(57)【要約】  本発明は、2つの発現カセットを含むサルアデノウイルスベクターであって、各発現カセットが導入遺伝子およびプロモーターを含み、第1発現カセットが該サルアデノウイルスベクターのE1領域に挿入されており、かつ第2発現カセットがベクター複製に適合する該アデノウイルスベクターの領域に挿入されている、該サルアデノウイルスベクターを提供する。【選択図】図7
2021500880.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2つの発現カセットを含むサルアデノウイルスベクターであって、各発現カセットが導入遺伝子およびプロモーターを含み、第1発現カセットが該サルアデノウイルスベクターのE1領域に挿入されており、かつ第2発現カセットがベクター複製に適合する該アデノウイルスベクターの領域に挿入されている、該サルアデノウイルスベクター。
【請求項２】
2つの発現カセットを含むサルアデノウイルスベクターであって、各発現カセットが導入遺伝子およびプロモーターを含み、第1発現カセットが該サルアデノウイルスベクターのE1領域に挿入されており、かつ第2発現カセットが該サルアデノウイルスベクターのE3領域、L5およびE4の終止コドン間(「HE1」領域)またはITRの末端とE4 mRNAのキャップ部位との間(「HE2」領域)に挿入されている、該サルアデノウイルスベクター。
【請求項３】
前記第2発現カセットが前記サルアデノウイルスベクターのE3領域に挿入されている、請求項2に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項４】
前記第2発現カセットが前記サルアデノウイルスベクターのHE1領域に挿入されている、請求項2に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項５】
前記第2発現カセットが前記サルアデノウイルスベクターのHE2領域に挿入されている、請求項2に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項６】
前記ベクターがチンパンジーアデノウイルスベクターである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項７】
前記ベクターがアデノウイルスである、請求項1〜6のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項８】
前記ベクターがChAd155である、請求項7に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項９】
前記ベクターがChAd83である、請求項7に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
前記第1発現カセットがヒトCMVまたは増強されたヒトCMVプロモーターを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項１１】
前記第2発現カセットがヒトCMVまたは増強されたヒトCMVプロモーターを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
前記の増強されたhCMVプロモーターが、配列番号6に対して少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％の配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項10または11に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項１３】
前記プロモーターが配列番号6の核酸配列を含むかまたは配列番号6の核酸配列からなる、請求項10〜12のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
前記の第1および第2発現カセットが異なるプロモーターを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
前記アデノウイルスベクターが哺乳動物細胞に感染する能力を有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項１６】
前記の第1および／または第2発現カセットが転写後調節エレメントをさらに含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
前記転写後調節エレメントがウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントである、請求項16に記載のサルアデノウイルスベクター。
【請求項１８】
請求項1〜17のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクターと、製薬上許容される賦形剤とを含む、組成物。
【請求項１９】
薬剤として使用するための、請求項1〜18のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクターまたは組成物。
【請求項２０】
ワクチンとして使用するための、請求項1〜19のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクターまたは組成物。
【請求項２１】
疾病の治療または予防のための、請求項1〜20のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクターまたは組成物。
【請求項２２】
対象に、請求項1〜21のいずれか1項に記載のサルアデノウイルスベクターまたは組成物を投与することを含む、該対象において免疫応答を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットとして電子データにて提出され、かつその全内容が参照により本明細書中に組み込まれるものとする配列表を含む。2018年10月11日に作成されたこのASCIIコピーは、ファイル名がVU66441A_WO_SL.txtであり、かつそのサイズは178,926バイトである。
【０００２】
本発明の属する技術分野
本発明は組換えアデノウイルスベクターの分野に属する。本発明は2つの発現カセットを含むアデノウイルスベクターに関する。特に、本発明は、2つの発現カセットを含むチンパンジー(chimp)アデノウイルスなどのサルアデノウイルスに関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えアデノウイルスは、遺伝子治療において、またワクチンとして、有用である。
【０００４】
ヒトアデノウイルスは、その大きな導入遺伝子容量、および多様な標的組織において高効率の遺伝子導入を達成するその能力のため、遺伝子導入用途に広く用いられいる。
【０００５】
しかし、大抵のヒトはヒトアデノウイルスに曝露されると該ヒトアデノウイルスに対する免疫を発達させる。従って、標的に分子を有効に送達し、かつヒトアデノウイルス血清型に対する既存の免疫の影響を最小限に抑えるベクターの需要がある。サルアデノウイルスはこの点で有効であり、それらはヒトウイルスと十分に近縁であるため、ヒトが既存の免疫を殆どまたは全く持たない、送達された外来抗原に対する免疫を誘導する上で有効である。従って、サルアデノウイルスに基づくウイルスベクターは、核酸ベースのワクチンの開発のための、ヒト由来アデノウイルスベクターの使用に代わる手段を提供しうる。
【０００６】
複製欠損アデノウイルスはそのゲノムを細胞の内部に送達し、またそれらは複製しないことから、導入遺伝子搭載物を増幅しない。典型的には、E1遺伝子を、選択されたプロモーターおよび目的の遺伝子または遺伝子群に対応する核酸配列を含む導入遺伝子カセットと置換し、結果として複製欠損組換えウイルスを得る。
【０００７】
改善された組換えアデノウイルスが当分野で必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、2つの発現カセットを含むサルアデノウイルスベクターに関する。特に、本発明は、2つの発現カセットを含むチンパンジー(chimp)アデノウイルスなどのサルアデノウイルスに関する。適切なchimpアデノウイルスの具体例としては、ChAd155およびChAd83が挙げられる。
【０００９】
本発明のアデノウイルスベクターは、対象における免疫応答の誘導のため免疫原性組成物、治療におけるその使用のための方法および製造のための工程の構成要素として有用である。
【００１０】
用語「ベクター」は、遺伝物質を含有または運搬し、かつ生物に外来遺伝子を導入するために使用できる作用物質(例えば、プラスミドまたはウイルス)を指す。本発明のアデノウイルスベクターは、「サルアデノウイルス」とも称される、非ヒトサルアデノウイルスに由来する。好ましくは、本発明のサルアデノウイルスベクターは、サルアデノウイルスである。
【００１１】
本発明のアデノウイルスベクター中の各発現カセットは、導入遺伝子およびプロモーターを含む。「導入遺伝子」は、目的のポリペプチドをコードする、該導入遺伝子に隣接するベクター配列にとって異種の核酸配列である。この核酸コード配列は、宿主細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にする形で調節性の構成要素に動作可能に連結されている。「プロモーター」は、RNAポリメラーゼの結合を可能にし、かつ遺伝子の転写を指令するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、転写開始部位に近接する、遺伝子の非コード領域内に位置する。
【００１２】
本発明のアデノウイルスベクターにおいて、第1発現カセットは該ウイルスのE1領域に挿入されており、かつ第2発現カセットは該アデノウイルスベクターの別の領域に挿入されている。
【００１３】
本発明の2つの発現カセットを含むサルアデノウイルスベクターにおいて、第1発現カセットは該サルアデノウイルスベクターのE1領域に挿入されており、かつ第2発現カセットはベクター複製に適合する該アデノウイルスベクターの領域に挿入されている。このアデノウイルスベクターゲノムの領域は、この領域の破壊が該アデノウイルスベクターの複製する能力に影響を与えない場合、「ベクター複製に適合する(しうる)」とみなされる。
【００１４】
好ましくは、本発明のアデノウイルスベクターにおいて、第1発現カセットは該ウイルスのE1領域に挿入されており、かつ第2発現カセットは該アデノウイルスベクターのE3、HE1またはHE2領域に挿入されている。当分野では周知の通り、E3遺伝子は、ウイルス複製に向けて宿主細胞を調整するために、形質導入の初期段階に発現される。E3は免疫のモジュレーションに関与している。用語「HE1」は、L5およびE4の終止コドン間に位置する部位を説明するために使用される。用語「HE2」は、ITRの末端とE4 mRNAのキャップ部位との間に位置する部位を定義するために使用されている。
【００１５】
例えば、ChAd155アデノウイルスベクターの場合：
・HE1 ChAd155：配列番号1のbp 34611と34612の間の挿入部位。
・HE2 ChAd155：配列番号1のbp 37662と37663の間の挿入部位。
【００１６】
別の具体例では、ChAd83アデノウイルスベクターの場合：
・HE1 ChAd83：配列番号2のbp 33535と33536の間の挿入部位。
・HE2 ChAd83：配列番号2のbp 36387と36388の間の挿入部位。
【００１７】
第1発現カセットをアデノウイルスベクターのE1領域に挿入するので、天然のE1領域は欠失させる。該ベクターのクローニング能を増大させるために、天然のE3領域を該アデノウイルスベクターから除去することができる。天然のE3領域は、第2発現カセットをE3領域に挿入する本発明の実施形態、または第2発現カセットをE3領域に挿入しない実施形態において、該アデノウイルスベクターから欠失させることができる。HE1またはHE2部位への挿入は、該ベクターの骨格のいずれの特定配列の欠失も必要としない。
【００１８】
好ましくは、第2発現カセットをアデノウイルスベクターのHE1またはHE2領域に挿入する。最も好ましくは、第2発現カセットをアデノウイルスベクターのHE2領域に挿入する。一実施形態においては、天然のE3領域をアデノウイルスベクターから欠失させることにより該ベクターのクローニング能を増大させると共に、第2発現カセットを該アデノウイルスベクターのHE1またはHE2領域に挿入する。
【００１９】
本発明の実施形態においては、アデノウイルスベクターの第1発現カセットがヒトCMVもしくは増強されたヒトCMVプロモーターを含んでいてもよく、かつ／または第2発現カセットがヒトCMVもしくは増強されたヒトCMVプロモーターを含んでいてもよい。
【００２０】
好適な実施形態において、第1および第2発現カセットは異なるプロモーターを含む。例えば、一実施形態においては、第1発現カセットがヒトCMVプロモーターを含んでいてもよく、かつ第2発現カセットが増強されたヒトCMVプロモーターを含んでいてもよい(またはその逆であってもよい)。
【００２１】
本発明の一態様においては、第1発現カセットがアデノウイルスのE1領域に挿入されており、かつ第2発現カセットがベクター複製に適合するアデノウイルスベクターの領域に挿入されており、該第1および第2発現カセットのうちの少なくとも1つが増強されたCMVプロモーターを含む、本発明のアデノウイルスベクターが提供される。幾つかの実施形態においては、増強されたhCMVプロモーターは、配列番号6に対して、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含みうる。幾つかの実施形態において、該プロモーターは、配列番号6の核酸配列を含むか、または配列番号6の核酸配列からなる。
【００２２】
