(57)【要約】本開示は、ワクシニアウイルスのＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株に由来する改変ワクシニアウイルスベクター、並びに多様ながんの処置のために、これを使用する方法に関する。本開示は、腫瘍溶解活性、感染の拡散、免疫回避、腫瘍における存続、外因性ＤＮＡ配列を組み込むための能力、大スケールの製造への適性、及び安全性の増強を含む、多様で有益な治療活性を呈する、改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ由来ワクシニアウイルスベクターを提示する。【選択図】  図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニアＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株のゲノムに由来する組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、前記組換えワクシニアウイルスゲノムが、少なくとも６つのワクシニア遺伝子の欠失を含み、１つのワクシニア遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｆ）：
ａ）Ｆ１Ｌ；
ｂ）Ｎ１Ｌ及びＢ１４Ｒ；
ｃ）Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、及びＫ７Ｒ；
ｄ）Ｃ２Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１６Ｒ、及びＢ１９Ｒ；
ｅ）Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、及びＦ２Ｌ；並びに
ｆ）Ｂ１５Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、及びＢ２０Ｒ
の各々に由来し、
前記ゲノムのＴＫ遺伝子及びＨＡ遺伝子が、欠失していない、核酸。
【請求項２】
前記欠失が、Ｆ１Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記欠失が、Ｎ１Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記欠失が、Ｂ１４Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記欠失が、Ｍ２Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
前記欠失が、Ｋ１Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
前記欠失が、Ｋ７Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
前記欠失が、Ｃ２Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項９】
前記欠失が、Ｎ２Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１０】
前記欠失が、Ｍ１Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１１】
前記欠失が、Ｋ２Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１２】
前記欠失が、Ｋ３Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記欠失が、Ｆ３Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１４】
前記欠失が、Ｂ１６Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１５】
前記欠失が、Ｂ１９Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１６】
前記欠失が、Ｋ４Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１７】
前記欠失が、Ｋ５Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１８】
前記欠失が、Ｋ６Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１９】
前記欠失が、Ｆ２Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２０】
前記欠失が、Ｂ１５Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２１】
前記欠失が、Ｂ１７Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２２】
前記欠失が、Ｂ１８Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２３】
前記欠失が、Ｂ２０Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２４】
前記欠失が、前記Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、及びＢ２０Ｒ遺伝子の各々の欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２５】
前記組換えワクシニアウイルスゲノムが、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、及びＢ２０Ｒからなる群から独立的に選択される、少なくとも１つの遺伝子の欠失を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２６】
前記組換えワクシニアウイルスゲノムが、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、及びＦ３Ｌからなる群から独立的に選択される、少なくとも１つの遺伝子の欠失を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２７】
前記欠失の各々が、対応するポリヌクレオチドをコードする全遺伝子の欠失である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２８】
前記欠失の各々が、遺伝子の一部の欠失であり、前記欠失が、宿主細胞に導入されると前記遺伝子によりコードされる前記ポリヌクレオチドを非機能性とするのに十分である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２９】
トランス遺伝子をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３０】
前記トランス遺伝子が、腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質、治療用ポリペプチド、又は治療用核酸をコードする、請求項２９に記載の核酸。
【請求項３１】
前記トランス遺伝子が、腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質をコードする、請求項３０に記載の核酸。
【請求項３２】
前記トランス遺伝子が、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質をコードする、請求項３０に記載の核酸。
【請求項３３】
前記トランス遺伝子が、治療用ポリペプチドをコードする、請求項３０に記載の核酸。
【請求項３４】
前記トランス遺伝子が、治療用核酸をコードする、請求項３０に記載の核酸。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のワクシニアウイルスゲノムによりコードされる、組換えワクシニアウイルス。
【請求項３６】
少なくとも１つのトランス遺伝子をコードするウイルスベクターである、請求項３３に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３７】
前記欠失が、対応するポリヌクレオチドをコードする全遺伝子の欠失である、請求項３７に記載の組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項３８】
前記欠失の各々が、遺伝子の一部の欠失であり、前記欠失が、宿主細胞に導入されると前記遺伝子によりコードされる前記ポリヌクレオチドを非機能性とするのに十分である、請求項３７又は３８に記載の組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項３９】
前記ベクターが、腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質、治療用ポリペプチド、若しくは治療用核酸、又は腫瘍溶解免疫活性の改善をもたらすタンパク質をコードするトランス遺伝子をさらに含む、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項４０】
前記トランス遺伝子が、腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質をコードする、請求項３９に記載の組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項４１】
前記トランス遺伝子が、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質をコードする、請求項３９に記載の組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項４２】
前記トランス遺伝子が、治療用ポリペプチドをコードする、請求項３９に記載の組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項４３】
前記トランス遺伝子が、治療用核酸をコードする、請求項３９に記載の組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項４４】
前記トランス遺伝子が、腫瘍溶解免疫活性の改善をもたらすタンパク質をコードする、請求項３９に記載の組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項４５】
前記ベクターが、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐである、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４６】
哺乳動物細胞の集団を前記核酸又は前記組換えワクシニアウイルスベクターと接触させると、前記細胞が、前記欠失を含まない形態のワクシニアウイルスベクターと接触した、同じ種類の哺乳動物細胞の集団と比べて、合胞体の形成の増大を呈する、請求項１に記載の核酸、又は請求項３７に記載の組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項４７】
哺乳動物細胞の集団を、前記核酸又は前記組換えワクシニアウイルスベクターと接触させると、前記細胞が、前記欠失を含まない形態のワクシニアウイルスベクターと接触した、同じ種類の哺乳動物細胞の集団と比べて、ワクシニアウイルスベクターの拡散の増大を呈する、請求項１に記載の核酸、又は請求項３７に記載の組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項４８】
前記核酸又は前記組換えワクシニアウイルスベクターが、哺乳動物細胞の集団に対する細胞傷害効果を、前記欠失を含まない形態のワクシニアウイルスベクターの細胞傷害効果と比べて増大させる、請求項１に記載の核酸、又は請求項３６に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４９】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項５０】
前記ヒト細胞が、がん細胞である、請求項４９に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルスベクター。
【請求項５１】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項３７に記載の組換えワクシニアウイルスベクターを含むパッケージング細胞株。
【請求項５２】
哺乳動物患者におけるがんを処置する方法であって、治療有効量の請求項１に記載の核酸、又は請求項３６に記載の組換えワクシニアウイルスを、前記患者に投与するステップを含む方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物患者が、ヒト患者である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記がんが、白血病、リンパ腫、肝臓がん、骨がん、肺がん、脳がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、心臓がん、子宮頸がん、子宮がん、頭頸部がん、胆嚢がん、喉頭がん、口唇口腔がん、眼がん、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、結腸直腸がん、精巣がん、及び咽頭がんからなる群から選択される、請求項５２又は５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記がんが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＣＭＬ）、副腎皮質癌腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、肝外がん、ユーイング肉腫ファミリー、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発性リンパ腫、脊索種、慢性骨髄増殖性新生物、結腸がん、肝外胆管がん、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、嗅神経芽腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵管がん、骨の線維性組織球腫、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間葉系腫瘍（ＧＩＳＴ）、精巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、小児性脳幹神経膠腫、有毛細胞白血病、肝細胞がん、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、膵島細胞腫瘍、膵内分泌腫瘍、ウィルムス腫瘍及び他の小児腎臓腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、小細胞肺がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、眼内黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、正中線癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞細胞腫、骨髄異形成症候群、鼻腔副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、上皮卵巣がん、胚細胞卵巣がん、低悪性度卵巣がん、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜がん、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、カポジ肉腫、横紋筋肉腫、セザリー症候群、小腸がん、軟部組織肉腫、咽頭がん、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、並びにワルデンシュトロームマクログロブリン血症からなる群から選択される、請求項５２又は５３に記載の方法。
【請求項５６】
請求項１に記載の核酸、又は請求項３６に記載の組換えワクシニアウイルスと、前記キットの使用者に、前記核酸又は前記ベクターを宿主細胞において発現させるように指示するパッケージ添付文書とを含むキット。
【請求項５７】
請求項１に記載の核酸、又は請求項３６に記載の組換えワクシニアウイルスと、使用者に、治療有効量の前記核酸又は組換えワクシニアウイルスベクターを、がんを有する哺乳動物患者に投与し、これにより、前記がんを処置するように指示するパッケージ添付文書とを含むキット。
【請求項５８】
前記哺乳動物患者が、ヒト患者である、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
Ｂ８Ｒ遺伝子が欠失している、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６０】
少なくとも１つのトランス遺伝子が、前記欠失したＢ８Ｒ遺伝子の遺伝子座に挿入されている、請求項５９に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６１】
少なくとも２つのトランス遺伝子が、前記欠失したＢ８Ｒ遺伝子の遺伝子座に挿入されている、請求項６０に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６２】
少なくとも３つのトランス遺伝子が、前記欠失したＢ８Ｒ遺伝子の遺伝子座に挿入されている、請求項６１に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６３】
少なくとも１つのさらなるトランス遺伝子が、Ｂ８Ｒ遺伝子の遺伝子座ではない遺伝子座に挿入されている、請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６４】
前記遺伝子座が、５ｐ欠失の境界である、請求項６３に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６５】
前記遺伝子座が、３ｐ欠失の境界である、請求項６４に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、がんなどの細胞増殖障害を処置するための免疫療法の分野に関する。特に、本発明は、遺伝子改変ワクシニアウイルス、並びにこれを作る方法及びこれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、腫瘍細胞を同定し、それらを、破壊のためにターゲティングするように刺激されうる。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを援用する免疫療法は、がん研究の領域において、急速に進化しつつある。腫瘍溶解性ウイルスについて、効率及び安全性を最大化するために、腫瘍選択性を操作及び／又は増強する、新たな手法が必要とされている。この選択性は、潜在的に毒性の治療剤又は遺伝子が、ウイルスに付加される場合に、とりわけ、重要である。
【０００３】
ワクシニアウイルスの、臨床における腫瘍溶解性ベクターとしての使用は、がん処置のために有望なパラダイムであるが、患者におけるポックス病変及び免疫抑制性の副作用などの毒性に起因して、最新の臨床候補物質の大半は、慎ましい臨床的成功を示したに過ぎない。より頑健な、ウイルスの複製、がん細胞の殺滅、及び感染地点からの拡散を呈する、ワクシニアウイルスを操作する方法が必要とされている。本発明は、改変ワクシニアウイルスを援用することにより、この必要に取組み、選択性及び安全性の限界に対する解決策を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、がんを処置するためのＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ由来ワクシニアウイルスベクターの使用について記載する。特に、本開示は、ワクシニアウイルスが、以下の遺伝子：Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、Ｂ２０Ｒ、Ｋ  ＯＲＦ  Ａ、Ｋ  ＯＲＦ  Ｂ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｅ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｆ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｇ、Ｂ２１Ｒ、Ｂ２２Ｒ、Ｂ２３Ｒ、Ｂ２４Ｒ、Ｂ２５Ｒ、Ｂ２６Ｒ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｒ、及びＢ２９Ｒのうちの一部又は全てにおいて、欠失を含有するように遺伝子改変された場合に認められる、腫瘍溶解活性、感染の拡散、及び安全性の結果の驚くべき増強に部分的に基づく。とりわけ、これらの遺伝子のうちの１つ若しくは複数、又は全てにおける変異を呈する、遺伝子改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ由来ワクシニアウイルスに由来するベクターは、腫瘍溶解能、腫瘍における複製、感染性、免疫回避、腫瘍における存続、外因性ＤＮＡ配列を組み込むための能力、及び大スケールの製造への適性の改善など、一連の有益な特徴を呈しうる。本開示は、Ｂ８Ｒ遺伝子において、欠失を含有するように、さらに遺伝子改変されたワクシニアウイルスについて記載する。下記で開示される、多様な実施形態では、本発明は、Ｂ８Ｒ遺伝子の欠失をさらに含みうる。多様な実施形態では、改変ワクシニアウイルスは、少なくとも１つのトランス遺伝子を発現させる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、少なくとも６つのワクシニア遺伝子の欠失を含み、１つのワクシニア遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｆ）：（ａ）Ｆ１Ｌ；（ｂ）Ｎ１Ｌ、及びＢ１４Ｒ；（ｃ）Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、及びＫ７Ｒ；（ｄ）Ｃ２Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１６Ｒ、及びＢ１９Ｒ；（ｅ）Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、及びＦ２Ｌ；（ｆ）Ｂ１５Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、及びＢ２０Ｒの各々に由来する、核酸を特徴とする。
【０００６】
一部の実施形態では、欠失は、各々が、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、Ｂ２０Ｒからなる群から独立的に選択される、少なくとも７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２の遺伝子を含む。一部の実施形態では、欠失は、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、Ｂ２０Ｒ遺伝子の各々を含む。多様な実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ８Ｒの欠失をさらに含みうる。
【０００７】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、及びＢ２０Ｒからなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、欠失は、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、及びＢ２０Ｒの各々を含む。多様な実施形態のうちのいずれか１つでは、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ８Ｒの欠失をさらに含みうる。
