(57)【要約】本明細書には、正しく組み立てられた完全長二重特異性抗体の生成を促進する非対称な撹乱変異によって半分では不安定化されている2つの2/3-IgG間の半抗体交換反応による、多重特異性抗体の生成方法が掲載されている。本方法は、還元剤の非存在下で行うことができ、出発2/3-IgG中にヒンジ領域ジスルフィド結合を必要としない。2021500348.tif 000072
2021500348.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
・（a-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
第1多量体
と、
（b-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（b-2）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-3）第1ポリペプチドが変異ホール-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-4）第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）、（a-4）および（b-3）における変異とは異なる変異であって、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
【請求項２】
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がE357Kであり、第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-4）における変異がK370Eであり、第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-4）における変異がK439Eであり、第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含み、第4ポリペプチドおよび/または第3ポリペプチドがアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
・（a-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
（a-5）第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
第1多量体
と、
（b-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（b-2）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-3）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-4）第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）、（a-4）および（b-3）における変異とは異なる変異であって、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
（b-5）第4ポリペプチドおよび/または第3ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
【請求項６】
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がE357Kであり、第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-4）における変異がK370Eであり、第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-4）における変異がK439Eであり、第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項5記載の方法。
【請求項８】
第1ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第2ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
第4ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第3ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、
請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・（a-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含む、
第1多量体
と、
（b-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（b-2）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-3）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-4）第3ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
【請求項１０】
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・（a-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含む、
第1多量体
と、
（b-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（b-2）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-3）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-4）第3ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
【請求項１１】
第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーが、第1多量体および/または第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーよりも低い、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとが、（単離可能な）二量体を形成し、第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとが、（単離可能な）二量体を形成する、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
第1ポリペプチドおよび/もしくは第2ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP（SEQ ID NO:31）の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）を含み、かつ/または
第1ポリペプチドおよび/もしくは第2ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列：
2021500348.tif 000068
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP（SEQ ID NO:31）の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列：
2021500348.tif 000069
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
請求項4〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
第1ポリペプチドが変異ノブを含み、第2ポリペプチドが変異ホールを含み、第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドが変異ホールを含む、請求項5〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、第2ポリペプチドが変異ホールを含み、第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含む、請求項5〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、IgG1 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、
（i）互いに独立して、
アミノ酸配列：
2021500348.tif 000070
またはアミノ酸配列：
2021500348.tif 000071
またはアミノ酸配列：
DKTHT（SEQ ID NO:91）
のうちのいずれか、
（ii）IgG1 CH2ドメイン、および
（iii）IgG1 CH3ドメイン
を含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
（i）第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドがそれぞれ、IgG1 CH1ドメインおよび可変ドメインをさらに含むか、または
（ii）第1ポリペプチドもしくは第4ポリペプチドがIgG1 CH1ドメインを含み、他方のポリペプチドが軽鎖定常ドメインを含み、各ポリペプチドが可変ドメインをさらに含む、
請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
第1ポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、かつ第4ポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであるか、またはその逆であり、これらのドメインがポリペプチド中で結合部位を形成する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（v）scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（x）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（xi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（xii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（xiii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xvi）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群から、互いに独立して選択される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
第1多量体および第2多量体が、それぞれ第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
第1多量体が、以下：
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異（perturbing mutation）D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第5ポリペプチド、
ここで、第3ポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されているもの
と、を含み、かつ
第2多量体が、以下：
第3ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第2撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第5ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異が、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、ポリペプチド
と、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体を形成する、ポリペプチドと、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、第6ポリペプチド
と、を含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
インキュベーション工程が還元剤の存在下または非存在下にある、請求項1〜3および請求項9〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
インキュベーション工程が還元剤の非存在下にある、請求項4〜8および請求項13〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
（i）第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチドが（C末端）タグをさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
（i）タグがアミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）またはHHHHHHHH（SEQ ID NO:68）を有し、回収する工程が金属（ニッケル）キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによるか、または
（ii）タグがアミノ酸配列EPEA（SEQ ID NO:87）を有し、回収する工程がC-タグアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる、
請求項25記載の方法。
【請求項２７】
多重特異性ポリペプチドを同定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
（a）第1標的に特異的に結合する第1の多数の多量体から選択される第1多量体と、（第1標的とは異なる）第2標的に特異的に結合する第2の多数の多量体から選択される第2多量体との各組合せを、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法に供することによって、多数の多重特異性ポリペプチドを生産する工程；
（b）工程（a）において生産された多数の多重特異性ポリペプチドの各メンバーについて、結合アッセイにおいて、前記2種の標的に対する同時結合を、個別に測定する工程；および
（c）多数の多量体ポリペプチドから、結合アッセイの結果に基づいて多量体ポリペプチドを選択する工程であって、それによって多重特異性ポリペプチドを同定する、工程。
【請求項２８】
結合アッセイがELISAまたはSPR法である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
（a）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-2）第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（a-3）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（a-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド；または
（b）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（b-1）（i）第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含むか、または
（ii）第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、
（b-2）第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（b-3）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（b-1）における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（b-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
変異ノブを含む、多量体ポリペプチド。
【請求項３０】
撹乱変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項29記載の多量体ポリペプチド。
【請求項３１】
第1撹乱変異がD356Kであり、かつ第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項29記載の多量体ポリペプチド。
【請求項３２】
（a-1）（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
単離された多量体ポリペプチド。
【請求項３３】
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-4）における変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項32記載の単離された多量体ポリペプチド。
【請求項３４】
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-4）における変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項32記載の単離された多量体ポリペプチド。
【請求項３５】
第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドがアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、請求項32〜34のいずれか一項記載の単離された多量体ポリペプチド。
【請求項３６】
（a-1）（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
（a-5）第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
単離された多量体ポリペプチド。
【請求項３７】
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-4）における変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項36記載の単離された多量体ポリペプチド。
【請求項３８】
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がD356Kであり、かつ第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-4）における変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項36記載の単離された多量体ポリペプチド。
【請求項３９】
第1ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第2ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、請求項32〜36のいずれか一項記載の単離された多量体ポリペプチド。
【請求項４０】
（a-1）（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
単離された多量体ポリペプチド。
【請求項４１】
（a-1）（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
単離された多量体ポリペプチド。
【請求項４２】
第1ポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（v）scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（x）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（xi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（xii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（xiii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xvi）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択される、請求項29〜42のいずれか一項記載の単離された多量体ポリペプチド。
【請求項４３】
第1ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、請求項29〜42のいずれか一項記載の単離された多量体ポリペプチド。
【請求項４４】
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドと；
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、ポリペプチドと；
第3ポリペプチドとして、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチドであって、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチドと
を含む、請求項43記載の単離された多量体ポリペプチド。
【請求項４５】
第2ポリペプチドが（C末端）タグをさらに含む、請求項29〜44のいずれか一項記載の単離された多量体ポリペプチド。
【請求項４６】
（i）タグが、アミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）またはHHHHHHHH（SEQ ID NO:68）を有するか、または
（ii）タグが、アミノ酸配列EPEA（SEQ ID NO:87）を有する、
請求項45記載の単離された多量体ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、新規な半抗体交換法を用いる、容易でスケーラブルな、二重特異性抗体および多重特異性抗体の生成方法が掲載される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
単一特異性抗体誘導体を、組み立てられた二重特異性抗体へと生化学的に変換するための、現行最先端の方法では、（i）半抗体相補反応および（ii）IgG-IgG交換反応が利用される。
【０００３】
これらの技術は、例えばWO 2015/046467、Rispens et al.,J.Biol.Chem.289（2014）6098-6109、US 9,409,989、WO 2013/060867、WO 2011/131746、WO 2011/133886、WO 2011/143545、WO 2010/151792、Gunasekaran et al.,J.Biol.Chem.285（2010）19637-19646、WO 2009/041613、WO 2009/089004、WO 2008/119353、WO 2007/114325、US 8,765,412、US 8,642,745、WO 2006/047340、WO 2006/106905、WO 2005/042582、WO 2005/062916、WO 2005/000898、US 7,183,076、US 7,951,917、Segal,D.M.,et al.,Curr.Opin.Immunol.11（1999）558-562、WO 98/50431、WO 98/04592、Merchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16（1998）677-681、WO 96/27011、Carter,P.,et al.,Immunotechnol.2（1996）73、WO 93/11162およびKostelny,S.A.,et al.,J.Immunol.148（1992）1547-1553に開示されている。
【０００４】
単一特異性の抗体または抗体誘導体をbsAbに変換するための最先端の方法には、例えば、組立て後のbsAb調製物のためのプロセスおよび組立て後のbsAb調製物の組成に関する制約などといった短所がある。
【０００５】
例えば半抗体技術では、単一特異性一価抗体サイドを二価IgGに組み立てる。入力分子の発現および交換反応は、それだけで、半抗体だけでなく、IgG様二価（単一特異性）抗体誘導体も生成する。入力材料および組立て反応の出力物には凝集物も存在する。両者（二価単一特異性抗体と凝集物）を、組み立てられたbsAbから入念な精製アプローチによって定量的に除去する必要があるか、または（定量的除去をハイスループットに達成することは困難であるから）それらがbsAb調製物をある程度は「汚染」することになる。
【０００６】
Fabアーム交換技術では、例えば、単一特異性二価IgG誘導体から二重特異性二価IgGを組み立てる。したがって、交換反応への入力は二価であり、すなわちアビディティはデフォルトで有効になっている。アビディティスクリーンまたはアゴニスト抗体スクリーンに供される残存二価単一特異性入力材料が交換反応中に全くないことを保証するには、あらゆる残存二価入力物の、そして交換反応中に形成されうるあらゆる凝集物の、完全な除去を保証する必要があるだろう。入力物とbsAbとは類似性が高いので、定量的除去のための入念な手順が必要になるか（これをハイスループットで達成することは極めて難しい）、または残存二価入力物および凝集物が最終bsAb調製物をある程度は汚染することになる。
【０００７】
Labrijn,A.F.らは、制御されたFabアーム交換による安定な二重特異性IgG1の効率のよい生成を開示した（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110（2013）5145-5150）。
【０００８】
WO 2014/081955はヘテロ二量体抗体および使用方法を開示している。
【０００９】
WO 2009/089004は、静電ステアリング効果（electrostatic steering effect）を使って抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための方法を開示した。そこには、ドメイン-ドメイン相互作用に関与する4つのユニークな荷電残基ペア（Asp356---Lys439'、Glu357--Lys370'、Lys392---Asp399'、Asp399---Lys409'）のうち、Lys409---Asp399'だけが、どちらの残基も構造的に保存されかつ埋没していたことから、工学的操作に適していることが開示されている。他の3つのペアの場合は、パートナーの少なくとも一方が溶媒露出している（％ASA＞10）。
【００１０】
WO 2018/155611は、液体に混ぜた場合に、ホモ二量体よりも容易にヘテロ二量体を形成する、共有結合によって結合しない第1抗原結合分子と第2抗原結合分子との組合せを開示した。そこには一態様として、より好ましくは、EUナンバリングシステムで226番目および229番目の一方または両方のシステイン残基における他のアミノ酸による置換が、第1CH3および第2CH3の一方または両方の、EUナンバリングシステムで357番目または397番目の少なくとも一方における他のアミノ酸による置換と組み合わされることが開示されている。
【発明の概要】
【００１１】
本明細書には、半抗体交換反応による多重特異性抗体の生成方法が掲載される。出発材料としては、重鎖-重鎖相互作用が非対称な撹乱変異（perturbing mutation）によって、好ましくはFc領域断片における非対称な撹乱変異によって、不安定化されている非完全抗体、例えば抗体軽鎖、抗体重鎖および抗体重鎖Fc領域断片を含む2/3-IgGが有利であることが見いだされた。この撹乱変異は、出発非完全抗体の解離および正しく組み立てられた（例えば完全長）二重特異性抗体の生成を促進することが見いだされた。
【００１２】
本発明の方法は還元剤の存在下でも還元剤の非存在下でも行うことができる。後者の場合、出発抗体、例えば2/3-IgGまたは完全抗体などには、重鎖-重鎖ジスルフィド結合、例えばヒンジ領域ジスルフィド結合などは必要ではなく、それゆえに存在しない。したがって、本発明の鎖交換反応および鎖交換法では、初期還元を伴わない二重特異性抗体のインビトロ組立ても可能である。それゆえに、出発分子（2/3-IgG）の重鎖間の分子内ジスルフィド結合は、例えば変異導入PCR（mutagenesis PCR）によって、除去することができる。2/3-IgGの精製はプロテインL/SEC法で行うことができ、それをこれらの分子にとっての標準的精製戦略と規定することができる。重鎖の分子間ジスルフィド結合をすべて欠くにもかかわらず、安定な、すなわち単離可能な、2/3-IgGの正しい形成が起こる。したがって、これらの出発分子を使って、無還元（reduction-free）鎖交換反応による二重特異性抗体のインビトロ生成を実現することが可能であった。鎖交換反応後は、形成された二重特異性抗体の精製を、例えばヒスチジンタグを使用するのであれば、ニッケル吸収クロマトグラフィーによって実現することができる。この無還元鎖交換反応を使って、精製二重特異性抗体を、還元的鎖交換反応に依拠する最先端の手順と比較して、より高いタンパク質収率で形成させることができた。全体として、本発明の無還元鎖交換法は、純粋で機能的な二重特異性抗体の、より効率的な生産を可能にする。
【００１３】
概して、本明細書には、以下の工程を含む、（多重特異性）結合物質/多量体ポリペプチドの生産方法が掲載される：
・どちらもヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメインを含む第1（単量体）ポリペプチドと第2（単量体）ポリペプチドとを含む第1結合物質（これは単一特異性または二重特異性かつヘテロマー型である）/多量体ポリペプチドであって、
第1ポリペプチドのCH3ドメインはその野生型配列に対して1つまたは複数の変異を含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインはその野生型配列に対して1つまたは複数の変異を含み、ここで、第1CH3ドメインおよび第2CH3ドメイン中の前記2つ以上の変異は、ヘテロ二量体の形成をもたらし、
第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、ヘテロ二量体化に必要な変異とは異なる（そしてE345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される）少なくとも1つの/第1の撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは互いに共有結合的または非共有結合的に会合する/共有結合的または非共有結合的二量体を形成する/互いに共有結合的または非共有結合的に会合している/共有結合的または非共有結合的二量体である（ここで、第2ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチドと第1ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに不安定化相互作用をもたらす）、
第1結合物質/多量体ポリペプチドと、
どちらもヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメインを含む第3（単量体）ポリペプチドと第4（単量体）ポリペプチドとを含む第2結合物質（これは単一特異性または二重特異性かつヘテロマー型である）/多量体ポリペプチドであって、
第3ポリペプチドのCH3ドメインはその野生型配列に対して1つまたは複数の変異を含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインはその野生型配列に対して1つまたは複数の変異を含み、ここで、第1CH3ドメインおよび第2CH3ドメイン中の前記2つ以上の変異はヘテロ二量体の形成をもたらし、
第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、ヘテロ二量体化に必要な変異とは異なる（そしてE345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される）少なくとも1つの/第2の撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第3ポリペプチド中の変異は第2ポリペプチド中の変異とは異なる位置にあり、
第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは互いに共有結合的または非共有結合的に会合し/共有結合的または非共有結合的二量体を形成し/互いに共有結合的または非共有結合的に会合しており/共有結合的または非共有結合的二量体であり（ここで、第3ポリペプチド中の撹乱変異は、第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに不安定化相互作用をもたらす）、
第2ポリペプチド中の（第1）撹乱変異と第3ポリペプチド中の（第2）撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす、
第2結合物質/多量体ポリペプチドと
をインキュベートする工程、および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む結合物質を回収する工程であって、それによって、（多重特異性）結合物質を生産する、工程。
【００１４】
本明細書には、以下の工程を含む、（多重特異性）結合物質/多量体ポリペプチドの生産方法が掲載される：
・どちらもヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメインを含む第1（単量体）ポリペプチドと第2（単量体）ポリペプチドとを含む第1結合物質（これは単一特異性または二重特異性かつヘテロマー型である）/多量体ポリペプチドであって、
（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブ（knob）を含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホール（hole）を含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される）少なくとも1つの/第1の撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは互いに共有結合的または非共有結合的に会合する/共有結合的または非共有結合的二量体を形成する/互いに共有結合的または非共有結合的に会合している/共有結合的または非共有結合的二量体である（ここで、第2ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチドと第1ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに不安定化相互作用をもたらす）、
第1結合物質/多量体ポリペプチドと、
どちらもヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメインを含む第3（単量体）ポリペプチドと第4（単量体）ポリペプチドとを含む第2結合物質（これは単一特異性または二重特異性かつヘテロマー型である）/多量体ポリペプチドであって、
（i）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、（i）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または（ii）第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される）少なくとも1つの/第2の撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第3ポリペプチド中の変異は第2ポリペプチド中の変異とは異なる位置にあり、
第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは互いに共有結合的または非共有結合的に会合し/共有結合的または非共有結合的二量体を形成し/互いに共有結合的または非共有結合的に会合しており/共有結合的または非共有結合的二量体であり（ここで、第3ポリペプチド中の撹乱変異は、第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに不安定化相互作用をもたらす）、
第2ポリペプチド中の（第1）撹乱変異と第3ポリペプチド中の（第2）撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす
第2結合物質/多量体ポリペプチドと
をインキュベートする工程、および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む結合物質を回収する工程であって、それによって、（多重特異性）結合物質を生産する、工程。
【００１５】
本発明の一方法は、以下の工程を含む、多量体ポリペプチドの生産方法である：
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1多量体出発ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（b-1）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（c-1）第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なる第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第1撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（d-1）第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドは二量体である、
第1多量体出発ポリペプチドと、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2多量体出発ポリペプチドであって、
（a-2）（i）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、（i）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または（ii）第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
（b-2）第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（c-2）第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（a-2）における変異とは異なる第2撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第2撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（d-2）第2撹乱変異は第1撹乱変異とは異なる位置にあり、
（e-2）第3ポリペプチドおよび第4ポリペプチドは二量体であり、
（f-2）第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす、
第2多量体出発ポリペプチドと
をインキュベートする工程、および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドを回収する工程であって、それによって多量体ポリペプチドを生産する、工程。
【００１６】
一態様において、第1〜第4ポリペプチドはそれぞれ、N末端からC末端に向かって、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン（変異体ヒトIgG1 CH2ドメイン）およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン（変異体ヒトIgG1 CH3ドメイン）を含む。
【００１７】
一態様において、第1〜第4ポリペプチドはそれぞれ、N末端からC末端に向かって、（i）互いに独立して、アミノ酸配列
2021500348.tif 000003
またはアミノ酸配列
2021500348.tif 000004
のどちらか1つ、（ii）ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、および（iii）ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメインを含む。
【００１８】
一態様において、（i）第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドはそれぞれ、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン（（変異体）ヒトIgG1 CH1ドメイン）および（互いに独立して）（重鎖または軽鎖）可変ドメインをさらに含むか、または（ii）第1ポリペプチドもしくは第4ポリペプチドはヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン（（変異体）ヒトIgG1 CH1ドメイン）を含み、かつそれぞれ他方のポリペプチドは軽鎖定常ドメイン由来のドメイン（（変異体）ヒトカッパまたはラムダCLドメイン）を含み、各ポリペプチドは可変ドメインをさらに含む。一態様において、第1ポリペプチドの可変ドメインと第4ポリペプチドの可変ドメインは（異なる）重鎖可変ドメインである。一態様において、第1ポリペプチドの可変ドメインは重鎖可変ドメインであり、かつ第4ポリペプチドの可変ドメインは軽鎖可変ドメインであるか、またはその逆である。
【００１９】
一態様において、第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって同じまたは異なる配列を有することができ、第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとが異なる場合、それらは互いに独立して、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（v）scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（ix）第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および第2重鎖可変ドメイン、
（x）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（xi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（xii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および軽鎖可変ドメイン、
（xiii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（xiv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、
（xv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、および第2重鎖可変ドメイン、
（xvi）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および（同じポリペプチドの）結合ドメインの第2部分は（会合して）標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片（VH-CH1またはCH1-VH）であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片（VL-CLまたはCL-VL）であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群から選択される。
【００２０】
一態様において、第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドの一方は、N末端からC末端に向かって、第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、第2重鎖可変ドメイン、第1軽鎖定常ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメインを含み、かつ第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドのうちの他方は、N末端からC末端に向かって、第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメインを含む。一態様において、2つの重鎖可変ドメインを含むポリペプチドを含む結合物質は、第1軽鎖可変ドメインと第2軽鎖定常ドメインとを含む第1軽鎖（第1重鎖可変ドメインとペアを形成する）および第2軽鎖可変ドメインとヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）とを含む（ドメイン交換済み）第2軽鎖（第2重鎖可変ドメインとペアを形成する）をさらに含み、他方の結合物質は第1軽鎖をさらに含む。
【００２１】
一態様において、第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドの一方は、N末端からC末端に向かって、第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、第1軽鎖可変ドメイン、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメインを含み、第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドのうちの他方は、N末端からC末端に向かって、第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメインを含む。一態様において、2つの可変ドメインを含むポリペプチドを含む結合物質は、第2可変軽鎖ドメインと第1軽鎖定常ドメインとを含む第1軽鎖（第1重鎖可変ドメインとペアを形成する）および第2重鎖可変ドメインと第2軽鎖定常ドメインとを含む（ドメイン交換済み）第2軽鎖（第1軽鎖可変ドメインとペアを形成する）とをさらに含み、他方の結合物質は第1軽鎖をさらに含む。
【００２２】
一態様において、第1および第2の結合物質/多量体出発ポリペプチドはそれぞれ、抗体軽鎖をさらに含む。
【００２３】
一態様において、
第1結合物質/多量体出発ポリペプチドは、
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および（同じポリペプチドの）結合ドメインの第2部分は（会合して）標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片（VH-CH1またはCH1-VH）であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片（VL-CLまたはCL-VL）であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは互いに非共有結合的または共有結合的に会合する/非共有結合的または共有結合的二量体を形成する（ここで、第2ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチドと第1ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、不安定化相互作用をもたらす）、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチド
と、を含み、かつ
第2結合物質/多量体出発ポリペプチドは、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2撹乱変異を含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド、
と、
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および（同じポリペプチドの）結合ドメインの第2部分は（会合して）標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片（VH-CH1またはCH1-VH）であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片（VL-CLまたはCL-VL）であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは互いに非共有結合的または共有結合的に会合する/非共有結合的または共有結合的二量体を形成する（ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第4ポリペプチドと第5ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、不安定化相互作用をもたらす）、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている第6ポリペプチド
と、を含む。
【００２４】
一態様において、インキュベーション工程は還元剤の存在下で行われる。
【００２５】
一態様において、インキュベーション工程は還元剤の非存在下で行われる。
【００２６】
