(57)【要約】【課題】ＣＤ１３７アゴニスト分子の臨床開発は、用量を制限する高グレードの肝臓の炎症（ウレルマブ）又は低い臨床効果（ウトミルマブ）のいずれかに関連する処置のため、阻止されてきた。【解決手段】本出願は、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７の両方に結合し、ＣＤ１３７のアゴニスト作用を誘導することができる抗体分子に関する。抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの結合部位と、抗体分子の定常ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位とを含む。本発明の抗体分子は、例えば、癌などの疾患の処置に、用途が見出される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）及びＣＤ１３７に結合する抗体分子であって、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１の相補性決定領域（ＣＤＲ）ベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）前記抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位
を含み、前記ＣＤＲベースの抗原結合部位が、
（ｉ）それぞれ配列番号１、２、３、４、５及び６［E12v2］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１、２、３、１８、１９及び２０［E05v2］；又は
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１、２、３、１８、１９及び２９［G12v2］；
に記載のＣＤＲ１〜６を含み、
前記ＣＤ１３７抗原結合部位が、それぞれ、前記ＣＨ３ドメインのＡＢ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列及び第２の配列を含み、前記第１及び第２の配列が、それぞれ配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］、又は７９及び８０［FS22-53-008］に記載の配列を有する、
抗体分子。
【請求項２】
前記抗体分子が、
（ｉ）それぞれ配列番号１２及び１４［E12v2］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号２３及び２５［E05v2］；又は
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２３及び３０［G12v2］
に記載のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３】
前記抗体分子が、
（ｉ）それぞれ配列番号１、２、３、４、５及び６に記載のＣＤＲ１〜６［E12v2］；及び／又は
（ｉｉ）それぞれ配列番号１２及び１４に記載のＶＨドメイン及びＶＬドメイン［E12v2］
を含む、請求項１又は２に記載の抗体分子。
【請求項４】
（ｉ）前記第１の配列が、前記抗体分子の前記ＣＨ３ドメインの１４位と１７位の間に位置している；及び／又は
（ｉｉ）前記第２の配列が、前記抗体分子の前記ＣＨ３ドメインの９１位と９９位の間に位置しており；並びに
アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、
請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項５】
前記抗体分子が、配列番号１１５に記載のＣＨ３ドメイン［FS22-172-003］を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項６】
前記抗体分子が、抗体：
（ｉ）それぞれ配列番号１３４及び１７に記載のFS22-172-003-AA/E12v2；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１３７及び２８に記載のFS22-172-003-AA/E05v2；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１４０及び３３に記載のFS22-172-003-AA/G12v2；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１４３及び１７に記載のFS22-053-008-AA/E12v2；
（ｖ）それぞれ配列番号１４６及び２８に記載のFS22-053-008-AA/E05v2；又は
（ｖｉ）それぞれ配列番号１４９及び３３に記載のFS22-053-008-AA/G12v2
の重鎖及び軽鎖を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項７】
前記抗体分子が、それぞれ配列番号１３４及び１７［FS22-172-003-AA/E12v2］に記載の重鎖及び軽鎖を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項８】
前記抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体への前記抗体分子の前記ＣＨ２ドメインの結合を低減又は抑制するように修飾されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項９】
前記抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体に結合しない、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１０】
免疫細胞上のＣＤ１３７への及び腫瘍細胞表面に結合したＰＤ−Ｌ１への前記抗体分子の結合が、前記免疫細胞上のＣＤ１３７のクラスター化を引き起こす、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、１つ又は複数の核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む、１つ又は複数のベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の１つ又は複数の核酸分子、又は請求項１２に記載の１つ又は複数のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項１４】
前記抗体分子の産生条件下で請求項１３の組換え宿主細胞を培養することを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体分子を産生する方法。
【請求項１５】
前記抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体分子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
個体の癌を処置する方法における使用のための請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１８】
治療有効量の、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体分子を個体に投与することを含む、個体の癌を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７の両方に結合し、ＣＤ１３７のアゴニスト作用を誘導することができる抗体分子に関する。抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの結合部位と、抗体分子の定常ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位とを含む。本発明の抗体分子は、例えば、癌などの疾患の処置に、用途が見出される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プログラム細胞死１（ＰＤ−１）及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４、Ｂ７−Ｈ１）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）は、Ｔ細胞の活性化、耐性、及び免疫病理学のバランスを調節する阻害シグナルを伝達する。ＰＤ−Ｌ１は、全ての免疫細胞及び一部の腫瘍細胞で一過性に発現する。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ７タンパク質ファミリーのメンバーであり、Ｂ７．１及びＢ７．２とおよそ２０％のアミノ酸配列同一性を共有している。ヒトＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−Ｌ１のマウス及びカニクイザルのオルソログとそれぞれ７０％及び９３％のアミノ酸同一性を共有している。
【０００３】
ＰＤ−Ｌ１は、その受容体ＰＤ−１に７７０ｎＭの親和性（ＫＤ）で結合する。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄細胞に発現し、並びに細胞性免疫応答の活性化又は阻害を調節する。ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合すると、阻害性シグナルが伝達され、サイトカイン産生及びＴ細胞の増殖が減少する。その結果、細胞によるＰＤ−Ｌ１発現は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の死滅に対する保護を媒介することができ、これは、ウイルス感染時の慢性免疫応答を弱める調節メカニズムである。癌は、慢性及び炎症誘発性疾患として、ＰＤ−Ｌ１発現のアップレギュレーションを通じてこの免疫保護経路を破壊し、宿主の免疫応答を回避する。能動免疫応答では、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）は、ＰＤ−Ｌ１の発現もアップレギュレートする。
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１はまた、別のタンパク質であるＢ７．１（ＣＤ８０としても知られる）との相互作用を通じて免疫抑制を媒介し、ＣＤ２８を通じてＴ細胞の活性化の二次シグナルの１つを送達する能力を遮断する。腫瘍細胞でのＰＤ−Ｌ１発現とそのＢ７．１との関与に関して、腫瘍免疫抵抗性におけるこの特定の相互作用の関連性はまだ不明である。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１の発現は、多種多様な固形腫瘍で示されている。ある研究で調べられた６５４のサンプルのうち、異なる部位からの１９の腫瘍に及ぶ、８９（１４％）がＰＤ−Ｌ１陽性（５％以上の頻度）であった。最も高いＰＤ−Ｌ１陽性頻度は、頭頸部（１７／５４；３１％）、子宮頸部（１０／３４；２９％）、原発不明の癌（ＣＵＰ；８／２９；２８％）、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ；５／２０；２５％）、膀胱（８／３７；２１％）、食道（１６／８０；２０％）、トリプルネガティブ（ＴＮ）乳房（６／３３；１８％）、及び肝細胞癌（６／４１；１５％）で見られた（Grosso et al., 2013）。ＰＤ−Ｌ１の腫瘍関連発現は、免疫抵抗性を付与し、Ｔ細胞媒介性アポトーシスから腫瘍細胞を保護する可能性があることが示されている。
【０００６】
臨床試験では、患者のＰＤ−Ｌ１を標的とすることの臨床的利点が示され、これまでに３つの抗ＰＤ−Ｌ１標的モノクローナル抗体が承認された。ＰＤ−Ｌ１に結合するヒト化ＩｇＧ１抗体であるアテゾリズマブ（MPDL3280A、RG7466、Tecentriq（商標））は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の一次処置、並びに臨床試験でＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍を有する患者においてそれぞれ客観的応答率（ＯＲＲ）３８％及び４３％を示した後の膀胱癌の一次及び二次処置に承認されている（Iwai et al., 2017）。アベルマブ（MSB0010718C、Bavencio（商標））はＰＤ−Ｌ１に結合する完全ヒトＩｇＧ１抗体であり、メルケル細胞癌の処置及び膀胱癌の二次処置に承認されている一方で、完全ヒトＩｇＧ１抗体デュルバルマブ（MEDI4736、Imfinzi（商標））は二次膀胱癌の処置に承認されている。これらの抗体及びその他の抗ＰＤ−Ｌ１治療薬を用いた追加の試験は、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、卵巣癌、及び腎細胞癌を含む、処置可能な固形癌の範囲を拡大することに焦点を当てて進行中である。
【０００７】
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ；ＴＮＦＲＳＦ９）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の共刺激分子である。ＣＤ１３７は、活性化後にＣＤ８＋Ｔ細胞で上方制御されることが広く知られており、活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）においても発現され得る（Bartkowiak & Curran, 2015）。Ｔ細胞の細胞傷害性の増強におけるＣＤ１３７の主要な機能的役割は、最初に１９９７年に説明され（Shuford et al., 1997）、その後すぐ、抗ＣＤ１３７ｍＡｂが抗癌治療薬として提案された。
【０００８】
ＣＤ１３７は、ＣＲＤ１〜４と呼ばれる４つの細胞外システインリッチドメインと、ＣＤ１３７シグナル伝達に関与する細胞質領域とを有する膜貫通タンパク質である。ＣＤ１３７のリガンドはＣＤ１３７Ｌである。ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ複合体の結晶構造は存在しないが、ＣＤ１３７はＣＤ１３７Ｌと三量体／三量体複合体を形成すると予測されている（Won et al., 2010）。ＣＤ１３７Ｌの関与は、受容体三量体の形成とそれに続く複数の受容体三量体のクラスター化をもたらし、ＣＤ１３７シグナル伝達カスケードの活性化につながる。このシグナル伝達カスケードは、活性化誘導細胞死に対する生存シグナルをＴ細胞に提供し（Hurtado et al., 1997）、それにより、効果的なＴ細胞免疫応答の維持及び免疫学的記憶の生成に重要な役割を果たす（Bartkowiak & Curran, 2015）。
【０００９】
ＣＤ１３７は活性化Ｔ細胞によって発現され、抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を同定するためのマーカーとして使用されている（Wolfl et al., 2007；Ye et al., 2014）。通常、ＣＤ１３７の発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞で高くなる（Wen et al., 2002）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合、インターフェロンガンマ及びインターロイキン２の産生を介した増殖、生存及び細胞傷害性エフェクター機能は、ＣＤ１３７架橋に起因するとされている。ＣＤ１３７架橋は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の分化及び維持にも寄与する（Chacon et al., 2013）。ＣＤ４＋Ｔ細胞の一部のサブセットでは、ＣＤ１３７架橋が同様に増殖及び活性化を引き起こし、インターロイキン２などのサイトカインの放出をもたらす（Makkouk et al., 2016）。ＣＤ１３７は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の腫瘍応答性サブセットで発現することも実証されている。ＣＤ１３７単剤療法は、ＭＣ３８、ＣＴ２６及びＢ細胞リンパ腫などのいくつかの前臨床免疫原性腫瘍モデルで有効であることが示されている。
【００１０】
ＣＤ１３７アゴニスト抗体処置に関連する用量を制限する高グレードの肝臓の炎症のため、ＣＤ１３７ｍＡｂの臨床開発は遅れている。非リガンド遮断ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体（Chester et al, 2018）であるウレルマブ（BMS-663513）は、臨床試験に入った最初の抗ＣＤ１３７抗体であったが、これらは、顕著なオンターゲットの用量依存的な肝毒性が観察された後に中止された（Chester et al., 2018；Segal et al., 2017；及びSegal et al., 2018）。より最近では、固形癌の処置におけるウレルマブの臨床試験が再開され、ウレルマブ処置は、放射線療法（NCT03431948）、又はリツキシマブ（NCT01775631）、セツキシマブ（NCT02110082）、抗ＰＤ−１抗体ニボルマブ（NCT02253992、NCT02534506、NCT02845323）、及びニボルマブと抗ＬＡＧ−３抗体BMS986016（NCT02658981）の組み合わせなどの、他の治療用抗体と組み合わされた。しかし、ウレルマブ処置に関連する肝毒性を低減するために、これらの試験でのウレルマブの投与は制限されなければならず、有効性の結果は期待外れであった（Chester et al., 2018）。
【００１１】
ヒトＩｇＧ２アイソタイプ抗体であるファイザーの抗ＣＤ１３７抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）では、進行癌の第Ｉ相臨床試験において、０．０３ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまでの用量範囲で用量制限毒性は観察されていない（Chester et al.2016；Segal et al., 2018）。しかし、この抗体による全体的な客観的応答率は、固形腫瘍を有する患者においてわずか３．８％であり、ウトミルマブはウレルマブよりも効力及び臨床的有効性が弱い一方、安全性プロファイルがより良好であることを示している可能性がある（Chester et al., 2018；Segal et al., 2018）。ウトミルマブは、放射線療法（NCT03217747）又は化学療法との組み合わせ、並びに抗ＰＤ−Ｌ１抗体アベルマブ（NCT02554812）及び抗ＰＤ−１抗体ペンブロリズマブ（NCT02179918）を含む他の抗体療法との組み合わせで、安全性、忍容性、用量制限毒性（ＤＬＴ）、最大耐量（ＭＴＤ）、及び異なる処置の組み合わせの有効性を評価するために試験された。これらの試験は進行中であり、初期の結果では、５ｍｇ／ｋｇまでの用量でＤＬＴを示さず、ウトミルマブとペンブロリズマブの組み合わせで２６％の患者応答率を示している。（Tolcher et al., 2016）（Perez-Ruiz et al, 2017）。
【００１２】
抗ＣＤ１３７抗体であるウトミルマブを、抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるアベルマブと組み合わせて試験するための臨床試験が進行中である（NCT02554812、NCT3390296）。ウトミルマブとアベルマブ及び他の療法との３つの組み合わせも試験されている（NCT02554812、NCT03217747、NCT03440567、NCT03414658）。
【００１３】
ＣＤ１３７を標的とする多くの二重特異性分子も開発の初期段階にある。例えば、ＣＤ１３７及びＦＡＰ−アルファ（Link et al., 2018；Reichen et al., 2018）、ＨＥＲ２（Hinner et al., 2015及び国際公開第２０１６／１７７８０２  Ａ１号）、又はＥｐｈＡ２（Liu et al., 2017）を標的とするものである。例えばＦＡＰ−アルファを介して腫瘍を標的とするＣＤ１３７Ｌ融合タンパク質（Claus et al., 2017）も開発されている。最も臨床的に進歩したＣＤ１３７二重特異性は、ＣＤ１３７／ＨＥＲ２二重特異性分子であるＰＲＳ−３４３であり、最近、その安全性、忍容性及び有効性を評価するための一連の固形腫瘍の処置に関する第Ｉ相臨床試験に入っている（NCT03330561）。
【００１４】
抗ＣＤ１３７活性及び抗ＰＤ−Ｌ１活性を二重特異性療法に組み合わせる他のアプローチが存在する。１つのアプローチは、バイクロニクス技術を利用して、ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１の両方に一価結合する完全長のヘテロ二量体ヒトＩｇＧを生成し（国際公開第２０１８０５６８２１号）、ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１の両方に結合し、高レベルのＰＤ−Ｌ１の存在下でＣＤ１３７アゴニスト作用を誘導できる分子を得る。ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１の両方を標的とするｓｄＡｂ−Ｆｃ融合を使用した第２のアプローチが説明されている（国際公開第２０１７１２３６５０号）。どちらのアプローチも、ＰＤ−Ｌ１結合の非存在下でＣＤ１３７に結合することができ、ＰＤ−Ｌ１の非存在下で低レベルのＣＤ１３７アゴニスト作用を誘発する。このアゴニスト作用は、高レベルのＰＤ−Ｌ１の存在下で増加する。ヒト化抗ＣＤ１３７結合領域と、ＰＤ−Ｌ１のレベルの存在下でＣＤ１３７アゴニスト作用を誘発するヒト抗ＰＤ−Ｌ１領域とを含む、ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１の両方に一価結合するさらなるヘテロ二量体二重特異性抗体が記載されている（国際公開第２０１９／０２５５４５  Ａ１号）。
【００１５】
現在のデータは、抗ＰＤ−Ｌ１単剤療法による全体的な処置が癌患者の５０％未満で反応をもたらすことを示している。したがって、ＰＤ−Ｌ１を標的とすることができ、癌治療における用途が見出されるさらなる分子が当技術分野で依然として必要とされている。
【００１６】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断は強力な臨床的検証を有するが、単剤療法の設定で応答する患者は５０％未満である。ＰＤ−Ｌ１と追加の免疫モジュレーターの組み合わせは、改善された有効性を示すことが期待される。しかし、そのような組み合わせは、処置に関連する有害事象の増加に関連している可能性があり、その結果、限られた治療域に有効性が制限される可能性がある。ＣＤ１３７を標的とするアゴニスト性分子は、癌患者でまだ有意な応答を示しておらず、これは、治療指数が限られているため、用量レベルが比較的低いことが一因であり得る。したがって、当技術分野には、ＰＤ−Ｌ１遮断を組み合わせ、安全且つ効果的な療法でＣＤ１３７アゴニスト作用を誘発する処置を開発する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
発明の記載
上記の背景セクションで説明したように、ＣＤ１３７アゴニスト分子の臨床開発は、用量を制限する高グレードの肝臓の炎症（ウレルマブ）又は低い臨床効果（ウトミルマブ）のいずれかに関連する処置のため、制限されてきた。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、高活性を示し、アゴニスト作用を腫瘍微小環境に局在化させることができるＣＤ１３７アゴニスト分子が当技術分野で必要であることを認識した。そのような分子は、分子の効力、ひいては有効性を最適化する用量で個体に投与され得、例えば、免疫療法剤として癌の処置に使用され得る。
【００１９】
本発明の抗体分子は、抗体分子の定常ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含む。本発明者らは、単量体ＣＤ１３７よりも高い親和性で二量体ＣＤ１３７に結合する分子（本明細書では「Ｆｃａｂ」とも呼ばれる）を含むＣＤ１３７抗原結合部位のパネルを単離するために広範な選択及び親和性成熟プログラムを実施した。
【００２０】
本明細書において言及される「親和性」は、ＫＤによって測定される、抗体分子とその同族抗原の間の結合相互作用の強度を指し得る。当業者には容易に明らかであるように、抗体分子が抗原と複数の結合相互作用を形成することができる場合（例えば、抗体分子が抗原を二価的に結合することができ、任意選択により、抗原が二量体である場合）ＫＤによって測定される親和性は、結合力によっても影響を受ける可能性があり、ここで、結合力は、抗体−抗原複合体の全体的な強度を指す。
【００２１】
Ｔ細胞によるＣＤ１３７の発現は、活性化の際にアップレギュレートされる。理論に縛られることを望むものではないが、活性化されたＴ細胞上でのＣＤ１３７の高発現のために、ＣＤ１３７はそのような細胞の表面上で二量体、三量体及び高次多量体の形態になると考えられている。対照的に、ナイーブＴ細胞などのナイーブ免疫細胞は、細胞表面に低レベル又は無視できるレベルのＣＤ１３７を発現するため、存在するＣＤ１３７は単量体形態である可能性がある。したがって、二量体又は多量体のＣＤ１３７に高い結合力で結合するＣＤ１３７抗原結合部位を含む抗体分子は、例えばナイーブ免疫細胞に対抗して、活性化Ｔ細胞などの活性化免疫細胞に優先的に結合すると予想される。
【００２２】
ＣＤ１３７抗原結合部位のこれらの特徴は、本発明の抗体分子を、ＣＤ１３７に結合する既知の抗体、例えば、国際公開第２０１８０５６８２１号に記載の抗体と区別すると考えられている。国際公開第２０１８０５６８２１号には、高い親和性でＣＤ１３７に結合する一価のＣＤ１３７結合ドメインを含有する抗体が記載されている（低ｎＭ範囲、国際公開第２０１８０５６８２１号の表６を参照）。これらの抗体は単量体と二量体又は多量体のＣＤ１３７とを区別しないため、これらの従来技術の抗体が活性化免疫細胞に対して同じ優先的結合を示すことは予想されない。
【００２３】
上記の背景セクションで説明したように、ＣＤ１３７リガンドのＣＤ１３７への最初のライゲーションは、受容体の三量体化、続いて受容体のクラスター化、活性化、及びその後の強力な抗腫瘍Ｔ細胞活性の開始につながる一連のイベントを開始すると考えられている。したがって、治療剤がＣＤ１３７の活性化を効率的に達成するためには、いくつかの受容体単量体が、三量体リガンドによる架橋を模倣する方法で一緒に架橋される必要があると予想される。
【００２４】
ウトミルマブはＩｇＧ２分子であり、アゴニスト活性をＦｃγ受容体による架橋に依存している。ウレルマブは構成的活性を有するＩｇＧ４分子であるため、活性のためにＦｃγ受容体による架橋を要しないが、そのアゴニスト活性は一部のＦｃγ受容体による架橋で増強される。Ｆｃγ受容体はヒトの体全体に見られる。したがって、ウトミルマブ及びウレルマブの免疫細胞活性化活性は、体内の特定の部位に限定されず、したがって、肝臓などの腫瘍微小環境以外の位置で発生し得る。
【００２５】
本発明者らは、本発明の抗体分子に存在するＣＤ１３７抗原結合部位が、ＣＤ１３７をクラスター化及び活性化するために架橋を要することを示した。しかし、これはＣＤ１３７バインダーの固有の特徴ではないことに注意されたい。むしろ、スクリーニングプログラム中に単離されたＣＤ１３７バインダーの多くはＣＤ１３７に結合したが、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化のために架橋を必要とせず、架橋の非存在下において限定的なＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を誘導した。
【００２６】
上記のように、Ｆｃγ受容体媒介性架橋には、Ｆｃγ受容体がヒトの体全体に見られ、したがって、ＣＤ１３７の活性化は特定の部位に限定されないという欠点がある。したがって、本発明者らは、Ｆｃγ受容体結合を低減又は抑制するために、ＦｃａｂのＣＨ２ドメインに変異を導入した。したがって、Ｆｃγ受容体以外の薬剤を介した架橋の非存在下では、本発明の抗体分子は、ＣＤ１３７アゴニスト活性を示さない。さらに、これらの変異は、本発明の抗体分子が抗体細胞の細胞傷害性を誘導することができないという結果をもたらし、そのため、抗体分子は、それらが活性化する免疫細胞の死滅を誘発しないことが予想される。
【００２７】
本発明者らは、上記のＣＤ１３７抗原結合部位及びＰＤ−Ｌ１に対するＣＤＲベースの結合部位を含有する抗体分子が、例えば、腫瘍微小環境において、ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１が共発現される位置で免疫細胞を活性化するのに非常に効果的であることを実証した。この意味での共発現は、ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１が同じ細胞、例えば、Ｔ細胞で発現される状況、並びにＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１が異なる細胞、例えば、それぞれＴ細胞及び腫瘍細胞で発現される状況を包含する。
【００２８】
抗体分子は、ＣＤ１３７とＰＤ−Ｌ１に同時に結合することができる。したがって、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７が共発現している位置では、抗体のＰＤ−Ｌ１への結合が、抗体分子の架橋を引き起こし、Ｔ細胞表面で結合したＣＤ１３７のクラスター化及び活性化につながると考えられる。
【００２９】
本発明者らによって示されるように、Ｆｃγ受容体結合を減少させる、又は抑制することにより、抗体分子のアゴニスト活性は、存在するＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７の両方に依存する。換言すれば、アゴニスト活性は条件的であり、したがって、抗体分子は、腫瘍微小環境などのＰＤ−Ｌ１が存在する位置でのみ免疫細胞を活性化できると予想される。免疫細胞のこの標的化された活性化は、例えば、ウレルマブ処置で見られる肝臓の炎症を回避するのに有益であると期待されている。
【００３０】
実際、本発明者らは、上記の特徴を有する抗体分子が、治療的用量でマウスモデルに投与された場合、重度の肝毒性を示さないことを実証する。これらの抗体分子を投与されたマウスでは最小限の肝臓病変しか観察されず、これは他の抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体について以前に報告された重度の肝毒性を表すとは見なされなかった。カニクイザルでの予備研究においても、抗体分子は安全で、３０ｍｇ／ｋｇまで十分に許容されることが示された。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの動物モデルからの結果は、ヒト患者における肝毒性のリスクを予測するにおいて、臨床に変換され、したがって、本発明の抗体分子は、治療的用量で処置されるヒト患者で肝毒性を誘導するリスクが低いであろうと予想される。
【００３１】
本発明者らはまた、抗体分子によって誘導されるＣＤ１３７アゴニスト活性のレベルが細胞表面におけるＰＤ−Ｌ１発現の量と相関するというインビトロでのエビデンスを提供する。本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１発現のレベルが低い場合であっても抗体分子がＣＤ１３７をアゴナイズすることができ、系内のＰＤ−Ｌ１のレベルが増加するにつれてＣＤ１３７アゴニスト活性も増加することを実証する。この結果は、ＣＤ１３７アゴニスト活性がＰＤ−Ｌ１発現に依存している証拠をさらにサポートし、本発明の抗体分子が腫瘍細胞表面で様々なレベルのＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍に対して広範囲の活性を有することを示唆する。
【００３２】
上記のＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの結合部位は、ＰＤ−Ｌ１のその受容体ＰＤ−１への結合を効率的に遮断することができる。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄細胞に発現しており、細胞性免疫応答の活性化又は阻害を調節する。ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合すると、阻害性シグナルが伝達され、サイトカイン産生及びＴ細胞の増殖が減少し、それにより、免疫応答が弱まる。癌では、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１とＴ細胞上のＰＤ−１の相互作用が、Ｔ細胞の活性を低減し、免疫系が腫瘍細胞を攻撃するのを防ぐ。したがって、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を遮断することにより、本発明の抗体分子は、腫瘍細胞がこのように免疫系を回避することを防ぐことができると予想される。理論に拘束されることを望むものではないが、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合のこの効率的な遮断は、抗体分子の抗腫瘍効力を増加させるために上記のＣＤ１３７アゴニスト活性と共に機能すると考えられる。
【００３３】
本発明者らはまた、上記のＣＤ１３７抗原結合部位及びＰＤ−Ｌ１に対するＣＤＲベースの結合部位を含む、そのような二重特異性抗体分子が、インビボで腫瘍増殖を抑制できることを示した。さらに、一方の抗体分子がＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位を含み、他方の分子がＣＤＲベースのＣＤ１３７の抗原結合部位を含む、２つの単一特異性抗体分子の組み合わせと比較して、二重特異性抗体分子では、より効果的な腫瘍増殖抑制が観察された。このことは、ＣＤ１３７の増強されたクラスター化及びシグナル伝達、ひいてはＴ細胞の活性化及び対応する抗腫瘍効果が、本発明の抗体分子で見られることを実証する。
【００３４】
本発明のＣＤ１３７抗原結合部位を含む抗体分子は、抗体分子がＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１の両方に二価で結合するように、さらにＰＤ−Ｌ１に二価で結合することができ得る。両方の標的の二価結合は、ＣＤ１３７を発現するＴ細胞とＰＤ−Ｌ１発現細胞との間の架橋をより安定させ、それにより、Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１が腫瘍微小環境などでＣＤ１３７と共発現し、疾患、例えば腫瘍に作用できる部位に局在する時間を延長すると予想されるため、これは有利であると予想される。これは、ヘテロ二量体であり、１つのＦａｂアームを介して各標的抗原に一価的に結合する、従来の二重特異性抗体形式の大部分とは異なる。そのような一価の相互作用は、安定性が低いだけでなく、ＣＤ１３７などのＴＮＦ受容体のクラスター化を誘導する効率が低いこと、及び／又はそのようなクラスター化、ひいてはＴ細胞の活性化を誘導するために一方又は両方の標的のより高い発現を要することが予想される。これは、分子のＣＨ３ドメインの１つにおいて、ＰＤ−Ｌ１に対する二価のＦａｂ結合部位及びＣＤ１３７に対する一価の結合部位を含む、ｍＡｂ２分子が、両方の標的に二価的に結合するｍＡｂ２より低レベルの、ＩＦＮγ放出によって測定されるＴ細胞活性化を誘導することを示す、本発明者らによって実施された実験によって裏付けられる。
【００３５】
本発明者らによって同定された抗体分子のさらなる特徴は、ＣＤ１３７の抗原結合部位及びＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの結合部位の両方が抗体構造自体の中に含まれていることである。特に、抗体分子は、リンカー又は他の手段を介して他のタンパク質を抗体分子に融合させて、その両方の標的に二価で結合する分子をもたらすことを必要としない。これは多くの利点を有する。具体的には、抗体分子は、それらが追加の融合部分を含まないため、標準的な抗体の産生に使用されるものと同様の方法を使用して産生することができる。リンカーは時間の経過と共に分解し、抗体分子の不均一な集団をもたらし得るため、この構造は、抗体の安定性の向上にもつながることが期待されている。このような不均一な集団では、１つのタンパク質のみが融合し、したがって１つの標的に一価のみで結合する集団内の抗体は、２つのタンパク質が融合して両方の標的に二価で結合することができる抗体ほどは、効率的にＣＤ１３７などのＴＮＦ受容体の条件的アゴニスト作用を誘導しないと予想される。リンカーの切断／分解は、患者への治療薬の投与前又は投与後に（例えば、酵素的切断又は患者のインビボｐＨを介して）起こり得、それにより、患者内を循環している間にその有効性の低下をもたらす。本発明の抗体分子にはリンカーがないため、抗体分子は、投与の前及び後の両方で同数の結合部位を保持すると予想される。さらに、抗体分子の構造は、分子の免疫原性の観点からも好ましい。これは、融合タンパク質若しくはリンカー、又はその両方の導入が、分子が患者に投与される場合に免疫原性を誘発し得、その結果、治療薬の有効性が低下するからである。
【００３６】
したがって、本発明は、以下を提供する。
【００３７】
［１］
（ａ）ＰＤ−Ｌ１の相補性決定領域（ＣＤＲ）ベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位
を含み、ＣＤＲベースの抗原結合部位が、
（ｉ）それぞれ配列番号１、２、３、４、５及び６［E12v2］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１、２、３、１８、１９及び２０［E05v2］；又は
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１、２、３、１８、１９及び２９［G12v2］
に記載のＣＤＲ１〜６を含み、ＣＤ１３７抗原結合部位が、それぞれ、ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列及び第２の配列を含み、第１及び第２の配列が、それぞれ配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］、又は７９及び８０［FS22-53-008］に記載の配列を有する、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）及びＣＤ１３７に結合する抗体分子。
【００３８】
［２］
（ａ）ＰＤ−Ｌ１の相補性決定領域（ＣＤＲ）ベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位
を含み、ＣＤＲベースの抗原結合部位が、
（ｉ）それぞれ配列番号７、８、９、１０、１１及び６［E12v2］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号２１、８、９、２２、１１及び２０［E05v2］；又は
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２１、８、９、２２、１１及び２９［G12v2］
に記載のＩＭＧＴに従うＣＤＲ１〜６を含み、ＣＤ１３７抗原結合部位が、それぞれ、ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列及び第２の配列を含み、第１及び第２の配列が、それぞれ配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］、又は７９及び８０［FS22-53-008］に記載の配列を有する、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）及びＣＤ１３７に結合する抗体分子。
【００３９】
［３］抗体分子が、［１］又は［２］の（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のＣＤＲ１〜６を含む、［１］又は［２］に記載の抗体分子。
【００４０】
［４］抗体分子が、［１］又は［２］の（ｉ）に記載のＣＤＲ１〜６を含む、［１］又は［２］に記載の抗体分子。
【００４１】
［５］抗体分子が、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び／又は軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、好ましくは、ＶＨドメイン及びＶＨドメインを含む、［１］から［４］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００４２】
［６］抗体分子が、免疫グロブリン重鎖及び／又は免疫グロブリン軽鎖、好ましくは、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含む、［１］から［５］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００４３】
［７］抗体分子が、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含み、好ましくは、ＶＨドメイン及びＶＨドメインが、
（ｉ）それぞれ配列番号１２及び１４［E12v2］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号２３及び２５［E05v2］；又は
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２３及び３０［G12v2］
に記載のものである、［５］から［６］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００４４】
［８］抗体分子が、（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、［７］に記載の抗体分子。
【００４５】
［９］抗体分子が、（ｉ）に記載のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、［８］に記載の抗体分子。
【００４６】
［１０］第１の配列が、抗体分子のＣＨ３ドメインの１４位と１７位の間に位置し、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１］から［９］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００４７】
［１１］第１の配列が、抗体分子のＣＨ３ドメインの１５、１６、１６．５、１６．４、１６．３、１６．２、及び１６．１位に位置し、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１０］に記載の抗体分子。
【００４８】
［１２］第２の配列が、抗体分子のＣＨ３ドメインの９２から９８位に位置し、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１］から［１１］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００４９】
［１３］抗体分子が、ＣＨ３ドメインのＣＤ構造ループに位置する第３の配列をさらに含む、［１］から［１２］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００５０】
［１４］第３の配列が、抗体分子のＣＨ３ドメインの４３から７８位に位置し、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１３］に記載の抗体分子。
【００５１】
［１５］第３の配列が、配列番号７３に記載の配列を有する、［１３］から［１４］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００５２】
［１６］抗体分子が、
（ｉ）配列番号１１５［FS22-172-003］；又は
（ｉｉ）配列番号８１［FS22-53-008］
に記載のＣＨ３ドメイン配列を含む、［１］から［１５］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００５３】
［１７］第１及び第２の配列が、それぞれ配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］に記載の配列を有する、［１］から［１５］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００５４】
［１８］抗体分子が、配列番号１１５に記載のＣＨ３ドメイン配列［FS22-172-003］を含む、［１］から［１５］及び［１７］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００５５】
［１９］抗体分子が、ヒトＩｇＧ１分子である、［１］から［１８］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００５６】
［２０］抗体分子が、抗体：
（ｉ）それぞれ配列番号１３４及び１７に記載のFS22-172-003-AA/E12v2；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１３７及び２８に記載のFS22-172-003-AA/E05v2；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１４０及び３３に記載のFS22-172-003-AA/G12v2；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１４３及び１７に記載のFS22-053-008-AA/E12v2；
（ｖ）それぞれ配列番号１４６及び２８に記載のFS22-053-008-AA/E05v2；又は
（ｖｉ）それぞれ配列番号１４９及び３３に記載のFS22-053-008-AA/G12v2
の重鎖及び軽鎖を含む、［１］から［１９］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００５７】
［２１］抗体分子が、［２０］の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つに記載の軽鎖及び重鎖を含む、［２０］に記載の抗体分子。
【００５８】
［２２］抗体分子が、［２０］の（ｉ）に記載の軽鎖及び重鎖を含む、［２０］に記載の抗体分子。
【００５９】
［２３］抗体のＣＨ２ドメインの１１４位のプロリン（Ｐ）が、アラニン（Ａ）で置換され、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［２０］から［２２］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００６０】
［２４］抗体分子が、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７に結合する、［１］から［２３］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００６１】
［２５］ＰＤ−Ｌ１が、配列番号１８０に記載の配列からなるか、又はそれを含む、［２４］に記載の抗体分子。
【００６２】
［２６］ヒトＣＤ１３７が、配列番号１８６に記載の配列からなるか、又はそれを含む、［２４］又は［２５］に記載の抗体分子。
【００６３】
［２７］抗体分子が、癌細胞表面に結合したＰＤ−Ｌ１の存在下で免疫細胞上のＣＤ１３７を活性化することができる、［１］から［２６］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００６４】
［２８］免疫細胞上のＣＤ１３７への及び腫瘍細胞表面に結合したＰＤ−Ｌ１への抗体分子の結合が、免疫細胞上のＣＤ１３７のクラスター化を引き起こす、［１］から［２６］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００６５】
［２９］免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、又は樹状細胞（ＤＣ）である、［２７］又は［２８］に記載の抗体分子。
【００６６】
［３０］免疫細胞がＴ細胞である、請求項［２９］に記載の抗体分子。
【００６７】
［３１］抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体への抗体分子のＣＨ２ドメインの結合を低減又は抑制するように修飾されている、［１］から［３０］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００６８】
［３２］抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体に結合しない、［１］から［３１］のいずれか一項に記載の抗体分子。
【００６９】
［３３］Ｆｃγ受容体が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択される、［３１］又は［３２］に記載の抗体分子。
【００７０】
［３４］［１］から［３３］のいずれか一項に記載の抗体分子と生物活性分子とを含む、コンジュゲート。
【００７１】
［３５］［１］から［３３］のいずれか一項に記載の抗体分子と検出可能な標識とを含む、コンジュゲート。
【００７２】
［３６］［１］から［３３］のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、１つ又は複数の核酸分子。
【００７３】
［３７］核酸分子が、
（ｉ）それぞれ配列番号３２及び３９、又は１３５及び１３６に記載のFS22-172-003-AA/E12v2、好ましくは、それぞれ配列番号３２及び３９；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１３８及び１３９に記載のFS22-172-003-AA/E05v2；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１４１及び１４２に記載のFS22-172-003-AA/G12v2；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１４４及び１４５に記載のFS22-053-008-AA/E12v2；
（ｖ）それぞれ配列番号１４７及び１４８に記載のFS22-053-008-AA/E05v2；又は
（ｖｉ）それぞれ配列番号１５０及び１５１に記載のFS22-053-008-AA/G12v2
の重鎖核酸配列及び／又は軽鎖核酸配列を含む、［１］から［２］、［５］から［７］、［１０］から［１６］、［１９］から［２０］及び［２３］から［３３］のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、１つ又は複数の核酸分子。
【００７４】
［３８］［３６］から［３７］のいずれか一項に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む、１つ又は複数のベクター。
【００７５】
［３９］［３６］から［３７］のいずれか一項に記載の１つ又は複数の核酸分子、又は［３８］に記載の１つ又は複数のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【００７６】
［４０］抗体分子の産生条件下で［３９］の組換え宿主細胞を培養することを含む、［１］から［３３］のいずれか一項に記載の抗体分子を産生する方法。
【００７７】
［４１］抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含む、［４０］に記載の方法。
【００７８】
［４２］［１］から［３５］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【００７９】
［４３］個体の癌を処置する方法における使用のための［１］から［３５］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲート。
【００８０】
［４４］治療有効量の、［１］から［３５］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲートを個体に投与することを含む、個体の癌を処置する方法。
【００８１】
［４５］癌の処置のための医薬の調製における、［１］から［３５］のいずれか一項に記載の抗体分子又はコンジュゲートの使用。
【００８２】
［４６］癌が、黒色腫、膀胱癌、脳癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎癌、胃癌及び消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）からなるリストから選択される、［４３］から［４５］のいずれか一項に記載の使用のための抗体分子若しくはコンジュゲート、方法、又は使用。
【００８３】
［４７］処置が、抗体分子又はコンジュゲートを第２の治療剤と組み合わせて個体に投与することを含む、［４３］に記載の使用のための抗体分子又はコンジュゲート。
【００８４】
［４８］方法が、治療有効量の第２の治療を個体に投与することをさらに含む、［４４］に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】図１Ａは、Ｆｃａｂ  FS22-053、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-010、FS22-053-011、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-014、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053-017、FS22-172、FS22-172-001、FS22-172-002、FS22-172-003、FS22-172-004、FS22-172-005及びFS22-172-006、並びに野生型（ＷＴ）ＦｃａｂのＣＨ３ドメインの配列のアライメントを示す。ＩＭＧＴ、ＩＭＧＴエクソン（連続番号付け）、ＥＵ及びKabat番号付けシステムに従った残基の番号が示される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｆｃａｂ  FS22-053、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-010、FS22-053-011、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-014、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053-017、FS22-172、FS22-172-001、FS22-172-002、FS22-172-003、FS22-172-004、FS22-172-005及びFS22-172-006、並びに野生型（ＷＴ）ＦｃａｂのＣＨ３ドメインの配列のアライメントを示す。ＩＭＧＴ、ＩＭＧＴエクソン（連続番号付け）、ＥＵ及びKabat番号付けシステムに従った残基の番号が示される。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｆｃａｂ  FS22-053、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-010、FS22-053-011、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-014、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053-017、FS22-172、FS22-172-001、FS22-172-002、FS22-172-003、FS22-172-004、FS22-172-005及びFS22-172-006、並びに野生型（ＷＴ）ＦｃａｂのＣＨ３ドメインの配列のアライメントを示す。ＩＭＧＴ、ＩＭＧＴエクソン（連続番号付け）、ＥＵ及びKabat番号付けシステムに従った残基の番号が示される。
【図２】図２は、ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/E12v2が活性化ＣＤ４＋（図２Ａ）及びＣＤ８＋（図２Ｂ）Ｔ細胞に結合できることを示す。抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２FS22-172-003-AA/E12v2は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合は０．８ｎＭ、ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合は０．９ｎＭのＥＣ５０値で、活性化Ｔ細胞に結合した。陽性対照の抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体（G1-AA/E12v2）は、両方の細胞型について０．８ｎＭのＥＣ５０値を有するｍＡｂ２に非常に類似した親和性を示した。陽性対照の抗ヒトＣＤ１３７抗体（G1-AA/MOR7480.1）は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞への低結合を示し、これは、これらの細胞タイプでのＣＤ１３７発現レベルが低いことを示している。
【図３】図３は、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/E12v2がＦｃγ受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞に結合しないことを示す。抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２FS22-172-003-AA/E12v2、Ｆｃγ受容体結合の陽性対照抗体、G1/4420、及びＦｃγ受容体結合のない陰性対照抗体、G1-AA/4420は、５つの異なるＦｃγ受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞株（（Ａ）ＦｃｇＲＩＩＡ  １３１Ｈ、（Ｂ）ＦｃｇＲＩＩＡ  １３１Ｅ、（Ｃ）ＦｃｇＲＩＩＢ、（Ｄ）ＦｃｇＲＩＩＩＡ  １５８Ｆ、（Ｅ）ＦｃｇＲＩＩＩＡ  １５８Ｖ、及び（Ｆ）陰性対照として使用されるＣＨＯ  ＷＴ細胞株を発現する）に対する細胞結合アッセイで試験された。ＣＨ２領域にＬＡＬＡ変異を含有する抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、試験したＦｃγ受容体のいずれにも結合せず、ＣＨＯ  ＷＴ細胞にも非特異的に結合しなかった（中実黒三角）。陽性対照抗体はＦｃγ受容体に結合し（中実黒丸）、ＣＨ２領域にＬＡＬＡ変異を含有する陰性対照抗体G1-AA/4420は、予想された通り、Ｆｃγ受容体に結合しなかった（中空灰色四角）。
【図４】図４は、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２又は陽性対照抗ヒトＣＤ１３７抗体G1-AA/20H4.9の存在下でのヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＩＬ−２（ＨＩＬ−２）の放出を示す。試験した全てのｍＡｂ２は、ｍＡｂ２がヒトＩＬ−２の放出をもたらすヒトＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ細胞により架橋された場合にのみ、ＣＤ１３７クラスター化及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を駆動した。抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２のＥＣ５０値は、抗ヒトＣＨ２二次抗体で架橋した場合（中実黒丸、点線）、陽性対照抗ヒトＣＤ１３７抗体、G1-AA/20H4.9のＥＣ５０値よりも小さかった。これは、改善されたＴ細胞活性化が、ｍＡｂ２で達成されたことを示す。全てがｈＩＬ−２放出の増加を示し、陽性対照抗体では、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２よりも大きいＩＬ−２の放出（Ｅｍａｘ）があった。
【図５】図５は、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２又は陽性対照抗ヒトＣＤ１３７抗体G1-AA/20H4.9の存在下でのヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＩＬ−２（ＨＩＬ−２）の放出を示す。試験した全てのｍＡｂ２は、ｍＡｂ２がヒトＩＬ−２の放出をもたらすヒトＰＤ−Ｌ１を内因的に発現するＭＤＡ−ＭＤ−２３１により架橋された場合にのみ、ＣＤ１３７クラスター化及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を駆動した。抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２のＥＣ５０値は、抗ヒトＣＨ２二次抗体で架橋した場合（中実黒丸、点線）、陽性対照抗ヒトＣＤ１３７抗体、G1-AA/20H4.9のＥＣ５０値よりも小さかった。これは、より良い活性が、ｍＡｂ２で達成されたことを示す。全てがｈＩＬ−２放出の増加を示し、陽性対照抗体では、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２よりも大きいＩＬ−２の放出（Ｅｍａｘ）があった。
【図６】図６は、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/E12v2又は陽性対照抗ヒトＣＤ１３７抗体G1-AA/20H4.9の存在下でのヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＩＬ−２（ＨＩＬ−２）の放出を示す。試験した全てのｍＡｂ２は、ｍＡｂ２が全ＨＥＫ細胞集団の少なくとも６．５％を構成するＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞によって架橋され、ヒトＩＬ−２の放出をもたらす場合にのみ、ＣＤ１３７クラスター化及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を駆動した。抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２のＥＣ５０値は、アッセイに存在するＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞のパーセンテージを調節するときに同様のままであったが、最大活性化（Ｅｍａｘ）は、アッセイにおけるＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１架橋細胞のパーセンテージの増加に関連して増加した。これは、ＨＥＫ細胞の１００％がＰＤ−Ｌ１を発現する場合、より良好な最大活性がｍＡｂ２全体で達成されることを示していた。
【図７】図７は、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２が、Ｔ細胞を活性化することが可能であることを示す。（Ａ）及び（Ｂ）：初代ヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるＩＦＮ−γの放出は、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２、抗ヒトＰＤ−Ｌ１陽性対照抗体G1/S70又は抗ヒトＣＤ１３７陽性対照抗体G1-AA/20H4.9（抗ヒトＣＨ２抗体で架橋）の存在下で試験された。（Ａ）FS22-053-008  ＦｃａｂベースのｍＡｂ２及び（Ｂ）FS22-172-003  ＦｃａｂベースのｍＡｂ２は、いずれかの陽性対照抗体よりも、このアッセイにおいてより高い活性を示し、これは、同じ分子内のＰＤ−Ｌ１遮断及びＣＤ１３７アゴニスト作用が、おそらくＣＤ１３７のＰＤ−Ｌ１ベースのクラスター化及び活性化を通じて、より大きなＴ細胞活性化を誘発することを示す。（Ｃ）ＭＬＲアッセイにおけるＩＦＮ−γの放出は、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２、抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体G1-AA/E12v2、抗ヒトＣＤ１３７陽性対照抗体G1-AA/20H4.9（抗ヒトＣＨ２抗体で架橋）、又はモックｍＡｂ２形式における抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂ（FS22-172-003-AA/D1.3）の存在下で試験された。FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2は、陽性対照抗体又はそのモックｍＡｂ２形式における成分Ｆｃａｂのいずれよりも、このアッセイにおいてより高いＴ細胞活性化活性を示し、これは、同じ分子内のＰＤ−Ｌ１遮断及びＣＤ１３７アゴニスト作用が、おそらくクラスター化及び活性化につながるＣＤ１３７のＰＤ−Ｌ１ベースの架橋を通じて、より大きなＴ細胞活性化を誘発することを示す。
【図８】図８は、Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ−２放出を示す。ここで、Ｔ細胞は、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２及び陽性対照抗ヒトＣＤ１３７抗体G1-AA/MOR7480.1の存在下で、カニクイザルＣＤ１３７を過剰発現するように操作されている。試験した全てのｍＡｂ２は、カニクイザルＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ細胞で架橋する場合（中実及び中空の黒色及び灰色記号とそれを繋ぐ実践）にのみＣＤ１３７のククラスター化及び活性化を駆動し、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイでマウスインターロイキン−２（ｍＩＬ−２）の放出をもたらした。漸増濃度では、カニクイザルＣＤ１３７と交差反応するカニクイザルによって、他の人によって以前に示された陽性対照抗ヒトＣＤ１３７抗体、G1-AA/MOR7480.1は、ｍＩＬ−２放出の増加を示す（黒丸、点線）が、最大放出は、全ての抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２よりも有意に少なかった。架橋のためのＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ細胞を含まない全ての抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、架橋した場合と比較して有意に低いｍＩＬ−２放出を示す（データは示さず）。
【図９】図９は、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２ FS22-053-008-AA/E12v2若しくは172-003-AA/E12v2又は抗ヒトＰＤ−Ｌ１陽性対照抗体G1-AA/E12v2又はアイソタイプ対照抗体G1-AA/HelD1.3の滴定の存在下、同種異系カニクイザル単球と共に培養されたカニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞からの２日目のＩＬ−２放出（図９Ａ）又は６日目のＩＦＮ−γ放出（図９Ｂ）を示す。
【図１０】図１０は、プロテインＬで架橋した場合、モックｍＡｂ２形式のマウス及びヒト交差反応ＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22-053-014及びFS22-053-017を試験するＤＯ１１．１０マウスＣＤ１３７  Ｔ細胞活性化アッセイにおける、マウスＩＬ−２放出を示す。FS22-053-014及びFS22-053-017、並びに抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063は、全てＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２形式で、プロテインＬと架橋するとＣＤ１３７を活性化し、ｍＩＬ−２を放出した。陽性対照抗マウスＣＤ１３７ｍＡｂ、Ｌｏｂ１２．３は、予想通り、ｍＩＬ−２放出の増加を示した。架橋のためのプロテインＬを含まないモックｍＡｂ２形式の全ての抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂ（点線）は、架橋した場合に比べて大幅に減少したＭＩＬ−２放出を示した。FS22-053-017は、このアッセイでは活性が低かった（FS22-053-014と比較してＥＣ５０が８倍悪い）が、それでもアッセイにおいて活性を示した。
【図１１】図１１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を示すマウスＩＦＮγの放出を示す。抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、ヒトＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１に対する陽性対照抗体のいずれか、又は２つの組み合わせよりも、このアッセイで最大の効力を示す。予想通り、モックｍＡｂ２形式のFS22m-063-AA  Ｆｃａｂ（FS22m-063-AA/HelD1.3）いかなる活性も示さない。
【図１２】図１２は、G1-AA/4420（ＩｇＧ対照）、G1/S70（ＰＤ−Ｌ１陽性対照）、G1-AA/Lob12.3及びG1/Lob12.3（ＬＡＬＡ変異あり及びなしのＣＤ１３７陽性対照）、G1/S70プラスG1-AA/Lob12.3の組み合わせ、及びFS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に成長したＣＴ２６同系腫瘍モデルの腫瘍体積測定値を示す。平均腫瘍体積プラス又はマイナス９５％信頼区間がプロットされる。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウス及び抗ＰＤ−Ｌ１陽性対照のｍＡｂと比較して、ＣＴ２６同系腫瘍モデルの腫瘍増殖を有意に減少させることができる。統計的有意性は、混合モデル分析を使用した研究の全時間にわたる増殖速度につき対で示される。平均腫瘍体積は、データ正規性検定に基づき、必要に応じて幾何学的平均又は算術平均として示される。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。