【０００８】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、及びＦ３Ｌからなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、欠失が、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、及びＦ３Ｌの各々を含む。多様な実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ８Ｒの欠失をさらに含みうる。
【０００９】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、カスパーゼ９阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、カスパーゼ９阻害剤をコードする遺伝子は、Ｆ１Ｌである。
【００１０】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、ＢＣＬ−２阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、ＢＣＬ−２阻害剤をコードする遺伝子は、Ｎ１Ｌである。
【００１１】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、ｄＵＴＰアーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、ｄＵＴＰアーゼをコードする遺伝子は、Ｆ２Ｌである。
【００１２】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、ＩＦＮアルファ／ベータ受容体様分泌型糖タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、ＩＦＮアルファ／ベータ受容体様分泌型糖タンパク質をコードする遺伝子は、Ｂ１９Ｒである。
【００１３】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、ＩＬ−１ベータ阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、ＩＬ−１ベータ阻害剤をコードする遺伝子は、Ｂ１６Ｒである。
【００１４】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、ホスホリパーゼＤをコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、ホスホリパーゼＤをコードする遺伝子は、Ｋ４Ｌである。
【００１５】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、ＰＫＲ阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、ＰＫＲ阻害剤をコードする遺伝子は、Ｋ３Ｌである。
【００１６】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする遺伝子は、Ｋ２Ｌである。
【００１７】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、ＴＬＲシグナル伝達阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一一部の実施形態では、ＴＬＲシグナル伝達阻害剤をコードする遺伝子は、Ｎ２Ｌである。
【００１８】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、ケルチ様タンパク質をコードする少なくとも１つ又は２つの遺伝子の欠失を有する。一部の実施形態では、ケルチ様タンパク質をコードする遺伝子は、Ｆ３Ｌ及びＣ２Ｌからなる群から独立的に選択される。
【００１９】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、モノグリセリドリパーゼをコードする少なくとも１つ又は２つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、モノグリセリドリパーゼをコードする遺伝子は、Ｋ５Ｌ及びＫ６Ｌからなる群から独立的に選択される。
【００２０】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムが、ＮＦ−κＢ阻害剤をコードする少なくとも１つ、２つ、又は３つの遺伝子の欠失を有する、核酸を特徴とする。一部の実施形態では、ＮＦ−κＢ阻害剤をコードする遺伝子は、Ｋ７Ｒ、Ｋ１Ｌ、及びＭ２Ｌからなる群から独立的に選択される。
【００２１】
一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、アンキリンリピートタンパク質の欠失をコードする少なくとも１つ、２つ、又は３つの遺伝子の欠失を有する。一部の実施形態では、アンキリンリピートタンパク質をコードする遺伝子は、Ｂ１８Ｒ、Ｂ２０Ｒ、及びＭ１Ｌからなる群から独立的に選択される。
【００２２】
一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１７Ｒ、及びＢ１４Ｒからなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、又は３つの遺伝子の欠失を有する。多様な実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ８Ｒの欠失をさらに含みうる。
【００２３】
一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ２１Ｒ、Ｂ２２Ｒ、Ｂ２３Ｒ、Ｂ２４Ｒ、Ｂ２５Ｒ、Ｂ２６Ｒ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｒ、及びＢ２９ＲからなるＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）遺伝子の群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つの遺伝子の欠失を有する。一部の実施形態では、欠失は、Ｂ２１Ｒ、Ｂ２２Ｒ、Ｂ２３Ｒ、Ｂ２４Ｒ、Ｂ２５Ｒ、Ｂ２６Ｒ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｒ、及びＢ２９Ｒの各々を含む。多様な実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ８Ｒの欠失をさらに含みうる。多様な実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ８Ｒの欠失をさらに含みうる。
【００２４】
一部の実施形態では、欠失のうちの１つ若しくは複数又は全ては、対応する遺伝子をコードする全ポリヌクレオチドの欠失である。一部の実施形態では、欠失のうちの１つ若しくは複数又は全ては、欠失が、宿主細胞に導入されると遺伝子を非機能性とするのに十分であるように、対応する遺伝子をコードするポリヌクレオチドの一部の欠失である。
【００２５】
一部の実施形態では、核酸は、腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質、治療用ポリペプチド、又は治療用核酸をコードするトランス遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、トランス遺伝子は、腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質をコードする。一部の実施形態では、トランス遺伝子は、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質をコードする。一部の実施形態では、トランス遺伝子は、治療用ポリペプチドをもたらすタンパク質をコードする。一部の実施形態では、トランス遺伝子は、治療用ポリペプチドをコードする。
【００２６】
別の態様では、本発明は、各々が、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、Ｂ２０Ｒ、Ｋ  ＯＲＦ  Ａ、Ｋ  ＯＲＦ  Ｂ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｅ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｆ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｇ、Ｂ２１Ｒ、Ｂ２２Ｒ、Ｂ２３Ｒ、Ｂ２４Ｒ、Ｂ２５Ｒ、Ｂ２６Ｒ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｒ、及びＢ２９Ｒからなる群から独立的に選択される、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２の遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、欠失は、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、Ｂ２０Ｒ、Ｋ  ＯＲＦ  Ａ、Ｋ  ＯＲＦ  Ｂ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｅ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｆ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｇ、Ｂ２１Ｒ、Ｂ２２Ｒ、Ｂ２３Ｒ、Ｂ２４Ｒ、Ｂ２５Ｒ、Ｂ２６Ｒ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｒ及びＢ２９Ｒの各々を含む。多様な実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ８Ｒの欠失をさらに含みうる。
【００２７】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む、組換えワクシニアウイルスベクターであって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、及びＢ２０Ｒからなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、欠失は、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、及びＢ２０Ｒの各々を含む。多様な実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ８Ｒの欠失をさらに含みうる。
【００２８】
別の態様では、本発明は、組換えワクシニアウイルスゲノムを含む、組換えワクシニアウイルスベクターであって、組換えワクシニアウイルスゲノムが、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、及びＦ３Ｌからなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６の遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、欠失は、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、及びＦ３Ｌの各々を含む。多様な実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ８Ｒの欠失をさらに含みうる。
【００２９】
別の態様では、本発明は、カスパーゼ９阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、カスパーゼ９阻害剤をコードする遺伝子は、Ｆ１Ｌである。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ＢＣＬ−２阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、ＢＣＬ−２阻害剤をコードする遺伝子は、Ｎ１Ｌである。
【００３１】
別の態様では、本発明は、ｄＵＴＰアーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、ｄＵＴＰアーゼをコードする遺伝子は、Ｆ２Ｌである。
【００３２】
別の態様では、本発明は、ＩＦＮアルファ／ベータ受容体様分泌型糖タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、ＩＦＮアルファ／ベータ受容体様分泌型糖タンパク質をコードする前記遺伝子は、Ｂ１９Ｒである。
【００３３】
別の態様では、本発明は、ＩＬ−１ベータ阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、ＩＬ−１ベータ阻害剤をコードする遺伝子は、Ｂ１６Ｒである。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ホスホリパーゼＤをコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、ホスホリパーゼＤをコードする遺伝子は、Ｋ４Ｌである。
【００３５】
別の態様では、本発明は、ＰＫＲ阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、ＰＫＲ阻害剤をコードする遺伝子は、Ｋ３Ｌである。
【００３６】
別の態様では、本発明は、セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、セリンプロテアーゼ阻害剤をコードする遺伝子は、Ｋ２Ｌである。
【００３７】
別の態様では、本発明は、ＴＬＲシグナル伝達阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。一部の実施形態では、ＴＬＲシグナル伝達阻害剤をコードする遺伝子は、Ｎ２Ｌである。
【００３８】
別の態様では、本発明は、ケルチ様タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。
【００３９】
一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、ケルチ様タンパク質をコードする少なくとも１つ又は２つの遺伝子の欠失を有する。一部の実施形態では、ケルチ様タンパク質をコードする遺伝子は、Ｆ３Ｌ及びＣ２Ｌからなる群から独立的に選択される。
【００４０】
別の態様では、本発明は、モノグリセリドリパーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。
【００４１】
一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、モノグリセリドリパーゼをコードする少なくとも１つ又は２つの遺伝子の欠失を有する。一部の実施形態では、モノグリセリドリパーゼをコードする遺伝子は、Ｋ５Ｌ及びＫ６Ｌからなる群から独立的に選択される。
【００４２】
別の態様では、本発明は、ＮＦ−κＢ阻害剤をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。
【００４３】
一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、ＮＦ−κＢ阻害剤をコードする少なくとも１つ、２つ、又は３つの遺伝子の欠失を有する。一部の実施形態では、ＮＦ−κＢ阻害剤をコードする遺伝子は、Ｋ７Ｒ、Ｋ１Ｌ、及びＭ２Ｌからなる群から独立的に選択される。
【００４４】
別の態様では、本発明は、アンキリンリピートタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失を有する、組換えワクシニアウイルスベクターを特徴とする。
【００４５】
一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、アンキリンリピートタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ又は３つの遺伝子の欠失を有する。一部の実施形態では、アンキリンリピートタンパク質をコードする遺伝子は、Ｂ１８Ｒ、Ｂ２０Ｒ、及びＭ１Ｌからなる群から独立的に選択される。
【００４６】
一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１７Ｒ、及びＢ１４Ｒからなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ又は３つの遺伝子の欠失を有する。
【００４７】
一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスベクターは、Ｂ２１Ｒ、Ｂ２２Ｒ、Ｂ２３Ｒ、Ｂ２４Ｒ、Ｂ２５Ｒ、Ｂ２６Ｒ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｒ、及びＢ２９ＲからなるＩＴＲ遺伝子の群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つの遺伝子の欠失を有する。多様な実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ８Ｒの欠失をさらに含みうる。
【００４８】
一部の実施形態では、欠失のうちの１つ若しくは複数又は全ては、対応する遺伝子をコードする全ポリヌクレオチドの欠失である。一部の実施形態では、欠失のうちの１つ若しくは複数又は全ては、欠失が、宿主細胞に導入されると遺伝子を非機能性とするのに十分であるように、対応する遺伝子をコードするポリヌクレオチドの一部の欠失である。
【００４９】
一部の実施形態では、ベクターは、腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質、治療用ポリペプチド、又は治療用核酸をコードするトランス遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、トランス遺伝子は、腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質をコードする。一部の実施形態では、トランス遺伝子は、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質をコードする。一部の実施形態では、トランス遺伝子は、治療用ポリペプチドをもたらすタンパク質をコードする。一部の実施形態では、トランス遺伝子は、治療用ポリペプチドをコードする。
【００５０】
一部の実施形態では、哺乳動物細胞の集団（例えば、ヒトがん細胞などのヒト細胞）を、核酸又はワクシニアウイルスベクターと接触させると、細胞は、例えば、本明細書で記載されるか、又は当技術分野で公知の顕微鏡法を使用して、目視により評価される、欠失を含まない形態のワクシニアウイルスベクターと接触した、同じ種類の哺乳動物細胞の集団と比べて、合胞体の形成の増大を呈する。
【００５１】
一部の実施形態では、哺乳動物細胞の集団（例えば、ヒトがん細胞などのヒト細胞）を、核酸又はワクシニアウイルスベクターと接触させると、細胞は、例えば、本明細書で記載されるか、又は当技術分野で公知のプラーク形成アッセイを使用して評価される、欠失を含まない形態のワクシニアウイルスベクターと接触した、同じ種類の哺乳動物細胞の集団と比べて、ワクシニアウイルスベクターの拡散の増大を呈する。
【００５２】
一部の実施形態では、核酸又は組換えワクシニアウイルスベクターは、例えば、本明細書で記載されるか、又は当技術分野で公知の細胞死アッセイを使用して評価される通り、哺乳動物細胞（例えば、ヒトがん細胞などのヒト細胞）の集団に対する細胞傷害効果を、欠失を含まない形態のワクシニアウイルスベクターの細胞傷害効果と比べて増大させる。
【００５３】
一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｕ２ＯＳ、２９３、２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＢＨＫ、ＢＳＣ４０、ＣＨＯ、ＯＶＣＡＲ−８、７８６−０、ＮＣＩ−Ｈ２３、Ｕ２５１、ＳＦ−２９５、Ｔ−４７Ｄ、ＳＫＭＥＬ２、ＢＴ−５４９、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫ−ＯＶ−３、ＭＣＦ７、Ｍ１４、ＳＦ−２６８、ＣＡＫＩ−１、ＨＰＡＶ、ＯＶＣＡＲ−４、ＨＣＴ１５、Ｋ−５６２、及びＨＣＴ−１１６からなる群から選択される細胞株に由来する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される態様又は実施形態のうちのいずれか１つによる、核酸又は組換えワクシニアウイルスベクターを含有すパッケージング細胞株を特徴とする。
【００５５】
別の態様では、本発明は、治療有効量の核酸又は組換えワクシニアウイルスベクターを、患者に投与することにより、哺乳動物患者におけるがんを処置する方法を特徴とする。
【００５６】
一部の実施形態では、哺乳動物患者は、ヒト患者である。
【００５７】
一部の実施形態では、がんは、白血病、リンパ腫、肝臓がん、骨がん、肺がん、脳がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、心臓がん、子宮頸がん、子宮がん、頭頸部がん、胆嚢がん、喉頭がん、口唇口腔がん、眼がん、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、結腸直腸がん、精巣がん、及び咽頭がんからなる群から選択される。
【００５８】
一部の実施形態では、がんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＣＭＬ）、副腎皮質癌腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、肝外がん、ユーイング肉腫ファミリー、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発性リンパ腫、脊索種、慢性骨髄増殖性新生物、結腸がん、肝外胆管がん、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、嗅神経芽腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵管がん、骨の線維性組織球腫、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間葉系腫瘍（ＧＩＳＴ）、精巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、小児性脳幹神経膠腫、有毛細胞白血病、肝細胞がん、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、膵島細胞腫瘍、膵内分泌腫瘍、ウィルムス腫瘍及び他の小児腎臓腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、小細胞肺がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、眼内黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、正中線癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞細胞腫、骨髄異形成症候群、鼻腔副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、上皮卵巣がん、胚細胞卵巣がん、低悪性度卵巣がん、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜がん、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、カポジ肉腫、横紋筋肉腫、セザリー症候群、小腸がん、軟部組織肉腫、咽頭がん、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、並びにワルデンシュトロームマクログロブリン血症からなる群から選択される。
【００５９】
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される態様又は実施形態のうちのいずれかによる核酸又はベクターと、キットの使用者に、核酸又はベクターを宿主細胞において発現させるように指示するパッケージ添付文書とを含有するキットを特徴とする。
【００６０】
