(57)【要約】  本発明は、リンパ球を含む対象からのサンプルまたはそのサンプルに由来するリンパ球を、抗原を含む１つまたは複数のペプチドの存在下および／または抗原を提示する抗原提示細胞の存在下で培養することにより、抗原特異的リンパ球を拡大する方法に関する。個別化免疫療法（例えば、腫瘍免疫療法）を改善するためのそのような方法の使用も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的リンパ球を拡大する方法であって、
ａ）対象から得られたサンプル中のリンパ球またはそのようなサンプルから単離されたリンパ球を拡大するステップであって、前記拡大は少なくとも２つの拡大フェーズを含むステップ；
ｂ）前記少なくとも２つの拡大フェーズのうちの少なくとも第１の拡大フェーズ中に１つまたは複数のペプチドを添加するステップであって、前記ペプチドの各々は異なる抗原を含み、抗原特異的リンパ球が拡大されるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも２つの拡大フェーズは、第１の拡大および第２の拡大を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の拡大が、ＣＤ３複合体アゴニスト、マイトジェン、またはフィーダー細胞の少なくとも１つの存在下で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）が、少なくとも２つの拡大フェーズのうちの少なくとも１つの拡大フェーズ中に２つ以上のペプチドを添加することを含み、前記ペプチドのそれぞれが異なる抗原を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）が、少なくとも２つの拡大フェーズのうちの少なくとも１つの拡大フェーズの開始時にペプチドを添加することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）が、ペプチドを少なくとも１回再添加することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）が、最初の添加後に毎日、ペプチドを再添加することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）が、最初の添加後に隔日で、ペプチドを再添加することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが初日から少なくとも２日後に再添加される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが第２の拡大中に存在しない、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが可溶性形態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが約０．１ｎＭ〜約１００μＭの濃度である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが約１μΜの濃度で存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドが第１の拡大の開始時に添加される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが、第１の拡大の開始時および隔日で２日間添加される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプル中に存在する細胞とＡＰＣとの比が約１：１〜約１：１００である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記比が約１：１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
リンパ球とＡＰＣとの比が約０．０１：１〜約１００：１であり、リンパ球がサンプルから単離される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記比が約１：１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１の拡大の開始時にＡＰＣが添加される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＡＰＣが可溶性ペプチドとプレインキュベートされている、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドが約９アミノ酸長〜約３１アミノ酸長である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドが９または１０アミノ酸長である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ペプチドが１２〜１５アミノ酸長である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドが約２５〜約３１アミノ酸長である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ペプチドが約２〜約３００の異なるペプチドのプールに存在する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ペプチドが、約２〜約１００、約１０〜約１００、約２０〜約１００、約３０〜約１００、約４０〜約１００、約５０〜約１００、約６０〜約１００、約７０〜約１００、約８０〜約１００、または約９０〜約１００の異なるペプチドのプールに存在する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペプチドが、約２０〜約５０の異なるペプチドのプールに存在する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ペプチドが約２〜約１０の異なるペプチドのプールに存在する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペプチドが、約２〜約５の異なるペプチドのプールに存在する、請求項１〜２８および３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡＰＣが、その表面上に前記ペプチドを発現するように改変されている、請求項１６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＡＰＣが、前記ペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをＡＰＣに導入するために、トランスフェクション、形質導入、または一時的な細胞膜破壊の少なくとも１つによって改変される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記ペプチドをコードするＤＮＡプラスミドおよび／またはｍＲＮＡである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｍＲＮＡが、約５０〜約５０００ヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ｍＲＮＡが、約７５〜約４０００、約７５〜約３０００、約７５〜約２０００、約７５〜約１０００、約７５〜約５００ヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドが、前記ペプチドをコードする１〜約１５個の遺伝子を含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドが、単一のペプチドをコードする１つの遺伝子から本質的になる、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｍＲＮＡが、前記ペプチドをコードする少なくとも２個の遺伝子をタンデムに含む少なくとも１つのポリヌクレオチドである、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｍＲＮＡが、前記ペプチドをコードする少なくとも２個の遺伝子をタンデムに含む単一のポリヌクレオチドである、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ペプチドをコードする合計約２〜約４０個の遺伝子が存在する、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ペプチドをコードする合計約２〜約１５個の遺伝子が存在する、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ペプチドをコードする合計約２〜約５個の遺伝子が存在する、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
各ポリヌクレオチドが、ペプチドをコードする５個の遺伝子を含む、請求項３４〜３７または３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
各遺伝子が、抗原内に見られる個々の変異アミノ酸を中心とする約９〜約３１アミノ酸長のポリペプチドをコードする、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記遺伝子がリンカーによって分離されている、請求項３４〜３７または３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＡＰＣが少なくとも１つの免疫調節物質を発現するように改変され、前記免疫調節物質が、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ７０、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＣＤ１２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３）、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ−Ｌ（ＣＤ２７５）、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０）、ＣＤ６６２Ｌ、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、Ｂｃｌ−６、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、ＭＣＬ１、またはＳＴＡＴ−５、あるいはＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路、ＢＣＲシグナル伝達経路、またはＢＡＦＦ−ＢＡＦＦＲシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つの経路の活性化因子の少なくとも１つである、請求項１６〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記免疫調節物質が、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、またはＩＬ−１２の少なくとも１つである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＡＰＣが、少なくとも１つの免疫調節物質を導入するために、トランスフェクション、形質導入、または一時的な細胞膜破壊の少なくとも１つによって改変される、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＡＰＣが、免疫調節物質を一過性発現するように改変される、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＡＰＣが、免疫調節物質を安定発現するように改変される、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＡＰＣが、第１の拡大の開始時に添加され、少なくとも１日さらに添加される、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＡＰＣが、第１の拡大の開始時に添加され、最初の添加から１０日後に再び添加される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
トランスフェクションがエレクトロポレーションにより行われる、請求項３３〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ペプチドが予測モデリングにより同定されたものである、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ペプチドが、全エクソームシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、またはＲＡシーケンシングにより同定されたものである、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチドが質量分析により同定されたものである、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗原が、抗原特異的変異の同定に基づき事前選択されたものである、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗原が、抗原特異的変異の同定に基づき事前選択されたものである、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ステップａ）が、少なくとも１つの拡大促進剤の存在下でリンパ球を拡大させることを含む、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記拡大促進剤の少なくとも１つが免疫調節剤である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記拡大促進剤の少なくとも１つがサイトカインである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記サイトカインが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、またはインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）の少なくとも１つである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記拡大促進剤の少なくとも１つが可溶性分子である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記可溶性分子が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＦ１、ＣＤ３９、またはＢＡＴＦの少なくとも１つに対するアンタゴニストである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記拡大促進剤の少なくとも１つが、リンパ球の拡大に有利に働く抗体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記リンパ球の拡大に有利に働く抗体が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＦ１、ＣＤ３９、またはＢＡＴＦの少なくとも１つに対する抗体である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記拡大促進剤の少なくとも１つがＩＬ−２である、請求項６０〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ＩＬ−２が、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１０，０００ＩＵ／ｍｌの範囲内で第１の拡大中に存在する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ＩＬ−２が、約６，０００ＩＵ／ｍｌの濃度で第１の拡大中に存在する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ＩＬ−２が、約５０ＩＵ／ｍｌ〜約１０，０００ＩＵ／ｍｌの範囲内で第２の拡大中に存在する、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ＩＬ−２が、約３，０００ＩＵ／ｍｌの濃度で第２の拡大中に存在する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ＣＤ３複合体アゴニストが抗ＣＤ３複合体アゴニスト抗体である、請求項３〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
抗ＣＤ３複合体抗体がＯＫＴ−３である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
マイトジェンが、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）、メゼレイン（Ｍｚｎ）、またはテトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）の少なくとも１つである、請求項３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
フィーダー細胞が自己由来である、請求項３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
フィーダー細胞が同種異系である、請求項３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
フィーダー細胞が照射される、請求項３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
フィーダー細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項３〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
フィーダー細胞とリンパ球とが約１０００：１〜約１：１の比で存在する、請求項３〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
フィーダー細胞とリンパ球とが１００：１の比で存在する、請求項３〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１の拡大が、サンプル中に存在し得る他の細胞よりもリンパ球の成長に有利に働く条件下でリンパ球を拡大することを含む、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
抗原特異的リンパ球が、非抗原特異的リンパ球よりも優先的に拡大される、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記リンパ球が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記リンパ球が末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である、請求項１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記サンプルが流入領域リンパ節から得られたものである、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記サンプルが、未処理の腫瘍断片、酵素処理された腫瘍断片、解離／懸濁腫瘍細胞、リンパ節サンプル、または体液サンプルである、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記酵素処理された腫瘍断片が、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ、リベラーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）の少なくとも１つで処理されたものである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記体液が、血液、腹水、またはリンパ液である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記リンパ球がＴ細胞である、請求項１〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＡＰＣが活性化される、請求項１６〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＡＰＣが自己由来である、請求項１６〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＡＰＣが同種異系である、請求項１６〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記ＡＰＣが人工ＡＰＣである、請求項１６〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＡＰＣが、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、またはランゲルハンス細胞の少なくとも１つである、請求項１６〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＡＰＣがＢ細胞である、請求項１６〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記Ｂ細胞がＣＤ１９＋細胞のポジティブセレクションにより単離される、請求項９８または請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｂ細胞が、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２１、またはＩＬ−４の少なくとも１つとのインキュベーションによって活性化される、請求項９８〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記Ｂ細胞が、Ｂｃｌ−６、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、ＭＣＬ１、またはＳＴＡＴ−５、あるいはＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路、ＢＣＲシグナル伝達経路、またはＢＡＦＦ−ＢＡＦＦＲシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つ経路の活性化因子の少なくとも１つと共にさらに培養される、請求項９７〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記抗原が、腫瘍抗原、翻訳後修飾、長鎖非コード抗原、またはウイルス抗原である、請求項１〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記抗原が腫瘍抗原であり、該腫瘍抗原は、共通腫瘍抗原、過剰発現された腫瘍抗原、異常発現された腫瘍抗原、または腫瘍特異的ネオ抗原である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記腫瘍特異的ネオ抗原が標準ネオ抗原または非標準ネオ抗原である、請求項１０４記載の方法。
【請求項１０６】
前記腫瘍抗原が固形腫瘍に由来する、請求項１０４または１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記腫瘍抗原が、卵巣腫瘍、黒色腫、肺腫瘍、乳房腫瘍、白血病、または胃腸腫瘍の少なくとも１つに由来する、請求項１０３〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
培養後に抗原特異的リンパ球を単離することをさらに含む、請求項１〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
培養前に対象からサンプルを得ることをさらに含む、請求項１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
培養前にサンプルからリンパ球を単離することをさらに含む、請求項１〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
培養前にサンプルから抗原特異的リンパ球を単離することをさらに含む、請求項１〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
リンパ球の頻度を増加させる、請求項１〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
抗原特異的リンパ球の頻度を増加させる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
第１の拡大中のペプチドへの曝露により、第２の拡大のみでペプチドに曝露された抗原特異的リンパ球と比較して、疲弊が少ない抗原特異的リンパ球がもたらされる、請求項１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
第２の拡大中にはペプチドに曝露しないで第１の拡大中にペプチドに曝露することにより、第１および第２の拡大中にペプチドに曝露された抗原特異的リンパ球と比較して、疲弊が少ない抗原特異的リンパ球がもたらされる、請求項１０〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
第２の拡大中にはペプチドに曝露しないで第１の拡大中にペプチドに曝露することにより、第２の拡大中にのみペプチドに曝露された抗原特異的リンパ球と比較して、疲弊が少ない抗原特異的リンパ球がもたらされる、請求項１０〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
抗原特異的リンパ球を対象に再導入することをさらに含む、請求項１〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記対象がヒトである、請求項１〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
請求項１〜１１８のいずれか一項に記載の方法によって生成された抗原特異的リンパ球の集団。
【請求項１２０】
請求項１１９に記載のリンパ球の有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において腫瘍を処置する方法。
【請求項１２１】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記腫瘍が、卵巣腫瘍、黒色腫、肺腫瘍、胃腸腫瘍、乳房腫瘍、または白血病である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記腫瘍が、腫瘍抗原を含む少なくとも１つのペプチドと一致する変異を発現する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記対象がヒトである、請求項１１８〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる２０１７年１１月６日出願の米国仮出願第６２／５８２，１６３号に基づく優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、抗原を含む１つまたは複数のペプチドの存在下および／または抗原を提示する抗原提示細胞の存在下で、リンパ球を含む対象からのサンプルを培養することにより、または前記サンプル由来のリンパ球を培養することにより、抗原特異的リンパ球を拡大する方法に関する。個別化免疫療法を改善するためのそのような方法の使用も開示する。
【背景技術】
【０００３】
免疫原性腫瘍は、さまざまな免疫療法的介入の恩恵を受けることができる。それらの中で、自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子細胞移入（ＡＣＴ）は、腫瘍退縮を媒介するのに効果的である。
【０００４】
最近の技術の進歩により、非同義体細胞腫瘍変異により生じるいわゆる腫瘍ネオ抗原に対するＴ細胞特異性の同定が加速している。ネオ抗原（ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）は、腫瘍特異性が高いためだけでなく、高アビディティおよび／または親和性のネオ抗原特異的Ｔ細胞は胸腺によって対抗選択されるべきではないため、免疫療法の理想的な潜在的標的である（非特許文献１〜３）２−４。ネオ抗原は成功した免疫チェックポイント阻害療法の鍵となるメディエーターであることが示されている（非特許文献４〜６）５−７だけでなく、ＡＣＴでの使用にも成功している（非特許文献７および８）８−９。最後に、いくつかのグループは、ネオ抗原特異的Ｔ細胞によって媒介される腫瘍退縮の直接的な証拠を提供する。実際に、Ｔｒａｎらは、上皮がんにおけるネオ抗原反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞のＡＣＴによって後者を初めて実証した（非特許文献９）１０。最近では、ＳａｈｉｎおよびＯｔｔは、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、個別化ネオ抗原ワクチン接種（それぞれ、ｍＲＮＡ１１およびペプチド１２ベース）で治療したメラノーマ患者による完全な反応を実証した（非特許文献１０および１１）１１、１２。
【０００５】
ＴＩＬの拡大のための現在のプロトコルは、通常、２つの主要な増幅プロセスを伴う。初期のＴＩＬ培養は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を豊富に含む培地で腫瘍サンプルを培養して、初期のバルク量のＴＩＬを取得することを含む。この初期フェーズ中に得られたＴＩＬは、通常、その後に急速増幅プロトコル（「ＲＥＰ」）を受ける。ＲＥＰプロセスは、ＴＩＬの最終的な数を１０９〜１０１１のオーダーに増加させる。
【０００６】
従来のＴＩＬの拡大はがん患者に有用であったが、当技術分野ではＴＩＬ培養プロセスを最適化して、ネオ抗原特異的Ｔ細胞クローンの回収を最大化する、またはネオ抗原特異的ＴＩＬを濃縮する必要がある。本明細書に開示される発明は、この必要性に対処し、かつ腫瘍特異的ネオ抗原以外の他の抗原にも適用可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hacohen, N., Fritsch, E. F., Carter, T. A., Lander, E. S. & Wu, C. J. Getting Personal with Neoantigen- Based Therapeutic Cancer Vaccines. Cancer Immunol. Res. 1, 11-15 (2013)
【非特許文献２】Schumacher, T. N. & Schreiber, R. D. Neoantigens in cancer immunotherapy. Science (80- . ). 348, 69-74 (2015)
【非特許文献３】Schumacher, T. N. & Hacohen, N. Neoantigens encoded in the cancer genome. Current Opinion in Immunology 41, 98-103 (2016)
【非特許文献４】Rizvi, N. A. et al. Mutational landscape determines sensitivity to PD- 1 blockade in non- small cell lung cancer. Science (80- . ). 348, 124-128 (2015)
【非特許文献５】Yarchoan, M., Johnson, B. A., Lutz, E. R., Laheru, D. A. & Jaffee, E. M. Targeting neoantigens to augment antitumour immunity. Nat. Rev. Cancer (2017). doi:10.1038/nrc.2016.154
【非特許文献６】McGranahan, N. et al. Clonal neoantigens elicit T cell immunoreactivity and sensitivity to immune checkpoint blockade. Science (80- . ). 351(6280), 1463-9 (2016)
【非特許文献７】Prickett, T. D. et al. Durable Complete Response from Metastatic Melanoma after Transfer of Autologous T Cells Recognizing 10 Mutated Tumor Antigens. Cancer Immunol. Res. 4, 669-678 (2016)
【非特許文献８】Zhou, J., Dudley, M. E., Rosenberg, S. a & Robbins, P. F. Persistence of multiple tumor- specific T cell clones is associated with complete tumor regression in a melanoma patient receiving adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 28, 53-62 (2005)
【非特許文献９】Tran, E. et al. Cancer Immunotherapy Based on Mutation- Specific CD4+ T Cells in a Patient with Epithelial Cancer. Science (80- . ). 9, 641-645 (2014)
【非特許文献１０】Sahin, U. et al. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly- specific therapeutic immunity against cancer. Nature (2017). doi:10.1038/nature23003
【非特許文献１１】Ott, P. A. et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma. Nature (2017). doi:10.1038/nature22991
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
当技術分野では、個別化免疫療法を改善する大きな必要性がある。本発明は、対象からのリンパ球を含むサンプル、またはそれに由来するリンパ球を、抗原を含む１つまたは複数のペプチドの存在下で培養することにより、抗原特異的リンパ球を濃縮（または富化）（enrich）する方法を提供することによって、この必要性および他の必要性に対処する。
【０００９】
一態様では、本発明は、対象から得られたサンプルまたはそれに由来するリンパ球を１つまたは複数のペプチドの存在下で培養することを含み、前記ペプチドのそれぞれが異なる抗原を含む、ｅｘ  ｖｉｖｏでネオ抗原特異的リンパ球を濃縮（enrichment）および拡大（expansion）する方法を提供する。
【００１０】
本発明の方法では、任意の数のペプチドを使用することができる。好ましくは、異なるペプチドの数は、いくつかのＴ細胞クロノタイプの最適以下の刺激を回避するためにＭＨＣ分子の競合が最小化されるような数であるべきである。いくつかの実施形態では、この方法は、２つ以上のペプチドの存在下で培養することを含み、前記ペプチドのそれぞれは、異なる腫瘍特異的ネオ抗原を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、１〜３００のペプチドの存在下で培養することを含み、前記ペプチドのそれぞれは、異なる腫瘍特異的ネオ抗原を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、１〜１００のペプチドの存在下で培養することを含み、前記ペプチドのそれぞれは、異なる腫瘍特異的ネオ抗原を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、２０〜５０のペプチドの存在下で培養することを含み、前記ペプチドのそれぞれは、異なる腫瘍特異的ネオ抗原を含む。
【００１１】
