(57)【要約】  Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の治療に使用するための医薬組成物は、ＣＤ１１ｂに対する有効量の抗体またはその結合フラグメントを含む。Ｂ型肝炎ウイルス感染症を治療する方法は、ＣＤ１１ｂに対する抗体をそれを必要とする対象に投与することを含む。ＣＤ１１ｂに結合する抗ＣＤ１１ｂ抗体は、ＣＤ１１ｂ＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ８６の表面発現の増加、血中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびＨＢＶ  ＤＮＡのレベルの抑制、ならびに肝臓からのＨＢＶクリアランスの加速の観察結果から明らかであるように、免疫刺激応答をトリガーし得る。
2021534109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１１ｂに対する有効量の抗体またはその結合フラグメントを含む、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の治療に使用するための医薬組成物。
【請求項２】
ＣＤ１１ｂに対する前記抗体がモノクローナル抗体である
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＣＤ１１ｂに対する前記抗体が、ＮＹＷＩＮ（配列番号１）またはＧＦＳＬＴＳＮＳＩＳ（配列番号２）のアミノ酸残基から構成される重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＮＩＹＰＳＤＴＹＩＮＨＮＱＫＦＫＤ（配列番号３）またはＡＩＷＳＧＧＧＴＤＹＮＳＤＬＫＳ（配列番号４）のアミノ酸残基から構成される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、ＳＡＹＡＮＹＦＤＹ（配列番号５）またはＲＧＧＹＰＹＹＦＤＹ（配列番号６）のアミノ酸残基から構成される重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＨ（配列番号７）またはＫＳＳＱＳＬＬＹＳＥＮＱＥＮＹＬＡ（配列番号８）のアミノ酸残基から構成される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、ＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号９）またはＷＡＳＴＲＱＳ（配列番号１０）のアミノ酸残基から構成される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、およびアミノ酸残基ＱＱＳＤＳＷＰＴＬＴ（配列番号１１）またはＱＱＹＹＤＴＰＬＴ（配列番号１２）から構成される軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＣＤ１１ｂに対する前記抗体が、
（ａ）配列番号１３の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２３の配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１４の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２４の配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号１５の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２５の配列を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号１６の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２６の配列を含む軽鎖可変領域、
（ｅ）配列番号１７の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２７の配列を含む軽鎖可変領域、
（ｆ）配列番号１８の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２８の配列を含む軽鎖可変領域、
（ｇ）配列番号１９の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２９の配列を含む軽鎖可変領域、
（ｈ）配列番号２０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３０の配列を含む軽鎖可変領域、
（ｉ）配列番号２１の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３１の配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｊ）配列番号２２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３２の配列を含む軽鎖可変領域を含む