【図１３】図１３は、ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の用量応答試験の結果を示す。Ａ：３用量のG1-AA/4420（ＩｇＧ対照、１０ｍｇ／ｋｇ）、G1/Lob12.3（ＣＤ１３７陽性対照、１ｍｇ／ｋｇ）、及び４つの異なる用量（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、及び１０．０ｍｇ／ｋｇ）の抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  FS22m-063-AA/S70で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に成長したＣＴ２６同系腫瘍モデルの腫瘍体積測定値を示す。各用量は、ｘ軸上の垂直の黒矢印で示される。平均腫瘍体積プラス又はマイナス９５％信頼区間がプロットされる。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウス及び抗ＰＤ−Ｌ１陽性対照のｍＡｂと比較して、ＣＴ２６同系腫瘍モデルの腫瘍増殖を有意に減少させることができる。統計的有意性は、混合モデル分析を使用した研究の全時間にわたる増殖速度につき対で示される。平均腫瘍体積は、データ正規性検定に基づき、必要に応じて幾何学的平均又は算術平均として示される。＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊  ＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。Ｂ：３用量のG1-AA/4420（ＩｇＧ対照、約１０ｍｇ／ｋｇ）、及び４つの異なる用量２μｇ、６μｇ、２０μｇ、及び２００μｇ（およそ０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、及び１０．０ｍｇ／ｋｇ相当）の抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  FS22m-063-AA/S70で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に成長したＣＴ２６同系腫瘍モデルのカプラン・マイヤープロットを示す。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウスと比較して、ＣＴ２６同系腫瘍モデルで用量依存性の生存率の増加を誘導する。
【図１４】図１４は、ｑ２ｄｘ３を投与されたマウスの腫瘍及び血液におけるＣＤ８＋：ＣＤ４＋パーセンテージ比の用量依存性の増加を示す。４つの異なる用量レベルの抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  FS22m-063-AA/S70は、パネルＡ及びＢに示され、ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＫｉ６７発現は、パネルＣ及びＤに示される。
【図１５】図１５は、G1-AA/4420（アイソタイプ対照）、G1-AA/S70（ＰＤ−Ｌ１陽性対照）、G1-AA/Lob12.3（ＣＤ１３７陽性対照）、G1-AA/S70プラスG1-AA/Lob12.3の組み合わせ、及びFS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に成長したＭＣ３８同系腫瘍モデルの腫瘍体積測定値を示す。平均腫瘍体積［ｍｍ３］プラス又はマイナス９５％信頼区間がプロットされる。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウス、抗ＰＤ−Ｌ１陽性対照ｍＡｂで処置したマウス、抗ＣＤ１３７陽性対照で処置したマウスと比較して、ＭＣ３８同系腫瘍モデルの腫瘍増殖を有意に減少させることができる。統計的有意性は、混合モデル分析を使用した研究の全時間にわたる増殖速度につき対で示される。＊＊＊＊≦０．０００１ｐ値。
【図１６】図１６は、G1-AA/4420（アイソタイプ対照）及び抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  FS22m-063-AA/S70で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に成長したＢ１６．Ｆ１０同系腫瘍モデルの腫瘍体積測定値を示す。両方の組成物は１ｍｇ／ｋｇで投与された。平均腫瘍体積［ｍｍ３］プラス又はマイナス９５％信頼区間がプロットされる。FS22m-063-AA/S70処置は、ＩｇＧ対照で処置したマウスと比較して、Ｂ１６．Ｆ１０同系腫瘍モデルで部分的な腫瘍増殖を有意に低減した。統計的有意性は、混合モデル分析を使用した研究の全時間にわたる増殖速度につき対で示される。平均腫瘍体積は、データ正規性検定に基づき、必要に応じて幾何学的平均又は算術平均として示される。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。
【図１７】図１７は、（Ａ）G1-AA/4420（ＩｇＧ対照）、（Ｃ）G1/S70（ＰＤ−Ｌ１陽性対照）、（Ｂ）G1-AA/Lob12.3及び（Ｄ）G1/Lob12.3（ＬＡＬＡ変異あり及びなしの抗ＣＤ１３７陽性対照）、又は（Ｅ）G1/S70プラスG1-AA/Lob12.3の組み合わせ及び（Ｆ）FS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に成長したＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける個々のマウスのスパゲッティプロットを示す。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウスと比較して、ＣＴ２６同系腫瘍モデルで有意な腫瘍増殖阻害を誘導した。
【図１８】図１８は、全て１ｍｇ／ｋｇのG1-AA/4420（ＩｇＧ対照）、G1/S70プラスG1-AA/Lob12.3の組み合わせ、及びFS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に成長したＣＴ２６同系腫瘍モデルのカプラン・マイヤープロットを示す。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウスと比較して、ＣＴ２６同系腫瘍モデルで有意な生存を誘導した。
【図１９】図１９は、G1-AA/HelD1.3（ＩｇＧ対照）、G1/S70（抗ＰＤ−Ｌ１陽性対照）、G1-AA/Lob12.3（抗ＣＤ１３７陽性対照）、及びFS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に成長したＣＴ２６同系腫瘍モデルの腫瘍体積測定値を示す。平均腫瘍体積プラス又はマイナス９５％信頼区間がプロットされる。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウス、抗ＰＤ−Ｌ１陽性対照ｍＡｂで処置したマウス及び抗ＣＤ１３７陽性対照で処置したマウスと比較して、ＣＴ２６同系腫瘍モデルの腫瘍増殖を有意に減少させることができた。統計的有意性は、混合モデル分析を使用した研究の全時間にわたる増殖速度につき対で示される。平均腫瘍体積は、データ正規性検定に基づき、必要に応じて幾何学的平均又は算術平均として示される。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。
【図２０】図２０は、G1-AA/HelD1.3（ＩｇＧ対照）、G1/S70（抗ＰＤ−Ｌ１陽性対照）、G1-AA/Lob12.3（抗ＣＤ１３７陽性対照）、及びFS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に成長したＣＴ２６同系腫瘍モデルのカプラン・マイヤープロットを示す。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウス及びＣＤ１３７陽性対照で処置したマウスと比較して、ＣＴ２６同系腫瘍モデルで有意な生存を誘導する。
【図２１】図２１は、３用量の（Ａ）G1-AA/4420（アイソタイプ対照）、（Ｂ）G1-AA/S70（ＰＤ−Ｌ１陽性対照）、（Ｃ）G1-AA/Lob12.3（抗ＣＤ１３７陽性対照）、（Ｄ）G1-AA/S70プラスG1-AA/Lob12.3の組み合わせ、及び（Ｅ）FS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に成長したＭＣ３８同系腫瘍モデルにおける個々のマウスのスパゲッティプロットを示す。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウスと比較して、ＭＣ３８同系腫瘍モデルで完全な腫瘍増殖阻害を誘導し、１００％腫瘍のないマウスをもたらす。
【図２２】図２２は、３用量のG1-AA/4420（アイソタイプ対照）、G1-AA/S70（抗ＰＤ−Ｌ１陽性対照）、G1-AA/Lob12.3（抗ＣＤ１３７陽性対照）、G1-AA/S70プラスG1-AA/Lob12.3の組み合わせ、及びFS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に成長したＭＣ３８同系腫瘍モデルのカプラン・マイヤープロットを示す。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウスと比較して、ＭＣ３８同系腫瘍モデルで完全な生存を誘導する。
【図２３】図２３は、G1-AA/4420（アイソタイプ対照）（図２３Ａ）及び抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２FS22m-063-AA/S70（図２３Ｂ）で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に成長したＢ１６．Ｆ１０同系腫瘍モデルにおける個々のマウスのスパゲッティプロットを示す。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウスと比較して、Ｂ１６．Ｆ１０同系腫瘍モデルで部分的な腫瘍増殖阻害を誘導した。
【図２４】図２４は、フローサイトメトリーによって決定された、エクスビボでのＴ細胞に対する抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２結合データを示す。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値は、細胞に結合した抗ｍＣＤ１３７／ＰＤｌ−Ｌ１  ｍＡｂ２のヒトＦｃ領域を検出するAlexa Fluor 488とコンジュゲートした抗ヒトＦｃ二次抗体から測定された。染色されていない対照サンプルよりも大きいＭＦＩを有する陽性細胞は、抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１につき陽性として同定され、提示されたデータは、血液からの（Ａ）全てのＣＤ８＋又は（Ｂ）全てのＣＤ４＋Ｔ細胞、又は腫瘍からの（Ｃ）全てのＣＤ８＋又は（Ｄ）全てのＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとしての陽性集団を示す。これらの結果は、抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２が、腫瘍及び血液の両方に存在するＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方に迅速に結合すること、及び陽性Ｔ細胞集団のパーセンテージは、用量レベルに応じて時間と共に減少することを示す。
【図２５】図２５は、フローサイトメトリーによって決定された、エクスビボでのＴ細胞によるＫｉ６７発現データを示す。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値は、細胞に結合したＰＥ−Ｃｙ７とコンジュゲートした抗Ｋｉ６７抗体から測定された。染色されていない対照サンプルよりも大きいＭＦＩを有する陽性細胞は、Ｋｉ６７発現につき陽性として同定され、提示されたデータは、血液からの（Ａ）全てのＣＤ８＋又は（Ｂ）全てのＣＤ４＋Ｔ細胞、又は腫瘍からの（Ｃ）全てのＣＤ８＋又は（Ｄ）全てのＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとしての陽性集団を示す。これらの結果は、抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２を投与されたマウスのＴ細胞が、血中のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方でＫｉ６７を急速に発現すること、及び高パーセンテージのＫｉ６７陽性Ｔ細胞が、腫瘍微小環境からのサンプルにすでに存在していることを示す。用量レベルに依存する経時的なＫｉ６７発現の増加が観察された。
【図２６】図２６は、対照抗体G1-AA/4420を投与され、全てのＰＤ−Ｌ１受容体を飽和させるために１００ｎＭの抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２をエクスビボでスパイクされ、したがって、１００％ＰＤ−Ｌ１受容体占有レベルを示す（三角記号と破線）、マウスからの時間一致サンプルと比較したＰＤ−Ｌ１受容体占有率を示す。遊離ＰＤ−Ｌ１受容体は、Ｂｖ６０５とコンジュゲートした競合する抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を使用して検出された。染色されていない対照サンプルよりも大きいＭＦＩを有する陽性細胞は、遊離ＰＤ−Ｌ１につき陽性として同定された。結果は、陽性集団を、血液からの（Ａ）ＣＤ８＋又は（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、又は腫瘍からの（Ｃ）ＣＤ８＋又は（Ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の１００％飽和サンプルと比較した、ＰＤ−Ｌ１受容体占有率のパーセンテージとして示す。これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１受容体の占有率が血中で急速に１００％に達した後、時間の経過と共に用量レベルに応じて減少することを実証する。Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１受容体占有率は、血液よりも腫瘍微小環境において長く維持された。
【図２７】図２７は、Ｃ５７ＢＬ／６ナイーブマウスに静脈内単回用量を単回投与した後の、２５、１０、３、及び１ｍｇ／ｋｇでの抗ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の薬物動態プロファイルを示す。経時的なマウスにおけるＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の濃度が示される。図２７は、各用量での抗ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２のクリアランス速度が、マウスにおける標準的なヒトＩｇＧのクリアランスと同等であることを示す。
【図２８】図２８は、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  FS22-172-003-AA/E12v2が、（Ａ）カニクイザルＰＢＭＣ又は（Ｂ）ヒトＰＢＭＣを使用したＰＢＭＣ  Ｔ細胞活性化アッセイでＴ細胞を活性化できることを示す。ＰＢＭＣアッセイにおけるＩＦＮ−γの放出は、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２、抗ヒトＣＤ１３７陽性対照抗体G1-AA/MOR7480.1（抗ヒトＣＨ２抗体で架橋）の存在下で試験された。ｍＡｂ２は、両方のアッセイで活性を示し、陽性対照抗体よりも高い活性化レベルを示した。これは、同じ分子によるＰＤ−Ｌ１遮断及びＣＤ１３７アゴニスト作用が、カニクイザル及びヒトの両方で、おそらくＣＤ１３７のＰＤ−Ｌ１ベースのクラスター化及び活性化を通じて、より大きなＴ細胞活性化を誘発することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
詳細な説明
ここで、本発明の態様及び実施形態を、添付の図面を参照して論ずる。さらなる態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。この文章で言及される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
本発明は、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７の両方に結合する抗体分子に関する。具体的には、本発明の抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位と、抗体分子の定常ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位とを含む。「ＰＤ−Ｌ１」及び「ＣＤ１３７」という用語は、文脈上別段の必要がない限り、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７、マウスＰＤ−Ｌ１及びマウスＣＤ１３７、及び／又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１及びカニクイザルＣＤ１３７を指し得る。好ましくは、「ＰＤ−Ｌ１」及び「ＣＤ１３７」という用語は、文脈上別段の必要がない限り、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７を指す。
【００８８】
「抗体分子」という用語は、天然であるか、部分的又は全体的に合成的に産生されるかを問わず、免疫グロブリンを説明する。抗体分子は、ヒト又はヒト化、好ましくはヒトであり得る。抗体分子は、好ましくはモノクローナル抗体分子である。抗体の例は、免疫グロブリンＧなどの免疫グロブリンアイソタイプ、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などのそれらのアイソタイプサブクラス、並びにそれらのフラグメントである。抗体分子は、他のポリペプチド及び／又は血清成分に結合することができる抗体などの汚染物質を含まないという意味で、単離され得る。
【００８９】
したがって、本明細書で使用される「抗体分子」という用語は、抗体フラグメントを含む。ただし、前記フラグメントは、ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位及び定常ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含む。したがって、文脈上別段の必要がない限り、本明細書で使用される「抗体分子」という用語は、「抗体分子又はそのフラグメント」と同等である。
【００９０】
モノクローナル抗体及び他の抗体で、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生することができる。そのような技術は、ＣＤＲ、又は可変領域、及び／又はＣＤ１３７抗原結合部位を提供する定常ドメイン配列を異なる免疫グロブリンに導入することを含み得る。ある免疫グロブリンのＣＤＲの別の免疫グロブリンへの導入は、例えば、欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号、又は欧州特許出願公開第Ａ−２３９４００号に記載されている。同様の技術を、関連する定常ドメイン配列に使用することができる。或いは、抗体分子を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は、遺伝子変異又は他の変化を受け得、これは、産生される抗体の結合特異性を変化させる場合も、変化させない場合もある。
【００９１】
抗体は多くの方法で修飾できるため、「抗体分子」という用語は、抗体フラグメント、誘導体、機能的同等物、及び抗体の相同体をカバーすると解釈されるべきであり、これは、天然であるか、又は全体的若しくは部分的に合成であるかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。したがって、別のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメイン又は同等物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第Ａ−０１２０６９４号及び欧州特許出願公開第Ａ−０１２５０２３号に記載されている。
【００９２】
ＣＤＲ配列及びＣＨ３ドメインの両方を含む抗体フラグメントの例は、ＣＨ３ドメインに連結されたｓｃＦｖを含むミニボディである（Hu et al. (1996), Cancer Res., 56(13):3055-61）。
【００９３】
本発明の抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する。この文脈での結合は、特定の結合を指し得る。「特異的」という用語は、抗体分子がその特異的結合パートナー（ここではＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７）以外の分子への有意な結合を示さない状況を指し得る。「特異的」という用語は、抗体分子が、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７上のエピトープなどの、いくつかの抗原によって運ばれる特定のエピトープに特異的である場合にも適用でき、この場合、抗体分子は、エピトープを運ぶ様々な抗原に結合できる。
【００９４】
本発明者らは、本明細書に記載の抗体分子がヒトＰＤ−Ｌ１に対して高レベルの特異性を示し、他のＴ細胞標的ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ８０、ＰＤ−１又はＢ７−Ｈ３への有意な結合を示さないことを実証した。実施例９．３を参照。したがって、好ましい実施形態において、抗体分子は、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＰＤ−１、及びＢ７−Ｈ３のいずれか１つ、好ましくは全てに結合しないか、又は有意な結合を示さない。本発明者らはまた、ＣＤ１３７抗原結合部位がヒトＴＮＦＲＳＦ受容体ＣＤ４０、ＯＸ４０及びＧＩＴＲへの有意な結合を示さないことを実証した。実施例３．６を参照。したがって、より好ましい実施形態において、抗体分子は、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ４０、ＯＸ４０及びＧＩＴＲのいずれか１つ、好ましくは全てに結合しないか、又は有意な結合を示さない。
【００９５】
抗体及びそれらの構築及び使用のための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Holliger & Hudson (2005)に記載されている。モノクローナル抗体及び他の抗体で、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生することができる。そのような技術は、ある抗体分子のＣＤＲ又は可変領域を異なる抗体分子に導入することを含み得る（欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号及び欧州特許出願公開第Ａ−２３９４００号）。
【００９６】
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域の抗原結合部位である。ＣＤＲベースの抗原結合部位は、３つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ又は３つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲなどの、３つのＣＤＲによって形成され得る。好ましくは、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、６つのＣＤＲ、３つのＶＬ  ＣＤＲ及び３つのＶＨ  ＣＤＲによって形成される。抗原の結合に対する異なるＣＤＲの寄与は、異なる抗原結合部位によって変動し得る。
【００９７】
抗原結合部位の３つのＶＨドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＨドメイン内に位置し得、そして３つのＶＬドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＬドメイン内に位置し得る。例えば、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域に位置し得る。
【００９８】
抗体分子は、第１の抗原に対して１つ、又は好ましくは１つを超える、例えば２つのＣＤＲベースの抗原結合部位を有し得る。したがって、抗体分子は、１つのＶＨ及び１つのＶＬドメインを含み得るが、好ましくは、２つのＶＨ及び２つのＶＬドメイン、すなわち、例えば天然に存在するＩｇＧ分子の場合のように、２つのＶＨ／ＶＬドメイン対を含む。
【００９９】
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、G12v2、又はlam-G02v3、好ましくは、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、より好ましくは、E12v2又はE05v2、最も好ましくは、E12v2の、３つのＶＨ  ＣＤＲ又は３つのＶＬ  ＣＤＲ、好ましくは３つのＶＨ  ＣＤＲ及び３つのＶＬ  ＣＤＲを含み得る。
【０１００】
これらの抗体のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、次のように記載される。
（ｉ）抗体E12v2のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、それぞれ配列番号１２及び１４に示され；
（ｉｉ）抗体E05v2のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、それぞれ配列番号２３及び２５に示され；
（ｉｉｉ）抗体G12v2のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、それぞれ配列番号２３及び３０に示され；
（ｉｖ）抗体lam-G02v3のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、それぞれ配列番号２３及び４１に示される。
【０１０１】
当業者は、上記の抗体のＶＨ及びＶＬドメイン配列からＣＤＲの配列を決定することに困難はないであろう。ＣＤＲ配列は、例えば、Kabat（Kabat, E.A et al. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242. U.S. Department of Health and Human Services）又は国際的なImMunoGeneTics情報システム（ＩＭＧＴ：Lefranc, M.-P. et al. Nucleic Acids Res. 43, D413-22 (2015)）に従って決定され得る。
【０１０２】
Kabat番号付けによる抗体分子のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれＶＨドメインの３１〜３５、５０〜６５、及び９５〜１０２位に位置する配列であり得る。
【０１０３】
ＩＭＧＴ番号付けによる抗体分子のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれ抗体分子のＶＨドメインの２７〜３８、５６〜６５、及び１０５〜１１７位に位置する配列であり得る。
【０１０４】
Kabat番号付けによる抗体分子のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれＶＬドメインの２４〜３４、５０〜５６、及び８９〜９７位に位置する配列であり得る。
【０１０５】
ＩＭＧＴ番号付けによる抗体分子のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、それぞれＶＬドメインの２７〜３８、５６〜６５、及び１０５〜１１７位に位置する配列であり得る。
【０１０６】
抗体分子は、ＳＹＧＩＳのＶＨドメインＣＤＲ１（配列番号１）、ＷＩＳＡＹＳＧＧＴＮＹＡＱＫＬＱＧのＶＨドメインＣＤＲ２（配列番号２）、及びＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹのＶＨドメインＣＤＲ３（配列番号３）の配列を含み得、ここで、ＣＤＲ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。
【０１０７】
好ましい実施形態において、抗体分子は、Kabat番号付けスキームによる２８位にプロリンを含む。
【０１０８】
抗体分子は、ＧＹＸ１ＦＴＳＹＧのＶＨドメインＣＤＲ１（配列番号４５）、ＩＳＡＹＳＧＧＴのＶＨドメインＣＤＲ２（配列番号８）、及びＡＲＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹのＶＨドメインＣＤＲ３（配列番号９）の配列を含み得、
ここで、Ｘ１は、Ｐ又はＴであり、好ましくは、Ｘ１は、Ｐであり；
ここで、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
【０１０９】
抗体分子は、
（ｉ）それぞれ配列番号７、８及び９［E12v2］；又は
（ｉｉ）それぞれ配列番号２１、８及び９［E05v2、G12v2又はlam-G02v3］、
のＶＨドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み得、
ここで、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
【０１１０】
ＶＨドメインのＣＤＲは、フレームワーク（ＦＷ）配列（ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、及びＨＦＷ４）に隣接し得る。ＶＨドメインは、それぞれ配列番号５１、５２、５３及び５４のＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４配列を含み得、ここで、ＦＷ及びＣＤＲ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。或いは、ＶＨドメインは、それぞれ配列番号５５、５６、５７及び５４のＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３及びＨＦＷ４配列を含み得、ここで、ＦＷ及びＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
【０１１１】
抗体分子は、ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳのＶＬドメインＣＤＲ１（配列番号３４）、ＥＶＴＮＲＰＳのＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号３５）、及びＳＳＦＫＲＧＳＴＬＶＶのＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号３６）の配列を含み得、ここで、ＣＤＲ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。ＶＬドメインは、ラムダＶＬドメインに由来し得る。例えば、各ＶＬドメインＣＤＲは、ラムダＶＬドメイン由来のフレームワーク（ＦＷ）配列（ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、及びＬＦＷ４）に隣接し得る。具体的には、ＶＬドメインは、それぞれ配列番号６５、６６、６７及び６８のＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及びＬＦＷ４配列を含み得、ここで、ＦＷ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。
【０１１２】
抗体分子は、ＲＡＳＱＳＩＸ２Ｘ３ＲＬＡのＶＬドメインＣＤＲ１（配列番号４６）、ＥＡＳＸ４Ｘ５ＥＸ６のＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号４７）、及びＱＱＳＹＳＸ７ＰＸ８Ｘ９ＴのＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号４８）の配列を含み得、
ここで、Ｘ２は、Ｓ又はＧであり、Ｘ３は、Ｎ又はＧであり；Ｘ４は、Ｔ又はＮであり；Ｘ５は、Ｓ又はＬであり；Ｘ６は、Ｔ又はＳであり；Ｘ７は、Ｔ又はＷであり；Ｘ８は、不存在又はＲであり；Ｘ９は、Ｙ、Ｒ、又はＶであり；
ここで、ＣＤＲ配列及び位置の番号付けは、Kabat番号付けスキームに従って定義される。
【０１１３】
好ましくは、抗体分子は、ＲＡＳＱＳＩＧＮＲＬＡのＶＨドメインＣＤＲ１（配列番号４）、ＥＡＳＴＳＥＴのＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号５）、及びＱＱＳＹＳＴＰＹＴのＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号６）の配列を含み、ここで、ＣＤＲ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。ＶＬドメインは、カッパＶＬドメインに由来し得る。例えば、各ＶＬドメインＣＤＲは、カッパＶＬドメイン由来のフレームワーク（ＦＷ）配列（ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、及びＬＦＷ４）に隣接し得る。具体的には、ＶＬドメインは、それぞれ配列番号５８、５９、６０及び６１のＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及びＬＦＷ４配列を含み得、ここで、ＦＷ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。
【０１１４】
例えば、抗体分子は、
（ｉ）それぞれ配列番号４、５及び６［E12v2］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１８、１９及び２０［E05v2］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１８、１９及び２９［G12v2］；又は
（ｉｖ）それぞれ配列番号３４、３５及び３６［lam-G02v3］、
のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み得、
ここで、ＣＤＲ配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。
【０１１５】
抗体分子は、ＳＳＤＶＧＧＹＮＹのＶＬドメインＣＤＲ１（配列番号３７）、ＥＶＴのＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号３８）、及びＳＳＦＫＲＧＳＴＬＶＶのＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号３６）の配列を含み得、ここで、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。ＶＬドメインは、ラムダＶＬドメインに由来し得る。例えば、各ＶＬドメインＣＤＲは、ラムダＶＬドメイン由来のフレームワーク（ＦＷ）配列（ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、及びＬＦＷ４）に隣接し得る。具体的には、ＶＬドメインは、それぞれ配列番号６９、７０、７１及び６８のＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及びＬＦＷ４配列を含み得、ここで、ＦＷ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
【０１１６】
或いは、抗体分子は、ＱＳＩＸ１０Ｘ１１ＲのＶＬドメインＣＤＲ１（配列番号４９）、ＥＡＳのＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＱＱＳＹＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＴのＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号５０）の配列を含み得、
ここで、Ｘ１０は、Ｇ又はＳであり；Ｘ１１は、Ｎ又はＧであり；Ｘ１２は、不在又はＴであり；Ｘ１３は、Ｔ、Ｗ又はＰであり；Ｘ１４は、Ｐ又はＲであり；Ｘ１５は、Ｙ又はＲであり、
ここで、ＣＤＲ配列及び位置の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
【０１１７】
好ましくは、抗体分子は、ＱＳＩＧＮＲのＶＨドメインＣＤＲ１（配列番号１０）、ＥＡＳのＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＱＱＳＹＳＴＰＹＴのＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号６）の配列を含み、ここで、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。ＶＬドメインは、カッパＶＬドメインに由来し得る。例えば、各ＶＬドメインＣＤＲは、カッパＶＬドメイン由来のフレームワーク（ＦＷ）配列（ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３、及びＬＦＷ４）に隣接し得る。具体的には、ＶＬドメインは、それぞれ配列番号６２、６３、６４及び６１のＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及びＬＦＷ４配列を含み得、ここで、ＦＷ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
【０１１８】
例えば、抗体分子は、
（ｉ）それぞれ配列番号１０、１１及び６［E12v2］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号２２、１１及び２０［E05v2］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２２、１１及び２９［G12v2］；又は
（ｉｖ）それぞれ配列番号３７、３８及び３６［lam-G02v3］、
のＶＬドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み得、
ここで、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って定義される。
【０１１９】
ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、G12v2、又はlam-G02v3、好ましくは、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、より好ましくは、E12v2又はE05v2、最も好ましくは、E12v2の、ＶＨ又はＶＬドメイン、好ましくはＶＨ及びＶＬドメインを含み得る。
【０１２０】
抗体E12v2、E05v2、G12v2、及びlam-G02v3のＶＨドメインは、それぞれ配列番号１２、２３、２３、及び２３に記載の配列を有し得る。抗体E12v2、E05v2、G12v2、及びlam-G02v3のＶＬドメインは、それぞれ配列番号１４、２５、３０、及び４１に記載の配列を有し得る。
【０１２１】
本発明の抗体分子は、抗体分子の定常ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含む。定常ドメインは、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＨ４ドメインであり得、好ましくは、定常ドメインは、ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメイン、より好ましくは、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、ＣＨ３ドメインである。ＣＤ１３７抗原結合部位は、抗体分子の定常ドメインに１つ以上の修飾された構造ループを含む。標的抗原の抗原結合部位を作製するための抗体定常ドメイン構造ループの操作は当技術分野で知られており、例えば、Wozniak-Knopp G et al. (2010)、並びに国際公開第２００６／０７２６２０号及び国際公開第２００９／１３２８７６号に記載される。
【０１２２】
抗体分子のＣＤ１３７抗原結合部位は、第１及び第２の配列を含み得、好ましくは、第１及び第２の配列であって、第１及び第２の配列が、それぞれ、抗体分子の定常ドメイン、好ましくはＣＨ３ドメインの、ＡＢ及びＥＦ構造ループ中に位置する配列を含み得る。
【０１２３】
好ましい実施形態において、抗体分子のＣＨ３ドメインの９５位及び９６位の残基は、野生型であり、すなわち、好ましくは、それぞれ、アルギニン（Ｒ）及びトリプトファン（Ｗ）である。これらの残基は両方ともＥＦ構造ループに位置している。アミノ酸残基の位置は、特に明記しない限り、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）の番号付けスキームに従って本明細書で番号付けされる。ＩＭＧＴ番号付けスキームは、Lefranc et al., 2005に記載されている。
【０１２４】
第１の配列は、好ましくは、配列ＰＰＹ（配列番号７８）を含む。
【０１２５】
ＰＰＹ配列は、抗体分子のＣＨ３ドメインの１０位と１９位、好ましくは１５位と１７位の間に位置し得る。好ましい実施形態において、ＰＰＹ配列は、ＣＨ３ドメインの１６、１６．５及び１６．４位に位置する。或いは、ＰＰＹ配列は、ＣＨ３ドメインの１６位と１７位の間に位置し得る。代替的な好ましい実施形態において、ＰＰＹ配列は、ＣＨ３ドメインの１６．３、１６．２及び１６．１位に位置する。ＩＭＧＴ番号付けスキームでは、挿入された残基は、それらが位置するループの方向に従って番号付けされる。ループが「上」に行く場合、挿入された残基は挿入の直前の残基の番号を取り、配列内に挿入された残基の番号は、小数の昇順で示される。例えば、残基１６に３つの変異が続く場合、１６、１６．１、１６．２、１６．３と示される。ループが「下」に行く場合、挿入された残基は挿入の直前の残基の番号を取り、配列内に挿入された残基の番号は、小数の降順で示される。例えば、残基１６に３つの変異が続く場合、１６、１６．３、１６．２、１６．１と示される（LeFranc et al., 2005、及びLeFranc et al.2015）。
【０１２６】
好ましい実施形態において、ＡＢ構造ループはアミノ酸挿入を含む。挿入は、１から１０、２から９、３から７、４から６又は５アミノ酸の長さであり得る。好ましくは、挿入は５アミノ酸の長さである。
【０１２７】
挿入は、抗体分子のＣＨ３ドメインの１０位と１９位の間、好ましくは１４位と１７位の間、より好ましくは１６位と１７位の間に位置し得る。好ましい実施形態において、挿入は、抗体分子のＣＨ３ドメインの１６．５から１６．１位に位置している。図１は、挿入がＣＨ３ドメインの１６．５から１６．１位に位置するＣＨ３ドメインを含むＦｃａｂを示す。
【０１２８】
親和性成熟後に同定されたＦｃａｂの大部分は、ＣＨ３ドメインの９７位にロイシン（Ｌ）残基を含んでいた。これらのＦｃａｂの多くは、ＣＨ３ドメインの９８位にアスパラギン酸（Ｄ）残基又はグルタミン酸（Ｅ）残基も含んでいた。これらのアミノ酸の変化は両方ともＥＦ構造ループに位置している。これらの結果は、これらの残基の一方又は両方がＣＤ１３７結合に重要であり得ることを示唆している。したがって、第２の配列は、好ましくは、配列ＬＤ又はＬＥを含み、ここで、ＬＤ又はＬＥ配列は、好ましくは、抗体分子のＣＨ３ドメインの９７位及び９８位に位置する。
【０１２９】
第１の配列及び第２の配列は、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-053-010、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053、好ましくは、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、又はFS22-053-014、より好ましくは、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、又はFS22-053-017、さらにより好ましくは、特異的結合メンバーFS22-053-008のＣＨ３ドメインの第１及び第２の配列であり得る。
【０１３０】
第１の配列及び第２の配列は、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-053-010、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053、FS22-172-003、FS22-172-002、FS22-172-004、FS22-172-001、FS22-172-005、FS22-172-006、又はFS22-172、好ましくは、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-172-003、FS22-172-002、FS22-172-004、FS22-172-001、FS22-172-005、又はFS22-172-006、より好ましくは、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-172-003、FS22-172-002、又はFS22-172-004、さらに好ましくは、FS22-053-008又はFS22-172-003、さらにより好ましくは、FS22-172-003のＣＨ３ドメインの第１及び第２の配列であり得る。代替的に好ましい実施形態において、第１の配列及び第２の配列は、FS22-053-017のＣＨ３ドメインの第１及び第２の配列であり得る。
【０１３１】
FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-053-010、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053、FS22-172-003、FS22-172-002、FS22-172-004、FS22-172-001、FS22-172-005、FS22-172-006、及びFS22-172のＣＨ３ドメイン配列は、それぞれ配列番号８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０及び１３２に記載される。
【０１３２】
FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-053-010、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053、FS22-172-003、FS22-172-002、FS22-172-004、FS22-172-001、FS22-172-005、FS22-172-006、及びFS22-172の第１及び第２の配列は、それぞれ、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-053-010、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053、FS22-172-003、FS22-172-002、FS22-172-004、FS22-172-001、FS22-172-005、FS22-172-006、及びFS22-172のＣＨ３ドメインの１４位と１７位、及び９１位と９９位の間の配列であり得る。
【０１３３】
或いは、FS22-053-008、FS22-053-010、FS22-053-011、FS22-053-012、及びFS22-053-016の第１及び第２の配列は、それぞれ、FS22-053-008、FS22-053-010、FS22-053-011、FS22-053-012、及びFS22-053-016のＣＨ３ドメインの１４位と１７位、及び９２位と９９位の間の配列であり得る。
【０１３４】
或いは、FS22-053-015の第１及び第２の配列は、それぞれ、FS22-053-015のＣＨ３ドメインの１４位と１７位、及び９２位と９８位の間の配列であり得る。
【０１３５】
抗体分子のＣＤループ配列は、好ましくは未修飾、すなわち野生型である。したがって、ＣＤループ配列は、好ましくは、配列番号７３に示される配列を有する。ＣＤループ配列は、好ましくは、ＣＨ３ドメインの４３から７８位に位置する。
【０１３６】
第１及び第２の配列は、それぞれ、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-053-010、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053、FS22-172-003、FS22-172-002、FS22-172-004、FS22-172-001、FS22-172-005、FS22-172-006、又はFS22-172の完全なＡＢ及びＥＦ構造ループ配列であり得る。ＣＨ３ドメイン配列におけるＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ構造ループの位置の決定は、例えば、ＩＭＧＴ、ＩＭＧＴエクソン、ＥＵ、又はKabat番号付けシステムに従い、当業者の能力の範囲内であり、Hasenhindl et al. (2013)に記載されている。好ましい実施形態において、ＩＭＧＴ番号付けシステムによるＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループは、それぞれ、ＣＨ３ドメインの１０位と１９位、４２位と７９位、及び９１位と１０２位の間に位置する。したがって、好ましい実施形態において、第１、第２及び第３の配列は、それぞれ、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-053-010、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053、FS22-172-003、FS22-172-002、FS22-172-004、FS22-172-001、FS22-172-005、FS22-172-006、又はFS22-172のＣＨ３ドメインの１０位と１９位、４２位と７９位、及び９１位と１０２位の間の配列である。
【０１３７】
したがって、好ましい一実施形態において、ＣＤ１３７抗原結合部位の第１及び第２の配列は、それぞれ配列番号１７１及び１７２［FS22-172-003］に記載のＡＢ及びＥＦループ配列、又はそれぞれ配列番号１７３及び１７４［FS22-53-008］に記載のＡＢ及びＥＦループ配列を含む。さらに好ましい実施形態において、ＣＤ１３７抗原結合部位の第１及び第２の配列は、それぞれ配列番号１７１及び１７２［FS22-172-003］に記載のＡＢ及びＥＦ構造ループを含む。
【０１３８】
代替的に好ましい実施形態において、ＣＤ１３７抗原結合部位の第１及び第２の配列は、それぞれ配列番号１７３及び１７５［FS22-053-017］に記載のＡＢ及びＥＦ構造ループ配列を含む。
【０１３９】
好ましい実施形態において、ＣＤ１３７抗原結合部位は、
（ｉ）それぞれ配列番号７９及び８０［FS22-053-008］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号７９及び８３［FS22-053-009］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号７９及び８６［FS22-053-011］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号７９及び８９［FS22-053-017］；
（ｖ）それぞれ配列番号７９及び９２［FS22-053-014］；
（ｖｉ）それぞれ配列番号７９及び９５［FS22-053-010］；
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号７９及び９８［FS22-053-012］；
（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号７９及び１０１［FS22-053-013］；
（ｉｘ）それぞれ配列番号７９及び１０４［FS22-053-015］；
（ｘ）それぞれ配列番号７９及び１０７［FS22-053-016］；
（ｘｉ）それぞれ配列番号７９及び１１０［FS22-053］；
（ｘｉｉ）それぞれ配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］；
（ｘｉｉｉ）それぞれ配列番号１１７及び１１４［FS22-172-002］；
（ｘｉｖ）それぞれ配列番号１２０及び１１４［FS22-172-004］；
（ｘｖ）それぞれ配列番号１２３及び１１４［FS22-172-001］；
（ｘｖｉ）それぞれ配列番号１２６及び１１４［FS22-172-005］；
（ｘｖｉｉ）それぞれ配列番号１２９及び１１４［FS22-172-006］；又は
（ｘｖｉｉｉ）それぞれ配列番号１２９及び１１４［FS22-172］；
に記載の第１及び／又は第２の、好ましくは第１及び第２の配列を含み、ここで、第１及び第２の配列は、好ましくは、それぞれ、抗体分子のＣＨ３ドメインの１４位と１７位、及び９１位と９９位の間に位置する。
【０１４０】
さらにより好ましい実施形態において、抗体分子は、
（ｉ）それぞれ配列番号７９及び８０［FS22-053-008］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号７９及び８３［FS22-053-009］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号７９及び８６［FS22-053-011］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号７９及び８９［FS22-053-017］；
（ｖ）それぞれ配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］；
（ｖｉ）それぞれ配列番号１１７及び１１４［FS22-172-002］；又は
（ｖｉｉ）それぞれ配列番号１２０及び１１４［FS22-172-004］；
に記載の第１及び／又は第２の、好ましくは第１及び第２の配列を含む。
【０１４１】
さらにより好ましい実施形態において、抗体分子のＣＤ１３７抗原結合部位は、それぞれ配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］に記載の第１及び第２の配列、又はそれぞれ配列番号７９及び８０［FS22-53-008］に記載の第１及び第２の配列を含む。さらにより好ましい実施形態において、抗体分子のＣＤ１３７抗原結合部位は、それぞれ配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］に記載の第１及び第２の配列を含む。例えば、ＣＤ１３７抗原結合部位は、それぞれ配列番号１７１及び１７２［FS22-172-003］に記載のＡＢ及びＥＦ構造ループ配列を含み得る。
【０１４２】
一実施形態において、抗体分子、特に、配列番号１２９及び１１４［FS22-172-006］に記載の、第１及び／又は第２の、好ましくは第１及び第２の配列を含む抗体分子は、抗体分子のＣＨ３ドメインの１９位にロイシン（Ｌ）を含み得る。
【０１４３】
ＩＭＧＴ番号付けの代替として、本明細書に記載のアミノ酸配列、置換、欠失及び挿入の位置を含む、アミノ酸残基の位置は、ＩＭＧＴエクソン番号付け（連続番号付けとも呼ばれる）、ＥＵ番号付け、又はKabat番号付けに従って番号付けされ得る。ＣＨ３ドメインの残基位置のＩＭＧＴ番号付け、ＩＭＧＴエクソン番号付け、ＥＵ番号付け、及びKabat番号付けの間の一致を図１に示す。したがって、例えば、本出願が、クローンのＣＨ３ドメインのそれぞれ１４位と１７位の間に位置する第１の配列に言及し、残基の位置は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って番号付けされる場合、第１の配列は、ＣＨ３ドメインの１８位と２１位の間に位置し、ここで、残基の位置は、図１に示すように、ＩＭＧＴエクソン番号付けスキームに従って番号付けされる。或いは、本明細書に記載されるような、ＣＨ３ドメイン中のアミノ酸配列、置換、欠失及び挿入の位置を含む、ＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基の位置は、配列番号７５に記載の野生型ＣＨ３ドメイン配列におけるそれらの位置を参照することにより定義され得る。ＩＭＧＴ番号付け及び野生型ＣＨ３ドメイン配列の一致も図１に示される。
【０１４４】
一実施形態において、抗体分子は、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-053-010、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053、FS22-172-003、FS22-172-002、FS22-172-004、FS22-172-001、FS22-172-005、FS22-172-006、又はFS22-172のＣＨ３ドメイン配列を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、ＣＨ３ドメインを含み、ここで、FS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-053-010、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053、FS22-172-003、FS22-172-002、FS22-172-004、FS22-172-001、FS22-172-005、FS22-172-006、及びFS22-172のＣＨ３ドメイン配列は、それぞれ配列番号８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０及び１３２に記載される。
【０１４５】
好ましい実施形態において、抗体分子は、それぞれ配列番号１１５及び８１に記載のFS22-172-003又はFS22-053-008のＣＨ３ドメイン配列を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、ＣＨ３ドメインを含む。より好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号１１５に記載のFS22-172-003のＣＨ３ドメイン配列を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、ＣＨ３ドメインを含む。
【０１４６】
代替的に好ましい実施形態において、抗体分子は、それぞれ配列番号９０に記載のFS22-053-017のＣＨ３ドメイン配列を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、ＣＨ３ドメインを含む。
【０１４７】
抗体分子のＣＨ３ドメインは、任意選択により、ＣＨ３ドメイン配列の直近のＣ末端に追加のリジン残基（Ｋ）を含み得る。
【０１４８】
さらに、本発明の抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子のＣＨ２ドメインなどの免疫グロブリンＧ分子のＣＨ２ドメインを含み得る。好ましくは、本発明の抗体分子は、ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインは、配列番号７６に記載の配列を有し得る。
【０１４９】
ＣＨ２ドメインは、Ｆｃγ受容体及び補体に結合することが知られている。ＣＨ２ドメインのＦｃγ受容体への結合には抗体依存性細胞媒介性傷害性（ＡＤＣＣ）が必要である一方、補体への結合には補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）が必要である。抗体分子のＣＨ２ドメインは、好ましくは、ＣＨ２ドメインの１つ以上のＦｃγＲＩ、ＦｃγＩＩｌａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃγ受容体、及び／又は補体への結合を低減又は抑制する１つ以上の変異を含む。本発明者らは、Ｆｃγ受容体への結合を減少させる、又は抑制することにより、抗体分子によって媒介されるＡＤＣＣが減少する、又は排除されると仮定する。同様に、補体への結合を減少させる、又は抑制することは、抗体分子によって媒介されるＣＤＣを減少又は排除することが期待される。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、抗体分子が患者に投与される場合に、肝毒性を軽減又は回避することが期待される。さらに、Ｆｃγ受容体への結合を低減又は抑制することは、抗体分子が免疫細胞抗原の第２の抗原結合部位を含む場合に有用であることが期待され、ここで、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを介した、抗体分子が結合した免疫細胞の死滅は避けるべきである。１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を減少させる、又は抑制する変異は、当技術分野で公知である（Wang et al., 2018）。これらの変異には、Bruhns et al., 2009及びHezareh et al., 2001に記載される「ＬＡＬＡ変異」が含まれ、これは、ＣＨ２ドメインの１．３位及び１．２位のロイシン残基をアラニン（Ｌ１．３Ａ及びＬ１．２Ａ）で置換することを含む。或いは、ＣＨ２ドメインの８４．４位のアスパラギン（Ｎ）をアラニン、グリシン、又はグルタミン（Ｎ８４．４Ａ、Ｎ８４．４Ｇ、又はＮ８４．４Ｑ）に変異させることによる、保存されたＮ結合型グリコシル化部位の変異を通じたα−グリコシル抗体の生成は、ＩｇＧ１エフェクター機能を低下させることも知られている（Wang et al., 2018）。さらなる代替として、補体活性化（Ｃ１ｑ結合）及びＡＤＣＣは、ＣＨ２ドメインの１１４位のプロリンをアラニン又はグリシン（Ｐ１１４Ａ又はＰ１１４Ｇ）に変異させることによって低減することが知られている（Idusogie et al., 2000；Klein et al., 2016）。これらの変異は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性がさらに低下した、又は全くない抗体分子を生成するために組み合わせることもできる。
【０１５０】
したがって、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み得、ここで、ＣＨ２ドメインは、好ましくは、
（ｉ）１．３位及び１．２位のアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位のアラニン又はグリシン；及び／又は
（ｉｉｉ）８４．４位のアラニン、グルタミン又はグリシン；
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１５１】
好ましい実施形態において、抗体分子はＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位のアラニン残基；及び
（ｉｉ）１．２位のアラニン残基；
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１５２】
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号７７に記載の配列を有し得る。
【０１５３】
代替的な好ましい実施形態において、抗体分子はＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位のアラニン残基；
（ｉｉ）１．２位のアラニン残基；及び
（ｉｉｉ）１１４位のアラニン；
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１５４】
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号１７６に記載の配列を有し得る。
【０１５５】
好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位
を含み、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2の３つのＶＨ  ＣＤＲ及び３つのＶＬ  ＣＤＲ（ＣＤＲ１〜６）を含み；
ＣＤ１３７抗原結合部位は、それぞれ、ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列及び第２の配列を含み、第１及び第２の配列は、それぞれ配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］、又は７９及び８０［FS22-53-008］に記載の配列を有し、好ましくは、第１及び第２の配列は、配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］に記載の配列を有する。
【０１５６】
実施例に記載されるように、それぞれ配列番号７９及び８９［FS22-053-017］に示される第１の配列及び第２の配列を含むＣＤ１３７抗原結合部位を有する抗体分子は、ヒト、カニクイザル、及び予想外にもマウスのＣＤ１３７に結合することができた。本発明者らは、この抗体分子が、架橋された場合に、ヒト、カニクイザル及びマウスのＴ細胞活性化アッセイにおいて活性を有することを実証した。
【０１５７】
代替的に好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位
を含み、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2の３つのＶＨ  ＣＤＲ及び３つのＶＬ  ＣＤＲ（ＣＤＲ１〜６）を含み；
ＣＤ１３７抗原結合部位は、それぞれ、ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列及び第２の配列を含み、第１及び第２の配列は、それぞれ配列番号７９及び８９［FS22-053-017］に記載の配列を有する。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、抗体分子は、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＣＤ１３７抗原結合部位
を含み、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2の３つのＶＨ  ＣＤＲ及び３つのＶＬ  ＣＤＲ（ＣＤＲ１〜６）を含み；
ＣＤ１３７抗原結合部位は、それぞれ、ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列及び第２の配列を含み、第１及び第２の配列は、それぞれ配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］、又は７９及び８０［FS22-53-008］に記載の配列を有し、好ましくは、第１及び第２の配列が、配列番号１１３及び１１４［FS22-172-003］に記載の配列を有し、ただし、抗体分子は、配列番号７９及び８０［FS22-053-008］に記載の第１及び第２の配列を有するＣＤ１３７抗原結合部位と対形成される抗体G12v2のＣＤＲ１〜６を含まない。
【０１５９】
さらに好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）配列番号１１５［FS22-172-003］、又は８１［FS22-53-008］、好ましくは配列番号１１５［FS22-172-003］、に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、ＣＨ３ドメイン；
を含み、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2の３つのＶＨ  ＣＤＲ及び３つのＶＬ  ＣＤＲ（ＣＤＲ１〜６）を含む。
【０１６０】
さらに代替的に好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位；及び
（ｂ）配列番号９０［FS22-053-017］に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、ＣＨ３ドメイン；
を含み、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2の３つのＶＨ  ＣＤＲ及び３つのＶＬ  ＣＤＲ（ＣＤＲ１〜６）を含む。
【０１６１】
さらにより好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位を含むＶＨドメイン及びＶＬドメイン；及び
（ｂ）配列番号１１５［FS22-172-003］、又は８１［FS22-53-008］、好ましくは配列番号１１５［FS22-172-003］、に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、ＣＨ３ドメイン；
を含み、ＶＨ及びＶＬドメインは、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2のＶＨ及びＶＬを含むか、それを有するか、又はそれからなる。
【０１６２】
さらにより好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位を含むＶＨドメイン及びＶＬドメイン；及び
（ｂ）配列番号９０［FS22-053-017］に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、ＣＨ３ドメイン；
を含み、ＶＨ及びＶＬドメインは、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2のＶＨ及びＶＬを含むか、それを有するか、又はそれからなる。
【０１６３】
さらにより好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位を含むＶＨドメイン及びＶＬドメイン；
（ｂ）配列番号１１５［FS22-172-003］、又は８１［FS22-53-008］、好ましくは配列番号１１５［FS22-172-003］、に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、ＣＨ３ドメイン；
（ｃ）ＣＨ２ドメインが、
（ｉ）１．３位のアラニン残基；
（ｉｉ）１．２位のアラニン残基；
を含む、配列番号７６に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、ＣＨ２ドメイン；
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従い；
ＶＨ及びＶＬドメインは、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2のＶＨ及びＶＬを含むか、それを有するか、又はそれからなる。
【０１６４】
さらなる実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、
（ａ）ＣＤＲベースの抗原結合部位がＣＤＲ１〜６を含む、ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位を含むＶＨ及びＶＬドメイン；及び
（ｂ）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置し、ＣＤ１３７抗原結合部位であって、ＣＨ３ドメインのＡＢ及びＥＦ構造ループに位置する第１の配列及び第２の配列を含む、ＣＤ１３７抗原結合部位；
を含み、ここで、ＣＤＲ１〜６、第１の配列及び第２の配列は、
（ｉ）それぞれ配列番号１、２、３、４、５、６、１１３及び１１４［FS22-172-003-AA/E12v2］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１、２、３、１８、１９、２０、１１３及び１１４［FS22-172-003-AA/E05v2］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１、２、３、１８、１９、２９、１１３及び１１４［FS22-172-003-AA/G12v2］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１、２、３、４、５、６、７９及び８０［FS22-053-008-AA/E12v2］；又は
