(57)【要約】  組換えヒトインスリンの前駆体またはそのアナログを調製するための方法が開示され、これは、工程ａ．細菌の発酵、発酵ブロスを連続フローで遠心分離して上澄みを収集すること、工程ｂ．工程ａの上澄みを中空糸膜によって濾過し、濾液を収集すること、および、工程ｃ．工程ｂの濾液をクロマトグラフィーカラムによって精製すること、を含む。この方法は、合理化された工程、拡張性、有機溶媒の不使用、高収率、等の利点がある。インスリン前駆体の純度は９０％を超え、宿主細胞タンパク質の除去率は９０％を超え、外因性ＤＮＡの除去率は８９％以上であり、０．１ｎｇ／ｍｇ未満を達成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体を調製するための方法であって、
工程ａ．細菌の発酵後に得られた発酵ブロスに対して連続フロー遠心分離を行い、軽液を収集する工程、
工程ｂ．前記工程ａの前記軽液を中空糸膜によって濾過し、得られた濾液を収集する工程、
工程ｃ．前記工程ｂの濾液をクロマトグラフィーカラムによって精製する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記中空糸膜は、好ましくは、０．２２μｍまたは０．４５μｍの孔径、より好ましくは０．２２μｍの孔径を有し、もしくは、前記中空糸膜は、５００〜１０００ＫＤａの分子量カットオフ、好ましくは、７５０ＫＤａの分子量カットオフを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｂの前記中空糸膜の濾過は、循環タンジェンシャルフロー濾過である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ．細菌の発酵後に得られた発酵ブロスに対して連続フロー遠心分離を行い、軽液と重液とを別々に収集し、前記重液を少なくとも１回希釈し、次に再度遠心分離を行って別の軽液を得て、得られた二種類の軽液を一つにプールする工程。
工程ｂ．前記工程ａで得られた軽液を中空糸膜を使用する循環タンジェンシャルフロー濾過によって濾過し、濾液を収集する工程、
工程ｃ．前記工程ｂの濾液を、充填剤として陽イオン交換リガンドと疎水性リガンドを含む複合充填剤を使用するクロマトグラフィーカラムによって精製する工程であって、好適な前記陽イオン交換リガンドは強陽イオン交換リガンドである、工程、を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ａの希釈は、酸性溶液またはアルカリ性溶液から選択される希釈剤を適用し、ここで、前記酸性溶液は、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液とクエン酸緩衝液から選択され、前記アルカリ性溶液は、トリヒドロキシメチル−アミノメタン−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酸性溶液は２．０〜６．０のｐＨを有し、前記アルカリ性溶液は７．０〜９．０のｐＨを有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酸性溶液は、１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ〜２０ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭの濃度を有し、前記アルカリ性溶液は、１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ〜３０ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭの濃度を有する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程ａの発酵ブロスは、遠心分離の前に、２．０〜９．０のｐＨ、好ましくは３．０〜８．５のｐＨ、より好ましくは４．０〜８．０のｐＨに調整される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程ａの発酵ブロスのｐＨは、遠心分離の前に、約２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８.０、または８．５に調整される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程ａの前記連続フロー遠心分離は、ディスク遠心分離機によって行われ、好ましくは、８０００ｇ〜１４０００ｇの遠心力を選択する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ．細菌の前記発酵後に前記発酵ブロスを３．０〜８．０のｐＨに調整し、連続フロー遠心分離を行って、軽液を収集する工程、
工程ｂ．前記工程ａの前記軽液を中空糸膜を使用する循環タンジェンシャルフロー濾過システムによって濾過し、濾液を収集する工程、
工程ｃ．前記工程ｂの前記濾液を、強陽イオン−疎水性交換リガンドを使用するクロマトグラフィーカラムによって精製する工程、を含み、
ここで、前記工程ａは、軽液と重液を別々に収集し、前記重液を少なくとも１回希釈し、次に遠心分離を行って別の軽液を得て、二種類の前記軽液を一つにプールする工程を有し、前記希釈は、３．０〜６．０のｐＨを有する酢酸−酢酸ナトリウム、および、７．０〜９．０のｐＨを有するトリヒドロキシメチル−アミノメタン−塩酸緩衝液、から選択される希釈剤を適用する、