一態様において、（i）第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチド、または（ii）第2ポリペプチドおよび第5ポリペプチドは、（C末端）タグをさらに含む。一態様において、タグはアミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）またはHHHHHHHH（SEQ ID NO:68）を有し、回収は、金属（ニッケル）キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる。一態様において、タグはアミノ酸配列EPEA（SEQ ID NO:87）を有し、回収はC-タグアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる。
【００２７】
一態様において、
第1結合物質/多量体出発ポリペプチドは、
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および（同じポリペプチドの）結合ドメインの第2部分は（会合して）標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片（VH-CH1またはCH1-VH）であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片（VL-CLまたはCL-VL）であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは互いに非共有結合的または共有結合的に会合する/非共有結合的または共有結合的二量体を形成する（ここで、第2ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチドと第1ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、不安定化相互作用をもたらす）、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチド
とを含み、かつ
第2結合物質/多量体出発ポリペプチドは、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される第2撹乱変異を含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド、
と、
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および（同じポリペプチドの）結合ドメインの第2部分は（会合して）標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片（VH-CH1またはCH1-VH）であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片（VL-CLまたはCL-VL）であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは互いに非共有結合的または共有結合的に会合する/非共有結合的または共有結合的二量体を形成する（ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第4ポリペプチドと第5ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、不安定化相互作用をもたらす）、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている第6ポリペプチド
と、を含む。
【００２８】
本明細書に掲載される一局面は、以下の工程を含む、（二重特異性）結合物質の組合せを同定するための方法である：
・第1の多数の（単一特異性）結合物質から選択された第1（単一特異性）結合物質と第2の（ただし第1の多数の単一特異性結合物質とは異なる）多数の（単一特異性）結合物質から選択された第2（単一特異性）結合物質との各組合せを本発明の方法に供することによって、多数の（二重特異性）結合物質を生産する工程、
・例えばELISAアッセイまたはSPRアッセイなどの結合アッセイにおいて、少なくとも2種の抗原への、生産された多数の結合物質のうちの各結合物質の同時結合（の量）を、個別に測定する工程、および
・多数の結合物質から、例えばELISAアッセイまたはSPRアッセイなどの結合アッセイの結果に基づいて結合物質を選択する工程であって、それによって（二重特異性）結合物質の組合せを同定する、工程。
【００２９】
本明細書に掲載される一局面は、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドであって、
両ポリペプチドはヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメインを含み、
（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、少なくとも1つの撹乱変異（E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される）を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは互いに非共有結合的または共有結合的に会合する/非共有結合的または共有結合的二量体を形成する（ここで、第2ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチドと第1ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、不安定化相互作用をもたらす）、
多量体ポリペプチドである。
【００３０】
一態様において、
第1ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、ならびに
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および（同じポリペプチドの）結合ドメインの第2部分は（会合して）標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片（VH-CH1またはCH1-VH）であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片（VL-CLまたはCL-VL）であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであり、
かつ変異ノブまたは変異ホールを含み、
かつ
第2ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチドである。
【００３１】
一態様において、多量体ポリペプチドは、少なくとも1つのジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチドを、さらに含む。
【００３２】
本明細書に掲載される一局面は、
第1ヘテロ三量体ポリペプチドであって、
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、ならびに
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および（同じポリペプチドの）結合ドメインの第2部分は（会合して）標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片（VH-CH1またはCH1-VH）であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片（VL-CLまたはCL-VL）であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチド
と、
第3ポリペプチドとして、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチド
と、を含む、第1ヘテロ三量体ポリペプチド
および
第2ヘテロ三量体ポリペプチドであって、
第1（第4）ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2撹乱変異を含み、ここで、第2（第5）ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリン（IgG1）において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含む、ここで、第1（第4）ポリペプチド中の撹乱変異は第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド
と、
第2（第5）ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第1CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来の第2CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン由来のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来のCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン（由来の軽鎖定常ドメイン）、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および（同じポリペプチドの）結合ドメインの第2部分は（会合して）標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成し、一態様において、結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fab断片（VH-CH1またはCH1-VH）であり、かつ結合ドメインの第2部分は軽鎖Fab断片（VL-CLまたはCL-VL）であるか、またはその逆であるもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1（第4）ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1（第4）ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含む、
ポリペプチド
と、
第3（第6）ポリペプチドとして、ジスルフィド結合によって第1（第4）ポリペプチドに共有結合されている、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチド
とを含む、第2ヘテロ三量体ポリペプチド
を含む組成物であって、
（i）第1ヘテロ三量体の第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ヘテロ三量体の第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、（i）第1ヘテロ三量体の第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第2ヘテロ三量体（第4）ポリペプチドの第1ポリペプチドは変異ノブを含むか、または（ii）第1ヘテロ三量体の第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第2ヘテロ三量体（第4）ポリペプチドの第1ポリペプチドは変異ホールを含み、
第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドと第2ヘテロ三量体（第4）ポリペプチドの第1ポリペプチドとは、同じ位置には撹乱変異を含まない/異なる位置に撹乱変異を含む、
組成物である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の態様の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、出発材料として非完全抗体、すなわち二重特異的には結合しない抗体を使用する半抗体交換反応によって、多重特異性抗体を得ることができるという知見に基づく。例示的な非完全抗体はいわゆる2/3-IgGである。例示的な2/3-IgGは、抗体軽鎖と、抗体重鎖（重鎖と軽鎖は互いに共有結合的に会合して、それらのVHドメインおよびVLドメインのペアによる結合部位を形成する）と、抗体重鎖Fc領域断片とを含む。該重鎖Fc領域断片は、それ自体、例えば完全抗体重鎖または延長型抗体重鎖または変異体抗体重鎖などの一部であることができる。2/3-IgG中に存在する重鎖::重鎖Fc領域断片ペアおよび（機能的）結合部位は、本発明の交換反応に要求される最小構造要素を規定する。非完全抗体において、例えば2/3-IgGなどにおいて、Fc領域間の相互作用は、非対称な撹乱変異によって、好ましくはFc領域断片中に存在するものによって、不安定化される。撹乱変異は、より良くマッチする相補的な非完全抗体が存在する場合に、出発非完全抗体の解離と、正しく組み立てられた完全二重特異性抗体の精製とを促進する。
【００３４】
本発明は、少なくとも部分的には、上に概説した出発化合物を使用することにより、還元剤の非存在下で本発明の方法を行うことができるという、さらなる知見に基づく。すなわち、Fc領域断片と重鎖の間のジスルフィド結合は、必要でない。したがって、ヒンジ領域ジスルフィド結合および他の重鎖-重鎖ジスルフィド結合は、出発非完全抗体から除去することができる。重鎖-重鎖ジスルフィド結合を持たない出発非完全抗体の生成ならびに交換反応および多重特異性抗体の生産は、依然として効率よく進むことが見いだされた。
【００３５】
I. 定義
本明細書において、重鎖および軽鎖のすべての定常領域および定常ドメインのアミノ酸位置は、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD（1991）に記載のKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、これを本明細書では「ナンバリングはKabatに従う」という。具体的に述べると、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLには、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD（1991）のKabatナンバリングシステム（647〜660頁参照）を使用し、定常重鎖ドメイン（CH1、ヒンジ、CH2およびCH3）には、Kabat EUインデックスナンバリングシステム（661〜723頁参照）を使用する（この場合、本明細書では、「ナンバリングはKabat EUインデックスに従う」ということによって、これをさらに明確にする）。
【００３６】
二価二重特異性抗体の重鎖のFc領域におけるCH3ドメインは、例えばWO96/027011、Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng.9（1996）617-621およびMerchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16（1998）677-681にいくつか例を挙げて詳述されている「ノブ・イントゥ・ホールズ」（knob-into-holes）技術によって、改変することができる。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用面が、それら2つのCH3ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化が増加するように、改変される。（2つの重鎖の）2つのCH3ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、その場合、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入はヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant,A.M.,et al,Nature Biotech.16（1998）677-681、Atwell,S.,et al,J.Mol.Biol.270（1997）26-35）、収率を増加させる。
【００３７】
抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366Wは「ノブ変異」と表され、抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、Y407Vは「変異ホール」と表される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。CH3ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋も、例えば「ノブ変異」を持つ重鎖のCH3ドメインにS354C変異を導入すること（「ノブ-cys変異」または「変異ノブ-cys」と表示する）および「ホール変異」を持つ重鎖のCH3ドメインにY349C変異を導入すること（「ホール-cys変異」または「変異ホール-cys」と表示する）によって（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、またはその逆によって、使用することができる（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16（1998）677-681）。
【００３８】
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD（1991）に与えられている。
【００３９】
本発明の実行に有用な方法および技法は、例えばAusubel,F.M.（ed.）,Current Protocols in Molecular Biology,Volumes I〜III（1997）、Glover,N.D.,and Hames,B.D.,ed.,DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes IおよびII（1985）,Oxford University Press、Freshney,R.I.（ed.）,Animal Cell Culture-a practical approach,IRL Press Limited（1986）、Watson,J.D.,et al,Recombinant DNA,Second Edition,CHSL Press（1992）、Winnacker,E.L.,From Genes to Clones;N.Y.,VCH Publishers（1987）、Celis,J.,ed.,Cell Biology,Second Edition,Academic Press（1998）、Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,second edition,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.（1987）に記載されている。
【００４０】
組換えDNA技術の使用により、核酸の誘導体を生成させることが可能になる。そのような誘導体は、例えば、個々のヌクレオチド位置またはいくつかのヌクレオチド位置が、置換、改変、交換、欠失または挿入によって修飾されたものであることができる。修飾および誘導体化は、例えば部位特異的変異誘発法を使って実行することができる。当業者は、そのような修飾を容易に実行することができる（例えばSambrook,J.,et al,Molecular Cloning:A laboratory manual（1999）Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA、Hames,B.D.,and Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization-a practical approach（1985）IRL Press,Oxford,England参照）。
【００４１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって例えば、「細胞」（a cell）と書いた場合、それは、複数のそのような細胞および当業者に公知のそれらの等価物を包含する、などとなる。同様に、「1つの」（「a」または「an」）、「1つまたは複数の」および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書では、相互可換的に使用されうる。「comprising」（を含む）、「including」（を包含する）および「having」（を有する）という用語が、相互可換的に使用されうることにも留意されたい。
【００４２】
「約」という用語は、その後ろに続く数値の±20％の範囲を表す。一態様において、約という用語は、その後ろに続く数値の±10％の範囲を表す。一態様において、約という用語は、その後ろに続く数値の±5％の範囲を表す。
【００４３】
「アミノ酸置換」または「（アミノ酸」変異という用語は、前もって決定された親アミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基を、異なる「置き換え」アミノ酸残基で置き換えることを表す。1つまたは複数の置換え残基は「天然のアミノ酸残基」（すなわち遺伝暗号によってコードされているもの）であってよく、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、システイン（Cys）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、およびバリン（Val）からなる群より選択されうる。一態様において、置換え残基はシステインではない。本明細書におけるアミノ酸置換の定義には、1つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置換も包含される。「非天然アミノ酸残基」とは、ポリペプチド鎖中の隣接アミノ酸残基に共有結合的に結合することができる、上に列挙した天然アミノ酸残基以外の残基を表す。非天然アミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、aibおよび他のアミノ酸残基類似体、例えばEllman,et al,Meth.Enzym.202（1991）301-336に記載されているものが挙げられる。そのような非天然アミノ酸残基を生成させるには、Norenら（Science 244（1989）182）および/またはEllmanら（前掲）の手法を使用することができる。簡単に述べると、これらの手法では、サプレッサーtRNAを非天然アミノ酸残基で化学的に活性化してから、インビトロ転写およびRNAの翻訳を行う。非天然アミノ酸は、化学ペプチド合成と、それに続くそれらのペプチドと組換え生産されたポリペプチド、例えば抗体または抗体断片との融合とによって、ペプチドに組み込むこともできる。
【００４４】
「抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）」という用語はFc受容体結合によって媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下で抗体Fc領域によって媒介される標的細胞の溶解を指す。ADCCは、一態様では、新鮮単離PBMC（末梢血単核球）などのエフェクター細胞の存在下または単球もしくはNK（ナチュラルキラー）細胞のようなバフィーコートからの精製エフェクター細胞の存在下で、標的を発現する赤血球系細胞（例えば組換え標的を発現するK562細胞）の調製物を、本明細書に掲載するFc領域を含む2/3-IgGで処理することによって測定される。標的細胞をCr-51で標識してから、2/3-IgGと共にインキュベートする。標識細胞をエフェクター細胞と共にインキュベートし、放出されたCr-51について上清を分析する。対照には、標的内皮細胞をエフェクター細胞と共に、ただし2/3-IgGなしで、インキュベートすることを含める。2/3-IgGの、ADCCを媒介する初期段階を誘導する能力は、FcγRIおよび/またはFcγRIIAを組換え発現する細胞または（本質的にFcγRIIIAを発現する）NK細胞などといったFcγ受容体発現細胞への結合を測定することによって調べられる。好ましい一態様では、NK細胞上のFcγRへの結合が測定される。
【００４５】
「CH1ドメイン」という用語は、抗体重鎖ポリペプチドのうち、およそEU位置118からEU位置215まで（EUナンバリングシステム）にわたる部分を表す。一態様において、CH1ドメインは
2021500348.tif 000005
のアミノ酸配列を含む。
【００４６】
「CH2ドメイン」という用語は、抗体重鎖ポリペプチドのうち、およそEU位置231からEU位置340まで（KabatによるEUナンバリングシステム）にわたる部分を表す。一態様において、CH2ドメインは
2021500348.tif 000006
のアミノ酸配列を含む。CH2ドメインは、もう一つのドメインと密接にはペアを形成していない点でユニークである。むしろ、無傷のネイティブFc領域の2つのCH2ドメインの間には、2つのN結合型分岐糖質鎖が差し挟まれている。この糖質はドメイン-ドメインペア形成の代用物となっていて、CH2ドメインの安定化に役立つのだろうと推測されている。Burton,Mol.Immunol.22（1985）161-206。
【００４７】
「CH3ドメイン」という用語は、抗体重鎖ポリペプチドのうち、およそEU位置341からEU位置446までにわたる部分を表す。一態様において、CH3ドメインは
2021500348.tif 000007
のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
「を含む」（comprising）という用語は「からなる」（consisting of）という用語も包含する。
【００４９】
「補体依存性細胞傷害（CDC）」という用語は、補体の存在下で、本明細書に掲載する抗体のFc領域によって誘導される細胞の溶解を指す。CDCは、一態様では、標的を発現するヒト内皮細胞を、補体の存在下で、本明細書に掲載される2/3-IgGで処理することによって測定される。一態様では、細胞をカルセインで標識する。2/3-IgGが30μg/mlの濃度で20％以上の標的細胞の溶解を誘導すれば、CDCが見いだされる。補体因子C1qへの結合はELISAにおいて測定することができる。そのようなアッセイでは、原則として、ある濃度範囲の2/3-IgGでELISAプレートをコーティングし、そこに精製ヒトC1qまたはヒト血清を加える。C1q結合は、C1qに対する抗体とそれに続くペルオキシダーゼ標識コンジュゲートとによって検出される。結合の検出（最大結合Bmax）は、ペルオキシダーゼ基質ABTS（登録商標）（2,2'-アジノ-ジ-［3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホネート］）の場合は、405 nmにおける光学密度（OD405）として測定される。
【００５０】
「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域に帰因する生物学的活性を指し、それが由来する抗体クラスによってさまざまである。抗体エフェクター機能の例として、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、貪食、細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーション、ならびにB細胞活性化が挙げられる。
【００５１】
Fc受容体結合依存的エフェクター機能は、抗体のFc領域と、造血細胞上の特殊化した細胞表面受容体であるFc受容体（FcR）との相互作用によって媒介されうる。Fc受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の貪食による抗体被覆病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）による、Fc領域を提示する赤血球および他のさまざまな細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解とを、どちらも媒介することが示されている（例えばVan de Winkel,J.G.and Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49（1991）511-524を参照されたい）。FcRは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性によって規定され、IgG型Fc領域に対するFc受容体はFcγRと呼ばれる。Fc受容体結合は、例えばRavetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9（1991）457-492、Capel,P.J.,et al.,Immunomethods 4（1994）25-34、de Haas,M.,et al.,J.Lab.Clin.Med.126（1995）330-341、Gessner,J.E.,et al.,Ann.Hematol.76（1998）231-248に記載されている。
【００５２】
IgGタイプの抗体のFc領域に対する受容体（FcγR）の架橋は、貪食、抗体依存性細胞性細胞傷害、および炎症性メディエーターの放出、ならびに免疫複合体クリアランスおよび抗体生産の調節を含む、多種多様なエフェクター機能の引き金を引く。ヒトでは、3つのFcγRクラスが特徴づけられており、それらは以下のとおりである。
・FcγRI（CD64）は、単量体IgGに高いアフィニティーで結合し、マクロファージ、単球、好中球および好酸球上に発現する。アミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327およびP329（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のうちの少なくとも1つにおけるIgGのFc領域中の修飾は、FcγRIへの結合を低減する。IgG2の233〜236番目の残基でIgG1中およびIgG4中の残基を置換すると、FcγRIへの結合は103分の1に低減し、抗体感作赤血球細胞に対するヒト単球応答は排除された（Armour,K.L.,et al,Eur.J.Immunol.29（1999）2613-2624）。
・FcγRII（CD32）は、複合体化したIgGに、中〜低アフィニティーで結合し、広く発現している。この受容体は2つのサブタイプFcγRIIAおよびFcγRIIBに分類することができる。FcγRIIAは、キリング（killing）に関与する多くの細胞（例えばマクロファージ、単球、好中球）に見いだされ、キリングプロセスを活性化することができるようである。FcγRIIBは、阻害プロセスにおいて役割を果たすと思われ、B細胞、マクロファージならびに肥満細胞および好酸球上に見いだされる。これは、B細胞上では、さらなる免疫グロブリン生産および例えばIgEクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制する機能を果たすようである。FcγRIIBは、マクロファージ上では、FcγRIIAによって媒介される貪食を阻害するように作用する。好酸球および肥満細胞上では、IgEがその別個の受容体に結合することによって起こるこれらの細胞の活性化を抑制するのに、このB型が役立ちうる。FcγRIIAに対する結合の低減は、例えばアミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292およびK414（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のうちの少なくとも1つに変異を持つIgG Fc領域を含む抗体に見いだされる。
・FcγRIII（CD16）は中〜低アフィニティーでIgGに結合し、2つのタイプとして存在する。FcγRIIIAはNK細胞、マクロファージ、好中球ならびに一部の単球およびT細胞上に見いだされ、ADCCを媒介する。FcγRIIIBは好中球に高発現している。FcγRIIIAへの結合の減少は、例えばアミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338およびD376（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のうちの少なくとも1つに変異を持つIgG Fc領域を含む抗体に見いだされる。
【００５３】
Fc受容体に対するヒトIgG1上の結合部位のマッピング、上述の変異部位ならびにFcγRIおよびFcγRIIAへの結合を測定するための方法は、Shields,R.L.,et al.J.Biol.Chem.276（2001）6591-6604に記載されている。
【００５４】
「ヒンジ領域」という用語は、抗体重鎖ポリペプチドのうち、野生型抗体重鎖中でCH1ドメインとCH2ドメインとを接合している部分、例えばKabatのEUナンバーシステム（number system）で約221番目から約230番目まで、またはKabatのEUナンバーシステムで約226番目から約230番目までを表す。他のIgGサブクラスのヒンジ領域は、IgG1サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基との整列によって決定することができる。
【００５５】
ヒンジ領域は、通常、同一のアミノ酸配列を持つ2つのポリペプチドからなる二量体分子である。一態様において、ヒンジ領域はアミノ酸配列
2021500348.tif 000008
を有し、ここでXはSまたはPである。一態様において、ヒンジ領域はアミノ酸配列HTCPXCP（SEQ ID NO:31）を有し、ここでXはSまたはPである。一態様において、ヒンジ領域はアミノ酸配列CPXCP（SEQ ID NO:32）を有し、ここでXはSまたはPである。一態様において、ヒンジ領域は内部ジスルフィド結合を有しない。これは、SEQ ID NO:32の配列中の（同様にSEQ ID NO:30および31中の）システイン残基をセリン残基によって置換することによって、またはSEQ ID NO:30、31または32のヒンジ領域からCPXCストレッチ（SEQ ID NO:89）を欠失させることによって、達成される。
【００５６】
「ペプチド性リンカー」という用語は、天然起源および/または合成起源のリンカーを表す。ペプチド性リンカーは、20種の天然アミノ酸を、ペプチド結合によってつながれるモノマービルディングブロックとする、アミノ酸の線状鎖からなる。この鎖は、1〜50アミノ酸残基、好ましくは1〜28アミノ酸残基、とりわけ好ましくは3〜25アミノ酸残基の長さを有する。ペプチド性リンカーは、反復アミノ酸配列または天然ポリペプチドの配列を含有しうる。ペプチド性リンカーは、2/3-IgGのドメインが正しく折りたたまれることおよびドメインが適正に提示されることを可能にすることによって、それらのドメインがそれぞれの生物学的活性を発揮できることを保証する機能を有する。好ましくは、ペプチド性リンカーは、グリシン、グルタミン、および/またはセリン残基に富むように設計された「合成ペプチド性リンカー」である。これらの残基は、例えば5アミノ酸までの小さな繰り返し単位、例えば
2021500348.tif 000009
に配置される。この小さな繰り返し単位は、2〜5回繰り返されて、例えば
2021500348.tif 000010
などの多量体単位を形成しうる。一態様において、ペプチド性リンカーはSEQ ID NO:69〜82のリンカーの群より選択される。一態様において、ペプチド性リンカーのそれぞれは、SEQ ID NO:69〜82からなるリンカーの群から、互いに独立して選択される。好ましい一態様において、ペプチド性リンカー/各ペプチド性リンカーは、SEQ ID NO:75〜81からなるリンカーの群より（互いに独立して）選択される。マルチマー単位のアミノ末端および/またはカルボキシ末端には、任意の天然アミノ酸を6個まで追加することができる。他の合成ペプチド性リンカーは、例えばリンカー
2021500348.tif 000011
中のセリンなど、10〜20回繰り返される単一アミノ酸で構成され、アミノ末端および/またはカルボキシ末端に任意の天然アミノ酸をさらに6個まで含みうる。すべてのペプチド性リンカーは核酸分子によってコードすることができるので、組換え発現させることができる。リンカーはそれ自体がペプチドであるから、抗融合性ペプチド（antifusogenic peptide）は、2つのアミノ酸の間に形成されるペプチド結合によって、リンカーにつながれる。
【００５７】
「抗体断片」とは、インタクト抗体以外の分子であって、インタクト抗体のうち、インタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む分子を指す。抗体断片の例として、2/3-IgG、Fv、scFv、Fab、scFab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えばscFv）、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一定の抗体断片に関する総説として、Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9（2003）129-134を参照されたい。scFv断片の総説として、例えばPlueckthun,A.,In;The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore（eds.）,Springer-Verlag,New York（1994）,pp.269-315を参照されたい。また、WO93/16185;US5,571,894およびUS5,587,458も参照されたい。
【００５８】
ダイアボディは、二価であっても二重特異性であってもよい2つの抗原結合部位を持つ抗体断片である。例えばEP 0 404 097、WO 1993/01161、Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9（2003）129-134およびHolliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90（1993）6444-6448を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもHudson,P.J.et al.,Nat.Med.9（20039 129-134）に記載されている。
【００５９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。一定の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Domantis,Inc.、マサチューセッツ州ウォルサム;例えばUS6,248,516参照）である。
【００６０】
抗体断片は、さまざまな技法によって、例えば限定するわけではないがインタクト抗体のタンパク質分解消化および組換え宿主細胞（例えば大腸菌（E.coli）またはファージ）による生産などによって、作成することができる。
【００６１】
「抗体断片」という用語は、2つの異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Fab」（Dual Acting Fab）、すなわち「DAF」も包含する（例えばUS 2008/0069820を参照されたい）。
【００６２】
「単一特異性抗体」とは、1つの抗原に対する単一の結合特異性を有する抗体を表す。単一特異性抗体は、完全長抗体もしくは抗体断片（例えば2/3-IgG、F（ab'）2）またはそれらの組合せ（例えば完全長抗体＋追加のscFvまたはFab断片）として調製することができる。
【００６３】
「多重特異性抗体」は、同じ抗原上または2つの異なる抗原上の少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を表す。多重特異性抗体は、完全長抗体もしくは抗体断片（例えばF（ab'）2二重特異性抗体）またはそれらの組合せ（例えば完全長抗体＋追加のscFvまたはFab断片）として調製することができる。2つ、3つまたはそれ以上（例えば4つ）の機能的抗原結合部位を持つ操作された抗体も報告されている（例えばUS 2002/0004587 A1参照）。多重特異性抗体の一つは二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、抗体Fc-ヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果を工学的に操作することによって作製することもできる（WO 2009/089004）。
【００６４】
「に結合する」という用語は、結合部位のその標的への結合、例えば抗体重鎖可変ドメインと抗体軽鎖可変ドメインとを含む抗体結合部位のそれぞれの抗原への結合を表す。この結合は、例えばBIAcore（登録商標）アッセイ（GE Healthcare、スウェーデン国ウプサラ）を使って、決定することができる。すなわち、「（抗原に）結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて抗体がその抗原に結合することを表す。一態様において、結合は、抗体が表面に結合され、その抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定される結合アッセイにおいて、決定される。結合とは、例えば10-8 M以下の、いくつかの態様では10-13〜10-8 Mの、いくつかの態様では10-13〜10-9 Mの、結合アフィニティー（KD）を意味する。「結合する」という用語は「特異的に結合する」という用語も包含する。
【００６５】
例えば、BIAcore（登録商標）アッセイの考えうる一態様では、抗原を表面に結合し、表面プラズモン共鳴（SPR）によって抗体結合部位の結合を測定する。結合のアフィニティーは、ka項（会合定数:複合体を形成する会合に関する速度定数）、kd項（解離定数:複合体の解離に関する速度定数）項およびKD項（kd/ka）によって定義される。あるいは、SPRセンサーグラムの結合シグナルを、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、リファレンスの応答シグナルと直接比較することができる。
【００６６】
結合はBIAcoreアッセイ（GE Healthcare Biosensor AB、スウェーデン国ウプサラ）によって調べることができる。結合のアフィニティーは、ka項（抗体/抗原複合体からの抗体の会合に関する速度定数）、kd項（解離定数）およびKD項（kd/ka）によって定義される。
【００６７】
「結合部位」という用語は、標的に対して結合特異性を示す任意のタンパク質性の実体を表す。これは、例えば受容体、受容体リガンド、アンチカリン、アフィボディ、抗体などであることができる。したがって、本明細書において使用する「結合部位」という用語は、第2のポリペプチドに特異的に結合しうるかまたは第2のポリペプチドによって特異的に結合されうるポリペプチドを表す。一態様において、結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメイン、抗体重鎖可変ドメインと抗体軽鎖可変ドメインのペア、受容体またはその機能的断片、受容体リガンドまたはその機能的断片、酵素またはその基質からなるポリペプチドの群より選択される。
【００６８】
抗体の場合、結合部位は、少なくとも3つのHVR（例えばVHHの場合）または6つのHVR（例えば天然の、すなわち従来型の、抗体の場合）を含む。一般に、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基は結合部位を形成している。これらの残基は、通常、抗体重鎖可変ドメインとコグネイト抗体軽鎖可変ドメインのペアに含まれている。抗体の抗原結合部位は「超可変領域」または「HVR」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域、すなわち「FR」領域は、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。それゆえに、抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、N末端からC末端に向かって、以下の領域を含む:FR1、HVR1/CDR1、FR2、HVR2/CDR2、FR3、HVR3/CDR3およびFR4（免疫グロブリンフレームワーク）。とりわけ、重鎖可変ドメインのHVR3/CDR3領域は、抗原結合への寄与が最も大きく、抗体の結合特異性を規定する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合する能力を有する。「に特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、一態様では結合アッセイにおいて、結合部位がその標的に結合することを表す。そのような結合アッセイは、結合事象を検出することができる限り、任意のアッセイであることができる。例えば、抗体が表面に結合され、抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定される結合アッセイ。あるいはブリッジングELISA（bridging ELISA）を使用することができる。結合とは、10-8 M以下の、いくつかの態様では10-13〜10-8 Mの、いくつかの態様では、10-13〜10-9 Mの、抗体（結合物質）からその標的への結合アフィニティー（KD）を意味する。
【００６９】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が持つ定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要クラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2に分類されうる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
【００７０】
「Fc領域」という用語は、ヒンジ領域の少なくとも一部、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を表す。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のAsp221から、またはCys226から、またはPro230から、カルボキシル末端までにわたる。ただし、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は存在しても存在しなくてもよい。Fc領域は、2つの重鎖Fc領域ポリペプチドで構成され、それら2つの重鎖Fc領域ポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基によって互いに共有結合されうる。
【００７１】
本明細書に掲載する方法において生産される抗体はFc領域を含み、一態様ではヒト由来のFc領域を含む。一態様において、Fc領域は、ヒト定常領域のすべてのパーツを含む。抗体のFc領域は、補体活性化、C1q結合、C3活性化およびFc受容体結合に直接関与する。補体系に対する抗体の影響は一定の条件に依存するが、C1qへの結合は、Fc領域中の所定の結合部位が引き起こす。そのような結合部位は、現在の技術水準では公知であり、例えばLukas,T.J.,et al,J.Immunol.127（1981）2555-2560、Brunhouse,R.,and Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16（1979）907-917、Burton,D.R.,et al,Nature 288（1980）338-344、Thommesen,J.E.,et al,Mol.Immunol.37（2000）995-1004、Idusogie,E.E.,et al,J.Immunol.164（2000）4178-4184、Hezareh,M.,et al.,J.Virol.75（2001）12161-12168、Morgan,A.,et al,Immunology 86（1995）319-324およびEP 0 307 434によって記載されている。そのような結合部位は、例えばL234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331およびP329（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）である。サブクラスIgG1、IgG2およびIgG3の抗体が、通常、補体活性化、C1q結合およびC3活性化を示すのに対し、IgG4は補体系を活性化せず、C1qに結合せず、C3を活性化しない。「抗体のFc領域」は、当業者には周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。一態様において、Fc領域はヒトFc領域である。一態様において、Fc領域は、変異S228Pおよび/またはL235E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を含むヒトIgG4サブクラスのFc領域である。一態様において、Fc領域は、変異L234AおよびL235Aを含み、任意でP329Gを含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、ヒトIgG1サブクラスのものである。
【００７２】
「完全長抗体」という用語は、ネイティブ抗体の構造に実質的に類似する構造を有する抗体を表す。完全長抗体は、それぞれが軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む2つの完全長抗体軽鎖と、それぞれが重鎖可変ドメイン、第1定常ドメイン、ヒンジ領域、第2定常ドメインおよび第3定常ドメインを含む2つの完全長抗体重鎖とを含む。完全長抗体は、例えば完全長抗体の鎖のうちの1つまたは複数にコンジュゲートされた追加のscFvまたはscFabなどといった、さらなるドメインを含みうる。これらのコンジュゲートも完全長抗体という用語に包含される。
【００７３】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」という用語は、相互可換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を包含し、それらには、初代形質転換細胞とそこから派生する子孫とが継代数を問わず包含される。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全には同一でなくて、変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞において選別または選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫は、本明細書に包含される。