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される態様又は実施形態のうちのいずれかによる核酸又はワクシニアウイルスベクターと、使用者に、治療有効量の核酸又は組換えワクシニアウイルスベクターを、がんを有する哺乳動物患者（例えば、ヒト患者）に投与し、これにより、がんを処置するように指示するパッケージ添付文書とを含有するキットを特徴とする。
【００６１】
定義
本明細書で使用される、「約」という用語は、記載される値を、１０％以内上回るか、又は下回る値を指す。例えば、「約５ｎＭ」という用語は、４．５ｎＭ〜５．５ｎＭの範囲を指し示す。
【００６２】
本明細書で使用される、「欠失させる」、「欠失」などの用語は、遺伝子、又はこれと関連するか、若しくはこれに作動的に連結された調節エレメント（例えば、プロモーターエレメント又はエンハンサーエレメントなどの転写因子結合性部位）への改変であって、遺伝子を除去するか、又は他の形で、遺伝子を非機能性とする改変を指す。本明細書で記載される、例示的な欠失は、標的遺伝子の、開始コドンから、終止コドンまで、目的の遺伝子をコードする核酸の全体の除去を含む。本明細書で記載される、欠失の他の例は、部分的に欠失した標的遺伝子が発現させると、産物（例えば、ＲＮＡ転写物、タンパク質産物、又はｍｉＲＮＡなどの調節性ＲＮＡ）が、非機能性となるか、又は標的遺伝子の野生型形態より低機能的となるような、標的遺伝子をコードする核酸の一部の除去（例えば、単一のヌクレオチド欠失など、１つ又は複数のコドン、又はそれらの一部の除去）を含む。本明細書で記載される、例示的な欠失は、標的遺伝子の発現を調節する、プロモーター及び／又はエンハンサーの核酸の全部又は一部など、目的の遺伝子と関連する、調節的エレメント（複数可）の全部又は一部の除去を含む。
【００６３】
本明細書で使用される、「内因性」という用語は、特定の生物（例えば、ヒト）又は生物内の特定の場所（例えば、臓器、組織、又はヒト細胞などの細胞）において、天然で見出される分子（例えば、ポリペプチド、核酸、又は補因子）について記載する。
【００６４】
本明細書で使用される、「配列同一性パーセント（％）」という用語は、配列をアライメントし、必要な場合、ギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した（例えば、ギャップは、最適のアライメントのために、候補配列及び参照配列の一方又は両方に導入される場合があり、比較を目的として、非相同配列は、無視されうる）後において、参照配列のアミノ酸（又は核酸）残基と同一な、候補配列のアミノ酸（又は核酸）残基の百分率を指す。配列同一性パーセントを決定することを目的とするアライメントは、当技術分野における技術の範囲内にある、多様な方式で、例えば、ＢＬＡＳＴ（ブラスト）ソフトウェア、ＡＬＩＧＮ（アライン）ソフトウェア、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（メガライン）（ＯＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、市販のコンピュータソフトウェアを使用して達成されうる。当業者は、比較される配列の全長にわたり、最大のアライメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための、適切なパラメータを決定することができる。例えば、候補配列との比較のためにアライメントされる参照配列は、候補配列が、候補配列の全長、又は候補配列の連続アミノ酸（又は核酸）残基の、選択された一部にわたり、５０％〜１００％の配列同一性を呈することを示しうる。比較を目的としてアライメントされる候補配列の長さは、例えば、参照配列の長さの、少なくとも３０％（例えば、３０％、４０、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％）でありうる。候補配列における５つの位置が、参照配列における対応する位置と同じアミノ酸残基により占有される場合、分子は、この位置において同一である。
【００６５】
本明細書で使用される、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書で記載される、特定の疾患又は状態（がん又は感染性疾患など）のための処置を施される生物を指す。対象及び患者の例は、疾患又は状態、例えば、がんなどの細胞増殖障害のための処置を施される、ヒトなどの哺乳動物を含む。
【００６６】
本明細書で使用される、「〜を処置する」又は「処置」という用語は、目標が、がんなどの細胞増殖障害の進行など、所望されない生理学的変化又は障害を防止又は緩徐化する（軽減する）ことである、治療的処置を指す。有益な臨床結果又は所望される臨床結果は、検出可能であれ、検出不能であれ、症状の緩和、疾患の広がりの消失、疾患状態の安定化（すなわち、非増悪）、疾患進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の改善又は軽減、及び寛解（部分寛解であれ、完全寛解であれ）を含むがこれらに限定されない。処置を必要とする者は、状態又は障害を既に伴う者、並びに状態若しくは障害を有しやすい者、又は状態若しくは障害が阻止されるべき者を含む。
【００６７】
本明細書で使用される、「ベクター」という用語は、核酸ベクター、例えば、プラスミドなどのＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルス、又は他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）を指す。外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、原核細胞又は真核細胞に送達するために、様々なベクターが開発されている。このような発現ベクターの例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第１９９４／１０２６号において開示されている。本発明の発現ベクターは、タンパク質の発現及び／又はこれらのポリヌクレオチド配列の、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）など、宿主細胞のゲノムへの組込みのために使用される、１つ又は複数のさらなる配列エレメントを含有しうる。本明細書で記載される抗体及び抗体断片の発現のために使用されうる、例示的なベクターは、遺伝子の転写を方向付ける、プロモーター領域及びエンハンサー領域などの調節配列を含有するプラスミドを含む。ベクターは、標的遺伝子の翻訳の速度をモジュレートするか、又は遺伝子の転写から生じるｍＲＮＡの安定性若しくは核からの移出を改善する核酸を含有しうる。これらの配列エレメントは、発現ベクターに保有される遺伝子の効率的な転写を方向付けるために、例えば、５’及び３’の非翻訳領域、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、並びにポリアデニル化シグナル部位を含みうる。本明細書で記載されるベクターはまた、このようなベクターを含有する細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドも含有しうる。適切なマーカーの例は、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、又はノーセオスリシンなどの抗生剤に対する耐性をコードする遺伝子を含む。
【００６８】
遺伝子の定義
本明細書で使用される「Ｃ２Ｌ」とは、ケルチ様タンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｃ２Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｃ２Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００６９】
本明細書で使用される「Ｃ１Ｌ」とは、ワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｃ１Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｃ１Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００７０】
本明細書で使用される「Ｎ１Ｌ」とは、ＢＣＬ−２阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｎ１Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｎ１Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００７１】
本明細書で使用される「Ｎ２Ｌ」とは、ＴＬＲシグナル伝達阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｎ２Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｎ２Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００７２】
本明細書で使用される「Ｍ１Ｌ」とは、アンキリンリピートタンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｍ１Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｍ１Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００７３】
本明細書で使用される「Ｍ２Ｌ」とは、ＮＦ−κＢ阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｍ２Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｍ２Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００７４】
本明細書で使用される「Ｋ１Ｌ」とは、ＮＦ−κＢ阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ１Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｋ１Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００７５】
本明細書で使用される「Ｋ２Ｌ」とは、アンキリンリピートタンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ２Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｋ２Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００７６】
本明細書で使用される「Ｋ３Ｌ」とは、ＰＫＲ阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ３Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｋ３Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００７７】
本明細書で使用される「Ｋ４Ｌ」とは、ホスホリパーゼＤをコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ４Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｋ４Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００７８】
本明細書で使用される「Ｋ５Ｌ」とは、モノグリセリドリパーゼをコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ５Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｋ５Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００７９】
本明細書で使用される「Ｋ６Ｌ」とは、モノグリセリドリパーゼをコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ６Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｋ６Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００８０】
本明細書で使用される「Ｋ７Ｒ」とは、ＮＦ−κＢ阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ７Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｋ７Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００８１】
本明細書で使用される「Ｆ１Ｌ」とは、カスパーゼ９阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｆ１Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｆ１Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００８２】
本明細書で使用される「Ｆ２Ｌ」とは、ｄＵＴＰアーゼをコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｆ２Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｆ２Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００８３】
本明細書で使用される「Ｆ３Ｌ」とは、ケルチ様タンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｆ３Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｆ１Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００８４】
本明細書で使用される「Ｂ１４Ｒ」とは、ワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１４Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３６〜４０に列挙される。「Ｂ１４Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００８５】
本明細書で使用される「Ｂ１５Ｒ」とは、ワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１５Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３６〜４０に列挙される。「Ｂ１５Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００８６】
本明細書で使用される「Ｂ１６Ｒ」とは、ＩＬ−１ベータ阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１６Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３１〜３５に列挙される。「Ｂ１６Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００８７】
本明細書で使用される「Ｂ１７Ｌ」とは、ワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１７Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３６〜４０に列挙される。「Ｂ１７Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００８８】
本明細書で使用される「Ｂ１８Ｒ」とは、アンキリンリピートタンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１８Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３６〜４０に列挙される。「Ｂ１８Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００８９】
本明細書で使用される「Ｂ１９Ｒ」とは、ＩＦＮアルファベータ受容体様分泌型糖タンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１９Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３６〜４０に列挙される。「Ｂ１９Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００９０】
本明細書で使用される「Ｂ２０Ｒ」とは、アンキリンリピートタンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ２０Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３６〜４０に列挙される。「Ｂ２０Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【００９１】
本明細書で使用される「Ｂ８Ｒ」とは、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）に対して相同性を有する分泌型タンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。ワクシニアウイルスのＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株における、例示的なＢ８Ｒ遺伝子によりコードされるタンパク質配列の非限定例は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース登録番号Ｐ２１００４に与えられており、下記にも再掲される：
【００９２】
MRYIIILAVLFINSIHAKITSYKFESVNFDSKIEWTGDGLYNISLKNYGIKTWQTMYTNVPEGTYDISAFPKNDFVSFWVKFEQGDYKVEEYCTGLCVEVKIGPPTVTLTEYDDHINLYIEHPYATRGSKKIPIYKRGDMCDIYLLYTANFTFGDSEEPVTYDIDDYDCTSTGCSIDFATTEKVCVTAQGATEGFLEKITPWSSEVCLTPKKNVYTCAIRKEDVPNFKDKMARVIKRKFNKQSQSYLTKFLGSTSNDVTTFLSMLNLTKYS
【００９３】
「Ｂ８Ｒ」という用語はまた、上記に列挙されたタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。バリアントは、限定せずに述べると、本明細書で開示される配列に対して、８５パーセント又はこれを超える同一性を有する配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ワクシニアウイルスのウイルス株を含む、５９のポックスウイルス株についての系統発生解析を示す図である。
【図２】異なる腫瘍型における、５つのワクシニアウイルスの継代後の、異なるウイルス株の存在度を示す図である。
【図３】ワクシニア野生型株が、多様で異なる患者腫瘍コアにおいて複製される能力を示す図である。
【図４】異なるワクシニア野生型株の、プラークサイズの測定を示す図である。
【図５】図５Ａは、ワクシニアＣｏｐｅｎｈａｇｅｎゲノムにおける、１ｋｂの領域にわたる、ＴＴＡＡ部位の数を示す図である。図５Ｂは、ワクシニアＣｏｐｅｎｈａｇｅｎゲノムにわたる、トランスポゾン挿入の頻度を示す図である。各ドットは、トランスポゾンによる、特定の遺伝子のノックアウトを表す。ｙ軸におけるドットの位置は、ノックアウトの頻度により決定される。図５Ｃは、５９のウイルスにおける、ポックスウイルス遺伝子の保存を示す図である。高度の保存は、遺伝子が、大半の種において存在することを指し示す。
【図６】許容状態のがん細胞における継代後の、多様なトランスポゾンノックアウトの頻度を示す図である。
【図７】精製されたトランスポゾンの、プラークサイズの測定を示す図である。
【図８】５ｐ欠失（ＣｏｐＭＤ５ｐ）及び３ｐ欠失（ＣｏｐＭＤ３ｐ）のゲノム構造を示す図である。ＣｏｐＭＤ５ｐと、ＣｏｐＭＤ３ｐと両方をかけ合わせて、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐを作出した。
【図９】多様な用量の、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ又はＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐの感染後における、がん細胞死を示すヒートマップである。
【図１０】４つの異なるがん細胞株における、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ及びＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐの複製の増殖曲線を示す図である。
【図１１】滴定により示される、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ及びＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐが、患者のｅｘ  ｖｉｖｏ試料において複製される能力を示す図である。
【図１２】改変ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐウイルスが、親ウイルスと異なるプラークを形成することを示す図である。中央図において、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐプラークの方がはるかに鮮明であり、合胞体（細胞融合）を見ることができる。
【図１３】ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐが、７８６−Ｏ細胞において、合胞体（細胞融合）を誘導することを示す図である。
【図１４】ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐが、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ野生型と同様に腫瘍の増殖を制御することが可能であるが、体重の減少を引き起こさないことを示す図である。
【図１５】ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐが、チミジンキナーゼの腫瘍溶解性ノックアウトを保有する、他の２つのワクシニア株（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ及びＷｙｅｔｈ）と比較した場合に、ポックス病変の形成を引き起こさないことを示す図である。
【図１６】ヌードＣＤ−１マウスにおける、全身投与後の、アイビス（ＩＶＩＳ）によるワクシニアの生体分布を示す図である。ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ（ＴＫ  ＫＯ）をコードするルシフェラーゼは、腫瘍特異的であり、オフターゲット組織において複製されない。
【図１７】全身投与後の、ワクシニアの生体分布を示す図である。ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐは、腫瘍では、他の腫瘍溶解性ワクシニアと同様に複製されるが、オフターゲットの組織／臓器では、それほど複製されない。
【図１８】ヒトＰＢＭＣにおける、ワクシニアの免疫原性を示す図である。ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐが、ヒト自然免疫細胞の活性化を誘導する能力は、野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎの能力より強力である。データは、フローサイトメトリー解析を介して収集した。
