(57)【要約】  超解像蛍光顕微鏡のための方法が、観察対象の試料（Ｅ）に含まれる蛍光発光体の確率的活性化を誘発するステップ、及び活性化された発光体からの蛍光発光（ＦＬＦ）を引き起こすのに適当な波長を有する励起光ビーム（ＦＬ２）で上記試料を照射するステップと、マトリクスイメージセンサ（ＣＩＭ）を含む結像系（ＳＩ）によって、蛍光画像（ＩＭ）シーケンスを取得するステップと、各光子が上記マトリクスイメージセンサの画素セット（ＥＰＸ）に関連付けられることを可能にする空間解像度で、上記励起光ビームのパルス（ＩＬ２）に対する蛍光光子の到達遅延を測定するステップと、を含む。そのような方法の実施のためのデバイス及びコンピュータプログラム製品。
2021501894.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超解像蛍光顕微鏡方法であって、
ａ）観察対象の試料（Ｅ）に含まれる蛍光発光体の確率的活性化を誘発するステップ、及び活性化された前記発光体からの蛍光発光（ＦＬＦ）を引き起こすのに適当な波長を有する励起光ビーム（ＦＬ２）で前記試料を照射するステップと、
ｂ）マトリクスイメージセンサ（ＣＩＭ）を含む結像系（ＳＩＭ）によって、前記蛍光発光の画像（ＩＭ）シーケンスを取得するステップと、
を含み、
前記励起光ビームがパルス型であり、２つの連続するパルス間の時間間隔が、前記蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、
前記方法が、前記励起光ビームの前記パルス（ＩＬ２）に対する光子の到達遅延を判定するために、前記蛍光発光の前記光子を計数するステップをさらに含み、前記計数するステップが、各光子が前記マトリクスイメージセンサの画素セット（ＥＰＸ）に関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
１つの前記画像の取得時間中に、多くとも１つの個々の蛍光発光体（ＥＦＩ）が、前記マトリクスイメージセンサの１つの前記画素セットに対応する前記試料の領域において平均して活性化されるように、前記蛍光発光体の前記確率的活性化が実行されることと、
を特徴とする、方法。
【請求項２】
前記光子を計数するステップが、
ｃ）前記蛍光発光の一部を光子計数検出器又は検出器のマトリクス（ＭＤＣＰ）に向けるステップであって、前記検出器又は前記マトリクスの各検出器（ＤＣＰ）が、前記マトリクスイメージセンサの画素セット（ＥＰＸ）に関連付けられる、ステップと、
ｄ）前記光子計数検出器を使用して、前記励起光ビームの前記パルスに対する蛍光光子の到達遅延（Δｔ１、Δｔ２）を測定するステップと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｅ）前記ステップｂ）において取得された前記画像シーケンスを使用して、前記個々の蛍光発光体を位置特定することによって超解像画像を構築するステップと、
ｆ）ステップｄ）において測定された前記蛍光光子の前記到達遅延を使用して蛍光寿命を計算し、前記ステップｅ）において位置特定された前記個々の蛍光発光体に前記蛍光寿命を関連付けるステップと、をさらに含み、
前記ステップｅ）及びｆ）が、電子プロセッサ（ＰＲ）によって実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップｅ）が、前記ステップｂ）において取得された前記画像内に存在する回折スポット（ＴＤ）の中心を推定することによる、前記個々の蛍光発光体の位置特定を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記個々の蛍光発光体に前記蛍光寿命を関連付けるための、前記ステップｂ）において取得された前記画像と、前記ステップｄ）において測定された前記蛍光光子の前記到達遅延との間の空間時間相関のステップｇ）をさらに含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記光子計数検出器のマトリクスが、複数の行及び複数の列に従って配置された複数の前記検出器（ＤＣＰ）を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料に含まれる前記蛍光発光体が、変換可能であり、前記ステップａ）が、前記励起光ビーム（ＦＬ２）及び変換光ビーム（ＦＬ１）による前記試料の前記照射を含み、前記変換光ビームが、前記励起光ビームの波長とは異なる波長を有し、第１の状態から前記第１の状態とは異なる第２の状態への前記蛍光発光体の変換を誘発することによって前記蛍光発光体を活性化するように選択され、１つの前記画像の前記取得時間中に、多くとも１つの個々の蛍光発光体（ＥＦＩ）が、前記マトリクスイメージセンサの１つの前記画素セットに対応する前記試料の領域において平均して活性化されるように、前記変換光ビームの強度が選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、
マイクロメートル未満の厚さを有し、
前記励起光ビームの前記波長に対して透明な、誘電体支持体（ＳＤＴ）の面（ＳＳ）上に堆積され、
第１の種類の分子（ＢＲ１）で機能化される前記支持体に対向する面を有し、平均して、多くとも１つの第２の種類の分子が、前記マトリクスイメージセンサの１つの前記画素セットに対応する前記試料の領域において前記第１の種類の分子に結合されるように、蛍光発光体（ＥＦ）に結合された、且つ運動性を有する反応によって前記第１の種類の前記分子と一過的に結合しやすい、前記第２の種類の分子（ＢＲ２）を含む溶液に接触して置かれ、
前記ステップａ）が、前記誘電体支持体の前記面からマイクロメートル未満の距離に位置する単独の前記蛍光発光体からの前記蛍光発光が活性化されるように、前記励起光ビームを用いた内部全反射による前記試料の前記照射を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
超解像蛍光顕微鏡デバイスであって、
観察対象の試料（Ｅ）に含まれる蛍光発光体の確率的活性化のための手段と、
励起光ビーム（ＦＬ２）と呼ばれる光ビームを、活性化された前記蛍光発光体からの蛍光発光を引き起こすのに適当な波長で放射するのに適当な、励起光ソースと呼ばれる光源（ＳＬ２）と、
前記励起光ビームを前記試料（Ｅ）の方に向けるように構成される光学系（ＭＤ１、Ｌ１、ＭＤ２、ＯＢＪ）と、
前記試料の蛍光画像（ＩＭ）のシーケンスを取得するように構成されるマトリクスイメージセンサ（ＣＩＭ）を含む、光学検出系（ＳＩＭ、ＳＣＰ）と、を備え、
前記励起光ソースがパルス型ソースであり、前記ソースの２つの連続するパルス間の時間間隔が、前記蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、前記光学検出系が、前記第２の光ビームの前記パルス（ＩＬ２）に対する光子の到達遅延（Δｔ１、Δｔ２）を判定するために、前記蛍光発光の前記光子の計数を実行するようにさらに構成され、前記計数が、各光子が前記マトリクスイメージセンサの画素セット（ＥＰＸ）に関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
を特徴とする、デバイス。
【請求項１０】
前記光学検出系が、
前記試料の前記蛍光画像のシーケンスを取得するように構成される、結像系（ＳＩＭ）と、
前記試料から蛍光発光の一部を受けるように配置される光子計数検出器又は検出器のマトリクス（ＭＤＣＰ）であって、前記検出器又は前記マトリクスの各検出器（ＤＣＰ）が、前記マトリクスイメージセンサの前記画素セット（ＥＰＸ）に関連付けられる、光子計数検出器又は検出器のマトリクスと、
