(57)【要約】  本発明は、免疫原性が低減された最適化済みＨＩＶ‐１  ｇｐ４１結合分子を対象とする。より具体的には、本発明は、ｇｐ４１結合可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び／又はｇｐ４１結合可変重鎖（ＶＨ）ドメインであって、レシピエント被験者への投与時に1つ以上の該ドメインの免疫原性を低減するように最適化されているｇｐ４１結合可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び／又はｇｐ４１結合可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、最適化済みｇｐ４１結合分子に関する。本発明は特に、（（ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを含む）二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、二重特異性抗体、（ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）分子を含む）３価結合分子等を含む）多重特異性ｇｐ４１結合分子である、ｇｐ４１結合分子であって：（ｉ）１つ以上の上述のような最適化済みｇｐ４１結合可変ドメイン；及び（ｉｉ）エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに結合できるドメインを含む、ｇｐ４１結合分子に関する。本発明はまた、上述のようなｇｐ４１結合分子のいずれを含む医薬組成物、及びＨＩＶ‐１感染の治療における上述のようなｇｐ４１結合分子のいずれの使用を伴う方法も対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、ｇｐ４１結合分子であって、前記ＶＬドメインは配列番号５７のアミノ酸配列を含み、及び／又は前記ＶＨドメインは配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ｇｐ４１結合分子。
【請求項２】
前記ｇｐ４１結合分子は：
（ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む前記ＶＬドメイン；及び
（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む前記ＶＨドメイン
を含む、請求項１に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項３】
前記分子は、抗体であるか、前記抗体のｇｐ４１エピトープ結合部分を含む、請求項１又は２に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項４】
前記分子は：
（ａ）二重特異性抗体；又は
（ｂ）２つ、３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、ダイアボディ；又は
（ｃ）３つ、４つ、５つ、若しくは６つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、３価結合性分子
である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項５】
前記分子は前記ダイアボディであり、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む、請求項４に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項６】
前記分子はＦｃ領域を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項７】
前記Ｆｃ領域は、変異型Ｆｃ領域であって：
（ａ）ＦｃγＲに対する前記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する１つ以上のアミノ酸修飾；及び／又は
（ｂ）前記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる１つ以上のアミノ酸修飾
を含む、変異型Ｆｃ領域である、請求項５に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項８】
ＦｃγＲに対する前記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する前記修飾は、Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含み、前記番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である、請求項７に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項９】
前記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる前記修飾は、Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋの置換を含み、前記番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である、請求項７又は８に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項１０】
前記分子は二重特異性であり、ｇｐ４１のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位と、エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位とを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項１１】
前記分子は二重特異性であり、ｇｐ４１のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位と、エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位とを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項１２】
前記分子は三重特異性であり：
（ａ）ｇｐ４１のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位；
（ｂ）エフェクタ細胞の表面上に存在する第１の分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位；及び
（ｃ）エフェクタ細胞の表面上に存在する第２の分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項１３】
前記分子は三重特異性であり：
（ａ）ｇｐ４１の第１のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位；
（ｂ）ｇｐ４１の第２のエピトープ、又は異なるＨＩＶ‐１タンパク質のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位；及び
（ｃ）エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位
を含み、ｇｐ４１の前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとは異なるものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項１４】
前記分子は、ｇｐ４１とエフェクタ細胞の表面上に存在する分子とに同時に結合できる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項１５】
エフェクタ細胞の表面上に存在する前記分子は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、又はＮＫＧ２Ｄである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項１６】
前記エフェクタ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項１７】
エフェクタ細胞の表面上に存在する前記分子はＣＤ３である、請求項１５に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項１８】
エフェクタ細胞の表面上に存在する前記第１の分子はＣＤ３であり、エフェクタ細胞の表面上に存在する前記第２の分子はＣＤ１８である、請求項１２に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項１９】
前記分子は、ｇｐ４１を発現する細胞と細胞傷害性Ｔ細胞との協調的結合を仲介する、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項２０】
前記分子は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、及び第３のポリペプチド鎖を含み：
Ｉ）（ａ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１３を含み；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１４を含み；及び
（ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は配列番号１１２を含むか；
又は
ＩＩ）（ａ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１５を含み；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１６を含み；及び
（ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は配列番号１１２を含む、
請求項１〜４及び６〜９のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項２１】
前記分子は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖、及び第４のポリペプチド鎖を含み：
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１３を含み；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１４を含み；
（ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は配列番号１１７を含み；及び
（ｄ）前記第４のポリペプチド鎖は配列番号１１８を含む、
請求項１〜４及び６〜９のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項２２】
前記分子は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖、及び第４のポリペプチド鎖を含み：
Ｉ）（ａ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１３を含み；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１４を含み；
（ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は配列番号１１９を含み；及び
（ｄ）前記第４のポリペプチド鎖は配列番号１２０を含むか；
又は
ＩＩ）（ａ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１５を含み；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１６を含み；
（ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は配列番号１１９を含み；及び
（ｄ）前記第４のポリペプチド鎖は配列番号１２０を含む、
請求項１〜４及び６〜９のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子。
【請求項２３】
有効量の請求項１〜２２のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項２４】
ＨＩＶ‐１感染の治療又は予防を必要とする被験者においてＨＩＶ‐１感染を治療又は予防するための方法であって、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子又は請求項２３に記載の医薬組成物を治療的有効量で含む組成物を前記被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２５】
前記方法は更に、潜伏感染活性化剤を投与するステップを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記潜伏感染活性化剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ジスルフィラム、ＪＱ１、ブリオスタチン、ＰＭＡ、イオノマイシン、又はこれらのいずれの組み合わせである、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許出願第６２／６７３，４６２号（２０１９年５月１８日出願；係属中）に対する優先権を主張するものであり、上記出願は参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００２】
［配列表の参照］
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ以上の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１５５ＰＣＴ＿配列＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１９年５月１１日作成、サイズ：１５８，８３５バイト）において開示されており、上記ファイルはその全体が本出願に援用される。
【０００３】
本発明は、免疫原性が低減された最適化済みＨＩＶ‐１  ｇｐ４１結合分子を対象とする。より具体的には、本発明は、ｇｐ４１結合可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び／又はｇｐ４１結合可変重鎖（ＶＨ）ドメインであって、レシピエント被験者への投与時に1つ以上の該ドメインの免疫原性を低減するように最適化されているｇｐ４１結合可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び／又はｇｐ４１結合可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、最適化済みｇｐ４１結合分子に関する。本発明は特に、（（ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを含む）二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、二重特異性抗体、（ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）分子を含む）３価結合分子等を含む）多重特異性ｇｐ４１結合分子である、ｇｐ４１結合分子であって：（ｉ）１つ以上の上述のような最適化済みｇｐ４１結合可変ドメイン；及び（ｉｉ）エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに結合できるドメインを含む、ｇｐ４１結合分子に関する。本発明はまた、上述のようなｇｐ４１結合分子のいずれを含む医薬組成物、及びＨＩＶ‐１感染の治療における上述のようなｇｐ４１結合分子のいずれの使用を伴う方法も対象とする。
【背景技術】
【０００４】
高活性抗レトロウイルス療法（Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＨＡＡＲＴ）は、感染した個体におけるウイルス負荷の低減及びＨＩＶ  １型（ＨＩＶ‐１）感染の影響の改善に有効であった。しかしながら、ＨＡＡＲＴはＨＩＶ‐１感染を根絶することはできず、感染細胞の除去を加速しない。感染した個体において、ＨＩＶ‐１はＨＡＡＲＴとってアクセス不可能である静止記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞内に統合されたプロウイルスとして、潜伏状態で生存する。よって、このような療法の投与にもかかわらず、ＨＩＶ‐１ウイルスは、治療を回避したＨＩＶ‐１感染細胞の潜伏リザーバ内において、個体内で生存する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、このような潜伏状態で感染している細胞内のＨＩＶ‐１の排除に関して、限定された能力しか有しない。
【０００５】
よって、ＨＩＶ‐１感染個体の治療のための治療剤、特にウイルス感染細胞を標的とし、ＨＩＶ‐１感染細胞の潜伏リザーバを減少させる可能性があり、反復投与に好適である作用剤に対する需要が存在する。
【０００６】
ＨＩＶ‐１ウイルスのエンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：Ｅｎｖ）は、（ＣＤ４受容体に結合するウイルスの能力による）ウイルスの感染性にとって、及び膜融合の促進のために、重要である。ＨＩＶ‐１  Ｅｎｖ遺伝子産物は、２つのサブユニットｇｐ１２０及びｇｐ４１の三量体複合体からなる。Ｅｎｖタンパク質は、グリコシル化ｇｐ１６０前駆体タンパク質として合成され、これは三量体へと折り畳まれ、タンパク質分解的に切断されて、成熟したｇｐ１２０及びｇｐ４１タンパク質がもたらされる。切断されたＥｎｖは、細胞表面からのビリオンの発芽のために、他のウイルス成分と共に集合し、感染細胞の表面上に存在する（非特許文献１）。よって、ＨＩＶ  Ｅｎｖ及び特にそのｇｐ４１サブユニットは、抗体仲介型細胞殺滅による持続性ＨＩＶ感染リザーバの治療的排除のための、極めて特異的なウイルス標的である（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Miranda、L., et al. , 2002 “Cell Surface Expression Of The HIV-1 Envelope Glycoproteins Is Directed From Intracellular CTLA-4-Containing Regulated Secretory Granules.” Proc Natl Acad Sci U S A. 99(12): 8031-8036
【非特許文献２】Sloane, D. , et al. , 2015, “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells” PLOS Pathogens | DOI:10.1371/journal.ppat.1005233
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、これまでの全ての進歩にも関わらず、抗ＨＩＶ活性が強化された、及び／又は免疫原性が低減された、最適化済みＨＩＶ  ｇｐ４１結合分子に対する需要は依然として残っている。本発明はこの需要、並びにＨＩＶ‐１の治療及び予防のための改良された治療法に対する需要に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、免疫原性が低減された最適化済みＨＩＶ‐１  ｇｐ４１結合分子を対象とする。より具体的には、本発明は、ｇｐ４１結合可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び／又はｇｐ４１結合可変重鎖（ＶＨ）ドメインであって、レシピエント被験者への投与時に該ドメインの免疫原性を低減するように最適化されているｇｐ４１結合可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び／又はｇｐ４１結合可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、最適化済みｇｐ４１結合分子に関する。本発明は特に、（（ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを含む）二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、二重特異性抗体、（ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）分子を含む）３価結合分子等を含む）多重特異性ｇｐ４１結合分子である、ｇｐ４１結合分子であって：（ｉ）１つ以上の上述のような最適化済みｇｐ４１結合可変ドメイン；及び（ｉｉ）エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに結合できるドメインを含む、ｇｐ４１結合分子に関する。本発明はまた、上述のようなｇｐ４１結合分子のいずれを含む医薬組成物、及びＨＩＶ‐１感染の治療における上述のようなｇｐ４１結合分子のいずれの使用を伴う方法も対象とする。
【００１０】
詳細には、本発明は、可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含むｇｐ４１結合分子を提供し、上記ＶＬドメインは配列番号５７のアミノ酸配列を含み、及び／又は上記ＶＨドメインは配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
本発明は更に、上記ｇｐ４１結合分子が：
（ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む上記ＶＬドメイン；及び
（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む上記ＶＨドメイン
を含む、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００１２】
本発明は更に、上記分子が、抗体であるか、上記抗体のｇｐ４１エピトープ結合部分を含む、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００１３】
本発明は更に、上記分子が：
（ａ）二重特異性抗体；又は
（ｂ）２つ、３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、ダイアボディ；又は
（ｃ）３つ、４つ、５つ、若しくは６つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、３価結合性分子
である、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００１４】
本発明は更に、上記分子が上記ダイアボディであり、アルブミン結合ドメイン（Ａｌｂｕｍｉｎ‐Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ：ＡＢＤ）を含む、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００１５】
本発明は更に、上記分子がＦｃ領域を含む、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。本発明は更に、上記Ｆｃ領域が、変異型Ｆｃ領域であって：
（ａ）ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する１つ以上のアミノ酸修飾；及び／又は
（ｂ）上記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる１つ以上のアミノ酸修飾
を含む、変異型Ｆｃ領域である、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００１６】
本発明は更に、ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する上記修飾が、Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含み、上記番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００１７】
本発明は更に、上記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる上記修飾が、Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋの置換を含み、上記番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００１８】
本発明は更に、上記分子が二重特異性であり、ｇｐ４１のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位と、エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位とを含む、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００１９】
本発明は更に、上記分子が二重特異性であり、ｇｐ４１のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位と、エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位とを含む、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００２０】
本発明は更に、上記分子が三重特異性であり：
（ａ）ｇｐ４１のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位；
（ｂ）エフェクタ細胞の表面上に存在する第１の分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位；及び
（ｃ）エフェクタ細胞の表面上に存在する第２の分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位
を含む、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００２１】
本発明は更に、エフェクタ細胞の表面上に存在する上記第１の分子がＣＤ３であり、エフェクタ細胞の表面上に存在する上第２の分子がＣＤ８である、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００２２】
本発明は更に、上記分子が三重特異性であり：
（ａ）ｇｐ４１の第１のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位；
（ｂ）ｇｐ４１の第２のエピトープ、又は異なるＨＩＶ‐１タンパク質のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位；及び
（ｃ）エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位
を含み、ｇｐ４１の上記第１のエピトープと上記第２のエピトープとは異なるものである、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００２３】
本発明は更に、上記分子が、ｇｐ４１とエフェクタ細胞の表面上に存在する分子とに同時に結合できる、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。本発明は更に、エフェクタ細胞の表面上に存在する上記分子が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、又はＮＫＧ２Ｄである、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００２４】
本発明は更に、上記エフェクタ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００２５】
本発明は更に、上記分子が、ｇｐ４１を発現する細胞と細胞傷害性Ｔ細胞との協調的結合を仲介する、上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００２６】
本発明は更に、上記分子が、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、及び第３のポリペプチド鎖を含み：
Ｉ）（ａ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１３を含み；
（ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１４を含み；及び
（ｃ）上記第３のポリペプチド鎖は配列番号１１２を含むか；
又は
ＩＩ）（ａ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１５を含み；
（ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１６を含み；及び
（ｃ）上記第３のポリペプチド鎖は配列番号１１２を含む、
上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００２７】
本発明は更に、上記分子が、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖、及び第４のポリペプチド鎖を含み：
（ａ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１３を含み；
（ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１４を含み；
（ｃ）上記第３のポリペプチド鎖は配列番号１１７を含み；及び
（ｄ）上記第４のポリペプチド鎖は配列番号１１８を含む、
上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００２８】
本発明は更に、上記分子が、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖、及び第４のポリペプチド鎖を含み：
Ｉ）（ａ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１３を含み；
（ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１４を含み；
（ｃ）上記第３のポリペプチド鎖は配列番号１１９を含み；及び
（ｄ）上記第４のポリペプチド鎖は配列番号１２０を含むか；
又は
ＩＩ）（ａ）上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１１５を含み；
（ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１１６を含み；
（ｃ）上記第３のポリペプチド鎖は配列番号１１９を含み；及び
（ｄ）上記第４のポリペプチド鎖は配列番号１２０を含む、
上述のｇｐ４１結合分子の実施形態に関する。
【００２９】
本発明は更に、有効量の請求項１〜２２のいずれか１項に記載のｇｐ４１結合分子と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物に関する。
【００３０】
本発明は更に、それを必要とする被験者においてＨＩＶ‐１感染を治療又は予防するための方法であって、上述のｇｐ４１結合分子のうちのいずれか１つ又は上述の医薬組成物を治療的有効量で含む組成物を上記被験者に投与するステップを含む、方法に関する。
【００３１】
本発明は更に、潜伏感染活性化剤（ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ジスルフィラム、ＪＱ１、ブリオスタチン、ＰＭＡ、イオノマイシン、又はこれらのいずれの組み合わせ等）を投与するステップを更に含む、ＨＩＶ‐１感染を治療又は予防するための上記方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、それぞれＥコイル又はＫコイルヘテロ二量体促進ドメイン（選択できるヘテロ二量体促進ドメインは以下で提示する）を有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図を提供する。システイン残基は、リンカー中（図１Ａ）及び／又はヘテロ二量体促進ドメイン中（図１Ｂ）に存在してよい。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。この図、及び結合分子ドメインの概略図を提供する全ての図における、波状の線（ＷＷＷ）は、１つ以上の任意のヘテロ二量体促進ドメインを表し、これは存在することが好ましい。
【図２】図２は、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、２ペアのポリペプチド鎖（即ち合計４つのポリペプチド鎖）からなる４つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合した４価ダイアボディの概略図である。各ペアのうちの１つのポリペプチド鎖は、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。上記２ペアのポリペプチド鎖は、同一であってよい。（図３Ａ〜３Ｂに示すように）２ペアのポリペプチド鎖が同一であり、かつＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合ドメインを有し、二重特異性であり、結合する各エピトープに対して２価である。ＶＬ及びＶＨドメインが同一のエピトープを認識する（例えば同一のＶＬドメインＣＤＲ及び同一のＶＨドメインＣＤＲを両方の鎖に対して使用する）実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合ドメインを有し、単一特異性であり、単一のエピトープに対して４価である。あるいは、上記２ペアのポリペプチドは異なっていてよい。（図３Ｃにおいて様々な陰影及びパターンで示すように）ポリペプチドの各ペアのＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合ドメインを有し、四重特異性であり、結合する各エピトープに対して１価である。図３Ａは、システイン残基を含むペプチドヘテロ二量体促進ドメインを含有するＦｃ領域含有ダイアボディを示す。図３ＢはＦｃ領域含有ダイアボディを示し、これは、システイン残基及び（任意のシステイン残基を有する）リンカーを含む、Ｅコイル及びＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを含有する。図３Ｃは、抗体ＣＨ１及びＣＬドメインを含有するＦｃ領域含有ダイアボディを示す。以下で提示されるように、ポリペプチド鎖の連結によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は四重特異性の４価結合を可能とするために、同一であっても異なっていてもよい。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂは、３つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図５】図５は、５つのポリペプチド鎖からなる４つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合型結合分子の概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を含むＦｃ領域を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。以下で提示するように、ポリペプチド鎖の連結によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は四重特異性の４価結合を可能とするために、同一であっても異なっていてもよい。
【図６Ａ−６Ｆ】図６Ａ〜６Ｆは、３つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的なＦｃ領域含有３価結合分子の概略図である。図６Ａは、ダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対するＮ末端となる異なるドメイン配向を有する、２つのダイアボディ型結合ドメイン及びＦａｂ型結合ドメインを含む３価結合分子のドメインの概略図を示す。図６Ｂは、ダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対するＣ末端となる異なるドメイン配向を有する、２つのダイアボディ型結合ドメイン及びＦａｂ型結合ドメインを含む３価結合分子のドメインを概略図で示す。図６Ａ〜６Ｂの分子は４つの鎖を含む。図６Ｃ及び６Ｄはそれぞれ、Ｆｃ領域のＮ末端に２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む、３価結合分子のドメインの概略図を示す。図６Ｅ及び６Ｆの３価結合分子はそれぞれ、Ｆｃ領域のＣ末端に２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む、３価結合分子のドメインの概略図を示す。図６Ｃ〜６Ｆの３価結合分子は、３つの鎖を含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、７Ｂ２、生殖細胞系列化７Ｂ２（７Ｂ２ＧＬ）、及び指示されたヒト生殖細胞系列の、アミノ酸配列の配置を示す。７Ｂ２からの差異には網掛けが付され、フレームワーク（ＦＷ）領域及びＣＤＲ領域が示され、Ｋａｂａｔの番号付与が提供されている。ＶＬドメインが図７Ａに提示され、ＶＬドメインが図７Ｂに提示されている。
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、Ａｔｔａｎａ  Ｃｅｌｌ  Ａ２００  ＱＣＭで測定された、不動化された７Ｂ２  ＩｇＧ（図８Ａ）及び７Ｂ２ＧＬ  ＩｇＧ（図８Ｂ）への組み換えＨＩＶ‐１  ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０（１００、５０、２５ｎＭ）の結合のセンサーグラムを示す。
【図９】図９は、（免疫原性を最小化するように最適化された７Ｂ２ＧＬ  ＶＬ及びＶＨドメインを含む）ＤＡＲＴ‐Ａ、並びに（親７Ｂ２  ＶＬ及びＶＨドメインを含む）ＤＡＲＴ‐１の、ｇｐ１４０発現性ＨＥＫ  ２９３／Ｄ３７１細胞の表面に結合する能力を示す。