本発明のアデノウイルスベクターは、サルアデノウイルスベクターに由来するもの、例えば、チンパンジー(Pan troglodytes)、ボノボ(Pan paniscus)、ゴリラ(Gorilla gorilla)ならびにオランウータン(スマトラオランウータン(Pongo abelii)およびボルネオオランウータン(Pongo pygnaeus))に由来するものである。チンパンジーアデノウイルスとしては、AdY25、ChAd3、ChAd19、ChAd25.2、ChAd26、ChAd27、ChAd29、ChAd30、ChAd31、ChAd32、ChAd33、ChAd34、ChAd35、ChAd37、ChAd38、ChAd39、ChAd40、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd15、SadV41、sAd4310A、sAd4312、SAdV31、SAdV-A1337、ChAdOx1、ChAdOx2およびChAd157が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のサルアデノウイルスベクターは、ChAd83またはChAd155アデノウイルスベクター、最も好ましくはChAd155アデノウイルスベクターである。
【００２３】
好ましくは、本発明のアデノウイルスベクターは、ヒト対象において30％未満、好ましくは10％未満の血清陽性率を示し、また最も好ましくは、ヒト対象において血清陽性率を示さない。
【００２４】
好適な実施形態において、本発明のサルアデノウイルスベクターは、哺乳動物細胞に感染する能力を有する。
【００２５】
一実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターの第1および第2発現カセットは、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)由来の導入遺伝子を含む。例えば、一実施形態においては、該発現カセットのうちの一方がRSV F抗原を含み、かつ他方の発現カセットがRSV MおよびN抗原を含む。かかる実施形態においては、該ベクターは、好ましくはRSV F0ΔTM抗原(膜貫通領域および細胞質領域を欠失させた融合(F)タンパク質)、ならびにRSV M2-1(抗転写終結(transcription anti-termination))およびN(ヌクレオカプシド)抗原をコードする。
【００２６】
また本発明は、サルアデノウイルスベクターと製薬上許容される賦形剤を含む組成物も提供する。
【００２７】
さらに、本発明は、薬剤、ワクチンとして使用するため、および／または疾病の治療もしくは予防のための、サルアデノウイルスベクターまたはかかるアデノウイルスベクターを含む組成物も提供する。
【００２８】
また本発明は、対象に前記サルアデノウイルスベクターまたは前記組成物を投与することを含む、該対象において免疫応答を誘導する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図1は、単一発現カセットを有するサルアデノウイルス構築物を示す図である。逆方向末端反復配列(ITR)は3’および5’末端に隣接しており、E1は初期遺伝子1であり、CMVはサイトメガロウイルスプロモーターであり、CASIはCASIプロモーターであり、RGはモデル抗原であり、WPREはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Woodchuck Hepatitis Postranscriptional Regulatory Element)であり、ΔE3は初期遺伝子3が欠失していることを示しており、ファイバーはファイバータンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子を示しており、かつE4は初期遺伝子4である。3つの異なるサルアデノウイルスベクターを図1に示す。図1のベクター(i)はアデノウイルスゲノムのE3領域の代わりに導入遺伝子発現カセットを挿入することにより構築し(「RC1」)(上部パネル)、図1のベクター(ii)はHE1領域内、すなわち、ファイバー遺伝子およびE4領域の終止コドン間に導入遺伝子発現カセットを挿入することにより形成し(「RC3」)(中央パネル)、また図1のベクター(iii)はHE2領域内、すなわち、ITRの末端とE4 mRNAのキャップ部位との間に導入遺伝子発現カセットを挿入することにより作製した(「RC2」)(下部パネル)。
【図２Ａ】図2Aは、初代ヒト細胞系における、導入遺伝子カセットがE3およびHE2部位に挿入されているChAd155およびChAd83(図1のRC1およびRC2ベクター)の産生を示す図である。
【図２Ｂ】図2Bは、感染後2および7日目のヒトMRC5細胞系における、導入遺伝子カセットがE3、HE1およびHE2に挿入されているChAd83(図1のRC1、RC2およびRC3ベクター)の産生を示す図である。細胞には250および1250の感染多重度で感染させた。
【図３Ａ】図3Aは、初代ヒト細胞系における図1のRC1およびRC2ベクター(ChAd155およびChAd83)の全ウイルスゲノムコピー数を示す図である。
【図３Ｂ】図3Bは、感染後2および7日目のヒトMRC5細胞系における、図1のChAd83ベクターのRC1、RC2およびRC3バージョンの全ウイルスゲノムコピー数を示す図である。細胞には250および1250の感染多重度で感染させた。
【図４】図4は、マウス細胞系(図4(a)、上部パネル)および非ヒト霊長類細胞系(図4(b)、下部パネル)における、図1のChAd155 RC1およびRC2ベクターならびにChAd83 RC1およびRC2ベクターの全ウイルスゲノムコピー数を示す図である。細胞には50および250の感染多重度で感染させた。
【図５−１】図5は、感染後2および5日目にウェスタンブロットにより実証された、マウス細胞系においてモデル狂犬病糖タンパク質(RG)導入遺伝子を発現するChAd155 RC1およびRC2ベクターの発現レベルの比較を示す図である(図5(a)、上部パネル)。図5は、感染後2および5日目にウェスタンブロットにより実証された、マウス細胞系においてモデル狂犬病糖タンパク質(RG)導入遺伝子を発現するChAd155 RC1およびRC2ベクターとChAd83 RC1およびRC2ベクターの発現レベルの比較を示す図である(図5(b)、下部パネル)。細胞には50、250および1250の感染多重度で感染させた。
【図５−２】図5(c)は、感染後2および7日目にウェスタンブロットにより実証された、ヒトMRC5細胞系においてモデル狂犬病糖タンパク質(RG)導入遺伝子を発現するChAd83 RC1、RC2およびRC3ベクターの発現レベルの比較を示す図である。細胞には250および1250の感染多重度で感染させた。
【図６】図6は、単一発現カセットを有する別のサルアデノウイルス構築物を示す図である。逆方向末端反復配列(ITR)は3’および5’末端に隣接しており、ヒトCMV(hCMV)はサイトメガロウイルスプロモーターであり、FΔTM(F0DTM)およびN.M2-1はRSV抗原であり、2Aは自己切断型連結配列であり、ΔE4は初期遺伝子4が欠失していることを意味しており、ファイバーはファイバータンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子を意味している。図6のベクターでは、導入遺伝子発現カセットがアデノウイルスゲノムのE1領域の代わりに挿入されている。
【図７】図7は、二重(dual)発現カセットを有する本発明によるサルアデノウイルス構築物を示す図である。逆方向末端反復配列(ITR)は3’および5’末端に隣接しており、ヒトCMV(hCMV)はサイトメガロウイルスプロモーターであり、増強hCMVは増強されたサイトメガロウイルスプロモーターであり、N-M2-1およびFΔTM(F0DTM)はRSV抗原であり、WPREはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントであり、ΔE3は初期遺伝子3が欠失していることを意味しており、ファイバーはファイバータンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子を意味しており、かつAd5E4orf6は初期遺伝子4(E4)領域の代わりである。図7のベクターは、アデノウイルスゲノムのE1領域の代わりに第1導入遺伝子発現カセットを挿入し、かつHE2領域内、すなわち、右のITRの下流に第2導入遺伝子発現カセットを挿入することにより構築した。
【図８】図8は、非還元条件下で感染後48および96時間目にウェスタンブロットにより実証された、MRC5細胞系においてF0ΔTM導入遺伝子を発現するベクターの発現レベルの比較を示す図である。細胞には500および1250の感染多重度で感染させた。
【図９】図9は、還元条件下で感染後48時間目にウェスタンブロットにより実証された、MRC5細胞系においてNM2-1導入遺伝子を発現しているベクターの発現レベルの比較を示す図である。細胞には250および1250の感染多重度で感染させた。
【図１０】図10は、RSV抗原F0ΔTM(FΔTm)を発現するChAd155ベクター由来の免疫原性の比較を示す図である。データは、5×108個のウイルス粒子の投与によるワクチン接種後4週および8週目に収集した。
【図１１】図11は、M2 RSV抗原を発現するChAd155ベクター由来の免疫原性の比較を示す図である。データは、107または106個のウイルス粒子の投与によるワクチン接種後3週目に収集した。
【図１２Ａ】図12Aは、ChAd155ベクター由来の肺T細胞応答を調査するための実施例9の実験で得た結果を例示した図である。図12AはCD4+応答を示している。
【図１２Ｂ】図12Bは、ChAd155ベクター由来の肺T細胞応答を調査するための実施例9の実験で得た結果を例示した図である。図12BはCD8+応答を示している。
【図１３Ａ】図13Aは、ChAd155ベクター由来の末梢T細胞応答を調査するための実施例9の実験で得た結果を示す図である。図13AはPBMC CD4+応答を示している。
【図１３Ｂ】図13Bは、ChAd155ベクター由来の末梢T細胞応答を調査するための実施例9の実験で得た結果を示す図である。図13BはPBMC CD8+応答を示している。
【図１４Ａ】図14Aもまた実施例9で得た結果を示す図である。図14AはRSV中和Ab力価を示している。
【図１４Ｂ】図14Bもまた実施例9で得た結果を示す図である。図14Bは日付D90で得たnAbのD0に対する比を例示している。
【図１５Ａ】図15Aは、実施例10の免疫原性実験の結果を示す図である。
【図１５Ｂ】図15Bは、実施例10の免疫原性実験の結果を示す図である。
【図１５Ｃ】図15Cは、実施例10の免疫原性実験の結果を示す図である。
【図１６Ａ】図16Aは、実施例11においてベクターのHeLa細胞における発現を利用して取得したウェスタンブロットを示す図である。
【図１６Ｂ】図16Bは、実施例11においてベクターのHeLa細胞における発現を利用して取得したウェスタンブロットを示す図である。
【図１７】図17は、実施例12のCRPV実験の結果を例示した図である。
【図１８】図18は、実施例13のHPV二重カセットベクターの特徴付けの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
配列のアノテーション
配列番号1−野生型ChAd155をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号2−野生型ChAd83をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号3−CASIプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号4−ChAd155/RSVをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号5−RSV F0ΔTM-N-M2-1アミノ酸配列
配列番号6−増強されたhCMVプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号7−hCMV NM2 bghpolyAカセットをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号8−NM2アミノ酸(タンパク質)配列
配列番号9−hCMV F0 WPRE bghpolyAカセットをコードするポリヌクレオチド配列
配列番号10−F0アミノ酸(タンパク質)配列
配列番号11−フレキシブルリンカーのアミノ酸配列
配列番号12−フレキシブルリンカーのアミノ酸配列
【００３１】
本発明の詳細な説明
アデノウイルス
アデノウイルスは、約36 kbの線状二本鎖DNAゲノムを持つ非エンベロープ型正二十面体ウイルスである。アデノウイルスは、分裂細胞と非分裂細胞の両方を含む幾つかの哺乳動物種の多数の細胞型に、宿主細胞のゲノムに組み込むこと無く形質導入することができる。それらはその証明済みの安全性、多様な標的組織において高効率の遺伝子導入を達成するその能力、およびその大きな導入遺伝子容量のため、遺伝子導入用途に広く用いられている。ヒトアデノウイルスベクターは、遺伝子治療およびワクチンに現在使用されているが、一般的なヒトアデノウイルスへの以前の曝露後の、既存免疫の高い世界的発生率という欠点を有する。
【００３２】
アデノウイルスは、3種の主要なタンパク質、ヘキソン(II)、ペントンベース(III)およびノブを有するファイバー(IV)を、幾つかの他の微量のタンパク質、VI、VIII、IX、IlIaおよびIVa2と共に含む正二十面体カプシドを持つ特徴的な形態を有する。ヘキソンはカプシドの構造成分の大半を占めており、該カプシドは240個の三量体ヘキソンカプソメアと12個のペントンベースからなる。ヘキソンは3つの保存された二重バレルを有し、またその頂部は3つのタワーを有し、各タワーはカプシドの大部分を形成する各サブユニット由来のループを含有する。ヘキソンの基部はアデノウィルスの血清型間で高度に保存されているが、表面のループは可変性である。ペントンはもう1つのアデノウィルスカプシドタンパク質であり、ファイバーが結合する五量体のベースを形成する。三量体ファイバータンパク質は、カプシドの12個の頂点の各々でペントンベースから突出し、ノブを有する棒状構造をとる。ファイバータンパク質の主な役割は、ノブ領域と細胞受容体との相互作用を介して細胞表面にウイルスカプシドを繋ぎ止めることである。ファイバーの可動性シャフト、ならびにノブ領域の変動は、種々のアデノウィルス血清型に特有である。
