(57)【要約】  本発明は、細胞解析法であって、表面抗原、細胞質抗原、または核抗原（マーカー）を有する有核細胞を含む血液試料を調製する工程；細胞マーカーを抗体染色する工程；前述の細胞を固定および透過処理する工程；ＦＩＳＨプローブを細胞内の染色体にハイブリッド形成させる工程；前述の細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程；イメージングフローサイトメトリーの実施から得たデータを解析する工程；データ解析に基づいて医学的状態を診断、予後診断、またはモニタリングする工程を含む、方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞解析法であって、
ａ．細胞のマーカーまたは抗原（細胞表面抗原、細胞質抗原、または核抗原）を有する有核細胞を含む単細胞懸濁液を調製する工程；
ｂ．細胞マーカーを抗体染色する工程；
ｃ．前記細胞を固定および／または透過処理する工程；
ｄ．前記細胞に対して細胞遺伝学的技術を実施して、目的の染色体の特徴を検出する、細胞遺伝学的技術を実施する工程；
ｅ．細胞のＤＮＡを染色する工程；および
ｆ．前記細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施して、工程（ｂ）における抗体の存在および工程（ｄ）で標的にされた目的の染色体の特徴を測定し、定量し、そして／または同定する、イメージングフローサイトメトリーを実施する工程
を含む、方法。
【請求項２】
有核細胞の単細胞懸濁液を調製する工程が、血液試料もしくは骨髄試料内の赤血球を溶解することまたは組織試料中の細胞外基質および細胞間接着の酵素消化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有核細胞試料を調製する工程が、調製された試料を適切な緩衝液で緩衝化することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
赤血球を溶解することまたは細胞外基質を消化することが、溶解または消化が生じる条件下で前記試料をインキュベートする工程を含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単細胞懸濁液を調製する工程が、（ａ）前記試料を遠心分離し、上清を除去すること、または（ｂ）余剰細胞外基質を除去するのに適切な条件下で前記細胞を洗浄することのうちの少なくとも１つを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞マーカーを抗体染色する工程が、免疫表現型検査の抗体調製物を使用して前記細胞を染色することを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞を固定および透過処理する工程が、ホルムアルデヒドおよび非イオン性界面活性剤を前記試料に添加して、前記試料を固定および透過処理する、添加する工程を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞遺伝学的技術が、前記細胞のＤＮＡを変性させる工程を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞遺伝学的技術が、リン酸緩衝生理食塩水中で前記細胞をクエンチする工程を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞遺伝学的技術を実施する工程が、細胞を遠心分離する工程、上清を除去する工程、前記細胞を再懸濁する工程を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞遺伝学的技術が、前記細胞内のＤＮＡを少なくとも１つのＦＩＳＨプローブとハイブリッド形成させる工程を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハイブリッド形成物を、ストリンジェンシー溶液で洗浄して非結合プローブを除去する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞遺伝学的技術が、前記細胞を核ＤＮＡ染色する工程を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
イメージングフローサイトメトリーを、工程（ｂ）または（ｄ）の結果を測定するのに適切なレーザーを使用した励起レーザーおよび発光の捕捉を用いて実施する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
イメージングサイトメトリーの実施が、前記試料中の少なくとも１０，０００個の細胞を記録することを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
データ解析が、蛍光強度が高い細胞を排除することによって蛍光強度ヒストグラム中の有核非分裂細胞を同定することを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
データ解析に基づいて医学的状態を診断、予後診断、またはモニタリングすることを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
本発明の方法の構成要素のうちの１つまたは複数を、１つまたは複数の容器に、前記本発明の方法の構成要素の使用に関する指示および／または情報を提供する指示書または情報小冊子と組み合わせて含む、キット。
【請求項１９】
（ａ）標準的なフローサイトメトリーに適切な少なくとも１つの抗原マーカー検出システム、および（ｂ）１つまたは複数の本発明のＦＩＳＨプローブを含むキットであって、（ａ）および（ｂ）の各々が、１つまたは複数の容器に、本発明の方法における（ａ）および（ｂ）の使用に関する指示および／または情報を提供する指示書または情報小冊子と組み合わせて存在する、キット。
【請求項２０】
１つまたは複数の容器に本発明の方法での使用に適切な１つまたは複数の緩衝液をさらに含む、請求項３９および４０に記載のキット。
【請求項２１】
前記キット中に存在するマーカー検出システムが、細胞試料の免疫表現型検査に適切な抗体である、請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、細胞解析に関する。特定の非限定的な態様では、本発明は、組織試料の診断方法および予後診断方法ならびに／または細胞解析に関する。例えば、本発明は、医学的状態または治療状態の診断、予後診断、またはモニタリングのための解析方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
以下の背景技術の考察は、本発明の理解を容易にすることのみを意図する。この考察は、参照された任意の資料が本出願の優先日時点の一般知識の一部である、または一部であったことを了承または承認するものではない。
【０００３】
細胞遺伝学的解析は、悪性疾患、トリソミー２１などの染色体数異常を伴う症候群（ダウン症候群）、および移植レシピエントにおけるキメラ現象などの多数の障害の評価における不可欠な構成要素である。
【０００４】
診断研究所では、現在、特定のゲノムの欠損を同定するために、ガラススライド上の細胞（細胞スミアまたは組織切片のいずれか）に対する蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）解析を使用している。ＦＩＳＨでは、蛍光標識された一本鎖ＤＮＡプローブの、標的ゲノム中のその相補配列へのアニーリグに基づいて、ＤＮＡ配列および超顕微鏡的な遺伝子の変化を検出する。プローブは、染色体座（領域）を標的にして細胞全体における間期および中期の両方の再編成、欠失、および獲得を同定するように設計される。染色体に結合した蛍光プローブの位置を試験するために蛍光顕微鏡法が使用されるので、このことが解析される細胞数を制限している（一般に、１ケースあたり５００個未満）。それ故、この方法の感度は低い。さらに、細胞内の染色体異常を可視化するためのＦＩＳＨ法は、悪性疾患（特に、血液学的悪性疾患）および非悪性疾患（例えば、遺伝病の出生前診断）の診断評価に重要である一方で、労働集約的であり、目的の細胞は特異的に同定されない−核のみが可視化され、これらの核は、任意の細胞型に由来し得る。
【０００５】
スライドベースのＦＩＳＨの特異性を、目的の細胞の表現型同定（免疫表現型検査）と組み合わせた場合に（すなわち、細胞の抗原の免疫蛍光標識およびＦＩＳＨとの統合）増加させることができる。この組み合わせは、「免疫ＦＩＳＨ」または「新生物調査ツールとしての蛍光免疫表現型および間期細胞遺伝学」（ＦＩＣＴＩＯＮ）として公知である。免疫ＦＩＳＨ／ＦＩＣＴＩＯＮは、細胞遠心分離調製物、細胞スミア、または組織切片に対して実施することができる表現型に基づいた細胞内の遺伝子異常の同定に有用なツールであり、細胞（例えば、ＣＤ１３８陽性形質細胞）内のその表現型によって同定された特異的な遺伝子異常を検出することができる（図１）。これは、全新生物細胞に存在する遺伝子の一次異常（例えば、ＭＹＣ転座）および表現型によって区別される細胞亜集団に存在する二次変化（クローンの不均一性）も検出可能である。免疫表現型検査と遺伝子解析の組み合わせ（すなわち、ＦＩＣＴＩＯＮ）は染色体異常のＦＩＳＨ検出の特異性が増大するが、この方法には、染色体に結合した蛍光プローブの位置を手作業で試験するための蛍光顕微鏡法を依然として必要とし、したがって、（ＦＩＳＨと同様に）解析される細胞数が制限される。それ故、方法の感度は依然として低い。
【０００６】
対照的に、従来のフローサイトメトリーによる免疫表現型検査は、何千もの細胞を解析して定量的な集団データを提供し、異常細胞集団を検出可能な自動化された細胞表現型検査法である。しかし、最近まで、この方法は、ＦＩＳＨプローブ結合を検出するために適用することができなかった（図１）。
【０００７】
最近になって、ＦＩＳＨは、「懸濁液中の」細胞に対して実施され（すなわち、「ＦＩＳＨ−ＩＳ」、「懸濁液−ＦＩＳＨ」、または「Ｓ−ＦＩＳＨ」）、フローサイトメトリーによって解析されている。ＦＩＳＨ−ＩＳは、細胞をインタクトな状態に保ち、元は三次元の（すなわち、球形の）間期核の、スライド上で実施されるＦＩＳＨのための風乾工程に伴って生じる平坦化の問題に対処している。試験の原理は同一であるが、ハイブリッド形成条件のストリンジェンシーによってプローブ標識が特異的であることを確実にする一方で、細胞およびＤＮＡをインタクトに保持しなければならないので、ハイブリッド形成手順がスライド用のプロトコールと異なる。間期のＦＩＳＨ−ＩＳ標識された細胞全体を、顕微鏡法ベースのアプローチより数ログ多い細胞の自動化遺伝子解析が可能なフローサイトメトリーで解析することができる。しかし、これは、実施することができるＦＩＳＨ解析のタイプに制限される。
【０００８】
イメージングフローサイトメトリーは、伝統的なＦＩＳＨ法よりも感度がさらに改善されていることが示されている。自動細胞イメージングフローサイトメトリーは、懸濁液中の細胞を１，０００〜２，０００細胞／秒の速度で解析する。このテクノロジーは、各細胞について１２枚までの画像を取得することができ、この画像には倍率６００倍の顕微鏡法に匹敵する品質の１０枚の蛍光画像が含まれる。このマルチパラメータアプローチは、標準的なフローサイトメトリーの感度および統計的検出力とデジタル顕微鏡法とを組み合わせている。このテクノロジーを使用すると、細胞内シグナル（結合したＦＩＳＨプローブの蛍光シグナルまたは「スポット」が含まれる）が、広範囲の被写界深度のイメージングを使用して高精度に局在化することが可能である。したがって、蛍光プローブを使用して特定の遺伝子異常を検出するために使用される可能性がある。Ｍｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．による最近の報告では、ＦＩＳＨ−ＩＳを使用してハイブリッド形成された細胞をイメージングフローサイトメトリーによって解析することができることが明確に実証されている（Ｍｉｎｄｅｒｍａｎ  Ｈ，Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  Ｋ，Ａｒｃａｄｉ  ＪＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍａｇｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ａ  ２０１２；８１Ａ：７７６−７８４）。この解析方法は、動原体プローブを用いて白血病細胞内の染色体コピー数を決定するために首尾よく使用されている。この高処理自動イメージング解析アプローチは、ＦＩＳＨ−ＩＳを評価するための従来のフローサイトメトリーと比較して以下の１つの大きな利点がある：この利点はイメージングに関し、ハイブリッド形成「スポット」を可視化してカウントする能力である。このアプローチは、細胞集団を定量的に解析して多数の細胞について「スポット」を高処理カウントすることが可能であり、染色体異常がより正確に解析される。しかし、その利点にもかかわらず、ＦＩＳＨ−ＩＳは、各試料を解析する能力に限界があり、感度およびばらつきの面から改善の余地がかなりある。
【０００９】
したがって、先行技術に関連する問題、欠点、または不利益のいくつかを低減、制限、克服、または改善するか、有効な代替物を提供する新規の方法、デバイス、および／またはシステムを提供することが有利であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明者らは、医学的状態または治療状態を診断、予後診断、またはモニタリングするための細胞解析の改良された「免疫フローＦＩＳＨ」技術を開発することによって、先行技術の１つまたは複数の欠点に対処しようとした。
【００１１】
前述の技術は、イメージングフローサイトメーターを使用した懸濁液中の細胞の免疫表現型検査とＦＩＳＨ解析の組み合わせである。イメージングフローサイトメトリーは、単一のプラットフォームにおいて、高解像度のデジタル画像を、標準的なフローサイトメトリーから入手した定量的情報と組み合わせている。概して、本発明の医学的状態または治療状態を診断、予後診断、またはモニタリングするための細胞解析法は、
ａ．フローサイトメトリーの免疫表現型検査を使用して細胞集団の抗原プロフィールに基づいて解析すべき細胞集団を選択する工程、および
ｂ．イメージングフローサイトメトリーの結果から、その正確な表現型によって同定されたこれらの特定の細胞中のＦＩＳＨプローブのシグナルをカウントする工程
を含む。
【００１２】
結果として、目的の細胞（例えば、白血病細胞）の抗原発現パターンまたは表現型に基づいて、これらの細胞中のＦＩＳＨ染色体シグナルのみが評価される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、第１の形態によれば、本発明は、細胞集団における状態を診断、予後診断、またはモニタリングする方法であって、
ａ．解析すべき細胞集団を選択し、細胞集団の抗原プロフィールを、フローサイトメトリーを使用して前述の集団を免疫表現型検査することによって解析して、測定または評価されるべき前述の状態に関連する１つまたは複数の生物学的マーカーまたはパラメーターの有無を検出する、選択および解析する工程、および
ｂ．前述の集団を前述の細胞を可視化してカウントすることが可能な少なくとも１つのＦＩＳＨプローブに供して、特定の細胞をその正確な表現型によって同定し、表現型によって同定された細胞のゲノム異常を同定する、ＦＩＳＨプローブに供する工程
を含む、方法にある。
【００１４】
方法の第１の工程によれば、フローサイトメトリーを使用して細胞集団を免疫表現型検査することにより、複数の蛍光パラメーターを同時に評価することができる。この工程はまた、集団の細胞形態（細胞の特徴）の可視化を可能にし、細胞を免疫表現型検査し、膜上、細胞質内、または核内のいずれかの抗原の位置を同定可能である。この後者の結果は、マーカーの局在を可視化すること、または膜抗原、細胞質抗原、または核抗原を区別する異なるマーカーまたは測定パラメーターを使用することによって達成することができる。
【００１５】
好ましくは、ＦＩＳＨプローブは、その正確な表現型によって同定された（すなわち、工程；（ａ）で選択された）これらの特定の細胞においてカウント（または測定）すべき蛍光「スポット」または別のシグナルを生成する。
【００１６】
免疫フローＦＩＳＨ解析は複雑であり、細胞の完全性、抗体結合のためのエピトープ、および特定の染色体座へのプローブハイブリッド形成を維持するために注意深くバランスをとることが必要である。技術的に困難であるが、免疫フローＦＩＳＨは、従来のスライドベースのＦＩＳＨよりもはるかに多くのデータを提供し、以前に記載された免疫−Ｓ−ＦＩＳＨより感度が高く、ばらつきが少ない（試料あたり８０％未満の細胞に制限される）。免疫フローＦＩＳＨは、細胞が試料中の細胞のサブセットのみを構成する場合でさえも、その細胞表現型によって同定される多数の細胞を自動でＦＩＳＨ解析することが可能である。
【００１７】
イメージングフローサイトメーターがマルチスペクトル画像機能を備えているので、「免疫フローＦＩＳＨ」（すなわち、懸濁液中の細胞の免疫ＦＩＳＨ）が可能である。免疫フローＦＩＳＨは、表現型によって同定された細胞におけるゲノム異常を同定するための統合された自動高処理単一プラットフォーム試験を提供する機能を備えており、より高い感度が得られる。
【００１８】
懸濁液中の細胞に対するＦＩＳＨ（ＦＩＳＨ−ＩＳ）の細胞表現型検査との組み合わせにより、遺伝子座特異的プローブ（すなわち、特定の遺伝子配列に指向するプローブ；その配列は、研究される材料に応じて、正常な遺伝子でも異常な遺伝子でもよい）を、単一の高処理自動試験において表現型によってゲーティングされた（「選択された」）細胞の遺伝子型を同定するために使用することができる。これにより、スライドベースの免疫ＦＩＳＨ（多数の細胞を解析することができることに起因する）およびフローサイトメトリーＦＩＳＨ−ＩＳ（懸濁液中の表現型に基づいて目的の細胞集団を同定する能力に起因する）に検出力を付加することができる。
【００１９】
本発明者らのテクノロジーは、現在のマニュアルＦＩＳＨ法、ＦＩＳＨ−ＩＳ法、およびＦＩＣＴＩＯＮ法、または従来のフローサイトメトリーによる免疫表現型検査に寄与する不利益を改善することを目指している。特に、本発明者らは、免疫フローＦＩＳＨが、以下の現在のＦＩＳＨおよびＦＩＣＴＩＯＮテクノロジーとの差別化要因のうちの少なくとも１つを達成すると考えている：
ａ．単一の高処理イメージングフローサイトメトリープラットフォームでインタクトな新生物細胞全体の形態、表現型、および遺伝子型の全体的な評価が可能であること；
ｂ．現在のマニュアルＦＩＳＨ法（１〜３％細胞）より感度が高いこと（１：１０，０００細胞超）；
ｃ．現在のマニュアルＦＩＣＴＩＯＮ法より迅速であること（特に、総じてインタクトな細胞を評価する場合に迅速かつ正確である）こと。ＦＩＣＴＩＯＮは、免疫表現型として間違った結果を生じる可能性があり、ＦＩＳＨは、３〜４ｕｍの組織切片で実施される。試験が全細胞を評価するのではなく、その「スライス」を評価するので、これにより誤った結果を生じる可能性がある；
ｄ．従来のフローサイトメトリー法のための免疫表現型検査に類似する試料調製を使用すること；
ｅ．現在のＦＩＳＨ法またはＦＩＣＴＩＯＮ法を使用した数百個の細胞と比較して、何千もの細胞を解析する手段を提供すること；
ｆ．目的の細胞集団（血液学的悪性疾患における新生物細胞など）における染色体異常の検出について、現在のＦＩＳＨをよりも感度が高いこと；または
ｇ．イメージングフローサイトメーターにおいて抗原ベースのゲーティングストラテジーを使用し、それにより、少数の目的の細胞を有する試料でも信頼性のある解析ができること。低レベルの目的の細胞を検出することができ、それ故、残存疾患の評価（モニタリング）に適用することができる。このことは、疾患の重荷が低い疾患の検出を補助し、大量療法（患者のアウトカムの改善が予想される移植が含まれる）の早期導入が可能であろう。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、細胞解析法であって、
ａ．細胞表面膜上、細胞質内、または細胞核内に存在する細胞の抗原（細胞マーカーとしても公知）を発現する有核細胞を含む単細胞懸濁液を調製する工程；
ｂ．細胞抗原を抗体染色する工程；
ｃ．細胞を固定する工程；
ｄ．前述の細胞の核内の染色体領域／遺伝子座／その特徴を検出するために、前述の細胞に対して細胞遺伝学的技術（本明細書中に記載）を実施する工程；
ｅ．前述の細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程
を含む方法を提供する。