【図１０】図１０は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞レポータアッセイで測定された、（免疫原性を最小化するように最適化された７Ｂ２ＧＬ  ＶＬ及びＶＨドメインを含む）ＤＡＲＴ‐Ａ、並びに（親７Ｂ２  ＶＬ及びＶＨドメインを含む）ＤＡＲＴ‐１の、Ｔ細胞を活性化する能力を示す。
【図１１】図１１は、ＣＴＬアッセイにおける、（免疫原性を最小化するように最適化された７Ｂ２ＧＬ  ＶＬ及びＶＨドメインを含む）ＤＡＲＴ‐Ａ、並びに（親７Ｂ２  ＶＬ及びＶＨドメインを含む）ＤＡＲＴ‐１の、ＨＩＶ  ｇｐ４１発現性標的細胞のＴ細胞標的転換殺滅を仲介する能力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、免疫原性が低減された最適化済みＨＩＶ‐１  ｇｐ４１結合分子を対象とする。より具体的には、本発明は、ｇｐ４１結合可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び／又はｇｐ４１結合可変重鎖（ＶＨ）ドメインであって、レシピエント被験者への投与時に該ドメインの免疫原性を低減するように最適化されているｇｐ４１結合可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び／又はｇｐ４１結合可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、最適化済みｇｐ４１結合分子に関する。本発明は特に、（（ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディを含む）二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、二重特異性抗体、（ＴＲＩＤＥＮＴ（商標）分子を含む）３価結合分子等を含む）多重特異性ｇｐ４１結合分子である、ｇｐ４１結合分子であって：（ｉ）１つ以上の上述のような最適化済みｇｐ４１結合可変ドメイン；及び（ｉｉ）エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに結合できるドメインを含む、ｇｐ４１結合分子に関する。本発明はまた、上述のようなｇｐ４１結合分子のいずれを含む医薬組成物、及びＨＩＶ‐１感染の治療における上述のようなｇｐ４１結合分子のいずれの使用を伴う方法も対象とする。
【００３４】
Ｉ．抗体及び他の結合分子
Ａ．抗体
本発明のｇｐ４１結合分子は、抗体であってよく、又は（例えば抗体ポリペプチドの断片化、切断等によって）ｇｐ４１結合抗体から誘導可能であってよく、若しくは抗体分子のポリペプチド鎖のうちの１つ以上のアミノ酸配列の使用によって得られるものであってよく、若しくはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって発現されるものであってよく、若しくはこのようなポリヌクレオチドのヌクレオチド配列から得られるものであってよい。
抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の分子の特定のドメイン又は部分又は立体配座（「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。エピトープ含有分子は、免疫原性活性を有してよく、従ってエピトープ含有分子は動物の体内で抗体産生応答を誘発する。このような分子は「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」と呼ばれる。本明細書において使用される場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ及びａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ部分、Ｆ（ａｂ’）部分、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、及び以上のうちのいずれかのエピトープ結合ドメインを包含する。このような免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1及びＩｇＡ2）若しくはサブクラス、又は種（ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類、（例えばカニクイザル等のサル、ヒトを含む）霊長類等）のものとすることができる。
【００３５】
用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープ（又は抗原部位）に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの部分（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、並びに必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した部分等を含む。
【００３６】
モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125を参照）。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、以下で詳述するように、本発明の単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性）分子、並びに親和性最適化済み、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／又はイヌ化抗体を生成することによって、抗体の親和性又は他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。
【００３７】
本発明の抗体及び結合分子は、その結合ドメインを介して、「免疫特異的な（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」様式でエピトープに結合する。本明細書中で使用される場合、分子は、別の分子のあるエピトープに、代替的なエピトープに対してよりも頻繁に、迅速に、長期間、及び／又は高い親和性で結合又は連結する場合に、該エピトープに免疫特異的な様式で（又は「免疫特異的に（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」）結合すると表現される。例えば、ウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、該抗体が他のウイルスエピトープ又は非ウイルスエピトープに結合するよりも、高い親和性で、高い結合活性で、より迅速に、及び／又はより長期間結合する抗体である。この定義を読むと、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合するものであっても、そうでなくてもよいことも理解される。従って「免疫特異的結合（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、必ずしも排他的な結合を要求しない（ただしこれを含み得る）。一般には、結合に関する言及は「免疫特異的な」結合を意味するが、必ずしもそうではない。天然抗体は１つのエピトープ種にしか結合できない（即ちこれらは「単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」である）が、天然抗体は、該種の複数の複製に免疫特異的に結合できる（即ち「２価性（ｂｉｖａｌｅｎｃｙ）」又は「多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）」を示す）。２つの分子は、これらの結合が、それぞれのリガンドに受容体が結合する際の特異性を示す場合に、「生理特異的に（ｐｈｙｓｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」様式で互いに結合できると表現される。
【００３８】
この数十年、抗体の治療能力に対する関心が再燃しており、抗体は、バイオテクノロジー由来薬物の主要な分類の１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666）。２００を超える抗体ベースの薬物について、その使用が承認されているか、又は開発中である。
【００３９】
１．抗体の一般的な構造的属性
自然発生した免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本的な構造単位は、２つの長い「重鎖」と複合体化した２つの短い「軽鎖」からなる四量体であり、通常約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として表される。各鎖は、「可変ドメイン」を含むアミノ末端（「Ｎ末端」）部分と、少なくとも１つの「定常ドメイン」を含むカルボキシ末端（「Ｃ末端」）部分とからなる。ＩｇＧ軽鎖は、単一の「軽鎖可変ドメイン」（「ＶＬ」）と、単一の「軽鎖定常ドメイン」（「ＣＬ」）とからなる。よって、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造は、ｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃである（ここでｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。ＩｇＧ重鎖は、単一の「重鎖可変ドメイン」（「ＶＨ」）、３つの「重鎖定常ドメイン」（「ＣＨ１」、「ＣＨ２」及び「ＣＨ３」）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する「ヒンジ」領域（「Ｈ」）からなる。よって、ＩｇＧ重鎖の構造は、ｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。無傷の修飾されていない抗体（例えばＩｇＧ抗体）の、抗原のエピトープに結合する能力は、可変ドメインの存在及びその配列に左右される。特段の記載がない限り、本明細書に記載のタンパク質分子のドメインの順序は、「Ｎ末端からＣ末端への（Ｎ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｏ  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ）」方向である。
【００４０】
（ａ）定常ドメイン
（ｉ）軽鎖定常ドメイン
好ましいＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ  ＣＬκドメインである。例示的なヒトＣＬκドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 
SFNRGEC
である。
【００４１】
あるいは、例示的なＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ  ＣＬλドメインである。例示的なヒトＣＬλドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA 
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP 
TECS
である。
【００４２】
（ｉｉ）重鎖ＣＨ１ドメイン
抗体の２つの重鎖のＣＨ１ドメインは、抗体の軽鎖の「ＣＬ」定常領域と複合体化し、介在ヒンジドメインを介して重鎖ＣＨ２ドメインに付着する。
【００４３】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
【００４４】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
【００４５】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ３  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ３  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号５）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
である。
【００４６】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号６）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
である。
【００４７】
（ｂ）重鎖ヒンジ領域
１つの例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号７）：EPKSCDKTHTCPPCPである。
【００４８】
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号８）：ERKCCVECPPCPである。
【００４９】
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ３ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ３ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９）：
ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK 
SCDTPPPCPR CP
である。
【００５０】
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０）：ESKYGPPCPSCPである。本明細書中で記載されるように、ＩｇＧ４ヒンジドメインは、Ｓ２２８Ｐ置換等の安定化突然変異を含んでよい。例示的なＳ２２８Ｐ‐安定化ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１１）：ESKYGPPCPPCPである。
【００５１】
（ｃ）重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン
２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、相互作用してＩｇＧ抗体の「Ｆｃドメイン（Ｆｃ  Ｄｏｍａｉｎ）」を形成し、これは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を含むがこれに受容されない細胞Ｆｃ受容体によって認識されるドメインである。本明細書中で使用される場合、用語「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域の一部分（Ｆｃ領域全体を包含する一部分を含む）を、本明細書では「Ｆｃドメイン」と呼ぶ。Ｆｃ領域は、そのアミノ酸配列が、他のＩｇＧアイソタイプに対してよりも、あるＩｇＧアイソタイプに対して最も相同性が高い場合に、この特定のＩｇＧアイソタイプ、クラス又はサブクラスのものであると表現される。抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。
【００５２】
例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１２）：
231     240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVKFNWYVD
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
340          350          360          370          380
PIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE
440      447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００５３】
例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１３）：
231     240          250          260          270          280
APPVA-GPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFNWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTF   RVVSVLTVVH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPA 
340          350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDISVE
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE 
440      447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００５４】
例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１４）：
231     240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFKWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTF   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
340          350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
390          400          410          420          430
WESSGQPENN   YNTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NIFSCSVMHE
440      447
ALHNRFTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００５５】
例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１５）：
231     240          250          260          270          280
APEFLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSQED   PEVQFNWYVD 
290          300         310           320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPS 
340          350          360          370          380
SIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSQEEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE 
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSRL   TVDKSRWQEG   NVFSCSVMHE 
440      447
ALHNHYTQKS   LSLSLGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００５６】
本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖の定常領域の残基の番号付与は、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service、NH1、MD (1991)（「Ｋａｂａｔ」、これは参照により明示的に本明細書に援用される）によるＥＵインデックスの番号付与である。用語「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ａｓ  ｉｎ  Ｋａｂａｔ）」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の定常ドメインの番号付与を指す。多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによる番号付与で２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従ってここで提示される配列と従来技術の配列との間にはわずかな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提示される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、発現系によっては、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字）は、翻訳後に除去できる。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明のｇｐ４１結合分子の任意のアミノ酸残基である。本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基が欠けたｇｐ４１結合分子である。また本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含む構造である。
【００５７】
（ｄ）可変ドメイン
ＩｇＧ分子の可変ドメインは、エピトープと接触することになる抗体のアミノ酸残基を含有する３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、及びフレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる介在性非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワークセグメントは、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基もエピトープに接触し得る）。従って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。ＣＤＲのアミノ酸配列は、ある抗体がある特定のエピトープに結合できるかどうかを決定する。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特に、それぞれ別個のポリペプチド上に存在するこれらのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、抗体のエピトープ結合部位を形成する。
【００５８】
免疫グロブリンの成熟した重鎖及び軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖内でのアミノ酸の位置によって指定される。Ｋａｂａｔは、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を同定し、残基番号を各アミノ酸に割り当てており、またＣＤＲは、Ｋａｂａｔによって定義されるように同定される（Chothia, C. & Lesk, A. M.(1987) “Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,” J. Mol. Biol. 196:901-917）によって定義されるＣＤＲH１は、残基５個分前から始まることが理解されるだろう）。Ｋａｂａｔの番号付与スキームは、その大要に含まれていない抗体に対して、保存されたアミノ酸を参照して上記抗体をＫａｂａｔのコンセンサス配列のうちの１つと整列させることにより、拡張可能である。残基番号を割り当てるこの方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ変異型又はヒト化変異型を含む異なる抗体の同一の位置のアミノ酸が容易に同定される。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同一位置を占める。
【００５９】
抗体の軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体の重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ（登録商標）等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。
【００６０】
用語「エピトープ結合ドメイン（Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ）」（例えばｇｐ４１結合ドメイン）は、結合分子の、あるエピトープ（例えばｇｐ４１のエピトープ）に免疫特異的に結合できる能力に寄与する、該結合分子の部分（又はこのような部分のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を指す。エピトープ結合ドメインは、抗体のＶＬ若しくはＶＨドメイン、若しくは抗体のＣＤＲドメインのうちの１、２、３、４若しくは５個を含有してよく、又は抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有してよく、このようなエピトープに免疫特異的に結合できるものの、このような抗体のエピトープとは異なるエピトープに対する免疫特異性、親和性又は選択性を呈してもよい。エピトープ結合ドメインは、ＣＤＲの一部のみ、即ちＣＤＲ残基の、結合に必要なサブセットのみを含有してよく、これはＳＤＲと呼ばれる（Kim, J.H. et al. (2012) “Humanization By CDR Grafting And Specificity-Determining Residue Grafting,” Methods Mol. Biol. 907:237-245; Kim, K.S. et al. (2010) “Construction Of A Humanized Antibody To Hepatitis B Surface Antigen By Specificity-Determining Residues (SDR)-Grafting And De-Immunization,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 396(2):231-237; Kashmiri, S.V. et al. (2005) “SDR Grafting - A New Approach To Antibody Humanization,” Methods 36(1):25-34; Gonzales, N.R. et al. (2004) “SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity,” Mol. Immunol. 41:863-872）。しかしながら好ましくは、エピトープ結合ドメインは、このような抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有することになる。あるエピトープ結合ドメインは、単一のポリペプチド鎖（例えばｓｃＦｖ）であってよく、又はそれぞれがアミノ末端及びカルボキシ末端を有する、ジスルフィド結合によって互いに共有結合できる２つ以上のポリペプチド鎖（例えばダイアボディ、Ｆａｂ部分、Ｆａｂ2部分等）を含んでよい。
【００６１】
２．抗体のヒト化
本発明はまた特に、ある抗体のＶＬ又はＶＨドメイン、好ましくはある抗体のＶＬ及びＶＨドメインの両方を含む結合分子を包含する。好ましくは、このような抗体はヒト化抗体である。モノクローナル抗体は典型的には、マウス又はウサギ等の非ヒト種の体内で調製される。このような抗体の変異型及び／又は定常ドメインは、免疫原として認識され得るため、これらに対する免疫応答が引き起こされる。しかしながら、このような分子は、１つ以上のアミノ酸置換を導入して、上記抗体をヒトによって生成される抗体により近い抗体とすることにより「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅ）」でき、これによって上記抗体の免疫原性を低減又は排除できる。用語「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンのエピトープ結合ドメインと、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。このような抗体の可変ドメインのポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224; Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ及び／又は６つ）を有する。
【００６２】
抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体のエピトープ結合ドメインの塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。
【００６３】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合ドメインを含む多数のヒト化抗体分子が記述されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類可変ドメインと、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含む（例えばWinter et al. (1991) “Man‐made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989); Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538;及びBrown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフと重合される、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536;及びJones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,”Nature 321:522-525を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば欧州公開特許第５１９，５９６号を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476並びに米国特許第６，１８０，３７７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第５，９９７，８６７号；及び米国特許第５，８６６，６９２号によって開示されている。本発明は特に、「ヒト化」抗体のＶＬ及び／又はＶＨドメインを含む（抗体及びダイアボディを含む）結合分子を包含する。
【００６４】
このような成功にもかかわらず、治療用途に最適化された、安定した官能性ヘテロ二量体非単一特異性ダイアボディの生産は、ポリペプチド鎖で採用するドメインを注意深く考察し配置することによって、更に改善できる。よって本発明は、ｇｐ４１と、免疫エフェクタ細胞の表面上に存在する分子とに同時に結合できる、安定した治療に有用なヘテロ二量体ダイアボディ及びヘテロ二量体Ｆｃダイアボディを、共有結合によって形成するよう特に設計された、特定のポリペプチドの提供を対象とする。
【００６５】
Ｂ．二重特異性抗体
上述のように、天然抗体は１つのエピトープ種にしか結合できない（即ちこれらは単一特異性である）が、上記種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。抗体の、抗原のエピトープに結合する能力は、該抗体のＶＬ及びＶＨドメインの存在及びそのアミノ酸配列に依存する。抗体の軽鎖と重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、ＩｇＧ等の天然抗体の２つのエピトープ結合ドメインのうちの１つを形成する。
【００６６】
抗体の官能性は、２つの別個の異なる抗原（若しくは同一の抗原の異なるエピトープ）に同時に結合できる多重特異性抗体系分子を生成することによって、並びに／又は同一のエピトープ及び／若しくは抗原に関して更に高い価数（即ち３つ以上の結合ドメイン）を有する抗体系分子を生成することによって、増強できる。
【００６７】
天然抗体より高い能力を有する分子を提供するために、広範な組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されてきた（例えば国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００９／１３２８７６号、国際公開第２００８／００３１０３号、国際公開第２００７／１４６９６８号、国際公開第２００９／０１８３８６号、国際公開第２０１２／００９５４４号、国際公開第２０１３／０７０５６５号を参照）。このようなアプローチの大半は、更なる結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）へ若しくは上記抗体コア内に融合させるため、又は複数の抗原結合部分（例えば２つのＦａｂ部分若しくはｓｃＦｖ）を互いに融合させるために、リンカーペプチドを使用する。代替的なフォーマットは、結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は代替となるポリペプチド等の二量体化ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（国際公開第２００５／０７０９６６号、国際公開第２００６／１０７７８６Ａ号、国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号、国際公開第２００７／０４６８９３号）。典型的には、このようなアプローチは妥協及びトレードオフを伴う。例えば国際公開第２０１３／１７４８７３号、国際公開第２０１１／１３３８８６号、及び国際公開第２０１０／１３６１７２号は、リンカーの使用によって、治療的設定に問題が生じる場合があることを開示しており、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を教示している（国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号）。従って、これらの文書に開示されている分子は、結合特異性を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１３／１６３４２７号及び国際公開第２０１３／１１９９０３号は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを含む融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。この文書は、ＣＨ２が、エフェクタ機能の仲介において最低限の役割しか果たさないらしいことを記載している。国際公開第２０１０／０２８７９７号、国際公開第２０１００２８７９６号、及び国際公開第２０１０／０２８７９５号は、Ｆｃ領域が追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。国際公開第２００３／０２５０１８号及び国際公開第２００３０１２０６９号は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。国際公開第２０１３／００６５４４号は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、エフェクタ機能を仲介する能力の全て又はある程度を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１４／０２２５４０号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２００８／０２４１８８号、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第１９９２／０２２５８３号、及び国際公開第１９９１／００３４９３号は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、ナイーブ抗体構造を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。
【００６８】
ＩＩ．二重特異性ダイアボディ
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えばHolliger et al. (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; 米国公開特許第２００４／００５８４００号（Hollinger et al.）；米国公開特許第２００４／０２２０３８８号（Mertens et al.）；Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.）；Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27；Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944を参照）。
【００６９】
ダイアボディの設計は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインが短い連鎖ペプチドを用いて連結されている、単鎖可変ドメイン部分（ｓｃＦｖ）の構造に基づく。Bird et al. (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426)は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426）。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。
【００７０】
