(57)【要約】  二分免疫受容体の同種対をコードする融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドのハイスループットクローニングのための組成物および方法が本明細書に提供される。また、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチド、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、または融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドもしくは発現ベクターを含有する細胞の種々の適用も本明細書に提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを調製するための方法であって、
（ａ）複数のベッセルを生成するステップであって、各々が、（１）二分免疫受容体の第１のペプチド鎖をコードする第１の核酸および前記二分免疫受容体の第２のペプチド鎖をコードする第２の核酸を含む細胞と、（２）複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーとを含む、ステップと、
（ｂ）前記複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを重合またはゲル化して複数の硬化粒子を形成するステップであって、前記複数の硬化粒子のそれぞれが重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーからなるマトリクスを有し、前記複数の硬化粒子のそれぞれが前記第１の核酸の第１のプライマー伸長産物および前記第２の核酸の第２のプライマー伸長産物を含み、前記第１のプライマー伸長産物および前記第２のプライマー伸長産物が前記マトリクス内に包埋または封入されており、前記第１のプライマー伸長産物および前記第２のプライマー伸長産物の拡散が抑制される、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１および前記第２のプライマー伸長産物が、逆転写（ＲＴ）産物、第２の鎖合成（ＳＳＳ）産物、または増幅産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１および／または前記第２のプライマー伸長産物がアダプター配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アダプター配列が、前記第１または前記第２の核酸分子とハイブリダイズできないか、または相補的ではない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および前記第２のプライマー伸長産物が可変ドメインをコードする、請求項１または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記可変ドメインが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および／または前記第２のプライマー伸長産物が、定常ドメインをさらにコードする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞を溶解して前記第１の核酸および前記第２の核酸を放出させるステップをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の核酸および前記第２の核酸を逆転写するステップをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記逆転写するステップが、ＲＴプライマーを使用することによって実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＴプライマーが拡散抑制剤に連結しており、前記拡散抑制剤が前記マトリクス内の前記ＲＴプライマーの拡散を抑制する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
鋳型スイッチ反応またはＳＳＳ反応を実施するステップをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の核酸および前記第２の核酸を増幅させて第１および第２の増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１または前記第２の核酸の各々について、前記増幅させるステップが、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーを使用することによって実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の増幅プライマーが拡散抑制剤に連結しており、前記拡散抑制剤が前記マトリクス内の前記第１の増幅プライマーの拡散を抑制する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の硬化粒子を洗浄するステップをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の硬化粒子を洗浄して、試薬が前記複数の硬化粒子から拡散することを可能にするステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試薬が、ＲＴプライマー、増幅プライマー、鋳型スイッチプライマー、ＳＳＳプライマー、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の硬化粒子を繰り返し洗浄するステップをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
洗浄するステップの後に油中で前記複数の硬化粒子を乳化し、それによってさらなる複数のベッセルを形成するステップであって、前記さらなる複数のベッセルの各ベッセルが前記複数の硬化粒子の単一の硬化粒子を含む、ステップをさらに含む、請求項６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１および前記第２のプライマー伸長産物が拡散抑制剤に連結している、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記拡散抑制剤がポリマーである、請求項１１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリマーが、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、または多糖である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記拡散抑制剤が粒子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記粒子が、前記マトリクスの孔径より大きい直径を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記拡散抑制剤が前記マトリクスである、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１および前記第２のプライマー伸長産物が、捕捉剤を介して前記拡散抑制剤に連結している、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記捕捉剤が固定化部分を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記固定化部分が、前記捕捉剤を前記拡散抑制剤に連結する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記固定化部分が反応基を含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記捕捉剤がターゲティング部分をさらに含む、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ターゲティング部分が捕捉オリゴヌクレオチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の増幅プライマーが、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１４から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１および前記第２の増幅産物が、前記捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含み、それによって前記第１および前記第２の増幅産物を前記捕捉剤に連結し、それによって前記拡散抑制剤に連結する、請求項１４から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の増幅産物および前記第２の増幅産物を連結して、前記さらなる複数のベッセルの各ベッセル内に融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを形成し、それによって複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを有する前記融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを生成するステップをさらに含む、請求項２０から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の増幅産物および前記第２の増幅産物がライゲーションまたはＰＣＲによって連結されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の増幅産物および前記第２の増幅産物がホスホジエステル結合によって連結して連続ポリヌクレオチドを形成する、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の増幅産物および前記第２の増幅産物がインフレームで連結している、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記さらなる複数のベッセルから前記複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを放出させるステップをさらに含む、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数の各融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを環状化させるステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記複数の各融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドをベクターに挿入するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ベクターが、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ベクターが非ウイルスベクターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記二分免疫受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）である、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファペプチド鎖およびＴＣＲベータペプチド鎖、またはＴＣＲガンマペプチド鎖およびＴＣＲデルタペプチド鎖を含み、前記ＢＣＲが、重ペプチド鎖および軽ペプチド鎖を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が免疫細胞である、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記リンパ球がＴ細胞またはＢ細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｔ細胞が、炎症性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはそれらの組合せである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｂ細胞が、形質芽球細胞、形質細胞、リンパ形質細胞様細胞、メモリーＢ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ−１細胞、Ｂ−２細胞、または調節性Ｂ細胞である、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記免疫細胞が、腫瘍組織または血液試料から単離される、請求項４７から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達するステップをさらに含む、請求項３５から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーが、少なくとも５０個の異なる融合二分免疫受容体配列を含む、請求項３５から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１のペプチド鎖および前記第２のペプチド鎖が前記二分免疫受容体の同種対である、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ベッセルが液滴である、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記液滴が油中水液滴である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記硬化粒子がヒドロゲル粒子である、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポリマーが、多糖、ポリアクリルアミド、またはそれらの組合せである、請求項１から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記多糖が、アガロース、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、キトサン、またはアルギネートである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記モノマーが、アクリルアミドまたはメタクリルアミドモノマーである、請求項１から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーが、アガロースおよびポリアクリルアミドの混合物を含む、請求項１から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを重合またはゲル化するステップが、開始剤を使用するステップを含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記開始剤がＵＶ光または化学物質である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを重合またはゲル化するステップが、前記ベッセルの温度を低下させるステップを含む、請求項１から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法であって、
（ａ）複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を準備するステップであって、前記複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が、前記複数のＴＣＲのＴＣＲの同種対を発現する、ステップと、
（ｂ）前記複数のＴ細胞を複数の区画に分配するステップであって、各区画が前記複数のＴ細胞の個々のＴ細胞を含む、ステップと、
（ｃ）各区画内で、第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドおよび前記個々のＴ細胞の前記ＴＣＲの同種対の第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを連結させ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを生成するステップであって、（ｉ）前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが前記個々のＴ細胞の内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または（ｉｉ）前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと、
（ｄ）前記複数の融合ポリヌクレオチドを複数の細胞に送達するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記複数の融合ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップと、
（ｅ）前記複数の細胞において複数のベクターから前記複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、前記複数の細胞のサブセットが複数の標的反応性ＴＣＲを発現する、ステップと、
（ｆ）前記複数の細胞を１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性ＴＣＲを発現する前記複数の細胞のサブセットが前記１つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップと、
（ｇ）前記複数の細胞のサブセットの前記複数の標的反応性ＴＣＲの標的反応性ＴＣＲを同定するステップと
を含む、方法。
【請求項６８】
送達するステップの前に、前記複数の融合ポリヌクレオチドを含む複数のベクターを生成するステップであって、前記複数のベクターの各ベクターが前記複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記複数の細胞が複数のレシピエント細胞である、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記内因性核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項６７から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡである、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項７３】
接触させるステップが、細胞の集団を、前記１つまたは複数の標的抗原を提示する１つまたは複数の細胞と接触させるステップをさらに含む、請求項６７から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記１つまたは複数の細胞が、１つもしくは複数の腫瘍細胞、腫瘍様塊、腫瘍溶解物パルス抗原提示細胞（ＡＰＣ）または前記１つもしくは複数の標的抗原を提示するように操作されたＡＰＣである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記１つまたは複数の標的抗原を提示するように操作された前記１つまたは複数のＡＰＣが、標的抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡと共に送達される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
接触させるステップが、前記細胞の集団を腫瘍組織と接触させるステップをさらに含む、請求項６７から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記１つまたは複数の標的抗原が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成している、請求項６７から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＭＨＣがＭＨＣ四量体である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１のＴＣＲ鎖がＴＣＲアルファ鎖であり、前記第２のＴＣＲ鎖がＴＣＲベータ鎖である、請求項６７から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記第１のＴＣＲ鎖がＴＣＲガンマ鎖であり、前記第２のＴＣＲ鎖がＴＣＲデルタ鎖である、請求項６７から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記複数の細胞が細胞系細胞である、請求項６７から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞系細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２−ＯＳ細胞；ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ−１０８０細胞；ＨＣＴ−１１６細胞；Ｈｕ−ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；またはＭｏｌｔ４細胞である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記複数の細胞が、対象由来の試料から単離される、請求項６７から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記複数のＴ細胞が、対象由来の試料から単離される、請求項６７から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記試料が、腫瘍組織、血液試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、またはそれらの組合せである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記腫瘍組織が多くても約２０００ｍｍ３である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記血液試料が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記複数のＴ細胞が、腫瘍浸潤Ｔ細胞または末梢Ｔ細胞である、請求項６７から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記複数のＴ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、疲弊Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項６７から８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも１つの細胞を単離するステップをさらに含む、請求項６７から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも１つの細胞がＦＡＣＳによって単離される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも１つの細胞がマーカーに基づいて単離される、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記マーカーが、細胞表面マーカーまたはサイトカインである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞表面マーカーが、ＣＤ３９、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、またはそれらの組合せである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記サイトカインが、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、パーフォリン、またはそれらの組合せである、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
（ｉ）前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも１つの細胞を前記対象に投与するステップまたは（ｉｉ）同定された標的反応性ＴＣＲを含む自家もしくは同種異系間細胞を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項６７から９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記自家または前記同種異系間細胞が、前記同定された標的反応性ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記同定された標的反応性ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドが、前記融合ポリヌクレオチドもしくはその増幅産物であるか、または前記融合ポリヌクレオチドの前記第１のＴＣＲ鎖および前記第２のＴＣＲ鎖をコードする配列を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
複数の標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法であって、
（ａ）複数のＴＣＲを発現する複数の細胞を準備するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記複数のＴＣＲのＴＣＲを発現し、前記複数のＴＣＲが少なくとも５０個の異なる同種対を含み、複数のＶ遺伝子由来のＶ領域を含み、前記複数のＴＣＲが前記複数の細胞に対して外因性である、ステップと、
（ｂ）前記複数の細胞を１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性ＴＣＲを発現する前記複数の細胞のサブセットが前記１つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップと、
（ｃ）前記複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも２つの細胞を同定するステップであって、少なくとも２つの細胞が前記複数の標的反応性ＴＣＲのうちの少なくとも２つの標的反応性ＴＣＲを発現し、それによって前記複数の標的反応性ＴＣＲのうちの前記少なくとも２つの標的反応性ＴＣＲを同定する、ステップと
を含む、方法。
【請求項１００】
前記複数のＶ遺伝子が、少なくとも１０個の異なるＶ遺伝子を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記複数の細胞が、複数の遺伝子操作された細胞である、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記複数の細胞が、対象由来の試料から単離される、請求項９９から１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記試料が、組織試料、血液試料、ＰＢＭＣ試料、またはそれらの組合せである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記複数のＴＣＲが、少なくとも１００個の異なる同種対を含む、請求項９９から１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記複数の細胞のサブセットのうちの前記少なくとも２つの細胞を単離するステップをさらに含む、請求項９９から１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
（ｂ）が、前記複数の細胞を、前記１つまたは複数の標的抗原を提示する１つまたは複数の細胞と接触させるステップを含む、請求項９９から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記１つまたは複数の細胞が、１つまたは複数の腫瘍細胞、腫瘍様塊、腫瘍溶解物パルス抗原提示細胞（ＡＰＣ）または前記１つもしくは複数の標的抗原を提示するように操作されたＡＰＣである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記１つまたは複数の標的抗原を提示するように操作された前記１つまたは複数のＡＰＣが、標的抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
（ｂ）が、前記複数の細胞を腫瘍組織と接触させるステップを含む、請求項９９から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
（ｂ）が、前記複数の細胞を、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成している前記１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップを含む、請求項９９から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＭＨＣがＭＨＣ四量体である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記１つまたは複数の標的抗原の配列または同一性が知られていない、請求項９９から１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記複数の細胞のサブセットのうちの前記少なくとも２つの細胞のうちの少なくとも１つを対象に投与するステップをさらに含む、請求項９９から１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記複数の細胞の各細胞がレポーター遺伝子を含み、前記細胞のＴＣＲが前記１つまたは複数の標的抗原の標的抗原に結合すると、前記レポーター遺伝子がシグナルを送るように調節される、請求項９９から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記複数の細胞が細胞系細胞である、請求項９９から１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記複数のＴＣＲが、少なくとも１００の異なるＶＪの組合せを含む、請求項９９から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記複数のＴＣＲが対象由来の試料からのＴＣＲを含む、請求項９９から１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記対象が疾患または状態を有する、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記複数のＴＣＲが、対象由来の腫瘍浸潤リンパ球を含む試料からのＴＣＲを含む、請求項９９から１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
対象におけるがんを治療する方法であって、
（ａ）複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を準備するステップであって、前記複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が前記複数のＴＣＲのＴＣＲの同種対を発現する、ステップと、
（ｂ）前記複数のＴ細胞を複数の区画に分配するステップであって、各区画が前記複数のＴ細胞の個々のＴ細胞を含む、ステップと、
（ｃ）各区画内で、第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドおよび前記個々のＴ細胞の前記ＴＣＲの同種対の第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを連結させ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを生成するステップであって、（ｉ）前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが前記個々のＴ細胞の内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または（ｉｉ）前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと、
（ｄ）前記複数の融合ポリヌクレオチドを複数の細胞に送達するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記複数の融合ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップと、
（ｅ）前記複数の細胞において前記複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、前記複数の細胞のサブセットが、前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットから複数の標的反応性ＴＣＲを発現する、ステップと、
（ｆ）前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットから前記複数の標的反応性ＴＣＲを同定するステップと、
（ｇ）前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットの１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドまたはその誘導体を複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、前記複数のレシピエント細胞の各細胞が、前記複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットの前記１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドまたはその誘導体のうちの少なくとも１つを含む、ステップと、
（ｈ）（ｉ）前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも１つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップ、または（ｉｉ）前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも２つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップであって、前記少なくとも２つのレシピエント細胞が異なるＴＣＲを発現する、ステップと
を含む、方法。
【請求項１２１】
前記複数のＴ細胞が、腫瘍浸潤Ｔ細胞または末梢Ｔ細胞である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記複数のＴ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、疲弊Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１２０または１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記複数のＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化され、および／または増殖する、請求項１２０から１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記複数の融合ポリヌクレオチドが複数のベクターにおいて送達され、前記複数のベクターの各ベクターが、前記複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、請求項１２０から１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
（ｄ）における送達するステップの前に、前記複数のベクターを生成するステップをさらに含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
（ｆ）における同定するステップが、前記複数の細胞を１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性ＴＣＲを発現する前記複数の細胞のサブセットが、前記１つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップを含む、請求項１２０から１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記１つまたは複数の標的抗原が、１つまたは複数の腫瘍細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、または人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）によって提示される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記１つまたは複数のＡＰＣまたはａＡＰＣが、（ｉ）前記１つもしくは複数の標的抗原によってパルスされるか、または（ｉｉ）標的抗原をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記１つまたは複数の抗原の各抗原が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成している、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ＭＨＣがＭＨＣ四量体である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
（ｇ）における送達するステップの前に、前記複数の細胞のサブセットの１つまたは複数の細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１２０から１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記対象から前記複数のＴＣＲを発現する前記複数のＴ細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１２０から１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
投与するステップが、前記複数のＴ細胞を単離してから多くても約６０日後に実施される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記複数のレシピエント細胞が、同種異系間細胞、自家細胞、または細胞系細胞である、請求項１２０から１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記複数の細胞が、遺伝子操作された細胞または細胞系細胞である、請求項１２０から１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
（ｈ）の前に、前記複数のレシピエント細胞を増殖させるステップをさらに含む、請求項１２０から１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記誘導体が、前記１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの配列を含む、請求項１２０から１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記誘導体が、前記１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの増幅産物または合成産物である、請求項１２０から１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
対象における腫瘍を治療する方法であって、
（ａ）複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する前記対象から複数のＴ細胞を単離するステップであって、前記複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が、内因性核酸から前記複数のＴＣＲのＴＣＲの同種対を発現し、前記複数のＴＣＲが複数の腫瘍反応性ＴＣＲを含む、ステップと、
（ｂ）前記複数のＴＣＲから前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲを同定するステップと、
（ｃ）前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、前記複数のレシピエント細胞の各レシピエント細胞が、前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、（ｉ）前記ポリヌクレオチドが前記内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと、
（ｄ）前記複数のレシピエント細胞において前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現させるステップと、
（ｅ）（ｉ）前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも１つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップ、または（ｉｉ）前記複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも２つのレシピエント細胞を前記対象に投与するステップであって、前記少なくとも２つのレシピエント細胞が異なるＴＣＲを発現する、ステップと
を含む、方法。
【請求項１４０】
ホスホロアミダイトを使用した前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドの化学合成を含まない、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記複数のＴ細胞が、腫瘍浸潤Ｔ細胞または末梢Ｔ細胞である、請求項１３９または１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記複数のＴ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、疲弊Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項１３９から１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記複数のレシピエント細胞が、同種異系間Ｔ細胞、自家Ｔ細胞、または細胞系細胞である、請求項１３９から１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
（ｂ）の前に、複数のレポーター細胞において前記複数のＴＣＲを発現させるステップをさらに含む、請求項１３９から１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
発現させるステップが、ウイルスベクターによって前記複数のＴＣＲをコードする核酸配列を送達するステップを含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記複数のレポーター細胞の各レポーター細胞がレポーター遺伝子を含む、請求項１４４から１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
（ｂ）において、同定するステップが、前記複数のＴＣＲを、１つもしくは複数の標的抗原、または１つもしくは複数の標的抗原を提示する細胞もしくは組織と接触させるステップを含む、請求項１４４から１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記１つまたは複数の標的抗原が、１つまたは複数の腫瘍細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）によって提示される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記１つまたは複数のＡＰＣまたはａＡＰＣが、標的抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記１つまたは複数の標的抗原がＭＨＣと複合体を形成している、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ＭＨＣがＭＨＣ四量体である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記複数のＴＣＲの前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲが、ＴＣＲの少なくとも２つの異なる同種対を含む、請求項１４４から１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲの各ＴＣＲが、異なるエピトープまたは異なるタンパク質に特異的である、請求項１４４から１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲの各ＴＣＲが、異なる（ｉ）ＴＣＲアルファＣＤＲ３配列、（ｉｉ）ＴＣＲベータＣＤＲ３可変ドメイン配列、（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ可変ドメイン配列、（ｉｖ）ＴＣＲベータ可変ドメイン配列、または（ｖ）ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータ可変ドメイン配列の組合せを含む、請求項１４４から１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲが、前記対象由来の腫瘍細胞に結合するが、前記対象由来の健康な細胞に結合しないか、または前記腫瘍細胞に対してより少なくとも１０倍低い親和性で前記対象由来の健康な細胞に結合する、請求項１４４から１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
（ｅ）において投与される前記複数のレシピエント細胞が、（ａ）において単離される前記複数のＴ細胞より少なくとも１０倍多い細胞を含む、請求項１４４から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
対象における腫瘍を治療する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の集団を発現する前記対象からＴ細胞の集団を単離するステップであって、前記Ｔ細胞の集団が多くても約１０，０００個の細胞を含む、ステップと、
（ｂ）前記ＴＣＲの集団から複数の腫瘍反応性ＴＣＲを同定するステップと、
（ｃ）前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現する複数の細胞を前記対象に投与するステップであって、前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットが少なくとも２個の異なる同種対を含む、ステップと
を含む、方法。
【請求項１５９】
対象における腫瘍を治療する方法であって、
（ａ）ＴＣＲの集団から複数の腫瘍反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するステップであって、前記ＴＣＲの集団がＴＣＲの少なくとも５０個の異なる同種対を含む、ステップと、
（ｂ）前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現する複数の細胞を前記対象に投与するステップであって、前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットが、少なくとも５０個の異なる同種対のうちの少なくとも５個の異なる同種対を含み、前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲが前記複数の細胞に対して外因性である、ステップと
を含む、方法。
【請求項１６０】
対象における腫瘍を治療する方法であって、
（ａ）ＴＣＲの集団から同定された複数の腫瘍反応性ＴＣＲを発現する複数の細胞を前記対象に投与するステップであって、前記ＴＣＲの集団がＴＣＲの少なくとも５０個の異なる同種対を含み、前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットが、前記少なくとも５０個の異なる同種対のうちの少なくとも５個の異なる同種対を含み、前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲが前記複数の細胞に対して外因性である、ステップ
を含む、方法。
【請求項１６１】
前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットが少なくとも５個のＴＣＲを含み、前記少なくとも５個のＴＣＲの各ＴＣＲが、（１）異なるエピトープもしくは異なるタンパク質に特異的であるか、または（２）異なる（ｉ）ＴＣＲアルファＣＤＲ３配列、（ｉｉ）ＴＣＲベータＣＤＲ３可変ドメイン配列、（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ可変ドメイン配列、（ｉｖ）ＴＣＲベータ可変ドメイン配列、もしくは（ｖ）ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータ可変ドメイン配列の組合せを含む、請求項１５９または１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
（ａ）の前に、前記対象から前記ＴＣＲの集団を発現するＴ細胞の集団を単離するステップをさらに含む、請求項１５９から１６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記少なくとも５０個の異なる同種対が、少なくとも５個の異なるＶ遺伝子由来のＶ領域を含む、請求項１５９から１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
同定するステップが、マーカーによって前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲを単離するステップを含む、請求項１５９から１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現する前記複数の細胞が、複数の同種異系間細胞、自家細胞または細胞系細胞である、請求項１５９から１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記複数の同種異系間細胞が、抑制性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体に結合するタンパク質を発現する、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記タンパク質が、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−ＥまたはＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ融合タンパク質である、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための方法であって、
（ａ）第１の試料由来の複数のＴ細胞を、対象由来の腫瘍細胞を含む第２の試料または第３の試料と接触させるステップであって、前記第３の試料が前記第２の試料に由来し、前記第３の試料が、
（ｉ）前記第２の試料の前記腫瘍細胞由来の標的抗原または前記標的抗原をコードする核酸、およびＭＨＣ、
（ｉｉ）ＭＨＣにおける前記標的抗原を提示する細胞、または
（ｉｉｉ）ＭＨＣを含む細胞および前記核酸によってコードされるタンパク質産物
を含み、
前記複数のＴ細胞のサブセットが、前記ＭＨＣと複合体を形成している前記標的抗原に結合する、ステップと、
（ｂ）前記第１の試料の前記複数のＴ細胞のサブセットまたはその一部を単離するステップと、
（ｃ）前記複数のＴ細胞のサブセットまたはその一部を複数の区画に分配するステップであって、各区画が前記複数のＴ細胞のサブセットまたはその一部の個々のＴ細胞を含む、ステップと、
（ｄ）各区画内で、第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドおよび前記個々のＴ細胞のＴＣＲの同種対の第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを同定し、それによって１つまたは複数の対合ポリヌクレオチドを生成するステップと
を含む、方法。
【請求項１６９】
同定するステップが、前記第１のＴＣＲ鎖をコードする前記第１のポリヌクレオチドおよび前記個々のＴ細胞のＴＣＲの同種対の前記第２のＴＣＲ鎖をコードする前記第２のポリヌクレオチドを物理的に連結させるステップを含む、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記１つまたは複数の対合ポリヌクレオチドが、１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドである、請求項１６８または１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
同定するステップが、シークエンシングによって前記第１のＴＣＲ鎖をコードする前記第１のポリヌクレオチドおよび前記個々のＴ細胞のＴＣＲの同種対の前記第２のＴＣＲ鎖をコードする前記第２のポリヌクレオチドを連結させるステップを含む、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７２】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、ホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、請求項１６８から１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、前記個々のＴ細胞の内因性核酸の転写産物または増幅産物である、請求項１６８から１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記第１の試料または前記第２の試料が対象から単離される、請求項１６８から１７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
前記第１の試料および前記第２の試料が同じ対象から単離される、請求項１６８から１７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
前記第１の試料および前記第２の試料が異なる対象から単離される、請求項１６８から１７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記第１の試料または前記第２の試料が、組織試料、血液試料、ＰＢＭＣ試料、またはそれらの組合せである、請求項１６８から１７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記組織試料が、腫瘍組織または健康な組織である、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記第１の試料または前記第２の試料が、コア生検、細針生検、またはアフェレーシスによって対象から単離される、請求項１６８から１７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
単離するステップが、マーカーによって前記複数のＴ細胞のサブセットまたはその一部を単離するステップを含む、請求項１６８から１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
前記マーカーが、細胞表面マーカーまたはサイトカインである、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記細胞表面マーカーが、ＣＤ３９、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、またはそれらの組合せである、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
前記標的抗原を提示する細胞が、腫瘍細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、または人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である、請求項１６８から１８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８４】
前記ＡＰＣまたは前記ａＡＰＣが、前記標的抗原によりパルスされる、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞が、前記核酸またはその誘導体と共に送達されるＡＰＣまたはａＡＰＣである、請求項１６８から１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記ＡＰＣまたは前記ａＡＰＣが、前記ＭＨＣをコードするさらなる核酸と共にさらに送達される、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記核酸またはその誘導体がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１８５または１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記標的抗原を提示する細胞または前記核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞が、対象から単離されるか、または細胞系細胞である、請求項１６８から１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記標的抗原を提示する細胞または前記核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞が、前記第１の試料および前記第２の試料が単離される同じ対象から単離される、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のベクターを生成するステップであって、前記１つまたは複数のベクターの各ベクターが、前記１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップをさらに含む、請求項１６８から１８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
前記１つまたは複数のベクターを複数の細胞に送達するステップであって、前記複数の細胞の各細胞が前記１つまたは複数のベクターのうちの少なくとも１つのベクターを含む、ステップをさらに含む、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
前記複数の細胞において前記１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、前記複数の細胞のサブセットが複数の標的反応性ＴＣＲを発現する、ステップをさらに含む、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
前記複数の細胞を１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、前記複数の標的反応性ＴＣＲを発現する前記複数の細胞のサブセットが前記１つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップをさらに含む、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記複数の標的反応性ＴＣＲの１つまたは複数の標的反応性ＴＣＲを同定するステップをさらに含む、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記１つまたは複数の標的反応性ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップをさらに含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
前記複数のレシピエント細胞の１つまたは複数の細胞を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
請求項６７から１１６および１６８から１９６のいずれか一項に記載の方法によって同定される標的反応性または腫瘍反応性ＴＣＲをコードする配列を含むレシピエント細胞を含む医薬組成物。
【請求項１９８】
請求項１９７に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、レシピエント細胞を投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
[0001]本出願は、２０１８年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／７１８，２２７号、２０１８年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／７２５，８４２号、２０１８年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７３２，８９８号、２０１９年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８１８，３５５号、および２０１９年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８２３，８３１号に対する優先権を主張し、それらの各々は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
[0002]Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は抗原−主要組織適合遺伝子複合体の認識に関与し、炎症反応の開始をもたらす。細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞を含む、多くのＴ細胞サブセットが存在する。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られている）は、異常細胞、例えば、ウイルスに感染した細胞または腫瘍細胞を殺傷する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られている）は他の免疫細胞の活性化および成熟を支援する。細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の両方は、それらのそれぞれの応答を引き起こす特異的標的抗原の認識後にそれらの機能を果たす。Ｔ細胞の抗原特異性はＴ細胞の表面上で発現されたＴＣＲによって規定され得る。Ｔ細胞受容体は、２つのポリペプチド鎖、最も一般的にはアルファおよびベータ鎖からなるヘテロ二量体タンパク質であるが、少数のＴ細胞はガンマおよびデルタ鎖を発現することができる。ＴＣＲの特定のアミノ酸配列および得られる三次元構造はＴＣＲ抗原特異性および親和性を規定する。膨大の数の可能なＴＣＲ配列が存在するので、任意の個々のＴ細胞についてのＴＣＲ鎖のアミノ酸およびコードＤＮＡ配列は、ほとんどの場合、生物の全ＴＣＲレパートリーにおいて一つだけであるか、または非常に少ない量である。この大きな配列多様性は、多くの細胞機構を介してＴ細胞発生の間に達成され、多種多様な潜在的抗原に応答する免疫系の能力の重要な態様であり得る。
【０００３】
[0003]ＴＣＲレパートリーを分析することは、免疫系の特徴、ならびに疾患の病因および進行、特に未知の抗原誘発因子を有する疾患のさらなる理解を得るのに役立ち得る。ＴＣＲレパートリーの極端な多様性およびＴＣＲの２つの部分からなる性質は主要な分析に関する課題を表している。ハイスループットシークエンシングは、スペクトラタイピング（ｓｐｅｃｔｒａｔｙｐｉｎｇ）より高額ではあるが、ＴＣＲクローン型の存在度のより大きいシークエンシング深度および有意により正確な定量を可能にすることができる。しかしながら、ハイスループットシークエンシングは依然としてＰＣＲバイアスおよびシークエンシングエラーを受け、その結果、クローン型の存在度が劇的にゆがめられる可能性があり、存在しないクローン型が記録される可能性があり、それによって観察される多様性が不当に増加することになる。さらに、クローニング、機能的研究および治療的使用などの下流の適用のためのシークエンシングデータからのＴＣＲ鎖の同種対の選択および／または合成は、時間がかかる可能性がある。そして、ＴＣＲ鎖の選択され、合成された同種対のライブラリーは、少なくなるか、または低い多様性を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004]種々の適用のために使用され得る自然に対合したＴＣＲのハイスループットクローニングのための組成物および方法が本明細書に提供される。本明細書に提供される組成物および方法は、シークエンシングおよび合成より優れることができ、宿主細胞における直接発現のためのＴＣＲの同種対をコードする融合核酸分子を提供することができる。組成物および方法はまた、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）などの他の二分免疫受容体にも適用され得る。
【０００５】
[0005]一態様によれば、複数の融合Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリヌクレオチドを含む組成物であって、複数の各融合ＴＣＲポリヌクレオチドが第１の核酸配列および第２の核酸配列を含み、（１）第１の核酸配列が第１のＴＣＲペプチド鎖の第１の可変ドメインをコードし、第１の可変ドメインがＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、（２）第２の核酸配列が第２のＴＣＲペプチド鎖の第２の可変ドメインをコードし、第２の可変ドメインがＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；各融合ＴＣＲポリヌクレオチドの第１および第２の核酸配列が、免疫細胞由来の第１および第２のＴＣＲペプチド鎖の同種対をコードし；複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドが少なくとも５０個の異なる同種対をコードし；複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドが少なくとも５個、１０個、または２０個の異なるＶ遺伝子由来のＶ領域を含む、組成物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、第１のＴＣＲペプチド鎖はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファペプチド鎖であり、第２のＴＣＲペプチド鎖はＴＣＲベータペプチド鎖である。一部の実施形態では、第１のＴＣＲペプチド鎖はＴＣＲガンマペプチド鎖であり、第２のＴＣＲペプチド鎖はＴＣＲデルタペプチド鎖である。一部の実施形態では、第１の可変ドメインはＣＤＲ１をさらに含み、および／または第２の可変ドメインはＣＤＲ１をさらに含む。一部の実施形態では、第１のＴＣＲペプチド鎖の第１の可変ドメインは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３を含む第１の完全長可変ドメインであり、ならびに／または第２のＴＣＲペプチド鎖の第２の可変ドメインは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３を含む第２の完全長可変ドメインである。一部の実施形態では、第１の核酸配列は、第１のＴＣＲペプチド鎖の第１の定常ドメインもしくはその一部をさらにコードし、および／または第２の核酸配列は、第２のＴＣＲペプチド鎖の第２の定常ドメインもしくはその一部をさらにコードする。一部の実施形態では、第１の定常ドメインは第１の細胞外ドメインであり、および／または第２の定常ドメインは第２の細胞外ドメインである。一部の実施形態では、第１の定常ドメインは、第１のＴＣＲ鎖の第１の細胞外ドメイン、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通領域および第１の細胞質尾部を含み、ならびに／または第２の定常ドメインは、第２のＴＣＲペプチド鎖の第２の細胞外ドメイン、第２のヒンジ領域、第２の膜貫通領域および第２の細胞質尾部を含む。一部の実施形態では、複数の各融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、または少なくとも１５００の塩基対の長さである。一部の実施形態では、複数の各融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも１０００、少なくとも１５００、または少なくとも２０００の塩基対の長さである。一部の実施形態では、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、免疫細胞から得られるか、または放出される。
【０００６】
[0006]一部の実施形態では、免疫細胞は試料から単離される。一部の実施形態では、試料は対象から得られる。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球はＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、炎症性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖する。一部の実施形態では、試料は、血液細胞試料、骨髄試料、臍帯血試料、腹水試料、胸水試料、脳脊髄試料、精液試料、痰試料、尿試料、糞便試料、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、試料は、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節、扁桃腺、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道、胸腺、胃、腫瘍、感染部位、またはそれらの組合せに由来する組織試料である。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、またはラットである。一部の実施形態では、対象は健康な対象または疾患対象である。一部の実施形態では、免疫細胞はマーカーによって試料から単離される。一部の実施形態では、マーカーは細胞表面マーカーである。一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ３９、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯ、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、マーカーはサイトカインである。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、パーフォリン、またはそれらの組合せである。
【０００７】
[0007]一部の実施形態では、複数の各融合ＴＣＲポリヌクレオチドはプロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、プロモーターは構成的または誘導的である。一部の実施形態では、プロモーターはテトラサイクリン応答性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターはウイルスプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、Ｆｒｉｅｎｄ脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、ヘルペスウイルスＴＫプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター；マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニア７．５Ｋプロモーター、またはエノラーゼプロモーターである。一部の実施形態では、第１の核酸および第２の核酸はインフレームで融合され、その結果、第１の可変ドメインおよび第２の可変ドメインの発現は１つのプロモーターの制御下である。一部の実施形態では、複数の各融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、プロテアーゼ切断部位をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、細胞プロテアーゼ切断部位またはウイルスプロテアーゼ切断部位である。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ切断部位、第Ｘａ因子切断部位、トロンビン切断部位、レニン切断部位、コラゲナーゼ切断部位、トリプシン切断部位、カスパーゼプロテアーゼ切断部位、フューリン切断部位、ＰＣ５／６プロテアーゼ切断部位；ＰＡＣＥプロテアーゼ切断部位、ＬＰＣ／ＰＣ７プロテアーゼ切断部位、第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位、ゲネナーゼＩ（ｇｅｎｅｎａｓｅ  Ｉ）切断部位、ＭＭＰプロテアーゼ切断部位、またはＫＥＸ２プロテアーゼ切断部位である。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ウイルス２Ａプロテアーゼ切断部位、ウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、感染性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）ＶＰ４プロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、またはカブモザイクポチウイルス切断部位の核封入タンパク質ａ（Ｎ１ａ）である。一部の実施形態では、複数の各融合ＴＣＲポリヌクレオチドは自己切断ペプチドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、自己切断ペプチドは、インテインペプチド、ヘッジホッグペプチド、または２Ａペプチドである。一部の実施形態では、少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子は、少なくとも１０個の異なるＴＲＡＶ遺伝子および／または少なくとも１０個の異なるＴＲＢＶ遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＴＲＡＶ遺伝子およびＴＲＢＶ遺伝子は、ヒトまたはマウスＴＲＡＶ遺伝子およびＴＲＢＶ遺伝子である。
【０００８】
[0008]一部の実施形態では、少なくとも１０個の異なるＴＲＡＶ遺伝子は、ヒトＴＲＡＶ１−１、ＴＲＡＶ１−２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８−１、ＴＲＡＶ８−２、ＴＲＡＶ８−３、ＴＲＡＶ８−４、ＴＲＡＶ８−６、ＴＲＡＶ９−１、ＴＲＡＶ９−２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２−１、ＴＲＡＶ１２−２、ＴＲＡＶ１２−３、ＴＲＡＶ１３−１、ＴＲＡＶ１３−２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６−１、ＴＲＡＶ２６−２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８−１、ＴＲＡＶ３８−２、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、ＴＲＡＶ４１からなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１０個の異なるＴＲＢＶ遺伝子は、ヒトＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３−１、ＴＲＢＶ４−１、ＴＲＢＶ４−２、ＴＲＢＶ４−３、ＴＲＢＶ５−１、ＴＲＢＶ５−４、ＴＲＢＶ５−５、ＴＲＢＶ５−６、ＴＲＢＶ５−８、ＴＲＢＶ６−１、ＴＲＢＶ６−２、ＴＲＢＶ６−３、ＴＲＢＶ６−４、ＴＲＢＶ６−５、ＴＲＢＶ６−６、ＴＲＢＶ６−８、ＴＲＢＶ６−９、ＴＲＢＶ７−２、ＴＲＢＶ７−３、ＴＲＢＶ７−４、ＴＲＢＶ７−６、ＴＲＢＶ７−７、ＴＲＢＶ７−８、ＴＲＢＶ７−９、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０−１、ＴＲＢＶ１０−２、ＴＲＢＶ１０−３、ＴＲＢＶ１１−１、ＴＲＢＶ１１−２、ＴＲＢＶ１１−３、ＴＲＢＶ１２−３、ＴＲＢＶ１２−４、ＴＲＢＶ１２−５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０−１、ＴＲＢＶ２４−１、ＴＲＢＶ２５−１、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９−１、およびＴＲＢＶ３０からなる群から選択される。
【０００９】
[0009]一部の実施形態では、少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子は、少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子サブグループを含む。一部の実施形態では、少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子サブグループは、少なくとも１０個の異なるＴＲＡＶ遺伝子サブグループおよび／または少なくとも１０個の異なるＴＲＢＶ遺伝子サブグループを含む。一部の実施形態では、少なくとも１０個の異なるＴＲＡＶ遺伝子サブグループは、ヒトＴＲＡＶ１、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８、ＴＲＡＶ９、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１３、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、およびＴＲＡＶ４１サブグループからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１０個の異なるＴＲＢＶ遺伝子サブグループは、ヒトＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３、ＴＲＢＶ４、ＴＲＢＶ５、ＴＲＢＶ６、ＴＲＢＶ７、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０、ＴＲＢＶ１１、ＴＲＢＶ１２、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０、ＴＲＢＶ２４、ＴＲＢＶ２５、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９、およびＴＲＢＶ３０サブグループからなる群から選択される。
【００１０】
[0010]一部の実施形態では、少なくとも１０個の異なるＴＲＡＶ遺伝子は、マウスＴＲＡＶ１、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３−１、ＴＲＡＶ３−３、ＴＲＡＶ３−４、ＴＲＡＶ３Ｄ−３、ＴＲＡＶ３Ｎ−３、ＴＲＡＶ４−２、ＴＲＡＶ４−３、ＴＲＡＶ４−４、ＴＲＡＶ４Ｄ−２、ＴＲＡＶ４Ｄ−３、ＴＲＡＶ４Ｄ−４、ＴＲＡＶ４Ｎ−３、ＴＲＡＶ４Ｎ−４、ＴＲＡＶ５−１、ＴＲＡＶ５−２、ＴＲＡＶ５−４、ＴＲＡＶ５Ｄ−２、ＴＲＡＶ５Ｄ−４、ＴＲＡＶ５Ｎ−２、ＴＲＡＶ５Ｎ−４、ＴＲＡＶ６−１、ＴＲＡＶ６−２、ＴＲＡＶ６−３、ＴＲＡＶ６−４、ＴＲＡＶ６−５、ＴＲＡＶ６−６、ＴＲＡＶ６−７、ＴＲＡＶ６Ｄ−３、ＴＲＡＶ６Ｄ−４、ＴＲＡＶ６Ｄ−５、ＴＲＡＶ６Ｄ−６、ＴＲＡＶ６Ｄ−７、ＴＲＡＶ６Ｎ−５、ＴＲＡＶ６Ｎ−６、ＴＲＡＶ６Ｎ−７、ＴＲＡＶ７−１、ＴＲＡＶ７−２、ＴＲＡＶ７−３、ＴＲＡＶ７−４、ＴＲＡＶ７−５、ＴＲＡＶ７−６、ＴＲＡＶ７Ｄ−２、ＴＲＡＶ７Ｄ−３、ＴＲＡＶ７Ｄ−４、ＴＲＡＶ７Ｄ−５、ＴＲＡＶ７Ｄ−６、ＴＲＡＶ７Ｎ−４、ＴＲＡＶ７Ｎ−５、ＴＲＡＶ７Ｎ−６、ＴＲＡＶ８−１、ＴＲＡＶ８−２、ＴＲＡＶ８Ｄ−１、ＴＲＡＶ８Ｄ−２、ＴＲＡＶ８Ｎ−２、ＴＲＡＶ９−１、ＴＲＡＶ９−２、ＴＲＡＶ９−３、ＴＲＡＶ９−４、ＴＲＡＶ９Ｄ−１、ＴＲＡＶ９Ｄ−２、ＴＲＡＶ９Ｄ−３、ＴＲＡＶ９Ｄ−４、ＴＲＡＶ９Ｎ−２、ＴＲＡＶ９Ｎ−３、ＴＲＡＶ９Ｎ−４、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１０Ｄ、ＴＲＡＶ１０Ｎ、ＴＲＡＶ１１、ＴＲＡＶ１１Ｄ、ＴＲＡＶ１１Ｎ、ＴＲＡＶ１２−１、ＴＲＡＶ１２−２、ＴＲＡＶ１２−３、ＴＲＡＶ１２Ｄ−１、ＴＲＡＶ１２Ｄ−２、ＴＲＡＶ１２Ｄ−３、ＴＲＡＶ１２Ｎ−１、ＴＲＡＶ１２Ｎ−２、ＴＲＡＶ１２Ｎ−３、ＴＲＡＶ１３−１、ＴＲＡＶ１３−２、ＴＲＡＶ１３−３、ＴＲＡＶ１３−４、ＴＲＡＶ１３−５、ＴＲＡＶ１３Ｄ−１、ＴＲＡＶ１３Ｄ−２、ＴＲＡＶ１３Ｄ−３、ＴＲＡＶ１３Ｄ−４、ＴＲＡＶ１３Ｎ−１、ＴＲＡＶ１３Ｎ−２、ＴＲＡＶ１３Ｎ−３、ＴＲＡＶ１３Ｎ−４、ＴＲＡＶ１４−１、ＴＲＡＶ１４−２、ＴＲＡＶ１４−３、ＴＲＡＶ１４Ｄ−１、ＴＲＡＶ１４Ｄ−２、ＴＲＡＶ１４Ｄ−３、ＴＲＡＶ１４Ｎ−１、ＴＲＡＶ１４Ｎ−２、ＴＲＡＶ１４Ｎ−３、ＴＲＡＶ１５−１、ＴＲＡＶ１５−２、ＴＲＡＶ１５Ｄ−１、ＴＲＡＶ１５Ｄ−２、ＴＲＡＶ１５Ｎ−１、ＴＲＡＶ１５Ｎ−２、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１６Ｄ、ＴＲＡＶ１６Ｎ、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、およびＴＲＡＶ２１からなる群から選択される。