【００７４】
「に由来する（から誘導された）」（derived from）という用語は、変異体アミノ酸配列が親アミノ酸配列から、少なくとも1つの位置に改変/変異を導入することによって得られることを表す。したがって、誘導されたアミノ酸配列は、対応する親アミノ酸配列と少なくとも1つの対応する位置において異なる。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜15個のアミノ酸残基が異なる。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜10個のアミノ酸残基が異なる。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜6個のアミノ酸残基が異なる。同様に、誘導されたアミノ酸配列は、その親アミノ酸配列に対して高いアミノ酸配列同一性を有する。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、80％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、90％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、95％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００７５】
一態様では、一方または両方の重鎖Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO:01のFc領域ポリペプチドに由来し、SEQ ID NO:01のFc領域ポリペプチドと比較して、少なくとも1つのアミノ酸変異を有する。一態様において、Fc領域ポリペプチドは、約1〜約10個のアミノ酸変異を、一態様では約1〜約5個のアミノ酸変異を、含む/有する。一態様において、Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO:01のヒトFc領域ポリペプチドと少なくとも約80％の相同性を有する。一態様において、Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO:01のヒトFc領域ポリペプチドと少なくとも約90％の相同性を有する。一態様において、Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO:01のヒトFc領域ポリペプチドと少なくとも約95％の相同性を有する。
【００７６】
SEQ ID NO:01または02または03または04のヒトFc領域ポリペプチドに由来するFc領域ポリペプチドは、含まれているアミノ酸改変によって、さらに規定される。したがって、例えばP329Gという用語は、SEQ ID NO:01または02または03または04のヒトFc領域ポリペプチドとの比較で、アミノ酸位置329にプロリンからグリシンへの変異を持つ、ヒトFc領域ポリペプチド由来のFc領域ポリペプチドを表す。
【００７７】
ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000012
【００７８】
以下のFc領域は野生型ヒトIgG1 Fc領域由来の変異体である。
【００７９】
変異L234A、L235Aを持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000013
【００８０】
Y349C、T366S、L368AおよびY407V変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000014
【００８１】
S354C、T366W変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000015
【００８２】
L234A、L235A変異およびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000016
【００８３】
L234A、L235AおよびS354C、T366W変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000017
【００８４】
P329G変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000018
【００８５】
L234A、L235A変異およびP329G変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000019
【００８６】
P329G変異およびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000020
【００８７】
P329G変異およびS354C、T366W変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000021
【００８８】
L234A、L235A、P329GおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000022
【００８９】
L234A、L235A、P329G変異およびS354C、T366W変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000023
【００９０】
ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000024
【００９１】
以下のFc領域は野生型ヒトIgG4 Fc領域に由来する変異体である。
【００９２】
S228PおよびL235E変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000025
【００９３】
S228P、L235E変異およびP329G変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000026
【００９４】
S354C、T366W変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000027
【００９５】
Y349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000028
【００９６】
S228P、L235EおよびS354C、T366W変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000029
【００９７】
S228P、L235EおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000030
【００９８】
P329G変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000031
【００９９】
P329GおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000032
【０１００】
P329GおよびS354C、T366W変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000033
【０１０１】
S228P、L235E、P329GおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000034
【０１０２】
S228P、L235E、P329GおよびS354C、T366W変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
2021500348.tif 000035
【０１０３】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRからのアミノ酸残基とヒトFRからのアミノ酸残基とを含む抗体を指す。一定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質上すべてを含み、その可変ドメインでは、HVR（例えばCDR）のすべてまたは実質上すべてが非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべてまたは実質上すべてがヒト抗体のものに対応するであろう。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含みうる。抗体の、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０１０４】
本明細書において使用する用語「超可変領域」または「HVR」は、抗体可変ドメインのうち、配列が超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」）かつ/または構造上明確なループ（「超可変ループ」）を形成しかつ/または抗原接触残基（「抗原コンタクト」（antigen contact））を含有するアミノ酸残基ストレッチを含む領域のそれぞれを指す。一般に抗体は、重鎖可変ドメインVH中に3つ（H1、H2、H3）と軽鎖可変ドメインVL中に3つ（L1、L2、L3）の、6つのHVRを含む。
【０１０５】
HVRは、
（a）アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）および96〜101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196（1987）901-917）、
（b）アミノ酸残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、89〜97（L3）、31〜35b（H1）、50〜65（H2）および95〜102（H3）に存在するCDR（Kabat,E.A.et al,Sequence of Proteins of Immunological Interest,5th ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD（1991）,NIH Publication 91-3242）、
（c）アミノ酸残基27c〜36（L1）、46〜55（L2）、89〜96（L3）、30〜35b（H1）、47〜58（H2）および93〜101（H3）に存在する抗原コンタクト（MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745（1996））、ならびに
（d）アミノ酸残基46〜56（L2）、47〜56（L2）、48〜56（L2）、49〜56（L2）、26〜35（H1）、26〜35b（H1）、49〜65（H2）、93〜102（H3）および94〜102（H3）を含む（a）、（b）および/または（c）の組み合わせ
を含む。
【０１０６】
別段の表示がある場合を除き、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えばFR残基）は、本明細書では、前掲のKabatらに従ってナンバリングされる。
【０１０７】
「軽鎖」という用語は、ネイティブIgG抗体の短い方のポリペプチド鎖を表す。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2タイプのうちの一方に割り当てうる。ヒトカッパ軽鎖定常ドメインについてはSEQ ID NO:33を、またヒトラムダ軽鎖定常ドメインについてはSEQ ID NO:34を参照されたい。
【０１０８】
「パラトープ」という用語は、所与の抗体分子のうち、標的と結合部位の間の特異的結合に必要な部分を指す。パラトープは、連続的である場合、すなわち結合部位中に存在する隣り合ったアミノ酸残基によって形成される場合もあるし、不連続である場合、すなわち一次配列中で、例えばHVR/CDRのアミノ酸配列中で、配列上は異なる位置にあるが、結合部位がとる三次元構造では近接しているアミノ酸残基によって形成される場合もある。
【０１０９】
「単離された」抗体とは、その自然環境の構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様において、抗体は、例えば電気泳動（例えばSDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動、CE-SDS）またはクロマトグラフィー（例えばサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換もしくは逆相HPLC）による決定で、純度95％超または99％超まで精製される。抗体純度の評価方法を概観するには、例えばFlatman,S.et al.,J.Chrom.B 848（2007）79-87を参照されたい。
【０１１０】
「単離された」核酸とは、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、その核酸分子を通常含有する細胞に含まれている核酸分子であるが、染色体外に存在するか、その自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が包含される。
【０１１１】
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、例えば天然の変異を含有する抗体変異体、またはモノクローナル抗体調製物の生産中に生じる抗体変異体などといった考えうる抗体変異体を除けば（そのような変異体の存在量は一般に少量である）、前記集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基を指向する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示しているのであって、何か特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるものではない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定するわけではないがハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン座位の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法などといった、さまざまな技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的方法は、本明細書において説明する。
【０１１２】
「ネイティブ抗体」とは、さまざまな構造を持つ天然の免疫グロブリン分子を指す。例えばネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合された2つの同一軽鎖および2つの同一重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端に向かって、可変領域（VH）（可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインともいう）と、それに続く3つの定常ドメイン（CH1、CH2およびCH3）とを有する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端に向かって、可変領域（VL）（可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインともいう）と、それに続く定常軽鎖（CL）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2タイプのうちの一方に割り当てうる。
【０１１３】
「薬学的製剤」という用語は、そこに含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを許すような形態にあって、その製剤を投与されることになる対象にとって許容できないほど毒性である追加の構成成分を含有しない調製物を指す。
【０１１４】
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤または保存剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１５】
本明細書において使用する「組換え抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、創製または単離されるすべての（キメラ、ヒト化およびヒト）抗体を表す。これには、NS0、HEK、BHKもしくはCHO細胞などの宿主細胞から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現プラスミドを使って発現させた抗体が含まれる。そのような組換え抗体は、再編成された形態の可変領域および定常領域を有する。本明細書に掲載される組換え抗体は、インビトロ体細胞超変異を受けうる。したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH配列およびVL配列に由来し、それらに関係するものの、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然には存在しないこともありうる配列である。
【０１１６】
本願において使用される用語「価」は、指定した数の結合部位が（抗体）分子中に存在することを表す。したがって「二価」、「四価」および「六価」という用語は、（抗体）分子中にそれぞれ2つの結合部位、4つの結合部位および6つの結合部位が存在することを表す。本明細書に掲載される二重特異性抗体は、好ましい一態様では、「二価」または「三価」である。
【０１１７】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の、その抗原への結合に関与する、抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインを指す。抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似する構造を有し、各ドメインは4つのフレームワーク領域（FR）と3つの超可変領域（HVR）とを含んでいる（例えばKindt,T.J.et al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.（2007）91頁参照）。単一のVHドメインまたはVLドメインでも、抗原結合特異性を付与するには十分でありうる。さらにまた、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体からのVHドメインまたはVLドメインを使ってそれぞれ相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることによって、単離しうる。例えばPortolano,S.,et al.,J.Immunol.150（1993）880-887、Clackson,T.,et al.,Nature 352（1991）624-628を参照されたい。
【０１１８】
「変異体」という用語は、親分子のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する分子を表す。通例、そのような分子は、1つまたは複数の改変、挿入または欠失を有する。一態様において、修飾抗体または修飾融合ポリペプチドは、自然には存在しないFc領域の少なくとも一部分を含むアミノ酸配列を含む。そのような分子は、親ドメインまたは親Fc領域と、100％未満の配列同一性を有する。一態様において、変異体は、親ドメインまたは親Fc領域のアミノ酸配列と、約75％〜100％未満の、とりわけ約80〜100％未満の、とりわけ約85％〜100％未満の、とりわけ約90％〜100％未満の、とりわけ約95％〜100％未満の、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。一態様において、親ドメインまたは親Fc領域と変異体ドメインまたは変異体Fc領域とは、1つ（単一）、2つまたは3つのアミノ酸残基が相違する。
【０１１９】
本明細書において使用する用語「ドメイン交差」は、抗体重鎖VH-CH1断片とその対応するコグネイト抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体結合アームにおいて（すなわちFab断片において）、少なくとも1つの重鎖ドメインがその対応軽鎖ドメインで置換され、その逆の置換もなされている点で、ドメイン配列が天然配列から逸脱していることを表す。ドメイン交差には3つの一般的タイプ、（i）VL-CH1ドメイン配列を持つドメイン交差軽鎖とVH-CLドメイン配列を持つドメイン交差重鎖断片（またはVH-CL-ヒンジ-CH2-CH3ドメイン配列を持つ完全長抗体重鎖）とをもたらすCH1ドメインとCLドメインとの交差、（ii）VH-CLドメイン配列を持つドメイン交差軽鎖とVL-CH1ドメイン配列を持つドメイン交差重鎖断片とをもたらすVHドメインとVLドメインとのドメイン交差、および（iii）VH-CH1ドメイン配列を持つドメイン交差軽鎖とVL-CLドメイン配列を持つドメイン交差重鎖断片とをもたらす完全軽鎖（VL-CL）と完全VH-CH1重鎖断片とのドメイン交差（「Fab交差」）がある（上述のドメイン配列はいずれもN末からC末に向かう方向に示されている）。
【０１２０】
対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して本明細書において使用する用語「互いに入れ替えられ」るとは、上述のドメイン交差を指す。したがって、CH1ドメインとCLドメインとが「互いに入れ替えられ」ている場合、それは、項目（i）で述べたドメイン交差と、その結果生じる重鎖および軽鎖ドメイン配列とを指す。したがって、VHとVLとが「互いに入れ替えられ」ている場合、それは、項目（ii）で述べたドメイン交差を指し、また、CH1ドメインとCLドメインが「互いに入れ替えられ」かつVH1ドメインとVLドメインとが「互いに入れ替えられ」ている場合、それは、項目（iii）で述べたドメイン交差を指す。ドメイン交差を含む二重特異性抗体は、例えばWO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254およびSchaefer,W.et al,Proc.Natl.Acad.Sci USA 108（2011）11187-11192に掲載されている。
【０１２１】
本明細書に掲載する方法で生産される多重特異性抗体は、上記項目（i）で述べたCH1ドメインとCLドメインとのドメイン交差または上記項目（ii）で述べたVHドメインとVLドメインとのドメイン交差を含むFab断片を含みうる。同じ抗原に特異的に結合するFab断片は、同じドメイン配列を持つように構築される。したがって、あるドメイン交差を伴うFab断片が多重特異性抗体に2つ以上含まれている場合、それらのFab断片は同じ抗原に特異的に結合する。
【０１２２】
II.本発明の具体的方法および化合物
多重特異性抗体、例えば二重特異性または三重特異性抗体における使用に最適な結合物質の組合せを同定するには、可能な限り多くの組合せを試験することが望ましい。それゆえに、それぞれが異なる結合特異性を持つ多数の異なる結合部位、すなわち結合物質を互いに組み合わせて、結合アッセイまたは機能アッセイにおいて最適な組合せをスクリーニングすることを可能にする方法が必要になる。
【０１２３】
例えば、第1結合特異性を持つ第1の多数の結合部位の各結合物質（例えば異なる軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインペア、Fv断片）を、第2結合特異性を持つ第2の多数の部位の各結合物質（例えば同じ抗原上の異なるエピトープに結合するか異なる抗原に結合するもの）と組み合わせる。これは、該第1多数の結合部位と該第2多数のそれぞれとの各組合せを包含する組合せマトリックス（combination matrix）の調製をもたらす。加えて、また好ましくは、この組合せマトリックスには、価数および機能性に関して異なるフォーマットも含まれる。生成した多重特異性抗体を、次に、所望の機能性を有する組合せおよびフォーマットを（例えば機能的性能および/または医薬品開発にとって望ましく重要なパラメータに応じてランク付けすることなどによって）同定するためのアッセイに供する。2特異性の組合せマトリックスのサイズは、入力分子数の線形的増加に伴って指数的に増大する。例えば100種の「A結合物質」と100種の「B結合物質」は、10,000種の異なる「A＋B-bsAb」（bsAb＝二重特異性抗体）を生じる。個々のデザインおよび発現カセットの生成と、それに続く発現および精製による、そのような多数の異なるA＋B bsAbの生成は、面倒であり、評価することができるマトリックスのサイズに制限を課す。
【０１２４】
数多くの異なる入力実体（異なる特異性、エピトープ、ジオメトリー、アフィニティーおよび/または価数）の組合せの生成およびスクリーニングから、少なくとも2つの課題、すなわちアビディティによる結合の改良（avidity-mediated binding improvement）およびアゴニストbsAbの生成が恩恵を受ける。
【０１２５】
アビディティによる結合の改良は、一価型では結合機能性がわずかであるか結合機能性がなく、2つの（異なる）一価結合部位を物理的につないで二価（さらには多価）bsAbにすることによって初めて結合機能性を獲得する抗体誘導体に基づく。二価性または多価性は、特異性が2つの異なる結合部位の結合に依存するアビディティを生成する。
【０１２６】
二重特異性または多重特異性アゴニスト抗体の原理も類似しており、機能性は、異なる抗原の同時結合（これは架橋を含みうる）によって引き出され、一価結合体の結合だけでは活性がない。
【０１２７】
上記の原理の共通項は（個々の一価結合体には機能性がないか、あってもわずかであることと）二価または多価の組合せが持つ望ましい機能性である。望ましい結合部位の組合せの同定は、（二価性または多価性によって媒介される）アビディティによる結合またはアゴニストbsAbの結合および/または機能の評価に基づく。したがってこのスクリーニングには、試験抗体、すなわち例えば本発明の交換反応によって生成したbsAbが、残存（二価）単一特異性分子を一切含有しないことが要求される。それらは偽陽性結果を生じうるからである。同じ理由で同等にまたはそれ以上に妨げとなるのは、多価反応副生成物、例えば凝集物などである。
【０１２８】
（A）単一特異性一価IgG誘導体を二重特異性二価IgGに変換するための方法
本発明の方法により、単一特異性（一価）抗体または抗体断片の、二価bsAbへの変換が達成される。これらの方法は、未変換出発材料、および二価だが単一特異性である副生成物、および反応中に形成される凝集物の、容易な除去を可能にする。すなわち本発明の方法は、なかんずく、二価単一特異性抗体および望ましくない凝集物が最終調製物中に存在するという少なくとも2つの問題を解決する。
【０１２９】
これを達成するために、2つの非機能的半抗体（単一特異性のみ）が出発材料として使用される。例えば、いわゆる2/3-IgGを出発材料として使用することができる。2/3-IgGは、第1ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）（KiH）変異セットを持つ重鎖、それに相補的な軽鎖、ならびにそれぞれの第2相補ノブ・イントゥ・ホール変異セットによって前記重鎖のFc領域に対して相補的にしたFc領域で構成される。相補的Fc領域は、例えばFc領域重鎖断片または第2重鎖であることができる。所望の二重（多重）特異性抗体の正しい組立てをさらに促進するために、相補的Fc領域は、第2相補KiH変異セットの他に、追加の撹乱（不安定化）反発電荷導入変異も含む。加えて、相補的Fc領域は、反応後に望ましくない遊離体（educt）および生成物を効率よく除去するためのアフィニティータグ（例えばHis6またはC-タグ）を含みうる。第2の2/3-IgGは、例えば混合時に、抗体の半分（antibody-half）が互いに交換すれば、誘引的変異に変わる相補的撹乱変異を含む。
【０１３０】
本発明の交換反応/方法は以下の工程:
・第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1（出発）ヘテロ二量体ポリペプチドを、第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2（出発）ヘテロ二量体ポリペプチドと共にインキュベートすることで、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを交差的に交換して、第3ヘテロ二量体ポリペプチドおよび第4ヘテロ二量体ポリペプチドを形成させる工程、および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4（交換済み）ヘテロ二量体ポリペプチドを回収する工程
を含み、ここで、
（i）第2ポリペプチドは、第2ポリペプチド中の変異を除けば第1ヘテロ二量体ポリペプチドと同一である（ヘテロ二量体）ポリペプチドと比べて、第1ヘテロ二量体ポリペプチドの不安定化をもたらす（第1撹乱）変異を含み、
（ii）第3ポリペプチドは、第3ポリペプチド中の変異を除けば第2（ヘテロ二量体）ポリペプチドと同一であるヘテロ二量体ポリペプチドと比べて、第2ヘテロ二量体ポリペプチドの不安定化をもたらす（第2撹乱）変異を含み、
（iii）第2ポリペプチド中の（第1撹乱）変異と第3ポリペプチド中の（第2撹乱）変異は、第1（出発）ヘテロ二量体ポリペプチドおよび/または第2（出発）ヘテロ二量体ポリペプチドと比べて、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3（交換済み）ヘテロ二量体ポリペプチドの安定化をもたらし、
（iv）第4（交換済み）ヘテロ二量体ポリペプチドは、第1（出発）ヘテロ二量体ポリペプチドおよび/または第2（出発）ヘテロ二量体ポリペプチドと比べて、より安定である。
【０１３１】
このように本発明は、少なくとも部分的には、ヘテロ二量体ポリペプチドに単一（ペアではなく片側）の不安定化（撹乱）変異を加えれば、同様に単一（ペアではなく片側）の不安定化（撹乱）変異を含む第2ヘテロ二量体ポリペプチドとのポリペプチド鎖交換を促進するには十分であるという知見に基づく。というのも、結果として新しく形成される交換済みヘテロ二量体ポリペプチドは、どちらも、出発ヘテロ二量体ポリペプチドと比べて改良された安定性（すなわち低下したCH3-CH3結合自由エネルギー）を有するからである。従う必要がある唯一の条件は、不安定化（撹乱）変異が、それぞれのポリペプチドが互いに会合したときに、互いに相互作用する位置に導入されることである。
【０１３２】
この方法論は、上に概説した基準を満たす任意のヘテロ二量体ポリペプチドに適用することができる。
【０１３３】
とはいえ、本発明の方法は医薬分野ではとりわけ有用である。
【０１３４】
本発明の方法では、交換反応中に互いに会合する各ヘテロ二量体出発ポリペプチドのそれぞれのポリペプチドが1つまたは複数の結合部位を含むのであれば、二重特異性結合物質の大きなライブラリーを、容易に生成させることができる。したがって、本発明の方法で得られる交換済みヘテロ二量体ポリペプチドのうちの1つはこれらの結合部位を含むことになる。
【０１３５】
当技術分野では、ヘテロ二量体ポリペプチドを生成させるためのさまざまな方法が公知である。これらの方法はいずれも、出発ヘテロ二量体ポリペプチドの形成に要求される変異が本発明の交換反応に必要な（撹乱）不安定化変異と干渉またはオーバーラップしない限り、使用することができる。
【０１３６】
医薬分野に話を戻すと、抗体は最も広く使用されている種類の結合物質である。抗体は、それらの定常領域における相互作用、とりわけ重鎖のCH3ドメイン間の相互作用によって、二量体化する。
【０１３７】
したがって本発明は、少なくとも部分的には、本発明の方法を行うには、CH3ドメインのペアのうちの一方のCH3ドメインに単一の不安定化変異を導入すれば十分であるという知見に基づく。より具体的には、第1出発ヘテロ二量体ポリペプチドの片方のCH3ドメインの357番目に第1不安定化変異を導入し、第2出発ポリペプチドの片方のCH3ドメインの370番目に第2不安定化変異を導入すれば、それら2種の出発ヘテロ二量体ポリペプチドをインキュベートしたときに、これらの出発ポリペプチド間でのポリペプチド鎖の自発的交換が促進されることがわかった。結果として生じる交換済みポリペプチドのうちの一方は、それぞれ357番目と370番目に変異を持つCH3ドメインのペアを含み、それが交換済みヘテロ二量体の安定化をもたらす。同様のことを356番目および439番目における変異でも達成することができる。すべての位置のナンバリングはKabatのEUインデックスに従う。変異の好ましいペアの一つはE357KとK370Eである。変異の別の好ましいペアはD356KとK439Eである。問題の残基は高度に保存されているので、本発明の方法は、任意のIgGサブクラス、すなわちIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に適用することができる。好ましい一態様において、CH3ドメインはIgG1サブクラスである。
【０１３８】
本発明は、少なくとも部分的には、出発ヘテロ二量体ポリペプチドのポリペプチド鎖が、例えばジスルフィド結合などを介して互いに共有結合されていなくても、出発ヘテロ二量体ポリペプチドの形成および単離は可能であるという知見に基づく。より詳しく述べると、出発ポリペプチドは既にヘテロ二量体であるから、これらはヘテロ二量体化のためのさらなる変異を含むことになる。これらの変異は、不安定化（撹乱）単一片側変異の存在下でさえ、出発ヘテロ二量体を安定化するのに十分であることがわかった。これにより、出発ヘテロ二量体ポリペプチド中の鎖を共有結合する必要は、もはやない。したがって一態様において、ヒンジ領域を含有する出発ヘテロ二量体ポリペプチドの場合、これらのヒンジ領域は、変異C226SおよびC229Sを含むか、CPXC（SEQ ID NO:89）配列全体の欠失を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０１３９】
ヘテロ二量体出発ポリペプチドのFc領域を含む鎖間のジスルフィド結合を省くことにより、交換反応を開始させるために還元剤を加える必要がなくなる。これにより、より温和な反応条件が可能になる。加えて、ジスルフィド結合が、出発ヘテロ二量体ポリペプチドに、例えばFab断片などに、存在してもよい。
【０１４０】
本発明は、少なくとも部分的には、交換済みヘテロ二量体ポリペプチド、例えば結合部位を含むものが、交換反応後に限って、ジスルフィド結合の形成によって、さらに安定化されうるという知見に基づく。例えば、ヘテロ二量体抗体を形成させるための確立された変異は、ノブズ・イントゥ・ホールズ（knobs-into-holes）変異である。これらには、追加のジスルフィド結合を持つものと持たないものという、2つの変異体がある。したがって、代替的出発ヘテロ二量体ポリペプチドの1つは、出発ヘテロ二量体ポリペプチドを形成させるためのノブズ・イントゥ・ホールズ変異を含み、結合部位を保持するポリペプチド鎖にのみ、ノブズ・イントゥ・ホールズ・システイン残基を設ける。これにより、結合部位を含む交換済みヘテロ二量体ポリペプチドでのみ、ジスルフィド結合の形成に必要な両システイン残基が、対応する適合した位置に存在することになる。したがって、該交換生成物でのみ、ジスルフィド結合が形成される。これは、標的とする交換済みヘテロ二量体ポリペプチドのさらなる安定化をもたらす。
【０１４１】
本発明は、少なくとも部分的には、（撹乱）不安定化変異も含んでいるポリペプチド鎖のそれぞれにおけるタグの存在により、結合部位を含む交換済みヘテロ二量体ポリペプチドの生成が改良されるという知見に基づく。例えば、結合部位を含む交換済みヘテロ二量体ポリペプチドだけが該タグを含まないので、未反応出発材料および標的でない交換済みヘテロ二量体ポリペプチドからの分離が可能である。
【０１４２】
本明細書において使用する「ヘテロ二量体」という用語は、アミノ酸配列が部分的にまたは完全に同一でなく、本発明の要件を満たす、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含むポリペプチドを表す。この用語は、3つ以上のポリペプチド鎖を含むポリペプチドも、それらのうちの少なくとも2つが本発明のヘテロ二量体である限り、包含する。したがって「多量体」という用語は、少なくとも3つのポリペプチド鎖を含み、そのうちの少なくとも2つがヘテロ二量体であって本発明の要件を満たすポリペプチドを表す。
【０１４３】
「撹乱変異」という用語は、（ヘテロ）二量体ポリペプチドの不安定化をもたらす変異を表す。この不安定化は、一般的には、アミノ酸残基の電荷を変えることによって、例えば正荷電アミノ酸残基を負荷電アミノ酸残基と交換することまたはその逆などによって、達成される。そのような交換は、相互作用する位置に類似する電荷をもたらし、したがって電荷反発をもたらす。変異の好ましいペアの一つはE357KとK370Eである。変異の別の好ましいペアはD356KとK439Eである。加えて、問題の残基は高度に保存されているので、本発明の方法は、任意のIgGサブクラス、すなわちIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に適用することができる。好ましい一態様において、CH3ドメインはIgG1サブクラスである。
【０１４４】
二量体の安定化に対するCH3ドメイン変異の効果を評価する方法は、WO 2009/089004（参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている。この文献では、次のとおり、EGADソフトウェアを使ってCH3-CH3ドメイン結合自由エネルギーを見積る方法が概説されている（参照によりその全体が本明細書に組み入れられるPokala,N.and Handel,T.M.,J.Mol.Biol.347（2005）203-227も参照されたい）:
EGADは、CH3ドメイン境界面に加えられたさまざまな変異の結合自由エネルギーを比較するために使用することができる。変異型の結合自由エネルギーはΔΔGmut＝μ（ΔGmut-ΔGwt）（mut＝変異型、wt＝野生型）と定義される。ここで、μ（一般的には＝0.1）は、結合アフィニティーの予測される変化を、実験的エネルギーと比較したときに傾きが1になるように標準化するために使用される換算係数（scaling factor）である。解離の自由エネルギー（ΔG）は、複合体（ΔGbound）と遊離状態（ΔGfree）の間のエネルギー差と定義される。
【０１４５】
以下の説明では、具体的な例示的出発材料、すなわち2/3-IgGで、本発明を例示する。これは、基礎をなす一般概念の実例として提示されるのであって、本発明の限定と解釈してはならない。本発明の真の範囲は特許請求の範囲に記載される。
【０１４６】
図1は、本発明の方法において例示的出発化合物として使用される2/3-IgGのデザインおよびモジュラー組成を示している。2/3-IgGは、3つの個別の鎖、すなわち1つの軽鎖（通常は軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む完全長軽鎖）、1つの重鎖（通常は重鎖可変ドメインとヒンジ領域を含むすべての重鎖定常ドメインとを含む完全長重鎖）および1つの相補的重鎖Fc領域ポリペプチド（通常は少なくともヒンジの断片およびCH2-CH3を含む重鎖Fc領域断片）で構成される。軽鎖と重鎖の可変ドメインは機能的結合部位、すなわちVH-VLペアを形成する。重鎖（通常はヒトIgG1サブクラスのもの）は、ノブ・イントゥ・ホールFc領域ヘテロ二量体の形成が可能になるように、CH3ドメイン中に（i）ノブ変異またはホール変異（抗体重鎖のCH3ドメイン中の変異T366Wは「ノブ変異」と表され、抗体重鎖のCH3ドメイン中の変異の組合せT366S/L368A/Y407Vは「ホール変異」と表される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う））または（ii）ノブ-cys変異またはホール-cys変異（抗体重鎖のCH3ドメイン中の変異の組合せT366W/S354Cは「ノブ-cys変異」と表され、抗体重鎖のCH3ドメイン中の変異の組合せT366S/L368A/Y407V/Y349Cは「ホール-cys変異」と表される;逆の設定、すなわちT366W/Y349CおよびT366S/L368A/Y407V/S354Cも、同様に可能である（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う））のどちらか一方を含有する。相補的重鎖Fc領域ポリペプチドは、「ダミーFc」（dummy-Fc）、すなわちVHおよびCH1を欠き、N末端がヒンジ領域配列（またはその断片）から始まり、そのC末端に精製タグ、例えばHis6もしくはHis8またはC-タグを保持するIgG1誘導体と表すこともできる。加えて、2/3-IgGの相補的重鎖Fc領域ポリペプチドは、そのCH3ドメインに、重鎖中の変異に応じてノブ変異またはホール変異のどちらか一方を含有する。ノブ変異またはホール変異に加えて、重鎖Fc領域ポリペプチドは、野生型配列に関して1つの（すなわち単一の追加）反発電荷を導入する少なくとも1つの撹乱（すなわち不安定化）変異、例えばそれぞれD356KまたはE357Kを、それぞれK370EまたはK439Eとの組合せで含む（SEQ ID NO:35、36、37および38、これらは本発明の局面でもある）（図2参照）。以下の説明では、そのような変異型重鎖Fc領域ポリペプチド（mutated heavy chain Fc-region polypeptide）をMHCFcRPと表す。
【０１４７】
重鎖とMHCFcRPは、ノブ・イントゥ・ホール変異の分布に応じて、以下の2タイプのヘテロ二量体を形成することができる:
（i）重鎖-ノブ（-cys）::MHCFcRP-ホール、および
（ii）重鎖-ホール（-cys）::MHCFcRP-ノブ。
【０１４８】
したがって2/3-IgGは、軽鎖が会合しているヘテロ二量体、すなわちヘテロ三量体である。しかし、これらには多少の「欠陥」がある。というのも、MHCFcRP中の電荷変異は、適合する対応物を重鎖中に持たず、重鎖中に存在するとしても、MHCFcRPは重鎖への鎖間ジスルフィド結合を形成するために必要な追加のCH3システインを欠くからである。
【０１４９】
2/3-IgGは、通常のIgGと同様の収率で発現させ精製することができる一価で非二量体化性/非凝集性の1アーム抗体誘導体である（図3参照）。これは出発材料の一価性を保証する。二価2/3-IgGが使用される場合、それは単一特異性および二重特異性でありうる。
【０１５０】
しかしこれらの欠陥2/3-IgGを構成するポリペプチドは、図4に示すように、二重特異性抗体へと再編成する能力を有する。
【０１５１】
2種の出発分子間での交換反応は、KiH（ノブズ・イントゥ・ホールズ）重鎖（H鎖）相互のより良い相補性（電荷反発がないこと、および任意で、遊離のシステイン残基が存在する場合にはジスルフィド結合の形成）によって、および2種のMHCFcRP相互のより良い相補性によって推進される。この反応では、2種の出発分子のFc領域複合体が解離し、ポリペプチドを交換することで、2種の、より有利な複合体を形成する。これは反応を以下のように推進する。
2021500348.tif 000036
【０１５２】
図4に図示する例では、出発2/3-IgG（A）の重鎖（ノブ-cys）と出発2/3-IgG（B）の重鎖（ホール-cys）とが、適合する二重特異性抗体ヘテロ四量体（2×HC＋2×LC）を形成する。
【０１５３】
交換反応は（ヒンジ領域/重鎖間ジスルフィド結合が存在する場合には）ジスルフィド結合を切るための還元工程によって開始される。ヒンジ領域ジスルフィド結合非含有（disulfide-bond-free）2/3-IgGを使用する場合には、還元工程を省くことができる（下記参照）。その後は鎖再編成が自発的に起こる。
【０１５４】
すべての2/3-IgG出発分子、すべての二量体MHCFcRP副生成物および交換反応中に形成されうるすべての凝集物は、少なくとも1つのアフィニティータグ（例えばHis6またはHis8またはC-タグ）を含む。したがって、1回の、簡単な、そしてハイスループットに対応できる吸収（アフィニティークロマトグラフィー）工程を使って、凝集物を含む望ましくない分子をすべて除去することができる。例えばHis6タグの場合、この工程は金属キレートアフィニティークロマトグラフィーである（図6および図7参照）。結果として生じる精製bsAbは、そのまま、所望の機能性を持つbsAbを同定するためのスクリーニング手順に、適用することができる（図8参照）。
【０１５５】
下記の実施例、とりわけ実施例1〜5を参照されたい。
【０１５６】
（B）一価および/または二価の単一特異性または二重特異性IgG誘導体を二価、三価または四価の二重、三重または四重特異性抗体に変換するための方法
本発明の方法では、異なる結合特異性を組み合わせることが可能であるばかりでなく、それと同時に、それらの組合せを異なるフォーマット内でかつ異なる価数で生産することも可能である。これは、上記のセクションで概説した方法において使用される出発材料を拡張することによって達成される。
【０１５７】
例えば、上記のセクションで概説した2/3-IgGから出発して、MHCFcRPはそのまま変化させないが、重鎖は異なるフォーマットで使用する。そのようなフォーマットは、例えばC末端もしくはN末端に1つの結合部位を有するか、または各末端に1つ（N末端に1つとC末端に1つ）で2つの結合部位を有する鎖であることができる（図9および図10参照）。
【０１５８】
この例では、異なる結合部位、異なる価数、異なるジオメトリーおよび個々の結合部位の異なる三次元配置/位置を有する9つの異なるbsAbフォーマットが結果的に生じるように、本発明の方法において3つの異なる出発フォーマット（N末端結合部位、C末端結合部位、N末端およびC末端結合部位）を互いに組み合わせた（図11参照）。
【０１５９】
一例として、50種の「結合物質A」出発分子と50種「結合物質B」出発分子を、それぞれ3つのフォーマット（N末端結合部位、C末端結合部位、N末端およびC末端結合部位）で発現させることで、結果として、出発分子としての各結合物質につき、150（3×50）種の2/3-IgG調製物を生じさせることができる。次に、これらを本発明の方法でシャッフルして組み合わせることができる。これにより、22,500（50×3×50×3）の異なるbsAbが生成する。
【０１６０】
bsAbの生成に関して、交換を推進する原理（欠陥入力分子から適合出力分子への変換）は変わらない。MHCFcRPも保たれる。したがって重鎖だけを変化/多様化させる。
【０１６１】
図1および図9〜10は、3つの異なる出発分子（N末端、C末端、N末端およびC末端結合部位を持つ2/3-IgG）が、本発明の交換反応において互いに組み合わされて、9つの異なる二重特異性フォーマットをもたらすことを示している。これらは、価数、ジオメトリーおよび個々の結合部位のさまざまな位置が異なる。
【０１６２】
この理論に拘泥するわけではないが、2つの異なる2/3-IgGの欠陥ヘテロ多量体の一時的な分離に基づく交換反応は、優先的に適合するFc領域ヘテロ二量体を含有する生成物をもたらすはずであると考えられる。それゆえに交換は、単一特異性2/3-IgGを、（さまざまなフォーマットの）二重特異性IgGと、対応するFc領域ヘテロ二量体とに変換する。
【０１６３】
交換反応の例示的説明のために、入力分子を以下のように名付ける:
・重鎖（H鎖）の通常のN末端にFabアームを有する分子については「nAまたはnB」、
・H鎖のC末端にFabアームを有する分子については「cAまたはcB」、
・H鎖のN末端とC末端にFabアームを有する分子については「ncAまたはncB」。
【０１６４】
さまざまなフォーマット交換反応は以下のとおりである:
2/3-IgG（nA）-タグ＋2/3-IgG（nB）-タグ→bsAb（nAnB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（nA）-タグ＋2/3-IgG（cB）-タグ→bsAb（nAcB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（nA）-タグ＋2/3-IgG（ncB）-タグ→bsAb（nAncB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（cA）-タグ＋2/3-IgG（cB）-タグ→bsAb（cAcB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（cA）-タグ＋2/3-IgG（nB）-タグ→bsAb（cAnB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（cA）-タグ＋2/3-IgG（ncB）-タグ→bsAb（cAncB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（ncA）-タグ＋2/3-IgG（nB）-タグ→bsAb（ncAnB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（ncA）-タグ＋2/3-IgG（cB）-タグ→bsAb（ncAcB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（ncA）-タグ＋2/3-IgG（ncB）-タグ→bsAb（ncAncB）＋（MHCFcRP）2-タグ
【０１６５】
ヒンジ領域ジスルフィド結合が存在する場合、交換反応は、鎖間ヒンジ領域ジスルフィド結合を切るための還元工程によって開始される。鎖交換と再編成は自発的に起こった。すべての入力分子、すべての副生成物および交換反応中に潜在的に形成されうるすべての凝集物はアフィニティータグ（例えばHis6）を保持する。しかし、交換反応において生産される所望のbsAbは、アフィニティータグを担持せず、それゆえにNiNTAアフィニティークロマトグラフィー（吸収）によって除去することができた。（さまざまなフォーマットの）残存bsAbは、最適な機能性を持つフォーマットのbsAbを同定しランク付けするためのスクリーニング手順および分析にそのまま適用することができる。
【０１６６】
実施例6および実施例7を参照されたい。
【０１６７】
