(57)【要約】  【解決手段】    二次スフェロイドを含む細胞シートを作成する方法であって、（ａ）カーディオスフェア由来細胞を取得する工程と、（ｂ）二次スフェロイドを形成するために、少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体を含む第１の培地で第１の期間、前記カーディオスフェア由来細胞を培養する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で形成された一定の量の前記スフェロイドを鋳型に移す工程と、（ｄ）少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体を含む第２の培地で第２のスフェロイドを第２の期間培養する工程であって、前記少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体が細胞外マトリックスの形成を促進するために有効な量で存在する、前記培養する工程と、および（ｅ）工程（ｄ）で取得した生成物を、前記少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体の非存在下で、第３の期間培養する工程と、を含む方法。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二次スフェロイドを含む細胞シートを作成する方法であって、
（ｆ）カーディオスフェア由来細胞を取得する工程と、
（ｇ）二次スフェロイドを形成するために、少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体を含む第１の培地で第１の期間、前記カーディオスフェア由来細胞を培養する工程と、
（ｈ）工程（ｂ）で形成された一定の量の前記スフェロイドを鋳型に移す工程と、
（ｉ）前記少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体を含む第２の培地で第２のスフェロイドを第２の期間培養する工程であって、前記少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体が細胞外マトリックスの形成を促進するために有効な量で存在する、前記培養する工程と、および
（ｊ）工程（ｄ）で取得した生成物を、前記アスコルビン酸およびその類似体の少なくとも１つの非存在下で、第３の期間培養する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記第１の期間は、約２４時間である、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記第２の期間は、約３日である、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記第３の期間は、約４日である、方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記第２および第３の期間の合計は、約７日である、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、生成された前記細胞シートは、約５００μｍ〜約１４５０μｍの直径を有する二次スフェロイドを含む、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、生成された前記細胞シートは、６００μｍ超〜約１４５０μｍの直径を有する二次スフェロイドを含む、方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記アスコルビン酸の類似体は、アスコルビン酸２−リン酸、アスコルビン酸３−リン酸、ならびにＭｇおよびＭｇ水和物を含むそれらの塩および水和物を含む、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、工程（ｂ）における第１の培地および工程（ｄ）における第２の培地のうちの少なくとも１つは、前記カーディオスフェア由来細胞の成長を促進するために有効な量の成長因子をさらに含む、方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、前記成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子である、方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法において、工程（ａ）での前記カーディオスフェア由来細胞は、６．０×１０４〜２．０×１０５細胞／１００μＬの濃度を有する、方法。
【請求項１２】
請求項１記載の方法において、前記鋳型は、
（ａ）少なくとも１つの開口を含む第１の低接着性材料を含む上層と、
（ｂ）第２の低接着性材料を含む膜と、および
（ｃ）ベースと、
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、前記第１の低接着性材料および前記第２の低接着性材料は、非コラーゲン被覆ＰＴＦＥである、方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法において、少なくとも１つの第１の低接着性材料および前記第２の低接着性材料は、４μｍ〜１０μｍの孔径を有する、方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、工程（ｄ）での二次スフェロイドの培養は、孔を通る第２の培地の拡散による、鋳型内での第２の培地の循環を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１２記載の方法において、前記第１の低接着材料は４つの開口を含み、前記各開口が約４×４ｍｍである、方法。