請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＣＤ１１ｂに対する有効量の抗体またはその結合フラグメントをそれを必要とする対象に投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルス感染症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓免疫療法の分野、特にＢ型肝炎ウイルス感染症の免疫クリアランスに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、急性および慢性の肝炎と肝細胞癌（ＨＣＣ）を引き起こす重要なヒト病原体である。効果的なＨＢＶワクチンが利用可能であるが、世界中で２億４０００万人以上がＨＢＶに慢性的に感染していると推定される。未治療の人はウイルスキャリアとして機能し、肝硬変およびＨＣＣを発症するリスクが高い。ペグ化インターフェロンおよびヌクレオシド類似体（ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、およびテノホビルなど）を含む慢性Ｂ型肝炎の現在の治療レジメンは、ＨＢＶのＤＮＡ複製を抑制することができる。しかし、持続的な反応を示したのはペグ化インターフェロンで治療を受けた患者の約３％〜７％、およびヌクレオシド類似体で治療を受けた患者の１％〜１２％にすぎない。さらに、ヌクレオシド類似体による治療は、薬剤耐性ＨＢＶ変異体を誘発する可能性がある。したがって、慢性ＨＢＶ感染症の治療のための他の治療戦略を検討する必要がある。
【０００３】
肝臓は体内で最大の臓器であり、解毒、代謝活動、および栄養素の貯蔵を担う。さらに、肝臓は、自然免疫が優勢で適応免疫が少なく、免疫寛容を誘導するなど、独自の特性を備えた免疫器官である。したがって、肝臓は通常、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、またはマラリアなどの多くの重要な病原体を除去するための効果的な免疫応答を発揮することができない。これらの病原体は、免疫監視を回避し、肝微小環境での持続的な感染を維持することができる。持続的な感染を完全に取り除くためには、肝臓の免疫寛容を逆転させることが重要である。
【０００４】
ＣＤ１１ｂは、クッパー細胞（肝臓に存在するマクロファージ）、樹状細胞（ＤＣ）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、およびＢ細胞とＴ細胞のサブセットを含む肝免疫細胞の表面に発現するＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１１ｂはインテグリンアルファＭ（ＩＴＧＡＭ）とも呼ばれ、β鎖パートナーであるＣＤ１８と非共有結合して、機能的なインテグリンであるヘテロダイマーＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を形成する。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、マクロファージ−１抗原（Ｍａｃ−１）または補体受容体３（ＣＲ３）とも呼ばれ、細胞接着、遊走、走化性、および食作用を調節することによって炎症を仲介する。
【０００５】
最近の研究では、活性化されたＣＤ１１ｂが、ユビキチンを介したＭｙＤ８８およびＴＲＩＦの分解を介してＴＬＲシグナル伝達を負に調節することが示されている（Ｃ．Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１０、１１（８）：７３４−４２）。活性化されたＣＤ１１ｂはまた、ＤＣ機能を負に調節してＴ細胞の活性化を抑制し、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達を負に調節してＢ細胞の寛容を維持する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃ．Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０，１１（８）：７３４−４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、肝骨髄性およびリンパ性免疫細胞集団へのＣＤ１１ｂの結合に基づいて免疫応答を調節する方法に関する。特に、抗ＣＤ１１ｂ抗体によるＣＤ１１ｂへの結合は、ＣＤ１１ｂ＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ８６の表面発現を増加させる効果、血中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびＨＢＶ  ＤＮＡのレベルを抑制する効果、および肝臓からのＨＢＶクリアランスを加速させる効果の１つまたは複数を有する免疫刺激環境をトリガーする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、Ｂ型肝炎ウイルス感染症の治療に使用するための医薬組成物に関する。本発明の一実施形態による医薬組成物は、ＣＤ１１ｂに対する有効量の抗体またはその結合フラグメントを含む。有効量とは、目的の効果が得られる量である。当業者は、有効量が患者の状態、年齢、性別などに依存し、有効量は、過度の実験なしに日常的なスキルを使用して決定できることを理解するであろう。抗体からの結合フラグメントには、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０００９】
本発明の実施形態によれば、ＣＤ１１ｂに対する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。ＣＤ１１ｂに対する抗体は、ＮＹＷＩＮ（配列番号１）またはＧＦＳＬＴＳＮＳＩＳ（配列番号２）のアミノ酸残基から構成される重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＮＩＹＰＳＤＴＹＩＮＨＮＱＫＦＫＤ（配列番号３）またはＡＩＷＳＧＧＧＴＤＹＮＳＤＬＫＳ（配列番号４）のアミノ酸残基から構成される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、およびＳＡＹＡＮＹＦＤＹ（配列番号５）またはＲＧＧＹＰＹＹＦＤＹ（配列番号６）のアミノ酸残基から構成される重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、ならびにＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＨ（配列番号７）またはＫＳＳＱＳＬＬＹＳＥＮＱＥＮＹＬＡ（配列番号８）のアミノ酸残基から構成される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、ＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号９）またはＷＡＳＴＲＱＳ（配列番号１０）のアミノ酸残基から構成される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、およびアミノ酸残基ＱＱＳＤＳＷＰＴＬＴ（配列番号１１）またはＱＱＹＹＤＴＰＬＴ（配列番号１２）から構成される軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み得る。