(57)【要約】  クロトータンパク質レベルを監視するため、および特に室温で、または凍結せずに、哺乳動物血液試料中のクロトータンパク質をある期間にわたって安定化させるための製品および方法が開示される。クロトータンパク質レベル、具体的には内因性および／または外因性可溶性アルファクロトータンパク質レベルを検出および定量化する方法、クロトータンパク質欠損を診断する方法、ならびにクロトータンパク質レベルまたは産生を増加させる方法、具体的には哺乳動物対象における内因性および／または外因性可溶性アルファクロトータンパク質レベル（複数可）、発現、または産生、ならびにクロトータンパク質欠損を治療するための診断キットおよび組成物を含む、それらの実施に有用な製品が開示される。組成物は、天然の可溶性アルファクロトータンパク質産生を増大させ、クロトータンパク質の損傷もしくは分解を減弱し、かつ／またはクロトータンパク質レベルを外因性組換えタンパク質で補充するように構成または製剤化される。治療方法および使用には、ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象への組成物の投与が含まれる。
2021508037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の血液試料中のクロトータンパク質を安定化させる方法であって、
哺乳動物対象から毛細血管血を取得するステップであって、前記毛細血管血が、ある量の可溶性クロトータンパク質を含有する、取得するステップと、
室温で、または凍結せずに、前記毛細血管血を容器内で少なくとも２４時間保管するステップであって、前記容器が、その中に配置された保存剤または抗凝血剤を有し、前記保存剤または抗凝血剤が、前記容器内の前記毛細血管血と混合され、前記保存剤または抗凝血剤が、室温で、または凍結せずに、前記可溶性クロトータンパク質を少なくとも２４時間安定化させ、前記保存剤または抗凝血剤が、ヘパリン、リチウムヘパリン、ＥＤＴＡ、およびＫ２ＥＤＴＡの１つ以上を含む、保管するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
室温で、または凍結せずに、前記保存剤または抗凝血剤と混合された前記毛細血管血を少なくとも３日間保管するステップであって、前記保存剤または抗凝血剤が、室温で、または凍結せずに、前記可溶性クロトータンパク質を少なくとも３日間安定化させる、保管するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
室温で、または凍結せずに、前記保存剤または抗凝血剤と混合された前記毛細血管血を少なくとも７日間保管するステップであって、前記保存剤または抗凝血剤が、室温で、または凍結せずに、前記可溶性クロトータンパク質を少なくとも７日間安定化させる、保管するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記保管するステップの後に、前記可溶性クロトータンパク質の量を定量化するステップ、または前記可溶性クロトータンパク質の存在についてアッセイするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記可溶性クロトータンパク質の量を定量化するステップが、質量分析、多分析物プロファイリング（ｘＭＡＰ）、および／または前記可溶性クロトータンパク質の一部分に結合する第１の抗体を使用して、前記可溶性クロトータンパク質を検出することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記可溶性クロトータンパク質の量を定量化するステップが、前記第１の抗体の一部分に結合する検出抗体を使用して前記可溶性クロトータンパク質を検出すること、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施して、前記可溶性クロトータンパク質を検出および任意で定量化することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記毛細血管血を取得するステップが、前記哺乳動物の皮膚をランセットで切開すること、および前記毛細血管血を前記容器内に採取することのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記毛細血管血が、約１０〜１０００μｌ、好ましくは約５０〜２００μｌの前記毛細血管血であるか、または前記毛細血管血を取得するステップが、約１０〜１０００μｌ、好ましくは約５０〜２００μｌの前記毛細血管血を取得することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物対象におけるクロトー欠損を診断する方法であって、
流体試料混合物を取得するステップであって、前記流体試料混合物が、
ヘパリン、リチウムヘパリン、ＥＤＴＡ、およびＫ２ＥＤＴＡのうちの１つ以上を含む保存剤または抗凝血剤と混合された、任意で毛細血管血の形態の哺乳動物血清であって、ある量の可溶性クロトータンパク質を有する、哺乳動物血清、ならびに
任意で毛細血管血の形態の哺乳動物血清であって、ある量の可溶性クロトータンパク質を有し、前記方法が、前記哺乳動物血清を、ヘパリン、リチウムヘパリン、ＥＤＴＡ、およびＫ２ＥＤＴＡのうちの１つ以上を含む保存剤または抗凝血剤と混合して、前記混合物を形成することをさらに含む、哺乳動物血清、からなる群から選択される、取得するステップと、
室温で、または凍結せずに、前記混合物を少なくとも２４時間保管するステップであって、前記保存剤または抗凝血剤が、室温で、または凍結せずに、可溶性クロトータンパク質を少なくとも２４時間安定化させる、保管するステップと、
前記保管するステップの後に、前記混合物中の前記可溶性クロトータンパク質の前記量を定量化するステップと、
前記混合物中の前記可溶性クロトータンパク質の定量化された量が、所定の閾値量未満である場合に、前記哺乳動物対象をクロトー欠損と診断するステップと、を含む、方法。
【請求項１０】
前記流体試料混合物が、前記哺乳動物対象からの約１０〜１０００μｌ、好ましくは約５０〜２００μｌの毛細血管血を含むか、または前記流体試料混合物を取得する前記ステップが、前記哺乳動物対象から約１０〜１０００μｌ、好ましくは約５０〜２００μｌの毛細血管血を取得することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合物中の前記可溶性クロトータンパク質の量を定量化する前記ステップが、質量分析、多分析物プロファイリング（ｘＭＡＰ）、ならびに／もしくは前記可溶性クロトータンパク質の一部分に結合する第１の抗体および任意で前記第１の抗体の一部分に結合する検出抗体を使用して、前記可溶性クロトータンパク質を検出すること、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施して、前記可溶性クロトータンパク質を検出および任意で定量化することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物対象をクロトー欠損と診断するステップが、クロトー欠損の判定もしくは診断をコンピュータシステムのユーザインターフェース上に表示すること、および／または前記クロトー欠損の判定もしくは診断を表示する、物理的もしくは電子的形式のファイルもしくはレポートを生成することを含み、前記クロトー欠損の判定または診断が、前記可溶性クロトータンパク質の前記定量化された量および／または前記所定の閾値量を任意で含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物対象におけるクロトー欠損を治療する方法であって、
哺乳動物対象から血清または毛細血管血を取得するステップであって、前記血清または毛細血管血が、ある量の可溶性クロトータンパク質を有する、取得するステップと、
室温で、または凍結せずに、前記血清または毛細血管血を容器内で少なくとも２４時間保管するステップであって、前記容器が、その中に配置され、混合物を形成するように前記血清または毛細血管血と混合された保存剤または抗凝血剤を有し、前記保存剤または抗凝血剤が、室温で、または凍結せずに、前記可溶性クロトータンパク質を少なくとも２４時間安定化させ、前記保存剤または抗凝血剤が、ヘパリン、リチウムヘパリン、ＥＤＴＡ、およびＫ２ＥＤＴＡのうちの１つ以上を含む、保管するステップと、
前記保管するステップの後に、前記混合物中の前記可溶性クロトータンパク質の前記量を定量化するステップと、
前記混合物中の前記可溶性クロトータンパク質の定量化された量が、所定の閾値量未満である場合に、前記哺乳動物対象をクロトー欠損と診断するステップと、
前記哺乳動物対象をクロトー欠損と診断した後に、前記哺乳動物対象に組成物を投与するステップであって、前記組成物が、
薬学的に許容される担体または賦形剤と、前記担体または賦形剤中に配置された薬学的有効量の組換えクロトータンパク質、組換えクロトータンパク質断片、または組換えクロトー融合タンパク質と、を含む、１つ以上の薬学的組成物、
前記哺乳動物対象による可溶性クロトータンパク質の内因性産生を増加または増強させることによって血清可溶性クロトータンパク質レベルを上昇させるように適合された複数の構成成分を含む、１つ以上の栄養補助組成物、ならびに
血圧医薬品、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断剤（ＡＲＢ）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ロサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、ＡＴ１受容体拮抗剤または遮断剤、テストステロン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、セルモレリン、処方または処方用量ビタミンＤ、１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール、カルシトロール、パリカルシトロール、インドキシル硫酸結合剤、Ｋｒｅｍｅｚｉｎ、ＡＳＴ−１２０、スタチン、ＰＰＡＲアゴニスト、トログリタゾン、およびロシグリタゾンからなる群から任意で選択される、内因性クロトーレベルを増加させる１つ以上の薬学的組成物、のうちの１つ以上を含む、投与するステップと、を含む、方法。
【請求項１４】
前記投与するステップが、
任意で修飾放出形態の、摂取、頬側投与、および舌下投与からなる群から任意で選択される、経口または経口関連投与、
修飾放出形態の、任意で静脈内、真皮内、腹腔内、筋肉内、皮内、および皮下注射から任意で選択される、１つ以上のボーラスまたは漸進的注射を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記血清または毛細血管血を取得するステップが、
前記哺乳動物対象の皮膚をランセットで切開することと、
約１０〜１０００μｌ、好ましくは約５０〜２００μｌの前記毛細血管血を取得することと、
前記毛細血管血を、その中に配置またはそれに添加された保存剤または抗凝血剤を有する容器内に採取することであって、前記毛細血管血が、任意で約１０〜１０００μｌ、好ましくは約５０〜２００μｌの毛細血管血である、採取することと、のうちの１つ以上を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬学的組成物が、配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、薬学的有効量の組換えクロトータンパク質、組換えクロトータンパク質断片、または組換えクロトー融合タンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬学的組成物が、それらの間のリンカー配列の有無にかかわらず、可溶性クロトータンパク質配列の少なくとも一部分に融合された免疫グロブリンＦｃドメイン配列またはヒト血清アルブミン配列の少なくとも一部分を含む薬学的有効量の組換えクロトー融合タンパク質を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記栄養補助組成物が、ビタミンＣ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、クエルセチン二水和物、ロスマリン酸（ＲＡ）、プテロスチルベン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、および１つ以上の腸内有益菌からなる群から選択される、２つ以上の構成成分を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の腸内有益菌が、有効量のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種および／または株であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ  ＢＬ−０４、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ／ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ−０２、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＢＬ−０５、ならびにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種および／または株であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＡ−１４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＲ−３２、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＬＰＣ−３７を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
薬学グレードの組換えクロトータンパク質、組換えクロトータンパク質断片、または組換えクロトー融合タンパク質を精製する方法であって、
（ｉ）組換えクロトータンパク質、組換えクロトータンパク質断片、または組換えクロトー融合タンパク質、および（ｉｉ）１つ以上の汚染物質を含む、懸濁細胞培養流体を取得するステップと、
親和性クロマトグラフィーを使用して精製ステップを実施するステップであって、前記親和性クロマトグラフィーでは、前記組換えクロトータンパク質、組換えクロトータンパク質断片、または組換えクロトー融合タンパク質が、プロテインＡまたは他の親和性実体に結合され、任意で洗浄され、ｐＨ約２〜ｐＨ約６のｐＨおよび約１Ｍ〜約６Ｍの塩濃度を有する溶出緩衝液でプロテインＡから溶出され、前記塩が、任意でＭｇＣｌ２を含む、実施するステップと、
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製ステップを実施するステップであって、前記サイズ排除クロマトグラフィーでは、前記溶出された組換えクロトータンパク質、組換えクロトータンパク質断片、または組換えクロトー融合タンパク質が、移動相緩衝液中でさらに溶出され、前記移動相緩衝液が、緩衝剤および１つ以上の任意の還元剤を有し、前記緩衝剤が、任意でリン酸含有緩衝液以外であり、前記還元剤が、任意でＬ−メチオニンおよび／またはチオグリコール酸ナトリウムを含み、前記移動相緩衝液が、任意でｐＨ約６〜ｐＨ約１０のｐＨを有する、実施するステップと、を含み、
前記さらに溶出された組換えクロトータンパク質、組換えクロトータンパク質断片、または組換えクロトー融合タンパク質の少なくともいくらかが、任意で多量体形態である、方法。
【請求項２１】
前記組換えクロトータンパク質、配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本開示は、患者におけるクロトータンパク質レベルの評価および増加に関する。具体的には、本開示は、内因性および／または外因性クロトータンパク質のレベルを監視、検出、および／または認定するための、ならびにヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）対象におけるクロトータンパク質欠損を診断するための製品および方法、ならびに対象におけるクロトータンパク質レベルを増加させるための薬学的組成物または栄養補助組成物の生産、精製、および投与に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術
クロトー（またはアルファ−クロトー、α−クロトーなど）は、ヒト染色体１３に位置するＫＬ（またはクロトー）遺伝子によってコードされる近年特徴付けられたタンパク質である。選択的ＲＮＡスプライシングを通して、単一のクロトー遺伝子から生じる２つの転写物が同定されている。図１および２を参照されたい。第１の転写物は、短い細胞質尾部（ヒト残基１００３〜１０１２）と、膜貫通（ＴＭ）ドメイン（ヒト残基９８２〜１００２）と、各々β−グルコシダーゼと２０％〜４０％のアミノ酸配列相同性を共有するが、同様のレベルのグルコシダーゼ触媒活性を欠き得る）、２つの（大部分が）相同な（内部反復）ドメイン（ＫＬ１（４５０残基長であるヒト残基５６〜５０６）およびＫＬ２（４３８残基長であるヒト残基５１５〜９５３と称されるもの）を含む、細胞外領域またはドメイン（ヒト残基１〜９８１）と、シグナル配列（ＳＳ）ドメイン（ヒト残基１〜３３）とを含む、全長１，０１２個のアミノ酸の１回膜貫通膜タンパク質であるクロトーアイソフォーム１をコードすると予測される。ＳＳ、ＫＬ１、およびＫＬ２ドメイン含有細胞外領域（ヒト残基１〜９８１）は、α／β−セクレターゼによって酵素的に切断され、可溶性クロトー（またはｓクロトー、ｓ−クロトー、アルファ可溶性クロトーなど）と称される１３０ｋＤａ循環タンパク質として循環流に放出され得る。細胞外領域はまた、別個の６８ｋＤａタンパク質（ＫＬ１＋ＳＳ）および６４ｋＤａタンパク質（ＫＬ２）に切断され得る。
【０００３】
アルファ−クロトーｍＲＮＡのスプライシング多様体である第２の転写物は、主にＫＬ１ドメインに対応するクロトータンパク質の第２のアイソフォームをコードする。内部スプライスドナー部位は、クロトー遺伝子のエクソン３に位置すると考えられている。得られる選択的にスプライシングされた転写物は、エクソン３の後に、その末端にインフレーム翻訳終止コドンを有する、５０塩基対の挿入を含有する（図１、灰色）。発現されたタンパク質産物は循環中に分泌され、分泌クロトー（またはクロトーアイソフォーム２）と称され、これはアミノ酸残基５３５〜５４９でアイソフォーム１の標準配列と異なり、ＤＴＴＬＳＱＦＴＤＬＮＶＹＬＷ→ＳＱＬＴＫＰＩＳＳＬＴＫＰＹＨ、アミノ酸残基５５０〜１０１２を欠く。
【０００４】
したがって、遺伝子発現、ＲＮＡスプライシング、および酵素的切断に依存して、任意の所与の時間で、循環中にいくつかの異なるクロトータンパク質が存在し得る。様々な形態のアルファ−クロトータンパク質の存在にもかかわらず、全長の膜結合アイソフォーム１のみが線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体と複合体を形成し、尿中へのリン酸排泄を誘導し、ＰｉおよびビタミンＤ代謝を調節する役割を有する骨由来ホルモンである、ＦＧＦ２３の必須共受容体として機能することが知られている。
【０００５】
クロトーは、腎臓、脳で高度に発現し、他の器官では程度がより低く、哺乳動物の血液、脳脊髄液、および尿中にも見出され得る。ヒトを含む哺乳動物における可溶性クロトータンパク質の循環レベルは、年齢とともに減少すると考えられている。加えて、クロトー欠損マウスは、加齢表現型の加速を呈する一方で、マウスにおけるクロトーの過剰発現は、寿命を延長することが示されている。加えて、クロトーは、加齢に関連するいくつかの細胞プロセスに関係付けられている。前述の見地から、可溶性クロトーは、人体において抗加齢化合物として機能し得るという仮説が立てられている。
【０００６】
加齢は不可避かつ進行性の生物学的プロセスであり、ほとんど全ての組織および器官の機能障害および破滅をもたらし、最終的には死をもたらす。例えば、人体の加齢は、様々な疾患の発症につながり得る細胞機能の低下と関連している。加齢は、遺伝的因子と後天的因子との間の厳密に制御された複雑な相互作用によって引き起こされると考えられ、老化の増加、幹細胞の定量的および定質的減少、ならびに組織レベルでの異常な構造が典型的な特徴である。
【０００７】
いわゆる「ベビーブーマー」の世代が年齢を重ねるにつれて、高齢者（例えば、６０〜６５歳）人口は世界的に急速に増加している。この高齢者集団に対する医療需要の増加は、あらゆる医療制度の顕著な経済的負担となっている。組換えクロトータンパク質は、年齢に関係する健康状態に対抗する有望な治療剤を提供し得る。これまでに、クロトーに関連する全ての関連治療データは、動物モデルにおける前臨床研究試験である。（ｉ）組換えｓ−クロトータンパク質またはタンパク質多様体の産生および／または（例えば、実質的に均一になるまでの）精製、ならびに（ｉｉ）対象、特にヒトへの、および／または増加する高齢者集団における、組換えｓ−クロトータンパク質もしくはタンパク質多様体および／またはｓ−クロトータンパク質レベル増加健康補充剤の投与に基づく、戦略および健康介入製品および方法の開発は、この状況の改善に役立ち得る。
【０００８】
現在、ヒトでの使用に好適な、組換え可溶性ヒトアルファ−クロトータンパク質またはタンパク質多様体、特に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって判定および施行される、医薬品適正製造基準（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ｃＧＭＰ）規制に準拠するタンパク質などの、外因性形態のヒトクロトータンパク質を提供するための製品または方法は、単独でも、または１つ以上の追加の活性構成成分と組み合わせでも、存在しない。
【０００９】
同様に、現在、安全かつ効果的な方式で、内因性クロトータンパク質レベルまたはタンパク質産生を（自然に）増加させるための製品または方法、特に１９９４年の栄養補助食品健康教育法（ＤＳＨＥＡ）に準拠する製品または（米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって判定および施行される）医薬品適正製造基準（ｃＧＭＰ）規制に準拠する製品は、単独でも、または１つ以上の追加の活性構成成分、薬物、医薬品、もしくは栄養補助食品と組み合わせでも、存在しない。
【００１０】
さらに、現在、クロトータンパク質レベルを効率的に、確実に、再現性よく、実用的に、および／または（商業的もしくは経済的に）実行可能に監視するための製品（例えば、キットもしくはシステム）または方法、具体的には内因性および／または外因性クロトータンパク質レベル、ならびにより具体的には内因性および／または外因性可溶性アルファクロトータンパク質またはタンパク質多様体レベルをオンデマンドおよび／または実時間で監視および／または定量化するための製品または方法、あるいはヒトおよび非ヒト動物におけるクロトータンパク質欠損、具体的には血清可溶性クロトータンパク質欠損を診断するための製品または方法は、存在しない。
【００１１】
現在、組換えクロトータンパク質、具体的には組換えクロトータンパク質断片および組換えクロトー融合タンパク質を含む薬学グレードの組換えクロトータンパク質を効率的に、確実に、再現性よく、実用的に、および／または（商業的もしくは経済的に）実行可能に産生および精製するための好適で大規模な方法も、存在しない。
【発明の概要】
【００１２】
本開示の実施形態は、患者におけるクロトータンパク質レベルを評価し、それを増加させるための製品および方法を用いて、当該技術分野における前述または他の問題のうちの１つ以上を解決する。いくつかの実施形態は、（１）ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）の血液または血清中のクロトータンパク質を安定化させるための組成物および方法、（２）クロトータンパク質レベル（複数可）、具体的には内因性および／もしくは外因性可溶性アルファクロトータンパク質レベル（複数可）を監視、検出、および／もしくは定量化するための組成物および方法、ならびに／またはヒトもしくは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）対象におけるクロトータンパク質欠損を診断するための組成物および方法、ならびにそれらの実施に有用な製品、（３）対象におけるクロトータンパク質レベルを増加させるための薬学的組成物または栄養補助組成物を含む。いくつかの実施形態は、治療剤として、クロトータンパク質（複数可）、またはその断片（複数可）もしくは多様体（複数可）、およびより具体的にはｃＧＭＰグレードのヒト（もしくは非ヒト）組換え可溶性アルファクロトータンパク質（複数可）、またはその断片（複数可）もしくは多様体（複数可）、あるいはそれらを含む（薬学的）組成物を含む。いくつかの実施形態は、（組換え）クロトータンパク質（複数可）、またはその断片（複数可）もしくは多様体（複数可）を製造し、それをヒトまたは非ヒト対象に投与するための製品および／または方法、ならびに具体的には対象における血清可溶性クロトータンパク質レベルを増加させるための製品および／または方法を含む。いくつかの実施形態は、対象における血清可溶性クロトータンパク質レベルを増加させるための栄養補助組成物または健康補充組成物を含む。具体的には、いくつかの実施形態は、対象に投与されると、対象におけるクロトータンパク質（具体的には内因性可溶性アルファクロトータンパク質）レベル（複数可）、発現、または産生の増加を引き起こす製品、ならびに（４）組換えクロトータンパク質、具体的には薬学グレードの組換えクロトータンパク質、組換えクロトータンパク質断片、および組換えクロトー融合タンパク質を精製する方法を含む。
【００１３】
様々な実施形態は、組成物を含む。組成物は、（ｉ）１つ以上の組換えヒトクロトータンパク質、タンパク質断片、および／もしくはタンパク質多様体、発現核酸構築物および／もしくはベクター、細胞株および／もしくは細胞懸濁培養物、ならびに／または（ｉｉ）対象に投与されると、対象におけるクロトータンパク質レベル（複数可）、発現、もしくは産生、具体的には内因性可溶性アルファクロトータンパク質レベル（複数可）、発現、もしくは産生の増加を引き起こすかもしくは誘発する、１つ以上の成分を含み得る。特定の実施形態は、本開示の組成物を製造し、それを精製し、それを（ヒトまたは非ヒト動物）対象に投与する方法を含む。いくつかの実施形態は、対象におけるクロトータンパク質（具体的には（外因性および／もしくは内因性）可溶性アルファクロトータンパク質）レベル（複数可）、発現、または産生を増加させる方法を含む。いくつかの実施形態は、クロトータンパク質レベル（複数可）、具体的には（内因性および／もしくは外因性）可溶性アルファクロトータンパク質レベル（複数可）を監視、検出、および／もしくは定量化するための製品（例えば、診断キット）および／もしくは方法、ならびに／または対象におけるクロトータンパク質欠損を診断するための製品および／もしくは方法を含む。
【００１４】
本開示のいくつかの実施形態は、組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質、タンパク質断片、および／もしくはタンパク質多様体（例えば、ｃＧＭＰグレードのヒト組み換え可溶性アルファクロトータンパク質、タンパク質断片、および／またはタンパク質多様体）；組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質、タンパク質断片、および／またはタンパク質多様体を含む組成物（例えば、治療用組成物、薬学的組成物、医薬、製剤など）；組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質および（薬学的に許容される）ビヒクル（例えば、担体または賦形剤）を含む組成物；組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質および少なくとも１つの追加の（活性）成分を含む組成物；ヒト組換えアルファ可溶性クロトータンパク質をコードする核酸構築物またはベクター；（ｉ）組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質をコードする核酸構築物もしくはベクターを含有する、かつ／または（ｉｉ）組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質を発現する細胞株；（各々）（ｉ）組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質をコードする核酸構築物もしくはベクターを含有する、かつ／または（ｉｉ）組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質を発現する１つ以上の細胞の細胞懸濁培養物；組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質を製造および任意で精製する方法；組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質の医薬（または治療用組成物、すなわち、製剤）を製造する方法；（ヒトまたは非ヒト動物）対象に組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質を投与する方法；対象におけるクロトータンパク質欠損を判定するための診断方法；対象におけるクロトータンパク質欠損を診断する方法；投与により組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質を受ける必要があると対象を診断する方法；それを必要とする対象に対するタンパク質の有効性を評価および／または有効投薬量を判定する方法；ヒトまたは非ヒト動物（例えば、非ヒト哺乳動物）における特定の医学的病または他の病態の治療に使用するための組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質；ヒトまたは非ヒト動物における特定の医学的病態または他の病態の治療のための組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質の使用；ヒトまたは非ヒト動物における特定の医学的病態または他の病態の治療のための、組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質を含む組成物の使用；ならびに／あるいはヒトまたは非ヒト動物における特定の医学的病態または他の病態の治療のための医薬の製造における組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質の使用のうちの１つ以上を含み得る。
【００１５】
いくつかの実施形態は、組換えクロトータンパク質を含み得、タンパク質の少なくとも一部分は、配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態は、配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つ、好ましくは配列番号５２、配列番号５４、配列番号６６、配列番号１２５〜配列番号１２８、配列番号１３３、および配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部、ならびに任意でその間の任意のリンカー配列の有無にかかわらず、免疫グロブリンＦｃドメイン配列、ヒト血清アルブミン配列、Ｈｉｓ（例えば、６Ｈｉｓ）タグ配列、および／またはＴｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ配列の少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、クロトータンパク質配列を含む、組換えタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態は、２つ以上の組換えクロトータンパク質を含み得る。
【００１６】
いくつかの実施形態は、薬学的有効量の本明細書に記載の組換えクロトータンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物を含み得る。いくつかの実施形態は、薬学的有効量の組換え可溶性クロトータンパク質であって、タンパク質の少なくとも一部分が、ヒトアルファクロトーアイソフォーム１もしくはアイソフォーム２のアミノ酸残基１〜９８１、２９〜９８１、３４〜９８１、３６〜９８１、１３１〜９８１、１〜５４９、２９〜５４９、３４〜５４９、３６〜５４９、もしくは１３１〜５４９の少なくともサブセット、または配列番号２〜配列番号７０、もしくは配列番号１０７〜配列番号１２０、もしくは配列番号１２５〜配列番号１２８、もしくは配列番号１３３、もしくは配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、組換え可溶性クロトータンパク質、および薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物を含み得る。いくつかの実施形態は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤、ならびに配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つ、好ましくは配列番号５２、配列番号５４、配列番号６６、配列番号１２５〜配列番号１２８、配列番号１３３、および配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部、ならびに任意でその間の任意のリンカー配列の有無にかかわらず、免疫グロブリンＦｃドメイン配列、ヒト血清アルブミン配列、Ｈｉｓ（例えば、６Ｈｉｓ）タグ配列、および／またはＴｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ配列の少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、クロトータンパク質配列を含む、有効量の組換えタンパク質を含む、薬学的組成物を含み得る。いくつかの実施形態は、薬学的有効量の２つ以上の組換えクロトータンパク質を含む組成物を含み得る。
【００１７】
いくつかの実施形態は、治療用クロトータンパク質、および薬物、抗体、ホルモン、ヒト細胞、組織、細胞産生物もしくは組織系産生物（ＨＣＴ／Ｐｓ）などの少なくとも１つの他の活性構成成分を含む組成物、ならびに／またはそれらをヒトもしくは非ヒト対象に投与する方法を含み得る。コンビナトリアル組成物および方法は、年齢に関係する障害または病態、臨床（例えば、代謝）障害、慢性疾患、および急性傷害などを有する対象の治療に有用であり得る。明白な病態または障害を有さない対象への併用治療の予防的投与はまた、本明細書に記載の特定の病態または障害の遅延または防止にも有用であり得る。
【００１８】
いくつかの実施形態は、核酸または核酸構築物を含み得る。例えば、実施形態は、発現ベクターまたは核酸を含み得る。核酸は、組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質、タンパク質断片、またはタンパク質多様体をコードし得る。核酸は、天然または非天然シグナル伝達配列をコードし得る。例えば、核酸は、コードされたクロトータンパク質配列の上流（またはＮ末端）に非天然シグナル伝達配列をコードし得る。いくつかの実施形態は、組換えタンパク質であって、配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つ、好ましくは配列番号５２、配列番号５４、配列番号６６、配列番号１２５〜配列番号１２８、配列番号１３３、および配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部、ならびに任意でその間の任意のリンカー配列の有無にかかわらず、免疫グロブリンＦｃドメイン配列、ヒト血清アルブミン配列、Ｈｉｓ（例えば、６Ｈｉｓ）タグ配列、および／またはＴｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ配列の少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、クロトータンパク質配列を含む、組換えタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸構築物を含み得る。
【００１９】
いくつかの実施形態は、細胞株を含み得る。細胞株は、（複数の）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（複数可）、ＨＥＫ−２９３細胞、または他の好適な（タンパク質発現）細胞株を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｓ細胞などのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞、またはＧＳ−／−ＣＨＯ細胞などのグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）欠損ＣＨＯ細胞であり得る。細胞は、配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つ、好ましくは配列番号５２、配列番号５４、配列番号６６、配列番号１２５〜配列番号１２８、配列番号１３３、および配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、ポリペプチドをコードする、（導入遺伝子またはｃＤＮＡを含む）１つ以上の外因性核酸（のコピー）を含有し得る。ポリペプチドは、ヒト組換えアルファ可溶性クロトータンパク質を含み得る。外因性核酸は、好ましくは配列番号７６〜配列番号１０６または配列番号１２１〜配列番号１２４のうちの１つと少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する導入遺伝子またはｃＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は（また）、（導入遺伝子に関連する）プロモーター、および／または（機能性）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）酵素、（機能性）グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）酵素などの任意の（外因性）酵素を含み得るか、またはコードし得る。
【００２０】
少なくとも１つの実施形態は、好ましくは炭素源、窒素源、および／または１つ以上のビタミン、無機質、塩、アミノ酸、補充剤、もしくは添加剤を含み、細胞が核酸によってコードされたポリペプチドを発現するような液体培地中で成長する細胞株を含む、懸濁細胞培養物を含む。液体培地は、（ヒト、ウシ、ウシ胎児、もしくは他の）無血清および／または動物（もしくは動物由来）タンパク質（構成成分）を含まないものであり得る。例えば、液体培地は、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンなどを含まないものであり得る。いくつかの実施形態では、懸濁細胞培養物は、液体培地、好ましくは無血清および／または動物タンパク質構成成分を含まない液体培地であって、好ましくは炭素源、窒素源、および１つ以上のビタミン、無機質、塩、アミノ酸、補充剤、または添加剤を含み、より好ましくはヒポキサンチン、チミジン、および／またはグルタミンを欠く、液体培地と、細胞が核酸によってコードされたポリペプチドを発現するような液体培地中で成長する細胞株であって、ポリペプチドが、組換えクロトータンパク質を含む、細胞株とを含み得る。
【００２１】
いくつかの実施形態は、細胞、液体培地、またはそれらの両方の懸濁細胞培養物の抽出物の、またはそれらからの抽出物を含み、この抽出物は、配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つ、好ましくは配列番号５２、配列番号５４、配列番号６６、配列番号１２５〜配列番号１２８、配列番号１３３、および配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する組換えタンパク質を含有する。特定の実施形態は、細胞、液体培地、またはそれらの両方（例えば、懸濁細胞培養物）の、またはそれらからの、ヒト組換えアルファ可溶性クロトータンパク質含有抽出物を含む。少なくとも一実施形態は、配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離組換えタンパク質を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態は、組換えクロトータンパク質（例えば、組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質）を製造する方法を含み得る。例示的な方法は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ＨＥＫ−２９３内、好ましくはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞内、より好ましくはＣＨＯ−Ｓ細胞内、または好ましくはグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）欠損ＣＨＯ細胞内、より好ましくはＧＳ−／−ＣＨＯ細胞内で、組換えクロトータンパク質を産生することを含み得、タンパク質は、好ましくは配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、製造方法は、液体培地中でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を成長させること、細胞内で組換え可溶性クロトータンパク質を産生すること、および／または細胞、液体培地、もしくはそれらの両方から組換え可溶性クロトータンパク質含有抽出物を精製することを含み得る。抽出物は、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の乾燥重量の組換え可溶性クロトータンパク質、および／または約１〜１００ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含み得る。細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＣＨＯ−Ｓ細胞などのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞、またはＧＳ−／−ＣＨＯ細胞などのグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）欠損ＣＨＯ細胞であり得る。産生された（発現された）タンパク質は、細胞から液体培地に放出（例えば、分泌）され得、かつ／またはそれに結合した１つ以上のグリカンを有し得る。
【００２４】
細胞は、タンパク質、および任意でジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）酵素などの機能性酵素をコードする、１つ以上の外因性核酸を含有し得る。外因性核酸は、細胞内の外因性タンパク質の発現に使用されるのが慣習的または典型的なプロモーターなどの、プロモーター（例えば、強力なプロモーター、弱いプロモーターなど）を含み得る。外因性核酸は、好ましくは、配列番号７６〜配列番号１０６もしくは配列番号１２１〜配列番号１２４のうちの１つ、または本明細書に記載のクロトータンパク質をコードする任意の他の好適な核酸酸性配列（例えば、Ｓ−クロトー多様体）と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する導入遺伝子またはｃＤＮＡ（例えば、プロモーターの制御下にある）を含み得る。
【００２５】
方法は、トランスフェクションなどによって外因性核酸を細胞に導入することを含み得る。方法は、（ヒト、ウシ、ウシ胎児、もしくは他の）無血清および／または動物（もしくは動物由来）タンパク質（構成成分）を含まない培地などの液体培地中で細胞を成長させることを含み得る。培地は、好ましくは炭素源、窒素源、および／または１つ以上のビタミン、無機質、塩、アミノ酸、補充剤、もしくは添加剤を、好ましくはバイオリアクター内に含む。特定の細胞株に応じて、方法は、有効量のメトトレキサート（ＭＴＸ）、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）、もしくは他の薬剤を液体培地に導入すること、および／または（例えば、細胞サブクローニング、限界希釈法、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などによって）液体培地中で成長する生存細胞の懸濁培養物を選択することを含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、選択および／または遺伝子増幅は、トランスフェトされた細胞を、ヒポキサンチンおよび／またはチミジン（例えば、−ＨＴ培地）、グルタミンなどを欠く培地などの選択培地中で培養することによって実施され得る。少なくとも１つの実施形態では、低濃度（複数可）のＭＴＸを添加または使用して、トランスフェクトされた核酸（またはその遺伝子（複数可））を増幅し、それによって（例えば、ＤＨＦＲ導入遺伝子でトランスフェクトされたＤＨＦＲ欠損細胞内の）タンパク質発現の増加を選択することができる。代替的に（または加えて）、選択および／または遺伝子増幅は、少なくとも１つの（外因性）グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）導入遺伝子を有する細胞の懸濁培養物にＭＳＸ（（内因性）グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）の阻害剤）を添加することによって実施され得る。
【００２７】
方法は、生存細胞または培養物（例えば、ＭＴＸ耐性および／またはＭＳＸ耐性細胞または培養物）を継代培養することを含み得る。選択懸濁培養物および／または選択細胞は、（例えば、細胞による）タンパク質の産生の増加、（例えば、液体培地中の）タンパク質の濃度の増加、および／または例えば、（選択されなかった懸濁培養物または細胞と比較した）外因性核酸の（例えば、細胞当たりの）コピー数の増加を有し得るか、または呈し得る。
【００２８】
いくつかの実施形態では、液体培地はまた、有効量のＭＴＸおよび／またはＭＳＸを含み得る。懸濁培養物（またはその細胞）は、（例えば、細胞による）タンパク質の産生の増加を呈し、（例えば、液体培地中の）タンパク質の濃度の増加を呈し、（例えば、液体培地中に）タンパク質を分泌し、かつ／または好ましくは選択されなかった懸濁培養物と比較して、外因性核酸の（例えば、細胞当たりの）コピー数の増加を有し得る（ように選択され得る）。タンパク質は、それに結合した１つ以上のグリカンを有し得る。
【００２９】
本開示のいくつかの実施形態は、天然の可溶性アルファクロトータンパク質産生を増大、改善、または増加させるように構成または製剤化された組成物に関する。いくつかの実施形態は、対象における（内因性）クロトータンパク質レベルを増加させるための組成物または方法を含む。いくつかの実施形態は、対象におけるクロトータンパク質レベル、特に血清可溶性クロトータンパク質レベルを増加させるための（栄養補助または健康補充）組成物を含む。いくつかの実施形態は、対象に投与されると、対象におけるクロトータンパク質レベル（複数可）、発現、または産生、具体的には内因性可溶性アルファクロトータンパク質レベル（複数可）、発現、または産生の増加を引き起こす製品を含む。
【００３０】
本開示のいくつかの実施形態は、クロトータンパク質の損傷または分解を減弱するように構成または製剤化された組成物に関する。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の組成物を製造する方法に関する。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の組成物の使用、またはそれを使用してヒトもしくは非ヒト動物対象を治療する方法に関する。本開示のいくつかの実施形態は、ヒトまたは非ヒト動物対象へのそれらの投与を含む、本開示の組成物に関与する治療方法に関する。そのような使用および治療方法は、天然の可溶性アルファクロトータンパク質産生を増大させること、および／またはクロトータンパク質の損傷もしくは分解を減弱することなどによって、内因性クロトータンパク質レベルを増加させ得る。
【００３１】
特定の実施形態は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）対象に投与されると、ヒトまたは非ヒト動物対象における内因性可溶性アルファクロトータンパク質のレベルを増加させる健康補充剤を含む、物質の組成物を含む。組成物または健康補充製剤は、（合成）化学的および／または天然の構成成分または成分を含み得る。言い換えれば、組成物または健康補充製剤の構成成分または成分は、（合成）化学的および／または天然の供給源であるか、それらに由来し得る。例示的な組成物は、哺乳動物対象による可溶性クロトータンパク質の内因性産生を増加または増強させることによって血清可溶性クロトータンパク質レベルを上昇させるように適合（もしくは化学的に構成）されるか、またはそのように適合（もしくは化学的に構成）された複数の構成成分を含み得る。
【００３２】
例示的な組成物は、好ましくは、例えば、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＫ、３，５，４’−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン（レスベラトロール）、プテロスチルベン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、トログリタゾン、ロシグリタゾン、Ｎｏｔｏｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｉｎｃｉｓｕｍ  Ｔｉｎｇ、ゲンチアナ（根、抽出物）、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  Ｓｉｎｅｎｓｉｓ（ＣＳ）菌糸）、イソフラボン（大豆）、ゲニステイン、ダイゼイン、クエルセチン（二水和物、ディル、ベイリーフ、オレガノ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アスタキサンチン、セサミン（Ｓｅｍｅｎ  Ｓｅｓａｍｉｎ  Ｎｉｇｒｕｍ（黒色））、ゴマ（種子抽出物）、ロスマリン酸（ＲＡ、（マジョラム））、テトラデシルチオ酢酸（ＴＴＡ）、リン酸二カルシウム（無水）、微結晶性セルロース（ＭＣＣ）、クロスカルメロースナトリウム（プリメロース）、ステアリング酸（Ｓｔｅａｒｉｎｇ  Ａｃｉｄ）、ステアリン酸マグネシウム、アルファリポ酸、共役（アルファ）リノール酸（ＣＬＡ）、腸内有益菌、活性炭、および当該技術分野で既知の他のものからなる群から選択される１つ以上の構成成分を含み得る。
【００３３】
例示的な組成物は、好ましくは好適な栄養補助濃度で、かつ好ましくは、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、クエルセチン（二水和物）、ロスマリン酸（ＲＡ）、プテロスチルベン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、および１つ以上の腸内有益菌からなる群から選択される、１つ以上の構成成分を含み得る。１つ以上の腸内有益菌は、有効量のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種および／または株であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ  ＢＬ−０４、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ／ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ−０２、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＢＬ−０５、ならびにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種および／または株であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＡ−１４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＲ−３２、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＬＰＣ−３７を含む。
【００３４】
特定の成分または構成成分は、加齢とともに生じる細胞および組織の機能障害に関連する１つ以上の病態の治療または影響に正の利益および非常に低い副作用を有し得る。特定の成分または構成成分は、その投与後に、ヒトまたは非ヒト動物対象における可溶性アルファクロトー（ｓ−クロトー）レベルの循環血漿レベルを（直接的または間接的に）増加させ得る。
【００３５】
少なくとも１つの実施形態では、本開示の組成物は、一般用医薬品として販売し、市販し、かつ／もしくは消費者に直接売ることができるか（ＤＴＣ）、または処方箋／医師の指示なしで購入することができる、１９９４年の栄養補助食品健康教育法（ＤＳＨＥＡ）に準拠する栄養補充剤であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認した医薬品であり得るか、またはそれを含み得る。
【００３６】
いくつかの実施形態では、成分は、好ましくは少なくともいくつかの共製剤を介して、同時投与され得る。いくつかの実施形態では、成分は、別個の製剤で同時投与され得る。例えば、いくつかの実施形態では、成分は、多丸剤、多カプセル、または投薬パックで同時投与され得る。いくつかの成分は、固体、顆粒、粉末、液体、または他の形態で提供され得る。
【００３７】
本明細書に記載のように、いくつかの実施形態は、１つ以上の（追加の）成分または構成成分を含み得る。例えば、いくつかの実施形態は、本明細書に記載されるように、１つ以上の組換え（例えば、ヒトまたは哺乳動物）クロトータンパク質、タンパク質断片、および／またはタンパク質多様体を含み得る。特定の実施形態は、発現核酸構築物および／またはベクター、細胞株および／または細胞懸濁培養、ならびに１つ以上の組換え（例えば、ヒトまたは哺乳動物）クロトータンパク質、タンパク質断片、および／またはタンパク質多様体を製造し、それを精製し、それを（ヒトまたは非ヒト動物）対象に投与する方法を含み得る。いくつかの実施形態は、医薬品または処方医薬品（例えば、ＡＲＢ（例えば、ロサルタン、バルサルタン）、テストステロン、ビタミンＤ受容体アゴニスト（例えば、カルシトリオール、パリカルシトール）、ＰＰＡＲ（ガンマ）アゴニスト（例えば、チアゾリジンジオン、トログリタゾン、ロシグリタゾン）、および／または上記に組み込まれる特許参考文献に記載の他のもの）などの１つ以上の活性成分を含み得る。
【００３８】
いくつかの実施形態は、薬学的有効量の１つ以上の組換えクロトータンパク質、および（例えば、哺乳動物対象における）内因性クロトータンパク質レベルまたは産生を増加させるように製剤化された有効量の組成物（例えば、健康補充剤）を含む、組成物を含み得る。いくつかの実施形態では、組換えクロトータンパク質は、組成物と同時投与され得る。いくつかの実施形態では、組換えクロトータンパク質は、薬学的に許容される担体と組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、投与された組換えクロトータンパク質は、外因性クロトータンパク質を提供することによって血清可溶性クロトータンパク質レベルを上昇させ得る一方で、組成物は、患者または対象によるクロトータンパク質の（天然）産生を増加または増強させることによって血清可溶性クロトータンパク質レベルを上昇させ得る。