【請求項１７】
心臓損傷を患っている対象を治療する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の方法により細胞シートを取得する工程と、
（ｂ）前記細胞シートをバルーンステントカテーテルに巻き付ける工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で形成された細胞シートで覆われたバルーンステントカテーテルを前記被験者の冠状動脈に挿入する工程と、
（ｄ）前記ステントを拡張するためにバルーンカテーテルを膨張させる工程と、および
（ｅ）前記バルーンカテーテルを収縮させて取り除く工程と、
を有する方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法において、前記対象は、前記心臓損傷の治療における心臓再生のために、前記細胞シートによって放出されるパラクリン因子を必要とする、方法。
【請求項１９】
心臓損傷を患っている対象を治療する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の方法により細胞シートを取得する工程と、
（ｂ）前記細胞シートをバルーンステントカテーテルに巻き付ける工程と、
（ｃ）アセンブリを形成するために、工程（ｂ）で形成された前記細胞シートで覆われたバルーンステントカテーテルを第２のステントの内側に挿入する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の前記アセンブリを前記被験者の冠状動脈に配置する工程と、
（ｅ）工程（ｂ）の前記ステントおよび工程（ｃ）の第２のステントを拡張するために、前記バルーンカテーテルを膨張させる工程と、および
（ｆ）前記バルーンカテーテルを収縮させて取り除く工程と、
を有する方法。
【請求項２０】
心臓損傷を患っている対象を治療する方法であって、
（ｆ）二次スフェロイドを含む細胞シートを作成する工程であって、
（ｖｉ）カーディオスフェア由来の細胞を取得する工程と、
（ｖｉｉ）二次スフェロイドを形成するために、少なくとも１つアスコルビン酸およびその類似体を含む第１の培地で前記カーディオスフェア由来細胞を第１の期間培養する工程と、
（ｖｉｉｉ）工程（ｂ）で形成されたある量の前記スフェロイドを鋳型に移す工程と、
（ｉｘ）少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体を含む第２の培地で第２のスフェロイドを第２の期間培養する工程であって、前記少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体が細胞外マトリックスの形成を促進するために有効な量で存在する、前記培養する工程と、および
（ｘ）工程（ｄ）で取得した生成物を、前記少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体の非存在下で、第３の期間培養する工程と、
を含む前記作成する工程と、
（ｇ）前記取得した細胞シートをバルーンステントカテーテルに巻き付ける工程と、
（ｈ）工程（ｂ）で形成された前記細胞シートで覆われたバルーンステントカテーテルを前記被験者の冠状動脈に挿入する工程と、
（ｉ）前記ステントを拡張するために前記バルーンカテーテルを膨張させる工程と、および
（ｊ）前記バルーンカテーテルを収縮させて取り除く工程と、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１７年１２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／６１０，７２１号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９に基づく優先権主張をするものである。前述の出願の開示全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、カーディオスフェア由来の細胞シート、ならびにそれを製造する方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
成体幹細胞（すなわち、骨髄、脂肪組織、心臓（カーディオスフェア）などに由来する）は、壊死の心筋を再生し、左心室（ＬＶ）機能を改善するための有望な治療法を提供する。カーディオスフェア由来細胞（ＣＤＣ）によって誘発される心筋再生は、ＣＤＣの直接分化から新規心臓細胞へというよりむしろ、主に成長因子、サイトカイン、マイクロＲＮＡなどのパラクリン因子（例：ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１を含む）のＣＤＣ分泌に起因することが示されてきた。つまり、ＣＤＣは、瘢痕量と筋細胞のアポトーシスを減らし、筋細胞の増殖を増加させ、内因性心臓幹細胞を活性化して新しい筋細胞を生成するパラクリン因子を分泌する。したがって、幹細胞からのパラクリン因子の変調は、心筋梗塞後の心臓再生に重要な役割を果たす。
【０００４】