【図１９】マウス脾臓細胞における、ワクシニアの免疫原性を示す図である。ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐが、マウス自然免疫細胞の活性化を誘導する能力は、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎの能力より強力である。
【図２０】ヒト細胞における、ワクシニアの免疫原性を示す図である。ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐが、ＮＦ−ｋＢ免疫転写因子を活性化させる能力は、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ又はＶＶｄｄの能力より強力であるが、ＭＧ−１の能力と同等である。
【図２１】多様なワクシニア株において、５ｐメジャー欠失（左）及び３ｐメジャー欠失（右）を、デノボで作出するのに援用される、相同組換えターゲティング戦略についての概略表示である。
【図２２】野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス、及びいくつかの改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアビリオンが、多様な細胞株において増殖する能力を示す図である。
【図２３】クリスタルバイオレットアッセイ（上パネル）及びアラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）アッセイ（下パネル）により評価される、多様な細胞株における、野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス、及びいくつかの改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアビリオンの細胞傷害効果を示す図である。下パネルに示されるグラフのｘ軸に沿って、各細胞株について列挙された株の順序は、以下：左から右に、ＣｏｐＭＤ５ｐ、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ、ＣｏｐＭＤ３ｐ、及びＣｏｐＷＴの通りである。
【図２４】マウスへの投与時における、野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス、及びいくつかの改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアビリオンの分布を示す図である。
【図２５】野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス、及びいくつかの改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアビリオンが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化させ、抗腫瘍免疫を促進する能力を示す図である。
【図２６】野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス、及びいくつかの改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアビリオンが、ＮＫ細胞活性及び抗腫瘍免疫の尺度である、ＨＴ２９細胞に対する、ＮＫ細胞媒介性脱顆粒を増強する能力を示す図である。
【図２７】野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス、及びいくつかの改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアビリオンが、Ｔ細胞をプライミングして、抗腫瘍免疫応答を誘発する能力を示す図である。
【図２８】野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス、及びいくつかの改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアビリオンが、初期の感染点から、遠隔の場所に拡散する能力を示す図である。
【図２９】野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス、及びいくつかの改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアビリオンが、ウイルス増殖の尺度である、プラークを形成する能力を示す図である。
【図３０】野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス、及びいくつかの改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアビリオンが、７８６−Ｏ細胞において、プラークを形成する能力を示す図である。
【図３１】ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐにおいて欠失した遺伝子の、多様なポックスウイルスゲノム中の百分率を示す図である。
【図３２】がん細胞株と対比した、正常細胞株への、ＳＫＶ−Ｂ８Ｒ＋ウイルスの感染を示す図である。
【図３３】ＳＫＶ−Ｂ８Ｒ＋が、インターフェロンによるシグナル伝達を損なわないことを示す図である。
【図３４】ＳＫＶ（ＣｏｐＭＤ５ｐ３−Ｂ８Ｒ−）が、腫瘍のコントロールにおいて、ＳＫＶ−Ｂ８Ｒ＋と比較して、同等の効能を及ぼすことを示す図である。
【図３５】多様なワクシニア株において操作された、二重メジャー欠失が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、がん細胞の殺滅を増強することを示す図である。
【図３６】多様なワクシニア株を感染させたＨｅＬａ細胞についての、表現型の特徴付けを示す図である。
【図３７】５ｐ３ｐワクシニア株が、野生型株と比較して、体重の減少を誘導しないことを示す図である。
【図３８】５ｐ３ｐワクシニア株が、野生型株と比較して、ポックス病変を誘導しないことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
本発明は、遺伝子改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ由来ワクシニアウイルス、並びに多様ながんを処置するためのこれらの使用を特徴とする。本発明は、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株などのワクシニアウイルスが、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、Ｂ２０Ｒ、Ｋ  ＯＲＦ  Ａ、Ｋ  ＯＲＦ  Ｂ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｅ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｆ、Ｂ  ＯＲＦ  Ｇ、Ｂ２１Ｒ、Ｂ２２Ｒ、Ｂ２３Ｒ、Ｂ２４Ｒ、Ｂ２５Ｒ、Ｂ２６Ｒ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｒ、及びＢ２９Ｒのうちの１つ若しくは複数、又は全てにおいて、欠失を含有するように操作された場合に、腫瘍溶解活性、腫瘍における複製、感染性、免疫回避、腫瘍における存続、外因性ＤＮＡ配列を組み込むための能力、及び大スケールの製造への適性の顕著な改善を呈するという、驚くべき発見に、部分的に基づく。本発明の多様な実施形態では、改変ワクシニアウイルスは、Ｂ８Ｒ遺伝子の欠失を含有する。マウスでは不活性であるが、Ｂ８Ｒ遺伝子は、ヒトＩＦＮ−γの抗ウイルス活性を中和する。多様な実施形態では、その後、少なくとも１つのトランス遺伝子が、相同組換えターゲティング戦略を介して、Ｂ８Ｒ遺伝子の遺伝子座（今は欠失した）に挿入される。
【００９６】
本明細書で記載されるワクシニアウイルスは、広範にわたるがんを含む、様々な細胞増殖障害を処置するように、哺乳動物患者（例えば、ヒト患者）などの患者に投与されうる。以下の節は、ワクシニアウイルス及びこれに対する遺伝子改変、並びに遺伝子改変ワクシニアウイルスを作製し、繁殖させる方法と、これを、患者に投与するための技法とについて記載する。
【００９７】
ワクシニアウイルス
ワクシニアウイルスは、オルトポックスウイルス又はポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、コルドポックスウイルス亜科（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）、及びオルトポックスウイルス属（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）のメンバーである。オルトポックスウイルスは、コルドポックスウイルス亜科の他のメンバーより、比較的同種であり、ワクシニアウイルス種、天然痘ウイルス種（天然痘の病原物質）、牛痘ウイルス種、バッファロー痘ウイルス種、サル痘ウイルス種、マウス痘ウイルス種、及び馬痘ウイルス種のほか、他のウイルス種を含む、１１の顕著に異なるが、近縁である種（Ｍｏｓｓ、１９９６を参照されたい）を含む。本明細書で記載される、本発明のある特定の実施形態は、オルトポックスウイルス属の他のメンバーのほか、パラポックスウイルス属（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ）、アビポックスウイルス属（Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、カプリポックスウイルス属（Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、レポリポックスウイルス属（Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、スイポックスウイルス属（Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、モラスキポックスウイルス属（Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、及びヤタポックスウイルス属（Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ）に拡張されうる。オルトポックスウイルス属のファミリーは、一般に、実験動物における中和及び交差反応性を含む、血清学的手段により規定される。オルトポックスウイルス属の多様なメンバー、並びにコルドポックスウイルス亜科の他のメンバーは、宿主生物の免疫応答に対抗するように、本明細書で例が提示される、免疫調節性分子を利用する。
【００９８】
ワクシニアウイルスは、約１９０Ｋｂｐである、直鎖状の二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、約２５０の遺伝子をコードする、大型で複雑なエンベロープウイルスである。ワクシニアは、天然痘を根絶したワクチンとしての、その役割について周知である。天然痘の根絶後、研究者らは、遺伝子を、生物学的組織に送達するためのツールとしてのワクシニアの使用（遺伝子治療及び遺伝子工学）について探索している。ワクシニアウイルスは、宿主細胞の細胞質だけにおいて複製されるので、ＤＮＡウイルスの間で固有である。したがって、ウイルスＤＮＡの複製に必要とされる、多様な酵素及びタンパク質をコードするのに、大型のゲノムが要求される。複製時に、ワクシニアは、それらの外膜が異なる、いくつかの感染性形態：細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープビリオン（ＩＥＶ）、細胞関連エンベロープビリオン（ＣＥＶ）、及び細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）をもたらす。ＩＭＶは、最も夥多な感染性形態であり、宿主間の拡散の一因となると考えられる。他方、ＣＥＶは、細胞間の拡散において、役割を果たすと考えられ、ＥＥＶは、宿主生物内の、長射程の播種に重要であると考えられる。
【００９９】
ワクシニアウイルスは、牛痘を引き起こすウイルスと近縁である。ワクシニアの正確な由来は、未知であるが、最も一般的な見方は、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、及び天然痘ウイルス（天然痘の原因作用物質）が、全て、共通の先祖ウイルスに由来したという見方である。ワクシニアウイルスは、元来、ウマから単離されたという推測もまたなされている。ワクシニアウイルス感染は、軽度であり、典型的に、健常個体では、無症状であり、軽度の発赤及び発熱を引き起こす場合はあるが、致死率は極めて小さい。ワクシニアウイルス感染に対して発生した免疫応答は、感染者を、致死性の天然痘感染に対して保護する。この理由で、ワクシニアウイルスは、天然痘に対する、生ウイルスワクチンとして使用された。ワクシニアウイルスワクチンは、天然痘ウイルスを含有しないため、安全であるが、時に、とりわけ、ワクチンが、免疫障害個体に投与される場合、ある特定の合併症及び／又はワクチンの有害作用が生じうる。
【０１００】
ワクシニアウイルスの例示的な株は、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ由来ワクシニアウイルスを含む。
【０１０１】
チミジンキナーゼ変異体
ワクシニアウイルスを、腫瘍溶解性ウイルスとして調べる、いくつかの進行中の臨床研究は、ウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に、欠失を施す。この欠失は、ウイルスを弱毒化し、ウイルスを、ＤＮＡの複製のために、したがって、ウイルスの繁殖のために、細胞のチミジンキナーゼの活性に依存的にする。細胞のチミジンキナーゼは、大半の正常組織では、低レベルで発現されるが、多くのがん細胞では、高レベルで発現される。代謝ターゲティングを介して、ＴＫ−ウイルスは、代謝速度が大きな細胞（例えば、健常細胞又は腫瘍細胞）では、増殖しうるが、チミジンキナーゼが低レベルの細胞では、十分に増殖しないであろう。休眠腫瘍細胞（例えば、がん幹細胞）が存在するので、ＴＫ−ウイルスは、化学療法が、大部分、無効であるのと全く同様に、このがん細胞集団を死滅させる、それらの能力が損なわれている可能性が高い。本開示で記載される改変ウイルスベクターは、ウイルス合成機構（ＴＫを含む）を保持し、休眠がん細胞においても繁殖しうる。本開示のウイルス改変であれば、ウイルスが、ＴＫ又は他のＤＮＡ代謝酵素（例えば、リボヌクレオチドレダクターゼ）を欠失させずに、高度に選択的であることを可能とし、代謝速度が小さい腫瘍においても有効でありうるであろう。
【０１０２】
ウイルスの繁殖
本発明は、ウイルスが、がん細胞に対する使用に所望される特性を呈しながら、非がん細胞に対して、低毒性又は非毒性であるように、野生型と比較して、１つ又は複数の遺伝子欠失を伴って構築されたポックスウイルスを含むポックスウイルスを特徴とする。本節は、例を目的として、組換えＤＮＡ技術の使用を介して、変異ウイルスを発生させるための方法など、本明細書で記載される、組換えポックスウイルスを作製するための、多様なプロトコールをまとめる。
【０１０３】
例えば、ポックスウイルスゲノムにおいて、変異を作出するために、天然ポリペプチド及び修飾ポリペプチドは、ベクターに含まれる核酸分子によりコードされうる。ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を含む。当業者は、いずれもが、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４において記載されている、標準的な組換え技法を介して、ベクターを構築するのに、十分な素養があるであろう。修飾ゲロニンなどの修飾ポリペプチドをコードすることに加えて、ベクターは、タグ又はターゲティング分子などの非修飾ポリペプチド配列もコードしうる。
【０１０４】
宿主細胞において、ベクターを繁殖させるために、ベクターは、複製が開始される、特異的核酸配列である、１つ又は複数の複製起点部位（「ｏｒｉ」と称することが多い）を含有しうる。代替的に、宿主細胞が酵母である場合、自立複製型配列（ＡＲＳ）も援用されうる。
【０１０５】
異種核酸配列を発現させる文脈では、「宿主細胞」とは、原核細胞又は真核細胞を指し、ベクターを複製すること、及び／又はベクターによりコードされる異種遺伝子を発現させることが可能な、任意の形質転換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクター又はウイルス（外因性ポリペプチドを発現させない場合、ベクターとして適格ではない）のレシピエントとして使用される場合があり、レシピエントとして使用されている。宿主細胞は、「トランスフェクト」又は「形質転換」される場合があり、これは、修飾タンパク質をコードする配列などの外因性核酸が、宿主細胞に、移入又は導入される工程を指す。形質転換細胞は、初代対象細胞及びその後代を含む。宿主細胞は、所望される結果が、ベクターの複製であるのか、ベクターによりコードされる核酸配列の一部又は全部の発現であるのかに応じて、原核生物から導出される場合もあり、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む、真核生物から導出される場合もある。多数の細胞株及び培養物が、宿主細胞としての使用のために利用可能であり、生物の培養物及び遺伝子素材のためのアーカイブとして用いられる機構である、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）を介して得られうる。適切な宿主は、ベクター骨格及び所望される結果に基づき、当業者により決定されうる。プラスミド又はコスミドは、例えば、多くのベクターの複製のために、原核宿主細胞に導入されうる。ベクターの複製及び／又は発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞は、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、及びＫＣＢ、並びにシュア（ＳＵＲＥ）（登録商標）コンピテント細胞及びソロパック（ＳＯＬＯＰＡＣＫ）（商標）ゴールドセル（Ｇｏｌｄ  Ｃｅｌｌ）（ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）（登録商標）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）など、多数の市販の細菌宿主を含む。代替的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＥ３９２などの細菌細胞も、ファージウイルスのための宿主細胞として使用されうるであろう。適切な酵母細胞は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、及びメタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む。ベクターの複製及び／又は発現のための真核宿主細胞の例は、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、Ｓａｏｓ、及びＰＣ１２を含む。多様な細胞型及び生物に由来する、多くの宿主細胞が利用可能であり、当業者にも公知であろう。同様に、ウイルスベクターは、真核宿主細胞又は原核宿主細胞、特に、ベクターの複製又は発現に対して、許容状態にある真核宿主細胞又は原核宿主細胞と共に使用されうる。一部のベクターは、それが、原核細胞及び真核細胞のいずれにおいても、複製されること、及び／又は発現されることを可能とする制御配列を援用しうる。当業者は、上記の宿主細胞の全てを、それらを維持し、ベクターの複製を許容するようにインキュベートするための条件を、さらに理解するであろう。大スケールにおけるベクターの作製、並びにベクターによりコードされる核酸及びそれらのコグネイトポリペプチド、タンパク質、又はペプチドの作製を可能とする技法及び条件もまた、理解されており、公知である。
【０１０６】
ワクシニアウイルスゲノムに対する遺伝子改変
遺伝子改変の方法
標的ゲノムへの核酸の挿入又は標的ゲノムからの核酸の欠失の方法は、本明細書で記載され、当技術分野で公知の方法を含む。標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、標的ゲノムに組み込むために使用されうる、１つのこのような方法は、トランスポゾンの使用を伴う。トランスポゾンとは、トランスポザーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドであり、５’切出し部位と、３’切出し部位とに挟まれた、目的のポリヌクレオチド配列又は遺伝子を含有する。トランスポゾンが、標的核酸（例えば、宿主細胞における）に送達されると、トランスポザーゼ遺伝子の発現が始まり、目的の遺伝子を、トランスポゾンから切断する活性酵素を結果としてもたらす。この活性は、トランスポザーゼによる、トランスポゾン切出し部位の、部位特異的認識により媒介される。ある特定の場合には、これらの切出し部位は、末端反復又はＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）でありうる。トランスポゾンから切り出されると、目的の遺伝子は、細胞の核ゲノム内に存在する、同様の切出し部位の、トランスポザーゼ触媒性切断により、標的ゲノムに組み込まれうる。これは、目的の遺伝子が、切断された核ＤＮＡに、相補的な切出し部位において挿入されることを可能とし、その後における、目的の遺伝子を、標的ゲノムのＤＮＡに接続する、ホスホジエステル結合の、共有結合的ライゲーションが、組込み過程を完結させる。ある特定の場合には、トランスポゾンは、標的遺伝子をコードする遺伝子が、哺乳動物細胞ゲノムへの組込みの前に、まず、ＲＮＡ産物に転写され、次いで、ＤＮＡに逆転写されるように、レトロトランスポゾンでありうる。トランスポゾン系は、各々の開示が、参照により本明細書に組み込まれる、ピギーバックトランスポゾン（例えば、国際公開第２０１０／０８５６９９号において、詳細に記載されている）及びスリーピングビューティートランスポゾン（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１１２７６４号において、詳細に記載されている）を含む。
【０１０７】
本発明の組成物の発現をもたらす、核酸送達のためのさらなる方法は、本明細書で記載されるか、又は当業者に公知である、核酸（例えば、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターを含むＤＮＡ）が、細胞小器官、細胞、組織、又は生物に導入されうる、事実上任意の方法を含むと考えられる。このような方法は、マイクロインジェクション（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｌａｎｄ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号）を含む、注射（各々が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号、及び同第５，５８０，８５９号）；電気穿孔（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３８４，２５３号）；リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎＤｅｒＥｂ、１９７３；Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）；ＤＥＡＥ−デキストランに続く、ポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ、１９８５）；直接的超音波ローディング（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）；リポソーム媒介型トランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７；Ｗｏｎｇら、１９８０；Ｋａｎｅｄａら、１９８９；Ｋａｔｏら、１９９１）；微粒子銃（各々が、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願国際公開第９４／０９６９９号及び同第９５／０６１２８号；米国特許第５，６１０，０４２号；同第５，３２２，７８３号、同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号及び同第５，５３８，８８０号）；炭化ケイ素繊維による攪拌（各々が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号及び同第５，４６４，７６５号）；アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属媒介性形質転換（各々が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９１，６１６号及び同第５，５６３，０５５号）；又はプロトプラストによる、ＰＥＧ媒介性形質転換（各々が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら、１９９３；米国特許第４，６８４，６１１号及び同第４，９５２，５００号）；乾燥／阻害媒介性ＤＮＡ取込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５）によるＤＮＡの直接的送達などのＤＮＡの直接的送達を含むがこれらに限定されない。これらの技法などの技法の適用を介して、細胞小器官（複数可）、細胞（複数可）、組織（複数可）又は生物（複数可）が、安定的に形質転換される場合もあり、一過性に形質転換される場合もある。
