(57)【要約】  免疫療法のための組成物および方法が、本明細書において提供される。特に、キメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体を発現する細胞、および免疫療法（例えば、ガン免疫療法）におけるそのような細胞の使用が、本明細書において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：
ａ）ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインであって、前記細胞外抗原結合ドメインは２つのポリペプチドを含み、前記ポリペプチドの各々は可変ドメインおよび定常ドメインを含む、細胞外抗原結合ドメイン；
ｂ）前記細胞外抗原結合ドメインに作動可能に連結された単一の膜貫通ドメインおよび
ｃ）前記膜貫通ドメインに作動可能に連結された細胞内シグナル伝達ドメイン。
【請求項２】
前記２つのポリペプチドが、少なくとも２つのジスルフィド架橋によって連結され、各々の架橋が前記ポリペプチドの定常ドメインにおける２つのシステイン残基によって形成される、請求項１に記載の受容体。
【請求項３】
前記膜貫通ドメインが以下を含む、請求項１または２に記載の受容体：
ａ）配列番号５もしくは配列番号５と少なくとも９０％同一の配列；
ｂ）配列番号１２もしくは配列番号１２と少なくとも９０％同一の配列；または
ｃ）配列番号１４もしくは配列番号１４と少なくとも９０％同一の配列。
【請求項４】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが以下を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の受容体：
ａ）配列番号６もしくは配列番号６と少なくとも９０％同一の配列；
ｂ）配列番号１３もしくは配列番号１３と少なくとも９０％同一の配列；または
ｃ）配列番号１５もしくは配列番号１５と少なくとも９０％同一の配列。
【請求項５】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号６および配列番号７を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項６】
前記抗原結合ドメインが、配列番号１および配列番号２、またはその機能的フラグメントを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項７】
前記抗原結合ドメインが、腫瘍反応性Ｔ細胞受容体に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項８】
前記抗原結合ドメインが、配列番号１および配列番号２、または配列番号１および２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項９】
前記抗原結合ドメインが、配列番号１および配列番号２、または配列番号１および２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、ただし、配列番号１は３つのＣＤＲであるＤＳＶＮＮ、ＩＰＳＧＴおよびＡＶＮＡＧＮＭＬＴＦを含み、そして配列番号２または１６は３つのＣＤＲであるＭＤＨＥＮ、ＳＹＤＶＫＭおよびＡＳＳＳＧＶＴＧＥＬＦＦを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項１０】
前記抗原結合ドメインが、配列番号８および配列番号９、または配列番号８および９に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項１１】
前記抗原結合ドメインが、配列番号８および配列番号９もしくは１７、または配列番号８および９に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、ただし、配列番号８は３つのＣＤＲであるＤＲＧＳＱＳ、ＩＹＳＮＧＤおよびＡＶＮＦＧＧＧＫＬＩＦを含み、そして配列番号９は３つのＣＤＲであるＭＲＨＮＡ、ＳＮＴＡＧＴおよびＡＳＳＬＳＦＧＴＥＡＦＦを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項１２】
前記抗原結合ドメインが、配列番号３または配列番号３に対する少なくとも９８％の同一性を有する配列によって表される１つの定常ドメインを含み、ただし、４８位および９１位におけるアミノ酸残基の両方はシステイン残基であり；そして前記抗原結合ドメインが、配列番号４または配列番号４に対する９８％より高い同一性を有する配列によって表される１つの定常ドメインを含み、ただし、５７位および１３１位におけるアミノ酸残基の両方はシステイン残基である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項１３】
α鎖由来の定常ドメインおよびβ鎖由来の定常ドメインを含み；前記α鎖由来の定常ドメイン中の４８位におけるスレオニン残基がシステイン残基で置換され、そして前記β鎖由来の定常ドメイン中の５７位におけるセリン残基がシステイン残基で置換されている、請求項２に記載の受容体。
【請求項１４】
以下を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：
ａ）ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインであって、前記細胞外抗原結合ドメインは２つのポリペプチドを含み、前記ポリペプチドの各々は可変ドメインおよび定常ドメインを含み、前記２つのポリペプチドは少なくとも２つのジスルフィド架橋によって連結され、各々の架橋は前記ポリペプチドの定常ドメインにおける２つのシステイン残基によって形成される、細胞外抗原結合ドメイン；
ｂ）前記細胞外抗原結合ドメインに作動可能に連結された単一の膜貫通ドメイン；および
ｃ）前記膜貫通ドメインに作動可能に連結された細胞内シグナル伝達ドメイン。
【請求項１５】
前記膜貫通ドメインが以下を含む、請求項１４に記載の受容体：
ｄ）配列番号５もしくは配列番号５と少なくとも９０％同一の配列；
ｅ）配列番号１２もしくは配列番号１２と少なくとも９０％同一の配列；または
ｆ）配列番号１４もしくは配列番号１４と少なくとも９０％同一の配列。
【請求項１６】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが以下を含む、請求項１４または１５に記載の受容体：
ｄ）配列番号６もしくは配列番号６と少なくとも９０％同一の配列；
ｅ）配列番号１３もしくは配列番号１３と少なくとも９０％同一の配列；または
ｆ）配列番号１５もしくは配列番号１５と少なくとも９０％同一の配列。
【請求項１７】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号６および配列番号７を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項１８】
前記抗原結合ドメインが、腫瘍反応性Ｔ細胞受容体に由来する、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項１９】
前記抗原結合ドメインが、配列番号１および配列番号２、またはその機能的フラグメントを含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項２０】
前記抗原結合ドメインが、配列番号１および配列番号２、または配列番号１および２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項２１】
前記抗原結合ドメインが、配列番号１および配列番号２、または配列番号１および２に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、ただし、配列番号１は３つのＣＤＲであるＤＳＶＮＮ、ＩＰＳＧＴおよびＡＶＮＡＧＮＭＬＴＦを含み、そして配列番号２は３つのＣＤＲであるＭＤＨＥＮ、ＳＹＤＶＫＭおよびＡＳＳＳＧＶＴＧＥＬＦＦを含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項２２】
前記抗原結合ドメインが、配列番号８および配列番号９、または配列番号８および９に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項２３】
前記抗原結合ドメインが、配列番号８および配列番号９、または配列番号８および９もしくは１７に対する少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、ただし、配列番号８は３つのＣＤＲであるＤＲＧＳＱＳ、ＩＹＳＮＧＤおよびＡＶＮＦＧＧＧＫＬＩＦを含み、そして配列番号９は３つのＣＤＲであるＭＲＨＮＡ、ＳＮＴＡＧＴおよびＡＳＳＬＳＦＧＴＥＡＦＦを含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項２４】
前記抗原結合ドメインが、配列番号３または配列番号３に対する少なくとも９８％の同一性を有する配列によって表される１つの定常ドメインを含み、ただし、４８位および９１位におけるアミノ酸残基の両方はシステイン残基であり；そして前記抗原結合ドメインが、配列番号４または配列番号４に対する９８％より高い同一性を有する配列によって表される１つの定常ドメインを含み、ただし、５７位および１３１位におけるアミノ酸残基の両方はシステイン残基である、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項２５】
α鎖由来の定常ドメインおよびβ鎖由来の定常ドメインを含み、前記α鎖由来の定常ドメイン中の４８位におけるスレオニン残基がシステイン残基で置換され、そして前記β鎖由来の定常ドメイン中の５７位におけるセリン残基がシステイン残基で置換されている、請求項１４に記載の受容体。
【請求項２６】
前記受容体が、配列番号２２、２３、２４、２５および２６からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸から発現される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の受容体。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の受容体をコードする核酸。
【請求項２８】
可変ドメインおよび定常ドメインを含む２つの配列が、２Ａリボソームスキッピング配列によって分離される、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
請求項２７または２８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３０】
自細胞膜において請求項１〜２６のいずれか１項に記載の受容体を発現する細胞。
【請求項３１】
前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞およびＮＫ−９２細胞からなる群より選択される、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
自細胞膜において、抗体由来の抗原結合ドメインを介して表面エピトープを標的化する従来のＣＡＲをさらに発現する、請求項３０または３１に記載の細胞。
【請求項３３】
前記細胞が不死化細胞株である、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３４】
対象において標的細胞集団または組織に対するリンパ球媒介性免疫応答を刺激する方法であって、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の細胞の有効量を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３５】
前記標的細胞集団または組織が、ガン細胞または腫瘍である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
対象においてガンを処置する方法であって、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の細胞の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項３７】
前記リンパ球が、自己Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、不死化細胞株、およびＮＫ−９２細胞からなる群より選択される、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
対象におけるガンの処置または標的細胞集団もしくは組織に対するリンパ球媒介性免疫応答の刺激における使用のための、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３９】
治療における使用のための、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は２０１７年１０月６日に出願された米国仮出願第６２／５６８，８３７号、および２０１７年１１月８日に出願された米国仮出願第６２／５８３，０５８号の優先権および利益を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
免疫療法のための組成物および方法が、本明細書において提供される。特に、キメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体を発現する細胞、および免疫療法（例えば、ガン免疫療法）におけるそのような細胞の使用が、本明細書において提供される。
【０００３】
［発明の背景］
Ｔ細胞の力を結びつけ、そして腫瘍に対してＴ細胞を再指向させる免疫療法は、過去５年間に、非常に成功するものであることが判明しており、そしてかなりの関心を引き付けている。それは、選択された抗原受容体を用いるエフェクター細胞（主にＴ細胞およびナチュラルキラー細胞）の再指向を含む。現在までに、以下の２つの主な再指向剤が開発されている：抗体由来の抗原結合ドメインに基づくキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；および、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。抗体は、可溶性タンパク質であり、（ｉ）抗原結合ドメインを内在するタンパク質膜貫通（ＴＭ）ドメインに融合させ、そして（ｉｉ）既知のＴＣＲシグナル伝達タンパク質のシグナル伝達ドメイン、主にシグナルＩおよびＩＩに関与するパートナーのリン酸化部位を付加することによって、細胞受容体に改変される（Letourneur, F. & Klausner, T-cell and basophil activation through the cytoplasmic tail of T-cell-receptor zeta family proteins. Proc. Nat’l Acad. Sci. 88, 8905-8909 (1991)；Romeo, C. & Seed, B. Cellular immunity to HIV activated by CD4 fused to T cell or Fc receptor polypeptides. Cell 64, 1037-1046 (1991)；Irving, B. A. & Weiss, A. The cytoplasmic domain of the T cell receptor zeta chain is sufficient to couple to receptor-associated signal transduction pathways. Cell 64, 891-901 (1991)）。抗体の単鎖可変部分（ｓｃＦｖ）に連結されたドメインの組成および組み合わせは多様であり、そして最も強力な普遍的設計の明確なロードマップはこれまで描かれていない。これらのＣＡＲは、免疫シナプスを生成し、そしてエフェクター細胞機能、サイトカイン放出および標的死滅を誘発する能力を有する。血液悪性腫瘍の処置のために抗ＣＤ１９  ＣＡＲを使用した様々なチームによって生み出された驚くべき結果の後（Jensen, M. C. & Riddell, S. R. Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells. Immunol Rev 257, 127-144, doi:10.1111/imr.12139 (2014)；Brentjens, R. J. et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Sci Transl Med 5, (2013)；Kochenderfer, J. N. & Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nat Rev Clin Oncol 10, 267-276, (2013)；Kalos, M. et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med 3, 95ra73, (2011)）、これらの構築物の使用が華々しく上昇した。新たな標的が現在評価されているが、成果は、特に固形腫瘍を扱う場合、一般的なＢ細胞マーカーであるＣＤ１９について観察されるほどの成功ではなかった（Park, J. R. et al. Adoptive transfer of chimeric antigen receptor re-directed cytolytic T lymphocyte clones in patients with neuroblastoma. Mol Ther 15, 825-833, (2007)；Lamers, C. H. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with CAIX CAR-engineered T cells: clinical evaluation and management of on-target toxicity. Mol Ther 21, 904-912, (2013)；Katz, S. C. et al. Phase I Hepatic Immunotherapy for Metastases Study of Intra-Arterial Chimeric Antigen Receptor-Modified T-cell Therapy for CEA+ Liver Metastases. Clin Cancer Res 21, 3149-3159, (2015)）。
【０００４】
固形腫瘍は、Ｂ細胞悪性病変と比較して、以下のような様々な一連の課題を呈する：Ｔ細胞媒介性細胞傷害性に対する全体的により低い感受性、腫瘍型の間で異なる数々の免疫抑制機構をもたらす微小環境、およびＣＤ１９ほどに好都合な発現プロファイルを有する標的抗原の不足。目覚ましい数の標的の検討にもかかわらず、腫瘍特異的であるか、または腫瘍および「なくても済む」正常細胞型もしくは免疫攻撃からかくまわれている組織に制限される標的候補はほとんどない。この観点では、患者の安全を確実にしつつ、有効な腫瘍拒絶を達成するための確実な標的を同定することが本質的な目標である。それゆえ、ＣＡＲ療法における明白なボトルネックは、ガン特異的標的の欠如である。実際、Ｔ細胞中に導入される場合、従来のＣＡＲは、標的細胞の表面上に発現される抗原（タンパク質、糖残基）に限定される。
【０００５】