【００３９】
いくつかの実施形態は、治療方法を含み得る。方法は、（薬学的）有効量の本開示の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含み得る。組成物は、（ｉ）薬学的有効量の本開示の１つ以上の組換え可溶性クロトータンパク質もしくはタンパク質多様体、および／または（ｉｉ）（例えば、哺乳動物対象における）内因性クロトータンパク質レベルもしくは産生を増加させるように製剤化された薬学的有効量の組成物（例えば、健康補充剤）を含み得る。
【００４０】
いくつかの実施形態は、（例えば、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）患者または対象における）クロトー欠損を治療する方法を含み得る。方法は、任意でまたは好ましくは哺乳動物対象をクロトー欠損と診断した後に、哺乳動物対象に組成物を投与することを含み得る。組成物は、例えば、薬学的に許容される担体または賦形剤と、担体中または賦形剤に配置された薬学的有効量の組換えクロトータンパク質、組換えクロトータンパク質断片、または組換えクロトー融合タンパク質とを含む、薬学的組成物；ならびに哺乳動物対象による可溶性クロトータンパク質の内因性産生を増加または増強させることによって血清可溶性クロトータンパク質レベルを上昇させるように適合された複数の構成成分を含む、栄養補助組成物のうちの１つ以上を含み得る。
【００４１】
いくつかの実施形態は、加齢に関係する、または他の病態、疾患、または障害を治療する方法を含み得る。いくつかの実施形態は、急性腎傷害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、または他の病態を治療および／または防止する方法を含み得る。組成物が投与される対象は、様々な病態（例えば、障害、疾患、傷害、疾病など）に苦しんでいるか、またはそのリスクがあり得る。例えば、いくつかの実施形態は、（ヒト）加齢に関連する身体的、知能的、神経学的、または他の病態など、１つ以上の慢性疾患および／または加齢に関係する病態を治療する方法を含む。いくつかの実施形態は、１つ以上の機構または作用を通して治癒、回復、長寿化、および／または他の有益な結果を促進し得る。本発明の組成物（複数可）の投与は、ヒト対象における慢性および／または年齢に関係する疾患および長寿化を含む、病態の経過および結果に正の治療効果、ならびにその特徴付けを有し得る。
【００４２】
薬学的有効量の組成物（複数可）は、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を、血清１ミリリットル当たり、約５０〜３０００ピコグラムを上回る、それと同等、またはその間の可溶性クロトータンパク質などの所定のレベルまで上昇または増加させるのに十分であり得る。その量もまた、または代替的に、所定の期間にわたって所定の閾値以上で対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を維持するのに十分であり得る。実施形態はまた、所定の期間にわたって所定の閾値以上で対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を維持するように、組成物（複数可）をそれを必要とする対象に投与することを含み得る。
【００４３】
実施形態はまた、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を判定することを含み得る。実施形態はまた、本開示の組成物の薬学的有効量を計算することを含み得る。実施形態はまた、対象の血清中での可溶性クロトータンパク質の低下速度を判定することを含み得る。実施形態はまた、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度が、判定された速度に基づいて第２の所定のレベル以下になる、後続投薬時間を計算することを含み得る。実施形態はまた、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を第２の所定のレベルから第１の所定のレベルまで上昇させるのに十分な、後続投薬時間および／または組成物の量を計算することを含み得る。実施形態はまた、後続投薬量の組成物を対象に投与することを含み得る。特定の実施形態は、（例えば、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度の判定されたレベルに基づいて）対象に通常（例えば、毎日）の用量または剤形の組成物を処方することを含み得る。
【００４４】
特定の実施形態では、組成物（例えば、タンパク質もしくは補充剤）または上昇した可溶性クロトータンパク質レベルは、ＩＧＦ−１および／もしくはＷｎｔシグナル伝達経路を調節し得（調節するために有効であり得）、β−グルクロニダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ活性を呈し得、ｐ５３／ｐ２１シグナル伝達経路を抑制し得、かつ／または好ましくはｐ５３／ｐ２１シグナル伝達経路の抑制を通して、Ｈ２Ｏ２誘発性細胞老化およびアポトーシスを低減し得る。タンパク質または上昇したタンパク質レベルは、好ましくは多面発現活性を呈し、ならびに／または好ましくは酸化ストレス、成長因子シグナル伝達、イオン恒常性維持、および／もしくは１つ以上のイオンチャネルタンパク質および／もしくはインスリン／インスリン様成長因子−１受容体などの成長因子受容体などの細胞表面上での糖タンパク質の活性の調節において、体液性因子として機能し得るか、または機能的であり得る。
【００４５】
特定の実施形態では、組成物（例えば、タンパク質もしくは補充剤）または上昇した可溶性クロトータンパク質レベルはまた、虚弱、骨密度減少または骨塩量減少、体重減少、筋萎縮または退化、筋量低下、筋力、握力、脚力または体力の低下、動作、動作自由、生活の質評価、駆出率、運動能力の低下、学習力、学習能力、記憶力、または知能指数の低下、認知力劣化または健忘症、認知能力または機能の低下、シナプス可塑性またはシナプス機能の低下、および細胞老化などの、１つ以上の加齢に関係する病態（または（ヒト）加齢に関連する病態）を治療し（治療に有効であり）得る。
【００４６】
特定の実施形態では、組成物（例えば、タンパク質もしくは補充剤）または上昇した可溶性クロトータンパク質レベルは、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症もしくは血管性認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）もしくは運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、心房細動、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、線維筋痛症、成人発症糖尿病、関節炎もしくは関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症、緑内障、白内障、黄斑変性および他の眼疾患／障害、多発性硬化症（ＭＳ）、狼瘡、ならびに／または潰瘍性大腸炎などの、１つ以上の加齢に関係する病態（または（ヒト）加齢に関連する病態）を治療し（治療に有効であり）得る。
【００４７】
特定の実施形態では、組成物（例えば、タンパク質もしくは補充剤）または上昇した可溶性クロトータンパク質レベルは、１つ以上の他の疾患または状態を治療し（治療に有効であり）得る。例えば、本開示のいくつかの実施形態は、癌を治療すること、患者の血清リン酸レベルを低下させること、治療を必要とする対象の糖尿病または糖尿病に関係する病態（例えば、１型糖尿病など）を治療すること、対象の心臓の病態（例えば、心血管疾患、左心室肥大（ＬＶＨ）、病理学的ＬＶＨ、および／または鬱血性心不全など）を治療すること、（例えば、ナノ粒子を使用して）対象の急性肺傷害を治療すること、酸化的傷害に対して患者の肺を保護すること、重症患者の早期急性腎傷害を検出すること、対象の血管石灰化を減弱すること、認知力を改善すること、腎虚血および／または肝虚血を治療すること、（ヒト）老化内皮細胞のストレス反応を調節すること、急性および／もしくは慢性の腎損傷、疾患、もしくは疾患の進行、および／もしくは尿毒症性心筋症を予防的および／もしくは治療的に治療、防止、軽減、阻止、および／または逆転させること、メラノーマの年齢に関係する治療耐性を逆転または減弱すること、老化細胞のアポトーシスを標的とし、好ましくはそれによって組織恒常性維持を回復させること、ならびに他の様々な適応症のうちの１つ以上において有用であり得る。
【００４８】
したがって、実施形態はまた、１つ以上の加齢に関係する病態または他の病態の治療に使用するための組成物も含み得る。加齢に関係するまたは他の病態、疾患、または障害を治療する例示的な方法は、有効量の本開示の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。組成物は、（ｉ）本明細書に記載の補充剤、および／または（ｉｉ）（例えば、配列番号２〜配列番号７０、もしくは配列番号１０７〜配列番号１２０、もしくは配列番号１２５〜配列番号１２８、もしくは配列番号１３３、もしくは配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部分と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する）組換え可溶性クロトータンパク質を含み得る。任意で、組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得る。
【００４９】
いくつかの実施形態は、内因性および／または外因性クロトータンパク質、ならびにより具体的には内因性および／または外因性可溶性アルファクロトータンパク質を検出および／または定量化する方法を含む。いくつかの実施形態は、対象におけるクロトータンパク質欠損を診断する方法を含む。いくつかの実施形態は、クロトータンパク質レベル、ならびにより具体的には内因性および／または外因性の可溶性アルファクロトータンパク質レベルを検出および定量化するための製品（例えば、システムまたはキット）を含む。いくつかの実施形態は、対象におけるクロトータンパク質欠損を診断する方法を含む。いくつかの実施形態は、対象におけるクロトー欠損を治療する方法を含み得る。
【００５０】
特定の実施形態は、（哺乳動物）対象の血液または血清試料、好ましくは毛細血管血および／または指刺もしくは他の非瀉血（非静脈切開）採血技術から取得された血液を含み得るか、または利用し得る。しかしながら、本明細書では、瀉血（静脈切開）および他の好適な採血技術も企図されることが理解されるであろう。
【００５１】
いくつかの実施形態は、キットを含む。実施形態は、例えば、試料採取容器を含み得る。容器は、毛細血管血を受け入れるように構成された開口部を有し得る。いくつかの実施形態では、毛細血管血は、ある量の可溶性クロトータンパク質を含有し得るか、または含有する疑いがあり得る。実施形態は、好ましくは１つ以上のＥＤＴＡおよびヘパリンを含む、試料保存剤または抗凝血剤を含み得る。いくつかの実施形態では、試料保存剤または抗凝血剤は、容器の試料採取コンパートメント内に配置され得る。溶液は、室温で、または凍結せずに、可溶性クロトータンパク質を少なくとも２４時間、および最大７日以上安定化させるように構成され得る。実施形態は、任意で、好ましくはランセット切開デバイスまたはランセットを備える、毛細血管血サンプリングデバイスを含み得る。
【００５２】
いくつかの実施形態は、方法を含む。例えば、いくつかの実施形態は、哺乳動物血液試料中のクロトータンパク質を安定化させる方法を含み得る。実施形態は、例えば、哺乳動物対象から毛細血管血を採血または取得することと、室温で、または凍結せずに、毛細血管血を容器内で少なくとも２４時間保管することとを含み得る。容器は、保存剤または抗凝血剤が容器内の毛細血管血と混合されるように、その中に配置された保存剤または抗凝血剤を有し得る。保存剤または抗凝血剤は、室温で、または凍結せずに、可溶性クロトータンパク質を少なくとも２４時間安定化させ得る。保存剤または抗凝血剤は、ヘパリン、ヘパリンリチウム、ＥＤＴＡ、およびＫ２ＥＤＴＡの１つ以上であるか、またはそれを含み得る。
【００５３】
実施形態はまた、毛細血管血を容器内に採取すること、および／または毛細血管血を保存剤もしくは抗凝血剤と混合して、混合物を形成することを含み得る。いくつかの実施形態では、毛細血管血の採血は、哺乳動物の皮膚をランセットで切開することを含み得る。いくつかの実施形態では、毛細血管血を容器内に採取するステップは、少なくともまたは約１０〜１０００μｌ、好ましくは約５０〜２００μｌの毛細血管血を容器内に採取することを含み得る。いくつかの実施形態は、室温で、または凍結せずに、混合物を保管すること、または混合物の保管を可能にすることを含み得、保存剤または抗凝血剤は、室温で、または凍結せずに、可溶性クロトータンパク質を少なくとも３日間安定化させる。
【００５４】
いくつかの実施形態は、任意で、混合物を可溶性クロトータンパク質の存在についてアッセイすることを含み得る。混合物を可溶性クロトータンパク質の存在についてアッセイするステップは、可溶性クロトータンパク質を検出すること、および／または可溶性クロトータンパク質の量を定量化することを含み得る。可溶性クロトータンパク質を検出すること、および／または可溶性クロトータンパク質の量を定量化することは、混合物を、可溶性クロトータンパク質に結合するように構成された抗体と接触させることを含み得る。可溶性クロトータンパク質を検出すること、および／または可溶性クロトータンパク質の量を定量化することは、可溶性クロトータンパク質に結合するように構成された抗体を使用して、混合物に対してＥＬＩＳＡを実施することを含み得る。他の検出方法は、質量分析または多分析物プロファイリング（ｘＭＡＰ）、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術（例えば、小型化液体アレイバイオアッセイ、小型レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、デジタルシグナルプロセッサ、光検出器、および／または電荷結合素子イメージング）などを含み得る。
【００５５】
いくつかの実施形態は、哺乳動物対象におけるクロトー欠損を診断する方法、または哺乳動物対象におけるクロトー欠損を治療する方法を含む。実施形態は、例えば、流体生物学的試料を提供または取得することを含み得る。試料は、好ましくは毛細血管血の形態の哺乳動物の血清を含み得る。方法は、任意で、哺乳動物血清を保存剤または抗凝血剤と混合して、混合物を形成することを含み得る。試料もまた、または代替的に、好ましくは毛細血管血の形態の哺乳動物血清、および保存剤または抗凝血剤を含む、混合物を含み得る。方法は、混合物を可溶性クロトータンパク質の存在についてアッセイすることを含み得る。混合物を可溶性クロトータンパク質の存在についてアッセイするステップは、室温で、または凍結せずに、クロトー安定化混合物をある期間にわたって保管した後に、存在する場合、混合物中の可溶性クロトータンパク質の存在を検出すること、および／または存在する場合、混合物中の可溶性クロトータンパク質の量を定量化することを含み得る。方法は、混合物中に可溶性クロトータンパク質が検出されない場合、または混合物中の定量化された可溶性クロトータンパク質の量が所定の量未満である場合に、哺乳動物対象をクロトー欠損と診断することを含み得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象をクロトー欠損と診断することは、クロトー欠損の判定もしくは診断をコンピュータシステムのユーザインターフェース上に表示すること、および／またはクロトー欠損の判定もしくは診断を表示する、物理的もしくは電子的形式のファイルもしくはレポートを生成することを含み得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、流体生物学的試料を提供または取得することは、哺乳動物対象から毛細血管血を採血すること、および／または毛細血管血を容器内に採取することを含み得る。いくつかの実施形態では、混合物を可溶性クロトータンパク質の存在についてアッセイするステップは、可溶性クロトータンパク質に結合するように構成された抗体を使用して、混合物に対してＥＬＩＳＡを実施することを含み得る。いくつかの実施形態は、混合物中に可溶性クロトータンパク質が検出されない場合、または混合物中の定量化された可溶性クロトータンパク質の量が所定の量未満である場合に、哺乳動物対象に組成物を投与することを含み得る。質量分析もまた、または代替的に、実施され得る。
【００５７】
可溶性クロトーの循環および／または内因性レベルを増加させるように具体的に構成された、開示される戦略、製品、および／または健康介入方法は、患者におけるクロトーレベルの減少に関連する状況および問題の改善に役立ち得る。
【００５８】
いくつかの実施形態は、本開示の他の態様または実施形態を含む、本開示の他の場所に記載された特性、選択肢、および／または可能性のいずれかを含み得る。本明細書に記載の前述の、以下の、および／または他の特性の各々はまた、本開示の別個の実施形態を表すことにも留意されたい。さらに、そのような特性のうちの任意の２つ以上の組み合わせは、本開示の別個の実施形態を表す。そのような特性または実施形態はまた、本開示の範囲から逸脱することなく、任意の好適な組み合わせおよび／または順序で組み合わされ得る。したがって、本明細書に記載の特性の各々は、任意の好適な組み合わせおよび／または順序で、本明細書に記載の任意の１つ以上の他の特性と組み合わされ得る。したがって、本開示は、本明細書に詳細に記載される例示的な実施形態の特定の組み合わせに限定されない。
【００５９】
本開示の例示的な実施形態の追加の特性および利点は、以下の説明に記載され、その一部は説明から明らかになるか、またはそのような例示的な実施形態の実施によって習得され得る。そのような実施形態の特性および利点は、添付の特許請求の範囲で具体的に指摘される機器および組み合わせによって実現および取得され得る。これらの特性および他の特性は、以下の説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるか、または以下に記載のようなそのような例示的な実施形態の実施によって習得され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】クロトー遺伝子の選択的ＲＮＡスプライシングを説明する図。
【図２−１】クロトー遺伝子の選択的ＲＮＡスプライシングを説明する図。
【図２−２】同上。
【図３】室温および他の温度での、長期間にわたる、ヒト血清中のクロトータンパク質の驚くべきかつ予想外の安定性を例示する図。
【図４】精製されたタンパク質の純度および完全性を、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ試薬で染色した４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元）で分析した図。
【図５Ａ】用量応答性曲線を示す。
【図５Ｂ】用量応答性曲線を示す。
【図６】用量応答性曲線を示す。
【図７Ａ】精製された抗体の純度および完全性を、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ試薬で染色した４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元）で分析した図。
【図７Ｂ】精製された抗体の純度および完全性を、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ試薬で染色した４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元）で分析した図
【図８Ａ】４５０ｎｍでの生吸光度データおよび対応する抗体滴定曲線。
【図８Ｂ】４５０ｎｍでの生吸光度データおよび対応する抗体滴定曲線。
【図９Ａ】ＩｇＹ／ＨＲＰ−ＩｇＹペアには比較的弱いシグナルが存在することを示す。
【図９Ｂ】ＩｇＹ／ＨＲＰ−ＩｇＹペアには比較的弱いシグナルが存在することを示す。
【図１０】ヒト対象における循環クロトータンパク質レベルの（毎日の）変化のグラフ表示。
【図１１Ａ】クロトータンパク質のさらなる測定を示す。
【図１１Ｂ】クロトータンパク質のさらなる測定を示す。
【図１２−１】室温での異なるインキュベーション時間でのクロトーレベルを示す。
【図１２−２】同上。
【図１３】例示的なレポートのグラフまたはチャートを示す。
【図１４】クロトー−Ｆｃタンパク質のクロマトグラフを示す。
【図１５Ａ】抗Ｆｃ抗体−（配列番号５２および５４）またはＳｔｒｅｐ−タクチン−（配列番号６６）ＨＲＰ共役体ベースの検出を使用する例示的なウェスタンブロット分析。
【図１５Ｂ】抗Ｆｃ抗体−（配列番号５２および５４）またはＳｔｒｅｐ−タクチン−（配列番号６６）ＨＲＰ共役体ベースの検出を使用する例示的なウェスタンブロット分析。
【図１６Ａ】抗Ｆｃ抗体−（配列番号５２および５４）またはＳｔｒｅｐ−タクチン−（配列番号６６）ＨＲＰ共役体ベースの検出を使用する例示的なウェスタンブロット分析。
【図１６Ｂ】抗Ｆｃ抗体−（配列番号５２および５４）またはＳｔｒｅｐ−タクチン−（配列番号６６）ＨＲＰ共役体ベースの検出を使用する例示的なウェスタンブロット分析。
【図１７】様々な示される組換えクロトータンパク質構築物のゲルを示す。
【図１８−１】それぞれの示される組換えクロトータンパク質構築物の一連のゲルを示す。
【図１８−２】同上。
【図１８−３】同上。
【図１８−４】同上。
【図１８−５】同上。
【図１９】上位１０個のクローンから評価した密度のデータ。
【図２０】上位１０個のクローンから評価した生存率のデータ。
【図２１】上位１０個のクローンから評価した産生性のデータ。
【図２２】上位１０個のクローンから評価した産生性のデータ。
【図２３】上位４つのクローンのデータ。
【図２４】上位４つのクローンのデータ。
【図２５】上位４つのクローンのデータ。
【図２６】上位４つのクローンのデータ。
【図２７】コピー数の安定性を示す。
【図２８】クローンのうちの５つの安定性を示す。
【図２９】クローンのうちの５つの安定性を示す。
【図３０】クローンのうちの５つの安定性を示す。
【図３１】クローンのうちの５つの安定性を示す。
【図３２】クローンのうちの５つの安定性を示す。
【図３３】ＥＬＩＳＡ後にゲル上で観察した精製クロトータンパク質を示す。
【図３４Ａ】測定されたクロトータンパク質濃度およびそれぞれの試料中で観察されたスパイク回収率を示す。
【図３４Ｂ】測定されたクロトータンパク質濃度およびそれぞれの試料中で観察されたスパイク回収率を示す。
【図３４Ｃ】測定されたクロトータンパク質濃度およびそれぞれの試料中で観察されたスパイク回収率を示す。
【図３５Ａ】網羅的グリカン予備分析。
【図３５Ｂ】網羅的グリカン予備分析。
【図３６Ａ】各細胞株の成長を示す。
【図３６Ｂ】各細胞株の生存率を示す。
【図３６Ｃ】各細胞株の力価曲線を示す。
【図３７Ａ】各細胞株の成長を示す。
【図３７Ｂ】各細胞株の生存率を示す。
【図３７Ｃ】各細胞株の力価曲線を示す。
【図３８Ａ】各細胞株の成長を示す。
【図３８Ｂ】各細胞株の生存率を示す。
【図３８Ｃ】各細胞株の力価曲線を示す。
【図３９Ａ】発現タンパク質プールに対するウェスタンブロット分析。
【図３９Ｂ】発現タンパク質プールに対するウェスタンブロット分析。
【図４０Ａ−１】クロトータンパク質の溶出を示す。
【図４０Ａ−２】同上。
【図４１Ａ】クロトータンパク質の溶出を示す。
【図４１Ｂ】クロトータンパク質の溶出を示す。
【図４２】Ｋｏｎ（会合）、Ｋｏｆｆ（解離）、およびＫＤ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）の分析を示す。
【図４３Ａ】天然ＨｉｓおよびＦｃ−クロトーの両方の精製クロトータンパク質が、用量依存的な方法で細胞増殖を刺激したことを示す図。
【図４３Ｂ】天然ＨｉｓおよびＦｃ−クロトーの両方の精製クロトータンパク質が、用量依存的な方法で細胞増殖を刺激したことを示す図。
【図４３Ｃ】天然ＨｉｓおよびＦｃ−クロトーの両方の精製クロトータンパク質が、用量依存的な方法で細胞増殖を刺激したことを示す図。
【図４３Ｄ】天然ＨｉｓおよびＦｃ−クロトーの両方の精製クロトータンパク質が、用量依存的な方法で細胞増殖を刺激したことを示す図。
【図４３Ｅ】天然ＨｉｓおよびＦｃ−クロトーの両方の精製クロトータンパク質が、用量依存的な方法で細胞増殖を刺激したことを示す図。
【図４４】１２日間の試験（毎日）の経過にわたる各群のラットの平均（平均）体重（平均の±標準誤差、ＳＥＭバー）を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
本開示の実施形態は、ヒトまたは非ヒト動物（または哺乳動物）対象における血清可溶性クロトータンパク質レベルを増加させるための組成物および方法と、クロトータンパク質レベル（複数可）、具体的には内因性および／もしくは外因性可溶性アルファクロトータンパク質レベル（複数可）を監視、検出、および／もしくは定量化するための、ならびに／または対象におけるクロトータンパク質欠損の診断および／もしくは治療するための組成物および方法とに関する。いくつかの実施形態は、（ｉ）組換えヒトクロトータンパク質、タンパク質断片、および／もしくはタンパク質多様体、発現核酸構築物および／もしくはベクター、細胞株および／もしくは細胞懸濁培養物、ならびに／または（ｉｉ）対象に投与されると、クロトータンパク質レベル（複数可）、発現、もしくは産生、具体的には内因性可溶性アルファクロトータンパク質レベル（複数可）、発現、もしくは産生の増加を引き起こす、製品（例えば、補充剤）を含む、１つ以上の組成物を含む。特定の実施形態は、本開示の組成物を製造し、それを精製し、それを（ヒトもしくは非ヒト動物）対象に投与する方法、および／または対象におけるクロトータンパク質レベル（複数可）、発現、もしくは産生、具体的には（内因性および／もしくは外因性）可溶性アルファクロトータンパク質レベル（複数可）、発現、もしくは産生の増加を増加させるための方法を含み得る。いくつかの実施形態は、クロトータンパク質レベル（複数可）、具体的には（内因性および／もしくは外因性）可溶性アルファクロトータンパク質レベル（複数可）を監視、検出、および／もしくは定量化するための方法、ならびに／または対象におけるクロトータンパク質欠損を診断するための方法を含む。
【００６２】
本開示の様々な実施形態を詳細に説明する前に、本開示は、それぞれの実施形態で変動し得る特定のパラメータ、言い回し、ならびに特定の例示されたシステム、方法、および／または製品の説明のみに限定されないことが理解されるものである。したがって、本開示の特定の実施形態は、特定の特性（例えば、構成、パラメータ、特性、ステップ、構成要素、成分、部材、要素、部品、および／または部分など）を参照して詳細に説明されるが、説明は、例示的なものであり、本開示および／または特許請求される発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。加えて、本明細書で使用される用語は、実施形態を説明する目的のためであり、必ずしも本開示および／または特許請求される発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００６３】
詳細な説明は、段落に分かれているが、各段落内の段落見出しおよび内容は、構成的な目的のみに過ぎず、独立した説明および実施形態であること、または説明もしくは特許請求の範囲を限定することを意図しない。むしろ、詳細な説明の中の各段落の内容は、１つの段落の要素が他の段落に関係し、かつ／または他の段落の特徴をなし得る集合的な全体として読み取られ、理解されることを意図する。したがって、１つの段落内に具体的に開示される実施形態はまた、同じおよび／または同様の製品、方法、および／または用語を有する別の段落内の追加のおよび／または代替的な実施形態に関係し得、かつ／または機能し得る。
【００６４】
理解を促進するために、可能な場合は、本開示の異なる実施形態に共通の同様の要素を表記するために、同様の参照（すなわち、構成要素および／または要素の同様の名称）が使用されている。同様に、同様の構成要素、または同様の機能を有する構成要素は、可能な場合は、同様の参照表記で提供されるであろう。本明細書では、例示的な実施形態を説明するために特定の言語が使用されるであろう。それでもなお、それによって本開示の範囲を限定することを意図しないことが理解されるであろう。むしろ、例示的な実施形態を説明するために使用される言語は、（そのような言語が不可欠であると明らかに本明細書に記載されない限り）例示に過ぎず、本開示の範囲を限定するものと解釈されるものではないことが理解されるものである。
【００６５】
簡潔にするために、本開示は、数値のリストまたは範囲を列挙し得る。しかしながら、数値のそのようなリストまたは範囲（例えば、特定の値を超える、特定の値未満、最大特定の値、少なくとも特定の値、および／もしくは約特定の値、ならびに／または２つの列挙された値の間）が開示または列挙される場合、開示される値もしくはリスト、または値の範囲内にある任意の特定の値または値の範囲は、同様に、本明細書に具体的に開示および企図されることが理解されるであろう。例示的な例として、「最大１，０００ｍｇ」の特定の成分または構成成分の開示は、（ｉ）０．０１ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、９９０ｍｇ、および１，０００ｍｇを含むがこれらに限定されない、ゼロを超え、かつ１，０００ミリグラム以下の任意の値、ならびに／または（ｉｉ）０．０１〜１，０００ｍｇ、１ｍｇ〜９９０ｍｇ、５ｍｇ〜７５０ｍｇ、１０ｍｇ〜５００ｍｇ、および５０ｍｇ〜１００ｍｇを含むがこれらに限定されない、ゼロを超え、かつ１，０００ミリグラム以下、もしくはその間の任意の値の範囲の具体的な開示を含む。同様に、「少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性」または「８０％〜１００％のアミノ酸配列同一性」の開示は、（ｉ）８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％を含む、８０％〜１００％の任意の全パーセンテージ値、ならびにその間のパーセント値の任意の小数部分、ならびに／または（ｉｉ）非限定的な例として、８１％〜１００％、８２％〜１００％、８３％〜１００％、８４％〜１００％、８５％〜１００％、８６％〜１００％、８７％〜１００％、８８％〜１００％、８９％〜１００％、９０％〜１００％、９１％〜１００％、９２％〜１００％、９３％〜１００％、９４％〜１００％、９５％〜１００％、９６％〜１００％、９７％〜１００％、９８％〜１００％、および９９％〜１００％を含む、８０％〜１００％の任意のパーセンテージ値の範囲の具体的な開示を含む。
【００６６】
定義された用語の概略リスト
前述の範囲および内容ならびに以下に記載の説明および特許請求の範囲の理解を助けるために、選択されたいくつかの用語を以下に定義する。
【００６７】
別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
システム、方法、および／または製品を含む本開示の様々な態様は、本質的に例示的な１つ以上の実施形態を参照して例示され得る。本明細書で使用される場合、用語「実施形態」は、「例、事例、または例示としての役割を果たす」ことを意味し、必ずしも本明細書に開示される他の態様よりも好ましいか、または有利であると解釈されるべきではない。加えて、本開示または本発明の「実施形態」への言及は、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を限定することなく、例示的な例を提供することを意図する。
【００６８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は各々、別段文脈により明確に指示されない限り、単数および複数の指示対象の両方を企図し、含み、かつ具体的に開示する。例えば、「タンパク質」への言及は、１つ、および複数（例えば、２つ以上、３つ以上など）のタンパク質を企図し、かつ具体的に開示する。同様に、複数の指示対象の使用は、必ずしも複数のそのような指示対象を必要としないが、別段文脈により明確に指示されない限り、単数および複数のそのような指示対象の支持を企図し、含み、具体的に開示し、かつ／または提供する。
【００６９】
本開示を通して使用される場合、単語「し得る（ｃａｎ）」および「してもよい（ｍａｙ）」は、強制的な意味（すなわち、しなければならない（ｍｕｓｔ）を意味する）ではなく、むしろ許容的な意味（すなわち、可能性を有することを意味する）で使用される。加えて、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「関与する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」、それらの変形（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ」、および「関与する（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」など）、ならびに特許請求の範囲を含む本明細書で使用される同様の用語は、包括的かつ／または無制限であるものとし、例示的に、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその変形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）と同じ意味を有するものとし、かつ追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。
【００７０】
実施例を除いて、または別段明示的に示される場合を除いて、材料または反応条件および／または使用の量を示す、この説明における全ての数値は、単語「約」によって修飾されることが理解されるものである。本明細書で使用される場合、値に関して、用語「約」は、記載された値の＋／−１０％またはそれによって表される量を意味する。例えば、本開示を通して、用語「約」は、構成要素または成分のパーセント濃度または組成（例えば、流体または液体混合物、水性混合物、溶液などの混合物中、任意でまたは好ましくはｗ／ｗパーセント、ｗ／ｖパーセント、ｖ／ｖパーセントなどとして測定される）に関して使用される。そのような場合、用語「約」および／または用語「＋／−１０％」は、列挙されたパーセントの＋／−１０パーセントポイントとは対照的に、記載された数値の＋／−１０％を意味し、かつ／または含む。例として、構成要素または成分の２０％（ｗ／ｗ）が、全混合物１００ｍＬ当たり２０ｇの構成要素または成分を反映する場合、用語「約」および／または用語「＋／−１０％」は、１０％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）の範囲ではなく、１８ｇ〜２２ｇ（すなわち、１８％（ｗ／ｗ）〜２２％（ｗ／ｗ））の列挙された範囲を意味し、かつ／または含む。いわゆる「約」値および／または＋／−１０％の代替は、記載された値の＋／−１％、＋／−２％、＋／−３％、＋／−４％、＋／−５％、＋／−６％、＋／−７％、＋／−８％、または＋／−９％を含み、この各々が、本明細書では用語「約」または＋／−１０％の使用の好適な代替または代用として考えられる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「およそ」および「実質的に」は、（例えば、依然として所望の機能を果たすか、または（所望もしくは予想される）結果を達成する）記載された量に近い（または任意の）量を表すか、または意味する。例えば、用語「およそ」および「実質的に」は、記載された量の１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、もしくは他のパーセントの範囲内またはそれ未満の量を指し得る。本明細書で使用される場合、用語「実質的に含まない」は、（１）検出不能もしくは定量不可能な量、（２）検出可能もしくは定量可能な量を反映すると当業者によって一般に見なされる量未満もしくはそれより少ない量、および／または（３）機能的であるか、もしくは（所望のもしくは予想される）結果を達成することができると当業者によって一般に見なされる量未満もしくはそれより少ない量（例えば、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、もしくは他のパーセント未満）を意味する。
【００７２】
「適量」（「適量（ｑ．ｓ．）」または「適量（ｑｓ）」とも称される）は、十分な量を意味する。したがって、「適量１００％の」、「適量１００％で提供される」、または「１００％まで適量の」構成要素または成分は、構成要素または成分が、組成物を完成させるのに、または（列挙されているかどうかにかかわらず、全ての構成要素の）全体を１００％にもたらすのに十分な量で提供されるか、または含まれることを示す。しかしながら、「適量１００％の」、「適量１００％で提供される」、または「１００％まで適量の」（最終）構成要素または成分は、混合物が、「適量１００％の」構成要素の直前にリストまたは列挙された構成要素からなるか、それらから本質的になるか、またはそれらのみを含有することを示すものではないことに留意されたい。言い換えれば、「適量１００％の」および同様の用語は、その残りが何であれ、その残りの供給源を示す無制限の表現であることが意図される。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「製品（複数可）」は、組成物、製剤、および混合物、ならびにデバイス、機器、アセンブリ、キット、およびシステムなどを含む。同様に、用語「方法」は、プロセス、手順、およびステップなどを含む。
【００７４】
本明細書で使用される場合、本開示または本明細書に開示される実施形態の「特性」または「態様」は、当面の主題の、特性、特質、構成要素、成分、要素、メンバー、部品、部分、（方法）ステップ、または他の面を指す。
【００７５】
本明細書で使用される場合、単語「または」は一般に、特定のリストの任意の１つの部材を意味するが、該リストの２つ以上の部材の任意の組み合わせも含む。同様に、用語「および」は、用語「または」と互換的であり得、そのいずれも「および／または」を意味すると理解され得る。
【００７６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義である。これらの用語は、包括的かつ無制限であり、追加の、引用されていない要素または方法ステップを除外しない。
【００７７】
語句「からなる」は、特許請求の範囲で特定されていない要素、ステップ、または成分を除外する。この語句が、前文の直後ではなく、むしろ請求項本文の条項に出現する場合、それは、その条項に記載の要素のみを限定し、他の要素は、請求項全体から除外されない。
【００７８】
語句「から本質的になる」は、請求項の範囲を、特定の材料またはステップに加えて、特許請求される主題の基本的かつ新規の特徴（複数可）に実質的に影響しないものに限定する。
【００７９】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる」、および「から本質的になる」は、代替的に使用され得る。これら３つの用語の１つが使用される場合、現在開示され、特許請求される主題は、他の２つの用語のいずれかの使用を含み得る。
【００８０】
用語「複数」および「少なくとも２つ」は、互換的に使用される。
用語「病態」は、当業者によって理解されるように、患者において現れるかまたは予期される任意の障害、疾患、傷害、または疾病を指す。そのような病態の現れは、病態前の症状、予兆、またはマーカーを含む、当該技術分野で既知の早期、中期、または後期段階の現れであり得る。そのような病態の予期は、科学的もしくは医学的根拠、リスク評価、または単なる不安もしくは恐怖のいずれに見出されるかにかかわらず、病態の予測、予想、想像、推定、想定、および／または憶測される発生であり得るか、またはそれらを含み得る。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、用語「対象」と同義であり、その用語が本明細書で定義されるように、具体的には（ｉ）（医師、看護師、医療助手、または医療ボランティアの保護下の）ヒト、および（ｉｉ）（獣医師もしくは他の獣医学専門家、助手、またはボランティアの保護下の）非ヒト哺乳動物などの非ヒト動物に関して、一般に、医療専門家の保護下の任意の動物を指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「医療専門家」という用語は一般に、ヒト、および非ヒト哺乳動物などの非ヒト動物を含む動物に医療を提供する責任を負う任意の個人または機関を指し、有資格医療提供者または無資格提供者（助手、技術者、および／またはボランティアなど）、具体的には（包括的な）免許または医療提供者の保険の対象となる者に重点を置いている。この用語は、文脈上適切な場合、腫瘍医、外科医、または医師助手、看護師、採血技師（ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｉｓｔ）、獣医師などを含み得る。
【００８３】
用語「癌」は、異常な、典型的には制御されない細胞成長を指す。本明細書で使用される場合、「癌細胞」は、異常な、典型的には制御されない成長を有する悪性細胞を含む。このように、用語、癌は、典型的には制御されない方式で成長する悪性細胞を特徴とする、複数の異なる別個の疾患を包含する包括的な用語である。
【００８４】
本書で使用される場合、用語「診断」または「診断すること」および同様の用語は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または任意の他の政府もしくは非政府機関、組織、もしくは機関によって要求または規制される、認定され規制に準拠した医療診断を（いかなる場合でも）伝達または要求することを意図しない。むしろ、本明細書で使用される場合、「診断」または「診断すること」および同様の用語は、病態を示す、および／または病態に関連する判定を行うのに役立ち得る情報を提供することに関する。
【００８５】
用語「同時投与」および同様の用語は、２つ以上の構成成分の並行、連続、および／または併用投与を指す。例えば、２つの構成成分は、各構成成分を別個の投薬量で並行、同時、または連続投与（例えば、ある期間によって隔てられた別個の投与）することによって、同時投与され得る。期間は、非常に短く（例えば、実質的に第１の投与の直後）ても、それより長く（例えば、１〜６０秒、１〜６０分、１〜２４時間、１〜７日、１〜４週間、１〜１２ヶ月など、またはそれらの間の任意の値もしくは値の範囲）てもよい。並行または同時投与には、２つ以上の構成成分の投与時間枠の重複、または２つ以上の構成成分の混合物を含む組み合わせ製品の投与が含まれ得る。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「室温」は、凝固点（０℃、または凝固点調整構成要素の存在に応じて他の（等価の）凝固温度）を超え、かつ通常のヒトの体温（３７℃、または沸点調整構成要素の存在に応じて他の（等価の）沸騰温度）未満の、好ましくは約４度を超え、かつ約３５℃未満、より好ましくは約５℃〜約３２℃、約８℃〜約３０℃、約１０℃〜約３０℃、約１０℃〜約２５℃、約１０℃〜約２０℃、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約３０℃、約１５℃〜約２５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約３０℃、約２０℃〜約２５℃、約２０℃〜約２２℃、またはそれらの間の任意の値もしくは値の範囲の任意の温度を指し得る。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「冷蔵」は、凝固点（０℃）を超え、かつ約３２℃未満、好ましくは約１℃〜約３０℃、約１℃〜約２５℃、約１℃〜約２０℃、約１℃〜約１５℃、約２℃〜約２０℃、約２℃〜約１５℃、約３℃〜約２０℃、約３℃〜約１５℃、約４℃〜約２０℃、約４℃〜約１５℃、またはそれらの間の任意の値もしくは値の範囲の温度を指し得る。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「核酸」および同様の用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンスのいずれかの、天然に存在するか、または合成のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。具体的には、核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。本開示の核酸にはまた、当該技術分野で既知のヌクレオチドまたは核酸類似体（例えば、ＢｒｄＵ）、および非ホスホジエステル（ヌクレオシド間）結合または主鎖（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）が含まれ得る。
【００８９】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」または「タンパク質」は、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物、またはタンパク質を指す。ペプチドは、連続したアミノ酸で構成される。用語「ペプチド」または「タンパク質」は、天然に存在するか、または合成の分子を包含する。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「標準アミノ酸」には、アラニン−ａｌａ−Ａ；アルギニン−Ａｒｇ−Ｒ；アスパラギン−ａｓｎ−Ｎ；アスパラギン酸−ａｓｐ−Ｄ；システイン−ｃｙｓ−Ｃ；グルタミン−ｇｌｎ−Ｑ；グルタミン酸−ｇｌｕ−Ｅ；グリシン−ｇｌｙ−Ｇ；ヒスチジン−ｈｉｓ−Ｈ；イソロイシン−ｉｌｅ−Ｉ；ロイシン−ｌｅｕ−Ｌ；リジン−ｌｙｓ−Ｋ；メチオニン−ｍｅｔ−Ｍ；フェニルアラニン−ｐｈｅ−Ｆ；プロリン−ｐｒｏ−Ｐ；セリン−ｓｅｒ−Ｓ；スレオニン−ｔｈｒ−Ｔ；トリプトファン−ｔｒｐ−Ｗ；チロシン−ｔｙｒ−Ｙ；およびバリン−ｖａｌ−Ｖが含まれる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「コドン最適された」または「コドン最適化」は、ヌクレオチド配列内のコドンを、その分子の発現のために使用される生物におけるコドン使用パターンに好ましいか、またはより密接に一致するコドンに修飾するか、または変化させるプロセスを指す。したがって、核酸の発現の有効性を増強させるために、例えば、より速い翻訳速度および高精度を達成するために、生物における既知のコドン使用に基づいて発現が所望される特定の生物への使用のために、コドンが最適化され得る。特定の生物におけるコドン使用は、既知である。
【００９２】
コード核酸分子は、修飾野生型、またはコドンが特定の宿主細胞内、例えば、ＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞などの哺乳動物細胞内、または酵母中、または植物細胞内、真核細胞内などで発現するように最適化された、コドン最適化配列であり得る。
【００９３】
特定の例では、核酸配列は、例えば、コードされた配列の発現レベルを増加させるために、コドン最適化され得る。特定のコドン使用は、修飾ポリペプチドが発現される宿主生物に依存する。当業者は、哺乳動物またはヒト細胞内、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉもしくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む細菌中または酵母中での発現に最適なコドンに精通している。例えば、コドン使用情報は、ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ．ｃｏｄｏｎで入手可能なＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅから入手可能である（データベースの説明については、例えば、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１：２４１を参照されたい。また、Ｆｏｒｓｂｕｒｇ（２００４）Ｙｅａｓｔ，１０：１０４５−１０４７、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：４２９８、Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：８２０７−８２１１、Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｙｅａｓｔ，６５７−７８も参照されたい）。
【００９４】
頭字語または他の略語の最初の定義は、同じ略語の後続する全ての使用に適用され、最初に定義された略語の通常の文法的多様性に準用され、特に反対に明確に記載されない限り、特性の測定は、同じ特性について以前または後に言及されたものと同じ技術によって判定される。
【００９５】
例示的な実施形態
本開示の例示的な実施形態には、組成物、物質の組成物、製品、製造品、製剤、組み合わせ製品、同時投与、共製剤、投薬量、プロセス、方法、治療プロトコル、診断方法、キットなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
血中クロトータンパク質を安定化させるための製品および方法
特に室温での、およびより特に（延長された）期間の血中または血清中のクロトータンパク質（例えば、可溶性クロトー）の安定性は、以前に報告されていない。図３は、室温および他の温度での、長期間にわたる、ヒト血清中のクロトータンパク質の驚くべきかつ予想外の安定性を例示する。
【００９７】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、典型的な血液または血清タンパク質診断は、タンパク質（レベル）の監視、検出、および／または定量化に好適な量の血液を採取するために、静脈採血を必要とする。さらに、採血された血液試料は、典型的には、サンプリング直後に処理されるか（例えば、同日、サンプリングから数分もしくは数時間以内など）、またはタンパク質および試料の安定性の保存のために冷蔵（室温未満）される。しかしながら、本開示のいくつかの実施形態では、本発明者らは、血中クロトータンパク質が、室温で最大７日、９日、１４日、またはそれ以上安定であり得ることを見出した。いくつかの実施形態では、例えば、試料にＥＤＴＡおよび／またはヘパリンを添加することにより、室温で、クロトータンパク質を少なくとも３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、または３０日間安定化させ得る（データ示さず）。非限定的な例として、４人のドナーから採取した血液試料中のクロトーのレベルは、ＥＤＴＡおよび／またはヘパリンを添加した場合、室温で、７日間（および１４日間）にわたって比較的一定であった（図３を参照されたい）。加えて、試験した両方の抗凝血剤、ＥＤＴＡおよびヘパリンは、クロトー濃度に関して有意差を示さなかった。これは、発明者にとって驚くべきかつ予想外のことであった。
【００９８】
室温での保管は、数百、数千、数万などの試料の冷蔵が（論理的および／または金銭的に）商業的に実用的ではない場合がある商業的診断用途にとって重要であり得る。本明細書に記載の好適な室温安定化方法を使用した場合、クロトー血液または血清レベルの商業的診断試験が達成され得る。
【００９９】
前述の見地から、本開示の実施形態は、ＥＤＴＡおよび／またはヘパリンを、クロトータンパク質を含有する生物学的試料（例えば、血液または血清）に組み合わせる方法および／または製品を含み得る。いくつかの例示的な製品は、試料採取容器および試料保存組成物を含む試料採取キットを含み得る。
【０１００】
いくつかの実施形態は、哺乳動物血液試料中のクロトータンパク質を安定化させる方法を含む。方法は、哺乳動物対象から毛細血管血を取得することを含み得る。毛細血管血は、ある量の可溶性クロトータンパク質を含有し得る（か、または含有する疑いがあり得る）。方法は、好ましくは室温で、毛細血管血を（例えば、容器内に）少なくとも２４時間（または好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１８、２１、２８、もしくは３０日間、またはそれ以上）保管することを含み得る。毛細血管血試料は、保存剤または抗凝血剤と混合され得る。例えば、保存剤または抗凝血剤が容器内の毛細血管血と混合されるように、その中に配置またはそれに添加された保存剤または抗凝血剤を有し得る。保存剤または抗凝血剤は、ヘパリン、ヘパリンリチウム、ＥＤＴＡ、およびＫ２ＥＤＴＡの１つ以上であるか、またはそれを含み得る。保存剤または抗凝血剤は、好ましくは室温で、可溶性クロトータンパク質を少なくとも２４時間（またはそれ以上）安定化させ得る。しかしながら、本明細書では冷蔵および／または凍結もまた企図されることが理解されるであろう。
【０１０１】
加えて、発明者らは、フィンガー・スティック法（約１０〜１０００μｌ、好ましくは約５０〜２００μｌの血液）で測定されるクロトータンパク質レベルが、同じ対象の静脈採血から測定されるクロトータンパク質レベルと一致することを見出した。したがって、クロトータンパク質は、比較的少ない商業的に実用的な血液量で、正確に、再現性よく、および確実に測定され得る。これは、発明者にとって驚くべきかつ予想外のことであった。具体的には、発明者らは、血中クロトータンパク質を正確に、再現性よく、および確実に測定するには、標準的なバイアルに採取される血液量が必要とされ得ると予想していた。
【０１０２】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、静脈採血（例えば、ＦＤＡ承認または他の診断）は、典型的には、専門の採血技師を必要とする。静脈採血はまた、患者にとっても不便であり、痛みを伴う。一方、フィンガー・スティック法は、簡便かつ低費用である。商業的に、直接消費者向け用途（例えば、診断キット）は、自宅での血液サンプリングを必要とし得る。そのような場合では、静脈採血は、望ましくない、および／または非実用的であり得る。本開示の実施形態は、単純かつ簡便な指刺（または毛細血管血をサンプリングする他の手段）による毛細血管血サンプリングを可能にし得る。サンプリングされる毛細血管血の量は、例えば、約１０〜１０００μｌ、好ましくは約２０〜８００μｌ、より好ましくは約３０〜６００μｌ、さらにより好ましくは約４０〜４００μｌ、さらにより好ましくは約５０〜２００μｌの毛細血管血であり得る。
【０１０３】
前述の見地から、本開示のいくつかの実施形態は、血液または血清の毛細血管血（非静脈、非瀉血など）サンプリングのための製品および方法を含み得る。いくつかの実施形態は、毛細血管血サンプリングデバイスを含み得る。例示的に、毛細血管血サンプリングデバイスは、ランセット切開デバイスであり得るか、もしくはそれを含み得、かつ／または（血液）ランセットを含み得る）。いくつかの実施形態では、血液サンプリングまたはランセット切開デバイスは、（ばね式）指刺器などのフィンガー・スティック機器であり得るか、またはそれを含み得る。しかしながら、本開示は、指および迅速指刺デバイスに限定されないことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、ランセット切開デバイスまたはそのランセットは、使い捨てかつ／または交換可能であり得る。実施形態はまた、キットを使用して、血液試料を採取するための書面による指示を含み得る。
【０１０４】
