(57)【要約】  本明細書に提供される開示は、単一特異性及び多重特異性抗ＴＭＥＦＦ２抗体、並びに記載の抗体を産生及び使用する方法に関する。
2021524255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体又は前記その抗原結合断片が、ＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域への結合に関して、
ａ）配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む参照抗体と競合する、請求項１に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体又は前記その抗原結合断片が、残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）又はＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）内でＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合する、請求項１又は２に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２、
ｂ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３、
ｃ）それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４、
ｄ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２、又は
ｅ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６、
の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体又は前記その抗原結合断片が、約０．４×１０−９Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合し、前記ＫＤが、室温でｐＨ４．５〜５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用して測定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体又は前記その抗原結合断片が、約０．１×１０−１０Ｍ〜約０．４×１０−９Ｍの前記ＫＤでＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合する、請求項５に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
ＶＨ３＿３−２３（配列番号５３）又はＶＨ１＿１−６９（配列番号５４）に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）フレームワークを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
ＶＫＩ＿Ｌ１１（配列番号５５）又はＶＫＩＩＩＩ＿Ａ２７（配列番号５６）に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）フレームワークを含む、請求項７に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
ａ）それぞれ配列番号５３のＶＨ３＿３−２３及び配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１、
ｂ）それぞれ配列番号５４のＶＨ１＿１−６９及び配列番号５６のＶＫＩＩＩ＿Ａ２７、又は
ｃ）それぞれ配列番号５４のＶＨ１＿１−６９及び配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１
に由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、請求項８に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
ａ）配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
ａ）配列番号３２の重鎖（ＨＣ）及び配列番号３５の軽鎖（ＬＣ）、
ｂ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３６のＬＣ、
ｃ）配列番号３４のＨＣ及び配列番号３７のＬＣ、
ｄ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３８のＬＣ、
ｅ）配列番号９１のＨＣ及び配列番号９２のＬＣ、又は
ｆ）配列番号９３のＨＣ及び配列番号９４のＬＣ、
を含む、請求項１１に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３２のＨＣ及び配列番号３５のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
ａ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３６のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
ａ）それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３４のＨＣ及び配列番号３７のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
ａ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号３３のＨＣ及び配列番号３８のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号９１のＨＣ及び配列番号９２のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、並びに／又は
ｃ）配列番号９３のＨＣ及び配列番号９４のＬＣ、
を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１９】
前記抗体が、多重特異性抗体である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、二重特異性抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、ＣＤ３、所望によりＣＤ３イプシロンに結合する、請求項１９又は２０に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
１つ又は２つ以上の異種分子にコンジュゲートした、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２４】
ａ）請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片をコードし、
ｂ）配列番号２５、２６、２７、８７、若しくは８９の前記抗ＴＭＥＦＦ２抗体ＶＨ、及び／又は配列番号２８、２９、３０、３１、８８、若しくは９０のＶＬをコードし、
ｃ）配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、又は１０２のポリヌクレオチド配列を含む、
単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、前記抗体が発現する条件下で請求項２６に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することとを含む、方法。
【請求項２８】
ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療する方法であって、治療に有効な量の請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項２２に記載の医薬組成物を、前記対象に投与して、前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法。
【請求項２９】
前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌が、前立腺癌である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記前立腺癌が、再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺癌、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の治療剤が、手術、化学療法、アンドロゲン遮断療法、若しくは放射線、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の抗体に結合する、抗イディオタイプ抗体。
【請求項３４】
請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の抗体を含む、キット。
【請求項３５】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３６】
前記抗体が、ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の前記膜近位領域に結合する、請求項３５に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３７】
前記抗体が、ＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域への結合に関して、
ａ）配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む、参照抗体と競合する、請求項３５又は３６に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３８】
前記抗体が、残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）又はＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）内でＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合する、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３９】
前記抗体が、約０．４×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合し、前記ＫＤが、室温でｐＨ４．５〜５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用して測定される、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４０】
前記抗体が、約０．１×１０−１０Ｍ〜約０．４×１０−９Ｍの前記ＫＤでヒトＴＭＥＦＦ２の前記膜近位領域に結合する、請求項３９に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４１】
前記第１のドメインが、
ａ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２、
ｂ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３、
ｃ）それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４、
ｄ）それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２、又は
ｅ）それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６、
のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４２】
前記第２のドメインが、
ａ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５、又は
ｂ）それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３、
のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項４１に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４３】
前記第１のドメインが、
ａ）配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
ｂ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
ｃ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
ｄ）配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
ｅ）配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
ｆ）配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、
を含む、請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４４】
前記第２のドメインが、
ａ）配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
ｂ）配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬ、
を含む、請求項３５〜４３のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４５】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３２の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号３５の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号７６の第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４６】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３２のＨＣ１、配列番号３５のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４７】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４８】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４９】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５０】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５１】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５２】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５３】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号９１のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５４】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５５】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号９３のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５６】
ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
ａ）前記第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
ｂ）前記第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、前記第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
ｃ）前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくは前記その抗原結合断片が、配列番号９３のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、
単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５７】
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項３５〜５６のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５８】
前記抗体が、ＨＣ１、ＨＣ２、又はＨＣ１及びＨＣ２に、位置２３４でアラニン、位置２３５でアラニン、又は位置２３４でアラニン及び位置２３５でアラニンを含み、残基の付番が、ＥＵインデックスに従う、請求項３５〜５７のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５９】
前記抗体が、ＨＣ１及びＨＣ２に、位置２２８でプロリンを含み、残基の付番が、ＥＵインデックスに従う、請求項３５〜５８のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６０】
前記抗体が、ＨＣ１に位置４０５でフェニルアラニン及び位置４０９でアルギニン、並びにＨＣ２に位置４０５でロイシン及び位置４０９でリジンを含む、請求項３５〜５９のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６１】
請求項３５〜６０のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項６２】
ａ）請求項４５〜５６のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片をコードするか、又は
ｂ）配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、８０、８１、８２、８３、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、及び１０２のポリヌクレオチド配列を含む、
ポリヌクレオチド。
【請求項６３】
請求項６２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項６４】
請求項６３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６５】
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、前記抗体が発現する条件下で請求項６４に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又は前記その抗原結合断片を回収及び精製することと、を含む、方法。
【請求項６６】
請求項４５〜５６のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、
ａ）２つの同一のＨＣ１及び２つの同一のＬＣ１を有する単一特異性二価ＴＭＥＦＦ２抗体、並びに２つの同一のＨＣ２及び２つの同一のＬＣ２を有する単一特異性二価ＣＤ３抗体を約１：１の混合物のモル比で組み合わせることと、
ｂ）前記混合物に還元剤を導入することと、
ｃ）前記混合物を約９０分〜約６時間インキュベートすることと、
ｄ）前記還元剤を除去することと、
ｅ）ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２を含む前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を精製することと、
を含む、方法。
【請求項６７】
前記還元剤が、２−メルカプトエタノールアミン（２−ＭＥＡ）である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記２−ＭＥＡが、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度で存在する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記インキュベートする工程が、約２５℃〜約３７℃の温度で実施される、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療する方法であって、治療に有効な量の請求項４５〜６０のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項６１に記載の医薬組成物を、前記対象に投与して、前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法。
【請求項７１】
前記ＴＭＥＦＦ２陽性癌が、前立腺癌である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記前立腺癌が、再発性、難治性、悪性、若しくは去勢抵抗性前立腺癌、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記第２の治療剤が、手術、化学療法、アンドロゲン遮断療法、若しくは放射線、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
請求項４５〜５６のいずれか一項に記載の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片に結合する、抗イディオタイプ抗体。
【請求項７６】
請求項４５〜５６のいずれか一項に記載の抗体を含む、キット。
【請求項７７】
療法に使用するための、請求項４５〜５６のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７８】
ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための、請求項４５〜５６のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７９】
ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療用薬品の製造のための、請求項４５〜６０のいずれか一項に記載の単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１９年１月３１日に作成され、ＪＢＩ５１６０ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔの名称であり、１４４，１５６バイトのサイズである。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書に提供される開示は、単一特異性及び多重特異性抗ＴＭＥＦＦ２抗体、並びに記載の抗体を産生及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
前立腺癌は、世界中の男性において２番目に最も一般的な癌であり、癌関連死では６番目に多い原因である。世界的には、およそ１，１００，０００人の新たな症例及び３００，０００人の死亡例が毎年存在し、これは全癌死の４％を構成する。男性の６人に１人が生涯のうちにこの疾患を有すると診断されるであろうと推定されている。前立腺癌リスクは、年齢と強く相関している：約４分の３の症例が、６５歳を超える男性に生じ、７０〜７４歳の症例が最も多い。５０代の男性のうちの約半数及び８０歳の男性のうちの８０％が、前立腺における癌の組織学的証拠を有することが、検死データから推定される。早期のステージでは、５年生存率はほぼ１００％である。しかしながら、癌が転移すると、５年生存率は２８％まで低下し、進行したステージの前立腺癌の有効な治療に対する必要性が未だ存在する。
【０００４】
精巣アンドロゲン遮断療法は、通常、（患者のうちの８０％に）疾患の安定化又は退行を生じる。前立腺癌の現在の治療方法としては、手術、放射線療法、及びホルモン療法が挙げられる。一般的には、癌ワクチンであるシプリューセルＴ（sipuleucel-T）、放射性治療剤（塩化ラジウム２２３など）、二次ホルモン療法（アビラテロン又はエンザルタミドなど）、及び／又は化学療法（ドセタキセル及びカバジタキセル）が、順番にホルモン療法に加えられる。これらの治療の各々は、癌の成長を数ヶ月遅らせ、疾患により生じる症状を和らげることができるが、最終的には転移性前立腺癌の進行は進む。ホルモン療法によるテストステロンレベルの低下にもかかわらず前立腺癌が成長すると、治療選択肢が限定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、前立腺癌を治療するための更なる療法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００７】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、抗体又はその抗原結合断片が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合に関して、配列番号２５の重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、を含む参照抗体と競合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００８】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、抗体又はその抗原結合断片が、残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）又はＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）内でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００９】
本発明はまた、本明細書に記載のある特定の重鎖及び軽鎖相補性決定領域配列を有する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体を提供する。
【００１０】
本発明はまた、本明細書に記載のある特定の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列を有する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体を提供する。
【００１１】
本発明はまた、本明細書に記載のある特定の重鎖及び軽鎖配列を有する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体を提供する。
【００１２】
本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、並びに／又は
配列番号３２のＨＣ及び配列番号３５のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１３】
本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、並びに／又は
配列番号３３のＨＣ及び配列番号３６のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１４】
本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、並びに／又は
配列番号３４のＨＣ及び配列番号３７のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１５】
本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、並びに／又は
配列番号３３のＨＣ及び配列番号３８のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１６】
本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、並びに／又は
配列番号９１のＨＣ及び配列番号９２のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１７】
本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、
配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、並びに／又は
配列番号９３のＨＣ及び配列番号９４のＬＣ、を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１８】
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号２５、２６、２７、８７、若しくは８９の抗ＴＭＥＦＦ２抗体ＶＨ及び／若しくは配列番号２８、２９、３０、３１、８８、若しくは９０のＶＬをコードするか、又は配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、又は１０２のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２１】
本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２２】
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、抗体又は抗原結合断片が発現する条件下で、本発明の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生された抗体又はその抗原結合断片を回収することと、を含む、方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療する方法であって、治療に有効な量の本発明の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体若しくはその抗原結合断片、又は本発明の医薬組成物を対象に投与して、ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【００２５】
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を含む、キットを提供する。
【００２６】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００２７】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、抗体が、ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の膜近位領域に結合する、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００２８】
本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、抗体が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合に関して、配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、を含む参照抗体と競合する、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００２９】