一態様では、本明細書に記載されるのは、対象から得られたサンプル中のリンパ球またはそのようなサンプルから単離されたリンパ球を拡大することを含む、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的リンパ球を拡大する方法であって、拡大は、拡大中に１つまたは複数のペプチドを添加することを含み、前記ペプチド（単数または複数）のそれぞれは異なる抗原を含み、抗原特異的リンパ球が拡大される。ある実施形態では、この方法は、２つ以上のペプチド（すなわち、異なるペプチドのプール）を添加することを含む。ある実施形態では、１つの拡大フェーズが行われ、その拡大フェーズは、プレ急速拡大プロトコル（pre-rapid expansion protocol）（プレＲＥＰ）である。ある実施形態では、第１の拡大は、サンプル中に存在し得る他の細胞よりもリンパ球の成長に有利に働く条件下でリンパ球を拡大することを含む。ある実施形態では、抗原特異的リンパ球は、非抗原特異的リンパ球よりも優先的に拡大される。
【００１２】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的リンパ球を拡大する方法であって、ａ）対象から得られたサンプル中のリンパ球またはそのようなサンプルから単離されたリンパ球を拡大すること、ここで拡大は少なくとも２つの拡大フェーズを含む、およびｂ）少なくとも２つの拡大フェーズのうちの少なくとも１つの拡大フェーズ中に、１つまたは複数のペプチドを添加することを含み、前記ペプチドのそれぞれは異なる抗原を含み、抗原特異的リンパ球が拡大される。ある実施形態では、第１の拡大は、サンプル中に存在し得る他の細胞よりもリンパ球の成長に有利に働く条件下でリンパ球を拡大することを含む。ある実施形態では、抗原特異的リンパ球は、非抗原特異的リンパ球よりも優先的に拡大される。
【００１３】
ある実施形態では、少なくとも２つの拡大フェーズは、第１の拡大および第２の拡大を含む。ある実施形態では、第１の拡大は、第２の拡大の直前に起こる。ある実施形態では、ペプチドは、第２の拡大中には存在しない。
【００１４】
ある実施形態では、第１の拡大と第２の拡大との間に１つまたは複数の追加の拡大が生じる。ある実施形態では、第２の拡大は、ＣＤ３複合体アゴニスト、マイトジェン、またはフィーダー細胞の少なくとも１つの存在下で行われる。ある実施形態では、ＣＤ３複合体アゴニストは、抗ＣＤ３複合体アゴニスト抗体（例えば、ＯＫＴ−３）である。ある実施形態では、マイトジェンは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）、ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）、メゼレイン（Ｍｚｎ）、またはテトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）の少なくとも１つである。ある実施形態では、フィーダー細胞は、自己由来、同種異系由来、および／または照射されている。ある実施形態では、フィーダー細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ある実施形態では、フィーダー細胞とリンパ球とが約１０００：１〜約１：１の比で存在する。他の実施形態では、フィーダー細胞とリンパ球とが約１００：１の比で存在する。
【００１５】
ある実施形態では、ステップｂ）は、少なくとも２つの拡大フェーズのうちの少なくとも１つのフェーズ中に２つ以上のペプチドを添加することを含み、前記ペプチドのそれぞれは異なる抗原を含む。他の実施形態では、ステップｂ）は、少なくとも２つの拡大フェーズのうちの少なくとも１つのフェーズの開始時にペプチドを添加することを含む。追加の実施形態では、ステップｂ）は、少なくとも１回ペプチドを再添加することをさらに含む。さらに追加の実施形態では、ステップｂ）は、最初の添加後、毎日ペプチドを再添加することをさらに含む。さらに別の実施形態では、ステップｂ）は、最初の添加後、隔日でペプチドを再添加することをさらに含む。
【００１６】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、ペプチドは、最初の日から少なくとも２日後に再添加される。
【００１７】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、ペプチドは可溶性形態である。ある実施形態では、ペプチドは、約０．１ｎＭ〜約１００μＭの濃度である。ある実施形態では、ペプチドは、約９アミノ酸長〜約３１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは９または１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは１２〜１５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２５〜約３１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２〜約３００の異なるペプチドのプールに存在する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２〜約３００の異なるペプチドのプールに存在する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２〜約１００、約１０〜約１００、約２０〜約１００、約３０〜約１００、約４０〜約１００、約５０〜約１００、約６０〜約１００、約７０〜約１００、約８０〜約１００、または約９０〜約１００の異なるペプチドのプールに存在する。ある実施形態では、ペプチドは、約２０〜約５０の異なるペプチドのプールに存在する。ある実施形態では、ペプチドは、約２〜約１０の異なるペプチドのプールに存在する。他の実施形態では、ペプチドは、約２〜約５の異なるペプチドのプールに存在する。ある実施形態では、ペプチドは、約１μＭの濃度で存在する。
【００１８】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、ペプチドは、第１の拡大の開始時に添加される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、第１の拡大の開始時および隔日で２日間添加される。
【００１９】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、ペプチドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示される。ある実施形態では、サンプル（例えば、組織または体液）中に存在する細胞とＡＰＣとの比（細胞：ＡＰＣ）は、約１：１〜約１：１００である。ある実施形態では、サンプル中に存在する細胞とＡＰＣとの比は約１：１である。他の実施形態では、リンパ球とＡＰＣとの比（リンパ球：ＡＰＣ）は約０．０１：１〜約１００：１であり、リンパ球はサンプルから単離される。ある実施形態では、リンパ球とＡＰＣとの比は約１：１である。ある実施形態では、ペプチドを提示するＡＰＣは、第１の拡大の開始時に添加される。
【００２０】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、ＡＰＣは、可溶性形態のペプチドとプレインキュベートされている。ある実施形態では、ペプチドは、約９アミノ酸長〜約３１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは９または１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは１２〜１５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２５〜約３１アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２〜約３００の異なるペプチドのプールに存在する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約２〜約１００、約１０〜約１００、約２０〜約１００、約３０〜約１００、約４０〜約１００、約５０〜約１００、約６０〜約１００、約７０〜約１００、約８０〜約１００、または約９０〜約１００の異なるペプチドのプールに存在する。ある実施形態では、ペプチドは、約２０〜約５０の異なるペプチドのプールに存在する。ある実施形態では、ペプチドは、約２〜約１０の異なるペプチドのプールに存在する。他の実施形態では、ペプチドは、約２〜約５の異なるペプチドのプールに存在する。ある実施形態では、ペプチドは、約１μＭまたは２μＭの濃度で存在する。
【００２１】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、ＡＰＣは、前記ペプチドをその表面上に発現するように改変されている。ある実施形態では、前記ペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをＡＰＣに導入するために、ＡＰＣは、トランスフェクション、形質導入、または一時的な細胞膜破壊の少なくとも１つによって改変される。ある実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、前記ペプチドをコードするＤＮＡプラスミドおよび／またはｍＲＡである。ある実施形態では、ｍＲＮＡは、約５０〜約５０００ヌクレオチドを含む。別の態様において、ｍＲＮＡは、約７５〜約４０００、約７５〜約３０００、約７５〜約２０００、約７５〜約１０００、約７５〜約５００のヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、ペプチドをコードする１〜約１５個の遺伝子を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単一のペプチドをコードする１つの遺伝子から本質的になる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、前記ペプチドをコードする少なくとも２個の遺伝子をタンデムに含む少なくとも１つのポリヌクレオチドである。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、前記ペプチドをコードする少なくとも２個の遺伝子をタンデムに含む単一のポリヌクレオチドである。ある実施形態では、ペプチドをコードする合計約２〜約４０個、約２〜約１５個、または約２〜約５個の遺伝子が存在する。ある実施形態では、各ポリヌクレオチドは、ペプチドをコードする５個の遺伝子を含む。ある実施形態では、各遺伝子は、抗原内に見られる個々の変異アミノ酸を中心とする約９〜約３１アミノ酸長のポリペプチドをコードし、遺伝子は任意選択でリンカーによって分離されていてもよい。
【００２２】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、ＡＰＣは、少なくとも１つの免疫調節物質を発現するように改変され、免疫調節物質は、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ７０、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＣＤ１２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３）、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ−Ｌ（ＣＤ２７５）、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０）、ＣＤ６６２Ｌ、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、Ｂｃｌ−６、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、ＭＣＬ１、またはＳＴＡＴ−５；あるいは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路、ＢＣＲシグナル伝達経路、またはＢＡＦＦ−ＢＡＦＦＲシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つの経路の活性化因子である。ある実施形態では、免疫調節物質は、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、またはＩＬ−１２の少なくとも１つである。ある実施形態では、ＡＰＣは、免疫調節物質を一過性発現または安定発現するように改変される。ある実施形態では、改変ＡＰＣは（engineered APC）、第１の拡大の開始時に添加され、少なくとも１日さらに添加される。ある実施形態では、改変ＡＰＣは、第１の拡大の開始時に添加され、最初の添加から１０日後に再び添加される。
【００２３】
本明細書に記載の方法のある実施形態において、ＡＰＣは、少なくとも１つの免疫調節物質を導入するために、トランスフェクション、形質導入、または一時的な細胞膜破壊の少なくとも１つによって改変される。ある実施形態では、トランスフェクションはエレクトロポレーションによって行われる。
【００２４】
ある実施形態では、ペプチドは、予測モデリング、全エクソームシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、または質量分析により同定されている。ある実施形態では、抗原は、抗原特異的変異の同定に基づいて事前選択されている。他の実施形態では、抗原は、抗原特異的変異の同定に基づいて事前選択されている。
【００２５】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、リンパ球は、少なくとも１つの拡大促進剤（expansion-promoting agent）の存在下で拡大される。ある実施形態では、拡大促進剤は免疫調節剤である。ある実施形態では、免疫調節剤は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ）−１５）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、またはインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）などのサイトカインであるが、これらに限定されない。ある実施形態では、拡大促進剤は、可溶性分子（例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＦ１、ＣＤ３９、またはＢＡＴＦの少なくとも１つに対するアンタゴニスト）である。他の実施形態では、拡大促進剤は、リンパ球の拡大に有利に働く抗体（例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＦ１、ＣＤ３９またはＢＡＴＦの少なくとも１つに対する抗体）である。ある実施形態では、拡大促進剤はＩＬ−２である。ある実施形態では、ＩＬ−２は、第１の拡大中に約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１０，０００ＩＵ／ｍｌの範囲内で存在する。ある実施形態では、ＩＬ−２は、第１の拡大中に約６，０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。ある実施形態では、ＩＬ−２は、第２の拡大中に約５０ＩＵ／ｍｌ〜約１０，０００ＩＵ／ｍｌの範囲内で存在する。ある実施形態では、ＩＬ−２は、第２の拡大中に約３，０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。
【００２６】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、リンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および／または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である。ある実施形態では、リンパ球はＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞）である。
【００２７】
ある実施形態では、サンプルは、流入領域リンパ節（draining lymph node）から得られる。他の実施形態では、サンプルは、未処理の腫瘍断片、酵素処理された腫瘍断片、解離／懸濁（dissociated/suspended）腫瘍細胞、リンパ節サンプル、または体液（例えば、血液、腹水、またはリンパ液）サンプルである。ある実施形態では、酵素処理された腫瘍断片は、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ、リベラーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）の少なくとも１つで処理されている。
【００２８】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、ＡＰＣは活性化される。ある実施形態では、ＡＰＣは、自己、同種異系、または人工のものである。ある実施形態では、ＡＰＣは、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、またはランゲルハンス細胞である。ある実施形態では、ＡＰＣはＢ細胞（例えば、ＣＤ１９＋）である。ある実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２１、またはＩＬ−４の少なくとも１つとのインキュベーションによって活性化される。ある実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂｃｌ−６、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、ＭＣＬ１、またはＳＴＡＴ−５、あるいはＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路、ＢＣＲシグナル伝達経路、またはＢＡＦＦ−ＢＡＦＦＲシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つの経路の活性化因子の少なくとも１つと共にさらに培養される。
【００２９】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、翻訳後修飾、長鎖非コード抗原、またはウイルス抗原である。ある実施形態では、腫瘍抗原は、共通腫瘍抗原（shared tumor antigen）、過剰発現された腫瘍抗原、異常発現された腫瘍抗原、または腫瘍特異的ネオ抗原である。ある実施形態では、腫瘍特異的ネオ抗原は、標準（canonical）ネオ抗原または非標準（non-canonical）ネオ抗原である。ある実施形態では、腫瘍抗原は、固形腫瘍（例えば、卵巣腫瘍、黒色腫、肺腫瘍、乳房腫瘍、または胃腸腫瘍）、または液性腫瘍（例えば、白血病、またはリンパ腫）に由来する。
【００３０】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、この方法は、培養後に抗原特異的リンパ球を単離することをさらに含む。ある実施形態では、この方法は、培養前に対象からサンプルを得ることをさらに含む。ある実施形態では、この方法は、培養前にサンプルからリンパ球を単離することをさらに含む。ある実施形態では、この方法は、培養前にサンプルから抗原特異的リンパ球を単離することをさらに含む。
【００３１】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、第１の拡大中のペプチドへの曝露は、リンパ球の頻度の改善をもたらす。ある実施形態では、第１の拡大中のペプチドへの曝露は、抗原特異的リンパ球の頻度の改善をもたらす。ある実施形態では、リンパ球および／または抗原特異的リンパ球の頻度の改善は、リンパ球が第１の拡大中にペプチドに曝露されない方法よりも優れている。
【００３２】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、第１の拡大中のペプチドへの曝露により、第２の拡大でのみペプチドに曝露された抗原特異的リンパ球と比較して、疲弊（exhaustion）が少ない抗原特異的リンパ球がもたらされる。他の実施形態では、第２の拡大中にはペプチドに曝露しないで第１の拡大中にペプチドに曝露することにより、第１および第２の拡大中にペプチドに曝露された抗原特異的リンパ球と比較して、疲弊が少ない抗原特異的リンパ球がもたらされる。さらに他の実施形態では、第２の拡大中にはペプチドに曝露しないで第１の拡大中にペプチドに曝露することにより、第２の拡大中にのみペプチドに曝露された抗原特異的リンパ球と比較して、疲弊が少ない抗原特異的リンパ球がもたらされる。
【００３３】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、この方法は、抗原特異的リンパ球を対象に再導入することをさらに含む。
【００３４】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、対象はヒトである。
【００３５】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって生成される抗原特異的リンパ球の集団に関する。
【００３６】
別の態様では、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載の方法により生成されるリンパ球の有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において腫瘍を処置する方法である。ある実施形態では、腫瘍は固形腫瘍（例えば、卵巣腫瘍、黒色腫、肺腫瘍、胃腸腫瘍、乳房腫瘍）である。ある実施形態では、腫瘍は液性腫瘍（例えば、白血病、またはリンパ腫）である。ある実施形態では、腫瘍は、腫瘍抗原を含む少なくとも１つのペプチドと一致する変異を発現する。ある実施形態では、対象はヒトである。
【００３７】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明、特許請求の範囲、および図面において当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した、卵巣腫瘍単細胞懸濁液から生成されたＴＩＬのＴ細胞反応性の代表的な例を示す。ＴＩＬ生成には次の条件を使用した：ＩＬ−２単独（従来）、あるいはＩＬ−２と抗ＣＴＬＡ４（４ｍＡＢ）および抗ＰＤｌ（１０μｇ／ｍｌ）阻害剤との組合せ（図１Ａ）、またはＩＬ−２と変異ペプチド（プライベート予測ネオ抗原プール；図１Ｂ）との組合せ。５０〜１００のプライベートペプチドのプール（すなわち、この患者について具体的に予測される）を使用した。ペプチドは９〜１０アミノ酸長であった。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ペプチド−ＭＨＣマルチマー染色によりネオ抗原特異的ＴＩＬの存在について照合した、従来の（ＩＬ−２のみ）ＴＩＬおよびプライミングされた（ＩＬ−２＋プライベート予測ネオ抗原のプール）ＴＩＬの代表的な例を示す。卵巣がん患者のＣＴＥ−００１１（図２Ａ）およびＣＴＥ−００１３（図２Ｂ）からのＴＩＬ培養物を、図１に示すようにＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された予測ペプチドとＴ細胞応答のセットで最初に照合した。デコンボリューションおよび単一免疫原性ペプチドの同定の後、マルチマー染色により検証（validation）を行った。患者ＣＴＥ−００１１の場合、ＳＥＰＴ９Ｒ２８９Ｈ特異的Ｔ細胞が従来のＴＩＬとプライミングされたＴＩＬとで異なる頻度で検出された；患者ＣＴＥ−００１３の場合、ＨＨＡＴＬ７５Ｆ特異的Ｔ細胞が、プライミングされたＴＩＬでのみ明らかとなった。これらのアッセイは、抗ＰＤ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体の存在下で腫瘍断片を用いて行った。５０〜１００のプライベートペプチドのプール（すなわち、この患者について具体的に予測される）を使用した。ペプチドは９〜１０アミノ酸長であった。
【図３】従来の（ＩＬ−２のみ、ｘ軸）およびプライミングされた（ＩＬ−２＋予測ネオ抗原のプール、ｙ軸）卵巣腫瘍サンプルの単細胞懸濁液からのＴＩＬ培養物で検出されたネオ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の頻度の累積分析を示す。
【図４】ネオ抗原特異的ＴＩＬの存在について照合した、従来の（ＩＬ−２のみ）およびプライミングされた（ＩＬ−２＋予測ネオ抗原のプール）メラノーマ患者からのＴＩＬの代表的な例を示す。５０〜１００のプライベートペプチドのプール（すなわち、この患者について具体的に予測される）を使用した。ペプチドは９〜１０アミノ酸長であった。
【図５】流入領域リンパ節からのネオ抗原特異的ＴＩＬの拡大を示す。患者ＣＴＥ−０００９の「従来の」ＴＩＬと「プライミングされた」ＴＩＬの両方を、本明細書に記載の方法に従って、流入領域リンパ節の単細胞懸濁液から作成した。４つの予測ペプチドのそれぞれに対するおよび対応する野生型（ｗｔ）ペプチドに対するネオ抗原Ｔ細胞反応性の存在について、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴによって１４日目に各培養物を調べた。ペプチド＃３（ｐｅｐ３ｍｕｔ）に特異的なＴ細胞が、プライミングされた培養物でのみ明らかになった（ｗｔでは見られない）。ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。ＰＨＡは１μｇ／ｍｌで使用した。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは本明細書に開示される非限定的な実施形態のスキーマを示す。図６Ａは、タンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）の原理を示し、各ミニ遺伝子は、個々の点変異を中心とする３１ｍｅｒをコードする。図６Ａは配列番号２６１の配列を開示する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、トランスフェクトされたＣＤ４０活性化Ｂ細胞の生成の詳細を示す。図の左側は、同定された変異に基づくベクターの設計、その後の細菌の形質転換、および続く細菌内での増幅を示す。次に、ＤＮＡを直線状にし、ポリアデニル化されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡを生成し、次にそれを（例えばエレクトロポレーションを介して）ＣＤ４０活性化Ｂ細胞にトランスフェクションする。図の右側は、ＣＤ１９単離を介して濃縮されたＣＤ４０活性化Ｂ細胞の生成を示しており、多量体ＣＤ４０リガンドによる刺激がＩＬ−４の存在下で生じる。これらのプロセスにより、ネオ抗原を提示するＣＤ４０活性化Ｂ細胞が生成される。これらの活性化Ｂ細胞は、ｉ）ネオ抗原特異的ＴＩＬ（すなわち、ネオ抗原ＴＩＬ反応性）をスクリーニングするため、またはｉｉ）トランスフェクトＣＤ４０活性化Ｂ細胞による刺激を介してネオ抗原特異的ＴＩＬを濃縮するために使用できる。
【図７】ＣＤ４０活性化Ｂ細胞へのトランスフェクションに使用されるＩＶＴ  ｍＲＮＡのためのベクターテンプレートを開発するための非限定的な実施形態を示す。Ｔ７プロモーターをＩＶＴ反応の開始に使用する；シグナルペプチド（ＳＰ）、ＭＨＣＩトラフィッキングシグナル（ＭＩＴＤ）、およびリンカー配列を、クラスＩおよびクラスＩＩ  ２５〜３１ｍｅｒの正しいプロセシングおよび提示のために使用する。図の右側は、示された要素のそれぞれを構成するアミノ酸配列の非限定的な実施形態を示す。この実施形態で使用されるＵＴＲは、タンデムβ−グロビン３’ヌクレオチドＵＴＲ配列である。図７は、出現順にそれぞれ配列番号２６２〜２６６の配列を開示する。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、ネオ抗原を提示するために単離ＡＰＣを使用する、ネオ抗原特異的ＴＩＬの生成を検討する。特に、Ｂ細胞をペプチドでパルスした（すなわち、方法で説明するように、プレロード／インキュベートした）（ペプチド）、あるいはタンデムミニ遺伝子でトランスフェクトした（ＴＭＧ）。すべてのＢ細胞がＣＤ４０活性化された。図８Ａは、ＭｅｌａｎＡ  ＣＤ８＋抗原（ＭｅｌａｎＡ：表２のＴＭＧ  １０３）を用いて、ペプチドプレロードＢ細胞（ペプチド）またはＴＭＧ−Ｂ細胞によって引き起こされた抗原刺激レベルを示す。図８Ｂでは、卵巣がん患者ＣＴＥ−００９からのＴＩＬを、プレロードＢ細胞（ペプチド）またはＴＭＧ−Ｂ細胞（ＴＭＧ）と共に培養し、ＥＬＩＳｐｏｔおよびＣＤ１３７陽性によりアッセイした；ＣＴＥ−００９特異的ネオ抗原をコードするペプチドおよびＴＭＧを使用した（ペプチド：ＩＰＩＮＰＲＲＣＬ（配列番号１）；ＣＯＰＧ２：表２のＴＭＧ  １０５）。図８Ｃは、ＴＭＧ−Ｂ細胞のエレクトロポレーション後の抗原刺激の半減期を表すＥＬＩＳｐｏｔグラフを示す；ＨＬＡ−Ａ２＋ＣＤ４０活性化Ｂ細胞のいくつかのバッチを、指定された時間休止させ、ＭｅｌａｎＡ  ＣＤ８＋クローン（ＭｅｌａｎＡ：表２のＴＭＧ  １０３）と共培養した。これは、ＡＰＣでＴＭＧの発現がどのくらいの期間続くかを示す。ペプチド：Ｂ細胞は、ネオ抗原をコードするペプチドをプレロードされた。ＴＭＧ：Ｂ細胞はネオ抗原をコードするｍＲＮＡでエレクトロポレーションされた。ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。モック（Ｍｏｃｋ）は空であるか、またはノンコーディング（または非コード）ｍＲＮＡである。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、ウイルスおよび腫瘍関連ネオ抗原を使用して、ＨＬＡクラスＩＩ抗原のプロセシングおよび提示を検討する。Ｂ細胞をパルスした（すなわち、プレロード／インキュベートした；ペプチド）、またはタンデムミニ遺伝子でトランスフェクトした（ＴＭＧ）。図９Ａは、ペプチドパルスＡＰＣまたはＴＭＧ−ＡＰＣ（表２のＴＭＧ  １０３）と共培養した、Ｆｌｕ  ＭＰ１１７−３１（ＭＨＣ−Ｉ抗原）およびＦｌｕ  ＭＰ１３１ｍｅｒ（ＭＨＣ−ＩＩ抗原）が濃縮（富化）されたＰＢＭＣの代表例を示す。ＰＢＭＣを、細胞内サイトカインＴＮＦαおよびＩＦＮγの発現について照合した。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＭａｇｅＡ３１１１−１２６ペプチド（ペプチド；ＲＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＬＫＹＲＡ（配列番号２））パルスＢ細胞、またはＭａｇｅＡ３１１１−１２６を発現するＴＭＧ（表２のＴＭＧ  １０３）でトランスフェクトしたＢ細胞と共培養した、ＭａｇｅＡ３１１１−１２６特異的ＣＤ４＋クローンのＥＬＩＳｐｏｔアッセイを示す。ＯＮ：一晩。モック（Ｍｏｃｋ）は空であるか、またはノンコーディング（または非コード）ｍＲＮＡである。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、プレＲＥＰ（ｐｒｅ−ＲＥＰ）フェーズ中のＴＩＬの拡大に対する、本発明およびそのバリエーションの効果を示す。図１０Ａにおいて、卵巣がん患者ＣＴＥ−００６からの腫瘍酵素消化物を、従来の条件（従来；６０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２）でインキュベートするか、または３つのペプチド（９〜１０ｍｅｒｓ）のプールの追加によりプライミングした（プライミング）。ＴＩＬの反応性を、ネオ抗原による刺激後のＩＦＮγ分泌を検出することによって試験した（Ｐｏｏｌ  Ｍｕｔ、灰色のバー）。図１０Ｂでは、ＴＭＧ−Ｂ細胞を用いてさまざまな比の効果を試験した。ＣＤ４０活性化Ｂ細胞をエレクトロポレーションし（示される場合、ＴＭＧ（ＴＭＧ１０６−ＣＤＣ２０３１ｍｅｒ同族ネオ抗原））、Ｂ細胞と酵素消化腫瘍細胞との比を変えた（示すように、１：１または１：２）。試験したすべての条件で、ＣＤ４０活性化Ｂ細胞を使用した；生成時に抗ＰＤ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体を使用し、培地を阻害剤で更新した。ＣＤＣ２０  Ｓ２３１Ｃをコードするペプチドとのインキュベーション（Ｐｏｏｌ  Ｍｕｔ、灰色のバー）により、ＩＦＮγ産生についてＴＩＬをスクリーニングした。図１０Ａおよび１０Ｂに関して、ＴＩＬ培養の全期間中、培地に１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ１  ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１０μｇ／ｍＬの抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ）を補足した。
【図１１】改変Ｂ細胞の分析と、４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、およびＩＬ１２の検出を示す。左側は、エレクトロポレーション後の４１ＢＢＬまたはＯＸ４０Ｌの発現のフローサイトメトリー分析である。ＣＤ４０活性化Ｂ細胞に１μｇのＯＸ４０Ｌまたは４１ＢＢＬ  ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。右側は、０．２５μｇまたは１μｇのＩＬ−１２  ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした後のＢ細胞によるＩＬ−１２産生のＥＬＩＳＡによる分析である。トランスフェクションの４〜８時間後にアッセイを行った。
【図１２】卵巣がん患者ＣＴＥ−００７からの組織および細胞における、改変Ｂ細胞を使用した、１回（０日目）または２回（０日目および１０日目）の刺激後のＴＩＬの濃縮（enrichment）を示す。ＣＤ１３７＋ＣＤ４＋ネオ抗原反応性ＴＩＬのパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって決定した。ＴＩＬを、Ｂ細胞と共インキュベーションしない（従来）か、あるいはペプチドでパルスされた（すなわち、プレロードされた）Ｂ細胞（ＡＰＣ、ペプチド；ペプチドは患者に特異的であった、９〜２５ｍｅｒ）、またはタンデムミニ遺伝子でトランスフェクトされたＢ細胞（ＴＭＧ−ＡＰＣ；ＴＭＧ  １０５（ＳＧＯＬ１同族ネオ抗原））、またはタンデムミニ遺伝子と免疫刺激分子ＯＸ４０−Ｌ、ＩＬ１２および４−１ＢＢＬとの両方を発現するように改変されたＢ細胞（改変ＴＭＧ−ＡＰＣ）と共インキュベートした。（１０日目）と示されている場合、再刺激が行われた。ＴＩＬ活性のスクリーニングのために、ネオ抗原（Ｐｏｏｌ  Ｍｕｔ）とのインキュベーションを行った。ＴＩＬ培養の全期間中、培地に１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１０μｇ／ｍＬの抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ）を補足した。
【図１３】Ｂ細胞の存在下でのＴＩＬの拡大倍率を示す。データは、従来の方法を使用した場合と、プレＲＥＰフェーズ中にＢ細胞が存在する場合のバルクＴＩＬの総数の拡大倍率を示す。腫瘍サンプルは、卵巣がん患者ＣＴＥ−００５（正方形）、ＣＴＥ−００６（円形）、およびＣＴＥ−０１０（菱形）から分離した。データは、プレＲＥＰの異なる条件の累積的な拡大を表す。
【図１４−１】代表的であるが非限定的な実施形態による本発明の結果の要約を示す。図１４（１段目）：従来のＴＩＬとプライミングされたＴＩＬ（５０ペプチドのプール、９および１０ｍｅｒ）を比較することにより、黒色腫患者Ｍｅｌ０１１（腫瘍断片）からの細胞においてＴＩＬの濃縮が観察された。図１４（２段目）：従来の方法と、タンデムミニ遺伝子および免疫刺激分子を発現するＢ細胞を０日目に１回（改変ＴＭＧ−ＡＰＣ）または２回（すなわち、０日目と１０日目）（改変ＴＭＧ−ＡＰＣ、再刺激）（ＴＭＧ１０８）添加した場合を比較して、大腸がんＣｒＣｐ５（腫瘍断片）でもＴＩＬの濃縮が観察された。
【図１４−２】図１４−１の続き。図１４（３段目および４段目）：同様に、本発明の方法を用いた場合、患者からの解離卵巣腫瘍はＴＩＬの劇的な濃縮を示す（従来の（従来）；プライミングされた（プライミング）；ＡＰＣ、ペプチド（ペプチドでパルスされたＢ細胞）；ＴＭＧでトランスフェクトされたＢ細胞（ＴＭＧ−ＡＰＣ）；およびＴＭＧと免疫調節物質でトランスフェクトされたＢ細胞（改変ＴＭＧ−ＡＰＣ）；および示されている場合は再刺激される）。患者ＣＴＥ−００６からのＴＩＬ（３段目）については、３つのペプチドのプールとＴＭＧ  １０６を使用した；患者ＣＴＥ−００７（４段目）からのＴＩＬでは、１つの３１ｍｅｒの同族ペプチドとＴＭＧ  １０５を使用した。従来：ＩＬ−２のみを用いて生成されたＴＩＬ；プライミング：ＩＬ−２をネオ抗原ペプチドと共に使用；ＡＰＣ、ペプチド：腫瘍断片または消化物をペプチドパルスＢ細胞と共培養；ＴＭＧ−ＡＰＣ：腫瘍断片または消化物をタンデムミニ遺伝子Ｂ細胞と共培養；改変ＴＭＧ−ＡＰＣ：免疫刺激分子の発現およびタンデムミニ遺伝子の発現のために改変されたＢ細胞；再刺激：ＡＰＣ（改変ＴＭＧ−ＡＰＣおよび／またはＴＭＧ−ＡＰＣ）を１０日目に再びインキュベートした。３段目と４段目に関して、ＴＩＬ培養の全期間中、培養培地に１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ１  ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１０μｇ／ｍＬの抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ）を補足した。