【００２１】
好ましくは、細胞遺伝学的技術は、細胞のプローブ（好ましくは、細胞の核内の染色体領域／遺伝子座／その特徴の検出に適切なＦＩＳＨプローブ）とのハイブリッド形成を含む。細胞のＤＮＡの変性、非特異的プローブＤＮＡ結合のブロッキング、およびＦＩＳＨプローブの試験中の細胞内の核物質とのハイブリッド形成によってこれを行うことができる。望ましくは、細胞を、ハイブリッド形成後に氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でクエンチし、次いで、遠心分離する。
【００２２】
好ましくは、ブロッキングを使用するとき、非特異的プローブＤＮＡを、ＦＩＳＨプローブハイブリッド形成物への結合からブロッキングする。試料のＰＢＳ／ＢＳＡへの曝露およびその後の細胞の洗浄によってこれを行うことができる。次いで、得られた上清を除去し、細胞を、ＦＩＳＨプローブ解析のためのハイブリッド形成緩衝液に再懸濁することができる。本発明のこの形態では、次いで、細胞を加熱してＤＮＡを変性させ、そして／またはプローブアニーリングを容易にする。この工程を、自動サーモサイクラーで行うことが好ましい。次いで、細胞を、ストリンジェンシー溶液で少なくとも１回洗浄し、再懸濁することができる。次いで、細胞の核ＤＮＡ染色を行う。
【００２３】
本発明の一形態において、本方法は、さらに、イメージングフローサイトメトリーから得たデータを解析する工程を含む。
【００２４】
細胞集団の免疫表現型、集団中の細胞数、プローブの存在／位置、および各細胞内に存在するプローブスポット数などの試料の情報（すなわち、細胞遺伝学）を決定するためのＩＤＥＡＳ（ＡＭＮＩＳ  Ｍｅｒｃｋ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＵＳＡ）および類似のソフトウェアなどのイメージングフローサイトメトリーソフトウェアでデータを解析する。
【００２５】
あるいは、単一の染色された細胞を、明視野技術を使用せずに解析することができ、補正行列を計算することができる。
【００２６】
好ましくは、細胞に対するイメージングフローサイトメトリーは、励起レーザーを使用し、その発光を捕捉する。励起レーザーは、１００ｍＷ  ４０５ｎｍ、および／または５０ｍＷ  ４８８ｎｍ、および／または１５０ｍＷ  ５６１ｎｍ、および／または１５０ｍＷ  ５９２ｎｍ、および／または１２０ｍＷ  ６４２ｎｍのレーザーを含み得る。これに関して、細胞に対するイメージングフローサイトメトリーの実施において、細胞をイメージングフローサイトメーター（例えば、ＡＭＮＩＳ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ  ｍａｒｋＩＩ；ＡＭＮＩＳ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＵＳＡ）で解析し、明視野（形態）画像および蛍光画像ならびに蛍光強度などのデータを記録する。
【００２７】
イメージングサイトメトリーの実施は、好ましくは、少なくとも４０倍の対物レンズを使用して画像を取り込むことを含む。画像を、３０倍〜７０倍の範囲の対物レンズで取り込むことができる。望ましくは、画像を、およそ６０倍の対物レンズで取り込む。
【００２８】
イメージングサイトメトリーの実施はまた、散布図中の細胞の同定を含み得る。望ましくは、試料中のおよそ１０，０００〜２０，０００個の細胞が記録される。
【００２９】
本発明のさらなる形態または別の形態では、本方法は、データ解析に基づいて医学的状態または治療状態を診断、予後診断、またはモニタリングする工程を含む。
【００３０】
本発明の一形態によれば、イメージングフローサイトメトリー工程において、免疫フローＦＩＳＨのデータ解析を、画像解析ソフトウェアを使用して行う。データ解析は、画像の鮮明さまたは品質を測定することによって、焦点画像を選択することを含み得る。望ましくは、データを、散布図にする。散布図は、アスペクト比対明視野領域の好ましい一形態である。
【００３１】
解析は、蛍光強度の高い細胞を排除することによって蛍光強度ヒストグラム中の有核非分裂細胞を同定する工程も含み得る。かかるデータ解析は、理想的には、使用したアプリケーションおよび細胞マーカーに応じて、正常細胞および新生物細胞（例えば、リンパ球、白血球）などのマーカーの蛍光強度に基づいて目的の細胞集団をゲーティングする工程を含むであろう。
【００３２】
好ましくは、データ解析は、２つの画像がマスキングした領域内で線形に相関する程度の尺度を使用して、ＦＩＳＨプローブシグナルの核染色剤との共存を決定することを含む。データ解析は、ピーク、スポット、または強度マスクを使用して、細胞あたりのＦＩＳＨプローブスポット数をカウントすることを含み得る。これは、各ピクセルが特定のスポットまたはバックグラウンドに連結するかどうかに基づいた各ピクセルの連結性を試験することを含み得る。好ましくは、スポットカウントを、各スポットカウント集団についてＦＩＳＨシグナルの蛍光強度の測定値を比較して、１スポット、２スポット、および３スポットまたはそれを超えるスポットカウントを確認するか、染色体転座があるときにスポットを重ねる単一パラメーターヒストグラムによって検証する。細胞集団間のスポットカウントの比較により、ＦＩＳＨプローブに関連する細胞遺伝学の存在を決定することができる。正常細胞と比較した異常細胞の核内の「スポット」数の比を計算することができる（例えば、白血球の核内のスポットを正常なリンパ球と比較してスポット比を得ることができる）。
【００３３】
第３の態様では、本発明は、細胞解析のための診断方法であって、
ａ．細胞試料から単細胞懸濁液を調製する工程；
ｂ．懸濁液を抗体染色して１つまたは複数の細胞マーカーを検出する、抗体染色する工程；
ｃ．前述の細胞を固定する工程；
ｄ．懸濁液中の細胞のＤＮＡを変性させる工程；
ｅ．少なくとも１つのＦＩＳＨプローブを工程（ｄ）由来の細胞ＤＮＡにハイブリッド形成させる工程；
ｆ．前述の細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施して、明視野画像、蛍光画像、ならびに免疫表現型検査マーカーおよびＦＩＳＨプローブの強度測定値に関するデータを取得する、イメージングフローサイトメトリーを実施する工程；および
ｇ．前述のデータを解析して、医学的状態の有無を診断、予後診断、またはモニタリングする、解析する工程
を含む、方法を提供する。
【００３４】
好ましくは、明確な境界を同定できるように、上記方法を、コントロール細胞および試料細胞に対して実施する。
【００３５】
第４の態様では、本発明は、本発明の方法の１つまたは複数の構成要素を、方法におけるキットの使用方法についての説明書と共に含む診断キットを提供する。
【００３６】
特に、本発明は、（ａ）少なくとも１つの標準的なフローサイトメトリーに適切なマーカー検出システム、（ｂ）１つまたは複数の本発明のＦＩＳＨプローブを含むキットであって、（ａ）および（ｂ）の各々が、１つまたは複数の容器に、本発明の方法における（ａ）および（ｂ）の使用に関する指示および／または情報を提供する指示書または情報小冊子と組み合わせて存在する、キットに及ぶ。
【００３７】
さらに、キットは、１つまたは複数の容器に本発明の方法での使用に適切な１つまたは複数の緩衝液も含むことができる。
【００３８】
好ましくは、キット中に存在するマーカー検出システムは、細胞試料の免疫表現型検査に適切な抗体である。
【００３９】
このテクノロジーを適用することができる用途には、制限されないが、以下が含まれる：出生前の適用（染色体欠損または母体血との相違を有する疾患の出生前診断、母体循環系内の胎児細胞（例えば、有核赤血球、栄養芽層、またはリンパ球）の同定、胎児起源の有核赤血球の同定、ＨｂＦ（細胞内の胎児ヘモグロビン）、ＣＤ７１（細胞表面上のトランスフェリン受容体）、栄養芽層を同定するためのＨＬＡ−Ｇに対する抗体を使用した有核赤血球を同定するための免疫表現型検査、目的の疾患のためのプローブ（例えば、ダウン症候群におけるトリソミー２１のためのＣＥＰ２１）の同定；母体血中の男性起源の胎児リンパ球の同定（Ｙ染色体ＦＩＳＨプローブ）：免疫表現型解析（ＣＤ４５、ＨｂＦ、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ７１による同定が含まれる）；キメラ現象（移植後性別不適合移植が含まれる）の同定、およびＣＤ４５によるリンパ球を同定するための免疫表現型検査が含まれる）などの非悪性疾患の同定。
【００４０】
あるいは、本方法を、悪性疾患（血液学的悪性疾患（血液がん）または他のタイプのがんなど）の同定；表現型によって同定された新生物細胞における染色体異常の検出のために使用することができる。表現型および染色体を利用したＷＨＯ分類に基づいた疾患分類、数の異常（「異数性」）：モノソミー、トリソミー、テトラソミー、高二倍性、低二倍性（例：急性白血病、慢性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫）；構造異常：欠失、転座、重複、増幅（例：急性白血病、慢性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、慢性好酸球性白血病、非ホジキンリンパ腫）。「液体生検」とも呼ばれる血液（すなわち、循環腫瘍細胞を同定するための血液試料）または組織試料から得た癌細胞における他のタイプのがんの染色体の数および構造の両方の異常の検出。特に、本方法を、任意の身体部位（例えば、リンパ節、乳房、皮膚）由来の脱凝集した組織試料に対して使用して、染色体の異常を検出することができる。
【００４１】
あるいは、本方法を、細胞内ウイルス検出などの非ヒト遺伝子型評価のために使用することができる：表現型によって同定されたヒト細胞に取り込まれたウイルスゲノムＤＮＡ配列の検出。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）はＢ細胞に感染し、細胞複製およびアポトーシスを調節解除する（例えば、ＭＹＣ遺伝子およびＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子のハイジャック）公知のオンコウイルスである。ＷＨＯによって分類されるように、血液学的悪性疾患（非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫またはバーキットリンパ腫）およびホジキンリンパ腫など）は、ＥＢＶ感染と強く関連する。ＥＢＶ  ＤＮＡまたは関連転写物（例えば、ペプチド核酸プローブ）の検出用の市販のプローブを利用可能であり、ＥＢＶゲノムの特異的検出のための種々のタイプのフルオロフォアに抱合した特異的オリゴヌクレオチドプローブを合成することも可能である。
【００４２】
本方法を、処置の決定を伝えるために使用することができる：表現型によって同定された特定の疾患（例えば、ｄｅｌ（１７ｐ）を有する慢性リンパ球性白血病；ｄｅｌ（５ｑ）を有する骨髄異形成症候群）における染色体欠損の存在に基づいた処置の選択。
【００４３】
本方法を、予後診断を伝えるために使用することができる：染色体の異常によって層別化された疾患（慢性リンパ球性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、急性骨髄球性白血病、および急性リンパ芽球性白血病、ＥＢＶ陽性リンパ腫など）。
【００４４】
本方法を、残存疾患（その表現型によって同定された特定の細胞における染色体欠損に基づいた微小残存病変の負荷が含まれる）を伝えるために使用することができる。あるいは、本方法を、新規の染色体欠損に基づいた新規のクローンの獲得または自家移植のための採取前の疾患根絶を伝えるために使用することができる。
【００４５】
本方法を、原発性腫瘍などの非造血細胞の診断および分類を伝えるために使用することができる：組織：組織から抽出した細胞の鑑別診断。数の異常：異数性（例えば、黒色腫対非定型母斑の鑑別診断）および構造異常：欠失、融合。
【００４６】
本方法を、表現型によって同定された特定の疾患における染色体欠損の存在に基づいた処置の選択を伝えるために使用することができる。これには、妊娠中の母体血中の異常な胎児細胞の検出が含まれる。
【００４７】
本方法を、新生物細胞（循環腫瘍細胞が含まれる）に特徴的な表面または細胞内の非造血抗原（ｎｏｎ−ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）によって同定するために使用することができる。例：乳房；黒色腫、および骨髄の転移細胞。
【００４８】
本方法を、導入遺伝子ベクター配列に対するプローブによるＣＡＲ−Ｔ細胞耐性を同定するために使用することもできる。特に、本方法を、操作された導入核酸配列および細胞内のその発現の検出のため使用することができる。
【００４９】
本発明のさらなる特徴を、以下のいくつかのその非限定的な実施形態の説明でより完全に説明する。この説明は、本発明の例示のみを目的として含まれる。この説明は、上記発明の広範な概要、開示、または説明を制限するものと理解すべきではない。
【００５０】
添付の図面を参照して説明する：
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、細胞解析のための現在の診断方法（スライド上の細胞に対するマニュアルＦＩＳＨ（核の青色対比染色を使用したＶｙｓｉｓ  ＣＬＬプローブキット）、自動フローサイトメトリーによる免疫表現型検査（ＦＩＳＨを行うことはできない）、および免疫表現型検査をＦＩＳＨと組み合わせたマニュアルＦＩＣＴＩＯＮ法が含まれる）を示す。
【図２】図２は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した１２番染色体コピー数についての代表的なＣＬＬ血液試料の評価を示す。（Ａ）細胞集団を、免疫表現型マーカーの組み合わせの発現に基づいてゲーティングする。（Ｂ）各ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＶｙｓｉｓ  ＣＥＰ１２  ＦＩＳＨプローブのハイブリッド形成スポットの「スポットカウント」またはスポット数。（Ｃ）各ＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるＶｙｓｉｓ  ＣＥＰ１２  ＦＩＳＨプローブのハイブリッド形成スポットの「スポットカウント」またはスポット数。ゲーティングした集団を、画像ギャラリー中に見ることもできる（Ｄ）。細胞６３９は、ＣＤ１９−ＢＶ４８０陰性、ＣＤ３−ＡＦ６４７陽性、ＣＤ５−ＢＢ５１５陽性のＣＥＰ１２ダイソミーＴ細胞であり、細胞３２６は、ＣＤ１９−ＢＶ４８０陽性、ＣＤ３−ＡＦ６４７陰性、ＣＤ５−ＢＢ５１５陽性のＣＥＰ１２ダイソミーＢ細胞であり、細胞１６４は、ＣＤ１９−ＢＶ４８０陽性、ＣＤ３−ＡＦ６４７陰性、ＣＤ５−ＢＢ５１５陽性のＣＥＰ１２トリソミーＢ  ＣＬＬ細胞である。オーバーレイ画像は、免疫表現型検査、ＣＥＰ１２プローブ、および核ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ画像の重ね合わせである。
【図３】図３は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した代表的な急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）骨髄試料およびＲｅｈ（ＡＬＬ）細胞株の免疫表現型検査の例を実証している画像ギャラリーを示す。（Ａ）ＡＬＬ細胞５６３４および８３７０は、ＣＤ２２−ＢＢ７００陽性、ＴｄＴ−ＢＶ４２１陽性、ＣＤ１９−ＡＦ６４７陽性、およびＣＤ３３−ＢＶ６０５陰性である。（Ｂ）Ｒｅｈ細胞３９０および４０３は、ＣＤ２２−ＢＢ７００陽性、ＣＤ３４−ＢＶ４２１陰性、ＣＤ４５−Ｖ５００ｃ陽性、ＣＤ１０−ＢＶ６０５陽性、ＣＤ１９−ＡＦ６４７陽性、およびＦＶＤｅＦｌｕｏｒ７８０陰性であり、これらの細胞が、免疫表現型評価時に生存細胞であったことを示す。略語：ＡＦ−アレクサフルオル、ＢＢ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅフルオロフォア、ＢＦ−明視野、ＢＶ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔフルオロフォア、ＦＶＤ−Ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素。
【図４】図４は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した代表的な形質細胞性骨髄腫の骨髄試料の免疫表現型検査の例を実証している画像ギャラリーを示す。上および中央の細胞は、ＣＤ１３８−Ｖ５００ｃ陽性、ＣＤ４５−ＢＶ４８０陰性、ＣＤ１９−ＡＦ６４７陰性の形質細胞骨髄腫の細胞であり、下の細胞は、ＣＤ１３８−Ｖ５００ｃ陰性、ＣＤ４５−ＢＶ４８０陽性、ＣＤ１９−ＡＦ６４７陽性の正常な形質細胞である。略語：ＡＦ−アレクサフルオル、ＦＶＤ−Ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素。
【図５】図５は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の骨髄試料の評価を実証している。（Ａ）細胞１５７０は、３コピーの４番染色体またはトリソミー４（緑色スポット）を有する。トリソミーは、ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ核染色剤との共存解析によって確認される。オーバーレイ画像は、ＣＥＰ４プローブおよび核ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ画像の重ね合わせである。（Ｂ）細胞１８５３は、ＥＴＶ６−ＳＧ／ＲＵＮＸ１−ＳＯオーバーレイ画像中の重複スポットによって認められるように、１コピーのＥＴＶ６（緑色スポット）および１コピーのＲＵＮＸ１（橙色スポット）が並置しているＥＴＶ６−ＲＵＮＸ１転座を有するＡＬＬ細胞である。略語：ＢＦおよびＢＦ１−明視野、ＣＥＰ４−４番染色体計数プローブ、ＳＧ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＳＯ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖ−ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ。
【図６】図６は、本発明の適切な実施形態にしたがった免疫表現型検査の性能に及ぼす固定液および透過処理液の影響を示す。ＢＢ５１５と抱合したＣＤ３クローンＳＫ７で染色した健康な末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を使用して、異なる固定および透過処理法を試験した。両プロトコール由来のアリコートを、細胞表面染色後（Ｐｏｓｔ−Ｓｔａｉｎ）、固定および透過処理後（Ｐｏｓｔ−Ｆｉｘ／ｐｅｒｍ）、１Ｍ塩酸変性後（Ｐｏｓｔ−Ａｃｉｄ）、および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成後（ＦＩＳＨ；Ｐｏｓｔ−Ｈｙｂ）のＡＭＮＩＳ  ＩＳＸ  ＭＫＩＩでの解析のために取り出した。この代表的な実験由来のデータにより、（Ａ）７０％メタノール＋４％ホルムアルデヒド（ＦＡ）＋５％酢酸（ＡＡ）での固定および透過処理後のＣＤ３−ＢＢ５１５陽性染色細胞の喪失および相対蛍光強度の増加ならびに（Ｂ）４％ＦＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０での固定および透過処理後のＣＤ３−ＢＢ５１５陽性染色細胞の解像度の保存が実証された。プロトコールを通した陽性染色集団のシグナル解像度の低下は、４８０〜５６０ｎｍの範囲（Ｃｈ０２）で検出された陰性集団の自己蛍光の増加にも原因していた。
【図７】図７は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した細胞外観の進行性の変化についての代表的な健康な血液試料の評価を示す。画像を、ＡＭＮＩＳ  ＩＳＸ  ＭＫＩＩにて倍率４０倍で作成した。（Ａ）分離直後の新鮮な末梢血単核球（ＰＢＭＣ）。（Ｂ）細胞は、４％ホルムアルデヒド（ＦＡ）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０での固定および透過処理後にインタクトなままであり、比較的十分に保存された。（Ｃ）細胞は、酸変性後に外観がより単調になった。（Ｄ）一晩のプローブハイブリッド形成後、細胞は、処理を通して細胞膜、細胞質、核の変化の一貫した顕著な変化の証拠として単調な外観であり続け、より大きくかつ丸く見える。