（ｖ）それぞれ配列番号１、２、３、１８、１９、２０、７９及び８０［FS22-053-008-AA/E05v2］、
に記載の配列を有するか、
ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、第１の配列及び第２の配列は、
（ｉ）それぞれ配列番号１２、１４、１１３及び１１４［FS22-172-003-AA/E12v2］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号２３、２５、１１３及び１１４［FS22-172-003-AA/E05v2］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２３、３０、１１３及び１１４［FS22-172-003-AA/G12v2］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１２、１４、７９及び８０［FS22-053-008-AA/E12v2］；又は
（ｖ）それぞれ配列番号２３、２５、７９及び８０［FS22-053-008-AA/E05v2］；
に記載の配列を有するか、
ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、及びＣＨ３ドメインは、
（ｉ）それぞれ配列番号１２、１４、及び１１５［FS22-172-003-AA/E12v2］；
（ｉｉ）それぞれ配列番号２３、２５、及び１１５［FS22-172-003-AA/E05v2］；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２３、３０、及び１１５［FS22-172-003-AA/G12v2］；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１２、１４、及び８１［FS22-053-008-AA/E12v2］；又は
（ｖ）それぞれ配列番号２３、２５、及び８１［FS22-053-008-AA/E05v2］
に記載の配列を有する。
【０１６５】
さらにより好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、抗体：
（ｉ）それぞれ配列番号１３４及び１７に記載のFS22-172-003-AA/E12v2；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１３７及び２８に記載のFS22-172-003-AA/E05v2；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１４０及び３３に記載のFS22-172-003-AA/G12v2；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１４３及び１７に記載のFS22-053-008-AA/E12v2；
（ｖ）それぞれ配列番号１４６及び２８に記載のFS22-053-008-AA/E05v2；又は
（ｖｉ）それぞれ配列番号１４９及び３３に記載のFS22-053-008-AA/G12v2
の重鎖及び軽鎖を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、重鎖を含む。
【０１６６】
さらにより好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、抗体：
（ｉ）それぞれ配列番号１３４及び１７に記載のFS22-172-003-AA/E12v2；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１３７及び２８に記載のFS22-172-003-AA/E05v2；
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１４０及び３３に記載のFS22-172-003-AA/G12v2；
（ｉｖ）それぞれ配列番号１４３及び１７に記載のFS22-053-008-AA/E12v2；又は
（ｖ）それぞれ配列番号１４６及び２８に記載のFS22-053-008-AA/E05v2；
の重鎖及び軽鎖を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、重鎖を含む。
【０１６７】
さらにより好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、抗体：
（ｉ）それぞれ配列番号１３４及び１７に記載のFS22-172-003-AA/E12v2；又は
（ｉｖ）それぞれ配列番号１４３及び１７に記載のFS22-053-008-AA/E12v2
の重鎖及び軽鎖を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、重鎖を含む。
【０１６８】
さらにより好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、それぞれ配列番号１３４及び１７に記載の抗体FS22-172-003-AA/E12v2の重鎖及び軽鎖を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、重鎖を含む。
【０１６９】
さらにより代替的に好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する抗体分子は、抗体：
（ｉ）それぞれ配列番号１５２及び１７に記載のFS22-053-017-AA/E12v2；
（ｉｉ）それぞれ配列番号１５３及び２８に記載のFS22-053-017-AA/E05v2；又は
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１５４及び３３に記載のFS22-053-017-AA/G12v2
の重鎖及び軽鎖を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、重鎖を含む。
【０１７０】
本発明の抗体分子はまた、本明細書に記載の第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＦＷ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖配列の変異体を含み得る。適切な変異体は、配列の変更又は変異、及びスクリーニングの方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、１つ以上の変異体配列を含む抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に対する結合特異性及び／又は結合親和性などの、親抗体分子の１つ以上の機能的特徴を保持する。例えば、１つ以上の変異体配列を含む抗体分子は、好ましくは、（親）抗体分子と同じ親和性、又はより高い親和性で、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＣＤ１３７に結合する。親抗体分子は、変異体抗体分子に組み込まれているアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含まない抗体分子である。
【０１７１】
例えば、本発明の抗体分子は、本明細書に記載の構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＦＷ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有する、第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＦＷ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖配列を含み得る。
【０１７２】
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号１１５［FS22-172-003］又は８１［FS22-053-008］、好ましくは配列番号１１５［FS22-172-003］に記載のＣＨ３ドメイン配列に対し、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ３ドメイン配列を含む。
【０１７３】
さらに好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号７６又は７７に記載のＣＨ２ドメイン配列に対し、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ２ドメイン配列を有するか、又はそれを含む。
【０１７４】
配列同一性は、一般的に、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCGパッケージ、Accelerys Inc、米国サンディエゴ（San Diego USA））を参照して定義される。ＧＡＰは、NeedlemanとWunschのアルゴリズムを使用して、２つの完全配列を整列させ、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般的に、ギャップ生成ペナルティが１２に等しく、ギャップ拡張ペナルティが４に等しいデフォルトのパラメーターが使用される。ＧＡＰの使用が好ましい場合もあるが、他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al., 1990の方法を使用）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, 1988の方法を使用）、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981）、又は上掲Altschul et al.(1990)のＴＢＬＡＳＴＮプログラムも、一般的にデフォルトパラメーターを使用して用いられ得る。特に、psi-Blastアルゴリズム（Altschul et al., 1997）が使用され得る。
【０１７５】
本発明の抗体分子はまた、本明細書に記載の第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＦＷ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を有する、第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＦＷ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖を含み得る。特に、変更は、ＶＨ及びＶＬドメイン配列の外側の抗体分子の１つ以上のフレームワーク領域、及び／又はＣＨ３ドメインの１つ以上のフレームワーク領域においてなされ得る。例えば、変更は、第１、第２、及び第３の配列として、又はＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列として、本明細書に記載される配列の外側のＣＨ３ドメインに存在し得る。
【０１７６】
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、又は１３２に記載のＣＨ３ドメイン配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を伴う、ＣＨ３ドメイン配列を含み得る。より好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、配列番号１１５［FS22-172-003］又は８１［FS22-053-008］、好ましくは配列番号１１５［FS22-172-003］に記載のＣＨ３ドメイン配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を伴う、ＣＨ３ドメイン配列を含み得る。
【０１７７】
さらに好ましい実施形態において、抗体分子は、配列番号７６又は７７に記載のＣＨ２ドメイン配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を伴う、ＣＨ２ドメイン配列を含む。
【０１７８】
１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている好ましい実施形態において、置換は、例えば以下の表に従う、保存的置換であり得る。いくつかの実施形態において、中央の列の同じカテゴリーのアミノ酸は、互いに置換されており、すなわち、非極性アミノ酸は、例えば、別の非極性アミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態において、右端の列の同じ行のアミノ酸が互いに置換されている。
【０１７９】
【表１】
2021524268.tif 000002
【０１８０】
いくつかの実施形態において、置換は、機能的に保存的であり得る。すなわち、いくつかの実施形態において、置換は、同等の非置換抗体分子と比較して、置換を含む抗体分子の１つ以上の機能的特性（例えば、結合親和性）に影響を与えない（又は実質的に影響を与えない）可能性がある。
【０１８１】
抗体分子が、本明細書に開示されるような第１の配列、ＡＢ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、又は重鎖配列の変異体を含む場合、好ましくは、抗体分子は、抗体分子のＣＨ３ドメインの１１位と１９位の間、好ましくは、１５位と１７位の間に、ＰＰＹ配列を保持する。さらに、好ましくは、抗体分子は、抗体分子のＣＨ３ドメインの１６位と１７位の間に、挿入、好ましくは、５アミノ酸挿入を保持する。さらに好ましい実施形態において、抗体分子は、好ましくは、抗体分子のＣＨ３ドメインの９７位及び９８位に配列を保持する。
【０１８２】
さらに、又は或いは、抗体分子が、本明細書に開示されるＣＨ３ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、軽鎖又は重鎖配列の変異体を含む場合、変異体は、好ましくは、抗体分子のＣＨ３ドメインのＡＢ及びＥＦ構造ループに位置する第１及び第２の配列中にアミノ酸の変化を含まない。例えば、変異体は、抗体分子のＣＨ３ドメインのＡＢ及びＥＦ構造ループにアミノ酸の変化を含まない場合がある。さらに、変異体は、抗体分子のＣＨ３ドメインのＣＤ構造ループにアミノ酸の変化を含まない場合がある。すなわち、変異体は、抗体分子のＣＨ３ドメインのＡＢ及びＥＦ構造ループにアミノ酸の変化を含まない場合がある。
【０１８３】
抗体分子が、本明細書に開示されるＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列の変異体を含む場合、好ましくは、抗体分子は、ＣＤＲ配列中にいかなるアミノ酸の変化も含まない。すなわち、存在する任意のアミノ酸変化は、ＦＷ配列、例えば、ＨＦＷ１、ＨＦＷ２、ＨＦＷ３、ＨＦＷ４、ＬＦＷ１、ＬＦＷ２、ＬＦＷ３及び／又はＬＦＷ４に存在し得る。例えば、変異体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５及び／又はＣＤＲ６配列にアミノ酸の変化を含まない場合がある。
【０１８４】
抗体分子は、好ましくは、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７に結合する。好ましくは、抗体分子は、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７に同時に結合することができ、ここで、ヒトＣＤ１３７及びヒトＰＤ−Ｌ１は共発現される。本明細書で使用される場合、共発現は、２つの標的が単一の細胞の表面上、又は２つの別個の細胞の表面上で発現されることを意味する。例えば、抗体分子は、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７が２つの別個の細胞上、例えば、腫瘍微小環境でＣＤ１３７を発現する免疫細胞とＰＤ−Ｌ１を発現する別の腫瘍細胞上で共発現される場合、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７に結合することができるだけでなく、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７が単一の細胞、例えば免疫細胞上で共発現される場合、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７に結合することができる可能性がある。
【０１８５】
抗体分子は、好ましくは、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、又は０．３ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はそれより高い親和性で、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。好ましくは、抗体分子は、０．３ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はそれより高い親和性で、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。
【０１８６】
ヒトＰＤ−Ｌ１は、例えば、配列番号１８０に記載の配列を有し得る。ヒトＰＤ−Ｌ１は、例えば、Acro Biosystemsから入手可能な、Ａｖｉタグ（ｈＰＤ−Ｌ１−Ａｖｉ−Ｈｉｓ）を備えた組換えヒトＰＤ−Ｌ１であってもよい（カタログ番号：PD1-H82E5）。組換えヒトＰＤ−Ｌ１は、ビオチン化されていてもよい。
【０１８７】
抗体分子は、好ましくは、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、又は２ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はそれより高い親和性で、二量体のヒトＣＤ１３７に結合する。好ましくは、抗体分子は、２ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はそれより高い親和性で、二量体のヒトＣＤ１３７に結合する。
【０１８８】
好ましい実施形態において、抗体分子は、単量体のＣＤ１３７よりも高い親和性で二量体のＣＤ１３７に結合する。好ましい実施形態において、抗体分子は、単量体のＣＤ１３７に対する抗体分子の親和性よりも、少なくとも５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍又は２００倍高い親和性で二量体のＣＤ１３７に結合する。
【０１８９】
ヒトＣＤ１３７は、例えば、配列番号１８６に示される配列を有し得る。二量体及び単量体のＣＤ１３７抗原を産生するための方法が実施例に記載される。
【０１９０】
抗体分子は、好ましくはカニクイザルＰＤ−Ｌ１及びカニクイザルＣＤ１３７に結合する。好ましくは、抗体分子は、カニクイザルＰＤ−Ｌ１及びカニクイザルＣＤ１３７に同時に結合することができ、ここで、カニクイザルＰＤ−Ｌ１及びカニクイザルＣＤ１３７は、単一の細胞の表面、又は２つの別個の細胞の表面に発現される。
【０１９１】
好ましい実施形態において、抗体分子は、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、又は０．３ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はそれより高い親和性で、カニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合し得る。好ましくは、抗体分子は、１ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はそれより高い親和性で、カニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合する。
【０１９２】
カニクイザルＰＤ−Ｌ１は、例えば、配列番号１８４に記載の配列を有し得る。
【０１９３】
好ましい実施形態において、抗体分子は、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、又は２ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はそれより高い親和性で、二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合し得る。好ましくは、抗体分子は、２ｎＭの親和性（ＫＤ）で、又はそれより高い親和性で、二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合する。
【０１９４】
抗体分子は、同様の親和性でヒトＰＤ−Ｌ１及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合し、及び／又は同様の親和性で二量体のヒトＣＤ１３７及び二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合し得る。これは、カニクイザルで抗体分子を用いて実施された有効性及び毒性の研究が、ヒトにおける抗体分子及び有効性と毒性を予測することを保証するために有益であると考えられている。
【０１９５】
したがって、好ましい実施形態において、抗体分子は、抗体分子がヒトＰＤ−Ｌ１に結合する親和性よりも、１０倍以下、好ましくは５倍以下低い又は高い親和性でカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合する。好ましい実施形態において、抗体分子は、抗体分子が二量体のヒトＣＤ１３７に結合する親和性よりも、１０倍以下、好ましくは５倍以下低い又は高い親和性で二量体のカニクイザルＣＤ１３７に結合する。
【０１９６】
ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＣＤ１３７、カニクイザルＰＤ−Ｌ１、又はカニクイザルＣＤ１３７などの、同族抗原に対する抗体分子の結合親和性は、例えば、Biacoreなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。適切な方法のさらなる詳細は、実施例に記載される。
【０１９７】
同時に２つの同族抗原、例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１とヒトＣＤ１３７、又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１とカニクイザルＣＤ１３７、に結合する抗体分子の能力は、例えば、BiacoreなどのＳＰＲによって決定することができる。適切な方法のさらなる詳細は、実施例に記載される。
【０１９８】
抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１とその受容体であるＰＤ−１との間、好ましくはヒトＰＤ−Ｌ１とヒトＰＤ−１との間の相互作用を遮断することができ得る。
【０１９９】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路は、免疫抑制を媒介する上で重要であることが知られている。したがって、この経路を遮断することができる抗体分子は、免疫抑制を低下させ得、抗腫瘍応答を増加させるのに役立ち得るという点で、有利であると期待される。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達阻害及びＣＤ１３７活性化は、抗腫瘍能力を高めるために連携して機能し得る。
【０２００】
ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を遮断する抗体分子の能力は、例えばPromegaのPD-1/PD-L1 Blockade Bioassay製品を使用した、生体発光細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を遮断する抗体分子の能力は、ＥＬＩＳＡを使用して決定され得る。これらのアッセイのさらなる詳細は、実施例に記載される。
【０２０１】
ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を遮断する抗体分子の能力は、本明細書ではＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断活性とも呼ばれ、それぞれ国際公開第２０１１／０６６３８９  Ａ１号に記載の抗体2.14H9OPTの重鎖及び軽鎖、又はそれぞれ配列番号１７７及び１７８に記載の抗体G1/280_02_G02の重鎖及び軽鎖を含むか、又はそれらからなる、抗体分子を参照することによって決定され得る。
【０２０２】
例えば、抗体分子は、国際公開第２０１１／０６６３８９  Ａ１号に記載の抗体2.14H9OPTの重鎖及び軽鎖、又はそれぞれ配列番号１７７及び１７８に記載の抗体G1/280_02_G02の重鎖及び軽鎖を含むか、又はそれらからなる、抗体分子と、同等又はそれより高いレベルのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断活性を有し得る。
【０２０３】
抗体分子は、国際公開第２０１１／０６６３８９  Ａ１号に記載の抗体2.14H9OPTの重鎖配列及び軽鎖配列、又はそれぞれ配列番号１７７及び１７８に記載の抗体G1/280_02_G02の重鎖及び軽鎖を含むか、又はそれらからなる、抗体分子のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断活性の少なくとも７０％、８０％、又は９０％であるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断活性を有し得る。
【０２０４】
抗体分子は、国際公開第２０１１／０６６３８９  Ａ１号に記載の抗体2.14H9OPTの重鎖配列及び軽鎖配列、又はそれぞれ配列番号１７７及び１７８に記載の抗体G1/280_02_G02の重鎖及び軽鎖を含むか、又はそれらからなる、抗体分子のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断活性の７０％から１３０％、８０％から１２０％、又は９０％から１１０％の間であるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断活性を有し得る。
【０２０５】
上記のように、本発明の抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に同時に結合することができ、これは、ＣＤ１３７の活性化（アゴニスト作用）をもたらす。好ましい実施形態において、抗体分子は、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７の両方に同時に結合することができ、ここで、そのような結合はヒトＣＤ１３７の活性化を引き起こす。さらなる好ましい実施形態において、抗体分子は、カニクイザルＰＤ−Ｌ１及びカニクイザルＣＤ１３７の両方に同時に結合することができ、ここで、そのような結合はカニクイザルＣＤ１３７の活性化を引き起こす。同時結合及び活性化を試験する例示的な方法には、以下により詳細に記載されるように、Ｔ細胞活性化アッセイが含まれる。
【０２０６】
Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、Ｔ細胞活性化アッセイを使用して測定することができる。Ｔ細胞は活性化するとＩＬ−２を放出する。したがって、Ｔ細胞活性化アッセイは、ＩＬ−２放出を測定して、抗体分子によって誘導されるＴ細胞活性化のレベルを決定し得る。
【０２０７】
例えば、Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によるＩＬ−２の最大半量の放出を達成するために必要な抗体分子の濃度を測定することによって決定される。これは以下でＥＣ５０と呼ばれる。
【０２０８】
好ましい実施形態において、抗体分子は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、同じアッセイにおけるFS22-172-003-AA/E12v2のＥＣ５０の５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１０倍、５倍、４倍、３倍、又は２倍以内であるＥＣ５０を有し、ここで、FS22-172-003-AA/E12v2は、配列番号１３４の重鎖及び配列番号１７の軽鎖からなる。
【０２０９】
例えば、抗体分子は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、３０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１４ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、又は０．３ｎＭ以下、好ましくは、１ｎＭ以下、より好ましくは、抗体分子が架橋されている場合、１．５ｎＭ以下のＥＣ５０を有し得る。
【０２１０】
さらに、又は或いは、Ｔ細胞を活性化する抗体分子の能力は、抗体分子の存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおいて、Ｔ細胞によって放出されるＩＬ−２の最大濃度（Ｅｍａｘ）を測定することによって決定され得る。
【０２１１】
抗体分子は、少なくとも１５００ｐｇ／ｍｌ、２０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ、３０００ｐｇ／ｍｌ、又は３２５０ｐｇ／ｍｌ以上、好ましくは２５００ｐｇ／ｍｌ以上の抗体分子の存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおいて、Ｔ細胞によって放出されるＩＬ−２の最大濃度を有し得る。
【０２１２】
好ましい実施形態において、抗体分子の存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおいて、Ｔ細胞によって放出されるＩＬ−２の最大濃度は、同じアッセイにおいてFS22-172-003-AA/E12v2の存在下でＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最大濃度の２０％、又は１０％以内であり、ここで、FS22-172-003-AA/E12v2は、配列番号１３４の重鎖及び配列番号１７の軽鎖からなる。
【０２１３】
Ｔ細胞活性化アッセイは、好ましくは、ＣＤ１３７を発現するＴ細胞及びＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を含み、例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１）は、実施例に記載されるように調製及び使用され得る。或いは、又はさらに、ヒト乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）細胞及び／又はＳＫＢＲ３細胞などの、異なるレベルのＰＤ−Ｌ１を発現する細胞が使用され得る。実施例に記載されるように、ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１は高レベルのヒトＰＤ−Ｌ１を発現し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は中レベルのヒトＰＤ−Ｌ１を発現し、ＳＫＢＲ３細胞は低レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する。
【０２１４】
好ましい実施形態において、Ｔ細胞活性化アッセイは、ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１発現細胞以外の抗体分子を架橋することができるいかなる薬剤も含まない。抗体分子を架橋することができる薬剤の例には、実施例に記載されているように、抗ヒトＣＨ２抗体が含まれる。
【０２１５】
Ｔ細胞活性化アッセイは、本実施例に記載されるような汎Ｔ細胞アッセイなどの、本明細書に記載されるようなＴ細胞アッセイであり得る。
【０２１６】
例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＴ細胞に基づくＩＬ−２放出アッセイであり得る。例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、白血球枯渇コーンからヒトＰＢＭＣを単離することを含み得る。ＰＢＭＣを単離するための方法は当技術分野で公知であり、本実施例に記載されている。次に、Ｔ細胞がＰＢＭＣから単離され得る。ＰＢＭＣからＴ細胞（全てのＴ細胞）を単離するための方法は、当技術分野で公知であり、本実施例に記載されている。
【０２１７】
活性化アッセイは、例えば、Ｔ細胞培地などの実験培地において、必要な数のＴ細胞を調製することを含み得る。必要なＴ細胞の数は、１．０×１０６細胞／ｍｌの濃度で調製され得る。次に、Ｔ細胞の活性化に必要なシグナルを提供する適切なＴ細胞活性化試薬を使用して、Ｔ細胞が刺激され得る。例えば、Ｔ細胞活性化試薬は、ＣＤ３及びＣＤ２８を含むビーズなどの、ＣＤ３及びＣＤ２８を含む試薬であり得る。単離されたＴ細胞は、Ｔ細胞を活性化するために、Ｔ細胞活性化試薬と共に一晩インキュベートされ得る。これに続き、活性化されたＴ細胞は、洗浄されて、Ｔ細胞がＴ細胞活性化試薬から分離され、２．０×１０６細胞／ｍｌなどの適切な濃度でＴ細胞培地に再懸濁され得る。次に、活性化されたＴ細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体でコーティングされたプレートに添加され得る。
【０２１８】
細胞（例えば、ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞）は、Ｔ細胞培養培地中の抗ＣＤ３抗体でコーティングした組織培養プレート上に、ウェルあたり例えば２×１０５細胞でプレーティングされ得る。インキュベーションの、例えば４時間後、全てのＴ細胞培養培地を除去し、Ｔ細胞を例えば５．０×１０５細胞／ｍｌの濃度で含有する１００μｌのＴ細胞培養培地で置換し、５．０×１０４細胞／ウェルを得てもよい。
【０２１９】
各試験抗体分子の適切な希釈液が調製され、ウェルに添加され得る。次に、Ｔ細胞は、試験抗体と共に、３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間インキュベートされ得る。上清を収集し、アッセイして、上清中のＩＬ−２の濃度が測定され得る。溶液中のＩＬ−２の濃度を決定するための方法は当技術分野で公知であり、本実施例に記載されている。ヒトＩＬ−２の濃度は、抗体分子の対数濃度に対してプロットされ得る。得られた曲線は、対数（アゴニスト）対応答方程式を使用して適合され得る。
【０２２０】
抗体分子は、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。この場合、抗体分子はコンジュゲートと呼ばれ得る。そのようなコンジュゲートにより、本明細書に記載されるような疾患の処置における用途が見出される。
【０２２１】
例えば、生物活性分子は、サイトカイン、好ましくはヒトサイトカインなどの免疫系モジュレーターであり得る。例えば、サイトカインは、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を刺激するサイトカインであり得る。抗体分子にコンジュゲートするためのサイトカインの例には、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γが含まれる。
【０２２２】
或いは、生物活性分子は、サイトカイン、例えば、ＴＧＦ−ベータ又はＩＬ−６のリガンドトラップなどの、リガンドトラップであり得る。
【０２２３】
或いは、生物活性分子は、治療用放射性同位体であり得る。
【０２２４】
放射免疫療法は、例えば癌処置に使用される。放射免疫療法に適した治療用放射性同位体は、当技術分野で知られており、イットリウム−９０、ヨウ素−１３１、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、ルテチウム１７７、レニウム−１８８、銅−６７、アクチニウム−２２５、及びヨウ素−１２５及びテルビウム−１６１が含まれる。
【０２２５】
抗体分子にコンジュゲートされ得る適切な検出可能な標識は当技術分野で公知であり、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、イットリウム９０、インジウム１１１、テクネチウム９９などの放射性同位体；フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、テキサスレッド（Texas Red）並びにシアニン色素誘導体（例えば、Cy7及びAlexa750）などの、蛍光色素；ジアミノベンジジンなどの発色色素；ラテックスビーズ；西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識；スペクトル的に分離された吸収又は発光特性を備えた蛍光体又はレーザー色素；並びに特定の同族の検出可能部分（例えば、標識されたアビジン）への結合を介して検出され得る、ビオチンなどの化学部分を含む。
【０２２６】
抗体分子は、ジスルフィド又はペプチド結合などの任意の適切な共有結合又は非共有結合によって、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。生物活性分子がサイトカインである場合、サイトカインは、ペプチドリンカーによって抗体分子に結合され得る。適切なペプチドリンカーは当技術分野で公知であり、長さは５から２５アミノ酸、５から２０アミノ酸、５から１５アミノ酸、１０から２５アミノ酸、１０から２０アミノ酸、又は１０から１５アミノ酸であり得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、生物活性分子は、切断可能なリンカーによって抗体分子にコンジュゲートされ得る。リンカーは、治療部位での抗体分子からの生物活性分子の放出を可能にし得る。リンカーには、アミド結合（例えば、ペプチドリンカー）、ジスルフィド結合、又はヒドラゾンが含まれ得る。例えば、ペプチドリンカーは部位特異的プロテアーゼによって切断され得、ジスルフィド結合は細胞質ゾルの還元環境によって切断され得、ヒドラゾンは酸媒介性加水分解によって切断され得る。
【０２２８】
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードする単離された１つ又は複数の核酸分子を提供する。当業者は、当技術分野で周知の方法を使用してそのような核酸分子を調製することに困難はないであろう。
【０２２９】
１つ又は複数の核酸分子は、例えば、配列番号８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１、又は１３３に記載の配列を含み得、これらはそれぞれFS22-053-008、FS22-053-009、FS22-053-011、FS22-053-017、FS22-053-014、FS22-053-010、FS22-053-012、FS22-053-013、FS22-053-015、FS22-053-016、FS22-053、FS22-172-003、FS22-172-002、FS22-172-004、FS22-172-001、FS22-172-005、FS22-172-006、及びFS22-172のＣＨ３ドメインをコードする。好ましくは、１つ又は複数の核酸分子は、配列番号１１６又は８２に記載の配列を含み、これはそれぞれFS22-172-003又はFS22-053-008のＣＨ３ドメインをコードする。より好ましくは、１つ又は複数の核酸分子は、配列番号１１６に記載の配列を含み、これはFS22-172-003のＣＨ３ドメインをコードする。
【０２３０】
１つ又は複数の核酸分子は、抗体E12v2、E05v2、G12v2、又はlam-G02v3、好ましくは、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、より好ましくは、E12v2又はE05v2、最も好ましくは、E12v2の、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、好ましくは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードし得る。これらの抗体のＶＨ及びＶＬドメイン配列は本明細書に記載されている。
【０２３１】
例えば、核酸分子は、
（ｉ）配列番号１３に記載の抗体E12v2のＶＨドメイン核酸配列、及び／又は配列番号１５に記載の抗体E12v2のＶＬドメイン核酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号２４に記載の抗体E05v2のＶＨドメイン核酸配列、及び／又は配列番号２６に記載の抗体E05v2のＶＬドメイン核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２４に記載の抗体G12v2のＶＨドメイン核酸配列、及び／又は配列番号３１に記載の抗体G12v2のＶＬドメイン核酸配列；又は
（ｖ）配列番号２４に記載の抗体lam-G02v3のＶＨドメイン核酸配列、及び／又は配列番号４２に記載の抗体lam-G02v3のＶＬドメイン核酸配列
を含み得る。
【０２３２】
１つ又は複数の核酸分子は、抗体FS22-172-003-AA/E12v2、FS22-172-003-AA/E05v2、FS22-172-003-AA/G12v2、FS22-053-008-AA/E12v2、FS22-053-008-AA/E05v2、又はFS22-053-008-AA/G12v2、好ましくは、抗体FS22-172-003-AA/E12v2、FS22-172-003-AA/E05v2、FS22-172-003-AA/G12v2、FS22-053-008-AA/E12v2、又はFS22-053-008-AA/E05v2、さらに好ましくは、抗体FS22-172-003-AA/E12v2の、重鎖及び／又は軽鎖、好ましくは、重鎖及び軽鎖をコードし得る。これらの抗体の重鎖及び軽鎖配列は本明細書に記載されている。
【０２３３】
例えば、核酸分子は、
（ｉ）配列番号３２又は１３５に記載の抗体FS22-172-003-AA/E12v2の重鎖核酸配列、及び／又は配列番号３９又は１３６に記載の抗体FS22-172-003-AA/E12v2の軽鎖核酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１３８に記載の抗体FS22-172-003-AA/E05v2の重鎖核酸配列、及び／又は配列番号１３９に記載の抗体FS22-172-003-AA/E05v2の軽鎖核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１４１に記載の抗体FS22-172-003-AA/G12v2の重鎖核酸配列、及び／又は配列番号１４２に記載の抗体FS22-172-003-AA/G12v2の軽鎖核酸配列；
（ｉｖ）配列番号１４４に記載の抗体FS22-053-008-AA/E12v2の重鎖核酸配列、及び／又は配列番号１４５に記載の抗体FS22-053-008-AA/E12v2の軽鎖核酸配列；
（ｖ）配列番号１４７に記載の抗体FS22-053-008-AA/E05v2の重鎖核酸配列、及び／又は配列番号１４８に記載の抗体FS22-053-008-AA/E05v2の軽鎖核酸配列；又は
（ｖｉ）配列番号１５０に記載の抗体FS22-053-008-AA/G12v2の重鎖核酸配列、及び／又は配列番号１５１に記載の抗体FS22-053-008-AA/G12v2の軽鎖核酸配列；
を含み得る。
【０２３４】
核酸が本発明の抗体分子のＶＨ及びＶＬドメイン、又は重鎖及び軽鎖をコードする場合、２つのドメイン又は鎖は、２つの別個の核酸分子上にコードされ得る。
【０２３５】
単離された核酸分子を使用して、本発明の抗体分子を発現させ得る。核酸は、一般的に、発現のための組換えベクターの形態で提供される。したがって、本発明の別の態様は、上記のような核酸を含むベクターを提供する。プロモーター配列、転写終結フラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含有する適切なベクターを選択又は構築することができる。好ましくは、ベクターは、宿主細胞における核酸の発現を駆動するための適切な調節配列を含む。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス性、例えば、ファージ、又はファージミドであり得る。
【０２３６】
本明細書に記載の核酸分子又はベクターは、宿主細胞に導入され得る。核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための技術は、当技術分野で十分に確立されており、任意の適切な技術が使用され得る。組換え抗体分子の産生に適した様々な宿主細胞が当技術分野で公知であり、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の宿主細胞が含まれる。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ、ＮＳ０、又はＨＥＫ細胞などの哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である。
【０２３７】
本発明の別の態様は、宿主細胞において抗体分子をコードする核酸を発現すること、及び任意選択により、そのように産生された抗体分子を単離及び／又は精製することを含む、本発明の抗体分子を産生する方法を提供する。宿主細胞を培養するための方法は、当技術分野で周知である。この方法は、抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含み得る。組換え抗体分子を精製するための技術は当技術分野で周知であり、例えば、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又はアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＬを使用するもの）が含まれる。いくつかの実施形態において、精製は、抗体分子上のアフィニティータグを使用して実施され得る。方法はまた、抗体分子を、任意選択により、薬学的に許容される賦形剤又は以下に記載される他の物質と共に、医薬組成物へと製剤化することを含み得る。
【０２３８】
ＰＤ−Ｌ１は多くの癌細胞で発現することが知られており、免疫系の細胞で発現する。ＣＤ１３７は、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、免疫系の細胞に発現している。ＣＤ１３７は、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも低レベルで、ＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現するが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の一部のサブセットの増殖及び活性化の誘導に関与することも示されている。
【０２３９】
ＣＤ１３７の活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、生存及び細胞傷害性エフェクター機能、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞の分化及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の維持を増強する役割を果たすことが示されている。ＣＤ１３７の活性化は、ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ、並びにＢ細胞の増殖、生存、及びサイトカイン産生を増強することも実証されている。
【０２４０】
本明細書に詳細に記載されるように、本発明者らは、本発明の抗体分子が、ＣＤ１３７のアゴニスト作用を誘導するために、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に同時に結合することができることを実証した。このように、抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７の発現に基づいて、追加の架橋剤を必要とせずに、自律的にアゴニスト作用を駆動する。ＰＤ−Ｌ１は多くの癌細胞で発現し、ＣＤ１３７は免疫細胞で発現し、免疫細胞の増殖及び生存を増強する既知の役割を有するため、本発明の抗体分子は、例えば腫瘍微小環境において、ＰＤ−Ｌ１が発現される位置で免疫応答を増強することができると予想される。さらに、本発明者らは、これらの特性を有する抗体分子の使用は、癌の同系マウスモデルにおける腫瘍増殖の抑制に効果的であること、及びこのような抗体分子は、それぞれＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７に結合する２つの結合分子の投与よりも効果的であることを示した。
【０２４１】
したがって、本明細書に記載の抗体分子は、治療用途、特に癌の処置に有用であり得る。
【０２４２】
本明細書に記載の抗体分子は、ヒト又は動物の体の処置方法において使用され得る。本発明の関連する態様は、
（ｉ）医薬としての使用のための本明細書に記載の抗体分子、
（ｉｉ）疾患又は障害の処置方法における使用のための本明細書に記載の抗体分子、
（ｉｉｉ）疾患又は障害の処置における使用のための医薬品の製造における本明細書に記載の抗体分子の使用；及び
（ｉｖ）個体の疾患又は障害の処置方法であって、本明細書に記載の治療有効量の抗体分子を個体に投与することを含む方法
を提供する。
【０２４３】
個体は、患者、好ましくはヒト患者であり得る。
【０２４４】
処置は、何らかの所望の治療効果、例えば、状態の進行の阻害又は遅延など、が達成される任意の処置又は治療であり得、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の改善、状態の治癒又は寛解（部分的又は全体的）、１つ以上の症状及び／又は状態の兆候を予防、改善、遅延、軽減、若しくは阻止すること、又は個体若しくは患者の生存期間を処置の不存在時に予想される期間を超えて延長することを含む。
【０２４５】
予防的手段（すなわち、予防法）としての処置も含まれる。例えば、癌などの疾患の発生又は再発の影響を受けやすい、又はそのリスクがある個体は、本明細書に記載されるように処置され得る。そのような処置は、個体における疾患の発生又は再発を予防又は遅延させ得る。
【０２４６】
記載されているような処置方法は、抗体分子に加えて、少なくとも１つのさらなる処置を個体に投与することを含み得る。したがって、本明細書に記載の抗体分子は、単独で、又は１つ以上の他の処置と組み合わせて、個体に投与され得る。抗体分子が別の処置と組み合わせて個体に投与される場合、追加の処置は、抗体分子の投与と同時に、連続的に、又は別個に個体に投与され得る。追加の処置が抗体分子と同時に投与される場合、抗体分子及び追加の処置は、組み合わせた調製物として個体に投与され得る。例えば、追加の治療は、処置される疾患に対する既知の治療又は治療剤であり得る。
【０２４７】
抗体分子は単独で投与され得るが、抗体分子は通常、抗体分子に加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗体分子を含む医薬組成物を提供する。抗体分子を医薬組成物に製剤化することを含む方法も提供される。
【０２４８】
医薬組成物は、抗体分子に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、又は当業者に周知の他の材料を含み得る。本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症のない、対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに適した、化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。各担体、賦形剤などもまた、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容可能」でなければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、これは、以下で論じられるように、注入、注射、又は他の適切な経路によるものであり得る。
【０２４９】
非経口、例えば皮下又は静脈内投与（例えば、注射による）の場合、抗体分子を含む医薬組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を備えた、非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。関連技術を有する当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、乳酸リンガー注射などの等張性ビヒクルを使用して、適切な溶液を調製することが十分に可能である。リン酸、クエン酸及びその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、デキストリを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を必要に応じて使用してもよい。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、抗体分子は、投与前に再構成するために凍結乾燥形態で提供され得る。例えば、凍結乾燥された抗体分子は、個体に投与する前に、滅菌水で再構成され且つ生理食塩水と混合され得る。
【０２５１】
投与は「治療有効量」であり得、これは個体への利点を示すのに十分である。実際に投与される量、並びに投与の速度及び時間経過は、処置される対象の性質及び重症度、処置される特定の個体、個体の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、抗体分子のタイプ、投与方法、投与のスケジュール、並びに医師に知られている他の要因に依存する。処置の処方、例えば、投与量の決定などは、一般医及び他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度及び／又は処置されている疾患の進行に依存し得る。抗体分子の適切な用量は当技術分野で周知である（Ledermann et al., (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664;及びBagshawe et al., (1991 Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922）。投与される抗体分子に対して適切な、本明細書又はPhysician’s Desk Reference (2003)に示されている特定の投与量が使用され得る。抗体分子の治療有効量又は適切な用量は、動物モデルにおけるインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿するための方法は公知である。正確な用量は、処置される領域のサイズ及び位置、並びに抗体分子の正確な性質を含む、多数の要因に依存する。
【０２５２】
典型的な抗体用量は、全身投与の場合は１００μｇから１ｇの範囲であり、局所投与の場合は１μｇから１ｍｇの範囲である。最初により高い負荷用量、続いて１つ以上のより低い用量が投与され得る。これは、成人個体の単回処置用の用量であり、比例的に小児及び乳児用に調整され得、分子量に比例して他の抗体形式にも調整できる。
【０２５３】
処置は、医師の裁量により、毎日、週に２回、週に１回、又は月に１回繰り返され得る。個体の処置スケジュールは、抗体組成物の薬物動態学的及び薬力学的特性、投与経路、並びに処置される状態の性質に依存し得る。
【０２５４】
処置は定期的であり得、投与間の期間は、約２週間以上、例えば、約３週間以上、約４週間以上、約月１回以上、約５週間以上、又は約６週間以上であってもよい。例えば、処置は２から４週間ごと、又は４から８週間ごとであり得る。適切な製剤及び投与経路は上に記載されている。
【０２５５】
好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子は、癌の処置方法における使用のためのものであり得る。
【０２５６】
癌は、悪性癌細胞の異常な増殖を特徴とし得る。乳癌などの特定の種類の癌に言及される場合、これは、乳房組織などの関連組織の悪性細胞の異常な増殖を指す。乳房に位置するが、卵巣組織などの別の組織の悪性細胞の異常増殖の結果である二次癌は、本明細書で言及されるような乳癌ではなく、卵巣癌である。
【０２５７】
癌は、原発癌又は二次癌であり得る。したがって、本明細書に記載の抗体分子は、癌が原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である、個体の癌を処置する方法における使用のためのものであり得る。
【０２５８】
本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌の腫瘍は、例えばその細胞表面上に、ＣＤ１３７を発現するＴＩＬを含み得る。一実施形態において、腫瘍は、ＣＤ１３７を発現するＴＩＬを含むと決定されたものであってもよい。細胞表面上の抗原の発現を決定するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、フローサイトメトリーを含む。
【０２５９】
例えば、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などの白血病；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫などのリンパ腫；並びに肉腫（例えば、軟部肉腫）、皮膚癌（例えば、メルケル細胞癌）、黒色腫、膀胱癌（例えば、尿路上皮癌）脳腫瘍（例えば、多形神経膠芽腫）、乳癌、子宮／子宮内膜癌、卵巣癌（例えば、卵巣漿液性嚢胞腺腫）、前立腺癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ））、結腸直腸癌（例えば、結腸直腸腺癌）、子宮頸癌（例えば、子宮頸扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌）、肝癌（例えば、肝細胞癌）、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌）、食道癌、膵臓癌、腎癌（例えば、腎細胞癌）、副腎癌、胃癌（例えば、胃腺癌）、精巣癌、胆嚢及び胆道の癌（例えば、胆管細胞癌）、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌、及び脳癌などの固形癌からなる群から選択され得る。
【０２６０】
好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、固形癌である。
【０２６１】
より好ましくは、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、黒色腫、膀胱癌、脳癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎癌、胃癌、及び消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）からなる群から選択される固形癌である。
【０２６２】
さらに好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＣＴＬＡ４に結合する抗体などの１つ以上のチェックポイント阻害剤による処置に応答する癌であり得る。そのような腫瘍は、チェックポイント阻害剤治療に感受性でない腫瘍よりも高いＴＩＬレベル及び／又は高い腫瘍変異負荷を有すると考えられる。このような腫瘍は、温かい腫瘍（warm tumour）又は熱い腫瘍（hot tumour）とも呼ばれる。
【０２６３】
このような腫瘍の例には、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）、黒色腫、肺癌（扁平上皮肺癌、肺腺癌、非小細胞肺癌［ＮＳＣＬＣ］、又は小細胞肺癌［ＳＣＬＣ］など）、前立腺癌、子宮頸癌（子宮頸部扁平上皮癌又は子宮頚管内腺癌など）、膀胱癌、乳癌、甲状腺癌、腎癌、結腸直腸癌（ＭＳＩ又はＭＳＳ、例えば、結腸直腸腺癌）、食道癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、胃癌、子宮内膜癌、膵臓癌、卵巣癌、肝細胞癌、中皮腫、尿路上皮癌、メルケル細胞癌、及び胃腺癌が含まれる。好ましい実施形態において、癌は、ＨＮＳＣＣである。癌はさらに、以前に化学療法剤又は放射線治療剤で処置されていない癌であり得る。すなわち、処置される個体は、問題の癌の化学療法剤又は放射線治療剤で処置を受けていない癌患者であり得る。
【０２６４】
或いは、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＣＴＬＡ４に結合する抗体などの１つ以上のチェックポイント阻害剤による処置に応答しない、膵臓癌又は前立腺癌などの癌であり得る。したがって、本発明の抗体で処置される個体は、抗ＰＤ−Ｌ１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの１つ以上のチェックポイント阻害剤に対して以前に不十分な応答を示した、膵臓癌又は前立腺癌患者などの癌患者であり得る。
【０２６５】
１つ以上のチェックポイント阻害剤による処置に応答しない腫瘍は、冷たい腫瘍とも呼ばれる。理論に拘束されることを望むものではないが、１つ以上のチェックポイント阻害剤のみによる処置に応答しない癌の、化学療法、放射線療法、免疫刺激剤などの免疫療法剤、又は抗腫瘍ワクチンによる処置は、癌細胞死を引き起こし、その結果、腫瘍内のＴＩＬが増加し、免疫抑制受容体の発現が高くなり、これにより、癌はチェックポイント阻害剤による処置に反応するようになる、すなわち、冷たい腫瘍が温かい腫瘍に変化すると考えられている。したがって、本発明の抗体分子は、個体の癌を処置する方法における使用のためのものであり得、ここで、癌は、１つ以上のチェックポイント阻害剤のみによる処置に応答しないか、又は抵抗性であり、方法は、化学療法剤、放射線療法剤、若しくは免疫刺激剤、又は抗癌ワクチンと組み合わせて、抗体分子を個体に投与することを含む。個体の癌を処置する方法であって、癌が、１つ以上のチェックポイント阻害剤のみによる処置に応答しないか、又は抵抗性であり、方法が、化学療法剤、放射線療法剤、若しくは免疫刺激剤、又は抗癌ワクチンと組み合わせて、抗体分子を個体に投与することを含む、方法も企図される。
【０２６６】
癌において、処置は、完全な癌の寛解を含む癌の成長の阻害、及び／又は癌の転移の阻害、及び癌の再発の阻害を含み得る。癌の増殖は、一般的に、癌内のより発達した形態への変化を示す多数の指標のいずれかを指す。したがって、癌増殖の阻害を測定するための指標には、癌細胞の生存の低下、腫瘍の体積又は形態の減少（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、又は他の画像化方法を使用して決定される）、腫瘍増殖の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏性皮膚検査のパフォーマンスの改善、抗癌免疫細胞又は他の抗癌免疫応答の活性の増加、及び腫瘍特異的抗原のレベルの減少が含まれる。個体の癌性腫瘍に対する免疫応答を活性化又は増強することにより、癌の増殖、特に対象にすでに存在する癌の増殖に抵抗する個体の能力を改善し、及び／又は個体の癌増殖の傾向を低下させ得る。
【０２６７】
癌処置において、本明細書に記載の抗体分子は、問題の癌の処置に適切であることが示されているか、適切である可能性がある抗癌療法又は治療剤などの、別の抗癌療法又は治療剤と組み合わせて、個体に投与され得る。例えば、抗体分子は、化学療法剤、放射線療法、放射性核種、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、養子ＮＫ細胞療法などの養子細胞移植（ＡＣＴ）療法、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＴＩＬ、若しくはガンマ／デルタＴ細胞による治療、又はホルモン療法のための薬剤と組み合わせて個体に投与され得る。
【０２６８】
理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載の抗体分子は、抗癌治療におけるアジュバントとして作用し得ると考えられる。具体的には、例えば、化学療法又は放射線療法と組み合わせた、抗体分子の個体への投与は、化学療法又は放射線療法単独で達成されるよりも、癌に対してより大きな免疫応答を誘発すると考えられる。
【０２６９】
本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための１つ以上の化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、アルキル化剤、プラチナ類似体、ヌクレオシド類似体、葉酸代謝拮抗剤、サリドマイド誘導体、抗悪性腫瘍化学療法剤などからなる群から選択され得る。タキサンは、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ−パクリタキセルを含み；細胞傷害性抗生物質は、アクチノマイシン、ブレオマイシン、並びにドキソルビシン、ミトキサントロン及びバルルビシンなどのアントラサイクリンを含み；チロシンキナーゼ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コベミチニブ及びトラメチニブを含み；ＰＡＲＰ阻害剤は、ピラパリブを含み；Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤は、ベムラフェニブ及びダブラフェニブを含み；アルキル化剤は、ダカルバジン、シクロホスファミド及びテモゾロミドを含み；プラチナ類似体は、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンを含み；ヌクレオシド類似体は、アザシチジン、カペシタビン、フルダラビン、フルオロウラシル及びゲムシタビンを含み；葉酸代謝拮抗剤は、メトトレキサート及びペメトレキセドを含む。本発明における使用に適した他の化学療法剤には、デファクチニブ、エンチノスタット、エリブリン、イリノテカン、及びビンブラスチンが含まれる。
【０２７０】
本明細書に記載の抗体分子と共に投与するための好ましい治療剤は、ドキソルビシン、ミトキサントロン、シクロホスファミド、シスプラチン、及びオキサリプラチンである。
【０２７１】
本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための放射線療法は、外照射療法又は近接照射療法であり得る。
【０２７２】
本明細書に記載の抗体分子と共に投与するための放射性核種は、イットリウム−９０、ヨウ素−１３１、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、ルテチウム１７７、レニウム−１８８、銅−６７、アクチニウム−２２５、ヨウ素−１２５及びテルビウム−１６１からなる群から選択され得る。
【０２７３】
本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子、ヌクレオチド、サイトカイン、又はサイトカインベースの治療剤であり得る。例えば、治療用抗体分子は、免疫調節分子、例えば、阻害性チェックポイント分子又は免疫共刺激分子、自然免疫系の受容体、又は腫瘍抗原、例えば、細胞表面腫瘍抗原又は可溶性腫瘍抗原に結合し得る。治療用抗体分子が結合し得る免疫調節分子の例には、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＲ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、ＩＬ−１０及びＣＳＦ−１が含まれる。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例には、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（例えば、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ−５）、及びＳＴＩＮＧが含まれる。治療用抗体分子が結合し得る腫瘍抗原の例には、ＨＥＲ２、ＥＧＦＷ、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０及びＴＧＦ−ベータが含まれる。
【０２７４】
本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のためのヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡであり得る。
【０２７５】
サイトカイン又はサイトカインベースの治療は、ＩＬ−２、コンジュゲートＩＬ−２のプロドラッグ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、及びＩ型インターフェロンからなる群から選択され得る。
【０２７６】
癌の処置のための抗腫瘍ワクチンは、クリニックで実施され、且つ科学文献で詳細に議論されている（Rosenberg, S. 2000 Development of Cancer Vaccinesなど）。これは主に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を伴う場合と伴わない場合の両方で、ワクチン接種方法としてこれらの細胞を使用することにより、自己又は同種異系の癌細胞によって発現される様々な細胞マーカーに応答するように免疫系を刺激する戦略を含む。ＧＭ−ＣＳＦは、抗原提示において強い反応を引き起こし、前記戦略で使用される場合、特によく機能する。
【０２７７】
前述の説明、以下の特許請求の範囲、又は添付の図面に開示され、それらの特定の形態で、又は開示された機能を実行するための手段、若しくは開示された結果を得るための方法若しくはプロセスの観点から、適切に表現された特徴は、別個に、又はそのような特徴の任意の組み合わせで、その多様な形態で本発明を実現するために利用され得る。
【０２７８】
本発明は、上記の例示的な実施形態と併せて説明されてきたが、本開示を与えられた場合、多くの同等の改変及び変形が当業者には明らかであろう。したがって、上記の本発明の例示的な実施形態は、例示的であり、限定的ではないと見なされる。記載される実施形態に対する様々な変更は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行われ得る。
【０２７９】
疑義を避けるため、本明細書において提供される理論的説明はいずれも、読み手の理解を向上させる目的で提供されている。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれにも拘束されることを望むものではない。
【０２８０】
本明細書において使用されるセクションの見出しは、整理的な目的のみであり、説明されている主題を制限するものとして解釈されるべきではない。
【０２８１】
以下の特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上別段の定めがない限り、「含む（comprise）」及び「含む（include）」という単語、並びに「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、及び「含んでいる（including）」などの変形は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含むが、他のいかなる整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外するものではないことを意味するものと理解される。