【００３３】
アデノウイルスのゲノムは十分に特徴付けられている。その線状の二本鎖DNAは強塩基性タンパク質VIIおよび小ペプチドpX(muとも称される)と結合している。別のタンパク質であるVは、このDNA-タンパク質複合体と共にパッケージングされ、タンパク質VIを介してカプシドへの構造的連結を提供する。同様に配置されている特定のオープンリーディングフレーム、例えば各ウイルスのE1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4およびL5遺伝子の位置に関しては、アデノウイルスゲノムの組織全体に普遍的な保存が認められる。アデノウイルスゲノムの各末端は、ウイルス複製に必要である、逆方向末端反復配列(ITR)として知られる配列を含む。アデノウイルスゲノムの5’末端は、パッケージングおよび複製に必要な5'シスエレメント、すなわち、5’ITR配列(複製の起点として機能しうる)ならびに天然の5'パッケージングエンハンサードメイン(線状アデノウィルスゲノムおよびE1プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするのに必要な配列を含有する)を含有する。アデノウイルスゲノムの3’末端は、パッケージングおよびカプシド形成に必要な3’シスエレメント、例えばITRを含む。該ウイルスはウイルスにコードされたプロテアーゼも含み、該プロテアーゼは感染性ビリオンを産生するために必須の構造タンパク質の一部をプロセシングする際に必要である。
【００３４】
アデノウイルスゲノムの構造は、宿主細胞形質導入後にウイルス遺伝子が発現されるその順序に基づいて記載されている。より具体的には、該ウイルス遺伝子は、その転写がDNA複製の開始前または開始後に生じるか否かに応じて初期(E)または後期(L)遺伝子と称される。形質導入の初期段階では、アデノウイルスのE1A、E1B、E2A、E2B、E3およびE4遺伝子が、ウイルス複製に向けて宿主細胞を調整するために発現される。E1遺伝子はマスタースイッチと考えられており、該E1遺伝子は転写アクチベーターとして働き、また初期および後期遺伝子の両方の転写に関与している。E2はDNA複製に関与しており、E3は免疫のモジュレーションに関与しており、かつE4はウイルスmRNAの代謝を調節している。感染の後期段階の間に、ウイルス粒子の構造成分をコードする後期遺伝子L1〜L5の発現が活性化される。後期遺伝子は、主要後期プロモーター(MLP)から転写され、これには選択的スプライシングを伴う。
【００３５】
HE1およびHE2部位は、これらの特定の場所への挿入がCまたはE型chimpアデノウイルス(例えば、ChAd155およびChAd83)などのchimpアデノウイルスのコード配列または重要な調節配列を分断しないことから、導入遺伝子の潜在的挿入部位として同定された。HE1およびHE2部位は任意のchimpアデノウイルスにおいて配列アラインメントにより同定することができる。従って、ChAdゲノムのHE1およびHE2部位内の発現カセットのクローニングは、該ウイルスの複製サイクルに影響を与えない。
【００３６】
アデノウイルスの複製
歴史上、アデノウイルスワクチンの開発は、不完全な、非複製型ベクターに重点を置いてきた。それらは、複製に必須であるE1領域遺伝子の欠失により複製欠損となっている。典型的には、非必須E3領域遺伝子を同様に欠失させることで、外来導入遺伝子用の場所を空ける。外来プロモーターの制御下にある導入遺伝子を含む発現カセットをその後挿入する。これらの複製欠損ウイルスをその後、E1補完細胞で産生させる。
【００３７】
用語「複製欠損」または「複製不能」アデノウイルスとは、少なくとも機能的欠失(または「機能喪失」変異)、すなわち遺伝子を完全に除去することなく該遺伝子の機能を低下させる欠失もしくは変異、例えば、人工終止コドンの導入、活性部位もしくは相互作用ドメインの欠失もしくは変異、遺伝子の調節配列の変異もしくは欠失等、またはウイルス複製に必須である遺伝子産物をコードする遺伝子、例えば、E1A、E1B、E2A、E2B、E3およびE4 (例えば、E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2および／もしくはE4 ORF1)から選択されるアデノウイルス遺伝子のうちの1つ以上の完全除去を含むよう操作されているために複製能力がないアデノウィルスを指す。適切には、E1ならびに場合によってはE3および／またはE4を欠失させる。欠失させる場合、前述の欠失遺伝子領域は、別の配列に関して％同一性を決定する際にアラインメントにおいて考慮しないことが適切である。
【００３８】
本発明のベクター
非ヒトサルアデノウイルスに基づくウイルスベクターは、遺伝子治療および遺伝子ワクチンのためのヒト由来ベクターの使用に代わる手段である。非ヒト類人猿から単離されたある特定のアデノウイルスは、ヒト起源の細胞におけるそれらの効率的な増殖によって実証される通り、ヒトから単離されたアデノウィルスと近縁関係にある。ヒトはサルアデノウイルスに対する免疫を殆どまたは全く発達させないため、それらはヒトアデノウィルス使用の改善された代替手段を提供する見込みがある。
【００３９】
「低い血清陽性率」は、ヒトアデノウイルス5(Ad5)と比較して低下した既存中和抗体レベルを有することを意味し得る。同様にまたはあるいは、「低い血清陽性率」は、約30％未満の血清陽性率、約20％未満の血清陽性率、約15％未満の血清陽性率、約10％未満の血清陽性率、約5％未満の血清陽性率、約4％未満の血清陽性率、約3％未満の血清陽性率、約2％未満の血清陽性率、約1％未満の血清陽性率または検出不能な血清陽性率を意味し得る。血清陽性率は、Hum. Gene Ther. (2004) 15：293に記載されたような方法を利用し、臨床上関連がある中和力価(50％中和力価＞200と定義される)を有する個体のパーセンテージとして測定することができる。
【００４０】
本発明のアデノウイルスベクターは、「サルアデノウイルス」とも称される非ヒトサルアデノウイルスに由来するものである。多数のアデノウイルスが非ヒト類人猿、例えば、チンパンジー、ボノボ、アカゲザル、オランウータンおよびゴリラから単離されている。これらのアデノウイルスに由来するベクターは、これらのベクターによってコードされる導入遺伝子に対する強力な免疫応答を誘導することができる。非ヒトサルアデノウイルスに基づくベクターの幾つかの利点としては、ヒト標的集団におけるこれらのアデノウイルスに対する交差中和抗体の相対的欠如が挙げられ、従ってそれらの使用はヒトアデノウイルスに対する既存の免疫を克服する。例えば、一部のサルアデノウイルスは、既存のヒト中和抗体との交差反応性を示さず、またある特定のチンパンジーアデノウイルスと既存のヒト中和抗体との交差反応は、ある特定の候補ヒトアデノウイルスベクターの場合の35％と比較して、標的集団の2％においてのみ存在する(Sci. Transl. Med. (2012) 4：1)。
【００４１】
本発明のアデノウイルスベクターは、例えば、チンパンジー(Pan troglodytes)、ボノボ(Pan paniscus)、ゴリラ(Gorilla gorilla)ならびにオランウータン(スマトラオランウータン(Pongo abelii)およびボルネオオランウータン(Pongo pygmaeus))から得たサルアデノウイルスに由来するものである。それらのものとしては、B群、C群、D群、E群およびG群からのアデノウィルスが挙げられる。チンパンジーアデノウイルスとしては、AdY25、ChAd3、ChAd19、ChAd25.2、ChAd26、ChAd27、ChAd29、ChAd30、ChAd31、ChAd32、ChAd33、ChAd34、ChAd35、ChAd37、ChAd38、ChAd39、ChAd40、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd15、SadV41およびChAd157、ChAd3、ChAd19、ChAd25.2、ChAd26、ChAd27、ChAd29、ChAd30、ChAd31、ChAd32、ChAd33、ChAd34、ChAd35、ChAd37、ChAd38、ChAd39、ChAd40、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd15、SadV41、sAd4310A、sAd4312、SAdV31、SAdV-A1337、ChAdOx1、ChAdOx2およびChAd157が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、アデノウイルスベクターは、ボノボから単離された非ヒトサルアデノウイルス、例えばPanAd1、PanAd2、PanAd3、Pan 5、Pan 6、Pan 7(C7とも称される)およびPan 9に由来するものであってもよい。ベクターは、全体的または部分的に、非ヒトアデノウイルスのファイバー、ペントンまたはヘキソンをコードするヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００４２】
本発明のアデノウイルスベクターの実施形態において、アデノウイルスベクターは、ヒト対象において30％未満、20％未満、10％未満または5％未満の血清陽性率を示し、好ましくはヒト対象において血清陽性率を示さず、またより好ましくは、以前にチンパンジーアデノウイルスベクターと接触していないヒト対象において血清陽性率を示さない。
【００４３】
本発明のアデノウイルスベクターの実施形態において、アデノウィルスDNAは、哺乳動物標的細胞に侵入する能力を有する、すなわち、感染性である。本発明の感染性組換えアデノウイルスベクターは、予防または治療ワクチンとして、また遺伝子治療のために、使用することができる。従って、ある実施形態において、該組換えアデノウイルスベクターは標的細胞への送達用の内在性分子を含む。該標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ウシ細胞、イヌ細胞、ヤギ細胞、シカ細胞、チンパンジー細胞、翼手目細胞、ウマ細胞、ネコ細胞、ヒト細胞、オオカミ細胞、ヒツジ細胞、ブタ細胞、齧歯動物細胞、クマ細胞またはキツネ細胞である。該標的細胞への送達用の内在性分子は発現カセットである。
【００４４】
本発明の実施形態において、前記ベクターは、左ITR領域、欠失させたE1領域、次いで欠失させたE3領域、および、場合によっては、追加のエンハンサーエレメントを含み、これらの後にファイバー領域、E4領域および右ITRが続く。翻訳は右および左方向に生じる。この実施形態において、第1発現カセットは、欠失させたE1領域に挿入し、かつ第2発現カセットは、欠失させたE3領域に挿入する。さらなる実施形態において、2つの発現カセットのプロモーターはCMVプロモーターである。さらに別の実施形態において、エンハンサーエレメントはB型肝炎ウイルス転写後調節エレメント(HPRE)またはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)である。
【００４５】
本発明の一実施形態において、前記ベクターは、左および右ITR領域、欠失させたE1領域、少なくとも部分的に欠失させたE3領域、ファイバー領域、E4領域、2つの発現カセット(各々が以下、すなわち、プロモーターおよび少なくとも1つの目的の抗原ならびに、場合によっては、1つ以上のエンハンサーエレメントを含む)を含む。第1発現カセットは、欠失させたE1領域に挿入し、かつ第2発現カセットはHE1部位に、すなわち、ファイバー遺伝子およびE4領域の終止コドン間(「HE1部位」)に挿入する。ChAd155 HE1挿入部位は、野生型ChAd155配列のbp 34611と34612の間である。ChAd83 HE1挿入部位は、野生型ChAd83配列のbp 33535と33536の間である。翻訳は右および左方向に生じる。さらなる実施形態において、プロモーターはCMVプロモーターである。好適な実施形態においては、一方のプロモーターはCMVプロモーターであり、かつ他方はeCMVプロモーターである。さらに別の実施形態において、エンハンサーエレメントはHPREまたはWPREである。
【００４６】
さらなる実施形態において、前記ベクターは、左および右ITR領域、欠失させたE1領域、少なくとも部分的に欠失させたE3領域、ファイバー領域、E4領域、2つの発現カセット(各々が以下、すなわち、プロモーター、少なくとも1つの目的の抗原および、場合によっては、1つ以上のエンハンサーエレメントを含む)を含む。第1発現カセットは、欠失させたE1領域に挿入し、また第2発現カセットはHE2部位に、すなわち、左ITRの末端とE4 mRNAのキャップ部位との間(「HE2部位」)に挿入する。ChAd155 HE2挿入部位は野生型ChAd155配列のbp 37662と37663の間である。ChAd83 HE2挿入部位は野生型ChAd83配列のbp 36387と36388の間である。翻訳は右および左方向に生じる。さらなる実施形態において、プロモーターはCMVプロモーターである。好適な実施形態において、一方のプロモーターはCMVプロモーターであり、かつ他方はeCMVプロモーターである。さらに別の実施形態において、エンハンサーエレメントはHPREまたはWPREである(該エンハンサーエレメントは導入遺伝子の発現を増大させる)。
【００４７】
前記HE1およびHE2部位は、これらの特定の場所への挿入はChAd155およびChAd83のコード配列または調節配列を分断しないことから、導入遺伝子の挿入部位として同定された。従って、ChAdゲノムのHE1またはHE2部位への発現カセットの挿入は、ウイルスの複製サイクルに影響を与えない。
【００４８】
本発明の実施形態において、前記ベクターは、アデノウイルスベクターの機能性または免疫原性誘導体である。「アデノウイルスベクターの誘導体」とは、該ベクターの改変版を意味し、例えば、該ベクターの1つ以上のヌクレオチドが欠失、挿入、修飾または置換されている。