非単一特異性「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」の提供は、異なるエピトープを発現する細胞を共連結（ｃｏ‐ｌｉｇａｔｅ）して共存させることができる能力という、抗体を上回る有意な利点を提供する。従って二重特異性ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二重特異性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び操作の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その２価性、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221-1225）。
【００７１】
二重特異性ダイアボディを産生する能力により、異なる細胞上に存在する受容体の共連結（例えば細胞傷害性Ｔ細胞と、疾患抗原を発現する癌細胞又は病原体感染細胞等の標的細胞との架橋）によって、２つの細胞を共連結するために、上記ダイアボディを（「トランス（ｔｒａｎｓ）」として）使用できるようになる（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658; 非特許文献２）。あるいは又は更に、二重特異性（又は多重特異性）ダイアボディを（「シス」として）用いて、同一の細胞の表面上に存在する受容体等の分子を共連結できる。異なる細胞及び／又は受容体の共連結は、エフェクタ機能及び／又は免疫細胞シグナリングを変調するために有用である。エピトープ結合ドメインを含む多重特異性分子（例えば二重特異性ダイアボディ）は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、抗原提示細胞又は他の単核細胞上で発現される、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ等といったいずれの免疫細胞の表面決定因子、又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４０及びＣＤ７４といったＢ細胞の表面決定因子を対象としてよい（Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma,” N. Engl. J. Med. 359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) “Newer Monoclonal Antibodies For Hematological Malignancies,” Exp. Hematol. 36(7):755-768）。特に、免疫エフェクタ細胞上に存在する細胞表面受容体を対象とするエピトープ結合ドメインは、標的転換細胞殺滅を仲介できる多重特異性結合分子の生成に有用である。
【００７２】
多くの研究において、エフェクタ細胞決定因子、例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合するダイアボディは、エフェクタ細胞を活性化させることも分かった（Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916；国際公開第２００６／１１３６６５号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１２／１６２０６８号）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、Ｆｃドメイン‐ＦｃγＲ相互作用によるエフェクタ細胞への抗原結合抗体の結合によってトリガされる。従ってこれに関して、ダイアボディ分子は、Ｆｃドメインを含むかどうかとは無関係に、（例えば当該技術分野において公知の、又は本明細書に例示されているいずれのエフェクタ機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）においてアッセイされるように）Ｉｇ様官能性を示し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋させることによって、ダイアボディは腫瘍細胞近傍にエフェクタ細胞を移動させるだけではなく、効果的な腫瘍殺滅をもたらす（例えばCao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics, "Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197を参照）。
【００７３】
しかしながら、上述の二重特異性ダイアボディの利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止できる（即ちこれらのホモ二量体化を防止できる）ような方法で達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672を参照）。
【００７４】
しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非官能性単一ポリペプチド鎖モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672を参照）。
【００７５】
この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディと呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した。例えば、Liu. L et al. (2017) “MGD011, A CD19 x CD3 Dual-Affinity Retargeting Bi-specific Molecule Incorporating Extended Circulating Half-life for the Treatment of B-Cell Malignancies,” Clin Cancer Res. 23(6):1506-1518; Tsai, P. et al. (2016) “CD19xCD3 DART Protein Mediates Human B-Cell Depletion In Vivo In Humanized BLT Mice,” Mol. Ther. Oncolytics 3:15024. doi: 10.1038/mto.2015.24; Chen, X. et al. (2016) “Mechanistic Projection of First-in-Human Dose for Bispecific Immunomodulatory P-Cadherin LP-DART: An Integrated PK/PD Modeling Approach,” Clin. Pharmacol. Ther. 100(3):232-241;非特許文献２; Al Hussaini, M. et al. (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART(R)) Platform,” Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551；米国特許第９，９３２，４００号；米国特許第９，９０８，９３８号；米国特許第９，８８９，１９７号；米国特許第９，８８４，９２１号；米国特許第９，８２２，１８１号；米国特許第９，２９６，８１６号；米国特許第９，２８４，３７５号；米国特許第８，７９５，６６７号；米国特許第８，１８７，５９３号；米国特許第８，６６９，３４９号；米国特許第８，７８４，８０８号；米国特許第８，７９５，６６７号；米国特許第８，８０２，０９１号；米国特許第８，８０２，０９３号；米国特許第８，９４６，３８７号；及び米国特許第８，９６８，７３０号、並びに米国公開特許第２００９／００６０９１０号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；米国公開特許第２０１１／００８１３４７号；米国公開特許第２０１１／００９７３２３号；米国公開特許第２０１１／０１１７０８９号；米国公開特許第２０１２／００３４２２１号；米国公開特許第２０１２／０２９４７９６号；米国公開特許第２０１３／０１４９２３６号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１４／００１７２３７号；米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；米国公開特許第２０１４／０２５５４０７号；米国公開特許第２０１５／０１７５６９７号；米国公開特許第２０１６／００１７０３８号；米国公開特許第２０１６／０１５９９０８号；米国公開特許第２０１６／０１５９９０８号；米国公開特許第２０１６／０１９４３９６号；米国公開特許第２０１６／０１９４３９６号；米国公開特許第２０１６／０２００８２７号；米国公開特許第２０１６／０２００８２７号；米国公開特許第２０１６／０２２２１０５号；米国公開特許第２０１６／０２２２１０５号；米国公開特許第２０１６／０３３３１１１号；米国公開特許第２０１６／０３���５５８６号；米国公開特許第２０１６／０３５５５８６号；米国公開特許第２０１７／０１５７２５１号；米国公開特許第２０１７／０１５７２５１号；米国公開特許第２０１７／０１９８０３７号；米国公開特許第２０１７／０１９８０３７号；米国公開特許第２０１７／０１９８０４５号；米国公開特許第２０１７／０２０４１７６号；米国公開特許第２０１７／０２０４１７６号；米国公開特許第２０１７／０２４７４５２号；及び米国公開特許第２０１８／００９４０７２号；欧州特許第１８６８６５０号；欧州特許第２１５８２２１号；欧州特許第２２４７３０４号；欧州特許第２２５２６３１号；欧州特許第２２８２７７０号；欧州特許第２３２８９３４号；欧州特許第２３７６１０９号；欧州特許第２５４２２５６号；欧州特許第２６０１２１６号；欧州特許第２７１４０７９号；欧州特許第２７１４７３３号；欧州特許第２７８６７６２号；欧州特許第２８３９８４２号；欧州特許第２８４００９１号；並びに国際公開第２００６／１１３６６５号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２０１０／０２７７９７号；国際公開第２０１０／０３３２７９号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２０１１／１０９４００号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１２／１６２０６７号；国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１４／１５９９４０号；国際公開第２０１５／０２１０８９号；国際公開第２０１５／０２６８９２号；及び国際公開第２０１５／０２６８９４号を参照。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを含み、１つ以上のシステイン残基を、採用したポリペプチド種（これらはジスルフィド結合を形成でき、これによってこのようなポリペプチド鎖の１つ以上のペアを互いに共有結合させることができる）それぞれの中へと組み込むステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、関与するポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、ダイアボディの結合特性に干渉することなく、得られるダイアボディを安定化させる。
【００７６】
最も単純なＤＡＲＴ（登録商標）は、２つのポリペプチド鎖を含み、これらはそれぞれ３つのドメインを含む（図１Ａ〜１Ｂ）。第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含むドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む、第２のドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記第２のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進する役割、及びダイアボディの第２のポリペプチド鎖に対する第１のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす、第３のドメイン（「ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ‐Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ）を含む。第２のポリペプチド鎖は：相補的な第１のドメイン（ＶＬ２ドメイン）；相補的な第２のドメイン（ＶＨ１ドメイン）；並びに第１のポリペプチド鎖の第３のドメインと複合体化して、第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進する、第３のドメイン（「ヘテロ二量体促進ドメイン」）を含有する。このような分子は、安定かつ強力であり、２つ以上の抗原を同時に結合する能力を有する。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチド鎖の第３のドメインはそれぞれ、システイン（「Ｃマーク（Ｃを丸で囲んだマーク）」）残基を含有し、このシステイン残基は、ジスルフィド結合を介してポリペプチドを一体に結合させる役割を果たす。
【００７７】
上記ポリペプチド鎖のうちの一方又は両方の第３のドメインは更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、ダイアボディのポリペプチドの複合体化によって、細胞（Ｂリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞等）のＦｃ受容体に結合できるＦｃドメインが形成される）。このような分子の多数の変形例が記載されており（例えば米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号；米国公開特許第２００７‐０００４９０９号；米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２００６／１１３６６５号を参照）、また本明細書中で提供される。このような分子の多数の変異型が記載されており（例えば、米国公開特許第２０１５／０１７５６９７号；米国公開特許第２０１４／０２５５４０７号；米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；米国公開特許第２００９／００６０９１０号；米国公開特許第２００７‐０００４９０９号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；欧州公開特許第１８６８６５０号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号;国際公開第２００６／１１３６６５号参照）、また本明細書中で提供される。
【００７８】
二重特異性又は４価分子が望ましいもののＦｃは必要ない場合の用途のために、代替的な構成が当該技術分野において公知であり、これは、「ＢｉＴＥ（登録商標）抗体」とも呼ばれる、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ分子（例えば国際公開第１９９３／１１１６１号；及び国際公開第２００４／１０６３８１号参照）並びに「ＴａｎｄＡｂ（登録商標）」とも呼ばれる４価タンデム抗体（例えば米国公開特許第２０１１‐０２０６６７２号；欧州公開特許第２３７１８６６号；国際公開第１９９９／０５７１５０号；国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２０１３／０１３７００号参照）を含むが、これに限定されない。ＢｉＴＥ（登録商標）は、タンデム結合されたｓｃＦｖを含む単一のポリペプチド鎖から形成され、またＴａｎｄＡｂ（登録商標）は、ＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、及びＶＬ２ドメインをそれぞれ有する２つの同一の鎖のホモ二量体化によって形成される。
【００７９】
ＩＩＩ．本発明の実施形態
本発明は、「エピトープ結合分子（Ｅｐｉｔｏｐｅ‐Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」を対象とし、これは、上記分子がエピトープに結合することを可能にする「エピトープ結合部位（Ｅｐｉｔｏｐｅ‐Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）」を形成するために十分な、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、若しくはＣＤＲH３ドメイン、又はこれらのいずれの組み合わせ若しくは部分的組み合わせといった「エピトープ結合ドメイン（Ｅｐｉｔｏｐｅ‐Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ）」を含む。例えば、「ｇｐ４１エピトープ結合分子（ｇｐ４１‐Ｅｐｉｔｏｐｅ‐Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、上記分子がｇｐ４１のエピトープに結合することを可能にする「ｇｐ４１エピトープ結合部位（ｇｐ４１‐Ｅｐｉｔｏｐｅ‐Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）」を形成するために十分な、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、若しくはＣＤＲH３ドメイン、又はこれらのいずれの組み合わせ若しくは部分的組み合わせといった「エピトープ結合ドメイン（Ｅｐｉｔｏｐｅ‐Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ）」を含む。しかしながら好ましくは、このようなｇｐ４１結合分子は、ｇｐ４１のエピトープに免疫特異的に結合する「抗ｇｐ４１抗体（ａｎｔｉ‐ｇｐ４１  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」のＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインを有する。いくつかの実施形態では、このような分子は、このような抗ｇｐ４１抗体のｇｐ４１‐ＶＬ結合ドメインのみ、又はこのような抗ｇｐ４１抗体のｇｐ４１‐ＶＨ結合ドメインのみを含んでよく、これらのドメインは他の結合ドメインと相互作用して、ｇｐ４１のエピトープへの免疫特異的結合を仲介できるか、又はこれらのドメインだけで、このような結合を仲介するのに十分である場合もある。いくつかの実施形態では、このような分子は、抗ｇｐ４１抗体のｇｐ４１‐ＶＬ結合ドメイン及び抗ｇｐ４１抗体のｇｐ４１‐ＶＨ結合ドメインの両方を含んでよく、これらは同一の抗体由来であっても、異なる抗体由来であってもよい。
【００８０】
本発明の一実施形態は、「多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」ｇｐ４１結合分子に関し、これらは二重特異性であり、「第１のエピトープ」及び「第２のエピトープ」に結合でき、これらのエピトープは互いに同一ではない。エピトープを「第１のエピトープ」、「第２のエピトープ」等として表記することは、これらのエピトープの説明に先行する基礎を提供することのみを目的としており、実質的な区別を意味するものではない。このような多重特異性分子は、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、及び第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメインを含む。表記法「ＶＬ１」及び「ＶＨ１」はそれぞれ、このような二重特異性分子の第１のエピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ２」及び「ＶＨ２」はそれぞれ、このような二重特異性分子の第２のエピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。ある特定のエピトープが第１のエピトープ、第２のエピトープ等のいずれとして指定されるかは無関係であり、このような表記法は、本発明の結合分子のポリペプチド鎖のドメインの存在及び配向のみに関連する。一実施形態では、このようなエピトープのうちの一方はヒトｇｐ４１のエピトープであり、もう一方はｇｐ４１の異なるエピトープであるか、又はｇｐ４１ではない分子のエピトープである。特定の実施形態では、このようなエピトープのうちの一方はヒトｇｐ４１のエピトープであり、もう一方は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又は他の単核細胞といったエフェクタ細胞の表面上に存在する分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ等）のエピトープである。特定の実施形態では、多重特異性分子は３つ以上のエピトープ結合ドメインを含む。特定の実施形態では、本発明の多重特異性分子は三重特異性であり、第１のエピトープ、第２のエピトープ、及び「第３のエピトープ」に結合できる。このような三重特異性分子は、第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１ドメイン、第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２ドメイン、並びに第３のエピトープに結合できる「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」ドメインを含む。他の実施形態では、本発明の多重特異性分子は四重特異性であり、第１のエピトープ、第２のエピトープ、第３のエピトープ、及び「第４のエピトープ」に結合できる。このような四重特異性分子は、第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１ドメイン、第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２ドメイン、第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３ドメイン、並びに第４のエピトープに結合できる「ＶＬ４」及び「ＶＨ４」ドメインを含む。このような多重特異性分子は、ｇｐ４１の少なくとも１つのエピトープ、及びｇｐ４１ではない分子の少なくとも１つのエピトープに結合し、また更に、ｇｐ４１の更なるエピトープ及び／又はｇｐ４１ではない分子の更なるエピトープに結合してよい。本発明は特に、本明細書中で提供される方法のうちのいずれかを用いて生成される、二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、抗体、ＴａｎｄＡｂ（登録商標）、及び３価分子を包含する。
【００８１】
多重特異性ｇｐ４１結合分子
一実施形態では、本発明のｇｐ４１結合分子は、２つ以上の異なるエピトープに結合できる多重特異性ｇｐ４１結合分子となり：
（１）ｇｐ４１のあるエピトープに免疫特異的に結合する第１のエピトープ結合ドメイン（即ちｇｐ４１結合ドメイン；好ましくは本発明の最適化済みｇｐ４１結合ＶＬドメイン及び／又は本発明の最適化済みｇｐ４１結合ＶＨドメインを含む）；並びに
（２）第２のエピトープに免疫特異的に結合する第２のエピトープ結合ドメインであって、上記第２のエピトープは、（ｉ）ｇｐ４１の異なるエピトープ、又は（ｉｉ）ｇｐ４１ではない分子のエピトープである、第２のエピトープ結合ドメイン；並びに
（３）任意に、第３の更なるエピトープ、第３の更なるエピトープ及び第４の更なるエピトープ等に免疫特異的に結合する、１つ以上の追加のエピトープ結合ドメインであって、このような追加のエピトープ結合ドメインは、第１のエピトープ又は第２のエピトープと同一であっても異なっていてもよい、追加のエピトープ結合ドメイン
を含む。
【００８２】
このようなｇｐ４１結合分子は好ましくは、標的細胞又は免疫エフェクタ細胞に固有の抗原のセットを認識するエピトープ結合ドメインの組み合わせを含む。特に本発明は、ｇｐ４１のエピトープと、エフェクタ細胞の表面上に存在する分子（即ちエフェクタ細胞分子（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＥＣＭ））、特にＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又は他の単核細胞の表面上に存在する分子のエピトープとに結合できる、多重特異性ｇｐ４１結合分子に関する。例えば本発明のこのようなｇｐ４１結合分子は、ｇｐ４１のあるエピトープに免疫特異的に結合する第１のエピトープ結合ドメインと、ＥＣＭ、特にＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、又はＮＫＧ２Ｄのエピトープに免疫特異的に結合する第２のエピトープ結合ドメインとを含むように構築できる。本発明の他の実施形態では、このような結合分子は更に、このような分子が、ＥＣＭの追加のエピトープ、及び／又はＨＩＶ‐１感染細胞の表面上に存在する分子の追加のエピトープ（例えばｇｐ４１の第２のエピトープ、若しくはＨＩＶ‐１エンベロープタンパク質の他のエピトープ）に結合できるようにするために十分な、エピトープ結合ドメインを含有する。本発明はまた、１つ以上のこのような分子を含む医薬組成物も対象とする。
【００８３】
一実施形態では、このようなｇｐ４１結合分子は二重特異性であるものの１価であり、従って、ｇｐ４１の単一のエピトープのみ、及びエフェクタ細胞の表面上に存在する分子（ＥＣＭ）の単一のエピトープのみに結合する能力を有する。あるいは、このような分子は多重特異性かつ多価であってよく、即ち合計１つ、２つ、３つ、又は４つのエピトープに結合でき、これは：ｇｐ４１の１つ、２つ、又は３つのエピトープ（２つ又は３つのｇｐ４１エピトープは同一であっても異なっていてもよい）、及び１つ以上のＥＣＭの３つ、２つ、又は１つのエピトープ；あるいはｇｐ４１の１つ又は２つのエピトープ（２つのｇｐ４１エピトープは同一であっても異なっていてもよい）、及び１つ以上のＥＣＭの２つ又は１つのエピトープ、及び特に１つ以上のこのような分子がＨＩＶ‐１感染細胞の表面上で発現される場合には任意に１つ以上の異なるＨＩＶ‐１分子の１つ又は２つのエピトープに結合するように、いずれの方法で割り当てることができる。
【００８４】
よって、このような分子が単一のＥＣＭのみに免疫特異的に結合できる場合、これらの分子は：
（１）１つのみのｇｐ４１エピトープ、並びにＥＣＭの１つ、２つ、又は３つのエピトープ（２つのエピトープは同一であっても異なっていてもよく、３つのエピトープは同一であっても、異なっていても、同一である２つのエピトープ及び異なる１つのエピトープであってもよい）；あるいは
（２）２つのみのｇｐ４１エピトープ（２つのエピトープは同一であっても異なっていてもよい）、及びＥＣＭの１つ又は２つのエピトープ（２つのエピトープは同一であっても異なっていてもよい）；あるいは
（３）３つのｇｐ４１エピトープ（３つのエピトープは同一であっても、異なっていても、同一である２つのエピトープ及び異なる１つのエピトープであってもよい）、並びにＥＣＭの１つのエピトープ
に免疫特異的に結合できるものとなり得、あるいは任意に、これらの分子は、１つ又は２つのｇｐ４１エピトープ（これらのエピトープは同一であっても異なっていてもよい）、及び異なるＨＩＶ‐１分子の２つ又は１つのエピトープ（２つのエピトープは同一であっても異なっていてもよい）に結合できるものとなり得る。
【００８５】
同様に、このような分子が２つの異なるＥＣＭ（例えば第１のＥＣＭ及び第２のＥＣＭ）に免疫特異的に結合できる場合、これらの分子は：
（１）１つのみのｇｐ４１エピトープ、及び第１のＥＣＭの１つ又は２つのエピトープ（２つの第１のＥＣＭエピトープは同一であっても異なっていてもよい）、及び第２のＥＣＭの２つ又は１つのエピトープ（２つの第２のＥＣＭエピトープは同一であっても異なっていてもよい）；あるいは
（２）２つのみのｇｐ４１エピトープ（２つのエピトープは同一であっても異なっていてもよい）、及び第１のＥＣＭの１つのエピトープ、及び第２のＥＣＭの１つのエピトープ
に免疫特異的に結合できるものとなり得、あるいは任意に、これらの分子は、１つのｇｐ４１エピトープ、及び異なるＨＩＶ‐１分子の１つのエピトープに結合できるものとなり得る。
【００８６】
２つのエピトープに結合できるこのような多重特異性分子の非限定的な例は以下に記載されており：
（１）ｇｐ４１の１つのエピトープ、及びＥＣＭの１つのエピトープであるＣＤ３に結合する、ＤＡＲＴ‐Ａ；並びに
（２）ｇｐ４１の１つのエピトープ、及びＥＣＭの１つのエピトープであるＣＤ１６に結合する、ＤＡＲＴ‐Ｂ
を含む。
【００８７】
３つのエピトープに結合できるこのような多重特異性分子の非限定的な例は以下に記載されており：
（１）ｇｐ４１の１つのエピトープ、並びに２つの異なるＥＣＭのエピトープ（ＣＤ３及びＣＤ８）に結合する、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ；
（２）ｇｐ４１の１つのエピトープ、ＥＣＭの１つのエピトープ（ＣＤ３）、及び異なるＨＩＶ‐１分子の１つのエピトープ（ｇｐ１２０）に結合する、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ；
（３）ｇｐ４１の１つのエピトープ、ＥＣＭの１つのエピトープ（ＣＤ１６）、及び異なるＨＩＶ‐１分子の１つのエピトープ（ｇｐ１２０）に結合する、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｃ；及び
（４）  ｇｐ４１の２つのエピトープ、並びにＥＣＭの１つのエピトープ（ＣＤ３）に結合する、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｄ
を含む。
【００８８】
表１は更に、本発明の例示的な分子の結合特異性の可能な組み合わせを示す。
【００８９】
【表１】
2021524451.tif 000002
【００９０】
より複雑な分子を形成することにより、１つ以上のＥＣＭと、任意に５つ以上のエピトープ結合ドメインを有する１つ以上の異なるＨＩＶ‐１分子とに結合できる、ｇｐ４１結合分子を得ることができる。よって、本発明の分子が結合できるエピトープ又は追加のエピトープの性質に課される制限は、このような追加の結合能力によって、上記分子又はｇｐ４１のエピトープに結合できる上記分子の結合ドメインの、このような結合が阻害されず、また上記分子又はＥＣＭのエピトープに結合できる上記分子の結合ドメインの、このような結合が阻害されないこと以外には存在しない。よって、本発明のｇｐ４１結合分子は、代替的な又は追加のエピトープ結合ドメインを有してよい。一例として、本発明は、ｇｐ４１のエピトープに免疫特異的に結合できる第１のエピトープ結合ドメイン、及びＥＣＭのエピトープに免疫特異的に結合できる第２のエピトープ結合ドメイン、及び異なるＥＣＭ又は任意に異なるＨＩＶ‐１分子に免疫特異的に結合できる第３のエピトープ結合ドメインを含む、ｇｐ４１結合分子を考える。
【００９１】
１．Ｆｃドメインを含まない多重特異性ｇｐ４１結合ダイアボディ
一実施形態では、本発明の多重特異性ｇｐ４１結合分子は二重特異性ダイアボディであり、第１のエピトープ及び第２のエピトープ両方に結合できるドメインを含むものの、Ｆｃドメインを含まず、従ってＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用によるＦｃγＲ分子への結合が不可能である。しかしながら、このような分子は、そのｇｐ４１結合ドメインのＳＤＲ又はＣＤＲを介してｇｐ４１に結合できる。よって、Ｆｃドメインの不在は、このような分子が、阻害性受容体ＣＤ３２Ｂ等のＦｃγＲに結合するのを防止する役割を果たす。
【００９２】
二重特異性ダイアボディのこのような実施形態の第１のポリペプチド鎖は、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬgp41又はＶＬ第2のエヒ゜トーフ゜）；第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬ gp41を含有する場合は）第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン、又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬ第2のエヒ゜トーフ゜を含有する場合は）ｇｐ４１のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１Ａ〜１Ｂ）。
【００９３】
二重特異性ダイアボディのこの実施形態の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬgp41又はＶＬ第2のエヒ゜トーフ゜；及び上記ＶＬドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；介在スペーサペプチド（リンカー１）；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（即ちＶＨgp41又はＶＨ第2のエヒ゜トーフ゜；及び上記ＶＨドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１Ａ〜１Ｂ）。ある特定のエピトープに対して特異的な、採用されるＶＬ及びＶＨドメインは、好ましくは同一のモノクローナル抗体から得られる、又は同一のモノクローナル抗体に由来する。しかしながらこれらのドメインは、これらのドメインが連結して、上記エピトープに免疫特異的に結合できる官能性結合ドメインを形成する場合、異なるモノクローナル抗体に由来してもよい。このような異なる抗体は、本明細書では「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」抗体と呼ばれる。
【００９４】
このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、上記ダイアボディの第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、上記エピトープのうちの１つ（例えば第１のエピトープ又は第２のエピトープ）に対して特異的な第１の官能性エピトープ結合ドメインを形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、他方のエピトープ（即ち第２のエピトープ又は第１のエピトープ）に対して特異的な第２の官能性エピトープ結合ドメインを形成する。よって、第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインの選択は、ダイアボディのこれら２つのポリペプチド鎖が合わせて、第１のエピトープ及び第２のエピトープの両方に結合できるＶＬ及びＶＨドメインを含む（即ちこれらが合わせて、ＶＬ第1のエヒ゜トーフ゜／ＶＨ第1のエヒ゜トーフ゜及びＶＬ第2のエヒ゜トーフ゜／ＶＨ第2のエヒ゜トーフ゜、例えばＶＬgp41／ＶＨgp41及びＶＬ第2のエヒ゜トーフ゜／ＶＨ第2のエヒ゜トーフを含む）ように、「調整（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）」される。
【００９５】
最も好ましくは、介在スペーサペプチド（即ち上述のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てる「リンカー１」）の長さは、上記ポリペプチド鎖の上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合する（例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個の介在リンカーアミノ酸残基からなる）のを実質的に又は完全に防止するよう選択される。従って第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１６）：GGGSGGGGを有する。
【００９６】
上記第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）の長さ及び組成は、上述のような二量体化を促進する１つ以上のポリペプチドドメイン（即ち「ヘテロ二量体促進ドメイン」）の選択に基づいて選択される。典型的には、上記第２の介在スペーサペプチド（「リンカー２」）の長さは、３〜２０個のアミノ酸残基である。特に、採用した１つ以上のヘテロ二量体促進ドメインがシステイン残基を含まない場合、システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）が利用される。システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、１つ、２つ、３つ又は４つ以上のシステインを含有する。好ましいシステイン含有スペーサペプチド（リンカー２）は、配列GGCGGG（配列番号１７）を有する。あるいは、リンカー２はシステインを含まず（例えば、GGG、GGGS（配列番号１８）、LGGGSG（配列番号１９）、GGGSGGGSGGG（配列番号２０）、ASTKG（配列番号２１）、LEPKSS（配列番号２２）、APSSS（配列番号２３）等）、以下で説明されるシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインが使用される。任意に、システイン含有リンカー２及びシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの両方が使用される。
【００９７】
ヘテロ二量体促進ドメインは、一方のポリペプチド鎖上にGVEPKSC（配列番号２４）又はVEPKSC（配列番号２５）又はAEPKSC（配列番号２６）、及び他方のポリペプチド鎖上にGFNRGEC（配列番号２７）又はFNRGEC（配列番号２８）であってもよい（米国特許第２００７／０００４９０９号）。
【００９８】
ある好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインは、対向する電荷のタンデム反復コイルドメイン、例えば、グルタミン酸残基がｐＨ７において負の電荷を形成する「Ｅコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号２９：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK）、又はリシン残基がｐＨ７において正の電荷形成する「Ｋコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号３０：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE）を含む。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の連結が促進され、従ってヘテロ二量体形成が促進される。上述のＥコイル及びＫコイルの配列の、１つ以上のシステイン残基を含むような修飾を含む、ヘテロ二量体促進ドメインを利用してよい。このようなシステイン残基の存在により、一方のポリペプチド鎖に存在するコイルが、他方のポリペプチド鎖に存在する相補的なコイルと共有結合し、これにより上記ポリペプチド鎖を互いに共有結合させて、ダイアボディの安定性を向上できる。特に好ましい例は、アミノ酸配列EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK（配列番号３１）を有する修飾されたＥコイルと、アミノ酸配列KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE（配列番号３２）を有する修飾されたＫコイルとを含む、ヘテロ二量体促進ドメインである。