哺乳動物血液試料中のクロトータンパク質を安定化させる例示的な方法は、哺乳動物対象から毛細血管血を取得することであって、毛細血管血が、ある量の可溶性クロトータンパク質を含有する、取得することと、室温で、毛細血管血を容器内で少なくとも２４時間保管することであって、容器が、その中に配置された保存剤または抗凝血剤を有し、保存剤または抗凝血剤が、容器内の毛細血管血と混合され、保存剤または抗凝血剤が、室温で、可溶性クロトータンパク質を少なくとも２４時間安定化させ、保存剤または抗凝血剤が、ヘパリン、リチウムヘパリン、ＥＤＴＡ、およびＫ２ＥＤＴＡの１つ以上を含む、保管することと、を含み得る。いくつかの実施形態では、保存剤または抗凝血剤と混合された毛細血管血を、室温で、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１８、２１、２８、又は３０日間保管することであって、保存剤または抗凝血剤が、室温で、可溶性クロトータンパク質を少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１８、２１、２８、又は３０日間安定化させる、保管すること。特定の実施形態では、混合物の試料はまた、冷蔵されてもよい。
【０１０５】
特定の実施形態では、少量の血液（１〜４滴、約１０〜１０００μｌ、好ましくは約５０〜２００μｌ）が（例えば、自宅で）採取され得、非凍結、非冷蔵、または非冷却（例えば、周囲温度もしくは室温）の、診断施設への通常の輸送方法を介して送られ得る。これは、既存の方法または製品に比べて実質的な利益を提供する。したがって、個人的、自宅、または他の非診療ベースの試験または診断（例えば、定量化／測定指標を伴う側方流動、自宅用ＥＬＩＳＡキットなど）が本明細書で企図される。しかしながら、本明細書では、臨床または臨床ベースの試験または診断もまた企図されることが理解されるであろう。
【０１０６】
クロトータンパク質レベルを測定するための製品および方法
いくつかの実施形態は、内因性および／または外因性クロトータンパク質、ならびにより具体的には内因性および／または外因性可溶性アルファクロトータンパク質を検出および／または定量化する方法を含む。いくつかの実施形態は、対象におけるクロトータンパク質欠損を診断する方法を含む。いくつかの実施形態は、クロトータンパク質レベル、ならびにより具体的には内因性および／または外因性の可溶性アルファクロトータンパク質レベルを検出および定量化するための製品（例えば、システムまたはキット）を含む。いくつかの実施形態は、対象におけるクロトータンパク質欠損を診断する方法を含む。
【０１０７】
哺乳動物の血清中の循環可溶性クロトータンパク質のレベルは、加齢とともに減少すると仮定されている。しかしながら、本開示の前には、血清クロトーレベルのこの仮定された減少が何歳で起こり始め得るのか、ヒトおよび非ヒト動物における天然に存在する可溶性循環クロトータンパク質の正常レベル（または範囲）が何であるのか、ヒトおよび非ヒト動物における循環クロトーの低下速度が何であるのか、ならびにヒトおよび非ヒト動物における天然に存在する可溶性クロトータンパク質のレベル（または範囲）がどの程度低くなるのかについての確実で再現性のよいデータは、入手可能ではないか、または広く受け入れられていない。市販の抗体は、（粗および／または実質的に未精製の）哺乳動物血液または血清試料中の（内因性および外因性の両方の）クロトータンパク質の、確実な、再現性のよい、および／または費用効果の高い検出には、好適でない場合がある。したがって、（例えば、血液試料ＥＬＩＳＡ検出用の）好適な抗体を、以下の手順に従って開発した。
【０１０８】
第１相：クロトータンパク質発現：（Ｃ末端）６ｘＨｉｓタグ、（Ｃ末端）Ｆｃタグ、または（Ｎ末端もしくはＣ末端）ＨＡＳタグを有する、様々なサイズの（マウスおよびヒトの）アルファクロトータンパク質（例えば、ヒトの場合、アミノ酸残基３４〜９８１、３４〜５４９など）を製造した。上記のタンパク質に対応する遺伝子構築物を合成し、市販の発現ベクターにクローニングし、その後これをクロトータンパク質産生のためにＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。発現されたクロトータンパク質を、既知かつ本開示に記載の方法によって精製した。例示的に、ＩＭＡＣおよびＩＥタンパク質クロマトグラフィーを使用して、３３０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ８．０中の（２８０ｎｍのＵＶ吸光度で測定される）０．７８ｍｇ／ｍＬのタンパク質試料を得た。同様に、本明細書に記載のプロテインＡクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体ならびに多量体（例えば、二量体および四量体）の形態の活性タンパク質を得た。
【０１０９】
品質管理：精製されたタンパク質の純度および完全性を、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ試薬で染色した４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元）で分析した。例えば、図４を参照されたい。
【０１１０】
レーン１：クロトーＥＣＤ、ロット番号１７０９１８Ａ、２μｇ／レーン、還元。
レーンＭ：タンパク質分子量マーカー。
レーン２：クロトーＥＣＤ、ロット番号１７０９１８Ａ、２μｇ／レーン、非還元。
【０１１１】
レーン３：ＢＳＡ標準、２μｇ／レーン、還元
発現されたタンパク質の理論上の分子量計算値は、１０９．９７ｋＤａであった。
第２相：ニワトリポリクローナル（ＩｇＹ）およびマウスモノクローナル（ハイブリドーマ）の開発：発現されたタンパク質を抗原として使用して、マウスおよびニワトリを免疫し、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を開発した。ＥＬＩＳＡ抗体のいくつかの実施形態では、マウスモノクローナルが好ましい。融合プロセス（骨髄腫細胞を有する脾細胞）の後に、２ラウンドのハイブリドーマ選択を実施し、約３，０００個のクローンを最初にスクリーニングし、最終的には活性に基づいて１０個のクローンに絞り込んだ。これら１０個のクローンを保存し、培養および精製して、各々から約５ｍｇの精製された抗体を生成した。
【０１１２】
以下の表は、間接ＥＬＩＳＡ（標準的なＥＬＩＳＡプロトコル、ＴＭＢ５分間）による、標的抗原を使用した例示的なマウス血清ＩｇＧ力価評価を示す。
抗原１−５０ｍＭの重炭酸Ｎａ緩衝液中の６ｘＨｉｓタグ付きクロトー０．５μｇ／ｍＬ。
【０１１３】
抗原２−５０ｍＭの重炭酸Ｎａ緩衝液中のクロトー−Ｆｃ０．５μｇ／ｍＬ。
【０１１４】
【表１−１】
2021508037.tif 000003
【０１１５】
【表１−２】
2021508037.tif 000004
【０１１６】
表１の要約：マウスＭ３およびＭ５を、脾臓採取のために選択した。
クロトーハイブリドーマの一次スクリーニング：マウス番号Ｍ３および番号Ｍ５の脾細胞を採取し、標準的なプロトコルに従って骨髄腫細胞と融合させた。
【０１１７】
ハイブリドーマ上清を、標的抗原を使用した間接ＥＬＩＳＡによって評価した（標準的な間接ＥＬＩＳＡプロトコル、ＴＭＢ１０分間）。
抗原、５０ｍＭの重炭酸Ｎａ中のクロトータンパク質（ロット番号１７０９１８Ａ、０．７８ｍｇ／ｍＬ）０．５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、＋４℃、一晩。
【０１１８】
抗マウスＨＲＰ、ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）、Ｆｃγ断片特異的、ＳＥＤＢで１：４０００（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ．、カタログ番号１１５−０３５−１６４）、１００μＬ／ウェル、１時間、室温。
【０１１９】
選択カットオフＯＤ４５０ｎｍ＞０．５。
以下の表は、一次クロトーハイブリドーマスクリーニングを示す。ＯＤ４５０ｎｍが０．５〜＜２の間のクローンを、黄色（明るい灰色）で強調表示する。ＯＤ４５０ｎｍ＞２のクローンを、橙色（濃い灰色）で強調表示する。
【０１２０】
【表２−１】
2021508037.tif 000005
【０１２１】
【表２−２】
2021508037.tif 000006
【０１２２】
【表２−３】
2021508037.tif 000007
【０１２３】
【表２−４】
2021508037.tif 000008
【０１２４】
【表２−５】
2021508037.tif 000009
【０１２５】
【表２−６】
2021508037.tif 000010
【０１２６】
【表２−７】
2021508037.tif 000011
【０１２７】
【表２−８】
2021508037.tif 000012
【０１２８】
【表２−９】
2021508037.tif 000013
【０１２９】
【表２−１０】
2021508037.tif 000014
【０１３０】
【表２−１１】
2021508037.tif 000015
【０１３１】
【表２−１２】
2021508037.tif 000016
【０１３２】
【表２−１３】
2021508037.tif 000017
【０１３３】
【表２−１４】
2021508037.tif 000018
【０１３４】
【表２−１５】
2021508037.tif 000019
【０１３５】
【表２−１６】
2021508037.tif 000020
【０１３６】
表２の要約：２，９７６個のクローンを単離および分析した。確認スクリーニングのために拡張した、６６個の標的特異的クローン。
クロトーハイブリドーマの二次スクリーニング：ハイブリドーマ上清を、標的抗原を使用した間接ＥＬＩＳＡによって評価した（標準的な間接ＥＬＩＳＡプロトコル、ＴＭＢ１０分間）。
【０１３７】
抗原、（１）５０ｍＭの重炭酸Ｎａ中のクロトー−６ｘＨｉｓタンパク質（ロット番号１７０９１８Ａ、０．７８ｍｇ／ｍＬ）０．５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、＋４℃、一晩。（２）５０ｍＭの重炭酸Ｎａ中のクロトー−Ｆｃタンパク質（Ｖｉｓｔａ、０．１ｍｇ／ｍＬ））０．５μｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル、＋４℃、一晩。
【０１３８】
検出抗体：抗マウスＨＲＰ、ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）、Ｆｃγ断片特異的、ＳＥＤＢで１：５０００（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ．、カタログ番号１１５−０３５−１６４）、１００μＬ／ウェル、１時間、室温。
【０１３９】
【表３−１】
2021508037.tif 000021
【０１４０】
【表３−２】
2021508037.tif 000022
【０１４１】
表３の要約：２８個のクロトー−６ｘＨｉｓ特異的クローンを確認した（ＯＤ４５０カットオフ：＞０．５、クロトー−６ｘＨｉｓプレート）−１Ｆ６、２Ｅ１、２Ｅ１２、３Ｄ２、４Ｈ４、４Ｈ５、５Ｄ１２、７Ａ１２、７Ｆ９、８Ｇ１１、１０Ａ８、１０Ｄ１、１０Ｇ３、１１Ｃ９、１１Ｆ７、１１Ｈ３、１２Ｇ４、１２Ｈ３、１４Ｂ２、１４Ｂ７、１４Ｂ１２、１５Ｅ９、１６Ｈ１、１８Ｃ２、１８Ｇ５、２１Ｇ１２、２６Ｇ３、２８Ｆ１１。
【０１４２】
天然（タグなし）クロトーＥＬＩＳＡ開発（ＯＤ４５０＞２、クロトー−６ｘＨｉｓプレート）に推奨されている、９個のクロトー−６ｘＨｉｓ特異的クローンの第１のアレイ−２Ｅ１２、４Ｈ４、４Ｈ５、５Ｄ１２、１１Ｃ９、１１Ｆ７、１４Ｂ１２、２６Ｇ３、２８Ｆ１１。
【０１４３】
天然（タグなし）クロトーＥＬＩＳＡ開発（ＯＤ４５０＞１かつ＜２、クロトー−６ｘＨｉｓプレート）に推奨されている１１個のクロトー−６ｘＨｉｓ特異的クローンの第２のアレイ−１Ｆ６、２Ｅ１、３Ｄ２、７Ａ１２、７Ｆ９、８Ｇ１１、１０Ｇ３、１１Ｈ３、１４Ｂ７、１８Ｃ２、１８Ｇ５。
【０１４４】
タグなしタンパク質およびクロトー−Ｆｃタンパク質の両方を測定することができるＥＬＩＳＡの開発に推奨されている、１０個のクロトー−６ｘＨｉｓおよびクロトー−Ｆｃ特異的クローンの第１のアレイ（ＯＤ４５０＞１．７、クロトー−６ｘＨｉｓおよびクロトー−Ｆｃプレート）−１Ｆ６、２Ｅ１２、４Ｈ４、４Ｈ５、８Ｇ１１、１１Ｃ９、１１Ｆ７、１４Ｂ１２、２６Ｇ３、２８Ｆ１１。
【０１４５】
タグなしタンパク質およびクロトー−Ｆｃタンパク質の両方を測定することができるＥＬＩＳＡの開発に推奨されている、２個のクロトー−６ｘＨｉｓおよびクロトー−Ｆｃ特異的クローンの第２のアレイ（ＯＤ４５０＞１．２かつ＜１．７、クロトー−６ｘＨｉｓおよびクロトー−Ｆｃプレート）−５Ｄ１２、１４Ｂ７。
【０１４６】
ｍＩｇＧアイソタイピング：クロトーハイブリドーマ選択クローンのｍＩｇＧアイソタイピング：選択ハイブリドーマクローン培養物上清からの抗体アイソタイピング。
ハイブリドーマ培養培地の試料を使用して、急速ＥＬＩＳＡマウスｍＡｂアイソタイピングキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３７５０３）を製造業者の指示に従って使用して、抗体アイソタイプを判定した。
【０１４７】
以下の表は、クロトーハイブリドーマ選択クローンのｍＩｇＧアイソタイピングの結果を示す。
【０１４８】
【表４】
2021508037.tif 000023
【０１４９】
表４の要約：ｍＩｇＧアイソタイプ判定：
１Ｆ６、２Ｅ１２、４Ｈ４、４Ｈ５、８Ｇ１１、および１１Ｆ７：ＩｇＧ１
１１Ｃ９、１４Ｂ１２、２６Ｇ３、および２８Ｆ１１：ＩｇＧ２ｂ
品質管理：品質管理のために間接ＥＬＩＳＡを実施した：ＥＬＩＳＡプレートを、０．５μｇ／ｍｌの非共役６ｘＨｉｓタグ付きクロトータンパク質またはクロトー−Ｆｃタンパク質で、５０ｍＭの重炭酸Ｎａ緩衝液中、＋４℃で一晩コーティングした。精製された１Ｆ６、２Ｅ１２、４Ｈ４、４Ｈ５、８Ｇ１１、１１Ｃ９、１１Ｆ７、１４Ｂ１２、２６Ｇ３、および２８Ｆ１１抗体を、５００ｎｇ／ｍＬで開始する５倍連続希釈で適用し、二次抗体であるヤギ抗マウスＨＲＰを、０．１６μｇ／ｍｌで適用した。反応を、７分間発生させた。４５０ｎｍでの生吸光度データおよび対応する抗体滴定曲線。
【０１５０】
【表５−１】
2021508037.tif 000024
【０１５１】
【表５−２】
2021508037.tif 000025
【０１５２】
図５Ａ、５Ｂ、および６にそれぞれ例示される用量応答性曲線も参照されたい。
品質管理：精製された抗体の純度および完全性を、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ試薬で染色した４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元）で分析した。図７Ａおよび７Ｂをそれぞれ参照されたい。
【０１５３】
ポリクローナルＩｇＹ抗体：ポリクローナルＩｇＹ抗体もまた開発した。上記の設計を、ニワトリにおけるポリクローナルＩｇＹ抗体の産生のために必要に応じて適合させた。
間接ＥＬＩＳＡ（ＴＭＢ：５分間）による、標的抗原を使用したニワトリ血清ＩｇＹ力価評価。４５０ｎｍでの読み取り
抗原：５０ｍＭの重炭酸Ｎａ中のクロトー１μｇ／ｍＬ（０．７８ｍｇ／ｍＬ、ロット番号１７０９１８Ａ）。
【０１５４】
試料：ニワトリ番号１、番号２、室温、１時間（ＰＢＳ中の５％の乳）。
【０１５５】
【表６】
2021508037.tif 000026
【０１５６】
ＥＬＩＳＡプレートを、０．５μｇ／ｍｌの６ｘＨｉｓタグ付きクロトータンパク質またはクロトー−Ｆｃタンパク質で、５０ｍＭの重炭酸Ｎａ緩衝液中、＋４℃で一晩コーティングした。精製された抗クロトーＩｇＹ抗体（ロット番号１８０３２７Ａ）を、１０００ｎｇ／ｍＬで開始する５倍連続希釈で適用し、二次抗体であるヤギ抗ニワトリＨＲＰを、０．１６μｇ／ｍｌで適用した。反応を、５分間発生させた。４５０ｎｍでの生吸光度データおよび対応する抗体滴定曲線。図８Ａ〜８Ｂも参照されたい。
【０１５７】
【表７】
2021508037.tif 000027
【０１５８】
要約：ＨＲＰおよびビオチン抗クロトーＩｇＹの両方が、間接ＥＬＩＳＡにおいて有意なシグナルを示す。ビオ−ＩｇＹは、ＨＲＰ−ＩｇＹよりも強いシグナルを有する。
図９Ａおよび９Ｂに例示されるように、ＩｇＹ／ＨＲＰ−ＩｇＹペアには比較的弱いシグナルが存在する。ＩｇＹ／ビオ−ＩｇＹは、低濃度（０．２５μｇ／ｍＬ）でも比較的高いバックグラウンドを示す。ＩｇＹ／ビオ−４Ｈ５ペアは、ＩｇＹ／標識化−ＩｇＹペアよりも良好に機能するようである。
【０１５９】
哺乳動物の血清中の循環可溶性クロトータンパク質のレベルは、加齢とともに減少すると仮定されている。ヒト対象における天然に存在する循環可溶性クロトータンパク質の基準値測定は、様々な出版物で報告されている。徹底的な文献の論評により、示されるヒト対象における循環可溶性クロトータンパク質の以下の平均範囲（複数可）を得た（表８〜９を参照されたい）。
【０１６０】
【表８−１】
2021508037.tif 000028
【０１６１】
【表８−２】
2021508037.tif 000029
【０１６２】
【表９】
2021508037.tif 000030
【０１６３】
上記の表では、ＣＫＤ：慢性腎疾患、ＧＨ：成長ホルモン、Ｔ１Ｄ：１型糖尿病、Ｔ２Ｄ：２型糖尿病、ＣＡＤ：冠動脈疾患、ＣＯＰＤ：慢性閉塞性肺疾患、ＭＳ：多発性硬化症である。
【０１６４】
文献で観察される変動性の見地から、血清クロトーレベルを測定する、より堅牢な、より一貫性のある、および／またはより正確な手段が必要とされる。本開示の実施形態は、以下にさらに詳細に記載される、クロトー診断キットおよびそれを使用する方法を含む。
【０１６５】
表１０は、（任意の治療、例えば、健康補充剤、医薬品、治療用タンパク質などを受ける前の）ヒト対象における天然に存在する循環可溶性クロトータンパク質の基準値測定を示す。図１０は、ヒト対象における循環クロトータンパク質レベルの（毎日の）変化のグラフ表示である
【０１６６】
【表１０】
2021508037.tif 000031
【０１６７】
１時間に１回、０６時５０分に始めて、ヒト対象から血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡによってクロトータンパク質レベルを測定した。
本開示の実施形態による定量的ＥＬＩＳＡは、ヒト血漿試料中の（１）天然（例えば、内因性）クロトー、（２）組換えクロトー−Ｆｃ融合物、および（３）組換え６ｘＨｉｓクロトーを検出することができる。
【０１６８】
クロトータンパク質のさらなる測定を、以下の図１１Ａ〜１１Ｂおよび表１１に例示し、示す。
【０１６９】
【表１１】
2021508037.tif 000032
【０１７０】
ＥＬＩＳＡキットを使用したヒト血漿中でのクロトー安定性
静脈および毛細血管（「指」）血の試料を、４人のドナー（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）から採取し、（ｉ）ＥＤＴＡまたは（ｉｉ）ヘパリン含有チューブ内に保管した。１．５ｎｇ／ｍＬのクロトー（ロット番号１７０９１８Ａ−ヒト可溶性アルファクロトー）を、ドナーＡから採取した静脈および毛細血管血試料の組にスパイクした。採取した血液（血液試料）は、室温で、０、１、４、１６、２４、４８、７２、９６、または１６８時間分間保管し、その後沈降させた。各試料からの血漿を、ＥＬＩＳＡ試験の前に−８０℃で保管した。ＥＬＩＳＡプレートマップ、生データ、標準曲線データ、および濃度を、以下の表１２〜２１に示す。
【０１７１】
【表１２】
2021508037.tif 000033
【０１７２】
【表１３】
2021508037.tif 000034
【０１７３】
【表１４】
2021508037.tif 000035
【０１７４】
【表１５】
2021508037.tif 000036
【０１７５】
【表１６】
2021508037.tif 000037
【０１７６】
【表１７】
2021508037.tif 000038
【０１７７】
【表１８】
2021508037.tif 000039
【０１７８】
【表１９】
2021508037.tif 000040
【０１７９】
【表２０】
2021508037.tif 000041
【０１８０】
【表２１−１】
2021508037.tif 000042
【０１８１】
【表２１−２】
2021508037.tif 000043
【０１８２】
【表２１−３】
2021508037.tif 000044
【０１８３】
【表２１−４】
2021508037.tif 000045
【０１８４】
【表２１−５】
2021508037.tif 000046
【０１８５】
【表２１−６】
2021508037.tif 000047
【０１８６】
【表２１−７】
2021508037.tif 000048
【０１８７】
図１２は、室温での異なるインキュベーション時間でのクロトーレベルを例示する。
以下の表２２は、血漿中の平均クロトータンパク質レベル（ｎｇ／ｍＬ）を示す：
【０１８８】
【表２２】
2021508037.tif 000049
【０１８９】
以下の表２３は、スパイクしたクロトーの回収率（％）を示す
【０１９０】
【表２３】
2021508037.tif 000050
【０１９１】
輸送ストレスをエミュレートする様々な温度でのクロトー安定性試験
採血技師（複数可）は、４ドナーの各々から１２ｍＬを超える血液（試料）をヘパリン化血液チューブに採取した。技術者（複数可）は、各ドナーの採取した試料からの血液３００〜４００μＬを、直ちに別個のヘパリン化マイクロチューブ（ＢＤ製）に分注した。チューブを、試験設計に従って保管および処理した（下の表を参照されたい）。血液を、各時点で処理するか、または遠心分離し、−８０℃で保存（血漿）した。全ての試料を、およそ１７日目に試験した。
【０１９２】
この試験では、１４日間にわたる６つの条件を表す１２０個のデータ点を採取した（以下を参照されたい）。
【０１９３】
【表２４】
2021508037.tif 000051
【０１９４】
プレートのレイアウト（表２５を参照されたい）は、４人全てのドナーについて同じであった（以下の表２６〜２９を参照されたい）。
【０１９５】
【表２５】
2021508037.tif 000052
【０１９６】
ＥＬＩＳＡプロトコルを、可溶性クロトーＥＬＩＳＡキット（ヒト）、ＩＢＬ、カタログ番号２７９９８）の指示に従って行った。生データを、以下の表２６〜２９に示す。
【０１９７】
【表２６】
2021508037.tif 000053
【０１９８】
【表２７】
2021508037.tif 000054
【０１９９】
【表２８】
2021508037.tif 000055
【０２００】
【表２９】
2021508037.tif 000056
【０２０１】
データ分析を、以下の表３０〜４１に示す：
【０２０２】
【表３０】
2021508037.tif 000057
【０２０３】
【表３１−１】
2021508037.tif 000058
【０２０４】
【表３１−２】
2021508037.tif 000059
【０２０５】
【表３２】
2021508037.tif 000060
【０２０６】
【表３３】
2021508037.tif 000061
【０２０７】
【表３４−１】
2021508037.tif 000062
【０２０８】
【表３４−２】
2021508037.tif 000063
【０２０９】
【表３５】
2021508037.tif 000064
【０２１０】
【表３６】
2021508037.tif 000065
【０２１１】
【表３７−１】
2021508037.tif 000066
【０２１２】
【表３７−２】
2021508037.tif 000067
【０２１３】
【表３８】
2021508037.tif 000068
【０２１４】
【表３９】
2021508037.tif 000069
【０２１５】
【表４０−１】
2021508037.tif 000070
【０２１６】
【表４０−２】
2021508037.tif 000071
【０２１７】
【表４１】
2021508037.tif 000072
【０２１８】
前述の見地から、少なくとも１つの実施形態は、クロトー検出キットおよび／またはアッセイを含む。本発明のキットおよび／またはアッセイは、臨床試料のＣＬＩＡ実験室試験に好適であり得る。キットは、（１）天然（例えば、内因性）クロトー、（２）組換えクロトー−Ｆｃ融合物、および（３）組換え６ｘＨｉｓクロトーから選択される１つ以上のタンパク質の監視、検出、および／もしくは定量化、またはその欠損の診断に使用するために構成され得る。クロトータンパク質は、生物学的試料中で検出され得る。いくつかの実施形態では、試料は、（実質的に）未精製であり得る。例えば、試料は、哺乳動物（例えば、ヒト）血液および／または血漿であり得るか、またはそれを含み得る。
【０２１９】
少なくとも１つの実施形態では、キットは、指刺に適合された、構成された、または好適な１つ以上のランセット、指刺から血液を採取するのに適合された、構成された、または好適な試料採取容器、１つ以上の消毒要素（使い捨て（例えば、アルコール）ワイプ（複数可）など）、１つ以上の粘着性包帯、箔エンベロープまたは他の生分解性包装物、および輸送容器（エンベロープなど）を含み得る。
【０２２０】
いくつかの実施形態は、哺乳動物対象におけるクロトー欠損を診断する方法を含み得る。方法は、（ｉ）ヘパリン、リチウムヘパリン、ＥＤＴＡ、およびＫ２ＥＤＴＡのうちの１つ以上を含む保存剤または抗凝血剤と混合された、任意で毛細血管血の形態の毛細血管形態の哺乳動物血清であって、ある量の可溶性クロトータンパク質を有する、哺乳動物血清、ならびに（ｉｉ）任意で毛細血管血の形態の哺乳動物血清であって、ある量の可溶性クロトータンパク質を有する、哺乳動物血清からなる群から選択される流体試料混合物を得ることを含み得、方法は、哺乳動物血清を、ヘパリン、リチウムヘパリン、ＥＤＴＡ、およびＫ２ＥＤＴＡのうちの１つ以上を含む保存剤または抗凝血剤と混合することをさらに含み得る。方法はまた、室温で、混合物を少なくとも２４時間以上保管することを含み得、保存剤または抗凝血剤は、室温で、可溶性クロトータンパク質を少なくとも２４時間以上安定化させる。保管するステップの後に、方法は、混合物中の可溶性クロトータンパク質の量を定量化することを含み得る。方法はまた、混合物中の可溶性クロトータンパク質の定量化された量が、所定の閾値量未満である場合に、哺乳動物対象をクロトー欠損と診断することを含み得る。
【０２２１】
上記のように、流体試料混合物は、哺乳動物対象からの約１０〜１０００μｌ、好ましくは約５０〜２００μｌの毛細血管血を含むか、または流体試料混合物を取得するステップは、哺乳動物対象から約１０〜１０００μｌ、好ましくは約５０〜２００μｌの毛細血管血を取得することを含む。混合物中の可溶性クロトータンパク質の量を定量化するステップは、可溶性クロトータンパク質の一部分に結合する第１の抗体を使用して、可溶性クロトータンパク質を検出することと、および任意で第１の抗体の一部分に結合する検出抗体を使用して、可溶性クロトータンパク質を検出すること、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施して、可溶性クロトータンパク質を検出および任意で定量化することを含む。質量分析はまた、タンパク質の検出にも使用され得る。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、診断レポートまたは情報レポートが用意され得る。レポートは、１つ以上のクロトータンパク質の測定されたクロトーレベル（複数可）の指示または表示を含み得る。いくつかの実施形態では、レポートは、様々な年齢のクロトーレベルの平均または中央値を例示する年齢ベースのグラフに重ねた、測定されたレベルを描写する比較チャートまたはグラフ、ならびに様々な年齢の第２５パーセンタイルおよび／または第７５パーセンタイルの指示を表示する。図１３は、例示的なレポートのグラフまたはチャートを例示する。したがって、いくつかの実施形態では、哺乳動物対象をクロトー欠損と診断することは、クロトー欠損の判定、指示、もしくは診断をコンピュータシステムのユーザインターフェース上に表示すること、および／またはクロトー欠損の判定、指示、もしくは診断を表示する、物理的もしくは電子的形式のファイルもしくはレポートを生成することを含み、クロトー欠損の判定、指示、または診断は、任意で可溶性クロトータンパク質の定量化された量および／または所定の閾値量を含む。
【０２２３】
本明細書で使用される場合、用語「診断」または「診断すること」および同様の用語は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または任意の他の政府もしくは非政府機関、組織、もしくは機関によって要求または規制される、認定され規制に準拠した医療診断を（いかなる場合でも）伝達または要求することを意図しないことが理解されるであろう。むしろ、「診断」または「診断すること」および同様の用語は、病態を示す、および／または病態に関連する判定を行うのに役立ち得る情報を提供することに関する。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の分析物が、監視、検出、および／または定量化され得る。例示的に、追加の分析物は、腎疾患、線維性疾患、および／または加齢に関連し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の分析物は、ＦＧＦ、ＰＴＨ、非酸化ＰＴＨ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ＫＩＭ−１、ＮＧＡＬ、インターロイキンおよび他の炎症性バイオマーカー、テストステロン、エストロゲンなどからなる群から選択され得る。
【０２２５】
治療用タンパク質
本開示の実施形態は、１つ以上の治療用および／または組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質、タンパク質断片、および／またはタンパク質多様体を含み得る。
【０２２６】
タンパク質は、ヒトアルファクロトーアイソフォーム１または２のアミノ酸残基１〜１０１２、１〜９８１、２９〜９８１、３４〜９８１、３６〜９８１、１３１〜９８１、１〜５４９、２９〜５４９、３４〜５４９、３６〜５４９もしくは１３１〜５４９の全てまたはサブセットを含み得る。タンパク質は、ヒトアルファクロトーアイソフォーム１もしくは２のアミノ酸残基１〜１０１２、１〜９８１、２９〜９８１、３４〜９８１、３６〜９８１、１３１〜９８１、１〜５４９、２９〜５４９、３４〜５４９、３６〜５４９もしくは１３１〜５４９の全てまたはサブセットと少なくともおよび／または約８０％のアミノ酸配列を有し得る。例えば、タンパク質の少なくとも一部分は、配列番号２〜配列番号７０、もしくは配列番号１０７〜配列番号１２０、もしくは配列番号１２５〜配列番号１２８、もしくは配列番号１３３、もしくは配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部分、またはその２つ以上の組み合わせと少なくとも８０％などのアミノ酸配列同一性を有し得る。本出願に記載のタンパク質配列の他の部分または断片もまた、本明細書で企図される。例えば、いくつかの実施形態は、配列番号１〜７５のうちの１つの任意の好適な一部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせと、少なくとも８０％などのアミノ酸配列同一性を有する少なくとも一部分を有するタンパク質を含み得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態は、ヒトアルファクロトーアイソフォーム１と比較して１つ以上のアミノ酸多様性を有するタンパク質を含み得る。例示的に、タンパク質は、ヒトＣ３７０多様体を含み得る。例えば、タンパク質は、Ｃ３７０Ｓ改変を含み得、それによってＳ３７０を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ヒトＦ３５２、またはＦ３５２Ｖ以外のものを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、タンパク質は、Ｃ３７０Ｓ改変を含み得、それによってＦ３５２Ｖ多様体を含まず好ましくはＦ３５２を含む、Ｓ３７０を含む。タンパク質は、Ｈ１９３、またはＨ１９３Ｒ多様体以外のものを含み得る。ヒトアルファクロトーアイソフォーム１のアミノ酸残基（または位置）１９３、３５２、および／または３７０において、全ての他の標準アミノ酸置換が企図され、本明細書に明示的に開示される。
【０２２８】
いくつかの実施形態は、ヒトアルファクロトーアイソフォーム１のアミノ酸残基４５における多様性を含み得る。４５位では、残基は、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、または別のアミノ酸であり得る。
【０２２９】
タンパク質はまた、１つ以上の（それに結合した）グリカンを含み得る。例えば、天然ヒトアルファクロトーアイソフォーム１は、アミノ酸１０６、１５９、２８３、３４４、６０４、６１２および／または６９４で（グリコシル化を介して）結合したグリカンを有し得る。したがって、本開示のタンパク質またはそのクロトータンパク質配列は、（例えば、同じアミノ酸位置（複数可）で）（グリコシル化を介して）そこへ結合した同じ（または同様の）グリカンのうちの１つ以上を有し得る。好ましい実施形態では、タンパク質は、同じアミノ酸位置（複数可）でそこへ結合した同じまたは同様の（天然型）グリカンのうちの全てを含む。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、シグナルペプチドまたはシグナル伝達配列を含み得る。例えば、タンパク質は、天然クロトーシグナル伝達配列を含み得る。タンパク質は、非天然または合成シグナル伝達配列を含み得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達配列は、Ｎ末端シグナル伝達配列および／またはクロトータンパク質配列の上流（もしくはＮ末端）であり得る。他の実施形態では、シグナル伝達配列は、Ｃ末端であり得るか、または別の方法で配置され得る。好ましくは、シグナル伝達配列は、天然ヒトアルファクロトーアイソフォーム１シグナル伝達配列、天然ヒトアルファクロトーアイソフォーム２シグナル伝達配列、配列番号７１または配列番号７２であるか、それを含むか、またはそれと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性有し得る。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、アミノ酸タグを含み得る。タグは、Ｃ末端タグおよび／またはクロトータンパク質配列の下流（もしくはＣ末端）であり得る。他の実施形態では、タグは、Ｎ末端であり得るか、または別の方法で配置され得る。タグは、Ｆｃペプチド（またはＦｃ融合タグ、Ｆｃドメインなど）であり得るか、またはそれを含み得る。例えば、タグは、ＩｇＧ１−Ｆｃタンパク質配列であり得るか、またはそれを含み得る。好ましくは、タグは、配列番号７４であるか、それを含むか、またはそれと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し得る。
【０２３２】
タグはまた、または代替的に、Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグまたはタンパク質配列などのＴｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタンパク質配列を含むペプチドであるか、またはそれを含み得る（例えば、当該技術分野で既知のとおり）。好ましくは、シグナル伝達配列は、配列番号７５、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４であるか、それを含むか、またはそれと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し得る。
【０２３３】
タグはまた、または代替的に、ポリシアル酸（ＰＳＡ）であり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、ＰＳＡタグは、共役（クロトー）タンパク質を１つ以上のプロテアーゼに耐性にすることができる。いくつかの実施形態では、タンパク質共役体中にある量（例えば、比較的少量でさえ）のシアル酸を維持することは、プロテアーゼ攻撃、ならびに後続する分子の標的化、分解、およびクリアランス（例えば、肝臓を通して）を防止することができる。
【０２３４】
少なくとも１つの実施形態では、タグは、タンパク質から切断され得る。他の実施形態では、タグは、タンパク質の一部として保持され得る。いくつかの実施形態では、タグは、タンパク質の溶解度および／または（血清）半減期を増強し得る。いくつかの実施形態では、タグは、タンパク質精製の間に（例えば、精製機構の一部として）利用され得る。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、クロトータンパク質配列とアミノ酸タグとの間に配置されたリンカー（例えば、アミノ酸リンカー）を含み得る。例示的に、リンカーは、１〜４０個のアミノ酸、好ましくは５〜２０個のアミノ酸、より好ましくは６〜１２個のアミノ酸、最も好ましくは約８〜１０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＳリンカー（例えば、（Ｇ４Ｓ）２リンカー）または他のリンカー（例えば、ＧＧＥＮＬＹＦＱリンカー）であり得るか、またはそれを含み得る。好ましくは、リンカーは、配列番号７３または配列番号１０５であるか、それを含むか、またはそれと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し得る。
【０２３６】
少なくとも１つの実施形態では、タンパク質は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって判定および施行されるｃＧＭＰ規制に準拠し得る。例えば、クロトータンパク質は、乾燥重量で少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純粋であり得る。いくつかの実施形態では、クロトータンパク質試料は、１００万分率（ｐｐｍ）約１〜１００未満、１０億分率（ｐｐｂ）約１００〜１０００未満、または約１〜１００ｐｐｂ未満、またはそれらの間に配置される任意の値もしくは値の範囲のＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、核酸、および／または他の細胞構成成分を含み得る。
【０２３７】
クロトータンパク質多様体
様々な長さの治療用Ｓ−クロトータンパク質（例えば、Ｓ−クロトー、アイソフォーム１または２、１〜９８１、２９〜９８１、３４〜９８１、３６〜９８１、１３１〜９８１、１〜５４９、２９〜５４９、３４〜５４９、３６〜５４９、１３１〜５４９など）は、様々な方法で修飾されて、様々な有益な効果および／または天然クロトータンパク質が呈さない結果を達成し得る。例示的に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、様々なＳ−クロトー構築物の核酸配列を改変し得る。当該技術分野で既知の他の変異誘発方法およびキットもまた、使用され得る。例えば、様々なサブクローニング方法およびキットが当該技術分野で既知であり、市販されている。アミノ酸変化は、タンパク質発現、タンパク質安定性、タンパク質溶解度、タンパク質結合、タンパク質特異性、タンパク質活性、タンパク質機能、免疫原性、毒性などに影響（例えば、改善、増強、減少など）を与え得る。
【０２３８】
本開示の少なくとも１つの実施形態では、タンパク質は、１つ以上のＣ末端タグおよび／またはＮ末端タグで修飾される。そのようなタグは、タンパク質の血清および／または可溶性半減期を（１つ以上の治療または他の環境において）延長するように機能し得る。タグはまた、タンパク質の存在または診断的な局在化、タンパク質の単離または除去、タンパク質の送達または輸送、タンパク質の１つ以上の標的（例えば、タンパク質、核酸、オルガネラ、細胞構造構成要素など）への結合、酵素的処理または切断などのためのマーカーとして有用であり得る。少なくとも１つの実施形態では、タンパク質のＣ末端は、ＴＥＶ−Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグもしくは配列、免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃドメインタグもしくは配列、または当該技術分野において既知かつ／もしくは本明細書でさらに説明される他のタグもしくは配列でタグ付けされ得る。追加の説明は、各々の全体が特定の参照により本明細書に組み込まれる、文献「Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  Ｍａｋｅ  Ｂｉｏｂｅｔｔｅｒｓ」、「Ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ？」、および「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」に見出され得る。特定の実施形態では、リンカーまたはリンカーペプチドが、（天然または多様体）クロトータンパク質配列とタグとの間に挿入および／または配置され得る。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、修飾クロトータンパク質は、代替（例えば、天然、非天然、および／または合成）シグナルペプチドを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、天然シグナルペプチド配列は、代替シグナルペプチドまたはシグナル伝達配列（ＳＳ）で置換および／または補充され得る。いくつかの実施形態では、クロトータンパク質の天然メチオニン残基は除去され得、ＳＳのＮ末端にメチオニン残基が含まれ得る。追加の説明は、その全体が特定の参照により組み込まれる、論文「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」に見出され得る。特定の実施形態では、リンカーまたはリンカーペプチドは、（天然または多様体）クロトータンパク質配列と代替ＳＳとの間に挿入および／または配置され得る。
【０２４０】
いくつかの実施形態は、１つ以上のアミノ酸多様体を含み得る。本開示は、開示されたクロトータンパク質のいずれかの天然アミノ酸のうちの任意の１つ以上を、天然、合成、または他の構成にかかわらず任意の他のアミノ酸へ多様化させることを企図することが理解されるであろう。
【０２４１】
Ｓ−クロトーＶ４５Ｆタンパク質多様体
発明者らは、ヒトアルファクロトー（Ｖ４５Ｆ）の（天然）４５位にあるバリンに代わるフェニルアラニンの置換が、驚くべきかつ予想外の利益を有することを見出した。例えば、Ｖ４５Ｆ可溶性クロトー、およびその断片または融合タンパク質は、天然の野生型Ｖ４５タンパク質で発現するよりも、ＣＨＯおよびＨＥＫ−２９３細胞内でより高いレベルで発現する。商業的には、より高いレベルの可溶性タンパク質発現の達成が望ましくあり得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態は、Ｖ４５Ｆ置換を有するクロトータンパク質を含む。
【０２４２】
Ｓ−クロトーＣ３７０Ｓタンパク質多様体
ヒトでは、クロトー遺伝子は、染色体１３ｑ１２上に位置する。ＫＬ−ＶＳとして知られる多様体は、白人のおよそ１５〜２５％に存在する。この多様体は、６つの一塩基多型（ＳＮＰ）で構成され、そのうちの２つはアミノ酸置換を引き起こす（すなわち、Ｆ３５２ＶおよびＣ３７０Ｓ−フェニルアラニン３５２はバリンに変化、システイン３７０はセリンに変化）。インビトロトランスフェクションアッセイは、クロトーの分泌レベルが、Ｖ３５２多様体では６倍低減する一方、Ｓ３７０形態ではほぼ３倍増加することを示している。しかしながら、ヒトクロトー遺伝子におけるこれらの２つの多様体は、ともに分離し、クロトー分泌を１．６倍の範囲で増加させるＫＬ−ＶＳハプロタイプを形成する。例えば、地理的および／または民族的に別個のコホートから採取された３００人を超える個体のスクリーニングでは、Ｖ３５２多様体またはＳ３７０多様体のうちの１つのみを保有する個体は１人も見出されていないことが報告されている。
【０２４３】
本開示の一実施形態は、Ｃ３７０Ｓホモ多様体を有する（すなわち、Ｆ３５２Ｖ多様体が存在しない（またはその欠失を伴う））組換えＳ−クロトータンパク質を含む。Ｃ３７０Ｓ多様体は、本明細書に記載の任意のタンパク質構築物の文脈で、産生および／または発現され得る。例えば、Ｃ３７０Ｓ多様体は、タグ（例えば、（ＩｇＧ）Ｆｃタグ、ＴＥＶ−Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＥＶ配列など）の有無にかかわらず、Ｓ−クロトー、アイソフォーム１または２、１〜９８１、２９〜９８１、３４〜９８１、３６〜９８１、１３１〜９８１、１〜５４９、２９〜５４９、３４〜５４９、３６〜５４９、１３１〜５４９などの文脈で、産生または発現され得る。したがって、タンパク質が発現される核酸構築物またはｃＤＮＡは、対応する長さのものであり得る。
【０２４４】
実施形態は、Ｓ３７０ヘテロ接合性またはホモ接合性多様体構築物を産生すること、Ｓ−クロトーＣ３７０Ｓタンパク質をコードする得られた構築物を（例えば、トランスフェクションを介して）適切な発現系（例えば、ＣＨＯ細胞）に導入すること、および／またはＳ−クロトーＳ３７０タンパク質を一過性に発現することを含み得る。Ｓ３７０クロトータンパク質は、Ｆ３５２Ｖ／Ｃ３７０Ｓタンパク質および／または野生型Ｆ３５２／Ｃ３７０タンパク質よりも高いレベルで発現され得る。実施形態は、治療的投与のために発現されたタンパク質を精製すること（および任意で品質管理試験をすること）を含み得る。実施形態は、治療用、または治療有効量のＳ−クロトーＣ３７０Ｓタンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。対象は、例えば、ＫＬ−ＶＳ多様体を保有または発現し得る。代替的に、対象は、他の変異体または多様体の野生型のものであり得る。組換えＳ−クロトーＣ３７０Ｓタンパク質の投与は、血中Ｓ−クロトーレベルの有益な増加につながり得る。したがって、治療用組換えＳ−クロトーＣ３７０Ｓタンパク質を投与した対象におけるＳ−クロトーの循環濃度は、Ｆ３５２Ｖ多様体が存在するときに観察される希釈効果を受けない場合がある。
【０２４５】
核酸および発現ベクター
いくつかの実施形態は、核酸または核酸構築物を含み得る。例えば、実施形態は、発現ベクターまたは核酸構築物を含み得る。核酸は、本明細書に記載のように、組換えヒトアルファ可溶性クロトータンパク質、タンパク質断片、またはタンパク質多様体をコードし得る。少なくとも１つの実施形態では、核酸は、本明細書に記載のように、クロトータンパク質配列、（例えば、クロトータンパク質配列のＮ末端（複数可）の）任意の（天然もしくは非天然）シグナル伝達配列、任意のリンカー配列（例えば、ＧＳリンカー）、および／またはアミノ酸タグ（例えば、ＩｇＧ１−ＦｃもしくはＴＥＶ−Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ）をコードし得る。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、核酸は、ヒトアルファクロトーアイソフォーム１もしくは２のアミノ酸残基１〜１０１２、１〜９８１、２９〜９８１、３４〜９８１、３６〜９８１、１３１〜９８１、１〜５４９、２９〜５４９、３４〜５４９、３６〜５４９もしくは１３１〜５４９の全てまたはサブセットを含むタンパク質を発現し得る。タンパク質の少なくとも一部分は、ヒトアルファクロトー（アイソフォーム１もしくは２）のアミノ酸残基１〜１０１２、１〜９８１、２９〜９８１、３４〜９８１、３６〜９８１、１３１〜９８１、１〜５４９、２９〜５４９、３４〜５４９、３６〜５４９、もしくは１３１〜５４９の全てまたはサブセットと少なくともまたは約８０％のアミノ酸配列同一性を有し得る。例えば、タンパク質の少なくとも一部分は、配列番号１〜配列番号７５のうちの１つの全てもしくは一部分、またはその２つ以上の組み合わせと少なくともおよび／または約８０％のアミノ酸配列同一性を有し得る。少なくとも１つの実施形態では、タンパク質は、配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つの全てまたは一部分と少なくともおよび／または約８０％のアミノ酸配列同一性を有し得る。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、核酸の少なくとも一部分は、配列番号７６〜配列番号１０６もしくは配列番号１２１〜配列番号１２４のうちの１つ、またはその２つ以上の組み合わせと、少なくともおよび／または約８０％（例えば、少なくとも約８２％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有し得る核酸の少なくとも一部分を有し得る。好ましい実施形態では、核酸は、配列番号７６〜配列番号１０６または配列番号１２１〜配列番号１２４のうちの１つと少なくともおよび／または約８０％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。
【０２４８】
本開示の核酸配列はまた、当該技術分野で既知の停止コドン（例えば、ＴＧＡ、ＴＡＧ、ＴＡＡ）を含み得る。
細胞株および製造方法
本開示の一実施形態は、細胞株を含み得る。細胞株は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＬ−６０細胞、または当該技術分野で既知の他の細胞株などの任意の好適な細胞型を含み得る。例示的に、細胞株は、ＣＨＯ細胞（例えば、複数のＣＨＯ細胞）を含み得る。簡潔にするために、ＣＨＯ細胞への言及は、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞）、ＨＬ−６０細胞、および／または当該技術分野で既知の任意の他の（タンパク質発現）細胞（複数可）または細胞株（複数可）への特定の言及を企図する。いくつかの実施形態では、細胞は、（１コピー以上の）外因性核酸を（各々）含有し得る。核酸は、配列番号１〜配列番号７５のうちの１つ、またはその２つ以上の組み合わせ、好ましくは配列番号２〜配列番号７０のうちの１つと、少なくともおよび／または約８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードし得る。
【０２４９】
核酸は、少なくとも１つの導入遺伝子またはｃＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、核酸の少なくとも一部分は、配列番号７６〜１０６もしくは配列番号１２１〜１２４のうちの１つ、またはそれらの２つ以上の組み合わせ、好ましくは配列番号７６〜配列番号１０６または配列番号１２１〜配列番号１２４のうちの１つと、少なくともおよび／または約８０％の核酸配列同一性を有し得る。核酸は、プラスミドまたは他の（構造的な）形態の核酸であり得るか、またはそれを含み得る。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、外因性核酸は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）および／またはグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）などの機能性酵素をコードし得る。少なくとも１つの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｓ細胞またはＣＨＯ−Ｍ細胞などのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞であり得るか、またはそれを含み得る。核酸は、プロモーター（例えば、当業者によって理解されるように、弱いプロモーターから最大強力なプロモーターまで）を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つと、少なくとも８０％などの核酸配列同一性を有する導入遺伝子に関連する（強力な）プロモーターを含み得る。したがって、導入遺伝子は、プロモーターの制御下にあり得る。
【０２５１】
便宜上、本開示全体を通して、ＣＨＯ細胞および／または細胞株について言及されている。しかしながら、他の細胞、細胞株および／または宿主細胞（ＣＨＯ細胞に加えて）もまた、本開示の範囲内で企図されることに留意されたい。したがって、ＣＨＯ細胞および／または細胞株への言及はまた、他の既知の細胞、細胞株および／または宿主細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３などのＨＥＫ細胞、ＨＬ−６０細胞などの）への言及および／または使用も企図する。
【０２５２】
トランスフェクション
細胞株を製造する方法は、好ましくはトランスフェクションまたは当該技術分野で既知の他の技術を介して、外因性核酸を細胞に導入することを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、細胞株の無血清成長最適化細胞懸濁液を宿主細胞株として使用して、プロモーター、配列番号２〜配列番号７０、または配列番号１０７〜配列番号１２０、または配列番号１２５〜配列番号１２８、または配列番号１３３、または配列番号１５２のうちの１つの少なくとも一部と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヒトアルファＳ−クロトー導入遺伝子、および選択可能な（酵素）マーカーを含有する核酸（プラスミド）を挿入した。導入遺伝子はそれぞれ、ヒトアルファ可溶性クロトーのアミノ酸１〜９８１、２９〜９８１、または３４〜９８１をコードする。特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号７６〜配列番号１０６もしくは配列番号１２１〜配列番号１２４のうちの１つ以上に対応する配列部分（複数可）を有する（か、または配列番号７６〜配列番号１０６もしくは配列番号１２１〜配列番号１２４のうちの１つと少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する）。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−Ｓ細胞株など）では、選択可能な（酵素）マーカーは、外因性ＤＨＦＲであった。他の細胞株では、選択可能な（酵素）マーカーは、外因性ＧＳであった。
【０２５３】
成長、選択、および／または遺伝子増幅
いくつかの実施形態は、固体培地上で、および／または液体培地中（例えば、懸濁細胞培養物中）、好ましくは無血清および／または動物（もしくは動物由来の）タンパク質（構成成分）を含まない培地中で、細胞（例えば、トランスフェクトされた細胞）を成長させることを含み得る。例えば、細胞は、ある期間にわたって、固体成長培地上にプレーティングされ得る。細胞はまた、または代替的に、懸濁培養物中で、および／または液体培地中でも成長され得る。液体培地は、好ましくは炭素源、窒素源、および１つ以上のビタミン、無機質、塩、アミノ酸、補充剤、もしくは添加剤を含む。いくつかの実施形態では、培地はまた、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）、グルタミンなどを欠き得る。
【０２５４】
少なくとも１つの実施形態では、特定の期間後（例えば、トランスフェクション後４８時間）に、細胞は、集められ（例えば、切り離され）、任意で遠心分離され（例えば、５分間１００×ｇ）、かつ／または９６（例えば、血清補充された−ＨＴおよび／もしくは−グルタミン培地を含有する）ウェル粘着培養プレートなどに（例えば、およそ２０００個の細胞／ウェルで）播種され得る。特定の実施形態では、培地はまた、ＭＴＸおよび／またはＭＳＸを含み得る。非トランスフェクト細胞は、選択後（例えば、−ＨＴおよび／または−グルタミン培地中のＭＴＸおよび／またはＭＳＸへの曝露後、７〜１４日以内に死滅し得る。
【０２５５】