【００４９】
調節エレメント
調節エレメント、すなわち、発現制御配列としては、適当な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列、効率的なRNAプロセシングシグナル(例えば、ウサギβ-グロビンポリAを含むスプライシングおよびポリアデニル化(ポリA)シグナル)、テトラサイクリン調節系、マイクロRNA、転写後調節エレメント(例えば、WPRE、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント)、細胞質mRNAを安定化する配列、翻訳効率を向上させる配列(例えば、コザック共通配列)、タンパク質安定性を強化する配列、ならびに必要に応じて、コード化産物の分泌を亢進させる配列が挙げられる。
【００５０】
「プロモーター」は、RNAポリメラーゼの結合を可能にし、かつ遺伝子の転写を指令するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、転写開始部位に近接する、遺伝子の非コード領域内に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、共通ヌクレオチド配列を特徴とすることが多い。プロモーターの具体例としては、限定するものではないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、ならびに類人猿およびヒトを含む哺乳動物に由来するプロモーターが挙げられる。内部、天然、構成的、誘導性および／または組織特異的であるプロモーターを含む非常に多くの発現制御配列が当分野で公知であり、また利用されうる。
【００５１】
本発明のプロモーターは、典型的には異種プロモーターである。本発明のプロモーターは構成的なものでありうる。
【００５２】
プロモーターの具体例としては、限定するものではないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、および哺乳動物(例えばヒト)に由来するプロモーターが挙げられる。
【００５３】
プロモーターの具体例としては、限定するものではないが、TBGプロモーター、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルスのLTRプロモーター(場合によってはエンハンサーを併用)、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(場合によってはCMVエンハンサーを併用、例えば、Boshartら、Cell、41：521-530 (1985)を参照されたい)、CASIプロモーター、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーター、およびEF1aプロモーター(Invitrogen)が挙げられる。
【００５４】
適切なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびCASIプロモーターが挙げられる。CMVプロモーターは強力かつ遍在的に活性である。CMVプロモーターは、多くの組織型において高レベルの導入遺伝子発現を駆動する能力を有し、また当分野で周知である。CMVプロモーターは、CMVエンハンサーと共に、またはCMVエンハンサー無しで、本発明のベクターに使用することができる。
【００５５】
CASIプロモーターは、CMVエンハンサー、ニワトリβ-アクチンプロモーター、ならびにユビキチン(UBC)エンハンサーに隣接するスプライスドナーおよびスプライスアクセプターの組み合わせとして記載されている合成プロモーターである(US 8865881)。
【００５６】
幾つかの実施形態において、CASIプロモーターは、配列番号3に対して少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含みうる。幾つかの実施形態において、該プロモーターは、配列番号3の核酸配列を含むかまたは配列番号3の核酸配列からなる。
【００５７】
幾つかの実施形態において、増強されたhCMVプロモーターは、配列番号6に対して少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列をふくみうる。幾つかの実施形態において、該プロモーターは、配列番号6の核酸配列を含むかまたは配列番号6の核酸配列からなる。
【００５８】
場合によっては、治療上有用であるかまたは免疫原性の産物をコードする導入遺伝子を保持するベクターはさらに、選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子を含んでいてもよい。レポーター遺伝子は、当分野で公知のものから選択してもよい。適切なレポーター遺伝子としては、増強された緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよび分泌型胚性アルカリホスファターゼ(seAP)が挙げられるがこれらに限定されず、特にジェネテシン、ハイグロマイシンまたはピューロマイシン耐性をコードする配列を含んでいてもよい。かかる選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子(ウイルス粒子にパッケージングされるウイルスゲノムの外側に配置されていても、いなくてもよい)を使用することにより、アンピシリン耐性などの細菌細胞中のプラスミドの存在を示すことができる。該ベクターの他の構成要素としては、複製の起点を挙げることができる。
【００５９】
「転写後調節エレメント」は、本明細書中で使用する場合、転写されると、本発明のウイルスベクターにより送達される導入遺伝子(複数可)またはその断片の発現を増大させるDNA配列である。転写後調節エレメントとしては、B型肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Hepatitis B Virus Postranscriptional Regulatory Element)(HPRE)およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)が挙げられるが、これらに限定されない。WPREは、ある特定の、ただし全てではないプロモーターにより駆動される導入遺伝子発現を増大させることが実証されている、3部からなる(tripartite)シス作用エレメントである。
【００６０】
本発明の実施形態において、ChAd155ベクターは、プロモーター、エンハンサー、およびレポーター遺伝子のうちの1つ以上を含んでいてもよい。例えば、本発明のベクターは、ChAd155-増強hCMV-SeAP、ChAd155-CASI-seAPおよびChAd155-hCMV-seAPを、場合によってはテトラサイクリン・オン／オフ転写制御と併せて、またChAd155-CMV-hFerL-chEF1-seAPをテトラサイクリン・オン／オフ転写制御と併せて、含んでいてもよい。
【００６１】
本発明の実施形態において、ChAd83ベクターは、プロモーター、エンハンサー、およびレポーター遺伝子のうちの1つ以上を含んでいてもよい。例えば、本発明のベクターは、ChAd155-増強hCMV-SeAP、ChAd83-増強hCMV-SeAP、ChAd155-CASI-seAPおよびChAd83-hCMV-SeAPを場合によってはテトラサイクリン・オン／オフ転写制御と併せて、またChAd83-CMV-hFerL-chEF1-seAPをテトラサイクリン・オン／オフ転写制御と併せて、含んでいてもよい。
【００６２】
本発明のベクターは、本明細書中に提供する技術を、当業者に公知の技術と共に利用して作製する。かかる技術としては、教本に記載されているものなどのcDNAの従来のクローニング技術、アデノウイルスゲノムのオーバーラップするオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適切な方法が挙げられる。
【００６３】
導入遺伝子
「導入遺伝子」は、該導入遺伝子に隣接するベクター配列にとって異種の核酸配列であり、目的のポリペプチドをコードする。この核酸コード配列は、宿主細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で調節成分に動作可能に連結される。本発明の実施形態において、前記ベクターは、導入遺伝子を治療的または予防的レベルで発現する。トランスジェニックポリペプチドの「機能的誘導体」は、例えば1つ以上のアミノ酸が欠失、挿入、修飾または置換されている、ポリペプチドの改変版である。
【００６４】
導入遺伝子は、予防または治療のために、例えば、免疫応答を誘導するためのワクチンとして、欠陥もしくは欠損遺伝子を修正もしくは置き換えることにより遺伝的欠陥を修正する目的で、または癌の治療法として、使用してもよい。本明細書中で使用する場合、免疫応答の誘導とは、タンパク質に対するT細胞および／または液性抗体免疫応答を誘導する、該タンパク質の能力を指す。
【００６５】
導入遺伝子により誘発される免疫応答は、中和抗体を産生する抗原特異的B細胞応答であってもよい。誘発される免疫応答は抗原特異的T細胞応答であってもよく、全身性および／または局所性の応答であってもよい。抗原特異的T細胞応答は、CD4+T細胞応答、例えばサイトカイン(例えば、インターフェロンγ(IFNγ)、腫瘍壊死因子α(TNFα)および／またはインターロイキン2(IL2))を発現するCD4+T細胞が関与する応答を含んでいてもよい。あるいは、またはさらに、抗原特異的T細胞応答は、CD8+T細胞応答、例えばサイトカイン(例えば、IFNγ、TNFαおよび／またはIL2)を発現するCD8+T細胞が関与する応答を含む。
【００６６】
導入遺伝子配列の組成は、結果として得られるベクターを供する用途に依存する。ある実施形態において、導入遺伝子は、予防的導入遺伝子、治療的導入遺伝子または免疫原性導入遺伝子などの生物学および医学において有益な産物、例えば、タンパク質またはRNAをコードする配列である。タンパク質導入遺伝子としては抗原が挙げられる。本発明の抗原性導入遺伝子は、病原生物に対する免疫原性応答を誘導する。
【００６７】
本発明の導入遺伝子としては、限定するものではないが、狂犬病ウイルス抗原、例えば、狂犬病糖タンパク質(RG)、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)抗原、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗原、またはその断片が挙げられる。
【００６８】
遺伝暗号の重複の結果として、ポリペプチドは多様な種々の核酸配列によりコードされうる。符号化は、他のものより、一部の同義コドン、すなわち、同一アミノ酸をコードするコドンを使用するために偏っている。「コドン最適化」とは、組換え核酸のコドン組成における改変が、そのアミノ酸配列を変更することなく行われることを意味する。コドン最適化は、生物特有のコドン使用頻度を利用することにより種々の生物におけるmRNA発現を改良するために利用されている。
【００６９】
コドンバイアスに加えて、かつコドンバイアスとは関係なく、一部の同義コドンペアは他のものより頻繁に使用される。このコドンペアバイアスは、一部のコドンペアが大きな比率を占めており、かつ他のものの占める比率が少ないことを意味する。コドンペアの脱最適化は、ウイルスの毒性を低下させるために利用されている。例えば、少数しか存在しないコドンペアを含有するよう改変したポリオウイルスは翻訳効率の低下を示し、また野生型ポリオウイルスと比較して弱毒化したことが報告されている(Science (2008) 320：1784)。コドンペアの脱最適化による合成弱毒化ウイルスの操作により、野生型と同じアミノ酸配列をコードするが同義コドンの異なるペアワイズ配置を利用するウイルスを産生することができる。コドンペアの脱最適化により弱毒化したウイルスは、野生型と比較して最大で1000倍少ないプラークを生じ、より少ないウイルス粒子を産生し、またプラークを形成するために約100倍多いウイルス粒子を必要とした。
【００７０】
対照的に、ヒトゲノムにおいて大きな比率を占めるコドンペアを含有するよう改変したポリオウイルスは、野生型RNAと類似した様式で活動し、また野生型RNAと大きさが同一のプラークを生成した(Colemanら(2008) Science 320：1784)。これは、大きな比率を占めるコドンペアを持つウイルスが、少数しか存在しないコドンペアを持つウイルスと同様の数の変異を含有し、かつ野生型と比較して増強された翻訳を示したという事実にも関わらず生じた。この観察結果は、コドンペアを最適化した構築物は、その非コドンペア最適化対応物と同様の様式で活動することが予想され、かつ機能的利点をもたらすことは予想されないということを示唆している。理論に拘束されることを望むものではないが、これは自然な進化によりコドンペアリングが最適化されたからであろう。
【００７１】
本発明の構築物は、コドン最適化核酸配列を含んでいてもよい。あるいは、またはさらに、本発明のベクターは、導入遺伝子またはその免疫原性誘導体もしくは断片のコドン最適化配列を含む。本発明の構築物は、コドンペア最適化核酸配列を含んでいてもよい。あるいは、またはさらに、本発明のベクターは、導入遺伝子またはその免疫原性誘導体もしくは断片のコドンペア最適化配列を含むか、またはそれらからなる。
【００７２】
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)導入遺伝子
一実施形態において、本発明は、2つの発現カセットを含む組換えサル由来アデノウイルスベクターであって、各発現カセットがヒト呼吸器合胞体ウイルス(RSV)に由来する免疫原性導入遺伝子を含む該アデノウイルスベクターの、RSV感染の治療または予防における使用を提供する。一実施形態において、本発明の組換えサル由来アデノウイルスベクターは、前記発現カセットのうちの一方にRSV F抗原を含み、かつ他方の発現カセットに別のRSVウイルス抗原を含む。適切な抗原について以下でさらに検討する。一実施形態において、該組換えサル由来アデノウイルスベクターは、第2発現カセットにRSV MおよびN抗原を含む。かかる実施形態において、前記ベクターは、好ましくはRSV F0ΔTM抗原(膜貫通および細胞質領域を欠失させた融合(F)タンパク質)、ならびにRSV M2-1(抗転写終結)およびN(ヌクレオカプシド)抗原をコードする。