【００１１】
[0011]一部の実施形態では、少なくとも１０個の異なるＴＲＢＶ遺伝子は、マウスＴＲＢＶ１、ＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３、ＴＲＢＶ４、ＴＲＢＶ５、ＴＲＢＶ８、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０、ＴＲＢＶ１２−１、ＴＲＢＶ１２−２、ＴＲＢＶ１３−１、ＴＲＢＶ１３−２、ＴＲＢＶ１３−３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１７、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０、ＴＲＢＶ２１、ＴＲＢＶ２３、ＴＲＢＶ２４、ＴＲＢＶ２６、ＴＲＢＶ２９、ＴＲＢＶ３０、およびＴＲＢＶ３１からなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１０個の異なるＴＲＡＶ遺伝子サブグループは、ＴＲＡＶ１、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８、ＴＲＡＶ９、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１１、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１３、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１５、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、およびＴＲＡＶ２１サブグループからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１０個の異なるＴＲＢＶ遺伝子サブグループは、マウスＴＲＢＶ１、ＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３、ＴＲＢＶ４、ＴＲＢＶ５、ＴＲＢＶ８、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０、ＴＲＢＶ１２、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１７、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０、ＴＲＢＶ２１、ＴＲＢＶ２３、ＴＲＢＶ２４、ＴＲＢＶ２６、ＴＲＢＶ２９、ＴＲＢＶ３０、およびＴＲＢＶ３１サブグループからなる群から選択される。
【００１２】
[0012]一部の実施形態では、複数の各融合ＴＣＲポリヌクレオチドは環状化される。一部の実施形態では、複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個の異なる配列を含む。
【００１３】
[0013]別の態様によれば、各々が免疫細胞由来の異なる融合ＴＣＲポリヌクレオチドを含む、複数のベクターが本明細書に提供される。一部の実施形態では、複数のベクターは、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個のベクターを含む。一部の実施形態では、複数のベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンである。一部の実施形態では、複数のベクターは、宿主細胞Ｉ型インターフェロン産生を低減させ、発現の持続時間を延長させ、タンパク質産生のレベルを増加させ、および／または二分免疫受容体に加えて治療利益を有するさらなる物質を発現させるように選択または操作されているＴＣ−８３アルファウイルスレプリコンの誘導体である。一部の実施形態では、複数のベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルスまたはそれらの偽型に由来する。一部の実施形態では、複数のベクターは非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属性ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフィア（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）である。
【００１４】
[0014]各々が、本明細書に記載される組成物由来の異なる融合ＴＣＲポリヌクレオチド、または本明細書に記載される複数のベクター由来の異なる融合ＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる、複数のＴＣＲであって、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個のＴＣＲを含む、複数のＴＣＲもまた、本明細書に提供される。
【００１５】
[0015]各々が、本明細書に記載される組成物由来の異なる融合ＴＣＲポリヌクレオチド、本明細書に記載される複数のベクターの異なるベクター、または本明細書に記載される複数のＴＣＲの異なるＴＣＲを含む、複数の宿主細胞もまた、本明細書に提供される。一部の実施形態では、複数の宿主細胞はＴ細胞またはＢ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、炎症性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、複数の宿主細胞は自家細胞である。一部の実施形態では、複数の宿主細胞は同種異系間細胞である。一部の実施形態では、複数の宿主細胞はドナーから得られる。一部の実施形態では、ドナーはヒトである。一部の実施形態では、ドナーは健康なドナーまたは疾患ドナーである。一部の実施形態では、複数の宿主細胞は試料から得られる。一部の実施形態では、試料は、血液試料、骨髄試料、臍帯血試料、腹水試料、胸水試料、脳脊髄試料、精液試料、痰試料、尿試料、糞便試料、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、試料は、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節、扁桃腺、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道、胸腺、胃、腫瘍、感染部位、またはそれらの組合せから得られる組織試料である。一部の実施形態では、複数の宿主細胞は細胞系細胞である。一部の実施形態では、細胞系細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２−ＯＳ細胞；ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ−１０８０細胞；ＨＣＴ−１１６細胞；Ｈｕ−ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；またはＭｏｌｔ  ４細胞である。一部の実施形態では、複数の宿主細胞は遺伝子修飾された細胞である。
【００１６】
[0016]一部の実施形態では、ＴＣＲアルファペプチド鎖、ＴＣＲベータペプチド鎖、ＴＣＲガンマペプチド鎖、ＴＣＲデルタペプチド鎖、ＢＣＲ重ペプチド鎖、またはＢＣＲ軽ペプチド鎖をコードする内因性遺伝子は、下方制御されるか、または不活性化される。一部の実施形態では、さらなる内因性遺伝子は下方制御されるか、または不活性化され、そのさらなる内因性遺伝子は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、複数の宿主細胞の各々は、宿主細胞の機能を向上させるためにさらなる作用物質を発現するように操作される。一部の実施形態では、機能は、細胞傷害機能、炎症誘発機能、または抗炎症機能である。一部の実施形態では、さらなる作用物質はサイトカインである。一部の実施形態では、サイトカインは炎症性サイトカインである。一部の実施形態では、サイトカインは抗炎症性サイトカインである。一部の実施形態では、サイトカインは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）；インターロイキン（ＩＬ）−１α；ＩＬ−１β；ＩＬ−２；ＩＬ−５；ＩＬ−６；ＩＬ−８；ＩＬ−１５；ＩＬ−１８；インターフェロン（ＩＦＮ−γ）；血小板活性化因子（ＰＡＦ）；単球走化性タンパク質１および２（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２）；マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）；ＣＸＣＬ８；ＣＸＣＬ９；ＣＸＣＬ１０；高移動度群ボックスタンパク質１（ＨＭＧＢ−１）、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、ＩＬ−１６、またはそれらのいずれかの組合せである。
【００１７】
[0017]別の態様によれば、複数のベクターであって、複数の各ベクターが、第１の核酸配列および第２の核酸配列を有する融合Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリヌクレオチドを含み、（１）第１の核酸配列が第１のＴＣＲペプチド鎖の第１の可変ドメインをコードし、第１の可変ドメインが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、（２）第２の核酸配列が第２のＴＣＲペプチド鎖の第２の可変ドメインをコードし、第２の可変ドメインが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み；各融合ＴＣＲポリヌクレオチドの第１および第２の核酸配列が免疫細胞由来の第１および第２のＴＣＲペプチド鎖の同種対をコードし；複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドが少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子由来のＶ領域を含む、複数のベクターを含む組成物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、複数のベクターは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、または少なくとも１，０００，０００個の異なる同種対を含む。一部の実施形態では、複数のベクターは、少なくとも約５個、１０個、５０個、１００個、２５０個、５００個、７５０個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、５０００個、７５００個、または１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、２０００００個、３０００００個、４０００００個、５０００００個、６０００００個、７０００００個、８０００００個、９０００００個、１００００００個、２００００００個、３００００００個、４００００００個、５００００００個、１０００００００個、２０００００００個、またはそれより多くの異なる同種対を含む。一部の実施形態では、複数のベクターは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個の異なる配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子は、少なくとも１０個の異なるＴＲＡＶ遺伝子サブグループおよび／または少なくとも１０個の異なるＴＲＢＶ遺伝子サブグループを含む。
【００１８】
[0018]別の態様によれば、複数のヒドロゲル粒子またはビーズを含む組成物であって、複数の各ヒドロゲル粒子またはビーズが、第１の免疫受容体ペプチド鎖の第１の可変ドメインをコードする第１の核酸分子およびその第１の増幅産物（ここで第１の可変ドメインはＣＤＲ３を含む）、第２の免疫受容体ペプチド鎖の第２の可変ドメインをコードする第２の核酸分子およびその第２の増幅産物（ここで第２の可変ドメインはＣＤＲ３を含む）を含み、第１の増幅産物および第２の増幅産物が、重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーを有するマトリクス内に包埋または封入されており、第１の増幅産物および第２の増幅産物の拡散が抑制される、組成物が本明細書に提供される。
【００１９】
[0019]別の態様によれば、複数のヒドロゲル粒子またはビーズを含む組成物であって、複数の各ヒドロゲル粒子またはビーズが、第１の免疫受容体ペプチド鎖の第１の可変ドメインをコードする第１の核酸分子およびその第１のプライマー伸長産物（ここで第１の可変ドメインはＣＤＲ３を含む）、ならびに第２の免疫受容体ペプチド鎖の第２の可変ドメインをコードする第２の核酸分子およびその第２のプライマー伸長産物（ここで第２の可変ドメインはＣＤＲ３を含む）を含み、第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物が、重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーを有するマトリクス内に包埋または封入されており、第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物の拡散が抑制される、組成物が本明細書に提供される。
【００２０】
[0020]一部の実施形態では、第１および第２のプライマー伸長産物は予め設計された配列を有するアダプターを含む。一部の実施形態では、アダプターは、第１または第２の核酸とハイブリダイズできないか、または相補的ではない。一部の実施形態では、アダプターは、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの配列または逆相補的配列を含む。一部の実施形態では、第１および第２のプライマー伸長産物は逆転写（ＲＴ）産物である。一部の実施形態では、第１および第２のプライマー伸長産物は第２の鎖合成（ＳＳＳ）産物である。一部の実施形態では、ＲＴ産物は拡散抑制剤に連結している。一部の実施形態では、ＳＳＳ産物は拡散抑制剤に連結している。一部の実施形態では、ＳＳＳ産物は拡散抑制剤に間接的に連結している。一部の実施形態では、第１および第２のプライマー伸長産物は第１および第２の増幅産物である。一部の実施形態では、第１の増幅産物および／または第２の増幅産物は拡散抑制剤に連結している。一部の実施形態では、第１の増幅産物および／または第２の増幅産物は捕捉剤を介して拡散抑制剤に連結している。一部の実施形態では、捕捉剤は、第１の増幅産物および／または第２の増幅産物のアダプター配列に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００２１】
[0021]一部の実施形態では、拡散抑制剤はポリマーである。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、または多糖である。一部の実施形態では、拡散抑制剤は粒子である。一部の実施形態では、粒子はマトリクスの孔径より大きい直径を有する。一部の実施形態では、拡散抑制剤はマトリクスである。一部の実施形態では、第１の核酸分子および第２の核酸分子は細胞から放出される。一部の実施形態では、細胞は単一細胞である。一部の実施形態では、細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、細胞はＴ細胞またはＢ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ２８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、またはそれらのいずれかの組合せである。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、形質芽球細胞、形質細胞、リンパ形質細胞様細胞、メモリーＢ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ−１細胞、Ｂ−２細胞、または調節性Ｂ細胞である。一部の実施形態では、第１の免疫受容体ペプチド鎖はＴＣＲアルファペプチド鎖であり、第２の免疫受容体ペプチド鎖はＴＣＲベータペプチド鎖である。一部の実施形態では、第１の免疫受容体ペプチド鎖はＴＣＲガンマペプチド鎖であり、第２の免疫受容体ペプチド鎖はＴＣＲデルタペプチド鎖である。一部の実施形態では、第１の免疫受容体ペプチド鎖は免疫グロブリン重ペプチド鎖であり、第２の免疫受容体ペプチド鎖は免疫グロブリン軽ペプチド鎖である。一部の実施形態では、第１の免疫受容体ペプチド鎖および第２の免疫受容体ペプチド鎖は二分免疫受容体の同種対である。一部の実施形態では、第１の増幅産物および第２の増幅産物は連結して連続ポリヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、第１の増幅産物および／または第２の増幅産物は、第１の核酸分子および／または第２の核酸分子の少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも１００００個、またはそれより多くのコピーを含む。一部の実施形態では、第１または第２の核酸は、拡散が抑制される。一部の実施形態では、第１の核酸分子および／または第２の核酸分子はデオキシリボ核酸またはリボ核酸である。一部の実施形態では、第１の核酸分子および／または第２の核酸分子は一本鎖核酸または二本鎖核酸である。一部の実施形態では、第１の核酸分子は第１の定常ドメインをさらにコードし、および／または第２の核酸分子は第２の定常ドメインをさらにコードする。一部の実施形態では、第１の定常ドメインは第１の細胞外定常ドメインであり、および／または第２の定常ドメインは第２の細胞外定常ドメインである。一部の実施形態では、第１の定常ドメインは、第１の細胞外定常ドメイン、第１のヒンジ領域、第１の膜貫通ドメイン、および第１の細胞質尾部を含み、ならびに／または第２の定常ドメインは、第２の細胞外定常ドメイン、第２のヒンジ領域、第２の膜貫通ドメイン、および第２の細胞質尾部を含む。
【００２２】
[0022]一部の実施形態では、複数のヒドロゲル粒子またはビーズは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個のヒドロゲル粒子またはビーズを含む。一部の実施形態では、複数のヒドロゲル粒子またはビーズは、二分免疫受容体の少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個の異なる同種対を含む。一部の実施形態では、ポリマーは、多糖、ポリアクリルアミド、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、多糖は、アガロース、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、キトサン、デンプン、デキストラン、またはアルギネートである。一部の実施形態では、モノマーは、アクリルアミドまたはメタクリルアミドモノマーである。一部の実施形態では、重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーは、アガロースおよびポリアクリルアミドの混合物を含む。一部の実施形態では、重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーは架橋されている。一部の実施形態では、第１の可変ドメインおよび／または第２の可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはそれらの組合せをさらに含む。一部の実施形態では、各ヒドロゲル粒子またはビーズはアガロースゲル粒子である。
【００２３】
[0023]別の態様によれば、少なくとも５つのヒドロゲル粒子のうちの複数を含む組成物であって、少なくとも５つのヒドロゲル粒子の各々が、（ａ）第１の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第１のポリヌクレオチドおよび（ｂ）第２の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第２のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み、第１および第２の免疫受容体ペプチド鎖の各々が固有の同種免疫受容体対合鎖を含み、少なくとも５つのヒドロゲル粒子の個々のヒドロゲル粒子の第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが単一細胞由来であり、（ｉｉ）互いに連結しており；ヒドロゲル粒子由来の第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの拡散が抑制される、組成物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡは増幅産物である。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは共有結合的に連結している。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはホスホジエステル結合によって連結している。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドは拡散抑制剤に連結している。
【００２４】
[0024]別の態様によれば、少なくとも５つのヒドロゲル粒子のうちの複数を含む組成物であって、少なくとも５つのヒドロゲル粒子の各々が、（ａ）第１の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第１のＲＮＡおよび（ｂ）第２の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第２のＲＮＡを含み、第１および第２の免疫受容体ペプチド鎖の各々が固有の同種免疫受容体対合鎖を含み、少なくとも５つのヒドロゲル粒子の個々のヒドロゲル粒子の各々の第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡが単一細胞由来であり、（１）各々の第１のＲＮＡが第１のＲＮＡの逆相補的配列を含む第１のｃＤＮＡとハイブリダイズされ、（２）各々の第２のＲＮＡが第２のＲＮＡの逆相補的配列を含む第２のｃＤＮＡとハイブリダイズされ；ヒドロゲル粒子からの第１のｃＤＮＡおよび第２のｃＤＮＡの拡散が抑制される、組成物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、第１のｃＤＮＡまたは第２のｃＤＮＡは、第１のＲＮＡまたは第２のＲＮＡとハイブリダイズできないか、または相補的ではない配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１のｃＤＮＡまたは第２のｃＤＮＡは、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの逆相補的配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１のｃＤＮＡまたは第２のｃＤＮＡは拡散抑制剤に連結している。
【００２５】
[0025]別の態様によれば、少なくとも５つのヒドロゲル粒子のうちの複数を含む組成物であって、少なくとも５つのヒドロゲル粒子の各々が、（ａ）第１の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第１のポリヌクレオチドおよび（ｂ）第２の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第２のポリヌクレオチドを含み、第１および第２の免疫受容体ペプチド鎖の各々が固有の同種免疫受容体対合鎖を含み、少なくとも５つのヒドロゲル粒子の個々のヒドロゲル粒子の各々の第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが単一細胞由来であり、（１）各々の第１のポリヌクレオチドが第１のプライマーとハイブリダイズされ、（２）各々の第２のポリヌクレオチドが第２のプライマーとハイブリダイズされ；ヒドロゲル粒子からの第１のプライマーおよび第２のプライマーの拡散が抑制される、組成物が本明細書に提供される。
【００２６】
[0026]一部の実施形態では、第１のプライマーまたは第２のプライマーは逆転写プライマーである。一部の実施形態では、第１のプライマーまたは第２のプライマーは増幅プライマーである。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態では、第１のプライマーまたは第２のプライマーは拡散抑制剤に連結している。
【００２７】
[0027]別の態様によれば、少なくとも５つのヒドロゲル粒子のうちの複数を含む組成物であって、少なくとも５つのヒドロゲル粒子の各々が、（ａ）第１の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第１のＤＮＡおよび（ｂ）第２の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第２のＤＮＡを含み、第１および第２の免疫受容体ペプチド鎖の各々が固有の同種免疫受容体対合鎖を含み、少なくとも５つのヒドロゲル粒子の個々のヒドロゲル粒子の各々の第１のＤＮＡおよび第２のＤＮＡが単一細胞由来であり、（１）各々の第１のＤＮＡが、第１の免疫受容体鎖をコードする配列の逆相補的配列を含む第１のポリヌクレオチドとハイブリダイズされ、（２）各々の第２のＤＮＡが、第２の免疫受容体鎖をコードする配列の逆相補的配列を含む第２のポリヌクレオチドとハイブリダイズされ；ヒドロゲル粒子からの第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの拡散が抑制される、組成物が本明細書に提供される。
【００２８】
[0028]一部の実施形態では、第１のＤＮＡまたは第２のＤＮＡはｃＤＮＡである。一部の実施形態では、第１のＤＮＡまたは第２のＤＮＡはゲノムＤＮＡである。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。一部の実施形態では、ヒドロゲル粒子からの第１のＤＮＡまたは第２のＤＮＡの拡散は抑制される。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドは増幅産物である。一部の実施形態では、増幅産物は、第１または第２のＤＮＡとハイブリダイズできないか、または相補的ではないアダプターを含む。一部の実施形態では、アダプターは捕捉剤とさらにハイブリダイズする。一部の実施形態では、捕捉剤は拡散抑制剤に連結している。一部の実施形態では、拡散抑制剤はポリマーまたは粒子である。一部の実施形態では、第１および第２の免疫受容体ペプチド鎖は、ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータペプチド鎖、ＴＣＲガンマおよびＴＣＲデルタペプチド鎖、またはＢＣＲ重および軽ペプチド鎖である。一部の実施形態では、単一細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞またはＢ細胞である。
【００２９】
[0029]別の態様によれば、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）複数のベッセルを生成するステップであって、各々が、（１）二分免疫受容体の第１のペプチド鎖をコードする第１の核酸および二分免疫受容体の第２のペプチド鎖をコードする第２の核酸を含む細胞と、（２）複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーとを含む、ステップと、（ｂ）複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを重合またはゲル化して複数の硬化粒子を形成するステップであって、複数の硬化粒子のそれぞれが重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーからなるマトリクスを有し、複数の硬化粒子のそれぞれが第１の核酸の第１のプライマー伸長産物および第２の核酸の第２のプライマー伸長産物を含み；第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物がマトリクス内に包埋または封入されており、第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物の拡散が抑制される、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００３０】
[0030]一部の実施形態では、第１および第２のプライマー伸長産物は、逆転写（ＲＴ）産物、第２の鎖合成（ＳＳＳ）産物、または増幅産物である。一部の実施形態では、第１および／または第２のプライマー伸長産物はアダプター配列を含む。一部の実施形態では、アダプター配列は、第１または第２の核酸分子とハイブリダイズできないか、または相補的ではない。一部の実施形態では、第１および第２のプライマー伸長産物は可変ドメインをコードする。一部の実施形態では、可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のプライマー伸長産物は定常ドメインをさらにコードする。
【００３１】
[0031]一部の実施形態では、方法は、細胞を溶解して第１の核酸および第２の核酸を放出させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、第１の核酸および第２の核酸を逆転写するステップをさらに含む。一部の実施形態では、逆転写するステップはＲＴプライマーを使用することによって実施される。一部の実施形態では、ＲＴプライマーは拡散抑制剤に連結しており、拡散抑制剤はマトリクス内のＲＴプライマーの拡散を抑制する。一部の実施形態では、方法は、鋳型スイッチ反応またはＳＳＳ反応を実施するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、第１の核酸および第２の核酸を増幅させて第１および第２の増幅産物を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第１または第２の核酸の各々について、増幅させるステップは、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーを使用することによって実施される。一部の実施形態では、第１の増幅プライマーは拡散抑制剤に連結しており、拡散抑制剤はマトリクス内の第１の増幅プライマーの拡散を抑制する。
【００３２】
[0032]一部の実施形態では、方法は、複数の硬化粒子を洗浄するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、複数の硬化粒子を洗浄して、試薬が複数の硬化粒子から拡散することを可能にするステップをさらに含む。一部の実施形態では、試薬は、ＲＴプライマー、増幅プライマー、鋳型スイッチプライマー、ＳＳＳプライマー、またはそれらのいずれかの組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、複数の硬化粒子を繰り返し洗浄するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、洗浄するステップの後に油中で複数の硬化粒子を乳化し、それによってさらなる複数のベッセルを形成するステップであって、さらなる複数のベッセルの各ベッセルが複数の硬化粒子の単一の硬化粒子を含む、ステップをさらに含む。一部の実施形態では、第１および第２のプライマー伸長産物は拡散抑制剤に連結している。一部の実施形態では、拡散抑制剤はポリマーである。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、または多糖である。一部の実施形態では、拡散抑制剤は粒子である。一部の実施形態では、粒子は、マトリクスの孔径より大きい直径を有する。一部の実施形態では、拡散抑制剤はマトリクスである。一部の実施形態では、第１および第２のプライマー伸長産物は、捕捉剤を介して拡散抑制剤に連結している。一部の実施形態では、捕捉剤は固定化部分を含む。一部の実施形態では、固定化部分は、捕捉剤を拡散抑制剤に連結する。
【００３３】
[0033]一部の実施形態では、固定化部分は反応基を含む。一部の実施形態では、捕捉剤はターゲティング部分をさらに含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は捕捉オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、第１の増幅プライマーは、捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１および第２の増幅産物は、捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含み、それによって第１および第２の増幅産物を捕捉剤に連結し、それによって拡散抑制剤に連結する。一部の実施形態では、反応基は、スクシンイミジルエステル、アミド、アクリルアミド、アシルアジド、ハロゲン化アシル、アシルニトリル、アルデヒド、ケトン、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジリジン、ボロネート、カルボジイミド、ジアゾアルカン、エポキシド、ハロアセトアミド、ハロプラチネート、ハロトリアジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホロアミダイト、ハロゲン化シリル、スルホン酸エステル、ハロゲン化スルホニル、アミン、アニリン、チオール、アルコール、フェノール、ヒラジン（ｈｙｒａｚｉｎｅ）、ヒドロキシルアミン、カルボン酸、グリコール、または複素環である。一部の実施形態では、方法は、第１の増幅産物および第２の増幅産物を連結して、さらなる複数のベッセルの各ベッセル内に融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを形成し、それによって複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを有する融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第１の増幅産物および第２の増幅産物はライゲーションまたはＰＣＲによって連結されている。一部の実施形態では、第１の増幅産物および第２の増幅産物はホスホジエステル結合によって連結して連続ポリヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、第１の増幅産物および第２の増幅産物はインフレームで連結している。
【００３４】
[0034]一部の実施形態では、方法は、さらなる複数のベッセルから複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを放出放出させるステップをさらに含む。
[0035]一部の実施形態では、方法は、複数の各融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを環状化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、複数の各融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドをベクターに挿入するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンである。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルスまたはそれらの偽型に由来する。一部の実施形態では、ベクターは非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属性ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフィアである。一部の実施形態では、二分免疫受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）である。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファペプチド鎖およびＴＣＲベータペプチド鎖、またはＴＣＲガンマペプチド鎖およびＴＣＲデルタペプチド鎖を含み；ＢＣＲは、重ペプチド鎖および軽ペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球はＴ細胞またはＢ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、炎症性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、形質芽球細胞、形質細胞、リンパ形質細胞様細胞、メモリーＢ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ−１細胞、Ｂ−２細胞、または調節性Ｂ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、腫瘍組織または血液試料から単離される。一部の実施形態では、方法は、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達するステップをさらに含む。一部の実施形態では、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個の異なる融合二分免疫受容体配列を含む。一部の実施形態では、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は二分免疫受容体の同種対である。一部の実施形態では、ベッセルは液滴である。一部の実施形態では、液滴は油中水液滴である。一部の実施形態では、硬化粒子はヒドロゲル粒子である。一部の実施形態では、ポリマーは、多糖、ポリアクリルアミド、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、多糖は、アガロース、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、キトサン、またはアルギネートである。一部の実施形態では、モノマーは、アクリルアミドまたはメタクリルアミドモノマーである。一部の実施形態では、重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーは、アガロースおよびポリアクリルアミドの混合物を含む。一部の実施形態では、重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーは架橋されている。一部の実施形態では、複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを重合またはゲル化するステップは、開始剤を使用するステップを含む。一部の実施形態では、開始剤はＵＶ光または化学物質である。一部の実施形態では、複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを重合またはゲル化するステップは、ベッセルの温度を低下させるステップを含む。
【００３５】
[0036]別の態様によれば、液体中で実施される方法であって、（ａ）核酸分子とハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第１の伸長産物を形成するステップと；（ｂ）第１の伸長産物またはその逆相補鎖を、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅させ、それによって第１の増幅産物を形成するステップと；（ｃ）液体中でポリマーマトリクスを生成してヒドロゲル粒子を形成し、それによって第１の増幅産物の拡散を抑制するステップと；（ｄ）ヒドロゲル粒子を洗浄し、それによってヒドロゲル粒子から第２のプライマーを枯渇させるステップとを含む、方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、第１のプライマーまたは第１の増幅産物は拡散抑制剤に連結している。
【００３６】
[0037]別の態様によれば、液体中で実施される方法であって、（ａ）核酸分子とハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第１の伸長産物を形成するステップと；（ｂ）液体中でポリマーマトリクスを生成してヒドロゲル粒子を形成し、それによって第１の伸長産物またはその逆相補鎖の拡散を抑制するステップと；（ｃ）ヒドロゲル粒子を洗浄するステップと；（ｄ）第１の伸長産物またはその逆相補鎖を、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅させ、それによって第１の増幅産物を形成するステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００３７】
[0038]一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第１の伸長産物は拡散抑制剤に連結している。一部の実施形態では、方法は、さらなる核酸（ｎｕｃｌｅｉ  ａｃｉｄ）分子とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長するステップをさらに含む。一部の実施形態では、核酸分子およびさらなる核酸分子は免疫受容体の第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖をコードし、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は免疫受容体の同種対である。一部の実施形態では、拡散抑制剤はポリマーまたは粒子である。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、または多糖である。一部の実施形態では、粒子は、ポリマーマトリクスの孔径より大きい直径を有する。一部の実施形態では、拡散抑制剤はポリマーマトリクスである。一部の実施形態では、核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸分子はゲノムＤＮＡである。一部の実施形態では、核酸分子はメッセンジャーＲＮＡである。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは逆転写（ＲＴ）プライマーである。一部の実施形態では、方法は、ＲＴプライマーを、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いて伸長し、それによって鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの逆相補的配列を有する第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、アダプター配列を有する第２の鎖合成（ＳＳＳ）プライマーを使用して第１の伸長産物の逆相補鎖を合成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、アダプター配列は、核酸分子または第１の伸長産物とハイブリダイズできないか、または相補的ではない。一部の実施形態では、第１の伸長産物はアダプター配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は免疫受容体のペプチド鎖をコードする。一部の実施形態では、方法は、ヒドロゲル粒子を洗浄した後または洗浄している間、試薬をヒドロゲル粒子と接触させ、その結果、試薬がヒドロゲル粒子内に拡散するステップをさらに含む。一部の実施形態では、試薬はオリゴヌクレオチドまたは酵素である。一部の実施形態では、酵素はポリメラーゼである。一部の実施形態では、方法は、洗浄した後、油中でヒドロゲル粒子を乳化するステップをさらに含む。
【００３８】
[0039]別の態様によれば、液体中で実施される方法であって、（ａ）複数の液滴を形成するステップであって、複数のうちの少なくとも２つの液滴が単一細胞を含む、ステップと；（ｂ）単一細胞由来の第１の核酸分子とハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第１の伸長産物を形成するステップ；および単一細胞由来の第２の核酸分子とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第２の伸長産物を形成するステップと；（ｃ）第１の伸長産物またはその逆相補鎖を、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む第１のプライマーセットを用いて増幅させ、それによって第１のセットの増幅産物を形成するステップ；および第２の伸長産物またはその逆相補鎖を、第３のプライマーおよび第４のプライマーを含む第２のプライマーセットを用いて増幅させ、それによって第２のセットの増幅産物を形成するステップと；（ｄ）第１のセットの増幅産物の増幅産物を第２のセットの増幅産物の増幅産物と連結させるステップであって、連結が、第２および第４のプライマーの不在下での液体中での連結を含む、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００３９】
[0040]別の態様によれば、液体中で実施される方法であって、（ａ）複数の液滴を形成するステップであって、複数のうちの少なくとも２つの液滴が単一細胞を含む、ステップと；（ｂ）単一細胞由来の第１の核酸分子とハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第１の伸長産物を形成するステップ；および単一細胞由来の第２の核酸分子とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第２の伸長産物を形成するステップと；（ｃ）第１の伸長産物またはその逆相補鎖を、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む第１のプライマーセットを用いて増幅させ、それによって第１のセットの増幅産物を形成するステップ；および第２の伸長産物またはその逆相補鎖を、第３のプライマーおよび第４のプライマーを含む第２のプライマーセットを用いて増幅させ、それによって第２のセットの増幅産物を形成するステップと；（ｄ）第２および第４のプライマーを除去するステップ；および第１のセットの増幅産物の増幅産物を第２のセットの増幅産物の増幅産物と連結させるステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００４０】
[0041]一部の実施形態では、各液滴は、複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを含む。一部の実施形態では、方法は、液体中のポリマーマトリクスを生成してヒドロゲル粒子を形成し、それによって第１のセットの増幅産物および第２のセットの増幅産物の拡散を抑制するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ヒドロゲル粒子を洗浄し、それによってヒドロゲル粒子から第２のプライマーおよび第４のプライマーを枯渇させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、連結させるステップは、第１および第２のセットの増幅産物に付着末端を生成するステップを含む。一部の実施形態では、増幅産物に付着末端を生成するステップはＵＳＥＲ酵素を使用するステップを含む。一部の実施形態では、連結させるステップは、第１および第２のセットの増幅産物をハイブリダイズするステップを含む。一部の実施形態では、連結させるステップは、第１および第２のセットの増幅産物をライゲーションするステップを含む。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび第３のプライマーは同じプライマーである。一部の実施形態では、第１のプライマー、第３のプライマー、第１のセットの増幅産物、または第２のセットの増幅産物は拡散抑制剤に連結している。
【００４１】
[0042]別の態様によれば、液体中で実施される方法であって、（ａ）複数の液滴を形成するステップであって、複数の少なくとも２つの液滴が単一細胞を含む、ステップと；（ｂ）単一細胞由来の第１の核酸分子とハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第１の伸長産物を形成するステップ；および単一細胞由来の第２の核酸分子とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第２の伸長産物を形成するステップと；（ｃ）液体中でポリマーマトリクスを生成してヒドロゲル粒子を形成し、それによって第１の伸長産物および第２の伸長産物の拡散が抑制される抑制するステップと；（ｄ）第１の伸長産物またはその逆相補鎖を、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む第１のプライマーセットを用いて増幅させ、それによって第１のセットの増幅産物を形成するステップ；および第２の伸長産物またはその逆相補鎖を、第３のプライマーおよび第４のプライマーを含む第２のプライマーセットを用いて増幅させ、それによって第２のセットの増幅産物を形成するステップと；（ｅ）第１のセットの増幅産物の増幅産物を第２のセットの増幅産物の増幅産物と連結させるステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００４２】
[0043]一部の実施形態では、方法は、（ｃ）の後にヒドロゲル粒子を洗浄するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、試薬をヒドロゲル粒子と接触させ、その結果、試薬がヒドロゲル粒子内に拡散するステップをさらに含む。一部の実施形態では、試薬は酵素またはオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは第１のプライマーセットおよび／または第２のプライマーセットを含む。一部の実施形態では、酵素は、ポリメラーゼ、リガーゼ、ＵＳＥＲ酵素、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、方法は、洗浄した後、油中でヒドロゲル粒子を乳化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドは拡散抑制剤に連結している。一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドはＲＴプライマーである。一部の実施形態では、方法は、第２の鎖合成（ＳＳＳ）プライマーを使用して第１および／または第２の伸長産物の逆相補鎖を合成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＳＳＳプライマーはアダプター配列を含む。一部の実施形態では、アダプター配列は第１および／または第２の伸長産物とハイブリダイズできないか、または相補的ではない。一部の実施形態では、方法は、ＲＴプライマーを、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを用いて伸長するステップをさらに含む。一部の実施形態では、単一細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞またはＢ細胞である。一部の実施形態では、第１の核酸分子および第２の核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。一部の実施形態では、第１の核酸分子は免疫受容体の第１のペプチド鎖をコードし、第２の核酸分子は免疫受容体の第２のペプチド鎖をコードする。一部の実施形態では、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は免疫受容体の同種対である。一部の実施形態では、第１のペプチド鎖または第２のペプチド鎖は可変ドメインを含む。一部の実施形態では、可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第１のペプチド鎖または第２のペプチド鎖は定常ドメインを含む。一部の実施形態では、第１のペプチド鎖または第２のペプチド鎖は膜貫通領域および／または細胞質尾部を含む。一部の実施形態では、免疫受容体はＢ細胞受容体である。一部の実施形態では、免疫受容体はＴ細胞受容体である。一部の実施形態では、拡散抑制剤はポリマーまたは粒子である。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリアクリルアミド、多糖、またはポリエチレングリコールである。一部の実施形態では、粒子は、ヒドロゲル粒子の孔径より大きい直径を有する。一部の実施形態では、拡散抑制剤はポリマーマトリクスである。一部の実施形態では、連結させるステップは、第１および第２のセットの増幅産物に付着末端を生成するステップを含む。一部の実施形態では、増幅産物に付着末端を生成するステップはＵＳＥＲ酵素を使用するステップを含む。一部の実施形態では、連結させるステップは、第１および第２のセットの増幅産物をハイブリダイズするステップを含む。一部の実施形態では、連結させるステップは、第１および第２のセットの増幅産物をライゲーションするステップを含む。
【００４３】
[0044]別の態様によれば、（ａ）宿主細胞の集団を取得するステップであって、集団における各宿主細胞が、自然に対合したＴＣＲアルファおよびベータペプチド鎖を有するＴＣＲまたは自然に対合したＢＣＲ重および軽ペプチド鎖を有するＢＣＲを発現し；（ｉ）集団由来の宿主細胞の亜集団、または（ｉｉ）集団由来の宿主細胞の亜集団の発現されたＴＣＲもしくはＢＣＲを濃縮し、宿主細胞の亜集団または宿主細胞の亜集団の発現されたＴＣＲもしくはＢＣＲが標的抗原または標的ＭＨＣ−抗原複合体に結合している、ステップと；（ｂ）ステップ（ｂ）からの濃縮した宿主細胞の亜集団または亜集団の発現されたＴＣＲもしくはＢＣＲを、標的抗原または標的ＭＨＣ−抗原複合体を発現する対象に投与するステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００４４】
[0045]一部の実施形態では、取得するステップは、本明細書に記載される方法のいずれかを使用するステップを含む。一部の実施形態では、（ｂ）は、宿主細胞の集団または発現されたＴＣＲもしくはＢＣＲを標的抗原もしくは標的ＭＨＣ−抗原複合体と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ＭＨＣはＭＨＣ四量体である。一部の実施形態では、（ｃ）は注射によって投与するステップを含む。一部の実施形態では、注射は、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に注射することを含む。一部の実施形態では、標的抗原は新抗原または腫瘍関連抗原である。
【００４５】
[0046]別の態様によれば、（１）少なくとも１，０００個の細胞のうちの複数を準備するステップであって、少なくとも１，０００個の細胞の各細胞がＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖を含む、ステップと；（２）少なくとも１，０００個の区画のうちの複数を準備するステップであって、少なくとも１，０００個の区画の各区画が固体支持体を含み、固体支持体が、（ａ）第１の共通配列、第２の共通配列、および第１の共通配列と第２の共通配列との間のＴＣＲアルファ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）第３の共通配列、第４の共通配列、および第３の共通配列と第４の共通配列との間のＴＣＲベータ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含み、各区画におけるＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖は複数の細胞のうちの少なくとも１つに存在する同種対であり、それによってＴＣＲアルファ鎖を各々コードする第１の複数のタンパク質コード配列およびＴＣＲベータ鎖を各々コードする第２の複数のタンパク質コード配列を準備する、ステップと；（３）各区画において第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを物理的に連結させるステップとを含む、方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、第１の複数のタンパク質コード配列は少なくとも１０のＴＲＡＶサブグループを含み、第２の複数のタンパク質コード配列は少なくとも１０のＴＲＢＶサブグループを含む。一部の実施形態では、少なくとも１，０００個の区画の各区画は、少なくとも１，０００個の細胞のうちの複数由来の細胞を含む。一部の実施形態では、区画は、ウェル、マイクロウェル、または液滴である。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズ、ヒドロゲル粒子、またはウェルもしくはマイクロウェルの表面である。一部の実施形態では、第１の共通配列、第２の共通配列、第３の共通配列、または第４の共通配列は、少なくとも１，０００個の区画のうちの複数において同じである。
【００４６】
[0047]別の態様によれば、少なくとも１，０００個の区画のうちの複数を含む組成物であって、少なくとも１，０００個の区画の各区画が固体支持体を含み、固体支持体が、（ａ）第１の共通配列、第２の共通配列、および第１の共通配列と第２の共通配列との間のＴＣＲアルファ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）第３の共通配列、第４の共通配列、および第３の共通配列と第４の共通配列との間のＴＣＲベータ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む第２のポリヌクレオチドとを含み、（ｉ）各区画におけるＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖が同種対であり、（ｉｉ）複数の区画における複数の第１の共通配列が同じ配列を有し、第１のプライマーとハイブリダイズできるか、または相補的であり、（ｉｉｉ）複数の区画における複数の第２の共通配列が同じ配列を有し、第２のプライマーとハイブリダイズできるか、または相補的であり、（ｉｖ）複数の区画における複数の第３の共通配列が同じ配列を有し、第３のプライマーとハイブリダイズできるか、または相補的であり、（ｖ）複数の区画における複数の第４の共通配列が同じ配列を有し、第４のプライマーとハイブリダイズできるか、または相補的である、組成物が本明細書に提供される。
【００４７】
[0048]一部の実施形態では、各区画は、第１のプライマー、第２のプライマー、第３のプライマー、および第４のプライマーをさらに含む。一部の実施形態では、第１のプライマーの濃度は少なくとも１ｎＭであり、第２のプライマーの濃度は少なくとも１ｎＭであり、第３のプライマーの濃度は少なくとも１ｎＭであり、第４のプライマーの濃度は少なくとも１ｎＭである。一部の実施形態では、第２の共通配列は、各区画における第４の共通配列またはその逆相補配列とハイブリダイズできるか、または相補的である。
【００４８】
[0049]別の態様によれば、少なくとも１，０００個の区画のうちの複数を含む組成物であって、少なくとも１，０００個の区画の各区画が、（ａ）５’末端における第１の共通配列、３’末端における第２の共通配列、および第１の共通配列と第２の共通配列との間のＴＣＲアルファ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む、第１の完全または部分的一本鎖ポリヌクレオチドと、（ｂ）５’末端における第３の共通配列、３’末端における第４の共通配列、および第３の共通配列と第４の共通配列との間のＴＣＲベータ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む、第２の完全または部分的一本鎖ポリヌクレオチドとを含み、（ｉ）ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖が同種対であり、（ｉｉ）第２の共通配列が第４の共通配列とハイブリダイズする、組成物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、第１の共通配列、第２の共通配列、第３の共通配列、または第４の共通配列は、少なくとも１，０００個の区画のうちの複数において同じである。一部の実施形態では、各区画は固体支持体をさらに含む。一部の実施形態では、固体支持体はビーズまたはヒドロゲル粒子である。
【００４９】
[0050]別の態様によれば、標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法であって、（ａ）複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を準備するステップであって、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が複数のＴＣＲのＴＣＲの同種対を発現する、ステップと；（ｂ）複数のＴ細胞を複数の区画に分配するステップであって、各区画が複数のＴ細胞の個々のＴ細胞を含む、ステップと；（ｃ）各区画内で、第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドおよび個々のＴ細胞のＴＣＲの同種対の第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを連結させ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを生成するステップであって、（ｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが個々のＴ細胞の内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または（ｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと；（ｄ）複数の融合ポリヌクレオチドを含む複数のベクターを生成するステップであって、複数のベクターの各ベクターが複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップと；（ｅ）複数のベクターを複数の細胞に送達するステップであって、複数の細胞の各細胞が複数のベクターのうちの少なくとも１つのベクターを含む、ステップと；（ｆ）複数の細胞における複数のベクターから複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、複数の細胞のサブセットが複数の標的反応性ＴＣＲを発現する、ステップと；（ｇ）複数の細胞を１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、複数の標的反応性ＴＣＲを発現する複数の細胞のサブセットが１つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップと；（ｈ）複数の細胞のサブセットの複数の標的反応性ＴＣＲの標的反応性ＴＣＲを同定するステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００５０】
[0051]別の態様によれば、標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法であって、（ａ）複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を準備するステップであって、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が複数のＴＣＲのＴＣＲの同種対を発現する、ステップと；（ｂ）複数のＴ細胞を複数の区画に分配するステップであって、各区画が複数のＴ細胞の個々のＴ細胞を含む、ステップと；（ｃ）各区画内で、第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドおよび個々のＴ細胞のＴＣＲの同種対の第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを連結させ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを生成するステップであって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが個々のＴ細胞の内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または（ｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと；（ｄ）複数の融合ポリヌクレオチドを複数の細胞に送達するステップであって、複数の細胞の各細胞が複数の融合ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップと；（ｅ）複数の細胞において複数のベクターから複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、複数の細胞のサブセットが複数の標的反応性ＴＣＲを発現する、ステップと；（ｆ）複数の細胞を１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、複数の標的反応性ＴＣＲを発現する複数の細胞のサブセットが１つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップと；（ｇ）複数の細胞のサブセットの複数の標的反応性ＴＣＲの標的反応性ＴＣＲを同定するステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００５１】
[0052]一部の場合、方法は、送達するステップの前に、複数の融合ポリヌクレオチドを含む複数のベクターを生成するステップであって、複数のベクターの各ベクターが複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップをさらに含む。一部の場合、複数の細胞は複数のレシピエント細胞である。一部の場合、内因性核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。一部の場合、ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。一部の場合、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。一部の場合、接触させるステップは、細胞の集団を、１つまたは複数の標的抗原を提示する１つまたは複数の細胞と接触させるステップをさらに含む。一部の場合、１つまたは複数の細胞は、１つもしくは複数の腫瘍細胞、腫瘍様塊（ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）、腫瘍溶解物パルス抗原提示細胞（ｔｕｍｏｒ  ｌｙｓａｔｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（ＡＰＣ）または１つもしくは複数の標的抗原を提示するように操作されたＡＰＣである。一部の場合、１つまたは複数の標的抗原を提示するように操作された１つまたは複数のＡＰＣは、標的抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡと共に送達される（例えば、トランスフェクトされるか、または電気穿孔される）。一部の場合、接触させるステップは、細胞の集団を腫瘍組織と接触させるステップをさらに含む。一部の場合、１つまたは複数の標的抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成している。一部の場合、ＭＨＣはＭＨＣ四量体である。一部の場合、第１のＴＣＲ鎖はＴＣＲアルファ鎖であり、第２のＴＣＲ鎖はＴＣＲベータ鎖である。一部の場合、第１のＴＣＲ鎖はＴＣＲガンマ鎖であり、第２のＴＣＲ鎖はＴＣＲデルタ鎖である。一部の場合、複数の細胞は細胞系細胞である。一部の場合、細胞系細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２−ＯＳ細胞；ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ−１０８０細胞；ＨＣＴ−１１６細胞；Ｈｕ−ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；またはＭｏｌｔ４細胞である。一部の場合、複数の細胞は、対象由来の試料から単離される。一部の場合、複数のＴ細胞は、対象由来の試料から単離される。一部の場合、試料は、腫瘍組織、血液試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、またはそれらの組合せである。一部の場合、腫瘍組織は多くても約２０００ｍｍ３である。一部の場合、血液試料は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。一部の場合、複数のＴ細胞は、腫瘍浸潤Ｔ細胞または末梢Ｔ細胞である。一部の場合、複数のＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、疲弊Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む。一部の場合、方法は、複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも１つの細胞を単離するステップをさらに含む。一部の場合、複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも１つの細胞はＦＡＣＳによって単離される。一部の場合、複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも１つの細胞はマーカーに基づいて単離される。一部の場合、マー���ーは、細胞表面マーカーまたはサイトカインである。一部の場合、細胞表面マーカーは、ＣＤ３９、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、またはそれらの組合せである。一部の場合、サイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、パーフォリン、またはそれらの組合せである。一部の場合、方法は、（ｉ）複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも１つの細胞を対象に投与するステップまたは（ｉｉ）同定された標的反応性ＴＣＲを含む自家もしくは同種異系間細胞を対象に投与するステップをさらに含む。一部の場合、自家または同種異系間細胞は、同定された標的反応性ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の場合、同定された標的反応性ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドは、融合ポリヌクレオチドもしくはその増幅産物であるか、または融合ポリヌクレオチドの第１のＴＣＲ鎖および第２のＴＣＲ鎖をコードする配列を含む。
【００５２】
[0053]別の態様によれば、複数の標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法であって、（ａ）複数のＴＣＲを発現する複数の細胞を準備するステップであって、複数の細胞の各細胞が複数のＴＣＲのＴＣＲを発現し、複数のＴＣＲが少なくとも５０個の異なる同種対を含み、複数のＶ遺伝子由来のＶ領域を含み、複数のＴＣＲが複数の細胞に対して外因性である、ステップと；（ｂ）複数の細胞を１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、複数の標的反応性ＴＣＲを発現する複数の細胞のサブセットが１つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップと；（ｃ）複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも２つの細胞を同定するステップであって、少なくとも２つの細胞が複数の標的反応性ＴＣＲのうちの少なくとも２つの標的反応性ＴＣＲを発現し、それによって複数の標的反応性ＴＣＲのうちの少なくとも２つの標的反応性ＴＣＲを同定する、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００５３】
[0054]一部の場合、複数のＶ遺伝子は、少なくとも１０個の異なるＶ遺伝子を含む。一部の場合、複数の細胞は、複数の遺伝子操作された細胞である。一部の場合、複数の細胞は、患者から単離されていない。一部の場合、複数の細胞は、対象由来の試料から単離される。一部の場合、試料は、組織試料、血液試料、ＰＢＭＣ試料、またはそれらの組合せである。一部の場合、複数の細胞は、疲弊Ｔ細胞を含まない。一部の場合、複数のＴＣＲは、少なくとも１００個の異なる同種対を含む。一部の場合、方法は、複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも２つの細胞を単離するステップをさらに含む。一部の場合、（ｂ）は、複数の細胞を、１つまたは複数の標的抗原を提示する１つまたは複数の細胞と接触させるステップを含む。一部の場合、１つまたは複数の細胞は、１つもしくは複数の腫瘍細胞、腫瘍様塊、腫瘍溶解物パルス抗原提示細胞（ＡＰＣ）または１つもしくは複数の標的抗原を提示するように操作されたＡＰＣである。一部の場合、１つまたは複数の標的抗原を提示するように操作された１つまたは複数のＡＰＣは、標的抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の場合、（ｂ）は、複数の細胞を腫瘍組織と接触させるステップを含む。一部の場合、（ｂ）は、複数の細胞を、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成している１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップを含む。一部の場合、ＭＨＣはＭＨＣ四量体である。一部の場合、１つまたは複数の標的抗原の配列または同一性は知られていない。一部の場合、方法は、複数の細胞のサブセットのうちの少なくとも２つの細胞のうちの少なくとも１つを対象に投与するステップをさらに含む。一部の場合、複数の細胞の各細胞がレポーター遺伝子を含み、細胞のＴＣＲが１つまたは複数の標的抗原の標的抗原に結合すると、レポーター遺伝子がシグナルを送るように調節される。一部の場合、複数の細胞は細胞系細胞である。一部の場合、複数のＴＣＲは、少なくとも１００の異なるＶＪの組合せを含む。
【００５４】
[0055]別の態様によれば、対象におけるがんを治療する方法であって、（ａ）複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を準備するステップであって、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が複数のＴＣＲのＴＣＲの同種対を発現する、ステップと；（ｂ）複数のＴ細胞を複数の区画に分配するステップであって、各区画が複数のＴ細胞の個々のＴ細胞を含む、ステップと；（ｃ）各区画内で、第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドおよび個々のＴ細胞のＴＣＲの同種対の第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを連結させ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを生成するステップであって、（ｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが個々のＴ細胞の内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または（ｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと；（ｄ）複数の融合ポリヌクレオチドを複数の細胞に送達するステップであって、複数の細胞の各細胞が複数の融合ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップと；（ｅ）複数の細胞において複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、複数の細胞のサブセットが、複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットから複数の標的反応性ＴＣＲを発現する、ステップと；（ｆ）複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットから複数の標的反応性ＴＣＲを同定するステップと；（ｇ）複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットの１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドまたはその誘導体を複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、複数のレシピエント細胞の各細胞が、複数の融合ポリヌクレオチドのサブセットの１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドまたはその誘導体のうちの少なくとも１つを含む、ステップと；（ｈ）（ｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも１つのレシピエント細胞を対象に投与するステップまたは（ｉｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも２つのレシピエント細胞を対象に投与するステップであって、少なくとも２つのレシピエント細胞が異なるＴＣＲを発現する、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００５５】
[0056]一部の場合、複数のＴ細胞は、腫瘍浸潤Ｔ細胞または末梢Ｔ細胞である。一部の場合、複数のＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、疲弊Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む。一部の場合、複数のＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化され、および／または増殖する。一部の場合、複数の融合ポリヌクレオチドは複数のベクターにおいて送達され、複数のベクターの各ベクターが、複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む。一部の場合、方法は、（ｄ）における送達するステップの前に、複数のベクターを生成するステップをさらに含む。一部の場合、（ｆ）における同定するステップは、複数の細胞を１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、複数の標的反応性ＴＣＲを発現する複数の細胞のサブセットが、１つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップを含む。一部の場合、１つまたは複数の標的抗原は、１つまたは複数の腫瘍細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示される。一部の場合、１つまたは複数のＡＰＣは、（ｉ）１つもしくは複数の標的抗原によってパルスされるか、または（ｉｉ）標的抗原をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを含む。一部の場合、１つまたは複数の抗原の各抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成している。一部の場合、ＭＨＣはＭＨＣ四量体である。一部の場合、方法は、（ｇ）における送達するステップの前に、複数の細胞のサブセットの１つまたは複数の細胞を単離するステップをさらに含む。一部の場合、方法は、対象から複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を単離するステップをさらに含む。一部の場合、投与するステップが、複数のＴ細胞を単離してから多くても約６０日後、５０日後、４０日後、３０日後、２０日後またはそれより少ない日数の後に実施される。一部の場合、複数のレシピエント細胞は、同種異系間細胞、自家細胞、または細胞系細胞である。一部の場合、複数の細胞は、遺伝子操作された細胞または細胞系細胞である。一部の場合、方法は、（ｈ）の前に、複数のレシピエント細胞を増殖させるステップをさらに含む。一部の場合、誘導体は、１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの配列を含む。一部の場合、誘導体は、１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの増幅産物または合成産物である。
