(57)【要約】【課題】ＳＬＣ４５Ａ２と選択的に結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＴＣＲ可変領域が提供される。【解決手段】本発明のＴＣＲは、ガン（例えば、皮膚黒色腫、ぶどう膜黒色腫、粘膜黒色腫または転移性黒色腫など）を処置するための様々な治療法（例えば、自家細胞移植など）において利用され得る。ＳＬＣ４５Ａ２を標的とするＴ細胞の集団を拡大するための方法もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５もしくは配列番号４５のアミノ酸配列を有するアルファ鎖ＣＤＲ３、および／または配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０もしくは配列番号５０のアミノ酸配列を有するベータ鎖ＣＤＲ３を含む操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項２】
操作されたＴＣＲはＨＬＡ−Ａ２と結合する、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
操作されたＴＣＲはＨＬＡ−Ａ＊０２０１と結合する、請求項２に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
操作されたＴＣＲはＨＬＡ−Ａ２４と結合する、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
操作されたＴＣＲはＨＬＡ−Ａ＊２４０２と結合する、請求項４に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２もしくは配列番号４２のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の同一性を有するアルファ鎖可変領域、および／または配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７もしくは配列番号４７のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の同一性を有するベータ鎖可変領域を含む、請求項６に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２もしくは配列番号４２のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の同一性を有するアルファ鎖可変領域、および／または配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７もしくは配列番号４７のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の同一性を有するベータ鎖可変領域を含む、請求項６に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２もしくは配列番号４２のアミノ酸配列に対する少なくとも９９％の同一性を有するアルファ鎖、および／または配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７もしくは配列番号４７のアミノ酸配列に対する少なくとも９９％の同一性を有するベータ鎖を含む、請求項６に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２もしくは配列番号４２のアルファ鎖、および／または配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７もしくは配列番号４７のベータ鎖を含む、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１もしくは配列番号４１のヌクレオチド配列に対する少なくとも９５％の同一性を有するアルファ鎖、および／または配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６もしくは配列番号４６のヌクレオチド配列に対する少なくとも９５％の同一性を有するベータ鎖を含む、請求項６に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
配列番号１、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１もしくは配列番号４１のヌクレオチド配列を含むアルファ鎖、および／または配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６もしくは配列番号４６のヌクレオチド配列を含むベータ鎖を含む、請求項６に記載のＴＣＲ。
【請求項１２】
可溶性ＴＣＲとしてさらに定義され、ただし、該可溶性ＴＣＲは膜貫通ドメインを含まない、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１３】
検出可能な標識をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１４】
治療剤に共有結合により結合させられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１５】
前記治療剤が免疫毒素または化学療法剤である、請求項１４記載のＴＣＲ。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の複数のＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体。
【請求項１７】
相互に結合した２つ、３つ、４つまたはそれ以上のＴＣＲを含む、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１８】
脂質二重層に存在する、またはリポソームに存在する、またはナノ粒子に付着させられる、請求項１７に記載の複合体。
【請求項１９】
前記ＴＣＲがリンカー分子を介して相互に結合する、請求項１７に記載の複合体。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードするポリペプチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードする発現ベクター。
【請求項２３】
前記ＴＣＲをコードする配列がプロモーターの制御下にある、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
ウイルスベクターである、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項２４に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
リンカードメインをさらにコードする、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
前記リンカードメインが前記アルファ鎖と前記ベータ鎖との間に配置される、請求項２６に記載の発現ベクター。
【請求項２８】
前記リンカードメインが１つまたは複数の切断部位を含む、請求項２６に記載の発現ベクター。
【請求項２９】
前記１つまたは複数の切断部位がフリン切断部位および／またはＰ２Ａ切断部位である、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
前記フリン切断部位がＲＡＫＲである、請求項２９に記載の発現ベクター。
【請求項３１】
前記フリン切断部位がＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号５１）である、請求項２９に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
前記１つまたは複数の切断部位がスペーサーによって隔てられる、請求項２６に記載の発現ベクター。
【請求項３３】
前記スペーサーがＳＧＳＧまたはＧＳＧである、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴＣＲを発現するように操作される宿主細胞。
【請求項３５】
Ｔ細胞、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
免疫細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
臍帯から単離される、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはγδＴ細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
前記Ｔ細胞が調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
自家である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
同種である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
請求項３４に記載の宿主細胞を操作するための方法であって、前記免疫細胞を請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴＣＲまたは請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の発現ベクターと接触させることを含む、方法。
【請求項４３】
前記免疫細胞がＴ細胞または末梢血リンパ球である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
接触させることがさらに、トランスフェクションすること、または形質導入することとして定義される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
トランスフェクションすることが、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードするＲＮＡを前記免疫細胞にエレクトロポレーションすることを含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
請求項２２に記載の発現ベクターからのウイルス上清を前記免疫細胞への形質導入の前に生成させることをさらに含む、請求項４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記免疫細胞が、刺激されたリンパ球である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記刺激されたリンパ球がヒトリンパ球である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
刺激することが、前記免疫細胞をＯＫＴ３および／またはＩＬ−２と接触させること、あるいは前記免疫細胞をＯＫＴ３および／またはＩＬ−２においてインキュベーションすることを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫細胞を選別して、ＴＣＲ操作Ｔ細胞を単離することをさらに含む、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
Ｔ細胞クローニングを連続希釈によって行うことをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｔ細胞クローンを迅速拡大プロトコルによって拡大することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ガンを対象において処置する方法であって、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載のＴＣＲ操作された細胞の効果的な量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５４】
前記対象が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１対立遺伝子を有すると特定される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２対立遺伝子を有すると特定される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＴＣＲ操作された細胞がＴ細胞または末梢血リンパ球である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＴｒｅｇである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記ガンが黒色腫である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記黒色腫が、皮膚黒色腫、ぶどう膜黒色腫、粘膜黒色腫または転移性黒色腫である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象がヒトである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＴＣＲ操作された細胞が自家または同種である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
ＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞の投与に先立つ前記対象のリンパ球除去をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６３】
リンパ球除去がシクロホスファミドおよび／またはフルダラビンの投与を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
第２の抗ガン療法を施すことをさらに含む、請求項５３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記療法が、化学療法、免疫療法、手術、放射線療法または生物学的療法である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＴＣＲ操作された細胞、および／または前記少なくとも第２の治療剤が、静脈内投与、腹腔内投与、気管内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、内視鏡的投与、病巣内投与、経皮投与、皮下投与、局所投与によって、または直接注入もしくは灌流によって投与される、請求項５３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象が、ＳＬＣ４５Ａ２を過剰発現するガン細胞を有すると判定される、請求項５３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国仮特許出願第６２／５７１，４４７号（２０１７年１０月１２日出願、これはその内容全体が本明細書により参照によって組み込まれることになっている）の優先権を主張する。
【０００２】
（配列表の組み込み）
「ＵＴＦＣＰ１３１４ＷＯ．ｔｘｔ」という名前のファイル（４４．７ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓで測定される場合）、２０１８年１０月１２日作成）に含まれる配列表が電子提出によって本明細書とともに提出され、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００３】
本発明は一般には、免疫学および医学の分野に関連する。より具体的には、本発明はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。いくつかの実施形態において、本発明のＴＣＲは、ガンを処置するために使用される場合がある。
【背景技術】
【０００４】
Ｔ細胞に基づく様々な治療法が、多くのガンを処置するための方法として著しく有望であることが示されてきている。しかしながら、残念なことに、この取り組みはまた、免疫原性抗原標的が一般的なガンについては少ないこと、および非ガン性組織に対する潜在的な毒性によって妨げられている。Ｔ細胞に基づくこれらの治療法として、養子細胞移入（ＡＣＴ）およびワクチン接種による取り組みを挙げることができる。ＡＣＴでは一般に、多数の自家の活性化された腫瘍特異的Ｔ細胞を、例えば、ガンを処置するために患者に注入することが伴う。ＡＣＴは治療的臨床応答を黒色腫患者においてもたらしている（Ｙｅｅ、２００２；Ｄｕｄｌｅｙ、２００２；Ｙｅｅ、２０１４）。一般には、効果的な抗腫瘍Ｔ細胞応答を発達させるために、通常、下記の３つの工程が必要である：抗原特異的Ｔ細胞を抗原刺激し、活性化すること、活性化されたＴ細胞を腫瘍部位に遊走させること、および腫瘍が抗原特異的Ｔ細胞によって認識され、殺傷されること。標的抗原の選択は、効果的な抗原特異的Ｔ細胞を誘導するために重要である。
【０００５】
いくつかの腫瘍関連抗原が黒色腫および数えるほどの他の固形腫瘍悪性腫瘍について特定されているが、膵臓ガン、卵巣ガン、胃ガン、肺ガン、子宮頸ガン、乳ガンおよび頭頸部ガンについては免疫原性標的がほとんど知られていない。これらの一般的かつ処置困難な悪性腫瘍のための新規なエピトープおよび標的抗原を特定し、検証することには、十分な意義がある。
【発明の概要】
【０００６】
ある特定の実施形態において、本開示は、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５もしくは配列番号４５のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）の同一性を有するアルファ鎖ＣＤＲ３、および／または配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０もしくは配列番号５０のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）の同一性を有するベータ鎖ＣＤＲ３を含む操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。特定の局面において、ＴＣＲは、配列番号５および配列番号１０、配列番号１５および配列番号２０、配列番号２５および配列番号３０、配列番号３５および配列番号４０、または配列番号４５および配列番号５０のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。特定の局面において、ＴＣＲは、配列番号３〜配列番号５および配列番号８〜配列番号１０、配列番号１３〜配列番号１５および配列番号１８〜配列番号２０、配列番号２３〜配列番号２５および配列番号２８〜配列番号３０、配列番号３３〜配列番号３５および配列番号３８〜配列番号４０、または配列番号４３〜配列番号４５および配列番号４８〜配列番号５０のＣＤＲ１アミノ酸配列、ＣＤＲ２アミノ酸配列およびＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。いくつかの局面において、操作されたＴＣＲは、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ２４および／またはＨＬＡ−Ａ＊２４０２と結合する。
【０００７】
ある特定の局面において、ＴＣＲは、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２もしくは配列番号４２のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）の同一性を有するアルファ鎖可変領域、および／または配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７もしくは配列番号４７のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）の同一性を有するベータ鎖可変領域を含む。特定の局面において、ＴＣＲは、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２もしくは配列番号４２のアルファ鎖、および／または配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７もしくは配列番号４７のベータ鎖を含む。いくつかの局面において、ＴＣＲは、配列番号２および配列番号７、配列番号１２および配列番号１７、配列番号２２および配列番号２７、配列番号３２および配列番号３７、または配列番号４２および配列番号４７のアルファ鎖およびベータ鎖（それぞれ）を含む場合がある。特定の局面において、ＴＣＲは、ＣＤＲ領域の配列が不変のままである一方で、アルファ鎖および／またはベータ鎖の可変領域の配列が変動する場合がある。
【０００８】
いくつかの局面において、ＴＣＲは、配列番号１、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１もしくは配列番号４１のヌクレオチド配列に対する少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）の同一性を有するアルファ鎖、および／または配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６もしくは配列番号４６のヌクレオチド配列に対する少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）の同一性を有するベータ鎖を含む。具体的な局面において、ＴＣＲは、配列番号１、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１もしくは配列番号４１のヌクレオチド配列を含むアルファ鎖、および／または配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６もしくは配列番号４６のヌクレオチド配列を含むベータ鎖を含む。
【０００９】
ある特定の局面において、ＴＣＲはさらに、可溶性ＴＣＲとして定義され、ただし、可溶性ＴＣＲは膜貫通ドメインを含まない。
【００１０】
いくつかの局面において、ＴＣＲはさらに、検出可能な標識を含む。ある特定の局面において、ＴＣＲは治療剤に共有結合により結合させられる。具体的な局面において、治療剤は免疫毒素または化学療法剤である。
【００１１】
さらに本明細書中には、上記実施形態に記載の複数のＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体が提供される。いくつかの局面において、多価ＴＣＲは、相互に結合する２つ、３つ、４つまたはそれ以上のＴＣＲを含む。特定の局面において、多価ＴＣＲは脂質二重層に存在し、またはリポソームに存在し、またはナノ粒子に付着させられる。いくつかの局面において、ＴＣＲは、リンカー分子を介して相互に結合する。
【００１２】
別の実施形態において、上記実施形態に記載のＴＣＲをコードするポリペプチドが提供される。本明細書中にはまた、上記実施形態に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
さらなる実施形態により、上記実施形態に記載のＴＣＲをコードする発現ベクターが提供される。いくつかの局面において、ＴＣＲをコードする配列はプロモーターの制御下にある。特定の局面において、発現ベクターはウイルスベクターである。１つの具体的な局面において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの局面において、ベクターはさらに、リンカードメインをコードする。いくつかの局面において、リンカードメインは、アルファ鎖とベータ鎖との間に配置される。ある特定の局面において、リンカードメインは１つまたは複数の切断部位を含む。いくつかの局面において、１つまたは複数の切断部位はフリン切断部位および／またはＰ２Ａ切断部位である。いくつかの局面において、フリン切断部位はＲＡＫＲである。他の局面において、フリン切断部位はＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ（配列番号５１）である。ある特定の局面において、１つまたは複数の切断部位はスペーサーによって隔てられる。具体的な局面において、スペーサーはＳＧＳＧまたはＧＳＧである。