前記工程ｂの前記中空糸膜は、０．２２μｍの孔径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程ｃの前記精製は、平衡化、ローディング、不純物の洗浄および溶出の工程を含み、ここで、前記平衡化および前記洗浄は、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液の溶液を使用し、前記溶出は、トリヒドロキシメチル−アミノメタン−塩酸緩衝液の溶液を使用する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液は、１〜５０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭの濃度を有し、前記トリヒドロキシメチル−アミノメタン−塩酸緩衝液は、１０ｍＭ〜１５０ｍＭ、好ましくは３０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記平衡化に使用される前記溶液は３．０〜６．０のｐＨ、好ましくは４．０〜５．０のｐＨを有し、前記不純物の洗浄に使用される前記溶液は５．０〜７．０のｐＨ、好ましくは５．５〜６．０のｐＨを有する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
組換えヒトインスリンまたはそのアナログを調製するための方法であって、
工程１）酵母によって組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体を発現する工程、
工程２）前記組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体を請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って精製する工程、
工程３）前記組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体に対して酵素消化を行って、組換えヒトインスリンまたはそのアナログを得る工程、を含み、
ここで、前記組換えヒトインスリンのアナログは、好ましくは、Ｂ３０欠失を有するヒトインスリンである、方法。
【請求項１６】
アシル化インスリンのアナログを調製するための方法であって、
工程１）酵母によって組換えヒトインスリンの前駆体を発現する工程、
工程２）前記組換えヒトインスリンの前駆体を請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って精製する工程、
工程３）得られた組換えヒトインスリンに対して酵素消化を行う工程、
工程４）前記組換えヒトインスリンに対してアシル化基の置換を導く工程であって、ここで、前記置換は、好ましくは、Ｂ２９位でのリジンの置換である、工程、を含む方法。
【請求項１７】
前記アシル化インスリンアナログは、Ｂ３０欠失を有する組換えヒトインスリンであり、好ましくは、前記置換は、リジンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リジン−Ｎε−オキソブタノイル）ｄｅｓ（Ｂ３０）組換えヒトインスリンの生成物を有する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体をここに参考文献として合体させる、２０１８年５月２４日出願の中国特許出願２０１８１０５０７９２８.７の優先権を主張している。
【０００２】
技術分野
本発明は、タンパク質およびポリペプチド薬の分野、特に、組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体を調製するための方法に関連し、それにより、糖尿病関連疾患を治療するためのインスリンアナログ薬を調製する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は一般的な代謝性内分泌疾患であり、癌、心血管および脳血管疾患に次いで３番目に生命を脅かす疾患である。糖尿病の治療では、インスリンが第一選択薬である。糖尿病患者数の急増により、インスリンの需要が急速に増加している。バイオテクノロジーの急速な発展により、微生物プラットフォームと遺伝子工学を利用してヒトインスリンとそのアナログを発現させることが主流な産業手法になっている。
【０００４】
様々なインスリンアナログまたはそれらの誘導体が存在する。国際公開第２００５／０１２３４７号（特許文献１）は、Ｂ３０位のアミノ酸が欠失し、Ｂ２９位でグルタミン酸と長鎖脂肪酸とが連結されたインスリンアナログを開示している。国際公開第２００７／０７４１３３号（特許文献２）および国際公開第２０１１／１４１４０７号（特許文献３）は、それぞれ上記したインスリンアナログの調製物とその調製方法とを開示し、国際公開第１９９５／０７９３１号（特許文献４）は、Ｂ３０位でアミノ酸が欠失し、前記インスリンアナログのＢ２９位でテトラデシル側鎖が連結されている、インスリンアナログ、その製剤および調製方法を開示し、国際公開第２０１８／０２１８６号（特許文献５）は、ヒトインスリンアナログのアシル化誘導体の構造と生物学的活性を開示している。
【０００５】