【図１５】従来のＴＩＬ（ｘ軸）と濃縮したＴＩＬ（ｙ軸）（ＰＨＬＰＰ２、ＣＤＣ２０、ＳＧＯＬ１（すなわち、Ｂ細胞を使用した異なる実施形態））で検出されたネオ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の累積分析を示す。ＮＢＥＡ（正方形）は、従来のＴＩＬとプライミングされたＴＩＬを比較したデータを示す。ＣＤＣ２０およびＳＧＯＬ１に関して、ＴＩＬ培養の全期間を通して、培地に１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ１  ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１０μｇ／ｍＬの抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（イピリムマブ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ）を補足した。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｇは、本発明の非限定的な実施形態を示す。図１６Ａ（ネオ抗原）：ネオ抗原（例えば、腫瘍サンプルと対照サンプルを比較することにより同定される）を含むペプチドを、腫瘍断片、消化物、または対象から得られた腫瘍サンプルからの複数の細胞と共に、ＩＬ−２の存在下でインキュベートして、最初の抗原特異的ＴＩＬ集団を得る。この最初のＴＩＬ集団（プレＲＥＰ）は、次に急速拡大を経験する。
【図１６Ｂ】図１６Ｂ（タンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）でトランスフェクトされたＡＰＣ）：ネオ抗原をコードするＴＭＧ（腫瘍と対照組織からのエクソームおよびＲＮＡを比較することにより同定される）を合成し、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩによる提示のためにＡＰＣにトランスフェクトする。次に、これらのＡＰＣを、ＩＬ−２の存在下で、腫瘍断片、消化物、または対象の腫瘍からの複数の細胞と共培養して、最初のＴＩＬ集団を得て、それは急速拡大プロトコル中にさらに拡大される。
【図１６Ｃ】図１６Ｃ（ネオ抗原がプレロードされたＡＰＣ）：ＡＰＣをネオ抗原（腫瘍サンプルと対照サンプルを比較することにより同定される）を含むペプチドでパルスする。次に、これらのＡＰＣを、ＩＬ−２の存在下で、腫瘍断片、消化物、または対象の腫瘍からの複数の細胞と共培養する。得られたＴＩＬ集団（プレＲＥＰ）は、次に急速拡大を経験する。
【図１６Ｄ】図１６Ｄ（ＴＭＧでトランスフェクトされた改変ＡＰＣ）：ＡＰＣを、免疫刺激タンパク質の発現を誘導するように改変し、さらにネオ抗原をコードするｍＲＮＡでのトランスフェクションを介して、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩとの関連でネオ抗原を提示するように誘導される。現在ネオ抗原を提示している改変ＡＰＣを、次に、ＩＬ２の存在下で、腫瘍断片、消化物、または腫瘍サンプルからの複数の細胞とインキュベートして、プレＲＥＰ  ＴＩＬ集団を作成する。これらのプレＲＥＰ  ＴＩＬは、急速拡大によってさらに増幅される。
【図１６Ｅ】図１６Ｅ（ネオ抗原がプレロードされた改変ＡＰＣ）：ＡＰＣを、免疫刺激タンパク質の発現を誘導するように改変し、さらにネオ抗原への事前の曝露によってＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩとの関連でネオ抗原を提示するように誘導する。現在ネオ抗原を提示している改変ＡＰＣを、次に、ＩＬ２の存在下で、腫瘍断片、消化物、または腫瘍サンプルからの複数の細胞とインキュベートして、プレＲＥＰ  ＴＩＬ集団を作成する。これらのプレＲＥＰ  ＴＩＬは、急速拡大によってさらに増幅される。
【図１６Ｆ】図１６Ｆ（ネオ抗原と一緒にＡＰＣ）：ネオ抗原（例えば、腫瘍と対照の組織および／または細胞のエクソームおよびＲＮＡの比較により同定される）を含むペプチドを、ＩＬ−２の存在下で、ＡＰＣ、ならびに腫瘍断片、消化物、または対象から得られた腫瘍サンプルからの複数の細胞と共にインキュベートして、プレＲＥＰ  ＴＩＬの拡大を誘導する。これらのプレＲＥＰ  ＴＩＬは、その後、急速拡大を受ける。
【図１６Ｇ】図１６Ｇ（ネオ抗原と一緒に改変ＡＰＣ）：ＡＰＣを、免疫調節物質の発現のために改変し、さらにＩＬ−２とネオ抗原を含むペプチドの存在下で、腫瘍断片、消化物、または対象の腫瘍からの複数の細胞と共に共培養して、プレＲＥＰ  ＴＩＬの拡大を誘導する。これらのプレＲＥＰ  ＴＩＬは、その後、急速拡大を受ける。
【図１７】本明細書に記載される方法で使用するためのタンデムミニ遺伝子の非限定的な例を提供する。特に、この例はＴＭＧ  １０３である。図１７は出現順に、配列番号２６７および２６８を開示する。
【図１８】本明細書に記載される方法で使用するためのタンデムミニ遺伝子の非限定的な例を提供する。特に、この例はＴＭＧ  １０６である。図１８は出現順に、配列番号２６９および２７０を開示する。
【図１９】本明細書に記載される方法で使用するためのタンデムミニ遺伝子の非限定的な例を提供する。特に、この例はＴＭＧ  １０５である。図１９は出現順に、配列番号２７１および２７２を開示する。
【図２０】本明細書に記載される方法で使用するためのタンデムミニ遺伝子の非限定的な例を提供する。特に、この例はＴＭＧ  １０８である。図２０は出現順に、配列番号２７１および２７２を開示する。
【図２１】本明細書に記載の方法で使用するためのｈＩＬ−１２をコードするベクターの非限定的な例を提供する。図２１は配列番号２７３を開示する。
【図２２】本明細書に記載の方法で使用するためのｈＯＸ４０Ｌをコードするベクターの非限定的な例を提供する。図２２は配列番号２７４を開示する。
【図２３】本明細書に記載の方法で使用するためのｈ４−１ＢＢＬをコードするベクターの非限定的な例を提供する。図２３は配列番号２７５を開示する。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、特に、抗原を含む１つまたは複数のペプチドの存在下および／または抗原を提示する抗原提示細胞の存在下で、リンパ球を含む対象からのサンプルまたはそれに由来するリンパ球を培養することにより、抗原特異的リンパ球を拡大する方法を提供する。本明細書に記載の方法は、表面に前記抗原を有する細胞を選択的に標的にして攻撃することができるリンパ球を生成する。
【００４０】
一態様では、本発明は、特に、腫瘍抗原を含む１つまたは複数のペプチドの存在下および／または腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞の存在下で、腫瘍サンプルまたはそれに由来するリンパ球を培養することにより、腫瘍抗原特異的リンパ球を拡大する方法を提供する。本明細書に記載の方法は、腫瘍細胞を選択的に標的にして処置することができるリンパ球を生成する。
【００４１】
これらの方法は多くの利点をもたらす。例えば、本発明は、患者に特有の抗原（例えば、ネオ抗原）を含む、抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗原特異性を有するリンパ球を提供する。リンパ球は、それらの抗原特異性に基づいて拡大して、患者のがんを処置するおよび／または予防するなどであるがこれらに限定されない、養子細胞療法で使用するためのリンパ球の集団を提供することができる。例えば、これらの方法は、正常な非腫瘍細胞の破壊を低減または排除しながら腫瘍細胞の破壊を標的とするリンパ球を拡大するように働くことができるため、ネオ抗原を使用する場合に有利である。このように個別化医療を改善することにより、治療処置が患者にとってより効果的でかつ毒性が少なくなる可能性がある。
【００４２】
これらの方法はまた、抗原特異的リンパ球の頻度を改善するという驚くべき利点をもたらす。この利点は、拡大の初期フェーズ（プレＲＥＰフェーズなど）での（可溶性ペプチドやＡＰＣ提示による）ペプチド抗原の添加によって生じる。抗原特異的リンパ球の頻度の改善は、これらの方法から生じる重要な特徴である。これらの方法はまた、ペプチド抗原が（可溶性ペプチドおよび／またはＡＰＣ提示を介して）急速拡大フェーズ中にのみ提示される方法と比較して、疲弊が少ない抗原特異的リンパ球を提供する。
【００４３】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「抗原」という用語は、抗体に特異的に結合する、またはＴ細胞受容体によって認識されるペプチド断片を生成することができる、および／または免疫応答を誘発することができる分子および／または物質である。抗原は、１つまたは複数の「エピトープ」を含んでいてよい。ある実施形態では、抗原はいくつかのエピトープを有する。エピトープは、ＭＨＣ分子との関連で、抗体またはリンパ球によって認識される。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍またはがん細胞によって特異的に発現されるまたは腫瘍に関連する抗原またはネオ抗原として広く定義され、例えば、過剰発現されるまたは異常発現される抗原、発がん性ウイルスによって産生される抗原、がん胎児性抗原、改変された細胞表面糖脂質および糖タンパク質抗原の変化、細胞型特異的分化抗原などである。がん細胞の表面に存在する腫瘍抗原は、個体の正常な体細胞の表面には存在しない抗原であり、すなわち、その抗原は、正常な体細胞ではなく、がん細胞の免疫系に曝される。抗原は腫瘍細胞の細胞表面に発現され、そこでＢリンパ球（Ｂ細胞）などの体液性免疫系の構成要素によって認識される。細胞内腫瘍抗原は短鎖ペプチドフラグメントにプロセシングされ、それらは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と複合体を形成してがん細胞の細胞表面に提示され、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）またはナチュラルキラー細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。好ましくは、腫瘍抗原は、正常細胞で発現されないもの、または少なくとも腫瘍細胞と同じレベルまでは発現されないものである。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ネオ抗原」という用語は、体細胞変異から生じ、「非自己」として認識される、新たに形成された抗原決定基を指す。ネオ抗原は、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列を含むことができる。変異には、フレームシフトまたは非フレームシフトインデル、ミスセンスまたはナンセンス置換、スプライス部位の変化（例えば、選択的スプライシングされた転写物）、ゲノム再構成または遺伝子融合、またはネオＯＲＦ（ｎｅｏＯＲＦ）を生じさせる任意のゲノムまたは発現の変更が含まれる。変異はスプライスバリアントも含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾には、異常なリン酸化が含まれ得る。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾には、プロテアソームによって生成されたスプライスされた抗原も含まれ得る（例えば、Liepe et al., A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides; Science.2016 Oct 21;354(6310):354-358、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ネオ抗原には、標準抗原（canonical antigen）が含まれ得る。ネオ抗原には、非標準抗原（non-canonical antigen）も含まれ得る。ネオ抗原は腫瘍特異的であってよい。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「コード領域」という用語は、タンパク質をコードする遺伝子の部分である。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「コード変異（coding mutation）」という用語は、コード領域に生じる変異である。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「ＯＲＦ」という用語は、オープンリーディングフレームを意味する。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ネオＯＲＦ（ＮＥＯ−ＯＲＦ）」という用語は、変異、またはスプライシングなどの他の異常から生じる腫瘍特異的ＯＲＦである。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ミスセンス変異」という用語は、あるアミノ酸から別のアミノ酸への置換を引き起こす変異である。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「ナンセンス変異」という用語は、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こす変異である。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「フレームシフト変異」という用語は、タンパク質のフレームに変化を引き起こす変異である。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「インデル」は、１つまたは複数の核酸の挿入または欠失である。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「非標準（非カノニカル）抗原（non-canonical antigen）」は、標準的特徴を欠くネオ抗原である。非標準抗原の非限定的な例は、標準的なアンカーモチーフを欠くペプチド、短鎖ペプチド、３〜５ｍｅｒ、長鎖ペプチド（最大１８ｍｅｒ）、新しいＭＨＣポケット、代替アンカーアミノ酸、ＧａｌＮＡｃ残基として機能するアンカーを使用するペプチドである。非標準抗原には、非同義の体細胞変異、選択的スプライシングされた転写物、転写された５’ＵＲＴ、エクソン−イントロンジャンクション、イントロン領域、非標準的なリーディングフレーム、アンチセンス転写物、インデル、転座、短い新規のオープンオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、レトロウイルス転移因子およびｌｎｃＲＮＡが含まれ得る。非標準抗原に関する追加の開示は以下の文献に見ることができ、これらのそれぞれは、意図されたすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる：Ronsin, C. et al. A non-AUG-defined alternative open reading frame of the intestinal carboxyl esterase mRNA generates an epitope recognized by renal cell carcinoma-reactive tumor-infiltrating lymphocytes in situ. Journal of immunology 163, 483-490 (1999); Mayrand, S. M., Schwarz, D. A. & Green, W. R. An alternative translational reading frame encodes an immunodominant retroviral CTL determinant expressed by an immunodeficiency-causing retrovirus. Journal of immunology 160, 39-50 (1998); Van Den Eynde, B. J. et al. A new antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human kidney tumor results from reverse strand transcription. The Journal of experimental medicine 190, 1793-1800 (1999); Coulie, P. G. et al. A mutated intron sequence codes for an antigenic peptide recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, 7976-7980 (1995); Laumont, C. M. et al. Global proteogenomic analysis of human MHC class I-associated peptides derived from non-canonical reading frames. Nature communications 7, 10238, doi:10.1038/ncomms10238 (2016); Robbins, P. F. et al. The intronic region of an incompletely spliced gp100 gene transcript encodes an epitope recognized by melanoma-reactive tumor-infiltrating lymphocytes. Journal of immunology 159, 303-308 (1997); Lupetti, R. et al. Translation of a retained intron in tyrosinase-related protein (TRP) 2 mRNA generates a new cytotoxic T lymphocyte (CTL)-defined and shared human melanoma antigen not expressed in normal cells of the melanocytic lineage. The Journal of experimental medicine 188, 1005-1016 (1998); Wang, R. F., Parkhurst, M. R., Kawakami, Y., Robbins, P. F. & Rosenberg, S. A. Utilization of an alternative open reading frame of a normal gene in generating a novel human cancer antigen. The Journal of experimental medicine 183, 1131-1140 (1996); Wang, R. F. et al. A breast and melanoma-shared tumor antigen: T cell responses to antigenic peptides translated from different open reading frames. Journal of immunology 161, 3598-3606 (1998); Nakayama, M. Antigen presentation by MHC-dressed cells. Frontiers in Immunology 5, 672 (2015)；およびApostolopoulos, V. Lazoura, E. Noncanonical peptides in complex with MHC class I. Expert Review Vaccines 3(2), 151-162 (2004)。
【００５６】
「第１の拡大」、「プレ急速拡大プロトコル（pre-rapid expansion protocol）」、または「プレＲＥＰ（ｐｒｅ−ＲＥＰ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され、リンパ球（例えば、血液サンプル、組織、腫瘍断片、または酵素消化組織、解離／懸濁腫瘍細胞、リンパ節サンプル、または体液サンプルなどであるがこれらに限定されない対象のサンプルに由来する）が、最初の拡大フェーズ中にリンパ球の分裂および生存の継続を確実にする化合物が補足された培地において所定の期間にわたり最初に拡大される手順を指す。ある実施形態では、プレＲＥＰフェーズ中に使用される化合物は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、またはそれらの任意の組合せであってよいが、これらに限定されない。ある実施形態では、プレＲＥＰフェーズ中に使用される化合物はＩＬ−２であってよい。ある実施形態では、プレＲＥＰ手順は、腫瘍および他の非リンパ球細胞よりもリンパ球の成長および／または拡大に有利に働く条件下で行われる。ある実施形態では、プレＲＥＰ手順は、約３〜約４５日、約５〜約４０日、または約１１〜約３５日続く期間に生じる。
【００５７】
「第２の拡大」、「急速拡大プロトコル」、または「ＲＥＰ」という用語は、本明細書において互換的に使用され、リンパ球（例えば、血液サンプル、組織、腫瘍断片、または酵素消化された組織または腫瘍細胞懸濁液などであるがそれらに限定されない対象のサンプルに由来する）が、その数において、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、または少なくとも約１００倍拡大される、プレＲＥＰの手順の後に起こる手順を指す。「ＲＥＰ」は、ＣＤ３複合体を介したプレＲＥＰリンパ球の活性化（例えば、抗ＣＤ３ｍＡｂの使用）、および／または対象または正常な健康ドナーから得られたフィーダー細胞（例えば、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）フィーダー細胞）による活性化を伴うことができる。ある実施形態では、フィーダー細胞は照射される（例えば、５，０００ｃＧｙ）。ある実施形態では、プレＲＥＰリンパ球は、照射されたフィーダー細胞（例えば、ＰＭＢＣ）に対して２００：１の比で存在する。ある実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、またはそれらの組合せが、活性化リンパ球における急速な細胞分裂を促進するために添加される。ある実施形態では、ＩＬ−２が、活性化されたリンパ球における急速な細胞分裂を促進するために添加される。ある実施形態では、リンパ球はその後さらに１２日間拡大され、必要に応じてＩＬ−２を含む１：１培養液で希釈される。急速拡大および他の方法の例に関して、すべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２８７，８５７号を参照のこと。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および抗体フラグメント（例えば、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、（Ｆａｂ）２’フラグメントなどの二価抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、デカボディ、および他のドメイン抗体（例えば、Holt, L. J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490)）を指す。「抗体」という用語はまた、米国特許出願公開第２００７／０００４９０９号に開示されているような共有結合型ダイアボディ、および米国特許出願公開第２００９／００６０９１０号に開示されているようなＩｇ−ＤＡＲＴＳも指す。本明細書に記載の方法において有用な抗体には、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスの免疫グロブリン分子が含まれる。
【００５９】
状況、障害または状態を「処置する」または「処置」という用語には、（１）その状況、障害または状態を患っているまたはその素因を有している可能性があるが、その状況、障害または状態の臨床的または無症候性症状をまだ経験または表示していない対象において、その状況、障害または状態の少なくとも１つの臨床症状または無症候性症状の出現の発生および／または可能性を予防、遅延または低減させる；または（２）その状況、障害または状態を阻害する、すなわち、疾患またはその再発、あるいはそれらの少なくとも１つの臨床症状または無症候性症状を停止、軽減または遅延させる；または（３）疾患を軽減する、すなわち、状況、障害または状態あるいはそれらの臨床症状または無症候症状の少なくとも１つの後退を生じさせることが含まれる。処置される対象に対する利益は、統計的に有意であるか、あるいは少なくとも患者または医師に知覚可能であるかのいずれかである。
【００６０】
用量または量に適用される「有効」という用語は、それを必要とする対象に投与した際に所望の活性をもたらすのに十分な化合物または医薬組成物の量を指す。有効成分の組合せを投与する場合、組合せの有効量は、個別に投与された場合に有効であった各成分の量を含んでいても含まなくてもよいことに留意されたい。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、治療される状態の重症度、使用される特定の薬物（単数または複数）、投与方法などに応じて、対象ごとに異なる。
【００６１】
本明細書に記載の組成物に関連して使用される「薬学的に許容される」という句は、生理学的に許容可能でかつ哺乳動物（例えば、ヒト）に投与した場合に通常は望ましくない反応を生じない、そのような組成物の分子種および他の成分を指す。好ましくは、「薬学的に許容される」という用語は、米国連邦政府または州政府の規制機関によって承認されているか、または哺乳動物、より具体的にはヒトにおける使用のために米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に掲載されていることを意味する。
【００６２】
「患者」、「個体」、「対象」、および「動物」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、ヒトおよび獣医動物（例えば、猫、犬、牛、馬、羊、豚など）、および実験動物モデルを含むがそれらに限定されない哺乳動物を指す。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００６３】
「担体」という用語は、化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、水および油などの無菌液体であってよく、それら油には、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれる。水または水溶液、生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液が、特に注射可能な溶液のための担体として好ましく使用される。あるいは、担体は、結合剤（圧縮錠剤用）、滑剤、封入剤、香味剤、および着色剤の１つまたは複数を含むがこれらに限定されない固体剤形担体であってもよい。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ」に記載されている。
【００６４】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈から明確に指示されていない限り、複数への言及が含まれる。したがって、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載されたおよび／または本開示を読むと当業者に明らかになるタイプの１つまたは複数の方法、および／またはステップを含む。
【００６５】
「約」または「およそ」という用語は、統計的に意味のある値の範囲内であることを含む。このような範囲は、所定の値または範囲の１桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、さらにより好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内であり得る。「約」または「およそ」という用語に含まれる許容可能な変動は、研究中の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。
【００６６】
本明細書に例示的に記載される技術は、本明細書に具体的に開示されていない要素がなくてもうまく実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各場合において、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。ペプチドをコードする遺伝子の文脈において、「から本質的になる」とは、遺伝子が、例えば、コードされるペプチドを修飾しないがペプチドの発現を可能にするもの（例えば、プロモーター、エンハンサー、リンカー）などの、追加のヌクレオチドまたは領域をさらに含むことができることを意味する。
【００６７】
本発明の実施は、別途指示がない限り、統計分析、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、および生化学の従来の技術を使用し、これらは当業技術の範囲内である。そのようなツールおよび技術は、例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al. eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Bonifacino et al. eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coico et al. eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc. : Hoboken, NJ; および Enna et al. eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJに詳細に記載されている。
【００６８】
抗原特異的リンパ球を拡大する方法
一態様では、本明細書に記載されるのは、対象から得られたサンプル中のリンパ球またはそのようなサンプルから単離されたリンパ球を拡大することを含む、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的リンパ球を拡大する方法であって、拡大は、拡大中に１つまたは複数のペプチドを添加することを含み、前記ペプチドのそれぞれは異なる抗原を含み、抗原特異的リンパ球が拡大される。ある実施形態では、この方法は、２つ以上のペプチド（すなわち、異なるペプチドのプール）を添加することを含む。ある実施形態では、１つの拡大フェーズのみが行われる場合、その拡大フェーズは、プレ急速拡大プロトコル（プレＲＥＰ）である。ある実施形態では、抗原特異的リンパ球は、拡大中に存在する他のリンパ球よりも優先的に拡大される。ある実施形態では、この優先的な拡大は、抗原特異的リンパ球の濃縮（enrichment）をもたらす。
【００６９】
一態様では、本明細書に記載されるのは、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的リンパ球を拡大する方法であって、ａ）対象から得られたサンプル中のリンパ球またはそのようなサンプルから単離されたリンパ球を拡大すること、ここで拡大は少なくとも２つの拡大フェーズを含む、およびｂ）少なくとも２つの拡大フェーズのうちの少なくとも１つのフェーズ中に１つまたは複数のペプチドを添加することを含み、前記ペプチドのそれぞれは異なる抗原を含み、抗原特異的リンパ球が拡大される。ある実施形態では、この方法は、２つ以上のペプチド（すなわち、ペプチドのプール）を添加することを含む。ある実施形態では、抗原特異的リンパ球は、拡大中に存在する他のリンパ球よりも優先的に拡大される。ある実施形態では、この優先的な拡大は、抗原特異的リンパ球の濃縮をもたらす。
【００７０】
リンパ球の生成は、通常、２ステップのプロセスを使用して行われる：１）ＲＰＭＩなどの標準的な実験用培地で細胞を成長させ、リンパ球を試薬で処理してリンパ球を成長させかつその生存性を維持するプレＲＥＰ段階；および２）対象を治療するのに十分な大きな培養量でリンパ球が拡大されるＲＥＰ段階。ある実施形態では、異なる生成フェーズのための本明細書に開示される化合物を、それぞれのフェーズ中に培地に含めることができる。
【００７１】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法の少なくとも２つの拡大フェーズは、第１の拡大（すなわち、プレＲＥＰ）および第２の拡大（すなわち、ＲＥＰ）を含む。ある実施形態では、第１および／または第２の拡大フェーズは２回以上繰り返される。ある実施形態では、より効果的な治療的抗原特異的リンパ球（例えば、より少ない疲弊）を可能にするために、さらなる拡大フェーズが追加される。
【００７２】
ある実施形態では、第１の拡大は、リンパ球（例えば、組織、骨髄、胸腺、腫瘍断片、または酵素消化組織、解離／懸濁細胞、リンパ節サンプル、または体液サンプル（血液、腹水、リンパ液）などであるがこれらに限定されない、リンパ球を含む対象のサンプルに由来する）を、拡大フェーズ中にリンパ球の分裂および生存の継続を確実にする化合物を補足した培養液で、所定期間にわたり最初に拡大させる手順を指す。このやり方で実施される場合、第１の拡大はプレ急速拡大プロトコル（プレＲＥＰ）である。本明細書に記載の方法のプレＲＥＰフェーズを実施することができる条件は、当業者によく知られている。
【００７３】
ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）フェーズは、少なくとも１つの拡大促進剤の存在下でリンパ球を拡大することを含む。ある実施形態では、リンパ球の成長を促進するために第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）中に使用されるサイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、またはそれらの任意の組合せであってよいが、これらに限定はされない。ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）中に使用される化合物は、サイトカインＩＬ−２である。
【００７４】
ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）フェーズ中に使用される化合物は、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約１０，０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在するサイトカインであってよい。ある実施形態では、サイトカインは、約２００ＩＵ／ｍｌ〜約９，５００ＩＵ／ｍｌ、約４００ＩＵ／ｍｌ〜約９，０００ＩＵ／ｍｌ、約６００ＩＵ／ｍｌ〜約８，５００ＩＵ／ｍｌ、約８００ＩＵ／ｍｌ〜約８，０００ＩＵ／ｍｌ、約１，０００ＩＵ／ｍｌ〜約７，５００ＩＵ／ｍｌ、約２，０００ＩＵ／ｍｌ〜約７，０００ＩＵ／ｍｌ、約３，０００ＩＵ／ｍｌ〜約６，７５０ＩＵ／ｍｌ、約４，０００ＩＵ／ｍｌ〜約６，５００ＩＵ／ｍｌ、約５，０００ＩＵ／ｍｌ〜約６，２５０ＩＵ／ｍｌ、または約５，５００ＩＵ／ｍｌ〜約６，０００ＩＵ／ｍｌで細胞培養培地中に存在し得る。ある実施形態では、サイトカインは、約１，０００ＩＵ／ｍｌ〜約１０，０００ＩＵ／ｍｌ、約２，０００ＩＵ／ｍｌ〜約９，０００ＩＵ／ｍｌ、約３，０００ＩＵ／ｍｌ〜約８，０００ＩＵ／ｍｌ、約４，０００ＩＵ／ｍｌ〜約７，０００ＩＵ／ｍｌ、または約５，０００ＩＵ／ｍｌ〜約６，０００ＩＵ／ｍｌで細胞培養培地中に存在し得る。ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）フェーズ中に使用されるサイトカインは、約６，０００ＩＵ／ｍｌで細胞培養培地中に存在する。ある実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、またはそれらの任意の組合せであってよいが、それらに限定はされない。ある実施形態では、サイトカインはＩＬ−２である。ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）フェーズ中に存在するサイトカインは、約６，０００ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ−２である。
【００７５】
第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）フェーズ中に存在することができる追加の化合物には、小分子（例えば、小有機分子）、核酸、ポリペプチド、またはそれらのフラグメント、アイソフォーム、バリアント、アナログもしくは誘導体；あるいはＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、４−ＩＢＢ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＦ１、ＣＤ３９またはＢＡＴＦに対するアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、アンタゴニストはポリペプチドであってよい。ある実施形態において、アンタゴニストは、抗体またはそのフラグメントであってよい。ある実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。ある実施形態では、追加の化合物は、チェックポイント阻害調節剤（checkpoint blockade modulator）であってよい。
