(57)【要約】本明細書では、１つ以上のクレブス回路調節ポリペプチド、及び、関係する標的抗原に結合することができる任意のキメラ受容体ポリペプチド（例えば、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチド、または、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド）を発現する、遺伝子操作した造血細胞を開示している。本明細書では、標的抗原を発現する細胞を阻害する操作した造血細胞について、それを必要とする対象での使用も開示している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作した造血細胞であって、同じタイプのネイティブ造血細胞と比較して、調節を施したクレブス回路を有する、前記造血細胞。
【請求項２】
前記造血細胞が、（ｉ）クレブス回路調節因子を発現する、または、過剰に発現する、請求項１に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項３】
前記クレブス回路調節因子が、クレブス回路調節ポリペプチドである、請求項２に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項４】
前記クレブス回路調節ポリペプチドが、（ａ）前記クレブス回路での反応を触媒する酵素、（ｂ）クレブス回路代謝産物を基質として使用する酵素、または、（ｃ）前駆体を、クレブス回路代謝産物に変換する酵素である、請求項３に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項５】
前記クレブス回路調節ポリペプチドが、（ａ）であり、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、または、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）である、請求項４に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項６】
前記ＩＤＨが、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２である、及び／または、前記ＭＤＨが、ＭＤＨ１またはＭＤＨ２である、請求項５に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項７】
前記クレブス回路調節ポリペプチドが、（ｂ）であり、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、または、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）である、請求項４に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項８】
前記ＧＯＴが、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２である、請求項７に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項９】
前記クレブス回路調節ポリペプチドが、（ｃ）であり、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡＴ１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ１）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ１（ＧＰＴ１）、または、グルタミナーゼ（ＧＬＳ）である、請求項４に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項１０】
前記造血細胞が：
（ｉｉ）キメラ受容体ポリペプチドをさらに発現するものであり、前記キメラ受容体ポリペプチドは：
（ａ）細胞外標的結合ドメイン；
（ｂ）膜貫通ドメイン；及び、
（ｃ）細胞質シグナル伝達ドメイン、
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項１１】
前記キメラ受容体ポリペプチドは、（ａ）が細胞外Ｆｃ結合ドメインである、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドである、請求項１０に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項１２】
前記キメラ受容体ポリペプチドは、（ａ）が細胞外抗原結合ドメインである、キメラ受容体抗原（ＣＡＲ）ポリペプチドである、請求項１０に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項１３】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項１４】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、任意に、ＡＣＴＲポリペプチドであり、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項１５】
前記細胞質シグナル伝達ドメインが、免疫受容体チロシンをベースとした活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項１６】
（ｃ）が、前記キメラ受容体ポリペプチドのＣ末端に位置している、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項１７】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、（ａ）のＣ末端と、（ｂ）のＮ末端に位置するヒンジドメインをさらに含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項１８】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、そのＮ末端に、シグナルペプチドをさらに含む、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項１９】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、ＡＣＴＲポリペプチドであり、前記細胞外標的結合ドメイン（ａ）が、細胞外Ｆｃ結合ドメインであり、かつ、前記Ｆｃ結合ドメインを：
（Ａ）Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、
（Ｂ）免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する抗体フラグメント、
（Ｃ）免疫グロブリンのＦｃ部分、または、そのＦｃ結合フラグメントに結合する天然タンパク質、及び、
（Ｄ）免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する合成ポリペプチド、
からなる群から選択する、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項２０】
前記Ｆｃ結合ドメインが、（Ａ）であり、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、または、Ｆｃイプシロン受容体の細胞外リガンド結合ドメインである、請求項１９に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項２１】
前記Ｆｃ結合ドメインが、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ａ、または、ＣＤ６４Ａの細胞外リガンド結合ドメインである、請求項２０に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項２２】
前記Ｆｃ結合ドメインが、Ｆ１５８  ＣＤ１６Ａ、または、Ｖ１５８  ＣＤ１６Ａの細胞外リガンド結合ドメインである、請求項２０に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項２３】
前記Ｆｃ結合ドメインが、（Ｂ）であり、一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）、または、単一ドメイン抗体である、請求項１９に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項２４】
前記Ｆｃ結合ドメインが、（Ｃ）であり、プロテインＡもしくはプロテインＧ、または、それらのＦｃ結合フラグメントである、請求項１９に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項２５】
前記Ｆｃ結合ドメインが、（Ｄ）であり、Ｋｕｎｉｔｚペプチド、ＳＭＩＰ、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、または、アンチカリンである、請求項１９に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項２６】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、ＣＡＲポリペプチドであり、（ａ）の前記細胞外標的結合ドメインが、抗原結合ドメインであり、かつ、前記抗原結合ドメインが、腫瘍抗原、病原性抗原、または、自己抗原に特異的な免疫細胞に結合する一本鎖抗体フラグメントである、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項２７】
前記腫瘍抗原が、血液腫瘍に関連している、請求項２６に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項２８】
前記腫瘍抗原を、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＬｅＹ、ＣＤ１３８、ＣＤ５、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ４０、及び、ＩＬ−１ＲＡＰからなる群から選択する、請求項２７に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項２９】
前記腫瘍抗原は、固形腫瘍と関連している、請求項２６に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項３０】
前記腫瘍抗原を、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＦＯＬＲ、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥＦＧＲＶＩＩＩ、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦＲ２、ＲＯＲ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤ１７１、ＣＤ１３３、ＰＳＣＡ、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ、ＣＤ７０、ＭＵＣ１６、Ｌ１−ＣＡＭ、及び、ＣＡＩＸからなる群から選択する、請求項２９に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項３１】
前記病原性抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、または、真菌抗原である、請求項２６に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項３２】
前記（ｂ）の膜貫通ドメインが、１回貫通型膜タンパク質のものである、請求項１０〜３１のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項３３】
前記膜貫通ドメインを、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６Ａ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及び、ＦＧＦＲ２Ｂからなる群から選択する膜タンパク質のものである、請求項３２に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項３４】
前記（ｂ）の膜貫通ドメインが、非天然疎水性タンパク質セグメントである、請求項１０〜３１のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２８LL→GGバリアント、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、及び、ＣＤ２からなる群から選択する共刺激分子のものである、請求項１０〜１３、及び、１５〜３４のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、または、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項３５に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項３７】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１０〜１３、及び、１５〜３６のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項３８】
前記２つの共刺激ドメインが、
（ｉ）ＣＤ２８、及び、４−１ＢＢ；または、
（ｉｉ）ＣＤ２８LL→GGバリアント、及び、４−１ＢＢ
である、請求項３７に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項３９】
前記共刺激シグナル伝達ドメインの内の一方が、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインであり；及び、他方の共刺激ドメインを、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメイン、及び、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメインからなる群から選択する、請求項３７に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項４０】
前記（ｃ）の細胞質シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γの細胞質ドメインである、請求項１０〜３９のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項４１】
前記ヒンジドメインが、１〜６０アミノ酸長である、請求項１７〜４０のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項４２】
前記ヒンジドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ８α、または、ＩｇＧのものである、請求項１７〜４１のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項４３】
前記ヒンジドメインが、非天然ペプチドである、請求項１７〜４２のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項４４】
前記ヒンジドメインが、延長型組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）または（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）nポリペプチドであり、ｎは、３〜１２の整数であり、３と１２の整数を含む、請求項４３に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項４５】
前記キメラ受容体ポリペプチドは、任意に、ＡＣＴＲポリペプチドであり、あらゆるヒンジドメインを含まない、請求項１０〜１６、及び、１８〜４０のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項４６】
前記キメラ受容体ポリペプチドは、任意に、ＡＣＴＲポリペプチドであり、あらゆる非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含まない、請求項１０〜４４のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項４７】
前記ＡＣＴＲポリペプチドが、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン；及び、（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、または、これらの組み合わせを含む、請求項１９に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項４８】
前記ＡＣＴＲポリペプチドが、表３に示す構成要素（ａ）〜（ｅ）を含む、請求項１９に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項４９】
前記ＡＣＴＲポリペプチドが、配列番号１〜８０から選択するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項５０】
前記キメラ受容体ポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、または、これらの組み合わせと組み合わせたＣＤ２８共刺激ドメイン、または、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、または、これらの組み合わせと組み合わせた４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む、ＣＡＲポリペプチドである、請求項２６に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項５１】
前記ＣＡＲポリペプチドが、配列番号１０４または１０５のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項５２】
前記造血が、造血幹細胞、または、免疫細胞であり、任意に、前記免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、または、Ｔ細胞である、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項５３】
前記免疫細胞が、内在性Ｔ細胞受容体、内在性主要組織適合遺伝子複合体、内在性ベータ２−ミクログロブリン、または、これらの組み合わせの発現を、阻害または制限したＴ細胞である、請求項５２に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項５４】
前記造血細胞が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する免疫細胞である、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項５５】
前記造血細胞は、核酸または核酸セットを含み、それらは、集合的に：
（Ａ）前記クレブス回路調節ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；及び、任意に、
（Ｂ）前記キメラ受容体ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、
を含む、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項５６】
前記核酸、または、前記核酸セットが、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子のセットである、請求項５５に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項５７】
前記造血細胞が、前記第１のヌクレオチド配列と、前記第２のヌクレオチド配列の両方を含む前記核酸を含む、請求項５５または５６に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項５８】
前記核酸は、前記第１のヌクレオチド配列と、前記第２のヌクレオチド配列との間に位置する第３のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第３のヌクレオチド配列が、リボソームスキッピング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または、第２のプロモーターをコードする、請求項５７に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項５９】
第３のヌクレオチド配列は、Ｐ２Ａペプチドであるリボソームスキッピング部位をコードする、請求項５７に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項６０】
前記核酸、または、前記核酸セットが、ベクター、または、ベクターのセットの内部に含まれる、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項６１】
前記ベクター、または、ベクターのセットが、発現ベクター、または、発現ベクターのセットである、請求項６０に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項６２】
前記ベクター、または、ベクターのセットが、１つ以上のウイルスベクターを含む、請求項６０または６１に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項６３】
前記１つ以上のウイルスベクターが、レトロウイルスベクターであり、任意に、レンチウイルスベクター、または、ガンマレトロウイルスベクターである、請求項６２に記載の遺伝子操作した造血細胞。
【請求項６４】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞と、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項６５】
前記遺伝子操作した造血細胞が、ＡＣＴＲポリペプチドを発現し、かつ、前記組成物が、Ｆｃ含有治療薬をさらに含む、請求項６４に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記Ｆｃ含有治療薬が、治療抗体、または、Ｆｃ融合タンパク質である、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
前記Ｆｃ含有治療薬は、標的抗原であって、任意に、腫瘍抗原、病原性抗原、または、自己抗原に特異的な免疫細胞である前記抗原に対して結合する、請求項６５または６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
前記病原性抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原、または、真菌抗原である、請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記Ｆｃ含有治療薬が、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ムロモナブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トシツモマブ、ウステキヌマブ、及び、ベドリズマブからなる群から選択する治療抗体である、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
キットであって：
請求項１０〜６３のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞と、医薬として許容可能な担体とを含む第１の医薬組成物；及び
Ｆｃ含有治療薬と、医薬として許容可能な担体とを含む第２の医薬組成物、
を含む、前記キット。
【請求項７１】
前記Ｆｃ含有治療薬が、Ｆｃ融合タンパク質、または、治療抗体である、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
前記Ｆｃ含有治療薬が、標的抗原であって、任意に、腫瘍抗原、病原性抗原、または、自己抗原に特異的な免疫細胞である前記抗原に対して結合する、請求項７０または７１に記載のキット。
【請求項７３】
前記治療抗体を、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ムロモナブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トシツモマブ、ウステキヌマブ、及び、ベドリズマブ、からなる群から選択する、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
対象において標的抗原を発現する細胞を阻害する方法であって、請求項１０〜６３のいずれか１項に記載の遺伝子操作した造血細胞の集団を、それを必要とする対象に対して投与することを含む、前記方法。
【請求項７５】
前記遺伝子操作した造血細胞が、ＡＣＴＲポリペプチドを発現し、かつ、前記対象は、標的抗原に特異的なＦｃ含有治療薬を使用する治療を受けた、または、受けている、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記遺伝子操作した造血細胞は、ＣＡＲポリペプチドを発現し、標的抗原に特異的な細胞外抗原結合ドメインを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記標的抗原が、腫瘍抗原、病原性抗原、または、自己抗原に特異的な免疫細胞である、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記病原性抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原、または、真菌抗原である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記標的抗原を発現する前記細胞の内の少なくとも一部が、低グルコース環境に置かれている、請求項７５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記遺伝子操作した造血細胞が、自家である、請求項７４〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記遺伝子操作した造血細胞が、同種異系である、請求項７４〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記遺伝子操作した造血細胞を、エクスビボで活性化している、増殖している、または、その両方を行っている、請求項７４〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記Ｆｃ含有治療薬が、治療抗体、または、Ｆｃ融合タンパク質である、請求項７５、及び、７７〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記Ｆｃ含有治療薬を、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ムロモナブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、及び、ベドリズマブからなる群から選択する治療抗体である請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記対象が、がんを患うヒト患者であり、かつ、前記標的抗原が、腫瘍抗原である、請求項７４〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記がんを、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び、白血病からなる群から選択する請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記がんを、Ｂ細胞由来のがん、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、肝臓癌、及び、甲状腺癌からなる群から選択する請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記Ｂ細胞由来のがんを、Ｂ細胞系急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、及び、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫からなる群から選択する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記遺伝子操作した造血細胞が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、フィトヘマグルチニン、及び、改変人工刺激細胞または粒子の内の１つ以上の存在下で活性化するＴ細胞を含む、請求項７４〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記遺伝子操作した造血細胞が、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、Ｋ５６２細胞、及び、改変人工刺激細胞または粒子の内の１つ以上の存在下で活性化するナチュラルキラー細胞を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項９１】
核酸または核酸セットであって、それらは、集合的に：
（Ａ）請求項１０〜５１のいずれか１項に記載の抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；及び、
（Ｂ）クレブス回路調節ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、
を含む、前記核酸または前記核酸セット。
【請求項９２】
前記クレブス回路調節ポリペプチドを：ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡＴ１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ１）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ１（ＧＰＴ１）、及び、グルタミナーゼ（ＧＬＳ）からなる群から選択する、請求項９１に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９３】
前記ＧＯＴが、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２である、請求項９２に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９４】
前記ＩＤＨが、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２である、及び／または、前記ＭＤＨが、ＭＤＨ１またはＭＤＨ２である、請求項９２に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９５】
前記核酸または前記核酸セットが、ＲＮＡ分子、または、ＲＮＡ分子のセットである、請求項８９〜９４のいずれか１項に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９６】
前記核酸が、前記第１のヌクレオチド配列と前記第２のヌクレオチド配列の両方を含み、かつ、前記核酸が、前記第１のヌクレオチド配列と前記第２のヌクレオチド配列との間に位置する第３のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第３のヌクレオチド配列は、リボソームスキッピング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または、第２のプロモーターをコードする、請求項８９〜９５のいずれか１項に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９７】
前記リボソームスキッピング部位が、Ｐ２Ａペプチドである、請求項９６に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９８】
前記核酸または前記核酸セットが、ベクター、または、ベクターのセットの内部に含まれる、請求項９１〜９７のいずれか１項に記載の核酸または核酸セット。
【請求項９９】
前記ベクター、または、ベクターのセットが、発現ベクター、または、発現ベクターのセットである、請求項９８に記載の核酸または核酸セット。
【請求項１００】
前記ベクター、または、ベクターのセットが、１つ以上のウイルスベクターを含む、請求項９８または９９に記載の核酸または核酸セット。
【請求項１０１】
前記１つ以上のウイルスベクターが、レトロウイルスベクターであり、任意に、レンチウイルスベクター、または、ガンマレトロウイルスベクターである、請求項１００に記載の核酸または核酸セット。
【請求項１０２】
改変した造血細胞をインビボで生産する方法であって、それを必要とする対象に対して、請求項９１〜１０１のいずれか１項に記載の核酸または核酸セットを投与することを含む、前記方法。
【請求項１０３】
前記対象に対して、標的抗原に対して特異的なＦｃ含有治療薬を投与することをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月１４日に出願した米国仮出願第６２／７１８，４９１号、及び、２０１８年８月１４日に出願した米国仮出願第６２／７１８，５７９号の出願日の利益を主張する。先行出願のそれぞれの全内容を、参照により、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞を攻撃しつつ正常組織を温存する免疫応答を誘発するために、細胞をベースとした治療法などの免疫療法が用いられている。がん免疫療法は、薬剤耐性の遺伝子と細胞メカニズムを回避して、腫瘍細胞を標的としつつ正常組織を温存するその潜在能力ゆえに、様々なタイプのがんを治療するための有望な選択肢となっている。
【０００３】
細胞をベースとした治療法は、がん細胞に偏った反応を示す細胞傷害性Ｔ細胞を含み得る。Ｅｓｈｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．；１９９３；９０（２）：７２０−７２４；Ｇｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１６２（１０）：５９３１−５９３９；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００３；９（３）：２７９−２８６；Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（４）：１６３７−１６４４；及びＩｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００４；１８：６７６−６８４。ある手法は、１つ以上のＴ細胞活性化シグナル伝達ドメインに融合した抗原結合ドメインを有するキメラ受容体を発現させることである。抗原結合ドメインを介してがん抗原が結合すると、Ｔ細胞が活性化して、細胞傷害を誘発する。キメラ受容体を発現する自己Ｔリンパ球を注入する最近の臨床試験での結果は、それらの臨床的可能性について、説得力のあるの証拠を示した。Ｐｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００８；１４（１１）：１２６４−１２７０；Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ；２０１１；２５；３６５（８）：７２５−７３３；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（１８）：４８１７−４８２８；Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（１７）：３９４０−３９５０；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（１２）：２７０９−２７２０；及びＢｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３；５（１７７）：１７７ｒａ１３８。
【０００４】
別の手法は、造血細胞（例えば、造血幹細胞や、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞）において、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）タンパク質を発現させることであり、ＡＣＴＲタンパク質は、細胞外Ｆｃ結合ドメインを有む。ＡＣＴＲ発現造血細胞（例えば、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞、別名、「ＡＣＴＲ  Ｔ細胞」）を、抗がん抗体と一緒に、対象に対して投与すると、それらは、抗体のＦｃドメインとがん細胞との結合によって、抗体が標的とするがん細胞に対する毒性を増強し得る。Ｋｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１４）７４：９３−１０３。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞をベースとした免疫療法は、有望であるとはいえ、悪性腫瘍細胞と非形質転換細胞との間の相互作用によって生じた細胞環境である腫瘍内微小環境（ＴＭＥ）の特定の特性が引き起こす課題に直面している。それ故に、ＴＭＥの見地から、細胞をベースとした免疫療法の効果を向上させるための戦略を開発することが極めて重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、細胞をベースとした免疫療法での使用のためのものであり、免疫細胞などの造血細胞でのクレブス回路の調節を改善させる戦略の開発に基づいており、免疫細胞として、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチド、または、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドなどのキメラ受容体ポリペプチドを発現するものがある。クレブス回路の調節は、造血細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または、Ｔ細胞もしくはナチュラルキラー細胞などの免疫細胞）において、１つ以上のクレブス回路調節ポリペプチド、例えば、本明細書に記載したポリペプチドを発現（例えば、過剰発現）させて、達成し得る。そのような遺伝子操作した免疫細胞は、例えば、低グルコース環境、低アミノ酸環境、低ｐＨ環境、及び／または、低酸素環境（例えば、腫瘍内微小環境）において、調節した（例えば、改善した）クレブス回路反応を有するものと考えられる。そのような遺伝子操作した免疫細胞は、調節したエピジェネティック状態（例えば、アセチル化状態）、及び／または、調節したレベルの免疫抑制代謝産物（例えば、キヌレニン）をも有し得る。それ故に、１つ以上のクレブス回路調節ポリペプチドとキメラ受容体ポリペプチドを共発現するＨＳＣや免疫細胞などの造血細胞は、（例えば、任意に、治療抗体の存在下で、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／または、低酸素条件などの腫瘍内微小環境下で）優れた生理活性、例えば、細胞増殖性、活性化（例えば、サイトカイン生産、例えば、ＩＬ−２、または、ＩＦＮγの生産の増大）、細胞傷害性、及び／または、インビボ抗腫瘍活性を示す。
【０００７】
したがって、本明細書では、特に、例えば、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／または、低酸素条件で、同じタイプのネイティブ免疫細胞に関して調節したクレブス回路を有する、改変した（例えば、遺伝子改変した）造血細胞（例えば、造血幹細胞や、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞などの免疫細胞）を提供する。改変した免疫細胞は、クレブス回路調節ポリペプチドを発現し得る、または、過剰に発現し得る。
【０００８】
一部の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチドを、クレブス回路の反応を触媒する酵素とし得る。例として、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２などのイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）、ＭＤＨ１またはＭＤＨ２などのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、または、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）があるが、これらに限定されない。その他の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチドは、クレブス回路代謝産物を基質として使用する酵素である。例として、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２などのグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）（別名、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、または、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、または、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）があるが、これらに限定されない。なおもその他の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチドは、前駆体を、クレブス回路代謝産物に変換する酵素である。例として、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡＴ１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ１）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ１（ＧＰＴ１）、または、グルタミナーゼ（ＧＬＳ）があるが、これらに限定されない。
【０００９】
改変免疫細胞は、キメラ受容体ポリペプチドをさらに発現し得るものであり、キメラ受容体ポリペプチドは、（ａ）細胞外標的結合ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；及び、（ｃ）細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、免疫受容体チロシンをベースとした活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質ドメイン）を含み得る。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、細胞外Ｆｃ結合ドメイン（ａ）を含む抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である。その他の実施形態では、キメラ受容体は、細胞外抗原結合ドメイン（ａ）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。一部の事例では、（ｃ）は、キメラ受容体ポリペプチドのＣ末端に位置している。一部の事例では、キメラポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み得る。その他の事例では、キメラ受容体ポリペプチドは、共刺激シグナル伝達ドメインを含み得ない。
【００１０】
本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド、または、ＣＡＲポリペプチド）のいずれかは、（ａ）のＣ末端であり、かつ、（ｂ）のＮ末端である位置にあるヒンジドメインをさらに含み得る。その他の事例では、キメラ受容体ポリペプチドは、あらゆるヒンジドメインを含み得ない。なおも別の事例では、キメラ受容体ポリペプチド、例えば、ＡＣＴＲポリペプチドは、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含み得ない。あるいは、または、加えて、キメラ受容体ポリペプチドは、そのＮ末端に、シグナルペプチドをさらに含む。
【００１１】