受容体の第２の型であるＴＣＲは、抗体および従来のＣＡＲのように表面抗原の検出に限定されない。むしろ、それは、ＭＨＣ分子上に提示されるペプチド、ｐＭＨＣに「取り付かれている」と定義される（Yin, L., et al., T cells and their eons-old obsession with MHC. Immunol Rev 250, 49-60, (2012)）。ヒトＭＨＣは、ＨＬＡ(ヒト白血球抗原）複合体（しばしば単にＨＬＡ）とも呼ばれる。所定の細胞によって発現される全てのタンパク質が、分解され、そしてＭＨＣ分子上に負荷され得ることを考慮すると、ＴＣＲは潜在的にプロテオーム全体を認識することができる。このことは、可能な標的に関して、従来のＣＡＲを上回る顕著な数的利点を表す。さらに、ＴＣＲは、タンパク質の変異バリアントに対して特異的に指向され、そして野生型形態を残しておくことができる（Parkhurst, M. R. et al. Isolation of T cell receptors specifically reactive with mutated tumor associated antigens from tumor infiltrating lymphocytes based on CD137 expression. Clin Cancer Res. (2016)）；従って、、ＴＣＲは、変異タンパク質を発現するガン細胞を、非変異タンパク質を発現する健常細胞と区別することができる。一方、ＴＣＲは、操作するのが複雑な分子である：ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖から構成されるヘテロ二量体であり、自力でシグナル伝達せず、免疫シナプスを作り出すための全てのコンポーネントをリクルートするために関連するひとそろいのシグナル伝達タンパク質を必要とする。さらに、形質膜におけるその局在は、その発現がＴ細胞に制限されているＣＤ３複合体に依存する。その結果、ＴＣＲベースの再指向はＴ細胞においてのみ利用可能であった。なぜなら、それは、適正なＴＣＲ刺激のために必要とされる全てのコンポーネントを所有する唯一の細胞であるからである。さらに、外因性ＴＣＲは、これらのシグナル伝達タンパク質の使用について内因性ＴＣＲと競合し得る（Ahmadi, M. et al. CD3 limits the efficacy of TCR gene therapy in vivo. Blood 118, 3528-3537, (2011)）。再指向されたＴ細胞中への第２のＴＣＲの導入についての別の問題は、混合二量体を形成し、従って新規なＴＣＲを生成する可能性である（van Loenen, M. M. et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proc. Nat’l Acad. Sci. 107, 10972-10977, (2010)；Bendle, G. M. et al. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy. Nat Med 16, 565-570, 561p following 570, (2010) ）。ＴＣＲの誤対合は、臨床の状況ではまだ観察されていないが、これを防止するために重要な数の技術革新が開発されている。両方の鎖の定常部分への余分のシステインの付加は、再指向ＴＣＲの対合を支持するための第一段階を表した（Cohen, C. J. et al. Enhanced antitumor activity of T cells engineered to express T-cell receptors with a second disulfide bond. Cancer Res 67, 3898-3903 (2007)；Kuball, J. et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood 109, 2331-2338, (2007)。別のストラテジーは、治療用ＴＣＲの定常ドメインをマウス定常ドメインで置き換えることであった（Sommermeyer, D. & Uckert, W. Minimal amino acid exchange in human TCR constant regions fosters improved function of TCR gene-modified T cells. J. Immunol. 184, 6223-6231, (2010)；Bialer, G., et al., Selected murine residues endow human TCR with enhanced tumor recognition. J. Immunol. 184, 6232-6241, (2010)）。この背後にある理論的根拠は、（ｉ）マウスＴＣＲ定常ドメインは、ヒト��常ドメインよりもヒトＣＤ３に対する高い親和性を有すこと（Cohen, C. J., et al., Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, 8878-8886, (2006)）、および（ｉｉ）異種対合が生じないであろうことをそれ自体は受け入れて、これが適正なＴＣＲ対合の機会を増加させるであろうことである。しかし、本発明者らが知る限り、マウスおよびヒト定常部分が対合しないことはいまだかつて示されていない。これらの改変は、普遍的ではないが、特定のＴＣＲのＴＣＲ発現およびシグナル伝達を向上させ得るが（Kuball et al.、前出；Sommermeyer et al.、前出；Bialer et al.、前出）、ヒトＣＤ３に対するマウスＴＣＲ定常ドメインのより高い親和性がこの向上した効果の背後にある主なメカニズムであり得ることを排除することはできない（Cohen et al.、前出）。従って、ＣＤ３の独占は、マウス化された構築物について観察されるＴＣＲ再指向を向上させる主要な要因を表しているようである。治療用構築物におけるマウスタンパク質ドメインの使用は、非ヒト化ＣＡＲについて以前に報告されたように、患者の免疫系による拒絶を導き得る（Maus, M. V. et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunol. Res. 1, 26-31 (2013)）。最後に、再指向されたＴＣＲの効力を向上させ、そして誤対合を回避するための別のストラテジーは、ＴＣＲ鎖の１つの細胞内ドメインにシグナル伝達コンポーネントを融合させることによるものであった（Govers, C. et al. TCRs genetically linked to CD28 and CD3epsilon do not mispair with endogenous TCR chains and mediate enhanced T cell persistence and anti-melanoma activity. J. Immunol. 193, 5315-5326, (2014)）。
【０００６】
Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr; 19(4): 365-374によれば、いくつかの研究室は、融合細胞内シグナル伝達ドメインを介して近位のシグナル伝達を媒介することができる単鎖、３ドメインＴＣＲ（ＶαＶβＣβ）の使用を試みた。しかし、成功はＴＣＲの低い表面発現レベルによって限定され、そして構築物は内因性ＴＣＲ鎖との誤対合の危険性を回避しない。Aggen et alは、含まれるＣβドメインのゆえに、内因性α鎖の存在下で、３ドメインＴＣＲ構築物（ＶαＶβＣβ）が、誤対合した受容体を生じることを教示している。しかし、キメラシグナル伝達ドメインを有する安定化された２ドメインＴＣＲ（ＶαＶβ）は、誤対合をすっかり回避し、そしてＴ細胞活性を媒介する。
【０００７】
従って、免疫療法のための改善された構築物および方法が必要とされている。
【０００８】
［発明の概要］
免疫療法のための組成物および方法が、本明細書において提供される。特に、キメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体を発現する細胞、および免疫療法（例えば、ガン免疫療法）におけるそのような細胞の使用が、本明細書において提供される。
【０００９】
本開示は、ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性を有する新規なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。そのようなＴＣＲ−ＣＡＲは、抗体から得られる抗原結合ドメインに依存する従来のＣＡＲより広い範囲の標的を認識し得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞によって発現され、そして標的化された細胞傷害性を伝達する。いくつかの実施形態において、各々が可変ドメインおよび定常ドメインを含む２つの配列を含む抗原結合ドメインは、種々のｓｃＦｖに対する頑強な代替物である。理論によって縛られるものではないが、抗原結合ドメインにおける２つの配列が、定常ドメインにおけるシステイン残基によって形成される１つより多いジスルフィド架橋によって連結されるときに、安定性が増加され得る。本明細書に開示される置換は、所望されないエピトープの導入の最小の危険性を有する。従来のＴＣＲは、抗体より、低い親和性で、しかし高い特異性で、その標的に結合し得ることが知られている。従って、本明細書におけるＣＡＲは、非ヒトまたはヒト化抗体フラグメントに依存するＣＡＲと比較して、所望されない免疫応答のより低い危険性で、より広範な標的範囲を提供する。さらに、抗原結合ドメインにおける２つの配列が、２Ａリボソームスキッピング配列によって分離される場合、等モル産生が達成され得、そしてその所望される二量体化に寄与し得る。ＣＡＲにおける単一の膜貫通ドメインの使用によって、誤対合が回避される。本明細書に記載のＣＡＲは、機能性であり、そして内在性ＴＣＲシグナル伝達機構（例えば、ＣＤ３複合体）と独立して作用し得る。このことは、完全長ＴＣＲの古典的な過剰発現を上回る大きな利点を表す。なぜなら、このことはまた、ＣＡＲがＴ細胞以外の細胞において機能性であることを意味するからである。留意すべきことに、いくつかの実施形態において、本明細書におけるＣＡＲは、抗体由来の抗原結合ドメインを介して表面エピトープを標的化する従来のＣＡＲとの組み合わせで特に価値がある。例えば、いくつかの実施形態において、表面抗原を隠すことによって腫瘍細胞が従来のＣＡＲ療法に対する耐性を発達させる場合、ＴＣＲ−ＣＡＲはなお腫瘍細胞を標的化する能力を有することが意図される。いくつかの実施形態において、そのような組み合わせは、ＴＣＲ−ＣＡＲおよび従来の抗体ベースのＣＡＲの両方を発現する免疫エフェクター細胞を利用する。いくつかの実施形態において、併用療法は、ＴＣＲ−ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞および従来の抗体ベースのＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物、および、従来の抗体ベースのＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物の投与の前、投与と同時または投与の後の、ＴＣＲ−ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を含むそのような医薬組成物の投与を含む。
【００１０】
１つの実施形態において、ａ）ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性を有する細胞外抗原結合ドメイン（例えば、腫瘍反応性ＴＣＲから得られる）；ｂ）膜貫通ドメイン、ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体が提供され；ここで、抗原結合ドメインは２つの配列（ポリペプチド）を含み、その各々は可変ドメインおよび定常ドメインを含み；抗原結合ドメインは単一の膜貫通ドメインに連結される。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインにおける２つのポリペプチドは、定常ドメインにおけるシステイン残基によって形成される少なくとも１つのジスルフィド架橋によって連結される。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインにおける２つのポリペプチドは、定常ドメインにおけるシステイン残基によって形成される１つより多いジスルフィド架橋によって連結される。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインにおける２つのポリペプチドは、各々が定常ドメインにおける２つのシステイン残基によって形成される２つのジスルフィド架橋によって連結される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号５または当該配列と少なくとも９０％同一の配列（例えば、いかなる差異も保存的置換の形態にあるという条件で）を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６または当該配列と少なくとも９０％同一の配列（例えば、いかなる差異も保存的置換の形態にあるという条件で）を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６および配列番号７を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１および配列番号２もしくは１６、またはその機能的フラグメントを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１および配列番号２もしくは１６、またはその少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１および配列番号２もしくは１６、またはその少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなり、ただし、配列番号１は３つのＣＤＲであるＤＳＶＮＮ、ＩＰＳＧＴおよびＡＶＮＡＧＮＭＬＴＦを含み、そして配列番号２もしくは１６は３つのＣＤＲであるＭＤＨＥＮ、ＳＹＤＶＫＭおよびＡＳＳＳＧＶＴＧＥＬＦＦを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号８および配列番号９もしくは１７、またはその機能的フラグメントを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号８および配列番号９もしくは１７、またはその少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号８および配列番号９もしくは１７、またはその少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなり、ただし、配列番号８は３つのＣＤＲであるＤＲＧＳＱＳ、ＩＹＳＮＧＤおよびＡＶＮＦＧＧＧＫＬＩＦを含み、そして配列番号９もしくは１７は３つのＣＤＲであるＭＲＨＮＡ、ＳＮＴＡＧＴおよびＡＳＳＬＳＦＧＴＥＡＦＦを含む。
【００１１】
特定の実施形態において、ａ）ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性を有する細胞外抗原結合ドメイン；ｂ）膜貫通ドメイン；ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体が提供され；ここで、抗原結合ドメインは２つの配列を含み、その各々は可変ドメインおよび定常ドメインを含み；抗原結合ドメインは単一の膜貫通ドメインに連結され；そして抗原結合ドメインは、α鎖由来の１つの定常ドメインおよびβ鎖由来の１つの定常ドメインを含む。
【００１２】
１つの実施形態において、ａ）ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性を有する細胞外抗原結合ドメイン；ｂ）膜貫通ドメイン、ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体が提供され；ここで、抗原結合ドメインは２つのポリペプチドを含み、その各々は可変ドメインおよび定常ドメインを含み、抗原結合ドメインにおける２つのポリペプチドは、各々が定常ドメインにおける２つのシステイン残基によって形成される２つのジスルフィド架橋によって連結され；抗原結合ドメインは単一の膜貫通ドメインに連結される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ａ）ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性を有する細胞外抗原結合ドメイン；ｂ）膜貫通ドメイン；ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体が提供され；ここで、抗原結合ドメインは２つの配列を含み、その各々は可変ドメインおよび定常ドメインを含み；抗原結合ドメインは単一の膜貫通ドメインに連結され；そして抗原結合ドメインは配列番号３によって表される１つの定常ドメインおよび配列番号４によって表される１つの定常ドメインを含む。
【００１４】
１つの実施形態において、ａ）ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性を有する細胞外抗原結合ドメイン；ｂ）膜貫通ドメイン；ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体が提供され；ここで、抗原結合ドメインは２つの配列を含み、その各々は可変ドメインおよび定常ドメインを含み；抗原結合ドメインは単一の膜貫通ドメインに連結され；そして抗原結合ドメインは、配列番号３またはそれに対する９８％より高い同一性を有する配列によって表される１つの定常ドメインを含み、ただし、４８位および９１位におけるアミノ酸残基の両方はシステイン残基であり、そして抗原結合ドメインは、配列番号４またはそれに対する９８％より高い同一性を有する配列によって表される１つの定常ドメインを含み、ただし、５７位および１３１位におけるアミノ酸残基の両方はシステイン残基である。
【００１５】
１つの例示的な実施形態において、ａ）ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性を有する細胞外抗原結合ドメイン；ｂ）膜貫通ドメイン；ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体が提供され；ここで、抗原結合ドメインは２つの配列を含み、その各々は可変ドメインおよび定常ドメインを含み；抗原結合ドメインは単一の膜貫通ドメインに連結され；そして抗原結合ドメインは、配列番号３またはそれに対する９８％より高い同一性を有する配列によって表される１つの定常ドメインを含み、ただし、４８位におけるアミノ酸残基はシステイン残基であり、そして抗原結合ドメインは、配列番号４またはそれに対する９８％より高い同一性を有する配列によって表される１つの定常ドメインを含み、ただし、５７位におけるアミノ酸残基はシステイン残基である。
【００１６】
さらなる実施形態において、ａ）ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性を有する細胞外抗原結合ドメイン；ｂ）膜貫通ドメイン；ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体が提供され；ここで、抗原結合ドメインは単一の膜貫通ドメインに連結され；抗原結合ドメインはα鎖由来の定常ドメインおよびβ鎖由来の定常ドメインを含み；α鎖由来の定常ドメイン中の４８位におけるスレオニン残基はシステイン残基で置換され、そしてβ鎖由来の定常ドメイン中の５７位におけるセリン残基はシステイン残基で置換されている。
【００１７】
さらなる実施形態において、本明細書に記載の受容体をコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態において、可変ドメインおよび定常ドメインを含む２つの配列は、２Ａリボソームスキッピング配列によって分離される。特に、配列番号１および配列番号２もしくは１６は２Ａリボソームスキッピング配列によって分離され得、または配列番号８および配列番号９もしくは１７は２Ａリボソームスキッピング配列によって分離され得る。
【００１８】
さらに他の実施形態において、自細胞膜において第一の実施形態による受容体を発現する細胞が提供される。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、不死化細胞株または別の細胞型（例えば、免疫系に関連しない細胞）である。いくつかの実施形態において、細胞はＮＫ−９２細胞である。
【００１９】
また、対象において標的細胞集団または組織に対するリンパ球（例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞）媒介性免疫応答を刺激する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載の細胞の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞集団または組織は、ガン細胞または腫瘍である。
【００２０】
さらに、対象においてガンを処置する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載の細胞の有効量を哺乳動物に投与することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は自己Ｔ細胞である。
【００２１】
また、対象において標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための本明細書に記載の細胞の使用が本明細書において提供される。
【００２２】
さらに他の実施形態は、対象においてガンを処置するための本明細書に記載の細胞の使用を提供する。
【００２３】
他の実施形態は、対象におけるガンの処置または標的細胞集団もしくは組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答の刺激における使用のための、本明細書に記載の細胞または細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
さらなる実施形態は本明細書に記載される。