本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、抗体が、ＴＭＥＦＦ２上で配列番号５７又は配列番号５８のエピトープに結合する、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３０】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２の第１の重鎖（first heavy chain、ＨＣ１）、配列番号３５の第１の軽鎖（first light chain、ＬＣ１）、配列番号７６の第２の重鎖（second heavy chain、ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（second light chain、ＬＣ２）を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３１】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２のＨＣ１、配列番号３５のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３２】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３３】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３４】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３５】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３６】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３７】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３８】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３９】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００４０】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９３のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００４１】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９３のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００４２】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。
【００４３】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
【００４４】
本発明はまた、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を産生する方法であって、抗体が発現する条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を回収及び精製することと、を含む、方法を提供する。
【００４５】
本発明はまた、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、
２つの同一のＨＣ１及び２つの同一のＬＣ１を有する単一特異性二価ＴＭＥＦＦ２抗体、並びに２つの同一のＨＣ２及び２つの同一のＬＣ２を有する単一特異性二価ＣＤ３抗体を約１：１の混合物のモル比で組み合わせることと、
混合物に還元剤を導入することと、
混合物を約９０分〜約６時間インキュベートすることと、
還元剤を除去することと、
ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を精製することと、を含む、方法を提供する。
【００４６】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療する方法であって、治療に有効な量の本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片、又は本発明の医薬組成物を対象に投与して、ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法を提供する。
【００４７】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片に結合する、抗イディオタイプ抗体を提供する。
【００４８】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のアラインメントを示す。ＶＨ領域は、各行の先頭の配列番号によって同定される。
【図２】選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）のアラインメントを示す。ＶＨ領域は、各行の先頭の配列番号によって同定される。
【図３】選択二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体によって、カスパーゼ３／７活性を増加させることによって測定した、経時的なＬｎＣａＰ細胞の殺傷を示す。
【図４】雄ＮＧＳマウスにおけるエクスビボでのＬｎＣａＰ前立腺癌モデルにおける、選択二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体による、腫瘍移植の経時的な平均腫瘍体積の低減を示す。
【図５Ａ】雄ＮＧＳマウスにおけるエクスビボでのＬｎＣａＰ前立腺癌モデルにおける、０．５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ９３で治療した各マウスの平均腫瘍体積の低減を示す。
【図５Ｂ】雄ＮＧＳマウスにおけるエクスビボでのＬｎＣａＰ前立腺癌モデルにおける、０．５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ１３２で治療した各マウスの平均腫瘍体積の低減を示す。
【図６】Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスの確立されたＬＮＣａＰ異種移植片における、ＴＭＥＢ７６２ｘＣＤ３Ｂ３７６の有効性を示す。
【図７】ＴＭＣＢ１３２の投与に応答したＬｎＣａＰ前立腺癌細胞における、Ｔ細胞活性化を示す。
【図８】ＴＭＣＢ１３２のＴ細胞媒介性細胞障害を示す。
【図９】Ｔ細胞ヒト化マウスにおけるＴＭＣＢ１３２の抗腫瘍有効性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（但しそれらに限定されない）全ての刊行物は、完全に記載されているかのように参照により、本明細書に組み込まれる。
【００５１】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００５２】
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用することができるが、例示的な材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が使用される。
【００５３】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
【００５４】
文脈上明白に他の意味に解すべき場合を除き、明細書及び特許請求の範囲を通して、単語「含む（comprise）」、「含む（comprising）」などは、排他的又は排外的な意味とは対照的に、包括的な意味で、即ち、「〜を含むがこれらに限定されない」という意味で解釈されるべきである。
【００５５】
「特異的結合」、「特異的に結合する」、又は「特異的な結合」、又は「結合する」とは、抗体が、抗原又は抗原内のエピトープに、他の抗原に対するよりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、約５×１０−８Ｍ以下、例えば約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１２Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原又は抗原内のエピトープに結合し、非特異性抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に関しては、典型的には、そのＫＤより少なくとも１００倍小さいＫＤで結合する。解離定数は、本明細書に記載のプロトコルを使用して測定することができる。しかしながら、抗原又は抗原内のエピトープに結合する抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、又はＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合がある。単一特異性抗体は、１つの抗原又は１つのエピトープに結合するが、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原又は２つの異なるエピトープに結合する。
【００５６】
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性などの多重特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された形態を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えばＩｇＭ）からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域（constant region、ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（complementarity determining regions、ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
【００５７】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原に結合する抗体の領域である。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１３２：２１１−５０）（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−１７），ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５−７７）、及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６）Ｊ  Ｂｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６３：８００−１５）などの、様々な記述を使用して定義することができる。様々な記述と、可変領域の付番との対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５−７７、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２００１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０９：６５７−７０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース、ウェブリソース、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）。ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを描写することができる。本明細書で使用する場合、「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、明細書で別途明示的に記載のない限り、上述のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のうちのいずれかによって定義されるＣＤＲを含む。
【００５８】
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、即ち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
【００５９】
「抗原結合断片」とは、抗原に結合する免疫グロブリン分子の一部を意味する。抗原結合断片は合成ポリペプチド、酵素により入手可能なポリペプチド、又は遺伝子操作されたポリペプチドであってもよく、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）、サメ可変性ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４部分などの、抗体のＣＤＲを模倣したアミノ酸残基からなる最小の認識単位、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３が挙げられる。ＶＨ及びＶＬドメインは互いに、合成リンカーを介して結合し、様々なタイプの一本鎖抗体設計を形成することができ、ＶＨ及びＶＬドメインが、個別の一本鎖抗体構築物により発現される場合では、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内、又は分子間で対合し、一価の抗原結合部位、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又は二重特異性抗体を形成することができ、これらは、例えば国際公開第１９９８／４４００１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号、及び同第１９９２／０１０４７号に記載されている。
【００６０】
「モノクローナル抗体」とは、抗体分子の実質的に均質な母集団（即ち、母集団を含む個別の抗体が、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去する、又は、アミノ酸異性化若しくはアミド分解、メチオニン酸化若しくはアスパラギン若しくはグルタミンアミド分解などの翻訳後修飾といった、可能な周知の変更を除いて同一である）から入手される抗体を意味する。モノクローナル抗体は典型的には、１つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であってもよく、又は、二重特異性などの多重特異性であってもよく、一価、二価、又は多価であってもよい。
【００６１】
「単離された」とは、組み換え細胞などの分子が産生されるシステムの他の成分から実質的に分離及び／又は精製されている、分子の均質な母集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又は抗体などのタンパク質）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離抗体」とは、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない抗体を意味し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された抗体を包含する。
【００６２】
「ヒト化抗体」とは、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を意味する。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖系遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
【００６３】
「ヒト抗体」とは、ヒト対象に投与されるときに、最小の免疫応答を有するように最適化された抗体を意味する。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部分を含む場合、定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト起源の配列に「由来する」重鎖及び軽鎖可変領域を含む。そのような例示的な系は、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を担持するマウス又はラットなどの、非ヒトトランスジェニック動物である。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン座位を得るために使用する系間の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲ、又はその両方への、体細胞変異の導入又は意図的な置換の導入に起因する、ヒトで発現する免疫グロブリンと比較したときの、アミノ酸の違いを含む。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６に記載のヒトフレームワーク配列分析により誘導される、コンセンサスフレームワーク配列、又は、例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５−９６、及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載の、ファージ上に提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた、合成ＨＣＤＲ３を含み得る。
【００６４】
少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
【００６５】
「組み換え」は、異なる源からのセグメントを接合して組み換えＤＮＡ、抗体、又はタンパク質を産生するときに、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されたＤＮＡ、抗体、及び他のタンパク質を指す。
【００６６】
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の部分を指す。エピトープは典型的には、アミノ酸又は多糖側鎖などの化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）部分の表面集団からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、立体配座上の空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続なアミノ酸によって構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分にあるアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。
【００６７】
「二重特異性」は、２つの異なる抗原、又は同じ抗原中の２つの異なるエピトープと特異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト若しくはサル、例えば、Ｍａｃａｃａ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、若しくはＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓなどの他の種からの、同じ抗原（ホモログ）に対する交差反応性を有し得るか、又は２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。
【００６８】
「多重特異性」とは、同じ抗原内の２つ又は３つ以上の異なる抗原、又は２つ又は３つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する抗体を意味する。多重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト若しくはサル、例えば、Ｍａｃａｃａ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、若しくはＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓなどの他の種からの、同じ抗原（ホモログ）に対する交差反応性を有し得るか、又は２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。
【００６９】
「変異体」は、１つ又は２つ以上の修飾、例えば、１つ又は２つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
【００７０】
「ベクター」は、生物系内で複製可能な、又はそのような系間を移動することができる、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターを複製することができる生物学的要素を利用して生物系（例えば、細胞、ウイルス、動物、植物）及び再構成された生物系におけるこれらポリヌクレオチドの複製又は維持を促進する機能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル、又は選択マーカーなどの要素を含む。ベクターポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又はこれらのハイブリッドであり得る。
【００７１】
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指令するために、生物系又は再構成された生物系において利用することができるベクターを指す。
【００７２】
「ポリヌクレオチド」とは、糖−ホスフェート主鎖により共有結合した、又は他の等価な共有化学反応により結合した、ヌクレオチド鎖を含む合成分子を意味する。ｃＤＮＡは、例示的な合成ポリヌクレオチドである。
【００７３】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。
【００７４】
「ＴＭＥＦＦ２」は、ＥＧＦ様、及びトモレグリン２とも呼ばれる２つのフォリスタチン様ドメイン２を有する、ヒト膜貫通タンパク質を指す。完全長ヒトＴＭＥＦＦ２のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。ＴＭＥＦＦ２の細胞外ドメインは、配列番号２に示され、これは全長ＴＭＥＦＦ２の残基４０〜３７４に及ぶ。ＴＭＥＦＦ２細胞外ドメインは、３つの異なるサブドメイン、Ｋａｚａｌ様１（残基８５〜１３７）、Ｋａｚａｌ様２（残基１７６〜２２９）、及びＥＧＦドメイン（残基２６１〜３０１）を保有する。ＴＭＥＦＦ２  ＥＧＦドメインは、配列番号３に示される。ＴＭＥＦＦ２「膜近位領域」は、ＥＧＦドメイン及びＮ−Ｃ末端リンカー領域（例えば、配列番号１の全長ヒトＴＭＥＦＦ２の残基２３０〜３２０）を包含する、配列番号１１０のＴＭＥＦＦ２  ｒｅｑｉｏｎを指す。本明細書のタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片に対する全ての言及は、非ヒト種からのものとして明示的に指定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質断片のヒトバージョンを指すことが意図される。したがって、「ＴＭＥＦＦ２」は、非ヒト種、例えば、「マウスＴＭＥＦＦ２」又は「サルＴＭＥＦＦ２」などからのものとして指定されない限り、ヒトＴＭＥＦＦ２を意味する。
【００７５】
配列番号１（完全長ヒトＴＭＥＦＦ２）
ＭＶＬＷＥＳＰＲＱＣＳＳＷＴＬＣＥＧＦＣＷＬＬＬＬＰＶＭＬＬＩＶＡＲＰＶＫＬＡＡＦＰＴＳＬＳＤＣＱＴＰＴＧＷＮＣＳＧＹＤ
ＤＲＥＮＤＬＦＬＣＤＴＮＴＣＫＦＤＧＥＣＬＲＩＧＤＴＶＴＣＶＣＱＦＫＣＮＮＤＹＶＰＶＣＧＳＮＧＥＳＹＱＮＥＣＹＬＲＱＡＡ
ＣＫＱＱＳＥＩＬＶＶＳＥＧＳＣＡＴＤＡＧＳＧＳＧＤＧＶＨＥＧＳＧＥＴＳＱＫＥＴＳＴＣＤＩＣＱＦＧＡＥＣＤＥＤＡＥＤＶＷＣ
ＶＣＮＩＤＣＳＱＴＮＦＮＰＬＣＡＳＤＧＫＳＹＤＮＡＣＱＩＫＥＡＳＣＱＫＱＥＫＩＥＶＭＳＬＧＲＣＱＤＮＴＴＴＴＴＫＳＥＤＧ
ＨＹＡＲＴＤＹＡＥＮＡＮＫＬＥＥＳＡＲＥＨＨＩＰＣＰＥＨＹＮＧＦＣＭＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱＨＣ
ＥＫＫＤＹＳＶＬＹＶＶＰＧＰＶＲＦＱＹＶＬＩＡＡＶＩＧＴＩＱＩＡＶＩＣＶＶＶＬＣＩＴＲＫＣＰＲＳＮＲＩＨＲＱＫＱＮＴＧＨ
ＹＳＳＤＮＴＴＲＡＳＴＲＬＩ
【００７６】
配列番号２（ヒトＴＭＥＦＦ２の細胞外ドメイン）
ＦＰＴＳＬＳＤＣＱＴＰＴＧＷＮＣＳＧＹＤＤＲＥＮＤＬＦＬＣＤＴＮＴＣＫＦＤＧＥＣＬＲＩＧＤＴＶＴＣＶＣＱＦＫＣＮＮＤＹＶ
ＰＶＣＧＳＮＧＥＳＹＱＮＥＣＹＬＲＱＡＡＣＫＱＱＳＥＩＬＶＶＳＥＧＳＣＡＴＤＡＧＳＧＳＧＤＧＶＨＥＧＳＧＥＴＳＱＫＥＴＳ
ＴＣＤＩＣＱＦＧＡＥＣＤＥＤＡＥＤＶＷＣＶＣＮＩＤＣＳＱＴＮＦＮＰＬＣＡＳＤＧＫＳＹＤＮＡＣＱＩＫＥＡＳＣＱＫＱＥＫＩＥ
ＶＭＳＬＧＲＣＱＤＮＴＴＴＴＴＫＳＥＤＧＨＹＡＲＴＤＹＡＥＮＡＮＫＬＥＥＳＡＲＥＨＨＩＰＣＰＥＨＹＮＧＦＣＭ  ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬＹＶＶＰＧＰＶＲＦＱＹＶＬＩＡＡＶＩＧＴＩＱＩＡＶＩＣＶＶＶＬＣＩＴＲＫＣＰＲＳＮＲＩＨＲＱＫＱＮＴＧＨＹＳＳＤＮＴＴＲＡＳＴＲＬＩ
【００７７】
ＴＭＥＦＦ２  ＥＧＦドメイン  配列番号３
ＨＨＩＰＣＰＥＨＹＮＧＦＣＭＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥ
【００７８】
ＴＭＥＦＦ２膜近位領域  配列番号１１０
ＮＴＴＴＴＴＫＳＥＤＧＨＹＡＲＴＤＹＡＥＮＡＮＫＬＥＥＳＡＲＥＨＨＩＰＣＰＥＨＹＮＧＦＣＭＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣＲＣＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬＹＶＶＰＧＰＶＲＦＱＹＶ
【００７９】
「ＣＤ３」は、多分子Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）複合体の一部としてＴ細胞上で発現され、２つ又は４つの受容体鎖：ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ゼータ、及びＣＤ３ガンマの会合から形成されたホモ二量体又はヘテロ二量体からなる抗原を指す。ヒトＣＤ３イプシロンは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。本明細書のタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片に対する全ての言及は、非ヒト種からのものとして明示的に指定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質断片のヒトバージョンを指すことが意図される。したがって、「ＣＤ３」は、非ヒト種、例えば、「マウスＣＤ３」「サルＣＤ３」などからのものとして指定されない限り、ヒトＣＤ３を意味する。
【００８０】
配列番号４（ヒトＣＤ３イプシロン）
ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱ
ＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥ
ＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰ
ＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ
【００８１】
配列番号５（ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメイン）
ＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬ
ＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤ
【００８２】
「二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体」、ＴＭＥＦＦ２／ＣＤ３抗体、ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体などは、ＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３に結合する抗体を指す。
【００８３】
「〜と組み合わせて」とは、２つ又は３つ以上の治療薬を、混合物の状態で一緒に、単剤として同時に、又は単剤として任意の順序で逐次、対象に投与することを意味する。
【００８４】
「ＴＭＥＦＦ２陽性癌」は、ＴＭＥＦＦ２タンパク質の測定可能なレベルを示す癌組織又は癌細胞を指す。ＴＭＥＦＦ２タンパク質のレベルは、生細胞又は溶解細胞で、例えばＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、又は放射免疫アッセイを使用する周知のアッセイを使用して、測定することができる。
【００８５】
「サンプル」は、対象から単離された類似の流体、細胞、又は組織に加えて、対象の体内に存在する流体、細胞、又は組織の収集物を指す。例示的なサンプルは、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ液、尿、唾液、嚢胞液、涙液、糞便、喀痰などの体液、分泌組織及び器官の粘膜分泌液、膣分泌液、非固形腫瘍に関連するものなどの腹水、胸膜腔、心膜腔、腹膜腔、腹腔、及び他の体腔の流体、気管支洗浄によって回収された流体、対象又は生物源、例えば、細胞及び器官の培養培地（細胞又は器官の馴化培地を含む）、洗浄液などと接触した液体溶液、組織生検、穿刺吸引、又は外科的に切除された腫瘍組織のものである。
【００８６】
「癌細胞」又は「腫瘍細胞」とは、インビボ、エクスビボ、又は組織培養のいずれかにおいて、自然発生的な又は導入された表現型の変化を有する癌性、前癌性、又は形質転換細胞を指す。これらの変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の取り込み、又は外因性の核酸の取り込みにより発生し得るが、自然に又は発癌物質に対する曝露に続いて発生し、それにより内因性の遺伝子を変異させ得る。形質転換／癌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、及びｅｘ  ｖｉｖｏにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍の増殖などによって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ  ｅｄ．１９９４））。
【００８７】
「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、即ち測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に従う１つの標準偏差又は５％までの範囲のいずれかのより高い範囲内であることを意味する。
【００８８】
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」は、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物などの全ての脊椎動物を包含する。記載されている場合を除き、「患者」及び「対象」という用語は、互換的に使用される。
【００８９】
「治療する」、又は「治療」とは、治療的処置、及び予防的（prophylactic）若しくは予防的（preventative）手段の両方を意味し、対象は、望ましくない生理学的変化又は疾患を予防する、又は低減させる（少なくする）予定である。有益な又は所望の臨床結果としては、検出可能であろうと又は検出不可能であろうと、症状の緩和、疾患の程度の軽減、安定した（即ち、悪化しない）疾患状態、疾患の進行の遅延又は鈍化、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的であろうと又は全体的であろうと）が挙げられる。「治療」はまた、対象が治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長させることを意味し得る。治療を要する者には、既に状態若しくは疾患を有している者、及び、状態若しくは疾患を有しやすい者、又は状態若しくは疾患を予防しようとする者が含まれる。
【００９０】
「治療に有効な量」とは、必要な用量及び期間で所望の治療結果を得るための有効量を指す。治療に有効な量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を引き出す１つの治療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々であってもよい。有効な１つの治療薬、又は治療薬の組み合わせの例示的な指標としては、例えば、患者の改善された健康が挙げられる。
【００９１】
本明細書全体を通して、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、特に明示的に指定されない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
【００９２】
従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードを、表１に示すとおりに本明細書で使用する。
【００９３】
【表１】
2021524255.tif 000003
【００９４】
物質の組成