【００５６】
[0057]別の態様によれば、対象における腫瘍を治療する方法であって、（ａ）複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する対象から複数のＴ細胞を単離するステップであって、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が、複数のＴＣＲのＴＣＲの同種対を発現し、複数のＴＣＲが複数の腫瘍反応性ＴＣＲを含む、ステップと；（ｂ）複数のＴＣＲから複数の腫瘍反応性ＴＣＲを同定するステップと；（ｃ）複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、複数のレシピエント細胞の各レシピエント細胞が、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ステップと；（ｄ）複数のレシピエント細胞において複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現させるステップと；（ｅ）（ｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも１つのレシピエント細胞を対象に投与するステップ、または（ｉｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも２つのレシピエント細胞を対象に投与するステップであって、少なくとも２つのレシピエント細胞が異なるＴＣＲを発現し、投与が、（ａ）における複数のＴ細胞を単離してから多くても約６０日後、５０日後、４０日後、３０日後、２０日後またはそれより少ない日数の後に実施される、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００５７】
[0058]別の態様によれば、対象における腫瘍を治療する方法であって、（ａ）複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する対象から複数のＴ細胞を単離するステップであって、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が、複数のＴＣＲのＴＣＲの同種対を発現し、複数のＴＣＲが複数の腫瘍反応性ＴＣＲを含む、ステップと；（ｂ）複数のＴＣＲから複数の腫瘍反応性ＴＣＲを同定するステップと；（ｃ）複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、複数のレシピエント細胞の各レシピエント細胞が、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ステップと；（ｄ）複数のレシピエント細胞において複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現させるステップと；（ｅ）（ｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも１つのレシピエント細胞を対象に投与するステップ、または（ｉｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも２つのレシピエント細胞を対象に投与するステップであって、少なくとも２つのレシピエント細胞が異なるＴＣＲを発現し、複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも１つまたは少なくとも２つのレシピエント細胞を対象に投与するために対象から複数のＴ細胞を単離してから約６０日超、５０日超、４０日超、３０日超、２０日超またはそれより少ない日数の間、対象の腫瘍が進行していない、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００５８】
[0059]別の態様によれば、対象における腫瘍を治療する方法であって、（ａ）複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する対象から複数のＴ細胞を単離するステップであって、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が、複数のＴＣＲのＴＣＲの同種対を発現し、複数のＴＣＲが複数の腫瘍反応性ＴＣＲを含む、ステップと；（ｂ）複数のＴＣＲから複数の腫瘍反応性ＴＣＲを同定するステップと；（ｃ）複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、複数のレシピエント細胞の各レシピエント細胞が、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ステップと；（ｄ）複数のレシピエント細胞において複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現させるステップと；（ｅ）（ｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも１つのレシピエント細胞を対象に投与するステップ、または（ｉｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも２つのレシピエント細胞を対象に投与するステップであって、少なくとも２つのレシピエント細胞が異なるＴＣＲを発現し、（ｉ）腫瘍サイズが、約５０％未満、３０％未満、４０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満もしくは２％未満だけ増加しているか、または（ｉｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも１つまたは少なくとも２つのレシピエント細胞を投与するために複数のＴ細胞を単離してから対象における腫瘍細胞の数が、約２倍、３倍、４倍、５倍またはそれを超えて増加していない、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００５９】
[0060]別の態様によれば、対象における腫瘍を治療する方法であって、（ａ）複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する対象から複数のＴ細胞を単離するステップであって、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が、複数のＴＣＲのＴＣＲの同種対を発現し、複数のＴＣＲが複数の腫瘍反応性ＴＣＲを含む、ステップと；（ｂ）複数のＴＣＲから複数の腫瘍反応性ＴＣＲを同定するステップと；（ｃ）複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、複数のレシピエント細胞の各レシピエント細胞が、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ステップと；（ｄ）複数のレシピエント細胞において複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現させるステップと；（ｅ）（ｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも１つのレシピエント細胞を対象に投与するステップ、または（ｉｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも２つのレシピエント細胞を対象に投与するステップであって、少なくとも２つのレシピエント細胞が異なるＴＣＲを発現し、複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも１つまたは少なくとも２つのレシピエント細胞を投与するために複数のＴ細胞を単離してから腫瘍が新たなステージまで進行していない、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００６０】
[0061]別の態様によれば、対象における腫瘍を治療する方法であって、（ａ）複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する対象から複数のＴ細胞を単離するステップであって、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が、内因性核酸から複数のＴＣＲのＴＣＲの同種対を発現し、複数のＴＣＲが複数の腫瘍反応性ＴＣＲを含む、ステップと；（ｂ）複数のＴＣＲから複数の腫瘍反応性ＴＣＲを同定するステップと；（ｃ）複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップであって、複数のレシピエント細胞の各レシピエント細胞が、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、（ｉ）ポリヌクレオチドが内因性核酸の転写産物もしくは増幅産物であるか、または（ｉｉ）ポリヌクレオチドがホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない、ステップと；（ｄ）複数のレシピエント細胞において複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現させるステップと；（ｅ）（ｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも１つのレシピエント細胞を対象に投与するステップ、または（ｉｉ）複数のレシピエント細胞のうちの少なくとも２つのレシピエント細胞を対象に投与するステップであって、少なくとも２つのレシピエント細胞が異なるＴＣＲを発現する、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００６１】
[0062]一部の場合、方法は、ホスホロアミダイトを使用した複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットをコードするポリヌクレオチドの化学合成を含まない。一部の場合、複数のＴ細胞は腫瘍浸潤Ｔ細胞または末梢Ｔ細胞である。一部の場合、複数のＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、疲弊Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、またはそれらのいずれかの組合せを含む。一部の場合、複数のレシピエント細胞は、同種異系間Ｔ細胞、自家Ｔ細胞、または細胞系細胞である。一部の場合、方法は、（ｂ）の前に、複数のレポーター細胞において複数のＴＣＲを発現させるステップをさらに含む。一部の場合、発現させるステップは、ウイルスベクターによって複数のＴＣＲをコードする核酸配列を送達するステップを含む。一部の場合、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。一部の場合、複数のレポーター細胞の各レポーター細胞はレポーター遺伝子を含む。一部の場合、（ｂ）において、同定するステップは、複数のＴＣＲを、１つもしくは複数の標的抗原、または１つもしくは複数の標的抗原を提示する細胞もしくは組織と接触させるステップを含む。一部の場合、１つまたは複数の標的抗原は、１つまたは複数の腫瘍細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示される。一部の場合、１つまたは複数のＡＰＣは、標的抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の場合、１つまたは複数の標的抗原はＭＨＣと複合体を形成している。一部の場合、ＭＨＣはＭＨＣ四量体である。一部の場合、複数のＴＣＲの複数の腫瘍反応性ＴＣＲは、ＴＣＲの少なくとも２個、５個、１０個、１５個、または２０個の異なる同種対を含む。一部の場合、複数の腫瘍反応性ＴＣＲの各ＴＣＲは、異なるエピトープまたは異なるタンパク質に特異的である。一部の場合、複数の腫瘍反応性ＴＣＲの各ＴＣＲは、異なる（ｉ）ＴＣＲアルファＣＤＲ３配列、（ｉｉ）ＴＣＲベータＣＤＲ３可変ドメイン配列、（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ可変ドメイン配列、（ｉｖ）ＴＣＲベータ可変ドメイン配列、または（ｖ）ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータ可変ドメイン配列の組合せを含む。一部の場合、複数の腫瘍反応性ＴＣＲは、対象由来の腫瘍細胞に結合するが、対象由来の健康な細胞に結合しないか、または腫瘍細胞に対してより少なくとも１０分の１低い親和性で対象由来の健康な細胞に結合する。一部の場合、（ｅ）において投与される複数のレシピエント細胞は、（ａ）において単離される複数のＴ細胞より少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも１００，０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍多い細胞を含む。
【００６２】
[0063]別の態様によれば、対象における腫瘍を治療する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の集団を発現する対象からＴ細胞の集団を単離するステップであって、Ｔ細胞の集団が多くても約１０，０００個の細胞を含む、ステップと；（ｂ）ＴＣＲの集団から複数の腫瘍反応性ＴＣＲを同定するステップと；（ｃ）複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現する複数の細胞を対象に投与するステップであって、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットが少なくとも２個の異なる同種対を含む、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００６３】
[0064]別の態様によれば、対象における腫瘍を治療する方法であって、（ａ）ＴＣＲの集団から複数の腫瘍反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するステップであって、ＴＣＲの集団がＴＣＲの少なくとも５０個の異なる同種対を含む、ステップと；（ｂ）複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現する複数の細胞を対象に投与するステップであって、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットが、少なくとも５０個の異なる同種対のうちの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または少なくとも２０個の異なる同種対を含み、複数の腫瘍反応性ＴＣＲが複数の細胞に対して外因性である、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。一部の場合、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットは少なくとも５個のＴＣＲを含み、少なくとも５個のＴＣＲの各ＴＣＲは、（１）異なるエピトープもしくは異なるタンパク質に特異的であるか、または（２）異なる（ｉ）ＴＣＲアルファＣＤＲ３配列、（ｉｉ）ＴＣＲベータＣＤＲ３可変ドメイン配列、（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ可変ドメイン配列、（ｉｖ）ＴＣＲベータ可変ドメイン配列、もしくは（ｖ）ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータ可変ドメイン配列の組合せを含む。
【００６４】
[0065]一部の場合、方法は、（ａ）の前に、対象からＴＣＲの集団を発現するＴ細胞の集団を単離するステップをさらに含む。一部の場合、少なくとも５０個の異なる同種対は、少なくとも５個、１０個、１５個、または２０個の異なるＶ遺伝子由来のＶ領域を含む。一部の場合、同定するステップは、マーカーによって複数の腫瘍反応性ＴＣＲを単離するステップを含む。一部の場合、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットを発現する複数の細胞は、複数の同種異系間細胞、自家細胞または細胞系細胞である。一部の場合、複数の同種異系間細胞は、抑制性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体に結合するタンパク質を発現する。一部の場合、タンパク質は、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−ＥまたはＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ融合タンパク質である。
【００６５】
[0066]別の態様によれば、標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための方法であって、（ａ）第１の試料由来の複数のＴ細胞を、対象由来の腫瘍細胞を含む第２の試料または第３の試料と接触させるステップであって、第３の試料が第２の試料に由来し、第３の試料が、（ｉ）第２の試料の腫瘍細胞由来の標的抗原または標的抗原をコードする核酸、およびＭＨＣ、（ｉｉ）ＭＨＣにおける標的抗原を提示する細胞、または（ｉｉｉ）ＭＨＣを含む細胞および核酸によってコードされるタンパク質産物を含み、複数のＴ細胞のサブセットが、ＭＨＣと複合体を形成している標的抗原に結合する、ステップと；（ｂ）第１の試料の複数のＴ細胞のサブセットまたはその一部を単離するステップと；（ｃ）複数のＴ細胞のサブセットまたはその一部を複数の区画に分配するステップであって、各区画が複数のＴ細胞のサブセットまたはその一部の個々のＴ細胞を含む、ステップと；（ｄ）各区画内で、第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドおよび個々のＴ細胞のＴＣＲの同種対の第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを同定し、それによって１つまたは複数の対合ポリヌクレオチドを生成するステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【００６６】
[0067]一部の場合、同定するステップは、第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドおよび個々のＴ細胞のＴＣＲの同種対の第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを物理的に連結させるステップを含む。一部の場合、１つまたは複数の対合ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドである。一部の場合、同定するステップは、第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドおよび個々のＴ細胞のＴＣＲの同種対の第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドをシークエンシングするステップを含む。
【００６７】
[0068]一部の場合、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、ホスホロアミダイトを使用して化学的に合成されていない。一部の場合、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、個々のＴ細胞の内因性核酸の転写産物または増幅産物である。一部の場合、第１の試料または第２の試料は対象から単離される。一部の場合、第１の試料および第２の試料は同じ対象から単離される。一部の場合、第１の試料および第２の試料は異なる対象から単離される。一部の場合、第１の試料または第２の試料は、組織試料、血液試料、ＰＢＭＣ試料、またはそれらの組合せである。一部の場合、組織試料は、腫瘍組織または健康な組織である。一部の場合、第１の試料または第２の試料は、コア生検、細針生検、またはアフェレーシスによって対象から単離される。一部の場合、単離するステップは、マーカーによって複数のＴ細胞のサブセットまたはその一部を単離するステップを含む。一部の場合、マーカーは、細胞表面マーカーまたはサイトカインである。一部の場合、細胞表面マーカーは、ＣＤ３９、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、またはそれらの組合せである。一部の場合、標的抗原を提示する細胞は、腫瘍細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、人工ＡＰＣ、またはそれらのいずれかの組合せである。一部の場合、ＡＰＣまたはａＡＰＣは、標的抗原によりパルスされる。一部の場合、核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞は、核酸またはその誘導体と共に送達される（例えば、トランスフェクトされるまたは電気穿孔される）ＡＰＣまたはａＡＰＣである。一部の場合、ＡＰＣまたはａＡＰＣは、ＭＨＣをコードするさらなる核酸と共にさらに送達される。一部の場合、核酸またはその誘導体はＤＮＡまたはＲＮＡである。一部の場合、標的抗原を提示する細胞または核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞は、対象から単離されるか、または細胞系細胞である。一部の場合、標的抗原を提示する細胞または核酸によってコードされるタンパク質産物を含む細胞は、第１の試料および第２の試料が単離される同じ対象から単離される。一部の場合、方法は、１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のベクターを生成するステップであって、１つまたは複数のベクターの各ベクターが、１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドの融合ポリヌクレオチドを含む、ステップをさらに含む。一部の場合、方法は、１つまたは複数のベクターを複数の細胞に送達するステップであって、複数の細胞の各細胞が１つまたは複数のベクターのうちの少なくとも１つのベクターを含む、ステップをさらに含む。一部の場合、方法は、複数の細胞において１つまたは複数の融合ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、複数の細胞のサブセットが複数の標的反応性ＴＣＲを発現する、ステップをさらに含む。一部の場合、方法は、複数の細胞を１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップであって、複数の標的反応性ＴＣＲを発現する複数の細胞のサブセットが１つまたは複数の標的抗原に結合する、ステップをさらに含む。一部の場合、方法は、複数の標的反応性ＴＣＲの１つまたは複数の標的反応性ＴＣＲを同定するステップをさらに含む。一部の場合、方法は、１つまたは複数の標的反応性ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達するステップをさらに含む。一部の場合、方法は、複数のレシピエント細胞の１つまたは複数の細胞を対象に投与するステップをさらに含む。
【００６８】
[0069]別の態様によれば、本明細書に記載される方法によって同定される標的反応性または腫瘍反応性ＴＣＲをコードする配列を含むレシピエント細胞を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
【００６９】
[0070]別の態様によれば、本明細書に記載される医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法が本明細書に提供される。一部の場合、レシピエント細胞は、約１×１０９細胞〜約１×１０１１細胞の用量で投与される。
【００７０】
[0071]本開示のさらなる態様および利点は、本開示の単に例示的な実施形態が示され、記載される、以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろう。実現されるように、本開示は他のおよび異なる実施形態を可能にし、全て本開示から逸脱せずに、そのいくつかの詳細は種々の明らかな観点において改変が可能になる。したがって、図面および説明は、本質的に例示とみなされ、限定とみなされるべきではない。
【００７１】
参照による組み込み
[0072]本明細書に言及されている全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個々に参照により組み込まれることが示された場合と同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合、本明細書が、いずれかのそのような矛盾する事項に優先し、および／または矛盾する事項より優位になることが意図される。
【００７２】
[0073]本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に特に記載される。本発明の特徴および利点のさらなる理解は、本発明の原理を利用する例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、およびその添付の図面（本明細書の「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」、「図（Ｆｉｇ.）」、および「図（ＦＩＧＵＲＥ）」も）を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】[0074]図１は、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドおよび免疫受容体発現ベクターを産生する一般概念の例示的なスキームを示す図である。複数起源の免疫受容体発現細胞（例えば、３つのＴ細胞が示される）は同時に処理され得る。各細胞について、二分免疫受容体の２つの遺伝子の配列（例えば、Ｔ細胞１のＴ細胞受容体アルファ遺伝子座の遺伝子ＴＲＡおよびＴ細胞受容体ベータ遺伝子座の遺伝子ＴＲＢ、それぞれＴＲＡ１およびＴＲＢ１と名付けられた）を融合させて、両鎖をコードする融合ＤＮＡ分子を作製し、それは融合二分免疫受容体遺伝子と呼ぶことができる（ステップ１）。融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、１つの容器、例えば試験管内で混合され得る（ステップ２）。融合ＤＮＡ分子は、免疫受容体発現ベクターに作製され得る（ステップ３）。
【図２】[0075]図２は、例のように、３つのＴ細胞（図に示すように、Ｔ細胞１、Ｔ細胞２、およびＴ細胞３）を使用する、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを産生する単一細胞反応器の概念の例示的なスキームを示す図である。（ａ）各細胞は単一細胞反応器に入れることができる。（ｂ）細胞は、それらのそれぞれの単一細胞反応器内で溶解させて、２つの鎖をコードするｍＲＮＡ分子（例えば、Ｔ細胞１からＴＲＡおよびＴＲＢ、それぞれＴＲＡ１およびＴＲＢ１と名付けられた）を放出させることができる。（ｃ）次いで、各ｍＲＮＡ分子をＤＮＡ分子に変換させて、増幅することができる。（ｄ）融合ＤＮＡ分子（例えば、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチド）は、各鎖の増幅産物をライゲートさせることによって作製され得る。単一細胞反応器間の障壁のため、異なる細胞からのＴＲＡおよびＴＲＢの誤対合（例えば、ＴＲＢ２と融合したＴＲＡ１）は最小限にすることができる。
【図３】[0076]図３は、例としてＴＣＲを使用する、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドの異なる可能な方向を示す図である。点線の矢印は、タンパク質コード配列のセンス鎖の方向を示す。この例では、センス鎖の５’末端は「ヘッド」を指し、センス鎖の３’末端は「テイル」を指す。
【図４Ａ】[0077]図４Ａは、テイル−テイル方向でＴＲＡとＴＲＢを融合する例示的な戦略を示す図である。
【図４Ｂ】[0078]図４Ｂは、テイル−テイル方向でＴＲＡとＴＲＢを融合する例示的な戦略を示す図である。
【図５Ａ】[0079]図５Ａは、ＴＲＡの後にＴＲＢが続く順番で、ヘッド−テイル方向でＴＲＡとＴＲＢを融合する例示的な戦略を示す図である。
【図５Ｂ】[0080]図５Ｂは、ＴＲＡの後にＴＲＢが続く順番で、ヘッド−テイル方向でＴＲＡとＴＲＢを融合する例示的な戦略を示す図である。
【図５Ｃ】[0081]図５Ｃは、ＴＲＡの後にＴＲＢが続く順番で、ヘッド−テイル方向でＴＲＡとＴＲＢを融合する例示的な戦略を示す図である。
【図６Ａ】[0082]図６Ａは、テイル−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを、二方向プロモーターを有する免疫受容体発現ベクターへと変換する例示的な方法を示す図である。
【図６Ｂ】[0083]図６Ｂは、テイル−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを、二方向プロモーターを有する免疫受容体発現ベクターへと変換する例示的な方法を示す図である。
【図７Ａ】[0084]図７Ａは、テイル−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを、２シストロン性免疫受容体発現ベクターへと変換する例示的な方法を示す図である。
【図７Ｂ】[0085]図７Ｂは、テイル−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを、２シストロン性免疫受容体発現ベクターへと変換する例示的な方法を示す図である。
【図７Ｃ】[0086]図７Ｃは、テイル−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを、２シストロン性免疫受容体発現ベクターへと変換する例示的な方法を示す図である。
【図７Ｄ】[0087]図７Ｄは、テイル−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを、２シストロン性免疫受容体発現ベクターへと変換する例示的な方法を示す図である。
【図８Ａ】[0088]図８Ａは、ヘッド−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを、２シストロン性免疫受容体発現ベクターへと変換する例示的な方法を示す図である。
【図８Ｂ】[0089]図８Ｂは、ヘッド−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを、２シストロン性免疫受容体発現ベクターへと変換する例示的な方法を示す図である。
【図８Ｃ】[0090]図８Ｃは、ヘッド−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを、２シストロン性免疫受容体発現ベクターへと変換する例示的な方法を示す図である。
【図９Ａ】[0091]図９Ａは、テイル−テイル方向でＴＲＡとＴＲＢを融合する例示的な戦略を示す図である。
【図９Ｂ】[0092]図９Ｂは、テイル−テイル方向でＴＲＡとＴＲＢを融合する例示的な戦略を示す図である。
【図１０Ａ】[0093]図１０Ａは、ヘッド−テイル方向でＴＲＡとＴＲＢを融合する例示的な戦略を示す図である。
【図１０Ｂ】[0094]図１０Ｂは、ヘッド−テイル方向でＴＲＡとＴＲＢを融合する例示的な戦略を示す図である。
【図１１Ａ】[0095]図１１Ａは、水相が細胞およびプライマー−改変アガロースを含む、液滴形成の例を示す図である。
【図１１Ｂ】[0096]図１１Ｂは、形成された液滴の例を示す図である。明るい点は色素によって染色された細胞核を示し、より大きな球体はアガロースビーズを示す。
【図１２】[0097]図１２は、実施例８に記載するように、ＯＥ−ＰＣＲのエマルジョンの例示的なイメージを示す図である。拡大図は、ＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖ポリヌクレオチドを含有するアダプターを封入するアガロースビーズを含有するいくつかの液滴を示す。
【図１３】[0098]図１３は、シークエンシングライブラリー構築およびシークエンシングの例示的なスキームを示す図である。この図で使用する場合、（ｐ）は部分を意味し、（ｆ）は全長を意味する。
【図１４】[0099]図１４は、対合リードカウントマトリクス（Ｍ０）を示す例示的なシークエンシングデータを示す図である。
【図１５】[00100]図１５Ａは、ＴＲＡとＴＲＢクローンの優性対合を示す例示的なシークエンシングデータを示す図である。[00101]図１５Ｂは、ＴＲＡとＴＲＢクローンの優性対合を示す例示的なシークエンシングデータを示す図である。[00102]図１５Ｃは、ＴＲＡとＴＲＢクローンの優性対合を示す例示的なシークエンシングデータを示す図である。[00103]図１５Ｄは、ＴＲＡとＴＲＢクローンの優性対合を示す例示的なシークエンシングデータを示す図である。[00104]図１５Ｅは、ＴＲＡとＴＲＢクローンの優性対合を示す例示的なシークエンシングデータを示す図である。[00105]図１５Ｆは、ＴＲＡとＴＲＢクローンの優性対合を示す例示的なシークエンシングデータを示す図である。
【図１６Ａ】[00106]図１６Ａは、Ａ１、Ａ２、またはＡ３によって示すように、トップ１、２、または３のＴＲＢ対合パートナーにマップしたＴＲＡクローンのリードのクローンワイズな画分を示す例示的なシークエンシングデータを示す図である。
【図１６Ｂ】[00107]図１６Ｂは、Ｂ１、Ｂ２、またはＢ３によって示すように、トップ１、２、または３のＴＲＡ対合パートナーにマップしたＴＲＢクローンのリードのクローンワイズな画分を示す例示的なシークエンシングデータを示す図である。
【図１７Ａ】[00108]図１７Ａは、検出された優性対合の数を示す例示的なシークエンシングデータを示す図である。
【図１７Ｂ】[00109]図１７Ｂは、優性対合によって与えられるリードの画分を示す例示的なシークエンスデータを示す図である。
【図１８】[00110]図１８は、抗原についての先験的な知識の無い腫瘍反応性（または腫瘍特異的）ＴＣＲを選択する例示的なスキームを示す図である。
【図１９】[00111]図１９は、腫瘍反応性（または腫瘍特異的）ＴＣＲを選択し、ＴＣＲを発現するレシピエント細胞を使用して、対象における腫瘍を治療する例示的なスキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
[00112]本発明の種々の実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。多数のバリエーション、変更および置換が本発明から逸脱せずに当業者に想起され得る。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替が利用され得ることは理解されるべきである。
【００７５】
[00113]本開示では、具体的に別段の記載がない限り、単数形の使用は複数形を含む。また、別段の記載がない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定することを意図するものではない。
【００７６】
定義
[00114]「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差の範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣行に従い、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲において記載される場合、別段の記載がない限り、特定の値についての許容可能な誤差の範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
【００７７】
[00115]「免疫受容体」という用語は、免疫細胞がその標的を認識するために産生する受容体タンパク質または受容体タンパク質複合体を指す。標的は抗原またはその一部（例えば、エピトープ）であってもよい。抗原はタンパク質またはペプチドであってもよい。標的はＭＨＣ結合ペプチドであってもよい。免疫受容体の例には、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、抗体（「免疫グロブリン」と交換可能に使用される）、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が含まれる。
【００７８】
[00116]「免疫受容体鎖」という用語は、免疫受容体のサブユニットとして機能するポリペプチドを指す。免疫受容体鎖の例には、免疫グロブリン（Ｉｇ）の重鎖、免疫グロブリンの軽鎖、ＴＣＲのアルファ鎖、ＴＣＲのベータ鎖、ＴＣＲのガンマ鎖、ＴＣＲのデルタ鎖が含まれる。
【００７９】
[00117]「二分免疫受容体（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）」という用語は、２つの遺伝子によってコードされるポリペプチドによって形成される免疫受容体を指す。細胞内では、２つの遺伝子は染色体または異なる染色体の異なる遺伝子座に位置し得る。２つの遺伝子は、Ｖ（Ｄ）Ｊ再配列遺伝子などの再配列遺伝子であってもよい。Ｖ（Ｄ）Ｊ再配列遺伝子は、一次リンパ系臓器において発生し、可変（Ｖ）、結合（Ｊ）、および一部の場合、多様性（Ｄ）遺伝子セグメントをほぼランダム様式で再配列する、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えと呼ばれる機構によって生成され得る。二分免疫受容体の例には、限定されないが、ＢＣＲ（再配列重鎖遺伝子および再配列軽鎖遺伝子によってコードされる）、抗体（再配列重鎖遺伝子および再配列軽鎖遺伝子によってコードされる）、およびＴＣＲ（再配列ＴＲＡ遺伝子および再配列ＴＲＢ遺伝子によってコードされる、または再配列ＴＲＧ遺伝子および再配列ＴＲＤ遺伝子によってコードされる）が含まれる。
【００８０】
[00118]「遺伝子」という用語は、潜在的に転写および／または翻訳され得る核酸配列を指す（この定義は、５’および３’における調節エレメント、ならびに存在する場合、イントロンを含む）。オーファン（ｏｒｐｈｏｎ）および偽遺伝子もまた、「遺伝子」の概念の例である。一般に、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子とは、生殖細胞系列における遺伝子セグメントを指し、これらの生殖細胞系列遺伝子配列はＩＭＧＴデータベースにおいて見出され得る。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え後、再配列遺伝子におけるＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントは、それぞれＶ領域、Ｄ領域およびＪ領域と称される。再配列遺伝子におけるＶ領域、Ｄ領域およびＪ領域は、それぞれ生殖細胞系列におけるＶ遺伝子、Ｄ遺伝子またはＪ遺伝子に由来する。
【００８１】
[00119]「ソース免疫受容体発現細胞」という用語は、免疫受容体が免疫受容体発現ベクター内でクローニングされ得る免疫受容体発現細胞を指す。免疫受容体が二分免疫受容体である場合、これらの細胞は、後で免疫受容体発現ベクターに変換され得る、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを産生するために本明細書に記載される方法において入力細胞として使用され得る。例えば、ソース免疫受容体発現細胞は、ソースＢＣＲ発現細胞、ソース抗体発現細胞、またはソースＴＣＲ発現細胞であってもよい。
【００８２】
[00120]「融合二分免疫受容体ポリヌクレオチド」という用語は、二分免疫受容体の両方の遺伝子（再配列遺伝子を含む）についてのコード配列を含む連続ポリヌクレオチド分子を指し、そのコード配列は免疫受容体鎖をコードする完全または部分的配列であり得る。例えば、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、融合ＢＣＲポリヌクレオチド、融合抗体ポリヌクレオチド、または融合ＴＣＲポリヌクレオチドであってもよい。
【００８３】
[00121]「免疫受容体発現ベクター」という用語は、（１）融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを含み、（２）宿主細胞（例えば、本明細書に記載されるレシピエント細胞）において免疫受容体を発現するために使用され得るポリヌクレオチドベクター（プラスミドまたはウイルスベクターなど）を指す。例えば、免疫受容体発現ベクターは、ＢＣＲ発現ベクター、抗体発現ベクター、またはＴＣＲ発現ベクターであってもよい。
【００８４】
[00122]「レシピエント細胞」という用語は、免疫受容体発現ベクターが機能的に導入され得る細胞を指す。「機能的に導入される」という語句は、免疫受容体発現ベクターにおいてコードされる免疫受容体がレシピエント細胞において発現され得ることを意味する。レシピエント細胞の例には、限定されないが、ＣＤ４５＋細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、幹細胞、細菌細胞、酵母細胞および細胞系が含まれる。
【００８５】
[00123]「免疫受容体プログラムレシピエント細胞」という用語は、免疫受容体発現ベクターを保持し、免疫受容体を発現するように操作されたレシピエント細胞を指す。適切な場合、「免疫受容体プログラムレシピエント細胞」という語句における「免疫受容体」という単語は、「ＢＣＲ」、「抗体」または「ＴＣＲ」と置き換えられてもよい。適切な場合、「免疫受容体プログラムレシピエント細胞」という語句における「レシピエント細胞」という語句は、レシピエント細胞として使用される細胞の種類、例えば、「ＣＤ４５＋細胞」、「Ｔ細胞」、「Ｂ細胞」、「マクロファージ」、「ＮＫ細胞」、「幹細胞」、「ＨｅＬａ細胞」、「ＣＨＯ細胞」、「細菌細胞」および「酵母細胞」と置き換えられてもよい。例えば、免疫受容体プログラムレシピエント細胞は、ＴＣＲプログラムＴ細胞、ＢＣＲプログラムＢ細胞、または抗体プログラムＣＨＯ細胞であってもよい。
【００８６】
[00124]本明細書で使用される場合、「操作された」という用語およびその文法的等価物は、核酸（例えば、生物のゲノム内の核酸）またはポリペプチドの１つまたは複数の変更を指すことができる。１つまたは複数の変更には、遺伝子の修飾、付加および／または欠失が含まれ得る。操作された細胞とは、付加され、欠失され、および／または変更された遺伝子を有する細胞を指すことができる。
【００８７】
[00125]「ポリクローナル免疫受容体プログラムレシピエント細胞」という用語は、発現される１つより多い異なる免疫受容体を有する免疫受容体プログラムレシピエント細胞の集団を指す。発現される１つより多い異なる免疫受容体の各々は、異なるエピトープ、異なる抗原、または異なるＭＨＣによって提示されるエピトープに対して反応することができる。ポリクローナル免疫受容体プログラムレシピエント細胞の集団において発現される異なる免疫受容体の総数は、１００、１，０００、１０，０００、１００，０００または１，０００，０００を超えてもよい。一部の場合、ポリクローナル免疫受容体プログラムレシピエント細胞の集団において発現される異なる免疫受容体の総数は、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも５００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、少なくとも５，０００，０００個またはそれより多くであってもよい。
【００８８】
[00126]配列のドメインレベルの説明：本開示では、ポリヌクレオチド配列はドメインレベルで記載され得る。各ドメイン名は特定のポリヌクレオチド配列に対応し得る。例えば、ドメイン「Ａ」は５’−ＴＡＴＴＣＣＣ−３’の配列を有し得、ドメイン「Ｂ」は５’−ＡＧＧＧＡＣ−３’の配列を有し得、ドメイン「Ｃ」は５’−ＧＧＧＡＡＧＡ−３’の配列を有し得る。この場合、ドメインＡ、ＢおよびＣの連結である配列を有するポリヌクレオチドは、［Ａ｜Ｂ｜Ｃ｝と書くことができる。符号「［」は５’末端を示し、符号「｝」は３’末端を示し、符号「｜」はドメイン名を区切る。配列「Ｘ」を有するｓｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡの部分は、［Ｘ｝と称され得る。アスタリスク記号は配列相補性を示す。例えば、ドメイン［Ｘ＊｝は、ドメイン［Ｘ｝の逆相補体である。ｄｓ［Ｘ｝という表記は、［Ｘ｝および［Ｘ＊｝によって形成される二本鎖ＤＮＡを記載するために使用され得る。一部の場合、特にｄｓＤＮＡとｓｓＤＮＡとを区別する必要がない状況では、一方の鎖が配列［Ｘ｝を有するｄｓＤＮＡもまた、大まかに［Ｘ｝と称され得る。［Ｘ｝と同一の配列（ＴをＵと置き換えていることを除いて）を有する一本鎖ＲＮＡ分子またはセグメントもまた、［Ｘ｝と称され得る。文脈に応じて、ドメイン名は、正確な配列を指す場合があるか、またはＤＮＡもしくはドメインの一般的機能を記載する場合がある。例えば、［ＲＢＳ｝はリボソーム結合部位を記載するために使用され得るが、［ＲＢＳ｝についての正確な配列は変わってもよい。丸括弧はドメインの連結を分類するために使用され得、逆相補体操作（「＊」によって示される）は閉じ丸括弧の後に「＊」を付加することによって連結に適用され得る。例えば、［（Ｘ｜Ｙ）＊｝は［Ｙ＊｜Ｘ＊｝と同じである。
【００８９】
[00127]「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用される。それらは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログを指すことができる。ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、またはそれらのバリアントから選択される１つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは一般に、ヌクレオシドおよび少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多くのリン酸（ＰＯ３）基を含む。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）、および１つまたは複数のリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、種々の機能を実行することができる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖分析から規定された遺伝子座（複数も含む）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの、１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変がポリマーのアセンブリの前または後に与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識化成分とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに改変されてもよい。
【００９０】
[00128]ポリヌクレオチドは、非標準的なヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび／または改変ヌクレオチドを含む、１つまたは複数のヌクレオチドバリアントを含むことができる。改変ヌクレオチドの例には、限定されないが、ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン（ｘａｎｔｉｎｅ）、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｄ４６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノプリンなどが含まれる。一部の場合、ヌクレオチドは、トリホスフェート部分に対する改変を含む、それらのホスフェート部分における改変を含んでもよい。そのような改変の非限定的な例には、より長い長さのホスフェート鎖（例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多くのホスフェート部分を有するホスフェート鎖）およびチオール部分（例えば、アルファ−チオトリホスフェートおよびベータ−チオトリホスフェート）を用いた改変が含まれる。核酸分子はまた、塩基部分（例えば、典型的に、相補的ヌクレオチドと水素結合を形成するために利用可能である１つもしくは複数の原子においておよび／または典型的に、相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することができない１つもしくは複数の原子において）、糖部分またはホスフェート骨格において改変されてもよい。核酸分子はまた、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）などのアミン反応部分の共有結合性付着を可能にするために、アミノアリル（ａｍｉｎｏ  ａｌｌｙ  １）−ｄＵＴＰ（ａａ−ｄＵＴＰ）およびアミノヘキシルアクリルアミド（ａｍｉｎｏｈｅｘｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）−ｄＣＴＰ（ａｈａ−ｄＣＴＰ）などの、アミン改変基を含有してもよい。本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準的なＤＮＡ塩基対またはＲＮＡ塩基対に対する代替物は、立法ｍｍあたりのビットでのより高い密度、より高い安全性（天然毒素の偶発的または意図的な合成に対する抵抗性）、光プログラム化ポリメラーゼにおける���り容易な識別、またはより下級の二次構造を提供することができる。このような代替の塩基対は、新規および／または増幅合成のための天然および突然変異体ポリメラーゼと適合性がある。
【００９１】
[00129]ペプチドという用語は、アミノ酸のポリマーであり、アミド結合を介して一緒に結合され、代替的に「ポリペプチド」と称される。本明細書の文脈において、アミノ酸はＬ−光学異性体またはＤ−光学異性体であり得ることは理解されるべきである。ペプチドは２つ以上のアミノ酸モノマーの長さであり、多くの場合、２０より多いアミノ酸モノマーの長さであり得る。ポリペプチドは、線状に構造化されていなくてもよいか、または三次元構造に折り畳まれていてもよい。構造化されたポリペプチドはタンパク質であり得る。一部の場合、ペプチドは新抗原ペプチドである。一部の場合、ペプチドは腫瘍関連抗原ペプチドである。
【００９２】
[00130]「新抗原」という用語は、ゲノムによりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させる腫瘍特異的突然変異から生じる腫瘍抗原のクラスを指す。
[00131]本明細書で使用される場合、「配列」という用語およびその文法的等価物は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を指すことができる。ポリヌクレオチド配列はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく；線状、環状または分枝状であってもよく；一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。配列は突然変異されてもよい。配列は、任意の長さ、例えば、２から１，０００，０００の間またはそれより多くのアミノ酸またはヌクレオチドの長さ（またはそれらの間もしくはそれらを上回る任意の整数値）、例えば、約１００から約１０，０００の間のヌクレオチドまたは約２００から約５００の間のアミノ酸もしくはヌクレオチドであってもよい。核酸の配列は実際の配列および配列の逆相補的配列を包含し得る。
【００９３】
[00132]本明細書で使用される「ベッセル」という用語は、生化学反応（例えば、標的タンパク質および抗体結合、核酸ハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長）が発生し得る区画（例えば、マイクロ流体チャネル、ウェル、管または液滴）を指す。「ベッセル」および「区画」という用語は交換可能に使用され得る。ベッセルまたは区画は、固体壁付き（ｓｏｌｉｄ−ｗａｌｌｅｄ）（ベッセルまたは区画の境界が、ガラス、プラスチックまたはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの固体である場合）または液体壁付き（ｌｉｑｕｉｄ−ｗａｌｌｅｄ）（ベッセルまたは区画の境界が油などの液体である場合）であってもよい。固体壁付きベッセルは、ベッセルを全て接続する連続した固体である、固体足場を含有することができる。区画の体積は１ｍＬほどの大きさまたは１ピコリットルほどの小ささであってもよい。一部の実施形態では、複数の区画の区画のメジアン径は、１〜１０ピコリットル、１０〜１００ピコリットル、１００ピコリットル〜１ナノリットル、１〜１０ナノリットル、１０〜１００ナノリットル、１００ナノリットル〜１マイクロリットル、１〜１０マイクロリットル、１０〜１００マイクロリットル、または１００〜１０００マイクロリットルである。区画内の水性含有物の体積は区画の体積より小さくてもよいか、または区画の体積とほぼ等しくてもよい。一部の実施形態では、区画内の水性含有物のメジアン体積は１マイクロリットルまたはそれ以下である。ベッセルは複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを含むことができる。複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーは、重合またはゲル化すると、ヒドロゲルまたは硬化マトリクスを形成することができ、それによって硬化粒子を形成する。硬化粒子はビーズであってもよい。硬化粒子は多孔質粒子であってもよい。硬化粒子はヒドロゲル粒子であってもよい。ヒドロゲル粒子は、架橋ポリアクリルアミド、架橋ＰＥＧ、アガロースまたはアルギネートなどのゲル化ポリマーから作製され得る。硬化粒子は処理または刺激により融解され得る。例えば、アガロース粒子は高温によって融解され得る。クロスリンカーにおけるジスルフィド結合を有するポリアクリルアミド粒子は、ベータメルカプトエタノールまたはＤＴＴなどの還元剤で処理することによって融解され得る。
【００９４】
[00133]「液滴」という用語はある体積の液体を指す。「エマルジョン」とは、第１の液体が第２の液体中に溶解しないか、または混和しない、第２の液体中の第１の液体の微小液滴の分散を指す。エマルジョンの例には、油中水エマルジョン、水中油中水エマルジョンまたは脂質層（リポソーム）中水エマルジョンが含まれる。本明細書で使用される場合：「油中水エマルジョン」とは、油が連続相を形成し、水が不連続液滴中にある油中水混合物を指す。一部の実施形態では、液滴は均一のサイズまたは不均一のサイズであってもよい。一部の実施形態では、複数の液滴における液滴のメジアン直径は約０．００１μｍ〜約１ｍｍの範囲であり得る。一部の実施形態では、複数の液滴における液滴のメジアン体積は、０．０１ナノリットル〜１マイクロリットルの範囲であり得る。
【００９５】
[00134]「粒子」という用語は、球状、糸状、ブラシ状および多くの不規則な形を含む、任意の形状の不溶性物質を指す。粒子は内部に規則的またはランダムなチャネルを有する多孔質であってもよい。例には、シリカ、セルロース、セファロースビーズ、ポリスチレン（固体、多孔質および誘導体化（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚｅｄ））ビーズ、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、ゲルビーズ、ゾル、生体細胞、細胞内粒子、微生物（原性動物、細菌、酵母、ウイルスなど）ミセル、リポソーム、シクロデキストリン、二相系（例えば、ワックス中のアガロースビーズ）など、および物質を封入またはカプセル化することができる他の構造が含まれる。
【００９６】
[00135]本明細書で使用される場合、「分配」という用語は、動詞であってもよいか、または名詞であってもよい。動詞（「分配するため」または「分配する」）として使用される場合、この用語は一般に、１つの画分（または細分割）を別の画分から隔離するために使用され得るベッセル間の種または試料の分画（例えば、細分割）を指す。このようなベッセルは名詞の「分配」を使用して参照される。分配することは、例えば、マイクロ流体工学、ディスペンシング、ボルテックスなどを使用して実施され得る。分配は、例えば、ウェル、マイクロウェル、ホール、液滴（例えば、エマルジョン中の液滴）、エマルジョンの連続相、試験管、スポット、カプセル、ビーズ、希釈溶液中のビーズの表面、または試料の１つの画分を別の画分から隔離するための任意の他の適切な容器であってもよい。分配はまた、別の分配を含んでもよい。油中水エマルジョンは、マイクロ流体工学を使用することによって、または必要に応じて界面活性剤の存在下で水相と油相の混合物の物理的撹拌によって作り出され得る。
【００９７】
[00136]「重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマー」という用語は、重合または非重合機構を介してマトリクスを形成することができる任意のポリマーまたはモノマーを指す。本開示での使用に適した重合可能またはゲル化可能なポリマーは、水性液体中に溶解または分散できるものである。重合可能またはゲル化可能なポリマーには、架橋可能な基を介して適切な架橋剤と架橋することができるものが含まれる。「重合可能」は「架橋可能な」の意味を包含し得る。重合は、モノマーからのポリマー形成のプロセスであり得、線形ポリマーからの架橋ポリマー形成のプロセスでもあり得る。重合可能なポリマーはマクロマーであってもよい。本明細書で使用される場合、「マクロマー」という用語は、さらなる重合に関与し得る官能基を有する任意のポリマーまたはオリゴマーを指す。
【００９８】
[00137]「マトリクス」、「フレームワーク」および「ポリマーフレームワーク」という用語は交換可能に使用されてもよく、ベッセル内に形成されるポリマーネットワークを指すことができる。
【００９９】
[00138]「固体支持体」、「支持体」、「固相支持体」、「基板」という用語および他の文法的等価物は、分子の付着または会合に適した個々の部位を含有するように改変され得る任意の材料を指す。それらは剛性または半剛性表面（複数も含む）を有する材料または材料の群であってもよい。可能な基板には、限定されないが、ガラスおよび改変されたまたは機能化されたガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）などを含む）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリコンおよび改変シリコンを含むシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束および様々な他のポリマーが含まれる。固体支持体または基板はマルチウェルプレートであってもよい。一部の実施形態では、固体支持体の少なくとも１つの表面は実質的に平坦であってもよいが、一部の実施形態では、それは、異なる分子または例えば、ウェル、隆起領域、ピン、エッチングされたトレンチなどとの反応のための領域を物理的に分離することが有用であり得る。一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズ、樹脂、粒子、ゲル、ミクロスフェアまたは他の幾何学的形状の形態を取ることができる。
【０１００】
[00139]「濃縮する」、「単離する」、「分離する」、「選別する」、「精製する」、「選択する」という用語またはそれらの等価物は交換可能に使用されてもよく、試料由来の所与の特性を有する副試料を取得することを指す。例えば、それらは、例えば、ある特定の細胞マーカーを発現するか、またはその細胞表現型のある特定の細胞マーカー遺伝子特徴を発現しない、ある特定の細胞表現型を有する所望の細胞系列または所望の細胞のうちの少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を含有する細胞集団または細胞試料を取得することを指すことができる。
【０１０１】
概説
[00140]免疫受容体、例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、複数のサブユニットまたは鎖によって形成され得る。ＢＣＲ（およびＢＣＲの可溶型、すなわち抗体）分子は、重鎖（Ｈ鎖）の２つの同一のコピーおよび軽鎖（Ｌ鎖）の２つの同一のコピーによって形成され得る。ＴＣＲ分子は、アルファ鎖（ＴＲＡ遺伝子／配列によってコードされるα鎖またはＴＣＲα鎖）およびベータ鎖（ＴＲＢ遺伝子／配列によってコードされるβ鎖またはＴＣＲβ鎖）、またはガンマ鎖（ＴＲＧ遺伝子／配列によってコードされるγ鎖またはＴＣＲγ鎖）およびデルタ鎖（ＴＲＤ遺伝子／配列によってコードされるδ鎖またはＴＣＲδ鎖）によって形成され得る。これらの免疫受容体鎖は可変ドメイン（例えば、再配列ＶＤＪまたはＶＪ領域によってコードされる）を有することができる。可変ドメインの一部は超可変であってもよい。超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことができる。一部の場合、１つのＢ細胞内で、１つのみの機能的Ｈ鎖配列および１つの機能的Ｌ鎖配列が発現され得る。一部の場合、１つのＴ細胞内で、１つのみの機能的α鎖配列および１つの機能的β鎖配列が発現され得る。一部の場合、１つのＴ細胞内で、１つのみの機能的γ鎖配列および１つの機能的δ鎖配列が発現され得る。
【０１０２】
[00141]これらの免疫受容体のクローニングは、さらなる機能的研究および適用のために有用であり得る。しかしながら、これらの免疫受容体の二分性質により、従来の技術を使用して操作することが困難になり得る。例えば、１００個のＴ細胞が溶解した場合、１００個のＴＣＲα鎖および１００個のＴＣＲβ鎖をシークエンスおよび／またはクローニングすることができるが、ソースＴＣＲ発現細胞内でどのＴＣＲα鎖がどのＴＣＲβ鎖と対合しているかを知ることは困難であり得る。これらの１００個のＴ細胞から、ＴＣＲα鎖をコードする第１の配列およびＴＣＲβ鎖をコードする第２の配列を各々含む１００個の物理的に融合したＤＮＡ分子を取得することができれば、より価値があり得る（図１、ステップ１）。次いでＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は１つのソースＴＣＲ発現細胞内で共発現され得る。そのような融合分子は、対合したＴＲＡおよびＴＲＢ配列を取得するためにシークエンスされ得る。さらに、これらの融合分子は、発現ベクターを作り出すために、さらに操作され得、ベクターバックボーン（例えば、プラスミドバックボーン）に挿入され得（図１、ステップ３）、その結果、対合したＴＲＡおよびＴＲＢ配列が、免疫受容体プログラムレシピエント細胞を産生するために本明細書に記載されるレシピエント細胞と呼ばれる新たな宿主細胞内で発現され得る。この場合、第１の配列はＴＣＲα鎖の３つ全てのＣＤＲ配列を含むことができ、第２の配列はＴＣＲβ鎖の３つ全てのＣＤＲ配列を含むことができる。同様の操作がＢ細胞の集団に対して実施され得る。これらの免疫受容体発現ベクターは、ＴＣＲ−Ｔ療法、抗体療法、抗体操作、およびＴＣＲまたは特定の抗原もしくは抗原のセットを認識する抗体の同定などの複数の適用において使用され得る。
【０１０３】
[00142]融合免疫受容体鎖の生成は単一細胞反応器内で実施され得る。単一細胞反応器は液滴またはヒドロゲル粒子であってもよい。本明細書に記載される単一細胞反応器を使用した組成物および方法は、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドの集団のハイスループットクローニングを可能にすることができ、二分免疫受容体の少なくとも約１，０００個、１０，０００個、１００，０００個、１，０００，０００個または１０，０００，０００個の固有の同種対を含有する、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチド、免疫受容体発現ベクターまたは免疫受容体プログラムレシピエント細胞のライブラリーを生成することができる。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
[00143]本明細書に記載される免疫受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であってもよい。本明細書に提供される組成物および方法は、ＴＣＲα鎖をコードする第１の核酸配列およびＴＣＲβ鎖をコードする第２の核酸配列、またはＴＣＲγ鎖をコードする第１の核酸配列およびＴＣＲδ鎖をコードする第２の核酸配列を含む融合ＴＣＲポリヌクレオチドを産生するために使用され得る。融合ＴＣＲポリヌクレオチドはプロモーターをさらに含むことができ、および／またはレシピエント細胞内で発現されるようにベクターに挿入され得る。
【０１０４】
[00144]ＴＣＲは、種々のがんまたは感染性生物に関連する抗原を認識するＴ細胞の能力を与えるために使用され得る。ＴＣＲは、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖またはガンマ（γ）およびデルタ（δ）鎖の両方から構成される。これらの鎖を構成するタンパク質は、ＴＣＲの非常に多くの多様性を生じるための固有の機構を利用する、ＤＮＡによってコードされる。このマルチサブユニット免疫認識受容体はＣＤ３複合体と会合し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩおよびＩＩタンパク質によって提示されるペプチドに結合する。ＡＰＣ上の抗原ペプチドへのＴＣＲの結合は、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の接触点での免疫学的シナプスにおいて発生する、Ｔ細胞活性化における中心的な事象であり得る。
【０１０５】
[00145]ＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩ分子との関連でＴ細胞エピトープを認識することができる。ＭＨＣクラスＩタンパク質は高等脊椎動物の全ての有核細胞内で発現され得る。ＭＨＣクラスＩ分子は、１２ｋＤａの軽鎖β−２ミクログロブリンと非共有結合的に会合する４６ｋＤａの重鎖からなるヘテロダイマーである。ヒトにおいて、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ４５およびＨＬＡ−Ｃｗ８などの、いくつかのＭＨＣ対立遺伝子が存在する。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子は、一部の集団において、その集団のおよそ５０％によって発現される、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子である。一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、＊０２０２、＊０２０３、＊０２０６または＊０２０７遺伝子産物であってもよい。一部の場合、異なる集団間のサブタイプの頻度に差が存在し得る。例えば、一部の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ２陽性の白人集団の９５％超はＨＬＡ−Ａ＊０２０１であるのに対して、中国人の集団では、頻度は、およそ２３％のＨＬＡ−Ａ＊０２０１、４５％のＨＬＡ−Ａ＊０２０７、８％のＨＬＡ−Ａ＊０２０６および２３％のＨＬＡ−Ａ＊０２０３であると報告されている。
【０１０６】
[00146]一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩＩ分子との関連でＴ細胞エピトープを認識することができる。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質はＡＰＣのサブセットにおいて発現され得る。ヒトにおいて、例えば、ＤＲ１、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ７、ＤＲ５２、ＤＱ１、ＤＱ２、ＤＱ４、ＤＱ８およびＤＰＩなどの、いくつかのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子が存在する。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０７０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１遺伝子産物である。
【０１０７】
[00147]Ｂ細胞によって発現される免疫グロブリンと同様に（膜結合型免疫グロブリンは、多くの場合、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）と称される）、ＴＣＲ鎖は可変ドメイン（または可変領域）および定常ドメイン（または定常領域）からなる。完全長定常ドメイン／領域は、細胞外部分（本明細書では「細胞外定常ドメイン」と称される）、ヒンジ領域、膜貫通領域および細胞質尾部を含むことができる。種々の実施形態では、定常ドメインは、完全長定常ドメインまたはその一部、例えば、細胞外定常ドメインであってもよい。ＴＣＲαおよびδ鎖の可変ドメインは多数の可変（Ｖ）および結合（Ｊ）遺伝子によってコードされるが、ＴＣＲβおよびγ鎖は多様性（Ｄ）遺伝子によってさらにコードされる。ＶＤＪ組換えの間、各遺伝子セグメントの１つのランダム対立遺伝子は機能的可変ドメインを形成するために他の対立遺伝子と組換えられる。定常遺伝子セグメントとの可変ドメインの組換えにより、機能的ＴＣＲ鎖転写物を得ることができる。さらに、ランダムヌクレオチドが遺伝子セグメント間の接合部位において付加および／または欠失され得る。このプロセスは、強力なコンビナトリアル（どの遺伝子領域が組換えられるかに依存する）および接合多様性（どのおよびいくつのヌクレオチドが付加／欠失されるかに依存する）をもたらすことができ、その結果、大量の抗原の同定を確実にすることができる、大きく、高度に多様性があるＴＣＲレパートリーが得られる。さらなる多様性は、機能的ＴＣＲを形成するためのαおよびβまたはγおよびδ鎖の対合（「アセンブリ」とも称される）によって達成され得る。組換え、ランダム挿入、欠失および置換により、Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子の小セットが、１０１５個から１０２０個の間のＴＣＲクローン型を作り出す可能性を有する。本明細書で使用される場合、「クローン型」とは、同一の免疫受容体を保持する免疫細胞の集団を指す。例えば、クローン型とは、同一のＴＣＲを保持するＴ細胞の集団、または同一のＢＣＲ（または抗体）を保持するＢ細胞の集団を指す。免疫受容体多様性との関連で「多様性」とは、集団における免疫受容体（例えば、ＴＣＲ、ＢＣＲおよび抗体）クローン型の数を指す。本明細書で使用される場合、「同種対の組合せ」とは、免疫細胞内の二分免疫受容体の２つの鎖（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ、ＴＣＲγおよびＴＣＲδ、または重鎖および軽鎖）の天然の組合せを指す。２つの鎖の同じ同種対の組合せにより、同じＴＣＲを得ることができる。例えば、同じクローン型を有するＴ細胞はＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖の同じ同種対の組合せを有する。クローン型におけるより高度な多様性は、同種対の組合せのより高度な多様性を示し得る。
【０１０８】
[00148]各ＴＣＲ鎖は、相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）と呼ばれる、その構造において３つの超可変ループを含有する。ＣＤＲ１および２はＶ遺伝子によってコードされ、ＭＨＣ複合体とのＴＣＲの相互作用に必要とされ得る。しかしながら、ＣＤＲ３は、Ｖ遺伝子とＪ遺伝子との間またはＤ遺伝子とＪ遺伝子との間の接合領域によってコードされるので、高度に多様性になり得る。ＣＤＲ３はペプチド抗原と直接接触するＴＣＲの領域であり得る。ＣＤＲ３はＴ細胞クローン型を決定するための目的の領域として使用され得る。１つの個体のＴ細胞による全てのＴＣＲの合計はＴＣＲレパートリーまたはＴＣＲプロファイルと呼ばれる。ＴＣＲレパートリーは疾患の発症および進行と共に変化し得る。したがって、がん、自己免疫、炎症性および感染性疾患などの、異なる疾患状態下で免疫レパートリーのステータスを決定することは、疾患の診断および予後に有用であり得る。
【０１０９】
[00149]ＴＣＲは、完全長ＴＣＲおよびその抗原結合性部分または抗原結合性断片（ＭＨＣ−ペプチド結合断片とも呼ばれる）であってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲはインタクトなまたは完全長ＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、完全長ＴＣＲよりも短いが、ＭＨＣ分子に結合した特異的抗原ペプチド、すなわちＭＨＣ−ペプチド複合体に結合している抗原結合性部分である。ＴＣＲの抗原結合性部分または断片は、完全長またはインタクトなＴＣＲの構造ドメインの一部のみを含有することができるが、さらに完全ＴＣＲが結合しているエピトープ（例えば、ＭＨＣ−ペプチド複合体）にも結合することができる。一部の場合、ＴＣＲの抗原結合性部分または断片は、一般に各鎖が３つの相補性決定領域を含有する場合などの、特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体との結合のための結合部位を形成するのに十分な、ＴＣＲの可変α鎖および可変β鎖などの、ＴＣＲの可変ドメインを含有する。抗原結合ドメインまたは抗原結合ドメインに対して相同である結合ドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）および抗体
[00150]本明細書に記載される免疫受容体はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）であってもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫受容体は抗体（または免疫グロブリン）である。本明細書に提供される組成物および方法は、重鎖をコードする第１の核酸配列および軽鎖をコードする第２の核酸配列を含む融合ＢＣＲまたは抗体ポリヌクレオチドを産生するために使用され得る。融合二分ＢＣＲまたは抗体ポリヌクレオチドはプロモーターをさらに含むことができ、および／またはレシピエント細胞内で発現されるようにベクターに挿入され得る。
【０１１０】
[00151]ＢＣＲは、シグナル伝達タンパク質の対と関連する細胞膜結合型抗体からなる。ＢＣＲに結合している抗原は抗体分泌細胞に分化するようにＢ細胞を刺激することができる。ＢＣＲは、Ｂ細胞のクローン選択および抗体分泌形質細胞へのそれらの分化において重要な役割を果たすことができる。成熟Ｂ細胞はＢＣＲの免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）およびＩｇＤアイソタイプの両方を有することができ、それらの両方はシグナル伝達サブユニットＩｇαおよびＩｇβと関連し得るが、それらの膜結合型重鎖アイソフォームが異なる。
【０１１１】
[00152]全免疫グロブリンまたは抗体は典型的に４つのポリペプチドからなり得る：重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一のコピーおよび軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一のコピー。哺乳動物において、抗体は５つのアイソタイプ：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥに分類される。アイソタイプは、それらの生物学的特性、機能的位置および異なる抗原に対処する能力が異なる。存在する重鎖の種類は抗体のクラスを規定する。ギリシャ文字によって示される５種類の哺乳動物Ｉｇ重鎖：α、δ、ε、γおよびμが存在する。これらの鎖はそれぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体に見出される。重鎖はサイズおよび組成が異なり；αおよびγはおよそ４５０個のアミノ酸を含有するが、μおよびεはおよそ５５０個のアミノ酸を有する。重鎖の各々は１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域および３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）領域を含有することができ、各軽鎖は１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域および１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含有することができる。免疫グロブリン軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの異なる種類、カッパ（κ）またはラムダ（λ）のいずれかのうちの１つに割当てられ得る。典型的な免疫グロブリンでは、各軽鎖はジスルフィド結合によって重鎖に連結され得、２つの重鎖はジスルフィド結合によって互いに連結され得る。一部の実施形態では、提供される重鎖、軽鎖および／または抗体因子は１つまたは複数のジスルフィド結合を含む構造を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のジスルフィド結合は、ＩｇＧ４免疫グロブリンについて予想される位置におけるジスルフィド結合であるか、またはＩｇＧ４免疫グロブリンについて予想される位置においてジスルフィド結合を含む。軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列され得、軽鎖定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列され得る。重鎖の残りの定常ドメインは互いに整列され得る。
【０１１２】
[00153]軽鎖および重鎖の各対の可変ドメインは抗体の抗原結合部位を形成することができる。
[00154]抗体は、抗原結合性断片（Ｆａｂ）および断片結晶化可能領域（Ｆｃ）を含むことができる。Ｆｃ領域は、抗体が免疫系を活性化することを可能にし得る細胞表面受容体と相互作用することができる。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２および第３の定常ドメインに由来する、２つの同一のタンパク質断片からなり；ＩｇＭおよびＩｇＥ  Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖における３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２〜４）を含有する。ＩｇＧのＦｃ領域は高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を有する。Ｆｃ断片のグリコシル化は、Ｆｃ受容体媒介性活性に必須であり得る。この部位に付着したＮ−グリカンは主に複合型のコアフコシル化二分岐（ｄｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造であり得る。抗体断片の例には、限定されないが、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片、（２）ヒンジ領域にてジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（３）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（４）穏やかな還元性条件を使用したＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の切断によって生じる、Ｆａｂ’断片、（５）ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、および（６）特異的に抗原に結合する抗体単一可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）ポリペプチドである、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）が含まれる。
【０１１３】
[00155]軽鎖および重鎖の定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接関与されない場合があるが、定常ドメインは可変ドメインの配向に影響を与え得る。定常ドメインはまた、エフェクター分子および細胞との相互作用を介した抗体依存性相補体媒介性溶解または抗体依存性細胞毒性への関与などの、種々のエフェクター機能も示し得る。
【０１１４】
[00156]また、抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体および組換え抗体、トランスジェニック非ヒト動物から生成されたヒト抗体、ならびに濃縮技術を使用してライブラリーから選択された抗体が含まれ得る。