特定の実施形態では、細胞は、（例えば、細胞当たり）少なくとも約２〜１０コピー、少なくとも約１０〜２０コピー、少なくとも約２０〜３０コピー、または少なくとも約３０〜５０コピーの外因性核酸を含有し得る（含有するように選択され得る）。したがって、方法は、（例えば、細胞当たり）少なくとも約２〜１０コピー、少なくとも約１０〜２０コピー、少なくとも約２０〜３０コピー、または少なくとも約３０〜５０コピーの外因性核酸を含有する細胞を選択することを含み得る。例えば、（連続的に増加するレベルの）ＭＴＸおよび／またはＭＳＸが、細胞に（例えば、約１ｎＭ〜１μＭ、約１０〜１００ｎＭなどの濃度で）投与され得る。
【０２５６】
外因性ＤＨＦＲでトランスフェクトされたＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｓ細胞株など）内でのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子増幅は、成長培地中のメトトレキサート（ＭＴＸ）のレベルを連続的に増加させることによって達成された。プラスミドはＤＨＦＲを含有するため、ＭＴＸ（１０〜１００ｎＭ）への曝露時に宿主細胞内のＳ−クロトー遺伝子（断片）の増幅が可能になる。ＧＳ遺伝子発現系を使用して、（例えば、ＭＳＸへの曝露時に）外因性ＧＳでトランスフェクトされた細胞も増幅した。代替的に、ＧＳ−／−宿主細胞株を使用して、ＭＳＸの必要性も排除した。これらのステップは、Ｓ−クロトー遺伝子の多数のコピー（例えば、細胞当たり１０〜３０コピーの遺伝子）の産生、およびトランスジェニック細胞株内で得られるＳ−クロトータンパク質の高レベルの発現を生じた。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、懸濁培養物中で、タンパク質は、細胞から液体培地に分泌され得る。例えば、本開示の特定の細胞および／または細胞株は、（タンパク質を濃縮することなく）１リットルの液体培地当たり最大２００〜５００ｍｇのタンパク質、１リットルの液体培地当たり５００〜２０００ｍｇのタンパク質、１リットルの液体培地当たり２０００〜５０００ｍｇのタンパク質、またはそれらの間の任意の値または値の範囲の濃度で分泌し得る（か、または分泌するように選択され得る）。少なくとも１つの実施形態では、（選択された細胞株の選択された懸濁培養物（複数可）の）培地中のヒト組換えアルファ可溶性クロトータンパク質の濃度が、タンパク質を濃縮することなく、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも５０００ｍｇ／Ｌであるように、高産生細胞株（または懸濁培養物）が選択され得る。
【０２５８】
細胞限界希釈による、得られた高Ｓ−クロトー産生導入遺伝子含有コロニーのサブクローニングを行って、細胞条件培地に５００〜２０００ｍｇ／Ｌの範囲内のＳ−クロトーを分泌するＳ−クロトー分泌細胞株をさらに産生した。全ての細胞構築物を制限消化し、配列を確認した。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも１０リットル、好ましくは少なくとも２５リットル、より好ましくは少なくとも５０リットル、さらにより好ましくは少なくとも１００リットル、なおより好ましくは少なくとも２５０リットル、なおより好ましくは少なくとも５００リットル、さらにより好ましくは少なくとも１，０００リットル、さらにより好ましくは少なくとも２，０００リットル、さらにより好ましくは少なくとも２，５００リットル、さらにより好ましくは少なくとも５，０００リットル、さらにより好ましくは少なくとも１０，０００リットルの容積または作業容積を有するバイオリアクター内で、成長され得る。
【０２６０】
細胞株の維持
（例えば、ＤＨＦＲ／ＭＴＸまたはＧＳ／ＭＳＸ系によって産生される）増幅され、続いて細胞サブクローニングされた高産生Ｓ−クロトー細胞株では、スケールアップ中および最終的なバイオリアクターの運転まで、細胞株産生に投与される濃縮培地原料を慎重に使用して、無血清および動物性タンパク質構成成分を含まない基礎培地中で行った。
【０２６１】
高産出性細胞株のスケールアップは、振盪フラスコ内またはウェーブバッグシステム（Ｗａｖｅ  Ｂａｇ  ｓｙｓｔｅｍ）内の細胞懸濁液中で細胞接種材料の拡大、続いて１００Ｌおよびその後５００Ｌの容積のバイオリアクター内で産生された細胞の連続接種によって行った。細胞生存率は、振盪フラスコ、ウェーブバッグ、またはバイオリアクター内での成長サイクル全体を通して、８５％を超える生存細胞で、その後ＣＨＯ細胞成長のプラトー期の間にバイオリアクター中の生存細胞数を８０％以上で維持され、産生されるＳ−クロトーが最大１〜３ｇ／Ｌで付随して産生される（「高産生性」と表記する）。
【０２６２】
タンパク質産生
特定の実施形態は、哺乳動物（例えば、ＣＨＯ）細胞内でのクロトータンパク質の治療量の産生のために、強力なプロモーター配列および／または高コピー数のプラスミドを利用する組換えＤＮＡ方策を採用し得る。少なくとも１つの実施形態では、例えば、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞内でのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子増幅は、メトトレキサート（ＭＴＸ）を提供すること、および／または（連続的に増加するレベルの）ＭＴＸの使用を含み得る。同様に、外因性グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子含有細胞は、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）で処理され得る。
【０２６３】
クロトータンパク質はまた、（それに結合した）１つ以上のグリカンを含み得る。例えば、天然ヒトアルファクロトーアイソフォーム１（配列番号１）は、アミノ酸１０６、１５９、２８３、３４４、６０４、６１２および／または６９４で（グリコシル化を介して）結合したグリカンを有し得る。本開示のクロトータンパク質は、（例えば、同じアミノ酸（複数可）に）（グリコシル化を介して）そこへ結合した同じ（または同様の）グリカンのうちの１つ以上を有し得る。
【０２６４】
少なくとも１つの実施形態では、タンパク質は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって判定および施行されるｃＧＭＰ規制に準拠し得る。例えば、クロトータンパク質は、乾燥重量で少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純粋であり得る。いくつかの実施形態では、クロトータンパク質試料は、１００万分率（ｐｐｍ）約１〜１００未満、１０億分率（ｐｐｂ）約１００〜１０００未満、または約１〜１００ｐｐｂ未満、またはそれらの間に配置される任意の値もしくは値の範囲のＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、核酸、および／または他の細胞構成成分を含み得る。
【０２６５】
産生されたＳ−クロトータンパク質上に存在するグリカン構造は、ヒトの体液（すなわち、血液、血清、尿、脳脊髄液）から単離された天然Ｓ−クロトータンパク質上の構造と比較して、同様または同一であり得る。少なくとも１つの実施形態では、天然様グリカンの確認は、正しい天然の翻訳後修飾（ＰＴＭ）が生成され、細胞産生Ｓ−クロトータンパク質中で安定して維持されることを確実にし得る。
【０２６６】
クロトータンパク質の溶解度および／または半減期延長
ヒトＳ−クロトータンパク質の半減期を延長し、溶解度を増加させるための方法および組成物が開示される。また、これらの結果を達成するためにそのように産生されたタンパク質構築物の精製および特徴付けも、本開示の主題である。クロトー遺伝子または核酸構築物の配列（配列番号７６〜９６を参照されたい）内でなされた核酸変化、および／またはクロトータンパク質のアミノ酸配列（配列番号１〜７０を参照されたい）内の変化もしくは化学的改変、および／またはクロトータンパク質のアミノ酸配列に対する化学基、ペプチド、もしくはタンパク質の付加または除去に関する関連情報は、生物学的マトリックス（血液、脳脊髄液、尿、または様々なヒト組織など）において、天然クロトー分子のものよりも増加した生物学的半減期または増加した溶解度を有する、得られるヒトクロトー多様体タンパク質（新規の組成物）を得るために本開示に教示されている。これらの新規の組成物は、Ｓ−クロトータンパク質の修飾のために本明細書に記載の方法を通して作製され得る。
【０２６７】
例示的に、融合タンパク質構築物は、Ｓ−クロトータンパク質を、抗体（ＩｇＧ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのアルブミン、ヒトトランスフェリン（ＴＦ）などのトランスフェリン、および／またはＸＴＥＮ（登録商標）などの独自の組換えポリペプチドのＦｃドメインと組み合わせることによって作製され得る。新規のタンパク質は、Ｓ−クロトータンパク質を、ポリシアル酸（ＰＳＡ）またはペグ化などの翻訳後修飾と共役（または修飾）することによっても産生され得る。さらに、新規のＳ−クロトータンパク質は、ペグ化を介して産生され得る。前述および他の（半減期延長）方法論は、Ｓ−クロトー投薬間隔を増加させること、優れた患者利便性およびコンプライアンス可能性を提供すること、投薬頻度の要件を低減し、総計でより少ない薬物使用量をもたらすこと、薬物の費用を低減すること、親タンパク質と同じ投薬間隔で薬物量を低下させること、投薬製剤を単純化し、皮下製剤を可能にすること、親タンパク質と同じ用量および投薬間隔を使用してより高い薬物レベルを提供し、より長い薬物曝露および潜在的により良好な有効性をもたらすこと、ならびにＳ−クロトーの免疫原性を減少させることのうちの１つ以上によって、Ｓ−クロトータンパク質の性能を改善し得る。
【０２６８】
Ｓ−クロトーのＦｃドメイン融合タンパク質構築物の産生
抗体Ｆｃドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、およびポリシアル酸（ＰＳＡ）を、半減期を延長し、ヒトＳ−クロトータンパク質の溶解度を増加させる有効性について試験した。Ｆｃ融合物は、ペプチド、タンパク質、または受容体エキソドメインの抗体のＦｃ部分への融合を含む。Ｆｃ融合物およびアルブミン融合物の両方は、ペプチド薬物のサイズの増加によって半減期の延長を達成するだけでなく、両者はまた、新生児Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎへの伸長タンパク質の結合を通して、身体の自然再循環機構も利用する。ＦｃＲｎ受容体への伸長タンパク質の結合後、細胞のエンドソームにおける融合タンパク質の分解が防止される。Ｆｃまたはアルブミンの添加に基づく融合は、典型的なＰＥＧ化または脂質化ペプチドについて報告されているものよりもはるかに長く、３〜１６日の範囲内の生物学的半減期をもたらし得る。Ｆｃ融合タンパク質、ヒト血清アルブミンへの融合、カルボキシ末端ペプチドへの融合、およびより望ましい薬物動態学的プロファイルを有するバイオベター薬物を作製するための他のポリペプチド融合アプローチなどのタンパク質融合技術の使用について記載している論評については、その全体が特定の参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒｏｈｌ  ＷＲ．Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  Ｍａｋｅ  Ｂｉｏｂｅｔｔｅｒｓ．Ｂｉｏｄｒｕｇｓ．２０１５；２９（４）：２１５−２３９を参照されたい。
【０２６９】
Ｆｃドメインを、このようにして親タンパク質（Ｓ−クロトー）に付加して、Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性を増加させた。ＦｃＲｎは、血管を覆う内皮細胞内のリソソームの内側に存在し、ほとんどのタンパク質を循環中に短命にする分解から抗体を救済するように機能する。ＦｃＲｎとの相互作用の結果として、タンパク質は、数日から数週間の範囲の半減期を有し、伸長形態のタンパク質薬物が、この新たに産生された物質の組成物を有さない生物製剤よりも少ない頻度で投薬されることを可能にする。
【０２７０】
Ｆｃの二量体性質対ＨＳＡの単量体構造は、ＨＳＡとは対照的に、二量体または単量体としてのＦｃ融合ペプチドの存在につながり得る。ペプチドＦｃ融合物の二量体性は、Ｓ−クロトーの標的受容体が十分に密接して離間しているか、またはそれら自体が特定のヒト標的器官で二量体である場合に、結合活性効果を生成し得る。これは、標的に応じて、望ましい場合もあれば、そうでない場合もある。抗体ＦｃへのＳ−クロトータンパク質の融合もまた、Ｓ−クロトーの溶解度および安定性を改善するために本開示で教示される。驚くべきことに、Ｆｃ−融合クロトータンパク質は、改善された結合、結合活性、および／または免疫原性を有するようである。Ｓ−クロトーへのＦｃドメインの付加はまた、ヒト対象への投与の際に融合タンパク質の免疫原性の低下を可能にする。
【０２７１】
Ｓ−クロトータンパク質のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との共役
ヒトＩｇＧと同様の６６．５ｋＤａのタンパク質ＨＳＡは、１９日の範囲内で長い平均半減期を有する。約５０ｍｇ／ｍＬ（約６００μＭ）の濃度で、ＨＳＡはヒト血漿中で最も豊富に存在するタンパク質であり、血漿ｐＨ、代謝産物および脂肪酸輸送の維持、ならびに血圧維持の役割を含むいくつかの機能を有する。タンパク質の腎臓による糸球体濾過のためのサイズの上限であるＨＳＡもまた、強いアニオン性であり、腎臓を介した濾過をさらなる遅延に役立つ。ＩｇＧと同様に、ＨＳＡもまた、ＩｇＧ結合とは異なる部位で、かつＩｇＧ結合のものとは別個の機構を介したとしても、ｐＨ依存的方式でＦｃＲｎに結合し、ＩｇＧと同様に再循環され、その半減期の延長がもたらされる。ＨＳＡはまた、腫瘍および炎症を起こした組織にも蓄積する傾向があり、アルブミンへの融合または結合は、タンパク質またはペプチドをそれらの部位に標的化するのに潜在的に役立ち得ることを示唆している。
【０２７２】
これらの分子の血清半減期の延長のための、本質的に短い半減期特性を有するペプチドまたはタンパク質のＨＳＡへの融合は、１９９０年代初期から広く研究されている。それ以来、革新的および潜在的なバイオベター分子の両方として、数十の異なるペプチドおよび小タンパク質がＨＳＡに融合されている。市販承認された最初のＨＳＡ−ペプチドまたはタンパク質融合製品は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓで発見され、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって開発および市販されている、Ｔａｎｚｅｕｍ（登録商標）（欧州連合においてＥｐｅｒｚａｎ（登録商標）として市販されている）ＤＰＰ−４耐性ＧＬＰ−１−ＨＳＡ融合タンパク質であった。Ｔａｎｚｅｕｍ（登録商標）（アルビグルチド）は、２０１４年３月および４月にそれぞれ欧州医薬品局（ＥＭＡ）およびＦＤＡによって承認された。したがって、ＨＳＡは、薬理的に活性なＧＬＰ−１の半減期を、天然ＧＬＰ−１については１〜２分から４〜７日に改善し、これにより毎週１回の投薬が可能になる。７つの他の既知のＨＳＡ融合タンパク質産物候補が現在開発中であるか、または近年開発中である。また、Ｎｏｖｏｚｙｍｅは、さらにより長い半減期特性を有し得る「次世代」ＨＳＡタンパク質融合物の構築のために改善されたＦｃＲｎ結合を有する組換えＨＳＡの修飾バージョンを開発している。これは、マウスおよびカニクイザルの両方における野生型分子よりも長い半減期をＨＳＡに与える、１２倍高いＦｃＲｎへの親和性を有することが見出された、ＨＳＡのＫ５７３Ｐ変異体の使用に基づいていた。これらのより長い半減期のＨＳＡ変異体は、融合タンパク質の半減期を改善するための融合タンパク質としてのさらに使用され得ることが予想されている。
【０２７３】
したがって、本発明者らは、優れた患者利便性およびコンプライアンス可能性、総計でより少ない薬物使用量をもたらす投薬頻度の低減、ならびに／または商品費用の低減などの方策的な治療上の利益をもたらすために、クロトータンパク質を野生型ＨＳＡまたはＨＳＡの変異体形態に融合させて、ヒト血液、脳脊髄液、および他のヒト生物学的マトリックス中で、顕著に延長した半減期を有するクロトー融合分子（複数可）を産生することを本明細書に開示する。また、親タンパク質と同じ投薬間隔で薬剤量を低下させることにより、投薬製剤を単純化し、皮下製剤を可能にし得るか、またはＳ−クロトーの免疫原性の減少を可能にし得る。驚くべきことに、ＨＡＳ融合クロトータンパク質は、改善された結合、結合活性、および／または免疫原性を有するようである。
【０２７４】
Ｓ−クロトータンパク質のヒトトランスフェリン（ＴＦ）との共役
トランスフェリンは、非常に豊富な血清糖タンパク質であり、血清中に３〜４ｍｇ／ｍＬで見出され、これは強く可逆的に鉄に結合し、鉄を組織に運ぶように機能する。トランスフェリンは、６７９個のアミノ酸残基を有し、約８０ｋＤａのサイズであり、２つの高親和性Ｆｅ３＋結合部位を有し、一方はＮ末端ドメインに、他方はＣ末端ドメインにある。ヒトトランスフェリンは、７〜１０日、または１０〜１２日であると報告されている半減期を有する。総トランスフェリンプールの約２〜８％を占めるヒトトランスフェリンのアグリコシル化形態は、１４〜１７日間のわずかにより長い半減期を有する。ヒト血清中のトランスフェリンの延長した持続性は、（受容体結合トランスフェリンを循環中に戻して再循環する）クラスリン依存性トランスフェリン受容体が介在する機構によるものである。
【０２７５】
ペプチドおよびタンパク質の融合物は、ヒトトランスフェリンのＮ末端およびＣ末端に、ならびにトランスフェリンの２つの主な突起部をともに連結する、中央に位置するヒンジ領域に作製されている。トランスフェリンのＮ末端は空いており、直接融合され得る。Ｃ末端は、より埋もれており、近くのジスルフィド結合によって拘束されているため、タンパク質がＣ末端に融合されている場合には、典型的には可撓性リンカーが使用される。この能力は、特定の標的に対するペプチドのライブラリーを作製し、その後それらのライブラリーからの結合剤を、延長された半減期を有する治療用融合タンパク質へと開発されるアグリコ−トランスフェリン（Ｎ末端、Ｃ末端、ループ、またはリンカー領域）へと融合することによって拡大された。
【０２７６】
バイオテクノロジー企業ＢｉｏＲｅｘｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，は、トランスフェリン融合タンパク質プラットフォームを開発するために２００２年に創設され、これを治療用プラットフォームとして、「Ｔｒａｎｓ  Ｂｏｄｙ」プラットフォームと称した。それらのリード分子、ＢＲＸ−０５８５は、２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の治療のためのトランスフェリン−ＧＬＰ−１融合タンパク質であった。トランスフェリンへのＧＬＰ−１の融合は、ＧＬＰ−１の半減期を有意に増強することが実証された。ＢｉｏＲｅｘｉｓは、２００７年３月にＰｆｉｚｅｒによって買収された。確認され得る限りでは、ＢｉｏＲｅｘｉｓ由来の融合タンパク質は、現在のところ病院にはない。クロトータンパク質をヒトトランスフェリンに融合して、クロトー融合分子を産生することができ、これは、半減期、またはインビボでのヒト生物学的マトリックス中での安定性を有意に延長するために臨床投与され得る。
【０２７７】
Ｓ−クロトータンパク質のＡｍｕｎｉｘのＸＴＥＮとの共役
ＸＴＥＮ（登録商標）は、治療用ペイロードのインビボ半減期を延長する、独自の組換えポリペプチドである。ＸＴＥＮは、天然に存在する親水性アミノ酸からなり、生分解性である。タンパク質、ペプチド、および合成化合物などの医薬品は、化学的共役または遺伝子融合を介してＸＴＥＮ化され得る。ＸＴＥＮタンパク質は、二次および三次構造を欠き、それらの溶液挙動は、非常に大きな流体力学的半径を有する化学的に調製されたポリマーに似ている。サイズ排除クロマトグラフィーによって、ＸＴＥＮタンパク質ポリマーは、同様の分子量の典型的な球状タンパク質よりもはるかに大きく見える。ＸＴＥＮのバルキング効果は、結合した分子の腎クリアランスを大幅に低減し、したがってインビボ半減期を大幅に増加させる。本発明では、クロトータンパク質に付加されるＸＴＥＮポリマーの長さは、薬剤動態、ならびに結合したクロトータンパク質ペイロードの体内分布を最適化するように仕様されるであろう。
【０２７８】
このようにして、ＸＴＥＮは、分子のインビボ半減期を増加させるために、発明者らのＳ−クロトータンパク質Ｓ（複数可）に組換え融合され得る。１つの利益は、遺伝子的Ｓ−クロトー−ＸＴＥＮ融合構築物により、治療部分とバルキング部分の両方を含む単一分子の発現、精製、および特徴付けの利便性を有する分子が産生されることである。組換え融合は、精密に定義された位置にタンパク質ごとに複数のＸＴＥＮ鎖を結合させることを可能にし、治療薬物製造業者はこれをうまく使用して、ＸＴＥＮ化成長ホルモン（Ｖｅｒｓａｒｔｉｓ社のＳｏｍａｖａｒａｔａｎ）およびＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ（Ｂｉｏｇｅｎ）によって例示されるような、クラス最高の薬剤動態をもたらしている。  例えば、異なる用量のＳｏｍａｖａｒａｔａｎを受ける子供を対象に行われた薬物動態試験は、腎クリアランスに加えて受容体が介在する除去の低減により、ＸＴＥＮ化がクラス最高の半減期をもたらしたことを示している。
【０２７９】
ＸＴＥＮタンパク質ポリマーは、ペプチド、ペプチド模倣体、および他の合成分子への化学的共役のための遊離中間体として産生され得る。反応基（チオール、アミン）は、ＸＴＥＮをコードする遺伝子へのシステインまたはリシン残基の導入を介して、精密に定義された位置に挿入される。Ａｍｕｎｉｘは、様々な間隔で１〜９個のチオール基を含有するＸＴＥＮを開発しており、これは提携先に提供され得る。したがって、本発明では、ＸＴＥＮ中のアミノ基およびチオール基への直交共役は、本発明者らのクロトー−ＸＴＥＮ分子の産生を促進する。
【０２８０】
タンパク質の精製
クロトータンパク質は、細胞の（例えば、ＣＨＯ細胞株の）細胞懸濁培養物から抽出され得る。細胞は、クロトータンパク質を産生し、任意で（例えば、液体培地中に）分泌し得る。消費済み培地へのＳ−クロトーの分泌も観察された。
【０２８１】
本開示の組換えタンパク質の精製は、当該技術分野で既知の、または本明細書に記載の任意の好適な方法、例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、および／または電気泳動を含む任意の従来の手順によって実行され得る。タンパク質の精製に使用され得るさらなる精製手順は、標的タンパク質（複数可）に結合するモノクローナル抗体を使用する親和性クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態は、親和性クロマトグラフィーによって精製され得る、ＩｇＧタグ付きタンパク質、Ｆｃタグ付きタンパク質、Ｈｉｓタグ付きタンパク質、ＨＳＡタグ付きタンパク質、ＧＳＴタグ付きタンパク質などを含み得る。例えば、いくつかの実施形態は、ＩｇＧ１などのＩｇＧのＦｃドメインの少なくとも一部分を含み得る。一般に、組換えタンパク質を含有する粗調製物は、好適なモノクローナル抗体が固定化されたカラムに通される。他のタグの場合、対応するタグ結合親和性実体が、カラムに配置され得る。カラムの洗浄後、ｐＨまたはイオン強度を変化させることによって、タンパク質はゲルから溶出される。例えば、ＣＨＯ−Ｓ高産出性細胞株からの消費済み培地を、接線流濾過を介して濃縮し、親和クロマトグラフィー、続いてイオン交換カートリッジまたはカラムクロマトグラフィーによってＳ−クロトータンパク質を精製した。サイズ排除クロマトグラフィーはまた、タンパク質の精製にも使用され得る。様々な順序のクロマトグラフィーの種類が適用され得ることが理解されるであろう。本明細書では、クロマトグラフィーステップまたはカラムの任意の好適な組み合わせが企図される。
【０２８２】
代替的なプロトコルでは、１つ以上の親和性精製前または精製後ステップが実施された。そのようなステップには、例えば、（超）遠心分離、透析、膜および／もしくは接線流濾過、イオン交換などのクロマトグラフィー分離、（水性）二相抽出法などの液−液抽出、または他の既知の精製ステップが含まれ得る。特定の実施形態では、１つ以上の精製後処理ステップが実施された。そのような精製後処理ステップには、例えば、（結合および溶出クロマトグラフィーと対照的な）タンデムアニオン／カチオン通過画分クロマトグラフィー、膜濾過（例えば、０．２ミクロン、０．１ミクロンなど）による、または当業者に既知の他の手段によるウイルスおよび／または細菌の除去が含まれ得る。
【０２８３】
特定の実施形態は、組換えクロトータンパク質を精製する方法を含む。方法は、懸濁細胞培養中で組換えクロトータンパク質を発現させることを含み得る。方法は、懸濁培養培地および／または細胞の採取などによって、クロトータンパク質を採取することを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、方法は、第１の精製ステップを含み得る。「第１の」精製ステップは、第１に、または他の任意の精製ステップ（複数可）の前に、または他の任意の精製ステップ（複数可）の後に生じる必要がないことが理解されるであろう。第１の精製ステップは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを含み得るか、それに関与し得るか、またはそれを使用し得る。第１の精製ステップは、親和性クロマトグラフィーを含み得るか、それに関与し得るか、またはそれを使用し得る。親和性クロマトグラフィーは、クロトータンパク質のタグまたは他のタンパク質融合実体に基づき得る。例えば、Ｈｉｓタグ付きタンパク質は、Ｈｉｓタグ親和性クロマトグラフィー（例えば、ＨｉｓＴｒａｐまたはニッケルカラムクロマトグラフィー）によって精製され得る。同様に、ＧＳＴ共役タンパク質は、ＧＳＴ親和性クロマトグラフィーによって精製され得る。特定のタグ（複数可）に応じて、対応するタグ結合親和性実体が、タンパク質精製に使用するために配置され得る。
【０２８４】
少なくとも１つの実施形態では、第１の精製ステップは、例えば、Ｉｇタグ付きまたはＦｃ融合クロトータンパク質の精製のためのプロテインＡまたはプロテインＡ共役粒子もしくはビーズ（例えば、プロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４高速流動カラム（０．７５ｍｌ）（０．５ｃｍ×３ｃｍ））を使用する親和性クロマトグラフィーを含み得るか、それに関与し得るか、またはそれを使用し得る。カラムは、適切な溶液中で平衡化され得る。溶液は、好適な濃度（例えば、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）の緩衝剤を含み得る。好適な量のタンパク質含有試料（例えば、任意で１．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０でｐＨ８．０に調整した懸濁細胞培養上清）が、（例えば、０．７５ｍｌ／分の流量で）カラムに充填され、任意で好適な洗浄緩衝液（例えば、１０ｍＭのＴｒｉｓ／アルギニン−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄され、好適な流量（例えば、約０．５０〜０．２５ｍｌ／分またはそれと等価）で、かつ／または濃縮試料を生成するために、好適な溶出緩衝液（例えば、４ＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ３（すなわち、低ｐＨ、高塩分））でカラムから溶出され得る。
【０２８５】
少なくとも１つの実施形態では、溶出緩衝液は、約３のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、ｐＨ約２〜ｐＨ約６、好ましくはｐＨ約２〜ｐＨ約５、より好ましくはｐＨ約２〜ｐＨ約４、さらにより好ましくはｐＨ約２．５〜ｐＨ約３．５のｐＨを有し得る。
【０２８６】
少なくとも１つの実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つの塩を含み得る。例示的に、塩は、好ましくは約４Ｍの濃度のＭｇＣｌ２であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約１Ｍ〜約６Ｍ、好ましくは約２Ｍ〜約５Ｍ、より好ましくは約３Ｍ〜約５Ｍ、さらにより好ましくは約３．５Ｍ〜約４．５Ｍの塩濃度を有し得る。
【０２８７】
追加の精製ステップ（複数可）は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除（またはゲル濾過）クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを含み得るか、それに関与し得るか、またはそれを使用し得る。少なくとも１つの実施形態では、方法は、第２の精製ステップを含み得る。「第２の」精製ステップは、第２に、他の任意の精製ステップ（複数可）の前に、またはそ（れら）の後に生じる必要がないことが理解されるであろう。第２の精製ステップは、タンパク質含有試料（複数可）を分画、分解、清澄化、または精製するためのサイズ排除クロマトグラフィー（および好適な移動相緩衝液）を含み得るか、それに関与し得るか、またはそれを使用し得る。例えば、例示的な第２の精製ステップでは、（第１の精製ステップからの）タンパク質含有溶出試料（複数可）が、任意で緩衝液交換され、好適な移動相緩衝液中でサイズ排除クロマトグラフィー（例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（１ｃｍ×３０ｃｍ）カラム）を使用して精製され得る。少なくとも１つの実施形態では、移動相緩衝液は、好適なｐＨ（例えば、ｐＨ約８）の、好適な緩衝剤（例えば、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ）ならびに１つ以上の任意の還元剤（例えば、５ｍＭのＬ−メチオニンおよび／または０．６％のチオグリコール酸ナトリウム）を含み得る。少なくとも１つの実施形態では、緩衝剤は、リン酸含有緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、クエン酸塩など）以外であり得る。少なくとも１つの実施形態では、還元剤は、好ましくは有効還元濃度（複数可）の、Ｌ−メチオニンおよび／またはチオグリコール酸ナトリウムであり得るか、またはそれを含み得る。代替的な還元剤は、アセチルシステイン（すなわち、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、Ｎ−アセチル−Ｄ−システイン、およびラセミＮ−アセチルシステイン、またはＮ−アセチル−Ｌ−システインとＮ−アセチル−Ｄ−システインとの（ラセミ）混合物を含む、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ））、アスコルビン酸、亜ジチオン酸塩、エリチオルビン酸塩（ｅｒｙｔｈｉｏｒｂａｔｅ）、システイン、グルタチオン、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、ジエリスリトール、樹脂担持チオール、樹脂担持ホスフィン、ビタミンＥ、および／もしくはトロロックス、またはそれらの塩、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、ヨウ化カリウム、塩化アンモニウム、グアイフェネシン（ｇｕａｉｐｈｅｎｅｓｉｎ）（もしくはグアイフェネシン（ｇｕａｉｆｅｎｅｓｉｎ））、トルバルサム、バサカ、アンブロキソール、カルボシステイン、エルドステイン、メシステイン、ドルナーゼアルファなどを含み得る。
【０２８８】
少なくとも１つの実施形態では、移動相緩衝液は、約８のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、ｐＨ約６〜ｐＨ約１０、好ましくはｐＨ約７〜ｐＨ約９、より好ましくはｐＨ約７．２〜ｐＨ約８．８、さらにより好ましくはｐＨ約７．５〜ｐＨ約８．５のｐＨを有し得る。
【０２８９】
少なくとも１つの実施形態では、溶出されたタンパク質は、単量体クロトータンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、溶出されたタンパク質は、多量体クロトータンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、溶出されたタンパク質は、二量体クロトータンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、溶出されたタンパク質は、四量体クロトータンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、溶出されたタンパク質は、六量体クロトータンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、溶出されたタンパク質は、八量体クロトータンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、溶出されたタンパク質は、単量体クロトータンパク質および多量体クロトータンパク質の両方であり得るか、またはそれらを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、溶出されたタンパク質は、単量体クロトータンパク質または多量体クロトータンパク質のいずれかの単一種であり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、溶出されたタンパク質は、単量体クロトータンパク質または多量体クロトータンパク質のいずれかの単一種の約８０％以上であるか、またはそれを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、溶出されたタンパク質は、単量体ロトータンパク質または多量体クロトータンパク質のいずれかの単一種の約８２％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上であり得るか、またはそれを含み得る。
【０２９０】
追加の精製ステップ（複数可）は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除（またはゲル濾過）クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを含み得るか、それに関与し得るか、またはそれを使用し得る。
【０２９１】
クロトータンパク質の分析
タンパク質純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは当該技術分野で既知の他のアッセイもしくは手段によって実証され得る。例えば、少なくとも１つの実施形態では、クロトータンパク質試料（５０μｇ）をプレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜１５％、１０ウェル、カタログ番号４５６−１０８３、ＢｉｏＲａｄ）で分画し、クマシーブルー色素で染色した。試料間の混入を避けるために、全ての試料を、空のレーンを間に置くか、または別個のゲル上に置いた。クマシーブルー色素およびデンシトメトリーの透写によって、または銀染色の視覚化によって、またはＨＰＬＣもしくはＲＰ−ＨＰＬＣによって判定されるように、９８％を超えるＳ−クロトーがＣＨＯ  Ｓ条件培地から単離されたことが示された。配列情報を取得するために、タンパク質化学の既知の方法に従って、タンパク質（還元およびＳ−カルボキシメチル化後）を臭化シアン、トリプシン、および／またはプロテイナーゼＫで切断し、ＨＰＬＣによってペプチドを分離し得る。その後、このように調製した試料を、コンセントに接続したオンライン自動ＨＰＬＣ  ＰＴＨアミノ酸分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル１２０、ＡＢＩ、上記を参照されたい）を備えた自動気相ミクロ配列決定機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４７０Ａ、ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）で、配列決定した。
【０２９２】
タンパク質をまた、質量分析法を通しても分析した。質量分析のための試料調製に関しては、分析を正しいＳ−クロトータンパク質に限定するために、７５〜１５０ｋＤａのゲルバンドのみを分析のために切り抜いた。ゲル画分を、滅菌ブレードで軟化し、ゲル内消化に供した。ゲル画分を、８０μＬの５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）／５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムで３回洗浄することによって脱色し、１００％のＡＣＮで洗浄した。アルキル化ステップは、標的α−クロトーペプチド由来のシステイン残基の不在を考慮して省略した。６０μＬのトリプシン（配列決定グレード修飾、カタログ番号Ｖ５１１Ａ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム（０．００５μｇ／μＬ）中で、トリプシン消化を３７℃で一晩実行した。このプロセスで２５μＬが得られ、そのうち５μＬ（Ｓ−クロトーでは１μＬ）を、ｎａｎｏＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ＵＨＰＬＣ）に取り付けられた、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ｎａｎｏ−ＥＳＩ  Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）およびＰＲＭ分析に供した。ＭＳ／ＭＳ分析では、本開示の実施形態によって産生されたヒト組換えアルファ−Ｓ−クロトーが、ヒト血液、血清、尿または脳脊髄液に見出されるものと実質的に同様である（例えば、対応するアミノ酸配列において同一である）ことが確認された。
【０２９３】
上記の精製方法を使用して、混入されたＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルを、精製されたＳ−クロトータンパク質中で許容可能であると判定した。最終的なＳ−クロトー産物中では、ＨＣＰを１〜１００ｐｐｍ未満まで除去した。少なくとも９０％、かつ最大９８％の純度のＳ−クロトータンパク質産物を、消費済みＣＨＯ  Ｓ産出細胞株（細胞および／または液体培地）から単離した。具体的には、ヒト対象での臨床投与に好適な分析プロファイルを有するｃＧＭＰグレードのヒトアルファ−Ｓ−クロトーを産生し、精製した。例えば、ヒト組換えアルファＳ−クロトーの分析プロファイルは、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｅｏｍｅｃｅｎｔｒａｌ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｘｃｈａｎｇｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ＧｅｔＤａｔａｓｅｔ？ＩＤ＝ＰＸＤ００２７７５で見出され得る、ＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅＤａｔａｂａｓｅの参照番号ＰＸＤ００２７７５に表記されている。ＮＩＨの完全なＳ−クロトータンパク質データセットは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ［ｄｏｔ］ｎｃｂｉ［ｄｏｔ］ｎｌｍ［ｄｏｔ］ｎｉｈ［ｄｏｔ］ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｑ９ＵＥＦ７にある。
【０２９４】
臨床投与に好適なＳ−クロトーの分析プロファイル、および本開示の実施形態で取得された分析プロファイルは、１μｇのＳ−クロトー当たり０．１ｎｇ（１ＥＵ／μｇ）未満のエンドトキシンレベルを含んだ。加えて、精製されたヒト組換えＳ−クロトーはまた、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって９８％以上の純度を有することも示された。
【０２９５】
ＣＨＯ  Ｓ細胞で産生されたＳ−クロトーに存在するグリカン構造は、ヒトの体液（すなわち、血液、血清、尿、および脳脊髄液）から単離された天然Ｓ−クロトーの構造と比較して同一であった。これは、細胞で産生されたＳ−クロトータンパク質中で、同じ天然の翻訳後修飾（ＰＴＭ）が生成され、安定して維持されることを確実にした。したがって、本明細書に記載の製造および精製方法を使用して、本発明者らは、ヒト対象への臨床投与に好適な分析プロファイルを有するｃＧＭＰグレードのヒトＳ−クロトーの産生に成功している。
【０２９６】
治療用組成物
本開示のいくつかの実施形態は、治療用組成物などの薬学的組成物を含み得る。本開示の薬学的組成物は一般に、治療有効量の組換え可溶性アルファクロトータンパク質と、１つ以上の追加の構成成分で構成される（薬学的に許容される）ビヒクル、担体、または賦形剤との混和物を含み得る。クロトータンパク質は、約０．００１〜１０００ｍｇ、約０．０１〜１００ｍｇ、約０．１〜１０ｍｇ、約１〜５ｍｇ、またはそれらの間の任意の量もしくは量の範囲などの、任意の好適な量で含まれ得る。いくつかの実施形態では、組成物は、（例えば、組成物が投与される対象において血清クロトーレベルを所定のレベルまで上昇させるために）薬学的有効量または治療有効量のクロトータンパク質を含み得る。
【０２９７】
構成成分は、１つ以上の凝集阻害剤、緩衝液、等張化剤、および追加の賦形剤を含み得る。担体中の主溶媒は、本質的に水性または非水性のいずれであってもよい。組成物は、本開示の精製クロトータンパク質を薬学的に許容可能な担体と組み合わせることによって調製され得る。
【０２９８】
組成物中に含まれる様々な構成成分の組み合わせが、任意の適切な順序で行われ得ること、すなわち、緩衝液が、最初、中間、または最後に添加され得、等張化剤もまた、最初、中間、または最後に添加され得ることが、当業者には理解されるであろう。これらの化学物質のいくつかは、特定の組み合わせでは不適合であり得、したがって、同様の特性を有するが関連する混合物に適合する異なる化学物質で容易に置換されることもまた、当業者には理解されるものである。
【０２９９】
凝集阻害剤は、不適切なまたは望ましくない三成分または四成分の複合体に会合するポリペプチドの傾向を低減する。アミノ酸Ｌ−アルギニンおよび／またはＬ−システインは、製剤中のＦｃドメイン含有ポリペプチドの凝集を長期間、例えば、２年以上低減するように作用し得る。製剤中の凝集阻害剤の濃度は、好ましくは約１ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、さらにより好ましくは約１５ｍＭ〜約７５ｍＭ、およびさらにより好ましくは約２５ｍＭである。これらの化合物は、商業的供給者から入手可能である。
【０３００】
本開示の組成物は、緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、ｐＨを所望の範囲内に維持する。本開示の薬学的組成物への使用に好適な様々な緩衝液には、ヒスチジン、リン酸カリウム、アルカリ塩、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウムまたはそれらの水素塩もしくは二水素塩、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸カリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸、マレイン酸、酢酸アンモニウム、ｔｒｉｓ−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ｔｒｉｓ）、様々な形態の酢酸塩およびジエタノールアミン、ならびに当該技術分野で既知の、溶液のｐＨを所望の範囲内に維持するための任意の他の薬学的に許容されるｐＨ緩衝剤が含まれる。これらの緩衝剤の混合物もまた、使用され得る。
【０３０１】
組成物中で有用な緩衝剤の量は、使用される特定の緩衝液および溶液のｐＨに大きく依存する。例えば、酢酸塩は、ｐＨ６よりもｐＨ５でより効率的な緩衝液であるため、ｐＨ６よりもｐＨ５では、より少ない酢酸塩が溶液中で使用され得る。好ましい製剤の好ましいｐＨは、４．０〜５．０の範囲内であり、所望のｐＨを得るために、塩酸、クエン酸、水酸化ナトリウム、またはそれらの塩などのｐＨ調整剤もまた、含まれ得る。
【０３０２】
１つの好ましい緩衝液は、リン酸ナトリウムであり、これは、その緩衝能がｐＨ６．２またはその付近であるためである。しかしながら、任意の所望のｐＨ緩衝を達成するために、他の緩衝液が選択され得ることが理解されるであろう。製剤中の緩衝液の濃度は、好ましくは約１ｍＭ〜約１Ｍ、より好ましくは約１０ｍＭ〜約２００ｍＭである。緩衝液は、当該技術分野で周知であり、既知の方法によって製造され、商業的供給者から入手可能である。
【０３０３】
薬学的組成物のｐＨを生理学的レベルまたはその付近に設定すると、投与時の患者の快適性が最大化される。具体的には、ｐＨは、ｐＨ約５．８〜８．４の範囲内であることが好ましく、約６．２〜７．４が好ましいが、しかしながら、ｐＨを必要に応じて調整して、特定の製剤中でのポリペプチドの安定性および溶解度を最大化することができ、このように、生理学的範囲外のｐＨであっても患者にとって許容されるものが、本開示の範囲内であることが理解されるものである。
【０３０４】
本開示の製剤は、（例えば、注射のために溶液を患者の血液と等張にするために）１つ以上の等張化剤をさらに含み得る。等張化剤は、溶液の重量オスモル濃度に寄与する分子であると理解される。薬学的組成物の重量オスモル濃度は、好ましくは、活性成分の安定性を最大化し、また投与時の患者の不快感も最小限にするために調節される。血清が、１キログラム当たりおよそ３００＋／−５０ミリオスモルである場合。一般に、薬学的組成物が血清と等張であること、すなわち、等張化剤の添加によって達成される同じまたは同様の重量オスモル濃度を有することが好ましく、したがって重量オスモル濃度が約１８０〜約４２０ミリオスモルであり得ることが企図されるが、重量オスモル濃度は、特定の条件で必要なように、より高いかまたはより低いかのいずれでもよいことが理解されるものである。
【０３０５】
典型的な等張化剤は、当該技術分野で周知であり、それらには、様々な塩、アミノ酸、または多糖類が含まれるが、これらに限定されない。好適なアミノ酸の非限定的な例には、グリシンが含まれる。好適な多糖類の非限定的な例には、スクロース、マンニトール、およびソルビトールが含まれる。一度に２つ以上の等張化剤が使用され得、例えば、ソルビトールとグリシンとを組み合わせて使用して、製剤の張度を修飾し得ることが理解される。
【０３０６】
重量オスモル濃度の修飾に好適な等張化剤の追加の例には、アミノ酸（例えば、アルギニン、システイン、ヒスチジン、およびグリシン）、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびクエン酸ナトリウム）、ならびに／または糖類（例えば、スクロース、グルコース、およびマンニトール）が含まれるが、これらに限定されない。製剤中の等張化剤の濃度は、好ましくは約１ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは約１０ｍＭ〜約２００ｍＭである。等張化剤は、当該技術分野で周知であり、既知の方法によって製造され、商業的供給者から入手可能である。
【０３０７】
溶液中（乾燥または凍結形態でも）でポリペプチドを安定化させる、化学的添加剤、共溶質、または共溶媒とも称される、賦形剤もまた、薬学的組成物に添加され得る。賦形剤は、所望の効果、例えば、安定化、等張性を提供するために薬学的組成物に添加される非治療剤として本明細書では定義される。望ましい賦形剤の共通の属性は、水溶性、非毒性、非反応性、身体からの迅速なクリアランス、および免疫原性の不在である。加えて、賦形剤は、加工、保管、および患者への投与中の薬物の有効性および安全性を維持するために、タンパク質の天然のコンフォメーションを安定化させることが可能であるべきである。例には、スクロース、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、トレハロース、グルコースなどの糖／ポリオール；血清アルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトＳＡ、もしくは組換えＨＡ）、デキストラン、ＰＶＡ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）などのポリマー；多価アルコール（例えば、ＰＥＧ、エチレングリコール、およびグリセロール）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの非水性溶媒；プロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸ナトリウム、アラニン、グリシン、リジン塩酸塩、サルコシン、およびガンマ−アミノ酪酸などのアミノ酸；Ｔｗｅｅｎ−８０（商標）（ポリソルベート８０）、Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）（ポリソルベート２０）、ＳＤＳ、ポリソルベート、ポリオキシエチレンコポリマーなどの界面活性剤；ならびにリン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、金属イオン（例えば、亜鉛、銅、カルシウム、マンガン、およびマグネシウム）、ＣＨＡＰＳ、モノラウレート、２−Ｏ−ベータ−マンノグリセレート（ｍａｎｎｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）などの諸々の賦形剤、または上記の任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。注意として、非常に有毒なバイケイソウ（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ａｌｂｕｍ）は、リンドウと間違えられ得ることに留意されたい。
【０３０８】
本開示の製剤中の１つ以上の賦形剤の濃度は、好ましくは約０．００１〜５重量パーセント、より好ましくは約０．１〜２重量パーセントである。賦形剤は、当該技術分野で周知であり、既知の方法によって製造され、商業的供給者から入手可能である。
【０３０９】
１つの例示的な実施形態では、本開示の製剤は、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、またはＴｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ約７．３〜７．４に緩衝された約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および任意で本明細書に記載の１つ以上の追加の構成成分を含み得る。
【０３１０】
１つの例示的な実施形態では、本開示の製剤は、ｐＨ約６．０〜ｐＨ約７．０で、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのＬ−アルギニン中のある（治療有効）量のクロトータンパク質、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウム、約０．７５％〜約１．２５％のスクロース、および／または約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み得る。別の実施形態では、Ｌ−アルギニンは、製剤中でＬ−システイン（約１〜約５００マイクロモル）で置換され得る。さらに別の実施形態では、ｐＨは、ｐＨ約７．０であり得る。別の特定の実施形態では、本開示の製剤は、ｐＨ約６．２で、２５ｍＭのＬ−アルギニン中のある（治療有効）量のクロトータンパク質、約２５ｍＭのリン酸ナトリウム、約９８ｍＭの塩化ナトリウム、および／または約１％のスクロースを含み得る。
【０３１１】
別の実施形態では、本開示の製剤は、ｐＨ約６〜ｐＨ約７で、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのＬ−アルギニン中のある（治療有効）量のクロトータンパク質、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウム、約０．７５％〜１．２５％のスクロース、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み得る。特定の実施形態では、本開示の製剤は、ｐＨ約６．２で、約２５ｍＭのリン酸ナトリウム中のある（治療有効）量のクロトータンパク質、約９８ｍＭの塩化ナトリウム、および／または約１％のスクロースを含み得る。
【０３１２】
さらに別の実施形態では、本開示の製剤は、ｐＨ約６〜７で、治療有効量のＦｃドメイン含有クロトー融合タンパク質、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのＬ−アルギニン、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウム、約０〜５％のマンニトール、および／または０〜０．２％のＴｗｅｅｎ−２０（商標）（ポリソルベート２０）を含み得る。別の実施形態では、本開示の製剤は、有効量のクロトータンパク質、約２５ｍＭのＬ−アルギニン、約２５ｍＭのリン酸ナトリウム、約４％のマンニトール、約０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０（商標）（ポリソルベート２０）を含み得、かつ／または約ｐＨ６．０である。
【０３１３】
さらに別の実施形態では、本開示は、哺乳動物を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の薬学的組成物を投与することを含み、哺乳動物が、組成物中のＦｃドメイン含有ポリペプチドで有益に治療され得る疾患または障害を有する、方法を提供する。さらに別の実施形態では、Ｆｃドメイン含有ポリペプチドは、組成物で治療されるであろう哺乳動物と同じ種に由来する。特定の実施形態では、哺乳動物は、治療を必要とするヒト患者である。組成物のＦｃドメイン含有ポリペプチドがクロトー：Ｆｃである場合、治療され得る疾患または障害の例には、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、ウェゲナー病（肉芽腫症）、クローン病（または炎症性腸疾患）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、Ｃ型肝炎、子宮内膜症、喘息、悪液質、乾癬、およびアトピー性皮膚炎、または１つ以上のクロトー遺伝子に変異を有する遺伝性障害を有する人が含まれるが、これらに限定されない。クロトー：Ｆｃで治療され得る追加の疾患または障害には、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ００／６２７９０、ＷＯ０１／６２２７２、および米国特許出願第２００１／００２１３８０号に記載のものが含まれる。
【０３１４】
さらに別の実施形態では、本開示は、本開示の薬学的組成物中のＦｃドメイン含有ポリペプチド安定性の安定性試験の加速のための方法であって、保管前、すなわち、開始時に、本開示に従って製剤化されたポリペプチドの活性を試験し、組成物を３７℃で１ヶ月保管し、ポリペプチドの安定性を測定するステップと、開始時から１ヶ月時点までの安定性形態を比較するステップとを含む、方法を提供する。この情報は、最初は良好な安定性を有するように見えるが、長期間では良好に保管されないバッチまたはロットを早期に除去するのに役立つ。
【０３１５】