一部の実施形態では、本明細書で開示したキメラ受容体ポリペプチドは、Ｆｃ結合ドメイン（ａ）を含むＡＣＴＲポリペプチドとし得る。一部の事例では、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、例えば、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、または、Ｆｃイプシロン受容体の細胞外リガンド結合ドメインとすることができる。特定の事例では、Ｆｃ結合ドメインは、ＣＤ１６Ａ（例えば、Ｆ１５８  ＣＤ１６Ａ、または、Ｖ１５８  ＣＤ１６Ａ）、ＣＤ３２Ａ、または、ＣＤ６４Ａの細胞外リガンド結合ドメインである。その他の事例では、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する抗体フラグメントとすることができる。例えば、抗体フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、（例えばナノボディ）とすることができる。加えて、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分、または、そのＦｃ結合フラグメントに結合する天然タンパク質とすることができる。例えば、Ｆｃ結合ドメインは、プロテインＡもしくはプロテインＧ、または、そのＦｃ結合フラグメントとすることができる。さらなる事例では、（ａ）のＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する合成ポリペプチドとすることができる。例として、Ｋｕｎｉｔｚペプチド、ＳＭＩＰ、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、または、アンチカリンがあるが、これらに限定されない。
【００１２】
一部の実施形態では、本明細書で開示したキメラ受容体ポリペプチドは、細胞外抗原結合ドメイン（ａ）を含むＣＡＲポリペプチドとすることができる。一部の事例では、（ａ）の細胞外抗原結合ドメインは、腫瘍抗原、病原性抗原、または、自己抗原に特異的な免疫細胞に結合する一本鎖抗体フラグメントである。特定の事例では、腫瘍抗原は、血液腫瘍と関連している。例として、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＬｅＹ、ＣＤ１３８、ＣＤ５、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ４０、及び、ＩＬ−１ＲＡＰがあるが、これらに限定されない。特定の事例では、腫瘍抗原は、固形腫瘍と関連している。例として、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＦＯＬＲ（例えば、ＦＯＬＲ１、または、ＦＯＬＲ２）、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥＦＧＲＶＩＩＩ、ＩＬ１３ＲＡ２、ＶＥＧＦＲ２、ＲＯＲ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤ１７１、ＣＤ１３３、ＰＳＣＡ、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ、ＣＤ７０、ＭＵＣ１６、Ｌ１−ＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、及び、ＣＡＩＸがあるが、これらに限定されない。特定の事例では、病原性抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、または、真菌抗原、例えば、本明細書に記載したものである。
【００１３】
一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲ、または、ＣＡＲポリペプチド）のいずれかにおける（ｂ）の膜貫通ドメインは、１回貫通型膜タンパク質、例えば、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６Ａ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及び、ＦＧＦＲ２Ｂのものとすることができる。あるいは、（ｂ）の膜貫通ドメインを、非天然疎水性タンパク質セグメントとすることができる。
【００１４】
一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲ、または、ＣＡＲポリペプチド）の少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインは、適応可能であれば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２８LL→GGバリアント、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、及び、ＣＤ２とすることができる共刺激分子のものとすることができる。一部の事例では、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、または、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインである。一部の事例では、ＡＣＴＲポリペプチドは、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。一部の事例では、共刺激シグナル伝達ドメインの内の一方は、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインであり；他方の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメイン、または、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメインとすることができる。具体例として、ＣＤ２８、及び、４−１ＢＢ；または、ＣＤ２８LL→GGバリアント、及び、４−１ＢＢがあるが、これらに限定されない。あるいは、いずれのキメラ受容体ポリペプチも、共刺激シグナル伝達ドメインを含み得ない。
【００１５】
一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲ、または、ＣＡＲポリペプチド）のいずれかでの（ｃ）の細胞質シグナル伝達ドメインを、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γの細胞質ドメインとすることができる。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲ、または、ＣＡＲポリペプチド）のいずれかでのヒンジドメインは、適応可能であれば、ＣＤ２８、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ８α、または、ＩｇＧのものとすることができる。その他の事例では、ヒンジドメインは、非天然ペプチドである。例えば、非天然ペプチドを、延長型組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）または（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）nポリペプチドとすることができ、式中、ｎは、３〜１２であり、３と１２の整数を含む。一部の事例では、ヒンジドメインは、最大６０アミノ酸残基を含有し得る短いセグメントである。
【００１７】
特定の事例では、本明細書に記載したＡＣＴＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン；及び、（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、または、これらの組み合わせを含み得る。例えば、ＡＣＴＲポリペプチドは、表３に示す構成要素（ａ）〜（ｅ）を含む。特定の事例では、ＡＣＴＲポリペプチドは、配列番号１〜８０から選択するアミノ酸配列を含む。
【００１８】
特定の事例では、本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン、または、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及び、（ｉｉ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、または、これらの組み合わせを含み得る。さらなる特定の事例では、本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドは、（ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン、または、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、または、これらの組み合わせを含み得る。例えば、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号１０４及び１０５から選択するアミノ酸配列を含み得る。
【００１９】
クレブス回路調節ポリペプチド、及び、任意にキメラ受容体ポリペプチドを発現する本明細書に記載した造血細胞を、造血幹細胞、または、その子孫とし得る。一部の実施形態では、造血細胞は、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージ、好中球、好酸球、または、Ｔ細胞などの免疫細胞とし得る。免疫細胞を、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来したものとすることができる。一部の事例では、免疫細胞は、内在性Ｔ細胞受容体、内在性主要組織適合遺伝子複合体、内在性ベータ２−ミクログロブリン、または、これらの組み合わせの発現を、阻害または制限しているＴ細胞である。
【００２０】
本明細書に記載した造血細胞（例えば、ＨＳＣ、または、免疫細胞）のいずれかは、集合的に：（ａ）クレブス回路調節ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；及び、任意の（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、核酸または核酸セットを含み得る。核酸または核酸セットは、ＲＮＡ分子、または、ＲＮＡ分子のセットである。一部の事例では、免疫細胞は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の両方を含んだ核酸を含む。一部の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチドのコード配列は、ＣＡＲポリペプチドのコード配列の上流にある。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドのコード配列は、クレブス回路調節ポリペプチドのコード配列の上流にある。このような核酸は、第１のヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列との間に位置する第３のヌクレオチド配列をさらに含み得るものであり、第３のヌクレオチド配列は、リボソームスキッピング部位（例えば、Ｐ２Ａペプチド）、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または、第２のプロモーターをコードする。
【００２１】
一部の事例では、核酸または核酸セットは、発現ベクター、または、発現ベクターのセット（例えば、レンチウイルスベクター、または、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター）とすることができるベクター、または、ベクターのセットの内部にある。核酸セット、または、ベクターセットとは、関係のあるポリペプチド（すなわち、クレブス回路調節ポリペプチドとＣＡＲポリペプチド）の内の１つをそれぞれがコードする、２つ以上の核酸分子の群、または、２つ以上のベクターの群のことを意味する。また、本明細書に記載したいずれの核酸も、本開示の範囲内である。
【００２２】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載した免疫細胞のいずれかと、医薬として許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
さらに、本明細書では、対象における標的抗原を発現する細胞を阻害する（例えば、そのような細胞の個数を抑制する、細胞増殖を阻害する、及び／または、細胞の活性を抑制する）方法を提供しており、この方法は、クレブス回路調節ポリペプチドとＣＡＲポリペプチドを共発現し得る、本明細書に記載した免疫細胞の集団を、それを必要とする対象に対して投与することを含む。対象（例えば、がんを患っているヒト患者などのヒト患者）は、抗がん療法（例えば、抗がん剤）を受けたことがあり得る、または、受け得る。一部の事例では、標的抗原を発現する細胞の少なくとも一部は、低グルコース環境、低アミノ酸（例えば、低グルタミン）環境、低ｐＨ環境、及び／または、低酸素環境、例えば、腫瘍内微小環境に置かれている。
【００２４】
一部の事例では、免疫細胞は、自家である。その他の事例では、免疫細胞は、同種異系である。本明細書に記載した方法のいずれかにおいて、免疫細胞は、エクスビボで、活性化する、増殖する、または、その両方を実施することができる。一部の事例では、免疫細胞は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、フィトヘマグルチニン、及び、改変人工刺激細胞または粒子の内の１つ以上の存在下で活性化するＴ細胞を含む。その他の事例では、免疫細胞は、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、及び、Ｋ５６２細胞、改変人工刺激細胞または粒子の内の１つ以上の存在下で活性化するナチュラルキラー細胞を含む。
【００２５】
一部の事例では、本明細書に記載した方法で治療する対象を、がん、例えば、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、及び、白血病を患うヒト患者とし得る。さらなる例示的な標的がんとして、Ｂ細胞由来のがん、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、肝臓癌、及び、甲状腺癌があるが、これらに限定されない。例示的なＢ細胞由来のがんは、Ｂ細胞系急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、及び、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫からなる群から選択する。
【００２６】
がんまたは感染性障害などの標的疾患または障害の治療を目的とした、クレブス回路調節ポリペプチドとＣＡＲポリペプチドを共発現する本明細書に記載した遺伝子操作した免疫細胞の使用、ならびに、目的とする医学的治療のための医薬品を製造するためのその使用も、本開示の範囲内である。
【００２７】
本開示の１つ以上の実施形態の詳細を以下に説明する。本開示のその他の特徴または利点は、幾つかの実施形態の詳細な記載から、そして、添付した特許請求の範囲からも、明らかになるであろう。
【００２８】
以下の図面は、本明細書の一部を構成するものであり、かつ、本開示の特定の態様をさらに実証するために含めたものであり、本明細書で提供した特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これら図面の内の１つ以上を参照することで、それら態様の理解を深めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＧＰＣ３を発現するＪＨＨ７またはＨｅｐ３Ｂ標的細胞と、様々な濃度のグルコースの存在下で、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ（配列番号１０４）、または、「模倣物」非形質導入Ｔ細胞を発現するＴ細胞の増殖を示す図である。ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖は、グルコース濃度の関数として変化する。
【図２】Ａ及びＢは、ＧＰＣ３が発現するＪＨＨ７標的細胞の存在下で、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ（配列番号１０４）を発現するＴ細胞、または、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲとＧＯＴ１（配列番号８７）を共発現するＴ細胞の増殖を示す図である。Ａ：１．２５ｍＭグルコース。Ｂ：１０ｍＭグルコース。ＣＡＲ−Ｔだけを発現する細胞と比較して、ＧＯＴ１を共発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では、１．２５ｍＭと１０ｍＭの両方のグルコースでの増殖が旺盛である。
【図３】Ａ及びＢは、ＧＰＣ３が発現するＪＨＨ７標的細胞の存在下で、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ（配列番号１０４）を発現するＴ細胞、または、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲとＧＯＴ２（配列番号８８）を共発現するＴ細胞の増殖を示す図である。Ａ：１．２５ｍＭグルコース。Ｂ：１０ｍＭグルコース。ＣＡＲ−Ｔだけを発現する細胞と比較して、ＧＯＴ２を共発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では、１．２５ｍＭと１０ｍＭの両方のグルコースでの増殖が旺盛である。
【図４】ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ（配列番号１０４）とＧＯＴ２（配列番号８８）を共発現するＴ細胞のＪＨＨ７異種移植片腫瘍阻害活性を示すチャートである。
【図５】ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ（配列番号１０４）とＧＯＴ２（配列番号８８）を共発現するＴ細胞のＮＣＩ−Ｈ４４６異種移植片腫瘍阻害活性を示すチャートである。
【図６】ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ（配列番号１０４）とＧＯＴ２（配列番号８８）を共発現するＴ細胞のＨｅｐ３Ｂ異種移植片腫瘍阻害活性を示すチャートである。
【図７】ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ（配列番号１０４）とＧＯＴ２（配列番号８８）を共発現するＴ細胞で処理をしたＨｅｐ３Ｂ異種移植腫瘍を担持するマウス由来のＴ細胞の末梢血液計数を示すチャートである。
【図８】Ａ及びＢは、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞でのタンパク質発現、及び、アミノトランスフェラーゼ活性を示す。Ａ：ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号１０４）とＧＯＴ２（配列番号８８）を共発現するＴ細胞でのＧＯＴ２の発現の高まりを実証するウエスタンブロット。Ｔ細胞を、Ｈｅｐ３Ｂ  ＧＰＣ３発現腫瘍細胞で、４日間、活性化した。ブロットを、ローディングコントロールのために、それぞれ、抗ヒトＧＯＴ２抗体、または、抗ヒトＧＡＰＤＨで染色した。Ｂ：抗ＧＰＣ３  ＣＡＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞は、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）酵素活性の高まりを示す。Ｔ細胞を、Ｈｅｐ３Ｂ  ＧＰＣ３発現腫瘍細胞で、８日間、活性化し、そして、市販のＡｓｐａｒｔａｔｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ａｂｃａｍ）を使用して、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性を測定した。
【図９】Ａ及びＢは、ＧＯＴ２（配列番号８８）と、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号１０４）またはＡＣＴＲ（配列番号１）を共発現するＴ細胞が、ＣＡＲまたはＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、旺盛な増殖を示す図である。Ａ：ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ  ＧＰＣ３発現腫瘍細胞で、６日間、活性化した。ＣＤ３＋  Ｔ細胞の細胞分裂の尺度として細胞内セルトレースバイオレット希釈を使用するフローサイトメトリーで、増殖を評価した。；Ｂ：ＡＣＴＲ  Ｔ細胞を、ＨｅｐＧ２  ＧＰＣ３発現腫瘍細胞と、抗ＧＰＣ３抗体（ＧＣ３３、１μｇ／ｍｌ）で、３日間、活性化した。ＣＤ３＋  Ｔ細胞のフローサイトメトリー細胞数で、増殖を評価した。結果は、親構築物と比較して、ＧＯＴ２共発現構築物について表している。
【図１０】Ａ〜Ｃは、ＧＯＴ２（配列番号８８）と、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号１０４）またはＡＣＴＲ（配列番号１、及び、配列番号５７）を共発現するＴ細胞が、ＣＡＲまたはＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、ＩＬ−１７Ａの生産が増えている、ことを示す図である。Ａ：ＧＰＣ３−ＣＡＲ（配列番号１０４）。Ｂ：ＡＣＴＲ（配列番号１）。Ｃ：ＡＣＴＲ（配列番号５７）。Ｔ細胞を、ＧＰＣ３を発現するＨｅｐＧ２細胞で、２４時間、活性化し、ＡＣＴＲ共培養物に抗ＧＰＣ３抗体を添加して、ＭＳＤアッセイを使用して、上清でのＩＬ−１７Ａを測定した。ＣＡＲまたはＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、ＩＬ−１７Ａの生産の改善が、構築物のタイプ（ＣＡＲ、または、ＡＣＴＲ）と、一次共刺激ドメイン（４−１ＢＢ、または、ＣＤ２８）とは無関係に、ＧＯＴ２を共発現する構築物で認められた。
【図１１】Ａ〜Ｃは、ＧＯＴ２（配列番号８８）と、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号１０４）またはＡＣＴＲ（配列番号１、及び、配列番号５７）を共発現するＴ細胞が、ＣＡＲまたはＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、ＣＤ４＋多機能性が促された、ことを示す図である。Ａ：ＧＰＣ３−ＣＡＲ（配列番号１０４）。Ｂ：ＡＣＴＲ（配列番号１）。Ｃ：ＡＣＴＲ（配列番号５７）。ＡＣＴＲ共培養物に抗ＧＰＣ３抗体を添加して、タンパク質輸送阻害剤Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  ＡとＭｏｎｅｎｓｉｎとの存在下で、Ｔ細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で、６時間、ＧＰＣ３を発現するＨｅｐＧ２細胞と一緒にインキュベートした。細胞を固定し、そして、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦα、及び、ＩＬ−１７Ａに関する細胞内染色を、フローサイトメトリーで評価した。キメラ受容体タイプ（ＣＡＲ、または、ＡＣＴＲ）、及び、一次共刺激ドメイン（４−１ＢＢ、または、ＣＤ２８）に関係なく、ＣＡＲまたはＡＣＴＲだけを発現する細胞と比較して、ＧＯＴ２と、ＡＣＴＲまたはＣＡＲを共発現するＴ細胞では、１つ、２つ、または、３つ超のサイトカインを同時に生産するＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度が大きいことが認められた。
【図１２】Ａ〜Ｃは、ＧＯＴ２（配列番号８８）と、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号１０４）またはＡＣＴＲ（配列番号１、及び、配列番号５７）を共発現するＴ細胞では、ＣＡＲまたはＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、分化があまり進んでいないナイーブ様のＣＤ８＋  Ｔ細胞の集団が多い。Ａ：ＧＰＣ３−ＣＡＲ（配列番号１０４）。Ｂ：ＡＣＴＲ（配列番号１）。Ｃ：ＡＣＴＲ（配列番号５７）。１１名の健康なドナーから得たＣＡＲ（配列番号１０４）Ｔ細胞、及び、２名の健康なドナーから得たＡＣＴＲ  Ｔ細胞（４−１ＢＢ一次共刺激ドメイン、配列番号１；ＣＤ２８一次共刺激ドメイン、配列番号５７）を、表面マーカーのパネルを染色し、そして、フローサイトメトリーで、ナイーブ様表現型マーカーを分析した。細胞を、ＣＤ８＋／ＣＡＲ＋（ＣＡＲ）、または、ＣＤ８＋／ＣＤ１６＋（ＡＣＴＲ＋）で分別した。マーカーＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＯ、及び、ＣＤ６２Ｌに関してはポジティブに染色し、かつ、ＣＤ４５ＲＡに関してはネガティブに染色する、これらの集団のサブセットは、キメラ受容体タイプ（ＣＡＲ、または、ＡＣＴＲ）及び、一次共刺激ドメイン（４−１ＢＢ、または、ＣＤ２８）に関係なく、ＣＡＲまたはＡＣＴＲだけを発現する細胞と比較して、ＧＯＴ２と、ＡＣＴＲまたはＣＡＲを共発現するＴ細胞に富んでいた。
【図１３】ＧＯＴ２（配列番号８８）と抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号１０４）を共発現するＴ細胞が、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、分化の進んでいない（幼い）ＣＤ８＋  Ｔ細胞表現型を実証した、ことを示す図である。１１名の健康なドナーから得たＣＡＲ  Ｔ細胞を、表面マーカーのパネルに関して染色を行い、そして、フローサイトメトリーで分析した。細胞を、ＣＤ８＋／ＣＡＲ＋で分別した。染色をしたＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ２７＋ＲＯ−、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋、または、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ−集団は、分化の度合が小さな表現型を示す。これらのサブセットは、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、ＧＯＴ２を共発現するＣＡＲ  Ｔ細胞に富んでいた。
【図１４】ＧＯＴ２（配列番号８８）と抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号１０４）を共発現するＴ細胞が、長時間抗原刺激と、低酸素の下で、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、増殖面で有利であることを実証した、ことを示す図である。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｈｅｐ３Ｂ  ＧＰＣ３を発現する腫瘍細胞で、３日間、活性化し；次いで、低酸素の追加ストレスの有無に関する長時間抗原刺激の腫瘍内微小環境ストレスを模倣するために、正常酸素（２０％酸素）、または、低酸素（１．５％）条件下で、３日間、新鮮な標的細胞で再刺激した。次いで、細胞分裂の尺度として、細胞内セルトレースバイオレット希釈を使用して、ＣＤ３＋  Ｔ細胞のフローサイトメトリーで増殖を評価し、そして、平均蛍光の逆数をプロットした。
【図１５】ＧＯＴ２（配列番号８８）と抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号１０４）を共発現するＴ細胞が、制限グルコース下で、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、増殖面で有利であることを実証した、ことを示す図である。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、１０ｍＭまたは１．２５ｍＭのグルコースの存在下で、７日間、ＨｅｐＧ２  ＧＰＣ３発現腫瘍細胞で活性化した。次いで、細胞分裂の尺度として、細胞内セルトレースバイオレット希釈を使用して、ＣＤ３＋  Ｔ細胞のフローサイトメトリーで増殖を評価し、そして、平均蛍光の逆数をプロットした。次いで、細胞分裂の尺度として、細胞内セルトレースバイオレット希釈を使用するフローサイトメトリーで増殖を評価し、そして、平均蛍光の逆数を、プロットした。ＧＯＴ２を発現するＣＡＲは、両方のグルコース条件下で、増殖面で有利であった。
【図１６】ＧＯＴ２（配列番号８８）とＡＣＴＲ（配列番号５７）を共発現するＴ細胞が、ＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、Ｔ細胞阻害剤キヌレニンの存在下で、増殖が旺盛であることを実証した、ことを示す図である。
【図１７】Ａ〜Ｃは、ＧＯＴ２（配列番号８８）と抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号１０４）を共発現するＴ細胞が、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、腫瘍での活性化が高まったことを実証した、ことを示す図である。Ａ：ＣＤ６９。Ｂ：ＣＤ２５。Ｃ：ＩＣＯＳ。ＣＡＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞は、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、活性化マーカーの発現の高まりを示した。
【図１８】Ａ及びＢは、ＧＯＴ２（配列番号８８）と抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号１０４）を共発現するＴ細胞が、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、腫瘍における消耗に対する耐性が大きくなったことを実証した、ことを示す図である。Ａ：ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット。Ｂ：ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット。
【図１９】Ａ〜Ｄは、ＧＯＴ２を共発現するＣＡＲが、ＧＰＣ３を発現する腫瘍での消耗に対して抵抗を示すことを表した図である；ＣＡＲの活性化は、腫瘍対抗原ネガティブ脾臓に特異的である。Ａ：６日目、ＣＤ４＋  Ｔ細胞サブセット。Ｂ：６日目、ＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセット。Ｃ：１３日目、ＣＤ４＋  Ｔ細胞サブセット。Ｄ：１３日目、ＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセット。
【図２０】Ａ及びＢは、ＧＯＴ２（配列番号８８）と抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ（配列番号１０４）を共発現するＴ細胞が、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、インビボで腫瘍に対して曝露した後に認められる有意な機能を実証した、ことを示す図である。Ａ：ＩＬ−１７Ａ。Ｂ：ＩＦＮγ。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
腫瘍内微小環境は、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／または、低酸素条件などの特定の特性を有しており、それらの一部は、エフェクターＴ細胞などのエフェクター免疫細胞の活性を制限し得る。本開示は、少なくとも一部は、エフェクター免疫細胞でクレブス回路反応を調節する（例えば、高める）ことで、腫瘍内微小環境におけるエフェクター免疫細胞活性を高めるための様々な手法の開発に基づいており、それにより、それらの増殖性、及び、生物活性が高まる。クレブス回路は、クレブス回路酵素（例えば、天然酵素、または、その機能的同等物）の発現レベル、そのような酵素の活性化状態、クレブス回路代謝産物を基質として使用する酵素の発現レベル、及び／または、前駆体をクレブス回路代謝産物に変換する酵素の発現レベルや活性などの様々な要素によって調節することができる。
【００３１】
本明細書に開示した研究は、予想外にも、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２などのクレブス回路調節ポリペプチドと、Ｔ細胞などの免疫細胞におけるＣＡＲ（例えば、４−１ＢＢ共刺激ドメインを有するもの）またはＡＣＴＲ（例えば、４−１ＢＢ、または、ＣＤ２８共刺激ドメインを有するもの）の共発現は、ＣＡＲまたはＡＣＴＲだけを発現する免疫細胞と比較して、インビトロ及びインビボの両方で優れた特徴を示した。例えば、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２と、ＣＡＲまたはＡＣＴＲの共発現は、特に、固形腫瘍内微小環境条件下（例えば、低酸素、低グルコース条件、及び、ＴＭＥ阻害剤の存在）で、Ｔ細胞の増殖／増加、及び、Ｔ細胞機能強化を招いた。例えば、ＧＯＴ２の共発現は、抑制性受容体（例えば、ＰＤ１）の長期発現の耐性に寄与し、そして、腫瘍内微小環境でＴ細胞機能を維持した。さらに、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２と、ＣＡＲまたはＡＣＴＲとの共発現は、抗腫瘍効果を高めた。
【００３２】
したがって、本開示は、クレブス回路調節活性が高い改変した（例えば、遺伝子操作した）造血細胞（例えば、ＨＳＣ、または、免疫細胞）を提供する。免疫細胞でのクレブス回路の改変は、あらゆる適切な手法によって達成することができる。例えば、改変した免疫細胞は、１つ以上のクレブス回路調節因子を発現し得るものであり、この調節因子は、クレブス回路に直接的に関与する因子（例えば、クレブス回路の１つ以上の反応を触媒する酵素）、または、クレブス回路酵素の発現レベル、活性、及び／または、分解の１つ以上に影響を及ぼすことで、クレブス回路を間接的に調節する因子のいずれかである、あらゆるタイプの分子とすることができる。一部の実施形態では、クレブス回路調節因子を、本明細書に記載したようなクレブス回路調節ポリペプチドとすることができ、このポリペプチドは、それらのネイティブ対応物と比較して、発現する免疫細胞において、クレブス回路調節を強化する。その他の実施形態では、クレブス回路調節因子は、クレブス回路の１つ以上の反応を触媒する１つ以上の酵素の発現を調節する核酸（例えば、マイクロＲＮＡや、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ、または、アンチセンス核酸）とすることができる。さらなる実施形態では、クレブス回路調節因子は、１つ以上のクレブス回路酵素の発現を調節する転写因子とし得る。
【００３３】
そのような遺伝子操作した免疫細胞は、キメラ受容体ポリペプチド、例えば、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチド、または、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをさらに発現し得る。また、本明細書では、対象（例えば、ヒトがん患者）の免疫細胞の増殖を改善する、及び／または、例えば、ＡＤＣＣを介して、標的細胞（例えば、標的がん細胞）を阻害または抑制するために、任意に（例えば、免疫細胞が、ＡＣＴＲポリペプチドを発現する場合は）Ｆｃ含有剤を併用して、遺伝子操作した免疫細胞を使用することも提供する。また、本開示は、記載した遺伝子操作した免疫細胞を含む、医薬組成物及びキットも提供する。
【００３４】
クレブス回路調節ポリペプチドを発現（例えば、過剰発現）する本明細書に記載した遺伝子操作した免疫細胞は、少なくとも、以下の点で有利となり得る。クレブス回路調節ポリペプチドの発現は、Ｔ細胞の代謝活性を高める。それ故に、遺伝子操作した免疫細胞は、クレブス回路調節ポリペプチドを発現（または、過剰発現）しない免疫細胞と比較して、腫瘍内微小環境（例えば、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／または、低酸素環境において、良好な増殖性を示し、サイトカインの生産性に優れており、優れた抗腫瘍細胞傷害を示し、免疫抑制代謝産物が少なく、及び／または、Ｔ細胞生存率が高く、ひいては、サイトカインの生産性、生存率、細胞傷害性、及び／または、抗腫瘍活性を改善し得る。
【００３５】
Ｉ．クレブス回路調節ポリペプチド
本明細書で使用するクレブス回路調節ポリペプチドは、グルコース、アミノ酸、及び／または、脂肪酸を処理するための代謝経路などの様々な代謝経路と繋がっているクレブス回路を調節する、あらゆるポリペプチドのことを指す。クレブス回路、別名、クエン酸回路、及び、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路は、解糖系で生成したアセチルＣｏＡをオキサロ酢酸に付加してクエン酸を形成する、ことから始まる代謝経路である。そのようなポリペプチドは、クレブス回路での１つ以上の可逆的酵素反応を、そこから生成する代謝産物を調節するために、その他の方向に対して、一方の方向が有利になるように調節し得る。ある代謝源からクレブス回路への供給が増えると、別の経路の上流代謝産物に対して方向転換を迫り得る。例えば、クレブス回路調節ポリペプチドは、アラニンを、解糖経路に向けて方向転換させ、例えば、ＰＳＡＴ１を介して、ＴＣＡ、及び／または、セリン合成経路のためのα−ケト−グルタル酸（αＫＧ）を増やして、ミトコンドリア、及び／または、細胞質におけるＴＣＡ回路を促す；グルコースを、ＴＣＡ回路から外して、ＰＳＡＴ１またはＰＳＰＨを介して、セリンを生成し得る。
【００３６】
加えて、クレブス回路調節ポリペプチドは、ミトコンドリア、及び／または、細胞質におけるクレブス回路活性を高め得る。クレブス回路調節ポリペプチドは、乳酸などの阻害性代謝産物をピルビン酸に変換して、クレブス回路活性も高め得る。そのようなあらゆるクレブス回路調節ポリペプチドは、あらゆる適切な種（例えば、ヒトなどの哺乳動物）のものとし得るものであり、本明細書に記載した組成物及び方法での使用を企図し得る。
【００３７】
あるいは、クレブス回路代謝産物ポリペプチドは、活性化したクレブス回路調節ポリペプチド（例えば、リン酸化模倣物）を模倣するように変異した分子とし得る、または、変異をして、クレブス回路の活性を調節するように、その細胞内輸送（例えば、ミトコンドリアへの輸送）に影響を及ぼし得る。あるいは、内因性クレブス回路ポリペプチドについては、例えば、転写因子またはマイクロＲＮＡを発現して、または、ポリペプチドの安定性または分解を調節して、例えば、ポリペプチドの分解を媒介する因子、例えば、ユビキチン／プロテアソーム経路の一部であるＥ３リガーゼを調節して、内因性クレブス回路ポリペプチドの発現を調節し得る。加えて、内因性クレブス回路ポリペプチドについては、例えば、所望の細胞内区画、例えば、ミトコンドリアへの輸送を増やすポリペプチドを発現することで、内因性クレブス回路ポリペプチドの輸送を調節し得る。さらに、クレブス回路調節ポリペプチドについては、腫瘍内微小環境に高レベルで認められており、かつ、免疫細胞の活性を阻害または制限する基質を、もはや阻害効果を有さない分子へと酵素的に変換して、免疫細胞機能を改善するポリペプチドとし得る。
【００３８】
クレブス回路調節ポリペプチドは、クレブス回路における反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、例えば、クレブス回路反応を触媒する天然酵素、または、同じクレブス回路反応を触媒するその機能的変異体／相同体とし得る。例として、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２など）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ、ＭＤＨ１またはＭＤＨ２など）、または、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）があるが、これらに限定されない。
【００３９】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）とは、イソクエン酸の酸化的脱炭酸を触媒して、α−ケトグルタル酸とＣＯ2を生成する、あらゆるポリペプチド（酵素）のことを指す。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）とは、ＮＡＤ+からＮＡＤＨへの還元を使用して、リンゴ酸からオキサロ酢酸への酸化を触媒する、あらゆるポリペプチド（酵素）のことを指す。ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）とは、ＮＡＤ+からＮＡＤＨへの還元を使用して、３−ホスホ−Ｄ−グリセリン酸を、３−ホスホノオキシピルビン酸に変換し、そして、２−ヒドロジグルタル酸を、２−オキソグルタル酸に変換する反応を触媒する、あらゆるポリペプチド（酵素）のことを指す。例示的なＩＤＨ、ＭＤＨ、及び、ＰＨＧＤＨのアミノ酸配列を、以下に示す：
【００４０】
ＩＤＨ１（配列番号８１）
MSKKISGGSVVEMQGDEMTRIIWELIKEKLIFPYVELDLHSYDLGIENRDATNDQVTKDAAEAIKKHNVGVKCATITPDEKRVEEFKLKQMWKSPNGTIRNILGGTVFREAIICKNIPRLVSGWVKPIIIGRHAYGDQYRATDFVVPGPGKVEITYTPSDGTQKVTYLVHNFEEGGGVAMGMYNQDKSIEDFAHSSFQMALSKGWPLYLSTKNTILKKYDGRFKDIFQEIYDKQYKSQFEAQKIWYEHRLIDDMVAQAMKSEGGFIWACKNYDGDVQSDSVAQGYGSLGMMTSVLVCPDGKTVEAEAAHGTVTRHYRMYQKGQETSTNPIASIFAWTRGLAHRAKLDNNKELAFFANALEEVSIETIEAGFMTKDLAACIKGLPNVQRSDYLNTFEFMDKLGENLKIKLAQAKL
【００４１】
ＩＤＨ２（配列番号８２）
MAGYLRVVRSLCRASGSRPAWAPAALTAPTSQEQPRRHYADKRIKVAKPVVEMDGDEMTRIIWQFIKEKLILPHVDIQLKYFDLGLPNRDQTDDQVTIDSALATQKYSVAVKCATITPDEARVEEFKLKKMWKSPNGTIRNILGGTVFREPIICKNIPRLVPGWTKPITIGRHAHGDQYKATDFVADRAGTFKMVFTPKDGSGVKEWEVYNFPAGGVGMGMYNTDESISGFAHSCFQYAIQKKWPLYMSTKNTILKAYDGRFKDIFQEIFDKHYKTDFDKNKIWYEHRLIDDMVAQVLKSSGGFVWACKNYDGDVQSDILAQGFGSLGLMTSVLVCPDGKTIEAEAAHGTVTRHYREHQKGRPTSTNPIASIFAWTRGLEHRGKLDGNQDLIRFAQMLEKVCVETVESGAMTKDLAGCIHGLSNVKLNEHFLNTTDFLDTIKSNLDRALGRQ
【００４２】
ＭＤＨ１（配列番号８３）
MSEPIRVLVTGAAGQIAYSLLYSIGNGSVFGKDQPIILVLLDITPMMGVLDGVLMELQDCALPLLKDVIATDKEDVAFKDLDVAILVGSMPRREGMERKDLLKANVKIFKSQGAALDKYAKKSVKVIVVGNPANTNCLTASKSAPSIPKENFSCLTRLDHNRAKAQIALKLGVTANDVKNVIIWGNHSSTQYPDVNHAKVKLQGKEVGVYEALKDDSWLKGEFVTTVQQRGAAVIKARKLSSAMSAAKAICDHVRDIWFGTPEGEFVSMGVISDGNSYGVPDDLLYSFPVVIKNKTWKFVEGLPINDFSREKMDLTAKELTEEKESAFEFLSSA
【００４３】
ＭＤＨ２（配列番号８４）
MLSALARPASAALRRSFSTSAQNNAKVAVLGASGGIGQPLSLLLKNSPLVSRLTLYDIAHTPGVAADLSHIETKAAVKGYLGPEQLPDCLKGCDVVVIPAGVPRKPGMTRDDLFNTNATIVATLTAACAQHCPEAMICVIANPVNSTIPITAEVFKKHGVYNPNKIFGVTTLDIVRANTFVAELKGLDPARVNVPVIGGHAGKTIIPLISQCTPKVDFPQDQLTALTGRIQEAGTEVVKAKAGAGSATLSMAYAGARFVFSLVDAMNGKEGVVECSFVKSQETECTYFSTPLLLGKKGIEKNLGIGKVSSFEEKMISDAIPELKASIKKGEDFVKTLK
【００４４】
ＰＨＧＤＨ（配列番号８５）
MAFANLRKVLISDSLDPCCRKILQDGGLQVVEKQNLSKEELIAELQDCEGLIVRSATKVTADVINAAEKLQVVGRAGTGVDNVDLEAATRKGILVMNTPNGNSLSAAELTCGMIMCLARQIPQATASMKDGKWERKKFMGTELNGKTLGILGLGRIGREVATRMQSFGMKTIGYDPIISPEVSASFGVQQLPLEEIWPLCDFITVHTPLLPSTTGLLNDNTFAQCKKGVRVVNCARGGIVDEGALLRALQSGQCAGAALDVFTEEPPRDRALVDHENVISCPHLGASTKEAQSRCGEEIAVQFVDMVKGKSLTGVVNAQALTSAFSPHTKPWIGLAEALGTLMRAWAGSPKGTIQVITQGTSLKNAGNCLSPAVIVGLLKEASKQADVNLVNAKLLVKEAGLNVTTSHSPAAPGEQGFGECLLAVALAGAPYQAVGLVQGTTPVLQGLNGAVFRPEVPLRRDLPLLLFRTQTSDPAMLPTMIGLLAEAGVRLLSYQTSLVSDGETWHVMGISSLLPSLEAWKQHVTEAFQFHF