【００２５】
［図面の簡単な説明］
図１。ＴＣＲ−ＣＡＲ構築物の設計。（ａ）ＴＣＲ−ＣＡＲ遺伝子設計。ＴＣＲαおよびβ鎖を、それらの膜貫通領域（ＴＭ）またはドメインのレベルで短縮化し、システインをそれらの定常ドメインに付加し、そして２つの鎖を２Ａペプチド配列によって連結した。（ｂ）ｓＴＣＲは、可溶性タンパク質として産生され、これはおそらく、小胞分泌経路に従って、細胞媒質中に放出された（左）。適正な折り畳みは、ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体への特異的結合およびＣＤ２８−ＣＤ３シグナル伝達テイルを介したシグナル伝達を確実にするはずである（右）。
【００２６】
図２。ＴＣＲ−ＣＡＲの膜発現。（ａ）ＤＭＦ５  ＴＣＲおよびＴＣＲ−ＣＡＲをＪ７６細胞株において発現させた。（ｂ）（ａ）と同じであるが、Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ（平坦線）およびＴＣＲ−ＣＡＲ（点線）を発現させ、そしてＪ７６細胞を抗Ｖｂ３抗体（Ｖｂ）を用いて染色した。（ｃ）ＡおよびＢにおけるような細胞を抗ＣＤ３抗体を用いて染色した。
【００２７】
図３。ＴＣＲ−ＣＡＲの機能活性。（ａ）健常ドナーから単離された初代末梢Ｔ細胞を、モックエレクトロポレーションするか、またはＲａｄｉｕｍ−１もしくはＤＭＦ５構築物をコードするｍＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。（ｂ）同じ細胞を、１８時間後に、示されるペプチドを負荷したＡＰＣと５時間共インキュベートした（灰色＝ペプチドなし、白色＝ＴＧＦｂＲ２ペプチドおよび黒色＝ＭＡＲＴ−１ペプチド）。（ｃ）（ｂ）と同じであるが、ここではＲａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ−ＣＡＲを完全長Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲと比較した。ＤＭＦ５を、Ｍ１負荷についての対照として含めた。（ｄ）ＤＭＦ５（黒色）またはＲａｄｉｕｍ−１（灰色）ＴＣＲ−ＣＡＲおよび完全長構築物を発現するＴ細胞を、ＣＤ８集団における示されるサイトカインの応答について分析した。（ｅ）（ｄ）と同じであるが、ここで、示されるペプチドを負荷した標的細胞の特異的溶解を分析した。
【００２８】
図４。ＴＣＲ−ＣＡＲは、ＮＫ−９２細胞を再指向させることができる。（ａ）ＮＫ−９２細胞を、トランスフェクトしないか（灰色）またはＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲを用いてトランスフェクトした。（ｂ）同族ペプチドを負荷したか（＋）または負荷していない（−）Ｇｒａｎｔａ−５１９での、プレーンのＮＫ−９２細胞（白色）またはＴＣＲ−ＣＡＲ構築物を用いてトランスフェクトしたもの（ＤＭＦ５、黒色、およびＲａｄｉｕｍ−１、灰色）の刺激を、１：２のＥ：Ｔ比で６時間行った。（ｃ）ＢＬＩ細胞傷害性アッセイにおける、異なるＥ：Ｔ比での、プレーンのＮＫ−９２（丸）またはＴＣＲ−ＣＡＲを発現するＮＫ−９２（四角）による、示されるペプチド（ＭＡＲＴ−１ペプチド、黒色、ＴＧＦｂＲ２ペプチド、白色、ペプチドなし、灰色）を負荷した標的細胞の特異的溶解。
【００２９】
図５。Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲおよびＴＣＲ−ＣＡＲの発現分析。Ｊ７６およびＮＫ−９２細胞を、水（灰色）、Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ  ｍＲＮＡ（実線）またはＲａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ−ＣＡＲ  ｍＲＮＡ（破線）を用いてエレクトロポレーションした。
【００３０】
図６。（上）は、その最も重要なドメインを含む天然に生じるαβＴＣＲの構造（縮尺率を示すものではない）を示す。図６（下）は、本明細書における２つの実験によるＴＣＲ−ＣＡＲの構造（縮尺率を示すものではない）を視覚化している。
【００３１】
図７は、いかにして配列番号３によって表されるα鎖の定常ドメインが、配列番号４によって表されるβ鎖の定常ドメインに連結され得るかを示す。
【００３２】
図８は、例示的なＣＡＲ構築物の配列を示す。
【００３３】
［定義］
本明細書において使用する場合、用語「腫瘍反応性ＴＣＲ」は、腫瘍またはガン細胞に対する特異的親和性を有し、そして非ガン細胞に対する低い親和性を有するかまたは非ガン細胞に対する親和性を有しない任意のＴＣＲを指す。いくつかの実施形態において、腫瘍反応性ＴＣＲ由来の抗原結合ドメインは、「ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性」を有する。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性」は、分子および／または細胞の不均一な集団の存在下での、標的との測定可能でありそして再現性のある相互作用を指す。ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性を有する抗原結合ドメインは、それが他の標的に結合するよりも、大きな親和性、結合活性で、容易に、そして／または長い持続期間でその標的に結合する。特に、ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性を有する抗原結合ドメインは、生理的条件下で他の標的の低い結合を有する。特に、ペプチドを提示するＨＬＡ複合体に対する特異的親和性を有するＣＡＲを発現するＴ細胞は、生理的条件下でペプチドが負荷されたＨＬＡ複合体（例えば、ペプチドを提示するＨＬＡ複合体）を発現する細胞の有意な死滅を提供し得るが、他の細胞（例えば、標的ペプチドなしのＨＬＡ複合体を発現する細胞）の低い死滅を提供し得る。本明細書において使用する場合、「生理的条件」は、ヒト細胞の成長、増殖、繁殖および／または機能に適切な任意のインビトロまたはインビボの条件を意味する（例えば、３７℃の中性水性緩衝液）。
【００３５】
本明細書において使用する場合、「膜貫通ドメイン」は、免疫エフェクター細胞によって発現されるときに、一般に細胞膜中に包埋されているＣＡＲの部分を指す。本発明は、特定の膜貫通ドメインに限定されない。いくつかの適切な膜貫通ドメインが利用され得る。膜貫通ドメインは、１回または複数回、膜を貫通し得る。従って、抗原結合ドメインが単一の膜貫通ドメインに連結される場合、抗原結合ドメインにおける２つの配列のうち１つのみ（すなわち、２つのペプチド鎖のうち１つのみ）が膜貫通ドメインに連結されることを意味する。いくつかの例示的な実施形態において、膜貫通ドメインは、β鎖由来の定常ドメインのＣ末端に連結される。
【００３６】
本明細書において使用する場合、「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、ＣＡＲが免疫エフェクター細胞の細胞膜において発現されるときに、免疫エフェクター細胞の内部に位置するＣＡＲの部分を指す。このドメインは、標的の結合に際してシグナルを伝達することに関与する。シグナルは、活性化、サイトカイン産生、増殖および／または細胞傷害活性に寄与し得る。本発明は、特定の細胞内シグナル伝達ドメインに限定されない。例としては、限定するものではないが、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳなど由来のシグナル伝達ドメイン、またはそのようなドメインの機能的バリアント／フラグメントが挙げられる。
【００３７】
本明細書において使用する場合、「細胞外ドメイン」は、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）の細胞膜において発現されるときに、細胞外環境に面するＣＡＲの部分を指す。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、天然に生じるＴＣＲまたは合成ＴＣＲ（例えば、腫瘍反応性ＴＣＲ）から得ることができる抗原結合ドメインを含む。特に、抗原結合ドメインは、「可溶性ＴＣＲ」構築物（ｓＴＣＲ）を含み得る。特に、抗原結合ドメインは、「可溶性ＴＣＲ」（ｓＴＣＲ）からなり得る（例えば、α鎖由来の１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメイン、ならびにβ鎖由来の１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインを含むヘテロ二量体）。
【００３８】
本明細書において使用する場合、「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されているＴ細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されるサイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能に関連し得る。用語「活性化Ｔ細胞」は、とりわけ、細胞分裂を経ているＴ細胞を指す。
【００３９】
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然供給源に由来するかまたは組換え供給源に由来するインタクトな免疫グロブリンであり得、そしてインタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は、代表的には、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに単鎖抗体およびヒト化抗体を含む種々の形態で存在し得る（Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.；Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。
【００４０】
用語「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分を指し、そしてインタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例としては、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、線形抗体、ｓｃＦｖ抗体、および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が挙げられる。
【００４１】
本明細書において使用する場合、「抗体重鎖」は、その天然に生じる立体構造にある全ての抗体分子中に存在する２つの型のポリペプチド鎖の大きい方を指す。
【００４２】
本明細書において使用する場合、「抗体軽鎖」は、その天然に生じる立体構造にある全ての抗体分子中に存在する２つの型のポリペプチド鎖の小さい方を指す。κおよびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【００４３】
本明細書において使用する場合、用語「合成抗体」によって、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体（例えば、本明細書に記載のようにバクテリオファージによって発現される抗体）が意味される。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成された抗体を意味すると解釈されるべきであり、このＤＮＡ分子は、抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当該分野において利用可能であり、そしてよく知られている合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られている。
【００４４】
本明細書において使用する場合、用語「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特異的免疫適格性細胞の活性化のいずれか、またはその両方が関与し得る。当業者は、本質的に全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として作用し得ることを理解する。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、それゆえ、本明細書においてこの用語が使用される場合の「抗原」をコードすることを理解する。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によって単独でコードされる必要がないことを理解する。本発明が、限定するものではないが、１つより多い遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列が種々の組み合わせで配置されて、所望される免疫応答を惹起することは容易に明白である。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを理解する。抗原が生成され得、合成され得、または生物学的サンプルに由来し得ることは容易に明白である。そのような生物学的サンプルとしては、限定するものではないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生物学的流体が挙げられ得る。
【００４５】
本明細書において使用する場合、用語「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加、またはガン状態に関連する種々の生理学的症状の寛解によって顕在化され得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、第一に、腫瘍の発生の防止における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によって顕在化され得る。
【００４６】
本明細書において使用する場合、用語「自己」は、後にその個体中に再導入しようとするのと同じ個体に由来する任意の材料を指すように意味される。
【００４７】
本明細書において使用する場合、用語「ガン」は、異常細胞の迅速なそして制御されない増殖によって特徴付けられる疾患として定義される。ガン細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系を通じて身体の他の部分に広がり得る。種々のガンの例としては、限定するものではないが、乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、子宮頸ガン、皮膚ガン、膵臓ガン、結腸直腸ガン、腎臓ガン、肝臓ガン、脳ガン、リンパ腫、白血病、肺ガンなどが挙げられる。
【００４８】
その用語が本明細書において使用される場合、「同時刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族同時刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、Ｔ細胞応答（限定するものではないが、増殖、活性化、分化などを含む）を媒介するシグナルを提供する、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子を含む。同時刺激リガンドとしては、限定するものではないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性同時刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ，ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが挙げられ得る。同時刺激リガンドはまた、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する同時刺激分子（例えば、限定するものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンド）と特異的に結合する抗体を包含する。
【００４９】
「同時刺激分子」は、同時刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、限定するものではないが、増殖のようなＴ細胞による同時刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。同時刺激分子としては、限定するものではないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体が挙げられる。
【００５０】
「発現ベクター」は、発現させようとするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシスに作用するエレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターとしては、組換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソーム中に含まれる）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような当該分野において知られる全てのものが挙げられる。
【００５１】
用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書において互換的に使用され、そして本明細書に記載の方法を受けることができる任意の動物、またはその細胞（インビトロであってもインサイチュであっても）を指す。特定の非限定的な実施形態において、患者、対象または個体はヒトである。
【００５２】
用語「刺激」によって、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）がその同族リガンドと結合し、それよってシグナル伝達事象（例えば、限定するものではないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達）を媒介することによって誘導される一次応答が意味される。刺激は、特定の分子の発現の変化（例えば、ＴＧＦ−βのダウンレギュレーション、および／または細胞骨格構造の再編成など）を媒介し得る。
【００５３】
その用語が本明細書において使用される場合、「刺激分子」は、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
【００５４】
本明細書において使用する場合、「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在するときに、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（本明細書において「刺激分子」という）と特異的に結合し、それによって、Ｔ細胞による一時応答（限定するものではないが、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含む）を媒介することができるリガンドを意味する。刺激リガンドは、当該分野においてよく知られており、そして、とりわけ、ペプチドが負荷されたＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、およびスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【００５５】
用語「対象」は、その中で免疫応答が惹起され得る生存生物（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそのトランスジェニック種が挙げられる。
【００５６】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、そして単離された核酸を細胞の内側に送達するために使用され得る組成物である。限定するものではないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性もしくは両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含む多数のベクターが当該分野において知られている。従って、用語「ベクター」は、自律複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞中への核酸の移入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、限定するものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。
【００５７】
［発明の詳細な説明］
免疫療法のための組成物および方法が、本明細書において提供される。特に、キメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体を発現する細胞、および免疫療法（例えば、ガン免疫療法）におけるそのような細胞の使用が、本明細書において提供される。
【００５８】