さらに、薬学的組成物は、活性成分、例えばＦｃドメイン含有ポリペプチドが、液体または凍結状態のいずれかで保管経過にわたって安定であるように、長期保管を提供する。本明細書で使用される場合、語句「長期」保管は、薬学的組成物が、３ヶ月以上、６ヶ月以上、１年以上、および好ましくは２年以上保管され得ることを意味すると理解される。長期保管はまた、薬学的組成物が、２〜８℃で液体として保管されるか、または例えば−２０℃以下（例えば、−２０℃もしくは−８０℃）で凍結されるかのいずれかを意味すると理解される。組成物はまた、２回以上凍結および解凍され得ることも企図される。長期保管に関する用語「安定した」は、薬学的組成物の活性ポリペプチドが、保管開始時の組成物の活性と比較して、２０％、またはより好ましくは１５％、またはさらにより好ましくは１０％、および最も好ましくは５％を超えてその活性を失わないことを意味すると理解される。
【０３１６】
１つ以上の抗酸化剤が、本開示の製剤に含まれ得る。製剤の調製への使用が企図される抗酸化剤には、グリシンおよびリジンなどのアミノ酸、ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡなどのキレート剤、ならびにソルビトールおよびマンニトールなどのフリーラジカルスカベンジャーが含まれる。
【０３１７】
（経口または非経口）修飾放出製剤（例えば、コーティング、カプセル化、徐放、制御放出、延長放出、遅延放出、持続放出、逐次継続放出、デポーなど）、吸入ミスト、経口活性製剤、坐剤、および植込剤または植込み型医療デバイスなどの他の有効な投与形態もまた、本明細書で企図される。このように、製剤はまた、バルク浸食性ポリマー（ｂｕｌｋ  ｅｒｏｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）（例えば、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）コポリマー、ＰＬＧＡポリマーブレンド、ＰＥＧのブロックコポリマー、および乳酸およびグリコール酸、ポリ（シアノアクリレート）などのポリマー化合物の微粒子調製物）；表面侵食性ポリマー（例えば、ポリ（無水物）、およびポリ（オルトエステル））；ヒドロゲルエステル（例えば、プルロニックポリオール、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテルコポリマー、セルロース、ヒアルロン酸誘導体、アルギネート、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ならびにデンプンおよびデキストラン）、ならびにそれらの組成物系の微粒子調製物、またはリポソームもしくは微小球の調製物を含み得る。そのような製剤は、本タンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、ならびにインビボクリアランス速度に影響し得る。所望のタンパク質のための最適な薬学的製剤は、投与経路および所望の投薬量に依存して、当業者によって判定され得る。例示的な薬学的製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２、１４３５−１７１２ページに開示されおり、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３１８】
生物活性
（事前に）ヒト組換えアルファ可溶性クロトーの有効性を評価および／または（年齢に関係する障害もしくは臨床（例えば、代謝）障害を呈する患者、対象、もしくは個体に対する）有効用量を判定するための方法には、（例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、または他の何らかの非ヒト）を使用する）生物ベースのアッセイを実施することが含まれ得る。クロトータンパク質は、生物に１回、またはレジメン（規則的もしくは不規則的）通りに投与され得る。例えば、タンパク質は、所与の期間（例えば、毎月、半月ごと、毎週、半週ごと、毎日など）に好適な回数（例えば、１回、２回など）投与され得る。その後、生物のパラメータ（例えば、年齢に関連するパラメータ）が評価され得る。目的のクロトータンパク質は、参照（例えば、対照生物のパラメータ）と比較して、パラメータの変化を実現し得るか、またはもたらし得る。（例えば、毒性、クリアランス、および薬剤動態に関連する）他のパラメータもまた、評価され得る。
【０３１９】
本開示のクロトータンパク質は、年齢に関係するかまたは年齢に関連する障害または病態、臨床（例えば、代謝）障害または病態などの、特定の障害または病態を有するかまたはそれを呈する動物（モデル）を使用して評価され得る。そのような障害および病態はまた、タンパク質の生理学上の効果が観察され得る感作系を提供し得る。例示的な障害には、例えば、除神経、廃用性萎縮症、臨床（例えば、代謝）障害（例えば、ｄｂ／ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウスなどの肥満および／または糖尿病動物の障害）、脳障害、肝虚血（ｋｉｄｎｅｙ  ｉｄｓｃｈｅｍｉａ）または他の肝障害、シスプラチン／タキソール／ビンクリスチンモデル、腎阻血／再灌流モデル、様々な組織（異種移植片）移植、遺伝子導入骨モデル、疼痛症候群（例えば、炎症性および神経障害）、パラコート、遺伝毒性、酸化ストレスモデル、ならびに腫瘍（Ｉ）モデルが含まれる。
【０３２０】
本開示のＳ−クロトータンパク質を評価するために、タンパク質が、好適な動物に（好適な治療期間にわたって）投与され得、動物のパラメータが（例えば、１０〜６０分、１〜２４時間、１〜３０日、１〜１２ヶ月、１〜５年、またはそれらの間の任意の値もしくは値の範囲などの好適な期間の後に）評価される。動物には、適宜または通常通り栄養が与えられ得る（例えば、カロリー制限下ではないが、いくつかのパラメータは、そのような条件下で評価され得る）。典型的には、そのような動物のコホートが、アッセイに使用される。一般に、試験ポリペプチドが、カロリー制限に供される同様の動物の表現型の方向でパラメータに影響する場合、試験ポリペプチドは、動物の寿命制御を好都合に改変するように示され得る。そのような試験ポリペプチドは、生物のカロリー摂取を取り除くことなく、カロリー制限（例えば、そのような影響のサブセット）による少なくともいくらかの寿命制御効果を引き起こし得る。
【０３２１】
試験されるパラメータ（複数可）は、年齢に関連するかまたは疾患に関連するパラメータ（複数可）（例えば、動物モデルに関連する障害の症状）であり得る。好都合に示される試験タンパク質は、ポリペプチドで治療していない同様の参照動物と比較して、症状の改善を引き起こし得る。障害または加齢に関連する他のパラメータには、抗酸化レベル（例えば、抗酸化酵素レベルまたは活性）、ストレス耐性（例えば、パラコート耐性）、深部体温、グルコースレベル、インスリンレベル、甲状腺刺激ホルモンレベル、プロラクチンレベル、および黄体形成ホルモンレベルが含まれ得る。
【０３２２】
年齢に関係する障害を治療するための本開示のＳ−クロトータンパク質の有効性を測定するために、クロトー発現が減少した動物（例えば、変異体またはクロトー遺伝子欠損を有するマウス）が使用され得る。例えば、試験タンパク質を変異マウスに投与し、年齢に関係するパラメータを監視してもよい。好都合に示される試験タンパク質は、タンパク質で治療されていない同様の参照動物と比較して症状の改善を引き起こし得る。
【０３２３】
臨床（例えば、代謝）障害または加齢に関連するパラメータは、体重の測定、生殖能力獲得の検査、血糖レベルの測定、寿命の観察、皮膚の観察、歩行などの運動機能の観察などによって評価され得る。評価はまた、胸腺重量の測定、胸腔の内面に形成された石灰化結節のサイズの観察などによっても行われ得る。さらに、クロトー遺伝子またはクロトータンパク質のｍＲＮＡの定量的判定もまた、評価に有用であり得る。
【０３２４】
さらに他の（インビボ）モデルおよび生物アッセイには、臨床（例えば、代謝）パラメータ、例えば、インスリン障害、ＩＩ型糖尿病に関連するパラメータについて動物を評価することが含まれる。例示的な代謝パラメータには、グルコース濃度、インスリン濃度、およびインスリン感受性が含まれる。
【０３２５】
試験タンパク質が寿命制御を改変することができるかを評価する際に、いくつかの年齢に関連するパラメータまたはバイオマーカーが監視または評価され得る。例示的な年齢に関連するパラメータには、（ｉ）細胞または生物の寿命、（ｉｉ）生物学的な年齢に依存する発現パターンを有する細胞または生物における遺伝子転写または遺伝子産物の存在または存在量、（ｉｉｉ）ストレスに対する細胞または生物の耐性、（ｉｖ）細胞または生物の１つ以上の代謝パラメータ（例示的なパラメータには、循環インスリンレベル、血中グルコースレベル、脂肪含有量、深部体温などが含まれる）、（ｖ）生物に存在する細胞または細胞の組の増殖能力、ならびに（ｖｉ）細胞または生物の物理的外観または挙動が含まれる。
【０３２６】
用語「平均寿命」は、生物のコホートの平均死亡年齢を指す。場合によっては、「平均寿命」は、制御された環境条件下で遺伝的に同一の生物のコホートを使用して評価される。事故による死亡は、数に入れない。制御された環境条件下で平均寿命が判定できない場合（例えば、ヒトの場合）、十分に大きな母集団に対する（例えば、数理表からの）確実な統計情報が、平均寿命として使用され得る。
【０３２７】
２つのそのような生物、例えば、１つの参照生物とＳ−クロトータンパク質で治療された１つの生物との間の分子差の特徴付けにより、生物の生理学的状態の差異を明らかにすることができる。参照生物および治療された生物は、典型的には、同じ（または実質的に同じ）実年齢および／または性別である。本明細書で使用される場合、用語「実年齢」は、受胎、定義された胎生期もしくは胎児期、またはより好ましくは出生などの、予め選択された事象から経過した時間を指す。生物が比較分析のために「同じ」実年齢のものであるかを判定するために、様々な基準が使用され得る。
【０３２８】
典型的には、必要とされる精度の程度は、野生型生物の平均寿命と相関している。例えば、実験室野生型株Ｎ２がいくつかの制御された条件下で平均約１６日間生存する線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの場合、同じ年齢の生物は、同じ日数にわたって生存し得る。マウスの場合、同年齢の生物は、同じ週数または月数にわたって、霊長類またはヒトの場合、同じ年数（すなわち２年、３年または５年以内）など、生存し得る。一般に、同じ実年齢の生物は、その種の野生型生物の平均寿命の１５、１０、５、３、２、または１％以内の時間量にわたって生存し得る。好ましくは、生物は、成体である（例えば、生物は、平均的な野生型生物が、生殖能力のある年齢まで成熟する少なくともある時間量にわたって生存している）。
【０３２９】
生物が加齢の明白な物理的特性を呈する前に、生物学的スクリーニングアッセイが実施され得る。例えば、生物は、同じ種の野生型生物の平均寿命の１０、３０、４０、５０、６０、または７０％のみ生存した成体であってもよい。代謝、免疫能力、および染色体構造の、年齢に関連した変化が報告されている。これらの変化のいずれも、試験対象（例えば、生物ベースのアッセイ）において、または（例えば、（ヒトもしくは哺乳動物）患者の）本明細書に記載の治療剤での治療前、治療中、もしくは治療後のいずれかで評価され得る。
【０３３０】
カロリー制限に関連するマーカーはまた、スクリーニングアッセイの対象生物（または治療された対象）において評価され得る。これらのマーカーは年齢に関連しない場合があるが、クロトーまたはクロトーに関係する経路が調節されると改変される生理学的状態を示し得る。マーカーは、カロリー制限された動物において大きく変化するｍＲＮＡまたはタンパク質であり得る。本明細書に記載の動物の細胞に由来する細胞モデル、または本明細書に記載の動物モデルの類似体が、細胞ベースのアッセイに使用され得る。
【０３３１】
筋萎縮に対する試験タンパク質の効果を評価するためのモデルには、１）例えば、大腿中央部で右坐骨神経を切断することによる、除神経から生じるラットの内側腓腹筋量減少、２）（例えば、９０度の屈曲で右足首関節を固定することによる）固定化から生じるラットの内側腓腹筋量減少、３）後肢懸垂から生じるラットの内側腓腹筋量減少、４）悪液質サイトカインであるインターロイキン−１（ＩＬ−１）を用いた治療から生じる骨格筋萎縮、および５）グルココルチコイド、デキサメタゾンを用いた治療から生じる骨格筋萎縮が含まれる。
【０３３２】
製品、組成物、製剤、補充剤など
本開示のいくつかの実施形態は、天然可溶性アルファクロトータンパク質の産生を増大させ、かつ／またはクロトータンパク質の損傷もしくは分解を減弱するように構成または製剤化された組成物、ならびにそれに関連する方法、キット、製剤、組み合わせ製品、同時投与、共製剤、投薬量、プロセス、方法、治療プロトコル、および診断方法に関する。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の組成物を製造する方法に関する。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の組成物の使用、またはそれを使用してヒトもしくは非ヒト動物対象を治療する方法に関する。本開示のいくつかの実施形態は、ヒトまたは非ヒト動物対象へのそれらの投与を含む、本開示の組成物に関与する治療方法に関する。そのような使用および治療方法は、天然の可溶性アルファクロトータンパク質産生を増大させること、および／またはクロトータンパク質の損傷もしくは分解を減弱することなどによって、内因性クロトータンパク質レベルを増加させ得る。
【０３３３】
特定の実施形態は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）対象に投与されると、ヒトまたは非ヒト動物対象における内因性可溶性アルファクロトータンパク質のレベルを増加させる健康補充剤を含む、物質の組成物を含む。組成物または健康補充製剤は、（合成）化学的および／または天然の構成成分または成分を含み得る。言い換えれば、組成物または健康補充製剤の構成成分または成分は、（合成）化学的および／または天然の供給源であるか、それらに由来し得る。
【０３３４】
例示的な組成物は、好ましくは、例えば、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＫ、３，５，４’−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン（レスベラトロール）、プテロスチルベン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、トログリタゾン、ロシグリタゾン、Ｎｏｔｏｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｉｎｃｉｓｕｍ  Ｔｉｎｇ、ゲンチアナ（根、抽出物）、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  Ｓｉｎｅｎｓｉｓ（ＣＳ）菌糸）、イソフラボン（大豆）、ゲニステイン、ダイゼイン、クエルセチン（二水和物、ディル、ベイリーフ、オレガノ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アスタキサンチン、セサミン（Ｓｅｍｅｎ  Ｓｅｓａｍｉｎ  Ｎｉｇｒｕｍ（黒色））、ゴマ（種子抽出物）、ロスマリン酸（ＲＡ、（マジョラム））、テトラデシルチオ酢酸（ＴＴＡ）、リン酸二カルシウム（無水）、微結晶性セルロース（ＭＣＣ）、クロスカルメロースナトリウム（プリメロース）、ステアリング酸、ステアリン酸マグネシウム、アルファリポ酸、共役（アルファ）リノール酸（ＣＬＡ）、腸内有益菌、活性炭、および当該技術分野で既知の他のものからなる群から選択される１つ以上の構成成分を含み得る。
【０３３５】
特定の成分または構成成分は、加齢とともに生じる細胞および組織の機能障害に関連する１つ以上の病態の治療または影響に正の利益および非常に低い副作用を有し得る。特定の成分または構成成分は、その投与後に、ヒトまたは非ヒト動物対象における可溶性アルファクロトー（ｓ−クロトー）レベルの循環血漿レベルを（直接的または間接的に）増加させ得る。
【０３３６】
以下の実施例は、例示に過ぎない。以下の実施例は、本開示の実施形態の実施において有用であり得る様々な任意の成分、構成成分、方法ステップなどを例示する。
本開示の実施形態は、個々に、細胞および組織の機能障害に関連付けられている、かつ／または加齢に伴って生じ得る、１つ以上の病態への対処、治療、影響、および／または対抗において、正の利益および／または非常に低い副作用の潜在性を有し得る、いくつかの構成成分（または成分）の製剤（組成物、同時投与など）を含む。
【０３３７】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、本開示のいくつかの構成成分または成分は、（例えば、ヒトＨＥＫ２９３／ｋｌ細胞株内で）クロトー遺伝子のプロモーターを活性化し得るか、または肝臓、腎臓、および他の組織内でのクロトーの発現における年齢に関係する低下を逆転させ得る。構成成分のいくつかは、クロトータンパク質またはクロトー遺伝子に対する酸化的または他の損傷を減弱、減少、阻害、および／または防止し得る。
【０３３８】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、構成成分のいくつかは、細胞および組織の機能障害に関連付けられている、かつ／または加齢に伴って生じ得る、１つ以上の病態への対処、治療、影響、および／または対抗において、正の利益および／または非常に低い副作用の潜在性を有することが、１つ以上の動物およびヒト臨床試験によって示されている。本開示は、内因性クロトータンパク質レベルを増加させるための組成物および方法において、これらの様々な構成成分を利用する。具体的には、本開示は、天然可溶性アルファクロトータンパク質の産生を増大させ、かつ／またはクロトータンパク質の損傷もしくは分解を減弱するように構成または製剤化された組成物において、これらの様々な構成成分を利用する。
【０３３９】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、いくつかの実施形態の特定の個々の成分は、哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト）動物における可溶性アルファ−クロトーの循環血漿レベルを増加させ得る。成分の例には、抗酸化剤であるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ビタミンＤ３（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３［１，２５（ＯＨ）２Ｄ３］）などのＤビタミン、および／または慢性腎疾患に苦しんでいるマウスにおいてクロトー発現を増加させ、リン酸塩尿を増加させ、高リン酸血症を補正し、血清線維芽細胞成長因子−２３（ＦＧＦ−２３）を低下させ、大動脈石灰化症の関連する減少をもたらすと考えられているビタミンＤ受容体アゴニスト（例えば、カルシトリオール、パリカルシトール）、ならびに年齢に関係する塩類尿および近位尿細管での腎臓損傷を改善すると考えられているビタミンＣおよび／またはビタミンＥが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０３４０】
さらなる例示的な成分には、例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、リノール酸、共役リノール酸（ＣＬＡ）、イソフラボン（例えば、ゲニステイン、ダイゼイン、クエルセチン）、ロスマリン酸、セサミンおよびアスタキサンチン（食品由来の抗酸化剤）、ならびにテトラデシルチオ酢酸（ＴＴＡ）などのアルファクロトーの抗加齢特性を補充し得る非処方成分が含まれ得るが、これらに限定されない。いかなる理論にも拘束されるものではないが、加齢脳は、特に炎症性改変および酸化的改変を起こしやすく、これが、学習および記憶の減少の根底にあり得、ＤＨＡなどのオメガ３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、加齢脳を神経変性疾患の発症から保護する。したがって、アルファリノール酸はＤＨＡの製造において人体で使用される前駆体分子として機能し得るため、特定の式には、アルファリノール酸または共役アルファリノール酸が含まれ得る。
【０３４１】
少なくとも１つの実施形態では、１つ以上のＤＨＡ前駆体またはオメガ３脂肪酸（ＬＡまたはＣＬＡなど）は、製剤から省略され得る。いかなる理論にも拘束されるものではないが、ＬＡおよびＣＬＡなどのオメガ３脂肪酸は、抗凝血薬物の効果を増加させ、出血のリスクを上昇させ得る。薬物の例には、特に、ワルファリン（Ｃｏｕｍａｄｉｎ）、クロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ）、およびアスピリンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＤＨＡが、製剤に含まれ得る。いかなる理論にも拘束されるものではないが、ＤＨＡは、抗凝血を直接引き起こすことはない。
【０３４２】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、ミトコンドリア損傷は、様々な毒性発作、低酸素症、または外傷から生じる細胞傷害の原因および結果であり得る。腎近位尿細管細胞（ＲＰＴＣ）傷害後のミトコンドリア生合成の増加は、そのような傷害後のミトコンドリア機能および細胞機能の回復を加速させ得る。これらの観察に関連して、ダイゼインおよびゲニステインなどのイソフラボンは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ共活性化因子（ＰＧＣ）−１アルファ発現を増加させ、ＡＴＰシンターゼベータおよびＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット６（ＮＤ６）の発現の増加によって示されるミトコンドリア生合成をもたらし得、これは、ＲＰＴＣにおける呼吸およびＡＴＰの１．５倍の増加をもたらし得、傷害されたＲＰＴＣの回復の利益になり得る。いかなる理論にも拘束されるものではないが、ダイゼインは、腸内で、具体的には腸内細菌叢によって代謝されて、生理活性化合物エクオールを生成し得る。エクオールもまた、特定の実施形態に含まれ得る。一方、イソフラボン、クエルセチンは、酸化的に修飾または傷害されたタンパク質を認識し、除去することにより、酸化還元バランスの維持に主要な役割を果たす細胞タンパク質負荷の適切な制御に関与する大きなタンパク質複合体であるプロテアソームにおける酸化ストレス耐性を増加させることによって、加齢の有害効果に対抗し得る。
【０３４３】
ロスマリン酸もまた、いくつかの製剤中に成分として添加され得る。ロスマリン酸（ＲＡ）は、天然に存在するフェノール化合物であり、草本、香辛料、および薬用植物の有益な健康促進効果に寄与し得る。加齢マウスに１ｋｇ当たり２００ｍｇの用量のＲＡを１日１回３０日間投与すると、ＲＡを受けなかった加齢対照と比較して、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）カタラーゼ（ＣＡＴ）およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）の活性が有意に増加し、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）が減少し得る。したがって、ＲＡは、加齢マウスの肝臓および腎臓の組織内で有意な抗酸化酵素活性を促進し得る。
【０３４４】
いくつかの実施形態はまた、アスタキサンチン（Ａ）および／またはセサミン（Ｓ）などの食品由来の抗酸化剤を含有し得る。いかなる理論にも拘束されるものではないが、これらの成分（アスタキサンチンは、サケ、エビ、カニ、および微細藻類に見出される赤色カロテノイドである一方で、セサミンは、ゴマ抽出物に見出される主要なリグナンである）の両方を組み合わせ（すなわち、ＡＳ）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）を有する対象に毎日投与すると、プラセボ群と比較して、ＡＳ群において精神運動速度および処理速度の有意な改善が観察された。したがって、ＡＳの毎日の補充は、複雑なタスクを迅速かつ正確に理解し、実施する能力に関連する認知機能を改善し得る。
【０３４５】
テトラデシルチオ酢酸（ＴＴＡ）などの１つ以上のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ−γ）アゴニストもまた、特定の実施形態に添加され得る。ＰＰＡＲ−γアゴニストは、アミノ酸代謝およびＬ−カルニチン生合成の調節を通して、心筋に有益な効果を有し得る。
【０３４６】
上記の精製された化学化合物に加えて、いくつかの実施形態は、１つ以上（例えば、いくつか）の天然成分または抽出物を含有し得る。これらには、リンドウ根抽出物、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ（冬虫夏草）、およびＮｏｔｏｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｉｎｃｉｓｕｍ  Ｔｉｎｇが含まれるが、これらに限定されない。
【０３４７】
特定の実施形態は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌種（例えば、ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、ｂｒｅｖｉｓ、ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、ｃａｓｅｉ、ｇａｓｓｅｒｉ、ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、ｌａｃｔｉｓ、ｐｌａｎｔａｒｕｍ、ｐａｒａｃａｓｅｉ、ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、ｓａｋｅなど）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種（例えば、ｂｉｆｉｄｕｍ、ｂｒｅｖｅ、ｉｎｆａｎｔｉｓ、ｌａｃｔｉｓ、ｌｏｎｇｕｍなど）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌種（例えば、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓなど）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌種（例えば、ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓなど）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ菌種（例えば、ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉなど）、および当該技術分野で既知の他のものなどの（腸内有益菌）細菌のうちの１つ以上の（選択的な）株を含み得る。いかなる理論にも拘束されるものではないが、腸内有益菌は、（例えば、マウスにおいて）加齢による酸化ストレスを緩和し、加齢のバイオマーカーの発現を改善し得る。本開示の特定の実施形態に含まれ得る腸内有益菌に関する追加の情報は、その全体が特定の参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｒｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，２０１４Ｍａｙ；１１（５）：４７４５−４７６７に掲載の、Ｓａｂｉｎａ  Ｆｉｊａｎによる文献「Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｌａｉｍｅｄ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ：Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ」に見出され得る。
【０３４８】
表４２は、特定の実施形態（ＫＳＦ１０１と表記）に製剤化され得る成分のリストを提供する。
【０３４９】
【表４２】
2021508037.tif 000073
【０３５０】
非限定的な例として、ＫＳＦ１０１製剤は、経口投与されるＤＳＨＥＡに準拠した製剤または組成物であり得るか、またはそれを含み得る。したがって、場合によっては、ＫＳＦ１０１補充剤は、消費者に直接（ＤＴＣ）、および／または処方箋／医師の指示なしで、市販および／また売られ得る。しかしながら、ＫＳＦ１０１は、本開示の範囲から逸脱することなく、他の剤形で、および／またはＦＤＡ承認の薬物として製剤化され得ることが理解されるであろう。ＫＳＦ１０１の成分の濃度は、１５０ポンド（６８キログラム）の人の標準成人参照に基づく。当業者によって理解されるように、代替的な投薬量（複数可）もまた、本明細書で企図される。
【０３５１】
表４３は、本開示の別の実施形態に製剤化され得る潜在的な（例えば、好ましいおよび任意の）成分を列挙する。
【０３５２】
【表４３】
2021508037.tif 000074
【０３５３】
表４４は、本開示の別の実施形態に製剤化され得る潜在的な（例えば、好ましいおよび任意の）成分を列挙する。
【０３５４】
【表４４】
2021508037.tif 000075
【０３５５】
表４２〜４４の成分は、任意で好適な組み合わせで組み合わされ得る。非限定的な例として、代替的な製剤（複数可）は、経口投与されるＤＳＨＥＡに準拠した製剤または組成物であり得るか、またはそれを含み得る。しかしながら、代替的な製剤（複数可）は、本開示の範囲から逸脱することなく、他の剤形で、および／またはＦＤＡ承認の薬物として製剤化され得ることが理解されるであろう。代替的な製剤（複数可）中の成分のそれぞれの濃度は、１５０ポンド（６８キログラム）の人の標準成人参照に基づく。当業者によって理解されるように、代替的な投薬量（複数可）もまた、本明細書で企図される。
【０３５６】
例示的な組成物（例えば、栄養補助組成物）は、ビタミンＣ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、クエルセチン（二水和物）、ロスマリン酸（ＲＡ）、プテロスチルベン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、および１つ以上の腸内有益菌からなる群から選択される、２つ以上の構成成分を含み得る。１つ以上の腸内有益菌は、有効量の（ｉ）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ  ＢＬ−０４、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ／ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ−０２、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＢＬ−０５から選択される１つ以上のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種および／もしくは株、ならびに／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＡ−１４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＲ−３２、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＬＰＣ−３７から選択される１つ以上のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種および／もしくは株のうちの１つ以上を含み得る。
【０３５７】
例示的に、組成物（または製剤）は、最大、少なくとも、および／または約５００億ＣＦＵ（１日用量当たり）の腸内有益菌成分を含む。代替的な実施形態は、最大、少なくとも、これらの間、および／または約２００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、３００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、４００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、６００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、７００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、および／または８００億ＣＦＵ（１日用量当たり）の腸内有益菌成分を含み得る。例示的に、腸内有益菌成分は、単一の腸内有益菌（細菌）種もしくは株、または最大、少なくとも、および／もしくはこれらの間の２、３、４、５、６、７、８、９、および１０個の腸内有益菌（細菌）種もしくは株を含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）得るか、または含み（ｉｎｃｌｕｄｅ）得る。少なくとも１つの実施形態では、腸内有益菌成分は、以下の腸内有益菌（細菌）種または株、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、ならびに／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ  ＢＬ−０４、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ／ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ−０２、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＢＬ−０５の各株につき３００億ＣＦＵ／日を含む。しかしながら、特定の実施形態は、前述のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種および／もしくは株のうちの１つもしくは２つ、ならびに／または最大、少なくとも、これらの間、および／もしくは約１００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、２００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、３００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、４００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、および／もしくは５００億ＣＦＵ（１日用量当たり）の量を含み得ることが理解されるであろう。少なくとも１つの実施形態では、腸内有益菌成分は、以下の腸内有益菌（細菌）種または株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種および／または株であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＡ−１４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＬＲ−３２、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ＬＰＣ−３７の各株につき２００億ＣＦＵ／日を含む。しかしながら、特定の実施形態は、前述のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種および／もしくは株のうちの１つもしくは２つ、ならびに／または最大、少なくとも、これらの間、および／もしくは約５０億ＣＦＵ（１日用量当たり）、１００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、２００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、３００億ＣＦＵ（１日用量当たり）、および／もしくは４００億ＣＦＵ（１日用量当たり）の量を含み得ることが理解されるであろう。
【０３５８】
少なくとも１つの実施形態では、ビタミンＣは、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約５００ｍｇ、または約１００〜２０００ｍｇ、好ましくは約２００〜１５００ｍｇ、より好ましくは約２５０〜１２００ｍｇ、さらにより好ましくは約４００〜１０００ｍｇ、さらにより好ましくは約５００〜１０００ｍｇ、さらにより好ましくは約５００〜７５０ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ビタミンＣは、（１日当たりまたは１投薬量当たり）少なくとも約１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、または１０００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ビタミンＣは、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約２５００ｍｇ、２０００ｍｇ、１５００ｍｇ、１０００ｍｇ、または７５０ｍｇ以下の１日用量および／または濃度で含まれ得る。
【０３５９】
少なくとも１つの実施形態では、ビタミンＤ３は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約１０００ｍｇ、または約１００〜２５００ｍｇ、好ましくは２００〜２０００ｍｇ、より好ましくは約２５０〜１８００ｍｇ、さらにより好ましくは約４００〜１５００ｍｇ、さらにより好ましくは約５００〜１５００ｍｇ、さらにより好ましくは約７５０〜１２５０ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ビタミンＤ３は、１日当たりまたは１投薬量当たり）少なくとも約１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１０００ｍｇ、１２５０ｍｇ、１５００ｍｇ、または２０００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ビタミンＤ３は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約３０００ｍｇ、２５００ｍｇ、２０００ｍｇ、または１５００ｍｇ以下の１日用量および／または濃度で含まれ得る。
【０３６０】
少なくとも１つの実施形態では、ビタミンＥは、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約４００ｍｇ、または約１００〜２０００ｍｇ、好ましくは約１５０〜１５００ｍｇ、より好ましくは約２００〜１２００ｍｇ、さらにより好ましくは約２５０〜１０００ｍｇ、さらにより好ましくは約２５０〜７５０ｍｇ、さらにより好ましくは約２５０〜５００ｍｇ、さらにより好ましくは約３００〜７５０ｍｇ、さらにより好ましくは約３００〜５００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ビタミンＥは、（１日当たりまたは１投薬量当たり）少なくとも約１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、または１０００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ビタミンＥは、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約２０００ｍｇ、１５００ｍｇ、１０００ｍｇ、７５０ｍｇ、または５００ｍｇ以下の１日用量および／または濃度で含まれ得る。
【０３６１】
少なくとも１つの実施形態では、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約６００ｍｇ、または約１００〜２０００ｍｇ、好ましくは約１５０〜１５００ｍｇ、より好ましくは約２００〜１２００ｍｇ、さらにより好ましくは約２５０〜１０００ｍｇ、さらにより好ましくは約２５０〜７５０ｍｇ、さらにより好ましくは約５００〜７５０ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）少なくとも約１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、または１０００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約２０００ｍｇ、１５００ｍｇ、１０００ｍｇ、または７５０ｍｇ以下の１日用量および／または濃度で含まれ得る。
【０３６２】
少なくとも１つの実施形態では、クエルセチン（二水和物）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約１５０ｍｇ、または約１０〜１０００ｍｇ、好ましくは約２５〜７５０ｍｇ、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ、さらにより好ましくは約１００〜２５０ｍｇ、さらにより好ましくは約１００〜２００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、クエルセチン（二水和物）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）少なくとも約１０ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、または２５０ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、クエルセチン（二水和物）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約１０００ｍｇ、７５０ｍｇ、５００ｍｇ、４００ｍｇ、３００ｍｇ、２５０ｍｇ、または２００ｍｇ以下の１日用量および／または濃度で含まれ得る。
【０３６３】
少なくとも１つの実施形態では、ロスマリン酸（ＲＡ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約５００ｍｇ、または約１００〜２０００ｍｇ、好ましくは約２００〜１５００ｍｇ、より好ましくは約２５０〜１２００ｍｇ、さらにより好ましくは約４００〜１０００ｍｇ、さらにより好ましくは約５００〜１０００ｍｇ、さらにより好ましくは約５００〜７５０ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ロスマリン酸（ＲＡ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）少なくとも約１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、または１０００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ロスマリン酸（ＲＡ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約２５００ｍｇ、２０００ｍｇ、１５００ｍｇ、１０００ｍｇ、または７５０ｍｇ以下の１日用量および／または濃度で含まれ得る。
【０３６４】
少なくとも１つの実施形態では、プテロスチルベンは、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約５０ｍｇ、または約１０〜２００ｍｇ、好ましくは約２０〜１５０ｍｇ、より好ましくは約２５〜１２０ｍｇ、さらにより好ましくは約２５〜１２０ｍｇ、さらにより好ましくは約４０〜１００ｍｇ、さらにより好ましくは約５０〜１００ｍｇ、さらにより好ましくは約５０〜７５ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、プテロスチルベンは、（１日当たりまたは１投薬量当たり）少なくとも約１０ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、または１００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、プテロスチルベンは、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約２５０ｍｇ、２００ｍｇ、１５０ｍｇ、１００ｍｇ、または７５ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。
【０３６５】
少なくとも１つの実施形態では、ＤＨＡ（好ましくは菜食用ＤＨＡ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約２００ｍｇ、または約１０〜１０００ｍｇ、好ましくは約２５〜７５０ｍｇ、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ、さらにより好ましくは約１００〜２５０ｍｇ、さらにより好ましくは約１５０〜２５０ｍｇ、さらにより好ましくは約１００〜２００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、クエルセチン（二水和物）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）少なくとも約１０ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、または５００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、クエルセチン（二水和物）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約２０００ｍｇ、１５００ｍｇ、１０００ｍｇ、７５０ｍｇ、５００ｍｇ、４００ｍｇ、３００ｍｇ、または２５０ｍｇ以下の１日用量および／または濃度で含まれ得る。
【０３６６】
少なくとも１つの実施形態では、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約５００ｍｇ、または約１００〜２０００ｍｇ、好ましくは約２００〜１５００ｍｇ、より好ましくは約２５０〜１２００ｍｇ、さらにより好ましくは約４００〜１０００ｍｇ、さらにより好ましくは約５００〜１０００ｍｇ、さらにより好ましくは約５００〜７５０ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）少なくとも約１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、または１０００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約２５００ｍｇ、２０００ｍｇ、１５００ｍｇ、１０００ｍｇ、または７５０ｍｇ以下の１日用量および／または濃度で含まれ得る。
【０３６７】
少なくとも１つの実施形態では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約３００ｍｇ、または約５０〜２０００ｍｇ、好ましくは約１００〜１０００ｍｇ、より好ましくは約１５０〜７５０ｍｇ、より好ましくは約２００〜６００ｍｇ、さらにより好ましくは約２００〜５００ｍｇ、さらにより好ましくは約２００〜４００ｍｇ、さらにより好ましくは約２５０〜５００ｍｇ、さらにより好ましくは約２５０〜４００ｍｇ、さらにより好ましくは約３００〜５００ｍｇ、さらにより好ましくは約３００〜４００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）少なくとも約５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、または１０００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約２０００ｍｇ、１５００ｍｇ、１０００ｍｇ、７５０ｍｇ、５００ｍｇ、４００ｍｇ、または３５０ｍｇ以下の１日用量および／または濃度で含まれ得る。
【０３６８】
少なくとも１つの実施形態では、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約２００ｍｇ、または約１０〜１０００ｍｇ、好ましくは約２５〜７５０ｍｇ、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ、さらにより好ましくは約１００〜２５０ｍｇ、さらにより好ましくは約１５０〜２５０ｍｇ、さらにより好ましくは約１００〜２００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）少なくとも約１０ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、または５００ｍｇの１日用量および／または濃度で含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、（１日当たりまたは１投薬量当たり）約２０００ｍｇ、１５００ｍｇ、１０００ｍｇ、５００ｍｇ、４００ｍｇ、３００ｍｇ、または２５０ｍｇ以下の１日用量および／または濃度で含まれ得る。
【０３６９】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、ＮＡＤ＋および／またはＮＡＤ＋前駆体（複数可）（ＮＲおよび／またはＮＭＮ）を含む実施形態では、ＮＡＤ＋および／またはＮＡＤ＋前駆体（複数可）は、（例えば、血流に入り、最初に肝臓をバイパスし、肝臓がそれらをＮＡＭに変換するまでの時間を延長するための）舌下適用のためのロゼンジの形態であり得る。他の構成成分もまた、別個に投与され得るか、または同時投与され得る。いくつかの実施形態では、成分は、好ましくは少なくともいくつかの共製剤を介して同時投与され得るか、または複数回投薬組成物として製剤化され得る。例えば、いくつかの実施形態は、多丸剤、多カプセル、または他の投薬キットもしくはパックであり得るか、それを含み得るか、またはそれとして提供され得る。実施形態は、丸剤、カプセルなどの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の投薬構成成分を含み得る。いくつかの成分は、固体、顆粒、粉末、液体、または他の形態で提供され得る。
【０３７０】
表４５は、本開示の実施形態による例示的な製剤を示す。
【０３７１】
【表４５】
2021508037.tif 000076
【０３７２】
表４５の成分は、任意で、任意の好適な組み合わせで組み合わされ得る。非限定的な例として、代替的な製剤（複数可）は、経口投与されるＤＳＨＥＡに準拠した製剤または組成物であり得るか、またはそれを含み得る。しかしながら、代替的な製剤（複数可）は、本開示の範囲から逸脱することなく、他の剤形で、および／またはＦＤＡ承認の薬物として製剤化され得ることが理解されるであろう。代替的な製剤（複数可）中の成分のそれぞれの濃度は、１５０ポンド（６８キログラム）の人の標準成人参照に基づく。当業者によって理解されるように、代替的な投薬量（複数可）もまた、本明細書で企図される。
【０３７３】
いくつかの実施形態は、（例えば、哺乳動物対象において）内因性クロトータンパク質レベルまたは産生を増加させるように製剤化または共製剤化される、本明細書に記載の有効量の組成物（例えば、健康補充剤）を含む組成物を含み得る。薬学的有効量の組成物（複数可）は、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を、（例えば、血清１ミリリットル当たり、約５０〜３０００ピコグラムを上回る、それと同等、またはその間の可溶性クロトータンパク質などの所定のレベルまで）増加または上昇させるのに十分であり得る。薬学的有効量の組成物（複数可）もまた、または代替的に、所定の期間にわたって所定の閾値以上で対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を維持するのに十分であり得る。
【０３７４】
特定の実施形態では、クロトータンパク質レベルの十分なまたは好適な増加は、ＩＧＦ−１および／もしくはＷｎｔシグナル伝達経路を調節し得（調節するために有効であり得）、β−グルクロニダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ活性を呈し得、ｐ５３／ｐ２１シグナル伝達経路を抑制し得、かつ／または好ましくはｐ５３／ｐ２１シグナル伝達経路の抑制を通して、Ｈ２Ｏ２誘発性細胞老化およびアポトーシスを低減し得る。（上昇した）タンパク質は、好ましくは多面発現活性を呈し、ならびに／または好ましくは酸化ストレス、成長因子シグナリング、イオン恒常性の調節、および／もしくは１つ以上のイオンチャネルタンパク質および／もしくはインスリン／インスリン様成長因子−１受容体などの成長因子受容体などの細胞表面上での糖タンパク質の活性の調節において、体液性因子として機能し得るか、または機能的であり得る。
【０３７５】
本開示の製剤化された組成物（例えば、健康補充剤）は、患者もしくは対象によるクロトータンパク質の（天然）産生を増加もしくは増強するか、またはクロトータンパク質もしくはクロトー遺伝子の酸化的もしくは他の損傷もしくは分解を減弱（例えば、減少、阻害、および／もしくは防止）することによって、血清可溶性クロトータンパク質レベルを上昇させ得る。
【０３７６】
本開示のいくつかの実施形態は、治療用組成物または薬物などの薬学的組成物を含み得る。例えば、いくつかの実施形態は、医薬品または処方医薬品（例えば、ＡＲＢ（例えば、ロサルタン、バルサルタン）、テストステロン、ビタミンＤ受容体アゴニスト（例えば、カルシトリオール、パリカルシトール）、ＰＰＡＲ（ガンマ）アゴニスト（例えば、チアゾリジンジオン、トログリタゾン、ロシグリタゾン）、または他のもの）などの１つ以上の活性成分を含み得る。いくつかの実施形態は、アンジオテンシオン（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｏｎ）受容体遮断剤（ＡＲＢ）（すなわち、ロサルタン、バルサルタン）、またはビタミンＤ受容体アゴニスト（ＶＤＲＡ）（すなわち、カルシトリオールもしくはパリカルシトール）などの処方薬物と組み合わせて、製剤または共製剤を含み得る。製剤とともに投与され得る他の処方薬物には、ともにペルオキシダーゼ増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ−γ）アゴニストである、トログリタゾン（２００ｍｇ／ｋｇ／日）およびロシグリタゾン（２０ｍｇ／ｋｇ／日）が含まれる。いかなる理論にも拘束されるものではないが、クロトーは、培養されたヒト腎臓細胞内およびインビボでのマウス腎臓内でのＰＰＡＲ−γの標的遺伝子であると考えられている。さらに、クロトータンパク質発現は、（例えば、記載の経口投薬量での）ＰＰＡＲ−γアゴニストでの治療によって、増強（または上方制御）され得る。
【０３７７】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、ロサルタンは、ヒト２型糖尿病患者における循環α−クロトーレベルを平均で２３％だけ（有意に）増加させ得る（５４２ｐｇ／ｍｌから６６８ｐｇ／ｍｌへ、ｐ＝０．００１）。また、線形回帰分析は、血漿アルブミン−クロトーの増加が、尿アルブミン／クレアチニン比（β＝−０．２６３、ｐ＝０．０２９）の関連する減少によって見られる健康な腎機能の増強を達成したことを示唆している。同様に、バルサルタンは、α−クロトーレベルを有意に増加させ得る（４３２．７±１７９から５０６．４±２２６．８ｐｇ／ｍｌへ））。
【０３７８】
また、上記に関して、（続発性副甲状腺機能亢進症の治療に現在承認されているヒト対象から外挿されたＶＤＲＡ用量での）カルシトリオールまたはパリカルシトロールによる慢性腎疾患（ＣＫＤ）を有するマウスの治療は、ＶＤＲＡなしの場合と比較して、半分の量の大動脈石灰化症をもたらすと考えられている。具体的には、週３回、３週間にわたってカルシトリオールまたはパリカルシトールを腹腔内に与えたマウス（投薬：３０ｎｇ／ｋｇのカルシトリオール（Ｃ３０）、または１００ｎｇ／ｋｇのパリカルシトール（Ｐ１００）もしくは３００ｎｇ／ｋｇのパリカルシトール（Ｐ３００））は、血清および尿クロトーレベルの増加、リン酸塩尿の増加、高リン酸血症の補正、ならびに血清線維芽細胞成長因子−２３の低下を呈し得る。クロトーおよびオステオポンチンもまた、血清副甲状腺ホルモンおよびカルシウムの変化とは独立してＶＤＲＡ療法によって上方制御され得る。