【００４５】
また、クレブス回路調節ポリペプチドは、クレブス回路代謝産物を基質として使用するポリペプチド、例えば、グルタミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＯＴ１やＧＯＴ２など）、または、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）とし得る。グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、別名、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）とは、可逆反応を触媒して、アスパラギン酸とグルタミン酸との間でα−アミノ基を転移する、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）依存性酵素のことを指す。一部の事例では、ＧＯＴは、ＧＯＴ１及びＧＯＴ２として、それぞれ、細胞質、及び、ミトコンドリア内膜の形態で存在している。ＧＯＴ１やＧＯＴ２以外にも、様々なＰＬＰ−依存性酵素が、ＧＯＴとして公知であり、これらも、クレブス回路調節ポリペプチドであり、例えば、アミノトランスフェラーゼ、トリプトファンシンターゼ、アラニンラセマーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、及び、グリコーゲンホスホリラーゼがある。これらの酵素はすべて、本開示の範囲内にある。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）とは、オキサロ酢酸を、ホスホエノールピルビン酸と二酸化炭素に変換する、あらゆるポリペプチド（酵素）のことを指す。例示的なＧＯＴ、及び、ＰＣＫ１のアミノ酸配列を、以下に示す：
【００４６】
ＰＣＫ１（配列番号８６）
MPPQLQNGLNLSAKVVQGSLDSLPQAVREFLENNAELCQPDHIHICDGSEEENGRLLGQMEEEGILRRLKKYDNCWLALTDPRDVARIESKTVIVTQEQRDTVPIPKTGLSQLGRWMSEEDFEKAFNARFPGCMKGRTMYVIPFSMGPLGSPLSKIGIELTDSPYVVASMRIMTRMGTPVLEAVGDGEFVKCLHSVGCPLPLQKPLVNNWPCNPELTLIAHLPDRREIISFGSGYGGNSLLGKKCFALRMASRLAKEEGWLAEHMLILGITNPEGEKKYLAAAFPSACGKTNLAMMNPSLPGWKVECVGDDIAWMKFDAQGHLRAINPENGFFGVAPGTSVKTNPNAIKTIQKNTIFTNVAETSDGGVYWEGIDEPLASGVTITSWKNKEWSSEDGEPCAHPNSRFCTPASQCPIIDAAWESPEGVPIEGIIFGGRRPAGVPLVYEALSWQHGVFVGAAMRSEATAAAEHKGKIIMHDPFAMRPFFGYNFGKYLAHWLSMAQHPAAKLPKIFHVNWFRKDKEGKFLWPGFGENSRVLEWMFNRIDGKASTKLTPIGYIPKEDALNLKGLGHINMMELFSISKEFWEKEVEDIEKYLEDQVNADLPCEIEREILALKQRISQM
【００４７】
ＧＯＴ１（配列番号８７）
MAPPSVFAEVPQAQPVLVFKLTADFREDPDPRKVNLGVGAYRTDDCHPWVLPVVKKVEQKIANDNSLNHEYLPILGLAEFRSCASRLALGDDSPALKEKRVGGVQSLGGTGALRIGADFLARWYNGTNNKNTPVYVSSPTWENHNAVFSAAGFKDIRSYRYWDAEKRGLDLQGFLNDLENAPEFSIVVLHACAHNPTGIDPTPEQWKQIASVMKHRFLFPFFDSAYQGFASGNLERDAWAIRYFVSEGFEFFCAQSFSKNFGLYNERVGNLTVVGKEPESILQVLSQMEKIVRITWSNPPAQGARIVASTLSNPELFEEWTGNVKTMADRILTMRSELRARLEALKTPGTWNHITDQIGMFSFTGLNPKQVEYLVNEKHIYLLPSGRINVSGLTTKNLDYVATSIHEAVTKIQ
【００４８】
ＧＯＴ２（配列番号８８）
MALLHSGRVLPGIAAAFHPGLAAAASARASSWWTHVEMGPPDPILGVTEAFKRDTNSKKMNLGVGAYRDDNGKPYVLPSVRKAEAQIAAKNLDKEYLPIGGLAEFCKASAELALGENSEVLKSGRFVTVQTISGTGALRIGASFLQRFFKFSRDVFLPKPTWGNHTPIFRDAGMQLQGYRYYDPKTCGFDFTGAVEDISKIPEQSVLLLHACAHNPTGVDPRPEQWKEIATVVKKRNLFAFFDMAYQGFASGDGDKDAWAVRHFIEQGINVCLCQSYAKNMGLYGERVGAFTMVCKDADEAKRVESQLKILIRPMYSNPPLNGARIAAAILNTPDLRKQWLQEVKVMADRIIGMRTQLVSNLKKEGSTHNWQHITDQIGMFCFTGLKPEQVERLIKEFSIYMTKDGRISVAGVTSSNVGYLAHAIHQVTK
【００４９】
加えて、クレブス回路調節ポリペプチドは、前駆体をクレブス回路代謝産物に変換する酵素、例えば、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡＴ１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ１；別名、ＧＬＵＤ１）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ１（ＧＰＴ１）、または、グルタミナーゼ（ＧＬＳ）とし得る。ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡＴ１）とは、３−ホスホヒドロキシピルビン酸からホスホセリンへの可逆的変換、及び、３−ヒドロキシ−２−オキソ−４−ホスホノオキシブタノエートからホスホヒドロキシスレオニンへの可逆的変換を触媒する、あらゆるポリペプチド（酵素）のことを指す。ＰＳＡＴ１は、２−オキソグルタル酸と、Ｏ−ホスホ−Ｌ−セリンを生成する。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ１）とは、グルタミン酸を、α−ケトグルタル酸に、または、その逆に変換する、あらゆるポリペプチド（酵素）のことを指す。ＧＤＨ１は、グルタミン酸を、２−オキソグルタル酸（アルファ−ケトグルタル酸）に変換する。グルタメート−ピルビン酸トランスアミナーゼ１（ＧＰＴ１）とは、アラニンと２−オキソグルタル酸との間の可逆的アミノ基転移を触媒して、ピルビン酸とグルタミン酸を生成する、あらゆるポリペプチド（酵素）のことを指す。グルタミナーゼ（ＧＬＳ）とは、グルタミンからグルタメートを生成する、あらゆるポリペプチド（酵素）のことを指す。例示的なＰＳＡＴ１、ＧＤＨ１、ＧＰＴ１、及び、ＧＬＳのアミノ酸配列を、以下に示す：
【００５０】
ＧＰＴ１（配列番号８９）
MASSTGDRSQAVRHGLRAKVLTLDGMNPRVRRVEYAVRGPIVQRALELEQELRQGVKKPFTEVIRANIGDAQAMGQRPITFLRQVLALCVNPDLLSSPNFPDDAKKRAERILQACGGHSLGAYSVSSGIQLIREDVARYIERRDGGIPADPNNVFLSTGASDAIVTVLKLLVAGEGHTRTGVLIPIPQYPLYSATLAELGAVQVDYYLDEERAWALDVAELHRALGQARDHCRPRALCVINPGNPTGQVQTRECIEAVIRFAFEERLFLLADEVYQDNVYAAGSQFHSFKKVLMEMGPPYAGQQELASFHSTSKGYMGECGFRGGYVEVVNMDAAVQQQMLKLMSVRLCPPVPGQALLDLVVSPPAPTDPSFAQFQAEKQAVLAELAAKAKLTEQVFNEAPGISCNPVQGAMYSFPRVQLPPRAVERAQELGLAPDMFFCLRLLEETGICVVPGSGFGQREGTYHFRMTILPPLEKLRLLLEKLSRFHAKFTLEYS
【００５１】
ＧＬＳ（配列番号９０）
MMRLRGSGMLRDLLLRSPAGVSATLRRAQPLVTLCRRPRGGGRPAAGPAAAARLHPWWGGGGWPAEPLARGLSSSPSEILQELGKGSTHPQPGVSPPAAPAAPGPKDGPGETDAFGNSEGKELVASGENKIKQGLLPSLEDLLFYTIAEGQEKIPVHKFITALKSTGLRTSDPRLKECMDMLRLTLQTTSDGVMLDKDLFKKCVQSNIVLLTQAFRRKFVIPDFMSFTSHIDELYESAKKQSGGKVADYIPQLAKFSPDLWGVSVCTVDGQRHSTGDTKVPFCLQSCVKPLKYAIAVNDLGTEYVHRYVGKEPSGLRFNKLFLNEDDKPHNPMVNAGAIVVTSLIKQGVNNAEKFDYVMQFLNKMAGNEYVGFSNATFQSERESGDRNFAIGYYLKEKKCFPEGTDMVGILDFYFQLCSIEVTCESASVMAATLANGGFCPITGERVLSPEAVRNTLSLMHSCGMYDFSGQFAFHVGLPAKSGVAGGILLVVPNVMGMMCWSPPLDKMGNSVKGIHFCHDLVSLCNFHNYDNLRHFAKKLDPRREGGDQRVKSVINLLFAAYTGDVSALRRFALSAMDMEQRDYDSRTALHVAAAEGHVEVVKFLLEACKVNPFPKDRWNNTPMDEALHFGHHDVFKILQEYQVQYTPQGDSDNGKENQTVHKNLDGLL
【００５２】
ＰＳＡＴ１（配列番号９１）
MDAPRQVVNFGPGPAKLPHSVLLEIQKELLDYKGVGISVLEMSHRSSDFAKIINNTENLVRELLAVPDNYKVIFLQGGGCGQFSAVPLNLIGLKAGRCADYVVTGAWSAKAAEEAKKFGTINIVHPKLGSYTKIPDPSTWNLNPDASYVYYCANETVHGVEFDFIPDVKGAVLVCDMSSNFLSKPVDVSKFGVIFAGAQKNVGSAGVTVVIVRDDLLGFALRECPSVLEYKVQAGNSSLYNTPPCFSIYVMGLVLEWIKNNGGAAAMEKLSSIKSQTIYEIIDNSQGFYVCPVEPQNRSKMNIPFRIGNAKGDDALEKRFLDKALELNMLSLKGHRSVGGIRASLYNAVTIEDVQKLAAFMKKFLEMHQL
【００５３】
ＧＤＨ１（配列番号９２）
MTYKCAVVDVPFGGAKAGVKINPKNYTDNELEKITRRFTMELAKKGFIGPGIDVPAPDMSTGEREMSWIADTYASTIGHYDINAHACVTGKPISQGGIHGRISATGRGVFHGIENFINEASYMSILGMTPGFGDKTFVVQGFGNVGLHSMRYLHRFGAKCIAVGESDGSIWNPDGIDPKELEDFKLQHGSILGFPKAKPYEGSILEADCDILIPAASEKQLTKSNAPRVKAKIIAEGANGPTTPEADKIFLERNIMVIPDLYLNAGGVTVSYFEWLKNLNHVSYGRLTFKYERDSNYHLLMSVQESLERKFGKHGGTIPIVPTAEFQDRISGASEKDIVHSGLAYTMERSARQIMRTAMKYNLGLDLRTAAYVNAIEKVFKVYNEAGVTFT
【００５４】
クレブス回路調節ポリペプチドは、好適な種に由来する天然ポリペプチド、例えば、哺乳動物クレブス回路調節ポリペプチド、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類に由来するクレブス回路調節ポリペプチドなどとし得る。このような天然ポリペプチドは、当該技術分野で公知であり、例えば、一般に利用可能な遺伝子データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋを検索するためのクエリとして、上記アミノ酸配列のいずれかを使用して得ることができる。本開示に使用するクレブス回路調節ポリペプチドは、上記した例示的なタンパク質のいずれかと、少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または、それ以上）の配列同一性を共有し得る。
【００５５】
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７，１９９３において一部変更された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８，１９９０のアルゴリズムを用いて測定する。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴプログラム、及び、ＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を使用して、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２，１９９７に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラム、及び、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【００５６】
一部の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチドは、ポリペプチドを、所望の細胞内区画に輸送するために、細胞内区画局在化シグナル伝達ペプチド（例えば、ミトコンドリア局在化シグナル伝達ペプチド）にコンジュゲートし得る。例えば、ＧＯＴ２ポリペプチドは、ミトコンドリア局在化シグナル伝達ペプチドを含むことで、宿主免疫細胞のミトコンドリアへの輸送を可能ならしめる。
【００５７】
あるいは、クレブス回路調節ポリペプチドを、ネイティブ同等物の機能的バリアントとし得る。このような機能的バリアントは、ネイティブ同等物の機能的ドメイン（複数可）の外側に１つ以上の変異を含み得る。ネイティブクレブス回路調節ポリペプチドの機能的ドメインは、当該技術分野で公知のものとし得る、または、そのアミノ酸配列に基づいて予測することができる。機能的ドメイン（複数可）の外側の変異が、タンパク質の生物学的活性に実質的に影響を及ぼすことは予測し得ない。一部の事例では、機能的バリアントは、ネイティブ同等物と比較して、クレブス回路の高度の調節を示し得る。あるいは、機能的バリアントは、ネイティブ同等物と比較して、クレブス回路の調節を難しくし得る。
【００５８】
クレブス回路調節ポリペプチドの機能的バリアントは、野生型ポリペプチドの機能的バリアントとし得るものであり、このものは、ネイティブ対応物と比較して、１つ以上の突然変異を含み、そして、ネイティブ対応物と実質的に同じ生物学的活性を保持し得る。一部の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチドの機能的バリアントは、ネイティブ対応物と比較して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または、それ以上の突然変異を含む。
【００５９】
例えば、ＧＯＴの機能的バリアントは、ネイティブ対応物と比較して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または、それ以上の突然変異を含み得る。一部の実施形態では、ＧＯＴの機能的バリアントは、配列番号８８の位置１５９（例えば、Ｋ１５９Ｑ）のリジン残基の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＧＯＴの機能的バリアントは、配列番号８８の１８５位（例えば、Ｋ１８５Ｑ）のリジン残基の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＧＯＴの機能的バリアントは、配列番号８８の位置４０４（例えば、Ｋ４０４Ｑ）のリジン残基の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＧＯＴの機能的バリアントは、配列番号８８の位置１５９（例えば、Ｋ１５９Ｑ）と位置１８５（例えば、Ｋ１８５Ｑ）のリジン残基の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＧＯＴの機能的バリアントは、配列番号８８の位置１８５（例えば、Ｋ１８５Ｑ）と位置４０４（例えば、Ｋ４０４Ｑ）のリジン残基の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＧＯＴの機能的バリアントは、配列番号８８の位置１５９（例えば、Ｋ１５９Ｑ）と位置４０４（例えば、Ｋ４０４Ｑ）のリジン残基の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＧＯＴの機能的バリアントは、配列番号８８の位置１５９（例えば、Ｋ１５９Ｑ）、位置１８５（例えば、Ｋ１８５Ｑ）、及び、位置４０４（例えば、Ｋ４０４Ｑ）のリジン残基の突然変異を含む。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１５）３４：１１００−１１２５を参照されたい、この文献での関連する開示は、本明細書に記載の目的及び趣旨に関して、参照により、本明細書で援用する。
【００６０】
一部の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチドの機能的バリアントは、ネイティブ対応物と比較して変化し得る１つ以上の生物学的特性（例えば、改変状態、触媒活性、細胞位置、及び／または、結合パートナー）を示し得る。クレブス回路調節ポリペプチドの機能的バリアントの例として、クレブス回路での反応を触媒する酵素の機能的バリアント（例えば、ＩＤＨ、ＭＤＨ、または、ＰＨＧＤＨの機能的バリアント）、クレブス回路代謝産物を基質として使用する酵素の機能的バリアント（例えば、ＧＯＴ、または、ＰＣＫ１の機能的バリアント）、及び、前駆体をクレブス回路代謝産物に変換する酵素の機能的バリアント（例えば、ＰＳＡＴ１、ＧＤＨ１、ＧＰＴ１、または、ＧＬＳの機能的バリアント）があるが、これらに限定されない。
【００６１】
あるいは、または、加えて、機能的バリアントは、ネイティブ同等物における１つ以上の位置（例えば、最大２０の位置、最大１５の位置、最大１０の位置、最大で５、４、３、２、１の位置（複数可））に、保存的変異（複数可）を含有し得る。本明細書で使用する「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換が生じたタンパク質において、相対的な電荷またはサイズの特徴を変化させないアミノ酸置換のことを意味する。当業者に公知のポリペプチド配列を変化させる方法、例えば、このような方法を集めた参照文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている方法などに従って、バリアントを調製することができる。アミノ酸の保存的置換としては、以下のグループ、（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、及び、（ｇ）Ｅ、Ｄの中のアミノ酸内で生じた置換がある。
【００６２】
ＩＩ．キメラ受容体ポリペプチド
本明細書で使用するキメラ受容体ポリペプチドとは、宿主細胞の表面上で発現することができる非天然分子のことを意味する。キメラ受容体ポリペプチドは、関係する抗原（例えば、がんなどの疾患と関連する抗原、または、病原体と関連する抗原；本明細書の説明を参照されたい）を標的とすることができる細胞外標的結合ドメインを含む。細胞外標的結合ドメインは（例えば、本明細書で開示したＣＡＲポリペプチドでの細胞外抗原結合ドメイン）、関係する抗原に直接結合することができる。あるいは、細胞外標的結合ドメインは、中間物、例えば、抗体などのＦｃ含有薬を介して、関係する抗原に結合することができる。キメラ受容体ポリペプチドは、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、または、これらの組み合わせをさらに含み得る。一部の事例では、キメラ受容体ポリペプチドは、共刺激ドメインを含み得ない。キメラ受容体ポリペプチドは、宿主細胞上で発現する際に、標的抗原に対して直接的または間接的に結合するために、細胞外標的結合ドメインが細胞外に位置するように構成されている。任意の共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化、及び／または、エフェクターシグナル伝達を誘発するために、細胞質内に位置し得る。
【００６３】
一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドは、細胞外標的結合ドメインのＣ末端であり、かつ、膜貫通ドメインのＮ末端である位置にあり得るヒンジドメインをさらに含み得る。ヒンジは、任意の好適な長さのものとし得る。その他の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドは、ヒンジドメインを全く有し得ない。さらにその他の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドは、短いヒンジドメイン（例えば、最大２５アミノ酸残基を含む）を有し得る。
【００６４】
一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、及び、細胞質シグナル伝達ドメインを含む。その他の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質シグナル伝達ドメイン、及び、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【００６５】
一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドを、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ポリペプチドとすることができる。本明細書で使用するＡＣＴＲポリペプチド（別名、ＡＣＴＲ構築物）とは、宿主細胞の表面上で発現することができる非天然分子のことを意味し、そして、免疫グロブリンのＦｃ部分との結合親和性、及び、それに対する特異性を有する細胞外ドメイン（「Ｆｃ結合部」または「Ｆｃ結合ドメイン」）、膜貫通ドメイン、及び、細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載したＡＣＴＲポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み得る。
【００６６】
その他の実施形態では、本明細書で開示したキメラ受容体ポリペプチドを、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドとし得る。本明細書で使用するＣＡＲポリペプチド（別名、ＣＡＲ構築物）とは、宿主細胞の表面上で発現することができる非天然分子のことを意味し、そして、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞質シグナル伝達ドメインを含む。本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み得る。
【００６７】
細胞外抗原結合ドメインは、医学的症状（例えば、疾患）と関連する天然抗原を含む標的抗原に対して特異的に結合する、あらゆるペプチドもしくはポリペプチド、または、疾患関連抗原を標的とする治療薬にコンジュゲートした抗原部分に対して特異的に結合する、あらゆるペプチドもしくはポリペプチドとし得る。
【００６８】
一部の実施形態では、本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み得る。ＣＡＲポリペプチドは、宿主細胞上で発現する際に、標的分子及び細胞質シグナル伝達ドメインに結合するために、細胞外抗原結合ドメインが、細胞外に位置するように構成されている。任意の共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化、及び／または、エフェクターシグナル伝達を誘発するために、細胞質内に位置し得る。
【００６９】
本明細書で使用する語句「タンパク質Ｘ膜貫通ドメイン」（例えば、ＣＤ８膜貫通ドメイン）とは、所定のタンパク質の任意の部分、すなわち、膜内において熱力学的に安定な膜貫通タンパク質Ｘのことを意味する。
【００７０】
本明細書で使用する語句「タンパク質Ｘ細胞質シグナル伝達ドメイン」、例えば、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインとは、細胞の内部、すなわち、細胞小器官と相互作用し、当該技術分野で公知の一次シグナルを中継することで、免疫細胞の増殖及び／または活性化をもたらすことができる、タンパク質（タンパク質Ｘ）の任意の部分のことを意味する。本明細書に記載した細胞質シグナル伝達ドメインは、免疫細胞を完全に活性化させるための二次シグナルを中継する共刺激シグナル伝達ドメインとは異なる。
【００７１】
本明細書で使用する語句「タンパク質Ｘ共刺激シグナル伝達ドメイン」、例えば、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインとは、共刺激シグナル（二次シグナル）を、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞など）に伝達して、免疫細胞の完全な活性化をもたらすことができる、所与の共刺激タンパク質（タンパク質Ｘ、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、または、ＩＣＯＳなど）の部分のことを意味する。
【００７２】
Ａ．細胞外標的結合ドメイン
本明細書で開示したキメラ受容体ポリペプチドは、直接的結合または（抗体などの中間物を介した）間接的結合のいずれかで、関係する抗原（例えば、本明細書に記載した抗原）を標的とする細胞外ドメインを含む。キメラ受容体ポリペプチドを、Ｆｃ結合ドメインを含むＡＣＴＲポリペプチドとし得る。あるいは、キメラ受容体ポリペプチドを、細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドとし得る。
【００７３】
Ｆｃ結合ドメイン
本明細書に記載したＡＣＴＲポリペプチドは、Ｆｃ結合ドメイン、すなわち、好適な哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、または、サル）の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、または、ＩｇＥ）のＦｃ部分に結合することができるＦｃ結合ドメインである細胞外ドメインを含む。好適なＦｃ結合ドメインは、哺乳動物Ｆｃ受容体などの天然タンパク質、または、ある特定の細菌タンパク質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ）に由来し得る。加えて、Ｆｃ結合ドメインを、本明細書に記載した抗体のいずれかのＦｃ部分に対して、大きな親和性と特異性をもってして、特異的に結合するように改変した合成ポリペプチドとし得る。例えば、このようなＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分に特異的に結合する抗体、または、その抗原結合フラグメントとすることができる。例として、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、または、単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ）があるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆｃ結合ドメインを、Ｆｃに対する結合活性を使用してペプチドコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして同定し得る、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、小モジュール免疫治療薬（ＳＭＩＰ）、アドネクチン、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、または、アンチカリンなどのＦｃ部分に対して特異的に結合する合成ペプチドとすることができる。
【００７４】
一部の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、哺乳動物Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。本明細書で使用する「Ｆｃ受容体」は、数多くの免疫細胞（Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞、及び、好酸球など）の表面上に発現し、そして、抗体のＦｃドメインに対する結合特異性を示す細胞表面結合受容体である。Ｆｃ受容体は、一般的には、抗体のＦｃ（結晶性フラグメント）部分に対する結合特異性を有する少なくとも２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインで構成される。一部の事例では、抗体のＦｃ部分にＦｃ受容体が結合すると、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）作用を誘発し得る。本明細書に記載したＡＣＴＲポリペプチドを構築するために使用するＦｃ受容体は、野生型同等物と比較して、Ｆｃに対する大きな親和性または低い親和性を有し得る、天然の遺伝子多型バリアント（例えば、ＣＤ１６  Ｖ１５８バリアント）とし得る。あるいは、Ｆｃ受容体は、Ｉｇ分子のＦｃ部分に対する結合親和性を変化させる１つ以上の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または、１０の変異を含む最大１０アミノ酸残基置換）を有する、野生型同等物の機能的バリアントとし得る。一部の事例では、変異は、Ｆｃ受容体のグリコシル化パターンを改変させて、Ｆｃに対する結合親和性を改変させ得る。
【００７５】
本明細書に記載した方法または構築物のいずれかに用い得る、Ｆｃ受容体細胞外ドメイン（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．５３：１−９，２００１を参照されたい）での数多くの例示的な遺伝子多型を、以下の表に列挙する。
【表１】
2021534740.tif 000003
【００７６】
Ｆｃ受容体は、それが結合可能な抗体のアイソタイプに基づいて分類する。例えば、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、一般的には、ＩｇＧ抗体、例えば、１つ以上のそのサブタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）などに結合する；Ｆｃアルファ受容体（ＦｃαＲ）は、一般的には、ＩｇＡ抗体に結合する；及び、Ｆｃイプシロン受容体（ＦｃεＲ）は、一般的には、ＩｇＥ抗体に結合する。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、または、Ｆｃイプシロン受容体である。Ｆｃガンマ受容体の例として、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、及び、ＣＤ１６Ｂがあるが、これらに限定されない。Ｆｃアルファ受容体の例は、ＦｃαＲ１／ＣＤ８９である。Ｆｃイプシロン受容体の例として、ＦｃεＲＩと、ＦｃεＲＩＩ／ＣＤ２３があるが、これらに限定されない。本明細書に記載したＡＣＴＲポリペプチドの構築のために使用する例示的なＦｃ受容体、及び、対応するＦｃドメインに対するそれらの結合活性を、以下の表に列挙する。
【表２】
2021534740.tif 000004
【００７７】
本明細書に記載したＡＣＴＲポリペプチドでの使用のためのＦｃ受容体のリガンド結合ドメインの選択は、当業者に自明である。例えば、選択は、Ｆｃ受容体の結合が望まれる抗体のアイソタイプ、及び、結合相互作用の所望の親和性などの因子に依存し得る。
【００７８】
あらゆるＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメイン。一部の事例では、Ｆｃ結合ドメインは、Ｆｃに対する親和性を調節し得る天然の多型を導入し得るＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。一部の事例では、Ｆｃ結合ドメインは、１５８位に多型（例えば、バリン、または、フェニルアラニン）を導入したＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。一部の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、そのグリコシル化状態と、Ｆｃに対するその親和性を改変させる条件下で生産する。
【００７９】
Ｆ１５８残基及びＶ１５８残基を、太字及び下線（シグナルペプチドはイタリック体）で強調表示して、ヒトＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８バリアント、及び、ヒトＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８バリアントのアミノ酸配列を以下に記載する。
ＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８（配列番号９３）：
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNS
TQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPR
WVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYF
CRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVK
TNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
ＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８（配列番号９４）：
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
【００８０】
一部の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、ＩｇＧ抗体のサブセットに対してＡＣＴＲポリペプチドを特異的にする修飾を導入したＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。例えば、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）に対する親和性を高める、または、抑制する変異を導入し得る。
【００８１】
本明細書に記載したあらゆるＦｃ結合ドメインは、治療抗体のＦｃ部分に対する好適な結合親和性を有し得る。本明細書で使用する「結合親和性」とは、見かけの結合定数、すなわち、ＫAのことを意味する。ＫAは、解離定数であるＫDの逆数である。本明細書に記載したＡＣＴＲポリペプチドのＦｃ受容体ドメインの細胞外リガンド結合ドメインは、抗体のＦｃ部分に対して、少なくとも１０-5、１０-6、１０-7、１０-8、１０-9、１０-10Ｍ、または、それ以下の結合親和性Ｋdを有し得る。一部の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、別の抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、または、そのサブタイプ（複数可）に対するＦｃ結合ドメインの結合親和性と比較して、抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、または、そのサブタイプ（複数可）に対する高い結合親和性を有する。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、別の抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、または、そのサブタイプ（複数可）に対するＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインの結合性と比較して、抗体、抗体のアイソタイプ（複数可）、または、そのサブタイプ（複数可）に対する特異性を有する。
【００８２】
当該技術分野で公知のその他のＦｃ結合ドメインも、本明細書に記載したＡＣＴＲ構築物に使用することができ、それらとしては、例えば、ＷＯ２０１５０５８０１８Ａ１、及び、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１５９９９号に記載のものがあり、これら文献のそれぞれでの関連する開示は、本明細書に記載の目的及び趣旨に関して、参照により、本明細書で援用する。
【００８３】
細胞外抗原結合ドメイン
本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞の特異性を改めて転換する細胞外抗原結合ドメインを含む。本明細書で使用する「細胞外抗原結合ドメイン」とは、医学的症状（例えば、疾患）と関連する天然抗原であり得る関係する標的抗原に対する結合特異性を有するペプチドもしくはポリペプチド、または、疾患関連抗原を標的とする治療薬にコンジュゲートした抗原部分に対する結合特異性を有するペプチドもしくはポリペプチドのことを意味する。本明細書に記載した細胞外抗原結合ドメインは、Ｆｃ受容体の細胞外ドメインを含んでおらず、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合し得ない。Ｆｃフラグメントに結合しない細胞外ドメインとは、二者間の結合活性が通常のアッセイを用いて検出可能ではない、または、バックグラウンドだけ、もしくは、生物学的に有意ではない結合活性が、一般的なアッセイを使用して検出されることを意味する。
【００８４】
一部の事例では、本明細書に記載したあらゆるＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）に結合することができるペプチドもしくはポリペプチド、または、主要組織適合遺伝子複合体と複合体を形成して抗原提示細胞の細胞表面上に提示される抗原（または、そのフラグメント）に結合することができるペプチドもしくはポリペプチドである。このような細胞外抗原結合ドメインは、標的細胞表面抗原に対して高い結合親和性で結合する抗体に由来し得る一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）とし得る。例示的な細胞表面標的抗原、及び、それらに結合する例示的な抗体を以下の表３に列挙する。
【表３−１】
2021534740.tif 000005
【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
2021534740.tif 000015
【００８５】
細胞外抗原結合ドメインは、関係する標的抗原に応じて、表１に列挙した抗体のいずれかに由来する抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を含み得る。
【００８６】
その他の実施形態では、本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドのいずれかの細胞外抗原結合ドメインは、細菌抗原、ウイルス抗原、または、真菌抗原などの病原性抗原に特異的なものとし得る。一部の例を、以下に示す：インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、ヘマグルチニン、もしくは、Ｍ２タンパク質、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ糖タンパク質もしくはＧ糖タンパク質、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、もしくは、ｇＥ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ＭＯＭＰもしくはＰｏｒＢタンパク質、デング熱ウイルスコアタンパク質、マトリックスタンパク質、もしくは、糖タンパク質Ｅ、麻疹ウイルスヘマグルチニン、単純ヘルペスウイルスＩＩ型糖タンパク質ｇＢ、ポリオウイルスＩ  ＶＰ１、ＨＩＶ  １のエンベロープ糖タンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原もしくは表面抗原、ジフテリア毒素、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ２４Ｍ  エピトープ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ  ｐｉｌｉｎ、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質１９５、伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、または、ヒトＣ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｅ１もしくはＥ２。
【００８７】
加えて、本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、疾患または障害と関連する抗原（例えば、本明細書に記載した腫瘍抗原または病原性抗原）を標的とする治療薬にコンジュゲートしたタグに対して特異的なものとし得る。一部の事例では、治療薬にコンジュゲートしたタグは、抗原性のものとすることができ、ＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、抗原性タグに対する高い結合親和性と、特異性を有する抗体の抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）とすることができる。例示的な抗原性タグとして、ビオチン、アビジン、蛍光分子（例えば、ＧＦＰ、ＹＲＰ、ルシフェラーゼ、または、ＲＦＰ）、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ、Ｈｉｓ（例えば、６×ＨｉｓなどのポリＨｉｓ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＧＳＴ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ｔｒｘ、Ｔ７、ＨＳＶ、ＶＳＶ（例えば、ＶＳＶ−Ｇ）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｖ５、ｅ−タグ、Ｓ−タグ、ＫＴ３、Ｅ２、Ａｕ１、Ａｕ５、及び／または、チオレドキシンがあるが、これらに限定されない。
【００８８】
その他の事例では、治療薬にコンジュゲートしたタグは、リガンド−受容体ペアのメンバーであり、細胞外抗原結合ドメインは、タグに結合するリガンド−受容体ペアのその他のメンバーまたはそのフラグメントを含む。例えば、治療薬にコンジュゲートしたタグを、ビオチンとすることができ、ＣＡＲポリペプチドの細胞外抗原結合ドメインは、アビジンのビオチン結合フラグメントを含み得る。例えば、Ｕｒｂａｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８を参照されたい。その他の例として、細胞外抗原結合ドメインが、タンパク質タグ、例えば、ＦＩＴＣ（Ｔａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；及び、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、ＰＮＥ（Ｒｏｄｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、Ｌａ−ＳＳ−Ｂ（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、ビオチン（Ｌｏｈｍｕｌｌｕｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、及び、ロイシン−ジッパー（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）などに特異的なｓｃＦｖフラグメントである抗タグＣＡＲがある。本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドに使用する抗原結合ドメインの選択は、当業者に自明である。例えば、選択は、標的抗原のタイプ、及び、結合相互作用の所望の親和性などの因子に依存し得る。
【００８９】