本発明の方法の一般的利用可能性を示すために、さらなる2/3-IgGベースのフォーマット変異体を調製し、本発明の交換反応に供した。
【０１６８】
（i）非抗体結合物質:
さらなるフォーマットとして、1つの2/3-IgGのFab領域をアフィボディ（affibody）で置き換えた（図19参照）。交換反応は同様に奏効した（図23参照、ELISA結果）。
【０１６９】
実施例13参照。
【０１７０】
（ii）Fab領域における第3結合部位（VH/VLペア）の付加:
さらなるフォーマットでは、2/3-IgGの一方が第2のFab領域を含んだ（Fab延長型2/3-IgG;図26参照）。交換反応は同様に奏効した（図27参照）。
【０１７１】
交換反応を説明するために、入力分子を以下のように名付ける:
・重鎖の通常のn末端に2つのFabアームを有する分子（Fab延長型2/3-IgG）については「dA」
・重鎖（H鎖）の通常のN末端にFabアームを有する分子については「nB」、
・H鎖のC末端にFabアームを有する分子については「cB」、
・H鎖のN末端およびC末端にFabアームを持つ分子については「ncB」。
【０１７２】
さまざまなフォーマット交換反応は以下のとおりである:
2/3-IgG（dA）-タグ＋2/3-IgG（nB）-タグ→bsAb（dAnB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（dA）-タグ＋2/3-IgG（cB）-タグ→bsAb（dAcB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（dA）-タグ＋2/3-IgG（ncB）-タグ→bsAb（dAncB）＋（MHCFcRP）2-タグ
【０１７３】
実施例9、15および16参照。
【０１７４】
（iii）拘束型（constrained）結合物質:
さらなるフォーマットでは、2/3-IgGの一方が、Fab領域の代わりに、WO 2017/191101（参照により本明細書に組み入れられる）に記載の拘束型結合物質を含んだ（拘束型2/3-IgG、conA、conB;図31参照）。交換反応は同様に奏効した（図32、33および34参照）。
【０１７５】
交換反応を説明するために、入力分子を以下のように名付ける:
・Fc領域のN末端側にある結合部位の第1部分とFc領域のC末端側にある結合部位の第2部分とを含む拘束型結合部位を有する分子については「conAまたはconB」。ここで、第1部分と第2部分は互いに会合して、結合部位を形成し、これらの分子は環状である。
・重鎖（H鎖）の通常のN末端にFabアームを有する分子については「nAまたはnB」、
・H鎖のC末端にFabアームを有する分子については「cAまたはcB」、
・  H鎖のN末端およびC末端にFabアームを持つ分子については「ncAまたはncB」。
【０１７６】
さまざまなフォーマット交換反応は以下のとおりである:
2/3-IgG（conA）-タグ＋2/3-IgG（nB）-タグ→bsAb（nAnB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（conA）-タグ＋2/3-IgG（cB）-タグ→bsAb（nAcB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（conA）-タグ＋2/3-IgG（ncB）-タグ→bsAb（nAncB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（conA）-タグ＋2/3-IgG（conB）-タグ→bsAb（conAconB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（nA）-タグ＋2/3-IgG（nB）-タグ→bsAb（nAnB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（nA）-タグ＋2/3-IgG（cB）-タグ→bsAb（nAcB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（nA）-タグ＋2/3-IgG（ncB）-タグ→bsAb（nAncB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（nA）-タグ＋2/3-IgG（conB）-タグ→bsAb（nAconB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（cA）-タグ＋2/3-IgG（cB）-タグ→bsAb（cAcB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（cA）-タグ＋2/3-IgG（nB）-タグ→bsAb（cAnB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（cA）-タグ＋2/3-IgG（ncB）-タグ→bsAb（cAncB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（cA）-タグ＋2/3-IgG（conB）-タグ→bsAb（cAconB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（ncA）-タグ＋2/3-IgG（nB）-タグ→bsAb（ncAnB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（ncA）-タグ＋2/3-IgG（cB）-タグ→bsAb（ncAcB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（ncA）-タグ＋2/3-IgG（ncB）-タグ→bsAb（ncAncB）＋（MHCFcRP）2-タグ
2/3-IgG（ncA）-タグ＋2/3-IgG（conB）-タグ→bsAb（ncAconB）＋（MHCFcRP）2-タグ
【０１７７】
実施例21参照。
【０１７８】
（C）Fc領域鎖間ジスルフィド結合と還元工程の排除
重鎖鎖間ジスルフィド結合は抗体を安定化し、ヒンジにつながれたFabアームの可動性を規定している。ヒンジ領域を含む出発抗体の交換アプローチは、交換反応前または交換反応中にこれらのジスルフィドを還元することと、交換反応が完了した後に還元剤を除去することとを必要とする（実施例3および実施例7参照）。そのような還元工程を回避することは、いくつかのアプローチにとって望ましい場合があり、交換生成物の下流プロセシングを容易にしうる。
【０１７９】
したがって本明細書には、本発明の別の一局面として、ヒンジ領域は有するが鎖間ヒンジ領域ジスルフィド結合は有しない出発分子の交換反応が掲載される。
【０１８０】
これを例示するために、Fc領域中のすべてのジスルフィド結合が排除されている2/3-IgGを生産した。そのようなジスルフィド枯渇（disulfide-depleted）2/3-IgGは、それらの鎖間ジスルフィド結合がなくても、効果的に生産され、精製されうることがわかった（図15参照）。本発明の方法においてそのようなジスルフィド枯渇2/3-IgGを出発分子として使用すると、出発分子の還元と交換反応後の還元剤の除去とを省くことができる。これにより、bsAbを生成させるための改良された手順が提供される（プロセシング工程が少なく、副生成物が少ない）。これらのジスルフィド枯渇2/3-IgGから生産されたbsAbは機能的かつ安定であり、鎖間ジスルフィド結合なしで非共有結合的Fc-Fc相互作用によって一つにまとまっている（図16または図17参照）。
【０１８１】
したがって、Fc-Fc/ヒンジ領域鎖間ジスルフィド結合の除去により、交換反応を開始させるための還元工程の必要がなくなる。結果として生じるbsAbは機能的二重特異性分子であり、Fc領域鎖間ジスルフィド結合なしで非共有結合的Fc-Fc相互作用によって一つにまとまっている。このように、Fc-Fc鎖間ジスルフィドの排除は、還元と再酸化の必要がない、すなわち生理的条件下での、対応するFc領域ミスマッチ推進型（mismatch driven）交換反応を可能にする。これは調製手順および（ハイスループット）スクリーニング手順を容易にする。
【０１８２】
一態様において、ヒンジ領域はジスルフィド結合を含有しない。ジスルフィド結合非含有ヒンジ領域は、SEQ ID NO:32の配列においてシステイン残基の代わりにセリン残基を含む。反応は、ヒンジ領域ジスルフィド結合があってもなくても効率がよい（図24、実施例3または12によるELISA参照）。
【０１８３】
ジスルフィド結合の除去の他に、追加でヒンジ領域を短縮することもできる。そのような修飾ヒンジ領域を使用することにより、個々の結合部位間にさまざまな距離を与える二重特異性抗体を得ることができる（図25参照）。したがって一態様において、ヒンジ領域は、SEQ ID NO:31（HTCPXCP、X＝SまたはP）、またはSEQ ID NO:85（HTSPXSP、X＝SまたはP）、またはSEQ ID NO:86（HTPAPE;SEQ ID NO.31のCPXCが欠失している）のアミノ酸配列を有する。
【０１８４】
実施例10、11、18および19参照。
【０１８５】
2/3-IgGの組立て濃度（assembly-concentration）は、鎖交換反応の効率に影響を及ぼし、それにより、形成される二重特異性抗体の量に影響を及ぼすことがわかった。一態様において、効率のよい鎖交換反応を保証するために、2/3-IgGの濃度は少なくとも0.1μM、すなわち0.1μM以上（1 Mまで）、好ましい一態様では1μM以上である。
【０１８６】
実施例20および図30参照。
【０１８７】
好ましい一態様では、出発多量体が等モル濃度で混合される。
【０１８８】
（D）Fc領域変異体
一定の態様では、本明細書に提供される2/3-IgGのFc領域に1つまたは複数のさらなるアミノ酸修飾を導入することにより、Fc領域変異体を生成させうる。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトFc領域配列（例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域）を含みうる。
【０１８９】
一定の態様において、本発明では、全部ではなく一部のエフェクター機能を保有する2/3-IgG変異体が考えられる。これは、その2/3-IgG変異体を、インビボ半減期は重要であるが、一定のエフェクター機能（例えば補体およびADCC）は不必要であるか有害であるような応用にとって、望ましい候補にする。CDC活性および/またはADCC活性の低減/枯渇を確認するために、インビトロおよび/またはインビボ細胞傷害性アッセイを行うことができる。例えば、2/3-IgGがFcγR結合を欠く（それゆえにおそらくはADCC活性を欠く）が、FcRn結合能は保っていることを保証するために、Fc受容体（FcR）結合アッセイを行うことができる。ADCCを媒介するための主要細胞であるNK細胞がFcγRIIIだけを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9（1991）457-492の464頁のTable 3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、US 5,500,362（例えばHellstrom,I.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83（1986）7059-7063、およびHellstrom,I.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82（1985）1499-1502参照）、US 5,821,337（Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166（1987）1351-1361参照）に記載されている。あるいは、非放射性のアッセイ方法を使用してもよい（例えばフローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology,Inc.、カリフォルニア州マウンテンビュー）およびCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega、ウィスコンシン州マディソン）参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核球（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が挙げられる。これに代えて、またはこれに加えて、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えばClynes,R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95（1998）652-656に開示されているような動物モデルで、評価することもできる。抗体がC1qに結合することができず、したがってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合アッセイを行うこともできる（例えばWO 2006/029879およびWO 2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい）。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行うことができる（例えばGazzano-Santoro,H.et al.,J.Immunol.Methods 202（1996）163-171、Cragg,M.S.et al.,Blood 101（2003）1045-1052およびCragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103（2004）2738-2743を参照されたい）。FcRn結合およびインビボクリアランス/半減期の決定も、当技術分野において公知の方法を使って行うことができる（例えばPetkova,S.B.et al.,Int.Immunol.18（2006:1759-1769参照）。
【０１９０】
低減したエフェクター機能を持つFc領域を含む2/3-IgGとしては、Fc領域残基238、265、269、270、297、327および329のうちの1つまたは複数の置換を持つものが挙げられる（US 6,737,056）。そのようなFc領域変異型としては、残基265および297がアラニンに置換されているいわゆる「DANA」Fc領域変異型（US 7,332,581）を含めて、アミノ酸位置265、269、270、297および327のうちの2つ以上に置換を持つFc領域変異型が挙げられる。
【０１９１】
一定の2/3-IgGはFcRへの結合が改良または縮減されているFc領域変異体を含む（例えばUS 6,737,056、WO 2004/056312およびShields,R.L.et al.,J.Biol.Chem.276（2001）6591-6604を参照されたい）。
【０１９２】
一定の態様において、2/3-IgGは、ADCCを改良する1つまたは複数のアミノ酸置換、例えばFc領域の298、333および/または334番目（残基のEUナンバリング）に置換を持つ、Fc領域変異体を含む。
【０１９３】
いくつかの態様では、例えばUS 6,194,551、WO 99/51642およびIdusogie,E.E.et al.,J.Immunol.164（2000）4178-4184に記載されているように、C1q結合および/または補体依存性細胞傷害（CDC）の改変（すなわち改良または縮減のどちらか）をもたらす改変が、Fc領域に加えられる。
【０１９４】
増加した半減期を持ち、胎児への母体IgGの移行の原因となる新生児型Fc受容体（FcRn）（Guyer,R.L.et al.,J.Immunol.117（1976）587-593およびKim,J.K.et al.,J.Immunol.24（1994）2429-2434）に対する結合が改良されている抗体が、US 2005/0014934に記載されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を改良する1つまたは複数の置換を持つFc領域を含む。そのようなFc領域変異体として、Fc領域残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424または434のうちの1つまたは複数に置換を持つもの、例えばFc領域残基434の置換を持つものが挙げられる（US 7,371,826）。
【０１９５】
Fc領域変異体の他の例については、Duncan,A.R.and Winter,G.,Nature 322（1988）738-740、US5,648,260、US5,624,821およびWO94/29351も参照されたい。
【０１９６】
すべての局面の一態様において、2/3-IgGは、
（i）両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、L234AおよびL235Aを持つヒトIgG1サブクラスのFc領域、または
（ii）両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、S228PおよびL235Eを持つヒトIgG4サブクラスのFc領域、または
（iii）両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを持つか、または両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、L234A、L235A、H310A、H433A、およびY436Aを持つ、ヒトIgG1サブクラスのFc領域、または
（iv）両Fc領域ポリペプチドが変異P329G、L234AおよびL235Aを含み、かつ
（a）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368AおよびY407Vを含むか、または
（b）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、または
（c）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407VおよびY349Cを含む
ヒトIgG1サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、または
（v）両Fc領域ポリペプチドが変異P329G、S228PおよびL235Eを含み、かつ
（a）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368AおよびY407Vを含むか、または
（b）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、または
（c）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407VおよびY349Cを含む、
ヒトIgG4サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、または
（vi）（i）、（ii）および（iii）のうちの1つと（iv）および（v）のうちの1つとの組合せ
を含む（位置はいずれもKabatのEUインデックスに従う）。
【０１９７】
本明細書に掲載するすべての局面の一態様において、CH3ドメインを含む2/3-IgGは、追加のC末グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）を含む。本明細書に掲載するすべての局面の一態様において、CH3ドメインを含む2/3-IgGは、追加のC末グリシン残基（G446、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）を含む。
【０１９８】
本明細書に掲載する2/3-IgGは、一態様において、変異PVA236、L234A/L235Aおよび/またはGLPSS331（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を持つヒトサブクラスIgG1のFc領域であるかサブクラスIgG4のFc領域であることを特徴とするFc領域を含む。さらなる一態様において、2/3-IgGは、E233、L234、L235、G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331および/またはP329（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）に少なくとも1つの変異を含有する任意のIgGクラス（一態様ではIgG1またはIgG4サブクラス）であるFc領域を含むことを特徴とする。さらなる一態様において、2/3-IgGは、変異S228Pを含有するか、変異S228PおよびL235Eを含有する、ヒトIgG4サブクラスのFc領域（Angal,S.,et al,Mol.Immunol.30（1993）105-108）（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を含む。
【０１９９】
本明細書に掲載する2/3-IgGに含まれるFc領域ポリペプチドのC末端は、アミノ酸残基PGKで終わる完全なC末端であることができる。C末端は、C末端アミノ酸残基のうちの1つまたは2つが除去された短縮型C末端であることができる。好ましい一態様において、C末端は、アミノ酸残基PGで終わる短縮型C末端である。
【０２００】
（E）ヘテロ二量体化
ヘテロ二量体化をサポートすることを目的とするCH3修飾のためのいくつかのアプローチは、例えばWO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954、WO2013/096291に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０１】
通例、当技術分野において公知のアプローチでは、1つの操作（engineered）CH3ドメインを含む重鎖が同じ構造のもう一つの重鎖とはもはやホモ二量体化できない（例えば、CH3操作第1重鎖はもう一つのCH3操作第1重鎖とはもはやホモ二量体化できず、CH3操作第2重鎖はもう一つのCH3操作第2重鎖とはもはやホモ二量体化できない）ように、第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインがどちらも相補的に操作される。これにより、1つの操作CH3ドメインを含む重鎖は、相補的に操作されたCH3ドメインを含むもう一つの重鎖とヘテロ二量体化する。この態様のために、第1重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインと第2重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインは、第1重鎖Fc領域ポリペプチドと第2重鎖Fc領域ポリペプチドとがヘテロ二量体化し、第1重鎖Fc領域ポリペプチドおよび第2重鎖Fc領域ポリペプチドが（例えば立体的理由で）もはやホモ二量体化しないように、アミノ酸置換によって相補的に操作される。
【０２０２】
重鎖ヘテロ二量体化をサポートするための当技術分野において公知の異なるアプローチは、本明細書に掲載されるヘテロ二量体/多量体ポリペプチド（例えば2/3-IgG）の提供に使用される異なる代替アプローチとして考えられる。
【０２０３】
本明細書に掲載する2/3-IgGのCH3ドメインは、例えばWO96/027011、Ridgway,J.B.,et al,Protein Eng.9（1996）617-621およびMerchant,A.M.,et al,Nat.Biotechnol.16（1998）677-681にいくつか例を挙げて詳述されている「ノブ・イントゥ・ホールズ」技術によって、改変することができる。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用面が、それら2つのCH3ドメインを含有する両重鎖Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化が増加するように、改変される。（2つの重鎖Fc領域ポリペプチドの）2つのCH3ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、その場合、他方は「ホール」である。ヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16（1998）677-681、Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270（1997）26-35）、本発明の交換反応における収率を増加させるために、ジスルフィド架橋を追加して導入することもできる。
【０２０４】
好ましい一態様において、本明細書に掲載する2/3-IgGは、「ノブズ鎖」のCH3ドメイン中にT366W変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメイン中にT366S、L368A、Y407V変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。例えばノブズ鎖のCH3ドメインの1つにY349C変異を導入し、ホール鎖のCH3ドメインの1つにE356C変異またはS354C変異を導入することなどによって、CH3ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋も使用することができる（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16（1998）677-681）（本発明の交換反応では2種の多量体が出発材料として使用され、追加のジスルフィド結合が交換済み生成物においてのみ形成されるように、該多量体のCH3ドメインの1つだけが追加のシステイン残基を含む）。したがって、別の好ましい一態様において、本明細書に掲載する2/3-IgGは、第1多量体のCH3ドメインの1つにY349CおよびT366W変異を含み、かつ第2多量体のそれぞれの相補的CH3ドメインにE356C、T366S、L368AおよびY407V変異を含むか、または本明細書に掲載する2/3-IgGは、第1多量体のCH3ドメインの1つにY349CおよびT366W変異を含み、かつ第2多量体のそれぞれの相補的CH3ドメインにS354C、T366S、L368AおよびY407V変異を含む（一方のCH3ドメイン中の追加Y349C変異と、対応するCH3ドメイン中の追加のE356CまたはS354C変異とが、鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０２０５】
ただし、上記に代えてまたは上記に加えて、EP 1 870 459 A1に記載されている他のノブズ-イン-ホール技術を使用することもできる。一態様において、本明細書に掲載する2/3-IgGは、「ノブズ鎖」のCH3ドメインにR409DおよびK370E変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインにD399KおよびE357K変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０２０６】
一態様において、本明細書に掲載する2/3-IgGは、「ノブズ鎖」のCH3ドメインにT366W変異を、また「ホール鎖」のCH3ドメインにT366S、L368AおよびY407V変異を含み、さらに「ノブズ鎖」のCH3ドメインにR409DおよびK370E変異を、また「ホール鎖」のCH3ドメインにD399KおよびE357K変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０２０７】
一態様において、本明細書に掲載する2/3-IgGは、CH3ドメインの1つにY349CおよびT366W変異を含み、かつ相補的CH3ドメインにS354C、T366S、L368AおよびY407V変異を含むか、または本明細書に掲載する2/3-IgGは、CH3ドメインの1つにY349CおよびT366W変異を含み、かつ相補的CH3ドメインにS354C、T366S、L368AおよびY407V変異を含み、さらに「ノブズ鎖」のCH3ドメインにR409DおよびK370E変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインにD399KおよびE357K変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０２０８】
「ノブ・イントゥ・ホール技術」とは別に、2/3-IgGの重鎖のCH3ドメインを修飾してヘテロ二量体化を強制するための他の技法も、当技術分野では公知である。これらの技術、とりわけWO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954およびWO 2013/096291に記載されているものは、本明細書では、本明細書に掲載する2/3-IgGとの組合せで、「ノブ・イントゥ・ホール技術」の代替的選択肢として考えられる。
【０２０９】
本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、2/3-IgGの第1重鎖および第2重鎖のヘテロ二量体化をサポートするために、EP 1 870 459 A1に記載のアプローチが使用される。このアプローチは、両者間の、すなわち第1重鎖と第2重鎖の間の、CH3/CH3ドメイン境界面における特別なアミノ酸位置に、反対の電荷を持つ荷電アミノ酸を導入することに基づく。
【０２１０】
したがってこの態様は、多量体の三次構造において、第1重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインと第2重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインとが、それぞれのCH3ドメイン間に位置する境界面を形成し、第1重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインと第2重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、2/3-IgGの三次構造において、それぞれ、該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸は正電荷アミノ酸で置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第2のアミノ酸は負荷電アミノ酸で置換されている、本明細書に掲載する2/3-IgGに関する。この態様による2/3-IgGを、本明細書では、「CH3（＋/-）操作2/3-IgG」ともいう（ここで「＋/-」はそれぞれのCH3ドメインに導入された反対に荷電したアミノ酸を意味する）。
【０２１１】
本明細書に掲載するCH3（＋/-）操作2/3-IgGの一態様において、前記正荷電アミノ酸はK、RおよびHから選択され、前記負荷電アミノ酸はEまたはDから選択される。
【０２１２】
本明細書に掲載するCH3（＋/-）操作2/3-IgGの一態様において、前記正荷電アミノ酸はKおよびRから選択され、前記負荷電アミノ酸はEまたはDから選択される。
【０２１３】
本明細書に掲載するCH3（＋/-）操作2/3-IgGの一態様において、前記正荷電アミノ酸はKであり、前記負荷電アミノ酸はEである。
【０２１４】
本明細書に掲載するCH3（＋/-）操作2/3-IgGの一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、409番目のアミノ酸RはDで置換され、370番目のアミノ酸KはEで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、399番目のアミノ酸DはKで置換され、357番目のアミノ酸EはKで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０２１５】
本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、2/3-IgGの第1重鎖Fc領域ポリペプチドと第2重鎖Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2013/157953に記載のアプローチが使用される。本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはKで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸LはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。本明細書に掲載する2/3-IgGの別の一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはKで置換され、351番目のアミノ酸LはKで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸LはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０２１６】
本明細書に掲載する2/3-IgGの別の一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはKで置換され、351番目のアミノ酸LはKで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸LはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。加えて、他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインには、次に挙げる置換のうちの少なくとも1つが含まれている:349番目のアミノ酸YはEで置換されている、349番目のアミノ酸YはDで置換されている、および368番目のアミノ酸LはEで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。一態様において、368番目のアミノ酸LはEで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０２１７】
本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、2/3-IgGの第1Fc領域ポリペプチドと第2Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2012/058768に記載のアプローチが使用される。本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸LはYで置換され、407番目のアミノ酸YはAで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはAで置換され、409番目のアミノ酸KはFで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。別の一態様では、上述の置換に加えて、他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、411番目（元々はT）、399番目（元々はD）、400番目（元々はS）、405番目（元々はF）、390番目（元々はN）および392番目（元々はK）のアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。好ましい置換は
・N、R、Q、K、D、EおよびWから選択されるアミノ酸による411番目のアミノ酸Tの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
・R、W、YおよびKから選択されるアミノ酸による399番目のアミノ酸Dの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
・E、D、RおよびKから選択されるアミノ酸による400番目のアミノ酸Sの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
・I、M、T、S、VおよびWから選択されるアミノ酸による405番目のアミノ酸Fの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
・R、KおよびDから選択されるアミノ酸による390番目のアミノ酸Nの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、ならびに
・V、M、R、L、FおよびEから選択されるアミノ酸による392番目のアミノ酸Kの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）
である。
【０２１８】
本明細書に掲載する（WO 2012/058768に従って操作された）2/3-IgGの別の一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸LはYで置換され、407番目のアミノ酸YはAで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはVで置換され、409番目のアミノ酸KはFで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。本明細書に掲載する2/3-IgGの別の一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸YはAで置換されており、他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはAで置換され、409番目のアミノ酸KはFで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。最後に挙げた態様では、該他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、392番目のアミノ酸KはEで置換され、411番目のアミノ酸TはEで置換され、399番目のアミノ酸DはRで置換され、400番目のアミノ酸SはRで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０２１９】
本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、2/3-IgGの第1Fc領域ポリペプチドと第2Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2011/143545に記載のアプローチが使用される。本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、両重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおけるアミノ酸修飾は、368番目および/または409番目に導入される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０２２０】
本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、2/3-IgGの第1Fc領域ポリペプチドと第2Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2011/090762に記載のアプローチが使用される。WO2011/090762は「ノブ・イントゥ・ホール」技術によるアミノ酸修飾に関する。本明細書に掲載するCH3（KiH）操作2/3-IgGの一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはWで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸YはAで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。本明細書に掲載する該CH3（KiH）操作2/3-IgGの別の一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはYで置換されており、他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸YはTで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０２２１】
IgG2アイソタイプである本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、2/3-IgGの第1重鎖Fc領域ポリペプチドと第2重鎖Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2011/090762に記載のアプローチが使用される。
【０２２２】
本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、2/3-IgGの第1Fc領域ポリペプチドと第2Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2007/147901に記載のアプローチが使用される。本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、253番目のアミノ酸KはEで置換され、282番目のアミノ酸DはKで置換され、322番目のアミノ酸KはDで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、239番目のアミノ酸DはKで置換され、240番目のアミノ酸EはKで置換され、292番目のアミノ酸KはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０２２３】
本明細書に掲載する2/3-IgGの一態様では、2/3-IgGの第1ポリペプチドと第2ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2007/110205に記載のアプローチが使用される。
【０２２４】
本明細書に掲載するすべての局面の一態様において、2/3-IgGは、IgGタイプ抗体の定常ドメイン構造を有する。本明細書に掲載するすべての局面のさらなる一態様において、2/3-IgGは、2/3-IgGが、ヒトサブクラスIgG1のFc領域を含むか、または変異L234AおよびL235Aならびに任意でP329Gを持つヒトサブクラスIgG1のFc領域を含むことを特徴とする。本明細書に掲載するすべての局面のさらなる一態様において、2/3-IgGは、2/3-IgGが、ヒトサブクラスIgG2のFc領域を含むことを特徴とする。本明細書に掲載するすべての局面のさらなる一態様において、2/3-IgGは、2/3-IgGがヒトサブクラスIgG3のFc領域を含むことを特徴とする。本明細書に掲載するすべての局面のさらなる一態様において、2/3-IgGは、2/3-IgGが、ヒトサブクラスIgG4のFc領域を含むか、または追加の変異S228PおよびL235Eならびに任意でP329Gを持つヒトサブクラスIgG4のFc領域を含むことを特徴とする。
【０２２５】
すべての局面の一態様において、2/3-IgGは第1Fc領域ポリペプチドと第2Fc領域ポリペプチドとを含み、
（i）第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異Y436Aを含むか、または
（ii）第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異I253A、H310AおよびH435Aを含むか、または
（iii）第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異H310A、H433AおよびY436Aを含むか、または
（iv）第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異L251D、L314DおよびL432Dを含むか、または
（v）第1Fc領域ポリペプチドは変異Y436Aを含み、かつ第2Fc領域ポリペプチドは
（a）変異I253A、H310AおよびH435A、もしくは
（b）変異H310A、H433AおよびY436A、もしくは
（c）変異L251D、L314DおよびL432D
を含むか、または
（vi）第1Fc領域ポリペプチドは変異I253A、H310AおよびH435Aを含み、かつ第2Fc領域ポリペプチドは
（a）変異H310A、H433AおよびY436A、もしくは
（b）変異L251D、L314DおよびL432D
を含むか、または
（vii）第1Fc領域ポリペプチドは変異H310A、H433AおよびY436Aを含み、かつ第2Fc領域ポリペプチドは
（a）変異L251D、L314DおよびL432D
を含む。
【０２２６】
III.本発明の態様の例示的セット
本発明の態様の第1の例示的セット：
1.  多量体ポリペプチドの生産方法であって、以下の工程を含む、方法:
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む、第1多量体ポリペプチドであって、
（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第1撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドは二量体である、
第1多量体出発ポリペプチド
と、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む、第2多量体ポリペプチドであって、
（i）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、（i）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または（ii）第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に第2撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第2撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
第2撹乱変異は第1撹乱変異とは異なる位置にあり、
第3ポリペプチドおよび第4ポリペプチドは二量体であり、
第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす、
第2多量体出発ポリペプチド
とを、インキュベートする工程、
および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む結合物質を回収する工程であって、それによって（多重特異性）結合物質を生産する、工程。
【０２２７】
2.  第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、IgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメインを含む、態様1の方法。
【０２２８】
3.  第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、（i）互いに独立して、アミノ酸配列
2021500348.tif 000037
またはアミノ酸配列
2021500348.tif 000038
のどちらか一方、（ii）IgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、および（iii）IgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメインを含む、態様1〜2のいずれかの方法。
【０２２９】
4.  （i）第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドがそれぞれ、IgG1 CH1ドメインに由来するCH1ドメインおよび可変ドメインをさらに含むか、または（ii）第1ポリペプチドもしくは第4ポリペプチドがIgG1 CH1ドメインに由来するCH1ドメインを含み、他方のポリペプチドが軽鎖定常ドメイン由来のドメインを含み、各ポリペプチドは可変ドメインをさらに含む、態様1〜3のいずれかの方法。
【０２３０】
5.  第1ポリペプチドの可変ドメインは重鎖可変ドメインであり、かつ第4ポリペプチドの可変ドメインは軽鎖可変ドメインであるか、またはその逆であり、これらのドメインは、第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとが二量体を形成した場合に、結合部位を形成する、態様4の方法。
【０２３１】
6.  第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（v）scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（x）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（xi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（xii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（xiii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xvi）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群から、互いに独立して選択される、
態様1〜4のいずれかの方法。
【０２３２】
7.  第1結合物質および第2結合物質が抗体軽鎖をさらに含む、態様1〜6のいずれかの方法。
【０２３３】
8.  第1結合物質は、
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2CH1ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体である、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチド
とを含み、
かつ
第2結合物質は、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2撹乱変異を含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド
と、