本開示は、キメラ抗原受容体およびそれを発現する細胞に関する。可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）を産生することが検証された技術をもとに作り上げられた膜結合ＴＣＲが本明細書において提供される（Tadesse, F. G. et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. J Immunol. Methods 425, 37-44, (2015)；Walseng, E. et al. Soluble T-cell receptors produced in human cells for targeted delivery. PLoS One 10, e0119559, (2015)）。
【００５９】
大多数の抗体とは対照的に、ＴＣＲはしばしばそのｐＭＨＣ標的にかなり低い親和性（ＫＤ約０．１〜５００μｍ）で結合する。従って、ｓｃＦｖに基づくＣＡＲ技術を、ＴＣＲ由来の抗原結合ドメインに自動的に移すことはできない。さらに、本明細書に記載の構築物は、単一の膜貫通およびシグナル伝達ドメインに連結されたＴＣＲのαおよびβ鎖由来の可変および定常領域を利用する。
【００６０】
さらに、そのｐＭＨＣ標的の結合に際して、ＴＣＲは、特有の方法で下流の事象を誘発し得る。Brazin et al, Front Immunol. 2015; 6: 441.によって記載されるように、「ＴＣＲがメカノセンサーとして作用することの直接的な証拠が実験的に示された［．．．］ここで、力なしでの単なる結合は誘発のために不十分であったが、接線方向の力がＴ細胞活性化に導いた。Ｔ細胞がメカノセンサーとして作用するという概念は、上記の認識における精度と遊離非結合リガンドの低い親和性との間の不一致を調和させ得る」。従って、本明細書に記載される、その特異性を保持しそしてＴ細胞およびＮＫ細胞の両方にシグナルを伝達する能力を有するＴＣＲ由来の抗原結合ドメインを含むキメラ受容体構築物を提供することは、ささいなことではなくそして予想外であった。
【００６１】
従って、いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＡＲ構築物の膜貫通およびシグナル伝達ドメインに連結されたｓＴＣＲ構築物（Walseng et al.、前出）を含む構築物を提供する（すなわち、ＣＤ２８ＴＭとそれに続くＣＤ２８およびＣＤ３ζ細胞内ドメインの部分）（Almasbak, H. et al. Inclusion of an IgG1-Fc spacer abrogates efficacy of CD19 CAR T cells in a xenograft mouse model. Gene Ther. 22, 391-403, (2015)）。本明細書に記載の実験は、以下の２つの治療用ＴＣＲを使用した：ＤＭＦ５（ＭＥＬＡＮ−Ａペプチド特異的ＴＣＲ（Johnson, L. A. et al. Gene transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177, 6548-6559 (2006)））およびＲａｄｉｕｍ−１ＴＣＲ（ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦｂＲ２）フレームシフト変異を標的化するＴＣＲ（Inderberg, E. M. et al. T cell therapy targeting a public neoantigen in microsatellite instable colon cancer reduces in vivo tumor growth. Oncoimmunology 6, e1302631, (2017)））。両方のＴＣＲ−ＣＡＲを構築し、そして発現させた。Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲ−ＣＡＲは良好に検出され、そしてＮＫ細胞株、ＮＫ−９２のようなＣＤ３なしの系においても見ることができた。両方のＴＣＲ−ＣＡＲは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞をその同族ｐＭＨＣに対して再指向させ、そして標的細胞死滅を誘発することができた。従って、ＴＣＲ−ＣＡＲは、エフェクター細胞を再指向させ、そして非Ｔ細胞をｐＭＨＣ拘束性にするための代替物を提供して、ＣＡＲ標的化を全プロテオームに開放する。
【００６２】
例示的な構築物および使用は以下に記載される。
【００６３】
Ｉ．ＣＡＲ−ＴＣＲ
膜貫通ドメインを介してＣＡＲシグナル伝達テイルに融合された可溶性ＴＣＲ構築物を含む構築物が本明細書において提供される。ＴＣＲは、ＭＨＣ／ＨＬＡ分子の文脈で、ペプチドを認識するヘテロ二量体膜貫通タンパク質（例えば、ＴＣＲα／β）である。本開示は、ＴＣＲ鎖の１つ（例えば、ＴＣＲβ）の細胞質およびＴＭドメインをキメラシグナル伝達ドメインで置換することによって膜貫通（ＴＭ）ドメインが変化させられている、天然ＴＣＲの改変型の発現を記載する。
【００６４】
本発明は、特定のＴＣＲ構築物、膜貫通ドメイン、または細胞内シグナル伝達ドメインに限定されない。例示的な構成要素は本明細書に記載される。
【００６５】
本発明は、ＴＣＲ由来の特定の抗原結合ドメインに限定されない。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、腫瘍反応性ＴＣＲに基づく。例としては、限定するものではないが、以下に特異的なＴＣＲが挙げられる：Ｒａｄｉｕｍ１（ＷＯ２０１７１９４５５５；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＨＥＲ２、ＤＭＦ５、および以下に記載のもの：ＷＯ２０１７２０３３７０Ａ２、ＷＯ２０１７１９７３４７Ａ１（δ−１）、ＷＯ２０１７１９５１５３Ａ１（ＣＴ４５）、ＷＯ２０１７１９４５５５Ａ１（ＴＧＦ３ＲＩＩ）、ＷＯ２０１７１９４９２４Ａ１、ＵＳ２０１７０３１９６３８Ａ１、ＷＯ２０１７１８９２５４Ａ１（ＷＯ２０１７１９４５５５）、ＷＯ２０１７１７４８２３Ａ１（Ｂ２）、ＷＯ２０１７１７４８２４Ａ１（Ｂ２）、ＷＯ２０１７１７４８２２Ａ１（Ｂ２）、ＵＳ９８２２１６２Ｂ２（ＨＰＶ１６Ｅ６）、ＵＳ９７１７７５８Ｂ２（ＤＭＦ５）、ＵＳ９４８７５７３Ｂ２（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＥＰ２８３１１０９Ｂ１（γ９−Ｔ細胞およびδ２−Ｔ細胞）、ＵＳ９３４５７４８Ｂ２、ＵＳ９６７８０６１Ｂ２、ＵＳ８２８３４４６Ｂ２（ヒト白血球抗原血清型Ａ１）、ＵＳ９１８１５２７Ｂ２、ＵＳ８５１９１００Ｂ２（ＨＬＡ−Ａ２）、ＵＳ９６８８７３９Ｂ２、ＵＳ８６９７８５４Ｂ２（チロシナーゼ）、ＵＳ８４３１６９０Ｂ２、ＵＳ９３１５８６５Ｂ２（ウィルムス腫瘍）、ＵＳ８６１３９３２Ｂ２（ｇｐ１００）、ＵＳ９１２８０８０Ｂ２、ＵＳ９１３３２６４Ｂ２、ＵＳ８２１７００９Ｂ２、ＥＰ２０１６１０２Ｂ１、ＵＳ８９５１５１０Ｂ２（ＭＡＧＥ−Ａ４）、ＵＳ８２１７１４４Ｂ２、ＵＳ８０１７７３０Ｂ２（ＨＬＡ−Ａ２４）、ＵＳ７９１５０３６Ｂ２、ＵＳ８３６１７９４Ｂ２、ＥＰ１７５８９３５Ｂ１、ＵＳ９５１２１９７Ｂ２（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＵＳ７９５１７８３Ｂ２（ウィルムス腫瘍）、ＵＳ７５４１０３５Ｂ２、ＵＳ７６６６６０４Ｂ２、ＵＳ７５３８１９６Ｂ２（ＣＤ２８）、ＵＳ７４５６２６３Ｂ２（ｐ５３）、ＵＳ７７２３１１１Ｂ２、およびＵＳ６７７０７４９Ｂ２；その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
天然に生じるＴＣＲの大多数は、α鎖およびβ鎖を含むヘテロ二量体である。大部分のαおよびβ鎖は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するＮ末端可変ドメインを含む。ＣＤＲは一般に改変に対して感受性であるが、しかし、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲに隣接する配列）のいくらかの改変は、抗原結合ドメインの機能に悪影響を及ぼすことなしに許容されると考えられている。一般に、α鎖およびβ鎖は、可変ドメインのＮ末端（すなわち、上流）に位置するリーダー配列とともに、未成熟な形態でコードされ、そして内在的に合成される。リーダー配列（シグナルペプチドとしても知られる）は、ポリペプチド鎖の膜局在化を促進する。リーダー配列は通常、細胞膜中への挿入に際してα鎖およびβ鎖から切断される。従って、リーダー配列は、細胞膜においてそれが発現されるときに、ＴＣＲ−ＣＡＲ中に一般に存在しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の発現構築物（すなわち、核酸）は、リーダー配列をコードする。特に、いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインにおける２つのポリペプチドの各々は、細胞膜における発現のためのリーダー配列を含む。
【００６７】
可変ドメインは、定常ドメインに連結される。特に、可変ドメインのＣ末端は、ペプチド結合によって定常ドメインのＮ末端に連結される。
【００６８】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、その各々がＴＣＲ（例えば、腫瘍反応性ＴＣＲ）に由来する可変および定常領域を含む２つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインにおける２つのポリペプチドは、定常ドメインにおけるシステイン残基によって形成される少なくとも１つのジスルフィド架橋によって連結される。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインにおける２つのポリペプチドは、定常ドメインにおけるシステイン残基によって形成される１つより多いジスルフィド架橋によって連結される。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインにおける２つのポリペプチドは、各々が定常ドメインにおける２つのシステイン残基によって形成される２つのジスルフィド架橋によって連結される。
【００６９】
いくつかの例示的な実施形態において、ＴＣＲ部分は、Ｒａｄｉｕｍ１またはＤＭＦ５  ＴＣＲに由来する。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１および配列番号２、またはその少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１および配列番号１６、またはその少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１および配列番号２もしくは１６、またはその少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなり、ただし、配列番号１は３つのＣＤＲであるＤＳＶＮＮ、ＩＰＳＧＴおよびＡＶＮＡＧＮＭＬＴＦを含み、そして配列番号２もしくは１６は３つのＣＤＲであるＭＤＨＥＮ、ＳＹＤＶＫＭおよびＡＳＳＳＧＶＴＧＥＬＦＦを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号８および配列番号９もしくは１７、またはその機能的フラグメントを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号８および配列番号９もしくは１７、またはその少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号８および９もしくは１７、またはその少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなり、ただし、配列番号８は３つのＣＤＲであるＤＲＧＳＱＳ、ＩＹＳＮＧＤおよびＡＶＮＦＧＧＧＫＬＩＦを含み、そして配列番号９もしくは１７は３つのＣＤＲであるＭＲＨＮＡ、ＳＮＴＡＧＴおよびＡＳＳＬＳＦＧＴＥＡＦＦを含む。
【００７０】
本明細書において使用する場合、定常ドメインは、天然に生じるＴＣＲの可変ドメインと膜貫通ドメインとの間に同定され得るα鎖、β鎖、γ鎖またはδ鎖のフラグメントである。この用語が示唆するように、これらのドメインの配列はかなり保存されている。特に、ヒトα鎖またはβ鎖の定常ドメインが使用され得る。そのような定常ドメインの例は、例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号１０または配列番号１１によって表され得る。抗原結合ドメインが、α鎖由来の１つの定常ドメインおよびβ鎖由来の１つの定常ドメインを含むことが好ましい。ヒトα鎖の定常ドメインは、通常、約９０アミノ酸残基を含む。ヒトβ鎖の定常ドメインは、通常、約１３０アミノ酸残基を含む。定常ドメインは、１つ以上のジスルフィド架橋によって抗原結合ドメインにおける２つの配列を連結するために、システイン残基を含み得る。
【００７１】
いくつかの例示的な実施形態において、α鎖の定常ドメイン中の４８位におけるスレオニンがシステイン残基によって置換され得ることが見出された。そのような置換は、以下の配列番号３における下線を付したＣによって表される：
【００７２】
【化１】
2021500875.tif 000002
【００７３】
従って、いくつかの実施形態において、配列番号３の４８位および９１位におけるアミノ酸残基の両方はシステイン残基である。これらのシステイン残基は、β鎖の定常ドメインへの鎖間架橋を形成し得る（図７を参照のこと）。
【００７４】
いくつかの例示的な実施形態において、β鎖の定常ドメイン中の５７位におけるセリンがシステイン残基によって置換され得ることが見出された。そのような置換は、以下の配列番号４における下線を付したＣによって表される：
【００７５】
【化２】
2021500875.tif 000003
【００７６】
従って、いくつかの実施形態において、配列番号４の５７位および１３１位におけるアミノ酸残基の両方はシステイン残基である。これらのシステイン残基は、α鎖の定常ドメインへの鎖間架橋を形成し得る（図７を参照のこと）。
【００７７】
理論によって縛られるものではないが、上記のこれら置換は、α鎖由来の定常ドメインとβ鎖由来の定常ドメインとの間のさらなるジスルフィド架橋の形成を可能にし得る。これらの架橋は、抗原結合ドメインの安定性に寄与し得、そしてＴＣＲ−ＣＡＲが効率的にシグナルを免疫エフェクター細胞中に伝達することを可能にし得る。
【００７８】
本開示は、特定の膜貫通ドメインに限定されない。膜貫通ドメインは、天然または合成のいずれかの供給源に由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において特に有用な膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、βもしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２に由来し得る（すなわち、その少なくとも膜貫通領域を含むかまたはその少なくとも膜貫通領域からなり得る）。あるいは、膜貫通ドメインは、合成のものであり得る。任意に、短いオリゴまたはポリペプチドリンカー（好ましくは長さ２〜１０アミノ酸）は、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは特に適切なリンカーを提供する。
【００７９】
例えば、いくつかの実施形態において、ＣＤ８ａもしくはＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン、またはその機能的バリアント／フラグメントが使用され得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン（配列番号５によって表される）が使用される。この膜貫通ドメインは、ＴＣＲ−ＣＡＲが内在性ＴＣＲシグナル伝達機構をバイパスすることを可能にする。いくつかの実施形態において、配列番号１２および配列番号１４によって表されるナチュラルキラー細胞シグナル伝達アダプター分子ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０および１２（ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２）由来の膜貫通ドメインが使用される。
【００８０】
本開示は、特定の細胞内シグナル伝達ドメインに限定されない。本発明のＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体会合の後にシグナル伝達を開始するように協調して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。
【００８１】
本発明において特に有用なシグナル伝達配列の例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄ由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞質ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳなど由来のシグナル伝達ドメイン、またはそのようなドメインの機能的バリアント／フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、配列番号６によって表されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインの機能的フラグメントが使用される。いくつかの実施形態において、配列番号６によって表されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインの機能的フラグメントが、配列番号７によって表されるＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと一緒に使用される。いくつかの実施形態において、配列番号１３および配列番号１５によって表されるＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来の細胞内シグナル伝達ドメインが、ナチュラルキラー細胞におけるシグナル伝達のために使用される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＴＣＲ−ＣＡＲは、抗体由来の抗原結合ドメインを介して表面エピトープを標的化する従来のＣＡＲとの組み合わせで使用される。
【００８３】
本発明の実施形態は、開示される配列のバリアント、フラグメントなどを提供する。いくつかの実施形態において、置換は、保存的または非保存的置換である。いくつかの実施形態において、バリアントおよびフラグメントは、もとのポリペプチドの機能性を保持している。上記のように、いくつかの実施形態において、バリアントは、もとのポリペプチドと少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％、または９９％）同一である。
【００８４】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277）（好ましくはバージョン3.0.0.またはそれ以降）のNeedleプログラム中に実装されるようなNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を使用して決定される。使用される任意パラメーター11644.000-EP7は、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、およびEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と明示されるNeedleの出力（-nobriefオプションを使用して得られる）が同一性百分率として使用され、そして以下のように算出される：（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）。
【００８５】
いくつかの実施形態において、この構築物をコードするトランスジーンは、ポリシストロン遺伝子として設計され、そして、いくつかの実施形態において、ＴＣＲαおよびβコード配列は、２Ａリボソームスキッピング配列（これは、最終的なヘテロ二量体の等モル産生を確実にする）によって連結される。２Ａ配列は、上流タンパク質の遊離および下流遺伝子の翻訳を可能にする。２Ａはまた、２つのサブユニットを接触させ、そしてその二量体化を向上させるように作用することが期待される。最後に、必要に応じて、各々の鎖のＣ末端部分は、さらなるタグ／ドメインを保有するように改変され得る。細胞外ドメインはまた、二量体の安定性を増加させるように改良され得る（追加のシステインの付加）。
【００８６】