【０１０８】
ＣｏｐＭＤ５ｐ、ＣｏｐＭＤ３ｐ、及びＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐの欠失
多様な実施形態では、ワクシニアウイルスの腫瘍溶解活性を増強するように、多様な遺伝子が欠失している。本明細書で記載される欠失の大半は、ウイルス感染に対する宿主応答の遮断に関与するか、又は他の形における未知の機能を有する。多様な実施形態では、表１に描示された遺伝子のうちの少なくとも１つが、組換えワクシニアウイルスゲノムから欠失している。多様な実施形態では、表１に描示された遺伝子のうちの、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１が、組換えワクシニアウイルスゲノムから欠失している。多様な実施形態では、表２に描示された遺伝子の全てが、組換えワクシニアウイルスゲノムから欠失している。本明細書では、本発明の３つの例示的な実施形態である、ＣｏｐＭＤ５ｐ、ＣｏｐＭＤ３ｐ、及びＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐについて記載される。下記の表２では、欠失した遺伝子のクラスター、並びにＣｏｐＭＤ５ｐウイルス、ＣｏｐＭＤ３ｐウイルス、及びＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐウイルスにおけるそれらの機能が描示される。ＩＴＲの２つのコピーが存在する、多様な実施形態では、ゲノムの右側のＩＴＲが欠失し、左側のＩＴＲは、インタクトのままである。欠失は、全ゲノムシーケンシングにより確認された。
【０１０９】
【表１】
2021509815.tif 000003
2021509815.tif 000004
【０１１０】
Ｂ８Ｒ遺伝子の欠失
多様な実施形態では、ワクシニアウイルスは、Ｂ８Ｒ遺伝子における欠失を含有するように、さらに遺伝子改変される。ワクシニアウイルスＢ８Ｒ遺伝子は、ガンマインターフェロン受容体（ＩＦＮ−γ）に対する相同性を伴う分泌型タンパク質をコードする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｂ８Ｒタンパク質は、ヒト及びラットのガンマインターフェロンを含む、ガンマインターフェロンのいくつかの分子種に結合し、これらの抗ウイルス活性を中和するが、マウスＩＦＮ−γへの結合が著明である。Ｂ８Ｒ遺伝子を欠失させることは、ヒトにおけるＩＦＮ−γの機能不全を阻止する。Ｂ８Ｒ遺伝子の欠失は、免疫原性の、共時的な低減を伴わずに、安全性の増強を結果としてもたらす。
【０１１１】
トランス遺伝子の挿入
多様な実施形態では、さらなるトランス遺伝子が、ベクターに挿入されうる。多様な実施形態では、１つ、２つ、又は３つのトランス遺伝子が、欠失したＢ８Ｒ遺伝子の遺伝子座に挿入されている。一部の株では、Ｂ８Ｒの欠失部位に存在するトランス遺伝子（複数可）に加えて、株はまた、少なくとも１つのトランス遺伝子も、欠失したＢ８Ｒ遺伝子の遺伝子座ではない、ワクシニアウイルスのさらなる遺伝子座に挿入されている。多様な実施形態では、少なくとも１つのトランス遺伝子は、５ｐ欠失の境界に挿入され、少なくとも１つのトランス遺伝子は、３ｐ欠失の境界又はこれらの両方に挿入されている。多様な実施形態では、少なくとも３つ、４つ、５つ、又はこれを超えるトランス遺伝子が、改変ワクシニアウイルスゲノムに挿入されている。
【０１１２】
処置法
医薬組成物、投与、及び用量
本発明の組換えワクシニアウイルスベクターを含有する治療用組成物は、当技術分野で公知の方法を使用して調製されうる。例えば、このような組成物は、例えば、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤（参照により本明細書に組み込まれる、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））を使用し、所望の形態、例えば、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において調製されうる。
【０１１３】
本発明の方法及び組成物を使用して、腫瘍溶解を誘導し、細胞を死滅させ、増殖を阻害し、転移を阻害し、腫瘍サイズを減少させ、腫瘍細胞の悪性表現型を、他の形で抑制又は軽減するために、例えば、ワクシニアウイルスの、がんを有する患者への、例えば、本明細書で記載される投与経路のうちの１又は複数を介する投与により、腫瘍を、改変ワクシニアウイルスと接触させることができる。投与経路は、がんの場所及び性格により変動する場合があり、例えば、皮内投与及び皮内製剤、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与及び経皮製剤、非経口投与及び非経口製剤、静脈内投与及び静脈内製剤、筋内投与及び筋内製剤、鼻腔内投与及び鼻腔内製剤、皮下投与及び皮下製剤、局所（例えば、特に、腫瘍の血管系又は腫瘍に隣接する血管系を伴う、腫瘍の近傍における）投与及び局所製剤、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与及び経皮製剤、髄腔内投与及び髄腔内製剤、腹腔内投与及び腹腔内製剤、動脈内投与及び動脈内製剤、小胞内投与及び小胞内製剤、腫瘍内投与及び腫瘍内製剤、吸入投与及び吸入製剤、灌流投与及び灌流製剤、洗浄投与及び洗浄製剤、並びに経口投与及び経口製剤を含みうる。
【０１１４】
「血管内」という用語は、患者の血管系への送達を指すように理解され、患者の１つ若しくは複数の血管への送達、これらの中の送達、又はこれらにおける送達を意味する。ある特定の実施形態では、投与は、静脈であると考えられる血管への投与（静脈内投与）であるのに対し、他の実施形態では、投与は、動脈であると考えられる血管への投与である。静脈は、内頸静脈、末梢静脈、冠状静脈、肝静脈、門脈脈、大伏在静脈、肺静脈、上大静脈、下大静脈、胃静脈、脾静脈、下腸間膜静脈、上腸間膜静脈、橈側皮静脈、及び／又は大腿静脈を含むがこれらに限定されない。動脈は、冠状動脈、肺動脈、上腕動脈、内頸動脈、大動脈弓、大腿動脈、末梢動脈、及び／又は毛様体動脈を含むがこれらに限定されない。送達は、細動脈又は毛細血管を介する送達の場合もあり、これらへの送達の場合もあることが想定される。
【０１１５】
腫瘍内注射、又は腫瘍血管系への直接の注射は、詳細には、孤発性腫瘍、充実性腫瘍、アクセス可能な腫瘍のために想定される。局所投与、領域内投与、又は全身投与もまた、適切でありうる。ウイルス粒子は、例えば、約１ｃｍ間隔で隔てられた、腫瘍への複数回の注射を投与することにより接触させると有利でありうる。手術による介入の場合、本発明は、手術不可能な腫瘍対象を、切除にかけられるようにするためなど、手術前に使用されうる。適切な場合、例えば、カテーテルを、腫瘍又は腫瘍血管系に植え込むことにより、連続投与もまた適用されうる。このような連続灌流は、例えば、処置の開始後、約１〜２時間、約２〜６時間、約６〜１２時間、又は約１２〜２４時間にわたり行われうる。一般に、治療用組成物の、連続灌流を介する用量は、単回又は複数回の注射により施される用量と同等であることが可能であり、灌流が生じる期間にわたり調整されうる。特に、黒色腫及び肉腫の処置において、本発明の治療用組成物を投与するのに、四肢灌流が使用されうることもさらに想定される。
【０１１６】
処置レジメンは、変動する場合があり、腫瘍型、腫瘍の場所、疾患の進行、並びに患者の健康状態及び年齢に依存することが多い。ある特定の種類の腫瘍は、より侵襲性の処置を要求するが、同時に、ある特定の患者は、負荷の大きなプロトコールを忍容できない。医師は、治療用製剤の、既知の効能及び毒性（存在する場合）に基づき、このような決定を下すのに最も適する。ある特定の実施形態では、処置される腫瘍は、少なくとも初期に切除可能とは限らない場合がある。本開示の治療剤による処置は、辺縁部における退縮のために、又はある特定の部分、特に、浸潤部分の消失により、腫瘍の切除可能性を増大させうる。処置後、切除は、可能でありうる。切除に後続するさらなる処置は、腫瘍部位における、顕微鏡的遺残病変を消失させるのに用いられるであろう。
【０１１７】
処置は、多様な「単位用量」を含みうる。単位用量は、所定数量の治療用組成物を含有するものとして規定される。投与される数量、並びに特定の経路及び製剤は、臨床技術分野の技術の範囲内にある。単位用量は、単回注射として投与される必要はなく、設定期間にわたる連続注入を含みうる。本発明の単位用量は、ウイルス構築物についてのプラーク形成単位（ｐｆｕ）との関係で記載されると好都合でありうる。単位用量は、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２〜１０１３ｐｆｕ及びこれを超える範囲でありうる。加えて、又は代替的に、ウイルスの種類及び達成可能な力価に応じて、１〜１００、１０〜５０、１００〜１０００ｐｆｕ、或いは最大で約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、若しくは１×１０１５ｐｆｕ、又はこれを超える感染性ウイルス粒子（ｖｐ）、或いは少なくともこれらの量のｖｐであって、これらの間の全ての値及び範囲を含む数のｖｐを、腫瘍又は腫瘍部位に送達することができる。
【０１１８】
本明細書で開示される組換えワクシニアウイルスゲノムを、がん細胞又は腫瘍細胞に送達する、別の方法は、腫瘍内注射を介しうる。しかし、本明細書で開示される医薬組成物は、代替的に、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号、及び米国特許第５，３９９，３６３号（各々が、参照によりその全体において本明細書に詳細に組み込まれる）において記載されている通り、非経口投与、静脈内投与、皮内投与、筋内投与、経皮投与、なお又は腹腔内投与されうる。核酸構築物の注射は、シリンジにより送達される場合もあり、発現構築物が、注射に要求される、特定ゲージの注射針を通過しうる限りにおいて、溶液の注射のために使用される、他の任意の方法により送達される場合もある。本明細書で記載される組換えワクシニアウイルスを投与するために使用されうる、例示的な無針注射システムは、米国特許第５，８４６，２３３号において例示されている。このシステムは、溶液を保持するためのアンプルチャンバーを規定するノズルと、溶液を、ノズルから、送達部位に押し出すためのエネルギーデバイスとを特徴とする。別の例示的なシリンジシステムは、所定数量の溶液の、任意の正確な深度における、複数回の注射を可能とするシリンジシステムである（米国特許第５，８４６，２２５号）。
【０１１９】
本明細書で記載されるウイルス粒子又は核酸の混合物は、１つ又は複数の賦形剤、担体、又は希釈剤と、適切に混合された水において調製されうる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物、並びに油における分散液もまた調製されうる。通常の保存及び使用の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有しうる。注射のための使用に適する医薬剤形は、滅菌注射用溶液又は滅菌注射用分散液の即席の調製のための、滅菌水溶液又は滅菌分散液、及び滅菌粉末を含む（参照によりその全体において詳細に本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４６６，４６８号）。全ての場合に、剤形は、滅菌剤形であることが可能であり、容易な注射可能性が存在する程度において、流体でありうる。剤形は、製造条件下及び保存条件かで安定であることが可能であり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、及び／又は植物油を含有する、溶媒又は分散媒でありうる。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物作用の防止は、多様な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによりもたらされうる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中の、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらされうる。
【０１２０】
水溶液による非経口投与のために、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝処理される場合があり、液体の希釈剤は、十分な生理食塩液又はグルコースにより、まず等張とされうる。これらの特定の水溶液は、とりわけ、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、腫瘍内投与、及び腹腔内投与に適する。これに関して、本開示に照らして、援用されうる滅菌水性媒質は、当業者に公知であろう。例えば、単回投与のための用量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入用流体に添加される場合もあり、提起された注入部位に注射される場合もある。処置される対象の状態に応じて、投与量の何らかの変動が必然的に生じるであろう。いずれにせよ、投与の責任者が、個々の対象に適切な用量を決定することになる。さらに、ヒト投与では、調製物は、ＦＤＡのＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ基準により要請される、滅菌性、発熱物質性、一般的な安全性、及び純度についての基準を満たすものとする。
【０１２１】
本明細書で使用される、「担体」は、任意及び全ての溶媒、分散媒、媒体、コーティング、希釈剤、抗菌剤、及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。当技術分野では、医薬活性物質のためのこのような媒質及び薬剤の使用が周知である。任意の従来の媒質又は薬剤が有効成分と不適合性である場合を除き、治療用組成物におけるその使用が想定される。また、有効成分補助物質も、組成物に組み込まれうる。「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」という語句は、ヒトに投与される場合に、アレルギー性の有害反応又は類似の有害反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。当技術分野では、タンパク質を有効成分として含有する、水性組成物の調製が十分に理解されている。典型的に、このような組成物は、溶液又は懸濁液としての注射用剤として調製されるが、また、注射前に液体に溶解又は懸濁させるのに適する固体形態も、調製されうる。
【０１２２】
がん
本明細書で開示される、組換えワクシニアウイルスは、例えば、腫瘍溶解により、直接がん細胞を死滅させること、及び／又は標的がん細胞に対する獲得免疫応答の有効性を増強することのために、がんなどの細胞増殖障害を患う、ヒトなどの哺乳動物対象に投与されうる。一部の実施形態では、細胞増殖障害は、白血病、リンパ腫、肝臓がん、骨がん、肺がん、脳がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、心臓がん、子宮頸がん、子宮がん、頭頸部がん、胆嚢がん、喉頭がん、口唇口腔がん、眼がん、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、結腸直腸がん、精巣がん、又は咽頭がんなどのがんである。特定の症例では、細胞増殖障害は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＣＭＬ）、副腎皮質癌腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、肝外がん、ユーイング肉腫ファミリー、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発性リンパ腫、脊索種、慢性骨髄増殖性新生物、結腸がん、肝外胆管がん、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、嗅神経芽腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵管がん、骨の線維性組織球腫、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間葉系腫瘍（ＧＩＳＴ）、精巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、小児性脳幹神経膠腫、有毛細胞白血病、肝細胞がん、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、膵島細胞腫瘍、膵内分泌腫瘍、ウィルムス腫瘍及び他の小児腎臓腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、小細胞肺がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、眼内黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、正中線癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞細胞腫、骨髄異形成症候群、鼻腔副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、上皮卵巣がん、胚細胞卵巣がん、低悪性度卵巣がん、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜がん、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、カポジ肉腫、横紋筋肉腫、セザリー症候群、小腸がん、軟部組織肉腫、咽頭がん、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、並びにワルデンシュトロームマクログロブリン血症からなる群から選択されるがんでありうる。
【０１２３】
当技術分野における技術を有する医師は、それを必要とする哺乳動物対象（例えば、ヒト）への投与のための、組換えワクシニアウイルスベクターの有効量を、たやすく決定することができる。例えば、医師は、まず、組換えワクシニアウイルスベクターの用量を、所望される治療効果を達成するために要求されるレベルより低レベルで処方し、投与量を、所望される効果が達成されるまで、徐々に増大させることができる。代替的に、医師は、用量の組換えワクシニアウイルスベクターを投与することにより、処置レジメンを開始し、その後、治療効果（例えば、１つ又は複数の腫瘍の体積の低減）が達成されるまで、漸進的に、低用量を投与することもできる。一般に、本発明の組換えワクシニアウイルスベクターの、適切な毎日の用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量である、組換えワクシニアウイルスベクターの量であろう。本発明の組換えワクシニアウイルスベクターの治療用組成物の毎日の用量は、任意選択で、単位剤形により、単回投与として投与される場合もあり、１日間、１週間、１カ月間、又は１年間を通して、適切な間隔で隔てて投与される、２、３、４、５、６回、又はこれを超える回数の投与として投与される場合もある。本発明の組換えワクシニアウイルスベクターは、単独で投与される可能性もあるが、また、賦形剤、担体と組み合わせた医薬製剤として、任意選択で、さらなる治療剤と組み合わせた医薬製剤としても投与されうる。
【０１２４】
本発明の組換えワクシニアウイルスベクターは、がんなどの細胞増殖疾患の進行を和らげる、それらの能力について、当技術分野で公知の様々な方法のうちのいずれかによりモニタリングされうる。例えば、医師は、患者における、１つ又は複数の腫瘍の体積を解析することにより、本発明の組換えワクシニアウイルスベクターによる処置に対する、哺乳動物対象（例えば、ヒト）の応答をモニタリングしうる。代替的に、医師は、特定の対象のリンパ中のＴ−ｒｅｇ細胞集団を解析することにより、本発明の組換えワクシニアウイルスベクターによる処置に対する、対象（例えば、ヒト）の応答性をモニタリングしうる。例えば、医師は、哺乳動物対象（例えば、ヒト）から、試料を採取し、蛍光活性化細胞分取など、確立された手順を使用して、がん細胞の数量又は密度を決定することができる。試料中のがん細胞の数量が、組換えワクシニアウイルスを投与する前に、対象から得られた試料中の、がん細胞の数量と比べて減少した（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれを超えて）という知見は、ワクシニアウイルスの投与が、がんを、有効に処置しつつあることの指標でありうる。
【０１２５】
ウイルスの特徴を測定するためのアッセイ
ウイルスの、腫瘍における拡散及び毒力を測定するための、当技術分野で公知のアッセイは、プラークサイズの測定、合胞体の形成の測定、及び／又はコメットアッセイ（ＥＥＶ）を含むがこれらに限定されない。ウイルスの免疫刺激活性を測定するための、当技術分野で公知のアッセイは、ＮＫ活性化（ＣＤ６９の発現％により測定される）、ＮＫ脱顆粒（ＣＤ１０７ａの増大倍数により測定される）、及び／又はＴ細胞プライミングアッセイを含むがこれらに限定されない。ウイルスの選択性を測定するための、当技術分野で公知のアッセイは、尾におけるポックス病変、生体分布、及び／又は体格指数の測定を含むがこれらに限定されない。
【０１２６】
ワクシニアウイルス遺伝子によりコードされるタンパク質の例
下記で使用される通り、「場所」という用語は、本明細書で記載される、例示的なワクシニアウイルスベクターにおいて欠失している核酸に関して、遺伝子の場所を指す。多様な遺伝子について、アミノ酸配列情報及びタンパク質受託番号を提示する。
【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
【表３】
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【実施例】
【０１２９】
以下の実施例は、当業者に、本明細書で特許請求される組成物及び方法が、どのようにして実施され、作られ、査定されるのかについての記載をもたらすように明示されるものであり、本発明について、純粋に例示的あることが意図され、本発明者が、本発明と考えるものの範囲を限定することは意図されない。
【０１３０】
実施例１−ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ「ＳＫＶ−Ｂ８Ｒ＋」組換えワクシニアウイルスの創出
５９のポックスウイルス株に由来するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、オーソログにクラスター化し、アミノ酸レベルでアライメントした（系統発生解析については、図１を参照されたい）。ベイズ解析を実施して、全ての株の類縁性を決定した。ポックスウイルスは、遺伝子内容及び宿主範囲において、極めて多様である。互いと異なる、いくつかの自然発生のワクシニア野生型株が存在する。
【０１３１】