【０１１５】
[00157]抗体は、脊椎動物の血液または他の体液に見出されるタンパク質であってもよく、細菌およびウイルスなどの異物を同定し、中和するために免疫系によって使用される。抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体および多反応性（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｅ）抗体）、および抗体断片が含まれ得る。したがって、抗体は、限定されないが、任意の特異的結合メンバー、免疫グロブリンクラスおよび／またはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ）；限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖ（一本鎖または関連実体）を含む、生物学的に関連する断片またはその特異的結合メンバーを含むことができる。抗体断片は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生される。「二重特異性」または「二機能性」抗体以外の抗体は、同一のその各々の結合部位を有すると理解される。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から取得され得る。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在する場合がある起こり得る天然に存在する突然変異を除いて同一である。ポリクローナル抗体は、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む調製物であってもよい。
【０１１６】
[00158]多くの免疫受容体の可変ドメイン（例えば、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、抗体重鎖、抗体軽鎖）は同じ一般構造を有することができ、各ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続されている４つのフレームワーク（ＦＷまたはＦＲ）領域を含む。本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」という用語は、超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）の間に位置する可変ドメイン内の比較的保存されたアミノ酸配列を指すことができる。典型的な免疫グロブリンまたはＴＣＲ鎖では、各可変ドメインに４つのフレームワーク領域が存在し得、それらはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と指定される。フレームワーク領域は可変ドメインの構造的フレームワークを提供するβシートを形成する。典型的な免疫グロブリンまたはＴＣＲ鎖では、各可変ドメインに３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が存在し得、それらはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と指定される。ＣＤＲは抗体の「超可変領域」を形成し、それは抗原結合に関与し得る。
【０１１７】
単一細胞反応器
[00159]融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドのライブラリーを産生するための組成物および方法が本明細書に提供される。融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、単一細胞由来の二分免疫受容体をコードする２つのＶ（Ｄ）Ｊ再配列遺伝子のコード配列を含むことができる。単一細胞反応器は、単一細胞から融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを産生するために使用され得る。本明細書に記載される方法の例示的なスキームは図２に示される。単一細胞反応器（図２の影付きの構造によって概念的に示される）を使用することによって、誤対合を引き起こし得る、異なる細胞由来の異なる免疫受容体鎖をコードする核酸分子間の接触（すなわち、細胞間配列接触）が最小化され得る。例えば、図２に示されるように、ＴＣＲα鎖１をコードする核酸分子（ＴＲＡ１）は、ＴＣＲβ鎖２をコードする核酸分子（ＴＲＢ２）と接触することはできない。
【０１１８】
[00160]この例示的なスキームによって例示されるように、単一細胞反応器は、単一の生物学的粒子（例えば、単一細胞）由来の目的の分子が試薬または互いと反応し得る容器であってもよい。単一細胞反応器は２つの構成要素を含むことができる：（１）単一細胞由来の目的の分子が会合され得る固体支持体、および（２）生化学反応を発生させるための水性含有物。単一細胞反応器内の目的の分子は反応を受けることができ、その反応の間、異なる細胞由来の目的の分子は互いに接触しないか、または混合しない。目的の分子は、核酸、タンパク質または細胞に存在する他の分子であってもよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡなどであってもよい。核酸は免疫受容体または免疫受容体鎖をコードすることができる。
【０１１９】
[00161]一部の場合、固体支持体はバッチ処理され得る。例えば、固体支持体はビーズであってもよく、その場合、多くのビーズが連続体積の水溶液中に浸漬され得、その結果、全てのビーズ上の全ての分子は水溶液中の反応物に接近することができる。例えば、固体支持体は、より大きな固体表面上にパターン化された固体マイクロウェルの表面であってもよい。この場合、固体表面全体が連続体積の水溶液中に浸漬され得、その結果、全てのマイクロウェル上の全ての分子が水溶液中の反応物に接近することができる。
【０１２０】
単一細胞反応器：形および形態
[00162]単一細胞反応器は障壁を有することができ、その障壁は、異なる単一細胞反応器の含有物が互いに接触することを制限する。
【０１２１】
[00163]単一細胞反応器が障壁を有する場合、単一細胞反応器はベッセルであり得る。この場合、単一細胞反応器は固体壁付きまたは液体壁付きであってもよい。障壁は、油障壁、固体障壁または他の障壁であってもよい。例えば、単一細胞反応器の障壁は、管、ウェル、マイクロウェルまたは油中水液滴であってもよい。一部の場合、単一細胞反応器はエマルジョン中の油中水液滴である。単一細胞反応器として油中水液滴を使用すると、超ハイスループットを提供することができる。なぜなら、数百万またはそれより多くのこのような液滴は数分〜数時間で作り出され得るからである。油中水液滴の生成は、ボルテックスすることによって、またはフローフォーカシング（ｆｌｏｗ−ｆｏｃｕｓｉｎｇ）マイクロ流体チップなどのマイクロ流体チップを使用することによって達成され得る。
【０１２２】
[00164]一部の実施形態では、エマルジョンはマイクロ流体デバイスを使用して受動的に形成される。これらの方法には、圧搾、滴下、噴射、チップストリーミング（ｔｉｐ−ｓｔｒｅａｍｉｎｇ）、チップマルチブレーキング（ｔｉｐ−ｍｕｌｔｉ−ｂｒｅａｋｉｎｇ）または同様のものが含まれ得る。受動的マイクロ流体液滴生成は、２つの異なる流体の競合する力を変化させることによって、特定の数、サイズおよび直径を制御するためにモジュレートされ得る。これらの力は、２つの溶液の混合時の毛細管力、粘着力および／または慣性力であってもよい。
【０１２３】
[00165]一部の実施形態では、エマルジョンはマイクロ流体チップの能動的制御によって形成される。能動的制御では、液滴生成は、電気力、磁力または求心力などの外力の適用によって操作され得る。マイクロ流体チップ内の液滴の能動的操作を制御するための一般的な方法は、油および水などの、２つの混合溶液の流速を変えることによって固有の力を変更することである。
【０１２４】
[00166]逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的な分子生物学反応は油中水エマルジョン中で実施され得る。界面活性剤が、エマルジョンを安定化させるために水相または油相に添加されてもよい。
【０１２５】
[00167]一部の場合、単一細胞反応器は障壁を有さない。例えば、ヒドロゲル粒子（例えば、約１００ミクロンの直径を有するアガロース粒子など）は、単一細胞由来の目的の分子が安定に付着しているポリマーマトリクスを含むことができる。ヒドロゲルの水性含有物は、目的の分子と反応することができる反応物を含むことができる。一部の実施形態では、目的の分子はヒドロゲル粒子のポリマーマトリクスに安定に付着しているので、異なる細胞由来の目的の分子は互いに接触しないか、または混合しない。
【０１２６】
[00168]別の例として、非多孔質粒子（例えば、約１０ミクロンの直径を有するポリスチレン粒子）は、単一細胞由来の目的の分子が安定に付着している表面を含むことができる。固体粒子は、粒子の表面上の目的の分子と反応する反応物を含む溶液中に浸漬され得る。この場合、粒子はそれを取り囲む溶液と共に、単一細胞反応器を構成する。一部の場合、このような非多孔質粒子はベッセル内にさらに含まれてもよい。例えば、単一細胞反応器は、エマルジョンの液滴中の液体に取り囲まれたビーズ、またはウェル中の液体に取り囲まれたビーズであってもよい。
【０１２７】
単一細胞反応器：固体支持体−一般
[00169]種々の種類の固体支持体および種々の付着化学物質が、単一細胞由来の目的の分子が安定に会合され得る固体支持体を提供するために使用されてもよい。本開示は、任意の特定の種類の固体支持体材料または構成に限定されることを意図するものではない。
【０１２８】
[00170]固体支持体は平坦もしくは平面であってもよいか、または実質的に異なる構成を有してもよい。例えば、固体支持体は、粒子、ビーズ、ストランド、沈殿物、ゲル、ゾル−ゲル、シート、チューブ、球、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、ディップスティック、スライドなどとして存在してもよい。磁気ラテックスビーズおよび酸化鉄粒子などの磁気ビーズまたは粒子が、固体基板の例である。
【０１２９】
[00171]固体支持体を形成することができる例示的な材料には、ガラスまたは他のセラミック、プラスチック、ポリマー、金属、半金属、合金、合成物、有機物などが含まれる。例えば、固体支持体は、シリコン、シリカ、石英、ガラス、制御細孔ガラス、炭素、アルミナ、チタニア、酸化タンタル、ゲルマニウム、窒化ケイ素、ゼオライトおよびガリウムヒ素からなる群から選択される材料を含むことができる。金、白金、アルミニウム、銅、チタンおよびそれらの合金などの多くの金属もまた、固体支持体として使用するための選択肢である。さらに、多くのセラミックおよびポリマーもまた、固体支持体として使用され得る。固体支持体として使用され得るポリマーには、限定されないが、以下：ポリスチレン；ポリ（テトラ）−フルオロエチレン（ＰＴＦＥ）；ポリビニリデンジフルオリド；ポリカーボネート；ポリメチルメタクリレート；ポリビニルエチレン；ポリエチレンイミン；ポリ（エーテルエーテル）ケトン；ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）；ポリビニルフェノール；ポリラクチド；ポリメタクリルイミド（ＰＭＩ）；ポリアトケンスルホン（ｐｏｌｙａｔｋｅｎｅｓｕｌｆｏｎｅ）（ＰＡＳ）；ポリプロピレン；ポリエチレン；ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）；ポリジメチル−シロキサン；ポリアクリルアミド；ポリイミド；およびブロック−コポリマーが含まれる。アレイについての基板には、シリコン、シリカ、ガラスおよびポリマーが含まれる。固体支持体は、単一材料（例えば、ガラス）、材料の混合物（例えば、コポリマー）または異なる材料の多層（例えば、小分子の単層でコーティングされた金属、ＢＳＡでコーティングされたガラスなど）からなってもよい。
【０１３０】
[00172]固体支持体の構成は任意の適切な形態であってもよく、例えば、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、ゾル−ゲル、自己集合単層（ＳＡＭ）または表面（平坦であってもよいか、または成形した特徴を有してもよい）を含むことができる。固体支持体には、半固体支持体が含まれ得る。固体支持体の表面は、平面、実質的に平面、または非平面であってもよい。固体支持体は多孔性または非多孔性であってもよく、膨張または非膨張の特徴を有してもよい。固体支持体は、ウェル、くぼみまたは他の容器、ベッセル、特徴もしくは位置の形態で構成されてもよい。複数の固体支持体は、試薬のロボットによる送達のためにアドレス指定可能な、またはレーザーもしくは他の照明およびＣＣＤ、共焦点もしくは偏向集光による走査を含む検出手段によって種々の位置におけるアレイで構成されてもよい。
【０１３１】
[00173]一部の実施形態では、固体支持体はビーズ（粒子と同義）の形態である。ビーズは、生物学的、非生物学的、有機、無機、ポリマー、金属またはこれらのいずれかの組合せを含む、任意の基板材料から作製され得る。ビーズの表面または内部は、化学的に改変されてもよく、任意の種類の処理またはコーティング、例えば、ツール分子との結合相互作用を可能にする反応基を含有するコーティングに供されてもよい。
【０１３２】
[00174]一部の実施形態では、固体支持体は細胞であってもよい。細胞はソース免疫受容体発現細胞（例えば、ＴＲＡ遺伝子／ｍＲＮＡおよびＴＲＢ遺伝子／ｍＲＮＡを有するソースＴ細胞）であってもよく、固体支持体であってもよい。細胞は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドもしくは同様の固定剤、またはそれらの組合せを使用して固定され得る。固定後、細胞は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などの洗浄剤を使用して透過処理され得る。固定され、透過処理された細胞は、多孔質粒子、粒子および固体支持体とみなされ得る。細胞は固定されているので、そのＴＲＡ含有およびＴＲＢ含有ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡの一部）およびｍＲＮＡは、細胞内で拡散が抑制され得るか、または細胞に安定に付着され得る。細胞は透過性であり、多孔性であるので、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、鋳型スイッチングオリゴ（ＴＳＯ）などの試薬は、逆転写、プライマー伸長および鋳型スイッチングなどの反応を実施するためにＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ＴＲＡおよびＴＲＢ  ｍＲＮＡ）と接触するように細胞内に拡散され得る。
【０１３３】
[00175]一部の実施形態では、ビーズは、それらの迅速な単離および／または精製を容易にする手段で産生され得る。例えば、磁気ビーズは、プレートウェル内の液相からビーズを迅速に単離するために磁場を印加することによって操作され得る。
【０１３４】
単一細胞反応器：固体支持体−ヒドロゲル
[00176]固体支持体はヒドロゲルを含むことができる。固体支持体はヒドロゲル粒子であってもよい。ヒドロゲルは既存の方法を使用してヒドロゲル粒子になり得る。例えば、ヒドロゲルのゾル状態または前駆体は油中水エマルジョンになり得る。水滴は、「油中ヒドロゲル」エマルジョンを生じるようにゲル状態に（例えば、前駆体の重合によって、またはアガロースなどの熱可逆性ヒドロゲルの温度を低下させることによって）変化され得る。前駆体の重合は、光によって、または油相に開始剤もしくは促進剤（例えば、ＴＥＭＥＤ）を加えることによって引き起こされ得る。このエマルジョンは、水溶液中に懸濁されたヒドロゲル粒子を生じるように解乳化され得る。
【０１３５】
[00177]一部の実施形態では、ヒドロゲルは、ゲル相と溶液（ゾル）相との間で可逆的であり得る可逆性ヒドロゲルである。一部の実施形態では、可逆性ヒドロゲルのゲル相とゾル相との間の遷移は温度によって制御される（すなわち、熱的に制御されるか、または熱可逆性である）。例えば、熱的に制御された可逆性（または熱可逆性）ヒドロゲルはアガロースヒドロゲルであってもよい。可逆性ヒドロゲルの有用な特性は、ゾル相において、捕捉剤、捕捉剤に付着した分子および目的の他の分子が自由に拡散することができ、ある特定の反応をより効率的にすることであり得る。
【０１３６】
[00178]例えば、熱応答性ポリマーを使用することによって熱感受性または熱可逆性ヒドロゲルを提供するための他の方法が存在する。温度感受性ポリマーは、両親媒性ジブロック（ＡＢ）、トリブロック（ＡＢＡまたはＢＡＢ型）またはマルチブロックコポリマーを作り出すために親水性ブロックへの疎水性ブロックの重合後グラフトによって、または共重合によって合成され得る。Ａは、ＰＥＧ（ポリ（酸化エチレン）（ＰＥＯ）としても知られている）のような親水性ブロックであるのに対して、Ｂは、ポリエステル、ポリ（酸化プロピレン）（ＰＰＯ）（ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）とも呼ばれる）またはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡｍ）などの疎水性ブロックである。両親媒性ブロックコポリマーは、低温で親水性ブロックのシェルおよび疎水性ブロックのコアを有するミセルを形成するために水中で自己集合し、高温でのミセルの会合はゲル化を引き起こす。熱応答性ポリマー溶液がゲルに変化する温度はゲル化温度と呼ばれる。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＳＡＦ）またはＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）ＰＥ（ＩＣＩ）として商業的に知られているポロキサマー（ＡＢＡ型ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯポリマー）が、熱感受性ヒドロゲルを形成するために使用され得る。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の水溶液は周囲温度でミセルを形成するために自己集合し、体温でのミセルの会合の結果としてゲル化が起こった。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）のマルチブロックコポリマーは、カップリング剤としてホスゲンまたはヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ）をそれぞれ使用してＰＥＯおよびＰＰＯセグメントまたはＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）をカップリングすることによって調製され得る。ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）およびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）のような脂肪族エステルは、加水分解により分解可能なＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ヒドロゲルを調製するために触媒としてオクタン酸第一スズ（Ｓｎ（ｏｃｔ）２）を使用して、対応するε−カプロラクトン（ＣＬ）および乳酸（ＬＡ）モノマーの開環重合（ＲＯＰ）を介してＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の末端にカップリングされ得る。酸に不安定なアセタール結合に基づくＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）のマルチブロックコポリマーは、ｐ−トルエンスルホン酸無水物（ｐ−ＴＳＡ）触媒の存在下で、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）およびジ−（エチレングリコール）ジビニルエーテル（ＤＥＧＤＶＥ）の反応によって作り出され得る。
【０１３７】
[00179]ＰＬＡ、ＰＣＬ、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）およびポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート］（ＰＨＢ）などの脂肪族エステルを有するＰＥＧに基づいた熱可逆性ヒドロゲルが使用されてもよい。例えば、ＡＢＡ型ＰＥＧ−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）トリブロックコポリマーは加水分解により分解可能なヒドロゲルを形成した。コポリマーは２つのステップによって合成され得る。最初に、モノメトキシＰＥＧ−ＰＬＧＡ（ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ）のジブロックコポリマーが、触媒としてＳｎ（ｏｃｔ）２の存在下で、ＭＰＥＧにおけるＤ，Ｌ−ラクチド（ＤＬＬＡ）およびグリコリド（ＧＡ）のＲＯＰを介して合成され得、続いてトリブロックＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマーが、ＨＤＩカップリング剤を使用してジブロックＭＰＥＧ−ＰＬＧＡコポリマーを互いにカップリングすることによって調製され得る。コポリマー溶液は低温で存在し得るが、３７℃でゲルになる（ゾルからゲルへの遷移）。中央のＰＥＧブロックに隣接するＰＬＧＡブロックを有するＢＡＢ型トリブロックコポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）は、カップリング剤を必要とせずにＰＥＧにおけるＤＬＬＡおよびＧＡのＲＯＰを介して合成され得る。ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡは、ＰＥＧ−ＰＣＬＡ−ＰＥＧと同様のゾルからゲルへの遷移傾向を示す。これらのヒドロゲルのゲル化および分解は、疎水性および親水性ブロックの分子量、疎水性ブロックの組成、ポリマー濃度および添加剤を変化させることによって調整され得る。ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡのゲル化挙動は、種々の末端基（すなわち、ヒドロキシル、アセチル、プロピオニルおよびブタノイル基）の組み込みによってモジュレートされ得る。
【０１３８】
[00180]ＰＮＩＰＡｍは室温で水溶液に溶解するが、そのコイルから小球への遷移に起因して３２℃（相転移温度）を超えると沈殿する。他のポリマーとのＰＮＩＰＡｍの組み込みは、温度の増加に応じて水溶液中でゾルからゲルへの相転移を示すコポリマーを生じ得る。ラジカル重合が、ＰＮＩＰＡｍベースのポリマーを作り出すために他のメタクリレートまたはアクリレートモノマー／ポリマーと共にＮＩＰＡｍを組み込むために使用され得る。例えば、ＰＮＩＰＡｍ−ポリ（２−メタ−クリロイルオキシエチルホスホリルコリン）−ＰＮＩＰＡｍ（ＰＮＩＰＡｍ−ＭＰＣ−ＰＮＩＰＡｍ）コポリマーは、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を介して合成され得る。ＮＩＰＡｍのＡＴＲＰは２つのステップで行われ得る：（１）マクロ開始剤の調製および（２）ブロックコポリマーを得るためのマクロ開始剤へのＮＩＰＡｍの添加。ネットワークの形成の間、ポリマー鎖間の疎水性相互作用に起因して温度が３２℃を超えて上昇すると、ポリマー溶液はゲルを形成することができる。
【０１３９】
[00181]熱応答性ポリホスファゼンもまた、温度の増加に伴い、水溶液中でゾルからゲルへの相転移を示し得る。これらのポリマーは多段階合成によって調製され得る。最初に、ジクロロホスファゼンポリマーが、触媒として塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）を使用するヘキサクロロシクロトリホスファゼンの溶融重合反応を介して合成され得る。次いで、親水性ＰＥＧブロックおよび疎水性ブロックは、ヒドロゲルマクロマーを得るためにジクロロホス−ファゼンポリマー骨格にコンジュゲートされ得る。疎水性ブロックは、ジ−、トリ−およびオリゴ−ペプチドまたは単一の改変アミノ酸（例えば、Ｌ−イソロイシンエチルエステル（ＩｌｅＯＥｔ）、Ｄ，Ｌ−ロイシンエチルエステル（ＬｅｕＯＥｔ）、Ｌ−バリンエチルエステル（ＶａｌＯＥｔ））であってもよい。
【０１４０】
[00182]ＭＰＥＧおよびポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）からなるＡＢＡ型トリブロックコポリマーは、ＰＰＦにおける不飽和二重結合の架橋によってさらに安定化され得る熱感受性ゲルを生じ得る。
【０１４１】
[00183]エナンチオマーＰＥＧ−Ｐ（Ｌ−ラクチド）−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＬＬＡ−ＰＥＧ）およびＰＥＧ−Ｐ（Ｄ−ラクチド）−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＤＬＡ−ＰＥＧ）トリブロックコポリマーの混合は、ゾルからゲルへの遷移を誘導することができる。温度が３７℃に増加すると、ヒドロゲルが形成され得、それらは７０℃を超える溶液になり得る。同様に、ヒドロゲルは、エナンチオマーＰＥＧ−（ＰＬＬＡ）８およびＰＥＧ−（ＰＤＬＡ）８星形ブロック、ならびにＰＥＧ−（ＰＬＬＡ）２およびＰＥＧ−（ＰＤＬＡ）２トリブロックコポリマーの立体錯体形成（ｓｔｅｒｅｏｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）によって形成され得る。
【０１４２】
[00184]合成ポリマーの自己集合に加えて、合成分子により化学的に改変された天然材料もまた、ヒドロゲルを形成するために水性媒体中で自己集合し得る。例えば、天然に豊富にあるキチンの部分的な脱アセチル化に由来する多糖であるキトサンはヒドロゲル形成のために使用され得る。キトサンは、いくつかのポリマーとコンジュゲートすると、物理的なヒドロゲルを形成することができる。例えば、ＰＥＧ−アルデヒドはシッフ塩基反応を介してキトサンとカップリングされ得、続いてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）により還元されてＰＥＧ−ｇ−キトサンを生じる。得られたグラフトポリマーは低温で溶液であり、３７℃付近の温度でゲルに変換することができる。ゲル化はポリマー鎖間の疎水性相互作用に起因し得、キトサンセグメントの会合およびＰＥＧ移動度の減少をもたらす。同様に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）−ｇ−キトサンもまた、加熱すると熱可逆性のゾルからゲルへの転移を示す。
【０１４３】
[00185]ポリアクリルアミドはヒドロゲルについてのポリマーフレームワークであってもよい。ポリアクリルアミドゲルは、低粘度および高い固定化効率で捕捉剤を固定化する容易さなどのいくつかの利点を与える液滴中でモノマー（例えば、アクリルアミド）およびクロスリンカー（例えば、ビス−アクリルアミド）から重合され得る。
【０１４４】
[00186]ポリマーの自己集合は、物理的に架橋されたヒドロゲルを調製するための簡単な方法を提供することができる。自己集合は、水素結合および疎水性相互作用などの、分子内力および分子間力の結果として一部のポリマーで発生する。これらのポリマーの水溶液は、ｐＨおよび温度などの外部刺激に応答して自己集合すると、ゾルからゲルへの遷移を受ける。熱応答性ポリマーの自己集合は温度の変化だけでヒドロゲルを製造するための手段である。
【０１４５】
[00187]さらに、アルギネートおよびアガロースなどの、いくつかの多糖ベースのポリマーが考慮され得る。アルギネートは容易に誘導体化され得、これにより、捕捉剤を固定化するための多くの選択肢を提供する（例えば、ＰａｗｅｒおよびＥｄｇａｒ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３３（２０１２）、３２７９を参照のこと）。ポリマーが誘導体化されない場合でも、さらに、捕捉剤とポリマーフレームワークとの間で安定な物理的会合を達成することができる場合がある。例えば、大きな粒子（例えば、ミクロンサイズのストレプトアビジンによりコーティングされたビーズ）は誘導体化されていないポリマーフレームワーク内に封入され得、捕捉剤は、大きな粒子の表面または内部と安定した物理的会合を形成することができる。
【０１４６】
[00188]一部のポリマーでは、ゲル化は元に戻され得る。すなわち、ヒドロゲル粒子はゲル状態から流体状態に変換され得る。言い換えれば、ゲルは融解され得る。これは、ヒドロゲル粒子から標的分子またはＤＮＡを回収することなどの、一部の状況において有用であり得る。例えば、ポリアクリルアミドゲルにおけるビス−アクリルアミドは、ＤＡＴＤ（ジアリル−酒石酸ジアミド）、ＤＨＥＢＡ（ジヒドロキシエチレン−ビス−アクリルアミド）およびＢＡＣ（ビス−アクリルイルシスタミン）（ｂｉｓ−ａｃｒｙｌｙｌｃｙｓｔａｍｉｎｅ）などのクロスリンカーと置き換えられ得る。これらのクロスリンカーは、いくつかの還元剤または酸化剤によって切断され得る。アルギネートゲルはＥＤＴＡによって容易に融解され得、アガロースゲルは高温によって融解され得る。
【０１４７】
単一細胞反応器：固体支持体−ヒドロゲル：誘発されたゲル化および硬化粒子
[00189]一部の場合、重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを含む水溶液は、重合または非重合機構を介してマトリクスを形成することによってヒドロゲルに変換され得る。このプロセスはゲル化と呼ばれる。このような水溶液が区画の含有物である場合、ゲル化プロセスによって形成されるヒドロゲルはヒドロゲル粒子であり得る。区画（例えば、マイクロウェルまたは油中水液滴）の水相中の含有物から形成されるヒドロゲル粒子は、硬化粒子と称される。
【０１４８】
[00190]重合機構によって形成されるマトリクスの例には、限定されないが、ポリアクリルアミドが含まれる。ポリアクリルアミドは、アクリルアミドおよびビス−アクリルアミドのモノマーから形成されるマトリクスであってもよい。重合反応はフリーラジカルによって触媒されるビニル添加であってもよい。反応は、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）からフリーラジカル形成を誘導する、ＴＥＭＥＤによって開始され得る。フリーラジカルは電子をアクリルアミド／ビスアクリルアミドモノマーに移動させ、それらをラジカル化し、それらを互いに反応させてポリアクリルアミド鎖を形成する。ビス−アクリルアミドの不在下で、アクリルアミドは、多孔質ゲルではなく、長鎖に重合することができる。ビス−アクリルアミドはアクリルアミド鎖を架橋することができ、多孔質ゲルマトリクスの形成を引き起こすことができる。架橋の量、ならびにそれにより、ゲルの孔径および結果として生じる分離特性は、アクリルアミドのビス−アクリルアミドに対する比を変化させることによって制御され得る。非重合機構によって形成されるマトリクスの例には、限定されないが、アガロースゲルが含まれる。アガロースは多糖であってもよい。アガロースのモノマー単位は、Ｄ−ガラクトースおよび３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトピラノースの二糖であってもよい。ある特定の温度（ゲル化温度）、例えば３５℃未満の水溶液では、これらのポリマーストランドは、水素結合のような非共有結合性相互作用および静電相互作用によって多孔質ゲル構造内に一緒に保持され得る。ゲル化温度を上回る温度に増加させるために溶液を加熱すると、これらの非共有結合性相互作用を分解することができ、ストランドを分離することができる。次いで溶液が冷えると、これらの非共有結合性相互作用が再び確立され得、ゲルが形成し得る。したがって、アガロースゲルは、水素結合および静電相互作用によるゲル化によって形成することができる。ゲル化温度および融解温度はアガロースの種類に応じて変化し得る。テングサ（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ）に由来する標準的なアガロースは、３４〜３８℃（９３〜１００°Ｆ）のゲル化温度および９０〜９５℃（１９４〜２０３°Ｆ）の融解温度を有することができるのに対して、そのより高いメトキシ置換基に起因するオゴノリ（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）に由来するアガロースは、４０〜５２℃（１０４〜１２６°Ｆ）のゲル化温度および８５〜９０℃（１８５〜１９４°Ｆ）の融解温度を有することができる。融解温度およびゲル化温度は、特に１％未満の低いゲル濃度では、ゲルの濃度に依存し得る。したがって、ゲル化温度および融解温度は、通常、指定されたアガロース濃度で与えられる。天然アガロースは非荷電メチル基を含有することができ、メチル化の程度はゲル化温度に正比例し得る。しかしながら、合成メチル化は逆効果をもたらす可能性があり、それによりメチル化の増加はゲル化温度を低下させる可能性がある。異なる融解温度およびゲル化温度を有する様々な化学的に改変されたアガロースが化学的改変によって利用可能である。
【０１４９】
[00191]液滴中でポリアクリルアミドヒドロゲル粒子を作製する場合、重合開始剤は過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）または水溶性光開始剤であってもよい。ＡＰＳが開始剤として使用される状況では、促進剤であるテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）がキャリアオイルに添加され得る。例えば、２．５ｍＬのキャリアオイルおよび１０μＬのＴＥＭＥＤが合わされてＴＥＭＥＤ含有キャリアオイルを形成することができる。ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤ含有キャリアオイルが使用される場合、得られたエマルジョンは、ポリアクリルアミドヒドロゲルの重合を誘導するために６５℃で一晩インキュベートされ得る。他の水溶性光開始剤が使用されてもよい。一部の場合、光開始剤は３６５ｎｍ  ＵＶ（核酸に対して安全とみなされ得る）で励起され得る。（ａ）Ｋｏｊｉｍａら、Ｃｈｅｍ  Ｍａｔｅｒ  １０（１９９８）：３４２９に記載されている方法などによって合成され得るナトリウム４−［２−（４−モルホリノ）ベンゾイル−２−ジメチルアミノ］−ブチルベンゼンスルホネート（ＭＢＳ）、および（ｂ）Ａｙｕｂら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１２５（２０１５）：８４に記載されている方法などによって調製され得る２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノンおよびメチル化−β−シクロデキストリン（ＤＭＰＡ：ＭβＣＤ複合体）によって形成される分子複合体などの、ＬＡＰ以外のいくつかの選択肢が存在する。
【０１５０】
[00192]アルギネートがポリマーフレームワークとして使用される状況では、ゲル化は、マイクロ流体デバイスにおいて液滴にカルシウムイオンを直接送達することによって、またはフォトケージド（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）カルシウムの放出によって引き起こされ得る。アガロースがポリマーフレームワークとして使用される状況では、ゲル化は温度を低下させることによって引き起こされ得る。
【０１５１】
[00193]生物学的粒子が複数の仕切りに分けられ、標的核酸が放出された後、仕切り内のモノマーおよびクロスリンカーは、ヒドロゲルを支持する架橋されたポリマーネットワークを形成するために重合され得る。このような重合を引き起こすためにいくつかの方法が使用され得る。例示的な方法は、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエタン−１，２−ジアミン（ＴＥＭＥＤ）を使用することであり得る。ＡＰＳは水相中（例えば、液滴中）に含まれ得、ＴＥＭＥＤは分配油に添加され得る。液滴生成後、エマルジョンは、長期間（例えば、一晩）、（例えば、６５℃で）加熱され得、これにより重合が引き起こされる。しかしながら、一部の適用では、このようなプロセスは、標的核酸の質の維持などの他の態様において困難になり得る。したがって、一部の場合、より速く、およびより穏やかな処理で重合を引き起こすことが望まれ得る。長波長ＵＶ（例えば、＞３６０ｎｍ）の光開始剤は必要に応じてもよい。長波長ＵＶは、通常、ほとんどの生体分子（タンパク質および核酸を含む）にとって安全とみなされる。便利なＬＥＤベースの光源は、少なくとも３６０ｎｍ、３６１ｎｍ、３６２ｎｍ、３６３ｎｍ、３６４ｎｍ、３６５ｎｍ、またはそれより高いｎｍの照明のために利用可能であり得る。
【０１５２】
[00194]多くの分子または分子複合体は、長波長ＵＶと適合する水溶性光開始剤、例えば、リチウム−およびマグネシウムフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィネート（ＴＭＰＰＬおよびＴＭＰＰＭ）であってもよい。それらは、水溶液中のアクリルアミドおよびメタクリルアミドなどの適切なモノマーのフリーラジカル重合のための効果的な水溶性光開始剤である。ＴＭＰＰＬ（ＬＡＰとも呼ばれる）は生体適合性ヒドロゲルの形成を引き起こすために使用され得る。同様に、２−ベンジル−２−（ジメチルアミノ）−１−（４−モルホリノフェニル）−１−ブタノン（ＢＤＭＢ）のスルホン化による、ナトリウム４−［２−（４−モルホリノ）ベンゾイル−２−ジメチルアミノ］−ブチルベンゼンスルホネート（ＭＢＳ）が水溶性の長波長ＵＶ光開始剤として使用され得る。水溶性光開始剤はまた、メチル化−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）と複合体を形成することなどによって水溶性形態で製剤化され得る。例えば、水溶性光開始剤としてＭβＣＤと複合体を形成した２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）が使用され得る。
【０１５３】
単一細胞反応器：固体支持体への付着化学−一般
[00195]目的の分子は、静電相互作用または物理的封入を介するなどの非特異的な様式で固体支持体に付着され得る。例えば、カルボキシル分子でさらにコーティングされる、磁石の層によって囲まれたポリスチレン製の固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズは、「クラウディング剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および塩（例えば、２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ）の存在下でポリヌクレオチドに安定に結合することができる。同様に、シリカビーズは、グアニジウムの存在下でポリヌクレオチドに安定に結合することができる。様々に、正電荷ビーズはポリヌクレオチドに結合することが記載されている。封入の例として、固体支持体がヒドロゲルであり、目的の分子がヒドロゲルの孔径より大きい流体力学半径を有する場合、目的の分子は、物理的封入によってヒドロゲルベースの固体支持体に付着され得る。
【０１５４】
[00196]より特異的な付着のために、捕捉剤が使用されてもよい。捕捉剤は、固体支持体への目的の分子（例えば、目的のポリヌクレオチド）の安定な付着を媒介する化学組成物であってもよい。捕捉剤は、標的分子への結合、標的核酸分子上で伸長するプライマーとしての役割、標的分子との反応などの複数の機能を介して安定な付着を媒介することができる。
【０１５５】
単一細胞反応器：固体支持体への付着化学−一般：捕捉剤
[00197]本明細書に提供される組成物または方法は捕捉剤を含むことができる。捕捉剤は、単一細胞反応器内の目的の分子（標的分子と同義語）を固定化または封入するためのアンカーとして機能することができる。一方で、捕捉剤は標的分子に結合することができる。他方で、捕捉剤は、それ自体の拡散を抑制するために固体支持体と会合することができ、その結果、次に標的分子の拡散が制限される。一部の実施形態では、捕捉剤はヒドロゲルのフレームワーク内で拡散抑制剤に連結している。標的分子は、核酸鋳型またはそのコピー、例えば、免疫受容体鎖をコードする核酸またはそのコピーであってもよい。
【０１５６】
[00198]捕捉剤は２つの部分：ターゲティング部分および固定化部分を含むことができる。固定化部分は、非多孔質固体支持体およびヒドロゲルなどの多孔質固体支持体を含む固体支持体に捕捉剤を付着するのに関与し得る。ヒドロゲルの場合、固定化部分は、ヒドロゲルまたは拡散抑制剤を支持するポリマーフレームワーク（例えば、マトリクス）に付着され得る。ターゲティング部分は核酸鋳型またはそのコピーとの安定な相互作用を行うことに関与し得る。捕捉剤は、ターゲティング部分および固定化部分が同じ分子の２つの部分であり、共有結合している、１つの分子であってもよい。捕捉剤は、ターゲティング部分および固定化部分がリンカーを介して共有結合的に連結され得るか、または非共有結合的に連結され得る、１つより多い分子であってもよい。例えば、固定化部分はポリマーフレームワークに連結している第１のポリヌクレオチドであってもよく、ターゲティング部分は第１のポリヌクレオチドとハイブリダイズできる第２のポリヌクレオチドを含んでもよい。捕捉剤のターゲティング部分と固定化部分との間の相互作用の種類に制限がないことは理解されるべきである。
【０１５７】
[00199]一部の実施形態では、捕捉剤はターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは化学基である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはプライマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーである。一部の実施形態では、プライマーは逆転写プライマーである。一部の実施形態では、逆転写プライマーは、ポリ−デオキシ−チミジンヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗体もしくはその断片、またはペプチドアプタマーである。一部の実施形態では、化学基は反応基である。一部の実施形態では、反応基は核酸鋳型の核酸塩基と共有結合を形成する。一部の実施形態では、反応基は、ＮＨＳエステル、マレイミド基または標識−ＩＴリンカーおよび反応基である。一部の実施形態では、核酸塩基はグアニンである。
【０１５８】
[00200]例えば、ポリヌクレオチドが目的の分子である場合、ターゲティング部分は、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。ターゲティング部分は、細胞内の全てのｍＲＮＡ種とハイブリダイズする逆転写プライマーであってもよい。ターゲティング部分は、目的の特定のＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズする特定または設計された配列を有するプライマーであってもよい。
【０１５９】
[00201]適用および標的分子に応じて、ターゲティング部分は、プライマー（ポリメラーゼまたは逆転写酵素によって伸長され得る）、標的分子に非共有結合的に安定に結合する親和性剤、または標的分子と共有結合を形成する結合剤であってもよい。一部の場合、ターゲティング部分は、塩基対合によってその標的ポリヌクレオチド分子（例えば、免疫受容体鎖またはそのコピーをコードするポリヌクレオチド）に結合するオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０１６０】
[00202]一部の実施形態では、ターゲティング部分は、プライマーにおけるアダプター配列（例えば、ＡＲＳ）とハイブリダイズでき、それによってプライマーを固体支持体に連結するＡＣＯである。一部の場合、ターゲティング部分は、プライマー、例えば、ＲＴプライマーまたはＰＣＲプライマーとして役立つオリゴヌクレオチドである。プライマーからの伸長産物もまた、捕捉剤を介して固体支持体に連結され得る。
【０１６１】
[00203]捕捉剤は固定化部分を含むことができる。固定化部分は捕捉剤を固体支持体に連結することができる。捕捉剤はリンカーを含むことができるか、またはリンカーを介して固体支持体に付着され得る。リンカーは、予め形成され得るか（例えば、ＰＥＧリンカー）、または捕捉剤における第１の反応基および固体支持体に固定化された第２の反応基によって形成され得る。
【０１６２】
[00204]固定化部分は、ＮＨＳエステル、ビオチン、マレイミド基、チオール基、アジド基、アビジンもしくはストレプトアビジン、一本鎖ポリヌクレオチド、ビオチン基、メタクリル基、またはそれらの反応産物であってもよい。固定化部分は反応基を含むことができる。
【０１６３】
[00205]反応基の例には、スクシンイミジルエステル、アミド、アクリルアミド、アシルアジド、ハロゲン化アシル、アシルニトリル、アルデヒド、ケトン、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジリジン、ボロネート、カルボジイミド、ジアゾアルカン、エポキシド、ハロアセトアミド、ハロプラチネート（ｈａｌｏｐｌａｔｉｎａｔｅ）、ハロトリアジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホロアミダイト、ハロゲン化シリル、スルホン酸エステル、ハロゲン化スルホニル、アミン、アニリン、チオール、アルコール、フェノール、ヒラジン（ｈｙｒａｚｉｎｅ）、ヒドロキシルアミン、カルボン酸、グリコールおよび複素環が含まれる。
【０１６４】
[00206]一部の実施形態では、固定化部分における反応基は求電子部分であり、これは固体支持体における求核部分と反応することができるか、またはその逆も同様である。求核部分または求電子部分のいずれかは、固定化部分または固体支持体に付着され得る。このような求電子部分には、限定されないが、例えば、カルボニル基、スルホニ基、アルデヒド基、ケトン基、ヒンダードエステル基、チオエステル基、安定イミン基、エポキシド基、アジリジン基などが含まれる。
【０１６５】
[00207]本開示において使用され得る反応基化学物質は上記の項目のものに限定されない。例として、他の実施形態では、第１の反応基と第２の反応基との間の反応は、親双極子反応を介して進行することができる。例えば、第１の反応基はアジドであってもよく、第２の反応基はアルキンであってもよい。あるいは、第１の反応基はアルキンであってもよく、第２の反応基はアジドであってもよい。アジドまたはアルキン含有ポリヌクレオチドに関与する付加環化反応は、触媒量で、ｉｎ  ｓｉｔｕでＣｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤の存在下で、Ｃｕ（ＩＩ）（例えば、触媒量のＣｕＳＯ４の形態において）の添加により水性条件下で室温にて実施され得る。還元剤には、アスコルビン酸塩、金属銅、キニーネ、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、ＣＯ２＋、および印加電位が含まれる。本開示において使用され得るさらに他の反応性化学物質には、限定されないが、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションおよびオレフィンメタセシス化学物質が含まれる（例えば、Ｍａｈａｌら、（１９９７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１２５−１１２８を参照のこと）。
【０１６６】
[00208]一部の実施形態では、捕捉剤（または目的の分子）と固体支持体との間の付着は非共有結合性付着である。例えば、適切な酸性基を有する捕捉剤（または目的の分子）は、ヒドロキシルまたは他の負電荷の基を保持する固体支持体と強力な会合を形成することができる。このシステムの他のバリエーションでは、互いに対して強い親和性を有する他の種類の部分が、捕捉剤（または目的の分子）および固体支持体における反応基に組み込まれてもよい。例えば、捕捉剤（または目的の分子）は適切な反応基を介してビオチンとカップリングされ得るのに対して、固体支持体はアビジンとコーティングされ得、その結果、捕捉剤（または目的の分子）と固体支持体との間に極めて強い非共有結合が生じる。
【０１６７】
単一細胞反応器：固体支持体への付着化学−ヒドロゲル
[00209]固体支持体がヒドロゲルを含む場合、捕捉剤の固定化部分は、ヒドロゲルまたは拡散抑制剤を支持するポリマーフレームワーク（例えば、マトリクス）に付着され得る。
【０１６８】
[00210]固定化部分は、一般的な固体支持体について本明細書に記載される化学物質を使用してポリマーフレームワーク（例えば、ヒドロゲルフレームワーク）または拡散抑制剤における反応基と反応することができる。ある特定の場合、必要に応じて、捕捉剤がフレームワークから放出され得るように、捕捉剤とポリマーフレームワークとの間の相互作用は可逆的であってもよい。例えば、固定化部分がストレプトアビジンを含み、ポリマーフレームワークがビオチンを含む場合、ストレプトアビジンとビオチンとの間の相互作用は、変性剤（ホルムアミドなど）の存在下で、かつ加熱しながら過剰量の遊離ビオチンを添加することによって逆転され得る。別の例として、固定化部分とポリマーフレームワークとの間の相互作用が核酸ハイブリダイゼーションを介する場合、相互作用は、核酸二本鎖を融解するために温度を増加させることによって逆転され得る。
【０１６９】
[00211]一部の実施形態では、固定化部分は、共有結合または非共有結合性相互作用を介してマトリクスまたはポリマーフレームワークと会合することができる。固定化部分は、（ａ）ポリマーフレームワークに組み込まれる化学物質、（ｂ）直接的にポリマーフレームワークと安定に相互作用する化学物質もしくはタンパク質、または（ｃ）間接的にポリマーフレームワークと安定に相互作用する化学物質もしくはタンパク質を含むことができる。（ａ）の例はメタクリル基であってもよく、これはポリアクリルアミドゲルに共重合され得る。（ｂ）の例はＮＨＳエステルであってもよく、これは安定な共有結合性相互作用を形成するために第一級アミン基と反応することができる。この例は、ポリマーフレームワークが第一級アミン基を含有する場合、適用可能であり得る。（ｂ）の別の例はマレイミドであってもよく、これは安定な共有結合性相互作用を形成するためにチオール基と反応することができる。この例は、ポリマーフレームワークがチオール基を含有する場合、適用可能であり得る。（ｂ）の別の例はチオール基であり、これは、安定な共有結合性相互作用を形成するためにＣ−Ｃ二重結合含有基（マレイミドおよびアクリレートなど）と反応することができる。この例は、ポリマーフレームワークがＣ−Ｃ二重結合含有基を含有する場合、適用可能であり得る。（ｂ）の別の例はアジド基であってもよく、これは安定な共有結合性相互作用を形成するためにアルキン基と反応することができる。この例は、ポリマーフレームワークがアルキン基を含有する場合、適用可能であり得る。（ｂ）の別の例はアビジンまたはストレプトアビジンであってもよく、これは安定な非共有結合性相互作用を形成するためにビオチンと相互作用することができる。この例は、ポリマーフレームワークがビオチン基を含有する場合、適用可能であり得る。（ｂ）の別の例は一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドであってもよく、これは、安定な非共有結合性相互作用を形成するために逆相補配列の一本鎖ポリヌクレオチドと相互作用することができる。この例は、ポリマーフレームワークが一本鎖ポリヌクレオチドを含有する場合、適用可能であり得る。（ｃ）の例はビオチンであってもよい。この例は、ポリマーがビオチンを含有する場合、およびヒドロゲルがストレプトアビジン四量体をさらに含有する場合、適用可能であり得る。この場合、固定化部分および同じストレプトアビジンの別のモノマーがポリマーにおけるビオチンと安定に相互作用することができるので、ストレプトアビジンの１つのモノマーはビオチンと安定に相互作用することができる。このように、固定化部分は間接的にポリマーと安定に相互作用することができる。
【０１７０】
[00212]ヒドロゲル内に核酸分子を封入するために、核酸分子がヒドロゲル外へ拡散することを阻止するために核酸分子はヒドロゲルのマトリクス内に固定化され得る。固定化は、直接的または間接的のいずれかで核酸分子に結合し、また、ヒドロゲルのマトリクスと相互作用する捕捉剤によって達成され得る。一部の場合、捕捉剤は核酸鋳型に連結している。一部の実施形態では、捕捉剤は核酸鋳型のコピーに連結している。捕捉剤は共有結合または非共有結合性相互作用を介してマトリクスに結合することができる。
【０１７１】
[00213]固体支持体がヒドロゲルを含む場合、ヒドロゲルは、捕捉用プローブ（またはターゲティング部分）をヒドロゲルフレームワークに付着させるために機能化され得る。固定化されたまたは拡散が抑制された捕捉剤（例えば、ＡＣＯ）により改変されたヒドロゲルを作り出すことは、機能化されたヒドロゲルを作り出すことの例であり得る。一部の実施形態では、捕捉剤はポリマーフレームワークに連結している。一部の実施形態では、捕捉剤は拡散抑制剤（以下を参照のこと）に連結している。機能化されたヒドロゲルを作り出すことはヒドロゲル内に目的の核酸を抑制することに有用であり得、それによって目的の核酸、および目的の核酸が結合している他の分子は、（１）ヒドロゲル内で拡散しないか、もしくはヒドロゲル外へ拡散せず、または（２）制御された様式で、ヒドロゲル内で拡散することができるか、もしくはヒドロゲル外へ拡散することができる。一部の実施形態では、ヒドロゲルはヒドロゲル粒子の形態である。
【０１７２】
[00214]固体支持体が重合可能なモノマーまたはゲル化可能なポリマーから作製されたヒドロゲルである場合、固定化部分は、ポリマーおよび／もしくはモノマーと共重合される化学物質、ポリマーおよび／もしくはモノマーまたは拡散抑制剤と直接的に安定に相互作用する化学物質またはタンパク質、あるいはポリマーおよび／もしくはモノマーまたは拡散抑制剤と間接的に安定に相互作用する化学物質またはタンパク質であり得る。
【０１７３】
[00215]ヒドロゲル粒子は、ヒドロゲル粒子の構成単位を直接的に改変することによって機能化され得る。構成単位は、重合または非重合機構によってヒドロゲルまたは硬化マトリクスを形成することができる重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーである。例えば、ヒドロゲル粒子が構成単位の重合によって形成される場合、捕捉剤は構成単位に付着され得る。したがって、重合の間、捕捉剤はポリマーフレームワークに共重合され得る。あるいは、中間分子（例えば、リンカー）はツール分子を固定化するために使用され得る構成単位に付着され得る。ヒドロゲル粒子の構成単位はモノマーであってもよい。モノマーは、アクリルアミド、酢酸ビニル、ビニルアルコール、メチルアクリルアミドまたはアクリル酸であってもよい。このストラテジーの例は、Ａｃｒｙｄｉｔｅ（商標）により改変されたオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドヒドロゲルに共重合することである。この例では、オリゴヌクレオチドは捕捉用プローブの例である。このストラテジーの別の例は、「機能化されたアクリレート／アクリルアミド」をポリアクリルアミドヒドロゲルに共重合することである。機能化されたアクリレート／アクリルアミドは、ツール分子が、アミン−ＮＨＳエステル反応、クリックケミストリーなどのようなコンジュゲーション化学物質を介して付着され得る、コンジュゲーションハンドルを含有することができる。この例では、コンジュゲーションハンドルは中間分子として役立つことができる。機能化されたアクリレート／アクリルアミドの例は、３−アジドプロピルメタクリレート（ＡｚＰＭＡ）であってもよく、アジド基は、捕捉剤がクリックケミストリーを介して付着され得るコンジュゲートハンドルである。機能化されたアクリレート／アクリルアミドの別の例はＮ−（３−アミノプロピル）−メタクリルアミドであり、第一級アミン基（３−アミノプロピル側鎖における）は、捕捉剤がＮＨＳエステルを介して付着され得るコンジュゲーションハンドルである。
【０１７４】
[00216]ヒドロゲル粒子は構成単位の代わりにフレームワークを改変することによって機能化され得る。ヒドロゲル粒子を形成した後、ヒドロゲル粒子のフレームワークは、捕捉剤が付着され得るように改変され得る。例えば、アガロースヒドロゲル粒子の多価の特徴はその反応性の主要因であり得るので、ヒドロキシル官能基が部分的または完全に誘導体化され得る。このように、いくつかの新たな化学的機能が、アミン、カルボキシル、スルホネート、シアノおよびジクロロトリアジニルなどのアガロースゲルのポリマー鎖に沿ってグラフトされ得る。例えば、グリオキシルアガロースは、グリオキシル基を生成するために過ヨウ素酸ナトリウムにより後で酸化され得るジオールを導入するためにグリシドールによるヒドロゲルフレームワークの第一級ヒドロキシル基のエーテル化によって調製され得る。アクリル酸を含有するヒドロゲルにおけるカルボキシル基の改変はまた、例えば、ＥＤＣ化学を使用して容易に実施され得る。
【０１７５】
[00217]小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質をヒドロゲルフレームワークとカップリングするための標準的な技術のほとんどが、本明細書で適用可能であり得る。一般的に使用される誘導体化の例には、カルボキシルまたはアミン基が含まれるが、他の官能基も使用されてもよい。適切なモノマーを使用することによって、重合の間、エポキシリンカーが導入されてもよいが、アルデヒドまたはチオール基が、水性条件における重合後手順の後、導入されてもよい。クリックケミストリーは機能化のために活用され得る。クリックケミストリー反応およびクリックケミストリー反応のための適切な反応基には、限定されないが、末端アルキン、アジド、歪アルキン（ｓｔｒａｉｎｅｄ  ａｌｋｙｎｅ）、ジエン、ジエノフィル（ｄｉｅｎｅｏｐｈｉｌｅｓ）、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジド、チオールおよびアルケンが含まれる。例えば、一部の実施形態では、アジドおよびアルキンがクリックケミストリー反応に使用される。
【０１７６】
[00218]重合可能またはゲル化可能なポリマーまたはモノマーの官能基が、所与の標的の特定の捕捉を可能にするために使用され得る。ある特定の場合、所望の官能基が、プレポリマー混合物に直接加えられ得、共重合することが可能になり得る。このようなアプローチの実現可能性は、選択された生体分子の安定性または重合条件に存在するある特定の化学基の交差反応性に依存し得る。しかしながら、カルボキシルまたはアミン官能基を有する少量のコモノマーが、合成後の段階においてヒドロゲルのさらなる官能化を可能にするために重合ステップの間に使用されてもよい。このアプローチは、重合反応条件に耐えることができない分子のコンジュゲーションのために行われ得る。
【０１７７】
単一細胞反応器：固体支持体への付着化学−ヒドロゲル：拡散抑制剤
[00219]一部の場合、捕捉剤は、ヒドロゲル内に捕捉剤を封入するために拡散抑制剤に固定化され得る。
【０１７８】
[00220]拡散抑制剤は、ヒドロゲル内での拡散またはヒドロゲル外への拡散が抑制される剤（例えば、化学組成物）であってもよい。拡散抑制剤はヒドロゲル粒子の孔径より大きい流体力学半径を有することができる。拡散抑制剤は粒子またはポリマーであってもよい。粒子は磁気ビーズであってもよい。ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸またはＰＥＧであってもよい。
【０１７９】
[00221]拡散抑制剤は拡散抑制ポリマーであってもよい。拡散抑制剤は、コンジュゲートされた捕捉剤がポリマーフレームワークと絡み合うのに十分に長いように、捕捉剤に直接的にコンジュゲートされる長いポリマー鎖であってもよい。例えば、捕捉剤は、標的分子と共に捕捉剤の拡散がフレームワーク内で抑制されるように、複数の長いＰＥＧ鎖とコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、長いポリマー鎖はポリアクリルアミド鎖であってもよい。一部の他の場合、拡散抑制剤は大きな粒子（例えば、ミクロンサイズのストレプトアビジンでコーティングされたビーズ）であってもよい。捕捉剤が大きな粒子と会合する場合、捕捉剤がヒドロゲルのフレームワーク内に封入されるように、大きな粒子はヒドロゲルの孔径より大きくてもよい。
【０１８０】
[00222]拡散抑制ポリマーは、ＰＥＧ分子またはポリアクリルアミド分子であってもよい。拡散抑制ポリマーは、ヒドロゲルの機構の完全性を支持するフレームワークの形成に関与することができるか、または関与しなくてもよい。
【０１８１】
[00223]拡散抑制剤は、１つまたは複数の高分子量ポリマー（例えば、３３５０、８０００および２０，０００の分子量を有するポリエチレングリコール）を含むことができ、それにより、ヒドロゲルの孔径より大きい流体力学半径を得ることができるか、またはそうでなければ、例えば、ヒドロゲルのポリマーフレームワークと絡み合うことによってヒドロゲル内に封入され得る。ポリマー（または鎖）の全分子量は５ｋＤａ〜１０００ｋＤａであってもよい。一部の場合、ポリマーの全分子量は、５ｋＤａ〜１０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１５ｋＤａ、１５ｋＤａ〜２０ｋＤａ、２０ｋＤａ〜２５ｋＤａ、２５ｋＤａ〜３０ｋＤａ、３０ｋＤａ〜３５ｋＤａ、３５ｋＤａ〜４０ｋＤａ、４０ｋＤａ〜４５ｋＤａ、または４５ｋＤａ〜５０ｋＤａであってもよい。一部の場合、ポリマーの全分子量は、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２５０ｋＤａ、２５０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、３００ｋＤａ〜３５０ｋＤａ、３５０ｋＤａ〜４００ｋＤａ、４００ｋＤａ〜４５０ｋＤａ、または４５０ｋＤａ〜５００ｋＤａであってもよい。一部の場合、ポリマーの全分子量は、５００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、６００ｋＤａ〜７００ｋＤａ、７００ｋＤａ〜８００ｋＤａ、８００ｋＤａ〜９００ｋＤａ、９００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、１０００ｋＤａ〜１５００ｋＤａ、１５００ｋＤａ〜２０００ｋＤａ、２０００ｋＤａ〜３０００ｋＤａ、または３０００ｋＤａ〜５０００ｋＤａであってもよい。ポリマーは線形ポリアクリルアミドポリマーであってもよい。一部の場合、ポリマーの全分子量は、少なくとも約２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａであってもよいし、またはそれより大きくてもよい。線形ポリアクリルアミドポリマーは、ヒドロゲルのフレームワークを形成するために使用されなくてもよい。例えば、線形ポリアクリルアミドポリマーはアガロースゲルのゲル化温度より高い水性形態でアガロースと混合されてもよく、温度をゲル化温度未満に減少させると、アガロースはゲル化を経て、フレームワーク内に線形ポリアクリルアミドポリマーを捕捉することができるポリマーフレームワークを形成することができる。一部の実施形態では、アクリルアミドモノマーは、重合の間、水性形態でアガロースと混合されてもよい。捕捉剤を架橋されたポリアクリルアミドヒドロゲルに付着させるために使用される本明細書に記載される化学物質もまた、ツール分子を線形ポリアクリルアミドポリマーに付着させるために使用されてもよい。
【０１８２】
[00224]拡散抑制剤は大きな粒子であってもよい。大きな粒子はヒドロゲルの孔径より大きいサイズを有することができる。大きな粒子を選択し、それに応じてヒドロゲルの孔径を調整することができる。大きな粒子のサイズ（直径によって表される）は０．５μｍ〜５μｍであってもよい。一部の場合、大きな粒子のサイズは、０．５μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１．５μｍ、１．５μｍ〜２μｍ、２μｍ〜２．５μｍ、２．５μｍ〜３μｍ、３μｍ〜３．５μｍ、３．５μｍ〜４μｍ、４μｍ〜４．５μｍ、または４．５μｍ〜５μｍであってもよい。一部の他の場合、大きな粒子のサイズは、５μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜２０μｍ、２０μｍ〜３０μｍ、３０μｍ〜４０μｍ、または４０μｍ〜５０μｍであってもよい。一部の場合、大きな粒子のサイズは、少なくとも約１μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍであってもよいし、またはそれより大きくてもよい。
【０１８３】
単一細胞反応器：目的の分子
[00225]一部の実施形態では、単一細胞反応器は目的の分子を含む。一部の実施形態では、目的の分子は目的の核酸である。一部の実施形態では、目的の分子は固体支持体に付着される。一部の実施形態では、目的の核酸は固体支持体に付着される。一部の実施形態では、単一細胞反応器は第１の核酸および第２の核酸を含むことができる。一部の実施形態では、単一細胞反応器は、第１の核酸および第２の核酸が付着される固体支持体を含むことができる。付着は安定な付着であってもよい。付着は可逆的付着であってもよい。
【０１８４】
[00226]第１および／または第２の核酸は免疫受容体または免疫受容体鎖をコードするｍＲＮＡであってもよい。第１および／または第２の核酸は、免疫受容体または免疫受容体鎖をコードするｍＲＮＡの逆転写産物（すなわち、ｃＤＮＡ産物）であってもよい。逆転写産物は鋳型スイッチ逆転写産物であってもよい。第１および／または第２の核酸はアダプター配列をさらに含むことができる。単一細胞反応器は第１の核酸および第２の核酸のコピーをさらに含むことができる。一部の場合、第１および第２の核酸分子のコピーは固体支持体に付着される。
【０１８５】
[00227]様々な実施形態では、単一細胞反応器は融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは捕捉剤または固体支持体に結合している。一部の実施形態では、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはそれらの組合せである。融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、改変されたＤＮＡ、例えば、メチル化されたＤＮＡであってもよい。一部の実施形態では、単一細胞反応器は融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドの複数のコピーをさらに含むことができる。
【０１８６】
[00228]一部の実施形態では、目的の核酸は、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、重鎖または軽鎖をコードする核酸分子である。一部の実施形態では、目的の核酸は融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドまたはそのコピーである。
【０１８７】
[00229]一部の実施形態では、核酸鋳型のコピーは伸長プライマー（または伸長プライマー産物）である。核酸鋳型のコピーは、核酸鋳型の同じ配列または核酸鋳型の逆相補配列を有する合成産物を含むことができる。一部の実施形態では、核酸鋳型のコピーは伸長されたフォワードまたはリバースプライマーである。一部の実施形態では、核酸鋳型のコピーは伸長された逆転写（ＲＴ）プライマーである。一部の実施形態では、核酸鋳型のコピーは伸長された増幅プライマーである。本明細書で使用される場合、「伸長されたプライマー」または「プライマー伸長産物」とは、限定されないが、核酸増幅、第２の鎖合成および逆転写を含む、鋳型依存性核酸合成の間にプライマー伸長を受けているプライマーを指す。核酸鋳型またはそのコピーを固定化または封入するために、プライマーは、核酸鋳型とハイブリダイズできないか、または相補的ではないアダプター配列を有することができる。アダプター配列は捕捉剤に連結され得、捕捉剤はフレームワーク内で拡散抑制剤にさらに連結される。一部の実施形態では、アダプター配列は捕捉剤の配列とハイブリダイズする。一部の実施形態では、プライマーのアダプター配列は、鋳型とハイブリダイズできるか、または相補的である部分からの連続的に核酸配列であり得る。アダプター配列自体は、鋳型とハイブリダイズできなくてもよいか、または相補的でなくてもよい。一部の実施形態では、プライマーのアダプター配列は、化学リンカーによって鋳型とハイブリダイズできるか、または相補的である部分に連結され得る。ヘキサエチレングリコールなどの種々の化学リンカーが使用されてもよい。
【０１８８】
単一細胞反応器：水相中の反応物
[00230]単一細胞反応器の水相は、基質として核酸を使用する酵素を含むことができる。これらの酵素の例には、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、制限酵素、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＵＳＥＲミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）における酵素、リガーゼが含まれる。
【０１８９】
[00231]単一細胞反応器の水相はプライマーを含むことができる。したがって、単一細胞反応器はプライマーおよび核酸鋳型（例えば、免疫受容体の鎖をコードする核酸配列）の両方を含むことができ、プライマーは水相に存在することができ、核酸鋳型が固体支持体に付着され得る。プライマーは、限定されないが、逆転写（ＲＴ）プライマーおよび増幅プライマーを含む、鋳型依存性核酸合成を実施するために使用される任意のプライマーであってもよい。一部の実施形態では、第１のプライマーおよび／または第２のプライマーはベッセル内の核酸鋳型により区分されている。一部の実施形態では、フォワードプライマーおよび／またはリバースプライマーはベッセル内の核酸鋳型により区分されている。
【０１９０】
[00232]単一細胞反応器の水相は、共通配列（アダプター配列とも呼ばれる）を逆転写産物の３’末端に付着するのに有用である鋳型スイッチングオリゴ（ＴＳＯ）を含むことができる。
【０１９１】
単一細胞反応器：試薬の連続添加
[00233]一部の実施形態では、異なる試薬が、同時ではなく、規定された順序で同じ細胞に由来する標的分子に接触するように作製され得る。同様に、一部の実施形態では、いくつかの試薬または反応副産物は、次の反応が起こる前に除去され得る。例えば、溶解緩衝剤が細胞を溶解するために添加されてもよく（図２、パネル（ｂ））、逆転写酵素および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、ｍＲＮＡを逆転写し（ＲＴ）、ＰＣＲ増幅させるために添加されてもよい（図２、パネル（ｃ））。この状況では、溶解緩衝剤はＲＴおよび／またはＰＣＲを阻害する場合があり、ＲＴ−ＰＣＲステップの前に除去されることを必要とし得る。本開示の一部の態様はこれらの目標を達成するための方法を提供する。
【０１９２】
[00234]本開示では、新しい試薬の添加ならびに／または古い試薬、副産物および不要物の除去は、まとめて「試薬交換」と呼ばれる。試薬交換が必要とされる状況では、相互汚染を生じる可能性のある細胞間配列接触（例えば、第２の細胞由来の別の配列と接触する第１の細胞由来の配列）は、試薬交換の間、最小化される必要があり得る。固体支持体の使用は細胞間配列接触を最小化するのに役立ち得る。例えば、ウェルまたはマイクロウェルは単一細胞反応器として使用され得、この状況において、免疫受容体をコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは増幅されたＤＡＮ分子は、配列特異的または非配列特異的相互作用によってウェルまたはマイクロウェルの表面に付着され得る。例えば、捕捉剤（例えば、「親和性捕捉オリゴ（ＡＣＯ）」）として役立つオリゴヌクレオチドは、本明細書に提供される種々の化学物質によって表面上で改変され得る。同時に、ＲＴおよびＰＣＲプライマーの一部または全てには、配列が捕捉オリゴに相補的であるオリゴヌクレオチドが、必要に応じてフレキシブルなリンカー（例えば、ＰＥＧ６のためのＰＥＧ４などのエチレングリコールスペーサー）を介して付加され得る。本明細書に記載される一部の例では、付加されたオリゴヌクレオチドは、「親和性保持配列（ＡＲＳ）」と称される。ＡＣＯまたはＡＲＳの長さは、約５〜約１０、約１０〜約１５、約１５〜約２０、約２０〜約３０、または約３０〜約５０ヌクレオチドであってもよい。ＡＣＯまたはＡＲＳの長さは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０であってもよいし、またはそれより長くてもよい。捕捉ＡＣＯ：ＡＲＳ相互作用は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用などの他の共有結合または非共有結合相互作用によって置き換えられ得る。あるいは、ＲＴまたはＰＣＲプライマーの一部または全ては、例えば、プライマーにおける反応基と表面との間に形成される化学結合を介して、直接的に表面に付着され得る。
【０１９３】
[00235]例えば、油中水液滴の水相は、誘因により、ヒドロゲル粒子（すなわち、硬化粒子）を形成することができるモノマーまたはポリマーを含有することができる。ヒドロゲル内でのまたはヒドロゲル外へのＡＣＯの拡散が抑制され得るように、ＡＣＯはヒドロゲル粒子に結合することができるか、またはヒドロゲル粒子内に封入され得る。ＡＣＯは拡散抑制剤に連結され得る。例えば、ＡＣＯは、ヒドロゲル粒子のフレームワークとして役立つポリマーに共有結合的または非共有結合的に連結され得る。ＡＣＯはまた、ヒドロゲルフレームワーク内に封入される粒子またはポリマーに付着され得る。このように、他の試薬、副産物および不要物がヒドロゲル粒子内でまたはヒドロゲル粒子外へ拡散され得ながら、細胞間配列接触を最小化するためにＲＴおよびＰＣＲプライマーには、（必要に応じてフレキシブルなリンカーを介して）ＡＲＳが付加され得る。あるいは、ＲＴまたはＰＣＲプライマーの一部または全ては、ポリマーフレームワークまたは拡散抑制剤に直接的に付着され得る。ヒドロゲルフレームワークが十分に高密度である場合、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドおよびＰＣＲ産物などの大きな分子は、ヒドロゲル粒子外へ拡散するには大きすぎる可能性があり（例えば、１ｋｂのｄｓＤＮＡは４％アガロースゲル内で自由に拡散することができない）、これらの分子は、ポリマーフレームワークまたは拡散抑制剤と特定の反応をせずにポリマーフレームワーク内に封入され得る。ある意味では、これらの状況では、これらの大きな分子はそれ自体で拡散が抑制される。核酸鋳型またはそのコピーおよび生体粒子を封入するための方法は、米国特許出願第６２／６０９，７５６号および同第６２／６７４，２１４号に記載されており、それらの各々は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９４】
[00236]拡散抑制剤は、自由拡散を阻止し、および／または標的分子が剤に付着されている場合、標的分子が自由拡散するのを抑制するように機能することができる剤であり得る。標的分子は、その分子が、例えば、（ｉ）固体支持体を有する単一細胞反応器の表面に直接的もしくは間接的に付着される場合、または（ｉｉ）ヒドロゲル内のポリマーフレームワークもしくは拡散抑制剤に直接的もしくは間接的に付着される場合、または（ｉｉｉ）ヒドロゲル内に封入される場合、単一細胞反応器内で拡散が抑制され得る。
【０１９５】
[00237]一部の場合、試薬、副産物および不要物は、拡散が抑制されなくてもよく、ヒドロゲル粒子内へおよびヒドロゲル粒子外へ拡散することができる。一部の場合、拡散効率を増加させるために、ヒドロゲル粒子はゾル相に変化されてもよい。
【０１９６】
[00238]一部の他の場合、ヒドロゲル粒子における反応は、温度を、（例えば、ＰＣＲの間）熱可逆性ゲルの融点を上回って上昇させることを必要とし得る。ヒドロゲル粒子は再乳化され得、その再乳化は、ヒドロゲル粒子およびキャリアオイルを単に混合し、（例えば、ボルテックスおよびフリッキングすることによって）混合物を撹拌することによって、またはマイクロ流体チップを使用することによって行われ得る。新たに形成された「油中ゲル」液滴もまた、単一細胞反応器として使用され得る。一部の実施形態では、固体支持体はその機械的完全性を一時的に喪失し得るが（例えば、アガロース粒子などの熱可逆性ヒドロゲル粒子は、プライマーが標的に結合するために必要とされ得る高温で融解され得る）、または標的分子（例えば、免疫受容体をコードするポリヌクレオチド）が、固体支持体から一時的に解離し得るが（例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーションが固体支持体への標的分子の付着を媒介する場合）、温度が低下すると、固体支持体は再び形成することができ（例えば、アガロースはゲル化することができ）、標的分子は固体支持体に再び付着することができる。一部の実施形態では、区画内の体積の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超または９０％超は、熱可逆性粒子によって占められる。このような場合、融解粒子が区画内の他の水性含有物と混合された後、ゲル化可能なポリマーの希釈は、約２倍未満、１．７倍未満、１．５倍未満、１．３倍未満、１．２倍未満またはそれ以下に制限され得る。したがって、希釈されたゲル化可能なポリマーは依然として適切な実験温度（例えば、室温または４℃）でゲルを形成することができる。
【０１９７】
[00239]一部の実施形態では、（１）エマルジョン中で反応を実施すること、（２）ゲルを形成すること（例えば、冷却することによって）、（３）解乳化、（４）拡散に基づく試薬交換、および（５）再乳化のサイクルは、複数回繰り返され得る。一部の場合、ヒドロゲル粒子を洗浄することが、解乳化後に実施され得る。
【０１９８】
[00240]手順の例として、ヒドロゲル粒子（冷却時にアガロースを含有する油中水液滴によって形成される）内の同じ細胞から免疫受容体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを捕捉することができ、「油中ゲル」エマルジョンを解乳化することができ、緩衝剤中でヒドロゲル粒子を洗浄することによって拡散に基づく試薬交換を実施することができる。試薬交換は、免疫受容体をコードする核酸を捕捉した後、逆転写の後、予備増幅ステップの後、または試薬交換を実施することが必要とされ得る場合の他のステップなどの、本明細書に記載される方法の間の任意のステップで実施され得る。例えば、免疫受容体をコードするＲＮＡを捕捉することができ、逆転写および／または第２の鎖合成（アダプター配列を付加するため）を実施することができ、次いで増幅プライマーおよび試薬を拡散させるために試薬交換を実施することができる。別の例として、免疫受容体をコードするＲＮＡを捕捉することができ、逆転写および／または第２の鎖合成（アダプター配列を付加するため）を実施することができ、予備増幅ステップを実施することができ、次いでさらなる増幅プライマーおよび試薬を拡散させるために試薬交換を実施することができる。一部の場合、ヒドロゲル粒子はさらなる反応を実施するために再乳化され得る。再乳化後、再乳化されたヒドロゲル粒子の各々は、油によりカプセル化され得るか、または取り囲まれ得る。一部の場合、再乳化されたヒドロゲル粒子は、油によってカプセル化されるか、または取り囲まれる場合、融解され得る。例えば、再乳化されたヒドロゲル粒子は、ヒドロゲル粒子のゲル化温度より高い温度で実施される反応の間、融解され得る。
免疫受容体をコードするポリヌクレオチドにより改変された固体支持体
[00241]本開示は、免疫受容体をコードするポリヌクレオチドにより改変された複数の固体支持体を提供する。一部の実施形態では、固体支持体（例えば、ビーズまたはマイクロウェルの壁）は１つの細胞からの標的ポリヌクレオチド（「単一細胞充実性」と呼ばれる特徴）を含有する。標的ポリヌクレオチドは免疫受容体をコードするポリヌクレオチドであってもよい。免疫受容体はＴＣＲまたはＢＣＲであってもよい。
【０１９９】
[00242]このような複数の固体支持体を提供することは、免疫受容体発現細胞またはそれらの核（またはソース免疫受容体発現生体粒子、もしくは生体粒子と称される）を複数の区画に分配することを含むことができる。
【０２００】
[00243]単一の生体粒子に由来する第１および第２の免疫受容体をコードするポリヌクレオチドにより各々改変された複数の固体支持体は、（１）複数の生体粒子を複数の区画に分配することであって、各区画は、（ａ）１つもしくは複数の予め形成された固体支持体も含有するか、または（ｂ）固体支持体として役立ち得る硬化粒子に変化され得る、分配すること、（２）各区画において、生体粒子を溶解すること、またはそうでなければ免疫受容体鎖をコードする標的ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子を放出させること、（３）各区画において、標的ＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子を固体支持体に付着させることによって提供され得る。
【０２０１】