【００７６】
ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）手順は、サンプルおよび他の非リンパ球細胞よりもリンパ球の成長および／または拡大に有利に働く条件で生じる。
【００７７】
ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）手順は、約３〜約４５日、約５〜約４０日、または約１１〜約３５日間続く期間に生じる。
【００７８】
ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）は、ペプチドを添加しないでリンパ球を拡大する場合と比較して、（例えば、１〜２週間の期間にわたり）抗原特異的リンパ球の数の約１．５倍〜約１０００倍の増加をもたらす条件下でリンパ球を拡大することを含む。ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）は、ペプチドを添加しないでリンパ球を拡大する場合と比較して、一週間の期間にわたりリンパ球数の約１．５倍以上の増加をもたらす条件下でリンパ球を拡大することを含む。ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）は、ペプチドを添加しないでリンパ球を拡大する場合と比較して、一週間の期間にわたりリンパ球の数の約２倍以上の増加をもたらす条件下でリンパ球を拡大することを含む。ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）は、ペプチドを添加しないでリンパ球を拡大する場合と比較して、一週間の期間にわたりリンパ球数の約１．５〜約２倍の増加をもたらす条件下でリンパ球を拡大することを含む。ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）は、ペプチドを添加しないでリンパ球を拡大する場合と比較して、一週間の期間にわたりリンパ球数の１．５倍を超える増加をもたらす条件下でリンパ球を拡大することを含む。ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）は、抗原特異的Ｔ細胞の頻度の最大１０００倍の濃縮を含む（例えば、図１５を参照）。ある実施形態では、頻度の最大１，０００倍の濃縮が２週間で達成される。濃縮の倍率は、第１の拡大フェーズ中にペプチド抗原に曝露した場合と従来の曝露とで、得られる抗原特異的リンパ球の頻度を比較することによって決定される。ある実施形態では、第１の拡大は、プレＲＥＰフェーズ中にペプチドが存在しない方法と比較して、抗原特異的リンパ球の約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約３０、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、または約１０００の濃縮をもたらす。
【００７９】
本明細書に記載の方法の第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）フェーズを実施することができる条件は、当業者によく知られている。
【００８０】
ある実施形態において、第２の拡大は、リンパ球（例えば、プレＲＥＰフェーズの後にリンパ球の集団から採取されるサンプルに由来する）を、その拡大フェーズ中のリンパ球の急速な分裂を確実にする化合物を補足した培地中で所定期間にわたり最初に拡大させる手順を指す。このやり方で実施する場合、第２の拡大は急速拡大プロトコル（ＲＥＰ）である。ある実施形態では、ＲＥＰ段階は、ｃＧＭＰグレードの試薬および３０〜４０Ｌの培地を必要とする。本明細書に記載の方法のＲＥＰフェーズを実施することができる条件は、当業者によく知られている。
【００８１】
ある実施形態では、第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）は、ＣＤ３複合体アゴニスト、マイトジェン、および／またはフィーダー細胞の存在下で行われる。
【００８２】
ある実施形態において、ＣＤ３複合アゴニストは、化合物、小分子（例えば、小有機分子）、核酸、ポリペプチド、またはそれらのフラグメント、アイソフォーム、変異体、類似体、もしくは誘導体であってよいが、これらに限定されない。ある実施形態では、ＣＤ３複合体アゴニストはポリペプチドである。ある実施形態では、ＣＤ３複合体アゴニストは、抗体またはそのフラグメントである。ある実施形態では、ＣＤ３複合体アゴニストはモノクローナル抗体である。ある実施形態では、ＣＤ３複合アゴニストはＯＫＴ−３（例えば、３０ｎｇ／ｍｌ）である。ある実施形態では、ＣＤ３複合アゴニストは、抗ＣＤ２８抗体と組み合わせて添加される。
【００８３】
ある実施形態では、マイトジェンには、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）、メゼレイン（Ｍｚｎ）、およびテトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
フィーダー細胞は、リンパ球細胞またはその子孫の拡大を支持することができる細胞を包含する。フィーダー細胞が提供する支持は、接触依存性および非接触依存性の両方として特徴付けることができる。フィーダー細胞は、前駆細胞の拡大を支持する因子を分泌するまたはそれを細胞表面に発現することができる。フィーダー細胞の一例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。他の非限定的な例には、脾細胞、リンパ節細胞および樹状細胞が含まれる。フィーダー細胞はまた、Ｔ細胞前駆細胞の拡大の支持に必要な因子を分泌するまたはそれを細胞表面に発現するように改変された、線維芽細胞などの通常はフィーダー細胞として機能しない細胞であってもよい。フィーダー細胞は、リンパ球および／または対象にとって、自己、同種異系、同系、人工、または異種であってよい。
【００８５】
フィーダー細胞は、組織培養技術における標準的な手順によって非有糸分裂にされる。そのような方法の例は、ガンマ線源によるフィーダー細胞の照射、または細胞を有糸分裂的に不活性にするのに十分な時間のマイトマイシンＣとのフィーダー細胞のインキュベーションである。
【００８６】
ある実施形態では、リンパ球の成長を促進するために第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）中に使用されるサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、またはそれらの組合せであってよいが、これらに限定されない。ある実施形態では、ＲＥＰ中に使用される化合物はＩＬ−２である。
【００８７】
急速拡大の非限定的な例には、細胞のプール（例えば、１ｘ１０６のプレＲＥＰリンパ球）を、ＩＬ２（３，０００ＩＵ／ｍｌ）および１００：１の比で同種異系フィーダー細胞（例えば、３つの異なるドナーから）と共に、ＯＫＴ−３抗体の存在下で拡大することが含まれる。
【００８８】
ある実施形態では、第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）中に使用されるサイトカインは、（少なくとも細胞が最初に添加されるときに）約５０ＩＵ／ｍｌ〜約１０，０００ＩＵ／ｍｌで細胞培養培地中に存在することができる。ある実施形態では、化合物は、約１００ＩＵ／ｍｌ〜約９，０００ＩＵ／ｍｌ、約２００ＩＵ／ｍｌ〜約８，０００ＩＵ／ｍｌ、約４００ＩＵ／ｍｌ〜約７，０００ＩＵ／ｍｌ、約６００ＩＵ／ｍｌ〜約６，０００ＩＵ／ｍｌ、約８００ＩＵ／ｍｌ〜約５，０００ＩＵ／ｍｌ、約１，０００ＩＵ／ｍｌ〜約４，０００ＩＵ／ｍｌ、または約２，０００ＩＵ／ｍｌ〜約３，０００ＩＵ／ＩＵ／ｍｌで細胞培養培地中に存在することができる。ある実施形態では、化合物は、約５００ＩＵ／ｍｌ〜約６，０００ＩＵ／ｍｌ、約１，０００ＩＵ／ｍｌ〜約５，０００ＩＵ／ｍｌ、または約２，０００ＩＵ／ｍｌ〜約４，０００ＩＵ／ｍｌで細胞培養培地中に存在することができる。ある実施形態では、第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）中に使用されるサイトカインは、約３，０００ＩＵ／ｍｌで細胞培養培地中に存在する。ある実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、またはそれらの任意の組合せであってよいが、それらに限定されない。ある実施形態では、サイトカインはＩＬ−２である。ある実施形態では、第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）中に存在するサイトカインは、約３，０００ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ−２である。
【００８９】
第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）フェーズ中に存在し得る追加の化合物には、小分子（例えば、小有機分子）、核酸、ポリペプチド、またはそれらのフラグメント、アイソフォーム、バリアント、アナログ、もしくは誘導体；ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＦ１、ＣＤ３９、もしくはＢＡＴＦに対するアゴニストが含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、アンタゴニストはポリペプチドであってよい。ある実施形態において、アンタゴニストは、抗体またはそのフラグメントであってよい。ある実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。ある実施形態では、追加の化合物はチェックポイント阻害剤であってよい。
【００９０】
ある実施形態では、第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）手順は、サンプルおよび他の非リンパ球細胞よりもリンパ球の成長および／または拡大に有利に働く条件で生じる。
【００９１】
ある実施形態では、第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）手順は、約５〜約４２日間続く期間に生じる。ある実施形態では、第２の拡大は、約７〜約３５日、約１０〜約２８日、または約１４〜約２１日の間に生じる。ある実施形態において、第２の拡大は約１０日間の長さである。ある実施形態では、第２の拡大は約１１日の長さである。ある実施形態では、第２の拡大は約１４日の長さである。
【００９２】
Ｔ細胞の拡大に使用できる物質には、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２１などのインターロイキンが含まれる（例えば、Cornish et al. 2006, Blood. 108(2):600-8, Bazdar and Sieg, 2007, Journal of Virology, 2007, 81(22):12670-12674, Battalia et al, 2013, Immunology, 139(1):109-120を参照のこと）。Ｔ細胞の拡大に使用できる物質の他の具体例は、αＣＤ８抗体、αＣＤ４５抗体またはαＣＤ９０抗体などの、ＣＤ８、ＣＤ４５またはＣＤ９０に結合する物質である。Ｔ細胞集団の具体例には、抗原特異的Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（メモリーＴ細胞の具体例はＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋特異的セントラルメモリーＴ細胞である）または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇの具体例は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇ細胞である）が含まれる。Ｔリンパ球を拡大するために使用することができる追加の物質には、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；および同第６，８６７，０４１号に記載されている方法が含まれ、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
ナチュラルキラー細胞の拡大に使用できる物質には、例えばαＣＤ１６抗体またはαＣＤ５６抗体などの、ＣＤ１６またはＣＤ５６に結合する物質が含まれる。ある実施形態では、結合剤には抗体が含まれる（例えば、Hoshino et al, Blood. 1991 Dec. 15; 78(12):3232-40を参照のこと）。ＮＫ細胞の拡大に使用できる他の物質はＩＬ−１５であってよい（例えば、Vitale et al. 2002. The Anatomical Record. 266:87-92を参照のこと）。 
【００９４】
ある実施形態では、第２の拡大は、ペプチドを添加しないでリンパ球を拡大する場合と比較して、１週間の期間にわたり抗原特異的リンパ球の数の約１．５倍〜少なくとも約１００倍の増加をもたらす条件下でリンパ球を拡大することを含む。ある実施形態では、第２の拡大は、ペプチドを添加しないでリンパ球を拡大する場合と比較して、１週間の期間にわたり抗原特異的リンパ球の数の約３倍〜少なくとも約１００倍の増加をもたらす条件下でリンパ球を拡大することを含む。
【００９５】
本明細書に記載の方法は、１つまたは複数のペプチドを添加することを含むことができる。ある実施形態では、その方法は、ペプチドのプール（すなわち、２つ以上の異なるペプチド）を添加することを含む。ある実施形態では、その方法は、抗原を含む単一のペプチドのみを添加する。ある実施形態では、その方法は、約２〜約３００の異なるペプチドを添加することを含む。ある実施形態では、その方法は、約２〜約１００、約２０〜約１００、約５０〜約１００、約２〜約１０、または２〜約５の異なるペプチドを添加することを含む。ある実施形態では、その方法は、約５つの異なるペプチドを添加することを含む。
【００９６】
ある実施形態において、方法は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、または少なくとも３００の異なるペプチドを含む。ある実施形態では、方法は、少なくとも約２〜約１００、約２〜約５０、約２〜約４０、約２〜約３０、約２〜約２０、約２〜約１５、約２〜約１０、約２〜約９、約２〜約８、約２〜約７、約２〜約６、約２〜約５、約２〜約４、または約２〜約３の異なるペプチドを含む。ある実施形態では、方法は、約２０〜約３００、約２０〜約２００、約２０〜約１００、約２０〜約９０、約２０〜約８０、約２０〜約７０、約２０〜約６０、約２０〜約５０、約２０〜約４０、または約２０〜約３０の異なるペプチドを含む。ある実施形態では、方法は、約１０〜約１００、約２０〜約１００、約３０〜約１００、約４０〜約１００、約５０〜約１００、約６０〜約１００、約７０〜約１００、８０〜約１００、または約９０〜約１００の異なるペプチドを含む。
【００９７】
ある実施形態では、方法は、少なくとも２つの拡大フェーズのうちの少なくとも１つのフェーズ中にペプチドを添加することを含み、２種類以上のペプチドがある場合、前記ペプチドのそれぞれは異なる抗原を含む。ある実施形態では、ペプチドは、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）中にのみ添加される。ある実施形態では、ペプチドは、第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）中にのみ添加される。ある実施形態では、ペプチドは、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）中および第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）中の両方で添加される。
【００９８】
ある実施形態では、方法は、少なくとも２つの拡大フェーズのうちの少なくとも１つのフェーズの開始時にペプチドを添加することを含む。ある実施形態では、ペプチドは、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）の開始時に添加される。ある実施形態では、ペプチドは、第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）の開始時に添加される。ある実施形態では、ペプチドは、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）のみの開始時に添加される。ある実施形態において、ペプチドは、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）および第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）の両方の開始時に添加される。
【００９９】
ある実施形態では、方法は、少なくとも１回ペプチドを再添加することを含む。ある実施形態では、ペプチドは、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）中にのみ再添加される。ある実施形態では、ペプチドは、第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）中にのみ再添加される。ある実施形態では、ペプチドは、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）中および第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）中の両方で再付加される。
【０１００】
ある実施形態では、方法は、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に毎日、ペプチドを再添加することを含む。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズにおいて、最初の添加後に毎日、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日、少なくとも２１日、少なくとも２２日、少なくとも２３日、少なくとも２４日、少なくとも２５日、少なくとも２６日、少なくとも２７日、少なくとも２８日、少なくとも２９日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、または少なくとも５０日間、再添加されてもよい。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズにおいて、最初の添加後に毎日、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約３５日、約４０日、約４５日、または約５０日間、再添加されてもよい。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に少なくとも１回再添加される。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に１回再添加される。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に少なくとも２日間再添加される。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に２日間再添加される。
【０１０１】
ある実施形態では、方法は、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に隔日でペプチドを再添加することを含む。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズにおいて、最初の添加後に隔日で、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２１回、少なくとも２２回、少なくとも２３回、少なくとも２４回、少なくとも２５回、少なくとも２６回、少なくとも２７回、少なくとも２８回、少なくとも２９回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、または少なくとも５０回、再添加されてもよい。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズにおいて、最初の添加後に隔日で、約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約１１回、約１２回、約１３回、約１４回、約１５回、約１６回、約１７回、約１８回、約１９回、約２０回、約２１回、約２２回、約２３回、約２４回、約２５回、約２６回、約２７回、約２８回、約２９回、約３０回、約３５回、約４０回、約４５回、または約５０回、再添加されてもよい。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に少なくとも１回再添加される。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に１回再添加される。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に少なくとも２回再添加される。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に２回再添加される。
【０１０２】
ある実施形態では、方法は、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、７日ごと、８日ごと、９日ごと、または１０日ごとにペプチドを再添加することを含む。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、または７日ごとに、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２１回、少なくとも２２回、少なくとも２３回、少なくとも２４回、少なくとも２５回、少なくとも２６回、少なくとも２７回、少なくとも２８回、少なくとも２９回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、または少なくとも５０回添加されてもよい。ある実施形態では、ペプチドは、最初の添加後、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、または７日ごとに、約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約１１回、約１２回、約１３回、約１４回、約１５回、約１６回、約１７回、約１８回、約１９回、約２０回、約２１回、約２２回、約２３回、約２４回、約２５回、約２６回、約２７回、約２８回、約２９回、約３０回、約３５回、約４０回、約４５回、または約５０回添加される。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に少なくとも１回再添加される。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に１回再添加される。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に少なくとも２回再添加される。ある実施形態では、ペプチドは、それぞれの拡大フェーズ内で、最初の添加後に２回再添加される。
【０１０３】
ある実施形態では、ペプチドは、拡大フェーズの初日（1日目）にのみ添加することができる。ある実施形態では、ペプチドは、拡大フェーズの１日目および３日目に添加される。ある実施形態では、ペプチドは、拡大の１日目、３日目および５日目に添加される。ある実施形態では、ペプチドは、拡大の１日目および１０日目に添加される。
【０１０４】
ペプチドは、可溶性形態、または表面上にペプチドを提示するように改変された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示された形態で添加することができる。ある実施形態において、ペプチドは、可溶性形態、およびＡＰＣの表面に提示された形態の両方で添加することができる。ある実施形態では、ＡＰＣは、添加される／リンパ球と一緒に共培養される前にそれらの表面上にペプチドを提示するように処理される。ある実施形態において、ペプチドは、添加される／リンパ球と一緒に共培養される前にそれらの表面上にペプチドを提示するために前処理されていないＡＰＣと共に、可溶性形態で添加される。ある実施形態では、ペプチドは、添加される／リンパ球と一緒に共培養される前にそれらの表面上にペプチドを提示するために前処理されたＡＰＣおよび前処理されていないＡＰＣと共に、可溶性形態で添加される。
【０１０５】
可溶性形態で添加される場合、ペプチドは、各ペプチドについて、約０．１ｎＭ〜約１００μＭの濃度で添加され得る。ある実施形態では、可溶性ペプチドは、各ペプチドについて、約９０μＭ、約１０ｎＭ〜約８０μＭ、約５０ｎＭ〜約７０μＭ、約１００ｎＭ〜約６０μＭ、約１５０ｎＭ〜約５０μＭ、約２００ｎＭ〜約４０μＭ、約２５０ｎＭ〜約３０μＭ、約３００ｎＭ〜約２０μＭ、約３５０ｎＭ〜約１０μＭ、約４００ｎＭ〜約９μＭ、約４５０ｎＭ〜約８μＭ、約５００ｎＭ〜約７μＭ、約５５０ｎＭ〜約６μＭ、約６００ｎＭ〜約５μＭ、約６５０ｎＭ〜約４μＭ、約７００ｎＭ〜約３μＭ、約７５０ｎＭ〜約２．５μＭ、約８００ｎＭ〜約２μＭ、約９００ｎＭ〜約１．５μＭ、または約９５０ｎＭ〜約１．２５μＭの濃度で添加することができる。ある実施形態では、可溶性ペプチドは、各ペプチドについて、約１００ｎＭ〜約１００μＭ、約２５０ｎＭ〜約７５μＭ、約５００ｎＭ〜約５０μＭ、約７５０ｎＭ〜約２５μＭ、約９００ｎＭ〜約１０μＭ、または約９９０ｎＭ〜約５μＭの濃度で添加することができる。
【０１０６】
ある実施形態では、可溶性ペプチドは、各ペプチドについて、少なくとも約０．１ｎＭ、約１ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２６０ｎＭ、約２７０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約２９０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３１０ｎＭ、約３２０ｎＭ、約３３０ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３６０ｎＭ、約３７０ｎＭ、約３８０ｎＭ、約３９０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４１０ｎＭ、約４２０ｎＭ、約４３０ｎＭ、約４４０ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４６０ｎＭ、約４７０ｎＭ、約４８０ｎＭ、約４９０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５１０ｎＭ、約５２０ｎＭ、約５３０ｎＭ、約５４０ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５６０ｎＭ、約５７０ｎＭ、約５８０ｎＭ、約５９０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６１０ｎＭ、約６２０ｎＭ、約６３０ｎＭ、約６４０ｎＭ、約６５０ｎＭ、約６６０ｎＭ、約６７０ｎＭ、約６８０ｎＭ、約６９０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７１０ｎＭ、約７２０ｎＭ、約７３０ｎＭ、約７４０ｎＭ、約７５０ｎＭ、約７６０ｎＭ、約７７０ｎＭ、約７８０ｎＭ、約７９０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８１０ｎＭ、約８２０ｎＭ、約８３０ｎＭ、約８４０ｎＭ、約８５０ｎＭ、約８６０ｎＭ、約８７０ｎＭ、約８８０ｎＭ、約８９０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９１０ｎＭ、約９２０ｎＭ、約９３０ｎＭ、約９４０ｎＭ、約９５０ｎＭ、約９６０ｎＭ、約９７０ｎＭ、約９８０ｎＭ、約９９０ｎＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、または約１００μＭの濃度で添加することができる。
【０１０７】
ある実施形態では、可溶性ペプチドは、各ペプチドについて、約０．１ｎＭ、約１ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２６０ｎＭ、約２７０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約２９０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３１０ｎＭ、約３２０ｎＭ、約３３０ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３６０ｎＭ、約３７０ｎＭ、約３８０ｎＭ、約３９０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４１０ｎＭ、約４２０ｎＭ、約４３０ｎＭ、約４４０ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４６０ｎＭ、約４７０ｎＭ、約４８０ｎＭ、約４９０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５１０ｎＭ、約５２０ｎＭ、約５３０ｎＭ、約５４０ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５６０ｎＭ、約５７０ｎＭ、約５８０ｎＭ、約５９０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６１０ｎＭ、約６２０ｎＭ、約６３０ｎＭ、約６４０ｎＭ、約６５０ｎＭ、約６６０ｎＭ、約６７０ｎＭ、約６８０ｎＭ、約６９０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７１０ｎＭ、約７２０ｎＭ、約７３０ｎＭ、約７４０ｎＭ、約７５０ｎＭ、約７６０ｎＭ、約７７０ｎＭ、約７８０ｎＭ、約７９０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８１０ｎＭ、約８２０ｎＭ、約８３０ｎＭ、約８４０ｎＭ、約８５０ｎＭ、約８６０ｎＭ、約８７０ｎＭ、約８８０ｎＭ、約８９０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９１０ｎＭ、約９２０ｎＭ、約９３０ｎＭ、約９４０ｎＭ、約９５０ｎＭ、約９６０ｎＭ、約９７０ｎＭ、約９８０ｎＭ、約９９０ｎＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、または約１００μＭの濃度で添加することができる。ある実施形態において、可溶性ペプチドは、各ペプチドについて、約１μＭの濃度で添加され得る。
【０１０８】
リンパ球がＡＰＣによる提示を介してペプチドに曝露される場合、サンプル（例えば、腫瘍サンプル）中の細胞と、ペプチド（単数または複数）を提示するＡＰＣとの比（細胞：ＡＰＣ）は約１：１〜約１：１００である。ある実施形態では、サンプル中の細胞とペプチド提示ＡＰＣとの比は、約１：１〜約１：９０、約１：１〜約１：８０、約１：１〜約１：７０、約１：１〜約１：６０、約１：１〜約１：５０、約１：１〜約１：４０、約１：１〜約１：３０、約１：１〜約１：２０、約１：１〜約１：１０、約１：１〜約１：９、約１：１〜約１：８、約１：１〜約１：７、約１：１〜約１：６、約１：１〜約１：５、約１：１〜約１：４、約１：１〜約１：３、または約１：１〜約１：２である。ある実施形態では、サンプル中の細胞とペプチド提示ＡＰＣとの比は、約１：２〜約１：９０、約１：３〜約１：８０、約１：４〜約１：７０、約１：５〜約１：６０、約１：６〜約１：５０、約１：７〜約１：４０、約１：８〜約１：３０、または約１：９〜約１：２０である。
【０１０９】
ある実施形態では、サンプル中の細胞のペプチド提示ＡＰＣに対する比は、少なくとも約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、または約１：９、または約１：１０、または約１：１２、または約１：１４、または約１：１６、または約１：１８、または約１：２０、または約１：２５、または約１：３０、または約１：３５、または約１：４０、または約１：４５、または約１：５０、または約１：５５、または約１：６０、または約１：６５、または約１：７０、または約１：７５、または約１：８０、または約１：８５、または約１：９０、または約１：１００である。
【０１１０】
ある実施形態では、サンプル中の細胞とペプチド提示ＡＰＣとの比は、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、または約１：９、または約１：１０、または約１：１２、または約１：１４、または約１：１６、または約１：１８、または約１：２０、または約１：２５、または約１：３０、または約１：３５、または約１：４０、または約１：４５、または約１：５０、または約１：５５、または約１：６０、または約１：６５、または約１：７０、または約１：７５、または約１：８０、または約１：８５、または約１：９０、または約１：１００である。
【０１１１】
リンパ球がＡＰＣによる提示を介してペプチドに曝露される場合、サンプル中のリンパ球と、ペプチドを提示するＡＰＣとの比は、約０．０１：１〜約１００：１である。ある実施形態では、サンプル中のリンパ球とペプチド提示ＡＰＣとの比は、約０．０２５：１〜約９０：１、約０．０５：１〜約８０：１、約０．０７５：１〜約７０：１、約０．１：１〜約６０：１、約０．１２５：１〜約５０：１、約０．１５：１〜約４０：１、約０．１７５：１〜約３０：１、約０．２：１〜約２０：１、約０．３：１〜約１０：１、約０．４：１〜約９：１、約０．５：１〜約８：１、約０．６：１、約７：１、約０．７：１、約６：１、約０．７：１〜約５：１、約０．８：１〜約４：１、約０．９：１〜約３：１である。ある実施形態では、リンパ球はサンプルから単離される。
【０１１２】
ある実施形態では、サンプル中のリンパ球とペプチド提示ＡＰＣとの比は、少なくとも約０．０１：１、約０．０２：１、約０．０４：１、約０．０６：１、約０．０８：１、約０．０９：１、約０．１：１、約０．２：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、約０．９：１、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約５５：１、約６０：１、約６５：１、約７０：１、約７５：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１である。ある実施形態では、リンパ球はサンプルから単離される。
【０１１３】
ある実施形態では、サンプル中のリンパ球とペプチド提示ＡＰＣとの比は、約０．０１：１、約０．０２：１、約０．０４：１、約０．０６：１、約０．０８：１、約０．０９：１、約０．１：１、約０．２：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、約０．９：１、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約５５：１、約６０：１、約６５：１、約７０：１、約７５：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１である。ある実施形態では、リンパ球はサンプルから単離される。
【０１１４】
ある実施形態では、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）中にペプチドに曝露させることにより、第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）のみでペプチドに曝露させた抗原特異的リンパ球と比較して、疲弊が少ない抗原特異的リンパ球をもたらす。
【０１１５】
ある実施形態では、第２の拡大ではペプチドに曝露させないで第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）中にペプチドに暴露させることにより、第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）および第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）でペプチドに暴露された抗原特異的リンパ球と比較して、疲弊が少ない抗原特異的リンパ球をもたらす。
【０１１６】
ある実施形態では、第２の拡大（例えば、ＲＥＰ）ではペプチドに曝露させないで第１の拡大（例えば、プレＲＥＰ）中にペプチドに暴露させることにより、第２の拡大でのみペプチドに曝露させた抗原特異的リンパ球と比較して、疲弊が少ない抗原特異的リンパ球をもたらす。