インスリンアナログまたはそれらの誘導体の調製に関して、１９８２年にGenetechとLillyはE. coliシステムを使用することによるインスリンの生成において協力した。E.coli細胞に封入体の形で存在するインスリン前駆体は細胞溶解後に遊離された。細胞溶解から再生後に正しい構造を備えるインスリン前駆体が得られた。中国特許出願公開第１０４３７１９号（特許文献６）は、酵母システムを使用してインスリンを生成することを開示し、ここで、インスリン前駆体は発酵ブロス中に直接分泌することができ、遠心分離による細菌除去後の上澄みをクロマトグラフィーカラムに通し、それによって、凍結乾燥により前記前駆体を単離する。中国特許出願公開第１０６２８２２７４号（特許文献７）は、ピキア・パストリス（P.pastoris）の高密度発酵と、遠心分離による発酵液上での固液分離とによるインスリン前駆体タンパク質の調製方法を開示している。米国特許出願公開第２０１４／０５７３１８号（特許文献８）は、中空糸膜システムを使用してインスリン前駆体の発酵ブロスを清澄化するための方法を開示している。中国特許出願公開第１２９０２９９号（特許文献９）は、マクロポーラス樹脂に吸着し、有機溶媒で溶出してインスリン前駆体を捕捉する方法を開示している。中国特許出願公開第１０５１５３２９４号（特許文献１０）は、Capto MMCシリーズのフィラーを直接ロードして、酵素消化に直接使用できるインスリン前駆体を取得できることを開示している。
【０００６】
発酵ブロスの清澄化は、酵母が分泌し発現するインスリン前駆体の調製における最初の工程であり、これは、細菌とタンパク質を分離して、インスリン前駆体を含む発酵上清を得ることが目的である。従来の酵母固液分離法には、プレートアンドフレームフィルタープレス、中空糸膜を使用する清澄化と分離、遠心分離、凝集と沈降、エクスパンデッドベッドクロマトグラフィー等が含まれる。発酵ブロスが清澄化された後、インスリン前駆体を含む透明な液体が得られる。この透明な液体は通常、酵素消化前に捕捉プロセスを経る必要がある。導電性が高いため、前記透明液は、イオン交換クロマトグラフィーの前に希釈する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１２３４７号
【特許文献２】国際公開第２００７／０７４１３３号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１４１４０７号
【特許文献４】国際公開第１９９５／０７９３１号
【特許文献５】国際公開第２０１８／０２１８６号
【特許文献６】中国特許出願公開第１０４３７１９号
【特許文献７】中国特許出願公開第１０６２８２２７４号
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１４／０５７３１８号
【特許文献９】中国特許出願公開第１２９０２９９号
【特許文献１０】中国特許出願公開第１０５１５３２９４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体を調製するための既存の方法には、高コスト、時間がかかる、複雑な操作、有機溶媒を使用することによる生成ワークショップの防爆要求性の増加、前記透明液の量が多すぎることによって保存タンクの面積を増大することが必要である、得られたインスリン前駆体を直接消化できないこと、インスリン前駆体生成物の収率が低いこと、等を含む多くの問題がある。上記の問題に鑑みて、組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体を調製するための、改善された、高効率、高収率、低コスト、およびスケールアップが容易な方法が緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要約
本発明は、連続フロー遠心分離と中空糸精密濾過（hollow fiber microfiltration）とを有機的に組み合わせて、組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体を調製するものであり、これは、インスリン前駆体およびインスリンの大規模な工業生産に適している。
【００１０】
いくつかの実施形態において、組換えヒトインスリンの前駆体またはそのアナログを調製するための方法が提供され、前記方法は、以下の工程を含む。
【００１１】
工程ａ．細菌の発酵後に得られた発酵ブロスに対して連続フロー遠心分離を行い、軽液を集める。
【００１２】
工程ｂ．工程ａの前記軽液を中空糸膜濾過によって濾過し、得られた濾液を収集する。
【００１３】
工程ｃ．工程ｂの前記濾液をクロマトグラフィーカラムによって精製する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、連続フロー遠心分離後、１％未満の細菌含有量を有する軽液を得ることができ、９０％を超える純度を有するインスリン前駆体を、クロマトグラフィー後に得ることができる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、工程ｂの前記中空糸膜は、好ましくは、０．２２μｍまたは０．４５μｍの孔径を有する。少なくとも１つの実施形態では、中空糸膜は０．２２μｍの孔径を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、工程ｂの前記中空糸膜濾過は、循環タンジェンシャルフロー濾過（cyclical tangential flow filtration）であり、前記中空糸膜は、５００〜１０００ＫＤａの分子量カットオフを有する。少なくとも１つの実施形態において、前記中空糸膜は、７５０ＫＤａの分子量カットオフを有する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、前記方法は、以下の工程を含む。
【００１８】