本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドのいずれかの細胞外抗原結合ドメインは、標的抗原（例えば、本明細書に記載した標的の内のいずれか１つ）、または、その抗原性エピトープに対する好適な結合親和性を有し得る。本明細書で使用する「結合親和性」とは、見かけの結合定数すなわちＫAのことを意味する。ＫAは、解離定数（ＫD）の逆数である。本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドに使用する細胞外抗原結合ドメインは、標的抗原または抗原性エピトープに対して、少なくとも１０-5、１０-6、１０-7、１０-8、１０-9、１０-10Ｍ、または、それ以下の結合親和性（ＫD）を有し得る。強い結合親和性は、低いＫDに対応している。第２の抗原と比較した、第１の抗原に対する細胞外抗原結合ドメインの大きな親和性の結合は、第２の抗原に結合するためのＫA（または、数値のＫD）と比較して、第１の抗原に結合するためのより大きなＫA（または、小さな数値のＫD）で示し得る。このような事例では、細胞外抗原結合ドメインは、第２の抗原（例えば、二次構造での同一の第１のタンパク質、もしくは、その模倣体；または、第２のタンパク質）と比較して、第１の抗原（例えば、一次構造での第１のタンパク質、もしくは、その模倣体）に対して特異性を有する。結合親和性の（例えば、特異性、または、その他の比較での）差異は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００、または、１０5倍とすることができる。
【００９０】
結合親和性（または、結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または、分光法（例えば、蛍光アッセイを用いたもの）などの様々な方法を使用して測定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ−Ｐ緩衝剤（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）中である。これらの技術を使用して、標的タンパク質濃度に応じた、結合した結合タンパク質の濃度を測定することができる。結合した結合タンパク質の（［結合した］）濃度は、一般的に、以下の方程式で、遊離標的タンパク質の濃度（［遊離］）と関連している：
［結合した］＝［遊離］／（Ｋｄ＋［遊離］）
【００９１】
しかしながら、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析などの方法を使用して測定した、ＫAに比例する親和性の定量的測定値を得ることが時に十分であり、それにより、比較のために、例えば、大きな親和性が、例えば、２倍を超えるか否かを測定するために、例えば、機能アッセイ、例えば、インビトロまたはインビボアッセイでの活性を使用して、親和性の定性的な測定値を得ること、または、親和性の推定を得ることができるので、ＫAの正確な測定を実施することが常に必要というわけではない。
【００９２】
Ｂ．膜貫通ドメイン
本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド、または、ＣＡＲポリペプチド）の膜貫通ドメインは、当該技術分野で公知のあらゆる形態とすることができる。本明細書で使用する「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜内、好ましくは、真核細胞膜内において熱力学的に安定なあらゆるタンパク質構造のことを意味する。本明細書で使用するキメラ受容体ポリペプチドでの使用に適応する膜貫通ドメインは、天然タンパク質から取得し得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成の非天然タンパク質セグメント、例えば、細胞膜内において熱力学的に安定な疎水性タンパク質セグメントとすることができる。
【００９３】
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、アルファへリックス、２つ以上のアルファへリックスの複合体、ベータ−バレル、または、細胞のリン脂質二重層を貫通するあらゆるその他の安定構造を形成し得る。さらに、膜貫通ドメインは、さらに、または、あるいは、膜貫通ドメインが膜を貫通して通過する回数、及び、タンパク質の配向を含む、膜貫通ドメインのトポロジーに基づいて分類し得る。例えば、１回貫通型膜タンパク質は、細胞膜を１回貫通し、複数回貫通型膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７、または、それ以上の回数）貫通する。
【００９４】
膜タンパク質は、その末端のトポロジー、及び、細胞の内外に対する膜貫通セグメント（複数可）のトポロジーに応じて、Ｉ型、ＩＩ型、または、ＩＩＩ型と定義し得る。Ｉ型膜タンパク質は、１回膜貫通領域を有し、そして、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側上に存在し、かつ、タンパク質のＣ末端が細胞質側上に存在するように配向している。ＩＩ型膜タンパク質も、１回膜貫通領域を有しており、そして、タンパク質のＣ末端が、細胞の脂質二重層の細胞外側上に存在し、かつ、タンパク質のＮ末端が、細胞質側上に存在するように配向している。ＩＩＩ型膜タンパク質は、複数の膜貫通セグメントを有しており、そして、膜貫通セグメントの数、ならびに、Ｎ末端及びＣ末端の位置に基づいてさらに分類し得る。
【００９５】
一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドの膜貫通ドメインは、Ｉ型１回貫通型膜タンパク質に由来する。１回貫通型膜タンパク質として、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及び、ＦＧＦＲ２Ｂ、があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、次に示す：ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及び、ＦＧＦＲ２Ｂから選択される膜タンパク質に由来する。一部の事例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８のものである（例えば、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αのものである）。一部の事例では、膜貫通ドメインは、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７のものである。その他の事例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８のものである。一部の事例では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドは、あらゆる非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含み得ない。一部の事例では、このようなキメラ受容体ポリペプチドは、ヒンジドメインを含み得ない。あるいは、または、加えて、そのようなキメラ受容体ポリペプチドは、本明細書に記載したような２つ以上の共刺激領域を含み得る。その他の事例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３４のものである。なおもその他の事例では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８αに由来しない。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドの膜貫通ドメインは、１回貫通型アルファへリックスである。
【００９６】
複数回貫通型膜タンパク質に由来する膜貫通ドメインも、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドでの使用に適応し得る。複数回貫通型膜タンパク質は、複合アルファへリックス構造（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、または、それ以上のアルファへリックス）、または、ベータシート構造を含み得る。複数回貫通型膜タンパク質のＮ末端及びＣ末端は、脂質二重層の相対する側に存在することが好ましく、例えば、タンパク質のＮ末端は、脂質二重層の細胞質側に存在し、かつ、タンパク質のＣ末端は、細胞外側に存在する。複数回貫通型膜タンパク質に由来する１つのへリックス貫通部、または、複数のへリックス貫通部のいずれかを、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドの構築のために使用することができる。
【００９７】
本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドに使用する膜貫通ドメインは、合成非天然タンパク質セグメントの少なくとも一部も含み得る。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、合成非天然アルファへリックス、または、ベータシートである。一部の実施形態では、タンパク質セグメントは、少なくとも約２０アミノ酸、例えば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または、それ以上のアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は、当該技術分野、例えば、米国特許第７，０５２，９０６Ｂ１号、及び、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０００／０３２７７６Ａ２号において公知であり、それぞれの文献での関連する開示は、参照により、本明細書で援用する。
【００９８】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、システイン残基を含まない。一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、１つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、２つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、３つ以上（例えば、３、４、５、または、それ以上）のシステイン残基を含む。
【００９９】
膜貫通ドメインは、膜貫通領域と、膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する細胞質領域とを含み得る。膜貫通ドメインの細胞質領域は、３つ以上のアミノ酸を含み得るものであり、そして、一部の実施形態では、脂質二重層内において膜貫通ドメインが配向することを補助する。一部の実施形態では、１つ以上のシステイン残基が、膜貫通ドメインの膜貫通領域内に存在している。一部の実施形態では、１つ以上のシステイン残基が、膜貫通ドメインの細胞質領域内に存在している。一部の実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正に荷電したアミノ酸を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸アルギニン、セリン、及び、リジンを含む。
【０１００】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、膜貫通領域は、主として、疎水性アミノ酸残基、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、または、バリンなどを含む。一部の実施形態では、膜貫通領域は、疎水性である。一部の実施形態では、膜貫通領域は、ポリ−ロイシン−アラニン配列を含む。
【０１０１】
タンパク質またはタンパク質セグメントの疎水性指標、疎水特性、または、親水特性は、例えば、Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性指標解析を含む、当該技術分野で公知のあらゆる方法を使用して、評価することができる。
【０１０２】
Ｃ．共刺激シグナル伝達ドメイン
数多くの免疫細胞は、細胞の増殖、分化、及び、生存を促すことに加えて、細胞のエフェクター機能を活性化するために、抗原特異的シグナルの刺激の他に、共刺激を必要としている。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチド、例えば、本明細書に記載したＡＣＴＲまたはＣＡＲポリペプチドなどは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、または、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。本明細書で使用する用語「共刺激シグナル伝達ドメイン」とは、細胞内でシグナル伝達を媒介して、エフェクター機能などの免疫応答（二次シグナル）を誘導する共刺激シグナル伝達タンパク質の少なくとも１つのフラグメントのことを意味する。当該技術分野で公知のとおり、Ｔ細胞などの免疫細胞の活性化は、２つのシグナル：（１）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、抗原提示細胞が提示する抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体との結合によって誘発され、一般的には、このＴＣＲ複合体の構成要素であるＣＤ３ζによって駆動される抗原特異的シグナル（一次シグナル）；及び、（ｉｉ）共刺激受容体と、そのリガンドとの間の相互作用によって誘発される共刺激シグナル（二次シグナル）を必要とすることが多い。共刺激受容体は、ＴＣＲ誘発シグナル伝達の他に、共刺激シグナル（二次シグナル）を伝達し、そして、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または、好酸球などの免疫細胞が介在する反応を調節する。
【０１０３】
宿主細胞（例えば、免疫細胞）での共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、細胞のサイトカインの生産及び分泌、貪食性、増殖、分化、生存、及び／または、細胞傷害を改善または抑制し得る。あらゆる共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドでの使用に適応し得る。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ（複数可）は、キメラ受容体ポリペプチドが発現し得る免疫細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または、好酸球）、及び、所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）などの因子に基づいて選択される。キメラ受容体ポリペプチドに使用する共刺激シグナル伝達ドメインの例として、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ、及び、ＰＤＣＤ６）；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンフォトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−アルファ、及び、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）；ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及び、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）；ならびに、あらゆるその他の共刺激分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、イカロス、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ  Ｒ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、及び、ＮＫＧ２Ｃなどの共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１（ＣＤ１１ａ）、もしくは、ＣＤ２、または、それらのあらゆるバリアントのものである。
【０１０４】
本明細書に記載した共刺激シグナル伝達ドメインのいずれかのバリアントもまた本開示の範囲内であり、その結果、共刺激シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の免疫応答を調節することができる。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、野生型同等物と比較して、最大１０（例えば、１、２、３、４、５、または、８）のアミノ酸残基の変異、例えば、アミノ酸置換、欠失、または、付加などを含む。１つ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換、欠失、または、付加）を含むこのような共刺激シグナル伝達ドメインを、バリアントと称し得る。
【０１０５】
共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の改善、及び、免疫応答の刺激の改善をもたらし得る。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達の抑制、及び、免疫応答の刺激抑制をもたらし得る。例えば、天然ＣＤ２８アミノ酸配列の残基１８６及び１８７の変異は、キメラ受容体ポリペプチドの共刺激ドメインによる共刺激活性の改善、及び、免疫応答の誘導をもたらし得る。一部の実施形態では、変異は、ＣＤ２８共刺激ドメインのグリシン残基を有する１８６位と１８７位のそれぞれでのリジンの置換であり、ＣＤ２８LL→GGバリアントと称する。ドメインの共刺激活性を改善または抑制し得る、共刺激シグナル伝達ドメインにて生成可能な別の変異は、当業者に自明である。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、または、ＣＤ２８LL→GGバリアントのものである。
【０１０６】
一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、単一の共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２７共刺激ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＩＣＯＳ共刺激ドメイン、または、ＯＸ４０共刺激ドメインなどを含有し得る。
【０１０７】
一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、２つ以上（例えば、２、３、または、それ以上）の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、２つ以上の同一の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインの２つの複製を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、異なる共刺激タンパク質に由来する２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載した任意の２つ以上の共刺激タンパク質などを含む。共刺激シグナル伝達ドメインのタイプ（複数可）の選択は、キメラ受容体ポリペプチドと共に使用する宿主細胞のタイプ（例えば、Ｔ細胞、または、ＮＫ細胞）、及び、所望の免疫エフェクター機能などの因子に基づき得る。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、２つの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインの２つの複製を含む。一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチドは、異なる共刺激受容体に由来する２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載した任意の２つ以上の共刺激受容体など、例えば、ＣＤ２８と４−１ＢＢ、ＣＤ２８とＣＤ２７、ＣＤ２８とＩＣＯＳ、ＣＤ２８LL→GGバリアントと４−１ＢＢ、ＣＤ２８とＯＸ４０、または、ＣＤ２８LL→GGバリアントとＯＸ４０を含み得る。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８と４−１ＢＢである。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８LL→GGバリアントと４−１ＢＢである。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８とＯＸ４０である。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８LL→GGバリアントとＯＸ４０である。一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドは、ＣＤ２８とＩＣＯＳＬの組み合わせを含有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドは、ＣＤ２８とＣＤ２７の組み合わせを含有し得る。特定の実施形態では、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ＣＤ２８またはＣＤ２８LL→GGバリアント共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端側に位置している。
【０１０８】
一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドは、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。
【０１０９】
Ｄ．細胞質シグナル伝達ドメイン
あらゆる細胞質シグナル伝達ドメインを使用して、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲ、または、ＣＡＲポリペプチド）を作製することができる。このような細胞質ドメインは、免疫細胞の増殖、及び／または、活性化をもたらす細胞シグナル伝達（一次シグナル伝達）の誘発に関与するあらゆるシグナル伝達ドメインとし得る。本明細書に記載した細胞質シグナル伝達ドメインは、免疫細胞を完全に活性化させるための共刺激または二次シグナルを中継することが当該技術分野で公知である共刺激シグナル伝達ドメインではない。
【０１１０】
本明細書に記載した細胞質ドメインは、免疫受容体チロシンをベースとした活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）ドメイン（例えば、少なくとも１つのＩＴＡＭドメイン、少なくとも２つのＩＴＡＭドメイン、または、少なくとも３つのＩＴＡＭドメイン）を含み得る、または、ＩＴＡＭを含み得ない。本明細書で使用する「ＩＴＡＭ」は、一般的には、数多くの免疫細胞で発現するシグナル伝達分子の尾部に存在している保存タンパク質モチーフである。このモチーフは、６〜８個のアミノ酸で隔てられたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つのリピートを含み得るものであり、式中、それぞれのｘは、独立して、あらゆるアミノ酸であり、保存モチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ(6~8)ＹｘｘＬ／Ｉをもたらす。シグナル伝達分子内のＩＴＡＭは、シグナル伝達分子の活性化に続いて、ＩＴＡＭでのチロシン残基のリン酸化が少なくとも部分的に介在する細胞内のシグナル伝達において重要である。ＩＴＡＭは、シグナル伝達経路のその他のタンパク質のためのドッキング部位としても機能し得る。
【０１１１】
一部の事例では、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γのものである。その他の事例では、細胞質シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζに由来しない。なおもその他の事例では、細胞質シグナル伝達ドメインは、同一キメラ受容体ポリペプチドの細胞外Ｆｃ結合ドメインがＣＤ１６Ａに由来する場合、Ｆｃ受容体に由来しない。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、相加効果または相乗効果のために、幾つかのシグナル伝達ドメインを一緒に融合することができる。有用な別のシグナル伝達ドメインとして、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩｙ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ２Ｒ−ベータ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２Ｒ−ガンマ／ＣＤ１３２、及び、ＣＤ４０の内の１つ以上の一部または全てがあるが、これらに限定されない。
【０１１３】
その他の実施形態では、本明細書に記載した細胞質シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含まない。例として、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ、Ｔｏｌｌ−インターロイキン受容体（ＴＩＲ）、及び、チロシンキナーゼの細胞質シグナル伝達ドメインがあるが、これらに限定されない。
【０１１４】
Ｅ．ヒンジドメイン
一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチド、例えば、本明細書に記載したＡＣＴＲまたはＣＡＲポリペプチドなどは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインをさらに含む。ヒンジドメインは、タンパク質の２つのドメインの間に通常は存在するアミノ酸セグメントであり、タンパク質を柔軟にして、ドメインの一方または両方の互いに関する移動を可能ならしめる。キメラ受容体ポリペプチドの膜貫通ドメインに関して、細胞外リガンド結合ドメインのこのような柔軟性及び移動を可能とするあらゆるアミノ酸配列を、使用することができる。
【０１１５】
ヒンジドメインを取り込むための当該技術分野で公知のヒンジドメインのあらゆるタンパク質は、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドでの使用に適応する。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、天然タンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、そして、キメラ受容体ポリペプチドに柔軟性を付与する。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８のヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ８のヒンジドメインの少なくとも１５個（例えば、２０、２５、３０、３５、または、４０個）の連続アミノ酸を含有するフラグメントである。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８のものである。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８のヒンジドメインの一部であり、例えば、ＣＤ２８のヒンジドメインの少なくとも１５個（例えば、２０、２５、３０、３５、または、４０個）の連続したアミノ酸を含有するフラグメントである。ヒンジドメイン、及び／または、膜貫通ドメインは、Ｎ末端部分、Ｃ末端部分、または、その両方において、さらなるアミノ酸（例えば、１５  ａａ、１０−ａａ、８−ａａ、６−ａａ、または、４−ａａ）に連結し得る。例えば、Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２５（６）：９４７−９５３（２０１９）に、それらの例が認められる。
【０１１６】
一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ１６Ａ受容体のもの、例えば、ＣＤ１６Ａ受容体の最大４０（例えば、２０、２５、３０、３５、または、４０）の連続アミノ酸から構成し得る、ＣＤ１６Ａ受容体のヒンジドメイン全体、または、その一部である。このようなキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド）は、異なる受容体（非ＣＤ１６Ａ受容体）に由来するヒンジドメインを含有し得ない。
【０１１７】
抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、または、ＩｇＤ抗体などのヒンジドメインも、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドでの使用に適応する。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１及びＣＨ２を連結しているヒンジドメインである。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のものであり、かつ、抗体のヒンジドメインと、抗体の１つ以上の定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインと、抗体のＣＨ３定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン、ならびに、抗体のＣＨ２定常領域及びＣＨ３定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、または、ＩｇＤ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、または、ＩｇＧ４抗体である。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域、ならびに、ＣＨ２定常領域及びＣＨ３定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域と、ＣＨ３定常領域を含む。
【０１１８】
非天然ペプチドは、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドのためのヒンジドメインとしても使用し得る。一部の実施形態では、細胞外標的結合ドメインのＣ末端と、膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、ペプチドリンカー、例えば、（ＧｌｙxＳｅｒ）nリンカーなどであり、式中、ｘ及びｎは、独立して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または、それ以上などの３〜１２の整数とすることができる。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）n（配列番号９５）であり、式中、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または、６０などの３〜６０の整数とすることができる。特定の実施形態では、ｎは、６０超の整数とすることができる。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3（配列番号９６）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）6（配列番号９７）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）9（配列番号９８）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）12（配列番号９９）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）15（配列番号１００）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）30（配列番号１０１）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）45（配列番号１０２）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）60（配列番号１０３）である。
【０１１９】
その他の実施形態では、ヒンジドメインは、様々な長さの親水性残基（例えば、１０〜８０アミノ酸残基）で構成される非構造的なポリペプチドである延長型組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）である。ＸＴＥＮペプチドのアミノ酸配列は、当業者に自明であり、例えば、米国特許第８，６７３，８６０号に認めることができ、その文献での関連する開示は、参照により、本明細書で援用する。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、６０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、３０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、４５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、１５アミノ酸を含む。
【０１２０】
本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドを作り出すために使用するあらゆるヒンジドメインは、最大２５０アミノ酸残基を含有し得る。一部の事例では、キメラ受容体ポリペプチドは、例えば、１５０〜２５０アミノ酸残基（例えば、１５０〜１８０アミノ酸残基、１８０〜２００アミノ酸残基、または、２００〜２５０アミノ酸残基）を含有する、比較的に長いヒンジドメインを含有し得る。その他の事例では、キメラ受容体ポリペプチドは、６０〜１５０アミノ酸残基（例えば、６０〜８０、８０〜１００、１００〜１２０、または、１２０〜１５０アミノ酸残基）を含有し得る中程度のサイズのヒンジドメインを含有し得る。あるいは、キメラ受容体ポリペプチドは、６０未満のアミノ酸残基（例えば、１〜３０アミノ酸、または、３１〜６０アミノ酸）を含有し得る短いヒンジドメインを含有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド）は、ヒンジドメインを含有しない、または、非ＣＤ１６Ａ受容体に由来するヒンジドメインを含有しない。
【０１２１】
Ｆ．シグナルペプチド
一部の実施形態では、キメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲ、または、ＣＡＲポリペプチド）は、ポリペプチドのＮ末端に、シグナルペプチド（シグナル配列としても公知である）も含み得る。一般的に、シグナル配列は、ポリペプチドを細胞内の所望の部位へと仕向けるペプチド配列である。一部の実施形態では、シグナル配列は、キメラ受容体ポリペプチドを細胞の分泌経路に仕向け、そして、キメラ受容体ポリペプチドの脂質二重層への組み込みと、アンカリングを可能ならしめる。本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドでの使用に適応可能な天然タンパク質のシグナル配列または合成非天然シグナル配列を含むシグナル配列は、当業者に自明である。一部の実施形態では、シグナル配列はＣＤ８αに由来する。一部の実施形態では、シグナル配列は、ＣＤ２８に由来する。その他の実施形態では、シグナル配列は、マウスカッパ鎖に由来する。なおもその他の実施形態では、シグナル配列は、ＣＤ１６に由来する。
【０１２２】
Ｇ．ＡＣＴＲポリペプチドの例
本明細書に記載した方法及び組成物と共に使用するための例示的なＡＣＴＲ構築物は、例えば、本明細書及び図面で認め得るものであり、または、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１６０４０４４１Ａ１号、第ＷＯ２０１７／１６１３３３号、及び、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１５９９９号で認め得るものであり、これらの文献の各々は、この目的に関して、参照により、本明細書で援用する。本明細書に記載したＡＣＴＲポリペプチドは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に対する結合親和性と特異性とを有するＣＤ１６Ａ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。一部の実施形態では、ＡＣＴＲポリペプチドは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み得るものであり、その内の１つを、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、または、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインとし得る。ＡＣＴＲポリペプチドは、宿主細胞上で発現する際に、標的分子及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインに結合するために、細胞外リガンド結合ドメインが細胞外に位置するように構成されている。共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化、及び／または、エフェクターシグナル伝達を誘発するために、細胞質内に位置し得る。
【０１２３】
一部の実施形態では、本明細書に記載したＡＣＴＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＣＤ１６Ａ細胞外ドメインなどのＦｃ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、任意の１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメイン、または、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメイン）、及び、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。
【０１２４】
あるいは、または、加えて、本明細書に記載したＡＣＴＲポリペプチドは、互いに連結し得る、または、細胞質シグナル伝達ドメインで隔て得る、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含有し得る。ＡＣＴＲポリペプチドにおいて、細胞外Ｆｃ結合部、膜貫通ドメイン、任意の共刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）、及び、細胞質シグナル伝達ドメインは、直接的に、または、ペプチドリンカーを介して、互いに連結し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載したＡＣＴＲポリペプチドのいずれかは、Ｎ末端にシグナル配列を含み得る。
【０１２５】
本明細書に記載した例示的なＡＣＴＲポリペプチドを、表４に記載する。これらの例示的な構築物は、任意の共刺激ドメイン、及び、細胞質シグナル伝達ドメインの位置を交換することができ、また、Ｎ末端からＣ末端に向けて、シグナル配列、Ｆｃ結合ドメイン（例えば、Ｆｃ受容体の細胞外ドメイン）、ヒンジドメイン、及び、膜貫通部を有する。
【表４−１】
2021534740.tif 000016
【表４−２】
2021534740.tif 000017
【表４−３】
2021534740.tif 000018
【表４−４】
2021534740.tif 000019
【表４−５】
2021534740.tif 000020
【０１２６】
例示的なＡＣＴＲポリペプチドのアミノ酸配列を、以下に記載する（シグナル配列は、イタリック体）。
配列番号１：
【化１】
2021534740.tif 000021
配列番号２：
【化２】
2021534740.tif 000022
配列番号３：
【化３】
2021534740.tif 000023
配列番号４：
【化４】
2021534740.tif 000024
配列番号５：
【化５】
2021534740.tif 000025
配列番号６：
【化６】
2021534740.tif 000026
配列番号７：
【化７】
2021534740.tif 000027
配列番号８：
【化８】
2021534740.tif 000028
配列番号９：
【化９】
2021534740.tif 000029
配列番号１０：
【化１０】
2021534740.tif 000030
配列番号１１：
【化１１】
2021534740.tif 000031
配列番号１２：
【化１２】
2021534740.tif 000032
配列番号１３：
【化１３】
2021534740.tif 000033
配列番号１４：
【化１４】
2021534740.tif 000034
配列番号１５：
【化１５】
2021534740.tif 000035
配列番号１６：
【化１６】
2021534740.tif 000036
配列番号１７：
【化１７】
2021534740.tif 000037
配列番号１８：
【化１８】
2021534740.tif 000038
配列番号１９：
【化１９】
2021534740.tif 000039
配列番号２０：
【化２０】
2021534740.tif 000040
配列番号２１：
【化２１】
2021534740.tif 000041
配列番号２２：
【化２２】
2021534740.tif 000042
配列番号２３：
【化２３】
2021534740.tif 000043
配列番号２４：
【化２４】
2021534740.tif 000044
配列番号２５：
【化２５】
2021534740.tif 000045
配列番号２６：
【化２６】
2021534740.tif 000046
配列番号２７：
【化２７】
2021534740.tif 000047
配列番号２８：
【化２８】
2021534740.tif 000048
配列番号２９：
【化２９】
2021534740.tif 000049
配列番号３０：
【化３０】
2021534740.tif 000050
配列番号３１：
【化３１】
2021534740.tif 000051
配列番号３２：
【化３２】
2021534740.tif 000052
配列番号３３：
【化３３】
2021534740.tif 000053
配列番号３４：
【化３４】
2021534740.tif 000054
配列番号３５：
【化３５】
2021534740.tif 000055
配列番号３６：
【化３６】
2021534740.tif 000056
配列番号３７：
【化３７】
2021534740.tif 000057
配列番号３８：
【化３８】
2021534740.tif 000058
配列番号３９：
【化３９】
2021534740.tif 000059
配列番号４０：
【化４０】
2021534740.tif 000060
配列番号４１：
【化４１】
2021534740.tif 000061
配列番号４２：
【化４２】
2021534740.tif 000062
配列番号４３：
【化４３】
2021534740.tif 000063
配列番号４４：
【化４４】
2021534740.tif 000064
配列番号４５：
【化４５】
2021534740.tif 000065
配列番号４６：
【化４６】
2021534740.tif 000066
配列番号４７：
【化４７】
2021534740.tif 000067
配列番号４８：
【化４８】
2021534740.tif 000068
配列番号４９：
【化４９】
2021534740.tif 000069
配列番号５０：
【化５０】
2021534740.tif 000070
配列番号５１：
【化５１】
2021534740.tif 000071
配列番号５２：
【化５２】
2021534740.tif 000072
配列番号５３：
【化５３】
2021534740.tif 000073
配列番号５４：
【化５４】
2021534740.tif 000074
配列番号５５：
【化５５】
2021534740.tif 000075
配列番号５６：
【化５６】
2021534740.tif 000076
配列番号５７：
【化５７】
2021534740.tif 000077
配列番号５８：
【化５８】
2021534740.tif 000078
配列番号５９：
【化５９】
2021534740.tif 000079
配列番号６０：
【化６０】
2021534740.tif 000080
配列番号６１：
【化６１】
2021534740.tif 000081
配列番号６２：
【化６２】
2021534740.tif 000082
配列番号６３：
【化６３】
2021534740.tif 000083
配列番号６４：
【化６４】
2021534740.tif 000084
配列番号６５：
【化６５】
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配列番号６６：
【化６６】
2021534740.tif 000086
配列番号６７：
【化６７】
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配列番号６８：
【化６８】
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配列番号６９：
【化６９】
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配列番号７０：
【化７０】
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配列番号７１：