残念ながら、梗塞を起こした心筋を有する患者における成体幹細胞の治療効果は、注入された幹細胞の保持が低いことに関連する一時的なパラクリン効果のせいで、よく見積もっても控えめなものだった。心筋内または冠状動脈内幹細胞注射から数分以内に、細胞の大部分（細胞の〜８５％）が洗い流され、注射後１か月で細胞の１〜２％のみが心臓に保持される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の問題に照らして、本発明の目的は、生体工学技術を利用して、生存可能な幹細胞を含む薄く、柔軟で耐久性のある細胞シートを提供し、細胞保持を最適化し、パラクリン分泌を持続させることである。
【０００６】
上述の目的を達成するための本発明の第１の実施形態によると、以下：
二次スフェロイドを含む細胞シートを作成する方法であって、
（ａ）カーディオスフェア由来細胞を取得する工程と、
（ｂ）二次スフェロイドを形成するために、少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体を含む第１の培地で第１の期間、前記カーディオスフェア由来細胞を培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で形成された一定の量の前記スフェロイドを鋳型に移す工程と、
（ｄ）少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体を含む第２の培地で第２のスフェロイドを第２の期間培養する工程であって、前記少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体が細胞外マトリックスの形成を促進するために有効な量で存在する、前記培養する工程と、および
（ｅ）工程（ｄ）で取得した生成物を、前記少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体の非存在下で、第３の期間培養する工程と、
を含む方法が提供される。
【０００７】
上記の目的を達成するための本発明の第２の実施形態によると、以下：
心臓損傷を患っている対象を治療する方法であって、
（ａ）二次スフェロイドを含む細胞シートを作成する工程であって、
（ｉ）カーディオスフェア由来の細胞を取得する工程と、
（ｉｉ）二次スフェロイドを形成するために、少なくとも１つアスコルビン酸およびその類似体を含む第１の培地でカーディオスフェア由来細胞を第１の期間培養する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｂ）で形成されたある量の前記スフェロイドを鋳型に移す工程と、
（ｉｖ）少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体を含む第２の培地で第２のスフェロイドを第２の期間培養する工程であって、前記少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体が有効な量で存在する細胞外マトリックスの形成を促進する、前記培養する工程と、および
（ｖ）工程（ｄ）で取得した生成物を、前記少なくとも１つのアスコルビン酸およびその類似体の非存在下で、第３の期間培養する工程と、
を含む前記作成する工程と、
（ｂ）前記取得した細胞シートをバルーンステントカテーテルに巻き付ける工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で形成された前記細胞シートで覆われたバルーンステントカテーテルを前記被験者の冠状動脈に挿入する工程と、
（ｄ）前記ステントを拡張するために前記バルーンカテーテルを膨張させる工程と、および
（ｅ）前記バルーンカテーテルを収縮させて取り除く工程と、
を含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
以下、本発明を、例示的な図面を参照して、以下により詳細に説明する。
【図１】図１は、細胞シート形成および移植のプロセスを示す。
【図２】図２は、心臓組織から二次カーディオスフェアを作成するプロセスを示す。
【図３】図３は、初期心臓マーカーを発現するＣＤＣのデータを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、細胞シート鋳型の例を示し、上の２つの画像は、鋳型および媒体に浸漬された鋳型を示し、下の２つの画像は、それぞれの側面図を示す。
【図５】図５は、ＣＤＣの数およびカーディオスフェアのサイズの例を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｂは、より小さいサイズのカーディオスフェアを使用する細胞シート作成の例を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｂは、より小さいサイズのカーディオスフェアを使用する細胞シート作成の例を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃは、比較的大きいサイズのカーディオスフェアを使用した細胞シート作成の例を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｃは、比較的大きいサイズのカーディオスフェアを使用した細胞シート作成の例を示す。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、比較的大きいサイズのカーディオスフェアを使用した細胞シート作成の例を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｄは、は、細胞シートの３Ｄ印刷のための構造およびカーディオスフェアを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｄは、は、細胞シートの３Ｄ印刷のための構造およびカーディオスフェアを示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｄは、は、細胞シートの３Ｄ印刷のための構造およびカーディオスフェアを示す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｄは、は、細胞シートの３Ｄ印刷のための構造およびカーディオスフェアを示す。