【００７３】
RSVによる感染は完全な防御免疫を付与しない。乳児期の感染は、成人期を通じて継続する症候性RSV再感染をもたらす。これらの再感染は一般に、それらが通常はよくある急性上気道感染として現れるため、診断されないままである。しかし、より脆弱な人々(例えば、免疫不全状態の成人または高齢者)では、再感染が重篤な疾患につながる可能性もある。免疫系の両腕(液性および細胞性免疫)は重篤な疾患からの防御に関与している[Guvenel AK, Chiu CおよびOpenshaw PJ. Current concepts and progress in RSV vaccine development. Expert Rev Vaccines. 2014；13(3)：333-44.]。
【００７４】
液性免疫応答は、ウイルスを中和しかつウイルス複製を阻害し、それによって下気道RSV感染および重篤な疾患に対する防御において主要な役割を果たすことができる[Piedra PA, Jewell AM, Cron SG, ら、Correlates of immunity to respiratory syncytial virus (RSV) associated-hospitalization：establishment of minimum protective threshold levels of serum neutralizing antibodies. Vaccine. 2003；21(24)：3479-82.]。予防的に投与された免疫グロブリンG(IgG)RSV-中和モノクローナル抗体(Synagis)という形での受動免疫は、気管支肺異形成症または基礎心肺疾患を有する未熟児および新生児においてRSV疾患をある程度予防することが示された[Cardenas S, Auais AおよびPiedimonte G. Palivizumab in the prophylaxis of respiratory syncytial virus infection. Expert Rev Anti Infect Ther. 2005；3(5)：719-26]。
【００７５】
T細胞もまたRSV疾患の抑制に関与している。重症複合免疫不全症、骨髄および肺の移植レシピエントの場合のような、CD8 T細胞数が低下している患者における致死的なRSV感染が記載されている[Hertz, 1989]。新生児のRSV感染の死亡例の病理組織診断から、肺浸潤物中のCD8 T細胞の相対的不足が認められることが示された[Welliver TP, Garofalo RP, Hosakote Y, ら、Severe human lower respiratory tract illness caused by respiratory syncytial virus and influenza virus is characterized by the absence of pulmonary cytotoxic lymphocyte responses. J Infect Dis. 2007. 195(8)：1126-36.]。さらに、インターフェロンγ(IFN-γ)を産生するCD8 T細胞の存在は、RSVの動物モデルにおけるTh2応答の減少および好酸球増加症の低減と関連している[Castilow EMおよびVarga SM. Overcoming T cell-mediated immunopathology to achieve safe RSV vaccination. Future Virol. 2008；3(5)：445-454；Stevens WW, Sun J, Castillo JP, ら、Pulmonary eosinophilia is attenuated by early responding CD8(+) memory T cells in a murine model of RSV vaccine-enhanced disease. Viral Immunol. 2009；22(4)：243-51]。
【００７６】
ヒトまたは非ヒト動物に免疫を付与するための免疫原として有用であるRSVの適切な抗原は、以下、すなわち、融合タンパク質(F)、付着タンパク質(G)、基質タンパク質(M2)および核タンパク質(N)から選択することができる。用語「Fタンパク質」または「融合タンパク質」または「Fタンパク質ポリペプチド」または「融合タンパク質ポリペプチド」は、RSV融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。同様に、用語「Gタンパク質」または「Gタンパク質ポリペプチド」は、RSV付着タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。用語「Mタンパク質」または「基質タンパク質」または「Mタンパク質ポリペプチド」は、RSV基質タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドまたはタンパク質を指し、M2-1(本明細書中ではM2.1と記載する場合がある)およびM2-2遺伝子産物の一方または両方を含んでいてもよい。同様に、用語「Nタンパク質」または「ヌクレオカプシドタンパク質」または「Nタンパク質ポリペプチド」は、RSV核タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【００７７】
ヒトRSV株の2つの群(AおよびB群)は、主にG糖タンパク質の抗原性の違いに基づいて説明されている。RSVの多数の株がこれまでに単離されており、そのいずれも、本明細書中に開示した免疫原性の組み合わせの抗原という観点から適している。GenBankおよび／またはEMBLアクセッション番号により示される典型的な株は、米国特許出願公開第2010/0203071号(WO2008114149)に見出すことが可能であり、かかる文献は本発明における使用に適したRSV FおよびGタンパク質の核酸およびポリペプチド配列を開示することを目的として参照により本明細書中に組み込まれるものとする。ある実施形態において、RSV Fタンパク質はRSV Fタンパク質の細胞外ドメイン(F0ΔTM)でありうる。
【００７８】
典型的なMおよびNタンパク質の核酸およびタンパク質配列は、例えば、米国特許出願公開第2014/0141042号(WO2012/089833)に見出すことが可能であり、かかる文献は、本発明における使用に適したRSV MおよびNタンパク質の核酸およびポリペプチド配列を開示することを目的として本明細書中に組み込まれるものとする。
【００７９】
適切には、本発明において共に使用するために、導入遺伝子核酸はRSV F抗原およびRSV, MおよびN抗原をコードする。より具体的には、該核酸はRSV F0ΔTM抗原(膜貫通および細胞質領域を欠失させた融合(F)タンパク質)、ならびにRSV M2-1(抗転写終結)およびN(ヌクレオカプシド)抗原をコードする。
【００８０】
膜貫通および細胞質領域を欠失させた融合(F)タンパク質(F0ΔTM)
RSV Fタンパク質は主要な表面抗原であり、標的細胞へのウイルスの融合を媒介する。該Fタンパク質は、RSVの亜群間および株間で高度に保存されている抗原である。該Fタンパク質は、予防的RSV-中和モノクローナル抗体Synagisを含む中和抗体の標的である。膜貫通領域および細胞質尾部の欠失により、F0ΔTMタンパク質の分泌が可能となる。この可溶型のFタンパク質を認識する中和抗体、例えばSynagisは、RSVの感染力を阻害する[Magro M, Andreu D, Gomez-Puertas P,ら、Neutralization of human respiratory syncytial virus infectivity by antibodies and low-molecular-weight compounds targeted against the fusion glycoprotein. J Virol. 2010；84(16)：7970-82]。
【００８１】
ヌクレオカプシド(N)タンパク質
Nタンパク質は、RSV株間で高度に保存されかつ多くのT細胞エピトープの供給源であることが知られている内部(非露出)抗原である。Nタンパク質はRSVゲノムの複製および転写に必須である。Nタンパク質の主な機能は、RNAの転写、複製およびパッケージングを目的としてウイルスゲノムを封入し、該ウイルスゲノムをリボヌクレアーゼから保護することである。
【００８２】
抗転写終結(M2-1)タンパク質
M2-1タンパク質は、全長メッセンジャーRNA(mRNA)の効率的な合成にとって、ならびに非分節マイナス鎖RNAウイルスの特徴であるポリシストロン性リードスルーmRNAの合成にとって、重要な抗転写終結因子である。M2-1は、RSV株間で高度に保存されかつ多くのT細胞エピトープの供給源であることが知られている内部(非露出)抗原である。
【００８３】
N-M2-1融合タンパク質
リンカーをコードするポリヌクレオチドは、RSV N抗原、またはその断片をコードするポリヌクレオチドと、RSV M2.1抗原、またはその断片をコードするポリヌクレオチドとの間に位置する。従って、ある特定の好適な例では、発現カセットは、融合されたRSVウイルスタンパク質N-リンカー-M2.1をコードする導入遺伝子を含有する。該リンカーはフレキシブルリンカー、好ましくは配列番号11のアミノ酸配列(Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly)または配列番号12のアミノ酸配列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)を含むフレキシブルリンカーであることが好ましい。
【００８４】
パピローマ(PV)導入遺伝子
一実施形態において、本発明は、2つの発現カセットを含む組換えサル由来アデノウイルスベクターであって、各発現カセットがパピローマウイルス(PV)に由来する免疫原性導入遺伝子を含む該組換えサル由来アデノウイルスベクターの、パピローマウイルス誘発性疾患の治療または予防における使用を提供する。適切には、本発明の組換えサル由来アデノウイルスベクターは、前記発現カセットの一方に改変パピローマウイルスE1抗原を含み、かつ他方の発現カセットに改変パピローマウイルスE2抗原を含む。
【００８５】
ヒトパピローマウイルス(HPV)は、粘膜および／または皮膚に感染して複数の疾病状態、例えば、子宮頸部新生物、子宮頸癌、および他の肛門性器癌を引き起こす小さなDNAウイルスである。ヒトの肛門性器管に感染することが知られているHPVは40を超える型が存在し、また約15のハイリスクHPV遺伝子型がヒト子宮頸癌と因果関係にある。子宮頸部上皮のHPV感染の大半は無症状であり、また2年間以内に自己解決する。しかし、ハイリスクなHPV型による持続感染は、病変を引き起こして湿潤癌に進行する場合がある。
【００８６】
免疫原として有用であるHPVの適切な抗原はWO2018060288に記載されており、また例としては、特にHPV E1およびE2タンパク質が挙げられる。
【００８７】
狂犬病(RG)導入遺伝子
リッサウイルスは、ラブドウイルス科のエンベロープを持つ一本鎖RNAウイルスである。リッサウイルス属のメンバーは狂犬病を引き起こし、またあらゆる公知のヒトウイルス病原体の中で最も高い致死率を示す。狂犬病は感染した哺乳動物の唾液を介して伝染する。神経向性ウイルスは、その宿主の神経系に侵入し、ほぼ例外なく死に至る脳脊髄炎を引き起こす。現在、世界中で毎年約60,000人が狂犬病で死亡しており、その大半はアジアおよびアフリカ内の発展途上国でイヌ咬傷により、また北米では野生生物およびコウモリにより引き起こされている。
【００８８】
狂犬病は狂暴型または麻痺型を呈する。その潜伏期間は約5日から数年と様々であるが、典型的には約20〜90日である。臨床疾患は、不快感、食欲不振、疲労、頭痛および発熱という前駆症状から始まり、続いて曝露の部位における疼痛または感覚異常が生じることが最も多い。不安感、激越または易刺激性がこの期間中は顕著である場合があり、その後活動亢進、見当識障害、痙攣発作、恐水病、流涎過多および、最終的には、麻痺、昏睡および死に至る。
【００８９】
狂犬病抗原は、狂犬病ウイルス糖タンパク質(RG)に由来するものであってもよい。例えば、狂犬病糖タンパク質をモデル抗原として使用してもよい。
【００９０】
アデノウイルスベクターの送達
幾つかの実施形態においては、本発明の組換えアデノウイルスベクターを、皮膚上投与、皮内投与、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、経鼻投与、経口投与、直腸投与、皮下注射、経皮投与または膣内投与により対象に投与する。
【００９１】
本発明の実施形態において、前記ベクターは、筋肉内に投与(IM)する、すなわち、筋肉内に直接注射することができる。筋肉は十分に血管が発達しているので、取込みは通常迅速である。
【００９２】
アジュバント
特定の病原体に対する強力かつ持続的な免疫を確立するためのアプローチとして、ワクチンへのアジュバントの添加が挙げられる。「アジュバント」とは、組成物の活性成分に対する免疫応答を増大させるか、刺激するか、活性化するか、増強するかまたは調節する作用物質を意味する。アジュバントの効果は細胞もしくは体液レベル、またはその両方で生じうる。アジュバントは実際の抗原に対する免疫系の応答を刺激するが、それ自体は免疫学的効果を持たない。あるいはまたはさらに、本発明のアジュバント添加組成物は、1つ以上の免疫刺激剤を含んでいてもよい。「免疫刺激剤」とは、抗原と共に投与されたか個別に投与されたかにかかわらず、対象の免疫応答の全般的、一時的な増加を誘導する作用物質を意味する。
【００９３】