【００１４】
別の実施形態において、上記実施形態に記載のＴＣＲを発現するように操作される宿主細胞が提供される。いくつかの局面において、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。ある特定の局面において、宿主細胞は免疫細胞である。特定の局面において、宿主細胞は臍帯から単離される。いくつかの局面において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはγδＴ細胞である。特定の局面において、Ｔ細胞は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。いくつかの局面において、細胞は自家である。特定の局面において、細胞は同種である。
【００１５】
さらなる実施形態により、実施形態に記載の宿主細胞を操作するための方法であって、前記免疫細胞を上記実施形態に記載のＴＣＲまたは上記実施形態に記載の発現ベクターと接触させることを含む方法が提供される。いくつかの局面において、免疫細胞はＴ細胞または末梢血リンパ球である。ある特定の局面において、接触させることはさらに、トランスフェクションすること、または形質導入することとして定義される。いくつかの局面において、トランスフェクションすることは、上記実施形態に記載のＴＣＲをコードするＲＮＡを免疫細胞にエレクトロポレーションすることを含む。
【００１６】
さらなる局面において、上記方法はさらに、上記実施形態に記載のＴＣＲをコードする発現ベクターからのウイルス上清を免疫細胞への形質導入の前に生成させることを含む。
【００１７】
いくつかの局面において、免疫細胞は、刺激されたリンパ球である。ある特定の局面において、刺激されたリンパ球はヒトリンパ球である。ある特定の局面において、刺激することは、免疫細胞をＯＫＴ３および／またはＩＬ−２と接触させること、あるいは免疫細胞をＯＫＴ３および／またはＩＬ−２においてインキュベーションすることを含む。
【００１８】
いくつかの局面において、上記方法はさらに、免疫細胞を選別して、ＴＣＲ操作されたＴ細胞を単離することを含む。ある特定の局面において、上記方法はさらに、Ｔ細胞クローニングを連続希釈によって行うことを含む。いくつかの局面において、上記方法はさらに、Ｔ細胞クローンを迅速拡大プロトコルによって拡大することを含む。
【００１９】
別の実施形態において、ガンを対象において処置する方法であって、上記実施形態に記載のＴＣＲ操作された細胞の効果的な量を対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの局面において、対象は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１対立遺伝子またはＨＬＡ−Ａ＊２４０２対立遺伝子を有すると特定される。いくつかの局面において、対象はヒトである。
【００２０】
ある特定の局面において、ＴＣＲ操作された細胞はＴ細胞または末梢血リンパ球である。具体的な局面において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＴｒｅｇである。
【００２１】
いくつかの局面において、ガンは黒色腫である。特定の局面において、黒色腫は、皮膚黒色腫、ぶどう膜黒色腫、粘膜黒色腫または転移性黒色腫である。ある特定の局面において、ＴＣＲ操作された細胞は自家または同種である。
【００２２】
さらなる局面において、上記方法はさらに、ＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞の投与に先立つ対象のリンパ球除去を含む。いくつかの局面において、リンパ球除去は、シクロホスファミドおよび／またはフルダラビンの投与を含む。
【００２３】
いくつかの局面において、上記方法はさらに、第２の抗ガン療法を施すことを含む。ある特定の局面において、療法は、化学療法、免疫療法、手術、放射線療法または生物学的療法である。いくつかの局面において、ＴＣＲ操作された細胞、および／または少なくとも第２の治療剤は、静脈内投与、腹腔内投与、気管内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、内視鏡的投与、病巣内投与、経皮投与、皮下投与、局所的投与、または直接注入もしくは灌流によって投与される。ある特定の局面において、対象は、ＳＬＣ４５Ａ２を過剰発現するガン細胞を有すると判定される。
【００２４】
ある特定の実施形態において、本開示は、ＳＬＣ４５Ａ２と選択的に結合するＴＣＲを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるＴＣＲ配列のアルファ部分およびベータ部分は、養子Ｔ細胞療法において使用され得るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれる場合がある。いくつかの実施形態において、ＴＣＲのアルファ部分およびベータ部分は、例えば、黒色腫を処置するために使用することができるＤＮＡにコードされる場合がある。代替において、ＴＣＲのアルファ可変領域およびベータ可変領域はタンパク質（例えば、ＴＣＲまたは可溶化タンパク質など）に含まれ、抗ガン療法（例えば、養子免疫療法など）において使用される場合がある。いくつかの好ましい実施形態において、ＴＣＲ、ＣＡＲ、または可溶性ペプチドは、ＳＬＣ４５Ａ２と特定のエピトープ（例えば、ＳＬＣ４５Ａ２３８２〜３９０またはＳＬＣ４５Ａ２３９３〜４０２の免疫原性エピトープなど）において選択的に結合する。ＴＣＲは非ガン性細胞に対する毒性における軽減をもたらし得ること、および、黒色腫（例えば、皮膚黒色腫、ぶどう膜黒色腫、粘膜黒色腫）の処置のために特に有用であり得ることが予想される。いくつかの実施形態において、クローニングされたＴ細胞受容体はキメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）に含まれ、養子Ｔ細胞移入または免疫療法において使用される場合がある。
【００２５】
いくつかの局面において、本開示は、ＨＬＡ−Ａ２陽性のガン患者を直接に処置するために使用することができる可溶性ＴＣＲを提供する。可溶性である二重特異性のＴ細胞会合分子を、ＳＬＣ４５Ａ２  ＴＣＲをＣＤ３特異的Ｆａｂフラグメントに連結することによって得ることができる。Ｔ細胞会合ＴＣＲは、それぞれのペプチド／ＭＨＣ複合体を提示することによって腫瘍細胞表面と結合し、その後、Ｆａｂフラグメントは、抗原暴露を受けたＣＤ８＋Ｔ細胞の表面においてＴＣＲを架橋し、それにより、細胞の活性化および標的細胞の排除をもたらすことができる。したがって、この可溶性の二重特異性ＴＣＲ構築物は、ガン患者を直接に処置するために使用することができる。
【００２６】
最後に、可溶性ＴＣＲは、腫瘍細胞におけるペプチド／ＭＨＣの診断評価のためのプローブとして、または治療分子を腫瘍部位に向かわせるために使用することができる。この可溶性ＴＣＲ分子はまた、トレーサー（例えば、蛍光プローブまたは放射性プローブなど）により標識され、その後、腫瘍細胞におけるペプチド／ＭＨＣの提示の診断評価のために使用され得るであろう。さらには、この可溶性ＴＣＲ分子は様々な治療分子（例えば、毒素など）と連結され、その結果、これらの治療分子をガン患者の処置のために腫瘍部位に向かわせるようにすることができるであろう。
【００２７】
ある特定の局面において、ＳＬＣ４５Ａ２特異的Ｔ細胞は必要な場合には第２の治療剤との組合わせで、静脈内投与、腹腔内投与、気管内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、内視鏡的投与、病巣内投与、経皮投与、皮下投与、局所的投与、または直接注入もしくは灌流によって投与することができる。
【００２８】
本開示のなおさらに別の局面が、本開示のペプチドまたは上記で記載されるようなペプチドと、賦形剤とを含む医薬組成物に関連する。医薬用調製物は、非経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、吸入または皮下注射のために配合され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、リポソーム、脂質含有ナノ粒子、または脂質に基づくキャリアに含まれる。
【００２９】
本開示の別の局面が、特定のＴ細胞受容体可変領域（例えば、配列番号５１〜７０）に関連する。
【００３０】
用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、本明細書中で使用される場合、例えば、人為的なＴ細胞受容体、キメラなＴ細胞受容体、またはキメラな免疫受容体を示す場合があり、人為的な特異性が特定の免疫エフェクター細胞に移植される操作された受容体を包含する。様々なＣＡＲが、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与し、それにより、多数の特異的なＴ細胞を、例えば、養子細胞療法における使用のために生じさせることを可能にするために用いられる場合がある。具体的な実施形態において、ＣＡＲにより、細胞の特異性が、例えば、腫瘍関連抗原に向けられる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメインと、膜貫通ドメインと、腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインとを含む。特定の局面において、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ、膜貫通ドメインおよびエンドドメインに融合される、モノクローナル抗体由来の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合体を含む。他のＣＡＲ設計の特異性が、受容体のリガンド（例えば、ペプチド）から、またはパターン認識受容体（例えば、デクチンなど）から得られる場合がある。ある特定の場合には、抗原認識ドメインの間隔を、活性化誘導細胞死を軽減させるために変更することができる。ある特定の場合には、ＣＡＲは、さらなる共刺激シグナル伝達のためのドメイン、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０および／またはＯＸ４０などを含む。いくつかの場合には、様々な分子をＣＡＲと共発現させることができ、これらには、共刺激性分子、画像化（例えば、陽電子放射断層撮影法）のためのレポーター遺伝子、プロドラッグを加えたときにＴ細胞の条件的除去をもたらす遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、およびサイトカイン受容体が含まれる。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「本質的に含まない」は、指定の成分に関しては、指定の成分が意図的に組成物に配合されていないこと、および／または、混入物としてのみ、もしくは微量でのみ存在することを意味するために本明細書中では使用される。したがって、組成物への何らかの意図されない混入に起因する指定成分の総量は０．０５％を十分に下回っており、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいものが、指定成分の量が標準的な分析方法により検出することができない組成物である。
【００３２】
ＨＬＡ−Ａ２はヒト白血球抗原血清型Ａ２を示し、ＨＬＡ−Ａ＊０２としてもまた示される。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、＊０２０２、＊０２０３、＊０２０６、＊０２０７および＊０２１１の遺伝子産物を含めて、多くのＨＬＡ−Ａ＊０２対立遺伝子の遺伝子産物のいくつかの血清型が広く知られている。
【００３３】
ＨＬＡ−Ａ２４はヒト白血球抗原血清型Ａ２４を示し、ＨＬＡ−Ａ＊２４としてもまた示される。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２および＊２４０３の遺伝子産物を含めて、多くのＨＬＡ−Ａ＊２４対立遺伝子の遺伝子産物のいくつかの血清型が広く知られている。
【００３４】
用語“ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ”（阻害する）、用語“ｒｅｄｕｃｉｎｇ”（軽減する、低下させる）、もしくは用語“ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ”（防止）、または、どのような変化形であれこれらの用語の変化形は、請求項および／または明細書において使用されるときには、所望の結果を達成するための測定可能な低下または完全な阻害をどのようなものであれ含む。
【００３５】
用語「効果的な」は、その用語が明細書および／または請求項において使用される場合、所望の結果、予想された結果、または意図された結果を達成するために十分であることを意味する。
【００３６】
“ａ”または“ａｎ”の単語の使用は、請求項および／または明細書において用語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（含む）と併せて使用されるときには、“ｏｎｅ”（１つ）を意味する場合があり、しかし、“ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ”（１つまたは複数）、“ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ”（少なくとも１つ）、および“ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ”（１つまたは２つ以上）の意味ともまた一致している。
【００３７】
本明細書において議論されるどのような実施形態も、本発明のどのような方法または組成物に関してであっても実施され得ること、また、逆に、本明細書において議論されるどのような方法または組成物も、本発明のどのような実施形態に関してであっても実施され得ることが意図される。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用することができる。
【００３８】
用語「約」、用語「実質的に」および用語「およそ」は一般には、述べられた値のプラスまたはマイナス５％を意味する。
【００３９】
請求項における用語“ｏｒ”（または、もしくは、あるいは）の使用は、代替物のみに言及するために明示的に示される場合、または代替物が相互に排他的である場合を除き、“ａｎｄ／ｏｒ”（および／または）を意味するために使用され、だが、開示では、単に代替物および“ａｎｄ／ｏｒ”を示す定義が維持される。
【００４０】
本明細書および請求項において使用される場合、単語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（含む）（およびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇのどのような形態も、例えば、“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”および“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”など）、単語“ｈａｖｉｎｇ”（有する）（およびｈａｖｉｎｇのどのような形態も、例えば、“ｈａｖｅ”および“ｈａｓ”など）、単語“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”（含む）（およびｉｎｃｌｕｄｉｎｇのどのような形態も、例えば、“ｉｎｃｌｕｄｅｓ”および“ｉｎｃｌｕｄｅ”など）、または単語“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”（含有する）（およびｃｏｎｔａｉｎｉｎｇのどのような形態も、例えば、“ｃｏｎｔａｉｎｓ”および“ｃｏｎｔａｉｎ”など）は包括的または開放型であり、さらなる列挙されていない要素または方法工程を除外しない。
【００４１】
本発明の他の目的、特徴および利点が、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な例は、本発明の好ましい実施形態を示している一方で、本発明の精神および範囲に含まれる様々な変化および改変がこの詳細な説明から当業者には明らかになるであろうから、例示としてのみ与えられていることを理解しなければならない。
【００４２】
以下の図面は本明細書の一部を形成しており、本発明のある特定の局面をさらに明らかにするために含まれる。本発明は、本明細書中に示される具体的な実施形態の詳細な説明との組合わせでこれらの図面の１つまたは複数を参照することによってよりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＴＣＲベータ鎖と、ペプチドリンカーと、ＴＣＲアルファ鎖とを含むレトロウイルス構築物の概略図。
【００４４】
【図２】（図２Ａ〜２Ｂ）  ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞による標的細胞の特異的溶解。Ｍｅｌ５２６（ＨＬＡ  Ａ２＋）細胞およびＭｅｌ８８８（ＨＬＡ  Ａ２−）細胞を使用するクロム放出アッセイによるＴＣＲクローン＃Ｖｂ３の細胞毒性活性。親のＴ細胞の細胞毒性活性を試験するために、標準的なクロム放出アッセイを行い、ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞と、親のＴ細胞クローンとの間で比較した。図２Ａ、ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４一致の標的、すなわち、Ｍｅｌ８８８を溶解することができ、しかし、ＨＬＡ−Ａ２４不一致の標的、すなわち、Ｍｅｌ５２６を溶解することができない（なお、これらの細胞はともにＳＬＣ４５Ａ２を発現する）。図２Ｂ、親のＴ細胞の細胞毒性活性は同様の溶解を示した。
【００４５】
【図３】（図３Ａ〜Ｂ）  ＴＣＲレトロウイルスを使用するＴＣＲの安定的発現。ＴＣＲクローンＶｂ３および親クローンのＳＬＣ４５Ａ２テトラマー染色およびＣＤ８染色。図３Ａ、活性化された自家ＰＢＭＣに対して、ＴＣＲ遺伝子を含むレトロウイルスによる形質導入を行った。８日後、Ｔ細胞をＳＬＣ４５Ａ２−ＰＥコンジュゲート化テトラマーにより染色した。ＳＬＣ４５Ａ２テトラマー陽性のＴ細胞を選別し、ＲＥＰに供した。図３Ｂ、親のＴ細胞クローンを自家ＰＭＢＣから得た。
【００４６】
【図４】（図４Ａ〜Ｂ）  ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞による標的細胞の特異的溶解。Ｍｅｌ５２６（ＨＬＡ  Ａ２＋）細胞およびＭｅｌ８８８（ＨＬＡ  Ａ２−）細胞を使用するクロム放出アッセイによるＴＣＲクローン＃２４の細胞毒性活性。親のＴ細胞の細胞毒性活性を試験するために、標準的なクロム放出アッセイを行い、ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞と、親のＴ細胞クローンとの間で比較した。図４Ａ、ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞は、ＨＬＡＡ２４一致の標的、すなわち、Ｍｅｌ８８８を溶解することができ、しかし、ＨＬＡ−Ａ２４不一致の標的、すなわち、Ｍｅｌ５２６を溶解することができない（なお、これらの細胞はともにＳＬＣ４５Ａ２を発現する）。図４Ｂ、親のＴ細胞の細胞毒性活性は同様の溶解を示した。
【００４７】
【図５】（図５Ａ〜Ｂ）  ＴＣＲレトロウイルスを使用するＴＣＲの安定的発現。ＴＣＲクローン＃２４および親クローンのＳＬＣ４５Ａ２テトラマー染色およびＣＤ８染色。図５Ａ、活性化された自家ＰＢＭＣに対して、ＴＣＲ遺伝子を含むレトロウイルスによる形質導入を行った。８日後、Ｔ細胞をＳＬＣ４５Ａ２−ＰＥコンジュゲート化テトラマーにより染色した。ＳＬＣ４５Ａ２テトラマー陽性のＴ細胞を選別し、ＲＥＰに供した。図５Ｂ、親のＴ細胞クローンを自家ＰＭＢＣから得た。
【００４８】
【図６】（図６Ａ〜Ｂ）  ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞による標的細胞の特異的溶解。Ｍｅｌ５２６（ＨＬＡ  Ａ２＋）細胞およびＭｅｌ８８８（ＨＬＡ  Ａ２−）細胞を使用するクロム放出アッセイによるＴＣＲクローン＃３９の細胞毒性活性。親のＴ細胞の細胞毒性活性を試験するために、標準的なクロム放出アッセイを行い、ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞と、親のＴ細胞クローンとの間で比較した。図６Ａ、ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４一致の標的、すなわち、Ｍｅｌ８８８を溶解することができ、しかし、ＨＬＡ−Ａ２４不一致の標的、すなわち、Ｍｅｌ５２６を溶解することができない（なお、これらの細胞はともにＳＬＣ４５Ａ２を発現する）。図６Ｂ、親のＴ細胞の細胞毒性活性は同様の溶解を示した。
【００４９】
【図７】（図７Ａ〜Ｂ）  ＴＣＲレトロウイルスを使用するＴＣＲの安定的発現。ＴＣＲクローン＃３９および親クローンのＳＬＣ４５Ａ２テトラマー染色およびＣＤ８染色。図７Ａ、活性化された自家ＰＢＭＣに対して、ＴＣＲ遺伝子を含むレトロウイルスによる形質導入を行った。８日後、Ｔ細胞をＳＬＣ４５Ａ２−ＰＥコンジュゲート化テトラマーにより染色した。ＳＬＣ４５Ａ２テトラマー陽性のＴ細胞を選別し、ＲＥＰに供した。図７Ｂ、親のＴ細胞クローンを自家ＰＭＢＣから得た。
【００５０】
【図８】ＴＣＲ操作Ｔ細胞のテトラマー染色検出。ＳＬＣ４５Ａ２  ＣＴＬ由来のＴＣＲ（＃３９クローン）をレトロウイルス発現ベクターｐＭＳＧＶ１にクローニングし、組換えレトロウイルスをＰＢＭＣへの感染のために作製した。感染後、テトラマー＋の集団がＣＤ８＋およびＣＤ４＋の両方のＴ細胞について現れた。ＣＤ８＋テトラマー＋およびＣＤ４＋テトラマー＋の集団を選別し、迅速拡大プロトコル（ＲＥＰ）により拡大し、その後、純度について調べた。
【００５１】
【図９】ＴＣＲ操作Ｔ細胞についてのペプチド結合力価測定アッセイ。Ｔ２細胞を種々の濃度のＳＬＣ４５Ａ２ペプチド（１０ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ）によりパルス刺激し、５１Ｃｒにより標識した。ＣＤ８＋またはＣＤ４＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し、Ｔ２細胞と共培養した（Ｅ：Ｔ＝２０：１）。５１Ｃｒ放出を４時間の共培養の後で検出した。
【００５２】
【図１０】ＣＤ８＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞の、内因的提示エピトープの認識。ＣＤ８＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞はＭｅｌ５２６（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＳＬＣ４５Ａ２＋）およびＭｅｌ８８８−Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２強制発現、ＳＬＣ４５Ａ２＋）の腫瘍細胞株を殺すことができ、しかし、Ａ３７５（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＳＬＣ４５Ａ２−）またはＭｅｌ６２４（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＳＬＣ４５Ａ２＋）の腫瘍細胞株を殺すことができなかった（図１０）。しかしながら、Ｔ細胞は、ＳＬＣ４５Ａ２ペプチドによりパルス刺激されたＡ３７５細胞を殺すことができた。
【００５３】
【図１１】ＣＤ４＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞の、内因的提示エピトープの認識。ＣＤ４＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞はＲＥＰ後にテトラマー＋の集団を明白に生じさせなかったが、長期共培養（２０時間）の後では依然として腫瘍細胞を殺した。