【図９】図９は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析によって評価されたカーディオスフェアのパラクリン因子および細胞シート形成に関するデータを示す。
【図１０】図１０は、ＣＤＣおよび細胞シートのタンパク質発現に関するデータを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｆは、細胞シートの特徴に関する代表的な組織学的画像およびデータを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｆは、細胞シートの特徴に関する代表的な組織学的画像およびデータを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｆは、細胞シートの特徴に関する代表的な組織学的画像およびデータを示す。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｆは、細胞シートの特徴に関する代表的な組織学的画像およびデータを示す。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜１１Ｆは、細胞シートの特徴に関する代表的な組織学的画像およびデータを示す。
【図１１Ｆ】図１１Ａ〜１１Ｆは、細胞シートの特徴に関する代表的な組織学的画像およびデータを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、細胞シート送達のプロセスを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、細胞シート送達のプロセスを示す。
【図１３】図１３は、ＣＤＣの標準的な冠動脈内注入と対比される管腔内細胞シートに関するデータを示す。および
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｄは、心筋梗塞における管腔内細胞シートの再生効果を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｄは、心筋梗塞における管腔内細胞シートの再生効果を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｄは、心筋梗塞における管腔内細胞シートの再生効果を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｄは、心筋梗塞における管腔内細胞シートの再生効果を示す。
【０００９】
本発明の他の特徴および利点は、例として本発明の原理を示す添付の図面と併せて、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の好ましい実施形態について説明する。数値は、本発明の理解を容易にするための例示に過ぎず、特に明記しない限り、本発明を限定するものではない。なお、本明細書と各図において、実質的に同一の機能を有する要素には同一の符号を付し、本発明と直接関係のない要素については重複する説明を省略する。
【００１１】
本質的に、本発明は、本明細書に記載されるようなカーディオスフェア由来細胞から培養された二次スフェロイドを含む細胞シートを提供する。細胞シートは、冠状動脈の内側に配置することによって心臓損傷を治療するために使用し得、より具体的には、細胞シートを動脈の内腔に配置し得る。細胞シートは、心臓再生におけるＣＤＣまたはＣＤＣ単層の使用など、既存の生体工学の潜在的なリスクと欠点を回避する。
【００１２】
本発明は、シートが心膜心臓に埋め込まれた場合よりも細胞シートのより長い存続を可能にするために、冠状動脈における細胞シートのそのような配置を含む。細胞シートの心外膜の配置は、開胸手術を必要とし、患者により大きなストレスを引き起こす。一方、カーディオスフェアが冠状動脈に直接注入された場合、それらは毛細血管網を詰まらせる。それらが心臓に直接注入された場合、それらは細胞シート内にある限り保持されない。本発明の生体工学は、細胞保持およびパラクリン分泌の持続を最適化する。構造が非常に壊れやすく、急性血栓の形成と破片の微小塞栓を引き起こす可能性があるため、ステントなしの腔内細胞シート送達は実用的ではない。
【００１３】
本発明により、カーディオスフェアから放出された細胞外マトリックスと融合した二次カーディオスフェアは、豊富なパラクリン因子分泌を犠牲にすることなく、幹細胞動員効果を増幅しながら、柔軟で耐久性のある細胞シートを形成する。したがって、本発明は、上記の潜在的なリスクを克服する生存可能な幹細胞を含む、薄く、柔軟で耐久性のある細胞シートを作成する。
【００１４】
