(57)【要約】  本発明は、標的構造を検出するための方法およびＤＮＡナノ構造に関する。本発明は、特に、ＤＮＡナノ構造の形状およびそこに固定されたマーカー分子の配置の巧妙な選択によって、複数のそのようなＤＮＡナノ構造の局所配列と独立して、マーカー分子の数および測定シグナルに対する、好ましくは線形の依存性を確実にする、ＤＮＡナノ構造に関する。本発明は、さらに、好ましくはマルチプレックス法による複数の標的分子の同時定量化のための方法において、好ましくは定量化するために標的分子に特異的に結合するアダプターと組み合わせて、前記ＤＮＡナノ構造および他のナノレポーターを使用することに関する。本方法は、特に、単一細胞分析に関する。【選択図】なし
2021509013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的構造の検出のための方法であって、
ｐ１）正確に１つの宿主体が少なくとも１つのマイクロウェルに存在するような、標的構造を有する宿主体を含む宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入；
ｐ２）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つのマイクロウェルへの導入であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入；
ａ）（ｉ）標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが標的構造に特異的に結合し、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、少なくとも１つのマイクロウェル中で、同定構造を形成するステップ；
ｂ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる標的構造の検出
を含み、
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらがそれぞれの同定構造中で結合しない場合に、ａ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも２つの単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択され、同定構造が、第１の表面、好ましくは少なくとも１つのマイクロウェルの底部に結合する、方法。
【請求項２】
宿主体が、細胞、ウイルス、エキソソーム、小胞および／または液滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的構造が宿主体中に存在し、方法が、
ｃ）宿主体から標的構造を放出させるための、好ましくは破壊緩衝液との液体交換による、宿主体の破壊
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的構造が、ポリヌクレオチド、好ましくは部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはｍＲＮＡを含むか、またはポリヌクレオチド、好ましくは部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはｍＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
蛍光顕微鏡のためのマイクロウェルアレイであって、複数のマイクロウェルを含み、それぞれのマイクロウェルが底部および周囲壁を含み、底部が、蛍光顕微鏡に適しており、マイクロウェルのそれぞれが、好ましくは開いた上面を有し、
マイクロウェルアレイが、
蛍光顕微鏡に適しており、好ましくはカバースリップである、マイクロウェルの底部を形成する第１の層；
マイクロウェルの壁を形成する、第１の層に適用される第２の層
をさらに含む、マイクロウェルアレイ。
【請求項６】
１つまたは複数のキャリアアダプターが、少なくとも１つのマイクロウェルの底部に結合する、請求項５に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項７】
第２の層が、ＳＵ−８、好ましくはＰＥＧ−ＤＡ、特に好ましくはＰＤＭＳ、より好ましくはＣＹＴＯＰ、特に好ましくは液体ガラスを含み、および／またはこれらからなる、請求項５または６のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項８】
マイクロウェルアレイが、請求項５〜７のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイであり、第１の表面が、少なくとも１つのマイクロウェルの底部であり、好ましくは、標的構造が、標的構造に特異的に結合するキャリアアダプターの媒介によって、マイクロウェルの底部に結合する、および／または結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｆ）マイクロウェルアレイの上面を、第２の層に油層を適用することによって閉じるステップであって、油が脂質を含んでいてもよい、ステップ
をさらに含み、
ｇ）マイクロウェルアレイ上に水溶液を注ぐことによって油を排出するステップであって、水溶液が、膜チャネルを含んでいてもよい、ステップ
をさらに含んでいてもよい、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
互いに異なる１つまたは複数のさらなる標的構造の検出にさらに追加で適しており、異なる標的構造が、対で異なり、
標的構造のそれぞれについて、ステップｐ１）における宿主体の群が、関連する標的構造を有する少なくとも１つの宿主体を含み；
方法が、
ｃ）互いに異なる１つまたは複数のさらなる標的構造のそれぞれについて、
それぞれ割り当てられた同定構造を形成するステップであって、さらなる同定構造のそれぞれが、
（ｉ）それぞれの割り当てられたさらなる標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、それぞれのさらなる標的構造に特異的に結合し、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、それぞれの標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、ステップ
をさらに含み、
ステップａ）が、
ｄ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる、１つまたは複数のさらなる標的構造の検出をさらに含み、
すべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造の１つの中で結合しない場合に、ａ）およびｃ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、すべての形成された同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択され、異なる標的構造のそれぞれが、複数回存在していてもよく、方法が、１つまたは複数の異なる標的構造の複数の検出を含んでいてもよい、請求項１〜４または８〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｐ１）において、宿主体が、マイクロウェルアレイの上面に宿主体を含有する液体の容積を適用し、重力の効果を介して、宿主体がマイクロウェルの底部に沈む時間を与えることによって単離される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ａａ）少なくとも１つのマイクロウェル中でキャリアマトリックスを調製するステップ
をさらに含み、
ｂｂ）キャリアアダプターをキャリアマトリックスに付着させるステップ
をさらに含んでいてもよい、請求項１〜４または８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ｈ）マイクロウェルの、好ましくは第２の層の周囲壁を、ステップｐ１）およびａ）の間、またはａ）およびｂ）の間に、底部から除去するステップ
を含む、請求項１〜４または９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
好ましくは請求項５〜７のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイ；
少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含むキットであって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、少なくとも１つの内向きに配置された蛍光色素分子を含む、キット。
【請求項１５】
少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれについて、少なくとも１つの内向きに配置された蛍光色素分子と３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の周縁部との距離が、少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも３ｎｍ、特に好ましくは少なくとも５ｎｍであり、少なくとも１つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、少なくとも２つの内向きに配置された蛍光色素分子を含んでいてもよく、少なくとも２つの内向きに配置された蛍光色素分子の対の距離が、少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも５ｎｍ、特に好ましくは少なくとも９ｎｍである、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的構造を検出するための方法およびＤＮＡナノ構造に関する。特に、本発明は、ＤＮＡナノ構造の形状およびそれに付着したマーカー分子の配置の巧みな選択により、複数のそのようなＤＮＡナノ構造の物理的配列にかかわらず、マーカー分子の数および測定シグナルに対する、好ましくは線形の依存性を確実にする、ＤＮＡナノ構造に関する。加えて、本発明は、好ましくは同時的な方法で、マルチプレックス法を使用する複数の標的分子の定量化のための方法における、好ましくは標的分子に特異的に結合するアダプターと組み合わせた、前記ＤＮＡナノ構造および他のナノレポーターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
研究、ならびに医薬の適用およびバイオテクノロジーにおいて頻繁に起こる問題は、特定の標的構造の、分析、すなわち検出である。例えば、敗血症の患者の場合において、関係する毒素の検出が必要であることがあり、または細胞の構成の変化を伴う疾患、例えばがんの場合において、遺伝情報の変換の定量分析が必要であることがある。
遺伝情報の変換の定量分析、いわゆる遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）は、異なる標的ｍＲＮＡ分子の数の検出および同定を必要とする（Stadler, Z. K. et al. Critical Reviews in Oncology Hematology 69, 1-11 (2009)）。ｍＲＮＡは、英語のメッセンジャーＲＮＡ（ドイツ語では「Ｂｏｔｅｎ−ＲＮＡ」）という用語についての定着した略語であり、これは、ドイツにおいても使用される。ｍＲＮＡ配列は、対応する遺伝子の発現プロセスにおいて特異的に生成するので、分析される物質の遺伝子発現は、その方法で定量化することができる。
【０００３】
ＧＥＰは、個々の細胞の、もしくは組織試料（複数の細胞）の状態またはタイプにおける情報を提供することが可能であり、それによって、例えば、腫瘍組織の分子診断を可能にする。ＧＥＰは、少なくとも１つの遺伝子の発現の分析、好ましくは複数の遺伝子の発現の分析を含む。この最終的な目的を達成するために、好ましくは可能な限り多くの遺伝子の数に対して、可能な限り最高の特異性および感度を有する定量分析を同時に可能にする技術を必要とする。臨床診療における総合的な適用性のために、この技術は、迅速な分析時間、低コストおよび簡単な使用によってさらに特徴付けられなければならない。
未解決の問題に応じて、異なる利点および欠点を有する、複数のＧＥＰの手法がある。
マイクロアレイ。マイクロアレイを使用するＧＥＰ分析は、チップ上で特定の物理的に離れた標的配列への蛍光ＤＮＡ分子の表面ハイブリダイゼーションに基づく（Trevino, V. et al. Mol Med 13, 527-541 (2007)）。これらの分子は、ＲＮＡ分子の逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅による先立つステップにおいて生じる。これにより、マイクロアレイは、最大で数千までの配列の並列検出を可能にする。しかしながら、逆転写およびＰＣＲ増幅などの酵素反応は、系統誤差を伴うので、正確な定量化は不可能である。また、マイクロアレイに基づく方法は、約１日の比較的長いプロセスの時間を必要とし、したがって、多くの数の臨床応用に適してない。
【０００４】
ｑＰＣＲ／ｄＰＣＲ。ＰＣＲを使用すると、特定のＤＮＡ分子は、酵素プロセスにおいて、指数関数的に複製され得る（VanGuilder, H. D. et al. Biotechniques 44, 619-626 (2008)）。ＰＣＲ反応のために、ｍＲＮＡ標的は、一般に、ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写を使用して、酵素的に変換されなければならない。増幅は、蛍光を添加することによって測定することができ、ＤＮＡが結合した分子および元の濃度を、日常的に決定することができる（ｑＰＣＲ）。増幅速度は、さまざまなパラメーター（とりわけ、標的配列、標的の長さ、プライマー、機器、試薬、反応容積）に大いに依存するので、前記定量化は、厳密に較正されなければならない。これらの欠点の補償のために、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）が開発された。これは、個々の標的分子の区画化によって、より正確な定量化を可能にする（Baker, M. Nature Methods 9, 541-544 (2012)）。しかしながら、前記高精度のｄＰＣＲは、典型的には２つの標的への制限によって相殺される。したがって、ｄＰＣＲは、ＧＥＰ分析に適していない。
【０００５】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ／ＮＧＳ。ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ  ｓｅｑ）にも基づく、いわゆる次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により、配列は、塩基ごとに、いくつかのステップで、読み取られ、同定される（Wang, Z. et al. Nat Rev Genet 10, 57-63 (2009)）。ＲＮＡ  ｓｅｑでも、ＲＮＡは、最初にＤＮＡに酵素的に変換されなければならない。転写分析におけるＮＧＳの利点および固有の特徴は、新規または変更された配列を認識する可能性である。多数の複雑なプロセスのステップに起因して、分析装置は複雑および高価であり、プロセスの期間は非常に長い。これは、ポイントオブケアの分野におけるその使用を排除する。上記に記載の方法と同じように、酵素プロセスは、正確な定量可能性を妨げる。
【０００６】
ｎＣｏｕｎｔｅｒ。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのｎＣｏｕｎｔｅｒシステムは、一方で蛍光レポーター（バーコード）、ならびに他方で顕微鏡チップへの付着のための第２のＤＮＡ分子（捕捉鎖）を使用するハイブリダイゼーションによるＲＮＡ分子の検出に基づく（Geiss, G. K. et al. Nat Biotechnol 26, 317-325 (2008)）。蛍光レポーターは、マイクロメートルの長さの、蛍光色素で標識された異なる領域の配列で構成される、線状の幾何学的バーコードである。ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムの利点の１つは、酵素を含まないこと、および最大で８００個までの異なるＲＮＡ標的分子の定量的検出である。この方法の１つの欠点は、それぞれのバーコードを読み取ることを可能にするために、標的のハイブリダイゼーションおよび表面固定の後、幾何学的バーコード分子を伸長することが不可欠であることである。これは、２つの重要な意味を有する：（１）レポーターの電気泳動の伸長は複雑なプロセスのステップである、（２）このステップの低い効率によって条件付けられた、およそ８０％の標的分子は、同定不可能なバーコードに起因して除外される。さらにまた、例えば、磁気粒子を使用する、複雑で時間がかかる精製ステップが必要である。要約すると、これらのプロセスのステップは、高価な分析装置（＞２００，０００ユーロ）および長い測定時間（２４〜４８時間）をもたらす。
このように、これらの従来の方法は、ＧＥＰのための上記で言及した好ましい要件のすべてを満たしておらず、例えば、必要な感度についての部分的な定量可能性を犠牲にする。
【０００７】
ＧＥＰのためのさらに有望な分析アプローチは、いわゆる、蛍光レポーターを使用するハイブリダイゼーションによる、個々の標的ｍＲＮＡ配列の直接標識化に基づく。蛍光法は、単一分子の鋭敏な検出を可能にする（Joo, C. et al. Annu Rev Biochem 77, 51-76 (2008)）。しかしながら、確立された方法は、多数の異なるレポーターを決定することはできない。
利用可能な方法の利用に基づく単一細胞に対する定量的ＧＥＰは、限られた方法でのみ可能であるが、科学的研究および工業的な研究開発の両方にとって、ならびに臨床応用にとって非常に有利であろう。
【０００８】
ＧＥＰの重要な望ましい特徴は、正確な定量化および分析の効率的な実行であろう。これは、改善されたＧＥＰのための以下の好ましい基準をもたらす。
−  ｍＲＮＡ、特に、例えば逆転写による、ＤＮＡへの翻訳なしのｍＲＮＡの直接検出
−  正確ではない増幅が定量化を損なうので、標的分子の増幅なし
−  それにより：個々の標的分子の検出
−  可能な限り早い分析（分オーダー）
−  可能な限り簡単な分析、特に、少ない作業ステップ
−  分析結果と試料の元の成分との相関の可能性
【０００９】
核酸およびタンパク質は別として、数ナノメートル〜数十ナノメートルのオーダーの単位が検出および好ましくはカウントされなければならず、ならびに／または濃度が決定されなければならないという、無数のさらなる課題、例えば、無機複合体およびナノ粒子が存在する。
【発明の概要】
【００１０】
すべてのこれらの課題は、分子または他の構造を、迅速、簡単および正確な方法で検出されなければならず、好ましくはカウントされなければならないという共通点を有する。特に、正確なカウントには、偽陽性および／または偽陰性をカウントする事象の蓋然性を可能な限り低く保たなければならないことが必要である。本発明は、前記性質の１つまたは複数の改善を目指し、特に、偽陽性および／または偽陰性をカウントする事象の蓋然性の低減を目指す。
この課題は、独立請求項に記載の本発明によって解決される。
本発明は、先行技術と比較して、有利な複数の態様に起因する、前述の課題の解決を可能にする。
【００１１】
本発明は、このスケールもしくは同様のスケールで、分析される個々の細胞または他の構造の分析を可能にする方法に関する。この点における特に有利な効果を有する方法の１つの態様は、マイクロウェルにおいて分析される構造の単離である。これは、拡散損失、外部入力、および／または実際に個々に分析される構造の混合に起因する結果の歪曲の低減を可能にする。マイクロウェルの使用は、さらに、不正確にロードされたマイクロウェルを迅速および簡単に廃棄し得るという利点を有し、したがって、分析結果の正確さの増強をもたらす。
本発明のさらなる態様によれば、分析される構造の個々の分析にもかかわらず、分析される複数の構造を並行して分析することが可能である。
冒頭で述べた既知の方法と比較して、本方法は、少ない数のステップを含み、このため、分析プロセス自体による不自然な結果の形成の危険性が低減される。
分析される構造を単離するための方法のステップは、有利には、簡単さを保ち、これは、例えば、単一の液滴への分離などの他の単離手法と比較して、本方法の遂行を大いに簡素化する。
本発明の特に有利な態様は、分析される個々の構造を分子的に分析できるだけでなく、それらの表現型、例えばそれらの形態に関して、分析することも可能であるという事実に見ることができる。これらの２つの分析結果は、互いに帰属されてもよく、その結果、分子の性質は、さらなる評価、例えば、相関分析などを可能にする、分析される構造の他の表現型の特徴に帰属されてもよい。
【００１２】
したがって、本発明は、標的構造の検出（好ましくは定量化）のための方法であって、
ｐ１）正確に１つの宿主体が少なくとも１つのマイクロウェルに存在するような、標的構造を有する宿主体を含む宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入；
ｐ２）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つのマイクロウェルへの導入であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入；
ａ）（ｉ）標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、標的構造に特異的に結合し、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、少なくとも１つのマイクロウェル中で、同定構造を形成するステップ；
ｂ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる標的構造の検出
を含み、
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらがそれぞれの同定構造中で結合しない場合に、ａ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも２つの単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択され、同定構造が、第１の表面、好ましくは、少なくとも１つのマイクロウェルの底部に結合する、方法を対象とする。
【００１３】
好ましくは、個々に考慮される３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、それらが、単離して（すなわち、同定構造に結合していない）または同定構造中に存在するか否かにかかわらず、同じ蛍光シグナルを有する。したがって、ステップｂ）において測定される少なくとも１つの蛍光シグナルは、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の組み合わせにより、未結合の（すなわち、単離された）３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の個々の蛍光シグナルと異なる。したがって、それが可能であるとしても、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、例えばスペクトラムのシフトおよび／または強度の変更により、同定構造中での結合によって、その蛍光シグナルが変化することは必要ではない。
【００１４】
本明細書において、宿主体は、分析される構造を指し、これは、分析される標的構造を含んでいてもよい。例えば、宿主体は、細胞、例えば、原核生物、真核生物、細菌、植物および／もしくは動物の細胞、ウイルス、エキソソーム、小胞ならびに／または液滴であってもよい。分析される標的構造は、宿主体の表面および／または宿主体の内部に局在化し得る。
したがって、本発明は、標的構造が、宿主体の内部に存在し、方法が、
ｅ）宿主体から標的構造を放出させるための、好ましくは破壊緩衝液との液体交換による、宿主体の破壊
をさらに含む、方法の変形も対象とする。
【００１５】
宿主体の群が、細胞、小胞および／またはエキソソームを含有する場合において、破壊ステップｅ）は、好ましくは溶解、特に好ましくは低浸透圧性または洗浄剤に基づく溶解（例えば、"Thermo Scientific Pierce Cell Lysis Technical Handbook" (2nd ed.), Thermo Scientific；D. Liu and L. Huang, "Tripsin-induced lysis of lipid vesicles: effect of surface charge and lipid composition"”, Anal Biochem 1992, 202(1), 1-5；L. Turnbull et al., "Explosive cell lysis as a mechanism for the biogenesis of bacterial membrane vesicles and biofilms", Nat Commun 2016 Apr 14; 7:11220；C. Lasser et al., "Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes", J Vis Exp 2012, 59 3037および／またはPin Li et al., "Progress in Exosome Isolation Techniques", Theranostics 2017, 7(3): 789-804)を参照されたい）、好ましくは、溶解緩衝液または物理的溶解、例えば、レーザー誘起溶解（例えば、MD. Dhawan et al., "Development of a laser-induced cell lysis system", Anal Bioanal Chem 2002, 373(3): 421-6；K. Rau et al., "Pulsed Laser Microbeam-induced Cell Lysis: Time-Resolved Imaging and Analysis of Hydrodynamic Effects", Biophys. J. 2006, 91(1): 317-329を参照されたい）または超音波溶解（例えば、"Thermo Scientific Pierce Cell Lysis Technical Handbook" (2nd ed.), Thermo Scientificを参照されたい）を使用する、溶解を含む。宿主体の群が、水中油中水型エマルジョンの液滴を含む場合において、細胞の溶解と同様の方法および／または当業者に公知の等価な方法を使用することができる（例えば、M. Chavez-Paez et al., "Coalescence in double emulsions", Langmuir 2012, 28, 5934-5939を参照されたい）。油中水型エマルジョンの液滴の形態の宿主体のために、破壊は、そのような液滴が親水性マイクロウェルの境界、すなわち壁および／または底部に直接溶融するので、自動的に生じ、その結果、方法のこのステップは、インキュベーション期間の終わりまで、好ましくは５〜１２０分のインキュベーション期間、特に好ましくは１５分のインキュベーション期間、待つことのみを含む。宿主体の群がウイルスを含む場合において、ウイルス溶解のための方法は、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および／またはホルムアミドを含有する、例えば溶解緩衝液を含めて、使用してもよい（例えば、G.F. Steward and A.I. Culley, "Extraction and purification of nucleic acids from viruses", Manual of aquatic viral ecology, Chapter 16, American Society of Limnology and Oceanography, 2010, pp. 154-165を参照されたい）。
【００１６】
溶解は、例えば、機械的に、溶解緩衝液によって、酵素的におよび／もしくは化学的に、または光によって、行うことができる。本技術分野において公知の細胞の溶解のための方法は、例えば、"Thermo Scientifi Pierce Cell Lysis Technical Handbook" (2nd ed.), Thermo Scientificにおいて言及されており、溶解緩衝液として、界面活性剤のＴｒｉｔｏｎ  Ｘの使用を含む。この理由のため、この方法の詳細は、本文書においてさらに論じない。同様の方法は、液滴の破壊のために公知でもある。例えば、M. Chavez-Paez et al. "Coalescence in double emulsions", Langmuir 2012, 28, 5934-5939は、界面活性剤、例えば、ＳＤＳまたはＳｐａｎ  ８０を使用する、液滴の破壊を記載している。
【００１７】
本発明の別の態様は、マイクロウェルアレイに関する。マイクロウェルアレイは、互いに宿主体を単離し、大多数（配置に依存し、例えば７０％、好ましくは８５％、特に好ましくは９９％）の個々の宿主体の標的構造を、関連するマイクロウェルに局在化する。マイクロウェルアレイは、キャリアの好ましい実施形態であり得る。特に、マイクロウェルアレイの第１の層は、キャリアとして機能し得る。キャリアは、本説明の過程でより詳細に記載し、キャリアに関連して言及されるすべての特徴は、特に、マクロウェルアレイとしてのキャリアの実施形態にも適用される。
マイクロウェルアレイは、好ましくは、蛍光顕微鏡に適している。マイクロウェルアレイは、好ましくは１０〜５００μメートルの直径を有する、アレイのウェル、すなわち、凹部であり、それぞれのウェルは、底部および周囲壁を含む。マイクロウェルの底部は、好ましくは、蛍光顕微鏡に適している。マイクロウェルのそれぞれは、好ましくは、開いた上面を含む。
【００１８】
マイクロウェルアレイは、好ましくは、マイクロウェルの底部を好ましく形成する第１の層を含み、第１の層は、好ましくは、蛍光顕微鏡に適しており、好ましくはカバースリップである。本技術分野において公知のすべての材料、例えば、ガラスまたは特殊なプラスチックは、第１層のための材料として考慮することができる。マイクロウェルアレイは、さらに好ましくは、第１層の上に適用される第２の層を含み、第２の層は、マイクロウェルの壁を形成する。好ましい実施形態において、マイクロウェルの底部は、第１の層によって形成され、第２の層の材料を含まない。しかしながら、別の実施形態において、マイクロウェルの底部は、少なくともセグメントにおいて、好ましくは、０〜５μメートル、より好ましくは０〜１μメートル、さらにより好ましくは０〜１００ナノメートルの第２の層の材料の薄い層で覆われていてもよい。好ましい実施形態において、第１の層は、第２の層以外の材料を含む。
第２の層の材料は、好ましくは、分析がマイクロウェルアレイの自己蛍光によって妨害されないように、分析に関係する波長で可能な限り低い自己蛍光を有するような方法で選択される。分析方法による蛍光測定において、第２の層の自己蛍光に起因する蛍光シグナルは、好ましくは、５つの蛍光分子、好ましくは４つの蛍光分子、より好ましくは３以下の蛍光分子を有する、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に起因する蛍光シグナルよりも高くない。
【００１９】
マイクロウェルアレイの第２の層の現象上の自己蛍光δを測定するために、単一細胞の遺伝子発現の分析の方法の実験ステップは、マイクロウェルアレイの第２の層が分析される材料で構成されるという相違とともに、下記に記載する実施例６に従って（すなわち、実施例６に記載の評価ステップを除いて）行われる。画像化は、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ落射蛍光顕微鏡を使用して行われる。光源は、Ｌｕｍｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ、米国によるＳｏｌａ  ＳＥである。カメラは、ＰＣＯ  ＧｍｂＨ、Ｋｅｈｌｈｅｉｍドイツによるｐｃｏ．ｅｄｇｅ  ４．２である。ＡＨＦ  Ａｎａｌｙｓｅｎｔｅｃｈｎｉｋ  ＡＧ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、ドイツによるＡｒｔｉｃｌｅ  Ｆ７３−８３２という品物は、ビームスプリッターとして使用される。青色チャネルのために、励起および放射フィルターはＦ３９−４８０およびＦ３７−５２７であり、緑色チャネルのために、フィルターはＦ３９−５６３およびＦ３９−６３７であり、赤色チャネルのために、Ｆ３９−６４０およびＦ３７−６９８が、使用される。Ｎｉｋｏｎ  ＧｍｂＨ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、ドイツによるＦＩ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ＴＩＲＦ  ６０×ｏｉｌ  １．４９が対物レンズとして使用される。測定のためには、焦点調節は、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が焦点に合うように、第１の層の上表面に対する。それぞれのチャネルについて、２つの画像が、１秒の露出時間、光源の最大強度で取得される：１つが３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を有するマイクロウェルの底部の領域の画像、および１つが第２の層で満たされた領域の画像。第２の層の現象上の自己蛍光δは、それぞれのチャネルについて別々に計算され、第２の層の画像の平均ピクセル強度と、関連するチャネルの画像において見えるすべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の最大ピクセル値の平均値との比率に基づいて計算される。
現象上の自己蛍光δは、好ましくは０〜０．１、より好ましくは０〜１０-2、さらにより好ましくは０〜１０-4、特に好ましくは０〜１０-6である。
マイクロウェルアレイの第２の層のために考慮される材料を分析するために、本発明の方法に関係する自己蛍光に関して、吸収および蛍光に関する以下の考慮が有用である。
【００２０】
一般に、粒子の吸収によって引き起こされる均質な材料における吸収は、例えば、Demtroder, "Experimentalphysik 2 - Elektrizitat und Optik", Springer 1995, ISBN 3-540-57095-0, pp. 212 et seqq.およびP. Atkins: Physikalische Chemie, 5th edition, 2013, Wiley-VHC, Weinheimに見出され得るように、初期値Ｉ0と比較して、放射強度Ｉの減少によって記載することができる。
Ｉ＝Ｉ0×ｅｘｐ（−Ａ）
（式中、吸光度Ａは、
Ａ＝ｂ×ｄ＝εabs×ｃ×ｄ＝Ｎ×σabs
（式中、ｄは、照射された材料の厚さであり、ｂは、吸収係数であり、εabsは、濃度に関連する吸収係数（通常、吸収係数と称され、ｂおよびεabsの間の差は当業者には本文脈から明らかである）であり、ｃは、吸収するタイプの粒子の濃度である）として表すことができる）。
【００２１】
散乱断面に合わせて（例えば、Demtroder, "Experimentalphysik 2 - Elektrizitat und Optik", Springer 1995, ISBN 3-540-57095-0, pp. 218 et seqq.を参照されたい）、個々の吸収する粒子について、すなわち、任意の入射光子が吸収される粒子の周辺の概念的な表面について、吸収断面σabsを定義することが可能である。したがって、吸収は、
Ａ＝Ｎ×σabs／Ｆ＝Ｎ×σabs×ｄ／Ｖ
（式中、Ｎは、照射された粒子の数を指し、Ｆは、照射された試料の表面を指し、ｄは、照射された材料の厚さを指し、Ｖは、照射された試料の容積を指す）
である。
【００２２】
これらの関係は、濃度に関係する吸収係数および吸収断面の相関：
σabs＝εabs／ＮA
（式中、ＮAは、６．０２２×１０23モル-1のアボガドロ定数である）
を可能にする。
【００２３】
単一の蛍光粒子が励起強度Ｉexで照射される場合、
Ｉex＝（ｈ×νex）×Ｎexphot／（ｔ×Ｆ）
すなわち、表面Ｆを横断する時間ｔを通して、Ｎexphotの光子の流れ、そのエネルギーは、ｈ×νexであり、
吸収断面σabsの上記定義によれば、σabs.fluoと指定される蛍光粒子に関連する場合において、その結果、
Ｎabsphot＝Ｎexphot×σabs.fluo／Ｆ
であり、光子は、前記時間を通して吸収される。放射された光子の数Ｎemphotは、吸収された光子の数および蛍光粒子の蛍光量子効率ηfluoの積であり（例えば、P. Atkins: Physikalische Chemie, 5th edition, 2013, Wiley-VCH, Weinheimを参照されたい）：
Ｎemphot＝ηfluo×Ｎabsphotである。
【００２４】
したがって、蛍光粒子の放射された光子の流れのＮemphot／ｔについて、これは、顕微鏡で捕捉され、顕微鏡画像によって表される蛍光シグナルと比例し、これは：
Ｎemphot／ｔ＝ηfluo×σabs,fluo×Ｉex／（ｈ×νex）＝ηfluo×（εabs,fluo／ＮA）×Ｉex／（ｈ×νex）
が適用され、εabs,fluo（蛍光粒子についてεabs）およびηfluoは、蛍光マーカーについてのパラメーターであり、両方とも製造者によって示される。これらはまた、当業者が精通している方法を使用して、蛍光および吸収分光法によって、独立して決定されてもよい。この目的で、市販されている当業者に公知の装置、例えば以下の装置を使用してもよい：Ｈｏｒｉｂａ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＦｌｕｏｒｏＭａｘ−４およびＱｕａｎｔａ−Ｐｈｉ（Ｈｏｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、ドイツにより販売）。ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−４は、εabs,fluoの測定のために必要であり、両方の装置の組み合わせは、ηfluoの測定のために必要である。
【００２５】
吸収係数ｂmat（以下、ｂ＿ｍａｔともいう）を有する材料の１つの単位のために、これは、上記に記載のように、入射強度Ｉが、材料の厚さｄに依存して、以下のように、入射強度Ｉexの値から減少する。
Ｉ＝Ｉex×ｅ-b_mat×d
エネルギーの保存に起因して、以下の強度が吸収される。
Ｉabsmat＝Ｉex×（１−ｅ-b_mat×d） 
次いで、時間ｔを通して、領域Ｆbに吸収される光子の数Ｎabsphotmatは、
Ｎabsphotmat／ｔ＝Ｉabs／（ｈ×νex）×Ｆb＝Ｉex×（１−ｅ-b_mat×d）／（ｈ×νex）×Ｆb
である。
放射された光子の数Ｎemphotmatは、材料の蛍光量子収量ηmatまで低減した吸収された光子の数に基づいて計算される。
Ｎemphotmat／ｔ＝ηmat×Ｎabsphot／ｔ＝ηmat×Ｉex×（１−ｅ-b_mat×d）／（ｈ×νex）×Ｆb 
材料の単位の放射された光子の流れＮemphotmat／ｔは、顕微鏡で得られ、顕微鏡画像によって表される蛍光シグナルに比例する。
【００２６】
測定を妨げる可能性のある自己蛍光について材料を試験するために、その吸収係数ｂmatおよび蛍光量子収量ηmatを決定することが必要である。この目的で、当業者にとって一般的な方法のように、材料の試料単位は、蛍光分光法のために有利な形態、多くの場合において、例えば、１ｃｍ×１ｃｍ×３ｃｍの直方体の形状で、調製される。この試料単位は、市販されている当業者に公知の装置、例えば、Ｈｏｒｉｂａ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＦｌｕｏｒｏＭａｘ−４およびＱｕａｎｔａ−Ｐｈｉ（Ｈｏｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、ドイツにより販売）を用いて測定され、ｂmatおよびηmatは、異なる波長の範囲で決定される。本発明の方法に関係する波長の範囲は、３Ｄ ＤＮＡナノ構造に付着した蛍光色素分子で使用される励起波長および放射波長の範囲である。励起波長は、例えば、５１０〜５５０ナノメートル、５７０〜６３０ナノメートルおよび／または６６０〜７２０ナノメートルの範囲であり得る。
【００２７】
材料についてのｂおよびηの測定は、ＣＣＤおよびＱｕａｎｔａ−Ｐｈｉを有するＦｌｕｏｒｏＭａｘ−４からなるＨｏｒｉｂａによる量子効率測定システムを用いて行ってもよい。この目的で、材料の直方体は、Ｑｕａｎｔａ−Ｐｈｉのための液体試料ホルダーのキュベットホルダーに配置される。その後、試料ホルダーは、Ｑｕａｎｔａ−Ｐｈｉの光度計の球に配置され、その後、閉じられる。その後、Ｑｕａｎｔａ−ＰｈｉおよびＦｌｕｏｒｏＭａｘの間の光ファイバーが、操作マニュアルに従ってインストールされる。材料の測定は、Ｑｕａｎｔａ−Ｐｈｉの操作マニュアル（"Quanta-Phi F-3029 Integrating Sphere Operation Manual - Part number J81089 rev. C", Horiba Scientific 2010）に従って、Ｈｏｒｉｂａ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＦｌｕｏｒＥｓｓｅｎｃｅ（商標）ソフトウェアを使用して行われる。空の試料チャンバーは、バックグラウンドの参照試料として測定される。この参照試料について、レイリー励起ピークは、ソフトウェアにおいて１０6カウント／秒に設定される。励起波長は、青色、緑色および赤色のチャネルにおける測定のために、４８８ナノメートル、５６１ナノメートルおよび６４７ナノメートルに設定される。バックグラウンドの参照の測定のために、放射範囲は、２９０ナノメートル〜１１００ナノメートルに設定される。積分時間および蓄積数は、マニュアルに記載されているように、測定値が、励起波長について１０6カウント／秒であるような方法で、設定される。その後、測定は、同じパラメーターを用いて、材料の試料の直方体において行われる。評価は、ユーザーマニュアルにおいて示されているように、ソフトウェアを使用して行われ、励起波長は、青色、緑色および赤色について、４８０〜４９５、５５０〜５７０および６４０〜６５５ナノメートルに設定され、放射波長は、５５０〜５４０、５７５〜６２０および６６０〜７００ナノメートルに設定される。その後、ソフトウェアは、量子効率ηについての値を計算する。
【００２８】
吸収定数ｂを測定するために、通常のキュベット試料ホルダーが、光ファイバーの代わりにＦｌｕｏｒｏＭａｘ−４に再び取り付けられ、吸収測定は、操作マニュアル（"FluoroMax-4 & FluoroMax-4P with USB Operation Manual - Part number J810005 rev. D", Horiba Scientific 2012）に従って、異なるチャネルについて上記に示された励起波長を使用して、行われる。試料なしで再び行われたバックグラウンドの測定についての測定値は、再び、１０6カウント／秒に設定される。
【００２９】
測定に対する第２の層の材料の自己蛍光の妨害の程度は、マイクロウェルの高さに対応する厚さｄを有する第２の層の材料の回折限界領域Ｆbの蛍光シグナルと、蛍光色素の蛍光シグナルとの間の関係γによって決定することができる。
γ＝ηmat×ＮAvogadro×Ｆb×（１−ｅ-b_mat×d）／（εabs,fluo×ηfluo）
【００３０】
半径ｒairyを有するエアリーディスク（Y. Soskind, "Field Guide to Diffractive Optics", SPIE Press 2011, Bellingham, Washington USA, ISBN 978-0-8194-8690-5, p. 14）は、回折限界領域のために使用される。
Ｆb＝πｒairy2＝π×（０．６１×λ／ＮＡ）2
（式中、πは、数学定数パイ（３．１４１５・・・）であり、λは、放射波長および／または放射波長範囲の中央波長であり、ＮＡは、使用される顕微鏡の開口数である）
以下において、λは、フルオロフォアに関する自己蛍光と称され、蛍光チャネルの少なくとも１つについて、好ましくは５より低く、より好ましくは２より低く、特に好ましくは０．５より低く、最も特に好ましくは０．０１より低い。
【００３１】