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ１１ｂに対する抗体は、（ａ）配列番号１３の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２３の配列を含む軽鎖可変領域、（ｂ）配列番号１４の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２４の配列を含む軽鎖可変領域、（ｃ）配列番号１５の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２５の配列を含む軽鎖可変領域、（ｄ）配列番号１６の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２６の配列を含む軽鎖可変領域、（ｅ）配列番号１７の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２７の配列を含む軽鎖可変領域、（ｆ）配列番号１８の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２８の配列を含む軽鎖可変領域、（ｇ）配列番号１９の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２９の配列を含む軽鎖可変領域、（ｈ）配列番号２０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３０の配列を含む軽鎖可変領域、（ｉ）配列番号２１の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３１の配列を含む軽鎖可変領域、または（ｊ）配列番号２２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３２の配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１１】
本発明の一態様は、ＨＢＶ感染症を治療するための方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、ＣＤ１１ｂに対する有効量の抗体をそれを必要とする対象に投与することを含む。ＣＤ１１ｂに結合する抗ＣＤ１１ｂ抗体は、ＣＤ１１ｂ＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ８６の表面発現の増加、血中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびＨＢＶ  ＤＮＡのレベルの抑制、ならびに肝臓からのＨＢＶクリアランスの加速の観察結果から明らかであるように、免疫刺激応答をトリガーする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の一実施形態による治療プロトコルを示す概略図である。
【図２】図２は、抗体治療後のハイドロダイナミックインジェクションＨＢＶキャリアマウスのＣＤ１１ｂ＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ８６の表面発現を示す図である。
【図３】図３は、抗体治療後のハイドロダイナミックインジェクションＨＢＶキャリアマウスにおける血清ＨＢｓＡｇの動的変化を示す図である。データは平均±ＳＥＭとして示されている（＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。
【図４】図４は、抗体治療後のハイドロダイナミックインジェクションＨＢＶキャリアマウスにおける血清ＨＢＶ  ＤＮＡの動的変化を示す図である。データは平均±ＳＥＭとして示されている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。
【図５】図５は、抗体治療後のハイドロダイナミックインジェクションＨＢＶキャリアマウスにおけるＣＤ１１ｂ＋ＰＢＭＣ上の血清ＨＢＶ  ＤＮＡ、ＭＨＣ  ＩＩ、およびＣＤ８６発現のレベル間の関係を示す図である。相関は、ピアソンの相関係数を使用して決定された。
【図６】図６Ａは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＣＤ１１ｂの発現を示す図である。図６Ｂは、ＨＢｓＡｇの力価を示す図であり、図６Ｃは、抗ＣＤ１１ｂ抗体治療後のＨＢＶトランスフェクトＨｅｐＧ２細胞のアポリポプロテインＢ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ−Ｂ）ＲＮＡ発現の力価を示す図である。データは平均±ＳＥＭとして示されている。
【図７】図７は、肝臓におけるＨＢＶ  ＤＮＡの定量化の結果を示す図である。全肝臓ＤＮＡを抽出し、ＨＢｘ特異的プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより１μｇのｇＤＮＡを測定した。各ドットは、１個のマウス肝臓からのＨＢＶ  ＤＮＡを表す。検出限界は１０００コピー／μｇである。
【図８】図８は、１０個のヒト化抗ＣＤ１１ｂ抗体の軽鎖可変領域配列を示す図である。
【図９】図９は、１０個のヒト化抗ＣＤ１１ｂ抗体の重鎖可変領域配列を示す図である。