カーディオスフェア由来細胞（ＣＤＣ）のサンプル収集、処理、および特性評価
ブタの標本は心室自由壁の針生検から得られた。組織標本を１〜２ｍｍ３の小片に切った。断片から肉眼的な結合組織を取り除いた後、組織断片を洗浄し、タイプＩＶコラゲナーゼの溶液中で３７℃で６０分間酵素的に消化した。組織断片は、フィブロネクチンでコーティングされた皿上で「外植片」として培養された。８日以上の期間の後、間質様細胞の層が外植片から出現して取り囲んだ。この層の上に、小さくて丸い、明るい位相細胞が移動した。融合した後、外植片の周囲の細胞を穏やかな酵素消化により採取した。これらのカーディオスフェア形成細胞は、カーディオスフェア培地（２０％熱不活化ウシ胎児血清、ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、および０．１ミリモル／Ｌの２−メルカプトエタノール（イスコーブの改変ダルベッコ培地中））のポリ−Ｄ−リジンコーティング皿に２〜３
１０４細胞／ｍＬで播種された。培養で４〜１０日後、カーディオスフェアが形成され、組織培養表面から分離し、懸濁液中でゆっくりと成長し始めた。サイズと数が十分な場合、これらの自由に浮遊するカーディオスフェアは、培地と一緒に吸引することによって収穫された。ポリ−Ｄ−リジンコーティング皿に付着したままの細胞は廃棄された。分離したカーディオスフェアをフィブロネクチンでコーティングしたフラスコにプレーティングし、培養面に付着させて広げ、「カーディオスフェア由来細胞」（ＣＤＣ）の単層を形成した。元の心臓組織が得られた時間の４〜６週間以内に、５，０００〜１億個のＣＤＣが増殖することができた。ＣＤＣは、細胞シートが作成されるまで冷凍庫（−８０度）で保管した。
【００１５】
以上の過程を図２に示す。１．心臓組織（「外植片」）は、フィブロネクチンでコーティングされた皿上で培養された。１週間後、間質様細胞の層が外植片１を取り囲み始めた（画像ａは、心臓の外植片と増殖細胞を示す）。この層の上に、小さく丸い、明るい位相細胞が検出された。これらの細胞を採取し、カーディオスフェア２の形成を開始した（画像ｂはカーディオスフェアを示す）。カーディオスフェアを収集し、フィブロネクチンでコーティングした皿３で拡大した（画像ｃはカーディオスフェア由来細胞３ａを示す）。等量の細胞を超低付着円形プレートにプレーティングして、同じサイズ４の第２のカーディオスフェアを作成した（画像ｄは第２のカーディオスフェアを示す）。
【００１６】
ＣＤＣは異種細胞マーカー（ｃＫｉｔ：幹細胞、ＣＤ９０／ＣＤ１０５：間葉系細胞、ＧＡＴＡ４／Ｎｋｘ２．５：初期心筋細胞）を発現するため、幹細胞と心臓の運命に関与する心臓前駆細胞の混合物である。図３は、ＣＤＣが初期心臓マーカーを発現したことを支持する特徴付けの結果および代表的な画像を示す。注射前の継代６でのＣＤＣが特徴付けられた。ＣＤＣはｃ−ｋｉｔ陽性率が低く（〜５％）、９５％以上が間葉系マーカーを発現した（図３の５および６参照）。ＣＤＣは、筋細胞転写因子についてのみ陽性であった（図３の７および８の代表的な画像に示されるように、ＧＡＴＡ４：１００％；およびＮｋｘ２．５：９４％）。しかし、造血および心臓（ｃＴｎＴおよびｃＴｎＩ）マーカーについては陰性であった（図３の７参照）。したがって、データは、ＣＤＣが初期の心臓前駆細胞系に関与したことを示す。
【００１７】
カーディオスフェアベースの細胞シートを生成するための鋳型システム（カーディオスフェアサイズの最適化）
以下の本発明の可能な実施形態の説明は、カーディオスフェアから放出された細胞外マトリックスを利用する細胞シートの鋳型を使用して、薄く、柔軟で耐久性のあるカーディオスフェアベースの幹細胞シートがどのように生成されたかを説明する。
【００１８】
ＣＤＣは凍結から回収され、細胞シート生産の前に１週間培養された。細胞懸濁液（総細胞数２．０×１０４）を、当業者に周知のように、超低付着性の丸型９６Ｕウェルプレート（日本、東京、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ  Ｃｏ．Ｌｔｄ製）の各ウェルにプレーティングし、カーディオスフェア培地（２０％熱不活化ウシ胎仔血清、ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ２−メルカプトエタノール（イスコフの改変ダルベッコ培地中）、４０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞成長因子および４ｎｇ／ｍｌのアスコルビン酸で満たした。２４時間後、細胞は凝集して丸い形状のカーディオスフェア（第２のカーディオスフェア）を形成した。
【００１９】
カーディオスフェア媒体はアスコルビン酸またはその類似体を含むことができることに留意するべきである。そのような類似体には、アスコルビン酸２−リン酸、アスコルビン酸３−リン酸、ならびにＭｇおよびＭｇ水和物などのその塩および水和物が含まれるが、これらに限定されない。そのような培地はまた、塩基性線維芽細胞成長因子などの、カーディオスフェア由来細胞の成長を促進するのに有効な量の成長因子を含み得る。
【００２０】
図５は、ＣＤＣの数とカーディオスフェアのサイズを示す。つまり、各スフェアの細胞数を最適化するために、４ドナー動物のＣＤＣをさまざまな濃度（２．０×１０４、６．０×１０４、２．０×１０５細胞／１００μＬ）でテストし、スフェアのサイズを測定した。上記のように、細胞を超低付着性の丸型９６Ｕウェルプレートにプレーティングした。２４時間以内に、スフェアが形成され、それらのサイズが血球計算盤グリッドによって測定され、結果は図５に示される。