所望の分子をコードする核酸配列は、組換え方法を使用して、例えば、遺伝子を発現している細胞由来のライブラリーをスクリーニングすることによって、遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を引き出すことによって、または遺伝子を含む細胞および組織から直接的に単離することによって、標準的な技術を使用して得られ得る。あるいは、目的の遺伝子は、クローニングではなく、合成で産生され得る。
【００８７】
本発明はまた、その中に本発明の核酸が挿入されているベクターを提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルス由来のベクターは、長期の遺伝子移入を達成するために適切なツールである。なぜなら、それは、トランスジーンの長期の安定な組み込みおよび娘細胞におけるその繁殖を可能にするからである。レンチウイルスベクターは、それが肝細胞のような非増殖細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスのようなオンコレトロウイルス由来のベクターを上回る追加の利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低い免疫原性という追加の利点を有する。
【００８８】
核酸は、多くの型のベクター中にクローニングされ得る。例えば、核酸は、限定するものではないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むベクター中にクローニングされ得る。特に目的とするベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが挙げられる。
【００８９】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該分野においてよく知られており、そして、例えば、Sambrook et al.（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）ならびに他のウイルス学および分子生物学の手引き書に記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、限定するものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。一般に、適切なベクターは、少なくとの１つの生物において機能性である複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択マーカーを含む（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；および米国特許第６，３２６，１９３号）。
【００９０】
多くのウイルスベースのシステムが、哺乳動物細胞中への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための好都合なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該分野において知られる技術を使用して、ベクター中に挿入され、そしてレトロウイルス粒子中にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスは、単離され、そしてインビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルスシステムが当該分野において知られている。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当該分野において知られている。１つの実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
【００９１】
さらなるプロモーターエレメント（例えば、エンハンサー）は、転写開始の頻度を調節する。代表的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモーターが、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが最近示されている。プロモーターエレメント間の間隔は、しばしばフレキシブルであり、それで、エレメントが反転させられるかまたは互いに相対的に移動させられたときにプロモーター機能は保たれる。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が減衰し始める前に５０ｂｐ分離まで増加され得る。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、協同的にまたは独立してのいずれかで機能して転写を活性化し得るようである。
【００９２】
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成性プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子１α（ＥＦ−１α）である。しかし、限定するものではないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに限定するものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターのようなヒト遺伝子プロモーターを含む他の構成性プロモーター配列もまた使用され得る。さらに、本発明は、構成性プロモーターの使用に限定されるべきでない。誘導性プロモーターも本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、その発現が所望されときにそれが作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されないときに発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、限定するものではないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
【００９３】
細胞中に遺伝子を導入しそして発現させる任意の適切な方法が利用され得る。発現ベクターの文脈で、当該分野における任意の方法によって、ベクターは容易に宿主細胞（例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞）中に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって、宿主細胞中に移入され得る。
【００９４】
宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を産生するための方法は当該分野においてよく知られている。例えば、Sambrook et al.（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照のこと。宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入のための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【００９５】
宿主細胞中に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター（そして特にレトロウイルスベクター）は、哺乳動物（例えば、ヒト細胞）中に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および同第５，５８５，３６２号を参照のこと。
【００９６】
宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段としては、コロイド分散システム、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースのシステムが挙げられる。インビトロおよびインビボにおける送達ビヒクルとしての使用のための例示的なコロイドシステムは、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【００９７】
非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。宿主細胞中への核酸の導入（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）のために脂質処方物の使用が意図される。別の態様において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合される核酸は、リポソームの水性の内側における被包、リポソームの脂質二重層内での散在、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と結合されている連結分子を介したリポソームへの付着、リポソームにおける捕捉、リポソームとの複合体化、脂質を含む溶液における分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁物としての含有、ミセルとの含有または複合体化、またはその他の方法での脂質との結合をなされ得る。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それは、二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊」した構造で存在し得る。それはまた、おそらく、大きさまたは形状が均一でない凝集物を形成して、単に溶液中に散在し得る。脂質は、天然に生じるかまたは合成の脂質であり得る脂肪性物質である。例えば、脂質としては、細胞質中に天然に生じる脂肪性液滴、ならびに、長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物の分類およびその誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドが挙げられる。
【００９８】
使用に適切な脂質は、商業的供給源から得られ得る。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はSigma, St. Louis, Mo.から得られ得；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）はK & K Laboratories（Plainview, N.Y.）から得られ得；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はCalbiochem-Behringから得られ得；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質はAvanti Polar Lipids, Inc.（Birmingham, Ala.）から得られ得る。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は約−２０℃で貯蔵され得る。クロロホルムは唯一の溶媒として使用される。なぜなら、それはメタノールより容易に蒸発させられるからである。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集物の生成によって形成される種々の単および多重層脂質ビヒクルを包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒質を有する小胞構造を有するとして特徴付けられ得る。多重層リポソームは、水性媒質によって分離された多重脂質層を有する。それは、リン脂質が過剰の水性溶液中に懸濁されるときに自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成の前に自己再構成を経、そして脂質二重層の間の溶解された溶質および水を捕捉する（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかし、通常の小胞構造とは異なる溶液中の構造を有する組成物もまた包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取り得るかまたは単に脂質分子の非均一な凝集物として存在し得る。リポフェクタミン−核酸複合体もまた意図される。
【００９９】
ＩＩ．細胞
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＣＡＲを含む細胞を提供する。本発明は、特定の細胞型に限定されない。例としては、限定するものではないが、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ＮＫ−９２細胞などが挙げられる。細胞は、初代（例えば、自己もしくは異種ドナー由来）または不死化細胞株であり得る。
【０１００】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象から単離され、そしてエクスビボで改変された細胞を利用する。そのような実施形態において、Ｔ細胞の拡大および遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源が対象から得られる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多くの供給源から得られ得る。本発明の特定の実施形態において、当該分野において利用可能な任意の多くのＴ細胞株が使用され得る。本発明の特定の実施形態において、Ｔ細胞は、当業者に知られる任意の多くの技術（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離）を使用して対象から採集された血液の単位から得られ得る。１つの好ましい実施形態において、個体の循環血液由来の細胞がアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、代表的には、リンパ球（Ｔ細胞を含む）、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む。１つの実施形態において、アフェレーシスによって採集された細胞は、血漿画分を除去し、そして細胞をのちの処理工程のために適切な緩衝液または培地中に入れるために、洗浄され得る。本発明の１つの実施形態において、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄される。別の実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを欠いており、そしてマグネシウム欠き得るか、または全てではないにしても多くの二価カチオンを欠き得る。他の洗浄方法としては、製造業者の説明書に従った半自動化「フロースルー遠心分離」（例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMate、またはHaemonetics Cell Saver 5）が挙げられる。洗浄後、細胞は、例えば、Ｃａ２＋不含、Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ、PlasmaLyte A、または他の緩衝剤有りまたは無しの生理食塩水のような種々の生体適合性緩衝液中に再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシスサンプルの所望されない成分が除去され得、そして細胞は直接培養培地中に再懸濁され得る。
【０１０１】
別の実施形態において、赤血球を溶解し、そして単球を枯渇させることによって（例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離によって、または向流遠心溶出によって）、Ｔ細胞は抹消血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特定の亜集団（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞）は、ポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離され得る。例えば、１つの実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）結合ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T）との、所望のＴ細胞のポジティブ選択のために十分な期間のインキュベーションによって単離される。他の細胞型に比較してＴ細胞が少ししか存在しない任意の状況では（例えば、腫瘍組織からまたは免疫が損なわれた個体からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の単離）、Ｔ細胞を単離するために、より長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕獲の効率を増加させ得る。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることによって、培養開始時または他の所望される時点で、Ｔ細胞の亜集団は、それについてまたはそれに対して優先的に選択され得る。当業者は、本発明の文脈で、複数回の選択もまた使用され得ることを認識する。特定の実施形態において、選択手順を行い、そして「非選択」細胞を活性化および拡大プロセスにおいて使用することが所望され得る。「非選択」細胞はまた、選択のさらなる回に供され得る。
【０１０２】
ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブに選択される細胞に特有な表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて達成され得る。１つの方法は、ネガティブに選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、ネガティブ磁性免疫接着またはフローサイトメトリーを介する細胞ソーティングおよび／または選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、代表的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。特定の実施形態において、代表的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞について濃縮またはポジティブ選択することが所望され得る。あるいは、特定の実施形態において、制御性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５結合ビーズまたは他の類似の選択方法によって枯渇される。
【０１０３】
ポジティブまたはネガティブ選択による所望の細胞集団の単離のために、細胞および表面（例えば、ビーズのような粒子）の濃度は変動され得る。特定の実施形態において、細胞およびビーズの最大の接触を確実にするように、その中にビーズおよび細胞が一緒に混合される容量を有意に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが所望され得る。例えば、１つの実施形態において、２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。１つの実施形態において、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる実施形態において、１億細胞／ｍｌ超が使用される。さらなる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、または１億細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化、および細胞拡大の増加をもたらし得る。さらに、高細胞濃度の使用は、目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞、または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（すなわち、白血病血液または腫瘍組織など）からの細胞のより効率的な捕獲を可能にする。そのような細胞集団は、治療的価値を有し得、そして得ることが所望される。
【０１０４】
関連する実施形態において、より低濃度の細胞を使用することが所望され得る。Ｔ細胞および表面（例えば、ビーズのような粒子）の混合物を有意に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用を最小化する。これは、粒子に結合させようとする所望の抗原を多量に発現する細胞について選択する。１つの実施形態において、使用される細胞濃度は、５×１０６／ｍｌである。他の実施形態において、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌ、およびその間の任意の整数値であり得る。
【０１０５】
他の実施形態において、細胞は、ローテータ上で、種々の長さの時間、種々の速度で、２〜１０℃または室温のいずれかでインキュベートされ得る。
【０１０６】