本発明は、抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体の抗原結合断片を含む多重特異性抗体、及び二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。本発明は、本発明の抗体をコードするポリペプチド及びポリヌクレオチド、又はそれらの相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。
【００９５】
抗ＴＭＥＦＦ２抗体
ＴＭＥＦＦ２発現は、他の正常組織と比較して、前立腺組織及び前立腺腺癌に著しく豊富である。膜状ＴＭＥＦＦ２は、疾患進行全体を通じて保持され、抗腫瘍療法の可能な標的として機能する。ＴＭＥＦＦ２は、プロテアーゼにより切断され、抗原の可溶性形態を生じることが既知である。本発明では、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に導かれる抗体を生成して、膜ＴＭＥＦＦ２への抗体結合を最大化し、得られた抗体の可溶性ＴＭＥＦＦ２形態への結合を生じる可能性を最小限にした。
【００９６】
本発明は、ＴＭＥＦＦ２の配列番号１１０の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、細胞によって内在化されない。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、非内在化抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、内在化抗ＴＭＥＦＦ２抗体と比較すると、ＴＭＥＦＦ２の内在化及び分解の欠如から生じる抗体エフェクター機能によって媒介される、発癌に対して改善された効果を有することを予想することができる。
【００９７】
「膜近位領域に結合する」とは、水素／重水素交換（Ｈ／Ｄ交換）を使用して同定される抗体エピトープ残基の９０％が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域内に存在することを意味する。エピトープ残基は、Ｈ／Ｄ交換を通じた重水素化レベルの少なくとも５％の違いで、試験抗体によって保護されるものである。例示的なそのような抗体は、本明細書に記載のＴＭＥＢ６７５、ＴＭＥＢ５７０、ＴＭＥＢ６７４、ＴＭＥＢ５６５、ＴＭＥＢ７６２、及びＴＭＥＢ７５７である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）又はＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）内でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する。残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）内に結合する例示的な抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ＴＭＥＢ５７０である。残基ＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）内に結合する例示的な抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ＴＭＥＢ６７５である。ＴＭＥＢ６７５変異体ＴＭＥＢ７６２及びＴＭＥＢ７５７もまた、残基ＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）内でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合することが予想される。
【００９９】
Ｈ／Ｄ交換アッセイでは、組み換えにより発現するＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤを、抗体の存在又は非存在下の重水素化水中で所定の時間にわたってインキュベートし、抗体によって保護されていない交換可能な水素原子での重水素組み込みが生じ、タンパク質のプロテアーゼ消化及びＬＣ−ＭＳを使用するペプチド断片の分析が続く。Ｈ／Ｄ交換アッセイは、既知のプロトコルを使用して実施することができる。例示的なプロトコルを実施例５に記載する。
【０１００】
本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、抗体又はその抗原結合断片が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合に関して、配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、を含む参照抗体と競合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１０１】
ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への試験抗体の結合に関する参照抗体との競合は、周知の方法を使用してインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識参照抗体の存在下での、ＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏタグ（商標）ＮＨＳ−エステル標識試験抗体の、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合は、ＥＬＩＳＡによって評価することができるか、又はＢｉａｃｏｒｅ分析若しくはフローサイトメトリーを使用して競合を実証することができる。試験抗体が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への参照抗体の結合を８５％以上、例えば、９０％以上、又は９５％以上阻害すると、試験抗体は、ＴＭＥＦＦ２への結合に関して参照抗体と競合する。
【０１０２】
本発明はまた、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２、
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３、
それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４、
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２、又は
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６、の重鎖相補性決定領域（heavy chain complementarity determining region 1、ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域（light chain complementarity determining region 1、ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明の単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、約０．４×１０−９Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合し、ＫＤが、室温でｐＨ４．５〜５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用して測定される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、約０．１×１０−１０Ｍ〜約０．４×１０−９ＭのＫＤでＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する。
【０１０５】
ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に対する抗体の親和性は、任意の好適な方法を使用する実験によって決定することができる。例示的な方法は、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００又はＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ、若しくは当業者に既知の競合的結合アッセイを利用する。抗体のＴＭＥＦＦ２に対する親和性についての測定値は、異なる条件（例えば、容量オスモル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定した場合に変動し得る。したがって、親和性及び他の結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、及びＫｏｆｆ）の測定は、典型的には、本明細書に記載の標準的な条件及び緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。例えばＢｉａｃｏｒｅ  ３０００又はＰｒｏｔｅＯｎを使用した親和性測定での内部エラー（標準偏差（standard deviation、ＳＤ）として測定されるもの）は典型的に、典型的な検出範囲内で測定した場合、５〜３３％の範囲内であり得ることが当業者には分かるであろう。したがって、ＫＤ値を指すとき、「約」という用語は、アッセイにおける典型的な標準偏差を反映する。例えば、ＫＤが１×１０−９Ｍの場合の典型的なＳＤは、±０．３３×１０−９Ｍ以下である。
【０１０６】
本発明はまた、ＶＨ３＿３−２３（配列番号５３）又はＶＨ１＿１−６９（配列番号５４）に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）フレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１０７】
本発明はまた、ＶＫＩ＿Ｌ１１（配列番号５５）又はＶＫＩＩＩＩ＿Ａ２７（配列番号５６）に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）フレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１０８】
本発明はまた、配列番号５３のＶＨ３＿３−２３及び配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１にそれぞれ由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１０９】
本発明はまた、配列番号５４のＶＨ１＿１−６９及び配列番号５６のＶＫＩＩＩ＿Ａ２７にそれぞれ由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１１０】
本発明はまた、配列番号５４のＶＨ１＿１−６９及び配列番号５５のＶＫＩ＿Ｌ１１にそれぞれ由来するＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークを含む、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１１１】
特定のフレームワーク又は生殖系列配列「に由来する」重鎖又は軽鎖可変領域を含む抗体は、本明細書で述べるトランスジェニックマウス、ラット、若しくはニワトリから、又はファージディスプレイライブラリからなどの、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる抗体を指す。生殖系列配列に由来する特定のフレームワークを含む抗体は、例えば自然発生する体細胞変異又は意図的な置換に起因する、その由来である配列と比較した際のアミノ酸の違いを含み得る。
【０１１２】
本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３９のポリヌクレオチドによってコードされ、ＶＬは、配列番号４２のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３２のＨＣ及び配列番号３５のＬＣを含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４６のポリヌクレオチドによってコードされ、ＶＬは、配列番号４９のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１１７】
本発明はまた、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０のポリヌクレオチドによってコードされ、ＶＬは、配列番号４３のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３３のＨＣ及び配列番号３６のＬＣを含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４７のポリヌクレオチドによってコードされ、ＬＣは、配列番号５０のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１２２】
本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４１のポリヌクレオチドによってコードされ、ＶＬは、配列番号４４のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３４のＨＣ及び配列番号３７のＬＣを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４８のポリヌクレオチドによってコードされ、ＬＣは、配列番号５１のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１２７】
本発明はまた、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０のポリヌクレオチドによってコードされ、ＶＬは、配列番号４５のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３３のＨＣ及び配列番号３８のＬＣを含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号４７のポリヌクレオチドによってコードされ、ＬＣは、配列番号５２のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１３２】
本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号９５のポリヌクレオチドによってコードされ、ＶＬは、配列番号９６のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９１のＨＣ及び配列番号９２のＬＣを含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号９７のポリヌクレオチドによってコードされ、ＬＣは、配列番号９８のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１３７】
本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号９９のポリヌクレオチドによってコードされ、ＶＬは、配列番号１００のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９３のＨＣ及び配列番号９４のＬＣを含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＨＣは、配列番号１０１のポリヌクレオチドによってコードされ、ＬＣは、配列番号１０２のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、多重特異性抗体である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性抗体である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、Ｔ細胞抗原に結合する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ３に結合する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＴＭＥＦＦ２二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ３イプシロンに結合する。
【０１４７】
本発明の例示的な抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＶＨ、ＶＬ、ＨＣＤＲ、ＬＣＤＲ、ＨＣ、及びＬＣ配列は、表５〜１２に示される。
【０１４８】
実施例で説明する実施形態は、一方が重鎖に由来し、一方が軽鎖に由来する可変ドメインの対を含むが、当業者であれば、代替的な実施形態が単一の重鎖又は軽鎖可変ドメインを含み得ることを認識するであろう。単一可変ドメインを使用して、ＴＭＥＦＦ２に結合することができる２ドメイン特異性抗原結合断片を形成することができる可変ドメインについて、スクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、国際公開第１９９２／０１０４７号に開示されている階層的二重コンビナトリアルアプローチ（hierarchical dual combinatorial approach）を使用したファージディスプレイスクリーニング法によって行うことができる。このアプローチでは、ＶＨ鎖又はＶＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを使用して、他方の鎖（ＶＬ又はＶＨ）をコードしているクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた二本鎖特異的抗原結合ドメインを既知の方法及び本明細書に記載されるものを使用してファージディスプレイ技術に従って選択する。したがって、個々のＶＨ及びＶＬポリペプチド鎖は、国際公開第１９９２／０１０４７号に開示の方法を使用して、加えて抗ＴＭＥＦＦ２抗体を同定するのに有用である。
【０１４９】
相同抗体
表９に示されるＶＨ又はＶＬアミノ酸配列を含む本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片の変異体は、本発明の範囲内である。例えば、変異体は、親抗体と比較すると、相同抗体が、ＴＭＥＦＦ２への匹敵する結合又は改善された安定性などの機能特性を保持しているか又は改善された機能特性を有する限り、ＶＨ及び／又はＶＬに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、配列同一性は、本発明のＶＨ又はＶＬアミノ酸配列に対して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であり得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本発明の相同抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、約０．４×１０−９Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合し、ＫＤが、室温でｐＨ４．５〜５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用して測定される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明の相同抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、約０．１×１０−１０Ｍ〜約０．４×１０−９ＭのＫＤでＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する。
【０１５２】
本発明はまた、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０１５３】
本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０１５４】
本発明はまた、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０１５５】
本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０１５６】
本発明はまた、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０１５７】
本発明はまた、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＨ、ＶＬ、又はＶＨ及びＶＬの両方が、所望により１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸置換を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に置換は全く存在しない。
【０１５８】
本発明はまた、配列番号２５、２６、２７、８７、又は８９のＶＨに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有するＶＨを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に上記配列番号からの配列の変異は全く存在しない。
【０１５９】
本発明はまた、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、又は９０のＶＬに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、ＣＤＲ内に上記配列番号からの配列の変異は全く存在しない。
【０１６０】
選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列のアラインメントは図１に示され、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列のアラインメントは図２に示される。ＶＨ及びＶＬ鎖は、各行の先頭の配列番号によって同定される。抗体間で異なる残基位置は、ＶＨ及び／又はＶＬにおいて置換可能な部位である。例えば、置換は、（配列番号２５に基づく付番の）配列番号２５、２７、８７、及び８９のＶＨにおける残基位置１４、２０、５４、５６、５９、７６、８２、８４、９３、１０７で行うことができる。同様に、配列番号２８、３０、８８、及び９０のＶＬにおける残基位置１、９５、及び１０７で置換を行ってもよい。行われ得る例示的な置換は、保存的アミノ酸置換、又は各抗ＴＭＥＦＦ２抗体における対応する残基位置に存在するアミノ酸残基による置換である。
【０１６１】
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一の位置の数の関数である（即ち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。
【０１６２】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ  ４：１１−１７（１９８８））を使用して、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．Ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））を使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びにギャップ重み（gap weight）１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、及び長さ重み（length weight）１、２、３、４、５、又は６を使用して、決定することができる。
【０１６３】
保存的修飾を有する抗体
本発明はまた、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列を含むＶＨと、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含むＶＬとを含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲ配列のうちの１つ又は２つ以上が、本明細書に記載の抗体（例えば、表５〜１２に示される抗体）に基づく特定のアミノ酸配列、又はその保存的修飾を含み、抗体が、親抗体の所望の機能特性を保持している、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、保存的修飾を有する抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、約０．４×１０−９Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合し、ＫＤが、室温でｐＨ４．５〜５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用して測定される。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、保存的修飾を有する抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片は、約０．１×１０−１０Ｍ〜約０．４×１０−９ＭのＫＤでＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する。
【０１６６】
本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２又はその抗原結合断片を提供する。
【０１６７】
本発明はまた、それぞれ配列番号配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２又はその抗原結合断片を提供する。
【０１６８】
本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２又はその抗原結合断片を提供する。
【０１６９】
本発明はまた、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２又はその抗原結合断片を提供する。
【０１７０】
本発明はまた、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、並びにそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２又はその抗原結合断片を提供する。
【０１７１】
本発明はまた、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、並びにそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１７２】
本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、並びにそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１７３】
本発明はまた、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、並びにそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１７４】
本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、並びにそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１７５】
本発明はまた、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、並びにそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１７６】
本発明はまた、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、並びにそれらの保存的修飾を含む、単離された抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１７７】
「保存的修飾」とは、アミノ酸修飾を含む抗体の結合特性に著しく影響を与えることも変化させることもないアミノ酸修飾を指す。保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、アラニンスキャニング変異誘発について以前に説明されているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ  ６４３：５５−６７、Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３５：１−２４）、ポリペプチド内のいずれの天然残基もアラニンで置換され得る。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は、例えばＰＣＲ突然変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）などの既知の方法によって行うことができる。あるいは、変異体のライブラリは、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン（例えば１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコドン）を使用して生成することもできる。結果として生じる抗体変異体は、それらの特性に関して、本明細書に記載のアッセイを使用して試験することができる。
【０１７８】
免疫コンジュゲート（Immunoconjugates）
「免疫コンジュゲート」は、１つ又は２つ以上の異種分子（複数可）とコンジュゲートさせた本発明の抗体を指す。
【０１７９】
本発明はまた、異種分子とコンジュゲートした本発明の単離された抗体又はその抗原結合断片を含む、免疫複合体を提供する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、異種分子は、検出可能な標識である。
【０１８１】
検出可能な標識にコンジュゲートした本発明の単離された抗体又はその抗原結合断片は、多様なサンプルにおけるＴＭＥＦＦ２の発現を評価するために使用することができる。検出可能な標識としては、本発明の単離された抗体又はその抗原結合断にコンジュゲートすると、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段を介してその後検出可能になる組成物が挙げられる。
【０１８２】
例示的な検出可能な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えば、一般的にＥＬＩＳＡにおいて使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンシレート（scintillates）、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体又はその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、及び比色基質が挙げられる。
【０１８３】
検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識が放射性同位体であるときなど、自発的にシグナルを発し得る。他の場合では、検出可能な標識は、外場によって刺激された後、シグナルを放出する。
【０１８４】
例示的な放射性同位体は、γ放出、オージェ放出、β放出、アルファ放出、又はポジトロン放出性の放射性同位体であり得る。例示的な放射性同位体としては、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１５Ｉｎ、１２３１、１２４１、１２５Ｉ、１３１１、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２６Ｒａ、２２５Ａｃ、及び２２７Ａｃが挙げられる。
【０１８５】
例示的な金属原子は、２０超の原子番号を有する金属、例えば、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユウロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バーケリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はローレンシウム原子である。
【０１８６】
好適な色素としては、例えば、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤマレイミド、又はＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などの任意の市販の色素が挙げられる。
【０１８７】