【０２８２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明確に別のものを示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書において、範囲は、「約」ある特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値まで、として表され得る。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、ある特定の値から、及び／又は他の特定の値まで、を含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」を使用することにより、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。数値に関連する「約」という用語は、任意選択によるものであり、例えば、＋／−１０％を意味する。
【実施例】
【０２８３】
実施例
実施例１：抗原選択及び特性評価
ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７の両方に結合し、ＣＤ１３７にアゴナイジングすることが可能なｍＡｂ２を識別するために使用される選択及びスクリーニング方法は、様々なＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７抗原の使用を必要とする。これらの抗原の産生については、以下でより詳細に記載される。
【０２８４】
１．１  組換えＣＤ１３７抗原
ＣＤ１３７などの腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーは、同族リガンドに結合する場合、クラスターを形成する多量体を形成する傾向があることで知られている（Croft,M.2003）。それらの機能のために凝集するこの傾向は、ファージ及び酵母ディスプレイなどのインビトロ選択で使用するため、及び選択されたタンパク質の特性評価のために、溶液中で凝集しない可溶性組換えタンパク質を産生することを困難にする。
【０２８５】
いくつかの市販されている組換え抗原が試験され、存在する凝集体のレベルのために、その大部分がこれらの選択による使用に不適切であることが見出された。試験したもののうち、ビオチン化されたヒト分泌ＣＤ１３７、ｈＦｃ融合タンパク質（BPS Biosciences、カタログ番号71171）のみ（以下「hCD137-hFc-Avi-BPS」と表記）は、十分に凝集が低く適切であり、選択に使用されたが、限定的な成功であった（実施例２を参照）。
【０２８６】
市販されている抗原の大部分は、不適切であると見なされたため、以下の組換え二量体及び単量体ＣＤ１３７抗原（表１を参照）は、選択に使用するために自社生産された。
【０２８７】
【表２】
2021524268.tif 000003
【０２８８】
単量体抗原は、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＢａｍＨＩ−ＨＦ制限酵素を使用して、Ａｖｉ配列及び６つのＣ末端ヒスチジン残基と共にヒト（配列番号１８６）又はマウスＣＤ１３７（配列番号１８８）の細胞外ドメインをコードするＤＮＡを修飾ｐＦＵＳＥベクター（Invivogenカタログ番号pfuse-mg2afc2）にクローニングすることにより産生された。ベクターをＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（National Research Council of Canada）にトランスフェクトし、発現したＣＤ１３７をHisTrap（商標）excelニッケルカラム（GE LifeSciences、29048586）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して精製し、抗原が単一種であり、凝集体を含まないことを確実にした。
【０２８９】
二量体抗原を産生するために、Ａｖｉ配列と共にｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインと融合したヒト、マウス又はカニクイザルＣＤ１３７の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ構築物を修飾pFUSE vectorにクローニングし、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞にトランスフェクトした。組換えＣＤ１３７は、MabSelect SuRe（商標）プロテインＡカラム（GE Healthcare、11003494）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して精製し、抗原が単一種であり、凝集体を含まないことを確実にした。
【０２９０】
二量体及び単量体抗原はそれぞれ、BirA biotin-biotin protein ligase reaction kit（Avidity LLC、BirA500）を使用してビオチン化し、単一ビオチン分子で標識された単量体ＣＤ１３７抗原及び２つの単量体の各々一つずつの２つのビオチン分子で標識された二量体ＣＤ１３７抗原を産生した。３ｍｇの抗原を７．８μｌのＢｉｒＡ酵素混合物と、酵素対基質のモル比を１：５０で混合した。次に、製造業者の推奨に従って添加剤を添加し（１４２μｌのBiomix A、１４２μｌのBiomix B、１４２μのビオチン）、反応混合物を室温で２時間インキュベートした。ビオチン化タンパク質の完全性を維持するために、Amicon ３０μｍフィルター（Merck Millipore UFC503096）を使用して、反応混合物を直ちにＤＰＢＳ（Life Technologies 14190-169）に緩衝液交換をした。
【０２９１】
タンパク質は、ＳＥＣによってさらに精製され、ＢｉｒＡ酵素の除去、及び高分子量の凝集体を含まない最終的な高品質の単分散タンパク質調製物の生成を確実にした。より詳細には、同じ製造ロットの材料を混合し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及び多角度光散乱検出器付きサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）によって安定性及び純度を分析した。タンパク質の完全なビオチン化は、ストレプトアビジンシフトＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認された。組換えヒト及びマウス抗原は、インビトロで、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、抗ＣＤ１３７陽性対照抗体（それぞれ、２０Ｈ４．９（米国特許第７２８８６３８号）及びＬｏｂ１２．３（University of Southampton））、及びフローサイトメトリーによるヒト及びマウスＣＤ１３７リガンド発現ＤＯ１１．１０細胞に結合することが確認された。細胞をＣＤ１３７抗原と共に１時間インキュベートした後、蛍光標識した抗マウスＦｃフラグメント抗体を使用して細胞結合を検出した。組換えｃｙｎｏ抗原は、上記のフローサイトメトリーによりｃｙｎｏＣＤ１３７リガンドを発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）に結合することが確認された。選択プロトコルで使用される材料について可能な限り高い純度を確実にするために、抗原の徹底的なタンパク質特性評価は、タンパク質凝集体の存在は、割合が２％を超えないことを確実にするために実行された。
【０２９２】
１．２  細胞発現ＣＤ１３７抗原
ＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）発現完全長マウスＣＤ１３７（配列番号１８７）又はヒトＣＤ１３７（配列番号１８５）、それぞれ「DO11.10.mCD137」及び「DO11.10.hCD137」と指定され、表２に列挙されたように選択されたＦｃａｂの選択及びさらなる特性評価のために、その天然形態に最も類似した膜結合立体配座で抗原を提示するために産生された。
【０２９３】
レンチウイルス形質導入は、Lenti-X HTX Packaging System（Clontech、カタログ番号631249）を使用して、ヒト又はマウスＣＤ１３７受容体を過剰発現するこれらのＤＯ１１．１０細胞を産生するために使用された。ヒトＣＤ１３７（配列番号１８５）をコードする、又はマウスＣＤ１３７（配列番号１８７）をコードするｃＤＮＡを含有するLenti-X expression vector（ｐＬＶＸ）（Clontech、カタログ番号631253）は、Lenti-X HTX Packaging Mixと共にLenti-X 293T Cell Line（Clontech、カタログ番号632180）に同時トランスフェクトして、ウイルスを生成した。次に、ＤＯ１１．１０細胞株にこれらのレンチウイルスベクターを形質導入した。
【０２９４】
これらの細胞でのヒトＣＤ１３７又はマウスＣＤ１３７の発現は、フローサイトメトリーによる細胞への２０Ｈ４．９、及びＬｏｂ１２．３抗ＣＤ１３７陽性対照抗体それぞれの結合によって確認された。細胞をヒト又はマウスの陽性対照抗体と１時間インキュベートした後、蛍光標識した抗ヒトＦｃ検出抗体（Stratech Scientific Ltd、カタログ番号109-546-098-JIR）を使用して細胞結合を検出した。
【０２９５】
カニクイザルＣＤ１３７を発現するＤＯ１１．１０細胞（配列番号１８９、「DO11.10.cCD137」と表記）も、同じレンチウイルス形質導入方法を使用して生成され、カニクイザルＣＤ１３７と抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの交差反応性を試験するために使用された。カニクイザルＣＤ１３７の発現は、前記のとおりフローサイトメトリーによる細胞への抗ＣＤ１３７陽性対照抗体（MOR7480.1、米国特許出願公開第２０１２／０２３７４９８  Ａ１号）の結合によって確認された。
【０２９６】
【表３】
2021524268.tif 000004
【０２９７】
１．３  ＣＤ４＋及びＦｃタグ付きマウス及びヒトＰＤ−Ｌ１
融合タンパク質を含むヒト及びマウスのＰＤ−Ｌ１抗原は、抗体の選択及びスクリーニングに使用するために生成された。抗原は、Ｃ末端Ｈｉｓタグ及び単量体ラットＣＤ４＋、ドメイン３及び４（ｒＣＤ４）タグ（Brown and Barclay, 1994）、二量体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又は、ヒトＰＤ−Ｌ１のみにつき、Ａｖｉタグ、（ｈＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓをもたらす（配列番号１９５）、ｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓ（配列番号１９６）、ｍＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ（配列番号１９７）、ｍＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓ（配列番号１９８）及びｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ−Ａｖｉ（配列番号１９９）のいずれかと共に発現させた。異なる形式での抗原の産生により、抗体ファージディスプレイのパニングの連続ラウンド中に、タグバインダーの除去が可能となった。抗原をコードする発現プラスミドは、Chapple et al.,2006に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクションの５日後に上清を回収し、分泌された抗原をNi-NTAセファロースアフィニティークロマトグラフィーで精製した（Schofield et al.,2007）。ｒＣＤ４及びＦｃ含有ＰＤ−Ｌ１抗原は、EZ-link Sulfo-NHS-ビオチン試薬（Thermo Fisher Scientific、製品コード21326）を使用して、製造元の推奨に従ってビオチン化された。ビオチン化反応生成物をゲル濾過し、単量体画分を回収した。単量体画分は、全ての液相ファージディスプレイの選択のために使用された。蛍光ビオチン定量キット（Thermo Fisher Scientific、製品コード46610）を使用して決定した分子あたりの平均ビオチン数は、ＰＤ−Ｌ１単量体あたり１から３ビオチンであった。
【０２９８】
実施例２：抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの選択及び特性評価
２．１  抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂのナイーブ選択
ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂを選択するために、酵母及びファージディスプレイ選択キャンペーンを採用して、同定されたＦｃａｂの多様性を最大化した。細胞表面は、両方ともヒトＣＤ１３７及び組換え二量体ヒトＣＤ１３７を表示し、二量体又は多量体ＣＤ１３７タンパク質に対して結合力駆動型選択圧を発揮するために、様々な抗原形式を提供するために使用された。単量体ＣＤ１３７への高親和性ではなく、ＣＤ１３７複合体へ強く結合するＦｃａｂを取得することは、そのようなＦｃａｂがＴ細胞刺激の後に、ＣＤ１３７のアップレギュレーションが生じる活性化及びプライミングされたＴ細胞を優先的に標的化するであろうために有益であると考えられた。理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＤ１３７膜発現のレベルが非常に低い又は無視できるＴ細胞は、タンパク質の大部分が二量体、三量体、又はそれ以上の多量体状態である高度にアップレギュレートされたＣＤ１３７を有する活性化Ｔ細胞とは異なり、単量体状態のＣＤ１３７を持つ可能性が高いと仮定された。結合力駆動型選択の結果、Ｆｃａｂは活性化Ｔ細胞に優先的に結合し、単量体ＣＤ１３７だけに表示するナイーブＴ細胞には良好に結合しない。結合力の高いＣＤ１３７  Ｆｃａｂを選択することにより、潜在的な標的外Ｔ細胞の活性化が減少し、それに伴う毒性が減少する。
【０２９９】
ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを表示する６つのナイーブファージライブラリを、ファージディスプレイによる選択に使用した。６つのライブラリーは全て、ランダム化されたＡＢループ（ＩＭＧＴ番号付けによる位置１４〜１８の残基を含む）及びランダム化されたＥＦループ（ＩＭＧＴ番号付けによる位置９２〜１０１の残基を含む）で構成された。ライブラリーの１つは、ＥＦループの１０１位に２つ又は４つのアミノ酸（２つ又は４つのＮＮＫコドンによってコードされる）のいずれかが挿入されたクローンで構成された（挿入された残基はＩＭＧＴ番号付けによる１０１．４〜１０１．１の位置にある）。
【０３００】
３２３０個のファージクローンを、二量体組換えｈＣＤ１３７抗原への結合についてファージＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、組換えＦｃは陰性対照として使用された。１１４０個のファージクローンを、DO11.10.hCD137細胞への特異的結合についてファージＦＡＣＳによりスクリーニングした。次に、個々のヒットを配列決定し、得られた７６個の固有配列をＦｃａｂクローン識別子に割り当て、ｍＡｂ２形式においてＦｃａｂクローンを発現させる目的で、ＨｅｌＤ１．３  ＩｇＧ  １重鎖発現カセットを含有するｐＴＴ５発現ベクター（National Research Council of Canada）にサブクローニングした（実施例３．２を参照）。
【０３０１】
ヒトＩｇＧ１のＣＨ１からＣＨ３ドメインを表示する４つのナイーブ酵母ライブラリーを酵母表示による選択に使用した。４つのライブラリーは全て、ＣＨ３ドメインのランダム化されたＡＢループ（ＩＭＧＴ番号付けによる位置１４から１８の残基を含む）及びランダム化されたＥＦループ（ＩＭＧＴ番号付けによる位置９２から１０１の残基を含む）で構成された。ライブラリーのうちの２つは、ＣＨ３ドメインのＡＢループの１６位に５つのアミノ酸残基を挿入することをさらに含んだ（ＩＭＧＴ番号付けによる１６．５から１６．１位の残基）。
【０３０２】
ライブラリー選択から同定された２７８４個の酵母単一クローンを、細胞をビオチン化組換え二量体ヒト抗原又はマウスＦｃフラグメントとインキュベートし、組換えｈＣＤ  １３７抗原のＦｃ部分に結合する酵母クローンと区別することを含むフローサイトメトリー抗原結合アッセイを使用して、抗原結合についてスクリーニングした。ヒット数を増やすために、誘導温度を上げる、選択ストリンジェンシーを下げる、又はラウンド数を減らすなど、様々な抗原濃度及び条件で選択を繰り返した。ヒット配列により、かなり低いアウトプット多様性が明らかになり、特定された固有配列を有するＦｃａｂクローンは、ＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−１７３、ＦＳ２２−１７４、ＦＳ２２−１７５、ＦＳ２２−１７６、ＦＳ２２−１７７、ＦＳ２２−１７８及びＦＳ２２−１７９の９つだけであった。
【０３０３】
２．２  「モック」ｍＡｂ２形式における抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの調製
ファージから単離された７６個の抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂクローン及び酵母選択から単離された９個のクローンを含むＩｇＧ１分子からなる「モック」ｍＡｂ２抗体は、ｍＡｂ２形式でＦｃａｂの特性評価を可能にするために産生した。モックｍＡｂ２は、抗鶏卵リゾチーム抗体ＨｅｌＤ１．３のＣＨ３ドメインの対応する領域に対して、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループを含むＣＨ３ドメインＦｃａｂの一部を置換することにより調製した。ＨｅｌＤ１．３抗体の生成は、Tello et al.1993に記載されている。抗体ＨｅｌＤ１．３の重鎖及び軽鎖配列は、それぞれ配列番号１９１及び１５９に示されている。モックｍＡｂ２分子がＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中での一過性発現によって産生された。産生されたタンパク質の量を評価するために、PALL（18-5021）のプロテインＡ定量バイオセンサーを備えたOctet QKeプラットフォームを使用して、バイオレイヤー干渉法によってＩｇＧタンパク質含有量を定量した。タンパク質を、mAb SelectSureカラムを使用したプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。５３個のファージ由来ＣＤ１３７ｍＡｂ２タンパク質は、検出閾値を下回る測定値を示し、そのため、さらなる分析には不適であると判断された。３２ｍＡｂ２を、mAb Select SuReプロテインＡカラム（GE Healthcare、11003494）を使用して精製した。
【０３０４】
次に、これらのｍＡｂ２の選択を、Octet QKeプラットフォームを使用したバイオレイヤー干渉法（BLI）を使用して、ヒト組換え抗原（ビオチン化ｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ）への結合について試験した。１２個のｍＡｂ２は、結合せず、１９個はＣＤ１３７コーティングセンサーに結合した（ＦＳ２２−００７、ＦＳ２２−０３３、ＦＳ２２−０４２、ＦＳ２２−０４９、ＦＳ２２−０５０、ＦＳ２２−０５２、ＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−０５４、ＦＳ２２−１６９、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−１７３、ＦＳ２２−１７４、ＦＳ２２−１７９、ＦＳ２２−１８０、ＦＳ２２−１８１、ＦＳ２２−１８３、ＦＳ２２−１８７、ＦＳ２２−１９４、ＦＳ２２−１９５）。
【０３０５】
２．３  ヒトＮＦ−κＢレポーターアッセイにおける選択された抗ＣＤ１３７モックｍＡｂ２の活性
ＴＮＦＲシグナル伝達には多量体化及びクラスター化が必要である（Bitra et al.,2017）。ＣＤ１３７は、ＮＦ−κＢ同族のリガンドであるＣＤ１３７Ｌと相互作用する場合、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路をクラスター化し活性化する。アゴニスト分子は、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を促進するリガンドを模倣し、それによってＮＦ−κＢシグナル伝達経路を活性化する。一部のアゴニスト性抗体は、例えば、ウレルマブのように、結合時にＣＤ１３７クラスター化を本質的に引き起こすことができ、一方で、他の抗体は、例えば、ウトミルマブのように、ＣＤ１３７クラスター化を誘導するために抗体自体の追加の架橋を必要とするものも知られている（Fisher et al,2012）。エフェクター細胞上のＦｃガンマ受容体は、インビボでそのような架橋を誘導することが知られているが、これは非効率的であり、治療上の関心のある部位から離れて発生する可能性がある。用量制限毒性はウレルマブに関連しているがウトリムマブには関連していないため、本質的にアゴナイズする能力を持たない抗ＣＤ１３７結合Ｆｃａｂを選択するが、ＣＤ１３７クラスター化を誘導するために追加の架橋を必要とするもののみを選択することにした。そこで、架橋抗体により細胞表面に発現させたＣＤ１３７のクラスター化することにより、細胞内のＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化を検出できるが、抗体が架橋されていない場合には、ほとんど活性を示さないアッセイを開発した。次に、このアッセイは、ＦｃａｂがＢＬＩによって組換え抗原に結合することが見出されたかどうかにかかわらず、モックｍＡｂ２形式における２７個の抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂクローン、及び抗ＣＤ２０ｍＡｂ２形式における６個の抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂクローンのアゴニスト性機能活性を試験するために使用された。
【０３０６】
これは、アッセイにおいてＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化により測定できる。タンパク質Ｌを架橋剤として使用して、アッセイにおけるＦａｂ部分を介して、モックｍＡｂ２架橋を促進し、ＮＦ−κＢ活性化を測定した。
【０３０７】
ヒトＣＤ１３７をコードするｃＤＮＡ（配列番号１８５）をEcoRI-HF及びXhoI制限酵素を使用して、pMSCV-ネオマイシンベクター（Takara Clontech、Cat.634401）にサブクローニングした。RetroPack PT67細胞株（Clontech、Cat.631510）を、製造元のプロトコルに従ってレトロウイルス粒子を産生するために使用した。その後、このレトロウイルスを用いて、ルシフェラーゼの発現を制御するＮＦ−κＢ感受性プロモーターを含有するQiagen Cignal Lenti NFkB リポーター（ｌｕｃ）（Qiagen、カタログ番号336851）レンチウイルスを用いて、Flp-In T-REx 293 HEK細胞株（Life Technologies、R780-07）を形質導入することによって以前に産生されたＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞を形質導入した。これらのHEK.FRT.luc.hCD137細胞を使用して、選択において同定されたＣＤ１３７結合体を含有するモックｍＡｂ２をスクリーニングした。
【０３０８】
各モックｍＡｂ２の２μＭ希釈をＤＰＢＳ（Life Technologies、14190169）中で調製し、レポーター細胞培地（ＤＭＥＭ（Gibco、Cat.61965-026）；１０％ＦＣＳ（Gibco、Cat.10270-106）；PennStrep１個（Gibco、Cat.15140-122）；ブラスチシジン１５μｇ／ｍｌ（Melford Laboratories Ltd、Cat.B1105）；ピューロマイシン５μｇ／ｍｌ（Life technologies、Cat.A11113803）；ゼオシン１００μｇ／ｍｌ（InvivoGen、Cat.11006-33-0）；ジェネチシン５００μｇ／ｍｌ（Life Technologies、Cat.10131-027）中で１：３にさらに希釈した。タンパク質Ｌ（Life Technologies、21189）を、人工架橋剤として使用し、ｍＡｂ２分子と１：４のモル比で混合した。２４時間のインキュベーション後、細胞を１００μｌのPromega Bio-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promegaカタログ番号G7941）で製造元の指示に従って処置し、Gen5 Software、BioTekを備えたプレートリーダーで０．５秒の積分時間で発光を測定した。発光値は、架橋Ｆｃａｂによって誘導されるＣＤ１３７のクラスター化によるＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化に応答して産生されるルシフェラーゼの尺度である。発光値をＦｃａｂの対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０３０９】
ヒットは、架橋されていない場合と比較して、タンパク質Ｌで架橋された場合に、ルシフェラーゼシグナルが少なくとも１０倍増加することによって識別された。これらのクローンは、ＣＤ１３７のクラスター化及びそれに続く下流シグナル伝達経路の活性化を誘導できると判断された。試験した全てのクローンのうち、２つは架橋時、ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２、ルシフェラーゼのこの１０倍の増加を誘導できたが、ＥＣ５０はどちらも決定できなかった。両方ともＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおいてのさらなる特性評価のために選択された。驚くべきことに、ＢＬＩによってＣＤ１３７標的に結合しているにもかかわらず、架橋状態にある残りのクローンは、活性が観察されなかったことから、おそらくそれらがＣＤ１３７上の無関係なエピトープで結合していたか、又はそのようなクローンの親和性が、ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードを開始するのに十分強くＣＤ１３７に結合するのに十分ではなかったことを示している。
【０３１０】
全体として、３０を超えるＦｃａｂが試験され、ナイーブ選択から２つのＦｃａｂ（ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２）のみが同定され、架橋する場合、ＮＦ−κＢレポーターアッセイで目的の機能を示し、架橋しない場合ほとんど活性がなかった。
【０３１１】
２．４  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおける選択された抗ＣＤ１３７モックｍＡｂ２活性
活性化Ｔ細胞上のアゴニスト分子を介したＣＤ１３７クラスター化は、Ｔ細胞の活性化及び下流のシグナル伝達を誘発し、その結果ＩＬ−２産生をもたらすが、これに限定されるものではない。ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２はＮＦ−κＢレポーターアッセイにおいて、活性があることが確認されたため、ＣＤ１３７を活性化するそれらの能力をＴ細胞活性化アッセイで試験した。ヒトＣＤ１３７を過剰発現するように操作されたＤＯ１１．１０Ｔ細胞を使用してＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイが開発され、ＩＬ−２放出を測定することにより、Ｔ細胞活性化が評価された。
【０３１２】
ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞（National Jewish Health）に、前述のように、マウス又はヒトＣＤ１３７を過剰発現するように設計されたレンチウイルスベクターを形質導入した。ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２と同様に、次のクローンがこのＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイで試験された。ＦＳ２２−００７、ＦＳ２２−０３３、ＦＳ２２−０４２、ＦＳ２２−０４９、ＦＳ２２−０５０、ＦＳ２２−０５２、ＦＳ２２−０５４（全て「モック」ＨｅｌＤ１．３ｍＡｂ２形式）。ｍＡｂ２又は２０Ｈ４．９陽性対照ｍＡｂを、組換えタンパク質Ｌ（Life Technologies、21189）架橋剤を有する又は有しないいずれかで希釈して調製し、一晩０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（クローン17A2、BioLegend、100208）でコーティングした９６ウェルの丸底プレートに入れられたDO11.10.hCD137細胞に添加した。１８時間のインキュベーション後、上清を回収し、製造元の指示に従ってマウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、88-7024-86）でアッセイした。Gens Software、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から５７０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gens Software、BioTek）に基づいていた。ｍＩＬ−２の濃度をｍＡｂ２又はベンチマークｍＡｂの対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０３１３】
クローンＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２は、このアッセイにおいてタンパク質Ｌと架橋する場合、顕著に活性が増強されたことを示した。ＦＳ２２−０５３は、架橋されていない場合に１２６ｎＭの活性、及び架橋された場合に２１ｎＭの活性を有し（６倍の改善）、ＦＳ２２−１７２は、架橋されていない場合に９５０ｎＭの活性及び架橋された場合に４４ｎＭの活性を有した（２２倍の改善）。その結果、両方のクローンが親和性成熟のために選択された。
【０３１４】
実施例２．４は、ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２が、試験したｍＡｂ２形式のタンパク質Ｌによって架橋された場合に、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞の表面でＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を促進できることを示している。
【０３１５】
実施例３：抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの親和性成熟及びその後の特性評価
前述のように、ＮＦ−κＢレポーターアッセイ、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおける機能特性に基づいて、親和性成熟のために２つのクローン（ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２）を選択した。
【０３１６】
３．１  ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２の親和性成熟
ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２Ｆｃａｂクローンから４つの酵母ディスプレイライブラリを構築した。各クローンのＣＨ３ドメインのＡＢループでＥＬＬＡプライマーを使用して７つの残基（ＩＭＧＴによる位置１５〜１６．１）をランダム化し、ライブラリーＦＳ２２−０５３ＡＢ及びＦＳ２２−１７２ＡＢを作成した。ＣＨ３ドメインのＥＦループでＥＬＬＡプライマーを使用して５つの残基（ＩＭＧＴによる位置９２〜９４及び９７〜９８）をランダム化し、ライブラリーＦＳ２２−０５３ＥＦ及びＦＳ２２−１７２ＥＦを得た。
【０３１７】
ライブラリーＦＳ２２−０５３ＡＢ及びＦＳ２２−０５３ＥＦ、並びにＦＳ２２−１７２ＡＢ及びＦＳ２２−１７２ＥＦについて、二量体ｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ抗原又は単量体ｈＣＤ１３７−Ａｖｉ−Ｈｉｓ抗原を使用して、親和性成熟クローンについて選択するために酵母ライブラリーで３回又は４回の選択ラウンドを実行した。単量体抗原を二量体抗原と交互に使用して、クローンが抗原に対する親和性を保持し、結合力を介してのみに結合しないようにした。単量体又は二量体抗原の使用、及び使用される濃度は、フローサイトメトリーによって各ラウンド中に経験的に決定され、単量体又は二量体抗原に対する濃縮が前のラウンドで観察されたかどうかによって決定された。可能な場合はいつでも、親分子と比較して親和性成熟クローンを単離するために、親分子の上のソーティングゲートを使用した。選択圧は、二量体抗原の１ｎＭまで増加した。各選択ラウンド中に、個々のクローンを寒天プレートにスポットして、選択の進行状況を評価した。各クローンを個別に増殖及び誘導し、次に、その結合及び構造パラメーターを、前述のように、ビオチン化二量体抗原及び抗ＣＨ２構造マーカーを使用してフローサイトメトリーによって決定した。このスクリーニングカスケードに続いて、選択アウトプットからのクローンのサンプルに基づいて選択の成功の決定を可能にし、その後可溶性タンパク質として生成することができる個々のクローンの早期スクリーニングを可能にした。
【０３１８】
合計１１５２個の酵母単一クローンを、前述のように抗原結合フローサイトメトリーでビオチン化組換え抗原への結合についてスクリーニングした。ＦＳ２２−０５３ＥＦライブラリーでの選択により、１３８個の固有のループ配列を強化した。同様に、３０個の固有のループ配列をＦＳ２２−１７２ＡＢライブラリーから単離した。ライブラリーＦＳ２２−０５３ＡＢ及びＦＳ２２−１７２ＥＦには、親クローンを上回る結合改善を示したクローンは含まれていなかった。ＦＳ２２−０５３ＥＦ及びＦＳ２２−１７２ＡＢライブラリーからの最良の結合クローン全体の配列分析により、ＡＢループ内の保存されたＰＰＹ配列パターンが明らかになった。
【０３１９】
保存されたＰＰＹモチーフの存在は、プロリン残基の限られた柔軟性に基づいて、より剛性又は露出したループを導入することにより、拡張された結合領域の形成を促進してもよい。或いは、プロリンに富んだ配列がＳＨ３ドメインタンパク質の芳香族配列に結合することが実証されているため、ＰＰＹ配列は、これらのクローンの結合に関与する特定の保存モチーフを表していてもよい。さらに、ＰＰＹ保存配列は、Ｆｃａｂの異なる２つの系統で独立して選択されているため、ＣＤ１３７でのエピトープ結合に重要であってもよい。さらに、ＦＳ２２−０５３系統及びＦＳ２２−１７２系統の両方のクローンのＣＨ３ドメインのＥＦループに保存されたＬＥ又はＬＤ配列パターンは、ＥＦループにおけるこのアミノ酸モチーフが結合の改善に必要であることを示唆している。
【０３２０】
選択の進行及び親和性成熟クローン間で変異したＡＢループ及びＥＦループを再結合する必要があるかどうかを評価するために、ＦＳ２２−０５３ＥＦライブラリーの上位５つの固有クローン（ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２）は、１０ｎＭの二量体ヒト抗原（フローサイトメトリー結合アッセイにおいて３０％を超えるＡＰＣ陽性細胞）への特異的結合を示すことによってランク付けされ、ＦＳ２２−１７２ＡＢライブラリーの上位６つの固有クローン（ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、同様のアッセイで１０ｎＭの二量体ヒト抗原でスクリーニングした場合、全て１０％を超えるＡＰＣ陽性細胞を示す）は、ランダム化ループの機能的及び速度論的改善を評価するために、モックｍＡｂ２（ＨｅｌＤ１．３）及びモデルｍＡｂ２（ＰＤ−Ｌ１）として産生された。
【０３２１】
３．２  「モック」及び「モデル」ｍＡｂ２形式における抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの構築
親ＦＳ２２−０５３クローン（ＦＳ２２−０５３−００１からＦＳ２２−０５３−０１６）に由来する１６の親和性成熟クローン、及び親ＦＳ２２−１７２クローン（ＦＳ２２−１７２−００１からＦＳ２２−１７２−００６）に由来する６つの親和性成熟クローンを「モック」及び「モデル」ｍＡｂ２形式で調製した。クローンＦＳ２２−０５３−００１からＦＳ２２−０５３−００７は、さらなる試験及び特性評価のための下流精製を可能にするレベルでｍＡｂ２形式において発現しなかったため、さらに追跡されなかった。
【０３２２】
ＨｅｌＤ１．３における抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂを含む「モック」ｍＡｂ２抗体は、ｍＡｂ２形式の親和性成熟Ｆｃａｂのさらなる特性評価のために調製された。これらのｍＡｂ２は、実施例２．２で記載したように調製した。
【０３２３】
抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂ及びＰＤ−Ｌ１結合Ｆａｂ領域（米国特許第８，２１７，１４９ Ｂ２号からのクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）を含む「モデル」ｍＡｂ２もまた産生された。これらは、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ含有抗ＰＤ−Ｌ１結合抗体のＣＨ３の一部をＦｃａｂの対応する領域で置換することにより、実施例２．２に記載の方法と類似の方法で調製した。これらのＰＤ−Ｌ１モデルｍＡｂ２は、ＣＨ２ドメイン（ＡＡ）にＬＡＬＡ変異を含んでいた。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインにＬＡＬＡ変異の導入は、すると、Ｆｃγ受容体結合の低下が知られている（Bruhns,P.,et al. (2009)及びHezareh M.,et al. (2001)）。
【０３２４】
CD137/HelD1.3「モック」及びCD137-AA/PD-L1「モデル」ｍＡｂ２をＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中で一過性発現によって産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製した。
【０３２５】
３．３  ヒトＮＦ−κＢレポーター細胞アッセイにおけるモックｍＡｂ２形式におけるヒトＦｃａｂの活性
列挙されたモックｍＡｂ2（ＨｅｌＤ１．３）形式の親和性成熟抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの機能的活性を、実施例２．３に記載された同様のＮＦ−κＢルシフェラーゼアッセイで試験した。Gen5 Software、BioTekを備えたプレートリーダーで０．５秒の積分時間で発光を測定した。予想通り、Ｆｃａｂはタンパク質Ｌ架橋（−ＸＬ）なしでは活性を示さなかった。全ての親和性成熟ＣＤ１３７  Ｆｃａｂは、親ＣＤ１３７  Ｆｃａｂよりも大きな改善を示し、このアッセイにおいては陽性であるが、ＥＣ５０値の計算は不可能であった（実施例２．３参照）ＦＳ２２−０５３−００８及びＦＳ２２−１７２−００３は、たんぱく質Ｌ（＋ＸＬ）で架橋した場合、最も低いＥＣ５０（それぞれ２６．３４ｎＭ及び３２．６４ｎＭ）で各ファミリーから最高の活性を示した。
【０３２６】
３．４  ヒトＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおけるモデルｍＡｂ２形式の親和性成熟ヒトＦｃａｂの活性
モデルｍＡｂ2（ＰＤ−Ｌ１  ＬＡＬＡ）形式の親和性成熟ヒトＦｃａｂの機能的活性を、実施例２．４で記載したアッセイと類似のＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイで試験した。
【０３２７】
ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して、マウスＰＤ−Ｌ１（配列番号１８７）をコードするｃＤＮＡをpcDNA５ＦＲＴベクター（Life Technologies）にサブクローニングし、リポフェクタミン２０００（Life Technologies、11668-019）を使用して、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞株（Life Technologies、R780-07）に形質転換することにより、ＨＥＫ．ｍＰＤ−Ｌ１細胞を産生した。細胞を、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）及び１５μｇ／ｍｌブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）を含有するＤＭＥＭで、安定的に形質転換された細胞のコロニーが形成されるまで３〜４週間増殖させた。これらのコロニーを１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Sigma Aldrich、D9891）の存在下で増幅し、ＰＥコンジュゲート抗マウスＰＤ−Ｌ１（ＭＩＨ５）抗体（BD Biosciences、558091）を使用してＰＤ−Ｌ１の発現について試験した。
【０３２８】
細胞解離緩衝液を使用して細胞を解離し、ＰＢＳで１度洗浄し、２ｘ１０５個の細胞を９６ウェルプレートのウェルにプレートし、その後ＰＢＳで１：２０に希釈した抗体で、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、Accuri C6サイトメーター（BD Biosciences）で測定し、FlowJoXを使用してデータを分析した。マウスＰＤ−Ｌ１の発現が再度確認された。
【０３２９】
ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２において、実施例３．２で産生された１５個のクローンを、このＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイで試験した。ｍＡｂ２又は陽性対照ｍＡｂの希釈液を調製し、DO11.10.hCD137（７．５ｘ１０３細胞／ウェル）及びＨＥＫ．ｍＰＤ−Ｌ１細胞（２ｘ１０４細胞／ウェル）のいずれか、又はDO11.10.hCD137（７．５ｘ１０３細胞／ウェル）及びｍＰＤ−Ｌ１を発現するように導入されていないＨＥＫ細胞（２ｘ１０４細胞／ウェル）を０．１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（クローン１７Ａ２、BioLegend、100208）で一晩コーティングした９６ウェル平底プレートに添加した。１８時間のインキュベーション後、上清を回収し、製造元の指示に従ってマウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、88-7024-86）でアッセイした。Gens Software、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から５７０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gens Software、BioTek）に基づいていた。ｍＩＬ−２の濃度をｍＡｂ２又はベンチマークｍＡｂの対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。Ｔ細胞活性化は、ｍＩＬ−２の放出を測定することによって検出された。
【０３３０】
ＰＤ−Ｌ１発現細胞に結合することによる架橋なしでは、Ｔ細胞活性は観察されなかった。架橋に伴い、全てのｍＡｂ２は、高レベルのｍＩＬ−２及びナノモル濃度以下のＥＣ５０値の放出によって見られるように、強力なＴ細胞活性を示した。ＦＳ２２−０５３−００９及びＦＳ２２−１７２−００５以外の全てのクローンは、ＥＣ５０が０．３ｎＭ未満であったため、陽性対照より良好でないとしても、同程度良好であった（抗ヒトＣＤ１３７ｍＡｂ、G1-AA/20H4.9）。最大Ｔ細胞活性化の尺度であり、インビボでより大きなＴ細胞抗腫瘍活性に関連している可能性がある最小Ｅｍａｘは、７７５８ｐｇ／ｍｌであり、これは陽性対照（抗ヒトＣＤ１３７ｍＡｂ、G1-AA/20H4.9）よりも高いことが観察された。
【０３３１】
３．５  初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイ
ＣＤ１３７を過剰発現するＴ細胞上でＣＤ１３７を活性化するＦｃａｂの能力を実施例３．３に示した。ＣＤ１３７を過剰発現するように操作されていない細胞に対するＦｃａｂの活性を試験するには、初代ヒトＴ細胞アッセイが必要であった。活性化細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、癌細胞を直接殺傷するのに関与し、それらの細胞表面にＣＤ１３７を発現する（Ye et al,2014）。ＣＤ１３７のクラスター化は、下流のシグナル伝達及びさらなるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化の誘導に不可欠であることが知られている。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイを使用して、Ｆｃａｂ（以下に詳述するｍＡｂ２形式）がＣＤ１３７のクラスター化及び下流シグナル伝達を駆動する能力を評価した。ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、ｈＩＬ−２の放出を測定することによって検出された。
【０３３２】
Ｔ細胞を単離するために、血小板提供の副産物である白血球枯渇コーンから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収した。簡単に説明すると、白血球コーンの内容物をＰＢＳで洗い流し、フィコール（Sigma-Aldrich、1440-02）勾配に重ねた。ＰＢＭＣを遠心分離により回収し、フィコール勾配を通過しなかった細胞を回収した。ＰＢＭＣをさらにＰＢＳで洗浄し、残りの赤血球を、製造元の指示に従って１０ｍｌ  １Ｘの赤血球溶解緩衝液（eBioscience、00-4300-54）の添加により溶解した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec Ltd、130-096-495）を製造業者の指示に従って使用して、溶出液中に存在するＰＢＭＣから単離した。
【０３３３】
抗ＣＤ３抗体とのインキュベーションは、Ｔ細胞の初期活性化を促進するための最初のシグナルとして使用された。９６ウェル平底組織培養プレートを、ＰＢＳ中の８μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１、R&D Systems、MAB100-SP）で、４℃で一晩コーティングした。次にプレートを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。
【０３３４】
ＰＤ−Ｌ１モデルｍＡｂ２形式における親和性成熟ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの細胞ベースの架橋のために、実施例５．３に記載したように、マウスＰＤ−Ｌ１の代わりにヒトＰＤ−Ｌ１配列（配列番号１８５）をコードするｃＤＮＡをサブクローニングすることにより、ヒトＰＤ−Ｌ１（ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を産生した。ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞を２×１０５細胞／ウェルで、抗ＣＤ３抗体（８μｇ／ｍｌ）でコーティングした９６ウェル平底プレート上に１００μｌのＴ細胞培養培地（１０％ＦＢＳ（Life Technologies）、１Ｘペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies、15140122）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070）、１０ｍＭヘペス（Sigma-Aldrich、H0887）、２ｍＭＬ−グルタミン（Sigma-Aldrich、G7513）及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Gibco、M6250）を含むＲＰＭＩ培地（Life Technologies、61870-044））でプレーティングした。ｈＰＤ−Ｌ１を発現するように形質導入されなかったＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞又はＨＥＫ細胞が４時間のインキュベーション後に付着した時点で、全てのＴ細胞培養培地を除去し、Ｔ細胞を含有する１００μｌのＴ細胞培養培地で５．０×１０５細胞／ｍｌの濃度で置き換え、５．０×１０４細胞／ウェルを得た。
【０３３５】
ｍＡｂ２を、５００ｎＭで開始する２倍の最終濃度でＴ細胞培地中に希釈し、１：３滴定を実行した。１００μｌのｍＡｂ２滴定を２００μｌの総アッセイ体積及び１倍の抗体濃度ために細胞に添加した。
【０３３６】
陽性対照抗ＣＤ１３７抗体（G1-AA/20H4.9）及び陰性対照アイソタイプＩｇＧ抗体（G1-AA/HelD1.3）をそれぞれ、５００ｎＭ架橋剤（抗ヒトＣＨ２、自社製造（Jefferis et al.,1985及びJefferis et al.,1992）（mG1/MK1A6））を含有する５００ｎＭで開始する２倍の最終濃度でＴ細胞培地中に希釈し、１：３滴定を実行した。１００μｌの希釈した陽性対照抗体／架橋剤混合物又は陰性対照ＩｇＧ抗体／架橋剤混合物を、合計２００μｌのアッセイ体積及び１倍の抗体濃度のために細胞に添加した。
【０３３７】
このアッセイを、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。上清を回収し、製造元の指示に従ってヒトＩＬ−２ELISA Ready-SET-Go!キット（eBioscience、カタログ番号88-7025-88）でアッセイした。Gen5 Software、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０３３８】
陽性対照抗ヒトＣＤ１３７ｍＡｂである２０Ｈ４．９は、抗ｈＣＨ２抗体（mG1/MK1A6）で架橋する場合、０．５ｎＭのＥＣ５０でｈＩＬ−２放出の増加を示す。全てのクローンは、アッセイにおいて活性を有し、大部分はナノモル濃度以下のＥＣ５０で良好な効力を示した。Ｆｃａｂ含有ｍＡｂ２は、ＦＳ２２−０５３−００７、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ  ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００５が０．１９〜０．４９ｎＭの範囲で、最も低いＥＣ５０で最大のＴ細胞応答を誘導した。ｍＡｂ２のサブセット（Ｆｃａｂ含有ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−１７３−００３及びＦＳ２２−１７２−００４）も、ＨＥＫ細胞上で発現されたＰＤ−Ｌ１による架橋なしで試験され、予想されたように、このアッセイにおいて活性を示さなかった。これにより、ＮＦ−ｋＢアッセイ及びＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイで見られる活性が確認される。
【０３３９】
３．６  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの特異性決定
他の関連するＴＮＦＳＦＲファミリーメンバーと比較したヒトＣＤ１３７に対する抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの特異性を試験した。Ｆｃａｂのうち８つを、モックｍＡｂ２（ＨｅｌＤ１．３）形式で試験し、他のヒトＴＮＦＲＳＦ受容体：ＣＤ４０、ＯＸ４０及びＧＩＴＲへの結合を試験することにより、Biacore T200（GE Healthcare）でＳＰＲによって測定された。アミンカップリング（アミンカップリングキット、GE Healthcare、BR-1000-50）を使用して、Biacore CM5チップ（GE Healthcare、カタログ番号２９１４９６０３）でヒトＣＤ４０、ＧＩＴＲ、及びＯＸ４０を約１０００ＲＵにコーティングした。１μＭから開始のモックｍＡｂ２形式での抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの希釈液（FS22-053-008/HelD1.3、FS22-053-009/HelD1.3、FS22-053-010/HelD1.3、FS22-053-011/HelD1.3、FS22-053-012/HelD1.3、FS22-053-014/HelD1.3、FS22-172-003/HelD1.3、FS22-172-004/HelD1.3）を、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（BR100669）で調製し、３０μｌ／分で３分間注入した後、緩衝液中で４分間解離した。チップを、１０ｍＭグリシンｐＨ２．５を３０μｌ／分で１２秒間注入することにより再生した。異なるＴＮＦＲＳＦメンバーに特異的な抗体を、Biacoreチップコーティングを検証するための陽性対照として使用した。データを、二重参照減算し、BIAevaluation３．２ソフトウェアを使用して分析した。Ｆｃａｂは、試験したＴＮＦＲＳＦ受容体のいずれにも結合せず、ＣＤ１３７に対する特異性を示した。結果として、Ｆｃａｂ、又はこれらのＦｃａｂから抗原結合部位を含むｍＡｂ２は、ＣＤ１３７以外のいかなるものへ非標的結合を誘発することは期待されていない。
【０３４０】
３．７  ＳＰＲによるヒト、カニクイザル及びマウスＣＤ１３７に対するモックｍＡｂ２形式における抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの結合親和性及びＦＳ２２−０５３−０１７の生成
ヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏ）及びマウスＣＤ１３７に対するモックｍＡｂ２形式（実施例３．２参照）における抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂ（ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００４）の親和性をＳＰＲで測定し、Ｆｃａｂが動物試験での試験に有用であり得るかどうかを決定した。抗ヒトＦａｂ捕捉抗体を、製造業者の推奨（GE Healthcare、ヒトＦａｂキャプチャーキット、#28958325）に従って、平均表面密度６０００ＲＵになるように、ＣＭ５シリーズＳチップ（GE Healthcare#BR-1005-30）の４つのフローセル全てに固定化した。２５℃及び１０μｌ／分の流速での固定化は、６０００ＲＵの平均最終応答を達成した。各ｍＡｂ２は、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（GE Healthcare#BR1006-69）で希釈したｍＡｂ２の３μｇ／ｍｌ溶液を３０μｌ／分で６０秒間注入することにより、約１５０ＲＵまで捕捉した。次に、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中の異なる濃度のヒト、Ｃｙｎｏ又はマウスＣＤ１３７抗原（非ビオチン化ヒト、ｃｙｎｏ又はマウスＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ又はヒトＣＤ１３７−Ａｖｉ−Ｈｉｓ）を、６０μｌ／分で３分間チップ上に流し、次いで１０分間解離させた。各抗原濃度の後、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１を３０μｌ／分の流速で３０秒間感染させることにより、チップを再生した。緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋を、参照減算のために、最高濃度の抗原の前及び最低濃度の抗原の後に注入し、ランダムな濃度の１つを２回繰り返した。結合速度論を、１：１ラングミュアモデルに適合させて、各サンプルにつき平衡結合（ＫＤ）を生成した。データ分析は、BiaEvaluationソフトウェアバージョン３．２を使用して実行された。結果を表３に示す。
【０３４１】
結果の分析は、それぞれの親分子と比較して、全ての親和性成熟クローンによるヒト及びカニクイザルＣＤ１３７の両方に対する結合が改善されていることが明らかになった。単量体のヒトＣＤ１３７抗原に対する結合親和性は、二量体のヒト及びｃｙｎｏＦｃ融合抗原よりも弱かった（少なくとも１００倍）。実施例２．１で議論ように、Ｆｃａｂは、ＣＤ１３７の単量体型よりも二量体に優先的に結合するように選択され、このデータは、選択戦略が成功したことを確認する。この速度論的挙動により、刺激されていないＴ細胞上で最小限のレベルで発現する単量体ＣＤ１３７に結合する可能性が低くなり、その結果、いくつかの抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体療法に関連する肝臓又は全身毒性のリスクが低減される。
【０３４２】
データはまた、抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂが、ヒト二量体ＣＤ１３７と同等の親和性でカニクイザル二量体ＣＤ１３７に結合したことを示す。
【０３４３】
【表４】
2021524268.tif 000005
【０３４４】
マウス二量体ＣＤ１３７に結合するモックｍＡｂ２形式におけるＦｃａｂの能力も試験した。クローンＦＳ２２−０５３−０１４はマウス抗原に対して２４ｎＭのＫＤを有することが驚くべきことに見出されたクローンＦＳ２２−０５３−０１４を除いて、いずれのクローンもマウス抗原（表中のＮ／ＡはＫＤが算出できなかったことを示す）に強い結合を示さなかった。マウスＣＤ１３７及びヒトＣＤ１３７の配列相同性は５７％未満を共有するため、これは予想外であった。
【０３４５】
ＦＳ２２−０５３−０１４の配列分析は、そのＣＨ３ドメインのＥＦループの位置９８で翻訳後のアスパラギン酸異性化を引き起こす可能性のある配列の責任を明らかにした。位置９８のアスパラギン酸（Ｄ）は、製造元の推奨に従って、QuickChange II mutagenesisキット（Agilent、カタログ番号200523）を使用して、部位特異的変異誘発法により、グルタミン酸（Ｅ）に変異し、クローンＦＳ２２−０５３−０１７が得られた。
【０３４６】
次に、この変異が、ＦＳ２２−０５３−０１４クローンと比較して、ＦＳ２２−０５３−０１７クローンの結合親和性又は機能活性に負の影響を与えなかったことを確認するために実験が行われた。
【０３４７】
ヒトＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ抗原及びマウスＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ−Ａｖｉをそれぞれ使用したBiacore T200 systemのＳＰＲにより、ＦｃａｂクローンＦＳ２２−０５３−０１７の平衡解離定数（ＫＤ）をクローンＦＳ２２−０５３−０１４のそれと比較した。その結果は、両方のＦｃａｂクローンについて、ヒト抗原と非常に類似した速度論的プロファイルを示し、それにより、位置９８のアスパラギン酸をグルタミン酸に変異させてもヒト抗原への結合に対して負の影響がなかったことを証明した。この結果は、ＦＳ２２−０５３−０１７がマウスＣＤ１３７抗原に対する結合強度の２倍の減少を示したことを示した。
【０３４８】
ＦｃａｂクローンＦＳ２２−０５３−０１７をサブクローン化し、ＨｅｌＤ１．３「モック」ｍＡｂ２として発現させ（実施例２．２参照）、次に、実施例２．４に記載されているヒトＣＤ１３７ＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、同じくＨｅｌＤ１．３ｍＡｂ２形式のＦＳ２２−０５３−０１４クローンと比較した。G1-AA/20H4.9を抗ＣＤ１３７陽性対照として使用し、G1-AA/HelD1.3をＩｇＧ対照として使用した。ｍＡｂ２を、タンパク質Ｌ架橋なしで試験した又は、タンパク質Ｌと１：４の比率で架橋した。
【０３４９】
その結果は、同じＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、タンパク質Ｌにより架橋した場合、モックｍＡｂ２形式のＦＳ２２−０５３−１７Ｆｃａｂ及びモックｍＡｂ２形式のＦＳ２２−０５３−０１４の両方は、同等の活性を有することを示した。したがって、実施された変異誘発は、機能活性に負の影響を与えなかった。モックｍＡｂ２形式における両方のクローンは、架橋なしで活性を有さなかった。
【０３５０】
３．８  抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの親和性成熟及び特性評価の概要
要約すると、親和性成熟抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂを生成し、ｍＡｂ２形式に調製され、その後特性評価された。ＣＨ３ドメインにこれらのＣＤ１３７抗原結合ドメイン含有ｍＡｂ２は、ヒトＮＦ−κＢリポーター細胞アッセイにおいて高いレベルの活性を示し、この活性は架橋依存性であることが示された。ＦＳ２２−０５３−００８及びＦＳ２２−１７２−００３Ｆｃａｂからの抗原結合ドメイン含有ｍＡｂ２は、このアッセイにおいて最も優れた活性を示した。
【０３５１】
さらに、ｍＡｂ２がこれらのＦｃａｂから調製された場合、ＣＤ１３７抗原結合ドメイン及びＰＤ−Ｌ１結合Ｆａｂ領域、並びにＣＨ２ドメインにおけるＬＡＬＡ変異を含み、Ｆｃγ受容体への結合を減少又は抑制することが示され、次にｍＡｂ２は、ヒトＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイで強力なＴ細胞活性を有し、この活性は、ＰＤ−Ｌ１発現細胞に結合することによる架橋に依存することが示された。ｍＡｂ２は、初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおいて架橋依存性活性を有することも示され、これらの親和性成熟ＣＤ１３７抗原結合ドメイン含有ｍＡｂ２が、ＣＤ１３７のアゴニスト作用を効果的に誘導できること、及びこのアゴニスト活性は、架橋を条件とするというさらなる証拠を提供した。
【０３５２】
抗ヒトＣＤ１３７抗原結合ドメイン含有ｍＡｂ２はまた、ＣＤ１３７に特異的であり、他のＴＮＦＲＳＦメンバーには結合しないことが示された。ｍＡｂ２は、単量体のヒトＣＤ１３７抗原よりもヒト二量体ＣＤ１３７抗原に優先的に結合することが示された。最後に、これらのｍＡｂ２は、二量体ヒトＣＤ１３７と同等の親和性を持つ二量体カニクイザルＣＤ１３７に結合することが示された。
【０３５３】
一つのＦｃａｂクローンであるＦＳ２２−０５３−０１４は、驚くべきことにマウスＣＤ１３７にも結合することができることが見出された。ＦＳ２２−０５３−０１４の配列解析により、ＦＳ２２−０５３−０１７クローンを産生するための側向変異誘発により修正された可能な配列の傾向が明らかになった。ＦＳ２２−０５３−０１７の特性評価は、それが類似の結合特性を保持し、ＦＳ２２−０５３−０１４としてのヒトＣＤ１３７  ＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおいて類似の機能活性を示したことが明らかになった。
【０３５４】
抗ヒトＣＤ１３７抗原結合ドメイン含有ｍＡｂ２は、ＣＤ１３７をクラスター化し、活性化するために架橋を必要とすると実証したことから、次の目的は、ＣＤ１３７に加えてヒトＰＤ−Ｌ１を結合するｍＡｂ２を調製することであった。Ｆａｂアームを介したヒトＰＤ−Ｌ１へのｍＡｂ２の結合は、抗体分子の架橋を引き起こし、その結果、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化につながり、この活性化はヒトＰＤ−Ｌ１発現の存在に依存するはずであるという仮説が立てられた。
【０３５５】
ＣＤ１３７に加えて、ヒトＰＤ−Ｌ１を結合するｍＡｂ２を調製するために、ＰＤ−Ｌ１に結合することができるｍＡｂを生成することが最初に必要であった。これらのｍＡｂの生成について以下に記載する。
【０３５６】
実施例４：ナイーブ抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ280_02_G02の単離
４．１  選択
「IONTAS 1」ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー（IONTAS Ltd.）を使用して、抗ＰＤ−Ｌ１クローンを選択した。IONTAS 1ライブラリーの構築のために使用された抗体遺伝子は、ヒトリンパ球（４２のバフィーコートの提供）及び１つの扁桃腺組織サンプルに由来した。バフィーコート及び扁桃腺組織の両方が、地域研究倫理委員会（Local Research Ethical Committee）の承認の下で入手された。
【０３５７】
Schofield et al, 2007に記載されたように、ポリスチレンNuncチューブに直接コーティングされた抗原を使用して、IONTAS1抗体ファージディスプレイライブラリーで３ラウンドの固相選択を実行した。第１、第２，及び第３の選択ラウンドは、それぞれヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓ、マウスＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ及びヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓが使用された（抗原の詳細については実施例１．３参照）。
【０３５８】
選択された可変重（ＶＨ）抗ＰＤ−Ｌ１抗体集団は、Dyson et al., 2011に記載されるように、ナイーブ可変軽（ＶＬ）抗体集団とシャッフルされ、このシャッフルされ、レスキューされた抗体ファージディスプレイ集団が溶液相の選択において使用された。簡単に説明すると、パニングは、第１、第２、及び第３のラウンドで、それぞれヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（１０ｎＭ）、ヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（２００ｐＭ）及びマウスＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（１０ｎＭ）で実行され、これにより、「選択２８０」と呼ばれるアウトプット抗ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖ集団が得られた。このｓｃＦｖ集団は、Dyson et al., 2011に記載されるように、実行されたファージポリクローナルＥＬＩＳＡによって決定されたように、ヒト及びマウスの抗ＰＤ−Ｌ１結合ｓｃＦｖを含み、ヒトＰＤ−１若しくはｒＣｄ４又はＦｃタグとの最小の交差反応性を示した。
【０３５９】
４．２  スクリーニング：ＥＬＩＳＡ、組換えブロッキングアッセイ、細胞ベースのブロッキングアッセイ
４．２．１  モノクローナルｓｃＦｖＥＬＩＳＡ
実施例４．１からの選択２８０ｓｃＦｖ集団をＥＬＩＳＡによってスクリーニングして、ヒトＰＤ−Ｌ１に最もよく結合するクローンを同定した。ｓｃＦｖ集団を可溶性ｓｃＦｖベクターｐＳＡＮＧ１０にサブクローニングし、（Martin et al., 2006; Studier, 2005）に記載されているように、可溶性ｓｃＦｖを含有する大腸菌（E.coli）培養物を調製した。次に、可溶性ｓｃＦｖを、Schofield et al., 2007により記載されたように、固定化されたヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓを用いたモノクローナルＥＬＩＳＡで使用した。Nunc Maxisorpプレート（Thermo Fisher Scientific、437111）をヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ）で一晩コーティングし、２％ＭＰＢＳで１時間ブロックし、大腸菌（E.coli）培養上清（２ｘ２％ＭＰＢＳで１：２に希釈）を添加し、ｓｃＦｖを室温で１時間結合させた。結合したｓｃＦｖは、ユーロピウムで標識された抗FLAG M2抗体（Sigma、F1804）で検出された。合計４７０のクローンがスクリーニングされ、これにより、抗原を含有しない「空の」ブロックされたウェルと比較して、バックグラウンドより少なくとも１０倍高いＰＤ−Ｌ１の結合シグナルを持つ３４６の抗ＰＤ−Ｌ１クローンが同定された。一次ＥＬＩＳＡシグナルによって評価された１９２の最良の抗ヒトＰＤ−Ｌ１クローンが、さらなる分析のために選択された。
【０３６０】
４．２．２  ＥＬＩＳＡベースのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１ブロッキングアッセイにおけるｓｃＦｖのスクリーニング
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の間の相互作用を遮断したクローンを特定するために、ＥＬＩＳＡを実行してブロッキングｓｃＦｖのためのスクリーニングを実行した。簡単に説明すると、Nunc Maxisorpプレート（437111、Thermo Fisher Scientific）を抗ｒＣｄ４（ドメイン３及び４）抗体（MCA1022、OX-68、Bio-Rad）で一晩コーティングし、３％ＭＰＢＳでブロックし、室温で１時間、ヒトＰＤ−１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（３％ＭＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓ（５０μｌ、０．２ｎＭ）を、ｓｃＦｖを含有する大腸菌（E.coli）培養上清と事前に混合した。Nunc９６ウェルプレートを、ＰＢＳ、０．１％Tween（商標）-20（ＰＢＳ−Ｔ）で３回、ＰＢＳで３回洗浄した後、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓ／ｓｃＦｖ混合を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合したヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓをヤギ抗Ｆｃ−ビオチン（Jackson ImmunoResearch、109-065-098、Laboratories、０．１μｇ／ｍｌ、３％ＭＰＢＳ）及びストレプトアビジン・ユーロピウム（Streptavidin-Europium）（Perkin Elmer、1244-360）、その後にDELFIAエンハンスメントソリューション（Perkin Elmer、4001-0010）を使用して検出した。スクリーニングされた１９２個のクローンのうち、培地対照と比較して、１８３個は少なくとも９０％のブロッキング活性を示した。同定された１８３個の抗ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖクローンを、上記の実施例４．２．１に記載されているように、一次ＥＬＩＳＡでマウスＰＤ−Ｌ１交差反応性についてさらにスクリーニングしたが、ヒトＰＤ−Ｌ１の代わりに固定化マウスＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓを使用した。これにより、５０のマウス交差反応性抗ＰＤ−Ｌ１クローンが特定され、これは、ＩｇＧ１形式への変換の候補であった。