本発明の組成物は、アジュバントと共に、またはアジュバント無しで投与してもよい。あるいは、またはさらに、該組成物は1つ以上のアジュバント(例えばワクチンアジュバント)を含むかまたは該アジュバントと併用して投与してもよく、特に該組成物は、導入遺伝子をコードする本発明のベクターの免疫学的有効量を含む。
【００９４】
使用方法／用途
本明細書中に開示した構築物または組成物の免疫学的有効量を投与するステップを含む、病原体により引き起こされる疾患に対する免疫応答をその必要がある対象において誘導するための方法が提供される。幾つかの実施形態においては、トランスジェニック抗原に対する免疫応答を、その必要がある対象において誘導するための、本明細書中に開示した構築物または組成物の使用が提供される。本発明のベクターを、感染による疾患の予防、治療または回復に適用してもよい。
【００９５】
本発明の方法は、医薬への本発明のベクターの使用を含む。それらの方法としては、病原体により引き起こされる疾患の治療のための本発明のベクターの使用が挙げられる。本発明のベクターは、病原体により引き起こされる疾患を治療するための薬剤の製造に使用することができる。本発明のベクターは、疾患、例えば、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)により引き起こされる疾患の予防または治療のための薬剤の製造に使用することができる。
【００９６】
アデノウイルスベクターによる有効な免疫化は、該アデノウイルスベクター骨格の固有の免疫調節能に依存する。免疫学的に作用が弱いアデノウイルスは抗原発現をあまり誘導しない。有効な免疫化は、プロモーターの、強力かつ持続的な導入遺伝子発現を駆動するその能力にも依存する。例えば、サイトメガロウイルス前初期(CMV-IE)プロモーターにより駆動されるアデノウイルスベクターは、それらが発現を低下させるサイトカインを誘導するため、長期導入遺伝子発現を維持しない。
【００９７】
「対象」とは、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒトまたは家畜哺乳動物を意図する。幾つかの実施形態において、該対象はヒトである。
【００９８】
総論
本発明のベクターは、本明細書中に提供する技術および配列を、当業者に公知の技術と併せて使用して作製する。かかる技術としては、教本に記載されているものなどのcDNAの従来のクローニング技術、アデノウイルスゲノムのオーバーラップするオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適切な方法が挙げられる。
【００９９】
特に説明しない限り、本明細書中で使用する全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の熟練者により通常理解されるものと同じ意味を有する。単数形の用語「a」、「an」、および「the」は、文脈上明確に他に示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、単語「または(もしくは／あるいは)」は、文脈上明確に他に示さない限り、「および(ならびに)」を含むことを意図する。用語「複数」は、2つ以上であることを指す。さらに、物質の濃度またはレベルに関して与えられる数値限定、例えば、溶液成分濃度またはその比率、ならびに温度、圧力およびサイクル時間などの反応条件は、近似であることを意図する。本明細書中で使用する用語「約」は、量±10％を意味することを意図する。
【０１００】
本発明をここで、以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：単一発現カセットを有するチンパンジーアデノウイルスの構築
野生型チンパンジーアデノウイルス155型(ChAd155)(WO 2016/198621)および83型(ChAd83)(WO 2010/086189)を、標準的手法を利用して健康なチンパンジーから単離し、Sci Transl Med (2012) 4：1およびWO 2010/086189に記載されている通りに構築した。
【０１０２】
実施例１において、ChAd155およびChAd83ベクターは各々、単一の導入遺伝子発現カセットを挿入することにより構築した。該発現カセットの構成要素には、古典的ヒトCMVプロモーターまたはCASIプロモーターのどちらか一方、モデル抗原としての狂犬病糖タンパク質および、場合によっては、WPREエンハンサーを使用した。3つの異なる挿入部位、すなわち、
(i)E3領域を導入遺伝子カセットで置き換える、
(ii)ファイバー領域とE4領域の間(部位HE1)に導入遺伝子カセットを挿入する、および
(iii)右ITRの下流(部位HE2)に導入遺伝子カセットを挿入する、
を導入遺伝子カセットについて試験した。
【０１０３】
これらの挿入部位のこの番号付けは、図1の図解に対応しており、ここで
(i)上部パネルは導入遺伝子カセットをE3領域と置き換えたRC1ベクターを例示したものであり、
(ii)中央パネルは導入遺伝子カセットをファイバー遺伝子とE4領域の終止コドン間(部位HE1)に挿入したRC3ベクターを例示したものであり、また
(iii)下部パネルは導入遺伝子カセットを右ITRの下流(部位HE2)に挿入したRC2ベクターを例示したものである。
【０１０４】
実施例１に示すベクターでは、E1領域は全ての形態において無傷のままである。
【０１０５】
導入遺伝子は、配列番号1および配列番号2の次の位置、すなわち、
HE1 ChAd155：配列番号1のbp 34611と34612の間の挿入部位、
HE2 ChAd155：配列番号1のbp 37662と37663の間の挿入部位、
HE1 ChAd83：配列番号2のbp 33535と33536の間の挿入部位、
HE2 ChAd83：配列番号2のbp 36387と36388の間の挿入部位
に相同組換え技術により挿入した。
【０１０６】
導入遺伝子カセットを部位HE1に挿入した場合、ChAd155は複製しなかった。しかし、ChAd83のHE1部位への導入遺伝子カセットの挿入は、生存可能なベクターをもたらした。
【０１０７】
実施例２：実施例１のベクターのウイルス産生、ベクター力価および発現
ベクター複製を数値化するための動物モデルを特定するために、実施例１のC型アデノウイルスChAd155 RC2ベクターおよびE型アデノウイルスChAd83 RC2ベクターを、様々な動物起源の細胞において、ベクター力価およびゲノムコピー数により測定されるそれらの複製能力について評価した。結果を表1に示す。
【０１０８】
表1.実施例１のRC2 ChAd155およびRC2 ChAd83の複製および発現
【表１】
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【０１０９】
表1に示すように、ヒトMRC5細胞およびブタPK15細胞は、ChAd155およびChAd83の両方の高いベクター力価および高ゲノムコピー数を生じた。マウスNMuLiおよび非ヒト霊長類Vero細胞もRC ChAd155を産生したが、ヒトまたはブタ細胞よりもその程度は低かった。マウスNMuLi細胞および、驚いたことに、非ヒト霊長類Vero細胞では、RC ChAd83は十分に増殖しなかった。
【０１１０】
ヒトMRC5、マウスNMuLiおよび非ヒト霊長類Vero細胞は、7日を通してRC ChAd155の発現を支持した。ヒトMRC5細胞は7日を通してRC ChAd83の発現を支持し、マウスNMuLiおよび非ヒト霊長類Vero細胞も同様であったが、ヒト細胞よりもその程度は低かった。
【０１１１】
ウイルス産生
図2Aは、ChAd155またはChAd83(各々が実施例１のRC1またはRC2ベクター構築物を含む)に感染させたヒト初代MRC5細胞により産生されたウイルスの量を示している。該細胞を感染後7日目に回収し、ベクター力価を、3回の凍結融解サイクル後に取得した細胞溶解物において数値化した。ベクター力価は、それぞれのプロモーター領域に対して設計したプライマーを用いて定量的PCR(QPCR)解析により測定した。感染多重度(moi)は細胞当たり1250個のウイルス粒子とした。ウイルス産生を、バーの上に細胞当たりのウイルス粒子の数(vp／細胞)で示す。
【０１１２】
ヒトMRC5細胞はRC1(2.17×103vp／細胞)またはRC2(4.40×103vp／細胞)を含むChAd155の産生を支持し、同時にRC1(1.18×104vp／細胞)またはRC2(1.06×105vp／細胞)を含むChAd83の産生も支持した。図2Aに示すように、ChAd83はChAd155よりも高いレベルで産生され、RC2を含むChAd83ベクターはこれら4種のウイルス／ベクターの組み合わせの中で最も強力であった。
【０１１３】
図2Bは、実施例１のRC1、RC2またはRC3ベクター構築物を含むChAd83に感染させたヒト初代MRC5細胞により産生されたウイルスの量を示している。該細胞を感染後2および7日目に回収した。図2Aと同様に、ベクター力価を、それぞれのプロモーター領域に対して設計したプライマーを用いて定量的PCR(QPCR)解析により測定した。感染多重度(moi)は細胞当たり250または1250個のウイルス粒子とした。ウイルス産生を、バーの上に細胞当たりのウイルス粒子の数(vp／細胞)で示す。
【０１１４】
ヒトMRC5細胞は、RC1、RC2またはRC3を含むChAd83の産生を支持した。図2Bに示すように、RC2およびRC3 ChAd83ベクターに関して、RC1ベクターに関するものよりも高いウイルス産生が認められた。同様に、ChAd83 RC2 HE2ベクターに関しても、RC3 HE1ベクターに関するものよりも高いウイルス産生が認められた。
【０１１５】
ベクターゲノムコピー数
感染後、前記ベクターは前記細胞内で複製するので、そのベクターゲノムコピー数をQPCRにより測定することができる。ベクターDNA複製は、ウイルスの複製および増殖を完全には許容しない細胞においてさえ生じうる。ベクターDNAのQPCRは、ウイルスが複製サイクルを完了しかつ成熟したウイルス子孫として放出されるその能力とは無関係に、感染細胞内のベクター複製の尺度を提供する。従って、ベクター複製は、ChAdウイルスの複製または増殖を許容しない動物種、組織型および細胞型において定量化することができる。
【０１１６】
ベクターゲノムコピー数をベクター力価と並行して測定し、結果を図3Aおよび図３Ｂに示した。
【０１１７】
図2Aに示したウイルス産生と同様に、ヒトMRC5細胞をChAd155またはChAd83(各々が実施例１のRC1またはRC2ベクター構築物を含む)に感染させた。該細胞を感染後7日目に回収し、全DNAを抽出し、ウイルスゲノムをQPCRにより定量化し、さらにその結果を細胞当たりのベクターゲノムコピーとして表した。感染多重度(moi)は細胞当たり250個のウイルス粒子とし、細胞当たりのウイルス粒子の数は、細胞当たりのウイルスゲノムコピーを意味するバーの上に示す。コピー数は導入遺伝子発現のレベルに正比例する。
【０１１８】
図3Aに示すように、ChAd155によるRC1のウイルスDNA複製の量(6.21×103vp／細胞)とRC2のウイルスDNA複製の量(6.71×103vp／細胞)は同様であった。ChAd83は、ChAd155よりも多くのRC1(2.76×104vp／細胞)およびRC2(9.19×104vp／細胞)ウイルスDNAを産生した。最も高いレベルのウイルスDNA複製はChAd83 RC2によって観察された。
【０１１９】
図2Bに示したウイルス産生と同様に、ヒトMRC5細胞を、実施例１のRC1、RC2またはRC3ベクター構築物を含むChAd83に感染させた。該細胞を、感染後2および7日目に回収し、全DNAを抽出し、ウイルスゲノムをQPCRにより定量化し、さらにその結果を細胞当たりのベクターゲノムコピーとして表した。感染多重度(moi)は細胞当たり250または1250個のウイルス粒子とし、細胞当たりのウイルス粒子の数は、細胞当たりのウイルスゲノムコピーを意味するバーの上に示す。コピー数は導入遺伝子発現のレベルに正比例する。
【０１２０】
図3Bに示すように、RC2およびRC3 ChAd83ベクターに関するウイルスDNA複製の量は、RC1ベクターに関するものよりも多かった。RC2およびRC3 ChAd83ベクター間で同等のウイルスDNA複製が認められた。
【０１２１】
実施例３：実施例１のベクターのアデノウィルスゲノムコピー数
細胞当たりのベクターコピーとして表される、実施例１の構築物を有する複製可能アデノウイルスベクターの効率を、マウスおよび非ヒト霊長類の両方に由来する細胞培養物において数値化した。
【０１２２】
図4(a)は、単層で増殖させてからChAd155 RC1、ChAd155 RC2、ChAd83 RC1またはChAd83 RC2に細胞当たり250個のウイルス粒子という感染多重度で感染させたマウス肝NMuLi細胞中で増殖させた、複製可能ベクターのゲノムコピー数を示している。全DNAを感染後5日目に抽出してから、ベクターの複製を、該ベクターのプロモーター領域にアニーリングするプライマーを使用してQPCRにより測定した。
【０１２３】
細胞当たりのベクターコピーとして表した結果を図4(a)に示す。ChAd155は、NMuLi細胞において高効率でRC1およびRC2ベクターの両方を増幅した。ChAd155はRC1(1.73×104)およびRC2(1.92×104)ベクターをほぼ同程度まで複製した。ChAd83はRC1およびRC2ベクターを複製する点でChAd155より効率が劣っていた。ChAd83は前記マウス細胞においてベクターDNAをごく少量複製した。RC1ベクターは5.47×102コピー／細胞のレベルで複製し、またRC2ベクターは6.74×102コピー／細胞のレベルで複製した。
【０１２４】
非ヒト霊長類Vero細胞を同様に、単層で増殖させてから、ChAd155 RC1、ChAd155 RC2、ChAd83 RC1またはChAd83 RC2に感染させた(図4(b))。2つの異なる感染多重度、すなわち、細胞当たり50および250個のウイルス粒子を使用した。全DNAを感染後5日目に抽出してから、ベクターの複製を、該ベクターのプロモーター領域にアニーリングするプライマーを使用してQPCRにより測定した。