【００９９】
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディを、ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのポリペプチド鎖のＣ末端に配置されることになる。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合ドメインを有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120）。従って、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するための、血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びより好ましくは、連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号３３）：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALPである。
【０１００】
国際公開第２０１２／１６２０６８号（参照により本出願に援用される）に開示されているように、配列番号３３の「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）」変異型は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減衰させる又は排除する能力を有する。組み合わさった突然変異の結果に基づいて、以下の置換の組み合わせが、このような脱免疫化ＡＢＤを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｄ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ及びＤ７９Ａ、又は修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ及びＤ７９Ａを有する変異型ＡＢＤ。アミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70 A71EGVKALIDE ILAALP（配列番号３４）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号３５）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号３６）
を有する、変異型脱免疫化ＡＢＤが特に好ましい。というのは、このような脱免疫化ＡＢＤは、ＭＨＣクラスＩＩ結合の減衰を提供しながら、略野生型の結合を呈するためである。従って、ＡＢＤを有するこのようなダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖は、好ましくはこのようなポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）ドメインに対してＣ末端に位置決めされることによって、上記Ｅコイル（又はＫコイル）ドメインとＡＢＤ（これは好ましくは脱免疫化ＡＢＤである）との間に介在する、第３のリンカー（リンカー３）を含有する。このようなリンカー３の好ましい配列は、配列番号１８：GGGSである。
【０１０１】
２．Ｆｃドメインを含む多重特異性ｇｐ４１結合ダイアボディ
本発明の一実施形態は、Ｆｃドメインを含み、またｇｐ４１のエピトープと第２のエピトープ（例えば異なるＨＩＶ‐１エンベロープタンパク質のエピトープ、又はエフェクタ細胞の表面上で発現されるエピトープ）とに同時に結合できる、多重特異性ダイアボディ（例えば二重特異性、三重特異性、四重特異性等）に関する。このような分子のＦｃドメインは、いずれのアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のものであってよい。上記分子は更に、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジドメインを含んでよい。ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジドメインが存在する場合、これらはいずれのアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のものであってよく、好ましくは所望のＦｃドメインと同一のアイソタイプのものである。
【０１０２】
上記ダイアボディポリペプチド鎖のうちの一方又は両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを追加して、上記ダイアボディ鎖の複合体化によってＦｃドメインが形成されるようにすると、上記ダイアボディの生物学的半減期が増大し、及び／又は価数が変化する。このようなダイアボディは、ポリペプチド鎖を互いに共有結合させて、ｇｐ４１及び第２のエピトープに同時に結合できる共有結合ダイアボディを形成できる配列を有する、２つ以上のポリペプチド鎖を含む。上記ダイアボディポリペプチドの両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、２鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディの形成が可能となる（図２）。
【０１０３】
あるいは、上記ダイアボディポリペプチドのうちの一方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、より複雑な４鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディの形成が可能となる（図３Ａ〜３Ｃ）。図３Ｃは、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン及び定常重鎖ＣＨ１ドメインを有する代表的な４鎖ダイアボディを示すが、このようなドメインの部分及び他のポリペプチドを代わりに採用してもよい（例えば図３Ａ及び３Ｂ、米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号、及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号を参照）。従って例えば、ＣＨ１ドメインの代わりに、ヒトＩｇＧのヒンジドメイン由来のアミノ酸配列GVEPKSC（配列番号２４）、VEPKSC（配列番号２５）又はAEPKSC（配列番号２６）を有するペプチドを採用してよく、またＣＬドメインの代わりに、ヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸、GFNRGEC（配列番号２７）又はFNRGEC（配列番号２８）を採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なペプチドを図３Ａに示す。あるいは、又は更に、対向する電荷のタンデムコイルドメイン、例えば「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号２９：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK又は配列番号３０：EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK）；及び「Ｋコイル」ドメイン（配列番号３１：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE又は配列番号３２：KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE）を含むペプチドを採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なコイルドメインを図３Ｂに示す。
【０１０４】
本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディ分子は、更なる介在スペーサペプチド（リンカー）を含んでよく、このようなリンカーは一般に、ヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル若しくはＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間、及び／又はＣＨ２‐ＣＨ３ドメインと可変ドメイン（即ちＶＨ若しくはＶＬ）との間に組み込まれる。典型的には、この追加のリンカーは３〜２０個のアミノ酸残基を含み、任意にＩｇＧヒンジドメインの全体又は一部分（好ましくは、１個、２個、３個、若しくは４個以上のシステイン残基を有するＩｇＧヒンジドメインのシステイン含有部分）を含有してよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディ分子において採用できるリンカーとしては：GGGS（配列番号１８）、LGGGSG（配列番号１９）、GGGSGGGSGGG（配列番号２０）、ASTKG（配列番号２１）、LEPKSS（配列番号２２）、APSSS（配列番号２３）、APSSSPME（配列番号３７）、VEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３８）、LEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３９）、DKTHTCPPCP（配列番号４０）、ｓｃＦｖリンカー：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号４１）；「長い（ｌｏｎｇ）」リンカー：GGGGSGGGSGGG（配列番号４２）、GGC、及びGGGが挙げられる。クローニングを容易にするために、GGG又はGGCの代わりにLEPKSS（配列番号２２）を使用してよい。更に、ペプチドGGG又はLEPKSS（配列番号２２）の直後にDKTHTCPPCP（配列番号４０）を続けることによって、代替リンカー：GGGDKTHTCPPCP（配列番号４３）；及びLEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号４４）を形成してよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子は、リンカーに加えて又はリンカーに代えて、ＩｇＧヒンジドメインを組み込んでよい。例示的なヒンジドメインとしては：ＩｇＧ１からのEPKSCDKTHTCPPCP（配列番号７）；ＩｇＧ２からのERKCCVECPPCP（配列番号８）；ＩｇＧ３からのELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPP PCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP（配列番号９）；ＩｇＧ４からのESKYGPPCPSCP（配列番号１０）；及び鎖交換を低減するための安定化Ｓ２２８Ｐ置換（下線を付して示されている）を含むＩｇＧ４ヒンジ変異型からのESKYGPPCPPCP（配列番号１１）が挙げられる（Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従って番号付与）。
【０１０５】
図３Ａ〜３Ｃに提示されているように、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは４つの異なる鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、４つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。第２及び第４のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第１／第３のポリペプチド鎖と第２／第４のポリペプチド鎖との二量体化を促進する。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメイン、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は四重特異性の４価結合が可能となる。表記法「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第３のエピトープ」に結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ４」及び「ＶＨ４」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第４のエピトープ」に結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。本発明の代表的な４鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表２に提示する。
【０１０６】
【表２】
2021524451.tif 000003
【０１０７】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計４つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図３Ａ〜３Ｃ）。本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、２つの第１のエピトープ結合ドメイン及び２つの第２のエピトープ結合ドメインを含む。
【０１０８】
更なる実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなダイアボディの第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含む。従ってこのようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、上記第１又は第２のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合ドメイン、及び上記エピトープ農地のもう一方に結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合ドメインを形成する。上記第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメインのシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。このような二重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図４Ａ及び４Ｂは、このようなダイアボディの構造を示す。このようなＦｃドメイン含有ダイアボディは、２つの配向（表３）のうちのいずれを有してよい。
【０１０９】
【表３】
2021524451.tif 000004
【０１１０】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計３つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、２価（即ち２つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図４Ａ〜４Ｂ）。本発明の二重特異性、２価Ｆｃ含有ダイアボディは、第１又は第２のエピトープに対して免疫特異的な１つのエピトープ結合ドメイン、及び上記エピトープのうちのもう一方に対して特異的に結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合ドメインを含む。
【０１１１】
更なる実施形態では、上記Ｆｃドメイン含有ダイアボディは、合計５つのポリペプチド鎖を含んでよい。ある特定の実施形態では、上記５つのポリペプチド鎖のうちの２つは、同一のアミノ酸配列を有する。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第１のポリペプチド鎖は、ＶＨ１及び重鎖定常領域を含有する抗体の重鎖であってよい。このようなダイアボディの第２及び第５のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。このようなダイアボディの上記第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、上記第１／第３のポリペプチド鎖のＶＨ１に対して相補的なＶＬ１を含有する抗体の軽鎖であってよい。上記第１、第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって構成できる。このようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメイン；（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｖ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｖｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、上記第３の鎖と上記第４の鎖との二量体化を促進する。このようなダイアボディの第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第３のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。
【０１１２】
従って、このようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖と上記第３及び第５のポリペプチド鎖とは、互いに連結して、第１のエピトープに結合できる２つのＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合ドメインを形成する。このようなダイアボディの上記第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに連結して、第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合ドメイン、及び第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合ドメインを形成する。上記第１及び第３のポリペプチドは、それぞれの定常領域のシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、Ｆｃドメインを形成する。このような多重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図５は、このようなダイアボディの構造を示す。ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう。
【０１１３】
上記ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、所望のエピトープに特異的なＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成するよう選択される。上記ポリペプチド鎖の連結によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性、三重特異性又は四重特異性である４価結合が可能となる。特に上記ＶＬ及びＶＨドメインは、多価ダイアボディが、第１のエピトープに関する２つの結合ドメイン及び第２のエピトープに関する２つの結合ドメイン、又は第１のエピトープに関する３つの結合ドメイン及び第２のエピトープに関する１つの結合ドメイン、又は（図５に示すように）第１のエピトープに関する２つの結合ドメイン、第２のエピトープに関する１つの結合ドメイン、及び第３のエピトープに関する１つの結合ドメインを含むように選択してよい。本発明の代表的な５鎖Ｆｃドメイン含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表４に示す。
【０１１４】
【表４】
2021524451.tif 000005
【０１１５】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、第１のエピトープに免疫特異的な２つのエピトープ結合ドメイン、及び第２のエピトープに特異的な２つのエピトープ結合ドメインを有する、合計５つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、第１のエピトープに免疫特異的な３つのエピトープ結合ドメイン、及び第２のエピトープに特異的な１つのエピトープ結合ドメインを含む。上述のように、ＶＬ及びＶＨドメインは、三重特異性結合が可能となるように選択してよい。従って本発明は、三重特異性４価Ｆｃ含有ダイアボディも包含する。本発明の三重特異性４価Ｆｃ含有ダイアボディは、第１のエピトープに対して免疫特異的な２つのエピトープ結合ドメイン、第２の分子に対して免疫特異的な１つのエピトープ結合ドメイン、及び第３のエピトープに対して免疫特異的な１つのエピトープ結合ドメインを含む。
【０１１６】
従来の免疫機能では、抗体‐抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞傷害性、肥満細胞脱顆粒及び食作用等のエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌を制御するもの等の免疫調節性シグナルにまで及ぶ、広範な応答をもたらす。これらの相互作用は全て、抗体又は免疫複合体のＦｃドメインの、造血細胞上の特殊化された細胞表面受容体への結合によって開始される。上述のように、抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造不均質性によって得られる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち免疫系増強）受容体であり；ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（即ち免疫系減衰）受容体である。更に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用は、エンドソームから細胞表面へのＩｇＧ分子の再循環及び血中への放出を仲介する。例示的な野生型ＩｇＧ１（配列番号１２）、ＩｇＧ２（配列番号１３）、ＩｇＧ３（配列番号１４）及びＩｇＧ４（配列番号１５）のアミノ酸配列は、既に提示されている。
【０１１７】
Ｆｃドメインの修飾は、表現型の変化、例えば血清半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化、又はエフェクタ機能の変化につながり得る。従って、本発明のＦｃドメイン含有結合分子をエフェクタ機能に関して修飾して、例えば癌の治療におけるこのような分子の有効性を増強することが望ましい場合がある。例えば、作用機序が、標的抗原を担持する細胞の殺滅ではなく遮断又は拮抗作用を伴う抗体の場合といった、特定の場合においては、Ｆｃドメイン仲介型エフェクタ機能の低減又は削減が望ましい。エフェクタ機能の上昇は、ＦｃγＲが低いレベルで発現する腫瘍及び外来細胞、例えばＦｃγＲＩＩＢのレベルが低い腫瘍特異性Ｂ細胞（例えば非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）といった、望ましくない細胞を対象とする場合に一般に望ましい。エフェクタ機能活性が与えられた又は変更された本発明のこのような分子は、エフェクタ機能活性の効率の増強が望ましい疾患、障害又は感染の治療及び／又は予防のために有用である。
【０１１８】
従って特定の実施形態では、本発明のｇｐ４１結合Ｆｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、操作された可変Ｆｃ領域であってよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、１つ以上のＦｃ受容体（例えば１つ以上のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよいが、より好ましくは、上記変異型Ｆｃドメインは、（野生型Ｆｃドメインが呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）への結合が変化しており、例えばある活性化受容体への結合が増強されており、及び／又は１つ以上の阻害性受容体に結合する能力が低下しているか若しくは上記能力を有しない。従って、本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、完全ＦｃドメインのＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全ＦｃドメインのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ以上の挿入及び／若しくは１つ以上の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を含んでよい。このようなＦｃドメインは、非Ｆｃポリペプチド部分を含んでよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃドメインの部分を含んでよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を含んでよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３ドメイン、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
【０１１９】
変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン修飾は当該技術分野において公知であり、活性化型受容体に対する結合を増大させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））、及び阻害型受容体に対する結合を低下させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））が含まれる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890を参照）。表５は、活性化受容体への結合を増大させる、及び／又は阻害性受容体への結合を低下させる例示的な修飾の、単一、二重、三重、四重及び五重置換のリスト（（ＥＵインデックスに従った）番号付与及び置換は、上で提示した配列番号１２のアミノ酸配列に対するものである）を示す。
【０１２０】
【表５】
2021524451.tif 000006
【０１２１】
ＣＤ３２Ｂへの結合が低下した、及び／又はＣＤ１６Ａへの結合が増大した、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの例示的な変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ３９６Ｌ置換を含有し、ここでの番号付与は、Ｋａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせで、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン内に存在してよい。一実施形態では、上記変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ置換を含有する。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子のＦｃドメインに関して、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号１２）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）への結合が低下している（又はこれらに略結合しない）ことが好ましい。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、抗体依存性細胞仲介型細胞傷害性（ＡＤＣＣ）エフェクタ機能が低下したＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む。ある好ましい実施形態では、このような結合分子のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、及びＮ２９７Ｇのうちのいずれの１つ、２つ、３つ又は４つを含み、ここでの番号付与は、Kabat中のEUインデックスの番号付与である。別の実施形態では、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｎ２９７Ｇ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換又はＤ２６５Ａ置換を含有するが、それはこれらの突然変異がＦｃＲ結合を消失させるためである。あるいは、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号１２）が呈する結合及びエフェクタ機能に対して）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）に対する結合が元来低い（又は略結合しない）、及び／又はエフェクタ機能が元来低い、天然のＦｃドメインのＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを利用する。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、ＩｇＧ２  Ｆｃドメイン（配列番号１３）、ＩｇＧ３  Ｆｃドメイン（配列番号１４）、又はＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（配列番号１５）を含む。ＩｇＧ４  Ｆｃドメインを利用する場合、本発明は、上述のヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換（例えば配列番号１１参照）等の安定化突然変異の導入も包含する。Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ置換はエフェクタ機能を消失させるため、エフェクタ機能が望まれる状況下では、これらの置換は採用しないことが好ましい。
【０１２３】
エフェクタ機能が低下したか又は消失した、本発明のＦｃドメイン含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１配列は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの置換を含む（配列番号４５）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１２４】
Ｆｃドメインを含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに関するＦｃドメインの結合親和性を増大させることによって増大させることができる。本明細書において使用される場合、用語「半減期（ｈａｌｆ‐ｌｉｆｅ）」は、投与後の分子の平均生存時間の尺度となる、分子の薬物動態特性を意味する。半減期は、血清中で（即ち循環半減期）又は他の組織中で測定した場合に、分子の既知の量の５０パーセント（５０％）が被験者の身体（例えばヒト患者若しくは他の哺乳類）又はその特定の体腔から排除されるために必要な時間として表すことができる。一般に、半減期の増大は、投与される分子の循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の増大につながる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、従って（野生型Ｆｃドメインを含む場合に対して）増大した半減期を有する、変異型Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、２３８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６からなる群から選択される１つ以上の位置に半減期延長アミノ酸置換を含む、変異型ＩｇＧ  Ｆｃドメインを含み、ここでの番号付与は、Ｋａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である。Ｆｃドメイン含有分子の半減期を増大させることができる多数の突然変異が当該技術分野において公知であり、例えばＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ及びこれらの組み合わせが挙げられる。例えば：米国特許第６，２７７，３７５号；米国特許第７，０８３，７８４号；米国特許第７，２１７，７９７号；米国特許第８，０８８，３７６号；米国公開特許第２００２／０１４７３１１号；米国公開特許第２００７／０１４８１６４号；並びに国際公開第９８／２３２８９号；国際公開第２００９／０５８４９２号；及び国際公開第２０１０／０３３２７９号（これらは参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている突然変異を参照。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、半減期が増強された本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、Ｆｃドメイン残基２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２８８、３０７、３０８、３０９、３１１、３７８、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６のうちの２つ以上における置換、特にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、Ｖ３０８Ｐ、Ａ３７８Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ｋ及びＹ４３６Ｉから選択される２つ以上の置換を含む変異型Ｆｃドメインを有し、ここでの番号付与は、Ｋａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である。ある具体的実施形態では、上記分子は：
（Ａ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｂ）Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ；
（Ｅ）Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ；
（Ｆ）Ａ３７８Ｖ及びＮ４３４Ａ；
（Ｇ）Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ；
（Ｈ）Ｖ３０８Ｐ及びＮ４３４Ａ；又は
（Ｉ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ
の置換を含む変異型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を有してよい。
【０１２７】
ある好ましい実施形態では、本発明のｇｐ４１結合Ｆｃドメイン含有分子は、置換：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む変異型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を有する。本発明は更に：
（Ａ）エフェクタ機能及び／又はＦｃγＲを変化させる、１つ以上の突然変異；並びに
（Ｂ）血清半減期を延長させる、１つ以上の突然変異
を含む変異型Ｆｃ領域を有する、ｇｐ４１結合分子を包含する。
【０１２８】
半減期の増大を提供する（及びカニクイザルＦｃＲｎ及びヒトＦｃＲｎの両方への結合が１０倍増大した本発明のＦｃドメイン含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関するＩｇＧ１配列（Dall’Acqua, W.F. et al. (2006) “Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn),” J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524）は、置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含む（配列番号４６）：
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１２９】
置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａによって提供されるエフェクタ機能の低下又は消失と、置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅによって提供される血清半減期の増大とが組み合わさった、本発明のＦｃドメイン含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する別のＩｇＧ１配列は、配列番号４７：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
によって提供され、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３０】