【００５４】
【図１２Ａ】ＴＣＲ操作Ｔ細胞は標的細胞遭遇時に特異的に応答する。
【図１２Ｂ】ＴＣＲ操作Ｔ細胞は標的細胞遭遇時に特異的に応答する。
【図１２Ｃ】ＴＣＲ操作Ｔ細胞は標的細胞遭遇時に特異的に応答する。
【図１２Ｄ】ＴＣＲ操作Ｔ細胞は標的細胞遭遇時に特異的に応答する。
【図１２Ｅ】ＴＣＲ操作Ｔ細胞は標的細胞遭遇時に特異的に応答する。  内部サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイを、ＴＣＲ操作Ｔ細胞が標的細胞と遭遇したときのＴＣＲ操作Ｔ細胞の特異的応答を検出するために行った。Ｍｅｌ５２６（ＳＬＣ４５Ａ２の生来的に存在する内因性エピトープ）、Ａ３７５（ＳＬＣ４５Ａ２について陰性）、ＳＬＣ４５Ａ２ペプチドによりパルス刺激されたＴ２、およびＭ２６ペプチドによりパルス刺激されたＴ２（陰性コントロール）をＴＣＲ操作Ｔ細胞（ＣＤ８＋またはＣＤ４＋）と共培養した（Ｅ：Ｔ＝１０：１）。一晩のインキュベーションの後、ＴＮＦ−α（図１２Ａ）、ＣＤ１０７ａ（図１２Ｂ）、ＩＦＮ−γ（図１２Ｃ）、ＣＤ１３７（図１２Ｄ）およびＩＬ−２（図１２Ｅ）の発現レベルをＩＣＳにより検出した。
【００５５】
【図１３Ａ】ＴＣＲクローン＃２４のアルファ鎖についての配列。
【図１３Ｂ】ＴＣＲクローン＃２４のベータ鎖についての配列。
【図１３Ｃ】ＴＣＲクローン＃３９のアルファ鎖についての配列。
【図１３Ｄ】ＴＣＲクローン＃３９のベータ鎖についての配列。
【図１３Ｅ】ＴＣＲクローン＃７６のアルファ鎖についての配列。
【図１３Ｆ】ＴＣＲクローン＃７６のベータ鎖についての配列。
【図１３Ｇ】ＴＣＲクローンＶβ３のアルファ鎖についての配列。
【図１３Ｈ】ＴＣＲクローンＶβ３のベータ鎖についての配列。
【図１３Ｉ】ＴＣＲクローンＶβ２２のアルファ鎖についての配列。
【図１３Ｊ】ＴＣＲクローンＶβ２２のベータ鎖についての配列。下線：シグナルペプチド；ハイライト表示：可変領域；下線：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３；黒色：定常領域。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
例示的実施形態の説明
Ｉ．操作された抗原受容体
様々な局面において、ＳＬＣ４５Ａ２または本開示のＳＬＣ４５Ａ２ペプチドと特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が本明細書中において提供される（例えば、配列番号１〜５０）。ＴＣＲの抗原結合領域が、抗原結合領域を含む細胞外ドメインとしてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれる場合がある。ＴＣＲは、養子細胞移入療法において使用されることがある細胞（例えば、自家または同種の細胞）にトランスフェクションされる場合がある。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、免疫原性を低下させるためにヒト化される（ｈＣＡＲ）。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本開示の宿主細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞およびＴｒｅｇなど）、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などは、抗原受容体（例えば、操作されたＴＣＲおよび／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）など）を発現するように遺伝子操作することができる。例えば、自家または同種の細胞（例えば、臍帯から単離される細胞）が、ガン抗原についての抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように改変される。特定の実施形態において、抗原受容体は、ＳＬＣ４５Ａ２についての、例えば、ＳＬＣ４５Ａ２３８２〜３９０ペプチドまたはＳＬＣ４５Ａ２３９３〜４０２ペプチドのペプチドなどについての抗原特異性を有する。ある特定の実施形態において、操作されたＴＣＲは、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５もしくは配列番号４５に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアルファ鎖ＣＤＲ３、および／または配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０もしくは配列番号５０に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するベータ鎖ＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１もしくは配列番号４２に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアルファ鎖、および／または配列番号６、配列番号７、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４６もしくは配列番号４７に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するベータ鎖を有する。様々な好適な改変方法がこの技術分野では知られている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌ（上掲）を参照のこと。例えば、Ｔ細胞に対して、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ他、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９：４９６〜５１０（２００８）、およびＪｏｈｎｓｏｎ他、Ｂｌｏｏｄ、１１４：５３５〜４６（２００９）に記載される形質導入技術を使用して、ガン抗原についての抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように形質導入が行われる場合がある。
【００５８】
ＴＣＲの全長のα鎖およびβ鎖（またはγ鎖およびδ鎖）をコードするＲＮＡのエレクトロポレーションを、レトロウイルス形質導入のＴＣＲ鎖と、内因性のＴＣＲ鎖との対形成によって引き起こされる自己反応性に伴う様々な長期的問題を克服するための代替手段として使用することができる。そのような代わりの対形成がたとえ、一過性トランスフェクション戦略において生じるとしても、導入されたＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は一過性にしか発現されないため、生じる可能性のある自己反応性Ｔ細胞は通常、この自己反応性をしばらくすると失うことになるであろう。導入されたＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の発現が低下すると、正常な自家Ｔ細胞のみが残る。このことは、全長のＴＣＲ鎖が、導入されたＴＣＲ鎖の喪失をもたらさず、これにより、常に存在する自己反応性を患者において引き起こす安定的なレトロウイルス形質導入によって導入されるときには当てはまらない。
【００５９】
ＣＡＲおよび組換えＴＣＲを含めて様々な例示的な抗原受容体、同様にまた、受容体を操作し、細胞に導入するための様々な方法として、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、同ＷＯ２０１３１２６７２６、同ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４０３１６８７、同ＷＯ２０１３／１６６３２１、同ＷＯ２０１３／０７１１５４、同ＷＯ２０１３／１２３０６１、米国特許出願公開第２００２１３１９６０号、同第２０１３２８７７４８号、同第２０１３０１４９３３７号、米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号および同第８，４７９，１１８号、ならびに欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載される抗原受容体および方法、ならびに／あるいは、Ｓａｄｅｌａｉｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．、２０１３  Ａｐｒｉｌ；３（４）：３８８〜３９８；Ｄａｖｉｌａ他（２０１３）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（４）：ｅ６１３３８；Ｔｕｒｔｌｅ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２  Ｏｃｔｏｂｅｒ；２４（５）：６３３〜３９；Ｗｕ他、Ｃａｎｃｅｒ、２０１２  Ｍａｒｃｈ  １８（２）：１６０〜７５によって記載される抗原受容体および方法が挙げられる。いくつかの局面において、遺伝子操作された抗原受容体には、米国特許第７，４４６，１９０号に記載されるようなＣＡＲ、および国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１４０５５６６８（Ａｌ）に記載されるＣＡＲが含まれる。
【００６０】
Ａ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体には、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、および／または天然に存在するＴ細胞からクローニングされるＴＣＲが含まれる。「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、可変ａ鎖および可変β鎖（これらはＴＣＲαおよびＴＣＲβとしてもまたそれぞれ知られている）、または可変γ鎖および可変δ鎖（これらはＴＣＲγおよびＴＣＲδとしてもまたそれぞれ知られている）を含有し、かつ、ＭＨＣ受容体に結合している抗原ペプチドに特異的に結合することができる分子を示す。いくつかの実施形態において、ＴＣＲはαβ形態である。ある特定の実施形態において、操作されたＴＣＲは、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５もしくは配列番号４５のアルファ鎖ＣＤＲ３、および／または配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０もしくは配列番号５０のベータ鎖ＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１または配列番号４２のアルファ鎖と、配列番号６、配列番号７、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４６または配列番号４７のベータ鎖とをそれぞれ有する。
【００６１】
典型的には、αβ形態およびγδ形態で存在するＴＣＲは一般に構造的に類似しており、しかし、それらを発現するＴ細胞は、異なった解剖学的位置または機能を有する場合がある。ＴＣＲを細胞の表面に、または可溶性形態で見出すことができる。一般には、ＴＣＲが、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識することを一般に担うＴ細胞（またはＴリンパ球）の表面に見出される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または短い細胞質尾部を含有することができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ他、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、第３版（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４３３頁、１９９７年）を参照のこと）。例えば、いくつかの局面において、ＴＣＲのそれぞれの鎖が、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端での短い細胞質尾部を有することができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、シグナル伝達を媒介することに関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と結合する。別途明記される場合を除き、用語「ＴＣＲ」は、その機能的なＴＣＲフラグメントを包含することが理解されなければならない。この用語はまた、αβ形態またはγδ形態でのＴＣＲを含めて、無傷または全長のＴＣＲを包含する。
【００６２】
したがって、本明細書中における様々な目的のために、ＴＣＲに対する言及は、いずれかのＴＣＲまたは機能的フラグメント、例えば、ＭＨＣ分子において、すなわち、ＭＨＣ−ペプチド複合体において結合した特異的な抗原性ペプチドに結合するＴＣＲの抗原結合部分などを含む。交換可能に使用され得るが、ＴＣＲの「抗原結合部分」または抗原結合フラグメント」は、ＴＣＲの構造ドメインの一部分を含有し、しかし、完全なＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ−ペプチド複合体）と結合する分子を示す。いくつかの場合において、抗原結合部分は、特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するために十分であるＴＣＲの可変ドメイン（例えば、ＴＣＲの可変ａ鎖および可変β鎖など）を含有する（例えば、一般に、この場合、それぞれの鎖が３つの相補性決定領域を含有する）。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは結合して、ループ、またはＴＣＲ分子の結合部位を形成することによって抗原認識を与え、かつ、ペプチド特異性を決定し、かつペプチド特異性を決定する、免疫グロブリンに類似する相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する。典型的には、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられる（例えば、Ｊｏｒｅｓ他、ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：９１３８、１９９０；Ｃｈｏｔｈｉａ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、７：３７４５、１９８８を参照のこと；Ｌｅｆｒａｎｃ他、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７：５５、２００３もまた参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原を認識することに関わる主たるＣＤＲであり、だが、アルファ鎖のＣＤＲ１はまた、抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されており、これに対して、ベータ鎖のＣＤＲ１は抗原ペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられている。いくつかの実施形態において、β鎖の可変領域は、さらなる超可変性（ＨＶ４）領域を含有することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は定常ドメインを含有する。例えば、免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖（例えば、ａ鎖、β鎖）の細胞外部分は、２つの免疫グロブリンドメイン、Ｎ末端における可変ドメイン（例えば、ＶａまたはＶｐ；典型的にはＫａｂａｔ番号表記（Ｋａｂａｔ他、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、１９９１、第５版）に基づいてアミノ酸１〜１１６）、および細胞膜に隣接する１つの定常ドメイン（例えば、ａ鎖定常ドメインまたはＣａ、典型的にはＫａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２５９、β鎖定常ドメインまたはＣｐ、典型的にはＫａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２９５）を含有することができる。例えば、いくつかの場合において、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜近位定常ドメインと、ＣＤＲを含有する２つの膜遠位可変ドメインとを含有する。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、これにより２つの鎖の間を連結する短い接続配列を含有する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、当該ＴＣＲが２つのジスルフィド結合を定常ドメインにおいて含有するようにさらなるシステイン残基をα鎖およびβ鎖のそれぞれに有する場合がある。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は膜貫通ドメインを含有することができる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは正に帯電している。いくつかの場合において、ＴＣＲ鎖は細胞質尾部を含有する。いくつかの場合において、この構造により、ＴＣＲは、ＣＤ３のような他の分子と結合することできる。例えば、定常ドメインを膜貫通領域とともに含有するＴＣＲはタンパク質を細胞膜内に固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置またはＣＤ３シグナル伝達複合体のインバリアントサブユニットと結合することができる。
【００６６】
一般に、ＣＤ３は、哺乳動物では３つの異なった鎖（γ、δおよびε）と、ζ鎖とを有し得る多タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物において、複合体は、ＣＤ３γ鎖と、ＣＤ３δ鎖と、２つのＣＤ３ε鎖と、ＣＤ３ζ鎖のホモダイマーとを含有することができる。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖は、ただ１つの免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの非常に近縁の細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負に帯電しており、このことが、これらの鎖が正荷電のＴ細胞受容体鎖と結合することを可能にする特徴である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の細胞内尾部はそれぞれが、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして知られている１つだけの保存されたモチーフを含有しており、これに対して、それぞれのＣＤ３ζ鎖は３つの保存されたモチーフを有する。一般に、ＩＴＡＭはＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与している。これらのアクセサリー分子は、負に帯電した膜貫通領域を有しており、ＴＣＲからのシグナルを細胞内に伝播する際に役割を果たしている。ＣＤ３鎖およびζ鎖はＴＣＲと一緒になって、Ｔ細胞受容体複合体として知られているものを形成する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、αおよびβの２つの鎖（または場合によってはγおよびδ）のヘテロダイマーである場合があり、または単鎖のＴＣＲ構築物である場合がある。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、例えば、ジスルフィド結合（１つまたは複数）などによって連結される２つの別個の鎖（α鎖およびβ鎖、またはγ鎖およびδ鎖）を含有するヘテロダイマーである。いくつかの実施形態において、標的抗原（例えば、ガン抗原）についてのＴＣＲが特定され、細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲをコードする核酸を様々な供給源から、例えば、ＴＣＲの公的に入手可能なＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などによって得ることができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲが生物学的供給源から、例えば、細胞などから、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマまたは他の公的に入手可能な供給源などから得られる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を、インビボ単離された細胞から得ることができる。いくつかの実施形態において、高親和性のＴ細胞クローンを患者から単離することができ、ＴＣＲを単離することができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞クローンであることが可能である。いくつかの実施形態において、標的抗原についてのＴＣＲクローンが、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、またはＨＬＡ）により操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製されている。例えば、腫瘍抗原を参照のこと（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ他（２００９）、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１５：１６９〜１８０、およびＣｏｈｅｎ他（２００５）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７５：５７９９〜５８０８を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ファージディスプレイが、標的抗原に対するＴＣＲを単離するために使用される（例えば、Ｖａｒｅｌａ−Ｒｏｈｅｎａ他（２００８）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、１４：１３９０〜１３９５、およびＬｉ（２００５）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：３４９〜３５４を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲまたはその抗原結合部分をＴＣＲの配列の知識から合成により作製することができる。
【００６８】
Ｂ．キメラなＴ細胞受容体
いくつかの実施形態において、操作された抗原受容体には、活性化ＣＡＲもしくは刺激性ＣＡＲ、共刺激性ＣＡＲ（国際公開ＷＯ２０１４／０５５６６８を参照のこと）、および／または阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖ他、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５（２１５）（２０１３年１２月）を参照のこと）を含めて様々なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が含まれる。ＣＡＲは一般には、いくつかの局面ではリンカーおよび／または膜貫通ドメインを介して１つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に連結される細胞外の抗原（またはリガンド）結合ドメインを含む。そのような分子は典型的には、天然の抗原受容体を介するシグナル、共刺激性受容体との組合わせでそのような受容体を介するシグナル、および／または共刺激性受容体だけを介するシグナルを模倣するか、または近似する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗体分子の抗原結合部分、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）に由来する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）などの抗原結合部分を（１つまたは複数）含む。