工程ａ．細菌の発酵後に得られた発酵ブロスに対して連続フロー遠心分離を行い、軽液と重液とを別々に収集し、前記重液を少なくとも１回希釈してから再度遠心分離を行って別の軽液を得て、得られた二種類の軽液を一つにプールする。
【００１９】
工程ｂ．工程ａで得られた前記軽液を中空糸膜を使用する循環タンジェンシャルフロー濾過によって濾過し、濾液を収集する。
【００２０】
工程ｃ．工程ｂの前記濾液をクロマトグラフィーによって精製する。
【００２１】
ここで、クロマトグラフィーカラムで使用される充填剤は、陽イオン交換リガンドと疎水性リガンドを含む複合充填剤である。いくつかの特定の実施形態では、前記複合充填剤のクロマトグラフィー媒体としてＥｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＨＣＸが選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記陽イオン交換リガンドは、強陽イオン交換リガンドである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、前記希釈は、酸性溶液またはアルカリ性溶液から選択される希釈剤を使用し、ここで、前記酸性溶液は、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液およびクエン酸緩衝液から選択され、前記アルカリ性溶液は、トリヒドロキシメチル−アミノメタン−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液、リン酸緩衝液、および、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液から選択される。少なくとも一実施形態では、前記酸性溶液は２．０〜６．０のｐＨを有し、前記アルカリ性溶液は７．０〜９．０のｐＨを有する。少なくとも１つの実施形態において、前記酸性溶液の濃度は、１ｍＭ〜１００ｍＭ、または１ｍＭ〜５０ｍＭ、または１０ｍＭ〜２０ｍＭ、または、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、若しくは、１００ｍＭであるか、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、若しくは、１００ｍＭである。少なくとも１つの実施形態において、前記アルカリ性溶液の濃度は、１ｍＭ〜１００ｍＭ、または１ｍＭ〜５０ｍＭ、または１０ｍＭ〜３０ｍＭ、または、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、若しくは、１００ｍＭであるか、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、若しくは、１００ｍＭである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、工程ａの前記発酵ブロスは、遠心分離の前に、２．０〜９．０、または３．０〜８．５、または４．０〜８．０の範囲の任意の値のｐＨに調整される。少なくとも１つの実施形態において、前記ｐＨは、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８.０、または、８．５であるか、約２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８.０、または、８．５である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、前記連続フロー遠心分離は、ディスク遠心分離機を使用して行われる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、前記連続フロー遠心分離の遠心力は、８０００ｇ〜１４０００ｇの範囲の任意の値であり、例えば、８０００、８５００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、または、１４０００ｇであるか、約８０００、８５００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、または、１４０００ｇである。
【００２７】
いくつかの実施形態では、前記方法は、以下の工程を含む。
【００２８】
工程ａ．細菌の前記発酵後、前記発酵ブロスのｐＨを３．０〜８．０に調整し、連続フロー遠心分離を行い、軽液を収集する。
【００２９】
工程ｂ．工程ａでの前記軽液を中空糸膜を使用する循環タンジェンシャルフロー濾過システムによって濾過し、濾液を収集する。
【００３０】
工程ｃ．工程ｂの前記濾液を、強陽イオン−疎水性交換リガンドを使用するクロマトグラフィーカラムによって精製する。
【００３１】
ここで、工程ａは、以下の工程をさらに含む。軽液と重液をそれぞれ収集し、重液を少なくとも１回希釈し、次に遠心分離を行って別の軽液を得て、そして、二種類の軽液を一つにプールする。前記希釈は、３．０〜６．０のｐＨを有する酢酸−酢酸ナトリウム、または、７．０〜９．０のｐＨを有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、から選択される。工程ｂの前記中空糸膜は、０．２２μｍの孔径を有するものとできる。
【００３２】
いくつかの特定の実施形態において、前記酢酸−酢酸ナトリウム希釈剤の前記ｐＨは、３．０、４．０または５．０であり得るか、約３．０、４．０または５．０であり、前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液のｐＨは、７．０、８．０または９．０であり得るか、約７．０、８．０または９．０である。