第２の層は、好ましくはＳＵ−８、好ましくはＰＥＧ−ＤＡ、特に好ましくはＰＤＭＳ、より好ましくはＣｙｔｏｐ、特に好ましくは液体ガラスを含む。第２の層は、これらの材料の１つからなることが特に好ましい。液体ガラスは、溶媒、プラスチックおよびシリカナノ粉末のナノ複合材料を指し、これは、室温で液体であり、オーブン中で焼結することによって、ほぼ純粋な、好ましくは純粋な二酸化ケイ素／ガラスに焼成される（例えば、F. Kotz et al., "Three-dimensional printing of transparent fused silica glass", Nature 2017, 544 (7650), 337-339、およびF. Kotz et al., "Liquid Glass: A Facile Soft Replication Method for Structuring Glass", Advanced Materials 2016, 28, 4646-4650を参照されたい）。
好ましい実施形態において、第２の層は、弾性材料、好ましくはＰＤＭＳからなり、マイクロウェルの上部で閉じられ、第１および第２の層は、互いに、好ましくは圧力によって、可逆的に接続される。
あるいは、または加えて、マイクロウェルはまた、特に層がガラスからなる場合、層にエッチングされてもよい。結果として、第１の連続的な底部の層、およびマイクロウェルとしてエッチングされた凹部を有する第２の上層が存在し、ここで、第２の層は、第１の層と堅く結合され、マイクロウェルの周囲壁を形成する。
【００３２】
個々のウェルの形態は、好ましくは均質であり、しかしながら、これらは、互いに異なっていてもよい。平面図におけるウェルの形態は、例えば、正方形、環状、楕円形、六角形、円形、三角形、多角形および／または不規則な形状であり得る。マイクロウェルの底部は、好ましくは、１０μｍ〜１，０００μｍ、好ましくは２０μｍ〜５００μｍ、より好ましくは５０μｍ〜２００μｍの内接円の直径、および／または１，０００，０００μｍ2以下、好ましくは２５０，０００μｍ2以下、特に好ましくは４０，０００μｍ2以下の面積を有する。マイクロウェルの深さは、好ましくは、関係のあるマイクロウェルの内接円の直径と等しいか、またはそれより大きい。
【００３３】
１つの態様において、本発明は、１つまたは複数のキャリアアダプターが、少なくとも１つのマイクロウェルの底部に結合する、マイクロウェルアレイも対象とする。好ましくは、標的構造は、標的構造に特異的に結合するキャリアアダプターの媒介によって、キャリアおよび／またはキャリアの第１の表面に結合する、および／または結合している。したがって、好ましくは、標的構造は、少なくとも１つのマイクロウェルの底部に結合し、および／または結合しており、この結合は、好ましくは、標的構造に特異的に結合するキャリアアダプターによって媒介される。
【００３４】
特に好ましい実施形態において、マイクロウェルアレイは、マイクロウェルチャンバーの部分として形成されてもよい。マイクロウェルチャンバーにおいて、マイクロウェルアレイは、第２の層に付着した第３の層を含む。第１、第２および第３の層の配列は、好ましくは、第２の層が、第１および第３の層の間に位置するような配列である。第３の層は、マイクロウェルアレイのマイクロウェルに直接隣接する追加のキャビティを含み、すなわち、第３の層の追加のキャビティおよびマイクロウェルによって形成されるキャビティは、連続的な作業キャビティを形成し、これは、第１の層、第２の層および第３の層によって、周囲の環境に向けて閉じられる。
好ましくは、第３の層のキャビティは、第３の層を通って伸びた入口および出口を介して、周囲の環境とさらに接続される。入口および出口は、好ましくは、特に、本発明の方法のステップにおいて、作業キャビティを液体で効率的に充填すること、および／または過剰な液体を効率的に排出することが意図される。この目的で、入口および／または出口は、標準コネクター、例えば、ルアーコネクターを備えることができる。
【００３５】
前記実施形態は、一方では、それが、上部で開いたマイクロウェルに起因する、既に記載されたプロセスのステップの簡単さを維持し、他方では、最終的に試薬および試料の材料の使用を最小化することができように、使用される液体の流れ挙動および容積をより良好に制御することが可能であるという理由で特に有利である。
【００３６】
正確に１つの宿主体が少なくとも１つのマイクロウェルに存在するように、標的構造を有する宿主体を含む宿主体の群をマイクロウェルアレイに導入する方法のステップは、宿主体の単離ステップを表す。この文脈において、適切な濃度で宿主体の群を有する適切な液体の容積が使用されることが好ましい。好ましくは、宿主体の液体は、マイクロウェルに添加され、その後、宿主体は、重力の効果を介して、マイクロウェルの底部に沈むように時間を与えられる。ＰＢＳ中のＨｅＬａ細胞について（処方は、例えば、実施例６を参照されたい）、沈む時間は、例えば１５〜３０分であり得る。宿主体の液体のマイクロウェルへの導入は、好ましくは、マイクロウェルアレイの開いた側に宿主体の液体を使用することによって行われる。宿主体が、細菌、ウイルスまたは重力によって沈まない他の宿主体である場合において、マイクロウェルアレイの第１の層および／または第２の層の表面は、そのような宿主体の統計学的移動および／または拡散に基づいて、十分な数の宿主体が、カチオン性ポリマーに十分に近づいて、宿主体がそこに接着するように、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）などのカチオン性ポリマーを備えていてもよい（例えば、B. Fang et al., "Surfaces for Competitive Selective Bacterial Capture form Protein Solutions", ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015, 7(19), pp. 10275-10282を参照されたい）。カチオン性ポリマーを有するマイクロウェルアレイの提供は、好ましくは、キャリアアダプターを有するマイクロウェルアレイを提供する任意の所与のステップと、同時、前および／または後に、好ましくは、方法のステップｐ１）の前に、行われる。例えば、緩衝液、好ましくはＲＸ０７中に、０．０１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｍｌの、（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されているような）好ましくは２００００ｇ／ｍｏｌの分子質量を有するポリ−Ｌ−リジンを有する溶液を添加すること、および追加の方法のステップｃｃ）において、および方法のステップｐ１）の前に、５〜１２０分間、好ましくは１５〜４５分間、インキュベートすることが可能である。
【００３７】
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のカチオン性ポリマーへの望ましくない結合の可能性を防止するために、さらなる方法のステップｄｄ）が、方法のステップｐ１）の後、および方法のステップｐ２）の前に導入されてもよく、ここで、マイクロウェルアレイに存在するカチオン性ポリマーの正電荷は、アニオン性ポリマーによって満たされる。例えば、このステップにおいて、緩衝液、好ましくはＲＸ０７中の、０．０１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｍｌの、好ましくは１０，０００〜２００，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは２０，０００ｇ／ｍｏｌの分子質量を有するＰＳＳ（ポリスチレンスルホン酸）の溶液が添加されてもよく、５〜１２０分間、好ましくは１５〜４５分間インキュベートされてもよい。
【００３８】
宿主体の液体のマイクロウェルへの導入は、特に、好ましくは少なくとも１ｍｍ×１ｍｍ、より好ましくは少なくとも２ｍｍ×２ｍｍ、より好ましくは少なくとも５ｍｍ×５ｍｍ、より好ましくは１ｃｍ×１ｃｍ、特に好ましくは１．５ｃｍ×１．５ｃｍのマイクロウェルアレイの十分なサイズを有する、標準的なピペットおよびピペットチップを用いるピペッティングによって行われてもよい。
あるいは、または加えて、宿主体の液体のマイクロウェルへの導入は、チューブおよび／または異なる液体チャネルを用いて行うことができる。
【００３９】
宿主体の液体に対する液体の適合性は、宿主体のタイプおよび方法に含まれる他の物質に依存し、これは、当業者によって適切に選択される。好ましくは、液体は、水性および／または親水性の液体である。これは、例えば、細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）がＰＢＳ中に存在する、細胞懸濁液であり得る。適切な宿主体の濃度は、マイクロウェルアレイの形状、すなわち、マイクロウェルの形態、サイズおよび配列（特に距離）、ならびに宿主体の形態およびサイズに依存する。濃度は、十分な数のマイクロウェルが個々の宿主体を含有するように、十分に高くあるべきである。それにもかかわらず、濃度は、２つ以上の宿主体を有するマイクロウェルの数が可能な限り少ない程度に低減されるべきである。選択される濃度についての良好な出発点は、充填された溶液中に、マイクロウェルあたり１つの細胞を有することである。例えば、１ｃｍ2の表面および１００万のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイは、細胞懸濁液で充填することができ、これは、１ミリメートルの深さで底部を覆い、かつ１ミリリットルあたり１０００万個の細胞を含有する。別の充填の選択肢は、１平方センチメートルあたり１万マイクロウェルを有するマイクロウェルアレイを、１００マイクロメートルの深さおよび１ミリリットルあたり１００万個の宿主体を含有する、宿主体懸濁液で充填することである。
【００４０】
好ましい実施形態において、マイクロウェルの充填は、ステンシルを使用して行うことができる。この目的で、凹部を有する、予め形成された層、好ましくは、ＰＤＭＳの予め形成された層が調製され得、凹部は、０．２〜５×平均容積、好ましくは０．５〜２×、より好ましくは０．８〜１．２×宿主体の平均容積を有する（例えば、Y. Wang et al., "Trapping cells on a stretchable microwell array for single cell analysis", Anal Bioanal Chem 2012, 402(3): 1065-72；C. Probst et al., "Polydimethylsiloxane (PDMS) Sub-Micron Traps for Single-Cell Analysis of Bacteria参照されたい）。凹部の間の距離は、マイクロウェルアレイのマイクロウェルの間の距離と同じサイズを有し得る。このステンシルは、高密度の宿主体の懸濁液（例えば１ミリリットルあたり１００万〜１０００億の宿主体、好ましくは１ミリリットルあたり１０００万〜１０億の宿主体）を注ぐことによって、充填され得、大部分の凹部（８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９９％）は、ウェルが２つ以上の宿主体のための空間を提供しないので、正確に１つの宿主体によって占有される。その後、ステンシルは、マイクロウェルアレイ上の開いた側を下にして配置することができ、マイクロウェルは、圧力によってステンシルで閉じられてもよい。正確に対応する凹部およびマイクロウェルの距離に起因して、正確に１つの凹部がマイクロウェルの上にちょうどあり、宿主体は、重力により、ステンシルからマイクロウェルに下降する。この実施形態は、宿主体によるマイクロウェルのより効率的な単一占有の利点を有する。
本発明の方法の好ましい実施形態において、マイクロウェルの周囲壁、好ましくは第２の層の周囲壁が除去される、ステップｅ）の後に、方法のステップｈ）を行うことが可能である。
【００４１】
この目的で、例えば、第２の層が、弾性材料、好ましくはＰＤＭＳからなり、マイクロウェルの上部で閉じられる、本発明のマイクロウェルアレイの実施形態を使用することが可能である。上記に記載のように、マイクロウェルのこの第２の層は、ステップｐ１）において、宿主体で逆さまに充填されてもよく、その後、例えば圧力によって、キャリアアダプターを備える第１の層で可逆的に閉じられる。その後すぐ、宿主体は、ステップｅ）において、好ましくは物理的に、特に好ましくはレーザー誘導または音響学的に、溶解され得る。特に、マイクロウェルアレイは、例えば４００ナノメートル〜２０００ナノメートル、好ましくは１．０６４ナノメートルのレーザーで、５０〜５００ミリワットの出力で、１分〜１２０分間、好ましくは１５分間照射することができ、それによって、細胞が溶解する。次いで、遊離した細胞構造は、次いで、５分〜２４時間、好ましくは１０〜１２０分、より好ましくは１５〜４５分のインキュベーション時間内に、第１の層のキャリアアダプターに結合することができる。その後、方法のステップｈ）において、第２の層は、第１の層から除去することができる。好ましい変形において、これは、さらなる方法のステップをこれなしで行うように、完全に除去され得る。あるいは、特に好ましい変形において、これは、１０マイクロメートル〜５ミリメートル、好ましくは１００〜２００マイクロメートルまで除去することができ、その結果、液体交換を含むその後の方法のステップを行うことができる液体チャンバーが形成される。
この実施形態は、続く方法のステップにおける液体および成分の交換を、より自由に行うことができ、第２の層のバリアによって妨げられないという利点を有する。したがって、それぞれの方法のステップは、迅速かつより経済的な方法で行うことができる。
【００４２】
少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を少なくとも１つのマイクロウェルに導入するステップは、宿主体の溶液の導入と同じ方法、すなわち、例えば上記および以下に記載するようなピペッティングおよび／またはチューブを適用することなどによって、行うことができる。３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の導入は、宿主体の導入の、前、同時および／または後に行うことができる。順序は、とりわけ、方法に関与する構造が担体に結合するか否か、および任意に方法に関与する構造のどれが担体に結合するかに、依存する。
本発明の好ましい実施形態において、方法は、
ｆ）マイクロウェルの上面を、第２の層上に好ましくはフッ素化された油層を適用することによって閉じるステップ
をさらに含む。
【００４３】
第２の層上に好ましくはフッ素化された油層を適用するステップは、ステップｐ１）の後に、好ましくは水性の宿主体の液体で充填されたマイクロウェルアレイ上に、好ましくはフッ素化された油を注ぐことによって、行われる。それにより、過剰の水性液体が洗い流され、前にマイクロウェルに既に存在していた水性液体のみがそこに残る。その疎水性に起因して、好ましくはフッ素化された油は、マイクロウェル内の水性液体によってマイクロウェルへの侵入が防止されるので、前にマイクロウェルに既に存在していた水性液体はそこに残る。したがって、好ましくはフッ素化された油は、マイクロウェルからマイクロウェル内の水性液体をすすぐための標的を有さない。加えて、好ましくはフッ素化された油の密度は、水性液体の密度よりも低く、したがって、好ましくはフッ素化された油によるマイクロウェルの充填は妨げられる。マイクロウェルに対する好ましくはフッ素化された油の注入が完了したら、好ましくはフッ素化された油の層が残り、これは、周囲の環境に対してマイクロウェルを密封する。マイクロウェル内での水性液体との混合は、好ましくはフッ素化された油の既に言及した疎水性に起因して生じない。
【００４４】
好ましい実施形態において、油は脂質を含む。一般に知られているように、脂質は疎水性および親水性のセグメントを有する。この理由のために、脂質層は、油およびマイクロウェルの間の界面で形成される。油層が水溶液で置き換えられると、第２の脂質層は、脂質二重層が形成されるように、単一の脂質層を覆う。
そのため、方法の好ましい実施形態は、
ｇ）マイクロウェルアレイ上に水溶液を注ぐことによって油を除去するステップ
をさらに含む。
それにより、もはや必要ではない油が、脂質二重層を残して、マイクロウェルアレイから除去される。マイクロウェルは脂質二重層によって閉じられたままである。
【００４５】
好ましい実施形態において、水溶液は、方法のステップｇ）において、膜チャネル、例えばイオンチャネルを含有する。これらは、マイクロウェルを閉じる脂質二重層に自発的に組み込まれる（例えば、R. Wanatabe et al., "Arrayed lipid bilayer chambers allow single molecule analysis of membrane transporter activity", Nat. Commun. 5, ncomms5519 (2014)を参照されたい）。それにより、脂質二重層はイオンに対して透過性になるが、より大きな分子に対しては不透過性になることが可能である。したがって、標的構造がマイクロウェル中に残り、そこから拡散しないことを確実にしながら、その後、マイクロウェル中の塩濃度を、低浸透圧溶液（より低い塩濃度を有する）によりマイクロウェルの外側の水溶液を交換することによって、低減させて、このようにして、宿主体を低浸透圧的に溶解する（すなわち、浸透作用によってそれらを破壊する、例えば、C.J. Schroter et al., "A rapid method to separate endosomes from lysosomal contents using differential centrifugation and hypotonic lysis of liposomes", Journal of immunological methods 1999, 227 (1-2), pages 161-168を参照されたい）ことが可能である。
したがって、方法の好ましい実施形態において、ステップｇ）は、
ｇ）マイクロウェルアレイ上に膜チャネルを含む水溶液を注ぐことによって油を除去するステップ
に含む。
【００４６】
膜チャネルを脂質二重層に添加するために、方法のステップｇ）において、例えば０．０１〜５ｍｇ／ｍｌのα−溶血素（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈにより市販されているαＨＬ）、緩衝液、好ましくはＰＢＳまたはＲＸ０７中の、好ましくは０．５〜１ｍｇ／ｍｌのαＨＬを使用すること、および５〜１２０分間、好ましくは１５〜４５分間インキュベートすることが可能である（例えば、X. Zhang et al., "Natural channel protein inserts and functions in a completely artificial, solid-supported bilayer membrane", Scientific Reports 2013, 3: 2196, DOI: 10.1038/srep02196を参照されたい）。
【００４７】
本発明の代替の実施形態において、ステップｇ）において、膜チャネルのＴＲＰ  Ｍ８を脂質二重層に組み込むことが可能である。この目的で、ミセルのＲＧＰＭ８溶液（E. Zakharian, "Recording of Ion Channel Activity in Planar Lipid Bilayer Experiments", Methods Mol Biol. 2013, 998, pp. 109-118に記載）は、方法のステップｇ）において、膜チャネルを含有する水溶液として使用される。膜チャネルを含有する水溶液の少なくとも一部は、マイクロウェルアレイ上に残り、膜チャネルが、膜チャネルを含有する水溶液から脂質二重層に組み込まれるように、５分〜２４時間、好ましくは２時間インキュベートされる。
【００４８】
油層および／または脂質二重層を用いるマイクロウェルの閉鎖（方法のステップｆ）およびｇ））は、依然として未結合の標的構造が逃げるのを防止するため、およびキャリアアダプターとの結合におけるそれらの効率を増加させるために、好ましくは、ＤＮＡナノ構造が導入される前、および／または宿主体の破壊の後に、行われる。方法のステップｆ）およびｇ）の間の１５分、好ましくは３０分、特に好ましくは１時間、非常に特に好ましくは２４時間の十分なインキュベーション期間の後、ほとんどすべて、好ましくはすべての標的構造は、キャリアアダプターに結合され、もはやマイクロウェルから拡散する危険性がなくなる。したがって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、方法のステップｇ）の後に添加することができる。ここで、脂質なしの油の場合において、これは、密封する油層がステップｇ）において既にすすぎ落とされているので、ステップｇ）の後に行うことができることを考慮しなければならない。方法が脂質層の形成（すなわち、脂質含有油の使用）を含む場合において、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が添加される前に、最初に脂質（二重）層が除去される必要がある。脂質二重層の除去は、界面活性剤に基づく溶解方法（例えば、"Thermo Scientific Pierce Cell Lysis Technical Handbook" (2nd ed.), Thermo Scientificを参照されたい）のための溶解緩衝液を用いてすすぐこと、および５〜１２０分間、好ましくは１５〜４５分間インキュベートすることによって、行うことができる。その後、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、油層および／または脂質二重層を現在含まないマイクロウェルに導入することができる。
【００４９】
油層および／または脂質二重層を用いるマイクロウェルの閉鎖（方法のステップｆ）およびｇ））の上記で言及された実施形態は、好ましくは、マイクロウェルチャンバーを使用して行われる。この目的で、すべてのステップは、すべての液体のマイクロウェルへの導入がマイクロウェルチャンバーの入口を介して行われ、過剰の液体および／またはすすぎ流された液体がマイクロウェルチャンバーの出口を介して逃がされるのとともに、既に記載したようにして行われる。
既に記載したように、マイクロウェルチャンバーは、洗浄およびすすぎ落とされた液体の流れの方向が特に制御されるという利点を有し、特に有利である。これは、特に、水溶液および油による交互のすすぎに適用される。油によるマイクロウェルアレイの表面からの過剰の水溶液のすすぎは、特に、マイクロウェルチャンバー内の配列によって促進される、第２の層の表面に平行に動く流れの剪断効果によって容易になる。同じことは、脂質二重層の維持とともに、水溶液を用いる油のすすぎ落としにも適用される。
【００５０】
さらにまた、本発明は、とりわけ、少なくとも１つの蛍光色素分子が付着した３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の形状が、少なくとも１つの蛍光色素分子が付着した第２の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が接近すると、２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光色素分子が著しく相互作用することを防止する、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を対象とする。
好ましくは、本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、キャビティ、および少なくとも１つの内向きに配置された蛍光色素分子を有する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であり、少なくとも１つの内向きに配置された蛍光色素分子と３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の周縁部との距離は、少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも３ｎｍ、特に好ましくは少なくとも５ｎｍである。
【００５１】
３Ｄナノ構造の形状、および３Ｄナノ構造の内側／３Ｄナノ構造のキャビティ中の蛍光色素分子の配列の巧みな選択は、色素分子が周囲と立体的に相互作用しないことを確実にする。添付の実験実施例において示されるように、本発明の３Ｄナノ構造は、それにより、例えば、同じ色素を含む２Ｄナノ構造よりも、ガラス表面などの表面と著しく少ない程度で相互作用する。これは、本発明による方法におけるそのような３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の使用のために非常に有利である。例えば、標的構造の偽陽性の検出の割合は、特に、キャリア構造、例えばマイクロウェルアレイが使用される場合、この方法で低減することができる。また、蛍光色素分子を遮蔽する利点は、２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光色素分子が（光学的におよび／または立体的に）著しく相互有用しないことである。これは、本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルが、非常に接近して隣接する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造によって著しく影響を受けないことを許容する。また、蛍光色素分子によって媒介される３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の非特異的な相互作用は防止される。全体として、これは、標的構造の検出のための前記３Ｄナノ構造の使用において非常に有利である。特に、本発明の方法におけるように、これは、個々の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルがそれらの近接に起因して影響されることなく、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の標的構造への結合を可能にする（例えば、蛍光消光またはＦＲＥＴによる）。
【００５２】
測定方法に応じて、少なくとも２つのＤＮＡナノ構造の使用は、標的構造で作られ、ＤＮＡナノ構造と結合した同定構造を、遊離のＤＮＡナノ構造から区別するために、さらに必要であり得る。これは、特に、溶液中で実行される測定方法による場合である。同定構造が、検出のための方法において、キャリアおよび／またはキャリア表面と結合する場合（本発明の方法の好ましい実施形態におけるように、特にキャリアとしてマイクロウェルアレイを使用する本発明の方法の好ましい実施形態におけるように）、これは、１つまたは複数の洗浄ステップを使用して、遊離のＤＮＡナノ構造の除去を可能にする。キャリアを使用する方法における、標的構造に結合した少なくとも２つのＤＮＡナノ構造の使用は、偽陽性の検出の割合を低下させ得るという利点を有する。第１に、少なくとも２つのＤＮＡナノ構造を有する同定構造は、非特異的な方法で表面と相互作用するＤＮＡナノ構造と明確に区別することができる。これは、１つのみのＤＮＡナノ構造が標的構造を認識する類似の方法において可能ではない。第２に、標的構造の異なる領域を両方が認識する、少なくとも２つのＤＮＡナノ構造の使用は、他の類似の標的構造が疑いのある標的構造として誤って検出されることを、著しく低減し得、多くの場合ではその可能性を排除し得る。
【００５３】
また、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造（例えば、異なる直交測定可能なナノレポーター）の標的分子とのカップリングと独立して、測定の感度は、著しく増加し得る。これは、独立したカップリング反応の数の効力により増加する。これは、特に、高い動力学のために、すなわち、例えば、非常に低い発現および非常に高い発現を有する遺伝子を同時に測定するために、非常に有利である。
好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも２つの異なる標的構造（例えば、異なる遺伝子に由来する、すなわち異なる核酸配列を含む、２つのｍＲＮＡ）の、好ましくは複数の異なる標的構造の、検出および／または定量化のための方法も対象とする。異なる標的構造は、対で区別可能である。
【００５４】
好ましくは、前記方法は、以下のステップ：
ａ）（ｉ）それぞれの標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、それぞれの標的構造に特異的に結合し、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、対で異なるそれぞれの標的構造の領域と結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、少なくとも２つの異なる標的構造のそれぞれについての、同定構造の形成；
ｂ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる少なくとも２つの標的構造の検出
を含み、
すべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらがそれぞれの同定構造の１つの中で結合しない場合に、ａ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、個々の異なる標的構造に対して形成された同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択される、方法である。
好ましくは、異なる標的構造のそれぞれは、数回検出され、すなわち、特定の標的構造に帰属された同定構造のそれぞれが数回形成される。
特に、方法のステップｐ１）およびｐ２）の組み合わせが好ましい。
【００５５】
上記で言及された本発明による方法の利点のすべては、この場合において、変更すべきところは変更して適用される。関連する形態を有することで、ＤＮＡナノ構造は、複数の同一および／または異なる蛍光色素分子に付着する可能性を提供する。国際公開第２０１６／１４０７７２７号および国際公開第２０１６／１４０７７２６号から公知であるように、区別可能な蛍光シグナルを有する複数のＤＮＡナノ構造を、このようにして発生させることができる。しかしながら、区別可能な組み合わせの量は、ＤＮＡナノ構造のサイズに非常に依存し、これは、互いに相互作用することなく、そこに付着し得る蛍光色素分子の数を制限する。しかしながら、大きなＤＮＡナノ構造は、より努力を必要とし、それらの生成に関してより高価であり、さらに、標的構造の検出のための方法における速度論に関して、より小さな構造よりも劣る。同定構造の部分になる少なくとも２つのＤＮＡナノ構造の使用に起因して、本発明の方法は、標的構造に結合する、著しく小さなＤＮＡナノ構造による、類似の複数の蛍光分子の組み合わせも、発生し得るという利点を有する。さらにまた、同定構造における少なくとも２つのＤＮＡナノ構造の使用は、国際公開第２０１６／１４０７７２７号および国際公開第２０１６／１４０７７２６号に記載されるように、同じ最大のサイズを有する、標的構造における、および／または同定構造中における、蛍光色素分子の異なる区別可能な組み合わせの数のさらなる増加を可能にする。それにより、方法において検出することができる異なる標的構造の数は、原則として、かなり増加し得る。少なくとも２つのＤＮＡナノ構造の使用とは別に、特に、３Ｄナノ構造の形態および構造の内側への蛍光色素分子の配向は明白である。上記で言及したように、これは、その結果、２つのＤＮＡナノ構造の色素の相互作用を防止する、ならびに２つ以上の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の組み合わせのシグナルが確実に予測可能および測定可能である、唯一のものである。
【００５６】
本発明によれば、ＤＮＡナノ構造またはＤＮＡオリガミとも称される核酸ナノ構造が使用される。ＤＮＡナノ構造またはＤＮＡオリガミとも称される核酸ナノ構造は、とりわけ、核酸からなる、二または三次元構造である。「オリガミ」という用語は、核酸、好ましくはＤＮＡの１つまたは複数の鎖または成分が、ほぼすべての事前に規定された構造または形状に折り畳まれ得ることを説明する。そのようなＤＮＡ鎖は、スキャフォールド鎖とも称される。１つまたは複数のスキャフォールド鎖は、より短い核酸鎖（少なくとも１つのスキャフォールド鎖と比べて短い）によって形状が保持され、これは、ステープル鎖とも称される。ここで、より短い鎖（ステープル鎖）が、ＤＮＡオリガミの明確に定義された位置に非常に正確に配置されることは大いに重要である。ＤＮＡオリガミは、例えば、Rothemund, "Folding DNA to create nano-scale shapes and patterns", Nature, March 2006, pp. 297-302, vol. 440；Douglas et al., Nature, 459, pp. 414-418 (2009)；およびSeeman, "Nanomaterials based on DNA", An. Rev. Biochem. 79, pp.65-87 (2010)において、より詳細に記載されている。これらの文書のすべてに対する参照は、本明細書において、本出願の部分として、それらの全体において行われる。
【００５７】
前記ＤＮＡオリガミナノ構造は、光活性分子、特に１つまたは複数の蛍光色素分子を有する光活性分子で機能化することができる。それにより、ＤＮＡオリガミは全体として蛍光粒子になる。ＤＮＡオリガミに基づくそのようなＤＮＡナノ構造は、国際公開第２０１６／１４０７２７号および国際公開第２０１６／１４０７７２６号に記載されている。これらの文書のすべてに対する参照は、本明細書において、本出願の部分として、それらの全体において行われる。
好ましくは、本発明のＤＮＡナノ構造は、少なくとも１つの蛍光色素分子が付着した３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の形状が、第２の類似または同一の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に接近するとともに、少なくとも１つの蛍光色素分子が付着し、２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光色素分子が著しく相互作用することを防止する。したがって、立体的な効果によって、ＤＮＡナノ構造の形状は、異なるＤＮＡナノ構造の蛍光色素分子を互いに近づきすぎるのを防止する。
【００５８】
その名称から推測され得るように、ＤＮＡナノ構造は、好ましくはＤＮＡからなる。原則として、本発明のＤＮＡナノ構造は、しかしながら、例えば、ＲＮＡ、ＬＮＡなどのＲＮＡ類似体もしくはＤＮＡ類似体などの他の核酸も含有していてもよく、またはこれらからなってもよい。したがって、本発明は、ＤＮＡナノ構造および／または３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、核酸ナノ構造および／または３Ｄ核酸ナノ構造である、本明細書に記載のすべての実施形態も含む。ＤＮＡで形成されるナノ構造は、例えば、そのようなナノ構造に対するついての低い製造コストに起因して好ましい。
【００５９】
蛍光色素分子は、例えば、ＲＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰまたは任意のそれらの誘導体（例えば、PJ Cranfill et al., "Quantitative assessment of fluorescent proteins", Nature Methods, 13, 557-562 (2016)を参照されたい）、Ａｔｔｏ色素（例えば、Ａｔｔｏ６４７Ｎ、Ａｔｔｏ５６５またはＡｔｔｏ４８８）、Ａｌｅｘａ色素、ＤＡＰＩ、ローダミン、ローダミン誘導体、シアニン、シアニン誘導体、クマリン、クマリン誘導体（異なる有機蛍光色素について、例えば、Q. Zheng and L Lavis, "Development of photostable fluorophores for molecular imaging", Curr. Op. Chem. Biol. 39 p32-38 (2017)を参照されたい）、または量子ドット（量子ドット、E. Petryayeva et al, "Quantum dots in Bioanalysis: a review of applications across various platforms for fluorescence spectroscopy and imaging", Appl. spectroscopy 67 (2013)を参照されたい）であってもよい。
【００６０】
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、好ましくは、実質的に三次元に広がり、したがって、例えば、わずかな曲がり、粗さまたは波状の表面などの実質的に二次元の構造とは異なる、構造を指す。言い換えれば、互いに垂直の３つの空間方向における最小寸法は、少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも５ｎｍ、より好ましくは少なくとも１０ｎｍ、特に好ましくは少なくとも２０ｎｍである。
２つの蛍光色素分子の相互作用は、特に、蛍光消光および／またはＦＲＥＴを含んでいてもよい。
【００６１】
特に、少なくとも２つの蛍光色素分子は、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に付着していてもよく、少なくとも２つの蛍光色素分子の間の距離は、蛍光色素分子が対で著しく相互作用する距離よりも、対で大きい。２つの蛍光色素分子を有する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の例示的な場合について、これは、２つの蛍光色素分子が、相互作用の距離よりも大きい距離を有することを意味する。３つの蛍光色素分子を有する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の例示的な場合について、これは、それぞれの蛍光色素分子が、それぞれの相互作用の距離よりも大きい、他の２つの蛍光色素分子との距離を有することを意味する。より多くの蛍光色素分子について、同じことが、それに応じて、適用される。つまり、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のどの蛍光色素分子の対が観察されるかに関係なく、観察された対の蛍光色素分子の距離は、観察された対の相互作用半径よりも常に大きい。「相互作用半径」は、蛍光色素分子が、無視できる相互作用（例えば、蛍光消光またはＦＲＥＴなど）を示すために最小で有さなければならない、距離を指す。どの種類の色素の対が、どの種類の相互作用半径を有するかは、当業者に公知である。例えば、対応する相互作用半径は、Novotny, Lukas: Principles of nano-optics 2.ed, Cambridge Univ. Press, 2013, Kapitel "Optical Interactions", pp 224 et seqq.；Peter Atkins: Physikalische Chemie, 5th edition, 2013, Wiley-VCH, Weinheim, Chapter 17 "Wechselwirkungen zwischen Molekulen", pp 657 et seqq.；Forster T:Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. In:Ann. Physik. 437, 1948, S.55.doi:10.1002/andp.19484370105に記載されている。ＦＲＥＴに関して、相互作用半径は、例えば、５０％のＦＲＥＴ率を与える距離であり得る。
【００６２】
ＤＮＡナノ構造は、好ましくは、１つまたは複数の種類の明確に定義された数のマーカー分子（好ましくは蛍光色素分子）を正確な配列の目的を果たす。幾何学的配列は、マーカー分子（好ましくは蛍光色素分子）の間の相互作用を防止するために、極めて重要である。定義された数のマーカー分子（好ましくは蛍光色素分子）は、強度値をプログラミングすること、したがって、その後の確定的な同定を可能にする。異なる組み合わせの数は、Ｎ＝ｋ＾ｍ（式中、ｋは、強度レベルの数であり、ｍは、異なる（この場合において直交測定可能な）マーカー分子（好ましくは蛍光色素分子）の数である）である。この多重化によって、多くの数の異なるＤＮＡナノ構造が、多重化することなく区別することができ、数はｍのみになろう。実施例において、５つの強度レベル、および３つのタイプのマーカー分子、したがって、３つの同時に区別可能な種に代わる１２４が存在する。したがって、ＤＮＡナノ構造はナノレポーターである。
したがって、「ナノレポーター」という用語は、付着したマーカー分子を有する構造を定義するために本明細書において使用され、これは、ナノメーターの範囲の寸法で測定可能および同定される特性を有する。特に、本発明のＤＮＡナノ構造は、ナノレポーターであり得る。例えばＲｏｔｈｅｍｕｎｄによる他のＤＮＡオリガミも、蛍光タンパク質のカスケードと同様に、ナノレポーターであり得る。
【００６３】
「直交測定可能」という用語は、マーカー分子（例えば蛍光色素分子）の測定値の線形結合から、基礎となるマーカー分子および／またはナノ構造の組み合わせの線形結合に明確に外挿することができるという性質を説明する。蛍光検出の例では、これは、スペクトル的に遠く離れた色素によって、したがって、離れて分離された励起および検出波長（例えば、青および赤）によって、またはマルチスペクトル検出との組み合わせにおいてより近く隣接する色素によって、実現され得、その結果、直交成分は「線形非混合」によって計算され得る。
【００６４】
本発明のＤＮＡナノ構造は、好ましくは、１つまたは複数の種類のマーカー分子の１つまたは複数のマーカー分子（例えば蛍光色素分子）が、２つのマーカー分子の間の距離が、それらが著しく相互作用する距離よりも大きくなるように付着するという点、ならびにその形成が同様のＤＮＡナノ構造に近づくとともに、そのマーカー分子が他のＤＮＡナノ構造のものと著しく相互作用することを防止するという点において特徴付けられる。本発明の好ましいＤＮＡナノ構造は、１つまたは複数の種類のマーカー分子の１つまたは複数のマーカー分子が、同一のマーカー分子の間の距離が蛍光消光が起こる距離よりも大きく、異なるマーカー分子の間の距離がＦｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）半径よりも大きくなるように付着し、その形状が、類似のＤＮＡナノ構造に近づくとともに、そのマーカー分子が蛍光消光またはＦＲＥＴによる他のＤＮＡナノ構造の１つまたは複数のマーカー分子と相互作用することを防止する、ＤＮＡナノ構造である。
「マーカー分子」は、測定可能なシグナルを発する粒子を指す。特に、蛍光色素分子はマーカー分子である。蛍光色素分子のシグナルは、強度だけでなく、寿命、偏光、明滅の速度論、または同様の量であってもよい。金粒子は、この意味内でマーカー分子でもある。
【００６５】
２つのマーカー分子、特に２つの蛍光色素分子は、少なくとも１つのそれらによって発せられたシグナルが他のものの存在または非存在に著しく依存する場合、著しく相互作用する。我々の目的のために、例えば、別の分子の存在に起因するシグナルの強度の１％までの減少は無視し得るが、２０％までの減少は無視することができない。第１の場合において、マーカー分子（特に蛍光色素分子）は著しく相互作用しないが、それらは第２の場合においては著しく相互作用する。類似の蛍光色素分子の場合において、我々のためによく見られる相互作用メカニズムは蛍光消光であり、これは、蛍光色素分子に応じて異なるが、約２〜３ナノメートルの蛍光色素分子の間の距離を発端として無視できるようになる。異なるタイプの蛍光色素分子のために、よく見られる相互作用メカニズムは、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）であり、蛍光色素分子の対がもはや著しく相互作用しない距離（ＦＲＥＴ距離とも称される）は、個々の対に応じて、２〜２０ナノメートルの範囲で変動する。ＦＲＥＴ距離は、複数の蛍光色素の対について公知であり、例えば、多くの色素の製造者は、それらの色素のＦＲＥＴ距離についてのリストを公開している（例えば、://www.atto-tec.com/fileadmin/user_upload/Katalog_Flyer_Support/R_0_-Tabelle_2016_web.pdf）。また、ＦＲＥＴ距離は、蛍光色素分子のスペクトル特性を使用して計算してもよい（Atkins, Physikalische Chemieを参照されたい）。