【００６９】
ＣＡＲの抗原結合ドメインの配置はマルチマー型（例えば、ジアボディーまたはマルチマーなど）である場合がある。マルチマーを、軽鎖および重鎖の可変部分をダイアボディとして示され得るものにクロスペアリング（ｃｒｏｓｓ  ｐａｉｒｉｎｇ）することによって形成させることができる。ＣＡＲのヒンジ部分がいくつかの実施形態においては短縮または除外される場合がある（すなわち、これにより、抗原結合ドメイン、膜貫通領域および細胞内シグナル伝達ドメインを含むだけであるＣＡＲが得られる）。多数のヒンジが、例えば、表１に示されるように、本発明とともに使用される場合がある。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、最初のシステインが維持される場合があり、またはプロリン置換もしくはセリン置換によって変異させられる場合があり、または最初のシステインまで切り詰められる場合がある。Ｆｃ部分が、ＣＡＲを本発明に従って作製するために抗原結合領域として使用されるｓｃＦｖから欠失される場合がある。いくつかの実施形態において、抗原結合領域はＦｃドメインの１つだけをコードする場合があり、例えば、ヒト免疫グロブリンに由来するＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのどちらかをコードする場合がある。ダイマー化およびオリゴマー化を改善するために改変されたヒト免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域もまた含まれる場合がある。いくつかの実施形態において、ヒンジ部分は、８アミノ酸〜１４アミノ酸のペプチド（例えば、１２ＡＡペプチド）、ＣＤ８αの一部、またはＩｇＧ４のＦｃを含む場合があり、あるいは８アミノ酸〜１４アミノ酸のペプチド（例えば、１２ＡＡペプチド）、ＣＤ８αの一部、またはＩｇＧ４のＦｃからなる場合がある。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、オリゴマー化を促進するドメイン（例えば、ＣＤ８アルファなど）を使用して細胞表面からぶら下げられる場合がある。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）クローン２Ｄ３（例えば、Ｓｉｎｇｈ他（２００８）に記載されるｍＡｂクローン２Ｄ３）によって認識されるドメインを使用して細胞表面からぶら下げられる場合がある。
【００７０】
ＣＡＲのエンドドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは一般には、ＣＡＲを含む免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を引き起こすことができ、または促進させることができる。例えば、エンドドメインは、Ｔ細胞のエフェクター機能、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性などを促進させる場合がある。ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞またはメモリータイプＴ細胞のエフェクター機能には、抗原依存性増殖が含まれる場合がある。用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」または用語「エンドドメイン」は、エフェクター機能シグナルを変換すること、および／または特殊化した機能を行うように細胞に命じることができるＣＡＲの一部分を示す。通常の場合には細胞内シグナル伝達ドメイン全体がＣＡＲに含まれることがあり、いくつかの場合にはエンドドメインの切り詰められた部分が含まれることがある。一般に、エンドドメインには、エフェクター機能シグナルを細胞において変換する能力を保持する切り詰められたエンドドメインが含まれる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、エンドドメインは、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖またはそのホモログのいずれか（例えば、イータ、デルタ、ガンマまたはイプシロン）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、Ｆｃ  ＲＩＩＩ、Ｆｃ  ＲＩ、およびシグナル伝達分子の組合わせ（例えば、ＣＤ３ζおよびＣＤ２８など）、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＤＡＰ−１０、ＯＸ４０、ならびにそれらの組合わせ、同様にまた他の類似する分子およびフラグメントを含む。活性化タンパク質の様々なファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分を使用することができる（例えば、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃεＲＩなど）。これらの代替の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの様々な例が見出され得る：例えば、Ｇｒｏｓｓ他（１９９２）、Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ他（１９９３）、Ｍｏｒｉｔｚ他（１９９４）、Ｈｗｕ他（１９９５）、Ｗｅｉｊｔｅｎｓ他（１９９６）およびＨｅｋｅｌｅ他（１９９６）、これらはそれらの全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、エンドドメインはヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む場合がある。
【００７２】
抗原特異的な細胞外ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとは好ましくは、膜貫通ドメインによって連結される。ＣＡＲに含まれ得る膜貫通ドメインには、例えば、ヒトＩｇＧ４のＦｃヒンジ領域およびＦｃ領域、ヒトＣＤ４の膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、膜貫通のヒトＣＤ３ζドメイン、またはシステイン変異のヒトＣＤ３ζドメイン、またはヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質（例えば、ＣＤ１６およびＣＤ８ならびにエリスロポイエチン受容体など）に由来する膜貫通ドメインが含まれる。膜貫通ドメインの様々な例が、例えば、表１に提供される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、エンドドメインは、共刺激性受容体をコードする配列、例えば、改変されたＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメイン、あるいはＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０または４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の共刺激性受容体などをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３（１）ζによって開始される一次シグナル、ヒト共刺激性受容体によってもたらされるさらなるシグナルがともに、養子免疫療法のインビボ持続性および治療的成功を改善することを助け得る形質転換されたＴ細胞をより効果的に活性化するためにＣＡＲに含まれる場合がある。表１に記されるように、エンドドメインまたは細胞内受容体シグナル伝達ドメインはＣＤ３のゼータ鎖を単独で、またはＦｃγＲＩＩＩ共刺激性シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２、４−１ＢＢなど）との組合わせで含む場合がある。いくつかの実施形態において、エンドドメインは、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ−２Ｒベータ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２Ｒアルファ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ４０の１つまたは複数の一部またはすべてを含む。いくつかの実施形態において、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の細胞質ドメインがエンドドメインに含まれる場合がある。例えば、いくつかのＣＡＲでは、融合されて一緒になった少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインが相加的または相乗的な効果をもたらし得ることが認められている。
【００７４】
いくつかの局面において、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む単離された核酸セグメントおよび発現カセットが作製される場合がある。様々なベクターが使用され得る。いくつかの好ましい態様において、ベクターは、ＣＡＲをコードするＤＮＡを免疫細胞（例えば、Ｔ細胞など）に送達することを可能にする場合がある。ＣＡＲの発現は、調節された真核生物プロモーター（例えば、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーターまたはユビキチンプロモーターなど）の制御下にある場合がある。また、ベクターは、他に理由がないならば、インビトロでのその操作を容易にするために、選択マーカーを含有する場合がある。いくつかの実施形態において、ＣＡＲを、ＤＮＡテンプレートからインビトロ転写されるｍＲＮＡから発現させることができる。
【００７５】
キメラ抗原受容体分子は組換え型であり、抗原と結合することができるだけでなく、その細胞質尾部に存在する免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介して活性化シグナルを変換する伝達することができることによって区別される。抗原結合部分を利用する受容体構築物（例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）から作製される受容体構築物）は、ＨＬＡ非依存的様式で標的細胞表面の生来型抗原と結合することができるという点で「万能的」であるというさらなる利点をもたらす。例えば、ｓｃＦｖ構築物が、ＣＤ３複合体のゼータ鎖（ζ）の細胞内部分、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、およびｓｋｙチロシンキナーゼをコードする配列に融合される場合がある（Ｅｓｈｈａｒ他、１９９３；Ｆｉｔｚｅｒ−Ａｔｔａｓ他、１９９８）。ＣＴＬによる腫瘍の認識と溶解を含む再命令されたＴ細胞エフェクター機構が、いくつかのマウス抗原−およびヒト抗原−ｓｃＦｖ：ζ系において実証されている（Ｅｓｈｈａｒ他、１９９７；Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔ他、１９９７；Ｂｒｏｃｋｅｒ他、１９９８）。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲが抗原結合ドメインとして（例えば、ｓｃＦｖ領域として）ＣＡＲに含まれ、ＣＡＲはさらに、ヒンジ領域、膜貫通領域およびエンドドメインを含む。例えば、ＴＣＲ（例えば、配列番号５１〜７０）が、下記の表１に記載されるようなヒンジ領域、膜貫通領域およびエンドドメインを有するＣＡＲに含まれる場合がある。
【表１】
2021500878.tif 000002
【表２】
2021500878.tif 000003
【表３】
2021500878.tif 000004
ζ−ゼータ；Δ−変異体；注＝４−１ＢＢはＣＤ１３７としてもまた示される；「＋」は、異なる領域の融合であることを示す。
【００７７】
ＩＩ．可溶性ＴＣＲ
いくつかの実施形態において、本開示は、可溶性ＴＣＲ、例えば、本明細書中に提供されるＳＬＣ４５Ａ２  ＴＣＲなどを提供する。可溶性ＴＣＲは、特異的なＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用を詳しく調べるという目的のためだけではなく、潜在的には、感染を検出するための、または自己免疫疾患マーカーを検出するための診断ツールとしてもまた有用である。可溶性ＴＣＲはまた、例えば、ＭＨＣの状況で提示される特定のペプチド抗原の存在について細胞を染色するための、染色における様々な用途を有する。同様に、可溶性ＴＣＲは、特定の抗原を提示する細胞に治療剤（例えば、細胞毒性化合物または免疫刺激化合物）を送達するために使用することができる。可溶性ＴＣＲはまた、Ｔ細胞（例えば、自己免疫ペプチド抗原に反応するＴ細胞）を阻害するために使用される場合がある。
【００７８】
本出願に関連して、「溶解性」は、ＴＣＲが１ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＫＣＬ  ２．７ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  １．５ｍＭ、ＮａＣｌ  １３７ｍＭ、Ｎａ２ＰＯ４  ８ｍＭ、ｐＨ７．１〜７．５：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）における単分散ヘテロダイマーとして精製され、かつ、前記ＴＣＲの９０％超が２５℃での１時間のインキュベーションの後で依然として単分散ヘテロダイマーとして残存することが可能であるとして定義される。
【００７９】
いくつかの局面において、本開示は、（ｉ）ＴＣＲα鎖のすべてまたは一部（例えば、配列番号１、２、１１、１２、２１、２２、３１、３２、４１または４２）（ただし、その膜貫通ドメインを除く）と、（ｉｉ）ＴＣＲβ鎖のすべてまたは一部（例えば、配列番号６、７、１６、１７、２６、２７、３６、３７、４６または４７）（ただし、その膜貫通ドメインを除く）とを含み、（ｉ）および（ｉｉ）が、ＴＣＲ鎖の機能的な可変ドメインと、その定常ドメインの少なくとも一部とをそれぞれにおいて含み、かつ、生来型ＴＣＲには存在しない定常ドメイン残基の間でのジスルフィド結合によって連結される、可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）を提供する。
【００８０】
いくつかの局面において、可溶性ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲγ鎖の細胞外ドメインを、一対のＣ末端ダイマー化ペプチド（例えば、ロイシンジッパーなど）によってＴＣＲβ鎖またはＴＣＲδ鎖の細胞外ドメインにそれぞれダイマー化されて含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９９／６０１２０；米国特許第７，６６６，６０４号）。
【００８１】
本開示の可溶性ＴＣＲ（好ましくはヒト由来である）は実質的に純粋な形態で提供される場合があり、あるいは精製または単離された調製物として提供される場合がある。例えば、本開示の可溶性ＴＣＲは、他のタンパク質を実質的に含まない形態で提供される場合がある。
【００８２】
本開示の複数の可溶性ＴＣＲは多価複合体で提供される場合がある。したがって、本開示は１つの局面において、本明細書中に記載されるような複数の可溶性Ｔ細胞受容体を含む多価のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を提供する。複数の可溶性ＴＣＲのそれぞれが好ましくは同一である。
【００８３】
その最も単純な形態において、本発明による多価ＴＣＲ複合体は、好ましくはリンカー分子を介して相互に結合した（例えば、共有結合または他の方法で連結される）２つまたは３つまたは４つまたはそれ以上のＴ細胞受容体分子のマルチマーを含む。好適なリンカー分子には、多価結合分子、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）およびエクストラアビジン（ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ）（これらのそれぞれがビオチンについての４つの結合部位を有する）などが含まれるが、これらに限定されない。したがって、ビオチン化されたＴＣＲ分子を、複数のＴＣＲ結合部位を有するＴ細胞受容体のマルチマーにすることができる。マルチマーにおけるＴＣＲ分子の数は、マルチマーを作製するために使用されるリンカー分子の量に関連してＴＣＲの量に、同様に何らかの他のビオチン化分子の有無にも依存するであろう。好ましいマルチマーは、ダイマー型、トリマー型またはテトラマー型のＴＣＲ複合体である。
【００８４】
本願方法において使用されるための好適な構造には、リポソームなどの膜構造、および、好ましくは粒子（例えば、ビーズなど、例えば、ラテックスビーズ）である固体構造が含まれる。Ｔ細胞受容体分子により外部から被覆されることがある他の構造もまた好適である。好ましくは、これらの構造は、個々のＴ細胞受容体分子により被覆されるよりはむしろ、Ｔ細胞受容体マルチマーにより被覆される。
【００８５】
リポソームの場合、Ｔ細胞受容体分子またはそのマルチマーは膜に付属させられる場合があり、そうでなければ、膜と結合させられる場合がある。このための様々な技術が当業者には広く知られている。
【００８６】
標識または別の部分（例えば、毒性または治療用の部分など）が本発明の多価ＴＣＲ複合体に含まれる場合がある。例えば、標識または他の部分が混合型分子マルチマーに含まれる場合がある。そのようなマルチマー分子の一例が、３つのＴＣＲ分子と、１つのペルオキシダーゼ分子とを含有するテトラマーである。これが、ＴＣＲと酵素とを約３：１のモル比で混合して、テトラマー複合体を生成させ、正しい比率の分子を含有しない複合体のいずれからも所望の複合体を単離することによって達成され得る。立体障害が分子の所望の機能を損なわない、または著しく損なわないならば、これらの混合型分子は分子のどのような組合わせであれ含有する場合がある。結合部位をストレプトアビジン分子表面に配置することは、立体障害が生じる可能性がないため、混合型テトラマーには適している。
【００８７】
本開示のＴＣＲ（またはその多価複合体）は代替において、または加えて、治療剤、例えば、細胞殺傷において使用されるための毒性部分であり得る治療剤、または免疫刺激剤（例えば、インターロイキンまたはサイトカインなど）であり得る治療剤と（例えば、共有結合により）結合させられる場合がある（そうでなければ、そのような治療剤に連結される場合がある）。本発明の多価ＴＣＲ複合体は、非マルチマー型のＴ細胞受容体ヘテロダイマーと比較して、増強された結合能をＴＣＲリガンドについて有する場合がある。したがって、本発明による多価ＴＣＲ複合体は、特定の抗原を提示する細胞をインビトロまたはインビボで追跡するために、または標的化するために特に有用であり、また、そのような用途を有するさらなる多価ＴＣＲ複合体を製造するための中間体としても有用である。したがって、ＴＣＲまたは多価ＴＣＲ複合体は、インビボで使用されるための医薬的に許容される配合物で提供される場合がある。
【００８８】
本開示はまた、治療剤を標的細胞に送達するための方法であって、潜在的な標的細胞を、標的細胞へのＴＣＲまたは多価ＴＣＲ複合体の結合を可能にするための条件のもと、本開示によるＴＣＲまたは多価ＴＣＲ複合体と接触させることを含み、前記ＴＣＲまたは多価ＴＣＲ複合体はＴＣＲリガンドについて特異的であり、治療剤が前記ＴＣＲまたは多価ＴＣＲ複合体と結合している、方法を提供する。
【００８９】
特に、可溶性ＴＣＲまたは多価ＴＣＲ複合体を、特定の抗原を提示する細胞の場所に治療剤を送達するために使用することができる。このことは多くの状況において、また、特に腫瘍に対して有用であろう。治療剤は、治療剤が結合する細胞に対してだけではないが、局所的に治療剤がその効果を及ぼすであろうように送達され得るであろう。したがって、１つの特定の戦略では、腫瘍抗原について特異的であるＴ細胞受容体または多価ＴＣＲ複合体に連結される抗腫瘍分子が想定される。
【００９０】
多くの治療剤がこの使用のために使用され得るであろう。例えば、放射性化合物、酵素（例えば、パーフォリン）または化学療法剤（例えば、シスプラチン）が使用され得るであろう。毒性影響を所望の場所に限定することを改善するために、毒素は、ストレプトアビジンに連結されるリポソームの内側に提供され、その結果、化合物がゆっくり放出されるようにされる場合がある。これにより、体内における輸送期間中の損傷影響が軽減されることがあり、また、ＴＣＲが関連の抗原提示細胞に結合した後まで毒性影響を制限することが助けられることがある。
【００９１】
他の好適な治療剤には、下記のものが含まれる：
・小分子の細胞毒性剤、すなわち、分子量が７００ダルトン未満である、哺乳類細胞殺傷能を有する化合物。そのような化合物はまた、細胞毒性影響を有することができる毒性金属を含有し得るであろう。さらに、これらの小分子細胞毒性剤には、プロドラッグ、すなわち、生理学的条件下で崩壊し、または変換されて、細胞毒性剤を放出する化合物もまた含まれることが理解されなければならない。そのような薬剤の例には、ｃｉｓ−プラチン、メイタンシン誘導体、ラチェルミシン（ｒａｃｈｅｌｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーナトリウムフォトフリン（ｓｏｒｆｉｍｅｒ  ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）ＩＩ、テモゾルミド（ｔｅｍｏｚｏｌｍｉｄｅ）、トポテカン、トリメトレアート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ）グルクロナート、アウリスタチンＥビンクリスチンおよびドキソルビシンが含まれる；
・ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞殺傷能を有するタンパク質またはそのフラグメント。例には、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス属細菌の菌体外毒素Ａ、ＤＮＡアーゼおよびＲＮＡアーゼが含まれる；
・放射性核種、すなわち、１つもしくは複数のα粒子もしくはβ粒子、またはγ線の同時放射を伴って崩壊する元素の不安定な同位体。例には、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０およびビスマス２１３、アクチニウム２２５、ならびにアスタチン２１３が含まれる；
・プロドラッグ、例えば、抗体に向けられた酵素プロドラッグなど；
・免疫刺激剤、すなわち、免疫応答を刺激する部分。例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２など）、ケモカイン（例えば、ＩＬ−８など）、血小板因子４、黒色腫増殖刺激タンパク質など、抗体またはそのフラグメント（例えば、抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントなど）、補体活性化因子、異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、およびウイルス／細菌ペプチドが含まれる。
【００９２】
本開示の可溶性ＴＣＲは、特異的なＴＣＲリガンドに結合し、それによりＴ細胞の活性化を阻害することによってＴ細胞の活性化を調節するために使用される場合がある。Ｔ細胞媒介の炎症および／または組織損傷を伴う自己免疫疾患がこの取り組みには適しているであろう（例えば、Ｉ型糖尿病）。関連したｐＭＨＣによって提示される特異的なペプチドエピトープの知識がこの使用には必要である。