【図１０】図１０は、フローサイトメトリーで分析した、Ｋ５６２細胞上に発現したＣＤ１１ｂへの１０個のヒト化抗ＣＤ１１ｂ抗体の結合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施形態は、ＨＢＶ感染症の状態を治療または緩和する方法に関する。本発明の方法は、抗体またはその結合フラグメント、肝骨髄性およびリンパ性免疫細胞集団上のＣＤ１１ｂへの結合による免疫応答の調節に基づく。本発明の発明者は、抗ＣＤ１１ｂ抗体によるＣＤ１１ｂへの結合が、ＣＤ１１ｂ＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ８６の表面発現を増加させる効果、血中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびＨＢＶ  ＤＮＡのレベルを抑制する効果、および肝臓からのＨＢＶクリアランスを加速させる効果の１つまたは複数を有する免疫刺激環境をトリガーすることを発見した。
【００１４】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、共有結合で閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）ゲノムを有するエンベロープウイルスである。ＨＢＶ感染症は、急性および慢性の炎症性肝疾患を引き起こす。長期のＨＢＶ感染症は、肝硬変や肝細胞癌を引き起こす可能性がある。ＨＢＶの長期の慢性感染は、ＨＢＶ特異的免疫応答の障害に起因し、そのため、免疫系は感染した肝細胞を排除または治癒することができない。
【００１５】
ＣＤ１１ｂは、クッパー細胞（肝臓に存在するマクロファージ）、樹状細胞（ＤＣ）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、およびＢ細胞とＴ細胞のサブセットを含む肝免疫細胞の表面に発現するＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１１ｂはインテグリンアルファＭ（ＩＴＧＡＭ）とも呼ばれ、β鎖パートナーであるＣＤ１８と非共有結合して、機能的なインテグリンであるヘテロダイマーＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を形成する。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８は、マクロファージ−１抗原（Ｍａｃ−１）または補体受容体３（ＣＲ３）とも呼ばれ、細胞接着、遊走、走化性、および食作用を調節することによって炎症を仲介する。
【００１６】
全身性エリテマトーデスでは、インテグリン−αＭの変異体（ＣＤ１１ｂ変異体）は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の架橋に対して過剰増殖反応を示す自己反応性Ｂ細胞に関連している。Ｄｉｎｇらは、ＣＤ１１ｂの野生型または狼瘡関連変異体でトランスフェクトされたＢ細胞を使用し、変異体ＣＤ１１ｂの変異が、ＣＤ２２−ＣＤ１１ｂの直接結合を破壊することにより、ＢＣＲシグナル伝達に対するＣＤ１１ｂの調節効果を無効にすることを発見した。（Ｃ．Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３；４：２８１３）。Ｄｉｎｇらは、ＣＤ１１ｂがＢＣＲシグナル伝達を負に調節して、自己反応性Ｂ細胞寛容を維持すると結論付けている。
【００１７】
ただし、ＣＤ１１ｂは、様々なシステムや疾患で様々な役割を果たす可能性がある。たとえば、ＣＤ１１ｂ欠損症は、マクロファージのＴＬＲ媒介性応答を増強し、マウスをエンドトキシンショックおよび大腸菌による敗血症に対してより感受性にし、ＣＤ１１ｂがＭｙＤ８８およびＴＲＩＦのユビキチン媒介性分解を介してＴＬＲシグナル伝達を負に調節することを示唆する（Ｃ．Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０、１１（８）：７３４−４２）。インテグリン−αＭ（ＣＤ１１ｂ）がＨＢＶ感染症などの肝疾患に何らかの役割を果たすかどうかは不明である。
【００１８】
したがって、本発明の発明者は、ＣＤ１１ｂがＨＢＶ感染症において何らかの役割を果たすかどうかを調査することに着手した。予期せぬことに、発明者は、ＣＤ１１ｂが慢性ＨＢＶ感染症に対する肝免疫応答に実際に関与していることを発見した。簡単に説明すると、ＣＤ１１ｂに抗ＣＤ１１ｂ抗体を結合することによるＣＤ１１ｂ機能の阻害は、ＣＤ１１ｂ＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ８６の表面発現の増加、血中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびＨＢＶ  ＤＮＡのレベルの抑制、ならびに肝臓からのＨＢＶクリアランスの加速によって証明されるように、免疫刺激応答をもたらした。
【００１９】
これらの予想外の発見に基づいて、本発明の実施形態は、ＨＢＶ感染症の状態を制御または治療または緩和するための方法に関する。本発明の方法は、ＣＤ１１ｂ、特に肝骨髄細胞およびリンパ性免疫細胞上のＣＤ１１ｂへの抗体結合に基づく。本発明の実施形態は、以下の特定の例で説明される。当業者は、これらの実施例が例示のみであり、本発明の範囲から逸脱することなく他の修正および変形が可能であるため、本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解するであろう。
【００２０】
抗ＣＤ１１ｂ抗体