【００６６】
好ましくは、２つの蛍光色素分子の間の著しい相互作用は、１つの分子の測定された蛍光シグナル（通常の励起による）が、他の分子の存在によって、他の分子の非存在中での１つの分子の測定された蛍光シグナルと比較して、８０％以下、好ましくは９０％以下、特に好ましくは９５％以下、非常に特に好ましくは９９％以下に、低減される、相互作用である。
本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、好ましくは、キャビティを含み、キャビティは、少なくとも０．１ゼプトリットル（１ｅ−２２リットル）、好ましくは少なくとも１０ゼプトリットル、特に好ましくは少なくとも１００ゼプトリットルの容積を有する。
本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、中空円柱状のＤＮＡナノ構造、すなわち中空円柱体として、実質的に形成されてもよく、少なくとも１つの蛍光色素分子は、中空円柱状のＤＮＡナノ構造の内側に付着する。中空円柱体のキャビティは、好ましくは上記に示された容積を有する。
【００６７】
中空円柱体のシェルに相当する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の部分は、ギャップを含んでいてもよい。中空円柱体の上部および底部の表面に相当する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のこれらの部分は、好ましくは開いていてもよいが、少なくとも部分的にそれぞれ閉じていてもよく、および／または完全に閉じていてもよい。中空円柱体のバレル、および任意に上部および底部の表面は、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造によって形成され、これは、例えば、ナノ構造の個々のらせんが突起および凹部を有する不均一な表面を形成するので、数学的に正確な円柱ではないことを意味する。しかしながら、３Ｄナノ構造の外筒は、実質的に円柱の形態である。
好ましくは、本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造において、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも１５、特に好ましくは少なくとも３０、特に好ましくは少なくとも６０の蛍光色素分子が付着する。好ましくは、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造上の蛍光色素分子は、均一である、すなわち同じタイプである。
【００６８】
好ましくは、本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、キャビティ、および少なくとも１つの内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも１つの内向きに配置された蛍光色素分子と３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の外筒の周縁部および／または表面の外側との距離は、少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも３ｎｍ、特に好ましくは少なくとも５ｎｍである。これは、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の内側の配列、および３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の周縁部との最小距離に起因して、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の色素が、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が方法の過程で相互作用し得る、他の構造との前記最小距離も含むという利点を有する。例えば、キャリア、例えば基材の表面に対、色素は、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が前記表面に接触する場合、最小距離より大きいまたは最小距離に等しい距離を有する。
【００６９】
好ましくは、本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、少なくとも２つの内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも２つの内向きに配置された蛍光色素分子の対の距離は、少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも５ｎｍ、特に好ましくは少なくとも９ｎｍである。２つの色素分子を有する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の例示的な場合について、これは、２つの色素分子が、少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも５ｎｍ、特に好ましくは少なくとも９ｎｍの距離を含むことを意味する。３つの色素分子を有する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の例示的な場合について、これは、それぞれの色素が、少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも５ｎｍ、特に好ましくは少なくとも９ｎｍの、２つの他の色素との距離を含むことを意味する。より多くの色素について、同じことが変更すべきところは変更して適用される。これは、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のどの色素の対が観察されるかに関係なく、観察された対の色素の距離は、常に、少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも５ｎｍ、特に好ましくは少なくとも９ｎｍである。
【００７０】
色素分子の距離は、例えば、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の構造を同定することによって決定されてもよく、これから、どの位置に色素分子が位置するかを推測することができる。この目的で、例えば、配列分析が必要であってもよい。この目的のために、ＤＮＡナノ構造を有する溶液は、例えば塩濃度の低減によって、個々の核酸鎖を有する溶液に移される。塩濃度の低減により、ＤＮＡ主鎖の負電荷は、塩基対を形成する水素結合の持続的な一定の結合エネルギーと比較して、遮蔽の低減に起因して、よく見られる。したがって、塩濃度の低減により、ＤＮＡナノ構造は、最初に不安定化され、さらなる低減により、個々のＤＮＡの二重らせんは、破壊され、例えば、ＭｙＳｅｑ、またはＩｌｌｕｍｉｎａ．Ｉｎｃ．によって提供される別の方法で、製造者によって示されたプロトコールを用いて、配列決定される。したがって、試料中に存在するすべての核酸鎖の配列は、公知になる。ＤＮＡナノ構造の形態は、この配列情報を用いて再構成されてもよい。この目的で、任意の配列エディター（例えば、ＡｐＥ２．０（http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/））を使用することができる。分析の最も長いＤＮＡ鎖はスキャフォールド鎖である。これは、エディターにロードされ、スキャフォールド鎖と相補的な配列の領域が計算され、それぞれの単一のステープル配列について、記述される。それぞれのステープル鎖に対するスキャフォールド鎖上に２つの異なる領域が存在する。本明細書において異なるポイントで記載されるように、この情報により、トポロジーを、次にＣａＤＮＡｎｏにおいて定義することができ、したがって、ＤＮＡナノ構造の設計を再構成することができる。次のステップにおいて、どのステープル鎖が色素を備えるかを決定しなければならない。これは、色素アダプターの使用により、特定の数のステープル鎖がさらに同一の配列を有し、上記のＤＮＡナノ構造の再構成後も一本鎖のままであるので、簡単である。ステープル鎖を直接修飾する場合、個々のステープル鎖は、単離して、それらの蛍光特性を分析しなければならない。それぞれの個々のステープル鎖は、相補鎖とのハイブリダイゼーションによって追加の分子量でロードされ得、個々の核酸鎖を有する上記の溶液からアガロースゲル電気泳動において単離され得る。最後に、それぞれの蛍光測定は、どのステープル鎖がフルオロフォアで標識されたかを示す。これらは、ｃａＤＮＡｎｏにおいて同定することができ、蛍光分子の間の距離を計算することができる。
【００７１】
この方法の代替として、質量分析（Sauer S, Lechner D, Berlin K et al. (2000) Full flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the GOOD assay. Nucleic Acids Res 28:E100；Haff LA, Smirnov IP (1997) Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Res 7:378-388；Wenzel T, Elssner T, Fahr K et al. (2003) Genosnip: SNP genotyping by MALDI-TOF MS using photocleavable oligonucleotides. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 22:1579- 1581；Braun A, Little DP, Koster H (1997) Detecting CFTR gene mutations by using primer oligo base extension and mass spectrometry. Clin Chem 43:1151-1158；Sun X, Ding H, Hung K et al. (2000) A new MALDI-TOF based mini-sequencing assay for genotyping of SNPS. Nucleic Acids Res 28:E68）を使用して、ＤＮＡナノ構造を有する溶液を直接配列決定することができ、これは、どのステープル鎖が蛍光分子と付着しているかを同時に確立することができる。上記と同様に、ＤＮＡ構造のトポロジーは、その後、ステープル鎖およびスキャフォールド鎖（これは再び最も長い鎖である）の相補的配列分析を使用して、ＣａＤＮＡｎｏにおいて再構成することができる。蛍光分子がどの鎖に付着しているかに対して共測定された情報は、ｃａＤＮＡｎｏを使用して、蛍光分子の距離を計算するために直接使用することができる。
好ましい実施形態において、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、実質的に楕円の円柱体として、好ましくは実質的に環状の円柱体として、形成される。
【００７２】
上記で既に説明したように、本発明による構造は、単一原子のレベルでの構造の表面は極めて不均一であり、例えばナノ構造の個々のらせんのレベルで、他のらせん半径またはらせん直径のオーダーで不均一さを含み得るので、数学的に正確な円柱ではない。しかしながら、これらの構造は、それにもかかわらず、例えば、３Ｄナノ構造の外筒が実質的に円柱の形態を有し得るので、当業者にとって円柱状である。
好ましい実施形態において、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の中空円柱体は、環状の円柱体であり、少なくとも５ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、好ましくは少なくとも２０ｎｍ、好ましくは少なくとも２０ｎｍの外半径、好ましくは３０ｎｍ〜８０ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ〜７０ｎｍの外半径、特に好ましくは６０ｎｍの外半径を有する。外半径は、構造の外筒の外半径を指す。
好ましい実施形態において、好ましくは環状の外筒である３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の中空円柱体は、最大で２００ｎｍの高さ、好ましくは６０ｎｍ〜３０ｎｍの高さ、特に好ましくは３０ｎｍの高さを有する。構造の高さは、外筒の高さを指す。
好ましい実施形態は、互いからの、好ましくは３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の内側の色素分子の十分な距離で十分な数の色素分子を付着させるために、十分なサイズの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を確実にする。
【００７３】
好ましい実施形態において、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の中空円柱体は、少なくとも２ｎｍ、好ましくは２ｎｍ〜７ｎｍ、特に好ましくは５ｎｍの壁厚を含む。構造の壁厚は、外半径および内半径の間の距離を指す。言い換えれば、壁厚は、円柱体の外側の外筒、および円柱体のキャビティの内側の外筒の間の距離に相当する。
好ましくは、本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、ＤＮＡ二重らせんの直径に少なくとも相当する壁厚を含む。好ましくは、壁厚は、２〜４本、特に好ましくは３本のＤＮＡ二本鎖のための空間を有し、ＤＮＡ鎖は、好ましくは、それらの長さにおける壁厚に垂直で配列され、加えて、ハニカム空間格子の隣接する空間格子の部位に配列される。
中空円柱体の内径は、中空円柱体の外径および壁厚の差として定義される。したがって、好ましい内径は、本明細書に示される外径および壁厚における詳細からもたらされる。
記載されている最小の壁厚は、周囲から色素を遮断する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の形状と組み合わせて、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の色素と、キャリアおよび／または別の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に付着し得る別の色素の表面との相互作用が、立体障害によって防止されるという事実にも寄与する。したがって、特に、別の色素、および／もしくはキャリア、特に基材の表面との非特異的な結合による消光ならびに／またはＦＲＦＴが防止される。
【００７４】
ＤＮＡオリガミに対して一般的であるように、本発明の３Ｄナノ構造は、好ましくは、「スキャフォールド鎖」としてＤＮＡ一本鎖を含む。好ましくは、スキャフォールド鎖は、少なくとも３０００塩基、好ましくは５０００〜５００００塩基、特に好ましくは１００００〜１１０００塩基を含む。しかしながら、異なる数の塩基が可能である。好ましくは、スキャフォールド鎖は環状である。ここで、環状とは、ＤＮＡ鎖が、開いていない５’末端、および開いていない３’末端を含むことを意味する。スキャフォールド鎖についての非限定的な例は、添付の実施例において言及され、配列番号１２５８に示される。
【００７５】
また、ＤＮＡオリガミに対して一般的であるように、３Ｄナノ構造は、好ましくは、複数のさらに短い一本鎖ＤＮＡ分子を含む。これらは、好ましくは「ステープル鎖」と称される。本発明によれば、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のステープル鎖の数は、好ましくは、それが３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つのスキャフォールド鎖の長さに適合して、選択される。好ましくは、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は１００〜５００のステープル鎖を含む。ステープル鎖は好ましくは３０〜１００塩基を含む。ステープル鎖の非限定的な例は、添付の実施例において言及され、および／または配列番号１〜５０４に示される。
【００７６】
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、マーカー分子が相互作用半径の少なくとも半分の周縁部との距離で内向きに配置された、円柱状の形状であってもよい。これは、異なるＤＮＡ構造のマーカー分子が、互いに対するＤＮＡ構造の位置に関係なく、相互作用半径よりも互いに近づかないことを確実にする。この目的で、およそ正方形である側面図を有する円柱体は、立体障害（および、したがって遮蔽）、小さな水力学的半径（および、したがって拡散速度）、およびマーカー分子の間の十分な距離で内向きに配置されたマーカー分子の位置の良好な比率を提供する。特に、約３０〜９０ナノメートルの直径および約３０〜９０ナノメートルの高さを有するＤＮＡナノ構造の中空円柱体が想定される。
【００７７】
あるいは、ＤＮＡ構造は、バスケットの「底部」に位置する染料およびマーカー分子のタイプのすべての組み合わせの最大の相互作用半径と少なくとも同じ大きさのバスケットの周縁部を有する、バスケット形状であってもよい。バスケットの周縁部は、バスケットの底部に対して任意の角度を有していてもよく、しかしながら、好ましくは、角度は−４５°から＋４５°の範囲内である。好ましくは、バスケットの周縁部は、最大で２００ｎｍの高さ、好ましくは６０ｎｍから３０ｎｍの高さ、特に好ましくは３０ｎｍの高さを有する。再び、構造の高さは、外筒の高さを指す。
バスケットの開いた側は、好ましくは、少なくとも５ｎｍの外径、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの内半径、特に好ましくは６０ｎｍの内半径を含む。開いた上面および閉じた上面を有する中空円柱体は、バスケットの特定の場合である。
【００７８】
本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、実質的に正方形の投影を含んでいてもよく、すなわち、高さと幅および／または直径の比は、０．８〜１．２の範囲内である。特に、中空円柱体および／またはバスケットとして設計された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、実質的に正方形の投影を含んでいてもよい。
本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、中空球の形態を含んでいてもよく、好ましくは内向きに配置されたマーカー分子を備えていてもよい。
本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、四面体、八面体、立方体、六面体、ピラミッドなどのワイヤーフレーム形状でもある。
【００７９】
ＤＮＡオリガミ、したがって異なる形状のＤＮＡナノ構造の生成の一般原則は、例えば、Rothemund, "Folding DNA to create nano-scale shapes and patterns", Nature, March 2006, pp. 297-302, vol. 440；Douglas et al., Nature, 459, pp. 414-418 (2009)；およびSeeman, "Nanomaterials based on DNA", An. Rev. Biochem. 79, pp.65-87 (2010)から、十分に確立されている。既に言及したように、ＤＮＡオリガミについての生成原理は、好ましくは一本鎖である少なくとも１つのスキャフォールド鎖、および複数のステープル鎖の共同インキュベーションに基づく。ステープル鎖は、スキャフォールド鎖の相補的なセグメントにそれぞれ結合する目的を有する少なくとも２つの結合セグメントを含む。インキュベーションの間、これは、その後低下させる５０〜７０℃の温度で好ましくは開始され、ステープル鎖およびスキャフォールド鎖は、それらのそれぞれの相補的な結合セグメントを介して結合する。それにより、発生したＤＮＡナノ構造は、高次構造に折り畳まれる。スキャフォールド鎖およびステープル鎖、ならびにそれらの相補的な結合セグメントの直接設計によって、ＤＮＡオリガミは、ユーザーのニーズに従って、設計および製造され得る。ＤＮＡオリガミを設計するために、自由にアクセス可能なソフトウェアが利用可能である。例えば、プログラムＣａＤＮＡｎｏ２．５（ソースコードは、https://github.com/cadnanoで利用可能;ユーザーマニュアルはhttp://cadnano.org/docs.htmlおよび／または http://cando-dna-origami.org/tutorial/で利用可能（S.M. Douglas et al, "Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno, Nucleic Acids Res., 37(15), 2009)も参照されたい）を使用してもよい。
【００８０】
このプログラムにおいて、好ましくはＤＮＡナノ構造の生成に利用可能な任意のスキャフォールド鎖配列が事前に定義され、スキャフォールド鎖ｐ７３０８（配列番号１２５８）およびｐ７２４９（配列番号１２５７）が特に好ましい。加えて、ＤＮＡナノ構造の所望のトポロジーが指定される。詳細には、ＣａＤＮＡｎｏは、（１）スキャフォールド鎖の長さおよび（２）スキャフォールド鎖の配列、（３）スキャフォールド鎖の空間形状、ならびに（４）スキャフォールド鎖の開始位置の特定により、必要なスキャフォールド鎖およびステープル鎖の数ならびに配列を計算する。スキャフォールド鎖の空間形状は、想定される構造の形状を定義し、らせんの数および配列、ならびにこれらのらせんを通るスキャフォールド鎖のコースを含有する。ボタンを押すと、プログラムは、自主的な方法で、決定されたスキャフォールド鎖をステープル鎖と連結することが可能である。その後、ステープル鎖は、表形式で出力することができる。表は、特に、一義的な同定、塩基の数（すなわちステープル鎖の長さ）およびステープル鎖の配列について、ステープル鎖の開始位置および終了位置（らせん、およびらせんの端からの塩基の数によって定義される、例えば、７［１２８］は、７番目のらせん上の、任意ではあるが一様に定義された左端から１２８の塩基の位置を指す）を含有する。同一の構造設計（ポイント（１）〜（３））であるが、異なる環状のスキャフォールド鎖の開始位置で、他のステープル鎖配列が生成されることは注目の価値がある。これらは、異なる開始位置を有するものと同様に制限なく使用可能であるが、これらと互換可能ではない。
【００８１】
３Ｄ構造において時々有用であるＤＮＡらせんの曲がりについて、スキャフォールド鎖に沿った位置は、対応するステープル鎖が多かれ少なかれ１つの塩基を含んで、定義され得る。追加のステープル鎖−ステープル鎖の対形成も定義され得、これは、規定のスキャフォールド鎖の長さを超えて、構造にさらなるＤＮＡらせんの輪郭の長さを追加する。ＣａＤＮＡｎｏが平面上の表示を単に示すこと、および３Ｄ表示がユーザーの空間創造、または設計プログラムＡｕｔｏｄｅｓｋ  Ｍａｙａ（D Selnihin und ES Andersen, "Computer-aided design of DNA origami structures", Comp. Meth. Synth. Biol. 1244, pp 23-44 (2014)）のためのＣａＤＮＡｎｏのプラグインによって作られなければならないことに留意されたい。ＣａＤＮＡｎｏは、最終的に、所望の構造を作成することができる手段によって、ステープル鎖のリストを提供する。
【００８２】
これらのステープル鎖のそれぞれは、原則として、フルオロフォア／蛍光色素分子を備え得る。しかしながら、プログラムは、エクスポートされたステープル鎖のリストにおいて直接標識するための蛍光色素分子の位置の定義についての機能を想定しない。しかしながら、プログラムは、これが鎖の開始位置および終了位置、ならびにスキャフォールド鎖の形状およびらせんの配列を示すので、このプロセスの視覚化において助けとなる。このツールを使用して、ユーザーは、設計された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造内のステープル鎖上の可能な位置の相対距離を容易に計算することができる。具体的に、および好ましくは、ユーザーは、修飾されるべきステープル鎖上の位置を選択する。これらは、例えば、５’末端または３’末端である。その後、ユーザーは、例えば、それらがキャビティ構造の内側に位置し、構造の周縁部と所望の十分な距離を有する、蛍光色素分子についての位置決めの要件に合うステープル鎖を選択する。上記に記載したように、これは、ＣａＤＮＡｎｏから推測することができる。最後に、ユーザーは、依然として選択することができるステープル鎖上の修飾される位置の最小距離を計算し、これは、ＣａＤＮＡｎｏにおける設計の空間格子構造および視覚化に起因して、２〜３回の計算に限定され、容易に実行することができる。最後に、実現される蛍光色素分子の数に応じて、ユーザーは、選択可能なステープル鎖の任意のサブセットを選択し、ステープル鎖のＩＤを記述し、選択された位置で蛍光色素分子の修飾を有するエクスポートされたステープル鎖のリスト内の対応する配列を順序付ける。蛍光色素分子アダプターに基づくＤＮＡナノ構造上の蛍光色素分子の付着のためには、戦略は、エクスポートされたステープル鎖の配列が蛍光色素分子の修飾で使用されないが、蛍光色素分子アダプターに相補的なアダプター配列によって延長された配列で使用されるという相違のみで、同様である。また、好ましくは、ステープル鎖に沿った選択された位置は、特に好ましくは構造から内側にはみ出た（および／またはキャビティにはみ出た）、ステープル鎖の一端である。ＤＮＡ構造におけるこのアダプターに基づく蛍光色素分子の付着により、蛍光色素分子（および異なる蛍光色素分子の色のための配列番号、例えば、１２５９〜１２６１）を備えた同様の種類の多くのアダプター鎖は、多くの異なるステープル鎖に結合し、これは、ＤＮＡナノ構造におけるアダプターのために同じ相補的配列でそれぞれ延長される。蛍光色素分子アダプターを使用する場合、蛍光色素分子は、好ましくは、周縁部および／または壁に向かう蛍光色素分子アダプターの構造の側において結合する。これは、移動度の低減を可能にする。例えば、これは、ＣａＤＮＡｎｏによって定義されるステープル鎖の５’末端が相補的なアダプター配列によって延長される場合、蛍光色素分子アダプターの３’末端である。しかしながら、逆の場合も考えられる。
フルオロフォアアダプターのためのステープル鎖についての同じモデルによれば、１つのステープル鎖がそれぞれの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造についての標的アダプターのために設計され、ステープル鎖の位置についての選択基準は、異なる、例えば、標的構造との良好な結合効率のための露出であってもよい。
【００８３】
異なる３Ｄ形状、例えば、中空円柱体の構造における３Ｄナノ構造の生成は、Knudsen J. et al.（Nature Nanotechnology 10, 892-898 (2015) doi:10.1038/nnano.2015.190）からも公知である。本明細書における設計に基づく本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を生成するために、中空円柱体の内側を指し、かつ中空円柱体の端（周縁部）の１つに位置しない、らせんに独占的に結合する、オリゴマーの好ましくはすべてまたはサブセットは、一端に色素を備え、および／または（蛍光色素分子を含む蛍光アダプターが結合することができるように）アダプター配列によって延長される。標的アダプターまたはキャリアアダプターのために、中空円柱体の周縁部に位置するらせんに組み込まれるオリゴマーが選択され得る。
【００８４】
また、添付の実施例において（特に実施例１において）、例示的な実施例は、本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の生成方法について説明する。この方法のために使用される配列に基づいて、およびその生成のために提供される方法に基づいて、当業者はまた、同様の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造（例えば、（しかしながら、例えば、類似または同じ位置で、相補的なＤＮＡ配列を有する）全体的に異なる配列を有する）を生成し得る。
【００８５】
別の態様において、本発明は、複数の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造（好ましくは本出願に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が存在する）のセットであって、セットが、Ｎ個の対で異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を含み、セットのＮ個の異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、蛍光色素分子中で互いに対で異なる、セットに関する。好ましくは、Ｎ個の対で異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、異なる数の蛍光色素分子および／または異なる蛍光色素分子を含有し、その結果、セットのＮ個の対で異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造により、互いに区別可能であるｋ強度レベル、および／または互いに区別可能であるｍ色レベルを発生させることができる。好ましくは、Ｎ個の対で異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも一部は、セットに複数回含有され、その結果、ｋ強度レベルのそれぞれは、強度分布によって形成され、ｋ強度分布は、互いに、好ましくは統計学的に区別可能である。好ましくは、Ｎ個の対で異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも一部は、セットに複数回含有され、その結果、ｍ色レベルのそれぞれは、色分布によって形成され、ｍ色分布は、互いに、好ましくは統計学的に区別可能である。隣接する分布の重複は、３０％未満、好ましくは２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは２％未満、特に好ましくは１％未満である。
この文脈において、これは、好ましくはｋ＞２、好ましくはｋ＞３、より好ましくはｋ＞４、さらにより好ましくはｋ＞５、特に好ましくはｋ＞６；および／またはｍ＞２、好ましくはｍ＞３、より好ましくはｍ＞４、さらにより好ましくはｍ＞５、特に好ましくはｍ＞６が好ましく適用される。
【００８６】
別の態様において、本発明は、標的構造の検出のための方法も対象とする。この方法は、
ａ）（ｉ）標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、標的構造に（特異的に）結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、同定構造の形成；
ｂ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる標的構造の検出
を含み、
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造中で結合しない場合に、ａ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも２つの単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択される、方法である。
好ましくは、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、対で異なる標的分子の領域／セグメントに結合する。したがって、標的構造の検出のためのより高い特異性が達成される。
特に、方法のステップｐ１）およびｐ２）を有する前記方法の組み合わせが好ましい。
【００８７】
本発明の方法により検出される標的構造は、分子、いくつかの分子の複合体、または粒子であってもよい。特に、標的構造は、ＤＮＡ（好ましくは少なくとも部分的に一本鎖のＤＮＡ）、ＲＮＡ（好ましくは少なくとも部分的に一本鎖のＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）、ＬＮＡ（好ましくは少なくとも部分的に一本鎖のＬＮＡ）またはタンパク質であってもよい。しかしながら、１つもしくは複数のＤＮＡ（好ましくは少なくとも１つの少なくとも部分的に一本鎖のＤＮＡ）、１つもしくは複数のＲＮＡ（好ましくは少なくとも１つの少なくとも部分的に一本鎖のＲＮＡ）、１つもしくは複数のＬＮＡ（好ましくは少なくとも１つの少なくとも部分的に一本鎖のＬＮＡ）および／または１つもしくは複数のタンパク質を含むならびに／あるいはこれらからなる、複合体である標的構造も、適用可能である。原則として、標的構造はまた、無機粒子であってもよい。好ましくは、標的構造は、ポリヌクレオチド（すなわち、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＬＮＡ）、特に好ましくは少なくとも部分的に一本鎖のポリヌクレオチド、特に好ましくは一本鎖のポリヌクレオチドを含むか、またはこれらである。特に好ましくは、標的構造は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＬＮＡを含むか、またはこれらである。好ましい態様において、本発明の方法は、遺伝子発現分析のために使用される。この場合において、標的構造は、好ましくは、ｍＲＮＡまたはタンパク質、特に好ましくはｍＲＮＡである。それ故に、標的構造は、タンパク質またはｍＲＮＡであってもよい。「部分的に」一本鎖とは、ポリ核酸（すなわち、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＬＮＡ）が、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、特に好ましくは少なくとも２１塩基の一本鎖の領域を含むことを意味する。
それ故に、方法の好ましい実施形態において、標的構造は、ポリヌクレオチド、好ましくは部分的に一本鎖のポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはｍＲＮＡを有し得るか、またはこれらであり得る。
【００８８】
それ故に、好ましい実施形態において、本発明の方法は、遺伝子発現分析のための方法であってもよく、ｍＲＮＡが検出され（したがってｍＲＮＡは標的構造である）、方法は、
ａ）（ｉ）ｍＲＮＡ、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、対で異なるｍＲＮＡの配列セグメントに（特異的に）結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、同定構造の形成；
ｂ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる標的構造の検出
を含み、
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造中で結合しない場合に、ａ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも２つの単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択される、方法である。
【００８９】
特に、方法のステップｐ１）およびｐ２）による組み合わせが好ましく、その結果、好ましい実施形態は、遺伝子発現分析のための方法であって、ｍＲＮＡが検出され（したがってｍＲＮＡは標的構造である）、方法は、
ｐ１）正確に１つの宿主体が少なくとも１つのマイクロウェルに存在するような、ｍＲＮＡを有する宿主体を含む宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入；
ｐ２）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つのマイクロウェルへの導入であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入；
ａ）（ｉ）ｍＲＮＡ、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、対で異なるｍＲＮＡの配列セグメントに（特異的に）結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、同定構造を形成するステップ；
ｂ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによるｍＲＮＡの検出
を含み、
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造中で結合しない場合に、ａ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも２つの単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択される、方法である。
本発明の方法に関して、「３Ｄ  ＤＮＡナノ構造」は、本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に関連して上記に定義されたものと同じものを指す。言い換えれば、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、ＤＮＡオリガミと称してもよい。
同定構造の部分である少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の、好ましくは少なくとも１つ、好ましくはすべてが、本明細書に記載の本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造である。
【００９０】
当業者には、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および測定パラメーターが互いに依存してどのように選択されるか、ならびにどの蛍光シグナルがどの種類の測定方法およびどの種類の測定パラメーターで区別することができるかは公知である。互いに異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、それらの蛍光応答において、例えば、色および／または強度によって、互いに異なっていてもよい。異なる色を使用する場合、したがって、適切な励起波長および色に適応したフィルターを使用しなければならないことは、当業者には明らかである。得られ得る色のレベルｍの最大数は、とりわけ、どのようにして厳密に２つの隣接する色分布を技術的に解像することができるかに依存する。同じことは、方法が２つの隣接する強度分布（強度レベルｋ１およびｋ１＋１）を依然として分離することができる（少なくとも統計学的に）という事実に基づくので、達成可能な強度レベルの最大数に適用される。例えば、個々の強度分布は、モデル化することができ、複数の部分的に重複する強度分布の混合分布に基づいて、個々の分布の相対的な集団サイズは、解析または統計学的な干渉、好ましくはベイズ推論によって、計算することができる。
しかしながら、色および／または強度の代わりに他の変数も利用することができ、これらは、例えば色分子の退色率または蛍光の寿命などの異なる同定構造の蛍光シグナルを区別するために適している。
【００９１】
標的構造の検出は、標的構造が存在することの検出を含んでいてもよい。しかしながら、原則として、検出はまた、標的構造が存在しないという除外を含んでいてもよい。特に、本発明の方法は、標的構造の定量化のためにも適している。言い換えれば、標的構造の検出は、好ましくは、標的構造（例えば、試料溶液中）の定量化を含む。定量化は、相対的、すなわち、別の成分（例えば、試料溶液中の第２の構造／標的構造）に関して相対的、または絶対的（すなわち、濃度または絶対数の形態）であってもよい。例えば、これは、同定構造の検出が、フローサイトメトリー、ＦＣＳまたは光シート顕微鏡に基づく測定形状などの溶液中である場合に、絶対的な用語で定量化され得る。次いで、所与の試料容積中のすべての同定構造を測定することができ、絶対数および／または濃度を示すことができる。より正確な記述のために、試料は、異なる希釈ステップで複数回測定することができ、および／または考慮されない標的構造の数は、統計学的方法によって推定することができ、好ましくは、分けられた測定事象（例えば、測定事象におけるＤＮＡナノ構造の予測数よりも少ない存在に起因する）によって、ベイズ推論によって推定され得る。キャリアおよび／またはキャリア表面に結合した同定構造の測定のために、類似のアプローチが考えられる。この目的で、パラメーターは、同定構造がキャリアおよび／または（第１の）キャリア表面に結合しない可能性が低くなるように、選択されなければならない。これは、例えば、試料容積に対するキャリア表面および／または第１のキャリア表面の高い比率（例えば、０．０１／μｍ、好ましくは０．１／μｍ、より好ましくは０．５／μｍ、非常に好ましくは１／μｍ）によって、および／または長いインキュベーション期間（例えば３０分、好ましくは２時間、より好ましくは１０時間、非常に好ましくは２４時間）によって、達成され得る。次いで、すべての同定構造は、再び測定することができ、それらの数は、試料容積によって割ってもよい。上記の場合におけるように、分析におけるさらなるステップは推定を精緻化することができる。好ましくは、測定は、唯一の表面がキャリアアダプター（好ましくは測定が最も容易な表面）を含み、すべての他の表面が（例えば、本明細書の他の箇所で記載されるようにして）不動態化される試料チャンバー中で行うことができ、その結果、すべての同定構造の測定はより簡単である。
定量化は、内部標準または経験的データに基づいて行うこともできる。好ましくは、内部標準は、既知の濃度との比較値を定義する。
【００９２】
標的構造の検出のための本発明の方法は、ａ）において形成された同定構造が、キャリアに結合するか、または結合していることをさらに含んでいてもよい。それ故に、形成された同定構造は、キャリアに、好ましくはキャリアの第１の表面に結合することができる。したがって、この方法は、形成された同定構造の、キャリア、好ましくはキャリアの第１の表面への結合のステップを含んでいてもよい。
【００９３】
同定構造がキャリアに結合する場合、これは、好ましくは、同定構造がキャリア上に形成されることを意味する。同定構造のキャリアへの結合は、標的構造および／または少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の１つ（好ましくは標的構造）が、事前に結合されるか、または同定構造の形成の既に前にキャリアに結合している点で、媒介されてもよい。言い換えれば、標的構造および／または少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の１つ（好ましくは標的構造）は、（同定構造の形成の前に）キャリアに結合されていてもよい。したがって、この方法は、標的構造および／または少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つ（好ましくは標的構造）のキャリアへの結合のステップをさらに含んでいてもよい。例えば、このステップは、キャリアおよび／または第１のキャリア表面の、標的構造（および任意に、例えばさらなるポリヌクレオチド、好ましくはｍＲＮＡなどのさらなる成分も）を含有する試料溶液とのインキュベーションを含んでいてもよい。さらにまた、このステップは、１つまたは複数の洗浄ステップ（緩衝溶液による）を含むことができる。少なくとも１つの洗浄ステップと組み合わされる、標的構造のキャリアおよび／または第１のキャリア表面との事前結合は、標的構造が、同定構造の形成の前に試料溶液の状況から既に除去することができるという利点を有する。これは、多くのおよび任意の類似の成分を有する複合体試料で特に有利である。
【００９４】