【図８】図８は、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅおよびＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎの蛍光ＦＩＳＨプローブ抱合体の比較を示す。この代表的なＣＬＬ患者由来のデータにより、Ｖｙｓｉｓ  ＣＥＰ１２−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ抱合プローブを使用してカウントしたＦＩＳＨ「スポット」数（Ａ）がＶｙｓｉｓ  ＣＥＰ１２−ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ抱合プローブを用いてカウントしたＦＩＳＨ「スポット」数（Ｂ）と等しいことが実証された。
【図９】図９は、免疫フローＦＩＳＨによる二重ＦＩＳＨプローブ解析を示す。この代表的な実験由来のデータにより、２つのＦＩＳＨプローブが細胞に同時にハイブリッド形成することができることが実証された。核ＤＮＡの正確なハイブリッド形成を確認するためにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２核染色剤を用いたＶｙｓｉｓ  ＣＥＰ１２−ＳＧプローブおよびＣＥＰ１−ＳＯプローブとハイブリッド形成した細胞。
【図１０】図１０は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を使用した１７ｐ内の遺伝子座を欠失した代表的なＣＬＬ血液試料の評価を示す。（Ａ）各ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＳｕｒｅＦＩＳＨ  １７ｐ  ＰＭＰ  ＦＩＳＨプローブのハイブリッド形成スポットの「スポットカウント」またはスポット数。（Ｂ）各ＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるＳｕｒｅＦＩＳＨ  １７ｐ  ＰＭＰ  ＦＩＳＨプローブのハイブリッド形成スポットの「スポットカウント」またはスポット数。ゲーティングした集団を、画像ギャラリー中に見ることもできる（Ｃ）。細胞１６６および６４１は、ＣＤ１９−ＢＶ４８０陽性、ＣＤ３−Ｖ５００ｃ陰性、ＣＤ５−ＡＦ６４７陽性の１７ｐモノソミーＢ細胞（ｄｅｌ１７ｐ）であり、細胞７２４は、ＣＤ１９−ＢＶ４８０陽性、ＣＤ３−Ｖ５００ｃ陰性、ＣＤ５−ＡＦ６４７陽性の１７ｐダイソミーＢ細胞であり、細胞１６１０および２８４５は、ＣＤ１９−ＢＶ４８０陰性、ＣＤ３−Ｖ５００ｃ陽性、ＣＤ５−ＡＦ６４７陽性の１７ｐダイソミーＴ細胞である。オーバーレイ画像は、免疫表現型検査、１７ｐプローブ、および核ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ画像の重ね合わせである。
【図１１】図１１は、本発明の適切な実施形態にしたがった細胞解析法のプロトコールを示す。Ａ：細胞集団を、免疫表現型マーカーの組み合わせの発現に基づいてゲーティングし、画像ギャラリーに示す。Ｂ：各細胞において目視可能なＶｙｓｉｓ  ＣＥＰ１  ＦＩＳＨプローブのハイブリッド形成の「スポットカウント」またはスポット数。Ｃ：ＦＩＳＨプローブスポット計数の正確度は、Ｖｙｓｉｓ  ＣＥＰ１  ＦＩＳＨプローブシグナルの核マーカーＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２との共存の解析によっても増加した。これは、ダブレット（細胞２２９および８２０）および核外のプローブシグナル（細胞１３７４６）を除外している。適切には、異数性解析を正確に行うためにこれらの細胞は排除される。
【図１２】図１２は、プローブスポットの平均蛍光強度に基づいたスポットカウントの調整を示す。（Ａ）２−スポット集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、２２２６６蛍光単位であり、３またはスポットのＭＦＩは６１５１１であった。（Ｂ）１−スポット集団のＭＦＩは２２３４３蛍光単位であり、２−スポット集団とほとんど同一であった。（Ｃ）Ｂ由来の１−スポット細胞のＨｏｅｃｈｓｔおよびＣＥＰ１２−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅのオーバーレイ画像ギャラリー。（Ｄ）Ａ由来の２−スポット単細胞の画像ギャラリー。（Ｅ）Ａ由来の２またはそれを超えるスポットを有する細胞クランプの画像ギャラリー。
【図１３】図１３は、本発明の実施形態にしたがって細胞解析法を実施したときの処理中の蛍光強度の減少を示す。免疫フローＦＩＳＨを、（Ａ）ＢＢ５１５、（Ｂ）ＢＶ４８０、および（Ｃ）ＡＦ６４７と抱合したＣＤ１９クローンＨＩＢ１９で染色した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対して実施した。アリコートを、細胞表面抗体染色後（ｐｏｓｔ−ｓｔａｉｎ）、４％ホルムアルデヒド（ＦＡ）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０での固定および透過処理後（ｐｏｓｔ−ｆｉｘ／ｐｅｒｍ）、１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）での酸変性後（ｐｏｓｔ−ａｃｉｄ）、および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成後（ＦＩＳＨ）（ｐｏｓｔ−ｈｙｂ）のＡＭＮＩＳ  ＩＳＸ  ＭＫＩＩでの解析のために取り出した。この代表的な実験由来のデータは、（Ａ）免疫フローＦＩＳＨを通してＣＤ１９−ＢＢ５１５陽性細胞の解像度の保存が最高であったこと、（Ｂ）陽性細胞においてＣＤ１９−ＢＶ４８０蛍光が十分に保存されたこと、および（Ｃ）ｐｏｓｔ−ｈｙｂのＣＤ１９−ＡＦ６４７陽性細胞の喪失が顕著であったことが証明された。ｐｏｓｔ  ａｃｉｄおよび特にｐｏｓｔ−ｈｙｂのＣＤ１９クローンＨＩＢ１９抗体によって染色された全陽性集団にわたってＭＦＩが減少し、陽性集団のシグナル解像度はフルオロフォアに依存していた。全マーカーを使用した陽性集団のシグナル解像度の喪失は、ｐｏｓｔ−ｈｙｂ後の陰性集団の蛍光強度の減少およびバックグラウンド／自己蛍光の増加の両方に起因し、これは、全プロトコール後にＣｈ０２（４８０〜５６０ｎｍ）範囲およびＣｈ１１（６７０〜７４５ｎｍ）範囲と比較してＣｈ０７（４３０〜５０５ｎｍ）範囲で顕著に検出された。
【図１４】図１４は、本発明の実施形態にしたがって細胞解析法を実施したときの処理中のＡＰＣ蛍光の喪失を示す。細胞解析法を、ＢＢ５１５、ＡＰＣ、およびＦＩＴＣと抱合したＣＤ３クローンＳＫ７で染色した末梢血有核細胞に対して実施した。アリコートを、細胞表面染色後（Ｐｏｓｔ−Ｓｔａｉｎ）、４％ホルムアルデヒド（ＦＡ）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０での固定および透過処理後（Ｐｏｓｔ−Ｆｉｘ／ｐｅｒｍ）、１Ｍ塩酸変性後（Ｐｏｓｔ−Ａｃｉｄ）、および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成後（ＦＩＳＨ；Ｐｏｓｔ−Ｈｙｂ）のＡＭＮＩＳ  ＩＳＸ  ＭＫＩＩでの解析のために取り出した。この代表的な実験由来のデータにより、以下が実証された：（Ａ）ＣＤ３−ＢＢ５１５陽性細胞の解像度の保存；（Ｂ）ｐｏｓｔ−ｈｙｂのＣＤ３−ＡＰＣ陽性細胞の完全な喪失；および（Ｃ）フルオロフォアと無関係のＣＤ３−ＦＩＴＣ陽性細胞のｐｏｓｔ−ａｃｉｄ集団の顕著な喪失。さらに、陰性集団の自己蛍光は４８０〜５６０ｎｍの波長（Ｃｈ０２）においてｐｏｓｔ−ｈｙｂで増加し、ＢＢ５１５またはＦＩＴＣと抱合された陽性染色亜集団の解像度も減少した。略語：ＡＰＣ−アロフィコシアニンフルオロフォア、ＢＢ５１５−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ５１５フルオロフォア、Ｃｈ−チャネル、ＦＩＴＣ−フルオレセインイソチオシアナートフルオロフォア、ＩＳＸ  ＭＫＩＩ−  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ  ＭａｒｋＩＩ
【図１５】図１５は、本発明の実施形態にしたがって細胞解析法を実施したときのビス（スルホスクシンイミジル）基質（ＢＳ３）架橋を使用した処理中の蛍光強度の保存を示す。細胞解析法を、染色後にＢＳ３架橋を（Ａ）用いない場合および（Ｂ）用いた場合の両方におけるＡＦ６４７と抱合されたＣＤ５クローンＵＣＴＨＣ２で染色した末梢血有核細胞に対して実施した。アリコートを、細胞表面染色および架橋後（Ｐｏｓｔ−Ｓｔａｉｎ）、４％ホルムアルデヒド（ＦＡ）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０での固定および透過処理後（Ｐｏｓｔ−Ｆｉｘ／ｐｅｒｍ）、１Ｍ塩酸変性後（Ｐｏｓｔ−Ａｃｉｄ）、および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成後（ＦＩＳＨ；Ｐｏｓｔ−Ｈｙｂ）のＡＭＮＩＳ  ＩＳＸ  ＭＫＩＩでの解析のために取り出した。この代表的な実験由来のデータにより、免疫フローＦＩＳＨプロトコール中にＢＳ３架橋を用いた場合にＣＤ３−ＡＦ６４７陽性染色細胞の数および蛍光強度が保存されることが実証された。略語：ＡＦ−アレクサフルオル。
【図１６】図１６は、本発明の適切な実施形態にしたがって細胞解析法を実施したときのＣＬＬ試料の評価のための２つの免疫表現型検査パネルの比較を示す。免疫表現型検査パネル１（Ａ）、パネル２（Ｂ）を用いたＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ１９集団およびＣＥＰ１２スポットカウントの代表的なＣＬＬ患者試料の評価は、等価な集団密度およびＦＩＳＨスポットカウントを実証している。ゲーティングした集団を、画像ギャラリーに認めることができる。（Ｃ）．免疫表現型検査パネル１では、細胞１９８は、ＣＤ１９−ＢＶ４８０陽性、ＣＤ３−Ｖ５００ｃ陰性、ＣＤ５−ＡＦ６４７陽性のＣＥＰ１２ダイソミーＢ  ＣＬＬ細胞であり、細胞３９２は、ＣＤ１９−ＢＶ４８０陰性、ＣＤ３−Ｖ５００ｃ陽性、ＣＤ５−ＡＦ６４７陽性のＣＥＰ１２ダイソミーＴリンパ球である。（Ｄ）パネル２では、細胞４は、ＣＤ１９−ＢＶ４８０陽性、ＣＤ３−ＡＦ６４７陰性、ＣＤ５−ＢＢ５１５陽性のＣＥＰ１２ダイソミーＢ  ＣＬＬ細胞であり、細胞６７６４は、ＣＤ１９−ＢＶ４８０陰性、ＣＤ３−ＡＦ６４７陽性、ＣＤ５−ＢＢ５１５陽性のＣＥＰ１２ダイソミーＴリンパ球である。オーバーレイ画像は、免疫表現型検査の画像およびＣＥＰ１２プローブ画像の重ね合わせである。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
実施形態の説明
便宜上、以下のセクションでは、本明細書中で使用した用語の種々の意味を概説している。この考察の後、本発明の組成物、医薬の使用、および方法に関する一般的な態様が考察され、本発明の種々の実施形態の性質および実施形態をどのように使用することができるかを実証する具体例が続く。
定義
【００５３】
将来の特許出願は、本出願に基づくか、本出願の優先権を主張して、オーストラリアまたは海外に出願する可能性がある。添付の特許請求の範囲はほんの一例として提供しており、任意の前述の将来の出願において主張し得る範囲を制限することを意図しないと理解すべきである。特徴を、１つまたは複数の発明をさらに定義するか再定義するために、後日に仮の請求項に追加するか、仮請求項から省略することが可能である。
【００５４】
本明細書、実施例、および添付の仮請求項で使用した一定の用語および句の意味を以下に提供する。当該分野での用語の用法と本明細書中に提供した定義との間に明らかな不一致がある場合、本明細書内に提供された定義が優先されるものとする。
【００５５】
当業者は、本明細書中に記載の発明が、具体的に記載されたもの以外の変更および修正の余地があると認識するであろう。本発明は、全てのかかる変形および修正を含む。本発明はまた、個別にまたは集合的に、本明細書で言及または示されるすべての工程、特徴、製剤、および化合物、ならびに工程および特徴のありとあらゆる組み合わせまたは任意の２つ以上を含む。
【００５６】
このテキストで引用されている各文書、参考文献、特許出願、または特許は、その全体が本明細書中で参考として明確に援用される。これは、前述の引用文献をこのテキストの一部として読者が読んで検討すべきであることを意味する。前述のテキストで引用されている文書、参考文献、特許出願、または特許がこのテキスト中で繰り返されていないのは、単に簡潔にするためである。しかし、引用されている資料またはその資料に含まれる情報は、一般的な知識ではないと理解すべきである。
【００５７】
本明細書中で、または本明細書中で参考として援用される任意の文書で言及される任意の製品の製造者の指示、説明、製品仕様書、および製品シートは、本明細書中で参考として援用され、本発明の実施において使用され得る。
【００５８】
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態のいずれによってもその範囲が限定されるべきではない。これらの実施形態は、例示のみを目的とする。機能的に同等の製品、処方物、および方法は、明らかに本明細書中に記載の発明の範囲内にある。
【００５９】
操作例において、または別段の表示をしたときを除き、本明細書中で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数字は、すべての例で用語「およそ」または「約」によって修飾されていると理解すべきである。百分率と併せて使用されるときの用語「およそ」または「約」は、±１％を意味し得る。
【００６０】
本明細書中に記載の発明は、値（例えば、サイズ、濃度など）の１つまたは複数の範囲を含み得る。値の範囲は、範囲内の全ての値（範囲を定義する値が含まれる）、および前述の範囲の境界を画定する値のすぐ近くにある値と同一または実質的に同一の結果をもたらす、前述の範囲に隣接する値を含むと理解されるであろう。例えば、当業者は、範囲の上限または下限の１０％の変動が完全に適切であり得、本発明に包含されると理解するであろう。より具体的には、範囲の上限または下限の変動は、５％または当該分野で認識されている変動のうちのどちらか大きい方であろう。
【００６１】
本出願では、特に別記しない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。本出願では、別段の記載がない限り、「または」は「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定ではない。また、「要素」または「構成要素」などの用語は、特に明記しない限り、１つの単位を含む要素および構成要素ならびに１つを超えるサブユニットを含む要素および構成要素の両方を含む。また、用語「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」の使用は、ある区分（ｍｏｉｅｔｙ）の一部（ｐａｒｔ）または区分全体を含み得る。
【００６２】
本明細書を通して、文脈上別段の解釈を必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、述べられた整数または整数群を含むが、いかなる他の整数または整数群も排除しないことを意味すると理解されるであろう。
【００６３】
本明細書中で使用される選択された用語の他の定義は、発明の詳細な説明内に見出すことができ、本明細書を通して適用することができる。別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての他の科学用語および技術用語は、本発明に属する当業者が一般的に理解している意味を有する。
【００６４】
本発明の特徴は、以下の非限定的な説明および実施例を参照してここで考察されるであろう。
例示的な実施形態
【００６５】
第１の形態によれば、本発明は、細胞集団における状態を診断または予後診断する方法であって、
ａ．解析すべき細胞集団を選択し、細胞集団の抗原プロフィールを、フローサイトメトリーを使用して前述の集団を免疫表現型検査することによって解析して、測定または評価されるべき状態に関連する１つまたは複数の生物学的マーカーまたはパラメーターの有無を検出する、選択および解析する工程、および
ｂ．前述の集団を前述の細胞を可視化してカウントすることが可能な少なくとも１つのＦＩＳＨプローブに供して、特定の細胞をその正確な表現型によって同定し、表現型によって同定された細胞のゲノム異常を同定する、ＦＩＳＨプローブに供する工程
を含む方法にある。
【００６６】
方法の第１の工程によれば、フローサイトメトリーを使用した細胞集団の免疫表現型検査により、複数の蛍光パラメーターを同時に評価することができる。この工程は、集団の細胞形態（細胞特性）の可視化も可能であり、細胞の免疫表現型検査および膜上；細胞質内；核内のいずれかの抗原の位置の同定が可能である。
【００６７】
好ましくは、第２の工程では、ＦＩＳＨプローブは、その正確な表現型によって同定されたこれらの特定の細胞でカウントすべき蛍光「スポット」または別のシグナルを生成する。
【００６８】
次いで、（工程１および２由来の）両方のデータセットを使用して、イメージングフローサイトメトリーを用いて、特定の医学的状態または治療状態の有無を判定することができる。
【００６９】
本発明によれば、本明細書中に記載の例示的な方法は、血液学的悪性疾患の評価のために最適化されており、表現型によって同定された細胞における異数性ならびに欠失、転座、または融合が検出される可能性がある。好ましくは、本発明の方法を、以下のために使用することができる：
ａ．悪性疾患の診断、分類、および病期分類；
ｂ．処置後残存疾患のモニタリングの評価。これは、疾患の重荷が低い疾患の検出を補助し、大量療法（患者のアウトカムの改善が予想される移植が含まれる）の早期導入が可能であろう；
ｃ．予後の判断；および／または
ｄ．処置の決定。
【００７０】
本発明の制限されない好ましい形態では、免疫フローＦＩＳＨ法を、新生物細胞の亜集団の遺伝子の相違の検出のために使用する。例えば、異なる遺伝子異常を有する新生物細胞の細胞動態（すなわち、倍数性、アポトーシス、および細胞周期）の相違および疾患進行に伴うゲノムドリフトまたはクローン進化（すなわち、新規の染色体異常の獲得）を研究することができる。これらの生物学的特徴を利用して、臨床転帰を改善する可能性がある治療（例えば、特定の標的療法）のタイミングおよび選択を修正することができる。
【００７１】
がん関連の解析に加えて、免疫フローＦＩＳＨプロトコールを、非悪性疾患の調査（母体血中に存在する胎児細胞における染色体欠損の検出による出生前診断または血液キメラ現象（ある個体に由来する別の個体の血液中の遺伝的に異なる細胞の存在である）が含まれる）のために使用することができる。胎児−母体間輸送、双生児研究、固形臓器移植または同種造血細胞移植、および非白血球輸血が含まれるいくつかの臨床環境でこの調査が発生することが実証されている。したがって、いくつかの非悪性疾患で免疫フローＦＩＳＨ法が適用されている。
【００７２】
好ましくは、本発明の方法を、以下の例示的な方法の実行できる適用のうちの１つまたは複数の調査のために使用する：
ａ．以下などの非悪性疾患への適用：
ｉ．出生前の適用
１．染色体欠損または母体血との相違を有する疾患の出生前診断：母体循環系内の胎児細胞（有核赤血球または栄養芽層）の同定
ａ．胎児起源の有核細胞：
ｉ．ＨｂＦ（細胞内）、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）に対する抗体を使用した有核赤血球、またはＨＬＡ−Ｇに対する（そして、ＣＤ４５に陰性の）抗体を使用した栄養芽層を同定するための免疫表現型
ｉｉ．目的の疾患のためのプローブ、
１．数：例えば、ＣＥＰ２１ダウン症候群
２．構造：あまり一般的でない
ｂ．母体血中の男性起源の胎児リンパ球：
ｉ．免疫表現型：ＣＤ４５による同定（母系と胎児とを区別できないであろう）
ｉｉ．プローブ：Ｙ染色体を有する男性の性別
ｉｉ．キメラ現象：
１．移植後性別不適合移植
ａ．免疫表現型：ＣＤ４５によるリンパ球の同定（レシピエントとドナーとを区別できないであろう）
ｂ．プローブ：Ｘ染色体およびＹ染色体
ｂ．悪性疾患：
ｉ．血液学的悪性疾患：表現型によって同定された新生物細胞における染色体異常の検出。適切な抗体−蛍光色素の組み合わせおよびプローブのみに制限される
１．分類：表現型および染色体を利用したＷＨＯ分類に基づいた疾患の診断および分類。
ａ．数の異常（「異数性」）：モノソミー、トリソミー、テトラソミー、高二倍性、低二倍性（ｈｙｐｏｄｉｐｏｉｄｙ）