本発明の実施形態では、様々な抗ＣＤ１１ｂ抗体を使用してよく、抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得、市販の抗体も含まれる。いくつかの抗ＣＤ１１ｂ抗体は、様々なベンダーから市販されている。たとえば、ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（Ｍ１／７０）、ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（Ｍ１／７０．１５）、およびＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（ＩＣＲＦ４４）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）などから入手できる。本発明の実施形態では、これらの市販の抗ＣＤ１１ｂ抗体またはそのＣＤ１１ｂ結合フラグメントのいずれかが使用され得る。
【００２１】
さらに、本発明者は、ＣＤ１１ｂに特異的に結合するいくつかのモノクローナル抗体とヒト化抗体を生成した。これらの抗体は、同様の生物学的活性を有することがわかった。モノクローナル抗体の製造および抗体のヒト化には、当技術分野で知られている技術が使用される（米国特許第２０１８／０３６２６５１号明細書を参照、その開示は参照により組み込まれる）。ヒト化のために、マウス抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体の可変ドメイン配列をヒト抗体データベースに対して検索した。例として、マウス抗ヒトＣＤ１１ｂと高い相同性を有する１０セットのヒトフレームワーク配列を、軽鎖および重鎖の両方のヒトアクセプターとして選択した。一方で、Ｎ−グリコシル化モチーフを分析した。したがって、ヒト可変領域候補における潜在的なグリコシル化部位は避けられるはずである。１０個の軽鎖ヒト化可変ドメインをＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＬＣ１、ＬＣ２、ＬＣ３、ＬＣ４、およびＬＣ５として示し（図８）、１０個の重鎖ヒト化可変ドメインをＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３、ＨＣ４、およびＨＣ５として示した（図９）。これらの軽鎖および重鎖ペプチド配列は、ヒト抗ＣＤ１１ｂに高い親和性で結合するヒト化抗体または抗原結合部分を提供する。
【００２２】
ヒト化抗ＣＤ１１ｂ抗体の特異性を、ＣＤ１１ｂ発現ベクターでトランスフェクトされたＫ５６２細胞を使用したフローサイトメトリーで決定した。図１０に示すように、試験したすべてのヒト化抗ＣＤ１１ｂ抗体は、ＣＤ１１ｂ発現Ｋ５６２細胞に結合することができた。対照的に、これらの抗体は、トランスフェクトされていないＫ５６２細胞に結合しなかった。これらの結果は、ヒト化抗ＣＤ１１ｂ抗体がＣＤ１１ｂエピトープに特異的に結合できることを示す。なお、重鎖と軽鎖のすべての組み合わせまたは順列がＣＤ１１ｂにしっかりと結合する。同様に、これらのヒト化抗体はＨｅｐＧ２細胞上のＣＤ１１ｂにも特異的に結合する。
【００２３】
本発明の実施形態では、ＮＹＷＩＮ（配列番号１）またはＧＦＳＬＴＳＮＳＩＳ（配列番号２）のアミノ酸残基から構成される重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＮＩＹＰＳＤＴＹＩＮＨＮＱＫＦＫＤ（配列番号３）またはＡＩＷＳＧＧＧＴＤＹＮＳＤＬＫＳ（配列番号４）のアミノ酸残基から構成される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、およびＳＡＹＡＮＹＦＤＹ（配列番号５）またはＲＧＧＹＰＹＹＦＤＹ（配列番号６）のアミノ酸残基から構成される重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）の少なくとも１つと、ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＨ（配列番号７）またはＫＳＳＱＳＬＬＹＳＥＮＱＥＮＹＬＡ（配列番号８）のアミノ酸残基から構成される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、ＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号９）またはＷＡＳＴＲＱＳ（配列番号１０）のアミノ酸残基から構成される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、およびアミノ酸残基ＱＱＳＤＳＷＰＴＬＴ（配列番号１１）またはＱＱＹＹＤＴＰＬＴ（配列番号１２）から構成される軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）の少なくとも１つとを含む、上記の抗ＣＤ１１ｂ抗体、またはその抗原結合部分のいずれかが使用され得る。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態において、抗ＣＤ１１ｂ抗体またはその抗原結合部分は、（ｉ）配列番号１を含むＨ−ＣＤＲ１と、配列番号３を含むＨ−ＣＤＲ２と、配列番号５を含むＨ−ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および（ｉｉ）配列番号７を含むＬ−ＣＤＲ１と、配列番号９を含むＬ−ＣＤＲ２と、配列番号１１を含むＬ−ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域、または（ｉｉｉ）配列番号２を含むＨ−ＣＤＲ１と、配列番号４を含むＨ−ＣＤＲ２と、配列番号６を含むＨ−ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および（ｉｖ）配列番号８を含むＬ−ＣＤＲ１と、配列番号１０を含むＬ−ＣＤＲ２と、配列番号１２を含むＬ−ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化抗ＣＤ１１ｂ抗体またはその抗原結合部分は、
【００２６】