前記励起光ビームの前記パルスに対する前記検出器又は前記各検出器上に到達する光子の到達遅延を測定するように構成される、前記光子計数検出器又は検出器のマトリクスに関連付けられる電子回路（ＣＭＲ）と、
を含む、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記マトリクスイメージセンサによって取得された前記蛍光画像のシーケンスを入力として受信し、前記蛍光画像のシーケンスを使用して、前記シーケンスの前記画像において個々の蛍光発光体を位置特定することによって超解像画像を構築し、
前記電子回路によって得られた遅延測定値を入力として受信し、前記遅延測定値を使用して蛍光寿命を計算し、
位置特定された前記個々の蛍光発光体に前記蛍光寿命を関連付ける、
ように構成される電子プロセッサ（ＰＲ）をさらに備える、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記電子プロセッサが、前記マトリクスイメージセンサによって取得された前記画像内に存在する回折スポット（ＴＤ）の中心を推定することにより、前記個々の蛍光発光体を位置特定するように構成される、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記電子プロセッサが、前記マトリクスイメージセンサによって取得された前記画像と前記電子回路によって得られた前記遅延測定値との間の空間時間相関を実行することによって、前記位置特定された個々の蛍光発光体に前記蛍光寿命を関連付けるように構成される、請求項１１又は１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記光子計数検出器が、個々の光子アバランシェダイオードである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５】
１つの前記光子計数検出器のマトリクスを含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記光子計数検出器のマトリクスが、不連続の個々の光子アバランシェダイオードのマトリクスであり、前記デバイスが、前記マトリクスのそれぞれの個々の光子アバランシェダイオードに対向して配置される１つのマイクロレンズを含む、連続収束マイクロレンズ（ＭＭＬ）のマトリクスをさらに含み、それぞれの前記マイクロレンズが、前記マトリクスイメージセンサの画素セットと光学的に共役である、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
複数の前記光子計数検出器（ＤＣＰ）を備え、前記デバイスが、それぞれの光ファイバの第１の端面が前記マトリクスイメージセンサの画素セットと光学的に共役であるように配置される光ファイバ束（ＦＦ）をさらに含み、１つの前記光子計数検出器がそれぞれの前記光ファイバの第２の端面に対向して配置される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記蛍光発光体の確率的活性化のための手段が、変換光ビームと呼ばれ、前記励起光ビームの波長とは異なる波長を有し、且つ第１の状態から前記第１の状態とは異なる第２の状態への前記蛍光発光体の変換を誘発することによって光変換可能型である前記蛍光発光体を活性化するように選択される、光ビーム（ＦＬ１）を前記試料に向かって放射するのに適当な、変換光ソースと呼ばれる光源（ＳＬ１）を含み、前記変換光ビームの強度が、１つの前記画像の取得時間中に、多くとも１つの個々の蛍光発光体（ＥＦＩ）が、前記マトリクスイメージセンサの１つの前記画素セットに対応する前記試料の領域において平均して活性化されるように選択される、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記蛍光発光体の確率的活性化のための手段が、前記試料が堆積され得る面（ＳＳ）上において、前記励起光ビームの前記波長に対して透明な誘電体支持体（ＳＤＴ）と、前記支持体を含む流体タンク（ＣＦ）と、を含み、前記光学系が、前記励起光ビームが前記面上での内部全反射を経験するように前記支持体を通って前記励起光ビームを方向付けるように構成される、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０】
コンピュータプログラム製品であって、前記プログラムがコンピュータ上で実行されるときに、
マトリクスイメージセンサ（ＣＩＭ）を含む結像系（ＳＩＭ）によって取得される、個々の蛍光発光体を含む試料（Ｅ）から蛍光発光の画像（ＩＭ）シーケンスを、入力として受信し、
パルス型光ビームのパルスに対する前記蛍光発光の光子の到達遅延（Δｔ１、Δｔ２）を入力として受信し、前記光子が、光子計数検出器又は検出器のマトリクス（ＭＤＣＰ）によって検出され、前記検出器又は前記マトリクスの各検出器（ＤＣＰ）が、前記マトリクスイメージセンサの画素セット（ＥＰＸ）に関連付けられ、
前記画像シーケンスを使用して、前記個々の蛍光発光体を位置特定することによって前記試料の超解像画像を構築し、
前記蛍光発光の前記光子の前記到達遅延を使用して蛍光寿命を計算し、前記個々の蛍光発光体に前記蛍光寿命を関連付ける、
ためのコンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明は、ナノメートル空間解像度及び個々の分子のスケールで蛍光寿命測定を行うことを可能にする、超解像蛍光顕微鏡のデバイス及び方法に関する。発明は、また、そのような方法のデータ処理ステップを実施することを可能にする、コンピュータプログラム製品に関する。
【０００２】
発明は、光学顕微鏡、より具体的には蛍光顕微鏡の分野の範囲内にあり、生物学及び生化学への適用を主に目的とする。
【背景技術】
【０００３】
従来の光学顕微鏡技術の空間解像度は、回折効果によって、使用される光の波長の大きさ（典型的には数百ナノメートル）のオーダーの値に制限される。しかしながら、回折限界より良好な解像度が得られるように、多くの方法が考えられている。これらは、「超解像度」と見なされる。特に引用され得る技術は、近接場結像及び構造化照明顕微鏡などの遠視野蛍光顕微鏡技術を含む。蛍光顕微鏡技術は、生物学において特に重要であり、それらの開発には、とりわけ２０１４年のノーベル化学賞が授与されている。
【０００４】
引用され得る超解像蛍光顕微鏡技術は、特にＳＴＥＤ（「誘導放出抑制」）顕微鏡法及びＳＭＬＭ（「１分子局在顕微鏡法」）を含み、ＳＭＬＭは、ＰＡＬＭ（「光活性化局在性顕微鏡法」）及びＳＴＯＲＭ（「確率的光学再構成顕微鏡法」）を含む。例えば、以下を参照されたい。
−  Ｓ．Ｗ．  Ｈｅｌｌ，Ｊ．  Ｗｉｃｈｍａｎｎ  “Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ：ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１１，Ｊｕｎｅ  １，１９９４
−  Ｔ．Ａ．  Ｋｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｂｒｏｋｅｎ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ”，  ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１５，Ｊｕｌｙ  １８，２０００