【００３３】
いくつかの特定の実施形態において、工程ｃの前記精製は、平衡化、ローディング、不純物の洗浄および溶出の工程を含み、前記平衡化および洗浄は、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液の溶液を使用し、前記溶出は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の溶液を使用する。いくつかの特定の実施形態では、前記酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液の濃度は、１〜５０ｍＭ、または１０〜４０ｍＭ、または２０〜３０ｍＭ、若しくは、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、または、５０ｍＭであるか、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、または、５０ｍＭである。前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の濃度は、１０ｍＭ〜１５０ｍＭ、または３０ｍＭ〜１００ｍＭ、または５０ｍＭ〜７０ｍＭ、若しくは、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、または、１５０ｍＭであるか、約２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、または、１５０ｍＭである。前記平衡化に使用する前記溶液は３．０〜６．０または４．０〜５．０のｐＨを有し、前記不純物の洗浄に使用する溶液は５．０〜７．０または５．５〜６．０のｐＨを有する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、組換えヒトインスリンまたはそのアナログを調製するための方法も提供され、前記方法は、１）酵母によって組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体を発現する工程、２）前記組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体を上記した方法に従って精製する、３）前記組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体に対して酵素消化を行って、組換えヒトインスリンまたはそのアナログを得る。
【００３５】
いくつかの特定の実施形態において、前記組換えヒトインスリンアナログは、Ｂ３０欠失ヒトインスリンである。
【００３６】
いくつかの実施形態において、アシル化インスリンアナログを調製するための方法が提供され、前記インスリン誘導体は、アシル化インスリンアナログであり得、ここで、前記方法は、以下の工程を有する、１）酵母によって組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体を発現する、２）前記組換えヒトインスリンまたはそのアナログの前駆体を上記の方法に従って精製する、３）得られた組換えヒトインスリンに対して酵素消化を行う、４）前記組換えヒトインスリンに対してアシル化基の置換を行う。
【００３７】
いくつかの実施形態において、前記アシル化置換は、Ｂ２９位でのリジンで置換され、前記アシル化インスリンアナログは、Ｂ３０を欠く組換えヒトインスリンであってもなくてもよい。一部の特定の実施形態では、前記置換は、リジンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リジン−Ｎε−オキソブタノイル）ｄｅｓ（Ｂ３０）組換えヒトインスリン（Lysine B29 (Nε−(Nα−hexadecanedioic acid−L−lysine−Nε−oxobutanoyl)) des(B30) human recombinant insulin）である生成物を有する。
【００３８】
いくつかの特定の実施形態において、高い細胞含有量（４０％等）を有する前記発酵ブロスは、連続フロー遠心分離機を使用する連続スラッギングによって処理され、これは、細胞および上澄みの初期分離を迅速に実現し、１％未満の細胞含有量の軽液を得ることができる。前記軽液を中空糸精密濾過で濾過し、インスリン前駆体を含む高透明度の液体を得る。前記単一中空糸膜濾過との比較で透明液体の量が７０％減少し、単一連続フロー遠心分離機との比較で、その透明度は大幅に向上した。
【００３９】
いくつかの実施形態において、上記した方法によって得られたインスリン前駆体およびそのアナログの収率は６０％より高く、純度は８０％より高く、宿主細胞タンパク質の除去率は８０％より高く、外因性ＤＮＡの除去率は８０％より高い。いくつかの特定の実施形態において、上記した方法によって得られたインスリンおよびそのアナログの前駆体の収率は７０％より高く、純度は９０％より高く、宿主細胞タンパク質除去率は８５％より高く、そして外因性ＤＮＡ除去率は８５％より高い。いくつかの特定の実施形態において、上記した方法によって得られたインスリンおよびそのアナログ前駆体の収率は８０％より高く、純度は９０％より高く、宿主細胞タンパク質の除去率は９０％より高く、外因性ＤＮＡの除去率は８８％より高い。いくつかの特定の実施形態において、上記した方法によって得られたインスリンおよびそのアナログの前駆体の収率は８１％以上であり、純度は９３％より高く、宿主細胞タンパク質除去率は９５％より高く、そして外因性ＤＮＡ除去率は８９％より高い。いくつかの特定の実施形態において、上記した方法によって得られたインスリンおよびそのアナログ前駆体の収率は８５％以上であり、純度は９３％より高く、宿主細胞タンパク質除去率は９６％より高く、そして外因性ＤＮＡ除去率は８９％より高い。いくつかの特定の実施形態において、上記した方法によって得られたインスリンおよびそのアナログの前駆体の収率は９３％以上であり、純度は９０％より高く、宿主細胞タンパク質除去率は９１％以上であり、そして外因性ＤＮＡの除去率は８９％以上である。
