド（ＤＧＴｘｘｘＰＦＲ（配列番号１１８５））と緊密に類似する「Ｃ５７ＢＬ／６シグネチャ」を示したが、ＢＡＬＢ／Ｃシグネチャは、異なるコンセンサス（ＤＧＴｘｘｘｘＧＷ（配列番号１１８３））を示した。これは、異なる細胞受容体が使用されたことを示唆する（図４８Ｃ）。
【０３２３】
【表１２−１】
2021534809.tif 000051
【０３２４】
【表１２−２】
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【０３２５】
【表１２−３】
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【０３２６】
【表１２−４】
2021534809.tif 000054
【０３２７】
【表１２−５】
2021534809.tif 000055
【０３２８】
また、３３３個のカプシドバリアントのＣＮＳ形質導入の有効性を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスＢＭＶＥＣおよびヒトＢＭＶＥＣで比較した（図５８Ａおよび図５８Ｂ）。
実施例１４．完全長カプシドバリアントのＮＧＳ駆動性選択系の遺伝子操作
バーコード系を遺伝子操作して、完全カプシド長修飾による富化研究を可能にした。ここに記載されるＴＲＡＣＥＲプラットフォームは、初期には、ペプチドディスプレイライブラリーを使用するために開発されたものであり、ランダム化ペプチド配列それ自体は、そのサイズが短いためＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳ分析に使用することができるが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定技法は、典型的には３００個よりも多くの連続した塩基の配列決定が可能ではなく、したがって、本発明者らのプラットフォームは、ＤＮＡシャッフリング技法またはエラープローンＰＣＲにより生成されたものなど、完全長カプシドバリアントのＮＧＳ分析に使用することができない。
【０３２９】
識別された固有分子（ＵＭＩ、ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）がカプシド遺伝子の外側に配置されており、ＮＧＳ富化分析に使用することができる、完全長カプシドライブラリーの代替的ＲＮＡ駆動性プラットフォームを設計した（図５９Ａ〜図５９Ｃ）。所望の特性を有するバリアントを動物組織のＵＭＩ富化分析により識別したら、ＵＭＩ配列により、出発物質からの完全長カプシドの高度に特異的な回収が最小限のエラー率で可能になるはずである。この系は、有効であるためには、以下の特性の１つまたは複数を有するべきである：１）ＵＭＩは、細胞タイプ特異的プロモーターの制御下で転写されるべきである；２）ＵＭＩは、ウイルス産生中にカプシド発現またはスプライシングに干渉するべきではない；３）ＵＭＩは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳ配列決定に十分な程度の短さであるべきである（典型的には、標準的なシングルエンド７５ｎｔ配列決定の場合は６０ｎｔ未満）；および４）ＵＭＩは、開始ＤＮＡ／ウイルスライブラリーから目的の完全長カプシドの配列特異的回収を最小限のエラー率で可能にすべきである。
【０３３０】
こうした特性に対処するため、１）ＵＭＩを、カプシドライブラリーの転写領域（つまり、転写開始部位とポリアデニル化シグナルとの間の任意の場所）に配置し、２）ＵＭＩを、ＡＡＶイントロン（ヘルパー機能の非存在下ではほとんどスプライシングされない）の種々の位置またはカプシド終止コドンとポリアデニル化シグナルとの間のいずれかに配置し、３）ＵＭＩカセットは、１５ｎｔスペーサーで隔てられている２つのランダム化２１ｎｔ配列で構成され、全長は５７ｎｔであり、プライマーアニーリングのために１８個のヌクレオチドの追加が可能であり、４）ＵＭＩランダム化配列を、ＮＳＷトリプレット（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ；Ｓ＝Ｇ、Ｃ；Ｗ＝Ａ、Ｔ）で形成して、増幅プライマーとのアニーリング温度の大きな変動性を防止し、ホモポリマース的な伸長を回避し、中途ポリＡシグナル（ＡＡＴＡＡＡ）の形成を防止した。
【０３３１】
重要なことには、ＵＭＩカセットは、２つのランダム配列を直列に含有していた。第１の配列（最も外側）を、一致するカプシド回収プライマーの設計に使用し、第２の配列（最も内側）を、クローニング後にカプシドアンプリコンの同一性を確認するために使用する。この方法は、非特異的な増幅産物を含有するすべてのクローンを消失させることが可能であるはずである。代替的な実施形態では、増幅の特異性を増加させるために、最も内側の配列を使用して、ネステッドＰＣＲプライマーを設計することもできる（図５９Ａ〜図５９Ｃ）。
【０３３２】
ウイルス生存率および力価に対する影響を試験するために、タンデムバーコードの幾つかの挿入部位を探究した。一連の構築物を遺伝子操作して、ＣＡＧ９プラスミドのＡＡＶイントロンにバーコードを挿入した（図６０Ａ）。ＡＡＶイントロンはウイルス産生中にスプライシングされるため、バーコードの存在は、収量に対して最小限の影響しか及ぼさないはずである。逆に、ＡＡＶスプライシングはヘルパー機能の非存在下では非常に非効果的であるため（モウら（Ｍｏｕｗ  ｅｔ  ａｌ．），２０００）、バーコード配列は、動物組織から回収されるＲＮＡに保存されることになる。ｐＨｅｌｐｅｒプラスミドおよびｐＲＥＰ３ｓｔｏｐプラスミドをそれらに共トランスフェクトすることにより、高力価のＡＡＶ子孫を産生する能力について、すべてのイントロンバーコード構築物を試験した。すべての構築物は、非バーコード化ＣＡＧ９ウイルスの５０％〜８０％に及ぶ高力価ＡＡＶ産生を可能にした（図６０Ｂ）。
【０３３３】