好適なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyante、ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジン、ローダミン、テキサスレッド、ＣｙＤｙｅｓ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（near infrared、ＮＩＲ）（７００〜９００ｎｍ）蛍光染料、並びにカルボシアニン及びアミノスチリル染料である。
【０１８８】
検出可能な標識とコンジュゲートした、本発明の単離された抗体又はその抗原結合断片は、造影剤として使用することができる。
【０１８９】
本発明の単離された抗体又はその抗原結合断片は、既知の方法を使用して検出可能な標識とコンジュゲートさせることができる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、キレート剤と複合体を形成している。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介して本発明の抗体又はその抗原結合断片とコンジュゲートする。
【０１９２】
検出可能な標識は、既知の方法を使用して、本発明の抗体又はその抗原結合断に、直接又は間接的に連結することができる。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ−スクシミジル−ベンゾエートの誘導体、ドデカボラート）、大環状及び非環式の両キレート剤のキレート部分、例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアナート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）、並びに他のキレート部分が挙げられる。好適なペプチドリンカーは周知である。
【０１９３】
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１９４】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、抗体が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する二重特異性抗体は、腫瘍細胞のＴ細胞媒介性殺傷の媒介に、より効果的であり得る。
【０１９５】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインとを含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、抗体が、ＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合に関して、配列番号２５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、を含む参照抗体と競合する、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、約０．４×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合し、ＫＤが、室温でｐＨ４．５〜５．０の酢酸緩衝液中の表面プラズモン共鳴を使用して測定される。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、約０．１×１０−１０Ｍ〜約０．４×１０−９ＭのＫＤでＴＭＥＦＦ２の膜近位領域に結合する。
【０１９８】
本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、第１のドメインが、
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２、
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３、
それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４、ｏ
それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２、又は
それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６、のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０１９９】
本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、第２のドメインが、
それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５、又は
それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３、のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２００】
本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、第１のドメインが、
配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬ、
配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬ、
配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬ、
配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬ、
配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬ、又は
配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬ、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２０１】
本発明はまた、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、第２のドメインが、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬ、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、第２のドメインは、配列番号５９のＶＨ及び配列番号１１１のＶＬを含む。
【０２０３】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号３５の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号７６の第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２０４】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２のＨＣ１、配列番号３５のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２０５】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２０６】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２０７】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２０８】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２０９】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２１０】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２１１】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号９２の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号７６の第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２１２】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２１３】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９３の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号９４の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号７６の第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２１４】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号９３のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０２１５】
操作及び修飾された抗体
本発明の抗体又はその抗原結合断片を更に操作して、親抗体と比較すると類似の又は変化した特性を有する修飾抗体を生成することができる。本発明の抗体では、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、定常領域、重鎖フレームワーク、軽鎖フレームワーク、又は６つのＣＤＲのうちのいずれか若しくは全てが操作されてもよい。
【０２１６】
本発明の抗体は、ＣＤＲグラフト化により操作されてもよい。本発明の抗体の１つ又は２つ以上のＣＤＲ配列を、異なるフレームワーク配列にグラフト化してもよい。ＣＤＲグラフト化は、既知の方法及び本明細書に記載の方法を使用して行うことができる。
【０２１７】
使用され得るフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は刊行されている参照文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメイン遺伝子に関する生殖系列ＤＮＡ及びコードタンパク質配列は、ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｗｗｗ．Ｉｍｇｔ．ｏｒｇに見出すことができる。本発明の抗体の既存のフレームワーク配列を置き換えるために使用することができるフレームワーク配列は、ＶＨ若しくはＶＬの全長、又はＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４の長さにわたって親可変ドメインに対して最も高い同一性パーセント（％）を示すものであってもよい。更に、好適なフレームワークは、更に、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ１及びＣＤＲ２の長さ、又は同一のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、及びＨＣＤＲ２の標準構造に基づいて選択され得る。好適なフレームワークは、既知の方法、例えば、米国特許第８，７４８，３５６号に記載のヒトフレームワーク適応又は米国特許第７，７０９，２２６号に記載の超ヒト化を使用して選択され得る。
【０２１８】
親抗体及び操作を受けた抗体のフレームワーク配列を、更に、例えば米国特許第６，１８０，３７０号に記載のとおり、復帰突然変異によって更に修飾して、生成される抗体の抗原への結合を回復及び／又は改善させることができる。親抗体又は操作を受けた抗体のフレームワーク配列を、更に、フレームワーク領域内の（あるいは１つ又は２つ以上のＣＤＲ領域内の）１つ又は２つ以上の残基を変異させることによって修飾して、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低減することもできる。このアプローチは「脱免疫」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００７００１４７９６号に更に詳述されている。
【０２１９】
本発明の抗体のＣＤＲ残基を変異させて、ＴＭＥＦＦ２及び／又はＣＤ３に対する抗体の親和性を調節することができる。
【０２２０】
本発明の抗体のＣＤＲ残基を変異させて、翻訳後修飾のリスクを最小化することができる。脱アミノ化（ＮＳ）、酸触媒加水分解（ＤＰ）、異性化（ＤＳ）、又は酸化（Ｗ）についての推定モチーフのアミノ酸残基を天然のアミノ酸のいずれかで置換して、当該モチーフの突然変異を誘発することができ、得られた抗体を、本明細書に記載の方法を使用して、その機能及び安定性について試験することができる。
【０２２１】
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的若しくは生物物理学的特性を改善するために修飾される本発明の抗体は、本発明の範囲内である。抗体の安定性は、分子内力及び分子間力の中でも特に、（１）固有の安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとの対合に影響するタンパク質／タンパク質界面相互作用、（３）極性残基及び帯電残基の埋没、（４）極性残基及び帯電残基の水素（Ｈ）結合ネットワーク、並びに（５）表面電荷及び極性残基の分布、を含む、多くの要因によって影響を受ける（Ｗｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０５：９８９−１０１０）。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構造に基づいて、又は場合によっては分子モデリングによって同定することができ、また、抗体の安定性に対する残基の効果は、同定された残基において変異を保有する変異体を生成及び評価することによって試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つには、示差走査熱量測定法（differential scanning calorimetry、ＤＳＣ）によって測定したときの熱転移中点温度（Ｔｍ）を高くするというものがある。一般に、タンパク質のＴｍは、その安定性と相関しており、溶液中でのアンフォールディング及び変性のしやすさ、並びにそのタンパク質がアンフォールディングする傾向に応じた分解プロセスとは逆相関する（Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｂｉｏｐｈａｒｍ  １３：３６−４６）。多数の研究で、ＤＳＣによって熱安定性として測定された配合物（formulations）の物理的安定性のランク付けと他の方法によって測定された物理的安定性との間に相関が見出されている（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉ  ５Ｅ８；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：３０７６−８９；Ｍａａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  １４０：１５５−６８；Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２１：１３５３−６１；Ｒｅｍｍｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １５：２００−８）。配合物の研究により、ＦａｂのＴｍは、対応するｍＡｂの長期物理的安定性と密接な関係があることが示唆されている。
【０２２２】
Ｃ末端リジン（C-terminal lysine、ＣＴＬ）は、注入された抗体から、血流中の内因性循環カルボキシペプチダーゼによって除去され得る（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０８：４０４−４１２）。製造中、米国特許出願公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり、細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、又はＥＤＴＡ−Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御することができる。抗体のＣＴＬ含量は、既知の方法を使用して測定することができる。
【０２２３】
本発明の抗体に対してＦｃ置換を行って、抗体エフェクター機能及び／又は薬物動態特性を調節することができる。従来の免疫機能では、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用の結果、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害、マスト細胞の脱顆粒、及び食作用から免疫調整性シグナル、例えば、リンパ球の増殖及び抗体の分泌の制御に及ぶ広範な応答が生じる。これら相互作用全てが、抗体又は免疫複合体のＦｃドメインの、細胞上の特殊な細胞表面受容体への結合を通して開始される。抗体及び免疫複合体によって誘発される細胞応答の多様性は、Ｆｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）の異種性から生じ、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、Ｆｃγ受容体を活性化し（即ち、免疫系の増強）、一方、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２Ｂ）は、阻害性Ｆｃγ受容体である（即ち、免疫系の減弱）。ＦｃＲｎ受容体への結合は、抗体の半減期を調節する。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、Ｆｃ領域に少なくとも１つの置換を含む。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、Ｆｃ領域に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の置換を含む。
【０２２６】
抗体半減期を調節するために置換され得るＦｃ位置。抗体の半減期を延長するために行うことができる例示的な単独又は組み合わせの置換は、置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａである。抗体の半減期を短縮するために行うことができる例示的な単独又は組み合わせの置換は、置換Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒである。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択される、少なくとも１つの置換をＦｃ領域に含む。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、抗体の活性化Ｆｃγ受容体（Fc recepter、ＦｃγＲ）への結合を低減する及び／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞障害（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞障害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）、若しくは貪食作用（antibody-dependent cell-mediated phagocytosis、ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低減する、少なくとも１つの置換をＦｃ領域に含む。
【０２２９】
ＦｃγＲを活性化しその後エフェクター機能を低減するために、抗体の結合を低減するために置換され得るＦｃ位置は、ＩｇＧ１における置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６−欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６−欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓである。
【０２３０】
ＩｇＧ４の安定性を高めるために、周知のＳ２２８Ｐ置換をＩｇＧ４抗体に行うことができる。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、Ｓ２２８Ｐ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、又はＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
【０２３４】
相同抗体、保存的修飾を有する抗体、並びに操作及び修飾されている抗体の生成方法
親抗体と比較してアミノ酸配列が変化している本発明の抗体は、標準的なクローニング及び発現技術を使用して生成され得る。例えば、部位特異的変異導入又はＰＣＲを介在させることによる変異導入を実施して変異を導入することができ、抗体結合又は他の所望の特性に対する影響を、周知の方法及び本明細書において実施例に記載されている方法を使用して評価することができる。
【０２３５】
抗体のアイソタイプ及びアロタイプ
本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプであり得る。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプのものである。
【０２４０】
治療用抗体の免疫原性は、注入反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮に関連している（Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：６０２−０８）。宿主において治療用抗体が免疫応答を誘導する程度は、抗体のアロタイプによって部分的に決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３−２１）。抗体のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の変異に関連する。表２は、選択ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アロタイプを示す。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、Ｇ２ｍ（ｎ）アロタイプである。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、Ｇ２ｍ（ｎ−）アロタイプである。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体発明は、Ｇ２Ｍ（ｎ）／（ｎ−）アロタイプである。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ｎＧ４ｍ（ａ）アロタイプである。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、Ｇ１ｍ（１７）アロタイプである。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプである。
【０２４７】
【表２】
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【０２４８】
抗イディオタイプ抗体
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０２４９】
本発明はまた、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０２５０】
本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０２５１】
本発明はまた、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０２５２】
本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０２５３】
本発明はまた、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０２５４】
本発明はまた、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含む、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０２５５】
抗イディオタイプ（idiotypic、Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原決定基（例えば、パラトープ又はＣＤＲ）を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗原をブロッキングするものであっても、しないものであってもよい。抗原を遮断するＩｄを使用して、サンプル中の遊離抗体（例えば、本明細書に記載の本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体）を検出することができる。ブロッキングしないＩｄを使用して、サンプル中の全抗体（遊離しているもの、抗原に一部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの）を検出することができる。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されている抗体で動物を免疫することによって調製することができる。
【０２５６】
また、更に別の動物で免疫応答を誘導する免疫原として抗Ｉｄ抗体を使用して、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生することもできる。抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元のｍＡｂとエピトープが同一であり得る。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。抗Ｉｄ抗体は、本明細書の他の箇所に記載のものなどの任意の好適な技術によって変動（それにより、抗Ｉｄ抗体変異体を産生する）、及び／又は誘導することができる。
【０２５７】
本発明の単一特異性抗体の生成
いくつかの実施形態では、抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ヒトである。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ヒト化されている。
【０２５９】
本発明の単一特異性抗体は、様々な技術を使用して生成することができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５のハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を生成することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、又はハムスター、ラット、若しくはサルなどの他の宿主動物を、ＴＭＥＦＦ２の膜近位ドメインなどのＴＭＥＦＦ２のヒト、チンパンジー、又はマカクのＴＭＥＦＦ２又はＴＭＥＦＦ２の断片で免疫し、続いて標準的な方法を使用して、免疫した動物の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から発生したコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、及び抗原親和性などの所望の特性を有する抗体の産生についてスクリーニングする。
【０２６０】
様々な宿主動物を使用して、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体を産生することができる。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、マウス抗ヒトＴＭＥＦＦ２抗体を生成することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウス及び他の非ヒト動物において生成された抗体を、よりヒトに近い配列を生成するための様々な技術を使用してヒト化することもできる。
【０２６１】
ヒトアクセプターフレームワークの選別を含む例示的なヒト化技術は既知であり、ＣＤＲグラフト化（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲグラフト化（米国特許第６，８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：４８９−４９９）、特異性決定残基のリサーフェシング（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適応（米国特許第８，７４８，３５６）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）を含む。これらの方法では、ＣＤＲの長さの類似性若しくはカノニカル構造の同一性、又はこれらの組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づき選択され得るヒトフレームワークに親抗体のＣＤＲを移植する。
【０２６２】
ヒト化抗体は、国際公開第１０９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号に記載されているものなどの技術によって、結合親和性を保存するように変化させたフレームワーク支持残基を組み込むことによって（復帰変異）、又は任意のＣＤＲに変異を導入して、例えば抗体の親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択性又は親和性を改善するように更に最適化させてもよい。
【０２６３】
自身のゲノムにヒト免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）遺伝子座を担持する、マウス、ラット、又はニワトリなどのトランスジェニック動物を使用して、標的タンパク質に対するヒト抗体を生成することができ、これらは例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第９９／４５９６２号、国際公開第２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８号、及び同第１９９０／０４０３６号、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−９、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−９５、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５−９３、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３−１３２６、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４５−８５１、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：１４６−１５６、Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：１２３６−１２４３、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ（１９９７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：４５５−４５８に記載されている。そのような動物の内在的な免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組み換えを使用して、導入染色体（transchromosome）を使用して、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｗｗｗ．Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ．ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｗｗｗ．Ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｗｗｗ．Ｏｍｔｉｎｃ．ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｗｗｗ．Ｋｙｍａｂ．ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｗｗｗ．Ｔｒｉａｎｎｉ．ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｗｗｗ．Ａｂｌｅｘｉｓ．ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を使用して、選択された抗原に導かれるヒト抗体を提供するべく取り組んでいる場合がある。