【００２１】
図４Ａおよび４Ｂに示すように、カーディオスフェア（〜２００スフェア）を鋳型９の上に置き、７日間培養した。可能な実施形態では、細胞シート鋳型９の最上層１０は、テフロン（商標登録）ＰＴＦＥ（厚さ０．７９ｍｍ）などの低接着材料で作られ、鋳型はまた、５μｍの細孔、およびポリカーボネートベース１２を有するＰＴＦＥなどの低接着材料で作られた膜１１を含む。媒体の循環を可能にするために、細孔サイズは、通常、４μｍ〜１０μｍの範囲であることを留意すべきである。上層１０は少なくとも１つの開口１０ａを有し、そこにカーディオスフェア（〜２００スフェア）が配置される。開口部１０ａが開口部を提供し、ＰＴＦＥ膜が小さな孔を有するので、培養培地１３は、細胞シートの上部および底部から循環することができる。最初の３日間、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）とＬ−アスコルビン酸２−リン酸（Ｌ−ＡＡ、２０μｇ／ｍｌ）を、２０％ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、１００００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンおよび０．１ｍｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエタノールに加えた。ｂＦＧＦは、細胞のサイズと分裂において小さく保つのに役立つ。Ｌ−ＡＡは細胞外マトリックスの分泌を促進し、スフェア同士の結合を助ける。４日目に、ｂＦＧＦおよびＬ−ＡＡを除去し、カーディオスフェアを７日目まで培養した。
【００２２】
動作中、図４Ｂおよび図１の１３ａに示されるように、鋳型９は、容器１４内の媒体１３に浸漬される。媒体１３は、鋳型９の最上レベルより上のレベル１６まで充填される。次に、媒体１３は、図４Ｂの側面図の矢印に示すように、拡散によって膜１１を通って循環する。膜１１は、典型的には、４〜１０μｍのいずれかの範囲の孔サイズを有し得る。膜１１の孔径とは無関係に、最上層１０はまた、典型的には４〜１０μｍの範囲の孔径を有し得る。最上層１０は、可能な実施形態では、４つの開口１０ａを有することができ、各開口は、４ｍｍ×４ｍｍの細胞シートのテンプレートとして、約４ｍｍ×４ｍｍである。
【００２３】
なお、上記第２の媒体１３は、上記のカーディオスフェア媒体の組成にかかわらず、鋳型９が浸漬されるものとして、アスコルビン酸またはその類似体を含むことができる。そのような類似体には、アスコルビン酸２−リン酸、アスコルビン酸３−リン酸、ならびにＭｇおよびＭｇ水和物などのその塩および水和物が含まれるが、これらに限定されない。そのような培地はまた、塩基性線維芽細胞成長因子などの、カーディオスフェア由来細胞の成長を促進するのに有効な量の成長因子を含み得る。
【００２４】
細胞シートの形成が完了すると、上層をピンセットで拾うことができる。その後、細胞シート自体をピンセットで取り除くことができる。これは、細胞シートを除去するために酵素作用を必要とする鋳型よりも大きな利点である。そのような酵素の使用は細胞シートを弱めるか、破壊する。酵素的分離を必要とするそのような鋳型の１つは、コラーゲンコーティングされたＰＦＴＥを利用する。本発明は、鋳型のためにコラーゲンで未コーティングのＰＴＦＥの使用を可能にし、それによりそのような酵素の不利な使用を回避する。
【００２５】
上記のプロセスは、それらの間のすべての範囲および整数を含めて、約５００μｍ〜約１４５０μｍの直径を有する二次スフェロイドからなる細胞シートを生成し得る。他の実施形態では、二次スフェロイドの直径は、６００μｍ〜約１４５０μｍの範囲であるか、または６００μｍ〜約１４５０μｍより著しく大きいか、またはすべて約５００μｍであり得る。そのような直径のスフェロイドを形成するために使用できる細胞密度は、約６０，０００〜２００，０００細胞／μｌである。
【００２６】
図５に関して上述したように、細胞シートを作成するための細胞数を最適化するために、ＣＤＣは最初に実験的にウェルあたり夫々２．０×１０４、６．０×１０４および２．０×１０５細胞に分けられた。対応するスフェアの直径は、夫々３７０±３７、６３０±４７および１４５０±４２μｍだった。上記のように、２００枚の第２のカーディオスフェア１５を細胞シートの鋳型に入れた。その結果、図６Ａ〜６Ｂで示すように、１ウェルあたり２．０×１０４細胞から作製された細胞シートは、半分のサイズの細胞シートを作り、製品は壊れやすかった。すなわち、図６Ａは鋳型内のスフェアを示し、図６Ｂは培養７日後の結果を示し、細胞シートは収縮しており、鋳型中で壊れやすかった。
【００２７】
対照的に、鋳型内のスペース／開口部に充填されたウェルあたり６．０×１０４および２．０×１０５の細胞から作成された細胞シートと最終製品は、７Ａ〜７Ｃ（ウェルあたり６．０×１０４細胞）に示すように、柔軟性と耐久性があった。すなわち、図７ａは、鋳型内のスフェアを示し、図７Ｂは、培養７日後の結果を示し、細胞シートは柔軟で耐久性があった。図７Ｃの例示的な画像は、６ウェルプレートで得られた細胞シートを示す。
【００２８】
以下の説明では、ウェルあたり６．０×１０４細胞を超える濃度（１枚あたり１０００〜１２００万個のＣＤＣに相当）で作成された第２のカーディオスフェアを使用した。
【００２９】