ｉ．例：急性白血病、慢性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、リンパ腫
ｂ．構造異常：欠失、融合
ｉ．例：急性白血病、慢性白血病、形質細胞性骨髄腫、骨髄異形成症候群、慢性好酸球性白血病、リンパ腫
２．処置の決定：表現型によって同定された特定の疾患（例えば、ｄｅｌ（１７ｐ）を有する慢性リンパ球性白血病；ｄｅｌ（５ｑ）を有する骨髄異形成症候群）における染色体欠損の存在に基づいた処置の選択
ａ．高感度
ｂ．低クローン負荷が検出され得る
３．予後診断：染色体の異常によって層別化された疾患、例えば、
ａ．慢性リンパ球性白血病
ｂ．形質細胞性骨髄腫
ｃ．骨髄異形成症候群
ｄ．急性骨髄球性白血病
ｅ．急性リンパ芽球性白血病
ｆ．リンパ腫
４．残存疾患：
ａ．染色体欠損に基づいた微小残存病変の負荷
ｂ．染色体欠損に基づいた新規のクローンの獲得
ｃ．自家移植のための採取前の疾患根絶
ｄ．感度の問題：感度１：１０５
ｉ．形態学より高感度
ｉｉ．ＦＩＳＨより高感度（１〜５細胞／１００）
ｉｉｉ．フローＭＲＤより高感度
ｉｖ．ＲＴ−ＰＣＲより低感度かもしれない（１：１０５）
ｉｉ．非造血細胞：診断および分類
１．原発性腫瘍：以下の鑑別診断
ａ．組織：組織から抽出した細胞。
ｉ．数の異常：異数性（例えば、黒色腫対非定型母斑の鑑別診断）
ｉｉ．構造異常：欠失、融合（例えば、非ホジキンリンパ腫）
ｂ．処置の決定：表現型によって同定された特定の疾患における染色体欠損の存在に基づいた処置の選択
２．転移性疾患：新生物細胞に特徴的な表面または細胞内の非造血抗原（ｎｏｎ−ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）によって同定する。
ａ．血液：循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）
ｂ．例：乳房；黒色腫
ｃ．骨髄：転移細胞
ｃ．他の適用には、以下が含まれる：
ｉ．ＤＮＡ：特定の遺伝子領域のためのＢＡＫプローブ
ｉｉ．ＲＮＡプローブ：転写物の検出
ｉｉｉ．科学的適用：
１．細胞倍数性（例えば、巨核球）
ｄ．非ヒト遺伝子型の評価：
ｉ．細胞内ウイルス検出：表現型によって同定されたヒト細胞に取り込まれたウイルスゲノムＤＮＡ配列の検出。
１．エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）：Ｂ細胞に感染し、細胞複製およびアポトーシスを調節解除する（例えば、ＭＹＣ遺伝子およびＢＣＬ２Ｌ１１遺伝子のハイジャック）公知のオンコウイルスである。
ａ．ＷＨＯによって分類されるように、血液学的悪性疾患（非ホジキンリンパ腫（すなわち、バーキットリンパ腫）およびホジキンリンパ腫など）は、潜伏ＥＢＶ感染と強く関連する。
２．ＥＢＶ  ＤＮＡまたは関連転写物（例えば、ペプチド核酸プローブ）の検出用の市販のプローブを利用可能であり、ＥＢＶゲノムの特異的検出のための種々のタイプのフルオロフォアに抱合した特異的オリゴヌクレオチドプローブを合成することも可能である。
【００７３】
本方法を、導入遺伝子ベクター配列に対するプローブによるＣＡＲ−Ｔ細胞耐性を同定するために使用することもできる。特に、本方法を、操作された導入核酸配列および細胞内のその発現の検出のため使用することができる。
【００７４】
本発明のテクノロジーが特に有用な主な非悪性適用のうちの１つは、胎児の疾患、特にダウン症候群の出生前（または出産前）診断である。ダウン症候群は、例えば、１９５９年に最初に報告されており、オーストラリアでは１０００人に１人、米国では８００人に１人が罹患する、新生児における最も一般的な染色体状態である。ダウン症候群を有する人は、通常、特有の顔の特徴、いくつかの知的障害、心臓または消化管の問題、および視覚または聴覚の障害を有する。ダウン症候群は、２コピーの代わりに３コピーの２１番染色体の存在に起因する（「トリソミー２１」）。高齢の母親ほど卵子内の染色体数にエラーを有する可能性が高くなり、３５歳を超える母親におけるダウン症候群を有する生産児の確率は１／２５９まで増加する（Ｍｏｒｒｉｓ  ＪＫ，Ｍｕｔｔｏｎ  ＤＥ，Ａｌｂｅｒｍａｎ  Ｅ．Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ａｇｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｖｅ  ｂｉｒｔｈ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｄｏｗｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．２００２；９：２−６）。現在提供されている出産前スクリーニング検査には、妊娠初期のリスク評価、母体血清検体スクリーニング、および胎児構造の超音波解析が含まれる。これらはリスクを予測するだけであり、確認診断検査は侵襲的検査（羊水穿刺または絨毛生検）であり、胎児の損傷または流産の重大なリスクを伴う。診断には２１番染色体のコピー数を検出する必要があり、この診断は、２１番染色体を特異的に「タグ付けして識別する」ための全染色体分析（核型分析）またはＦＩＳＨによって行われる。１９６９年に、母体循環系に少数の有核胎児赤血球（１０，０００母体血球あたり１）が存在することが最初に報告された。これにより、これらの血球を分離して非侵襲的な出産前検査に使用できる可能性が高まった。いくつかの分離、濃縮、評価方法が開発されたが、これらの方法の複雑さ、細胞収率の低さ、および結果の一貫性のなさにより、いずれの方法も臨床診療につながっていない。しかし、免疫フローＦＩＳＨ法は、分離、濃縮、または侵襲的検査を用いずに、胎児細胞内の２１番染色体のコピー数を母体循環系内で判定可能である。
【００７５】
当業者は、出願人の免疫フローＦＩＳＨプロトコールを、免疫表現型検査された試料の高処理ＦＩＳＨ解析を必要とする多数の異なる試料の調査に適用することができ、そのようなものとして、国内外の診断病理検査室および研究所で大いに役立つ可能性があると認識するであろう。
【００７６】
第２の態様では、本発明は、細胞解析のための免疫フローＦＩＳＨ法であって、
ａ．細胞表面マーカー、細胞質マーカー、または核マーカー（抗原）を有する有核細胞を含む単細胞懸濁液を調製する工程；
ｂ．前述の細胞マーカーを抗体染色して前述の細胞を表現型検査する、抗体染色する工程；
ｃ．同一工程において細胞を固定および透過処理する工程；
ｄ．細胞染色体（正常または異常）の検出のために前述の細胞に対して（本明細書中に記載の）細胞遺伝学的技術を実施する工程；
ｅ．前述の細胞のＤＮＡを染色する工程；および
ｆ．前述の細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程
を含む、方法を提供する。
【００７７】
本発明の一形態において、本方法は、
ａ．イメージングフローサイトメトリーから得たデータを解析して、前述のデータ解析に基づいて医学的状態または治療状態の有無を検出する、解析する工程をさらに含む。
【００７８】
好ましくは、本発明の実施において、プロトコールを通して試料を光から防御する。
【００７９】
細胞試料の調製において、試料を、軽度疾患または障害を罹患している疑いのある被験体から採取する。試料は、末梢血もしくは骨髄または組織の試料を含み得る。例えば有核細胞を含む末梢血から試料を採取する場合、試料中の有核細胞は、悪性細胞（例えば、ＣＬＬ細胞）および正常な染色体を有する健康なコントロールとして解析で使用することができるリンパ球（例えば、Ｔリンパ球）を含み得る。
【００８０】
好ましくは、方法で使用される試料は、１×１０６個と５×１０６個との間またはこれらの細胞数の間の任意の数の有核細胞を有するであろう。
【００８１】
最初に、試料が血液または骨髄である場合、好ましくは赤血球を溶解することによって単細胞懸濁液を調製する。試料を、好ましくは塩化アンモニウムなどの低張緩衝液または塩化アンモニウムカリウムなどの市販の溶解液の存在下でインキュベートするか、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＮＰ−４０、またはＢｒｉｊ−５８での処理によって調製することができる。単細胞懸濁液を、密度勾配遠心分離、磁気細胞分離、または酵素消化によって調製することもできる。遠心分離の条件は、細胞を破損することなく細胞を分離するのに十分な条件であろう。かかる条件は、当業者に認識されているであろう。
【００８２】
試料が組織生検である場合、有核細胞の単細胞懸濁液を、組織基質および細胞間接着を切断（「消化」）するための酵素（コラゲナーゼ、プロテアーゼ、およびＤＮアーゼＩなど）を含む緩衝液と試料をインキュベートすることによって調製する。
【００８３】
試料を凍結保存する場合（例えば、バイオバンク）、有核細胞の細胞懸濁液を、塩化マグネシウムおよびＤＮアーゼＩ酵素を含むロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地または類似の培地中で試料を解凍および洗浄することによって調製することができる。
【００８４】
細胞試料調製工程はまた、遠心分離工程（例えば、２００×ｇで５分間または任意の同様の分離速度での遠心分離を含む）、その後の有核細胞からの溶解または消化された細胞材料の分離のための上清の除去を含み得る。
【００８５】
好ましくは、工程はまた、例えば、５ｍｌ  ＰＢＳを用いた２００×ｇで５分間の遠心分離を含む洗浄工程を含む。遠心分離の条件には、細胞を破損することなく細胞を分離するのに十分な条件が含まれ、この条件は当業者に認識されているであろう。
【００８６】
本発明によれば、細胞マーカーの抗体染色は、好ましくは、目的の集団の適切な免疫表現型検査であるＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＢｉｏＬｅｇｅｎｄなどの企業から購入した抗体（例えば、慢性リンパ球性白血病  ［ＣＬＬ］  解析のための抗ヒトＣＤ１９、ＣＤ５、およびＣＤ３）の免疫表現型検査のための抗体混合物で有核細胞を染色することを含む。かかる免疫表現型検査抗体は市販されており、以下の抗体が含まれる：ＦＩＴＣ−ＣＤ３、ＦＩＴＣ−ＣＤ４、ＢＢ５１５−ＣＤ３、ＢＢ５１５−ＣＤ４、ＢＢ５１５−ＣＤ５、ＢＢ５１５−ＣＤ１９、ＢＢ７００−ＣＤ４、ＰＥ−ＣＤ３、ＰＥ−ＣＤ４、ＰＥＣｙ５−ＣＤ４、ＰＥＣＦ５９４−ＣＤ４、ＰＥＣｙ７−ＣＤ４、ＰＥＣｙ７−ＣＤ１９、ＰｅｒＣＰＣｙ５．５−ＣＤ４、ＢＶ４２１−ＣＤ４、ＢＶ４８０−ＣＤ３、ＢＶ４８０−ＣＤ４、ＢＶ４８０−ＣＤ５、ＢＶ４８０−ＣＤ１９、ＢＶ５１０−ＣＤ４、Ｖ５００ｃ−ＣＤ３、ＢＶ６０５−ＣＤ４、ＢＶ６５０−ＣＤ４、ＢＶ６５０−ＣＤ１９、ＢＶ７１１−ＣＤ３、ＡＰＣ−ＣＤ３、ＡＰＣ−ＣＤ４、ＡＰＣ−ＣＤ１９、ＡＦ６４７−ＣＤ３、ＡＦ６４７−ＣＤ５、ＡＦ６４７−ＣＤ１９、ＡＰＣＣｙ７−ＣＤ４、ＡＰＣＨ７−ＣＤ３、ＡＰＣＨ７−ＣＤ１９、ＡＦ７００−ＣＤ３、ＡＦ７００−ＣＤ４、ＡＰＣＲ７００−ＣＤ４、ＡＰＣｅＦｌｏｕｒ７８０−ＣＤ３、ＡＰＣｅＦｌｏｕｒ７８０−ＣＤ１９、またはＡＰＣＦｉｒｅ７５０−ＣＤ３。
【００８７】
抗体染色は、抗体がその細胞の抗原またはリガンドに結合するのに十分な時間細胞をインキュベートすることをさらに含み得る。例えば、細胞を、およそ４℃でおよそ３０分間インキュベートすることができる。抗体染色の条件は、細胞を破損することなく抗体抗原相互作用を容易にするのに十分な条件であろう。かかる条件は、当業者に認識されているであろう。
【００８８】
抗体染色はまた、過剰な非結合抗体を除去するための洗浄工程を含み得る。かかる工程を、８００ｕＬ  ２％ＦＣＳ／ＰＢＳおよび９５０×ｇで３分間の細胞の遠心分離を用いて行うことができる。しかし、かかる環境における洗浄条件は、結合した抗体を除去しないようにしながら非結合抗体を除去するのに十分な条件であり、この条件は当業者に認識されているであろう。
【００８９】
本発明によれば、細胞固定工程は、好ましくは、ホルムアルデヒドを試料に添加することを含む。最適なレジメンは、およそ４パーセントのホルムアルデヒドを細胞懸濁液とインキュベートすることである。代替の細胞固定には、以下が含まれる：０．５〜３％ホルムアルデヒド；カルノア固定液（メタノール３：１酢酸）；メタノール５０〜１００％；７０％メタノール＋４％ホルムアルデヒド＋５％酢酸；５０％メタノール＋４％ホルムアルデヒド＋５％酢酸；７０％メタノール＋４％ホルムアルデヒド；７０％メタノール＋５〜２５％酢酸；ホルムアルデヒド４％＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、および７０％アセトン。さらに、この４パーセントのホルムアルデヒド固定工程は、およそ０．１パーセントの非イオン性界面活性剤の非イオン性界面活性剤の添加を含み得る。非イオン性界面活性剤は、ＦＩＳＨのために標的ＤＮＡにプローブがアクセスできるようにするための細胞透過処理に必要である。ホルムアルデヒドと非イオン性界面活性剤の組み合わせにより、単一の工程で細胞を固定および透過処理することが可能であり、この組み合わせはより経済的であり、プロトコールにおける時間および操作が削減される。例えば、非イオン性界面活性剤はＴｗｅｅｎ２０であり得る。このＴｗｅｅｎ２０は、通常、フローサイトメトリーまたは細胞内抗原もしくは標的ＤＮＡをそれぞれ検出するためのＦＩＳＨでの適用の両方のための細胞透過処理のために利用される。望ましくは、試料はまた、ホルムアルデヒドおよびｔｗｅｅｎ２０での固定および透過処理のために、インキュベーション、洗浄、および／または遠心分離にこの順序で供される。
【００９０】
次いで、試料を、固定後に、例えば、４℃で３〜５日間保存するために、ウシ胎児／ウシ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、その間に、試料を輸送するか、または他の試料とまとめ、その後にハイブリッド形成および解析することができる。
【００９１】
細胞遺伝学的技術の実施には、細胞をプローブ、好ましくはＦＩＳＨプローブとハイブリッド形成する必要がある。この点において、細胞遺伝学的技術の工程には、ＤＮＡの変性、非特異的プローブＤＮＡ結合のブロッキング、および試験中の細胞内の核物質とのＦＩＳＨプローブのハイブリッド形成の工程も含まれ得る。
【００９２】
酸を使用してＤＮＡを変性させることができる。変性のために酸を使用する場合、酸は、好ましくは、およそ０．５Ｍ〜１Ｍの濃度の塩酸である。試験した別のＤＮＡ変性条件には、以下が含まれる：０．５〜４Ｍ塩酸；５〜２５％酢酸；５〜１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；７０％アセトン、および０．１ｕｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ。
【００９３】
細胞遺伝学的技術工程の好ましい形態において、細胞を、３ｍｌの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でクエンチする。次いで、クエンチした細胞を、６００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去する。
【００９４】
好ましくは、ブロッキング工程の間に、非特異的プローブＤＮＡを、ＦＩＳＨプローブハイブリッド形成物への結合からブロックする。試料をＰＢＳ／ＢＳＡに曝露し、次いで、細胞を洗浄すること（例えば、１ｍｌ  ＰＢＳ／ＢＳＡを使用した９５０×ｇで３分間の遠心分離）によってこれを行うことができる。次いで、得られた上清を除去することができ、細胞を、ハイブリッド形成緩衝液（ＦＩＳＨプローブ解析用の５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２×標準クエン酸ナトリウムなど）に再懸濁する。本発明のこの形態では、次いで、細胞を、７３〜７４℃まで加熱してＤＮＡを変性させ、そして／またはプローブアニーリングを容易にする。この工程を、好ましくは、自動サーモサイクラーで行う。次いで、細胞を、ストリンジェンシー溶液（０．１〜０．３％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０を含む０．４〜２×標準クエン酸ナトリウム緩衝液など）で少なくとも１回洗浄し、再懸濁することができる。Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０は、膜性構成要素および非特異的プローブ結合を溶解する非イオン性界面活性剤であり、標準クエン酸ナトリウムは、細胞を懸濁液中に維持しながら濃度依存様式で（すなわち、塩濃度が低いほどストリンジェンシーが高い）非特異的プローブ結合を不安定化もする塩である。次いで、細胞の核ＤＮＡ染色を行い、この染色は、室温で２０分間のＨｏｅｃｈｓｔ（１：１０００または１ｕｇ／ｍｌ）またはＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ（１：５０００または０．２ｕＭ）を含み得る。
【００９５】
本発明によれば、細胞に対してイメージングサイトメトリーを実施する工程は、励起レーザーを使用することおよび明視野画像を取り込むことを含み、蛍光発光および画像の波長範囲は５１５〜８１０ｎｍである。励起レーザーは、１００ｍＷ  ４０５ｎｍ、および／または５０ｍＷ  ４８８ｎｍ、および／または１５０ｍＷ  ５６１ｎｍ、および／または１５０ｍＷ  ５９２ｎｍ、および／または１２０ｍＷ  ６４２ｎｍのレーザーを含み得る。イメージングサイトメトリーの実施は、好ましくは、少なくとも４０倍の対物レンズを使用して画像を取り込むことを含む。画像を、３０倍〜７０倍の範囲の対物レンズで取り込むことができる。望ましくは、画像を、およそ６０倍の対物レンズで取り込むことができる。
【００９６】
イメージングサイトメトリーの実施はまた、散布図中の細胞を同定することを含み得る。最低でも試料中の１０，０００細胞が記録されることが適切であり、合計で１００，０００〜１，０００，０００細胞が記録されることが好ましい。さらに、単一の染色細胞を、明視野および７８５ｎｍの「散乱」レーザーの非存在下で解析することができ、補正行列を計算することができる。
【００９７】
本発明によれば、イメージングフローサイトメトリー工程において、免疫フローＦＩＳＨのデータ解析を、画像解析ソフトウェア（ＩＤＥＡＳ（ＡＭＮＩＳ  Ｍｅｒｃｋ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＵＳＡ）、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）、およびＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖ６  Ｉｍａｇｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）など）を使用して行う。データ解析は、画像の鮮明さまたは品質を測定すること（例えば、勾配二乗平均平方根、すなわちＧＲＭＳ）によって、焦点画像を選択することを含むことができ、それにより、ＦＩＳＨ解析のためのプローブスポットカプンとの正確度が向上するであろう。好ましくは、データをアスペクト比対明視野領域の散布図にして単細胞を同定し、偽陽性のＦＩＳＨ結果（例えば、高数性）を生じ得るダブレットおよび細胞クランプを除去する。
【００９８】
解析は、蛍光強度の高い細胞を排除することによって蛍光強度ヒストグラム中の有核非分裂細胞を同定する工程も含み得る。かかるデータ解析は、理想的には、使用したアプリケーションおよび細胞マーカーに応じて、正常なリンパ球（すなわち、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球）および悪性細胞（例えば、ＣＬＬ、急性骨髄球性白血病、形質細胞性骨髄腫の細胞）などのマーカーの蛍光強度に基づいて目的の細胞集団をゲーティングする工程を含むであろう。
【００９９】
好ましくは、データ解析は、２つの画像がマスキングした領域内で線形に相関する程度の尺度を使用して、ＦＩＳＨプローブシグナルの核染色剤との共存を決定することを含む。データ解析は、ピーク、スポット、または強度マスクを使用して、細胞あたりのＦＩＳＨプローブスポット数をカウントすることを含み得る。これは、各ピクセルが特定のスポットまたはバックグラウンドに連結するかどうかに基づいた各ピクセルの連結性を試験することを含み得る。好ましくは、スポットカウントを、各スポットカウント集団についてＦＩＳＨシグナルの蛍光強度の測定値を比較する単一パラメーターヒストグラムによって検証する。
【０１００】
第３の態様では、本発明は、細胞解析のための診断方法であって、
ａ．有核単細胞懸濁液を調製する工程；