[00244]一部の実施形態では、捕捉剤はプライマーであってもよい。プライマーは、鋳型として免疫受容体をコードするポリヌクレオチドを使用して伸長され得る。したがって、固体支持体に付着された第１および第２の免疫受容体をコードするポリヌクレオチドはプライマー伸長産物であり得る。プライマーは、免疫受容体をコードするポリヌクレオチドのＣ領域（定常ドメインをコードするポリヌクレオチドにおける領域）、Ｊ領域またはＶ領域を認識することができる。プライマーは、フォワードプライマー（免疫受容体のセンス配列の一部を有する）またはリバースプライマー（免疫受容体のアンチセンス配列の一部を有する）であってもよい。捕捉剤は、予め形成された固体支持体または硬化粒子に付着され得る。細胞は、溶解緩衝剤を区画に添加することによって、または温度を上昇させることによって区画内で溶解され得る。溶解は、捕捉剤に結合することができる、免疫受容体をコードするポリヌクレオチドの放出を引き起こすことができる。区画はまた、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素を含有することができる。この場合、免疫受容体をコードするポリヌクレオチドに結合しているプライマーは、鋳型として免疫受容体をコードするポリヌクレオチドを使用して伸長され得、プライマー伸長産物を形成する。区画はまた、鋳型スイッチングオリゴ（ＴＳＯ）も含有することができる。一部の実施形態では、捕捉剤はＴＳＯを含むことができる。ＴＳＯの存在下では、逆転写産物は、ＴＳＯに相補的な配列を用いて、その３’末端で伸長され得る。各区画の含有物は本明細書に記載される２つのプライマーを含むことができ、各々は二分免疫受容体鎖をコードするポリヌクレオチドのうちの１つに結合するように設計されている。例えば、各区画の含有物は２つのプライマーを含むことができ、一方はＴＣＲアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドに結合するように設計され、他方はＴＣＲベータ鎖をコードするポリヌクレオチドに結合するように設計されている。
【０２０２】
[00245]プライマー伸長産物は１つまたは両方の末端に共通配列を有することができる。プライマーは免疫受容体をコードする配列のＣ領域に結合するように設計され得る。Ｃ領域の配列は定常であるので、１つのプライマーのみが免疫受容体鎖（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＫ、ＩｇＬ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ）の１つの種類に必要とされ得る。例えば、１つのプライマーが、１つの実験において使用される全ての細胞からＴＣＲアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドを捕捉するために使用され得る。したがって、プライマーの配列は共通配列とみなされ得る。Ｃ領域はセンス鎖における再配列Ｖ（Ｄ）Ｊ領域の下流にあるので、この共通配列は下流共通配列と呼ばれる。ｍＲＮＡが標的ポリヌクレオチドである場合、Ｃ領域ターゲティングプライマーが使用され得る。ＴＳＯおよび鋳型スイッチング可能な逆転写酵素が区画内に存在する場合、ＲＴ産物の３’末端は、［ＴＳＯ＊｝を用いて伸長され得る。ＴＳＯ配列は全ての区画、したがって全ての細胞内で定常であり得るので、ＴＳＯ配列はまた、共通配列でもある。それはセンス鎖におけるＶ（Ｄ）Ｊ領域の上流にあるので、上流共通配列と呼ばれる。ＴＳＯ配列は任意に設計されてもよく、標的配列のいずれかの部分に結合する必要がないので、ＴＳＯ配列はまた、アダプター配列とも呼ばれる。この例では、プライマー伸長産物はＶ（Ｄ）Ｊ領域の上流および下流の両方に共通配列を有し、これらの共通配列はさらなる増幅および融合反応のために使用され得る。
【０２０３】
[00246]ＤＮＡが鋳型として使用される場合、プライマーのパネルはＪ領域またはＶ領域の各々について設計され得る。Ｊ領域およびＶ領域は定常ではないので、さらなるアダプター配列が、パネル内のプライマーの各々の５’末端に付加されてもよい。アダプター配列は、下流共通配列（例えば、プライマーがＪ領域に結合するように設計される場合）または上流共通配列（例えば、プライマーがＶ領域に結合するように設計される場合）であってもよい。
【０２０４】
[00247]生体粒子（例えば、細胞、核、エキソソームなど）を分配するための方法には、例えば、マイクロ流体ベースの方法および非マイクロ流体ベースの方法（例えば、ボルテックス）が含まれる。本開示は、一部の区画内で、１つのみの生体粒子が１つの区画に存在するようにソース生体粒子を区画に分配するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、区画の少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、生体粒子を含有しないか、または１つのみの生体粒子を含有する。一部の実施形態では、区画の少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、プライマー送達粒子を含有しないか、または１つのみのプライマー送達粒子を含有する。
【０２０５】
[00248]利用される仕切りまたは区画の数は適用に応じて変化し得る。例えば、仕切りまたは区画の数は、約５個、１０個、５０個、１００個、２５０個、５００個、７５０個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、５０００個、７５００個もしくは１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、２０００００個、３０００００個、４０００００個、５０００００個、６０００００個、７０００００個、８０００００個、９０００００個、１００００００個、２００００００個、３００００００個、４００００００個、５００００００個、１０００００００個、２０００００００個、またはそれより多くであってもよい。仕切りまたは区画の数は、少なくとも約１個、５個、１０個、５０個、１００個、２５０個、５００個、７５０個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、５０００個、７５００個もしくは１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、２０００００個、３０００００個、４０００００個、５０００００個、６０００００個、７０００００個、８０００００個、９０００００個、１００００００個、２００００００個、３００００００個、４００００００個、５００００００個、１０００００００個、２０００００００個、またはそれより多くであってもよい。仕切りまたは区画の数は、５個未満、１０個未満、５０個未満、１００個未満、２５０個未満、５００個未満、７５０個未満、１０００個未満、１５００個未満、２０００個未満、２５００個未満、５０００個未満、７５００個未満もしくは１００００個未満、２００００個未満、３００００個未満、４００００個未満、５００００個未満、６００００個未満、７００００個未満、８００００個未満、９００００個未満、１０００００個未満、２０００００個未満、３０００００個未満、４０００００個未満、５０００００個未満、６０００００個未満、７０００００個未満、８０００００個未満、９０００００個未満、１００００００個未満、２００００００個未満、３００００００個未満、４００００００個未満、５００００００個未満、１０００００００個未満、２０００００００個未満、またはそれより多くの数未満であってもよい。仕切りまたは区画の数は、約５〜１０００００００個、５〜５００００００個、５〜１００００００個、１０〜１００００個、１０〜５０００個、１０〜１０００個、１０００〜６０００個、１０００〜５０００個、１０００〜４０００個、１０００〜３０００個または１０００〜２０００個であってもよい。
【０２０６】
[00249]区画に分配される生体粒子の数は、約１個、２個、３個、４個、５個、１０個、５０個、１００個、２５０個、５００個、７５０個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、５０００個、７５００個もしくは１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、２０００００個、３０００００個、４０００００個、５０００００個、６０００００個、７０００００個、８０００００個、９０００００個、１００００００個、２００００００個、３００００００個、４００００００個、５００００００個、１０００００００個、２０００００００個、またはそれより多くであってもよい。区画に分配される生体粒子の数は、少なくとも約１個、５個、１０個、５０個、１００個、２５０個、５００個、７５０個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、５０００個、７５００個もしくは１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、２０００００個、３０００００個、４０００００個、５０００００個、６０００００個、７０００００個、８０００００個、９０００００個、１００００００個、２００００００個、３００００００個、４００００００個、５００００００個、１０００００００個、２０００００００個、またはそれより多くであってもよい。区画に分配される生体粒子の数は、２個未満、５個未満、１０個未満、５０個未満、１００個未満、２５０個未満、５００個未満、７５０個未満、１０００個未満、１５００個未満、２０００個未満、２５００個未満、５０００個未満、７５００個未満もしくは１００００個未満、２００００個未満、３００００個未満、４００００個未満、５００００個未満、６００００個未満、７００００個未満、８００００個未満、９００００個未満、１０００００個未満、２０００００個未満、３０００００個未満、４０００００個未満、５０００００個未満、６０００００個未満、７０００００個未満、８０００００個未満、９０００００個未満、１００００００個未満、２００００００個未満、３００００００個未満、４００００００個未満、５００００００個未満、１０００００００個未満、２０００００００個未満、またはそれより多くの数未満であってもよい。区画に分配される生体粒子の数は、約５〜１０００００００個、５〜５００００００個、５〜１００００００個、１０〜１００００個、１０〜５０００個、１０〜１０００個、１０００〜６０００個、１０００〜５０００個、１０００〜４０００個、１０００〜３０００個または１０００〜２０００個であってもよい。
【０２０７】
[00250]一部の実施形態では、区画は、選別によって補助される分離を備えた標準的なマイクロウェルプレートにおけるウェルである。一部の実施形態では、ソーターは蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）である。さらに、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１と同様に、分配は、分離されたマイクロ流体チャンバにおける自動ライブラリー生成と合わせられてもよい。一部の実施形態では、仕切りは１ナノリットル未満のウェルであり、粒子は半透膜によって封止される。
【０２０８】
[00251]単一の生体粒子を個々の区画に分配した後、生体粒子は、その構成要素が放出されるように操作され得る。例えば、単一の細胞または核は、さらなる分析のためにそのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および／またはペプチドを区画に放出させるために溶解され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡは免疫受容体をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【０２０９】
[00252]ある特定の態様によれば、細胞などの生体粒子は、仕切り内に細胞の含有物を放出させるために溶解剤（例えば、細胞溶解試薬）と共に分配され得る。そのような場合、溶解剤は、例えば、チャネルジャンクションの上流のさらなるチャネル（複数も含む）を介して分配ジャンクション／液滴生成ゾーンへの細胞の導入と同時またはその直前に細胞懸濁液と接触され得る。溶解剤の例には、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、リゾスタフィン、ラビアーゼ（ｌａｂｉａｓｅ）、キタラーゼ、リティカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）から入手可能である様々な他の溶解酵素、ならびに他の市販の溶解酵素などの、異なる細胞型、例えば、グラム陽性または陰性細菌、植物、酵母、哺乳動物などの溶解のために使用される溶解酵素などの生体活性試薬が含まれる。他の溶解剤は、さらにまたは代替として、仕切りへの細胞の含有物の放出を引き起こすために細胞と共分配されてもよい。例えば、一部の場合、界面活性剤ベースの溶解溶液が細胞を溶解するために使用され得るが、それらは、界面活性剤が安定なエマルジョンを妨げ得るエマルジョンベースのシステムにとってあまり望ましくない場合がある。一部の場合、溶解溶液には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＴｗｅｅｎ２０などの非イオン性界面活性剤が含まれ得る。一部の場合、溶解溶液には、例えば、サルコシルおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのイオン性界面活性剤が含まれ得る。同様に、電気穿孔などの、他の方法を利用する溶解方法が使用されてもよく、熱的、音響的または機械的細胞破壊もまた、ある特定の場合、例えば、液滴分配に加えてであってもよいか、または液滴分配の代わりであってもよい細胞のカプセル化などの非エマルジョンベースの分配に使用されてもよく、カプセル化の任意の孔径は、細胞破壊の後、所望のサイズの核酸断片を保持するように十分小さい。
【０２１０】
[00253]上記の細胞と共分配された溶解剤に加えて、例えば、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ不活性化剤またはプロテイナーゼＫなどの阻害剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ならびに核酸の後の処理に対する異なる細胞溶解成分の負の活性または影響を取り除くまたはそうでなければ低減させる際に利用される他の試薬を含む、他の試薬もまた、細胞と共分配されてもよい。さらに、カプセル化された細胞の場合、細胞は、共分配されたマイクロカプセルから細胞またはそれらの含有物を放出させるために適切な刺激に曝露され得る。例えば、一部の場合、化学的刺激が、マイクロカプセルの分解および細胞またはその含有物のより大きな仕切りへの放出を可能にするためにカプセル化された細胞と共に共分配されてもよい。
【０２１１】
[00254]細胞のＤＮＡを断片化するためのエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ酵素および細胞の核酸断片を増幅させるために使用されるｄＮＴＰなどの、さらなる試薬もまた、細胞と共分配されてもよい。また、さらなる試薬には、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を含む、逆転写酵素、プライマーおよびオリゴヌクレオチド、ならびに鋳型スイッチングのために使用され得るスイッチオリゴヌクレオチド（「スイッチオリゴ」または「鋳型スイッチオリゴ」または「ＴＳＯ」とも本明細書で称される）も含まれ得る。一部の場合、鋳型スイッチングはｃＤＮＡの長さを増大させるために使用され得る。鋳型スイッチングの一例では、ｃＤＮＡは、鋳型の逆転写、例えば細胞ｍＲＮＡから生成されてもよく、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素は、さらなるヌクレオチド、例えばｐｏｌｙＣを、ｃＤＮＡの末端などにおいて鋳型によってコードされていないｃＤＮＡに付加することができる。スイッチオリゴは、さらなるヌクレオチド、例えばｐｏｌｙＧと相補的な配列を含むことができる。ｃＤＮＡにおけるさらなるヌクレオチド（例えばｐｏｌｙＣ）は、スイッチオリゴにおけるさらなるヌクレオチド（例えば、ｐｏｌｙＧ）と相補的な配列とハイブリダイズでき、それによってスイッチオリゴは、ｃＤＮＡをさらに伸長するための鋳型として逆転写酵素によって使用され得る。スイッチオリゴは、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む改変された核酸、またはいずれかの組合せを含むことができる。
【０２１２】
[00255]上記の作用物質は細胞または他の生体粒子と共分配されてもよいが、これらの作用物質を必ずしも共分配する必要はない。本明細書に記載される方法は、硬化粒子の形成および硬化粒子内への標的分子の封入を可能にするので、種々のステップが、試験管内で作用物質をプールされた硬化粒子と直接混合することによって硬化粒子の形成後に実施されてもよい。単一細胞に由来する標的分子は、異なる単一細胞由来の標的分子と混合することなく、それらの同一性を依然として維持する。例えば、溶解剤は、硬化粒子をプールした後に添加されてもよい。別の例として、逆転写のための作用物質が、硬化粒子をプールした後に添加されてもよい。封入された標的部分を有する硬化粒子はバルクでの様々な操作を可能にすることが理解されるべきである。
【０２１３】
[00256]様々な実施形態では、生体粒子は、重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを含む溶液と共分配され得る。一部の実施形態では、生体粒子は重合可能またはゲル化可能なポリマーと共分配される。一部の実施形態では、生体粒子は重合可能またはゲル化可能なモノマーと共分配される。一部の実施形態では、生体粒子は重合可能またはゲル化可能なポリマーおよびモノマーの混合物と共分配される。ポリマーは同じ化学物質であってもよいか、または異なる化学物質であってもよい。モノマーは同じ化学物質であってもよいか、または異なる化学物質であってもよい。一部の実施形態では、溶液は、ゲル化プロセスを開始するのに必要な作用物質をさらに含む。一部の実施形態では、溶液は、硬化粒子（例えば、ヒドロゲル粒子）を形成する重合プロセスを開始するのに必要な作用物質をさらに含む。
【０２１４】
[00257]本明細書に提供される反応の後、予め形成された固体支持体および硬化粒子は、それらがさらなる操作のために水溶液中に浸漬され得るように回収され得る。
[00258]固体壁付き区画の水性含有物が硬化粒子に変換されると、硬化粒子は、固体足場を変形させること、固体足場を溶解させること、ベッセルの開口によって硬化粒子を誘導させるために遠心力を使用すること、またはそれらの組合せによって区画から除去され得る。
【０２１５】
[00259]一部の実施形態では、区画は液体壁付き（例えば、油中水液滴）である。この場合、硬化粒子は、区画を合体させることによって、例えば、油中水エマルジョンを解乳化することによって区画から除去され得る。解乳化は、パーフルオロオクタノールおよびクロロホルムなどの解乳化剤により達成され得る。解乳化の方法は使用されるキャリアオイルに依存し得る。フルオロカーボンオイルの場合、エマルジョンは、ＨＦＥ−７５００オイル（２０％〜１００％ＰＦＯ）中の２０％〜１００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロオクタノールを添加することによって解乳化され得る。鉱物油の場合、エマルジョンは、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１；ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ；Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＢＰ１７５２１）によって解乳化され得る。解乳化はまた、ハンドヘルド帯電防止ガンを使用すること、およびセルストレーナーの上で水溶液により洗浄することなどの非化学的方法によっても達成され得る。
【０２１６】
アダプター付加
[00260]本開示は、単一の生体粒子に由来する第１および第２の免疫受容体をコードするポリヌクレオチドにより各々改変された複数の固体支持体を得るための方法を提供する。一部の実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、上流の共通配列（例えば、ＴＳＯ配列）および下流の共通配列（例えば、Ｃ領域に結合するプライマーの配列）の両方を有する。この場合、これらの固体支持体は予備増幅または融合のために直接使用され得る。
【０２１７】
[00261]他の場合、第１または第２のポリヌクレオチドは、再配列Ｖ（Ｄ）Ｊ配列の上流または下流のいずれかに共通配列を有さなくてもよいか、または１つのみの共通配列を有してもよい。この場合、さらなる共通配列が付加され得る。さらなる共通配列はアダプター配列であってもよい。アダプター配列はプライマー伸長によって付加され得、プライマーはその５’末端においてアダプター配列を含有する。一部の実施形態では、プライマーのパネルが使用されてもよく、全てのプライマーは同じアダプター配列を共有する。パネルの各プライマーは、ソース免疫受容体発現細胞の免疫受容体レパートリーに存在し得る異なるＶ領域を認識することができる。パネルの各プライマーは、ソース免疫受容体発現細胞の免疫受容体レパートリーに存在し得る異なるＪ領域を認識することができる。Ｖ領域をターゲティングするプライマーのパネルを使用して上流のアダプター配列を付加するための例は実施例の段落に提供される。
【０２１８】
[00262]単一細胞充実性を維持しながら（すなわち、固体支持体に付着した免疫受容体をコードするポリヌクレオチドが１つの細胞に由来していることを確保しながら）、これらのプライマー伸長反応を実施するために、単一細胞反応器が使用され得る。
【０２１９】
[00263]機械的強度ならびに固体支持体への第１および第２のポリヌクレオチドの付着がプライマー伸長反応の温度に耐えることができる場合、固体支持体はプライマーおよび酵素を含む連続体積の水溶液中に浸漬され得る。そうでなければ、固体支持体は、大部分の区画の各区画が１つ以下の固体支持体を含有する区画に再分配され得る。この場合、区画はプライマー伸長反応のためのプライマーおよび酵素も含むことができる。
【０２２０】
[00264]固体支持体が粒子である場合、固体支持体の再分配は、生体粒子が固体支持体（例えば、粒子）と置き換えられることを除いて、生体粒子を分配するために使用される同じ方法により行われ得る。固体支持体がヒドロゲル粒子である場合、酵素およびプライマーはヒドロゲル粒子に拡散され得、ヒドロゲル粒子は、本明細書に記載される他の方法を使用して再乳化され得る。
【０２２１】
[00265]本明細書に記載される方法を使用して、単一の生体粒子に由来する第１および第２の免疫受容体をコードするポリヌクレオチドにより各々改変された複数の固体支持体を提供することができ、第１および第２の免疫受容体をコードするポリヌクレオチドの両方は上流の共通配列および下流の共通配列を有する。
【０２２２】
対合二分免疫受容体ポリヌクレオチドの融合
[00266]第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを産生するための組成物および方法が本明細書に提供される。第１の核酸配列は第１の免疫受容体鎖をコードすることができ、第２の核酸配列は第２の免疫受容体鎖をコードすることができる。第１の免疫受容体鎖および第２の免疫受容体鎖は機能的免疫受容体の受容体を形成することができる。第１の免疫受容体鎖および第２の免疫受容体鎖をコードする核酸配列は単一細胞由来であり得る。第１の免疫受容体鎖および第２の免疫受容体鎖は、細胞（例えば、免疫細胞）から得られた免疫受容体の同種対の組合せ（または自然に対合した組合せ）由来であり得る。第１および／または第２の核酸配列は、免疫受容体の完全長可変ドメイン（例えば、３つ全てのＣＤＲ：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む）をコードすることができる。第１および／または第２の核酸配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択される１つまたは複数のＣＤＲを含む部分的可変ドメインをコードすることができる。第１および／または第２の核酸配列は、免疫受容体の定常ドメインをさらにコードすることができる。定常ドメインは、完全長定常ドメイン、または細胞外定常ドメイン、または完全長定常ドメインの任意の部分であってもよい。一部の場合、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１２００、少なくとも１５００、またはそれより多くのヌクレオチド（または塩基対）長である。一部の場合、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、またはそれより多くのヌクレオチド（または塩基対）長である。一部の場合、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、６００〜１０００または１５００〜３０００ヌクレオチド（または塩基対）長である。
【０２２３】
[00267]単一細胞反応器内で、ライゲーションおよびＰＣＲベースの方法などの、種々の方法が、二分免疫受容体の２つのペプチド鎖をコードする配列を融合させるために使用され得る。本明細書で使用される場合、「融合する」とは、連結することまたは物理的に連結することを指す。二分免疫受容体の２つのペプチド鎖をコードする配列は、単一細胞（または本明細書に記載される単一ソース免疫受容体発現細胞）由来であり得る。発現されたｍＲＮＡの性質に基づいて、ＲＴ−ＰＣＲを実施することによってゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから標的核酸をコピーするか、または増幅させるかのどちらかの選択がなされ得る。鋳型としてゲノムＤＮＡを使用すると、逆転写ステップを必要しなくてもよいが、非機能的受容体を増幅させるリスクを有することがあり、一方、鋳型としてｍＲＮＡを使用すると、より多いコピー数から利益を受けることができ、機能的な発現された受容体を捕捉することができる。二分免疫受容体の２つのペプチド鎖をコードする２つの核酸の物理的融合は、複数の機構を介して生じ得る。例えば、物理的融合は、標準的なスプライシングオーバーラップ伸長（ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｂｙ−ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ）（融合ＰＣＲ、クロスオーバーＰＣＲ、またはＯＥ−ＰＣＲと略されるオーバーラップ伸長ＰＣＲとしても知られている）によって達成され得、それによってＰＣＲプライマーの２つが相補配列を有し、その結果、２つのアンプリコンがプライマーとして機能し、それらは互いに融合する。この方法の１つの利点は、融合構築物が有効なｓｃＦＶフォーマットに即座になるように重複配列が設計され得ることであり得る。別の例として、融合は、タグがＰＣＲプライマーに組み込まれるという点でＳＯＥ−ＰＣＲと同様の機構によって達成され得る。この場合、融合がＣｒｅ媒介性組換えにより生じ得るようにタグはｌｏｘＰ部位を含有することができる。物理的融合はまた、平滑末端ライゲーションおよび付着末端ライゲーションを含むライゲーションによって達成され得る。
【０２２４】
予備増幅
[00268]融合反応の前に、二分免疫受容体ペプチド鎖の各々をコードする標的核酸が増幅され得、これは「予備増幅」と称される。予備増幅は、調製手順および増幅手順を含む、２つの手順を含むことができる。調製手順の間、１つまたは複数の反応が、増幅前に、共通配列（例えば、アダプター配列）を有するオリゴヌクレオチドを標的核酸に付加するために実施され得る。例えば、調製手順は、アダプターを用いて新たに合成される産物を生成するためにアダプター配列を有するプライマーを使用した標的核酸の核酸合成を含むことができる。アダプターは、標的核酸とハイブリダイズできなくてもよいか、または相補的でなくてもよい。本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズできる」とは、所与の条件下で２つの核酸鎖の間に安定な塩基対合を形成することを指す。アダプターは所定の配列を含むことができ、増幅手順のためのプライマーを結合するために使用され得る。一部の場合、調製手順後、新たに合成された産物は、各末端に１つのアダプター配列を有する２つのアダプター配列を含む。
【０２２５】
[00269]上記の段落は、単一の生体粒子に由来する第１および第２の免疫受容体をコードするポリヌクレオチドにより各々が改変された複数の固体支持体を提供するための一般的な方法を記載し、第１および第２の免疫受容体をコードするポリヌクレオチドの両方は上流の共通配列および下流の共有配列を有する。このような複数の支持体の提供は調製手順を実施した結果であり得る。
【０２２６】
[00270]一部の場合、標的核酸はＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）であり、調製手順は、ＤＮＡのコピーを生成するために第１のアダプター配列を有する第１のプライマーおよび第２のアダプター配列を有する第２のプライマーを使用することを含むことができる。第１のアダプター配列および第２のアダプター配列は、予め設計されてもよいか、または人工配列であってもよい。第１のプライマーおよび第２のプライマーのうちの一方は、ＤＮＡのコピーをヒドロゲル粒子のポリマーフレームワークに連結させるために使用され得る。両方のアダプター配列がさらなる増幅のためのプライマーを結合するために使用され得る。二分免疫受容体の標的核酸はイントロンを含有することができるゲノムＤＮＡであってもよい。プライマーは、イントロンを有さない領域を合成（またはコピー）するように設計され得、例えば、イントロンは、通常、Ｊ領域とＣ領域との間に位置するので、プライマーはＴＣＲ鎖についての可変ドメインのみを合成（またはコピー）するように設計され得る。
【０２２７】
[00271]一部の場合、二分免疫受容体の標的核酸はｍＲＮＡである。そしてこのような場合、ＲＴステップはＰＣＲによる増幅の前に実施され得る。ＲＴプライマーは拡散が抑制され得る。一部の場合、ＲＴプライマーは拡散が抑制されなくてもよい。ＲＴプライマーは捕捉剤のターゲティング部分であってもよい。例えば、単一細胞反応器がヒドロゲル粒子である場合、ＲＴプライマーはポリマーフレームワークに直接的または間接的に連結され得る。表面または固体支持体またはフレームワーク上に捕捉剤を固定化するための本明細書に記載される種々の方法は、ＲＴプライマーをポリマーフレームワークに連結させるために使用され得る。ＲＴプライマーは拡散抑制剤に連結され得る。ＲＴステップの結果として、ＲＴ産物（ｃＤＮＡまたは伸長ＲＴプライマー）は、ポリマーフレームワークに直接的または間接的に連結され得る（または拡散が抑制され得る）。ＲＴステップの間、鋳型スイッチングオリゴ（ＴＳＯ）を使用する鋳型スイッチが実施され得る。一部の場合、鋳型スイッチステップはＲＴステップの間に実施され、鋳型スイッチされたＲＴ産物はポリマーフレームワークに連結されるか、または拡散が抑制される。ＴＳＯは、増幅手順の間、プライマーを結合するために使用され得るアダプター配列として機能することができる。ＲＴプライマーは、ポリＴであってもよいし、または定常ドメインの配列とハイブリダイズできるか、または相補的である配列であってもよい。一部の他の場合、鋳型スイッチは実施されなくてもよく、第２の鎖合成（ＳＳＳ）ステップはＲＴステップ後に実施される。ＳＳＳステップの間、共通アダプター配列を有するプライマーのパネルが使用され得る。
【０２２８】
[00272]予備増幅において、増幅産物（またはアンプリコン）は免疫受容体ペプチド鎖の全てのＣＤＲ配列をコードすることができる。免疫受容体ペプチド鎖をコードする核酸（例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ）の全てのＣＤＲ配列を含有する配列を増幅させるための様々な手段が存在する。非限定的な例が本明細書に記載される。例えば、鋳型スイッチング反応はＲＴの間に実施され得る。ＴＳＯを使用する鋳型スイッチングがＲＴの間に実施され、ｃＤＮＡがＴＳＯの同じ配列を本質的に有するフォワードプライマー、および免疫受容体ポリヌクレオチドのＣ領域を認識するリバースプライマーによって増幅される場合、免疫受容体鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を包含するＶ領域およびＶ（Ｄ）Ｊジャンクションの全体が増幅され得る（例えば、図４Ａ、矢印（１）〜（２））。あるいは、鋳型スイッチングがＲＴの間に実施されない場合、フォワードプライマーは、免疫受容体鎖のＦＲ１（すなわち、ＣＤＲ１の上流にあるフレームワーク１）セグメント上またはその上流の配列を認識するように設計され得る。このフォワードプライマーはＳＳＳまたはＰＣＲに使用され得る（例えば、図５Ａおよび５Ｂ、矢印（１）〜（３））。
【０２２９】
[00273]免疫受容体のＶ遺伝子は非常に多様であり得る。したがって、所与の生物（例えば、ヒト）における所与の免疫細胞型（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）における免疫受容体鎖を増幅させるために、１０〜１００個のプライマー（「Ｖ遺伝子プライマー」と称される）のパネルが設計され得る。一部の場合、少なくとも２個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、またはそれより多くのプライマーのパネルは、少なくとも２個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、またはそれより多くの異なるＶ遺伝子を標的とする（例えば、増幅させる）ように設計され得る。一部の場合、所与の生物における所与の免疫細胞型における全ての可能な免疫受容体鎖が増幅される。
【０２３０】
[00274]ヒトにおいて、ＴＲＡＶ１−１、ＴＲＡＶ１−２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８−１、ＴＲＡＶ８−２、ＴＲＡＶ８−３、ＴＲＡＶ８−４、ＴＲＡＶ８−６、ＴＲＡＶ９−１、ＴＲＡＶ９−２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２−１、ＴＲＡＶ１２−２、ＴＲＡＶ１２−３、ＴＲＡＶ１３−１、ＴＲＡＶ１３−２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６−１、ＴＲＡＶ２６−２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８−１、ＴＲＡＶ３８−２、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、およびＴＲＡＶ４１を含む、ＴＲＡについての４０個より多い機能的Ｖ遺伝子が存在し得る。これらのＶ遺伝子の中で、それらの一部は同じサブグループに分類され得、それらは、「−」の記号の後は異なる番号であるが、「ＴＲＡＶ」のすぐ後の同じサブグループ番号で示される。例えば、ＴＲＡＶ１−１およびＴＲＡＶ１−２は同じサブグループ由来である。本明細書で使用される場合、「グループ」は、同じ「遺伝子型」（例えば、Ｖ、Ｄ、ＪまたはＣ型）を共有し、同じ「鎖型」のポリペプチドの合成に潜在的に関与する遺伝子のセットである。ひいては、グループは、関連する偽遺伝子およびオーファンを含む。「サブグループ」は、所与の種における同じグループに属し、ヌクレオチドレベルにおいて（Ｖ、ＤおよびＪについての生殖細胞系列構成において）少なくとも７５％の同一性を共有する遺伝子のセットを意味する。
【０２３１】
[00275]ヒトにおいて、ＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３−１、ＴＲＢＶ４−１、ＴＲＢＶ４−２、ＴＲＢＶ４−３、ＴＲＢＶ５−１、ＴＲＢＶ５−４、ＴＲＢＶ５−５、ＴＲＢＶ５−６、ＴＲＢＶ５−８、ＴＲＢＶ６−１、ＴＲＢＶ６−２、ＴＲＢＶ６−３、ＴＲＢＶ６−４、ＴＲＢＶ６−５、ＴＲＢＶ６−６、ＴＲＢＶ６−８、ＴＲＢＶ６−９、ＴＲＢＶ７−２、ＴＲＢＶ７−３、ＴＲＢＶ７−４、ＴＲＢＶ７−６、ＴＲＢＶ７−７、ＴＲＢＶ７−８、ＴＲＢＶ７−９、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０−１、ＴＲＢＶ１０−２、ＴＲＢＶ１０−３、ＴＲＢＶ１１−１、ＴＲＢＶ１１−２、ＴＲＢＶ１１−３、ＴＲＢＶ１２−３、ＴＲＢＶ１２−４、ＴＲＢＶ１２−５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０−１、ＴＲＢＶ２４−１、ＴＲＢＶ２５−１、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９−１、およびＴＲＢＶ３０を含む、ＴＲＢについての４０個より多い機能的Ｖ遺伝子が存在し得る。他の種、例えば、マウスについてのＶ遺伝子はＩＭＧＴデータベース上に見出され得る。
【０２３２】
[00276]一部の場合、予備増幅に使用されるＶ遺伝子プライマーの数は少ない（例えば、ＢＣＲまたは抗体遺伝子を増幅させる場合、約５個、６個、８個または１０個のＶ遺伝子プライマーのみが必要とされ得る）。このような場合、これらのプライマーはマルチプレックスＰＣＲに使用され得る。一部の場合、予備増幅に使用されるＶ遺伝子プライマーの数は多い（例えば、ＴＣＲ遺伝子を増幅させる場合、約５０個、８０個、１００個、またはそれより多くのＶ遺伝子プライマーが必要とされ得る）。このような場合、各Ｖ遺伝子プライマーの５’末端に付着させるための共有アダプター配列が設計され得、これらのプライマー（「アダプター含有Ｖ遺伝子プライマー」と称される）が、ｃＤＮＡとハイブリダイズし、単一サイクルプライマー伸長を実施するために使用され得る。このステップは、例えば、図５Ａに示されるように、ＳＳＳステップを指す。ＳＳＳステップ後、１つの共有プライマー対、すなわち、アダプターをターゲティングするフォワードプライマーおよびＣ領域をターゲティングするリバースプライマーが、可能な免疫受容体鎖を増幅させるために使用され得る。融合およびその後の操作の目的のために、異なるアダプターが各鎖について使用され得る。例えば、第１のアダプター配列がＴＲＡ鎖について使用され得、第２のアダプター配列がＴＲＢ鎖について使用され得る。一部の実施形態では、Ｖ遺伝子プライマーは、タンパク質コード配列（ＡＴＧから開始する）の最初の１５〜４０塩基の配列を有することができる。この場合、ＰＣＲ産物はＶ遺伝子およびＶＤＪジャンクションのコード配列全体を含むことができる。このようなアダプター含有Ｖ遺伝子プライマーの一部の例は、図５Ａおよび実施例の節に記載されるように［ＡｄｐｔＡ｜ＣＤＳＴＲＡ｝および｛ＡｄｐｔＢ｜ＣＤＳＴＲＢ｝である。アダプター含有Ｖ遺伝子プライマーのプライマーは、その３’末端を保護するためにブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされ得る。ブロッカーオリゴヌクレオチドは２つ以上の別個のオリゴヌクレオチド鎖であってもよい。
【０２３３】
[00277]ＳＳＳまたはＰＣＲにおいて１０〜１００個のプライマーを適用する場合、配列特異性を維持することは困難であり得る。しかしながら、限定されないが、ＤＭＳＯおよびベタインなどの添加剤を使用すること、ＬＮＡまたはリボヌクレオチド（この後者はＲＮａｓｅ  Ｈ依存性ＰＣＲと併せて使用され得る）などの化学改変を使用すること、Ｙｉｎ−Ｙａｎｇプローブまたはトーホールド（ｔｏｅｈｏｌｄ）プローブなどの競合オリゴヌクレオチドを使用することを含む、ＳＳＳまたはＰＣＲについてのハイブリダイゼーションの特異性を増加させるために多くの方法が使用され得る。
【０２３４】
[00278]調製手順を実施した後、固体支持体を各々含む複数の単一細胞反応器が生成され得、ＯＥ−ＰＣＲなどのワンステップ融合反応（実施例６を参照のこと）が実施され得る。ＯＥ−ＰＣＲの間、アウタープライマー（例えば、図９ＢのｐＴＳＯ）が、インナープライマー（例えば、図９Ｂのプライマー１Ｒおよび２Ｒ）より高い濃度で使用され得る。指数関数的増幅段階の後、アウタープライマーは線形増幅を誘導することができ、その結果、アウタープライマーから伸長される一本鎖伸長産物の蓄積が生じる。これらの一本鎖伸長産物の３’末端は重複を有し、その配列はインナープライマーによって決定され、したがって互いにハイブリダイズできる。ハイブリダイゼーション産物は二本鎖融合産物を産生するためにさらに伸長され得る。
【０２３５】
[00279]一部の実施形態では、増幅手順は、融合産物を作り出すことなく、単一細胞反応器において免疫受容体をコードするポリヌクレオチドを増幅させるために実施され得る。これを行うために、単一の固体支持体を各々含む複数の単一細胞反応器が調製手順において調製され得、第１の対のプライマーが、その上流および下流の共通配列への結合を介して第１の免疫受容体コードポリヌクレオチド（例えば、ＴＣＲアルファ鎖について）を増幅し、第２の対のプライマーが、その上流および下流の共通配列への結合を介して第２の免疫受容体コードポリヌクレオチド（例えば、ＴＣＲベータ鎖について）を増幅する。
【０２３６】
[00280]予備増幅産物は、拡散が抑制され得る。例えば、このＰＣＲベースの予備増幅のためのプライマーは捕捉剤であってもよい。例えば、プライマーには、［ＡＲＳ｝が付加され得る。［ＡＲＳ｝は、ＰＥＧリンカーまたはＳｐａｃｅｒ  １８などの、フレキシブルなリンカーを介してプライマー配列に連結され得る。これらのプライマーの非限定的な例には、図４Ａおよび４ＢのＡＲＳ−ｐＴＳＯおよび図５Ｂのｈｔ１Ｆ、ｈｔ２Ｒが含まれる。
【０２３７】
[00281]増幅手順の後、第１の免疫受容体をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＴＣＲアルファ鎖をコードする）の第１の複数の増幅産物および第２の免疫受容体をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＴＣＲベータ鎖をコードする）の第２の複数の増幅産物により各々改変された複数の固体支持体を提供することができ、第１および第２の免疫受容体をコードするポリヌクレオチドは自然な対を形成する。
【０２３８】
重複設計
[00282]二分免疫受容体の２つのペプチド鎖をコードする２つの核酸は、いくつかの配向、例えば、頭−頭、頭−尾、および尾−尾で融合され得る（図３）。本明細書に記載されるように、「頭」はセンス核酸鎖の「５’末端」を指し、「尾」はセンス核酸鎖の「３’末端」を指す。一部の場合、配向は頭−尾であり、融合の順序（例えば、ＴＲＡの後にＴＲＢ、またはＴＲＢの後にＴＲＡ）が制御され得る。このような制御性を達成するために、配列依存性融合が実施され得る。これを行うために、重複配列が２つの鎖の増幅産物内で操作され得る。本明細書に記載されるように、ＴＣＲのＴＲＡおよびＴＲＢポリヌクレオチドの融合は、異なるストラテジーを説明するための例として使用される。このストラテジーは、ＢＣＲ鎖融合、抗体鎖融合およびＴＣＲγδ鎖融合に適用され得る。
【０２３９】
尾−尾設計
[00283]図４Ａおよび４Ｂは、ＴＣＲ免疫受容体のＴＲＡおよびＴＲＢの尾−尾（tail-to-tail）融合の例を示す。ＴＲＡセグメントの増幅に関して、ＴＲＡのＣ領域を認識するプライマー（すなわち、ＴＲＡＣ）がリバースプライマーとして使用され得る。ＴＲＡＣを認識するこのプライマーの配列は、［ＴＲＡＣ−５Ａ＊｝と表記され得る。［ＯＬ−２＊｝で表記される約１０ｎｔの配列は［ＴＲＡＣ−５Ａ＊｝の５’末端に付加されて、配列［ＯＬ−２＊｜ＴＲＡＣ−５Ａ＊｝を有する「１Ｒ」と表記されるプライマーを形成することができる。同様に、ＴＲＢセグメントの増幅に関して、ＴＲＢのＣ領域を認識するプライマー（すなわち、ＴＲＢＣ）がリバースプライマーとして使用され得る。ＴＲＢＣを認識するこのプライマーの配列は、［ＴＲＢＣ−５Ａ＊｝と表記される。［ＯＬ−１｝で表記される約１０ｎｔの配列は［ＴＲＢＣ−５Ａ＊｝の５’末端に付加されて、配列［ＯＬ−１｜ＴＲＢＣ−５Ａ＊｝を有する、本発明者らが「２Ｒ」と呼ぶプライマーを形成することができる。この設計では、［ＯＬ−１＊｝は［ＴＲＡＣ−５Ａ＊｝の最初の約１０塩基であり、［ＯＬ−２｝は［ＴＲＢＣ−５Ａ＊｝の最初の約１０塩基である。したがって、ＴＲＡ増幅産物のセンス鎖の最後の約２０塩基は［ＯＬ−１｜ＯＬ−２｝の配列を有することができ、ＴＲＢ増幅産物のセンス鎖の最後の約２０塩基は［ＯＬ−２＊｜ＯＬ−１＊｝の配列を有することができる。５’−３’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）、３’−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、配列およびリガーゼ非依存性クローニングまたはＳＬＩＣ）、またはＵＳＥＲ酵素ミックス（例えば、ＵＳＥＲフレンドリーＤＮＡ組換え（ＵＳＥＲ  ｆｒｉｅｎｄｌｙ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）またはＵＳＥＲｅｃ）を使用して長い付着末端を作り出した後、２つの末端はライゲーションによって融合され得る。アセンブリ方法のさらなる例には、限定されないが、環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ＣＰＥＣ）およびシームレスライゲーションクローニング抽出物（ＳＬｉＣＥ）アセンブリが含まれる。あるいは、これらの２つの末端はオーバーラップＰＣＲによって融合され得る。尾−尾配向においてＴＲＡおよびＴＲＢを融合するためのストラテジーの詳細な説明は実施例１にさらに提供される。
【０２４０】
頭−尾設計
[00284]図５Ａ〜５Ｃは、ＴＣＲ免疫受容体のＴＲＡおよびＴＲＢポリヌクレオチドの頭−尾（head-to-tail）融合の例を示す。本明細書に記載されるように、アダプター含有Ｖ遺伝プライマー−は、ＳＳＳの間、アダプター配列をＶ遺伝子配列に付加するために使用され得る。頭−尾融合を実施するために、［ＡｄｐｔＡ｝および［ＡｄｐｔＢ｝で表記される２つの異なるアダプター配列は、それぞれＴＲＡおよびＴＲＢについてのアダプター配列として使用され得る。ＴＲＡの後にＴＲＢの順序で頭−尾融合を作り出すために、配列［ＴＲＡＣ−５Ａ＊｝を有するＴＲＡを増幅させるためのリバースプライマーには、［ｈｔＯＬ−２＊｝と呼ばれる配列が付加されて、配列［ｈｔＯＬ−２＊｜ＴＲＡＣ−５Ａ＊｝を有する「ｈｔ１Ｒ」で表記されるプライマーを形成することができる。同時に、［ｈｔＯＬ−１｝と呼ばれる配列には、配列［ＡｄｐｔＢ｝を有するプライマーが付加されて、配列［ｈｔＯＬ−１｜ＡｄｐｔＢ｝を有する「ｈｔ２Ｆ」で表記される新しいプライマーを形成することができる。このプライマー「ｈｔ２Ｆ」は、ＴＲＢを増幅させるためのフォワードプライマーであってもよい。この設計では、［ｈｔＯＬ−１＊｝は［ＴＲＡＣ−５Ａ＊｝の最初の約１０塩基であり得、［ｈｔＯＬ−２｝は［ＡｄｐｔＢ｝の最初の約１０塩基であり得る。ＴＲＡおよびＴＲＢの増幅産物は、単一細胞反応器内でのライゲーションおよびオーバーラップＰＣＲなどの様々なストラテジーによって融合され得、単一細胞に由来する免疫受容体をコードする配列を有する増幅産物は固体支持体に付着され、各単一細胞反応器内に１つの固体支持体のみが存在する。これらの単一細胞反応器内で、増幅産物は本明細書に提供される方法（例えば、固体支持体を融解すること）を使用して自由に拡散可能に作製され得る。例えば、２つの末端は、５’−３’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）、３’−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、配列およびリガーゼ非依存性クローニングまたはＳＬＩＣ）、またはＵＳＥＲ酵素ミックス（例えば、ＵＳＥＲフレンドリーＤＮＡ組換えまたはＵＳＥＲｅｃ）を使用して長い付着末端を作り出した後、ライゲーションによって融合され得る。アセンブリ方法のさらなる例には、限定されないが、環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ＣＰＥＣ）およびシームレスライゲーションクローニング抽出物（ＳＬｉＣＥ）アセンブリが含まれる。頭−尾配向において、およびＴＲＡの後にＴＲＢの順序でＴＲＡおよびＴＲＢを融合するためのストラテジーの詳細な説明は実施例２にさらに提供される。
【０２４１】
免疫受容体発現ベクター
[00285]融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、本開示において「レシピエント細胞」と称される宿主細胞において発現されるように発現ベクターに挿入され得る。融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、線形または環状核酸鎖としてレシピエント細胞に送達され得る。融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、発現ベクターとしてレシピエント細胞に送達され得る。一部の場合、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドまたはベクターは電気穿孔によってレシピエント細胞に送達され得る。一部の場合、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドまたはベクターは、カチオン性ポリマーなどの担体によって送達され得る。
【０２４２】
[00286]二分免疫受容体の２つの鎖は、プラスミド、トランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐｉｇｇｙ  Ｂａｃ）、およびウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクター）などのベクターから発現され得る。ベクターのさらなる例には、シャトルベクター、ファージミド、コスミドおよび発現ベクターが含まれる。プラスミドベクターの非限定的な例には、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそれらのバリアントが含まれる。さらに、ベクターは、さらなる発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含むことができる。一部の場合、ベクターはレシピエント細胞に導入される核酸分子であり、それによって形質転換したレシピエント細胞を産生する。ベクターは、複製起点などの、レシピエント細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントを含むことができる。ベクターは、融合遺伝子の発現を可能にする配列に作動可能に連結した本開示による融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを含む発現ベクターであってもよい。ベクターは、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、複製可能、複製欠損およびそれらの脆弱な形態を含むアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシ乳頭腫ベクター、エプスタイン・バーベクター、ヘルペスベクター、ワクシニアベクター、Ｍｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ベクター、Ｈａｒｖｅｙネズミ肉腫ウイルスベクター、ネズミ乳腺腫瘍ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターおよび非ウイルスプラスミドなどの、ウイルスまたは非ウイルスベクターであってもよい。バキュロウイルスベクターは昆虫細胞における発現に適切であり得る。
【０２４３】
[00287]一部の実施形態では、ベクターは、自己複製型（ｍ）ＲＮＡ、自己複製（ｍ）ＲＮＡ、自己増幅（ｍ）ＲＮＡ、またはＲＮＡレプリコンとも称される自己増幅ＲＮＡレプリコンである。自己増幅ＲＮＡレプリコンはそれ自体を複製することができるＲＮＡである。一部の実施形態では、自己増幅ＲＮＡレプリコンは細胞内部でそれ自体を複製することができる。一部の実施形態では、自己増幅ＲＮＡレプリコンはＲＮＡポリメラーゼおよび目的の分子をコードする。ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰまたはＲｄＲｐ）であってもよい。自己増幅ＲＮＡレプリコンはまた、プロテアーゼまたはＲＮＡキャッピング酵素をコードすることができる。一部の実施形態では、自己増幅ＲＮＡレプリコンベクターは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、エバーグレーズウイルス（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ムカンボウイルス（Ｍｕｃａｍｂｏ  ｖｉｒｕｓ）、ピクスナウイルス（Ｐｉｘｕｎａ  ｖｉｒｕｓ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、南アフリカアルボウイルス（Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｒｂｏｖｉｒｕｓ）Ｎｏ．８６、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ミデルブルグウイルス（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ）、オニョン・ニョンウイルス（Ｏｎｙｏｎｇ−ｎｙｏｎｇ  ｖｉｒｕｓ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、バーマ森林ウイルス（Ｂａｒｍａｈ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｖｉｒｕｓ）、ゲタウイルス（Ｇｅｔａｈ  Ｖｉｒｕｓ）、サギヤマウイルス（Ｓａｇｉｙａｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ベバルウイルス（Ｂｅｂａｒｕ  ｖｉｒｕｓ）、マヤロウイルス（Ｍａｙａｒｏ  ｖｉｒｕｓ）、ウナウイルス（Ｕｎａ  ｖｉｒｕｓ）、アウラウイルス（Ａｕｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ワタロアウイルス（Ｗｈａｔａｒｏａ  ｖｉｒｕｓ）、ババンキウイルス（Ｂａｂａｎｋｉ  ｖｉｒｕｓ）、キジラガチウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ  ｖｉｒｕｓ）、高地Ｊウイルス（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ  Ｊ  Ｖｉｒｕｓ）、フォート・モーガンウイルス（Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎ  ｖｉｒｕｓ）、ヌドゥムウイルス（Ｎｄｕｍｕ  ｖｉｒｕｓ）、バギークリークウイルス（Ｂｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋ  ｖｉｒｕｓ）を含むことができるアルファウイルスとして知られているウイルスのトガウイルス科、およびアルファウイルスとして国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）よって分類される任意の他のウイルスであるか、またはそれらに由来する。一部の実施形態では、自己増幅ＲＮＡレプリコンは、ＶＥＥ  ＴＣ−８３ワクチン株などの、アルファウイルスの弱毒化形態由来の部分であるか、またはそれを含有する。一部の実施形態では、自己増幅ＲＮＡレプリコンベクターは、細胞変性をせずにまたは細胞へのアポトーシス効果なしに目的の分子（二分免疫受容体ならびに「レシピエント細胞のさらなるゲノム操作」および「レシピエント細胞によって発現されるさらなる作用物質」）という標題の節に記載されるさらなる作用物質を含む）の発現を可能にするウイルスの弱毒化���態である。一部の実施形態では、自己増幅ＲＮＡレプリコンベクターは、宿主細胞、標的細胞または生物における特定の機能（例えば、長期のまたは増加した二分免疫受容体発現）についてｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｓｉｌｉｃａで操作されているか、または選択されている。例えば、自己増幅ＲＮＡレプリコンの異なるバリアントを保有する宿主細胞の集団は、異なる時点で目的の１つまたは複数の分子（自己増幅ＲＮＡレプリコンまたは宿主ゲノムにおいてコードされる）の発現レベルに基づいて選択され得る。一部の実施形態では、選択されたまたは操作された自己増幅ＲＮＡレプリコンは、Ｉ型インターフェロン応答、先天性抗ウイルス応答、または宿主細胞もしくは生物からの適応免疫応答を低減させるように改変されており、その結果、宿主細胞、標的細胞、または生物において、より長く持続するか、またはより高レベルで発現するＲＮＡレプリコンのタンパク質発現を生じる。一部の実施形態では、この最適化された自己増幅ＲＮＡレプリコン配列は、所望の表現型形質（例えば、目的の分子のより高いもしくは十分に持続的な発現、または野生型株もしくはワクチン株と比較してベクターに対する低減した先天性抗ウイルス免疫応答）を有する個々の細胞または細胞の集団から得られる。一部の実施形態では、所望のまたは選択された自己増幅ＲＮＡレプリコン配列を保有する細胞は、自己増幅ＲＮＡレプリコンを含む治療剤で処置した後、有益な応答特性を有する対象（例えば、ヒトまたは動物）（例えば、優良応答者または完全寛解の対象）から得られる。一部の実施形態では、自己増幅ＲＮＡレプリコンベクターは、「レシピエント細胞のさらなるゲノム操作」および「レシピエント細胞によって発現されるさらなる作用物質」という標題の節に記載されるさらなる作用物質を発現することができる。一部の実施形態では、さらなる作用物質には、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦアルファ、グランザイムＢ、またはそれらの組合せなどのサイトカインが含まれる。一部の実施形態では、さらなる作用物質は、免疫受容体の発現に直接影響を与えることによって、または宿主細胞表現型をモジュレートすること（例えば、アポトーシスまたは増殖を誘導すること）によってのいずれかで二分免疫受容体の発現をモジュレートすることができる。一部の実施形態では、自己増幅ＲＮＡレプリコンは、１つまたは複数のサブゲノムポリヌクレオチドを産生するために１つまたは複数のサブゲノム配列を含有することができる。一部の実施形態では、サブゲノムポリヌクレオチドは、細胞翻訳機構による翻訳のための機能的ｍＲＮＡ分子として作用する。サブゲノムポリヌクレオチドは、サブゲノム配列からサブゲノムポリヌクレオチドを産生するようにポリメラーゼを誘導する自己増幅ＲＮＡレプリコンにおける規定された配列エレメント（例えば、サブゲノムプロモーターまたはＳＧＰ）の機能によって産生され得る。一部の実施形態では、ＳＧＰはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰまたはＲｄＲｐ）によって認識される。一部の実施形態では、複数のＳＧＰ配列は単一の自己増幅ＲＮＡレプリコンに存在し、二分免��受容体、二分免疫受容体の構成要素、またはさらなる作用物質をコードするサブゲノム配列の上流に位置することができる。一部の実施形態では、ＳＧＰ配列のヌクレオチド長または組成は、サブゲノムポリヌクレオチドの発現特性を変更するために改変され得る。一部の実施形態では、非同一ＳＧＰ配列は、対応するサブゲノムポリヌクレオチドの割合が、ＳＧＰ配列が同一である場合と異なるように、自己増幅ＲＮＡレプリコンに位置する。一部の実施形態では、非同一ＳＧＰ配列は、それらが、二分免疫受容体の増加した発現、標的細胞もしくは宿主に対して細胞傷害効果を有さない標的細胞の増加したもしくはより速い増殖を導くか、またはＲＮＡレプリコンに対する先天性もしくは適応免疫応答を弱める、互いに対する割合で産生されるように二分免疫受容体およびさらなる作用物質（例えば、サイトカイン）の産生を誘導する。一部の実施形態では、互いに対するサブゲノム配列およびＳＧＰ配列の位置ならびにゲノム配列自体は、互いに対するサブゲノムポリヌクレオチドの割合を変更するために使用され得る。一部の実施形態では、二分免疫受容体をコードするＳＧＰおよびサブゲノム配列は、二分免疫受容体の発現がさらなる作用物質に対して実質的に増加するように、さらなる作用物質をコードするＳＧＰおよびサブゲノム領域の下流に位置することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡレプリコンまたはＳＧＰは、サイトカインがＴ細胞の発現を促進するか、または二分免疫受容体の治療効果を増大するが、サイトカイン放出症候群、サイトカインストーム、または神経毒性などの重度の副作用を引き起こさないように最適量のサイトカインを発現するように選択されているか、または操作されている。
【０２４４】
[00288]一部の実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書に提供される。一部の実施形態では、ＴＣＲγ鎖およびＴＣＲδ鎖をコードする融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書に提供される。一部の実施形態では、ＢＣＲまたは抗体重鎖およびＢＣＲまたは抗体軽鎖をコードする融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書に提供される。一部の実施形態では、ベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンである。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルスまたはそれらの偽型に由来する。一部の実施形態では、ベクターは非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフィアに製剤化され得る。
【０２４５】
[00289]２つの鎖の発現は２つのプロモーターまたは１つのプロモーターによって駆動され得る。一部の場合、２つのプロモーターが使用される。一部の場合、２つのプロモーターは、２つの鎖についてのそれらのそれぞれのタンパク質コード配列と共に、頭−頭、頭−尾、または尾−尾の配向において配列され得る。一部の場合、１つのプロモーターが使用される。１つのプロモーターが両方の鎖を発現するために使用され得るように２つのタンパク質コード配列がフレーム内で連結され得る。そしてこのような場合、２つのタンパク質コード配列は頭−尾の配向において配列され得、バイシストロニック発現を容易にするためにリボソーム結合部位（例えば、内部リボソーム結合部位またはＩＲＥＳ）、プロテアーゼ切断部位、または自己プロセシング切断部位（２Ａペプチドをコードする配列など）と接続され得る。一部の場合、２つの鎖が一本鎖ポリペプチドとして発現され得るように２つの鎖はペプチドリンカーと連結され得る。各々の発現された鎖は、再配列Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子を含む完全な可変ドメイン配列を含有することができる。各々の発現された鎖は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む完全な可変ドメイン配列を含有することができる。各々の発現された鎖は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３を含む完全な可変ドメイン配列を含有することができる。一部の場合、各々の発現された鎖は、定常ドメイン配列をさらに含有することができる。
【０２４６】
[00290]発現ベクターを作り出すために、さらなる配列が融合免疫受容体遺伝子に付加される必要があり得る。これらのさらなる配列には、ベクターバックボーン（例えば、標的細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの一時的な宿主におけるベクターの複製に必要とされるエレメント）、プロモーター、ＩＲＥＳ、自己切断ペプチドをコードする配列、ターミネーター、アクセサリー遺伝子（ペイロードなど）、および免疫受容体ポリヌクレオチドの部分配列（定常ドメインをコードする配列の一部など）が含まれる。
【０２４７】
[00291]プロテアーゼ切断部位には、限定されないが、エンテロキナーゼ切断部位：（Ａｓｐ）４Ｌｙｓ；第Ｘａ因子切断部位：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；トロンビン切断部位、例えば、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ；レニン切断部位、例えば、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ；コラゲナーゼ切断部位、例えば、Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（Ｘが任意のアミノ酸である場合）；トリプシン切断部位、例えば、Ａｒｇ−Ｌｙｓ；限定されないが、ピコルナウイルス由来のプロテアーゼ２Ａ切断部位、Ａ型肝炎ウイルス３Ｃ切断部位、ヒトライノウイルス２Ａプロテアーゼ切断部位、ピコルナウイルス３プロテアーゼ切断部位；およびカスパーゼプロテアーゼ切断部位、例えば、切断が第２のアスパラギン酸残基の後に起こる、活性化カスパーゼ−３によって認識され、切断されたＤＥＶＤを含む、ウイルス２Ａまたは３Ｃプロテアーゼ切断部位などのウイルスプロテアーゼ切断部位が含まれる。一部の実施形態では、本開示は、プロテアーゼ切断部位を含む発現ベクターを提供し、プロテアーゼ切断部位は細胞プロテアーゼ切断部位またはウイルスプロテアーゼ切断部位を含む。一部の実施形態では、第１のタンパク質切断部位は、フューリンによって認識される部位；ＩＰＮＶのＶＰ４；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ；ライノウイルスの３Ｃプロテアーゼ；ＰＣ５／６プロテアーゼ；ＰＡＣＥプロテアーゼ、ＬＰＣ／ＰＣ７プロテアーゼ；エンテロキナーゼ；第Ｘａ因子プロテアーゼ；トロンビン；ゲネナーゼＩ；ＭＭＰプロテアーゼ；カブモザイクポチウイルスの核封入タンパク質ａ（Ｎ１ａ）；４型デング熱フラビウイルスのＮＳ２Ｂ／ＮＳ３、黄熱病ウイルスのＮＳ３プロテアーゼ；カリフラワーモザイクウイルスのＯＲＦ  Ｖ；ＫＥＸ２プロテアーゼ；ＣＢ２；または２Ａを含む。一部の実施形態では、タンパク質切断部位は、ウイルス内部で切断可能なシグナルペプチド切断部位である。一部の実施形態では、ウイルス内部で切断可能なシグナルペプチド切断部位は、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス、または風疹ウイルス由来の部位を含む。
【０２４８】
[00292]本開示のベクターに含めるのに適したＩＲＥＳエレメントは、真核リボソームに関与することができるＲＮＡ配列を含むことができる。一部の実施形態では、本開示のＩＲＥＳエレメントは、少なくとも約２５０塩基対、少なくとも約３５０塩基対、または少なくとも約５００塩基対である。本開示のＩＲＥＳエレメントは、限定されないが、ウイルス、哺乳動物、およびショウジョウバエを含む生物のＤＮＡに由来し得る。一部の場合、ＩＲＥＳエレメントが由来するウイルスＤＮＡには、限定されないが、ピコルナウイルス相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ｃＤＮＡおよびポリオウイルスｃＤＮＡが含まれる。ＩＲＥＳエレメントが由来する哺乳動物ＤＮＡの例には、限定されないが、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）をコードするＤＮＡおよび塩基性線維芽増殖因子（ｂＦＧＦ）をコードするＤＮＡが含まれる。ＩＲＥＳエレメントが由来するショウジョウバエＤＮＡの例には、限定されないが、キイロショウジョウバエ由来のアンテナペディア遺伝子が含まれる。ポリオウイルスＩＲＥＳエレメントのさらなる例には、例えば、ポリオウイルスＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、またはＡ型肝炎ウイルスＩＲＥＳが含まれる。フラビウイルスＩＲＥＳエレメントの例には、限定されないが、ウシウイルス性下痢ウイルスＩＲＥＳまたは古典的ブタ熱ウイルスＩＲＥＳを含む、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ＧＢウイルスＢ  ＩＲＥＳ、またはペスチウイルスＩＲＥＳが含まれる。
【０２４９】
[00293]自己プロセシング切断部位の例には、限定されないが、インテイン配列；改変インテイン；ヘッジホッグ配列；他のホッグファミリー配列；２Ａ配列、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）に由来する２Ａ配列；および各々についてのそれらのバリエーションが含まれる。
【０２５０】
[00294]組換え免疫グロブリンまたは他のタンパク質発現のためのベクターは、任意の数のプロモーターを含むことができ、プロモーターは、構成的、調節的または誘導的、細胞型特異的、組織特異的、または種特異的である。さらなる例には、テトラサイクリン応答性プロモーターが含まれる。ベクターは、組換え融合遺伝子が発現される宿主細胞に適合されたレプリコンであってもよく、それは、細菌細胞および例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において機能的なレプリコンを含むことができる。プロモーターは構成的または誘導的であってもよく、誘導は、例えば、特定の細胞型または特定の成熟レベルと関連する。あるいは、多くのウイルスプロモーターが適切であり得る。プロモーターの例には、β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０早期および後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、伸長因子１Ａ（ＥＦ−１Ａ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＦｒｉｅｎｄ脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーターが含まれる。プロモーターは、エンハンサーと関連していてもよいか、またはしていなくてもよく、エンハンサーは、特定のプロモーターと天然に関連していてもよいか、または異なるプロモーターと関連していてもよい。
【０２５１】
[00295]遺伝子発現のための宿主細胞であるレシピエント細胞は、限定されないが、動物細胞、特に哺乳動物細胞であってもよいか、またはそれは微生物細胞（細菌、酵母または真菌）または植物細胞であってもよい。宿主細胞の例には、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞などの昆虫培養細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母細胞、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｕｍ）およびペニシリン属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）などの真菌ならびにＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＣＯＳ、２９３、３Ｔ３（マウス）、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル）細胞などの哺乳動物細胞が含まれ、限定されないが、ブタ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシを含む、種々のトランスジェニック動物系も同様に使用されてもよい。バキュロウイルス、特にＡｃＮＰＶベクターは、例えば、昆虫細胞系におけるポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なプロモーターの調節制御下での単一ＯＲＦの発現を伴う、単一のＯＲＦ免疫受容体発現および本開示の切断のために使用され得る。哺乳動物細胞において使用されるプロモーターは、構成的（ヘルペスウイルスＴＫプロモーター；ＳＶ４０早期プロモーター；ラウス肉腫ウイルスプロモーター；サイトメガロウイルスプロモーター；マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター）または調節的（例えば、メタロチオネインプロモーター）であってもよい。ベクターは、特定の哺乳動物細胞に感染するウイルス、例えば、レトロウイルス、ワクシニアおよびアデノウイルスならびにそれらの誘導体に基づいてもよい。プロモーターには、限定されないが、サイトメガロウイルス、アデノウイルス後期、およびワクシニア７．５Ｋプロモーターが含まれる。エノラーゼは構成的酵母プロモーターの一例であり、アルコールデヒドロゲナーゼは調節的プロモーターの一例である。
【０２５２】
[00296]特定のプロモーター、転写終結配列および組織特異的配列をコードする配列などの他の必要に応じた配列の選択は、発現が実施される細胞の種類によって決定され得る。それは、細菌、酵母、真菌、哺乳動物、昆虫、ニワトリまたは他の動物細胞であってもよい。
【０２５３】
[00297]免疫受容体発現ベクターから発現された免疫受容体は、それらの自然形態であってもよいか、または操作された形態であってもよい。一部の場合、操作された形態は一本鎖抗体断片または一本鎖ＴＣＲ断片である。例えば、フレキシブルなリンカーは抗体の重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインを連結することができ、それによって一本鎖抗体断片（すなわち、ｓｃＦｖ）を形成する。一部の場合、操作された形態はＴＣＲ−ＣＡＲである。実施例３、４および５は、免疫受容体発現ベクターを作り出すために機能的配列（例えば、定常ドメインコード配列、Ｐ２Ａリンカーおよびプロモーター）を融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドにさらに融合するための方法を提供する。これらの方法はまた、免疫受容体のこれらの操作された形態を発現する免疫受容体発現ベクターを作り出すために機能的配列（例えば、リンカーＣＤ２８  ＴＭドメイン）を融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドに導入するために使用され得る。
【０２５４】
ソース免疫受容体発現細胞
[00298]融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドが本明細書に記載される方法を使用して作り出され得るソース免疫受容体発現細胞は、種々の生物由来の種々の細胞型であってもよく、種々の組織または臓器から単離されてもよい。ソース免疫受容体発現細胞は種々の試料から得られ得る。ソース免疫受容体発現細胞は、ＢＣＲ、ＴＣＲおよび抗体などの免疫受容体を産生することができる。ソース免疫受容体発現細胞は免疫細胞であってもよい。免疫細胞とは、先天性および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血起源の細胞を指す。ソース免疫受容体発現細胞は、リンパ球、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であってもよい。
【０２５５】
[00299]ソース免疫受容体発現細胞を宿主とする元の部位は、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドのレパートリーの特徴に影響を及ぼし得、その結果として、得られた免疫受容体発現ベクターおよび免疫受容体プログラムレシピエント細胞のレパートリーの特徴に影響を及ぼし得る。このようなレパートリーの特徴の態様は遺伝子使用の多様性であり得る。
【０２５６】
[00300]一部の場合、レパートリーは、２超、５超、１０超、５０超、１００超、５００超、１，０００超、５，０００超、１０，０００超、５０，０００超、または１００，０００超のＶ（Ｄ）Ｊの組合せを含有することができる。一部の場合、レパートリーは、２超、５超、１０超、５０超、１００超、５００超、１，０００超、５，０００超、１０，０００超、５０，０００超または１００，０００超の異なるＶ（Ｄ）Ｊの組合せを含有することができる。これは、ソース免疫受容体発現細胞のポリクローナル集団が、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子の非常に多様な用法を有することができ、その結果、非常に多様なＶ（Ｄ）Ｊの組合せが生じるためである。
【０２５７】
[00301]融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドまたは免疫受容体発現ベクターのＶＪの組合せは、両方の免疫受容体鎖によって使用されるＶ遺伝子およびＪ遺伝子によって規定され得る。融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドまたは免疫受容体発現ベクターのＶ（Ｄ）Ｊの組合せは、両方の免疫受容体鎖によって使用されるＶ遺伝子、Ｄ遺伝子およびＪ遺伝子によって規定され得る。例えば、ＴＲＡＶ８−４／ＴＲＡＪ４５／ＴＲＢＶ２９−１／ＴＲＢＪ１−５は、対合したＴＣＲの特定のＶＪの組合せを規定することができる。免疫受容体鎖についてのコード配列を考慮すると、Ｖ−ＱｕｅｓｔおよびＭｉＸＣＲなどの計算ツールを使用してＶ（Ｄ）Ｊの組合せを推測することができる。
【０２５８】
[00302]２つの異なる融合二分免疫受容体ポリヌクレオチド（または２つの異なる免疫受容体発現ベクター）は同じＶ（Ｄ）Ｊの組換えを共有することができるが、異なる配列を有することができることに留意されるべきであり、これは、（１）Ｖ（Ｄ）Ｊの組換えの間、ランダム挿入および欠失がＶ−Ｄ、Ｄ−ＪおよびＶ−Ｊジャンクションにおいて発生する場合があり、（２）配列変化が突然変異生成および遺伝子合成によって人工的に作り出され得、可変配列が遺伝子合成の間に導入され得るためであり得る。例えば、２つの融合ＴＣＲ遺伝子は同じＶＪの組換えを有してもよいが、異なるＣＤＲ３配列を有してもよい。融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、ソース免疫受容体発現細胞由来の第１の免疫受容体鎖および第２の免疫受容体鎖の同種対の組合せ（または細胞内の自然対の組合せ）を含むことができる。複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、複数の免疫受容体発現細胞由来の第１の免疫受容体鎖および第２の免疫受容体鎖の多数の同種対の組合せを含むことができる。ソース免疫受容体発現細胞は異なるクローン型を有することができるので、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドまたは発現ベクターのポリクローナル集団を生じることができる。ポリクローナル免疫受容体発現ベクターを複数のレシピエント細胞に送達することにより、少なくとも１００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、少なくとも１０，０００，０００個、または少なくとも１００，０００，０００個、またはそれより多くの異なる免疫受容体（または免疫受容体の異なる同種対の組合せ）を発現する、免疫受容体プログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団を産生することができる。異なる免疫受容体の各々は、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドにおいて固有の配列を有することができる。
【０２５９】
[00303]このポリクローナルの特徴により、本開示に記載される方法を使用して得られた融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドのライブラリー、発現ベクターのライブラリーおよび免疫受容体プログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団を、以前に報告された対応物から区別することができる。例えば、１つまたは少数の免疫受容体鎖コード配列、免疫受容体ドメインコード配列、または融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドから開始し、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドの大きなライブラリーを作り出すために突然変異生成またはエラープローンＰＣＲを使用してこれらの開始配列の多数のバリエーションを生成することができる。したがって、これらのライブラリーは１つまたは少数のＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子の組合せを含有することができる。対照的に、本開示に記載される方法を使用して得られた融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドのライブラリー、発現ベクターのライブラリーおよび免疫受容体プログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団は、約１，０００個超、約５，０００個超、約１０，０００個超、約５０，０００個超、約１００，０００個超、約５００，０００個超、約１，０００，０００個超、約５，０００，０００個超、または約１０，０００，０００個超の配列を含有することができ、約１，０００個超、約５，０００個超、約１０，０００個超、約５０，０００個超、約１００，０００個超、約５００，０００個超、約１，０００，０００個超、約５，０００，０００個超、または約１０，０００，０００個超のＶＪまたはＶＤＪの組合せを含有することができる。一部の場合、本開示に記載される方法を使用して得られた融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドのライブラリー、発現ベクターのライブラリーおよび免疫受容体プログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団は、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも５，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個のＶＪまたはＶＤＪの組合せを含有することができる。さらに、本開示に記載される方法を使用して得られた融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドのライブラリー、発現ベクターのライブラリーおよび免疫受容体プログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団は、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、もしくはそれより多くの異なるＴＲＡＶ（ＴＣＲα鎖についてのＶ遺伝子）サブグループ、および／または少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、もしくはそれより多くの異なるＴＲＢＶ（ＴＣＲβ鎖についてのＶ遺伝子）サブグループを含有することができる。