【０００５】
ＳＴＥＤ顕微鏡法は、フルオロフォア（蛍光マーカー）の蛍光発光を励起する第１のビームと、第１のビームによって照射される領域の周辺の蛍光をオフに切り替える誘導放出の低下を引き起こすリング形状の第２のビームと、の２つのコリニア照明光ビームを用いる走査型共焦点顕微鏡技術である。この技術は、数十ナノメートルの解像度を得ることを可能にするが、全ての走査型技術におけるように、取得時間が画像のサイズに依存し、非常に大きくなることがある。さらに、それは、平均して単一の蛍光分子が回折スポットに位置するように、蛍光マーキングの密度が非常に低いときにのみ、個々の分子の検出を可能にする。この場合でも、分子の拡散を追跡することは不可能である。
【０００６】
ＳＭＬＭは、確率型の技術であり、これは、光変換可能な蛍光マーカー、即ち、決定された波長での光放射の影響下において第１の状態から第２の状態へと切り替え得るマーカーを使用する。照射は、異なる波長の２つの光ビームによって行われる。第１のビームは、マーカーの光変換を引き起こし、第２のビームは、それらの第２の状態（光変換後又は光活性化後）にあるマーカーの分子の蛍光発光を引き起こす。マーカーの分子は、第１の状態から第２の状態へランダムに切り替える。第２の状態において、分子は、第２のビームによって励起され、それらが蛍光をオフに切り替える不可逆変化（ブリーチング）を経験するまでの制限された時間の間、蛍光光子を放射し得る。この時間は、典型的には、数十ミリ秒のオーダーである。よって、異なるマーカーの分子の蛍光は、経時的にランダムに「オンに切り替え」及び「オフに切り替え」を行う。複数の連続的な画像が取得され、その中で、異なる個々の蛍光発光体が回折スポットとして現われる。所与の時点において、第２の状態にある分子、及びしたがってそれらが第２のビームによって励起されるときに蛍光放射線を放射している分子が、回折限界よりも大きな平均距離だけ離間されるように、第１のビームの強度が選択される。このようにして、回折スポットの大半が区別され得る。それによって、個々の蛍光発光体の識別が可能となる。その際、後者の位置が、対応する回折スポットの中心を推定することによって、ナノメートルの精度で判定される。このようにして、超解像された画像が、再構築され得る。ＳＴＥＤ顕微鏡法と比較すると、ＳＭＬＭ技術は、「全視野」であり、したがって画像サイズとは無関係な取得時間を有するという利点、及び個々の分子の時間内の識別及び追跡を可能にするという利点を有する。ＳＭＬＭは、例えば、以下に説明されている。
−  Ｅ．  Ｂｅｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｔ  Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３１３，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，２００６
−  Ｍ．Ｊ．Ｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｓｕｂ−ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ−ｌｉｍｉｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｙ  ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  （ＳＴＯＲＭ）”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１０，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００６
【０００７】
フルオロフォアの蛍光寿命（即ち、その脱励起の確率の減衰率の逆数）は、その環境及びそれが経験する分子相互作用に依存する。その測定は、したがって、生化学的コンテキストについての有用な情報を提供する。
【０００８】
蛍光寿命イメージング顕微鏡法（ＦＬＩＭ）は、蛍光試料の蛍光寿命差に基づいて画像を作り出す結像技術である。典型的には、その解像度は、回折により制限される。例えば、以下を参照されたい。
−  Ｃ．−Ｗ．  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．８１，ｃｈａｐｔｅｒ  ２４
【０００９】
２つの技術が、空間的超解像度を用いて蛍光寿命測定値を得るために提案されている。
【００１０】
文献、欧州特許第１５８４９１８号明細書は、ＳＴＥＤ及びＦＬＩＭ技術を組み合わせる方法、並びにその実施のためのデバイスを説明する。この手法は、ＳＴＥＤ顕微鏡に関して既に説明された、蛍光分子の励起が共焦点走査、及びしたがって潜在的に非常に長時間の走査によって行われるという事実に起因する、画像サイズに依存した取得時間、並びに個々の分子を検出することが不可能であるという欠点を有する。さらに、実施される光強度が高く、したがって周知の光毒性現象により、生体内結像と調和させることが困難である。
【００１１】
文献、中国特許第１０２０３３０５８号明細書は、対面で配置された２つの対物レンズを含む顕微鏡デバイスを説明する。これらの対物レンズの１つは、走査により個々の分子を検出するために使用され、もう１つは、蛍光寿命測定を行うことを可能にする。これは、個々の分子の検出を可能にするが、この技術は、全ての走査型手法に共通の欠点、すなわち、画像サイズに依存する取得時間という欠点を有する。さらに、デバイスが、従来の（市場標準の）顕微鏡に基づいておらず、そのアライメントは、非常に複雑且つ困難である。
【００１２】
文献、米国特許出願公開第２０１３／０１２６７５５号明細書は、複数の蛍光顕微鏡パラメータを同期的に取得することを可能にするデバイスについて報告する。より詳細には、そのようなデバイスは、周辺デバイスに関連付けられたＴＳＣＳＰＣ（時間相関及び空間相関単一光子計数）検出器を含む。ＴＳＣＳＰＣ技術は、Ｓｅｒｇｅｉ  Ｓｔｅｐａｎｏｖ，Ｓｅｒｇｅｉ  Ｂａｋｈｌａｎｏｖ，Ｅｖｇｅｎｙ  Ｄｒｏｂｃｈｅｎｋｏ，Ｈａｎｎ−Ｊｏｒｇ  Ｅｃｋｅｒｔ，Ｋｌａｕｓ  Ｋｅｍｎｉｔｚによる記事、“Ｗｉｄｅｆｉｅｌｄ  ＴＳＣＳＰＣ−Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  Ｌａｒｇｅ−Ａｒｅａ−Ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｎｅｌ−ＦＬＩＭ”  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＳＰＩＥ，Ｊｕｎｅ  ２０１０において、より詳細に説明されている。
【００１３】
文献、米国特許出願公開第２０１３／００１５３３１号明細書及びＩ．  Ｍｉｃｈｅｌ  Ａｎｔｏｌｏｖｉｃによる記事“Ｐｈｏｔｏｎ−Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ”は、マイクロレンズのアレイに関連付けられた単一光子検出器のマトリクス、及び蛍光顕微鏡技術に対するそれらの適用を開示する。
【００１４】
文献、欧州特許第３２０３２１５号明細書は、光ファイバ束に関連付けられた光検出器のマトリクスを含むスペクトラルイメージングデバイスを開示する。
【００１５】
発明は、上述した先行技術の欠点を克服することを目的とする。より具体的には、発明は、個々の分子の時間内の検出及び追跡、並びにそれらの蛍光寿命の同時測定を可能にする、「全視野」超解像顕微鏡技術を提供することを目的とする。有利なことには、そのような技術は、市場標準の顕微鏡システムを中心として実施することが簡単であり、生細胞の結像と両立可能であるべきである。