（ａ）配列番号１３から構成されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２３から構成されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１４から構成されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２４から構成されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号１５から構成されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２５から構成されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号１６から構成されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２６から構成されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｅ）配列番号１７から構成されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２７から構成されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｆ）配列番号１８から構成されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２８から構成されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｇ）配列番号１９から構成されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２９から構成されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｈ）配列番号２０から構成されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３０から構成されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｉ）配列番号２１から構成されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３１から構成されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｊ）配列番号２２から構成されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３２から構成されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００２７】
抗ＣＤ１１ｂ抗体による治療は、ＣＤ１１ｂ＋免疫細胞の抗原提示能力を増強した。
慢性ＨＢＶ感染症に対する抗ＣＤ１１ｂ抗体の治療効果を評価するために、ＣＢＡ／ｃａＪマウスへのｐＡＡＶ／ＨＢＶ１．２プラスミドのハイドロダイナミックインジェクション（ＨＤＩ）によって作成したＨＢＶキャリアマウスモデルを利用した。簡単に説明すると、１０マイクログラムのｐＡＡＶ／ＨＢＶ１．２ＤＮＡを雄のＣＢＡ／ｃａＪマウスの尾静脈にハイドロダイナミック法により注射した。注射後、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ  ＤＮＡの血清レベルをモニターするためにマウスから定期的に採血した（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００６  Ｎｏｖ．２１；１０３（４７）：１７８６２−１７８６７）。
【００２８】
ＨＢＶキャリアマウスは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、および高レベルの血清ＨＢＶ  ＤＮＡを発現したが、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルは正常であり、肝臓の重大な炎症はなかった。ＨＢＶ持続性に関するこのマウスモデルの特徴は、免疫寛容期のヒト慢性ＨＢＶ感染症の特徴に類似している。（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１５  Ｆｅｂ  １７；１１２（７）：２１７５−８０）。
【００２９】
図１に示すように、ＨＢＶキャリアマウス（ハイドロダイナミックインジェクションの４週間後）を２群に分け、５ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ（ｃｔｒｌ  ＩｇＧ）または抗ＣＤ１１ｂ抗体で治療した。注射は３〜４日ごとに４回繰り返した。２、４、６、および８週目に、分析のために血液サンプルを採取した。
【００３０】
ＨＢＶキャリアマウスにおけるＣＤ１１ｂ＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の活性化状態を、最初の抗体治療の２週間後に評価した。対照ＩｇＧ治療マウスと比較して、抗ＣＤ１１ｂ抗体の投与は、ＣＤ１１ｂ＋ＰＢＭＣにおけるＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ８６の発現レベルの増加をもたらした（図２）。これらの結果は、抗ＣＤ１１ｂ抗体による治療が、ＣＤ１１ｂ＋免疫細胞の抗原提示能力を高めることができることを示し、これは、ＨＢＶキャリアマウスのウイルスを排除する自然免疫および養子免疫の活性化に有利であろう。したがって、抗ＣＤ１１ｂ抗体は、ＨＢＶ感染症の治療に有用な治療法となり得る。
【００３１】
抗ＣＤ１１ｂ抗体治療は、ＨＢＶ感染症のクリアランスを加速させる。