【０２６０】
試料
[00304]ソース免疫受容体発現細胞は、種々の試料から得られ得るか、または単離され得る。ソース免疫受容体発現細胞は、種々の試料から得られるか、または単離される免疫細胞であってもよい。試料は、本明細書に記載される種々の供給源または対象から得られ得る。レシピエント細胞もまた、本明細書に記載される試料から得られ得る。
【０２６１】
[00305]ある特定の実施形態では、ソース免疫受容体発現細胞は、病原体特異的、腫瘍特異的および／もしくは疾患特異的抗体または潜在的な臨床的有意性のＴＣＲを同定するために、ヒトまたは他の動物、例えば、免疫化されているか、または感染症、がん、自己免疫状態、もしくはいずれかの他の疾患に罹患しているヒトまたは他の動物などの、対象または宿主の血液試料または他の生体試料から単離され得る。例えば、ヒトは、疾患と診断されていてもよく、疾患の症状を示していてもよく、疾患と診断されていなくてもよく、または疾患の症状を示していなくてもよい。例えば、ヒトは、感染性因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、プリオンなど）、抗原もしくは疾患に曝露されたヒトおよび／またはそれらに対して有用な抗体もしくはＴＣＲを作製することができるヒトであってもよい。例えば、動物は、感染性因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、プリオンなど）、抗原もしくは疾患に曝露された動物および／またはそれらに対して有用な抗体もしくはＴＣＲを作製することができる動物であってもよい。免疫化された宿主由来のある特定の免疫細胞は、問題となる１つもしくは複数の標的抗原および／または１つもしくは複数の未知の抗原に対する抗体またはＴＣＲを作製することができる。本開示において、リンパ球プールは、試料から複数の免疫細胞を生成するために、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞分類（ＭＡＣＳ）、パニングまたは他のスクリーニング方法を使用した細胞のスクリーニングおよび選別などの任意の適切な方法によって所望の免疫細胞について濃縮され得る。
【０２６２】
[00306]免疫細胞は幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であってもよい。代表的なヒト幹細胞はＣＤ３４＋細胞であり得る。単離された免疫細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、Ｂ細胞、または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されるＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、またはＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球であってもよい。
【０２６３】
[00307]一部の実施形態では、ソース免疫受容体発現細胞は、非免疫化ヒトまたは非ヒトドナーから単離された免疫細胞であってもよい。抗体またはＴＣＲ結合部位の配列多様性は、生殖細胞系列において直接コードされなくてもよいが、Ｖ遺伝子セグメントから組合せ方式で構築されてもよい。免疫化は、増殖（クローン性増殖）するか、または対応する抗体を分泌するために免疫原に結合するＶＨ−ＶＬまたはＶａ−ＶβまたはＶγ−Ｖδの組合せを作製するいずれかの免疫細胞を誘発することができる。しかしながら、免疫化されていない対象由来の脾臓細胞および／もしくは免疫細胞または他の末梢血リンパ球の使用は、可能な抗体またはＴＣＲレパートリーの良好な表現を提供することができ、また、任意の動物種を使用して後のＢＣＲまたは抗体またはＴＣＲライブラリーの構築を可能にすることができる。
【０２６４】
[00308]一部の場合、ソース免疫受容体発現細胞は末梢血試料から得られ得る。末梢血細胞は、特定の細胞型（例えば、単核細胞；赤血球；ＣＤ４＋細胞；ＣＤ８＋細胞；免疫細胞；Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）について濃縮され得る。末梢血細胞はまた、特定の細胞型（例えば、単核細胞；赤血球；ＣＤ４＋細胞；ＣＤ８＋細胞；免疫細胞；Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）について選択的に枯渇され得る。試料は、異なるＢＣＲ（または抗体）またはＴＣＲを発現する個々の免疫細胞の少なくとも約５個、１０個、１００個、２５０個、５００個、７５０個、１０００個、２５００個、５０００個、１００００個、２５０００個、５００００個、７５０００個、１００００個、２５００００個、５０００００個、７５００００個、１００００００個、２５０００００個、５００００００個、７５０００００個または１０００００００個のサブセットを含むことができる。
【０２６５】
[00309]一部の場合、ソース免疫受容体発現細胞は、非限定的な例として、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃腺を含む）、甲状腺、胸腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道および胃由来の組織を含む、固体組織を含む組織試料から得られ得る。さらなる非限定的な供給源には、骨髄、臍帯血、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍が含まれる。一部の実施形態では、Ｔ細胞系が使用されてもよい。一部の実施形態では、細胞は、健康なドナー、がんと診断された患者もしくは感染症と診断された患者由来であってもよいか、またはそれらから得られてもよい。一部の実施形態では、細胞は、異なる表現型の特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。
【０２６６】
[00310]ソース免疫受容体発現細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、例えば、腫瘍浸潤Ｔ細胞であってもよい。ＴＩＬはがんに罹患している臓器から単離され得る。１つまたは複数の細胞は、脳、心臓、肺、眼、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、髪、爪、耳、腺、鼻、口、唇、脾臓、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨、腱、靭帯、腎上体、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節またはリンパ管であってもよい、がんを有する臓器から単離され得る。１つまたは複数のＴＩＬは、脳、心臓、肝臓、皮膚、腸、肺、腎臓、眼、小腸（ｓｍａｌｌ  ｂｏｗｅｌ）または膵臓由来であってもよい。ＴＩＬは、膵臓、腎臓、眼、肝臓、小腸、肺または心臓由来であってもよい。１つまたは複数の細胞は、膵島細胞、例えば、膵臓β細胞であってもよい。一部の場合、ＴＩＬは消化管がん由来であってもよい。ＴＩＬ培養物は多くの手段により調製され得る。例えば、腫瘍は非がん性組織または壊死領域から調整されてもよい。次いで腫瘍は約２〜３ｍｍの長さに断片化されてもよい。一部の場合、腫瘍は、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍのサイズ、約１ｍｍ〜約２ｍｍ、約２ｍｍ〜約３ｍｍ、約３ｍｍ〜約４ｍｍ、または約４ｍｍ〜約５ｍｍに断片化されてもよい。次いで腫瘍断片は、培地およびサイトカインなどの細胞刺激剤を利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され得る。一部の場合、ＩＬ−２は腫瘍断片からＴＩＬを増殖させるために利用され得る。ＩＬ−２の濃度は約６０００ＩＵ／ｍＬであってもよい。ＩＬ−２の濃度はまた、約２０００ＩＵ／ｍＬ、３０００ＩＵ／ｍＬ、４０００ＩＵ／ｍＬ、５０００ＩＵ／ｍＬ、６０００ＩＵ／ｍＬ、７０００ＩＵ／ｍＬ、８０００ＩＵ／ｍＬ、９０００ＩＵ／ｍＬ、または最大で約１００００ＩＵ／ｍＬまでであってもよい。ＴＩＬが増殖すると、それらは腫瘍反応性を決定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに供され得る。例えば、ＴＩＬは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５８発現についてＦＡＣによって評価され得る。ＴＩＬはまた、共培養、細胞傷害性、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供され得る。一部の場合、ＴＩＬ培養物は、凍結保存されてもよいか、または急速に増殖されてもよい。ＴＩＬなどの細胞は、限定されないが、胎児、新生児、若年および成人を含む、発達段階のドナーから単離されてもよい。
【０２６７】
[00311]１つまたは複数の試料は１つまたは複数の供給源由来であってもよい。試料の１つまたは複数は２つ以上の供給源由来であってもよい。試料の１つまたは複数は１つまたは複数の対象由来であってもよい。試料の１つまたは複数は２つ以上の対象由来であってもよい。試料の１つまたは複数は同じ対象由来であってもよい。１つまたは複数の対象は同じ種由来であってもよい。１つまたは複数の対象は異なる種由来であってもよい。１つまたは複数の対象は健康であってもよい。１つまたは複数の対象は、疾患、障害または状態による影響を受けていてもよい。
【０２６８】
[00312]試料は状態を有する対象から採取され得る。一部の実施形態では、試料が採取される対象は、患者、例えば、がん患者またはがんを有すると疑われる患者であってもよい。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよく、男性または女性であってもよい。一部の実施形態では、女性は妊娠している。試料は腫瘍生検であってもよい。生検は、例えば、医師、医師助手、看護師、獣医、歯科医、カイロプラクター、救急救命士、皮膚科医、がん専門医、消化器専門医または外科医を含む、医療提供者によって実施されてもよい。
【０２６９】
[00313]対象は、標的抗原が発現される疾患を有してもよい。例えば、疾患は、Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ）癌、副腎皮質（ａｄｒｅｎａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）がん、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、肝外がん、膀胱がん、骨がん（ユーイング肉腫および骨肉腫および悪性線維性組織球腫を含む）、脳腫瘍、乳がん、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（胃腸）、原発不明癌、中枢神経系、リンパ腫、原発性、子宮頸がん、胆管癌、慢性リンパ球性白血病（ｃｌｌ）、慢性骨髄性白血病（ｃｍｌ）、慢性骨髄増殖性新生物、大腸がん、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ｄｃｉｓ）、子宮内膜がん、食道、ユーイング肉腫、性腺外胚細胞腫瘍、眼がん、眼内黒色腫、網膜芽腫、卵管がん、骨の線維性組織球腫、悪性および骨肉腫、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、胚細胞腫瘍、性腺外、卵巣、精巣、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、組織球増殖症、ランゲルハンス細胞、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞腫、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓、ランゲルハンス細胞組織球増加症、喉頭がん、白血病、口唇および口腔がん（ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｃａｎｃｅｒ）、肝がん（原発性）、肺がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、ワルデンストレーム、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、黒色腫、黒色腫、眼内（眼）、メルケル細胞癌、中皮腫、悪性、原発不明の転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん（ｍｏｕｔｈ  ｃａｎｃｅｒ）、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物および慢性骨髄増殖性新生物、骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性（ｃｍｌ）、骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性（ＡＭＬ）、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽腔がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口唇および口腔がんならびに口腔咽頭がん、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、膵臓がんおよび膵神経内分泌腫瘍（島細胞腫）、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、妊娠および乳がん、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、網膜芽腫、唾液腺がん、肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明の扁平上皮頸部がん、転移性、胃（ｓｔｏｍａｃｈ、ｇａｓｔｒｉｃ）がん、ｔ細胞リンパ腫、皮膚、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、尿管および腎盂、移行上皮がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜および子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症またはウィルムス腫瘍を含むがんであってもよい。
【０２７０】
[00314]一部の実施形態では、試料は、血液、唾液、リンパ液、尿、脳脊髄液、精液、痰、糞便または組織ホモジネートなどの流体である。一部の実施形態では、試料は唾液である。一部の実施形態では、試料は全血である。一部の実施形態では、試験のための十分な量のポリヌクレオチドを得るために、少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍＬの血液体積が採取される。一部の場合、血液は、限定されないが、ＥＤＴＡを含むマグネシウムキレート剤を含有する装置内で収集され得、４℃で保存される。必要に応じて、限定されないが、ＥＧＴＡを含むカルシウムキレート剤が添加されてもよい。一部の場合、細胞溶解阻害剤が、限定されないが、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒド誘導体、タンパク質クロスリンカー、核酸クロスリンカー、タンパク質および核酸クロスリンカー、第一級アミン反応性クロスリンカー、スルフヒドリル反応性クロスリンカー、スルフヒドリル添加またはジスルフィド還元、炭水化物反応性クロスリンカー、カルボキシル反応性クロスリンカー、光反応性クロスリンカーまたは切断可能なクロスリンカーを含む血液に添加される。一部の実施形態では、非核酸材料は酵素処理（プロテアーゼ消化など）を使用して出発材料から除去され得る。
【０２７１】
[00315]複数の試料は、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個もしくは１００個またはそれより多くの試料を含むことができる。複数の試料は、少なくとも約１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個もしくは１０００個またはそれより多くの試料を含むことができる。複数の試料は、少なくとも約１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個の試料、９０００個、もしくは１０，０００個の試料、もしくは１００，０００個の試料、もしくは１，０００，０００個またはそれより多くの試料を含むことができる。複数の試料は、少なくとも約１０，０００個の試料を含むことができる。
【０２７２】
[00316]第１の試料は１つまたは複数の細胞を含んでもよく、第２の試料は１つまたは複数の細胞を含んでもよい。第１の試料の１つまたは複数の細胞は、第２の試料の１つまたは複数の細胞と同じ細胞型であってもよい。第１の試料の１つまたは複数の細胞は、複数の試料の１つまたは複数の異なる細胞と異なる細胞型であってもよい。
【０２７３】
[00317]複数の試料は同時に得られてもよい。複数の試料は一緒に得られてもよい。複数の試料は連続して得られてもよい。複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を取得してから数年、例えば、１００年、１０年、５年、４年、３年、２年または１年の過程にわたって得られてもよい。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を取得してから約１年以内に得られてもよい。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を取得してから１２ヵ月以内、１１ヵ月以内、１０ヵ月以内、９ヵ月以内、８ヵ月以内、７ヵ月以内、６ヵ月以内、４ヵ月以内、３ヵ月以内、２ヵ月以内または１ヵ月以内に得られてもよい。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を取得してから３０日以内、２８日以内、２６日以内、２４日以内、２１日以内、２０日以内、１８日以内、１７日以内、１６日以内、１５日以内、１４日以内、１３日以内、１２日以内、１１日以内、１０日以内、９日以内、８日以内、７日以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内または１日以内に得られてもよい。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を取得してから約２４時間以内、２２時間以内、２０時間以内、１８時間以内、１６時間以内、１４時間以内、１２時間以内、１０時間以内、８時間以内、６時間以内、４時間以内、２時間以内または１時間以内に得られてもよい。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を取得してから約６０秒以内、４５秒以内、３０秒以内、２０秒以内、１０秒以内、５秒以内、２秒以内または１秒以内に得られてもよい。１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の異なる試料を取得してから１秒未満以内に得られてもよい。
【０２７４】
Ｔ細胞の供給源
[00318]Ｔ細胞は対象から得られてもよい（例えば、初代Ｔ細胞）。一部の場合、ソースＴＣＲ発現細胞は対象から得られる。Ｔ細胞は本明細書に記載される任意の試料から得られてもよい。一部の場合、レシピエントＴ細胞は対象から得られる。「対象」という用語は、免疫応答が誘発され得る生物（例えば、哺乳動物）を含むことを意図する。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多くの供給源から得られてもよい。ある特定の態様では、Ｔ細胞系が使用されてもよい。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、アルファベータＴ細胞またはガンマデルタＴ細胞であってもよい。本開示のある特定の態様では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの様々な技術を使用して対象から収集された血液単位から得られてもよい。個体の循環血液由来の細胞はアフェレーシスによって得られてもよい。アフェレーシス産物は、Ｔ細胞、単球、顆粒細胞、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含む、リンパ球を含有することができる。アフェレーシスによって収集された細胞は、血漿画分を除去するため、およびその後の処理ステップのために適切な緩衝剤または培地に細胞を入れるために洗浄され得る。一部の場合、細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され得る。洗浄溶液は、カルシウムもしくはマグネシウムまたは他の二価カチオンを欠いていてもよい。カルシウムの不在化での最初の活性化ステップは拡大された活性化をもたらし得る。洗浄ステップは、製造業者の指示書に従って半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  セルプロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を使用することのような方法によって達成され得る。洗浄後、細胞は、例えば、Ｃａフリー、ＭｇフリーＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、または緩衝剤を有するもしくは有さない他の食塩水溶液などの様々な生体適合性緩衝剤に再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分が除去され得、細胞は培養培地中に直接再懸濁され得る。
【０２７５】
[00319]一態様では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって、または向流遠心エルトリエーションによって単球を枯渇させることによって末梢血リンパ球または組織から単離される。Ｔ細胞を組織から単離すると（例えば、腫瘍浸潤Ｔ細胞を腫瘍組織から単離すると）、赤血球を溶解するか、または単球を枯渇させる前に細胞を解離するために組織は細分化または断片化され得る。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などの、Ｔ細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択技術によってさらに単離され得る。例えば、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択のための十分な時間、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）とコンジュゲートしたビーズとのインキュベーションによって単離され得る。一態様では、時間は約３０分である。さらなる態様では、時間は３０分〜３６時間またはそれより長くおよびそれらの間の全ての整数値の範囲である。さらなる態様では、時間は、少なくとも約１、２、３、４、５もしくは６時間であるか、またはそれらと等しい。さらに別の態様では、時間は１０〜２４時間である。一態様では、インキュベーション時間は約２４時間である。他の細胞型と比較してＴ細胞がほとんど存在しない任意の状況において、例えば、腫瘍組織または免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する際に、より長いインキュベーション時間がＴ細胞を単離するために使用されてもよい。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉の効率を増加させることができる。したがって、時間を単に短くするか、または長くすることによって、Ｔ細胞は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズに結合することができ、および／またはビーズのＴ細胞に対する比を増加もしくは減少させることによって、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始もしくはプロセスの間の他の時点について、または培養開始もしくはプロセスの間の他の時点に対して選択され得る。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることによって、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始もしくは他の所望の時点についてまたは培養開始もしくは他の所望の時点に対して選択され得る。一部の場合、選択の複数のラウンドが使用されてもよい。ある特定の態様では、選択手順が実施され得、「選択されていない」細胞（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズに結合し得ない細胞）が活性化および増殖プロセスにおいて使用され得る。「選択されていない」細胞はまた、さらなる選択のラウンドに供され得る。
【０２７６】
[00320]陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組合せにより達成され得る。１つの例示的な方法は、陰性磁気免疫粘着または陰性選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の態様では、典型的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋およびＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を濃縮または陽性選択することが有用であり得る。あるいは、ある特定の態様では、Ｔ調節性細胞は、抗ＣＤ２５とコンジュゲートしたビーズまたは他の同様の選択方法によって枯渇される。
【０２７７】
[00321]一実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリン、または他の適切な分子、例えば、Ｔ−ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、Ｔｃｆ１（ヒトにおけるＴＣＦ７）などの他のサイトカインおよび転写因子のうちの１つまたは複数を発現するＴ細胞集団が選択され得る。細胞発現をスクリーニングするための方法は、例えば、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ２０１３／１２６７１２に記載される方法によって決定され得る。
【０２７８】
[00322]陽性または陰性選択による細胞の所望の集団の単離のために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は変化されてもよい。ある特定の態様では、ビーズおよび細胞が一緒に混合される体積は細胞およびビーズの最大接触を確保するために減少され得る（例えば、細胞の濃度を増加させる）。例えば、一態様では、２０億個の細胞／ｍＬの濃度が使用される。別の態様では、１０億個の細胞／ｍＬの濃度が使用される。さらなる態様では、１億個超の細胞／ｍＬが使用される。さらなる態様では、少なくとも約１０００万個、１５００万個、２０００万個、２５００万個、３０００万個、３５００万個、４０００万個、４５００万個または５０００万個の細胞／ｍＬの細胞の濃度が使用される。一部の態様では、少なくとも約７５００万個、８０００万個、８５００万個、９０００万個、９５００万個または１億個の細胞／ｍＬの細胞の濃度が使用される。一部の態様では、少なくとも約１億２５００万個または１億５０００万個の細胞／ｍＬの細胞の濃度が使用され得る。高濃度を使用すると、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖の増加が生じ得る。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得るか、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病血液、腫瘍組織など）由来の細胞のより効率的な捕捉を可能にすることができる。このような細胞の集団は治療的価値を有することができる。例えば、高濃度の細胞を使用すると、より弱いＣＤ２８発現を有し得るＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択が可能となる。
【０２７９】
[00323]一部の場合、より低い濃度の細胞が使用されてもよい。Ｔ細胞および表面の混合物を有意に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小化され得る。これにより、粒子に結合する大量の所望の抗原を発現する細胞を選択することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現することができ、希釈濃度においてＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉され得る。一部の態様では、使用される細胞の濃度は、少なくとも約５×１０５／ｍＬ、５×１０６／ｍＬであるか、またはそれより高い。他の態様では、使用される濃度は、約１×１０５／ｍＬ〜１×１０６／ｍＬ、およびそれらの間の任意の整数値であってもよい。他の態様では、細胞は、２〜１０℃または室温のいずれかで可変速度にて様々な長さの時間、回転子上でインキュベートされ得る。
【０２８０】
[00324]刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄ステップ後に凍結され得る。凍結およびその後の解凍ステップは、細胞集団内の顆粒球およびある程度の単球を除去することによってより均一な産生物を提供することができる。血漿および血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞は凍結溶液に懸濁され得る。多くの凍結溶液およびパラメーターがこの状況において有用であり得るが、使用され得る１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、もしくは３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、またはＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含有する他の適切な細胞凍結培地を使用することを含む。次いで細胞は−８０℃に凍結され得、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保存され得る。細胞は、−２０℃または液体窒素中で直ちに制御せずに凍結することによって凍結され得る。ある特定の態様では、凍結保存された細胞は本明細書に記載されるように解凍され、洗浄され、活性化の前に室温で１時間静置される。
【０２８１】
[00325]また、本開示の文脈において、増殖細胞（例えば、Ｔ細胞療法のためのＴＣＲを発現する操作された細胞）が必要とされ得る前の時点での対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の収集も企図される。したがって、増殖される細胞の供給源は必要な任意の時点で収集され得、Ｔ細胞などの所望の細胞は、本明細書に記載されるものなどの、Ｔ細胞療法から恩恵を受けるいくらかの疾患または状態についてのＴ細胞療法において後で使用するために単離され、凍結される。一部の場合、血液試料またはアフェレーシスは全体的に健康な対象から採取される。ある特定の態様では、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない全体的に健康な対象から採取され、目的の細胞は後での使用のために単離され、凍結される。ある特定の態様では、Ｔ細胞は、後の時点で増殖され、凍結され、使用されてもよい。ある特定の態様では、試料は、本明細書に記載されるように特定の疾患の診断の直後であるが、任意の処置の前に患者から収集される。さらなる態様では、細胞は、限定されないが、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６、抗体または他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射などの薬剤による処置を含む、いくらかの関連する処置様式の前に対象由来の血液試料またはアフェレーシスから単離される。
【０２８２】
[00326]本開示のさらなる態様では、Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞を対象に残す処置の後、患者から直接得られる。これに関して、ある特定のがん処置、特に免疫系を損傷する薬物による処置後、患者が処置から正常に回復している期間の間の処置直後、得られたＴ細胞の質は、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖するそれらの能力に関して最適であり得るか、または改善され得ることが観察される。したがって、本開示の文脈内で、この回復段階の間、Ｔ細胞、樹状細胞または造血系の他の細胞を含む、血液細胞を収集することが企図される。さらに、ある特定の態様では、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦによる動員）およびコンディショニングレジメンが、特に療法後の規定された時間枠の間、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増殖が好ましい対象における状態を生じるように使用され得る。例示的な細胞型には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞が含まれる。
【０２８３】
[00327]対象から得られた初代Ｔ細胞に加えて、ソース細胞またはレシピエント細胞として使用されるＴ細胞は、細胞系Ｔ細胞などの細胞系細胞であってもよい。細胞系Ｔ細胞の例には、限定されないが、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｋ−Ｔ１、ＴＡＬＬ−１、ＭＯＬＴ１６／１７およびＨＵＴ７８／Ｈ９が含まれる。
【０２８４】
[00328]Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から得られ得る。Ｔ細胞は、組織または細胞と接触することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化または増殖され得る。「活性化および増殖」の節を参照のこと。例えば、患者の末梢血から単離されたＴ細胞は、腫瘍細胞、腫瘍組織、腫瘍様塊、腫瘍溶解パルスＡＰＣまたは腫瘍ｍＲＮＡ負荷ＡＰＣなどの腫瘍抗原を提示する細胞と共培養され得る。腫瘍抗原を提示する細胞は、規定された抗原、規定された抗原のセットまたは規定されていない抗原のセット（腫瘍溶解物または全腫瘍ｍＲＮＡなど）によりパルスされたか、またはそれらを発現するように操作されたＡＰＣであってもよい。例えば、規定された抗原を提示する場合、ＡＰＣは、既知の配列を有する１つまたは複数の短いエピトープ（例えば、７〜１３アミノ酸長）をコードする１つまたは複数のミニ遺伝子を発現することができる。ＡＰＣはまた、２つ以上のエピトープをコードする配列を含有するベクターから２つ以上のミニ遺伝子を発現することができる。規定されていない抗原を提示する場合、ＡＰＣは腫瘍溶解物または全腫瘍ｍＲＮＡによりパルスされ得る。腫瘍抗原を提示する細胞は共培養前に照射され得る。共培養は、共刺激シグナルまたはサイトカインを提供することができる試薬（例えば、抗ＣＤ２８抗体）を含む培地においてであってもよい。このような共培養は腫瘍抗原反応性Ｔ細胞を刺激し、および／または増殖させることができる。これらの細胞は、本明細書に記載される細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７）を使用して選択されてもよいか、または濃縮されてもよい。この方法を使用して、腫瘍抗原反応性Ｔ細胞は患者の末梢血から予め濃縮され得る。これらの予め濃縮されたＴ細胞は、本明細書に記載される方法を使用して融合（または物理的に連結した）ＴＣＲを得るための入力として使用され得る。一部の場合、予め濃縮されたＴ細胞は、例えば、単一細胞バーコードを使用したシークエンシングによってＴＣＲの同種対を同定するために任意の他の方法に供される入力として使用され得る。予め濃縮されたＴ細胞（例えば、ＣＤ１３７＋）は、共培養の間にマーカー（例えば、ＣＤ１３７）発現を獲得したＴ細胞を含有することができ、また、採決時にマーカーを既に発現しているＴ細胞も含有することができる。それにもかかわらず、後者の集団は腫瘍反応性であり得る。この方法は、記載されるＴＩＬを単離するための、より容易な代替手段を提供することができる。
【０２８５】
免疫受容体プログラムレシピエント細胞
[00329]本明細書に記載される融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、免疫受容体プログラムレシピエント細胞を作り出すために新たな宿主細胞（本開示において「レシピエント細胞」と称される）に導入され得る。異なる目的のために、異なる種類の免疫受容体が異なる種類のレシピエント細胞に導入されてもよい。例えば、抗体は、発現のために様々な初代細胞（例えば、Ｂ細胞）または細胞系（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞）に導入されてもよい。例えば、ＴＣＲはＴ細胞に新たな特異性を与えるためにＴ細胞に導入されてもよい。免疫受容体プログラムレシピエント細胞は、標的分子または細胞を感知する（例えば、認識または結合する）ために新たに導入された免疫受容体を使用することができる。例えば、標的分子は抗原またはその断片であってもよい。標的分子はペプチドであってもよい。標的分子はエピトープであってもよい。
【０２８６】
レシピエント細胞の供給源
[00330]レシピエント細胞は、「試料」の節に記載されるように試料から得られ得る。レシピエント細胞としてのＴ細胞は、「Ｔ細胞の供給源」の節に記載されるように供給源由来であってもよい。レシピエント細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、顆粒球、好酸球、赤血球、血小板、幹細胞、ｉＰＳＣまたは間充織幹細胞であってもよい。さらに、レシピエント細胞は細胞系細胞であってもよい。細胞系は腫瘍形成性または人工的に不死化された細胞系であってもよい。細胞系の例には、限定されないが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２−ＯＳ細胞；ＮＩＨ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ−１０８０細胞；ＨＣＴ−１１６細胞；Ｈｕ−ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；およびＭｏｌｔ４細胞が含まれる。レシピエント細胞は自家Ｔ細胞または同種異系間Ｔ細胞であってもよい。レシピエント細胞は、遺伝子修飾されたまたは操作された細胞であってもよい。
【０２８７】
活性化および増殖
[00331]免疫受容体発現ベクターをＴ細胞に移入する前であるか後であるかにかかわらず、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載される方法を一般的に使用して活性化され、増殖され得る。Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで増殖され得る。
【０２８８】
[00332]Ｔ細胞は、Ｔ細胞のための活性化シグナルを生じるようにＣＤ３  ＴＣＲ複合体を刺激する作用物質およびＴ細胞の表面上の共刺激分子との接触によって増殖され得る。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）またはフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）のような分裂促進性レクチンなどの化学物質が、Ｔ細胞のための活性化シグナルを生じるように使用され得る。非限定的な例として、Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片、または表面上で固定化された抗ＣＤ２抗体との接触、あるいはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触などによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激され得る。Ｔ細胞の表面上でのアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。例えば、各シグナルを提供する作用物質は、溶液中にあってもよいか、または表面に結合していてもよい。粒子の細胞に対する比は、標的細胞に対する粒径に依存し得る。さらなる実施形態では、Ｔ細胞などの細胞は、作用物質でコーティングされたビーズと合わせられ、その後、ビーズおよび細胞は分離され、次いで細胞が培養される。代替の実施形態では、培養前に、作用物質でコーティングされたビーズおよび細胞は分離されないが、一緒に培養される。Ｔ細胞培養に適した条件には、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは細胞の成長のための任意の他の添加物を含む、増殖および生存に必要な因子を含有することができる適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ５（Ｌｏｎｚａ））が含まれる。細胞の成長のための他の添加物には、限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｉ）などの還元剤が含まれる。培地には、ＲＰＭＩ１６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンを添加し、血清を含まないか、または適切な量の血清（または血漿）もしくは規定されたホルモンのセット、ならびに／またはＴ細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカインを補足したＯｐｔｉｍｉｚｅｒが含まれ得る。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気プラス５％ＣＯ２）下で維持され得る。様々な刺激時間に曝露されていたＴ細胞は異なる特徴を示し得る。
【０２８９】
[00333]別の実施形態では、細胞は、腫瘍または細胞と共培養することによって活性化され得るか、または増殖され得る。Ｔ細胞を活性化するために使用される細胞はＡＰＣまたは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）であってもよい。ＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージまたはＢ細胞などのプロフェッショナルＡＰＣであってもよい。ＡＰＣは、単球または単球由来の樹状細胞であってもよい。ａＡＰＣは、Ｔ細胞受容体および共刺激分子についてのリガンドを発現することができ、移入のためのＴ細胞を、一部の場合、それらの効力および機能を改善しながら、活性化し、増殖することができる。ａＡＰＣは、Ｔ細胞活性化のための任意の遺伝子を発現するように操作され得る。ａＡＰＣは、Ｔ細胞増殖のための任意の遺伝子を発現するように操作され得る。ａＡＰＣは、ビーズ、細胞、タンパク質、抗体、サイトカイン、またはいずれかの組合せであってもよい。ａＡＰＣは、ゲノム移植を受けることができる細胞集団にシグナルを送達することができる。例えば、ａＡＰＣは、シグナル１、シグナル２、シグナル３またはいずれかの組合せを送達することができる。シグナル１は抗原認識シグナルであってもよい。例えば、シグナル１は、ペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲのライゲーションまたはＣＤ３シグナル変換複合体の活性化を導き得るＣＤ３に対するアゴニスト抗体の結合であってもよい。シグナル２は共刺激シグナルであってもよい。例えば、共刺激シグナルは、抗ＣＤ２８、誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）であってもよく、それらはそれぞれＩＣＯＳ−Ｌ、ＣＤ７０および４−１ＢＢＬに結合する。シグナル３はサイトカインシグナルであってもよい。サイトカインは任意のサイトカインであってもよい。サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１またはそれらのいずれかの組合せであってもよい。
【０２９０】
[00334]一部の場合、ａＡＰＣは、細胞集団を活性化し、および／または増殖させるために使用され得る。一部の場合、人工物は自己特異性を誘導することができない。一部の場合、ａＡＰＣはＨＬＡを発現することができない。ａＡＰＣは、活性化および／または刺激のために使用され得る遺伝子を安定に発現するように遺伝子修飾され得る。一部の場合、Ｋ５６２細胞が活性化のために使用され得る。Ｋ５６２細胞はまた、増殖のために使用され得る。Ｋ５６２細胞はヒト赤白血病細胞系であってもよい。Ｋ５６２細胞は目的の遺伝子を発現するように操作され得る。Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩ、ＩＩまたはＣＤ１ｄ分子を内因的に発現することができないが、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現することができる。Ｋ５６２はシグナル１をＴ細胞に送達するように操作され得る。例えば、Ｋ５６２細胞はＨＬＡクラスＩを発現するように操作され得る。一部の場合、Ｋ５６２細胞は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４−１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３  ｍＡｂ、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、膜結合型ＩＬ−１５、膜結合型ＩＬ−１７、膜結合型ＩＬ−２１、膜結合型ＩＬ−２、切断型ＣＤ１９、またはいずれかの組合せなどのさらなる分子を発現するように操作され得る。一部の場合、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０およびＣＤ８３に加えて、抗ＣＤ３  ｍＡｂ、クローンＯＫＴ３の膜型を発現することができる。一部の場合、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０およびＣＤ８３に加えて、抗ＣＤ３  ｍＡｂ、クローンＯＫＴ３の膜型、抗ＣＤ２８  ｍＡｂの膜型を発現することができる。
【０２９１】
[00335]一部の場合、細胞の再刺激は、抗原およびフィーダーＰＢＭＣなどの照射された組織適合ＡＰＣにより実施され得る。一部の場合、細胞は、ＰＨＡおよび同種異系間フィーダー細胞などの非特異的マイトジェンを使用して成長され得る。フィーダーＰＢＭＣは４０Ｇｙで照射され得る。フィーダーＰＢＭＣは、約１０Ｇｙ〜約１５Ｇｙ、約１５Ｇｙ〜約２０Ｇｙ、約２０Ｇｙ〜約２５Ｇｙ、約２５Ｇｙ〜約３０Ｇｙ、約３０Ｇｙ〜約３５Ｇｙ、約３５Ｇｙ〜約４０Ｇｙ、約４０Ｇｙ〜約４５Ｇｙ、約４５Ｇｙ〜約５０Ｇｙで照射され得る。一部の場合、照射されたフィーダー細胞のみの対照フラスコは抗ＣＤ３およびＩＬ−２により刺激され得る。
【０２９２】
[00336]ａＡＰＣはビーズであってもよい。球状ポリスチレンビーズは、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体でコーティングされ得、Ｔ細胞活性化のために使用され得る。ビーズは任意のサイズであってもよい。一部の場合、ビーズは約３および６マイクロメートルであってもよい。ビーズは約４．５マイクロメートルのサイズであってもよい。ビーズは任意の細胞対ビーズ比で利用され得る。例えば、１ミリリットルあたり１００万個の細胞で３対１のビーズ対細胞比が使用され得る。ａＡＰＣはまた、剛性な球状粒子、ポリスチレンラテックスマイクロビーズ、磁気ナノ粒子またはマイクロ粒子、ナノサイズの量子ドット、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、非球状粒子、カーボンナノチューブ束、楕円体ＰＬＧＡ微粒子、ナノワーム（ｎａｎｏｗｏｒｍ）、流体脂質二重層含有系、２Ｄ支持脂質二重層（２Ｄ−ＳＬＢ）、リポソーム、ＲＡＦＴソーム（ＲＡＦＴｓｏｍｅ）／マイクロドメインリポソーム、ＳＬＢ粒子またはこれらのいずれかの組合せであってもよい。
【０２９３】
[00337]一部の場合、ａＡＰＣはＣＤ４Ｔ細胞を増殖させることができる。例えば、ａＡＰＣは、抗原プロセシングおよびＨＬＡクラスＩＩ抑制ＣＤ４Ｔ細胞の提示経路を模倣するように操作され得る。Ｋ５６２は、ＨＬＡ−Ｄ、ＤＰα、ＤＰβ鎖、Ｉｉ、ＤＭα、ＤＭβ、ＣＤ８０、ＣＤ８３またはそれらのいずれかの組合せを発現するように操作され得る。例えば、操作されたＫ５６２細胞は、ＨＬＡ抑制抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞を増殖させるためにＨＬＡ抑制ペプチドによりパルスされ得る。
【０２９４】
[00338]一部の場合、ａＡＰＣの使用は、Ｔ細胞活性化、増殖またはいずれかの組合せのために外因的に導入されたサイトカインと組み合わせられてもよい。細胞はまた、例えば、対象へのゲノム的に移植した細胞の投与後、対象の血液中でｉｎ  ｖｉｖｏで増殖され得る。
【０２９５】
[00339]細胞（例えば、レシピエント細胞）はまた、例えば、対象へ細胞を投与した後、対象の血液中でｉｎ  ｖｉｖｏで増殖され得る。
ミスアセンブリの阻止
[00340]一部の場合、免疫受容体発現ベクターは内因性二分免疫受容体を発現するレシピエント細胞に導入され得る。このような場合、内因性免疫受容体と外因性免疫受容体との間のミスアセンブリが阻止され得る。例えば、ＴＣＲ発現ベクターがＴ細胞に導入される場合、内因性（ゲノム由来）ＴＣＲ鎖および外因性（ベクター由来）ＴＣＲ鎖の両方が発現され得る。したがって、内因性アルファ鎖が外因性ベータ鎖と二量体を形成し得、その結果、望ましくないＴＣＲ（すなわち、ミスアセンブリしたＴＣＲ）を生じる可能性がある。同様の状況がＢＣＲプログラムＢ細胞において発生する場合がある。種々の方法が、免疫受容体鎖の定常ドメインを操作すること、または免疫受容体をコードする内因性遺伝子をノックアウト／ダウンすること、例えば、ジスルフィド結合を操作すること（Ｋｕｂａｌｌ  ２００７）、ドメインスワッピング（Ｂｅｔｈｕｎｅ  ２０１６）、ＲＮＡ干渉によるノックダウン（Ｂｕｎｓｅ  ２０１４）、遺伝子ノックアウト（Ｐｒｏｖａｓｉ  ２０１２）、ＴＣＲの一部をマウス化すること（ｍｕｒｉｎｉｚｉｎｇ）、一本鎖としてＴＣＲを発現すること（ＵｃｋｅｒｔおよびＳｃｈｕｍａｃｈｅｒ、２００９）、およびＴＣＲ−ＣＡＲ構築物においてＴＣＲを発現すること（Ｗａｌｓｅｎｇら、２０１７）によってこのようなミスアセンブリを最小化するために使用され得る。
【０２９６】
[00341]一部の場合、免疫受容体鎖の定常ドメインをコードする配列は突然変異生成によって操作される。一部の場合、２つの免疫受容体鎖の両方の定常ドメインをコードする配列は、１つまたは複数のシステインが各鎖の接触領域に導入され得るように操作される。一部の場合、２つの免疫受容体鎖の両方の定常ドメインをコードする配列は、１つまたは複数のジスルフィド結合が、発現された免疫受容体の２つの鎖の間で形成され得るように操作される。例えば、１つまたは複数のシステインは、免疫受容体の２つの鎖（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖、またはＢＣＲ重鎖および軽鎖）の各定常ドメインに導入され得、ジスルフィド結合はシステイン間に形成され得る。
【０２９７】
[00342]一部の場合、免疫受容体の２つの鎖の定常ドメインをコードする配列は、その配列が、レシピエント細胞が得られる種と異なる種において見出される定常ドメインをコードするように操作される。例えば、レシピエント細胞がヒトから得られる場合、免疫受容体の２つの鎖の定常ドメインをコードする配列は、マウスにおいて見出される免疫受容体の定常ドメインをコードする配列に変化され得る（すなわち、マウス化）。
【０２９８】
[00343]一部の場合、第１の鎖（例えば、ＴＣＲα鎖）の第１の定常ドメインをコードする第１の配列の第１のセグメントおよび第２の鎖（例えば、ＴＣＲβ鎖）の第２の定常ドメインをコードする第２の配列の第２のセグメントがスワップされ得る。例えば、スワップした後、ミスアセンブルしたＴＣＲ分子はＣＤ３またはシグナルと適切にアセンブルすることができない。
【０２９９】
[00344]一部の場合、第１の鎖（例えば、ＴＣＲα鎖）の第１の定常ドメインをコードする第１の配列の第１のセグメントおよび第２の鎖（例えば、ＴＣＲβ鎖）の第２の定常ドメインをコードする第２の配列の第２のセグメントは、別のタンパク質、例えば、ＣＤ３−ゼータの細胞内ドメインに変化され得る。例えば、細胞外システイン（鎖間ジスルフィド架橋を媒介する）の下流の元の定常ドメインが完全なヒトＣＤ３−ゼータと置き換えられ得る、改変されたＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖により、改変されたＴＣＲ鎖は、内因性ＴＣＲ鎖とミスアセンブルすることができなくなり、初代ヒトＴ細胞においてこれらのＴＣＲ鎖の正確な対合を生じる。
【０３００】
[00345]一部の場合、Ｐ２Ａリンカーを介して改変されたＴＣＲβに連結される改変されたＴＣＲα鎖をコードする構築物が使用され得る。
[00346]一部の場合、改変されたＴＣＲβ鎖が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に使用されるものと同様の人工シグナル伝達ドメイン、すなわち、ＣＤ２８膜貫通（ＴＭ）コード配列、続く２つのシグナル伝達モジュール（ＣＤ２８およびＣＤ３ζ）に融合され得る。同時に、改変されたＴＣＲα鎖はＴＣＲαの細胞外ドメインのみを含有することができる。さらに、システイン置換が、ＴＣＲ二量体の安定性を増加させるためにＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の定常ドメイン（Ｃ−ドメイン）において実施され得る。この構築物は、「ＴＣＲ−ＣＡＲ」と称される。このようなＴＣＲ−ＣＡＲは、ＮＫ細胞などの非Ｔ細胞においてシグナル伝達することができる。
【０３０１】
[00347]レシピエント細胞は、その内因性免疫受容体がノックアウトまたはノックダウンされた遺伝子修飾された細胞であってもよい。本明細書に記載される例はレシピエント細胞としてＴ細胞を使用するが、同様のストラテジーが他の細胞型に適用され得る。
【０３０２】
[00348]内因性ＴＣＲの成分を破壊するために遺伝子編集ヌクレアーゼが利用され得る。ＴＣＲα／β二量体は完全に機能するＴＣＲ複合体を産生することができるので、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ機能の破壊は、内因性ＴＣＲ発現を低減させる（またはさらに取り除く）ことができる。内因性ＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子を破壊するために種々の方法が使用され得る。例えば、使用者が規定したＤＮＡの配列を結合し、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を媒介する際に共通の作用様式を共有する４つのクラスの遺伝子編集タンパク質が存在する。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は標的ＤＮＡ部位において共局在化するヘテロ二量体アレイである。ＺＦＮは、ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断するＦｏｋｌヌクレアーゼドメインにつながれる個々のフィンガーサブユニットを含む。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡ塩基認識を規定する超可変の２つのアミノ酸配列（反復可変二残基；ＲＶＤ）によってＤＮＡに結合する反復単位を含む。ＺＦＮＳと同様に、ＴＡＬＥＮは、ＤＳＢ生成のためのＦｏｋｌエンドヌクレアーゼドメインに融合する二量体タンパク質として機能する。メガヌクレアーゼ（ＭＮ）は、細菌のホーミングエンドヌクレアーゼに由来し、固有の標的部位のために操作される生来のヌクレアーゼ活性を有する単量体タンパク質である。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）および関連するＣａｓ９ヌクレアーゼプラットフォームは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を介して標的ＤＮＡ配列と接触する小さなガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）転写産物およびＤＮＡを切断するＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。
【０３０３】
[00349]一部の場合、ゲノム編集ヌクレアーゼをＴ細胞に導入することは、ゲノム編集ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含む。一部の場合、ゲノム編集ヌクレアーゼをＴ細胞に導入することは、Ｃａｓ９ポリペプチドをＴ細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、ゲノム編集ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはメガＴＡＬヌクレアーゼを含む。一部の場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のいずれかに由来する。これらの実施形態の一部では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、例えば、少なくとも１つの２’−ＯＭｅ−ホスホロチオエート改変塩基、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル改変塩基または少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ改変塩基などのヌクレアーゼ耐性ｇＲＮＡを含む。一部の場合、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼまたはメガＴＡＬヌクレアーゼは、外因性ポリアデニル化シグナルを有するＲＮＡによってコードされる。一部の場合、本明細書に記載される方法は、ゲノム改変Ｔ細胞の集団を増殖させるのに有効な条件下でＴ細胞を培養することをさらに含むことができる。
【０３０４】
レシピエント細胞のさらなるゲノム操作
[00350]一部の場合、免疫受容体プログラムレシピエント細胞は、ＰＤ１およびＣＴＬＡ−４などの免疫チェックポイントタンパク質をコードする不活性遺伝子を含む。これは、ＰＤ１およびＣＴＬＡ−４などの免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子の不活性化によって可能になり得る。一部の場合、遺伝子修飾は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４からなる群から選択される１つの遺伝子または２つの遺伝子の不活性化に依存する。一部の場合、遺伝子修飾は、Ｂ２ＭなどのＭＨＣ成分のノックアウトを含むことができる。本明細書に記載される遺伝子はまた、例えば、マイクロＲＮＡによって下方制御され得る。
【０３０５】
レシピエント細胞によって発現されるさらなる作用物質
[00351]免疫受容体プログラムレシピエント細胞は、これらの細胞の機能を向上させるためにさらなる作用物質（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）を発現するように操作され得る。例えば、機能は、細胞傷害機能、炎症誘発機能または抗炎症機能であってもよい。一部の場合、免疫受容体プログラムレシピエント細胞は、抗腫瘍効果を向上させるためにさらなる作用物質を発現するように操作され得る。一部の場合、さらなる作用物質は分泌タンパク質である。分泌タンパク質は、サイトカインもしくは抗体またはそれらの断片であってもよい。一部の場合、分泌タンパク質はサイトカインである。一部の場合、分泌タンパク質は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。分泌タンパク質は抑制分子を阻害することができ、その抑制分子は免疫エフェクター応答を開始する免疫細胞の能力を減少させる。分泌タンパク質は炎症誘発性サイトカインまたは抗炎症性サイトカインであってもよい。炎症誘発性サイトカインの例には、限定されないが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）；インターロイキン（ＩＬ）−１α；ＩＬ−１β；ＩＬ−２；ＩＬ−５；ＩＬ−６；ＩＬ−８；ＩＬ−１５；ＩＬ−１８；インターフェロン（ＩＦＮ−γ）；血小板活性化因子（ＰＡＦ）；単球走化性タンパク質１および２（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２）；マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）；ＣＸＣＬ８；ＣＸＣＬ９；ＣＸＣＬ１０；および高移動度群ボックスタンパク質１（ＨＭＧＢ−１）が含まれる。抗炎症性サイトカインの例には、限定されないが、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）およびＩＬ−１６が含まれる。一部の場合、さらなる作用物質はＲＮＡである。一部の場合、さらなる作用物質はＲＮＡをコードするＤＮＡであってもよい。ＲＮＡは、ガイドＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたは小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ＲＮＡは抑制分子の転写または翻訳を阻害することができる。抑制分子の例には、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータが含まれる。一部の場合、ＲＮＡは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ベータ−２ミクログロブリン、ＨＬＡ分子、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１およびＦＡＳを含む外因性遺伝子の遺伝子発現を下方制御することができる。これらの抑制分子をコードする外因性遺伝子はまた、本明細書に記載される遺伝子編集方法によってノックアウトされてもよい。
【０３０６】
[00352]一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫受容体プログラムレシピエント細胞は、別の作用物質、例えば、免疫受容体プログラムレシピエント細胞の活性を向上させる作用物質をさらに発現することができる。例えば、作用物質は抑制分子を阻害する作用物質であってもよい。抑制分子は、免疫エフェクター応答を開始する免疫受容体プログラムレシピエント細胞の能力を減少させることができる。抑制分子の例には、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータが含まれる。
【０３０７】
[00353]さらなる作用物質はスイッチ受容体であってもよい。例えば、抑制分子を阻害する作用物質は、細胞に陽性シグナルを提供する第２のポリペプチド、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに関連する、第１のポリペプチド、例えば、抑制分子を含む。一部の実施形態では、作用物質は、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４およびＴＩＧＩＴ、またはこれらのいずれかの断片（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）などの抑制分子の第１のポリペプチド、ならびに細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン４−１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）である第２のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、作用物質は、ＰＤ１またはその断片（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部）の第１のポリペプチド、およびＣＤ２８シグナル伝達ドメインまたはＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインなどの細胞内シグナル伝達ドメインの第２のポリペプチドを含む。さらなる作用物質は、リンパ球枯渇耐性または低減した移植片対宿主疾患の可能性を与えるタンパク質であってもよい。例えば、タンパク質は抑制性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体に結合することができるので、ＮＫ細胞はレシピエント細胞を殺傷することを阻害され得る。タンパク質はＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇであってもよい。
【０３０８】
[00354]一部の実施形態では、さらなる作用物質は、免疫受容体発現ベクターによってコードされるか、またはそれから発現される。
適用
[00355]本明細書に記載されるように、ソース免疫受容体発現細胞のポリクローナル集団は、免疫受容体プログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団に変換され得、免疫受容体プログラムレシピエント細胞の操作された免疫受容体レパートリーは、ソース免疫受容体発現細胞の天然の免疫受容体レパートリー（例えば、免疫受容体鎖の同種対の組合せ）を含むことができる。多くの免疫受容体の二分性質は、従来技術ではこのタスクを困難にする。本明細書に提供される方法はこれらの困難を克服するために使用され得る。ソース免疫受容体発現細胞を使用することより、免疫受容体プログラムレシピエント細胞を使用するいくつかの利点が存在し得る。例えば、免疫受容体プログラムレシピエント細胞は、より多くの数で調製され得、より理想的な機能特性を有することができ、より理想的なエピジェネティック状態であり得、より均一な遺伝的または表現型バックグラウンドを有することができ、抗腫瘍効果を向上させるためにさらなる作用物質を発現するように操作され得、または選択を補助するためにレポーター遺伝子を発現するように操作され得る。免疫受容体プログラムレシピエント細胞は多くの分野において多くの適用に使用され得る。
【０３０９】
抗体発見
[00356]ソース免疫受容体発現細胞がＢ細胞である場合、得られる融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーは、様々な抗体をコードするライブラリーであり得る。このライブラリーは、所望の特徴を有する抗体を見つけるためにスクリーニングされ得る。所望の特徴は、特定の標的タンパク質への結合または標的細胞におけるある特定の細胞応答の誘発を含むことができる。抗体発見のために、プライマーおよびリンカー配列が、当業者によって行われ得る、ｓｃＦｖ構築物の必要性に適合するように再設計され得ることを除いて、融合ＢＣＲ遺伝子は実施例に記載される同様のストラテジーを使用して一本鎖Ｆｖ構築物（ｓｃＦｖ）およびｓｃＦｖ発現ベクターに変換され得る。ソース免疫受容体発現細胞は、形質芽球、形質細胞、リンパ形質細胞性細胞、メモリーＢ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ−１細胞、Ｂ−２細胞または調節性Ｂ細胞であってもよい。
【０３１０】
結合の選択
[00357]抗体発現ベクターまたはｓｃＦｖ発現ベクターは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイなどの従来のスクリーニング技術と共に使用され得る。さらに、抗体発現ベクターライブラリーは、操作された抗体発現レシピエント細胞のライブラリーを産生するためにＢ細胞株（例えば、Ｒａｊｉ細胞）に導入され得る。これらの細胞は、Ｅｙｅｒら、２０１７およびＭａｚｕｔｉｚら、２０１３に記載される表現型スクリーニングに使用され得、抗体発現レシピエント細胞は動物から直接単離されたＢ細胞に置き換えることができる。
【０３１１】
機能の選択
[00358]抗体発現ベクターライブラリーはまた、表面受容体の機能のためのレポーター回路により操作された哺乳動物細胞に導入され得る。受容体アゴニストである抗体の直接選択が達成され得る。例えば、レンチウイルスの形態の抗体発現ベクターのライブラリーが、受容体アゴニストまたはアンタゴニスト抗体が求められる受容体に結合している蛍光レポーター系を含有する真核細胞を感染させるために使用され得る。この方法の実施形態では、非常に多数の候補抗体を発現するレンチウイルスおよび真核レポーター細胞が、各々が複製できる形式で一緒にパッケージ化され得るので、遺伝子型と表現型との間の直接的な相関を構築する。拡散抑制構成での（例えば、軟寒天または液滴中での）感染およびインキュベーション後、変化した蛍光（おそらく、抗体発現ベクターによってコードされる分泌抗体の作用に起因する）を示す細胞が保存され得、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体をコードする統合遺伝子が回収され得る。インキュベーションは、適切なバックグラウンドシグナル伝達を提供するために同種リガンドまたは受容体の既知のアゴニストもしくはアンタゴニスト抗体の存在下であり得る。この系は、完全なトロンボポエチン表現型コピーである有効な抗体アゴニストを迅速に生成するその能力を例示することによって立証されている（Ｈｏｎｇｋａｉ  Ｚｈａｎｇら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０（５）：７３４〜７４１、２０１３年５月）。この系は、その活性化が選択可能な表現型の産生に関連付けられ得る任意の経路に一般化可能であり得る。
【０３１２】
ポリクローナル抗体の治療的使用
[00359]本明細書に記載される方法は、ヒトドナー由来のＢ細胞および形質細胞レパートリーから得たＤＮＡライブラリーから組換えポリクローナル抗体を調製するために使用され得る。組換えポリクローナル抗体はある特定の疾患を処置するために使用され得る。例えば、免疫不全の患者は、数千のヒトドナーからプールされる血漿試料に由来する血漿ベースの薬物製品により処置され得る。このような製品の例には、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）および過免疫、特定の病原体に対する高力価の抗体を有するドナーの血漿から調製されるＩＶＩＧのバリエーションが含まれる。過免疫は、急性感染症を処置するため、または臓器移植後などの、免疫不全患者における感染症を阻止するために使用され得る。組換えポリクローナル抗体は現在の血漿ベースの製品を置き換えるために使用され得る。組換えポリクローナル抗体は血漿由来の等価物より高い効力を有するように操作され得る。
【０３１３】
ポリクローナル免疫受容体−プログラムレシピエント細胞の治療使用
[00360]免疫受容体−プログラムレシピエント細胞を患者に投与し、様々な疾患を治療することができる。一部の実施形態では、免疫受容体−プログラムレシピエント細胞は、ポリクローナル免疫受容体−プログラムレシピエント細胞である。
【０３１４】
がんの処置のためのＴＣＲ−Ｔ細胞
[00361]多くの腫瘍が、腫瘍微小環境内に浸潤した大量のＴ細胞を有し、これらの腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＴ）の多くが、腫瘍発現抗原を認識するＴＣＲを有し得る。これらのＴＩＴは、腫瘍反応性Ｔ細胞であり得る。ＴＩＴによって認識される抗原は、ネオ抗原、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原であり得る。これらの抗原は、野生型配列または変異型配列であり得る。がんを治療する一般的な戦略は、これらのＴＩＴの数および／または活性を増大するものであり得る。この戦略を実施する１つの特異的なアプローチは、ＴＩＴのｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖であり得る。しかしながら、このアプローチは、多くの制限を有し得る。例えば、いくつかのＴＩＴは、一部、慢性的な抗原暴露により、ひどく疲弊した表現型を示し得る。これらのＴ細胞は、わずかにしか増殖させることができない。さらに、外科的に除去された腫瘍から単離された少ないＴ細胞から患者の体へと再注入するのに十分多くの数（数億または数十億個の細胞さえも必要な場合がある）へと増殖するのには非常に長い時間がかかることがある。単一細胞シークエンシングの近年の進歩により可能になった代替の方法は、ひどく疲弊した細胞を含む、これらの腫瘍浸潤Ｔ細胞から対合ＴＣＲ配列を得ることである。次に、これらのＴＣＲ配列を合成し、ＴＣＲ発現ベクターを得ることができる。また、これらのベクターを、多くの新鮮な宿主Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔのために宿主細胞を調製する工程と同様に、患者の末梢血から単離された後にｅｘ  ｖｉｖｏで増殖）に導入し、ＴＣＲ−Ｔ細胞を産生することができる。しかしながら、ＤＮＡ合成の限界により、一度にわずかな（例えば、１００より少ない、または５０より少ない）ユニークＴＣＲ発現ベクターしか作製することができない。言い換えると、ＴＣＲ−Ｔ細胞は、限定的な外因性ＴＣＲレパートリーを有し得る。
【０３１５】
[00362]上記のように融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを素早く得るための技術により、多くのＴＣＲをコードする、多くの（例えば、約１００個より多い、約１，０００個より多い、約１０，０００個より多い、約１００，０００個より多い、または約１，０００，０００個より多い）ユニークＴＣＲ発現ベクターを生成することができる。これらのベクターを、新鮮な宿主Ｔ細胞（レシピエント細胞として）に導入して、非常に多様な外因性ＴＣＲレパートリー（約１００より多い、約１，０００より多い、約１０，０００より多い、約１００，０００より多い、または約１，０００，０００より多いクローン型）を有するポリクローナルＴＣＲ−Ｔ細胞を作製することができる。次いで、これらのポリクローナルＴＣＲ−Ｔ細胞は、患者に投与され得る。
【０３１６】
[00363]この適用に使用する起源ＴＣＲ発現細胞は、外科的に除去された腫瘍から単離されたＴＩＴであり得る。例えば、腫瘍組織は、脂肪および結合組織をトリミングした後、３〜５ｍｍ２断片へと切断し、Ｓｅｗａｒｄ  Ｓｔｏｍａｃｈｅｒデバイス（Ｆｉｓｈｅｒ社、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用する優しい機械粉砕を使用して、コールドＲＰＭＩ１６４０中で脱凝集させることができる。この工程は、酵素消化せずに、単一細胞懸濁液を素早く産生することができる。細胞懸濁液は、７５μｍ孔サイズスクリーン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）を通して濾過し、培養培地で洗浄することができる。即時染色およびフローサイトメトリーによる分析のために使用する細胞の部分は、培養培地で洗浄することができ、細胞懸濁液は、不連続の７０％とそれに続く１００％のＦｉｃｏｌｌ  Ｉｓｏｐａｑｕｅの勾配上に積層させ、遠心分離して、濃縮ＴＩＴ（１００％界面）から腫瘍細胞（７０％界面）を分離することができる。次いで、濃縮ＴＩＴは、Ｄ−ＰＢＳ、１％  ＢＳＡ中で洗浄し、次いで処理することができる。いくつかの場合では、腫瘍試料からのＴＩＴは、３，０００ＩＵ／ｍｌ組換えＩＬ−２を使用して、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）、１ｍＭ  ピルビン酸、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＲＰＭＩ１６４０を含有するＴＩＴ培養培地（ＴＩＬ−ＣＭ）中で増殖させることができる。
【０３１７】
[00364]いくつかの場合では、新鮮な腫瘍が入手できないこともあり、そのような場合には、核は、凍結または固定組織から単離され得る。これらの核は、対合二分免疫受容体クローニング工程（この場合、対合ＴＣＲクローニング）のためのインプットとしても寄与し、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを得ることができる。これらの細胞および核は、さらなる選択をせずに使用することができる。あるいは、細胞または核の特定の集団を単離し、腫瘍特異的ＴＣＲを濃縮することができる。例えば、細胞表面マーカーＣＤ３９、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＯＸ−４０、４−１ＢＢの発現は、腫瘍反応性と相関し得る。細胞表面マーカーを使用して、ＦＡＣＳにより腫瘍反応性ＴＣＲを単離／濃縮することができる。言い換えると、これらのマーカーの１つまたは組合せを高発現する細胞は、対合ＴＣＲクローニングのためのインプットとして使用され得る。
【０３１８】
[00365]Ｔ細胞は、レシピエント細胞として使用して、ポリクローナルＴＣＲ−Ｔ細胞を作製することができる。レシピエント細胞としてのＴ細胞は、「Ｔ細胞の供給源」の節で記載した供給源から得ることができ、「試料」の節で記載した様々な試料から得ることができる。いくつかの場合では、レシピエント細胞としてのＴ細胞は、患者の末梢血から得て、本明細書に記載のようにｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。
【０３１９】
[00366]あるいは、レシピエント細胞としてのＴ細胞は、ドナーから得ることができる。ドナーは、健康なドナーであり得る。ドナーから得られたＴ細胞は、例えば、冷凍庫内で好適に保存して、次いで、要求に応じて同種異系間個体へと注入することができる。レシピエント細胞またはポリクローナルＴＣＲ−Ｔ細胞は、「レシピエント細胞の供給源」、「活性化および増殖」、「ミスアセンブリーの防止」、「レシピエント細胞のさらなるゲノム操作」および「レシピエント細胞によって発現されたさらなる因子」と題した節に記載の方法を使用して、培養または改変することができる。レシピエント細胞がＴ細胞である場合、Ｔ細胞の内在性ＴＣＲは、本明細書に記載のようにノックアウトまたはノックダウンされ得る。レシピエント細胞がＴ細胞である場合、それは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＣＤ８＋ＣＤ４＋二重陽性Ｔ細胞であり得る。それは、ガンマ−デルタＴ細胞であり得る。これらのＴＣＲ−Ｔ細胞は、本明細書に記載のように、さらに他の調節分子のサイトカインを発現するように操作して、それらの抗腫瘍活性を増大させることができる。ドナー（例えば、治療される対象とは異なる対象）から得られたレシピエント細胞を操作し、抑制性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体に結合するタンパク質を発現させることができる。抑制性ＮＫ細胞受容体は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）またはＣ型レクチンファミリー受容体であり得る。抑制性ＮＫ細胞受容体は、ＮＫＧ／ＣＤ９４またはＫＩＲ２ＤＬ４であり得る。抑制性ＮＫ細胞受容体に結合するタンパク質は、膜貫通タンパク質、細胞表面タンパク質、または分泌タンパク質であり得る。抑制性ＮＫ細胞受容体に結合するタンパク質は、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇを含み得る。一部の実施形態では、抑制性ＮＫ細胞受容体に結合するタンパク質は、Ｂ２Ｍドメインをさらに含む。一部の実施形態では、抑制性ＮＫ細胞受容体に結合するタンパク質は、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｅ融合またはＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ融合タンパク質である。