緩衝溶液は、１倍〜８倍のＳＳＣ、好ましくは３倍〜５倍のＳＳＣ、特に好ましくは４倍のＳＳＣを含有することができる。ここでは、ＳＳＣは、ＳＳＣなどのいわゆる生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液を指し、これは、１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび１５ｍＭのクエン酸三ナトリウムの水溶液で構成され、ＨＣｌを用いてｐＨ７．０に調整される。緩衝液のベースとして、ＴｒｉｓまたはＰＢＳも、ＳＳＣのようなクエン酸緩衝液の代替として使用することができる。緩衝液は、（好ましくはＳＳＣの代替として）ＮａＣｌおよび／またはＭｇＣｌ2を含むこともできる。ＮａＣｌの濃度は、好ましくは５０ｍＭ〜１２００ｍＭ、特に好ましくは２００ｍＭ〜８００ｍＭである。例えば、ＮａＣｌの濃度は、６００ｍＭ、好ましくは５００ｍＭ、特に好ましくは３００ｍＭであり得る。ＭｇＣｌ2の濃度は、２ｍＭ〜２０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜１５ｍＭ、好ましくは８ｍＭ〜１２ｍＭ、特に好ましくは１０ｍＭであり得る。また、緩衝溶液は、４％〜６％、２％〜１０％、１５％または２０％の硫酸デキストランを含むことができる。好ましくは、緩衝液は、例えば、５％の硫酸デキストランを含む。緩衝溶液は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ１０００を含むこともできる。緩衝液は、０．０１〜５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むこともできる。任意に、緩衝液は、ＥＤＴＡを、好ましくは０．１ｍＭ〜５ｍＭ、特に好ましくは１ｍＭの濃度で含むことができる。緩衝液のさらなる任意の成分は、「剪断されたサケ精子」（市販）、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌの濃度の「剪断されたサケ精子」（市販）である。「剪断されたサケ精子」は、潜在的に特異性を増加させることができる。緩衝液は、デンハート培地（０．０２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ４００（市販）および０．０２％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の水溶液で構成される、Cold Spring Harb Protoc 2008, doi:10.1101/pdb.rec11538も参照されたい）を、好ましくは、１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍の濃度で含むこともできる。特に好ましい緩衝液は、４倍のＳＳＣ、５％のデキストラン硫酸および０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０の組成物を含むか、またはこの組成物を有する。この緩衝液は、少なくとも１つ、好ましくはすべての検出される標的構造が、ポリ核酸、例えばｍＲＮＡである場合に、特に好ましく使用される。
【００９５】
同定構造がキャリアに結合している場合、これは、好ましくは、同定構造が形成されるだけでなく、キャリア、好ましくはキャリアの第１の表面に対する結合も得られることを意味する。言い換えれば、同定構造の成分は事前に結合されない。したがって、この方法は、同定構造の、キャリア、好ましくはキャリアの第１の表面への結合のステップを含むことができる。結合は、ａ）における同定構造の形成を伴う１つのステップで生じ得る（すなわち、同定構造の形成のために必要なキャリアおよびすべての成分（およびキャリアへの結合のために必要な任意の成分、例えば下記に記載されるキャリアアダプター）が１つのステップで混合され、インキュベートされる）。あるいは、キャリアへの結合は、その後（好ましくはｂ）における測定の前）に生じ得る。両方の場合において、同定構造のキャリアおよび／または第１のキャリア表面への結合の後、この方法は、未結合の成分（例えば、試料溶液に含有される３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および／または他の成分）をキャリアから除去するために、少なくとも１つの洗浄ステップ（例えば、上記で言及した緩衝溶液の１つを用いる）をさらに含むことができる。同定構造が結合している場合、結合は、標的構造および／または少なくとも２つの３Ｄ−ＤＮＡナノ構造の１つ（好ましくは標的構造）によって、「結合される」のと同様に、媒介され得る。
【００９６】
同定構造の、結合（同定構造がキャリアに結合する場合）または結合状態（同定構造がキャリアに結合している場合）は、標的構造および／または少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の１つ（好ましくは標的構造）によって媒介され得る。結合および／または結合状態は、標的構造によって媒介されることが特に好ましい。
【００９７】
同定構造のキャリアおよび／もしくはキャリアの第１の表面への結合ならびに／または結合状態は、直接的またはキャリアアダプターによって媒介され得る。それ故に、同定構造中で結合した標的構造および／もしくは少なくとも１つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造（好ましくは標的構造）の結合ならびに／または結合状態は、キャリアおよび／もしくは第１のキャリア表面に（例えば、共有結合または非共有結合によって）直接的であり得るか、またはキャリアアダプターによって（すなわち間接で）媒介され得る。この目的で、キャリアアダプターは、標的構造と（特異的に）結合し、キャリアおよび／もしくは第１のキャリア表面に結合するか、ならびに／または結合している。キャリアアダプターのキャリアおよび／または第１のキャリア表面への結合は、再び（例えば、共有結合または非共有結合によって）直接的であり得るか、あるいはキャリアアダプターに特異的に結合し、かつそれらのキャリアおよび／もしくは第１の表面自体に、特異的に結合するか、または直接的もしくは間接的に結合する、中間キャリアアダプターによって媒介され得る。原則として、同じ概念によるさらなる中間キャリアアダプターが考えられる。キャリアアダプター自体が、キャリアおよび／もしくは第１のキャリア表面に、直接結合する／直接結合していることが好ましい。キャリアおよび／または第１のキャリア表面は、例えば、キャリアアダプターでコーティングすることができる。
【００９８】
「キャリアアダプター」は、好ましくは、標的構造（例えば、標的分子）またはナノレポーター（すなわち、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の１つ）のサブ領域に特異的に結合することができ、かつキャリアに（直接的または間接的に）カップリングすることができる、粒子を指す。標的構造への特異的な結合は、例えば、ワトソンクリック塩基対合によって、ファンデルワールス相互作用によって、または水素架橋で達成することができ、とりわけ、核酸、抗体、アプタマー、アドヒロン（ａｄｈｉｒｏｎ）またはナノボディを用いて（標的構造に応じて）実現され得る。
【００９９】
同定構造が結合する／結合しているキャリアは、異なる形状を有することができ、異なる材料から形成することができる。好ましくは、キャリアは、第１のキャリア表面を有し、同定構造は、第１のキャリア表面に結合する。それ故に、標的構造の検出のための方法において、同定構造は、好ましくは、キャリア表面に、結合するおよび／または結合している。キャリアの第１のキャリア表面は、キャリア構造の完全な外側表面を含むことができる。あるいは、キャリア構造の外側表面の一部のみが、第１の表面であり得る。第１のキャリア表面は、少なくとも０．０１ｍｍ2、好ましくは少なくとも１ｍｍ2、特に好ましくは少なくとも１０ｍｍ2の表面であり得る。第１のキャリア表面は、最大で１０００ｍｍ2、好ましくは最大で４００ｍｍ2、特に好ましくは最大で１００ｍｍ2の面積を含むことができる。キャリア表面および／またはキャリアの第１の表面は、好ましくは、ガラス表面（例えば、ホウケイ酸ガラス表面または石英ガラス表面）、またはポリマー表面（例えば、ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨのμ−Ｓｌｉｄｅ  ＶＩ0.1、または蛍光顕微鏡に適した他のポリマーに基づく表面など）を含む。さらに、キャリア表面および／またはキャリアの第１の表面は、ガラス表面（例えば、ホウケイ酸ガラス表面または石英ガラス表面）、またはポリマー表面（例えば、ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨのμ−Ｓｌｉｄｅ  ＶＩ0.1、または蛍光顕微鏡に適した他のポリマーに基づく表面など）であり得る。言い換えれば、キャリアの第１の表面は、好ましくは、ガラス表面（例えば、ホウケイ酸ガラス表面または石英ガラス表面）、またはポリマー表面（例えば、ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨのμ−Ｓｌｉｄｅ  ＶＩ0.1、または蛍光顕微鏡に適した他のポリマーに基づく表面など）である。それ故に、キャリアは、ガラス表面（例えば、ホウケイ酸ガラス表面または石英ガラス表面）、もしくはポリマー表面（例えば、ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨのμ−Ｓｌｉｄｅ  ＶＩ0.1、または蛍光顕微鏡に適した他のポリマーに基づく表面など）を含むか、またはこれらからなる第１の表面を含むことができる。キャリアは、以下の材料：バイオポリマー、アガロース、コラーゲンの１つまたはこれらの組み合わせを好ましく含む、ポリマー網目構造を含むこともできる。本発明の文脈における好ましいキャリアは、顕微鏡チップ、ウェルもしくはプレート（好ましくは高解像度蛍光顕微鏡法に適する；例えばＩｂｉｄｉのμプレート）、またはカバーガラスであり、マイクロウェルアレイおよび／またはマイクロウェルチャンバーが最も好ましい。
【０１００】
キャリアおよび／または第１のキャリア表面は好ましくは不動態化される。「不動態化される」とは、キャリアまたは第１のキャリア表面が、標的構造、ならびに／または３Ｄ  ＤＮＡナノ構造、ならびに／またはキャリアおよび／もしくは第１のキャリア表面と接触する任意のさらなる成分（例えば、標的構造を含有する試料のさらなる成分）の非特異的結合が最小化されるように、コーティングまたは処理されることを意味する。好ましくは、不動態化は、表面が、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度を有するＢＳＡ溶液と接触および／または洗浄されることを意味し得る。不動態化は、ＰＥＧ化（例えば、以下の文献：S Chandradoss et al, Jove 2014, "Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies"、J Piehler et al, Biosensors & Bioelectronics 2000, "A high-density poly(ethylene glycol) polymer brush for immobilization on glass-type surfaces"、R Schlapak et al, Langmuir 2006, "Glass Surfaces Grafted with High-Density Poly(ethylene glycol) as Substrates for DNA Oligonucleotide Microarrays"に記載される）、またはシラン処理（例えば、以下の文献：B Hua et al. und Tj Ha, Nature Methods 2014, "An improved surface passivation method for single-molecule studies"、A. Kumar et al, Nuc Ac Research 2000, "Silanized nucleic acids: a general platform for DNA immobilization"、H Labit et al, BioTechniques 2008, "A simple and optimized method of producing silanized surfaces for FISH and replication mapping on combed DNA fibers"に記載される）によって行うこともできる。また、不動態化は、キャリアまたはキャリア表面を、標的構造と同じタイプ（すなわち、一本鎖ポリヌクレオチド）であるが、標的構造と同一ではない構造を含む溶液での洗浄を含むこともできる。キャリアおよび／またはキャリアの第１の表面は、第１のキャリア表面がガラス表面であるか、またはガラス表面を含む場合に、特に好ましくは、不動態化される。ガラス表面で、これは、ＢＳＡ溶液、ＰＥＧ化またはシラン処理を用いて、好ましく不動態化される。
【０１０１】
キャリアは、例えばポリマーマトリックスなどのマトリックスを含むこともできる。これは、単一細胞のレベルでの分析のために特に有利である。この場合において、同定構造は、ポリマーマトリックスに、埋め込まれる、または埋め込まれていることが好ましい。あるいは、または加えて、同定構造は、ポリマーマトリックスの表面に、結合することができる／結合していることができる。マトリックスおよび／またはポリマーマトリックスのための出発物質として、特にアガロース、コラーゲン、ＤＮＡおよび／もしくはこれらの組み合わせが適している。アガロースが特に好ましい。同定構造および／または同定構造の成分の生成および埋め込みのための方法は（標的構造および／または少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の１つの事前結合の場合において）、当業者に周知である。この目的で、アガロースマトリックスは、アガロースおよびビオチン化アガロース（市販）の混合物、またはストレプトアビジンアガロース（市販）で生成することができ、標的アダプターまたはキャリアアダプターは、これらが持つ官能基に結合することができる（前にストレプトアビジンのすすぎを伴うビオチン化アガロースの場合において）。あるいは、他の任意のマトリックス材料について、アダプターは、マトリックス材料（すなわち、抗アガロース、抗コラーゲンなど）に特異的に結合する抗体に（直接的に、またはビオチン−ストレプトアビジンを介して）カップリングすることができる。アダプターが、マレイミドまたはＮＨＳエステル修飾形態で購入され、マトリックス材料の対応する化学基に直接共有結合することもさらに可能である。キャリアとしてＤＮＡポリマーマトリックスの場合において、これ自体が、キャリア配列を有する一本鎖セグメントを含有することができる。
【０１０２】
このようなマトリックスの使用は、マイクロウェルアレイとの組み合わせであり得る。上記で言及したポリマーマトリックスは、溶解によって細胞または別の宿主体から放出された標的構造の拡散を制限することができる。このようなマトリックスの使用は、したがって、分析されるマイクロウェルの内容物が、外部からの侵入および／または、例えば拡散によるマイクロウェルからの流出により変化し、それによって分析結果の歪曲を防止するために、方法のステップｆ）およびｇ）の代替としてだけでなく、追加としても特に有利である。このようなキャリアマトリックスを使用する場合、ポリマーマトリックスが、非常に迅速に生成され、宿主体が、宿主体の破壊の前にその標的構造の組成を変化させることができないこと、またはポリマーマトリックスが、宿主体の標的構造の組成がこれによって影響されないように生成されることを確実にしなければならない。後者は、例えば、低融点のアガロースを使用することによって確実にすることができる。
好ましい実施形態において、方法のステップａａ）において、好ましくは、方法のステップｐ１）の後、キャリアマトリックスは、マイクロウェルアレイにおいて生成され、キャリアアダプターは、好ましくは、方法のステップｂｂ）においてキャリアマトリックスに固定される。
【０１０３】
特に、方法のステップａａ）およびｂｂ）と既に記載された方法のステップとの組み合わせが好ましく、その結果、好ましい実施形態は、遺伝子発現分析のための方法であって、ｍＲＮＡが検出され（したがってｍＲＮＡは標的構造である）、方法は、
ｐ１）正確に１つの宿主体が少なくとも１つのマイクロウェルに存在するような、ｍＲＮＡを有する宿主体を含む宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入；
ａａ）少なくとも１つのマイクロウェル中でキャリアマトリックスを生成するステップ、
ｂｂ）キャリアアダプターをキャリアマトリックスに付着させるステップ、
ｐ２）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つのマイクロウェルへの導入であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入；
ａ）（ｉ）ｍＲＮＡ、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、対で異なるｍＲＮＡの配列セグメントに（特異的に）結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、同定構造を形成するステップ；
ｂ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによるｍＲＮＡの検出
を含み、
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造中で結合しない場合に、ａ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも２つの単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択される、方法である。
ｍＲＮＡ以外の他の標的構造について、変更すべきところは変更して前記方法を使用することも可能である。
【０１０４】
好ましくは、ポリマー網目構造は、１μｍ〜５０μｍ、好ましくは２μｍ〜１０μｍの中位メッシュサイズを含む。これは、拡散を制限するため、ならびにキャリアアダプターおよび／またはキャリアアダプターの結合部位に対して十分な結合部位を提供するためである。キャリアアダプターおよび／またはキャリアアダプターの結合部位の対の最小距離は、実質的に２００ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは５００ｎｍ〜５μｍ、特に好ましくは２μｍ〜３μｍであり得る。この文脈において、キャリアアダプターおよび／またはキャリアアダプターの結合部位の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９９％が、隣接するキャリアアダプターおよび／またはキャリアアダプターの結合部位の少なくとも上記で言及された距離を有することを実質的に意味する。
【０１０５】
同定構造のキャリアおよび／もしくはキャリア表面への結合ならびに／または結合状態（例えば、同定構造の、標的結合または少なくとも２つのＤＮＡナノ構造の少なくとも１つを介する）は、それが、直接的にまたはキャリアアダプターもしくはキャリアアダプターに結合された中間キャリアアダプターを介してであるか否かに関係なく、当業者に公知の異なる共有結合および非共有結合を介して行うことができる。
【０１０６】
例えば、結合は、ビオチン−ストレプトアビジンカップリングを介して達成することができる。それ故に、キャリア（例えば、キャリアアダプター、標的構造、ＤＮＡナノ構造の１つ、または中間キャリアアダプター）と直接相互作用する成分は、ビオチンまたはストレプトアビジンのいずれかを含むことができる。したがって、キャリアおよび／またはキャリア表面は、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用が可能であるように、対応物としてストレプトアビジンおよび／またはビオチンを含むことができる。ストレプトアビジン−ビオチン相互作用とは別に、例えば、抗体結合などの他の相互作用を使用することもできる。キャリア（例えば、キャリアアダプター、標的構造、ＤＮＡナノ構造の１つ、または中間キャリアアダプター）と直接相互作用する成分が、アミン修飾されたキャリアおよび／またはアミン修飾されたキャリア表面上のＮＨＳ反応によって、キャリアアダプターを介して、付着する（付着している）ことも考えられる。クリック化学法（例えば、H. C. Kolb; M. G. Finn; K. B. Sharpless (2001). "Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions". Angewandte Chemie International Edition. 40 (11): 2004-2021に記載されている）の適用も考えられる。
【０１０７】
本発明の方法により、標的構造のいくつかのコピーを検出することができる。標的構造のいくつかのコピーが検出される場合（すなわち、同定構造が複数回形成される場合）、好ましくは、前記標的構造のために形成された、大部分、好ましくはすべての同定構造は、キャリア、好ましくはキャリアの第１の表面に結合する。好ましくは、同定構造の大部分または実質的にすべては、ｂ）における少なくとも１つの蛍光シグナルの測定のために使用される測定方法によって依然として解決されるように、キャリアに付着する。これは、すべてもしくは実質的にすべての同定構造および／またはそれらの測定事象が、空間的に重複しない（例えば、蛍光顕微鏡を使用する場合、同定構造の回折限界の画像）ことを意味し得る。好ましくは、すべてまたは実質的にすべての同定構造は、少なくとも２５０ｎｍ、好ましくは少なくとも５００ｎｍ、特に好ましくは少なくとも１μｍの距離を有する。これは、いくつかのキャリアアダプターまたは中間キャリアアダプターが、キャリアおよび／または第１のキャリア表面上で、言及された最小距離で付着することを意味し得る。実質的にすべてとは、形成される同定構造の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％が、これらの要件を満たすことを意味する。
【０１０８】
好ましくは、いくつかの同定構造は、個々の同定構造の蛍光シグナルが別々に測定され得るように、キャリアおよび／またはキャリア表面に結合する／結合している。表面上の結合部位の密度および／または距離によって、すなわち、例えば、キャリアおよび／もしくはその表面に付着した、ストレプトアビジンならびに／またはビオチンならびに／またはキャリアアダプターもしくは中間キャリアアダプターの密度によって、これは、どの空間距離の同定構造が、キャリアおよび／またはキャリア表面に結合するかを制御することができる。
好ましくは、結合部位、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、キャリアアダプターまたは中間キャリアアダプターは、以下の距離／パターン／密度で、キャリアおよび／またはキャリア表面上に配列される。
好ましくは、すべてまたは実質的にすべての結合部位は、少なくとも２５０ｎｍ、好ましくは少なくとも５００ｎｍ、特に好ましくは少なくとも１μｍの距離を有する。好ましくは、結合部位は、上記で言及されたエッジの長さを有する六角形の空間格子で配列される。結合部位はまた、好ましくは、１ｅ−５／μｍ2〜１ｅ３／μｍ2、好ましくは１ｅ−３／μｍ2〜４／μｍ2、特に好ましくは０．１／μｍ2〜１／μｍ2の表面密度で、任意の方法においてキャリアおよび／またはその表面上で配列され得る。前記表面密度は、結合部位の十分な距離を確実にする。
【０１０９】
加えて、または代替として、キャリアおよび／またはその表面上の同定構造の空間距離の制御は、同定構造の濃度によって制御することができる。濃度が、キャリア上の結合部位の飽和を生じないように選択される場合、すべてのさらなる濃度の低減（すなわち希釈）は、キャリア上の付着密度の低減を引き起こす。任意に、必要な希釈を決定するために、この方法は、適切な希釈／濃度が確立されるまで、１回または数回の希釈系列で行われる。したがって、同定構造の形成の後、本発明の方法は、同定構造を形成する溶液を希釈するステップも含むことができ、このステップは、同定構造のキャリアへの結合の前である。
【０１１０】
上記で言及されたように、本方法における標的構造は、部分的に一本鎖のポリヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレオチドであり得るか、またはこれらを含み得る。この場合において、キャリアアダプターが、オリゴヌクレオチドを含むか、またはオリゴヌクレオチドであることが特に好ましく、その核酸配列は、それが請求項２の標的構造の核酸配列の第１の一本鎖セグメントに特異的に結合するように、設計される。標的構造が、ポリ（Ａ）テールを有するｍ−ＲＮＡであることが特に好ましく、キャリアアダプターは、それがｍＲＮＡ標的構造のポリ（Ａ）テールに特異的に結合するように設計された、オリゴヌクレオチド、その核酸配列を含むか、またはこれらである。ポリ（Ａ）テールに結合するための設計は、ポリ（Ｔ）配列セグメントを含ませることを含み得る。
上記で言及されたように、本方法における標的構造は、タンパク質でもあり得るか、またはタンパク質も含み得る。この場合において、キャリアアダプターは、標的構造に（特異的に）結合する、抗体または抗体の抗原結合ドメインを含むか、またはこれらであることが特に好ましい。
【０１１１】
標的構造の検出のための方法は、ａ）の後、およびｂ）の前に、緩衝溶液による、キャリアおよび／または第１のキャリア表面の洗浄をさらに含むことができる。このような洗浄ステップは、表面に結合しない成分を除去する目的を有し得る。特に、このような洗浄ステップは、同定構造に結合しない遊離の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、キャリアおよび／または第１のキャリア表面を洗い落とすことを確実にすることができる。これは、とりわけ、遊離の３Ｄナノ構造による蛍光シグナルのバックグラウンドの可能性のある破壊を低減または防止するという利点を有する。
洗浄ステップは、好ましくは、緩衝溶液を用いて行われる。他の洗浄ステップに関連して上記で既に定義された、緩衝液の成分が好ましい。
同定構造において、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、直接的に、または標的構造への標的アダプターを介してのいずれかで結合することができる。
【０１１２】
したがって、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つ、好ましくはすべては、標的構造への直接結合のために設計されてもよく、標的分子と直接結合してもよい。好ましくは、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つ、特に好ましくはすべては、それが／それらが、標的構造のそれぞれの領域に対して直接設計され、標的分子と直接結合するように設計される。直接結合は、例えば、塩基対合を介して（例えば、標的構造としての、部分的に一本鎖のポリヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレオチドにより）生じ得る。それ故に、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つ、好ましくはすべては、一本鎖配列セグメントを含有することができ、これは、標的構造（例えば、部分的に一本鎖のポリ核酸または一本鎖ポリ核酸）と特異的に結合することができる。好ましくは、前記配列セグメントは、外の方へ配置され、および／または３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の外側表面で配列される。それにより、配列セグメントは、最も可能な方法でアクセス可能であることを確実にする。
【０１１３】
あるいは、少なくとも１つ、好ましくはすべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の特異的結合は、それぞれ割り当てられた標的アダプターによって媒介され得る。標的アダプター、またはそれぞれの標的アダプターは、それぞれのＤＮＡナノ構造、および標的構造のそれぞれの領域に結合するように設計される。したがって、標的アダプターは、それぞれの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に（特異的に）結合するように設計された第１のセグメントを含むことができる。また、標的アダプターは、標的構造に（特異的に）結合するように設計された第２のセグメント（標的結合セグメントとも称される）を含むことができる。好ましくは、標的構造への結合が標的アダプターによって媒介される３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、それが標的アダプターに特異的に結合するように設計された少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡセグメントを含む。この一本鎖ＤＮＡセグメントは、好ましくは外の方へ配置され、すなわち外側からアクセス可能である。上記で言及された標的アダプターの第１のセグメントは、好ましくは、それがハイブリダイゼーションによって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の一本鎖ＤＮＡセグメントに特異的に結合するよう（すなわち、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の一本鎖ＤＮＡセグメントの少なくとも一部と相補的である）に設計されたポリ核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＬＮＳまたはＲＮＡ配列）である。結合は、塩基対合を介して生じる。好ましくは、２つの一本鎖セグメントの少なくとも１５個、好ましくは少なくとも１８個、特に好ましくは２１個の塩基がハイブリダイズされる。
標的結合アダプターは、好ましくは、１つ（および／または少なくとも１つ）の標的結合セグメントを含む。標的結合セグメントは、好ましくは、それが、それぞれの同定構造が結合する、標的構造および／または標的構造のそれぞれの領域への特異的結合を媒介するように設計される。
【０１１４】
標的構造が、部分的に一本鎖のポリヌクレオチドもしくは好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）であるか、またはこれらを含む場合、標的結合セグメントは、好ましくは、標的構造の一本鎖セグメントに特異的に結合するように設計された核酸配列を含む。好ましくは、標的結合セグメントは、標的構造の一本鎖セグメントに相補的である。標的構造への結合は、好ましくは塩基対合を介して生じる。好ましくは、２つの一本鎖セグメントの少なくとも１４個、好ましくは少なくとも１８個、特に好ましくは２１個の塩基がハイブリダイズされる。
標的構造は、タンパク質であるか、またはタンパク質を含む場合、標的アダプターの標的結合セグメントは、ペプチド／タンパク質、またはタンパク質に特異的に結合する抗体（および／または抗体の抗原結合フラグメント）を含み得るか、またはこれらであり得る。
【０１１５】
標的構造の検出のための方法は、好ましくは水性の試料溶液の提供をさらに含むことができ、これは、標的構造および少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の標的構造を含有する。試料溶液は、例えば、細胞溶解物、細胞懸濁液および／もしくは組織から抽出された核酸ならびに／またはｍＲＮＡを含み得る。任意に、この方法は、キャリア、キャリアアダプターおよび／または標的アダプターの提供をさらに含むことができる。前記提供ステップの１つまたは両方は、同定構造の形成のステップによって構成され得る。
【０１１６】
この方法は、標的構造を含有する好ましくは水性の試料溶液を、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造、ならびに任意にキャリアアダプターおよび／または標的アダプターとの混合することをさらに含むことができる。試料溶液は、例えば、細胞溶解物、細胞懸濁液および／もしくは組織から抽出された核酸ならびに／またはｍＲＮＡを含む。さらにまた、この方法は、前記混合物をキャリアおよび／または第１のキャリア表面と接触させることを含むことができる。成分の混合は、段階的であることもできる。
【０１１７】
標的構造を含有する試料溶液は、細胞溶解物、好ましくは個々の細胞の細胞溶解物であり得る。試料溶液はまた、核酸、例えば精製された核酸の混合物であり得る。特に、試料溶液はまた、精製された細胞の全ＲＮＡであり得る。前記全ＲＮＡは、細胞から市販のキット（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによる、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＬＳ、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）トータルＲＮＡ血液キット、ＦＦＰＥのためのＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）トータル核酸単離キット、またはＱｕｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨによる、ＲＮｅａｓｙキット、ＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡキット、もしくはＲＮＡｌａｔｅｒ試薬）によって入手することができる。
好ましくは、標的構造の検出のための本発明の方法は、第１の標的構造と異なる（ここで、異なる標的構造は対で異なる）さらなる標的構造の検出のためにも設定される。それ故に、この方法は、少なくとも２つの異なる標的構造の検出のための方法とも称することができ、少なくとも２つの異なる標的構造は、互いに対で区別可能である。
【０１１８】
さらなる態様において、本発明は、特に、互いに異なる１つまたは複数のさらなる標的構造の検出にさらに追加で適しており、
ここで、異なる標的構造が、対で異なり、
標的構造のそれぞれについて、ステップｐ１）における宿主体の群が、関連する標的構造を有する少なくとも１つの宿主体を含み；
方法が、
ｃ）互いに異なる１つまたは複数のさらなる標的構造のそれぞれについて、
それぞれ割り当てられた同定構造を形成するステップであって、さらなる同定構造のそれぞれが、
（ｉ）それぞれの割り当てられたさらなる標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、それぞれのさらなる標的構造に特異的に結合し、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、それぞれの標的構造の対で異なる領域と結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、ステップ
をさらに含み；
ステップａ）が、
ｄ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる、１つまたは複数のさらなる標的構造の検出をさらに含み、
すべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造の１つの中で結合しない場合に、ａ）およびｃ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、形成された同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択され、異なる標的構造のそれぞれが、複数回存在していてもよく、方法が、１つまたは複数の異なる標的構造の複数の検出を含んでいてもよい、方法を対象とする。
【０１１９】
したがって、これは、第１のタイプの１つまたは複数の類似の標的構造の以前の検出および／または定量化の、互いから、および第１のタイプから対で異なる１つまたは複数のさらなるタイプの１つまたは複数の類似の標的構造の検出および／または定量化への一般化である。この場合において、この方法は、１つの標的構造のために、上記で記載された標的構造のそれぞれについて行われる。しかしながら、検出および／または定量化される多数の標的構造のための方法は、実質的に並行の方法で行われ、同一の方法のステップは、それぞれ好ましく要約される。
【０１２０】
好ましくは、異なる標的構造のそれぞれは、複数回検出され、すなわち、同定構造のそれぞれは、好ましくは複数回形成される。言い換えれば、例えばＮ個の異なる標的構造を検出することができ、これは、互いにそれぞれ対で区別可能であり、Ｎ個の異なる標的構造の１つまたは複数のそれぞれは複数回検出される。これは、複数回検出される標的構造に割り当てられたこれらの同定構造が、したがって複数回形成されるという意味を含む。当然のことながら、それぞれ同じ標的構造のために形成された同じ同定構造の蛍光シグナルは、互いに異なる必要はない。むしろ、同じ蛍光シグナルの反復測定は、対応する標的構造の定量化のために役立つ。
【０１２１】
例えば、本発明の方法は、水溶液中で互いに異なる、標的構造Ａ、ＢおよびＣを検出する目的を有し得る。この目的で、これらに割り当てられた３Ｄ  ＤＮＡナノ構造ａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２、ｃ１およびｃ２が提供され、これらは、標的構造Ａ、ＢおよびＣと一緒に、同定構造Ａａ１ａ２、Ｂｂ１ｂ２およびＣｃ１ｃ２を形成する。ここで、同定構造Ａａ１ａ２、Ｂｂ１ｂ２およびＣｃ１ｃ２の蛍光シグナルは、互いに対で異なり、単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造ａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２、ｃ１およびｃ２と異なる。標的構造Ａ、ＢおよびＣがそれぞれ複数回提供される場合、例えば同じ同定構造Ａａ１ａ２の蛍光シグナルは、互いに異なる必要はない。同定構造Ａａ１ａ２の蛍光シグナルのそれぞれの測定は、次いで、標的構造Ａの検出に対応し、その結果、濃度は、測定点の数に由来し得る。
標的構造の検出について上記で言及したことは、変更すべきところは変更して、異なる標的構造のさらなるおよび／またはそれぞれのさらなる標的構造の検出に適用される。特に、標的構造、同定構造、同定構造のキャリアへの結合または結合状態、キャリアアダプター、３Ｄ−ＤＮＡナノ構造、標的アダプターおよびさらに任意の方法のステップに関する上記のすべては、変更すべきところは変更して、少なくとも１つ、好ましくはすべてのさらなる同定構造に適用可能である。
【０１２２】
複数の異なる標的構造の好ましい検出に関して、本発明は、１つの態様において、少なくとも２つの異なる標的構造の検出のための方法であって、少なくとも２つの異なる標的構造が、互いにすべて対で区別可能であり、方法が、
ａ）（ｉ）それぞれの標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、標的構造に（特異的に）結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、少なくとも２つの異なる標的構造のそれぞれについての、同定構造の形成；
ｂ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる少なくとも２つの標的構造の検出
を含み、
すべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらがそれぞれの同定構造の１つの中で結合しない場合に、ａ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、かつ個々の異なる標的構造に対して形成された同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択される、方法も対象とする。
【０１２３】
また、この場合において、標的構造の検出のための方法について上記で特定された好ましい特徴は、変更すべきところは変更して、適用することができる。特に、標的構造、同定構造、同定構造のキャリアへの結合または結合状態、キャリアアダプター、３Ｄ−ＤＮＡナノ構造、標的アダプターおよびさらに任意の方法のステップに関する上記で言及されたすべては、変更すべきところは変更して、少なくとも２つの同定構造の少なくとも１つ、好ましくはそれぞれに適用可能である。特に、方法のステップｐ１）およびｐ２）との組み合わせが好ましい。
【０１２４】
標的構造の検出のための方法が、第１の標的構造と異なるさらなる標的構造の検出のために設計される場合、またはその方法が、少なくとも２つの異なる標的構造の検出のためである場合、標的構造は、対で異なる構造／配列を有する同じタイプ（例えば、いくつかのｍＲＮＡ）の標的構造、または同じタイプのいくつかの異なる標的構造を含む標的構造であり得る。あるいは、異なるタイプの標的構造（例えば、少なくとも１つの部分的に一本鎖のＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡ、および少なくとも１つの部分的に一本鎖のＲＮＡもしくは一本鎖ＲＮＡ；または少なくとも１つの部分的に一本鎖のＲＮＡもしくは一本鎖ＲＮＡ）が考えられる。好ましくは、しかしながら、標的構造は、同じタイプの標的構造であり、構造または配列において、互いに対で区別可能である。特に、本発明の方法は遺伝子発現分析のための方法であることが意図される。遺伝子発現分析のために、好ましくは、すべての標的構造は、ＲＮＡ、特に好ましくはｍＲＮＡ、またはタンパク質である。遺伝子発現分析の場合において、特に好ましくは、すべての標的構造は、ＲＮＡ、特に好ましくはｍＲＮＡである。
方法が、２つ以上の標的構造の検出のためである場合、特に好ましくは、さらなる標的構造の１つ、好ましくはすべてのさらなる同定構造を含む、少なくとも１つのさらなる同定構造は、キャリアに結合する／結合している。特に好ましくは、すべての同定構造は、同じキャリアに結合する。同定構造に関連して言及された上記の「結合している」および「結合する」は、より多く／さらなる同定構造の場合における「結合する」および「結合している」に対して、変更すべきところは変更して、適用される。
【０１２５】
１つ、複数、またはすべての同定構造が、キャリアおよび／または第１のキャリア表面に結合する／結合している実施形態において、好ましくは、すべてまたは実質的にすべての同定構造は、それらが、少なくとも１つの蛍光シグナルを測定するためにｂ）において使用される測定方法により依然として解決することができるような方法で、キャリアに結合している／結合する。これは、すべてもしくは実質的にすべての同定構造および／またはそれらの測定事象（例えば、蛍光顕微鏡の場合における（回折限界）画像）が、空間的に重複しないことを意味し得る。好ましくは、（同じ標的構造またはいくつかの標的構造の）すべての同定構造は、少なくとも２５０ｎｍ、好ましくは少なくとも５００ｎｍ、特に好ましくは少なくとも１μｍの距離を含む。実質的にすべてとは、この文脈において、形成される同定構造の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％が、この要件に適合することを意味する。
【０１２６】
どのようにして同定構造のこのような密度を達成することができるかに関して、標的構造の検出のための方法の例に基づいて上記で説明された方法は、それに応じて、適用される。特に、キャリアおよび／または第１のキャリア表面は、１つまたは複数の標的構造が結合する（事前に）結合したキャリアアダプターを含んでいてもよい。これらは、上記で言及された距離で、キャリアおよび／または第１のキャリア表面と結合していてもよい。
【０１２７】
「特異的に結合する」または「特異的に結合した」が１つまたは複数の標的構造の検出のための本発明の方法においてどのように理解されるべきかは、当業者に公知である。特に、ポリヌクレオチド一本鎖のハイブリダイゼーションの文脈において、「特異的に結合する」とは、少なくとも１４個、好ましくは少なくとも１８個、特に好ましくは２１個の相補的な塩基が対になることを意味し得る。特に、「特異的に結合する」は、２つの相補的なポリヌクレオチドの一本鎖の少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に好ましくは９９％が対になる（好ましくは、前の文章において言及された塩基対の最小数で）ことも意味し得る。タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、抗体抗原結合）の文脈において、好ましくは、「特異的に結合する」は、少なくとも５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、好ましくは少なくとも８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、特に好ましくは少なくとも１１ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合親和性（−ΔΔＧ）を意味し得る。結合親和性は、例えば、熱泳動測定（M. Jerabek-Willemsen et al., "Molecular Interaction Studies Using Microscale Thermophoresis", Assay Drug Dev Technol, 9(4): 342-353 (2011)）によって、決定することができる。別の可能性は、例えばＤｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＧｍｂＨによって提供されるような電気力学測定（A. Langer et al, "Protein analysis by time-resolved measurements with an electro-switchable DNA chip", Nat. Comm. 4:2099 (2013)）である。