【００９３】
ガンまたは自己免疫疾患を処置するための組成物の調製における本開示の可溶性ＴＣＲおよび／または多価ＴＣＲ複合体の使用もまた想定される。
【００９４】
ガンまたは自己免疫疾患を処置する方法であって、その必要性のある患者に、効果的な量の本発明の可溶性ＴＣＲおよび／または多価ＴＣＲ複合体を投与することを含む方法もまた提供される。
【００９５】
抗ガン療法および自己免疫療法において一般的であるように、本開示のｓＴＣＲは、ガンおよび自己免疫疾患、ならびに類似した患者群において見出される他の関連状態を処置するための他の薬剤との組合わせで使用される場合がある。
【００９６】
ＩＩＩ．養子細胞移入療法
本明細書中には、個体におけるガンを処置するための、または個体におけるガンの進行を遅らせるための方法であって、効果的な量の抗原特異的細胞（例えば、自家または同種のＴ細胞（例えば、調節性Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはガンマデルタＴ細胞）、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞など）療法（例えば、ＳＬＣ４５Ａ２特異的細胞療法など）を個体に施すことを含む方法が提供される。遺伝子操作されたＴＣＲ形質導入Ｔ細胞（例えば、配列番号５１〜配列番号７０の１つを含むＴＣＲを発現するもの）を用いた養子Ｔ細胞療法もまた本明細書中に提供される。さらなる実施形態において、ガン（例えば、黒色腫）を処置するための方法であって、精製された腫瘍抗原、または免疫優性腫瘍抗原特異的ペプチドにより対象を免疫化することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、養子細胞移入療法は、第２の治療法（例えば、化学療法、放射線療法、手術、または第２の免疫療法など）との組合わせで対象（例えば、ヒト患者）に与えられる。
【００９７】
本開示の様々な実施形態が、ＴＣＲ操作された細胞を取得し、ガン細胞を標的とするための免疫療法として対象に投与することに関する。特に、ＴＣＲ操作された（例えば、自家または同種のＴ細胞（例えば、調節性Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはガンマデルタＴ細胞）、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞）細胞は、抗原特異的細胞（例えば、ＳＬＣ４５Ａ２特異的細胞）である。機能的な抗腫瘍エフェクター細胞の誘導、活性化および拡大のためのいくつかの基本的な取り組みが、過去２０年において記載されている。これらは下記の細胞を含む：自家細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）など）；自家ＤＣ、リンパ球、人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）、またはＴ細胞リガンドにより被覆されるビーズおよび活性化抗体、あるいは標的細胞膜を捕捉することによって単離される細胞を使用してエクスビボで活性化されるＴ細胞；抗宿主腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を生来的に発現する同種の細胞；および「Ｔ−ボディー」として知られている、抗体様の腫瘍認識能を示す腫瘍反応性ＴＣＲ分子またはキメラなＴＣＲ分子を発現するように遺伝子的に再プログラミングされる、または「再命令される」腫瘍非特異的な自家または同種の細胞。これらの取り組みは、本明細書中に記載される方法において使用することができる、Ｔ細胞の調製およびＴ細胞による免疫化のための数多くのプロトコルをもたらしている。
【００９８】
Ａ．Ｔ細胞の調製および投与
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は自家である。しかしながら、細胞は同種であることが可能である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が患者から単離され、その結果、細胞は自家である。Ｔ細胞が同種であるならば、Ｔ細胞をいくつかのドナーから混合することができる。細胞は、処置されている疾患の症状および徴候を抑制するために、軽減するために、または排除するために十分な量で、目的とする対象に投与される。
【００９９】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ、臍帯またはリンパ様器官に由来する。いくつかの局面において、細胞はヒト細胞である。細胞は典型的には初代細胞であり、例えば、対象から直接に単離された細胞、および／または対象から単離され、凍結された細胞などである。いくつかの実施形態において、細胞には、Ｔ細胞または他の細胞タイプの１つまたは複数のサブセット、例えば、完全なＴ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、およびそれらの亜集団（例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化能、拡大能、再循環能、局在化能および／または持続能についての潜在能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官または区画における存在、マーカープロファイルまたはサイトカイン分泌プロファイル、ならびに／あるいは分化度によって定義される亜集団など）などが含まれる。処置されることになる対象に関して、細胞は同種および／または自家である場合がある。いくつかの局面において、例えば、既製技術などのためには、細胞は多能性および／または多分化能であり、例えば、幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）など）などである。いくつかの実施形態において、方法は、対象からの細胞の単離、細胞の調製、処理、培養および／または操作を本明細書中に記載されるように行い、細胞を凍結保存の前または後において同じ患者に再導入することを含む。
【０１００】
Ｔ細胞のサブタイプおよび亜集団（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋のＴ細胞）には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞およびそのサブタイプ（例えば、幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、または最終分化したエフェクターメモリーＴ細胞など）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、天然に存在する適応性の調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、アルファ／ベータＴ細胞およびデルタ／ガンマＴ細胞など）が含まれる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＴ細胞集団は、特異的なマーカー（例えば、表面マーカーなど）について陽性である細胞、または特異的なマーカーについて陰性である細胞が濃縮され、または枯渇化される。いくつかの場合において、そのようなマーカーは、Ｔ細胞のある特定の集団（例えば、非メモリー細胞など）では存在しないか、または比較的低いレベルで発現し、しかし、Ｔ細胞のある特定の他の集団（例えば、メモリー細胞）では存在し、または比較的より高いレベルで発現するものである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が、非Ｔ細胞（例えば、Ｂ細胞、単球または他の白血球など）で発現されるマーカー（例えば、ＣＤ１４など）の負の選択によってＰＢＭＣサンプルから分離される。いくつかの局面において、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋の選択工程が、ＣＤ４＋ヘルパー細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離するために使用される。そのようなＣＤ４＋集団およびＣＤ８＋集団はさらに、１つまたは複数のナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団および／またはエフェクターＴ細胞亜集団で発現される、または比較的より高い程度に発現されるマーカーについての正の選択または負の選択によって亜集団に選別することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞はさらに、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞および／またはセントラルメモリー幹細胞が、例えば、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく正の選択または負の選択などによって濃縮され、または枯渇化される。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞についての濃縮が、効力を増大させるために、例えば、いくつかの局面ではそのような亜集団において特に頑強である長期生存、拡大、および／または投与後の生着を改善するなどのために行われる。Ｔｅｒａｋｕｒａ他（２０１２）、Ｂｌｏｏｄ、１：７２〜８２；Ｗａｎｇ他（２０１２）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５（９）：６８９〜７０１を参照のこと。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。この方法において、腫瘍サンプルが患者から得られ、単一細胞懸濁物が得られる。単一細胞懸濁物は、どのような様式であれ好適な様式で得ることができ、例えば、機械的に（腫瘍を、例えば、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して解離させて）、または酵素的に（例えば、コラゲナーゼまたはＤＮａｓｅを使用して）得ることができる。腫瘍の酵素消化物の単一細胞懸濁物がインターロイキン−２（ＩＬ−２）中で培養される。細胞はコンフルエンス（例えば、約２×１０６個のリンパ球）になるまで、例えば、約５日から約２１日まで、好ましくは約１０日から約１４日まで培養される。例えば、細胞は、５日、５．５日または５．８日から、２１日、２１．５日または２１．８日まで、例えば、１０日、１０．５日または１０．８日から、１４日、１４．５日または１４．８日までなどで培養される場合がある。
【０１０５】
培養されたＴ細胞はプールされ、急速拡大させることができる。急速拡大は、約１０日〜約１４日の期間にわたる少なくとも約５０倍（例えば、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍もしくは１００倍またはそれ以上）の抗原特異的Ｔ細胞の数における増大をもたらす。より好ましくは、急速拡大は、約１０日〜約１４日の期間にわたる少なくとも約２００倍（例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００またはそれ以上）の増大をもたらす。
【０１０６】
拡大を、この技術分野において知られているような多数の方法のいずれかによって達成することができる。例えば、Ｔ細胞を、非特異的なＴ細胞受容体刺激をフィーダーリンパ球およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）のいずれか（ＩＬ−２が好ましい）の存在下で使用して急速拡大させることができる。非特異的なＴ細胞受容体刺激として、３０ｎｇ／ｍｌ前後のＯＫＴ３（マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体、これはＯｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌ（登録商標）（Ｒａｒｉｔａｎ、Ｎ．Ｊ．）から入手可能である）を挙げることができる。代替において、Ｔ細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＴ細胞増殖因子の存在下、例えば、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２またはＩＬ−１５（ＩＬ−２が好ましい）などの存在下、必要な場合にはベクターから発現させることができるガンの１つまたは複数の抗原（その抗原性部分（例えば、エピトープなど）を含む、または細胞）により、例えば、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチドなどによりインビトロで刺激することによって急速に拡大させることができる。インビトロ誘導されたＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２を発現する抗原提示細胞に対してパルス刺激されたガンの同じ抗原による再刺激によって急速拡大させられる。代替において、Ｔ細胞は、例えば、放射線照射された自家リンパ球により、または放射線照射されたＨＬＡ−Ａ２＋の同種リンパ球およびＩＬ−２により再刺激することができる。
【０１０７】
自家Ｔ細胞は、自家Ｔ細胞の成長および活性化を促進させるＴ細胞増殖因子を発現するように改変することができる。好適なＴ細胞増殖因子には、例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２が含まれる。様々な好適な改変方法がこの技術分野では知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎ．Ｙ．、２００１年）、およびＡｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９４年）を参照のこと。特定の局面において、改変された自家Ｔ細胞はＴ細胞増殖因子を高レベルで発現する。Ｔ細胞増殖因子コード配列（例えば、ＩＬ−１２のコード配列など）は、高レベルの発現がＴ細胞増殖因子コード配列への作動可能な連結により促進される様々なプロモーターと同様にこの技術分野では容易に入手可能である。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、自家Ｔ細胞の成長および活性化を促進させるＴ細胞増殖因子が、自家Ｔ細胞と同時に、または自家Ｔ細胞に続いてのどちらであっても対象に投与される。Ｔ細胞増殖因子は、自家Ｔ細胞の成長および活性化を促進させる好適な増殖因子であればどのようなものも可能である。好適なＴ細胞増殖因子の例には、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２が含まれ、これらは単独で、または様々な組合わせで、例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−７、ＩＬ−２およびＩＬ−１５、ＩＬ−７およびＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５、ＩＬ−１２およびＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５、またはＩＬ−１２およびＩＬ２などの組合わせで使用することができる。ＩＬ−１２が、好ましいＴ細胞増殖因子である。
【０１０９】
Ｔ細胞は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、腹腔内投与、クモ膜下腔内投与、非経口投与、クモ膜下腔内投与、腔内投与、脳室内投与、動脈内投与により、あるいは脳脊髄液を介して、あるいは埋め込み型または半埋め込み型の永続的デバイスまたは分解性デバイスのどのようなものによってでも投与することができる。Ｔ細胞療法の適切な投与量が、処置される疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、個体の臨床状態、個体の病歴および処置に対する応答、ならびに主治医の裁量に基づいて決定され得る。
【０１１０】
腫瘍内注入、すなわち、腫瘍血管系内への注入が、孤立した固形状の到達可能な腫瘍については特に意図される。局所投与、区域投与または全身投与もまた、適切である場合がある。４ｃｍを超える腫瘍については、投与体積が約４ｍｌ〜１０ｍｌ（特に１０ｍｌ）となるであろう。一方、４ｃｍ未満の腫瘍については、約１ｍｌ〜３ｍｌの体積が使用されるであろう（特に３ｍｌ）。単回用量として送達される複数回の注入は約０．１ｍｌ〜約０．５ｍｌの容量を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードするネイキッドＤＮＡまたは好適なベクターを、対象のＴ細胞（例えば、ガンまたは他の疾患のヒト患者から得られるＴ細胞）に導入することができる。ネイキッドＤＮＡを使用するエレクトロポレーションによってＴ細胞を安定的にトランスフェクションする様々な方法がこの技術分野では知られている。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照のこと。ネイキッドＤＮＡは一般には、発現のための適切な配向でプラスミド発現ベクターに含有される本発明のキメラ受容体をコードするＤＮＡを示す。いくつかの実施形態において、ネイキッドＤＮＡの使用は、本発明の方法により生成されるＣＡＲを発現するＴ細胞を作製するために要求される時間を短縮させる場合がある。
【０１１２】
代替において、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）を、キメラ構築物をＴ細胞に導入するために使用することができる。一般に、対象からのＴ細胞をトランスフェクションするために使用される、ＣＡＲをコードするベクターは一般には、対象のＴ細胞において非複製でなければならない。ウイルスに基づくベクターで、細胞内に維持されるウイルスのコピー数が、細胞の生存率を維持するために十分に低い非常に多数のベクターが知られている。例示的なベクターには、ｐＦＢ−ｎｅｏベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））、同様にまた、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクターが含まれる。
【０１１３】
トランスフェクションまたは形質導入されたＴ細胞が、所望の調節により、かつ、所望のレベルでＣＡＲを表面膜タンパク質として発現する能力を有することが立証されると、キメラ受容体が、所望のシグナル誘導に備えるために宿主細胞において機能的であるかどうかを判定することができる。続いて、形質導入されたＴ細胞は、抗腫瘍応答を対象において活性化するために対象に再導入または投与される場合がある。投与を容易にするために、形質導入されたＴ細胞は、好ましくは医薬的に許容され得る適切なキャリアまたは希釈剤を用いて、インビボでの投与のために適切である医薬組成物にされる場合があり、またはインプラントにされる場合がある。そのような組成物またはインプラントを作製する様々な手段がこの技術分野において記載されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ編（１９８０）を参照のこと）。適切である場合、ＣＡＲを発現する形質導入されたＴ細胞は、半固体形態または液体形態での調製物に、例えば、カプセル、溶液、注射剤、吸入剤またはエアロゾル剤などに、それらのそれぞれの投与経路のための通常の方法で配合することができる。この技術分野において知られている様々な手段を、組成物が標的組織または標的器官に到達するまで組成物の放出および吸収を防止するために、または最小化に抑えるために、あるいは組成物の持続放出を保証するために利用することができる。一般には、キメラ受容体を発現する細胞を無効にしない医薬的に許容され得る形態が好ましくは用いられる。したがって、望ましくは、形質導入されたＴ細胞は、平衡塩類溶液（例えば、ハンクス平衡塩類溶液など）または生理食塩水を含有する医薬組成物にすることができる。
【０１１４】
Ｂ．抗原提示細胞
マクロファージ、Ｂリンパ球および樹状細胞が含まれるが、抗原提示細胞は、特定のＭＨＣ分子を発現することによって区別される。ＡＰＣは抗原を内在化し、その抗原の一部を再発現し、その外側の細胞膜におけるＭＨＣ分子と一緒になる。主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）は、多数の遺伝子座を有する大きな遺伝子複合体である。ＭＨＣ遺伝子座は、クラスＩ  ＭＨＣおよびクラスＩＩ  ＭＨＣとして示される２つの主要なクラスのＭＨＣ膜分子をコードする。Ｔヘルパーリンパ球は一般に、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合した抗原を認識し、Ｔ細胞傷害性リンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子と会合した抗原を認識する。ヒトでは、ＭＨＣはＨＬＡ複合体として示され、マウスではＨ−２複合体として示される。
【０１１５】
いくつかの場合において、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、ＣＡＲに基づく治療用組成物および細胞療法製造物を調製する際に有用である。抗原提示システムの調製および使用に関する一般的な指針については、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号および同第６，７９０，６６２号、米国特許出願公開第２００９／００１７０００号および同第２００９／０００４１４２号、ならびに国際公開番号ＷＯ２００７／１０３００９を参照のこと。
【０１１６】
ａＡＰＣは、ＣＡＲを発現するＴ細胞を拡大するために使用される場合がある。腫瘍抗原と遭遇している間に、抗原提示細胞によってＴ細胞に送達されるシグナルは、Ｔ細胞のプログラミングおよびその後の治療効力に影響を与える可能性がある。このことは、Ｔ細胞に提供されるシグナルの最適な制御を可能にする人工抗原提示細胞を開発するための努力を刺激している（Ｔｕｒｔｌｅ他、２０１０）。目的とする抗体または抗原に加えて、ａＡＰＣシステムはまた、少なくとも１つの外因性の補助分子を含む場合がある。補助分子の好適な数および組合わせはどれも用いられ得る。補助分子は、共刺激性分子および接着分子などの補助分子から選択される場合がある。例示的な共刺激性分子には、ＣＤ７０およびＢ７．１（これはＢ７またはＣＤ８０とも呼ばれる）が含まれ、これらはＴ細胞の表面のＣＤ２８分子および／またはＣＴＬＡ−４分子に結合することができ、それにより、例えば、Ｔ細胞拡大、Ｔｈ１分化、短期のＴ細胞生存、およびサイトカイン分泌（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２など）に影響を与える（Ｋｉｍ他（２００４）を参照のこと）。接着分子には、炭水化物結合糖タンパク質（例えば、セレクチンなど）、膜貫通結合糖タンパク質（例えば、インテグリンなど）、カルシウム依存性タンパク質（例えば、カドヘリンなど）、および一回膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのタンパク質（例えば、細胞間または細胞−マトリックスの接触を促進する細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）など）が含まれる場合がある。例示的な接着分子には、ＬＦＡ−３および各種ＩＣＡＭ（例えば、ＩＣＡＭ−１など）が含まれる。共刺激性分子および接着分子を含めて、例示的な補助分子の選択、クローニング、調製および発現のために有用な様々な技術、方法および試薬が、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号および同第６，３６２，００１号に例示される。
【０１１７】
Ｃ．核酸