【化７１】
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配列番号７２：
【化７２】
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配列番号７３：
【化７３】
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配列番号７４：
【化７４】
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配列番号７５：
【化７５】
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配列番号７６：
【化７６】
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配列番号７７：
【化７７】
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配列番号７８：
【化７８】
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配列番号７９：
【化７９】
2021534740.tif 000099
配列番号８０：
【化８０】
2021534740.tif 000100
【０１２７】
Ｈ．ＣＡＲポリペプチドの例
本明細書に記載した方法、及び、組成物と共に使用する例示的なＣＡＲポリペプチドは、例えば、本明細書及び図面に認め得る、または、当該技術分野で公知のＣＡＲポリペプチドである。本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドは、関係する抗原（例えば、上の表３に列挙した抗原）、膜貫通ドメイン、及び、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインに対する結合親和性と特異性を有する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含み得る。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み得るものであり、その内の１つは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、または、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインとし得る。ＣＡＲポリペプチドは、宿主細胞上で発現する際に、標的分子とＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインに結合するために、細胞外抗原結合ドメインが細胞外に位置するように構成されている。共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化、及び／または、エフェクターシグナル伝達を誘発するために、細胞質内に位置し得る。
【０１２８】
一部の実施形態では、本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、任意の１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７共刺激シグナル伝達ドメイン、または、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達ドメイン）、及び、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。
【０１２９】
あるいは、または、加えて、本明細書に記載したＣＡＲポリペプチドは、互いに連結し得るものであり、または、細胞質シグナル伝達ドメインで隔て得る２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含有し得る。ＣＡＲポリペプチドにおける、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、任意の共刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）、及び、細胞質シグナル伝達ドメインは、直接的に、または、ペプチドリンカーを介して、互いに連結し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載したあらゆるＣＡＲポリペプチドは、Ｎ末端にシグナル配列を含み得る。
【０１３０】
本明細書に記載した例示的なＣＡＲポリペプチドを、表５に記載する。これらの例示的な構築物は、任意の共刺激ドメイン、及び、細胞質シグナル伝達ドメインの位置を交換することができ、また、Ｎ末端からＣ末端に向けて、シグナル配列、抗原結合ドメイン（例えば、腫瘍抗原、または、病原性抗原などの抗原を標的とするｓｃＦｖフラグメント）、ヒンジドメイン、及び膜貫通部を有する。
【表５】
2021534740.tif 000101
【０１３１】
例示的なＣＡＲポリペプチドのアミノ酸配列を、以下に記載する（シグナル配列は、イタリック体）。
配列番号１０４：
【化８１】
2021534740.tif 000102
配列番号１０５：
【化８２】
2021534740.tif 000103
【０１３２】
ＩＩＩ．クレブス回路調節ポリペプチドと、任意のキメラ受容体ポリペプチドを発現する造血細胞
本明細書では、本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチドの１つ以上を発現する遺伝子操作した宿主細胞（例えば、ＨＳＣなどの造血細胞、及び、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を提供する。遺伝子操作した宿主細胞は、本明細書に記載した通り、キメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲ発現細胞、例えば、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞、または、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）をさらに発現し得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、造血細胞、または、その子孫である。一部の実施形態では、造血細胞を、造血幹細胞とすることができる。その他の実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。その他の実施形態では、免疫細胞は、確立した細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞とすることができる。
【０１３３】
一部の実施形態では、ＨＳＣまたは免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、または、ＮＫ細胞）などの遺伝子操作した造血細胞は、本明細書に開示したようなＣＡＲ構築物のいずれかと、クレブス回路調節ポリペプチド（例えば、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２）などのクレブス回路調節剤のいずれかを共発現し得る。一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物は、４−１ＢＢまたはＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含み得るものであり、かつ、クレブス回路調節ポリペプチドは、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２である。ＣＡＲ構築物は、ＣＤ８またはＣＤ２８に由来するヒンジ及び膜貫通ドメインをさらに含み得る。
【０１３４】
その他の実施形態では、ＨＳＣまたは免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、または、ＮＫ細胞）などの遺伝子操作した造血細胞は、本明細書に開示したようなＡＣＴＲ構築物のいずれかと、クレブス回路調節ポリペプチド（例えば、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２）などのクレブス回路調節剤のいずれかを共発現し得る。一部の実施形態では、ＡＣＴＲ構築物は、４−１ＢＢまたはＣＤ２８由来の共刺激ドメインを含み得るものであり、かつ、クレブス回路調節ポリペプチドは、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２である。ＡＣＴＲ構築物は、ＣＤ８またはＣＤ２８由来のヒンジ及び膜貫通ドメインをさらに含み得る。
【０１３５】
あるいは、本明細書で開示した遺伝子操作した宿主細胞は、キメラ受容体ポリペプチドを何ら発現し得ない。一部の実施形態では、本明細書で開示した１つ以上のクレブス回路調節ポリペプチドを過剰発現し得る遺伝子操作した免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来し得る。クレブス回路調節ポリペプチドの過剰発現は、腫瘍内微小環境において、抗腫瘍活性またはＴＩＬを改善し得る。あるいは、または、加えて、遺伝子操作した免疫細胞は、遺伝子操作したＴ細胞受容体をさらに有し得るＴ細胞とし得る。ＴＩＬ、及び／または、遺伝子操作したＴＣＲは、ペプチド−ＭＨＣ複合体を標的とし得るペプチドは、病原体、腫瘍抗原、または、自己抗原に由来し得る。一部の例を、以下の表６に記載する。
【０１３６】
また、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞と共に使用する本明細書で開示したＣＡＲ構築物または抗体のいずれかは、このようなペプチド／ＭＨＣ複合体内のペプチドのいずれかを標的とし得る。
【表６】
2021534740.tif 000104
【０１３７】
一部の実施形態では、宿主細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などである。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパー細胞、または、ＣＤ８＋細胞傷害性細胞、または、これらの組み合わせとすることができる。あるいは、または、加えて、Ｔ細胞は、抑制性Ｔ細胞、例えば、Ｔreg細胞などとすることができる。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。その他の実施形態では、免疫細胞は、樹立した細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞とすることができる。一部の事例では、免疫細胞は、当該技術分野で公知の異なるタイプのＴ細胞及び／またはＮＫ細胞の混合物とすることができる。例えば、免疫細胞は、好適なドナー（例えば、ヒト患者）から単離した免疫細胞の集団とすることができる。以下の開示内容を、参照されたい。
【０１３８】
一部の事例では、宿主細胞に導入するクレブス回路調節ポリペプチドは、宿主細胞の内在性タンパク質と同一である。クレブス回路調節ポリペプチドのコード配列のさらなる複製を宿主細胞に導入することで、ネイティブ同等物と比較して、ポリペプチドの発現レベルを改善（すなわち、過剰発現）し得る。一部の事例では、宿主細胞に導入するクレブス回路調節ポリペプチドは、宿主細胞に対して異種、すなわち、宿主細胞には存在しない、または、宿主細胞では発現しない。このような異種クレブス回路調節ポリペプチドは、宿主細胞では本来発現しない天然タンパク質（例えば、異なる種に由来するもの）とし得る。あるいは、異種クレブス回路調節ポリペプチドは、ネイティブタンパク質のバリアント、例えば、本明細書に記載したネイティブタンパク質のバリアントなど、とし得る。一部の事例では、外来（すなわち、宿主細胞に内在していない）複製のコード核酸は、染色体外に存在し得る。その他の事例では、外来複製のコード配列は、宿主細胞の染色体に組み込み得るものであり、そして、内在性遺伝子の天然の遺伝子座とは異なる位置に配置し得る。
【０１３９】
そのような遺伝子操作した宿主細胞は、解糖速度を高める能力を有しており、そして、例えば、環境からグルコースを取り込む能力を改善し得る。したがって、これらの遺伝子操作した宿主細胞は、例えば、腫瘍内微小環境において、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／または、低酸素条件下で、より旺盛な増殖、及び／または、生物活性を示し得る。遺伝子操作した細胞は、本明細書で開示したキメラ受容体ポリペプチドを発現する場合、直接的に（例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞によって）、または、Ｆｃ含有治療薬、例えば、抗腫瘍抗体などを介して（例えば、ＡＣＴＲ発現免疫細胞によって）のいずれかで、標的細胞を認識して、それらを阻害することができる。低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／または、低酸素環境（例えば、腫瘍内微小環境）において想定される増殖性を高める率、生物活性、及び／または、生存率を考慮すると、Ｔ細胞及びＮＫ細胞などの遺伝子操作した細胞は、クレブス回路調節ポリペプチドを発現しない、または、より低レベル、もしくは、より低活性の形態のクレブス回路調節ポリペプチドを発現する、キメラ受容体発現Ｔ細胞と比較して、より高い治療効果を示すものと予測し得る。
【０１４０】
免疫細胞の集団は、あらゆる供給源、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、または、脾臓、リンパ節、胸腺、幹細胞、もしくは、腫瘍組織などの組織などから得ることができる。あるいは、免疫細胞集団は、幹細胞、例えば、造血幹細胞、及び、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来し得る。望ましいタイプの宿主細胞を得るのに好適な供給源は、当業者に自明である。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、本明細書に記載した治療を必要とする患者（例えば、ヒト患者）から採取し得るＰＢＭＣに由来する。細胞を刺激分子と共培養して得た細胞の集団内で、望ましいタイプの宿主細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）を増殖し得る。例として、Ｔ細胞を増殖させるために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用し得るが、これらに限定されない。
【０１４１】
本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチドのいずれか、及び、任意のキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞を構築するために、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドの安定発現または一過性発現のための発現ベクターを、本明細書に記載した通常の方法を用いて作製し、そして、免疫宿主細胞に導入し得る。例えば、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸を、１つまたは２つの好適な発現ベクター、例えば、好適なプロモーターと機能的に連結したウイルスベクターなどにクローニングし得る。一部の事例では、キメラ受容体ポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドのためのコード配列のそれぞれは、２つの別々の核酸分子上にあり、そして、２つの別々のベクターにクローニングすることができ、それらのベクターを、同時または連続的に好適な宿主細胞に導入し得る。あるいは、キメラ受容体ポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドのためのコード配列は、１つの核酸分子上にあり、そして、１つのベクターにクローニングし得る。キメラ受容体ポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドのためのコード配列は、２つのポリペプチドの発現を、異なるプロモーターで制御させるために、２つの異なるプロモーターと機能的に連結し得る。あるいは、キメラ受容体ポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドのためのコード配列は、２つのポリペプチドの発現を、単一のプロモーターで制御させるために、１つのプロモーターと機能的に連結し得る。２つの別々のポリペプチドを、単一のｍＲＮＡ分子から翻訳させるために、２つのポリペプチドのためのコード配列の間に好適な配列を挿入し得る。このような配列、例えば、ＩＲＥＳまたはリボソームスキッピング部位は、当該技術分野で公知である。さらなる説明を、以下に記載する。
【０１４２】
適切な条件下で、核酸及びベクター（複数可）を、制限酵素と接触させて、それぞれの分子上に、それらが互いに対を形成し、かつ、リガーゼと連結することができる、相補末端を生成し得る。あるいは、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸の末端に、合成核酸リンカーをライゲートすることができる。合成リンカーは、ベクター内の特定の制限部位に対応する核酸配列を含有し得る。発現ベクター／プラスミド／ウイルスベクターの選択は、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを発現させるための宿主細胞のタイプに依存するが、真核細胞における導入及び複製に好適でなくてはならない。
【０１４３】
本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを発現させるために、様々なプロモーターを使用することができ、同プロモーターとして、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモーター、ウイルスＬＴＲ、例えば、Ｒｏｕｓ  ｓａａｒｃｏｍａウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１  ＬＴＲ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ヒトＥＦ１−アルファプロモーター、または、単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターがあるが、これらに限定されない。クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを発現させるためのさらなるプロモーターとして、免疫細胞内のあらゆる構成的に活性なプロモーターがある。あるいは、免疫細胞内でその発現を調節可能ならしめるために、あらゆる調節性プロモーターを使用し得る。
【０１４４】
加えて、ベクターは、例えば、次のもの：宿主細胞内の安定的または一過性形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子、例えば、ネオマイシン遺伝子、または、カナマイシン遺伝子；高レベルの転写を行うためのヒトＣＭＶの前初期遺伝子に由来するエンハンサー／プロモーター配列；ヒトＥＦ１−アルファ遺伝子由来のイントロン配列、ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０に由来する転写終了シグナル、及び、ＲＮＡプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマウイルス複製起点、及び、ＣｏｌＥ１；配列内リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、汎用性マルチクローニング部位；センス及びアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７及びＳＰ６  ＲＮＡプロモーター；ベクターを有する細胞を誘発時に死滅させる「自殺スイッチ」または「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ、または、誘導性カスパーゼ、例えば、ｉＣａｓｐ９など）、ならびに、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドの発現を評価するためのレポーター遺伝子の一部または全てを含有し得る。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、このようなベクターは、自殺遺伝子をも含む。本明細書で使用する用語「自殺遺伝子」とは、その自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子のことを意味する。自殺遺伝子は、その遺伝子を細胞が発現する際に、作用物質、例えば、薬物への感受性を付与する遺伝子とすることができ、細胞が作用物質と接触または曝露すると、細胞の死滅が始まる。自殺遺伝子は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃａｒｏｌｉｎｅ  Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照されたい）、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼ、及び、カスパーゼ、例えば、カスパーゼ８などがある。
【０１４６】
好適なベクター、及び、導入遺伝子を含有するベクターを生産するための方法は、当該技術分野で公知であり、かつ、利用可能である。クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを発現させるためのベクターの調製の例は、例えば、ＵＳ２０１４／０１０６４４９に認められており、本明細書の一部を構成するものとして、参照により、その全内容を援用する。
【０１４７】
本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターのいずれもが、本開示の範囲内である。このようなベクター、または、そこに含まれるクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドをコードする配列を、あらゆる好適な方法によって、宿主細胞、例えば、宿主免疫細胞などに導入し得る。ベクターを免疫細胞に導入するための方法は、当該技術分野で公知であり、ＤＮＡエレクトロポレーション、ＲＮＡエレクトロポレーション、リポソームなどの試薬を用いたトランスフェクション、または、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入などのレトロウイルス形質導入）がある。
【０１４８】
一部の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを発現させるためのベクターは、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス、または、ガンマ−レトロウイルス形質導入などのレトロウイルス形質導入）によって、宿主細胞に導入する。導入を行うための例示的なウイルス法として、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０７９３６号；第ＷＯ９４／０３６２２号；第ＷＯ９３／２５６９８号；第ＷＯ９３／２５２３４号；第ＷＯ９３／１１２３０号；第ＷＯ９３／１０２１８号；及び、第ＷＯ９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０号、及び、第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；及び、欧州特許第０３４５２４２号を参照されたい）、アルファウイルスをベースとしたベクター、及び、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号、第ＷＯ９３／０３７６９号；第ＷＯ９３／１９１９１号；第ＷＯ９４／２８９３８号；第ＷＯ９５／１１９８４号；及び、第ＷＯ９５／００６５５号を参照されたい）があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドの発現のためのベクターは、レトロウイルスである。一部の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドの発現のためのベクターは、レンチウイルスである。
【０１４９】
レトロウイルス形質導入について記載している参照文献の例として、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：１５３（１９８３）；Ｔｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０（１９８８）；Ｔｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第号５，１２４，２６３；１９９５年３月１６日に公開されたＤｏｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．による国際特許公開第ＷＯ９５／０７３５８号；及び、Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８２：８４５（１９９３）がある。国際特許公開第ＷＯ９５／０７３５８号は、初代Ｂリンパ球の高効率形質導入について記載している。本明細書に記載した目的及び趣旨に関して、参照により、本明細書で援用するＷＯ２０１６／０４０４４１Ａ１も参照されたい。
【０１５０】
ウイルスベクターを使用して、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドをコードするベクターを宿主細胞に導入する例では、免疫細胞を感染させてベクターを担持することができるウイルス粒子は、当該技術分野で公知のあらゆる方法、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ１９９１／００２８０５Ａ２号、第ＷＯ１９９８／００９２７１Ａ１号、及び、米国特許６，１９４，１９１に認められる方法で生産し得る。ウイルス粒子を、細胞培養上清から回収して、単離及び／または精製してから、それらウイルス粒子を、免疫細胞と接触させ得る。
【０１５１】
一部の実施形態では、本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドのいずれかをコードするＲＮＡ分子を、通常の方法（例えば、インビトロ転写）で調製してから、周知の方法、例えば、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７：１０２７−１０３５により、好適な宿主細胞、例えば、本明細書に記載した宿主細胞に導入し得る。
【０１５２】
一部の事例では、クレブス回路調節ポリペプチドをコードする核酸、及び、好適なキメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸は、別々の発現ベクターにクローニングし得るものであり、それらの発現ベクターを、同時または連続的に好適な宿主細胞に導入し得る。例えば、クレブス回路調節ポリペプチドの発現のための発現ベクター（または、ＲＮＡ分子）は、まず、宿主細胞に導入し得るものであり、そして、クレブス回路調節ポリペプチドを発現するトランスフェクションした宿主細胞を、インビトロで単離及び培養し得る。次に、好適なキメラ受容体ポリペプチドの発現ための発現ベクター（または、ＲＮＡ分子）は、クレブス回路調節ポリペプチドを発現する宿主細胞に導入し得るものであり、両方のポリペプチドを発現するトランスフェクションした細胞を単離し得る。別の例では、クレブス回路調節ポリペプチドと、キメラ受容体ポリペプチドの発現ためのそれぞれの発現ベクター（または、ＲＮＡ分子）は、宿主細胞に同時に導入し得るものであり、両方のポリペプチドを発現するトランスフェクションした宿主細胞を、通常の方法で単離し得る。
【０１５３】
その他の事例では、クレブス回路調節ポリペプチドをコードする核酸、及び、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸は、同一の発現ベクターにクローニングし得る。キメラ受容体ポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドの発現ためのポリヌクレオチド（このようなポリヌクレオチドを、少なくとも１つの調節エレメントと機能的に連結しているベクターなど）も、本開示の範囲内である。本開示の有用なベクターの例として、ウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクター、及び、レンチウイルスベクター、及び、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）などのレトロウイルスベクターがあるが、これらに限定されない。
【０１５４】
一部の事例では、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸（複数可）を、トランスポゾンを介して、宿主細胞に導入し得る。一部の事例では、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または、メガヌクレアーゼなどの遺伝子編集を介して、コード核酸（複数可）を、宿主細胞に導入し得る。
【０１５５】
一部の事例では、本明細書に記載した核酸は、２つのコード配列を含み得るものであり、一方は、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドをコードし、他方は、クレブス回路を調節することができるポリペプチド（すなわち、クレブス回路調節ポリペプチド）をコードする。本明細書に記載した２つのコード配列を含む核酸は、２つのコード配列がコードするポリペプチドが独立した（かつ、物理的に離間している）ポリペプチドとして発現できるように構成し得る。この目的を達成するために、本明細書に記載した核酸は、第１のコード配列と第２のコード配列との間に位置する第３のヌクレオチド配列を含有し得る。この第３のヌクレオチド配列は、例えば、リボソームスキッピング部位をコードし得る。リボソームスキッピング部位は、正常なペプチド結合形成を阻害する配列である。このメカニズムにより、１つのメッセンジャーＲＮＡに由来する別のオープンリーディングフレームが翻訳される。この第３のヌクレオチド配列は、例えば、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、または、Ｆ２Ａペプチドをコードし得る（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（４）：ｅ１８５５６を参照されたい）。例として、例示的なＰ２Ａペプチドは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ  配列番号１０６のアミノ酸配列を有し得るが、これに限定されない。
【０１５６】
別の実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードし得る。ＩＲＥＳは、末端非依存的な翻訳開始を可能とし、１つのメッセンジャーＲＮＡに由来する別のオープンリーディングフレームの翻訳もまた可能とするＲＮＡエレメントである。あるいは、第３のヌクレオチド配列は、第２のポリペプチドの発現を制御する第２のプロモーターをコードし得る。また、第３のヌクレオチド配列は、２つ以上のリボソームスキッピング配列、ＩＲＥＳ配列、別のプロモーター配列、または、これらの組み合わせをコードし得る。
【０１５７】
また、核酸は、別のコード配列（第４のコード配列、及び、第５のコード配列などがあるが、これらに限定されない）を含み得るものであり、そして、別のコード配列がコードするポリペプチドが、さらに独立しており、かつ、物理的に離間しているポリペプチドとして発現するように構成し得る。この目的のために、別のコード配列を、１つ以上のリボソームスキッピング配列、ＩＲＥＳ配列、または、別のプロモーター配列をコードする１つ以上のヌクレオチド配列によって、その他のコード配列から離間させ得る。
【０１５８】
一部の事例では、核酸（例えば、本明細書に記載した発現ベクター、または、ＲＮＡ分子）は、クレブス回路調節ポリペプチド（例えば、本明細書に記載したもの）と、好適なキメラ受容体ポリペプチドの両方のためのコード配列を含み得るものであり、それら２つのコード配列は、任意の順番で、Ｐ２Ａペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列（例えば、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、配列番号１０６）で隔てられている。その結果、このような核酸から、２つの別々のポリペプチド、クレブス回路調節ポリペプチド、それに、キメラ受容体を生成することができ、Ｐ２Ａ部分ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号１０７）を、上流のポリペプチド（上流のコード配列でコードしたもの）に連結し、そして、Ｐ２Ａペプチドに由来する残基Ｐを、下流のポリペプチド（下流のコード配列でコードしたもの）に連結する。一部の事例では、キメラ受容体ポリペプチドは、上流のポリペプチドであり、そして、クレブス回路調節ポリペプチドは、下流のポリペプチドである。その他の事例では、クレブス回路調節ポリペプチドは、上流のポリペプチドであり、そして、キメラ受容体ポリペプチドは、下流のポリペプチドである。
【０１５９】
一部の事例では、核酸（例えば、本明細書に記載した発現ベクター、または、ＲＮＡ分子）は、クレブス回路調節ポリペプチド（例えば、本明細書に記載したもの）と、適切なＡＣＴＲポリペプチドの両方のためのコード配列であって、任意の順序で、Ｐ２Ａペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列（例えば、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号１０６）で隔てられている２つのコード配列を含み得る。結果として、２つの別個のポリペプチドである、クレブス回路調節ポリペプチドと、ＡＣＴＲ）は、そのような核酸から生産することができ、Ｐ２Ａ部分ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号１０７）を、（上流コード配列でコードしている）上流ポリペプチドに連結しており、また、Ｐ２Ａペプチド由来の残基Ｐを、（下流のコード配列でコードしている）下流のポリペプチドに連結している。一部の事例では、ＡＣＴＲポリペプチドは、上流のポリペプチドであり、かつ、クレブス回路調節ポリペプチドは、下流のポリペプチドある。その他の事例では、クレブス回路調節ポリペプチドは、上流のポリペプチドあり、かつ、ＡＣＴＲポリペプチドは、下流のポリペプチドである。
【０１６０】
一部の事例では、上記した核酸は、２つのセグメントのコード配列の間、例えば、上流のポリペプチドと、Ｐ２Ａペプチドとの間のリンカー（例えば、ＧＳＧリンカー）をさらにコードし得る。
【０１６１】
特定の事例では、本明細書に記載した核酸は、核酸をトランスフェクションする宿主細胞内で、２つの別々のポリペプチドを発現するように構成している：（ｉ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、好適なＣＡＲ（例えば、配列番号１０４、または、配列番号１０５）、ペプチドリンカー（例えば、ＧＳＧリンカー）、及び、Ｐ２Ａペプチドに由来するＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号１０７）セグメントを含有する第１のポリペプチド、及び、（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｐ２Ａペプチドに由来するＰ残基、及び、クレブス回路調節ポリペプチド（例えば、配列番号８１〜９２のいずれか）を含有する第２のポリペプチド。
【０１６２】
特定の事例では、本明細書に記載した核酸は、核酸をトランスフェクションする宿主細胞内で、２つの別々のポリペプチドを発現するように構成している：（ｉ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、好適なＡＣＴＲ（例えば、本明細書に記載した配列番号１〜８０のいずれか、例えば、配列番号１、または、配列番号５７）、ペプチドリンカー（例えば、ＧＳＧリンカー）、及び、Ｐ２Ａペプチドに由来するＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号１０７）セグメントを含有する第１のポリペプチド；及び、（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｐ２Ａペプチドに由来するＰ残基、及び、クレブス回路調節ポリペプチド（例えば、配列番号８１〜９２のいずれか）を含有する第２のポリペプチド。
【０１６３】
一部の事例では、関係するさらなるポリペプチドも、宿主免疫細胞に導入し得る。
【０１６４】
本明細書で提供するクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドのいずれかをコードするベクター、または、キメラ受容体ポリペプチド、及び／または、クレブス回路調節ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子）を、宿主細胞に導入した後に、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、それらの細胞を培養し得る。クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドをコードする核酸を、調節性プロモーターで調節する例では、調節性プロモーターを活性化する条件下で、宿主細胞を培養し得る。一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであり、かつ、免疫細胞を、誘導性分子の存在下、または、誘導性分子を生産する条件下で培養する。クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドの発現の有無を確認することは、当業者に自明のことであり、そして、あらゆる公知の方法、例えば、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いた、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出、または、ウエスタンブロット法、蛍光顕微鏡、及び、フローサイトメトリーなどの方法を使用した、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドの検出によって評価し得る。
【０１６５】
あるいは、免疫細胞を対象に対して投与した後に、キメラ受容体ポリペプチドの発現を、インビボで起こし得る。本明細書で使用する用語「対象」は、あらゆる哺乳動物、例えば、ヒト、サル、マウス、ウサギ、または、家畜哺乳動物などを意味する。例えば、対象を、霊長類とし得る。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１６６】
あるいは、本明細書で開示した免疫細胞のいずれかでのクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドの発現は、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を導入して達成することができる。このようなＲＮＡ分子は、インビトロ転写または化学合成によって、調製することができる。その後、例えば、エレクトロポレーションを使用して、好適な宿主細胞、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方）などに、それらＲＮＡ分子を導入し得る。例えば、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７：１０２７−１０３５及びＷＯＷＯ２０１３／０４０５５７に記載されている方法に従って、ＲＮＡ分子を合成し、そして、宿主免疫細胞に導入することができる。
【０１６７】
特定の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを含むベクター（複数可）、または、ＲＮＡ分子（複数可）を、インビボで、宿主細胞または免疫細胞に導入し得る。本明細書に記載した１つ以上のクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、１つ以上のキメラ受容体ポリペプチドをコードするベクターまたはＲＮＡ分子を、対象に対して直接に投与（例えば、静脈内投与）して、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを含む宿主細胞をインビボで生産して、この導入を達成し得るが、この手法に限定されない。
【０１６８】
本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドのいずれかを発現する宿主細胞を調製するための方法は、宿主細胞をエクスビボで活性化させることも含み得る。宿主細胞の活性化とは、宿主細胞を刺激して、その細胞が、エフェクター機能を発揮し得る活性化状態にさせる、ことを意味する。宿主細胞を活性化させる方法は、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを発現させるために使用する宿主細胞のタイプに依存している。Ｔ細胞は、１つ以上の分子、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、フィトヘマグルチニン、改変した人工刺激細胞もしくは粒子、または、これらの組み合わせなど、これらに限定されない分子の存在下で、エクスビボで活性化し得る。改変した人工刺激細胞は、当該技術分野で公知の人工抗原提示細胞とし得る。例えば、Ｎｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．２０１７，２（１）：６８−７９及びＴｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．２０１０，１６（４）：３７４−３８１を参照されたい、これら文献のそれぞれでの関連する開示は、本明細書に記載の目的及び趣旨に関して、参照により、本明細書で援用する。
【０１６９】
その他の事例では、１つ以上の分子、例えば、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ−２１、Ｋ５６２細胞、及び／または、改変した人工刺激細胞または粒子などの存在下で、ＮＫ細胞をエクスビボで活性化し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドのいずれかを発現する宿主細胞（ＡＣＴＲ−／ＣＡＲ−、及び／または、クレブス回路調節ポリペプチドを発現する細胞）を、エクスビボで活性化してから、対象に対して投与する。宿主細胞での活性化の有無を確認することは当業者に自明であり、細胞の活性化、サイトカインの発現または分泌、及び、細胞の形態と関連する１つ以上の細胞表面マーカーの発現の評価を含み得る。
【０１７０】
本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドのいずれかを発現する宿主細胞を調製するための方法は、宿主細胞を、エクスビボで増殖させることを含み得る。宿主細胞を増殖させることは、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを発現する細胞の個数を増やす、例えば、宿主細胞を増殖させる、または、宿主細胞を刺激して増殖させる、あらゆる方法を含み得る。宿主細胞の増殖を刺激する方法は、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを発現させるために使用する宿主細胞のタイプに依存しており、そして、それらは、当業者に自明である。一部の実施形態では、本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドのいずれかを発現する宿主細胞をエクスビボで増殖させてから、対象に対して投与する。
【０１７１】
一部の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを発現する宿主細胞を、エクスビボで増殖及び活性化させてから、それらの細胞を、対象に対して投与する。宿主細胞の活性化と増殖を使用して、ウイルスベクターをゲノムに導入し、そして、本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を発現し得る。ｍＲＮＡエレクトロポレーションを使用する場合、活性化細胞において実施すると、エレクトロポレーションがより効果的になり得るが、活性化、及び／または、増殖は必須にはなり得ない。一部の事例では、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドは、好適な宿主細胞において、一過的（例えば、３〜５日間）に発現する。一過性発現は、潜在的な毒性がある場合には有利になり得るものであり、そして、臨床試験の初期段階で発生し得る副作用に有用となる。
【０１７２】
クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドを発現する宿主細胞のいずれかを、医薬として許容可能な担体と混合して医薬組成物を形成し得るが、その医薬組成物も、本開示の範囲内である。