【０１２８】
本発明の方法において、１つまたは複数の異なる標的構造は、細胞懸濁液の細胞、液滴乳濁液、細菌、ウイルスもしくはエキソソームを有する水溶液、全血試料、唾液試料または動物もしくはヒトに由来する任意の液体に存在し得る。好ましくは、複数またはすべての標的構造は、同じ液体中の宿主体に存在する。好ましくは、液体中の宿主体の濃度は、マイクロウェルの単一の占有の確率が高いそのような程度に高い。好ましくは、マイクロウェルアレイが充填される場合、マイクロウェルあたり０．５〜１．５の宿主体、より好ましくはマイクロウェルあたり０．８〜１．２の宿主体、より好ましくはマイクロウェルあたり０．９〜１．１の宿主体、特に好ましくはマイクロウェルあたり１つの宿主体が液体中に存在する。１つまたは複数の宿主体のより高い濃度が溶液中で予測される場合、この方法は、同定構造の形成の前の試料溶液の希釈をさらに含むことができる。好ましくは、それぞれの標的構造は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも１０、特に好ましくは１００の量で少なくとも１つの宿主体中に存在する。
【０１２９】
本発明の方法において、１つまたは複数の同定構造の形成は、好ましくは、好ましくはハイブリダイゼーション緩衝液と指定される緩衝溶液中で行われる。緩衝溶液は、１倍〜８倍のＳＳＣ、好ましくは３倍〜５倍のＳＳＣ、特に好ましくは４倍のＳＳＣを含有することができる。「ＳＳＣ」は、１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび１５ｍＭのクエン酸三ナトリウムの水溶液で構成される、いわゆる生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液を指し、これはＨＣｌを用いてｐＨ７．０に調整される。ＳＳＣなどのクエン酸緩衝液の代替として、ＴｒｉｓまたはＰＢＳを、緩衝液のベースとして使用することもできる。緩衝液は、（好ましくはＳＳＣの代替として）ＮａＣｌおよび／またはＭｇＣｌ2を含むこともできる。ＮａＣｌの濃度は、好ましくは５０ｍＭ〜１２００ｍＭ、特に好ましくは２００ｍＭ〜８００ｍＭである。例えば、ＮａＣｌの濃度は、６００ｍＭ、好ましくは５００ｍＭ、特に好ましくは３００ｍＭであり得る。ＭｇＣｌ2の濃度は、２ｍＭ〜２０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜１５ｍＭ、好ましくは８ｍＭ〜１２ｍＭ、特に好ましくは１０ｍＭであり得る。さらにまた、緩衝溶液は、４％〜６％、２％〜１０％、１５％または２０％の硫酸デキストランを含むことができる。好ましくは、緩衝液は、例えば、５％の硫酸デキストランを含む。緩衝溶液は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ１０００を含むこともできる。緩衝液は、０．０１〜５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むこともできる。任意に、緩衝液は、ＥＤＴＡを、好ましくは０．１〜５ｍＭ、特に好ましくは１ｍＭの濃度で含むこともできる。緩衝液のさらなる任意の成分は、「剪断されたサケ精子」（市販）、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌの濃度の「剪断されたサケ精子」（市販）である。剪断されたサケ精子は、潜在的に特異性を増加させることができる。緩衝液は、デンハート培地（０．０２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ４００（市販）および０．０２％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の水溶液で構成される、Cold Spring Harb Protoc 2008, doi:10.1101/pdb.rec11538も参照されたい）を、好ましくは、１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍の濃度で含むこともできる。特に好ましい緩衝液は、４倍のＳＳＣ、５％のデキストラン硫酸および０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０の組成物を含むか、またはこの組成物を有する。この緩衝液は、少なくとも１つ、好ましくはすべての検出される標的構造が、ポリ核酸、例えばｍＲＮＡである場合に、特に好ましく使用される。
【０１３０】
本発明の方法において、本発明の方法における同定構造の形成は、好ましくは、４℃〜５０℃、好ましくは１８℃〜４０℃の温度で行われる。例えば、温度は４０℃であり得る。３０℃が特に好ましく使用される。述べられた温度は、１つまたは複数の部分的に一本鎖のポリヌクレオチドまたは一本鎖のポリヌクレオチドが検出される場合、特に好ましい。
同定構造の形成は、成分の混合物がそこに結合するインキュベーション期間を含むことができる。好ましくは、インキュベーション期間は、５分〜２０時間、好ましくは１時間〜２０時間（例えば、１時間、２時間、４時間、８時間）、特に好ましくは１０時間〜２０時間であり得る。
本発明の方法において、１つまたはいくつかの同定構造はまた、連続的（好ましくは上記で言及された緩衝溶液中）の代わりに１ステップで形成され得、キャリアに結合し得る。
【０１３１】
１ステップでの同定構造の形成のために、ＤＮＡナノ構造（標的構造あたり少なくとも２つ；好ましくは上記で言及された濃度）は、宿主体を含有する液体に添加される。任意に、１つまたは複数のキャリアアダプターも溶液に添加することができる。キャリアアダプターは、しかしながら、既にキャリアに事前結合することができる。マイクロウェル中での宿主体の破壊の後、次いで、同定構造のすべての成分は、マイクロウェル中に既に存在し、それらを形成することができる。したがって、調製の開始から分析の結果までの期間を大幅に短縮することができ、労力を低減することができる。これは、例えば敗血症の病原体の決定のためなどの、時間的制約がある臨床試料の単一細胞の遺伝子発現分析で、特に重要であり得る。また一般に、しかしながら、これは経済的に有利である。
【０１３２】
例えば、キャリアアダプターは、キャリアアダプターに結合される標的構造あたり１ｎＭの濃度で添加することができる。好ましくは、キャリアアダプターは、標的構造あたり３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の総濃度（例えば、それぞれ１ｎＭの標的のための３Ｄ  ＤＮＡナノ構造で３ｎＭ）で添加される。同定構造の形成のための総容量は、例えば、１μｌ〜５００μｌであり得る。形成された同定構造の結合のために、好ましくは、同定構造の形成のための上記に記載された混合物は、キャリアおよび／または第１のキャリア表面に添加される。キャリアアダプターは、事前に結合するか（これが、同定構造の形成のための溶液の部分ではない場合）、またはインキュベーションの間にキャリア表面に結合するかのいずれかであり得る。結合／結合は、共有または非共有（例えば、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用）のいずれかである。キャリアへの結合は、１分〜２時間、５分〜１時間、８分〜２５分、特に好ましくは１０分のインキュベーション期間を含み得る。インキュベーション期間についてのさらなる例は、２分、５分、２０分である。インキュベーションは、４℃〜３０℃、好ましくは室温（例えば２０℃〜２５℃）で行うことができる。キャリア表面への適用の前に、溶液は、例えば、デキストランの量を低減するため、より大きな面積を覆うため、または濃度を調整するために、（例えば、ＰＢＳ、または同定構造の形成のために使用される上記で言及された緩衝液を用いて）再び希釈され得る。測定の前に、表面を緩衝液で洗浄することができる。好ましくは、洗浄ステップのために上記で定義された緩衝液を使用することができる。
【０１３３】
好ましくは、本発明の方法における少なくとも１つの蛍光シグナルの測定は、
ｑ）蛍光顕微鏡、好ましくは落射蛍光顕微鏡、ＴＩＲＥ顕微鏡、光シート顕微鏡および／または共焦点顕微鏡による、試料の部分／区分から放射された蛍光シグナルに関するデータを含有するデータセットを作成するステップ
を含む。言い換えれば、少なくとも１つの蛍光シグナルの測定は、例えば、二次元または三次元の試料の部分によって放射される強度が、ピクセルまたはボクセルで測定および保存するという点で、いくつかの蛍光シグナルまたは複数の蛍光シグナルの測定を含むことができる。この文脈において、測定は、いくつかの励起波長および／もしくはいくつかの検出波長（バンド）による同時または連続的な測定を含むこともできる。
【０１３４】
好ましくは、標的構造および／または１つもしくは複数のさらなる標的構造の検出は、
ｗ）同定構造の１つの蛍光シグナルを表す、データセット中に含有される１つまたは複数のデータムの同定
を含む。
この同定は、例えば、特定の励起波長および／もしくは検出波長によるピクセルまたはボクセルの測定された強度と、そのような所定の組み合わせのセットとの比較を含むことができ、この結果、比較は、組み合わせが割り当てられている同定構造を示す。
【０１３５】
したがって、ステップｑ）は、試料の部分／区分の蛍光データを含有する少なくとも１つの画像ファイルを記録するステップを含むことができる。さらにまた、ステップｗ）における同定は、以下のステップ
ｗ１）（好ましくは）データムおよび／または画像要素の色および／または強度情報の読み出し、ならびに
ｗ２）（好ましくは）データムおよび／または画像要素の色および／または強度情報を、同定構造について代表する色および／または強度情報と比較するステップ
を含むことができる。
【０１３６】
好ましくは、試料は、蛍光顕微鏡手法によって視覚化される。情報のさらなる処理のために、提供された画像を、直接分析することができる。好ましくは、しかしながら、これは保存される。画像は、好ましくは、デジタル的に保存され、しかしながら、画像はアナログ的に記録することもできる。画像情報は、１つまたは複数の画像要素の図解を含むことができる。画像要素は、画像の部分である。画像要素は、例えば、第２の強度の背景において、第１の強度の拡大されたポイントまたは別の構造であり得る。
ＤＮＡナノ構造における蛍光色素の選択に応じて、標的構造は、それらの色によって、および／またはそれらの強度によって、区別可能である。好ましくは、試料の部分は、すべての色で個々に記録され、別々の画像で保存される。しかしながら、試料の部分はまた、いくつかの色で同時に記録され得、異なる色の記録は、共通の画像において、または別々の画像において、保存される。
これらのステップは、手動、手動であるがソフトウェアによる支援、または分析ソフトウェアにより自動的に、行うことができる。
【０１３７】
手動分析において、検出される標的構造の色および／または強度情報を知るユーザーは、画像中の対応する色および／または強度情報を検索および同定することができる。任意に、ユーザーは、そのような同定された標的構造の数および／または対応する位置情報を分析することができる。多色の同定構造における色および／または強度情報が異なる画像に存在する場合、画像要素は、それぞれの色について、すなわち位置情報を別々に含むそれぞれの画像について、分析することができる。その後、有色要素は、十分に類似する位置情報を用いて、異なる色の画像要素の同定によって、認識することができる。あるいは、最初に、有色画像を、個々の単色画像を重ね合わせることによって作成することができる。有色同定構造は、次いで、対応する混色を有する画像要素として同定することができる。画像を実際の色で保管する必要がないことに注意を払わなければならない。当然ながら、実際の色または疑似色である色を、後の時点で、画像に加えることができる。
手動分析は、例えばＦｉｊｉなどの画像分析ソフトウェアによるソフトウェアの支援によって、行うことができる。完全に自動化された分析へのスムーズな移行が存在する。一般に、手動またはソフトウェアによる任意の個々のステップを行うことが可能である。
本発明の１つの態様は、ソフトウェアによる分析であって、分析が、ノイズ法による密度に基づく適用の空間クラスタリング（要するにＤＢＳＣＡＮ）に基づく、分析に関する。説明は、分析される画像がいくつかの蛍光要素を有する場合についての適用に基づく。分析は、当然ながら、１つのみの蛍光要素が画像に存在するか、蛍光要素が画像に存在しない場合、同じ方法で作業される。
【０１３８】
好ましくは、この目的のためにプログラムされた分析ソフトウェアは、Ｐｙｔｈｏｎに基づく。Ｐｙｔｈｏｎに基づく分析ソフトウェアは画像データをロードする。好ましくは、これは、画像ボックス中の極大を決定する。好ましくは、画像ボックスのサイズは、使用される対物レンズの倍率および開口数に応じて調整され、例えば９〜１５ピクセルである。好ましくは、ソフトウェアは、シグナルのバックグラウンドに依存しない測定値として、勾配の累積絶対値を計算する。ＤＮＡナノ構造ありおよびなしの画像ボックスの間で区別するために、好ましくはＤＢＳＣＡＮ（ノイズを有するアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング）（Ester, Martin; Kriegel, Hans-Peter; Sander, Jorg; Xu, Xiaowei "A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise", Proceedings of the Second International Conference on Knowledge Discovery and Data Mining (KDD-96). AAAI Press. pp. 226-231 (1996)において公開）が使用される。あるいは、ＨＤＢＳＣＡＮ（Ricardo J. G. B. Campello, Davoud Moulavi, Joerg Sander; "Density-Based Clustering Based on Hierarchical Density Estimates", Advances in Knowledge Discovery and Data Mining 2013, pp. 160-172）、ｋ−平均法または階層的クラスタリング（Rokach, Lior, and Oded Maimon. "Clustering methods." Data mining and knowledge discovery handbook. Springer US, 2005. 321-352）などの他のクラスタリングアルゴリズムも使用することができる。任意に、画像ボックスは、勾配の累積絶対値の異なる値のグループに分割され、これは、フルオロフォアの異なる数による分割に対応する。これは、特に、異なる標的構造が、異なる強度の同定構造によって同定される場合、行うことができる。それらの横（ｘ，ｙ）位置に起因して、色チャネルのＤＮＡナノ構造を有する画像ボックスは、画像中の多色の蛍光要素、例えばスポットを認識するために、他の色チャネルのＤＮＡナノ構造を有するすべての画像ボックスと比較することができる。これは、当然ながら、単一色の同定構造のみが存在する場合、すべてで行う必要はない。ソフトウェアは、画像中の単一色のスポットの数、および任意でそれらの位置について決定された値、ならびに画像中の多色のスポットの数、および任意でそれらの位置についての値を、さらなる使用のために保管することができる。ソフトウェアは、スポットの強度値を保管することもできる。例えば、ソフトウェアは、多色の蛍光要素と比較して、単一色の蛍光要素の数を決定するために使用することができる。例えば、ソフトウェアは、標的構造を有するかまたは有さない試料を用いる実験において検出された蛍光要素の数を比較するために使用することができる。これは、添付の実施例１〜３において詳細に説明される。
【０１３９】
３Ｄナノ構造の製造の間に時々発生し得る３Ｄナノ構造あたりの色素分子の数における変動に起因して、および測定誤差に起因して、これは、典型的には、例えば強度分布を用いて対応される。２つの隣接する強度分布が無視できない重複を有する場合、これは、正確に１つの同定構造が存在する疑念がなく、同一性の測定に単に起因して結論を出すことが可能ではない可能性がある。この問題に対処するために、統計学的方法は、統計学的割り当てを達成することができる手段によることが好ましい。これらの分布は、強度または色の勾配に沿って１つまたは複数の次元に拡張することができ、言及された累積勾配、ボックスにわたる平均値、ボックス内の最大ピクセル値または他の測定値などの１つまたは複数の測定値によってそれぞれ記載することができる。測定された、任意に複数の次元の分布は、同じ標的構造を有する同定構造の個々の分布の混合分布である。分析の目的は、これらの個々の分布の混合分布への寄与を計算することであり、したがって、異なる標的構造の相対数を決定することである。これらの個々の分布は、別々の測定によって、またはモデル（例えば、ガウス分布および／もしくはポアソン分布、またはこれらの混合、場合により異なる次元における相違）による近似によってのいずれかで決定することができる。したがって、異なる寄与は、解析によって、または統計学的方法、好ましくはベイズ推論に基づく統計学的方法によって、計算することができる（参照：D.S. Sivia "Data Analysis, a bayesian tutorial", Oxford science publications, second edition, ISBN: 0198568320および／またはA.B. Downey, "Think Bayes", O'Reilly, Sebastopol CA, fourth edition 2013 ISBN: 9781449370787）。この文脈において、標的構造の数の均一な分布を最初に仮定し、これらから出発して、それぞれの測定事象について、分布のそれぞれが起源の確率を計算して、それにより、標的構造の数の分布に関する仮定を更新する可能性がある。十分に多くの数の同定構造の測定事象（５０を超える、好ましくは１００を超える、特に好ましくは１０００を超える）により、この方法は、標的構造の数の分布の最初の仮定と無関係である。
【０１４０】
我々は、異なるナノレポーターの強度分布が重複し、方法のステップ（ｈ／ｉｉ）において記載されているように、分布ヒストグラムを考慮に入れることによって、統計学的手段によってのみ互いに明確に区別可能である場合を可能にする。これは、それぞれの測定事象について、各種のナノレポーターに由来する確率が計算され、重複がより大きくなり、同じ量の測定事象は結果がより不確かになるので、分析に複雑さを与える。しかしながら、異なるナノレポーターの組み合わせの数、したがって標的分子の数は、強度のレベルが低減されるので、増加し得る。したがって、強度分布の重複のサイズ、および同時に定量化可能な標的分子の数の間の秤が存在する。したがって、最適な立体配置を、それぞれの適用について選択することができる。
【０１４１】
好ましくは、個々の異なる標的構造のために形成された同定構造の蛍光シグナルは、それらが同定構造の１つに結合しない場合に、すべての単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルと異なり、個々の異なる標的構造のために形成された同定構造の蛍光シグナルは、対応する蛍光シグナルが色および／または強度情報の異なる区別可能な組み合わせを含むという点で、対で異なる。上記で説明されたように、「異なる区別可能な組み合わせ」は、統計学的に区別され得る組み合わせであり得、すなわち、区別性は、統計学的方法によって保証される。
【０１４２】
好ましくは、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造において、ｋの対で（統計学的に）区別可能な強度レベルおよび／またはｍの対で（統計学的に）区別可能な色レベルが使用され、ｋ強度レベルのそれぞれは、強度分布によって形成され、ｋ強度分布は互いに、好ましくは統計学的に区別可能であり、および／または好ましくは、ｍ色レベルのそれぞれは、色分布によって形成され、色分布ｍは互いに、好ましくは統計学的に区別可能である。この目的のために、好ましくは、隣接する分布の重複は、３０％未満、好ましくは１０％未満、特に好ましくは５％未満、特に好ましくは２％未満、非常に特に好ましくは１％未満である。
この文脈において、以下が好ましく適用される：ｋ＞２、好ましくはｋ＞３、より好ましくはｋ＞４、さらにより好ましくはｋ＞５、特に好ましくはｋ＞６。さらにまた、以下が好ましく適用される：ｍ＞２、好ましくはｍ＞３、より好ましくはｍ＞４、さらにより好ましくはｍ＞５、特に好ましくはｍ＞６。
【０１４３】
ステップｗ１）が以下のステップおよび／もしくは手法の１つまたは組み合わせを含むことがさらに好ましい：画像要素の平均値を決定する、最大の画像要素を決定する、累積勾配を計算する、画像要素、変動係数、ファノ因子における、例えばピクセルの分散などの１つまたは複数の統計学的モーメントを計算する。ステップｗ２）は、クラスタリング法、好ましくはＤＢＳＣＡＮ（ノイズを有するアプリケーションの密度ベースの空間クラスタリング）法に基づくことがさらに好ましい。ステップｗ１）および／またはｗ２）は、好ましくはベイズ定理を考慮に入れる、確率的考察に基づくことがさらに好ましい。
特に、それぞれ直交測定可能なタイプのナノレポーターおよび／または３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の強度勾配は、例えば、数、距離または方向の変動によって、異なって選択することができる。勾配は、光子のポアソン統計または不完全なマーカー分子の付着などの因子に起因して拡張される強度分布が重複しないように、非常に大きくあり得る。したがって、分析は簡単で、測定値はナノレポーターによって直接同定することができる。一方、勾配はまた、隣接する強度勾配の強度分布が０．１〜１０％まで、さらに５〜８０％まで重複するように、より小さくあり得る。したがって、測定の後、直交測定の結果の分布からのベクトルを、予測されるベクトルと比較することができ、標的分子の相対頻度を、最小二乗または最大尤度に基づく方法によって決定することができる。同じことは、予測される分布を含めるか、または含めることなく、クラスターに基づく機械学習の方法で達成することができる。
【０１４４】
直交測定可能なナノレポーターの１つは、固定された振幅値で設計されることも好ましく、その測定値は、二重の振幅値の１つから明確に区別可能であり、それぞれの標的分子について設計される。したがって、測定事象における標的分子の数は、直接測定することができ、これは、キャリアに互いに近接近して結合した標的構造によって引き起こされる、測定事象の検出および排除を容易にする。
【０１４５】
上記で議論された方法について、好ましくは、いくつかの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のセットが使用され（３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、好ましくは本出願に記載のものである）、セットは、互いに異なるＮ個の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を含み、互いに異なるセットのＮ個の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、蛍光色素分子に起因して対で異なる。好ましくは、互いに異なるＮ個の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、異なる数の蛍光色素分子および／または異なる蛍光色素分子を含み、その結果、区別可能なｋ強度レベル、および／または区別可能なｍ色レベルは、セットのＮ個の区別可能な３Ｄ  ＤＮＡナノ構造によって発生し得る。好ましくは、Ｎ個の区別可能な３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも一部は、セットに数回含有され、その結果、ｋ強度レベルのそれぞれは、強度分布によって形成され、ｋ強度分布は、互いに、好ましくは統計学的に区別可能である。好ましくは、Ｎ個の異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも一部は、セットに数回含有され、その結果、ｍ色レベルのそれぞれは、色分布によって形成され、ｍ色分布は、互いに、好ましくは統計学的に区別可能である。隣接する分布の重複は、３０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは２％未満、特に好ましくは１％未満である。
また、この文脈において、以下が好ましく適用される；ｋ＞２、好ましくはｋ＞３、より好ましくはｋ＞４、さらにより好ましくはｋ＞５、特に好ましくはｋ＞６：および／またはｍ＞２、好ましくはｍ＞３、より好ましくはｍ＞４、さらにより好ましくはｍ＞５、特に好ましくはｍ＞６。
【０１４６】
１つの態様において、本発明は、
マイクロウェルアレイ、好ましくは既に記載した実施形態のいずれか１つのマイクロウェルアレイ；
少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含むキットであって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、少なくとも１つの内向きに配置された蛍光色素分子を含む、キットを対象とする。
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、好ましくは、上記または本明細書の以下で記載される３Ｄ  ＤＮＡナノ構造である。
【０１４７】
特に、本発明は、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つが、少なくとも２つの内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも２つの内向きに配置された蛍光色素分子の対の距離が、少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも５ｎｍ、特に好ましくは少なくとも９ｎｍである、キットに関する。
本発明の１つの態様は、複数の異なる標的構造の検出および／または定量化のために提供されるキットに関する。好ましくは、本発明のキットは、したがって、複数の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のセットを含み、セットは、Ｎ個の異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を含み、セットのＮ個の異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、蛍光色素分子中で互いに対で異なる。
【０１４８】
本発明の方法において、少なくとも１つの蛍光シグナルの測定は、蛍光顕微鏡によって、好ましくは以下の手法：点スキャン顕微鏡、広視野顕微鏡、（回転ディスク）共焦点顕微鏡；二光子分光法、落射蛍光顕微鏡、光シート顕微鏡；ＴＩＲＦの１つまたは組み合わせによって行うことができ、それぞれの時に、好ましくは交互レーザー励起（ＡＬＥＸ）またはパルス交互光源による励起が行われる。
【０１４９】
前記ＤＮＡナノ構造または他のナノレポーターを用いる所望の目的を達成するための例示的な方法は、以下のステップを有するか、または以下のステップからなる。
ａ．それぞれのタイプの標的構造に対して、１つまたは複数の直交測定可能なナノレポーター（例えば、本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造）の一義的な組み合わせを、それぞれのタイプの標的構造が一義的な方法で区別可能および同定可能であるような方法で、割り当てる、
ｂ．それぞれのタイプの標的構造のために、ナノレポーターとして少なくとも多くの結合領域を同定し、特異的および一義的に結合領域に結合することが可能なアダプターを選択する、
ｃ．１つのタイプの標的構造に割り当てられたナノレポーターおよびアダプターを、一時的に対合およびカップリングさせる、
ｄ．任意に、ナノレポーターに割り当てられなかったアダプターを、基材、キャリアまたはマトリックスとカップリングさせる、
ｅ．ナノレポーターおよびアダプターからなる複合体を、溶液中の標的構造とともにインキュベートする、
ｆ．標的分子、アダプターおよびナノレポーターからなる得られた複合体を、存在するマーカーについて、許容可能な低い確率でのみ、２つ以上の複合体が測定事象の原因となるような方法で、測定装置により測定する、
ｇ．直交シグナルの最小数を有さない測定事象を取り除く、
ｈ．他の測定事象は、
ｉ．個々のシグナルによって直接割り当てられたナノレポーターの組み合わせを、または
ｉｉ．測定シグナルの測定された分布およびそれぞれのナノレポーターについて予測される分布の比較による、ナノレポーターの組み合わせに由来する、統計学的に割り当てられた確率、または
ｉｉｉ．クラスターに基づくアルゴリズムによる、ナノレポーターの組み合わせに由来する、割り当てられた確率
のいずれかである、
ｉ．標的構造の相対数を、ナノレポーターの計算された組み合わせの総数、またはその確率によって決定する、および 
ｊ．任意に、少なくとも１つの標的構造の既知の絶対濃度により、または既知の測定容積により、標的構造の絶対数を決定する、ならびに 
ｋ．任意に、すべての他のナノレポーターに関して直交測定することができるナノレポーターは、その測定シグナルが、１つの測定事象に基づく標的構造の数に対する情報を提供するように、すべての標的構造について設計することができる。
特に、本発明の方法および／または３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、遺伝子発現分析、好ましくは単一細胞レベルでの遺伝子発現分析のために使用されることが想定される。
【０１５０】
単一レベルでの遺伝子発現の分析のために、好ましくは、ポリマーマトリックスは、好ましくは宿主体を部分的または完全に包むキャリアとして使用される。この場合において、同定構造の形成は、好ましくは、以下を含む。
１）マイクロウェルに宿主体を提供する。
２）ポリマーマトリックス（すなわちキャリア）により宿主体を包む；ポリマーマトリックスが、非常に迅速な方法で生成され、その結果、宿主体の破壊の前に宿主体がその標的構造の組成を変化させることができないこと、またはポリマーマトリックスが、宿主体の標的構造の組成がこれによって影響されないように生成されることを確実にしなければならない。後者は、例えば、低融点のアガロースを使用することによって確実にすることができる。
３）宿主体を破壊する、例えば、宿主体が細胞である場合において、溶解（例えば、超音波、浸透もしくは凍結により機械的に；または例えば、ｐＨ値の改変、ＥＤＴＡ、例えば、リゾチームなどの酵素、トルオール、Ｔｒｉｔｏｎ−ＸもしくはＴｒｉｚｏｌの導入によって化学的に、これは細胞壁もしくは膜をすべて不安定化するか、または自己分解を誘導する）によって宿主体を破壊し、その結果、ｍＲＮＡは、宿主体から、例えば細胞に放出される。
【０１５１】
宿主体（例えば、細胞）の濃度、およびポリマーマトリックスの密度の対応する選択により、ポリマーマトリックスは、それらが対応するマイクロウェルの外側に拡散しないような方法で、宿主体から放出される標的構造の拡散を制限する。好ましくは、ポリマーネットワークは、１μｍ〜５０μｍ、好ましくは２μｍ〜１０μｍの中位メッシュサイズを有する。これは、拡散を制限するため、ならびにキャリアアダプターおよび／またはキャリアアダプターの結合部位に対して十分な結合部位を提供するためである。キャリアアダプターおよび／またはキャリアアダプターの結合部位の対の最小距離は、実質的に２００ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは５００ｎｍ〜５μｍ、特に好ましくは２μｍ〜３μｍであり得る。この文脈において、キャリアアダプターおよび／またはキャリアアダプターの結合部位の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９９％が、隣接するキャリアアダプターおよび／またはキャリアアダプターの結合部位の少なくとも上記で言及された距離を有する。
【０１５２】
個々の宿主体の標的構造の組成の分析のために、
（ａ）マイクロウェル中で、ポリマーマトリックスにより部分的または完全に細胞を包むこと；
（ｂ）相補的オリゴヌクレオチドなどの標的分子へ結合することを可能にする要素でポリマーマトリックスを装飾すること；
（ｃ）標的構造が拡散し、装飾要素と結合するように、宿主体を破壊すること；
（ｄ）３Ｄ  ＤＮＡナノ構造または他の要素を添加すること、および適切なインキュベーション期間後にこれらを洗い流すこと；
（ｅ）試料を、例えば、落射蛍光顕微鏡、光シート顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化すること、および上記に記載のようにしてそれを分析すること
が好ましくあり得る。
【０１５３】
この文脈において、大多数の複合体が画像中で重ならないように、ポリマーマトリックス上の標的構造が結合する要素の装飾密度が十分に低くなければならないことを考慮して進めることが重要である。ポリマーマトリックスのための適切な出発材料は、特にアガロースであるが、しかしながら、コラーゲン、ＤＮＡまたは他の材料でもある。
本明細書において、「細胞」という用語は、すべての生物有機体、特に、ヒト細胞、組織試料からの細胞、動物細胞、細菌、真菌、藻類を含む。特に、細胞について記載されるすべての特徴は、変更すべきところは変更して、他の宿主体に適用される。
【０１５４】
「マトリックス」という用語は、アガロースまたは他の物質からのゲルを含み、その目的は、
・拡散に起因するマイクロウェルからの標的構造の損失を最小化するために、標的分子の拡散を制限すること、および／または
・マイクロウェルあたりより多くの標的構造を分析することができるように、標的構造のためのより多くの固定点を提供すること
である。
【０１５５】
正確に単一細胞を有する遺伝子発現分析は、以下を含んでいてもよい。
１．マイクロウェルアレイ中での分析される宿主体の蓄積。
２．ポリマーマトリックスによる宿主体の包囲。
３．標的構造が放出され得るように宿主体の破壊。
４．キャリア（ポリマーマトリックスおよび／またはマイクロウェルの第１および第２層の表面）における同定構造の形成。
５．対応する機器による同定構造の検出。
６．検出された同定構造、および対応する標的構造の分析およびそれらの元の宿主体への割り当て。
【０１５６】
本発明は、中でも以下の態様を対象とする：
１．標的構造の検出（好ましくは定量化）のための方法であって：
ｐ１）正確に１つの宿主体が少なくとも１つのマイクロウェルに存在するような、標的構造を有する宿主体を含む宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入；
ｐ２）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つのマイクロウェルへの導入であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入；
ａ）（ｉ）標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが標的構造に特異的に結合し、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、少なくとも１つのマイクロウェル中で、同定構造を形成するステップ；
ｂ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる標的構造の検出
を含み、
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造中で結合しない場合に、ａ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも２つの単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択され、同定構造が、第１の表面、好ましくは少なくとも１つのマイクロウェルの底部に結合する、方法。
２．標的構造が、部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはｍＲＮＡを含むか、または部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはｍＲＮＡである、態様１に記載の方法。
３．同定構造が、キャリア、好ましくはキャリアの第１の表面に結合し、および／または方法が、形成された同定構造をキャリア、好ましくはキャリアの第１の表面に結合させるステップをさらに含む、態様１または２に記載の方法。
【０１５７】
４．キャリアおよび／またはキャリアの第１の表面が、ガラス表面および／またはポリマー表面を含み、および／またはこれらからなり、キャリアおよび／またはキャリアの第１の表面が、任意に不動態化され、および／またはキャリアが、ポリマー網目構造を含み、ポリマー網目構造が好ましくは以下の材料：バイオポリマー、アガロース、コラーゲンの１つまたは組み合わせを含む、態様３に記載の方法。
５．キャリアが顕微鏡チップまたはカバースリップである、態様３または４に記載の方法。
６．キャリアおよび／またはキャリアの第１の表面に対する同定構造の結合および／または結合状態が、標的構造によって媒介され、および／または媒介されている、態様３〜５に記載の方法。
７．標的構造がキャリアおよび／またはキャリアの第１の表面に結合し、および／または結合しており、結合および／または結合状態が、標的構造に特異的に結合する、および／または結合しているキャリアアダプターによって媒介される、態様６に記載の方法。
８．キャリアアダプターが、キャリアまたはキャリアの第１の表面に直接結合する、および／または直接結合している、態様７に記載の方法。
９．キャリアアダプターが、共有結合または非共有結合によってキャリアまたはキャリアの第１の表面に結合する、および／または結合している、態様７または８に記載の方法。
【０１５８】
１０．キャリアアダプターが、ビオチン・ストレプトアビジン結合によってキャリアまたはキャリアの第１の表面に結合し、および／または結合しており、いずれかのキャリアアダプターがビオチンを含み、キャリアおよび／もしくはキャリアの第１の表面がストレプトアビジンを含むか、またはキャリアアダプターがストレプトアビジンを含み、キャリアおよび／もしくはキャリアの第１の表面がビオチンを含む、態様７から９のいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
１１．標的構造が態様２の標的構造であり、キャリアアダプターが、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり、その核酸配列が、それが態様２の標的構造の核酸配列の第１の一本鎖セグメントに特異的に結合する、好ましくはハイブリダイゼーションによって特異的に結合するように設計される、態様７〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．標的構造が、ポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡであり、キャリアアダプターが、オリゴヌクレオチドであり、その核酸配列がｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールに特異的に結合するように設計される、態様７〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１３．方法が、ａ）の後でｂ）の前に、キャリアおよび／または第１のキャリア表面を緩衝溶液によって洗浄するステップをさらに含む、態様３〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の１つ、好ましくはそれより多く、特に好ましくはすべてが、標的構造のそれぞれの領域に直接結合するように設計され、および／または標的分子に直接結合している、態様１から１３のいずれか１つに記載の方法。
【０１６０】
１５．少なくとも１つ、好ましくはすべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の特異的結合が、対応する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に割り当てられた標的アダプターによって媒介され、標的アダプターおよび／もしくは標的アダプターのそれぞれが、それぞれのＤＮＡナノ構造および標的構造のそれぞれの領域に結合するように設計され、ならびに／または標的アダプターおよび／もしくは標的アダプターのそれぞれが、好ましくはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、特に好ましくはＤＮＡを含むか、または好ましくはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、特に好ましくはＤＮＡである、態様１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、ナノ構造の外部にまたは外部の上に整列し、およびそれがそれぞれの標的アダプターに特異的に結合するように設計される少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡセグメントを含む、態様１５に記載の方法。
１７．１つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、それぞれの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に対する特異的結合を媒介するようにそれぞれ設計される一本鎖ＤＮＡセグメントを含む、態様１５または１６に記載の方法。
１８．１つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、標的構造のそれぞれの領域に対する特異的結合を媒介するようにそれぞれ設計される標的結合セグメントを含む、態様１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．標的構造が態様２に定義した標的構造であり、それぞれの標的結合セグメントが、標的構造の１つの一本鎖セグメントに特異的に結合するヌクレオチド配列を含む、態様１８に記載の方法。
２０．標的構造がタンパク質を含むかまたはタンパク質であり、それぞれの標的結合セグメントが、標的構造のタンパク質に特異的に結合するペプチド、好ましくは抗体を含む、態様１８に記載の方法。
【０１６１】
２１．方法が、標的構造を含有する好ましくは水性試料溶液を提供するステップ、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を提供するステップをさらに含み、ならびに任意にキャリア、キャリアアダプター、および／または標的アダプターを提供するステップを提供するステップをさらに含み、試料溶液が、好ましくは細胞溶解物、細胞浮遊液および／もしくは組織から抽出した核酸、ならびに／またはｍＲＮＡを含む、態様１から２０のいずれか１つに記載の方法。
【０１６２】
２２．方法が、標的構造を含有する好ましくは水性試料溶液を、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造、および任意にキャリアアダプターおよび／または標的アダプターと共に混合するステップをさらに含み、試料溶液が好ましくは、細胞溶解物、細胞浮遊液および／もしくは組織から抽出した核酸、ならびに／またはｍＲＮＡを含む、態様１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６３】
２３．互いに異なる１つまたは複数のさらなる標的構造の検出にさらに追加で適しており、異なる標的構造が、対で異なり、方法が、
ｃ）互いに異なる１つまたは複数のさらなる標的構造のそれぞれについて、
それぞれに割り当てられた同定構造の形成であって、さらなる同定構造のそれぞれが、