ＨＢＶキャリアマウスの慢性ＨＢＶ感染症に対する抗ＣＤ１１ｂ抗体の治療効果を調べた。抗ＣＤ１１ｂ抗体による治療は、対照ＩｇＧ治療群と比較して、抗体注射の２週間後に血清ＨＢｓＡｇレベルを著しく阻害した（図３）。抗ＣＤ１１ｂ抗体治療はまた、最初の抗体注射の２週間後にＨＢＶ複製のレベルを劇的に低下させた（より低いＤＮＡレベルによって証明される）（図４）。抗ＣＤ１１ｂ抗体を数週間投与したマウスでは、持続的なウイルス抑制が観察された。さらに、血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ  ＤＮＡのリバウンドは、抗ＣＤ１１ｂ抗体で治療したほとんどのマウスでは発生しなかった（図３および図４）。感染のリバウンドがないということは、ウイルスが一時的に抑制されるのではなく、強化された免疫応答によって排除されることを示す。これらの結果は、抗ＣＤ１１ｂ抗体治療がＨＢＶクリアランスの加速を誘導することができ、感染の再発が起こらないことを示す。
【００３２】
抗ＣＤ１１ｂ抗体治療による抗原提示能力の増強は、ＨＢＶ感染症のクリアランスに関連している。
上記のように、抗ＣＤ１１ｂ抗体による治療は、ＣＤ１１ｂ＋免疫細胞の抗原提示能力を高め、免疫応答を高めることができる。ＨＢＶ感染症のクリアランスとＣＤ１１ｂ＋免疫細胞の抗原提示能力との間に関係があるかどうかを調査するために、ＣＤ１１ｂ＋ＰＢＭＣにおける血清ＨＢＶ  ＤＮＡ、ＭＨＣ  ＩＩ、およびＣＤ８６発現の相関を評価した。
【００３３】
図５に示すように、ＣＤ１１ｂ＋ＰＢＭＣにおけるＭＨＣＩＩおよびＣＤ８６の表面発現の増加は、血清ＨＢＶ  ＤＮＡのレベルと負の相関がある。これらの結果は、抗ＣＤ１１ｂ抗体治療による抗原提示能力の増強が、ＨＢＶ感染症のクリアランスの増強と関連していることを示す。
【００３４】
抗ＣＤ１１ｂ抗体は、ＨＢＶをトランスフェクトしたヒト肝細胞腫ＨｅｐＧ２細胞株のＨＢｓＡｇ産生を阻害し、ＨＢＶ共有閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）を分解する可能性のあるアポリポプロテインＢ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）タンパク質を含むＤＮＡデアミナーゼを誘導する。
上記のＨＢＶマウスモデルに加えて、ＨＢＶ感染症の治療における抗ＣＤ１１ｂ抗体の有効性も、ヒトＨＢＶ感染ＨｅｐＧ２細胞を使用して調査した。細胞表面でのＣＤ１１ｂ発現をフローサイトメトリーによって評価した。図６Ａに示すように、ＨｅｐＧ２細胞におけるＣＤ１１ｂの発現は、ヒト単球におけるＣＤ１１ｂの発現よりもはるかに低い。ヒトＨｅｐＧ２細胞にＨＢＶプラスミドをトランスフェクトし、培養スープ中のＨＢｓＡｇの力価をＨＢｓＡｇ定量ＥＬＩＳＡキットで評価した。３日間の抗ＣＤ１１ｂ抗体治療後、ＨＢＶトランスフェクトＨｅｐＧ２細胞のＨＢｓＡｇの力価は、急速かつ有意に減少した（図６Ｂ）。
【００３５】
ＡＰＯＢＥＣ３Ｂは、ＨＢＶの細胞制限因子であることがわかっているシチジンデアミナーゼであり、なぜならＡＰＯＢＥＣ３Ｂは核内のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを編集して、その分解を引き起こすことができるためである。（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ、２０１８  Ｊａｎ；１４９：１６−２５）。ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ発現ＲＮＡは、抗ＣＤ１１ｂ抗体で治療したＨＢＶトランスフェクトＨｅｐＧ２細胞において増加した（図６Ｃ）。これらの結果は、非細胞溶解性のメカニズムが、抗ＣＤ１１ｂ抗体での治療後のＨＢｓＡｇクリアランスに少なくとも部分的に関与していることを示唆している。さらに、抗ＣＤ１１ｂ抗体による治療は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの機能的阻害および／または分解を伴う可能性があり、これがエピジェネティック修飾、ＤＮＡデアミナーゼＡＰＯＢＥＣタンパク質、マイクロＲＮＡの誘導、弛緩した環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）からｃｃｃＤＮＡへの変換の阻害、核へのｒｃＤＮＡ輸送の遮断、および／またはｃｃｃＤＮＡ転写の阻害を通じて抗ＣＤ１１ｂ抗体の標的となり得る。
【００３６】
抗ＣＤ１１ｂ抗体による治療は、肝臓でＨＢＶ  ＤＮＡの減少を誘発する。
上記の結果は、抗ＣＤ１１ｂ抗体がＨＢｓＡｇおよびＤＮＡのレベルを著しく低下させることができることを示す。これがＨＢＶの一時的な抑制（ウイルスの休止状態など）によるものか、または長期的な効果（ＨＢＶの低下または肝臓からの除去など）によるものかは、治療のずっと後に肝臓のＨＢＶ  ＤＮＡのレベルを評価することによってさらに調査される。たとえば、抗ＣＤ１１ｂ抗体治療の３６週間後に、肝臓に存在するＨＢＶ  ＤＮＡを定量化した。簡単に説明すると、肝臓を液体窒素中で粉砕し、肝臓の全ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。ＨＢＶ  ＤＮＡをＨＢｘ特異的プライマー（フォワードプライマー：５’−ＣＣＧＡＴＣＣＡＴＡＣＴＧＣＧＧＡＡＣ−３’、配列番号３３；リバースプライマー：５’−ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡ−３’、配列番号３４）を使用したリアルタイムＰＣＲで検出した。
【００３７】
図７は、この研究の結果を示す。ＨＢＶ  ＤＮＡは、１μｇのマウスｇＤＮＡのコピー数を表す。ＨＢＶ  ＤＮＡの平均値は、対照ＩｇＧ治療群が１．０１ｘ１０６、抗ＣＤ１１ｂ抗体治療群が２．２６ｘ１０５であった。したがって、抗ＣＤ１１ｂ抗体治療群のＨＢＶのコピー数は、対照ＩｇＧ治療群よりも著しく低い（約２２％）。肝臓のＨＢＶクリアランス率は、対照ＩｇＧ治療群および抗ＣＤ１１ｂ抗体治療群でそれぞれ１２．５％（８匹中１匹はＨＢＶ  ＤＮＡが検出できなかった）および３７．５％（８匹中３匹はＨＢＶ  ＤＮＡが検出できなかった）であった。これらの結果は、肝臓のＨＢＶ  ＤＮＡが抗ＣＤ１１ｂ抗体で治療されたマウスで著しく減少したことを示す。さらに重要なことに、これらは治療のずっと後の結果であり、治療効果が持続的であり、ウイルスの一時的な抑制ではなく、肝臓からのウイルスの除去によるものであることを示唆している。したがって、抗ＣＤ１１ｂ抗体を使用する本発明の方法は、ＨＢＶ感染症の治療に非常に有望である。