本明細書に記載の拡大された細胞が必要とされ得るときの前の時期に、対象から血液サンプルまたはアフェレーシス生成物を採集することも、本発明の文脈で意図される。それで、本明細書に記載されるもののような、Ｔ細胞療法の恩恵を受ける任意の多くの疾患または状態のために、拡大しようとする細胞の供給源は任意の必要な時点で採集され得、そして所望の細胞（例えば、Ｔ細胞）はＴ細胞療法におけるのちの使用のために単離および凍結され得る。１つの実施形態において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、一般的に健常な対象から取られる。特定の実施形態において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、疾患を発達させる危険性があるが、未だ疾患を発達させていない一般的に健常な対象から取られ、そして目的の細胞はのちの使用のために単離および凍結される。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、拡大され、凍結され、そしてのちの時点で使用され得る。特定の実施形態において、サンプルは、本明細書に記載のような特定の疾患の診断の直後であるが、いかなる処置の前に、患者から採集される。さらなる実施形態において、細胞は、対象由来の血液サンプルまたはアフェレーシスから、限定するものではないが以下を含む任意の多くの関連処置様式の前に単離される：薬剤での処置、例えば、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、照射、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および照射。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）または増殖因子誘導シグナル伝達のために重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害するか（ラパマイシン）のいずれかである（Liu et al., Cell 66:807-815, 1991；Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993）。さらなる実施形態において、細胞は、患者のために単離され、そして骨髄もしくは幹細胞移植、Ｔ細胞除去療法（化学療法剤、例えば、フルダラビン、外部照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体、例えば、ＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨのいずれかを使用する）との組み合わせでの（例えば、その前、同時もしくは後の）のちの使用のために凍結される。別の実施形態において、細胞は事前に単離され、そしてＣＤ２０と反応する薬剤（例えば、リツキサン）のようなＢ細胞除去療法後の処置のためののちの使用のために凍結され得る。
【０１０７】
本発明のさらなる実施形態において、Ｔ細胞は、処置の後に直接患者から得られる。これに関して、特定のガン処置（特に免疫系を損なう薬物での処置）の後、通常は患者が処置から回復している期間の間の処置のすぐ後に、得られたＴ細胞の質は、エクスビボで拡大するその能力について至適であるかまたは改良され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するエクスビボ操作の後に、これらの細胞は、増強された生着およびインビボ拡大のために好ましい状態にあり得る。従って、この回復期の間に、血液細胞（Ｔ細胞、樹上細胞、または造血系の他の細胞を含む）を採集することが、本発明の文脈内で意図される。さらに、特定の実施形態において、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦを用いる動員）およびコンディショニングレジメンを使用して、特に治療後の規定された時間窓の間に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、および／または拡大が好都合である対象における状態を作ることができる。実例となる細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞が挙げられる。
【０１０８】
本発明の所望のＴＣＲ−ＣＡＲを発現させるためのＴ細胞の遺伝子改変の前であれ後であれ、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されるような方法を一般に使用して、Ｔ細胞は活性化および拡大され得る。
【０１０９】
本発明のさらなる実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、薬剤コートビーズと組み合わされ、次にビーズと細胞とは分離され、次いで細胞は培養される。別の実施形態において、培養の前に、薬剤コートビーズと細胞とは分離されず、一緒に培養される。さらなる実施形態において、ビーズおよび細胞はまず力（例えば、磁力）の適用によって濃縮され、その結果、細胞表面マーカーの増加した連結が生じ、それによって細胞刺激が誘導される。
【０１１０】
変動する刺激時間に曝露されたＴ細胞は、様々な特徴を示し得る。例えば、代表的な血液またはアフェレーシスされた抹消血単核細胞生成物は、細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より大きなヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のエクスビボ拡大は、約８〜９日目の前は主にＴＨ細胞からなり、一方、約８〜９日目の後はＴ細胞の集団が漸増的により大きなＴＣ細胞の集団を含む、Ｔ細胞の集団を生じる。従って、処置の目的に依存して、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を用いる対象の注入が有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットをより大きな程度まで拡大することが有益であり得る。
【０１１１】
ＩＩＩ．治療適用
本明細書に記載のＣＡＲは、種々の治療適用における使用を見出す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＴＣＲ−ＣＡＲを発現する細胞は、抗ガン養子細胞移入（ＡＣＴ）において使用される。いくつかの実施形態において、細胞は、標的化されるエピトープ（ペプチド）およびＨＬＡアレルについてその腫瘍が陽性である患者に注射される。いくつかの実施形態において、これは、ＮＫ細胞（および任意の非Ｔ細胞）のような死滅能力を有するエフェクター細胞を、Ｔ細胞標的に対して、そしてまた制御機能（例えば、サイトカイン放出または抗原提示）を有する他の型の免疫エフェクター細胞（マクロファージ）に対して再指向させる。
【０１１２】
本発明は特定のガンに限定されないが、発明の実施形態の開発の過程の間に実施された実験は、悪性黒色腫および直腸結腸ガンのペプチドに指向されたＴＣＲ−ＣＡＲを実証した。
【０１１３】
１つの実施形態において、本発明は、細胞がＣＡＲを発現するように遺伝子改変され、そしてＣＡＲＴ細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される、細胞治療の型を含む。注入される細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ細胞はインビボで複製することができ、これは、持続性の腫瘍制御に導き得る長期的持続を生じる。
【０１１４】
処置され得るガンとしては、血管形成されていないかまたはまだ実質的に血管形成されていない腫瘍、ならびに血管形成された腫瘍が挙げられる。ガンは、非固形ガン（血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫のような）を含み得るか、または固形ガンを含み得る。本発明のＣＡＲを用いて処置しようとするガンの型としては、限定するものではないが、細胞ガン、芽腫、および肉腫、ならびに特定の白血病またはリンパ系腫瘍、良性および悪性腫瘍、および悪性病変、例えば、肉腫、細胞ガンおよび黒色腫が挙げられる。成人腫瘍／ガンおよび小児腫瘍／ガンも含まれる。
【０１１５】
血液ガンは、血液または骨髄ガンのである。血液（または血行性）ガンの例としては、白血病（以下を含む）、急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワンデンストレームマクログロブリン血症、重鎖症、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病および骨髄形成異常が挙げられる。
【０１１６】
固形腫瘍は、通常は嚢胞または液体領域を含まない組織の異常な塊である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。様々な型の固形腫瘍が、それを形成する細胞の型を取って名付けられている（例えば、肉腫、細胞ガン、およびリンパ腫）。肉腫および細胞ガンのような固形ガンの例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、リンパ系腫瘍、膵臓ガン、乳ガン、肺ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、肝細胞ガン、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、腺ガン、汗腺ガン、甲状腺髄様ガン、甲状腺乳頭ガン、褐色細胞腫、脂腺ガン、乳頭ガン、乳頭腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン、腎細胞ガン、肝細胞ガン、胆管ガン、絨毛ガン、ウィルムス腫瘍、子宮頸ガン、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱ガン、黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫および混合膠腫）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られる）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽腫および脳転移）が挙げられる。
【０１１７】
本発明のＣＡＲ改変細胞はまた、哺乳動物におけるガン特異的免疫応答を誘導するエクスビボ方法における使用を見出す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。エクスビボ治療に関して、以下の少なくとも１つが、哺乳動物中に細胞を投与する前にインビトロで生じる：ｉ）細胞の拡大、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入、および／またはｉｉｉ）細胞の冷凍保存。
【０１１８】
任意の適切なエクスビボ手順が利用され得る。１つの例示的な方法において、細胞は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）から単離され、そして本明細書に開示されるＣＡＲを発現するベクターを用いて遺伝子改変される（例えば、インビトロで形質導入またはトランスフェクトされる）。ＣＡＲ改変細胞は、治療的恩恵を提供するために哺乳動物レシピエントに投与され得る。哺乳動物レシピエントはヒトであり得、そしてＣＡＲ改変細胞はレシピエントに関して自己であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに関して同種、同系または異種であり得る。
【０１１９】
造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボ拡大の手順は、米国特許第５，１９９，９４２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、本発明の細胞に適用され得る。他の適切な方法は、当該分野において知られており、それゆえ、本発明は、細胞のエクスビボ拡大のいかなる特定の方法にも限定されない。簡潔に記載すると、Ｔ細胞のエクスビボ培養および拡大は、以下を含む：（１）哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞を末梢血収集物または骨髄外植片から採集すること；および（２）そのような細胞をエクスビボで拡大すること。米国特許第５，１９９，９４２号に記載の細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドのような他の因子が、細胞の培養および拡大のために使用され得る。
【０１２０】
エクスビボ免疫化に関する細胞ベースのワクチンの使用に加えて、本発明はまた、患者において抗原に対する免疫応答を惹起するためのインビボ免疫化のための組成物および方法を提供する。
【０１２１】
本発明のＣＡＲ改変細胞は、単独で、あるいは、稀釈剤および／または他の成分（例えば、ＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団）と組み合わせた医薬組成物としてのいずれかで投与され得る。簡潔に記載すると、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の標的細胞集団を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために処方される。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、処置（または予防）しようとする疾患に適切な方法で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態、および患者の疾患の型および重篤度のような要素によって決定されるが、適切な投薬量は臨床治験によって決定され得る。
【０１２３】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療的量」が示される場合、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態における個別の差異を考慮して医師によって決定され得る。本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内の全ての整数値を含む）の投薬量で投与され得ることを、一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投薬量で、複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般に知られる注入技術を使用することによって投与され得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照のこと）。特定の患者のための至適な投薬量および処置レジメンは、疾患の兆候について患者をモニターし、そしてそれに応じて処置を調整することによって、医学の当業者によって容易に決定され得る。
【０１２４】
特定の実施形態において、活性化されたＴ細胞を対象に投与し、次いでその後採血し（またはアフェレーシスを行わせ）、本発明に従ってそれ由来のＴ細胞を活性化させ、そしてこの活性化されそして拡大されたＴ細胞を用いて患者を再注入することが所望され得る。このプロセスは数週間毎に複数回行われ得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血から活性化される。理論によって縛られるものではないが、この複数回の採血／複数回の再注入のプロトコルの使用は、Ｔ細胞の特定の集団を選択するように作用し得る。
【０１２５】
主題の組成物の投与は、エアロゾル吸引、注射、摂取、輸注、留置または移植を含む任意の好都合な方法で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、皮下で、皮内で、腫瘍内で、節内で、髄内で、筋肉内で、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内で、患者に投与され得る。１つの実施形態において、本発明のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態において、本発明のＴ細胞組成物は、好ましくはｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染の部位中に直接注射され得る。
【０１２６】
本発明の特定の実施形態において、本明細書に記載の細胞は、限定するものではないが、薬剤での処置、例えば、抗ウイルス治療、シドフォビルおよびインターロイキン２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても知られる）またはＭＳ患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置またはＰＭＬ患者のための他の処置を含む任意の多くの関連処置様式とともに（例えば、前、同時または後に）患者に投与される。さらなる実施形態において、本発明の細胞は、化学療法、照射、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射との組み合わせで使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）または増殖因子誘導シグナル伝達のために重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害するか（ラパマイシン）のいずれかである（Liu et al., Cell 66:807-815, 1991；Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993）。さらなる実施形態において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、Ｔ細胞除去療法（化学療法剤、例えば、フルダラビン、外部照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体、例えば、ＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨのいずれかを使用する）とともに（例えば、前、同時または後に）患者に投与される。別の実施形態において、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤（例えば、リツキサン）のようなＢ細胞除去療法の後に投与される。例えば、１つの実施形態において、対象は、高用量化学療法およびそれに続く末梢血幹細胞移植を用いる標準的な処置を経てもよい。特定の実施形態において、移植後に、対象は、本発明の拡大された免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態において、拡大された細胞は、手術の前または後に投与される。
【０１２７】
患者に投与しようとする上記の処置の投薬量は、処置されている状態および処置のレシピエントの正確な性質によって変動する。ヒトの投与のための投薬量の増減は、当該分野において許容されているプラクティスに従って行われ得る。例えば、ＣＡＭＰＡＴＨのための用量は、一般に、成人患者について１〜約１００ｍｇの範囲であり、通常毎日１〜３０日の期間投与される。好ましい一日の用量は、一日当たり１〜１０ｍｇであるが、いくつかの場合には、一日当たり４０ｍｇまでのより高い用量が使用され得る（米国特許第６，１２０，７６６号に記載）。
【０１２８】
［実験］
実施例１
方法