アミノ酸配列が異なる複数のＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖を有することが望まれる（例えばＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖が同一ではないことが望まれる）特定の抗体、ダイアボディ及び３価結合分子に関して、同一の鎖（例えば２つの第１のポリペプチド鎖、又は２つの第３のポリペプチド鎖）のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン間でのホモ二量体化の発生を低減又は防止することが望ましい。このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間のヘテロ二量体複合体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」と対合させて、ヘテロ二量体化を促進できる。このような一連の突然変異は、Ｆｃドメインを形成するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。
【０１３１】
好ましいノブは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。ホール担持ポリペプチド鎖ホモ二量体を、二重特異性ヘテロ二量体Ｆｃドメイン含有分子から精製するのを補助するために、好ましくは、ポリペプチド鎖のホール担持ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合ドメインを、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、ホール担持ポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性ヘテロ二量体は、タンパク質Ａ結合ドメインを介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。代替実施形態では、ホール担持ポリペプチド鎖は、４３４位及び４３５位にアミノ酸置換を組み込んでよい（Ｎ４３４Ａ／Ｎ４３５Ｋ）。
【０１３２】
本発明のＦｃドメイン含有分子のあるＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ノブ担持」配列（配列番号４８）を有する：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３３】
Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換及び「ノブ担持」配列を有する、本発明のＦｃドメイン含有分子のあるＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する別のＩｇＧ１アミノ酸配列は、配列番号４９：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３４】
２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃドメイン含有分子の他方のＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖（又は３つ、４つ、若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃドメイン含有分子の第３のポリペプチド鎖）のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ホール担持」配列を有する（配列番号５０）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３５】
Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換及び「ホール担持」配列を有する、本発明のＦｃドメイン含有分子の他方のＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する別のＩｇＧ１アミノ酸配列は、配列番号５１：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGX
であり、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３６】
本発明のＦｃドメイン含有分子の上記１つのＦｃドメイン含有ポリペプチドのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関するＩｇＧ４アミノ酸配列は、Ｙ２５２／Ｔ２５４／Ｅ２５６を有することにより、（ＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに比べて）血清半減期が増大する（配列番号５２）：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSLGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３７】
このようなＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３アミノ酸配列の「ノブ担持」変異型は、配列番号５３：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSLGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３８】
このようなＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３アミノ酸配列の「ホール担持」変異型は、配列番号５４：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSLGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３９】
後に記載されるように、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃドメイン（配列番号１２）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃドメインを形成する。本発明はまた、野生型アラニン残基、Ｆｃドメインのエフェクタ機能及び／又はＦγＲ結合活性を修正する代替的な及び／又は更なる置換を含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。本発明はまた、１つ以上の半減期延長アミノ酸置換を更に含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。特に本発明は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを更に含む、このようなホール担持及びノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを包含する。
【０１４０】
第１のポリペプチド鎖が、配列番号４８又は配列番号４９のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号５０又は配列番号５１）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号４８又は配列番号４９）は、２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃドメイン含有分子の第２のポリペプチド鎖中（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃドメイン含有分子の第３のポリペプチド鎖中）に採用される。
【０１４１】
他の実施形態では、本発明は、国際公開第２００７／１１０２０５号；国際公開第２０１１／１４３５４５号；国際公開第２０１２／０５８７６８号；国際公開第２０１３／０６８６７号；国際公開第２０１４／０８１９５５号；国際公開第２０１６／０８６１８９号（これらは全て、参照によりその全体が本出願に援用される）において開示されているもの等の当該技術分野で公知の突然変異を用いて、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を指向するよう操作されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含む、Ｆｃドメイン含有結合分子を包含する。
【０１４２】
３．Ｆｃドメインを含有する３価結合分子
本発明の更なる実施形態は、Ｆｃドメインを含み、また第１のエピトープ、第２のエピトープ及び第３のエピトープ（ここで上記エピトープのうちの少なくとも１つは、別のエピトープと同一ではない）に同時に結合できる、三重特異性３価結合性分子に関する。このような三重特異性３価結合性分子は３つのエピトープ結合ドメインを含み、そのうちの２つは、結合ドメインＡ及び結合ドメインＢを提供するダイアボディ型結合ドメインであり、１つは、結合ドメインＣを提供するＦａｂ型結合ドメイン（又はｓｃＦｖ型結合ドメイン）である（例えば図６Ａ〜６Ｆ、並びに国際公開第２０１５／１８４２０７号及び国際公開第２０１５／１８４２０３号を参照）。このような３価結合分子は従って、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、並びに第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメイン、並びに上記３価結合分子の第３のエピトープに結合できる「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」ドメインを含む。「ダイアボディ型結合ドメイン」は、上述のように、ダイアボディ中に存在するエピトープ結合ドメインのタイプであり、単一のポリペプチド鎖は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインの両方を含むが、これらのドメインは相互作用してエピトープ結合部位を形成することはない。「Ｆａｂ型結合ドメイン」及び「ｓｃＦｖ型結合ドメイン」はそれぞれ、上述のように、抗体中に存在するエピトープ結合ドメインのタイプであり、（１）単一のポリペプチド鎖はＶＬドメイン若しくはＶＨドメインを含み、かつ第２のポリペプチド鎖は対応するＶＨドメイン若しくはＶＬドメインを含み、これによってエピトープ結合部位が形成されるか；又は（２）単一のポリペプチド鎖はＶＬドメイン及びＶＨドメインの両方を含み、これらのドメインが相互作用してエピトープ結合部位を形成する。Ｆａｂ型結合ドメインもまた、Ｆａｂ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が単一のエピトープ結合ドメインしか含まないが、ダイアボディ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖は少なくとも２つのエピトープ結合部位を含むという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。同様に、ｓｃＦｖ型結合ドメインも、これらが単一のエピトープ結合ドメインしか含まないという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。よって本明細書において使用される場合、Ｆａｂ型及びｓｃＦｖ型結合ドメインは、ダイアボディ型結合ドメインとは別個である。
【０１４３】
典型的には、本発明の３価ｇｐ４１結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖を含む（図６Ａ〜６Ｂ参照）が、上記分子は、例えばこれらのポリペプチド鎖を（例えばペプチド結合によって）互いに融合させることによって、又はこれらのポリペプチドを「分割（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）」して追加のポリペプチド鎖を形成することによって、又はより少数若しくは追加のポリペプチド鎖をジスルフィド結合によって連結することによって、より少数又はより多数のポリペプチド鎖を含むことができる。図６Ｃ〜６Ｆは、３つのポリペプチド鎖を有する分子を概略的に示すことによって、本発明のこの態様を図示している。図６Ａ〜６Ｆに提示されているように、本発明の３価結合分子は、上記ダイアボディ型結合ドメインがＦｃドメインに対するＮ末端（図６Ａ、６Ｃ、及び６Ｄ）又はＣ末端（図６Ｂ、６Ｅ、及び６Ｆ）となる交互の配向を有してよい。３価結合分子の生成に有用なＣＨ２及びＣＨ３ドメインは上述されており、ノブ担持及びホール担持ドメインを含む。
【０１４４】
特定の実施形態では、本発明のこのような３価ｇｐ４１結合分子の第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記ＶＬ１及びＶＬ２ドメインは、表５（図６Ａ及び６Ｂも参照）に提示されるように、上記ＣＨ２‐ＣＨ３含有ドメインに対してＮ末端又はＣ末端に位置する。このような実施形態の第２のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。このような実施形態の第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第３のポリペプチド鎖は、ＶＨ３及び重鎖定常領域を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、重鎖であってよい。このような実施形態の第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。上記第４のポリペプチド鎖は、上記第３のポリペプチド鎖のＶＨ３に対して相補的なＶＬ３を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、軽鎖であってよい。上記第３又は第４のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって、合成によって、又は他の手段によって構成できる。
【０１４５】
上記第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインは、介在スペーサペプチドによって、このようなポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインから隔てられ、上記介在スペーサリンカーは、これらのＶＬ１／ＶＨ２（又はこれらのＶＬ２／ＶＨ１）ドメインを一体に連結して、第１又は第２のエピトープに結合できるエピトープ結合ドメインを形成することを可能にするには短すぎる長さを有する。この目的のために好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１６）：GGGSGGGGを有する。上記３価結合分子の他のドメインは、任意にシステイン残基を含む、１つ以上の介在スペーサペプチド（リンカー）によって隔てられていてよい。特に上述のように、このようなリンカーは典型的には可変ドメイン（即ちＶＨ又はＶＬ）とペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）との間、及び上記ペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間に組み込まれる。３価結合分子の生成に有用な例示的なリンカーは上で提示されており、また国際公開第２０１５／１８４２０７号；及び国際公開第２０１５／１８４２０３号にも提示されている。従ってこのような３価結合分子の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１結合ドメイン、及び第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合ドメインを形成する。このような３価結合分子の第３及び第４のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合ドメインを形成する。
【０１４６】
上述のように、本発明の３価ｇｐ４１結合分子は、３つのポリペプチドを含んでよい。３つのポリペプチド鎖を含む３価結合分子は、（例えば介在スペーサペプチド（リンカー４）を用いて）第４のポリペプチドＮ末端のドメインを第３のポリペプチドのＶＨ３含有ドメインに連結することによって得ることができる。あるいは、以下の３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する本発明の３価結合分子の第３のポリペプチド鎖が利用され、ここでＶＬ３及びＶＨ３は、これらのドメインが連結してエピトープ結合ドメインを形成できるようにするために十分な長さ（少なくとも９以上のアミノ酸残基）を有する介在スペーサペプチドによって、互いから隔てられる。この目的に関して好ましい１つの介在スペーサペプチドは、配列：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号４１）を有する。
【０１４７】
このような３価結合性分子のＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは異なっていてよく、それによって単一特異性、二重特異性又は三重特異性の結合が可能となることが理解されるだろう。特に、ＶＬ及びＶＨドメインは、３価結合分子が第１のエピトープに対する２つの結合ドメイン及び第２のエピトープに対する１つの結合ドメイン、又は第１のエピトープに対する１つの結合ドメイン及び第２のエピトープに対する２つの結合ドメイン、又は第１のエピトープに対する１つの結合ドメイン、第２のエピトープに対する１つの結合ドメイン、及び第３のエピトープに対する１つの結合ドメイン、を含むように選択される。
【０１４８】
本発明の代表的な３価結合性分子のポリペプチド鎖の一般構造を、図６Ａ〜６Ｆ及び表６で提供する。
【０１４９】
【表６】
2021524451.tif 000007
【０１５０】
上述のように、このような３価結合分子は、３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含んでよい。
【０１５１】
ＩＶ．本発明の例示的なｇｐ４１結合分子
本発明は、７Ｂ２抗体の結合特異性を有する最適化済みｇｐ４１結合ドメインを有することによって、ｇｐ４１  ＨＩＶ‐１エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質に結合できる、ｇｐ４１結合分子（例えば抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体、ＴａｎｄＡｂ（登録商標）、ｔｒｉｄｅｎｔ（商標）等）を対象とする。
【０１５２】
Ａ．ＨＩＶのエンベロープ（Ｅｎｖ）糖タンパク質
ＨＩＶのエンベロープ（Ｅｎｖ）糖タンパク質は、増殖性感染細胞の表面上で発現される。ＨＩＶ  １型（ＨＩＶ‐１）は、トランスサイトーシスとして知られるプロセスでの全ての伝達において、粘膜を通って宿主に入る（Shen, R. et al. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium,” J. Immunol. 184(7):3648-3655）。腸及び生殖器上皮を通したＨＩＶ‐１トランスサイトーシスは、ｇｐ４１  ｅｎｖタンパク質（Bomsel, M. et al. (1998) “Intracellular Neutralization Of HIV Transcytosis Across Tight Epithelial Barriers By Anti-HIV Envelope Protein dIgA Or IgM,” Immunity 9:277-287; Alfsen, A. et al. (2002) “HIV-1 Gp41 Envelope Residues 650-685 Exposed On Native Virus Act As A Lectin To Bind Epithelial Cell Galactosyl Ceramide,” J. Biol. Chem. 277:25649-25659; Alfsen, A. et al. (2001) “Secretory IgA Specific For A Conserved Epitope On gp41 Envelope Glycoprotein Inhibits Epithelial Transcytosis Of HIV-1,” J. Immunol. 166:6257-6265; Tudor, D. et al. (2009) “HIV-1 gp41-Specific Monoclonal Mucosal IgAs Derived from Highly Exposed But IgG-Seronegative Individuals Block HIV-1 Epithelial Transcytosis And Neutralize CD4+ Cell Infection: An IgA Gene And Functional Analysis,” Mucosal Immunol. 2:412-426）、ｇｐ１２０、及びｇｐ１６０を含むウイルス成分と、グリコスフィンゴ脂質ガラクトシルセラミド、共受容体ＣＣＲ５、ヘパリン硫酸塩プロテオグリカン付着受容体、シンデカン及びアグリンを含む宿主上皮細胞受容体及び付着分子（Shen, R. et al. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa and Model Colonic Epithelium,” J. Immunol. 184(7):3648-3655）とを伴うことが報告されている。
【０１５３】
よって、ｇｐ４１は、細胞傷害性免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＩＣ）のための標的として使用でき、ここでは、毒素、薬物、又は放射性核種を含む細胞殺滅部分が、ｇｐ４１結合分子に化学的又は遺伝子的に連結される（例えばPincus, S.H. et al. (2017) “Design and In Vivo Characterization of Immunoconjugates Targeting HIV gp160,” J. Virol. 91(3). pii: e01360-16. doi: 10.1128/JVI.01360-16を参照）。
【０１５４】
Ｂ．抗体７Ｂ２
抗体７Ｂ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＸ１８８４３８及びＪＸ１８８４３９）は、この分子の免疫優性ヘリックス‐ループ‐ヘリックス領域の５９８〜６０４において、ＨＩＶ  ｇｐ４１に結合する、抗ＨＩＶ  ｅｎｖ  ヒトＩｇＧ１抗体である（Sadraeian, M. et al. (2017) “Selective Cytotoxicity Of A Novel Immunotoxin Based On Pulchellin A Chain For Cells Expressing HIV Envelope,” Sci. Rep. 7(1):7579 doi: 10.1038/s41598-017-08037-3）。上記抗体は、エプスタイン・バー（ＥＢ）ウイルスＢ細胞の形質転換及びヘテロハイブリドーマの産生を用いて、ＨＩＶ‐１慢性感染被験者から単離された（Pincus, S.H. et al. (2003) “In Vivo Efficacy Of Anti-Glycoprotein 41, But Not Anti-Glycoprotein 120, Immunotoxins In A Mouse Model Of HIV Infection,” J. Immunol. 170(4):2236-2241）。抗体７Ｂ２は、ウイルス粒子及び感染細胞の両方を認識できることが分かっている（Santra, S. et al. (2015) “Human Non-neutralizing HIV-1 Envelope Monoclonal Antibodies Limit the Number of Founder Viruses during SHIV Mucosal Infection in Rhesus Macaques,” PLoS Pathog. 11(8):e1005042. doi: 10.1371/journal.ppat.1005042; Tay, M.Z. et al. (2016) “Antibody-Mediated Internalization of Infectious HIV-1 Virions Differs among Antibody Isotypes and Subclasses,” PLoS Pathog. 12(8):e1005817. doi: 10.1371/journal.ppat.1005817）。
【０１５５】
７Ｂ２抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５５）を以下及び図７Ａに示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）:
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP 
KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH 
PPTFGHGTRV EIK
【０１５６】
７Ｂ２抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５６）を以下及び図７Ｂに示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）:
QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMTWVRQA PGKGLEWLAY 
ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCARAD
GLTYFSELLQ YIFDLWGQGA RVTVSS
【０１５７】
Ｃ．最適化済み７Ｂ２ＧＬ
最適化済み７Ｂ２ＧＬ抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５７）を以下及び図７Ａに示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQKPGQPP 
KLLIYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCHQYSSH 
PPTFGQGTKV EIK
【０１５８】
最適化済み７Ｂ２ＧＬ抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５８）を以下及び図７Ｂに示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS EYYMTWIRQA PGKGLEWVSY 
ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARAD 
GLTYFSELLQ YIFDLWGQGT LVTVSS
【０１５９】
Ｖ．例示的なエフェクタ細胞結合能力
本明細書に記載されているように、本発明は、ｇｐ４１のエピトープ及びエフェクタ細胞表面分子（「ＥＣＭ］）のエピトープに結合できる多重特異性ｇｐ４１結合分子に関する。本明細書中で使用される場合、用語「エフェクタ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ）」は、標的細胞（例えば外来細胞、感染細胞又は癌細胞）の殺滅を直接的又は間接的に仲介する細胞を指す。エフェクタ細胞の例としては、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞（抗体分泌Ｂ細胞）、マクロファージ及び顆粒球が挙げられる。好ましいエフェクタ細胞表面分子（「ＥＣＭ」）としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ及びＮＫＧ２Ｄ受容体が挙げられる。従って、上記分子のエピトープに、又は他のエフェクタ細胞表面分子に免疫特異的に結合できる分子を、本発明の原理に従って使用してよい。標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子の構築にＶＨ及び／若しくはＶＬドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全て、並びに／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全てを使用してよい例示的な抗体を、以下に提供する。
【０１６０】
Ａ．例示的なＣＤ２結合能力
一実施形態では、本発明の分子は、上述のようなエフェクタ細胞の表面上に存在するＣＤ２のエピトープに結合できる。ＣＤ２は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に見られる細胞付着分子である。ＣＤ２は、恐らくＮＫ細胞ナノチューブ形成の促進因子として、ＮＫ細胞の細胞傷害性を強化する（Mace, E.M. et al. (2014) “Cell Biological Steps and Checkpoints in Accessing NK Cell Cytotoxicity,” Immunol. Cell. Biol. 92(3):245-255; Comerci, C.J. et al. (2012) “CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation,” PLoS One 7(10):e47664:1-12）。ＣＤ２に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ２抗体「ＣＤ２  ｍＡｂ  Ｌｏ‐ＣＤ２ａ」が挙げられる。
【０１６１】
ＣＤ２  ｍＡｂ  Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＨドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受託番号：ＨＢ‐１１４２３；配列番号５９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）:
EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMYWVKQR PKQGLELVGR 
IDPEDGSIDY VEKFKKKATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCARGK 
FNYRFAYWGQ GTLVTVSS
【０１６２】
ＣＤ２  ｍＡｂ  Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＬドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受託番号：１１４２３；配列番号６０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISCRSSQSLL HSSGNTYLNW LLQRTGQSPQ 
PLIYLVSKLE SGVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYCMQFTHYP 
YTFGAGTKLE LK
【０１６３】
Ｂ．例示的なＣＤ３結合能力
一実施形態では、本発明の分子はＣＤ３のエピトープに結合できる。ＣＤ３は、４つの別個の鎖で構成されたT細胞共受容体である（Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) “Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14）。哺乳類では、この複合体は、１つのＣＤ３γ鎖、１つのＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子と連結して、Ｔリンパ球の活性化シグナルを生成する。ＣＤ３の不在下では、ＴＣＲは適切に集合せず、崩壊する（Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170-177）。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞の膜に結合し、また他の細胞タイプには事実上結合しないことが分かっている（Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease,” 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216; Sun, Z. J. et al. (2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer,” Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,” Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139を参照）。ＣＤ３に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ３抗体「ＣＤ３  ｍＡｂ  １」及び「ＯＫＴ３」が挙げられる。抗ＣＤ３抗体ＣＤ３  ｍＡｂ  １は、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）に結合できる。
【０１６４】
ヒト化ＣＤ３  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
2021524451.tif 000008
【０１６５】
ヒト化ＣＤ３  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG
【０１６６】
ヒト化変異型「ＣＤ３  ｍＡｂ  １（Ｄ６５Ｇ）」を組み込むこともできる。ＣＤ３  ｍＡｂ  １（Ｄ６５Ｇ）は、ＣＤ３  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン（配列番号６２）と、Ｄ６５Ｇ置換（Ｋａｂａｔ第６５位、配列番号６３の残基６８に対応）を有するＶＨ  ＣＤ３  ｍＡｂ  １ドメインとを含む。
【０１６７】
ＣＤ３  ｍＡｂ  １（Ｄ６５Ｇ）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されており、置換された位置（Ｄ６５Ｇ）は二重下線を付して示されている）：
2021524451.tif 000009
【０１６８】
あるいは、ＣＤ３  ｍＡｂ  １のヒト化親和性変異型を組み込むこともできる。変異型としては、「ＣＤ３  ｍＡｂ  １  Ｌｏｗ」と呼ばれる低親和性変異型、及び「ＣＤ３  ｍＡｂ  １  Ｆａｓｔ」と呼ばれる、より高いオフレートを有する変異型が挙げられる。ＣＤ  ｍＡｂ１のＶＬドメイン（配列番号６２）はＣＤ３  ｍＡｂ  １  Ｌｏｗ及びＣＤ３  ｍＡｂ１  Ｆａｓｔと共通であり、上で提供されている。ＣＤ３  ｍＡｂ  １  Ｌｏｗ及びＣＤ３  ｍＡｂ１  ＦａｓｔそれぞれのＶＨドメインのアミノ酸配列を以下で提供する。
【０１６９】
抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ  １  Ｌｏｗの可変重鎖ドメインのアミノ酸配列（配列番号６４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR 
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR 
HGNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS
【０１７０】
抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ  １  Ｆａｓｔの可変重鎖ドメインのアミノ酸配列（配列番号６５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR 
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR 
HKNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS
【０１７１】
利用可能な別の抗ＣＤ３抗体は、抗体ムロモナブ‐ＣＤ３「ＯＫＴ３」である（Xu et al. (2000) “In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16-26); Norman, D.J. (1995) “Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3,” Ther. Drug Monit. 17(6):615-620; Canafax, D.M. et al. (1987) “Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection,” Pharmacotherapy 7(4):121-124; Swinnen, L.J. et al. (1993) “OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin-10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation,” Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678）。
【０１７２】
ＯＫＴ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY 
INPSRGYTNY NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY 
DDHYCLDYWG QGTTLTVSS
【０１７３】
ＯＫＴ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWIYDT 
SKLASGVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG 
TKLEINR
【０１７４】
利用可能な更なる抗ＣＤ３抗体としては、限定するものではないが、国際公開第２００８／１１９５６６号；及び国際公開第２００５／１１８６３５号に記載されているものが挙げられる。
【０１７５】
Ｃ．例示的なＣＤ８結合能力