【００３８】
材料および方法
ハイドロダイナミックインジェクションＨＢＶキャリアマウスと治療プロトコル
８％体重のＰＢＳに溶解した合計１０μｇのｐＡＡＶ／ＨＢＶ１．２を、６〜８週齢のＣＢＡ／ｃａＪマウスの尾静脈に注射した。全量を５〜７秒以内に送達した。（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０１５；１１２（７）：２１７５−８０）。ｐＡＡＶ／ＨＢＶ１．２には、ＡＡＶの逆位末端反復配列に隣接するヌクレオチド１４００−３１８２／１−１９８７にまたがるＨＢＶフラグメントが含まれている。（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００６，１０３（４７）：１７８６２−１７８６７）。４週間後、マウスを５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ１１ｂ  Ａｂまたはアイソタイプ対照Ａｂで腹腔内（ｉ．ｐ．）処置した。注射は３〜４日ごとに４回繰り返した。すべてのマウスは、国立台湾大学医学部動物センター研究所で特定病原体除去条件下で飼育された。実験は、国立台湾大学医学部によって指定された実験動物使用のガイドラインに従って実施された。
【００３９】
血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ  ＤＮＡ分析
血清Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、ＡＸＳＹＭ（登録商標）システムキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ、米国イリノイ州アボットパーク）を使用して定量化した。製造業者のプロトコルに従ってアッセイを実施した。血清ＨＢＶ  ＤＮＡを検出するために、各血清サンプルから全ＤＮＡを抽出し、ＨＢｘ特異的プライマーを使用したリアルタイムＰＣＲによってＨＢＶ  ＤＮＡを検出した。
【００４０】
肝臓ＨＢＶ  ＤＮＡ分析
肝臓のＨＢＶ  ＤＮＡを検出するために、肝臓を液体窒素中で粉砕し、市販のキットを使用して肝臓の全ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。ＨＢＶ  ＤＮＡは、ＨＢｘ特異的プライマー（上記）を使用したリアルタイムＰＣＲで検出した。
【００４１】
フローサイトメトリー分析
ＣＤ１１ｂ＋ＰＢＭＣの抗原提示能力を、ＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ８６マーカーの発現について調べた。ＰＢＭＣを蛍光標識抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０、ＩＣＲＦ４４）、ＣＤ８６（ＧＬ−１）、ＭＨＣ  ＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）、または適切なアイソタイプ対照抗体とともに２０分間インキュベートした。サンプルをＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ（米国インディアナ州インディアナポリス）のＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターにかけ、データの取得と分析はＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒのＫａｌｕｚａ分析ソフトウェアバージョン２．０を使用して行った。
【００４２】
ＨｅｐＧ２細胞感染アッセイ
ＨｅｐＧ２細胞を１０％ＤＭＥＭ培地で維持し、ｐＡＡＶ／ＨＢＶ１．２プラスミド（台湾、台北、国立台湾大学のＤｒ．ＰＥＩ−ＪＥＲ  ＣＨＥＮから提供された）をトランスフェクトし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用し、８時間インキュベートした。トランスフェクション後、細胞をＰＢＳで３回リンスし、抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を含む／含まない１０％ＤＭＥＭ培地で継続的に培養した。細胞培養スープを毎日採取し、ＨＢｓＡｇの力価をＨＢｓＡｇ定量ＥＬＩＳＡキット、Ｒａｐｉｄ−ＩＩ（Ｂｅａｃｌｅ  Ｉｎｃ．、日本、京都）で測定した。ＨｅｐＧ２細胞のＲＮＡをＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ  Ｋｉｔで抽出し、ＤＮａｓｅで処理してゲノムＤＮＡの混入を除去した。ＡＰＯＢＥＣ３の遺伝子発現を、前述のようにリアルタイムＰＣＲで評価した（Ｊ．Ｌｕｃｉｆｏｒａ  ｅｔ  ａｌ、核Ｂ型肝炎ウイルスの特異的および非肝毒性分解、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４  Ｍａｒ  １４；３４３（６１７６）：１２２１−８）。
【００４３】
統計分析
Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してデータを分析し、平均±ＳＥＭとして表した。群間の比較は、スチューデントのｔ検定を使用して行った。相関は、ピアソンの相関係数を使用して決定された。０．０５未満のｐ値を有意であると見なした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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