細胞株、培地、化学物質およびペプチド。Ｔ細胞を、血液バンク（Ulleval hospital, Oslo, Norway）からの健常血液ドナー由来のバフィーコートから得た。Ｊ７６３１（M．Heemskerk, Leiden University Medical Center, The Nederlandsから入手）を、１０％ＨｙＣｌｏｎｅ  ＦＣＳ（HyClone, Logan, UT, USA）およびゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ（PAA, Paschung, Austria）中で維持した。Ｋ５６２（ATCC, CCL-243）、Ｇｒａｎｔａ−５１９（DSMZ, ACC 342）およびＴ２細胞を、同じ培地中で維持した。パッケージング細胞は、改変ヒト胎児腎細胞２９３、Ｈｅｋ−Ｐｈｏｅｎｉｘ（Ｈｅｋ−Ｐ）であり、そしてそれらを１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（ＰＡＡ）中で増殖させた。Ｔ細胞を、５％熱不活性化ヒト血清（Trina Bioreactives AG, Nanikon、Switzerland）、１．２５ｍｇ／ｍＬ  Ｎ−アセチルシステイン（Mucomyst 200mg/mL, AstraZeneca AS, London, UK）、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Life Technologies, Norway）、ゲンタマイシン０．０５ｍｇ／ｍＬ（Garamycin, Schering-Plough Europe, Belgium）を補充したＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地（CellGenix, Freiburg, Germany）中で増殖させた。ＮＫ−９２細胞を、５％熱不活化ＨＳおよび５００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充したＸ−Ｖｉｖｏ１０培地中で培養および維持した。ＴＧＦｂＲ２フレームシフトペプチド１３１−１３９、ＲＬＳＳＣＶＰＶＡは、Norsk Hydro ASA（Porsgrunn, Norway）によって提供された。ＭＡＲＴ−１ペプチド２６−３５  ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶは、ProImmune Ltd（Oxford, UK）によって製造され、そしてＭＡＲＴ−１デキストラマーは、Immudex（Copenhagen, Denmark）から入手した。ＤＮＡ構築物。ＣＡＲ２５ドメイン由来の膜貫通および細胞質ドメインを、以下のプライマーを使用することによるオーバーラップＰＣＲによって、以前に記載された可溶性ＴＣＲ２４に付加した：ＣＡＲテンプレート（５’−３’）フォワードggtagagcagactgtggtaaattttgggtgctggtggtgg（配列番号２７）（１）、リバースctcgagttagcgaggaggcagggcctgcatgtgaag（配列番号２８）（２）、ｓＴＣＲテンプレートフォワード（Ｒａｄｉｕｍ１）caccatgaagaggatat（配列番号２９）（３）、（ＤＭＦ５）caccatgatgaaatcct（配列番号３０）（４）、リバースccaccaccagcacccaaaatttaccacagtctgctctaccc（配列番号３１）（５）。続いて、Ｒａｄｉｕｍ−１については以下のプライマー対（３）および（２）を、そしてＤＭＦ５については（４）および３（２）を使用して、２つのＰＣＲ産物をＴＣＲ−ＣＡＲに組み合わせた。最終的なＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ（Themofisher、Waltham, MA, USA）中にクローニングした。配列を確認した構築物を、記載されるように、Ｇａｔｅｗａｙ改変ｐＭＰ７１（レトロウイルスベクター）またはｐＣＩｐＡ１０２（ｍＲＮＡ合成構築物）に組換えた（Walchli, S. et al. A practical approach to T-cell receptor cloning and expression. PLoS One 6, e27930 (2011)）。ここで使用したＴＣＲ発現構築物は、それぞれＤＭＦ５およびＲａｄｉｕｍ−１について記載されている（Inderberg, E. M. et al. T cell therapy targeting a public neoantigen in microsatellite instable colon cancer reduces in vivo tumor growth. Oncoimmunology 6, (2017)；Walchli, S. et al. A practical approach to T-cell receptor cloning and expression. PLoS One 6, e27930 (2011)）。ＨＬＡ−Ａ２構築物は、以前に記載されている（Walchli, S. et al. Invariant chain as a vehicle to load antigenic peptides on human MHC class I for cytotoxic T-cell activation. Euro. J Immunol. 44, 774-784, (2014)）、Addgene（Plasmid #85162）。インビトロｍＲＮＡ転写。インビトロｍＲＮＡ合成を、本質的に以前に記載されるように行った（Aggen, D. H. et al. Identification and engineering of human variable regions that allow expression of stable single-chain T cell receptors. Protein Eng Des Sel 24, 361-372 (2010)）。Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（Trilink Biotechnologies Inc., San Diego, CA, USA）を、ＲＮＡをキャッピングするために使用した。ｍＲＮＡの質を、アガロースゲル電気泳動およびＮａｎｏｄｒｏｐ（Thermo Fisher Scientific）によって評価した。
【０１２９】
Ｔ細胞のインビトロ拡大およびエレクトロポレーション。健常ドナー由来のＴ細胞を、記載されるようにＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８を用いるＴ細胞のＧＭＰ産生に適合させたプロトコルを使用して拡大した（Almasbak, H. et al. Transiently redirected T cells for adoptive transfer. Cytotherapy 13, 629-640, (2011)）。簡単に記載すると、ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離によってバフィーコートから単離し、そして１０日間、１００Ｕ／ｍＬ組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Proleukin, Prometheus Laboratories Inc., San Diego, CA, USA）を含む完全ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地中で３：１の比でＤｙｎａｂｅａｄｓ（Dynabeads（登録商標）ClinExVivo（商標）CD3/CD28, ThermoFischer, Oslo, Norway）と共に培養した。細胞を凍結し、そして、アリコートを融解し、トランスフェクション前に完全培地中に静置した。拡大したＴ細胞を、２回洗浄し、そしてＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地（CellGenix GmbH）中７０×１０６細胞／ｍＬに再懸濁した。ｍＲＮＡを、１００μｇ／ｍＬで細胞懸濁液と混合し、そしてＢＴＸ  ８３０  Ｓｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（BTX Technologies Inc., Hawthorne, NY, USA）を使用して５００Ｖおよび２ｍｓで、４ｍｍギャップキュベット中でエレクトロポレーションした。トランスフェクションの直後に、Ｔ細胞を３７℃で５％ＣＯ２中一晩、完全培養培地に移した。
【０１３０】
ＮＫ−９２のレトロウイルス形質導入およびＫ５６２（ＨＬＡ−Ａ２）の調製。ウイルス粒子を、記載されるように産生し（Walchli et al、前出)、そして以下のようにＮＫ−９２およびＫ５６２細胞を形質導入するために使用した：レトロネクチン（５０μｇ／ｍＬ、Takara Bio. Inc., Shiga, Japan）でプレコートした１２ウェル（最終２ｍＬ）または２４ウェル（最終１ｍＬ）非処理プレート（Nunc A/S, Roskilde, Denmark）中で、１容量の細胞（０．３Ｍ／ｍＬ）と混合した１容量のレトロウイルス上清を用いてスピノキュレーションを行った。ＮＫ−９２細胞を、３２℃、７５０×ｇで６０分間、２回スピノキュレーションした。次いで、細胞を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を用いて収集し、そしてそれらの通常の培地中で増殖させた。
【０１３１】
機能性アッセイおよびフローサイトメトリー。５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で一晩、Ｋ５６２（ＨＬＡ−Ａ２）またはＧｒａｎｔａ−５１９細胞にペプチドを負荷した。上記と同じ条件で、５時間、１：２のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、エフェクター細胞を標的細胞で刺激した。結合ＣＤ１０７ａを、インキュベーションの前に細胞に添加した。無関係なペプチドまたはペプチドなしを陰性対照とした。以下の抗体を使用した: Ｖβ３ＦＩＴＣ（Beckman Coulter-Immunotech SAS, Franc）、ＣＤ３−ｅＦｌｕｏｒ４５０、ＣＤ５６−ｅＦｌｕｏｒ、ＣＤ１０７ａ−ＰＥ−Ｃｙ５、ＴＮＦα−ＰＥ（BD Biosciences, USA）、ＩＬ２−ＡＰＣ、ＩＦＮγ−ＦＩＴＣ（eBiosciences, ThermoFischer）。細胞をフローバッファー（ＦＢ、２％ヒトウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．５μＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））中で洗浄した。デキストラマーおよび抗体染色のために、細胞を、ＦＢ中、推奨される希釈で、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。固定する場合、細胞を、１％パラホルムアルデヒドを含むＦＢ中でインキュベートした。細胞内染色のために、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを、製造業者のプロトコルに従って使用した（BD Biosciences）。全ての抗体を、特筆した場合を除いて、eBioscience, USAから購入した。細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで取得し、そしてデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Treestar Inc., Ashland, OR, USA)を使用して分析した。プロットおよび統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェア（La Jolla, CA, USA）を使用して行った。
【０１３２】
生物発光に基づく細胞傷害性アッセイ。ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を、計数し、そして３×１０５細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。Ｘｅｎｏｌｉｇｈｔ  Ｄ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎカリウム塩（７５μｇ／ｍＬ; Perkin Elmer, Oslo, Norway）を腫瘍細胞に添加し、これを９６ウェル白色丸底プレート中に、１００μＬ細胞懸濁液／ウェルで、３連で入れた。続いて、エフェクター細胞を、示されるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で添加した。ベースライン細胞死および最大死滅能力を決定するために、３つのウェルを標的細胞のみとともに放置し、そして別の３つを１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）中の標的細胞とともに放置した。細胞を３７℃で２時間インキュベートした。
【０１３３】
生物発光（ＢＬＩ）を、ルミノメーター（VICTOR Multilabel Plate Reader, Perkin Elmer）を用いて相対発光量（ＲＬＵ）として測定した。いかなるエフェクター細胞もなしでインキュベートした標的細胞を使用して、各時点におけるベースラインの自発性死ＲＬＵを決定した。３連のウェルを平均し、そして溶解百分率を以下の式を使用して算出した：％特異的溶解＝１００×（自発性細胞死ＲＬＵ−サンプルＲＬＵ)／（自発性死ＲＬＵ−最大死滅ＲＬＵ）。プロットおよび統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアを使用して行った。
【０１３４】
サイトカイン測定。Ｇｒａｎｔａ−５１９細胞と共にインキュベートした形質導入または非形質導入ＮＫ−９２細胞から放出されたサイトカインを、２４時間の共培養の後に採集した。上清中のサイトカインを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  １００システムで、製造業者のプロトコルに従って、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ＰｒｏＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １７−ｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ（Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA）を使用することによって測定した。プロットおよび統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアを使用して行った。
【０１３５】
結果
ＴＣＲ−ＣＡＲの設計。ヒト胎児腎（Ｈｅｋ）細胞および誘導体（例えば、Ｈｅｋ−Ｐｈｏｅｎｉｘ）において可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）を効率的に発現させることができることが以前に示された（Walseng, E. et al. Soluble T-cell receptors produced in human cells for targeted delivery. PLoS One 10, (2015)）。２Ａベースの発現システムを利用することによって、高収量（４ｍｇ／Ｌ）の活性材料を得た（Kim, J. H. et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One 6, e18556, (2011)）。これらの結果はそれ自体予測不可能であった。なぜなら、２つの分離された可溶性鎖の遊離は安定な分子の形成を機械的にはもたらさず、起こりそうな結果は、ＥＲにおけるそれらの分解か、または形質膜に送られることはないことであり得たからである。ｓＴＣＲ生成の合成および輸送が可能であったので、ＴＣＲβ鎖を、ＣＡＲのために使用されるものと同様の人工シグナル伝達ドメインに融合させた関連する構築物を設計した（図１ａ）：すなわち、ＣＤ２８膜貫通コード配列およびそれに続く２つのシグナル伝達モジュール（ＣＤ２８およびＣＤ３ζ）。さらに、ＴＣＲ二量体安定性を増加させるために、定常ドメイン（Ｃ−ドメイン）上でシステイン置換を行った（Cohen, C. J. et al. Enhanced antitumor activity of T cells engineered to express T-cell receptors with a second disulfide bond. Cancer Res 67, 3898-3903 (2007)；Walseng et al.、前出）。このＴＣＲ−ＣＡＲカセットを、先に公開されたストラテジーを使用して、２つの異なる発現システム、すなわちＭＰ７１レトロウイルスベクターおよびｍＲＮＡ合成ベクター中にサブクローニングした(Walchli et al、前出）。
【０１３６】
ＴＣＲ−ＣＡＲ構築物のタンパク質生成物が、受容体のように形質膜に輸送されること、および、ｐＭＨＣの遭遇に際して、それがその基質に結合しそしてシグナル伝達することが予想された（図１ｂ）。２つのＭＨＣ−クラスＩ拘束性ＴＣＲ、ＤＭＦ５（Johnson, L. A. et al. Gene transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177, 6548-6559 (2006)）、およびＲａｄｉｕｍ−１（Inderberg, E. M. et al. T cell therapy targeting a public neoantigen in microsatellite instable colon cancer reduces in vivo tumor growth. Oncoimmunology 6, e1302631, doi:10.1080/2162402X.2017.1302631 (2017)）を選択した。これらはそれぞれＭＡＲＴ−１ペプチドに対して指向されている（Johnson et al.、前出；Inderberg et al.、前出；Kim et al.、前出；Walchli et al、前出；Saeterdal, I. et al. Frameshift-mutation-derived peptides as tumor-specific antigens in inherited and spontaneous colorectal cancer. Proc. Nat’l Acad. Sci. 98, 13255-13260, (2001)；Heemskerk, M. H. et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood 102, 3530-3540 (2003)；Birnbaum, M. E. et al. Molecular architecture of the alphabeta T cell receptor-CD3 complex. Proc. Nat’l Acad. Sci. 111, 17576-17581, (2014)；Krshnan, L., et al., A conserved alphabeta transmembrane interface forms the core of a compact T-cell receptor-CD3 structure within the membrane. Proc. Nat’l Acad. Sci.113, E6649-E6658, (2016)；Almasbak, H. et al. Transiently redirected T cells for adoptive transfer. Cytotherapy 13, 629-640, (2011)；Daniel-Meshulam, I., et al., Front. Immunol. 3, 186, (2012) (EAAGIGILTV) and TGFbR2 frameshift neoantigen peptide 131-139 (RLSSCVPVA) (Saeterdal et al.、前出）。まず、これらの構築物が、効率的に産生され、そして形質膜に送られ得るかどうかを試験した。ＴＣＲ−ＣＡＲの発現を、ＴＣＲ陰性であるがＴＣＲ発現に際してＣＤ３陽性になるＪ７６細胞において、その対応する完全長ＴＣＲと比較した（Heemskerk et al、前出）。ＤＭＦ５  ＴＣＲおよびＴＣＲ−ＣＡＲを、市販のＭＡＲＴ−１デキストラマーを使用して検出した（図２ａ）。ＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲの弱い発現が検出された。このことは、この形式で発現させた場合に、それが膜に十分に輸送されなかったか、またはタンパク質が安定でなかったかのいずれかであることを示す。Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ染色のために利用可能な多量体が存在しなかったので、両方の構築物を検出するために、Ｒａｄｉｕｍ−１のＶβ鎖に対する抗体（抗Ｖｂ３、Ｖｂ）を使用した（図２ｂ）。ＤＭＦ５について観察されたものとは異なり、Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ−ＣＡＲは、その完全長ＴＣＲ対応物と同様の効率で発現された。一方、ＤＭＦ５は、デキストラマーに結合する限定的な能力を示した。ＴＣＲ−ＣＡＲタンパク質は形質膜において発現されたので（図２ａおよびｂ）、本発明者らはＣＤ３をリクルートするその能力を試験した。
【０１３７】
Ｊ７６細胞においてＴＣＲを発現させた場合、それらはＣＤ３陽性となる。しかし、ＣＤ３染色は、ＴＣＲ−ＣＡＲが内因性ＣＤ３と相互作用しないことを示した。なぜなら、Ｊ７６はＣＤ３陰性のままであったからである（図２ｃ）。このことは、本明細書におけるＴＣＲ−ＣＡＲ中に必ずしも存在しない、ネイティブな膜貫通ドメインを介するＣＤ３とＴＣＲとの間の相互作用を提唱する最近の報告と一致し（Birnbaum et al.、前出；Krshnan et al.、前出）、従って、おそらくＣＤ２８膜貫通ドメインの存在に起因して、ＴＣＲ−ＣＡＲが内因性ＴＣＲシグナル伝達機構とは独立して作用し得ることを示す。古典的ＣＡＲ構築物に関しては、ＣＤ２８膜貫通ドメインの存在に起因して、構築物が「ＣＤ３ブロック」をバイパスすると予測されることが意図された。