【０３６１】
４．２．３  ブロッキング抗ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖクローンのＩｇＧ１形式への変換
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の間の相互作用を遮断した抗ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖクローンは、ＶＬ及びＶＨ遺伝子をＩｇＧ１発現プラスミドｐＩＮＴ３−ＩｇＧ１にサブクローニングすることにより、ＩｇＧ１形式に変換され、Chapple et al., 2006に記載されるように、ＨＥＫ２９３で、４ｍｌスケールで発現した。抗体は、製造元の指示に従って、プロテインＡセファロースビーズ（ＰＣ−Ａ１００）及びProteus「１ステップバッチ」ミディスピンカラム（Generon、GEN-1SB08）を使用して、バッチアフィニティー精製された。精製された抗体の透析は、８ｋＤａカットオフのGeBAflexマキシチューブ（Generon、D045）を使用して実行された。必要に応じて、抗体を限外濾過により２μＭに濃縮した。
【０３６２】
４．２．４  ジャーカットＮＦＡＴレポーター共培養アッセイにおけるＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１ブロッキング活性のためのスクリーニング
次に、精製された抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの機能的活性を、共培養レポーターアッセイスクリーニングで評価した。このスクリーニングは、GloResponse NFAT-luc2／PD-1安定ジャーカット細胞株（Promega、CS187102）及び、解凍及び使用ＰＤ−Ｌ１細胞（Promega、CS178103）を使用して製造元の指示に従って実行された。ＰＤ−Ｌ１細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＨＡＭ’Ｓ−Ｆ１２培地に播種した。翌日、培地を除去し並行して、ＰＤ−１ジャーカットレポーター細胞（Promega、CS187102）をアッセイ培地（９０％  ＲＰＭＩ１６４０、１％  ＦＢＳ）中に再懸濁した。付着したＰＤ−Ｌ１細胞を含有するプレートに、２倍濃度（２００ｎＭ）で異なる抗体を含む４０μｌのアッセイ培地、その後に４０μｌのＰＤ−１細胞混合物を添加した。プレートは、５％ＣＯ２、３７℃で６時間インキュベートした。BioGlo試薬（Promega、G7940、８０μｌ）を各ウェルに添加し、BMG pherastarプレートリーダーを使用してルシフェラーゼアウトプットを読み取った。これにより、抗体を含有しない対照と比較してルシフェラーゼ活性が増加するために共培養アッセイでＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断することができる抗体G1/280_02_G02が特定された。この活性は、用量反応共培養アッセイ（濃度範囲を２倍にする：２００から１．５６ｎＭ）で確認され、計算された半数効果濃度（ＥＣ５０）は４．２ｎＭになった。
【０３６３】
４．３  配列の最適化
G1/280_02_G02抗体の配列の予備分析により、ＶＨ−ＣＤＲ２の潜在的な脱アミド化部位、具体的にはKabat位５４から５５のＮＧモチーフが同定された。この部位での脱アミド化は、潜在的に結合に影響を与える可能性があるため、ＮＧモチーフがＮＡ、ＮＳ、ＳＧ、又はＧＧのいずれかに変更された変異体クローンが作成された。これらの修飾は、組換えＰＤ−Ｌ１に対する親和性又はＰＤ−Ｌ１ブロッキング活性の効力の顕著な低下をもたらさず、軽鎖シャッフルで使用するために、G1/280_02_G02_NSと指定されたＮＳ修飾を含有する変異体クローンを選択した。
【０３６４】
４．４  ナイーブ選択概要
ファージ選択戦略により、強力なインビトロＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ブロッキング活性とマウスＰＤ−Ｌ１交差反応性を備えた５０を超える抗ヒトＰＤ−Ｌ１結合クローンが同定された。特に、G1/280_02_G02は、細胞ベースのＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイで強力な活性化を示し、そのためにさらなる最適化のために選択された。
【０３６５】
実施例５：カッパ軽鎖を含有する抗ＰＤ−Ｌ１クローンの生成及び特性評価
G1/280_02_G02_NS抗体はラムダ軽鎖を有する。臨床状況で使用されてきたほとんどのモノクローナル抗体はカッパ軽鎖を持っているため（Jain et al., 2017）、チェーンシャッフリングキャンペーンを使用して、G1/280_02_G02_NS抗体の重鎖を含むが、ヒトＰＤ−Ｌ１及びマウスの交差反応性に対する親和性を保持したカッパ軽鎖と対となる、クローンを生成することが求められた。ファージディスプレイプラスミドpIONTAS-1（カッパライブラリー）のIONTAS（商標）カッパ軽鎖ライブラリーを使用して、軽鎖変異体と結合したG1/280_02_G02_NS抗体の重鎖を含むｓｃＦｖクローンの軽鎖シャッフルライブラリーを調製した。
【０３６６】
５．１  ファージの選択及びスクリーニング戦略
ビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ及びマウスＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ抗原（抗原の詳細は実施例１．３を参照）を使用して、３ラウンドで多数のファージディスプレイ溶液の選択を行った。選択は、全てのラウンドで抗原濃度を減少させることによって実行され（１００から０．０２ｎＭまで変化）、選択の各ラウンドにおいて「非抗原」対照が使用された。
【０３６７】
セクション４．２．１に記載されているように、可溶性ｓｃＦｖ発現システムを使用して、ラウンド２から２つ（ｎｏ．８７１及び８７２）及びラウンド３から４つ（ｎｏ．８８７、８９０、８９１及び８９４）の６つの選択アウトプットがスクリーニングのために選択された。ＤＥＬＦＩＡ増強溶液を使用した上記の実施例１．３．１に記載されたアッセイを使用して、合計１６９２個の可溶性ｓｃＦｖクローンを、ＥＬＩＳＡ（ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ抗原を、ダルベッコ（Dulbecco）ＰＢＳ５０μｌ中、３μｇ／ｍＬでMaxisorbプレート上にコーティングした）で固定化抗原に結合させるためにスクリーニングした。
【０３６８】
スクリーニングされた１６９２クローンのうち、１０２９クローンがＤＥＬＦＩＡアッセイで２０００ＲＦＵを超えるシグナルを生じ、成功率は約６１％であった。次に、上位７３６クローンを選択し、ｈＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ抗原の３つの濃度（１．０ｎＭ、０．２ｎＭ、及び０．０４ｎＭ）を使った二次アッセイ（親和性ランキング）を使用して分析した。スクリーニングされた７３６クローンから、最大のシグナルを示した４８クローンが、ＩｇＧ１形式でのクローニング及び発現のために選択された。クローンをExpi293F（商標）（Fisher Scientificカタログ番号13479756）細胞を８００μｌスケールで発現させ、培養上清をＩｇＧ１形式でさらにスクリーニングするためにトランスフェクション後５日目に回収した。
【０３６９】
５．２  ＳＰＲスクリーニング
４８の抗体は全て、ＳＰＲ（Biacore T200機器）を使用して親和性によってランク付けされた。ランク付けのために、希釈した上清（１ＸＰＢＳ及び０．００２％Tween（商標）-20で作製されたランニングバッファー中１：１０）をプロテインＡチップ（GE healthcare、製品コード：29127556）上に固定化し、ヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓを５０ｎＭの濃度で調製した表面上に流した。この１回の注入を使用して生成された結合（ｋａ）及び解離（ｋｄ）速度定数を使用して、解離定数（ＫＤ）を決定した。クローンのＫＤ値は、Ｉｇ１形式（G1/280_02_G02_NS）にクローンG1/280_02_G02_NSのそれと比較した。クローンG1/280_02_G02_NSよりもヒトＰＤ−Ｌ１に対して高い親和性を示し、そのためクローンG1/280_02_G02_NSとともに完全な速度論的分析が行われたユニークな配列の１０個のクローンが同定された。
【０３７０】
簡単に説明すると、ＳＰＲ実験はBIAcoreT200機器を使用して実行された。希釈した培養上清からの抗体を、ＦＣ２上のプロテインＡチップ（GE Healthcare、29127556）に１０μｌ／分の流速で、６０秒の接触時間で捕捉した。典型的には、これにより５００〜８００ＲＵの抗体が捕捉される。ＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓの２倍希釈液を、ＦＣ１及びＦＣ２上で５０ｎＭから３０μｌ／分の流速で注入した（濃度範囲：５０ｎＭ〜０．０５ｎＭ）。結合は１８０秒にわたって測定され、解離は３００秒にわたって測定された。全ての測定は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Tween（商標）-20で、２５℃で実施した。速度論的パラメーターは、参照細胞の減算及びBIAevaluationソフトウェア（GE、BR-1005-97）を使用した１：１の相互作用を想定したセンソグラム実験データのフィッティングによって決定された。得られたデータは、BIAevaluationソフトウェアを使用してフィッティングされ、対応するｋａ、ｋｄ、及びＫＤ値を算出した。試験された１０個のクローンのうち、「G1/887_04_E12」、「894_08_A05」、「G1/894_08_E05」及び「G1/887_04_G12」と指定された４つの抗体は、ナノモル濃度以下のＫＤ値を示し、これは、G1/280_02_G02_NSにつきＫＤよりも低かった。記載のスクリーニング条件下で得られた親和性データは、実施例５．１に記載のカッパ軽鎖シャッフルにより、G1/280_02_G02_NS抗体の重鎖がラムダ軽鎖だけでなくカッパ軽鎖とも対になって、組換えヒトＰＤ−Ｌ１に対する良好な、そして実際に改善された、親和性を有する抗体を産生することを示した。
【０３７１】
５．３：ＩｇＧ１形式のカッパクローンの特性評価
５．３．１  細胞ベースのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ブロッキングアッセイ
カッパ軽鎖、G1/887_04_E12、G1/894_08_E05及びG1/887_04_G12を含有する抗ＰＤ−Ｌ１クローンが、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の間の相互作用を遮断する能力を、PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay製品（Promega、J1250/J1255）を製造元の推奨に従って使用した生体発光細胞ベースのアッセイで評価した。ブロッキング活性をG1/280_02_G02_NSクローンと比較した。
【０３７２】
簡単に説明すると、全ての抗体は実施例４．２．３に記載されているように精製され、１００ｎＭから３５ｐＭまで（８つの濃度）の３倍希釈で２回試験された。試験された全てのクローンは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の強力な阻害剤であることが示され、３つのカッパ軽鎖を含有するクローンG1/887_04_E12、G1/894_08_E05、及びG1/884_04_G12は、ラムダ軽鎖を含有するクローンG1/280_02_G02_NSよりもさらに優れたＩＣ５０値を示した。
【０３７３】
５．３．２  親和性
抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  G1/887_04_E12、G1/887_04_G12及びG1/894_08_E05の組換えヒト（ビオチン化hPD-L1-Avi-His, Acro Biosystems、PD1-H82E5）、カニクイザル（cPD-L1-His, Acro Biosystems、PD1-C52H4）及びマウス（mPD-L1-His, Acro Biosystems、PD1-M5220）との結合を、Biacore T200処理ユニット（GE Healthcare）を使用してＳＰＲで測定した。親和性をＩｇＧ１形式の280_02_G02_NSクローンと比較した（G1-AA/280_02_G02_NS；このクローン名の「ＡＡ」は、このクローンがＣＨ２ドメインに「ＬＡＬＡ」変異も含んでいたことを示す）。
【０３７４】
簡単に説明すると、HBS-EP緩衝液（GE Healthcare、BR100188）で２μｇ／ｍｌに希釈した抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂを、３０μｌ／分で、プロテインＡチップ（GE Healthcare、29127556）のフローセル２、３、及び４に個別に注入し、約１１０ＲＵの最終応答を達成した。HBS-EP緩衝液で希釈した組換えヒト、カニクイザル及びマウスＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ抗原を、必要に応じてフローセル１、２、３、又は４に、８１ｎＭから０．０３７ｎＭの濃度範囲で３倍希釈して、７５μｌ／分で４分間注入し、その後緩衝液中で１０分間解離させた。再生は、１０ｍＭグリシン−ＨＣＬ  ｐＨ１．５（GE Healthcare、Human Antibody Capture Kit、ＢＲ００３５６）を３０μｌ／分の速度で３０秒間注入することによって達成された。差し引かれたデータ（フローセル２−フローセル１、フローセル３−フローセル１、又はフローセル４−フローセル１）は、BIAevaluation 3.2ソフトウェア（GE Healthcare）を使用して分析して、屈折率（ＲＩ）定数０で、質量移動を伴うモデル１：１結合を使用して結合を同定した。マウスＰＤ−Ｌ１結合曲線の親和性を決定するために、対応するヒト結合プロファイルのＲｍａｘを使用した。
【０３７５】
結合データは、G1-AA/280_02_G02_NSクローン及びG1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12クローンが、１桁台前半のナノモル濃度又はナノモル濃度以下の親和性でヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合し、完全にヒト／カニクイザルの交差反応性であることを示した。G1-AA/280_02_G02_NSクローンと比較して、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12、及びG1/887_04_G12クローンの結合親和性は、ヒトで約１．８から４．８倍、カニクイザルＰＤ−Ｌ１で２．７から４．７倍高かった。組換えマウスＰＤ−Ｌ１に対するクローンの親和性は低く、ＫＤ値は３８から２２５ｎＭの範囲であり、最も高い親和性がG1/887_04_E12クローンで観察された。これらのデータは、G1-AA/280_02_G02_NS抗体の重鎖が、組換えヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１についての良好な（及びカッパ軽鎖ペアリングの場合はナノモル濃度以下の）親和性、並びに組換えマウスＰＤ−Ｌ１についての低くともいくらかの親和性を有する抗体を産生するために、ラムダ軽鎖及びカッパ軽鎖の両方と対となることができることを示す。
【０３７６】
５．３．３  細胞発現ＰＤ−Ｌ１への抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの結合
抗ヒトＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12を、次に、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＰＤ−Ｌ１（ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞）を発現するＨＥＫ２９３細胞への結合を試験した。非特異的結合は、ヒトＰＤ−Ｌ１を欠くＨＥＫ２９３親細胞（Flp-In T-Rex 293細胞株、Life Technologies、R780-07）への結合を試験することによっても評価された。
【０３７７】
ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して、ヒトＰＤ−Ｌ１配列（配列番号１８５）をコードするｃＤＮＡを、pcDNA（商標）5/FRTベクター（ThermoFisher Scientific、カタログ番号V601020）にサブクローンし、その後、Lipofectamine 2000（Life Technologies、11668-019）を使用してベクターをFlp-In T-REx 293細胞株（Life Technologies、R780-07）に形質転換した。細胞を、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）及び１５μｇ／ｍｌブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）を含有するＤＭＥＭで、安定的に形質転換された細胞のコロニーが形成されるまで３〜４週間増殖させた。これらのコロニーを１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Sigma Aldrich、D9891）の存在下で増幅し、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＰＤ−Ｌ１（ＭＩＨ１）抗体（BD Biosciences、557924）を使用してＰＤ−Ｌ１の発現について試験した。細胞解離緩衝液を使用して細胞を剥離し、ＰＢＳで１回洗浄し、９６ウェルプレートのウェルに２×１０５細胞でプレーティングし、ＰＢＳで１：２０に希釈した抗体と４℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで再度洗浄し、Accur iC6サイトメーター（BD Biosciences）を使用して測定した。FlowJoXソフトウェアを使用してデータを分析した。ヒトＰＤ−Ｌ１の発現が細胞株で検出された。
【０３７８】
G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12クローンは、ＥＣ５０値が０．２６〜０．２９ｎＭの範囲で細胞表面ヒトＰＤ−Ｌ１に結合することが見出された。親ＨＥＫ２９３細胞への結合は観察されず、結合の特異性を示した。したがって、試験した全てのｍＡｂクローンは、非特異的な結合は観察されず、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合した。
【０３７９】
５．３．４  混合リンパ球反応アッセイにおける抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの活性
抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの活性は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで試験された。ＭＬＲアッセイは、２つの同種異系リンパ球集団（同じ種であるが、遺伝的に異なる）間で発生する細胞性免疫応答を測定する。このアッセイでは、あるドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞及び別のドナーからの単球由来樹状細胞（ｉＤＣ）を使用する。免疫細胞には生理学的レベルの免疫チェックポイント調節因子が含まれているため、ＭＬＲアッセイを使用して、Ｔ細胞活性化がヒトシステムのｍＡｂによって増強されることを確認することができる。
【０３８０】
拡大培養ＣＤ４＋Ｔ細胞の生成
ＰＢＭＣは、フィコール勾配分離によって白血球錐体から分離された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Human CD4+T Cell Isolation Kit（Miltenyi Biotec Ltd、130-096-533）を使用して、製造元の指示に従って分離した。ヒトＴ−アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８ Dynabeads（Life Technologies、11131D）をボルテックスで再懸濁した。ビーズを滅菌１５ｍｌチューブに移し、１０％ＦＢＳ（Life Technologies、10270106）を含む１０ｍｌ  ＲＰＭＩ（Life Technologies、61870044）及び１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies、15140122）を加えてダイナビーズを洗浄した。上澄みを廃棄した。１０％ＦＢＳ及び１×ペニシリンストレプトマイシン溶液を添加したＲＰＭＩ中の１．０×１０６細胞／ｍｌのＣＤ４＋Ｔ細胞、及び３：１のビーズ対細胞比を有する５０ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２（Peprotech、200-02-50μg）をＴ７５フラスコ（Greiner Bio-one、690195）に移し、３７℃＋５％ＣＯ２でインキュベートした。３日後、細胞を穏やかに再懸濁し、計数した。細胞密度は、必要に応じて新鮮な培地（ＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ＋ペニシリンストレプトマイシン溶液１Ｘ＋５０ＩＵ／ｍｌのｒｈｕＩＬ−２）を添加することにより、０．８〜１×１０６細胞／ｍｌの範囲に維持した。７日目又は８日目に、ＣＤ３／２８ビーズを除去し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、減量した１０ＩＵ／ｍｌのｒｈｕＩＬ−２を有する新鮮培地ＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ＋ペニシリンストレプトマイシン溶液１Ｘの１×１０６細胞／ｍｌで一晩静置した。細胞は必要になるまで凍結保存した。
【０３８１】
ｉＤＣの分化
未処理の単球は、Human Pan Monocyte Isolation Kit（Miltenyi Biotec Ltd、130-096-537）を使用して、製造元の指示に従ってヒトＰＢＭＣから分離した。単球は、ヒトMo-DC分化培地（Miltenyi Biotec Ltd、130-094-812）を使用して、製造元の指示に従ってｉＤＣに分化させた。
【０３８２】
拡大培養されたＴ細胞は、実験の１日前に解凍し、ＡＩＭ  Ｖ培地（GIBCO、12055-091）で洗浄し、ＡＩＭ  Ｖ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12を、９６ウェル丸底プレート（VWR、734-1797）中、５０μｌのＡＩＭ  Ｖ培地で、最終濃度の４倍で３回希釈した。ＬＡＬＡ変異を含有する４４２０と指定される抗ＦＩＴＣ抗体（Bedzyk et al., 1989及びBedzyk et al., 1990）が陰性対照として含まれていた。３０ｎＭから０．００２ｎＭまでの３倍希釈系列を試験した。５０μｌのＡＩＭ  Ｖ培地に懸濁した１×１０４ｉＤＣ細胞、及び１００μｌのＡＩＭ  Ｖ培地に懸濁した１×１０５拡大培養したＣＤ４＋Ｔ細胞の両方を、抗体希釈液に添加し、３７℃＋５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。以下の対照が含まれていた：ＣＤ４＋Ｔ細胞単独、ｉＤＣ単独、ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ｉＤＣ、及びＡＩＭＶ培地単独。上清を回収し、サンプルを希釈し（１：２５）、ヒトＩＦＮガンマＥＬＩＳＡ  Ready-SET-Go!キット（Life Technologies、88-7316-77）を使用して、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）濃度を測定した。Gen5 Software、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４パラメーターロジスティック曲線適合（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。ヒトＩＦＮ−γの濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０３８３】
抗ヒトＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ  G1/894_8_E05、G1/887_4_E12及びG1/887_4_G12は、ＥＣ５０値が０．０３０ｎＭ未満、及びＩＦＮ−γ（Ｅｍａｘ）の最大レベルが１００００ｐｇ／ｍｌを超えるＭＬＲアッセイにおいて強力な活性を示した。ＥＣ５０は、応答の半分が達成されるｍＡｂの濃度を示し、他方で、Ｅｍａｘは、アッセイで達成されるＩＦＮ−γの最大濃度を示す絶対値である。予想通り、陰性対照G1-AA/4420 mAbでは活性は観察されなかった。
【０３８４】
５．４  マウスＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの活性
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  G1/887_04_E12、G1/887_4_G12及びG1/894_08_E05はマウスＰＤ−Ｌ１に対して弱い交差反応性を示すことが示されたため（実施例５．３．２を参照）、マウスＰＤ−Ｌ１に対するそれらの機能的活性を、ＤＯ１１．１０  ＯＶＡ  Ｔ−リンパ球及びＬＫ３５．２Ｂ−リンパ球ハイブリドーマ細胞株に基づく、インターロイキン２（ＩＬ−２）放出アッセイで調査した。ＩＬ−２放出はＴ細胞活性化のマーカーである。内因性マウスＰＤ−１を発現するＴ細胞に空のベクター（ｐＬＶＸ）をトランスフェクトした。Ｂ−細胞にマウスＰＤ−Ｌ１構築物をトランスフェクトした。
【０３８５】
５．４．１  空のベクターを用いたＴ細胞株の産生
レンチウイルス形質導入法を使用したLenti-X HTXパッケージングシステム（Clontech、631249）を使用して、空のレンチウイルスベクターｐＬＶＸを含有するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）を生成した。Lenti-X発現ベクター（pLVX）（カタログ番号631253）をLenti-X HTXパッケージングミックスと共にLenti-X293T細胞株（カタログ番号632180）に同時トランスフェクトして、ウイルスを生成した。ＤＯ１１．１０細胞株は、Lenti-XHTXパッケージングシステムで産生されたレンチウイルス粒子を使用して形質導入された。
【０３８６】
５．４．２  ＰＤ−Ｌ１を過剰発現する抗原提示細胞の産生
レンチウイルス形質導入法を使用したLenti-X HTXパッケージングシステム（カタログ番号631249）を使用してマウスＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＬＫ３５．２  Ｂ細胞リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ、ＨＢ−９８）を生成した。ｃＤＮＡをコードするマウスＰＤ−Ｌ１（配列番号１８７）を含有するLenti-X発現ベクター（pLVX）（カタログ番号631253）は、Lenti-XHTXパッケージングミックスと共にLenti-X293T細胞株（カタログ番号632180）に同時トランスフェクトして、ウイルスを生成した。ＬＫ３５．２細胞株は、Lenti-X HTXパッケージングシステムで生成したレンチウイルスベクターを使用して形質導入された。
【０３８７】
５．４．３  マウスＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイ
抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  G1/887_04_E12、G1/887_4_G12及びG1/894_08_E05又は抗ＦＩＴＣ陰性対照ｍＡｂ（G1-AA/4420）の希釈液は、実験培地（ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）、１０％  ＦＢＳ（Gibco、10270-106）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070））で調製された。２．４６μＭ  ＯＶＡペプチド（Ｈ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ−ＯＨ（配列番号１９２）（Pepscan））（１００μＬ  ＬＫ３５．２ｍＰＤ−Ｌ１細胞（マウスＰＤ−Ｌ１を過剰発現させるためにｍＰＤ−Ｌ１を含むレンチウイルスベクターで形質導入されたＢ細胞ハイブリドーマ）／ｍＡｂ混合物が９６丸底プレートの１ウェルあたり）の存在下、ｍＡｂは、４×１０５／ｍｌ  ＬＫ３５．２ｍＰＤ−Ｌ１細胞と１：１で、実験培地中で混合し、３７℃、５％  ＣＯ２で１時間インキュベートした。１００μｌ容量の実験培地中の２×１０５／  ＤＯ１１．１０  ｐＬＶＸ細胞（空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＤＯ１１．１０  Ｔ細胞ハイブリドーマ）を、１００μｌのＬＫ３５．２ｍＰＤ−Ｌ１／（ｍＡｂｓ）混合物に添加した。次いで、細胞を混合し、３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間インキュベートした。上清を収集し、製造元の指示に従ってマウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、88-7024-88又はR＆Dシステム、SM2000）でアッセイした。Gen5 Software、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から５７０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４パラメーターロジスティック曲線適合（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。マウスＩＬ−２の濃度をｍＡｂの対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０３８８】
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂは、マウスＴ細胞活性化アッセイで顕著な活性を示し、効力（ＥＣ５０）は１〜４．４ｎＭの範囲であった。予想通り、陰性対照ｍＡｂでは活性は観察されなかった。試験した３つのクローンのうち、組換えマウスＰＤ−Ｌ１に対して最も高い親和性を示したG1/887_04_E12も、Ｔ細胞活性化アッセイで最も強力なクローンであった。効力の差は、測定された親和性よりも低く、これは、このアッセイにおけるＬＫ３５．２細胞でのマウスＰＤ−Ｌ１の過剰発現によるためである可能性が高い。
【０３８９】
５．５  ＩｇＧ１形式のカッパクローンの特性評価の概要
選択されたカッパ軽鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  G1/894_08_E05、G1/887_04_E12、及びG1/887_04_G12は、カニクイザル及びマウスＰＤ−Ｌ１の交差反応性を示し、細胞表面に発現したＰＤ−Ｌ１への特異的結合を示し、ラムダ軽鎖を含むクローンG1/280_02_G02よりも、組換えヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対してさらに高い親和性を示した。抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  G1/894_08_E05、G1/887_04_E12、及びG1/887_04_G12は、インビトロでヒトＴ細胞の強力な活性化因子であり、且つ機能的なマウス交差反応性を有することを示した。
【０３９０】
実施例６：ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの配列最適化
６．１  潜在的なタンパク質脱アミド化部位の特定及び除去
G1/280_02_G02_NSクローン配列の解析により、Ｈ−ＣＤＲ２ループ（Kabat位５４〜５７）内の配列ＮＳＮＴが、脱アミド化された場合、結合に影響を与える可能性がある潜在的な脱アミド化部位として同定された。このクローンの重鎖は、実施例５に記載のチェーンシャッフリングキャンペーンによって得られた全てのカッパ軽鎖含有クローンに保持されていたため、この潜在的な脱アミド化部位は、クローンG1/887_04_E12、G1/894_08_A05、G1/894_08_E05、及びG1/887_4_G12にも存在した。生殖細胞系列配列に最も近い特定のプライマーを使用して、４つのカッパ軽鎖含有クローンにおいて、ＮＳＮＴ配列は、部位特異的変異導入法により、ＧＧＳＴ、ＳＧＧＴ又はＳＧＮＡのいずれかに変化して、特定される変異体クローンを産生した。この潜在的な脱アミド化部位を除去すると同時に、カッパ軽鎖シャッフル中にこの抗体の配列に意図せず導入された、G1/887_04_E12クローンのＶＨ領域内のKabat位２８のプロリン残基の役割は、G1/280_02_G02_NSクローンに含まれるスレオニン残基に戻すことによっても調査された。親及び得られた変異体クローン（全てＩｇＧ１形式）を０．８ｍｌスケールでトランスフェクトし、トランスフェクションの５日後に回収した培養上清を使用して、ＳＰＲによるヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓに対するクローンの親和性を決定した。Ｃｙｎｏ  ＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓを実施例１．３で記載されているように生成した。G1/887_04_E12クローンに由来する変異体クローンを除いて、全ての変異体クローンは、それぞれの親クローンと比較して、ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対するナノモル濃度以下の親和性を保持していた。
【０３９１】
G1/894_08_A05、G1/894_08_E05、及びG1/887_04_G12親クローンに由来する修飾クローンは全て、それぞれの親クローンと同等のヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対するナノモル濃度以下の親和性を示し、ＧＧＳＴ、ＳＧＧＴ、及びＳＧＮＡ置換が良好に許容されていることを示唆した。親（G1/887_04_E12）と比較してG1/929_01_A01、G1/929_01_A02、及びG1/929_01_A03クローンの親和性が大幅に低下したのは、Ｈ−ＣＤＲ２におけるＧＧＳＴ、ＳＧＧＴ及びＳＧＮＡの置換の存在よりも、Kabat位２８におけるＶＨ領域のプロリンが除去に起因する可能性が高いと考えられた。G1/887_04_E12クローン内のこのプロリン残基がＰＤ−Ｌ１に対する親和性について重要であるように見えたことは驚くべきことであった。Ｈ−ＣＤＲ２（５４〜５７位）におけるＳＧＧＴ置換を含む３つの親クローンG1/887_04_E12、G1/894_08_E05及びG1/887_04_G12に由来する変異体、すなわちクローンG1/929_01_A02、G1/929_01_A08及びG1/929_01_A11は、このＳＧＧＴ置換が生殖細胞系列配列に最も近いことに基づいて、さらなる特性評価のために選択された。
【０３９２】
部位特異的変異導入を使用して、G1/280_02_G02_NSクローンのＨ−ＣＤＲ２ループ内の潜在的な脱アミド化部位（Kabat位５４から５７のＮＳＮＴ）もＳＧＧＴへと修飾された。さらに、このクローンのラムダ軽鎖のＣＤＲ１におけるKabat位３１から３２で特定される、さらなる潜在的な脱アミド化部位（ＮＳモチーフ）は、ＩＧＬＶ２−８−０１、ＩＧＬＶ２−８−０２、ＩＧＬＶ２−８−０３、ＩＧＬＶ２−１１−０１、ＩＧＬＶ２−１１−０２、ＩＧＬＶ２−１１−０３及びＩＧＬＶ２−１４−０１、ＩＧＬＶ２−１４−０２、ＩＧＬＶ２−１４−０３、ＩＧＬＶ２−１４−０４などのいくつかの生殖細胞系列配列におけるこの位置にチロシンが見られるように、セリン３２（Kabat番号付け）をチロシンに変異させることによってＮＹへと修飾された。これらの修飾の組み合わせにより、ラムダ軽鎖含有クローンG1/lam-G02v3が得られ、これもさらなる特性評価のために選択された。
【０３９３】
実施例７：ｍＡｂの特性評価
７．１  ｍＡｂ形式におけるクローンのクローニング化及び産生
実施例６で同定されたG1/929_01_A02「ＳＧＧＴ」変異体クローンのＶＨ領域のKabat位２８のスレオニン残基を、ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対する親和性を改善する目的で、親クローンG1/887_04_E12の同じ位置に存在するようにプロリンに変異させた。ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞における一過性発現及びmAb Select SuReプロテインＡカラムを使用した精製を使用して、この修飾された変異体クローン、及び実施例６においてＩｇＧ１形式及びＬＡＬＡ変異で同定された他の３つの「ＳＧＧＴ」変異体クローン（G1/929_01_A08、G1/929_01_A11、及びG1/lam-G02v3）を産生し、エフェクター機能が非存在下の場合の機能的活性の試験を可能にした。得られたｍＡｂは、G1-AA/E12v2、G1-AA/E05v2、G1-AA/G12v2及びG1-AA/lamG02v3（G1-AA/lamG02v3又はG1-AA/lambdav3と呼ばれる）と指定された。重鎖及び軽鎖配列は、それぞれG1-AA/E12v2につき配列番号１６及び配列番号１７、G1-AA/E05v2につき配列番号２７及び配列番号２８、G1-AA/G12v2につき配列番号２７及び配列番号３３、及びG1-AA/lam-G02v3につき配列番号２７及び配列番号４４に示されている。
【０３９４】
７．２  ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対するｍＡｂの親和性
G1-AA/lam-G02v3（すなわち、ＶＨ−ＣＤＲ２におけるＮＳＮＴからＳＧＧＴ、ＶＬ−ＣＤＲ１におけるＮＳからＮＹ、及びＬＡＬＡ変異）及びカッパ軽鎖含有ｍＡｂのG1-AA/E12v2、G1-AA/E05v2及びG1-AA/G12v2（すなわち、ＬＡＬＡ変異、及びG1-AA/E12v2単独、ＶＨ領域におけるKabat位２８のスレオニンからプロリン）に存在するさらなる配列修飾が結合動力学に影響を及ぼしたかどうかを決定するために、実施例５．３．２に記載のように、ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１についてのこれらの抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの親和性が決定された。ｍＡｂのG1-AA/lam-G02v3、G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、及びG1-AA/G12v2は、ｍＡｂのG1-AA/280_02_G02_NS、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12について実施例５．３で観察されたそれらと類似のヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１についての親和性を示し、試験されたｍＡｂ及びｍＡｂ２の結合親和性は、潜在的な脱アミノ化部位の修飾又はＬＡＬＡ変異の導入により影響を受けなかったことが実証された。G1-AA/E12v2ｍＡｂは、試験した４つのｍＡｂ全ての中で最低のＫＤ値を示した（ヒトＰＤ−Ｌ１では０．２１ｎＭ、カニクイザルＰＤ−Ｌ１では０．３７ｎＭ）。結果を表４に示す。
【０３９５】
G1-AA/E12v2 ｍＡｂのＶＨは、G1/929_01_A02領域（実施例６）と１残基異なり、E12v2はKabat位２８にプロリンを保持するが、G1/929_01_A02はこの位置にスレオニンを保持する。G1/929_01_A02は、G1-AA/E12v2と比較した場合、ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１の両方に対して１０倍を超える低い親和性を示した。このデータは、クローンE12v2のＶＨにおける２８位（Kabat命名法）のプロリン残基が、ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対する親和性に重要であることを示す。
【０３９６】
【表５】
2021524268.tif 000006
【０３９７】
７．３  ＭＬＲにおける抗ヒトＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの活性
抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂのG1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、及びG1-AA/G05v2は、実施例５．３．４に記載されているように混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで試験された。G1-AA/4420を陰性対照として使用した。結果を表５に示す。ｍＡｂのG1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2及びG1-AA/G12v2は、０．０５４ｎＭ未満のＥＣ５０及び６００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮ−γの最大レベル（Ｅｍａｘ）のＭＬＲアッセイにおいて強力な活性を示した（表５）。ＥＣ５０、特にＥｍａｘ値は、実施例５．３．４で記載した値とは顕著に異なっていた。応答は、あるドナーからのＴ細胞及び別のドナーからの単球由来樹状細胞との間の同種反応に依存するため、この違いはドナーのばらつきによるものと考えられている。抗ヒトＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの効力は、クローンの効力の順序にランク付けしたのと同様に、実施例５．３．４に記載されたデータと一致していた。予想通り、陰性対照G1-AA/4420  ｍＡｂの活性は観察されなかった。
【０３９８】
【表６】
2021524268.tif 000007
【０３９９】
７．４  抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの発現、精製及び分析特性
ｍＡｂのG1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、及びG1-AA/G12v2はラボスケールで産生され、ＳＥＣ及び示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の標準的な分析方法によって特徴付けられた。
【０４００】
７．４．１  ラボスケールでの抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの発現及び精製
ｍＡｂのG1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、及びG1-AA/G12v2をコードするＤＮＡ配列を、PEIpro（Polyplus、フランス）を使用してＨＥＫ２９３  ６Ｅ（カナダ国立研究評議会（National Research Council Canada））細胞にトランスフェクトした。５日後、細胞培養液を回収し、AKTAxpress機器を使用してMabSelectプロテイン−Ａプレパックカラム（両方GE Healthcare、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）で精製した。カラムの平衡化は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０の２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、で行い、その後、回収した細胞培養液をロードした。樹脂を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０の２５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用して洗浄し、続いてｐＨ３．５未満の緩衝液を使用してｍＡｂを溶出した。
【０４０１】
７．４．２  ＳＥ−ＵＰＬＣによる分析
精製後のＳＥ−ＵＰＬＣは、Acquity H-Class Bio UPLC（Waters Corp、UK）を使用して、単量体の割合を測定するために精製から２４時間以内に実施した（材料は４℃で保存した）。Acquity UPLC BEH200 SEC  １．７ｍｍカラム（４．６×１５０ｍｍ）を使用し、移動相は、２５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、ｐＨ６．８で構成されていた。単量体、低分子量及び高分子量種の定量化は、Empowerソフトウェア（Waters Corp、UK）を使用して実行された。
【０４０２】
７．４．３  熱安定性
G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、及びG1-AA/G12v2の融解温度（Ｔｍ）は、Microcal VPキャピラリー示差走査熱量計（ＤＳＣ）を使用して測定した。G1-AA/lam-G02v3は、カッパ軽鎖含有ｍＡｂ及びラムダ軽鎖含有ｍＡｂの違いを評価するために含まれていた。サンプルは、サンプル緩衝液中、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で測定された。スキャン速度は６０℃／時間に設定され、データは３５℃から１００℃の間で収集された。データ分析は、Origin7.0ソフトウェアを使用して実行された。Ｆａｂ及びＣＨ３のＤＳＣピークが重複していたため、１つの値が報告された。
【０４０３】
【表７】
2021524268.tif 000008
【０４０４】
結果の概要を表６に示す。３つのｍＡｂ：G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、及びG1-AA/G12v2は、良好な分析的特性評価パラメーターを示した。プロテインＡ後の単量体純度は９８％を超え、Ｆａｂ遷移の熱安定性（Ｔｍ）は、ＩｇＧ１について典型的に報告される遷移の上端で確認され、G1-AA/E12v2が最も熱的に安定しているように見えた（Ｆａｂ／ＣＨ３  ＴＭ＝８１．４８４．１℃）。ラムダ軽鎖ｍＡｂのG1-AA/lamG02v3は、３つのカッパ軽鎖含有ｍＡｂよりもＴｍが低かった。
【０４０５】
実施例８：抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２の産生及び特性評価
８．１  抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２の産生
３つの抗ヒトＣＤ１３７  ＦｃａｂクローンＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−０１７及びＦＳ２２−１７２−００３（実施例３参照）を含むＩｇＧ１分子からなるＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２抗体を産生し、ｍＡｂ２形式でのＦｃａｂの特性評価を可能にした。ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２は、３つの抗ＰＤ−Ｌ１結合抗体（G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、G1-AA/G12v2、実施例７．１参照）のうちの１つのＣＨ３ドメインの対応する領域について、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループを含むＣＨ３ドメインＦｃａｂの一部を置換することによって調製された。全ての結果のｍＡｂ２は、ＬＡＬＡ変異を含んでいた。ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２は、PEIpro（Polyplus、France）を使用してＨＥＫ２９３  ６Ｅ（NRCC、Canada）細胞で一過性に発現した。５日後、細胞培養液を回収し、AKTAxpress機器を使用してMabSelectプロテイン−Ａプレパックカラム（両方GE Healthcare、ウプサラ、スウェーデン）で精製した。カラムの平衡化は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０の２５０ｍＭ  ＮａＣｌで行い、続いて、回収した細胞培養液をロードした。次に、樹脂を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０の２５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用して洗浄し、その後ｐＨ＜３．５の緩衝液を使用してｍＡｂ２を溶出した。
【０４０６】
産生されたタンパク質の量を評価するために、PALL（18-5021）のプロテインＡ定量バイオセンサーを備えたOctet QKe（ForteBio）を使用して、バイオレイヤー干渉法によってＩｇＧタンパク質含有量を定量した。タンパク質を、mAbSelectSureカラムを使用したプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。９つのｍＡｂ２を、mAb Select SuReプロテインＡカラム（GE Healthcare、11003494）を使用して精製した。結果を表７に示す。
【０４０７】
【表８】
2021524268.tif 000009
【０４０８】
９つのＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２抗体は全て、ＨＥＫ２９３６Ｅにおける一過性発現によって産生され、ラボスケールで予想される典型的な範囲内の力価及びプロテインＡ精製収量が得られた。FS22-172-003-AA-Iam/G02v3も発現され、さらなる試験のために精製された。
【０４０９】
８．２  サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによるｍＡｂ２の生物物理学的特性評価
８．２．１  ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析
移動相として、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８を使用し、TSK-GEL SUPERSW 3000 ４．６ｍｍＩＤｘ３０．０ｃｍカラム（Tosoh Bioscience）を装備したAgilent１１００シリーズＨＰＬＣ（Agilent、UK）で精製後ＳＥ−ＨＰＬＣを行った。単量体の割合の定量化を、Chemstationソフトウェア（Agilent、UK）を使用して実行した。
【０４１０】
８．２．２  ＣＥ−ＳＤＳによる分析
ＣＥ−ＳＤＳ分析を、製造元の指示に従い、2100 Bioanalyzerキャピラリー電気泳動システム（Agilent、UK）で実行した。還元条件ために、ＤＴＴを添加し、サンプルを７０℃で５分間変性させた。
【０４１１】
【表９】
2021524268.tif 000010
【０４１２】
分析結果の概要を表８に示す。FS22−053−008−AA/G12v2を除く全てのｍＡｂ２は、プロテインＡを使用した高純度の後精製を示した；％単量体ポストプロテインＡ＞９５％、及び還元ＣＥ−ＳＤＳ（＞９５％、重鎖％と軽鎖％の合計）で示される高純度によって示されるような低レベルの可溶性凝集及び断片化。FS22-053-008-AA/G12v2は、プロテインＡ精製後に凝集を示し、その結果、それ以上進行しなかった。
【０４１３】
実施例９：ｍＡｂ２結合の特性評価
９．１  ＳＰＲによるヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１について抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２結合親和性
次に、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２、FS22-172-003-AA/lam-G02v3、FS22-172-003-AA/E05v2、FS22-053-008-AA/E05v2、FS22-172-003-AA/E12v2、FS22-053-008-AA/E12v2及びFS22-172-003-AA/G12v2の組換えヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１抗原への結合を、Biacore T200processing unit（GE Healthcare）を使用してＳＰＲにより測定した。
【０４１４】
簡単に説明すると、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（GE Healthcare、BR100188）で２μｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２を、３０μｌ／分で、プロテインＡチップ（GE Healthcare、29127556）のフローセル２、３、及び４に個別に注入し、約１１０ＲＵの最終応答を達成した。２つの異なる組換えヒトＰＤ−Ｌ１抗原、すなわちｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ−Ａｖｉ（抗原の詳細については実施例１．３を参照）及びビオチン化ｈＰＤ−Ｌ１−Ａｖｉ−Ｈｉｓ（Acrobiosystems、PD-1-H82E5）を使用した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で希釈したヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（Acrobiosystems、PD-1-C52H4）抗原を、８１ｎＭから０．０３７ｎＭの濃度範囲で、７５μｌ／分で４分間、３倍希釈して、フローセル１、２、３又は４上に適当に注入し、その後、緩衝液中で１０分間解離させた。再生は、１０ｍＭグリシン−ＨＣＬ  ｐＨ１．５（GE Healthcare、Human Antibody Capture Kit、BR00356）を３０μｌ／分の速度で３０秒間注入することによって達成された。減算したデータ（フローセル２−フローセル１、フローセル３−フローセル１、又はフローセル４−フローセル１）を、BIAevaluation３．２ソフトウェア（GE Healthcare）を使用して分析し、屈折率（ＲＩ）定数０で、質量移動を伴うモデル１：１結合を使用して結合を同定した。
【０４１５】
【表１０】
2021524268.tif 000011
【０４１６】
結合データは、各抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２がヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に低からナノモル濃度以下の親和性で結合し、ヒト／カニクイザルが交差反応することを示した（表９）。全てのｍＡｂ２クローンは、各抗原について等価ＫＤ値を有するヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に等しく良好に結合した。
【０４１７】
９．２  ＳＰＲによるヒト及びカニクイザルＣＤ１３７について抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２結合親和性
抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２の組換え二量体ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７抗原への結合も、Biacore T200processing unit（GE Healthcare）を使用してＳＰＲによって測定された。
【０４１８】
簡単に説明すると、２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ抗体（GE Healthcare、Human Fab Capture kit 28958325）を、BiacoreセンサーＳチップＣＭ５（GE Healthcare、BR100530）のフローセル１、２、３及び４上にコーティングし、約５０００ＲＵの最終応答を達成した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（GE Healthcare、BR100188）で２〜５μｇ／ｍｌに希釈したｍＡｂ２クローンを、３０μｌ／分で、フローセル２、３、及び４に個別に注入し、約７０ＲＵ（FS22-172-003-AA/E12v2については２００ＲＵ）の応答を達成した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で希釈した組換え二量体抗原、ヒトＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ又はカニクイザルＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ（抗原の詳細については実施例１．１参照）を、フローセル１、２、３又は４に、８１ｎＭから０．０３７ｎＭの濃度範囲で３倍希釈して、７０μｌ／分で４分間適当に注入し、その後、緩衝液中で１０分間解離させた。再生は、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１（GE Healthcare、Human Fab Capture kit 28958325）を３０μｌ／分の速度で６０秒間注入することによって達成された。データ分析は、実施例９．１で記載したように実行した。
【０４１９】
【表１１】
2021524268.tif 000012
【０４２０】
結合データは、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２クローンが、低ナノモル濃度親和性を有する二量体ヒト又はカニクイザルＣＤ１３７と結合し、ヒト／カニクイザル交差反応することを実証した（表１０）。予想通り、これらの結果は、「モック」ｍＡｂ２形式において、これらのＦｃａｂクローンについて報告された結合データと類似であった（表３、実施例３．７）。二量体ＣＤ１３７に対する最高の親和性は、FS22-172-003-AA/E12v2で観察され、その後、上記と同様の方法を使用して、単量体ＣＤ１３７−Ｈｉｓ−Ａｖｉに対しても親和性を試験した。８１ｎＭまでのFS22-172-003-AA/E12v2の単量体ＣＤ１３７への結合は検出されず、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２のＦｃａｂ結合領域は、単量体ＣＤ１３７に対して低い親和性を有することが示された。これらの結果は、ＦＳ２２−０５３−００８  ＣＤ１３７  Ｆｃａｂについても観察されたものと類似であり、ＦｃａｂのｍＡｂ２形式への変換は、ＣＤ１３７への結合においてほとんど変化をもたらさなかったことを示している。
【０４２１】
９．３  ＳＰＲによる抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２特異的決定
９．３．１  ヒトＰＤ−Ｌ１の特異性
抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の特異性を分析するために、６つのｍＡｂ２（FS22-172-003-AA/lam-G02v3、FS22-172-003-AA/E05v2、FS22-053-008-AA/E05v2、FS22-172-003-AA/E12v2、FS22-053-008-AA/E12v2及びFS22-172-003-AA/G12v2）の他のＴ細胞標的への結合を、ＳＰＲを用いて試験した。この目的は、ｍＡｂ２が、１μＭの濃度でＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＰＤ−１、及びＢ７−Ｈ３の抗原に対するｍＡｂ２の結合を示さないことにより特異性を実証することであった。
【０４２２】
ＣＭ５チップ上のフローセルは、およそ１０００ＲＵのヒトPD-L2-Fc（R&D Biosystems、1224-PL）、CD80-Fc（R&D Biosystems、140-B1）、PD-1-His（R&D Biosystems、8986-PD）、B7-H3-His（F-star自社産生、配列番号１９３）、PD-L1-Fc（R&D Biosystems、156-B7）及びPD-L1-His（Acrobiosystems、PD1-H83F3）のいずれかで固定された。フローセル１はブランクの固定化用として残した。ｍＡｂ２を１×ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（GE Healthcare、製品コードBR100188）中で１μＭ及び１ｎＭに希釈し、３分間チップ上に流し、次いで４分間解離させた。１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の３０秒注入を再生に使用した。陽性対照抗体を、各抗原のコーティングを実証するために５０〜１００ｎＭで注入した。結合レベルは、会合フェーズの終わりに決定され、比較された。
【０４２３】
試験したｍＡｂ２は、高レベルの特異性を示し、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ又はＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓのいずれかに結合するために、１ｎＭで検出された結合応答の１０５ＲＵから５７０ＲＵの範囲に対し、１μＭで検出された４つの抗原に結合するｍＡｂ２は１０ＲＵ未満であった。これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１に対する抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２の高いレベルの特異性を実証したが、列挙された他のＴ細胞標的には結合しなかった。
【０４２４】
９．３．２  ヒトＣＤ１３７の特異性
ＣＤ１３７／ＨｅｌＤ１．３ｍＡｂ２と比較した場合、ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２において、ＣＤ１３７ Ｆｃａｂ結合部位の特異性が保持されていることが予想される（実施例３．６参照）。ＴＮＦＲファミリーメンバーであるＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０及びＤＲ６（R&D Biosystems）に対するFS22-172-003-AA/E12v2の特異性を、実施例９．３．１で記載したように類似してＳＰＲによって分析した。１μＭの濃度では、FS22-172-003-AA/E12v2は、ヒトＣＤ１３７−ｍＦｃに対して２７８ＲＵであったのに対し、ヒトＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０及びＤＲ６に対して７ＲＵ未満で結合した。この結果は、ＣＤ１３７に対するFS22-172-003-AA/E12v2ｍＡｂ２の高いレベルの特異性を実証した。
【０４２５】
９．４  ＳＰＲによる抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２のヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７への同時結合
ヒトＣＤ１３７及びヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ  Ａｖｉ（抗原の詳細については実施例１．３参照）に同時結合するFS22-172-003-AA/E12v2ｍＡｂ２の能力を、Biacore T200のＳＰＲにより試験した。G1/S70を対照として使用した。酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０（GE Healthcare、18-1069）で１０μｇ／ｍｌに希釈したヒトＰＤ−Ｌ１Ｈｉｓを、ＣＭ５センサーＳチップ（GE Healthcare、BR100530）に約１１００ＲＵの表面密度で固定化した。バックグラウンド除去のために固定化したタンパク質なしで、１つのフローセルを活性化及び不活性化した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で５μｇ／ｍｌに希釈した抗体を、約２００〜３００ＲＵの密度になるように３０μｌ／分の流速で捕捉した。ヒトＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉの結合は、０及び１００ｎＭで３０μｌ／分で５分間試験し、次いで２．５分間の解離ステップを行った。２０ｍＭ  ＮａＯＨを流速３０μｌ／分で６０秒間の各サイクル後、センサーチップを再生した。FS22-172-003-AA/E12v2は、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＣＤ１３７の両方に同時に結合できたが、対照G1/S70はヒトＰＤ−Ｌ１にのみ結合した。
【０４２６】
９．５  フローサイトメトリーによる細胞表面に発現したヒト又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対する抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２の結合親和性
抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２の細胞表面ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１への結合を評価するために、ヒトＰＤ−Ｌ１を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞を生成した。ヒトＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１）を、実施例５．３．３に記載のように産生した。カニクイザルＰＤ−Ｌ１をコードするｃＤＮＡ（配列番号１８９）を、ヒトＰＤ−Ｌ１配列の代わりにpcDNA（商標）５／ＦＲＴベクターにサブクローニングした以外は、カニクイザルＰＤ−Ｌ１（ＨＥＫ．ｃＰＤ−Ｌ１）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞もまた、実施例５．３．３．に記載したように作製した。
【０４２７】
次に、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２、FS22-172-003-AA/E12v2は、フローサイトメトリーを使用してヒト又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１を発現するＨＥＫ２９３細胞への結合について試験した。非特異的結合は、ヒトＰＤ−Ｌ１を欠くＨＥＫ２９３親細胞（Flp-In T-Rex 293細胞株、Life Technologies、R780-07）への結合を試験することによっても評価された。結合親和性を、陽性対照抗体G1-AA/E12v2（それぞれ重鎖及び軽鎖につき配列番号１６及び１７）と比較し、クローン化したその可変ドメインをＣＨ２ドメインのＬＡＬＡ変異を含むヒトＩｇＧ１形式（Ｇ１−ＡＡ形式）で発現させた。
【０４２８】
ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１及びＨＥＫ．ｃＰＤ−Ｌ１懸濁液をＦＡＣＳ緩衝液（０．５％  ＢＳＡ（Sigma、A7906）含有ＤＰＢＳ（Gibco、14190-094））中で調製し、１ｘ１０５細胞／ウェルで１００μｌの丸底９６ウェルプレート（VWR、734-1797）中に播種した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄した。ｍＡｂ２FS22-172-003-AA/E12v2、モックｍＡｂ２FS22-172-003-AA/HelD1.3、ｍＡｂG1-AA/E12v2及び陰性対照ｍＡｂG1-AA/4420を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で希釈した（４００ｎＭ〜０．００５ｎＭ、５倍希釈）。洗浄した細胞を希釈した抗体混合物に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次に、１００μｌ／ウェルの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧAlexa Fluor 647標識抗体、Invitrogen、A21445）をＦＡＣＳ緩衝液中で１：１０００に希釈して添加し、４℃で２０分間インキュベートし、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、そして７ＡＡＤ（１：１０００、Biotium、40043）を含有する１００μｌのＰＢＳに再懸濁し、その後、Canto IIフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて分析した。死細胞を除外し、ＡＰＣチャネル（６３８ｎｍ６６０／２０）の蛍光を測定した。幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）値を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０４２９】