カーディオスフェアの細胞シートを生成するためのＢｉｏ−３Ｄプリンター
例えば、日本のＣｙｆｕｓｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｋ．Ｋ．によって製造されたもの（図８Ａ）などの「バイオ３Ｄプリンター」を使用して、スキャッフォールドフリーの組織を構築するためのカーディオスフェアを組み立てられることが知られており、この方法は実験目的のために最初に使用された。図８Ａ〜図８Ｄに示すように、コンピュータシステム上で事前に設計された三次元構造に従って、「Ｂｉｏ−３Ｄプリンタ」は、２６×２６の針アレイ（図８Ｂ）に串刺したカーディオスフェアを串刺しにした。各針の外径は０．１７ｍｍ、各針間の距離は０．４ｍｍだった。針アレイのサイズは正方形であり、各側の長さは１０．０ｍｍであった（図８Ｃ）。このシステムでは、９６ウェルプレートからロボット制御の細かい吸引ノズル（外径０．４５ｍｍおよび内径０．２３ｍｍ）でカーディオスフェアを吸引し、複数の医療用ステンレス針で作られたニードルアレイに挿入した。事前設計された構成に従って、合計６７６のカーディオスフェアがロボットによって３Ｄ構造に配置された。配置に要した時間は約１．３時間だった。カーディオスフェアを針アレイ上に配置してから７日後、針アレイを取り外した（図８Ｄ）。７日間の期間は、予備実験の結果に応じて選択され、構造の構成は、カーディオスフェア中およびカーディオスフェア間の融合により、針配列からの取り外し後も保持された。
【００３０】
カーディオスフェアベースの細胞シートはパラクリン機能を維持する
上記のように、カーディオスフェア由来細胞（ＣＤＣ）によって誘発される心筋の再生は、ＣＤＣの直接分化からではなく、ｄｅ  ｎｏｖｏ心臓細胞へというよりむしろ、主に成長因子、サイトカイン、マイクロＲＮＡ（例えば、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦおよびＳＤＦ−１を含む）などのパラクリン因子のＣＤＣ分泌に起因することを示す。
【００３１】
上記の理由により、カーディオスフェアと細胞シートからのパラクリン因子は、ｑＰＣＲ分析によってＣＤＣと比較された。以下の参照される細胞シートは、上記の「バイオ３Ｄプリンタ」を介して組み立てられるスキャッフォールドフリーの組織というよりむしろ、本発明の上記の方法および鋳型システムを介して作成されるシートであることに留意されるべきである。
【００３２】
血管新生に関連する主要なパラクリン因子（ＨＧＦ／ＩＧＦ−１／ＶＥＧＦ／ＳＤＦ−１／ＩＬ−６）の発現は、カーディオスフェア形成後にアップレギュレートされた。これらの効果は、細胞シート形成後も維持された。特に、幹細胞／前駆細胞の遊走に関連するＳＤＦ−１は、図９（ＣＳ＝カーディオスフェア；シート＝細胞シート）に示されるように、細胞シートで有意に上昇した。さらに、細胞シートからのパラクリン因子の放出を検出するために、細胞シートからの馴化培地をＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を介して分析した。そのデータは、図２に示されるように、ＣＤＣからの条件培地上のデータと比較された。図１０に示すように、細胞シートからのＩＧＦ−１およびＶＥＧＦタンパク質レベルは、ＣＤＣ条件培地と比較して大幅に上昇した。したがって、細胞シートの形成は、カーディオスフェアが元々持っている豊富なパラクリン因子分泌を維持し、細胞シートの形成は幹細胞動員効果も増幅する。
【００３３】
細胞シートは幹細胞および血管新生能力を維持する
免疫組織学的分析は、図１１Ａ〜Ｅの画像および対応する図１１Ｆの表に示すように、細胞シートが幹細胞／前駆細胞および毛細血管ネットワークからなることを示した。各細胞は、細胞シート構造を引き締める可能性がある細胞外マトリックスと融合する。図１１Ａの画像が示すに、ＣＤ３１陽性毛細血管は、細胞シートの周辺領域からコアまで張り巡らせる。図１１Ｂに示すように、細胞外マトリックス（コラーゲンＩ&ＩＩＩ）は、幹細胞マーカーを発現するカーディオスフェアを凝集させる（ＣＤ１１７／ＣＤ９０、図１１Ｃ）。それらは、１１Ｄおよび１１Ｅに示すように、初期筋細胞（ＧＡＴＡ４）および細胞周期マーカー（Ｋｉ６７）を発現する。細胞シートは血管新生が良く、細胞の生存を高め、幹細胞の能力を維持する。細胞シートは、線維症、成熟した内皮（ｖＷＦ）、平滑筋マーカー（α−ＳＭＡ）、心筋細胞（ｃＴｎＩ）またはアポトーシス（ＴＵＮＥＬ）を発現しない。したがって、生体工学化された細胞シートは、カーディオスフェアの生物学的特性を維持し、豊富なパラクリン因子（ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１など）を分泌すると結論付ける。組織学的分析は、細胞シートが幹細胞の能力を維持していることを示す。
【００３４】
慢性心筋梗塞で冠状動脈内に細胞シートを送達する方法
以下は、本発明の細胞シートの冠状動脈内腔への展開の成功について説明する。ヨークシャー豚（公称体重３０ｋｇ、女性、ｎ＝１７）を使用して、虚血再灌流手順（２時間のＬＡＤ閉塞と再灌流）により心筋梗塞（ＭＩ）を作成した。左中前部下行動脈またはＬＡＤ（〜２．５ｍｍ×１２ｍｍ）に一致するサイズのバルーン血管形成術カテーテルを前進させ、ＬＡＤの２番目の対角枝の遠位で１２０分間膨張させた。ＭＩ後１ヶ月で、最初の生理学的研究が行われた。これらの研究には、冠動脈の血管造影評価、ＬＶ機能、血行動態分析、および２Ｄ心エコー図が含まれ、全体的（駆出率（ＥＦ））および局所的（壁肥厚）心機能を測定した。細胞シート投与の３日前に、すべての動物をクロピドグレル（経口で３００ｍｇ）で前処理した後、毎日アスピリン（３２５ｍｇ）とクロピドグレル（７５ｍｇ）で前処理した。最初の生理学的研究の後、動物はステント内の細胞シートの内腔内移植（１０×１０６細胞を含む細胞シート、ｎ＝５）、ＣＤＣの冠内注入（１０×１０６細胞、ｎ＝６）および生理食塩水（未処理、ｎ＝６）処理された。