１つの局面において、本開示は、ＳＬＣ４５Ａ２と、（例えば、ＳＬＣ４５Ａ２３８２〜３９０またはＳＬＣ４５Ａ２３９３〜４０２の免疫原性エピトープにおいて）選択的に結合し、かつ、本明細書中に開示されるＴＣＲ可変領域（例えば、配列番号１〜５０）に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する単離されたＴＣＲ、ＣＡＲまたは可溶性ペプチドをコードする核酸を提供し、あるいは、該ペプチドは、配列番号１〜５０と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つの点変異（例えば、置換変異）を有する場合がある。上記で述べられるように、ペプチドは、例えば、８アミノ酸長〜３５アミノ酸長、またはそれらにおいて導かれ得る任意の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原特異的ペプチドは、腫瘍抗原タンパク質（例えば、ＳＬＣ４５Ａ２など）の一部分に対応する。用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことが意図され、二本鎖または一本鎖のどちらもが可能である。
【０１１８】
本開示のいくつかの実施形態は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と特異的に結合することができる組換え産生された腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、ＳＬＣ４５Ａ２ペプチド）を提供する。したがって、腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸は発現ベクターに作動可能に連結される場合があり、ペプチドが、分子生物学技術分野において広く知られている方法を使用して、適切な発現系において産生させられる場合がある。本明細書中に開示される腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸は、どのような発現ベクターであれペプチドの良好な発現を保証する発現ベクターに組み込まれる場合がある。可能な発現ベクターには、ベクターが宿主細胞の形質転換のために好適である限り、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス（例えば、複製欠陥のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
組換え発現ベクターが「宿主細胞の形質転換のために好適である」ということは、当該発現ベクターが、本発明の核酸分子と、当該核酸分子に機能的に連結される、発現のために使用されることになる宿主細胞に基づいて選択された調節配列とを含有することを意味する。用語「機能的に連結される」または用語「作動可能に連結される」は交換可能に使用され、核酸が、当該核酸の発現を可能にする様式で調節配列に連結されることを意味することが意図される。
【０１２０】
したがって、本発明は、腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸と、挿入されたタンパク質配列の転写および翻訳のための必要な調節配列とを含む組換え発現ベクターを提供する。好適な調節配列は、細菌、真菌またはウイルスの遺伝子を含めて様々な供給源に由来し得る（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）に記載される調節配列を参照のこと）。
【０１２１】
適切な調節配列の選択は一般には、選ばれた宿主細胞に依存しており、当業者によって容易に達成され得る。そのような調節配列の例には、翻訳開始シグナルを含めて、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列が含まれる。加えて、選ばれた宿主細胞および用いられたベクターに依存して、他の配列、例えば、複製起点、さらなるＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性を与える配列などが、発現ベクターに組み込まれる場合がある。必要な調節配列は天然タンパク質および／またはその隣接領域によって供給され得ることもまた理解されるであろう。
【０１２２】
組換え発現ベクターはまた、本明細書中に開示される組換え腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、ＳＬＣ４５Ａ２ペプチド）により形質転換される、またはトランスフェクションされる宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子を含有する場合がある。選択マーカー遺伝子の例として、ある特定の薬物に対する耐性を与えるタンパク質（例えば、Ｇ４１８およびヒグロマイシンなど）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。選択マーカー遺伝子の転写が、選択マーカータンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼなど）の濃度における変化によってモニターされる。選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードするならば、形質転換体細胞をＧ４１８により選択することができる。選択マーカー遺伝子を取り込んでいる細胞は生き残ることになり、一方、それ以外の細胞は死滅する。このことは、組換え発現ベクターの発現を視覚化すること、および組換え発現ベクターの発現についてアッセイすることを可能にし、また、特に、発現および表現型に対する変異の影響を明らかにすることを可能にする。選択マーカーが、目的とする核酸とは別個のベクターで導入され得ることが理解されるであろう。
【０１２３】
組換え発現ベクターは、形質転換体宿主細胞を作製するために宿主細胞に導入することができる。用語「形質転換体宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターにより形質転換されている、またはトランスフェクションされている原核生物細胞および真核生物細胞を含むことが意図される。用語「により形質転換される」、用語「によりトランスフェクションされる」、用語「形質転換」および用語「トランスフェクション」は、この技術分野において知られている多くの可能な技術の１つによって核酸（例えば、ベクター）が細胞内に導入されることを包含することが意図される。好適な宿主細胞には、広範囲の様々な原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞が含まれる。例えば、本発明のタンパク質は、細菌細胞（例えば、大腸菌など）において、昆虫細胞において（バキュロウイルスを使用して）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現させられる場合がある。
【０１２４】
本発明の核酸分子はまた、標準的な技術を使用して化学合成される場合がある。ポリデオキシ−ヌクレオチドを化学合成する様々な方法が、ペプチド合成と同様に、市販のＤＮＡ合成装置で完全に自動化されている固相合成を含めて知られている（例えば、米国特許第４，５９８，０４９号、同第４，４５８，０６６号、同第４，４０１，７９６号および同第４，３７３，０７１号を参照）のこと。
【０１２５】
ＩＩ．医薬用調製物
選択された実施形態において、本明細書中に開示されるようなＴＣＲ、ＴＣＲの可変領域を含有するタンパク質、または本発明のＴＣＲの可変領域をコードするＤＮＡを発現する細胞はワクチン組成物に含まれ、ＳＬＣ４５Ａ２を発現するガン（例えば、黒色腫など）に対する対象における治療的免疫応答を誘導するために対象に投与され得ることが意図される。対象において医薬的に使用されるための治療用組成物は、本明細書中に開示されるＴＣＲ組成物（例えば、（必要に応じて造影剤に結合させられる）可溶性ＴＣＲなど）と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む場合がある。
【０１２６】
表現「医薬用の」、表現「医薬的に許容され得る」、または表現「薬理学的に許容され得る」は、適切であるように動物（例えば、ヒトなど）に投与されたとき、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じさせない分子実体および組成物を示す。本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容され得るキャリア」には、当業者には知られているであろうように、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑剤、甘味剤、香味矯臭剤、色素など、およびそれらの組合わせが含まれる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、２０１１年）を参照のこと；これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。どのようなキャリアであれ従来のキャリアは、有効成分と配合禁忌である場合を除いて、本発明のワクチン組成物におけるその使用が意図される。
【０１２７】
本明細書中で使用される場合、「防御免疫応答」は、哺乳動物宿主の免疫系によるガンに対する応答を示す。防御免疫応答は、ガンを処置するための治療効果、例えば、腫瘍サイズを低下させること、生存を増大させることなどをもたらす場合がある。
【０１２８】
医学分野の当業者は、動物またはヒト患者に投与される治療用組成物の実際の投薬量が、様々な身体的要因および生理学的要因によって、例えば、体重、状態の重篤度、処置されている疾患のタイプ、以前の治療的介入または同時での治療的介入、患者の特発性疾患などによって、また、投与経路に基づいて決定され得ることを理解するであろう。投与責任者はどのような場合においても、組成物における有効成分（１つまたは複数）の濃度および適切な服用（１回または複数回）を個体対象のために決定するであろう。
【０１２９】
本明細書中に開示される治療用組成物は、静脈内投与、皮内投与、動脈内投与、腹腔内投与、病巣内投与、頭蓋内投与、関節内投与、前立腺内投与、胸膜内投与、気管内投与、鼻腔内投与、硝子体内投与、膣内投与、直腸内投与、局所投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、結膜下投与、小胞内投与、粘膜投与、心膜内投与、臍帯内投与、眼内投与、経口投与、局部的投与、局所投与、ならびに、吸入、注射、注入、持続注入、洗浄および限局性灌流によって投与することができる。治療用組成物はまた、当業者には知られているであろうように、カテーテルを介して、クレームで、脂質組成物で、弾道学的微粒子送達によって、あるいは他の方法またはどのような組合わせであれ前述の組合わせによって投与される場合がある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年）を参照のこと；これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１３０】
当業者には知られている好適なキャリアはどれも、本発明の医薬組成物において用いられ得るが、キャリアのタイプは、投与様式に応じて変化するであろう。非経口投与（例えば、皮下注射など）のためには、キャリアは好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与のために、上記キャリアのいずれか、または固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムなど）が用いられる場合がある。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）もまた、本発明の医薬組成物のためのキャリアとして用いられる場合がある。好適な生分解性ミクロスフェアが、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および同第５，０７５，１０９号に開示される。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は微細構造化経皮微粒子送達または弾道学的微粒子送達によって投与される場合がある。ワクチン配合物のためのキャリアとしての微細構造体はワクチン用途のための望ましい構成であり、この技術分野では広範囲にわたって知られている（ＧｅｒｓｔｅｌおよびＰｌａｃｅ（１９７６）（米国特許第３，９６４，４８２号）；ＧａｎｄｅｒｔｏｎおよびＭｃＡｉｎｓｈ（１９７４）（米国特許第３，８１４，０９７号）；米国特許第５，７９７，８９８号、同第５，７７０，２１９号および同第５，７８３，２０８号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００６５４６３号）。弾道学的微粒子送達のために配合されるそのようなワクチン組成物は、本明細書中に開示される単離されたＳＬＣ４５Ａ２ペプチドを支持基体の表面に固定化されて含む場合がある。これらの実施形態において、支持基体として、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ミクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、またはそれらの組合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本明細書中に開示されるＴＣＲ（例えば、可溶性ＴＣＲなど）のための支持基体として役立つ微細構造体または弾道学的粒子は、生分解性材料および非生分解性材料から構成される場合があり、そのような支持基体は、合成ポリマー、シリカ、脂質、炭水化物、タンパク質、レクチン、イオン性薬剤、架橋剤、およびこの技術分野において利用可能な他の微細構造成分から構成される場合がある。そのような材料から構成される支持基体に本発明のペプチドを固定化するための様々なプロトコルおよび試薬が、商業的に、また、この技術分野において広範囲に入手可能である。
【０１３３】
他の実施形態において、ワクチン組成物は、本明細書中に開示される固定化された、またはカプセル封入されたＴＣＲまたは可溶性ＴＣＲと、支持基体とを含む。これらの実施形態において、支持基体として、脂質ミクロスフェア、脂質ナノ粒子、エトソーム（ｅｔｈｏｓｏｍｅ）、リポソーム、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）、リン脂質、スフィンゴソーム（ｓｐｈｉｎｇｏｓｏｍｅ）、界面活性剤、トランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）、エマルション、またはそれらの組合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。リポソームならびに他の脂質ナノキャリア配合物および脂質ミクロキャリア配合物を形成させ、使用することが、当業者には一般に知られており、リポソーム、マイクロ粒子およびナノカプセルなどの使用が、治療剤の送達における広範囲にわたる使用を得てきた（例えば、米国特許第５，７４１，５１６号、これは参照によってその全体が特に本明細書中に組み込まれる）。ペプチドのカプセル封入を含めて、潜在的な薬物キャリアとしてのリポソーム調製物およびリポソーム様調製物の数多くの方法が再検討されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号および同第５，７９５，５８７号、これらのそれぞれが参照によってその全体で特に組み込まれる）。
【０１３４】
本明細書中に記載される送達方法に加えて、多数の代替技術もまた、開示されたワクチン組成物を投与するために意図される。非限定的な例として、ワクチン組成物が、循環系への薬物浸透および循環系を介した薬物浸透の速度および効力を高めるために米国特許第５，６５６，０１６号において使用され、記載されているソノフォレーシス（すなわち、超音波）；骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号）、またはフィードバック制御された送達（米国特許第５，６９７，８９９号）によって投与される場合がある。この段落における特許のそれぞれが参照によってその全体で本明細書中に特に組み込まれる。
【０１３５】
様々なアジュバントのどれもが、免疫応答を非特異的に増強するために本発明のワクチンにおいて用いられ得る。ほとんどのアジュバントが、抗原を急速な異化から保護するための意図的な物質（例えば、水酸化アルミニウムおよび鉱油など）と、免疫応答の非特異的な刺激物質（例えば、リピドＡ、ボルタデラ・ペルツシス（Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）または結核菌など）とを含有する。好適なアジュバントが、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈ．）、ならびにＭｅｒｃｋ社のアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）として市販されている。他の好適なアジュバントには、ミョウバン、生分解性ミクロスフェア、モノホスホリルリピドＡおよびキル（ｑｕｉｌ）Ａが含まれる。
【０１３６】
可溶性ＴＣＲが中性形態または塩形態で組成物に配合される場合がある。医薬的に許容され得る塩には、酸付加塩（タンパク質のフリーのアミノ基により形成される酸付加塩）、および無機酸（例えば、塩酸またはリン酸など）またはそのような有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸およびマンデル酸など）により形成される酸付加塩が含まれる。フリーのカルボキシル基により形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄など）、ならびに、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンおよびプロカインなどのような有機塩基に由来することができる。
【０１３７】
どのような場合においても、組成物は、１つまたは複数の成分の酸化を遅らせるための様々な酸化防止剤を含む場合がある。加えて、微生物の作用の防止を、保存剤によって、例えば、パラベン類（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組合わせ（これらに限定されない）を含めて、様々な抗菌剤および抗真菌剤などによってもたらすことができる。
【０１３８】
無菌の注射可能な溶液が、活性なペプチドを必要量で、要求される場合には上記で列挙される様々な他の成分とともに適切な溶媒に組み込み、その後、ろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散物が、様々な滅菌された有効成分を、基礎的分散媒体および／または他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁物またはエマルションを調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法が、有効成分と、それに加えて、どのような成分であれ、さらなる所望の成分との粉末を、それらの前もって無菌ろ過された液体媒体からもたらす真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要ならば好適に緩衝化されなければならず、液体希釈剤は最初に、十分な生理食塩水またはグルコースにより注射に先立って等張性にしなければならない。直接注入のための高濃度組成物の調製もまた意図され、この場合には、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が、極めて迅速な浸透をもたらし、それにより、高濃度の活性な薬剤を小さい領域に送達するために想定される。
【０１３９】
組成物は製造および貯蔵の条件のもとで安定でなければならず、かつ、微生物（例えば、細菌および真菌など）の混入作用から保護されなければならない。エンドトキシンの混入は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質よりも少ないレベルで最小限に抑えなければならないことが理解されるであろう。
【０１４０】
特定の実施形態において、注射可能な組成物の持続的吸収を、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはそれらの組合わせなど）を組成物において使用することによってもたらすことができる。
【０１４１】
Ａ．併用療法
ある特定の実施形態において、本実施形態の組成物および方法では、抗原特異的細胞（例えば、自家または同種のＴ細胞（例えば、調節性Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはガンマデルタＴ細胞）、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞）集団が、少なくとも１つのさらなる治療法との組合わせで伴う。さらなる治療法は、放射線療法、手術（例えば、乳腺腫瘤摘出術および乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、または前述の組合わせである場合がある。さらなる治療法はアジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態である場合がある。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、さらなる治療法は、小分子酵素阻害剤または転移抑制剤の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は、副作用制限剤（例えば、処置の副作用の発生および／または重篤度を軽減するために意図される薬剤（例えば、制吐剤など）など）の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は放射線療法である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は手術である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は放射線療法と手術と組合わせである。いくつかの実施形態において、さらなる治療法はガンマ線照射である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は化学療法である（例えば、ダカルバジンまたはテモゾロミドなど）。さらなる治療法は、この技術分野において知られている化学療法剤の１つまたは複数である場合がある。
【０１４３】
Ｔ細胞療法が、さらなるガン治療（例えば、免疫チェックポイント療法など）の前、その期間中、その後において、またはそれに対して様々な組合わせで施される場合がある。投与は、同時から、数分にまで、数日にまで、数週間にまで及ぶ間隔で行われる場合がある。Ｔ細胞療法がさらなる治療剤とは別に患者に施される実施形態においては一般に、有効な期間がそれぞれの送達の時間帯の間で終了せず、その結果、２つの化合物が依然として、好都合な併用効果を患者に及ぼすことができるであろうになることが保証されるであろう。そのような場合において、患者には抗体療法および抗ガン療法が互いに約１２時間〜２４時間または７２時間の範囲内で、より具体的には互いに約６時間〜１２時間の範囲内で与えられ得ることが意図される。いくつかの状況においては、処置のための期間を著しく延長することが望ましい場合があり、この場合、数日（２、３、４、５、６または７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）がそれぞれの投与の間において経過する。
【０１４４】
様々な組合わせが用いられ得る。下記の例について、抗原特異的Ｔ細胞療法、ペプチドまたはＴＣＲが「Ａ」であり、抗ガン療法が「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０１４５】
本実施形態の化合物または治療をどのようなものであれ患者に投与することは、もし存在するならば、薬剤の毒性を考慮して、そのような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施形態において、併用療法に起因し得る毒性をモニターする工程が存在する。