【０３７９】
いくつかの実施形態、またはその薬学的構成成分は、１つ以上の組換え（例えば、ヒトまたは哺乳動物）クロトータンパク質、タンパク質断片、および／またはタンパク質多様体を含み得る。そのような活性成分または薬学的構成成分は、患者または対象における内因性クロトータンパク質（産生）のレベルの増加に寄与し得る。治療剤、組換えタンパク質、医薬品、および／または処方薬物などの（様々なおよび／または追加の）有効成分の追加の説明は、上記に組み込まれた特許参考文献に記載されている（すなわち、（ｉ）２０１７年６月２日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３５７５５、（ｉｉ）２０１７年１１月２２日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６３１４９、および（ｉｉｉ）２０１７年１２月６日に提出された米国特許仮出願第６２／５９５，５６７号）。そのような活性成分は、患者または対象における内因性クロトータンパク質（産生）のレベルの増加に寄与し得る。
【０３８０】
薬学的組成物または構成成分は一般に、種類にかかわらず、１つ以上の追加の成分からなる（薬学的に許容される）ビヒクル、担体、または賦形剤と任意で混和された薬物構成成分を含み得る。構成成分は、１つ以上の凝集阻害剤、緩衝液、等張化剤、および追加の賦形剤を含み得る。担体中の主溶媒は、本質的に水性または非水性のいずれであってもよい。
【０３８１】
いくつかの実施形態は、組換えクロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分を含む、組み合わせ製品、組成物、または製剤を含み得る。１つ以上の追加の活性成分は、本明細書に記載の構成成分、薬物、物質、治療組成物など、または当該技術分野で既知の他のものの中から選択され得る。例えば、クロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分は、注射可能な（例えば、筋肉内、静脈内など）、摂取可能な、経皮的な、吸入可能な、局所的な、または他の製剤に共製剤化され得る。代替的に、併用治療または同時投与は、クロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分が、組み合わせ製品、組成物、または製剤に組み合わされること、または製剤化されることなく、クロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分の治療または投与を含み得る。例えば、クロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分は、別個に注射可能な（例えば、筋肉内、静脈内など）、摂取可能な、経皮的な、吸入可能な、局所的な、または他の製剤を各々含むか、またはそのような製剤中にあり得る。
【０３８２】
いくつかの実施形態は、（例えば、哺乳動物対象において）内因性クロトータンパク質レベルまたは産生を増加させるように製剤化または共製剤化される、本明細書に記載の有効量の組成物（例えば、健康補充剤）、ならびに任意で有効（例えば、薬学的有効）量の組換えクロトータンパク質および／または医薬品もしくは処方薬物を含む組成物を含み得る。いくつかの実施形態では、組換えクロトータンパク質および／または医薬品もしくは処方薬物は、組成物と同時投与され得る。いくつかの実施形態では、組換えクロトータンパク質および／または医薬品もしくは処方薬物は、薬学的に許容される担体と組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、任意で投与される任意の組換えクロトータンパク質は、外因性クロトータンパク質を提供することによって血清可溶性クロトータンパク質レベルを上昇させ得る一方で、任意で投与される任意の医薬品または処方薬物は、患者もしくは対象によるクロトータンパク質の（天然）産生を増加もしくは増強すること、またはクロトータンパク質もしくはクロトー遺伝子の酸化的もしくは他の損傷もしくは分解を減弱（例えば、減少、阻害、および／もしくは防止）することによって血清可溶性クロトータンパク質レベルを上昇させ得る。
【０３８３】
また、同時投与は、２つ以上の構成成分の同時投与、または２つ以上の構成成分の別個の投与を含み得、別個の投与は、好ましくはある期間によって隔てられていることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、期間は非常に短くてもよい。例えば、第２の構成成分は、実質的に、第１の構成成分の投与の直後に投与され得る。代替的に、第１および第２の投与は、１〜６０秒、１〜６０分、１〜２４時間、１〜７日、１〜４週間、１〜１２ヶ月など、または任意の値もしくはその間の値の範囲などの期間によって隔てられ得る。同様に、同時投与は、２つ以上の構成成分の投与時間枠の重複を含み得る。
【０３８４】
前述のまたは他の組成物、製剤、または同時投与のいずれも、個々の構成要素のいずれか単独によるものに比べて相加的または相乗的効果を有し得る。例えば、様々な健康補充剤成分または健康補充組成物と活性構成成分（例えば、組換えクロトータンパク質、医薬品など）との同時投与は、同様の濃度の個々の単独構成成分を投与する個々の結果の合計よりも大きい治療結果をもたらし得る。加えて、相乗効果は、より低い濃度で、単独構成成分を投与する個々の結果のものと同様の治療結果を含み得る。相乗効果はまた、構成成分のうちの１つ以上の最大有効用量の増加、構成成分のうちの１つ以上の毒性の低減、または個々の治療結果の単なる相加的な効果以上の任意の他の有益な結果を含み得る。加えて、個々の治療結果の相加的な効果は、１つ以上の相加的な効果を含み得る。そのような相加的／相乗的な効果は、個々の構成成分の性質および理解を考慮すると予測または予想されない場合がある。
【０３８５】
特定の実施形態は、発現核酸構築物および／またはベクター、細胞株および／または細胞懸濁培養、ならびに１つ以上の組換え（例えば、ヒトまたは哺乳動物）クロトータンパク質、タンパク質断片、および／またはタンパク質多様体を製造し、それを精製し、それを（ヒトまたは非ヒト動物）対象に投与する方法を含み得る。
【０３８６】
健康補充剤、製剤、共製剤、同時投与、組み合わせ製品などを含む前述のいずれも、「組成物」または「本発明の組成物」と称され得ることが理解されるであろう。
外因性Ｓ−クロトーの投与
本開示は、（例えば、正常および／または（例えば、慢性的病態を有さない）若年（例えば、１８〜３０歳）の人の範囲内のＳ−クロトーの血清濃度を増加および／または維持するための）Ｓ−クロトー製剤、臨床投薬量、および投与に関する。
【０３８７】
本開示の態様または実施形態は、例えば、それを必要とする（ヒト）対象に（ｃＧＭＰおよび／または臨床グレードの）ヒト組換えアルファ可溶性クロトータンパク質または（アイソフォーム１の）タンパク質断片を投与することを含む。実施形態はまた、（（ヒトの）対象において）血清Ｓ−クロトーレベルまたは濃度を（例えば、質量分析（ＭＳ）またはＥＬＩＳＡによって）測定することを含み得る。そのような測定は、Ｓ−クロトー投与の前、後、および／またはその間に生じ得、必要に応じて、血清Ｓ−クロトーレベル、および／または血清Ｓ−クロトーレベルの代謝、分解、もしくは低減の速度を判定するために反復され得る。ＭＳは、当該技術分野で周知の技術である。ＭＳは、対象の血清中の１つ以上の（天然および／または組換え）クロトータンパク質のレベルを同定し、さらに定量化するために使用され得る。
【０３８８】
１つ以上の追加のタンパク質もまた、対象の血清中で測定され得る。例えば、１つ以上のクロトーに関係するおよび／もしくは加齢に関係するタンパク質（例えば、ＦＧＦ２１、ＧＤＦ−１１、ＴＩＭＰ２、ＮＡＤ＋、ＣＣＬ１１、ホルモンテストステロン、エストロゲンなど）、ならびに／または腎臓機能タンパク質（例えば、ＫＩＭ−１、シスタチン−Ｃ、クレアチニン、ＢＵＮ、クレアチニン、ＮＧＡＬなど）は、血清中のクロトーの測定とは別個に、またはそれと組み合わせて測定され得る。
【０３８９】
少なくとも１つの実施形態では、血液試料などの血清試料が取得される。試料は、当該技術分野で既知のように、採血によって取得され得る。好ましい実施形態では、血液試料を取得する指刺、または他のより低侵襲性の手段が使用され得る。したがって、血液試料は、より頻繁に（例えば、１日を通して、および／または０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２時間ごとに）採取され得る。合計クロトータンパク質血清濃度、および天然クロトー種（例えば、可溶性クロトー、切断クロトー、分泌クロトーなど）などの様々なアルファクロトータンパク質種の血清濃度、ならびに／または本開示の１つ以上のクロトータンパク質を測定するために、ＭＳが使用され得る。いくつかの実施形態では、クロトーレベルは、治療用組換えクロトータンパク質の投与前、および再度１日を通して、ならびに／または投与後０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２時間ごと（もしくはこれらのうちの１つ以上）に測定され得る。代替的に、または加えて、クロトーレベルは、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１８、２０、２１、２５、２８、３０、３６、４０、４５、５０、６０、または９０日（または週間）ごと（またはこれらのうちの１つ以上）に測定され得る。
【０３９０】
実施形態はまた、そのような速度を判定すること、および／またはそのような対象の血清中のＳ−クロトータンパク質濃度を、正常な若年の人のＳ−クロトーの血清濃度の範囲内に維持するための治療プロトコル（例えば、（後続する）Ｓ−クロトーの投与（複数可）の頻度、量、および／または継続時間を含む）を計算することを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、Ｓ−クロトーの濃度は、血清１ミリリットル当たりおよそ１０００ピコグラム（ｐｇ／ｍＬ）の（Ｓ−クロトー）タンパク質で維持され得る。
【０３９１】
少なくとも１つの実施形態では、（ヒトにおける）Ｓ−クロトー投与方策は、Ｓ−クロトーの１つ以上の薬剤動態学的パラメータの測定を含み得る。例えば、Ｓ−クロトー投与に応答した血清、尿、および脳脊髄液中のＳ−クロトーレベルに得られたインビボ変化が測定され得る。いくつかの実施形態は、１つ以上の臨床指標に対するＳ−クロトー投与の有効性を測定することを含み得る。様々な病態、疾患、および障害の臨床指標は、当該技術分野で既知であり、本明細書でさらに説明される。
【０３９２】
実施形態はまた、（例えば、開始時（あらゆる外因性Ｓ−クロトーの投与前）、ならびに／または治療プロトコルの前および／もしくは治療プロトコル全体を通して異なる時間に、（ヒト）対象（複数可）における任意の概日リズム効果を説明するために、（例えば、Ｓ−クロトーの投与前後に））、（基準値）Ｓ−クロトーレベル測定（複数可）を行うことを含み得る。
【０３９３】
実施形態はまた、Ｓ−クロトー投与の好適な頻度、量、および／または継続時間を測定することを含み得る。例えば、（例えば、ＭＳまたはＥＬＩＳＡイムノアッセイ定量化によって測定される）低Ｓ−クロトー血清レベルを有する対象には、対象の血清Ｓ−クロトーレベルを第１の所定のレベル（例えば、約１０００ｐｇ／ｍＬ）にするように構成および／または適合されたクロトーの第１の投与が（例えば、任意の好適な投与経路を介して）与えられてもよく、対象の血清Ｓ−クロトー濃度（で得られた変化）を（ＭＳまたはＥＬＩＳＡによって）測定し、（第１の投与後の）レベルおよび／または血清Ｓ−クロトーレベルの代謝、分解もしくは低減速度を測定し、投与されたＳ−クロトーの半減期を計算し、ならびに／または（例えば、血清Ｓ−クロトーレベルを第２の所定のレベルを超えて維持するために）Ｓ−クロトーの第２の後続する投与が与えられるべき頻度および／もしくは時間枠を判定することができる。少なくとも１つの実施形態では、第２の所定のレベルは、第１の所定のレベルの約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、および／もしくは、５％、ならびに／またはその間であり得る。
【０３９４】
さらなる投与は、正常な同性の若年の人の血清維持レベル（例えば、およそ１０００ｐｇ／ｍｌ）と同等のＳ−クロトー血清レベルを、対象において（長期的に）産生するのに好適な時間枠にわたって与えられ得る。（（ヒト）対象への）Ｓ−クロトー投与の合計期間は、１日〜５年以上の範囲であり得る。臨床虚弱スコア（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｒａｉｌｔｙ  ｓｃｏｒｅ）の使用および他の測定に基づく対象の虚弱性の測定および／または判定もまた、時間枠にわたって行われ得る。
【０３９５】
本開示の実施形態は、正常範囲（例えば、例示的には少なくとも約５００〜１０００ｐｇ／ｍｌ血清）を超えた、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％以上のＳ−クロトーレベルの上昇を維持するように、Ｓ−クロトー投薬量を増加させることをさらに含む。
【０３９６】
特定の実施形態は、Ｓ−クロトータンパク質を投与することを含む。好適な投与経路の非限定的な例には、注射（例えば、ボーラス、漸進的、静脈内、真皮内、腹腔内、筋肉内、皮内、および／または皮下注射）、経口または経口関連投与（例えば経口摂取、頬投与、および／または舌下投与）、局所投与、経皮投与、直腸投与、膣内投与、吸入などが挙げられる。
【０３９７】
例示的な実施形態は、単回ボーラス注射または長期（ＩＶ）注射（例えば、長期間にわたる点滴）でＳ−クロトータンパク質または組成物を投与することを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、対象の体重１ｋｇ当たり０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、２．７５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０マイクログラム以上のＳ−クロトーが、１回の治療につき投与され得る。好適な投与量は、当該技術分野で既知の１つ以上の方法を通して計算され得る。１つのそのような方法は、相対成長率（ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｌｉｎｇ）方法である。例えば、ラット実験では、１回の投与当たり０．０１ｍｇのＳ−クロトー／体重ｋｇまたは１０μｇ／ｋｇが使用される。例示的に、ヒト相対成長率と等価である０．１６を使用すると、ヒト等価用量（ＨＥＤ）＝１０μｇ／ｋｇｘ０．１６＝１．６μｇ／ｋｇである。したがって、例示的に、７０ｋｇのヒト個体は、７０ｋｇｘ１．６μｇ／ｋｇ＝１１２μｇが必要であり、および６０ｋｇのヒトは、６０ｋｇｘ１．６＝９６μｇが必要とされるであろう。以下の表４６は、体表面積に基づいた、様々な動物用量のヒト等価用量（ＨＥＤ）への変換を実証する。変換は６０ｋｇのヒトを想定する。
【０３９８】
ＨＥＤは、参照により本明細書に組み込まれるＲｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ（２００８）によって記載されているプロセスである、体表面積の標準化を使用して確立された。このプロセスは、相対成長率と称され、異なる種間の代謝速度の基礎的な差異を補正し、単純な投薬量外挿よりも好ましい場合がある。例示的に、動物種用量が既知である場合、ＨＥＤは、ＨＥＤ＝ｍｇ／ｋｇでの動物用量×その適切な動物種の相対成長率因子として計算され得る。その後、患者に投与される実際の用量が、ＨＥＤに患者の体重を乗算することによって計算され得る。
【０３９９】
【表４６】
2021508037.tif 000077
【０４００】
（組換えタンパク質投与の前および／または後の）ヒトにおけるＳ−クロトーの量および／もしくは生物学的利用能、投与されるＳ−クロトーの合計量および／もしくは濃度、ならびに／または組換えタンパク質投与後の血清レベル応答（経時的）の判定、測定、および／または推定には、複数の因子が考慮され得るか、または配慮され得る。例えば、そのような因子には、希釈剤の組成、投与経路、投与部位、対象の組織および器官への分布、対象の代謝または他の速度、薬剤動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、毒物学（Ｔｏｘ）などが含まれ得る。
【０４０１】
少なくとも１つの実施形態では、（例えば、健康な、若年（１８〜３０歳の）ヒト成人における）Ｓ−クロトーの（正常な）濃度は、血清中でおよそ１０００ｐｇ／ｍｌであり得る。典型的な成人は、およそ５リットルの血液量を有し得、女性は一般に男性より少ない血液量を有する。ヒトの血液のおよそ５５％は、血清で構成され得る。したがって、（５リットルの血液／成人）ｘ（０．５５血清／血液リットル）＝２．７５リットル（２７５０ｍｌ）の血清／成人となる。内因性血清Ｓ−クロトーがないと想定した場合、合計血清中に１０００ｐｇ／ｍｌの最終濃度を達成するためには、成人対象当たり２７５０ｍｌ×１０００ｐｇ／ｍｌ＝２，７５０，０００ｐｇ（または２７５０ｎｇまたは２．７５μｇ）の外因性Ｓ−クロトーが投与され得る。
【０４０２】
可溶性クロトーを典型的な健康なレベル（例えば、１５００ｐｇ／血清ｍｌ）よりも５０％増加させるためには、４．１２５マイクログラム／対象の用量が投与され得る。可溶性クロトーを典型的な健康なレベル（例えば、２０００ｐｇ／血清ｍｌ）よりも１００％増加させるためには、５．５マイクログラム／対象の用量が投与され得る、などである。
【０４０３】
対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を任意の好適なレベルまで上昇させるために、血清１ミリリットル当たり、約５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００  ４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００ピコグラムを上回る、それと同等、もしくはその間の可溶性クロトータンパク質、または血清中の可溶性クロトータンパク質の典型的な健康レベルを、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１２００％、１５００％、２０００％、２５００％、３０００％、４０００％、５０００％を上回る、それと同等、もしくはその間の、薬学的に有効なおよび／または十分な量の精製された組換えＳ−クロトータンパク質が投与され得る。
【０４０４】
いくつかの実施形態では、対象には、好適な量のクロトー緩衝液（例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）または他の薬学的に許容可能な担体中の、約０．０１ｍｇ／体重ｋｇを上回る、それと同等、もしくはその間の投薬量の組換えヒトＳ−クロトータンパク質の１つ以上の（ボーラス）静脈内、真皮内、腹腔内、筋肉内、皮内、皮下、および／または他の注射が投与され得る。したがって、１６０ポンド（すなわち、７２．５７ｋｇの体重）の対象には、１回の投与当たり約０．７３ｍｇのＳ−クロトー（０．０１ｍｇのＳ−クロトー／ｋｇ×体重７２．５７ｋｇの計算に基づいて）の（ボーラス）注射が投与され得る。同様に、１７０ポンドの人は、１回の投与当たり０．７７ｍｇのＳ−クロトーを受け得る。投与の合計数および頻度は、例えば１０００ｐｇ／ｍｌのＳ−クロトー（０．０００００１ｍｇ／血清ｍｌと等価）の濃度を血清中で達成および維持することに基づいて判定され得る。後者は、ＭＳによって、またはヒトＳ−クロトーＥＬＩＳＡアッセイによって測定されて確認され得る。
【０４０５】
他の実施形態では、投薬量は、約０．０００１〜１０ｍｇ／体重ｋｇ、０．０００１〜１０μｇ／体重ｋｇ、０．０００１〜１０ｎｇ／体重ｋｇ、０．０００１〜１０ｐｇ／体重ｋｇを上回る、それらと同等、またはそれらの間の任意の値または値の範囲であり得る。尿および／または血液は、（例えば、血清Ｓ−クロトーレベル、ならびに投与応答および／または経時的応答における変化を測定、試験、および／または判定するために）組換えクロトータンパク質の医学的手順または第１の投与（用量）後、約５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、２．５日、３日、５日、７日、１０日、１４日、２１日、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月を上回る、それらを下回る、それらと同等、それらの間の１つ以上の時点で採取され得る。
【０４０６】
１つ以上の実施形態は、Ｓ−クロトー活性薬物製品の独特な製剤および／または薬学的に許容される担体との組み合わせの、製造および／または（後続する）投与を含む。担体は、ＩＶおよび／またはボーラス注射に好適であり得る。実施形態はまた、（不活性Ｓ−クロトーが、動物またはヒト対象において生物学的に有効なＳ−クロトーを放出するようにインビボで活性化され得るように、Ｓ−クロトーおよび／または薬学的に許容される担体と組み合わせの独特な不活性プロドラッグ製剤の製造および／または（後続する）投与を含み得る。そのようなプロドラッグ製剤は、コーティングまたは逐次継続放出製剤を含み得る。
【０４０７】
治療方法、使用など
いくつかの実施形態は、（例えば、１つ以上の方法ステップを含む）方法または治療方法を含む。いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上の組成物を対象（例えば、それを必要とする対象）に投与することを含み得る。本発明の組成物（複数可）の投与は、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を所定の閾値以上に上昇させるか、または対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度をある期間にわたって所定の閾値以上に維持するのに十分であり得る。
【０４０８】
組成物は、例えば、（ｉ）本開示に記載の治療用組換えクロトータンパク質またはその断片もしくは融合タンパク質、ならびに／あるいは（ｉｉ）製品が投与された患者における内因性クロトータンパク質産生および／またはレベル（複数可）を増加、増強、増大、および／または支持する製品を、任意で（ｉｉｉ）１つ以上の追加の（活性または不活性）成分または組成物とともに含み得る。当業者は、組換え治療用クロトータンパク質および製品、組成物、ならびにそれらに関連する方法に関して本明細書に概説される治療効果、適応症、および／または治療の各々が、内因性クロトータンパク質産生および／またはレベル（複数可）を（自然に）増加、増強、増大、および／または支持することによって達成され得ることを理解するであろう。当業者はまた、内因性クロトータンパク質産生および／またはレベル（複数可）を（自然に）増加、増強、増大、および／または支持することに関して本明細書に概説される治療効果、適応症、および／または治療の各々が、組換え治療用クロトータンパク質および製品、組成物を投与することによって、ならびにそれらに関連する方法を通して達成され得ることを理解するであろう。したがって、簡潔にするために、本開示は、（ｉ）組換え治療用クロトータンパク質の投与、および（ｉｉ）本開示の健康補充剤または栄養補助組成物の投与の両方に関して、開示される治療効果、適応症、および／または治療の各々は、本明細書に明確に企図されているため、詳しく述べる必要はない。
【０４０９】
特定の実施形態は、１つ以上の疾患、障害、傷害、および／または（医学的）病態の治療に使用するための、本明細書に記載の組成物を含み得る。同様に、実施形態は、１つ以上の疾患、障害、傷害、および／または（医学的）病態を治療（または緩和、対処、防止、阻害など）する方法を含み得る。例示的な治療方法は、それを必要とする対象に有効量の本開示の組成物を投与することを含む。いかなる理論にも拘束されるものではないが、それを必要とする対象に有効量の組成物を投与すると、対象における血清可溶性クロトータンパク質濃度の増加（または上昇）が引き起こされるか、またはもたらされ得る。したがって、「有効量」の本開示の組成物は、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を所定の閾値以上に増加もしくは上昇させるか、または対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を所定の期間にわたって所定の閾値以上に維持するのに有効な量であり得る。代替的に、または加えて、「有効量」の本開示の組成物は、組成物が投与される患者において有益な治療効果を達成するのに有効な量であり得る。
【０４１０】
方法、組成物、または（上昇した）タンパク質はまた、１つ以上の疾患、障害、傷害、および／または（医学的）病態の治療に有効であり得る。例示的に、病態は、虚弱、骨密度減少または骨塩量減少、体重減少、筋萎縮または退化、筋量低下、筋力、握力、脚力または体力の低下、動作、動作自由、生活の質評価、駆出率、運動能力の低下、学習力、学習能力、記憶力、または知能指数の低下、認知力劣化または健忘症、認知能力または機能の低下、シナプス可塑性またはシナプス機能の低下、および細胞老化などの、年齢に関係するかまたは加齢に関係する病態（または（ヒト）加齢に関連する病態）であり得るか、またはそれを含み得る。しかしながら、病態はまた、または代替的に、血清クロトーレベルの増加が本開示に記載のものおよび当業者に既知のものを含む有益な治療効果を提供し得る、任意の身体的、知能的、情緒的、または他の欠損、必要性、または願望であり得るか、またはそれを含み得ることが理解されるであろう。
【０４１１】
方法、組成物、または（上昇した）タンパク質はまた、組成物（例えば、タンパク質もしくは補充剤）または上昇した可溶性クロトータンパク質レベルは、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症もしくは血管性認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）もしくは運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、心房細動、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、線維筋痛症、成人発症糖尿病、関節炎もしくは関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症、緑内障、白内障、黄斑変性および他の眼疾患／障害、多発性硬化症（ＭＳ）、狼瘡、ならびに／または潰瘍性大腸炎などの、１つ以上の加齢に関係する病態（または（ヒト）加齢に関連する病態）の治療に有効であり得る。
【０４１２】
本開示のいくつかの実施形態は、癌を治療すること、患者の血清リン酸レベルを低下させること、治療を必要とする対象の糖尿病または糖尿病関連病態（例えば、１型糖尿病など）を治療すること、対象の心臓の病態（例えば、心血管疾患、左心室肥大（ＬＶＨ）、病理学的ＬＶＨおよび／または鬱血性心不全など）を治療すること、対象の急性肺傷害を治療すること（例えば、ナノ粒子を用いること）、酸化的傷害に対して患者の肺を保護すること、重症患者の早期急性腎傷害を検出すること、対象の血管石灰化を軽減すること、認知力を改善させること、腎虚血および／または肝虚血を治療すること、（ヒト）老化内皮細胞のストレス反応を調節すること、急性および／もしくは慢性の腎損傷、疾患、もしくは疾患の進行、および／もしくは尿毒症性心筋症を予防的および／もしくは治療的に治療、防止、軽減、阻止および／または逆転させること、メラノーマおよび他の癌ならびに筋ジストロフィー（ＤＭＤを含む）の年齢に関係する治療耐性を逆転または軽減させること、老化細胞のアポトーシスを標的とし、好ましくはそれにより組織恒常性を回復させること、および他の様々な適応のうちの１つ以上において有用であり得る。
【０４１３】
本開示のいくつかの実施形態は、１つ以上の他の病態の治療に有用であり得る。そのような病態は、本明細書に記載または開示され得る。そのような病態は、クロトー血清レベルに関連することが当業者に既知であり得る。
【０４１４】
簡潔に上記したように、本開示は、本開示の組成物の様々な剤形および／または投与方法を含み、企図する。いくつかの実施形態は、経口剤形で投薬され得る、かつ／または（例えば、チンキ剤、錠剤、カプセル、粉末、茶などを含む１つ以上の簡便な形態で）経口投与され得る。例えば、草本または天然成分のアルコールまたはグリセリンベースの抽出物からなるチンキ剤は、ガラス点滴器ボトルに包装され得る。グリセリンベースのチンキ剤は、甘い味を提供し、製剤の嚥下をより容易にし得る。チンキ剤はまた、点滴器でも投与され得る。チンキ剤は、標識にある投薬量範囲（例えば、成人用量当たり２０〜４０滴）を含み得る。
【０４１５】
カプセルおよび錠剤もまた、補充剤の経口投与にとって一般的な形態である。例えば、乾燥した草本を粉末化し、ゼラチンカプセル内に圧縮してもよい。補充剤は、カプセルおよび／または錠剤として供給され得る。補充剤は、使用される投薬量が容器に列挙されたボトルまたはエンベロープ内の粉末として供給され得る。用量当たりの適切な量の粉末は、投薬量カプセルを開け、内容物を飲み物または食品に振りかけることによっても取得され得る。
【０４１６】
茶（例えば、草本煎じ出し）は、草本治療薬の一般的な形態であり、草本を服用する鎮静方法である。草本煎じ出しは、少量の草本をカップに入れ、カップを沸騰したお湯で満たし、浸漬することで作製され得る。茶の形態では、補充剤の草本成分の効力は、浸漬時間の延長とともに増加し得、茶は、少なくとも１０分間浸漬するのが最良である。カップを覆うことで（小さな受け皿が良好に機能する）、蒸気が保たれ、茶がより長時間高温で保たれる。
【０４１７】
いくつかの実施形態は、加齢に関係するまたは他の病態、疾患、または障害を治療する方法であって、有効量の本開示の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を含み得る。いくつかの実施形態は、哺乳動物対象において、病態、疾患、または障害、好ましくは加齢に関係する病態、疾患、または障害を治療および／または防止する方法であって、有効量の本開示の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を含み得る。いくつかの実施形態は、急性腎傷害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、または他の病態を治療または防止する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本開示の組成物を投与することを含む、方法を含み得る。いくつかの実施形態は、哺乳動物対象における腎傷害を治療および／または防止する方法であって、医学的手順もしくは腎毒素の投与の前および／または医学的手順もしくは腎毒素の投与の後に、対象に、任意で予防的に、有効量の本開示の組成物を投与することを含む、方法を含み得る。いくつかの実施形態は、本開示の組成物を、それを必要とするヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）対象に投与する方法を含み得る。組成物が投与される対象は、様々な病態（例えば、障害、疾患、傷害、疾病など）に苦しんでいるか、またはそのリスクがあり得る。例えば、いくつかの実施形態は、（ヒト）加齢に関連する身体的、知能的、神経学的、または他の病態など、１つ以上の慢性疾患および／または加齢に関係する病態を治療する方法を含む。いくつかの実施形態は、１つ以上の機構または作用を通して治癒、回復、長寿化、および／または他の有益な結果を促進し得る。
【０４１８】
薬学的有効量の組成物（複数可）は、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を、（例えば、血清１ミリリットル当たり、約５０〜３０００ピコグラムを上回る、それと同等、またはその間の可溶性クロトータンパク質などの所定のレベルまで）増加または上昇させるのに十分であり得る。薬学的有効量の組成物（複数可）もまた、または代替的に、所定の期間にわたって所定の閾値以上で対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を維持するのに十分であり得る。
【０４１９】
特定の実施形態では、タンパク質レベルの好適な増加は、ＩＧＦ−１および／もしくはＷｎｔシグナル伝達経路を調節し得（調節するために有効であり得）、β−グルクロニダーゼおよび／もしくはシアリダーゼ活性を呈し得、ｐ５３／ｐ２１シグナル伝達経路を抑制し得、かつ／または好ましくはｐ５３／ｐ２１シグナル伝達経路の抑制を通して、Ｈ２Ｏ２誘発性細胞老化およびアポトーシスを低減し得る。（上昇した）タンパク質は、好ましくは多面発現活性を呈し、ならびに／または好ましくは酸化ストレス、成長因子シグナリング、イオン恒常性の調節、および／もしくは１つ以上のイオンチャネルタンパク質および／もしくはインスリン／インスリン様成長因子−１受容体などの成長因子受容体などの細胞表面上での糖タンパク質の活性の調節において、体液性因子として機能し得るか、または機能的であり得る。
【０４２０】
特定の実施形態は、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を判定すること、薬学的有効量を計算すること、対象の血清中の可溶性クロトータンパク質の低下速度を判定すること、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度が、測定された速度に基づいて第２の所定のレベル以下になるであろう後続する投薬時間を計算すること、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を第２の所定のレベルから第１の所定のレベルまで上昇させるのに十分な組成物の後続する投薬量を計算すること、および／または後続する投薬量の組成物を対象に投与することを含み得る。特定の実施形態は、（例えば、対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度の判定されたレベルに基づいて）対象に通常（例えば、毎日）の用量または剤形の組成物を処方することを含み得る。
【０４２１】
例示的な実施形態は、（治療）方法を含む。治療方法は、本開示の様々な組成物の治療効果または健康上の利益の試験に類似し、かつ／またはそれをモデルとし得る。様々な組成物の投与の結果は、ヒト対象において監視される。対象が自発的に試験に参加することに同意し、患者同意書に署名した後、身体検査ならびに血液および唾液試験が行われる。試験プロトコルの包含基準に適合すると、対象は、試験に登録される。例示的に、試験には、現在ビタミンＤの補充を受けておらず、かつ日当たりの良い環境に居住していない、１００人の健康な個体が含まれ得る。ＫＬＶＳ多様体（クロトー過剰発現因子）および／またはクロトー遺伝子（複数可）の他の遺伝子多様体を有する対象は、試験から除外され得る。登録後、対象は、本開示のクロトー補充剤製剤、または二重盲検試験ではプラセボの３ヶ月分の供給を受ける。対象は、標識されていない補充剤製剤またはプラセボのボトルを無料で受ける。対象は、この補充剤を３ヶ月間毎日服用する。
【０４２２】
この３ヶ月間の終了時に、空腹時血液検査のために採血し、対象の体重、血圧を測定し、アルファクロトー（α−クロトー）ヒト可溶性ＥＬＩＳＡアッセイキット（例えば、ＩＢＬ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡのカタログ番号２７９９８のもの）によって判定される血漿アルファ可溶性クロトーの濃度とともに記録する。
【０４２３】
この試験におけるヒト対象に関する試験／設計手順を以下に示す。
試験設計／手順：
最大１００人の患者
期間：第１のエンドポイントまで３ヶ月、クロスオーバー、補充剤の服用を選択したプラセボ患者を含む６ヶ月時点の第２のエンドポイント。
【０４２４】
含める基準値質問票：現在の薬物（スタチン、ＡＲＢ）、栄養補充剤、血圧、運動頻度、アルコール消費量。
登録前：
血液試料および頬スワブの採取（ＰＩオフィスまたは移動採血技師）
ＫＬＶＳ多様体（クロトー過剰発現因子）の判定−頬スワブを実験室に送って、ＫＬＶＳ多様体（クロトー過剰発現因子）状態を判定する
クロトーレベル、ビタミンＤおよびＥの実験室分析、ならびに治療前基準値の他の分析
補充：参加者に輸送（３ヶ月分の供給）。（活性補充剤およびプラセボ対照、同数の活性およびプラセボ対照）
結果測定：参加者は、モバイルアプリケーションをダウンロードして、コンプライアンスおよび質問票（運動、血圧）を監視する
３ヶ月後および６ヶ月後の経過観察の血液試料採取
補充剤中の成分は、もたらされるリスクが非常に低い栄養構成成分で構成される。対象が製剤に対して何らかの不快感または有害反応を経験した場合、対象は、製品の服用を中止し、試験担当医師に連絡するよう指示される。
【０４２５】
あらゆる有意な副作用が、４８時間以内に試験のＩＲＣＭ機関審査委員会（ＩＲＢ）に報告される。
例示的な病態
いくつかの実施形態では、本開示の組成物（複数可）および／または方法（複数可）で治療される病態、疾患、または障害は、好ましくは、例えば、虚弱、骨密度減少、骨塩量減少、体重減少、筋萎縮、筋肉退化、筋量低下、筋力低下、握力低下、脚力低下、体力の低下、動作の低下、動作自由の低下、生活の質評価の低下、駆出率の低下、運動能力の低下、学習力の低下、学習能力の低下、記憶力の低下、知能指数の低下、認知力劣化、健忘症、認知能力の低下、認知機能の低下、シナプス可塑性の低下、シナプス機能の低下、細胞老化、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、慢性腎疾患に伴う骨無機質障害（ＣＫＤ−ＭＢＤ）、多嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）、常染色体優性多嚢胞腎臓（ＡＤＰＫＤ）、急性腎臓傷害（ＡＫＩ）、急性尿細管壊死（ＡＴＮ）、急性アレルギー性間質性腎炎（ＡＡＩＮ）、糸球体腎炎、腎疾患、腎不全、アルポート症候群、非乏尿性腎不全、アルコール依存症、高リン酸血症、筋ジストロフィー（ＭＳ）、１型糖尿病、２型糖尿病、心血管疾患（ＣＶＤ）、心血管石灰化、脳血管不全、血管石灰化、虚血性心疾患、心不全、左室肥大、尿毒性心筋症、血圧異常、食塩感受性高血圧、組織石灰化、石灰化アテローム硬化性プラーク負荷、石灰化症、家族性腫瘍性石灰化症、癌、１つ以上の腫瘍、ミエリンに関係する疾患、脱髄疾患、神経変性疾患、神経血管疾患、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、ポンペ病、ニーマンピック病、微小膠症、ファーバー病（ＦＤ）、骨量疾患、骨粗鬆症、骨減少症、骨減少症（具体的には皮質骨のＢＭＤの減少）、肺気腫、肺線維症、嚢胞性線維症、特発性（すなわち、原因不明）肺線維症、放射線誘発性肺傷害、硬変、胆道閉鎖症、心房線維症、心内膜心筋線維症、（陳旧性）心筋梗塞、神経膠瘢痕、動脈硬化、関節線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮、ケロイド、縦隔線維症、骨髄線維症、ペロニー病、腎性全身性線維症、進行性塊状線維症、後腹膜線維症、強皮症／全身性硬化症、癒着性関節包炎、皮膚萎縮、胸腺萎縮、腎間質マトリックスの蓄積、糸球体硬化、貧血、アルブミン尿症、タンパク尿症、不妊症、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、血管性認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、心房細動、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、線維筋痛症、成人発症糖尿病、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、緑内障、白内障、黄斑変性、多発性硬化症（ＭＳ）、狼瘡、潰瘍性大腸炎、悪液質、肥満、ビタミンＤに関係する病態、骨疾患、骨再形成を通じた骨疾患、腸疾患および関連する病態、幹細胞の枯渇、船酔い、宇宙不適応症候群（ＳＡＳ）、吐き気、回転性めまい、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、およびアルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択され得る。
【０４２６】
クロトー血清レベルはまた、傷害後の筋肉の治癒などの筋肉の回復に関連していると報告されている。具体的には、かついかなる理論にも拘束されるものではないが、α−クロトーの年齢に関係する低下は、前駆細胞のミトコンドリア機能障害および筋再生の障害を引き起こし得る。臨床的には、これは、筋肉傷害を受けた、または筋肉を損傷する手術を受けた高齢者の治療につながり得る。本開示の実施形態は、予防的にかつ／または手術後に、本明細書に記載の組成物を投与することを含み得る。適切な時点（複数可）での投与は、筋再生を増強または支持し、より完全な回復につながり得る。血清クロトータンパク質レベルもまた、アスリートおよび他の患者の筋再生を増強または支持し得る。したがって、本開示の実施形態は、予防的に（トレーニング前）かつ／または運動後に、本明細書に記載の組成物を投与することを含み得る。
【０４２７】
ヒトおよび非ヒト哺乳動物における年齢に関係する虚弱を治療するための組成物の投与
本開示の例示的な実施形態は、（例えば、ヒトまたは非ヒト動物における）年齢に関係する虚弱を治療するための組成物の投与に関する。ｓ−クロトーは、ヒト疾患の動物モデルにおいて、筋原幹細胞を救済し、筋肉の修復を改善し、かつ／または線維症を抑制する。したがって、ｓ−クロトーは、虚弱の徴候を示している高齢なヒト対象における、筋肉退化に対抗する有望なアプローチであり得る。
【０４２８】
例えば、本開示は、対象においてｓ−クロトーの維持血清濃度を（例えば、いかなる慢性病態も有さない）正常な人および／または若年の人（例えば、１８〜３０歳）の範囲内に維持するための、脆弱な人および／または高齢者（例えば、６０〜９５歳）に対する、ｓ−クロトーレベル増加組成物、製剤、および投薬量、ならびにそれらの投与に関する。
【０４２９】
長期間にわたるそのようなクロトー治療は、高齢者、虚弱者、または他の生理学的加齢者における１つ以上の加齢に関係する指標または病態を回復および／または改善し得る。
ヒトおよび非ヒト哺乳動物の筋萎縮を治療する（減少させる）ための組成物の投与
本開示の例示的な実施形態は、筋萎縮に対抗するクロトーの投与の効果についてのガイダンスを提供するための、骨格筋組織質量、ならびに好ましくは上記の組成物および分子指標の同時使用によって測定される、ヒトにおける筋萎縮を治療する（例えば、（その速度を）減少させる）ための本開示の組成物の投与に関する。
【０４３０】
筋萎縮には、多数の神経筋、代謝、免疫、および神経障害および疾患、ならびに飢餓、栄養欠損、代謝ストレス、糖尿病、加齢、筋ジストロフィー、またはミオパチーが含まれ得る。筋萎縮は、加齢プロセス中に生じ得る。筋萎縮はまた、筋肉の使用の低減または廃用からも生じ得る。症状には、骨格筋組織質量の低下が含まれる。ヒト男性では、５０〜８０歳の間で筋量が３分の１だけ低下する。筋萎縮のいくつかの分子特性には、ユビキチンリガーゼの上方制御、および筋原線維性タンパク質の減少が含まれ得る。これらのタンパク質の分解は、例えば、特定の筋肉のミオシンで（例えば、アクチンの特異的構成物である３−メチル−ヒスチジン産生を測定することによって）監視され得る。クレアチンキナーゼ（細胞損傷マーカー）の放出もまた、指標となり得る。
【０４３１】
ヒトおよび非ヒト哺乳動物における筋肉の修復または回復を治療（改善）するための組成物の投与
クロトー血清レベルはまた、傷害後の筋肉の治癒などの筋肉の回復に関連していると報告されている。具体的には、かついかなる理論にも拘束されるものではないが、α−クロトーの年齢に関係する低下は、前駆細胞のミトコンドリア機能障害および筋再生の障害を引き起こし得る。臨床的には、これは、筋肉傷害を受けた、または筋肉を損傷する手術を受けた高齢者の治療につながり得る。本開示の実施形態は、予防的にかつ／または手術後に、本明細書に記載の組成物を投与することを含み得る。適切な時点（複数可）での投与は、筋再生を増強または支持し、より完全な回復につながり得る。血清クロトータンパク質レベルもまた、アスリートおよび他の患者の筋再生を増強または支持し得る。したがって、本開示の実施形態は、予防的に（トレーニング前）かつ／または運動後に、本明細書に記載の組成物を投与することを含み得る。
【０４３２】
老年および／またはヒト寿命全体を通して知能および／または認知力の低下を治療するための組成物の投与
本開示の例示的な実施形態は、（加齢に関係する）認知機能（複数可）の低下の改善および／または抑制するための本開示の組成物の投与に関する。本開示の時点で、本開示の組成物の投与が、ヒトにおける認知力低下を抑制し得るかは不明であった。しかしながら、クロトーの全身の過剰発現を有する遺伝子導入マウスは、学習力および記憶力の複数の試験において対照よりも良好な成績であった。マウスのクロトー上昇はまた、シナプス可塑性の形態で、長期的な相乗作用を増強し、学習力および記憶力に重要な機能を有するＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）サブユニットであるシナプスＧｌｕＮ２Ｂを濃縮させた。ＧｌｕＮ２Ｂの遮断により、クロトーが介在する効果が失われた。
【０４３３】
クロトーを調節した経路は、アルツハイマー病および他の形態の認知症の進行を遅らせることに関連し得る。５３歳以上の４００人以上の健康な男女の脳スキャンでは、特定のクロトー遺伝子多様体の単一コピーを保有していた人々が、計画および意思決定を扱う脳領域を、より大きく有していたことが見出された。この群へのさらなる試験では、右背外側前頭前皮質（ｒＤＬＰＦＣ）が拡大している人々は、一連の知能的課題に対してより良好であったことが見出された。
【０４３４】
約５人に１人が、心臓および腎臓機能を改善するＫＬ−ＶＳとして知られる遺伝子多様体または対立遺伝子の単一コピーを継承し、平均して約３年ヒトの寿命を延ばす。しかしながら、脳機能に関しては、より大きなｒＤＬＰＦＣを有することによる人々の知能的試験スコアの改善は１２％を占めるに過ぎない一方、編集者が指摘するには、ＫＬ−ＶＳ対立遺伝子の１コピーを保有することで、ｒＤＬＰＦＣの構造および機能の予想される低下に対して、１０年分の回復力が与えられるようである。したがって、ＫＬ−ＶＳヘテロ接合性は、右背外側前頭前皮質（ｒＤＬＰＦＣ）のより大きな体積と関連しているようである。
【０４３５】
ｒＤＬＰＦＣは実行機能に重要であるため、研究者らはまた、個体の作業記憶力および処理速度も分析した。ＫＬ−ＶＳヘテロ接合性は、試験された寿命にわたって実行機能の増強と関連し得る。要するに、クロトー遺伝子の多様性が、より大きな脳体積およびより良好な機能と関連し得ることを結果は示唆している。
【０４３６】
本開示の例示的な実施形態は、（例えば、認知力を増強し、ヒトの寿命全体を通して認知力欠損を抑制するために）インビボクロトータンパク質レベルならびに／または（細胞、分子、および／もしくは下流）効果を増大させるための本開示の組成物の投与に関する。ｓ−クロトーレベル増加組成物の投与は、（例えば、ヒトにおいて）認知機能を保存および／または改善し得る。
【０４３７】
ヒト長寿化および／または寿命を治療（延長）するための組成物の投与
例示的な実施形態は、実年齢（例えば、出生時からの年齢が同じ）かつ同性のヒト対象に本開示の組成物を投与して、平均寿命を改善することに関する。組成物投与（ヒト対象の実験群）で取得された平均寿命の結果は、組成物を受けていない個体（対照群）および／または十分に大きな集団に対する（例えば、数理表からの）統計情報と確実に比較され得る。
【０４３８】
他の臨床適応症を治療するための組成物の投与
本開示の例示的な実施形態は、任意の年齢に関連するか、または他の年齢に関連しない病態を治療するための本発明の組成物の投与に関し、病態には、ヒト虚弱（の増加）、長寿化（の減少）、細胞老化（の減少）、筋力（の低下）、骨量減少または密度（の減少）、認知力（の減少）、筋量（の低下）、体力（の低下）、握力（の低下）、脚力（の低下）などが含まれるが、これらに限定されない。本開示はまた、（例えば、男性ではなく女性の）骨塩量（ＢＭＤ）の増加、閉経後に低減される（例えば、高齢女性の）ＢＭＤの増加、（退化した）骨格筋の再生またはその退化の低減、歩行の改善、空間学習力および記憶、動作、動作自由、生活の質評価、駆出率の改善（または低下の低減）、運動の変化、運動の改善などのための、本開示の組成物の投与に関する。本開示はさらに、認知力劣化または健忘症の減少、認知能力の増加、認知機能およびシナプス可塑性の改善、学習力、学習能力、またはＩＱの低下の減少、学習力、学習能力、またはＩＱの改善などのための本開示の組成物の投与に関する。
【０４３９】
急性腎傷害（ＡＫＩ）を治療するための組成の投与
以前は急性腎不全（ＡＲＦ）と呼ばれていた急性腎傷害（ＡＫＩ）は、多くの場合、軽度の機能減少から機能不全までの範囲にわたる腎機能障害の突然の発症として定義される。ＡＫＩは、毎年入院患者のおよそ４％〜７％に発症する一般的な臨床的合併症であり、予後は不良であり得る。ＡＫＩに関連する死亡率は、５％〜３５％の範囲である。腎クロトーの発現は、ＡＫＩに続いて抑制されることが示されている。クロトーのアデノウイルス遺伝子導入は、ＡＫＩでは細胞保護的であり得る。
【０４４０】
急性腎傷害（ＡＫＩ）は、毎年およそ４．９％〜７％の入院患者において報告されている。ＡＫＩの割合は、（入院した）高齢者では６０％、高齢者または重病患者では２０〜３０％と高くなり得る。ＡＫＩはまた、死亡率の増加、滞在期間（ＬＯＳ）、３０日再投与率、および病院費用にも関連している。
【０４４１】
ＡＫＩは、腎臓移植もしくは他の手術、急性尿細管壊死（ＡＴＮ）、急性アレルギー性間質性腎炎（ＡＡＩＮ）、腎炎（例えば、糸球体腎炎）、腎毒性（例えば、薬物誘発性腎毒性）、低血圧、敗血症もしくは敗血症性病態、または他の寄与因子（複数可）から少なくとも部分的に生じ得る。腎臓移植および他の手術は、腎臓に急性の損傷または傷害を引き起こし、腎疾患および／または腎不全を引き起こし得る。腎毒性は、ＡＫＩ、ＡＴＮ、ＡＡＩＮ、腎炎などに寄与し得る。薬物（例えば、臨床的に投与された薬物、処方薬、違法薬物、または他の薬物）は、ＡＫＩの全症例の１５％〜２５％に関連していることが報告されている。造影剤単独では、院内感染した急性腎不全（例えば、造影剤誘発性急性腎傷害ＣＩＡＫＩ）の全原因の１０％を占め、腎灌流の減少後の入院中の腎機能の劣化および術後腎不全の第３の主要原因である。
【０４４２】
場合によっては、薬物誘発性ＡＫＩは、抗菌剤誘発性（抗菌処理から生じる）腎毒性であり得るか、またはそれを含み得る。例えば、特定の（グラム陰性）細菌感染症は、パロモマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシンなどの１つ以上のアミノグリコシドで治療され得る。アミノグリコシドは、腎毒性であることが示されている。表４７は、アミノグリコシドを受ける成人患者に関して採取された治療データを示す。例えば、図４７に例示されるように、一般的なアミノグリコシドであるアミカシンで治療された患者の２３％近くが急性腎疾患を発症し、アミカシンで治療された患者の１７％超が退院前に死亡している。ゲンタマイシンおよびトブラマイシンを含む他のアミノグリコシドはまた、腎疾患を誘発した（またはそれに関連していたか、または寄与していた）。
【０４４３】
【表４７】
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【０４４４】
図１３Ａおよび１３Ｂに例示されるように、様々な年齢層の１２０万人を超える成人患者が、２０１０年にアミノグリコシドで治療された。他の抗菌剤には、例えば、ペニシリン、アンピシリン、セファロスポリン、スルホンアミド、シプロフロキサシン、バンコマイシン、マクロライド、テトラサイクリン、リファンピンなどが含まれる。
【０４４５】
薬物誘発性腎毒性はまた、アスピリン（アセチルサリチル酸）、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク、トルメチンなどの１つ以上の非ステロイド抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）を用いた治療から生じ得る。
【０４４６】
薬物誘発性腎毒性はまた、１つ以上のシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤（例えば、バルデコキシブ、ロフェコキシブ、セレコキシブなど）、プロトンポンプ阻害剤（例えば、オメプラゾール、ランソプラゾールなど）、抗痙攣薬（例えば、フェニトイン、バルプロ酸など）、ヒスタミンＨ２受容体拮抗剤（例えば、ニザチジン、ラニチジン、ファモチジン、シメチジンなど）、利尿薬（例えば、炭酸脱水酵素阻害薬、ループ利尿薬（例えば、ブメタニド、エタクリン酸、トラセミド、フロセミドなど）、カリウム保持性利尿薬（例えば、トリアムテレン、スピロノラクトン、アミロライドなど）、チアジド利尿薬（例えば、インダパミド、クロルタリドン、メトラゾン、メチクロチアジド、ヒドロクロロチアジド、クロロチアジド、ベンドロフルメチアジド、ポリチアジド、ヒドロフルメチアジドなど）、またはパマブロム、マンニトールなど他の利尿剤などを用いた治療から生じ得る。
【０４４７】
薬物誘発性腎毒性はまた、体内の神経細胞および筋肉細胞を通ってナトリウムの流動に影響し得るリチウムを用いた治療からも生じ、多くの場合、多動、切迫談話、判断力（ｊｕｄｇｍｅｎｔ）低下、睡眠欲求の低減、攻撃性、および怒りを特徴とする、双極性障害の躁病エピソードの治療に使用され得る。リチウムはまた、躁病エピソードの防止または強度の軽減にも役立ち得る。薬物誘発性腎毒性はまた、金、水銀、銅、または他の元素物質を用いた治療またはそれらへの曝露から生じ得る。
【０４４８】
薬物誘発性腎毒性はまた、強皮症、ウィルソン病（尿を通して除去するための銅が蓄積されて結合することによる）、システイン尿症（システインと結合してシステインよりも可溶性の混合ジスルフィドを生じることによる）の治療に使用され得る、キレート化剤クラスの医薬品である（Ｄ−）ペニシラミン、平滑筋に直接作用する弛緩剤（例えば、ヒドララジン）、鎮痙剤（例えば、カリソプロドール、シクロベンザプリン、メタキサロン、メトカルバモール、ジアゼパム、クロニジンおよび他のイミダゾリン化合物などのベンゾジアゼピン、チザニジン、バクロフェン、ヒダントイン誘導体、ダントロレンなどを用いた治療から生じ得る。
【０４４９】
他の形態の薬物誘発性腎毒性には、例えば、造影剤誘発性腎毒性（例えば、（ヨウ素化）造影剤への曝露後のもの、放射線造影剤誘発性腎症（ＣＩＮ）としても知られている）；麻薬（オピオイド）誘発性腎毒性（例えば、コカイン、ヘロインなどの特定の麻薬（例えば、オピオイド）の使用または乱用後）；化学療法誘発性腎毒性（例えば、シスプラチン；カルボプラチン；オキサリプラチン；ベンダムスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、テモゾロミド、メルファランなどのアルキル化剤；マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、アントラサイクリン、および関係する薬剤などの抗腫瘍抗生物質；カペシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビンなどの代謝拮抗剤；ビンカアルカロイド；トポテカン；エトポシド；タキサン；イリノテカン；レナリドマイド；エリブリン；三酸化ヒ素；イキサゾミブ；などの癌治療剤を用いた治療後）などが含まれ得る。事実、多種多様な腎毒性薬物が腎毒性を誘発し、ＡＫＩにつながり得る。薬物誘発性腎毒性（および他の形態のＡＫＩ）は、治療しなければ生命を脅かし得、（患者、病院、および保険会社に）莫大な治療費用が発生し得る。