【００１６】
発明によれば、この目的は、ＳＭＬＭ技術及び蛍光寿命測定を組み合わせることによって達成される。面白いことに、この組み合わせは、以前は不可能であると考えられていた。Ｂｅｃｋｅｒ，Ｗ．（Ｅｄ．）（２０１５）．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｔｉｍｅ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｖｏｌ．１１１）”  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｖｌａｄｉｓｌａｖ  Ｓｈｃｈｅｓｌａｖｓｋｉｙ，  Ｈａｕｋｅ  Ｓｔｕｄｉｅｒ  “ＴＣＳＰＣ  ＦＬＩＭ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．１０）を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許第１５８４９１８号明細書
【特許文献２】中国特許第１０２０３３０５８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１３／０１２６７５５号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１３／００１５３３１号明細書
【特許文献５】欧州特許第３２０３２１５号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｓ．Ｗ．  Ｈｅｌｌ，Ｊ．  Ｗｉｃｈｍａｎｎ  “Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ：ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１１，Ｊｕｎｅ  １，１９９４
【非特許文献２】Ｔ．Ａ．  Ｋｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｂｒｏｋｅｎ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ”，  ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１５，Ｊｕｌｙ  １８，２０００
【非特許文献３】Ｅ．  Ｂｅｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｔ  Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３１３，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，２００６
【非特許文献４】Ｍ．Ｊ．Ｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｓｕｂ−ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ−ｌｉｍｉｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｙ  ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  （ＳＴＯＲＭ）”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１０，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００６
【非特許文献５】Ｃ．−Ｗ．  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．８１，ｃｈａｐｔｅｒ  ２４
【非特許文献６】Ｓｅｒｇｅｉ  Ｓｔｅｐａｎｏｖ，Ｓｅｒｇｅｉ  Ｂａｋｈｌａｎｏｖ，Ｅｖｇｅｎｙ  Ｄｒｏｂｃｈｅｎｋｏ，Ｈａｎｎ−Ｊｏｒｇ  Ｅｃｋｅｒｔ，Ｋｌａｕｓ  Ｋｅｍｎｉｔｚ  “Ｗｉｄｅｆｉｅｌｄ  ＴＳＣＳＰＣ−Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  Ｌａｒｇｅ−Ａｒｅａ−Ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｎｅｌ−ＦＬＩＭ”  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＳＰＩＥ，Ｊｕｎｅ  ２０１０
【非特許文献７】Ｉ．  Ｍｉｃｈｅｌ  Ａｎｔｏｌｏｖｉｃ  “Ｐｈｏｔｏｎ−Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ”
【非特許文献８】Ｂｅｃｋｅｒ，Ｗ．（Ｅｄ．）（２０１５）．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｔｉｍｅ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｖｏｌ．１１１）”  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｖｌａｄｉｓｌａｖ  Ｓｈｃｈｅｓｌａｖｓｋｉｙ，  Ｈａｕｋｅ  Ｓｔｕｄｉｅｒ  “ＴＣＳＰＣ  ＦＬＩＭ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、発明の主題は、
ａ）観察対象の試料に含まれる蛍光発光体の確率的活性化を誘発するステップ、及び活性化された発光体からの蛍光発光を引き起こすのに適当な波長を有する励起光ビームで上記試料を照射するステップと、
ｂ）マトリクスイメージセンサを含む結像系によって、上記蛍光発光の画像シーケンスを取得するステップと、を含み、
−  上記励起光ビームがパルス型であり、２つの連続するパルス間の時間間隔が、蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、
−  方法が、上記励起光ビームのパルスに対する上記光子の到達遅延を判定するために、蛍光発光の光子を計数するステップをさらに含み、上記計数するステップが、各光子が上記マトリクスイメージセンサの画素セットに関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
−  １つの上記画像の取得時間中に、多くとも１つの個々の蛍光発光体が、マトリクスイメージセンサの１つの上記画素セットに対応する試料の領域において平均して活性化されるように、蛍光発光体の確率的活性化が実行されることと、
を特徴とする、超解像蛍光顕微鏡方法である。
【００２０】
より詳細には、第１の実施形態によれば、方法は、
ａ）第１の波長の第１の光ビーム及び第２の波長の第２の光ビームによって光変換可能な蛍光発光体を含む試料を照射するステップであって、第１の波長が、第１の状態から第１の状態とは異なる第２の状態への蛍光発光体の変換を誘発することによって上記蛍光発光体を活性化するように選択され、第２の波長が、第１の波長とは異なり、第２の状態の蛍光発光体の蛍光発光を引き起こすのに適当である、ステップと、
ｂ）マトリクスイメージセンサを含む結像系によって、上記蛍光発光の画像シーケンスを取得するステップと、を含み、