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分および結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体である、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、第6ポリペプチド
と、を含む、
態様1〜7のいずれかの方法。
【０２３４】
9.  インキュベーション工程が還元剤の存在下にある、態様1〜8のいずれかの方法。
【０２３５】
10.  （i）第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチドまたは（ii）第2ポリペプチドおよび第5ポリペプチドが（C末端）タグをさらに含む、態様1〜9のいずれかの方法。
【０２３６】
11.  タグがアミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）またはHHHHHHHH（SEQ ID NO:68）を有し、回収が金属（ニッケル）キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる、態様10の方法。
【０２３７】
12.  結合物質の組合せの同定方法であって、以下の工程を含む、方法:
・第1の多数の結合物質から選択される第1結合物質と第2の多数の結合物質から選択される第2結合物質との各組合せを態様1〜11のいずれかの方法に供することによって、多数の結合物質を生産する工程、
・生産された多数の結合物質の各結合部位の、少なくとも2種の抗原への同時結合を、ELISAアッセイにおいて個別に測定する工程、および
・ELISAの結果に基づいて多数の結合物質から結合物質を選択する工程であって、それによって結合物質の組合せを同定する、工程。
【０２３８】
13.  第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドであって、
両ポリペプチドはヒト免疫グロブリンCH3ドメインを含み、
（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、少なくとも1つの撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体である、
多量体ポリペプチド。
【０２３９】
14.  第1ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって
変異ノブまたは変異ホールを含み、
かつ
第2ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、変異ノブまたは変異ホールを含むヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチドであり、
かつ
第3ポリペプチドは軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている、
態様13の多量体ポリペプチド。
【０２４０】
15.  第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、
ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチド
と、
第1ポリペプチドにジスルフィド結合によって共有結合された、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチド
とを含む、第1ヘテロ三量体ポリペプチド
ならびに、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ヘテロ三量体の第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2撹乱変異を含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド
と、
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1（第4）ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1（第4）ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含む、
ポリペプチド
と、
第6ポリペプチドとして、ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチド
とを含む、第2ヘテロ三量体ポリペプチド
を含む組成物であって、
（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、（i）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または（ii）第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
第2ポリペプチドと第4ポリペプチドは同じ位置に撹乱変異を含まない、
組成物。
【０２４１】
本発明の態様の第2の例示的セット：
1.  多量体ポリペプチドの生産方法であって、以下の工程を含む、方法:
Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1多量体出発ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（b-1）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（c-1）第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なる第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第1撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（d-1）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1多量体出発ポリペプチドと、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2多量体出発ポリペプチドであって、
（a-2）（i）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホール-cysを含むか、または（ii）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブ-cysを含み、ここで、（i）第1ポリペプチドが変異ホール-cysを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブ-cysを含むか、または（ii）第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホール-cysを含み、
（b-2）第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（c-2）第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（a-2）における変異とは異なる第2撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第2撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（d-2）第2撹乱変異は第1撹乱変異とは異なる位置にあり、
（e-2）第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは二量体を形成し、
（f-2）第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす（ように設計される）、
第2多量体出発ポリペプチドと
をインキュベートする工程、
および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドを回収する工程であって、それによって多量体ポリペプチドを生産する、工程。
【０２４２】
2.  第1撹乱変異はE357Kであり、第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含み、第2撹乱変異はK370Eであり、かつ第4ポリペプチドは357番目にアミノ酸残基Eを含む、態様1の方法。
【０２４３】
3.  第1撹乱変異はD356Kであり、第1ポリペプチドは439番目にアミノ酸残基Kを含み、第2撹乱変異はK439Eであり、かつ第4ポリペプチドは356番目にアミノ酸残基Dを含む、態様1の方法。
【０２４４】
4.  多量体ポリペプチドの生産方法であって、以下の工程を含む、方法:
Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1多量体出発ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（b-1）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（c-1）第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なる第1撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第1撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（d-1）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成し、
（e-1）第1ポリペプチドは、ヒンジ領域に、IgG1野生型アミノ酸配列HTCPPCP（SEQ ID NO:31）の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）を含む、
第1多量体出発ポリペプチドと、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2多量体出発ポリペプチドであって、
（a-2）（i）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、（i）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または（ii）第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
（b-2）第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（c-2）第3ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（a-2）における変異とは異なる第2撹乱変異を含み、ここで、第4ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第2撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（d-2）第2撹乱変異は第1撹乱変異とは異なる位置にあり、
（e-2）第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは二量体を形成し、
（f-2）第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらし、
（g-2）第2ポリペプチドは、IgG1野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP（SEQ ID NO:31）の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはIgG1野生型ヒンジ領域配列HTCPPCPAPE（SEQ ID NO:90）の代わりにアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:85）を含む、
第2多量体出発ポリペプチドと
をインキュベートする工程、
および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドを回収する工程であって、それによって多量体ポリペプチドを生産する、工程。
【０２４５】
5.  第1撹乱変異はE357Kであり、第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含み、第2撹乱変異はK370Eであり、かつ第4ポリペプチドは357番目にアミノ酸残基Eを含む、態様4の方法。
【０２４６】
6.  第1撹乱変異はD356Kであり、第1ポリペプチドは439番目にアミノ酸残基Kを含み、第2撹乱変異はK439Eであり、かつ第4ポリペプチドは356番目にアミノ酸残基Dを含む、態様4の方法。
【０２４７】
7.  多量体ポリペプチドの生産方法であって、以下の工程を含む、方法:
Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1多量体出発ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（b-1）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（c-1）第2ポリペプチドはCH3ドメイン中に第1撹乱変異として変異E357Kを含み、かつ第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含み、
（d-1）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1多量体出発ポリペプチドと、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2多量体出発ポリペプチドであって、
（a-2）（i）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、（i）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または（ii）第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
（b-2）第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（c-2）第3ポリペプチドはCH3ドメイン中に第2撹乱変異として変異K370Eを含み、かつ第4ポリペプチドは357番目にアミノ酸残基Eを含み、
（d-2）第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは二量体を形成し、
（f-2）第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす、
第2多量体出発ポリペプチドと
をインキュベートする工程、
および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドを回収する工程であって、それによって多量体ポリペプチドを生産する、工程。
【０２４８】
8.  多量体ポリペプチドの生産方法であって、以下の工程を含む、方法:
Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
・どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む第1多量体出発ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（b-1）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（c-1）第2ポリペプチドはCH3ドメイン中に第1撹乱変異として変異D356Kを含み、かつ第1ポリペプチドは439番目にアミノ酸残基Kを含み、
（d-1）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1多量体出発ポリペプチドと、
どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第2多量体出発ポリペプチドであって、
（a-2）（i）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第3ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第4ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、ここで、（i）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ノブを含むか、または（ii）第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドは変異ホールを含み、
（b-2）第4ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（c-2）第3ポリペプチドはCH3ドメイン中に第2撹乱変異として変異K439Eを含み、かつ第4ポリペプチドは356番目にアミノ酸残基Dを含み、
（d-2）第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは二量体を形成し、
（e-2）第2ポリペプチド中の第1撹乱変異と第3ポリペプチド中の第2撹乱変異は、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成したときに、誘引的相互作用をもたらす、
第2多量体出発ポリペプチドと
をインキュベートする工程、
および
・第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む多量体ポリペプチドを回収する工程であって、それによって多量体ポリペプチドを生産する、工程。
【０２４９】
9.  第1ポリペプチドは変異ノブを含み、第2ポリペプチドは変異ホールを含み、第3ポリペプチドは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドは変異ホールを含む、態様4〜8のいずれかの方法。
【０２５０】
10.  第1ポリペプチドは変異ノブ-cysを含み、第2ポリペプチドは変異ホールを含み、第3ポリペプチドは変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドは変異ホール-cysを含む、態様4〜8のいずれかの方法。
【０２５１】
11.  第1〜第4ポリペプチドはそれぞれ、N末端からC末端に向かって、IgG1 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインを含む、態様1〜10のいずれかの方法。
【０２５２】
12.  第1〜第4ポリペプチドはそれぞれ、N末端からC末端に向かって、（i）互いに独立して、アミノ酸配列
2021500348.tif 000039
またはアミノ酸配列
2021500348.tif 000040
またはアミノ酸配列DKTHT（SEQ ID NO:91）のいずれか1つ、（ii）IgG1 CH2ドメイン、および（iii）IgG1 CH3ドメインを含む、態様1〜3および態様7〜11のいずれかの方法。
【０２５３】
13.  （i）第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドはそれぞれ、IgG1 CH1ドメインおよび可変ドメインをさらに含むか、または（ii）第1ポリペプチドもしくは第4ポリペプチドはIgG1 CH1ドメインを含み、他方のポリペプチドは軽鎖定常ドメインを含み、各ポリペプチドは可変ドメインをさらに含む、態様1〜12のいずれかの方法。
【０２５４】
14.  第1ポリペプチドの可変ドメインは重鎖可変ドメインであり、かつ第4ポリペプチドの可変ドメインは軽鎖可変ドメインであるか、またはその逆であり、これらのドメインは、第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとが二量体を形成した場合に、結合部位を形成する、態様13の方法。
【０２５５】
15.  第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドは、互いに独立して、
（A）N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（v）scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（x）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（xi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（xii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（xiii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xvi）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群、
または
（B）
N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（v）scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（x）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（xi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（xii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（xiii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xvi）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群
から選択される、態様1〜14のいずれかの方法。
【０２５６】
16.  第1多量体出発ポリペプチドおよび第2多量体出発ポリペプチドは抗体軽鎖をさらに含む、態様1〜15のいずれかの方法。
【０２５７】
17.  （A）
第1多量体出発ポリペプチドは、
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含むポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている、第3ポリペプチド
とを含み、
かつ
第2多量体出発ポリペプチドは、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第2撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド
と
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体を形成する、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている第6ポリペプチド
とを含むか、
または
（B）
第1多量体出発ポリペプチドは、
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第3ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている、第3ポリペプチド
とを含み、
かつ
第2多量体出発ポリペプチドは、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第2撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第5ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異は、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、
ポリペプチド
と、
第5ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体を形成する、
ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、第6ポリペプチド
とを含む、
態様1〜16のいずれかの方法。
【０２５８】
18.  インキュベーション工程が還元剤の存在下にある、態様1〜17のいずれかの方法。
【０２５９】
19.  （i）第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチドまたは（ii）第2ポリペプチドおよび第5ポリペプチドが（C末端）タグをさらに含む、態様1〜18のいずれかの方法。
【０２６０】
20.  （i）タグがアミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）またはHHHHHHHH（SEQ ID NO:68）を有し、回収が金属（ニッケル）キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによるか、
または
（ii）タグがアミノ酸配列EPEA（SEQ ID NO:87）を有し、回収がC-タグアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる、
態様19の方法。
【０２６１】
21.  多量体ポリペプチドの組合せの同定方法であって、以下の工程を含む、方法:
（a）第1の多数の多量体ポリペプチドから選択される第1多量体出発ポリペプチドと第2の多数の多量体ポリペプチドから選択される第2多量体出発ポリペプチドとの各組合せを、態様1〜20のいずれかの方法に供することによって、多数の多量体ポリペプチドを生産する工程、
（b）工程（a）において生産された多数の多量体ポリペプチドの、少なくとも2種の抗原への同時結合を、結合アッセイにおいて個別に測定する工程、および
（c）多数の多量体ポリペプチドから、結合の結果に基づいて多量体ポリペプチドを選択する工程であって、それによって多量体ポリペプチドの組合せを同定する、工程。
【０２６２】
22.  結合アッセイがELISAまたはSPR法である、態様21の方法。
【０２６３】
23.  Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
（a）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（a-2）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（a-3）第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（a-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
または
（b）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（b-1）（i）第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホール-cysを含むか、または（ii）第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブ-cysを含み、
（b-2）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（b-3）第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（b-1）における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（b-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
を含む多量体ポリペプチド。
【０２６４】
24.  撹乱変異はE357Kであり、かつ第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異はK370Eであり、かつ第1ポリペプチドは357番目にアミノ酸残基Eを含む、態様23の多量体ポリペプチド。
【０２６５】
25.  第1撹乱変異はD356Kであり、かつ第1ポリペプチドは439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異はK439Eであり、かつ第1ポリペプチドは356番目にアミノ酸残基Dを含む、態様23の多量体ポリペプチド。
【０２６６】
26.  （a）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（a-2）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（a-3）第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（a-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成し、
（a-5）第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドは、IgG1野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP（SEQ ID NO:31）の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはIgG1野生型ヒンジ領域配列
2021500348.tif 000041
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:85）を含む、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
または
（b）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（b-1）（i）第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（b-2）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（b-3）第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、（a-2）における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（b-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成し、
（b-5）第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドは、IgG1野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP（SEQ ID NO:31）の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはIgG1野生型ヒンジ領域配列
2021500348.tif 000042
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:85）を含む、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
を含む多量体ポリペプチド。
【０２６７】
27.  撹乱変異はE357Kであり、かつ第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異はK370Eであり、かつ第1ポリペプチドは357番目にアミノ酸残基Eを含む、態様26の多量体ポリペプチド。
【０２６８】
28.  第1撹乱変異はD356Kであり、かつ第1ポリペプチドは439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異はK439Eであり、かつ第1ポリペプチドは356番目にアミノ酸残基Dを含む、態様26の多量体ポリペプチド。
【０２６９】
29.  Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
（a）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（a-2）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（a-3）第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、変異E357Kを含み、かつ第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含み、
（a-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
または
（b）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（b-1）（i）第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（b-2）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（b-3）第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、変異K370Eを含み、かつ第1ポリペプチドは357番目にアミノ酸残基Eを含み、
（b-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
を含む多量体ポリペプチド。
【０２７０】
30.  Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
（a）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（a-2）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（a-3）第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、変異D356Kを含み、かつ第1ポリペプチドは439番目にアミノ酸残基Kを含み、
（a-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
または
（b）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（b-1）（i）第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含むか、または（ii）第2ポリペプチドのCH3ドメインは変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインは変異ノブを含み、
（b-2）第1ポリペプチドは少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（b-3）第2ポリペプチドは、CH3ドメイン中に、変異K439Eを含み、かつ第1ポリペプチドは356番目にアミノ酸残基Dを含み、
（b-4）第3ポリペプチドと第4ポリペプチドは二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
を含む多量体ポリペプチド。
【０２７１】
31.  第1ポリペプチドは変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドは変異ホールを含むか、または第2ポリペプチドは変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドは変異ホールを含む、態様26〜30のいずれかの多量体ポリペプチド。
【０２７２】
32.  第1ポリペプチドは変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドは変異ホールを含むか、または第2ポリペプチドは変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドは変異ホール-cysを含む、態様26〜30のいずれかの多量体ポリペプチド。
【０２７３】
33.  第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドは、IgG1野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP（SEQ ID NO:31）の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはIgG1野生型ヒンジ領域配列
2021500348.tif 000043
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:85）を含む、態様29〜32のいずれかの多量体ポリペプチド。
【０２７４】
34.  （A）
第1ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであり、
かつ
第2ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eから選択される変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチドであり、
かつ
第3ポリペプチドは軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されているか、
または
（B）
第1ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであり、
かつ
第2ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eから選択される変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチドであり、
かつ
第3ポリペプチドは軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている、
態様22〜33のいずれかの多量体ポリペプチド。
【０２７５】
本発明の態様の第3の例示的セット：
１.  ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
・  （i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-1）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-2）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なる第1変異であって、該第1変異の導入が、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、第1変異、を含む、
第1多量体
と、
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-1）第1ポリペプチドが変異ホール-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-2）第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-1）、（a-2）および（b-1）における変異とは異なる第2変異であって、該第2変異の導入が、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、第2変異、を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
【０２７６】
２.  Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-2）における変異がE357Kであり、第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-2）における変異がK370Eであり、第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、態様1の方法。
【０２７７】
３.  Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-2）における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-2）における変異がK439Eであり、第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、態様1の方法。
【０２７８】
４.  第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含み、第4ポリペプチドおよび/または第3ポリペプチドがアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、態様1〜3のいずれかの方法。
【０２７９】
５.  ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
・  （i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-1）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-2）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なる第1変異であって、該第1変異の導入が、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、第1変異、を含み、
（a-3）第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
第1多量体
と、
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-1）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-2）第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-1）、（a-2）および（b-1）における変異とは異なる変異であって、該第2変異の導入が、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
（b-3）第4ポリペプチドおよび/または第3ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
【０２８０】
６.  Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-2）における変異がE357Kであり、第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-2）における変異がK370Eであり、第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、態様5の方法。
【０２８１】
７.  Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-2）における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-2）における変異がK439Eであり、第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、態様5の方法。
【０２８２】
８.  第1ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第2ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
第4ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第3ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、
態様1または5の方法。
【０２８３】
９.  ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・  （i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-1）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-2）第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含む、
第1多量体
と、
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-1）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-2）第3ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
【０２８４】
１０.  ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・  （i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-1）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-2）第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含む、
第1多量体
と、
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-1）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-2）第3ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
【０２８５】
１１.  第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーが、第1多量体および/または第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーよりも低い、態様1〜10のいずれかの方法。
【０２８６】
１２.  第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとが、（単離可能な）二量体を形成し、第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとが、（単離可能な）二量体を形成する、態様1〜11のいずれかの方法。
【０２８７】
１３.  第1ポリペプチドおよび/もしくは第2ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP（SEQ ID NO:31）の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）を含み、かつ/または
第1ポリペプチドおよび/もしくは第2ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列：
2021500348.tif 000044
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP（SEQ ID NO:31）の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列：
2021500348.tif 000045
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
態様4〜12のいずれかの方法。
【０２８８】
１４.  第1ポリペプチドが変異ノブを含み、第2ポリペプチドが変異ホールを含み、第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドが変異ホールを含む、態様5〜13のいずれかの方法。
【０２８９】
１５.  第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、第2ポリペプチドが変異ホールを含み、第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含む、態様5〜13のいずれかの方法。
【０２９０】
１６.  第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、IgG1 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインを含む、態様1〜15のいずれかの方法。
【０２９１】
１７.  第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、
（i）互いに独立して、
アミノ酸配列：
2021500348.tif 000046
またはアミノ酸配列：
2021500348.tif 000047
またはアミノ酸配列：
DKTHT（SEQ ID NO:91）
のうちのいずれか、
（ii）IgG1 CH2ドメイン、および
（iii）IgG1 CH3ドメイン
を含む、態様1〜16のいずれかの方法。
【０２９２】
１８.  （i）第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドがそれぞれ、IgG1 CH1ドメインおよび可変ドメインをさらに含むか、または
（ii）第1ポリペプチドもしくは第4ポリペプチドがIgG1 CH1ドメインを含み、他方のポリペプチドが軽鎖定常ドメインを含み、各ポリペプチドが可変ドメインをさらに含む、
態様1〜17のいずれかの方法。
【０２９３】
１９.  第1ポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、かつ第4ポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであるか、またはその逆であり、これらのドメインがポリペプチド中で結合部位を形成する、態様18の方法。
【０２９４】