FS22-172-003-AA/E12v2ｍＡｂ２及びG1-AA/E12v2抗体は、ＥＣ５０値が３．１〜３．７ｎＭの範囲の細胞表面ヒトＰＤ−Ｌ１に、及びＥＣ５０値が０．６〜０．７ｎＭの範囲の細胞表面カニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合することが見出された（表１１参照）。ＰＤ−Ｌ１過剰発現を欠くＨＥＫ２９３細胞への結合は観察されず、結合の特異性を示した。したがって、試験したFS22-172-003-AA/E12v2ｍＡｂ２は、非特異的な結合は観察されず、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合した。これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（実施例５．３．３参照）について観察されたヒト及びｃｙｎｏＰＤ−Ｌ１に対する特異性が保持されていることを示す。
【０４３０】
【表１２】
2021524268.tif 000013
【０４３１】
９．６  フローサイトメトリーによる細胞表面に発現したヒト又はカニクイザルＣＤ１３７に対する抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２の結合親和性
完全長ヒト（配列番号：１８５）又はカニクイザルＣＤ１３７（配列番号：１８９）を発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）は、それぞれ「DO11.10.hCD137」及び「DO11.10.cCD137」と指定され、選択された抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２のさらなる特性評価のために、その天然形態に最も類似した膜結合立体配座で抗原を提示するために産生された。DO11.10.hCD137及びDO11.10.cCD137細胞の産生及び発現の確認の詳細は、実施例１．２に記載されている。
【０４３２】
抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２FS22-172-003-AA/E12v2を、フローサイトメトリーを使用して、ヒト又はカニクイザルＣＤ１３７（DO11.10.hCD137又はDO11.10.cCD137）を発現する細胞への結合について試験した。非特異的結合は、ＣＤ１３７発現を欠くＤＯ１１．１０細胞への結合を試験することによっても評価された。ＭＯＲ７４８０．１（米国特許出願公開第２０１２／０２３７４９８号）の可変ドメインをクローン化し、ＣＨ２ドメインにＬＡＬＡ変異を含むヒトＩｇＧ１形式（Ｇ１−ＡＡ形式）で発現させ、これを陽性対照として使用した。
【０４３３】
簡単に説明すると、ＤＯ１１．１０、DO11.10.hCD137及びDO11.10.cCD137懸濁液をＦＡＣＳ緩衝液（０．５％  ＢＳＡ（Sigma、A7906）含有ＤＰＢＳ（Gibco、14190-094））中で調製し、１ｘ１０５細胞／ウェルで１００μｌの丸底９６ウェルプレート（VWR、734-1797）中に播種した。細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、ｍＡｂ２FS22-172-003-AA/E12v2、モックｍＡｂ２FS22-172-003-AA/HelD1.3、抗体G1-AA/MOR7480.1及び陰性対照ｍＡｂG1-AA/4420を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で希釈した（４００ｎＭ〜０．００５ｎＭ、５倍希釈）。洗浄した細胞を希釈した抗体混合物に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次に、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１０００に希釈した１００μｌ／ウェルの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧAlexa Fluor 647標識抗体、Invitrogen、A21445）を添加し、細胞／抗体混合物を４℃で２０分間インキュベートし、その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、７ＡＡＤ（１：１０００、Biotium、40043）を含有する１００μｌのＰＢＳに再懸濁した後、Canto IIフローサイトメーター（BD Bioscience）を使用して分析した。死細胞を除去し、ＡＰＣチャネル（６３８ｎｍ  ６６０／２０）の蛍光を測定した。幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）値を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０４３４】
結果を表１２に示す。FS22-172-003-AA/E12v2ｍＡｂ２及びFS22-172-003-AA/HelD1.3モックｍＡｂ２は、細胞表面に発現したヒト及びｃｙｎｏＣＤ１３７受容体にＥＣ５０値が４．８〜９．１ｎＭの範囲で結合し、陽性対照ｍＡｂは、ヒト及びｃｙｎｏＣＤ１３７受容体にＥＣ５０値がそれぞれ１．４５ｎＭ及び４．４ｎＭで結合したことが確認された。ＣＤ１３７を過剰発現しなかったＤＯ１１．１０又はＨＥＫ２９３細胞への結合は認められず、ｍＡｂ２による結合の特異性が確認された。
【０４３５】
【表１３】
2021524268.tif 000014
【０４３６】
９．７  活性化された初代ヒトＴ細胞に内因性発現ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１に対する抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２の結合親和性
活性化された初代ヒトＴ細胞の内因性発現ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１に対する抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２の親和性を、フローサイトメトリーを使用して決定した。Ｔ細胞を単離するために、血小板提供の副産物である白血球枯渇コーンから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。簡単に説明すると、白血球コーンの内容物をＰＢＳで洗い流し、フィコール（Sigma-Aldrich、1440-02）勾配に重ねた。ＰＢＭＣを遠心分離により分離し、フィコール勾配を通過しなかった細胞を回収した。ＰＢＭＣをさらにＰＢＳで洗浄し、残りの赤血球を、製造元の指示に従って１０ｍｌ  １Ｘの赤血球溶解緩衝液（eBioscience、00-4300-54）の添加により溶解した。汎Ｔ細胞を、汎Ｔ細胞単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec Ltd、130-095-130）を製造業者の指示に従って使用して、溶出液中に存在するＰＢＭＣから単離した。ＣＤ１３７は、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞上で高レベルに急速に発現し、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞上でも低レベルに発現する（Xue-Zhong Yu et al,2013）ので、製造業者の指示に従って、Dynabeads（商標）Human T-Activator CD3/CD28（Thermo、11132D）を使用して、汎Ｔ細胞を２４時間刺激した。Human T-Activator beads は、FS22-172-003-AA/E12v2ｍＡｂ２、FS22-172-003-AA/HelD1.3モックｍＡｂ２、G1-AA/E12v2陽性対照抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体、G1-AA/MOR7480.1陽性対照抗ヒトＣＤ１３７抗体、G1-AA/4420陰性対照抗体の結合について試験をするために細胞結合アッセイを使用する前に、製造業者の指示に従って、DynaMag（商標）-15マグネット（Thermo、12301D）を使用してＴ細胞から洗浄した。
【０４３７】
刺激された汎ヒトＴ細胞懸濁液をＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ（Sigma、A7906）を含むＤＰＢＳ（Gibco、14190-094））中で調製し、１００μｌの丸底９６ウェルプレート（VWR、734-1797）中に１×１０５細胞／ウェルで播種した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液に１回洗浄し、ｍＡｂ２FS22-172-003-AA/E12v2、モックｍＡｂ２FS22-172-003-AA/HelD1.3、陽性対照抗体G1-AA/E12v2、陽性対照抗体G1-AA/20H4.9、及び陰性対照抗体G1-AA/4420を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で希釈した（８０ｎＭ〜０．００５ｎＭ、５倍希釈）。洗浄した細胞を、抗ヒトＣＤ４＋ＦＩＴＣ標識抗体（BD Biosciences、550628）及び抗ヒトＣＤ８＋eFluor450標識抗体（Invitrogen、48-0087-42）を含有する希釈した抗体混合物中に再懸濁し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を分化させ、４℃で３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄した。次に、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１０００に希釈した１００μｌ／ウェルの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧAlexa Fluor 647標識抗体、Invitrogen、A21445）を添加し、細胞／抗体混合物を４℃で２０分間インキュベートし、その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、７ＡＡＤ（１：１０００、Biotium、40043）を含有する１００μｌのＰＢＳに再懸濁した後、Canto IIフローサイトメーター（BD Bioscience）を使用して分析した。死細胞を除去し、ＡＰＣチャネル（６３８ｎｍ  ６６０／２０）の蛍光を測定し、試験抗体結合を示した。幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）値を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０４３８】
FS22-172-003-AA/E12v2ｍＡｂ２は、図２のＭＦＩ値に示されているように、刺激されたヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞に結合することが見出された。ＰＤ−Ｌ１陽性対照抗体G1-AA/E12v2は、ｍＡｂ２と類似のＭＦＩ値でＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に結合し、ＰＤ−Ｌ１が細胞上で発現していることを確認した。
【０４３９】
G1-AA/MOR7480.1、ＣＤ１３７陽性対照は上記と同じ細胞に結合することが見出されたが、ＭＦＩはFS22-172-003-AA/E12v2又はG1-AA/E12v2のいずれかで観察されたものよりはるかに低かった。これは、ＰＤ−Ｌ１発現と比較して、細胞上のＣＤ１３７発現が低いことに起因すると考えられる。さらに、G1-AA/MOR7480.1の結合についてＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の方が、ＭＦＩ値が高かった。前述したように、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞の方が低いＣＤ１３７発現を観察することが予想され（Xue-Zhong Yu et al,2013）、これはＣＤ８＋Ｔ細胞とは対照的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ１３７陽性対照抗体ＭＯＲ７４８０．１の低い結合レベルを説明する。初代Ｔ細胞、特にＣＤ４＋Ｔ細胞で見られるこの低いＣＤ１３７発現は、モックｍＡｂ２形式（FS22-172-003-AA/HelD1.3）におけるＦｃａｂの結合が無い又はほとんど見られないことも説明している可能性がある。
【０４４０】
９．８  ＳＰＲによる抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２のＦｃＲｎへの結合
胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の結合は、抗体のリサイクルに重要である（Martins et al.,2016）。FS22-172-003-AA/lam-G02v3、FS22-172-003-AA/E12v2、及びFS22-053-008-AA/E12v2ｍＡｂ２のヒト及びマウスＦｃＲｎへの結合は、BIAcore T200（GE Healthcare）を使用してＳＰＲにより測定された。G1-AA/HelD1.3は、ＣＨ３ドメインに変異がないアイソタイプ対照ＩｇＧ対照として含まれた。
【０４４１】
簡単に説明すると、ｍＡｂ２をSeries S Sensor Chip CM5（GE Healthcare、BR100530）のフローセル２、３、及び４に個別にコーティングして、約１０００ＲＵの応答を達した。フローセル１を活性化／不活性化したが、参照としてブランクのままにした。ヒトＦｃＲｎ（Acro Biosystems、FCM-H5286）又はマウスＦｃＲｎ（R&D systems、9114-Fc）を透析し、ＭＨＢＳ−ＥＰ＋Ｂ  ｐＨ６．０又はｐＨ７．４緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、ForteBio、18-5026；１ｘ  ＨＢＳ−ＥＰ、GE Healthcare、BR100669；０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、Sigma、A7906）で希釈し、フローセル１，２，３及び４に２０００〜３０００ｎＭで２倍希釈液を１分間８０μｌ／分で注入し、次いで緩衝液中で３分間解離させた。再生は必要なかった。減算したデータ（フローセル２−フローセル１、フローセル３−フローセル１、又はフローセル４−フローセル１）をBiacore T200評価ソフトウェア２．０を使用して分析し、モデルの定常状態親和性を使用して結合を特定した。結合データを表１３に示し、FS22-172-003-AA/lam-G02v3、FS22-172-003-AA/E12v2及びFS22-053-008-AA/E12v2ｍＡｂ２が、ｐＨ６．０でヒト又はマウスＦｃＲｎに、対照抗体G1-AA/HelD1.3と類似の親和性で結合することを示した。ｐＨ７．４のヒト又はマウスのＦｃＲｎでは結合は観察されなかった。このデータは、ＦｃＲｎ結合は、ｍＡｂ２によって保持されたことを示した。
【０４４２】
【表１４】
2021524268.tif 000015
【０４４３】
９．９  フローサイトメトリーによってＦｃγ受容体を発現する細胞への抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２の結合
ＴＮＦＲＳＦメンバーを標的とするアゴニスト抗体は、Ｆｃγ受容体を介した架橋を必要とし、標的のクラスター化及び活性化を促進してインビボ活性を達成する（Li et al, 2013）。しかし、Ｆｃγ受容体結合による架橋のため、体系的なＣＤ１３７活性化などの潜在的な標的外作用を回避し、両標的を発現する免疫細胞、例えばＴ細胞のＡＤＣＣ誘導の可能性を低下させるため、ＣＨ２ドメインにＬＡＬＡ変異（ＬＡＬＡ形式の詳細については、実施例３．２参照）を導入することにより、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２のＦｃγ受容体結合能を低下させることを決定した。FcγRIIA（ECACCカタログ番号15042905）、FcγRIIA（ECACCカタログ番号15042903）、FcγRIIA （ECACCカタログ番号15042902）、FcγRIIIA （ECACCカタログ番号15042901）又はFcγRIIB（ECACCカタログ番号15042907）のみを過剰発現しているＣＨＯ細胞へのフローサイトメトリーによる細胞結合を使用して、抗ヒトCD137/PD−L1ｍＡｂ２のＣＨ２ドメインにおけるＬＡＬＡ変異の存在が先述のＦｃγ受容体に対する結合親和性を低下させることを確認した。
【０４４４】
簡単に説明すると、ＣＨＯ．ＦｃγＲＩＩＡ．１３１Ｈ、ＣＨＯ．ＦｃγＲＩＩＡ．１３１Ｅ、ＣＨＯ．ＦｃγＲＩＩＡ．１５８Ｆ、ＣＨＯ．ＦｃγＲＩＩＡ．１５８Ｖ、ＣＨＯ．ＦｃγＲＩＩＢ、又はＣＨＯ．ＷＴ懸濁液をＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ（Sigma、A7906）含有ＤＰＢＳ（Gibco、14190-094））中で調製し、丸底９６ウェルプレート（VWR、734-1797）中の１００μｌに１ｘ１０５細胞／ウェルで播種した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄し、ｍＡｂ２FS22-172-003-AA/E12v2、Ｆｃγ受容体結合抗体G1/4420に対する陽性対照及びＦｃγ受容体抗体G1-AA/4420に対する陰性対照を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で希釈した（５００ｎＭ〜０．０３ｎＭ、４倍希釈）。洗浄した細胞を希釈した抗体混合物に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次に、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１０００に希釈した１００μｌ／ウェルの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧAlexa Fluor 488標識抗体、Stratech Scientific Ltd、109-545-098-JIR）を添加し、細胞／抗体混合物を４℃で２０分間インキュベートし、その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、７ＡＡＤ（１：１０００、Biotium、40043）を含有する１００μｌのＰＢＳに再懸濁した後、CytoFLEXフローサイトメーター（Beckman Coulter）を使用して分析した。死細胞を除外し、ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍ／５２５／４０）の蛍光を測定した。幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）値を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０４４５】
FS22-172-003-AA/E12v2ｍＡｂ２は、試験した全てのＦｃγ受容体発現細胞に対する結合（又は陰性対照抗体G1-AA/4420のレベル以下に結合）を示さなかった（図３（Ａ）ＦｃｇＲＩＩＡ１３１Ｈ、（Ｂ）ＦｃｇＲＩＩＡ１３１Ｅ、（Ｃ）ＦｃｇＲＩＩＢ、（Ｄ）ＦｃｇＲＩＩＩＡ１５８Ｆ、（Ｅ）ＦｃｇＲＩＩＩＡ１５８Ｖ）。これは、ＬＡＬＡ変異がＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ又はＦγｇＲＩＩＢへの結合を減少させ、インビボでこれらの受容体を介したｍＡｂ２架橋も減少させるはずであることを示す。
【０４４６】
実施例１０：ｍＡｂ２機能の特性評価
１０．１  ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
実施例３．５に記載のヒト初代Ｔ細胞アッセイは、ｍＡｂ２の活性を試験するために使用した。
【０４４７】
抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の細胞ベースの架橋のために、ｈＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１）は、本質的に実施例３．５に記載のように産生した。ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞は、高レベルのヒトＰＤ−Ｌ１を発現するように設計されており、中レベルのヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、及び製造元の指示に従い、抗体結合能ビーズ（Quantum Simply Cellular, Bans Laboratories, Inc. カタログ番号816A）によって定量化された、低レベルのヒトＰＤ−Ｌ１（表１４）を発現するＳＫＢＲ３細胞と共に使用した。
【０４４８】
【表１５】
2021524268.tif 000016
【０４４９】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、実施例３．５に記載されるように抗ＣＤ３抗体を使用して活性化した。ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞を２×１０５細胞／ウェルで、抗ＣＤ３抗体（８μｇ／ｍｌ）でコーティングした９６ウェル平底プレート上に１００μｌのＴ細胞培養培地（１０％ＦＢＳ（Life Technologies）、１Ｘペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies、15140122）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070）、及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Gibco、M6250）を含むＲＰＭＩ培地（Life Technologies、61870-044））でプレーティングした。対照として使用されたｈＰＤ−Ｌ１を発現するように形質導入されなかったＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞又はＨＥＫ細胞が４時間のインキュベーション後に付着した時点で、全てのＴ細胞培養培地を除去し、Ｔ細胞を含有する１００μｌのＴ細胞培養培地で５．０×１０５細胞／ｍｌの濃度で置き換え、５．０×１０４細胞／ウェルを得た。
【０４５０】
ＰＤ−Ｌ１発現のより低い生理学的レベルでの細胞ベースの架橋のために、ヒト乳腺癌細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）を、ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞ベースの架橋について記載したのと同じ方法で使用した。
【０４５１】
ｍＡｂ２を、５０ｎＭで開始する２倍の最終濃度でＴ細胞培地中に希釈し、１：５滴定を実行した。１００μｌのｍＡｂ２滴定を２００μｌの総アッセイ体積及び１倍の抗体濃度ために細胞に添加した。
【０４５２】
陽性対照抗ＣＤ１３７抗体（G1-AA/20H4.9）を５０ｎＭ架橋剤（抗ヒトＣＨ２抗体（mG1/MK1A6））を含有する５０ｎＭで開始する２倍の最終濃度でＴ細胞培地中に希釈し、１：５滴定を実行した。１００μｌの希釈した陽性対照抗体／架橋剤混合物を、合計２００μｌのアッセイ体積及び１倍の抗体濃度のために細胞に添加した。
【０４５３】
このアッセイを、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。上清を回収し、製造元の指示に従ってヒトＩＬ−２ELISA Ready-SET-Go!キット（eBioscience、カタログ番号88-7025-88）でアッセイした。Gen5 Software、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０４５４】
表１５は、細胞ベースの架橋で試験された抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２存在下で、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて観察されたＩＬ−２放出のＥＣ５０値及び最大応答を示す。陽性対照抗ヒトＣＤ１３７ｍＡｂである２０Ｈ４．９は、いずれかのアッセイにおいて抗ｈＣＨ２抗体で架橋する場合、０．２１から０．３１ｎＭのＥＣ５０でｈＩＬ−２放出の増加を示す。全てのクローンは、アッセイにおいて活性を有し、それぞれナノモル濃度以下のＥＣ５０で効力を示した。Fcab FS22-172-003を含有するｍＡｂ２は、ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１ベースのアッセイでは０．１９〜０．３１ｎＭの範囲、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ベースのアッセイでは０．０１〜０．０２ｎＭの範囲のＥＣ５０を有する最大のＴ細胞応答を誘発した。ｍＡｂ２のサブセット（Ｆｃａｂ含有ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−１７３−００３及びＦＳ２２−１７２−００４）も、ＨＥＫ細胞上で発現されたＰＤ−Ｌ１による架橋なしで試験され、予想されたように、このアッセイにおいて活性を示さなかった。図４及び図５は、表１５に列挙されたｍＡｂ２のＴ細胞活性化アッセイについてＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。
【０４５５】
FS22-053及びFS22-172 Fcab系統も、このアッセイで、最も低いＰＤ−Ｌ１発現ヒト乳腺癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３０）を使用して試験した。予想通り、ＰＤ−Ｌ１の発現が低いと、前の２つのアッセイと一致してＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化が低下した（データは示さず）。
【０４５６】
【表１６】
2021524268.tif 000017
【０４５７】
結果は、ｍＡｂ２が、異なるレベルのＰＤ−Ｌ１を発現する細胞に結合し得ることを示した。細胞発現ＰＤ−Ｌ１への結合は、ｍＡｂ２の架橋をもたらし、ＩＬ−２産生によって測定されるように、Ｔ細胞上のＣＤ１３７に結合し、クラスター化し、活性化することができた。観察された活性化のレベルは、ＰＤ−Ｌ１に結合することによる架橋のレベルに関連しており、ここで、ｍＡｂ２は、より大きい活性化を有するより高いレベルのhPD-L1（ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１）を発現する細胞に結合し、一方で、より低いレベルのＰＤ−Ｌ１発現は、より低い活性化を誘発した。
【０４５８】
１０．２  ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞の異なる集団で架橋された抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
異なる細胞株によるＰＤ−Ｌ１の発現レベルがＣＤ１３７の活性化に影響することが観察されたため、試験したｍＡｂ２の機能的活性に対するＰＤ−Ｌ１発現の影響をさらに調査することを決定した。集団ベースのアプローチにおいて、ヒトＰＤ−Ｌ１発現のレベルを調節するために、ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１対ＨＥＫ．ＷＴ細胞の比率を変化させた、実施例１０．１に記載されたものと同様のアッセイを実施した。
【０４５９】
ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞と、ｈＰＤ−Ｌ１を発現するように形質導入されなかったＨＥＫ細胞（ＨＥＫ．ＷＴ）とを異なる比率でプレーティングして、図６に記載のＨＥＫ細胞全体に占めるＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞のパーセンテージを示した（１００％、５０％、２５％、１２．５％、６．５％、又は０％）。ＨＥＫ細胞を２×１０５総ＨＥＫ細胞／ウェルで、抗ＣＤ３抗体（８μｇ／ｍｌ）でコーティングした９６ウェル平底プレート上に１００μｌのＴ細胞培養培地（１０％ＦＢＳ（Life Technologies）、１Ｘペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies、15140122）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070）、及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Gibco、M6250）を含むＲＰＭＩ培地（Life Technologies、61870-044））でプレーティングした。４時間のインキュベーション後に全てのＨＥＫ細胞を接着した後、全てのＴ細胞培養培地を除去し、Ｔ細胞を５．０×１０５細胞／ｍｌの濃度で含有する１００μｌのＴ細胞培養培地で置換し、５．０×１０４細胞／ウェルを得た。
【０４６０】
アッセイは、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/E12v2を使用して実行したが、それ以外は実施例１０．１に記載のプロトコルに従った。抗ＣＤ１３７陽性対照抗体G1-AA/20H4.9は、抗ＣＨ２抗体を介した追加の架橋と共に含まれていた。抗体G1-AA/4420を陰性対照として使用した。
【０４６１】
図６の結果は、観察される最大hIL-2濃度の増加によって示されるように、ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞の集団が増加するにつれて、ｍＡｂ２の活性も増加したことを示す。存在するＨＥＫ細胞集団の１００％がＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１であった場合、最大の架橋が達成され、最高の最大hIL-2濃度が観察された。陽性対照抗体G1-AA/20H4.9も、抗ＣＨ２抗体によって最大限に人工的に架橋された場合、同様の最大hIL-2濃度に達した。
【０４６２】
データは、系に存在するＰＤ−Ｌ１の量（細胞表面に異なるレベルのＰＤ−Ｌ１を発現する細胞株を試験するか、又はＰＤ−Ｌ１を提示する集団内の細胞数を調節することによって表される）が、ｍＡｂ２の架橋を制御し、それにより、ｍＡｂ２により誘導されるＣＤ１３７アゴニスト作用のレベルを決定するという所見をサポートする。しかし、低レベルのＰＤ−Ｌ１しか存在しない場合でも、ｍＡｂ２は依然としてＣＤ１３７をアゴナイズすることができた。したがって、ｍＡｂ２は、ＰＤ−Ｌ１が系内で発現する活性を有し、ＣＤ１３７を発現する活性化Ｔ細胞が存在すると予想される。系内のＰＤ−Ｌ１のレベルが上がると、発揮されるアゴニスト作用も増加すると予想される。依然として低レベルのＣＤ１３７の存在下でのＣＤ１３７アゴニスト作用を誘導することができるｍＡｂ２とは対照的に、ＰＤ−Ｌ１に結合した分子は、ＣＤ１３７のクラスター化を駆動するには離れすぎている可能性が高く、これは、本発明のｍＡｂ２の場合のように、分子がＣＤ１３７に二価で結合できる問題であるとは予想されないため、ＣＤ１３７に一価で結合するＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１分子は、低レベルのＰＤ−Ｌ１の存在下で、低い効率を有することが予想される。
【０４６３】
１０．３  ヒト初代混合リンパ球反応アッセイにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで試験された（実施例５．３．４を参照）。ＭＬＲアッセイでは、あるドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞及び別のドナーからの単球由来樹状細胞（ｉＤＣ）を使用した。免疫細胞には生理学的レベルの免疫チェックポイント調節因子が含まれているため、ＭＬＲアッセイを使用して、Ｔ細胞活性化がヒト系のｍＡｂ２によって増強されることを確認することができる。
【０４６４】
実施例５．３．４に記載されるように、拡大培養したＣＤ４＋Ｔ細胞及びｉＤＣを生成した。
【０４６５】
拡大培養されたＴ細胞は、実験の１日前に解凍し、ＡＩＭ  Ｖ培地（GIBCO、12055-091）で洗浄し、ＡＩＭ  Ｖ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。表１６に記載の抗ＣＤ１３７及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体並びに抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２を、９６ウェル丸底プレート（VWR、734-1797）中、５０μｌ  ＡＩＭ  Ｖ培地で最終濃度の４倍に希釈した。ＬＡＬＡ変異を含むＭＳＬ１０９（国際公開第１９９４／０１６７３０  Ａ１号に記載）と呼ばれる抗サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｇＨ糖タンパク質抗体を陰性対照として含めた。３０ｎＭから０．００２ｎＭまでの３倍希釈系列を試験した。５０μｌのＡＩＭ  Ｖ培地に懸濁した１ｘ１０４ｉＤＣ細胞、及び１００μｌのＡＩＭ  Ｖ培地に懸濁した１ｘ１０５拡大培養したＣＤ４＋Ｔ細胞の両方を、抗体希釈液に添加し、３７℃＋５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。以下の陰性対照が含まれていた：ＣＤ４＋Ｔ細胞単独、ｉＤＣ単独、ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ｉＤＣ、及びＡＩＭ  Ｖ培地単独。上清を回収し、サンプルを希釈し（１：２５）、ヒトＩＦＮガンマELISA Ready-SET-Go!キット（Life Technologies、88-7316-77）を使用して、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）濃度を測定した。Gen5 Software、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。ヒトＩＦＮ−γの濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０４６６】
抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体G1/S70は、ＥＣ５０値が０．０６ｎＭであり、最大レベルのＩＦＮ−γ（Ｅｍａｘ）が１１３５ｐｇ／ｍｌであるＭＬＲアッセイにおいて強力な活性を示した（表１６、代表図７Ａ及び７Ｂ）。ＥＣ５０は、アゴニスト性応答の半分が達成されるｍＡｂの濃度を示し、他方で、Ｅｍａｘは、アッセイで達成されるＩＦＮ−γの最大濃度を示す絶対値である。予想通り、陰性対照G1-AA/MSL109抗体では活性は観察されなかった。陽性の抗ヒトCD137抗体対照G1-AA/20H4.9は、抗hCH2抗体と架橋した場合、活性を誘発しなかった。これは、ＣＤ１３７の発現が低い可能性があり、ＰＤ−Ｌ１の遮断が非常に強いため、このアッセイではＰＤ−Ｌ１の遮断がＣＤ１３７のシグナル伝達を圧倒することを示している。驚くべきことに、このアッセイにおいて試験された全ての抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、２６２６から３３２７ｐｇ／ｍｌの範囲で０．０４未満の非常に強力なＥＣ５０値及び高いＥｍａｘ値を示した。これは、ｍＡｂ２が、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７モノクローナル抗体のいずれよりもこのアッセイで効力が増加していることを示す。
【０４６７】
【表１７】
2021524268.tif 000018
【０４６８】
上記と同じプロトコルに従って、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/E12v2の活性をＭＬＲで、しかし今回は、各構成部分（モックｍＡｂ２形式の抗ヒトFS22-172-003 Fcab及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体G1-AA/E12v2）及びこれらの組み合わせに対して、再度試験した。
【０４６９】
抗ヒトＰＤ−Ｌ１成分抗体G1-AA/E12v2は、ＥＣ５０値が０．０８ｎＭであり、最大レベルのＩＦＮ−γ（Ｅｍａｘ）が１２４２１ｐｇ／ｍｌであるＭＬＲアッセイにおいて強力な活性を示した（表１７；代表図７Ｃ）。予想通り、陰性対照G1-AA/4420抗体では活性は観察されず、モックｍＡｂ２形式の抗ヒトFcab FS22-173-003では活性は観察されなかった。陽性の抗ヒトCD137抗体対照G1-AA/20H4.9は、抗hCH2抗体と架橋した場合、活性を誘発しなかった。これは、ＣＤ１３７の発現が低い可能性があり、上記で見られたようにＰＤ−Ｌ１の遮断が非常に強いため、このアッセイではＰＤ−Ｌ１の遮断がＣＤ１３７のシグナル伝達を圧倒することを示している。予想通り、抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2は、０．０７ｎＭの非常に強力なＥＣ５０値及び１７８７４ｐｇ／ｍｌの高いＥｍａｘ値を示した。これは、ｍＡｂ２が、抗ＰＤ−Ｌ１及び抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体のいずれか単独又は両方の組み合わせよりも、このアッセイで効力が増加していることを示す。データは、ｍＡｂ２が、それぞれ、ｍＡｂ２のＦｃａｂ及びＦａｂ結合部位を含む２つの抗体の組み合わせよりも大きな効力を有していたことも示す。
【０４７０】
【表１８】
2021524268.tif 000019
【０４７１】
１０．４  抗原リコールＴ細胞活性化アッセイにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
生理学的に関連する抗原を含有する２つの異なるペプチドプールに対する免疫応答を測定することによって、抗原リコールＴ細胞活性化アッセイにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性を試験した。１つのプールは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を試験するサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、及びインフルエンザウイルス（ＣＥＦ）からのＭＨＣクラスＩ制限ペプチドを含み、第２のプールは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を試験したサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、及び破傷風毒素（ＣＥＦＴ）からのＭＨＣクラスＩＩ制限ペプチドを含む。単一のドナーからのヒトＰＢＭＣが使用され、免疫細胞は生理学的レベルの免疫チェックポイント調節因子を含み、抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞受容体の架橋ではなく抗原提示によって刺激されたため、アッセイの結果は、抗原駆動Ｔ細胞活性化は、ヒトの系におけるｍＡｂ２により増強されること確認する。
【０４７２】
凍結保存された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍して計数し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２＋５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７、及び１μｇ／ｍｌのＣＥＦペプチドプール（Thinkpeptides、カタログ番号PX-CEF-G）又は１μｇ／ｍｌのＣＥＦＴペプチドプール（Thinkpeptides、カタログ番号PX-CEF-G）のいずれかを含有する、２００μｌのRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）培地中、ウェルあたり１．９ｘ１０５細胞を９６ウェル平底プレートに播種した。細胞を、３日間、５％ＣＯ２と共に３７℃でインキュベートした。３日後、１０％ＦＢＳを含有し、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２及び１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を維持する、２２．５μｌの新鮮ＲＰＭＩを添加して培地を補充した。細胞を、さらに４日間、５％ＣＯ２と共に３７℃でインキュベートした。
【０４７３】
細胞を収集し、一緒にプールし、次に、１０％ＦＢＳ＋１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２＋５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７、及び１μｇ／ｍｌのＣＥＦペプチドプール又は１μｇ／ｍｌのＣＥＦＴペプチドプールのいずれかを含有する、１５０μｌのＲＰＭＩ中、ウェルあたり１×１０５細胞で、９６ウェル丸底プレートに分配した。ｍＡｂ２は、細胞を播種し、細胞に添加したものと同じ培地で希釈した。
【０４７４】
陽性対照抗ＣＤ１３７抗体（G1-AA/20H4.9）及び陽性対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体（G1-AA/E12v2）のそれぞれを、４００ｎＭ架橋剤（抗ヒトＣＨ２抗体（mG1/MK1A6））を含有する４００ｎＭで開始する２倍の最終濃度で、細胞を播種したものと同じ培地中に希釈し、１：５滴定を実行した。５０μｌの希釈した陽性対照抗体／架橋剤混合物のいずれかを、合計２００μｌのアッセイ体積及び１倍の抗体濃度のために細胞に添加した。
【０４７５】
このアッセイを、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。上清を収集し、MSD U-PLEXキット（Meso Scale Discovery、カタログ番号K15067L-2）を使用して、製造元の指示に従ってアッセイした。プレートは、１：５のサンプル希釈を使用して、MESO QuickPlex SQ 120電気化学発光プレートリーダー機器で読み取った。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、MSD Discovery Workbench 4.0ソフトウェアを使用して計算され、上清中のサイトカイン濃度は、GraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合された。
【０４７６】
表１８及び表１９に示すように、抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体G1-AA/E12v2は、それぞれ０．０６ｎｍ及び０．０４ｎＭのＥＣ５０値（それぞれ６５８４０ｐｇ／ｍｌ及び８６６１３ｐｇ／ｍｌのＥｍａｘ）で、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方のＴ細胞の活性化につき活性を示した。ＥＣ５０は、アゴニスト性応答の半分が達成されるｍＡｂの濃度を示し、他方で、Ｅｍａｘは、アッセイで達成されるＩＦＮ−γの最大濃度を示す絶対値である。陽性の抗ヒトＣＤ１３７抗体対照G1-AA/20H4.9は、抗hCH2抗体と架橋した場合、０．３３ｎＭのＥＣ５０値及び１１６２０４ｐｇ／ｍｌのＥｍａｘ値で、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化につき活性を示したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化につき活性は誘発されず、これは、ＣＤ１３７発現が、ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞でより高い可能性があることを示している。予想通り、陰性対照G1-AA/4420抗体では活性は観察されなかった。驚くべきことに、ｍＡｂ２は、それぞれ０．０８ｎＭ及び０．０３ｎＭのＥＣ５０値で、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の両方のアッセイにおいて活性を示した。ｍＡｂ２は、ＰＢＭＣ発現ＰＤ−Ｌ１に結合でき、両方の細胞タイプで同等のＰＤ−Ｌ１活性を示した。さらに、ＰＢＭＣ発現ＰＤ−Ｌ１への結合は、ｍＡｂ２の架橋をもたらし、ＩＦＮ−γ放出によって測定されるように、両方のＴ細胞サブタイプにおいて、ＣＤ１３７を結合し、クラスター化し、活性化することができた。ｍＡｂ２で処置されたＴ細胞によって放出されたＩＦＮ−γの最大濃度は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化につき、それぞれ、８６６８０ｐｇ／ｍｌ及び１８８２４２ｐｇ／ｍｌのＥｍａｘ値で、どの陽性対照抗体よりも高かった。これは、ｍＡｂ２が、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７モノクローナル抗体のいずれよりもこのアッセイで活性が増加していることを示す。
【０４７７】
【表１９】
2021524268.tif 000020
【０４７８】
【表２０】
2021524268.tif 000021
【０４７９】
１０．５  ＰＤ−Ｌ１遮断マウスＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
FS22-172-003-AA/E12v2の活性は、ＰＤ−Ｌ１チェックポイント遮断活性を調査するために、マウスＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイで試験した。ヒトＰＤ−Ｌ１に対する機能的活性は、実施例５．４に記載されているように、ＤＯ１１．１０  ＯＶＡ  Ｔ細胞及びＬＫ３５．２  Ｂ細胞ハイブリドーマ細胞を使用するＩＬ−２放出アッセイで調べた。
【０４８０】
結果を表２０に示す。抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ２は、１．２７ｎＭのＥＣ５０値で、マウスＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイで強力な活性を示し、これは、FS22-172-003-AA/E12v2がＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の相互作用を遮断できることを確認する。その活性は、陽性対照抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体G1-AA/E12v2及びG1-AA/S70の活性と類似しており、これは、G1-AA/E12v2がFS22-172-003-AA/E12v2 mAb2分子に組み込まれた場合、抗ヒトＰＤ−Ｌ１活性の喪失が発生しなかったことを示す。
【０４８１】
【表２１】
2021524268.tif 000022
【０４８２】
実施例１１：カニクイザル機能アッセイにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の機能的交差反応性
１１．１  カニクイザルＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
活性化Ｔ細胞上のアゴニスト分子を介したＣＤ１３７クラスター化は、Ｔ細胞の活性化及び下流のシグナル伝達を誘発し、その結果ＩＬ−２産生をもたらすが、これに限定されるものではない。カニクイザルＣＤ１３７を発現するＤＯ１１．１０細胞を活性化する抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の能力は、Ｔ細胞活性化アッセイで試験した。カニクイザルＣＤ１３７を過剰発現するように操作されたＤＯ１１．１０Ｔ細胞を使用してＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイが開発され、ＩＬ−２放出を測定することにより、Ｔ細胞活性化が評価された。
【０４８３】
「DO11.10.cCD137」呼ばれる、全長カニクイザルＣＤ１３７（配列番号１８９）を発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）は、実施例１．２に記載されているように産生され、カニクイザルＣＤ１３７の発現が確認された。
【０４８４】
以下の抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、このＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイで試験した。FS22-172-003-AA/lamG02v3、FS22-053-008-AA/E05v2、FS22-053-008-AA/E12v2、FS22-053-008-AA/G12v2、FS22-053-017-AA/E05v2、FS22-053-017-AA/E12v2、FS22-053-017-AA/G12v2、FS22-172-003-AA/E05v2、FS22-172-003-AA/E12v2、FS22-172-003-AA//G12v2。ｍＡｂ２又はG1-AA/MOR7480.1陽性対照ｍＡｂを、抗ｈＣＨ２抗体（mG1/MK1A6）架橋剤を有するか又は有しないいずれかで希釈して調製し、一晩０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（clone 17A2、BioLegend、100208）でコーティングした９６ウェルの丸底プレートに入れられたDO11.10.cCD137細胞に添加し、２×１０５HEK.cyPD-L1細胞を播種して、カニクイザルＰＤ−Ｌ１を過剰発現する細胞ベースの架橋細胞として使用した。実施例９．５に記載のカニクイザルＰＤ−Ｌ１を使用して、実施例５．３．３に記載のようにカニクイザルＰＤ−Ｌ１を過剰発現する細胞を作製した。１８時間のインキュベーション後、上清を回収し、製造元の指示に従ってマウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、88-7024-86）でアッセイした。Gens Software、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から５７０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４つのパラメーターのロジスティック曲線適合（Gens Software、BioTek）に基づいていた。ｍＩＬ−２の濃度をｍＡｂ２又はベンチマークｍＡｂの対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０４８５】
このアッセイにおいて試験された全ての抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、ｍＡｂ２を架橋するカニクイザルＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ細胞の存在下で活性を示し、これは、全てのｍＡｂ２は、両方のカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合し、ＩＬ−２産生による読み出しとしてＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化を誘発するカニクイザルＣＤ１３７に結合し、クラスター化することを示す（表２１及び図８を参照）。全ての抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、細胞発現カニクイザルＰＤ−Ｌ１を介して架橋された場合にのみ、０．０６から０．１１ｎＭの範囲のＥＣ５０値及び８０６０から１２３００ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−２の範囲のＥｍａｘで、類似の活性を示した。カニクイザルＰＤ−Ｌ１の不存在下において、カニクイザルＰＤ−Ｌ１を発現しないＨＥＫ細胞を使用してアッセイを行った場合、架橋がない結果として活性を有しなかった。カニクイザルの交差反応性が示されている陽性対照ＣＤ１３７抗体G1-AA/MOR7480.1（Fisher et al, 2012）は、抗ＣＨ２と架橋した場合、このアッセイで活性を示すが、全ての抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、カニクイザルＣＤ１３７発現系において、交差反応性及びより良好な活性を示す、より低いＥＣ５０値及びより高いＥｍａｘ値の両方の意味でより良好である。
【０４８６】
【表２２】
2021524268.tif 000023
【０４８７】
１１．２  カニクイザル初代混合白血球反応アッセイにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性は、カニクイザル混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで試験された。実施例１０．３に記載のヒトＭＬＲアッセイと同様に、このアッセイは、２つの同種異系リンパ球集団（同じ種であるが、遺伝的に異なる）間で発生する細胞性免疫アッセイ応答を測定する。このアッセイでは、一個体のカニクイザルのＣＤ４＋Ｔ細胞と、別の個体のＣＤ１４＋単球を使用する。免疫細胞には生理学的レベルの免疫チェックポイント調節因子が含まれているため、ＭＬＲアッセイを使用して、Ｔ細胞活性化がカニクイザル系のｍＡｂ２によって増強されることを確認することができる。
【０４８８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離
ＰＢＭＣは、フィコール勾配分離によってカニクイザル血液サンプルから分離された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、非ヒト霊長類ＣＤ４＋単離キット（Miltenyi Biotec Ltd、130-091-102）を使用して、製造元の指示に従って単離した。細胞は、ＭＬＲアッセイで新鮮に使用された。
【０４８９】
ＣＤ１４＋単球の単離
未処理の単球は、非ヒト霊長類ＣＤ１４単離キット（Miltenyi Biotec Ltd、130-091-097）を使用して、製造元の指示に従ってカニクイザルＰＢＭＣから単離した。単球は、ＭＬＲアッセイで新鮮に使用された。
【０４９０】
ＭＬＲアッセイ
抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２ FS22-172-003-AA/E12v2及び抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体G1-AA/E12v2及びアイソタイプ対照抗体G1-AA/4420を、９６ウェル丸底プレート（VWR、734-1797）中、５０μｌ  ＡＩＭ  Ｖ培地で最終濃度の４倍に希釈した。ＬＡＬＡ変異を含有するＨｅｌＤ１．３と呼ばれる抗鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）抗体（実施例２．２に記載）を陰性対照として含めた。３００ｎＭから０．０２ｎＭまでの４倍希釈系列を試験した。５０μｌのＡＩＭ  Ｖ培地に懸濁した７．５ｘ１０４単球細胞、及び１００μｌのＡＩＭ  Ｖ培地に懸濁した７．５ｘ１０５ＣＤ４＋Ｔ細胞の両方を、抗体希釈液に添加し、３７℃＋５％ＣＯ２で６日間インキュベートした。以下の陰性対照が含まれていた：ＣＤ４＋Ｔ細胞単独、ＣＤ１４＋Ｔ単球単独、ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ｉＤＣ、及びＡＩＭ  Ｖ培地単独。上清を２日目に収集し、インターロイキン２（ＩＬ−２）濃度をMILLIPLEX MAP非ヒト霊長類サイトカイン磁気ビーズパネル（Merck Millipore、カタログ番号PRCYTOMAG-40K-01）を使用して測定し、上清をまた６日目に収集し、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）濃度を同じキットを使用して測定した。サンプルは、Bio-RadのBio Plex 200装置で分析した。
【０４９１】
両方の抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、このアッセイにおいて活性を示し、これは、ｍＡｂ２が、カニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合し、その後、新たに単離されたカニクイザル免疫細胞に対して内因性の発現レベルでカニクイザルＣＤ１３７に結合してクラスター化することができ、Ｔ細胞の活性化の結果としてのサイトカイン放出をもたらすことを示す（図９を参照）。
【０４９２】
１１．３  カニクイザル初代ＰＭＢＣアッセイにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性がカニクイザル初代ＰＭＢＣアッセイで試験された。このアッセイは、抗ＣＤ３  ｍＡｂで刺激されたＰＢＭＣの混合集団で発生する細胞性免疫アッセイ応答を測定する。アッセイは、一個体のカニクイザルからの全ＰＢＭＣを使用し、免疫細胞には生理学的レベルの免疫チェックポイント調節因子が含まれているため、ＰＢＭＣアッセイを使用して、Ｔ細胞活性化がカニクイザル系のｍＡｂ２によって増強されることを確認することができる。
【０４９３】
実験は、基本的に実施例３．５に記載されているように、以下の偏差を伴って実施した。陽性対照抗ＣＤ１３７抗体（G1-AA/MOR7480.1）を、４０ｎＭ架橋剤（抗ヒトＣＨ２抗体（mG1/MK1A6））を含有する４０ｎＭで開始する２倍の最終濃度で、細胞を播種したものと同じ培地中に希釈し、１：４滴定を実行した。ｍＡｂ２（FS22-172-003-AA/E12v2）及び陰性対照抗体（G1-AA/HelD1.3）は、架橋剤なしで同じ方法で希釈した。１００μｌの希釈した抗体／架橋剤混合物を、合計２００μｌのアッセイ体積及び１倍の抗体濃度のために細胞に添加した。このアッセイを、３日間、５％ＣＯ２と共に３７℃でインキュベートした。
【０４９４】
上清を収集し、MSD V-Plex Proinflammatory Panel 1（NHP）キット（Meso Scale Discovery、カタログ番号K15056D-2）を使用して、製造元の指示に従ってアッセイした。プレートは、MESO QuickPlex SQ120電気化学発光プレートリーダー機器で読み取った。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、MSD Discovery Workbench 4.0ソフトウェアを使用して計算され、上清中のサイトカイン濃度は、GraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合された。
【０４９５】
図２８Ａは、カニクイザルＰＢＭＣアッセイにおけるＴ細胞活性化からのＩＦＮ−γ放出の代表的なプロットを示し、図２８Ｂは、ヒトＰＢＭＣアッセイにおけるＴ細胞活性化からのＩＦＮ−γ放出の代表的なプロットを示す。
【０４９６】
抗ヒトＣＤ１３７抗体G1-AA/MOR7480.1は、抗ｈＣＨ２抗体と架橋した場合、両方のＰＢＭＣアッセイで活性を示した。予想通り、陰性対照G1-AA/HelD1.3抗体では活性は観察されなかった。驚くべきことに、ｍＡｂ２は、それぞれ０．０８ｎＭ及び０．０３ｎＭのＥＣ５０値で、両方のＰＢＭＣアッセイにおいて類似の活性を示した。ＥＣ５０は、アゴニスト性応答の半分が達成されるｍＡｂの濃度を示す。したがって、ｍＡｂ２は、ＰＢＭＣ発現ＰＤ−Ｌ１へ結合でき、ｍＡｂ２の架橋をもたらし、ＩＦＮ−γ放出によって測定されるように、両方の種のＴ細胞において、ＣＤ１３７を結合し、クラスター化し、活性化することができた。ｍＡｂ２で処置されたＴ細胞によって放出されたＩＦＮ−γの最大濃度は、どの陽性対照抗体よりも高く、これは、ｍＡｂ２が、抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体よりもこのアッセイで活性が増加していることを示す。
【０４９７】
実施例１２：抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂの産生
マウス及びヒトのＣＤ１３７配列間の配列相同性が低いことから、マウスのヒト交差反応性Ｆｃａｂを取得できないリスクがあるため、インビボのマウスモデルにおけるＣＤ１３７抗原結合領域を含有するｍＡｂ２の活性を試験するために、マウスＣＤ１３７に特異的に結合するＦｃａｂを生成され、特性評価した。マウスＣＤ１３７結合Ｆｃａｂが生成された後、驚くべきことに、FS22-053-14はマウス及びヒトの交差反応性を有することができることがその後見出された。
【０４９８】
１２．１  抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂのナイーブ選択
ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂを選択するために、ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの選択について前述したものと同様に、酵母及びファージディスプレイ選択キャンペーンを採用した（実施例２．１を参照）。組換えマウス二量体ＣＤ１３７又は抗原として使用される完全長マウスＣＤ１３７を発現する細胞（実施例１を参照）。
【０４９９】
インハウスのmCD137-mFc-Avi抗原及びｍＣＤ１３７を発現するＤＯ１１．１０細胞（DO11.10.mCD137）を、６つのファージライブラリーを使用した選択に使用した。全てのラウンド３組換え抗原アウトプット（５７６クローン）及び全てのラウンド３細胞選択アウトプット（５７６クローン）は、ファージＥＬＩＳＡによって、及びDO11.10.mCD137細胞への細胞結合について、スクリーニングした。３４個のＦｃａｂクローンヒットをサブクローン化し、実施例２．２に記載のようにＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂ2として産生した。
【０５００】
ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの選択に以前に使用されたヒトＩｇＧ１のＣＨ１からＣＨ３ドメインを表示する４つのナイーブ酵母ライブラリーを、マウスＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの選択に使用した。抗マウスＣＤ１３７バインダーを同定するために、合計５３回の別個のラウンドの選択が実施された。インハウスで産生した組換え二量体ビオチン化マウスＣＤ１３７（mCD137-mFc-Avi）抗原を使用して、酵母ナイーブライブラリーからバインダーを選択した。
【０５０１】
１２．２  ナイーブ選択からの抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ特性評価
マウスＣＤ１３７に対する抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂの特異性は、ＨｅｌＤ１．３「モック」ｍＡｂ２形式で試験し、Ｆｃａｂの他のマウスＴＮＦＲＳＦ受容体（ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ）への結合を試験することにより、Octet QKeシステムのＢＬＩによって測定した。１０ｎｇ／μｌのマウスＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０受容体をコーティングするためのストレプトアビジンバイオセンサー（PALL ForteBio 18-5021）（全てR&D Systemsから入手し、Thermoscientific #21328のEZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotinキットを使用してビオチン化した）。モックｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂは、少なくとも１μＭの最終濃度まで、動的バッファー（PALL 18-1092）で１：１に希釈した。抗原でコーティングされたセンサーをｍＡｂ２溶液に１８０秒間浸した後、１×動的バッファーに１８０秒間浸した。各ＴＮＦＲＳＦ受容体の抗体を陽性対照として使用した。ＦｃａｂクローンFS22m-055、FS22m-063、FS22m-066、FS22m-075、FS22m-135、FS22m-055、FS22m-063、FS22m-066は、試験したＴＮＦＲＳＦ受容体のいずれにも結合せず、したがって、そのマウスＣＤ１３７に対する特異性を示した。
【０５０２】
マウスＣＤ１３７配列を発現するHEK.FRT.luc細胞（配列番号１８７）は、実施例２．３で前述したものと同じ方法に従って産生された。前に選択された抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂを含有するｍＡｂ２は、実施例２．３に記載された方法に従って、この細胞株、HEK.FRT.luc.mCD137を使用してスクリーニングした。５６のｍＡｂ２が試験され、そのうち２９がＮＦ−κＢ活性につき陽性であった。ＬＡＬＡ変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（G1-AA/Lob12.3）を含有するＬｏｂ１２．３を、陽性対照抗マウスＣＤ１３７  ｍＡｂとして使用し、発光の増加を示し、アッセイの有効性を確認した。ＬＡＬＡ変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃも含有するＨｅｌＤ１．３を、陰性対照ヒトＩｇＧアイソタイプとして使用して、このアッセイにおけるヒトＩｇＧモックＦａｂからの干渉を除外した。可能な場合、ＥＣ５０を計算し、活性においてプラトーに達しなかったｍＡｂ２は、古典的なＳ字状の活性動態を示したｍＡｂ２の有利になるよう無視された。ｍＡｂ２は、プロテインＬ架橋時の活性のＥＣ５０及び倍率変化の順にランク付けした。FS22m-063は、架橋時に最高のＥＣ５０（１．４４ｎＭ）を有し、架橋時に活性の倍率変化が最も大きい（２７倍）ことに基づいて選択された。
【０５０３】
１２．３  マウスＣＤ１３７  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるモックｍＡｂ２形式のFS22m-063、FS22-053-014及びFS22-053-017 Fcabの活性
FS22-053-017クローン（ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２形式）も、実施例２．４に記載されているようなマウスCD137DO11.10T細胞活性化アッセイにおいて、親のFS22-053-014クローン（ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２形式）と同様に、マウスＣＤ１３７結合ＦｃａｂクローンFS22m-063（ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２形式）と比較された。ｍＡｂ２分子は、４：１のモル比（ｍＡｂ２：タンパク質Ｌ）で、プロテインＬと架橋された。結果を表２２に示す。
【０５０４】
予想通り、試験した全ての分子は、プロテインＬによって架橋された場合にＩＬ−２放出によって測定された活性を示したが、架橋されていない場合は活性を有しなかった。マウスＣＤ１３７に結合するように選択されたFS22m-063は、架橋した場合、０．３９ｎＭのＥＣ５０で、アッセイ中最高の活性を有していた。FS22-053-14とFS22-053-017の両方がアッセイで活性を示し、変異誘発によって機能が失われなかったことを示している。ただし、FS22-053-017は、プロテインＬで架橋された場合にFS22-053-14よりおよそ８倍低いＥＣ５０で、活性のわずかな損失を有していた。図１０は、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、親和性成熟ヒト及びマウス交差反応性ＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22-053-014及びFS22-053-017、並びに抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063が、ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２形式で、プロテインＬと架橋するとＣＤ１３７を活性化し、ｍＩＬ−２を放出することを示す。
【０５０５】
【表２３】
2021524268.tif 000024
【０５０６】
実施例１３：抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２のインビトロでの特性評価
インビボのマウスモデルにおけるＣＤ１３７抗原結合領域を含有するｍＡｂ２の活性を試験するために、実施例１２．３に記載されているように、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて最良の活性を示したＦｃａｂとしてFS22m-063を選択した。
【０５０７】
１３．１  抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の構築、発現及び精製
抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063と、ＰＤ−Ｌ１結合Ｆａｂ領域（米国特許第８，２１７，１４９ Ｂ２号からのクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）も含む、抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２が産生された。これらは、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ含有抗ＰＤ−Ｌ１結合抗体のＣＨ３の一部をＦｃａｂの対応する領域で置換することにより、実施例３．２に記載の方法と同様に調製した。これらのＰＤ−Ｌ１モデルｍＡｂ２は、ＣＨ２ドメイン（ＡＡ）にＬＡＬＡ変異を含んでいた。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインにＬＡＬＡ変異の導入は、すると、Ｆｃγ受容体結合の低下が知られている（Bruhns,P.,et al.（2009）及びHezareh M.,et al.（2001））。
【０５０８】
FS22m-063-AA/PD-L1 mAb2をＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中で一過性発現によって産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製した。
【０５０９】
１３．２  マウス初代ＯＴ−１  Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