【０２６４】
ヒト抗体はファージディスプレイライブラリから選択することができ、ここでファージは、ヒト免疫グロブリン、あるいはＦａｂ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は非対合若しくは対合抗体可変領域などのそれらの部分を発現するよう操作されている（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６、Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２５４：６７−８４、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４、Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）ＰＩＴＡＳ（ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２７：３８１、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１）。本発明の抗体は、例えば、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５−９６及び国際公開第０９／０８５４６２号）に記載のバクテリオファージｐＩＸコートタンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリから単離され得る。ライブラリを、ヒト及び／又はカニクイザルＴＭＥＦＦ２又はＣＤ３のファージ結合についてスクリーニングして、得られた陽性クローンの特性評価を更に行い、Ｆａｂをクローンの溶解物から単離し、完全長のＩｇＧとして発現させることができる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、及び同第６，５９３，０８１号に記載されている。
【０２６５】
免疫原性抗原の調製及びモノクローナル抗体の産生は、組み換えタンパク質産生などの任意の好適な技術を使用して実施することができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あるいは全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、抗原は、当該抗原又はその一部分をコードしている核酸から動物の体内で新たに形成されてもよい。
【０２６６】
本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体の生成
本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、本明細書の単離されたＴＭＥＦＦ２結合ＶＨ／ＶＬドメインを、本明細書に記載のもの及び公に入手可能なものを含む任意のＣＤ３結合ＶＨ／ＶＬドメインと、組み合わせることによって生成することができる。使用され得る例示的なＣＤ３結合ＶＨ／ＶＬドメインは、本明細書に記載の抗体ＣＤ３Ｂ２１９及びＣＤ３Ｂ３７６のものである。使用され得る例示的なＴＭＥＦＦ２結合ＶＨ／ＶＬドメインは、抗体ＴＭＥＢ６７５、ＴＭＥＢ５７０、ＴＭＥＢ６７４、ＴＭＥＢ５６５、ＴＭＥＢ７６２、及びＴＭＥＢ７５７の抗体である。生成された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３への結合について、並びにＴＭＥＦＦ２発現細胞（例えば、ＬＮＣａＰ）のＴ細胞媒介性殺傷などの所望の機能特性について試験することができる。
【０２６７】
本発明の二重特異性抗体は、例えば、２つの単一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して、インビトロで、無細胞環境下又は共発現使用下のいずれかで、異なる特異性を有する２つの抗体半分子の、好ましくヘテロ二量体を形成する各半分子の重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することによって生成することができる。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離−会合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は低減する。親単一特異性抗体のうちの１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離−会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体形成よりヘテロ二量体形成を好むように操作されてもよい。得られた産物は、各々異なるエピトープ、即ち、ＴＭＥＦＦ２上のエピトープ及びＣＤ３上のエピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。例えば、本発明の二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載のＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）技術を使用して生成することができる。ＩｇＧ１抗体の場合、一方の重鎖における変異Ｆ４０５Ｌ及び他方の重鎖におけるＫ４０９Ｒを使用することができる。ＩｇＧ２抗体では、Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換を有する野生型ＩｇＧ２及びＩｇＧ２抗体を使用してもよい。ＩｇＧ４抗体では、Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換を有する野生型ＩｇＧ４及びＩｇＧ４抗体を使用してもよい。二重特異性抗体を生成するために、第１の単一特異性二価抗体及び第２の単一特異性二価抗体を、Ｆｃ領域に前述の変異を有するように操作し、ヒンジ領域でシステインがジスルフィド結合異性化を受けることができる十分な還元条件下で、抗体を一緒にインキュベートし、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine、２−ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（dithioerythritol、ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（tris(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、及びβ−メルカプトエタノールである。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを使用することができる。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプであり、配列番号８４の野生型ＩｇＧ１と比較すると、第１の重鎖（ＨＣ１）にＦ４０５Ｌ置換及び第２の重鎖（ＨＣ２）にＫ４０９Ｒ置換を含む。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプであり、配列番号８５の野生型ＩｇＧ４と比較すると、ＨＣ２にＦ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ置換を含む。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプであり、配列番号８５の野生型ＩｇＧ４と比較すると、ＨＣ１にＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換、並びにＨＣ２にＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を含む。
【０２７１】
配列番号８４  野生型ＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ
ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ
ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２７２】
配列番号８５  野生型ＩｇＧ４
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ
ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹ
ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ
ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧ
ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０２７３】
配列番号１０３  ＩｇＧ１  Ｆ４０５Ｌ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ
ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ
ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２７４】
配列番号１０９  ＩｇＧ１  Ｋ４０９Ｒ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ
ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ
ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２７５】
配列番号１０４  ＩｇＧ４  Ｆ４０５Ｌ／Ｒ４０９Ｋ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ
ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹ
ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ
ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧ
ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０２７６】
二重特異性抗体はまた、Ｋｎｏｂ−ｉｎ−Ｈｏｌｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的適合（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ−ｍａｔｃｈｅｄ）（Ｃｈｕｇａｉ，Ａｍｇｅｎ，ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｏｎｃｏｍｅｄ）、ＬＵＺ−Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｔｒａｎｄ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、及びＢｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）などのデザインを使用して生成することもできる。
【０２７７】
「ノブ−イン−ホール」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照されたい）において、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインの界面を形成する選択アミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するために、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置に変異を導入され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換対は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）。
【０２７８】
Ｆａｂアーム交換のプロモータへの「ノブ−イン−ホール」戦略の利用に加えて、ＣｒｏｓｓＭＡｂ技術は、半アームのうちの１つにＣＨ１／ＣＬドメイン交換を利用して、得られる二重特異性抗体の正しい軽鎖の対合を保証する（例えば、米国特許第８，２４２，２４７号を参照されたい）。
【０２７９】
他の交差法を使用して、二重特異性抗体の重鎖と軽鎖の間又は重鎖内で、一方又は両方のアームにおいて、可変又は定常、又は両ドメインを交換することによって、本発明の完全長二重特異性抗体を生成してもよい。これらの交換としては、例えば、国際特許公開第２００９／０８０２５４号、同第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０１８３８６号、及び同第２００９／０８０２５２号に記載されるＶＨ−ＣＨ１とＶＬ−ＣＬ、ＶＨとＶＬ、ＣＨ３とＣＬ、及びＣＨ３とＣＨ１が挙げられる。
【０２８０】
米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されるような他の戦略、例えば、あるＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体化の促進を使用されてもよい。他の手法では、ヘテロ二量体化は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されているように、以下の置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表す）により促進することができる。
【０２８１】
ＳＥＥＤｂｏｄｙ技術を利用して、本発明の二重特異性抗体を生成してもよい。ＳＥＥＤｂｏｄｙは、それらの定常ドメインにおいて、米国特許出願第２００７／０２８７１７０号に記載されるように、ヘテロ二量体化を促進するためにＩｇＡ残基で置換された選択ＩｇＧ残基を有する。
【０２８２】
変異は、通常、標準的な方法を使用して、抗体の定常ドメインなどの分子に対してＤＮＡレベルで行われる。
【０２８３】
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書で提供された可変ドメインセグメントをコード可能な単離されたポリヌクレオチドは、抗体又は抗原結合断片を産生する同一の又は異なるベクターに含まれてもよい。ポリヌクレオチドは、相補的デオキシ核酸（complementary deoxynucleic acid、ｃＤＮＡ）であってもよく、好適な宿主において発現するためにコドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、周知の技術である。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（及びポリヌクレオチドがコードするペプチド）は、リーダー配列を含む。当技術分野において既知の任意のリーダー配列を利用することができる。リーダー配列は、制限部位又は翻訳開始部位を含み得る。
【０２８５】
本発明はまた、本発明の抗体のＶＨ、本発明の抗体のＶＬ、本発明の抗体の重鎖、又は本発明の抗体の軽鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２８６】
本発明はまた、配列番号２５、２６、２７、８７、又は８９のＶＨをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２８７】
本発明はまた、配列番号２８、２９、３０、３１、８８、又は９０のＶＬをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２８８】
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体のＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、又はＬＣ２をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２８９】
本発明はまた、配列番号３２、３３、３４、９１、又は９３のＨＣ１をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２９０】
本発明はまた、配列番号３５、３６、３７、３８、９２、又は９４のＬＣ１をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２９１】
本発明はまた、配列番号７６又は７８のＨＣ２をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２９２】
本発明はまた、配列番号７７又は７９のＬＣ２をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２９３】
本発明はまた、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、又は１０２のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２９４】
本発明はまた、配列番号１０５、１０６、８０、８１、１０７、１０８、８２、及び８３のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２９５】
本発明の抗体のＶＨ若しくはＶＬ若しくはその抗原結合断片、又は本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、意図される宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を可能にする、プロモータ又はエンハンサーなどの１つ又は２つ以上の制御エレメントに作動可能に連結させることができる。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってもよい。
【０２９６】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってもよい。例えば、所望により定常領域に連結されている本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入する。軽鎖及び／又は重鎖は、同じか又は異なる発現ベクターにクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードしているＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター中のコントロール配列に操作可能に連結することができる。そのようなコントロール配列としては、シグナル配列、プロモータ（例えば、天然に付随する又は異種のプロモータ）、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列が挙げられ、抗体を発現するように選択された宿主細胞と適合するように選択される。ベクターを適切な宿主に組み込み、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を高レベルで発現させるのに好適な条件下で宿主を維持する。
【０２９７】
本説明の範囲内の組み換え発現ベクターは、好適な調節エレメントに操作可能に連結することができる、抗体のＶＨ、ＶＬ、ＨＣ、又はＬＣなどの少なくとも１つの組み換えタンパク質をコードする合成又はｃＤＮＡ由来の核酸断片を含む。そのような調節エレメントには、転写プロモータ、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクター、特に、哺乳類の発現ベクターはまた、１つ又は２つ以上の非転写エレメント、例えば、複製の起点、発現される遺伝子に連結された好適なプロモータ及びエンハンサー、他の５’又は３’フランキング非転写配列、５’又は３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、又は転写終了配列を含んでもよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた包含されてもよい。
【０２９８】
脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳制御配列は、ウイルス資源により提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，３  Ｍｏｌ．ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）に記載のように構築することができる。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片のコード配列は、強力な構成的プロモータ、例えば、下記遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxanthine phosphoribosyl transferase、ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンなどのためのプロモータの制御下に置かれる。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で恒常的に機能し、記載された実施形態での使用に適している。そのようなウイルスプロモータには、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus、ＣＭＶ）中間初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳癌ウイルス（Mouse Mammary Tumor Virus、ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus、ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（long terminal repeats、ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片のコード配列は、メタロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、ドキシサイクリン誘導性プロモータなどの誘導性プロモータ、プロテインキナーゼＲ  ２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素、ＭＸ遺伝子、ＡＤＡＲ１などの１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（interferon-stimulated response elements、ＩＳＲＥ）を含むプロモータの制御下に置かれる。
【０３００】
本明細書に記載されたベクターは、１つ又は２つ以上の配列内リボソーム進入部位（Internal Ribosome Entry Site、ＩＲＥＳ）を含んでもよい。ＩＲＥＳ配列の融合ベクター内への包含は、一部のタンパク質の発現を増強させるのに有益であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含み、その部位は、前述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターの成分は、近接して連結されてもよいか、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（即ち、ＯＲＦ間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよいか、又は別の方法で位置付けられてもよい。調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフはまた、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
【０３０１】
ベクターは、当技術分野において周知の選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーには、陽性及び陰性選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子（例えば、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、テトラサイクリン抵抗性遺伝子、ペニシリン抵抗性遺伝子）、グルタミン酸合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ−ＴＫ、ＨＳＶ−ＴＫ誘導体、又は６−メチルプリン選択用の細菌のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（Ｇａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，７Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７３８−１７４３（２０００）が挙げられる。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
【０３０２】
使用され得る例示的なベクターは、細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ）並びにｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）である。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５のＶＨ及び／又は配列番号２８のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３９のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号４２のポリヌクレオチドを含む。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６のＶＨ、及び／又は配列番号２９のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４０のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号４３のポリヌクレオチドを含む。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２７のＶＨ及び／又は配列番号３０のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４１のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号４４のポリヌクレオチドを含む。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６のＶＨ、及び／又は配列番号３１のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４０のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号４５のポリヌクレオチドを含む。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８７のＶＨ、及び／又は配列番号８８のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９５のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号９６のポリヌクレオチドを含む。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８９のＶＨ、及び／又は配列番号９０のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９９のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号１００のポリヌクレオチドを含む。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６６のＶＨ、及び／又は配列番号６７のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１０５のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号１０６のポリヌクレオチドを含む。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号７４のＶＨ、及び／又は配列番号７５のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１０７のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号１０８のポリヌクレオチドを含む。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３２のＨＣ、及び／又は配列番号３５のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号４９のポリヌクレオチドを含む。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３３のＨＣ、及び／又は配列番号３６のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４７のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号５０のポリヌクレオチドを含む。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３４のＨＣ、及び／又は配列番号３７のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４８のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号５１のポリヌクレオチドを含む。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３３のＨＣ、及び／又は配列番号３８のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号４７のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号５２のポリヌクレオチドを含む。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９１のＶＨ、及び／又は配列番号９２のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９７のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号９８のポリヌクレオチドを含む。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号９３のＶＨ、及び／又は配列番号９４のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１０１のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号１０２のポリヌクレオチドを含む。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号７６のＨＣ、及び／又は配列番号７７のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８０のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号８１のポリヌクレオチドを含む。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号７８のＨＣ、及び／又は配列番号７９のＬＣをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号８２のポリヌクレオチド、及び／又は配列番号８３のポリヌクレオチドを含む。
【０３３５】