（ｉ）割り当てられたさらなる標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、それぞれのさらなる標的構造に特異的に結合し、および少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が対で異なるそれぞれの標的構造の領域に結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、それぞれに割り当てられた同定構造の形成
をさらに含み、
ステップｂ）が
ｄ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる１つまたは複数のさらなる標的構造の検出をさらに含み、
すべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造の１つの中で結合しない場合、ａ）およびｃ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、すべての形成された同定構造の測定された蛍光が、互いに対で区別可能であるように選択され、異なる標的構造のそれぞれが複数回存在していてもよく、方法が、１つまたは複数の異なる標的構造の複数の検出を含んでいてもよい、
態様１から２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．さらなる標的構造のそれぞれが、部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはｍＲＮＡを含むか、または部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはｍＲＮＡである、態様２３に記載の方法。
【０１６４】
２５．少なくとも１つ、好ましくはすべての同定構造が、キャリア、好ましくはキャリアの第１の表面に結合し、および／または方法が、少なくとも１つ、好ましくはすべての形成された同定構造を、キャリア、好ましくはキャリアの第１の表面に結合させるステップをさらに含む、態様２３または２４に記載の方法。
【０１６５】
２６．キャリアの表面が、ガラス表面および／もしくはポリマー表面を含むか、またはガラス表面および／もしくはポリマー表面であり、任意に不動態化され、ならびに／またはキャリアがポリマー網目構造を含み、好ましくは以下の材料：バイオポリマー、アガロース、コラーゲンの１つまたは組み合わせを含む、態様２５に記載の方法。
２７．キャリアが顕微鏡チップまたはカバースリップである、態様２５または２６に記載の方法。
２８．キャリアおよび／またはキャリアの第１の表面に結合する／結合している少なくとも１つ、好ましくはすべての同定構造の結合および／または結合状態が、それぞれの標的構造によって媒介される、および／または媒介されている、態様２５〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．キャリアおよび／またはキャリアの第１の表面に対するそれぞれの標的構造の結合および／または結合状態が、それぞれの標的構造に特異的に結合するそれぞれに割り当てられたキャリアアダプターによって媒介される、態様２８に記載の方法。
３０．それぞれのキャリアアダプターがキャリアまたはキャリアの第１の表面に直接結合する、および／または結合している、態様２９に記載の方法。
３１．それぞれのキャリアアダプターが、キャリアまたはキャリアの第１の表面に、共有結合または非共有結合によって結合する、および／または結合している、態様２９または３０に記載の方法。
【０１６６】
３２．それぞれのキャリアアダプターがビオチン・ストレプトアビジン結合によってキャリアまたはキャリアの第１の表面に結合し、および／または結合しており、それぞれのキャリアアダプターのいずれかがビオチンを含み、キャリアおよび／もしくはキャリアの第１の表面がストレプトアビジンを含むか、またはそれぞれのキャリアアダプターがストレプトアビジンを含み、キャリアおよび／もしくはキャリアの第１の表面がビオチンを含む、態様２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【０１６７】
３３．それぞれの標的構造が、態様２の標的構造であり、それぞれのキャリアアダプターが、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであり、その核酸配列が、それが態様２のそれぞれの標的構造の核酸配列の第１の一本鎖セグメントに特異的に結合するように設計される、態様２９〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．キャリアおよび／またはキャリアの第１の表面に結合した標的構造が、ポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡであり、前記結合した標的構造のそれぞれのキャリアアダプターが、オリゴヌクレオチドであり、その核酸配列が、それがｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールに特異的に結合するように設計される、態様２９〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．ａ）およびｃ）が１ステップで、好ましくは同時に実施される、態様２３〜３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．ａ）およびｃ）の後でｂ）の前に、キャリアまたはキャリアの第１の表面を緩衝溶液によって洗浄するステップをさらに含む、態様２５〜３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．１つ、好ましくはそれより多く、特に好ましくはすべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、それぞれの標的構造のそれぞれの領域に直接結合するように設計され、および／または標的分子に直接結合している、態様２３〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【０１６８】
３８．少なくとも１つ、好ましくはすべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の特異的結合が、それぞれに割り当てられた標的アダプターによって媒介され、標的アダプターおよび／または標的アダプターのそれぞれがそれぞれのＤＮＡナノ構造、およびそれぞれの標的構造のそれぞれの領域に結合するよう設計される、態様２３〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．少なくとも１つ、好ましくはすべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、ナノ構造の外部または外部の上に整列し、それぞれの標的アダプターに特異的に結合するように設計される、少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡセグメントを含む、態様３８に記載の方法。
４０．１つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、それぞれの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に対する特異的結合を媒介するように設計される一本鎖ＤＮＡセグメントを含む、態様３８または３９に記載の方法。
４１．１つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、標的構造のそれぞれの領域に対する特異的結合を媒介するように設計される標的結合セグメントを含む、態様３８〜４０に記載の方法。
４２．すべての標的構造が同じ試料に存在し、好ましくは試料溶液中に提供される、態様２３〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６９】
４３．蛍光顕微鏡を使用して少なくとも１つの蛍光シグナルを測定するステップが、好ましくは、以下の技術：ポイントスキャニング法、広視野顕微鏡、（スピンディスク）共焦点顕微鏡の１つまたは組み合わせによって実施され、好ましくは交互励起（ＡＬＥＸ）またはパルス光源を使用する励起をパルス交替励起で実施する、態様１〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０１７０】
４４．少なくとも１つの蛍光シグナルを測定するステップが、フローサイトメトリー、および／または蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によって、好ましくは以下の技術：共焦点顕微鏡、二光子分光法、落射蛍光顕微鏡、光シート顕微鏡、ＴＩＲＦの１つまたは組み合わせによって実施され、好ましくは交互励起（ＡＬＥＸ）またはパルス光源を使用する励起をパルス交替励起で実施する、態様１、２、１４〜２４、３５または３７〜４２のいずれか１つに記載の方法。
４５．同定構造または少なくとも１つおよび／もしくはすべての同定構造が、複数回形成される、態様１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【０１７１】
４６．少なくとも２つの異なる標的構造の検出のための方法であって、少なくとも２つの異なる標的構造が、互いに対で区別可能であり、方法が、
ｐ１）正確に１つの宿主体が少なくとも１つのマイクロウェルに存在するような、宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入であって、標的構造のそれぞれについて、縮主体の群が、関連する標的構造を有する少なくとも１つの宿主体を含む、導入；
ｐ２）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つのマイクロウェルへの導入であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入；
ａ）少なくとも２つの異なる標的構造のそれぞれについて、それぞれの同定構造を形成するステップであって、
（ｉ）それぞれの標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが標的構造に特異的に結合し、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、それぞれの標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、ステップ；
ｂ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる、１つまたは複数の異なる標的構造の検出
を含み、
すべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造の１つの中で結合しない場合に、ａ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、個々の標的構造について形成された異なる同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択され、異なる標的構造のそれぞれが複数回存在してもよく、方法が、１つまたは複数の異なる標的構造の複数の検出を含んでいてもよい、方法。
４７．少なくとも２つの標的構造が、同じ試料に存在する、態様４６に記載の方法。
４８．標的構造の少なくとも１つ、好ましくはそれぞれが、部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはｍＲＮＡを含むか、または部分的な一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド、特に好ましくはｍＲＮＡである、態様１に記載の方法。
【０１７２】
４９．少なくとも１つ、好ましくはすべての同定構造が、キャリア、好ましくはキャリアの第１の表面に結合した、および／または方法が、少なくとも１つ、好ましくはすべての形成された同定構造をキャリア、好ましくはキャリアの第１の表面に結合させるステップをさらに含む、態様４６〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．キャリアおよび／またはキャリアの第１の表面が、ガラス表面および／もしくはポリマー表面を含む、および／またはガラス表面および／もしくはポリマー表面からなり、ならびに／またはポリマー表面が任意に不動態化されている、態様４９に記載の方法。
５１．キャリアが顕微鏡チップまたはカバースリップである、態様４９または５０に記載の方法。
５２．キャリアおよび／またはキャリアの第１の表面に結合する、および／または結合している少なくとも１つ、好ましくはすべての同定構造の結合および／または結合状態が、それぞれの標的構造によって媒介される、または媒介されている、態様４９〜５１のいずれかに記載の方法。
【０１７３】
５３．それぞれの標的構造がキャリアおよび／またはキャリアの第１の表面に結合し、および／または結合しており、結合および／または結合状態が、それぞれの標的構造に割り当てられたキャリアアダプターによって媒介され、それぞれの標的構造に特異的に結合する、態様５２に記載の方法。
５４．それぞれのキャリアアダプターが、キャリアおよび／またはキャリアの第１の表面に直接結合する、および／または結合している、態様５３に記載の方法。
５５．それぞれのキャリアアダプターが、キャリアまたはキャリアの第１の表面に、共有結合または非共有結合によって結合する、および／または結合している、態様５３または５４に記載の方法。
【０１７４】
５６．それぞれのキャリアアダプターが、ビオチン・ストレプトアビジン結合によってキャリアまたはキャリアの第１の表面に結合し、および／または結合しており、いずれかのそれぞれのキャリアアダプターがビオチンを含み、キャリアおよび／もしくはキャリアの第１の表面がストレプトアビジンを含むか、またはそれぞれのキャリアアダプターがストレプトアビジンを含み、キャリアおよび／もしくはキャリアの第１の表面がビオチンを含む、態様５３から５５のいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
５７．それぞれの標的構造が、態様２の標的構造であり、それぞれのキャリアアダプターがオリゴヌクレオチドであり、その核酸配列が、態様２のそれぞれの標的構造の核酸配列の第１の一本鎖セグメントに特異的に結合するように設計される、態様５３〜５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．キャリアまたはキャリアの第１の表面に結合した標的構造が、ポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡであり、前記結合した標的構造のそれぞれのキャリアアダプターがオリゴヌクレオチドであり、その核酸配列がｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールに特異的に結合するように設計される、態様５３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．ａ）の後でｂ）の前に、キャリアおよび／または第１のキャリア表面を緩衝溶液によって洗浄するステップをさらに含む、態様４９〜５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．１つ、好ましくはそれより多く、特に好ましくはすべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、それぞれの標的構造のそれぞれの領域に直接結合するように設計されており、および標的分子に直接結合する、態様４６〜５９のいずれか１つに記載の方法。
【０１７６】
６１．少なくとも１つ、好ましくはすべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、それぞれに割り当てられた標的アダプターによって媒介され、標的アダプターおよび／または標的アダプターのそれぞれが、それぞれのＤＮＡナノ構造およびそれぞれの標的構造のそれぞれの領域に結合するように設計される、態様４６〜６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．少なくとも１つ、好ましくはすべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、外向きに配置され、それぞれの標的アダプターに特異的に結合するように設計される少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡセグメントを含む、態様６１に記載の方法。
６３．１つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、それぞれの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に対する特異的結合を媒介するようにそれぞれが設計される一本鎖ＤＮＡセグメントを含む、態様６１または６２に記載の方法。
６４．１つまたは複数の標的アダプターがそれぞれ、それぞれの標的構造のそれぞれの領域に対する特異的結合を媒介するようにそれぞれが設計される標的結合セグメントを含む、態様６１〜６３のいずれか１つに記載の方法。
６５．少なくとも２つの標的構造の第１が、態様４８に定義した標的構造であり、第１の標的構造に結合する標的結合アダプターの標的結合セグメントが、第１の標的構造の１つの一本鎖セグメントに特異的に結合するヌクレオチド配列を含む、態様６４に記載の方法。
６６．態様６３の特色がまた、すべてのさらなる標的構造およびそれぞれの標的結合アダプターのそれぞれの標的結合セグメントにも当てはまる、態様６５に記載の方法。
６７．少なくとも２つの標的構造の第１がタンパク質を含むかまたはタンパク質であり、第１の標的構造に結合する標的結合アダプターの標的結合セグメントが、第１の標的構造に特異的に結合するペプチド、好ましくは抗体を含む、態様６４に記載の方法。
６８．態様６３の特色がまた、すべてのさらなる標的構造およびそれぞれの標的結合アダプターのそれぞれの標的結合セグメントにも当てはまる、態様６７に記載の方法。
【０１７７】
６９．少なくとも２つの標的構造を含有する試料溶液を提供するステップをさらに含み、および少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を提供するステップ、ならびに任意にキャリア、キャリアアダプター、および／または標的アダプターを提供するステップをさらに含む、態様４６〜６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．少なくとも２つの標的構造を含有する試料溶液を、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造、ならびに任意にキャリアアダプターおよび／または標的アダプターと混合するステップをさらに含む、態様４６〜６９のいずれか１つに記載の方法。
【０１７８】
７１．少なくとも１つの蛍光シグナルを測定するステップが、
ｑ）蛍光顕微鏡、好ましくは落射蛍光顕微鏡、ＴＩＲＦ、光シート顕微鏡、および／または共焦点顕微鏡を使用することによって、試料の区分から放射された蛍光シグナルのデータを含有するデータセットを作成するステップ
を含み、
標的構造および／または１つもしくは複数のさらなる標的構造の検出が、
ｗ）同定構造の１つの蛍光シグナルを表す、データセットに含有される１つまたは複数のデータを同定するステップ
を含む、態様１から７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．ステップｑ）が、
試料区分の蛍光データを含有する少なくとも１つの画像ファイルを記録するステップ
を含む、態様７１に記載の方法。
７３．ステップｗ）における同定するステップが、以下のステップ：
ｗ１）データおよび／または画像要素の色および／または強度情報の読み出し、ならびに
ｗ２）データおよび／または画像要素の色および／または強度情報を、同定構造を表す色および／または強度情報と比較するステップ
を含む、態様７１または７２に記載の方法。
【０１７９】
７４．ステップｗ）における同定するステップが、以下のステップ：
ｗ１）データおよび／または画像要素の色および強度情報の読み出し、ならびに
ｗ２）データおよび／または画像要素の色および強度情報を、同定構造を表す色および強度情報と比較するステップ
を含む、態様７３に記載の方法。
７５．個々の異なる標的構造について形成された同定構造の蛍光シグナルが、それらが同定構造の１つの中で結合しない場合、すべての単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルとは異なり、および個々の異なる標的構造について形成された同定構造の蛍光シグナルが、対応する蛍光シグナルが、色および／または強度情報の区別可能に異なる組み合わせを含むという点において対で異なる、態様７３または７４に記載の方法。
【０１８０】
７６．３Ｄ  ＤＮＡナノ構造において、互いに区別可能なｋ強度レベルおよび／または互いに区別可能なｍ色レベルを使用し、好ましくはｋ強度レベルのそれぞれが強度分布によって形成され、ｋ強度分布が互いに区別可能であり、好ましくは統計学的に区別可能であり、および／または好ましくはｍ色レベルのそれぞれが色分布によって形成され、ｍ色分布が、互いに区別可能であり、好ましくは統計学的に区別可能であり、隣接する分布のそれぞれの重複が、好ましくは３０％より小さく、より好ましくは１０％より小さく、さらにより好ましくは５％より小さく、特に好ましくは２％より小さく、なお特に好ましくは１％より小さい、態様７５に記載の方法。
７７．ｋ＞２であり、好ましくはｋ＞３であり、より好ましくはｋ＞４であり、さらにより好ましくはｋ＞５であり、特に好ましくはｋ＞６である、態様７６に記載の方法。
７８．ｍ＞２であり、好ましくはｍ＞３であり、より好ましくはｍ＞４であり、さらにより好ましくはｍ＞５であり、特に好ましくはｍ＞６である、態様７６または７７に記載の方法。
【０１８１】
７９．ステップｗ１）が以下のステップおよび技術：画像要素の平均値を決定するステップ、画像要素の最大値を決定するステップ、累積勾配を計算するステップ、１つまたは複数の統計モーメント、例えば画像要素におけるピクセルの変動、変動係数、ファノ因子などを計算するステップ、の１つまたは組み合わせを含み；ならびに／またはステップｗ２）が、クラスタリング方法、好ましくはＤＢＳＣＡＮ（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｂａｓｅｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｉｓｅ）に基づいて実施され；ならびに／またはステップｆ１）および／もしくはｆ２）が、確率的観測に基づき、好ましくはベイズの定理を考慮に入れることによる確率的観測に基づく、態様７３〜７８のいずれか１つに記載の方法。
【０１８２】
８０．その上に少なくとも１つの蛍光色素分子が付着している３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の形状が、その上に少なくとも１つの蛍光色素分子が付着している第２の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に近づくと、２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光色素分子が有意に相互作用するのを防止する、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
８１．相互作用が消光および／またはＦＲＥＴを含む、態様８０に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
８２．少なくとも２つの蛍光色素分子が３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に結合し、少なくとも２つの蛍光色素分子の間の距離が、それらが有意に相互作用する距離より対で大きい、態様８０または８１に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
８３．３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が本質的に中空円柱体として形成され、少なくとも１つの蛍光色素分子または少なくとも２つの蛍光色素分子が円柱状のＤＮＡナノ構造の内側に付着する、態様８０〜８２のいずれか１つに記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
【０１８３】
８４．キャビティおよび少なくとも１つの内向きに配置された蛍光色素分子を有する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、少なくとも１つの内向きに配置された蛍光色素分子と３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の周縁部との距離が少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも３ｎｍ、特に好ましくは少なくとも５ｎｍである、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
８５．３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が少なくとも２つの内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも２つの内向きに配置された蛍光色素分子の距離が、少なくとも２ｎｍ、好ましくは少なくとも５ｎｍ、特に好ましくは少なくとも９ｎｍである、態様８４に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
８６．３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、本質的に楕円の中空円柱体として、好ましくは環状の中空円柱体として形成される、態様８０〜８５のいずれか１つに記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
８７．中空円柱体が環状の円柱体であり、少なくとも５ｎｍの内径、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの内径、特に好ましくは６０ｎｍの内径、および／または最大で２００ｎｍの高さ、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの高さ、特に好ましくは３０ｎｍの高さを含む、態様８６に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
【０１８４】
８８．中空円柱体が、少なくとも２ｎｍの壁厚、好ましくは２ｎｍ〜７ｎｍの壁厚、特に好ましくは５ｎｍの壁厚を含み、および／または中空円柱体がらせん直径を有するＤＮＡヘリックスを含み、壁厚が少なくとも１らせん直径、好ましくは少なくとも２らせん直径を有し、および／または壁厚が最大４らせん直径、好ましくは最大３らせん直径を有する、態様８６または８７に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
８９．３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、少なくとも３０００塩基，好ましくは５０００〜５００００塩基、特に好ましくは１００００〜１１０００塩基の一本鎖ＤＮＡスキャフォールド鎖を含み、ＤＮＡスキャフォールド鎖が、好ましくは環状である、態様８０〜８８のいずれか１つに記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
９０．複数のステープル鎖をさらに含み、好ましくはそれぞれが好ましくは３０〜１００塩基を有する１００〜５００個のステープル鎖を含む、態様８９に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
９１．内向きに配置された蛍光色素分子の１つがステープル鎖の内向きに配置されたセグメントに結合し、好ましくは内向きに配置された蛍光色素分子のそれぞれがステープル鎖のそれぞれの内向きに配置されたセグメントに結合する、態様９０に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
【０１８５】
９２．それがスキャフォールド鎖またはステープル鎖の１つの内向きに配置された一本鎖配列セグメントに特異的に結合するように設計された少なくとも１つの内向きに配置された一本鎖色素アダプターＤＮＡオリゴマーをさらに含み、少なくとも１つの色素アダプターＤＮＡオリゴマーが内向きに配置された色素分子の１つを含む、態様８９〜９１のいずれか１つに記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
９３．ステープル鎖の内向きに配置された一本鎖配列セグメントが、内向きに配置され、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のアセンブリにとって必要ではないオーバーハングである、態様９２に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
９４．標的構造、好ましくはポリヌクレオチド標的構造、特に好ましくは一本鎖ポリヌクレオチド標的構造に特異的に結合し得る一本鎖ＤＮＡセグメントを含む、態様８０〜９３のいずれか１つに記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
９５．３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、少なくとも１つの標的アダプターをさらに含み、標的アダプターが標的構造に対する特異的結合を媒介し得る、態様８０〜９４のいずれかに記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
【０１８６】
９６．標的アダプターが、第１の一本鎖ポリヌクレオチド配列を含み、第１の一本鎖ポリヌクレオチド配列が、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の一本鎖配列セグメント、好ましくは足場構造またはステープル鎖の１つの一本鎖配列セグメント、特に好ましくはステープル鎖の１つの一本鎖配列セグメントに結合する、態様９５に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
９７．標的アダプターが、標的構造に特異的に結合し得る標的結合セグメントをさらに含む、態様９５または９６に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
９８．標的結合セグメントが第２の一本鎖ポリヌクレオチド配列を含むか、または第２の一本鎖ポリヌクレオチド配列であり、標的構造が、一本鎖ポリヌクレオチド、好ましくはｍＲＮＡを含む、態様９７に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
９９．標的結合セグメントが、標的構造に特異的に結合するタンパク質、好ましくは抗体または抗体の抗体結合性断片を含む、態様９７に記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
１００．標的アダプター、好ましくは少なくとも標的結合セグメントが外向きである、態様９５〜９９のいずれか１つに記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
１０１．外向きに位置する蛍光色素分子を含まない、態様８０〜１００のいずれか１つに記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造。
１０２．態様１〜７９のいずれか１つに記載の方法のための態様８０〜１０１のいずれか１つに記載の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の使用。
１０３．セットが、互いに異なるＮ個の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を含み、セットのＮ個の異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、蛍光色素分子により互いに対で異なる、態様８０〜１０１のいずれか１つに記載の複数の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を含むセット。
【０１８７】
１０４．互いに異なるＮ個の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、異なる数の蛍光色素分子および／または異なる蛍光色素分子を含有し、それによって、互いに異なるセットのＮ個の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造により、互いに区別することができるｋ個の強度レベルおよび／または互いに区別することができるｍ個の色レベルを生成することができる、態様１０３に記載のセット。
１０５．互いに異なるＮ個の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも一部がセットに複数回含有され、それによってｋ個の強度レベルのそれぞれが強度分布によって形成され、ｋ個の強度分布が互いに、好ましくは統計学的に区別可能である、態様１０４に記載のセット。
【０１８８】
１０６．互いに異なるＮ個の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも一部がセットに複数回含有され、それによってｍ個の色レベルのそれぞれが強度分布によって形成され、ｍ個の色分布が互いに、好ましくは統計学的に区別可能である、態様１０５または１０６に記載のセット。
１０７．隣接する分布の重複が、３０％より小さい、好ましくは１０％より小さい、より好ましくは５％より小さい、さらにより好ましくは２％より小さい、特に好ましくは１％より小さい、態様１０５または１０６に記載のセット。
１０８．ｋ＞２、好ましくはｋ＞３、より好ましくはｋ＞４、さらにより好ましくはｋ＞５、特に好ましくはｋ＞６である、態様１０４〜１０７のいずれか１つに記載のセット。
１０９．ｍ＞２、好ましくはｍ＞３、より好ましくはｍ＞４、さらにより好ましくはｍ＞５、特に好ましくはｍ＞６である、態様１０４〜１０８のいずれか１つに記載のセット。
１１０．態様１〜７９のいずれか１つに記載の方法のための態様１０３〜１０９のいずれか１つに記載のセットの使用。
以下に、本発明の好ましい実施形態を、図面を参照してより詳細に説明する。図面は、以下を示している：
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】遺伝子発現解析の例示的な例に関する、概略的な本発明の基礎となる基本原理；
【図２】本発明の方法の好ましい実施形態に従う、概略的な単細胞遺伝子発現解析の経過；
【図３】実験の結果；および
【図４】好ましい実施形態に従う３Ｄ  ＤＮＡナノ構造；
【図５】好ましい実施形態に従う、概略的なマイクロウェルアレイ；
【図６】好ましい実施形態に従う、概略的なマイクロウェルチャンバー；および
【図７】単細胞遺伝子発現解析の概略的な方法のステップ。
【発明を実施するための形態】
【０１９０】
図１は、遺伝子発現解析の例示的な例に関する本発明の基礎となる基本原理を概略的に示す。内向きに配置された蛍光色素分子１ｂ（距離１ｃ）を有する、示される例の円柱状の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造１ｄ（図１の上部を参照されたい）は、概略的に示すように、円柱の壁を形成する２Ｄ  ＤＮＡナノ構造１ａを折り曲げる、および／または巻くことによって形成され、円柱体は、対応するステープル鎖のその形態によって安定化される。円柱体は、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造１ｄが、それによって標的構造１ｇ（図１の下部を参照されたい）に結合することができる手段、この場合はハイブリダイゼーションによってｍＲＮＡにカップリングされるアダプター１ｆを含む。参照番号１ｈは、例として３Ｄ  ＤＮＡナノ構造と標的構造との特異的結合のためのワトソンクリックの塩基対形成を示すためである。示される配列は、単に例示的に機構を説明するためであり、実際の配列を反映していない。標的構造が、アダプターによって基質１ｊにカップリングされる最適な位置を角括弧１ｉで表す。
図１の底部では、３つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造１ｅが、例示的に標的構造１ｇに結合し、蛍光条件で測定した３つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造１ｅの強度は、互いに異なり、これは「明るい」、「弱い」、および「中間」として示され、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造に存在する蛍光分子の異なる数によって引き起こされる。
【０１９１】
図２は、本発明の方法の好ましい実施形態に従う単細胞遺伝子発現解析の経過を概略的に示す。マイクロウェル２ａにおいて第２層２ｊによって制限された単細胞２ｃ（ここでは、宿主体は細胞である）は、ポリマーマトリックス２ｂの下および／または中に位置する。ポリマーマトリックスの拡大図（図の下部を参照されたい）は、その上にキャリアアダプター２ｈが位置するこのマトリックスのポリマーフィラメント２ｇを示す。ステップ１とステップ２の間で、細胞は溶解され、それによって標的構造、例えばｍＲＮＡ（２ｄ）ならびに他の細胞成分（２ｅ）が自由に移動し得る。標的構造は、キャリアアダプターに結合し、標的構造−キャリアアダプター複合体２ｉを形成する。ステップ３では、他の細胞成分の一部が洗い流される。ステップ４は、標的構造に結合する標的アダプターを有する追加の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造２ｆを示す。キャリアアダプターの高い局所密度により、個々の細胞の標的構造を特に良好に捕捉することができる。特に、ポリマーマトリックスは、そのマイクロウェルからのおよび／または他のマイクロウェルへの標的構造の拡散を妨害する。しかし、ポリマーマトリックスの３次元性により、例えば共焦点顕微鏡を使用することによって、密に整列した同定構造を、互いに個別に満足できる様式で撮像することが可能である。
【０１９２】
図４Ａは、直径ｄ  ６０ｎｍ、および高さｈ  ３０ｎｍの中空円柱体の形態での好ましい実施形態に従う３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を概略的に示す。示される例では、円柱体は、直径約２ｎｍの２２個のＤＮＡ二重らせんによって形成され、それぞれの円は、らせんの断面を表す。容易にわかるように、中空円柱体の壁の外面はなめらかではない（またはさらに数学的に完全ではない）。むしろ、壁の外面は、周囲方向に突起および凹部を含む。同じことが内壁にも当てはまる。らせんは、壁厚ｂが約２．５らせん直径（またはおよそ５ｎｍ）に対応するように、グリッド状、またはハニカム型構造で整列する。
【０１９３】
図５．１は、本発明に従うマイクロウェルアレイの平面での略図を示す。図５．２は、マーカーＳに沿った図５．１のマイクロウェルアレイの断面を示す。マイクロウェルアレイは、底部に第１（第１の）層５ａを含む。第１層は、好ましくは顕微鏡カバースリップであり、好ましくは蛍光顕微鏡にとって適したカバースリップである。第１層の材料は、好ましくはガラスを含むが、同様にプラスチックも含み得る。
【０１９４】
第１層の上に、第２（第２の）層５ｂが適用され、これはマイクロウェル６ｃの周囲壁６ｅを形成する。したがって、マイクロウェル５ｃは、第２層５ｂにおける凹部として形成される。マイクロウェル５ｃは、ここでは、長方形の輪郭、すなわち長方形の底部５ｆおよびそれに対して垂直な周囲壁５ｅによって説明される。マイクロウェル５ｃの底部５ｆは、第１層５ａ、ここでは顕微鏡カバースリップによって形成される。上部、すなわち第２層５ｂの上に、マイクロウェル５ｃが開口している。深さ５ｈもまた、図５．２に表す。しかし、既に記載したように、マイクロウェル５ｃはまた、全く異なる形態をとることができる。特に不規則な形状の輪郭を有するマイクロウェルでは、マイクロウェルのサイズは、内接する円５ｄの直径によって示すことができ、またはマイクロウェル５ｃの体積を示すことによっても示すことができる。マイクロウェルの周囲壁５ｂは、その底部５ｆに対して垂直である必要はない。周囲壁５ｅはまた、底部５ｆに対して角度≠９０°であり得る。底部５ｆに対する周囲壁５ｂの勾配は、宿主体を移入するために十分であることが重要であり、宿主体は重力の影響を受けてマイクロウェル５ｃの底部５ｆに向かって、マイクロウェル５ｃの底部５ｆに沈む。好ましくは、角度は、底部５ｆに対する垂直から±１５°またはそれ未満、より好ましくは±１０°またはそれ未満、より好ましくは±５°またはそれ未満、特に好ましくは±２°またはそれ未満外れる。
【０１９５】
図６．１は、本発明に従うマイクロウェルチャンバーの略図を平面図で示す。図６．２は、マーカーＳに従う図６．１のマイクロウェルチャンバーの断面の略図を示す。説明する実施形態では、マイクロウェルチャンバーは、カバースリップの第１（第１の）層、好ましくは顕微鏡にとって適したカバースリップの第１層、特に蛍光顕微鏡にとって適したカバースリップの第１層を含む。第１層は、好ましくはガラスからなるが、プラスチックからもなり得る。第２（第２の）層６ｂを、第１層６ａの上に適用する。第２層６ｂは、凹部６ｇを含む。凹部６ｇは、その底部が第１層によって限定される。それによって、それぞれが第１層６ａによって形成される底部、および第２層６ｂによって形成される周囲壁を含むマイクロウェルが形成される。マイクロウェルはその上部が開口している。第１層および第２層は、共にマイクロウェルアレイを形成する。図６に説明する実施形態では、第２層６ｂおよび／またはマイクロウェルアレイの上面に、第３（第３の）層６ｃが付着している。第３層６ｃは、キャビティ６ｆを含む。キャビティ６ｆは、マイクロウェルに接してそれを超えて伸長する。このように、第３層６ｃのキャビティと、マイクロウェルアレイのその上部で開口しているマイクロウェルとの間の直接接続が与えられる。これによって、第３層のキャビティ６ｆおよびマイクロウェルを含有する作業キャビティが得られる。作業キャビティは、第１、第２、および第３層によって周囲から封止される。作業キャビティと周囲との間の意図される接続は、入口６ｄおよび出口６ｅの形態で提供される。入口６ｄによって、方法のために必要な液体を、作業体積に添加することができ、このようにマイクロウェルアレイに適用することができる。過剰な液体体積、特に同様に空気は、出口６ｅを通して流れ出ることができる。それによって、液体の連続的な添加およびすすぎが確保される。
【０１９６】
図７は、本発明に従う一連の方法のステップの略図を示す。図７．１では、宿主体７ａの群を、マイクロウェルアレイ７ｂに導入する。好ましくは、これは宿主体７ａが適した液体に存在し、宿主体の液体がマイクロウェルアレイの上面に適用されるという点において実施される。宿主体７ａは、好ましくはこのステップにおいて、個々の宿主体７ａが互いに結合しない形態で使用される。宿主体７ａは、例示的に細胞として説明される。図７．２では、マイクロウェルアレイに適用される宿主体７ａは、重力の影響を受けて個々のマイクロウェル７ｃの中に落下し、底に沈む。このために必要なインキュベーション期間は、マイクロウェルの深さおよび使用する宿主体７ａ、ならびに使用する液体の粘度に依存する。当業者は適したインキュベーション期間を容易に見出すであろう。この目的について、それぞれのマイクロウェルは、宿主体７ａによって占有されない、正確には１つまたは１つより多くの宿主体７ａによって占有され得る。後の評価のために、マイクロウェルは、それぞれが好ましくは正確に１つの宿主体７ａによって占有される。この条件を確保するために、マイクロウェルを、その内容物について解析する。これは、例えば、明視野顕微鏡および／または他の任意の適した撮像技術によって実施することができる。複数の細胞を含むまたは細胞を含まないそれらのマイクロウェル７ｄを、図においてＸとして同定し、その後の解析から除外する。正確に１つの宿主体７ａを含むそれらのマイクロウェル７ｃを、その後の解析において考慮に入れる（図において追加で同定していない）。
【０１９７】