ｂ．（ａ）で生成された懸濁液由来の細胞表面マーカー、細胞質マーカー、または核マーカーを抗体染色し、染色された抗体を検出する工程；
ｃ．同一工程において懸濁液中の細胞を固定および透過処理する工程；
ｄ．ＤＮＡを変性させ、非特異的プローブＤＮＡ結合をブロッキングし、ＦＩＳＨプローブを試験中の細胞内の核物質とハイブリッド形成させる工程；
ｅ．細胞に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程；および
ｆ．工程（ｅ）由来のデータを解析して、工程（ｂ）および（ｅ）由来の結果に基づいて医学的状態の有無を診断する、解析する工程
を含む、方法を提供する。
【０１０１】
本発明の第３の態様の特定の形態では、方法は、以下の工程を含む：
ａ．有核細胞を単離し、細胞懸濁液を調製する工程；
ｂ．特に試験される条件について細胞マーカーを認識する免疫表現型検査抗体を使用して抗原−抗体複合体を形成することによって細胞表面抗原、細胞質抗原、または核抗原を染色する工程、
ｃ．安定化を含む完全な抗原抗体反応を行い、８０分以内にクエンチする工程、
ｄ．次いで、同一工程において細胞を固定および透過処理する工程、
ｅ．次いで、細胞由来のＤＮＡを変性させ、低濃度の塩酸を用いてクエンチする工程；
ｆ．次いで、好ましくはＢＳＡを用いて非特異的プローブＤＮＡ結合をブロックする工程；
ｇ．次いで、少なくとも１つのＦＩＳＨプローブを添加し、ＤＮＡにアニーリングし、ハイブリッド形成させる工程；
ｈ．次いで、試料を、ストリンジェントな条件下で洗浄して過剰なＦＩＳＨプローブを除去する、洗浄する工程；
ｉ．次いで、ＤＮＡを染色して核を可視化し、フローサイトメトリーを使用して試料を試験する工程；
ｊ．次いで、工程（ｂ）および（ｉ）由来のデータを、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸを使用して解析して、医学的状態（ＣＬＬにおけるトリソミー１２（染色体数の増加）または欠失１７ｐ（染色体の一部の喪失）など）の有無を判定する、解析する工程。
【０１０２】
特に、このプロトコールは、一定の重要な点で以前の先行技術のプロトコールと異なる（表１を参照のこと）。例えば、血液試料および骨髄試料において、最初に赤血球を溶解する。この溶解を、低張液（塩化アンモニウムまたはＢＤ  ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のような市販の溶液など）との試料のインキュベーションによって行うことができる。次に、同一工程において細胞の固定および透過処理を行い、それにより、より効率的に透過処理が行われる。第３に、抗体抗原架橋クエンチ後の洗浄工程の省略により、細胞の破損が軽減され、プロトコール終了時の収率がより向上する。次に、酸濃度が低いことにより、プロトコール終了時の細胞収率が大幅に改善される（免疫−Ｓ−ＦＩＳＨプロトコールに制限される）。次に、ＤＮＡとＦＩＳＨプローブのハイブリッド形成工程中に、本方法は、非特異的プローブＤＮＡ結合のためのＢＳＡを用いたブロッキング工程を含む。次に、ストリンジェンシー洗浄の順序が、プローブ製造者（例えば、Ｖｙｓｉｓ  ＣＥＰプローブについてはＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）の推奨事項と比較して逆であり、それにより、非結合ＦＩＳＨプローブおよび非特異的ＦＩＳＨプローブ結合がより適切に除去される。
【０１０３】
第４の態様では、本発明は、本発明の方法の１つまたは複数の構成要素を、方法におけるキットの使用方法についての説明書と共に含む診断キットを提供する。
【０１０４】
特に、本発明は、（ａ）少なくとも１つの標準的なフローサイトメトリーに適切なマーカー検出システム、（ｂ）１つまたは複数の本発明のＦＩＳＨプローブを含むキットであって、（ａ）および（ｂ）の各々が、１つまたは複数の容器に、本発明の方法における（ａ）および（ｂ）の使用に関する指示および／または情報を提供する指示書または情報小冊子と組み合わせて存在する、キットに及ぶ。
【０１０５】
さらに、キットは、１つまたは複数の容器に本発明の方法での使用に適切な１つまたは複数の緩衝液も含むことができる。
【０１０６】
好ましくは、キット中に存在するマーカー検出システムは、細胞試料の免疫表現型検査に適切な抗体である。
【０１０７】
【表１】
2021501885.tif 000002
【０１０８】
方法の実例
本発明を、ここに、以下の本発明の特定の非限定的な例を考慮して記載するであろう。
【０１０９】
本発明の非常に好ましい例では、免疫フローＦＩＳＨプロトコールは、制限されないが以下の工程を含み、以下の工程は個別に提示されているが、共通の段階で共にグループ化することができる：
ａ．細胞試料を採取し、単細胞懸濁液を調製する（例えば、血液／骨髄中の赤血球（ＲＢＣ）を溶解し、酵素とインキュベートして組織生検中の組織基質を除去するか、凍結保存された試料を解凍する）；
ｂ．製造者の説明書に従って細胞を蛍光抱合された抗体と４℃で３０分間インキュベートして細胞の抗原を検出する；
ｃ．細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄する；
ｄ．１ｍＭ  ＢＳ３中にて４℃で３０分間インキュベートする（細胞を洗浄しない）；
ｅ．１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．４／１５０ｍＭ  ＮａＣｌとインキュベートし、４℃で２０分間クエンチする（好ましくは、吸引しない）；
ｆ．０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む４％ホルムアルデヒドを添加し、穏やかに吸引して混合し、室温で１０分間インキュベートする；
ｇ．細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄する；
ｈ．０．５Ｍ  ＨＣＬ（酸）にて室温で２０分間インキュベートする；
ｉ．氷冷ＰＢＳを添加し、６００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去する；
ｊ．ＰＢＳ／１％ＢＳＡで試料をブロックする；
ｋ．洗浄し、上清を除去する；
ｌ．０．１％ＮＰ−４０を含む２×ＳＳＣに再懸濁する−細胞を０．２ｍｌ微量遠心管に移す；
ｍ．９５０×ｇで３分間遠心分離し、全ての過剰な緩衝液を除去する；
ｎ．ＦＩＳＨプローブを含むＣＥＰハイブリッド形成緩衝液に再懸濁する；
ｏ．７３〜７４℃で５分間変性させる；
ｐ．３７℃で１６〜２０時間ハイブリッド形成させる；
ｑ．０．１％ＮＰ−４０を含む２×ＳＳＣで洗浄し、上清を除去する；
ｒ．０．３％ＮＰ−４０を含む０．４×ＳＳＣ（４２℃に予熱する）に再懸濁し、４２℃で５分間インキュベートする；
ｓ．細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄する；
ｔ．ＤＮＡ染色剤（例えば、ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄのＰＢＳでの５倍希釈液）に再懸濁し、室温で２０分間インキュベートする；
ｕ．ＡＭＮＩＳ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸにて倍率６０倍およびＥＤＦを用いて解析する。
【０１１０】
この方法では、以下の略語を使用する：
ａ．ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン
ｂ．ＣＥＰ−染色体計数プローブ
ｃ．ＤＡＰＩ−ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）
ｄ．ＥＤＦ−被写界深度
ｅ．ＦＢＳ／ＦＣＳ−胎児ウシ血清（別名ＦＣＳまたは仔ウシ血清）
ｆ．ＰＢＳ−リン酸緩衝生理食塩水
ｇ．ＳＳＣ−生理食塩水−クエン酸ナトリウム
【０１１１】
好ましくは、上記のように、プロトコールを通して試料を光から防御する。
【０１１２】
好ましくは、免疫フローＦＩＳＨプロトコールで解析される細胞は有核細胞であり、特に、このプロトコールにより、染色体（１、１２、および１７番染色体など）および／もしくは染色体の一部、遺伝子座、または遺伝子（１７番染色体の短腕上の遺伝子など）を解析可能である。
【０１１３】
かかる細胞および遺伝子材料を解析して、遺伝子または染色体の獲得または喪失から生じる細胞遺伝学的異常または先天性障害を同定することができる。
【０１１４】
特定の態様では、免疫フローＦＩＳＨプロトコールを使用して、医学的状態（慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）など）を染色体の変化（トリソミー１２または１７ｐの欠失（ｄｅｌ１７ｐ）など）について試験することができる。本発明の説明を容易にするために、例として、１２番染色体のコピー数および１７ｐの欠失（ｄｅｌ１７ｐ）についての慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の試験における正常な血液Ｂリンパ球およびＴリンパ球集団の解析での免疫フローＦＩＳＨプロトコールを記載している。したがって、これらの例は、健康で正常なＢ細胞集団およびＴ細胞集団における１番および１２番染色体ダイソミー解析ならびにＣＬＬにおける１２番染色体トリソミー解析（図２）を用いた染色体数解析、ならびに構造変異（１７ｐ番染色体上の遺伝子座の欠失など）への本方法の適用を例示している。
生存染色
【０１１５】
死細胞は「粘着性」を示し、免疫表現型検査のために使用される抗体への非特異的な結合により偽陽性の結果を生じ得る。従来のフローサイトメトリー免疫表現型検査のアッセイにおいて生存細胞と死細胞の相対比率を決定することは日常的な作業である。この決定は、しばしば、生存染色（すなわち、損傷した／透過処理した膜を有する細胞内の核酸のみを染色する細胞不透過性色素（ヨウ化プロピジウム、７ＡＡＤ、またはＤＲＡＱ７など）での生（非固定）細胞の染色）によって行われる。このＤＮＡ染色は、蛍光染色とＤＮＡとが平衡状態にある場合に生じるため、その後の処理中にＤＮＡから染色剤が解離し、最終的には試料中の全ての細胞が染色される。
【０１１６】
現在のプロトコールによれば、生存細胞に対して弱い陽性蛍光を示す（表面アミン染色のみ）のに対して、死細胞には強い陽性染色を示す（表面および細胞内のアミン染色）アミン反応性色素であるＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｚｏｍｂｉｅ  Ｄｙｅｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（ＦＶＤ）ｅＦｌｕｏｒ７８０、またはＴｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅｓなどの固定可能な生存マーカーを使用することが好ましい。固定可能な生存色素の最適量を、予備滴定試験によって決定される必要があり得る。
有核単細胞懸濁液の調製
【０１１７】
好ましくは、免疫フローＦＩＳＨプロトコールの第１の工程は、患者から試料を単離することを含み、前述の試料は、およそ５×１０６個の細胞を含む。かかる試料は、イメージングフローサイトメトリーによって少なくとも２００，０００の事象を解析することが可能であろう。
【０１１８】
好ましくは、プロトコールの構築において、既知の染色体の異常を有するポジティブコントロール（トリソミー１２を有することが知られているＣＬＬ患者または細胞培養物など）およびネガティブコントロール（トリソミー１２を持たないＣＬＬ患者または健康なドナー血液など）も存在するであろう。
【０１１９】
例示的なプロトコールでは、血液から有核単細胞懸濁液を調製する工程は、以下を含み得る：
ａ．前腕前部静脈穿刺によって健康なボランティアおよびＣＬＬ患者からＶＡＣＵＥＴＴＥ  ＥＤＴＡ真空採血管（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｐｒｅａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に採血すること；
ｂ．全血を１：４０体積のＢＤ  ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（緩衝化塩化アンモニウムベースの溶解試薬、ｐＨ７．１〜７．４）と（例えば、２５０μＬの血液を１０ｍＬ  ＰｈａｒｍＬｙｓｅと）１０分間インキュベートして赤血球を溶解することによって末梢血有核細胞を調製すること（凍結保存された試料を、５ｍＭ塩化マグネシウムおよび１０Ｕ／ｍＬ  ＤＮアーゼＩ酵素を含むＲＰＭＩ培地で急速解凍し、洗浄することができる）；および
ｃ．細胞を２００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去すること。
【０１２０】
さらに、方法におけるこの工程は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）やＥＤＴＡを含まない）での細胞の洗浄（好ましくは、２回）および２００ｇで５分間の遠心分離を含み得る。任意選択的に、洗浄緩衝液は、（プロトコールを通して）ＰＢＳ／２〜６％ＦＢＳ、ＰＢＳ／０．５〜１％ＢＳＡ、ＰＢＳ／２％ＦＢＳ／１〜５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡを有する。最適な洗浄緩衝液は、新たに採取した試料についてはＰＢＳ／２％ＦＢＳであり、凍結保存された試料についてはＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡである。
表面マーカーの抗体染色（免疫表現型検査）
【０１２１】
プロトコールの次の工程は、細胞抗原を染色することである。本発明の１つの例において、これは、細胞のマーカーの抗体ベースの染色を含む。プロトコールはまた、特異的抗体抗原結合と非特異的な細胞への抗体の結合とを識別する「アイソタイプコントロール」を含み得る。アイソタイプコントロール抗体での染色によってこれを行う。
【０１２２】
さらに、マルチパラメトリック解析を行う場合、プロトコールはまた、バックグラウンドレベルを超える蛍光を示す細胞を正確に同定可能な「フルオレセンス・マイナス・ワン（ＦＭＯ）」コントロールを含み得る。好ましくは、データ解析中に細胞の自己蛍光のバックグラウンドレベルを判定するための未染色試料も含まれる。アイソタイプコントロールおよびＦＭＯコントロールは、完全なプロトコールを経て進行しないので、試料あたり１×１０６細胞のみを必要とし得る。表２は、ＣＬＬの場合の１２番染色体のコピー数の評価のための試料およびコントロールの設定を示す。
【０１２３】
【表２】
2021501885.tif 000003
ＡＦ６４７−アレクサフルオル６４７フルオロフォア、ＢＢ５１５−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  ５１５フルオロフォア、ＣＬＬ−慢性リンパ球性白血病、ＰＢＭＣ−末梢血単核球、ＣＥＰ−染色体計数プローブ、ＦＭＯ−フルオレセンス・マイナス・ワン
【０１２４】
本発明の１つの例示的な形態において、細胞のマーカーの抗体染色工程（免疫表現型検査）は、
ａ．以下を含む免疫表現型検査抗体カクテルで有核細胞を染色する工程：
ｉ．ＣＬＬ評価のためのＡＦ６４７抱合マウス抗ヒトＣＤ３（クローンＳＫ７，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＢ５１５抱合ＣＤ５（クローンＵＣＨＴＣ２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＶ４８０抱合マウス抗ヒトＣＤ１９（クローンＳＪ２５Ｃ１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（図２、表３ａ）；または
ｉｉ．ＣＬＬ評価のためのＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｖ５００ｃ抱合マウス抗ヒトＣＤ３（クローンＳＫ７，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＦ６４７抱合ＣＤ５（クローンＵＣＨＴＣ２，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、およびＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＶ４８０抱合マウス抗ヒトＣＤ１９（クローンＳＪ２５Ｃ１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（表３ａ）；または
ｉｉｉ．急性リンパ芽球性白血病評価のためのＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＢ７００抱合マウス抗ヒトＣＤ２２（クローンＨＩＢ２２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＶ４２１抱合マウス抗ヒトＣＤ３４（クローン５８１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｖ５００ｃ抱合マウス抗ヒトＣＤ４５（クローン２Ｄ１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＶ６０５抱合マウス抗ヒトＣＤ１０（クローンＨＩ１０Ａ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＦ６４７抱合ＣＤ１９（クローンＨＩＢ１９，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、およびＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ７８０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（図３、表３ｂ）；または
ｉｖ．多発性骨髄腫評価のためのＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＶ４８０抱合マウス抗ヒトＣＤ３８（クローンＨＩＴ２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｖ５００ｃ抱合マウス抗ヒトＣＤ１３８（クローンＭＩ１５，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＶ６０５抱合マウス抗ヒトＣＤ４５（クローンＨＩ３０，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＦ６４７抱合ＣＤ１９（クローンＨＩＢ１９，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、およびＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ７８０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（図４、表３ｂ）；ｏｒ
ｖ．製造者の推奨に従った適切なアイソタイプコントロール（表３）；
ｂ．５×１０６細胞を４℃で３０分間インキュベートする工程；
ｃ．細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄する工程；および
ｄ．細胞を９５０ｇで３分間遠心分離する工程
を含む。
【０１２５】
【表３】
2021501885.tif 000004
＊試験したフルオロフォアに関連するチャネルのみを列挙している。＊＊ＣＤ３クローンＳＫ７、ＣＤ５クローンＵＣＴＨＣ２、ＣＤ１９クローンＳＪ２５Ｃ１。略語：ＡＦ６４７−アレクサフルオル６４７フルオロフォア、ＢＦ−明視野、ＢＢ５１５−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  ５１５フルオロフォア、ＢＶ４８０−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４８０フルオロフォア、ＣＥＰ−染色体計数プローブ、Ｃｈ−チャネル、Ｄｅｌ−欠失、ＳＧ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＳＯ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＯＲ−ＯｒａｎｇｅＲｅｄ
【０１２６】
【表４】
2021501885.tif 000005
2021501885.tif 000006