ＣＤ１３７を過剰発現するように操作されていない細胞に対する抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性を試験するには、マウス初代Ｔ細胞アッセイが必要であった。活性化細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、癌細胞を直接殺傷するのに関与し、それらの細胞表面にＣＤ１３７を発現する（Ye et al,2014）。ＣＤ１３７のクラスター化は、下流のシグナル伝達及びさらなるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化の誘導に不可欠であることが知られている。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイを使用して、ｍＡｂ２がＣＤ１３７のクラスター化及び下流シグナル伝達を駆動する能力を評価した。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイを同じように反映する試みがなされたが、ナイーブＣ５７ＢＬ／６又はＢａｌｂ／ｃ脾臓から単離されたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞は、そのようなアッセイに必要な活性化の可能性を示さなかった。したがって、代替の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイが開発された。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、オバルブミンペプチド２５７−２６４に特異的なＴ細胞受容体を有するＣ５７ＢＬ／６  ＯＴ−１マウス（Jackson Laboratory、カタログ番号００３８３１）から単離された遺伝子改変ＯＴ−１Ｔ細胞の抗原刺激によって達成され、ＩＬ−２の放出によって決定された。
【０５１０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するために、脾臓細胞を新鮮なＯＴ−１マウス脾臓から単離した。簡単に説明すると、Ｃ５７ＢＬ／６  ＯＴ−１マウスの各脾臓を収集し、ＰＢＳに保存した後、６ウェル組織培養プレートのウェルに移し、２本の針で機械的に破砕した。破砕した脾臓を７０μｍの細胞ストレーナーに通し、ストレーナーをＰＢＳですすいだ。次に、細胞懸濁液を遠心分離によってペレット化し、上清を除去し、赤血球を製造元の指示に従って１０ｍｌの１×赤血球溶解緩衝液（eBioscience、00-4300-54）の添加により溶解した。脾細胞を、１０ｎＭのSIINFEKLペプチド（配列番号１９４）（InvivoGen、カタログ番号vac-sin）を含有するＴ細胞活性化培地（ＩＭＤＭ、５％ＦＣＳ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１×Penstrep）用にウェルあたり１０×１０６細胞で６ウェルプレートにプレーティングした。プレートは、５％ＣＯ２と共に３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造元の指示に従って、CD8+T cell Isolation Kit（Miltenyi Biotec、130-104-075）を用いて単離した。単離及び活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、３０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２（Peprotech、AF-200-02）を補充した培地（ＩＭＤＭ、５％ＦＣＳ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１×Penstrep）にプレーティングし、さらに３日間、毎日各分割でｍｌあたり１×１０６未満に維持した。３日間の拡大培養後、細胞を次のアッセイで使用した。
【０５１１】
ＰＤ−Ｌ１の発現を誘導するためにＩＦＮ−γの存在下で培養され、次にSIINFEKLペプチドでパルスされたB16.F10細胞とのインキュベーションは、ＯＴ−１  Ｔ細胞の初期活性化を促進するための最初のシグナルとして使用され、その後、抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２FS22m-063-AA/S70の有効性を評価するために使用された。
【０５１２】
簡単に説明すると、B16.F10細胞を最初に２０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＦＮ−γ（Peprotech、カタログ番号AF-315-05-100UG）の存在下で培養し、ＰＤ−Ｌ１の発現を誘導した。次いで、これらの細胞を平底９６ウェルプレートに１００μｌの培地中ウェルあたり１．５×１０４細胞で播種する前に、３７℃で１時間５００ｎＭのSIINFEKLペプチドとインキュベートした。５０μｌの培地中、ウェルあたり２×１０４のＯＴ−１細胞をＢ１６．Ｆ１０細胞に添加した。試験抗体（FS22m-063-AA/S70、G1-AA/S70、G1-AA/Lob12.3、FS22m-063-AA/HelD1.3）は、１６０ｎＭ（最終濃度の４倍）から開始する１：４滴定で調製し、５０μｌの抗体ミックスを各ウェルに添加し、それに応じて最終アッセイ量を２００μｌにした。このアッセイを、３日間、５％ＣＯ２と共に３７℃でインキュベートした。３日後、上清を回収し、ｍＩＦＮ−γ（eBioscience、カタログ番号88-7314-88）につき製造元の指示に従ってＥＬＩＳＡを実施した。
【０５１３】
図１１及び表２３に見られるように、抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、ＥＣ５０値０．００３ｎＭの最も高い効力を有する。このアッセイは、ＣＤ１３７のクラスター化の結果としてｍＡｂ２が強力な効力を有し、アゴニスト作用及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を増加させることを示す。
【０５１４】
【表２４】
2021524268.tif 000025
【０５１５】
インビトロでの活性及び陽性抗体対照よりも優れた活性を示したため、その後適切なインビボ同系マウス腫瘍モデルにおいて抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２を試験することが望まれた。
【０５１６】
実施例１４：抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２のインビボでの特性評価
１４．１  ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
FS22m-063 FcabがインビトロでＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を駆動できることを示したため、インビボでＣＤ１３７を活性化する能力を試験することが望まれた。
【０５１７】
マウスでインビボ試験するためのｍＡｂ２形式のFS22m-063 Fcabの調製
実施例３．２で産生したモデルｍＡｂ２と同様の方法を用いて、抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ、ＦＳ２２ｍ−０６３、及びＰＤ−Ｌ１に特異的なＦａｂ領域を含むｍＡｂ２を、ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルにおけるインビボ抗腫瘍活性について調製及び試験した。
【０５１８】
対照：G1/Lob12.3、G1-AA/Lob12.3、G1/S70、G1-AA/4420。
【０５１９】
インビボ実験用の対照抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｓ７０（米国特許第８，２１７，１４９  Ｂ２号からのクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）の可変重領域を、ＬＡＬＡ変異を含有するヒトＩｇＧ１（Ｇ１ｍ１７）定常領域に結合することによって産生され、Ｓ７０抗体からの可変軽領域は、ヒトカッパＪ−領域を介してヒト定常領域（Ｌｍ１）に結合された。定常領域にＬＡＬＡ変異を有する及び有しないヒトＩｇＧ１形式の抗マウスＣＤ１３７抗体Ｌｏｂ１２．３（Taraban et al., 2002）を、抗マウスＣＤ１３７陽性対照抗体として使用した。ｍＡｂ２は、上記の再フォーマットされた構築物のＣＨ３ドメインをFS22m-063で置き換えることによって生成され、「FS22m-063-AA/S70」と命名された。
【０５２０】
同系マウスモデルは、治療標的を阻害する抗腫瘍効果を試験するための適切なマウス系として受け入れられており、ヒト治療薬の開発を検証するために広く使用されてきた。ＣＴ２６腫瘍は、免疫原性が高く（Lechner et al, 2013）、抗ＣＤ１３７抗体単剤療法に部分的に応答し（Kim et al, 2009）、ＰＤ−Ｌ１を発現する（Kleinovink, 2017）ことが知られているため、この実験ではＣＴ２６同系腫瘍モデルを使用した。
【０５２１】
８〜１０週齢及び体重２０〜２５ｇの各ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）は、試験開始前の１週間休息させた。全ての動物は、マイクロチップ化され、固有の識別子が与えられた。各コホートには１２匹のマウスがいた。ＣＴ２６結腸癌細胞株（S.Rosenberg, NIH）を最初に拡大培養し、保存し、その後ＩＭＰＡＣＴ  Ｉプロトコルを用いて病原体に対するIDEXX Bioresearchにより予備スクリーニングし、病原体フリーであることを示した。各動物は、左脇腹に１００μｌのＤＭＥＭ中の０．１×１０６細胞の皮下注射を受けた。腫瘍細胞接種後の７日目に、この時点で腫瘍を有しないマウスは試験から除外された。
【０５２２】
FS22m-063-AA/S70 mAb2及び対照抗体（G1/Lob12.3、G1-AA/Lob12.3（抗ＣＤ１３７陽性対照）、G1/S70（陽性対照抗PD-L1）、G1-AA/4420（アイソタイプ対照））を、ＤＰＢＳ＋１ｍＭアルギニン＋０．０５  Tween 80中、マウスあたり２０μｇ（最終濃度約１ｍｇ／ｋｇ）で、マウスに腹腔内注射した。各マウスは、腫瘍接種後７日目、９日目及び１１日目に２００μｌの腹腔内（ＩＰ）注射により、ｍＡｂ２分子又は対照抗体若しくは２つの対照抗体の組み合わせを投与された。腫瘍の正確な測定が行われ、問題の日に予定されている薬物投与が行われ、残りの研究の間、マウスは綿密な観察下に置かれた。腫瘍の最長軸及び最短軸を決定するために、カリパスを使用して腫瘍体積の測定を行った。次の計算式を使用して、腫瘍体積を計算した。
ＬＸ（Ｓ２）／２
（ここで、Ｌ＝最長軸、Ｓ＝最短軸）
【０５２３】
図１２に示すように、FS22m-063-AA/S70 mAb2は、一部の対照抗体で処置したマウスと比較して、有意な腫瘍増殖阻害を示した。統計的有意性は、全ての群を比較した混合モデル分析を使用した研究の全時間にわたる増殖速度につき対で示された。明白な毒性の兆候を示したマウスはなく、全ての処置は十分に許容され、これは、ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１を標的とする二重特異性が重大な毒性を誘発しないことを示している。
【０５２４】
６２．５ｍｍ３以下の腫瘍を含有する全ての動物は、完全応答動物として計数された（表２４を参照）。G1/Lob12.3（ＬＡＬＡ変異を伴わない抗ＣＤ１３７陽性対照）で治療された動物の２８％は、研究の終わりに腫瘍がないと見なされ、一方、G1-AA/Lob12.3（ＬＡＬＡ変異を伴う抗ＣＤ１３７陽性対照）で処置された動物の７％、及びFS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置されたマウスの０％は、腫瘍がないと見なされた。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウスと比較して、ＣＴ２６同系腫瘍モデルで有意な腫瘍増殖阻害を誘導する。G1-AA/4420（ＩｇＧ対照）又はG1/S70（ＰＤ−Ｌ１陽性対照）で処置された動物で、研究の終了まで腫瘍がなかった動物はいなかった。図１７のグラフは、経時的な各動物の腫瘍増殖の測定値（ｍｍ３）を示す。
【０５２５】
【表２５】
2021524268.tif 000026
【０５２６】
この研究は、完全に機能する免疫系を有するマウスにおいて、ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルでは、おそらくＰＤ−Ｌ１を介した架橋の結果としてのＣＤ１３７アゴニスト作用が、おそらく腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性の増加を通じて腫瘍増殖の低下をもたらすことを示す。
【０５２７】
生存分析（図１８及び表２５）は、FS22m-063-AA/S70がアイソタイプ対照（G1-AA/4420）と比較して有意な延命効果を誘導したことを示した。表２５は、G1-AA/4420（ＩｇＧ対照）、G1/S70プラスG1-AA/Lob12.3の組み合わせ、及びFS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に成長したＣＴ２６同系腫瘍モデルの各群の生存日数中央値の概要及び対統計分析（対数順位）を示す。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置されたマウスと比較して有意な生存率の増加をもたらした。FS22m-063-AA/S70は、G1/S70+G1-AA/Lob12.3の組み合わせに対して有意な延命効果を示さなかった。
【０５２８】
【表２６】
2021524268.tif 000027
【０５２９】
完全に機能する免疫系を有するマウスにおいて、ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルでは、おそらくＰＤ−Ｌ１を介した架橋の結果としてのＣＤ１３７アゴニスト作用が、おそらく腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性の増加を通じて腫瘍増殖の低下をもたらすことを示したため、この研究は以下の偏差を伴って反復された。
【０５３０】
FS22m-063-AA/S70 mAb2及び対照抗体（G1-AA/Lob12.3（陽性対照抗ＣＤ１３７）、G1/S70（陽性対照抗PD-L1）、G1-AA/HelD1.3（アイソタイプ対照））を、ＤＰＢＳ＋１ｍＭアルギニン＋０．０５  Tween 80中、マウスあたり２００μｇ（最終濃度約１０ｍｇ／ｋｇ）で、マウスに腹腔内注射した。各マウスは、腫瘍接種後７日目、９日目及び１１日目に２００μｌの腹腔内（ＩＰ）注射により、ｍＡｂ２分子又は対照抗体若しくは２つの対照抗体の組み合わせを投与された。
【０５３１】
FS22m-063-AA/S70による処置は、対照抗体と比較して、有意な腫瘍増殖阻害（図１９に腫瘍体積平均として示される）をもたらした。
【０５３２】
生存分析（図２０及び表２６）は、FS22m-063-AA/S70がアイソタイプ対照（G1-AA/HelD1.3）及びG1/S70と比較して有意な延命効果を誘導したことを示した。G1-AA/Lob12.3に対して有意な延命効果はなかった。
【０５３３】
表２６は、G1-AA/HelD1.3（ＩｇＧ対照）、G1/S70（抗ＰＤ−Ｌ１陽性対照）、G1-AA/Lob12.3（抗ＣＤ１３７陽性対照）、及びFS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に成長したＣＴ２６同系腫瘍モデルの各群の生存日数中央値の概要及び対統計分析（対数順位）を示す。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウス及びＣＤ１３７陽性対照で処置したマウスと比較して、ＣＴ２６同系腫瘍モデルで有意な生存を誘導した。
【０５３４】
【表２７】
2021524268.tif 000028
【０５３５】
１４．２  ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の用量応答活性
用量応答抗腫瘍活性
抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２ FS22m-063-AA/S70は、２日ごとに３回投与されたマウスあたり２０μｇ（約１ｍｇ／／ｋｇ）の用量で、ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示した（ｑ２ｄｘ３）。インビボでのFS22m-063-AA/S70 mAb2の最適用量を調べるために、一連の用量（２、６、２０、及び２００μｇ／マウス、約０．１、０．３、１、及び１０ｍｇ／ｋｇに相当）が腫瘍細胞接種の７日後に開始する上記のｑ２ｄｘ３投与スケジュールでＣＴ２６モデルにおいて試験された。陰性対照抗体G1-AA/4420は、同じスケジュールで、マウス１匹あたり２００μｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）の用量で含まれていた。陽性対照抗体G1/Lob12.3は、同じスケジュールで、マウス１匹あたり２０μｇ（約１ｍｇ／ｋｇ）の最適以下の用量で含まれていた。
【０５３６】
実施例１４．１に記載されているのと同じプロトコルに従って、８〜１０週齢及び体重２０〜２５ｇの各Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（Charles River）は、試験開始前の１週間休息させた。全ての動物は、マイクロチップ化され、固有の識別子が与えられた。各コホートには１２匹のマウスがいた。ＣＴ２６結腸癌細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３８）を最初に拡大培養し、保存し、その後ＩＭＰＡＣＴ  Ｉプロトコルを用いて病原体に対するIDEXX Bioresearchにより予備スクリーニングし、病原体フリーであることを示した。各動物は、左脇腹に１００μｌのＤＭＥＭ中の０．１×１０５細胞の皮下注射を受けた。腫瘍細胞接種後の７日目に、この時点で腫瘍を有しないマウスは試験から除外された。
【０５３７】
研究７日目に、FS22m-063-AA/S70 mAb2を、上記の用量範囲に従った最終濃度でマウスに腹腔内注射した。対照抗体（G1/Lob12.3（ＣＤ１３７陽性対照抗体）、G1-AA/4420（アイソタイプ対照））を、ＤＰＢＳ＋１ｍＭアルギニン＋０．０５  Tween 80中、マウスあたり２０μｇ（約１ｍｇ／ｋｇ）及びマウスあたり２００μｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）の最終濃度で、マウスに腹腔内注射した。各マウスは、腫瘍接種後７日目、９日目及び１１日目に２００μｌの腹腔内（ＩＰ）注射により、ｍＡｂ２分子又は対照抗体を投与された（ｑ２ｄｘ３）。腫瘍の正確な測定が行われ、問題の日に予定されている薬物投与が行われ、残りの研究の間、マウスは綿密な観察下に置かれた。実施例１４．１で説明されるように、腫瘍の最長軸及び最短軸を決定するために、カリパスを使用して腫瘍体積の測定を行った。
【０５３８】
図１３Ａに示すように、FS22m-063-AA/S70 mAb2は、約０．３ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇで投与した場合、アイソタイプ対照（G1-AA/4420）で処置したマウスと比較して、有意な腫瘍増殖阻害を示した。統計的有意性は、全ての群を比較した混合モデル分析を使用して示された。生存分析（図１３Ｂ及び表２７）は、FS22m-63-AA/S70 mAb2が、０．３ｍｇ／ｋｇを超えるレベルで投与された場合、ＣＴ２６同種モデルのアイソタイプ対照と比較して統計的に有意な延命効果を誘導したことを示す。対数順位（Mantel Cox）検定を使用して統計的有意性が行われた。＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。明白な毒性の兆候を示したマウスはなく、全ての処置は十分に許容された。
【０５３９】
【表２８】
2021524268.tif 000029
【０５４０】
この研究は、完全に機能する免疫系を有するマウスにおいて、ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルでは、おそらくＰＤ−Ｌ１を介した架橋の結果としてのＣＤ１３７アゴニスト作用が、おそらく腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性の増加を通じて腫瘍増殖の用量依存性の低下及び生存率の用量依存性の増加をもたらすことを示す。
【０５４１】
１４．３  用量反応作用機序
抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の作用機序は、実施例１４．２に記載されているものと同じＣＴ２６担癌マウスモデルで評価された。FS22m-063-AA/S70を４つの異なる用量（２、６、２０、及び２００μｇ／マウス、およそ０．１、０．３、１、１０ｍｇ／ｋｇに相当）で処置したＣＴ２６担癌の血液、脾臓、及び腫瘍組織、並びに陰性対照抗体G1-AA/4420は、ＣＤ１３７アゴニスト作用の下流効果であることが知られているＴ細胞活性化及び増殖マーカーについて試験した（Fisher et al., 2012）。
【０５４２】
この実施例に記載されるものと同じ研究プロトコルに従って、９日目（最初の投与から４８時間後）、１１日目（２回目の投与から４８時間後）、及び１５日目（３回目及び最後の投与から９６時間後）に、血液を心臓穿刺によりＥＤＴＡ含有チューブに回収し、脾臓及び腫瘍組織を解剖によって収集した。脾臓及び腫瘍組織は、標準的な機械的及び酵素的方法によって単一細胞懸濁液へと分解された。赤血球は、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（eBioscience、カタログ番号00-4300-54）で１回溶解した。
【０５４３】
凝固していない血液の赤血球は、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（eBioscienceカタログ番号00-4300-54）で２回溶解した。
【０５４４】
次に、全てのサンプルを同じように処置した。次に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、サンプルを製造元の指示に従って、ＰＢＳで１：３０００に希釈した固定可能生存率色素（Invitrogen、カタログ番号65-0865-14）で染色した。Ｆｃブロック（eBioscience カタログ番号14-0161-86、１：５０）の存在下で、抗体染色パネル（Ｋｉ６７及びＦｏｘＰ３抗体を除く全て）（以下の表２８）を使用して、４℃で３０分間、細胞表面マーカーのフローサイトメトリー用に細胞を染色した。次に、製造元の指示に従って、細胞を固定し、eBioscience Foxp3染色キット（eBioscienceカタログ番号00-5523-00）で透過処理した。次に、細胞を、Ｆｃブロック（全て１：１００希釈）の存在下で、Ｋｉ６７及びＦｏｘｐ３抗体を有する１００μｌの透過処理緩衝液に再懸濁し、室温の暗所で３０分間インキュベートした。次に、細胞を透過処理緩衝液で１回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡに再懸濁した。次に、細胞をBD Fortessaフローサイトメーターで分析した。FlowJoX、Excel及びGraphPadPrismを使用してデータを分析した。プロットされたデータは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団について経時的に観察されたＴ細胞の存在量及び増殖を表す。データは、Ｙ軸に記載の集団に従う親集団のパーセンテージとして表示される。
【０５４５】
図１４Ｂに示すように、ＣＤ８＋：ＣＤ４＋パーセンテージ比は、抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の用量の増加に伴い、腫瘍及び末梢の両方でＣＤ８＋Ｔ細胞に有利に増加する。これは、処置が、ＣＤ８＋Ｔ細胞数の増加の結果である可能性が高い、２つのＴ細胞亜集団のバランスのシフトを引き起こすことを示している。１５日目までに、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖マーカーは処置用量レベルに沿って増加し、最高用量レベルで最高増殖が見られる。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が増殖していることを示しており、これは活性化の兆候であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞数の増加を説明し、ＣＤ８＋：ＣＤ４＋Ｔ細胞比の増加をもたらす。
【０５４６】
全体として、この研究は、抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１の用量レベルを増加させると、腫瘍内により多くのＣＤ８＋Ｔ細胞をもたらすことを示している。ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性リンパ球とも呼ばれる）の主な役割は、３つの主要なメカニズム：１）サイトカイン、例えば、ＴＮＦα及びＩＦＮ−γの放出、２）細胞傷害性顆粒の産生及び放出、並びに３）ＦａｓＬの発現を介した感染細胞又は悪性細胞の死滅、である。抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１による処置後の腫瘍における、より多くのＣＤ８＋Ｔ細胞の存在は、おそらく腫瘍に対するこれらのメカニズムを介して細胞傷害活性をもたらし、腫瘍制御をもたらす。
【０５４７】
【表２９】
2021524268.tif 000030
【０５４８】
１４．４  ＭＣ３８同系マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
同系マウスモデルは、治療標的を阻害する抗腫瘍効果を試験するための適切なマウス系として受け入れられており、ヒト治療薬の開発を検証するために広く使用されてきた。ＭＣ３８腫瘍は、免疫原性が高く、抗ＣＤ１３７抗体単剤療法に応答し（Kocak et al, 2006）、ＰＤ−Ｌ１を発現する（Juneja et al, 2017）ことが知られているため、この実験ではＭＣ３８同系腫瘍モデルを使用した。
【０５４９】
９〜１０週齢及び体重１８から２４ｇの各Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（The Jackson Laboratory）は、試験開始前の１週間休息させた。全ての動物は、マイクロチップ化され、固有の識別子が与えられた。各コホートには１２匹のマウスがいた。ＭＣ３８結腸癌細胞株（National Cancer Institute, USA）は、最初に拡大培養され、保存され、次に、病原体について事前にスクリーニングされ、病原体がないことが示された。各動物は、右脇腹に１００μｌの無血清培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中の１×１０６細胞を皮下注射した。腫瘍細胞接種後の７日目に、この時点で腫瘍を有しないマウスは試験から除外された。
【０５５０】
FS22m-063-AA/S70 mAb2及び対照抗体（G1-AA/Lob12.3（ＣＤ１３７陽性対照）、G1-AA/S70（陽性対照PD-L1）、G1-AA/4420（アイソタイプ対照））を、ＤＰＢＳ＋１ｍＭアルギニン＋０．０５  Tween 80中、用量あたり２０μｇの固定濃度で、マウスに腹腔内注射した。各マウスは、腫瘍接種後７日目、９日目及び１１日目に２００μｌの腹腔内（ＩＰ）注射により、ｍＡｂ２分子又は対照抗体を投与された。腫瘍の正確な測定が行われ、問題の日に予定されている薬物投与が行われ、残りの研究の間、マウスは綿密な観察下に置かれた。腫瘍の最長軸及び最短軸を決定するために、カリパスを使用して腫瘍体積の測定を行った。次の計算式を使用して、腫瘍体積を計算した。
ＬＸ（Ｓ２）／２
（ここで、Ｌ＝最長軸、Ｓ＝最短軸）
【０５５１】
図１５に示すように、FS22m-063-AA/S70 mAb2は、任意の対照抗体で処置したマウスと比較して、有意な腫瘍増殖阻害を示した。統計的有意性は、全ての群を比較した混合モデル分析を使用した研究の全時間にわたる増殖速度につき対で示された。表２９に示すように、予想外にも、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と抗ＣＤ１３７抗体（G1-AA/S70 + G1-AA/Lob12.3）の組み合わせ、又はＰＤ−Ｌ１若しくはＣＤ１３７抗体単独で処置された１２匹のマウスのうち４匹のみと比較して、FS22m-063-AA/S70 mAb2で処置された全てのマウスは、研究の終了時に腫瘍がなかった。図２１のグラフは、経時的な各動物の腫瘍増殖の測定値（ｍｍ３）を示す。
【０５５２】
【表３０】
2021524268.tif 000031
【０５５３】
この研究は、完全に機能する免疫系を有するマウスにおいて、１ｍｇ／ｋｇのＰＤ−Ｌ１ｍＡｂに対して最適以下の応答を示す第２の同系腫瘍モデルであるＭＣ３８では、驚くべきことに、１ｍｇ／ｋｇのＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、処置されたマウスの１００％で完全な腫瘍退縮を誘導することを示す。
【０５５４】
生存分析（図２２及び表３０）は、３用量のG1-AA/4420（アイソタイプ対照）、G1-AA/S70（抗ＰＤ−Ｌ１陽性対照）、G1-AA/Lob12.3（抗ＣＤ１３７陽性対照）、G1-AA/S70プラスG1-AA/Lob12.3の組み合わせ、及びFS22m-063-AA/S70（モデルＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２形式の抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  FS22m-063）で処置された各処置群の生存日数中央値の概要を示す。表３０はまた、対統計分析（対数順位）を示す。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウスと比較して、ＭＣ３８同系腫瘍モデルで完全な生存を誘導し、研究の終了時に動物の１００％生存率を有する（「未決定」と表示）。
【０５５５】
【表３１】
2021524268.tif 000032
【０５５６】
１４．５  Ｂ１６．Ｆ１０同系マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の活性
Ｂ１６．Ｆ１０同系マウス腫瘍モデルを、抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２（FS22m-063-AA/S70）の抗腫瘍活性をインビボで試験するために使用した。このモデルは、治療用抗体で処置するのがより難しいと考えられている（Baird, J. R., et al, 2013）。この試験では、抗体G1-AA/4420をアイソタイプ対照として使用した。Ｂ１６．Ｆ１０同系腫瘍モデルは、ＣＤ１３７アゴニスト抗体に感受性があることはこれまで示されていない。しかし、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍から単離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、ＣＤ１３７を発現する（Curran.M., et al, 2013）。
【０５５７】
８〜１０週齢及び体重２０〜２５ｇの各Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（Charles River）は、試験開始前の1週間順応させた。全ての動物は、マイクロチップ化され、固有の識別子が与えられた。各コホートは１０匹のマウスがいた。Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫細胞株（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−６４７５）を最初に拡大培養し、保存し、その後ＩＭＰＡＣＴ  Ｉプロトコルを用いて病原体に対するIDEXXX Bioresearchにより予備スクリーニングし、病原体フリーであることを示した。Ｂ１６．Ｆ１０細胞を−１５０℃の保存から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコ内の１０％ＦＣＳ（Gibco,10270-106）を含む２０ｍｌ  ＤＭＥＭ（Gibco, 61965-026）に添加した。各動物は、左脇腹に皮下注射された１×１０６細胞を受けた。
【０５５８】
２００μｌのＰＢＳ中の２０μｇの各抗体をマウス（約１ｍｇ／ｋｇ）に注入した。各マウスは、腫瘍細胞接種後７日目から開始して２日ごとに３用量にわたる腹腔内（ＩＰ）注射により抗体を投与された。腫瘍体積は、（実施例１４．１に記載されているように）カリパスを使用して測定することによって決定され、当該日に予定されている任意の薬物投与が行われ、試験の残りの間、マウスを綿密に観察した。腫瘍体積は、実施例１４．１に記載されるように計算した。
【０５５９】
腫瘍体積及び状態に基づいて、人道的なエンドポイントに達した時点で試験を中止した。増殖速度の統計分析は、混合モデル分析を使用して、研究の全時間にわたって対で実行された。
【０５６０】
アイソタイプ対照抗体G1-AA/4420と比較して、抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の腫瘍増殖速度は有意に低下した（図１６）。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウスと比較して、Ｂ１６．Ｆ１０同系腫瘍モデルで部分的な腫瘍増殖阻害を誘導した。図２３のグラフは、経時的な各動物の腫瘍増殖の測定値（ｍｍ３）を示す。
【０５６１】
生存分析（表３１）は、G1-AA/4420（アイソタイプ対照）及び抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２FS22m-063-AA/S70で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に成長したB16.F10同系腫瘍モデルの各群の生存日数中央値の概要及び対統計分析（対数順位）を示す。FS22m-063-AA/S70は、ＩｇＧ対照で処置したマウスと比較して、Ｂ１６．Ｆ１０同系腫瘍モデルで生存率の増加を誘導した。
【０５６２】
【表３２】
2021524268.tif 000033
【０５６３】
この研究は、完全に機能する免疫系を有するマウスにおいて、処置が難しいことで有名であるB16.F10同系マウス腫瘍モデルでは、おそらくＰＤ−Ｌ１を介した架橋の結果としてのＣＤ１３７アゴニスト作用が、おそらく腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性の増加を通じて腫瘍増殖の低下をもたらすことを示した。
【０５６４】
１４．６  ＣＴ２６同系マウス担癌モデルにおける抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の肝臓薬理
臨床試験中のウレルマブを伴う固形腫瘍患者の抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ処置は、投与されたウレルマブの用量に関連することが示されている重度の処置関連免疫事象をもたらした。これらの免疫事象の影響は、重度の肝毒性として肝臓に現れた（Segal, N. H., et al, 2017）。
【０５６５】
ＣＤ１３７アゴニスト性ツール抗体を使用して動物に投与した、マウスで行われた前臨床機構の研究は、同様の肝毒性を示している。これらの研究は、結果として生じる肝毒性におけるＴ細胞とＣＤ１３７の必要性を示した（Niu, L., et al 2007及びDubrot J, et al. 2010）。十分に理解されていないものの、骨髄とＴ細胞コンパートメント間の相互作用は、肝障害及び肝毒性につながる炎症カスケードの開始に重要であることが示されている（Bartkowiak, T et al., 2018）。したがって、これらの動物モデルは、他のＣＤ１３７アゴニスト、特にＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の投与後のヒト患者における肝毒性のリスクを予測するにおいて、臨床にとって変換される関連性を有する。
【０５６６】
実施例１４．１に記載されたＣＴ２６同系腫瘍研究からのマウスは、ＰＤ−Ｌ１架橋時にＣＤ１３７アゴニスト能力を有するFS22m-063-AA/S70 mAb2を反復投与した後、毒性の明白な兆候を示さなかった。これらの動物において、約１ｍｇ／ｋｇのFS22m-063-AA/S70 mAb2（抗腫瘍免疫活性と相関）による処置の結果として観察された免疫活性化が肝毒性と相関するかどうかを決定するために、肝臓サンプルが剖検時に組織学的評価のために採取された。FS22m-063-AA/S70 mAb2及び対照マウスを最後の投与から４、７及び１４日後に剖検し（各時点で群あたり３匹のマウス）、肝臓サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋した。次に、肝臓の切片を切り取り、ヘマトキシリン及びエオシン染色による組織病理学的評価、及び認定された病理医による肝臓の炎症及び損傷のパラメーターのスコアリングに供した。組織調製並びにヘマトキシリン及びエオシンによる組織病理学的染色の方法は、高度に標準化されており、当技術分野で周知である。
【０５６７】
スコアリングシステムを使用して、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された切片の肝臓病理を評価した。肝細胞壊死、門脈管炎症、変性肝細胞及び有糸分裂の増加に対応する病理について肝臓をスコアリングした。各群内で最小の、わずかな、中程度の、及び顕著な効果を示すマウスの頻度を表３２に示す。
【０５６８】
FS22m-063-AA/S70 mAb2で処置された動物は、最小限の肝臓病変を有する。具体的には：
・  柔組織における混合リンパ球浸潤を有する最小からわずかな肝細胞壊死
・  門脈周囲管における最小からわずかな混合炎症細胞
・  最小の変性肝細胞
・  最小から著しい有糸分裂の増加
【０５６９】
【表３３】
2021524268.tif 000034
【０５７０】
これらの所見は、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体の他の例で観察されたように、重度の肝毒性を表すとは見なされない。
【０５７１】
ＣＤ１３７アゴニスト剤で処置されたヒト患者における重度の肝毒性のリスク評価につきマウスでの前臨床試験の関連性を考えると、これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１結合を介した架橋を介してＣＤ１３７をアゴナイズするｍＡｂ２が、治療的用量で処置されたヒト患者に肝毒性を誘発するリスクが低いことを示す。
【０５７２】
１４．７  ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルにおける抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の腫瘍及び末梢受容体占有率並びに薬力学的効果
実施例１４．３において、抗マウスCD137-PD-L1 mAb2 FS22m-063-AA/S70は、複数回投与後に腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させる能力を示した。Ｔ細胞への標的結合、ＰＤ−Ｌ１遮断、及びFS22m-063-AA／S70がＴ細胞増殖に及ぼす影響の程度を調べるために、実施例１４．１に記載されるものと同じＣＴ２６同系腫瘍モデルで単回投与の薬力学的研究を実施した。
【０５７３】
抗体G1-AA/4420を対照として使用した。実施例１４．１に記載のように、インビボ実験のための抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２及び対照抗体を作製した。
【０５７４】
実施例１４．１に記載されているのと同じプロトコルに従って、８〜１０週齢及び体重２０〜２５ｇの各Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（Charles River）は、試験開始前の１週間休息させた。全ての動物は、マイクロチップ化され、固有の識別子が与えられた。本研究は、８時点（２時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１９２時間）にわたる２つの用量のうち１つで、対照抗体又はｍＡｂ２のいずれかを投与される３つの投与群を含んでいた。各投与コホートには６４匹のマウスがいた（時点ごとに８匹のマウス）。ＣＴ２６結腸癌細胞株（S.Rosenberg, NIH）を最初に拡大培養し、保存し、その後ＩＭＰＡＣＴ  Ｉプロトコルを用いて病原体に対するIDEXX Bioresearchにより予備スクリーニングし、病原体フリーであることを示した。各動物は、左脇腹に１００μｌのＤＭＥＭ中の１×１０５細胞の皮下注射を受けた。腫瘍細胞接種後の７日目に、この時点で腫瘍を有しないマウスは試験から除外された。
【０５７５】
各マウスは、腫瘍接種後１１日目に１００μｌの静脈内（ＩＶ）注射によって試験サンプルを受けた。ｍＡｂ２を投与される群では、FS22m-063-AA/S70 mAb2は、マウス当たり２０μｇ又は２００μｇ（それぞれ約１ｍｇ／ｋｇ及び約１０ｍｇ／ｋｇの最終濃度）のいずれかでマウスに静脈内注射し、対照抗体G1-AA/4420（アイソタイプ対照）を投与される群では、ＤＰＢＳ＋１ｍＭアルギニン＋０．０５  Tween 80中、マウスあたり２００μｇ（最終濃度約１０ｍｇ／ｋｇ）でマウスに静脈内注射した。
【０５７６】
腫瘍及び末梢血受容体係合及び抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の投与の結果としての薬力学的応答を評価した。各用量で、FS22m-063-AA/S70（抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２）、並びに陰性対照抗体G1-AA/4420で処置されたＣＴ２６担癌マウスからの腫瘍組織及び血液は、抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２結合陽性Ｔ細胞、Ｔ細胞増殖、及び抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２に結合していない遊離ＰＤ−Ｌ１につき試験された。総ＣＤ１３７発現も評価された。
【０５７７】
血液（１００μｌ）は、尾静脈出血によりＥＤＴＡコーティングされた毛細管に採取され、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（eBioscience、カタログ番号00-4300-54）で２回溶解した。
【０５７８】
腫瘍組織を解剖によって収集し、標準的な機械的及び酵素的方法によって単一細胞懸濁液へと分解した。分解された腫瘍組織に残っている赤血球は、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（eBioscience、カタログ番号00-4300-54）で１回溶解した。
【０５７９】
細胞をＰＢＳで１回洗浄し、サンプルを製造元の指示に従って、ＰＢＳで１：３０００に希釈した固定可能生存率色素（Invitrogen、カタログ番号65-0865-14）で染色した。Ｆｃブロック（eBioscience カタログ番号14-0161-86、１：５０）の存在下で、抗体染色パネル（Ｋｉ６７及びＦｏｘＰ３抗体を除く全て）（以下の表３３）を使用して、４℃で３０分間、フローサイトメトリー用に細胞表面マーカーで細胞を染色した。次に、製造元の指示に従って、細胞を固定し、eBioscience Foxp3染色キット（eBioscienceカタログ番号00-5523-00）で透過処理した。次に、細胞を、Ｆｃブロックの存在下で、Ｋｉ６７及びＦｏｘｐ３抗体を有する１００μｌの透過処理緩衝液に再懸濁し、室温の暗所で３０分間インキュベートした。次に、細胞を透過処理緩衝液で１回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡに再懸濁した。次に、細胞をBD Fortessaフローサイトメーターで分析した。FlowJoX、Excel及びGraphPadPrismを使用してデータを分析した。
【０５８０】
図２４は、サンプル中、ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２に結合した抗ＩｇＧ抗体陽性である、血液又は腫瘍から単離されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。図２４に示すように、Ｔ細胞は、静脈内投与の２時間後すぐに、結合した抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２について陽性であった。結合の寿命には用量依存性の相関関係があり、抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、１ｍｇ／ｋｇ用量の投与から９６時間後に、血液及び腫瘍から単離されたＴ細胞で検出されなくなったが、抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、１０ｍｇ／ｋｇの投与後１２０時間から１９２時間の間でも依然として検出された。予想通り、対照抗体では最小限のバックグラウンド染色が観察された。抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２につき陽性であった腫瘍から単離されたＴ細胞の集団は、血液から単離されたＴ細胞と比較して最初は大きかった。これは、ＣＤ１３７又はＰＤ−Ｌ１のいずれかの標的発現レベルが腫瘍から単離されたＴ細胞でより高く、その結果、抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１は、血中のＴ細胞と比較して、より効率的に腫瘍を標的としたことを示している可能性がある。
【０５８１】
図２５は、血液及び腫瘍から単離されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴ細胞増殖のマーカーとしてのＫｉ６７検出を示す。図２５に示すように、対照抗体と比較した場合、抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２は、薬力学的（ＰＤ）応答を示す、Ｋｉ６７陽性末梢血Ｔ細胞の頻度の増加をもたらし、すなわち、両方の標的が関与しているか、又はある時点で関与していたことが、試験された両方の用量レベルにおいて、増殖応答によって見られるように、Ｔ細胞の活性化をもたらした。腫瘍浸潤Ｔ細胞は炎症性環境にさらされているため、腫瘍から単離されたＴ細胞集団は、より高い頻度でＫｉ６７陽性増殖性Ｔ細胞を示した。対照的に、Ｋｉ６７陽性Ｔ細胞のベースライン頻度は血中ではるかに低かった。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞はどちらも、抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１処置に応答するようであり、これは、両方の細胞型上のＣＤ１３７は、ｍＡｂ２と係合し、増殖の増加を生じるＣＤ１３７シグナル伝達及びＴ細胞の活性化をもたらすＰＤ−Ｌ１に結合することによって一緒にクラスター化したことを示す。効果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも高レベルのＣＤ１３７を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞に沿ったＣＤ８＋Ｔ細胞についてより強く現れた。データは、最大効果が１ｍｇ／ｋｇで達成されることを示唆しているが、応答の持続時間は１０ｍｇ／ｋｇでより長いようであり、これは、より長い受容体の占有、ひいてはより高い用量レベルでより長い標的係合に関連する可能性がある。受容体の占有が長引くほど、ＰＤ応答は大きくなる。腫瘍において、Ｔ細胞はすでに高度に増殖し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方で用量に相関した増殖の大きさの増加が経時的に観察された。
【０５８２】
対照抗体G1-AA/4420で処置したマウスのサンプルを、１００ｎＭの抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２でスパイクし、１００％ＰＤ−Ｌ１受容体係合の対照として機能させた。これは、競合する抗ｍＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０Ｆ．９Ｇ２、表３３を参照）からの結合がないことによって示された。抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１で処置されたマウスの腫瘍及び血液からのサンプルは、研究の全期間にわたって１０ｍｇ／ｋｇの用量でほぼ完全なＰＤ−Ｌ１遮断を示し、図２６に示すように、１００％ＰＤ−Ｌ１受容体占有率で表される。１ｍｇ／ｋｇの抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１で処置されたマウスのサンプルでは、ＰＤ−Ｌ１受容体の係合は、血液及び腫瘍に存在するＴ細胞でおよそ７２時間後に減少し、血液に存在するＴ細胞におけるＰＤ−Ｌ１受容体の係合は、腫瘍に存在するＴ細胞よりもはるかに速く減少した。このデータは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を阻害し、血液におけるよりも長く、腫瘍における抗ｍＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２を保持する利点の両方を有するＰＤ−Ｌ１の腫瘍特異的遮断を示し、これは、薬剤の完全な効果が腫瘍内で持続することを可能にすると同時に、末梢での標的効果を制限することが期待される。
【０５８３】
全体として、この研究は、抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１の用量の増加が、ｍＡｂ２が結合した細胞の数、ｍＡｂ２が係合したＰＤ−Ｌ１受容体、及び増殖のマーカーとしてのＫｉ６７の発現増加によって測定される、腫瘍内のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化及び増殖をもたらすことを示した。活性化され、増殖しているＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞も末梢血で観察され、抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１誘導活性のさらなるマーカーとして機能した。この用量依存的なＴ細胞活性化は、抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１の投与時に実施例１４で前に観察された腫瘍増殖阻害をサポートする。
【０５８４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性リンパ球とも呼ばれる）の主な役割は、３つの主要なメカニズム：１）サイトカイン、例えば、ＴＮＦα及びＩＦＮ−γの放出、２）細胞傷害性顆粒の産生及び放出、並びに３）Ｆａｓリガンドの発現、を介した感染細胞又は悪性細胞の死滅である。抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１による処置後の腫瘍における、より多くのＣＤ８＋Ｔ細胞の存在は、腫瘍に対するこれらのメカニズムを介して細胞傷害活性をもたらし、その結果腫瘍制御をもたらすことが期待される。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞死滅を説明する最も重要な細胞傷害性Ｔ細胞であるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドを認識することにより、適応免疫において極めて重要な役割を果たし、活性化され、どちらも腫瘍からの保護を媒介するＩＦＮ−γ及びＴＮＦαを産生する（Zanetti, 2015, JI, 2015）。
【０５８５】
【表３４】
2021524268.tif 000035
【０５８６】
実施例１５：マウスにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の薬物動態
マウスにおける抗ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の薬物動態を決定するために、ＭＣ３８腫瘍を含まないＣ５７ＢＬ／６雌マウス（実施例１４．４を参照）、すなわち腫瘍のないマウスに、１００μｌの抗ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２を４用量（２５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）で投与し、３８４時間にわたって監視した。
【０５８７】
約２０μｌの全血のマイクロサンプリングを２、６、２４、４８、９６、及び３８４時間で実施し、処理して約５μｌの血清を単離した。各時点で存在する抗ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の量は、Gyros Protein TechnologiesのGyrolab xPloreシステムを使用して決定した。捕捉試薬としてビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ−（重鎖及び軽鎖）サル吸着抗体（Cambridge Bioscience、製品番号A80-319B）、及び検出抗体としてヤギ抗ヒトＩｇＧ−AlexaFluor（登録商標）６４７（Cambridge Bioscience、製品番号2040-31）を用い、Gyrolab Bioaffy 1000 CD（製品番号P0004253）を使用してサンドイッチアッセイを実施した。８０００〜０．０７ｎｇ／ｍｌの範囲で作成された標準曲線を使用してサンプル濃度を決定し、必要に応じてサンプルをRexxip ANバッファーで希釈した（Gyros 製品番号P0004994）。製造元の推奨に従い、他のバッファーを使用した。時点ごとの個々のマウス（時点ごとに３匹のマウス）からの平均サンプル濃度をプロットした（図２７）。
【０５８８】
図２７は、抗ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２の薬物動態を示し、これは、ｍＡｂ２がマウスにおける標準的なヒトＩｇＧと同等の末端クリアランスを有することを示している（Bergman et al, 1998）。
【０５８９】
実施例１６：カニクイザルにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２に対する薬物動態／薬力学的応答及びその忍容性
カニクイザルにおける抗ヒトＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ２  ｍＡｂ２に対する薬物動態／薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）応答及びその忍容性を評価するために、予備的な用量範囲発見研究が実施された。簡単に説明すると、FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2は、単回投与又は反復投与として静脈内（ＩＶ）注入を介してカニクイザルに投与した。体重、食餌量、臨床所見、血液学及び血液化学などの標準的な毒物学パラメーターについて、試験期間中の忍容性評価を評価した。
【０５９０】
FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2は、およそ６日間の半減期を有し、臨床化学及び組織病理学の結果によって決定されるように、一般的に、週当たり３０ｍｇ／ｋｇ投与まで良好に忍容された。血清ｓＰＤ−Ｌ１レベルの上昇（直接的な標的の係合及び細胞活性化の指標）が１日目に全ての動物で観察され、注入終了後１６８時間でピークに達し、その後、レベルは、FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2の全身レベルの低下に沿って減少した。
【０５９１】
同系マウス腫瘍モデル（実施例１５）における抗マウスＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２のＰＤ応答を評価するための研究の所見と一致して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋セントラルメモリー及びエフェクターメモリーＴ細胞において、また、細胞増殖及び活性化における薬物関連の増加が観察され、これは、Ｋｉ６７の発現の増加によって測定された。同様の動態がＮＫ細胞で観察され、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）の相対パーセンテージ及び絶対数が中程度ではあるが一過性に増加した。
【０５９２】
これらの結果から、抗ヒトFS22-172-003-AA/E12v2 mAb2は、カニクイザルにおいてインビボで強力な薬理学的活性を有し、３０ｍｇ／ｋｇまでの良好な忍容性であることが強く示唆された。また、生成されたＰＫ／ＰＤデータは、代替分子（FS22m-063-AA/S70）のデータと一致し、臨床設定においてFS22-172-003-AA/E12v2 mAb2を使用するための根拠を強化する。
【０５９３】
配列表
E12v2 mAbのＣＤＲアミノ酸配列（Kabat）
ＶＨ  ＣＤＲ１−ＳＹＧＩＳ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２−ＷＩＳＡＹＳＧＧＴＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３−ＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号３）
ＶＬ  ＣＤＲ１−ＲＡＳＱＳＩＧＮＲＬＡ（配列番号４）
ＶＬ  ＣＤＲ２−ＥＡＳＴＳＥＴ（配列番号５）
ＶＬ  ＣＤＲ３−ＱＱＳＹＳＴＰＹＴ（配列番号６）
【０５９４】
E12v2のＣＤＲアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＶＨ  ＣＤＲ１−ＧＹＰＦＴＳＹＧ（配列番号７）
ＶＨ  ＣＤＲ２−ＩＳＡＹＳＧＧＴ（配列番号８）
ＶＨ  ＣＤＲ３−ＡＲＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号９）
ＶＬ  ＣＤＲ１−ＱＳＩＧＮＲ（配列番号１０）
ＶＬ  ＣＤＲ２−ＥＡＳ（配列番号１１）
ＶＬ  ＣＤＲ３−ＱＱＳＹＳＴＰＹＴ（配列番号６）
【０５９５】
E12v2 mAbのＶＨドメインアミノ酸配列（配列番号１２）
ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）。
【化１】
2021524268.tif 000036
E12v2 mAbのＶＨドメイン核酸配列（配列番号１３）
【化２】
2021524268.tif 000037
E12v2 mAbのＶＬドメインアミノ酸配列（配列番号１４）
ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）。
【化３】
2021524268.tif 000038
E12v2 mAbのＶＬドメイン核酸配列（配列番号１５）
【化４】
2021524268.tif 000039
G1-AA/E12v2 mAbの重鎖アミノ酸配列（ＬＡＬＡあり）（配列番号１６）
ＶＨドメイン（斜体）；ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）；ＬＡＬＡ変異（太字及び下線）
【化５】
2021524268.tif 000040
G1-AA/E12v2 mAbの軽鎖アミノ酸配列（配列番号１７）
ＶＨドメイン（斜体）；ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）
【化６】
2021524268.tif 000041
【０５９６】
E05v2 mAbのＣＤＲアミノ酸配列（Kabat）
ＶＨ  ＣＤＲ１−ＳＹＧＩＳ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２−ＷＩＳＡＹＳＧＧＴＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３−ＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号３）
ＶＬ  ＣＤＲ１−ＲＡＳＱＳＩＳＧＲＬＡ（配列番号１８）
ＶＬ  ＣＤＲ２−ＥＡＳＮＬＥＳ（配列番号１９）
ＶＬ  ＣＤＲ３−ＱＱＳＹＳＴＰＲＶＴ（配列番号２０）
【０５９７】
E05v2のＣＤＲアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＶＨ  ＣＤＲ１−ＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２１）
ＶＨ  ＣＤＲ２−ＩＳＡＹＳＧＧＴ（配列番号８）
ＶＨ  ＣＤＲ３−ＡＲＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号９）
ＶＬ  ＣＤＲ１−ＱＳＩＳＧＲ（配列番号２２）
ＶＬ  ＣＤＲ２−ＥＡＳ（配列番号１１）
ＶＬ  ＣＤＲ３−ＱＱＳＹＳＴＰＲＶＴ（配列番号２０）
【０５９８】
E05v2 mAbのＶＨドメインアミノ酸配列（配列番号２３）
ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）
【化７】
2021524268.tif 000042
E05v2 mAbのＶＨドメイン核酸配列（配列番号２４）
【化８】
2021524268.tif 000043
E05v2 mAbのＶＬドメインアミノ酸配列（配列番号２５）
ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）
【化９】
2021524268.tif 000044
E05v2 mAbのＶＬドメイン核酸配列（配列番号２６）
【化１０】
2021524268.tif 000045
G1-AA/E05v2 mAbの重鎖アミノ酸配列（ＬＡＬＡあり）（配列番号２７）
ＶＨドメイン（斜体）；ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）；ＬＡＬＡ変異（太字及び下線）
【化１１】
2021524268.tif 000046
G1-AA/E05v2 mAb並びにFS22-172-003-AA/E05v2及びFS22-053-008-AA/E05v2 mAb2の軽鎖アミノ酸配列（配列番号２８）
ＶＨドメイン（斜体）；ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）
【化１２】
2021524268.tif 000047
【０５９９】
G12v2 mAbのＣＤＲアミノ酸配列（Kabat）
ＶＨ  ＣＤＲ１−ＳＹＧＩＳ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２−ＷＩＳＡＹＳＧＧＴＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３−ＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号３）
ＶＬ  ＣＤＲ１−ＲＡＳＱＳＩＳＧＲＬＡ（配列番号１８）
ＶＬ  ＣＤＲ２−ＥＡＳＮＬＥＳ（配列番号１９）
ＶＬ  ＣＤＲ３−ＱＱＳＹＳＷＰＲＴ（配列番号２９）
【０６００】
G12v2のＣＤＲアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＶＨ  ＣＤＲ１−ＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２１）
ＶＨ  ＣＤＲ２−ＩＳＡＹＳＧＧＴ（配列番号８）
ＶＨ  ＣＤＲ３−ＡＲＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号９）
ＶＬ  ＣＤＲ１−ＱＳＩＳＧＲ（配列番号２２）
ＶＬ  ＣＤＲ２−ＥＡＳ（配列番号１１）
ＶＬ  ＣＤＲ３−ＱＱＳＹＳＷＰＲＴ（配列番号２９）
【０６０１】
G12v2 mAbのＶＨドメインアミノ酸配列（配列番号２３）
ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）
【化１３】
2021524268.tif 000048
G12v2 mAbのＶＨドメイン核酸配列（配列番号２４）
【化１４】
2021524268.tif 000049
G12v2 mAbのＶＬドメインアミノ酸配列（配列番号３０）
ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）
【化１５】
2021524268.tif 000050
G12v2 mAbのＶＬドメイン核酸配列（配列番号３１）
【化１６】
2021524268.tif 000051
G1-AA/G12v2 mAbの重鎖アミノ酸配列（ＬＡＬＡあり）（配列番号２７）
ＶＨドメイン（斜体）；ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）；ＬＡＬＡ変異（太字及び下線）
【化１７】
2021524268.tif 000052
G1-AA/G12v2 mAb並びにFS22-172-003-AA/G12v2及びFS22-053-008-AA/G12v2 mAb2の軽鎖アミノ酸配列（配列番号３３）
ＶＨドメイン（斜体）；ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）
【化１８】
2021524268.tif 000053
【０６０２】
lambdav3/lam-G02v3 mAbのＣＤＲアミノ酸配列（Kabat）
ＶＨ  ＣＤＲ１−ＳＹＧＩＳ（配列番号１）
ＶＨ  ＣＤＲ２−ＷＩＳＡＹＳＧＧＴＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列番号２）
ＶＨ  ＣＤＲ３−ＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号３）
ＶＬ  ＣＤＲ１−ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ（配列番号３４）
ＶＬ  ＣＤＲ２−ＥＶＴＮＲＰＳ（配列番号３５）
ＶＬ  ＣＤＲ３−ＳＳＦＫＲＧＳＴＬＶＶ（配列番号３６）
【０６０３】
lambdav3/lam-G02v3のＣＤＲアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＶＨ  ＣＤＲ１−ＧＹＴＦＴＳＹＧ（配列番号２１）
ＶＨ  ＣＤＲ２−ＩＳＡＹＳＧＧＴ（配列番号８）
ＶＨ  ＣＤＲ３−ＡＲＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号９）
ＶＬ  ＣＤＲ１−ＳＳＤＶＧＧＹＮＹ（配列番号３７）
ＶＬ  ＣＤＲ２−ＥＶＴ（配列番号３８）
ＶＬ  ＣＤＲ３−ＳＳＦＫＲＧＳＴＬＶＶ（配列番号３６）
【０６０４】
lambdav3/lam-G02v3 mAbのＶＨドメインアミノ酸配列（配列番号２３）
ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）
【化１９】
2021524268.tif 000054
lambdav3/lam-G02v3 mAbのＶＨドメイン核酸配列（配列番号２４）
【化２０】
2021524268.tif 000055
lambdav3/lam-G02v3 mAbのＶＬドメインアミノ酸配列（配列番号４１）
ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）
【化２１】
2021524268.tif 000056
lambdav3/lam-G02v3 mAbのＶＬドメイン核酸配列（配列番号４２）
【化２２】
2021524268.tif 000057
G1-AA/lambdav3/lam-G02v3 mAbの重鎖アミノ酸配列（ＬＡＬＡあり）（配列番号２７）
ＶＨドメイン（斜体）；ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）；ＬＡＬＡ変異（太字及び下線）
【化２３】
2021524268.tif 000058
G1-AA/lambdav3/lam-G02v3 mAbの軽鎖アミノ酸配列（ＬＡＬＡあり）（配列番号４４）
ＶＬドメイン（斜体）；ＩＭＧＴ  ＣＤＲ（太字及び斜体）；Kabat  ＣＤＲ（斜体及び下線）
【化２４】
2021524268.tif 000059
【０６０５】
ＨＣＤＲ１の代替的定義（ＩＭＧＴ）（配列番号４５）
ＧＹＸ１ＦＴＳＹＧ
ここで、Ｘ１は、Ｐ又はＴである
【０６０６】
ＬＣＤＲ１の代替的定義（Kabat）（配列番号４６）
ＲＡＳＱＳＩＸ２Ｘ３ＲＬＡ
ここで、Ｘ２は、Ｓ又はＧであり、Ｘ３は、Ｎ又はＧである
【０６０７】
ＬＣＤＲ２の代替的定義（Kabat）（配列番号４７）
ＥＡＳＸ４Ｘ５ＥＸ６
ここで、Ｘ４は、Ｔ又はＮであり；Ｘ５は、Ｓ又はＬであり；Ｘ６は、Ｔ又はＳである
【０６０８】
ＬＣＤＲ３の代替的定義（Kabat）（配列番号４８）
ＱＱＳＹＳＸ７ＰＸ８Ｘ９Ｔ
ここで、Ｘ７は、Ｔ又はＷであり；Ｘ８は、不在又はＲであり；Ｘ９は、Ｙ、Ｒ又はＶである
【０６０９】
ＬＣＤＲ１の代替的定義（ＩＭＧＴ）（配列番号４９）
ＱＳＩＸ１０Ｘ１１Ｒ
式中、Ｘ１０は、Ｇ又はＳであり；Ｘ１１は、Ｎ又はＧである
【０６１０】
ＬＣＤＲ３の代替的定義（ＩＭＧＴ）（配列番号５０）
ＱＱＳＹＳＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｔ
式中、Ｘ１２は、不在又はＴであり；Ｘ１３は、Ｔ、Ｗ又はＰであり；Ｘ１４は、Ｐ又はＲであり；Ｘ１５は、Ｙ又はＲである
【０６１１】
ＨＦＷアミノ酸配列ＩｇＧ１（Kabat）
ＨＦＷ１−ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＲＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ１６ＦＴ（配列番号５１）
ここで、Ｘ１６は、Ｐ又はＴである
ＨＦＷ２−ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ（配列番号５２）
ＨＦＷ３−ＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号５３）
ＨＦＷ４−ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５４）
【０６１２】
ＩｇＧ１のＨＦＷアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＨＦＷ１−ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＲＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号５５）
ＨＦＷ２−ＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ（配列番号５６）