−  上記第２の光ビームがパルス型であり、２つの連続するパルス間の時間間隔が、蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、
−  方法が、上記第２の光ビームのパルスに対する上記光子の到達遅延を判定するために、蛍光発光の光子を計数するステップをさらに含み、上記計数するステップが、各光子が上記マトリクスイメージセンサの画素セットに関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
−  １つの上記画像の取得時間中に、多くとも１つの個々の蛍光発光体が、マトリクスイメージセンサの１つの上記画素セットに対応する試料の領域において平均して活性化されるように、第１の光ビームの強度が選択されることと、
を特徴とする。
【００２１】
方法の第２の実施形態によれば、
−  試料が、
−  マイクロメートル未満の厚さを有し、
−  励起光ビームの波長に対して透明な、誘電体支持体の面上に堆積され、
−  第１の種類の分子で機能化される支持体に対向する面を有し、平均して、多くとも１つの第２の種類の分子が、マトリクスイメージセンサの１つの上記画素セットに対応する試料の領域において第１の種類の分子に結合されるように、蛍光発光体に結合され、且つ運動性を有する反応によって第１の種類の分子と一過的に結合しやすい、第２の種類の分子を含む溶液に接触して置かれ、
−  ステップａ）が、誘電体支持体の面からマイクロメートル未満の距離に位置する単独の蛍光発光体からの蛍光発光が活性化されるように、上記励起光ビームを用いた内部全反射による試料の照射を含む。
【００２２】
そのような方法の有利な特徴によれば、以下が個別に又は組み合わせて用いられる。
【００２３】
−  上記光子計数ステップが、
ｃ）上記蛍光発光の一部を光子計数検出器又は検出器のマトリクスに向けるステップであって、上記検出器又はマトリクスの各検出器が、上記マトリクスイメージセンサの画素セットに関連付けられる、ステップと、
ｄ）光子計数検出器を使用して、上記励起光ビーム（第２の光ビーム）のパルスに対する蛍光光子の到達遅延を測定するステップと、
を含み得る。
【００２４】
−  方法が、
ｅ）ステップｂ）において取得された画像シーケンスを使用して、上記個々の蛍光発光体を位置特定することによって超解像画像を構築するステップと、
ｆ）ステップｄ）において測定された蛍光光子の到達遅延を使用して蛍光寿命を計算し、ステップｅ）において位置特定された個々の蛍光発光体に蛍光寿命を関連付けるステップと、
をさらに含んでもよく、
ステップｅ）及びｆ）が、電子プロセッサによって実施される。
【００２５】
−  上記ステップｅ）が、ステップｂ）において取得された画像内に存在する回折スポットの中心を推定することによる、上記個々の蛍光発光体の位置特定を含み得る。
【００２６】
−  方法は、上記個々の蛍光発光体に上記蛍光寿命を関連付けるための、ステップｂ）において取得された画像とステップｄ）において測定された蛍光光子の到達遅延との間の空間時間相関のステップｇ）をさらに含み得る。
【００２７】
−  上記光子計数検出器のマトリクスが、複数の行及び複数の列に従って配置された複数の上記検出器を含み得る。
【００２８】
発明の別の主題は、
−  観察対象の試料に含まれる蛍光発光体の確率的活性化のための手段と、
−  励起光ビームと呼ばれる光ビームを、活性化された蛍光発光体からの蛍光発光を引き起こすのに適当な波長で放射するのに適当な、励起光ソースと呼ばれる光源と、
−  励起光ビームを試料の方に向けるように構成される光学系と、
−上記試料の蛍光画像のシーケンスを取得するように構成されるマトリクスイメージセンサを含む、光学検出系と、を備え、
−  上記励起光ソースがパルス型ソースであり、このソースの２つの連続するパルス間の時間間隔が、蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、光学検出系が、上記第２の光ビームのパルスに対する上記光子の到達遅延を判定するために、蛍光発光の光子の計数を実行するようにさらに構成され、上記計数が、各光子が上記マトリクスイメージセンサの画素セットに関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
を特徴とする、超解像蛍光顕微鏡デバイスである。
【００２９】
第１の実施形態によれば、デバイスは、
−  第１の波長で第１の光ビームを放射するのに適当な第１の光源であって、上記第１の波長が、第１の状態から第１の状態とは異なる第２の状態への蛍光発光体の変換を誘発することによって蛍光発光体を活性化するように選択される、第１の光源と、
−  第１の波長とは異なる第２の波長で第２の光ビームを放射するのに適当な第２の光源であって、上記第２の波長が、第１の波長とは異なり、第２の状態の蛍光発光体の蛍光発光を引き起こすのに適当である、第２の光源と、
−  第１の光ビーム及び第２の光ビームを試料の方に向けるように構成される、光学系と、
−  上記試料の蛍光画像のシーケンスを取得するように構成される、光学検出系と、を備え、
−  上記第２の光源がパルス型ソースであり、このソースの２つの連続するパルス間の時間間隔が、蛍光発光体の蛍光寿命よりも大きいことと、光学検出系が、上記第２の光ビームのパルスに対する上記光子の到達遅延を判定するために、蛍光発光の光子の計数を実行するようにさらに構成され、上記計数が、各光子が上記マトリクスイメージセンサの画素セットに関連付けられることを可能にする空間解像度で実行されることと、
を特徴とする。
【００３０】
デバイスの第２の実施形態によれば、蛍光発光体の確率的活性化のための手段が、試料が堆積され得る面上において、励起光ビームの波長に対して透明な誘電体支持体と、上記支持体を含む流体タンクと、を含み、上記光学系が、励起光ビームが上記面上での内部全反射を経験するように支持体を通って励起光ビームを方向付けるように構成される。
【００３１】
そのようなデバイスの有利な特徴によれば、以下が個別に又は組み合わせて用いられる。
−  光学検出系が、上記試料の上記蛍光画像のシーケンスを取得するように構成される結像系と、上記試料から蛍光発光の一部を受けるように配置される光子計数検出器又は検出器のマトリクスであって、上記検出器又はマトリクスの各検出器が、上記マトリクスイメージセンサの上記画素セットに関連付けられる、光子計数検出器又は検出器のマトリクスと、上記第２の光ビームのパルスに対する上記検出器又は上記各検出器上に到達する光子の到達遅延を測定するように構成される、上記光子計数検出器又は検出器のマトリクスに関連付けられる電子回路と、を含み得る。
【００３２】
−  デバイスが、上記マトリクスイメージセンサによって取得された蛍光画像のシーケンスを入力として受信し、蛍光画像のシーケンスを使用して、シーケンスの画像において個々の蛍光発光体を位置特定することによって超解像画像を構築し、上記電子回路によって得られた遅延測定値を入力として受信し、遅延測定値を使用して蛍光寿命を計算し、位置特定された個々の蛍光発光体に上記蛍光寿命を関連付けるように構成される電子プロセッサをさらに含み得る。
【００３３】
−  上記電子プロセッサが、上記マトリクスイメージセンサによって取得された画像内に存在する回折スポットの中心を推定することにより、上記個々の蛍光発光体を位置特定するように構成され得る。
【００３４】
−  上記電子プロセッサが、上記マトリクスイメージセンサによって取得された画像と上記電子回路によって得られた遅延測定値との間の空間時間相関を実行することによって、位置特定された個々の蛍光発光体に上記蛍光寿命を関連付けるように構成され得る。