２０.  第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（v）scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（x）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（xi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（xii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（xiii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xvi）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群から、互いに独立して選択される、態様1〜19のいずれかの方法。
【０２９５】
２１.  第1多量体および第2多量体が、それぞれ第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、態様1〜20のいずれかの方法。
【０２９６】
２２.  第1多量体が、以下：
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第5ポリペプチド、
ここで、第3ポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されているもの
と、を含み、かつ
第2多量体が、以下：
第3ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第2撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第5ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異が、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、ポリペプチド
と、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体を形成する、ポリペプチドと、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、第6ポリペプチド
と、を含む、態様1〜21のいずれかの方法。
【０２９７】
２３.  インキュベーション工程が還元剤の存在下または非存在下にある、態様1〜3および態様9〜12のいずれかの方法。
【０２９８】
２４.  インキュベーション工程が還元剤の非存在下にある、態様4〜8および態様13〜22のいずれかの方法。
【０２９９】
２５.  （i）第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチドが（C末端）タグをさらに含む、態様1〜24のいずれかの方法。
【０３００】
２６.  （i）タグがアミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）またはHHHHHHHH（SEQ ID NO:68）を有し、回収する工程が金属（ニッケル）キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによるか、または
（ii）タグがアミノ酸配列EPEA（SEQ ID NO:87）を有し、回収する工程がC-タグアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる、
態様25の方法。
【０３０１】
２７.  多重特異性ポリペプチドを同定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
（a）第1標的に特異的に結合する第1の多数の多量体から選択される第1多量体と、（第1標的とは異なる）第2標的に特異的に結合する第2の多数の多量体から選択される第2多量体との各組合せを、態様1〜26のいずれかの方法に供することによって、多数の多重特異性ポリペプチドを生産する工程；
（b）工程（a）において生産された多数の多重特異性ポリペプチドの各メンバーについて、結合アッセイにおいて、前記2種の標的に対する同時結合を、個別に測定する工程；および
（c）多数の多量体ポリペプチドから、結合アッセイの結果に基づいて多量体ポリペプチドを選択する工程であって、それによって多重特異性ポリペプチドを同定する、工程。
【０３０２】
２８.  結合アッセイがELISAまたはSPR法である、態様27の方法。
【０３０３】
２９.  Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
（a）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-2）第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（a-3）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（a-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド；または
（b）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（b-1）（i）第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含むか、または
（ii）第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、
（b-2）第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（b-3）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（b-1）における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（b-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
を含む、単離された多量体ポリペプチド。
【０３０４】
３０.  撹乱変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、態様29の多量体ポリペプチド。
【０３０５】
３１.  第1撹乱変異がD356Kであり、かつ第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、態様29の多量体ポリペプチド。
【０３０６】
３２.  （i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-1）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-2）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なるさらなる変異であって、該さらなる変異の導入が、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、さらなる変異、を含む、
単離された多量体ポリペプチド。
【０３０７】
３３.  Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-2）における変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-2）における変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、態様32の単離された多量体ポリペプチド。
【０３０８】
３４.  Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-2）における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-2）における変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、態様32の単離された多量体ポリペプチド。
【０３０９】
３５.  第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドがアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、態様32〜34のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
【０３１０】
３６.  （i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-1）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-2）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なるさらなる変異であって、該さらなる変異の導入が、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、さらなる変異、を含み、
（a-3）第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
単離された多量体ポリペプチド。
【０３１１】
３７.  Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-2）における変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-2）における変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、態様36の単離された多量体ポリペプチド。
【０３１２】
３８.  Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-2）における変異がD356Kであり、かつ第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-2）における変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、態様36の単離された多量体ポリペプチド。
【０３１３】
３９.  第1ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第2ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、態様32〜36のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
【０３１４】
４０.  （i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-1）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-2）第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
単離された多量体ポリペプチド。
【０３１５】
４１.  （i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-1）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-2）第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
単離された多量体ポリペプチド。
【０３１６】
４２.  第1ポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（v）scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（x）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（xi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（xii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（xiii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xvi）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択される、態様29〜41のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
【０３１７】
４３.  第1ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、態様29〜42のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
【０３１８】
４４.  第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドと；
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、ポリペプチドと；
第3ポリペプチドとして、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチドであって、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチドと
を含む、態様43の単離された多量体ポリペプチド。
【０３１９】
４５.  第2ポリペプチドが（C末端）タグをさらに含む、態様29〜44のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
【０３２０】
４６.  （i）タグが、アミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）またはHHHHHHHH（SEQ ID NO:68）を有するか、または
（ii）タグが、アミノ酸配列EPEA（SEQ ID NO:87）を有する、
態様45の単離された多量体ポリペプチド。
【０３２１】
以下の実施例、配列および図面は本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。記載した手順には、本発明の要旨から逸脱することなく、変更を加えることができると理解される。
【図面の簡単な説明】
【０３２２】
【図１】本発明の方法において使用することができる2/3-IgGのデザインおよびモジュラー組成。
【図２】ノブ-cys重鎖とホール-cys重鎖の相互作用（上）およびノブ-cys重鎖とMHCFcRPの相互作用（中および下）。ジスルフィド共有結合は破線で示され、誘引的相互作用ペアは全円（full sphere）間の線で表され、反発的相互作用または結果的立体障害は、両方向に矢印がついている線で示されている。
【図３】MHCFcRPが異なる精製2/3-IgGのSECクロマトグラム。細胞培養上清からのプロテインA抽出後の2/3-IgG調製物のSECプロファイルが示されている。各プロファイルの主ピークは2/3-IgGを表す。fluos特異性またはbio特異性を持つもの（実施例2参照）。
【図４】2/3-IgGで例示される、本発明の交換反応によるbsAb（二重特異性抗体）の生成。
【図５】ヒンジ-ジスルフィド結合を（部分的に）還元するために、TCEP（2/3入力IgGに対するモル当量倍数）が適用される。SECは、2/3-IgG出発分子、生成したbsAbおよび二量体型MHCFcRPを識別する。さまざまなTCEP濃度における反応をいずれも同じインキュベーション時間後に停止させた（三角形:bsAb、十字:2/3-IgG、菱形:二量体型MHCFcRP）。
【図６】所望のbsAb生成物からの望ましくない未反応入力分子および副生成物の除去。
【図７】NiNTA精製のSDS-page;n.r.＝非還元;r＝還元;NiNTA結合物（上側）はNiNTAから溶出させたタンパク質を表し、NiNTA素通り画分（下側）は、His-6タグもHis-8タグも含有しないタンパク質である;n.r.＝非還元、r.＝還元;M＝マーカー。
【図８】本発明の交換反応によって生成したbsAbの二重特異的機能性。二重特異性抗体の結合部位の同時結合の検出を可能にするブリッジングELISAによって機能性を評価した。ELISAプレートにコーティングされる抗原Aをフルオレセイン（fluos-BSA）とし、抗原Bを、その蛍光によって検出されるbio-Cy5とした。
【図９】重鎖のC末端に結合部位を持つ、2/3-IgG交換反応用の例示的2/3-IgG。
【図１０】重鎖のN末端およびC末端に結合部位を持つ、2/3-IgG交換反応用の例示的2/3-IgG。
【図１１】2/3-IgGで例示される、結合特異性とフォーマットとが異なる出発材料を使ったIgG交換反応。
【図１２】例示的2/3-IgGを使った本発明の交換反応によって生成するさまざまなbsAbフォーマットマトリックス。フルオレセイン結合体およびビオシチンアミド（biocytinamid）結合体でマトリックスを生成させた。入力分子および交換による出力分子を図10に示す。二重特異性結合機能性を検出するために捕捉抗原としてのfluos-BSAとbio-Cy5とを用いるブリッジングELISAによって、生成したbsAbの機能性を評価した。ブリッジングELISAに由来するシグナルは、すべてのフォーマットが二重特異性結合効力を有することを示している。
【図１３】小型化された、ハイスループットおよび自動化に対応できるアプローチを用いる、交換反応によるbsAb多様性の生成および特性解析のためのマトリックス。
【図１４】HTS技術を使った本発明方法の交換による二重特異性抗体形成。示されているのは、二重特異性抗体の形成を表す濃度依存的な蛍光シグナルを示す、例示的ブリッジングELISAのシグナルである。fluos-bioブリッジングELISA、十字:fluos［ホール/K370E］＋bio［ノブ/E357K］、菱形:bio［ホール/K370E］＋fluos［ノブ/E357K］。他のすべての曲線:コグネイト交換パートナーを持たない2/3IgG入力分子はブリッジングシグナルを示さない。
【図１５】ヒンジ領域ジスルフィド結合およびCH3ドメイン鎖間ジスルフィド結合を持たない2/3-IgGで例示した本発明の交換反応のスキーム。これにより、還元剤を加えなくても、本発明の方法における鎖交換反応が可能になる。
【図１６】鎖間ジスルフィド架橋を持たない2/3-IgGを、標準的IgGのように培養上清に分泌させ、標準的プロテインAアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、SDS-PAGEによって分析したところ、発現産物として所望の100kDa 2/3-IgGが確認された。これは、鎖間ジスルフィド架橋を持たない精製2/3-IgG誘導体の正しい組立てと、望ましくない二量体および凝集物の非存在とを証明している。（i）抗bio抗体軽鎖（SEQ ID NO:39）＋ヒンジ領域システイン残基を持たない抗bio抗体重鎖-ノブ（SEQ ID NO:57）＋ヒンジ領域システイン残基を持たないMHCFcRP-ホール-E357K（SEQ ID NO:62）（左）と（ii）抗fluos抗体軽鎖（SEQ ID NO:42）＋ヒンジ領域ジスルフィド結合を持たない抗fluos抗体完全長重鎖-ホール（SEQ ID NO:60）＋ヒンジ領域システイン残基を持たないMHCFcRP-ノブ-K370E（SEQ ID NO:63）（右）の精製。
【図１７】ヒンジ領域ジスルフィド結合を持たない出発材料による本発明の交換反応の結果。2.5μM濃度の入力分子が、陽性対照としての精製bsAbと共に、Fc領域鎖間ジスルフィド結合を持たない単一特異性2/3-IgG入力分子での、鎖交換によるbsAb生成の成功を示している。
【図１８】2/3-IgG（左）およびIgG（右）で例示される、本発明の交換反応によるbsAb（二重特異性抗体）の生成。
【図１９】Fabがアフィボディで置き換えられた2/3-IgG（左）およびIgG（右）で例示される、本発明の交換反応によるbsAb（二重特異性抗体）の生成。
【図２０】細胞培養上清からのcOmplete（商標）Hisタグ精製後の、本発明の交換反応に使用するための精製アフィボディコンストラクトのSECクロマトグラム。水平線はさらなる研究のためにプールしたフラクションを示す。
【図２１】本発明の交換反応に使用されるSEC精製アフィボディコンストラクトのSDS-PAGE;M＝マーカー、S＝試料。
【図２２】ELISAアッセイスキーム。反応物はHisタグを担持していて、Niコートプレートに結合できるが、機能的ビオチン（Bio）結合体を有しないので、Bio-Cy5には結合しない。本発明の交換反応において鎖交換が起こって初めて、機能的抗ビオチン結合部位が生成し、それがBio-Cy5の捕捉と蛍光シグナル検出を可能にする。
【図２３】ELISAアッセイ結果。ELISAにより、Fabアームを担持する実体と非抗体結合スキャフォールドを担持する実体の間の鎖交換が確認される。
【図２４】ヒンジ領域ジスルフィド結合を持つ2/3-IgGおよびヒンジ領域ジスルフィド結合を持たない2/3-IgGで行われた、すなわち還元条件下（赤色）および非還元条件下（緑色）で行われた、本発明の交換反応。実施例に記載するブリッジングアッセイを使って交換反応をモニターした。陰性対照（灰色）は両単一特異性2/3-IgG出発分子であった。
【図２５】IgG1ヒンジ領域の修飾により、すなわちジスルフィド結合の除去により、またはヒンジ領域の短縮により、個々の結合部位間に、異なる距離を作り出すことができる。
【図２６】第2Fab領域を含む2/3-IgGでの本発明の交換反応。
【図２７】精製Fab延長型2/3-IgGのSECクロマトグラム。
【図２８】ビオチン標識タンパク質またはFITC標識タンパク質の逐次的注入（最初にビオチン標識体を注入し、次にFITC標識体を注入する操作を1回、および最初にFITC標識体を注入し、次にビオチン標識体を注入する操作を1回）によって得られる二重特異性抗体＜FITC＞＜CD3＞-ノブ-HC（dA）＋＜ビオチン＞-ホール-nc-His（ncB）のSPRセンサーグラム（sensogram）。
【図２９】C-タグを含む出発2/3-IgGおよび本発明の交換反応後の反応混合物に関する非還元CE-SDSクロマトグラム。出発2/3-IgG AはFluo-ノブ-n-HC＋ホール-MHCFcRP（E357K）-C-タグであり、出発2/3-IgG Bはビオチン-ホール-n-HC＋ノブ-MHCFcRP（K370E）-C-タグである。二重特異性抗体が形成されて、素通り画分中に収集されうることがわかる。交換反応後にC-タグ付きMHCFcRPをC-タグ樹脂に結合させて、そこから溶出することができる。これにより、分離と精製が達成される。
【図３０】交換反応の濃度依存性。
【図３１】拘束型結合部位を含む2/3-IgGでの本発明の交換反応。
【図３２】得られたconAconB交換反応生成物に関する分析SECクロマトグラム。
【図３３】得られたconAconB交換反応生成物に関する非還元CE-SDSクロマトグラム。
【図３４】cMET標識タンパク質およびFluo標識タンパク質の逐次的注入によって得られる二重特異性抗体＜cMET＞-ホール-HC（conA）＋＜Fluo＞-ノブ-c-His（ncB）に関するSPRセンサーグラム。
【実施例】
【０３２３】
実施例1
2/3-IgGのデザインおよびモジュラー組成
概論
図1に、本発明の方法において使用される2/3-IgGのデザインおよびモジュラー組成を示す。これらの2/3-IgGは、3つの個別の鎖、すなわち1つの軽鎖（通常は軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む完全長軽鎖）、1つの重鎖（通常は重鎖可変ドメインとヒンジ領域を含むすべての重鎖定常ドメインとを含む完全長重鎖）および1つの重鎖Fc領域ポリペプチド（通常はヒンジ-CH2-CH3を含む重鎖Fc領域断片）で構成される。軽鎖と重鎖の可変ドメインは機能的結合部位を形成する。重鎖（通常はヒトIgG1サブクラスに由来するもの）は、ノブ・イントゥ・ホールFc領域二量体の形成を可能にするために、CH3中にノブ-cys変異またはホール-cys変異のどちらかを含有する（抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366WおよびS354Cは「ノブ-cys変異」と表され、抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、Y407V、Y349Cは「ホール-cys変異」と表される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う））。重鎖Fc領域ポリペプチドは、いわゆる「ダミーFc」/HCFcRP（下記参照）、すなわち、VHおよびCH1を欠き、N末端はヒンジ領域配列で始まり、His6タグをそのC末端に保持するIgG1誘導体である。加えて、2/3-IgGの重鎖Fc領域ポリペプチドはそのCH3ドメイン中にノブ変異またはホール変異のどちらか一方を含有する（抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366Wは「ノブ変異」と表され、抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、Y407Vは「ホール変異」と表される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う））。ノブ変異またはホール変異に加えて、重鎖Fc領域ポリペプチドは、野生型配列に対して1つの（すなわち単一の追加）反発電荷を導入する不安定化変異、すなわちD356KまたはE357KまたはK370EまたはK439Eを含む：SEQ ID NO:35〜38。この変異型重鎖Fc領域ポリペプチドは以下の説明ではMHCFcRPと表される。
【０３２４】
重鎖とMHCFcRPは、ノブ・イントゥ・ホール変異の分布に応じて、以下の2タイプのヘテロ二量体を形成することができる:
（i）重鎖-ノブ::MHCFcRP-ホール、および
（ii）重鎖-ホール::MHCFcRP-ノブ。
【０３２５】
しかし、これらのヘテロ二量体には、多少の「欠陥」がある。というのも、相補的Fc領域が重鎖への鎖間ジスルフィド結合を形成するのに必要な追加のCH3システインを欠き、またこれらは適合する重鎖対応物がない電荷変異も含有するからである。
【０３２６】
実施例2
本発明の2/3-IgGの発現および精製
2/3-IgGの発現は、軽鎖、重鎖（ノブ変異またはホール変異を持つもの）および適合するMHCFcRP（ホールまたはノブ）をコードするプラスミドを、最先端の技術で、哺乳動物細胞（例えばHEK293）に共トランスフェクトすることによって達成された。
【０３２７】
より具体的には、例えば（HEK293細胞などにおける）一過性トランスフェクションによる2/3-IgGの生産には、CMVイントロンAプロモーターを持つもしくはCMVイントロンAプロモーターを持たないcDNA編成に基づくか、またはCMVプロモーターを持つゲノム構成に基づく、発現プラスミドを適用した。
【０３２８】
抗体発現カセットの他に、プラスミドは、以下：
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、
・大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子、および
・真核細胞における選択可能マーカーとしてのハツカネズミ（Mus musculus）由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
を含有した。
【０３２９】
各抗体遺伝子の転写単位は以下の要素で構成された：
・5'端のユニークな制限部位、
・ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・cDNA編成の場合は、それに続くイントロンA配列
・ヒト抗体遺伝子の5'-非翻訳領域、
・免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・cDNA編成としての、またはゲノム編成としての（免疫グロブリンエクソン-イントロン編成が維持されている）、抗体鎖、
・ポリアデニル化シグナル配列を持つ3'非翻訳領域、および
・3'端のユニークな制限部位。
【０３３０】
抗体鎖を含む融合遺伝子を、PCRおよび/または遺伝子合成によって生成させ、例えばそれぞれのプラスミド中のユニークな制限部位を使うなどして、一致する核酸セグメントを接続することにより、公知の組換え方法および組換え技法によって組み立てた。サブクローニングされた核酸配列はDNA配列決定によって検証した。一過性トランスフェクションのために、形質転換された大腸菌培養物からのプラスミド調製によって、より多量のプラスミドを調製した（Nucleobond AX、Macherey-Nagel）。
【０３３１】
Current Protocols in Cell Biology（2000）,Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.and Yamada,K.M.（eds.）,John Wiley＆Sons,Incに記載されているように、標準的な細胞培養技法を使用した。
【０３３２】
HEK293-Fシステム（Invitrogen）を製造者の説明書に従って使用する、それぞれのプラスミドの一過性トランスフェクションによって、2/3-IgGを生成させた。簡単に述べると、振とうフラスコまたは撹拌発酵槽中、無血清FreeStyle（商標）293発現培地（Invitrogen）において浮遊状態で成長するHEK293-F細胞（Invitrogen）に、それぞれの発現プラスミドと293fectin（商標）またはfectin（Invitrogen）との混合物をトランスフェクトした。2L振とうフラスコ（Corning）の場合、HEK293-F細胞を1.0×106細胞/mLの密度で600 mLに播種し、120 rpm、8％CO2でインキュベートした。翌日、細胞に、およそ1.5×106細胞/mLの細胞密度で、（A）600μgの総プラスミドDNA（1μg/mL）を含む20 mLのOpti-MEM（Invitrogen）と（B）20 ml Opti-MEM＋1.2 mL 293fectinまたはfectin（2μL/mL）との混合物約42 mLをトランスフェクトした。発酵中は、グルコース消費に応じて、グルコース溶液を加えた。正しく組み立てられた2/3-IgGは、標準的IgGのように、培養上清中に分泌された。分泌された2/3-IgGを含有する上清を5〜10日後に収穫し、2/3-IgGを上清から直接精製するか、または上清を凍結して保存した。
【０３３３】
2/3-IgGはFc領域を含有するので、標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを適用することによって、それらを精製した。
【０３３４】
抗体は、MabSelectSure-Sepharose（商標）（GE Healthcare、スウェーデン）およびSuperdex 200サイズ排除（GE Healthcare、スウェーデン）クロマトグラフィーを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製された。
【０３３５】
簡単に述べると、滅菌濾過した細胞培養上清をPBS緩衝液（10 mM Na2HPO4、1 mM KH2PO4、137 mM NaClおよび2.7 mM KCl、pH 7.4）で平衡化したMabSelectSuRe樹脂上に捕捉し、平衡化緩衝液で洗浄し、pH 3.0の25 mMクエン酸ナトリウムで溶出させた。溶出した抗体画分をプールし、2 M Tris、pH 9.0で中和した。20 mMヒスチジン、140 mM NaCl、pH 6.0で平衡化したSuperdex 200 26/60 GL（GE Healthcare、スウェーデン）カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって、抗体プールをさらに精製した。2/3-IgG含有画分をプールし、Vivaspin限外濾過デバイス（Sartorius Stedim Biotech S.A.、フランス）を使って必要な濃度まで濃縮し、-80℃で保存した。
【０３３６】
CE-SDSによる各精製工程後に、マイクロ流体Labchip技術（Caliper Life Science、米国）を使って、純度および完全性を分析した。HT Protein Express試薬キットを製造者の説明書に従って使用することで、タンパク質溶液（5μl）をCE-SDS分析用に調製し、HT Protein Expressチップを使って、LabChip GXIIシステムで分析した。データはLabChip GXソフトウェアを使って分析した。
【０３３７】
対応するL鎖、H鎖およびMHCFcRPをコードするプラスミドの同時発現により、以下の2/3-IgGを生産した。
【０３３８】
2021500348.tif 000048
対応するSECクロマトグラムを図3に示す。
【０３３９】
上に概説したプロテインA法に加えて、プロテインLも同様に使用することができる。
【０３４０】
簡単に述べると、滅菌濾過した細胞培養上清をPBS緩衝液（10 mM Na2HPO4、1 mM KH2PO4、137 mM NaClおよび2.7 mM KCl、pH 7.4）で平衡化したKappaSelect樹脂上に捕捉し、平衡化緩衝液で洗浄し、pH 2.5の50 mMクエン酸ナトリウムで溶出させた。溶出した抗体画分をプールし、1 M Tris、pH 9.0で中和した。20 mMヒスチジン、140 mM NaCl、pH 6.0で平衡化したSuperdex 200 26/60 GL（GE Healthcare、スウェーデン）カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって、抗体プールをさらに精製した。2/3-IgG含有画分をプールし、Vivaspin限外濾過デバイス（Sartorius Stedim Biotech S.A.、フランス）を使って必要な濃度まで濃縮し、-80℃で保存した。
【０３４１】
実施例3
2/3-IgG交換反応による二重特異性抗体（bsAb）の生成
軽鎖、重鎖およびMHCFcRPを含有する2/3-IgGを、完全長重鎖-ノブ::MHCFcRP-ホールおよび完全長重鎖-ホール::MHCFcRP-ノブという2タイプのKiHヘテロ二量体で、生成させた。両タイプの2/3-IgGには多少の「欠陥」がある。というのも、MHCFcRPは重鎖への鎖間ジスルフィドを形成するのに必要な追加のCH3システインを欠き、MHCFcRPは適合する完全長重鎖対応物がない電荷変異を含有するからである。しかし、これらの欠陥ヘテロ二量体を構成するモジュールは、図4に示すように、適合する電荷を持つ二重特異性ヘテロ二量体へと再編成する能力を有する。2/3-IgG Aの完全長重鎖（ノブ-cys）と2/3-IgG Bからの完全長重鎖（ホール-cys）は適合するヘテロ二量体を形成する。適合するヘテロ二量体はMHCFcRP（ホール-電荷）がMHCFcRP（ノブ-電荷）と相互作用した場合にも形成される。こうして、2つの異なる2/3-IgGの出発ヘテロ二量体の一時的な分離に基づく交換反応は、（電荷が）適合するヘテロ二量体を優先的に含有する生成物をもたらした。したがって交換反応は2種の単一特異性2/3-IgGを、1つの二重特異性IgGと1つのMHCFcRPヘテロ二量体とに変換した。
2/3-IgG（A）-His6（8）＋2/3-IgG（B）-His6（8）→bsAb（AB）＋Fc-His6（8）
【０３４２】
交換反応は、とりわけヒンジ領域鎖間ジスルフィド結合を切るための（例えば2-MEAまたはTCEPをさまざまな濃度で適用することなどによる）還元工程によって開始された。その後は鎖再編成が自発的に起こった。
【０３４３】
交換を開始させるためにさまざまなTCEP濃度を適用した。
【０３４４】
したがって、384ウェルREMP（登録商標）プレート（Brooks、＃1800030）上で、等モル量の抗フルオレセイン-2/3-IgG入力分子と抗ビオシチンアミド-2/3-IgG入力分子とを、表示のTCEP濃度を持つ総体積40μlの1×PBS＋0.05％Tween 20中、100μg/mlのタンパク質濃度で混合した。遠心分離後に、プレートをシールし、27℃で1時間インキュベートした。
【０３４５】
次にビオチン-フルオレセイン・ブリッジングELISAを使って二重特異性抗体を定量した。
【０３４６】
したがって、ホワイトNunc（登録商標）MaxiSorp（商標）384ウェルプレートを1μg/mlアルブミン-フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲート（Sigma、＃A9771）でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。90μlのPBST緩衝液（PBST、二回蒸留水、10×PBS＋0.05％Tween 20）で3回洗浄した後、90μl/ウェルのブロッキング緩衝液（1×PBS、2％ゼラチン、0.1％Tween-20）を加え、室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した後、各交換反応の1:10希釈液25μlを、各ウェルに加えた。室温で1時間のインキュベーション後に、再びプレートを90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した。0.5％BSA、0.025％Tween-20、1×PBS中のビオチン-Cy5コンジュゲート25μl/ウェルを、0.1μg/mlの最終濃度になるように加え、室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で6回洗浄した後、25μlの1×PBSを各ウェルに加えた。Cy5蛍光はTecan Safire 2リーダーを使って670 nmの放出波長（励起は649 nm）で測定した。
【０３４７】
図5は、2/3-IgG交換によるbsAbの生成に関する酸化還元条件の分析結果を示している。TCEPは、重鎖Fc領域ポリペプチド間の、すなわち完全長半IgGとMHCFcRPの間の、ヒンジ-ジスルフィド結合を（部分的に）還元するために適用される。鎖交換は、2/3-IgG入力物、bsAb出力物およびMHCFcRP副生成物を識別するSECによって同定することができる。2/3-IgGとTCEPの比に依存する交換反応の収率を図5に示す（比較のためにすべての反応を同じ反応時間後に分析した）。
【０３４８】
すべての2/3-IgG出発分子、すべての不要な副生成物および交換反応中に生成した可能性のあるすべての凝集物は、アフィニティータグ（His6またはHis8）を保持している。交換反応において生産された所望のbsAbは、Hisタグを担持していない唯一の分子である。それゆえに、望ましくない分子をすべて除去するために、単純なNiNTA吸収工程を適用した（図6および図7参照）。所望の機能性を持つbsAbを同定するために、残存bsAb（NiNTA吸収によって枯渇しなかったもの）をそのままスクリーニング手順に適用し、分析した。
【０３４９】
実施例4
2/3-IgG交換反応によって生成した二重特異性抗体（bsAb）の機能的評価
2/3-IgG交換反応の生成物として生成したbsAbの二重特異的機能性をブリッジングELISAアッセイによって評価した。図8に、一例として、本発明の交換反応によって生成した抗フルオレセイン/ビオシチンアミド二重特異性抗体に関する結合結果を示す。反応には、出発分子として、ビオシチンアミド（bio）結合2/3-IgGとフルオレセイン（fluos）結合2/3-IgGとを、使用した。抗fluos/bio二重特異性抗体のfluos結合アームは、fluos-BSAコートELISAプレートに結合する。続いてbio-Cy5に曝露すると、bsAbのbio結合アームを介したbio-Cy5のbsAbによる捕捉が起こった場合にのみ、シグナルが生成する。ブリッジングによるシグナルはbsAbでしか起こらず、単一特異性Fluos結合物質または単一特異性Bio結合物質のどちらかでは起こらないので、アッセイに2/3-IgGしか使用しない場合には、シグナルは観察されなかった。それゆえに、そしてまた交換反応が分子凝集を強いることはないので、このようなブリッジングELISAは、非bsAb分子のNiNTAによる枯渇を必要とすることなく、交換反応混合物で直接行うことができる。反応混合物を適用したときに観察されるシグナルにより、機能的bsAbの生成の成功とその存在が示された。ブリッジングELISAによるシグナル生成は、交換反応に使用した入力体の量に依存した。
【０３５０】
実施例5
本明細書に掲載される交換反応は、出発2/3-IgGの結合特異性またはV領域組成とは無関係に機能的である
2/3-IgGの生産および交換反応が、異なる抗体についてもそれらの特異性およびV領域組成とは無関係に機能するかどうか、そしてまた異なる抗体の組合せについても機能するかどうかを評価するために、さまざまな2/3-IgGを生産した。
【０３５１】
したがって、ビオシチンアミド（bio）、ジゴキシゲニン（dig）、フルオレセイン（fluos）、LeY糖質（LeY）、VEGFおよびPDGFに対する結合特異性を持つ2/3-IgGを使用した。これらは、上述のように完全長軽鎖、ノブ-またはホール-完全長重鎖および変異型重鎖Fc領域ポリペプチドをコードする発現プラスミドの共トランスフェクションによって生産された。
【０３５２】
2021500348.tif 000049
【０３５３】
SEQ ID NO:49〜52に、dig、VEGF、PDGFおよびLeYに対する特異性を持つ2/3-IgGのVH-CH1領域を記載する。これらをSEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:41のヒンジ-CH2-CH3領域に融合すること（すなわちbio VH-CH1領域を置き換えること）で、所望の特異性を持つ完全なH鎖を生成させた。これらの分子を生成させるために適用したMHCFcRPをSEQ ID NO:35〜38に列挙する。
【０３５４】
これらの2/3-IgGはいずれも、匹敵する条件下で、標準的なIgGの場合と類似する収率で生産し、精製することができた（実施例2参照）。さまざまな結合特異性を持つこれらの2/3-IgGの発現に関する例を以下の表に示す。
【０３５５】
2021500348.tif 000050
【０３５６】
特異性が異なるbsAbを生成させるために適用したこの交換マトリックスでは、以下の表に示すすべての組合せで、フルオレセイン、ビオシチンアミド、VEGF、PDGFおよびジゴキシゲニンに対する結合特異性を持つ2/3-IgGの組合せを使用した。
【０３５７】
2021500348.tif 000051
【０３５８】
出発2/3-IgGの鎖交換と、所望する特異性の組合せを持つbsAbの生成を、さまざまなbsAbの特異性の組合せと合致する、プレートにコーティングされた抗原とシグナル生成抗原コンジュゲート/複合体とが適用されるブリッジングELISA（実施例4参照）によってモニターした。
【０３５９】
さまざまなbsAb組合せの機能性を評価するために適用したブリッジングELISAの結果を以下の表に示す。捕捉抗原または検出抗原として存在する抗原のそれぞれのコグネイトペアを認識するbsAbだけが、ブリッジングELISAにおいてシグナルを生成する。マトリックスにおいて生成した他のbsAbは、少なくとも1つの特異性が存在しないために陰性である。
【０３６０】
（表）ブリッジングELISAにより、生成したbsAbの機能性が確認される。1つのアッセイ内での入力分子濃度1.3μMにおける相対的シグナル強度が示されている。最も高い値が基準値として100％に設定されている。n.a.＝利用不可
2021500348.tif 000052
2021500348.tif 000053
2021500348.tif 000054
2021500348.tif 000055
【０３６１】
VEGF含有二重特異性抗体について同じアッセイを行った。これらもそれぞれの組合せについてバックグラウンドレベルを上回るシグナルだけを示した。
【０３６２】
本発明の交換反応は一般に利用可能な方法であり、交換反応は、出発分子の結合特異性にもV領域組成にも依存せずに機能的なbsAbをもたらすことがわかる。
【０３６３】
実施例6
フォーマット変異体のデザイン、組成および生成
実施例4の2/3-IgG交換反応を、重鎖のC末端に1つの結合部位を有する出発分子またはN末端とC末端とに結合部位を持つ重鎖を有する出発分子へと拡張した。交換済みbsAbを生成させるために、交換を推進する原理（欠陥入力ヘテロ二量体から適合出力ヘテロ二量体への変換）には手を加えなかった。MHCFcRPの組成も上述のとおりに保った。
【０３６４】
図1および図9〜10は、異なるbsAbフォーマットを生成させるために適用した3つの2/3-IgGフォーマットのモジュラー組成を示す。2/3-IgGのうちの1つは、N末端位置に1つのFabアームを有する。2/3-IgGのうちの別の1つは、重鎖のC末端にフレキシブルなリンカーを介して取り付けられたFabアームを有する（すなわちN末端はヒンジ領域で始まる）。第3の2/3-IgGはC末端FabアームおよびN末端Fabアームを有する。
【０３６５】
これらの2/3-IgG変異体の発現は、軽鎖、重鎖（ノブまたはホール）および対応するMHCFcRP（ホールまたはノブ）をコードするプラスミドを哺乳動物細胞（例えばHEK293）に共トランスフェクトすることによって達成された（実施例2参照）。
【０３６６】
さまざまなbsAbフォーマットの生成に使用された、修飾された完全長重鎖の配列は以下のとおりである。
【０３６７】
2021500348.tif 000056
【０３６８】
2/3-IgGは標準的IgGのように培養上清に分泌され、標準的プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製された（実施例2参照）。サイズ排除および質量分析により、精製2/3-IgG変異体の正しい組立てと、望ましくない二量体および凝集物の非存在とが明らかになった。2/3-IgGの発現収率は同じ発現系では標準的IgGで観察されるものと類似していた。それぞれのデータを以下の表に提示する。
【０３６９】
2021500348.tif 000057
【０３７０】
実施例7
価数、化学量論およびジオメトリーが異なる複合的結合機能性を持つbsAbの特性解析
3つの異なる出発分子（N末端、C末端、N末端およびC末端結合部位を持つ2/3-IgG）を、本発明の交換反応において互いに組み合わせることで、9つの異なるbsAbフォーマットをもたらすことができる。これらは、価数、ジオメトリーおよび個々の結合部位の位置が異なる。これらの異なるbsAbを生成させるための交換反応を、実施例3に概説したものと同じ条件下で行った。
【０３７１】
どのタイプのインプットフォーマットにも「欠陥」がある。というのも、MHCFcRPは重鎖への鎖間ジスルフィドを形成するのに必要な追加のCH3システインを欠き、またそれは、反発電荷変異（すなわち適合する完全長重鎖対応物がない電荷）を含有するからである。これらの「欠陥」ヘテロ二量体を構成する重鎖は、本発明の方法において、再編成することで（電荷およびジスルフィド）適合ヘテロ二量体を形成する。異なるタイプの完全長重鎖（ノブ-cysとホール-cys）は適合するヘテロ二量体を形成する。適合するヘテロ二量体はMHCFcRP（ホール-電荷とノブ-電荷）からも形成される。
【０３７２】
この理論に拘泥するわけではないが、2つの異なる2/3-IgGの欠陥ヘテロ二量体の一時的な分離に基づく交換反応は、適合する電荷と、もし存在するのであれば、ジスルフィド結合を形成するためのシステイン残基とを持つ、完全に適合するヘテロ二量体を優先的に含有する生成物をもたらす。それゆえに交換は、単一特異性2/3-IgGを、（さまざまなフォーマットの）二重特異性IgGと、対応する（可変領域を含有しない、すなわち標的結合能を持たない）Fc領域ヘテロ二量体とに変換する。
【０３７３】
交換反応を説明するために、入力分子を以下のように名付ける：
・完全長重鎖（H鎖）の通常のN末端にFabアームを有する分子については「nAまたはnB」
・H鎖のC末端にFabアームを有する分子については「cAまたはcB」
・H鎖のN末端およびC末端にFabを持つ分子については「ncAまたはncB」。
【０３７４】
さまざまなフォーマット交換反応は以下のとおりである:
2/3-IgG（nA）-His-タグ＋2/3-IgG（nB）-His-タグ→bsAb（nAnB）＋Fc-His-タグ
2/3-IgG（nA）-His-タグ＋2/3-IgG（cB）-His-タグ→bsAb（nAcB）＋Fc-His-タグ
2/3-IgG（nA）-His-タグ＋2/3-IgG（ncB）-His-タグ→bsAb（nAncB）＋Fc-His-タグ
2/3-IgG（cA）-His-タグ＋2/3-IgG（cB）-His-タグ→bsAb（cAcB）＋Fc-His-タグ
2/3-IgG（cA）-His-タグ＋2/3-IgG（nB）-His-タグ→bsAb（cAnB）＋Fc-His-タグ
2/3-IgG（cA）-His-タグ＋2/3-IgG（ncB）-His-タグ→bsAb（cAncB）＋Fc-His-タグ
2/3-IgG（ncA）-His-タグ＋2/3-IgG（nB）-His-タグ→bsAb（ncAnB）＋Fc-His-タグ
2/3-IgG（ncA）-His-タグ＋2/3-IgG（cB）-His-タグ→bsAb（ncAcB）＋Fc-His-タグ
2/3-IgG（ncA）-His-タグ＋2/3-IgG（ncB）-His-タグ→bsAb（ncAncB）＋Fc-His-タグ
【０３７５】
交換反応は、鎖間（ヒンジ領域）ジスルフィド結合を切るための還元工程によって開始され、その後は、鎖再編成が自発的に起こる。すべての入力分子、すべての副生成物および交換反応中に潜在的に形成されうるすべての凝集物はアフィニティータグ（例えばHis6タグまたはHis8タグ）を保持する。しかし、交換反応のbsAb生成物はアフィニティータグを担持せず、それゆえにアフィニティー（例えばNiNTA）吸収クロマトグラフィーによって分離することができる。（さまざまなフォーマットの）bsAbは、最適な機能性を持つさまざまなbsAbフォーマットを同定しランク付けするためのスクリーニング手順および分析にそのまま適用することができる。
【０３７６】