【０１１７】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、第１の拡大中のペプチドへの曝露は、リンパ球の頻度の改善をもたらす。ある実施形態では、第１の拡大中のペプチドへの曝露は、抗原特異的リンパ球の頻度の改善をもたらす。ある実施形態では、リンパ球および／または抗原特異的リンパ球の頻度の改善は、第１の拡大中にリンパ球がペプチドに曝露されない方法よりも優れている。
【０１１８】
ある実施形態では、抗原特異的リンパ球は、ペプチドおよび／またはペプチド提示ＡＰＣとの共培養前に選択および／または単離されない。ある実施形態では、抗原特異的リンパ球は、ペプチドおよび／またはペプチド提示ＡＰＣとの共培養後に選択および／または単離されない。ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、培養中または組織サンプル内の抗原特異的リンパ球を同定するために使用されない。ある実施形態では、ペプチド提示ＡＰＣは、抗原特異的リンパ球を同定するために使用されない。ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、リンパ球が特定の抗原またはエピトープを認識するかどうかを決定するために使用されない。
【０１１９】
ペプチド
一態様では、本明細書に記載されるのは、対象から得られたサンプル中のリンパ球またはそのようなサンプルから単離されたリンパ球を拡大することを含む、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的リンパ球を拡大する方法であって、拡大は、拡大中に１つまたは複数のペプチドを添加することを含み、各ペプチドは異なる抗原を含み、抗原特異的リンパ球が拡大される。ある実施形態では、その方法は、２つ以上のペプチド（すなわち、異なるペプチドのプール）を添加することを含む。ある実施形態では、ペプチドは可溶性形態で添加される。ある実施形態では、ペプチドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示される。ある実施形態では、ＡＰＣは可溶性ペプチドとインキュベートされ、（例えば、その表面上のＭＨＣに直接結合することにより、またはＡＰＣによってプロセシングされることにより）その表面上にペプチドを提示するＡＰＣをもたらす。ある実施形態では、ＡＰＣは、（例えば、翻訳または形質導入を介して）ペプチドを発現するように改変される。ある実施形態において、添加されるペプチドは、可溶性ペプチドと、（例えば、ペプチドを発現するように改変された、ペプチドと共にプレインキュベートされた、またはその両方の）ＡＰＣの表面に提示されたペプチドの両方である。ある実施形態では、可溶性ペプチドは、リンパ球と共培養される前にはその表面にペプチドを提示するように事前に誘導されていないＡＰＣと共に添加される。
【０１２０】
一態様では、本明細書に記載されるのは、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的リンパ球を拡大する方法であって、ａ）対象から得られたサンプル中のリンパ球またはそのようなサンプルから単離されたリンパ球を拡大すること、ここで拡大は少なくとも２つの拡大フェーズを含む、およびｂ）少なくとも２つの拡大フェーズのうちの少なくとも１つのフェーズ中に１つまたは複数のペプチドを添加することを含み、前記ペプチドのそれぞれは異なる抗原を含み、抗原特異的リンパ球が拡大される。ある実施形態では、方法は、２つ以上のペプチド（すなわち、ペプチドのプール）を添加することを含む。ある実施形態では、ペプチドは可溶性形態で添加される。ある実施形態では、ペプチドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示される。ある実施形態では、ＡＰＣは可溶性ペプチドとインキュベートされ、（例えば、その表面上のＭＨＣに直接結合することにより、またはＡＰＣによってプロセシングされることにより）その表面上にペプチドを提示するＡＰＣをもたらす。ある実施形態では、ＡＰＣは、（例えば、翻訳または形質導入を介して）ペプチドを発現するように改変される。ある実施形態では、添加されるペプチドは、可溶性ペプチドと、（例えば、ペプチドを発現するように改変された、ペプチドと共にプレインキュベートされた、またはその両方の）ＡＰＣの表面に提示されたペプチドの両方である。ある実施形態では、可溶性ペプチドは、リンパ球と共培養される前にはその表面にペプチドを提示するように事前に誘導されていないＡＰＣと共に添加される。
【０１２１】
本明細書に記載の方法に有用なペプチドは、好ましくは特異的な様式で、ペプチドを提示するＭＨＣがリンパ球上の受容体に結合できるような様式で、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に結合できる任意のペプチドを含むことができる。ある実施形態では、そのような結合はＴ細胞応答を誘導する。ある実施形態では、そのような結合はナチュラルキラー細胞応答を誘導する。
【０１２２】
例には、加水分解によって生成されたペプチド、および最も一般的には、合成的に生成されたペプチドが含まれ、そのようなペプチドには、特別に設計されたペプチド、および少なくとも一部のアミノ酸位置がいくつかのペプチド間で保存されかつ残りの位置がランダムであるペプチドが含まれる。
【０１２３】
クラスＩ  ＭＨＣは、通常、細胞の細胞質で活発に合成されるタンパク質に由来するペプチドを提示する。対照的に、クラスＩＩ  ＭＨＣは、通常、細胞のエンドサイトーシス経路に入る外因性タンパク質またはＥＲで合成されたタンパク質のいずれかに由来するペプチドを提示する。細胞内輸送は、ペプチドがＭＨＣタンパク質と会合することを可能にする。
【０１２４】
ある実施形態では、ペプチドは、ポリペプチドが抗原内の個々の変異アミノ酸を中心とするようなものである。
【０１２５】
本発明のペプチドの長さは、１００未満のアミノ酸、５０未満のアミノ酸、４０未満のアミノ酸、３０未満のアミノ酸、２０未満のアミノ酸、または１５未満のアミノ酸を含んでいてよい。ある実施形態では、ペプチドは、少なくとも５アミノ酸、例えば、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、または少なくとも３５アミノ酸から構成されていてよい。ある実施形態では、ペプチドは、約５〜約６０アミノ酸残基、約６〜約５５アミノ酸残基、約７〜約５０アミノ酸残基、約８〜約４５アミノ酸残基、約９〜約４０アミノ酸残基、約１０〜約３５アミノ酸残基、約１２〜約３０アミノ酸残基であり、整数増分で５〜４０アミノ酸長の間の任意のサイズのペプチド（すなわち、５、６、７、８、９．．．１００）を含む。
【０１２６】
ある実施形態では、本発明のペプチドは、約９〜約３１アミノ酸残基、約９〜約３０アミノ酸残基、約９〜約２９アミノ酸残基、約９〜約２８アミノ酸残基、約９〜約２７アミノ酸残基、約９〜約２６アミノ酸残基、約９〜約２５アミノ酸残基、約９〜約２４アミノ酸残基、約９〜約２３アミノ酸残基、約９〜約２２アミノ酸残基、約９〜約２１アミノ酸残基、約９〜約２０アミノ酸残基、約９〜約１９アミノ酸残基、約９〜約１８アミノ酸残基、約９〜約１７アミノ酸残基、約９〜約１６アミノ酸残基、約９〜約１５アミノ酸残基、約９〜約１４アミノ酸残基、約９〜約１３アミノ酸残基、約９〜約１２アミノ酸残基、約９〜約１１アミノ酸残基、または約９〜約１０アミノ酸残基を含むことができる。
【０１２７】
ある実施形態では、本発明のペプチドは、約９〜約３１アミノ酸残基、約１０〜約３０アミノ酸残基、約１０〜約２９アミノ酸残基、約１０〜約２８アミノ酸残基、約１０〜約３０アミノ酸残基、約１０〜約２７アミノ酸残基、約１０〜約２６アミノ酸残基、約１０〜約２５アミノ酸残基、約１０〜約２４アミノ酸残基、約１０〜約２３アミノ酸残基、約１０〜約２２アミノ酸残基、約１０〜約２１アミノ酸残基、約１０〜約２０アミノ酸残基、約１０〜約１９アミノ酸残基、約１０〜約１８アミノ酸残基、約１０〜約１７アミノ酸残基、約１０〜約１６アミノ酸残基、約１０〜約１５アミノ酸残基、約１０〜約１４アミノ酸残基、約１０〜約１３アミノ酸残基、約１０〜約１２アミノ酸残基、または約１０〜約１１アミノ酸残基を含むことができる。
【０１２８】
ある実施形態では、本発明のペプチドは、約９〜約３１アミノ酸残基、約１２〜約３０アミノ酸残基、約１２〜約２９アミノ酸残基、約１２〜約２８アミノ酸残基、約１２〜約２７アミノ酸残基、約１２〜約２６アミノ酸残基、約１２〜約２５アミノ酸残基、約１２〜約２４アミノ酸残基、約１２〜約２３アミノ酸残基、約１２〜約２２アミノ酸残基、約１２〜約２１アミノ酸残基、約１２〜約２０アミノ酸残基、約１２〜約１９アミノ酸残基、約１２〜約１８アミノ酸残基、約１２〜約１７アミノ酸残基、約１２〜約１６アミノ酸残基、約１２〜約１５アミノ酸残基、約１２〜約１４アミノ酸残基、または約１２〜約１３アミノ酸残基を含むことができる。
【０１２９】
ある実施形態では、本発明のペプチドは、約９〜約３１アミノ酸残基、約１５〜約３０アミノ酸残基、約１５〜約２９アミノ酸残基、約１５〜約２８アミノ酸残基、約１５〜約２７アミノ酸残基、約１５〜約２６アミノ酸残基、約１５〜約２５アミノ酸残基、約１５〜約２４アミノ酸残基、約１５〜約２３アミノ酸残基、約１５〜約２２アミノ酸残基、約１５〜約２１アミノ酸残基、約１５〜約２０アミノ酸残基、約１５〜約１９アミノ酸残基、約１５〜約１８アミノ酸残基、約１５〜約１７アミノ酸残基、または約１５〜約１６アミノ酸残基を含むことができる。
【０１３０】
ある実施形態では、本発明のペプチドは、約９〜約３１アミノ酸残基、約２５〜約３０アミノ酸残基、約２５〜約２９アミノ酸残基、約２５〜約２８アミノ酸残基、約２５〜約２７アミノ酸残基、または約２５〜約２６アミノ酸残基を含むことができる。
【０１３１】
自然にＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは約９〜４０アミノ酸で変動するが、通常、ペプチドはＭＨＣ結合活性またはリンパ球認識を失うことなく、約９〜１１アミノ酸コアに短縮され得る。ある実施形態では、ペプチドは、約９〜約１０アミノ酸長、約１２〜約１５アミノ酸長、または約２５〜約３１アミノ酸長である。
【０１３２】
ある実施形態では、ＡＰＣは、ペプチドを発現するように改変される。ある実施形態では、ＡＰＣは、ペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをＡＰＣに導入するために、トランスフェクション、形質導入、または一時的な細胞膜破壊（すなわち、細胞スクイーズ（cell squeeze））の少なくとも１つによって改変される。したがって、ペプチドを発現するポリヌクレオチドがＡＰＣに導入される。ある実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡプラスミドである。ある実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡ分子である。ペプチドをコードする遺伝子を導入する方法は、以下でより詳細に議論される。ある実施形態では、ペプチドは、トランスフェクション／形質導入のウイルス法を介して導入される。ある実施形態では、各遺伝子は、抗原内に見られる個々の変異アミノ酸を中心とする約９〜約３１アミノ酸長のポリペプチドをコードする。
【０１３３】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、別個のペプチドをコードする約１〜約１００個の遺伝子を含む。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、別個のペプチドをコードする、約２〜約９０、約３〜約８０、約４〜約７０、約５〜約６０、約６〜約５０、約７〜約４０、約８〜約３０、約９〜約２０、または約１０〜約１５個の遺伝子を含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、別個のペプチドをコードする、約１〜約５０、約１〜約４０、約１〜約３０、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、約１〜約５、約１〜約５、約２〜約５０、約２〜約４０、約２〜約３０、約２〜約２０、約２〜約１５、約２〜約１０、約２〜約５、５〜約５０、約５〜約４０、約５〜約３０、約５〜約２０、約５〜約１５、約５〜約１０、約５〜約５、約１０〜約５０、約１０〜約４０、約１０〜約３０、約１０〜約２０、または約１０〜約１５個の遺伝子を含む。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、別個のペプチドをコードする、約１〜約１５、約１〜約５、約２〜約４０、約２〜約１５、または約２〜約５個の遺伝子を含む。
【０１３４】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、別個のペプチドをコードする、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、約３２、約３４、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、約４８、または約５０個の遺伝子を含む。
【０１３５】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、別個のペプチドをコードする、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、約３２、約３４、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、約４８、または約５０個の遺伝子を含む。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、別個のペプチドをコードする、１、２、３、４、５、１０、または１５個の遺伝子を含む。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、別個のペプチドをコードする、５個の遺伝子を含む。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、別個のペプチドをコードする、１、２、３、４、５、１０、または１５個の遺伝子から本質的になる。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、別個のペプチドをコードする５個の遺伝子から本質的になる。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードする１つの遺伝子から本質的になる。
【０１３６】
ある実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドをタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）構築物としてＡＰＣに導入することを含み、各ミニ遺伝子は異なる遺伝子を含み、各遺伝子は、抗原（例えば、変異アミノ酸配列をコードする腫瘍特異的変異）を含む。ＴＭＧは、それぞれが個々の変異アミノ酸を中心とする２５〜３１ｍｅｒをコードする可変数のミニ遺伝子で構成されるＤＮＡ配列である（図６Ａ）。ＴＭＧは、適切な発現ベクター中にクローン化することができ、これをテンプレートとして使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｍＲＡを生成することができる。次に、（例えば、エレクトロポレーションなどの、ｍＲＮＡトランスフェクションの既知の手段により）このｍＲＮＡをＡＰＣに導入することができる。ある実施形態では、ミニ遺伝子はリンカーによって分離されている。ＴＭＧは、当業者によく知られている任意の方法によって作成することができる。表２、ならびに図７および１７〜２０は、本発明の方法に有用なＴＭＧの非限定的な例を提供する。
【０１３７】
各ミニ遺伝子は、本発明の方法によって同定される１つの変異をコードしていてよく、その変異の両側に、同定遺伝子によりコードされる内因性タンパク質からの任意の適切な数の連続アミノ酸が隣接して配置されている。構築物中のミニ遺伝子の数は限定されず、例えば、約２、約３、約４、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、またはそれ以上、あるいはポリヌクレオチド中の遺伝子の数について上記で規定した範囲の数を含むことができる。ある実施形態では、ＴＭＧは約５つのミニ遺伝子を含む。ある実施形態では、ミニ遺伝子はリンカーによって分離されている（図７は、ミニ遺伝子に有用なリンカーの非限定的な例を提供する）。ＡＰＣは、ＴＭＧ構築物によってコードされる変異アミノ酸配列を発現し、ＭＨＣ分子に結合した抗原のアミノ酸配列を細胞膜上に表示する。一実施形態では、方法は、各構築物が異なる遺伝子によってコードされる抗原アミノ酸配列の異なるセットをコードする、複数のＴＭＧ構築物を調製し、さらに各ＴＭＧ構築物を同じまたは異なるＡＰＣ集団に導入することを含んでいてよい。これに関して、各集団が異なるＴＭＧ構築物によってコードされる変異アミノ酸配列を発現および表示する、ＡＰＣの複数の集団を得ることができる。
【０１３８】
ペプチドには、腫瘍または自己免疫障害に関連するタンパク質、感染因子のタンパク質、および毒性タンパク質（例えば、β−アミロイド）からなる群より選択されるタンパク質の少なくとも一部、例えば抗原決定基を含むペプチドが含まれる。
【０１３９】
がんは、体に大きな被害をもたらす能力を持ちながら、正常組織かのように免疫系から隠れることができることで有名である。しかしながら、最近、科学者は、腫瘍内の体細胞変異またはパッセンジャー変異が新たな抗原またはネオ抗原を生じさせることを明らかにした。これらネオ抗原は、適応免疫系によって「非自己」として認識され、免疫系にがんを正常細胞と区別させるものとして機能する。コードされるタンパク質に単一アミノ酸の違いをもたらすＤＮＡ配列への単一塩基対の変化は、免疫系に何かが違っていることを警告し、腫瘍に対する応答を開始させるのに十分となることができる。腫瘍細胞は、細胞のペプチドのアミノ酸配列を変更させ得る複数の変異を発生しやすいため、それらペプチドを自己タンパク質からネオ抗原を担持するものに変換する。これらネオ抗原はがん細胞に特有であり、対照的に、がん免疫療法のために探究されてきた他の抗原は正常細胞でも発現され得るため、患者の健康な組織が免疫応答を受けやすくなる。したがって、ネオ抗原は個別化免疫療法の強力な候補となり得る。
【０１４０】
ある例において、方法は、患者の腫瘍細胞における１つまたは複数の遺伝子を同定することを含んでいてよく、各遺伝子は、変異アミノ酸配列（すなわち、ネオ抗原を含む）をコードする腫瘍特異的変異を含む。腫瘍細胞は、腫瘍細胞を含むまたは含むと予想される対象由来の任意のサンプルから得ることができる。サンプルは、組織（例えば、原発腫瘍もしくは腫瘍転移）または体液（例えば、血液、腹水、またはリンパ液）などの、対象の体から採取された任意のサンプルであってよい。がん細胞の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。
【０１４１】
腫瘍特異的ネオ抗原は、非サイレント変異をコードし、対象の腫瘍細胞には存在するが対象の正常体細胞には存在しない任意の遺伝子の変異に由来する。ネオ抗原は、腫瘍細胞の細胞表面で発現される場合があり、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）などの体液性免疫系の構成要素によって認識される。細胞内腫瘍抗原は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と複合体を形成する短鎖ペプチドフラグメントにプロセシングされ、がん細胞の細胞表面に提示され、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。
【０１４２】
ある実施形態では、使用されるペプチドはプライベートペプチドである。プライベートペプチドは、特定の腫瘍に関して患者で特有に発現されるネオ抗原である。したがって、プライベートペプチドは、別の患者には使用できないペプチドである。ネオ抗原が２人以上の個人に共通する場合、それは共通ペプチドである。
【０１４３】
腫瘍抗原（ネオ抗原を含む）を同定することができる腫瘍関連タンパク質の非限定的な例には、例えば、１３ＨＣＧ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アディポフィリン、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、α−アクチニン−４、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＲＴＣ１、Ｂ−ＲＡＦ、ＢＡＧＥ−１、ＢＣＡ２２５、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質ｂ３ａ２、β−カテニン、ＢＩＮＧ−４、脳型グリコーゲンホスホリラーゼ、ＢＴＡＡ、ｃ−ｍｅｔ、ＣＡ−１２５、ＣＡ−１５−３（ＣＡ  ２７．２９／ＢＣＡＡ）、ＣＡ−１９−９、ＣＡ−２４２、ＣＡ−５０、ＣＡ−７２−４、ＣＡＬＣＡ、ＣＡＭ  １７．１、ＣＡＭ４３、がん胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、ＣＤ６８／ＫＰ１、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＬＰＰ、ＣＯ−０２９、ＣＯＡ−１、ＣＰＳＦ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＴ−７、ＣＴ９／ＢＲＤＴ、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、ＣＴｐ１１、サイクリンＤ１、サイクリン−Ａ１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＤＫＫ１、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、ＥＢＮＡ、ＥＦ２、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、上皮性腫瘍抗原（「ＥＴＡ」）、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、Ｇ２５０、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＧＡＧＥ−１，２，８、ＧＡＧＥ−３，４，５，６，７、ＧＡＳ７、グリピカン（ｇｌｙｐｉｃａｎ）−３、ＧｎＴＶ、ｇｐ１００、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ＧＰＮＭＢ、Ｈ−ｒａｓ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＨＡＵＳ３、ヘプシン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＯＭ−ＭＤ−２１、ＨＯＭ−ＭＤ−３９７、Ｈｏｍ／Ｍｅ１−４０、Ｈｏｍ／Ｍｅ１−５５、ＨＰＶ  Ｅ２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ｈｓｐ７０−２、ＨＴｇｐ−１７５、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＩＬ１３Ｒα２、腸のカルボキシルエステラーゼ、Ｋ−ｒａｓ、カリクレイン４、ＫＩＡＡＯ２０５、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＫＬＣ１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＣＣＤＣ１１０としても知られるＫＭＨＮ１、ＬＡＧＥ−１、ＬＡＧＥ−２、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ１３、ＭＡＧＥ−Ｂ（ＭＡＧＥ−Ｂ１−ＭＡＧＥ−Ｂ２４）、ＭＡＧＥ−Ｃ（ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７、ＣＴ１０）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、リンゴ酸酵素、マンマグロビンＡ、ＭＡＰＥ、ＭＡＲＴ−Ｉ、ＭＡＲＴ−２、ＭＡＴＮ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＥ１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌｏｅ、ＭＧ７−Ａｇ、ミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＯＶ１８、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ムチン、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ミオシン、ミオシンクラスＩ、Ｎ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｗ、ＮＡ８８−Ａ、ＮＡＧ、ＮＢ／１７０Ｋ、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＮｕＭａ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＣＯ−１、ＮＹ−ＣＯ−２、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ−９、Ｐポリペプチド、ｐ１５（５８）、ｐ１６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、多形性上皮ムチン（「ＰＥＭ」）、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＲＡＧＥ−１、ＲＢＡＦ６００、ＲＣＡＳ１、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＳＣＰ−１、ＳＤＣＣＡＧ１６、セセルニン（ｓｅｃｅｒｎｉｎ）１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＯＸ１０、Ｓｐ１７、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＳＹＴ−ＳＳＸ１または−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ会合タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、ＴＡＧ−７２−４、ＴＡＧＥ、テロメラーゼ、ＴＥＲＴ、ＴＧＦ−βＲＩＩ、ＴＬＰ、ＴＰＢＧ、ＴＰＳ  ＴＲＡＧ−３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、ＴＳＰ−１８０、ＴＳＰ５０、チロシナーゼ、チロシナーゼ（「ＴＹＲ」）、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ−ｌｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、Ｋｒａｓ、ＷＴ−１抗原（リンパ腫およびその他の固形腫瘍における）、ＥｒｂＢ受容体、Ｍｅｌａｎ  Ａ［ＭＡＲＴ１］、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、およびＴＲＰ−２（黒色腫における）；ＭＡＧＥ−１およびＭＡＧＥ−３（膀胱がん、頭頸部がん、および非小細胞がんにおける）；ＨＰＶ  ＥＧおよびＥ７タンパク質（子宮頸がんにおける）；ムチン［ＭＵＣ−１］（乳がん、膵臓がん、結腸がん、および前立腺がんにおける）；前立腺特異抗原［ＰＳＡ］（前立腺がんにおける）；がん胎児性抗原［ＣＥＡ］（結腸がん、乳がん、および胃腸がんにおける）；ならびにＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−１０、ＭＡＧＥ−１２、ＢＡＧＥ−１、ＣＡＧＥ−１、２、８、ＣＡＧＥ−３  ＴＯ  ７、ＬＡＧＥ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＮＡ−８８、ＧｎＴＶ、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２などの共通腫瘍特異的抗原（shared tumor-specific antigens）が含まれる。例えば、腫瘍に特徴的な抗原ペプチドには、Cancer Vaccines and Immunotherapy (2000) Eds Stern, Beverley and Carroll, Cambridge University Press, Cambridge, Cancer Immunology (2001) Kluwer Academic Publishers, The Netherlands、国際公開第２００００／０２０５８１号および米国特許出願公開第２０１０／０２８４９６５号、ならびにwww.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopesに記載されているものが含まれ、それらはそれぞれ意図されたすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
いくつかの他の身体サンプルからの腫瘍細胞（単数または複数）の核酸中の１つまたは複数の遺伝子を同定することは、腫瘍細胞の全エクソーム、全ゲノム、または全トランスクリプトームをシーケンシングすることを含む場合がある。トランスクリプトームシーケンシングとは、細胞からのメッセンジャーＲＮＡまたは転写産物をシーケンシングすることである。トランスクリプトームは、ＲＮＡに転写されるゲノムのごく一部（ヒトでは５％未満）である。ゲノムシーケンシングとは、生物のゲノムの完全なＤＮＡ配列をシーケンシングすることである。エクソームシーケンシングは、ゲノムのタンパク質コード部分をシーケンシングすることである。
【０１４５】
ある実施形態では、シーケンシングの深度（depth）は変化し得る。次世代シーケンシングでは、対象となるＤＮＡサンプルの重複フラグメントが生成され、シーケンシングされる。次に、重複配列がアライメントされ、アライメントされたシーケンスリードの完全なセットが生成される。シーケンシング深度はシーケンシングのカバレッジ(coverage)とも呼ばれ、アセンブリの一部に寄与するヌクレオチドの数を指す。ゲノムベースでは、シーケンシング深度とは、各塩基がシーケンシングされた回数を指す。例えば、３０Ｘにシーケンシングされたゲノムは、配列中の各塩基が３０個のシーケンシングリードでカバーされたことを意味する。ヌクレオチドベースでは、シーケンシング深度は、単一ヌクレオチドに関する情報を追加した配列の数を指す。
【０１４６】
ある実施形態では、例えば、対象のゲノムの特定の部分（例えば、腫瘍）がシーケンシングされる。ほとんどの場合、ゲノム／トランスクリプトーム全体をシーケンシングすることが好ましい：ゲノムは、浅い深度または深い深度にシーケンシングされ、ゲノム／トランスクリプトームのより少ないまたはより多い部分のカバレッジを可能にする。
【０１４７】
シーケンシングは、当技術分野で知られている任意の適切な方法で実施することができる。シーケンシング技術の例には、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）（「超並列シーケンシングテクノロジー」とも呼ばれる）または第３世代シーケンシングが含まれるが、これらに限定されない。ＮＧＳは、非サンガーベースのハイスループットＤＮＡシーケンス技術を指す。ＮＧＳテクノロジーおよびプラットフォームの非限定的な例には、合成時解読（sequencing-by-synthesis）（別名「パイロシーケンシング」）（例えば、ＧＳ−ＦＬＸ  ４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．）、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＳＯＬＥＸＡ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＨＩＳＥＱ  ２０００  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、あるいは例えば、Ｒｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１（５３７５）：３６３−３６５（１９９８）に記載されているものを使用する）、ライゲーションによるシーケンシング（sequencing-by-ligation）（例えば、ＳＯＬＩＤプラットフォーム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＯＬＯＮＡＴＯＲ  Ｇ．００７プラットフォーム（Ｄｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｌｅｍ，Ｎ．Ｈ．）を使用して実施される）、１分子シーケンシング（例えば、ＰＡＣＢＩＯ  ＲＳシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．）またはＨＥＬＩＳＣＯＰＥプラットフォーム（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を使用して実施される）、１分子シーケンシング用のナノテクノロジー（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）のＧＲＩＤＯＮプラットフォーム、Ｎａｂｓｙｓ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，Ｒ．Ｉ．）により開発されたハイブリダイゼーション支援ナノポアシーケンシング（hybridization-assisted nano-pore sequencing）（ＨＡＮＳ）プラットフォーム、およびプローブ−アンカーライゲーション（probe-anchor ligation）（ｃＰＡＬ）と称されるＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）技術を用いるリガーゼベースのＤＮＡシーケンシングプラットフォームを用いて実施される）、１分子シーケンシング用の電子顕微鏡ベースの技術、ならびにイオン半導体シーケンシング、例えば、Zhang et al., J. Genet. Genomics, 38(3): 95-109 (2011)、およびVoelkerding et al., Clinical Chemistry, 55: 641-658 (2009)に記載されているものが含まれる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ペプチドは予測モデリングによって作成される。ペプチド配列を予測するための任意の適切な方法を使用できる（例えば、ＮｅｔＭＨＣアルゴリズム）。例えば、特定の抗原／エピトープセット（例えば、腫瘍特異的）を作成するための相違ＤＮＡまたはＲＮＡマーカーセットの分析は、ＭＨＣ分子へのエピトープペプチドの結合を決定する予測アルゴリズムを使用することを含む。任意選択で、特定の抗原／エピトープセットを洗練して、ＭＨＣ拘束性の特定の抗原／エピトープセットを提供する。例えば、Ｋ、ＤまたはＬ対立遺伝子のＭＨＣ  Ｉ拘束性エピトープを提供することができる。ＭＨＣ拘束性エピトープセットは、ＭＨＣ−対立遺伝子特異的ペプチドに対するエピトープ含有ペプチドの結合を決定することによって作成することができる。そのようなアルゴリズムの１つの例は、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）とウェイトマトリックスを使用して、多数の異なるＨＬＡ対立遺伝子へのペプチドの結合を予測するＮｅｔＭＨＣ−３．２である。
【０１４９】
限定ではなく例として、健康な組織とがん組織との間のＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列の違いを、哺乳動物のＭＨＣ組成と組み合わせて、ＮｅｔＭＨＣなどのエピトープ予測アルゴリズムによって分析することができる。このアルゴリズムは、この個々の哺乳動物の潜在的な腫瘍特異的エピトープのリストを作成し、各エピトープに数値スコアを与える。現在の技術水準では、高いスコアはエピトープが免疫をもたらすことができる可能性が高いことを意味し、低い（負を含む）スコアはエピトープが免疫をもたらすことができる可能性が低いことを意味する。この方法は、腫瘍特異的エピトープセットまたはＭＨＣ拘束性腫瘍特異的エピトープセットの各エピトープの数値スコアを提供することをさらに含み、その数値スコアは、正常エピトープ（非変異）のスコアを、腫瘍特異的エピトープ（変異）のスコアから差し引くことにより計算される。正常エピトープの数値スコアを、変異がんエピトープの数値スコアから差し引き、その差の数値が得られる−そのエピトープの差分アグレトープ指数（Differential Agretopic Index）（ＤＡＩ）。推定エピトープは、ＤＡＩに基づいてランク付けすることができる。
【０１５０】