【００３５】
図１２Ａおよび１２Ｂで示すように、移植の準備として、細胞シート１７（サイズが４ｍｍ×４ｍｍ×０．５ｍｍ、約１０×１０６個の細胞を含む）を取り付け、収縮したステントバルーンカテーテル１８の周りに巻き付けた（図１２Ａおよび１２Ｂ）。本発明の別の実施形態では、細胞シートで包まれたバルーンステントカテーテルを第２のステントの内側にさらに挿入して、アセンブリ１９を形成することも可能である。中央ＬＡＤ２０では、図１２Ａおよび１２Ｂの膨張したバルーン２１によって示されるように、冠状動脈内に細胞シートを保持するために、ステントバルーンを膨張させた。ステントの拡張の成功は血管造影法により確認された。次に、ステントバルーン１８を収縮させ（図１参照）、カテーテルを取り外し、冠状動脈２０内で細胞シート１７を支持および保持するために拡張されたステント２２を残した。
【００３６】
図１は、プロセス図および対応する画像とともに、本発明の細胞シート形成および移植のための本発明の完全なプロセスを示し、カーディオスフェア由来細胞３ａからの二次スフェロイドの培養、鋳型９における細胞シートの形成、および中間ＬＡＤ２０における細胞シート１７の配置を示す。
【００３７】
細胞シート移植による微小塞栓症と急性血栓は、移植後の初期（０日）、１日、３日、１週間、および２週間の血液サンプルの収集と、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）およびＣＫ−ＭＢの分析を通じて評価された。治療後の機能障害がないことを確認するために、２Ｄ心エコー図（駆出率、壁肥厚）を実施した。治療後１か月で、最終的な生理学的研究（血行動態、血管造影および２Ｄ心エコー）を実施し、組織学およびタンパク質分析のために心臓を切除した。
【００３８】
心筋梗塞における腔内細胞シートの機能的効果
図１４Ａから１４Ｃおよび対応する図１４Ｄのグラフには、本発明の細胞シートを用いた治療が瘢痕の減少および新しい筋細胞の生成を促進することを示す。すなわち、心筋梗塞（ＭＩ）後１ヶ月で、死後の塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）分析（９．４±１．０％、図１４Ａ）によって評価されるように梗塞領域が増加した。しかしながら、ＣＤＣの冠動脈内注入後、梗塞サイズは有意に減少した（５．３±０．６％、ｐ＜０．０５ｖｓ未処置、図１４Ｂ）。細胞シートを用いた治療後、梗塞サイズは有意に減少し、梗塞領域の中央の生存可能な質量（図１４Ｃの矢印で示すように）は増加した（夫々、３．６±０．４％、ｐ＜０．０５ｖｓ未処置およびＣＤＣ）。したがって、このデータは、管腔内細胞シートの送達が梗塞瘢痕サイズの縮小を促進するとともに、新たに形成された心筋の生成を促進することを示す。
【００３９】
さらに、図１３のグラフにも描かれるように、心筋梗塞の１ヶ月後、心機能は正常対照と比較して有意に低下した（ＥＦ：ＭＩで４５±２％  ｖｓ  対照で６２±１％、ｐ＜０．０５）。細胞シートをＬＡＤ冠状動脈の内側に１ヶ月送達した。細胞シート療法後、心機能は回復し、ほぼ正常な機能に近づいた（夫々、ＥＦ：６１±５％、ｎ＝５、ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＣＤＣまたは未処置）。対照的に、ＣＤＣの冠動脈内注入は、治療後に心機能を維持する傾向があり（ＥＦ：４７±２％、ｎ＝６）、ｐ＜０．０５  ｖｓ  未処理）未処理の動物は心機能の低下を示した（ＥＦ：３６±１％、ｎ＝６）。したがって、データは、腔内細胞シート送達が、ＣＤＣの標準的な冠動脈内注入よりも有益な治療であることを示す。したがって、上記の結果は、本発明の細胞シートを用いた治療が標準的な細胞治療よりも効果的であることを示す。
【００４０】
上記で実証されたように、細胞シートは、移植後１か月で、新たに形成された心筋を伴う顕著な機能の改善と瘢痕の減少を促進した。治療効果は、幹細胞送達アプローチの冠動脈内注入による効果（標準的な細胞注入方法の１つを表す）よりもはるかに優れている。細胞シート移植後の血清心筋トロポニンＩの上昇はごくわずか（０．０２ｎｇ／μｌ未満）だった。したがって、集合的に、上記の管腔内移植は、細胞シート破片のいかなる急性閉塞、血栓形成、または微小塞栓を引き起こすことなく、安全かつ実現可能であることが実証される。さらに、そのような管腔内細胞シート送達は、心筋虚血における標準的な細胞療法よりも有望な効果をもたらす。
【００４１】
上述の実施形態は、本発明の原理の適用を表すことができる多くの可能な特定の実施形態の一部のみを例示するものであることを理解されたい。当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多数の様々な他の構成を容易に考案し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【国際調査報告】
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