【０４５０】
本開示の実施形態は、急性腎傷害（ＡＫＩ）、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、または他の病態を（例えば、予防的にまたは少なくとも１つの事象に応答して）治療または防止する方法を含み得る。方法は、本開示の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。例えば、方法は、（例えば、所定の期間にわたって、所定の閾値以上で対象の血清可溶性クロトータンパク質濃度を上昇させる、かつ／または維持するように）有効量の本開示の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。組成物は、（ｉ）治療用組換えクロトータンパク質またはその断片もしくは融合タンパク質、ならびに／あるいは（ｉｉ）製品が投与された患者における内因性クロトータンパク質産生および／またはレベル（複数可）を増加、増強、増大、および／または支持する製品を、任意で１つ以上の追加の成分または組成物とともに含み得る。
【０４５１】
いくつかの実施形態では、病態は、（ｉ）急性尿細管壊死（ＡＴＮ）、急性アレルギー性間質性腎炎（ＡＡＩＮ）、腎炎、糸球体腎炎、および／もしくは腎毒性、または（ｉｉ）敗血症、腎臓移植もしくは他の手術もしくは医学的手順、急性尿細管壊死（ＡＴＮ）、急性アレルギー性間質性腎炎（ＡＡＩＮ）、腎炎、糸球体腎炎、腎毒性、もしくは低血圧から少なくとも部分的に生じるＡＫＩを含み得る。病態は、薬物誘発性（例えば、アミノグリコシド誘発性）腎毒性を含み得る。タンパク質は、例えば、ＡＫＩを引き起こすかまたはそれに寄与することが既知であるかまたは予期される、腎臓移植、腎毒素投与、または他の活動、治療、もしくは事象の前に、予防的に投与され得る。代替的に、または加えて、タンパク質は、ＡＫＩを引き起こすかまたはＡＫＩに寄与するとことが既知であるかまたは予期される、腎臓移植もしくは他の手術、アミノグリコシドもしくは他の腎毒素投与、または他の活動、治療、もしくは事象の後など、ＡＫＩに応答して投与され得る。
【０４５２】
いくつかの実施形態では、腎毒素または他の薬物は、例えば、１つ以上のアミノグリコシド（例えば、パロモマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシンなど）、１つ以上の抗真菌剤（例えば、アムホテリシンＢ、フルシトシンなど）、１つ以上の造影剤（例えば、（ヨウ素化）放射性造影剤、約１．５：１のヨウ素対分子比を有する高浸透圧の造影剤（ＨＯＣＭ）、約３：１のヨウ素対分子比を有する低浸透圧の非イオン性造影剤（ＬＯＣＭ）、約６：１のヨウ素対分子比を有する等浸透圧の（等浸透圧）造影剤（ＩＯＣＭ）など）、１つ以上の抗レトロウイルス剤（例えば、アデホビル、シドホビル、テノホビル、ホスカルネットなど）、１つ以上の癌（または化学療法）治療剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、アルキル化剤（例えば、ベンダムスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、テモゾロミド、メルファランなど）、抗腫瘍抗生物質（マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、アントラサイクリン、および関連物質など）、代謝拮抗物質（カペシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート、ペメトレキセド、プララトレキサート、ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビンなど）、ビンカアルカロイド、トポテカン、エトポシド、タキサン、イリノテカン、レナリドマイド、エリブリン、三酸化ヒ素、イキサゾミブなど）、１つ以上のビスホスホネート、またはそれらの誘導体（例えば、ゾレドロネート／ゾレドロン酸、イバンドロナート、アレンドロネート、アレンドロネート／コレカルシフェロール、エチドロネート、リセドロネート（任意で、炭酸カルシウムとともに）、パミドロネート、チルドロネートなど）、および／またはコカイン、ヘロインなどの１つ以上の麻薬（例えば、オピオイド）であり得るか、またはそれを含み得る。
【０４５３】
本開示の実施形態は、本開示の組成物を投与する方法を含み得る。方法は、ＡＫＩまたはＡＫＩに関連する１つ以上の病態を（予防的に）治療または防止するために、本開示の組成物をヒトまたは非ヒト対象に投与することを含み得る。方法は、対象における血清可溶性クロトーレベルのレベルを判定すること、対象における血清可溶性クロトーレベルを所定のレベルもしくは正常レベルのパーセントまで上昇させるのに十分な第１の投薬量の本開示の組成物を計算すること、経口、ボーラス、もしくは漸進的投与などによって、対象に第１の投薬量を投与すること、第１の投薬量の投与後などに、対象の血清中の可溶性クロトー低下速度を判定すること、後続する投薬時間および量を計算すること、ならびに／または後続する投薬量のタンパク質を対象に投与することを含み得る。
【０４５４】
慢性腎疾患（ＣＫＤ）を治療するための組成物の投与
いかなる理論にも拘束されるものではないが、クロトーは、ヒト慢性腎疾患に関与し得る。循環中の可溶性クロトーは、慢性腎疾患（ＣＫＤ）段階２の早期に低下し始め、尿クロトーは、おそらくそれよりも早く、ＣＫＤ段階１に低下し始める。したがって、可溶性クロトーは、腎臓機能低下の早期的および高感度のマーカーとして機能し得る。さらに、前臨床動物データは、クロトー欠損が、単にバイオマーカーであるだけではなく、ＣＫＤ進行、ならびに心血管疾患および無機質代謝妨害を含む腎外ＣＫＤ合併症の病因であることを支持している。クロトー低下の防止、内因性クロトー産生の再活性化、または外因性クロトーの補充は全て、腎線維症の減弱、ＣＫＤ進行の遅延、無機質代謝の改善、心筋症の改善、およびＣＫＤにおける血管石灰化の緩和に寄与し得る。
【０４５５】
ＣＫＤは、ＥＳＲＤのリスクが高い腎機能の進行性の劣化を特徴とする。ＣＫＤリスクは年齢とともに増加し、７０歳以上の対象ではＣＫＤ段階３以上の症例の約半数に生じる。ＣＫＤは、加齢の加速した状態と見なされ得る。２５〜３４歳の透析患者の心血管系死亡率の相対リスクは、７５歳以上の非ＣＫＤ患者に類似している。心血管疾患は、ＣＫＤおよびＥＳＲＤ患者の主な死因である。ＣＫＤおよびＥＳＲＤ患者は、腎クロトー発現が低く、循環クロトーのレベルが低い。ＣＫＤ早期段階の腎クロトー欠損は、主に生存可能な腎尿細管の減少ではなく、むしろクロトー発現の抑制に起因し得る。さらに、いくらかの透析患者は、未だ検出可能な循環クロトーを有し、これは、腎クロトー発現が完全に抑制されておらず、その起源はこれまで明らかになっていないが、腎外の供給源（複数可）に由来し得ることを示唆している。クロトーの腎外の供給源を確立し、腎産生が失敗したときにこれらがどのように上方制御され得るのかを特徴付けることが、最も重要である。
【０４５６】
本開示の組成物の投与は、ＣＫＤにおける併存疾患の負担を防止、遅延、および減少させるのに役立ち得る。
腸疾患および関連する病態を治療するための組成物の投与
いかなる理論にも拘束されるものではないが、カハール介在細胞（ＩＣＣ）は、蠕動を制御する機能が進行中の胃腸管内の他の細胞間にある間質細胞である。ＩＣＣの（主な）機能は、腸内の律動的な平滑筋収縮を制御する電気シグナルを作成することである（胃腸系の異なる領域は、蠕動と呼ばれる異なる周波数の収縮を有する）。ＩＣＣは、腸（および他の多くの臓器）内の間葉系幹細胞の移動を誘導し得る。
【０４５７】
腸内では、ＩＣＣがクロトーによって産生および／または活性化され、これが最適化された再生プロセスにつながり得る。クロトーノックアウトマウスでは、ＩＣＣが減少し、これが蠕動プロセスの障害につながり、高齢のヒトにおいて生じる腸障害を模倣する。
【０４５８】
本開示の組成物の投与は、蠕動プロセスの障害の防止、遅延、および減少、ならびに／または少なくとも腸内の再生プロセスの増大、支持、および／もしくは最適化に役立ち得る。これらの効果は、腸の健康をさらに支持し、かつ／または腸疾患および関連する病態の発生および／もしくは重症度を防止、遅延、および減少させ得る。
【０４５９】
加齢に関係する病態の治療的処置
研究者らは、クロトーと、入院した高齢患者の臨床状態の指標として一般に受け入れられている生物学的パラメータとの間の関連性を発見した。研究者らは、５９４人の入院した高齢患者（６５〜９９歳）においてＫＬ遺伝子座の一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ９５３６３１４、ｒｓ１２０７５６８、およびｒｓ５６４４８１を遺伝子型判定し、連続して老人病棟に通い、共分散的かつ遺伝的リスクスコアモデルの分析を使用して、これらのＫＬ多様体と生物学的量的形質との関連性を試験した。ｒｓ９５３６３１４と血清レベルのヘモグロビン、アルブミン、および高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）との有意な関連性、ならびにｒｓ５６４４８１と血清レベルのヘモグロビン、空腹時インスリン、および空腹時グルコースとの有意な関連性が観察された。性別分析は、これらの関連性を確認し、ＫＬ遺伝子型とＨＤＬ−Ｃ、空腹時グルコース、および空腹時インスリンレベルとの関連性が、女性の性別によって引き起こされ得る一方で、血清レベルのヘモグロビンとの関連性が、男性の性別によって引き起こされ得ることを示唆している。ＫＬ遺伝子型とクレアチンレベルとの関連性は女性に見出された一方で、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）とリンパ球数（ＬＣ）との関連性は男性に見出された。遺伝的リスクスコア（ＧＲＳ）モデルにより、ＫＬ  ＳＮＰとヘモグロビン、総コレステロール、およびＨＤＬ−Ｃとの間の有意な関連性をさらに確認した。ＧＲＳタグ付きアプローチを用いた性別分析では、女性ではＨＤＬ−Ｃ、空腹時グルコースレベル、および空腹時インスリンレベルとの、男性ではヘモグロビンおよびＬＣとの関連性を確認した。この知見は、ＫＬ遺伝子座が、入院した高齢患者の脂質、空腹時グルコース、アルブミン、およびヘモグロビンの血清レベルなどの定量的形質に影響し得、クレアチン、ＩＧＦ−１レベル、およびＬＣではいくらかの性差が示唆され、したがって遺伝因子のうちの１つが年齢に関係する疾患および長寿化に寄与する可能性があることを示唆している。
【０４６０】
本開示の実施形態は、本開示の組成物を、それを必要とする対象（例えば、個体または患者、任意で高齢者、ならびに／または加齢に関係する病態、低内在性Ｓ−クロトータンパク質発現、および／もしくは年齢に関係する病態もしくは長寿化の減少の症状に苦しむ個体または患者）に投与することを含み得る。本開示の組成物（複数可）の投与は、血中ｓ−クロトーレベルの有益な増加につながり得る。投与は、加齢に関係する病態の悪影響を逆転もしくは抑制し、かつ／または正の治療方式で、（例えば、入院患者および／もしくは高齢患者における）総コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、空腹時グルコース、空腹時インスリン、アルブミン、クレアチン、ＩＧＦ−１、ヘモグロビン、およびリンパ球数の血清レベルなどの定量的形質に影響し得る。
【０４６１】
予防的な組成物投与
前述に加えて、本開示の実施形態は、予防目的および／または特定の健康属性の維持のために、本開示の組成物を、それを必要とする個体または対象に投与することを含み得る。例えば、本開示の特定の組成物の投与は、診断された加齢に関係する病態に未だ苦しんでいない任意で加齢患者において若さの維持に役立ち得る。したがって、本開示の特定の実施形態は、患者における病態の治療に関係し得、かつ／またはそれを含み得る一方で、他の実施形態は、１つ以上の病態の防止、発症の阻害、および／または予防的な対処に関係し得、かつ／またはこれらを含み得る。
【０４６２】
遺伝的欠陥を治療するための外因性Ｓ−クロトーの投与
本開示の例示的な実施形態は、既知のヒトの遺伝的欠陥を治療（例えば、補正）するための外因性Ｓ−クロトーの投与に関する。例えば、家族性腫瘍性石灰化症およびクロトー変異体を有する１３歳の少女が報告されている。家族性腫瘍性石灰化症は、ＦＧＦ２３またはＧＡＬＮＴ３の不活性化変異による、異所性石灰化および高リン酸血症を特徴とする常染色体劣性代謝疾患である。ＦＧＦ２３は、リン酸の腎排泄に必要なホルモンである一方で、ＧＡＬＮＴは、ＦＧＦ２３の成熟および分泌に寄与する酵素である。この１３歳の少女において、クロトー遺伝子のホモ接合性変異が同定されている。クロトーは、ＦＧＦ２３がその受容体に向かって放出するシグナルの伝達に必要な分泌タンパク質をコードする。外因性ヒト組換えＳ−クロトーの投与は、家族性腫瘍性石灰化症に関連する機能不全および症状に対処するために高度に標的化された、有効な治療法を構成する。
【０４６３】
他の構成成分（複数可）と組み合わせたＳ−クロトーおよび／または補充剤を含む組成物および治療
少なくとも１つの実施形態では、組成物、医薬、投薬量、または治療的処置は、治療用ヒト組換え可溶性アルファクロトー（Ｓ−クロトー）タンパク質、および内因性クロトー産生またはその１つ以上の構成成分を増加させる天然補充組成物を含み得る。クロトーはまた、内因性であるか外因性（組換え）であるかにかかわらず、ヒトの健康および福利のうちの１つ以上の側面に影響する他の化合物および／または構成成分を有する相加的または相乗的な物質中で作用し得る。例えば、治療用ヒト組換え可溶性アルファクロトー（Ｓ−クロトー）タンパク質、および／または内因性クロトー産生を増加させる天然補充組成物を、１つ以上の追加の活性構成成分と組み合わせて、かつ／または同時に含む治療は、ヒト患者の利益になり得る。そのような治療は、クロトータンパク質および／または他の構成成分（複数可）が治療効果を有し得る任意のヒト病態に予防的または応答性であり得る。そのような病態には、例えば、年齢に関係する病態、臨床（例えば、代謝）病態、慢性または急性の病態などが含まれ得る。特定の病態の特定の非限定的な例が、本明細書に開示されている。
【０４６４】
Ｓ−クロトーは、成長／分化因子１１（ＧＤＦ−１１）などの他の血液によって運ばれる抗加齢化合物とともに人体に存在し得る。したがって、特定の実施形態では、治療用Ｓ−クロトーは、治療用ＧＤＦ−１１と（例えば、同時に、連続的に、および／または組み合わせて）同時投与され得る。いくつかの実施形態では、そのような投与は、相加的または相乗的な抗加齢または他の効果を有し得る。同様に、ＣＣＬ１１に対する（中和）抗体、またはその抑制因子を用いる、ヒト対象へのＳ−クロトー同時投与は、加齢または他の病態に対抗するために同調して作用し得る（ＣＣＬ１１（エオタキシン−１としても知られる）は、幹細胞の若返りの負の制御因子であると理解されているため）。Ｓ−クロトーもまた、または代替的に、エオタキシン−２（ＣＣＬ２４）および／またはエオタキシン−３（ＣＣＬ２６）などの他のエオタキシンと同時投与され得る。
【０４６５】
いくつかの実施形態では、Ｓ−クロトーは、トランスフォーミング成長因子β−１（ＴＧＦ−β１）の抑制因子または抗体と同時投与され得る。Ｓ−クロトー投与は、腎線維化および他の組織の線維化につながる内因性抗細胞上皮−間葉移行（抗ＥＭＴ）に関与するＴＧＦ−β１シグナル経路の作用に対抗し得る。抗ＥＭＴはまた、癌細胞にも関連しており、ＥＭＴの阻害が癌細胞に転移能を付与し得、この後者のプロセスはクロトーによって対抗されると理解されている。したがって、Ｓ−クロトーとトランスフォーミング成長因子β−１（ＴＧＦ−β１）の抑制因子または抗体との同時投与は、相乗的または相加的な効果を有し得る。
【０４６６】
いくつかの実施形態では、Ｓ−クロトーは、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）の抗体または抑制因子と同時投与され得る。クロトーは、細胞内インスリン／ＩＧＦ−１シグナル伝達カスケードを阻害するホルモンであり、この阻害は、哺乳動物の細胞および生物レベルでの酸化ストレスに対する耐性を増加させ、寿命を延長するために進化的に保存されていると見なされる機構であると理解されている。したがって、Ｓ−クロトーとインスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）の抑制因子または抗体との同時投与は、相乗的または相加的な効果を有し得る。
【０４６７】
多数の試験により、クロトーアルファ−Ｋ１、ＦＧＦ２３、および１，２５（ＯＨ）２Ｄの相互に調節された正／負のフィードバック作用、ならびに／または胆汁酸／コレステロール代謝を調節するクロトーβ−Ｋ１、ＦＧＦ１５／ヒトＦＧＦ１９、および胆汁酸で構成される類似の制御ネットワークを含む鉱物ホメオスタシスの総合的な制御スキームが明らかになったため、いくつかの実施形態では、Ｓ−クロトーは、ビタミンＤ（例えば、ビタミンＤ３）、または１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３［１，２５（ＯＨ）２Ｄ３］、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１９、および／またはクロトーβと組み合わせて投与され得る。そのような同時投与は、体内の多数の病態および／またはプロセスに対して相乗的または相加的な効果を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｓ−クロトーは、ＦＧＦ−２１と組み合わせて投与され得る、
いくつかの実施形態では、Ｓ−クロトーは、アセタゾラミド、メタゾラミド、ジクロルフェナミド、ドルゾラミド、ブリンゾラミド、および／またはトピラマートなどの炭酸脱水酵素阻害剤と同時投与され得る。そのようなコンビナトリアル投与は、強直性脊椎炎（ＡＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、および様々な他の病態の治療に有用であり得る。様々な研究により、骨吸収の増加は、ＡＳおよびＲＡの特徴であること、ならびに炭酸脱水酵素阻害剤は骨吸収を阻害することによって抗関節炎の役割を果たすことが示されている。骨レベルでは、近年同定された破骨細胞機能調節因子であるＴＲＰＶ５への作用による異なる機構を通じ、Ｓ−クロトーは、骨吸収およびリン酸放出を刺激する。Ｓ−クロトー投与によって引き起こされる１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のレベルの上昇はまた、破骨細胞分化および骨吸収を刺激し、それによりリン酸を放出する。したがって、Ｓ−クロトーと炭酸脱水酵素阻害剤との同時投与は、特にＡＳおよびＲＡにおける、具体的には骨の健康促進において、相加的または相乗的効果を有し得る。
【０４６８】
重度の活動性関節リウマチの治療のために、Ｓ−クロトーは、１つ以上の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）と組み合わせて投与され得る。
シクロスポリンはクロトーｍＲＮＡおよびタンパク質を減少させ、シクロスポリンによって誘発される腎傷害（ＣｓＡ）につながる酸化ストレスを増加させるため、Ｓ−クロトーは、シクロスポリンと組み合わせて投与され得る。関連するクロトーｍＲＮＡおよびタンパク質の減少および酸化ストレスの増加は、Ｓ−クロトーの外因性同時投与によって対抗され得る。
【０４６９】
いくつかの実施形態では、Ｓ−クロトーは、ロサルタン、および／またはシクロスポリンと同時投与され得る。アンジオテンシンＩＩ１型（ＡＴ１）受容体遮断剤であるロサルタンを用いた治療は、シクロスポリンを用いて見られるクロトー発現の減少を逆転させた。ロサルタンはまた、腎組織（シクロスポリンによって引き起こされる尿細管間質線維症を減少させるロサルタンを用いて）の同時の改善をもたらした。
【０４７０】
いくつかの実施形態では、Ｓ−クロトーは、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシンなどの１つ以上のアミノグリコシドと同時投与され得る。感染症の治療へのアミノグリコシドの使用を大幅に拡大し得る（グラム陰性）病原体感染症を治療するためにアミノグリコシドが使用される場合、そのような治療は、腎毒性および／または急性腎傷害（ＡＫＩ）の防止に有用であり得る。ＡＫＩの遮断に使用されてきたベラパミルおよび／またはジルチアゼムとともにＳ−クロトーを投与することは、ＡＫＩからの腎機能障害の治療および／または防止に治療的であり得る。
【０４７１】
いくつかの実施形態では、Ｓ−クロトーは、テストステロンまたはアンドロゲン受容体（ＡＲ）上方制御化合物と同時投与され得る。近年の報告は、人格、心理的福利、または気分に関する男性へのテストステロン治療には有益な効果が観察されないことを示している。加えて、心血管の健康、性機能、身体機能、気分、または認知機能としての低Ｔに対するテストステロン補充の処方は、無作為化臨床試験による支持はないと見なされていた。しかしながら、テストステロン補充は、筋力を増加することが一貫して見出されたが、身体機能に有益な効果は見出されなかった。テストステロンおよび／またはアンドロゲン受容体（ＡＲ）上方制御化合物と組み合わせたＳ−クロトー投与は、テストステロンまたはＳ−クロトーが単独でこれらの治療群に対して有し得るいかなる効果をも超えて、高齢者、虚弱または低Ｔ男性の筋力および／または身体機能を有意に増加させ得る。
【０４７２】
いくつかの実施形態では、Ｓ−クロトーは、エストロゲンまたはエストロゲンホルモン（例えば、エストラジオール、エストリオール、エストロンなど）と同時投与され得る。そのような同時投与は、女性の健康指標（例えば、月経、閉経、または閉経に移行している女性）を改善し得、ならびに／または不妊症、多嚢胞性卵巣疾患もしくは障害、肥満、ホルモン不均衡および関係する病態、ならびに／または他の女性健康状態を治療し得る。
【０４７３】
いくつかの実施形態では、Ｓ−クロトーは、スマートドラッグまたは認知力向上剤とも呼ばれる、１つ以上のヌートロピックと同時投与され得る。ヌートロピック薬、補充剤、および／または他の物質は、認知機能、特に実行能力、記憶力、創造性、動機づけ、作業サリエンシー（ｔａｓｋ  ｓａｌｉｅｎｃｙ）（作業を実施する動機づけ）、（特に高度な努力を必要とする面倒な作業の）性能を改善し得、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、およびＡＤＨＤなどの障害の原因となる認知機能障害または運動機能障害の治療に有用であり得る。認知力のいくつかの側面を改善することが知られている最も一般的に使用される薬物の部類は、刺激物質、特に前頭前皮質のドーパミン受容体Ｄ１、アドレナリン受容体Ａ２、またはそれらの両方の受容体の直接アゴニストまたは間接アゴニストとして作用することによって、ヒトへの認知力向上効果を示す刺激物質のクラスである。刺激物質には、例えば、特にＡＤＨＤを有する個体における認知機能（例えば、抑制制御、エピソード記憶、作業記憶、および注意力の面）の範囲に有益であり得るアンフェタミン（例えば、アンフェタミン、デキストロアンフェタミン、リスデキサンフェタミンなど）、身体能力、警戒性、反応時間などを改善し得る１，３−ジメチルアミルアミンなどのジメチルアミルアミン（ＤＭＡＡ）、メチルフェニデート−認知機能の範囲（例えば、作業記憶、エピソード記憶、および抑制制御、注意力の面、および計画にかかる速度（ｐｌａｎｎｉｎｇ  ｌａｔｅｎｃｙ））を改善し得る置換フェネチルアミン、特に睡眠不足の個体の警戒性を高め、論理的思考および問題解決を容易にし、ナルコレプシー、交代制勤務による睡眠障害、および睡眠時無呼吸症の治療後にも残る日中の眠気などを治療し得る覚醒促進剤として機能し得るユーゲロイクス（ｅｕｇｅｒｏｉｃｓ）（例えば、アルモダフィニル、モダフィニルなど）、警戒性、パフォーマンス、および／または記憶力を高め得るキサンチン（例えば、カフェインなど）、ニコチン、などが含まれる。
【０４７４】
いくつかの実施形態では、Ｓ−クロトーは、当該技術分野で既知のとおり、１つ以上の骨粗鬆症薬物および／または骨減少症薬物と同時投与され得る。クロトーは、骨塩量を調節する役割を果たし得、クロトーの不在は、動物の骨塩量低減につながり得る。例えば、クロトーノックアウトマウスは、経時的な骨塩量の低減を示す。クロトー発現は、クロトーノックアウトマウスが経時的に示す骨塩量の低減などの骨欠陥を救済し得る。疫学試験は、様々なクロトー遺伝子多様体と、骨塩量の変化および手の変形性関節症の有病率との間の関連性を示している。
【０４７５】
Ｓ−クロトーは、化学療法などの１つ以上の抗癌治療および／または防止と組み合わせて投与され得る。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌では、例えば、Ｓ−クロトー投与は、肺癌細胞のシスプラチンおよび／または他の化学療法に対する耐性に影響し得る。加えて、Ｓ−クロトーは、肺癌、胃癌、膵臓癌（腺癌）、および他の形態の癌において潜在的な腫瘍抑制因子として機能し得る。Ｓ−クロトーは、肝細胞癌（ＨＣＣ）の治療のためにソラフェニブ化学療法と組み合わせて投与され得る。クロトーの過剰発現ならびに可溶性クロトータンパク質を用いた治療は、インビトロおよびインビボでの肝癌細胞成長を低減し得る。Ｓ−クロトー同時投与で治療され得る他の癌の種類には、肝細胞癌（ＨＣＣ）、中枢神経系（ＣＮＳ）癌（例えば、脳（例えば、神経膠腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、および髄膜腫）、脊髄および他の腫瘍、リンパ腫など）、（転移性の）結腸癌などが含まれる。
【０４７６】
Ｓ−クロトーはまた、癌患者における化学療法誘発性虚弱を治療するために、化学療法剤（複数可）と組み合わせて投与され得る。Ｓ−クロトーはまた、他の既知の治療後に、癌患者における癌誘発性虚弱を治療するために投与され得る。
【０４７７】
Ｓ−クロトーは、腎臓透析または他の手順と組み合わせて投与され得る。虚弱は、透析患者の予後不良と関連しているため、Ｓ−クロトーは、透析患者の虚弱を治療するために投与され得る。
【０４７８】
適切な量のＢＤＮＦが脳内の正常なニューロン回路を発達させ維持するのに役立ち得るため、Ｓ−クロトーは、１つ以上のアルツハイマー病治療もしくは防止と組み合わせて、または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と組み合わせて投与され得る。
【０４７９】
ＣＮＳに関係する病態を治療または防止するためにクロトーが中枢神経系（ＣＮＳ）に入る能力を増加させるために、Ｓ−クロトーは、クロトーが血液脳関門を通過する能力を増加させる１つ以上の分子と組み合わせて投与され得る。例えば、Ｓ−クロトーもＢＤＮＦも、血液脳関門を通過しないことが知られている。本開示の実施形態は、アルツハイマー病を治療するため、および／またはアルツハイマー病に罹患していない個体の認知力を改善するために、Ｓ−クロトーおよび／またはＢＤＮＦを有するＳ−クロトーをＣＮＳに投与するための血液脳関門送達技術を利用することを含む。
【０４８０】
Ｓ−クロトーは、５’アデノシンモノリン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）もしくはＡＭＰＫ活性化薬物、または脂肪酸酸化およびオートファジーを含む細胞のＡＴＰ供給を補給するシグナル伝達経路を正に調節するか、もしくは糖新生、脂質、およびタンパク質合成を含むＡＴＰ消費生合成プロセスを負に調節する成分と組み合わせて投与され得る。
【０４８１】
Ｓ−クロトーは、インスリン、フロリジン、または抗酸化剤タイロンなどの１つ以上の抗糖尿病薬と組み合わせて投与され得、これらの併用治療は、糖尿病性障害で生じる酸化ストレスによる腎損傷の防止にメリットを有し得る。Ｓ−クロトーと１型糖尿病用の他の抗糖尿病薬との同時投与は、インテグリンβ１−ＦＡＫ／Ａｋｔ経路の活性化を通してβ細胞のアポトーシスを阻害し、カスパーゼ３切断の阻害につながることによって、β−細胞を保護し得る。
【０４８２】
Ｓ−クロトーは、過体重および肥満糖尿病対象の血糖制御および血管機能を改善するために、メトホルミンなどの１つ以上の２型抗糖尿病薬と組み合わせて投与され得る。
Ｓ−クロトーは、１つ以上の血圧医薬品、カルシウム制御剤、または慢性腎疾患（ＣＫＤ）の治療もしくは防止と組み合わせて投与され得る。例えば、軟組織石灰化はＣＫＤの顕著な特性であり、クロトーは、リン酸塩尿の向上、糸球体濾過量の維持、および血管平滑筋によるリン酸取り込みの直接阻害によって、血管石灰化を改善し得る。
【０４８３】
ＰＡＩ−１阻害または欠損が老化の進行を遅延し、臓器の構造および機能を保護しながらクロトー欠損（ｋｌ／ｋｌ）マウスの寿命を延長すると考えられているため、Ｓ−クロトーは、ＴＭ５４４１または他のＰＡＩ−１阻害剤（プラスミノーゲン活性化因子１）と組み合わせて投与され得る。
【０４８４】
Ｓ−クロトーは、サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）またはレスベラトロールなどのＳＩＲＴ１活性化化合物（ＳＴＡＣ）と組み合わせて投与され得る。ＩＩＩ型タンパク質デアセチラーゼであるＳＩＲＴ１は、細胞老化／加齢および炎症の制御に関与する新規の抗加齢タンパク質であると考えられている。ＳＩＲＴ１レベルおよび活性は、酸化ストレスによって引き起こされる肺の炎症中に減少する。炎症に対するＳＩＲＴ１が介在する保護機構は、炎症、早期老化、テロメア短縮、老化に関連する分泌表現型、およびＤＮＡ損傷応答の制御に関連する。２型糖尿病、癌、心血管疾患、および炎症に関連する慢性閉塞性肺疾患の進行に介入するために、様々な食物ポリフェノールおよび薬理的活性化因子がＳＩＲＴ１を制御することが示されている。したがって、ＳＩＲＴ−１の健康上の利益の一部または全部は、Ｓ−クロトーとともに投与されるＳＩＲＴ１および／またはＳＩＲＴＩ活性化化合物の同時投与によって増大され得る。
【０４８５】
Ｓ−クロトーは、ＦＤＡによって承認済みの、１つ以上のヒト細胞、組織、ならびに細胞および組織系製品（ＨＣＴ／Ｐ）と組み合わせて投与され得る。そのような製品には、例えば、骨（脱灰骨、靭帯、腱、筋膜、軟骨を含む）、眼球組織（角膜および強膜）、皮膚、血管移植片（静脈および動脈）、任意で（またはこれら以外）保存された臍帯静脈、心膜、羊膜（眼の修復のために単独で使用される場合（細胞を添加されていない））、硬膜、心臓弁同種移植片、末梢血もしくは臍帯血、精液、卵母細胞、または胚由来の造血幹細胞のうちの１つ以上が含まれ得る。少なくとも１つの実施形態では、ＨＣＴ／Ｐは、１つ以上の幹細胞であり得るか、またはそれを含み得る。損傷した身体組織および器官の幹細胞治療は、一般的になってきている。幹細胞と組み合わせた治療用組換えクロトータンパク質の投与は、それを必要とする対象にとって驚くべき、予想外の、およびさらには相乗的な結果を提供した。
【０４８６】
本開示の実施形態は、ヒト幹細胞と組み合わせた治療用組換えクロトータンパク質を含む組み合わせ製品をさらに含む。組成物はまた、本明細書に記載の薬学的に許容可能な担体を含み得る。そのような組成物は、ＦＤＡによって承認済みの、重篤なまたは生命を脅かす疾患または病態を治療、修飾、逆転、または治癒するための再生薬として含まれ得るか、または再生薬として分類され得る。予備臨床的根拠は、組成物（薬物）が、そのような疾患または病態に対して適合していない医学的必要性に対処する潜在性を有することを示す。
【０４８７】
例示的に、幹細胞は、ヒト臍帯または胎盤からなどの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であり得るか、またはそれを含み得る。少なくとも１つの実施形態では、本開示のｈｕＭＳＣおよび治療用組換えクロトータンパク質を含む組成物は、ＡＫＩで生じる炎症性および酸化ストレス応答を減弱し、かつ／または老化に関係するタンパク質およびマイクロＲＮＡの発現を低減した。
【０４８８】
Ｓ−クロトーは、１つ以上の老化阻害剤と組み合わせて投与され得る。例えば、クロトータンパク質は、Ｐｉｎ１−ＦＯＸＭ１および／または他の老化阻害剤と組み合わせて、そのような治療を受けている患者における結果を増強し得る。
【０４８９】
Ｓ−クロトーは、クロトー刺激剤（例えば、ビタミンＤ、ロサルタン、テストステロン）、ＧＤＦ−１１、トリコスタチンＡ抗真菌剤（ＧＤＦ−１１刺激剤）、ＴＩＭＰ−２、ＣＣＬ−１１阻害剤／抗体、ダサチニブ、ニコチンアミドリボシド（例えば、ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）（例えば、ＮＤＡ＋）、ＡＭＰＫ刺激剤（例えば、レスベラトロール、アスピリン、サリチレート、ファイトケミカル、ＤＲ）、Ｃ６０フラーレン、ラパマイシン、ＦＧＦ阻害剤、ＦＯＸＯ４−ｐ５３干渉ペプチド（例えば、ＦＯＸＯ４−ＤＲＩ）などのセノリティック薬剤／化合物、抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−ｘＬの阻害剤のうちの１つ以上と組み合わせて投与され得る。
【０４９０】
前述のまたは他の治療または同時投与のいずれも、いずれかの治療単独のものよりも相加的または相乗的効果を有し得る。例えば、クロトータンパク質と前述のもののうちの１つ以上との同時投与は、同様の濃度で単独構成成分を投与する個々の結果の合計よりも、大きな治療結果をもたらし得る。加えて、相乗効果は、より低い濃度で、単独構成成分を投与する個々の結果のものと同様の治療結果を含み得る。相乗効果はまた、構成成分のうちの１つ以上の最大有効投薬量の増加、構成成分のうちの１つ以上の毒性の低減、または個々の治療結果の単なる相加的な効果以上の任意の他の有益な結果を含み得る。加えて、個々の治療結果の相加的な効果は、１つ以上の相乗効果を含み得る。そのような相加的／相乗的な効果は、個々の構成成分の性質および理解を考慮すると予測または予想されない場合がある。
【０４９１】
本明細書で使用される場合、併用治療または同時投与は、クロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分を含む組み合わせ製品、組成物、または製剤の治療または投与を含み得る。１つ以上の追加の活性成分は、本明細書に記載の構成成分、薬物、物質、治療組成物など、または当該技術分野で既知の他のものの中から選択され得る。例えば、クロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分は、注射可能な（例えば、筋肉内、静脈内など）、摂取可能な、経皮的な、吸入可能な、局所的な、または他の製剤に共製剤化され得る。
【０４９２】
代替的に、併用治療または同時投与は、クロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分が、組み合わせ製品、組成物、または製剤に組み合わされること、または製剤化されることなく、クロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分の治療または投与を含み得る。例えば、クロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分は、別個に注射可能な（例えば、筋肉内、静脈内など）、摂取可能な、経皮的な、吸入可能な、局所的な、または他の製剤を各々含むか、またはそのような製剤中にあり得る。
【０４９３】
また、同時投与は、２つ以上の成分の同時投与、または２つ以上の成分の別個の投与を含み得、別個の投与は、好ましくはある期間によって隔てられていることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、期間は非常に短くてもよい。例えば、クロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分の第１の構成成分の投与直後に、クロトータンパク質および１つ以上の追加の活性成分の第２の構成成分が、実質的に投与（例えば、注射）され得る。代替的に、第１および第２の投与は、１〜６０秒、１〜６０分、１〜２４時間、１〜７日、１〜４週間、１〜１２ヶ月など、または任意の値もしくはその間の値の範囲などの期間によって隔てられ得る。同様に、同時投与は、２つ以上の構成成分の投与時間枠の重複を含み得る。
【０４９４】
高リン酸血症性家族性腫瘍性石灰化症（ＨＦＴＣ）の治療的処置
罹患しているヒト個体では、ＨＦＴＣは、Ｓ−クロトー−ｒｓ１２１９０８４２３のアミノ酸（ＡＡ）１９３位でのヒスチジン（Ｈ）からアルギニン（Ｒ）への変異によって引き起こされる。いかなる理論にも拘束されるものではないが、ＨＦＴＣ個体におけるＨ１９３Ｒ変異は、Ｓ−クロトーがＦＧＦ２３およびＦＧＦＲ１ｃと三成分複合体を形成する能力を障害し、これがＫＬ依存性ＦＧＦ２３シグナル伝達を障害すると考えられている。結果として、罹患している対象は、皮膚および皮下組織に高リン酸血症および大量のカルシウム沈着が現れる重度の代謝障害を示す。一部の患者では、骨膜反応および皮質性骨増殖症および皮膚への浸潤の不在の放射線学的所見に関連する、再発性で一過性の長骨の痛みを伴う腫脹が現れる。
【０４９５】
本開示の一実施形態は、Ｈ１９３を有するＳ−クロトータンパク質を含む。Ｈ１９３タンパク質は、本明細書に記載の任意のタンパク質構築物の文脈において、産生または発現され得る。例えば、Ｈ１９３多様体は、タグ（例えば、Ｆｃタグ、ＴＥＶ−Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＥＶ配列など）の有無にかかわらず、Ｓ−クロトー、アイソフォーム１または２、１〜９８１、２９〜９８１、３４〜９８１、３６〜９８１、１３１〜９８１、１〜５４９、２９〜５４９、３４〜５４９、３６〜５４９、１３１〜５４９などの文脈において産生または発現され得る。したがって、タンパク質が発現される核酸構築物またはｃＤＮＡは、対応する立体配置であり得る。
【０４９６】
実施形態は、Ｈ１９３ヘテロ接合性またはホモ接合性多様体構築物を産生すること、Ｓ−クロトーＨ１９３タンパク質をコードする得られた構築物を（例えば、トランスフェクションを介して）適切な発現系（例えば、ＣＨＯ細胞）に導入すること、および／またはＳ−クロトーＨ１９３タンパク質を一過性に発現することを含み得る。Ｈ１９３クロトータンパク質はまた、Ｒ１９３（またはＨ１９３Ｒ）タンパク質よりも高いレベルで発現され得る。実施形態は、治療的投与のために発現されたタンパク質を精製すること（および任意で品質管理試験をすること）を含み得る。実施形態は、治療用または治療有効量のＳ−クロトーＨ１９３タンパク質を、それを必要とする対象（例えば、ＨＦＴＣ個体、ＨＦＴＣと診断された個体、またはＨ１９３Ｒ（ｒｓ１２１９０８４２３）もしくは他の多様体を保有する患者）に投与することを含み得る。代替的に、対象は、他の変異体または多様体の野生型のものであり得る。組換えＳ−クロトーＨ１９３タンパク質の投与は、血中Ｓ−クロトーレベルの有益な増加につながり得る。投与は、ＨＦＴＣに罹患している個体のヒトクロトー遺伝子に見出されるＨ−〜−Ｒ１９３点変異の結果として、ＨＦＴＣ個体において転写および循環されるＲ１９３変異体の悪影響を逆転または抑制し得る。したがって、Ｓ−クロトーＨ１９３の循環濃度は、Ｈ１９３ＲまたはＨＦＴＣ個体において観察される影響に対抗するのに役立ち得る。
【０４９７】
末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有するＣＣ遺伝子型患者における治療的処置
末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有するおよそ３５万人の患者が、常習的な血液透析のその最初の年に非常に高い死亡率に苦しんでいる。ビタミンＤおよび線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）−２３レベルの両方は、これらの患者の生存と相関する。いかなる理論にも拘束されるものではないが、クロトーは、動物モデルにおいて加齢の加速および若年死亡と関連しているビタミンＤ／ＦＧＦ−２３シグナル伝達経路中のタンパク質である。クロトー遺伝子の遺伝的多様性は、ＥＳＲＤを有する対象の生存と関連し得るとの仮説が立てられている。研究者らは、血液透析の最初の１年間に、クロトー遺伝子の１２の一塩基多型（ＳＮＰ）とＥＳＲＤ患者コホート（ｎ＝１３０７人、白人およびアジア人）の死亡率との間の関連性を試験した。１つのタグＳＮＰ、ｒｓ５７７９１２のＣＣ遺伝子型（イントロン１に位置するクロトー遺伝子配列内のマイナー対立遺伝子頻度ＭＡＦ］＞０．０５を有する一般的なＨａｐＭａｐ多様体）と、１年死亡率のリスク増加（ＲＲ、１．７６；９５％ＣＩ、１．１９〜２．５９；ｐ＝０．００３）との間の有意な関連性が発見された。活性型ビタミンＤ補充剤（ＨＲ、２．５１；９５％ＣＩ、１．１８〜５．３４；ｐ＝０．００５）を用いて治療されなかった患者のうち、ＣＣ遺伝子型を有する個体におけるこの効果はさらにより顕著であった。ＨａｐＭａｐ対象由来のリンパ芽球様細胞株では、ＣＣ遺伝子型は、ＡＡまたはＡＣ遺伝子型と比較して、１６〜２１％低いクロトー発現と関連していた。しかしながら、上述のｒｓ５７７９１２  ＳＮＰヌクレオチド変化のいずれも、クロトータンパク質のアミノ酸変化はもたらさない。したがって、この機能性ＳＮＰ（ｒｓ５７７９１２）は、ｍＲＮＡレベルでのクロトー遺伝子発現に定量的に影響し得る。
【０４９８】
本開示の一実施形態は、ＡＡまたはＡＣ遺伝子型から発現されるＳ−クロトータンパク質を含む。タンパク質は、本明細書に記載の任意のタンパク質構築物の文脈において産生または発現され得る。例えば、タンパク質は、Ｓ−クロトー、アイソフォーム１または２タグ付きまたはタグなしの１−９８１、２９−９８１、３４−９８１、３６−９８１、１３１−９８１、１−５４９、２９−５４９、３４−５４９、３６−５４９、１３１−５４９など（例えば、Ｆｃタグ、ＴＥＶ−Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＥＶ配列など）の文脈において産生または発現され得る。したがって、タンパク質が発現される核酸構築物またはｃＤＮＡは、対応する長さのものであり得る。
【０４９９】
実施形態は、ＡＡまたはＡＣヘテロ接合性またはホモ接合性構築物を産生すること、Ｓ−クロトータンパク質をコードする得られた構築物を（例えば、トランスフェクションを介して）適切な発現系（例えば、ＣＨＯ細胞）に導入すること、および／またはＳ−クロトータンパク質を一過性に発現することを含み得る。ＡＡまたはＡＣヘテロ接合性またはホモ接合性細胞内で発現されるクロトータンパク質は、ＣＣ細胞内よりも高いレベルで発現され得る。実施形態は、治療的投与のために発現されたタンパク質を精製すること（および任意で品質管理試験をすること）を含み得る。実施形態は、治療用または治療有効量のＳ−クロトータンパク質を、それを必要とする対象（例えば、内在性Ｓ−クロトータンパク質発現が低い、１つのタグＳＮＰ、ｒｓ５７７９１２のＣＣ変異を保有する、かつ／または末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有する、個体または患者）に投与することを含み得る。代替的に、対象は、他の変異体または多様体の野生型のものであり得る。組換えＳ−クロトータンパク質の投与は、血中Ｓ−クロトーレベルの有益な増加につながり得る。投与は、罹患している個体のヒトクロトー遺伝子に見出される点変異（複数可）の結果として、個体において転写および循環されるＣＣ変異の悪影響を逆転または抑制し得る。したがって、Ｓ−クロトーの循環濃度は、ＣＣ個体、特に末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有する患者に観察される効果、すなわち、常習的に血液透析を受けているＥＳＲＤ患者の最初の１年間の死亡率に対抗するのに役立ち得る。
【０５００】
レントゲン写真による手の変形性関節症（ＯＡ）および骨棘の治療的処置
変形性関節症（ＯＡ）は、強い遺伝性の構成要素を有する一般的な複雑な疾患である。研究者らは、白人女性の大きな集団において、クロトー遺伝子の４つの推定上の機能性遺伝子多様体と、手の変形性関節症ＯＡとの間の関連性を試験した。研究者らは、ＳＮＰ  Ｇ−３９５Ａと、レントゲン写真による手のＯＡおよび骨棘形成の存在／不在との間に有意な関連性を見出した。対立遺伝子Ｇはそれぞれ、１．４４（Ｐ＝０．００８、９５％信頼区間（ＣＩ）１．０９〜１．９１）および１．３６（Ｐ＝０．００６、９５％ＣＩ１．０９〜１．７０）のオッズ比（ＯＲ）で、レントゲン写真による手のＯＡおよび骨棘のリスクを有意に増加させた。ロジスティック回帰モデリングから、遺伝子型ＧＧは、遺伝子型ＡＡと比較したとき、レントゲン写真による手のＯＡ（ＯＲ＝３．１０、９５％ＣＩ１．１０〜８．７６）および骨棘（ＯＲ＝３．１０、９５％ＣＩ１．１０〜８．７５）の両方のリスクが３倍を超えて増加したことを示した。年齢調整後、遺伝子型ＧＧのＯＲは、レントゲン写真による手のＯＡでは４．３９（Ｐ＝０．００６、９５％ＣＩ１．５１〜１２．７４）、骨棘では４．４７（Ｐ＝０．００５、９５％ＣＩ１．５６〜１２．７７）にさらに増加した。研究者らはまた、クロトー遺伝子の１つの多様体（ＳＮＰ  Ｇ−３９５Ａ）が手のＯＡの感受性と関連し、軟骨損傷よりもむしろ骨棘形成を通して作用するようであることを示唆した。
【０５０１】
本開示の一実施形態は、ＳＮＰ  Ｇ３９５Ａを有する構築物から発現されるＳ−クロトータンパク質を含む。得られたタンパク質は、本明細書に記載の任意のタンパク質構築物の文脈において産生または発現され得る。例えば、Ａ３９５多様体は、タグ（例えば、Ｆｃタグ、ＴＥＶ−Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＥＶ配列など）の有無にかかわらず、Ｓ−クロトー、アイソフォーム１もしくは２、１〜９８１、２９〜９８１、３４〜９８１、３６〜９８１、１３１〜９８１、１〜５４９、２９〜５４９、３４〜５４９、３６〜５４９、１３１〜５４９などの文脈において産生または発現され得る。したがって、タンパク質が発現される核酸構築物またはｃＤＮＡは、対応する長さのものであり得る。
【０５０２】
実施形態は、Ｇ３９５Ａヘテロ接合性またはホモ接合性構築物を産生すること、Ｓ−クロトータンパク質をコードする得られた構築物を（例えば、トランスフェクションを介して）適切な発現系（例えば、ＣＨＯ細胞）に導入すること、および／またはＳ−クロトータンパク質を一過性に発現することを含み得る。Ａ３９５ヘテロ接合性またはホモ接合性細胞内で発現されるクロトータンパク質は、Ｇ３９６細胞内よりも高いレベルで発現され得る。実施形態は、治療的投与のために発現されたタンパク質を精製すること（および任意で品質管理試験をすること）を含み得る。実施形態は、治療用または治療的有効量のＳ−クロトータンパク質を、それを必要とする対象（例えば、Ｇ３９５  ＳＮＰ、ならびに／またはレントゲン写真による手の変形性関節症（ＯＡ）および／もしくは骨棘を保有する（これらを発症するリスクがある）個体または患者）に投与することを含み得る。代替的に、対象は、他の変異体または多様体の野生型のものであり得る。組換えＳ−クロトータンパク質の投与は、血中Ｓ−クロトーレベルの有益な増加につながり得る。投与は、罹患している個体で転写および循環されるＧ３９５  ＳＮＰの悪影響を逆転または抑制し得る。したがって、Ｓ−クロトーの循環濃度は、Ｇ３９５個体、特にレントゲン写真による手の変形性関節症（ＯＡ）および／または骨棘を発症するリスクがある個体において観察される影響に対抗するのに役立ち得る。したがって、Ｇ−３９５Ａ  Ｓ−クロトータンパク質の投与は、患者（例えば、Ｇ３９５  ＳＮＰを保有する患者におけるレントゲン写真による手の変形性関節症（ＯＡ）および骨棘形成のリスクを減少させ得る。
【０５０３】
メタボリック症候群の治療的処置
腹部肥満、高血糖、脂質異常、および高血圧を含む心血管代謝性危険因子の集団であるメタボリック症候群（ＭｅｔＳ）のリスクおよび／または発生率は年齢とともに増加する。高齢の成人では、ＭｅｔＳは心血管疾患および２型糖尿病のリスクを増加させるだけでなく、認知力低下および身体障害にも関連している。現在の根拠によると、ＭｅｔＳは、部分的に遺伝性であり、遺伝因子はＭｅｔＳの発生率に対する環境因子よりも大きな役割を果たすことが示唆されている。研究者らは、中国の９０歳代および１００歳代の集団において、Ｇ−３９５Ａ多型とメタボリック症候群（ＭｅｔＳ）との間の関連性を発見した。対象は、都江堰市（ＰＬＡＤ）の長寿および加齢のプロジェクトからであった。クロトー遺伝子のプロモーター領域におけるＧ−３９５Ａ（ｒｓ１２０７５６８）の遺伝子型決定を、ＴａｑＭａｎ対立遺伝子識別アッセイを使用して実施した。ＭｅｔＳは、国際糖尿病連合の基準に従って診断された。９３．５±３．２歳の６９５人の対象が含まれた。ＧおよびＡの対立遺伝子頻度はそれぞれ、０．８５２および０．１４８であった。集団全体では、ＭｅｔＳの頻度は、ＧＧおよびＧＡ＋ＡＡ遺伝子型群でそれぞれ、１０．８％および５．９％であった（ｐ＝０．００４）。−３９５Ａ対立遺伝子保有者は、集団全体では（オッズ比［ＯＲ］０．５０、９５％信頼区間［ＣＩ］０．２５〜０．９８）、および女性では（ＯＲ０．５１、９５％ＣＩ０．２４〜０．９７）の有意により低いＭｅｔＳのリスクを有したが、男性では（ＯＲ０．４２、９５％ＣＩ０．０５〜３．８５）であった。集団全体および女性では、クロトーＧ−３９５Ａ  ＳＮＰとＭｅｔＳとの間の関係は、高血圧（それぞれ、ＯＲ０．４８、９５％ＣＩ０．３４〜０．６７；ＯＲ０．４７、９５％ＣＩ０．３１〜０．７１）、および高トリグリセリド血症（それぞれ、ＯＲ０．６６、９５％ＣＩ０．３９〜０．９５；ＯＲ０．５４、９５％ＣＩ０．３１〜０．９８）へのその影響による可能性があった。男性では、この関係は、高血圧（ＯＲ０．４７、９５％ＣＩ０．２５〜０．９０）および低ＨＤＬ−Ｃ（ＯＲ０．６９、９５％ＣＩ０．２７〜０．９３）へのその影響による可能性があった。研究者らは、クロトー遺伝子の−３９５Ａ対立遺伝子保有者が、中国の特に女性の９０歳代および１００歳代の間のＭｅｔＳのより低いリスクと相関していると結論付けた。
【０５０４】
本開示の一実施形態は、−３９５Ａ対立遺伝子を有する構築物から発現されるＳ−クロトータンパク質を含む。得られたタンパク質は、本明細書に記載の任意のタンパク質構築物の文脈において、産生または発現され得る。例えば、Ａ３９５対立遺伝子は、タグ（例えば、Ｆｃタグ、ＴＥＶ−Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＥＶ配列など）の有無にかかわらず、Ｓ−クロトー、アイソフォーム１もしくは２、１〜９８１、２９〜９８１、３４〜９８１、３６〜９８１、１３１〜９８１、１〜５４９、２９〜５４９、３４〜５４９、３６〜５４９、１３１〜５４９などの文脈において産生または発現され得る。したがって、タンパク質が発現される核酸構築物またはｃＤＮＡは、対応する長さのものであり得る。
【０５０５】
実施形態は、−３９５Ａヘテロ接合性またはホモ接合性構築物を産生すること、Ｓ−クロトータンパク質をコードする得られた構築物を（例えば、トランスフェクションを介して）適切な発現系（例えば、ＣＨＯ細胞）に導入すること、および／またはＳ−クロトータンパク質を一過性に発現することを含み得る。Ａ３９５ヘテロ接合性またはホモ接合性細胞内で発現されるクロトータンパク質は、Ｇ３９６細胞におけるよりも高いレベルで発現され得る。実施形態は、治療的投与のために発現されたタンパク質を精製すること（および任意で品質管理試験をすること）を含み得る。実施形態は、治療用または治療的有効量のＳ−クロトータンパク質を、それを必要とする対象（例えば、Ｇ３９５  ＳＮＰ、および／またはメタボリック症候群（ＭｅｔＳ）を保有する（これらを発症するリスクがある）個体もしくは患者に投与することを含み得る。代替的に、対象は、他の変異体または多様体の野生型のものであり得る。組換えＳ−クロトータンパク質の投与は、血中Ｓ−クロトーレベルの有益な増加につながり得る。投与は、罹患している個体で転写および循環されるＧ３９５  ＳＮＰの悪影響を逆転または抑制し得る。したがって、Ｓ−クロトーの循環濃度は、Ｇ３９５個体、特にメタボリック症候群（ＭｅｔＳ）を発症するリスクのある個体において観察される影響に対抗するのに役立ち得る。したがって、Ｇ−３９５Ａ  Ｓ−クロトータンパク質の投与は、患者（例えば、Ｇ３９５  ＳＮＰを保有する高齢のヒトおよび／または女性の患者）におけるメタボリック症候群（ＭｅｔＳ）のリスクを減少させ得る。
【０５０６】
癌の治療的処置
Ｓ−クロトーは、基礎Ｗｎｔシグナル伝達活性を阻害し、それによって結腸直腸癌（ＣＲＣ）の腫瘍抑制因子として機能すると考えられている。加えて、寿命差に関連するクロトー遺伝子多様体は、酪酸塩が介在するＷｎｔの過剰活性化を抑制し、したがってＣＲＣのリスクを増加させ得る。このような方式で、存在するクロトー多様体の種類およびその相対的発現は、食事に由来する酪酸塩のレベルと相互作用し、ＣＲＣリスクを修飾し得るという仮説が立てられている。さらに、ｍＴＯＲシグナル伝達はまた、ヒトの加齢に関連しており、かつＷｎｔとｍＴＯＲとのシグナル伝達間のクロストークは、結腸腫瘍形成に影響し得る。
【０５０７】
ＫＬ−ＶＳ多様体または他の構築物は、（例えば、ＫＬ−ＶＳ内の）どのＳＮＰが、Ｓ−クロトーに影響して、基礎Ｗｎｔシグナル伝達の減少および／または酪酸塩が介在するＷｎｔの過剰活性化の抑制の生成に関与するかを研究するためのビヒクルとして機能し得、後者は、Ｓ−クロトー腫瘍抑制に関連しているＷｎｔに関係する活性である。実施形態は、ＫＬ−ＶＳ多様体の腫瘍抑制作用に影響することが示されている適切なアミノ酸（例えば、Ｓ−クロトーのＫＬ−ＶＳストレッチ）を修飾することを含む。本開示の一実施形態は、６つのＳＮＰのＫＬ−ＶＳストレッチにおいて１つ以上のアミノ酸改変を有する組換えＳ−クロトータンパク質を含む。タンパク質は、本明細書に記載の任意のタンパク質構築物の文脈において、産生およびまたは発現され得る。例えば、タンパク質は、タグ（例えば、Ｆｃタグ、ＴＥＶ−Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＥＶ配列など）の有無にかかわらず、Ｓ−クロトー、アイソフォーム１もしくは２、１〜９８１、２９〜９８１、３４〜９８１、３６〜９８１、１３１〜９８１、１〜５４９、２９〜５４９、３４〜５４９、３６〜５４９、１３１〜５４９などの文脈において産生または発現され得る。したがって、タンパク質が発現される核酸構築物またはｃＤＮＡは、対応する長さのものであり得る。
【０５０８】
実施形態は、ヘテロ接合性またはホモ接合性多様体構築物を産生すること、Ｓ−クロトータンパク質をコードする得られた構築物を（例えば、トランスフェクションを介して）適切な発現系（例えば、ＣＨＯ細胞）に導入すること、および／またはＳ−クロトータンパク質を一過性に発現することを含み得る。クロトータンパク質は、野生型を含む他のクロトータンパク質よりも高いレベルで発現され得る。実施形態は、治療的投与のために発現されたタンパク質を精製すること（および任意で品質管理試験をすること）を含み得る。実施形態は、治療用または治療有効量のＳ−クロトータンパク質を、それを必要とする対象（例えば、結腸直腸癌（ＣＲＣ）または別の腫瘍を有するかまたは発症するリスクがある患者）に投与することを含み得る。対象は、例えば、減少したＷｎｔ阻害活性を有するクロトー多様体を保有または発現し得る。代替的に、対象は、他の変異体または多様体の野生型のものであり得る。組換えＳ−クロトータンパク質の投与は、血中Ｓ−クロトーレベルの有益な増加につながり得る。
【０５０９】
非ヒト哺乳動物の治療的処置
上記に加えて、１つ以上の非ヒト哺乳動物クロトータンパク質またはタンパク質配列（またはその一部分（複数可））は、本開示の特定の実施形態の実施に有用であり得る。配列番号１２１〜１２４は、様々な非ヒト哺乳動物クロトータンパク質をコードするためのＤＮＡ配列を表す。配列番号１１１〜１２０は、様々な非ヒト哺乳動物のアミノ酸配列を表す。これらのクロトータンパク質配列（またはその一部分（複数可））は、上記と同様の方法で、発現され、精製され、組成物へと製剤化され、かつ／または動物に投与され得る。組換えクロトー（融合）タンパク質の治療剤投与は、本明細書に概説される非ヒト哺乳動物バージョンの医学的病態および他の病態の治療に有効であり得る。具体的には、本開示の実施形態は、当業者によって理解されるように、獣医学的治療方法、タンパク質、および組成物を含み得る。
【実施例】
【０５１０】
実施例１