【０１２５】
細胞当たりのベクターコピーとして表した結果を図4(b)に示す。Vero霊長類細胞系はChAd155 RC1(moi 50で3.71×103コピー／細胞およびmoi 250で4.93×104コピー／細胞)ならびにChAd155 RC2(moi 50で8.15×103コピー／細胞およびmoi 250で7.05×104コピー／細胞)に許容性を示した。該Vero霊長類細胞系は、ChAd83 RC1またはChAd83 RC2に許容性は、あるにしても、わずかなものであった。moi 50ではVero細胞から発現されるChAd83 RC1またはChAd83 RC2ベクターは検出されなかった。moi 250では、ChAd83はRC1ベクターを1.13×102コピー／細胞のレベルで複製し、またRC2ベクターを1.29×103コピー／細胞のレベルで複製した。
【０１２６】
実施例４：実施例１のベクターのマウスおよび非ヒト霊長類細胞からの導入遺伝子発現
ウェスタンブロット解析を実施することで、マウスNMuLi細胞におけるChAd155 RC1およびChAd155 RC2による導入遺伝子発現のレベルを比較した(図5(a))。該細胞を、ChAd155 RC1またはChAd155 RC2に細胞当たり50、250または1250個のウイルス粒子という感染多重度で感染させた。該細胞を感染後2および5日目に回収し、抽出物を標準法 を利用して調製してから、等量の全細胞抽出物をSDS-PAGEゲルにロードした。電気泳動分離の後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、これを次に、狂犬病糖タンパク質導入遺伝子に対する市販のモノクローナル抗体を用いてプローブした。
【０１２７】
図5(a)は、ChAd155 RC1とChAd155 RC2の両方がマウスNMuLi細胞において導入遺伝子を発現することを示している。発現は感染後2および5日目の両方で観察され、狂犬病糖タンパク質(RG)の予想分子量に相当する約51 kDaのバンドにより示された。ChAd155 RC2ベクターは、感染後2および5日目の両方でChAd155 RC1ベクターより高いレベルの導入遺伝子発現を生じた。
【０１２８】
次にウェスタンブロット解析を実施し、マウスNMuLi細胞におけるChAd155 RC1、ChAd155 RC2、ChAd83 RC1およびChAd83 RC2による導入遺伝子発現のレベルを比較した(図5(b))。該細胞を、ChAd155 RC1、ChAd155 RC2、ChAd83 RC1またはChAd83 RC2に細胞当たり50、250または1250個(ChAd83 RC1に関しては250および1250個)のウイルス粒子という感染多重度で感染させた。該細胞をウェスタンブロットのために処理した。該細胞を感染後2および7日目に回収し、抽出物を標準法を利用して調製してから、等量の抽出物をSDS-PAGEゲルにロードした。電気泳動分離の後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、これを次に狂犬病糖タンパク質導入遺伝子に対する市販のモノクローナル抗体を用いてプローブした。
【０１２９】
図5(b)は、ChAd155 RC1、ChAd155 RC2、ChAd83 RC1およびChAd83 RC2がマウスNMuLi細胞において導入遺伝子を発現することを示している。発現は感染後2および5日目の両方で観察され、狂犬病糖タンパク質(RG)の予想分子量に相当する約51 kDaのバンドにより示された。ChAd155はChAd83よりも効率的な導入遺伝子の発現を示した。感染後2日目に、ChAd155 RC2による強力な導入遺伝子発現が50vp／細胞という低い多重度でも観察されたが、ChAd155 RC1による強力な導入遺伝子発現はより高いmoiで初めて観察された。同様に、RC2は、ChAd155およびChAd83ウイルス血清型の両方においてRC1より効率的な導入遺伝子発現を示した。RC2は直接比較の各々においてRC1よりも強力に発現された。
【０１３０】
ウェスタンブロット解析を実施し、MRC5細胞におけるChAd83 RC1、RC2およびRC3による導入遺伝子発現のレベルを比較した(図5(c))。該細胞を、ChAd83 RC1、RC2またはRC3に、細胞当たり250または1250個のウイルス粒子という感染多重度で感染させた。該細胞を感染後2および7日目に回収し、抽出物を標準法を利用して調製してから、等量の全細胞抽出物をSDS-PAGEゲルにロードした。電気泳動分離の後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、これを次に狂犬病糖タンパク質導入遺伝子に対する市販のモノクローナル抗体を用いてプローブした。
【０１３１】
図5(c)は、ChAd83 RC1、RC2およびRC3がいずれもMRC5細胞において導入遺伝子を発現することを示している。発現は感染後2および7日目の両方で確認され、狂犬病糖タンパク質(RG)の予想分子量に相当する約51 kDaのバンドにより示された。ChAd83 RC2ベクターは、感染後2および7日目の両方で、ChAd83 RC1およびRC3ベクターよりも高いレベルの導入遺伝子発現をもたらした。7日目のRC1およびRC3ベクターに関しては、狂犬病糖タンパク質の検出は認められなかった。
【０１３２】
実施例５：単一発現カセットを有する代替チンパンジーアデノウイルスの構築
実施例１と同様に、標準的手法を利用して健康なチンパンジーから単離した野生型チンパンジーアデノウイルス155型(ChAd155)(WO 2016/198621)を、Sci Transl Med (2012) 4:1およびWO 2010/086189に記載されている通りに複製欠損ウイルスとして構築した。
【０１３３】
実施例５において、ChAd155は、単一導入遺伝子発現カセットを挿入することにより構築した。この発現カセットには、古典的ヒトCMV(hCMV)プロモーター、F0ΔTM、NおよびM2-1 RSV抗原ならびに、場合によっては、WPREエンハンサーを含めた。このベクターを図6に示す。この発現カセットを前記アデノウイルスのE1領域に(該E1領域を欠失させた後に)挿入した。
【０１３４】
図6に示すChAd155は、RSV F0ΔTM、M2-1およびN抗原の全てをコードする導入遺伝子を含み、ここで自己切断部位(「2A」)はRSV F0ΔTM抗原と複合RSV N.M2-1抗原の間に含まれており、フレキシブルリンカーはRSV M2-1およびN抗原の間に含まれている。
【０１３５】
実施例５のChAd155 RSVベクターは、配列番号4のポリヌクレオチドを含み、かつ配列番号5のポリペプチドをコードする。
【０１３６】
実施例６：二重発現カセットを有するチンパンジーアデノウイルスの構築
先と同様に、標準的手法を利用して健康なチンパンジーから単離した野生型チンパンジーアデノウイルス155型(ChAd155)(WO 2016/198621)を、Sci Transl Med (2012) 4：1およびWO 2010/086189に記載されている通りに複製欠損ウイルスとして構築した。
【０１３７】
実施例６のChAd155は、2つの導入遺伝子発現カセットを前記アデノウイルスの2つの異なる位置に挿入することにより構築した：
(1)第1発現カセット構成要素は、古典的ヒトCMV(hCMV)プロモーターおよびN.M2-1 RSV 複合抗原を含む。この第1発現カセットを、前記アデノウイルスのE1領域に(該E1領域を欠失させた後に)挿入する。
(2)第2発現カセットは、増強された古典的ヒトCMV(増強hCMV)プロモーター、F0ΔTM RSV抗原およびWPREエンハンサーを含む。この第２発現カセットを、前記アデノウイルスのHE2領域に(該HE2領域を欠失させた後に)挿入する。
【０１３８】
二重発現カセットを含むこのベクターを図7に示す。
【０１３９】
図7の構築物では、Ad5E4orf6を初期遺伝子4(E4)領域と置換している。該置換はHEK 293細胞における生産性を増大させるために必要である。
【０１４０】
実施例７：実施例６の二重発現カセットからの導入遺伝子発現
MRC5細胞における実施例６のChAd155ベクター中の導入遺伝子(図中では「二重」または「二重カセット」と表示)発現のレベルを比較するために、以下(i)〜(iii)、すなわち、
(i)単一F発現カセットを含むベクター(「F0ΔTm」と表示されるChAd155-F0ΔTM)、
(ii)単一NM2発現カセットを含むベクター(「NM2-1」と表示されるChAd155-NM2)、ならびに
(iii)FおよびN.M2-1 RSV抗原を含有する単一発現カセットを含む実施例５のベクター(「RSV」とも表示されるChAd155-F0ΔTM.NM2)
を用いてウェスタンブロット解析を実施した。
【０１４１】
ウェスタンブロット解析を図8および図9に示す。
【０１４２】
図8に示すように、前記細胞を、ChAd155-F0ΔTM、ChAd155-F0ΔTM.NM2(「RSV」)または実施例６のChAd155二重カセットに細胞当たり500個のウイルス粒子という感染多重度で感染させた。さらに、細胞を、ChAd155-F0ΔTM.NM2(「RSV」)に細胞当たり500または1250個のウイルス粒子という感染多重度で感染させた。該細胞を感染後48時間および96時間目に回収し、抽出物を標準法を利用して調製してから、等量の全細胞抽出物をSDS-PAGEゲルにロードした。
【０１４３】
図8は、ChAd155二重カセットが、MRC5細胞においてChAd155F0ΔTMに匹敵しかつChAd155-FΔTM.NM2より高いF抗原の発現レベルを与えることを示してる。
【０１４４】
図9に示すように、前記細胞に、ChAd155-NM2、ChAd155-F0ΔTM.NM2(「RSV」)または実施例６のChAd155二重カセットを、細胞当たり250および1250個のウイルス粒子という感染多重度で感染させた。該細胞を感染後48時間目に回収し、抽出物を標準法を利用して調製してから、等量の全細胞抽出物をSDS-PAGEゲルにロードした。
【０１４５】
図9では、ChAd155二重カセットは、MRC5細胞において少なくともChAd155-NM2単一ベクターに匹敵しかつChAd155-FΔTM.NM2(「RSV」)より高いNM2-1発現レベルを与えている。
【０１４６】
実施例８：実施例６の二重発現カセットの免疫原性
実施例６の二重発現カセットの免疫原性を、CD1非近交系マウス(10匹／群)において数値化した。実験は、5×108個のウイルス粒子をマウスに筋肉内注射することにより実施した。B細胞応答は、免疫化後4および8週目にRSV中和力価を測定することにより測定した。各点は、一匹のマウスにおける応答を表しており、また線は各投与群の平均に対応している。この解析の結果を図10に示す。
【０１４７】
図10は、ChAd155二重カセットが、ChAd155F0ΔTMに匹敵しかつChAd155-F0ΔTM.NM2(「RSV」)により引き起こされるものより高いB細胞応答をもたらすことを示している。
【０１４８】
実施例６の二重発現カセットの免疫原性を、BALB/c近交系マウス(48、11または8匹／群)においても評価した。実験は、筋肉内に107または106個のウイルス粒子を注射することにより実施した。T細胞応答は、BALB/cマウスにおいてマッピングされたM2ペプチドT細胞エピトープを使用してex vivoでのIFN-γ酵素結合免疫スポット(ELISpot)により免疫化後3週目に測定した。結果を図11に示し、脾細胞100万個当たりのIFN-γスポット形成細胞(SFC)として表す。各点は一匹のマウスにおける応答を表しており、また線は各投与群の平均に対応している。ウイルス粒子の数で表した注入用量をＸ軸上に示す。結果を図11に示す。図11は、ChAd155二重カセットが、単一カセットChAd155-F0ΔTM.NM2(「三重RSV」、結果は過去のデータから取得)により引き起こされるものより高いT細胞応答をもたらすことを示している。応答におけるこの差異は、106vp投与の場合により大きい。
【０１４９】
図11では、「＃陽性マウス」、すなわちワクチンに応答したマウスの数に言及している。
【０１５０】
実施例９：ウシにおける実施例６の二重発現カセットの免疫原性
本研究デザインについて、下記表2に詳述する：
【０１５１】
【表２】
2021500880.tif 000004
「ChAd155単一RSV」は実施例５のChAd155であり、また「ChAd155二重RSV」は実施例６のChAd155である。
【０１５２】
計12頭の成体ウシを本研究に登録した。これらのウシは年齢が2.7歳〜7.8歳であり、また平均範囲は4.8歳であった。
【０１５３】
それらのウシを本研究に登録する前に、該ウシをウシRSV(BRSV)抗体についてELISAによりプレスクリーニングした。これにより、類似した分布および平均BRSV Ab力価を有する研究群を確立することが可能となった(該群のいずれにも偏りが生じないようにするため)。
【０１５４】
試料は、ワクチン接種前(D-5またはD0)およびワクチン接種後(D7、10、14、28、60、90)にウシから採取した。本研究では、ウシに、前記2種のワクチンのうちの一方の1×1011個のウイルス粒子または生理食塩水を0日目(D0)に接種した。
【０１５５】
気管支肺胞洗浄(BAL)をワクチン接種後−5、7、10または28日目に実施することにより、ウシの肺のT細胞を単離した。次に、前記ワクチンにおいてコードされているRSV抗原(ペプチドプールの形態)による刺激時のCD4+およびCD8+T細胞のIFN-γサイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色(ICS)を利用して検出した(すなわち、IFNγICSを利用して動物における肺T細胞応答を検出した)。本実験の結果を図12Aおよび12Bに示す。本実験から、ChAd155-二重RSVは気管支肺胞洗浄(BAL)において一貫したRSV-特異的CD4+およびCD8+応答を誘導すると結論づけることができる。
【０１５６】