【００３５】
−  上記光子計数検出器が、個々の光子アバランシェダイオードであり得る。
【００３６】
−  デバイスは、１つの上記光子計数検出器のマトリクスを含み得る。光子計数検出器のマトリクスが、特に不連続の個々の光子アバランシェダイオードのマトリクスであってもよく、デバイスが、マトリクスのそれぞれの個々の光子アバランシェダイオードに対向して配置される１つの上記マイクロレンズを含む、連続収束マイクロレンズのマトリクスをさらに含み、それぞれの上記マイクロレンズが、上記マトリクスイメージセンサの画素セットと光学的に共役である。
【００３７】
−  代替的には、デバイスが、複数の上記光子計数検出器と、それぞれの光ファイバの第１の端面が上記マトリクスイメージセンサの画素セットと光学的に共役であるように、光ファイバ束と、を含んでもよく、１つの上記光子計数検出器がそれぞれの上記光ファイバの第２の端面に対向して配置される。
【００３８】
発明のさらに別の主題は、上述した方法のステップｅ）及びｆ）を少なくとも実施するためのコンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータプログラム製品である。
【００３９】
発明の他の特徴、詳細、及び利点は、例として与えられた添付図面を参照して与えられる説明を読むと現れるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】発明の実施形態による、デバイスの図である。
【図２】図１のデバイスにおけるマイクロレンズのアレイに関連付けられた光子計数検出器のマトリクスの機能的表現である。
【図３】発明の原理の例示である。
【図４】発明による方法のフロー図である。
【図５Ａ】単一画素センサを用いることによって得られる、発明の原理の証明である。
【図５Ｂ】単一画素センサを用いることによって得られる、発明の原理の証明である。
【図６】発明の代替的実施形態による、デバイスの詳細である。
【図７Ａ】図１のデバイスを用いて得られる画像である。
【図７Ｂ】図１のデバイスを用いて得られる画像である。
【図８】発明の別の代替的実施形態による、デバイスの詳細である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
図１に示されるように、発明の実施形態によるデバイスは、２つの光源、概してレーザを含む。
【００４２】
−  第１のソースＳＬ１（変換ソース）は、光変換可能な蛍光マーカーの光活性化を引き起こすことが可能な波長λ１で、第１の光ビームＦＬ１（変換ビーム）を放射する。例えば、マーカーが、Ｄｅｎｄｒａ、ＥＯＳ、又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）光活性フルオロフォアであるとき、それは、４０５ｎｍの波長で放射する低出力レーザダイオード（＜１ｍＷ）であってもよい。
【００４３】
−  第２のソースＳＬ２（励起ソース）は、第１のビームによって光活性化された蛍光マーカーを励起することが可能な波長λ２で、第２の光ビームＦＬ２（励起ビーム）を放射する。この第２のソースは、概して、ピコ秒（パルス期間が１００ｆｓと１００ｐｓとの間である）又はフェムト秒（パルス期間が１００ｆｓより少ない）の、光活性化されたマーカーの蛍光寿命よりも大きいパルス間の間隔を有するパルス型のものである。蛍光寿命は、概して数ナノ秒のオーダーである。後で説明するように、第２のソースのパルス型の性質は、蛍光寿命測定を可能にするために必須である。例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６７４の場合、それは、８０ＭＨｚの反復率及び１００ｐｓオーダーのパルス期間を有し、ｍＷオーダーの出力を有する６４７ｎｍの波長で放射するパルス型レーザダイオードであり得る。
【００４４】
ビームＦＬ１及びＦＬ２は、第１のダイクロイックミラーＭＤ１を用いて結合され、収束レンズＬ１によってフォーカスされ、次いで、ビームが広い開口数を有する対物レンズＯＢＪ、例えば、商業用顕微鏡の対物レンズの後側焦点面上にフォーカスされるように、第２のダイクロイックミラーＭＤ２によって方向付けられる。対物レンズの後、ビームは、それによってコリメートされ、試料Ｅが、全視野で照射される。試料Ｅは、波長λ１及びλ２の影響を受けやすい光変換可能フルオロフォア、例えば、Ｄｅｎｄｒａ若しくはＥｏｓのような蛍光タンパク質（４０５ｎｍで活性化、５６１ｎｍで活性化状態の励起）又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７のような有機着色剤（４０５ｎｍで活性化、６４７ｎｍで励起）によってマークされた、生物種若しくは生化学種又はナノ物質を含み得る。Ｄｅｎｄｒａ、Ｅｏｓ、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７は、商標名及び登録商標である。
【００４５】
試料Ｅによって放射される蛍光放射線は、第２のダイクロイックミラーＭＤ２を通過する平行ビームＦＬＦを形成するように対物レンズＯＢＪによって収集され、第２の収束レンズＬ２によってフォーカスされ、スプリッタプレートＬＳによって２つの成分ＦＬＦ１及びＦＬＦ２に分離される。
【００４６】
成分ＦＬＦ１は、その蛍光画像ＩＭを取得するように試料Ｅと光学的に共役である、例えば、ＥＭ−ＣＣＤ型（電子増倍電荷結合素子）又はｓＣＭＯＳ型（科学用ＣＭＯＳ）のマトリクスイメージセンサＣＩＭに対して方向付けされる。レンズＬ２及びセンサＣＩＭは、このように、結像系ＳＩを形成する。
【００４７】
マトリクスセンサＣＩＭによる画像の取得速度は、第２の光源ＳＬ２のパルスの反復周波数より非常に低く（１０５〜１０７倍）、典型的にはフレームにつき１０〜１００ｍｓのオーダーである。図３の部分Ａは、時間ｔにわたって取得される画像シーケンスを概略的に表し、これらの画像のうちの１つが、活性化された蛍光発光体に対応する光スポットを示す。
【００４８】
第１の光ビームによる試料のフルオロフォアの光活性化は、確率的現象であり、所与のフルオロフォアがセンサＣＩＭのフレーム取得時間中に活性化される確率は、ビームＦＬ１の強度に依存する。発明によれば、この強度は、活性化されたフルオロフォア、及びしたがって蛍光フルオロフォアが、画像上に解像され得るように選択される。ビームＦＬ１の最大許容強度は、フルオロフォアの密度、それらの光活性力、試料の厚さ、結像光学系の特性、及び画像の取得速度に依存する。
【００４９】
電子プロセッサＰＲは、例えば、コンピュータ、コンピュータネットワーク、専用電子回路などであってもよく、センサＣＩＭによって取得された画像ＩＭを入力として受信し、ガウス分布を画像上の各可視光スポットに適合させることによって、並びに個々の蛍光発光体（図２及び図３中の参照符号ＥＦＩ）が分布の中心に相関すると考えることによって、ＳＭＬＭの原理に従って画像ＩＭを処理する。位置の平均二乗誤差は、取得された光子の数の平方根に反比例し、典型的には、１０ｎｍのオーダー、回折限界より小さい大きさのオーダーである。それは、図３の部分Ａ及びＢに示されている。
【００５０】
蛍光放射線の成分ＦＬＦ２は、図１の実施形態において、レンズＬ３、収束マイクロレンズＭＭＬのマトリクス、及び光子計数検出器ＭＤＣＰのマトリクスを含む、光子計数系ＳＣＰの方に向けられる。検出器は、有利には、単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ、これは「単一光子アバランシェ検出器」の略語である）である。