表４８は、ＨＥＫおよび／またはＣＨＯ細胞株内での列挙されたクロトー多様体の一過性発現および精製の結果を例示する。以下の表４８に提供された結果では、以下の簡略化されたプロトコルに従った。
【０５１１】
Ｆｃ融合タンパク質については、標準的な方法を使用して、タンパク質発現ベクターをＨＥＫ２９３．ｓｕｓまたはＣＨＯにトランスフェクトした。要約すると、細胞を７日間成長させ、採取した。細胞数は、注釈の欄に記載されている。上清ｐＨを、１ＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４で調整し、アジ化ナトリウムを添加した。ＫａｎＣａｐ  Ａ樹脂を使用して、タンパク質を捕捉した。樹脂をＰＢＳで洗浄した。樹脂をＰＢＳに加えて１ＭのＮａＣｌで洗浄した。樹脂をＰＢＳで洗浄した。タンパク質を、５０ｍＭのクエン酸塩ｐＨ３．５、１００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。タンパク質を、１ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、０．５Ｍのアルギニンで直ちに中和した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル試料をこの段階で除去した。タンパク質をＰＢＳに緩衝液交換した。ＯＤ２８０によってタンパク質を定量化し、計算された吸光係数を使用して、量および濃度を判定した。還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ基準Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ、４〜２０％）を使用して、純度および分子量を判定した。Ｓｅｐａｘ  Ｚｅｎｉｘ−Ｃ  ＳＥＣ−３００、３ｕｍ、３００Ａ、４．６×１５０ｍｍサイズ排除カラムおよびＰＢＳ緩衝液運転を使用する２８０ｎｍでの検出で、ＨＰＬＣによって凝集状態を判定した。フィルター滅菌、液体窒素で急速凍結後、タンパク質をアリコートとして輸送した。精製の前後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで運転された試料から判定すると、ＰＢＳへの脱塩中に一部のＦｃタンパク質でタンパク質の減少が観察された。これらのタンパク質はＨＰＬＣから発現されたが、脱塩中またはＰＢＳ中のシリカＨＰＬＣカラムでのアッセイ中に問題が生じた。したがって、タンパク質の減少を低減するために、緩衝液の選択を最適化した。
【０５１２】
Ｓｔｒｅｐタグ付けタンパク質については、標準的な方法を使用して、タンパク質発現ベクターをＨＥＫ２９３．ｓｕｓまたはＣＨＯにトランスフェクトした。簡潔には、細胞を７日間成長させ、採取した。上清ｐＨを、１ＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４で調整し、アジ化ナトリウムを添加した。ＢｉｏＬｏｃｋビオチン隔離試薬を添加した。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂を使用して、タンパク質を捕捉した。樹脂を１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄した。タンパク質を１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および２．５ｍＭのデスチオビンで溶出した。ＯＤ２８０によってタンパク質を定量化し、計算された吸光係数を使用して、量および濃度を判定した。還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ基準Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ、４〜２０％）を使用して、純度および分子量を判定した。Ｓｅｐａｘ  Ｚｅｎｉｘ−Ｃ  ＳＥＣ−３００、３ｕｍ、３００Ａ、４．６×１５０ｍｍサイズ排除カラムおよびＰＢＳ緩衝液運転を使用する２８０ｎｍでの検出で、ＨＰＬＣによって凝集状態を判定した。フィルター滅菌、液体窒素で急速凍結後、タンパク質をアリコートとして輸送した。Ｓｔｒｅｐタグ付きタンパク質については、試料を溶出緩衝液中でアッセイしたことに留意すべきである。この溶出緩衝液は、非常に「中性」であり、タンパク質に有害ではない。また、ＳＥＣカラムの運転緩衝液はＰＢＳであったため、タンパク質はアッセイ中に緩衝液交換を受けた。７分を超える時間での吸光度は、小分子である。
【０５１３】
【表４８−１】
2021508037.tif 000079
【０５１４】
【表４８−２】
2021508037.tif 000080
【０５１５】
特定の実施形態では、ＥＤＴＡおよび／または他の金属キレート剤（複数可）を、精製ステップおよび／または緩衝液のうちの１つ以上（例えば、全て）から除去した（またはそれらに含めなかった）。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡおよび／または他の金属キレート剤（複数可）は、クロトータンパク質の不活性化に寄与するか、またはそれを引き起こし得る。
【０５１６】
経過観察試験では、一過性に発現したＦｃ−クロトータンパク質を、Ａｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣ分析カラム：１．７μｍ、４．６×１５０ｍｍ；移動相：１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．８；流量：０．３５ｍＬ／分；運転時間：９分；検出：Ａ２８０、ＭＡＬＳ＆ＲＩ検出器；周囲試料コンパートメント、３０Ｃカラムコンパートメント；１００μＬの試料の注入（３７μｇ）を使用して精製した。図１４は、クロトー−Ｆｃタンパク質のクロマトグラフを例示する。Ｆｃクロトータンパク質の大部分は、空隙容量近くのＭＷマーカーの第１のピークに重なっているようである。これは、（メガダルトンでの）主ピークに見られる非常に高い分子量に対応し、天然クロトーよりもはるかに高い。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）により、ピーク（画分）は単量体のサイズのタンパク質を含有し、これは溶液中での非共有結合を示唆する。主クロトーピーク（破線の楕円形で標識）の尾部に小さな肩部が観察され、これは、ＭＷマーカーと比較して、ＳＥＣカラムでの溶出時間によってＩｇＧよりも大きいＭＷ、および光散乱によって約７００ｋＤａ（ＬＳシグナルは非常に低く、凝集体が尾を引いているため、過大評価される可能性がある）を有する合計クロトーピーク面積の１％未満である。このピークは、多量体、おそらく二量体または四量体に対応する。
【０５１７】
異なるカラム、緩衝液、条件などを含む様々な代替的精製スキームを使用して、タンパク質の凝集および多量体形成の問題に対処した。しかしながら、少なくとも１つの実施形態では、多量体（二量体、四量体など）クロトータンパク質が精製され得る。
【０５１８】
実施例２
配列番号５２（Ｎ’−ヒトアルファクロトー３４〜９８１アイソフォーム１＿（Ｇ４Ｓ）２リンカー＿ヒトＩｇＧ１Ｆｃ−Ｃ’）、配列番号５４（Ｎ’−ヒトアルファクロトー３４〜５４９アイソフォーム２＿（Ｇ４Ｓ）２リンカー＿ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ−Ｃ’）、および配列番号６６（Ｎ’−ヒトアルファクロトー３４〜９８１アイソフォーム１＿Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ切断部位残基）で表される（ヒト）クロトー由来タンパク質の安定した発現をＣＨＯ細胞内で実施した。３つのクロトータンパク質構築物の各々を天然に存在しないＮ末端シグナル配列で発現させ、その後これを安定した発現／精製プロセス中に切断してＮ末端（クロトータンパク質）アミノ酸を得た。配列番号５２および５４のクロトータンパク質配列のＣ末端はＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）およびＦｃ融合タグ（ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン）であり、これらは発現されたタンパク質中に保持されている（または保持されているようである）。配列番号５２のクロトータンパク質配列のＣ末端は、ＴＥＶ−Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ（ＧＳリンカーを有する）（ＧＧＥＮＬＹＦＱ／ＳＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ−ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ−ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ）であり、これはＴＥＶ−Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ（すなわち、ＧＧＥＮＬＹＦＱ）のグルタミン８（Ｑ８）後に切断され、Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグ部分（ＳＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ−ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ−ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ）を放出し、ＴＥＶ（プロテアーゼ認識または一致）配列（ＧＧＥＮＬＹＦＱ−Ｃ’）の少なくとも一部分を保持する。
【０５１９】
コード配列を、ＤＮＡ２．０独自のアルゴリズムを使用してコドン最適化した。遺伝子を合成し、Ｐｄ３６００トランスポゾン骨格ベースの発現構築物を組み立てた。
ＧＳノックアウトＣＨＯＫ１誘導体宿主細胞株を使用して、ヒトクロトー多様体を発現させた。細胞を、３つの異なるｈクロトー設計およびＬｅａｐ−Ｉｎトランスポーゼース（ＡＴＵＭ）をコードするＬｅａｐ−Ｉｎトランスポゾンベースの発現プラスミド（ＡＴＵＭ）で、同時にトランスフェクトした。トランスフェクションは、Ｎｅｏｎ装置（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してエレクトロポレーションにより実施した。トランスフェクトした細胞を、グルタミンを含まない条件下で選択し、得られた安定したプールを凍結保存した。確立された安定したプールからの細胞を振盪フラスコに接種し、ＡＴＵＭの小規模の確立された供給および細胞培養条件を使用して、流加産生試験を行った。清澄化した採取試料を採取し、抗Ｆｃ抗体−（配列番号５２および５４）またはＳｔｒｅｐ−タクチン−（配列番号６６）ＨＲＰ共役体ベースの検出を使用するウェスタンブロット分析にかけた。例示的なウェスタンブロットを図１５Ａ〜１６Ｂに示す。
【０５２０】
ＦＬ−ＥＣＤ（３４〜９８１）−Ｆｃクロトー誘導体（配列番号５２）を発現する安定したプール２９１６４５は、主に予想されるサイズのタンパク質を産生する（図１５Ａを参照されたい）。全長細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質単量体の予測サイズは、１３９ｋＤａである。優勢な抗Ｆｃ陽性バンドは予測された約１４０ｋＤａサイズ（矢印）であり、これは発現構築物２９１６４５が正しいサイズの融合タンパク質を発現することを示している。タンパク質は、非天然および非還元条件下で二量体化する（図１５Ｂを参照されたい）。非還元条件下では、全長細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ二量体を形成し得る。非還元ウェスタンブロット（矢印）で抗Ｆｃ抗体によって検出される優勢なバンドのサイズは、予測されるホモ二量体の形成と一致する。
【０５２１】
安定したプール２９１６４７（配列番号６６）によって発現されたＦＬ−ＥＣＤ（３４〜９８１）−ＴＥＶ−Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ分子もまた、ウェスタンブロットで正しいサイズを示し、非天然および非還元条件下で単量体のままである（図１６Ａ〜１６Ｂを参照されたい）。予想されるサイズのアイソフォーム−２−Ｆｃ多様体は、分泌ヒトクロトータンパク質を表す。成熟全長ＥＣＤ（３４〜９８１）−ｔｗｉｎ−ｓｔｒｅｐタグ付きクロトータンパク質（配列番号６６）の予測される分子量は、約１０９ｋＤａである。非還元ウェスタンブロット分析は、発現構築物２９１６４７によってコードされるＣＨＯ細胞からの正しいサイズのタンパク質発現の成功を実証する（図１６Ａを参照されたい）。非還元変性ウェスタンブロット分析は、ＣＨＯ細胞から分泌された場合、ｈクロトーの全長細胞外ドメインが共有結合ホモ二量体を形成しないことを示す（図１６Ｂを参照されたい）。添付の配列表に表される他のタンパク質構築物も調製した。図１７は、様々な示される組換えクロトータンパク質構築物のゲルである。図１８は、それぞれの示される組換えクロトータンパク質構築物の一連のゲルである。
【０５２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているが、表４８には示されていない１つ以上の他のクロトー多様体に加えて、表４８に開示され、かつ／または図１５Ａ〜１８に示されるクロトー多様体の発現および／または精製が、天然クロトーの発現および／または精製に対する利点をもたらすことが理解されるべきである。例えば、クロトー多様体を発現および／または精製すると、代替的な産物の数および／または種類が低減し得る。加えて、または代替的に、天然クロトーの発現レベルと比較して、所望のクロトー多様体の発現レベルが増加され得る。加えて、または代替的に、所望のクロトー多様体は、同等の条件および方法下で、より純粋な形態で発現および／または精製される（例えば、所望のクロトー多様体の濃度は、発現および／または精製された副産物の付随した減少とともに増加する）。予備結果は、設計された組換え融合タンパク質が好適な力価範囲内で発現および精製されており、許容される緩衝液、担体、および賦形剤に可溶性であることを示した。
【０５２３】
さらなる細胞株を開発し、密度、生存率、および産生について評価した。上位１０個のクローンからのデータを図１９〜２２に例示する。上位４つのクローンのデータを図２３〜２６に例示する。流加順位に基づくと、上位２つのクローンは、１３８Ｄ９および１４５Ｇ８であるようである。疑似灌流の累積生産性に基づくと、１３８Ｄ９が最高の性能を有するようである。１４０Ｆ６は最高のＶＣＤに達した。図２７に例示されるように、コピー数の安定性も評価した。全ＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）を使用してＲＮＡ単離を実施した。ＲＮＡ単離後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２０５１１１）を使用してテンプレートの増幅を実行した。全てのｃＤＮＡ配列は、予想通りであった。
【０５２４】
図２８〜３２に例示されるように、クローンのうちの５つの安定性をさらに試験した。これらのクローンは、グルタミンを有するかまたは有さない成長培地中で成長させ、グルタミンを含まない条件と比較して、４ｍＭのグルタミンの存在下でより高い成長率を有することが示された。いずれの組でも、６０を超える集団倍加の間、成長率の変化は観察されなかった。７日間の時間経過にわたる生存細胞密度およびクローンの生存率を図３０〜３１に例示する。４ｍＭのグルタミンの存在下（＋）および非存在下（−）での、時間０、６０ＰＤの７日間の流加培養におけるクローンの体積生産性を図３２に例示する。Ｔ０およびＰＤ６０のグルタミン細胞なしによる体積生産性は、同等である。ＰＤ６０＋グルタミンの体積生産性は、同等であるか、または幾分より低いが、Ｔ０値の約７０％よりも低いことはなかった。
【０５２５】
ＥＸ−ＣＥＬＬ、ＡｃｔｉＰｒｏ、およびＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地では、細胞を１００％に適合させ、ＣＤ  ＣＨＯ、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ、ＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ、およびＳｅｌｅｃｔ  ＣＤ１０００培地に対しては、ほぼ１００％適合させた。
【０５２６】
実施例３
図３３に示されるように、ＥＬＩＳＡ後にゲル上で精製クロトータンパク質が観察された。表４９は、ＥＬＩＳＡプレートマップキー（上部の２つのセグメント）およびヒートマップ標識ＥＬＩＳＡの４５０ｎｍデータ（下部の２つのセグメント）を示す。表５０は、細胞培養上清およびヒト血清試料からのクロトータンパク質のＥＬＩＳＡデータを示す。表５１は、各試料群におけるクロトーの平均濃度を示す。
【０５２７】
表５２は、組換えクロトータンパク質注入前（上部の２つのセグメント）および後（下部の２つのセグメント）のヒト血清クロトーレベルのＥＬＩＳＡプレートマップキーを示す。表５３は、ＥＬＩＳＡによって測定された、組換えクロトータンパク質注入前（上部の２つのセグメント）および後（下部の２つのセグメント）のヒト血清試料中のクロトータンパク質レベルのヒートマップ標識ＥＬＩＳＡの４５０ｎｍデータを示す。ヒト血清試料を２倍に希釈し、クロトーＥＬＩＳＡアッセイ試料希釈緩衝液を使用して細胞培養上清を５，０００倍に希釈した。血清Ｂ１および細胞培養上清を、対照として両方のＥＬＩＳＡプレートに含めた。ＴＭＢ３０分。表５４は、示される試料中のクロトータンパク質の平均濃度の要約を示す。
【０５２８】
【表４９】
2021508037.tif 000081
【０５２９】
【表５０】
2021508037.tif 000082
【０５３０】
【表５１】
2021508037.tif 000083
【０５３１】
【表５２】
2021508037.tif 000084
【０５３２】
【表５３】
2021508037.tif 000085
【０５３３】
【表５４】
2021508037.tif 000086
【０５３４】
表５５は、複製クロトータンパク質試料の濃度およびモノクローナル性を示す。
【０５３５】
【表５５−１】
2021508037.tif 000087
【０５３６】
【表５５−２】
2021508037.tif 000088
【０５３７】
濃度を推定するための例示的な方法は、ＢＳＡ標準に対するＰＡＧＥによる定量化（数量化）に関与した。濃度を推定するための例示的な方法は、精製クロトー標準に対する測定に関与した。
【０５３８】
データの１つの解釈は、天然様組換え（ＴｗｉｎＳｔｒｅｐ−ＴＥＶタグ除去された）クロトータンパク質が、組換えＦｃタグ付きクロトータンパク質よりも、良好に発現し、清潔に精製し、かつ／または多くの活性を保持するということであり得る。これは、驚くべきかつ予想外であった。代替的な解釈は、いずれのタンパク質も、または天然様タンパク質よりもＦｃ融合タンパク質が、ネイティブ様タンパク質よりも、ＥＬＩＳＡ抗体に対するクロトータンパク質反応のレベルを示さなかったということである。したがって、我々は、天然様組換えクロトータンパク質およびＦｃ融合クロトータンパク質の発現、精製、保管、および／または投与が予想したほど単純ではないこと、ならびに標準的な技術が良好に機能しなかったことを同定した可能性がある。後の解釈に基づいて進み、手順を変更して、データをさらに解釈するための処理を続けながら、より活性なタンパク質を取得した。
【０５３９】
本開示の特定の実施形態に従って、クロトータンパク質のための３つの市販のＥＬＩＳＡ検出キットも、好適性について試験した。以下の表５７および５８を参照されたい。ＩＢＬキットは、低いバックグラウンド、血清試料の線形希釈、１：４の希釈後の許容されるスパイク回収率を示す。Ｃｌｏｕｄ−ｃｌｏｎｅキットは、高いバックグラウンドを示し、血清試料の線形希釈、許容できるスパイク回収率は示さなかった。ＥＩＡａｂキットは、低いバックグラウンド、血清試料中の非常に低いクロトー濃度を示し、血清試料の線形希釈、許容できるスパイク回収率は示さなかった。
【０５４０】
合計８つのヒト血清試料を、各キットの希釈緩衝液で１：２、１：４、１：８に希釈した。これらの８つの血清試料のうち４つに、各キットの最高濃度の標準を１：２０の希釈でスパイクした。各キットのプロトコルは、提供された指示に従った。
【０５４１】
図３４Ａ〜３４Ｃは、測定されたクロトータンパク質濃度およびそれぞれの試料中で観察されたスパイク回収率を例示する。
【０５４２】
【表５６】
2021508037.tif 000089
【０５４３】
【表５７】
2021508037.tif 000090
【０５４４】
実施例４
図３５Ａ〜３５Ｂに例示されるように、網羅的グリカン予備分析も実施した。グリカン分析の実験条件および結果を表５９に示す。
【０５４５】
【表５８】
2021508037.tif 000091
【０５４６】
以下の表６０および６１はそれぞれ、図３５Ａ〜３５Ｂに例示されるデータを示す。
【０５４７】
【表５９】
2021508037.tif 000092
【０５４８】
９つのクローンの追加のプール（以下の表６２を参照されたい）を、好適性について評価した。
【０５４９】
【表６０】
2021508037.tif 000093
【０５５０】
各細胞株の成長、生存率、および力価を以下の表６３に示す。
【０５５１】
【表６１】
2021508037.tif 000094
【０５５２】
図３６Ａ〜３６Ｃはそれぞれ、各細胞株の成長、生存率、および力価曲線を例示する。
３つのクローンの追加のプール（以下の表６４を参照されたい）を、好適性について評価した。
【０５５３】
【表６２】
2021508037.tif 000095
【０５５４】
各細胞株の成長、生存率、および産生を以下の表６５に示す。
【０５５５】
【表６３】
2021508037.tif 000096
【０５５６】
図３７Ａ〜３７Ｃはそれぞれ、各細胞株の成長、生存率、および力価曲線を例示する。
有望なクローンのうちの１つ（以下の表６６を参照されたい）を、成長、生存率、および産生について再評価した。
【０５５７】
【表６４】
2021508037.tif 000097
【０５５８】
図３８Ａ〜３８Ｃは、細胞株の成長、生存率、および力価曲線をそれぞれ例示する。
実施例５
図３９Ａ〜３９Ｂに例示されるように、発現タンパク質プールに対してウェスタンブロット分析を実施した。図３９Ａは、クロトーＥＣＤ（３４−９８１）６ｘＨｉｓタンパク質を例示し、図３９Ｂは、示されるクロトータンパク質を例示する。予想外に、クロトータンパク質はより高分子量の多量体へと凝集するようである。
【０５５９】
５Ｌのバイオリアクター発現運転を実行し、続いてアダプター精製プロトコルを実施した。第１の精製ステップでは、プロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４高速流動（０．７５ｍｌ）（０．５ｃｍ×３ｃｍ）カラムを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化した。タンパク質試料（１．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（約１ｍｌ））でｐＨ８．０に調整した１００ｍｌの細胞上清を、０．７５ｍｌ／分の流量で充填し、１０ｍＭのＴｒｉｓ／アルギニン−ＨＣｌ、ｐＨ８．０緩衝液で洗浄し、４ＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ３（すなわち、低ｐＨ、高塩）で０．５０〜０．２５ｍｌ／分で溶出して、濃縮試料を生成する。図４０Ａを参照されたい。カラムを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（塩の沈殿を防止するため）で再平衡化し、過圧を避けるために０．１ＭのＮａＯＨ：０．５〜０．３ｍｌ／ｍｌで衛生化した。最小限のクロトータンパク質が、再平衡化および衛生化中に溶出した。
【０５６０】
プロテインＡ溶出からのピーク番号１およびピーク番号２を別個に分析し、緩衝液交換し、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭのＬ−メチオニン／０．６％のチオグリコール酸ナトリウム、ｐＨ８．０、移動相（０．５ｍＬ／分の流量）を有するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（１ｃｍ×３０ｃｍ）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して分画した。図４０Ｂを参照されたい。リン酸含有緩衝液の代わりにＴｒｉｓを使用して移動相を緩衝して、マグネシウム塩の沈殿を防止した。還元剤（Ｌ−メチオニン）を使用して、クロトー−Ｆｃの酸化を防止した。チオグリコール酸ナトリウムを使用して、クロトー−Ｆｃの遊離スルフヒドリルシステイン基のスクランブルを防止した。緩衝液構成要素は、ＦＤＡによって列挙されたＧＲＡＳである。
【０５６１】
単一の分離されたピーク番号１およびピーク番号２からのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００画分は各々、異なるＭＷ種のクロトー−Ｆｃタンパク質を示す。図４１Ａおよび４１Ｂを参照されたい。要約すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる（培地中の）採取されたタンパク質の分析は、クロトー−Ｆｃが様々な凝集状態で存在することを示唆する。精製により、二量体（３００ｋＤａ以下）および四量体（６００ｋＤａ以下）に対応する多量体クロトー−Ｆｃの２つの集団が生成された。プロテインＡからの結合／溶出プロトコルは、はるかに優れた製品溶出プロファイルを示し、衛生化後に最小限のタンパク質を生成する。製剤は、還元剤としてチオグリコール酸を有するため、製品は加熱後に単量体として分離し、ゲル電気泳動での加熱なしでは単量体および二量体として分離する。これらの新たな精製手順は、非凝集Ｆｃ−クロトータンパク質をもたらした。
【０５６２】
実施例６
天然およびＦｃ−クロトータンパク質の両方の活性を試験するため、ならびに具体的にはＦｏｒｔｅＢｉｏのＢＬＩＴＺを使用して、ＦＧＦ２３に対するクロトータンパク質の結合親和性を試験するための、バイオアッセイを開発した。最初に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合法を使用して、マウスＦＧＦ−２３に対する組換えマウスクロトーの結合親和性を評価した。ＳＰＲは、移動分子である分析物と、センサーに結合した固定化分子であるリガンドとの間の分子相互作用の検出に利用される光学技術であり、相互作用時にセンサーの屈折率が変化する。この試験では、本発明者らは、マウスＦＧＦ−２３に対する６つの濃度の組換えマウスクロトー（４００μｇ／ｍＬから１２．５μｇ／ｍＬまでの２倍連続希釈）抗体の親和性を比較した。抗ＨＩＳ（ＨＩＳ２）センサーを使用して、マウスＦＧＦ−２３をセンサーに結合させ、その後これらのセンサーを後続して使用して、６つの異なる濃度のマウスクロトーの結合曲線を生成する。抗体について生成された６つの会合および解離曲線から、抗体の解離定数（Ｋｄ）値を判定する。アッセイを実施し、データを検証した（データ示さず）。
【０５６３】
ヒト組換えクロトータンパク質については、ＨＩＳタグバイオセンサーのチップをＰＢＳ中、室温で１０分間水和した。ＰＢＳ中３００μｇ／ｍｌのＨＩＳタグ標識ＦＧＦ２３（ＰｒｏＳｐｅｃ、カタログ番号ＣＹＴ−３７４）をバイオセンサーに２分間結合させた。ベースラインは、ＢＬＩＴＺ機器で３０秒間確立させた。その後、固定化ＦＧＦ２３に対する、５つの２倍連続希釈（４００μｇ／ｍｌから１２．５μｇ／ｍｌまで）の天然およびＦｃ−ｓクロトータンパク質の結合をＰＢＤ中で２分間試験し、後続してＰＢＳ中で２分間解離させた。Ｋｏｎ（会合）、Ｋｏｆｆ（解離）、およびＫＤ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を、網羅的分析を使用して分析した。図４２を参照されたい。
【０５６４】
細胞ベースの機能アッセイを使用して、クロトータンパク質の生物活性を試験するため、ならびに具体的にはＮＩＨ／３Ｔ３細胞増殖を刺激することに対するそれらの効果を測定することによって、天然およびＦｃ−クロトータンパク質の両方の生物活性を試験するために、さらなるアッセイを実施した。クロトーの生物学に基づいて、このアッセイ開発の理論的根拠は、ＦＧＦＲを発現したＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖を刺激することに対するクロトーの効果を試験することである。
【０５６５】
成長相の細胞を培養培地（１０％のＦＢＳ−ＤＭＥＭ）中に５０００個の細胞／ウェル／９６ウェルプレートの密度で播種し、一晩培養した後、培地を０．５％のＦＢＳに交換し、一晩培養した。細胞を、３０μｇ／ｍｌで開始して１０回用量のそれぞれのクロトータンパク質（２倍連続希釈、各用量３連）で処理し、４８時間インキュベートした。細胞増殖を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｕアッセイキットを使用して測定し、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで、４つのパラメーターフィット曲線を使用して分析した。データは、天然ＨｉｓおよびＦｃ−クロトーの両方の精製クロトータンパク質が、用量依存的な方法で細胞増殖を刺激したことを示す。図４３Ａ〜４３Ｅを参照されたい。
【０５６６】
実施例７
雄スプラーグドーリーラットに静脈内投与した後のアルファヒト天然クロトーおよびアルファヒトＦｃ融合クロトータンパク質の急性耐量（ＡＴＤ）を判定するための試験を行った。急性耐容用量試験では、試験物質のアルファヒト天然クロトータンパク質およびアルファヒトＦｃ融合クロトータンパク質の安全性を雄スプラーグドーリーラットで評価した。用量投与の前に、２１匹の動物にトランスポンダーを皮下移植した。試験１日目に、動物を体重に基づいて３匹ずつの７群に無作為に分けた。アルファヒト天然クロトータンパク質を、１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、および１００μｇ／ｋｇ（個々の体重に基づいて）の３つの用量濃度で試験し、試験０日目にビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中１ｍｌ／ｋｇ（個々の体重に基づいて）の投与量で静脈内投与した。
【０５６７】
アルファヒトＦｃ融合クロトータンパク質はまた、３μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、および３０μｇ／ｋｇ（個々の体重に基づいて）の３つの用量濃度で試験し、試験０日目にビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中１ｍｌ／ｋｇ（個々の体重に基づいて）の投与量で静脈内投与した。試験０日目に、ビヒクルのみ（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）群、１０μｇ／ｋｇのアルファヒト天然クロトータンパク質群、および３μｇ／ｋｇのアルファヒトＦｃ融合クロトータンパク質群で投薬を開始し、各試験物質用量レベル群間で少なくとも２４時間ずらした。全ての投薬をそれぞれの開始日に一度行った。動物を、治療後最大１４日間、あらゆる有害作用について観察した。
【０５６８】
生涯測定は、罹患率および死亡率の１日２回のチェックを含み、臨床観察を毎日記録した。体重測定を毎日記録した。観察相の完了後、全ての動物を心臓放血によって安楽死させた。最終測定には血液の血液学、血清生化学、および凝固が含まれた。肉眼での病理学的変化を剖検で全ての動物について記録し、１０個の臓器（副腎、脳、副睾丸、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、精巣、甲状腺／副甲状腺、および胸腺）の重量を採取した。
【０５６９】
表６７は、試験動物の要約を示す。
【０５７０】
【表６５】
2021508037.tif 000098
【０５７１】
表６８は、試験設計の要約を示す。
【０５７２】
【表６６】
2021508037.tif 000099
【０５７３】
群の割り当て：ＭａｔｃｈｅｄＰａｉｒＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎについては、個々の測定値を選択された全ての動物の平均と一致させるアルゴリズムを使用して最適化された分布方法を実施した。方法は、まず選択された全ての動物の平均に近い一致ペアをとり、次にそれらを選択された全ての動物の平均に（またはできるだけ近い）一致する群に分布させる。各群の測定の平均ができるだけ全ての選択された動物の平均に近くなるように動物を分布させる。
【０５７４】
統計分析のために、記述統計学は試験データから生成された。データを評価して、パラメトリック分析とノンパラメトリック分析のどちらが適切であるかを判定した。パラメトリックデータについては、分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて事後試験を実施して、治療、時点、および／または群間の有意差を判定した。ノンパラメトリックデータについては、適切な統計分析を実施した（例えば、カプラン−マイヤー生存、クラスカル−ワリスの一元ＡＮＯＶＡ、マンホイットニー、またはウィルコクソン順位和など）。
【０５７５】
表６９は、試料採取手順を要約する。
【０５７６】
【表６７】
2021508037.tif 000100
【０５７７】
表７０は、試料採取タスクを要約する。
【０５７８】
【表６８】
2021508037.tif 000101
【０５７９】
体重が初期体重の８５％を下回った、または重篤で長期にわたる有害な臨床徴候を示した動物はいずれも安楽死させた。上記のように、血漿、血清、および全血の採取のために動物を心臓出血により安楽死させた。
【０５８０】
予備結果は、ラットがそれに投与された比較的高用量の組換えクロトータンパク質に耐性を示すことを示した。
実施例８
雄スプラーグドーリーラットへのＩＶ投与後のアルファヒト天然クロトーおよびアルファヒトＦｃ融合クロトータンパク質の薬物動態を判定するための試験を行った。試験０日目の前に、動物にトランスポンダーを皮下移植した。試験１日目に体重を得て、動物を体重に基づいて無作為化した。試験０日目に、群５、６、および７の動物（１群当たり１０匹の動物）はそれぞれ、１ｍｌ／ｋｇのビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中、３、１０、および３０μｇ／ｋｇで、尾静脈を介して単回用量のアルファヒトＦｃ−融合クロトータンパク質を静脈内に受けた（以下の詳細な投薬スケジュールを参照されたい）。試験１日目に、群２、３、および４の動物（１群当たり１０匹の動物）はそれぞれ、１ｍｌ／ｋｇのビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中、１０、３０、および１００μｇ／ｋｇで、尾静脈を介して単回用量のアルファヒト天然クロトータンパク質を静脈内に受けた（以下の詳細な投薬スケジュールを参照されたい）。ビヒクル群１の動物（３匹の動物）にも、試験１日目に、タンパク質を有さないビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）を１ｍｌ／ｋｇで投薬した。各動物に投与された投薬溶液の体積を、試験−１日目に得た個々の体重測定に基づいて計算し、調整した。
【０５８１】
ラット１匹当たり３つの血液試料に相当する全ての時点について、３つの血液試料を各群（２〜７）から取得した（以下の詳細な採血スケジュールを参照されたい）。以下の表７１に示されるように、投与前、投与後３分、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、および２４時間の時点で、血液試料を取得した（群２、３、および４）。
【０５８２】
【表６９】
2021508037.tif 000102
【０５８３】
以下の表７２に示されるように、投与前、投与後３分、１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、および７日の時点で、血液試料を取得した（群５、６、および７）。投与後１４日目の追加の採血を、群５、６、および７で取得した。
【０５８４】
【表７０】
2021508037.tif 000103
【０５８５】
以下の表７３に示されるように、ビヒクル群１の動物は、投与の１時間後に、終末出血させた。
【０５８６】
【表７１】
2021508037.tif 000104
【０５８７】
得られた血清試料をアルファクロトーヒト可溶性ＥＬＩＳＡキットで分析した。
表７４は、試験動物の要約を示す。
【０５８８】
【表７２】
2021508037.tif 000105
【０５８９】
表７５は、試験設計の要約を示す。
【０５９０】
【表７３】
2021508037.tif 000106
【０５９１】
群の割り当て：階層別サンプリングについて、同様のサイズの測定値で動物の「ビン化」を使用する最適化されていない無作為化法を使用した。この方法によって、動物のプールを、目的の測定値によって昇順にそれらを分類することによって階層化する。その後、測定値のサイズに応じて、動物を「ビン」または階層に分類する。階層の数は、群ごとに割り当てられる動物の数によって決定される。例えば、１群当たり３匹の動物がいる場合、小、中、大の３つのビンが作成されると思われる。各サイズビンから１匹の動物を各群に無作為に割り当てる。階層別サンプリングは、各群が各サイズのビンから無作為に１匹の動物を受け取ることを確実にし、各群の平均は他の群と同様のままになるだろう。この方法は、群平均と標準偏差との差のバランスを取り、プール注文の偏りを制御する。
【０５９２】
統計分析のために、記述統計学を試験データから生成した。データを評価して、パラメトリック分析とノンパラメトリック分析のどちらが適切であるかを判定した。パラメトリックデータについては、分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて事後試験を実施して、治療、時点、および／または群間の有意差を判定した。ノンパラメトリックデータについては、適切な統計分析を実施した（例えば、カプラン−マイヤー生存、クラスカル−ワリスの一元ＡＮＯＶＡ、マンホイットニー、またはウィルコクソン順位和など）。
【０５９３】
表７６は、試料採取手順を要約する。
【０５９４】
【表７４】
2021508037.tif 000107
【０５９５】
表７７は、試料採取タスクを要約する。
【０５９６】
【表７５】
2021508037.tif 000108
【０５９７】
体重が初期体重の８５％を下回った、または重篤で長期にわたる有害な臨床徴候を示した動物はいずれも安楽死させた（データ示さず）。上記のように、血漿、血清、および全血の採取のために動物を心臓出血により安楽死させた。
【０５９８】
実施例９
ウィスターラットにおけるＩ／Ｒ誘発性ＡＫＩおよび腎臓バイオマーカー（血漿腎傷害バイオマーカーでの腎臓Ｉ／Ｒ誘発性増加を測定することによる）における、アルファヒトＦｃ−クロトーおよびアルファヒト天然クロトーの用量依存的効果を判定するための試験を実施した。具体的には、この試験の目的は、ラットにおける血漿腎傷害バイオマーカーの腎臓Ｉ／Ｒ誘発性増加に対するアルファヒトＦｃ−クロトーおよびアルファヒト天然クロトーの用量依存的効果を評価することであった。この試験は、両側性腎虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害（３０分の虚血期間）手術（ｎ＝６３）対偽手術（ｎ＝４）、化合物投薬（１回の静脈内注射／ラット）、代謝ケージ飼育場を介した連続採尿（３回の採取／ラット、１日目、２日目、および７日目）、クレアチニンおよびタンパク質の連続尿検体の臨床化学分析（１日目、２日目、および７日目）、連続採血（３回の採血／ラット、１日目、２日目、および７日目）、クレアチニンおよびＢＵＮの連続血漿検体の臨床化学分析（１日目、２日目、および７日目）、手術後からエンドポイントまでの毎日の体重および健康状態の観察、ならびにエンドポイントでの組織採取および処理からの、またはそれに関連するデータを提供するよう設計し、データは、表およびグラフ形式で示した。
【０５９９】
加えて、種特異的ＥＬＩＳＡを介したＫｉｍ−１の連続尿検体の分析（１日目、２日目、および７日目）、種特異的ＥＬＩＳＡを介したＮＧＡＬの連続尿検体の分析（１日目、２日目、および７日目）、左および／または右の腎臓のｍＲＮＡ発現分析（１〜２個の腎臓／動物：ｎ＝６７個の試料、１０個の分析物、３つの正規化遺伝子を含む；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  Ｐｌｅｘ２．０プラットフォームを用いて実施した）、ＭＣＰ−１、ＴＧＦ−β、α−ＳＭＡ、Ｃｏｌ１Ａ１、Ｃｏｌ３Ａ１、Ｆｎ−１、ＣＴＧＦ）、ならびに特異的染色およびＥＤ−１＋マクロファージ染色を介したマクロファージ浸潤の左および／または右の腎皮質の免疫組織化学および定量化も任意で実施した。
【０６００】
表７８は、その試験パラメータを示す。
【０６０１】
【表７６】
2021508037.tif 000109
【０６０２】
表７９は、試験設計の要約を示す。
【０６０３】
【表７７】
2021508037.tif 000110
【０６０４】
体重およそ１５１〜１７５ｇの６７匹の雄ウィスターラットを得、標準固形飼料（Ｈａｒｌａｎ８６４０）を与え、標準条件下で集団飼育し、試験に登録する前に少なくとも７日間順応させた。試験開始前に、試験ラットを体重が一致した治療群に入れた。動物を、手術日ごとに１群当たりほぼ同数の動物が登録され、動物の年齢の差を最小限にするために最も重い動物が最初に登録されるように、バランスの取れた設計を使用して試験に登録した。代謝ケージ飼育場にいないときは、ラットを標準条件下で静的ケージ飼育に集団収容した。
【０６０５】
ｔ−０．５時間で、試験ラットを、手術用に調製したノセコン上のイソフルラン麻酔で麻酔し、腎臓Ｉ／Ｒ術式の前に中核温度を平衡にさせた。体液量の変動を最小限に抑えるために、ラットに１０ｍｌ／ｋｇの温かい滅菌生理食塩水（皮下投与；手術前２５％および手術後７５％）を投与した。中核温度を、虚血期間を通して規範的（３７±０．２℃）に維持した。ｔ−０．５時間で、群７および８の動物もまた、必要に応じて化合物の静脈内注射を受けた。
【０６０６】
その後、開腹術を実施した。ｔ０で、ラットを、熱滅菌した機器、血管閉塞クランプ、および無菌外科的技術を使用して、偽（群１、ｎ＝４）または両側性腎動脈虚血（群２〜８、ｎ＝９／群）のいずれかに供した。３０分の連続虚血時間（ｔ＋０．５）に続いて、閉塞クランプを取り除き、腎臓を再灌流し、腹部創傷を滅菌絹縫合糸で閉じた。ラットに手術後鎮痛剤として０．０１ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを投与し、清潔な加熱ケージ内で短時間回復させた。ｔ＋１時間で、群１〜６の動物は、短時間拘束され、必要に応じてビヒクルまたはビヒクル中のクロトー化合物の静脈内注射を受けた。群７および８のラットもまた、ストレス対応を制御するために短時間拘束した（が、注射はしなかった）。その後、ラットを直ちに代謝ケージに入れた。
【０６０７】
再灌流（Ｄ１）の２４時間後、全ての動物の尿量を判定し、サンプリングした。その後、全ての動物を直接尾静脈穿刺によってＬｉ−ヘパリンに採血（５００μｌ）した。出血直後に、ラットに５００μｌの温かい生理食塩水を与えた。Ｄ２（再灌流後４８時間）およびＤ７（再灌流後１６８時間）に尿および採血を再度繰り返した。Ｄ２〜Ｄ５において、全てのラットを標準条件下で静的ケージに収容して秤量し、毎日健康観察を行った。全血（５００μｌ）を血漿の産生のために適切に処理し、記載のように処理した。
【０６０８】
投薬開始後、臨床観察を１日１回行った。採取／計算されるデータ／組織に関して、動物の健康状態を外科的手順後に毎日観察し、腎臓質量（左右の腎臓の重量）を脛骨の長さおよび体重に対して指数化した。尿を１日目、２日目、および７日目に採取した（ｎ＝３試料／動物、５００μｌ／試料を標的とする）。少なくとも１つの試料を臨床化学分析（クレアチニン、タンパク質）に供し、少なくとも１つの試料を任意でＫｉｍ−１およびＮＧＡＬ分析に使用した。血漿を１日目、２日目、および７日目にＬｉ−ヘパリンに採取した（ｎ＝２試料／動物、１２５μｌ／試料を標的とする）。少なくとも１つの試料を臨床化学分析（クレアチニン、ＢＵＮ）に供した。
【０６０９】
Ｄ７日目に、出血直後にラットをイソフルランで麻酔し、組織を採取した。左右両方の腎臓を直ちに０．９％の氷冷ＮａＣｌに入れ、脱被包し、秤量した。組織採取後（組織学的分析および他の分析用）、各偽および虚血性腎臓（各動物からの左右の腎臓、１チューブ／腎臓／動物）からの残りの全ての内側皮質／外側髄質（すなわち、Ｓ３／ＴＨＡＬ濃縮された）を適切に標識したチューブ内で急速凍結し、将来の潜在的な生化学的分析のために−８０℃で保管した。分析を実施する前に、皮質組織を任意に極低温粉末化し、混合して、生化学的アッセイにわたって組織試料のより良好な均一性を可能にし、ならびに皮質生検で起こり得るサンプリングバイアスの導入を制限した。各偽および虚血性腎臓（各動物から左右）の少なくとも１つの中央横断面切片を任意で採取し、組織学的分析のために１０％の中性緩衝ホルマリン中に浸漬固定した。その後、ラットを屠殺した。
【０６１０】
実施例１０
試験ラットの体重を測定して、対象に対するクロトータンパク質投与の効果を試験した。表８０は、試験動物の要約を示す。
【０６１１】
【表７８】
2021508037.tif 000111
【０６１２】
図４４は、１２日間の試験（毎日）の経過にわたる各群のラットの平均（平均）体重（平均の±標準誤差、ＳＥＭバー）をグラフで例示する。以下の表８１は、図４４に例示される平均体重の対応するデータを示し、以下の表８２は、図４４に例示される対応するＳＥＭを示し、以下の表８３は、１２日間の試験（毎日）の経過にわたる各群のラットの平均体重の変化パーセントを示す。
【０６１３】
実施例１１
腎虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）後の急性腎傷害（ＡＫＩ）に対するクロトー投与の治療効果を試験するために、スプラーグドーリーラットを偽群またはＡＫＩ群に無作為に分け、各群の動物を無作為にビヒクルまたはクロトー治療に割り当てた。ヒトにおいて、ＡＫＩは、虚血または腎毒素から主に生じる恐るべき臨床上の問題であり、その転帰は、完全回復から透析依存性の慢性腎疾患の発症、または死亡にまで及ぶ。クロトー群の動物は、再灌流の３０または６０分後に、組換えマウスクロトータンパク質（０．０１ｍｇ／ｋｇ体重）のボーラス腹腔内注射を１回受け、ビヒクル群のラットは、同体積のクロトー緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を受けた。手術後１、２、および７日目に２４時間尿および血液を採取した。この試験は、傷害後３０分のマウスＳ−クロトーの単回ボーラス注射が、ヒト病態の動物モデルにおける（ＡＫＩの）減弱に有効であることを示した。
【０６１４】
実施例１２
クロトーが酸化的傷害に対して肺を保護するかどうかを判定するために、スプラーグドーリーラット（体重約３００ｇ）を、正常酸素（Ｎ：２１％の吸気Ｏ）または高酸素（Ｈ：９０％のＯ）に３日間曝露し、その間、３つの調製物、すなわち、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、またはクロトー（クロトーＣＭ、約６０ｐｍｏｌ）もしくは空ベクター（対照ＣＭ）（各々ｎ＝６〜８匹の動物）を過剰発現するＣＨＯ細胞由来の条件培地（ＣＭ）のうちの１つの腹腔内注射を受けた。注射は１２時間前に行い、曝露中２４時間および４８時間に繰り返した。
【０６１５】
また、３ＬＬ細胞を、無胸腺マウスの脇腹に皮下注射（マウス当たり２×１０６細胞）で移植し、クロトータンパク質（０．０１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）またはビヒクルで１日おきに１０日間治療した。移植の２１日後に肺を採取し、転移性結節の数を数えた。
【０６１６】
【表７９】
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【０６１７】
結論
既存のクロトータンパク質測定は、自宅での採取および／または定量的診断には法外に高価であり、かつ／または技術的に困難であり得る。本開示の実施形態は、対象における、クロトータンパク質レベル（複数可）、具体的には内因性および／もしくは外因性可溶性アルファクロトータンパク質レベル（複数可）、およびより具体的には可溶性アルファクロトータンパク質レベルを監視、検出、および／もしくは定量化するため、クロトータンパク質欠損を診断するため、かつ／またはクロトータンパク質レベル（複数可）、発現、もしくは産生を増加させるための方法、ならびにクロトータンパク質欠損を治療するための診断キットおよび組成物を含む、それらの実施に有用な製品を提供する。
【０６１８】
加えて、遺伝子療法は、動物モデルまたは試験において特定のタンパク質レベルを増加させるのに有効であり得るが、特にヒトの治療のための遺伝子療法の安全性は、依然として疑わしい。動物（細胞）へのクロトー遺伝子のウイルス送達と比較して、ヒトにおける外因性および／または組換えクロタンパク質の投与は、（内分泌）クロトーレベルを回復するための、より安全、より容易、かつより直接的な様式であり得る。前臨床データは、年齢に関係する障害およびクロトー欠損に関連する疾患に対する、可溶性クロトータンパク質の治療の潜在性を支持している。疫学的データは、可溶性クロトーが若年成人よりも高齢者で低く、可溶性クロトーのレベルが年齢と逆相関することを示しており、これは、加齢が可溶性クロトーの低下と関連し得ることを示す。しかしながら、一般に、ヒトへの外因性および／または組換えタンパク質の産生および投与は、政府および他の機関により厳密に規制されている。規制準拠に関連する時間および費用のため、そのような治療の費用は、開発者、製造業者、および患者にとって同様に法外に高くなり得る。しかしながら、本開示の組成物および方法は、他の解決策に関連する欠点のうちの１つ以上もなく、ヒトおよび非ヒト動物における内因性クロトータンパク質レベルを増加させるための実行可能かつ有効な選択肢を提供し得る。具体的には、本開示のいくつかの実施形態は、（医薬品適正製造基準（ｃＧＭＰ）グレードの）ヒト組換え可溶性アルファ−クロトータンパク質、タンパク質断片、および／またはタンパク質多様体などの組換えヒトクロトータンパク質を、製造および／または使用する製品、組成物、および／または方法を含む。加えて、本開示のいくつかの実施形態は、患者または対象における（内因性および／または血清可溶性）クロトータンパク質レベル（複数可）、発現、または産生を（自然に）増加させるための（栄養補助または健康補充）製品、組成物、および／または方法を含む。
【０６１９】
当業者は、組換え治療用クロトータンパク質および製品、組成物、ならびにそれらに関連する方法に関して本明細書に概説される治療効果、適応症、および／または治療の各々が、内因性クロトータンパク質産生および／またはレベル（複数可）を（自然に）増加、増強、増大、および／または支持することによって達成され得ることを理解するであろう。当業者はまた、内因性クロトータンパク質産生および／またはレベル（複数可）を（自然に）増加、増強、増大、および／または支持することに関して本明細書に概説される治療効果、適応症、および／または治療の各々が、組換え治療用クロトータンパク質および製品、組成物を投与することによって、ならびにそれらに関連する方法を通して達成され得ることを理解するであろう。したがって、簡潔にするために、本開示は、（ｉ）組換え治療用クロトータンパク質の投与、および（ｉｉ）本開示の健康補充剤または栄養補助組成物の投与の両方に関して、開示される治療効果、適応症、および／または治療の各々を詳しく述べる必要はなく、そのようなものは、本明細書に明確に企図されている。
【０６２０】
前述の詳細な説明は、特定の例示的な実施形態を参照しているが、本開示は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、記載の実施形態は、全ての点において、例示に過ぎず、限定的なものではないと見なされるべきである。例えば、関連する当業者および本開示の所有者に考えられ得る、本明細書に記載および／または例示の本発明の特性の様々な置換、改変、および／または修正、ならびに本明細書に記載および／または例示の原理の追加の適用は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、記載および／または例示の実施形態になされ得る。そのような置換、改変、および／または修正は、本開示の範囲内であると見なされるものである。
【０６２１】
したがって、本発明の範囲は、前述の説明によってではなく、むしろ添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲に列挙される制限は、特許請求の範囲で採用される言語に基づいて広く解釈されるものであり、前述の詳細な説明に記載の特定の実施例に限定されず、これらの実施例は、非排他的かつ非限定的であると解釈されるものである。特許請求に相当する範囲および意味に入る全ての変更は、その範囲内に含まれるものである。
【０６２２】
特定の実施形態の様々な特性はまた、本開示の他の実施形態と互換性があり、それらに組み合わされ、含まれ、および／または組み込まれ得ることも理解されるであろう。例えば、本開示の特定の実施形態に従ったシステム、方法、および／または製品は、本明細書に開示および／または記載の他の実施形態に記載の特性を含み得るか、組み込み得るか、または他の方法で含み得る。したがって、本開示の特定の実施形態に関連する特定の特性の開示は、該特性の特定の実施形態への適用または包含を制限するものとして解釈されるべきではない。
【０６２３】
加えて、ある特性が特定の実施形態で要求されていると記載されていない限り、様々な実施形態に記載の特性は任意であり、本開示の他の実施形態には含まれない場合がある。さらに、特性がそれと組み合わせて別の特性を要求するものとして記載されていない限り、本明細書の任意の特性は、本明細書に開示の同じかまたは異なる実施形態の任意の他の特性と組み合わされ得る。特定の実施形態では、特性は任意であり得るが、そのような実施形態に特性が含まれるとき、それらは本開示で記載の特定の構成を有することが必要とされ得ることが理解されるであろう。
【０６２４】
同様に、本明細書に記載の、かつ／または特許請求の範囲に列挙される任意の方法またはプロセスに列挙されるいかなるステップも、任意の好適な順序で実行され得、別段（明示的または黙示的に）記載されない限り、記載および／または列挙される順序に必ずしも限定されない。しかしながら、そのようなステップはまた、本開示のある特定の実施形態では、特定の順序または任意の好適な順序で実施されることも要求され得る。
【０６２５】
さらに、例示的なシステム、方法、製品などの様々な周知の態様は、例示的な実施形態の態様を不明瞭にすることを避けるために、本明細書では詳細には記載されない。しかしながら、そのような態様もまた、本明細書において企図される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ−１】
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【図４０Ａ−２】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４３Ｅ】
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【図４４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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