一実施形態では、本発明の分子は、上述のようなエフェクタ細胞の表面上に存在するＣＤ８のエピトープに結合できる。ＣＤ８は、細胞傷害性Ｔ細胞上で発現される、２つの別個の鎖で構成されたＴ細胞共受容体である（Leahy, D.J., (1995) “A Structural View of CD4 and CD8,” FASEB J., 9:17-25）。ＣＤ８+  Ｔ細胞の活性化は、標的細胞の表面上に配列された抗原：主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｂｉｌｉｔｙ  ｃｌａｓｓ  Ｉ：ＭＨＣ  Ｉ）と、ＣＤ８+  Ｔ細胞の表面上に配列されたＣＤ８とＴ細胞受容体との複合体との間の、共刺激相互作用によって仲介されることが分かっている（Gao, G., and Jakobsen, B., (2000). "Molecular interactions of coreceptor CD8 and MHC class I: the molecular basis for functional coordination with the T-Cell Receptor". Immunol Today 21: 630-636）。特定の免疫系細胞によってしか発現されないＭＨＣ  ＩＩ分子とは異なり、ＭＨＣ  Ｉ分子は極めて広範に発現される。よって細胞傷害性Ｔ細胞は、多様な細胞タイプに結合できる。活性化された細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞毒素パーフォリン、グランザイム、及びグラニュライシンの放出によって細胞殺滅を仲介する。ＣＤ８に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ８抗体「ＯＫＴ８」及び「ＴＲＸ２」が挙げられる。
【０１７６】
ＯＫＴ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQS HGKSLEWIGY 
IYPYTGGTGY NQKFKNKATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF 
RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS
【０１７７】
ＯＫＴ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMHWY QQKPGQPPKV 
LIYLASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY 
TFGGGTKLEI KR
【０１７８】
ＴＲＸ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL 
IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH 
YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S
【０１７９】
ＴＲＸ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN 
TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG 
TKVEIK
【０１８０】
Ｄ．例示的なＣＤ１６結合能力
一実施形態では、本発明の分子はＣＤ１６のエピトープに結合できる。ＣＤ１６は、好中球、好酸球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び凝集しているものの単量体ではないヒトＩｇＧに結合する組織マクロファージによって発現される（Peltz, G.A. et al. (1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013-1017; Bachanova, V. et al. (2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer,” Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141; Miller, J.S. (2013) “Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253; Youinou, P. et al. (2002) “Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases,” Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19; Peipp, M. et al. (2002) “Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511）。ＣＤ１６に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ１６抗体「３Ｇ８」及び「Ａ９」が挙げられる。ヒト化３Ｇ８（「ｈ３Ｇ８」）抗体は、国際公開第０３／１０１４８５号に記載されている。
【０１８１】
マウス３Ｇ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLR TSGMGVGWIR QPSGKGLEWL 
AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSSNQV FLKIASVDTA DTATYYCAQI 
NPAWFAYWGQ GTLVTVSA
【０１８２】
マウス３Ｇ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 
LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY 
TFGGGTKLEI K
【０１８３】
ｈ３Ｇ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVGWIR QPPGKALEWL 
AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCAQI 
NPAWFAYWGQ GTLVTVSS
【０１８４】
マウスｈ３Ｇ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 
LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY 
TFGQGTKLEI K
【０１８５】
Ａ９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGAE LVRPGTSVKI SCKASGYTFT NYWLGWVKQR PGHGLEWIGD 
IYPGGGYTNY NEKFKGKATV TADTSSRTAY VQVRSLTSED SAVYFCARSA 
SWYFDVWGAR TTVTVSS
【０１８６】
Ａ９のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQAVVTQES ALTTSPGETV TLTCRSNTGT VTTSNYANWV QEKPDHLFTG 
LIGHTNNRAP GVPARFSGSL IGDKAALTIT GAQTEDEAIY FCALWYNNHW 
VFGGGTKLTVL
【０１８７】
米国特許第９，０３５，０２６号は、ＣＤ１６Ａに結合できるもののＣＤ１６Ｂには結合できない抗ＣＤ１６抗体を記載している。このような抗体は、疾患関連細胞を対象とした二重又は多重特異性分子の成分として特に有用である。というのは、上記抗体は主にＮＫ細胞を動員し、循環する可溶性ＣＤ１６Ｂによって結合されることがなく、又は好中球若しくは活性化された好酸球への結合によってＮＫ細胞の結合から逸らされることがないためである。
【０１８８】
米国特許第９，０３５，０２６号の抗ＣＤ１６Ａ抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVQSGAE VKKPGESLKV SCKASGYTFT SYYMHWVRQA PGQGLEWMGI 
INPSGGSTSY AQKFQGRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARGS
AYYYDFADYW GQGTLVTVSS
【０１８９】
米国特許第９，０３５，０２６号の上述の抗ＣＤ１６Ａ抗体のに関する７個の好適なＶＬドメインのアミノ酸配列を、以下に配列番号７９〜８５として示す:
SYELMQPPSV SVSSGQTASI PCSGDKLEEK YVSWYQQRPG QSPVLVIYQD 
NKRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQVW DNYSVLFGGG 
TKLTVL（配列番号７９）
SYELTQPLSE SVAQGQTARI TCGGNNIESR NVHWYQQKPG QAPVLVIYRD 
NNRPSGIPER FSGSNSGNMA TLTISRAQAG DAADYYCQVW DNYTVLFGGG 
TKLTVL（配列番号８０）
SYELTQPPSV AVAPGKTARI TCGGNNIGSK NVHWYQQKPG QAPVLVIYRD 
SNRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISRAQAG DEADFYCQVW DNYIVLFGGG 
TKLTVL（配列番号８１）
QAVLTQPPSV SVAPGQTARI PCEGNNIGSK NVHWYRQKPG QVPVLVMYDD 
SDRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQVW DNYSVLFGGG 
TKLTVL（配列番号８２）
QPVLTQPLSV SVAPGQTARI TCGGNNIGSK NVHWYQQKPG QAPVLVIYRD 
SSRPSGIPER LSGSNSGDTA TLTISRAQAG DEADYYCQVW DDYIVVFGGG 
TKLTVL（配列番号８３）
SYELTQPPSV SVTPGQTATI TCGANDIGKR NVHWYQQRPG QSPVLVIYQD 
NKRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQVW DNYSVLFGGG 
TKLTVL（配列番号８４）
QPVLTQPSSV SVAPGQTATI SCGGHNIGSK NVHWYQQRPG QSPVLVIYQD 
NKRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQVW DNYSVLFGGG 
TKLTVL（配列番号８５）
【０１９０】
更なる実施形態では、ヒト化抗ＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ１又はヒト化抗ＣＤ１６抗体ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＣＤ１６結合ドメインを、ｇｐ４１結合ドメインと協調して使用して、ＣＤ１６及びｇｐ４１に結合できる多重特異性結合分子を生成してよい。ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS NYGMSWVRQA PGKGLEWVAT 
ISGGGSYTFY PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRTED TALYYCVRQS
ARAPEPYWGQ GTLVTVSS
【０１９１】
ｈＣＤ１６‐Ｍ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS 
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ 
GTKLEIK 
【０１９２】
ｈＣＤ１６‐Ｍ２は、マウス抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗体ＣＤ１６‐Ｍ２のヒト化誘導体である。ヒト化は、２つの好適なＶＨドメイン（ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＨ１及びｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＨ２）をもたらした。これらはいずれも、得られるヒト化ＶＬドメイン（ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＬ１）と共に使用してよい。
【０１９３】
ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＶＨドメインＶＨ１のアミノ酸配列（配列番号１２９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SSAMHWVRQA PGQGLEWMGY 
INHYNDGIKY NERFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCATGY
RYASWFASWG QGTLVTVSS
【０１９４】
ｈＣＤ１６‐Ｍ２のＶＨドメインＶＨ２のアミノ酸配列（配列番号１３０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
2021524451.tif 000010
【０１９５】
認識されるように、ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＨ１のアミノ酸配列（配列番号１２９）は、ＣＤＲH３の直前の残基にＴ９８Ｒ置換（上では四角で囲んで示されている）有するという点で、ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＨ２のアミノ酸配列（配列番号１３０）とは異なる。
【０１９６】
ＶＬドメインのアミノ酸配列ｈＣＤ１６‐Ｍ２  ＶＬ１（配列番号１３１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVLTQSPAT LSVSPGERAT LSCRASQNIG TSIHWYQQKP DQSPKLLIKS 
VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDFATYYCQQ SNSWPLTFGQ 
GTKLEIK
【０１９７】
利用可能な更なる抗ＣＤ１６抗体としては、限定するものではないが、市販の抗体ＤＪ１３０ｃ（Tamm, A. et al. (1996) “The Binding Epitopes Of Human CD16 (Fc Gamma RIII) Monoclonal Antibodies. Implications For Ligand Binding,” J. Immunol. 157(4):1576-1581）、ｅＢｉｏＣＢ１６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、若しくは１Ｄ３（Ａｂｃａｍ）、又は国際公開第０３／１０１４８５号及び国際公開第２００６／１２５６６８号に記載されているものが挙げられる。
【０１９８】
Ｅ．例示的なＴＣＲ結合能力
一実施形態では、本発明の分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のエピトープに結合できる。Ｔ細胞受容体は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞によってネイティブに発現され、これらの細胞が、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩタンパク質によって結合及び提示される抗原ペプチドを認識できるようにする。ＴＣＲによるｐＭＨＣ（ペプチド‐ＭＨＣ）複合体の認識は、細胞免疫応答の伝播を開始させ、これは、サイトカインの産生及び抗原提示細胞の溶解につながる（例えばArmstrong, K.M. et al. (2008) “Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes,” Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) “Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy,” Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation,” Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) “Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes,” Am. J. Ther. 12(6):534-550を参照）。ＣＤ３は、ＴＣＲに結合する受容体である（Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170-177; Guy, C.S. et al. (2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex,” Immunol. Rev. 232(1):7-21; St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) “Novel Targeted Therapies For Autoimmunity,” Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657; Baeuerle, P.A. et al. (Epub 2009 Jun 9) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944; Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) “T Cell Activation,” Annu. Rev. Immunol. 27:591-619; Renders, L. et al. (2003) “Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression,” Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309）。
【０１９９】
Ｔ細胞受容体に特異的に結合する分子は、抗ＴＣＲ抗体「ＢＭＡ０３１」を含む（欧州特許第０４０３１５６号；Kurrle, R. et al. (1989) “BMA 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application,” Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan, B. et al. (1987) “Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex,” Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell,” J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor,” J. Immunol. 147(12):4366-4373）。
【０２００】
ＢＭＡ０３１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT SYVMHWVRQA PGQGLEWIGY 
INPYNDVTKY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY LQMNSLRSED TAVHYCARGS 
YYDYDGFVYW GQGTLVTVSS
【０２０１】
ＢＭＡ０３１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT 
SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG 
TKLEIK
【０２０２】
Ｆ．例示的なＮＫＧ２Ｄ結合能力
一実施形態では、本発明の分子はＮＫＧ２Ｄ受容体のエピトープに結合できる。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、全てのヒト（及び他の哺乳類）のナチュラルキラー細胞上（Bauer, S. et al. (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA,” Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19-29）並びに全てのＣＤ８+Ｔ細胞上（Groh, V. et al. (2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells,” Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19-29）で発現する。ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合する分子としては、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体「ＫＹＫ‐１．０」及び「ＫＹＫ‐２．０」が挙げられる（Kwong, KY et al. (2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156）。
【０２０３】
ＫＹＫ‐１．０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF 
IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR 
FGYYLDYWGQ GTLVTVSS
【０２０４】
ＫＹＫ‐１．０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QPVLTQPSSV SVAPGETARI PCGGDDIETK SVHWYQQKPG QAPVLVIYDD 
DDRPSGIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYCQVW DDNNDEWVFG 
GGTQLTVL
【０２０５】
ＫＹＫ‐２．０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF 
IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR 
GLGDGTYFDY WGQGTTVTVS S
【０２０６】
ＫＹＫ‐２．０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY 
YDDLLPSGVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNGPV 
FGGGTKLTVL
【０２０７】
Ｇ．例示的なＮＫｐ４６結合能力
一実施形態では、本発明の分子は、ＮＫｐ４６（ＣＤ３３５）のエピトープに結合できる。ＮＫｐ４６は、標的細胞の排除に関わる主要なＮＫ細胞活性化受容体である（Sivori S, et al. (1997). "p46, a Novel Natural Killer Cell-specific Surface Molecule That Mediates Cell Activation," J. Exp. Med. 186 (7): 1129-36.）。NKp46は、全てのNK細胞サブセット上のみで発現する（Narni-Mancinelli E, et al. (2011). “Fate mapping analysis of lymphoid cells expressing the NKp46 cell surface receptor,” Proc Natl Acad Sci U S A 108:18324-9）。ＮＫｐ４６に特異的に結合する分子としては、抗ＮＫｐ４６抗体「ＢＡＢ２８１」及び「ＮＫｐ４６‐３」が挙げられる（国際公開第２０１５／１９７５９３号）。
【０２０８】
ＢＡＢ２８１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QIQLVQSGPE LQKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW 
INTNTGEPTY AEEFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCARDY 
LYYFDYWGQG TTLTVSS
【０２０９】
ＢＡＢ２８１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DNIVMTQSPK SMSMSVGERV TLTCKASENV VTYVSWYQQK PEQSPKLLIY 
GASNRYTGVP DRFTGSGSAT DFTLTISSVQ AEDLADYHCG QGYSYPYTFG 
GGTKLEIK 
【０２１０】
ＮＫｐ４６‐３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKTSGYTFT EYTMHWVKQS HGKSLEWIGG 
ISPNIGGTSY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARRG 
GSFDYWGQGT TLTVSS
【０２１１】
ＮＫｐ４６‐３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSPAT LSVTPGDRVS LSCRASQSIS DYLHWYQQKS HESPRLLIKY 
ASQSISGIPS RFSGSGSGSD FTLSINSVEP EDVGVYYCQN GHSFPLTFGA 
GTKLELK
【０２１２】
ＮＫｐ４６に結合する更なる抗体は、国際公開第２０１５／１９７５９３号及び国際公開第２０１７／０１６８０５号に記載されている。ナチュラルキラー細胞の細胞表面に結合する他の例示的な抗体としては、抗体：Ａ１、ＡＣ２、ＥＰＲ３６７８（２）、ＥＰＲ２０４６１、ＥＰＲ２０６２７及びＩＭＧ１７Ｂ５Ｆ１１（ＣＤ３９に結合）；ＴＢ０１、ＨＮＫ‐１／Ｌｅｕ‐７及びＮＫ１（ＣＤ５７に結合）；ＦＮ５０（ＣＤ６９に結合）；５Ｂ５、Ｂ‐Ｌ２、ＴＳ８２ｂ及びＣ３３（ＣＤ８２に結合）；３Ｂ３、Ｂ１９９．２及びＥＰ７１６９（ＣＤ１６１に結合）；１７Ｄ９（ＣＬＥＣ１Ｂに結合）；２Ｆ９（ＫＩＲ２ＤＬ１に結合）；ＥＰＲ８８２５（ＫＩＲ２ＤＬ２に結合）；ｍＡｂ  ３３（ＫＩＲ２ＤＬ４に結合）；１１Ｅ３、１７Ｂ４、ＥＰＲ４３９２（２）、ＥＰＲ２０２６１及びＥＰＲ２０６２７（リンパ球活性化遺伝子３に結合）；Ａ１０、Ｃ７、ＣＸ５、１Ｄ１１及びＭＭ０４８９‐１０Ｒ２７（ＮＫＧ２Ｄに結合）；ＢＭＫ１３（ＰＲＧ２に結合）；ＥＰＲ９９１６（ＳＬＡＭＦ６に結合）；等が挙げられる。このようなＮＫ細胞表面分子それぞれに結合可能な抗体は、Ａｂｃａｍ  ｐｌｃ及び他の供給元から市販されており、本発明の目的に容易に適合させることができる。
【０２１３】
ＶＩ．例示的な代替ＨＩＶ‐１結合分子
成熟ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ‐１）エンベロープ（Ｅｎｖ）糖タンパク質三量体は、ウイルスｇｐ１６０前駆体タンパク質の切断によって生じる、非共有結合したｇｐ１２０／ｇｐ４１ヘテロ二量体の３つのコピーで構成される。一実施形態では、本発明の分子は、ＨＩＶ‐１  Ｅｎｖタンパク質ｇｐ１２０、ｇｐ１６０及び／又はｇｐ４１のエピトープに結合でき、これは７Ｂ２のエピトープとは異なる。
【０２１４】
モノクローナル抗体Ａ３２は、ＨＩＶ‐１  Ｅｎｖ  ｇｐ１２０のＣ１領域中の立体配座エピトープを認識し（Wyatt et al. (1995) “Involvement Of The V1/V2 Variable Loop Structure In The Exposure Of Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120 Epitopes Induced By Receptor Binding,” J. Virol. 69:5723-5733）、強力なＡＤＣＣ活性を仲介して、ＨＩＶ‐１感染個体において検出可能なＡＤＣＣ仲介型Ａｂ活性の大部分をブロックできる（Ferrari, G. et al. (2011) “An HIV-1 gp120 Envelope Human Monoclonal Antibody That Recognizes a C1 Conformational Epitope Mediates Potent Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) Activity and Defines a Common ADCC Epitope in Human HIV-1 Serum,” J. Virol. 85(14):7029-7036）。
【０２１５】
フレームワーク領域１及び／又は４に若干の変化を有する抗体Ａ３２の複数のＶＨドメインが、当該技術分野において報告されている（例えばタンパク質データベース受託番号ＰＤＢ：４ＹＢＬ＿Ｈ、米国公開特許第２０１５／０２３９９６１号、及び国際公開第２００６／０４４４１０号を参照）。これらの変異型抗体Ａ３２  ＶＨドメインのいずれを、本発明に従って使用してよい。Ａ３２の例示的なＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）:
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI 
GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG 
TRLRTLRNAF DIWGQGTLVT VSS
【０２１６】
Ａ３２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）:
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII 
SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV 
FGGGTKLTVL
【０２１７】
Ａ３２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９７）を、Ａ３２の例示的なＶＨドメイン（配列番号９６）と共に、又は変異型抗体Ａ３２  ＶＨドメイン（例えばタンパク質データベース受託番号ＰＤＢ：４ＹＢＬ＿Ｈ、米国公開特許第２０１５／０２３９９６１号、及び国際公開第２００６／０４４４１０号を参照）のいずれと共に使用して、抗ＨＩＶ‐１  Ｅｎｖ  ｇｐ１２０エピトープ結合部位を形成できる。
【０２１８】
モノクローナル抗体１０‐１０７４は、ＨＩＶ‐１  Ｅｎｖ  ｇｐ１２０のＶ３ループのベースを標的とし（例えば国際公開第２０１４／０６３０５９号を参照）、単離されている最も強力な抗体ＨＩＶ‐１中和抗体の１つであり、また初期段階の臨床試験においてある程度の生体内活性を示した（Caskey, M., et al., (2017) “Antibody 10-1074 Suppresses Viremia In HIV-1-infected individuals.” Nat Med. 23:185-191）。
【０２１９】
１０‐１０７４のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQESGPG LVKPSETLSV TCSVSGDSMN NYYWTWIRQS PGKGLEWIGY 
ISDRESATYN PSLNSRVVIS RDTSKNQLSL KLNSVTPADT AVYYCATARR 
GQRIYGVVSF GEFFYYYSMD VWGKGTTVTV SS
【０２２０】
１０‐１０７４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
SYVRPLSVAL GETARISCGR QALGSRAVQW YQHRPGQAPI LLIYNNQDRP 
SGIPERFSGT PDINFGTRAT LTISGVEAGD EADYYCHMWD SRSGFSWSFG 
GATRLTVL
【０２２１】
モノクローナル抗体３ＢＮＣ１１７は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を標的とし、幅広い中和性を有する抗ＨＩＶ‐１抗体であり（例えば国際公開２０１３／０１６４６８号を参照）、これは初期段階の臨床試験においてある程度の生体内活性を示した（Caskey, M., et al., (2015) “Viraemia Suppressed In HIV-1-Infected Humans By Broadly Neutralizing Antibody 3BNC117,” Nature 522:487-491）。
【０２２２】
３ＢＮＣ１１７のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１００）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLLQSGAA VTKPGASVRV SCEASGYNIR DYFIHWWRQA PGQGLQWVGW 
INPKTGQPNN PRQFQGRVSL TRHASWDFDT FSFYMDLKAL RSDDTAVYFC 
ARQRSDYWDF DVWGSGTQVT VSS
【０２２３】
３ＢＮＣ１１７のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDTVT ITCQANGYLN WYQQRRGKAP KLLIYDGSKL 
ERGVPSRFSG RRWGQEYNLT INNLQPEDIA TYFCQVYEFV VPGTRLDLK
【０２２４】
モノクローナル抗体ＰＧＴ１２１及びＰＧＴ１４５は、Ｅｎｖ認識に関してｇｐ１２０グリカンに強く依存する、幅広い中和性を有するＨＩＶ‐１抗体である（Mouquet H, et al., (2012) “Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies.” Proc Natl Acad Sci U S A 109: E3268-3277; Yasmeen, A., et al. (2014) “Differential Binding Of Neutralizing And Non-Neutralizing Antibodies To Native-Like Soluble HIV-1 Env Trimers, Uncleaved Env Proteins, And Monomeric Subunits.” Retrovirology 11:41; 国際公開第２０１２／０３０９０４号）。
【０２２５】
ＰＧＴ１２１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QMQLQESGPG LVKPSETLSL TCSVSGASIS DSYWSWIRRS PGKGLEWIGY 
VHKSGDTNYS PSLKSRVNLS LDTSKNQVSL SLVAATAADS GKYYCARTLH 
GRRIYGIVAF NEWFTYFYMD VWGNGTQVTVSS
【０２２６】
ＰＧＴ１２１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
SDISVAPGET ARISCGEKSL GSRAVQWYQH RAGQAPSLII YNNQDRPSGI 
PERFSGSPDS PFGTTATLTI TSVEAGDEAD YYCHIWDSRV PTKWVFGGGT 
TLTVL
【０２２７】
ＰＧＴ１４５のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGNSFS NHDVHWVRQA TGQGLEWMGW 
MSHEGDKTGL AQKFQGRVTI TRDSGASTVY MELRGLTADD TAIYYCLTGS 
KHRLRDYFLY NEYGPNYEEW GDYLATLDVW GHGTAVTVSS
【０２２８】
ＰＧＴ１４５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EVVITQSPLF LPVTPGEAAS LSCKCSHSLQ HSTGANYLAW YLQRPGQTPR 
LLIHLATHRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVESDDVGT YYCMQGLHSP 
WTFGQGTKVE IK
【０２２９】
モノクローナル抗体ＶＲＣ０１は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位を対象とする、幅広い中和性を有する抗ＨＩＶ‐１抗体である（Wu, X. et al. (2010) “Rational Design Of Envelope Identifies Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibodies To HIV-1,” Science 329:856-861 and Zhou, T. et al. (2010) “Structural Basis For Broad And Potent Neutralization Of HIV-1 By Antibody VRC01,” Science 329:811-817; 国際公開第２０１３／１６３４２７号）。
【０２３０】
ＶＲＣ０１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGGQ MKKPGESMRI SCRASGYEFI DCTLNWIRLA PGKRPEWMGW 
LKPRGGAVNY ARPLQGRVTM TRDVYSDTAF LELRSLTVDD TAVYFCTRGK 
NCDYNWDFEH WGRGTPVIVS S
【０２３１】
ＶＲＣ０１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVLTQSPGT LSLSPGETAI ISCRTSQYGS LAWYQQRPGQ APRLVIYSGS 
TRAAGIPDRF SGSRWGPDYN LTISNLESGD FGVYYCQQYE FFGQGTKVQV 
DIKR
【０２３２】
モノクローナル抗体１０Ｅ８は、幅広い中和性を有するＨＩＶ‐１  ｇｐ４１膜近位外部領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ‐ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ：ＭＰＥＲ）特異性抗体である(Huang,J.,et al. 2012. “Broad And Potent Neutralization Of HIV-1 By A gp41-Specific Human Antibody.” Nature. 491:406-12）.