本明細書に記載されたベクターを使用して、記載された抗体又は抗原結合断片をコードする遺伝子により種々の細胞を形質転換することができる。例えば、ベクターを使用して、抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は抗原結合断片を産生する細胞を生成することができる。したがって、本発明はまた、本発明の１つ又は２つ以上のベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【０３３６】
外来遺伝子を細胞に導入する技術は既知であり、本発明の組み換え細胞を構築するために使用することができる。
【０３３７】
「宿主細胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細胞株も指すことを意図すると理解される。変異又は環境の影響のいずれかに起因して、後続世代においてある特定の修飾が生じ得るので、そのような後代は親細胞に同一ではない場合があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然含まれる。
【０３３８】
そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってもよい。原核宿主細胞の例は、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）などの桿菌、並びにサルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、及び様々なシュードモナス属（Pseudomonas）の種などの他の腸内細菌科のものである。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス属（Saccharomyces）（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（S.cerevisiae））及びピキア属（Pichia）である。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞としては、不死化細胞株（例えばハイブリドーマ）又は骨髄腫細胞株（例えばＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株）が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するもの、例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ２ＳＶ（Ｌｏｎｚａ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４が挙げられる。
【０３３９】
本明細書に記載された発現ベクターにより形質転換された細胞は、本明細書に記載された抗体又は抗原結合断片の組み換え発現について選択され、又はスクリーニングされてもよい。組み換え陽性細胞は、タンパク質修飾又は変化させた翻訳後修飾により、所望の表現型、例えば、高レベルの発現、向上した増殖特性、又は所望の生化学的特性を有するタンパク質を生成する能力を示すサブクローンについて、増殖され、スクリーニングされる。これらの表現型は、所与のサブクローンの本来の特性又は変異によるものであり得る。変異は、化学物質、ＵＶ波長光、照射、ウイルス、挿入変異源、ＤＮＡミスマッチ修復の阻害、又はそのような方法の組み合わせの使用を通じて影響され得る。
【０３４０】
本発明はまた、本発明の抗体を産生する方法であって、抗体が発現する条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生された抗体を回収することと、を含む方法を提供する。抗体を作製し、それを精製する方法は、当該技術分野において周知である。合成されたら（化学的に又は組み換えによって）、抗体全体、その二量体、個々の軽鎖及び／若しくは重鎖、又はＶＨ及び／若しくはＶＬなどの他の抗体断片を、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動などの標準的な手順（概して、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照）に従って精製することができる。対象抗体は、実質的に純粋、例えば、少なくとも純度約８０％〜８５％、少なくとも純度約８５％〜９０％、少なくとも純度約９０％〜９５％、又は少なくとも約９８％〜９９％、又はそれを超える純度であり得、例えば、対象抗体以外の細胞残屑、巨大分子などの夾雑物を含まない。
【０３４１】
本発明のポリヌクレオチド配列は、標準的な分子生物学的方法を使用してベクターに組み込むことができる。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を使用して行われる。
【０３４２】
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体を産生する方法であって、
当該抗体のＶＨをコードしている第１のポリヌクレオチド及び当該抗体のＶＬをコードしている第２のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことと、
宿主細胞を当該発現ベクターで形質転換することと、
当該ＶＬ及び当該ＶＨが発現し、抗体を形成する条件下で、培養培地中で当該宿主細胞を培養することと、
当該宿主細胞又は当該培養培地から抗体を回収することと、
を含む、方法もまた提供する。
【０３４３】
医薬組成物／投与
本発明は、本発明の抗体及び医薬的許容される担体を含む医薬組成物もまた提供する。治療用途では、本発明の抗体は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効な量の抗体を含む医薬組成物として調製することができる。「担体」は、本発明の抗体と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってもよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用してもよい。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含み得る。そのような医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（ヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ６９１−１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８−９８９を参照されたい。
【０３４４】
本発明の抗体の投与方法は、当該技術分野において周知であるように、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若しくは皮下、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）、又は当業者に理解される他の手段などの任意の好適な経路であり得る。
【０３４５】
本発明の抗体はまた、癌などの疾患を発症するリスクを低減するために、予防的に投与され得る。
【０３４６】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水と、約１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの本発明の抗体と、を含むように調製することができる。
【０３４７】
抗ＴＭＥＦＦ２抗体及び二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を使用する方法
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療する方法であって、治療に有効な量の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を対象に投与して、ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法を提供する。
【０３４８】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療を必要とする対象においてＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療する方法であって、治療に有効な量の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又はその抗原結合断片を対象に投与して、ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療することを含む、方法を提供する。
【０３４９】
前立腺癌の発症には、複数の遺伝子が関与している。前立腺癌の発症及び進行に関与し、したがって新しい抗前立腺癌療法の有望な標的であるタンパク質のうちの１つは、ＥＧＦ様及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜タンパク質（ＴＭＥＦＦ２）である。ＴＭＥＦＦ２は、２つのフォリスタチン様（follistatin-like、ＦＳ）ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、膜貫通（transmembrane、ＴＭ）ドメイン、及び短細胞質尾部で構成されているＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＭＥＦＦ２タンパク質の最も高い発現は、脳及び前立腺の２つの器官で検出された（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ｈｏｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ＴＭＥＦＦ２の高い発現はまた、前立腺癌細胞株及び臨床サンプルにも見出され（Ｇｌｙｎｎｅ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１、Ｇｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．２００２、Ａｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、ＴＭＥＦＦ２が前立腺癌の進行において重要な役割を果たすことを示している。Ｔｍｅｆｆ２遺伝子の発現は、アンドロゲン受容体の制御下にある。多数のアンドロゲン依存性癌患者は、高レベルのＴＭＥＦＦ２  ｍＲＮＡを呈した。
【０３５０】
したがって、抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、前立腺癌の診断、予後、又は治療のための重要なツールになる可能性を有し得る。
【０３５１】
「癌」は、病理学的な種類又は侵襲性の段階に関係なく、全ての種類の癌性成長又は発癌プロセス、転移組織又は悪性腫瘍形質転換細胞、組織、又は器官を含むことを意味する。例示的なＴＭＥＦＦ陽性癌としては、前立腺癌が挙げられる。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、前立腺癌は、腺癌である。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、前立腺癌は、転移性前立腺癌である。いくつかの実施形態では、前立腺癌は、直腸、リンパ節、若しくは骨、又はそれらの任意の組み合わせに転移している。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、前立腺癌は、再発性又は難治性前立腺癌である。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌である。
【０３５６】
いくつかの実施形態では、前立腺癌は、アンドロゲン遮断療法に感応性である。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、前立腺癌は、アンドロゲン遮断療法に感応性ではない。
【０３５８】
本発明はまた、治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３５９】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６０】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２前立腺癌の治療に使用するための、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６１】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２陽性癌を治療するための医薬品を製造するための、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６２】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２の第１の重鎖（ＨＣ１）、配列番号３５の第１の軽鎖（ＬＣ１）、配列番号７６の第２の重鎖（ＨＣ２）、及び配列番号７７の第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６３】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３２のＨＣ１、配列番号３５のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６４】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６５】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１９、２１、及び２３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３６のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６６】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６７】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１４、１７、１８、２０、及び２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３４のＨＣ１、配列番号３７のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６８】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３６９】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１１、１３、１６、１８、２０、及び２２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号３３のＨＣ１、配列番号３８のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３７０】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３７１】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９１のＨＣ１、配列番号９２のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３７２】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９３のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７６のＨＣ２、及び配列番号７７のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３７３】
本発明はまた、前立腺癌などのＴＭＥＦＦ２陽性癌の治療に使用するための単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体が、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含み、
第１のドメインが、それぞれ配列番号１０、１２、１５、１８、２０、及び８６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、第２のドメインが、それぞれ配列番号６８、６９、７０、７１、７２、及び７３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含み、かつ／又は
二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片が、配列番号９３のＨＣ１、配列番号９４のＬＣ１、配列番号７８のＨＣ２、及び配列番号７９のＬＣ２を含む、単離された二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０３７４】
本発明の抗体は、第２の治療剤と併用して投与され得る。
【０３７５】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、手術、化学療法、アンドロゲン遮断療法若しくは放射線、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０３７６】
キット
本発明はまた、本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体又は二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットを提供する。キットは、治療的使用のために、又は診断キットとして使用することができる。キットを使用して、サンプル中でのＴＭＥＦＦ２、ＣＤ３、又はＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３の存在を検出することができる。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、キットは、本発明の抗体と、抗体を検出するための試薬とを含む。キットは、使用説明書と、他の試薬、例えば、標識、治療剤、又は抗体を標識若しくは治療剤、又は放射線防護組成物にキレート化する、ないしは別の方法でカップリングするのに有用な剤と、投与するために抗体を調製するためのデバイス又は他の材料と、医薬的に許容される担体と、対象に投与するためのデバイス又は他の材料とを含む、１つ又は２つ以上の他の構成要素を含み得る。
【０３７８】
いくつかの実施形態では、キットは、容器内の本発明の抗体と、キットの使用説明書とを含む。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、キットにおける抗体は標識されている。
【０３８０】
本発明はまた、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体を含む、キットを提供する。
【０３８１】
本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体を含む、キットを提供する。
【０３８２】
本発明はまた、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体を含む、キットを提供する。
【０３８３】
本発明はまた、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体を含む、キットを提供する。
【０３８４】
本発明はまた、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体を含む、キットを提供する。
【０３８５】
本発明はまた、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含む抗ＴＭＥＦＦ２抗体を含む、キットを提供する。
【０３８６】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３８７】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号２５のＶＨ及び配列番号２８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３８８】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３８９】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号２９のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３９０】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３９１】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号２７のＶＨ及び配列番号３０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３９２】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３９３】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号２６のＶＨ及び配列番号３１のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３９４】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３９５】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号８７のＶＨ及び配列番号８８のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３９６】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３９７】
本発明はまた、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインと、ＣＤ３に結合する第２のドメインと、を含む二重特異性抗ＴＭＥＥＦ２／抗ＣＤ３抗体を含む、キットであって、第１のドメインが、配列番号８９のＶＨ及び配列番号９０のＶＬを含み、第２のドメインが、配列番号７４のＶＨ及び配列番号７５のＶＬを含む、キットを提供する。
【０３９８】
ＴＭＥＦＦ２又はＣＤ３を検出する方法
本発明はまた、サンプル中のＴＭＥＦＦ２を検出する方法であって、サンプルを得ることと、サンプルを本発明の抗ＴＭＥＦＦ２抗体と接触させることと、サンプル中のＴＭＥＦＦ２に結合した抗体を検出することと、を含む、方法を提供する。
【０３９９】
本発明はまた、サンプル中のＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３を検出する方法であって、サンプルを得ることと、サンプルを、ＴＭＥＦＦ２に結合する第１のドメインとＣＤ３に結合する第２のドメインとを含む、本発明の二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３抗体と接触させることと、サンプル中のＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３に結合した抗体を検出することと、を含む、方法を提供する。
【０４００】
いくつかの実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に会合していない細胞（即ち、遊離細胞）、組織（例えば、外科的に切除された腫瘍組織、穿刺吸引を含む生検材料）、組織プレパラートなどに由来し得る。
【０４０１】
ＴＭＥＦＦ２、又はＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３に結合した本明細書に記載の本発明の抗体は、既知の方法を使用して検出することができる。例示的な方法としては、蛍光若しくは化学発光標識、又は放射線標識を使用して抗体を直接標識すること、あるいは本発明の抗体に、ビオチン、酵素、又はエピトープタグなどの容易に検出可能な部分を結合させることが挙げられる。例示的な標識及び部分は、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びベータガラクトシダーゼ、ポリ−ヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料である。
【０４０２】
本発明の抗体を多様なアッセイに使用して、サンプル中のＴＭＥＦＦ２、又はＴＭＥＦＦ２及びＣＤ３を検出することができる。例示的なアッセイは、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化学発光（electrochemiluminescence、ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）、又はＥＬＩＳＡアッセイである。
【０４０３】
次に、本発明を以下の特定の非限定的な実施例を参照して説明する。
【０４０４】
実施例１：抗原の生成
ヒト細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）ＴＭＥＦＦ２は、ＵｎｉＰｒｏｔ受諾＃Ｑ９ＵＩＫ５配列に基づいて産生された。ＥＣＤ構築物は、Ｃ末端に６Ｘ  Ｈｉｓタグ及びＡｖｉタグ配列を有するように設計した（構築物ＴＭＥＷ１、配列番号６）。ＦＳ２及びＥＧＦドメイン（アミノ酸１５１〜３２０を含む構築物は、６Ｘ  Ｈｉｓ−ｔａｇ及びａｖｉｔａｇ配列を有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合体として設計した（構築物ＴＭＥＷ７、配列番号７）。ＴＭＥＦＦ２膜近位ドメイン（残基２３０〜３２０）を含む構築物は、６ｘＨｉｓタグを有する（構築物ＴＭＥＷ１９、配列番号８）か、又はＨｉｓ−ｔａｇを有するラットＩｇＧ１  Ｆｃに融合させて（構築物ＴＭＥＷ２０、配列番号９）設計した。ＴＭＥＦＦ２の残基２３０〜３２０は、ＴＭＥＦＦ２の残基２６１〜３０１に及ぶＥＧＦドメインを含む。ヒトＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤ発現構築物を、製造業者のプロトコルに従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、ＨＥＫ２９３由来細胞、Ｅｘｐｉ２９３（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に一過的にトランスフェクトした。採取前にオービタルシェーカーで、８％のＣＯ２を用いて３７℃で５日間細胞をインキュベートした。発現した細胞を遠心分離により除去し、ｈｉｓタグを有する可溶性ＴＭＥＦＦ２タンパク質を、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する固定化金属親和性クロマトグラフィー、続いてＤｕｂｅｌｃｃｏのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．２（１ｘＤＰＢＳ）中でのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００分取サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、培地から精製した。生成した抗原のアミノ酸配列を、表３に示す。
【０４０５】
【表３】
2021524255.tif 000005
【０４０６】
実施例２．抗ＴＭＥＦＦ２抗体の生成
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックラット（ＯｍｎｉＲａｔ（登録商用））を使用する、抗体の生成ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、完全なヒトＩｇＬ座（Ｊκ−Ｃκに連結された１２個のＶκ及びＪλ−Ｃλに連結された１６個のＶλ）を一緒に有する、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座（ラットＣＨ遺伝子座に連結した、天然形態の２２個のヒトＶＨ、全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む）を含む。（例えば、Ｏｓｂｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０（４）：１４８１−１４９０を参照されたい）。したがって、ラットは、ラット免疫グロブリンの低減した発現を呈し、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子は、免疫化に応答して、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、完全長ヒト可変領域を有する高親和性キメラヒト／ラットＩｇＧモノクローナル抗体を生成した。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用、並びにそのようなラットによって担持されるゲノム修飾は、ＷＯ１４／０９３９０８に記載されている。
【０４０７】
ＯｍｎｉＲａｔｓをヒトＴＭＥＦＦ２構築物ＦＳ２−ＥＧＦ−Ｔｅｖ−ＨＳＡ（Ｃ３４Ｓ）−Ｈｉｓ−Ａｖｉｔａｇ（ＴＭＥＷ７、配列番号７）で免疫し、構築物ｓｐＴＭＥＦＦ２（２３０〜３２０）Ｇ３Ｓ−ｒａｔＩｇＧ１Ｆｃ（ＴＭＥＷ２０、配列番号９）でブーストした。８９日の免疫レジメンに続いて、ラットからリンパ節を採取し、ハイブリドーマを生成するために使用し、ＥＬＩＳＡ及び／又はＳＰＡＲＣＬ（Ｓｐａｔｉａｌ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によって、ヒトＴＭＥＦＦ２−ＦＦＬ  ＥＣＤ−ＨＩＳ−Ａｖｉｔａｇ（ＴＭＥＷ１）タンパク質への結合について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。ＴＭＥＦＦ  ＥＣＤ、ＦＳ２−ＥＧＦ、又はＥＧＦドメインのみのＴＭＥＦＦ２への結合の、二次ＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣＬスクリーニングのために、いくつかの上清を選択した。スクリーニング結果に基づいて、いくつかのハイブリドーマクローンを配列決定し、発現させ、機能について特性評価した。
【０４０８】
ファージディスプレイライブラリからの抗体生成
標準的な方法を使用して、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５−９６，２０１０、及びＷＯ２００９／０８５４６２）に記載の２セットの新たなｐＩＸファージディスプレイライブラリから、ＴＭＥＦＦ２に結合するＦａｂを選択した。簡潔に言えば、Ｖ３．０及びＶ５．０と呼ばれる２セットのライブラリは、ヒトスカフォールドを多様化させることによって生成されたものであり、生殖系列ＶＨ遺伝子ＩＧＨＶ１−６９＊０１、ＩＧＨＶ３−２３＊０１及びＩＧＨＶ５−５１＊０１を、Ｈ３ループを介してヒトＩＧＨＪ−４ミニ遺伝子で組み換え（Ｖ５．０ではＩＧＨＪ−６ミニ遺伝子も使用した）、そして、ヒト生殖系列ＶＬカッパ遺伝子Ｏ１２（ＩＧＫＶ１−３９＊０１）、Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１＊０１）、Ａ２７（ＩＧＫＶ３−２０＊０１）及びＢ３（ＩＧＫＶ４−１＊０１）をＩＧＫＪ−１ミニ遺伝子で組み換えて、完全なＶＨ及びＶＬドメインを構築した。多様化のために、タンパク質及びペプチド抗原と頻繁に接触する、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３ループ周辺の重鎖及び軽鎖可変領域における位置を選択した。選択した位置における配列多様性は、それぞれのＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ遺伝子のＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ生殖系列遺伝子ファミリーにおいてそれぞれの位置に存在する残基に制限した。Ｈ３ループにおける多様性は、Ｖ３．０ライブラリについては７〜１４アミノ酸長、Ｖ５．０ライブラリについては６〜１９アミノ酸長の短鎖〜中鎖の合成ループを使用して生成した。Ｈ３におけるアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動を模倣するよう設計された。ライブラリを生成するために利用したスカフォールドは、そのヒトＶＨ及びＶＬ生殖系列遺伝子の由来に従って命名した。Ｖ３．０及びＶ５．０のセットの両方では、３つの重鎖ライブラリの各々を、４つの生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖ライブラリと組み合わせて、選択実験に使用されるライブラリの各セットとして、１２とおりの固有のＶＨ：ＶＬの組み合わせを生成した。