384ウェルMTPフォーマットにおいて上述の入力2/3-IgGを交換することによって、二重特異性フォーマットを生成させた後、ブリッジングELISAを行って機能的な組立てを評価した。したがって、総体積100μlの1×PBS＋0.05％Tween 20中で、等モル量（4μM）の交換パートナー（ホール-cys変異を含有する完全長重鎖とMHCFcRP-ノブ-K370Eとからなる2/3-IgG分子1、ノブ-cys変異を含有する完全長重鎖とMHCFcRP-ホール-E357Kとからなる2/3-IgG分子2）を混合した。384深底ウェルプレート（Greiner 384 masterblock（登録商標））において、タンパク質溶液を11回、1:2希釈した。この希釈系列からの各試料20μlを、384ウェルREMP（登録商標）プレート（Brooks、＃1800030）で、20μlの0.5 mM TCEP溶液と混合することで、200〜0.2μg/mlの最終タンパク質濃度および0.25 mM TCEPにした。遠心分離後に、プレートをシールし、37℃で1時間インキュベートした。
【０３７７】
対照実施例として、片側にbio結合機能性を含有し、反対側にフルオレセイン結合機能性を含有するbsAbを使用した。結果として生じるbsAbの機能性を、ビオチン-フルオレセイン・ブリッジングELISAによって評価した。したがって、ホワイトNunc（登録商標）MaxiSorp（商標）384ウェルプレートを1μg/mlアルブミン-フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲート（Sigma、＃A9771）でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。90μlのPBST緩衝液（PBST、再蒸留水、10×PBS Roche ＃11666789001＋0.05％Tween 20）で3回洗浄した後、90μl/ウェルのブロッキング緩衝液（1×PBS、2％BSA、0.1％Tween 20）を加え、室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した後、各交換反応の1:4希釈液25μlを、各ウェルに加えた。室温で1時間のインキュベーション後に、再びプレートを90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した。0.5％BSA、0.025％Tween 20、1×PBS中のビオチン-Cy5コンジュゲート25μl/ウェルを加えて最終濃度を0.1μg/mlとし、プレートを室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で6回洗浄した後、25μlの1×PBSを各ウェルに加えた。Cy5蛍光はTecan Safire 2リーダーを使って670 nmの放出波長（励起は649 nm）で測定した。
【０３７８】
さまざまなフォーマットの2/3-IgGの交換により、1つのフルオレセイン結合体と1つのビオシチンアミド結合体とを持つさまざまなbsAbフォーマットを生成させた。入力分子および交換による出力分子を図11に示す。
【０３７９】
捕捉抗原としてのfluos-BSAと、二重特異性ブリッジング結合機能性を検出するためのbio-Cy5とを用いるブリッジングELISAによって、図12に示すように、生成したbsAbの機能性を評価した。さまざまなフォーマットのすべてが、ブリッジングELISAシグナルをもたらす。
【０３８０】
これらの結果は、本発明の方法を使って、鎖交換反応により、ロバストでハイスループットに対応できる方法で、さまざまなフォーマットを生成させることが可能であることを示している。
【０３８１】
実施例8
2/3-IgG交換による機能的bsAbの生成と所望の機能性を持つbsAbのスクリーニング/同定は、小型化およびハイスループットならびに自動化技術に適合する
結合部位の配列および/またはフォーマットが異なる多数の異なるbsAbを扱うには、ハイスループットおよび自動化技術の応用が望ましく、多くの場合、それが必要である。そこで、本発明の2/3-IgG交換法によるbsAb生成およびそれによって生成した二重特異性抗体の機能性、すなわち二重特異的結合の分析/スクリーニングを、ハイスループットおよび自動化技術と適合するように小型化することができるかどうかを分析した。
【０３８２】
そこで、348ウェルプレートにおいて、小型化された規模で、2/3-IgG交換反応を行い、反応生成物を分析した。
【０３８３】
マトリックススクリーンは384ウェルMTPフォーマットで以下のように設定した：
総体積30μlの1×PBS＋0.05％Tween 20中で、等モル量（4μM）の交換パートナー（ホール-cys変異を含有する完全長重鎖とMHCFcRP-ノブ-K370Eとからなる2/3-IgG分子1、ノブ-cys変異を含有する完全長重鎖とMHCFcRP-ホール-E357Kとからなる2/3-IgG分子2）を混合した。384深底ウェルプレート（Greiner 384 masterblock（登録商標））において、タンパク質溶液を4回、1:3希釈した。この希釈系列からの各試料20μlを、384ウェルREMP（登録商標）プレート（Brooks、＃1800030）で、20μlの0.5 mM TCEP溶液と混合することで、2μM〜0.025μMの最終タンパク質濃度および0.25 mM TCEPにした。遠心分離後に、プレートをシールし、37℃で1時間インキュベートした。
【０３８４】
次に、これによって生成したbsAbの機能性を、小型化されたハイスループットフォーマットでのブリッジングELISA（上記参照）によって評価した。すなわち、ホワイトNunc（登録商標）MaxiSorp（商標）384ウェルプレートを1μg/mlアルブミン-フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲート（Sigma、＃A9771）、1μg/ml PDGF（CST、＃8912）または1μg/ml VEGF121でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。90μlのPBST緩衝液（PBST、再蒸留水、10×PBS＋0.05％Tween 20）で3回洗浄した後、90μl/ウェルのブロッキング緩衝液（1×PBS、2％BSA、0.1％Tween 20）を加え、室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した後、各交換反応の1:4希釈液25μlを、各ウェルに加えた。室温で1時間のインキュベーション後に、再びプレートを90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した。0.5％BSA、0.025％Tween 20、1×PBS中のビオチン-Cy5コンジュゲートまたはdig-Cy5コンジュゲート25μl/ウェルを加えて最終濃度を0.1μg/mlとし、プレートを室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で6回洗浄した後、25μlの1×PBSを各ウェルに加えた。Cy5蛍光はTecan Safire 2リーダーを使って670 nmの放出波長（励起は649 nm）で測定した。VEGFまたはPDGFまたはdigまたはbioまたはfluosのいずれかに結合する2/3-IgGモジュールによる交換反応およびブリッジングELISA分析の詳細を図13に示す。例示的な分析の結果を図14に示す。これらの結果は、2/3-IgG交換反応とそれに続く機能分析をハイスループットおよび自動化技術で行うことができ、それらがハイスループットおよび自動化技術に適合することを実証している。
【０３８５】
実施例9
1つの結合部位で第1抗原を標的とし、他の2つの結合部位でさらにもう一つの抗原を標的とする、3つの結合部位を持つbsAbの生成
本発明の方法はT細胞二重特異性抗体（TCB）の生成に使用することができる。これらは以前に述べられたようなフォーマットを有しうる（例えばWO 2013/026831参照）。TCB交換アプローチの場合、一方のH鎖（上述のようにノブ-cysを持つかまたはホール-cysを持つもの）は、そのヒンジのN末端にCD3結合性のCrossFab由来の実体を含有し、N末端は別の抗体に由来するターゲティング実体によってさらに延長されている。交換反応は、上述の条件と同じ条件下で実行され、CD3結合体と2つの追加結合体とを保持するTCBをもたらす。これらは標的細胞抗原に結合することができる。これらの分子は、T細胞上のCD3と標的（例えば腫瘍細）細胞上の抗原とに同時に結合することによって、標的細胞のキリングを誘導することができる。
【０３８６】
実施例10
（ヒンジ領域およびCH3ドメイン中に）Fc領域鎖間ジスルフィド結合を持たない2/3-IgGのデザインおよび生成
Fc領域（ヒンジ領域）ジスルフィド含有2/3-IgGによる鎖交換は、鎖の分離とそれに続く所望のbsAbの組立てを可能にするために、初期工程として還元を必要とする。還元工程と、それに付随して還元剤を除去する必要とを回避するために、ヒンジ領域ジスルフィド結合を持たない2/3-IgGを生成させた。原理を図15に示す。ヒンジジスルフィド形成を担うヒンジ領域中のシステイン残基をセリンへの変異によって除去した。KiH関連ジスルフィド結合を形成する354番目または349番目のCH3-システインも省いた。それぞれのアミノ酸配列は次のとおりである。
【０３８７】
2021500348.tif 000058
【０３８８】
上記2/3-IgGの発現は、軽鎖、完全長重鎖（ノブまたはホール）および対応するMHCFcRP（ホールまたはノブ）をコードするプラスミドを、哺乳動物細胞（例えばHEK293）に共トランスフェクトすることによって達成された（実施例2参照）。2/3-IgGは標準的IgGのように培養上清に分泌され、その後、標準的プロテインAアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された（実施例2参照）。続いて、所望の100kDa 2/3-IgG発現生成物の、サイズ排除クロマトグラフィーおよびSDS-PAGEによる分析を行った（図16）。これにより、2/3-IgGの正しい組立てと、望ましくない二量体および凝集物の非存在とが証明される。これは驚くべきことである。このような分子は（ヒンジ領域でもCH3ドメインでも）Fc領域間のジスルフィドによって安定化されていないからである。Fc領域鎖間ジスルフィド結合を持たない抗fluos2/3-IgGおよび抗bio-2/3-IgGの精製収率を以下の表に提示する。
【０３８９】
2021500348.tif 000059
【０３９０】
実施例11
還元を伴わない2/3-IgG交換反応による機能的bsAbの生成
Fc領域鎖間ジスルフィド結合を含有しない2/3-IgGを、初期還元工程を省略した点以外は上述のように、鎖交換反応に供した（実施例3参照）。2/3-IgGは、fluos結合部位またはbio結合部位のどちらか一方と、完全長重鎖とMHCFcRPの間に鎖間ジスルフィド結合を持たないFc領域とを含有した。これらの2/3-IgGの組成および生産は実施例10で説明した。開始のための還元を伴わない交換反応に続いて、bsAbの二重特異的機能性を実証するために、ブリッジングELISAを行った。ブリッジングELISAは、固定化fluos-BSAへの交換反応生成物の添加と、それに続く洗浄工程、続いてbsAbの第2結合アームの存在を探るためのbio-Cys5の添加を含んだ（ブリッジングELISAの詳細については前述の実施例を参照されたい）。正しい、組み立てられた機能的bsAbだけが、それらのfluos結合部位によってアッセイプレートに結合することができ、保持され、bio-Cy5を捕捉し保持することによってシグナルを生成する。二重特異性を持たない分子はシグナルを生成しない。それらはプレートに結合しないか（bioのみを結合する物質）またはシグナルを生成するbio-Cy5を捕捉することができない（fluosのみを結合する物質）からである。これらの分析の結果（この実施例では精製bsAbを陽性対照として、2.5μMの入力分子濃度で交換反応を行う）を図17に示す。これらの結果は、Fc領域鎖間ジスルフィド結合を持たない単一特異性2/3-IgG入力分子を使った鎖交換によるbsAb生成の成功を実証している。初期還元を必要とすることなく、生産的な鎖交換が起こった。このようにFc領域ポリペプチド間ジスルフィド結合の除去により、初期還元工程の必要性は排除された。結果として生じるbsAbは非共有結合的Fc-Fc相互作用によって一つにまとまっている。このように、Fc-Fc鎖間ジスルフィドの排除は、還元の必要がない、対応するFc領域ミスマッチ推進型の交換反応を可能にする。
【０３９１】
実施例12
鎖交換反応は、部分的に不安定化された完全長重鎖-MHCFcRP境界面によって推進される
2/3-IgGからbsAbへの変換の推進要因は、完全長重鎖とMHCFcRPの間の意図的な「欠陥」境界面である。この人工的反発境界面は、MHCFcRPのノブ-またはホール-CH3ドメインに導入された変異の結果である。2/3IgGの発現中、MHCFcRPは依然として、対応する（「通常の」）ノブパートナーまたはホールパートナーと会合する（上記実施例参照）。これらの分子は2/3-IgGを、望ましくない凝集傾向を伴わない正しく振る舞う分子として提示するのに十分な安定性を有する。
【０３９２】
この理論に拘泥するわけではないが、bsAbをもたらす本発明の交換反応は、2つの相補的2/3-IgGが近接して、完全長抗体重鎖::MHCFcRPペアが隣り合わせに一部放出されたときに起こる。完全長抗体重鎖（CH3）境界面は完全であるので、そのような条件下では、適合する、すなわち電荷反発のない、ノブ-ホール完全長重鎖の再組立てが、好まれるはずである。したがって、形成されるbsAbの完全長重鎖は、部分的に不完全な（電荷がミスマッチした）2/3-IgG分子の再形成よりも優先的に会合した状態を保つ。したがって、意図的な部分的不安定化（電荷反発）CH3境界面は、指向的鎖交換反応の成功にとってキーパラメータである。
【０３９３】
Fc境界面の、とりわけCH3-CH3境界面の、部分的不安定化は、完全長抗体重鎖上の相互作用残基を維持したまま、MHCFcRPのCH3残基を変異させることによって達成することができる。
【０３９４】
MHCFcRPのCH3ドメインに導入することができて完全長抗体重鎖::MHCFcRP境界面に影響を及ぼす例示的変異を、以下の表に掲載する。
【０３９５】
2021500348.tif 000060
【０３９６】
変異の一部には、改変された電荷を境界面に入れる交換が含まれる。電荷変異は、以前に存在していた安定化電荷ペアを弱めもしくは破壊し、または反発効果をもたらし、またはその両方を生じる。
【０３９７】
同様に、サイズが異なる側鎖を持つアミノ酸を導入することで、立体反発効果を生じさせることもできる。そのような変異は、既存の疎水性境界面相互作用を弱めもしくは妨害し、または立体障害を生じさせ、またはその両方を併せ持つ。
【０３９８】
電荷および/または立体効果によって部分的に不安定化する変異を互いに組み合わせることもできる。
【０３９９】
さらにまた、そのMHCFcRPに導入された電荷および/または立体的改変を含有する第1の2/3-IgGを、そのMHCFcRPに導入された異なる電荷および/または立体改変であって、第1の2/3-IgGからのMHCFcRPの改変と合致するものを含有する第2の2/3-IgGと組み合わせることができる。
【０４００】
2/3-IgGおよび結果として生じるbsAbは、ペアになったCH3ドメインが片側にノブ変異を保持し、反対側にホール変異を保持するような形で集合する。それゆえに、MHCFcRPの対応するノブ残基またはホール残基の野生型組成への「復帰変異」は、やはり境界面障害を生じる。ノブ-CH3ドメインまたはホール-CH3-ドメインと野生型ドメインとのそのような組合せを以下の表に列挙する。
【０４０１】
2021500348.tif 000061
【０４０２】
これらの復帰変異は、CH3-CH3境界面を部分的に不安定化するために適用することができる。
【０４０３】
これらの復帰変異は、前述の表に記載したものを含む他の撹乱変異と組み合わせて適用することもできる。
【０４０４】
上述した部分的に撹乱性の個々の変異または変異の組合せはいずれも、それらが2/3-IgGを部分的に不安定化するが、交換反応の第2生成物であるノブ-MHCFcRP::ホール-MHCFcRPヘテロ二量体を安定化することにより、反応の平衡を生成物側（交換反応）へとさらにシフトさせるように、選ぶこともできる。
【０４０５】
実施例13
非抗体部分によるターゲティングおよび鎖交換反応を可能にする2/3-IgGのデザイン
本発明の交換反応は、CH3ノブ体とCH3ホール体の間の境界面変異を利用して、鎖交換反応を推進する。それぞれが「不完全」なFc境界面で構成されるH鎖ヘテロ二量体である2つの分子の相互作用により、それらのH鎖の交換が起こって、それぞれが「完全」なH-H鎖境界面を持つ2つの新しい実体が形成されるという原理を、図18に示す。この原理を応用することで、例えばスクリーニングのために、多種多様な二重特異性抗体およびフォーマットを生成させることができる。
【０４０６】
このステムユニット（stem-unit）は、例えば非抗体部分など、任意の結合物質と共に使用することができる。非抗体結合ユニットとして、HER2を標的とするアフィボディ（ZHER2:342;Orlova et al.,Cancer Res.66（2006）4339-4348）を含有し、それが2/3-IgG中の従来のFab結合ユニットと置き換わっている分子をデザインした。2つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列はSEQ ID NO:83およびSEQ ID NO:84である。この場合も本発明の原理は当てはまり、それを、特にこの交換反応について、図19に示す。
【０４０７】
分子は実施例2で概説したように生産し、交換反応は実施例3で概説したように行った。
【０４０８】
さらに具体的に述べると、発現用の配列を遺伝子合成または変異導入によって生成させ、CMVプロモーターに基づく発現プラスミドにクローニングした。これらのコンストラクトは、Her2アフィボディ結合物質を、本発明の鎖交換反応に供されるそれぞれの結合体に保持した。
【０４０９】
一過性発現を、FreeStyle（商標）293-F細胞（Invitrogen）において、製造者の説明書に従って行った。簡単に述べると、振とうフラスコ中、無血清FreeStyle（商標）293発現培地（Invitrogen）において浮遊状態で成長するHEK293-F細胞（Invitrogen）に、それぞれの発現プラスミドと293-fectin（商標）（Invitrogen）との混合物をトランスフェクトした。2L振とうフラスコ（Corning）の場合、HEK293-F細胞を1.0×106細胞/mLの密度で600 mLに播種し、120 rpm、8％CO2でインキュベートした。翌日、細胞に、およそ1.5×106細胞/mLの細胞密度で、600μgの総プラスミドDNA（1μg/mL）を含む20 mLのOpti-MEM（Invitrogen）と20 ml Opti-MEM＋1.2 mL 293-fectin（2μL/mL）との混合物、およそ42 mLをトランスフェクトした。製造者のプロトコールに従って、発現の進行中は、ボーラスグルコース溶液およびフィード溶液を加えた。正しく組み立てられたタンパク質が培養上清に分泌された。トランスフェクションの6日後に上清を収穫した。
【０４１０】
アフィボディ含有タンパク質の精製は、cOmplete（商標）Hisタグ精製樹脂（Roche、スイス）を使ったアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くSuperdex 200サイズ排除（GE Healthcare、スウェーデン）クロマトグラフィーによって行った。簡単に述べると、滅菌濾過した細胞培養上清を50 mM Na2HPO4および300 mM NaCl、pH 7.4で平衡化したcOmplete（商標）Hisタグ精製樹脂上に捕捉し、平衡化緩衝液で洗浄し、50 mM Na2HPO4、300 mM NaClおよび250 mMイミダゾール、pH 7.4で溶出させた。溶出したタンパク質画分をプールし、Vivaspin限外濾過デバイス（Sartorius Stedim Biotech S.A.、フランス）を使って総体積2 mlに濃縮し、20 mMヒスチジン、140 mM NaCl、pH 6.0で平衡化したSuperdex 200 16/60 GL（GE Healthcare、スウェーデン）カラムを使ったサイズ排除クロマトグラフィーによって、さらに精製した。タンパク質含有画分をプールし、必要な濃度まで濃縮し、-80℃で保存した。
【０４１１】
純度および正しい組成を図20（アフィニティー精製後のSECプロファイル）および図21（精製材料のSDS-PAGE）に示す。生産収率は他のFab含有2/3-IgGに匹敵した（5.8 mg/L培養物）。
【０４１２】
本発明の交換反応を、非抗体アフィボディ部分を担持するタンパク質で行った。それゆえに、20 mMヒスチジン、140 mM NaCl、pH 6.0中、300μlの総体積で、タンパク質を、LeYターゲティングプロドラッグ分子と、それぞれ2μMで混合し（交換スキームについては図19参照）、続いて37℃で1時間インキュベートした。
【０４１３】
プロドラッグ体から機能的結合分子への本発明による交換反応の成功は、ELISAによって実証された。ELISAアッセイの原理を図22に示す。反応物はHis-タグを担持するが、機能的抗原結合体、すなわちビオチン結合体を有しない。鎖交換が起こって初めて、機能的結合部位であって、Bio-Cy5捕捉と蛍光シグナル検出を可能にするビオチン結合部位（VH/VLペア、抗ビオチンFv）が形成される。ELISAのために、試料を、1％（w/v）ウシ血清アルブミンを含む1×PBSで1μMの反応物タンパク質濃度まで希釈し、100μlをBlack Pierce（C）ニッケルコート96ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific、米国）に適用し、室温で1時間インキュベートした。250μlのPBST緩衝液（1×PBS＋0.05％Tween 20）で3回洗浄した後、PBST中の100 ng/mlビオチン-Cy5コンジュゲート100μlを加えた。その後、室温で1時間のインキュベーションを実行した。250μlのPBST緩衝液で4回洗浄した後、100μlのPBSTを各ウェルに加えた。Cy5蛍光はTecan Infinite M200 Proリーダーを使って675 nmの放出波長（励起は647 nm）で測定した。図23はELISAの結果を示しており、鎖交換の成功と不活性なプロドラッグ体からの結合性Fvの活性化とを明らかにしている。これにより、本発明の交換反応と、それによるプロドラッグの活性化には、非抗体部分を使用できることが実証される。
【０４１４】
実施例14
ニッケルアフィニティークロマトグラフィー
未反応出発材料およびヒスチジンタグを保持する交換生成物の除去は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使って行うことができる。
【０４１５】
ニッケルアフィニティークロマトグラフィーは、0.2 ml HisPur（商標）Ni-NTA Spinカラム（ThermoScientific）を製造者の説明書に従って使用することによって行った。交換反応の粗反応混合物を平衡化したカラムに適用した。試料とアガロースベースのアフィニティー材料との接触を増加させるために、カラムを室温で1時間インキュベートした。任意でインキュベーション中はカラムを回転させることができる。非結合材料は洗浄緩衝液と共にフロースルーモードの遠心分離によって溶出させた。3回洗浄した後、結合した材料を、製造者の説明書に従い、溶出緩衝液を使って溶出させた。
【０４１６】
実施例15
本発明のFab延長型2/3-IgGの発現および精製
Fab延長型2/3-IgGの発現は、Fab延長型軽鎖、Fab延長型重鎖（ノブ変異またはホール変異を持つもの）および適合するMHCFcRP（ホールまたはノブ）をコードするプラスミドを、最先端の技術で、哺乳動物細胞（例えばHEK293）に共トランスフェクトすることによって達成された。
【０４１７】
より具体的には、例えば（HEK293細胞などにおける）一過性トランスフェクションによるFab延長型2/3-IgGの生産には、CMVイントロンAプロモーターを持つもしくはCMVイントロンAプロモーターを持たないcDNA編成に基づくか、またはCMVプロモーターを持つゲノム構成に基づく、発現プラスミドを適用した。このプラスミドは、Fab延長型重鎖用の1つの発現カセットと、それぞれ2つの軽鎖用の発現カセットを含有した。
【０４１８】
抗体発現カセットの他に、プラスミドは、以下：
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、
・大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子、および
・真核細胞における選択可能マーカーとしてのハツカネズミ由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
を含有した。
【０４１９】
各抗体遺伝子の転写単位は以下の要素で構成された：
・5'端のユニークな制限部位、
・ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・cDNA編成の場合は、それに続くイントロンA配列
・ヒト抗体遺伝子の5'-非翻訳領域、
・免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・cDNA編成としての、またはゲノム編成としての（免疫グロブリンエクソン-イントロン編成が維持されている）、それぞれの抗体鎖、
・ポリアデニル化シグナル配列を持つ3'非翻訳領域、および
・3'端のユニークな制限部位。
【０４２０】
融合遺伝子を、PCRおよび/または遺伝子合成によって生成させ、例えばそれぞれのプラスミド中のユニークな制限部位を使うなどして、一致する核酸セグメントを接続することにより、公知の組換え方法および組換え技法によって組み立てた。サブクローニングされた核酸配列はDNA配列決定によって検証した。一過性トランスフェクションのために、形質転換された大腸菌培養物からのプラスミド調製によって、より多量のプラスミドを調製した（Nucleobond AX、Macherey-Nagel）。
【０４２１】
Current Protocols in Cell Biology（2000）,Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.and Yamada,K.M.（eds.）,John Wiley＆Sons,Incに記載されているように、標準的な細胞培養技法を使用した。
【０４２２】
HEK293-Fシステム（Invitrogen）を製造者の説明書に従って使用し、それぞれのプラスミドの一過性トランスフェクションによって、Fab延長型2/3-IgGを生成させた。簡単に述べると、振とうフラスコまたは撹拌発酵槽中、無血清FreeStyle（商標）293発現培地（Invitrogen）において浮遊状態で成長するHEK293-F細胞（Invitrogen）に、それぞれの発現プラスミドと293fectin（商標）またはfectin（Invitrogen）との混合物をトランスフェクトした。2L振とうフラスコ（Corning）の場合、HEK293-F細胞を1.0×106細胞/mLの密度で600 mLに播種し、120 rpm、8％CO2でインキュベートした。翌日、細胞に、およそ1.5×106細胞/mLの細胞密度で、（A）600μgの総プラスミドDNA（1μg/mL）を含む20 mLのOpti-MEM（Invitrogen）と（B）20 ml Opti-MEM＋1.2 mL 293fectinまたはfectin（2μL/mL）との混合物およそ42 mLをトランスフェクトした。発酵中は、グルコース消費に応じて、グルコース溶液を加えた。正しく組み立てられたFab延長型2/3-IgGは、標準的IgGのように、培養上清中に分泌された。分泌されたFab延長型2/3-IgGを含有する上清を5〜10日後に収穫し、Fab延長型2/3-IgGを上清から直接精製するか、または上清を凍結して保存した。
【０４２３】
Fab延長型2/3-IgGはFc領域を含有するので、標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを適用することによって、それらを精製した。
【０４２４】
抗体は、MabSelectSure-Sepharose（商標）（GE Healthcare、スウェーデン）およびSuperdex 200サイズ排除（GE Healthcare、スウェーデン）クロマトグラフィーを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製された。
【０４２５】
簡単に述べると、滅菌濾過した細胞培養上清をPBS緩衝液（10 Mm Na2HPO4、1 mM KH2PO4、137 mM NaClおよび2.7 mM KCl、pH 7.4）で平衡化したMabSelectSuRe樹脂上に捕捉し、平衡化緩衝液で洗浄し、pH 3.0の2 5 mMクエン酸ナトリウムで溶出させた。溶出したFab延長型2/3-IgG画分をプールし、2 M Tris、pH 9.0で中和した。そのプールを、20 mMヒスチジン、140 mM NaCl、pH 6.0で平衡化したSuperdex 200 26/60 GL（GE Healthcare、スウェーデン）カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって、さらに精製した。Fab延長型2/3-IgG含有画分をプールし、Vivaspin限外濾過デバイス（Sartorius Stedim Biotech S.A.、フランス）を使って必要な濃度まで濃縮し、-80℃で保存した。
【０４２６】
CE-SDSによる各精製工程後に、マイクロ流体Labchip技術（Caliper Life Science、米国）を使って、純度および完全性を分析した。HT Protein Express試薬キットを製造者の説明書に従って使用することで、タンパク質溶液（5μl）をCE-SDS分析用に調製し、HT Protein Expressチップを使って、LabChip GXIIシステムで分析した。データはLabChip GXソフトウェアを使って分析した。
【０４２７】
以下の例示的なFab延長型-2/3-IgGを、対応するL鎖、H鎖およびMHCFcRPをコードするプラスミド、すなわち抗フルオレセイン-抗CD3-2/3-IgG-ノブ-cys＋抗ビオチン-E357K-ホール-MHCFcRPの共発現によって生産した。対応するSECクロマトグラムを図27に示す。SECによる単量体含量は93.4％であった。CE-SDSによる単量体含量は100％であった。質量はMSによって確認した。
【０４２８】
実施例16
出発材料としてFab延長型2/3-IgGを使った2/3-IgG交換反応による二重特異性抗体（bsAb）の生成
2つの軽鎖、重鎖およびMHCFcRPを含有するFab延長型2/3-IgGを、KiHヘテロ二量体、すなわち完全長重鎖-ノブ::MHCFcRP-ホールとして生成させた。Fab延長型2/3-IgGには多少の「欠陥」がある。MHCFcRPが、完全長重鎖対応物中に適合する電荷を持たない電荷変異を含有するからである。しかし、これらの欠陥ヘテロ二量体を構成するモジュールは、適合する電荷を持つ二重特異性ヘテロ二量体へと再編成する能力を有する。Fab延長型2/3-IgG Aの完全長重鎖（ノブ）と2/3-IgG Bからの完全長重鎖（ホール）は適合するヘテロ二量体を形成する。適合するヘテロ二量体はMHCFcRP（ホール-電荷）がMHCFcRP（ノブ-電荷）と相互作用した場合にも形成される。こうして、2つの異なる2/3-IgGの出発ヘテロ二量体の一時的な分離に基づく交換反応は、（電荷が）適合するヘテロ二量体を優先的に含有する生成物をもたらした。したがって交換反応は2種の単一特異性2/3-IgGを、1つの二重特異性IgGと1つのMHCFcRPヘテロ二量体とに変換した。
Fab延長型2/3-IgG-His6（8）＋2/3-IgG-His6（8）→bsAb（AB）＋Fc-His6（8）
【０４２９】
交換反応は、とりわけヒンジ領域鎖間ジスルフィド結合を切るための（例えば2-MEAまたはTCEPをさまざまな濃度で適用することなどによる）還元工程によって開始された。その後は鎖再編成が自発的に起こった。
【０４３０】
図26に示すFab延長型2/3-IgGによる3つの交換反応のための手順は、以下のとおりであった。
1 mgのFab延長型2/3-IgG（dA）を、総体積2 mlの1×PBS緩衝液中で、それぞれの2/3-IgGフォーマット（nBまたはcBまたはncB）1 mgと混合した。1×PBS緩衝液中の16倍モル当量のTCEPを混合物に加えた。試料を37℃および350 rpm撹拌下で1時間インキュベートした。インキュベーション時間後に、試料をNiNTAクロマトグラフィーカラム（HisComplete（商標）、Roche、スイス・バーゼル）で精製した。組み立てられた二重特異性抗体は素通り画分に収集された。素通り画分を室温で一晩、さらにインキュベートした。次に、分析用SEC、CE-SDSおよび質量分析法によって試料を分析した。
【０４３１】
交換反応の結果を以下の表に提示する。
【０４３２】
2021500348.tif 000062
【０４３３】
BIAcore T200機器（GE Healthcare）を使用し、表面プラズモン共鳴によって、ビオチンおよびFITCへの結合を調べた。ランニング緩衝液および希釈緩衝液としてHBS-P（10 mM HEPES、140 mM NaCl、0.05％Tween 20 pH 7.4）を使用して、すべての実験を25℃で行った。標準的なアミンカップリング化学を使って抗ヒトFc抗体（GE Healthcare ＃BR100839）をSeries S CM5センサーチップ（GE Healthcare ＃29104988）上に固定化した。二重特異性抗体を表面に捕捉した後、ビオチン標識タンパク質またはFITC標識タンパク質の逐次的注入（最初にビオチン標識体を注入し、次にFITC標識体を注入する操作を1回、および最初にFITC標識体を注入し、次にビオチン標識体を注入する操作を1回）を行った。それぞれ10μg/mlの濃度で、会合は60秒間、解離は120秒間モニターした。3 M MgCl2を60秒間注入することによって表面を再生した。モック表面からの応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ブランク注入を差し引いた（二重参照）。二重特異性抗体＜FITC＞＜CD3＞-ノブ-HC（dA）＋＜ビオチン＞-ホール-nc-His（ncB）に関する2つの例示的なSPRセンサーグラムを図28に示す（これら2つのセンサーグラムは、1回目にビオチン添加、2回目にFITC添加、および1回目にFITC添加、2回目にビオチン添加を表す）。すべての組合せに関する結果を以下の表に示す。
【０４３４】
2021500348.tif 000063
【０４３５】
すべての出発分子、すべての不要な副生成物および交換反応中に生成した可能性のあるすべての凝集物は、アフィニティータグ（His6またはHis8）を保持している。交換反応で生産された所望の二重特異性抗体はHisタグを担持していない唯一の分子である。それゆえに、望ましくない分子をすべて除去するために、単純なNiNTA吸収工程を適用することができる。素通り画分からの残存二重特異性抗体は、所望の機能性を持つ二重特異性抗体を同定するためのスクリーニング手順および分析にそのまま適用することができる。
【０４３６】
実施例17
交換反応後の精製のための代替的タグ
交換反応が、使用したタグの影響を受けないことを示すために、これらの実験では、ポリヒスチジン-タグの代わりにEPEA C-タグ（SEQ ID NO:87）を使用した。
【０４３７】
それぞれの末端に融合された短いリンカー付きのC-タグ（SEQ ID NO:88）を使用して、実施例6で述べたような2/3-IgGを発現させ、精製した。これらの2/3-IgGの生産および精製の結果を以下の表に示す。
【０４３８】
2021500348.tif 000064
【０４３９】
交換反応は以下のように行った。
それぞれの出発2/3-IgG各300μl（c＝1 mg/ml、合計600μl）を混合した。TCEPを15倍モル過剰に加えた。試料を37℃および400 rpmでインキュベートした。360μlの試料を200μlのC-タグ樹脂（Thermo Scientific、1×PBS pH 7.4で洗浄した50％スラリー）と混合し、スピンカップカラム中、室温および800 rpm撹拌下で60分インキュベートした。インキュベーション後に、スピンカラムを室温、800 rpmで5分間遠心分離し、素通り画分を収集した。樹脂を1×PBS pH 7.4（100μl、続いて遠心分離工程）で数回洗浄した。洗浄後に、試料の樹脂を100μlのHCl緩衝液pH 2.6と混合し、室温および800 rpm撹拌下で30分インキュベートした。室温および800 rpmで5分間の遠心分離によって、溶出液を生成させた。
【０４４０】
2/3-IgG A（Fluo-ノブ-n-HC＋ホール-MHCFcRP（E357K）-C-タグ）と2/3-IgG B（ビオチン-ホール-n-HC＋ノブ-MHCFcRP（K370E）-C-タグ）の例示的交換反応に関する非還元CE-SDSクロマトグラムを図29に示す。二重特異性抗体が形成されて、素通り画分中に収集されうることがわかる。交換反応後にC-タグ付きMHCFcRPをC-タグ樹脂に結合させて、そこから溶出することができる。これにより、分離と精製が達成される。
【０４４１】
実施例18
還元を伴わない2/3-IgG交換反応による二重特異性抗体の生産
Fc領域ジスルフィドを含有する2/3-IgGを使った鎖交換は、鎖分離と、その後の再組み立てによる所望の二重特異性抗体の形成とを可能にするために、初期工程として還元を必要とする。2/3-IgGは非ヒンジジスルフィド結合（ジスルフィドシャフリング）も含有するので、還元工程と、それに付随する副反応とを避けるために、H鎖FcとMHCFcRP Fcとの間にジスルフィドを持たない2/3-IgGを生成させた。これは、ノブ半抗体およびホール半抗体中ならびにノブまたはホールMHCFcRP鎖中の、ヒンジジスルフィド形成を担うシステインを変異させることによって達成された。半抗体間のKiH関連鎖間ジスルフィドを形成するCH3-システインも除去した。
【０４４２】
H-H鎖間ジスルフィドを形成する2つのシステインを排除するために、それぞれのH鎖ヒンジ領域中の2つのシステインをセリンに交換することによって、ヒンジ間ジスルフィドを持たないIgG1誘導体を生成させた。これにより、野生型IgG1ヒンジ領域の配列...HTCPXCP..（SEQ ID NO:31）は、...HTSPXSP..（SEQ ID NO:85）をコードするように改変された。
【０４４３】
鎖間ジスルフィド形成に寄与するヒンジ領域の配列ストレッチ全体を欠失させることにより、ヒンジ鎖間ジスルフィドを持たない実体をもう一つ生成させた。したがって、通常のIgG1のヒンジ領域CPPC配列を欠失させて、配列が...HTPAPE...（SEQ ID NO:86）である短いヒンジを生成させた。
【０４４４】
図25は、セリンによるシステインの置き換えが、本来であれば制約を課すヒンジジスルフィドが解除されることにより、差し渡し距離が長くなった抗体を生成させることを示している。
【０４４５】
HC-HC鎖間ジスルフィド結合を持たない2/3IgGの発現は、ジスルフィド含有体に関して上述した方法と同様に、CMVプロモーター推進型発現プラスミドの、哺乳動物細胞への共トランスフェクションによって達成された。HEK293細胞への発現プラスミドの一過性トランスフェクションは、個々の2/3-IgGのCMVプロモーター推進型共発現、分泌小器官における組立て、およびそれに続いて培養上清への分泌をもたらす。
【０４４６】
HC-HC鎖間ジスルフィドを持たない2/3IgGは、細胞培養上清に分泌され、Fc領域とカッパL鎖とを保持していた。そこで、最初の工程においてプロテインAまたはKappaSelect樹脂で精製することによって、それらを精製した。その後の工程では、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により、サイズに従って分離した。この2工程プロトコールにより、細胞培養上清から2/3IgG誘導体を、ロバストかつ効果的に、標準的抗体に観察される収率に似た収率で、効率よく回収することが可能になった。
【０４４７】
実施例19
還元を伴わない2/3-IgG交換反応による二重特異性抗体の生成
軽鎖、重鎖および相補的Fc領域を含有する2/3-IgGを、2タイプのKiHヘテロ二量体、すなわち重鎖-ノブ::対応するFc領域-ホールおよび重鎖-ホール::対応するFc領域-ノブとして生成させた。両タイプの2/3IgGには「欠陥」がある。相補的Fc領域は、適合するH鎖対応物を持たない電荷変異を含有するからである。しかし、これらの欠陥ヘテロ二量体を構成するモジュールは、完全なヘテロ二量体を再編成する能力を有する。すなわち2/3-IgG Aの重鎖（ノブ）と2/3-IgG Bからの重鎖（ホール）とが完全なヘテロ二量体を形成する。完全なヘテロ二量体は、相補的Fc領域（ホール-電荷）が相補的Fc領域（ノブ-電荷）と相互作用する場合にも形成される。こうして、2つの異なる2/3-IgGタイプの出発ヘテロ二量体の一時的な分離に基づく交換反応は、完全なヘテロ二量体を優先的に含有する生成物をもたらした。したがって、交換反応は2種の単一特異性2/3-IgGを、1つの二重特異性IgGと1つの相補的Fc領域ヘテロ二量体とに変換した。
【０４４８】
CH3ノブ-ホールおよび/またはヒンジ鎖間ジスルフィドを含有する元の2/3-IgGの交換反応は、前述の実施例で示したように、還元工程によって開始されなければならない。ジスルフィド結合を切るためにTCEPなどの還元剤が加えられ、その後に、鎖再編成が起こる。対照的に、鎖間HC-HCジスルフィド結合を持たない2/3-IgG誘導体は、鎖交換を開始するために還元工程を必要としない。なぜなら、それらのH鎖はジスルフィド結合によって互いにつながれていないからである。
【０４４９】
2/3-IgGからbsAbへの変換が初期還元に依存するかどうか、そしてどの程度に依存するかを分析するために、2/3-IgG（鎖間結合があるものおよびないもの）の交換反応を、還元ありおよび還元なしで行った。BioまたはFluosのどちらかに結合する一価単一特異性2/3-IgG（上述）を入力分子として使用した。結果として、交換反応は、BioとFluosに結合する二価二重特異性bsAbを生成する。生成したbsAbの形成および二重特異的機能性は、上述のようにブリッジングELISAによって評価した。ブリッジングELISAは、固定化fluos-BSAへの交換反応混合物の添加と、それに続く洗浄工程、続いて二重特異性抗体の第2結合アームの存在を探るためのBio-Cys5の添加からなった。正しい、組み立てられた機能的二重特異性抗体だけが、それらのFluos結合アームによってアッセイプレート上に保持され、かつBio-Cy5を捕捉し保持することによってシグナルを生成し、それによってアッセイシグナルを生じる。単一特異性入力分子または二重特異性を持たない「偽」（false）分子はシグナルを生成しない。というのも、それらはプレートに結合しないか（Bioのみを結合する物質）またはシグナルを生成するBio-Cy5を捕捉することができない（Fluosのみを結合する物質）からである。
【０４５０】
図24に、開始還元工程ありおよび開始還元工程なしでの、親（鎖間ジスルフィド含有）2/3-IgG交換反応およびH-H鎖間ジスルフィド欠失2/3-IgG交換反応の、これらのブリッジングELISA分析の結果を示す。アッセイプレート上のFluos結合アーム、およびBio-Cy5を捕捉し保持することによってシグナルを生成し、それによってアッセイシグナルを生じる。単一特異性入力分子または二重特異性を持たない「偽」分子はシグナルを生成しない。というのも、それらはプレートに結合しないか（Bioのみを結合する物質）またはシグナルを生成するBio-Cy5を捕捉することができない（Fluosのみを結合する物質）からである。図24に、開始還元工程ありおよび開始還元工程なしでの、親（鎖間ジスルフィド含有）2/3-IgG交換反応およびH-H鎖間ジスルフィド欠失2/3-IgG交換反応の、これらのブリッジングELISA分析の結果を示す。本発明者らは、ヒンジジスルフィドを含有する2/3-IgGの場合、鎖反応を可能にするには、初期還元が不可欠であることを観察した。ヒンジ-ジスルフィドを持つ2/3-IgGは、還元によって交換が開始された場合にのみ、二重特異性抗体に変換された。対照的に、ヒンジ（およびCH3）鎖間ジスルフィドを持たない2/3-IgGを適用すると、効果的な二重特異性抗体生成が達成された。これらの分子の鎖交換は、ヒンジでつながれた投入分子（entry molecule）について上述したのと同じように、還元条件下で二重特異性抗体を生成する。しかし、開始のための還元は、これらの分子の生産的鎖交換には不可欠ではなかった。というのも、生産的な鎖交換は、初期還元がなくても、すなわち還元剤の非存在下でも起こったからである。このように、Fc-Fc鎖間ジスルフィドの除去は、開始還元工程の必要性を排除した。結果として生じる二重特異性抗体は、ヒンジ領域鎖間ジスルフィド結合がなくても、一つにまとまっている。このように、二重特異性抗体の効果的な形成は、これらのヒンジジスルフィド非含有2/3-IgGを組み合わせたときに自発的に起こり、HC-HC鎖ジスルフィド結合を持たない2/3-IgGを使用する場合には、交換反応を開始させるための還元工程は免除されうる。
【０４５１】
実施例20
鎖交換反応は濃度依存的である
2/3-IgGから二重特異性抗体への変換の推進要因は、Fc領域間の意図的な「部分的欠陥」境界面である。この特殊な境界面は、MHCFcRP Fc分子のノブ-またはホール-CH3ドメインに導入された変異の結果である。2/3-IgGの発現中、変異型CH3ドメインは依然として、対応する「通常の」ノブパートナーまたはホールパートナーと会合する。これらの分子は2/3-IgGを、望ましくない凝集傾向を伴わない正しく振る舞う分子として提示するのに十分な安定性も有する。二重特異性抗体をもたらす生産的な鎖交換反応は、2つの相補的2/3-IgGが近接して、H鎖::MHCFcRPペアが隣り合わせに一部放出されたときに起こる。ノブ-ホールH鎖の再組立てによる、不安定化変異を持たない二重特異性抗体の形成が、そのような条件下では、好まれるはずである。なぜなら、これらのH鎖（CH3）境界面の方がより良く適合するからである。このように、二重特異性抗体生成物の鎖は、部分的に不完全な2/3-IgG入力分子の再形成に優先して会合した状態を保つ。意図的な部分的不安定化CH3境界面は、指向的鎖交換反応の成功にとってキーパラメータである。Fc境界面の部分的不安定化は、本明細書において上述したようにMHCFcRP鎖のCH3残基を変異させることによって達成することができる。
【０４５２】
交換反応が起こるために不可欠な他の必須の要件の一つは（部分的不安定化境界面に加えて）2つの相補的2/3-IgGが鎖交換を可能にするために近接しなければならないことである。そして近接する確率は、交換反応におけるそれらの濃度に依存するはずである。
【０４５３】
HC-HC鎖間ジスルフィド結合を持たないBioおよびFluos結合2/3-IgGをさまざまな濃度で適用して、交換反応を非還元条件下で設定した。交換反応の完了後に、遊離体濃度が高い試料を交換緩衝液で最も低い実験試料の濃度まで希釈することにより、すべての反応混合物を「等遊離体濃度」にした。次に、ブリッジングELISAを適用することで、各実験試料における機能的bsAbの相対量を決定した。希釈度を揃えた試料中には同一量の遊離体が存在するので、濃度非依存性は、すべての試料において等しい/類似するELISA値をもたらすであろう。逆に、反応中の遊離体濃度が高くなるにつれて連続的に増加するシグナルは、濃度依存的鎖交換を示すであろう。これらの分析の結果は、＞2μMの遊離体濃度を含有した反応では、ELISAシグナルがプラトーに達することを明らかにした。したがって、これらの濃度以上では、遊離体濃度は交換反応の効率に対して限られた効果しか有しない。遊離体濃度が低いほど、生成するELISAシグナルは用量依存的に低減した。したがって、一定のしきい未満では、交換によるbsAbの生成は、遊離体相互作用が起こる確率の低下ゆえに、遊離体濃度の影響を著しく受けた。結果を図30に示す。
【０４５４】
2021500348.tif 000065
【０４５５】
実施例21
出発材料として拘束型2/3-IgGsを使った2/3-IgG交換反応による二重特異性抗体（bsAb）の生成
拘束型2/3-IgGは環状であり、結合部位はFc領域のN末端側にある第1部分とFc領域のC末端側にある第2部分とで形成され、第1部分と第2部分が互いに会合して、結合部位を形成する。これをKiHヘテロ二量体、すなわち完全長環状重鎖-ノブ::MHCFcRP-ホールとして生成させた。拘束型2/3-IgGには多少の「欠陥」がある。というのも、MHCFcRPは重鎖への鎖間ジスルフィドを形成するのに必要な追加のCH3システインを欠き、MHCFcRPは適合する電荷を完全長重鎖対応物に持たない電荷変異を含有するからである。しかし、これらの欠陥ヘテロ二量体を構成するモジュールは、適合する電荷を持つ二重特異性ヘテロ二量体へと再編成する能力を有する。2/3-IgG Aの完全長または完全長拘束型重鎖（ノブ-cys）と2/3-IgG Bからの完全長または拘束型重鎖（ホール-cys）は適合するヘテロ二量体を形成する。適合するヘテロ二量体はMHCFcRP（ホール-電荷）がMHCFcRP（ノブ-電荷）と相互作用した場合にも形成される。こうして、2つの異なる2/3-IgGの出発ヘテロ二量体の一時的な分離に基づく交換反応は、（電荷が）適合するヘテロ二量体を優先的に含有する生成物をもたらした。したがって交換反応は2種の単一特異性2/3-IgGを、1つの二重特異性IgGと1つのMHCFcRPヘテロ二量体とに変換した。
拘束型2/3-IgG-His6（8）＋2/3-IgG-His6（8）→bsAb（AB）＋Fc-His6（8）
【０４５６】
交換反応は、とりわけヒンジ領域鎖間ジスルフィド結合を切るための還元工程によって開始された。その後は鎖再編成が自発的に起こった。
【０４５７】
図31に示す交換反応のための手順は以下のとおりであった。
1 mgの「入力フォーマットA」を、総体積2 mlの1×PBS緩衝液中で、1 mgの「入力フォーマットB」と混合した。1×PBS緩衝液中の16倍モル当量のTCEPを混合物に加えた。試料を37℃および350 rpm撹拌下で1時間インキュベートした。インキュベーション時間後に、試料をNiNTAクロマトグラフィーカラム（HisComplete（商標）、Roche、スイス）で精製した。組み立てられた二重特異性抗体は素通り画分に収集された。素通り画分を室温で一晩、さらにインキュベートした。次に、分析用SEC、CE-SDSおよび質量分析法によって試料を分析した。