【０１４６】
１．化学療法
広範囲の様々な化学療法剤が本実施形態に従って使用される場合がある。用語「化学療法」は、ガンを処置するために薬物を使用することを示す。「化学療法剤」は、ガンの処置において投与される化合物または組成物を暗示するために使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内におけるそれらの活性様式によって、例えば、それらが細胞周期に影響を与えるかどうか、およびどの段階で影響を与えるかによって分類される。代替において、薬剤は、ＤＮＡを直接に架橋し得るか、ＤＮＡ内に挿入し得るか、または核酸合成に影響を与えることによって染色体異常および有糸分裂異常を誘発し得るかに基づいて特徴づけられる場合がある。
【０１４７】
化学療法剤の例には、下記のものが含まれる：アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミドなど；アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなど；アジリジン系化合物、例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など；エチレンイミン系化合物およびメチルアメラミン系化合物（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）、例として、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン類（とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン類（例として、合成類似体のトポテカン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例として、その合成類似体のアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン）；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例として、合成類似体のＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）類；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミドおよびウラシルマスタードなど；ニトロソウレア系化合物、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチンなど；抗生物質、例えば、エンジイン系抗生物質（例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンガンマＩ１およびカリケアマイシンオメガＩ１）など；ジネミシン、例として、ジネミシンＡ；ビスホスホナート系化合物、例えば、クロドロナートなど；エスペラミシン類；同様にまた、ネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連した色素タンパク質エンジイン系抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オートラルニシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クモロミシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（例として、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン類（例えば、マイトマイシンＣなど）、ミコフェノール酸、ノガラルニシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリンおよびトリメトレキサートなど；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリンおよびチオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジンなど；アンドロゲン類、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトンなど；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、ミトタンおよびトリロスタンなど；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）；エポチロン類；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン類など；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫポリサッカリド複合体；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（とりわけ、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；���フルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸など；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビエン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、ならびに上記のいずれかの医薬的に許容され得る塩、酸または誘導体。
【０１４８】
２．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範囲に使用されている他の要素には、γ線、Ｘ線として一般に知られているもの、および／または腫瘍細胞への放射性同位体の誘導された送達が含まれる。他の形態のＤＮＡ損傷要素もまた意図される：例えば、マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）、およびＵＶ照射など。これらの要素のすべてが、ＤＮＡに対する、ＤＮＡの前駆体に対する、ＤＮＡの複製および修復に対する、また、染色体の組み立ておよび維持に対する広範囲の様々な損傷に影響する可能性が最も高い。Ｘ線についての適用量範囲が、長期間（３週間〜４週間）のための５０レントゲン〜２００レントゲンの１日線量から、２０００レントゲン〜６０００レントゲンの単回線量にまで及ぶ。放射性同位体についての適用量範囲は広範囲にわたって変化し、放射性同位体の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１４９】
３．免疫療法
当業者は、さらなる免疫療法が本実施形態の方法との組合わせまたは併用で使用され得ることを理解するであろう。ガン処置に関連して、免疫療法は一般には、ガン細胞を標的とし、破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））がそのような一例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面における何らかのマーカーについて特異的な抗体である場合がある。抗体は単独で、治療のエフェクターとして役立つ場合がある。あるいは、抗体は、実際に細胞殺傷に影響するために他の細胞を動員する場合がある。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲート化され、標的化剤として役立つ場合がある。代替において、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的のどちらでも相互作用する表面分子を保持するリンパ球である場合がある。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
【０１５０】
抗体−薬物コンジュゲートが、ガン治療剤の開発に対する画期的な取り組みとして現れている。ガンは世界における主要な死因の１つである。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞殺傷薬物に共有結合により連結されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。この取り組みでは、ＭＡｂの、その抗原標的に対する高い特異性が、非常に強力な細胞毒性薬物と組み合わされ、これにより、高まったレベルの抗原を有する腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装された」ＭＡｂをもたらしている。薬物の標的化された送達はまた、正常な組織におけるその曝露を最小限にし、これにより、毒性の低下および治療指数の改善をもたらしている。ＦＤＡによる２つのＡＤＣ薬物の承認により、すなわち、２０１１年におけるＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）および２０１３年におけるＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ−ＤＭ１）の承認により、この取り組みが有効であることが証明された。現在では３０を超えるＡＤＣ薬物候補が、ガン処置のための臨床試験の様々な段階にある（Ｌｅａｌ他、２０１４）。抗体工学およびリンカー−ペイロード最適化がますます成熟しつつあるので、新しいＡＤＣの発見および開発は、この取り組みに対して好適である新しい標的の特定および検証、ならびに標的化用ＭＡｂの作製にますます依存している。ＡＤＣ標的のための２つの判断基準が、腫瘍細胞におけるアップレギュレーションされた／高い発現レベルと、影響を受けない内在化とである。
【０１５１】
免疫療法の１つの局面において、腫瘍細胞は、標的化されやすい何らかのマーカー、すなわち、他の細胞の大部分には存在しない何らかのマーカーを有しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在しており、これらのどれもが、本実施形態の関係での標的化のために好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーには、ＣＤ２０、ガン胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、およびｐ１５５が含まれる。免疫療法の１つの代替局面が、抗ガン作用を免疫刺激作用と組み合わせることである。免疫刺激分子もまた存在しており、これらには、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮなど）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８など）、および増殖因子（例えば、ＦＬＴ３リガンドなど）が含まれる。
【０１５２】
現時点で検討中または使用中である免疫療法の例として、免疫アジュバント、例えば、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号；ＨｕｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ他、１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ならびにＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ他、１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎ他、１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ他、１９９８）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２およびｐ５３（Ｑｉｎ他、１９９８；Ａｕｓｔｉｎ−ＷａｒｄおよびＶｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；およびモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２および抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、２０１２；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ他、１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号）がある。１つまたは複数の抗ガン療法が本明細書中に記載される抗体療法とともに用いられ得ることが意図される。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤である場合がある。免疫チェックポイントはシグナル（例えば、共刺激性分子）を強めるか、またはシグナルを弱めるかのどちらかである。免疫チェックポイント遮断によって標的とされ得る抑制性の免疫チェックポイントには、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７−Ｈ３（これはＣＤ２７６としてもまた知られている）、Ｂ／Ｔリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、これはＣＤ１５２としても知られている）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞の免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が含まれる。特に、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ−１軸および／またはＣＴＬＡ−４を標的とする。
【０１５４】
免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、リガンドもしくは受容体の組換え形態などの薬物である場合があり、または特に抗体（例えば、ヒト抗体など）である（例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１５０１６７１８；Ｐａｒｄｏｌｌ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、１２（４）：２５２〜６４、２０１２；これらの両方が参照によって本明細書中に組み込まれる）。免疫チェックポイントタンパク質またはその類似体の知られている阻害剤が使用される場合があり、特に、キメラ化形態、ヒト化形態またはヒト形態の抗体が使用される場合がある。当業者は理解しているであろうように、代替名および／または対応名が、本開示において言及されるある特定の抗体については使用されている場合がある。そのような代替名および／または対応名は本開示の文脈では交換可能である。例えば、ランブロリズマブは、ＭＫ−３４７５およびペンブロリズマブの代替名および対応名でもまた知られていることが知られている。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１がそのリガンド結合パートナーに結合することを阻害する分子である。具体的な局面において、ＰＤ−１リガンド結合パートナーはＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。別の実施形態において、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１がその結合パートナーに結合することを阻害する分子である。具体的な局面において、ＰＤＬ１結合パートナーはＰＤ−１および／またはＢ７−１である。別の実施形態において、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２がその結合パートナーに結合することを阻害する分子である。具体的な局面において、ＰＤＬ２結合パートナーはＰＤ−１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである場合がある。例示的な抗体が、米国特許第８７３５５５３号、同第８３５４５０９号および同第８００８４４９号に記載される（これらのすべてが参照によって本明細書中に組み込まれる）。本明細書中に提供される方法において使用されるための他のＰＤ−１軸アンタゴニストが、例えば、米国特許出願公開第２０１４０２９４８９８号、同第２０１４０２２０２１号および同第２０１１０００８３６９号（これらのすべてが参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるなど、この技術分野では知られている。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−１結合アンタゴニストは抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびＣＴ−０１１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されるＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外部分またはＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１結合アンタゴニストはＡＭＰ−２２４である。ニボルマブは、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としてもまた知られているものであり、国際公開ＷＯ２００６／１２１１６８に記載される抗ＰＤ−１抗体である。ペンブロリズマブは、ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ  ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）およびＳＣＨ−９００４７５としてもまた知られているものであり、国際公開ＷＯ２００９／１１４３３５に記載される抗ＰＤ−１抗体である。ＣＴ−０１１は、ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ−１としてもまた知られているものであり、国際公開ＷＯ２００９／１０１６１１に記載される抗ＰＤ−１抗体である。ＡＭＰ−２２４は、Ｂ７−ＤＣＩｇとしてもまた知られているものであり、国際公開ＷＯ２０１０／０２７８２７および同ＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されるＰＤＬ２−Ｆｃ融合の可溶性受容体である。
【０１５７】
本明細書中に提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントが、ＣＤ１５２としてもまた知られている細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）である。ヒトＣＴＬＡ−４の完全なｃＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋアクセション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ−４はＴ細胞の表面に見出されており、抗原提示細胞の表面のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合したときに「オフ」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面に発現し、抑制シグナルをＴ細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４はＴ細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８に類似しており、両方の分子が抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６（これはまた、Ｂ７−１およびＢ７−２とそれぞれ呼ばれる）に結合する。ＣＴＬＡ４は抑制シグナルをＴ細胞に伝達し、これに対して、ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４が調節性Ｔ細胞においてもまた見出されており、それらの機能に対して重要であり得る。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８を介したＴ細胞の活性化は、ＣＴＬＡ−４（Ｂ７分子についての阻害性受容体）の増大した発現を引き起こす。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。
【０１５９】
本方法における使用のために好適である抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（あるいはそれに由来するＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン）を、この技術分野において広く知られている方法を使用して作製することができる。代替において、この技術分野で認められている抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用することができる。例えば、米国特許第８，１１９，１２９号、国際公開ＷＯ０１／１４４２４、同ＷＯ９８／４２７５２に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体；国際公開ＷＯ００／３７５０４に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体（ＣＰ６７５，２０６、これは、以前はチシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）として知られていたトレメリムマブとしてもまた知られている）；米国特許第６，２０７，１５６号に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体；Ｈｕｒｗｉｔｚ他（１９９８）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（１７）：１００６７〜１００７１に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体；Ｃａｍａｃｈｏ他（２００４）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ番号２５０５に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体（抗体ＣＰ−６７５２０６）；およびＭｏｋｙｒ他（１９９８）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５８：５３０１〜５３０４に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体を、本明細書中に開示される方法において使用することができる。前述の刊行物のそれぞれの教示が本明細書により参照によって組み込まれる。この技術分野で認められているこれらの抗体のいずれかと、ＣＴＬＡ−４への結合について競合する抗体もまた使用することができる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ−４抗体が、国際特許出願公開番号ＷＯ２００１０１４４２４、同ＷＯ２００００３７５０４、および米国特許第８，０１７，１１４号に記載される（これらのすべてが参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１６０】