【００５１】
マイクロレンズのマトリクスは、試料と光学的に共役であり、言い換えると、試料の画像がその表面上に形成される。図２に示されるように、各光子計数検出器ＤＣＰは、それぞれのマイクロレンズＭＬの後ろに配置される。マイクロレンズＭＬは、センサＣＩＭの複数の画素ＰＩＸのセットＥＰＸ（図２の例における５×５正方形を形成する２５個の画素）と対になっている試料の領域から生じる光子を、検出器ＭＬ上に集中させる。マイクロレンズマトリクスの主な機能は、検出器のマトリクスのフィルファクタを向上させることである。実際に、ＳＰＡＤ技術に固有の制約に起因して、マトリクスＭＤＣＰは、典型的には、辺５０μｍ及びピッチ２５０μｍの検出器を有する。マイクロレンズなしでは、結果的に、検出器のマトリクスに到達する光子の大部分が失われることとなる。図２は、受光器マトリクスの「非活性」部分はその中に表されておらず、機能の例示のみを構成し、マイクロレンズのマトリクス及び検出器のマトリクスの組立体の忠実な表現ではないとも理解されたい。
【００５２】
セットＥＰＸに対応する領域内で「同時に」（即ち、同一画像取得時間中に）活性化される２つの蛍光発光体を有する確率がわずかである（例えば、１／１００より大きくない）ように、光子計数検出器に関連付けられたセットＥＰＸの寸法は、ビームＦＬ１の光強度の関数として選択される。最低でも、セットＥＰＸに対応する領域内の同一画像取得時間中に活性化されるフルオロフォアの平均数は、１を超えないことが必要とされる。ビームＦＬ１の最大許容強度は、フルオロフォアの密度、それらの光活性力、試料の厚さ、セットＥＰＸのサイズ、及び画像の取得速度に依存する。
【００５３】
図２は、マトリクスＭＤＣＰのそれぞれの検出器ＤＣＰに関連付けられたそれぞれの画素セットＥＰＸ内の単一の個々の蛍光発光体ＥＦＩを示す。これらの条件において、検出器ＤＣＰによって検出される光子全てが、発光体ＥＦＩ、すなわち、上記で説明されたように位置がナノメートル精度で判定され得る個々の分子によるものとされ得る。図３の部分Ｃは、蛍光画像の取得時間中の、検出器ＤＣＰによる毎ミリ秒の光子計数を表すグラフである。
【００５４】
電子回路ＣＭＲは、蛍光励起光ビームＦＬ２の直前のパルスＩＬ２に対する、検出された各光子の遅延（図３の部分ＤにおけるΔｔ１、Δｔ２）を測定することを可能にする。回路は、判定される蛍光寿命よりも少なくとも１０倍、好適には少なくとも１００倍良好な時間解像度を有するべきである。典型的には、この時間解像度は、ピコ秒のオーダー（より良くは１００ｐｓ、好適には１０ｐｓ）であるべきである。
【００５５】
これらの測定値から、プロセッサＰＲは、遅延のヒストグラム（図３の部分Ｅ）を構築し、それを使用して個々の発光体ＥＦＩの蛍光寿命を計算する。回路ＣＭＲは、各パルスＩＬ２の放射の時点を表す信号、例えばフォトダイオードから生じる信号を受信することに留意されたい。図を乱雑にしないため、それは表されない。
【００５６】
よって、発明は、個々の発光分子の寿命を測定することを可能にし、個々の発光分子の位置は、密度の高いマーキング条件（例えば、１０ｎｍ毎に１つの分子）においてであっても、回折限界よりもはるかに良好な空間解像度で判定される。
【００５７】
図４は、発明による方法の異なるステップを概略的に示している。
【００５８】
ステップａ）は、光活性ビームＦＬ１及びパルス型蛍光励起ビームＦＬ２による、試料Ｅの照射に対応する。同時に、蛍光画像シーケンスが取得され（ステップｂ）、画像の画素に関連付けられた検出器による光子の検出（ステップｃ）が、その到達時間の測定（ステップｄ）とともに、行われる。
【００５９】
続くステップは、電子プロセッサＰＲによって、概して適当なソフトウェアを用いて実施される。個々の発光体は、ステップｂ（ｅ）において取得された画像に基づいて超解像で位置特定され、これらの発光体の蛍光寿命は、光子到達遅延（ｆ）から得られる。ステップｅ）及びｆ）において生成されるデータの空間時間相関は、超解像された単一分子の蛍光寿命画像を構築すること、並びに／又はその蛍光寿命シグネチャを有する単一分子の拡散、及び上記寿命の傾向でさえも、追跡する（ステップｇ）ことを可能にする。
【００６０】
より具体的には、アーチファクトを制限するために、プロセッサＰＲによって実行されるデータ処理ソフトウェアは、好適には以下の動作を実行する。
−  光活性化された蛍光分子の検出に有効に対応する信号のみを保持し、雑音を却下するように、マトリクスイメージセンサによって、及び光子計数検出器によって取得される信号を閾値で２値化すること。
−  異常な時間特性を表している信号をフィルタリングすること。例えば、フォトブリーチングは、平均値が既知である時間（例えば、３０ｍｓ）、蛍光をオフに切り替える。センサＣＩＭによって取得された画像が、あまりに長い間持続している光スポットを示す場合、それが複数の分子に起因し、したがって、破棄されるべきであることを意味する。光子計数検出器に関して、閾値の上及び下で、数ミリ秒の間隔で複数回「明滅する」信号が見られること、並びに少なくとも事前定義された最小数の光子（典型的には、数百、例えば２５０）が検出されることが予期される。これらの条件が満たされない場合、信号は破棄される。
−  「イベント」の形式で２つの検出器（イメージセンサ及び光子計数検出器のマトリクス）から導出するデータのバイナリ表現。空間的及び時間的に相関するイベントに対応する信号のみが、ステップｇ）の再構築に使用される。このステップの終わりに、それぞれの個々の蛍光発光体の位置が、その蛍光寿命に関連付けられる。
−  複数の蛍光発光体が、イメージセンサの１つの且つ同一の画素セット内で同時に検出される場合、様々な規則が適用され得る。１つの可能性は、対応する信号を純粋且つ単純に破棄することにある。別の可能性は、画素セットのエッジの近くに位置する発光体を無視することにある。第３の可能性は、ＤＣＰの応答が、ＥＰＸの中心及びそのエッジにある発光体について同一でないという事実に依存する。その結果、各発光体についてのＤＣＰによって検出される光子の数の端数の知識が、信頼性スコアを寿命測定に割り当てることを可能にする。例えば、このスコアは、ＥＰＸの中心で１つの発光体を、エッジにおいて２つ目の発光体を同時に検出する場合に高くなり、中心から同じ距離において２つの発光体を同時に検出する場合に低くなる。最初の検出が保持され、２つ目は却下される。
【００６１】
発明は、特定の実施形態を参照して説明されているが、変形が可能である。
【００６２】
例えば、少なくとも原則として、マイクロチャネルプレート（ＭＣＰ）などの１つの且つ同一の検出器を使用して、光子の計数及び画像の取得を同時に行うことが可能である。しかしながら、それによって得られる光学系の簡略化は、概して、それが引き起こす性能低下の正当な理由とならない。
【００６３】
第２の可能性が、デバイスのＳＣＰ部分におけるレンズＬ３による光ファイバ束ＦＦの入力時に試料の対象ゾーンを結像することにある。したがって、各ファイバの入力面が、センサＣＩＭの画素セットと光学的に共役である。各ファイバの出力において、信号は、それぞれのレンズＬＤＣＰを介して検出器ＤＣＰ上で検出される。この構成は、ＬＤＣＰレンズ及び個々の検出器の使用の方を選んで、マイクロレンズのアレイ及び検出器のアレイの使用を省くことを可能にする。この変形は、図６に示されている。
【００６４】
マイクロレンズのマトリクス及び光子計数検出器のマトリクスは、好ましくは２次元であり、行及び列に配置されるが、これは必須ではない。１次元マトリクス及び／又は非デカルト構成を有するマトリクスを使用することも可能である。