５つのワクシニア野生型株（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ  Ｔａｎ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｗｙｅｔｈ、及びＷＲ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ））を、等しいプラーク形成単位カウントで混合し、ＮＧＳによりシーケンシングした（インプットプール）。結果として得られる混合物を、異なるがん細胞株（ＨｅＬａ、７８６−Ｏ、ＨＴ２９、ＭＣＦ７）において、３代にわたり継代培養した。最終的な集団を、ＮＧＳイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングによりシーケンシングした。リード（短いＤＮＡ断片）を、配列同一性に基づき、多様な株に割り当て、各株の、最終集団中のパーセントを計算するのに使用した。次いで、異なるウイルス株の相対存在度を定量した。図２に示す通り、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株が、３代にわたる継代の後に、４つのがん細胞株のうちのいずれにおいても、最も夥多なワクシニア株であったことから、この株が、他の株より大きな増殖が可能であり、したがって、急速な複製が可能であることが指し示される。
【０１３２】
異なるワクシニア野生型株もまた、低ＰＦＵ（１×１０４）で、多様な患者腫瘍コアに感染させるのに使用した。各株は、各々が、２×２ｍｍの腫瘍コア３つずつを含有する、平均４連で感染した。複製は、ウイルス滴定により評価したものであり、図３に示す通り、プラーク形成単位（ＰＦＵ）として表す。Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株は、他の株より高力価まで増殖し、したがって、患者のｅｘ  ｖｉｖｏ試料において、より急速に複製される。患者のｅｘ  ｖｉｖｏコアは、患者の３Ｄ腫瘍の良好な模倣物である。
【０１３３】
次いで、ワクシニア野生型株を、３％のＣＭＣオーバーレイを伴う、Ｕ２−ＯＳ細胞におけるプラークアッセイにかけた。感染の２日後、各株につき、２０〜３０ずつのプラークを、それらのサイズについて測定した。Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、ＷＲ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）、Ｗｙｅｔｈ、Ｌｉｓｔｅｒ、及びＴｉａｎ  Ｔａｎについての、プラークサイズの測定値を、図４に示す。プラークの形成は、ウイルスの複製、拡散、及び殺滅の能力の影響を受ける。Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株について観察されたプラークサイズの大きさは、この株が、腫瘍溶解性ウイルスを開発するために重要である、これらの能力において優れていることを示唆する。
【０１３４】
次いで、ワクシニアＣｏｐｅｎｈａｇｅｎゲノムにおける、１ｋｂの領域にわたる、ＴＴＡＡ部位の数をカウントした（図５Ａを参照されたい）。イルミナＮＧＳディープシーケンシングを組み合わせ、トランスポゾン挿入部位を同定する（Ｔｎ−Ｓｅｑ）のに使用した。インプットライブラリーを、ＨｅＬａ細胞又はＵ２−ＯＳ細胞において、３代にわたり継代培養し、その後、トランスポゾンノックアウトの頻度を決定した。ノックアウトの頻度は直接、イベントを裏付けるリードの量に対応する（図５Ｂ及び図６を参照されたい）。
【０１３５】
最後に、図１による５９のポックスウイルスゲノムの全てを使用して、ＯＲＦを見出し、オーソログ群にクラスター化した。Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ遺伝子を含有する群を、遺伝子の、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎゲノム内の場所（ｘ軸）及び群のサイズ（ｙ軸）に基づき、プロットした。５９種全てが、同じ遺伝子を共有する場合、保存は、１００％であると考えられる。ＴＴＡＡモチーフが、トランスポゾンの挿入に要求され、このモチーフが、ゲノムに沿って遍在することは、トランスポゾンが、ゲノム内の任意の場所に挿入されうることを意味する。しかし、トランスポゾンは、ポックスウイルス遺伝子の保存が低度である領域に優先的に挿入されることが注目された。トランスポゾンによるノックアウトをシーケンシングすることから、主要な欠失を同定し、ＣｏｐＭＤ５ｐ及びＣｏｐＭＤ３ｐと命名した（図５Ｃ及び図６を参照されたい）。ゲノムの中央部に存在し、遺伝子保存が高度である遺伝子（図５Ｃ）は、ウイルスの複製に重要である。これは、これらの遺伝子を、トランスポゾンの挿入によりノックアウトすることは、適合性の低下（継代培養の後における頻度の低下）を引き起こすためである。メジャー欠失である、ＣｏｐＭＤ５ｐ及びＣｏｐＭＤ３ｐの一部である遺伝子は、それらの欠失が、適合性に影響を及ぼさないので、ウイルスの複製に、それほど重要ではないことが見出された。
【０１３６】
イルミナＮＧＳディープシーケンシングは、プラーク精製工程における、メジャー欠失の存在を明らかにした。ＣｏｐＭＤ５ｐ及びＣｏｐＭＤ３ｐは、精製され、ゲノムのメジャー欠失を保有することが見出されるプラークであったクローンを表す。これらの２つのクローンを、ＨｅＬａ細胞の単層に、高ＭＯＩ（ＭＯＩ：１０）で共感染させて、組換えを誘導するのに使用した。ランダムのプラーク採取及びＰＣＲは、いずれのゲノム欠失も含有する二重欠失である、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐの存在を明らかにした（図８を参照されたい）。これらの２つの欠失を組み合わせ、精製して、本明細書において、「ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ」と称される複製型ウイルスであって、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、及びＢ２０Ｒ遺伝子における欠失、並びにＩＴＲ遺伝子Ｂ２１Ｒ、Ｂ２２Ｒ、Ｂ２３Ｒ、Ｂ２４Ｒ、Ｂ２５Ｒ、Ｂ２６Ｒ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｒ、及びＢ２９Ｒの各々における、単一の欠失を呈する複製型ウイルスをもたらした。本明細書で使用される、「ＣｏｐＷＴ」とは、野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスを指し、「ＣｏｐＭＤ５ｐ」とは、代表的な５’遺伝子（Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ３Ｌ）において、欠失を保有する、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスを指し、「ＣｏｐＭＤ３ｐ」とは、代表的な３’遺伝子（Ｂ１４Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、及びＢ２０Ｒ）における欠失、並びにＩＴＲ遺伝子Ｂ２１Ｒ、Ｂ２２Ｒ、Ｂ２３Ｒ、Ｂ２４Ｒ、Ｂ２５Ｒ、Ｂ２６Ｒ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｒ、及びＢ２９Ｒの各々における、単一の欠失を保有する、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスを指す。
【０１３７】
次いで、５９のポックスウイルスゲノムを、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐにおいて欠失した、これらの３１の遺伝子の存在について評価した。相同性の検索を使用して、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎゲノムによる、表２の遺伝子のアミノ酸配列を伴う、他のクレードに由来するポックスウイルスに問い合わせた。図３６に示される通り、多様なポックスウイルス株において存在する、これらの３２の遺伝子の百分率は、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株からの分岐が増大するにつれて低下した（プロットにおける各ドットは、１つのポックスウイルスゲノムを表す）。しかし、ワクシニアファミリーのメンバーの大部分は、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ組換えベクターにおいて欠失した遺伝子のうちの、少なくとも８５％を含む。
【０１３８】
実施例２−がん細胞死
がん細胞に、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐを、ある範囲のＭＯＩ（１〜０．０１）において、２４ウェルプレートに、４連で感染させた。ウイルスを感染させた２日間後、プレートを、クリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ）により染色した。クリスタルバイオレット染料は、ＳＤＳに溶解させ、分光光度法により読み取った。データは、非感染細胞のパーセントとして表す（図９を参照されたい）。このデータは、がん細胞株の大部分が、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐウイルスに曝露された場合に、急速に死滅することを示す。
【０１３９】
野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス、及びいくつかの改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアビリオンが、抗腫瘍免疫応答を誘導し、多様ながん細胞株において繁殖する能力はまた、図２６、２７、及び２９〜３５においても示される。
【０１４０】
実施例３−がん細胞における増殖
４つのがん細胞株に、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐを、２４ウェルプレートにおいて、低ＭＯＩ（０．００１）、３連で感染させ、異なる時点において、ウイルスを回収し、滴定した。０時間後の時点は、インプットを表す。ＨｅＬａ、７８６−Ｏ、ＨＴ−２９、及びＭＣＦ７についての増殖曲線を、図１０に示す。このデータは、改変ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐウイルスが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増殖するその能力を損なわれていないことを示す。これは、ウイルスが、インターフェロン応答の存在下にあっても、なお、複製コンピテントであることを意味する。哺乳動物細胞株において複製される能力は、別の重要な利点をもたらす。こうして、ウイルスは、速度及び効率を増強して製造することができる。
【０１４１】
実施例４−患者腫瘍試料における増殖
患者腫瘍試料を、手術の直後に得、２ｍｍ×２ｍｍのコアに切り刻んだ。３つのコアに、野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ又はＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐの、少量のウイルス（１×１０４ＰＦＵ）を感染させた。７２時間後に、プラークアッセイにより、ウイルスのアウトプットを評価し、最終的なウイルス力価を、ＰＦＵとして表した（図１１を参照されたい）。このデータは、改変ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐウイルスが、新鮮な患者腫瘍試料において複製されうることを示す。患者腫瘍試料における複製は、患者３Ｄ腫瘍における複製についての良好なモデルである。
【０１４２】
実施例５−Ｕ２−ＯＳ細胞における合胞体
単層のＵ２−ＯＳ細胞に、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ野生型ウイルス又はＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐウイルスを感染させた。２時間後、培地を、プラークアッセイのためにするのと同様に、オーバーレイ培地に交換した。感染の４８時間後に、エボス（ＥＶＯＳ）により撮影して、プラーク表現型を評価した（図１２を参照されたい）。非感染細胞は、感染細胞と融合するので、合胞体としてもまた公知の細胞融合は、ウイルス拡散の一助となると考えられる。加えて、融合した細胞は、免疫原性であり、がん細胞の場合、抗腫瘍免疫応答を誘発する一助となりうることも示されている。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｒｅｓ．ａａｃｒｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／６２／２２／６５６６．ｌｏｎｇを参照されたい。
【０１４３】
実施例６−７８６−Ｏ細胞における合胞体
単層の７８６−Ｏ細胞に、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ野生型ウイルス又はＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐウイルスを感染させた。２４時間後に、エボスにより、１０倍の拡大率で撮影した（図１３を参照されたい）。これは、合胞体の発生についての、さらなる証拠である。図１２に、プラークの表現型を示す。本実験では、単層の細胞に、オーバーレイを伴わずに感染させた。ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐウイルスを感染させた大半の細胞は、融合した。
【０１４４】
実施例７−マウスモデルにおける、腫瘍のコントロール及び体重の減少
ヌードＣＤ−１（Ｃｒｌ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）マウスに、ＨＴ−２９ヒト結腸がん異種移植片（細胞５×１０６個）を接種した。皮下腫瘍が、約５ｍｍ×５ｍｍのサイズを確立したら、マウスを、１×１０７ＰＦＵの、いずれかのワクシニアウイルスにより、２４時間間隔で、３回（破線）にわたり、静脈内処置した。マウスを、ほぼ隔日で、腫瘍サイズ及び体重の減少について測定した（図１４を参照されたい）。この実験は、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐが、免疫障害ヌードマウスにおいて、体重の減少又は他の疾病の徴候を引き起こさないため、はるかに安全なウイルスであることを示す。この実験はまた、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐが、親Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ野生型ウイルと同様に、腫瘍の増殖をコントロールすることが可能なことも示す。
【０１４５】
実施例８−ポックス病変の形成
群１つ当たりのヌードＣＤ−１マウス６匹ずつを、１×１０７ＰＦＵの、いずれかのワクシニアウイルスにより、１回、静脈内処置した。処置の２週間後、マウスを屠殺し、尾の写真を撮影した。全てのマウス尾におけるポックス病変を、目視によりカウントした。代表的な写真を、図１５に示す。この実験は、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐが、免疫障害ヌードマウスにおいて、ポックス病変を引き起こさないため、はるかに安全なウイルスであることを示す。かつてのＯｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｉａ試験による臨床データが、処置時に、ポックス病変を発症する患者を示しているので、これは重要である。チミジンキナーゼ（ＴＫ）のノックアウトは、ＯＶ（腫瘍溶解性ウイルス）の安全性を増大させる一般的な方式であり、フェーズＩＩＩのＯｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｉａ試験及びＦＤＡにより承認されているＯｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｔ−Ｖｅｃ試験においてなされている。データは、マウスが、ＴＫを欠失したウイルスにより抗原投与されると、ポックス病変を発症するが、インタクトのＴＫを有するＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐにより抗原投与されると、ポックス病変を発症しない、このアッセイでは、ＴＫの欠失が、決定的な役割を果たさないことを示す。
【０１４６】
実施例９−全身投与後における、アイビスによる、ワクシニアの生体分布
感染細胞への、ＴＫを、Ｆｌｕｃ及びＹＦＰで置きかえる、ｐＳＥＭ１プラスミドのトランスフェクションを介して、ワクシニアウイルスである、野生型Ｗｙｅｔｈ、野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、及びＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐを操作して、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）及びＹＦＰを発現させた。ウイルスは、プラーク精製し、拡大した。全てのウイルスは、ＴＫノックアウトであり、それらのＴＫ遺伝子座において、機能的なＦｌｕｃをコードする。
【０１４７】
次いで、ヌードＣＤ−１マウスに、ＨＴ−２９ヒト結腸がん異種移植片を接種した。皮下腫瘍が、約５ｍｍ×５ｍｍのサイズを確立したら、群１つ当たりのマウス４匹ずつを、１×１０７ＰＦＵの、いずれかのワクシニアＦｌｕｃコードウイルスにより、１回、静脈内処置した。処置の４日後、マウスに、ルシフェリンを、ｉ．ｐ．（腹腔内）注射し、アイビスにより、ウイルスの存在についてイメージングした（図１６を参照されたい）。この実験は、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐが、腫瘍に対する特異性が大きいため、はるかに安全なウイルスであることを示す。他のウイルスは、尾、筋肉、足、及び鼻腔内における、オフターゲット複製を示す。ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐは、腫瘍だけに局在化される。前出の図１５及び１６に示した通り、尾において検出可能なＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐは、他の株と比較して少ない。図１７は、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐがまた、他の臓器においても、他の腫瘍溶解性ワクシニアと比較した場合に、低力価をもたらすことを示す。ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐは、腫瘍では、他のウイルスと同じレベルで複製されるが、オフターゲット組織では低レベルで複製されるので、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐは、腫瘍溶解性ウイルスのプロファイルに良好に適合する。
【０１４８】
野生型Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス、及びいくつかの改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアビリオンを含む、多様なワクシニアウイルスベクターの生体分布のさらなる例を、図２８に示す。
【０１４９】
実施例１０−ヒトＰＢＭＣにおける、ワクシニアの免疫原性
ＰＢＭＣを、健常ヒトドナー（ｎ＝２）の血液から単離した。ＰＢＭＣを、いずれかのワクシニアと共に、２４時間にわたりインキュベートし、フローサイトメトリーを使用して、早期の活性化マーカーについて点検した（図１８を参照されたい）。この実験は、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐの免疫原性が大きく、免疫細胞によりたやすく検出可能であることを示す。本発明者らは、腫瘍組織において複製されたＯＶは、抗腫瘍免疫応答を成功させるために、免疫細胞を活性化させる必要があるので、これが、所望の形質であると考える。
【０１５０】
実施例１１−マウス脾臓細胞における、ワクシニアの免疫原性
免疫コンピテントＢａｌｂ／Ｃマウスに、１×１０７ワクシニアＰＦＵのワクシニアウイルスを、静脈内注射した。１又は２日後、マウスを屠殺し、脾臓を摘出し、フローサイトメトリーを使用して、免疫活性化について解析した（図１９を参照されたい）。この実験は、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐの免疫原性が大きく、マウス免疫細胞によりたやすく検出可能であることを示す。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験の大半は、マウスにおいてなされるので、このデータは、前出の図１８を補うのに好都合である。
【０１５１】
実施例１２−ヒト細胞における、ワクシニアの免疫原性
ヒトがん細胞である７８６−Ｏに、０．０１のＭＯＩで、いずれかのウイルスを感染させた。翌日、細胞を採取し、核及び細胞質を、細胞分画により分離した。タンパク質を、各画分から抽出し、ＮＦ−ｋＢサブユニットである、ｐ６５及びｐ５０についてブロッティングした（図２０を参照されたい）。ＮＦ−ｋＢ免疫転写因子は、そのサブユニットである、ｐ６５及びｐ５０が、核に移行すると、免疫応答を誘発した。一部のウイルスは、免疫抑制性であり、この移行を遮断し、免疫応答を阻止する。ＮＦ−ｋＢの機能を抑制することは、腫瘍溶解性ウイルスを、免疫療法と組み合わせて使用することの目標に、直感的に反する。したがって、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐは、ＭＧ−１と同様に振る舞うので、より有利なウイルスである。
【０１５２】
実施例１３−対象を処置するための投与
本明細書で記載される方法を使用して、当技術分野における技術を有する医師は、対象（例えば、患者）に、本明細書で記載される、組換えワクシニアウイルスベクターを含有する医薬組成物を投与して、がん細胞又は腫瘍細胞を処置することができる。がんは、例えば、とりわけ、白血病、リンパ腫、肝臓がん、骨がん、肺がん、脳がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、心臓がん、子宮頸がん、子宮がん、頭頸部がん、胆嚢がん、喉頭がん、口唇口腔がん、眼がん、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、結腸直腸がん、精巣がん、又は咽頭がんでありうる。
【０１５３】
例えば、当技術分野における技術を有する医師は、患者が、がん又は腫瘍を患っていることを評価し、患者に、治療有効量（例えば、腫瘍のサイズを減少させるのに十分な量）の、本明細書で開示される組換えワクシニアウイルスベクターを含有する医薬組成物を投与することができる。医薬組成物は、対象に、指定された時間間隔ごと（例えば、毎週、毎日、又は毎時）の、１回又は複数回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、又はこれを超える回数）の投与により投与されうる。治療の有効性をモニタリングし、患者の応答に基づき、投与量を増大又は減少させるために、投与の間に、患者を査定することができる。医薬組成物は、患者に経口投与、非経口（例えば、局所）投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、又は鼻腔内投与されうる。処置は、医薬組成物の単回投与を伴いうる。処置は、医薬組成物の持続的投与（例えば、数日間、数週間、数カ月間、又は数年間にわたる）を伴いうる。処置は、別の治療剤（例えば、抗ＰＤ−１又は抗ＣＴＬＡ−４抗体又はその抗原結合性断片、ＩＬ−１２、ＦＬＴ３Ｌなどの免疫チェックポイント阻害剤）の使用をさらに伴いうる。
【０１５４】
実施例１４−ＣｏｐＭＤ５ｐ及びＣｏｐＭＤ３ｐの、欠失のターゲティング