【００４０】
定義
本明細書で使用される「インスリン」という用語は、ヒトインスリンホルモンを含む、よく知られた構造および特性を有するインスリンホルモンを指す。ヒトインスリンには、Ａ鎖とＢ鎖と称される２本のポリペプチド鎖を有する。Ａ鎖は２１アミノ酸のペプチドで、Ｂ鎖は３０アミノ酸のペプチドである。前記２本の鎖はジスルフィド架橋によってコンジュゲートされ、最初の架橋はＡ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインの間に位置し、２番目の架橋は、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインの間に位置する。３番目の架橋は、Ａ鎖の６位と１１位のシステインの間に位置する。
【００４１】
「親インスリン」という用語は、アミノ酸配列に任意の修飾が適用される前のインスリンを指す。
【００４２】
「インスリンアナログ」という用語は、インスリンの単数または複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されている、および／または、単数または複数のアミノ酸残基がインスリンから欠失されている、および／または、単数または複数のアミノ酸がインスリンに付加および/または挿入されている修飾インスリンのことを指す。いくつかの実施形態において、前記インスリンアナログは、親インスリンに対して８未満の修飾（置換、欠失、付加（挿入を含む）およびそれらの任意の組み合わせ）、あるいは親インスリンに対して７未満の修飾、あるいは親インスリンに対して６未満の修飾、あるいは親インスリンに対して５未満の修飾、あるいは親インスリンに対して４未満の修飾、あるいは親インスリンに対して３未満の修飾、親インスリンに対して２つ未満の修飾を含む。インスリンアナログの例には、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンが含まれる。
【００４３】
「インスリン誘導体」という用語は、化学的に修飾された親インスリンまたはそのアナログを指し、修飾は、連結アミド、炭水化物、アルキル、アシル、エステル、ペグ化等の形態である。一例は、リジンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リジンＮε−オキソブタノイル）ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンである。
【００４４】
従来技術と比較して、本発明は以下の利点を有する。
【００４５】
１．連続フロー遠心分離と中空糸精密濾過を組み合わせて、発酵ブロスの迅速な清澄化を達成する。単一中空糸膜濾過と比較して、清澄化された液体の量と貯蔵タンクの量を大幅に削減し、プラントの構築面積を削減し、下流側クロマトグラフィーのサンプルローディング時間を大幅に短縮する。これは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）の高−密度発酵ブロスの清澄化の工業的生成に特に適している。
【００４６】
２．清澄化された液体は透明度が高く、クロマトグラフィーに対して直接ローディングできるため、その後の処理が削減される。
【００４７】
３．清澄化した液体のワンステップクロマトグラフィーによって、色素とＨＣＰとが除去され、同時に酵素によって直接消化可能な高濃度インスリン前駆体を得ることができる。高いローディングで低価格の充填剤の利用によって、捕捉プロセスの生成コストが大幅に削減される。
【００４８】
４．得られるインスリン前駆体またはそのアナログは、高収率、高純度、不純物（宿主細胞タンパク質や外因性ＤＮＡ等）の高い除去率、を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例９の方法によって調製されたインスリン前駆体サンプルの捕捉サンプルのＨＰＬＣ検出チャート。
【図２】実施例１０の方法によって調製されたインスリン前駆体サンプルの捕捉サンプルのＨＰＬＣ検出チャート。
【図３】実施例１１の方法を使用して調製されたインスリン前駆体サンプルの捕捉サンプルのＨＰＬＣ検出チャート。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
好適実施例の詳細説明
以下の例は、本発明をさらに説明するために使用されるが、本発明の範囲はそれに限定されるものではない。
【００５１】
材料
ＭａｘＣｅｌｌ中空糸カラムとタンジェンシャルフロー濾過システムはＧｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ（Ｃｈｉｎａ）Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐから購入され、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＨＣＸは、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｈｉｎａから購入された。