【０２３３】
１０Ｅ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCSASGFDFD NAWMTWVRQP PGKGLEWVGR 
ITGPGEGWSV DYAAPVEGRF TISRLNSINF LYLEMNNLRM EDSGLYFCAR 
TGKYYDFWSG YPPGEEYFQD WGRGTLVTVS S
【０２３４】
１０Ｅ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
SYELTQETGV SVALGRTVTI TCRGDSLRSH YASWYQKKPG QAPILLFYGK 
NNRPSGVPDR FSGSASGNRA SLTISGAQAE DDAEYYCSSR DKSGSRLSVF 
GGGTKLTVL
【０２３５】
本発明は具体的には、上述の抗ＨＩＶ‐１モノクローナル抗体の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ、若しくは３つ、及び／若しくはＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ、若しくは３つを含む、多重特異性ｇｐ４１結合分子を含み、またこれを包含する。
【０２３６】
ＶＩＩ．例示的な多重特異性ｇｐ４１結合分子
ここで提供されるのは、ｇｐ４１のエピトープに対して免疫特異的である第１のエピトープ結合ドメイン（即ちｇｐ４１結合ドメイン）と、ＥＣＭのエピトープに対して免疫特異的である第２のエピトープ結合ドメインとが組み込まれた、一連の例示的なｇｐ４１結合分子である。任意に、このような分子には、ｇｐ４１の異なるエピトープ、並びに／又は異なるＨＩＶ‐１分子のエピトープ、並びに／又はＥＣＭの異なるエピトープ及び／若しくは異なるＥＣＭのエピトープに対して免疫特異的である、第３のエピトープ結合ドメイン（又は第３のエピトープ結合ドメイン及び第４のエピトープ結合ドメイン）が組み込まれる。特に好ましいのは、７Ｂ２ＧＬの最適化済みｇｐ４１結合ドメインを含むこのような分子である。このような例示的なｇｐ４１結合分子の共有ダイアボディ構造及び配列を、表７にまとめ、以下で詳細に説明する。認識されるように、類似の分子は、（これらの例示的なｇｐ４１結合分子中に使用されているＶＬ及びＶＨドメインの代わりに所望の抗体のＶＬ及びＶＨドメインを使用することによって）同様に構築できる。
【０２３７】
【表７】
2021524451.tif 000011
2021524451.tif 000012
【０２３８】
Ａ．ｇｐ４１×ＣＤ３結合分子、ＤＡＲＴ‐１
「ＤＡＲＴ‐１」と呼称されるｇｐ４１×ＣＤ３結合分子が、第１の例示的な二重特異性ｇｐ４１結合分子である。ＤＡＲＴ‐１は、ｇｐ４１及びＣＤ３抗原に結合できるＦｃドメイン含有二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐１は３つのポリペプチド鎖からなり、また抗ヒトｇｐ４１抗体７Ｂ２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってｇｐ４１のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、ＣＤ３  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ３抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。上記３つのポリペプチド鎖は、連結して、ｇｐ４１のエピトープ及びＣＤ３抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合ダイアボディを形成する（例えば図４Ａを参照）。
【０２３９】
ＤＡＲＴ‐１の第１のポリペプチド鎖は、配列番号１１０：
2021524451.tif 000013
のアミノ酸配列を有する。
【０２４０】
ＤＡＲＴ‐１の第１のポリペプチド鎖（配列番号１１０）の残基１〜１１３は、７Ｂ２のＶＬドメイン（配列番号５５）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１４〜１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１２２〜２４６は、ＣＤ３  ｍＡｂ  １（Ｄ６５Ｇ）のＶＨドメイン（配列番号６３）に対応する。残基２４７〜２５１は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２５２〜２７９は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８０〜２９２は、リンカー（配列番号４０）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２９３〜５０９は、「ノブ担持」ドメイン（配列番号４８）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０２４１】
ＤＡＲＴ‐１の第２のポリペプチド鎖は、配列番号１１１：
2021524451.tif 000014
のアミノ酸配列を有する。
【０２４２】
ＤＡＲＴ‐１の第２のポリペプチド鎖（配列番号１１１）の残基１〜１１０は、ＣＤ３  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン（配列番号６２）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１１〜１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１９〜２４４は、７Ｂ２のＶＨドメイン（配列番号５６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４５〜２４９は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２５０〜２７７は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０２４３】
ＤＡＲＴ‐１の第３のポリペプチド鎖は、配列番号１１２：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED 
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK 
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG 
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
のアミノ酸配列を有する。
【０２４４】
ＤＡＲＴ‐１の第３のポリペプチド鎖（配列番号１１２）の残基１〜１０は、リンカー（配列番号４０）に対応する。第３のポリペプチド鎖の残基１１〜２２７は、「ホール担持」ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５０）に対応し、Ｈ４３５Ｒ置換（下線を付して示されている）を含有し、その最後の残基はリシンである。上述のように、Ｈ４３５Ｒ置換は、上記分子の、タンパク質Ａに結合する能力を排除する。
【０２４５】
認識されるように、ＤＡＲＴ‐１の第３のポリペプチド鎖は、いずれのエピトープ結合部位を含有せず、よって、図４Ａ〜４Ｂで提供されている一般構造を有する様々なｇｐ４１結合分子中で使用できる。従ってＤＡＲＴ‐１の第３のポリペプチド鎖は、本明細書では「共通のダイアボディポリペプチド鎖（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｄｉａｂｏｄｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈａｉｎ）」と呼ばれる。
【０２４６】
Ｂ．ｇｐ４１×ＣＤ３結合分子、ＤＡＲＴ‐Ａ
「ＤＡＲＴ‐Ａ」と呼称される第２の例示的なｇｐ４１×ＣＤ３結合分子は、上述のＤＡＲＴ‐１と同様であるが、親７Ｂ２  ＶＬ及びＶＨドメインの代わりに抗ヒトｇｐ４１抗体７Ｂ２ＧＬのＶＬ及びＶＨドメインを含有する。
【０２４７】
ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１１３：
2021524451.tif 000015
のアミノ酸配列を有する。
【０２４８】
ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖（配列番号１１３）の残基１〜１１３は、７Ｂ２ＧＬのＶＬドメイン（配列番号５７）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１４〜１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１２２〜２４６は、ＣＤ３  ｍＡｂ  １（Ｄ６５Ｇ）のＶＨドメイン（配列番号６３）に対応する。残基２４７〜２５１は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２５２〜２７９は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８０〜２９２は、リンカー（配列番号４０）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２９３〜５０９は、「ノブ担持」ドメイン（配列番号４８）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０２４９】
ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１１４：
2021524451.tif 000016
のアミノ酸配列を有する。
【０２５０】
ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖（配列番号１１４）の残基１〜１１０は、ＣＤ３  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン（配列番号６２）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１１〜１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１９〜２４４は、７Ｂ２ＧＬのＶＨドメイン（配列番号５８）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４５〜２４９は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２５０〜２７７は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０２５１】
ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＤＡＲＴ‐１の第３のポリペプチド鎖（即ち配列番号１１２）のアミノ酸配列と同一である。
【０２５２】
Ｃ．ｇｐ４１×ＣＤ１６結合分子、ＤＡＲＴ‐Ｂ
「ＤＡＲＴ‐Ｂ」と呼称されるｇｐ４１×ＣＤ１６結合分子が、第３の例示的な二重特異性ｇｐ４１結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｂは、上述のＤＡＲＴ‐Ａと同様であるが、ＤＡＲＴ‐ＡのＣＤ３結合ドメインの代わりにＣＤ１６結合ドメインを含む。よってＤＡＲＴ‐Ｂは３つのポリペプチド鎖からなり、また抗ヒトｇｐ４１抗体７Ｂ２ＧＬのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってｇｐ４１のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、抗ヒトＣＤ１６抗体３Ｇ８のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。
【０２５３】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第１のポリペプチド鎖は、配列番号１１５：
2021524451.tif 000017
のアミノ酸配列を有する。
【０２５４】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第１のポリペプチド鎖（配列番号１１５）の残基１〜１１３は、７Ｂ２ＧＬのＶＬドメイン（配列番号５７）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１１４〜１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基１２２〜２３９は、ｈ３Ｇ８のＶＨドメイン（配列番号７４）に対応する。残基２４０〜２４４は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２４５〜２７２は、システイン含有Ｅコイル（配列番号３１）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２７３〜２８５は、リンカー（配列番号４０）に対応する。第１のポリペプチド鎖の残基２８６〜５０２は、「ノブ担持」ドメイン（配列番号４８）に対応し、その最後の残基はリシンである。
【０２５５】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１１６：
2021524451.tif 000018
のアミノ酸配列を有する。
【０２５６】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第２のポリペプチド鎖（配列番号１１６）の残基１〜１１１はｈ３Ｇ８のＶＬドメイン（配列番号７５）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１１２〜１１９（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基１２０〜２４５は、７Ｂ２ＧＬのＶＨドメイン（配列番号５８）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２４６〜２５０は、リンカー（配列番号２１、下線部）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２５１〜２７８は、システイン含有Ｋコイル（配列番号３２）に対応する。
【０２５７】
ＤＡＲＴ‐Ｂの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＤＡＲＴ‐１の第３のポリペプチド鎖（即ち配列番号１１２）のアミノ酸配列と同一である。
【０２５８】
Ｄ．ｇｐ４１×ＣＤ３×ＣＤ８結合分子、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ
「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ」と呼称されるｇｐ４１×ＣＤ３×ＣＤ８結合分子が、第１の例示的な３価ｇｐ４１結合分子である。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａは４つのポリペプチド鎖からなり、また抗ヒトｇｐ４１抗体７Ｂ２ＧＬのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってｇｐ４１のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、ＣＤ３  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ３抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、ＴＲＸ８のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ８抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。これら４つのポリペプチド鎖は連結して、ｇｐ４１のエピトープ、ＣＤ３抗原のエピトープ、及びＣＤ８抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる共有結合３化分子を形成する（例えば図６Ａを参照）。
【０２５９】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１１３）と同一である。同様に、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１１４）と同一である。
【０２６０】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖は、配列番号１１７：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL 
IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH 
YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV 
KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ 
TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK 
PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY 
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP 
QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 
VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG
K
のアミノ酸配列を有する。
【０２６１】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖の残基１〜１２１は、抗ＣＤ８抗体ＴＲＸ２のＶＨドメイン（配列番号７０）に対応する。残基１２１〜２１９は、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号３）に対応する。残基２２０〜２３４は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン（配列番号７）に対応する。残基２３５〜４５１は、ＩｇＧ１「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５０）に対応する。
【０２６２】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１８：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN 
TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG 
TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD 
NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 
SSPVTKSFNR GEC
のアミノ酸配列を有する。
【０２６３】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第４のポリペプチド鎖の残基１〜１０６は、抗ＣＤ８抗体ＴＲＸ２のＶＬドメイン（配列番号７１）に対応する。残基１０７〜２１３は、ＣＬκドメイン（配列番号１）に対応する。
【０２６４】
Ｅ．ｇｐ４１×ＣＤ３×ｇｐ１２０結合分子、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ
「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ」と呼称される第２の例示的な３価ｇｐ４１×ＣＤ３×ｇｐ１２０結合分子は、上述のＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａと同様であるが、ＴＲＩＤＥＮＴ‐ＡのＴＲＸ８  ＶＬ及びＶＨドメインの代わりに、抗ヒトｇｐ１２０抗体Ａ３２のＶＬ及びＶＨドメインを含有する。従ってＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂは４つのポリペプチド鎖からなり、また抗ヒトｇｐ４１抗体７Ｂ２ＧＬのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってｇｐ４１のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、ＣＤ３  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ３抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、Ａ３２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってｇｐ１２０抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。
【０２６５】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１１３）と同一である。同様に、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１１４）と同一である。
【０２６６】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂの第３のポリペプチド鎖は、配列番号１１９：
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI 
GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG 
TRLRTLRNAF DIWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC 
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG 
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP 
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE 
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR 
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LSCAVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT 
PPVLDSDGSF FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN RYTQKSLSLS   
PGK
のアミノ酸配列を有する。
【０２６７】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂの第３のポリペプチド鎖の残基１〜１２３は、抗ｇｐ１２０抗体Ａ３２のＶＨドメイン（配列番号９６）に対応する。残基１２４〜２２１は、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号３）に対応する。残基２２２〜２３６は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン（配列番号７）に対応する。残基２３７〜４５３は、ＩｇＧ１「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５０）に対応する。
【０２６８】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂの第４のポリペプチド鎖は、配列番号１２０：
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII 
SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV 
FGGGTKLTVL RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ 
WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT 
HQGLSSPVTK SFNRGEC
のアミノ酸配列を有する。
【０２６９】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂの第４のポリペプチド鎖の残基１〜１１０は、抗ｇｐ１２０抗体Ａ３２のＶＬドメイン（配列番号９７）に対応する。残基１１１〜２１７は、ＣＬκドメイン（配列番号１）に対応する。
【０２７０】
Ｆ．ｇｐ４１×ＣＤ１６×ｇｐ１２０結合分子、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｃ
「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｃ」と呼称される第３の例示的な３価ｇｐ４１×ＣＤ１６×ｇｐ１２０結合分子は、上述のＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂと同様であるが、ＴＲＩＤＥＮＴ‐ＢのＣＤ３  ｍＡｂ  １（Ｄ６５Ｇ）  ＶＬ及びＶＨドメインの代わりに、抗ヒトＣＤ１６抗体ｈ３Ｇ８のＶＬ及びＶＨドメインを含有する。従ってＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｃは４つのポリペプチド鎖からなり、また抗ヒトｇｐ４１抗体７Ｂ２ＧＬのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってｇｐ４１のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、ｈ３Ｇ８のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ１６抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインと、Ａ３２のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってｇｐ１２０抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。
【０２７１】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｃの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＤＡＲＴ‐Ｂダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１１５）と同一である。同様に、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｃの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＤＡＲＴ‐Ｂダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１１６）と同一である。
【０２７２】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｃの第３及び第４のポリペプチドのアミノ酸配列は、上述のＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂの第３及び第４のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１１９及び配列番号１２０）と同一である。
【０２７３】
Ｇ．ｇｐ４１×ＣＤ３×ｇｐ４１結合分子、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｄ
「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｄ」と呼称される第４の例示的な３価ｇｐ４１×ＣＤ３×ｇｐ４１結合分子は、上述のＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａと同様であるが、ＴＲＩＤＥＮＴ‐ＡのＴＲＸ２抗ＣＤ８  ＶＬ及びＶＨドメインの代わりに、抗ヒトｇｐ４１抗体７Ｂ２ＧＬのＶＬ及びＶＨドメインを含有する。従ってＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｄは４つのポリペプチド鎖からなり、また抗ヒトｇｐ４１抗体７Ｂ２ＧＬのＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってｇｐ４１のエピトープに対して免疫特異的である）２つの結合ドメインと、ｈＣＤ３  ｍＡｂ  １のＶＬ及びＶＨドメインを含む（従ってＣＤ３抗原のエピトープに対して免疫特異的である）１つの結合ドメインとを有する。
【０２７４】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｄの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１１３）と同一である。同様に、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｄの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＤＡＲＴ‐Ａダイアボディの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１１４）と同一である。
【０２７５】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｄの第３のポリペプチド鎖は、配列番号１２１：
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS EYYMTWIRQA PGKGLEWVSY 
ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARAD 
GLTYFSELLQ YIFDLWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA 
LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS 
SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF 
LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP 
REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG 
QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLSCAVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY 
KTTPPVLDSD GSFFLVSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNRYTQKSL 
SLSPGK
のアミノ酸配列を有する。
【０２７６】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｄの第３のポリペプチド鎖の残基１〜１２６は、最適化済み抗ｇｐ４１抗体７Ｂ２ＧＬのＶＨドメイン（配列番号５８）に対応する。残基１２７〜２２４は、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号３）に対応する。残基２２５〜２３９は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン（配列番号７）に対応する。残基２４０〜４５６は、ＩｇＧ１「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５０）に対応する。
【０２７７】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｄの第４のポリペプチド鎖は、配列番号１２２：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQKPGQPP 
KLLIYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCHQYSSH 
PPTFGQGTKV EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA 
KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC 
EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
のアミノ酸配列を有する。
【０２７８】
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｄの第４のポリペプチド鎖の残基１〜１１３は、抗ｇｐ４１抗体７Ｂ２ＧＬのＶＬドメイン（配列番号５７）に対応する。残基１１４〜２２０は、ＣＬκドメイン（配列番号１）に対応する。
【０２７９】
Ｈ．代替的な多重特異性ｇｐ４１結合分子
本開示に鑑みて認識されるように、上述の分子中に存在するＶＬ及びＶＨドメインの代わりに、代替的なＥＣＭ及び／又はＨＩＶ‐１抗原のＶＬ及びＶＨドメインを採用することによって、７Ｂ２ＧＬのＶＬ及びＶＨドメインを含み、かつ代替的なＥＣＭ及び／又はＨＩＶ‐１抗原のための結合部位を含む、上述の例示的な分子のうちのいずれの一般構造を有する更なる多重特異性ｇｐ４１結合分子を構築できる。数多くのＥＣＭ及びＨＩＶ‐１結合部位に由来するＶＬ及びＶＨドメインが本明細書中に提供されており、更なるＶＬ及びＶＨドメインが当該技術分野において公知である。同様に、本明細書中で提供されているように、特に本明細書中で提供されている代替的なリンカー及び／又はヘテロ二量体促進ドメインを組み込んだ、代替的な多重特異性ｇｐ４１結合分子も、同様に構築できる。
【０２８０】
ＶＩＩＩ．産生方法
最も好ましくは、本発明の分子は、当該技術分野において公知であるように、上記ポリペプチドをエンコードする核酸分子の組み換え発現によって産生される。
【０２８１】
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて便利に調製できる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131-5135; Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10）。
【０２８２】