【０１７３】
本開示の組成物と共に用いられる語句「医薬として許容可能な」とは、哺乳動物（例えば、ヒト）に対して投与する際に、生理学的に忍容性があり、通常は、有害反応を引き起こさない、そのような組成物の分子要素、及び、その他の成分のことを意味する。好ましくは、本明細書で使用する用語「医薬として許容可能な」とは、連邦政府または州政府の監督機関により承認されていること、または、哺乳動物、より詳細には、ヒトにおける使用のために、米国薬局方またはその他の一般に認められた薬局方に記載されている、ことを意味する。「許容可能である」とは、担体が、組成物の活性成分（例えば、核酸、ベクター、細胞、または、治療抗体）と相溶性があり、組成物（複数可）を投与する対象に負の影響を及ぼさない、ことを意味する。本方法で使用する医薬組成物のいずれかは、凍結乾燥組成物、または、水溶液の形態の医薬として許容可能な担体、賦形剤、または、安定化剤を含み得る。
【０１７４】
緩衝剤などの医薬として許容可能な担体は、当該技術分野で公知であり、リン酸、クエン酸、及び、その他の有機酸；アスコルビン酸、及び、メチオニンなどの酸化防止剤；防腐剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または、免疫グロブリン；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖；二糖；ならびに、その他の炭水化物；金属錯体；及び／または、非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照されたい。
【０１７５】
本開示の医薬組成物は、治療を行う特定の適応症のために、必要に応じて、活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する１つ以上のさらなる活性化合物も含み得る。考え得る別の活性化合物として、例えば、ＩＬ−２に加えて、当該技術分野で公知であり、かつ、以下の併用療法の説明で示したような様々な作用物質があるが、これらに限定されない。
【０１７６】
ＩＶ．本明細書に記載した遺伝子操作した造血細胞を使用する免疫療法
本明細書に開示した遺伝子操作した造血細胞（例えば、造血幹細胞、免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞、または、Ｔ細胞）は、様々な障害、例えば、がん、感染性疾患、及び、自己免疫疾患に対する免疫療法で使用し得る。
【０１７７】
（ａ）ＡＣＴＲポリペプチドを発現する遺伝子操作した造血細胞と、Ｆｃ含有治療薬との併用免疫療法
本開示の例示的なＡＣＴＲポリペプチドは、Ｔリンパ球に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）能を付与し、そして、ＮＫ細胞でのＡＤＣＣを増強する。細胞に結合した抗体が受容体に結合すると、その受容体は、Ｔ細胞の活性化、持続的な増殖、及び、結合細胞に対する特異的な細胞傷害を誘発する。
【０１７８】
ＩｇのＦｃ部分に対するＣＤ１６の親和性の度合いは、ＡＤＣＣの重要な決定因子であり、それ故に、抗体免疫療法に対する臨床効果の重要な決定因子である。Ｉｇに対して大きな結合親和性を示し、Ｆ１５８遺伝子多型を有するＣＤ１６と比較して、優れたＡＤＣＣを介在する、Ｖ１５８遺伝子多型を有するＣＤ１６を、一例として選択した。Ｆ１５８受容体は、Ｖ１５８受容体と比較して、Ｔ細胞増殖と、ＡＤＣＣの誘導において、低い潜在能を示すが、Ｆ１５８受容体は、Ｖ１５８受容体と比較して、より低いインビボ毒性を示し得るので、一部の臨床状況において有用なものである。
【０１７９】
免疫細胞においてＡＣＴＲポリペプチドと共発現させるクレブス回路調節ポリペプチドは、低グルコース、低アミノ、低ｐＨ、及び／または、低酸素環境で、細胞を効果的に増殖、及び／または、機能させることで、細胞をベースとした免疫療法、例えば、Ｔ細胞療法またはＮＫ細胞療法などにおいて役立つ。抗体誘導細胞傷害は、抗体投与を単に停止することで、必要であれば、いつでも停止させることができる。ｍＲＮＡエレクトロポレーションを使用して、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、ＡＣＴＲポリペプチドを一過的に発現させて、あらゆる潜在的な自己免疫反応を制限することで、臨床的安全性を、さらに向上することができる。
【０１８０】
それ故に、ある実施形態では、本開示は、抗体をベースとしたがんの免疫療法を必要とする対象において、その効果を改善する方法を提供しており、対象は、抗原発現細胞に結合可能な治療抗体などのＦｃ含有治療薬を用いた治療を受ける。Ｆｃ含有治療薬は、Ｆｃ部分、例えば、改変免疫細胞上に発現したＡＣＴＲのＦｃ結合部分（例えば、ヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン）が認識して結合することができる、ヒトまたはヒト化Ｆｃ部分を含有している。
【０１８１】
本明細書に記載した方法は、治療有効量の抗体、及び、治療有効量の遺伝子操作した宿主細胞、例えば、本開示のクレブス回路調節ポリペプチド、及び、ＡＣＴＲポリペプチドを共発現する造血細胞、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、または、ＮＫ細胞）などを対象に導入すること、を含み得る。対象（例えば、ヒト患者、例えば、ヒトがん患者など）は、標的抗原に特異的なＦｃ含有治療薬を用いた治療を受けたことがある、または、受けていてる。標的抗原として、腫瘍抗原、病原性抗原（例えば、細菌、または、ウイルスのもの）、または、異常細胞上の抗原、例えば、本明細書に記載したものなど、疾患または症状と関連しているあらゆる分子とし得るが、これらに限定されない。
【０１８２】
本明細書で示した疾患症状のいずれかと関連する範囲での本開示の文脈において、用語「治療する」、「治療」などとは、このような症状と関連する少なくとも１つの症候を、軽減もしくは改善すること、または、このような症状の進行を、遅延もしくは逆転させる、ことを意味する。また、本開示の趣旨の範囲内において、用語「治療する」とは、発症（すなわち、疾患の臨床発現前の段階）を、阻止、遅延させること、及び／または、疾患が進行もしくは悪化するリスクを低下させる、ことを意味する。例えば、がんに関連した用語「治療する」とは、患者の腫瘍負荷を制限もしくは低下させること、または、転移を予防、遅延、もしくは、阻害することなど、を意味し得る。
【０１８３】
本明細書で使用する用量または量に使用する用語「治療的に有効」とは、化合物または医薬組成物を、必要としている対象に、それを投与する際に、所望の活性をもたらすのに十分な化合物または医薬組成物の量のことを意味する。活性成分の組み合わせ（例えば、抗体を含む第１の医薬組成物、及び、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）構築物を発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞の集団を含む第２の医薬組成物）を投与する場合、組み合わせの有効量が、個別に投与する場合に有効となり得る各成分の量を含んでいても、または、含んでいなくともよい、ことに留意されたい。本開示の文脈の範囲内において、用語「治療的に有効」とは、本開示の方法で治療する障害の少なくとも１つの症候の発現を遅延させる、本開示の方法で治療する障害の少なくとも１つの症候の進行を阻止する、本開示の方法で治療する障害の少なくとも１つの症候を軽減または緩和するのに十分な化合物または医薬組成物の量のことを意味する。
【０１８４】
本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチド、及び、ＡＣＴＲポリペプチドを発現する宿主細胞（例えば、造血細胞、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、及び、ＮＫ細胞など）は、対象におけるＡＤＣＣを強める、及び／または、抗体をベースとした免疫療法の効果を改善する、及び／または、低グルコース環境での免疫細胞の成長、及び／または、増殖を改善させる上で有用である。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、マウス、ウサギ、または、家畜哺乳動物などである。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、ヒトがん患者である。一部の実施形態では、対象は、本明細書に記載した治療抗体のいずれかを使用した治療を受けたことがある、または、受けている。
【０１８５】
本明細書に記載した方法を実施するために、本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチド、及び、ＡＣＴＲポリペプチドのいずれかを発現する有効量の宿主細胞、例えば、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、及び／または、Ｔリンパ球）、及び、有効量の抗体、または、それらの組成物を、好適な経路、例えば、静脈内投与などで、治療を必要とする対象に対して投与し得る。本明細書で使用する有効量とは、投与をすると、対象に治療効果を付与する、それぞれの因子（例えば、クレブス回路調節ポリペプチド、ＡＣＴＲポリペプチドを発現するＮＫ細胞、及び／または、Ｔリンパ球、抗体、または、それらの組成物）の量のことを意味する。本明細書に記載した細胞または組成物の量での治療効果の達成の有無を確認することは、当業者に自明である。当業者が認識しているように、治療する個々の症状、症状の重症度、個々の患者の特徴、例えば、年齢、身体的状態、大きさ、ジェンダー、性別、及び、体重など、治療期間、併用療法（ある場合）の性質、個々の投与経路、ならびに、医療従事者の知見及び専門知識の範囲内の類似因子に応じて、有効量は変化する。一部の実施形態では、有効量は、対象における症候を緩和、軽減、改善、向上、抑制する、または、対象におけるあらゆる疾患または障害の進行を遅延させる。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、治療を必要とする対象は、ヒトがん患者である。一部の実施形態では、治療を必要とする対象は、１つ以上の病原性感染症（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、及び／または、真菌感染症）を患っている。
【０１８６】
あらゆるがん、または、あらゆる病原体を治療するために、本開示の方法を使用し得る。本開示の方法を用いて治療することができるがんの具体例として、例えば、リンパ腫、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、大腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、甲状腺癌、肝細胞癌、食道癌、及び、子宮頸癌があるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍とし得る。
【０１８７】
また、本開示の方法は、細菌感染、ウイルス感染、または、真菌感染が引き起こし得る感染性疾患を治療するために使用し得る。このような例にあっては、病原性抗原（例えば、感染症を引き起こす細菌、ウイルス、または、真菌と関連する抗原）を標的とするＦｃ含有治療薬（例えば、抗体）と共に、遺伝子操作した免疫細胞を使用し得る。病原性抗原の具体例として、細菌抗原、ウイルス抗原、及び／または、真菌抗原があるが、これらに限定されない。一部の例を、次に示す：インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、ヘマグルチニン、もしくは、Ｍ２タンパク質、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ糖タンパク質、もしくは、Ｇ糖タンパク質、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、もしくは、ｇＥ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ＭＯＭＰ、もしくは、ＰｏｒＢタンパク質、デング熱ウイルスコアタンパク質、マトリックスタンパク質、もしくは、糖タンパク質Ｅ、麻疹ウイルスヘマグルチニン、単純ヘルペスウイルスＩＩ型糖タンパク質ｇＢ、ポリオウイルスＩ  ＶＰ１、ＨＩＶ  １のエンベロープ糖タンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原または表面抗原、ジフテリア毒素、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ２４Ｍ  エピトープ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ  ｐｉｌｉｎ、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質１９５、伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、または、ヒトＣ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｅ１もしくはＥ２。
【０１８８】
一部の実施形態では、ＡＤＣＣ活性を、少なくとも２０％、及び／または、少なくとも２倍増強させる、例えば、ＡＤＣＣを、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、または、それ以上に増強する上で有効な量で、免疫細胞を対象に対して投与する。
【０１８９】
Ｆｃ含有治療薬が結合する抗原を発現する細胞を標的とするために、免疫細胞を、治療抗体などのＦｃ含有治療薬と共に同時投与する。一部の実施形態では、２つ以上のＦｃ含有治療薬、例えば、２つ以上の抗体などが、免疫細胞と共に使用し得る。抗体をベースとした免疫療法を使用して、免疫療法が有効と考えられる対象でのあらゆる疾患または障害の症候を、治療、緩和、または、抑制し得る。
【０１９０】
抗体（複数形で同義で用いる）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに対して特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する用語「抗体」は、インタクト（すなわち、全長）なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のみならず、Ｆｃ領域、その変異体を含むその抗原結合フラグメント、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ディアボディ、単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ）、直鎖状抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびに、所定の特異性の抗原認識部位と、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン分子のあらゆるその他の修飾形態、例えば、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、及び、共有結合修飾抗体なども含む。抗体として、あらゆるクラスの抗体、例えば、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、または、ＩｇＭ（または、そのサブクラス）などがあり、そして、抗体は、ある特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。５つの主なクラスの免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及び、ＩｇＭが存在しており、そして、これらの内の幾つかを、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及び、ＩｇＡ２へとさらに分類することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及び、ミューと呼ばれている。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造と、三次元構造は、公知である。本開示で使用する抗体は、共に使用するＡＣＴＲ−、及び／または、クレブス回路調節を改善するポリペプチド発現免疫細胞が認識することができるＦｃ領域を含有している。Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域、または、ヒト化Ｆｃ領域とし得る。
【０１９１】
本明細書に記載した抗体のいずれかは、モノクローナル、または、ポリクローナルのいずれかとすることができる。「モノクローナル抗体」とは、均質な抗体集団のことを意味しており、そして、「ポリクローナル抗体」とは、不均質な抗体集団のことを意味する。これら２つの用語は、抗体の供給源、または、抗体を作り出す方法を限定するものではない。
【０１９２】
ある例では、本明細書に記載した方法に使用する抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または、その抗原結合フラグメントである、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態のことを意味する。大抵の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び、性能を有するマウス、ラット、または、ウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基に置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、導入したＣＤＲ配列またはフレームワーク配列にも存在していないが、抗体性能をさらに改良し、及び、最適化するために含ませる残基を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、全て、または、ほぼ全てのＣＤＲ領域が、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応しており、そして、全て、または、ほぼ全てのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である、少なくとも１つの、通常は、２つの可変ドメインのほぼ全てを含む。また、ヒト化抗体は、至適には、免疫グロブリン定常領域、または、ドメイン（Ｆｃ）、一般的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域、または、ドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されているように修飾したＦｃ領域を有し得る。本明細書で用いる抗体は、グリコシル化（例えば、フコシル化）、または、アフコシル化し得る。ヒト化抗体のその他の形態は、当初の抗体を基準として変化させた１つ以上（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）のＣＤＲを有しており、それらは、当初の抗体の１つ以上のＣＤＲ「に由来する」１つ以上のＣＤＲとも称されている。また、ヒト化抗体は、親和性成熟を伴い得る。
【０１９３】
別の例では、本明細書に記載した抗体は、ヒト抗体に由来する重鎖定常領域、及び、軽鎖定常領域を含み得るキメラ抗体である。キメラ抗体とは、第１の種に由来する可変領域または可変領域の一部、及び、第２の種に由来する定常領域を有する抗体のことを意味する。一般的に、これらのキメラ抗体において、軽鎖と重鎖の両方の可変領域は、１つの哺乳動物（例えば、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、及び、ラット）に由来する抗体の可変領域を模倣している一方で、定常部分は、別の哺乳動物、例えば、ヒトなどに由来する抗体の配列に相同である。一部の実施形態では、可変領域、及び／または、定常領域において、アミノ酸修飾を行うことができる。
【０１９４】
本明細書で開示したクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、ＡＣＴＲポリペプチドのいずれかを発現する造血細胞、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、及び／または、ＮＫ細胞）を、Ｆｃ含有抗体を用いた治療を受けた、または、受けている対象に対して投与し得る。例えば、免疫細胞を、抗体と同時にヒト対象に対して投与し得る。あるいは、免疫細胞を、抗体をベースとした免疫療法の最中に、ヒト対象に対して投与し得る。一部の事例では、免疫細胞と抗体を、少なくとも４時間の間隔をあけて、例えば、少なくとも１２時間の間隔をあけて、少なくとも１日間の間隔をあけて、少なくとも３日間の間隔をあけて、少なくとも１週間の間隔をあけて、少なくとも２週間の間隔をあけて、または、少なくとも１ヶ月間の間隔をあけて、ヒト対象に対して投与し得る。
【０１９５】
一部の実施形態では、本明細書に記載した抗体は、対応する標的抗原、または、そのエピトープに対して特異的に結合する。抗原またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当該技術分野で十分に理解されている用語である。分子が、別の標的との反応と比較して、より頻繁に、より速やかに、より長時間にわたって、及び／または、より大きな親和性で、特定の標的抗原と反応する場合、その分子は「特異的結合」を示す、と呼ばれる。抗体が、その他の物質との結合と比較して、より大きな親和性で、結合力で、より速やかに、及び／または、より長時間にわたって結合する場合、その抗体は、標的抗原またはエピトープに対して「特異的に結合する」。例えば、抗原、または、その中の抗原性エピトープに対して特異的に（または、優先的に）結合する抗体は、その他の抗原、または、その同一抗原の中のその他のエピトープとの結合と比較して、より大きな親和性で、親和力で、より速やかに、及び／または、より長時間にわたって、この標的抗原と結合する抗体である。例えば、第１の標的抗原に対して特異的に結合する抗体が、第２の標的抗原に対して特異的または優先的に結合し得る、または、し得ないということも、この定義から理解できる。それ故に、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を（含み得るが）必要とはしていない。一部の事例では、標的抗原、または、そのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、その他の抗原、または、その同一抗原の中のその他のエピトープに結合し得ない。
【０１９６】
一部の実施形態では、本明細書に記載した抗体は、本明細書で開示した標的抗原（例えば、本明細書に記載した標的の内のいずれか１つ）、または、その抗原性エピトープに対する好適な結合親和性を有する。本明細書に記載した免疫療法の方法に使用する抗体は、関係する標的抗原、または、その中の特定の領域、もしくは、抗原性エピトープに結合（例えば、特異的に結合）し得る。関係する例示的な標的抗原、及び、それらに特異的な例示的な抗体を、前出の表３に記載する。
【０１９７】
（ｂ）ＣＡＲポリペプチドを発現する遺伝子操作した造血細胞の免疫療法
クレブス回路調節ポリペプチドと、ＣＡＲポリペプチドを共発現する本明細書に記載した遺伝子操作した造血細胞（例えば、造血幹細胞、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞などの免疫細胞）は、ＣＡＲポリペプチドが標的とする抗原を発現する異常細胞を、直接的または間接的に（例えば、ＣＡＲポリペプチドが結合するタグにコンジュゲートした治療薬を介して）阻害する、Ｔ細胞療法やＮＫ細胞療法などの免疫療法において使用することができる。免疫細胞においてＣＡＲポリペプチドと共発現するクレブス回路調節ポリペプチドは、細胞が、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、及び／または、低酸素環境、例えば、腫瘍内微小環境において、効果的に増殖すること、及び／または、機能することを可能ならしめて、細胞をベースとした免疫療法を促す。ｍＲＮＡエレクトロポレーションを使用して、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、ＣＡＲポリペプチドを一時的に発現させて、潜在的な非腫瘍特異的反応を制限することで、臨床的安全性を、さらに高め得る。
【０１９８】
本明細書に記載した方法は、クレブス回路調節ポリペプチドと、本開示のＣＡＲポリペプチドを共発現する造血細胞、例えば、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、または、ＮＫ細胞）などの遺伝子操作した宿主細胞の治療有効量を、対象に導入することを含み得る。対象（例えば、ヒトがん患者などのヒト患者）は、抗がん剤または感染防止剤など、これらに限定されない、抗がん療法または抗感染療法を使用した、さらなる治療を受けた、または、受け得る。ＣＡＲは、あらゆる標的抗原に結合し得る抗原結合ドメインを有する。そのような標的抗原は、疾患または病態に関連するあらゆる分子とし得るものであり、腫瘍抗原、病原性抗原（例えば、細菌、真菌、または、ウイルス）、または、本明細書で説明する異常細胞に存在する抗原があるが、これらに限定されない。
【０１９９】
本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチドと、ＣＡＲポリペプチドを発現する宿主細胞（例えば、造血細胞、例えば、Ｔ細胞、及び、ＮＫ細胞などの免疫細胞）は、標的抗原を発現する細胞を阻害する、及び／または、低グルコース環境、低アミノ酸環境、低ｐＨ環境、及び／または、低酸素環境、例えば、腫瘍内微小環境における免疫細胞の成長、及び／または、増殖を改善する上で有用である。一部の実施形態では、対象は、ヒト、サル、マウス、ウサギ、または、家畜哺乳動物などの哺乳動物である。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、ヒトがん患者である。一部の実施形態では、対象は、本明細書に記載した治療用抗体のいずれかを使用して、さらなる治療を受けた、または、受けている。
【０２００】
本明細書に記載した方法を実施するために、有効量の造血細胞、例えば、本明細書に記載したクレブス回路調節ポリペプチドと、ＣＡＲポリペプチドのいずれかを発現する免疫細胞（ＮＫ細胞、及び／または、Ｔリンパ球）、または、それらの組成物を、静脈内投与などの適切な経路を介して、治療を必要とする対象に対して投与し得る。本明細書で使用する有効量とは、投与すると、対象に治療効果を与える、それぞれの作用物質（例えば、クレブス回路調節ポリペプチド、ＣＡＲポリペプチド、または、それらの組成物を発現するＮＫ細胞、及び／または、Ｔリンパ球）の量のことを指す。本明細書に記載した細胞または組成物の量での治療効果の達成の有無の決定は、当業者に自明である。当業者が認識しているように、治療する個々の症状、症状の重症度、個々の患者の特徴、例えば、年齢、身体的状態、大きさ、ジェンダー、性別、及び、体重など、治療期間、併用療法（ある場合）の性質、個々の投与経路、ならびに、医療従事者の知見及び専門知識の範囲内の類似因子に応じて、有効量は変化する。一部の実施形態では、有効量は、対象における症候を緩和、軽減、改善、向上、抑制する、または、対象におけるあらゆる疾患または障害の進行を遅延させる。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、治療を必要とする対象は、ヒトがん患者である。一部の実施形態では、治療を必要とする対象は、１つ以上の病原性感染症（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、及び／または、真菌感染症）を患っている。
【０２０１】
あらゆるがん、または、あらゆる病原体を治療するために、本開示の方法を使用し得る。本開示の方法を用いて治療することができるがんの具体例として、例えば、リンパ腫、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、大腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、甲状腺癌、肝細胞癌、食道癌、及び、子宮頸癌があるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍とし得る。
【０２０２】
また、本開示の方法は、細菌感染、ウイルス感染、または、真菌感染が引き起こし得る感染性疾患を治療するために使用し得る。このような例においては、病原性抗原（例えば、感染症を引き起こす細菌、ウイルス、または、真菌と関連する抗原）に特異的なＣＡＲポリペプチドを発現する遺伝子操作した免疫細胞を使用して、感染細胞を排除することができる。病原性抗原の具体的な例として、細菌抗原、ウイルス抗原、及び／または、真菌抗原があるが、これらに限定されない。
【０２０３】
一部の実施形態では、免疫細胞は、標的抗原を発現する細胞を、少なくとも２０％、及び／または、少なくとも２倍を阻害する有効量で、例えば、標的抗原を発現する細胞を、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、または、それ以上を阻害する有効量で、対象に投与する。
【０２０４】
さらなる治療薬（例えば、抗体をベースとした免疫療法薬）を使用して、対象において治療薬が有用であると考えられる、あらゆる疾患または障害の症状を、治療、緩和、または、軽減し得る。
【０２０５】
抗体をベースとした免疫療法の効果は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて評価することができ、そして、熟練した医療従事者には自明である。例えば、抗体をベースとした免疫療法の効果は、対象の生存率、あるいは、対象または組織もしくはそれらの試料における、腫瘍負荷量またはがん負荷量で評価し得る。一部の実施形態では、免疫細胞は、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞の非不在下での効果と比較して、抗体をベースとした免疫療法の効果を、少なくとも２０％、及び／または、少なくとも２倍改善する、例えば、抗体をベースとした免疫療法の効果を、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、または、それ以上に改善する有効量を、治療を必要とする対象に対して投与する。
【０２０６】
本明細書に記載した組成物または方法のいずれかにおいて、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、及び／または、Ｔ細胞）は、対象に対して自家のものとし得る、すなわち、免疫細胞を、治療を必要とする対象から得て、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、ＣＡＲポリペプチドを発現するように遺伝子操作を行い、次いで、同一対象に対して投与し得る。ある特定の実施形態では、対象に再導入する前に、自家免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、または、ＮＫ細胞）を、エクスビボで、活性化、及び／または、増殖させる。対象への自家細胞の投与は、非自家細胞の投与と比較して、宿主細胞の拒絶反応の抑制をもたらし得る。
【０２０７】
あるいは、宿主細胞は、同種異系細胞である、すなわち、細胞を第１の対象から得て、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＣＴＲポリペプチド、または、ＣＡＲポリペプチド）を発現するように遺伝子操作を行い、そして、第１の対象とは異なるが、同一の種である第２の対象に対して投与する。例えば、同種異系免疫細胞は、ヒトドナーに由来しており、そして、ドナーとは異なるヒトレシピエントに対して投与し得る。特定の実施形態では、Ｔリンパ球は、内在性Ｔ細胞受容体の発現を阻害または制限している同種異系Ｔリンパ球である。ある特定の実施形態では、対象に導入する前に、同種異系Ｔリンパ球を、エクスビボで、活性化、及び／または、増殖させる。例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−２、フィトヘマグルチニン、改変した人工刺激細胞もしくは粒子、または、これらの組み合わせの存在下で、当該技術分野で公知のあらゆる方法を使用して、Ｔリンパ球を活性化する。
【０２０８】
例えば、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２タンパク質、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−２１タンパク質、及び、Ｋ５６２細胞株、及び／または、改変した人工刺激細胞または粒子からなる群から選択する１つ以上の作用物質の存在下で、当該技術分野で公知の方法を使用して、ＮＫ細胞を活性化することができる。ＮＫ細胞を増殖させるための有効な方法の記載については、例えば、米国特許第７，４３５，５９６号、及び、第８，０２６，０９７号を参照されたい。例えば、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ及び／またはＩＩ分子を欠いており、または、不十分に発現しており、かつ、膜結合ＩＬ−１５及び４−１ＢＢリガンド（ＣＤＩ３７Ｌ）を発現するように遺伝子改変した細胞に曝露することで、本開示の組成物または方法に使用するＮＫ細胞を優先的に増殖し得る。このような細胞株として、Ｋ５６２［ＡＴＣＣ，ＣＣＬ  ２４３；Ｌｏｚｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ４５（３）：３２１−３３４（１９７５）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １８：４２１−４３１（１９７６）］、及び、ウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ（Ｆｅｈｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０（３−４）：５０３−５３４（２００１）；Ｈａｒａｄａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３２（７）：６１４−６２１（２００４））、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−ＩＩ、肝芽細胞腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞癌細胞株Ｌｕ−１３０及びＬｕ−１３４−Ａ、神経芽細胞腫細胞株ＮＢ  １９及びＮ１３６９、精巣に由来する胎児性がん細胞株ＮＥＣ  １４、子宮頸部癌細胞株ＴＣＯ−２、ならびに、骨髄に転移した神経芽細胞腫細胞株ＴＮＢ  １［Ｈａｒａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９３：３１３−３１９（２００２）］があるが、必ずしもこれらに限定されない。使用する細胞株は、ＭＨＣＩ分子とＭＨＣＩＩ分子の両方を欠いている、または、不十分に発現していることが好ましく、例えば、Ｋ５６２細胞株、及び、ＨＦＷＴ細胞株などである。細胞株の代わりに、固体支持体を使用し得る。このような支持体は、好ましくは、その表面上に、ＮＫ細胞に結合し、そして、一次活性化イベント、及び／または、増殖性応答を誘導することができる少なくとも１つの分子、または、このような影響を及ぼす分子に結合させることで、足場として機能することができる少なくとも１つの分子を結合させておく必要がある。支持体は、その表面に、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、または、ＩＬ−１５受容体抗体を結合させ得る。好ましくは、支持体は、その表面上に結合したＩＬ−１５受容体抗体と、ＣＤ１３７抗体を有する。
【０２０９】
記載した組成物または方法のある実施形態では、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、または、Ｔリンパ球及びＮＫ細胞の対象への導入（または、再導入）に続いて、治療有効量のＩＬ−２の対象への投与を行う。
【０２１０】
本開示によれば、治療有効用量の免疫細胞、例えば、本開示のクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、ＣＡＲポリペプチドを、体重１キログラムあたり、約１０5〜１０10、または、それ以上の細胞（細胞／Ｋｇ）の範囲で含む、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞などを注入して、患者を治療することができる。患者が耐えることができるほど頻繁かつ多くの回数で、所望の応答が得られるまで注入を繰り返し得る。適切な注入用量やスケジュールは、患者毎に様々であるが、個々の患者用に、治療を行う医師が決定することができる。一般的に、初期用量の約１０6細胞／Ｋｇを注入してから、１０8以上の細胞／Ｋｇにまで漸増する。注入細胞を増殖させるために、ＩＬ−２を同時投与することができる。ＩＬ−２の量は、身体表面の平方メートルあたり、約１〜５×１０6国際単位とすることができる。
【０２１１】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」とは、当業者が測定した個々の値が、許容される誤差の範囲内にあることを意味するものであり、その値は、測定または決定の仕方、すなわち、測定システムの制約をある程度は受ける。例えば、「約」とは、当該技術分野での実施にあたって許容される標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」とは、所与の値の最大±２０％、好ましくは、最大±１０％、より好ましくは、最大±５％、及び、さらにより好ましくは最大±１％の範囲のことを意味し得る。あるいは、とりわけ、生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の桁内、好ましくは、２倍内であることを意味し得る。本出願及び特許請求の範囲において個々の値を記載する場合、特に断りのない限り、用語「約」とは、暗に、及び、この文脈で、個々の値の許容可能な誤差の範囲内である、ことを意味している。
【０２１２】
本明細書に記載した組成物または方法の効果は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して評価することができ、また、熟練した医療従事者に自明である。例えば、本明細書に記載した組成物または方法の効果は、対象の生存率、あるいは、対象または組織もしくはそれらの試料における、がん負荷量または病原体負荷量で評価し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載した組成物及び方法は、その療法（例えば、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞の投与）の対象における安全性または毒性に基づいて、例えば、対象の総合的な健康状態、及び／または、有害事象または重度の有害事象の存在によって評価し得る。
【０２１３】
（ｃ）その他の免疫療法
一部の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチド（例えば、ＧＯＴ、例えば、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２）の１つ以上を発現する遺伝子操作した免疫細胞は、異常細胞（例えば、がん細胞、または、病原体感染細胞）に特異的な天然免疫細胞に由来し得る。このような遺伝子操作した免疫細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球、または、ＴＩＬ）は、キメラ受容体ポリペプチドを全く共発現し得ないものであり、そして、標的異常細胞、例えば、がん細胞を破壊するために使用し得る。１つ以上のクレブス回路調節ポリペプチドを発現するが、キメラ受容体を発現しない遺伝子操作したＴＩＬを、標的腫瘍細胞と、ＴＩＬに結合することができる二重特異性抗体（ＢｉＴＥ）と共に使用し得る。
【０２１４】
一部の実施形態では、クレブス回路調節ポリペプチド（例えば、ＧＯＴ、例えば、ＧＯＴ１またはＧＯＴ２）の１つ以上を発現する遺伝子操作した免疫細胞を、Ｔreg細胞とし得る。そのようなＴreg細胞は、本明細書で開示したキメラ受容体ポリペプチドを共発現する。あるいは、Ｔreg細胞は、あらゆるキメラ受容体ポリペプチドを共発現し得るものではなく、そして、意図した療法で使用することができる。
【０２１５】
Ｖ．併用療法
本開示に記載した組成物及び方法は、がんのその他のタイプの治療法、例えば、化学療法、外科手術、放射線、遺伝子療法など、または、抗感染症療法などと共に使用し得る。本開示の免疫療法と共に、このような治療法を、同時または連続的に（任意の順番で）実施し得る。さらなる治療薬と同時投与する場合には、相加効果または相乗効果によって、それぞれの薬剤の好適な治療有効用量を抑制し得る。
【０２１６】
一部の事例では、本明細書に開示したクレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、キメラ受容体ポリペプチドのいずれかを発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、及び／または、ＮＫ細胞）を、さらなる治療薬（例えば、さらなる抗がん治療剤）で、治療した、または、治療を受けている対象に対して投与し得る。例えば、免疫細胞は、さらなる治療薬と同時に、ヒト対象に対して投与し得る。あるいは、免疫細胞は、さらなる治療薬の投与前に、ヒト対象に対して投与し得る。あるいは、免疫細胞は、さらなる治療薬の投与後に、ヒト対象に対して投与し得る。
【０２１７】
クレブス回路調節ポリペプチドと、タグに特異的なＣＡＲポリペプチドを共発現する遺伝子操作した免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、または、ＮＫ細胞）は、タグに結合した治療薬と併用することができる。腫瘍細胞などの異常細胞に関連する抗原に結合することができる治療薬を介して、そのような遺伝子操作した免疫細胞は、異常細胞と関与して、それらの増殖を阻害することができる。上記の表１に記載した抗体のいずれか、または、表１にも記載されている同じ標的抗原に特異的なその他の抗体は、適切なタグ（例えば、本明細書に記載したもの）にコンジュゲートし、そして、クレブス回路調節ポリペプチドと、タグに特異的なＣＡＲポリペプチドを共発現する免疫細胞と併用することができる。
【０２１８】
本開示の治療法は、その他の免疫調節治療法、例えば、治療ワクチン（ＧＶＡＸ、ＤＣ系ワクチンなどがあるが、これらに限定されない）、チェックポイント阻害薬（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３などをブロックする薬剤があるが、これらに限定されない）、または、活性化剤（４１ＢＢ、ＯＸ４０などを強める薬剤があるが、これらに限定されない）などと組み合わせることができる。
【０２１９】