【００６５】
別の変形が、マトリクスの代わりに、単一の光子計数検出器を使用することにある。それは、マイクロレンズのマトリクスの使用を避けることを可能にする。結論は、結像系の視野が、図２の単一の画素セットに対応して非常に制限されなければならず、単一の画素セットは、平均して単一の光活性化された分子のみを同時に（即ち、センサＣＩＭの取得時間にわたって）含むように、かなり小さくなければならないということである。この簡略化された実施形態は、発明の原理の証明を作り出すために使用された。図５Ａに示されるように、銀のナノワイヤＮＦ（直径１００ｎｍ、長さ数マイクロメートル）が、ディッシュに入っている水溶液ＳＡ内に浸されていた。光変換可能なフルオロフォアＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７は、タンパク質、ストレプトアビジンと共有原子価によって結合され、ストレプトアビジンはナノワイヤ及びガラスプレートの表面にビオチンを用いて結合される。ストレプトアビジンは、ビオチンとの非常に高い結合親和性を有し、ストレプトアビジンのコンジュゲートは、様々なタンパク質のうちの特定の検出のためにビオチンのコンジュゲートと同時に共通して使用される。図５Ａにおいて、参照符号ＦＰＣは、光交換可能フルオロフォア（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７）を示し、参照符号ＳＢＴＮは、ストレプトアビジン−ビオチン複合体を示す。図５Ｂは、図１のものと類似であるが、単一の光子計数検出器を含むデバイスによって得られる画像である。視野は、１０００×１０００ｎｍ（１μｍ２）である。灰色の陰は、測定された蛍光寿命（脱励起率）の逆数に対応する。ディッシュの底ＦＣＶに接着するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７の分子が１ｎｓ−１のオーダーの蛍光脱励起率を表すことが分かり得る。この率は、ナノワイヤに結合された分子についての大きさのオーダーよりも多く増加する。照射は、ディッシュの底を通るため、ナノワイヤの上部は、陰にあり、黒く見える。
【００６６】
図７Ａ及び図７Ｂは、収束マイクロレンズのマトリクス及び８個の光子計数検出器のマトリクスを有する図１のデバイスを用いて得られる画像を示す。より具体的には、図７Ａは、試料の平面内の光子計数検出器のマトリクス及びマトリクスイメージセンサの空間的相関を示す。より具体的には、この図は、マイクロレンズのアレイを用いて、試料の平面において連続するゾーンが、光子計数検出器のそれぞれと光学的に共役であり、上記ゾーンのそれぞれの間に情報の欠落がないことを示している。図７Ａは、試料の平面内でスポット光源（蛍光ボール）を走査することによって、及びボール（画像の画素）の各位置についての光子計数検出器のそれぞれにより測定される蛍光強度を表すことによって、得られた。図７Ｂは、図５について説明されたように、銀ナノワイヤ（直径１００ｎｍ）の存在によって引き起こされる蛍光寿命の変化のマッピングである。
【００６７】
発明は、光変換可能な蛍光発光体を用いて、特定の実施形態を参照して説明されている。しかしながら、それは必須ではない。実際、発明の実施のために考慮されるものは、平均して、多くとも単一の発光体が、マトリクスイメージセンサの画素セットに対応する試料の領域内で活性化されるように、蛍光発光体が確率的に活性化されるということである。それは、光化学手段以外により得られ得る。例えば、以下の記事においてそれぞれ説明される、ｕＰＡＩＮＴ及びＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ技術を使用することが可能である。
−  Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｇｉａｎｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｄｙｎａｍｉｃ−Ｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａ−Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ”，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．９９，Ａｕｇｕｓｔ  ２０１０，ｐａｇｅｓ  １３０３−１３１０
−  Ｊｏｅｒｇ  Ｓｃｈｎｉｔｚｂｚａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．６，ｐａｇｅｓ  １１９８−１２２８（２０１７）
【００６８】
これらの手法は、今度は蛍光発光体によってマークされる第２の種類の分子の溶液に接触して置かれた、第１の種類の分子によって機能化された試料を使用する（ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴの場合、第１の種類及び第２の種類の分子が、ＤＮＡ鎖である）。第１の種類及び第２の種類の分子は、互いに一過的に結合しやすい。適当な照明系が、試料の表面からマイクロメートル未満、さらには数百ナノメートルに位置する発光体のみ、したがって、実際には所与の時点に第１の種類の分子を介して試料に結合される第２の種類の分子に結合された発光体のみの蛍光を活性化するために使用される。それは、例えば、急傾斜光（８５°以上のオーダーの入射角度）を用いて、又は内部全反射で得られ得る。
【００６９】
図８は、後者の場合に関する。試料Ｅは、透明な誘電体支持体ＳＤＴ、例えば、ガラス板の表面ＳＳ上に堆積される薄層の形態をとる。励起光ビームＦＬ２は、支持体を通過し、その表面ＳＳ上で内部全反射を経験し、それは、ほぼ２００ｎｍの距離にわたって現れるエバネッセント波を発生させる。
【００７０】
試料の表面は、高密度（密度は１０ｎｍ当たり１つ以上の鎖）を有するＤＮＡ鎖（ＢＲ１）で覆われている。支持体と試料の集合体は、従来のフルオロフォア（光活性でない）ＥＦが付着した第２のＤＮＡ鎖（ＢＲ２）が中に存在する溶液で満たされた流体タンクＣＦ内にある。溶液内で、エバネッセント波によって照射されるゾーンの外側では、フルオロフォアは励起されない。ＤＮＡ鎖ＢＥ１及びＢＲ２は、弱い相互作用、ＤＮＡ鎖の長さを通して制御され得る結合運動を伴う認識配列を有する。拡散によって、ＢＲ２−フルオロフォア複合体は、鎖ＢＲ１に近接して到達し、一過的に付着する。それは、対応するフルオロフォアの励起を可能にする。後者は次いで、光子を放射し、マトリクスイメージ検出器及び光子計数検出器によって個々のフルオロフォアとして検出される。フォトブリーチングの後、ＢＲ１−ＢＲ２結合運動にしたがって、各ＢＲ２−フルオロフォア複合体は、鎖ＢＲ１から分離し、拡散によってエバネッセント波による照射ゾーンを離れる。現象は、上述のような密度の高いマッピングが得られるまで、反復される。平均的に、多くとも単一の発光体が、マトリクスイメージセンサの画素セットに対応する試料の領域内で活性化され、それによって個々のフルオロフォアの検出を可能にすることを保証するために、結合運動（ＤＮＡ鎖の長さに依存する）、及び溶液内の鎖ＢＲ２の密度の２つのパラメータに対して作用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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