他の実施形態において、本発明のペプチドは、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を含む多次元ＭＳ技術（ＭＳｎ）を使用する酵素消化物のシーケンシングによって同定することができる。このようなプロテオミクスアプローチは、迅速で高度に自動化された分析を可能にする（例えば、K. Gevaert and J. Vandekerckhove, Electrophoresis 21:1145- 1154 (2000); Bassani-Sternberg M. (2018) Mass Spectrometry Based Immunopeptidomics for the Discovery of Cancer Neoantigens. In: Schrader M., Fricker L. (eds) Peptidomics. Methods in Molecular Biology, vol 1719. Humana Press, New York, NYを参照のこと。これらは、それぞれがすべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１５１】
抗原提示細胞
一態様では、本明細書に記載されているのは、対象から得られたサンプル中のリンパ球またはそのようなサンプルから単離されたリンパ球を拡大することを含むｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的リンパ球を拡大する方法であって、拡大は、拡大中に１つまたは複数のペプチドを添加することを含み、前記ペプチドのそれぞれは異なる抗原を含み、抗原特異的リンパ球が形成される。ある実施形態では、ペプチドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示される。ある実施形態では、ＡＰＣは可溶性ペプチドとインキュベートされ、（例えば、その表面上のＭＨＣに直接結合するか、またはＡＰＣによりプロセシングされることによって）その表面上にペプチドを提示するＡＰＣをもたらす。ある実施形態では、ＡＰＣは、（例えば、翻訳または形質導入を介して）ペプチドを発現するように改変される。ある実施形態では、添加されるペプチドは、可溶性ペプチドと、（例えば、ペプチドを発現するように改変された、ペプチドと共にプレインキュベートされた、またはその両方の）ＡＰＣの表面に提示されたペプチドの両方である。ある実施形態では、可溶性ペプチドは、リンパ球と共培養される前にはその表面にペプチドを提示するように事前に誘導されていないＡＰＣと共に添加される。
【０１５２】
ある実施形態では、方法は、２つ以上のペプチド（すなわち、異なるペプチドのプール）を添加することを含む。ある実施形態では、１つの拡大フェーズのみが行われる場合、それは、プレ急速拡大プロトコル（プレＲＥＰ）を使用している。ある実施形態では、抗原特異的リンパ球は、拡大中に存在する他のリンパ球よりも優先的に拡大される。ある実施形態では、この優先的な拡大は、抗原特異的リンパ球の濃縮をもたらす。ある実施形態では、ペプチドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示される。ある実施形態では、ＡＰＣは、可溶性ペプチドとインキュベートされ、（例えば、その表面上のＭＨＣに直接結合するか、またはＡＰＣによりプロセシングされることによって）その表面上にペプチドを提示するＡＰＣをもたらす。ある実施形態では、ＡＰＣは、（例えば、翻訳または形質導入を介して）ペプチドを発現するように改変される。ある実施形態では、添加されるペプチドは、可溶性ペプチドと、（例えば、ペプチドを発現するように改変された、ペプチドと共にプレインキュベートされた、またはその両方の）ＡＰＣの表面に提示されたペプチドの両方である。ある実施形態では、可溶性ペプチドは、リンパ球と共培養される前にはその表面にペプチドを提示するように事前に誘導されていないＡＰＣと共に添加される。
【０１５３】
ある実施形態では、ＡＰＣは、リンパ球および／または対象にとって、自己、同種異系、同系、または異種であってよい。ある実施形態では、対象自身のＭＨＣとの関連でペプチドの提示を可能にするために、対象にとって自己由来のＡＰＣが使用される。
【０１５４】
ある実施形態では、ＡＰＣは人工ＡＰＣである。ある実施形態では、ＡＰＣは人工のものではない。
【０１５５】
ある実施形態では、ペプチドをＡＰＣの表面に提示させるために、ＡＰＣをペプチドとインキュベートする。
【０１５６】
ある実施形態では、ＡＰＣは、それがリンパ球との共培養に導入されると同時にペプチドとインキュベートされる。
【０１５７】
ある実施形態では、ＡＰＣは、リンパ球と共培養される前にペプチドとインキュベートされる。そのような場合、ＡＰＣは、ペプチドでパルスされたまたはプレロードされたと言うことができる。ある実施形態において、ペプチドは、各ペプチドについて、約０．１ｎＭ〜約１００μＭの濃度でＡＰＣとインキュベートされ得る。ある実施形態では、ペプチドは、各ペプチドについて、約１ｎＭ〜約９０μＭ、約１０ｎＭ〜約８０μＭ、約５０ｎＭ〜約７０μＭ、約１００ｎＭ〜約６０μＭ、約１５０ｎＭ〜約５０μＭ、約２００ｎＭ〜約４０μＭ、約２５０ｎＭ〜約３０μＭ、約３００ｎＭ〜約２０μＭ、約３５０ｎＭ〜約１０μＭ、約４００ｎＭ〜約９μＭ、約４５０ｎＭ〜約８μＭ、約５００ｎＭ〜約７μＭ、約５５０ｎＭ〜約６μＭ、約６００ｎＭ〜約５μＭ、約６５０ｎＭ〜約４μＭ、約７００ｎＭ〜約３μＭ、約７５０ｎＭ〜約２．５μＭ、約８００ｎＭ〜約２μＭ、約９００ｎＭ〜約１．５μＭ、または約９５０ｎＭ〜約１．２５μＭの濃度でＡＰＣとインキュベートされ得る。ある実施形態では、ペプチドは、各ペプチドについて、約１００ｎＭ〜約１００μＭ、約２５０ｎＭ〜約７５μＭ、約５００ｎＭ〜約５０μＭ、約７５０ｎＭ〜約２５μＭ、約９００ｎＭ〜約１０μＭ、または約９９０ｎＭ〜約５μＭの濃度でＡＰＣとインキュベートされ得る。
【０１５８】
ある実施形態では、ペプチドは、各ペプチドについて、少なくとも０．１ｎＭ、約１ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２６０ｎＭ、約２７０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約２９０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３１０ｎＭ、約３２０ｎＭ、約３３０ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３６０ｎＭ、約３７０ｎＭ、約３８０ｎＭ、約３９０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４１０ｎＭ、約４２０ｎＭ、約４３０ｎＭ、約４４０ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４６０ｎＭ、約４７０ｎＭ、約４８０ｎＭ、約４９０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５１０ｎＭ、約５２０ｎＭ、約５３０ｎＭ、約５４０ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５６０ｎＭ、約５７０ｎＭ、約５８０ｎＭ、約５９０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６１０ｎＭ、約６２０ｎＭ、約６３０ｎＭ、約６４０ｎＭ、約６５０ｎＭ、約６６０ｎＭ、約６７０ｎＭ、約６８０ｎＭ、約６９０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７１０ｎＭ、約７２０ｎＭ、約７３０ｎＭ、約７４０ｎＭ、約７５０ｎＭ、約７６０ｎＭ、約７７０ｎＭ、約７８０ｎＭ、約７９０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８１０ｎＭ、約８２０ｎＭ、約８３０ｎＭ、約８４０ｎＭ、約８５０ｎＭ、約８６０ｎＭ、約８７０ｎＭ、約８８０ｎＭ、約８９０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９１０ｎＭ、約９２０ｎＭ、約９３０ｎＭ、約９４０ｎＭ、約９５０ｎＭ、約９６０ｎＭ、約９７０ｎＭ、約９８０ｎＭ、約９９０ｎＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、または約１００μＭの濃度でＡＰＣとインキュベートされ得る。
【０１５９】
ある実施形態では、ペプチドは、各ペプチドについて、約０．１ｎＭ、約１ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２６０ｎＭ、約２７０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約２９０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３１０ｎＭ、約３２０ｎＭ、約３３０ｎＭ、約３４０ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３６０ｎＭ、約３７０ｎＭ、約３８０ｎＭ、約３９０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４１０ｎＭ、約４２０ｎＭ、約４３０ｎＭ、約４４０ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４６０ｎＭ、約４７０ｎＭ、約４８０ｎＭ、約４９０ｎＭ、約５００ｎＭ、約５１０ｎＭ、約５２０ｎＭ、約５３０ｎＭ、約５４０ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５６０ｎＭ、約５７０ｎＭ、約５８０ｎＭ、約５９０ｎＭ、約６００ｎＭ、約６１０ｎＭ、約６２０ｎＭ、約６３０ｎＭ、約６４０ｎＭ、約６５０ｎＭ、約６６０ｎＭ、約６７０ｎＭ、約６８０ｎＭ、約６９０ｎＭ、約７００ｎＭ、約７１０ｎＭ、約７２０ｎＭ、約７３０ｎＭ、約７４０ｎＭ、約７５０ｎＭ、約７６０ｎＭ、約７７０ｎＭ、約７８０ｎＭ、約７９０ｎＭ、約８００ｎＭ、約８１０ｎＭ、約８２０ｎＭ、約８３０ｎＭ、約８４０ｎＭ、約８５０ｎＭ、約８６０ｎＭ、約８７０ｎＭ、約８８０ｎＭ、約８９０ｎＭ、約９００ｎＭ、約９１０ｎＭ、約９２０ｎＭ、約９３０ｎＭ、約９４０ｎＭ、約９５０ｎＭ、約９６０ｎＭ、約９７０ｎＭ、約９８０ｎＭ、約９９０ｎＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、または約１００μＭの濃度でＡＰＣとインキュベートされ得る。ある実施形態において、ペプチドは、各ペプチドについて、約１μＭの濃度でＡＰＣとインキュベートされ得る。ある実施形態では、ペプチドは、各ペプチドについて約２μＭの濃度でＡＰＣとインキュベートされ得る。
【０１６０】
ある場合には、ペプチドとのインキュベーションにより、（例えば、ＭＨＣを介して）ペプチドがＡＰＣの表面に直接結合することができ、この場合、ペプチドの内部プロセシングはＡＰＣに必要ではない。直接結合により、エピトープの提示が速くなり、したがってアッセイ時間が短縮される。ＡＰＣはすでにＭＨＣと複合体を形成したペプチドを表面に表示している場合があるが、これらのＭＨＣ結合ペプチドの多くは、本発明のペプチドとのインキュベーションによって置き換えられ、抗原特異的リンパ球を拡大するのに使用できるＭＨＣペプチド複合体をもたらす。
【０１６１】
ある実施形態では、ＡＰＣは、少なくとも１つの免疫調節物質を発現するように改変される。免疫調節物質は、リンパ球の拡大をさらに増強するように作用することができる。ある実施形態では、免疫調節物質は、抗原特異的リンパ球の拡大をさらに増強するように作用することができる。ある実施形態では、免疫調節物質は、ペプチドを提示するＡＰＣと相乗的に作用して、リンパ球および／または抗原特異的リンパ球の拡大を増強する。
【０１６２】
ある実施形態では、ＡＰＣは、少なくとも１つの免疫調節物質を導入するためのトランスフェクション、形質導入、または一時的な細胞膜破壊の少なくとも１つによって、免疫調節物質を発現するように改変される。ある実施形態では、ＡＰＣは、遺伝子編集分子の使用により免疫調節物質を発現するように改変される。遺伝子編集分子の例には、エンドヌクレアーゼが含まれるが、これに限定されない。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素であるが、それらは内部のホスホジエステル結合のみを切断する。本発明の組成物および方法において有用な遺伝子編集エンドヌクレアーゼの例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（zinc finger nucleases）（ＺＦｎｓ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、およびクラスター化等間隔短鎖回分リピート（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法において有用なＣａｓタンパク質の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそれらのホモログまたは修飾形態が含まれる。
【０１６３】
ある実施形態では、ＡＰＣは、免疫調節物質を一過性発現するように改変される。ある実施形態では、ＡＰＣは、免疫調節物質を安定発現するように改変される。
【０１６４】
ある実施形態では、ＡＰＣを改変するのに使用するための免疫調節物質の非限定的な例には、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ７０、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＣＤ１２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３）、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ−Ｌ（ＣＤ２７５）、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０）、ＣＤ６６２Ｌ、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、またはインターロイキン−４（ＩＬ−４）が含まれる。
【０１６５】
ＡＰＣは、当業界で知られている任意の手段によってペプチドおよび／または免疫調節物質を発現するように改変することができ、そのような手段には、トランスフェクション、ウイルス送達（すなわち、形質導入）、リポソーム送達、エレクトロポレーション、細胞スクイーズ（例えば、まず細胞を破壊（例えば、圧搾、変形、または圧縮）し、続いて印加エネルギー場（例えば、電場、磁場、または音響場）に曝露する）、注入、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質、リン酸カルシウム、およびエンドサイトーシスが含まれるが、それらに限定されない。
【０１６６】
例えば、エレクトロポレーションを使用して、目的細胞に静電ポテンシャルを印加することにより、ＡＰＣを透過性にすることができる。このようにして外部電場に曝されたＡＰＣは、その後、外因性核酸の取込みを受けやすくなる。哺乳動物細胞のエレクトロポレーションは、例えば、Chu et al., Nucleic Acids Research 15:131 1 (1987)に詳細に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。同様の手法であるヌクレオフェクション（Nucleofection）（商標）は、外因性ポリヌクレオチドの真核細胞の核への取込みを刺激するために、印加電場を利用する。ヌクレオフェクション（商標）およびこの技術を実施するのに有用なプロトコルは、例えば、Distler et al., Experimental Dermatology 14:315 (2005)、ならびに米国特許出願公開第２０１０／０３１７１１４号に詳細に記載されており、それぞれの開示内容は、意図されたすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６７】
ＡＰＣのトランスフェクションに有用な追加の技術には、細胞スクイーズポレーション方法論（cell squeeze-poration methodology）がある。この技術は、加えられたストレスに応答して形成される膜の細孔を通して外因性ＤＮＡの取込みを刺激するために、細胞の急速な機械的変形を誘発する。この技術は、ヒト標的細胞などの細胞への核酸の送達にベクターが必要とされないという点で有利である。細胞スクイーズポレーションは、例えば、Sharei et al., Journal of Visualized Experiments 81:e50980 (2013)に詳細に記載されており、その開示内容は、意図されたすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６８】
リポフェクションは、標的細胞のトランスフェクションに有用な別の技術である。この方法は、第４級アミンまたはプロトン化アミンなどのカチオン性官能基をリポソーム外部に向かって提示するリポソームへの核酸のローディングを伴う。これは、細胞膜のアニオン性の性質により、リポソームと細胞との間の静電相互作用を促進し、最終的に、例えば、リポソームと細胞膜との直接融合により、または複合体のエンドサイトーシスにより、外因性核酸の取込みをもたらす。リポフェクションは、例えば、米国特許第７，４４２，３８６号に詳細に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。細胞膜とのイオン相互作用を利用して外来性核酸の取込みを誘発する同様の技術には、細胞をカチオン性ポリマー−核酸複合体と接触させることが含まれる。細胞膜との相互作用に好ましい正電荷を付与するようにポリヌクレオチドと会合する例示的なカチオン性分子には、活性化デンドリマー（例えば、Dennig, Topics in Current Chemistry 228:227 (2003)に記載され、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）、およびジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン（トランスフェクション剤としてのその使用は、例えば、Gulick et al., Current Protocols in Molecular Biology 40:1 :9.2:9.2.1 (1997)に詳細に記載され、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。磁気ビーズは、穏やかで効率的な様式で標的細胞をトランスフェクトするために使用できる別のツールであり、この方法論は、核酸の取込みを導くために、印加された磁場を利用する。この技術は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２２７４０６号に詳細に記載されている。上記の各参考文献の開示内容は、意図されたすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
ＡＰＣによる外因性核酸の取込みを誘導するための別の有用なツールは、レーザーフェクション（laserfection）であり、これは、細胞を穏やかに透過化してポリヌクレオチドに細胞膜を透過させるために、細胞を特定の波長の電磁放射線に曝すことを伴う技術である。この技術は、例えば、Rhodes et al., Methods in Cell Biology 82:309 (2007)に詳細に記載されており、その開示内容は、意図されるすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
微小小胞体（microvesicle）は、本明細書に記載の方法に従ってＡＰＣのゲノムを改変するために使用することができる別の潜在的な輸送手段を表す。例えば、ヌクレアーゼなどのゲノム修飾タンパク質と糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇの同時過剰発現（co-overexpression）によって誘導された微小小胞体を使用して、タンパク質を効率的に細胞に送達することができ、そのタンパク質はその後、遺伝子または調節配列などの目的ポリヌクレオチドの共有結合による組込みのために細胞ゲノムを準備するために、内因性ポリヌクレオチド配列の部位特異的切断を触媒する。真核細胞の遺伝子改変のための、ゲシクル（Gesicle）とも呼ばれるそのような小胞の使用は、例えば、Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American Society of Gene and Cell Therapy; 2015 May 13, Abstract No. 122の中のQuinn et al., Genetic Modification of Target Cells by Direct Delivery of Active Protein [abstract]に詳細に記載されている。上記の各参考文献の開示内容は、意図されたすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
様々な方法を使用して細胞に形質導入することができる。本発明のいくつかの実施形態では、ベクターまたはプラスミド、すなわち異なる細胞環境間または遺伝的環境間で核酸配列を輸送することができる核酸分子を用いて、細胞に形質導入する。異なる細胞環境には同じ生物の異なる細胞タイプが含まれ、異なる遺伝的環境には異なる生物の細胞または異なる遺伝物質および／またはゲノムを有する細胞の他の状況が含まれる。本発明の非限定的なベクターには、その中に存在する（細胞への送達のための）核酸配列の自律複製および発現が可能なものが含まれる。ベクターはまた、細胞タイプに特異的な因子に応答する様式で発現を誘導できる場合がある。非限定的な例には、インビトロでの外因性モジュレーターの添加による誘導、またはインビボでのベクター誘導薬物の全身送達が含まれる。ベクターはまた、任意選択で、使用される細胞系と適合性のある選択マーカーを含むことができる。本発明の実施において使用するための１つのタイプのベクターは、染色体外複製が可能な核酸であるエピソームとして維持される。別のタイプは、それが導入される細胞のゲノムに安定して組み込まれるベクターである。
【０１７２】
形質導入に使用されるベクターのタイプには、任意のウイルスに基づくものが含まれる。トリ細網内皮症ウイルス（アヒル伝染性貧血ウイルス、脾臓壊死症ウイルス、Ｔｗｉｅｈａｕｓ株細網内皮症ウイルス、Ｃ型レトロウイルス、細網内皮症ウイルスＨｕｎｇａｒｙ−２（ＲＥＶ−Ｈ−２））、およびネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）などの、レトロウイルスに由来するベクターは、特定の非限定的な例である。レトロウイルスゲノムはベクターとして使用するために改変されている（Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6349-6353, (1984)）。本発明のベクターとして使用することができるレトロウイルスの非限定的な例には、レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、マエディ／ビスナ（Ｍａｅｄｉ／Ｖｉｓｎａ）ウイルス、ヤギ関節炎／脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）など；トリＣ型レトロウイルス、例えば、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）など；ＨＴＬＶ−ＢＬＶレトロウイルス、例えば、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ヒトＴリンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）、およびサルＴリンパ好性ウイルスなど；哺乳動物Ｂ型レトロウイルス、例えばマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）など；哺乳動物Ｃ型レトロウイルス、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ネコ肉腫ウイルス（ＦｅＳＶ）、マウス肉腫ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、モルモットＣ型ウイルス、ブタＣ型ウイルス、ウーリーサル肉腫ウイルス、およびバイパーレトロウイルス（viper retrovirus）など；スプマウイルス（フォーミー（泡沫状）ウイルス群）、例えば、ヒトスプマウイルス（ＨＳＲＶ）、ネコシンシチウム形成ウイルス（ＦｅＳＦＶ）、ヒトフォーミーウイルス、サルフォーミーウイルス、ウシシンシチウムウイルスなど；ならびにＤ型レトロウイルス、例えば、メイソン・ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）、リスザルレトロウイルス、ラングールモンキーウイルスなどが含まれる。
【０１７３】
レンチウイルスおよびレトロウイルスベクターは、その天然のエンベロープタンパク質を用いてパッケージングすることができ、あるいは異種エンベロープタンパク質で被包されるように修飾することができる。エンベロープタンパク質の例には、限定はされないが、両指向性（amphotropic）エンベロープ、同種指向性（ecotropic）エンベロープ、または異種指向性（xenotropic）エンベロープが含まれ、あるいは両指向性部分および同種指向性部分を含むエンベロープであってもよい。エンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質はまた、上記のレトロウイルスおよびレンチウイルスのいずれのものであってもよい。あるいは、ｅｎｖタンパク質は、改変された、合成のまたはキメラのｅｎｖ構築物であってよく、あるいは水疱性口内炎ウイルスおよびＨＶＪウイルスなどの、非レトロウイルスから得ることもできる。特定の非限定的な例には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス、バキュロウイルス、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ）エンベロープタンパク質、およびネコ内在性ウイルスＲＤ１１４のエンベロープ；テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープ；ヒヒ内在性ウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ；サル肉腫関連ウイルス（ＳＳＡＶ）エンベロープ；両指向性のマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ａ）エンベロープ；ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ；トリ白血病ウイルスエンベロープ；内在性の異種指向性ＮＺＢウイルスエンベロープ；およびそれに限定はされないが、ＨＶＪウイルスエンベロープなどのパラミクソウイルス科のエンベロープが含まれる。
【０１７４】
ある実施形態では、ＡＰＣは、例えば、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、およびＴリンパ球（Ｔ細胞）のいずれか１つまたは複数を含むことができる。ある実施形態では、ＡＰＣは樹状細胞である。
【０１７５】
ある実施形態では、ＡＰＣはＢ細胞である。ある実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ１９またはＣＤ２０選択によって単離される。
【０１７６】
ある実施形態では、Ｂ細胞は活性化される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２１、および／またはＩＬ−４などであるがこれらに限定されない化合物とのインキュベーションによって活性化することができる。ある実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ４０Ｌとのインキュベーションによって活性化される。ＣＤ４０陽性Ｌ細胞および／またはＥＬ４Ｂ５細胞などのＢ細胞刺激細胞も、Ｂ細胞を活性化するために使用することができる。さらに、Ｂ細胞が得られた対象からのサンプルにも存在していた他の種類の細胞は、依然としてＢ細胞培養物中に存在していてよい。Ｂ細胞培養条件において存在する場合、そのような非Ｂ細胞は、通常、Ｂ細胞と比較して増殖能力が低く、そのため、そのような混入細胞の数は、通常、時間とともに減少する。好ましくは、Ｂ細胞培養物の細胞の少なくとも７０％がＢ細胞である。より好ましくは、前記Ｂ細胞培養物の細胞の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％がＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞、ならびにＣＤ４０陽性Ｌ細胞および／またはＥＬ４Ｂ５細胞などのＢ細胞刺激細胞は、本発明で使用されるＢ細胞培養物中に存在する本質的に唯一の種類の細胞である。一部の実施形態では、前記Ｂ細胞培養物の本質的にすべての細胞がＢ細胞である。
【０１７７】
ある実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂｃｌ−６、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、ＭＣＬ１、ＳＴＡＴ−５、および／またはＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路、ＢＣＲシグナル伝達経路、もしくはＢＡＦＦ−ＢＡＦＦＲシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つの経路の活性化因子とともにさらに培養される。
【０１７８】
ある実施形態では、樹状細胞は、得られた血液からの単核細胞を樹状細胞に増殖および／または分化させることによって、単核細胞から調製することができる。単核細胞をインターロイキン−４（ＩＬ−４）を含む培地において培養し、未成熟樹状細胞に分化させることができる。得られた未成熟樹状細胞を、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を含む培地で培養し、成熟樹状細胞に分化させることができる。樹状細胞は、プラスチック接着法を使用して作成することもできる。プラスチック接着法では、単核球全体を細胞培養容器に１〜２時間播種および培養して、底に付着した細胞を使用することができる。
【０１７９】
抗原のアップデートにより樹状細胞を活性化することができる。
【０１８０】
ペプチドを提示するＭＨＣ分子は、対象によって発現される任意のＭＨＣ分子であってよい。いくつかの実施形態では、クラスＩ  ＭＨＣポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇからなる群より選択されるヒトクラスＩ  ＭＨＣポリペプチドである。別のある実施形態では、クラスＩ  ＭＨＣポリペプチドは、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌ、Ｈ−２Ｑ、Ｈ−２Ｍ、およびＨ−２Ｔからなる群より選択されるマウスクラスＩ  ＭＨＣポリペプチドである。いくつかの実施形態では、クラスＩＩ  ＭＨＣポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＤＱからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、クラスＩＩ  ＭＨＣポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＰＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡおよびＨＬＡ−ＤＲＡからなる群より選択される。
【０１８１】
リンパ球
一態様では、本明細書に記載されるのは、対象から得られたサンプル中のリンパ球またはそのようなサンプルから単離されたリンパ球を拡大することを含む、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的リンパ球を拡大する方法であって、拡大は、拡大中に１つまたは複数のペプチドを添加することを含み、各ペプチドは異なる抗原を含み、抗原特異的リンパ球が拡大される。一態様では、本発明は、抗原特異的リンパ球を拡大して、免疫原性活性の増大（例えば、より高いおよび／またはより長い活性）を可能にする方法を提供する。
【０１８２】
一態様では、本明細書に記載されるのは、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的リンパ球を拡大する方法であって、ａ）対象から得られたサンプル中のリンパ球またはそのようなサンプルから単離されたリンパ球を拡大すること、ここで拡大は少なくとも２つの拡大フェーズを含む、およびｂ）少なくとも２つの拡大フェーズのうちの少なくとも１つのフェーズ中に１つまたは複数のペプチドを添加することを含み、前記ペプチドのそれぞれは異なる抗原を含み、抗原特異的リンパ球が拡大される。一態様では、本発明は、抗原特異的リンパ球を拡大して、免疫原性活性の増大（例えば、より高いおよび／またはより長い活性）を可能にする方法を提供する。
【０１８３】
リンパ球を含むサンプルは、対象の多数の供給源から得ることができ、そのような供給源には、組織（腫瘍組織、ウイルス感染組織、炎症部位、リンパ球浸潤部位および白血球浸潤部位の組織などを含むがこれらに限定されない）、胸腺、腫瘍組織（例えば、サンプル、フラグメント）、または酵素消化組織、解離／懸濁細胞、リンパ節サンプル、または体液サンプル（例えば、血液、腹水、リンパ）が含まれる。例示的な組織には、皮膚、脂肪組織；静脈、動脈、毛細血管、弁などの心血管組織；神経組織、骨髄；乳房、胃腸、肺組織；角膜や水晶体などの眼組織；軟骨、骨、粘膜組織が含まれる。
【０１８４】
サンプルは、未処理のもの、酵素処理されたもの、および／または解離／懸濁させて細胞懸濁液を形成したものであってよい。サンプルが酵素処理される場合、使用できる酵素の非限定的な例には、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ、リベラーゼ、およびデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）が含まれる。
【０１８５】
一態様では、本発明は、抗原特異的リンパ球を拡大させて、免疫原性活性の増大（例えば、より高いおよび／またはより長い活性）を可能にする方法を提供する。リンパ球は免疫系における白血球の１つのサブタイプである。
【０１８６】
ある実施形態では、本発明で使用するためのリンパ球は、腫瘍浸潤免疫細胞を含む。腫瘍浸潤免疫細胞は、単核免疫細胞および多形核免疫細胞の両方（すなわち、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球など）から可変比率で構成される。ある実施形態では、本発明で使用するためのリンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。ＴＩＬは、血流を離れて腫瘍に向かって移動した白血球である。多くの場合、ＴＩＬは腫瘍間質および腫瘍自体の中に見られる。ある実施形態では、ＴＩＬは「若い」Ｔ細胞または最小限に培養されたＴ細胞である。ある実施形態では、若い細胞は、培養時間が短縮されている（例えば、合計で約２２日から約３２日の間）。ある実施形態では、リンパ球はＣＤ２７を発現する。
【０１８７】
ある実施形態では、本発明で使用するためのリンパ球は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を含む。ある実施形態では、本発明で使用するためのリンパ球は、Ｔリンパ球（別名Ｔ細胞）および／またはナチュラルキラー細胞（別名ＮＫ細胞）を含む。
【０１８８】
ある実施形態では、リンパ球は、対象にとって、自己、同種異系、同系、または異種であってよい。ある実施形態では、リンパ球は、免疫療法処置のために対象に再導入された際のリンパ球に対する免疫反応性の応答を少なくするために自己由来のものである。
【０１８９】
ある実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。ある実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋細胞である。ある実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ペプチドおよび／またはペプチド提示ＡＰＣとのインキュベーション前に単離される。ある実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ペプチドおよび／またはペプチド提示ＡＰＣとのインキュベーション前に単離されない。ある実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ペプチドおよび／またはペプチド提示ＡＰＣとのインキュベーション前に単離される。ある実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ペプチドおよび／またはペプチド提示ＡＰＣとのインキュベーション前に単離されない。
【０１９０】