例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体が、イピリムマブ（これは、１０Ｄ１、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としてもまた知られている）またはその抗原結合フラグメントおよび変化体である（例えば、国際公開ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと）。他の実施形態において、抗体はイピリムマブの重鎖および軽鎖のＣＤＲまたはＶＲを含む。したがって、１つの実施形態において、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメインおよびＣＤＲ３ドメインと、イピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１ドメイン、ＣＤＲ２ドメインおよびＣＤＲ３ドメインとを含む。別の実施形態において、抗体は、上述の抗体と同じＣＴＬＡ−４上のエピトープとの結合および／または該エピトープに対する結合について競合する。別の実施形態において、抗体は、上述の抗体との少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブとの少なくとも約９０％、９５％または９９％の可変領域同一性）を有する。
【０１６１】
ＣＴＬＡ−４を調節するための他の分子には、ＣＴＬＡ−４リガンドおよびＣＴＬＡ−４受容体、例えば、米国特許第５８４４９０５号、同第５８８５７９６号、ならびに国際特許出願公開ＷＯ１９９５００１９９４および同ＷＯ１９９８０４２７５２（これらのすべてが参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるようなもの、ならびに、イムノアドヘシン、例えば、米国特許第８３２９８６７号（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるようなものが含まれる。
【０１６２】
４．手術
ガンに罹った人のおよそ約６０％が、予防的、診断的または病期分類、治療的および緩和的な手術を含めて、何らかのタイプの手術を受けることになっている。治療的手術は、ガン性組織のすべてまたは一部が物理的に除かれ、切除され、かつ／または破壊される摘出を含み、他の治療法との併用で、例えば、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法などとの併用で使用される場合がある。腫瘍摘出は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除くことを示す。腫瘍摘出に加えて、手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術および顕微鏡下手術（モース術）が含まれる。
【０１６３】
ガン性細胞、組織または腫瘍の一部またはすべてを切除すると、空洞が体内に形成される場合がある。処置が、灌流、直接注入、またはさらなる抗ガン療法による当該区域への局所適用によって達成される場合がある。そのような処置が、例えば、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎もしくは７日毎に、または１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎および５週間毎に、または１か月毎、２か月毎、３か月毎、４か月毎、５か月毎、６か月毎、７か月毎、８か月毎、９か月毎、１０か月毎、１１か月毎もしくは１２か月毎に繰り返される場合がある。これらの処置は同様に、様々な投与量であり得る。
【０１６４】
５．他の薬剤
他の薬剤が、処置の処置効力を改善するために本実施形態のある特定の局面との組合わせで使用され得ることが意図される。これらのさらなる薬剤には、細胞表面受容体のアップレギュレーションおよびＧＡＰ結合に影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる薬剤、または他の生物学的薬剤が含まれる。ＧＡＰ結合の数を増加させることによる細胞間シグナル伝達における増大は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増大させるであろう。他の実施形態において、細胞増殖抑制剤または分化剤を、処置の抗過剰増殖効力を改善するために本実施形態のある特定の局面との組合わせで使用することができる。細胞接着の阻害剤が、本実施形態の効力を改善するために意図される。細胞接着阻害剤の例には、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンがある。アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる他の薬剤（例えば、抗体ｃ２２５など）が、処置効力を改善するために本実施形態のある特定の局面との組合わせで使用され得るであろうことがさらに意図される。
【実施例】
【０１６５】
ＩＩＩ．実施例
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。下記の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって見出された技術を表しており、したがって、その実施のための好ましい態様を構成するとみなされ得ることが、当業者によって理解されなければならない。しかしながら、当業者は本開示に照らして、多くの変化を、開示される具体的な実施形態において行うことができ、また、多くの変化が依然として、同じ結果または類似する結果を、本発明の精神および範囲から逸脱することなくもたらし得ることを理解しなければならない。
【０１６６】
実施例１
ヒトＳＬＣ４５Ａ２  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のクローニング
方法
Ｔ細胞クローンの作製
ＴＣＲクローンを、細胞を特定のＳＬＣ４５Ａ２ペプチドにさらすことによって生成させた。ＳＬＣ４５Ａ２は、正常な組織と比較して、黒色腫において選択的に発現され得る。ＳＬＣ４５Ａ２ペプチドのＳＬＣ４５Ａ２３８２〜３９０およびＳＬＣ４５Ａ２３９３〜４０２は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ＨＬＡ−Ａ２）およびＨＬＡ−Ａ＊２４０２（ＨＬＡ−Ａ２４）にそれぞれ選択的に結合することができる免疫原性エピトープであり、これらのペプチドを使用して増殖させられる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、多発性の皮膚黒色腫、ぶどう膜黒色腫、粘膜黒色腫および転移性黒色腫を含めて様々な黒色腫細胞を効率的に殺すことができる。これらのＳＬＣ４５Ａ２ペプチドは、ＳＬＣ４５Ａ２特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の、抗原特異的で、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１またはＨＬＡ  Ａ＊２４０２に限定された応答を呈示する場合がある。
【０１６７】
全長のＶＣＸ３Ａ  ＲＮＡを成熟樹状細胞（ＤＣ）にトランスフェクションした。ＲＮＡトランスフェクトＤＣをＩＬ−２１の存在下、ＤＣ：Ｔ＝１：１０の比率で自源性のナイーブＴ細胞と共培養した。１週間後、ＲＮＡトランスフェクトＤＣを使用して、Ｔを再び刺激した。２回の刺激の後、ＣＤ８＋かつテトラマー＋の二重陽性のＴ細胞集団を選別し、迅速拡大プロトコル（ＲＥＰ）により拡大した。Ｔ細胞クローンを限定希釈法により得た。高活性のＣＴＬクローンを腫瘍細胞殺傷アッセイによりスクリーニングした。
【０１６８】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のクローニングおよびレトロウイルス発現ベクターの構築
ＴＣＲ（アルファ鎖およびベータ鎖を含む）を、５’−ＲＡＣＥ法をキットのマニュアルに従って使用してクローニングした。ＴＣＲ  Ｖ−アルファおよびＴＣＲ  Ｖ−ベータの使用をＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ注釈ツールにより特定した。さらに、ＴＣＲ  Ｖ−ベータの使用をまた、ＴＣＲ  Ｖβレパートリーキットを使用するフロー検出により特定した。ＴＣＲ  Ｖ−アルファの使用を、異なるＴＣＲ  Ｖ−アルファの５’末端にアニーリングさせられる一群の特別なプライマーを使用するＰＣＲにより特定した。ＴＣＲ発現レトロウイルスベクターの構築のために、順方向プライマーをＴＣＲ  Ｖ−アルファまたはＴＣＲ  Ｖ−ベータの使用に従って設計した。逆方向プライマーを、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータの定常領域の配列に従って設計した。Ｐ２Ａリンカーペプチドによって隔てられるアルファ−ＴＣＲ鎖およびベータ−ＴＣＲ鎖を含有する発現カセットを作製し、全長のＰＣＲ産物をレトロウイルスベクターｐＭＳＧＶ１にクローニングした。クローニングされたＤＮＡ配列を配列決定により確認した。
【０１６９】
レトロウイルスの生成およびヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）への感染
ＴＣＲを含有するｐＭＳＧＶ１ベクターと、エンベロープベクターＲＤ１１４とをパッケージ細胞株ＧＰ２−２９３に同時トランスフェクションした。６〜８時間のトランスフェクションの後、培地を新しくした。上清を２４時間後に集め、２０ｍｇ／ｍＬのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎにより被覆される６ウエルプレートに加え、続いて、遠心分離（２０００×ｇ）を３２℃で２時間行った。その後、上清を除き、５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３および３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２により２日間にわたって活性化されるＰＢＬをレトロウイルス負荷プレートに加え、続いて、遠心分離（１０００×ｇ）を３２℃で１０分間行った。その後、細胞を３２℃で一晩インキュベーションした。この手順を翌日に繰り返した（合計で２回の形質導入）。その後、細胞を５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で拡大し、必要に応じて分割した。
【０１７０】
ＴＣＲ操作されたＴ細胞クローンの作製
感染後、ＣＤ８＋およびテトラマー＋のＴ細胞集団が選別し、Ｔ細胞クローンを限定希釈法により得た。高活性のＣＴＬクローンを腫瘍細胞殺傷アッセイによりスクリーニングした。腫瘍殺傷活性が高いＴ細胞クローンをＲＥＰによりさらに拡大した。
【０１７１】
ＩＦＮ−γ放出アッセイ
Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ放出をＥＬＩＳＡ法により検出した。Ｔ細胞を、０．２ｍｌの培地を含む９６ウエルプレートにおいて１０：１の割当てでの標的細胞と３７℃でインキュベーションした。一晩の共培養の後、上清を集め、ＩＦＮ−γの濃度を、ＥＬＩＳＡをキットのマニュアルに従って使用して検出した。
【０１７２】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ
Ｔ細胞をブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の存在下、３７℃で一晩、１０：１の割当てでの標的細胞とインキュベーションした。共培養の後、Ｔ細胞を集め、洗浄した。細胞を最初にフロー抗体抗表面マーカーにより染色した。その後、細胞を洗浄し、固定処理用緩衝液により固定し、その後、透過処理用溶液を使用して透過処理した。その後、透過処理された細胞を細胞内サイトカインフロー抗体により染色する。最後に、細胞におけるサイトカイン産生のレベルを、ＦＡＣＳを使用して分析した。
【０１７３】
ペプチド−ＭＨＣテトラマー染色
ＳＬＣ４５Ａ２特異的なＣＤ８  Ｔ細胞を、ＨＬＡ  Ａ＊０２０１についてはＳＬＣ４５Ａ２３８２〜３９０ペプチド／ＭＨＣ複合体のテトラマーを用いた染色によって、またはＨＬＡ  Ａ＊２４０２についてはＳＬＣ４５Ａ２３９３〜４０２ペプチド／ＭＨＣ複合体のテトラマーを用いた染色によって確認した。ＣＤ８  Ｔ細胞をＰＥコンジュゲート化テトラマーと２０分間インキュベーションし、洗浄し、その後、ＡＰＣコンジュゲート化ＣＤ８抗体により室温で１５分間染色した。洗浄後、細胞をフローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０分析計）によって分析した。ＳＬＳＣ４５Ａ２３８２〜３９０  ＳＬＣ４５Ａ２３９３〜４０２を含有するＨＬＡ−Ａ＊Ａ０２０１およびＨＬＡ−Ａ＊Ａ２４０２のテトラマーをそれぞれ、Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒから購入した。
【０１７４】
５１クロム放出アッセイ
ＴＣＲ操作Ｔ細胞クローンまたはＣＴＬクローンがＨＬＡ−Ａ２腫瘍標的を溶解する殺傷能力を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイを使用して測定した。腫瘍細胞または正常な細胞を３７℃で２時間、２００μＣｉの５１Ｃｒにより標識し、３回の洗浄の後、標識された標的をウエルあたり２０００個の標的で三連のウエルで置床した。標識された標的細胞を洗浄し、その後、０．２ｍｌの完全培地において３７℃で４時間、種々の比率でエフェクター細胞とインキュベーションした。集めた上清を、自動ガンマカウンターを使用して計数した。最大および自発的な５１Ｃｒ放出を、標識された標的細胞をトリパン溶解緩衝液または培地のどちらかにおいて３７℃で４時間インキュベーションすることによって求めた。それぞれのデータポイントを四連ウエルの平均として求めた。特異的溶解率を下記のように計算した：％殺傷＝（（特異的放出−自発的放出）／（総放出−自発的放出））×１００。
【０１７５】
結果：いくつかのＳＬＣ４５Ａ２  ＣＤ８  Ｔ細胞クローンのＴＣＲ配列を決定した。β３、β２２、＃２４、＃３９および＃７６を含むこれらのＴＣＲクローンのＣＤＲ３配列を表２に示す。Ｔ細胞をこれらのＴＣＲクローンのそれぞれによりトランスフェクションし、細胞毒性活性を、Ｍｅｌ５２６（ＨＬＡ  Ａ２＋）細胞およびＭｅｌ８８８（ＨＬＡ  Ａ２−）細胞を使用するクロム放出アッセイによって評価し、親のＴ細胞クローンの活性と比較した。ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２４一致の標的、すなわち、Ｍｅｌ８８８を溶解すること、しかし、ＨＬＡ−Ａ２４不一致の標的、すわち、Ｍｅｌ５２６を溶解しないことがすべてのクローンについて認められた（図２Ａ〜図２Ｂ、図４Ａ〜図４Ｂ、および図６Ａ〜図６Ｂ）。親のＴ細胞は、類似する細胞毒性を示した。
【０１７６】
ＳＣＲ４５Ａ２テトラマーおよびＣＤ８の染色もまた、ＴＣＲクローンのすべておよび親細胞に対して行った。活性化された自家ＰＢＭＣに対して、ＴＣＲ遺伝子を含むレトロウイルスよる形質導入を行った。８日後、Ｔ細胞をＳＬＣ４５Ａ２−ＰＥコンジュゲート化テトラマーにより染色した。ＳＬＣ４５Ａ２テトラマー陽性のＴ細胞を選別し、ＲＥＰに供した（図３Ａ〜図３Ｂ、図５Ａ〜図５Ｂ、および図７Ａ〜図７Ｂ）。
【表４】
2021500878.tif 000005
【表５】
2021500878.tif 000006
【０１７７】
実施例２
ヒトＳＬＣ４５Ａ２  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）クローン＃３９の機能性
ＴＣＲ操作Ｔ細胞のテトラマー染色検出。ＳＬＣ４５Ａ２  ＣＴＬ由来のＴＣＲ（＃３９クローン）をレトロウイルス発現ベクターｐＭＳＧＶ１にクローニングし、組換えレトロウイルスをＰＢＭＣへの感染のために作製した。感染後、テトラマー＋の集団がＣＤ８＋およびＣＤ４＋の両方のＴ細胞について現れた。ＣＤ８＋テトラマー＋の集団と、ＣＤ４＋テトラマー＋の集団とを選別し、迅速拡大プロトコル（ＲＥＰ）により拡大した。拡大後、ＣＤ８＋テトラマー＋集団の純度が９６％に達した（図８）。しかしながら、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のテトラマー＋集団はＲＥＰ後に失われた（図８）。
【０１７８】
ＴＣＲ操作Ｔ細胞についてのペプチド結合力価測定アッセイ。Ｔ２細胞を種々の濃度のＳＬＣ４５Ａ２ペプチド（１０ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ）によりパルス刺激し、５１Ｃｒにより標識した。ＣＤ８＋またはＣＤ４＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し、Ｔ２細胞と共培養した。５１Ｃｒ放出を４時間の共培養の後で検出した。ＣＤ８＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞は高い親和性を示し、しかし、ＣＤ４＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞は示さなかった（図９）。
【０１７９】
ＣＤ８＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞の、内因的提示エピトープの認識。ＣＤ８＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞はＭｅｌ５２６（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＳＬＣ４５Ａ２＋）およびＭｅｌ８８８−Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２強制発現、ＳＬＣ４５Ａ２＋）の腫瘍細胞株を殺すことができ、しかし、Ａ３７５（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＳＬＣ４５Ａ２−）またはＭｅｌ６２４（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＳＬＣ４５Ａ２＋）の腫瘍細胞株を殺すことができなかった（図１０）。しかしながら、Ｔ細胞は、ＳＬＣ４５Ａ２ペプチドによりパルス刺激されたＡ３７５細胞を殺すことができた。このことは、Ｍｅｌ５２６およびＭｅｌ８８８−Ａ２が内因性エピトープを生来的に提示しており、ＴＣＲ操作Ｔ細胞はこのエピトープを認識することができることを示している。Ｍｅｌ６２４は、たとえＳＬＣ４５Ａ２を発現するとしても、低レベルのエピトープを細胞表面に提示しているかもしれない。
【０１８０】
ＣＤ４＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞の、内因的提示エピトープの認識。ＣＤ４＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞はＲＥＰ後にテトラマー＋の集団を明白に生じさせなかったが、長期共培養（２０時間）の後では依然として腫瘍細胞を殺した（図１１）。したがって、ＣＤ４＋のＴＣＲ操作Ｔ細胞は低レベルでの内因性の提示されたエピトープを認識することができる。
【０１８１】
ＴＣＲ操作Ｔ細胞は標的細胞遭遇時に特異的に応答する。内部サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイを、ＴＣＲ操作Ｔ細胞が標的細胞と遭遇したときのＴＣＲ操作Ｔ細胞の特異的応答を検出するために行った。Ｍｅｌ５２６（ＳＬＣ４５Ａ２の生来的に存在する内因性エピトープ）、Ａ３７５（ＳＬＣ４５Ａ２について陰性）、ＳＬＣ４５Ａ２ペプチドによりパルス刺激されたＴ２、およびＭ２６ペプチドによりパルス刺激されたＴ２（陰性コントロール）をＴＣＲ操作Ｔ細胞（ＣＤ８＋またはＣＤ４＋）と共培養した（Ｅ：Ｔ＝１０：１）。一晩のインキュベーションの後、ＴＮＦ−α（図１２Ａ）、ＣＤ１０７ａ（図１２Ｂ）、ＩＦＮ−γ（図１２Ｃ）、ＣＤ１３７（図１２Ｄ）、およびＩＬ−２（図１２Ｅ）の発現レベルをＩＣＳにより検出した。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋の両方のＴＣＲ操作Ｔ細胞は、Ａ３７５、およびＭ２６ペプチドによりパルス刺激されたＴ２と比較して、Ｍｅｌ５２６、およびＳＬＣ４５Ａ２ペプチドによりパルス刺激されたＴ２と共培養されるときには有意により高いレベルのＴＮＦ−α、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ−γ、ＣＤ１３７およびＩＬ−２を発現する。このことは、ＴＣＲ操作Ｔ細胞が機能的であり、かつ、標的細胞遭遇時には特異的な応答を示すことを示している。
【０１８２】
本明細書中に開示される方法および主張される方法のすべてが、本開示に照らして過度の実験を行うことなく得ることができ、また、実行することができる。本発明の組成物および方法が、好ましい実施形態に関して説明されているが、様々な変化が、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される方法に対して、また、本明細書中に記載される工程または一連の工程において適用され得ることが、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的の両方で関連するある特定の薬剤が、本明細書中に記載される薬剤の代わりに使用されることがあり、同時に、同じ結果または類似する結果が達成されるであろうことが、明らかであろう。当業者には明らかであるすべてのそのような類似した代用および改変は、添付された請求項によって定義されるような本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。
【０１８３】
文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に示されるものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【０１８４】
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【図１Ａ】
2021500878.tif 000007
【図１Ｂ】
2021500878.tif 000008
【図２】
2021500878.tif 000009
【図３】
2021500878.tif 000010
【図４】
2021500878.tif 000011
【図５】
2021500878.tif 000012
【図６】
2021500878.tif 000013
【図７】
2021500878.tif 000014
【図８Ａ】
2021500878.tif 000015
【図８Ｂ】
2021500878.tif 000016
【図９】
2021500878.tif 000017
【図１０】
2021500878.tif 000018
【図１１】
2021500878.tif 000019
【図１２Ａ１】
2021500878.tif 000020
【図１２Ａ２】
2021500878.tif 000021
【図１２Ｂ１】
2021500878.tif 000022
【図１２Ｂ２】
2021500878.tif 000023
【図１２Ｃ１】
2021500878.tif 000024
【図１２Ｃ２】
2021500878.tif 000025
【図１２Ｄ１】
2021500878.tif 000026
【図１２Ｄ２】
2021500878.tif 000027
【図１２Ｅ１】
2021500878.tif 000028
【図１２Ｅ２】
2021500878.tif 000029
【図１３Ａ】
2021500878.tif 000030
【図１３Ｂ】
2021500878.tif 000031
【図１３Ｃ】
2021500878.tif 000032
【図１３Ｄ】
2021500878.tif 000033
【図１３Ｅ】
2021500878.tif 000034
【図１３Ｆ】
2021500878.tif 000035
【図１３Ｇ】
2021500878.tif 000036
【図１３Ｈ】
2021500878.tif 000037
【図１３Ｉ】
2021500878.tif 000038
【図１３Ｊ】
2021500878.tif 000039
【配列表】
2021500878000001.app
【国際調査報告】
2021500878.tif 000040
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2021500878.tif 000043