【００５２】
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）
当該技術分野での発酵のための従来のピキア・パストリスをここで使用することができ、例えば、ＣＮ１０６２８２２７４ＡのＧＳ１１５ピキア・パストリス（米国Invitrogenから購入）を、発酵および組換えヒトインスリン前駆体を発現するために使用することができる。
【００５３】
組換えヒトインスリンおよびその前駆体
ここでの組換えヒトインスリンおよびその前駆体は、組換えヒトインスリンのリジンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リジン−Ｎε−オキソブタノイル））ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンおよびその前駆体等の、任意のタイプの組換えヒトインスリンおよびその前駆体とすることができる。
【００５４】
ヒトインスリンの構造の確認
本発明の組換えヒトインスリン前駆体の精製後、標的生成物を、例えば、Ｖ８プロテアーゼで消化することができ、消化された生成物をＬＣ−ＭＳによって分析することができる。
【００５５】
組換えヒトインスリン
ここでの組換えヒトインスリンは、ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０７４１４６の組換えヒトインスリンであるリジンＢ２９（Ｎε−（Ｎα−ヘキサデカン二酸−Ｌ−リジン−Ｎε−オキソブタノイル））ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン等、任意の種類の組換えヒトインスリンとすることができる。
【００５６】
実施例１．発酵ブロスの遠心分離
ピキア・パストリスを使用して発酵およびインスリン前駆体を発現させた。細菌含有量４０％の発酵ブロス５０Ｌを酢酸でｐＨ４．０に調整し、Alfa Lavalフロー遠心分離機Ｔ２０で処理した。遠心力は１０，０００ｇ、流速は６０Ｌ／時、スラグ排出頻度は２分毎に１回、であった。２５Ｌの軽液と２５Ｌの重液とが収集された。前記重液を、１０ｍＭのｐＨ４．０の酢酸−酢酸ナトリウムで５０Ｌに希釈し、再度遠心分離し、別の２５Ｌの軽液を収集し、合計５０Ｌの軽液を収集した。インスリン前駆体の総収率は９０％で、細菌含有量は１％未満であった。
【００５７】
実施例２．発酵ブロスの遠心分離
ピキア・パストリスを使用して発酵およびインスリン前駆体を発現させた。細菌含有量４０％の発酵ブロス５０ＬをＴｒｉｓでｐＨ５．０に調整し、Alfa Lavalフロー遠心分離機Ｔ２０で処理した。遠心力は１０，０００ｇ、流速は６０Ｌ／時、スラグ排出頻度は２分毎に１回、であった。２５Ｌの軽液と２５Ｌの重液とが収集された。前記重液を、１０ｍＭのｐＨ５．０の酢酸−酢酸ナトリウムで５０Ｌに希釈し、再度遠心分離し、別の２５Ｌの軽液を収集し合計５０Ｌの軽液を収集した。インスリン前駆体の総収率は９５％で、細菌含有量は１％未満であった。
【００５８】
実施例３．発酵ブロスの遠心分離
ピキア・パストリスを使用して発酵およびインスリン前駆体を発現させた。細菌含有量３４％の発酵ブロス５００Ｌを酢酸でｐＨ５．０に調整し、連続フロー遠心分離機で処理した。遠心力は１０，０００ｇ、供給速度は１０００Ｌ／時、軽液出口圧力は５ｂａｒであった。２１０Ｌの軽液と２９０Ｌの重液とが収集された。前記重液を、１０ｍＭのｐＨ５．０の酢酸−酢酸ナトリウムで４００Ｌに希釈し、再度遠心分離し、別の１２０Ｌの軽液を収集し合計３３０Ｌの軽液を収集した。インスリン前駆体の総収率は８８％で、細菌含有量は１％未満であった。
【００５９】
実施例４．発酵ブロスの遠心分離
ピキア・パストリスを使用して発酵およびインスリン前駆体を発現させた。細菌含有量４１％の発酵ブロス３５０Ｌを酢酸でｐＨ５．０に調整し、連続フロー遠心分離機で処理した。遠心力は１０，０００ｇ、供給速度は８００Ｌ／時、軽液出口圧力は５ｂａｒであった。１１０Ｌの軽液と２４０Ｌの重液とが収集された。前記重液を、１０ｍＭのｐＨ３．０の酢酸−酢酸ナトリウムで３５０Ｌに希釈し、再度遠心分離し、別の１２０Ｌの軽液を収集し、合計２３０Ｌの軽液を収集した。インスリン前駆体の総収率は８５％で、細菌含有量は１％未満であった。
【００６０】
実施例５．発酵ブロスの遠心分離
ピキア・パストリスを使用して発酵およびインスリン前駆体を発現させた。細菌含有量４０％の３５０Ｌ発酵ブロスを５Ｍ ＮａＯＨ溶液でｐＨ８．０に調整し、Alfa Lavalフロー遠心分離機Ｔ２０で処理した。遠心力は１０，０００ｇ、流速は６０Ｌ／時、供給速度は８００Ｌ／時、軽液出口圧力は５ｂａｒであった。１３０Ｌの軽液と２２０Ｌの重液とが収集された。前記重液を、２０ｍＭのｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌで３５０Ｌに希釈し、再度遠心分離し、別の１４０Ｌの軽液を収集し、合計２７０Ｌの軽液を収集した。インスリン前駆体の総収率は９５％で、細菌含有量は１％未満であった。
【００６１】
実施例６．中空糸精密濾過
還流端と供給入口のｐＨが等しくなるまで、０．２２μｍ中空糸カラムを平衡溶液（１０ｍＭの酢酸−酢酸ナトリウムｐＨ４．０）で循環的に洗浄した。実施例１で得られた５０Ｌの軽液を膜貫通圧力１５ｐｓｉで中空糸精密濾過に供した。約４８Ｌの濾液が浸透出口から収集され、インスリン前駆体の収率は９５％であった。
【００６２】
実施例７．中空糸精密濾過