＊試験したフルオロフォアに関連するチャネルのみを列挙している。略語：ＡＦ６４７−アレクサフルオル６４７フルオロフォア、ＡＬＬ−急性リンパ芽球性白血病、ＢＦ−明視野、ＢＢ５１５−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  ５１５フルオロフォア、ＢＢ７００−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  ７００  フルオロフォア、ＢＶ４２１−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１  フルオロフォア、ＢＶ４８０−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４８０  フルオロフォア、Ｃｈ−チャネル、Ｇ−Ｇｒｅｅｎフルオロフォア、Ｒ−Ｒｅｄフルオロフォア、ＳＧ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＳＯ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ
【０１２７】
酸変性中の細胞の抗原へのフルオロフォア抱合抗体結合の安定性を改善するために、細胞を、製造者の推奨事項にしたがって１ｍＭビス（スルホスクシンイミジル）基質（ＢＳ３）のＭｉｌｌｉＱ水溶液（アミン−アミン架橋剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））中にて４℃で３０分間インキュベートし、その後に５体積の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中にて４℃で２０分間クエンチする。
固定および透過処理
【０１２８】
本発明の１つの例示的な形態において、固定工程は、
ａ．０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む新たに調製した４％ホルムアルデヒドを細胞溶液に添加し、穏やかに吸引することによって混合すること；および
ｂ．細胞溶液を室温で１０分間インキュベートして、細胞タンパク質を固定し、細胞膜を透過処理すること
を含む。
【０１２９】
本発明の別の形態において、工程（ａ）は、１〜４．２％ホルムアルデヒド固定および０．０５〜２．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むことができ、ここで、ホルムアルデヒドの最適量は４％であり、Ｔｗｅｅｎ２０の最適量は０．０５〜０．１％である。
【０１３０】
ホルムアルデヒドは、フローサイトメトリーにおける一般的な固定液であり、これは、細胞のタンパク質を架橋し、可溶性タンパク質を細胞骨格に係留して細胞構造を保持する。ホルムアルデヒド固定は、細胞の形態を維持し、ＦＩＳＨシグナルを頑強にすることが可能である。別の形態では、アルコールを使用して、タンパク質の沈殿／変性によって細胞を固定することができ、酢酸（例えば、カルノア固定液）と組み合わせて使用することで形態およびＤＮＡの完全性をより適切に保持することができる。カルノア固定液はスライドＦＩＳＨ関連プロトコールのために日常的に使用されるが、ほとんどの市販のフルオロフォアを破損し、その結果、固定工程中に蛍光および免疫表現型検査が損なわれるので、このプロトコールで使用することができない。本発明者らは、メタノールベースの固定によって細胞が適切に固定されるが、免疫フローＦＩＳＨプロトコールにおいては、最適な結果が得られるのでメタノールを含まないホルムアルデヒドを使用したホルムアルデヒド固定が好ましいことを確認した。
【０１３１】
この工程はまた、インタクトな細胞の十分な透過処理（プローブの核に接近させる処理）を容易にする。すなわち、ホルムアルデヒドを非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０）などの原形質膜可溶化試薬と組み合わせて使用したときに細胞を透過処理することができる。しかし、フローサイトメトリーのために利用可能な様々な透過処理のキットおよびプロトコールが存在する。適用される方法は、通常、調査中の細胞型およびその後の分析に依存する（例えば、サイトカインおよび核膜タンパク質の細胞内染色）。例えば、サポニンは膜コレステロールを選択的に除去して細胞膜に穴をあけるが、多数の細胞型はサポニン活性に耐性がある。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、細胞透過処理プロトコールのために広く使用されている非イオン性界面活性物質の別の例であるが、これは、細胞膜を迅速に破壊する即効性の「強力な」界面活性剤であり、引き続くインキュベーション後の核酸蛍光解析を１０分間もの短期間に短縮することが認められている（Ａｍｉｄｚａｄｅｈ  Ｚ，Ｂｅｈｂａｈａｎｉ  ＡＢ，Ｅｒｆａｎｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ａｖｉｃｅｎｎａ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；６（１）：３８−４６）。Ｔｗｅｅｎ２０（本プロトコールで好ましい）は、より親水性の高い非イオン性界面活性剤であり、したがって、細胞膜をよりゆっくりと穏やかに透過処理する弱い乖離剤である。Ｔｗｅｅｎ２０のような弱い界面活性物質を使用することの利点は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの即効性の薬剤と比較したときに科学的純度の変動が小さいのでその作用に影響を及ぼす可能性が低く、それにより、実験中または診断研究所間で界面活性剤の異なるバッチを使用した場合により再現性の高い結果が得られるという点である。さらに、ある範囲の細胞型（例えば、末梢血球、脾細胞、およびいくつかの組織培養細胞株）にわたって細胞膜への影響が類似していることが認められており、免疫フローＦＩＳＨ解析中の細胞内での試薬によって変動が生じる可能性が低くなる。
【０１３２】
例示のプロトコールでは、本発明者らは、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を使用する。これにより、他のハイブリッド形成研究で認められるように、ＦＩＳＨプローブが細胞膜の完全性を損なうことなく細胞に侵入するのに十分な大きさの孔が細胞膜に生成される。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液はまた、細胞膜を破壊し、その後の酸変性およびハイブリッド形成中に高度に細胞喪失させる濃度よりも十分に低い濃度である。
【０１３３】
上記工程後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄する。細胞を、酸変性（次の工程）前に９５０ｇで３分間遠心分離することもできる。
【０１３４】
任意選択：試料を、固定後に、４℃で３〜５日間保存するために、胎児仔ウシ／ウシ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁することができ、その間に、試料を輸送するか、または他の試料とまとめ、その後にハイブリッド形成および解析することができる。
ＤＮＡ変性条件およびＦＩＳＨプローブハイブリッド形成条件
【０１３５】
本発明の１つの例示的な形態において、ＤＮＡを変性し、ＦＩＳＨプローブをハイブリッド形成する工程は、以下を含む：
ａ．０．５Ｍ〜１Ｍ（好ましくは、０．５Ｍ  ＨＣｌ）塩酸（３７％ＡｎａｌａＲ，ＳＧ１．１８，Ｎｏｒｍａｐｕｒ，ＶＷＲ  Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）にて室温で２０分間ＤＮＡを変性すること；
ｂ．氷冷ＰＢＳ中でクエンチすること；
ｃ．遠心分離し、細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁して非特異的プローブ結合をブロックすること；
ｄ．細胞を再度遠心分離すること；
ｅ．細胞を、０．１％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含む２×標準クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液（３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムのＭｉｌｌｉＱ水溶液（ｐＨ７）の２０×ＳＳＣストックからＭｉｌｌｉＱ水で２０倍に希釈する）に再懸濁すること；
ｆ．細胞を最大容積０．２ｍｌの回収用ＰＣＲチューブ（Ａｘｙｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に移すこと；
ｇ．９５０ｇで遠心分離すること；
ｈ．ピペットによって全ての上清を慎重に除去すること；および
ｉ．単一ＦＩＳＨプローブ解析については、ＭｉｌｌｉＱ水（２μＬ）および１μＬ  ＦＩＳＨプローブを含むハイブリッド形成緩衝液（７μＬ）に細胞を再懸濁し、または、二重ＦＩＳＨプローブ解析については、ＭｉｌｌｉＱ水（１ｕＬ）および１μＬの各ＦＩＳＨプローブ（全部で２μＬのプローブ）を含むハイブリッド形成緩衝液（７μＬ）に細胞を再懸濁すること。
【０１３６】
解析されるプローブには、Ｖｙｓｉｓ  ＣＥＰ１２−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅプローブ、Ｖｙｓｉｓ  ＣＥＰ１２−ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎプローブ、Ｖｙｓｉｓ  ＣＥＰ１−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅプローブ、およびＶｙｓｉｓ  ＣＥＰ４−ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎプローブ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）またはＶｙｓｉｓ  ＥＴＶ６−ＲＵＮＸ１転座プローブ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）（図５）またはＳｕｒｅＦＩＳＨ  １７ｐ１２  ＰＭＰ２２−ＯｒａｎｇｅＲｅｄ  ４５８ｋｂ遺伝子座特異的プローブ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が含まれ得る。
【０１３７】
適切なＣＥＰプローブを、別段の記載がない限り、５５％ホルムアミドおよび１０％硫酸デキストランを含む１×ＳＳＣであるＶｙｓｉｓ  ＣＥＰ（ＶＣＥＰ）ハイブリッド形成緩衝液または５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２×ＳＳＣのインハウスのＦＩＳＨハイブリッド形成緩衝液とインキュベートする。
【０１３８】
ハイブリッド形成前処理には、時折、特にインタクトなホールセルにおいて細胞核／クロマチンが容易に変性できるようにすることが必要である。最適な変性およびハイブリッド形成条件は、クロマチン構造の相違により、細胞のタイプごとに異なり得る（例えば、顆粒球は、リンパ球より高い温度を必要とする）。化学的処理（例えば、塩酸）または酵素処理（例えば、ペプシンまたはプロテイナーゼＫ）を、透過処理および核内のクロマチンを安定化するヒストンタンパク質の除去のために使用することができる。酸および塩基は、加熱または溶媒変性と同様に、二本鎖ＤＮＡの塩基対合に関与する水素結合も破壊する。プロテイナーゼＫは、内因性ヌクレアーゼを活性化する高活性のエンドペプチダーゼであり、例示の方法においては、固定後にヌクレアーゼ活性が低下するので、ハイブリッド形成の改善は見いだされなかった。
【０１３９】
このプロトコールの開発において、本発明者らは、ほとんどのヒストンが０．１Ｎ塩酸に可溶であるので、０．５〜１Ｍ  ＨＣｌでの末梢血有核細胞の酸処理がその後のＦＩＳＨに最適であることを確認した。このタイプのヒストン抽出は広範な核凝集が生じ、ＦＩＳＨ解析には不適切であるので、イオン強度の高い緩衝液（例えば、２Ｍ  ＮａＣｌ）でのヒストンの除去を解析しなかった。
【０１４０】
製造者は、ＦＩＳＨプローブを標的ＤＮＡに結合させるのに最短で６〜８時間を推奨し、プローブによっては一晩（１６時間）のインキュベーションが必要であった。このプロトコールでは、３７℃で８〜３０時間のハイブリッド時間を試験して、診断環境において都合がよいと考えられるインキュベーション時間の最適な範囲を判定した。バックグラウンドの非特異的プローブ結合が増加し、免疫表現型を染色する蛍光が減少するので、ハイブリッド形成時間の長期化は回避することが好ましい。非イオン性の非変性界面活性剤（Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０など）またはその化学的同等物Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０をストリンジェンシー洗浄に含めると、その後のプローブスポット数が増加する。しかし、高濃度および長時間でのインキュベーションによって免疫表現型検査のために使用される細胞表面マーカーなどの膜タンパク質が破壊され得るので、Ｉｇｅｐａｌは、低濃度（０．３％以下）で１０分未満使用することが好ましい（Ａｍｉｄｚａｄｅｈ  Ｚ，Ｂｅｈｂａｈａｎｉ  ＡＢ，Ｅｒｆａｎｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ａｖｉｃｅｎｎａ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；６（１）：３８−４６）。ＮＰ−４０（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ−ｔｙｐｅ  ＮＰ−４０）は使用しないことが好ましくは、なぜなら、この界面活性剤は親水−親油平衡（ＨＬＢ）が高く、原形質膜および核膜の両方を破壊するからである。ストリンジェンシー洗浄緩衝液に加えて、反応体積、ハイブリッド形成緩衝液中のホルムアミドおよび硫酸デキストランの濃度、ならびにタンパク質ｌｏ−ｂｉｎｄ反応チューブの使用などのハイブリッド形成条件も極めて重要である。したがって、プロトコールに記載のチューブおよび体積を使用することが好ましい。
【０１４１】
市販のＦＩＳＨプローブは、１つの試料内で複数のプローブの解析を可能にするためのある範囲の蛍光抱合体または「色」を用いて作製されている。複数のプローブを使用して、悪性疾患の亜型の細胞遺伝学的状態を判断することができる（例えば、Ｖｙｓｉｓ  ＣＬＬ  ＦＩＳＨプローブキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）は、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、およびＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａフルオロフォアを抱合した３つまでのプローブを組み合わせて、１３ｑ−、＋１２、または正常遺伝子型のＣＬＬ群と１１ｑ−または１７ｐ−予後不良群を判定する）。あるいは、処理エラーのために染色体全体が喪失されるか、不適切に探索される偽陽性の「喪失」とは対照的に、欠失プローブ（ｄｅｌ１７ｐ）を染色体計数プローブ（ＣＥＰ１７）と組み合わせて染色体上の特定の遺伝子座の欠失を確認することができる。このプロトコールは、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ抱合プローブおよびＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ抱合プローブの両方ならびに二重探索試料を正確に計数することが示されている。
【０１４２】
企業が専売するＦＩＳＨフルオロフォアが化学的に変動することは、プロトコールの強みであり、かつ限定要因でもある。伝統的に、ＦＩＳＨプローブは、高エネルギー発光範囲の波長がより短く、４５０〜５５０ｎｍである（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｙｓｉｓ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎフルオロフォア、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＯｒａｎｇｅＲｅｄフルオロフォア、およびＫｒｅａｔｅｃｈ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＢｒｉｇｈｔ４９５フルオロフォアなど）。これにより、前述の波長範囲でのプローブスポット解析によって計数に理想的な鋭く明確に画定されたスポットが得られるはずであるという点で、例示的方法に有利である。しかし、これは大部分のＰＢＭＣの内因性および処置に誘導された自己蛍光が生じる範囲でもある。より多数のフルオロフォアが結合する巨大プローブ（例えば、ＣＥＰプローブ）については、スポットの蛍光は、バックグラウンドより依然として明るいが、長さが２００ｋｂ未満のプローブ（遺伝子座特異的欠失プローブなど）の蛍光は小さく、解析ソフトウェアの検出限界を下回り得る。ＡＭＮＩＳ  ＩＳＸｍｋＩＩは、蛍光測定値を収集するために時間遅延積分を利用する。この時間遅延積分により、細胞が検出カメラの前を通過すると薄暗いシグナルが増幅されるので、本質的に細胞によって放射された全ての蛍光が回収および蓄積される（Ｏｒｔｙｎ  ＷＥ，Ｈａｌｌ  ＢＥ，Ｇｅｏｒｇｅ  ＴＣ，Ｆｒｏｓｔ  Ｋ，Ｂａｓｉｊｉ  ＤＡ，Ｐｅｒｒｙ  ＤＪ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ＣＡ，Ｃｏｄｅｒ  Ｄ，Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ＰＪ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ａ  ２００６；６９（８）：８５２−６２）。しかし、依然としてシグナル解像度には閾値が存在し、いくつかの小さな遺伝子座特異的プローブはそれを下回る可能性があり、それにより、スポットの検出および計数が不十分になる。現在開発中の装置の次世代のハードウェアの改良によってこの制限の影響が軽減されると予想されている。その一方で、所望する適用により小さなプローブが不可欠である場合、ＤＮＡプローブに適合させるために小さなＲＮＡプローブを用いて認められる蛍光プローブシグナルを増幅するプローブレポーター増幅キット（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅまたはＰｒｉｍｅＦｌｏｗなど）のリリースが検討され得る。
【０１４３】
本発明の実例では、別段の記載がない限り、ＳｕｒｅＦＩＳＨ  １７ｐ１２  ＰＭＰ２２プローブを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが提供する５０〜７５％ホルムアミドを含む５〜１０％塩化ナトリウム溶液であるＳｕｒｅＦＩＳＨ  ハイブリッド形成緩衝液（ＳＦＨＢ）とインキュベートする。この例によれば、プローブハイブリッド形成は、
ａ．細胞を７３℃〜７６℃（好ましくは、７３℃〜７４℃）に５分間加熱して、ＤＮＡを変性させ、特異的プローブのアニーリングを確実にする、加熱する工程；
ｂ．自動サーモサイクラーにおいて３７℃で１６〜３０時間（好ましくは、１６〜２０時間）ハイブリッド形成する工程；
ｃ．０．１％Ｉｇｅｐａｌを含む２×ＳＳＣから構成されるストリンジェンシー溶液で細胞を洗浄する工程；
ｄ．細胞をＣｌｅａｒｖｉｅｗ  ｌｏ−ｂｉｎｄ微量遠心管（Ｓｉｇｍａ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に移す工程、
ｅ．細胞を０．３％Ｉｇｅｐａｌ  ２−０．４×ＳＳＣ（好ましくは、０．３％Ｉｇｅｐａｌ  ０．４×ＳＳＣ）から構成されるストリンジェンシー溶液にて４２℃で５分間洗浄する工程；
ｆ．細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄する工程；および
ｇ．細胞を再懸濁し、ＳＹＴＯＸ（登録商標）ＡＡＤｖａｎｃｅｄ核ＤＮＡ染色剤（０．２μＭのＰＢＳ溶液，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて室温で３０分間染色する工程
を含む。
【０１４４】