当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、そのＤＮＡ配列を取得し、上記ＤＮＡ配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又は遺伝子組み換え動物のミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et a/.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231 : 147-157を参照）。例えばヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知であり、また上述されている。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。
【０２８３】
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクター（例えば本発明の結合分子のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド）は：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。
【０２８４】
ポリペプチド、又はタンパク質を発現する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８５】
本発明は、本発明の結合分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。
【０２８６】
本発明は、本開示の結合分子（上記分子の特性に有意な影響を及ぼさない、機能的に同等のポリペプチド、及び活性が増強した又は低下した変異型を含む）を含んでよい。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されており、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大幅に又は劣化するように変化させない１つ以上の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の、電荷、サイズ等の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ以上のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変ドメイン等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変ドメインの変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。
【０２８７】
一実施形態では、軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖の両方を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、該タンパク質をｇｐ４１及びＥＣＭ（例えばＣＤ３、ＣＤ１６等）の両方に免疫特異的に結合できるようにし、かつ天然分子においては上記抗体融合タンパク質が結合しない別のアミノ酸配列、例えば異種配列又は別の領域（例えば脱免疫化アルブミン結合ドメイン、タンパク質Ａ認識配列、ペプチドタグ等）由来の同種配列を含有する、ポリペプチドドメインを含有する。
【０２８８】
本発明は特に、診断又は治療用部分にコンジュゲートする上記結合分子（例えば抗体、ダイアボディ、３価結合分子等）を包含する。診断を目的として、本発明の結合分子を、検出可能な物質と連結させてよい。このような結合分子は、臨床試験手順の一部としての疾患の発症又は進行の監視及び／又は予後判定、例えば特定の療法の有効性の決定に有用である。検出可能な物質の例としては、様々な酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等）、補欠分子族（例：アビジン／ビオチン）、蛍光物質（例えばアンベリフェロン、フルオレセイン又はフィコエリスリン）、発光材料（例えばルミノール）、生物発光材料（例えばルシフェラーゼ又はエクオリン）、放射性材料（例えば炭素１４、マンガン５４、ストロンチウム８５又は亜鉛６５）、陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。上記検出可能な物質は、直接的に、又は当該技術分野において公知の技法を用いて、介在物（例えばリンカー）を介して間接的に、結合分子と連結又はコンジュゲートさせてよい。
【０２８９】
治療を目的として、本発明の結合分子を、細胞毒素等の治療成分（例えば細胞増殖抑制剤若しくは細胞破壊剤）、治療剤又はαエミッタ等の放射性金属イオンとコンジュゲートさせてよい。細胞毒素又は細胞傷害剤としては、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素Ａ〜Ｆ、リシンアブリン、サポリン、及びこれらの作用剤の細胞傷害性断片といった、細胞に有害ないずれの作用剤が挙げられる。治療剤としては、障害を予防的又は治療的に処置するための治療効果を有するいずれの作用剤が挙げられる。このような治療剤は、化学治療剤、タンパク質又はポリペプチド治療剤であってよく、所望の生物活性を有する、及び／又は所与の生物応答を修正する治療剤を含んでよい。治療剤の例としては、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、ホルモン療法剤、及び細胞増殖性疾患の治療に有用な抗体が挙げられる。治療用部分は、直接的に、又は当該技術分野において公知の技法を用いて、介在物（例えばリンカー）を介して間接的に、結合分子と連結又はコンジュゲートさせてよい。
【０２９０】
ＩＸ．本発明の結合分子の使用
上述のように、ｇｐ４１及びＥＣＭに結合できる分子は、細胞表面上にこのようなｇｐ４１を発現する標的細胞（即ち病原体感染細胞）の標的転換殺滅を仲介できる。このような分子は、治療目的のために、例えば感染症、特に潜伏ＨＩＶ‐１感染を有する被験者において使用できる。よって本発明の結合分子は、ｇｐ４１の発現に関連する又は上記発現を特徴とする疾患又は状態、特に潜伏ＨＩＶ‐１感染を治療する能力を有する。よって、限定するものではないが、本発明の結合分子は、ＨＩＶ‐１感染、特に潜伏ＨＩＶ‐１感染の治療に採用できる。
【０２９１】
特に本発明は、ｇｐ４１に結合できる分子が、ｇｐ４１に結合できる抗体のエピトープ結合ドメインを含み、かつ（標的転換細胞殺滅（例えば標的転換Ｔ細胞殺滅）を仲介することによって）ｇｐ４１発現性標的細胞の標的転換殺滅を仲介するために、免疫エフェクタ細胞の表面上のＥＣＭ（特にＣＤ３及び／又はＣＤ１６）に結合できるエピトープ結合ドメインを含む、上記方法を包含する。
【０２９２】
特定の態様では、本発明は、本発明のｇｐ４１結合分子、特に限定するものではないが二重特異性及び三重特異性分子（例えば二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、３価結合分子等）といった多重特異性ｇｐ４１結合分子の、ある個体のＨＩＶ‐１感染を治療及び予防する方法における使用を提供し、これは、上記個体に、治療有効量の本発明のｇｐ４１結合分子を含む組成物を、薬学的に許容可能な形態で投与するステップを含む。特定の実施形態では、上記ｇｐ４１結合分子は、異なる複数のＨＩＶ‐１エピトープ、好ましくはＨＩＶ‐１エンベロープ上に存在する異なる複数のエピトープに結合する。
【０２９３】
本明細書に記載の様々なｇｐ４１結合分子は、以下を含むがこれらに限定されない状況において、有用性を有する：
ｉ）ＨＩＶ‐１感染への予想される既知の曝露の状況において、本発明のｇｐ４１結合分子を殺菌剤として予防的に（例えばＩＶ、局所、又は経鼻）投与できる；
ｉｉ）レイプ被害者若しくは商業的セックスワーカーの状況、又はコンドームによる保護のないいずれの同性愛者若しくは異性愛者間での伝染の状況といった、既知の又は疑わしい曝露の状況において、本発明のｇｐ４１結合分子を曝露後予防法として例えばＩＶ又は局所投与できる；
ｉｉｉ）急性ＨＩＶ‐１感染（ＡＨＩ）の状況において、本発明のｇｐ４１結合分子を、初期ウイルス負荷の制御のため、又はウイルス感染ＣＤ４  Ｔ細胞の排除のために、ＡＨＩの治療として投与できる。
【０２９４】
本発明によると、本発明のｇｐ４１結合分子は、被験者若しくは被験者の免疫系／細胞がＨＩＶ‐１に接触する前、又はこのような接触の約４８時間以内に投与できる。この時間枠内での投与により、被験者の脆弱な細胞がＨＩＶに感染するのを最大限阻害できる。
【０２９５】
更に、様々な形態の本発明のｇｐ４１結合分子を、慢性又は急性ＨＩＶ‐１感染被験者に投与でき、これを用いて残存するウイルス感染細胞を殺滅できる。これは、これらのｇｐ４１結合細胞がウイルス感染細胞の表面に結合して、上記感染細胞の標的転換殺滅を仲介できることによる。
【０２９６】
特定の実施形態では、本発明のｇｐ４１結合分子は、潜伏感染活性化剤と組み合わせて投与でき、これにより、被験者の体内に存在し得るＨＩＶ感染細胞の潜伏リザーバを活性化できる。休止細胞中の潜伏プロウイルスＨＩＶ‐１  ＤＮＡを活性化させることによって、以前は不活性であった細胞が新たなウイルスの産生を開始し、これが、本発明のｇｐ４１結合分子によって増強された免疫系によって認識されて排除されることが期待される。潜伏感染活性化剤の非限定的な例は、ＨＤＡＣ阻害剤、例えばボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ジスルフィラム、ＪＱ１、ブリオスタチン、ＰＭＡ、イオノマイシン、又はこれらのいずれの組み合わせである。Bullen et al. Nature Medicine 20、425-429 (2014)を参照。
【０２９７】
特定の実施形態では、本発明のｇｐ４１結合分子は、抗レトロウイルス剤と組み合わせて投与できる。
【０２９８】
ある特定の実施形態では、ｇｐ４１及びＥＣＭに結合できる分子は、二重特異性抗体、ＢｉＴｅ（登録商標）、又はＴａｎｄＡｂ（登録商標）である。
【０２９９】
ある特定の実施形態では、ｇｐ４１及びＥＣＭに結合できる分子は、二重特異性ダイアボディである。
【０３００】
ある特定の実施形態では、ｇｐ４１及びＥＣＭに結合できる分子は、３価結合分子である。
【０３０１】
本明細書中で使用される場合、用語「療法を提供する（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ａ  ｔｈｅｒａｐｙ）」、及び「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は：疾患に由来する症状の低減；感染症の症状（例えばウイルス量、発熱、疼痛、敗血症等）の軽減；疾患に由来する症状の低減；レシピエント被験者のＱＯＬの向上；被験者の疾患の治療のために提供される他の薬物の用量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による、別の薬物の効果の増強；疾患の進行の遅延：並びに／又はレシピエント被験者の生存期間の延長といったいずれの臨床的結果を含むがこれに限定されない、有益な又は所望の結果のいずれの兆候に関連する、組成物のいずれの投与を指す。
【０３０２】
治療の被験者としては、動物、最も好ましくは非霊長類（例えばウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類種が挙げられる。ある好ましい実施形態では、被験者はヒトである。
【０３０３】
本発明の様々な実施形態によって治療できる例示的な障害としては、限定するものではないが、ＨＩＶ‐１感染（特に標的転換細胞殺滅を仲介できる分子によって結合されるｇｐ４１の発現に関連する潜伏ＨＩＶ‐１感染）が挙げられる。様々な実施形態では、本発明は、被験者の疾患又は障害の治療、予防又は管理のための方法及び組成物を包含し、これは、治療的有効量の本発明の結合分子を被験者に投与するステップを含む。このような分子は、ＨＩＶ‐１負荷の低減、又はＨＩＶ感染細胞の排除のために特に有用である。特定の作用機序による束縛を意図したものではないが、上記分子は、標的細胞に対するエフェクタ機能を仲介してよく、標的細胞、架橋細胞表面抗原及び／又は標的細胞上の受容体に対する免疫系の活性化を促進してよく、またアポトーシス又は負の成長調節シグナリングを増強してよく、又はこれらの組み合わせを実現してよく、これにより、標的細胞の除去及び／又はその個数の低減をもたらす。
【０３０４】
Ｘ．医薬組成物
本発明は、本発明のｇｐ４１結合分子を含む、組成物を包含する。本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験者又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量のｇｐ４１に結合でき、かつＥＣＭに結合できることにより、標的細胞（例えばＨＩＶ‐１感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる分子（即ちｇｐ４１×ＥＣＭ結合分子）、又はこれらの薬剤の組み合わせと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の結合分子のうちの１つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。ある好ましい態様では、上記組成物は略精製済みである（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を略含まない）。
【０３０５】
このような組成物の様々な処方を、投与に用いてよい。１つ以上の薬理学的有効成分に加えて、本発明の組成物は、好適な、薬学的に許容可能なキャリアを含有してよく、上記キャリアは、当該技術分野において公知の賦形剤及び助剤を含み、また薬理学的に有効な物質の投与を促進する、又は上記活性化合物の、作用部位への送達のために薬学的に使用できる調製物への加工を促進する、比較的不活性の物質である。例えば賦形剤は、形状若しくは粘度を与えることができ、又は希釈剤として作用できる。好適な賦形剤としては、安定化剤、湿潤及び乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、並びに皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０６】
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
【０３０７】
本発明はまた、単独の又は上述のような薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされた本発明のｇｐ４１結合分子で充填された１つ以上のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ以上の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ以上のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ以上のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
【０３０８】
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、本発明の結合分子のいずれを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ以上の他の予防剤及び／又は治療剤を、１つ以上のコンテナ内に含むことができる
【０３０９】
ＸＩ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明のｇｐ４１結合分子を含む医薬組成物を、被験者に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ以上の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。ある好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験者は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験者はヒトである。
【０３１０】
本発明のｇｐ４１結合分子又は上記ｇｐ４１結合分子を含む組成物を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明の結合分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。
【０３１１】
本発明はまた、本発明のｇｐ４１結合分子の調製物を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、上記ｇｐ４１結合分子は、気密性コンテナ内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験者への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明のｇｐ４１結合分子は、気密性コンテナ内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【０３１２】
凍結乾燥された本発明のｇｐ４１結合分子の調製物は、その元々のコンテナ内において２℃〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、このような分子は、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、このような結合分子は、液体形態で提供される場合、気密性コンテナ内に供給される。
【０３１３】
障害に関連する１つ以上の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の上記調製物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各レシピエント被験者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
【０３１４】
本明細書において使用される場合、医薬組成物の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は：疾患によってもたらされる症状の低減；感染の症状（例えばウイルス負荷、発熱、疼痛、敗血症等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。単独で投与される個々の有効成分に対して適用される場合、この用語は、上記成分のみを指す。組み合わせに対して適用される場合、この用語は、治療効果をもたらす複数の有効成分の合計量を指し、上記有効成分が組み合わせた状態で投与されるか、順次投与されるか、又は同時に投与されるかにかかわらない。
【０３１５】
有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な：ＨＩＶ‐１感染細胞の殺滅及び／若しくは増殖の低減；ＨＩＶ‐１ウイルスの増殖（又はその影響）の低減；並びにＨＩＶ仲介型疾患の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ以上の化学療法剤を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ以上の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。
【０３１６】
本発明に包含される結合分子に関して、レシピエント被験者に投与される投薬量は好ましくは、レシピエント被験者の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。本発明に包含される結合分子に関して、レシピエント被験者に投与される投薬量は典型的には、被験者の体重に対して約０．０１μｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ以上である。
【０３１７】
本発明の結合分子の投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によって分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は変更できる。
【０３１８】
レシピエント被験者に投与される本発明の結合分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、上記分子は他の治療用組成物と併用され、レシピエント被験者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
【０３１９】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、ＳＩＡＬＡＳＴＩＣ（登録商標）膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
【０３２０】
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327参照）。
【０３２１】
治療的又は予防的有効量の本発明の結合分子を用いた被験者の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験者は、本発明の医薬組成物を用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間にわたって処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。あるいは本発明の医薬組成物は、１日２回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。あるいは、本発明の医薬組成物は、１日３回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
【実施例】
【０３２２】
これまで本発明を概説してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することによって更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、特段の記載がない限り、本発明を限定することを意図したものではない。
【０３２３】
実施例１
最適化
「７Ｂ２  ＩｇＧ」と呼称される抗ＨＩＶ‐１  Ｅｎｖ（ｇｐ４１タンパク質）抗体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＱ３１５０３；Buchacher, A. et al. (1994) “Generation Of Human Monoclonal Antibodies Against HIV-1 Proteins; Electrofusion And Epstein-Barr Virus Transformation For Peripheral Blood Lymphocyte Immortalization,” AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(4):359-369; Shen, R. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV-1 Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium,” J. Immunol. 184(7):3648-3655）は、ヒトＩｇＧ生殖細胞系列レパートリーでは珍しいフレームワーク領域中に多数のアミノ酸残基を含むことが分かっている。このような珍しい非生殖細胞系列の残基の存在は、免疫原性となり得、レシピエント被験者への反復投与時に抗薬物抗体の生成をもたらす可能性がある。これらのドメインの免疫原性の可能性を低減する、更には排除するために、７Ｂ２可変領域を、そのフレームワーク領域に突然変異を導入することで、上述のような珍しいアミノ酸残基を生殖細胞系列アミノ酸残基に置換することにより、最適化した。
【０３２４】
図７Ａ〜７Ｂに示すように、９個の突然変異をＶＬフレームワーク領域に導入し（図７Ａ）、１７個のアミノ酸置換をＶＨフレームワーク領域に導入する（図７Ｂ）ことによって、それぞれ「７Ｂ２ＧＬ  ＶＬ」及び「７Ｂ２ＧＬ  ＶＨ」と呼称される、完全に生殖細胞系列化されたＶＬ及びＶＨドメインを生成した。得られたＶＬ／ＶＨドメインは、「７Ｂ２ＧＬ」と総称される。
【０３２５】
抗体７Ｂ２及び抗体７Ｂ２ＧＬのＶＬドメインのアミノ酸配列は、上で提示されている（それぞれ配列番号５５及び配列番号５７）。フレームワーク１〜３供与体のＶＬドメインのアミノ酸配列（ＩＧＫＶ４‐１）及びフレームワーク４供与体のフレームワーク４領域のアミノ酸配列（ＩＧＫＪ１‐０１）は：
ＩＧＫＶ４‐１（配列番号１２３）：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL YSSNNKNYLA WYQQKPGQPP 
KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQQYYST
P
及びＩＧＫＪ１‐０１（配列番号１２４）：
FGQGTKVEIK
である。
【０３２６】
抗体７Ｂ２及び抗体７Ｂ２ＧＬのＶＨドメインのアミノ酸配列は、上で提示されている（それぞれ配列番号５６及び配列番号５８）。フレームワーク１〜３供与体のＶＨドメインのアミノ酸配列（ＩＧＶＨ３‐１１）及びフレームワーク４供与体のフレームワーク４領域のアミノ酸配列（ＩＧＨＪ４‐０１）は：
ＩＧＶＨ３‐１１（配列番号１２５）：
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMSWIRQA PGKGLEWVSY 
ISSSSSYTNY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR
及びＩＧＨＪ４‐０１（配列番号１２６）：
WGQGTLVTVSS
である。
【０３２７】
完全に生殖細胞系列化された可変領域を含むＩｇＧ（「７Ｂ２ＧＬ  ＩｇＧ」と呼称される）の結合を、Ａｔｔａｎａ  Ｃｅｌｌ  Ａ２００  ＱＣＭによって調査した。簡潔に述べると、２５、５０、及び１００ｎＭのＨＩＶ‐１  ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０組み換えタンパク質（膜透過及びＣ末端アミノ酸残基が除かれているが、７Ｂ２によって認識されるｇｐ４１エピトープを保持している、ＨＩＶ‐１  Ｅｎｖタンパク質）に、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ表面によってコーティングされたＡｔｔａｎａセンサチップ上に個別に捕捉された７Ｂ２  ＩｇＧ（図８Ａ）又は７Ｂ２ＧＬ  ＩｇＧ（図８Ｂ）上を通過させる。動態パラメータ（ｋａ、ｋｄ、ＫＤ）の分析のために、当てはめモデルとして１：１結合を選択した。というのは、これが数学的に最小限しか操作されないモデルであるためである。しかしながら、ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０は単量体（２０〜３０％）、二量体（４０％）及び三量体（３０％）の混合物であるため、このモデルは相互作用を完全に記述しない。従って、表８で提供されている動態パラメータ（１：１結合の当てはめを用いたｋａ、ｋｄ、ＫＤ）は主に、７Ｂ２及び７Ｂ２ＧＬ構成物の互いに対するＡｇ結合活性を直接比較する目的において有用である。抗原結合にとって重要であることが知られており（Foote and Winter (1992) “Antibody Framework Residues Affecting The Conformation Of The Hypervariable Loops,” J. Mol. Biol. 224:487-499）、かつ典型的には変化しない（例えばChromikova et al. (2015) “Introduction Of Germline Residues Improves The Stability Of Anti-HIV mAb 2G12-IgM,” Biochim. Biophys. Acta 1854:1536-1544を参照）Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン（例えばＶＨドメインのＫａｂａｔ３０位、４８位、４９位、及び７９位、並びにＶＬドメインのＫａｂａｔ４８位）に、多数の変化が位置しているものの、これらの研究は、２６個の生殖細胞の突然変異全てが十分な耐容性を有していたこと、及び完全に生殖細胞系列化された抗体が、野生型抗体７B２と略同一のエピトープ結合動態を示したことを示している。
【０３２８】
【表８】
2021524451.tif 000019
【０３２９】
実施例２
ＨＩＶ×ＣＤ３結合分子
ＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ４１タンパク質及び例示的な免疫エフェクタ細胞標的ＣＤ３に結合できる、２つのＨＩＶ×ＣＤ３結合分子を生成した。特に、７Ｂ２又は７Ｂ２ＧＬ可変ドメインを含み、かつ３つのポリペプチド鎖を有する、（「ＤＡＲＴ‐１」及び「ＤＡＲＴ‐Ａ」と呼称される）２つの二重特異性ダイアボディを生成した。これらはそれぞれＣＤ３  ｍＡｂ  １（Ｄ６５Ｇ）可変ドメインを含む。ＤＡＲＴ‐１及びＤＡＲＴ‐Ａは、ＨＩＶ及びＣＤ３に結合できる、図４Ａに示されている一般構造を有するＦｃドメイン含有二重特異性ダイアボディである。これらの例示的な分子のドメイン及びアミノ酸配列については、上で詳述されている。
【０３３０】
ＤＡＲＴ‐１及びＤＡＲＴ‐Ａの生物学的活性を、多数のアッセイで調査した。ＤＡＲＴ‐１及びＤＡＲＴ‐Ａの、ＨＥＫ／Ｄ３７１細胞の表面上で発現されるｇｐ４１に結合する能力を、フローサイトメトリーで評価した。簡潔に述べると、ｇｐ１４０発現性ＨＥＫ２９３／Ｄ３７１細胞（Ｄｒ．  Ｊｏｈｎ  Ｋａｐｐｅｓ（アラバマ大学バーミンガム校）によって得られた、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを用いた２４時間の予備インキュベーションの後の、ＨＩＶ‐１  ＣＭ２４４（サブタイプＡＥ）ｇｐ１４０エンベロープのドキシサイクリン誘導性発現）を、ＤＡＲＴ‐１、ＤＡＲＴ‐Ａ、又はＲＳＶ×ＣＤ３陰性対照の連続希釈物（１０μｇ／ｍＬ〜０．００２４μｇ／ｍＬ）を用いてインキュベートした。洗浄後、細胞を、Ａｌｅｘａ  ４８８‐抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ二次抗体を用いてインキュベートし、（例えばＧｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７でプロットされたＭＦＩを用いて）フローサイトメトリーで分析した。図９に示すように、ＤＡＲＴ‐１及びＤＡＲＴ‐Ａは、同様の用量依存的様式で、ｇｐ１４０発現性ＨＥＫ２９３／Ｄ３７１細胞に結合する。
【０３３１】
ＤＡＲＴ‐１及びＤＡＲＴ‐Ａの、Ｔ細胞を活性化させる能力を、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞レポータアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。簡潔に述べると、Ｊｕｒｋａｔ  ＩＬ２  Ｌｕｃ２Ｐレポータ細胞を、ＤＡＲＴ‐１、ＤＡＲＴ‐Ａ、又はＲＳＶ×ＣＤ３陰性対照の連続希釈物（１０μｇ／ｍＬ〜０．００２４μｇ／ｍＬ）の存在下で、ｇｐ１４０発現性ＨＥＫ２９３／Ｄ３７１細胞（２０：１）と共培養し、ＯＮＥ‐ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発光を測定した。図１０に示すように、ＤＡＲＴ‐１及びＤＡＲＴ‐Ａは、同等のＴ細胞活性化活性を示す。
【０３３２】
ＤＡＲＴ‐１及びＤＡＲＴ‐Ａの、Ｔ細胞標的転換標的細胞殺滅を仲介する能力を、ＣＴＬアッセイを用いて評価した。簡潔に述べると、（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）ヒトＴ細胞キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて）Ｐａｎ  Ｔ細胞を健康なヒトＰＢＭＣから単離した。ｇｐ１４０発現性ＨＥＫ２９３／Ｄ３７１（１〜４×１０5細胞／ｍＬ）を用いて評価した。簡潔に述べると、Ｊｕｒｋａｔ  ＩＬ２  Ｌｕｃ２Ｐレポータ細胞を、ＤＡＲＴ‐１、ＤＡＲＴ‐Ａ、又はＲＳＶ×ＣＤ３陰性対照の連続希釈物と、ヒトＴ細胞とで、エフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）比＝１０：１で、又は指示されているような様々なＥ：Ｔ比で処理し、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした。細胞傷害性は、（例えばＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出によって測定される。図１１に示すように、ＤＡＲＴ‐１及びＤＡＲＴ‐Ａは、同等のＴ細胞標的転換標的細胞殺滅活性を示す。
【０３３３】
これらの研究の結果は、最適化されかつ完全に生殖細胞系列化された７Ｂ２ＧＬドメインを生成するために７Ｂ２のＶＬ及びＶＨドメインに導入される多数の置換が、ｇｐ１４０結合、又は上述のアッセイにおける生物学的活性に影響を及ぼさないことを実証している。
【０３３４】
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
【図１Ａ】
2021524451.tif 000020
【図１Ｂ】
2021524451.tif 000021
【図２】
2021524451.tif 000022
【図３Ａ】
2021524451.tif 000023
【図３Ｂ】
2021524451.tif 000024
【図３Ｃ】
2021524451.tif 000025
【図４Ａ】
2021524451.tif 000026
【図４Ｂ】
2021524451.tif 000027
【図５】
2021524451.tif 000028
【図６Ａ】
2021524451.tif 000029
【図６Ｂ】
2021524451.tif 000030
【図６Ｃ】
2021524451.tif 000031
【図６Ｄ】
2021524451.tif 000032
【図６Ｅ】
2021524451.tif 000033
【図６Ｆ】
2021524451.tif 000034
【図７Ａ】
2021524451.tif 000035
【図７Ｂ】
2021524451.tif 000036
【図８Ａ】
2021524451.tif 000037
【図８Ｂ】
2021524451.tif 000038
【図９】
2021524451.tif 000039
【図１０】
2021524451.tif 000040
【図１１】
2021524451.tif 000041
【配列表】
2021524451000001.app
【国際調査報告】
2021524451.tif 000042
2021524451.tif 000043
2021524451.tif 000044