末梢血単核細胞(PBMC)のRSV-特異的CD4+およびCD8+応答のIFN-γサイトカイン産生を細胞内サイトカイン染色(ICS)を利用して検出するために、血液試料を同様にワクチン接種後0、14、28、60および90日目にウシから採取した(すなわち、IFNγICSを利用して末梢T細胞応答を検出した)。本実験の結果を図13Aおよび13Bに示す。これらの結果を踏まえると、ChAd155-二重RSVはPBMCにおける既存のRSV-特異的CD4+およびCD8+応答を一貫して増大させると結論づけることができる。
【０１５７】
同様に前記血液試料を使用して、血清中のRSVに対する中和抗体(nAb)を検出した(すなわち、末梢液性応答を検出した)。本実験の結果を図14Aおよび14Bに示す。これらの結果は、ChAd155-二重RSVが、ワクチン接種後3ヶ月間基準値よりも高いレベルで維持される血清中のRSV nAbをブーストすることを示している。
【０１５８】
実施例１０：狂犬病GおよびRSV NM2タンパク質をコードするChAd155二重の免疫原性
使用する3つの異なるChAd155ベクター、すなわち、
・狂犬病G(RG)およびRSV NM2タンパク質を共にコードするChAd155(本実施例では「ChAd155二重」、およびChAd155二重hCMV NM 2-1−CASI RG WPREと称する)、
・狂犬病G(RG)タンパク質のみをコードするChAd155(本実施例では「ChAd155 RG」、およびChAd155(ΔE4)CASI RG WPREと称する)、ならびに
・図6に示すChAd155ベクター、すなわち、RSV F0ΔTM、M2-1およびN抗原の全てをコードする導入遺伝子を有するベクター(「ChAd155 RSV」と称する)
を本実験で構築した。
【０１５９】
ChAd155二重アデノウイルスの3つの異なる用量、すなわち、107個のウイルス粒子という最高用量、および106個のウイルス粒子という中用量、および105個のウイルス粒子という最低用量をマウスに投与した。
【０１６０】
前記のChAd155 RGおよびChAd155 RSVベクターの2つの異なる用量をマウスに投与した。ChAd155 RSVの場合、これは107個のワクチン粒子という高用量、および106個のワクチン粒子という低用量とした。ChAd155 RGの場合、これは106個のワクチン粒子という高用量、および105個のワクチン粒子という低用量とした。マウスを3週間後に犠牲にし、脾細胞を、該ワクチンがコードする抗原に対するT細胞応答についてIFNγELISpotにより試験した。
【０１６１】
本実験の結果を図15A、15Bおよび15Cに示す。図15A、15Bおよび15Cから分かるように、ChAd155二重RG-NM2ベクターは全体的に、RGおよびNM2抗原の各々を単独でコードするベクターに匹敵する免疫応答を示す。
【０１６２】
図15Cは、3つの異なるベクター全てに使用した共通の106vp用量での、全コード化抗原に対する累積応答を比較したものである。狂犬病Gタンパク質が2回記載されている(G1およびG2)のは、該タンパク質の全配列を網羅するためにオーバーラップペプチドの2つのプールを使用したからである。
【０１６３】
従って、2つの抗原を同一ベクター内に配置すると、異なる病原体に対する複数の抗原を同一ベクター内に提供できるようになると同時に、依然として同等の免疫応答が引き起こされる。
【０１６４】
実施例１１：HeLa細胞における狂犬病GおよびRSV NM2タンパク質をコードするChAd155二重の発現
実施例１１の実験では、HeLa細胞を、実施例１０で使用した精製「ChAd155二重」、「ChAd155 RG」および「ChAd155 RSV」に感染させた。
【０１６５】
50、250および1250の感染多重度(MOI)を本実験で利用した。
【０１６６】
図16Aに示すウェスタンブロット(還元条件下で取得)を得るために、細胞溶解物を感染後48時間目に回収した。NM2-1の推定サイズは65 kDaである。図16Aは、ChAd155二重カセットおよびChAd155 NM2-1に関して同等の発現レベルを示している。さらに、NM2-1の発現レベルは、ChAd155二重カセットに関してはChAd155 RSVベクターより高かった。
【０１６７】
図16Bに示すウェスタンブロットを得るために、上清を感染後48時間目に回収した。狂犬病糖タンパク質の推定サイズは57.6 kDaである。図16Bは、ChAd155二重およびChAd155 RGアデノウイルスに関して同等の発現レベルを示している。
【０１６８】
さらに、4つの異なるベクターを使用して感染力データも収集した。精製ウイルスの感染力は、ヘキソン免疫染色により接着性Procell 92細胞において評価した。結果を下記表3に示す(vp＝ウイルス粒子、ifu＝感染単位、およびRはこれら2つの数の比率である)。感染力の結果は、前記ベクターの全てが同様の感染力を有することを示している。さらに、R値の全てが300未満だったことから、全ベクターの感染力は許容性の範囲内であると思われた。
【０１６９】
【表３】
2021500880.tif 000005
【０１７０】
実施例１２：CRPV E2およびE1タンパク質をコードするChAd155二重の免疫原性
2つの異なるChAd155ベクター、すなわち、
・第1発現カセットにおいて改変CRPV E2タンパク質をコードし、かつ第2発現カセットにおいて改変CRPV E1タンパク質をコードするChAd155(「CRPV二重」と称する)、ならびに
・単一発現カセットにおいて改変CRPV E2およびE1タンパク質の融合体をコードするChAd155(「CRPV融合体」と称する)
を本実験で構築した。
【０１７１】
前記2つのアデノベクターの2つの異なる用量、すなわち、107個のウイルス粒子という高用量、および106個のウイルス粒子という低用量をマウスに投与した。本実験の結果を図17に示す。図17は、ワクチン接種の3週間後の脾細胞に関するIFNγELISpotである。統計解析をその結果について実施したところ、異なるベクターからの応答間の差は統計学的に有意であるとは思われなかった。しかし、図17から分かるように、ChAd155 CRPV二重ベクターは、CRPV融合体ベクターに比べて、最低用量で応答マウスの出現頻度の増加を示す(106用量のCRPV二重ベクターの場合は6/6が陽性応答マウスであるが、106用量のCRPV融合体ベクターの場合は4/6のみが陽性応答マウスである)。
【０１７２】
実施例１３：CRPV E2およびE1タンパク質をコードするChAd155二重の発現
実施例１２で使用した2つの異なるChAd155ベクターを実施例１３でも使用した。
【０１７３】
250および1250の感染多重度(MOI)を本実験で使用した。細胞溶解物を感染後48時間目に回収した。改変E1タンパク質の推定サイズは48 kDaであり、改変E2タンパク質は35 kDaであり、また改変E1およびE2タンパク質の両方を含有する融合タンパク質は88 kDaである。
【０１７４】
図18は、前記CRPV融合体ベクターに比べて、前記CRPV二重ベクターによる改変E1およびE2タンパク質のより良好な発現が認められたことを例示するウェスタンブロット(還元条件下で取得)を示している。図18中に示す「Pvj」の列は、使用した対照である。
【０１７５】
さらに、感染力データを、前記の2つの異なるベクターを使用して収集した。精製ウイルスの感染力は、ヘキソン免疫染色により接着性Procell 92細胞において評価した。結果を下記表4に示す(vp＝ウイルス粒子、ifu＝感染単位、およびRはこれら2つの数の比率である)。感染力の結果は、前記の2つのベクターが同様の感染力を有することを示している。さらに、R値の全てが300未満だったことから、全ベクターの感染力は許容性の範囲内であると思われた。
【０１７６】
【表４】
2021500880.tif 000006
【０１７７】
配列の記載
配列番号1  野生型ChAd155をコードするポリヌクレオチド配列
2021500880.tif 000007
2021500880.tif 000008
2021500880.tif 000009
2021500880.tif 000010
2021500880.tif 000011
2021500880.tif 000012
2021500880.tif 000013
2021500880.tif 000014
2021500880.tif 000015
2021500880.tif 000016
2021500880.tif 000017
2021500880.tif 000018
2021500880.tif 000019
【０１７８】
配列番号2  野生型ChAd83をコードするポリヌクレオチド配列
2021500880.tif 000020
2021500880.tif 000021
2021500880.tif 000022
2021500880.tif 000023
2021500880.tif 000024
2021500880.tif 000025
2021500880.tif 000026
2021500880.tif 000027
2021500880.tif 000028
2021500880.tif 000029
2021500880.tif 000030
2021500880.tif 000031
2021500880.tif 000032
2021500880.tif 000033
【０１７９】
配列番号3  CASIプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列
2021500880.tif 000034
【０１８０】
配列番号4  ChAd155/RSVをコードするポリヌクレオチド配列
2021500880.tif 000035
2021500880.tif 000036
2021500880.tif 000037
2021500880.tif 000038
2021500880.tif 000039
2021500880.tif 000040
2021500880.tif 000041
2021500880.tif 000042
2021500880.tif 000043
2021500880.tif 000044
2021500880.tif 000045
2021500880.tif 000046
2021500880.tif 000047
2021500880.tif 000048
2021500880.tif 000049
【０１８１】
配列番号5  RSV F0ΔTM-N-M2-1アミノ酸配列
2021500880.tif 000050
【０１８２】
配列番号6  増強されたhCMVプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列
2021500880.tif 000051
2021500880.tif 000052
【０１８３】
配列番号7  hCMV NM2 bghpolyAカセットをコードするポリヌクレオチド配列
2021500880.tif 000053
2021500880.tif 000054
CMVプロモーター配列：太字
導入遺伝子配列NM2：斜体
bghpolyA ポリAシグナル：斜体＋下線
【０１８４】
配列番号8  NM2タンパク質配列
2021500880.tif 000055
【０１８５】
配列番号9  hCMV F0 WPRE bghpolyAカセットをコードするポリヌクレオチド配列
2021500880.tif 000056
2021500880.tif 000057
2021500880.tif 000058
増強されたCMVプロモーターの配列：太字
導入遺伝子配列F0：斜体
WPRE配列：下線付きの太字
bghpolyA ポリAシグナル：斜体＋下線
【０１８６】
配列番号10  F0タンパク質配列
2021500880.tif 000059
【０１８７】
配列番号11  フレキシブルリンカーのアミノ酸配列
Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly
【０１８８】
配列番号12  フレキシブルリンカーのアミノ酸配列
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly
【図１】
2021500880.tif 000060
【図２Ａ】
2021500880.tif 000061
【図２Ｂ】
2021500880.tif 000062
【図３Ａ】
2021500880.tif 000063
【図３Ｂ】
2021500880.tif 000064
【図４】
2021500880.tif 000065
【図５−１】
2021500880.tif 000066
【図５−２】
2021500880.tif 000067
【図６】
2021500880.tif 000068
【図７】
2021500880.tif 000069
【図８】
2021500880.tif 000070
【図９】
2021500880.tif 000071
【図１０】
2021500880.tif 000072
【図１１】
2021500880.tif 000073
【図１２Ａ】
2021500880.tif 000074
【図１２Ｂ】
2021500880.tif 000075
【図１３Ａ】
2021500880.tif 000076
【図１３Ｂ】
2021500880.tif 000077
【図１４Ａ】
2021500880.tif 000078
【図１４Ｂ】
2021500880.tif 000079
【図１５Ａ】
2021500880.tif 000080
【図１５Ｂ】
2021500880.tif 000081
【図１５Ｃ】
2021500880.tif 000082
【図１６Ａ】
2021500880.tif 000083
【図１６Ｂ】
2021500880.tif 000084
【図１７】
2021500880.tif 000085
【図１８】
2021500880.tif 000086
【配列表】
2021500880000001.app
【国際調査報告】
2021500880.tif 000087
2021500880.tif 000088
2021500880.tif 000089