【０１３８】
また、ネイティブなＴＣＲ膜貫通ドメインを欠損失しているＴＣＲ−ＣＡＲは、内因性ＣＤ３について競合しないことが予想された。Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲおよびＴＣＲ−ＣＡＲは、特異的Ｖｂ抗体によって検出したところ、同様のレベルで発現された。このことは、Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ−ＣＡＲが、十分に折り畳まれ、そしてＶｂおよびＶａ鎖を含んでいたことを示す。一方、ＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲはより低い効率で産生された。これは驚くべきことであった。なぜなら、このＴＣＲは、ｓＴＣＲ２３として調製された場合に非常に安定であったからである。ソーティングされた細胞でさえ、数継代後にＭＡＲＴ−１−デキストラマー陽性シグナルを失う傾向を有することが観察された。このことは、ＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲが、高レベルでそれを発現する細胞に対して有害になり得ることを示す。デキストラマー染色は、Ｖｂ染色よりも厳密な発現の尺度である。なぜなら、デキストラマーは、適正に折り畳まれ、そしてヘテロ二量体化されたＴＣＲ鎖のみを検出するからである。結論として、両方のＴＣＲ−ＣＡＲ構築物はＪ７６細胞において膜で発現されたが、そのレベルは完全長ＴＣＲよりも低いことが観察された。これは、ＴＣＲ−ＣＡＲ構築物の乏しい安定性に起因し得る。しかし、ＣＤ３依存性の欠如は、完全長ＴＣＲの古典的過剰発現を上回る大きな利点を表す。なぜなら、このことは、ＴＣＲ−ＣＡＲ発現がＴ細胞以外の細胞に拡張され得ることも意味するからである。
【０１３９】
ＴＣＲ−ＣＡＲによって再指向されたＴ細胞。ＴＣＲの活性を、関連ペプチドを負荷した特異的ＭＨＣについて陽性の標的細胞を使用する機能性アッセイにおいて評価することができる。ＴＣＲ−ＣＡＲを、ｍＲＮＡエレクトロポレーションによって、ＰＢＭＣから単離された初代Ｔ細胞中に導入し（Krshnan et al.、前出）、そしてタンパク質発現をフローサイトメトリーによって分析した（図３ａ）。示すように、両方の完全長ＴＣＲは十分に発現されており、ＴＣＲ−ＣＡＲはＲａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲよりも低いレベルで検出され、そしてＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲは多量体によって検出されなかった。多量体染色は高感度の方法ではないので、ＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲが多量体によって検出されなかったという事実は、タンパク質が存在しなかったことを意味しない。
【０１４０】
それゆえ、初代Ｔ細胞が特異的標的に対して再指向され得るかどうかを試験した。ここで使用した両方のＴＣＲはＨＬＡ−Ａ２拘束性であるので、骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２を、ＨＬＡ−Ａ２を用いて形質導入し、そしてＡＰＣとして使用した。示されるペプチドを前負荷したこれらの細胞を、ＴＣＲ−ＣＡＲ再指向Ｔ細胞と共にインキュベートした。Ｔ細胞の形質膜における脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの存在を検出することによって、Ｔ細胞の活性化を５時間後にモニターした。示すように（図３ｂ）、ｐＭＨＣの適正な組み合わせのみがＴＣＲ−ＣＡＲによって認識された。モックエレクトロポレーションしたＴ細胞を陰性対照として使用し、そしてこれは刺激を示さなかった。ＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲをエレクトロポレーションした場合、わずかではあるが有意な活性化が観察された（図３ｂ）。このことは、Ｔ細胞におけるＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲの発現は検出可能でなかったが、いくらかのＴＣＲ−ＣＡＲ活性がなおモニターされたことを示す。これは、特異的抗ＣＡＲ抗体によって検出可能でないタンパク質レベルでさえ、活性が存在したことを示す、ｍＲＮＡがエレクトロポレーションされた従来のＣＡＲ  Ｔ細胞を使用した以前の観察と一致する（Almasbak et al.、前出）。一方、Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ−ＣＡＲは、持続的なｐＭＨＣ特異的刺激を示し、これはＶｂ３染色によって検出されたＴＣＲ−ＣＡＲの発現と一致した（図３ａ）。ＴＣＲ−ＣＡＲが誘導し得た刺激のレベルを研究するために、Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ−ＣＡＲを完全長Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲと比較する実験を反復し、そして両方の構築物が脱顆粒を誘発する能力を有することが実証された（図３ｃ）。
【０１４１】
最後に、Ｔ細胞を再指向させそしてサイトカイン放出および標的細胞死滅を誘発する構築物の能力をアッセイした。ＣＤ１０７ａ発現と一致して、ＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲはサイトカイン放出を誘発しなかったが、ペプチド負荷ＡＰＣを有意に死滅させた（それぞれ、図３ｄおよびｅ）。一方、Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ−ＣＡＲ再指向Ｔ細胞は、ペプチド依存性にサイトカインを産生し、そして特異的なペプチドを負荷した標的細胞を有意に死滅させることができた（図３ｄおよびｅ）。Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲは、両方のアッセイにおいてＴＣＲ−ＣＡＲよりも効率的に作用したが、ＴＣＲ−ＣＡＲ構築物は、統計的有意性に達して、機能性であった。このことは、この受容体が強力であったことを示す。まとめると、データは、ＴＣＲ−ＣＡＲ構築物を初代Ｔ細胞において発現させた場合：（１）人工シグナル伝達ドメインに融合された場合に、ＴＣＲ−ＣＡＲの認識部分がその特異性を維持し、そして（２）ＴＣＲに融合された場合に、シグナル伝達部分が、内因性シグナル伝達コンポーネントをリクルートして、脱顆粒および標的細胞死滅を誘発し得たことを示す。両方のＴＣＲ−ＣＡＲについての値は、完全長構築物について得られた値よりも低かったが、ＴＣＲ−ＣＡＲは機能性であった。これは、完全長ＴＣＲとＴＣＲ−ＣＡＲとの間の発現の差によって大部分は説明されるが、抗体ではなくＴＣＲ由来の標的認識ドメインを使用した場合のＴ細胞に対して至適でないシグナル伝達のような他の機構によっても影響され得る。このことは、ＴＣＲ−ＣＡＲ設計が改善され得るので重要である：抗体ベースのＣＡＲは、その標的に対して高い親和性を有し、そしてタンデムＣＤ２８−ＣＤ３ζシグナル伝達モジュールは、高親和性結合に十分であり得る。
【０１４２】
ＣＡＲと比較して、ｐＭＨＣへのＴＣＲの結合は相対的に低親和性であると考えられ、そして、サイトカイン放出および死滅効率を至適化するために、ＴＣＲ−ＣＡＲ構築物におけるシグナル伝達ボックスの数または効力を増加させることが助けになり得る。患者Ｔ細胞のＴＣＲ再指向は、様々な手段によって向上され得るが（Daniel-Meshulam et al、前出）、シグナル伝達に影響を及ぼすことは稀にしか利用されていない（Palmer, D. C. et al. Cish actively silences TCR signalling in CD8+ T cells to maintain tumor tolerance. J. Exper. Med. 212, 2095-2113, (2015)）。実際、ＣＤ３過剰発現によりＴＣＲ再指向効力が向上され得ることが以前に報告された（Ahmadi, M. et al. CD3 limits the efficacy of TCR gene therapy in vivo. Blood 118, 3528-3537, (2011)）。この向上は、内因性ＴＣＲを含む、形質膜におけるＴＣＲ分子数の増加に起因し得、これは誤対合の増加を、従って、オフターゲット効果をもたらし得る。ＴＣＲ−ＣＡＲはＣＤ３について競合せず、そして内因性ＴＣＲの存在によって影響されることなくシグナル伝達した。
【０１４３】
ＮＫ細胞のＴ細胞様再指向。
【０１４４】
それ自体のシグナル伝達ユニットを有するＴＣＲ−ＣＡＲは、Ｔ細胞以外のキラー細胞を再指向させ得る。これを、非Ｔ細胞株であるＮＫ−９２（これは、臨床的に承認されているナチュラルキラー細胞株である）を再指向させることによって試験した（Klingemann, H., et al., Natural Killer Cells for Immunotherapy - Advantages of the NK-92 Cell Line over Blood NK Cells. Front. Immunol. 7, 91, (2016)；Suck, G. et al. NK-92: an ‘off-the-shelf therapeutic’ for adoptive natural killer cell-based cancer immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother.: CII 65, 485-492,  (2016)）。まず、ＮＫ−９２細胞が完全長ＴＣＲを発現することができないことを、Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲまたはＲａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ−ＣＡＲのいずれかをコードするｍＲＮＡを用いてそれらをエレクトロポレーションし、そしてそれらを抗Ｖｂ３抗体で染色することによって確認した（図５）。示すように、ＴＣＲ−ＣＡＲ構築物のみがＮＫ−９２の細胞表面において検出され、一方、同じ条件で、Ｔ細胞株Ｊ７６は両方の構築物を発現した。それゆえ、ＮＫ−９２細胞は、その細胞表面において完全長ＴＣＲを発現することができなかった。ＮＫ−９２細胞を、ＴＣＲ−ＣＡＲ構築物を用いてレトロウイルスで形質導入し、そして、２回のスピノキュレーションの後、Ｖｂ３陽性ＮＫ−９２細胞の大きな集団が得られた。このことは、ＴＣＲ−ＣＡＲが、非Ｔ細胞株の表面において安定に発現させられ、折り畳まれ、そして標的化され得ることを示す（図４ａ）。対照的に、ＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲは、多量体を使用して検出されなかった（図４ａ）。次いで、非Ｔ細胞エフェクター細胞株ＮＫ−９２におけるＴＣＲ−ＣＡＲの活性を研究するために、機能性アッセイを行った。この目的のために標的細胞を変更した。なぜなら、Ｋ５６２は、ＮＫ細胞標的として一般的に使用されており、そして上昇したバックグラウンド応答を生成し得、従ってＴＣＲ刺激の影響を低下させ得るからである。
【０１４５】
ＣＤ１０７ａを検出する機能性アッセイにおいて、様々な標的細胞の存在下でＣＤ１０７ａシグナルが高いことが観察された。これは、腫瘍細胞株に対するＮＫ−９２の天然の反応性に起因し得る。様々なＨＬＡ−Ａ２陽性細胞株を試験し、そして、死滅アッセイにおいてＮＫ−９２に対して「最も耐性があり」そしてＢ細胞リンパ腫細胞株であるＧｒａｎｔａ−５１９（ＨＬＡ−Ａ２陽性のトランスフォームされたマントル細胞リンパ腫）が最も低い反応性を示した。それを、関連ペプチドの負荷後のまたは負荷なしの、ＮＫ−９２−ＴＣＲ−ＣＡＲと共インキュベートし、そして再指向されたＮＫ−９２細胞のサイトカイン放出および死滅活性をアッセイした（それぞれ、図４ｂおよびｃ）。標的刺激の際の脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａ発現および様々なサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）をアッセイした。示すように、Ｇｒａｎｔａ−５１９とともにインキュベートしたＮＫ−９２は、ＮＫ−９２単独と比較して、刺激された（図４ｂ、白色のカラム）。しかし、ペプチド負荷した標的の存在下でＴＣＲ−ＣＡＲをＮＫ−９２において発現させた場合、刺激は有意に増加した。このように、両方のＴＣＲ−ＣＡＲは、ＮＫ−９２細胞において発現され、そして、たとえ検出可能でなくても、ｐＭＨＣ特異的サイトカイン放出を誘発することができた。全体的なバックグラウンドはＴＣＲ−ＣＡＲ発現細胞においてより高かった。このことは、構築物が機能性であり、そしてその標的と結合することなくＮＫ−９２細胞のいくらかの活性化を与えたことを示す。次に、ＮＫ−９２およびＮＫ−９２−ＴＣＲ−ＣＡＲ細胞の標的細胞を死滅させる能力を試験した（図４ｃ）。低いＥ：Ｔ比においてさえ、ペプチド負荷細胞の増強された死滅が観察された。このことは、死滅が鋭敏であったことを示す。さらに、高いＥ：Ｔ比において、ＮＫ−９２細胞はｐＭＨＣの存在とは独立して標的細胞を死滅させることができ（図４ｃの丸、３つの条件での最大死滅はＥ：Ｔ  １：２５で３０％である）、ＴＣＲ−ＣＡＲ発現は標的の認識および死滅を劇的に向上させた。多量体染色によっては検出可能でなかったが、ＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲ改変ＮＫ−９２細胞は、非改変ＮＫ−９２細胞よりもＭＡＲＴ−１ペプチド負荷腫瘍細胞のはるかに強力なキラーとなった。このことは、このＴＣＲ−ＣＡＲが、低発現においてさえも、活性でありそして特異的であったことを示す。
【０１４６】
非負荷Ｇｒａｎｔａ−５１９を標的として使用して死滅を行った（図４ｃ、右パネル）。これは、ペプチドの存在下での特異的ＴＣＲ依存性死滅にもかかわらず、非負荷標的の死滅が、ＮＫ−９２細胞と比較して、ＴＣＲ−ＣＡＲ発現ＮＫ−９２細胞によって、より高い程度に、そしてＥ：Ｔ比依存的に観察されたことを示した。これは、ＴＣＲ−ＣＡＲを発現するＮＫ−９２細胞における基底のサイトカイン放出の増加と一致しており（図４ｂ、黒色および灰色のカラム）、そしてＴＣＲ−ＣＡＲの存在がＮＫ−９２細胞を活性化したことを実証する。
【０１４７】
結論として、ＴＣＲ−ＣＡＲは、Ｔ細胞以外の細胞を再指向させて、ＴＣＲ依存性死滅を生じさせることができた。まとめると、これらのデータは、ＴＣＲ−ＣＡＲが、ＴＣＲ発現スペクトルをＴ細胞以外の細胞に拡大することを示す。ＮＫ−９２細胞は以前に、裸か、またはＣＡＲを用いて再指向されるかのいずれかで利用されていた。腫瘍特異的表面抗原標的は希少であるので、ＴＣＲ−ＣＡＲ再指向は、ＮＫ細胞ベースの養子移入の標的化のための新たな機会を開く。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】ＴＣＲ−ＣＡＲ構築物の設計。（ａ）ＴＣＲ−ＣＡＲ遺伝子設計。ＴＣＲαおよびβ鎖を、それらの膜貫通領域（ＴＭ）またはドメインのレベルで短縮化し、システインをそれらの定常ドメインに付加し、そして２つの鎖を２Ａペプチド配列によって連結した。（ｂ）ｓＴＣＲは、可溶性タンパク質として産生され、これはおそらく、小胞分泌経路に従って、細胞媒質中に放出された（左）。適正な折り畳みは、ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体への特異的結合およびＣＤ２８−ＣＤ３シグナル伝達テイルを介したシグナル伝達を確実にするはずである（右）。
【図２】ＴＣＲ−ＣＡＲの膜発現。（ａ）ＤＭＦ５  ＴＣＲおよびＴＣＲ−ＣＡＲをＪ７６細胞株において発現させた。（ｂ）（ａ）と同じであるが、Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ（平坦線）およびＴＣＲ−ＣＡＲ（点線）を発現させ、そしてＪ７６細胞を抗Ｖｂ３抗体（Ｖｂ）を用いて染色した。（ｃ）ＡおよびＢにおけるような細胞を抗ＣＤ３抗体を用いて染色した。
【図３−１】ＴＣＲ−ＣＡＲの機能活性。（ａ）健常ドナーから単離された初代末梢Ｔ細胞を、モックエレクトロポレーションするか、またはＲａｄｉｕｍ−１もしくはＤＭＦ５構築物をコードするｍＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。（ｂ）同じ細胞を、１８時間後に、示されるペプチドを負荷したＡＰＣと５時間共インキュベートした（灰色＝ペプチドなし、白色＝ＴＧＦｂＲ２ペプチドおよび黒色＝ＭＡＲＴ−１ペプチド）。（ｃ）（ｂ）と同じであるが、ここではＲａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ−ＣＡＲを完全長Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲと比較した。ＤＭＦ５を、Ｍ１負荷についての対照として含めた。（ｄ）ＤＭＦ５（黒色）またはＲａｄｉｕｍ−１（灰色）ＴＣＲ−ＣＡＲおよび完全長構築物を発現するＴ細胞を、ＣＤ８集団における示されるサイトカインの応答について分析した。（ｅ）（ｄ）と同じであるが、ここで、示されるペプチドを負荷した標的細胞の特異的溶解を分析した。
【図３−２】図３の続きである。
【図３−３】図３の続きである。
【図４−１】ＴＣＲ−ＣＡＲは、ＮＫ−９２細胞を再指向させることができる。（ａ）ＮＫ−９２細胞を、トランスフェクトしないか（灰色）またはＤＭＦ５  ＴＣＲ−ＣＡＲを用いてトランスフェクトした。（ｂ）同族ペプチドを負荷したか（＋）または負荷していない（−）Ｇｒａｎｔａ−５１９での、プレーンのＮＫ−９２細胞（白色）またはＴＣＲ−ＣＡＲ構築物を用いてトランスフェクトしたもの（ＤＭＦ５、黒色、およびＲａｄｉｕｍ−１、灰色）の刺激を、１：２のＥ：Ｔ比で６時間行った。（ｃ）ＢＬＩ細胞傷害性アッセイにおける、異なるＥ：Ｔ比での、プレーンのＮＫ−９２（丸）またはＴＣＲ−ＣＡＲを発現するＮＫ−９２（四角）による、示されるペプチド（ＭＡＲＴ−１ペプチド、黒色、ＴＧＦｂＲ２ペプチド、白色、ペプチドなし、灰色）を負荷した標的細胞の特異的溶解。
【図４−２】図４の続きである。
【図５】Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲおよびＴＣＲ−ＣＡＲの発現分析。Ｊ７６およびＮＫ−９２細胞を、水（灰色）、Ｒａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ  ｍＲＮＡ（実線）またはＲａｄｉｕｍ−１  ＴＣＲ−ＣＡＲ  ｍＲＮＡ（破線）を用いてエレクトロポレーションした。
【図６】（上）は、その最も重要なドメインを含む天然に生じるαβＴＣＲの構造（縮尺率を示すものではない）を示す。図６（下）は、本明細書における２つの実験によるＴＣＲ−ＣＡＲの構造（縮尺率を示すものではない）を視覚化している。
【図７】いかにして配列番号３によって表されるα鎖の定常ドメインが、配列番号４によって表されるβ鎖の定常ドメインに連結され得るかを示す。
【図８−１】例示的なＣＡＲ構築物の配列を示す。
【図８−２】図８の続きである。
【図８−３】図８の続きである。
【図８−４】図８の続きである。
【図８−５】図８の続きである。
【図８−６】図８の続きである。
【図８−７】図８の続きである。
【図８−８】図８の続きである。
【図８−９】図８の続きである。
【図８−１０】図８の続きである。
【図１】
2021500875.tif 000004
【図２】
2021500875.tif 000005
【図３−１】
2021500875.tif 000006
【図３−２】
2021500875.tif 000007
【図３−３】
2021500875.tif 000008
【図４−１】
2021500875.tif 000009
【図４−２】
2021500875.tif 000010
【図５】
2021500875.tif 000011
【図６】
2021500875.tif 000012
【図７】
2021500875.tif 000013
【図８−１】
2021500875.tif 000014
【図８−２】
2021500875.tif 000015
【図８−３】
2021500875.tif 000016
【図８−４】
2021500875.tif 000017
【図８−５】
2021500875.tif 000018
【図８−６】
2021500875.tif 000019
【図８−７】
2021500875.tif 000020
【図８−８】
2021500875.tif 000021
【図８−９】
2021500875.tif 000022
【図８−１０】
2021500875.tif 000023
【配列表】
2021500875000001.app
【国際調査報告】
2021500875.tif 000024
2021500875.tif 000025
2021500875.tif 000026