【０４５８】
交換反応の結果を以下の表に提示する。
【０４５９】
2021500348.tif 000066
【０４６０】
BIAcore T200機器（GE Healthcare）を使用し、表面プラズモン共鳴によって、c-MET、ビオチンおよびFITCへの結合を調べた。ランニング緩衝液および希釈緩衝液としてHBS-P（10 mM HEPES、140 mM NaCl、0.05％Tween 20 pH 7.4）を使用して、すべての実験を25℃で行った。標準的なアミンカップリング化学を使って抗ヒトHisタグ抗体（GE Healthcare ＃28995056）をSeries S CM5センサーチップ（GE Healthcare ＃29104988）上に固定化した。その表面にc-MET-Fc（R＆D Systems ＃358-MT）を注入し、次にビオチン-またはFITC-標識タンパク質を、それぞれ10μg/mlの濃度で注入した。会合相および解離相を各結合事象について2分間モニターした。10 mMグリシンpH 1.5を60秒間注入することによって表面を再生した。モック表面からの応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ブランク注入を差し引いた（二重参照）。
【０４６１】
第2の設定では、c-METおよび抗ヒトFc抗体（GE Healthcare ＃BR100839）をシリーズS CM5センサーチップ上に固定化した。コントースボディ（Contorsbody）を、両フローセル上に、10μg/mlの濃度で30秒間注入した。3 M MgCl2を60秒間注入することによって表面を再生した。モック表面からの応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ブランク注入を差し引いた（二重参照）。評価のために、結果として生じるc-MET結合応答を、抗ヒトFc抗体結合に由来する応答に標準化した。二重特異性抗体＜cMET＞-ホール-con-HC（conA）＋＜Fluo＞-ノブ-c-His（cB）に関する例示的SPRセンサーグラムを図33に示す。すべての組合せに関する結果を以下の表に示す。
【０４６２】
2021500348.tif 000067
n/aは、それぞれの結合部位が二重特異性抗体に存在せず、それにより、結合なしと予想できることを示す。
【０４６３】
すべての出発分子、すべての不要な副生成物および交換反応中に生成した可能性のあるすべての凝集物は、アフィニティータグ（His6またはHis8）を保持している。交換反応で生産された所望の二重特異性抗体はHisタグを担持していない唯一の分子である。それゆえに、望ましくない分子をすべて除去するために、単純なNiNTA吸収工程を適用することができる。素通り画分からの残存二重特異性抗体は、所望の機能性を持つ二重特異性抗体を同定するためのスクリーニング手順および分析にそのまま適用することができる。
【図１】
2021500348.tif 000073
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2021500348.tif 000081
【図１０】
2021500348.tif 000082
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2021500348.tif 000089
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2021500348.tif 000100
【図２９】
2021500348.tif 000101
【図３０】
2021500348.tif 000102
【図３１】
2021500348.tif 000103
【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
2021500348.tif 000106
【配列表】
2021500348000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月18日(2020.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ二量体交換済みポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
- ・免疫グロブリンG CH3ドメインおよび少なくとも1つの機能的結合部位もしくはその一部を含む第1ポリペプチドと、免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第2ポリペプチドとを含む、第1ヘテロ二量体出発ポリペプチドであって、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドがヘテロ二量体を形成し、
- 第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含みかつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含みかつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ
- 第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、Kabat EUインデックスに従うナンバリングで、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択されるさらなる変異を含む、
第1ヘテロ二量体出発ポリペプチド
と、
・免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第3ポリペプチドと、免疫グロブリンG CH3ドメインおよび少なくとも1つの機能的結合部位もしくはその一部を含む第4ポリペプチドとを含む、第2ヘテロ二量体出発ポリペプチドであって、
第3ポリペプチドと第4ポリペプチドがヘテロ二量体を形成し、
- 第1ポリペプチドが変異ホール-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブ-cysを含みかつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含みかつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ
- 第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択されるさらなる変異を含み、さらなる変異が、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドのCH3ドメインに存在する変異とは異なる、
第2ヘテロ二量体出発ポリペプチド
とを、第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチドを交換するためにインキュベーションして、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3ヘテロ二量体交換済みポリペプチド、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4ヘテロ二量体交換済みポリペプチドを形成させる工程；ならびに
- 第4ヘテロ二量体交換済みポリペプチドを回収する工程。
【請求項２】
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異E357Kを含み、第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、第3ポリペプチドのCH3ドメインが変異K370Eを含み、かつ第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異D356Kを含み、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、第3ポリペプチドのCH3ドメインが変異K439Eを含み、かつ第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、第2ポリペプチドが変異ホールを含み、第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、IgG1 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドがそれぞれ、IgG1 CH1ドメインおよび可変ドメインをさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
第1ポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、かつ第4ポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであるか、またはその逆であり、これらのドメインが第4ヘテロ二量体交換済みポリペプチド中で結合部位を形成する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
第1ヘテロ二量体ポリペプチドおよび第2ヘテロ二量体ポリペプチドが、それぞれ第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
第1ヘテロ二量体出発ポリペプチドのヒンジ領域と第2ヘテロ二量体出発ポリペプチドのヒンジ領域が、Kabat EUインデックスに従うナンバリングで、変異C226SおよびC229Sを含むか、またはCPXC（SEQ ID NO:89）配列全体の欠失を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
インキュベーション工程が還元剤の非存在下にある、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチドがタグをさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
タグがC末端タグである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
タグがアミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）またはHHHHHHHH（SEQ ID NO:68）を有し、回収工程が金属キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる、請求項11または12記載の方法。
【請求項１４】
タグがアミノ酸配列EPEA（SEQ ID NO:87）を有し、回収工程がC-タグアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる、請求項11または12記載の方法。
【請求項１５】
多重特異性ポリペプチドを同定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
（a）第1標的に特異的に結合する第1の多数のヘテロ二量体出発ポリペプチドから選択される第1ヘテロ二量体出発ポリペプチドと、第2標的に特異的に結合する第2の多数のヘテロ二量体出発ポリペプチドから選択される第2ヘテロ二量体出発ポリペプチドとの各組合せを、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法に供することによって、多数の多重特異性ヘテロ二量体交換済みポリペプチドを生産する工程；
（b）工程（a）において生産された多数の多重特異性ヘテロ二量体交換済みポリペプチドの各メンバーについて、結合アッセイにおいて、前記2種の標的に対する同時結合を、個別に測定する工程；ならびに
（c）多数のヘテロ二量体交換済みポリペプチドから、結合アッセイの結果に基づいてヘテロ二量体交換済みポリペプチドを選択する工程であって、それによって多重特異性ポリペプチドを同定する、工程。
【請求項１６】
結合アッセイがELISAまたはSPR法である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドを含む、ヘテロ二量体ポリペプチドであって、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドがいずれも免疫グロブリンG CH3ドメインを含み、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドがヘテロ二量体を形成し、第1ポリペプチドが、少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、かつ
・第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含みかつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含みかつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ
・第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、Kabat EUインデックスに従うナンバリングで、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択されるさらなる変異を含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて第2ポリペプチドのCH3ドメイン中に含まれる前記さらなる変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、
前記ヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１８】
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドを含む、ヘテロ二量体ポリペプチドであって、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドがいずれも免疫グロブリンG CH3ドメインを含み、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドがヘテロ二量体を形成し、第1ポリペプチドが、少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、かつ
・第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含みかつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含むか、または第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含みかつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ
・第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、Kabat EUインデックスに従うナンバリングで、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S、およびW366Tからなる変異の群より選択されるさらなる変異を含み、かつ第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、
前記ヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項１９】
さらなる変異がE357Kでありかつ第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含むか、またはさらなる変異がK370Eでありかつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、請求項17または18記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２０】
さらなる変異がD356Kでありかつ第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、またはさらなる変異がK439Eでありかつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、請求項17または19記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２１】
第1ポリペプチドが、IgG1 CH1ドメインおよび可変ドメインをさらに含む、請求項17〜20のいずれか一項記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２２】
第1ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、請求項17〜21のいずれか一項記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２３】
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、IgG1 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインを含む、請求項17〜22のいずれか一項記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２４】
ヒンジ領域が、Kabat EUインデックスに従うナンバリングで、変異C226SおよびC229Sを含むか、またはCPXC（SEQ ID NO:89）配列全体の欠失を含む、請求項17〜23のいずれか一項記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２５】
第2ポリペプチドがタグをさらに含む、請求項17〜24のいずれか一項記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２６】
第2ポリペプチドがC末端タグをさらに含む、請求項17〜25のいずれか一項記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２７】
タグが、アミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）、HHHHHHHH（SEQ ID NO:68）、またはEPEA（SEQ ID NO:87）を有する、請求項26記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項1〜14のいずれか一項記載のヘテロ二量体交換済みポリペプチドを生産する方法において使用するための、請求項17〜26のいずれか一項記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項２９】
請求項15〜17のいずれか一項記載の多重特異性ポリペプチドを同定するための方法において使用するための、請求項17〜26のいずれか一項記載のヘテロ二量体ポリペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２１】
[本発明1001]
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
・（a-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
第1多量体
と、
（b-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（b-2）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-3）第1ポリペプチドが変異ホール-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-4）第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）、（a-4）および（b-3）における変異とは異なる変異であって、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
[本発明1002]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がE357Kであり、第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-4）における変異がK370Eであり、第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-4）における変異がK439Eであり、第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含み、第4ポリペプチドおよび/または第3ポリペプチドがアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
・（a-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
（a-5）第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
第1多量体
と、
（b-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（b-2）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-3）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-4）第3ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）、（a-4）および（b-3）における変異とは異なる変異であって、第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
（b-5）第4ポリペプチドおよび/または第3ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
[本発明1006]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がE357Kであり、第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-4）における変異がK370Eであり、第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、（b-4）における変異がK439Eであり、第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、本発明1005の方法。
[本発明1008]
第1ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第2ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
第4ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第3ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、
本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1009]
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・（a-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含む、
第1多量体
と、
（b-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（b-2）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-3）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-4）第3ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第4ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
[本発明1010]
ポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、
・（a-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、第1多量体であって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含む、
第1多量体
と、
（b-1）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第3ポリペプチドと、
（b-2）
（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第4ポリペプチドと
を含む、第2多量体であって、
（b-3）第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合は、第4ポリペプチドが変異ホールを含み、かつ第3ポリペプチドが変異ノブを含み、
（b-4）第3ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第4ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
第2多量体
とを、インキュベートする工程であって、第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体、および第1ポリペプチドと第4ポリペプチドとを含む第4多量体を形成させる、工程、
ならびに
・第4多量体を回収する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
[本発明1011]
第2ポリペプチドと第3ポリペプチドとを含む第3多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーが、第1多量体および/または第2多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーよりも低い、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとが、（単離可能な）二量体を形成し、第3ポリペプチドと第4ポリペプチドとが、（単離可能な）二量体を形成する、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
第1ポリペプチドおよび/もしくは第2ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP（SEQ ID NO:31）の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）を含み、かつ/または
第1ポリペプチドおよび/もしくは第2ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列：
2021500348.tif 000107
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列HTCPPCP（SEQ ID NO:31）の代わりにアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）を含み、かつ/または
第3ポリペプチドおよび/もしくは第4ポリペプチドが、IgG野生型ヒンジ領域アミノ酸配列：
2021500348.tif 000108
の代わりにアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
本発明1004〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
第1ポリペプチドが変異ノブを含み、第2ポリペプチドが変異ホールを含み、第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドが変異ホールを含む、本発明1005〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
第1ポリペプチドが変異ノブ-cysを含み、第2ポリペプチドが変異ホールを含み、第3ポリペプチドが変異ノブを含み、かつ第4ポリペプチドが変異ホール-cysを含む、本発明1005〜1013のいずれかの方法。
[本発明1016]
第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、IgG1 CH2ドメインおよびIgG1 CH3ドメインを含む、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
第1〜第4ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、
（i）互いに独立して、
アミノ酸配列：
2021500348.tif 000109
またはアミノ酸配列：
2021500348.tif 000110
またはアミノ酸配列：
DKTHT（SEQ ID NO:91）
のうちのいずれか、
（ii）IgG1 CH2ドメイン、および
（iii）IgG1 CH3ドメイン
を含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
（i）第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドがそれぞれ、IgG1 CH1ドメインおよび可変ドメインをさらに含むか、または
（ii）第1ポリペプチドもしくは第4ポリペプチドがIgG1 CH1ドメインを含み、他方のポリペプチドが軽鎖定常ドメインを含み、各ポリペプチドが可変ドメインをさらに含む、
本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
第1ポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、かつ第4ポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであるか、またはその逆であり、これらのドメインがポリペプチド中で結合部位を形成する、本発明1018の方法。
[本発明1020]
第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（v）scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（x）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（xi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（xii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（xiii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xvi）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群から、互いに独立して選択される、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
第1多量体および第2多量体が、それぞれ第1ポリペプチドおよび第4ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
第1多量体が、以下：
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
変異ノブまたは変異ホールを含む、ポリペプチド
と、
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異（perturbing mutation）D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含み、
第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、ポリペプチド
と、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第5ポリペプチド、
ここで、第3ポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されているもの
と、を含み、かつ
第2多量体が、以下：
第3ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第2ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第2ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第2撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第5ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型IgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒトIgG1野生型アミノ酸残基を含み、ここで、第4ポリペプチド中の撹乱変異が、第2ポリペプチド中の撹乱変異とは異なる位置にある、ポリペプチド
と、
第4ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメインおよび第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第4ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第4ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
第4ポリペプチドと第5ポリペプチドは二量体を形成する、ポリペプチドと、
軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む第6ポリペプチドであって、
ジスルフィド結合によって第4ポリペプチドに共有結合されている、第6ポリペプチド
と、を含む、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
インキュベーション工程が還元剤の存在下または非存在下にある、本発明1001〜1003および本発明1009〜1012のいずれかの方法。
[本発明1024]
インキュベーション工程が還元剤の非存在下にある、本発明1004〜1008および本発明1013〜1022のいずれかの方法。
[本発明1025]
（i）第2ポリペプチドおよび第3ポリペプチドが（C末端）タグをさらに含む、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
（i）タグがアミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）またはHHHHHHHH（SEQ ID NO:68）を有し、回収する工程が金属（ニッケル）キレートアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによるか、または
（ii）タグがアミノ酸配列EPEA（SEQ ID NO:87）を有し、回収する工程がC-タグアフィニティークロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーによる、
本発明1025の方法。
[本発明1027]
多重特異性ポリペプチドを同定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
（a）第1標的に特異的に結合する第1の多数の多量体から選択される第1多量体と、（第1標的とは異なる）第2標的に特異的に結合する第2の多数の多量体から選択される第2多量体との各組合せを、本発明1001〜1026のいずれかの方法に供することによって、多数の多重特異性ポリペプチドを生産する工程；
（b）工程（a）において生産された多数の多重特異性ポリペプチドの各メンバーについて、結合アッセイにおいて、前記2種の標的に対する同時結合を、個別に測定する工程；および
（c）多数の多量体ポリペプチドから、結合アッセイの結果に基づいて多量体ポリペプチドを選択する工程であって、それによって多重特異性ポリペプチドを同定する、工程。
[本発明1028]
結合アッセイがELISAまたはSPR法である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
Kabat EUインデックスによるナンバリングで、
（a）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（a-1）（i）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
（ii）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-2）第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（a-3）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-1）における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（a-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド；または
（b）どちらも免疫グロブリンG CH3ドメインを含む、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドであって、
（b-1）（i）第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含むか、または
（ii）第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、
（b-2）第1ポリペプチドが少なくとも1つの機能的結合部位または少なくとも結合部位の一部を含み、
（b-3）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（b-1）における変異とは異なる撹乱変異を含み、ここで、第1ポリペプチドは、そのアミノ酸配列中の、それぞれの野生型免疫グロブリンGにおいて前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含み、
（b-4）第1ポリペプチドと第2ポリペプチドが二量体を形成する、
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチド
変異ノブを含む、多量体ポリペプチド。
[本発明1030]
撹乱変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、本発明1029の多量体ポリペプチド。
[本発明1031]
第1撹乱変異がD356Kであり、かつ第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または撹乱変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、本発明1029の多量体ポリペプチド。
[本発明1032]
（a-1）（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブ-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホール-cysを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含む、
単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1033]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-4）における変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、本発明1032の単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1034]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がD356Kであり、第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-4）における変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、本発明1032の単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1035]
第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドがアミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、本発明1032〜1034のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1036]
（a-1）（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第2ポリペプチドが、CH3ドメイン中に、（a-3）における変異とは異なる変異であって、第1多量体のCH3-CH3結合自由エネルギーを増加させる、変異、を含み、
（a-5）第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドが、アミノ酸配列HTSPPSP（SEQ ID NO:85）またはアミノ酸配列HTPAPE（SEQ ID NO:86）を含む、
単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1037]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がE357Kであり、かつ第1ポリペプチドは370番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-4）における変異がK370Eであり、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、本発明1036の単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1038]
Kabat EUインデックスに従ってナンバリングされた位置で、（a-4）における変異がD356Kであり、かつ第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含むか、または（a-4）における変異がK439Eであり、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、本発明1036の単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1039]
第1ポリペプチドが、CH3ドメインにおいて、第2ポリペプチド中の変異アミノ酸残基と相互作用する位置に、それぞれの免疫グロブリンG野生型アミノ酸残基を含む、本発明1032〜1036のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1040]
（a-1）（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第1ポリペプチドが370番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異E357Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K370Eを含み、かつ第1ポリペプチドが357番目にアミノ酸残基Eを含む、
単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1041]
（a-1）（i）免疫グロブリンG CH3ドメイン、および
（ii）少なくとも1つの機能的結合部位またはその一部
を含む、第1ポリペプチドと、
（a-2）免疫グロブリンG CH3ドメイン
を含む、第2ポリペプチドと
を含む、単離された多量体ポリペプチドであって、
（a-3）第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含むか、または
第1ポリペプチドのCH3ドメインが変異ホールを含み、かつ第2ポリペプチドのCH3ドメインが変異ノブを含み、
（a-4）第1ポリペプチドが439番目にアミノ酸残基Kを含み、かつ第2ポリペプチドが変異D356Kを含むか、または
第2ポリペプチドが変異K439Eを含み、かつ第1ポリペプチドが356番目にアミノ酸残基Dを含む、
単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1042]
第1ポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（v）scFab、任意でペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（x）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（xi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（xii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（xiii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xv）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、ならびに
（xvi）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン由来のCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン由来のCH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択される、本発明1029〜1042のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1043]
第1ポリペプチドと会合する抗体軽鎖をさらに含む、本発明1029〜1042のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1044]
第1ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、第2重鎖可変ドメイン、およびヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意でペプチド性リンカー、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメイン、および第2重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1部分、任意で第1ペプチド性リンカー、SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメイン、任意で第2ペプチド性リンカー、および結合ドメインの第2部分、ここで、結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分が、標的に特異的に結合する機能的結合部位を形成するもの
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドと；
第2ポリペプチドとして、N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66または91のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択されるポリペプチドであって、
第1ポリペプチドが変異ホールを含む場合に変異ノブを含むか、または第1ポリペプチドが変異ノブを含む場合に変異ホールを含み、
撹乱変異D356K、E357K、K370E、またはK439Eを含み、ここで、第1ポリペプチドが、そのアミノ酸配列中の、野生型免疫グロブリンIgG1において前記撹乱変異部のアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸位置に、ヒト免疫グロブリンIgG1野生型アミノ酸残基を含む、ポリペプチドと；
第3ポリペプチドとして、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含むポリペプチドであって、ジスルフィド結合によって第1ポリペプチドに共有結合されている第3ポリペプチドと
を含む、本発明1043の単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1045]
第2ポリペプチドが（C末端）タグをさらに含む、本発明1029〜1044のいずれかの単離された多量体ポリペプチド。
[本発明1046]
（i）タグが、アミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）またはHHHHHHHH（SEQ ID NO:68）を有するか、または
（ii）タグが、アミノ酸配列EPEA（SEQ ID NO:87）を有する、
本発明1045の単離された多量体ポリペプチド。
以下の実施例、配列および図面は本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。記載した手順には、本発明の要旨から逸脱することなく、変更を加えることができると理解される。
【国際調査報告】
2021500348.tif 000111
2021500348.tif 000112
2021500348.tif 000113
2021500348.tif 000114