改変ワクシニアウイルスベクターを作製するための、以下のプロトコールは、例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｎｔｏｕｌら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．、６（９）：ｅ２４６４３（２０１１）において記載されている技法を利用する。
【０１５５】
略述すると、ＣｏｐＭＤ５ｐ（５’遺伝子：Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ３Ｌに欠失を保有する、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス）ターゲティング組換え構築物、及びＣｏｐＭｄ３ｐ（３’遺伝子：Ｂ１４Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、及びＢ２０Ｒにおける欠失、並びにＩＴＲ遺伝子Ｂ２１Ｒ、Ｂ２２Ｒ、Ｂ２３Ｒ、Ｂ２４Ｒ、Ｂ２５Ｒ、Ｂ２６Ｒ、Ｂ２７Ｒ、Ｂ２８Ｒ、及びＢ２９Ｒの各々における単一の欠失を保有する、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルス）ターゲティング組換え構築物を、ジーブロック（ｇ−Ｂｌｏｃｋ）技術（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）により合成した。Ｕ２ＯＳ細胞に、野生型ワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ、ＷＲ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）、Ｔｉａｎ  Ｔａｎ、Ｌｉｓｔｅｒ）を、無血清ＤＭＥＭ中に０．０１のＭＯＩで、１．５時間にわたり感染させた。ウイルス上清を吸引し、オプチメム（ＯｐｔｉＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）において、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、Ｕ２ＯＳ細胞に、ＰＣＲ増幅された、ＣｏｐＭＤ５ｐターゲティングジーブロック構築物又はＣｏｐＭｄ３ｐターゲティングジーブロック構築物をトランスフェクトした。トランスフェクションの３０分後に、１０％のＦＢＳを補充されたＤＭＥＭを、細胞に添加し、一晩にわたり放置した。翌日、トランスフェクション培地を吸引し、新鮮ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地を、細胞に添加した。感染によるトランスフェクションの４８時間後、Ｕ２ＯＳ細胞を採取し、単回の凍結融解サイクルにより溶解させた。系列希釈された溶解物を、コンフルエント単層のＵ２ＯＳ細胞に播種し、ｅＧＦＰ陽性プラーク（ＣｏｐＭＤ５ｐターゲティング型）又はエムチェリー（ｍＣｈｅｒｒｙ）陽性プラーク（ＣｏｐＭｄ３ｐターゲティング型）を、５ラウンドにわたるプラーク精製を介して単離及び精製した。
【０１５６】
二重メジャー欠失ワクシニアウイルスは、Ｕ２ＯＳ細胞において、各ウイルスについて、５のＭＯＩで、ＣｏｐＭＤ５ｐ欠失ワクシニアウイルス及びＣｏｐＭｄ３ｐ欠失ワクシニアウイルスの共感染により作出した。翌日、細胞を採取し、１ラウンドの凍結融解により溶解させた。溶解物を、系列希釈し、コンフルエント単層のＵ２ＯＳ細胞に播種し、二重陽性プラーク（ｅＧＦＰ＋エムチェリー）について選択した。プラークは、５ラウンドにわたるプラーク精製により精製した。
【０１５７】
本開示の改変ワクシニアウイルスベクター（例えば、改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスベクターなどの改変ワクシニアウイルスベクター）を作製するための、例示的なスキームを、図２５に示す。
【０１５８】
実施例１５−ＳＫＶ−ＧＦＰ（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ−Ｂ８Ｒ−）は、腫瘍のコントロールにおいて、ＳＫＶ（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ−Ｂ８Ｒ＋）と比較して、同等の効能を及ぼす
ワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｂ８Ｒ遺伝子は、ガンマインターフェロン受容体（ＩＦＮ−γ）に対する相同性を伴う分泌型タンパク質をコードする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｂ８Ｒタンパク質は、ヒト及びラットのガンマインターフェロンを含む、ガンマインターフェロンのいくつかの分子種に結合し、これらの抗ウイルス活性を中和するが、マウスＩＦＮ−γへの結合が著明である。本実施例では、本発明者らは、Ｂ８Ｒ遺伝子を欠く、組換えＶＶの構築及び特徴付けについて記載する。ターゲティング構築物と、Ｂ８Ｒ遺伝子座との間の相同組換えは、Ｂ８Ｒ遺伝子のうちの７５％の、２つのｌｏｘＰ部位に挟まれた、ＧＦＰトランス遺伝子（ＳＫＶ−ＧＦＰ）による置きかえを結果としてもたらした。
【０１５９】
Ｂ８Ｒ−ウイルスは、Ｂ８Ｒ＋ウイルスと同様の効能を示した（図３５）。ＳＫＶ又はＳＫＶ−ＧＦＰで処置されたマウスの生存を評価した。ＣＴ２６−ＬａｃＺ細胞５×１０６個を、０日目に皮下接種した。１４、１６、及び１８日目に、腫瘍を、１０７ｐｆｕの用量の、ＳＫＶ又はＳＫＶ−ＧＦＰの腫瘍内注射により処置した。注射されたウイルスが、Ｂ８Ｒ遺伝子座の欠失を有しても、効能の著明な低下は見られなかった。
【０１６０】
実施例１６−がん細胞株と対比した、正常細胞株への、ＳＫＶ（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ−Ｂ８Ｒ＋）ウイルスの感染
初代健常細胞の生存率を、がん細胞の生存率と比較した。コンフルエントの正常細胞又はがん細胞に、ある範囲のＭＯＩ（細胞１個当たりのｐｆｕ）で、４８時間にわたり感染させ、その後、生存率を定量した。図３３に指し示す通り、ＳＫＶ（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ−Ｂ８Ｒ＋）ウイルスは、がん細胞に、優先的に感染する。
【０１６１】
実施例１７−ＳＫＶ（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ−Ｂ８Ｒ＋）は、インターフェロンによるシグナル伝達を損なわない
様々な正常細胞株及び１つのがん細胞株（７８６−Ｏ）において、上方調節（発現の誘導）又は下方調節（発現の抑制）されるインターフェロン経路の遺伝子の数を決定することにより、インターフェロンによるシグナル伝達について評価した（図３４）。コンフルエント単層の細胞１００万個に、ＴＫ遺伝子を失効させたＳＫＶ−Ｂ８Ｒ＋（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ）ウイルス株、又は親Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎウイルス株を、３のＭＯＩ（３ｅ６  ＰＦＵ）で、１８時間にわたり感染させた。ＲＮＡ−ｓｅｑを使用して、ＲＮＡをシーケンシングし、発現正規化後のマッピングを読み取った後で、インターフェロン遺伝子の遺伝子発現を決定した。ＳＫＶ−Ｂ８Ｒ＋（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ）ウイルスは、インターフェロン経路における遺伝子の大半を誘導するが、親Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎウイルスは、遺伝子を抑制する。これは、ＳＫＶ−Ｂ８Ｒ＋（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ）が、正常細胞のウイルスクリアランスにおいて極めて重要な、Ｉ型インターフェロンによるシグナル伝達を誘導することが可能であることを示唆する。
【０１６２】
実施例１８−多様なワクシニア株において操作された、二重メジャー欠失は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、がん細胞の殺滅を増強する
Ｈｅｌａ細胞に、以下の操作ワクシニアウイルス株：（１）親野生型ウイルス（ｗｔ）株；（２）５プライムメジャー欠失（５ｐ）株、（３）３プライムメジャー欠失（３ｐ）株、及び（４）組換え５プライム／３プライム二重メジャー欠失（５ｐ３ｐ）株を、０．１のＭＯＩで感染させた。細胞生存率は、感染の７２時間後に、アラマーブルーアッセイにより定量した。５ｐメジャー欠失ワクシニア株及び５ｐ３ｐ二重メジャー欠失ワクシニア株のいずれも、それらの親野生型株及び３ｐメジャー欠失株と比較した場合、ＨｅｌＬａ細胞において、より細胞傷害性である。図３６を参照されたい。図３７は、メジャー欠失ワクシニア株の概要、並びに５ｐ欠失、３ｐ欠失、及び５ｐ３ｐ欠失の、合胞体、細胞傷害作用、及び複製に対する効果について描示する。ＣＤ−１ヌードマウスを、１×１０７ｐｆｕを伴う尾静脈注射を介して、静脈内処置し、表示の時点において測定した。５ｐ３ｐワクシニア株は、野生型株と比較して、体重の減少を誘導しなかった（図３８）。マウスはまた、注射後６日間にわたり、ポックス病変についても検査した。５ｐ３ｐワクシニア株は、野生型株と比較して、ポックス病変を誘導しない（図３９）。
【０１６３】
一部の実施形態
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各独立の刊行物又は特許出願が、参照により、詳細及び個別に組み込まれることが指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６４】
本発明は、その詳細な実施形態との関連で記載されたが、本発明は、さらなる改変も可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従い、本発明が関する技術分野内の、公知又は通例の慣行内に収まるような、本発明からの逸脱を含む、本発明の任意の変動、使用、又は適応を対象とすることが意図され、本明細書の前出で明示され、特許請求の範囲で後出する、不可欠の特徴へも適用されうることが理解される。
【０１６５】
一部の実施形態は、特許請求の範囲内にある。
【図１】
2021509815.tif 000016
【図２】
2021509815.tif 000017
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021509815.tif 000022
【図８】
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【図９】
2021509815.tif 000024
【図１０】
2021509815.tif 000025
【図１１】
2021509815.tif 000026
【図１２】
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【図１３】
2021509815.tif 000028
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
2021509815.tif 000049
【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
2021509815.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月11日(2020.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニアＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株のゲノムに由来する組換えワクシニアウイルスゲノムを含む核酸であって、前記組換えワクシニアウイルスゲノムが、少なくとも６つのワクシニア遺伝子の欠失を含み、１つのワクシニア遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｆ）：
ａ）Ｆ１Ｌ；
ｂ）Ｎ１Ｌ及びＢ１４Ｒ；
ｃ）Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、及びＫ７Ｒ；
ｄ）Ｃ２Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１６Ｒ、及びＢ１９Ｒ；
ｅ）Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、及びＦ２Ｌ；並びに
ｆ）Ｂ１５Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、及びＢ２０Ｒ
の各々に由来し、
前記ゲノムのＴＫ遺伝子及びＨＡ遺伝子が、欠失していない、核酸。
【請求項２】
前記欠失が、Ｆ１Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記欠失が、Ｎ１Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記欠失が、Ｂ１４Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記欠失が、Ｍ２Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
前記欠失が、Ｋ１Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
前記欠失が、Ｋ７Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
前記欠失が、Ｃ２Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項９】
前記欠失が、Ｎ２Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１０】
前記欠失が、Ｍ１Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１１】
前記欠失が、Ｋ２Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１２】
前記欠失が、Ｋ３Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記欠失が、Ｆ３Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１４】
前記欠失が、Ｂ１６Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１５】
前記欠失が、Ｂ１９Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１６】
前記欠失が、Ｋ４Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１７】
前記欠失が、Ｋ５Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１８】
前記欠失が、Ｋ６Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１９】
前記欠失が、Ｆ２Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２０】
前記欠失が、Ｂ１５Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２１】
前記欠失が、Ｂ１７Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２２】
前記欠失が、Ｂ１８Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２３】
前記欠失が、Ｂ２０Ｒの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２４】
さらにＣ１Ｌの欠失を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２５】
前記欠失が、前記Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、Ｆ３Ｌ、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、及びＢ２０Ｒ遺伝子の各々の欠失を含む、請求項２４に記載の核酸。
【請求項２６】
前記組換えワクシニアウイルスゲノムが、Ｂ１４Ｒ、Ｂ１６Ｒ、Ｂ１７Ｌ、Ｂ１８Ｒ、Ｂ１９Ｒ、及びＢ２０Ｒからなる群から独立的に選択される、少なくとも１つの遺伝子の欠失を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２７】
前記組換えワクシニアウイルスゲノムが、Ｃ２Ｌ、Ｃ１Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｍ２Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｋ２Ｌ、Ｋ３Ｌ、Ｋ４Ｌ、Ｋ５Ｌ、Ｋ６Ｌ、Ｋ７Ｒ、Ｆ１Ｌ、Ｆ２Ｌ、及びＦ３Ｌからなる群から独立的に選択される、少なくとも１つの遺伝子の欠失を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２８】
前記欠失の各々が、対応するポリヌクレオチドをコードする全遺伝子の欠失である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２９】
前記欠失の各々が、遺伝子の一部の欠失であり、前記欠失が、宿主細胞に導入されると前記遺伝子によりコードされる前記ポリヌクレオチドを非機能性とするのに十分である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３０】
トランス遺伝子をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３１】
前記トランス遺伝子が、腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質、治療用ポリペプチド、又は治療用核酸をコードする、請求項３０に記載の核酸。
【請求項３２】
前記トランス遺伝子が、腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質をコードする、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３３】
前記トランス遺伝子が、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質をコードする、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３４】
前記トランス遺伝子が、治療用ポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３５】
前記トランス遺伝子が、治療用核酸をコードする、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の核酸によりコードされる、組換えワクシニアウイルス。
【請求項３７】
少なくとも１つのトランス遺伝子をコードするウイルスベクターである、請求項３６に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３８】
前記欠失が、対応するポリヌクレオチドをコードする全遺伝子の欠失である、請求項３７に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３９】
前記欠失の各々が、遺伝子の一部の欠失であり、前記欠失が、宿主細胞に導入されると前記遺伝子によりコードされる前記ポリヌクレオチドを非機能性とするのに十分である、請求項３７又は３８に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４０】
腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質、治療用ポリペプチド、若しくは治療用核酸、又は腫瘍溶解免疫活性の改善をもたらすタンパク質をコードするトランス遺伝子をさらに含む、請求項３８又は３９に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４１】
前記トランス遺伝子が、腫瘍溶解活性の改善をもたらすタンパク質をコードする、請求項４０に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４２】
前記トランス遺伝子が、ワクチンとしての使用のための、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質をコードする、請求項４０に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４３】
前記トランス遺伝子が、治療用ポリペプチドをコードする、請求項４０に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４４】
前記トランス遺伝子が、治療用核酸をコードする、請求項４０に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４５】
前記トランス遺伝子が、腫瘍溶解免疫活性の改善をもたらすタンパク質をコードする、請求項４０に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４６】
ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐである、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４７】
哺乳動物細胞の集団を前記核酸又は前記組換えワクシニアウイルスと接触させると、前記細胞が、前記欠失を含まない形態のワクシニアウイルスと接触した、同じ種類の哺乳動物細胞の集団と比べて、合胞体の形成の増大を呈する、請求項１に記載の核酸、又は請求項３８に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４８】
哺乳動物細胞の集団を、前記核酸又は前記組換えワクシニアウイルスと接触させると、前記細胞が、前記欠失を含まない形態のワクシニアウイルスと接触した、同じ種類の哺乳動物細胞の集団と比べて、ワクシニアウイルスの拡散の増大を呈する、請求項１に記載の核酸、又は請求項３８に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４９】
前記核酸又は前記組換えワクシニアウイルスが、哺乳動物細胞の集団に対する細胞傷害効果を、前記欠失を含まない形態のワクシニアウイルスの細胞傷害効果と比べて増大させる、請求項１に記載の核酸、又は請求項３８に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項５０】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項５１】
前記ヒト細胞が、がん細胞である、請求項５０に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項５２】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項３７に記載の組換えワクシニアウイルスを含むパッケージング細胞株。
【請求項５３】
治療有効量の請求項１に記載の核酸、又は請求項３７に記載の組換えワクシニアウイルスを含有する、哺乳動物患者のがん治療用医薬組成物。
【請求項５４】
前記哺乳動物患者が、ヒト患者である、請求項５３に記載のがん治療用医薬組成物。
【請求項５５】
前記がんが、白血病、リンパ腫、肝臓がん、骨がん、肺がん、脳がん、膀胱がん、消化器がん、乳がん、心臓がん、子宮頸がん、子宮がん、頭頸部がん、胆嚢がん、喉頭がん、口唇口腔がん、眼がん、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、結腸直腸がん、精巣がん、及び咽頭がんからなる群から選択される、請求項５３又は５４に記載のがん治療用医薬組成物。
【請求項５６】