図７．３では、宿主体７ａ（ここでは、細胞）は、破壊緩衝液７ｅ（ここでは、溶解緩衝液）を添加することによって破壊される。このようにして、宿主体７ａに存在する標的構造７ｆが放出される。放出された標的構造７ｆは、マイクロウェル７ｃの底部に結合する。前記結合は、それぞれが底部および標的構造の両方に結合するキャリアアダプターによって媒介され得る。
【０１９８】
次に、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造７ｇを図７．４に追加する。３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、１つまたは複数の標的構造が解析されるように調節される。３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、互いに異なる１つまたは複数の標的構造のそれぞれについて、それぞれに割り当てられた同定構造を形成することができるように選択され、同定構造のそれぞれは、それぞれに割り当てられた標的構造および少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を含み、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれは、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれは、それぞれの標的構造に特異的に結合し、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、それぞれの標的構造の対で異なる領域に結合する。
【０１９９】
図７．５は、顕微鏡による解析を概略的に示し、目的７ｉのみを示す。ここでは、図７．２において解析のために既に認められたマイクロウェル７ｃのみを解析する。解析は、蛍光顕微鏡によって行う。３Ｄ  ＤＮＡナノ構造７ｇおよび蛍光測定のパラメーターは、同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、それらが同定構造の１つの中で結合しない場合に、すべての単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、すべての対で異なる同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択される。当然のこととして、異なる標的構造のそれぞれは、複数回存在してもよく、それによって異なる標的構造のそれぞれのシグナルは、蛍光測定において複数回存在してもよい。
以下の非制限的な実施例は本発明を説明するためである。
【実施例】
【０２００】
（実施例１）
本発明の３Ｄナノ構造の調製
１．調製した３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の説明
それぞれが６０個の内向きに配置された色素分子を有する中空円柱体の形態を有し、同じ３Ｄ  ＤＮＡナノ構造内で隣接する色素分子に対して少なくとも９ｎｍの対の距離を示す３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を、３つの異なる色素バリアント、すなわち３Ｄ＿１、３Ｄ＿２、および３Ｄ＿３で調製した：
・３Ｄ  ＤＮＡナノ構造バリアント３Ｄ＿１：赤色蛍光：
３Ｄ＿１  ＤＮＡナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する６０個の内向きに配置されたＤＮＡステープル鎖（配列Ｓ１と呼ぶ）、およびそれぞれがＡｔｔｏ６４７Ｎ色素分子と共に提供される６０個の関連するフルオロフォアアダプター（オリゴマー、配列番号１２５９）を含む。フルオロフォアアダプターの結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムＣａＤＮＡｎｏにおいて、それらが、中空円柱体の内部に位置する、それらが中空円柱体の周縁部から２ｎｍより大きい距離に位置する、それらが中空円柱体の内部表面上で遊離の末端を有する、およびそれらが互いに５ｎｍより大きい距離を有する（設計および配列の長さにより、後者の条件は上記の基準を満たすすべてのステープル鎖に当てはまる）という基準に基づいて選択した。色素アダプターは、３’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が中空円柱体の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。その上、３Ｄ＿１ナノ構造は、Ｔ１標的アダプター（オリゴマー配列番号１２６３）と共に提供された。３Ｄ＿１ナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール３Ｄ＿Ｓ１に要約する。鎖ｐ７３０８（配列番号１２５８）をスキャフォールド鎖として使用した。
【０２０１】
・３Ｄ  ＤＮＡナノ構造バリアント３Ｄ＿２：緑色蛍光：
３Ｄ＿２  ＤＮＡナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する６０個の内向きに配置されたＤＮＡステープル鎖（配列Ｓ２と呼ぶ）、およびそれぞれがＡｔｔｏ５６５色素分子と共に提供される６０個の関連するフルオロフォアアダプター（オリゴマー配列番号１２６０）を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムＣａＤＮＡｎｏにおいて、それらが、中空円柱体の内部に位置する、それらが中空円柱体の周縁部から２ｎｍ以下の距離に位置する、それらが中空円柱体の内部表面上で遊離の末端を有する、それらが互いに５ｎｍより大きい距離を有する（設計および配列の長さにより、後者の条件は上記の基準を満たすすべてのステープル鎖に当てはまる）という基準に基づいて選択した。色素アダプターは、３’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が中空円柱体の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。３Ｄ＿２ナノ構造は、Ｔ２標的アダプター（オリゴマー配列番号１２６４）と共に提供された。３Ｄ＿２ナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール３Ｄ＿Ｓ２に要約する。鎖ｐ７３０８（配列番号１２５８）をスキャフォールド鎖として使用した。
【０２０２】
・３Ｄ  ＤＮＡナノ構造バリアント３Ｄ＿３：青色蛍光：
３Ｄ＿３  ＤＮＡナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する６０個の内向きに配置されたＤＮＡステープル鎖（配列Ｓ３と呼ぶ）、およびそれぞれがＡｔｔｏ４８８色素と共に提供される６０個の関連するフルオロフォアアダプター（オリゴマー配列番号１２６１）を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムＣａＤＮＡｎｏにおいて、それらが、中空円柱体の内部に位置する、それらが中空円柱体の周縁部から２ｎｍ以下の距離に位置する、それらが中空円柱体の内部表面上で遊離の末端を有する、それらが互いに５ｎｍより大きい距離を有する（設計および配列の長さにより、後者の条件は上記の基準を満たすすべてのステープル鎖に当てはまる）という基準に基づいて選択した。色素アダプターは、３’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が中空円柱体の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。３Ｄ＿３ナノ構造は、Ｔ３標的アダプター（オリゴマー配列番号１２６５）と共に提供された。３Ｄ＿３ナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール３Ｄ＿Ｓ３に要約する。鎖ｐ７３０８（配列番号１２５８）をスキャフォールド鎖として使用した。
すべてのＤＮＡオリゴマー（蛍光色素と共に提供されるＤＮＡオリゴマーも同様に）を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨから得た。
【０２０３】
実施例１の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の説明を、上記で既に考察した図５に示す。図５Ａは、付着した蛍光色素分子のタイプのみが異なる３Ｄ  ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿１、３Ｄ＿２、および３Ｄ＿３の略図を示す。図５Ｂは、切断して広げた（説明する目的のため）図５Ａの中空円柱体を示し、図５Ａの中空円柱体の内部表面を平面図で示す。それぞれのｘは、蛍光色素分子を表す。最近傍の間の対の色素分子の距離は９ｎｍである。他の色素分子の間では、対の距離、例えば距離ｇはより大きい。色素分子はそれぞれ、図５Ａにおいて最も内側のらせんに位置し、そのため中空円柱体の外縁部からの色素分子の距離は、円柱体壁の壁厚にほぼ対応し、すなわちおよそ２．５らせん直径（およそ５ｎｍに対応する）である。
【０２０４】
２．調製プロトコール：
本実施例では、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿１〜３を、以下に記載される調製プロトコールに従って調製した：
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿１、３Ｄ＿２、および３Ｄ＿３の調製のために、第１に以下の成分を混合して最終体積２００μｌを得た：
・１０ｎＭ  ｐ７３０８スキャフォールド鎖（配列番号１２５８）
・１００ｎＭのそれぞれのステープル鎖（ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿１についてオリゴプール３Ｄ＿Ｓ１からの配列番号、ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿２についてオリゴプール３Ｄ＿Ｓ２の配列番号、およびＤＮＡナノ構造３Ｄ＿３についてオリゴプール３Ｄ＿Ｓ３からの配列番号）
・１２０ｎＭ蛍光色素改変ＤＮＡオリゴ（ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿１について配列番号１２５９、ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿２について配列番号１２６０、およびＤＮＡナノ構造３Ｄ＿３について配列番号１２６１）
・４００ｎＭ標的結合ＤＮＡオリゴ（ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿１について配列番号１２６３、ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿２について配列番号１２６４、およびＤＮＡナノ構造３Ｄ＿３について配列番号１２６５）
・１×緩衝液ＦＢ０２（緩衝液の組成については以下を参照されたい）
【０２０５】
ＤＮＡナノ構造をその形状に折り畳ませるために、上記で言及した混合物を最初に加熱して、存在する可能性がある二次構造を融解した後、塩基の対形成が熱平衡を見出し、それに従って計画される立体構造を見出すことができるように徐々に冷却する。この目的のために、以下のサーマルサイクラープログラムを使用した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ＧｅｒｍａｎｙによるＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｎｅｘｕｓ  Ｘ２を使用して）：
・６５℃で１５分間維持し、１分以内に５０℃に冷却する
・５０℃から４０℃に一定の速度で６６時間減少させる
・６６時間の終了時（任意に、４０℃でさらに数時間インキュベートすることが可能である）、１分以内に４℃に冷却し、２〜８℃で保存する。
【０２０６】
次に、正しく折り畳まれた３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を単一のＤＮＡオリゴマーまたはより小さいＤＮＡオリゴマー複合体から分離した。この目的のために、以下のＰＥＧ精製（ポリエチレングリコールによる精製）を使用した：
・サーマルサイクラー由来の液体を同じ体積のＰＥＧＸ０１（緩衝液の組成については以下を参照されたい）と混合する
・１３０００〜１６０００ｒｆｃ、室温（２０〜２５℃）で３５分間遠心分離する
・ピペットによって上清を除去する
・ＦＢ０２（緩衝液の組成については以下を参照されたい）２００μｌおよびＰＥＧＸ０１（緩衝液の組成については以下を参照されたい）２００μｌに再浮遊させる
・１３０００〜１６０００ｒｆｃ、室温（２０〜２５℃）で３５分間遠心分離する
・ＦＢ０１（緩衝液の組成については以下を参照されたい）１００μｌに再浮遊させる
・ペレットを完全に溶解するために、シェーカーにおいて、室温の暗所で８〜１６時間、好ましくは１０時間（この場合、一晩）、６００ｒｐｍでインキュベートする
・さらなる使用のために４℃で保存する（可能であれば最長１２ヶ月、しかし本発明の場合では保存はわずか数日であった）。
【０２０７】
本発明の場合、ＤＮＡナノ構造のＰＥＧ精製を使用したが、別の方法では本質的にアガロースゲル電気泳動の後にゲルからＤＮＡナノ構造を抽出することによって精製を実施することが可能である。アガロースゲル電気泳動に基づく精製は、例えば以下のように実施することができる：
・１．５質量／体積％アガロースゲルを調製する
・５×オレンジＧローディング緩衝液を試料に添加する
・氷中で冷却しながら４．５Ｖ／ｃｍの電圧で１．５時間電気泳動する
・ＤＮＡオリガミバンドを有するゲルの小片を切り出す。オリガミバンドは、約２ｍｍの幅を有し、任意に、隣接するレーンにスキャフォールド鎖をローディングし、それをＦｒｅｅｚｅ  ‘Ｎ  Ｓｑｕｅｅｚｅ（商標）ＤＮＡゲル抽出スピンカラム（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ）に入れ、室温、１０５０ｒｃｆで４．５分間遠心分離することによって、より容易に同定することが可能である。
【０２０８】
使用した緩衝溶液
ＰＥＧＸ０１：
・１５％  ＰＥＧ  ８０００
・１×ＴＡＥ（トリス酢酸ＥＤＴＡ緩衝液：４０ｍＭトリス、２０ｍＭ酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）
・１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
・５００ｍＭ  ＮａＣｌ
ＦＢ０１：
・１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０
・１ｍＭ  ＥＤＴＡ
・１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
ＦＢ０２：
・１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０
・１ｍＭ  ＥＤＴＡ
・１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
【０２０９】
ＤＮＡオリゴプール：
それぞれの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を調製するために、オリゴマーを、以下のプールにおいてその配列番号（角括弧内の数字はそれぞれの配列番号を示す）に基づいて組み合わせた：
オリゴプール＿３Ｄ−Ｓ１：［１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２７７、２８６、２８７、２８８、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、４６９、４７８、４７９、４８０、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、２６５、２７４、２７５、２７６、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、３０１、３１０、３１１、３１２、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、２５３、２６２、２６３、２６４、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２８９、２９８、２９９、３００、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、２４１、２５０、２５１、２５２、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２］
【０２１０】
オリゴプール＿３Ｄ−Ｓ２：［１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２７７、２８６、２８７、２８８、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、４８１、４９０、４９１、４９２、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、３３７、３４６、３４７、３４８、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３６１、３７０、３７１、３７２、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３２５、３３４、３３５、３３６、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３４９、３５８、３５９、３６０、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、２４１、２５０、２５１、２５２、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２］
【０２１１】
オリゴプール＿３Ｄ−Ｓ３：［１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２７７、２８６、２８７、２８８、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、４９３、５０２、５０３、５０４、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、３８５、３９４、３９５、３９６、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、４０９、４１８、４１９、４２０、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、３７３、３８２、３８３、３８４、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３９７、４０６、４０７、４０８、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、２４１、２５０、２５１、２５２、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２］
【０２１２】
（実施例２）
比較のための２Ｄ  ＤＮＡナノ構造の調製
１．調製した２Ｄ  ＤＮＡナノ構造の説明
それぞれが、同じ２Ｄ  ＤＮＡナノ構造内のそれぞれの最も近い色素分子に対して対の距離が５ｎｍである４８個の色素分子を有する長方形の２Ｄ  ＤＮＡナノ構造（そのような２Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、例えば国際公開第００２０１６１４０７２７号の図１Ａに示される）を、３つのバリアント、すなわちバリアント２Ｄ＿１、２Ｄ＿２、および２Ｄ＿３で調製した：
・２Ｄ  ＤＮＡナノ構造バリアント２Ｄ＿１：赤色蛍光：
２Ｄ＿１  ＤＮＡナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する４８個のＤＮＡステープル鎖（配列Ｓ１と呼ぶ）、ならびにそれぞれがＡｔｔｏ６４７Ｎ色素と共に提供される４８個の関連するフルオロフォアアダプター（オリゴマー、配列番号１２５９）を含む。フルオロフォアアダプターの結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムＣａＤＮＡｎｏにおいて、それらがすべて、長方形の同じ側に位置し、およびそれらが互いに有意に相互作用しないように十分な互いからの距離を有するという基準に従って選択した。色素アダプターは、３’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が長方形の表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。２Ｄ＿１  ＤＮＡナノ構造は、設計に従って、構造の周縁部に沿って位置するＴ１標的アダプター（オリゴマー配列番号１２６６）と共に提供された。２Ｄ＿１  ＤＮＡナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、さらに以下の定義オリゴプール２Ｄ＿Ｓ１に要約する。鎖ｐ７２４９（配列番号１２５７）をスキャフォールド鎖として使用した。
【０２１３】
・２Ｄ  ＤＮＡナノ構造バリアント２Ｄ＿２：緑色蛍光：
２Ｄ＿２  ＤＮＡナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する４８個のＤＮＡステープル鎖（配列Ｓ２と呼ぶ）、ならびにそれぞれがＡｔｔｏ５６５色素と共に提供される４８個の関連するフルオロフォアアダプター（オリゴマー配列番号１２６０）を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムＣａＤＮＡｎｏにおいて、それらがすべて、長方形の同じ側に位置し、およびそれらが互いに有意に相互作用しないように十分な互いからの距離を有するという基準に従って選択した。色素アダプターは、３’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が長方形の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。２Ｄ＿２  ＤＮＡナノ構造は、設計に従って、構造の周縁部に沿って位置するＴ２標的アダプター（オリゴマー配列番号１２６７）と共に提供された。使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール２Ｄ＿Ｓ２に要約する。鎖ｐ７２４９（配列番号１２５７）をスキャフォールド鎖として使用した。
【０２１４】
・２Ｄ  ＤＮＡナノ構造バリアント２Ｄ＿３：青色蛍光：
２Ｄ＿３  ＤＮＡナノ構造は、赤色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する４８個のＤＮＡステープル鎖（配列Ｓ３と呼ぶ）、ならびにそれぞれがＡｔｔｏ４８８色素と共に提供される４８個の関連するフルオロフォアアダプター（オリゴマー配列番号１２６１）を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムＣａＤＮＡｎｏにおいて、それらがすべて、長方形の同じ側に位置し、およびそれらが互いに有意に相互作用しないように十分な互いからの距離を有するという基準に従って選択した。色素アダプターは、３’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が長方形の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。２Ｄ＿３  ＤＮＡナノ構造は、設計に従って、構造の周縁部に沿って位置するＴ３標的アダプター（オリゴマー配列番号１２６８）と共に提供された。使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、さらに以下の定義オリゴプール２Ｄ＿Ｓ３に要約する。鎖ｐ７２４９（配列番号１２５７）をスキャフォールド鎖として使用した。
２．調製プロトコール：
本実施例では、２Ｄ  ＤＮＡナノ構造２Ｄ＿１〜３を以下に記載の調製プロトコールに従って調製した。
【０２１５】
２Ｄ  ＤＮＡナノ構造２Ｄ＿１〜３の調製のために、最初に以下の成分を混合して最終体積２００μｌを得た：
・１０ｎＭ  ｐ７２４９スキャフォールド鎖（配列番号１２５７）
・１００ｎＭのそれぞれのステープル鎖（ＤＮＡナノ構造２Ｄ＿１についてオリゴプール２Ｄ＿Ｓ１からの配列番号、ＤＮＡナノ構造２Ｄ＿２についてオリゴプール２Ｄ＿Ｓ２からの配列番号、ＤＮＡナノ構造２Ｄ＿３についてオリゴプール２Ｄ＿Ｓ３からの配列番号）
・１２０ｎＭ蛍光色素改変ＤＮＡオリゴ（ＤＮＡナノ構造２Ｄ＿１について配列番号１２５９、ＤＮＡナノ構造２Ｄ＿２について配列番号１２６０、およびＤＮＡナノ構造２Ｄ＿３について配列番号１２６１）
・４００ｎＭ標的結合ＤＮＡオリゴ（ＤＮＡナノ構造２Ｄ＿１について配列番号１２６６、ＤＮＡナノ構造２Ｄ＿２について配列番号１２６７、およびＤＮＡナノ構造２Ｄ＿３について配列番号１２６８）
・１×緩衝液ＦＢ０２（緩衝液の組成については実施例１を参照されたい）
【０２１６】
ＤＮＡナノ構造をその形状に折り畳ませるために、上記で言及した混合物を最初に加熱して、存在する可能性がある二次構造を融解した後、塩基の対形成が熱平衡を見出し、それに従って計画される立体構造を見出すことができるように徐々に冷却する。この目的のために、以下のサーマルサイクラープログラムを使用した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ＧｅｒｍａｎｙによるＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｎｅｘｕｓ  Ｘ２を使用して）：
・６５℃で１５分間維持し、１分以内に６０℃に冷却する
・６０℃から２０℃に一定の速度で１時間減少させる
・１分以内に４℃に冷却し、４℃で保存する。
【０２１７】
次に、正しく折り畳まれた２Ｄ  ＤＮＡナノ構造を単一のＤＮＡオリゴマーまたはより小さいＤＮＡオリゴマー複合体から分離した。この目的のために、以下のＰＥＧ精製（ポリエチレングリコールによる精製）を使用した：
・サーマルサイクラー由来の液体を同じ体積のＰＥＧＸ０１（緩衝液の組成については以下を参照されたい）と混合する
・１３０００〜１６０００ｒｆｃ、室温（２０〜２５℃）で３５分間遠心分離する
・ＦＢ０１  ２００μｌおよびＦＢ０２（緩衝液の組成については実施例１を参照されたい）２００μｌに再浮遊させる
・１３０００〜１６０００ｒｆｃ、室温（２０〜２５℃）で３５分間遠心分離する
・ＦＢ０１  １００μｌに再浮遊させる
・シェーカーにおいて、室温（２０〜２５℃）の暗所で一晩、６００ｒｐｍでインキュベートする
・さらなる使用のために−２０℃（例えば、最長３年）または４℃（例えば、最長１２ヶ月）で保存する（本発明の場合では保存はわずか数日であった）。
同様に、この場合、ＰＥＧに基づく精製の代替として、実施例１で言及したアガロースゲル電気泳動に基づく精製を、原則として使用することが可能である：
【０２１８】
使用したＤＮＡオリゴプール：
それぞれの２Ｄ  ＤＮＡナノ構造の調製のために、オリゴマーを、以下のプールにおいてその配列番号に基づいて組み合わせた（角括弧内の数字はそれぞれの配列番号を示す）
オリゴプール＿２Ｄ−Ｓ１：［５２９、５３８、５３９、５４０、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５６３、５７２、５７３、５７４、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、６２３、６３２、６３３、６３４、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６５７、６６６、６６７、６６８、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６９３、７０２、７０３、７０４、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７１４、７１５、７１６、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７８７、７９６、７９７、７９８、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８０８、８０９、８１０、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、５７５、５８４、５８５、５８６、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５９６、５９７、５９８、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、６６９、６７８、６７９、６８０、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６９０、６９１、６９２、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、５４１、５４８、５４９、５５０、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５６０、５６１、５６２、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、６３５、６４２、６４３、６４４、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６５４、６５５、６５６、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６］
【０２１９】
オリゴプール＿２Ｄ−Ｓ２：［５２９、５３８、５３９、５４０、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５６３、５７２、５７３、５７４、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、６２３、６３２、６３３、６３４、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６５７、６６６、６６７、６６８、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、５０５、５１４、５１５、５１６、５０６、５０７、５０８、５１０、５１２、５１４、５１５、５１６、５１７、５２６、５２７、５２８、５１８、５１９、５２０、５２２、５２４、５２６、５２７、５２８、５９９、６０８、６０９、６１０、６００、６０１、６０２、６０４、６０６、６０８、６０９、６１０、６１１、６２０、６２１、６２２、６１２、６１３、６１４、６１６、６１８、６２０、６２１、６２２、６９７、６９９、７０１、７０９、７１１、７１３、７９１、７９３、７９５、８０３、８０５、８０７、９５１、９６０、９６１、９６２、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９７２、９７３、９７４、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、１０４５、１０５４、１０５５、１０５６、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１０５６、１０５７、１０６６、１０６７、１０６８、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６５、１０６６、１０６７、１０６８、５４１、５４８、５４９、５５０、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５６０、５６１、５６２、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、６３５、６４２、６４３、６４４、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６５４、６５５、６５６、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６］
【０２２０】
オリゴプール＿２Ｄ−Ｓ３：［５２９、５３８、５３９、５４０、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５６３、５７２、５７３、５７４、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、６２３、６３２、６３３、６３４、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６５７、６６６、６６７、６６８、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、５０５、５１４、５１５、５１６、５０６、５０７、５０８、５１０、５１２、５１４、５１５、５１６、５１７、５２６、５２７、５２８、５１８、５１９、５２０、５２２、５２４、５２６、５２７、５２８、５９９、６０８、６０９、６１０、６００、６０１、６０２、６０４、６０６、６０８、６０９、６１０、６１１、６２０、６２１、６２２、６１２、６１３、６１４、６１６、６１８、６２０、６２１、６２２、６９７、６９９、７０１、７０９、７１１、７１３、７９１、７９３、７９５、８０３、８０５、８０７、５７５、５８４、５８５、５８６、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５９６、５９７、５９８、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、６６９、６７８、６７９、６８０、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６９０、６９１、６９２、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、１１０５、１１１２、１１１３、１１１４、１１０６、１１０７、１１０８、１１０９、１１１０、１１１１、１１１２、１１１３、１１１４、１１１５、１１２４、１１２５、１１２６、１１１６、１１１７、１１１８、１１１９、１１２０、１１２１、１１２２、１１２３、１１２４、１１２５、１１２６、１１９９、１２０６、１２０７、１２０８、１２００、１２０１、１２０２、１２０３、１２０４、１２０５、１２０６、１２０７、１２０８、１２０９、１２１８、１２１９、１２２０、１２１０、１２１１、１２１２、１２１３、１２１４、１２１５、１２１６、１２１７、１２１８、１２１９、１２２０］
【０２２１】
（実施例３）
実施例１の３Ｄナノ構造および実施例２の２Ｄ  ＤＮＡナノ構造による標的構造の検出の比較
１．概要
本明細書に記載の例における、標的構造を有する同定構造およびそれぞれの結合したＤＮＡナノ構造が、キャリア（本発明の場合、カバースリップの表面）の表面に結合する、および／または結合しているその実施形態において、標的構造をどのように良好に、本発明の方法による本発明の２Ｄ  ＤＮＡナノ構造または３Ｄ  ＤＮＡナノ構造によって検出することができるかを比較するために、同じ標的ＤＮＡオリゴマーを標的構造として使用し、一方で実施例２に記載したバリアント２Ｄ＿１、２Ｄ＿２、および２Ｄ＿３（２Ｄ試料）の赤色、緑色、および青色２Ｄ  ＤＮＡナノ構造の結合に基づいて、および他方で実施例１に記載のバリアント３Ｄ＿１、３Ｄ＿２、および３Ｄ＿３の赤色、緑色、および青色３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の結合に基づいて検出した。加えて、両方の実験について対照実験を実施し、標的構造が存在しない場合に、偽陽性の検出がカバースリップの表面上で起こるか否か、およびどの程度起こるかをチェックする。比較は、色素分子の最適化されて良好に認識された位置により、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が顕微鏡カバースリップの表面に対してはるかにより少ない程度に接着することを示している。
【０２２２】
２．材料および方法：
標的構造（本発明の場合、標的ＤＮＡオリゴマー、要するに標的オリゴマー）を検出するために、これらを最初に、適した緩衝液中でそれぞれのＤＮＡナノ構造（すなわち、２Ｄ＿１、２Ｄ＿２、および２Ｄ＿３、または３Ｄ＿１、３Ｄ＿２、および３Ｄ＿３）および捕捉鎖と共にハイブリダイゼーション反応において、これらのすべての成分が、互いに結合して同定構造を形成することができるようにインキュベートした（図１、１ｋを参照されたい）。これを、２Ｄおよび３Ｄ  ＤＮＡナノ構造について個別に実施した。
【０２２３】
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を有する試料について、以下の成分を有する溶液中でハイブリダイゼーションを実施した：
・実施例１に記載のＤＮＡナノ粒子あたり２００ｐＭのＤＮＡナノ粒子３Ｄ＿１〜３の４μｌ混合物
・２×緩衝液ＲＸ０７（組成については以下を参照されたい）１０μｌ
・ビオチンアダプターを有する２０ｎＭキャリアアダプター（本明細書において、捕捉鎖とも呼ぶ）（配列番号１２６２）１μｌ、この場合ビオチンアダプターを有する捕捉鎖（５’末端でビオチンによって改変されている）はＥｕｒｏｆｉｎｓ社によって提供される
・７５０ｐＭ一本鎖標的ＤＮＡオリゴマー（配列番号１２６９）１μｌ。このオリゴマーは、Ｔ１、Ｔ２、およびＴ３について相補的な領域を有し、それによって３Ｄ  ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿１、３Ｄ＿２、および３Ｄ＿３が、それぞれのＴ１、２、および３領域によって標的ＤＮＡオリゴマーの対応する相補的領域に、ならびに捕捉鎖の場合は相補的領域に結合することができる。標的構造およびそれぞれの結合領域は、３つすべての３Ｄ  ＤＮＡオリゴマーならびに捕捉鎖が、標的ＤＮＡオリゴマーに同時に結合することができるように設計された。対照実験では、この体積をＨ2Ｏと交換した。
・Ｈ2Ｏ  ４μｌ。
これを３０℃で１６時間インキュベートし、捕捉鎖、標的オリゴマー、および３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を互いに結合させた。
【０２２４】
２Ｄ  ＤＮＡナノ構造を有する試料の場合、ハイブリダイゼーションを、同じ成分を有する溶液中で実施したが、実施例１に従うＤＮＡナノ粒子あたり２００ｐＭのＤＮＡナノ粒子３Ｄ＿１〜３の４μｌ混合物の代わりに、実施例２に従うＤＮＡナノ粒子あたり２００ｐＭのＤＮＡナノ粒子２Ｄ＿１〜３の４μｌ混合物を使用した。この場合も同様に、３つすべての２Ｄ  ＤＮＡナノ構造、ならびに捕捉鎖が標的オリゴマーに確実に結合することができた。使用した標的ＤＮＡオリゴマーはまた、配列番号１２６９の配列を有した。２Ｄ  ＤＮＡナノ構造についても、標的ＤＮＡオリゴマーを含有しない対照反応を実施した。このように、全体で４つの実験を実施した。
【０２２５】
測定について、それぞれの実験の捕捉鎖を、それぞれの顕微鏡試料キャリアの顕微鏡表面に置いた。ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＶＩ0.1型のμスライドを、顕微鏡試料キャリアとして使用した。この目的に関して、これを試料として顕微鏡スライドの調製に関する以下のプロトコールに従って処置した：
・μスライドＶＩ0.1（ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ）を、緩衝液Ａ（組成については、以下を参照されたい）によってすすいだ。
・１ｍｇ／ｍｌビオチン化ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｍｂＨ）４０μｌをμスライドの対応するチャネルの第１のチャネル末端にピペッティングし、２分間インキュベートし、μスライドの対応するチャネルの他の第２のチャネル末端を通して流体をピペッティングによって除去し、緩衝液Ａ  １００μｌを上記の第１のチャネル末端にピペッティングし、流体をピペッティングによって上記の第２のチャネルを通して除去する。
・０．５ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）４０μｌを上記の第１のチャネル末端にピペッティングし、２分間インキュベートし、ピペッティングによって上記の第２のチャネル末端を通して除去し、緩衝液Ａ  １００μｌを上記の第１のチャネルにピペッティングし、ピペッティングによって上記の第２のチャネル末端を通して流体を除去する。
・緩衝液Ｂ（組成については以下を参照されたい）１００μｌを上記の第１のチャネルにピペッティングし、ピペッティングによって上記の第２のチャネル末端を通して流体を除去する、
・上記のステップからのハイブリダイズした溶液（２Ｄ試料プローブについて２Ｄナノ構造を有する溶液、または３Ｄ試料について３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を有する溶液、または標的ＤＮＡオリゴマーを有しない対応する対照実験）４０μｌを、上記の第１のチャネル末端にピペッティングする。１５分間インキュベートする。この間に、捕捉鎖のビオチンは、表面に結合したストレプトアビジンに結合する。加えて、ＤＮＡナノ構造の一部は表面に非特異的に接着する、これは、意図的ではなく、２Ｄ  ＤＮＡナノ構造では、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造より有意に頻繁に起こる。上記の第２のチャネル末端を通してピペッティングによって除去する。
・緩衝液ＲＸ０７（組成については以下を参照されたい）２００μｌを上記の第１のチャネルにピペッティングすることによって、非結合ＤＮＡナノ構造を洗浄し、ピペッティングによって上記の第２のチャネル末端を通して除去する。
・緩衝液ＲＸ０７（組成については以下を参照されたい）５０μｌを上記の第１のチャネル末端にピペッティングする。
【０２２６】
上記のステップが終了すると、２つの試料、１つは２Ｄ試料であり、１つは３Ｄ試料が得られた。その上、２Ｄおよび３Ｄナノ構造の両方についてそれぞれの対照（標的ＤＮＡを有しない）が存在した。上記の方法においてビオチン−ＢＳＡ、ストレプトアビジン、および標的構造の選択した濃度の組み合わせを、個々の同定構造がその後の解析において容易に解像され得るように選択した。
【０２２７】
次に、２つの試料中の同定構造を、落射蛍光顕微鏡によって撮像した。この目的のために、「Ｅｌｉｔｅ」顕微鏡（ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ）を使用した。「Ｔｉ  Ｅｃｌｉｐｓｅ」型（Ｎｉｋｏｎ）の顕微鏡の使用もまた考えられる。使用したカメラはｓＣＭＯＳカメラ（ＰＣＯによるｅｄｇｅ４．２）であり、ピクセルサイズは６．５μｍであった。倍率１００倍および開口数１．４の対物レンズにより、ピクセル解像度６０ｎｍが与えられ、すなわち画像における１ピクセルは実際の６０ｎｍに対応する。このように、ＤＮＡナノ構造の回折限界画像を得た。フィルターセットは、赤色の励起についてＣｈｒｏｍａ４９９１４、緑色の励起についてＣｈｒｏｍａ４９００８、青色の励起についてＣｈｒｏｍａ４９０２０であった。
２Ｄ試料および３Ｄ試料の両方について、ならびに標的ＤＮＡを有しない２つの対照について色毎に１０個の画像を得た。色を連続的に撮像した。これらの画像のそれぞれは、他の画像の区分と重複せず、チャネル幅に沿って平均値の半分に位置する試料の特定の区分で撮影した。
【０２２８】
それぞれの試料の関連する１０個の画像を解析した。本明細書に提示する解析の目的は、標的ＤＮＡを有するそれぞれの試料および標的ＤＮＡを有しないそれぞれの試料において検出されたスポット数をと比較すること、ならびに／または多色スポットと比較した単色スポットの数を明記することである。解析を、手作業によって実施した。この目的のために、画像を、画像処理プログラムＦＩＪＩ（ｗｗｗ．ｆｉｊｉ．ｓｃ）によって開き、単色スポット数、３色スポット数、ならびに蛍光スポット総数を計数した。２Ｄ  ＤＮＡナノ構造および３Ｄ  ＤＮＡナノ構造について、それぞれの１０個の画像の異なるパラメーターの平均値および標準偏差を決定し、図３にプロットした。
【０２２９】