ある実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋および／またはＣＤ５７＋ＮＫ細胞である。ＮＫは、特定の細胞溶解酵素の活性化により「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合して殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞または他の罹患細胞を殺す能力、および免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力により特徴付けられる。
【０１９１】
リンパ球培養に適した条件は、適切な培地（例えば、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加した、無血清の、あるいは適切な量の血清（または血漿）もしくは規定されたホルモンセット、および／または成長および拡大に十分な量のサイトカインを補足した、最少必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｌｏｎｚａ  ＲＰＭＩ  １６４０、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、ＴｅｘＭＡＣＳ、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５、Ｘ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）を含む。
【０１９２】
リンパ球拡大のための他の添加剤の例には、界面活性剤、プラスマネート（piasmanate）、ＨＥＰＥＳなどのｐＨ緩衝剤、Ｎ−アセチルシステインや２−メルカプトエタノールなどの還元剤などが含まれるが、これらに限定されない。抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）は、実験培養にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。
【０１９３】
拡大されたＴＩＬの特異的腫瘍反応性は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、腫瘍細胞との共培養後のサイトカイン放出（例えば、インターフェロン−γ）を測定することにより、試験することができる。一実施形態では、自己ＡＣＴ法は、細胞の急速拡大の前に、培養ＴＩＬをＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮することを含む。ＩＬ−２でＴＩＬを培養した後、Ｔ細胞からＣＤ４＋細胞を枯渇させ、例えば、ＣＤ８マイクロビーズ分離を使用して（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ＜ｐｌｕｓ＞ＣＤ８マイクロビーズシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して）、ＣＤ８＋細胞を濃縮する。別の実施形態では、自己ＡＣＴ法は、細胞の急速拡大の前に、培養ＴＩＬをＣＤ４＋Ｔ細胞について濃縮することを含む。ＩＬ−２でＴＩＬを培養した後、Ｔ細胞からＣＤ８＋細胞を枯渇させ、ＣＤ４マイクロビーズ分離を使用して（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ＜ｐｌｕｓ＞ＣＤ４マイクロビーズシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して）、ＣＤ４＋細胞を濃縮する。いくつかの実施形態では、自己Ｔ細胞の成長および活性化を促進するＴ細胞増殖因子は、自己Ｔ細胞と同時にまたは自己Ｔ細胞に続いてのいずれかに哺乳動物に投与される。Ｔ細胞増殖因子は、自己Ｔ細胞の成長および活性化を促進する任意の適切な増殖因子であってよい。
【０１９４】
処置方法
関連する態様において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の方法により生成された抗原特異的リンパ球の集団の有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における腫瘍を処置する方法である。ある実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。ある実施形態では、腫瘍は液性腫瘍（例えば、血液がん）である。
【０１９５】
本明細書に記載の方法により処置可能な腫瘍の非限定的な例には、例えば、がん腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、および白血病が含まれる。非限定的な具体例には、例えば、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、前立腺がん、結腸がん、腎がん、膀胱がん、頭頸部がん、甲状腺がん、軟部組織肉腫、卵巣がん、原発性または転移性黒色腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、すべての組織病理学的タイプの脳腫瘍、脈管肉腫、血管肉腫、骨肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、脈管肉腫、内皮肉腫、リンパ肉腫、リンパ管内皮腫（lymphangioendotheliosarcoma）、滑膜腫、精巣がん、子宮がん、子宮頸がん、胃腸がん、中皮腫、ウイルス感染に関連するがん（ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連腫瘍（例えば、がん子宮頸部、膣、外陰部、頭頸部、肛門、および陰茎がん））、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、原発不明がん（ＣＵＰ）、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、気管支がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、上皮がん、子宮頸がん、精巣腫瘍、神経膠腫（glioma）、神経膠芽腫(glioblastoma)、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、網膜芽細胞腫、白血病、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、膀胱がん、リンパ腫、多発性骨髄腫、髄様がん、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞リンパ腫、大顆粒リンパ球性リンパ腫または白血病、ガンマデルタＴ細胞リンパ腫またはガンマデルタＴ細胞白血病、マントル細胞リンパ腫、骨髄腫、白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、造血器腫瘍、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ＥＢＶ関連ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むがそれらに限定されないすべてのタイプのエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）誘導悪性腫瘍、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）を含むすべての形態の移植後リンパ腫、子宮がん、腎細胞がん、肝がん、肝芽腫が含まれる。本明細書に記載される方法および組成物によって処置することができるがんには、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮からのがん細胞が含まれるが、これらに限定されない。さらに、がんは特に、以下の組織型のものであってよいが、これらに限定されない：新生物、悪性腫瘍；がん腫；未分化がん；巨細胞および紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；毛様体がん；移行上皮がん；乳頭状移行上皮がん；腺がん；ガストリノーマ、悪性；胆管がん；肝細胞がん；肝細胞がんと胆管がんの合併；索状腺がん（trabecular adenocarcinoma）；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープの腺がん；腺がん、家族性大腸ポリポーシス；固形がん；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺がん（branchiolo-alveolar adenocarcinoma）；乳頭腺がん；嫌色素性がん；好酸性がん；好酸性腺がん；好塩基性がん；明細胞腺がん；��粒細胞がん；濾胞腺がん；乳頭および濾胞腺がん；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；類内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液性嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性乳管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；パジェット病、乳房；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生を伴う腺がん；胸腺腫、悪性；卵巣間質性腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；神経芽腫（roblastoma）、悪性；セルトリ細胞腫；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫（Glomangiosarcoma）；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児型横紋筋肉腫；胞巣型横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；がん肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性がん；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛がん；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星細胞腫；原形質性星細胞腫；原線維性星細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；その他の指定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；および有毛細胞性白血病。
【０１９６】
本明細書に記載の方法により拡大されたリンパ球での処置後の抗腫瘍反応は、異種移植腫瘍モデルにおいて決定することができる。腫瘍は、ウイルス粒子によって提示される腫瘍関連抗原を発現する任意のヒトがん細胞株を使用して確立することができる。異種移植腫瘍モデルを確立するために、例えばマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、約５×１０６個の生細胞を胸腺欠損ヌードマウスに、例えば皮下注射することができる。異種移植腫瘍モデルのエンドポイントは、当業者に知られている方法を使用して、腫瘍サイズ、動物の体重、生存期間、ならびにがんの組織化学的および組織病理学的検査に基づいて決定することができる。
【０１９７】
関連する態様において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の方法により生成された抗原特異的リンパ球の集団の有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における感染症および／または人獣共通感染症（zoonotic diseases）を処置する方法である。感染症は、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌などの病原微生物によって引き起こされる；その疾患は直接または間接的に人から人へと広がることができる。人獣共通感染症は、人間に伝染したときに病気を引き起こすことができる動物の感染症である。感染症および／または人畜共通感染症の例には、限定されないが、身体通路の閉塞をもたらすことができる急性および慢性の感染過程が含まれ、そのような閉塞には、例えば、男性の生殖管の閉塞（例えば、尿道炎、精巣上体炎、前立腺炎による狭窄）；女性の生殖管の閉塞（例えば、膣炎、子宮頸管炎、骨盤内炎症性疾患（例えば、結核、淋菌、クラミジア、腸球菌および梅毒））；尿路閉塞（例えば、膀胱炎、尿道炎）；気道閉塞（例えば、慢性気管支炎、結核、その他のマイコバクテリア感染症（ＭＡＩなど）、嫌気性菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症）、ならびに心血管閉塞（例えば、細菌性動脈瘤（mycotic aneurysms）および感染性心内膜炎）が含まれる。
【０１９８】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成されるリンパ球の投与は、ウイルス感染症および／またはウイルス感染に起因する腫瘍を治療するために使用することができる。
【０１９９】
例示的なウイルスには、ヘルペスウイルス、例えば、シンプレックスウイルス属（例えば、ヒトヘルペスウイルス−１（ＨＨＶ−１）、ヒトヘルペスウイルス−２（ＨＨＶ−２））、バリセロウイルス属（例えば、ヒトヘルペスウイルス−３（ＨＨＶ−３、水痘帯状疱疹ウイルスとしても知られている））、リンホクリプトウイルス属（例えば、ヒトヘルペスウイルス−４（ＨＨＶ−４、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）としても知られている））、サイトメガロウイルス属（例えば、ヒトヘルペスウイルス−５（ＨＨＶ−５）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）としても知られている））、ロゼオロウイルス属（例えば、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７））、ラジノウイルス属（例えば、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）としても知られている）など；ポックスウイルス、例えば、オルソポックスウイルス属（例えば、牛痘ウイルス、サルポックスウイルス、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス）、パラポックスウイルス属（例えば、牛丘疹性口炎ウイル、オルフ（ｏｒｆ）ウイルス、偽牛痘ウイルス）、モラスキポックスウイルス属（例えば、伝染性軟属腫ウイルス）、ヤタポックスウイルス属（例えば、タナポックスウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス）など；アデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルスＡ（ＨＡｄＶ−Ａ）、ヒトアデノウイルスＢ（ＨＡｄＶ−Ｂ）、ヒトアデノウイルスＣ（ＨＡｄＶ−Ｃ）、ヒトアデノウイルスＤ（ＨＡｄＶ−Ｄ）、ヒトアデノウイルスＥ（ＨＡｄＶ−Ｅ）、ヒトアデノウイルスＦ（ＨＡｄＶ−Ｆ））；パピローマウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））；パルボウイルス（例えば、Ｂ１９ウイルス）；ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））；レトロウイルス、例えばデルタレトロウイルス属（例えば、霊長類Ｔリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）および霊長類Ｔリンパ球向性ウイルス２（ＨＴＬＶ−２））およびレンチウイルス属（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）およびヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２））など；レオウイルス、例えば、オルソレオウイルス属（例えば、哺乳類オルトレオウイルス（ＭＲＶ））、オルビウイルス属（例えば、アフリカ馬疫ウイルス（ＡＨＳＶ）、チャングイノラウイルス（ＣＯＲＶ）、オルンゴウイルス（Orungo virus）（ＯＲＵＶ）、およびロタウイルス（例えば、ロタウイルスＡ（ＲＶ−Ａ）およびロタウイルスＢ（ＲＶ−Ｂ））など；フィロウイルス、例えば、「マールブルグ様ウイルス属（Marburg-like viruses）」（例えば、ＭＡＲＶ）、「エボラ様ウイルス属」（例えば、ＣＩＥＢＯＶ、ＲＥＢＯＶ、ＳＥＢＯＶ、ＺＥＢＯＶ）など；パラミクソウイルス、例えば、レスピロウイルス属（例えば、ヒトパラインフルエンザウイルス１（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウイルス３（ＨＰＩＶ−３））、ルブラウイルス属（例えば、ヒトパラインフルエンザウイルス２（ＨＰＩＶ−２）、ヒトパラインフルエンザウイルス４（ＨＰＩＶ−４）、ムンプスウイルス（ＭｕＶ））、およびモルビリウイルス属（例えば、麻疹ウイルス）など；ニューモウイルス（例���ば、ヒト呼吸器多核体ウイルス（ＨＳＣＶ））；ラブドウイルス、例えば、ベシキュロウイルス属（例えば、水疱性口内炎ウイルス）、リッサウイルス属（例えば、狂犬病ウイルス）など；オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス）；ブニヤウイルス（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス（ＣＥＶ））；ハンタウイルス（例えば、ラッククリークカナルウイルス（ＢＣＣＶ）、ニューヨークウイルス（ＮＹＶ）、シンノンブレウイルス（ＳＮＶ））；ピコルナウイルス、例えば、エンテロウイルス属（例えば、ヒトエンテロウイルスＡ（ＨＥＶ−Ａ）、ヒトエンテロウイルスＢ（ＨＥＶ−Ｂ）、ヒトエンテロウイルスＣ（ＨＥＶ−Ｃ）、ヒトエンテロウイルスＤ（ＨＥＶ−Ｄ）、ポリオウイルス（ＰＶ））、ライノウイルス属（例えば、ヒトライノウイルスＡ（ＨＲＶ−Ａ）、ヒトライノウイルスＢ（ＨＲＶ−Ｂ））、ヘパトウイルス属（例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ））など；カリシウイルス、例えば、「ノーウォーク様ウイルス」（例えば、ノーウォークウイルス（ＮＶ））、および「サッポロ様ウイルス」（例えば、サッポロウイルス（ＳＶ））など；トガウイルス、例えば、アルファウイルス属（例えば、西部馬脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）および東部馬脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ））、およびルビウイルス属（例えば、風疹ウイルス）など；フラビウイルス（例えば、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、日本脳炎（ＪＥＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ））；アレナウイルス（例えば、ラッサウイルス）；コロナウイルス（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）関連ウイルス）；ならびにヘパシウイルス（例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２００】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成される抗原特異的リンパ球の集団は、追加の治療剤と共に投与される。本明細書に記載の抗原特異的リンパ球の集団は、対象において（例えば、がんを治療するために）免疫応答を誘導する作用する追加の治療薬（小分子、抗体、または細胞試薬を含むが、これらに限定されない）と同時にまたはその前に（例えば、１〜３０日前に）、対象に投与することができる。追加の治療薬が共投与される場合、リンパ球と追加の治療薬は、同時または連続的（任意の順序）であってよい。各薬剤の適切な治療有効投薬量は、相加作用または相乗作用によってより低くなり得る。
【０２０１】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成されるネオ抗原特異的リンパ球の集団は、例えば、治療ワクチン（ＧＶＡＸ、ＤＣベースのワクチンなどが含まれるがこれらに限定されない）、チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３などをブロックする物質を含むがこれらに限定されない）または活性化物質（４１ＢＢ、ＯＸ４０などを増強する物質を含むがこれらに限定されない）などの、他の免疫調節処置と組み合わせることができる。本明細書に記載されている阻害処置はまた、前述の形態または製剤のいずれかで、ＮＫＴの機能または安定性を調節する能力を有する他の処置と、単独でまたは互いにもしくは他の物質と組み合わせて併用することができ、それら他の処置には、抗原をアンロードまたはロードされたＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｄ−融合タンパク質、ＣＤ１ｄ二量体、またはＣＤ１ｄのより大きなポリマー；ＣＤｌｄ−キメラ抗原受容体（ＣＤｌｄ−ＣＡＲ）；またはヒトに存在する５つの既知のＣＤ１異性体のいずれか他のもの（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤｌｅ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０２】
抗原特異的リンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇（lymphodepletion）は、制御性Ｔ細胞および免疫系の競合要素を排除することにより、治療効果の増強に役割を果たすことができる。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、本発明の抗原特異的リンパ球を導入する前に、対象に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング（immunosupressive conditioning）」とも呼ばれる）を利用する。リンパ球枯渇は、フルダラビンまたはシクロホスファミド（活性型はマホスファミドと呼ばれる）およびそれらの組合せなどであるがこれらに限定されない化合物を投与することにより達成することができる。そのような方法は、Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239、およびDudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357に記載されており、これらはすべてあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
ある実施形態では、抗原特異的リンパ球による処置の前に対象を免疫枯渇させる。例えば、本明細書に記載の方法により生成されたリンパ球の注入前に、骨髄非破壊的化学療法で対象を前処置してもよい。一実施形態では、抗原特異的リンパ球の集団は、注入によって投与することができる。一実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（抗原特異的リンパ球注入の２７日前および２６日前）、フルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で５日間（抗原特異的リンパ球注入の２７日前〜２３日前）であってよい。一実施形態では、本開示による骨髄非破壊的化学療法および抗原特異的リンパ球注入（０日目）の後、対象は、生理学的許容範囲(physiologic tolerance)まで、８時間ごとに７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ−２の静脈内注入を受けてもよい。ある実施形態では、抗原特異的リンパ球の集団は、ＩＬ−２と組み合わせてがんを治療するために使用することができ、ＩＬ−２は、抗原特異的リンパ球の集団の後に投与される。
【０２０４】
本明細書に記載の治療法は、追加の免疫療法および治療と組み合わせることができる。例えば、がんの処置に使用される場合、本明細書に記載のリンパ球は、腫瘍のタイプ、患者の状態、他の健康問題、およびさまざまな因子に応じて、例えば、外科手術、放射線療法、化学療法またはそれらの組合せなどの、従来のがん治療と組み合わせて使用することができる。ある態様では、本明細書に記載の阻害剤との併用がん療法（combination cancer therapy）に有用な他の治療薬には、抗血管新生薬が含まれる。多くの抗血管新生薬が同定されており、当該分野で公知であり、そのような抗血管新生薬には、例えば、ＴＮＰ−４７０、血小板因子４、トロンボスポンジン−１、組織メタロプロテアーゼ阻害物質（tissue inhibitors of metalloproteases）（ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６−Ｋｄフラグメント）、アンジオスタチン（プラスミノーゲンの３８Ｋｄフラグメント）、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、トランスフォーミング増殖因子β、インターフェロンα、可溶性ＫＤＲおよびＦＬＴ−１受容体、胎盤プロリフェリン関連タンパク質、ならびにＣａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ  （２０００）によって記載されたものが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害剤は、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断できるアプタマー、抗ＶＥＧＦＲ中和抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤、およびそれらの任意の組合せ（例えば、抗ｈＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１、ベバシズマブまたはラニビズマブ）などの、ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニストと組み合わせて使用できる。
【０２０５】
併用療法で使用できる化学療法化合物の非限定的な例には、例えば、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イリノテカン(ironotecan)、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンが含まれる。
【０２０６】
これらの化学療法化合物は、それらの作用機序によって、例えば以下の群に分類することができる：代謝拮抗剤／抗がん剤、例えば、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸拮抗剤および関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；抗増殖／抗有糸分裂剤、例えば、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）などの天然物、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、およびナベルビンなどの微小管崩壊剤（microtubule disruptor）、エピポドフィロシトキシン（epidipodophyllotoxin）（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミン、オキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホラミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミスラマイシン）およびマイトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギンを体系的に代謝し、自身でアスパラギンを合成する能力を持たない細胞を取り除くＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジニン（trazenes-dacarbazinine）（ＤＴＩＣ）；抗増殖／抗有糸分裂抗代謝剤、例えば葉酸類似体（メトトレキサート）；プラチナ配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）、およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩、および他のトロンビン阻害剤）；血栓溶解剤（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤（antimigratory agent）；抗分泌剤（ブレフェルジン（breveldin））；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モ��ェチル）；抗血管新生化合物（例えば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）および増殖因子阻害剤（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導因子（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾンおよびプレニゾロン）；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導因子およびカスパーゼ活性化因子；およびクロマチン崩壊剤。
【０２０７】
本明細書に開示される組成物はまた、アルミニウム塩および他の無機アジュバントなどのアジュバント、界面活性剤、細菌誘導体、ビヒクルおよびサイトカインを含むこともできる。アジュバントは、拮抗する免疫調節特性を有していてもよい。例えば、アジュバントは、Ｔｈ１またはＴｈ２免疫を刺激することができる。本明細書に開示される組成物および方法はまた、アジュバント療法を含むことができる。
【０２０８】
医薬組成物、剤形および投与
本明細書に記載の方法によって生成されたネオ抗原特異的リンパ球の集団、ならびに薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物も本明細書に開示される。さらに、本明細書に記載のウイルス粒子を含む医薬製剤も本明細書に開示される。
【０２０９】
本明細書で論じるように、本明細書に記載の偽型ウイルス粒子は、様々な治療用途（ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ）に、および研究ツールとして使用することができる。
【０２１０】
本明細書に記載の方法によって生成されたネオ抗原特異的リンパ球の集団に基づく医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容される担体および／または賦形剤を使用して、従来の方法で製剤化できる。リンパ球は、例えば、注射、非経口、経膣、直腸投与による、または腫瘍への直接投与による投与用に製剤化することができる。
【０２１１】
医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または持続注入によるなど、注射による非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、例えば、必要に応じて保存料を添加して、アンプル中または複数回投与用の容器中に、単位剤形で提供することができる。医薬組成物は、さらに、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとして製剤化することができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの他の物質を含むことができる。
【０２１２】
注射用途に適した剤形には、無菌の水溶液または分散液；ごま油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれ得る。すべての場合において、製剤は無菌でなければならず、また流動性でなければならない。それは、製造条件および特定の保管パラメーター（例えば、冷蔵および冷凍）の下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【０２１３】
本明細書に記載の製剤が、対象における免疫応答を高めるための治療薬として使用される場合、治療剤は、中性または塩の形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれ、それらは、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導できる。
【０２１４】
担体はまた、例えば、水、生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。微生物の作用の防止は、当技術分野で知られている様々な抗菌剤および抗真菌剤によってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。
【０２１５】
処方に基づき、製剤に適合する用法でかつ治療的に有効であるような量で、溶液を投与することができる。用量範囲および投与頻度は、本明細書に記載の方法により生成されるネオ抗原特異的リンパ球の集団の性質、ならびに特定の患者の病状およびパラメーター、さらには使用される投与経路に応じて変動し得る。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成されるネオ抗原特異的リンパ球の集団は、約１０７〜約１０１２の範囲の用量で対象に投与することができる。より正確な用量は、それが投与されている対象に依存し得る。例えば、対象が若年である場合、より低い用量が必要とされ、対象が成人ヒト対象である場合、より高い用量が必要とされ得る。ある実施形態では、より正確な用量は、対象の体重に依存し得る。
【実施例】
【０２１７】
本発明をさらに以下の実施例によって説明および実証する。しかしながら、明細書におけるこれらおよび他の実施例の使用はいずれも、単なる例示であり、決して本発明のまたは任意の例示された用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は、ここに記載された特定の好ましい実施形態に限定されない。実際に、本明細書を読むと、本発明の多くの修正および変更が当業者に明らかであり、そのような変更は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語およびそれら特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲によってのみ限定されるべきである。
【０２１８】
実施例１
材料および方法
非同義腫瘍変異の同定
凍結保存された腫瘍組織および対応する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して分離し、ＨｉＳｅｑ２５００イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）プラットフォームを使用して全エクソームキャプチャおよびペアエンドシーケンシングにかけた。ゲノムマッピングツール、ｆｅｔｃｈＧＷＩ２７で構成されたソフトウェアパイプラインと、その後に続く詳細なシーケンスアライメントツール、ａｌｉｇｎ０を使用することにより、エクソームリードとリファレンスヒトゲノムｈｇｌ９から体細胞バリアントをコールした。あらゆる種類の非決定論的予測因子は回避され、偽陰性を最小化するルートが優先され、合意に基づくバリアント検出／予測法（consensual variant detection/prediction method）としてのＧＡＴＫとの相互比較が９６％以上の一致に達した。腫瘍サンプルに存在し、対応する血液サンプルには存在しない変異は、体細胞性であると推定された。
【０２１９】
ネオ抗原特異的Ｔ細胞の単離
循環および腫瘍浸潤性のネオ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、社内のリバーシブルマルチマー（reversible multimers）（ＮＴＡｍｅｒｓ）を使用してＦＡＣＳでソートした（米国特許第１０，０２３，６５７号を参照のこと）。
【０２２０】
ネオ抗原予測
体細胞非同義変異を組み込んだすべての候補ペプチドのクラスＩ  ＨＬＡ対立遺伝子への結合予測は、ｎｅｔＭＨＣアルゴリズムｖ３．４を使用して行った(Lundegaard et al., Nucleic Acids Research 36, W509-512 (2008))。予測結合親和性が５００ｎＭ以下である候補ネオ抗原ペプチド（すなわち、可能な各位置に体細胞変異残基を含む変異９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチド配列）、およびそれらの野生型ネイティブ予測ペプチドを、ローザンヌ大学のタンパク質およびペプチド化学施設（Protein and Peptide Chemistry Facility）（ＰＰＣＦ）で合成した（＞９０％ＨＰＬＣ純度）。