本開示の免疫療法薬との組み合わせに有用なその他の治療薬の例として：（ｉ）抗血管新生薬（例えば、ＴＮＰ−４７０、血小板第４因子、トロンボスポンジン−１、メタロプロテアーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰ１、及び、ＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６Ｋｄのフラグメント）、アンジオスタチン（プラスミノーゲンの３８Ｋｄのフラグメント）、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターフェロンアルファ、可溶性ＫＤＲ受容体、及び、ＦＬＴ−１受容体、胎盤プロリフェリン関連タンパク質、ならびに、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ（２０００）に列挙されているもの）、（ｉｉ）ＶＥＧＦアンタゴニスト、または、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを阻害することができる、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体フラグメント、アプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤、及び、これらのあらゆる組み合わせ；及び、（ｉｉｉ）化学療法化合物、例えば、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン、及び、シタラビン）、プリン類似体、葉酸アンタゴニスト、及び、関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、及び、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、及び、ビノレルビン）などの天然物を含む抗増殖／有糸分裂阻害剤、微小管破壊剤、例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、及び、ナベルビンなど、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、及び、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホラミド、及び、エトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、及び、マイトマイシンなど；酵素（Ｌ−アスパラギンを組織的に代謝し、かつ、細胞自体のアスパラギンを合成する能力を持たない細胞を制限するＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板薬；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、及び、類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン、及び、メチルメラミン（ヘキサメチルメラミン、及び、チオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）、及び、類似体、ストレプトゾシン��、トラゼネス−ダカルバジン（ＤＴＩＣ）など；抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗薬、例えば、葉酸類似体（メトトレキサート）など；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）、及び、アロマターゼ阻害薬（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩、及び、トロンビンのその他の阻害剤）；線維素溶解薬（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、及び、ウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌薬（ブレフェルディン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（例えば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）、及び、増殖因子阻害剤（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤、及び、分化誘導因子（トレチノイン）；ＡＫＴ阻害剤（例えば、ＭＫ−２２０６  ２ＨＣｌ、ペリフォシン（ＫＲＸ−０４０１）、ＧＳＫ６９０６９３、イパタセルチブ（ＧＤＣ−００６８）、ＡＺＤ５３６３、ユプロセルチブ、アフレセルチブ、または、トリシリビンなど）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、及び、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、及び、プレドニゾロン）；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導因子、及び、カスパーゼ活性化因子；及び、クロマチン破壊剤があるが、これらに限定されない。
【０２２０】
別の有用な作用物質の例については、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｐ  Ｄ  Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ  Ｎ．Ｊ．；Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｍｄ．；Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，ＮＹ；Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ  Ｎ．Ｊ．も参照されたい。
【０２２１】
さらなる治療薬の投与は、全身投与、ならびに、疾患の部位（例えば、腫瘍）への直接的な投与など、あらゆる適切な経路で実施することができる。
【０２２２】
一部の実施形態では、この方法は、さらなる治療薬（例えば、抗体）を、対象に対して、１用量で投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、さらなる治療薬（例えば、抗体）を、対象に対して、複数の用量（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、または、８用量）で投与することを含む。一部の実施形態では、さらなる治療薬（例えば、抗体）を、対象に対して、複数の用量で投与する、ただし、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞を投与する約１、２、３、４、５、６、または、７日前に、さらなる治療薬（例えば、抗体）の第１の用量を投与する。一部の実施形態では、さらなる治療薬（例えば、抗体）の第１の用量を、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞を投与する約２４〜４８時間前に、対象に対して投与する。一部の事例では、さらなる治療薬を、関係する標的抗原に特異的な抗体、例えば、表１に記載した抗体、及び、同じ標的に特異的なその他の抗体とし得る。
【０２２３】
一部の実施形態では、さらなる治療薬（例えば、抗体）を、クレブス回路調節ポリペプチド、及び／または、ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫細胞を投与する前と、その後の約２週間ごとに、対象に対して投与する。一部の実施形態では、さらなる治療薬（例えば、抗体）の最初の２用量を、約１週間（例えば、約６、７、８、または、９日）の間隔で投与する。特定の実施形態では、第３以降の用量を、約２週間ごとに投与する。
【０２２４】
本明細書に記載した実施形態のいずれにおいても、さらなる治療薬（例えば、抗体）の投与の時期はおおよそのものであり、そして、前掲の日の前後の３日間を含む（例えば、３週間ごとの投与は、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、または、２４日での投与を含む）。
【０２２５】
本明細書に記載した方法の効果は、当該技術分野で公知のあらゆる方法を用いて評価することができ、熟練した医療従事者、及び／または、本明細書に記載した効果から自明である。例えば、抗体をベースとした免疫療法の効果は、対象の生存率、あるいは、対象または組織もしくはその試料における、がん負荷量で評価し得る。一部の実施形態では、抗体をベースとした免疫療法は、その療法の対象における安全性または毒性に基づいて、例えば、対象の総合的な健康状態、及び／または、有害事象または重度の有害事象の存在で評価する。
【０２２６】
ＶＩ．治療用途用のキット
また、本開示は、本明細書に記載した組成物の使用のためのキットも提供する。例えば、本開示は、異常細胞、例えば、腫瘍細胞の成長の阻害、及び／または、低グルコース環境、低アミノ酸環境、低ｐＨ環境、及び／または、低酸素環境、例えば、腫瘍内微小環境における免疫細胞の成長、及び／または、増殖の改善での使用のためのキットであって、クレブス回路調節ポリペプチドと、任意にキメラ受容体ポリペプチドを発現する免疫細胞の集団（例えば、インビトロまたはインビボで構築したＴリンパ球、または、ＮＫ細胞）を含むキットも提供する。キットは、治療薬、または、免疫細胞上で発現したキメラ受容体ポリペプチドが結合するタグに結合した治療薬（例えば、本明細書に記載したもの）をさらに含み得る。このようなキットは、クレブス回路調節ポリペプチドとキメラ受容体ポリペプチド、例えば、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドと、任意の治療薬、または、タグにコンジュゲートした治療薬を共発現する遺伝子操作した免疫細胞、例えば、本明細書に記載した免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、及び／または、ＮＫ細胞）の集団を含む、１つ以上の容器を含み得る。
【０２２７】
一部の実施形態では、本明細書に記載したキットは、インビトロで増殖した、クレブス回路調節ポリペプチド発現免疫細胞とキメラ受容体ポリペプチド発現免疫細胞、ならびに、活性化Ｔ細胞上に存在する細胞表面抗体に特異的な抗体、例えば、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ３８抗体、または、抗ＣＤ７抗体を含む。クレブス回路調節ポリペプチド発現免疫細胞、及び、キメラ受容体ポリペプチド発現免疫細胞は、当該技術分野で公知であり、または、本明細書で開示したキメラ受容体ポリペプチドのいずれかを発現し得る。
【０２２８】
あるいは、本明細書に開示したキットは、本明細書に記載した核酸または核酸セットを含み得るものであり、このものは、同じく本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドのいずれか、及び、クレブス回路調節ポリペプチドのいずれかを集合的にコードする。
【０２２９】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載した方法のいずれかでの使用のための取扱説明書をさらに含むことができる。備える取扱説明書は、目的の活性を得るために、例えば、対象での標的細胞の成長を阻害する、及び／または、低グルコース環境、低アミノ酸（例えば、低グルタミン環境）環境、低ｐＨ環境、及び／または、低酸素環境（例えば、低グルコース、低アミノ酸、低ｐＨ、または、低酸素腫瘍内微小環境）における免疫細胞の成長、及び／または、増殖を改善するために、第１及び第２の医薬組成物を対象に対して投与するための説明を含み得る。キットは、対象に関する治療の必要性の有無を判断して、治療に適した対象を選択するための説明をさらに含み得る。一部の実施形態では、取扱説明書は、遺伝子操作した免疫細胞の集団の投与の説明と、タグにコンジュゲートした治療薬の投与に関する任意の説明とを含む。
【０２３０】
本明細書に記載した免疫細胞と、タグにコンジュゲートした治療薬の任意の使用に関する取扱説明書は、一般的には、意図した治療のための用量、投与スケジュール、及び、投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）、または、単位未満の用量とすることができる。本開示のキットに提供される取扱説明書は、一般的には、ラベルまたは添付文書に記載した取扱説明書である。このラベルまたは添付文書は、医薬組成物が、対象における疾患または障害を治療する、疾患または障害の発症を遅延させる、及び／または、疾患または障害を緩和するために使用されることを示す。
【０２３１】
本明細書で提供するキットは、好適なパッケージに入れられている。好適なパッケージとして、バイアル、ボトル、瓶、柔軟なパッケージなどがあるが、これらに限定されない。特定の器具、例えば、吸入用器具、経鼻投与用器具、または、注入用器具などと組み合わせて使用するためのパッケージもまた意図している。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグ、または、バイアルとし得る）。容器は、滅菌アクセスポートも有し得る。第２の医薬組成物での少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載した抗体である。第１の医薬組成物での少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載したキメラ受容体ポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドを発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、または、ＮＫ細胞）の集団である。
【０２３２】
キットは、任意に、さらなる構成要素、例えば、緩衝剤、及び、説明情報などを提供し得る。通常、キットは、容器、及び、容器上または容器に結合したラベルまたは添付文書（複数可）を含む。一部の実施形態では、本開示は、上記したキットの内容物を含む製造物品を提供する。
【０２３３】
一般的な技術
本開示の実施にあっては、特に断りの無い限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び、免疫学の従来技術を用いるが、それらは当業者に公知である。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５＞＞；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４＞＞；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６＞＞；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６＞＞；及び、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献で、十分に説明されている。
【０２３４】
当業者であれば、さらなる技術思想を加えずとも、上記した説明に基づいて、本開示を最大限に利用できるものと考えられる。それ故に、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈すべきであり、いかなる意味においても、残余の開示を限定的に捉えるべきはない。本明細書で引用する全ての刊行物は、本明細書に記載の目的及び趣旨に関して、参照により、本明細書で援用する。
【実施例】
【０２３５】
実施例１：低グルコース環境でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現がＴ細胞機能に及ぼす影響。
クレブス回路調節ポリペプチド導入遺伝子を、同じＴ細胞において、ＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＨＧＤＧ、ＰＣＫ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ１、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＧＯＴ１、ＧＯＴ２、ＰＳＡＴ１、ＧＤＨ１、ＧＰＴ１、または、ＧＬＳ（例えば、配列番号８１〜９２）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＡＣＴＲポリペプチド、及び、グルコース輸入ポリペプチドをコードするウイルスを、Ｔ細胞に導入する。Ｔ細胞を、ＩＧＲＯＶ−１細胞などの腫瘍標的細胞、及び、抗ＦＯＬＲ１抗体などの腫瘍標的化抗体と、所与のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率で混合する。その後、反応物、異なる開始濃度のグルコース（例えば、０〜２０ｍＭ）で、５％ＣＯ2インキュベーターにおいて、３７℃で、一定期間（例えば、６〜８日間）培養する。次に、例えば、サイトカイン生産アッセイ、または、Ｔ細胞増殖アッセイ、または、長時間刺激に対する耐性を使用して、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン生産（例えば、ＩＬ−２、及び／または、ＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験のために、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体、及び、生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを使用して、生ＣＤ３陽性細胞の個数を、Ｔ細胞増殖の指標として評価する。ＡＣＴＲポリペプチドに加えて、クレブス回路調節ポリペプチドも発現するＴ細胞は、ＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、例えば、改善したサイトカイン生産、または、旺盛な増殖を伴う高度のＴ細胞機能を示す。この高度の機能は、低グルコース濃度において、さらに顕著であり得る。これらの実験は、Ｔ細胞においてクレブス回路調節ポリペプチドを発現させると、Ｔ細胞活性にプラスの影響を及ぼすことを実証している。
【０２３６】
実施例２：高濃度の可溶性阻害剤環境でのクレブス回路調節ポリペプチド遺伝子の発現が、Ｔ細胞機能に及ぼす影響。
クレブス回路調節ポリペプチド導入遺伝子を、同じＴ細胞において、ＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＨＧＤＧ、ＰＣＫ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ１、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＧＯＴ１、ＧＯＴ２、ＰＳＡＴ１、ＧＤＨ１、ＧＰＴ１、または、ＧＬＳ（例えば、配列番号８１〜９２）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＡＣＴＲポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドをコードするウイルスを、Ｔ細胞に導入する。形質導入したＴ細胞を、腫瘍内微小環境に存在する異なる濃度の可溶性阻害剤（例えば、ＴＧＦベータ、ＰＧＥ2、キヌレニン、及び／または、アデノシン）を含有する培地で、ＩＧＲＯＶ−１細胞などの腫瘍標的細胞、及び、抗ＦＯＬＲ１抗体などの腫瘍標的化抗体と、所与のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率で混合する。その後、反応物を、５％ＣＯ2インキュベーターにおいて、３７℃で、一定期間（例えば、６〜８日間）培養する。次に、例えば、サイトカイン生産アッセイ、または、Ｔ細胞増殖アッセイ、または、長時間刺激に対する耐性を使用して、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン生産（例えば、ＩＬ−２、及び／または、ＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験のために、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体、及び、生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを使用して、生ＣＤ３陽性細胞の個数を、Ｔ細胞増殖の指標として評価する。ＡＣＴＲポリペプチドに加えて、クレブス回路調節ポリペプチドも発現するＴ細胞は、ＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、例えば、改善したサイトカイン生産、または、旺盛な増殖を伴う高度のＴ細胞機能を示す。この高度の機能は、高濃度の可溶性阻害剤において達成し得る。これらの実験は、Ｔ細胞においてクレブス回路調節ポリペプチドを発現させると、Ｔ細胞活性にプラスの影響を及ぼすことを実証している。
【０２３７】
実施例３：免疫抑制細胞が多数存在する環境でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、Ｔ細胞機能に及ぼす影響。
クレブス回路調節ポリペプチド導入遺伝子を、同じＴ細胞において、ＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＨＧＤＧ、ＰＣＫ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ１、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＧＯＴ１、ＧＯＴ２、ＰＳＡＴ１、ＧＤＨ１、ＧＰＴ１、または、ＧＬＳ（例えば、配列番号８１〜９２）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＡＣＴＲポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドをコードするウイルスを、Ｔ細胞に導入する。形質導入したＴ細胞を、免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来の抑制細胞、及び／または、制御性Ｔ細胞）の存在下で、ＩＧＲＯＶ−１細胞などの腫瘍標的細胞、及び、抗ＦＯＬＲ１抗体などの腫瘍標的化抗体と、所与のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率で混合する。その後、反応物を、５％ＣＯ2インキュベーターにおいて、３７℃で、一定期間（例えば、６〜８日間）培養する。次に、例えば、サイトカイン生産アッセイ、または、Ｔ細胞増殖アッセイ、または、長時間刺激に対する耐性を使用して、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン生産（例えば、ＩＬ−２、及び／または、ＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験のために、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体、及び、生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを使用して、生ＣＤ３陽性細胞の個数を、Ｔ細胞増殖の指標として評価する。ＡＣＴＲポリペプチドに加えて、クレブス回路調節ポリペプチドも発現するＴ細胞は、ＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、例えば、改善したサイトカイン生産、または、旺盛な増殖を伴う高度のＴ細胞機能を示す。この高度の機能は、多量の（例えば、多数の、または、パーセンテージが大きな）免疫抑制細胞の存在下で達成し得る。これらの実験は、Ｔ細胞においてクレブス回路調節ポリペプチドを発現させると、Ｔ細胞活性にプラスの影響を及ぼすことを実証している。
【０２３８】
実施例４：腫瘍モデルでのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、Ｔ細胞機能に及ぼす影響。
クレブス回路調節ポリペプチド導入遺伝子を、同じＴ細胞において、ＡＣＴＲポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＰＨＧＤＧ、ＰＣＫ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ１、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＧＯＴ１、ＧＯＴ２、ＰＳＡＴ１、ＧＤＨ１、ＧＰＴ１、または、ＧＬＳ（例えば、配列番号８１〜９２）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＡＣＴＲポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドをコードするウイルスを、Ｔ細胞に導入する。形質導入したＴ細胞を、マウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性について評価する。これらの実験のために、腫瘍細胞株、例えば、ＩＧＲＯＶ−１を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃscid  ＩＬ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種する。続いて、腫瘍標的化抗体、ならびに、ＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞、または、ＡＣＴＲとクレブス回路調節ポリペプチドを発現するＴ細胞を、腫瘍担持マウスに対して投与する。実験期間中にわたって、腫瘍の増殖をモニターする。腫瘍標的化抗体と組み合わせると、ＡＣＴＲポリペプチドに加えて、クレブス回路調節ポリペプチドも発現するＴ細胞は、ＡＣＴＲポリペプチドだけを発現するＴ細胞と比較して、抗腫瘍活性が大きい。加えて、腫瘍標的化抗体と組み合わせると、ＡＣＴＲポリペプチドに加えて、クレブス回路調節ポリペプチドも発現するＴ細胞は、ＡＣＴＲポリペプチドだけを発現するＴ細胞と比較して、例えば、旺盛な増殖性、改善したＴ細胞持続性、及び／または、改善したサイトカインの生産性など、高いＴ細胞活性を示し得る。これらの実験は、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞においてクレブス回路調節ポリペプチドを発現させると、インビボにおけるＴ細胞機能にプラスの影響を及ぼすことを実証している。
【０２３９】
実施例５：低濃度のグルコース濃度が、Ｔ細胞機能に及ぼす影響。
配列番号１０４の例示的なＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ発現構築物をコードするガンマレトロウイルスを、組換え技術で作製し、そして、初代ヒトＴ細胞を感染させるために使用して、その細胞表面上にＧＰＣ３を標的とするＣＡＲポリペプチドを発現する細胞を作製した。次いで、６日間のフローをベースとした増殖アッセイを使用して、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ発現細胞の機能を試験した。具体的には、２００，０００個の非形質導入模擬Ｔ細胞、または、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ構築物を発現するＴ細胞を、５０，０００個のＧＰＣ３＋肝細胞癌ＪＨＨ７腫瘍細胞、または、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍細胞のいずれかと共に、４：１（エフェクター細胞／ＣＡＲ発現Ｔ細胞：標的細胞）の比率で培養した。共培養物を、異なる濃度のグルコースの存在下、５％ＣＯ2インキュベーターにおいて、３７℃で、６日間インキュベートした。６日間の最後に、共培養物を回収し、そして、抗ＣＤ３抗体で染色した。フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ３陽性細胞の個数を、Ｔ細胞増殖の指標として評価した。低濃度のグルコースでは、ＣＡＲ−Ｔ増殖は乏しかった（図１）。これらの実験は、低グルコース環境では、ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖活性にマイナスの影響を及ぼし得ることを実証している。
【０２４０】
実施例６：ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞構築物を使用するクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、Ｔ細胞機能に及ぼす影響。
例示的なＧＰＣ３を標的とするＣＡＲポリペプチド発現構築物（配列番号１０４）をコードするガンマレトロウイルスを、組換え技術により作製し、そして、初代ヒトＴ細胞を感染させるために使用して、その細胞表面上にＧＰＣ３を標的とするＣＡＲポリペプチドを発現する細胞を作製した。加えて、例示的なＧＰＣ３を標的とするＣＡＲポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ１、または、ＧＯＴ２）（それぞれ、配列番号８７及び８８）をコードするガンマレトロウイルスを、組換え技術により作製し、そして、初代ヒトＴ細胞を感染させるために使用して、ＧＰＣ３標的化ポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドを発現する細胞を作製した。ＣＡＲポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドの両方をコードする構築物において、２つのポリペプチドのコード配列を、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てた。発現したバリアントは、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ＋  ＧＯＴ１と、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ＋  ＧＯＴ２であった。次いで、６日間のフローをベースとした増殖アッセイを使用して、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ発現細胞の機能を試験した。具体的には、２００，０００個の非形質導入模擬Ｔ細胞、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞、または、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲポリペプチドと、クレブス回路調節ペプチドとを発現するＴ細胞を、５０，０００個のＧＰＣ３＋肝細胞癌ＪＨＨ７腫瘍細胞と共に、４：１（エフェクター細胞／ＣＡＲ発現Ｔ細胞：標的細胞）の比率で培養した。共培養物を、１．２５ｍＭのグルコース（腫瘍相当）、及び、１０ｍＭのグルコース（ほぼ末梢血レベル）の存在下で、５％ＣＯ2、３７℃で、６日間インキュベートした。６日間の最後に、共培養物を回収して、抗ＣＤ３抗体で染色した。
【０２４１】
フローサイトメトリーを使用し、ＣＤ３陽性細胞の個数を、Ｔ細胞増殖の指標として評価した。ＣＡＲポリペプチドに加えて、クレブス回路調節ポリペプチドも発現するＴ細胞は、ＣＡＲ構築物だけを発現するＴ細胞と比較して、旺盛なＴ細胞増殖を示した（図２Ａ、２Ｂ、３Ａ、及び、３Ｂ）。この旺盛な増殖性は、腫瘍相当の低濃度のグルコースでも認められた。これらの実験は、Ｔ細胞において、クレブス回路調節ポリペプチドを発現させると、ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖活性にプラスの影響を及ぼすことを実証している。
【０２４２】
実施例７：低グルコース環境でのクレブス回路調節遺伝子の発現が、Ｔ細胞機能に及ぼす影響。
クレブス回路調節導入遺伝子を、同じＴ細胞において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＧＰＴ１、ＧＬＳ、ＰＣＫ１、ＧＯＴ１、ＧＯＴ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＰＨＧＤＨ、ＰＳＡＴ１、または、ＧＤＨ１（例えば、配列番号８１〜９２）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＣＡＲポリペプチドと、クレブス回路代謝産物ポリペプチドをコードするウイルスを、Ｔ細胞に導入する。Ｔ細胞を、ＨｅｐＧ２細胞などの腫瘍標的細胞と、所与のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率で混合する。次いで、反応物を、異なる開始濃度のグルコース（例えば、０〜２０ｍＭ）で、５％ＣＯ2インキュベーターにおいて、３７℃で、一定期間（例えば、６〜８日間）インキュベートする。次いで、例えば、サイトカイン生産アッセイ、または、Ｔ細胞増殖アッセイを使用して、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン生産（例えば、ＩＬ−２、及び／または、ＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験のために、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体、及び、生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを使用して、生ＣＤ３陽性細胞の個数を、Ｔ細胞増殖の指標として評価する。
【０２４３】
ＣＡＲポリペプチドに加えて、クレブス回路調節ポリペプチドも発現するＴ細胞は、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、例えば、サイトカインの生産性が大きく、または、増殖性に優れるなど、高度のＴ細胞機能を示すものと考えられる。この高度の機能は、低濃度のグルコースにおいて、さらに顕著となり得る。
【０２４４】
実施例８：高濃度の可溶性阻害剤が存在する環境でのクレブス回路調節遺伝子の発現が、Ｔ細胞機能に及ぼす影響。
クレブス回路調節導入遺伝子を、同じＴ細胞において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＧＰＴ１、ＧＬＳ、ＰＣＫ１、ＧＯＴ１、ＧＯＴ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＰＨＧＤＨ、ＰＳＡＴ１、または、ＧＤＨ１（例えば、配列番号８１〜９２）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＣＡＲポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチドをコードするウイルスを、Ｔ細胞に導入する。Ｔ細胞を、腫瘍内微小環境に存在する異なる濃度の可溶性阻害剤（例えば、ＴＧＦ−ベータ、ＰＧＥ2、及び／または、アデノシン）を含有する培地で、ＨｅｐＧ２細胞などの腫瘍標的細胞と、所与のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率で混合する。次いで、反応物を、５％ＣＯ2インキュベーターにおいて、３７℃で、一定期間（例えば、６〜８日間）インキュベートする。次いで、例えば、サイトカイン生産アッセイ、または、Ｔ細胞増殖アッセイを使用して、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン生産（例えば、ＩＬ−２、及び／または、ＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験のために、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体、及び、生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを使用して、生ＣＤ３陽性細胞の個数を、Ｔ細胞増殖の指標として評価する。
【０２４５】
ＣＡＲポリペプチドに加えて、クレブス回路調節ポリペプチドも発現するＴ細胞は、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、例えば、サイトカインの生産性が大きく、または、増殖性に優れるなど、高度のＴ細胞機能を示すものと考えられる。この高度の機能は、高濃度の可溶性阻害剤で達成し得る。
【０２４６】
実施例９：数多くの免疫抑制細胞が存在する環境でのクレブス回路調節遺伝子の発現が、Ｔ細胞機能に及ぼす影響。
クレブス回路代謝産物入換導入遺伝子を、同じＴ細胞において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと共発現させる。導入遺伝子は、例えば、ＧＰＴ１、ＧＬＳ、ＰＣＫ１、ＧＯＴ１、ＧＯＴ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＰＨＧＤＨ、ＰＳＡＴ１、または、ＧＤＨ１（例えば、配列番号８１〜９２）である。例えば、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＣＡＲポリペプチドと、クレブス回路代謝産物入換ポリペプチドをコードするウイルスを、Ｔ細胞に導入する。形質導入したＴ細胞を、蛍光標識で目印を付けた免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来の抑制細胞、及び／または、制御性Ｔ細胞）の存在下で、ＨｅｐＧ２細胞などの腫瘍標的細胞と、所与のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率で混合する。次いで、反応物を、５％ＣＯ2インキュベーターにおいて、３７℃で、一定期間（例えば、３〜１０日間）インキュベートする。次いで、例えば、サイトカイン生産アッセイ、または、Ｔ細胞増殖アッセイを使用して、Ｔ細胞機能を評価する。反応上清からサイトカイン生産（例えば、ＩＬ−２、及び／または、ＩＦＮ−ガンマ）を測定する。増殖実験のために、共培養物を回収してから、抗ＣＤ３抗体、及び、生死細胞染料で染色する。フローサイトメトリーを使用して、生ＣＤ３陽性細胞の個数を、Ｔ細胞増殖の指標として評価する。
【０２４７】
ＣＡＲポリペプチドに加えて、クレブス回路調節ポリペプチドも発現するＴ細胞は、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、例えば、サイトカインの生産性が大きく、または、増殖性に優れるなど、高度のＴ細胞機能を示すものと考えられる。この高度の機能は、数多くの（例えば、多数の、または、パーセンテージが大きい）免疫抑制細胞の存在下で達成し得る。
【０２４８】
実施例１０：ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ発現構築物を使用するマウス腫瘍モデルでのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、Ｔ細胞機能に及ぼす影響
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）を、同じＴ細胞において、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号１０４）と共発現させた。ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ発現構築物をコードするガンマレトロウイルスを生成し、そして、初代ヒトＴ細胞を感染させるために使用して、その細胞表面にＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔを発現する細胞を生成した。また、Ｔ細胞に、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てられた、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲポリペプチドと、ＧＯＴ２をコードするウイルスで形質導入をした。
【０２４９】
ＣＡＲで形質導入したＴ細胞を、マウス腫瘍モデルにおいて、抗腫瘍活性について評価した。これらの実験のために、肝細胞癌腫瘍細胞株、ＪＨＨ７を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtmWj1／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種した。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用した治療を、腫瘍体積が、約５０ｍｍ3に達したときに開始した（接種の８日後）。マウスを、腫瘍体積に基づいて、それぞれ５匹のマウスの治療群に無作為に分け、そして、接種の８日後と１５日後に、５×１０6個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞で治療した。総Ｔ細胞用量は、各構築物のＣＡＲ形質導入効率に基づいて変えた。
【０２５０】
実験期間中、腫瘍体積と体重を、週に２〜３回測定した。ＧＯＴ２を共発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＧＰＣ３  ＣＡＲ構築物だけを発現するＴ細胞と比較して、抗腫瘍効果が大きいことが実証された（図４）。これらの実験は、ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、肝細胞癌のマウス異種移植モデルでのＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果にプラスの影響を及ぼすことを実証した。
【０２５１】
ＣＡＲで形質導入したＴ細胞を、マウス腫瘍モデルにおいて、抗腫瘍活性について評価した。これらの実験のために、肝細胞癌腫瘍細胞株、Ｈｅｐ３Ｂを、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtmWj1／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種した。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用した治療を、腫瘍体積が、約１００ｍｍ3に達したときに開始した（接種の８日後）。マウスを、腫瘍体積に基づいて、それぞれ５匹のマウスの治療群に無作為に分け、そして、接種して２０日後と２７日後に、１×１０6個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞で治療した。総Ｔ細胞用量は、各構築物のＣＡＲ形質導入効率に基づいて変えた。
【０２５２】
実験期間中、腫瘍体積と体重を、週に２〜３回測定した。ＧＯＴ２を共発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＧＰＣ３  ＣＡＲ構築物だけを発現するＴ細胞と比較して、抗腫瘍効果が大きいことが実証された（図６）。これらの実験は、ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、肝細胞癌のマウス異種移植モデルでのＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果にプラスの影響を及ぼすことを実証した。
【０２５３】
ＣＡＲで形質導入したＴ細胞を、マウス腫瘍モデルにおいて、抗腫瘍活性について評価した。これらの実験のために、小細胞肺癌腫瘍細胞株、ＮＣＩ−Ｈ４４６を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtmWj1／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種した。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用した治療を、腫瘍体積が、約１００ｍｍ3に達したときに開始した（接種の１８日後）。マウスを、腫瘍体積に基づいて、それぞれ５匹のマウスの治療群に無作為に分け、そして、接種して１８日後と２５日後に、５×１０6個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞で治療した。総Ｔ細胞用量は、各構築物のＣＡＲ形質導入効率に基づいて変えた。
【０２５４】
実験期間中、腫瘍体積と体重を、週に２〜３回測定した。ＧＯＴ２を共発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＧＰＣ３  ＣＡＲ構築物だけを発現するＴ細胞と比較して、抗腫瘍効果が大きいことが実証された（図５）。これらの実験は、ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、小細胞肺癌のマウス異種移植モデルでのＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果にプラスの影響を及ぼすことを実証した。
【０２５５】
実施例１１：ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ発現構築物を使用するマウス腫瘍モデルでのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、Ｔ細胞増殖に及ぼす影響
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）を、同じＴ細胞において、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号１０４）と共発現させた。ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ発現構築物をコードするガンマレトロウイルスを生成し、そして、初代ヒトＴ細胞を感染させるために使用して、その細胞表面にＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔを発現する細胞を生成した。また、Ｔ細胞に、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てられた抗ＧＰＣ３  ＣＡＲポリペプチドと、ＧＯＴ２をコードするウイルスで形質導入をした。
【０２５６】
ＣＡＲで形質導入したＴ細胞を、増殖について、そして、マウス腫瘍モデルで評価した。これらの実験のために、肝細胞癌腫瘍細胞株、Ｈｅｐ３Ｂを、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtmWj1／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種した。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用した治療を、腫瘍体積が、約１００ｍｍ3に達したときに開始した（接種の２０日後）。マウスを、腫瘍体積に基づいて、それぞれ５匹のマウスの治療群に無作為に分け、そして、接種して２０日後と２７日後に、１×１０6個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞で治療した。総Ｔ細胞用量は、各構築物のＣＡＲ形質導入効率に基づいて変えた。
【０２５７】
末梢血を採取し、そして、抗ＣＤ３、及び、抗ＣＡＲ抗体で染色した。ＣＤ３陽性細胞と、ＣＡＲ陽性細胞の個数を、Ｔ細胞の増殖と、ＣＡＲ活性の尺度として、フローサイトメトリーで評価した。ＧＯＴ２を共発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＧＰＣ３  ＣＡＲ構築物だけを発現するＴ細胞と比較して、Ｔ細胞の増殖が旺盛になっていた（図７）。これらの実験は、ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、肝細胞癌のマウス異種移植モデルでのＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖にプラスの影響を及ぼすことを実証した。
【０２５８】