【０４０９】
Ｖ領域クローニング
ファージのハイブリドーマ細胞溶解物からの全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ  ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。得られたＲＮＡを、Ｄｒｏｐ  Ｓｅｎｓｅを使用して定量化し、−８０℃で保存したか、又はＲＴ−ＰＣＲによるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡ合成に使用した。第１の鎖ｃＤＮＡ合成は、それぞれ重鎖、カッパ鎖、及びラムダ鎖の定常領域にアニーリングされた遺伝子特異的プライマーを使用して実行した。最大３μｇの精製したＲＮＡ、遺伝子特異性プライマー、ｄＮＴＰミックス、反応緩衝液、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）（４０Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃１８０８０−０５１）で構成されるＲＴ−ＰＣＲ反応混合物を５０℃で５０分間、及び８５℃で５分間インキュベートした。得られた一本鎖ｃＤＮＡを−２０℃で保存するか、又はＰＣＲ増幅に直接使用した。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ反応を実行した。ｖ領域断片を、最適化したＰＣＲ条件を使用して、リーダー配列、並びに重鎖、カッパ及びラムダ鎖の定常領域に順方向及び逆方向のプライマーアニーリングによって増幅させた。得られたＰＣＲ断片を配列決定し、回収したｖ領域のアミノ酸配列をコドン最適化し、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ４定常領域を担持するｐＵｎｄｅｒ系発現ベクター（ＩｇＧ４ＰＡＡアイソタイプ）にクローニングした。
【０４１０】
Ｅｘｐｉ２９３小規模トランスフェクション及び精製
免疫化キャンペーン又はファージディスプレイから同定した選択抗体をクローニングし、ＩｇＧ１ＰＡＡとして発現させ、小さい２ｍｌスケールを介して精製した。Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地中１．２５×１０５〜２．２５×１０５個の生存細胞／ｍＬ密度で播種し、３７℃、７％  ＣＯ２の１２５ｍＬ〜２Ｌ振盪フラスコ内で培養した。密度が３×１０６〜５×１０６個の生存細胞／ｍＬで生存率が９８〜９９％に対数増殖に達したときに、細胞を継代培養した。
【０４１１】
トランスフェクションの日に、生存細胞密度及び生存率を決定した。製造業者のトランスフェクションプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ番号ＭＡＮ０００７８１４）に従って、３×１０６個の生存細胞／ｍＬの密度で細胞をトランスフェクトした。精製前に、８５０ｘＧで１５分間遠心分離することにより、トランスフェクション６日後に培養物を採取した。ｍＡｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して清澄化した上清から抗体を精製し、ＰＢＳ中に透析した。タンパク質濃度は、ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｒｉｎｅａｎ）を使用して、濾液のＡ２８０測定によって測定した。
【０４１２】
実施例３．抗ＴＭＥＦＦ２抗体の特性評価
抗ＴＭＥＦＦ２抗体は高親和性でＴＭＥＦＦ２に結合する
ＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤ（ＴＭＥＷ１：ＴＭＥＦＦ２−ＦＬ  ＥＣＤ−Ｈｉｓ−Ａｖｉｔａｇ）及び／又は膜近位領域（ＴＭＥＷ１９：ｓｐＴＭＥＦＦ２（２３０−３２０）Ｇ３Ｓ−Ｈ６）への選択ＩｇＧ４ＰＡＡ抗ＴＭＥＦＦ２抗体の結合は、タンパク質（ＴＭＥＢ６７４、ＴＭＥＢ６７５、ＴＭＥＢ５６５、及びＴＭＥＢ５７０）又はＢｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲ（ＴＭＥＢ７６２及びＴＭＥＢ７５７）を使用して評価した。選択された抗体の結合の動態パラメータを、表４に示す。抗ＴＭＥＦＦ２抗体は、ピコモル親和性でＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤ及びＴＭＥＦＦ２膜近位領域の両方に結合することが見出された。
【０４１３】
【表４】
2021524255.tif 000006
【０４１４】
ＰｒｏｔｅＯｎ  ＳＰＲ
抗ＴＭＥＦＦ２  ｍＡｂのＥＣＤ及びヒトＴＭＥＦＦ２の膜近位領域への結合は、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＳＰＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定した。（ＰＢＳＴ中１μｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した）精製ｍＡｂをアッセイのリガンドとして使用し、Ｆｃ捕捉を通じてヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）ＩｇＧ  Ｆｃに固定化した。ＧＡＨ  ＩｇＧ  Ｆｃのアミンカップリングのために、ＥＤＣ（４０ｍＭ）及びＮＨＳ（１０ｍＭ）の１：１混合物を注入直前に混合して、チップ表面を活性化し、垂直方向に注入した。次いで、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中のＧＡＨ−Ｆｃ（３０μｇ／ｍｌ）抗体を、３０μｌ／分で３００秒間表面上に垂直方向に流した。その後、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を同じ方向に注入することによって、表面の任意の残りの反応性カルボキシル基を失活させた。固定化のために１μｇ／ｍｌの濃度で抗体を使用した。抗体は、表面上を水平方向に流した。３倍連続希釈した５つの濃度（最高濃度範囲１００〜６００ｎＭ）のヒトＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤ又は膜近位領域を、検体として垂直方向に流して、捕捉された分子に結合させた。また、垂直方向の６番目のチャネルに緩衝液サンプルを注入して、ベースラインシグナルの動向を監視した。全ての濃度での会合及び解離相を、それぞれ１００μＬ／分の流速で３分間及び３０（又は１５）分間にわたり監視した。次の相互作用サイクルのために、１８秒パルスの０．８％リン酸を使用して、結合した抗原を除去するために結合表面を再生した。応答データから２つのセットの参照データ：１）抗原と空のチップ表面との間での非特異的相互作用を補正するためのスポット間シグナル、２）（チップ上にＰＢＳＴのみが流された場合）非特異的ベースラインドリフトを補正するための、空のチャネル信号、を減算することによって未処理データを処理した。
【０４１５】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ  ＳＰＲ
ヒトＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤへの抗ＴＭＥＦＦ２  ｍＡｂの結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ  ＳＰＲによって測定した。アッセイのフォーマットは、高密度抗ヒトＦｃ表面を使用してｍＡｂを捕捉し、次いで単一サイクル動態方法を使用してヒトＴＭＥＦＦ２濃度滴定を注入するためのものである。ヤギ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ＃１０９−００５−０９８）を、１０ｍＭ酢酸緩衝液中３０μｇ／ｍＬのアミンカップリング、フローセル１及び２上、ＣＭ５センサ−チップ（ＧＥ）上ｐＨ４．５、ＨＢＳＰ（ＧＥ）緩衝液中３０μＬ／分の流量を介して直接固定化した。フローセル２上０．５μｇ／ｍＬ（約２００〜３００ＲＵ）で、ｍＡｂを抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ表面上に捕捉した。次いで、泳動用緩衝液をＨＢＳＰ＋１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡに変更した。単一サイクル動態方法を使用して、３倍連続希釈した３０ｎＭ濃度のＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤを、低濃度から高濃度で注入した。最後又は最高濃度の注入３０分後にオフレートを監視し、次いで０．８％リン酸（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して表面を再生した。緩衝液ブランク試験、同じｍＡｂの捕捉、及び同じサンプル実験条件の使用も完了した。未処理データは、応答データから２セットの参照データ：１）サンプルフローセル２から減算した参照フローセル１、及び２）実験的試験からの緩衝液ブランク試験、を減算することによって処理した。各ｍＡｂの全濃度での処理したデータを１：１の単純なラングミュア結合モデルに全体的に適合させて、およその動態性（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ）及び親和性（ＫＤ）定数を抽出した。
【０４１６】
抗ＴＭＥＦＦ２抗体の熱安定性
ＤＳＣ（示差走査熱量測定）による、アンフォールディング開始Ｔｍ＝５２℃、及び第１の熱転移（Ｔｍ１）＝６０．４℃によって、ＴＭＥＢ６７５は、通常の熱安定性プロファイルよりも低いことを示した。ＴＭＥＢ６７５の配列のより詳しい検査（実施例４を参照されたい）は、重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域内の体細胞超変異（Somatic HyperMutation、ＳＨＭ）の存在を示した。いくつかの再操作された変異体をサブクローニングし、発現させ、精製し、ＤＳＣによりプロファイルした。得られたｍＡｂ  ＴＭＥＢ７６２及びＴＭＥＦＢ７５７は、望ましい熱安定性プロファイル（それぞれ、Ｔｍ１＝６９．４℃、及びＴｍ１＝６９．７℃）を示した。ＴＭＥＢ６７５と比較して、ＴＭＥＢ７６２は、重鎖にＲ１４Ｐ、Ｐ２０Ｌ、及びＨ８１Ｑのアミノ酸修飾を有し、一方ＴＭＥＦＢ７５７は、重鎖にＲ１４Ｐ及びＰ２０Ｌのアミノ酸修飾を有した。ＴＭＥＢ６７５と比較して、ＴＭＥＢ７６２は、軽鎖にＡ１Ｄ及びＡ９１Ｐのアミノ酸修飾を有し、一方ＴＭＥＦＢ７５７は、軽鎖にＡ９１Ｐの修飾を有した。残基の付番は、Ｋａｂａｔに従う。ＴＭＥＢ６７５、ＴＭＥＢ７６２のＴＭＥＦＦ２  ＥＣＤへの結合の動態パラメータを、表４に示す。
【０４１７】
実施例４．ＴＭＥＦＦ２抗体の構造的特性評価
標準的な技術を使用して、抗体のｃＤＮＡ配列及びアミノ酸翻訳物を得た。ポリペプチド配列の決定後、発現をスケールアップするための標準的な方法を使用して、可変領域又は完全長抗体をコードするいくつかの抗体ｃＤＮＡを、コドン最適化した。
【０４１８】
表５は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２アミノ酸配列を示す。
【０４１９】
表６は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０４２０】
表７は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２アミノ酸配列を示す。
【０４２１】
表８は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【０４２２】
表９は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。
【０４２３】
表１０は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体の重鎖及び軽鎖の配列番号を示す。
【０４２４】
表１１は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体の重鎖アミノ酸配列を示す。
【０４２５】
表１２は、選択抗ＴＭＥＦＦ２抗体の軽鎖アミノ酸配列を示す。
【０４２６】
表１３は、様々な抗ＴＭＥＦＦ２抗体鎖をコードするポリヌクレオチドの配列番号を示す。
【０４２７】
【表５】
2021524255.tif 000007
【０４２８】
【表６】
2021524255.tif 000008
【０４２９】
【表７】
2021524255.tif 000009
【０４３０】
【表８】
2021524255.tif 000010
【０４３１】
【表９−１】
2021524255.tif 000011
【０４３２】
【表９−２】
2021524255.tif 000012
【０４３３】
【表１０】
2021524255.tif 000013
【０４３４】
【表１１】
2021524255.tif 000014
【０４３５】
【表１２】
2021524255.tif 000015
【０４３６】
【表１３】
2021524255.tif 000016
【０４３７】
配列番号３９（ＴＭＥＢ６７５  ＶＨ  ｃＤＮＡ）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＣＣＴＣＡＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
【０４３８】
配列番号４０（ＴＭＥＢ５７０、ＴＭＥＢ５６５  ＶＨ  ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＡＣＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＡＡＴＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＧＣＴＡＡＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＧＣＧＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＡＣＧＴＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＣＡＴＴＴＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＧＡＧＴ
【０４３９】
配列番号４１（ＴＭＥＢ６７４  ＶＨ  ｃＤＮＡ）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
【０４４０】
配列番号４２（ＴＭＥＢ６７５  ＶＬ  ｃＤＮＡ）
ＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＧＡＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＡＣＡＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ
【０４４１】
配列番号４３（ＴＭＥＢ５７０  ＶＬ  ｃＤＮＡ）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＡＡＣＧＣＧＣＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＴＴＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＧＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＧＴＧＣＣＴＣＣＴＡＴＣＧＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＧＡＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
【０４４２】
配列番号４４（ＴＭＥＢ６７４  ＶＬ  ｃＤＮＡ）
ＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧ
【０４４３】
配列番号４５（ＴＭＥＢ５６５  ＶＬ  ｃＤＮＡ）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＡＡＣＧＣＧＣＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＡＴＣＴＴＧＣＧＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＧＴＧＣＡＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＧＡＣＣＧＧＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＣＴＡＴＡＡＣＣＣＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
【０４４４】
配列番号４６（ＴＭＥＢ６７５  ＨＣ  ｃＤＮＡ）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＣＣＴＣＡＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡ
【０４４５】
配列番号４７（ＴＭＥＢ５７０、ＴＭＥＢ５６５  ＨＣ  ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＡＣＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＡＡＴＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＧＣＴＡＡＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＧＣＧＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＴＡＧＴＧＧＡＣＧＴＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＣＡＴＴＴＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡ
【０４４６】
配列番号４８（ＴＭＥＢ６７４  ＨＣ  ｃＤＮＡ）
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【０４４７】
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【０４５３】
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【０４５５】
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【０４５６】
配列番号１００（ＴＭＥＢ７５７  ＶＬ  ｃＤＮＡ）
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【０４５７】
配列番号１０１（ＴＭＥＢ７５７  ＨＣ  ｃＤＮＡ）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＣＣＴＣＡＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＣＴＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡ
【０４５８】
配列番号１０２（ＴＭＥＢ７５７  ＬＣ  ｃＤＮＡ）
ＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＧＡＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＡＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧ
【０４５９】
選択された抗ＴＭＥＦＦ２抗体のフレームワークを、表１４に示す。
【０４６０】
【表１４】
2021524255.tif 000017
【０４６１】
配列番号５３（ＶＨ３＿３−２３フレームワーク）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０４６２】
配列番号５４（ＶＨ１＿１−６９フレームワーク）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳ  ＳＹＡＩＳ  ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ  ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ  ＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
【０４６３】
配列番号５５（ＶＫＩ＿Ｌ１１フレームワーク）
ＡＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧ  ＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ  ＬＱＤＹＮＹＰ
【０４６４】
配列番号５６（ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７フレームワーク）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ  ＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰ
【０４６５】
実施例５．抗ＴＭＥＦＦ２抗体のエピトープマッピング
Ｈ／Ｄ交換を使用して、ＴＭＥＢ５７０及びＴＭＥＢ６７５のエピトープマッピングを行った。ＴＭＥＷ１（配列番号６）を、これらのアッセイでのＴＭＥＦＦ２の供給源として使用した。
【０４６６】
１３０μＬの対照緩衝液（５０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中１０μｇのＴＭＥＷ１を、１３０μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５ＭのＴＣＥＰ緩衝液（最終的なｐＨは２．５であった）を添加し、混合物を３分間１０℃でインキュベートすることによって、変性させた。次いで、社内で充填したペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ（ｗ／ｗ、１：１）カラム（２．１×３０ｍｍ）を使用して、混合物にオンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化を施した。Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｈｙｂｒｉｄ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）に結合されたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣで構成されるＵＰＬＣ−ＭＳシステムを使用して、得られたペプチドを分析した。ペプチドを２〜３４％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中、０．２％ギ酸）から１６．５分の勾配で５０×１ｍｍのＣ８カラム上で分離した。溶媒Ａは、水中０．２％のギ酸であった。注入バルブ、及びペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩカラム、及びそれらに関連する接続チューブは、１０℃に維持した冷却ボックス内に保持した。第２のスイッチングバルブ、Ｃ８カラム、及びそれらに関連するステンレス鋼接続チューブは、−６℃に維持した別の冷却循環ボックス内に置いた。ペプチド同定は、ＴＭＥＷ１配列に対するＭＳ／ＭＳデータをＭａｓｃｏｔで検索することを通じて行った。前駆体及び産生物イオンの質量許容差は、それぞれ７ｐｐｍ及び０．０２Ｄａであった。
【０４６７】
１０μＬのＴＭＥＷ１（５μｇ）又は１０μＬのＴＭＥＷ１及びＴＭＥＢ５７０又はＴＭＥＢ６７５混合物（５μｇ：１５μｇ）を、１２０μＬの酸化重水素標識緩衝液（ｐＨ７．４で、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム）と共に１０℃で０秒、３０秒、３６０秒、３６００秒、及び１４４００秒間インキュベートした。各時点での水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換を、重複して実施した。１３０μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５Ｍ  ＴＣＥＰ緩衝液（最終的なｐＨは２．５であった）を添加することによって水素／重水素交換物をクエンチした。その後、クエンチしたサンプルを、上記に記載されるようにオンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化及びＬＣ−ＭＳ分析に供した。質量スペクトルはＭＳのみのモードで記録した。
【０４６８】
未処理ＭＳデータを、Ｈ／Ｄ交換ＭＳデータの分析のためのソフトウェア、ＨＤＸ  ＷｏｒｋＢｅｎｃｈを使用して処理した（Ｐａｓｃａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１２，２３（９），１５１２−１５２１）。重水素化ペプチドとその天然形態（ｔ０）との平均質量差を使用して、重水素レベルを算出した。タンパク質の約９７−９９％を特定のペプチドにマッピングすることができた。重水素蓄積曲線は、ペプチドの交換時間にわたって、傾斜に著しい差を示した。
【０４６９】
ＴＭＥＢ５７０エピトープ：ＴＭＥＷ１は、残基２３５〜２４９（残基付番に従った配列番号２）での重酸素取り込みにおいて緩やかな低減を示し、膜近位領域内の例えば、残基ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）は、ＴＭＥＢ５７０への結合時にＨ／Ｄ交換から保護された。
【０４７０】
ＴＭＥＢ６７５エピトープ：ＴＭＥＷ１は、残基２５２〜２６８（残基付番に従った配列番号２）での重酸素取り込みにおいて緩やかな低減を示し、膜近位領域内の例えば、残基ＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）は、ＴＭＥＢ６７５への結合時にＨ／Ｄ／交換から保護された。
【０４７１】
したがって、ＴＭＥＢ５７０  ＴＭＥＦＦ２エピトープ残基は、ＨＧＫＣＥＨＳＩＮＭＱＥＰＳＣ（配列番号５７）を包含し、ＴＭＥＢ６７５エピトープ残基は、ＤＡＧＹＴＧＱＨＣＥＫＫＤＹＳＶＬ（配列番号５８）を包含した。両方の抗体は、膜近位領域内でＴＭＥＦＦ２に結合した。
【０４７２】
実施例６．抗ＣＤ３抗体の生成
抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ２１９は、ＵＳ９８５０３１０に記載されている。
【０４７３】
追加の抗ＣＤ３抗体は、ＯｍｎｉＲａｔｓ（ＯＭＴ（商標））を免疫することによって生成した。得られたハイブリドーマ上清を、ヒト及びカニクイザルＣＤ３＋Ｔリンパ球への結合についてスクリーニングし、クローンを単離し、配列決定し、場合によっては更に操作した。抗ＣＤ３抗体を、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ変異を有するエフェクターサイレントＩｇＧ４を含む様々なアイソタイプとして、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ変異を有するＩｇＧ１としてクローニングした。生成した２つの抗ＣＤ３抗体を、ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０と命名した。
【０４７４】
ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０のヒトＴ細胞に対するインビトロ結合親和性を、抗原特異性標的アームと交差させた後、フローサイトメトリーによって決定した。抗ＣＤ３トレーサー分子の飽和結合定数（ＫｄＴ）を決定するために、ヒトＴ細胞について予備研究を実行した。次いで、試験ｍＡの滴定濃度を使用する競合結合アッセイに、トレーサーの固定濃度（［Ｔ］）を使用した。試験分子のＩＣ５０（５０％阻害が達成される濃度）値を使用する次の式：Ｋｄ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ｔ］／ＫｄＴ））を使用して、結合親和性（Ｋｄ）を決定した。トレーサー、市販のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８  ＳＰ３４−２抗ＣＤ３（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ＃５５７７０５）（データは示さず）の飽和結合定数（ＫｄＴ）を決定するために、５人のヒトドナーを使用した。
【０４７５】
トレーサーの飽和結合定数（ＫｄＴ）の決定
方法：使用まで、ヒトｐａｎ  Ｔ細胞を窒素タンク内に低温保存した。Ｔ細胞を解凍し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ染色緩衝液に再懸濁し、計数し（生存率に留意して）、０．５×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁した。Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡＫＡ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｌ３４９７４）（バイアル中５０μＬのＤＭＳＯを）を１×１０６個の細胞当たり１μＬで添加し、ＦｃＲブロッカー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０５９−９０１）（０．５×１０６個の細胞当たり１：２０希釈の１ｍＬ）を各々細胞に１０分間添加した。細胞を５０，０００個の細胞／ウェルで播種し、洗浄した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８  ＳＰ−３４抗ＣＤ３の濃度を増加させて、４℃で２時間、Ｔ細胞に添加した。細胞を洗浄して非結合抗体を除去し、１５分間固定し、洗浄し、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＦＡＣＳ染色緩衝液中に再懸濁した。
【０４７６】
ｉＱｕｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して結合を測定した。Ｔ細胞集団、続いて細胞個片、続いて生存細胞について細胞をゲーティングした（ＦＬ４）。各ウェルの染色の幾何平均（ＦＬ１）を決定した。
【０４７７】
取得した平均蛍光強度値を抗体分子濃度の関数としてプロットし、一部位結合分析（総結合）にＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。ソフトウェアは、質量作用の法則に従う受容体（ヒトＰａｎ  Ｔ細胞上のＣＤ３）への抗体分子の結合を説明する、対応するＫｄ値を計算する。式は以下のとおりであり、（Ｂｍａｘ×Ｘ）／（Ｋｄ＋Ｘ）、式中、Ｂｍａｘが最大結合であり、Ｋｄが、半最大結合に達するのに必要な配位子の濃度である。
【０４７８】
結果：各ドナーについてＫｄ値を導出し、平均値を得た。ヒトＴ細胞の飽和結合定数（ＫｄＴ）を５．６±１．０ｎＭ（ｎ＝４）から導出し、前述の式に使用して、Ｋｄ結合親和性を決定した。
【０４７９】
競合アッセイによる抗ＣＤ３ｍＡの結合親和性の決定
ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０を使用して競合結合研究を実施した。ヒトパンＴ細胞を使用して、ｍＡｂの結合親和性を決定した。使用したトレーサーは、市販のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８  ＳＰ−３４抗ＣＤ３（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ＃５５７７０５）であり、このトレーサーの飽和結合定数は上記されている。
【０４８０】
Ｔ細胞は、使用まで、窒素タンク内に低温保存した。Ｔ細胞を解凍し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ染色緩衝液に再懸濁し、計数し生存率に留意して、０．５×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁した。Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡＫＡ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｌ３４９７４）（バイアル中５０μＬのＤＭＳＯを）を１×１０６個の細胞当たり１μＬで添加し、ＦｃＲブロッカー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０５９−９０１）（０．５×１０＾６個の細胞当たり１：２０希釈の１ｍＬ）を各々細胞に１０分間添加した。細胞を５０，０００個の細胞／ウェルで播種し、洗浄した。