これらの工程は、好ましくは、酸変性およびＤＮＡハイブリッド形成のための高温インキュベーションを含み、これらはフルオロフォアの性能に影響を及ぼすことが知られている。初期の免疫表現型検査パネルには、タンパク質ベースの巨大分子アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（ほとんどの免疫蛍光実験で現在使用されている最高輝度のプローブのうちの１つ）および光安定性が増強されるように化学修飾されているその類似体ＡＦ６４７が含まれていた。驚いたことに、ＡＰＣの蛍光はハイブリッド形成中に喪失し、一方で、ＡＦ６４７の蛍光は大幅に減少するが、依然として陽性細胞は非染色集団と区別可能であり、これはおそらくこの分子が受けた化学修飾に起因する。より新規の高分子色素であるＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＢＶ）およびＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＢＢ）は、プロトコールを通して最も安定していることが見いだされ、これらの色素は、蛍光がわずかに喪失するが、依然としてＡＰＣおよびＡＦ６４７より明るい蛍光を維持する。この所見は、テロメアフローＦＩＳＨ解析においてＢＶおよびＢＢフルオロフォアを用いて認められるストリンジェントな条件での熱耐性および蛍光維持能に関する公開データと一致していた。ｐ−共役ポリマーとして公知のＢＶ分子およびＢＢ分子（ＯＬＥＤおよび太陽光電池で見いだされる）は、電子の非局在化、大きな吸収波長範囲、および効率的な蛍光を可能にするｐ軌道の合成的に調整可能なネットワークを有する。しかし、有機色素分子（例えば、フィコエリトリンまたはＰＥ）と異なり、共役ポリマーの主鎖構造により、ポリマー鎖内の多数の反復単位にわたって非局在化を生じ、それにより分子吸光係数が高くなり、量子効率が上昇し、その結果おそらくＦＩＳＨ中に認められる蛍光が安定化する。これらのフルオロフォアは、４℃で長期間保存する場合の診断研究所において、また、抱合された抗体を細胞と３〜２４時間培養し、酵素切断に曝露する可能性のある共培養アッセイにおいて、抗体「カクテル」混合物中で安定であることも見いだされている。例示的な方法で十分に機能する別のフルオロフォアは、クマリン色素Ｖ５００およびＶ５００ｃ抱合物であり、これらのフルオロフォアは、例示的な方法の解析中に蛍光強度が減少するが、依然として維持される。これは、酸性度が高くなるにつれて蛍光強度が低下するが、細胞の刺激、固定、および透過処理中に蛍光強度が維持されたことが見いだされるＶ５００の安定性に関する以前に発表された研究と一致している。Ｖ５００の量子効率はＰＥまたはＢｒｉｌｌｉａｎｔポリマー色素より大いに低いが、そのサイズが小さいためにＰＥの５０倍の分子が免疫表現型検査抗体に抱合し、処理中のいくらかの蛍光の喪失が相殺され得る。細胞表面タンパク質の架橋は、タンパク質：タンパク質複合体を安定化させるために一般的に使用されている。類似の原理を使用して、本発明者らは、ＢＳ３（通常はタンパク質の外面に見いだされる第一級アミンにタンパク質を変性させることなく架橋する膜不透過性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル）を解析した。酸変性またはハイブリダイゼーション後の染色により高レベルの非特異的抗体結合が生じることが示されているの��、プロトコールの開始時に免疫表現型検査を行うことが重要である。
イメージングフローサイトメトリー
【０１４５】
ＤＮＡプローブおよびＦＩＳＨプローブのハイブリッド形成後、試料を、イメージングフローサイトメトリーを使用して解析する。好ましくは、これは、
ａ．ＩＮＳＰＩＲＥ  ｖ４．１取得ソフトウェア（Ａｍｎｉｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＵＳＡ）を備えたＡｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ  ｍａｒｋＩＩ  ＩＳＸｍｋＩＩを使用して細胞懸濁液に対してイメージングフローサイトメトリーを実施する工程
を含む。
【０１４６】
解析に適切な励起レーザーには、１００ｍＷ  ４０５ｎｍ、５０ｍＷ  ４８８ｎｍ、１５０ｍＷ  ５６１ｎｍ、１５０ｍＷ  ５９２ｎｍ、および１２０ｍＷ  ６４２ｎｍが含まれ得る。
【０１４７】
本発明の１つの例示的な形態において、細胞懸濁液に対するイメージングフローサイトメトリーは、
ａ．１．５ｍＷ  ７８５ｎｍレーザーを使用して散乱シグナルを得、内部較正用のＳｐｅｅｄＢｅａｄｓを測定すること；
ｂ．ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＶ４８０を４０５ｎｍレーザーによって励起し、４３０〜５０５ｎｍの波長範囲（Ｃｈ０７）で発光を取り込むこと；
ｃ．ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＢ５１５およびＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎを４８８ｎｍレーザーによって励起し、４８０〜５６０ｎｍの範囲（Ｃｈ０２）の発光を取り込むこと；
ｄ．ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ  ＤＮＡ染色剤を４８８ｎｍレーザーによって励起し、６６０〜７４０ｎｍの範囲（Ｃｈ０５）の発光を取り込むこと；
ｅ．Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＡＦ６４７を６４２ｎｍレーザーによって励起し、６４０〜７４５ｎｍの波長範囲（Ｃｈ１１）の発光を取り込むこと；および
ｆ．Ｖｙｓｉｓ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ抱合１２番染色体計数プローブおよびＳｕｒｅＦＩＳＨ  ｄｅｌ１７ｐ  ＰＭＰ−ＯｒａｎｇｅＲｅｄプローブを５６１ｎｍまたは５９２ｎｍレーザーによって励起し、５６０〜５９５ｎｍの範囲（Ｃｈ０３）の発光を取り込むこと
を含む。
【０１４８】
全ての画像は、６０倍の対物レンズで、焦点深度を４〜１６ミクロンに拡大するための専用の光学系および画像処理を使用する被写界深度（ＥＤＦ）画像化を使用して取り込まれる。
【０１４９】
本発明の１つの例示的な形態において、データを、
ａ．アスペクト比対明視野領域の散布図（Ｃｈ０１）中の細胞を同定し、試料あたりおよそ１０，０００〜２０，０００個の細胞を記録する工程；および
ｂ．明視野および７８５ｎｍレーザー照射が存在しない同一のレーザー設定を使用して単一染色された補正標準コントロール（例えば、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ抗マウス補正標準コントロール，Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）およびＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ染色細胞を解析し、ＩＮＳＰＩＲＥ  ｖ４．１ソフトウェア（Ａｍｎｉｓ）を使用して補正行列を計算する工程
をさらに含むイメージングフローサイトメトリーを使用して取得する。
【０１５０】
理想的には、コントロール試料あたり最低で１，０００個の補正粒子またはＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ染色細胞を記録する。
ＩＤＥＡＳ解析
【０１５１】
好ましくは、例示的なデータ解析工程は、補正データを使用したＩＤＥＡＳ  ｖ６．０画像解析ソフトウェア（Ａｍｎｉｓ）を使用して免疫フローＦＩＳＨデータ解析を実施することを含む。データ解析は、
ａ．画像中のピクセル値の大きな変化を検出することによって画像の鮮明さの品質を測定するＧｒａｄｉｅｎｔ  ＲＭＳ機能を使用して焦点画像を選択する工程であって、前述のＧｒａｄｉｅｎｔ  ＲＭＳ機能は、より焦点のあった細胞ほどＧｒａｄｉｅｎｔ  ＲＭＳ値が高くなる強度レベルのばらつきについて正規化されたピクセルの平均勾配を使用して計算される、選択する工程；
ｂ．アスペクト比対明視野領域の散布図中の単細胞を同定する工程であって、ここで、アスペクト比は、対象または細胞の短軸を長軸で割ったものであり、対象の円形または矩形の程度を示し、単一有核細胞はアスペクト比が高く、かつ領域値が低い、同定する工程；
ｃ．ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ蛍光強度ヒストグラムにおいて蛍光強度が高い細胞（分裂細胞）を排除することによって有核非分裂細胞を同定する工程；
ｄ．ＣＤ１９−ＢＶ４８０（正常Ｂリンパ球および新生物性Ｂリンパ球）、ＣＤ５−ＢＢ５１５（新生物性Ｂリンパ球および正常Ｔリンパ球）、およびＣＤ３−ＡＦ６４７（正常Ｔリンパ球）の蛍光強度に基づいて目的の集団をゲーティングする工程；
ｅ．Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｆｅａｔｕｒｅを使用してＣＥＰ１２  ＦＩＳＨプローブシグナル（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ蛍光）の核染色剤（ＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ蛍光）との共存を判定する工程であって、この機能は、２つの画像がマスクした領域内で線形に相関する程度の尺度であり、それにより、核内のＦＩＳＨプローブシグナルの類似性スコアは高い一方で、細胞膜に接着した破壊細胞由来のＤＮＡにハイブリッド形成した非特異的プローブの類似性スコアは低い、判定する工程；
ｆ．Ｓｐｏｔ  Ｃｏｕｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅを使用して、ピーク、スポット、または強度マスク（表４）を用いて細胞あたりのＣＥＰ１２  ＦＩＳＨプローブ（Ｃｈ０３）のスポット数をカウントする工程であって、ここで、Ｓｐｏｔ  Ｃｏｕｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅアルゴリズムは、ピクセルが特定のスポットまたはバックグラウンドに連結しているかどうかに基づいて各ピクセルの連結性を試験し、ブライトピークマスクオプションにより、スポット間の強度の相違と無関係に画像から明るい領域が得られ、スポット対細胞バックグラウンド比は、スポットピクセル値を明るい詳細画像における平均バックグラウンド値で割ったものである、Ｓｐｏｔ  Ｃｏｕｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅを使用する工程；および
ｇ．各スポットカウント集団についてのＦＩＳＨシグナルの蛍光強度の測定値を比較する単一パラメーターのヒストグラム（すなわち、１−スポット対２−スポット対３−スポット）によってソフトウェアによって生成されたスポットカウントをさらに定量的に検証する工程であって、ここで、蛍光強度の測定値の変化が、ハイブリッド形成プローブ数に対応し、それにより、二次元画像の投影に固有の重複シグナル（すなわち、１−スポットとして現れる２−スポット）を補正して、真の特異的ＦＩＳＨスポット数を判定し、モノソミー亜集団およびダイソミー亜集団の信頼性ある区別が可能である、検証する工程（Ｍｉｎｄｅｒｍａｎ  Ｈ，Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  Ｋ，Ａｒｃａｄｉ  ＪＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍａｇｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ａ  ２０１２；８１Ａ：７７６−７８４）、
ｈ．細胞あたりの平均スポットカウントからスポットカウント比をさらに計算する工程であって、総スポット数を、表現型亜集団サイズに対して正規化する、計算する工程（スポットカウント比＝平均スポットカウント新生物細胞／平均スポットカウント正常細胞（例えば、ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＬＬ／ＣＤ３＋Ｃ５＋Ｔ−細胞：ｄｅｌ（１７ｐ）＜２、トリソミー１２＞２比）
を含む。
【０１５２】
【表５】
2021501885.tif 000007
【０１５３】
他の適切な例示的方法において、
ａ．メタノール固定緩衝液（７０％メタノール／４％ホルムアルデヒド／５％酢酸）を、上記プロトコール中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む４％ホルムアルデヒド固定液の代わりに使用することができる。
ｂ．ハイブリッド形成のバリエーションは、０．１ｕｇ／ｍｌプロテイナーゼＫおよび以下の代替のＤＭＳＯ、ホルムアミド、または炭酸エチレンベースのハイブリッド形成緩衝液での前処理を含み得る：１５％ＤＭＳＯ、３５％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２×ＳＳＣ；５％ＤＭＳＯ、４５％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２×ＳＳＣ；５％ＤＭＳＯ、１０％硫酸デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２×ＳＳＣ；１０％ＤＭＳＯ、１０％硫酸デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２×ＳＳＣ；１５％ＤＭＳＯ、１０％硫酸デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２×ＳＳＣ；１５％ホルムアミド、１０％デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２×ＳＳＣ；１５％ホルムアミド、２０％デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、４×ＳＳＣ；５０％ホルムアミド、１０％デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２×ＳＳＣ；または１５％炭酸エチレン、２０％デキストラン、０．１％Ｔｗ２０、２×ＳＳＣ。
ｃ．代替のハイブリッド形成後の第２のストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．３％Ｉｇｅｐａｌを含む０．１×ＳＳＣ）を使用することができる。
ｄ．陽性の変動がエピトープまたはフルオロフォアの安定性に起因するかどうかを判定するために、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＢ５１５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＡＦ６４７（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）のいずれかと抱合した抗ＣＤ３抗体クローンＳＫ７、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＢ５１５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＡＦ６４７（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）のいずれかと抱合した抗ＣＤ５抗体クローンＵＣＴＨＣ２、およびＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＶ４８０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＢ５１５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＡＦ６４７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかと抱合した抗ＣＤ１９抗体クローンＨＩＢ１９を解析することができる。
ｅ．代替のＤＮＡマーカーには、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＤＲＡＱ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）が含まれ得る。
【０１５４】
以下の結果は、例示的プロトコールの開発試験および性能を考察している。特に、プロトコールを、健康なドナー末梢血有核細胞におけるセントロメア付近に存在する高度に反復配列を有するヒトサテライトＤＮＡ配列にハイブリッド形成する１番染色体計数プローブ（ＣＥＰ１）を用いて行った。
【０１５５】
結果は、本発明をさらに例示するのに役立ち、本発明を制限するものと解釈すべきではない。
例示的な結果
【０１５６】
プロトコールで試験した第１の固定液は、７０％メタノール／４％ホルムアルデヒド／５％酢酸のメタノールベースの緩衝液であり、この緩衝液は、伝統的なＦＩＳＨおよびＦＩＳＨ−ＩＳのために使用されるカルノア固定液（例えば、Ｍｉｎｄｅｒｍａｎ  Ｈ，Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  Ｋ，Ａｒｃａｄｉ  ＪＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍａｇｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ａ  ２０１２；８１Ａ：７７６−７８４に記載）と、免疫−Ｓ−ＦＩＳＨプロトコールで使用される４％ホルムアルデヒド固定液（例えば、Ｋ．Ｆｕｌｌｅｒ，Ｓ．Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｈ．Ｈｕｉ，Ａ．Ｃｈａｋｅｒａ  ａｎｄ  Ｗ．Ｅｒｂｅｒ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｉｍｍｕｎｏ−Ｓ−ＦＩＳＨ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｕｓｉｎｇ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ａ．２０１６；８９Ａ：７２０−７３０に記載）の組み合わせであった。
【０１５７】
ＣＤ３−ＢＢ５１５免疫表現型検査（図６）および健康なドナー有核細胞における染色体のセントロメア付近に存在する高度に反復配列を有するヒトサテライトＤＮＡ配列にハイブリッド形成する１番または１２番染色体計数プローブ（ＣＥＰ１またはＣＥＰ１２）を使用して実験を行った。ＦＩＳＨは、細胞あたり１〜２プローブスポットが得られると予想された。
【０１５８】
メタノール固定緩衝液を製造者（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）によって推奨されるように８０℃または７３℃のＤＮＡ変性温度で試験し、その結果、それぞれ、５３％および５９％の細胞において１〜２個のＣＥＰ１  ＦＩＳＨプローブスポットカウントが認められた（表５）。３個またはそれを超えるプローブスポットを有する細胞数の増加および細胞形態の目視検査によって判定したところ、８０℃でより高いＤＮＡ変性レベルが認められた（明視野チャネル、データ示さず）。免疫−Ｓ−ＦＩＳＨプロトコールに類似する６６℃への変性温度の低下により、たった５０％の細胞において核Ｈｏｅｃｈｓｔ染色が認められ、２％の細胞でＦＩＳＨプローブスポットが認められた。
【０１５９】
【表６】
2021501885.tif 000008
2021501885.tif 000009
2021501885.tif 000010
2021501885.tif 000011
略語：ＡＡ−酢酸、ＣＥＰ−染色体計数プローブ、ＤＳ−硫酸デキストラン、ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド、ＥＣ−炭酸エチレン、ＦＡ−ホルムアルデヒド、ＦＭ−ホルムアミド、ＨＣｌ−塩酸、ＭｅＯＨ−メタノール、ＰＫ−プロテイナーゼＫ、ＳＳＣ−クエン酸ナトリウム、ＳＯ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＶＣＥＰ−Ｖｙｓｉｓ染色体計数プローブハイブリッド形成緩衝液
＊４℃で１０分間    ＊＊室温で２０分間    ＊＊＊３７℃で１０分間    ＊＊＊＊５分間の熱変性および３７℃で１６〜２４時間のハイブリッド形成
＾ＭＦＩ計算によって未確認の１または２スポットカウント
ＡＡ−酢酸、ＣＥＰ−染色体計数プローブ、ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド、ＦＡ−ホルムアルデヒド、ＨＣｌ−塩酸、Ｍ−モル、ＭｅＯＨ−メタノール、ＳＯ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＳＳＣ−標準クエン酸ナトリウム緩衝液、Ｔｗ２０−Ｔｗｅｅｎ２０、ＶＣＥＰ−ＣＥＰプローブを含むＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒによって提供されたＶｙｓｉｓ  ＣＥＰハイブリッド形成緩衝液