本実施例では適用されていないが、手作業での解析の代わりに特にプログラムされた解析ソフトウェアを使用することが可能である。本実施例では、プログラムされた解析ソフトウェアはパイソンベースである。パイソンベースの解析ソフトウェアは、測定データをロードし、９〜１５ピクセルサイズ（対物レンズの倍率および開口数に応じて）の画像ボックスにおける極大値を決定し、シグナルのノイズ非依存的測定値として勾配の累積絶対値を計算する。ＤＮＡナノ構造を有するおよび有しない画像ボックスを区別するために、ＤＢＳＣＡＮ（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｂａｓｅｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｉｓｅ）（Ester, Martin; Kriegel, Hans-Peter; Sander, Jorg; Xu, Xiaowei "A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise", Proceedings of the Second International Conference on Knowledge Discovery and Data Mining(KDD-96) AAAI Press. pp. 226-231(1996）において公表）を使用する。任意に、画像ボックスを、異なる数のフルオロフォアに従う分類に対応する勾配の累積絶対値の値が異なる群に分配する。その横（ｘ、ｙ）位に基づいて、画像における多色スポットを認識するために、それぞれの色チャネルのＤＮＡナノ構造を有する画像ボックスを、他の色チャネルのＤＮＡナノ構造を有するすべての画像ボックスと比較する。本明細書において提示するパイソンベースのソフトウェアを使用する解析の目的はまた、標的ＤＮＡオリゴマーを有するおよび有しない実験において検出されたスポットの数を比較すること、および／または多色スポットと比較した単色スポットの数を明記することである。ソフトウェアは、さらなる使用のために、単色スポットの数ならびに画像におけるその位置について決定された値、ならびに多色スポットの数の値ならびに画像におけるその位置について決定された値を保存する。
【０２３０】
３．結果および考察：
記載の方法に関するＤＮＡナノ構造の適切性を評価するために、標的ＤＮＡオリゴマーを有する対応する試料との比較において、どれほど多くのＤＮＡナノ構造がそれぞれの対照（標的ＤＮＡオリゴマーを有しない）に見出されるかを測定した（図３の上部）。これによって、標的構造の存在下の試料中で測定されたＤＮＡナノ構造の割合が表面に結合した非特異的ナノ構造によるものであったという結論に達した。３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、顕微鏡試料キャリアの顕微鏡表面に対して有意により低い程度（２Ｄの４．０％と比較して３Ｄでは１．２％）の非特異的接着を示すことが見出された。３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のエラーバー（標準偏差）は、ゼロの線と交差し、このように、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造では、非特異的結合率が一連の測定の解像限界より下であることを示している。
【０２３１】
どれほど多くの３色スポット、すなわち標的分子として解釈することができるデータポイントが、標的ＤＮＡオリゴマーを有する試料と比較した場合に対照において見出され得るか、再度２Ｄ対照と比較した場合に２Ｄ試料において見出され得るか、および３Ｄ対照と比較した場合に３Ｄ試料において見出され得るかをさらに測定した。これは、２Ｄ  ＤＮＡナノ構造の場合および３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の場合の偽陽性によって認識される標的構造に関する情報を提供する。対照における３色測定ポイントの存在は、例えば異なるＤＮＡナノ構造の外向きに露出した色素の相互作用によって引き起こされ得る。これは、内向きに配置された色素を有する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を設計することによって回避された。図３（中央）は、２Ｄ  ＤＮＡナノ構造について０．７％および３Ｄ  ＤＮＡナノ構造について０．０％の結果を示す。３Ｄの場合、偽陽性測定は１つも行われなかった。このように、結果は、標的構造に結合する複数のＤＮＡナノ構造を使用することにより、測定される偽陽性シグナルが非常に低くなることを示す。結果はさらに、本発明の内向きに配置された蛍光色素分子を有する３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、実施例で使用したキャリア表面との相互作用がより少ないことを示している。これは、３Ｄ構造内部のその位置が原因である。
【０２３２】
別のパラメーターは、標的ＤＮＡオリゴマーを有する測定ポイントの総数における３色測定ポイントのパーセンテージである。これを、画像解析の結果に基づいて２Ｄ試料および３Ｄ試料の両方について計算し、図３（下部）に表す。反応速度論により、同定構造は、ある特定の状況下でごく部分的にハイブリダイズすると予測される。これは、例えばＤＮＡナノ構造の濃度が、ハイブリダイゼーション反応の期間内で反応が飽和するほど十分に高くない場合に起こり得る。反応が測定時に飽和でない場合、内部標準のまたは経験的データに基づく絶対的定量化が可能である。内部標準は、好ましくは公知の濃度を有する基準値を示すが、経験的データは、好ましくは不飽和測定と飽和測定との間の比較を可能にする。しかし、相対的測定（本明細書において実施される）の場合、標的構造に部分的にハイブリダイズする同定構造の割合は、標的構造および３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の実施形態に依存しないことから、これは適切ではなく、このため、これらの中で完全にハイブリダイズした同定構造の相対度数が、後者における標的構造の相対度数と同じである。なおもこの点において、２Ｄおよび３Ｄナノ構造は、サイズが類似であることにより同等である。しかし、互いに結合したＤＮＡナノ構造ならびに表面に非特異的に結合したＤＮＡナノ構造は、結果を劇的に変化させ得る。これは、図３（下部）において明らかであり、この場合２Ｄ  ＤＮＡナノ構造では、表面上の測定ポイントの６．８％のみが認識可能な構造であると考えられ得るが、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造では、２５．７％が認識可能な構造であると考えられ得る。このように、顕微鏡表面は、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造では２Ｄ  ＤＮＡナノ構造より効率的に使用することができる。
【０２３３】
要約すると、本発明の３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、２Ｄ  ＤＮＡナノ構造と比較して、顕微鏡試料キャリアの顕微鏡表面に非特異的に接着する傾向が３倍超低く、互いに接着する傾向が劇的に定量不可能なほど低いことに注目することができる。３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の面積使用効率はほぼ４倍高い。
本発明の方法は、特異性を増加させるためにＤＮＡナノ構造の複数の結合を使用し、すなわちこれは偽陽性同定率を低減させる。１つのみのＤＮＡナノ構造結合による測定法では、この比率は、図３（上部）に示すように高く、すなわち４．０％（２Ｄ）および１．２％（３Ｄ）であるが、本発明の方法では０．７％（２Ｄ）および０％（３Ｄ）である。
【０２３４】
使用した緩衝液
ＲＸ０７緩衝液
・４×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１５ｍＭクエン酸三ナトリウムの水溶液からなり、ＨＣｌによってｐＨ７．０に調節したクエン酸ナトリウム緩衝食塩水）
・５％硫酸デキストラン
・０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
・５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ
緩衝液Ａ
・１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
・１００ｍＭ  ＮａＣｌ
・０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０
緩衝液Ｂ
・１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０
・１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2
・１ｍＭ  ＥＤＴＡ
・０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０
【０２３５】
（実施例４）
組織試料に基づく遺伝子発現解析
本明細書において、例えば乳房腫瘍の組織試料を、複数のマーカー遺伝子、例えばＨｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＴＦＲＣ、ＧＡＰＤＨ等などの１００個の遺伝子の発現について解析する。
組織試料を最初に、例えば酵素的におよび／または剪断力によって単細胞浮遊液に溶解することができる。
次に細胞を、例えば機械によって、溶解緩衝液によって、酵素的および／もしくは化学的に、または光によって破壊してもよい。
溶解物を、さらに処理し、例えばＲＮＡを抽出し、成分を濾過し、核酸を例えばエタノール沈殿によって単離することができる。あるいは、溶解物をさらなる使用に直接供することができる。
【０２３６】
溶解物、すなわち少なくとも２つのナノレポーター（解析される遺伝子に対応するそれぞれのｍＲＮＡ配列について設計された）、一部の応用では基質結合アダプター（標的アダプター）および反応緩衝液を混合し、十分な期間、例えば１２時間インキュベートし、複合体（同定構造）を形成する。
次に、複合体を、一部の応用において表面上または溶液中で検出する
検出および同定された個々のｍＲＮＡ配列を計数することによって、相対的遺伝子発現を決定することが可能であり、例えばｍＲＮＡ１が２００回検出され、ｍＲＮＡ２が３００回検出される場合、遺伝子２の遺伝子発現は、遺伝子１の発現より３／２倍高い。
加えて、インキュベーションステップにおける参照として、既知濃度の既定のナノレポーター（ｍＲＮＡ配列と完全に同等である）に結合する核酸を添加することが可能である。これによって、検出された他のｍＲＮＡ配列の正規化および絶対的な定量化が可能となる。この基準値が、例えば１００ｐＭの初回濃度で１００回同定される場合、ｍＲＮＡ１の濃度は、２００ｐＭであると決定することができる。
【０２３７】
（実施例５）
タンパク質の検出
タンパク質標的分子の検出および同定は、核酸標的分子の検出および同定と類似の方法で実施することができる。
前提条件は、タンパク質標的分子が、対応する結合体（抗体、アプタマー、ナノボディ、アディロン）が結合することができる少なくとも２つの区別可能なエピトープを保有することである。
【０２３８】
これらのアダプターは、それらを同定するナノレポーターに特異的に結合することができる。この目的のために、タンパク質ベースの結合体（抗体、アディロン、ナノボディ）を、特異的な短い（１５〜３５ヌクレオチド）ＤＮＡ配列（ＳＮＡＰタグ、ＨＡＬＯタグ、クリックケミストリー、ＳＭＣＣリンカー、ＮＨＳ／アミノ反応等によって）によって改変することができ、その逆相補体が対応するＤＮＡナノ構造（ナノレポーター）に結合し、このようにアダプターとなる。核酸ベースの結合体（ＲＮＡまたはＤＮＡアプタマー）は、対応する配列をアダプターの中に伸長させることができ、その逆相補体が対応するＤＮＡナノ構造に結合する。
タンパク質標的分子およびアダプターをＤＮＡナノ構造において十分な反応時間で混合することによって、標的タンパク質およびそれぞれがＤＮＡナノ構造にカップリングされた少なくとも２つのアダプターからなる検出可能な複合体が形成される。
複合体は、少なくとも２つのＤＮＡナノ構造の同時検出によって同定することができる。
【０２３９】
２つのタンパク質標的の検出例
抗体Ａおよび抗体Ｂにそれぞれ結合する、エピトープＡおよびエピトープＢを有するタンパク質標的１。
抗体Ｃおよび抗体Ｄにそれぞれ結合する、エピトープＣおよびエピトープＤを有するタンパク質標的２。
抗体Ａは、赤色蛍光色素によって標識されたＤＮＡナノ構造にカップリングされる。
抗体Ｂは、緑色蛍光色素によって標識されたＤＮＡナノ構造にカップリングされる。
抗体Ｃは、黄色蛍光色素によって標識されたＤＮＡナノ構造にカップリングされる。
抗体Ｄは、青色蛍光色素によって標識されたＤＮＡナノ構造にカップリングされる。
タンパク質標的およびカップリングした抗体／ＤＮＡナノ構造を混合し、反応を十分な期間、例えば１２時間行う。
【０２４０】
フロー検出における複合体の測定。反応溶液を、極めてまれな場合に限って１つより多くの複合体が検出されるように希釈する。赤色／緑色の同時検出は、１つの単一のタンパク質標的１を同定し、黄色／青色の同時検出は、１つの単一のタンパク質標的２を同定する。前回の較正後、異なる検出を計数することによって、タンパク質標的１および２を定量化することが可能である。
同じ方法によって、タンパク質のクラスターを同定することが可能であり、この場合、異なる抗体は、標的クラスターにおける異なるタンパク質（異なるエピトープの代わりに）を同定する。
【０２４１】
（実施例６）
３つの遺伝子の遺伝子発現解析
方法の特に好ましい実施形態を証明するために、ＨｅＬａ細胞の遺伝子ＧＡＰＤＨ、ＴＦＲＣ、およびＡＣＴＢの遺伝子発現解析をより詳細に記載する。このように、遺伝子ＧＡＰＤＨ、ＴＦＲＣ、およびＡＣＴＢのｍＲＮＡは、標的構造であり、ＨｅＬａ細胞は宿主体である。
【０２４２】
この目的のため、適したセットの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造を調製する。これは３Ｄ  ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿１＿１、３Ｄ＿１＿２、３Ｄ＿２＿１、３Ｄ＿２＿２、３Ｄ＿３＿１、および３Ｄ＿３＿２からなる。これらは、実施例１に記載される３Ｄ  ＤＮＡナノ構造３Ｄ＿１、３Ｄ＿２、および３Ｄ＿３と類似であるが、以下の差を有する：３Ｄ＿１＿１の場合、組成は３Ｄ＿１に関する組成であり、差は、使用した標的結合ＤＮＡオリゴがＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの領域と部分的に相補的であること（配列番号１２６３の代わりに配列番号１２７０）であり、３Ｄ＿１＿２の場合、組成は３Ｄ＿２に関する組成であり、差は、使用した標的結合オリゴが、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの別の領域と部分的に相補的であること（配列番号１２６４の代わりに配列番号１２７６）であり、３Ｄ＿２＿１の場合、組成は３Ｄ＿１に関する組成であり、差は、使用した標的結合ＤＮＡオリゴが、ＴＦＲＣ（配列番号１２６３の代わりに配列番号１２７１）のｍＲＮＡの領域と部分的に相補的であり、３Ｄ＿２＿２の場合、組成は３Ｄ＿３に関する組成であり、差は、使用した標的結合ＤＮＡオリゴが、ＴＦＲＬのｍＲＮＡの別の領域の部分と部分的に相補的であること（配列番号１２６５の代わりに配列番号１２７７）であり、３Ｄ＿３＿１の場合、組成は、３Ｄ＿２に関する組成であり、差は、使用した標的結合ＤＮＡオリゴが、ＡＣＴＢのｍＲＮＡの領域と部分的に相補的であること（配列番号１２６４の代わりに配列番号１２７２）であり、および３Ｄ＿３＿２の場合、組成は、３Ｄ＿３に関する組成であり、差は、使用した標的結合ＤＮＡオリゴが、ＡＣＴＢのｍＲＮＡの別の領域と部分的に相補的であること（配列番号１２６５の代わりに配列番号１２７８）である。
【０２４３】
マイクロウェルチャンバーを、本実施例のために使用する。前記チャンバーは、厚さ１７０μｍのクオーツウェーハの第１層および液体ガラスの第２層を有するマイクロウェルアレイを含む。本発明のすべての実施形態について一般的に可能である液体ガラスの組成は以下の通りである：４９体積％ＨＥＭＡ（単量体、ヒドロキシエチルメタクリレート）；５体積％ＴＥＧＤＡ（ポリマー、テトラ（エチレングリコール）ジアクリレート）；１８体積％ＰＯＥ（溶解培地、フェノキシエタノール）、２８体積％エアロゾルＯＸ５０（シリカナノパウダー）；０．５質量％ＤＭＰＡＰ（光開始剤、２，２ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（例えば、F. Kotz et al, "Three-dimensional printing of transparent fused silica glass", Nature 2017, 544(7650)、337-339、おおびF. Kotz et al. "Liquid Glass: A Facile Soft Replication Method for Structuring Glass", Advanced Materials 2016, 28, 4646-4650を参照されたい）。本明細書では、マイクロウェルチャンバーの第３層は、第２層に接着するｉｂｉｄｉ粘着スライドＶＩ０．４（ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨ）によって形成される。あるいは、他の接着剤または他の接着技術を使用することができる。第３層は、キャビティを形成するための凹部を含む。第１層、第２層、および第３層は、それらが既に記載した様式に従ってマイクロウェルと共に作業キャビティを形成するように配置される。この場合、マイクロウェルを含む作業キャビティの体積は、例えば４０マイクロリットルである。
【０２４４】
次のステップとして、緩衝液Ａ中の１ｍｇ／ｍｌビオチン化ＢＳＡの溶液（ビオチン−ＢＳＡ：製品Ａ８５４９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｍｂＨ）を、作業キャビティの中に流し、１０分間インキュベートする。次に、緩衝液Ａ（処方は以下を参照されたい）０．５ｍｌによるすすぎステップが続く。次に、緩衝液Ａ中のストレプトアビジン溶液を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で流し、１０分間インキュベートする。インキュベーション期間に、ストレプトアビジンの少なくとも一部がマイクロウェルの表面に結合する。
次に、緩衝液Ａ  ０．５ｍｌによるすすぎステップおよび緩衝液ＲＸ０７（処方は以下を参照されたい）０．５ｍｌによるさらなるすすぎステップが続く。その後、ＲＸ０７中の１ｎＭビオチン−アダプターオリゴ（配列番号１２６２）をその中に流し、１０分間インキュベートする。インキュベーション期間の間に、ビオチン−アダプターオリゴの少なくとも一部が、ビオチン−ストレプトアビジン結合によって、表面に結合したストレプトアビジンに結合し、このようにして、それ自身が表面に結合する。
【０２４５】
次に、緩衝液ＲＸ０７  ０．５ｍｌによるすすぎステップが続く。その後、それぞれが緩衝液ＲＸ０７中で１ｎＭの濃度の配列番号１２７３、１２７４、および１２７５（以下を参照されたい）を有する溶液をその中に流し、１０分間インキュベートすると、配列番号１２７３、１２７４、および１２７５が、ビオチン−アダプターオリゴ配列番号１２６２に結合する。
次に、緩衝液ＲＸ０７  ０．５ｍｌによるすすぎステップの後、１ミリリットルあたり細胞１００万個の密度を有する細胞浮遊液をその中に流す。細胞浮遊液の緩衝液は、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、組成については以下を参照されたい）である。細胞を、１０分間マイクロウェルに沈める。
【０２４６】
次に、マイクロウェルチャンバーおよび正確に１つの細胞によって占有されるマイクロウェルの選択を、さらなる解析のために顕微鏡に適用する。顕微鏡上でマイクロウェルチャンバーを整列させることはまた、より早期の時点で、例えば記載のステップの非常に早期に行うことができる。好ましくは、顕微鏡はその後のすべての顕微鏡解析ステップにとって適している。あるいは、異なる顕微鏡を、異なる顕微鏡技術のために使用することができる。次に、個々のマイクロウェルを、それらが複数の細胞を含むか、正確に１つに細胞を含むか、または細胞を含まないかによって分類する。正確に１つの細胞を含むマイクロウェルのみを、その後の解析において考慮する。前記分類は、任意の適した顕微鏡技術、好ましくは明視野、位相差、暗視野、またはＤＩＣ（回折干渉位相差）顕微鏡または蛍光顕微鏡、中でも好ましくは落射蛍光顕微鏡、ＴＩＲＦ顕微鏡、ドットスキャニング共焦点顕微鏡、スピンディスク共焦点顕微鏡、光シート顕微鏡によって行うことができる。
【０２４７】
次に、破壊緩衝液、より正確には溶解緩衝液（処方については以下を参照されたい）をマイクロウェルチャンバーに添加し、３０分間インキュベートする。それによって細胞を溶解し、その中におそらく含有される標的構造を放出する。次に、標的構造は、個々のマイクロウェルの底部でキャリアアダプターに結合し、その中で標的構造が放出された。
ＲＸ０７  ０．５ｍｌによるすすぎステップの後、標的構造は底部との結合によりマイクロウェルに残っており、ＲＸ０７中のそれぞれ５０ｎＭの３Ｄ＿１＿１、３Ｄ＿１＿２、３Ｄ＿２＿１、３Ｄ＿２＿２、３Ｄ＿３＿１、および３Ｄ＿３＿２の溶液を注入し、６０分間インキュベートする。インキュベーションの間、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の多くが対応する標的構造に結合する。
ＲＸ０７のそれぞれ０．５ｍｌによる３回のすすぎステップが後に続く。
【０２４８】
次に、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造において使用した波長を含む、解析のために既に選択したマイクロウェルの底部に近い領域の蛍光の記録を行う。本実施例では、３個のみの遺伝子を解析したことから、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造は、２つのタイプの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造、すなわち本明細書において３Ｄ＿１＿１および３Ｄ＿２＿１が、第１の色、好ましくは赤色を有するように、２つの第２のタイプの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造、すなわち本明細書において３Ｄ＿１＿２および３Ｄ＿３＿１が、第２の色、好ましくは緑色を有するように、ならびにおよび２つの第３のタイプの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造、すなわち本明細書において３Ｄ＿２＿２および３Ｄ＿３＿２が、第３の色、好ましくは青色を有するように選択することができる。
次に、それぞれの色スポットを、解析のために選択した各マイクロウェルにおいて検索する評価、すなわち標的構造の検出および／または定量化を実施する。赤色−緑色スポットはＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを表し、赤色−青色スポットはＴＦＲＣ  ｍＲＮＡを表し、および緑色−青色スポットはＡＣＴＢ  ｍＲＮＡを表す。
【０２４９】
マイクロウェルあたりの検出された色スポット数の２つの散布図での表示により、必要に応じてさらなる評価が可能となる。第１の散布図では、マイクロウェルあたりの検出スポットの数を、赤色対緑色でプロットし、第２の散布プロットでは、マイクロウェルあたりの検出スポット数を、緑色対青色（またはあるいは赤色対青色）でプロットする。例えば、解析した３つの遺伝子ならびに細胞の異なる亜集団についての遺伝子発現レベルを、散布プロットから推定することができる。
【０２５０】
実施例６の処方：
緩衝液Ａ：実施例３の緩衝液Ａを参照されたい
ＲＸ０７緩衝液：実施例３のＲＸ０７緩衝液を参照されたい
溶解緩衝液
・２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５
・１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
・１ｍＭ  ＥＤＴＡ
・１ｍＭ  ＥＧＴＡ
・１％プロテアーゼ阻害剤カクテル、哺乳動物細胞用のＰ−８３４０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水）
・１３７ｍＭ  ＮａＣｌ
・２．７ｍＭ  ＫＣｌ
・１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4
・１．８ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4
【０２５１】
配列番号
配列番号１２７０  Ｔ４＿ｇａｐｄｈ
ＴＴＧＴＧＴＣＧＴＧＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴ
配列番号１２７１  Ｔ４＿ｔｆｒｃ
ＴＴＧＴＧＴＣＧＴＧＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＡＧＣＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＡＡＴＣＴＴＡＡＣ
配列番号１２７２  Ｔ４＿ａｃｔｂ
ＴＴＧＴＧＴＣＧＴＧＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧ
配列番号１２７３  キャリアアダプター＿ｇａｐｄｈ
ＧＣＣＡＴＧＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＧＧＴＴＧＴＡＣＴＧＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣ
配列番号１２７４  キャリアアダプターｔｆｒｃ
ＣＡＣＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＴＧＴＡＣＴＧＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣ
配列番号１２７５  キャリアアダプターａｃｔｂ
ＡＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＴＴＣＧＴＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＴＴＣＧＧＴＴＧＴＡＣＴＧＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣ
配列番号１２７６  Ｔ５＿ｇａｐｄｈ
ＴＴＧＴＧＴＣＧＴＧＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＴｃｔｇｇｇｔｇｇｃａｇｔｇａｔｇｇｃａｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｔｃａｔｇａｇｔｃｃｔ
配列番号１２７７  Ｔ５＿ＴＦＲＣ
ＴＴＧＴＧＴＣＧＴＧＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴａｃｃｃａｔｃｔｔｔｔａａｇａｃｃａｔａｔｃｔｇａｇａａｃａｔｃｔｇｇｇｃ
配列番号１２７８  Ｔ５＿ＡＣＴＢ
ＴＴＧＴＧＴＣＧＴＧＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＴＴｃａｇｔｇｔａｃａｇｇｔａａｇｃｃｃｔｇｇｃｔｇｃｃｔｃｃａｃｃｃ
【図１】
2021509013.tif 000003
【図２】
2021509013.tif 000004
【図３】
2021509013.tif 000005
【図４Ａ】
2021509013.tif 000006
【図４Ｂ】
2021509013.tif 000007
【図５】
2021509013.tif 000008
【図６】
2021509013.tif 000009
【図７】
2021509013.tif 000010
【配列表】
2021509013000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月8日(2020.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的構造の検出のための方法であって、
ｐ１）正確に１つの宿主体が少なくとも１つのマイクロウェルに存在するような、標的構造を有する宿主体を含む宿主体の群のマイクロウェルアレイへの導入；
ｐ２）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の少なくとも１つのマイクロウェルへの導入であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含む、導入；
ａ）（ｉ）標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが標的構造に特異的に結合し、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、少なくとも１つのマイクロウェル中で、同定構造を形成するステップ；
ｂ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる標的構造の検出
を含み、
３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらがそれぞれの同定構造中で結合しない場合に、ａ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、少なくとも２つの単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれの蛍光シグナルと区別可能であるように選択され、同定構造が、第１の表面に結合する、方法。
【請求項２】
宿主体が、細胞、ウイルス、エキソソーム、小胞および／または液滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的構造が宿主体中に存在し、方法が、
ｃ）宿主体から標的構造を放出させるための、宿主体の破壊
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的構造が、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
蛍光顕微鏡のためのマイクロウェルアレイであって、複数のマイクロウェルを含み、それぞれのマイクロウェルが底部および周囲壁を含み、底部が、蛍光顕微鏡に適しており、
マイクロウェルアレイが、
マイクロウェルの底部を形成する蛍光顕微鏡に適している第１の層とマイクロウェルの壁を形成する、第１の層に適用される第２の層とをさらに含む、マイクロウェルアレイ。
【請求項６】
１つまたは複数のキャリアアダプターが、少なくとも１つのマイクロウェルの底部に結合する、請求項５に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項７】
第２の層が、ＳＵ−８を含み、および／またはそれからなる、請求項５または６のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイ。
【請求項８】
マイクロウェルアレイが、請求項５〜７のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイであり、第１の表面が、少なくとも１つのマイクロウェルの底部であり、標的構造が、標的構造に特異的に結合するキャリアアダプターの媒介によって、マイクロウェルの底部に結合する、および／または結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｆ）マイクロウェルアレイの上面を、第２の層に油層を適用することによって閉じるステップであって、油が脂質を含んでいてもよい、ステップ
をさらに含み、
ｇ）マイクロウェルアレイ上に水溶液を注ぐことによって油を排出するステップであって、水溶液が、膜チャネルを含んでいてもよい、ステップ
をさらに含んでいてもよい、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
互いに異なる１つまたは複数のさらなる標的構造の検出にさらに追加で適しており、異なる標的構造が、対で異なり、
標的構造のそれぞれについて、ステップｐ１）における宿主体の群が、関連する標的構造を有する少なくとも１つの宿主体を含み；
方法が、
ｃ）互いに異なる１つまたは複数のさらなる標的構造のそれぞれについて、
それぞれ割り当てられた同定構造を形成するステップであって、さらなる同定構造のそれぞれが、
（ｉ）それぞれの割り当てられたさらなる標的構造、および
（ｉｉ）少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造であって、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、１つまたは複数の内向きに配置された蛍光色素分子を含み、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、それぞれのさらなる標的構造に特異的に結合し、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、それぞれの標的構造の対で異なる領域に結合する、少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含む、ステップ
をさらに含み、
ステップａ）が、
ｄ）少なくとも１つの蛍光シグナルを測定することによる、１つまたは複数のさらなる標的構造の検出をさらに含み、
すべての３Ｄ  ＤＮＡナノ構造および蛍光測定のパラメーターが、それらが同定構造の１つの中で結合しない場合に、ａ）およびｃ）において形成された同定構造の少なくとも１つの測定された蛍光シグナルが、すべての単離された３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の蛍光シグナルと区別可能であり、すべての形成された同定構造の測定された蛍光シグナルが、互いに対で区別可能であるように選択され、異なる標的構造のそれぞれが、複数回存在していてもよく、方法が、１つまたは複数の異なる標的構造の複数の検出を含んでいてもよい、請求項１〜４または８〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｐ１）において、宿主体が、マイクロウェルアレイの上面に宿主体を含有する液体の容積を適用し、重力の効果を介して、宿主体がマイクロウェルの底部に沈む時間を与えることによって単離される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ａａ）少なくとも１つのマイクロウェル中でキャリアマトリックスを調製するステップ
をさらに含み、
ｂｂ）キャリアアダプターをキャリアマトリックスに付着させるステップ
をさらに含んでいてもよい、請求項１〜４または８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ｈ）マイクロウェルの周囲壁を、ステップｐ１）およびａ）の間、またはａ）およびｂ）の間に、底部から除去するステップ
を含む、請求項１〜４または９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のマイクロウェルアレイ；及び
少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造
を含むキットであって、３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれが、少なくとも１つの内向きに配置された蛍光色素分子を含む、キット。
【請求項１５】
少なくとも２つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造のそれぞれについて、少なくとも１つの内向きに配置された蛍光色素分子と３Ｄ  ＤＮＡナノ構造の周縁部との距離が、少なくとも２ｎｍ、であり、少なくとも１つの３Ｄ  ＤＮＡナノ構造が、少なくとも２つの内向きに配置された蛍光色素分子を含んでいてもよく、少なくとも２つの内向きに配置された蛍光色素分子の対の距離が、少なくとも２ｎｍである、請求項１４に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
単一細胞レベルでの遺伝子発現の分析のために、好ましくは、ポリマーマトリックスは、好ましくは宿主体を部分的または完全に包むキャリアとして使用される。この場合において、同定構造の形成は、好ましくは、以下を含む。
１）マイクロウェルに宿主体を提供する。
２）ポリマーマトリックス（すなわちキャリア）により宿主体を包む；ポリマーマトリックスが、非常に迅速な方法で生成され、その結果、宿主体の破壊の前に宿主体がその標的構造の組成を変化させることができないこと、またはポリマーマトリックスが、宿主体の標的構造の組成がこれによって影響されないように生成されることを確実にしなければならない。後者は、例えば、低融点のアガロースを使用することによって確実にすることができる。
３）宿主体を破壊する、例えば、宿主体が細胞である場合において、溶解（例えば、超音波、浸透もしくは凍結により機械的に；または例えば、ｐＨ値の改変、ＥＤＴＡ、例えば、リゾチームなどの酵素、トルオール、Ｔｒｉｔｏｎ−ＸもしくはＴｒｉｚｏｌの導入によって化学的に、これは細胞壁もしくは膜をすべて不安定化するか、または自己分解を誘導する）によって宿主体を破壊し、その結果、ｍＲＮＡは、宿主体から、例えば細胞に放出される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
・３Ｄ  ＤＮＡナノ構造バリアント３Ｄ＿２：緑色蛍光：
３Ｄ＿２  ＤＮＡナノ構造は、緑色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する６０個の内向きに配置されたＤＮＡステープル鎖（配列Ｓ２と呼ぶ）、およびそれぞれがＡｔｔｏ５６５色素分子と共に提供される６０個の関連するフルオロフォアアダプター（オリゴマー配列番号１２６０）を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムＣａＤＮＡｎｏにおいて、それらが、中空円柱体の内部に位置する、それらが中空円柱体の周縁部から２ｎｍ以下の距離に位置する、それらが中空円柱体の内部表面上で遊離の末端を有する、それらが互いに５ｎｍより大きい距離を有する（設計および配列の長さにより、後者の条件は上記の基準を満たすすべてのステープル鎖に当てはまる）という基準に基づいて選択した。色素アダプターは、３’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が中空円柱体の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。３Ｄ＿２ナノ構造は、Ｔ２標的アダプター（オリゴマー配列番号１２６４）と共に提供された。３Ｄ＿２ナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール３Ｄ＿Ｓ２に要約する。鎖ｐ７３０８（配列番号１２５８）をスキャフォールド鎖として使用した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
・３Ｄ  ＤＮＡナノ構造バリアント３Ｄ＿３：青色蛍光：
３Ｄ＿３  ＤＮＡナノ構造は、青色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する６０個の内向きに配置されたＤＮＡステープル鎖（配列Ｓ３と呼ぶ）、およびそれぞれがＡｔｔｏ４８８色素と共に提供される６０個の関連するフルオロフォアアダプター（オリゴマー配列番号１２６１）を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムＣａＤＮＡｎｏにおいて、それらが、中空円柱体の内部に位置する、それらが中空円柱体の周縁部から２ｎｍ以下の距離に位置する、それらが中空円柱体の内部表面上で遊離の末端を有する、それらが互いに５ｎｍより大きい距離を有する（設計および配列の長さにより、後者の条件は上記の基準を満たすすべてのステープル鎖に当てはまる）という基準に基づいて選択した。色素アダプターは、３’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が中空円柱体の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。３Ｄ＿３ナノ構造は、Ｔ３標的アダプター（オリゴマー配列番号１２６５）と共に提供された。３Ｄ＿３ナノ構造のために使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール３Ｄ＿Ｓ３に要約する。鎖ｐ７３０８（配列番号１２５８）をスキャフォールド鎖として使用した。
すべてのＤＮＡオリゴマー（蛍光色素と共に提供されるＤＮＡオリゴマーも同様に）を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨから得た。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
・２Ｄ  ＤＮＡナノ構造バリアント２Ｄ＿２：緑色蛍光：
２Ｄ＿２  ＤＮＡナノ構造は、緑色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する４８個のＤＮＡステープル鎖（配列Ｓ２と呼ぶ）、ならびにそれぞれがＡｔｔｏ５６５色素と共に提供される４８個の関連するフルオロフォアアダプター（オリゴマー配列番号１２６０）を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムＣａＤＮＡｎｏにおいて、それらがすべて、長方形の同じ側に位置し、およびそれらが互いに有意に相互作用しないように十分な互いからの距離を有するという基準に従って選択した。色素アダプターは、３’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が長方形の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。２Ｄ＿２  ＤＮＡナノ構造は、設計に従って、構造の周縁部に沿って位置するＴ２標的アダプター（オリゴマー配列番号１２６７）と共に提供された。使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、以下の定義オリゴプール２Ｄ＿Ｓ２に要約する。鎖ｐ７２４９（配列番号１２５７）をスキャフォールド鎖として使用した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
・２Ｄ  ＤＮＡナノ構造バリアント２Ｄ＿３：青色蛍光：
２Ｄ＿３  ＤＮＡナノ構造は、青色色素のためのフルオロフォアアダプターと相補的な追加の一本鎖配列を有する４８個のＤＮＡステープル鎖（配列Ｓ３と呼ぶ）、ならびにそれぞれがＡｔｔｏ４８８色素と共に提供される４８個の関連するフルオロフォアアダプター（オリゴマー配列番号１２６１）を含む。フルオロフォアアダプター結合のために伸長させるステープル鎖は、設計プログラムＣａＤＮＡｎｏにおいて、それらがすべて、長方形の同じ側に位置し、およびそれらが互いに有意に相互作用しないように十分な互いからの距離を有するという基準に従って選択した。色素アダプターは、３’末端で色素によって改変されている。この末端は、色素が長方形の内部表面に可能な限り近くに位置し、ほとんど余裕がなく、このように可能な限り互いに近づくことができないことが確保されるように選択された。色素アダプターについてはいくつかの改変もまた考えられるが、それらは費用がより高いことおよびその配置のある特定の制御が失われることを暗示している。２Ｄ＿３  ＤＮＡナノ構造は、設計に従って、構造の周縁部に沿って位置するＴ３標的アダプター（オリゴマー配列番号１２６８）と共に提供された。使用したすべてのステープル鎖の配列番号を、さらに以下の定義オリゴプール２Ｄ＿Ｓ３に要約する。鎖ｐ７２４９（配列番号１２５７）をスキャフォールド鎖として使用した。
２．調製プロトコール：
本実施例では、２Ｄ  ＤＮＡナノ構造２Ｄ＿１〜３を以下に記載の調製プロトコールに従って調製した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2021509013.tif 000011
【国際調査報告】
2021509013.tif 000012
2021509013.tif 000013
2021509013.tif 000014
2021509013.tif 000015
2021509013.tif 000016
2021509013.tif 000017
2021509013.tif 000018
2021509013.tif 000019
2021509013.tif 000020
2021509013.tif 000021