還流端と供給入口のｐＨが等しくなるまで、０．２２μｍ中空糸カラムを平衡溶液（１０ｍＭの酢酸−酢酸ナトリウムｐＨ５．０）で循環的に洗浄した。実施例２で得られた５０Ｌの軽液を膜貫通圧力１５ｐｓｉで中空糸精密濾過に供した。約４８Ｌの濾液が浸透出口から収集され、インスリン前駆体の収率は９０％であった。
【００６３】
実施例８．中空糸精密濾過
還流端と供給入口のｐＨが等しくなるまで、０．２２μｍ中空糸カラムを平衡溶液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）で循環的に洗浄した。実施例５で得られた２７０Ｌの軽液を膜貫通圧力１５ｐｓｉで中空糸精密濾過に供した。約２５５Ｌの濾液が浸透出口から収集され、インスリン前駆体の収率は９３％であった。
【００６４】
実施例９．インスリン前駆体の捕捉
実施例６で得られた濾液を陽イオンクロマトグラフィーに供し、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＨＣＸを複合クロマトグラフィー媒体として使用し、前記マトグラフィーカラムを平衡溶液（１０ｍＭの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０）の３倍カラム容量で洗浄した。濾液を６０ｇ／Ｌのサンプル量で直接ローディングし、次にカラムを、洗浄液（１０ｍＭの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．８）の５倍カラム容量で洗浄して色素（pigment）とＨＣＰの一部を除去した。最後に溶出液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を溶出に使用し、溶出ピークを収集して純度９３．１％、収率８１％でインスリン前駆体を得た。結果を図１に示す。溶出ピーク中の宿主細胞タンパク質と外因性ＤＮＡを検出すると、濾液のクロマトグラフィーの１ステップ後に、前記宿主細胞タンパク質と前記外因性ＤＮＡとの除去率がそれぞれ９５．６％と８９．６％とに達したことが判った。結果を表１に示す。
【００６５】
実施例１０．インスリン前駆体の捕捉
実施例7で得られた濾液を陽イオンクロマトグラフィーに供し、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＨＣＸを複合クロマトグラフィー媒体として使用し、クロマトグラフィーカラムを平衡溶液（１０ｍＭの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）の３倍カラム容量で洗浄した。濾液を８０ｇ／Ｌのサンプル量で直接ローディングし、次にカラムを、洗浄液（１０ｍＭの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）の５倍カラム容量で洗浄して色素とＨＣＰの一部を除去した。最後に溶出液（３０ｍＭのＴｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ８．５）を溶出に使用し、溶出ピークを収集して純度９３．５％、収率８５％でインスリン前駆体を得た。結果を図２に示す。溶出ピーク中の宿主細胞タンパク質と外因性ＤＮＡを検出すると、濾液のクロマトグラフィーの１ステップ後に、前記宿主細胞タンパク質と前記外因性ＤＮＡとの除去率がそれぞれ９６．８％と８９．８％とに達したことが判った。結果を表１に示す。
【００６６】
実施例１１．インスリン前駆体の捕捉
実施例８で得られた濾液を陽イオンクロマトグラフィーに供し、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＨＣＸを複合クロマトグラフィー媒体として使用し、クロマトグラフィーカラムを平衡溶液（１０ｍＭの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）の３倍カラム容量で洗浄した。濾液を８０ｇ／Ｌのサンプル量で直接ローディングし、次にカラムを、洗浄液（１０ｍＭの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）の５倍カラム容量で洗浄して色素とＨＣＰの一部を除去した。最後に溶出液（３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）を溶出に使用し、溶出ピークを収集して純度９０．１％、収率９３％でインスリン前駆体を得た。結果を図３に示す。溶出ピーク中の宿主細胞タンパク質と外因性ＤＮＡを検出すると、濾液のクロマトグラフィーの１ステップ後に前記宿主細胞タンパク質と前記外因性ＤＮＡとの除去率がそれぞれ９１．０％と８９．０％に達したことが判った。結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
備考
ＨＣＰの前記検出方法は、２０１５年版中国薬局方の第ＶＩ巻の一般規則の３４１４であり、検出には市販のキットを使用される。ＨＣＤは、SYBR Green蛍光色素に基づいたリアルタイム蛍光定量ＰＣＲ法（ｑ−ＰＣＲ法）によって検出された。
【００６９】
当技術分野の当業者は、特定の実施例の上記した記載は純粋に例示的なものであって、本発明の原理および本質から逸脱することなくこれらの実施例に様々な変更または改変を加えることができることを理解すべきである。したがって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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