実施例１２：Ｔ細胞でのクレブス回路調節遺伝子（ＧＯＴ２）と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲの共発現は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性を高める
例示的なＧＰＣ３を標的とするＣＡＲポリペプチド発現構築物（配列番号１０４）をコードするガンマレトロウイルスを、組換え技術を介して生成し、そして、初代ヒトＴ細胞を感染させるために使用して、その細胞表面にＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔを発現する細胞を生成した。加えて、例示的なＧＰＣ３を標的とするＣＡＲポリペプチドと、クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）をコードするガンマレトロウイルスを、組換え技術を介して生成し、そして、初代ヒトＴ細胞を感染させるために使用して、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てられた２つのポリペプチドであるＧＰＣ３標的化ポリペプチドと、ＧＯＴ２を発現する細胞を生成した。ＧＯＴ２の発現は、ウエスタンブロットを使用して確認した。ＣＡＲを形質導入したＴ細胞を、エフェクターと標的との比率を４：１として、ＧＰＣ３＋肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍細胞と混合し、３７℃、５％ＣＯ2で、４日間インキュベートした。インキュベーションした後に、細胞溶解物を、１×１０6個の細胞から調製し、細胞溶解物を、Ｂｏｌｔ  ＬＤＳ試料緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、それに、１００ｎＭ  ＤＴＴと組み合わせ、そして、２つの別々のゲルに泳動させた。次いで、ゲルから得たタンパク質を、ニトロセルロースメンブレンに転写した（ＢｉｏＲａｄのＴｒａｎｓｂｌｏｔ  ｔｕｒｂｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐａｃｋ）。ブロットを、ウサギ抗ヒトＧＯＴ２抗体（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用して、ＧＯＴ２発現を一晩プローブし、次いで、ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体を使用してプローブする、または、マウス抗ヒトＧＡＰＤＨ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してＧＡＰＤＨ発現のプローブを行い、そして、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ二次抗体でプローブした。ＧＯＴ２発現は、親のＣＡＲと比較して、ＣＡＲ＋ＧＯＴ２構築物で形質導入したＴ細胞での発現が強かった（図８Ａ）
【０２５９】
形質導入したＴ細胞を、４：１のエフェクターと標的との比率で、ＧＰＣ３＋肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍細胞と混合し、３７℃、５％ＣＯ2で、８日間インキュベートした。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）酵素活性を、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性アッセイキット（Ａｂｃａｍ）を、製造業者のプロトコルに従って使用して測定をした。３７℃で、１分あたりに生成するグルタミン酸塩の量を測定して、ＡＳＴ活性を計算した。この例では、ＡＳＴ活性は、基質を添加して５０分後に計算した。ＣＡＲポリペプチドに加えて、クレブス回路調節ポリペプチドＧＯＴ２を発現するＴ細胞は、腫瘍細胞による活性化を受けた後に、ＡＳＴ活性が高まることを実証した。（図８Ｂ）。これらの実験は、Ｔ細胞でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、Ｔ細胞機能にプラスの影響を及ぼすことを実証した。
【０２６０】
実施例１３：Ｔ細胞でのクレブス回路調節遺伝子（ＧＯＴ２）と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ、または、ＡＣＴＲのいずれかとの共発現は、増殖を促す
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号１０）を、同じＴ細胞において、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号１）と共発現させた。Ｔ細胞を、ＣＡＲポリペプチドだけをコードするウイルス、または、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てられたＣＡＲとＧＯＴ２で形質導入した。ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、ＧＰＣ３−ＣＡＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞を、セルトレースバイオレットで標識し、細胞タンパク質を蛍光標識し、そして、２：１のエフェクターと標的との比率で、ＧＰＣ３＋肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍細胞と混合した。活性化して６日後に、細胞を抗ＣＤ３で染色し、そして、活性化して６日後に、フローサイトメトリーでセルトレースバイオレット希釈を測定して、増殖を測定した。ＣＡＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞のＣＤ３＋細胞のセルトレースバイオレット平均蛍光強度の逆数を、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞の平均逆蛍光強度と比較して表した。ＣＡＲポリペプチドと組み合わせてＧＯＴ２を発現するＴ細胞は、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、細胞分裂の増加を示した。図９Ａ
【０２６１】
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号１０）を、同じＴ細胞において、ＡＣＴＲポリペプチド（配列番号１）と共発現させた。Ｔ細胞を、ＡＣＴＲポリペプチドだけをコードするウイルス、または、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てられたＡＣＴＲ及びＧＯＴ２で形質導入した。ＡＣＴＲを発現し、かつ、ＡＣＴＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞を、２：１のエフェクターと標的との比率で、ＧＰＣ３＋肝細胞癌ＨｅｐＧ２腫瘍細胞、及び、１μｇ／ｍＬの抗ＧＰＣ３抗体ＧＣ３３と混合した（Ｎａｋａｎｏ、Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ．２０１０  Ｎｏｖ；２１（１０）：９０７−１６を参照されたい）。活性化して３日後に、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３で染色してから、フローサイトメトリーで計数をした。ＡＣＴＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞のＣＤ３＋細胞の総数を、ＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞のＣＤ３＋Ｔ細胞の総数と比較して表した。ＡＣＴＲポリペプチドに加えて、ＧＯＴ２を発現するＴ細胞は、Ｔ細胞の個数を増やすことを実証した。図９Ｂ
【０２６２】
これらの実験は、Ｔ細胞でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、Ｔ細胞増殖にプラスの影響を及ぼすことを実証した。
【０２６３】
実施例１４：Ｔ細胞でのクレブス回路調節遺伝子（ＧＯＴ２）と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ、または、ＡＣＴＲのいずれかとの共発現は、ＩＬ−１７Ａサイトカイン生産を促す
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）を、同じＴ細胞において、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号１０４）と共発現させた、または、Ｔ細胞において、ＡＣＴＲ−４−１ＢＢポリペプチド（配列番号１）、または、ＡＣＴＲ−ＣＤ２８ポリペプチド（配列番号５７）と共発現させた。これらのＴ細胞を、ＣＡＲまたはＡＣＴＲポリペプチドだけをコードするウイルス、または、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＣＡＲまたはＡＣＴＲと、ＧＯＴ２で形質導入した。形質導入したＴ細胞を、２：１のエフェクターと標的との比率で、ＧＰＣ３＋肝細胞癌ＨｅｐＧ２腫瘍細胞と混合した；ＡＣＴＲ  Ｔ細胞を用いた実験では、抗ＧＰＣ３抗体ＧＣ３３（１μｇ／ｍＬ）を加えた。これらの細胞を、５％ＣＯ2インキュベーターにて、３７℃で、２４時間インキュベートした。インキュベーションした後に、１００μＬの細胞培養上清を回収し、そして、ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、製造業者の指示に従って使用してＩＬ−１７Ａを測定した。ＩＬ−１７Ａ生産を、発現構築物の関数としてプロットしている（図１０Ａ〜１０Ｃ）。ＧＯＴ２と、ＣＡＲ（図１０Ａ）またはＡＣＴＲポリペプチド（図１０Ｂ〜１０Ｃ）を共発現するＴ細胞は、ＣＡＲまたはＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、ＩＬ−１７Ａを生産する能力の改善を示した。これらの実験は、Ｔ細胞でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、ＩＬ−１７Ａサイトカイン生産にプラスの影響を及ぼすことを実証した。
【０２６４】
実施例１５：クレブス回路調節遺伝子（ＧＯＴ２）と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ、または、ＡＣＴＲのいずれかとの共発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の多機能性を促す
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）を、同じＴ細胞において、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号１０４）と共発現させた、または、同じＴ細胞において、４−１ＢＢ（配列番号１）、または、ＣＤ２８（配列番号５７）一次共刺激ドメインのいずれかを含有するＡＣＴＲポリペプチドと共発現させた。これらのＴ細胞を、ＣＡＲまたはＡＣＴＲポリペプチドだけをコードするウイルス、または、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＣＡＲまたはＡＣＴＲと、ＧＯＴ２で形質導入した。形質導入したＴ細胞を、１：１のエフェクターと標的との比率で、ＧＰＣ３＋肝細胞癌ＨｅｐＧ２腫瘍細胞と混合した；ＡＣＴＲ  Ｔ細胞を用いた実験では、抗ＧＰＣ３抗体ＧＣ３３（１μｇ／ｍＬ）を加えた。これらの細胞を、タンパク質輸送阻害剤であるブレフェルディンＡ（５μｇ／ｍＬ）とモネンシン（２μＭ）の存在下で、５％ＣＯ2インキュベーターにて、３７℃で、６時間インキュベートした。インキュベートした後に、共培養物を、ＣＡＲ及びＡＣＴＲ  Ｔ細胞の両方を、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体で染色した；ＡＣＴＲ  Ｔ細胞も、抗ＣＤ１６抗体で染色した。続いて、これらの細胞を固定し、透過処理し、そして、抗ＩＦＮγ、抗ＩＬ−２、抗ＴＮＦα、及び、抗ＩＬ−１７Ａ抗体で染色して、細胞内サイトカイン生産を定量した。
【０２６５】
複数のサイトカインを生産するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を、フローサイトメトリーで定量した。ＣＡＲまたはＡＣＴＲポリペプチドに加えて、ＧＯＴ２を発現するＴ細胞は、ＣＡＲまたはＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、１つ、２つ、または、３つ超のサイトカインを同時に生産するＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度が高く、ＧＯＴ２発現細胞での高度の多機能性を実証している（図１１Ａ〜１１Ｃ）。これらの実験は、Ｔ細胞でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、ＣＤ４  Ｔ細胞の多機能性にプラスの影響を及ぼすことを実証した。
【０２６６】
実施例１６：クレブス回路調節遺伝子（ＧＯＴ２）と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ、または、ＡＣＴＲのいずれかとの共発現は、低分化、ナイーブ様表現型のＣＤ８＋細胞の頻度を高める
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）を、同じＴ細胞において、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号１０４）と共発現させた、または、同じＴ細胞において、４−１ＢＢ（配列番号１）、または、ＣＤ２８（配列番号５７）一次共刺激ドメインのいずれかを含有するＡＣＴＲポリペプチドと共発現させた。これらのＴ細胞を、ＣＡＲまたはＡＣＴＲポリペプチドだけをコードするウイルス、または、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＣＡＲまたはＡＣＴＲと、ＧＯＴ２で形質導入した。１１名の健康なドナー由来のＣＡＲ構築物、及び、２名の健康なドナーに関するＡＣＴＲ構築物のＴ細胞表現型を、フローサイトメトリーで評価した。これらの実験にあっては、細胞を解凍し、そして、ＣＡＲ及びＡＣＴＲを発現するＴ細胞の両方を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４５ＲＡ、抗ＣＤ４５ＲＯ、抗ＣＤ２７、及び、抗ＣＤ６２Ｌ抗体で染色した。ＣＡＲ  Ｔ細胞も、ＣＡＲポリペプチドを検出するための組換えＧＰＣ３タンパク質で染色し、そして、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞も、ＡＣＴＲポリペプチドを検出するために抗ＣＤ１６抗体で染色した。ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌに対して陽性に染色し、かつ、ＣＤ４５ＲＯに対して陰性に染色したＣＤ８＋  ＣＡＲ＋、または、ＡＣＴＲ＋  Ｔ細胞の頻度は、同族の親と比較して、ＧＯＴ２も共発現したＴ細胞において高くなっており、このことは、ＧＯＴ２発現細胞が、ナイーブさの濃いＣＤ８＋集団を有することを実証している（図１２Ａ〜１２Ｃ）。全体として、ＧＯＴ２を共発現するＣＤ８＋  ＣＡＲ、または、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞の表現型は、親のＣＡＲと比較して、分化の進んでいない（幼い）表現型（ＣＤ２７＋／ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ２７＋／ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ２７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ２７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）の表現型マーカーを有する細胞の割合が高いことを示している。（図１３）。これらの実験は、Ｔ細胞でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、ＣＤ８表現型にプラスの影響を及ぼすことを実証した。
【０２６７】
実施例１７：Ｔ細胞でのクレブス回路調節遺伝子（ＧＯＴ２）と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲの共発現は、長時間の抗原刺激、及び、低酸素下での増殖を促す
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）を、同じＴ細胞において、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号１０４）と共発現させた。これらのＴ細胞を、ＣＡＲポリペプチドだけをコードするウイルス、または、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＣＡＲと、ＧＯＴ２で形質導入した。ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞と、ＧＰＣ３−ＣＡＲとＧＯＴ２細胞を共発現するＴ細胞を、セルトレースバイオレットで標識し、細胞タンパク質を蛍光標識し、そして、２：１のエフェクターと標的との比率で、ＧＰＣ３＋肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍細胞と混合した。活性化して３日後に、細胞を洗浄し、そして、２：１のエフェクターと標的の比率で、第２の抗原刺激としての新鮮なＧＰＣ３＋肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍細胞と混合した。細胞を、正常酸素（２０％酸素）、または、低酸素（１．５％酸素）条件下で、さらに３日間インキュベートした後に、抗ＣＤ３で染色し、フローサイトメトリーで、セルトレースバイオレットの希釈度を測定して増殖を測定して、セルトレースバイオレット平均蛍光強度の逆数（ＭＦＩ-1）として表した。ＣＡＲポリペプチドに加えて、ＧＯＴ２を発現するＴ細胞は、正常酸素状態と低酸素状態の両方で、長時間の抗原刺激下で増殖の増大を招いており（図１４）、腫瘍内微小環境の複数のストレスを模倣した。これらの実験は、Ｔ細胞でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、固形腫瘍内微小環境に存在する好ましくない条件下で増殖させる上で有利であることを実証している。
【０２６８】
実施例１８：Ｔ細胞でのクレブス回路調節遺伝子（ＧＯＴ２）と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲの共発現は、制限グルコース条件での増殖を促す
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）を、同じＴ細胞において、４−１ＢＢ（配列番号１０４）、または、ＣＤ２８（配列番号１０５）共刺激ドメインを含有するＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチドと共発現させた。これらのＴ細胞を、ＣＡＲポリペプチドだけをコードするウイルス、または、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＣＡＲとＧＯＴ２で形質導入した。ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチドで形質導入したＴ細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７結合ＧＰＣ３組換えタンパク質、及び、抗ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で単離し、そして、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで一晩静置した。次に、形質導入したＴ細胞を、セルトレースバイオレットで標識し、そして、２：１のエフェクターと標的との比率で、ＧＰＣ３＋肝細胞癌ＨｅｐＧ２腫瘍細胞と混合した。共培養物を、腫瘍内微小環境での限られた栄養素の利用可能性を模倣するために、高濃度（１０ｍＭ）または低濃度（１．２５ｍＭ）グルコースの存在下でインキュベートした。５％ＣＯ2インキュベーターにて、３７℃で、７日経過した後に、これらの細胞を、抗ＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメトリーで、セルトレースバイオレットの希釈度を測定して細胞分裂を評価した。
【０２６９】
ＧＯＴ２とＣＡＲポリペプチドを共発現するＴ細胞は、セルトレースバイオレット蛍光強度の低下が示す通り、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、１０ｍＭと１．２５ｍＭの両方のグルコースで、旺盛な増殖を示した。セルトレースバイオレット蛍光強度の逆数を、グルコース条件とＴ細胞タイプの関数としてプロットした（図１５）。これらの実験は、Ｔ細胞でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、４−１ＢＢまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞、及び、高濃度グルコース及び低濃度グルコース条件でのＴ細胞増殖にプラスの影響を及ぼすことを実証した。
【０２７０】
実施例１９：Ｔ細胞でのクレブス回路調節遺伝子（ＧＯＴ２）と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲの共発現は、Ｔ細胞阻害剤キヌレニンの存在下での増殖を促す
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）を、同じＴ細胞において、ＣＤ２８一次共刺激ドメインを含有するＡＣＴＲポリペプチド（配列番号５７）と共発現させ、そして、機能アッセイにて、ＡＣＴＲポリペプチドだけを発現するＴ細胞と比較した。これらのＴ細胞を、ＡＣＴＲポリペプチドだけをコードするウイルス、または、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＡＣＴＲとＧＯＴ２で形質導入した。これらのＴ細胞を、２：１のエフェクターと標的との比率で、（ＦＯＬＲ＋）卵巣癌ＩＧＲＯＶ−１腫瘍細胞（パラホルムアルデヒドで固定したもの）を発現する葉酸受容体アルファと混合し、抗ＦＯＬＲ抗体（５μｇ／ｍＬ）を加えた。共培養物を、５％ＣＯ2インキュベーターにて、３７℃で、６日間培養した。インキュベートした後に、細胞の半分を、新しいプレートに移し、ＢｒｄＵ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ）でパルスし、５％ＣＯ2インキュベーターにて、３７℃で、約１６時間インキュベートを行い、そして、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、製造業者の指示に従って、ＢｒｄＵの取り込みを分析して、化学発光を検出した。ＧＯＴ２とＡＣＴＲを共発現するＴ細胞は、ＡＣＴＲだけを発現するＴ細胞と比較して、キヌレニンの非存在下と存在下の両方で、ＢｒｄＵ取り込みを増やしており、増殖の改善を示した。これらの実験は、Ｔ細胞でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、固形腫瘍内微小環境に認められる抑制性分子の存在下での増殖に利点をもたらすことを実証している。図１６。
【０２７１】
実施例２０：Ｔ細胞でのクレブス回路調節遺伝子（ＧＯＴ２）と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲの共発現は、ＧＰＣ３＋固形腫瘍異種移植片から単離したＴ細胞に関する持続的抑制性受容体発現の抑制を招く
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）を、同じＴ細胞において、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号１０４）と共発現させた。これらのＴ細胞を、ＣＡＲポリペプチドだけをコードするウイルス、または、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＣＡＲとＧＯＴ２で形質導入した。
【０２７２】
ＣＡＲ  Ｔ細胞のエクスビボ表現型を、マウス腫瘍モデルに注射をした後に評価した。これらの実験のために、ＧＰＣ３＋肝細胞癌腫瘍細胞株、ＪＨＨ７を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtmWj1／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種した。Ｔ細胞を使用する治療を、腫瘍体積が、約１００ｍｍ3に達したときに開始した（接種の１１日後）。マウスを、腫瘍体積に基づいて、それぞれ５匹のマウスの治療群に無作為に分け、そして、接種して１１日後に、１×１０6個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞、または、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞で治療した。
【０２７３】
Ｔ細胞を投与して２、７、及び、１４日後に、ＪＨＨ７腫瘍を有するマウスから皮下腫瘍を採取した。腫瘍を、カミソリの刃で細かく切り刻み、そして、ヒト腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、３７℃で、１時間、酵素消化した。細胞染色のために９６ウェルプレートに播種する前に、消化した腫瘍を、７０μｍのセルストレーナーに通した。
【０２７４】
皮下腫瘍を発現する確立したＪＨＨ７ＧＰＣ３を担持する免疫不全マウスを、ＣＡＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞、または、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞の５×１０6個を単回静脈内注射して治療した。動物のコホートを、２、７、及び、１４日目に安楽死させ、そして、Ｔ細胞を、手作業、及び、酵素消化で腫瘍から単離した。フローサイトメトリーを行い、そして、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及び、ＩＣＯＳ活性化分子の平均蛍光強度を、ＣＤ４＋、及び、ＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットで定量した。Ｔ細胞の表現型を、赤血球溶解、及び、細胞染色した後のフローサイトメトリーで評価した。これらの実験に関して、腫瘍から単離した細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＰＤ−１、抗ＴＩＭ−３、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ２５、及び、抗ＩＣＯＳ抗体で染色した。ＣＤ６９、ＣＤ２５、及び、ＩＣＯＳ活性化分子の平均蛍光強度は、２日目（ＣＤ６９）、または、７日目（ＣＤ２５、ＩＣＯＳ）に、腫瘍から単離したＣＤ４＋、及び、ＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットで定量を行い、それぞれのＴ細胞タイプについてプロットした。図１７Ａ〜１７Ｃに示すように、ＧＯＴ２と、ＣＡＲポリペプチドを共発現するＴ細胞は、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及び、ＩＣＯＳ活性化マーカーの発現を高めたことを実証した。
【０２７５】
皮下腫瘍を発現する確立したＪＨＨ７ＧＰＣ３を担持する免疫不全マウスを、ＣＡＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞、または、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞の５×１０6個を単回静脈内注射して治療した。動物のコホートを、２、７、及び、１４日目に安楽死させ、そして、Ｔ細胞を、手作業、及び、酵素消化によって、腫瘍及び脾臓から単離した。フローサイトメトリーを行い、そして、ＰＤ−１と、ＴＩＭ−３抑制分子を共発現するＴ細胞の頻度を、ＣＤ４＋、及び、ＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットで定量した。ＰＤ−１と、ＴＩＭ−３抑制分子を共発現するＴ細胞の頻度を、腫瘍から単離したＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットで定量し、そして、それぞれのＴ細胞タイプに関する時点の関数としてプロットした。ＣＡＲと、ＧＯＴ２を共発現するＴ細胞は、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、７日目に同等以上の頻度のＰＤ−１＋ＴＩＭ−３＋  Ｔ細胞を示したが、１４日目には、ＰＤ−１＋ＴＩＭ−３＋  Ｔ細胞の頻度は低くかった。図１８Ａ〜１８Ｂ。これらの結果は、ＣＡＲと、ＧＯＴ２を共発現するＴ細胞が、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、抑制性受容体の持続的な発現に対して耐性が大きいことを示している。これらの実験は、Ｔ細胞でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、活性化を促し、そして、固形腫瘍内微小環境でのＴ細胞の持続的な抑制性受容体の発現を制限することを実証している。
【０２７６】
実施例２１：Ｔ細胞でのクレブス回路調節遺伝子（ＧＯＴ２）と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲの共発現は、ＧＰＣ３＋固形腫瘍異種移植片から単離したＴ細胞に関する持続的抑制性受容体の発現に対する耐性を招く
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）を、同じＴ細胞において、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号１０４）と共発現させた。これらのＴ細胞を、ＣＡＲポリペプチドだけをコードするウイルス、または、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＣＡＲとＧＯＴ２で形質導入した。
【０２７７】
ＣＡＲ  Ｔ細胞のエクスビボ表現型を、マウス腫瘍モデルに注射をした後に評価した。これらの実験のために、ＧＰＣ３＋肝細胞癌腫瘍細胞株、ＪＨＨ７を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtmWj1／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種した。Ｔ細胞を使用する治療を、腫瘍体積が、約８０ｍｍ3に達したときに開始した（接種の１０日後）。マウスを、腫瘍体積に基づいて、それぞれ３匹のマウスの治療群に無作為に分け、そして、接種して１１日後に、５×１０6個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞、または、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞で治療した。
【０２７８】
Ｔ細胞を投与して１、６、及び、１３日後に、ＪＨＨ７腫瘍を有するマウスから皮下腫瘍及び脾臓組織を採取した。腫瘍を、カミソリの刃で細かく切り刻み、そして、ヒト腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、３７℃で、１時間、酵素消化した。脾臓は、注射器プランジャーの端部を使用して、機械的に分離した。細胞染色のために９６ウェルプレートに播種する前に、消化した腫瘍と脾臓を、７０μｍのセルストレーナーに通した。
【０２７９】
皮下腫瘍を発現する確立したＪＨＨ７ＧＰＣ３を担持する免疫不全マウスを、ＣＡＲとＧＯＴ２を共発現するＴ細胞、または、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞の５×１０6個を単回静脈内注射して治療した。動物のコホートを、６、及び、１３日目に安楽死させ、そして、Ｔ細胞を、手作業、及び、酵素消化で、腫瘍と脾臓から単離した。フローサイトメトリーを行い、そして、ＰＤ−１と、ＴＩＭ−３抑制分子を共発現するＴ細胞の頻度を、ＣＤ４＋、及び、ＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットで定量した。
【０２８０】
Ｔ細胞の表現型を、赤血球溶解、及び、細胞染色した後のフローサイトメトリーで評価した。これらの実験では、細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＰＤ−１、及び、抗ＴＩＭ−３抗体で染色した。ＰＤ−１と、ＴＩＭ−３を共発現するＴ細胞の頻度を、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットで定量した。ＣＡＲと、ＧＯＴ２を共発現する、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットでのＴ細胞は、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、６日目に、同等以上の頻度のＰＤ−１＋ＴＩＭ−３＋  Ｔ細胞を示しており、このことは、活性化を示すものであるが、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、腫瘍内微小環境に長時間曝露（１３日目）した後の発現の頻度は小さくなっており、持続的な抑制性受容体の発現に対する耐性を実証した。脾臓から単離したＴ細胞は、６日目または１３日目のいずれでも、ＰＤ−１＋ＴＩＭ−３＋の発現を示しておらず、ＧＰＣ３を発現する腫瘍だけに対する特異的な活性化を実証した。図１９Ａ〜１９Ｄ。ＣＡＲと、ＧＯＴ２を共発現するＴ細胞は、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、６日目に、ＰＤ−１＋ＴＩＭ−３＋  Ｔ細胞の頻度が高いことを示した。図１９Ａ及び１８Ｂ。一方で、ＣＡＲと、ＧＯＴ２を共発現するＴ細胞は、腫瘍内微小環境に長時間曝露した後に、１３日目では、ＰＤ−１＋ＴＩＭ−３＋  Ｔ細胞の頻度が低く、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、持続的な抑制性受容体の発現に対する耐性を示している。図１９Ｃ及び１９Ｄ。脾臓から単離したＴ細胞は、６日目または１３日目のいずれかに、ＰＤ−１＋ＴＩＭ−３＋の発現を示していらず、このことは、ＧＰＣ３発現腫瘍だけの事例でのＴ細胞活性化の特異性を実証している。図１９Ａ〜１９Ｄ。
【０２８１】
これらの実験は、Ｔ細胞でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、固形腫瘍内微小環境で耐性持続的抑制性受容体の発現を招くことを実証している。
【０２８２】
実施例２２：Ｔ細胞でのクレブス回路調節遺伝子（ＧＯＴ２）と、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲの共発現は、インビボで腫瘍内微小環境に曝露した後に持続的なＴ細胞機能をもたらす
クレブス回路調節ポリペプチド（ＧＯＴ２）（配列番号８８）を、同じＴ細胞において、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ−Ｔポリペプチド（配列番号１０４）と共発現させた。これらのＴ細胞を、ＣＡＲポリペプチドだけをコードするウイルス、または、Ｐ２Ａリボソームスキップ配列で隔てたＣＡＲとＧＯＴ２で形質導入した。
【０２８３】
ＣＡＲ形質導入細胞の機能を、マウス腫瘍モデルで評価した。これらの実験のために、ＧＰＣ３＋肝細胞癌腫瘍細胞株、ＪＨＨ７を、ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtmWj1／ＳｚＪ、系統００５５５７）マウスに接種した。Ｔ細胞を使用する治療を、腫瘍体積が、約８０ｍｍ3に達したときに開始した（接種の１０日後）。マウスを、腫瘍体積に基づいて、それぞれ３匹のマウスの治療群に無作為に分け、そして、接種して１１日後に、５×１０6個のＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞で治療した。
【０２８４】
ＣＡＲを投与して３日後に、ＪＨＨ７腫瘍を有するマウスから皮下腫瘍を採取した。腫瘍を、カミソリの刃で細かく切り刻み、そして、ヒト腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、３７℃で、１時間、酵素消化した。２４ウェルプレート（１×１０6個の細胞／１ｍＬ体積）に播種する前に、消化した腫瘍を、７０μｍのセルストレーナーに通した。５％ＣＯ２インキュベーターにて、３７℃で、１８時間インキュベートした後に、サイトカイン分析のために細胞上清を回収した。細胞上清でのＩＦＮγ及びＩＬ−１７Ａの濃度を、それぞれ、均一系時間分解螢光アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖ−Ｐｌｅｘアッセイ技術を使用して決定した。両方のアッセイは、製造業者のプロトコルに従って実行した。
【０２８５】
ＧＯＴ２とＣＡＲを共発現するＴ細胞を投与したマウスの腫瘍でのＴ細胞は、ＣＡＲだけを発現するＴ細胞を投与したマウスの腫瘍でのＴ細胞と比較して、ＩＦＮγとＩＬ−１７Ａの生産を高めていた。図２０Ａ〜２０Ｂ。これらの実験は、Ｔ細胞でのクレブス回路調節ポリペプチドの発現が、腫瘍内微小環境でのＴ細胞機能にプラスの影響を及ぼすことを実証している。
【０２８６】
その他の実施形態
本明細書において開示する全ての特徴は、あらゆる組み合わせで、組み合わせ得る。本明細書において開示するそれぞれの特徴は、同一、同等、または、類似の目的を満足する代替の特徴で置き換え得る。それ故に、特に断りの無い限り、開示したそれぞれの特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の例に過ぎない。
【０２８７】
上記した記載内容から、当業者であれば、本開示の本質的な特徴を容易に見極めることができ、また、本開示の趣旨及び範囲を逸脱せずとも、本開示の様々な変更及び修正を行い、様々な用法及び条件に適合させることができる。それ故に、その他の実施形態もまた、特許請求の範囲内である。
【０２８８】
等価物
幾つかの発明の実施形態について、本明細書で記載及び説明してきたが、当業者であれば、本明細書に記載した機能を実施するための、及び／または、本明細書に記載した結果及び／または本明細書に記載した利点の１つ以上を得るための、様々なその他の方法及び／または構成を容易に想到するものであり、このような変更形態及び／または修正のそれぞれは、本明細書に記載した本発明の実施形態の範囲内に属するものとみなす。より一般的に言えば、本明細書に記載した全てのパラメーター、寸法、物質、及び、構成が例示的であることを意味しており、実際のパラメーター、寸法、物質、及び／または、構成が、本発明の教示を利用する１つ以上の特定の用途に依存する、ということを当業者であれば容易に理解するであろう。本明細書に記載した特定の発明の実施形態に対する数多くの等価物を当業者は理解しており、または、通常の実験を行うだけで確認することができる。それ故に、上記した実施形態を単なる例示として提供しており、添付した特許請求の範囲及びその等価の範囲内において、具体的に記載したもの、及び、特許請求したもの以外の発明の実施形態を別様に実施することができる、と理解すべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載した、それぞれ個々の特徴、システム、物品、物質、キット、及び／または、方法に関する。加えて、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、物質、キット、及び／または、方法のあらゆる組み合わせは、このような特徴、システム、物品、物質、キット、及び／または、方法が互いに矛盾しない限りは、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【０２８９】
本明細書で定義及び使用した全ての定義は、辞書の定義、参照により援用する文献における定義、及び／または、定義する用語の通常の意味を超えて優先されるものと理解すべきである。
【０２９０】
本明細書で開示した全ての参照文献、特許、及び、特許出願は、それぞれが引用している要旨を、参照により、援用するものであって、一部の事例では、その文献の全内容を援用し得る。
【０２９１】
本明細書、及び、特許請求の範囲で使用する不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、特に断りが明示されていない限りは、「少なくとも１つ」を意味する、ものと理解すべきである。
【０２９２】
本明細書、及び、特許請求の範囲で使用する語句「及び／または」は、そのように繋いだ要素、すなわち、一部の事例では、接続的に示す要素、また、その他の事例では、選言的に示す要素の「一方、または、その両方」を意味する、と理解すべきである。同様に、「及び／または」と共に列挙される複数の要素は、すなわち、そのように繋いだ要素の内の「１つ以上」と解釈すべきである。具体的に示したそれら要素との関連の有無に関係なく、節「及び／または」が具体的に示す要素以外のその他の要素を任意に示し得る。それ故に、限定を意図しない例では、「Ａ、及び／または、Ｂ」とは、「含む」などのオープンエンド用語と共に使用する場合、ある実施形態では、Ａだけ（任意に、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂだけ（任意に、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、ＡとＢの両方（任意に、その他の要素を含む）など、を指す。
【０２９３】
本明細書、及び、特許請求の範囲で使用する「または」は、先に定義した「及び／または」と同一の意味を有するものと理解すべきである。例えば、列挙した要素を分ける場合、「または」または「及び／または」とは包括的であり、すなわち、要素の数、または、列挙した要素、及び、列挙していないさらなる任意の要素の内の少なくとも１つを含むが、それらの内の２つ以上もまた含むものと解釈すべきである。反対のことを明確に指し示す用語、例えば、「の内の１つだけ」もしくは「の内の厳密に１つ」など、または、特許請求の範囲で使用する「からなる」に限って、要素の数、または、列挙した要素の内の厳密に１つの要素を含む、ことを意味する。一般的に、本明細書で使用する用語「または」は、「いずれか」、「の内の１つ」、「の内の１つだけ」、または、「の内の厳密に１つ」などの排他的な用語が先行する場合、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）を指し示す、と専ら解釈すべきである。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用する場合、特許法の分野で使用されている、その通常の意味を与えるべきである。
【０２９４】
本明細書、及び、特許請求の範囲で使用する１つ以上の列挙した要素に関する語句「少なくとも１つ」とは、列挙した要素でのいずれか１つ以上から選択される、少なくとも１つの要素を意味するものと理解すべきであるが、列挙した要素の全ての要素の内の少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、列挙した要素の任意の組み合わせを除外するものでもない。また、この定義は、具体的に示したそれら要素との関連性の有無に関係なく、語句「少なくとも１つ」が指し示す列挙した要素として具体的に示した要素以外の要素を、任意に示し得ることを可能ならしめる。それ故に、限定を意図しない例では、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（すなわち、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、すなわち、「Ａ及び／またはＢの少なくとも１つ」）とは、ある実施形態では、Ｂが存在せず、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＡ（任意に、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ａが存在せず、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＢ（任意に、Ａ以外の要素を含む）；なおも別の実施形態では、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＡ、及び、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＢ（任意に、その他の要素を含む）など、を指す。
【０２９５】
特に明確な断りが無い限り、２つ以上の工程または行為を含む、本発明で特許請求するあらゆる方法では、本方法の工程または行為の順番は、列挙した本方法の工程または行為の順番に必ずしも限定されない、ことも理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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