【０４８１】
ｍＡｂ（及びアイソタイプ対照）を、開始濃度１０００又は２００μｇ／ｍＬ（２×）から１：２で連続希釈し、固定濃度（５μｇ／ｍＬ  ２×）のトレーサーを一緒に混合して、１×濃度を得た。したがって、トレーサーの最終濃度（１×）は、２．５μｇ／ｍＬ＝１６．６ｎＭであった。混合物をＴ細胞に４℃で２時間添加した。次いで、細胞を洗浄して非結合抗体を除去し、１５分間固定し、洗浄し、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＦＡＣＳ染色緩衝液中に再懸濁した。
【０４８２】
ｉＱｕｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して結合を測定した。Ｔ細胞集団、続いて細胞個片、続いて生存細胞（ＦＬ４）について細胞をゲーティングした。各ウェルの染色の幾何平均（ＦＬ１）を決定した。取得した平均蛍光強度値を、ｌｏｇ抗体分子濃度（ｎＭに変換）の関数としてプロットし、ＥＣ５０／ＩＣ５０値（ｎＭ単位）が由来するシグモイド用量応答（可変勾配）にＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。結合親和性（Ｋｄ）は、以下の式：Ｋｄ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ｔ］／ＫｄＴ））を使用して導出した。式中、Ｋｄが、競合物（非標識分子）の親和性であり、試験化合物のｎＭ単位でのＩＣ５０、［Ｔ］が、トレーサーの濃度（１６．６ｎＭ）であり、ＫｄＴが、飽和結合によって決定されるトレーサーのＫｄである（ヒトについては５．６ｎＭ）。
【０４８３】
ＣＤ３Ｂ３７６結合部位は、二価及び一価の両方の形態でＣＤ３Ｂ４５０よりも緊密であった。
【０４８４】
【表１５】
2021524255.tif 000018
【０４８５】
ＣＤ３Ｂ２１９、ＣＤ３Ｂ３７６、及びＣＤ３Ｂ４５０のＣＤＲ、ＶＨ、及びＶＬアミノ酸配列を、表１６に示す。
【０４８６】
【表１６】
2021524255.tif 000019
【０４８７】
配列番号７６  ＣＤ３Ｂ２１９  ＨＣ、（ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０４８８】
配列番号７７  ＣＤ３Ｂ２１９  ＬＣ
ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
【０４８９】
配列番号７８  ＣＤ３Ｂ３７６  ＨＣ（ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＲＬＶＲＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＦＮＮＮＡＡＷＳＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＬＹＤＹＡＶＳＶＫＳＲＩＴＶＮＰＤＴＳＲＮＱＦＴＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＧＹＳＳＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０４９０】
配列番号７９  ＣＤ３Ｂ３７６  ＬＣ
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＮＩＧＴＹＫＦＶＳＷＹＱＱＨＰＤＫＡＰＫＶＬＬＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＳＳＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＱＡＤＹＨＣＶＳＹＡＧＳＧＴＬＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
【０４９１】
表１７は、抗ＣＤ３抗体鎖をコードするポリヌクレオチドの配列番号を示す。
【０４９２】
【表１７】
2021524255.tif 000020
【０４９３】
配列番号１０５  ＣＤ３Ｂ２１９  ＶＨ  ｃＤＮＡ
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＡＴＣＴ
【０４９４】
配列番号１０６  ＣＤ３Ｂ２１９  ＶＬ  ｃＤＮＡ
ＣＡＧＡＣＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧ
【０４９５】
配列番号８０  ＣＤ３Ｂ２１９  ＨＣ  ｃＤＮＡ
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡ
【０４９６】
配列番号８１  ＣＤ３Ｂ２１９  ＬＣ  ｃＤＮＡ
ＣＡＧＡＣＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＡ
【０４９７】
配列番号１０７  ＣＤ３Ｂ３７６  ＶＨ  ｃＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＣＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＴＡＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＴ
【０４９８】
配列番号１０８  ＣＤ３Ｂ３７６  ＶＬ  ｃＤＮＡ
ＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＡＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧ
【０４９９】
配列番号８２  ＣＤ３Ｂ３７６  ＨＣ  ｃＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＣＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＴＡＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡ
【０５００】
配列番号８３  ＣＤ３Ｂ３７６  ＬＣ  ｃＤＮＡ
ＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＡＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＡ
【０５０１】
実施例７．二重特異性ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体の生成
選択単一特異性抗ＴＭＥＦＦ２及び抗ＣＤ３抗体をＩｇＧ４／κとして表した。抗ＴＭＥＦＦ２抗体が野生型ＩｇＧ４を有したままで、抗ＣＤ３抗体にＦ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換（ＥＵ付番）を行った。位置４０５及び４０９置換に加えて、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を有するように、ＩｇＧ４  ｍＡｂを操作した。
【０５０２】
プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム）を使用する標準的な方法を使用して、単一特異性抗体を発現及び精製した。溶出後、プールを、Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．２の中に透析した。
【０５０３】
二重特異性ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体を、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載のインビトロでのＦａｂアーム交換において、単一特異性ＴＭＥＦＦ２  ｍＡｂと単一特異性ＣＤ３  ｍＡｂとを組み合わせることにより生成した。簡潔に言えば、ｐＨ７〜７．４のＰＢＳ中モル比１：１で、約１〜２０ｍｇ／ｍＬの各抗体と、７５ｍＭの２−メルカプトエタノールアミン（２−ＭＥＡ）とを一緒に混合し、２５〜３７℃で２〜６時間インキュベートし、続いで透析、透析濾過、クロスフロー濾過、及び／又は標準的な方法を使用する細胞濾過物のスピンを介して２−ＭＥＡを除去した。
【０５０４】
疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するインビトロＦａｂアーム交換の後、二重特異性抗体を更に精製して、標準的な方法を使用して残留親抗ＴＭＥＦＦ２及び抗ＣＤ３抗体を最小限にした。
【０５０５】
表１８及び表１９は、生成された二重特異性抗体を示す。
【０５０６】
【表１８】
2021524255.tif 000021
【０５０７】
【表１９】
2021524255.tif 000022
【０５０８】
実施例８．二重特異性ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体の特性評価
分析用超遠心分離（Analytical Ultra Centrifugation、ＡＵＣ）による純度分析
分析用超遠心分離（ＡＵＣ）は、溶液中の巨大分子のサイズ、形状、凝集状態、及び可逆的相互作用の決定を可能にする。沈降速度（Sedimentation velocity、ＳＶ）は、遠心分離スピンの際に、濃度勾配をサンプルホルダー（セル）の外半径に移動させる、ＡＵＣ技術である。これにより、分子のサイズ及び形状の因子である沈降係数の決定が可能になり、これは各分子に固有である。この目的に、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  ＡＵＣ装置を使用した。サンプルを、１．２ｃｍのＢｅｃｋｍａｎセンターピース（定格５０Ｋ  ｒｐｍ）及び石英窓を装備した遠心セルに充填した。細胞をアセンブルし、１３０ｌｂｓにトルクをかける。遠心セルを、Ａｎ−５０（８穴）又はＡｎ−６０（４穴）ローターに置き、ＡＵＣチャンバ内に置いた。運転を開始する前に、ＡＵＣの温度を、チャンバ内のローターで少なくとも１時間、２０．５°に平衡化した。スキャンカウント（２５０スキャン）、スキャン収集の頻度（９０秒）、データ解像度（１０μＭ）、２８０ｎｍの波長、４０Ｋ  ｒｐｍで、ｍＡｂサンプルについて実験を実施した。データは、直接境界適合ソフトウェアＳＥＤＡＮＡＬを使用して分析した。二重特異性抗体ＴＭＣＢ１５０及びその親ｍＡｂの純度を測定した。ＴＭＣＢ１５０は、９７．１％モノマー、２．８％二量体モノマーを示し、更なる生物物理的特性評価のために一過性に発現させた研究材料が許容可能な基準を満たすＡＵＣによって決定される、凝集を示さなかった。ＴＭＥＢ７６２は、９５．５％モノマー、４．５％二量体を示し、凝集は示さなかったが、ＣＤ３Ｂ３７６は、凝集を示さずに９７．７％モノマー及び２．２％二量体を示した。最小２工程精製分子の＞５％の凝集体濃度は、生物活性、溶解性、安定性、及び貯蔵寿命に著しい影響を及ぼし得る。
【０５０９】
ＤＳＣによる抗ＴＭＥＦＦ２／ＣＤ３二重特異性の立体配座安定性
ＴＭＣＢ１５０熱的アンフォールディングは、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）によって決定し、これは、アンフォールディング開始Ｔｍ＝５２．６℃、６１．８℃での第１の熱転移（Ｔｍ１）、６７．６℃での第２の熱転移（Ｔｍ２）、及び７５．５℃での第３の熱転移（Ｔｍ３）を示した。前述のＤＳＣによって評価した親抗体（抗ＴＭＥＦＦ２、ＴＭＥＢ７６２、及び抗ＣＤ３、ＣＤ３Ｂ３７６）熱転移プロファイルに基づいて、ＴＭＣＢ１５０のＴｍ１は、ＣＤ３Ｂ３７６  ＦＡＢのアンフォールディングに対応し、ＴＭＣＢ１５０のＴｍ３は、ＴＭＥＢ７６２  Ｆａｂのアンフォールディング転移に対応する。
【０５１０】
血清安定性
血清安定性アッセイは、ヒト血清成分に対する非特異的又はオフ標的結合のためのリード候補の特性を評価するために開発されている。これにより、不十分な薬物動態及び生物分布特性を予測することができる。ＴＭＣＢ１５０の結合及び安定性は、蛍光系クロマトグラフィー法を使用して、緩衝液及びヒト血清の両方で評価する。二重特異性抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート（製造業者の指示に従ったＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎキット）で標識し、Ｈｅｐｅｓ緩衝液及びヒト血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）中４℃及び３７℃で２日間インキュベートし、次いで蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステムを使用するＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析した。凝集率は、各ピークの曲線下面積の積分から計算する。ＴＭＣＢ１５０は、時間０でＨｅｐｅｓ緩衝液中２．４％の凝集を示し、それぞれ摂氏４°及び３７°で２日後に２．０％及び１．３％の凝集を示した。ヒト血清において、ＴＭＣＢ１５０は、摂氏４°及び３７°の両方で、時間０で１，７％の凝集及び２日後に１．１％の凝集を示した。
【０５１１】
非特異的結合
無関係な表面へのリード分子の非特異的結合は、バイオセンサー技術（Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ）によって決定する。抗体を、無関係なタンパク質でコーティングしたＳＰＲ表面上に通過させる。抗体が、これらの無関係な表面への著しい結合を示す場合、不十分なインビボ特性を有し、製造上問題を呈すると予測される。最終濃度１μＭでリード分子を試験する。無関係な表面としては、負に帯電したタンパク質（Ｓｏｙ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、正に帯電したタンパク質（リゾチーム及びβ−ディフェンシン）、疎水性（Ｒｈ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａ４ｂ７）、ヒトＩｇＧ粘着性タンパク質（Ｒｈ−ＣＤ１９）が挙げられる。この実験では、適切な対照を使用する。一方はブランクであり、他方は直接固定化された分子を有する２つの表面上に、リードを流す。応答単位（response unit、ＲＵ）レベルは、試験表面ＲＵからブランクＲＵを減算することによって決定する。ＴＭＣＢ１５０のＲＵ及び親ｍＡｂを、以下の表に示す。製造中に問題を生じ、かつ不十分なＰＫ特性を意味する応答単位≧１００では、帯電／疎水性／ＩｇＧ表面への非特異的結合の高いリスクが予測される。抗体のうちのいずれも、無関係な表面への非特異的結合を示さない場合、製造及びインビボ挙動でのリスクが、低いか全くないことが予測される。
【０５１２】
【表２０】
2021524255.tif 000023
【０５１３】
高濃度安定性
注入量を低減して皮下投与を容易にするために、多くのモノクローナル抗体は、高濃度（≧１００ｍｇ／ｍｌ）で配合される。加えて、全てのモノクローナル抗体は、精製プロセス中に一過的に高濃度（≧５０ｍｇ／ｍｌ）に曝露される。したがって、高濃度安定性は、これらの分子の重要な品質属性である。３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜を備える遠心限外濾過デバイスを使用して濃縮を実施する。５．１〜５．３ｍｇの各タンパク質を最初に同じ開始濃度に希釈し、１５分間隔に４０００ｘｇで遠心分離した。各１５分の遠心分離工程の終了時に、濃縮器を遠心分離器から取り出し、残りのサンプル体積の視覚的推定値を記録する。濃度は、ＳｏｌｏＶＰＥ装置によって測定する。濃縮したサンプルを４Ｃ及び４０Ｃで２週間インキュベートし、一定時間間隔でアリコートを引いて、分析ＳＥＣによって一体性を確認した。ＴＭＣＢ１５０及び親ｍＡｂ（ＣＤ３Ｂ３７６及びＴＭＥＢ７６２）を通常どおり濃縮した。ＴＭＣＢ１５０の最終濃度は９９．４ｍｇ／ｍＬであり、親ｍＡｂの濃度は５２．２ｍｇ／ｍＬ（ＴＭＥＢ７６２）及び５２．６ｍｇ／ｍＬ（ＣＤ３Ｂ３７６）であった。濃度は４Ｃ及び４０Ｃで２週間同じままであり、これは、分子が、凝集又はエッペンドルフチューブへの吸着の可能性がない、良好な固有特性を有することを示唆している。ＳＥＣピーク積分から測定した種％（Ａ：凝集、Ｍ：モノマー、Ｆ：断片）を以下の表に提供する。高濃度では、分子は、４０Ｃで２週間保存した後、４〜５％の凝集及び≦０．３％の断片で無傷であり、良好な貯蔵寿命が予測される。
【０５１４】
【表２１】
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【０５１５】
動態排除アッセイ（kinetic exclusion assay、ＫｉｎＥｘＡ）による抗ＴＭＥＦＦ２／ＣＤ３二重特異性抗体の親和性決定
ＫｉｎＥｘＡ３２００装置（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、二重特異性ｍＡｂ  ＴＭＣＢ１５０及びその２価ＴＭＥＦＦ２親ＴＭＥＢ７６２ｍＡｂの、ヒトＴＭＥＦＦ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への溶液平衡親和性ＫＤを測定した。ヒトＴＭＥＦＦ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の連続希釈を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣＬ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、０．１％のＢＳＡ、及び０．０２％のＮａＮ３中で一定濃度の抗ＴＭＥＦＦ２ｍＡｂを用いて調製した。結合相互作用が平衡に達するまで、反応混合物を室温でインキュベートした。インキュベーションの継続時間は、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアシミュレーションを使用して決定された。ビス−アクリルアミド／アズラクトンコポリマー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で構成される活性化前ビーズ上でのアミン結合による、ＴＭＥＦＦ２−ＥＣＤの直接的共有結合固定によってビーズを調製した。インキュベーション後、サンプルをＫｉｎＥｘＡ装置にかけて、ＴＭＥＦＦ２修飾ビーズに混合物を通過させ、蛍光標識された二次抗体を使用して捕捉抗体を検出することによって、混合物中の遊離抗体を評価した。データは、ＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して、１：１結合モデルと適合させた。
【０５１６】
【表２２】
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【０５１７】
抗ＴＭＥＦＦ２／ＣＤ３二重特異性抗体のＮ末端ＣＤ３εペプチドに対する結合親和性の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び抗ヒトＦｃバイオセンサー表面を使用して実施したＳＰＲによって、動態速度定数を測定した。抗ヒト免疫グロブリン抗体は、ＣＭ４センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の表面に共有結合させた。対象の抗体を抗ヒト免疫グロブリンセンサーチップ上に捕捉し、続いて０．０５％界面活性剤Ｐ２０（Ｔｗｅｅｎ（商標）２０）及び１００ｕｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中様々な濃度でＮ末端ＣＤ３εペプチドを注入した。表面を、１００μＬ／分で３０μＬの０．８％リン酸の２パルス注入で再生した。データは、捕捉抗体を含む流動細胞と、捕捉抗体を含まない参照細胞との間のＳＰＲシグナルの差異を報告した。基準−除算シグナル（reference-subtracted signal）からブランク注入のデータを除算することによって、シグナルに対する追加的な装置の寄与を除去した。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、１：１結合モデルにおける全ての濃度（グローバルフィット）での会合及び解離段階を適合することにより、データを分析した。データは、反復数の９５％  ＣＩ＊標準偏差／平方根のｔ値によって計算される平均＋９５％  ＣＩ（信頼区間）として報告する。
【０５１８】
【表２３】
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表２３．
【０５１９】
実施例９．二重特異性ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体は、前立腺癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷に有効である。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける前立腺癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷。
【０５２０】
前立腺癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷を媒介する能力について、選択二重特異性ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体を評価した。
活性カスパーゼ３／７による蛍光基質の切断を介した細胞殺傷を間接的に測定するカスパーゼ細胞障害アッセイを使用して、ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞媒介性殺傷を測定した。基質の開裂により、蛍光ＤＮＡ染色が生じ、蛍光は細胞核に制限される。同じ座標でウェル（複数可）を正確に撮像することができる電動式１０Ｘ対物レンズを使用して、アッセイの過程を通して、各ウェルで複数回蛍光測定を行う。標的細胞集団は、定義されたサイズ制限に基づいて、及び／又は二次標識の使用を通じて同定する。
【０５２１】
正常な健康ドナーからの陰性選択によって、凍結Ｐａｎ  ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）を単離した。ＴＭＥＦＦ２（ＬＮＣａＰ−ＡＲ）を発現する前立腺癌細胞を、１０％のＨＩ  ＦＢＳ＋サプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。Ｔ細胞及び標的細胞を、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳ及びサプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（選択試薬なし）中３：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で組み合わせ、０．６ｕＬのＮｕｃＶｉｅｗカスパーゼ試薬（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造業者のガイドラインに従って各ｍＬの細胞に添加した。０．１ｍＬの細胞の総体積を、透明な９６ウェル平底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）の適切なウェルに添加した。ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３二重特異性抗体を、上に示すように調製したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ中２倍の最終濃度で調製し、０．１ｍＬの化合物を各ウェルに添加した。ウェルの縁部での細胞凝集を最小限にするために室温で３０分間インキュベートした後、３７℃、５％ＣＯ２に保持したＺｏｏｍ  Ｉｎｃｕｃｙｔｅ装置（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にプレートを移した。
【０５２２】
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ上の処理定義は、製造業者のガイドラインに従って、試験する各細胞株に対して設計した。カスパーゼシグナルにプラトーが観察されるまで、６時間ごとに測定を行い、続いて、最高濃度の試験化合物（複数可）を含むウェル（複数可）では最大シグナルから３回又は４回以上連続的に減少した。
【０５２３】
アッセイが完了した後、適切な処理定義を使用して各プレートを分析した。未加工の蛍光データをＩｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍソフトウェアからエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））に貼り付けた。カスパーゼ３／７活性は、ＧｒａｐｈＰａｄで、各ウェルの曲線下（ＡＵＣ）を計算することによって決定した。Ｌｏｇ１０  ｎＭ化合物の関数としてＡＵＣ値をプロットした。各用量曲線のナノモル（ｎＭ）でのＥＣ５０は、非線形回帰分析（４パラメータ適合、最小二乗回帰）に従って報告した。各アッセイは、最低３つの生物学的複製物を含み、各細胞株は、５人の健康なドナーからのＴ細胞を使用して試験した。非線形回帰モデルを使用して、非臨床統計によってデータを更に分析した。
【０５２４】
図３は、選択二重特異性抗ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体のカスパーゼ３／７活性を増加させて測定したときの、経時的なＬｎＣａＰ細胞の殺傷を示す。
【０５２５】
二重特異性ＴＭＥＦＦ２ｘＣＤ３抗体は、インビボ前立腺癌腫瘍モデルにおいて有効である。
選択二重特異性抗体を、雄ＮＳＧマウスにおけるエクスビボＬｎＣａＰ前立腺癌モデルで試験した。研究のために、５０％  Ｃｕｌｔｒｅｘ中１０６個のＬｎＣａＰ細胞を０．２ｍＬ／動物で、０日目に右脇腹に皮下注射により投与した。腫瘍がおよそ約１００〜１５０ｍｍ３の体積に達したときに動物を無作為化し、１５日目に２０６個のＴ細胞／マウスを腹腔内に注入した。各群に１０匹の動物を使用した。抗体を用いる処置は、Ｔ細胞注入の１〜３日後に開始した。抗体を週に２回腹腔内投与した。投与前に、全ての動物は、ＩＶＩＧ＋Ｆｃ遮断を受けた。腫瘍が約１２００ｍｍ３に達するまで、腫瘍体積及び体重を週２回評価した。治療群を表２４に示す。これらのアッセイにおいてＣＤ３Ｂ２１９  ＣＤ３結合アーム及びｎｕｌｌアーム結合ＨＩＶ  ｇｐ１２０を有する陰性対照として、ＣＤ３ｘＮｕｌｌ抗体を使用した。
【０５２６】
【表２４】
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【０５２７】
表２５は、腫瘍移植後の各群ごとの３８日目の腫瘍成長阻害率を示す。
【０５２８】
図４は、腫瘍移植後の経時的な平均腫瘍体積の低減を示す。図５Ａは、０．５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ９３で治療した各マウスの平均腫瘍体積の低減を示す。図５Ｂは、０．５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ１３２で治療した各マウスの平均腫瘍体積の低減を示す。
【０５２９】
【表２５】
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【０５３０】
また、ＴＭＥＢ７６２ｘＣＤ３Ｂ３７６（ＴＭＣＢ１５０）の有効性を、２０ｅ６Ｔ細胞でヒト化した雄ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスで確立されたＬＮＣａＰ異種移植片で評価した。腫瘍移植１３日後に平均腫瘍体積によって、動物を、各１０匹の動物群に無作為化した。０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＥＢ７６２ｘＣＤ３Ｂ３７６、又は０．５ｍｇ／ｋｇのｎｕｌｌｘＣＤ３Ｂ３７６抗体対照を、５週間の間週２回ＩＰ投与した。腫瘍移植３５日後に群当たり少なくとも８匹の動物が残存した場合、腫瘍体積によって決定された腫瘍成長阻害（tumor growth inhibition、ＴＧＩ％）を計算した。統計的に著しい腫瘍成長阻害は、ｎｕｌｌｘＣＤ３対照と比較して、０．５及び０．１ｍｇ／ｋｇのＴＭＥＢ７６２ｘＣＤ３Ｂ３７６で観察されたが、０．０５ｍｇ／ｋｇでは観察されなかった（図６）。ｎｕｌｌｘＣＤ３処置対照と比較して、０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇでのＴＭＥＢ７６２ｘＣＤＢ３７６では、それぞれ１１０％、８８％、及び２５％の腫瘍成長阻害が誘導された。ＴＭＥＢ７６２ｘＣＤＢ３７６治療により、それぞれ０．５及び０．１ｍｇ／ｋｇで７及び３匹に完全応答を生じた。皮下ＬＮＣａＰ腫瘍を、週２回キャリパで測定し、結果を平均腫瘍体積（ｍｍ３）±ＳＥＭ（群当たり≧８匹のマウス）として提示した。
【０５３１】
ＴＭＣＢ１３２の投与に応答したＴ細胞活性化
ＬｎＣａＰ前立腺癌細胞におけるＴ細胞活性化を、フローサイトメトリーによって、具体的には、ＴＭＣＢ１３２治療の７２時間後に６つの別個の正常な健康ドナー（９６４２、９６７２、９７６２、９７７２、９８３２、９８５２）におけるＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２５陽性を評価することによって測定した（図７）。３：１のエフェクター標的比で添加したＣＤ３＋ｐａｎ−Ｔ細胞の活性化は、ＬｎＣａＰ前立腺癌細胞におけるＴＭＣＢ１３２の投与に応答して観察された。
【０５３２】
インビトロでのＴＭＣＢ１３２のＴ細胞媒介性細胞障害性
Ｔ細胞媒介性細胞障害アッセイを使用して、Ｉｎｃｕｃｙｔｅプラットフォーム上でライブタイムラスプイメージングを使用して、インビトロでのＴＭＣＢ１３２の細胞障害性の可能性を評価した。健康なドナーから単離したｐａｎヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下で、ＴＭＥＦＦ２陽性細胞株ＬｎＣａＰでのＴＭＣＢ１３２を３：１の（エフェクター：標的）エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ比）で試験した。９６時間の期間にわたって活性カスパーゼ３／７の蛍光シグナルを測定することによって、アポトーシスによる細胞死を監視した。ＴＭＣＢ１３２は、時間の増加とともに、生存ＬｎＣａＰ細胞の用量依存的な低減を促進した。カスパーゼ３／７活性又は蛍光シグナルの用量依存的増加は、Ｔ細胞の存在下でＬｎＣａＰ細胞における細胞死を示した（図８）。データは、ＴＭＣＢ１３２が、ＬｎＣａＰ腫瘍細胞においてＴ細胞媒介性死を誘導するのに有効であることを示唆している。
【０５３３】
Ｔ細胞ヒト化マウスで確立されたＳＣヒト前立腺異種移植片におけるＴＭＣＢ１３２の有効性。
ＴＭＣＢ１３２の抗腫瘍有効性を、２０ｅ６Ｔ細胞でヒト化した雄Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ，Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ））マウスで確立された皮下（subcutaneous、ＳＣ）ヒト前立腺ＬＮＣａＰ異種移植片において評価した。ＮＳＧ雄。腫瘍移植１３日後に平均腫瘍体積によって、動物を、各１０匹の動物群に無作為化した。０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ１３２、又は０．５ｍｇ／ｋｇのｎｕｌｌｘＣＤ３Ｂ２１９抗体対照を、４週間の間週２回ＩＰ投与した。腫瘍移植４５日後に群当たり少なくとも７匹の動物が残存した場合、腫瘍体積によって決定された腫瘍成長阻害（ＴＧＩ％）を計算した。統計的に著しい腫瘍成長阻害は、ｎｕｌｌｘＣＤ３対照と比較して、０．５及び０．１ｍｇ／ｋｇ、並びに０．０５ｍｇ／ｋｇのＴＭＣＢ１３２で観察された（図９、ｐ≦０．０００１）。ｎｕｌｌｘＣＤ３処置対照と比較して、０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇでのＴＭＣＢ１３２では、それぞれ１０２％、１０９％、及び４７％の腫瘍成長阻害が誘導された。ＴＭＣＢ１３２治療は、それぞれ０．５、０．１、及び０．０５ｍｇ／ｋｇで３、２、及び１匹に完全応答を生じた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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