【０１６０】
Ｖｙｓｉｓ  ＣＥＰ１およびＣＥＰ１２プローブが供給され、Ｖｙｓｉｓ  ＣＥＰ（ＶＣＥＰ）ハイブリッド形成緩衝液を用いて事前に解析した。ハイブリッド形成効率を増加させ（１〜２プローブスポットを有する細胞）、ゼロスポット（不十分なＤＮＡ変性）の細胞数を減少させるために、いくつかのハイブリッド形成緩衝液のバリエーションを試験した。第１に、１５％ＤＭＳＯをハイブリッド形成緩衝液に添加し、ホルムアミド濃度を３５％まで減少させると、ＤＮＡを７３℃で変性させた場合に５８％の細胞において、および６６℃の場合４８％の細胞において、細胞あたり１〜２スポットのＣＥＰ１プローブカウントが得られた（表５）。両方の温度でハイブリッド形成が改善され、ＶＣＥＰ緩衝液を使用した場合よりもＤＮＡ変性が少なかった。ＤＭＳＯ濃度の５％までの減少およびホルムアミド濃度の４５％までの増加により、７３℃のＤＮＡ変性温度で６０％の細胞において１〜２プローブスポットが得られたが、ＤＮＡ変性は２９％の細胞まで増加した。また、ハイブリッド形成効率を、ＤＭＳＯのみ（ホルムアミドなし）を含むハイブリッド形成緩衝液（Ｘ％ＤＭＳＯ、１０％デキストラン、０．１％Ｔｗ２０、２×ＳＳＣ）を使用して、７３℃および６６℃のＤＮＡ変性温度で試験した。５％ＤＭＳＯを含むハイブリッド形成緩衝液により、７３℃で２４％の細胞および６６℃で２８％の細胞、１０％ＤＭＳＯを使用すると６６℃で２６％の細胞、または１５％ＤＭＳＯを使用すると７３℃で２６％の細胞および６６℃で２０．３％の細胞において１〜２個のＣＥＰ１スポットが得られた。緩衝液へのＤＭＳＯのみの添加では、ハイブリッド形成は十分に改善されなかった。ＦＩＳＨプローブスポットカウントは、７３℃の変性温度で一貫してより高かったので、このＤＮＡ温度を、その後の染色体計数プローブ（ＣＥＰ）実験のために使用した。ハイブリッド形成に及ぼすデキストラン濃度の影響の解析により、標準濃度１０％の硫酸デキストランを含めてホルムアミド濃度を減少させても（１５％）ＤＮＡを十分に変性させられず、それにより、たった２％の細胞においてしかプローブスポットが得られないことが見いだされた。濃度を２０％まで増加させた硫酸デキストランおよび４×ＳＳＣでは、２４％の細胞において１〜２個しかＣＥＰ１プローブスポットが得られなかった。インハウスの５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２×ＳＳＣハイブリッド形成緩衝液でのハイブリッド形成前に１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）を加えて室温で５分間インキュベートすると、１〜２個のＣＥＰ１プローブスポットを有する細胞数が９４％に増加した。１Ｍ  ＨＣｌ変性およびインハウスの５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２×ＳＳＣハイブリッド形成緩衝液でのハイブリッド形成前に３７℃で５分間のプロテイナーゼＫ（０．１μｇ／ｍｌ）予備消化工程を含めることにより、１〜２個のＣＥＰ１プローブスポットを有する細胞の減少は８３％とわずかであったが（表５）、試料中の細胞がかなり喪失された（データ示さず）。ハイブリッド形成緩衝液の最終的な調整は炭酸エチレンを含めることであったが、これは、スライド上��ＦＩＳＨのハイブリッド形成時間をかなり減少させることが以前に見いだされている。試料を１Ｍ  ＨＣＬで変性させ、次いで、ＣＥＰ１  ＦＩＳＨプローブと炭酸エチレンベースの緩衝液中にて７３℃で５分間同時変性させた後、３７℃で３時間または２４時間ハイブリッド形成させた。３時間後、１〜２個のプローブスポットが４７％の細胞において可視化され、２４時間で５４％の細胞に増加した。炭酸エチレンベースの緩衝液はインハウスの５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２×ＳＳＣハイブリッド形成緩衝液と比較してハイブリッド形成が改善されなかったので、さらなる実験では使用しなかった。
【０１６１】
プロトコールを、免疫−Ｓ−ＦＩＳＨプロトコール（Ｋ．Ｆｕｌｌｅｒ，Ｓ．Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｈ．Ｈｕｉ，Ａ．Ｃｈａｋｅｒａ  ａｎｄ  Ｗ．Ｅｒｂｅｒ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｉｍｍｕｎｏ−Ｓ−ＦＩＳＨ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｕｓｉｎｇ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ａ．２０１６；８９Ａ：７２０−７３０に記載）で用いる個別の固定液に基づいた４％ホルムアルデヒドを含む０．１％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液および透過処理緩衝液を使用して試験した。４％ホルムアルデヒド／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液は、細胞膜を損なうことない核の明るいＤＲＡＱ７染色（データ示さず）によって証明されるように細胞を十分に透過処理し、それにより、その後の処理中に細胞が喪失した（図７）。ＦＩＳＨのためにＤＮＡを十分に変性させるためには、４％ホルムアルデヒド／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液を１Ｍ塩酸と２０分間インキュベートすることが必要であり、それにより、８２％の細胞において１〜２個のＣＥＰ１プローブスポットが得られ、ＤＮＡ変性が減少した（表６）。製造者が推奨するおよそ７３℃の変性温度を６６℃（免疫−Ｓ−ＦＩＳＨプロトコールに類似）に低下させるとプローブハイブリッド形成が喪失し、このことは、１Ｍ  ＨＣｌ処置のみではＦＩＳＨ解析のためにＤＮＡを適切に変性させるのに不十分であることを示していた。ホルムアルデヒド固定およびＴｗｅｅｎ２０透過処理を、個別の工程および組み合わせた工程として試験して、ハイブリッド形成効率に及ぼす影響を判定した。４％ホルムアルデヒドと５分間インキュベートした後に０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と１０分間インキュベートした試料は、８７％の細胞において１〜２個のＣＥＰ１プローブスポットが実証され、４％ホルムアルデヒドと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液と組み合わせ、１０分間インキュベートすると、１〜２プローブショットカウントが９０％の細胞まで増加した（表６）。Ｔｗｅｅｎ２０透過処理を用いずに４％ホルムアルデヒドで固定すると、１〜２個のプローブスポットが８２％の細胞まで減少した。４％ホルムアルデヒドの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液との組み合わせは、「１工程」固定／透過処理に最適と見なされ、その後の実験で使用した。
【０１６２】
【表７】
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＊ＭＦＩによって１または２スポットに調整されない１−スポットカウント
ＣＥＰ−染色体計数プローブ、ＦＡ−ホルムアルデヒド、ＨＣｌ−塩酸、Ｍ−モル、ＳＧ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＳＯ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、Ｔｗ２０−Ｔｗｅｅｎ２０、ＶＣＥＰ−ＣＥＰプローブを含むＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒによって提供されたＶｙｓｉｓ  ＣＥＰハイブリッド形成緩衝液
【０１６３】
１Ｍ  ＨＣｌのインキュベーションを追加するとＤＮＡ変性およびその後のＦＩＳＨスポットカウントが増加したので、様々な濃度のＨＣｌもプロトコールで試験した。２Ｍまたは４Ｍに濃度を増加すると、１〜２個のＣＥＰ１プローブスポットを有する細胞が、それぞれ、６７％および３％に減少した。さらに、試料中の細胞の総数が減少し（データ示さず）、０〜１個または３＋個のスポットを有する細胞数が増加し、これは、ＤＮＡ変性度がより高いこと、および試料中の溶解／破損細胞由来の無細胞ＤＮＡを示す（表６）。ＨＣＬ酸濃度を０．５Ｍに減少させても、１Ｍ溶液（８２％）と比較して１〜２プローブスポットカウント（７９％）にあまり影響を及ぼさなかったが、試料中の全体的な細胞喪失は減少した（データ示さず）。０．５Ｍ  ＨＣｌ酸変性は、固定に最適と見なされ、その後の実験で実験した。
【０１６４】
市販のＦＩＳＨプローブは、ある範囲の蛍光抱合体を用いて作製されていた。ドナーおよびＣＬＬ患者の細胞を２つのアリコートに分割し、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（ＳＯ）またはＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（ＳＧ）と抱合したＶｙｓｉｓ  ＣＥＰ１２プローブとハイブリッド形成させて、各々の一対にした試料組内のスポットカウントが類似することを確認した（図８、表６）。さらに、細胞をＣＥＰ１−ＳＯプローブおよびＣＥＰ１２−ＳＧプローブで二重に探索して、多プローブ解析のためにプロトコールを使用することができることが確認された（図９）。
【０１６５】
計数に加えて、ＦＩＳＨプローブは、しばしば、１７番染色体の短腕に見いだされる腫瘍抑制遺伝子ｐ５３などの重要な遺伝子の喪失を検出するように設計される。これらの遺伝子座特異的プローブは、通常、セントロメアプローブより小さく、それにより、蛍光抱合体の存在量が少ないので、シグナルが「薄暗い」。ＣＬＬ試料を、ＳｕｒｅＦＩＳＨ（ＳＦ）ｄｅｌ１７ｐ  ＰＭＰ遺伝子座特異的（４５８ｋｂ）プローブを用いて解析して、より小さなＦＩＳＨプローブを用いた計数が正確であることを確認した（表７）。ＣＥＰプローブのために最適化されたプロトコールを用いて調製したＳＦ  ｄｅｌ１７ｐプローブを用いた７３℃で変性させた健康なコントロール試料において、５９％の細胞が１〜２個のプローブスポットを実証したが、２４％にプローブスポットは認められず、これは、不十分なハイブリッド形成（不正確な変性温度）または小さなプローブによる薄暗いシグナルに起因し得る。変性温度を７４、７６、または７８℃へ上昇させるとプローブスポットの無い細胞数が２％未満に減少したが、３個またはそれを超えるスポットを有する細胞数も６３〜６６％に増加した。変性温度７４℃を次の実験のために使用した。第２のハイブリッド形成後洗浄ストリンジェンシーを、０．３％Ｉｇｅｐａｌを含む０．１×ＳＳＣ緩衝液に上昇させると３個またはそれを超えるスポットを有する細胞数が４０％に低下した（表７）。１〜２個のプローブスポットを有する細胞数は依然として４９％でしかなかったので、ハイブリッド形成時間を３０時間まで増加させると、１〜２個のプローブスポットを有する細胞数が５６％にわずかに増加し、ゼロスポットを有する細胞数が１２％に減少し、３個またはそれを超えるスポットを有する細胞が３２％に減少した（図１０）。１７ｐの欠失が確認された患者のＳＦ  ｄｅｌ１７ｐプローブ計数解析はＣＥＰプローブ計数解析ほど効率的ではないが、Ｂ  ＣＬＬ細胞集団と正常なＴ  細胞集団の相違を判断することができた（図１０、表６）。ハイブリッド形成緩衝液およびストリンジェンシー緩衝液に対するさらなる調整により、３個またはそれを超えるプローブスポットを有する細胞数が減少し得るが、ゼロまたは単一プローブスポットを有する細胞の視覚的解析により、計数ソフトウェアが薄暗いプローブシグナルに起因してこれらを正確に分解するほど十分に頑強ではないことが見いだされた（データ示さず）。
【０１６６】
【表８】
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＊ＭＦＩによって１または２スポットに調整されない１−スポットカウント
ＦＡ−ホルムアルデヒド、ＨＣｌ−塩酸、Ｉｇｅｐａｌ−Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、Ｍ−モル、Ｔｗ２０−Ｔｗｅｅｎ２０、ＳＦＨＢ−１７ｐ欠失プローブを含むＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供されたＳｕｒｅＦＩＳＨハイブリッド形成緩衝液、ＳＳＣ−標準クエン酸ナトリウム緩衝液
【０１６７】
ハイブリッド形成後ストリンジェンシーおよびＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ共存と無関係に、Ｓｐｏｔ  Ｃｏｕｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅは、依然として、「スポット」カウント１を有する細胞の比率（１５〜２０％）を報告した（図１１）。Ｍｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．に従った１−スポット集団についての蛍光強度解析により、ＣＥＰ１プローブおよびＣＥＰ１２プローブについて、１−スポットカウントのＭＦＩは２−スポット集団と同一であることが見いだされ、このことは、真の単一のスポットのＭＦＩが二重スポットの半分であるので、２個のスポットが重複していることを示している（図１２）。プローブスポットが重複している細胞の数を判定するためのＳＹＴＯＸ  ＡＡＤｖａｎｃｅｄ共存基準（図１１）に基づいた３＋スポットを有する細胞の排除および１−スポット蛍光強度の解析により、健康なドナー細胞の９５％超の細胞において調整された２−スポットカウントが得られた。
【０１６８】
免疫表現型検査のフルオロフォアに及ぼす酸変性および高温（７３℃）の影響を判定するために、健康なドナーおよびＣＬＬ患者の有核細胞試料を、最適化したプロトコールにしたがって処理し、アリコートを、細胞の抗体染色後、固定および透過処理後、酸変性後、およびハイブリッド形成後のＡＭＮＩＳ  ＩＳＸｍｋＩＩの解析のために取り出した。これらは、ある範囲のフルオロフォアと抱合したＣＤ３（クローン：ＳＫ７）、ＣＤ４（クローンＳＫ３）、ＣＤ５（クローン：ＵＣＨＴＣ２）、およびＣＤ１９（クローン：ＨＩＢ１９）を含んでいた（表８）。
【０１６９】
【表９】
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＊蛍光強度は減少したが、陽性細胞を、依然として未染色集団と区別することができた。＾ＣＤ３クローンＳＫ７、ＣＤ４クローンＳＫ３、ＣＤ５クローンＵＣＴＨＣ２、ＣＤ１９クローンＨＩＢ１９およびＳＪ２５Ｃ。略語：ＡＦ−アレクサフルオル、ＡＰＣ−アロフィコシアニン、ＢＢ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ、ＢＶ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ、ＦＩＴＣ−フルオレセインイソチオシアナート、ＰＥ−フィコエリトリンフルオロフォア。
【０１７０】
ＢＢ５１５、ＢＢ７００、ＢＶ４２１、ＢＶ４８０、ＢＶ５１０、Ｖ５００ｃ、ＡＦ６４７、およびＡＦ７００について、３７℃で一晩のハイブリッド形成後に抗体結合が保存されたが、フルオロフォアの蛍光強度は減少した（図１３）。ＰＥ、ＡＰＣと抱合した抗体、またはこれらのタンデム抱合体は、処理中に蛍光を喪失した（図１４）。フルオロフォアの蛍光強度は、陽性染色された集団と陰性染色された集団との「輝度」および解像度によって判定したところ、ビス（スルホスクシンイミジル）基質（ＢＳ３）（非切断性、膜不透過性、水溶性のアミン反応性架橋剤）との架橋によって保存された（図１５）。２つの免疫表現型検査パネルを解析すると、パネルデザインは柔軟であり、その後の他の血液学的悪性疾患のためのプローブの選択に使用した。正常な血球およびＣＬＬ細胞を、両方のパネルを用いて解析し、ＣＤ３、ＣＤ５、およびＣＤ１９集団の染色プロフィールが類似することが見いだされた（図１６）。
【０１７１】
実施例２：免疫フローＦＩＳＨの先行技術のテクノロジーとの比較
表９に示した以下の実施例は、免疫フローＦＩＳＨテクノロジーを免疫−Ｓ−ＦＩＳＨテクノロジーと比較している。一方で、表１０は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）調製物の解析についての広範な作業範囲およびその方法論において非常に好ましい最適条件を提供している。
【０１７２】
【表１０】
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略語：ＡＬＬ−急性リンパ球性白血病、ＢＳ３−ビス（スルホスクシンイミジル）基質、ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン、Ｃｈ−チャネル、ＣＥＰ−染色体計数プローブ、ＣＬＬ−慢性リンパ球性白血病、ｄｅｌ（１７ｐ）−１７番染色体短腕の欠失、ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド、ＤＲＡＱ７−ディープレッドアントラキノン７、ＥＤＦ−被写界深度、ＦＩＳＨ−蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、ＦＢＳ−胎児ウシ血清、ＨＣｌ−塩酸、ｈｒｓ−時間、ＩＦＣ−イメージングフローサイトメトリー、ＩＳＸ  ＭＫＩＩ−ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ  ＭａｒｋＩＩ、ｍｉｎｓ−分間、ＭＭ−多発性骨髄腫、ＯＲ−ＯｒａｎｇｅＲｅｄ、ＰＢＳ−リン酸緩衝生理食塩水、ＰＭＰ−末梢ミエリンタンパク質、ＲＢＣ−赤血球、ＲＭＳ−二乗平均平方根、ＲＴ−室温、ＳＦＨＢ−ＳｕｒｅＦＩＳＨ  ハイブリッド形成緩衝液、ＳＧ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＳＯ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＳＳＣ−標準クエン酸ナトリウム、ＶＣＥＰ−Ｖｙｓｉｓ染色体計数、ＶＬＳＩ−Ｖｙｓｉｓ遺伝子座特異的識別子、７−ＡＡＤ−７−アミノアクチノマイシンＤ。
注意：プロトコールを通して試料を光から防御すべきである。
【０１７３】
【表１１】
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略語：ＡＬＬ−急性リンパ球性白血病、ＢＳ３−ビス（スルホスクシンイミジル）基質、ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン、Ｃｈ−チャネル、ＣＥＰ−染色体計数プローブ、ＣＬＬ−慢性リンパ球性白血病、ｄｅｌ（１７ｐ）−１７番染色体短腕の欠失、ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド、ＤＲＡＱ７−ディープレッドアントラキノン７、ＥＤＦ−被写界深度、ＦＩＳＨ−蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、ＦＢＳ−胎児ウシ血清、ＨＣｌ−塩酸、ｈｒｓ−時間、ＩＦＣ−イメージングフローサイトメトリー、ＩＳＸ  ＭＫＩＩ−ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ  ＭａｒｋＩＩ、ｍｉｎｓ−分間、ＭＭ−多発性骨髄腫、ＯＲ−ＯｒａｎｇｅＲｅｄ、ＰＢＳ−リン酸緩衝生理食塩水、ＰＭＰ−末梢ミエリンタンパク質、ＲＢＣ−赤血球、ＲＭＳ−二乗平均平方根、ＲＴ−室温、ＳＦＨＢ−ＳｕｒｅＦＩＳＨ  ハイブリッド形成緩衝液、ＳＧ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＳＯ−ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＳＳＣ−標準クエン酸ナトリウム、ＶＣＥＰ−Ｖｙｓｉｓ染色体計数、ＶＬＳＩ−Ｖｙｓｉｓ遺伝子座特異的識別子、７−ＡＡＤ−７−アミノアクチノマイシンＤ。
注意：プロトコールを通して試料を光から防御すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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