ＨＦＷ３−ＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号５７）
ＨＦＷ４−ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５４）
【０６１３】
カッパ軽鎖のＬＦＷアミノ酸配列（Kabat）
ＬＦＷ１−ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＲＤＲＶＩＩＴＣ（配列番号５８）
ＬＦＷ２−ＷＹＱＨＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５９）
ＬＦＷ３−ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号６０）
ＬＦＷ４−ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６１）
【０６１４】
カッパ軽鎖のＬＦＷアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＬＦＷ１−ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＲＤＲＶＩＩＴＣＲＡＳ（配列番号６２）
ＬＦＷ２−ＬＡＷＹＱＨＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号６３）
ＬＦＷ３−ＴＳＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号６４）
ＬＦＷ４−ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６１）
【０６１５】
ラムダ軽鎖のＬＦＷアミノ酸配列（Kabat）
ＬＦＷ１−ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣ（配列番号６５）
ＬＦＷ２−ＷＹＱＱＦＰＧＫＡＰＫＬＭＩＦ（配列番号６６）
ＬＦＷ３−ＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＤＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＥＹＹＣ（配列番号６７）
ＬＦＷ４−ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号６８）
【０６１６】
ラムダ軽鎖のＬＦＷアミノ酸配列（ＩＭＧＴ）
ＬＦＷ１−ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴ（配列番号６９）
ＬＦＷ２−ＶＳＷＹＱＱＦＰＧＫＡＰＫＬＭＩＦ（配列番号７０）
ＬＦＷ３−ＮＲＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＤＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＥＹＹＣ（配列番号７１）
ＬＦＷ４−ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号６８）
【０６１７】
ＷＴ  ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＷＴ  ＡＢループ−ＲＤＥＬＴＫＮＱ（配列番号７２）
ＷＴ  ＣＤループ−ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号７３）
ＷＴ  ＥＦループ−ＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶ（配列番号７４）
【０６１８】
ＷＴ  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号７５）
ＡＢ、ＣＤ、ＥＦループは下線が付されている
【化２５】
2021524268.tif 000060
ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号７６）
【化２６】
2021524268.tif 000061
ＬＡＬＡ変異を有するＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号７７）
ＬＡＬＡ変異は下線が付されている
【化２７】
2021524268.tif 000062
ＬＡＬＡ変異及びＰ１１４Ａ変異を有するＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１７６）
ＬＡＬＡ変異は下線が付され、Ｐ１１４Ａ変異は太字で下線が付されている
【化２８】
2021524268.tif 000063
【０６１９】
ＰＰＹモチーフのアミノ酸配列（配列番号７８）
ＰＰＹ
【０６２０】
FS22-053-008  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-053-008  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号７９）
FS22-053-008  第２の配列−ＤＹＷＲＷＬＥ（配列番号８０）
【０６２１】
FS22-053-008  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号８１）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化２９】
2021524268.tif 000064
FS22-053-008  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号８２）
【化３０】
2021524268.tif 000065
【０６２２】
FS22-053-009  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-053-009  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号７９）
FS22-053-009  第２の配列−ＥＨＴＲＷＬＤ（配列番号８３）
【０６２３】
FS22-053-009  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号８４）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化３１】
2021524268.tif 000066
FS22-053-009  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号８５）
【化３２】
2021524268.tif 000067
【０６２４】
Ｆｃａｂ  FS22-053-011  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-053-011  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号７９）
FS22-053-011  第２の配列−ＤＹＷＲＷＴＤ（配列番号８６）
【０６２５】
Ｆｃａｂ  FS22-053-011  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号８７）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化３３】
2021524268.tif 000068
Ｆｃａｂ  FS22-053-011  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号８８）
【化３４】
2021524268.tif 000069
【０６２６】
Ｆｃａｂ  FS22-053-017  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-053-017  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号７９）
FS22-053-017  第２の配列−ＹＨＷＲＷＬＥ（配列番号８９）
【０６２７】
Ｆｃａｂ  FS22-053-017  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号９０）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化３５】
2021524268.tif 000070
Ｆｃａｂ  FS22-053-017  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号９１）
【化３６】
2021524268.tif 000071
【０６２８】
Ｆｃａｂ  FS22-053-014  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-053-014  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号７９）
FS22-053-014  第２の配列−ＹＨＷＲＷＬＤ（配列番号９２）
【０６２９】
Ｆｃａｂ  FS22-053-014  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号９３）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化３７】
2021524268.tif 000072
Ｆｃａｂ  FS22-053-014  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号９４）
【化３８】
2021524268.tif 000073
【０６３０】
Ｆｃａｂ  FS22-053-010  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-053-010  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号７９）
FS22-053-010  第２の配列−ＤＹＭＲＷＬＤ（配列番号９５）
【０６３１】
Ｆｃａｂ  FS22-053-010  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号９６）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化３９】
2021524268.tif 000074
Ｆｃａｂ  FS22-053-010  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号９７）
【化４０】
2021524268.tif 000075
【０６３２】
Ｆｃａｂ  FS22-053-012  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-053-012  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号７９）
FS22-053-012  第２の配列−ＤＨＭＲＷＬＥ（配列番号９８）
【０６３３】
Ｆｃａｂ  FS22-053-012  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号９９）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化４１】
2021524268.tif 000076
Ｆｃａｂ  FS22-053-012  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１００）
【化４２】
2021524268.tif 000077
【０６３４】
Ｆｃａｂ  FS22-053-013  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-053-013  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号７９）
FS22-053-013  第２の配列−ＧＹＥＲＷＬＥ（配列番号１０１）
【０６３５】
Ｆｃａｂ  FS22-053-013  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０２）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化４３】
2021524268.tif 000078
Ｆｃａｂ  FS22-053-013  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１０３）
【化４４】
2021524268.tif 000079
【０６３６】
Ｆｃａｂ  FS22-053-015  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-053-015  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号７９）
FS22-053-015  第２の配列−ＤＨＷＲＷＬＱ（配列番号１０４）
【０６３７】
Ｆｃａｂ  FS22-053-015  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０５）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化４５】
2021524268.tif 000080
Ｆｃａｂ  FS22-053-015  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１０６）
【化４６】
2021524268.tif 000081
【０６３８】
Ｆｃａｂ  FS22-053-016  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-053-016  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号７９）
FS22-053-016  第２の配列−ＤＹＩＲＷＬＮ（配列番号１０７）
【０６３９】
Ｆｃａｂ  FS22-053-016  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０８）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化４７】
2021524268.tif 000082
Ｆｃａｂ  FS22-053-016  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１０９）
【化４８】
2021524268.tif 000083
【０６４０】
FS22-053  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-053-008  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号７９）
FS22-053-008  第２の配列−ＹＹＮＲＷＱＤ（配列番号１１０）
【０６４１】
FS22-053  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１１）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化４９】
2021524268.tif 000084
Ｆｃａｂ  FS22-053  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１１２）
【化５０】
2021524268.tif 000085
【０６４２】
Ｆｃａｂ  FS22-172-003  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-172-003  第１の配列−ＰＹＩＩＰＰＹ（配列番号１１３）
FS22-172-003  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１４）
【０６４３】
Ｆｃａｂ  FS22-172-003  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１５）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化５１】
2021524268.tif 000086
Ｆｃａｂ  FS22-172-003  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１１６）
【化５２】
2021524268.tif 000087
【０６４４】
Ｆｃａｂ  FS22-172-002  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-172-002  第１の配列−ＰＦＱＭＰＰＹ（配列番号１１７）
FS22-172-002  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１４）
【０６４５】
Ｆｃａｂ  FS22-172-002  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１８）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化５３】
2021524268.tif 000088
Ｆｃａｂ  FS22-172-002  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１１９）
【化５４】
2021524268.tif 000089
【０６４６】
Ｆｃａｂ  FS22-172-004  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-172-004  第１の配列−ＮＹＩＹＰＰＹ（配列番号１２０）
FS22-172-004  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１４）
【０６４７】
Ｆｃａｂ  FS22-172-004  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２１）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化５５】
2021524268.tif 000090
Ｆｃａｂ  FS22-172-004  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１２２）
【化５６】
2021524268.tif 000091
【０６４８】
Ｆｃａｂ  FS22-172-001  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-172-001  第１の配列−ＰＦＶＭＰＰＹ（配列番号１２３）
FS22-172-001  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１４）
【０６４９】
Ｆｃａｂ  FS22-172-001  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２４）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化５７】
2021524268.tif 000092
Ｆｃａｂ  FS22-172-001  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１２５）
【化５８】
2021524268.tif 000093
【０６５０】
Ｆｃａｂ  FS22-172-005  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-172-005  第１の配列−ＱＱＶＹＰＰＹ（配列番号１２６）
FS22-172-005  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１４）
【０６５１】
Ｆｃａｂ  FS22-172-005  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２７）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化５９】
2021524268.tif 000094
Ｆｃａｂ  FS22-172-005  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１２８）
【化６０】
2021524268.tif 000095
【０６５２】
Ｆｃａｂ  FS22-172-006  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-172-006  第１の配列−ＲＫＹＹＰＰＹ（配列番号１２９）
FS22-172-006  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１４）
【０６５３】
Ｆｃａｂ  FS22-172-006  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１３０）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化６１】
2021524268.tif 000096
Ｆｃａｂ  FS22-172-006  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１３１）
【化６２】
2021524268.tif 000097
【０６５４】
Ｆｃａｂ  FS22-172  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
FS22-172  第１の配列−ＲＫＹＹＰＰＹ（配列番号１２９）
FS22-172  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１４）
【０６５５】
Ｆｃａｂ  FS22-172  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１３２）
第１及び第２の配列に下線が付されている。
【化６３】
2021524268.tif 000098
Ｆｃａｂ  FS22-172  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１３３）
【化６４】
2021524268.tif 000099
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-172-003-AA/E12v2 mAb2の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１３４）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化６５】
2021524268.tif 000100
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-172-003-AA/E12v2 mAb2の重鎖の核酸配列（配列番号１３５）
【化６６】
2021524268.tif 000101
FS22-172-003-AA/E12v2及びFS22-053-008-AA/E12v2 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１７）
【化６７】
2021524268.tif 000102
FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2の軽鎖の核酸配列（配列番号１３６）
【化６８】
2021524268.tif 000103
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-172-003-AA/E05v2 mAb2の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１３７）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化６９】
2021524268.tif 000104
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-172-003-AA/E05v2 mAb2の重鎖の核酸配列（配列番号１３８）
【化７０】
2021524268.tif 000105
FS22-172-003-AA/E05v2 mAb2の軽鎖の核酸配列（配列番号１３９）
【化７１】
2021524268.tif 000106
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-172-003-AA/G12v2 mAb2の重鎖のアミノ酸（ＡＡ）配列（配列番号１４０）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化７２】
2021524268.tif 000107
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-172-003-AA/G12v2 mAb2の重鎖の核酸配列（配列番号１４１）
【化７３】
2021524268.tif 000108
FS22-172-003-AA/G12v2 mAb2の軽鎖の核酸配列（配列番号１４２）
【化７４】
2021524268.tif 000109
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-053-008-AA/E12v2 mAb2の重鎖のＡＡ配列（配列番号１４３）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化７５】
2021524268.tif 000110
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-053-008-AA/E12v2 mAb2の重鎖の核酸配列（配列番号１４４）
【化７６】
2021524268.tif 000111
FS22-053-008-AA/E12v2 mAb2の軽鎖の核酸配列（配列番号１４５）
【化７７】
2021524268.tif 000112
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-053-008-AA/E05v2の重鎖のＡＡ配列（配列番号１４６）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化７８】
2021524268.tif 000113
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-053-008-AA/E05v2 mAb2の重鎖の核酸配列（配列番号１４７）
【化７９】
2021524268.tif 000114
FS22-053-008-AA/E05v2 mAb2の軽鎖の核酸配列（配列番号１４８）
【化８０】
2021524268.tif 000115
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-053-008-AA/G12v2の重鎖のＡＡ配列（配列番号１４９）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化８１】
2021524268.tif 000116
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-053-008-AA/G12v2 mAb2の重鎖の核酸配列（配列番号１５０）
【化８２】
2021524268.tif 000117
FS22-053-008-AA/G12v2 mAb2の軽鎖の核酸配列（配列番号１５１）
【化８３】
2021524268.tif 000118
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-053-017AA/E12v2の重鎖のＡＡ配列（配列番号１５２）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化８４】
2021524268.tif 000119
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-053-017AA/E05v2の重鎖のＡＡ配列（配列番号１５３）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化８５】
2021524268.tif 000120
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-053-017AA/G12v2の重鎖のＡＡ配列（配列番号１５４）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化８６】
2021524268.tif 000121
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-172-003AA/lam-G02v3の重鎖のＡＡ配列（配列番号１５５）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化８７】
2021524268.tif 000122
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-172-003AA/S70の重鎖のＡＡ配列（配列番号１５６）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化８８】
2021524268.tif 000123
S70の軽鎖のＡＡ配列（配列番号１５７）
ＶＬドメイン（斜体）；
【化８９】
2021524268.tif 000124
ＬＡＬＡ変異を有するFS22-172-003AA/HelD1.3の重鎖のＡＡ配列（配列番号１５８）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化９０】
2021524268.tif 000125
ＨｅｌＤ１．３の軽鎖のＡＡ配列（配列番号１５９）
ＶＬドメイン（斜体）
【化９１】
2021524268.tif 000126
ＬＡＬＡ変異を有するFS22m-063AA/S70の重鎖のＡＡ配列（配列番号１６０）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化９２】
2021524268.tif 000127
ＬＡＬＡ変異を有するFS22m-063AA/HelD1.3の重鎖のＡＡ配列（配列番号１６１）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化９３】
2021524268.tif 000128
ＬＡＬＡ変異を有するG1-AA/E12v2の重鎖のＡＡ配列（配列番号１６２）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化９４】
2021524268.tif 000129
G1/S70の重鎖のＡＡ配列（配列番号１６３）
ＶＨドメイン（斜体）
【化９５】
2021524268.tif 000130
ＬＡＬＡ変異を有するG1-AA/S70の重鎖のＡＡ配列（配列番号１６４）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化９６】
2021524268.tif 000131
G1/4420の重鎖のＡＡ配列（配列番号１６５）
ＶＨドメイン（斜体）
【化９７】
2021524268.tif 000132
4420の軽鎖のＡＡ配列（配列番号１６６）
ＶＬドメイン（斜体）
【化９８】
2021524268.tif 000133
ＬＡＬＡ変異を有するG1-AA/4420の重鎖のＡＡ配列（配列番号１６７）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化９９】
2021524268.tif 000134
ＬＡＬＡ変異を有するG1-AA/HelD1.3の重鎖のＡＡ配列（配列番号１６８）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化１００】
2021524268.tif 000135
ＬＡＬＡ変異を有するG1-AA/MLS109の重鎖のＡＡ配列（配列番号１６９）
ＶＨドメイン（斜体）；ＬＡＬＡ変異（太字下線）
【化１０１】
2021524268.tif 000136
MLS109の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１７０）
ＶＬドメイン（斜体）
【化１０２】
2021524268.tif 000137
FS22-172-003  ＣＨ３ドメインＡＢ及びＥＦループのアミノ酸配列
ＡＢループ−ＲＤＥＬＰＹＩＩＰＰＹＮＱ（配列番号１７１）
ＥＦループ−ＧＡＤＲＷＬＥＧＮＶ（配列番号１７２）
【０６５６】
FS22-53-008  ＣＨ３ドメインＡＢ及びＥＦループのアミノ酸配列
ＡＢループ−ＲＤＥＬＮＰＰＹＬＦＳＮＱ（配列番号１７３）
ＥＦループ−ＤＹＷＲＷＬＥＧＮＶ（配列番号１７４）
【０６５７】
FS22-053-017  ＣＨ３ドメインＡＢ及びＥＦループのアミノ酸配列
ＡＢループ−ＲＤＥＬＮＰＰＹＬＦＳＮＱ（配列番号１７３）
ＥＦループ−ＹＨＷＲＷＬＥＧＮＶ（配列番号１７５）
【０６５８】
G1/280_02_G02の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１７７）
ＶＨドメイン（斜体）
【化１０３】
2021524268.tif 000138
G1/280_02_G02の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１７８）
ＶＬドメイン（斜体）
【化１０４】
2021524268.tif 000139
ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１７９）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）
【化１０５】
2021524268.tif 000140
ヒトＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８０）
【化１０６】
2021524268.tif 000141
マウスＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１８１）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）
【化１０７】
2021524268.tif 000142
マウスＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８２）
【化１０８】
2021524268.tif 000143
カニクイザルＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１８３）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）
【化１０９】
2021524268.tif 000144
カニクイザルＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８４）
【化１１０】
2021524268.tif 000145
ヒトＣＤ１３７のアミノ酸配列（配列番号１８５）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）
【化１１１】
2021524268.tif 000146
ヒトＣＤ１３７細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８６）
【化１１２】
2021524268.tif 000147
マウスＣＤ１３７のアミノ酸配列（配列番号１８７）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）
【化１１３】
2021524268.tif 000148
マウスＣＤ１３７細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８８）
【化１１４】
2021524268.tif 000149
カニクイザルＣＤ１３７のアミノ酸配列（配列番号１８９）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）
【化１１５】
2021524268.tif 000150
カニクイザルＣＤ１３７細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１９０）
【化１１６】
2021524268.tif 000151
G1/HelD1.3の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９１）
ＶＨドメイン（斜体）
【化１１７】
2021524268.tif 000152
ＯＶＡペプチド（配列番号１９２）
ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ
ヒトＢ７−Ｈ３細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１９３）
【化１１８】
2021524268.tif 000153
ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号１９４）
ＳＩＩＮＦＥＫＬ
ヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓのアミノ酸配列（配列番号１９５）
シグナルペプチド（下線）；ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（通常フォント）；Ｃ末端ラットＣＤ４＋（ドメイン３及び４）（斜体）；ＮｏｔＩ制限部位をコードする、抗原とＣ末端融合の間の接合部（太字及び下線）；Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（太字）
【化１１９】
2021524268.tif 000154
ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓのアミノ酸配列（配列番号１９６）
シグナルペプチド（下線）  ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（通常フォント）  ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（斜体）  ＮｏｔＩ制限部位をコードする、抗原とＣ末端融合の間の接合部（太字及び下線）  Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（太字）
【化１２０】
2021524268.tif 000155
マウスＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓのアミノ酸配列（配列番号１９７）
シグナルペプチド（下線）；ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（通常フォント）；Ｃ末端ラットＣＤ４＋（ドメイン３及び４）（斜体）；ＮｏｔＩ制限部位をコードする、抗原とＣ末端融合の間の接合部（太字及び下線）；Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（太字）
【化１２１】
2021524268.tif 000156
マウスＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓのアミノ酸配列（配列番号１９８）
シグナルペプチド（下線）  ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（通常フォント）  ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（斜体）  ＮｏｔＩ制限部位をコードする、抗原とＣ末端融合の間の接合部（太字及び下線）  Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（太字）
【化１２２】
2021524268.tif 000157
ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ−Ａｖｉのアミノ酸配列（配列番号１９９）
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（通常フォント）  Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（斜体）  Ａｖｉタグ（太字）
【化１２３】
2021524268.tif 000158
FS22-172-003-AA/E12v2重鎖をコードするコドン最適化核酸配列（配列番号３２）
【化１２４】
2021524268.tif 000159
FS22-172-003-AA/E12v2軽鎖をコードするコドン最適化核酸配列（配列番号３９）
【化１２５】
2021524268.tif 000160
【０６５９】
参考文献
本明細書で言及されている全ての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215(3), 403-10 (1990).
Altschul SF, Madden TL, Schaeffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25(17), 3389-402 (1997).
Bagshawe KD, Sharma SK, Springer CJ, Antoniw P, Rogers GT, Burke PJ, Melton R. Antibody-enzyme conjugates can generate cytotoxic drugs from inactive precursors at tumor sites. Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4, 915-922 (1991).
Baird JR et al. Immune-mediated regression of established B16F10 melanoma by intratumoral injection of attenuated Toxoplasma gondii protects against rechallenge. J Immunol. 190(1): 469-478 (2013).
Bartkowiak T, Curran MA. 4-1BB Agonists: Multi-Potent Potentiators of Tumor Immunity. Front Oncol. Jun 8;5, 117 (2015).
Bartkowiak T et al. Activation of 4-1BB on Liver Myeloid Cells Triggers Hepatitis via an Interleukin-27-Dependent Pathway. Clin Cancer Res. 24(5), 1138-51 (2018).
Bergman I, Burckart GJ, Pohl CR, Venkataramanan R, Barmada MA, Griffin JA And Cheung NV. Pharmacokinetics of IgG and IgM Anti-Ganglioside Antibodies in Rats and Monkeys After Intrathecal Administration. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 284(1), 111-115 (1998)
Bitra A, Doukov T, Wang J, Picarda G, Benedict CA, Croft M, Zajonc DM. Crystal structure of murine 4-1BB and its interaction with 4-1BBL support a role for galectin-9 in 4-1BB signaling. J Biol Chem. 293(4):1317-1329 (2017).
Brown MH, Barclay AN. Expression of immunoglobulin and scavenger receptor superfamily domains as chimeric proteins with domains 3 and 4 of CD4+ for ligand analysis. Protein Eng. 7(4), 515-21 (1994).
Bruhns P, Iannascoli B, England P, Mancardi DA, Fernandez N, Jorieux S, Daeron M. Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses. Blood. 113(16):3716-25 (2009).
Chacon JA1, Wu RC, Sukhumalchandra P, Molldrem JJ, Sarnaik A, Pilon-Thomas S, Weber J, Hwu P, Radvanyi L. Co-stimulation through 4-1BB/CD137 improves the expansion and function of CD8(+) melanoma tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive T-cell therapy. PLoS One. 8(4):e60031 (2013).
Chapple SD, Crofts AM, Shadbolt SP, McCafferty J, Dyson MR. Multiplexed expression and screening for recombinant protein production in mammalian cells. BMC Biotechnol. 6:49 (2006).
Chester C, Ambulkar S, Kohrt HE. 4-1BB agonism: adding the accelerator to cancer immunotherapy. Cancer Immunol Immunother. 65(10):1243-8 (2016).
Chester C, Sanmamed MF, Wang J, Melero I. Immunotherapy targeting 4-1BB: mechanistic rationale, clinical results, and future strategies. Blood. 131(1):49-57 (2018).
Claus C et al. A novel tumor-targeted 4-1BB agonist and its combination with T-cell bispecific antibodies: an off-the-shelf cancer immunotherapy alternative to CAR T-cells [abstract]. In: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2017. Cancer Res. 77 (2017).
Croft M. Co-stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T-cell immunity? Nat Rev Immunol. 3(8):609-20 (2003).
Curran MA, Geiger TL, Montalvo W, Kim M, Reiner SL, Al-Shamkhani A, Sun JC, Allison J. P. Systemic 4-1BB activation induces a novel T cell phenotype driven by high expression of Eomesodermin. J. Exp.Med. 210(4): 743-755 (2013).
Dubrot J et al. Treatment with anti-CD137 mAbs causes intense accumulations of liver T cells without selective antitumor immunotherapeutic effects in this organ. Cancer Immunol Immunother. 59(8):1223-1233 (2010).
Dyson MR, Zheng Y, Zhang C, Colwill K, Pershad K, Kay BK, Pawson T, McCafferty J: Mapping protein interactions by combining antibody affinity maturation and mass spectrometry. Anal. Biochem. 417(1), 25-35 (2011).
Fisher TS et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunol Immunother. 61(10):1721-33 (2012).
Grosso J, Inzunza D, Wu Q, Simon J, Singh P, Zhang X, Phillips T, Simmons P, Cogswell J. Programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in various tumor types. Journal for Immunotherapy of Cancer. 1(Suppl 1):P53. (2013).
Hasenhindl C, Traxlmayr MW, Wozniak-Knopp G, Jones PC, Stadlmayr G, Rueker F, Obinger C. Stability assessment on a library scale: a rapid method for the evaluation of the commutability and insertion of residues in C-terminal loops of the CH3 domains of IgG1-Fc. Protein Eng. Des. Sel., 26(10), 675-82 (2013).
Hezareh M, Hessell AJ, Jensen RC, van de Winkel JG, Parren PW. Effector function activities of a panel of mutants of a broadly neutralizing antibody against human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 75(24):12161-8. (2001).
Hinner MJ, Aiba, RSB., Wiedenmann A, Schlosser C, Allersdorfer A, Matschiner G, Rothe C, Moebius U, Kohrt HE, Olwill SA. Costimulatory T cell engagement via a novel bispecific anti-CD137 /anti-HER2 protein. J. Immunotherapy Cancer 3 (Suppl 2): P187. (2015).
Holliger P, Hudson PJ. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol. 23(9):1126-36 (2005).
Hu S, Shively L, Raubitschek A, Sherman M, Williams LE, Wong JY, Shively JE, Wu AM. Minibody: A novel engineered anti-carcinoembryonic antigen antibody fragment (single-chain Fv-CH3) which exhibits rapid, high-level targeting of xenografts. Cancer Res. 56(13):3055-61 (1996).
Hurtado JC, Kim YJ, Kwon BS. Signals through 4-1BB are costimulatory to previously activated splenic T cells and inhibit activation-induced cell death. J Immunol. 15;158(6):2600-9 (1997).
Idusogie EE, Presta LG, Gazzano-Santoro H, Totpal K, Wong PY, Ultsch M, Meng YG, Mulkerrin MG. Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 Fc. J Immunol. 164(8), 4178-84 (2000).
Jain T et al. Biophysical properties of the clinical-stage antibody landscape. PNAS 114 (5), 944-949 (2017).
Jefferis R, Reimer CB, Skvaril F, de Lange G, Ling NR, Lowe J, Walker MR, Phillips DJ, Aloisio CH, Wells TW. Evaluation of monoclonal antibodies having specificity for human IgG sub-classes: results of an IUIS/WHO collaborative study. Immunol. Lett.1, 223-52 (1985).
Jefferis R, Reimer CB, Skvaril F, de Lange GG, Goodall DM, Bentley TL, Phillips DJ, Vlug A, Harada S, Radl J. Evaluation of monoclonal antibodies having specificity for human IgG subclasses: results of the 2nd IUIS/WHO collaborative study. Immunol. Lett. 31(2),143-68 (1992).
Juneja VR, McGuire KA, Manguso RT, LaFleur MW, Collins N, Haining WN, Freeman GJ, Sharpe AH. PD-L1 on tumor cells is sufficient for immune evasion in immunogenic tumors and inhibits CD8+ T cell cytotoxicity. J Exp Med. 214(4), 895-904 (2017).
Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. NIH Publication No. 91-3242. Washington, D.C.: U.S. Department of Health and Human Services (1991).
Kim YH, Choi BK, Kim KH, Kang SW, Kwon BS. Combination Therapy with Cisplatin and Anti-4-1BB. Cancer Res. 68(18), 7264-7269 (2009).
Klein C, Schaefer W, Regula JT. The use of CrossMAb technology for the generation of bi- and multispecific antibodies. MAbs 8(6), 1010-20 (2016).
Kleinovink JW, Marijt KA, Schoonderwoerd MJA, Hall T, Ossendorp F, Fransen MF. PD-L1 expression on malignant cells is no prerequisite for checkpoint therapy. Oncoimmunology. 6(4), e1294299 (2017).
Kocak E et al. Combination therapy with anti-CTL antigen-4 and anti-4-1BB antibodies enhances cancer immunity and reduces autoimmunity. Cancer Res. 15;66(14), 7276-84 (2006).
Lechner MG et al. Immunogenicity of murine solid tumor models as a defining feature of in vivo behavior and response to immunotherapy. J Immunother. 36(9), 477-89 (2013).
Ledermann JA, Begent RH, Massof C, Kelly AM, Adam T, Bagshawe KD. A phase-I study of repeated therapy with radiolabelled antibody to carcinoembryonic antigen using intermittent or continuous administration of cyclosporin A to supress the immune response. Int. J. Cancer 47(5), 659-64 (1991).
Lefranc MP et al. IMGT（登録商標）, the international ImMunoGeneTics information system（登録商標）25 years on. Nucleic Acids Res. 43(Database issue):D413-22 (2015).
Lefranc MP et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains. Dev. Comp. Immunol. 29(3), 185-203 (2005).
Li F. and Ravetech JV. Antitumor activities of agonistic anti-TNFR antibodies require differential FcγRIIB coengagement in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 110(48), 19501-6 (2013).
Link A et al. Preclinical pharmacology of MP0310: a 4-1BB/FAP bispecific DARPin drug candidate promoting tumor-restricted T cell co-stimulation [abstract]. In: Proceedings of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2018 Apr 14-18; Chicago (IL) Abstract nr 3752 (2018).
Makkouk A, Chester C, Kohrt HE. Rationale for anti-CD137 cancer immunotherapy. Eur J Cancer. 54, 112-119 (2016).
Martins JP, Kennedy PJ, Santos HA, Barrias C, Sarmento B. A comprehensive review of the neonatal Fc receptor and its application in drug delivery. Pharmcol. Ther. 161, 22-39 (2016).
Niu L et al. Cytokine- mediated disruption of lymphocyte trafficking, hemopoiesis, and induction of lymphopenia, anemia, and thrombocytopenia in anti-CD137-treated mice. J Immunol. 178(7), 4194-4213 (2007).
Perez-Ruiz E, Etxeberria I, Rodriguez-Ruiz, Melero I. Anti-CD137 and PD-1/PD-L1 Antibodies En Route toward Clinical Synergy. Clin. Cancer Res. 23, (18) (2017)
Reichen C et al. FAP-mediated tumor accumulation of a T-cell agonistic FAP/4-1BB DARPin drug candidate analyzed by SPECT/CT and quantitative biodistribution [abstract]. In: Proceedings of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2018 Apr 14-18; Chicago (IL) Abstract nr 3029 (2018).
Schofield DJ et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8(11), R254 (2007).
Segal NH et al. Phase I Study of Single-Agent Utomilumab (PF-05082566), a 4-1BB/CD137 Agonist, in Patients with Advanced Cancer. Clin Cancer Res. 24(8):1816-1823 (2018).
Segal NH et al. Results from an Integrated Safety Analysis of Urelumab, an Agonist Anti-CD137 Monoclonal Antibody. Clin Cancer Res. 23(8):1929-1936 (2017).
Shuford WW et al.l 4-1BB costimulatory signals preferentially induce CD8+ T cell proliferation and lead to the amplification in vivo of cytotoxic T cell responses. J Exp Med. 186(1), 47-55 (1997).
Smith TF, Waterman MS. Identification of common molecular subsequences. J. Mol. Biol. 147(1), 195-7 (1981).
Taraban VY et al. Expression and costimulatory effects of the TNF receptor superfamily members CD134 (OX40) and CD137 (4-1BB), and their role in the generation of anti-tumor immune responses. Eur. J. Immunol. 32, 3617-3627 (2002).
Tello, D, Goldbaum, FA, Mariuzza, RA, Ysern, X, Schwarz, FP, Poljak, RJ. Three-dimensional structure and thermodynamics of antigen binding by anti-lysozyme antibodies, Biochem Soc. Trans., 21(4), 943-6 (1993).
Tolcher AW et al. Phase Ib Study of Utomilumab (PF-05082566), a 4-1BB/CD137 Agonist, in Combination with Pembrolizumab (MK-3475) in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin. Cancer Res. 23, 5349-57 (2017)
Wang X, Mathieu M, Brezski RJ. IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions. Protein Cell 9(1), 63-73 (2018).
Wen T, Bukczynski J, Watts TH. 4-1BB ligand-mediated costimulation of human T cells induces CD4+ and CD8+ T cell expansion, cytokine production, and the development of cytolytic effector function. J Immunol. 168(10), 4897-906 (2002).
Wolfl M, Kuball J, Ho WY, Nguyen H, Manley TJ, Bleakley M, Greenberg PD. Activation-induced expression of CD137 permits detection, isolation, and expansion of the full repertoire of CD8+ T cells responding to antigen without requiring knowledge of epitope specificities. Blood. 110(1):201-10 (2007).
Won EY, Cha K, Byun JS, Kim DU, Shin S, Ahn B, Kim YH, Rice AJ, Walz T, Kwon BS, Cho HS. The structure of the trimer of human 4-1BB ligand is unique among members of the tumor necrosis factor superfamily. J Biol Chem.285(12), 9202-10 (2010).
Wozniak-Knopp G et al. Introducing antigen-binding sites in structural loops of immunoglobulin constant domains: Fc fragments with engineered HER2/neu-binding sites and antibody properties. Protein Eng Des Sel. 23(4), 289-97 (2010).
Ye Q, Song DG, Poussin M, Yamamoto T, Best A, Li C, Coukos G, Powell DJ Jr. CD137 accurately identifies and enriches for naturally occurring tumor-reactive T cells in tumor. Clin Cancer Res. 20(1):44-55 (2014).
Yu X, Anasetti C. CH 10 - T-cell costimulation in graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia effect. Immune Biology of Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation. 195-222 (2013).
Zanetti M. Tapping CD4 T Cells for Cancer Immunotherapy: The Choice of Personalized Genomics. J Immunol. 194:2049-2056 (2015).
【図１Ａ】
2021524268.tif 000161
【図１Ｂ】
2021524268.tif 000162
【図１Ｃ】
2021524268.tif 000163
【図２】
2021524268.tif 000164
【図３】
2021524268.tif 000165
【図４】
2021524268.tif 000166
【図５】
2021524268.tif 000167
【図６】
2021524268.tif 000168
【図７−１】
2021524268.tif 000169
【図７−２】
2021524268.tif 000170
【図８】
2021524268.tif 000171
【図９】
2021524268.tif 000172
【図１０】
2021524268.tif 000173
【図１１】
2021524268.tif 000174
【図１２】
2021524268.tif 000175
【図１３−１】
2021524268.tif 000176
【図１３−２】
2021524268.tif 000177
【図１４】
2021524268.tif 000178
【図１５】
2021524268.tif 000179
【図１６】
2021524268.tif 000180
【図１７】
2021524268.tif 000181
【図１８】
2021524268.tif 000182
【図１９】
2021524268.tif 000183
【図２０】
2021524268.tif 000184
【図２１】
2021524268.tif 000185
【図２２】
2021524268.tif 000186
【図２３】
2021524268.tif 000187
【図２４−１】
2021524268.tif 000188
【図２４−２】
2021524268.tif 000189
【図２５−１】
2021524268.tif 000190
【図２５−２】
2021524268.tif 000191
【図２６−１】
2021524268.tif 000192
【図２６−２】
2021524268.tif 000193
【図２７】
2021524268.tif 000194
【図２８】
2021524268.tif 000195
【配列表】
2021524268000001.app
【国際調査報告】
2021524268.tif 000196
2021524268.tif 000197
2021524268.tif 000198