【０２２１】
ＴＩＬの拡大および照合
従来の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、他で説明されているように（Dudley et al., J Immunother 2008）、腫瘍酵素消化物および腫瘍断片から作成した。具体的には、８％ヒト血清ＡＢ（Ｂｉｏｗｅｓｔ）、１％  Ｈｅｐｅｓ  １Ｍ（Ａｍｉｍｅｄ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ピルビン酸ナトリウム１００ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ）、１％  １００Ｕ／ｍＬペニシリン−１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ）＋１％  β−メルカプトエタノール  ５０ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍＬカナマイシンおよび６０００ＩＵ／ｍＬ  ｈｒ  ＩＬ−２（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）を補足したＲＭＰＩ  １６４０  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）で構成される完全培地（ＣＭ）中、１ｘ１０６細胞／ウェルの密度で単細胞腫瘍懸濁液をｐ２４ウェルプレートにプレーティングした。あるいは、１〜２ｍｍ３の単一の腫瘍片をｐ２４ウェルの各ウェルに配置し、ＣＭで培養した。プレートを３７℃および５％ＣＯ２に置き、リンパ球の成長が見えるかどうかにかかわらず、培養開始後２日目から開始して週に３回培地の半分を交換した。ＴＩＬ培養物を、典型的には２〜３週間の間、１×１０６細胞／ｍＬの密度で維持し、その後、細胞を収集し、プールした。この細胞集団はプレＲＥＰ  ＴＩＬである。
【０２２２】
プライミングされたＴＩＬは、以下の変更を加えて従来のＴＩＬと同じように作成した：各１μＭの予測ペプチドのプールを、腫瘍消化物の場合０日目に、腫瘍断片の場合は０、２、４日目に培養液に添加した（最大５０ペプチド／プールおよび０．５％ＤＭＳＯの最終濃度まで（Chevalier, Bobisse et al, Oncoimm 2015））。プライミングは、プレＲＥＰフェーズの開始時に行われる。腫瘍材料の制限により、プールあたりわずかな複製（ウェル）しかプレーティングされなかった。記載する場合、ＣＭには、ＴＩＬ培養の全期間中（すなわち、図１および２）、１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤｌ  ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１０μｇ／ｍＬの抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ）が補足された。
【０２２３】
予測ネオ抗原に対するＴ細胞の反応性は、プレＲＥＰ  ＴＩＬでのＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって試験した。陽性は２回以上の独立した実験で確認した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、プレコート９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍａｂｔｅｃｈ）を使用して行い、Ｂｉｏｒｅａｄｅｒ−６０００−Ｅ（ＢｉｏＳｙｓ）でカウントした（Harari et al., The Journal of Experimental Medicine 205, 63-77 (2008))。
【０２２４】
実施例１および２（下記）で使用したペプチドを表１に示す。
【表１−１】
2021501596.tif 000002
【表１−２】
2021501596.tif 000003
【表１−３】
2021501596.tif 000004
【０２２５】
結果および考察
従来の腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の拡大法は黒色腫の患者に有用であったが、ネオ抗原特異的Ｔ細胞クローンの回収を最大化し、あるいはＴＩＬ培養物をネオ抗原特異的Ｔ細胞について濃縮（富化）するために、ＴＩＬ培養の最適化が必要とされる。この目的のために、この実施例では、ネオ抗原特異的Ｔ細胞の拡大を有利にするために、ＴＩＬ拡大方法論を最適化することを目指した。上記の目標は、複数の戦略を通して達成された。
【０２２６】
免疫チェックポイント阻害による抗腫瘍反応の改善は、進行した固形悪性腫瘍の処置のための新しいアプローチである。特に、抗ＰＤ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体での処置は、重大な臨床的利益をもたらした。追加の研究により、ＰＤ１を発現するＴＩＬがネオ抗原特異的Ｔ細胞において豊富になっていることが実証されている。この証拠に基づいて、この実施例では、抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体を組み合わせて添加することにより、ＴＩＬ培養物のネオ抗原特異的Ｔ細胞の濃縮がもたらされるかどうかを試験した。卵巣がん患者の再懸濁腫瘍細胞を酵素的に解離し、ＩＬ−２、抗ＰＤ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体で処理し、その後、すべての予測クラスＩネオ抗原の合成９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチド（５０〜１００の異なるペプチド）のプールに対する反応性を照合した。データは、抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体の添加が、ＴＩＬ培養物のネオ抗原特異的Ｔ細胞の濃縮を引き起こさなかったことを示す（図１Ａ）。
【０２２７】
次に、卵巣がん患者からの再懸濁腫瘍細胞を使用して、プレＲＥＰの開始時に予測ネオ抗原のプール（すべての予測クラスＩネオ抗原の合成９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドのプール）を添加することの効果を試験した。従来の条件下（すなわち、ＩＬ−２のみ）で培養したＴＩＬと比較して、予測ネオ抗原のプールと共に培養したＴＩＬは、ネオ抗原特異的Ｔ細胞が濃縮され（図１Ｂ）、それには、同じネオ抗原（図２Ａ；右上のパネルのＴＩＬの数は、従来の方法で検出可能なＴＩＬの量（０．１３）が、プライミングされたＴＩＬでは３．３２に増加することを示す）または従来の拡大プロトコルでは検出できなかった新しいネオ抗原（図２Ｂ）のいずれかを認識する著しく高い頻度のＴ細胞クローンが含まれる。
【０２２８】
ネオ抗原特異的Ｔ細胞の濃縮を、特定のペプチドＭＨＣマルチマーを使用して実証した。まとめると、予測ネオ抗原のプールと共に培養したＴＩＬは、ネオ抗原特異的Ｔ細胞の大きさ（頻度）（magnitude）と広さ（種類）（breadth）の両方に関して、同じ患者から生成された従来のＴＩＬと比較して、ネオ抗原特異的Ｔ細胞が有意に濃縮された（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞；図３）。
【０２２９】
次に、腫瘍の酵素消化から生成されたＴＩＬではなく、腫瘍断片を使用して、ネオ抗原特異的ＴＩＬを拡大できるかどうかを決定した。黒色腫患者からの腫瘍断片を、ＩＬ−２単独、または予測ネオ抗原のプールと組み合わせてＩＬ−２と培養し、その後、予測ネオ抗原のプールに対する反応性を調べた。卵巣がんのサンプルと一致して、予測ネオ抗原のプールに対する反応性は、予測ネオ抗原と共に培養したＴＩＬで高かった（図４）。
【０２３０】
まとめると、予測ネオ抗原のプールと共に培養したＴＩＬは、同じ患者から生成された従来のＴＩＬと比較して、ネオ抗原特異的Ｔ細胞が有意に濃縮された。予測ネオ抗原のプールと共に培養したＴＩＬは、出発材料が再懸濁腫瘍細胞または腫瘍断片である場合、ネオ抗原特異的Ｔ細胞が有意に濃縮された。予測ネオ抗原のプールと共に培養したＴＩＬは、出発物質がメラノーマまたは卵巣がんに由来する場合、ネオ抗原特異的Ｔ細胞が有意に濃縮された。
【０２３１】
ネオ抗原特異的Ｔ細胞の大きさ（頻度）と広さ（種類）の両方が予測ネオ抗原のプールと共に培養したＴＩＬで増大した。予測ネオ抗原のプールと共に培養したＴＩＬのネオ抗原特異的Ｔ細胞の濃縮は定量的および定性的であり、ペプチド−ＭＨＣマルチマーによる直接測定、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによるサイトカイン産生細胞の定量、およびＭＳＤなどのマルチプレックスバイオアッセイによる複数のサイトカイン産生の測定を含む、複数のツールを使用して実証された。
【０２３２】
実施例２
実施例１は、クラスＩ予測ネオ抗原に由来する９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒの合成ペプチドの使用に依存し、それは、ＣＤ８＋ＴＩＬ応答の照合に限定された。したがって、実施例１は、潜在的なＣＤ４＋ネオ抗原応答を調べなかった。クラスＩＩネオ抗原の臨床的関連性と特定腫瘍におけるその頻度１５、１６を考慮して、この実施例では、ＴＩＬ生成のこの手段を調べる。ＣＤ４＋ネオ抗原応答の可能性を調べるために、タンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）アプローチを利用した。ＴＭＧは、全エクソームシーケンシング８、１７、１８により同定された個々の変異アミノ酸を中心とする２５〜３１ｍｅｒ（図６Ａ）をそれぞれがコードする可変数のミニ遺伝子（最大１５個）で構成されるＤＮＡ配列である。ＴＭＧを適切な発現ベクター中にクローン化し、これをテンプレートとして使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡを生成し、次にそれを抗原提示細胞（ＡＰＣ）にエレクトロポレーションした（図６Ｂ）。この実施例では、ＡＰＣは患者由来のＣＤ４０活性化Ｂ細胞であった。重要なこととして、患者の自己プロフェッショナルＡＰＣ（例えば、樹状細胞ＤＣまたはＣＤ４０活性化Ｂ細胞）を使用すると、患者自身のクラスＩおよびクラスＩＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子との関連でネオ抗原の提示が可能となり、したがって患者のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の直接の照合が可能となる（図６Ｂ）。ネオ抗原特異的Ｔ細胞についてＴＩＬ培養物をさらに濃縮するために、自己の改変Ｂ細胞（さまざまなネオ抗原をコードするｍＲＮＡを一過性トランスフェクトした）をプレＲＥＰの段階で試験した（図６Ｂ）。
【０２３３】
材料および方法
ＩＶＴ  ｍＲＮＡの作成
上流にＴ７プロモーター、下流に非翻訳領域（ＵＴＲ）（図７）（ｍＲＮＡの安定性を高める役割）を有するタンデムの５つのミニ遺伝子（ＴＭＧ）をコードするプラスミドＤＮＡ構築物を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に注文した。５つのミニ遺伝子は、位置１６に変異がある５つの３１ｍｅｒにあり、それらは非免疫原性グリシン／セリンリンカー（図７に詳細に記載の配列）１１、１９によって分離されている。得られたＴＭＧは、シグナルペプチド（ＳＰ）とＭＨＣクラスＩトラフィッキングシグナル（ＭＩＴＤ）２０に挟まれ（図７）、クラスＩとクラスＩＩ経路の両方による各３１ｍｅｒのプロセシングおよび提示を可能にした。ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで直線化し、フェノール：クロロホルムで精製し、エタノールで沈殿させた。分光光度定量に続いて、１μｇの直線状ＤＮＡを、ｍＭＡｃｈｉｎｅ  ｍＭｅｓｓａｇｅ  Ｔ７  Ｕｌｔｒａキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写およびポリアデニル化のテンプレートとして使用した。得られたＩＶＴ  ｍＲＮＡを、製造元の指示に従ってＬｉＣｌで沈殿させた。ポリアデニル化および完全性を、変性条件でのゲル電気泳動によって検証した。ｍＲＮＡは最終的にＱｂｉｔ蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。４−１ＢＢＬおよびＯＸ−４０Ｌはすでに、ｐＣＭＶ６ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）のマルチプルクローニングサイトにクローン化されていた。ＩＬ−１２α／Ｐ２Ａ／ＩＬ−１２βヌクレオチド配列はＧｅｎｅＡｒｔで注文および合成し、Ｔ７プロモーターの下流で、ｐＭＡ−ＲＱプラスミド中にクローン化した。免疫調節物質の配列については、図２１〜２３を参照のこと。直線化後、ＴＭＧについて説明したように各分子のコード領域全体が逆転写された。ある例では、実験で使用されるＴＭＧは、合計５つのミニ遺伝子からなり、１つは同種抗原（cognate antigen）をコードしているが、他の４つは反応性でなくてもよい。これは、最も費用対効果の高い方法で異なる患者サンプルに同じ遺伝子構築物を使用できるようにするために行われた。
【０２３４】
自己ＣＤ４０活性化Ｂ細胞の生成
自己Ｂ細胞は、組換え多量体ＣＤ４０リガンド（ｍＣＤ４０−Ｌ）（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）およびｈｒＩＬ−４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して生成した（図６Ｂ）。最初に、自己凍結ＰＢＭＣまたはアフェレーシスサンプルから、マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いてＣＤ１９＋細胞のポジティブセレクションによってＢ細胞を単離した。次に、活性化ＣＤ４０−Ｂ細胞を拡大させるために、ＣＤ１９＋細胞をＢ細胞培地で１０〜１４日間培養した。Ｂ細胞培地は、８％ヒト血清、１μｇ／ｍｌのｍＣＤ４０−Ｌおよび２００ＩＵ／ｍｌ  ｈｒのＩＬ−４を補足したＲＰＭＩから構成されていた。
【０２３５】
ＡＰＣへのｌＶＴ  ｍＲＮＡのエレクトロポレーション
未ソートＰＢＭＣとの共培養アッセイ前またはＴＩＬ生成アッセイ前に、ＣＤ４０活性化Ｂ細胞を、８％ヒト血清および２００ＩＵ／ｍｌ  ｈｒのＩＬ−４を補足したＲＰＭＩ中において一晩休ませた。ＣＤ４０活性化Ｂ細胞を収集し、ＰＢＳで２回穏やかに洗浄してから、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブでＮｅｏｎエレクトロポレーションキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のバッファーＴで１０〜１５ｅ６細胞／ｍｌに再懸濁した。１００，０００〜１５０，０００細胞のエレクトロポレーションあたり、１μｇのＩＶＴ  ｍＲＮＡを添加した。次に、細胞をＮｅｏｎエレクトロポレーションピペット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１０μｌ（０．１〜０．１５ｅ６細胞）または１００μｌ（１〜１．５ｅ６細胞）のチップに収集し、以下のパラメーターでＮｅｏｎシステム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってエレクトロポレーションを行った：１４００Ｖ、２０ｍｓ、２パルス。その直後に、ｍＣＤ４０−Ｌを枯渇させた予熱Ｂ細胞培地（上記）に細胞を添加した。エレクトロポレーションした細胞を３７℃で４〜１７時間（一晩）インキュベートし、共培養アッセイまたはＴＩＬ生成アッセイの前にＲＰＭＩで２回洗浄した。
【０２３６】
ＡＰＣのペプチドパルス
最小抗原ロード（すなわち、クラスＩ抗原では９〜１０ｍｅｒおよびクラスＩＩ抗原では１２〜１５ｍｅｒ）の場合、細胞を収集し、ＲＰＭＩで２回洗浄し、ペプチドまたはペプチドプールを補足した１％ヒト血清  ＲＰＭＩで１ｅ６細胞/ｍｌに再懸濁した。９〜１０ｍｅｒおよび１２〜１５ｍｅｒを、それぞれ１μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌでＢ細胞とインキュベートした（すなわち、プレロードした）。細胞を３７℃で１〜２時間インキュベートし、共培養アッセイで使用する前にＲＰＭＩで２回洗浄した。長鎖ペプチドのプレロード（すなわち、３１ｍｅｒ）の場合、ＡＰＣを収集し、ＲＰＭＩで２回洗浄し、１〜２０μｇ／ｍｌの長鎖ペプチドを添加した２００ＩＵ／ｍｌ  ｈｒのＩＬ４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を補足した８％ヒト血清ＲＰＭＩでｌｅ６細胞／ｍｌに再懸濁した。次に、ＡＰＣを３７℃で１６〜２０時間（例えば、一晩）インキュベートし、共培養アッセイで使用する前にＲＰＭＩで２回洗浄した。
【０２３７】
共培養アッセイ：ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび細胞内サイトカイン染色
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、プレコートされた９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍａｂｔｅｃｈ）を使用して行われ、Ｂｉｏｒｅａｄｅｒ−６０００−Ｅ（ＢｉｏＳｙｓ）でカウントした。ＡＰＣをＥＬＩＳｐｏｔで使用して、腫瘍特異的ＴＩＬまたはＥＬＡクローン（ＭｅｌａｎＡペプチドを認識するＥ細胞クローン）を刺激する場合、３ｅ４のＡＰＣ（自己Ｂ細胞またはＨＬＡ適合細胞株）をｌ〜２ｅ３の特異的Ｔ細胞と共培養した。スクリーニング条件において、合計０．５〜１．５ｅ５のＴＩＬ（濃縮されているまたはされていない）を、２．５ｅ４〜ｌｅ５の自己Ｂ細胞（それぞれ４：１〜１：１の比）を用いて照合した。ＴＩＬは、ＥＬＩＳｐｏｔウェルにペプチド（最小または長鎖ペプチド）を直接添加（すなわち、ペプチドスパイク）することによっても照合することができる。１６〜２０時間後、製造元の指示に従ってＥＬＩＳｐｏｔプレートを展開させた。
【０２３８】
ＩＣＳについては、Ｔ細胞をＢ細胞と共に、ブレフェルジンＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む８％ヒト血清ＲＰＭＩ中で１：１または２：１の比でプレーティングした。１６〜１８時間後、細胞を収集し、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＩＦＮγ、抗ＴＮＦα（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ１３７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、および生存率染色（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。染色細胞を、４レーザーのＦｏｒｔｅｓｓａおよびＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）細胞分析装置で取得した。
【０２３９】
プレＲＥＰ：ＴＩＬ生成
１μｇ／ｍｌのクラスＩ予測ペプチド（≦５０ペプチドのプール）を添加しない（従来の）または添加した（ペプチドでプライミングした）８％ヒト血清およびｈｒＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍｌ）を補足したＲＭＰＩ中において、１ｅ５細胞／ウェルの密度でｐ２４ウェルプレートに全解離腫瘍をプレーティングすることにより、腫瘍酵素消化物からＴＩＬを生成した。プレＲＥＰの開始時にトランスフェクトＢ細胞の存在下でＴＩＬが生成される場合、解離腫瘍は、２．５〜５ｅ５のＢ細胞と共に５ｅ５細胞／ウェルの密度でプレーティングされる（Ｂ細胞プライミング）。Ｂ細胞はトランスフェクトされていないか、またはネオ抗原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされている。その後、培地の半分を２〜３日ごとに交換し、ＴＩＬを１〜２ｅ６／ｍｌの密度に維持した。予測ネオ抗原に対するＴ細胞反応性は、プレＲＥＰ  ＴＩＬでのＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって試験した。記載されている場合、ＴＩＬ培養の全期間中、培養液に１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ１  ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１０μｇ／ｍＬの抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ）を補足した（すなわち、図１０、１２、１４（３段目および４段目のみ）および１５（ＣＤＣ２０およびＳＧＯＬＩ）。
【０２４０】
【表２−１】
2021501596.tif 000005
【表２−２】
2021501596.tif 000006
【０２４１】
結果および考察
最初に、プレＲＥＰフェーズ中に、パルスＡＰＣ（すなわち、ペプチドをプレロードした）と比較して、エレクトロポレーションされたＡＰＣ（すなわち、ＴＭＧ−ＡＰＣ）によって引き起こされる抗原刺激のレベルを比較することによって、トランスフェクトされたＡＰＣによるＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩモデル抗原のプロセシングおよび提示を検証することができた。代表的な実験を示す図８Ａで強調されているように、プレＲＥＰフェーズ中にＴＭＧ−ＡＰＣによって引き起こされる抗原刺激のレベルは、１μＭのＭｅｌａｎＡペプチド（ルーチンのクラスＩペプチドパルス濃度）でパルスされたＡＰＣのレベルと同様であった。実際に、ＩＦＮγスポット数と、アップレギュレートされた活性化マーカーＣＤ１３７を含むＴ細胞クローンのパーセンテージは、ＡＰＣの両方の調製プールで同じ範囲内であった。
【０２４２】
しかしながら、図８Ａで用いられたモデル細胞はＥＬＡクローンであったため、次のステップは、腫瘍サンプル−患者ＣＴＥ−００９からの卵巣ポリクローナルＣＯＰＧ２Ｔ３７ＩペプチドでプライミングされたＴＩＬ（すなわち、ペプチドプールを添加してプレＲＥＰが行われたネオ抗原ＴＩＬ）−を用いて、ＴＭＧアプローチの感度に挑戦することであった（図８Ｂ）。再度、同様のレベルの抗原刺激が、１μＭのペプチドでパルスされたＣＤ４０活性化Ｂ細胞とｍＲＮＡトランスフェクトＢ細胞の両方によって引き起こされた。後者の細胞アッセイは、ＨＬＡクラスＩ抗原のプロセシングおよびＴＭＧ  ｍＲＮＡを介して導入された変異含有３１ｍｅｒの提示の証拠を提供した。
【０２４３】
ＨＬＡクラスＩＩ抗原のプロセシングおよび提示を実証するために、モデル抗原：ウイルスおよび腫瘍関連抗原：を使用した。ＨＬＡクラスＩ抗原に適用された方法と同様に、パルスされたＡＰＣとエレクトロポレーションされたＡＰＣによって引き起こされる抗原刺激のレベルを比較した。図９Ａおよび図９Ｂに示すように、ウイルス抗原（図９Ａ）および腫瘍関連抗原Ｍａｇｅ−Ａ３（図９Ｂ）のプロセシングおよび提示が達成された。重要なことに、これはＴＭＧ方法論を使用してＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩネオ抗原反応性をスクリーニングできることを実証する。これは、予測アルゴリズムに依存しないことを可能にするのみならず、自己ＡＰＣによる推定上のネオ抗原のプロセシングの追加の証拠を有することを可能にする。
【０２４４】
次に、プレＲＥＰの開始時のＴＭＧトランスフェクト自己ＣＤ４０活性化Ｂ細胞の添加を、ペプチドプライミング（ペプチドプールの添加）に基づく既に確立されている濃縮方法論と比較して試験した。患者ＣＴＥ−００６からＴＩＬを生成するために、各１μｇ／ｍｌの３つのペプチドのプールの添加（図１０Ａ）を、ＣＤ４０活性化Ｂ細胞（ＡＰＣ、図１０Ｂ）の添加、および同じ３つのネオ抗原をコードするｍＲＮＡでエレクトロポレーションしたＢ細胞（ＴＭＧ  Ｂ細胞）の添加と比較した。ペプチドプールでの濃縮は、１００，０００のプレＲＥＰ  ＴＩＬあたり〜７０のＩＦＮγスポットによって明らかになった（図１０Ａ、灰色のバー）。注目すべきことに、０日目（Ｄ０）のＴＭＧエレクトロポレーションＢ細胞をプレＲＥＰ  ＴＩＬに１：１の比で添加する（ＴＭＧ  Ｂ細胞１：１  図１０Ｂ）ことにより、ネオ抗原プールのみとのインキュベーションよりも２倍高い、１００，０００のＲＥＰ  ＴＩＬあたり〜１００のＩＦＮγ分泌細胞で示されるように、ネオ抗原特異的Ｔ細胞をさらに濃縮できた。
【０２４５】
後者（すなわち、ＴＭＧ−Ｂ細胞、１：１の比）が最良の条件であり、プレＲＥＰのＤ５でＴＭＧ−Ｂ細胞１：１を使用した２回目の刺激では、さらなる濃縮はなかったことに注意されたい（ＴＭＧ  Ｂ細胞、１：１の比、図１０Ａ）。興味深いことに、ネオ抗原特異的ＴＩＬは、未刺激（非トランスフェクション）自己ＣＤ４０活性化Ｂ細胞を添加することによっても、（程度は低いものの）濃縮することができた（図１０Ｂ、ＡＰＣ）。理論に拘束されることなく、Ｂ細胞の活性化がプロセスを改善するのに十分である可能性があるかもしれない。ただし、このプロセスは、ネオ抗原ペプチドまたはＴＭＧが使用される場合により優れており、共刺激分子（ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢＬ、ＩＬ１２）が使用される場合さらに優れている。
【０２４６】
改変されたＢ細胞はＯＸ４０Ｌおよび４１ＢＢＬをうまく発現し、かなりの量のＩＬ−１２を分泌した（図１１）。
【０２４７】
ＴＭＧに加えて、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢＬおよびＩＬ−１２をコードするｍＲＡで共エレクトロポレーション（co-electroporated）したＢ細胞を使用すると、ネオ抗原特異的Ｔ細胞の頻度をさらに増加させる（図１２：ＴＭＧ−ＡＰＣと改変ＴＭＧ−ＡＰＣとの比較）。また、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢＬおよびＩＬ−１２をコードするｍＲＮＡをＴＭＧと共エレクトロポレーションしたＢ細胞でのＲＥＰ開始後１０日目の再刺激ステップは、ネオ抗原特異的Ｔ細胞の頻度をさらに増加させることができる（図１２＆１４）。注目すべきことに、ネオ抗原特異的Ｔ細胞は、ＴＩＬ培養の開始時に、ネオ抗原を含む長鎖ペプチドと一緒にＢ細胞を添加することによっても濃縮することができる（図１２）．
【０２４８】
重要なことに、Ｂ細胞（改変されたまたはされていない、図１３）の存在下での拡大倍率の増加によって示されるように、ＴＩＬ生成中のＢ細胞の添加は、プレＲＥＰの収量を改善すると思われる。
【０２４９】
最後に、ＴＩＬ培養物のネオ抗原特異的Ｔ細胞の濃縮は、さまざまな起源の腫瘍細胞の異なる腫瘍タイプで達成された。特に、卵巣がん（ＣＴＥ−００６およびＣＴＥ−００７）および結腸直腸がん（ＣｒＣｐ５）、ならびに黒色腫（Ｍｅｌ００１１）の患者で一貫して濃縮が観察された（図１４）。さらに、解離腫瘍細胞（卵巣がん：図１４、３段目と４段目、図１５、ＣＤＣ２０およびＳＧＯＬ１）および腫瘍断片（黒色腫：図１４、１段目；図１５、ＮＢＥＡ；結腸直腸がん：図１４、２行段目；図１５、ＰＨＬＰＰ２）は、ＴＩＬの濃縮に適していることが証明された（図１４、１５）。
【０２５０】
まとめると、データは、ＴＩＬのネオ抗原特異的Ｔ細胞の濃縮が：１）可溶性ペプチドのみで達成される；２）Ｂ細胞の添加により改善される；３）ペプチドでパルスされたＢ細胞の添加により改善される；４）ネオ抗原をコードするＴＭＧでエレクトロポレーションしたＢ細胞の添加により改善される；５）ＯＳ４０Ｌ、４１ＢＢＬ、および／またはＩＬ−１２をコードするベクターで改変されたＢ細胞の添加により改善される；６）Ｂ細胞の添加または複数ラウンドのＢ細胞での刺激により改善される；７）解離腫瘍細胞または腫瘍断片に適している；８）卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、および黒色腫を含むがこれらに限定されない多様な腫瘍適応症に適している；および９）抗ＰＤ１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体処置を伴うのが適切である；ことを示す。
【０２５１】
実施例３
ＴＩＬの疲弊の分析
本明細書に記載の方法は、ＴＩＬの疲弊の発生を低下させる。いくつかの実施形態では、（直接またはＡＰＣを介した）ネオ抗原の存在により、ＴＩＬ疲弊の頻度が低くなる。
【０２５２】
ＴＩＬの疲弊を評価するために、グローバルな遺伝子発現プロファイルを使用して、従来の方法で生成されたＴＩＬ（例えば、プレＲＥＰフェーズにＩＬ−２のみ）を、ネオ抗原を追加して従来の方法で生成されたＴＩＬ（例えば、濃縮された）と比較した。コンセンサス階層的クラスタリングを使用した遺伝子発現プロファイルの分析は、疲弊していないＴＩＬと疲弊したＴＩＬにほぼ正確に対応する、濃縮されたサンプルと従来のサンプルの異なるクラスターを示し、ここに記載の実施形態がプレＲＥＰフェーズ以降のＴＩＬの質を向上させることを示す。遺伝子発現プロファイルの分析は、マイクロアレイと非常によく似た結果を示すであろう。濃縮されたＴＩＬと従来のＴＩＬは、遺伝子発現の異なるクラスターを示し、これらのクラスターは、それぞれ、疲弊していないＴＩＬと疲弊したＴＩＬに対応すると予想される。差次的に発現する遺伝子のリストの調査は、疲弊によりアップレギュレートされる抑制性受容体ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４の発現増加を含む、Ｔ細胞生物学における既知の役割を有する遺伝子を明らかにすることができる。
【０２５３】
プライミングされたＴＩＬと従来のＴＩＬとで差別的に活性である生物学的プロセスを同定するために、遺伝子セットの遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）コレクションを用いた遺伝子セット濃縮分析（gene set enrichment analysis）を行うことができる。
【０２５４】
さらに、細胞表面タンパク質の発現を、Ｔ細胞疲弊マーカーの存在に関して分析することができる。Ｔ細胞の疲弊は以下のものに関連している：ｉ）ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＦ１、ＣＤ３９、ＢＡＴＦなどの多数の抑制性受容体の発現；ｉｉ）ＩＬ−２産生、増殖能、細胞溶解活性の喪失；ｉｉｉ）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、およびｃｃ（β）ケモカインの産生の障害；ｉｖ）脱顆粒および高レベルのグランザイムＢの発現；ｖ）ＩＬ−７またはＩＬ−１５に対する低い反応性；ｖｉ）ＧＡＴＡ−３、Ｂｃｌ−６、およびＨｅｌｉｏｓの発現の変化；ｖｉｉ）Ｔ細胞の表現型の変化（例えば、Ｔ細胞は濾胞性ヘルパーＴの表現型を示す）；およびｖｉｉｉ）細胞死。
【０２５５】
したがって、本明細書に記載の方法および従来の方法によって生成されるプレＲＥＰ  ＴＩＬにおけるこれらの疲弊マーカーの比較分析を行って、どの群が多くまたは少なく疲弊しているかを決定することができる。
【０２５６】
プライミングされたＴＩＬと従来のＴＩＬがさらに拡大する能力は、刺激前にＣＦＳＥなどの細胞増殖トラッカーでＴＩＬを標識することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定できる。
【０２５７】
プライミングされたＴＩＬと従来のＴＩＬがさらに拡大する能力は、ＴＩＬをマウスモデルに養子移入することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで決定できる。
【０２５８】
プライミングされたＴＩＬと従来のＴＩＬの適応性（fitness）と幹細胞性（stemness）は、ＴＭＲＭやマイトトラッカー（ｍｉｔｏ  ｔｒａｃｋｅｒ）などのさまざまな表面マーカーおよび細胞内マーカーを使用して決定できる。
【０２５９】
実施例４
ＴＩＬの希釈効果
ネオ抗原特異的ＴＩＬのＴＩＬ生成のための従来の方法は、そのような方法がネオ抗原特異的ＴＩＬのみを効率的に拡大することができず、したがってネオ抗原特異的ＴＩＬが希釈されることになるという点で制限される。
【０２６０】
従来の方法のプレＲＥＰフェーズ中、ＴＩＬは濃縮することなく腫瘍細胞や他の細胞よりも拡大する。これは、ネオ抗原に反応するＴＩＬには限定的な効果しか与えず、共通抗原または免疫優勢抗原に反応するＴＩＬの数を劇的に増加させる。
【０２６１】
この問題のため、従来の方法は、ネオ抗原に反応するＴＩＬを選択する手段（ＴＩＬアリコートの反応性を決定するなど）を必要とする。したがって、本明細書に記載の方法は、希釈効果がないため、ＴＩＬを選択する手段を必要としない。例えば、従来のＴＩＬ拡大プロトコルでは、ネオ抗原反応性ＴＩＬは拡大する傾向はあるが、他のリンパ球よりも少ないため、希釈される。開示された方法では、ネオ抗原特異的リンパ球は特異的に刺激され、よりうまく拡大し、プレＲＥＰの終わりおよび最終的にＲＥＰの終わりに、より高い頻度に達する。
【０２６２】
この概念をよりよく理解するために、０日目に、ＴＩＬ培養物は、既知の抗原Ａを認識する１８個のＴ細胞、既知の抗原Ｂを認識する９個のＴ細胞、ネオ抗原Ｘを認識する２個のＴ細胞、およびネオ抗原Ｙを認識する３個のＴ細胞を有すると想定できる。２ｘ１０３の指数関数的な細胞増殖を仮定すると、従来の方法では、ＴＩＬ培養物は、既知の抗原Ａに対する５８３２個のＴ細胞、既知の抗原Ｂに対する７２９個のＴ細胞、ネオ抗原Ｘに対する８個のＴ細胞、ネオ抗原Ｙに対する２７Ｔ個の細胞を有する。したがって、ネオ抗原ＸおよびＹに反応性の画分は、既知の抗原ＡおよびＢに有利な細胞培養において希釈されている。しかしながら、本明細書に記載の方法は、ネオ抗原反応性Ｔ細胞の濃縮をもたらし、したがって、ネオ抗原ＸおよびＹに反応性の画分は希釈されない。
【０２６３】
この希釈効果（従来の方法で観察される）の低減および／または欠如を実証および決定するために、蛍光タンパク質を安定発現する免疫細胞を免疫不全動物モデルに注入する（例えば、免疫不全マウスモデルに移植する）ことができる。動物モデルは、蛍光タンパク質を介して追跡可能な免疫システムを有することになる。次に、動物モデルに、Ｂ１６黒色腫などの腫瘍細胞を注入することにより、腫瘍チャレンジを行う。蛍光免疫細胞は、組織に浸潤するために腫瘍部位に到達する。
【０２６４】
蛍光腫瘍浸潤リンパ球を含む腫瘍断片は、本明細書に記載の方法で処理することができ、抗原特異的ＴＩＬの頻度および増加倍率を決定できる。例えば、細胞を蛍光色素で標識することができ、これにより、増殖履歴を決定し、抗原特異的細胞の増殖履歴を他のリンパ球の増殖履歴と比較することができる。ネオ抗原特異的細胞の相対的増殖は、他のリンパ球と比較して、ネオ抗原特異的細胞の増殖が少ない（すなわち、希釈された）か否かを示す。結果は、従来の方法では、ネオ抗原特異的細胞の頻度が低下「希釈」されることを示すであろう。
【０２６５】
プレＲＥＰの最後に同定されたネオ抗原特異的ＴＩＬを精製し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列に関してその組成を分析することができる。次に、ネオ抗原特異的ＴＩＬからの特定のＴＣＲ配列を原発腫瘍で検出および定量化して、その頻度を推定できる。言い換えると、患者への養子移入後、濃縮ＴＩＬは、従来の方法で拡大されたＴＩＬよりも、よりうまく腫瘍に浸潤するであろう。これを実証する１つの方法は、従来の条件または濃縮条件で拡大されたＴＩＬから得られたリンパ球のＴＣＲ配列を決定し、患者の腫瘍生検におけるそのようなＴＣＲの相対頻度および絶対頻度を決定することである。従来の方法とプライミング方法を使用したネオ抗原特異的ＴＩＬからのＴＣＲ配列の相対的な拡大倍率を、患者への養子移入後に比較することができる。
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【０２６６】
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【０２６７】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明から当業者には明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【０２６８】
本明細書で引用されるすべての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021501596.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2021501596.tif 000012
【図６Ｂ】
2021501596.tif 000013
【図７】
2021501596.tif 000014
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021501596.tif 000044
2021501596.tif 000045
2021501596.tif 000046