トランスフェクト細胞のＲＮＡスプライシング分析は、ＡＡＶイントロンスプライシングの割合が構築物間でわずかに異なり、スプライスドナーの下流の保存された介在配列後にイントロンバーコードを挿入すると、より効率的であったことを示した（図５８Ｃ、上段パネル）。
【０３３４】
グロビンイントロンスプライシングは、すべての試験条件で１００％有効だった（図６０Ｃ、下段パネル）。予想通り、ヘルパー機能の非存在下では、ＡＡＶイントロンスプライシングはほとんど検出不能だった。
【０３３５】
カプシド終止コドンとポリアデニル化シグナルとの間にタンデムバーコードが配置された代替的プラットフォームを試験した（図５９Ｂ）。３’バーコード化構築物により生み出された力価は、非バーコード化ＣＡＧ９構築物と同一だった。
【０３３６】
全体として、完全長カプシドの外部バーコード付与は、高度に効率的なＡＡＶ産生を可能にし、新規のタンデムバーコードプラットフォームは、ライブラリー調製物からのＮＧＳ駆動性配列特異的回収を高い信頼性で可能にする。
【０３３７】
【表１３−１】
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【０３３８】
【表１３−２】
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【０３３９】
【表１３−３】
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【０３４０】
【表１３−４】
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【０３４１】
【表１３−５】
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【０３４２】
【表１３−６】
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【０３４３】
【表１３−７】
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【０３４４】
【表１３−８】
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【０３４５】
【表１３−９】
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【０３４６】
【表１３−１０】
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【０３４７】
【表１３−１１】
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【０３４８】
【表１３−１２】
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【０３４９】
【表１３−１３】
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【０３５０】
【表１３−１４】
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【０３５１】
【表１３−１５】
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【０３５２】
【表１３−１６】
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【０３５３】
【表１３−１７】
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【０３５４】
【表１３−１８】
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【０３５５】
【表１３−１９】
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【０３５６】
【表１３−２０】
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【０３５７】
【表１３−２１】
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【０３５８】
【表１３−２２】
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【０３５９】
【表１３−２３】
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【０３６０】
【表１３−２４】
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【０３６１】
【表１３−２５】
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【０３６２】
【表１３−２６】
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【０３６３】
【表１３−２７】
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【０３６４】
【表１３−２８】
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【０３６５】
引用文献
【０３６６】
【表１４−１】
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【０３６７】
【表１４−２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図５９Ｃ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021534809.tif 000182
2021534809.tif 000183
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