前記がんが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＣＭＬ）、副腎皮質癌腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、肝外がん、ユーイング肉腫ファミリー、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発性リンパ腫、脊索種、慢性骨髄増殖性新生物、結腸がん、肝外胆管がん、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、嗅神経芽腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵管がん、骨の線維性組織球腫、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間葉系腫瘍（ＧＩＳＴ）、精巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、小児性脳幹神経膠腫、有毛細胞白血病、肝細胞がん、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、膵島細胞腫瘍、膵内分泌腫瘍、ウィルムス腫瘍及び他の小児腎臓腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、小細胞肺がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、眼内黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、正中線癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞細胞腫、骨髄異形成症候群、鼻腔副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、上皮卵巣がん、胚細胞卵巣がん、低悪性度卵巣がん、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜がん、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、カポジ肉腫、横紋筋肉腫、セザリー症候群、小腸がん、軟部組織肉腫、咽頭がん、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、並びにワルデンシュトロームマクログロブリン血症からなる群から選択される、請求項５３又は５４に記載のがん治療用医薬組成物。
【請求項５７】
請求項１に記載の核酸、又は請求項３７に記載の組換えワクシニアウイルスと、使用者に、前記核酸又は前記組換えワクシニアウイルスを宿主細胞において発現させるように指示するパッケージ添付文書とを含むキット。
【請求項５８】
請求項１に記載の核酸、又は請求項３７に記載の組換えワクシニアウイルスと、使用者に、治療有効量の前記核酸又は前記組換えワクシニアウイルスを、がんを有する哺乳動物患者に投与し、これにより、前記がんを処置するように指示するパッケージ添付文書とを含むキット。
【請求項５９】
前記哺乳動物患者が、ヒト患者である、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
Ｂ８Ｒ遺伝子が欠失している、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６１】
少なくとも１つのトランス遺伝子が、前記欠失したＢ８Ｒ遺伝子の遺伝子座に挿入されている、請求項６０に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６２】
少なくとも２つのトランス遺伝子が、前記欠失したＢ８Ｒ遺伝子の遺伝子座に挿入されている、請求項６１に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６３】
少なくとも３つのトランス遺伝子が、前記欠失したＢ８Ｒ遺伝子の遺伝子座に挿入されている、請求項６２に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６４】
少なくとも１つのさらなるトランス遺伝子が、Ｂ８Ｒ遺伝子の遺伝子座ではない遺伝子座に挿入されている、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６５】
前記遺伝子座が、５ｐ欠失の境界である、請求項６４に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【請求項６６】
前記遺伝子座が、３ｐ欠失の境界である、請求項６５に記載の核酸又は組換えワクシニアウイルス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１７Ｌ、及びＢ１４Ｒからなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、又は３つの遺伝子の欠失を有する。多様な実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ８Ｒの欠失をさらに含みうる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
一部の実施形態では、組換えワクシニアウイルスゲノムは、Ｂ１５Ｒ、Ｂ１７Ｌ、及びＢ１４Ｒからなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ又は３つの遺伝子の欠失を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
遺伝子の定義
本明細書で使用される「Ｃ２Ｌ」とは、ケルチ様タンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｃ２Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｃ２Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
本明細書で使用される「Ｃ１Ｌ」とは、ワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｃ１Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｃ１Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
本明細書で使用される「Ｎ１Ｌ」とは、ＢＣＬ−２阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｎ１Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｎ１Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
本明細書で使用される「Ｎ２Ｌ」とは、ＴＬＲシグナル伝達阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｎ２Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｎ２Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
本明細書で使用される「Ｍ１Ｌ」とは、アンキリンリピートタンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｍ１Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｍ１Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
本明細書で使用される「Ｍ２Ｌ」とは、ＮＦ−κＢ阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｍ２Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｍ２Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
本明細書で使用される「Ｋ１Ｌ」とは、ＮＦ−κＢ阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ１Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｋ１Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
本明細書で使用される「Ｋ２Ｌ」とは、アンキリンリピートタンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ２Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｋ２Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
本明細書で使用される「Ｋ３Ｌ」とは、ＰＫＲ阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ３Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｋ３Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
本明細書で使用される「Ｋ４Ｌ」とは、ホスホリパーゼＤをコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ４Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｋ４Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
本明細書で使用される「Ｋ５Ｌ」とは、モノグリセリドリパーゼをコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ５Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｋ５Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
本明細書で使用される「Ｋ６Ｌ」とは、モノグリセリドリパーゼをコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ６Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｋ６Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
本明細書で使用される「Ｋ７Ｒ」とは、ＮＦ−κＢ阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｋ７Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｋ７Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
本明細書で使用される「Ｆ１Ｌ」とは、カスパーゼ９阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｆ１Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｆ１Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
本明細書で使用される「Ｆ２Ｌ」とは、ｄＵＴＰアーゼをコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｆ２Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｆ２Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
本明細書で使用される「Ｆ３Ｌ」とは、ケルチ様タンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｆ３Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表２に列挙される。「Ｆ３Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
本明細書で使用される「Ｂ１４Ｒ」とは、ワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１４Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３に列挙される。「Ｂ１４Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
本明細書で使用される「Ｂ１５Ｒ」とは、ワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１５Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３に列挙される。「Ｂ１５Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
本明細書で使用される「Ｂ１６Ｒ」とは、ＩＬ−１ベータ阻害剤をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１６Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３に列挙される。「Ｂ１６Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
本明細書で使用される「Ｂ１７Ｌ」とは、ワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１７Ｌ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３に列挙される。「Ｂ１７Ｌ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
本明細書で使用される「Ｂ１８Ｒ」とは、アンキリンリピートタンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１８Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３に列挙される。「Ｂ１８Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
本明細書で使用される「Ｂ１９Ｒ」とは、ＩＦＮアルファベータ受容体様分泌型糖タンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ１９Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３に列挙される。「Ｂ１９Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
本明細書で使用される「Ｂ２０Ｒ」とは、アンキリンリピートタンパク質をコードする遺伝子などのワクシニアウイルス遺伝子を指す。Ｂ２０Ｒ遺伝子をコードするタンパク質配列の非限定例は、下記の表３に列挙される。「Ｂ２０Ｒ」という用語はまた、下記の表に列挙されるタンパク質の断片若しくはバリアント、又は別のワクシニアウイルス株に由来する、相同な遺伝子も含みうる。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
ＣｏｐＭＤ５ｐ、ＣｏｐＭＤ３ｐ、及びＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐの欠失
多様な実施形態では、ワクシニアウイルスの腫瘍溶解活性を増強するように、多様な遺伝子が欠失している。本明細書で記載される欠失の大半は、ウイルス感染に対する宿主応答の遮断に関与するか、又は他の形における未知の機能を有する。多様な実施形態では、表１に描示された遺伝子のうちの少なくとも１つが、組換えワクシニアウイルスゲノムから欠失している。多様な実施形態では、表１に描示された遺伝子のうちの、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１が、組換えワクシニアウイルスゲノムから欠失している。多様な実施形態では、表２及び３に描示された遺伝子の全てが、組換えワクシニアウイルスゲノムから欠失している。本明細書では、本発明の３つの例示的な実施形態である、ＣｏｐＭＤ５ｐ、ＣｏｐＭＤ３ｐ、及びＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐについて記載される。下記の表２及び３では、欠失した遺伝子のクラスター、並びにＣｏｐＭＤ５ｐウイルス、ＣｏｐＭＤ３ｐウイルス、及びＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐウイルスにおけるそれらの機能が描示される。ＩＴＲの２つのコピーが存在する、多様な実施形態では、ゲノムの右側のＩＴＲが欠失し、左側のＩＴＲは、インタクトのままである。欠失は、全ゲノムシーケンシングにより確認された。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
次いで、５９のポックスウイルスゲノムを、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐにおいて欠失した、これらの３２の遺伝子の存在について評価した。相同性の検索を使用して、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎゲノムによる、表２の遺伝子のアミノ酸配列を伴う、他のクレードに由来するポックスウイルスに問い合わせた。図３１に示される通り、多様なポックスウイルス株において存在する、これらの３２の遺伝子の百分率は、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株からの分岐が増大するにつれて低下した（プロットにおける各ドットは、１つのポックスウイルスゲノムを表す）。しかし、ワクシニアファミリーのメンバーの大部分は、ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ組換えベクターにおいて欠失した遺伝子のうちの、少なくとも８５％を含む。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
本開示の改変ワクシニアウイルスベクター（例えば、改変Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎワクシニアウイルスベクターなどの改変ワクシニアウイルスベクター）を作製するための、例示的なスキームを、図２１に示す。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
Ｂ８Ｒ−ウイルスは、Ｂ８Ｒ＋ウイルスと同様の効能を示した（図３４）。ＳＫＶ又はＳＫＶ−ＧＦＰで処置されたマウスの生存を評価した。ＣＴ２６−ＬａｃＺ細胞５×１０６個を、０日目に皮下接種した。１４、１６、及び１８日目に、腫瘍を、１０７ｐｆｕの用量の、ＳＫＶ又はＳＫＶ−ＧＦＰの腫瘍内注射により処置した。注射されたウイルスが、Ｂ８Ｒ遺伝子座の欠失を有しても、効能の著明な低下は見られなかった。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
実施例１６−がん細胞株と対比した、正常細胞株への、ＳＫＶ（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ−Ｂ８Ｒ＋）ウイルスの感染
初代健常細胞の生存率を、がん細胞の生存率と比較した。コンフルエントの正常細胞又はがん細胞に、ある範囲のＭＯＩ（細胞１個当たりのｐｆｕ）で、４８時間にわたり感染させ、その後、生存率を定量した。図３２に指し示す通り、ＳＫＶ（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ−Ｂ８Ｒ＋）ウイルスは、がん細胞に、優先的に感染する。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
実施例１７−ＳＫＶ（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ−Ｂ８Ｒ＋）は、インターフェロンによるシグナル伝達を損なわない
様々な正常細胞株及び１つのがん細胞株（７８６−Ｏ）において、上方調節（発現の誘導）又は下方調節（発現の抑制）されるインターフェロン経路の遺伝子の数を決定することにより、インターフェロンによるシグナル伝達について評価した（図３３）。コンフルエント単層の細胞１００万個に、ＴＫ遺伝子を失効させたＳＫＶ−Ｂ８Ｒ＋（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ）ウイルス株、又は親Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎウイルス株を、３のＭＯＩ（３ｅ６  ＰＦＵ）で、１８時間にわたり感染させた。ＲＮＡ−ｓｅｑを使用して、ＲＮＡをシーケンシングし、発現正規化後のマッピングを読み取った後で、インターフェロン遺伝子の遺伝子発現を決定した。ＳＫＶ−Ｂ８Ｒ＋（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ）ウイルスは、インターフェロン経路における遺伝子の大半を誘導するが、親Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎウイルスは、遺伝子を抑制する。これは、ＳＫＶ−Ｂ８Ｒ＋（ＣｏｐＭＤ５ｐ３ｐ）が、正常細胞のウイルスクリアランスにおいて極めて重要な、Ｉ型インターフェロンによるシグナル伝達を誘導することが可能であることを示唆する。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
実施例１８−多様なワクシニア株において操作された、二重メジャー欠失は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、がん細胞の殺滅を増強する
Ｈｅｌａ細胞に、以下の操作ワクシニアウイルス株：（１）親野生型ウイルス（ｗｔ）株；（２）５プライムメジャー欠失（５ｐ）株、（３）３プライムメジャー欠失（３ｐ）株、及び（４）組換え５プライム／３プライム二重メジャー欠失（５ｐ３ｐ）株を、０．１のＭＯＩで感染させた。細胞生存率は、感染の７２時間後に、アラマーブルーアッセイにより定量した。５ｐメジャー欠失ワクシニア株及び５ｐ３ｐ二重メジャー欠失ワクシニア株のいずれも、それらの親野生型株及び３ｐメジャー欠失株と比較した場合、ＨｅｌＬａ細胞において、より細胞傷害性である。図３５を参照されたい。図３６は、メジャー欠失ワクシニア株の概要、並びに５ｐ欠失、３ｐ欠失、及び５ｐ３ｐ欠失の、合胞体、細胞傷害作用、及び複製に対する効果について描示する。ＣＤ−１ヌードマウスを、１×１０７ｐｆｕを伴う尾静脈注射を介して、静脈内処置し、表示の時点において測定した。５ｐ３ｐワクシニア株は、野生型株と比較して、体重の減少を誘導しなかった（図３７）。マウスはまた、注射後６日間にわたり、ポックス病変についても検査した。５ｐ３ｐワクシニア株は、野生型株と比較して、ポックス病変を誘導しない（図３８）。
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月25日(2021.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
MRYIIILAVLFINSIHAKITSYKFESVNFDSKIEWTGDGLYNISLKNYGIKTWQTMYTNVPEGTYDISAFPKNDFVSFWVKFEQGDYKVEEYCTGLCVEVKIGPPTVTLTEYDDHINLYIEHPYATRGSKKIPIYKRGDMCDIYLLYTANFTFGDSEEPVTYDIDDYDCTSTGCSIDFATTEKVCVTAQGATEGFLEKITPWSSEVCLTPKKNVYTCAIRKEDVPNFKDKMARVIKRKFNKQSQSYLTKFLGSTSNDVTTFLSMLNLTKYS（配列番号１２７）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021509815000001.app
【国際調査報告】
2021509815.tif 000054
2021509815.tif 000055