【０３２０】
[00367]本明細書に記載の方法は、オリゴクローナルまたはポリクローナルＴＣＲ−Ｔ細胞による個別化されたがん処置を可能にすることができる。これらのＴＣＲ−Ｔ細胞は、腫瘍反応性であり得る対象特異的ＴＣＲを含み得る。合成ＴＩＬまたはＳｙｎＴＩＬと名付けられた、例示的な治療方法を、図１９に概略する。まず、切除した腫瘍または腫瘍生検を患者から得ることができる。腫瘍浸潤Ｔ細胞は、既存の方法を使用して腫瘍組織から得ることができる（図１９、ステップ（１））。しかしながら、従来のＴＩＬ法でのようにこれらの細胞を培養する代わりに、本明細書で提供する方法を使用して、これらの細胞からのＴＣＲは融合ＴＣＲポリヌクレオチドへと変換され得る（図１９、ステップ（２））。次いで、融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、ＴＣＲ発現レンチウイルスベクターへと変換することができ（図１９、ステップ（３））、それは本明細書に記載のようにレポーター細胞に形質導入するために使用され得る（図１９、ステップ（４））。形質導入したレポーター細胞は、腫瘍細胞または腫瘍ｍＲＮＡ負荷ＡＰＣとインキュベートすることができ、その後、レポーター陽性細胞（例えば、腫瘍反応性細胞）は、本明細書に記載のように同定または単離され得る（例えば、ＦＡＣＳを使用する）（図１９、ステップ（５）、図１８も参照）。必要に応じて、同定されたレポーター陽性細胞のＴＣＲは、シークエンスされ得る。次に、選別した細胞からの融合ＴＣＲを再増幅させて、大部分のＴＣＲが腫瘍反応性であると考えられる、ＴＣＲ発現ベクターのプールを作製することができる（図１９、ステップ（６））。いくつかの場合では、ドナー由来の同種異系間Ｔ細胞を使用して、同種異系間Ｔ細胞の代わりに同定された腫瘍反応性細胞を発現させることができる。また、そのような場合では、同種異系間Ｔ細胞は、本明細書に記載のように操作され得る。異なるＴＣＲ発現ベクターは、個々にまたはプールとして調製することができ、次いで、既存のＴＣＲ−Ｔ製造方法を使用して、患者の末梢血からの多くの（例えば、数億または数十億の）同種異系間Ｔ細胞に形質導入するために使用することができる（図１９、ステップ（７））。ＴＣＲ発現ベクターが個々に調製される場合、それらの規定のサブセット（例えば、５〜２０ＴＣＲ）を使用して、末梢血Ｔ細胞を操作し、ＴＣＲ−Ｔ細胞を作製することができる。これらのＴＣＲ−Ｔ細胞は、オリゴクローナルと考えることができる。ＴＣＲ発現ベクターがプールとして調製される場合、結果生じるＴＣＲ−Ｔ細胞は、ポリクローナルと呼ぶことができる。例えば、プール内のＴＣＲクローンの総数は、約５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上、もしくは５０個以上、またはそれより多くてよい。プール内のＴＣＲクローンの総数は、少なくとも約２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、８０個、１００個、２００個、３００個、もしくは５００個、またはそれより多くであり得る。ＴＣＲ−Ｔ細胞を、一連の放出試験にかけ（図１９、ステップ（８））、患者に投与することができる（例えば、注入により）。各ステップに必要であり得る例示的なタイミングは、図１９��示す。特定の状況では、腫瘍浸潤Ｔ細胞を、患者由来の末梢Ｔ細胞と置き換え、免疫受容体発現細胞の供給源として使用することができる。これらの供給源Ｔ細胞（例えば、末梢Ｔ細胞）は、活性化し、組織または細胞との共培養によって増殖させることができる。末梢血由来の標的反応性Ｔ細胞（例えば、腫瘍反応性Ｔ細胞）は、（１）表面マーカー発現（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ−１、および本明細書に記載の他のマーカー）に基づき、（２）本明細書に記載の共培養法を使用して腫瘍抗原によりパルスした、または腫瘍抗原を発現するように操作したＡＰＣによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激、または２つの組合せにより濃縮することができる。ＡＰＣは、プロフェッショナルなＡＰＣまたは非プロフェッショナルなＡＰＣであり得る。ＡＰＣは、対象、例えば患者または健康なドナーから単離され得る。ＡＰＣは、本明細書に記載のＡＰＣであり得る（例えば、Ｋ５６２細胞）。
【０３２１】
[00368]本明細書で提供する方法は、従来の方法より、Ｔ細胞の単離から対象への治療細胞の投与までの早い所要時間を提供することができる。本明細書で提供する対象における腫瘍を治療する方法は、対象からＴ細胞の集団を単離するステップを含むことができ、Ｔ細胞の集団はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の集団を発現する。ＴＣＲの集団のサブ集団は濃縮することができ、サブ集団は複数の腫瘍反応性ＴＣＲを含み得る。次に、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそれらのサブセットを発現する複数のレシピエント細胞は、対象に投与され得る。いくつかの場合では、投与するステップは、Ｔ細胞の集団を単離してから、多くても約６０日後、５０日後、４０日後、３０日後、２０日後またはそれ以下で実施される。いくつかの場合では、対象の腫瘍は、対象からＴ細胞の集団を単離してから対象へと複数のレシピエント細胞を投与するまで、約６０日間、５０日間、４０日間、３０日間、２０日間、またはそれ以下より長い期間進行しなかった。いくつかの場合では、腫瘍のサイズは、Ｔ細胞の集団を単離してから複数のレシピエント細胞を投与するまで、約５０％、３０％、４０％、２０％、１５％、１０％、５％または２％より小さく増加した。いくつかの場合では、対象の腫瘍細胞の数は、Ｔ細胞の集団を単離してから複数のレシピエント細胞を投与するまで、約２倍、３倍、４倍、または５倍まで増加しなかった。いくつかの場合では、腫瘍は、Ｔ細胞の集団を単離してから複数のレシピエント細胞を投与するまで、新しいステージへと進行しなかった。例えば、腫瘍は、ステージＩからステージＩＩ、ステージＩＩからステージＩＩＩ、またはステージＩＩＩからステージＩＶに進行しなかった。
【０３２２】
[00369]本明細書で提供する対象における腫瘍を治療する方法は、Ｔ細胞の集団を対象から単離するステップを含むことができる。Ｔ細胞の集団は、内在性核酸からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の集団を発現することができる。次に、ＴＣＲの集団のサブ集団は濃縮することができ、サブ集団は複数の腫瘍反応性ＴＣＲを含み得る。次いで、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそれらのサブセットを発現する複数のレシピエント細胞は、対象に投与され得る。複数の腫瘍反応性ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドは、内在性核酸の複製産物であり得る（例えば、転写または増幅産物）。これらの複製産物は、相補鎖が鋳型として既存の鎖を使用して合成される、鋳型依存的な核酸合成、例えば、プライマー伸長、核酸増幅、第二鎖合成、転写、逆転写等によって生成され得る。
【０３２３】
[00370]いくつかの場合では、方法は、例えばフォスフォアミダイトを使用することによる、複数の腫瘍反応性ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの化学合成を含まない。Ｔ細胞の集団は、腫瘍浸潤Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞の集団は、疲弊Ｔ細胞または調節性Ｔ細胞を含み得る。複数のレシピエント細胞は、同種異系間Ｔ細胞、自家Ｔ細胞、または細胞系細胞であり得る。方法は、濃縮前のレポーター細胞の集団においてＴＣＲの集団を発現させるステップをさらに含み得る。いくつかの場合では、発現時に、ＴＣＲの集団をコードする核酸配列は、ウイルスベクターによってレポーター細胞の集団へと送達され得る。ウイルスベクターは本明細書に記載の任意の型のベクター、例えばウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。例えば、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルスベクターまたはそれらの偽型であり得る。レポーター細胞の集団の各レポーター細胞は、レポーター遺伝子を含み得る。濃縮時、ＴＣＲの集団は、腫瘍細胞または腫瘍ＲＮＡ負荷（例えばｍＲＮＡ負荷）抗原提示細胞または１つもしくは複数の抗原／ＭＨＣ複合体と接触させることができる。抗原の同一性または配列は公知でなくてよい。濃縮後、ＴＣＲの集団のサブ集団は、少なくとも約２個、５個、１０個、１５個、または２０個の異なるＴＣＲの同種対を含み得る。いくつかの場合では、サブ集団は、約２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、４００個以上、５００個以上、１，０００個以上、１，５００個以上、２，０００個以上、２，５００個以上、３，０００個以上、３，５００個以上、もしくは４，０００個以上、またはそれより多い異なる同種対を含み得る。ＴＣＲの集団のサブ集団の各ＴＣＲは、異なるエピトープまたは異なるタンパク質に特異的であり得る。ＴＣＲの集団のサブ集団の各ＴＣＲは、異なる（ｉ）ＴＣＲアルファＣＤＲ３配列、（ｉｉ）ＴＣＲベータＣＤＲ３可変ドメイン配列、（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ可変ドメイン配列、（ｉｖ）ＴＣＲベータ可変ドメイン配列、または（ｖ）ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータ可変ドメイン配列の組合せを含み得る。複数の腫瘍反応性ＴＣＲは、対象由来の腫瘍細胞に結合することができるが、対象由来の健康な細胞には結合せず、または腫瘍細胞に対してよりも少なくとも約１０分の１、２０分の１、５０分の１、１００分の１、５００分の１、または１０００分の１の親和性を有する対象由来の健康な細胞には結合する。
【０３２４】
[00371]本明細書で提供する方法は、化学合成による同定した同種対を合成するステップを必要としない。対象におけるがんを治療する方法は、対象からＴ細胞の第１の集団を単離するステップを含み得る。Ｔ細胞の第１の集団は、内在性核酸からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の集団を発現させることができる。次に、内在性核酸によってコードされるＴＣＲの集団をコードする核酸配列は、細胞の第２の集団において発現させることができ、ここで、核酸配列は、例えばフォスフォアミダイトを使用して、化学的に合成されない。次に、ＴＣＲの集団のサブ集団は、細胞の第２の集団から濃縮することができ、ここで、サブ集団は複数の腫瘍反応性ＴＣＲを含む。次いで、複数の腫瘍反応性ＴＣＲを発現する複数のレシピエント細胞は、対象に投与され得る。
【０３２５】
[00372]本明細書で提供する対象におけるがんを治療する方法は、対象からＴ細胞の第１の集団を単離するステップを含むことができ、ここで、Ｔ細胞の第１の集団は、内在性核酸からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の集団を発現する。次に、Ｔ細胞の第１の集団からの内在性核酸の転写または増幅産物は、細胞の第２の集団において発現させることができ、ここで、転写または増幅産物はＴＣＲの集団をコードする。転写または増幅産物は、親鎖の複製によって合成された核酸鎖であり得る。次に、細胞の第２の集団からのＴＣＲの集団のサブ集団は濃縮することができ、ここでサブ集団は複数の腫瘍反応性ＴＣＲを含む。次いで、複数の腫瘍反応性ＴＣＲを発現する複数のレシピエント細胞は、対象に投与され得る。
【０３２６】
[00373]本明細書で提供する対象におけるがんを治療する方法は、対象からＴ細胞の第１の集団を単離するステップを含むことができ、ここでＴ細胞の第１の集団は、内在性核酸からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の集団を発現する。次に、ＴＣＲの集団は、細胞の第２の集団において発現させることができる。細胞の第２の集団は、Ｔ細胞の第１の集団の表現型バックグラウンド／形質を持たなくてもよい。例えば、細胞の第２の集団は、Ｔ細胞の第１の集団として非ＴＣＲ遺伝子の同じ発現プロファイルを持たなくてもよい。細胞の第２の集団は、Ｔ細胞の第１の集団と同じ細胞型（例えば、疲弊Ｔ細胞、活性化Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、またはエフェクターＴ細胞）でなくてもよい。次に、ＴＣＲの集団のサブ集団は、細胞の第２の集団から濃縮することができ、ここでサブ集団は、複数の腫瘍反応性ＴＣＲを含む。次に、複数の腫瘍反応性ＴＣＲを発現する複数のレシピエント細胞は、対象に投与され得る。Ｔ細胞の第１の集団は、腫瘍浸潤Ｔ細胞または末梢Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞の第１の集団は、疲弊Ｔ細胞または調節性Ｔ細胞を含み得る。投与は、Ｔ細胞の第１の集団を単離してから多くても約６０日後、５０日後、４０日後、３０日後、２０日後またはそれ以下で実施することができる。濃縮時、細胞の第２の集団を、１つまたは複数の抗原／ＭＨＣ複合体と接触させることができる。抗原／ＭＨＣ複合体は、ＭＨＣ四量体との複合体中の抗原であり得る。いくつかの場合では、細胞の第２の集団は、各々１つまたは複数の標的抗原（例えば、腫瘍抗原）を提示する１つまたは複数の細胞と接触させることができる。例えば、細胞の第２の集団は、腫瘍細胞または腫瘍ＲＮＡ負荷ＡＰＣと接触させることができる。複数のレシピエント細胞は、同種異系間細胞、自家細胞、または細胞系細胞であり得る。
【０３２７】
[00374]本明細書で提供する方法を使用して、ＴＣＲの集団から複数の腫瘍反応性ＴＣＲを同定することができる。本明細書で提供する対象における腫瘍を治療する方法は、ＴＣＲの集団から複数の腫瘍反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するステップを含むことができ、ここでＴＣＲの集団は、少なくとも約２０個、３０個、５０個、１００個、１，０００個、１０，０００個、１００，０００個、１，０００，０００個、１０，０００，０００個またはそれより多くの異なる同種対を含む。次いで、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそれらのサブセットを発現する複数の細胞は、対象に投与され得る。複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそれらのサブセットは、複数の細胞に対して外因性であり得る。複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそれらのサブセットは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または少なくとも２０個の異なる同種対を含み得る。いくつかの場合では、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそれらのサブセットは、約２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、１，０００個、１，５００個、２，０００個、２，５００個、３，０００個、３，５００個、もしくは４，０００個、またはそれより多くより多くの、または等しい異なる同種対を含み得る。複数の腫瘍反応性ＴＣＲの各ＴＣＲは、異なるエピトープまたは異なるタンパク質に特異的であってよく、または異なる（ｉ）ＴＣＲアルファＣＤＲ３配列、（ｉｉ）ＴＣＲベータＣＤＲ３可変ドメイン配列、（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ可変ドメイン配列、（ｉｖ）ＴＣＲベータ可変ドメイン配列、または（ｖ）ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータ可変ドメイン配列の組合せを含み得る。方法は、対象からＴＣＲの集団を発現するＴ細胞の集団を単離するステップをさらに含み得る。ＴＣＲの異なる同種対は、少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、またはそれより多くの異なるＶ遺伝子由来のＶ領域を含み得る。
【０３２８】
[00375]本明細書で提供する方法は、小さい試料サイズ、例えば多くても約１００，０００個、１０，０００個、１，０００個、１００個、またはそれ以下の細胞を有する試料から標的反応性ＴＣＲを同定することができる。本明細書で提供する対象における腫瘍を治療する方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の集団を発現する対象からＴ細胞の集団を単離するステップを含むことができ、ここでＴ細胞の集団は、多くても約１０，０００個の細胞を含む。次に、複数の腫瘍反応性ＴＣＲは、ＴＣＲの集団から同定され得る。次に、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそれらのサブセットを対象に投与することができ、ここで複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそれらのサブセットは、少なくとも約２個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個、またはそれより多くの異なる同種対を含む。様々な実施形態では、複数のレシピエント細胞は、対象に投与する前に増殖させることができる。
【０３２９】
自己免疫疾患の処置のためのＴＣＲ−Ｔｒｅｇ細胞
[00376]がんを治療する「キラー」細胞の作製に加えて、自己免疫疾患を治療する「ヒーラー」細胞も作製し得る。抗原特異的調節性Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴｒｅｇ細胞（Ｊｅｌｅｎａ  Ｓｋｕｌｊｅｃら、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ａｉｒｗａｙ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｓｔｈｍａ、Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７年；８：１１２５）に導入することによって作製することができる。組織に特異的なＴＣＲを、本明細書に記載の方法を使用してＴｒｅｇ細胞に導入することができ（培養および操作方法を含む）、これらの細胞をホームに誘導し、特定の組織または臓器を保護する。供給源免疫受容体発現細胞は、組織常在性のＴ細胞から得ることができ、公知の組織特異的抗原に対して選択することができる。ここで、組織特異的抗原は、細胞内または細胞表面結合され得る。これらのＴＣＲ−Ｔｒｅｇ細胞は、さらに操作し、本明細書に記載のそれらの免疫調節活性を増大するさらなる因子（例えば、サイトカインまたは他の調節性分子）を発現させることができる。そのようなさらなる因子の例は、抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、およびＩＬ−１６を含む。
【０３３０】
標的反応性ＴＣＲの同定
[00377]Ｔ細胞は、特定のＭＨＣ結合抗原を認識するＴＣＲを同定するため、複数の臓器、例えば末梢血、脾臓、リンパ節、および腫瘍（ここでは、本開示の他の箇所の記載と一貫するように、「供給源ＴＣＲ発現細胞」と総称する）からスクリーニングされ得る。本明細書に記載の方法を使用して得られたポリクローナルＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、これらの適用において供給源ＴＣＲ発現細胞を置き換えることができる。これらの適用では、レシピエント細胞は、細胞系細胞、例えば細胞系Ｔ細胞であり得る。細胞系Ｔ細胞の例は、限定はされないが、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｋ−Ｔ１、ＴＡＬＬ−１、ＭＯＬＴ１６／１７、およびＨＵＴ７８／Ｈ９を含む。細胞系Ｔ細胞の内在性ＴＣＲは、本明細書に記載のようにノックアウトまたはノックダウンされ得る。
【０３３１】
[00378]一部の実施形態では、ＭＨＣ結合抗原は、ペプチドＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）、ｐＭＨＣ四量体、ｐＭＨＣオリゴマーである。例えば、ｐＭＨＣは、ストレプトアビジン足場上で四量体化、または様々な化学足場上でオリゴマー化することができる（Ｃｏｃｈｒａｎ＆Ｓｔｅｒｎ、２０００年）。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ、ｐＭＨＣ四量体、ｐＭＨＣオリゴマーを蛍光標識し、ｐＭＨＣを認識するポリクローナルＴＣＲプログラムレシピエント細胞のＦＡＣＳ選別を促進させる。
【０３３２】
[00379]一部の実施形態では、ＭＨＣ結合抗原は、細胞の表面上に提示される。いくつかの場合では、細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ＡＰＣは、プロフェッショナルなＡＰＣ、例えば樹状細胞、マクロファージ、またはＢ細胞であり得る。ＡＰＣは、ＭＨＣまたはＨＬＡを発現する他の細胞（例えば、人工ＡＰＣ）でもあり得る。例えば、がん細胞系由来の細胞はＡＰＣであり得る。一部の実施形態では、ＡＰＣを操作して、１つのクラスＩＭＨＣ対立遺伝子のみを発現させることができる。一部の実施形態では、ＡＰＣを操作して、任意の数のクラスＩＭＨＣ対立遺伝子およびクラスＩＩＭＨＣ対立遺伝子、例えば１人の対象から単離された全てのクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ対立遺伝子を発現させることができる。対象はヒトであり得る。ヒトは患者であり得る。患者はがん患者であり得る。
【０３３３】
[00380]一部の実施形態では、ＭＨＣ結合抗原のエピトープが明確に定義される。例えば、ｐＭＨＣ四量体において、エピトープペプチドは、化学的に合成され得る。一部の実施形態では、ＭＨＣ結合抗原のエピトープが知られていない、または明確に定義されない。例えば、抗原タンパク質は、ＡＰＣにおいて過剰発現させることができ、複数のエピトープをＡＰＣによって提示させることができる。別の例では、タンパク質の小さな群（例えば、少なくとも２個のタンパク質、少なくとも３個のタンパク質、少なくとも４個のタンパク質、少なくとも５個のタンパク質、少なくとも１０個のタンパク質、少なくとも２０個のタンパク質、少なくとも３０個のタンパク質、少なくとも４０個のタンパク質、または少なくとも５０個のタンパク質）をＡＰＣにおいて過剰発現させることができる。別の例では、未知の数のタンパク質をＡＰＣにおいて過剰発現させることができ、そのような場合、ｃＤＮＡプールをＡＰＣに送達することができる（例えば、トランスフェクト、電気穿孔、または本明細書に記載のベクターを使用する他の送達方法）。
【０３３４】
[00381]一部の実施形態では、抗原は、抗原コードＤＮＡまたはｍＲＮＡをＡＰＣにトランスフェクトすることによってＡＰＣに導入され得る。一部の実施形態では、タンパク質としての抗原は、ＡＰＣの培養培地に添加され得る。一部の実施形態では、ペプチドとしての抗原は、ＡＰＣの培養培地に添加され得る。
【０３３５】
[00382]ＭＨＣ結合抗原を認識するＴＣＲ発現レシピエント細胞は、そうでないものから選択され得る。選択は、可溶性の、蛍光標識したｐＭＨＣ、ｐＭＨＣ四量体またはｐＭＨＣオリゴマーへの結合に基づき得る。選択は、細胞がＭＨＣ結合抗原に接触した後の、ＴＣＲ発現レシピエント細胞上での細胞表面マーカー発現に基づき得る。細胞表面マーカーは、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ３９、ＣＤ１０３、ＣＤ１３７、ならびに他のＴ細胞活性化マーカー、またはそれらの組合せであり得る。選択は、カルシウム流入に基づき得る。選択は、レポーター遺伝子発現にも基づき得る。レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ）であり得る。レポーター遺伝子は、ＴＣＲシグナル伝達によって調節される転写因子の制御下にあり得る。これらの転写因子の例は、限定はされないが、ＡＰ−１、ＮＦＡＴ、ＮＦ−カッパ−Ｂ、Ｒｕｎｘ１、Ｒｕｎｘ３等を含む。
【０３３６】
[00383]一部の実施形態では、上記の基準に基づく、選択されたＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、増殖させ、ＭＨＣ結合抗原を認識するＴＣＲをさらに濃縮するため、再度選択を受けることができる。一部の実施形態では、選択されたＴＣＲ発現レシピエント細胞から単離されたＴＣＲ発現ベクターにおける融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、増幅させ、ＴＣＲ発現ベクターへと変換させることができる。また、これらのＴＣＲ発現ベクターを使用して、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞の新しい集団を得ることができる。これらの細胞は、ＭＨＣ結合抗原を認識するＴＣＲをさらに濃縮するため、再度選択を受けることができる。
【０３３７】
[00384]抗原、エピトープまたは提示するＭＨＣの同一性を必ずしも知る必要のない腫瘍反応性ＴＣＲの高速同定は、がんの免疫治療において広い適用範囲を持ち、レポーターベースの選択方法と組み合わせた本明細書に記載の大規模な平行ＴＣＲクローニング技術によって達成され得る。
【０３３８】
[00385]レポーターベースの選択方法の例示的なスキームを図１８に概略する。レポーター細胞系は、Ｔ細胞系（例えば、Ｊｕｒｋａｔ）であり得る。レポーター細胞系は、ＴＣＲシグナル伝達（例えば、ＮＦＡＴ、ＮＦ−カッパ−Ｂ、Ｎｕｒ７７）によって制御されるプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質または染色可能な細胞表面タンパク質）を担持し得る。必要に応じて、レポーター細胞系の内在性ＴＣＲは、ノックアウトされ得る。レポーター細胞は、Ｔ細胞（例えば、腫瘍浸潤Ｔ細胞）の集団から得られたポリクローナルＴＣＲ発現レンチウイルスベクターによって形質導入することができ、そのいくつかは腫瘍反応性（または腫瘍特異的）である（図１８、ステップ（１））。形質導入したレポーター細胞は、腫瘍細胞、腫瘍組織、腫瘍様塊、または腫瘍遺伝子を発現するように操作されたＡＰＣ（すなわち、がんワクチンとして研究されている腫瘍ｍＲＮＡ負荷ＡＰＣ）（自家ＭＨＣを発現するように操作された自家ＡＰＣまたは同種異系間ＡＰＣのいずれか）とインキュベートされ得る（図１８、ステップ（２））。レポーター細胞系に形質導入したＴＣＲが腫瘍反応性である場合、レポーター細胞内のレポーター遺伝子を発現させることができ、細胞を同定することができる（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して選択する／単離する／濃縮する）（図１８、ステップ（３））。必要に応じて、腫瘍反応性である同定されたＴＣＲはシークエンスされ得る。選別された細胞由来のすでに融合したＴＣＲは、単にＰＣＲ増幅され、バッチでＴＣＲ発現ベクターにクローニングされ得る。必要に応じて、個々のＴＣＲは、例えばＴＣＲ発現ベクターを持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコロニーを取ることによって得ることができる。
【０３３９】
[00386]本明細書に記載の方法は、免疫モニタリング試験を可能にし、患者の腫瘍組織または末梢血における腫瘍反応性Ｔ細胞を定量することができる。例えば、腫瘍生検は、がん患者から得ることができる。末梢Ｔ細胞も、同じ患者から得ることができる。末梢Ｔ細胞からのＴＣＲは、ＴＣＲ発現ベクターへとクローニングすることができ、順に本明細書に記載のようにレポーター細胞系を操作するために使用され得る。その間に、ＨＬＡ遺伝子は、末梢血から増幅され得る。ヒトＨＬＡ発現のないＡＰＣ細胞系（例えば、Ｋ５６２および７２１．２２１などのＭＨＣを発現しない、または非常に低いレベルで発現するヒト細胞系、ＣＯＳ−７などの非ヒト霊長類細胞系、または内在性ＨＬＡをノックアウトしたヒト細胞系）は、操作して患者のＨＬＡ遺伝子を発現させることができる。患者由来の自家ＡＰＣ（例えば、単球由来樹状細胞、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞）もＡＰＣとして使用され得る。腫瘍試料（外科的試料または生検）からの全長ｍＲＮＡを、単離、増幅および上記の自家またはＨＬＡ操作した同種異系間ＡＰＣへとトランスフェクトし、腫瘍ｍＲＮＡ負荷ＡＰＣを作製することができる。腫瘍試料は、コア生検または細針生検試料などの生検試料であり得る。これらの試料は、小体積の腫瘍試料でさえも増幅するのに十分なｍＲＮＡを含有し得るため、小体積（例えば、＜１０００ｍｍ３、＜５００ｍｍ３、＜１００ｍｍ３、＜５０ｍｍ３）であり得る。いくつかの場合では、腫瘍試料の体積は、約２０００ｍｍ３、１０００ｍｍ３、８００ｍｍ３、５００ｍｍ３、１００ｍｍ３、５０ｍｍ３、または２０ｍｍ３に等しいまたは多くても約２０００ｍｍ３、１０００ｍｍ３、８００ｍｍ３、５００ｍｍ３、１００ｍｍ３、５０ｍｍ３、または２０ｍｍ３であり得る。したがって、この方法は、大きな外科的腫瘍試料を得るのが難しい状況に適用することができる。ＴＣＲ操作したレポーター細胞および腫瘍ｍＲＮＡ負荷ＡＰＣは共にインキュベートすることができ、腫瘍反応性であるレポーター発現細胞を、上記のように単離することができる。単離された細胞由来のＴＣＲは、シークエンスし、配列および多くの腫瘍反応性ＴＣＲを提供することができる。そのような情報を含有する報告が発行されていることもある。この方法は、従来のＴＣＲレパートリー解析と組み合わせて、多くの腫瘍反応性ＴＣＲの正確性を改善することができる。ＡＰＣおよびこの段落に記載の腫瘍ｍＲＮＡ負荷ＡＰＣを得るおよび操作する方法は、本文書の他の箇所に記載の方法でも使用され得る。
【０３４０】
[00387]例えば、複数の標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法は、ＴＣＲの集団を発現する細胞の集団を提供するステップを含み得る。ＴＣＲの集団は、細胞の集団に対して外因性であり得る。ＴＣＲの集団は、異なる同種対、例えば、少なくとも５０個の異なる同種対を含み得る。ＴＣＲの集団は、少なくとも約１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、またはそれより多くの異なるＶ遺伝子由来のＶ領域を含み得る。ＴＣＲの集団は、少なくとも１００個の異なるＶＪ組合せを含み得る。方法は、細胞の集団を１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップをさらに含むことができ、ここで複数の標的反応性ＴＣＲは１つまたは複数の標的抗原に結合する。次いで、複数の標的反応性ＴＣＲは、単離または濃縮され得る。いくつかの場合では、複数の少なくとも約５個、１０個、１５個、２０個、３０個、５０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個またはそれより多くの標的反応性ＴＣＲが単離または濃縮され得る。細胞の集団は、操作細胞、非疲弊細胞、または患者から単離されていない細胞であり得る。方法は、細胞の集団を１つまたは複数の標的抗原と接触させるステップをさらに含むことができ、ここで複数の標的反応性ＴＣＲは１つまたは複数の標的抗原と結合することができる。次いで、複数の少なくとも５個の標的反応性ＴＣＲが単離または濃縮され得る。ＴＣＲの集団は、少なくとも約１００個、２００個、５００個、１，０００個、１０，０００個、１００，０００個、１，０００，０００個、または１０，０００，０００個の異なる同種対を含み得る。複数の標的反応性ＴＣＲは、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、またはそれより多くの異なるＶ遺伝子由来のＶ領域を含む。いくつかの場合では、細胞の集団を、腫瘍細胞または１つもしくは複数の標的抗原を提示する抗原提示細胞と接触させる。標的抗原は、腫瘍抗原または組織特異的抗原であり得る。１つまたは複数の標的抗原は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）との複合体であり得る。ＭＨＣは、ＭＨＣ四量体であり得る。方法は、複数の標的反応性ＴＣＲのうちの少なくとも１つの標的反応性ＴＣＲを対象に投与するステップをさらに含み得る。いくつかの場合では、細胞または操作した細胞の集団の細胞は、レポーター遺伝子を含み得る。レポーター遺伝子は、細胞のＴＣＲが１つまたは複数の標的抗原の標的抗原に結合する場合、シグナルを送るように調節され得る。細胞または操作した細胞の集団は、細胞系細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）であり得る。
【０３４１】
[00388]例えば、複数の標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法は、複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を提供するステップを含み得る。複数のＴＣＲは、少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子由来のＶ領域を含む、少なくとも５０個の異なる同種対を含み得る。方法は、複数のＴＣＲの各ＴＣＲのＴＣＲアルファ（またはガンマ）鎖をコードする第１のポリヌクレオチドとＴＣＲベータ（またはデルタ）鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを物理的に連結するステップ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを生成するステップをさらに含み得る。複数の融合ポリヌクレオチドは、複数の細胞において発現させることができ、ここで複数の細胞のサブセットが、複数の標的反応性ＴＣＲを発現する。複数の細胞を、１つまたは複数の標的抗原と接触させ、複数の標的反応性ＴＣＲを同定することができる。複数の標的反応性ＴＣＲを発現する複数の細胞のサブセットは、１つまたは複数の標的抗原に結合することができる。複数の細胞のサブセットを、単離または濃縮し、それによって複数の標的反応性ＴＣＲを単離または濃縮することができる。
【０３４２】
[00389]例えば、複数の標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法は、複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を提供するステップを含み得る。複数のＴＣＲは、少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子由来のＶ領域を含む少なくとも５０個の異なる同種対を含み得る。方法は、任意のバーコーディング、例えば単一細胞バーコーディングを使用しない、複数のＴＣＲの１つまたは複数の同種対をシークエンシングするステップをさらに含み得る。例えば、シークエンシングは、複数のＴＣＲの１つまたは複数の同種対のＴＣＲ鎖をシークエンシングするステップを含むことができ、ここでＴＣＲ鎖は同じバーコードを含まない。次いで、複数のＴＣＲまたはそれらのサブセットをコードする１つまたは複数の同種対を、例えば可溶性形態でまたは複数の細胞において発現させることができる。１つまたは複数の同種対を発現させるために使用する複数の細胞は、細胞系細胞であり得る。複数のＴＣＲまたはそれらのサブセットは、複数の標的反応性ＴＣＲを含み得る。次いで、複数のＴＣＲを、１つまたは複数の標的抗原と接触させて、標的反応性ＴＣＲを同定することができる。複数の標的反応性ＴＣＲは、１つまたは複数の標的抗原に結合することができ、次いで単離または濃縮することができる。いくつかの場合では、ＴＣＲの同種対を同定する場合、複数のＴＣＲの各ＴＣＲのＴＣＲアルファ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドとＴＣＲベータ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを物理的に連結させ、それによって複数の融合ポリヌクレオチドを生成することができる。方法は、複数のＴＣＲの１つまたは複数の同種対をシークエンシングするステップをさらに含み得る。複数のＴ細胞が対象から単離され得る。複数のＴ細胞は、腫瘍浸潤Ｔ細胞であり得る。複数のＴ細胞は、疲弊Ｔ細胞を含み得る。複数の標的反応性ＴＣＲは、ＦＡＣＳによって単離または濃縮され得る。複数の標的反応性ＴＣＲは、細胞表面マーカーまたはサイトカインマーカーによって単離され得る。例えば、標的反応性ＴＣＲは、ＦＡＣＳによる選別のための、ＣＤ６９、ＣＤ２５またはＣＤ４１ＢＢなどの表面マーカーに特異的な抗体を使用することによって単離または濃縮され得る。
【０３４３】
[00390]いくつかの場合では、試料から単離された複数のＴ細胞は、例えば、抗原を提示するＡＰＣによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで培養および刺激することができ、複数のＴ細胞のサブセットを濃縮することができる。次いで、これらの前もって濃縮したＴ細胞を使用して、標的反応性ＴＣＲを同定することができる。例えば、血液試料またはＰＢＭＣ試料から複数のＴ細胞を単離する場合、複数のＴ細胞の少ない画分が標的反応性Ｔ細胞であり得る。そのような場合では、先ず、複数のＴ細胞を１つまたは複数の標的抗原（例えば、ＭＨＣ四量体形態、または細胞表面に提示される）と接触させ、Ｔ細胞を活性化することができる。複数のＴ細胞のサブセットは、マーカー（例えば、表面マーカー）に基づいて濃縮または単離することができ、次いで、同種ＴＣＲ鎖を融合させるステップを含む、本明細書に記載の続く同定方法のために使用することができる。前もって濃縮したＴ細胞は、例えばシークエンシングを使用する、同種対を同定する公知の方法に供することもできる。シークエンシングは単一細胞バーコーディング（例えば、Ｔ細胞を個々の区画に分けるステップ、単一細胞から放出される核酸をバーコーディングするステップ、核酸をシークエンシングし、同じバーコードに基づく単一細胞からのＴＣＲ鎖を対合するステップ）を使用し得る。
【０３４４】
組成物
[00391]本開示は、融合免疫受容体ポリヌクレオチドを含む組成物、融合免疫受容体ポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、または融合免疫受容体ポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本開示は、融合免疫受容体ポリヌクレオチドを生成する核酸を含有する複数のヒドロゲル粒子を含む組成物も提供する。
【０３４５】
[00392]一態様では、本明細書は、複数の融合Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。複数の各融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含み得る。第１の核酸配列は、第１のＴＣＲペプチド配列の第１の可変ドメインをコードすることができ、ここで第１の可変ドメインはＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、第２の核酸配列は第２のＴＣＲペプチド配列の第２の可変ドメインをコードすることができ、ここで第２の可変ドメインはＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。各融合ＴＣＲポリヌクレオチドの第１および第２の核酸配列は、免疫細胞由来の第１および第２のＴＣＲペプチド配列の同種対をコードすることができる。複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも約５０個、１００個、１，０００個、１０，０００個、１００，０００個、１，０００，０００個、または１０，０００，０００個の異なる同種対をコードする。複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、またはそれより多くの異なるＶ遺伝子由来のＶ領域を含み得る。
【０３４６】
[00393]第１のＴＣＲペプチド鎖はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファペプチド鎖であってよく、第２のＴＣＲペプチド鎖はＴＣＲベータペプチド鎖であってよい。第１のＴＣＲペプチド鎖はＴＣＲガンマペプチド鎖であってよく、第２のＴＣＲペプチド鎖はＴＣＲデルタペプチド鎖であってよい。第１の可変ドメインはＣＤＲ１をさらに含み得る。第２の可変ドメインはＣＤＲ１をさらに含み得る。第１のＴＣＲペプチド鎖の第１の可変ドメインは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３を含む第１の全長可変ドメインであり得る。第２のＴＣＲペプチド鎖の第２の可変ドメインは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３を含む第２の全長可変ドメインであり得る。第１の核酸配列は、第１のＴＣＲペプチド鎖の第１の定常ドメインまたはそれらの部分をさらにコードし得る。第２の核酸配列は、第２のＴＣＲペプチド鎖の第２の定常ドメインまたはそれらの部分をさらにコードし得る。各融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、または少なくとも１５００塩基対長であり得る。各融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも１０００、少なくとも１５００、または少なくとも２０００塩基対長であり得る。
【０３４７】
[00394]第１の核酸配列および第２の核酸配列は、免疫細胞から獲得または放出され得る。免疫細胞は試料から単離され得る。例えば、試料は、血液試料、骨髄試料、臍帯血試料、腹水試料、胸水滲出液試料、脳脊髄試料、精液試料、唾液試料、尿試料、便試料、またはそれらの組合せであり得る。別の例としては、試料は、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節、扁桃、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、咽頭、食道、胸腺、胃、腫瘍、または感染部位を含む、様々な供給源から得た組織試料であり得る。試料は、対象から得ることができる。対象は、健康な対象または疾患の対象であり得る。いくつかの場合では、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、またはラットであり得る。免疫細胞は、二分免疫受容体を有するまたは発現する様々な免疫細胞であり得る。例えば、免疫細胞は、限定はされないが、Ｔ細胞またはＢ細胞を含む、リンパ球であり得る。Ｔ細胞は、炎症性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはそれらの組合せであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。
【０３４８】
[00395]いくつかの場合では、免疫細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。免疫細胞は、マーカーによって試料から単離され得る。マーカーは、細胞表面マーカーであり得る。例えば、好適な細胞表面マーカーは、限定はされないが、ＣＤ３９、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＧＩＴＲ、およびＦｏｘＰ３を含む。マーカーはサイトカインであり得る。例えば、サイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、パーフォリン、またはそれらの組合せであり得る。
【０３４９】
[00396]融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、プロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、構成的または誘導性であり得る。例えば、プロモーターは、テトラサイクリン応答性プロモーターであり得る。プロモーターは、ウイルスプロモーターであリ得る。プロモーターは、βアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、フレンド脾フォーカス形成ウイルス（Ｆｒｉｅｎｄ  ｓｐｌｅｅｎ  ｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ヘルペスウイルスＴＫプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニア７．５Ｋプロモーター、またはエノラーゼプロモーターであり得る。
【０３５０】
[00397]第１の核酸および第２の核酸は、第１の核酸および第２の核酸の発現が１つのプロモーターの制御下にあり得るように、インフレームで融合され得る。いくつかの他の場合では、第１の核酸および第２の核酸は、インフレームで融合されなくてもよい。第１の核酸および第２の核酸の発現は、２つのプロモーター下で制御され得る。２つのプロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。
【０３５１】
[00398]融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、プロテアーゼ切断部位をコードする配列をさらに含み得る。プロテアーゼ切断部位は、細胞性プロテアーゼ切断部位またはウイルスプロテアーゼ切断部位であり得る。プロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ切断部位、ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ切断部位、トロンビン切断部位、レニン切断部位、コラゲナーゼ切断部位、トリプシン切断部位、カスパーゼプロテアーゼ切断部位、フューリン切断部位、ＰＣ５／６プロテアーゼ切断部位、ＰＡＣＥプロテアーゼ切断部位、ＬＰＣ／ＰＣ７プロテアーゼ切断部位、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ切断部位、ｇｅｎｅｎａｓｅＩ切断部位、ＭＭＰプロテアーゼ切断部位、またはＫＥＸ２プロテアーゼ切断部位であり得る。プロテアーゼ切断部位は、ウイルス２Ａプロテアーゼ切断部位、ウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）ＶＰ４プロテアーゼ切断部位、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、またはカブモザイクポティウイルスの核内封入タンパク質ａ（Ｎ１ａ）切断部位であり得る。融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、自己切断型ペプチドをコードする配列を含み得る。自己切断型ペプチドは、インテインペプチド、ヘッジホッグペプチド、または２Ａペプチドであり得る。
【０３５２】
[00399]複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、またはそれより多くの異なるＶ遺伝子由来のＶ領域を含み得る。いくつかの場合では、複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子を含む。少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子は、少なくとも１０個の異なるＴＲＡＶ遺伝子および／または少なくとも１０個の異なるＴＲＢＶ遺伝子を含み得る。ＴＲＡＶ遺伝子またはＴＲＢＶ遺伝子は、ヒトＴＲＡＶ遺伝子またはＴＲＢＶ遺伝子であり得る。ＴＲＡＶ遺伝子またはＴＲＢＶ遺伝子は、マウスＴＲＡＶ遺伝子またはＴＲＢＶ遺伝子であり得る。ヒトＴＲＡＶ遺伝子の例は、ヒトＴＲＡＶ１−１、ＴＲＡＶ１−２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８−１、ＴＲＡＶ８−２、ＴＲＡＶ８−３、ＴＲＡＶ８−４、ＴＲＡＶ８−６、ＴＲＡＶ９−１、ＴＲＡＶ９−２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２−１、ＴＲＡＶ１２−２、ＴＲＡＶ１２−３、ＴＲＡＶ１３−１、ＴＲＡＶ１３−２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６−１、ＴＲＡＶ２６−２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８−１、ＴＲＡＶ３８−２、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０および、ＴＲＡＶ４１を含む。ヒトＴＲＢＶ遺伝子の例は、ヒトＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３−１、ＴＲＢＶ４−１、ＴＲＢＶ４−２、ＴＲＢＶ４−３、ＴＲＢＶ５−１、ＴＲＢＶ５−４、ＴＲＢＶ５−５、ＴＲＢＶ５−６、ＴＲＢＶ５−８、ＴＲＢＶ６−１、ＴＲＢＶ６−２、ＴＲＢＶ６−３、ＴＲＢＶ６−４、ＴＲＢＶ６−５、ＴＲＢＶ６−６、ＴＲＢＶ６−８、ＴＲＢＶ６−９、ＴＲＢＶ７−２、ＴＲＢＶ７−３、ＴＲＢＶ７−４、ＴＲＢＶ７−６、ＴＲＢＶ７−７、ＴＲＢＶ７−８、ＴＲＢＶ７−９、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０−１、ＴＲＢＶ１０−２、ＴＲＢＶ１０−３、ＴＲＢＶ１１−１、ＴＲＢＶ１１−２、ＴＲＢＶ１１−３、ＴＲＢＶ１２−３、ＴＲＢＶ１２−４、ＴＲＢＶ１２−５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０−１、ＴＲＢＶ２４−１、ＴＲＢＶ２５−１、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９−１および、ＴＲＢＶ３０を含む。
【０３５３】
[00400]複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、またはそれより多くの異なるＶ遺伝子サブグループ由来のＶ領域を含み得る。少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子は、少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子サブグループ由来の遺伝子を含み得る。少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子サブグループは、少なくとも１０個の異なるＴＲＡＶ遺伝子サブグループおよび／または少なくとも１０個の異なるＴＲＢＶ遺伝子サブグループを含み得る。ヒトＴＲＡＶ遺伝子サブグループの例は、ヒトＴＲＡＶ１、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８、ＴＲＡＶ９、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡＶ１３、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、およびＴＲＡＶ４１サブグループを含む。ヒトＴＲＢＶ遺伝子サブグループの例は、ヒトＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３、ＴＲＢＶ４、ＴＲＢＶ５、ＴＲＢＶ６、ＴＲＢＶ７、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０、ＴＲＢＶ１１、ＴＲＢＶ１２、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０、ＴＲＢＶ２４、ＴＲＢＶ２５、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９、およびＴＲＢＶ３０サブグループを含む。
【０３５４】
[00401]マウスＴＲＡＶ遺伝子の例は、マウスＴＲＡＶ１、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３−１、ＴＲＡＶ３−３、ＴＲＡＶ３−４、ＴＲＡＶ３Ｄ−３、ＴＲＡＶ３Ｎ−３、ＴＲＡＶ４−２、ＴＲＡＶ４−３、ＴＲＡＶ４−４、ＴＲＡＶ４Ｄ−２、ＴＲＡＶ４Ｄ−３、ＴＲＡＶ４Ｄ−４、ＴＲＡＶ４Ｎ−３、ＴＲＡＶ４Ｎ−４、ＴＲＡＶ５−１、ＴＲＡＶ５−２、ＴＲＡＶ５−４、ＴＲＡＶ５Ｄ−２、ＴＲＡＶ５Ｄ−４、ＴＲＡＶ５Ｎ−２、ＴＲＡＶ５Ｎ−４、ＴＲＡＶ６−１、ＴＲＡＶ６−２、ＴＲＡＶ６−３、ＴＲＡＶ６−４、ＴＲＡＶ６−５、ＴＲＡＶ６−６、ＴＲＡＶ６−７、ＴＲＡＶ６Ｄ−３、ＴＲＡＶ６Ｄ−４、ＴＲＡＶ６Ｄ−５、ＴＲＡＶ６Ｄ−６、ＴＲＡＶ６Ｄ−７、ＴＲＡＶ６Ｎ−５、ＴＲＡＶ６Ｎ−６、ＴＲＡＶ６Ｎ−７、ＴＲＡＶ７−１、ＴＲＡＶ７−２、ＴＲＡＶ７−３、ＴＲＡＶ７−４、ＴＲＡＶ７−５、ＴＲＡＶ７−６、ＴＲＡＶ７Ｄ−２、ＴＲＡＶ７Ｄ−３、ＴＲＡＶ７Ｄ−４、ＴＲＡＶ７Ｄ−５、ＴＲＡＶ７Ｄ−６、ＴＲＡＶ７Ｎ−４、ＴＲＡＶ７Ｎ−５、ＴＲＡＶ７Ｎ−６、ＴＲＡＶ８−１、ＴＲＡＶ８−２、ＴＲＡＶ８Ｄ−１、ＴＲＡＶ８Ｄ−２、ＴＲＡＶ８Ｎ−２、ＴＲＡＶ９−１、ＴＲＡＶ９−２、ＴＲＡＶ９−３、ＴＲＡＶ９−４、ＴＲＡＶ９Ｄ−１、ＴＲＡＶ９Ｄ−２、ＴＲＡＶ９Ｄ−３、ＴＲＡＶ９Ｄ−４、ＴＲＡＶ９Ｎ−２、ＴＲＡＶ９Ｎ−３、ＴＲＡＶ９Ｎ−４、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１０Ｄ、ＴＲＡＶ１０Ｎ、ＴＲＡＶ１１、ＴＲＡＶ１１Ｄ、ＴＲＡＶ１１Ｎ、ＴＲＡＶ１２−１、ＴＲＡＶ１２−２、ＴＲＡＶ１２−３、ＴＲＡＶ１２Ｄ−１、ＴＲＡＶ１２Ｄ−２、ＴＲＡＶ１２Ｄ−３、ＴＲＡＶ１２Ｎ−１、ＴＲＡＶ１２Ｎ−２、ＴＲＡＶ１２Ｎ−３、ＴＲＡＶ１３−１、ＴＲＡＶ１３−２、ＴＲＡＶ１３−３、ＴＲＡＶ１３−４、ＴＲＡＶ１３−５、ＴＲＡＶ１３Ｄ−１、ＴＲＡＶ１３Ｄ−２、ＴＲＡＶ１３Ｄ−３、ＴＲＡＶ１３Ｄ−４、ＴＲＡＶ１３Ｎ−１、ＴＲＡＶ１３Ｎ−２、ＴＲＡＶ１３Ｎ−３、ＴＲＡＶ１３Ｎ−４、ＴＲＡＶ１４−１、ＴＲＡＶ１４−２、ＴＲＡＶ１４−３、ＴＲＡＶ１４Ｄ−１、ＴＲＡＶ１４Ｄ−２、ＴＲＡＶ１４Ｄ−３、ＴＲＡＶ１４Ｎ−１、ＴＲＡＶ１４Ｎ−２、ＴＲＡＶ１４Ｎ−３、ＴＲＡＶ１５−１、ＴＲＡＶ１５−２、ＴＲＡＶ１５Ｄ−１、ＴＲＡＶ１５Ｄ−２、ＴＲＡＶ１５Ｎ−１、ＴＲＡＶ１５Ｎ−２、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１６Ｄ、ＴＲＡＶ１６Ｎ、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、およびＴＲＡＶ２１を含む。マウスＴＲＢＶ遺伝子の例は、マウスＴＲＢＶ１、ＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３、ＴＲＢＶ４、ＴＲＢＶ５、ＴＲＢＶ８、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０、ＴＲＢＶ１２−１、ＴＲＢＶ１２−２、ＴＲＢＶ１３−１、ＴＲＢＶ１３−２、ＴＲＢＶ１３−３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１７、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０、ＴＲＢＶ２１、ＴＲＢＶ２３、ＴＲＢＶ２４、ＴＲＢＶ２６、ＴＲＢＶ２９、ＴＲＢＶ３０、およびＴＲＢＶ３１を含む。マウスＴＲＡＶ遺伝子サブグループの例は、マウスＴＲＡＶ１、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８、ＴＲＡＶ９、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１１、ＴＲＡＶ１２、ＴＲＡ��１３、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１５、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、およびＴＲＡＶ２１サブグループを含む。マウスＴＲＢＶ遺伝子サブグループの例は、マウスＴＲＢＶ１、ＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３、ＴＲＢＶ４、ＴＲＢＶ５、ＴＲＢＶ８、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０、ＴＲＢＶ１２、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１７、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０、ＴＲＢＶ２１、ＴＲＢＶ２３、ＴＲＢＶ２４、ＴＲＢＶ２６、ＴＲＢＶ２９、ＴＲＢＶ３０、およびＴＲＡＶ３１サブグループを含む。
【０３５５】
[00402]融合ＴＣＲポリヌクレオチドは環状化させることができる。複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個の異なる（またはユニークな）配列を含み得る。
【０３５６】
[00403]融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、発現のため、宿主細胞に送達され得る。様々な遺伝子送達方法が使用され得る。上記のように、いくつかの場合では、融合ＴＣＲポリヌクレオチドは電気穿孔によって宿主細胞に送達することができ、いくつかの他の場合では、融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、ベクターによって宿主細胞に送達することができる。一部の実施形態では、本明細書は、各々本明細書に記載の複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチド由来の異なる融合ＴＣＲポリヌクレオチドを含む、複数のベクターを提供する。複数のベクターは、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、少なくとも１０，０００，０００個のベクターを含み得る。複数のベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンであり得る。複数のベクターは、ウイルスベクターであり得る。複数のベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、もしくはヒトパピローマウイルスまたはこれらの偽型由来であり得る。複数のベクターは、非ウイルスベクターであり得る。非ウイルスベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属性ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフィアであり得る。
【０３５７】
[00404]別の態様では、本明細書は、複数のベクターを含む組成物であって、複数の各ベクターが、第１の核酸配列および第２の核酸配列を有する融合ＴＣＲポリヌクレオチドを含み、ここで（１）第１の核酸配列が第１のＴＣＲペプチド鎖の第１の可変ドメインをコードし、第１の可変ドメインがＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、（２）第２の核酸配列が第２のＴＣＲペプチド鎖の第２の可変ドメインをコードし、第２の可変ドメインがＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み；各融合ＴＣＲ配列の第１および第２の核酸配列が、免疫細胞由来の第１および第２のＴＣＲペプチド鎖の同種対をコードする、組成物を提供する。複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、またはそれより多くの異なるＶ遺伝子を含み得る。いくつかの場合では、複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチドは、少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子を含む。いくつかの場合では、複数のベクターは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個の異なる同種対を含む。少なくとも２０個の異なるＶ遺伝子は、少なくとも１０個の異なるＴＲＡＶ遺伝子サブグループおよび／または少なくとも１０個の異なるＴＲＢＶ遺伝子サブグループを含み得る。
【０３５８】
[00405]別の態様では、本明細書は、複数のＴＣＲを提供する。複数の各ＴＣＲは、複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチド由来の異なる融合ＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされ得る。複数の各ＴＣＲは、本明細書に記載の複数のベクター由来の異なる融合ＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされ得る。複数のＴＣＲは、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個のＴＣＲを含み得る。
【０３５９】
[00406]別の態様では、本明細書は、複数の宿主細胞を提供する。本明細書に記載のように、そのような宿主細胞は、「レシピエント細胞」と呼ばれる。複数の各宿主細胞は、本明細書に記載の複数の融合ＴＣＲポリヌクレオチド由来の異なる融合ＴＣＲポリヌクレオチドを含み得る。複数の各宿主細胞は、本明細書に記載の複数のベクターの異なるベクターを含み得る。複数の各宿主細胞は、融合ＴＣＲポリヌクレオチドを発現し得る。複数の各宿主細胞は、複数のＴＣＲの異なるＴＣＲを含み得る。複数の宿主細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞であり得る。Ｔ細胞は、炎症性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはそれらの組合せであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。複数の宿主細胞は、自家細胞であり得る。複数の宿主細胞は、同種異系間細胞であり得る。複数の宿主細胞は、ドナーから得ることができる。ドナーはヒトであり得る。ドナーは、健康なドナーまたは疾患のドナーであり得る。複数の宿主細胞は、試料から得ることができる。例えば、試料は、血液試料、骨髄試料、臍帯血試料、腹水試料、胸水滲出液試料、脳脊髄試料、精液試料、唾液試料、尿試料、便試料、またはそれらの組合せであり得る。別の例としては、試料は、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節、扁桃、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、咽頭、食道、胸腺、胃、腫瘍、感染部位、またはそれらの組合せから得た組織試料であり得る。複数の宿主細胞は、細胞系細胞であり得る。細胞系細胞の例は、限定はされないが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２−ＯＳ細胞；ＮＩＨ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ−１０８０細胞；ＨＣＴ−１１６細胞；Ｈｕ−ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；またはＭｏｌｔ  ４細胞を含む。複数の宿主細胞は、遺伝子改変された細胞であり得る。いくつかの場合では、ＴＣＲアルファペプチド配列、ＴＣＲベータペプチド配列、ＴＣＲガンマペプチド配列、ＴＣＲデルタペプチド配列、ＢＣＲ重ペプチド配列、またはＢＣＲ軽ペプチド配列をコードする内在性遺伝子は、下方調節または不活性化され得る。いくつかの場合では、ＴＣＲアルファおよびベータペプチド配列の両方をコードする内在性遺伝子は、下方調節または不活性化される。いくつかの場合では、さらなる内在性遺伝子が下方調節または不活性化される。さらなる内在性遺伝子の例は、限定はされないが、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、および２Ｂ４を含む。いくつかの場合では、２つまたはそれより多くのさらなる内在性遺伝子が、下方調節または不活性化される。宿主細胞を、さらなる因子を発現するように操作して、宿主細胞の機能を増大させることができる。機能は、細胞傷害性機能、炎症促進性機能、または抗炎症機能であり得る。さらなる因子は、サイトカインであってよい。サイトカインは、炎症促進性サイトカインまたは抗炎症サイトカインであり得る。サイトカインは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ−γ）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、単球走化性タンパク質１および２（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、高移動度群ボックスタンパク質１（ＨＭＧＢ−１）、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、ＩＬ−１６、またはそれらの任意の組合せであり得る。
【０３６０】
[00407]本明細書は、複数のヒドロゲル粒子またはビーズを含む組成物も提供する。いくつかの態様では、複数の各ヒドロゲル粒子またはビーズは：（ａ）第１の可変ドメインがＣＤＲ３を含む、第１の免疫受容体ペプチド配列の第１の可変ドメインをコードする第１の核酸分子およびそれらの第１の増幅産物、ならびに（ｂ）第２の可変ドメインがＣＤＲ３を含む、第２の免疫受容体ペプチド配列の第２の可変ドメインをコードする第２の核酸分子およびそれらの第２の増幅産物を含み得る（例えば、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａ〜５Ｃ、図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａおよび図１０ＢのＴＲＡおよびＴＲＢ）。第１の増幅産物および第２の増幅産物は、重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーを有するマトリクス内に包埋または封入され得る。第１の増幅産物および第２の増幅産物の拡散は、抑制され得る。いくつかの他の態様では、複数の各ヒドロゲル粒子またはビーズは：（ａ）第１の可変ドメインがＣＤＲ３を含む、第１の免疫受容体ペプチド配列の第１の可変ドメインをコードする第１の核酸分子およびそれらの第１のプライマー伸長産物、ならびに（ｂ）第２の可変ドメインがＣＤＲ３を含む、第２の免疫受容体ペプチド配列の第２の可変ドメインをコードする第２の核酸分子およびそれらの第２のプライマー伸長産物、を含む。第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物は、重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーを有するマトリクス内に包埋または封入され得る。第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物の拡散は、抑制され得る。第１および第２のプライマー伸長産物は、予め設計された配列を有するアダプター配列を含み得る。アダプター配列は、第１または第２の核酸にハイブリダイズ可能または相補性でなくてもよい。アダプター配列は、鋳型−スイッチオリゴヌクレオチドの配列または逆相補配列であり得る。第１および第２のプライマー伸長産物は、逆転写（ＲＴ）産物であり得る。第１および第２のプライマー伸長産物は、第２の鎖合成（ＳＳＳ）産物であり得る。ＲＴ産物は、拡散抑制剤に連結され得る。ＳＳＳ産物は、拡散抑制剤に連結され得る。ＳＳＳ産物は、間接的に拡散抑制剤に連結され得る。例えば、ＳＳＳ産物はポリヌクレオチドにハイブリダイズし、それは次いで拡散抑制剤に連結され得る（例えば、図５Ａおよび図５Ｂならびに図１０Ａおよび図１０Ｂ）。
【０３６１】
[00408]第１および第２のプライマー伸長産物は、第１および第２の増幅産物であり得る。第１の増幅産物および／または第２の増幅産物は、拡散抑制剤に連結され得る。第１の増幅産物および／または第２の増幅産物は、捕捉剤を介して拡散抑制剤に連結され得る。捕捉剤は、第１の増幅産物および／または第２の増幅産物のアダプター配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み得る。拡散抑制剤は、ポリマーであり得る。ポリマーは線状ポリマーであり得る。ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、またはポリサッカライドであり得る。拡散抑制剤は、粒子であり得る。粒子がヒドロゲル粒子またはビーズのマトリクスから拡散できないように、粒子は、マトリクスの孔径より大きい直径を有し得る。拡散抑制剤は、マトリクス自体であり得る。例えば、ポリヌクレオチドはマトリクスに直接連結し、それによってポリヌクレオチドの拡散を抑制することができる。第１の核酸分子および第２の核酸分子は、細胞から放出され得る。細胞は、単一細胞であり得る。細胞は、リンパ球であり得る。細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ２８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、またはそれらの任意の組合せであり得る。Ｂ細胞は、形質芽細胞、形質細胞、リンパ形質細胞、メモリーＢ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ−１細胞、Ｂ−２細胞、または調節性Ｂ細胞であり得る。第１の免疫受容体ペプチド配列は、ＴＣＲアルファペプチド配列であってよく、第２の免疫受容体ペプチド配列は、ＴＣＲベータペプチド配列であってよい。
【０３６２】
[00409]第１の免疫受容体ペプチド鎖は、ＴＣＲガンマペプチド鎖であってよく、第２の免疫受容体ペプチド鎖は、ＴＣＲデルタペプチド鎖であってよい。第１の免疫受容体ペプチド鎖は、免疫グロブリン重ペプチド鎖であってよく、第２の免疫受容体ペプチド鎖は、免疫グロブリン軽ペプチド鎖であってよい。第１の免疫受容体ペプチド鎖および第２の免疫受容体ペプチド鎖は、二分免疫受容体の同種対であってよい。
【０３６３】
[00410]第１の増幅産物および第２の増幅産物は、連結して連続するポリヌクレオチドを形成することができる。第１の増幅産物および／または第２の増幅産物は、少なくとも約１００個、少なくとも約５００個、少なくとも約１０００個、少なくとも約１００００個、またはそれより多くの第１の核酸分子および／または第２の核酸分子のコピーを含み得る。第１および第２の核酸は、拡散を抑制され得る。例えば、第１または第２の核酸は、拡散抑制剤に直接的または間接的に連結され得る。第１の核酸分子および／または第２の核酸分子は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸であり得る。第１の核酸分子および／または第２の核酸分子は、一本鎖核酸または二本鎖核酸であり得る。第１の核酸分子は、第１の定常ドメインをさらにコードすることができ、および／または第２の核酸分子は、第２の定常ドメインをさらにコードすることができる。
【０３６４】
[00411]複数のヒドロゲル粒子またはビーズは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、もしくは少なくとも１０，０００，０００個のヒドロゲル粒子またはビーズを含み得る。複数のヒドロゲル粒子またはビーズは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個の二分免疫受容体の異なる同種対を含み得る。
【０３６５】
[00412]ヒドロゲル粒子またはビーズを作製するために使用するポリマーは、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、またはそれらの組合せであり得る。ポリサッカライドは、アガロース、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、キトサン、デキストラン、デンプン、またはアルギン酸であり得る。ヒドロゲル粒子またはビーズを作製するために使用するモノマーは、アクリルアミドまたはメタクリルアミドモノマーであり得る。重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーは、アガロースとポリアクリルアミドの混合物を含み得る。重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーは、架橋結合することができる。第１の可変ドメインおよび／または第２の可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはそれらの組合せをさらに含み得る。いくつかの場合では、各ヒドロゲル粒子またはビーズは、アガロースゲル粒子である。
【０３６６】
[00413]別の態様では、本明細書は、複数の少なくとも５個のヒドロゲル粒子を含む組成物であって、少なくとも５個のヒドロゲル粒子の各々が、（ａ）第１の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第１のポリヌクレオチド、および（ｂ）第２の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第２のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み、第１および第２の免疫受容体ペプチド鎖の各々が、ユニークな同種免疫受容体対鎖を含み、少なくとも５個のヒドロゲル粒子の個々のヒドロゲル粒子の第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが、（ｉ）単一細胞由来であり、また（ｉｉ）互いに連結し、ヒドロゲル粒子からの第１のポリヌクレオチドおよび第２のヌクレオチドの拡散が抑制される、組成物を提供する。第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドはＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、増幅産物であり得る。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、共有結合により連結され得る。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合により連結され得る。第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドは、拡散抑制剤に連結され得る。
【０３６７】
[00414]別の態様では、本明細書は、複数の少なくとも５個のヒドロゲル粒子を含む組成物であって、少なくとも５個のヒドロゲル粒子の各々が、（ａ）第１の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第１のＲＮＡおよび（ｂ）第２の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第２のＲＮＡを含み、第１および第２の免疫受容体ペプチド鎖の各々が、ユニークな同種免疫受容体対合鎖を含み、少なくとも５個のヒドロゲル粒子の個々のヒドロゲル粒子の第１のＲＮＡおよび第２のＲＮＡの各々が単一細胞由来であり、（１）各第１のＲＮＡが、第１のＲＮＡの逆相補配列を含む第１のｃＤＮＡにハイブリダイズし、また（２）各第２のＲＮＡが、第２のＲＮＡの逆相補配列を含む第２のｃＤＮＡにハイブリダイズし；ヒドロゲル粒子からの第１のｃＤＮＡおよび第２のｃＤＮＡの拡散が抑制される、組成物を提供する。第１のｃＤＮＡまたは第２のｃＤＮＡは、第１のＲＮＡまたは第２のＲＮＡにハイブリダイズできないまたは相補性ではない配列をさらに含み得る。第１のｃＤＮＡまたは第２のｃＤＮＡは、鋳型−スイッチオリゴヌクレオチドの逆相補配列をさらに含み得る。第１のｃＤＮＡまたは第２のｃＤＮＡは、拡散抑制剤に連結され得る。
【０３６８】
[00415]別の態様では、本明細書は、複数の少なくとも５個のヒドロゲル粒子を含む組成物であって、少なくとも５個のヒドロゲル粒子の各々が、（ａ）第１の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第１のポリヌクレオチドおよび（ｂ）第２の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第２のポリヌクレオチドを含み、第１および第２の免疫受容体ペプチド鎖の各々が、ユニークな同種免疫受容体対合鎖を含み、少なくとも５個のヒドロゲル粒子の個々のヒドロゲル粒子の第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの各々が単一細胞由来であり、（１）各第１のポリヌクレオチドが、第１のプライマーにハイブリダイズし、また（２）各第２のポリヌクレオチドが、第２のプライマーにハイブリダイズし；ヒドロゲル粒子からの第１のプライマーおよび第２のプライマーの拡散が抑制される、組成物を提供する。第１のプライマーまたは第２のプライマーは、逆転写プライマーであり得る。第１のプライマーまたは第２のプライマーは、増幅プライマーであり得る。第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドはＲＮＡであり得る。第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。第１のプライマーまたは第２のプライマーは、拡散抑制剤に連結され得る。
【０３６９】
[00416]別の態様では、本明細書は、複数の少なくとも５個のヒドロゲル粒子を含む組成物であって、少なくとも５個のヒドロゲル粒子の各々が、（ａ）第１の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第１のＤＮＡおよび（ｂ）第２の免疫受容体ペプチド鎖をコードする配列を含む第２のＤＮＡを含み、第１および第２の免疫受容体ペプチド鎖の各々が、ユニークな同種免疫受容体対合鎖を含み、少なくとも５個のヒドロゲル粒子の個々のヒドロゲル粒子の第１のＤＮＡおよび第２のＤＮＡの各々が単一細胞由来であり、（１）各第１のＤＮＡが、第１の免疫受容体鎖をコードする配列の逆相補配列を含む第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、また（２）各第２のＤＮＡが、第２の免疫受容体鎖をコードする配列の逆相補配列を含む第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし；ヒドロゲル粒子からの第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの拡散が抑制される、組成物を提供する。第１のＤＮＡまたは第２のＤＮＡは、ｃＤＮＡであり得る。第１のＤＮＡまたは第２のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであってよく、そのような場合、アダプター配列を有するプライマーを使用して第１のＤＮＡまたは第２のＤＮＡにハイブリダイズし、第１または第２のＤＮＡの伸長産物を生成することができる。第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドはＲＮＡであり得る。ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡであり得る。例えば、図４Ａまたは図５Ａは、ｍＲＮＡへのｃＤＮＡのハイブリダイズを示す。ヒドロゲル粒子からの第１のＤＮＡまたは第２のＤＮＡの拡散は抑制され得る。いくつかの場合では、第１のＤＮＡまたは第２のＤＮＡは、ｃＤＮＡであってよく、そのような場合、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドは、第２の鎖合成（ＳＳＳ）産物であってよい。第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドは、増幅産物であり得る。増幅産物は、第１または第２のＤＮＡにハイブリダイズしないまたは相補性ではないアダプター配列を含み得る。アダプター配列は、捕捉剤にさらにハイブリダイズすることができる。捕捉剤は、拡散抑制剤に連結され得る。
【０３７０】
[00417]拡散抑制剤は、ポリマーまたは粒子であり得る。第１および第２の免疫受容体ペプチド鎖は、ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータペプチド鎖、ＴＣＲガンマおよびＴＣＲデルタペプチド鎖、またはＢＣＲ重および軽ペプチド鎖であり得る。単一細胞は、免疫細胞であり得る。免疫細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞であり得る。
【０３７１】
[00418]別の態様では、本明細書は、複数の少なくとも１，０００個の区画を含む組成物であって、少なくとも１，０００個の区画の各区画が固体支持体を含み、固体支持体が：（ａ）第１の共通配列、第２の共通配列、および第１と第２の共通配列の間にＴＣＲアルファ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む第１のポリヌクレオチド、および（ｂ）第３の共通配列、第４の共通配列、および第３と第４の共通配列の間にＴＣＲベータ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む第２のポリヌクレオチドを含み、（ｉ）各区画のＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖が同種対であり、（ｉｉ）複数の区画の複数の第１の共通配列が、同じ配列を有し、第１のプライマーにハイブリダイズ可能または相補性であり、（ｉｉｉ）複数の区画の複数の第２の共通配列が、同じ配列を有し、第２のプライマーにハイブリダイズ可能または相補性であり、（ｉｖ）複数の区画の複数の第３の共通配列が、同じ配列を有し、第３のプライマーにハイブリダイズ可能または相補性であり、ならびに（ｖ）複数の区画の複数の第４の共通配列が、同じ配列を有し、第４のプライマーにハイブリダイズ可能または相補性である、組成物を提供する。各区画は、第１のプライマー、第２のプライマー、第３のプライマー、および第４のプライマーをさらに含み得る。第１のプライマーの濃度は、少なくとも１ｎＭであってよく、第２のプライマーの濃度は、少なくとも１ｎＭであってよく、第３のプライマーの濃度は、少なくとも１ｎＭであってよく、第４のプライマーの濃度は少なくとも１ｎＭであってよい。各プライマーの濃度は、少なくとも約０．５ｎＭ、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約１．５ｎＭ、少なくとも約２ｎＭ、少なくとも約２．５ｎＭ、少なくとも約３ｎＭ、少なくとも約３．５ｎＭ、または少なくとも約４ｎＭであってよい。第２の共通配列は、各区画の第４の共通配列またはそれらの逆相補配列にハイブリダイズ可能または相補性であり得る。
【０３７２】
[00419]別の態様では、本明細書は、複数の少なくとも１，０００個の区画を含む組成物であって、少なくとも１，０００個の区画の各区画は：（ａ）５'末端に第１の共通配列、３'末端に第２の共通配列、および第１の共通配列と第２の共通配列の間にＴＣＲアルファ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む、第１の完全または部分一本鎖ポリヌクレオチド、および（ｂ）５'末端に第３の共通配列、３'末端に第４の共通配列、および第３の共通配列と第４の共通配列の間にＴＣＲベータ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む、第２の完全または部分一本鎖ポリヌクレオチドを含み、（ｉ）ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖が同種対であり、（ｉｉ）第２の共通配列が第４の共通配列にハイブリダイズする、組成物を提供する。第１の共通配列、第２の共通配列、第３の共通配列、または第４の共通配列は、複数の少なくとも１，０００個の区画において同じであってもよい。各区画は、固体支持体をさらに含み得る。固体支持体は、ビーズまたはヒドロゲル粒子であり得る。
【０３７３】
方法
[00420]本開示は、本明細書に記載の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを作製または使用する方法を提供する。様々な方法および適用を提供する。
【０３７４】
[00421]一態様では、本明細書は、融合二分免疫受容体配列ライブラリーを調製するための方法であって、（ａ）複数の容器を生成するステップであって、各々が、（１）二分免疫受容体の第１のペプチド配列をコードする第１の核酸および二分免疫受容体の第２のペプチド配列をコードする第２の核酸を含む細胞と、（２）複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーとを含む、ステップと；（ｂ）複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを重合またはゲル化して複数の硬化粒子を形成するステップであって、複数の硬化粒子のそれぞれが重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーからなるマトリクスを有し、複数の硬化粒子のそれぞれが第１の核酸の第１のプライマー伸長産物および第２の核酸の第２のプライマー伸長産物を含むステップを含む、方法を提供する。いくつかの場合では、第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物は、マトリクス内に包埋または封入される。いくつかの場合では、第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物の拡散が抑制される。第１および第２のプライマー伸長産物は、逆転写（ＲＴ）産物、第２の鎖合成（ＳＳＳ）産物、または増幅産物であり得る。第１および／または第２のプライマー伸長産物は、アダプター配列を含み得る。アダプター配列は、第１または第２の核酸分子にハイブリダイズ可能または相補性でなくてもよい。第１および第２のプライマー伸長産物は、可変ドメインをコードし得る。可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３を含み得る。第１および／または第２のプライマー伸長産物は、定常ドメインをさらにコードし得る。
【０３７５】
[00422]各容器内の細胞は、溶解して、第１の核酸および第２の核酸を放出させることができる。第１の核酸および第２の核酸は、逆転写され得る。逆転写は、ＲＴプライマーを使用して実施され得る。ＲＴプライマーは、拡散抑制剤に連結することができ、拡散抑制剤は、マトリクス内のＲＴプライマーの拡散を抑制する。いくつかの場合では、鋳型−スイッチ反応またはＳＳＳ反応が実施される。第１の核酸または第２の核酸を、増幅して、第１および第２の増幅産物を生成することができる。いくつかの場合では、第１または第２の核酸の各々について、第１の増幅プライマーおよび第２の増幅プライマーを使用して増幅が実施される。第１の増幅プライマーは、拡散抑制剤に連結することができ、拡散抑制剤は、マトリクス内の第１の増幅プライマーの拡散を抑制する。
【０３７６】
[00423]いくつかの場合では、硬化粒子は洗浄され得る。硬化粒子を洗浄し、硬化粒子から試薬を拡散させることができる。試薬は、ＲＴプライマー、増幅プライマー、鋳型−スイッチプライマー、ＳＳＳプライマー、またはそれらの任意の組合せを含み得る。いくつかの場合では、硬化粒子を洗浄し、硬化粒子へと別の試薬を拡散させることができる。いくつかの場合では、方法は、硬化粒子を繰り返し洗浄するステップをさらに含み得る。硬化粒子は、洗浄ステップ後に油中で再乳化され得る。再乳化した硬化粒子は、再び、単一細胞反応として使用し、反応を実行することができる。特定の反応の間に、温度が上昇すると、硬化粒子は完全にまたは部分的に溶解し得る。
【０３７７】
[00424]第１および第２のプライマー伸長産物は、拡散抑制剤に連結され得る。拡散抑制剤は、ポリマーであり得る。拡散抑制剤として使用するポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、またはポリサッカライドであり得る。拡散抑制剤は、粒子であり得る。粒子は、マトリクスの孔径より大きい直径を有し得る。拡散抑制剤は、マトリクス自体であり得る。
【０３７８】
[00425]ポリヌクレオチドが制限され得るように、ポリヌクレオチドをマトリクスまたは拡散抑制剤に連結する様々な方法がある。例えば、第１および第２のプライマー伸長産物は、捕捉剤を介して拡散抑制剤に連結され得る。捕捉剤は、固定化部分を含み得る。固定化部分は、捕捉剤を拡散抑制剤に連結することができる。固定化部分は、反応基を含み得る。捕捉剤は、ターゲティング部分をさらに含み得る。ターゲティング部分は、捕捉オリゴヌクレオチドであり得る。第１の増幅プライマーは、捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含み得る。第１および第２の増幅産物は、捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それによって第１および第２の増幅産物を捕捉剤に連結し、それによって拡散抑制剤に連結する、オリゴヌクレオチド配列を含み得る。反応基は、スクシンイミジルエステル、アミド、アクリルアミド、アシルアジド、ハロゲン化アシル、アシルニトリル、アルデヒド、ケトン、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、無水物、ハロゲン化アリール、アジリジン、ボロン酸エステル、カルボジイミド、ジアゾアルカン、エポキシド、ハロアセトアミド、ハロ白金酸塩（ｈａｌｏｐｌａｔｉｎａｔｅ)、ハロトリアジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホロアミダイト、ハロゲン化シリル、スルホン酸エステル、ハロゲン化スルホニル、アミン、アニリン、チオール、アルコール、フェノール、ヒラジン（ｈｙｒａｚｉｎｅ）、ヒドロキシルアミン、カルボン酸、グリコール、または複素環であり得る。
【０３７９】
[00426]第１の増幅産物および第２の増幅産物は、さらに連結し、各容器または硬化粒子内で融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを形成し、それによって複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを有する融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを生成することができる。各融合ポリヌクレオチドは、ユニーク配列を有し得る。第１の増幅産物および第２の増幅産物は、ライゲーションまたはＰＣＲによって連結され得る。第１の増幅産物および第２の増幅産物は、ホスホジエステル結合によって連結され、連続したポリヌクレオチドを形成することができる。第１の増幅産物および第２の増幅産物は、インフレームで連結され得る。
【０３８０】
[00427]複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、複数の容器または硬化粒子から放出させることができる。複数の各融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、環状化させることができる。
【０３８１】
[00428]複数の各融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、ベクターに（例えば、融合線状ポリヌクレオチドをポリヌクレオチドベクター骨格へとライゲートすることによって）変換され得る。いくつかの場合では、ベクターはポリヌクレオチドではなく、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、非ポリヌクレオチドベクターによって宿主細胞へと送達され得る。
【０３８２】
[00429]ベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンであり得る。ベクターはウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルスまたはそれらの偽型に由来し得る。ベクターは非ウイルスベクターであり得る。非ウイルスベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属性ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞透過性ペプチド、またはリポスフィアであり得る。
【０３８３】
[00430]二分免疫受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）であり得る。ＴＣＲは、ＴＣＲアルファペプチド配列およびＴＣＲベータペプチド配列、またはＴＣＲガンマペプチド配列およびＴＣＲデルタペプチド配列を含み得る；ＢＣＲは、重ペプチド配列および軽ペプチド配列を含み得る。
【０３８４】
[00431]供給源細胞として使用される細胞は、免疫細胞であり得る。免疫細胞は、リンパ球であり得る。リンパ球は、Ｔ細胞またはＢ細胞であり得る。Ｔ細胞は、炎症性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはそれらの組合せであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。Ｂ細胞は、形質芽細胞、形質細胞、リンパ形質細胞、メモリーＢ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ−１細胞、Ｂ−２細胞、または調節性Ｂ細胞であり得る。免疫細胞は、腫瘍組織または血液試料から単離することができる。
【０３８５】
[00432]融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、宿主細胞に送達され得る。融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーは、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１，０００，０００個、または少なくとも１０，０００，０００個の異なる融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを含むことができ、各々異なる配列を有する。第１の核酸および第２の核酸によってコードされる第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は、二分免疫受容体の同種対であり得る。
【０３８６】
[00433]本明細書に記載の方法で使用する容器は、液滴であり得る。液滴は、油中水液滴であり得る。硬化粒子は、ポリマーおよび／またはモノマーを重合またはゲル化することによって液滴内で形成することができる。硬化粒子は、ヒドロゲル粒子であり得る。ヒドロゲル粒子を形成するために使用するポリマーは、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、またはそれらの組合せであり得る。ポリサッカライドは、アガロース、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、キトサン、デンプン、デキストラン、またはアルギン酸であり得る。ヒドロゲル粒子を形成するために使用するモノマーは、アクリルアミドまたはメタクリルアミドモノマーであり得る。重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーは、アガロースとポリアクリルアミドの混合物を含み得る。重合またはゲル化した複数のポリマーおよび／またはモノマーは、架橋結合され得る。いくつかの場合では、複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーは、開始剤（ｉｍｉｔａｔｏｒ）を使用することによって重合またはゲル化され得る。開始剤は、ＵＶ光または化学物質であり得る。いくつかの場合では、複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーは、容器の温度を低下させることによって重合またはゲル化され得る。例えば、アガロース粒子は、アガロースの温度を低下させることによって形成され得る。
【０３８７】
[00434]別の態様では、本明細書は、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを作製するために液体中で実施する方法を提供する。方法の例示的な手順は：（ａ）複数の容器（例えば、液滴）を生成するステップであって、各々が、単一細胞（例えば、免疫細胞）および複数の重合可能またはゲル化可能なポリマーおよび／またはモノマーを含む、ステップ；（ｂ）各容器容器で単一細胞を溶解し、第１の核酸および第２の核酸を有するその核酸を放出させるステップであって、第１の核酸および第２の核酸が免疫受容体の第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖をコードするステップ；（ｃ）第１の核酸および第２の核酸がＲＮＡである場合に、第１および第２の核酸を逆転写するステップ；（ｄ）第１および第２の核酸またはそれらの誘導体（例えば、ｃＤＮＡ）がヒドロゲル粒子内に封入されるように、ポリマーおよび／またはモノマーを重合またはゲル化するステップによりヒドロゲル粒子を生成するステップ；（ｅ）ヒドロゲル粒子を洗浄し、試薬交換を実施するステップ；（ｆ）ヒドロゲル粒子を再乳化するステップ；（ｇ）第１および第２の核酸またはそれらの誘導体を増幅し、第１および第２の核酸の増幅産物を生成するステップ；ならびに（ｈ）第１および第２の核酸の増幅産物を連結または融合し、複数の融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドを形成するステップを含み得る。いくつかの場合では、鋳型スイッチ反応は、逆転写の間に実施される。いくつかの他の場合では、第２の鎖合成反応は逆転写の後に実施される。いくつかの場合では、ヒドロゲル粒子を生成するステップは、第１および第２の核酸を増幅するステップの後に実施することができ、次いでヒドロゲル粒子を洗浄するステップは、第１および第２の核酸を増幅するために使用した内部プライマーを除去することができる。いくつかの他の場合では、ヒドロゲル粒子を生成するステップは、逆転写の後および増幅の前に実施されなくてもよい。
【０３８８】
[00435]一部の実施形態では、本明細書は、液体中で実施する方法であって、：（ａ）核酸分子にハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第１の伸長産物を形成するステップ；（ｂ）第１の伸長産物またはそれらの逆相補鎖を、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマーセットによって増幅し、それによって増幅産物を形成するステップ；（ｃ）液体中でポリマーマトリクスを生成し、ヒドロゲル粒子を形成し、それによって増幅産物の拡散を抑制するステップ；および（ｄ）ヒドロゲル粒子を洗浄し、それによってヒドロゲル粒子から第２のプライマーを枯渇させるステップを含む、方法を提供する。第１のプライマーまたは増幅産物は拡散抑制剤に連結され得る。方法は、さらなる核酸分子にハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長するステップをさらに含み得る。核酸分子およびさらなる核酸分子は、免疫受容体の同種対であり得る。
【０３８９】
[00436]一部の実施形態では、本明細書は、液体中で実施する方法であって、：（ａ）核酸分子にハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第１の伸長産物を形成するステップ；（ｂ）液体中でポリマーマトリクスを生成し、ヒドロゲル粒子を形成し、それによって第１の伸長産物またはそれらの逆相補鎖の拡散を抑制するステップ；（ｃ）ヒドロゲル粒子を洗浄するステップ；ならびに（ｄ）第１の伸長産物またはそれらの逆相補鎖を、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むプライマーセットによって増幅し、それによって増幅産物を形成するステップを含む、方法を提供する。第１のオリゴヌクレオチドまたは第１の伸長産物は拡散抑制剤に連結され得る。
【０３９０】
[00437]拡散抑制剤は、ポリマーまたは粒子であり得る。ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、またはポリサッカライドであり得る。粒子は、ポリマーマトリクスの孔径より大きい直径を有し得る。拡散抑制剤は、ポリマーマトリクスであり得る。核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。核酸分子は、ゲノムＤＮＡであり得る。核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡであり得る。第１のオリゴヌクレオチドは、逆転写（ＲＴ）プライマーであり得る。ＲＴプライマーは、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドによってさらに伸長され、それによって、鋳型スイッチオリゴヌクレオチドの逆相補配列を有する第１の伸長産物を生成することができる。いくつかの場合では、アダプター配列を有する第２の鎖合成（ＳＳＳ）プライマーを使用して、第１の伸長産物の逆相補鎖を合成することができる。アダプター配列は、核酸分子または第１の伸長産物にハイブリダイズ可能または相補性でなくてもよい。第１の伸長産物は、アダプター配列を含み得る。核酸分子は、免疫受容体のペプチド配列をコードすることができる。いくつかの場合では、方法は、ヒドロゲル粒子を洗浄するステップの後または間に、試薬がヒドロゲル粒子へと拡散するように、試薬をヒドロゲル粒子と接触させるステップをさらに含み得る。試薬は、オリゴヌクレオチドまたは酵素であり得る。酵素は、ポリメラーゼであり得る。ポリメラーゼは、プルーフリーディング活性を有し得る。ポリメラーゼの例は、ＤＮＡポリメラーゼ、熱安定性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変ポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｅａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｐｆｕ−ｔｕｒｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、およびバリアント、改変産物およびそれらの誘導体を含む。
【０３９１】
[00438]様々な実施形態では、ヒドロゲル粒子は、洗浄後、油中で再乳化され得る。
[00439]一部の実施形態では、本明細書は、液体中で実施する方法であって、：（ａ）複数の少なくとも２つの液滴が単一細胞を含む、複数の液滴を形成するステップ；（ｂ）単一細胞由来の第１の核酸分子にハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第１の伸長産物を形成するステップ；および単一細胞由来の第２の核酸分子にハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第２の伸長産物を形成するステップ；（ｃ）第１の伸長産物またはそれらの逆相補鎖を、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む第１のプライマーセットによって増幅し、それによって第１の増幅産物のセットを形成するステップ；ならびに第２の伸長産物またはそれらの逆相補鎖を、第３のプライマーおよび第４のプライマーを含む第２のプライマーセットによって増幅し、それによって第２の増幅産物のセットを形成するステップ；ならびに（ｄ）第１の増幅産物のセットの増幅産物を第２の増幅産物のセットの増幅産物に連結するステップであって、連結するステップが第２および第４のプライマーの不在下での液体中で連結するステップを含む、ステップ、を含む、方法を提供する。
【０３９２】
[00440]一部の実施形態では、本明細書は、液体中で実施する方法であって、：（ａ）複数の少なくとも２つの液滴が単一細胞を含む、複数の液滴を形成するステップ；（ｂ）単一細胞由来の第１の核酸分子にハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第１の伸長産物を形成するステップ；および単一細胞由来の第２の核酸分子にハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第２の伸長産物を形成するステップ；（ｃ）第１の伸長産物またはそれらの逆相補鎖を、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む第１のプライマーセットによって増幅し、それによって第１の増幅産物のセットを形成するステップ；ならびに第２の伸長産物またはそれらの逆相補鎖を、第３のプライマーおよび第４のプライマーを含む第２のプライマーセットによって増幅し、それによって第２の増幅産物のセットを形成するステップ；（ｄ）第２および第４のプライマーを除去するステップ；ならびに（ｅ）第１の増幅産物のセットの増幅産物を第２の増幅産物のセットの増幅産物に連結するステップ、を含む、方法を提供する。複数の各液滴は、複数の重合可能またはゲル化可能ポリマーおよび／またはモノマーを含み得る。液体中のポリマーマトリクスを生成し、ヒドロゲル粒子を形成し、それによって増幅産物の第１のセットおよび増幅産物の第２のセットの拡散を抑制することができる。ヒドロゲル粒子を緩衝液中で洗浄し、ヒドロゲル粒子から第２のプライマーおよび第４のプライマーを枯渇させることができる。
【０３９３】
[00441]様々な実施形態では、連結するステップは、第１および第２のセットの増幅産物に突出末端を生成するステップを含む。ＵＳＥＲ酵素を使用して、増幅産物に突出末端を生成することができる。いくつかの場合では、連結するステップは、第１および第２のセットの増幅産物をハイブリダイズするステップを含む。いくつかの場合では、連結するステップは、第１および第２のセットの増幅産物をライゲートするステップを含む。第１のプライマーおよび第３のプライマーは、同じプライマーであり得る（すなわち、同じ配列を有する）。第１のプライマー、第３のプライマー、増幅産物の第１のセット、または増幅産物の第２のセットは、拡散抑制剤に連結され得る。
【０３９４】
[00442]一部の実施形態では、本明細書は、液体中で実施する方法であって、：（ａ）複数の少なくとも２つの液滴が単一細胞を含む、複数の液滴を形成するステップ；（ｂ）単一細胞由来の第１の核酸分子にハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第１の伸長産物を形成するステップ；および単一細胞由来の第２の核酸分子にハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長し、それによって第２の伸長産物を形成するステップ；（ｃ）液体中のポリマーマトリクスを生成し、ヒドロゲル粒子を形成し、それによって第１の伸長産物および第２の伸長産物の拡散を抑制するステップ；（ｄ）第１の伸長産物またはそれらの逆相補鎖を、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む第１のプライマーセットによって増幅し、それによって第１の増幅産物のセットを形成するステップ；ならびに第２の伸長産物またはそれらの逆相補鎖を、第３のプライマーおよび第４のプライマーを含む第２のプライマーセットによって増幅し、それによって第２の増幅産物のセットを形成するステップ；ならびに（ｅ）第１の増幅産物のセットの増幅産物を第２の増幅産物のセットの増幅産物に連結するステップ、を含む、方法を提供する。方法は、（ｃ）の後に、ヒドロゲル粒子を洗浄するステップをさらに含み得る。方法は、試薬がヒドロゲル粒子に拡散するように、試薬をヒドロゲル粒子と接触させるステップをさらに含み得る。試薬は、酵素またはオリゴヌクレオチドを含み得る。試薬は、第１のプライマーセットおよび／または第２のプライマーセットであり得る。酵素は、ポリメラーゼ、リガーゼ、ＵＳＥＲ酵素、またはそれらの組合せであり得る。方法は、洗浄後に、油中でヒドロゲル粒子を乳化するステップをさらに含み得る。第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドは、拡散抑制剤に連結され得る。第１および第２の核酸分子がｍＲＮＡである場合に、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドは、ＲＴプライマーであり得る。ＲＴプライマーは、鋳型−スイッチオリゴヌクレオチドによってさらに伸長され得る。いくつかの場合では、第２の鎖合成（ＳＳＳ）プライマーを使用して、第１および／または第２の伸長産物の逆相補鎖を合成することができる。ＳＳＳプライマーは、アダプター配列を含み得る。アダプター配列は、第１および／または第２の伸長産物とハイブリダイズ可能または相補性でなくてもよい。ＳＳＳプライマーは、ＲＴプライマーと一緒に添加することができ、またはポリマーマトリクスに拡散することによって別々に添加することができる。単一細胞は免疫細胞であり得る。免疫細胞はＴ細胞またはＢ細胞であり得る。第１の核酸分子および第２の核酸分子はＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。
【０３９５】
[00443]様々な実施形態では、第１の核酸分子は、免疫受容体の第１のペプチド鎖をコードすることができ、第２の核酸分子は、免疫受容体の第２のペプチド配列をコードすることができる。第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は、免疫受容体の同種対である。第１のペプチド鎖または第２のペプチド鎖は、部分または全長可変ドメインを含み得る。可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはそれらの組合せを含み得る。第１のペプチド鎖または第２のペプチド鎖は、定常ドメインを含み得る。いくつかの場合では、第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖はＴＣＲ鎖であり、それらはヒンジ領域、膜貫通領域、および細胞質側末端をさらに含み得る。第１のペプチド鎖および第２のペプチド鎖は、機能性ＴＣＲを形成することができる。免疫受容体は、ＴＣＲまたはＢＣＲであり得る。
【０３９６】
[00444]別の態様では、本明細書は、本明細書に記載の、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチオド、免疫受容体発現ベクター、または宿主細胞（例えば、レシピエント細胞）を使用する方法を提供する。様々な適用を、本開示で提供する。例えば、方法は：（ａ）宿主細胞の集団、自然に対合したＴＣＲアルファおよびベータペプチド配列を有するＴＣＲまたは自然に対合したＢＣＲ重および軽ペプチド配列を有するＢＣＲを発現する集団の各宿主細胞を得るステップ；（ｂ）（ｉ）集団からの宿主細胞のサブ集団、または（ｉｉ）集団からの宿主細胞のサブ集団の発現されたＴＣＲまたはＢＣＲを濃縮するステップであって、宿主細胞のサブ集団または宿主細胞のサブ集団の発現されたＴＣＲまたはＢＣＲが標的抗原または標的ＭＨＣ抗原複合体に結合する、ステップ；ならびに（ｃ）宿主細胞のサブ集団またはステップ（ｂ）から濃縮されたサブ集団の発現されたＴＣＲまたはＢＣＲを、標的抗原または標的ＭＨＣ抗原複合体を発現する対象に投与するステップを含み得る。
【０３９７】
[00445]宿主細胞の集団は、本明細書に記載の方法を使用して得ることができる。Ｔ細胞のサブ集団は、宿主細胞の集団または発現されたＴＣＲまたはＢＣＲを、標的抗原または標的ＭＨＣ抗原複合体と接触させるステップによって濃縮することができる。ＭＨＣは、ＭＨＣ四量体であり得る。宿主細胞の濃縮したサブ集団または発現されたＴＣＲまたはＢＣＲは、注射によって対象に投与され得る。注射は、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内に注射するステップを含み得る。標的抗原は、ネオ抗原または腫瘍関連抗原である。対象は、がんまたは自己免疫疾患を有し得る。
【０３９８】
[00446]別の態様では、本明細書は：（１）ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖を含む複数の少なくとも１，０００個の細胞、少なくとも１，０００個の細胞の各細胞を提供するステップ；（２）固体支持体を含む複数の少なくとも１，０００個の区画、少なくとも１，０００個の区画の各区画を提供するステップであって、固体支持体が：（ａ）第１の共通配列、第２の共通配列、ならびに第１および第２の共通配列の間にＴＣＲアルファ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む、第１のポリヌクレオチド、（ｂ）第３の共通配列、第４の共通配列、ならびに第３および第４の共通配列の間にＴＣＲベータ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を含み、各区画のＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖が、複数の細胞の少なくとも１つに存在する同種対であり、それによって各々ＴＣＲアルファ鎖をコードする第１の複数のタンパク質コード配列および各々ＴＣＲベータ鎖をコードする第２の複数のタンパク質コード配列を提供するステップ；ならびに（３）各区画において第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを物理的に連結するステップを含む方法を提供する。第１の複数のタンパク質コード配列は、少なくとも１０個のＴＲＡＶサブグループを含んでよく、第２の複数のタンパク質コード配列は、少なくとも１０個のＴＲＢＶサブグループを含んでよい。少なくとも１，０００個の区画の各区画は、複数の少なくとも１，０００個の細胞からの細胞を含み得る。区画は、ウェル、マイクロウェル、または液滴であり得る。固体支持体は、ビーズ、ヒドロゲル粒子、またはウェルまたはマイクロウェルの表面であり得る。第１の共通配列、第２の共通配列、第３の共通配列、または第４の共通配列は、複数の少なくとも１，０００個の区画において同じ配列であり得る。
処置レジメン
[00447]処置レジメンで使用される細胞（例えば、免疫受容体プログラムレシピエント細胞）が本明細書に開示され得る。例えば、対象は、がんまたは疾患の処置のための処置レジメンの一部として細胞を受けることができる。処置レジメンは：いくつか挙げると、外科的処置、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、免疫刺激薬、抗真菌剤、抗ウイルス薬、抗生物質、または制吐薬を含み得る。いくつかの場合では、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法と共に（例えば、前、同時、または後に）、細胞組成物を対象に投与することができる。いくつかの場合では、増殖させた細胞を外科的処置の前または後に投与することができる。外科的処置は、いくつかの場合では、腫瘍切除であり得る。外科的処置を実施して、ＴＩＬまたはＴＩＴを単離することができる。
【０３９９】
[00448]治療有効量の細胞を、投与のために使用することができる。いくつかの場合では、約５×１０１０個の細胞が対象に投与される。いくつかの場合では、約５×１０１０個の細胞は、対象に投与される細胞の量の中央値を表す。一部の実施形態では、約５×１０１０個の細胞は、対象における治療応答をもたらすのに必要である。一部の実施形態では、少なくとも約１×１０６個の細胞、少なくとも約２×１０６個の細胞、少なくとも約３×１０６個の細胞、少なくとも約４×１０６個の細胞、少なくとも約５×１０６個の細胞、少なくとも約６×１０６個の細胞、少なくとも約６×１０６個の細胞、少なくとも約８×１０６個の細胞、少なくとも約９×１０６個の細胞、約１×１０７個の細胞、少なくとも約２×１０７個の細胞、少なくとも約３×１０７個の細胞、少なくとも約４×１０７個の細胞、少なくとも約５×１０７個の細胞、少なくとも約６×１０７個の細胞、少なくとも約６×１０７個の細胞、少なくとも約８×１０７個の細胞、少なくとも約９×１０７個の細胞、少なくとも約１×１０８個の細胞、少なくとも約２×１０８個の細胞、少なくとも約３×１０８個の細胞、少なくとも約４×１０８個の細胞、少なくとも約５×１０８個の細胞、少なくとも約６×１０８個の細胞、少なくとも約６×１０８個の細胞、少なくとも約８×１０８個の細胞、少なくとも約９×１０８個の細胞、少なくとも約１×１０９個の細胞、少なくとも約２×１０９個の細胞、少なくとも約３×１０９個の細胞、少なくとも約４×１０９個の細胞、少なくとも約５×１０９個の細胞、少なくとも約６×１０９個の細胞、少なくとも約６×１０９個の細胞、少なくとも約８×１０９個の細胞、少なくとも約９×１０９個の細胞、少なくとも約１×１０１０個の細胞、少なくとも約２×１０１０個の細胞、少なくとも約３×１０１０個の細胞、少なくとも約４×１０１０個の細胞、少なくとも約５×１０１０個の細胞、少なくとも約６×１０１０個の細胞、少なくとも約６×１０１０個の細胞、少なくとも約８×１０１０個の細胞、少なくとも約９×１０１０個の細胞、少なくとも約１×１０１１個の細胞、少なくとも約２×１０１１個の細胞、少なくとも約３×１０１１個の細胞、少なくとも約４×１０１１個の細胞、少なくとも約５×１０１１個の細胞、少なくとも約６×１０１１個の細胞、少なくとも約６×１０１１個の細胞、少なくとも約８×１０１１個の細胞、少なくとも約９×１０１１個の細胞、または少なくとも約１×１０１２個の細胞が対象に投与される。例えば、約５×１０１０個の細胞が対象に投与され得る。別の例では、３×１０６個の細胞で開始して、細胞は、約５×１０１０個の細胞に増殖させ、対象に投与することができる。いくつかの場合では、細胞は治療に十分な数に増殖させる。例えば、５×１０７個の細胞を急速に増殖させ、治療使用に十分な数を生成することができる。いくつかの場合では、治療使用に十分な数は、５×１０１０個であり得る。任意の数の細胞が、治療使用のために注入され得る。例えば、患者は、端点を含む、１×１０６個〜５×１０１２個の間の数の細胞を注入され得る。患者は、患者のために生成され得る限りの数の細胞を注入され得る。いくつかの場合では、患者に注入される細胞は、全てが操作細胞であるわけではな���。例えば、患者に注入される細胞のうちの少なくとも９０％が操作細胞であり得る。他の例では、患者に注入される細胞のうちの少なくとも４０％が操作細胞であり得る。患者において治療有効であるために必要な細胞の量は、細胞の生存率、および細胞が遺伝子改変される効率によって変わり得る。いくつかの場合では、遺伝子改変後の細胞の生存率の積（例えば、乗算）は、対象への投与に利用可能な細胞の治療用アリコットに相当し得る。いくつかの場合では、遺伝子改変後の細胞の生存率の増加は、患者において治療有効であるために投与に必要な細胞の量の減少に相当し得る。
【０４００】
[00449]いくつかの場合では、方法は、対象における治療応答をもたらすのに必要な量の操作細胞を計算および／または対象に投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、治療応答をもたらすのに必要な操作細胞の量を計算するステップは、操作細胞の生存率を決定するステップを含む。一部の実施形態では、対象における治療応答をもたらすために、対象に投与される細胞は生細胞である。一部の実施形態では、対象における治療応答をもたらすために、細胞のうちの、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％が生細胞である。一部の実施形態では、対象における治療応答をもたらすために、細胞のうちの、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％の細胞が、免疫受容体の同種対をコードするポリヌクレオチドを導入されている。
【０４０１】
[00450]いくつかの場合では、養子移植された細胞は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってモニターすることができる。養子移植された細胞のｑＰＣＲアッセイは、導入後に対象に存在する改変細胞のレベルを示すことができる。いくつかの場合では、養子移入された細胞を、フローサイトメトリーを使用してモニターすることができる。例えば、フローサイトメトリーアッセイは、４−１ＢＢ対ＴＣＲのレベルを決定することができる。いくつかの場合では、単一細胞ＴＣＲ  ＰＣＲを実施することができる。養子移入された細胞のレベルは、注入後４０日目に同定することができる。改変細胞など、養子移入された細胞のレベルは、注入後５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５日目、または最大２００日目に同定することができる。
【０４０２】
免疫刺激薬
[00451]いくつかの場合では、免疫刺激薬を、細胞または対象に導入することができる。免疫刺激薬は、特異的または非特異的であり得る。特異的免疫刺激薬は、ワクチンまたは抗原など、抗原特異性を提供することができる。非特異的免疫刺激薬は、免疫応答を増加させるまたは免疫応答を刺激することができる。非特異的免疫刺激薬は、アジュバントであり得る。免疫刺激薬は、ワクチン、コロニー刺激剤、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス、抗原、共刺激剤、免疫原性薬剤、免疫モジュレーター、または免疫療法剤であり得る。免疫刺激薬は、インターロイキンなどのサイトカインであり得る。１つまたは複数のサイトカインが、本開示の細胞と共に導入することができる。サイトカインは、細胞傷害性Ｔリンパ球（養子移入させる腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を含む）をブーストして、腫瘍微小環境内で増殖させるのに用いることができる。いくつかの場合では、ＩＬ−２を使用して、本明細書に記載の細胞の増殖を促進することができる。ＩＬ−１５などのサイトカインも用いることができる。例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはそれらの任意の組合せなど、免疫療法の分野において妥当である、他の関連サイトカインも利用することができる。いくつかの場合では、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を使用して、本開示の細胞を培養する。インターロイキンは、ＩＬ−２、またはアルデスロイキン（ａｌｄｅｓｋｅｕｋｉｎ）であり得る。アルデスロイキンは、低用量または高用量で投与され得る。高用量アルデスロイキンレジメンは、寛容性を示す限り、最大約１４回用量、約０．０３７ｍｇ／ｋｇ（６００，０００ＩＵ／ｋｇ）で、８時間ごとに静脈内にアルデスロイキンを投与するステップを含み得る。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、細胞投与後２４時間以内に投与され得る。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、細胞注入後、最大約４日間、約８時間ごとの約１５分間にわたる注入として投与され得る。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、約１００，０００ＩＵ／ｋｇ、約２００，０００ＩＵ／ｋｇ、約３００，０００ＩＵ／ｋｇ、約４００，０００ＩＵ／ｋｇ、約５００，０００ＩＵ／ｋｇ、約６００，０００ＩＵ／ｋｇ、約７００，０００ＩＵ／ｋｇ、約８００，０００ＩＵ／ｋｇ、約９００，０００ＩＵ／ｋｇ、または最大約１，０００，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与され得る。いくつかの場合では、アルデスロイキンは、約１００，０００ＩＵ／ｋｇ〜約３００，０００ＩＵ／ｋｇ、約３００，０００ＩＵ／ｋｇ〜約５００，０００ＩＵ／ｋｇ、約５００，０００ＩＵ／ｋｇ〜約７００，０００ＩＵ／ｋｇ、約７００，０００ＩＵ／ｋｇ〜約１，０００，０００ＩＵ／ｋｇの用量で投与され得る。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、１用量〜約１４用量で投与され得る。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、少なくとも約１用量、２回用量、３回用量、４回用量、５回用量、６回用量、７回用量、８回用量、９回用量、１０回用量、１１回用量、１２回用量、１３回用量、１４回用量、１５回用量、１６回用量、１７回用量、１８回用量、１９回用量、または最大約２０用量で投与��れ得る。いくつかの場合では、アルデスロイキンなどの免疫刺激薬は、約１用量〜３用量、３用量〜５用量、５用量〜８用量、８用量〜１０用量、１０用量〜１４用量、１４用量〜２０用量で投与され得る。いくつかの場合では、アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｋｅｕｋｉｎ）は、２０用量を超えて投与される。いくつかの場合では、アルデスロイキンなどの免疫刺激薬は、細胞投与と逐次的または同時に投与され得る。例えば、免疫刺激薬は、約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目、または最大約１４日目に投与され得る。いくつかの場合では、アルデスロイキンなどの免疫刺激薬は、細胞の集団の投与後０日目〜４日目に投与される。いくつかの場合では、免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、約１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間、２時間、または最大約３時間の期間にわたって投与される。いくつかの場合では、免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、操作細胞の投与の約２４時間前〜操作細胞の投与の約４日後に投与され得る。免疫刺激薬（例えば、アルデスロイキン）は、操作細胞の投与後−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９日目、または最大約２０日目に投与され得る。
【０４０３】
[00452]アルデスロイキンなどの免疫刺激薬は、およそ０．１７ｍｇの一塩基リン酸ナトリウムおよび０．８９ｍｇの二塩基リン酸ナトリウムによってｐＨ７．５（７．２〜７．８の範囲）に緩衝した、滅菌の、白色からオフホワイトの凍結乾燥したケーキとしての２２００万ＩＵ（−１．３ｍｇ）のＩＬ−２と、５０ｍｇのマンニトールおよび０．１８ｍｇのドデシル硫酸ナトリウムを含有する、単回使用バイアルとして提供され得る。バイアルは、１．２ｍＬの注射用滅菌水、ＵＳＰによって再構成することができ、生じる濃度は１８００万ＩＵ／ｍｌまたは１．１ｍｇ／ｍＬである。希釈剤は、バイアルの側面に沿って入れ、過剰な泡形成を避けるべきである。バイアルは保存剤を含有しないため、再構成された溶液は、２４時間で使用されるべきである。再構成されたアルデスロイキンは、５０ｍＬの５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でさらに希釈され得る。ＨＳＡは、ＲＩＬ−２の添加前に希釈剤に添加され得る。１０００倍の範囲を超える再構成された溶液の希釈（すなわち、１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｃｇ／ｍＬ）は、ガラスボトルまたはポリ塩化ビニルバッグのいずれかで許容され得る。アルデスロイキンは、冷蔵および室温、２℃〜３０℃で４８時間、化学的に安定であり得る。アルデスロイキンの投与は、総体重に基づいて計算することができる。アルデスロイキンの最終希釈物は、１５分間にわたって注入され得る。
【０４０４】
[00453]いくつかの場合では、免疫刺激薬は、コロニー刺激因子である。コロニー刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）であり得る。フィルグラスチムは、３００ｍｃｇ／ｍｌおよび４８０μｇ／１．６ｍｌバイアルで保存され得る。フィルグラスチムは、皮下注射として毎日投与され得る。フィルグラスチム投与は、約５ｍｃｇ／ｋｇ／日からであり得る。フィルグラスチム投与は、約１ｍｃｇ／ｋｇ／日からであってよく、フィルグラスチム投与は、約２ｍｃｇ／ｋｇ／日からであってよく、フィルグラスチム投与は、約３ｍｃｇ／ｋｇ／日からであってよく、フィルグラスチム投与は、約４ｍｃｇ／ｋｇ／日からであってよく、フィルグラスチム投与は、約５ｍｃｇ／ｋｇ／日からであってよく、フィルグラスチム投与は、約６ｍｃｇ／ｋｇ／日からであってよく、フィルグラスチム投与は、約７ｍｃｇ／ｋｇ／日からであってよく、フィルグラスチム投与は、約８ｍｃｇ／ｋｇ／日からであってよく、フィルグラスチム投与は、約９ｍｃｇ／ｋｇ／日からであってよく、フィルグラスチム投与は、約１０ｍｃｇ／ｋｇ／日からであってよい。いくつかの場合では、フィルグラスチムは、約０．５ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約１．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、約１．０ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約１．５ｍｃｇ／ｋｇ／日、約１．５ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約２．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、約２．０ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約３．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、約２．５ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約３．５ｍｃｇ／ｋｇ／日、約３．５ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約４．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、約４．０ｍｃｇ／ｋｇ／日〜約４．５ｍｃｇ／ｋｇ／日の範囲の用量で投与され得る。フィルグラスチム投与は、好中球数が少なくとも約１．０×１０９／Ｌ×３日または少なくとも約５．０×１０９／Ｌになるまで毎日続けることができる。フィルグラスチムなどの免疫刺激薬は、操作細胞の投与後−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９日目、または最大約２０日目に投与され得る。
【０４０５】
化学療法剤
[00454]化学療法剤または化合物は、がんの処置に有用な化学化合物であり得る。開示したＴ細胞と組み合わせて使用され得るがん化学療法剤は、限定はされないが、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）を含む。これらは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびＮａｖｅｌｂｉｎｅ（商標）（ビノレルビン、５’−ノルアンヒドロブラスチン）を含む。さらに他の場合では、がん化学療法剤は、カンプトテンシン化合物などのトポイソメラーゼＩ阻害剤を含む。本明細書で使用される場合、「カンプトテンシン化合物」は、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（商標）（イリノテカンＨＣＬ）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（商標）（トポテカンＨＣＬ）、ならびにカンプトテシンおよびその類似体に由来する他の化合物を含む。本明細書に開示の方法および組成物において使用され得るがん化学療法剤の別のカテゴリーは、エトポシド、テニポシドおよびミトポドジドなどのポドフィロトキシン誘導体である。本開示はさらに、アルキル化剤として公知の、他のがん化学療法剤であって、腫瘍細胞内の遺伝子素材をアルキル化するがん化学療法剤も包含する。これらは、限定ではなく、シスプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロランブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジンおよびダカルバジンを含む。本開示は、化学療法剤としての代謝拮抗剤を包含する。これらのタイプの薬剤の例は、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｍｅ)、およびプロカルバジンを含む。本明細書に開示の方法および組成物において使用され得るがん化学療法剤の追加のカテゴリーは、抗生物質を含む。例は、限定ではなく、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシン（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃおよびダウノマイシンを含む。これらの化合物のために、多数のリポソーム製剤が市販されている。本開示は、限定ではなく、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、イホスファミドおよびミトキサントロンを含む、他のがん化学療法剤をさらに包含する。
【０４０６】
[00455]本明細書に開示の免疫受容体プログラムレシピエント細胞は、細胞傷害剤／抗新生物剤および抗血管新生剤を含む、他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。細胞傷害剤／抗新生物剤は、がん細胞を攻撃および死滅させる薬剤として規定され得る。いくつかの細胞傷害剤／抗新生物剤は、腫瘍細胞における遺伝子素材をアルキル化するアルキル化剤、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、およびダカルバジンであり得る。他の細胞傷害剤／抗新生物剤は、腫瘍細胞のための代謝拮抗剤、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｍｅ)、およびプロカルバジンであり得る。他の細胞傷害剤／抗新生物剤は、抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシン（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ、およびダウノマイシンであり得る。これらの化合物のために、多数のリポソーム製剤が市販されている。さらに他の細胞傷害剤／抗新生物剤は、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）であってよい。これらは、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびエトポシドを含む。種々の細胞傷害剤／抗新生物剤は、タキソールおよびその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ−２６、イホスファミド、ミトキサントロン、ならびにビンデシンを含む。
【０４０７】
[00456]抗血管新生剤も使用することができる。本開示の方法および組成物において使用するための好適な抗血管新生剤は、ヒト化およびキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマー、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の血管新生阻害剤は、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（αおよびβを含む）、インターロイキン１２、レチノイン酸、ならびにメタロプロテナーゼ−１および−２組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１および−２）を含む。抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤である、ラゾキサンなどのトポイソメラーゼを含む低分子も使用することができる。
【０４０８】
[00457]本開示の操作細胞と組み合わせて使用され得る他の抗がん剤は、限定はされないが、以下を含む：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン（ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アバスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビセレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキルソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；プロピオン酸ドロモスタノロン；ズアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸エステルナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビンリン酸エステル；フルオロウラシル；フルロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）；インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレチオド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸エステル；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン��ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンレウロシン；ビノレルビン酒石酸塩；硫酸ビンロシジン；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩。他の抗がん剤としては、限定はされないが、以下を含む：２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗背側化形態形成タンパク質−１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；抗ネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポトーシス遺伝子調節物質；アポトーシス調節剤；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリアポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ−ポルフィリン；クラドリビン；クロミ���ェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペントアントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスフェート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；９−ジヒドロタキソール；ジオキサマイシン；ジフェニルスプロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドリン酸塩；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルニシン（ｆｌｕｏｒｏｄａｕｎｏｒｕｎｉｃｉｎ）塩酸塩；フォルフェニメックス；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン：ヨードドキソルビシン；４−イポメアノール；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン（ｌｙｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）；溶解ペプチド；メイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリクスメタロプロテアーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖���ＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多種腫瘍抑制剤１ベースの治療；マスタード系抗がん剤；ミカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調節物質；窒素酸化物抗酸化剤；ニトルリン；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導因子；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ポリ硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金複合体；白金化合物；
白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡ系免疫調節物質；タンパク質キナーゼＣ阻害剤；タンパク質キナーゼＣ阻害剤、微細藻類；プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビジノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣体；セムスチン；老化由来の阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達調節物質；単鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプテートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分割阻害剤；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンすず；チラパザミン；チタノセンビクロリド（ｔｉｔａｎｏｃｅｎｅ  ｂｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖器洞由来成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；赤血球遺伝子治療；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマー。前述の化学療法剤のいずれかが、臨床有効量で投与され得る。化学療法剤も、細胞の集団の投与後約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目、または最大約１４日目に投与され得る。いくつかの場合では、対象は、化学療法剤に���して不応性の難治性がんを有し得る。
【０４０９】
抗真菌剤
[00458]いくつかの場合では、抗真菌療法は、免疫受容体プログラムレシピエント細胞を受ける対象に投与される。抗真菌剤は、真菌を死滅または真菌の増殖を防止できる薬剤であり得る。抗真菌剤の標的は、ステロール生合成、ＤＮＡ生合成、およびβ−グルカン生合成を含み得る。抗真菌剤は、葉酸合成阻害剤または核酸架橋剤でもあり得る。葉酸合成阻害剤は、サルファに基づく薬剤であり得る。例えば、葉酸合成阻害剤は、真菌の葉酸合成を阻害する薬剤または競合阻害剤であり得る。サルファに基づく薬剤、または葉酸合成阻害剤は、メトトレキサートまたはスルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈａｘａｚｏｌｅ）であり得る。いくつかの場合では、抗真菌剤は、核酸架橋剤であり得る。架橋結合剤は、真菌においてＤＮＡまたはＲＮＡプロセスを阻害し得る。例えば、架橋剤は、シトシンのフッ化類似体であり得る、５−フルオロシトシンであってよい。５−フルオロシトシンは、５−フルオロウラシルへの細胞質内変換によりＤＮＡおよびＲＮＡ合成の両方を阻害し得る。他の抗真菌剤は、グリセオフルビンであり得る。グリセオフルビンは、ペニシリン・グリセオフルバム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍ）によって産生される抗真菌抗生物質である。グリセオフルビンは真菌の有糸分裂を阻害し、架橋剤と考えることができる。追加的な架橋剤は、アリルアミン（ナフチフィンおよびテルビナフィン）であってよく、スクアレンエポキシダーゼのレベルでエルゴステロールの合成を阻害し；１つのモルホリン（ｍｏｒｐｈｏｌｅｎｅ）誘導体（アモロルフィン）は、エルゴステロール経路のその後のステップを阻害する。
【０４１０】
[00459]いくつかの場合では、抗真菌剤は、ポリエン、アゾール、アリルアミン、またはエキノカンジンのクラスに由来し得る。一部の実施形態では、ポリエン抗真菌剤は、アンホテリシンＢ、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン、ニスタチン、またはリモシジンである。いくつかの場合では、抗真菌剤は、アゾールファミリーに由来し得る。アゾール抗真菌剤は、ラノステロール１４αデメチラーゼを阻害し得る。アゾール抗真菌剤は、イミダゾール、例えばビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール（ｓｕｌｃｏａｚｏｌｅ）、またはチオコナゾールであり得る。アゾール抗真菌剤は、トリアゾール、例えばアルバコナゾール、エフィコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブボナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、またはボリコナゾールであり得る。いくつかの場合では、アゾールは、チアゾール、例えばアバファンギンであり得る。抗真菌剤は、アリルアミン、例えばアモルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、またはテルビナフィンであり得る。抗真菌剤は、エキノカンジン、例えばアニデュラファンギン、カスポファンギン、またはミカファンギンでもあり得る。抗真菌剤であり得るさらなる薬剤は、オーロン、安息香酸、シクロピロクス、フルシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、トルナフテート、ウンデシレン酸、クリスタルバイオレット（ｃｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）、またはペルーバルサムであり得る。
【０４１１】
[00460]当業者は、個体に感染している真菌に基づいて、いずれの公知の抗真菌薬物療法を適用するか適切に決定することができる。いくつかの場合では、対象は、操作細胞と組み合わせてフルコナゾールを受けることができる。抗真菌薬療法は、予防的に投与することができる。
【０４１２】
[00461]フルコナゾールは、２００ｍｇ錠剤において利用することができる。いくつかの場合では、フルコナゾールは、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、または最大約４００ｍｇ錠剤として投与することができる。経口調製物に寛容を示すことができない対象におけるＩＶ投与のため、フルコナゾールは、２ＭＧ／ＭＬ注射用溶液に入れられる。これは、２００ｍｇ／時間の最大ＩＶ速度で投与されるべきである。いくつかの場合では、注入速度は、約５０ｍｇ／時間〜約５００ｍｇ／時間であり得る。注入速度はまた、約２０ｍｇ／時間〜約３０ｍｇ／時間、約３０ｍｇ／時間〜約４０ｍｇ／時間、約４０ｍｇ／時間〜約５０ｍｇ／時間、約５０ｍｇ／時間〜約６０ｍｇ／時間、約６０ｍｇ／時間〜約７０ｍｇ／時間、約７０ｍｇ／時間〜約８０ｍｇ／時間、約８０ｍｇ／時間〜約９０ｍｇ／時間、約９０ｍｇ／時間〜約１００ｍｇ／時間、約１００ｍｇ／時間〜約１２０ｍｇ／時間、約１２０ｍｇ／時間〜約１４０ｍｇ／時間、約１４０ｍｇ／時間〜約１６０ｍｇ／時間、約１６０ｍｇ／時間〜約１８０ｍｇ／時間、約１８０ｍｇ／時間〜約２００ｍｇ／時間、約１８０ｍｇ／時間〜約２２０ｍｇ／時間、約２２０ｍｇ／時間〜約２４０ｍｇ／時間、約２４０ｍｇ／時間〜約２７５ｍｇ／時間であり得る。
【０４１３】
[00462]抗真菌剤は、治療有効量で投与することができる。治療有効量は、真菌感染症を処置または防止するが、がんの処置に有効ではない用量である。例えば、フルコナゾールなどの抗真菌剤は、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇで投与することができる。フルコナゾールは、約１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、または最大約１０００ｍｇで投与することができる。フルコナゾールは、４００ｍｇで投与することができる。いくつかの場合では、抗真菌剤投与は、細胞療法の前、細胞療法の間、細胞療法が投与された後であり得る。例えば、フルコナゾール投与は、細胞療法の投与後約０日目（細胞療法が対象に導入される日）〜約４日目であり得る。抗真菌剤は、細胞療法投与までの約１４日間前から細胞療法が完了してから約１４日後に投与することができる。抗真菌剤は、約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目、または最大約１４日目に投与され得る。
【０４１４】
免疫抑制剤
[00463]いくつかの場合では、対象は、治療レジメンの一部として免疫抑制剤を受けることができる。免疫抑制剤は、放射線療法剤、生物剤、または化学薬剤を指し得る。いくつかの場合では、免疫抑制剤は、化学薬剤を含み得る。例えば、化学薬剤は、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア、白金、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、およびミスラマイシンからなる群由来の少なくとも１つのメンバーを含み得る。化学薬剤は、シクロホスファミドまたはフルダラビンであり得る。
【０４１５】
[00464]さらに、免疫抑制剤は、グルココルチコイド、細胞分裂阻害薬、抗体、抗イムノフィリンまたはそれらの任意の誘導体を含み得る。グルココルチコイドは、アレルギー応答、炎症、および自己免疫性状態を抑制することができる。グルココルチコイドは、プレドニゾン、デキサメタゾン、およびヒドロコルチゾンであり得る。免疫抑制療法は、免疫系を抑制する任意の処置を含み得る。免疫抑制療法は、レシピエントにおける移植片拒絶を軽減する、最小化する、または消失させる一助となり得る。例えば、免疫抑制療法は、免疫抑制剤を含み得る。移植前、移植中、および／または移植後に使用され得る免疫抑制剤は、限定はされないが、ＭＭＦ（ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４ＯＬ）、抗ＣＤ４０（２Ｃ１０、ＡＳＫＰ１２４０、ＣＣＦＺ５３３Ｘ２２０１）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）、抗ＩＬ−６Ｒ抗体（トシリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ）、抗ＩＬ−６抗体（サリルマブ、オロキズマブ）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ／Ｏｒｅｎｃｉａ）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ），シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）、エベロリムス、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）、ダクリズマブ（Ｚｅ−ｎａｐａｘ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、シクロスポリン、デオキシスパガリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒因子、コンプスタチン、抗Ｃ５抗体（エクリズマブ／Ｓｏｌｉｒｉｓ）、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、レフルノミド、抗ＩＬ−２Ｒ−Ａｂ、ラパマイシン、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗ＣＤ１２２抗体である。さらに、１つまたは１つを超える免疫抑制剤／薬物を、併せて、または逐次的に使用することができる。１つまたは１つを超える免疫抑制剤／薬物は、誘導療法のため、または維持療法のために使用することができる。同じまたは異なる薬物を、誘導期および維持期に使用することができる。いくつかの場合では、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）は、誘導療法のために使用することができ、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびシロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）は、維持療法のために使用することができる。ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）はまた、誘導療法のために使用することができ、低用量タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）および低用量シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）は、維持療法のために使用することができる。免疫抑制はまた、限定はされないが、全身放射線照射、胸腺放射線照射、ならびに全および／または部分脾臓摘出を含む非薬物レジメンを使用して達成することもできる。
【０４１６】
[00465]いくつかの場合では、細胞分裂阻害剤を免疫抑制のために投与することができる。細胞分裂阻害剤は、細胞分裂を阻害することができる。細胞分裂阻害剤は、プリン類似体であり得る。細胞分裂阻害剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、例えばメトトレキサート、アザチオプリン、またはメルカプトプリンであり得る。細胞分裂阻害剤は、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、チオデパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア、白金、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、およびミスラマイシンのうちの少なくとも１つであり得る。
【０４１７】
[00466]いくつかの場合では、フルダラビンなどの免疫抑制剤は、処置レジメンの一部として投与することができる。フルダラビンリン酸塩は、糖部分が、リボースまたはデオキシリボースの代わりにアラビノースであり得るという点において、生理的ヌクレオシドとは異なる合成プリンヌクレオシドであり得る。フルダラビンは、プリンアンタゴニスト代謝拮抗剤であり得る。フルダラビンは、５０ｍｇバイアル内に、白色の凍結乾燥した固体ケーキの形態のフルダラビンリン酸塩粉末として供給することができる。２５ｍｇ／ｍｌの濃度へと２ｍＬの注射用滅菌水により再構成した後に、溶液は、７．７のｐＨを有し得る。フルダラビン粉末は、２〜８℃で少なくとも１８か月間安定であり得る；再構成された場合、フルダラビンは、室温で少なくとも１６日間安定である。保存剤は存在しないため、再構成されたフルダラビンは、８時間以内に投与され得る。特異的適合性情報については専門的な参考文献を閲覧するべきである。フルダラビンは、血清中で脱リン酸化され、細胞内に輸送され、ヌクレオチドフルダラビン三リン酸に変換され得る；この２−フルオロ−ａｒａ−ＡＴＰ分子は、薬物の細胞傷害性効果に要求されると考えられる。フルダラビンは、ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドリダクターゼ、ＤＮＡプライマーゼを阻害し、鎖伸長、ならびにＲＮＡおよびタンパク質合成に干渉し得る。フルダラビンは、１５〜３０分間にわたる１００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰにおけるＩＶ注入として投与することができる。用量は、体表面積（ＢＳＡ）に基づき得る。患者が肥満である場合（ＢＭＩ＞３５）、薬物投与量は、実際の体重を使用して計算され得る。いくつかの場合では、フルダラビンなどの免疫抑制剤は、対象の体表面積の約２０ｍｇ／ｍ２〜約３０ｍｇ／ｍ２で投与することができる。いくつかの場合では、フルダラビンなどの免疫抑制剤は、対象の体表面積の約５ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２、対象の体表面積の約１０ｍｇ／ｍ２〜約１５ｍｇ／ｍ２、対象の体表面積の約１５ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２、対象の体表面積の約２０ｍｇ／ｍ２〜約２５ｍｇ／ｍ２、対象の体表面積の約２５ｍｇ／ｍ２〜約３０ｍｇ／ｍ２、対象の体表面積の約３０ｍｇ／ｍ２〜約４０ｍｇ／ｍ２で投与することができる。いくつかの場合では、フルダラビンなどの免疫抑制剤は、対象の体表面積の約１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、６ｍｇ／ｍ２、７ｍｇ／ｍ２、８ｍｇ／ｍ２、９ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１１ｍｇ／ｍ２、１２ｍｇ／ｍ２、１３ｍｇ／ｍ２、１４ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、１６ｍｇ／ｍ２、１７ｍｇ／ｍ２、１８ｍｇ／ｍ２、１９ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２１ｍｇ／ｍ２、２２ｍｇ／ｍ２、２３ｍｇ／ｍ２、２４ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、２６ｍｇ／ｍ２、２７ｍｇ／ｍ２、２８ｍｇ／ｍ２、２９ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３１ｍｇ／ｍ２、３２ｍｇ／ｍ２、３３ｍｇ／ｍ２、３４ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、３６ｍｇ／ｍ２、３７ｍｇ／ｍ２、３８ｍｇ／ｍ２、３９ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４１ｍｇ／ｍ２、４２ｍｇ／ｍ２、４３ｍｇ／ｍ２、４４ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、４６ｍｇ／ｍ２、��７ｍｇ／ｍ２、４８ｍｇ／ｍ２、４９ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５１ｍｇ／ｍ２、５２ｍｇ／ｍ２、５３ｍｇ／ｍ２、５４ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、５６ｍｇ／ｍ２、５７ｍｇ／ｍ２、５８ｍｇ／ｍ２、５９ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６１ｍｇ／ｍ２、６２ｍｇ／ｍ２、６３ｍｇ／ｍ２、６４ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、６６ｍｇ／ｍ２、６７ｍｇ／ｍ２、６８ｍｇ／ｍ２、６９ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７１ｍｇ／ｍ２、７２ｍｇ／ｍ２、７３ｍｇ／ｍ２、７４ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、７６ｍｇ／ｍ２、７７ｍｇ／ｍ２、７８ｍｇ／ｍ２、７９ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、８１ｍｇ／ｍ２、８２ｍｇ／ｍ２、８３ｍｇ／ｍ２、８４ｍｇ／ｍ２、８５ｍｇ／ｍ２、８６ｍｇ／ｍ２、８７ｍｇ／ｍ２、８８ｍｇ／ｍ２、８９ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、９１ｍｇ／ｍ２、９２ｍｇ／ｍ２、９３ｍｇ／ｍ２、９４ｍｇ／ｍ２、９５ｍｇ／ｍ２、９６ｍｇ／ｍ２、９７ｍｇ／ｍ２、９８ｍｇ／ｍ２、９９ｍｇ／ｍ２、最大約１００ｍｇ／ｍ２で投与することができる。いくつかの場合では、フルダラビンなどの免疫抑制剤は、１００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰにおける２５ｍｇ／ｍ２の用量であり、約１５〜約３０分間にわたって注入される。
【０４１８】
[00467]いくつかの場合では、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤は、処置レジメンの一部として投与することができる。シクロホスファミドは、窒素マスタード誘導体アルキル化剤であり得る。肝臓における活性代謝物への変換後に、シクロホスファミドは、アルキル化（ａｌｋｙａｔｉｎｇ）剤として機能する；この薬物も、強力な免疫抑制活性を保持する。ＩＶ投与後の血清半減期は、３〜１２時間の範囲である；薬物および／またはその代謝物は、投与後最大７２時間、血清中で検出することができる。指示通りの注射用滅菌水による再構成後に、シクロホスファミドは、室温で２４時間、または２〜８℃で維持された場合は６日間、安定であり得る。シクロホスファミドは、２５０ｍｌ  Ｄ５Ｗに希釈し、１時間にわたって注入することができる。用量は、対象の体重に基づき得る。対象が肥満である場合（ＢＭＩ＞３５）、薬物投与量は、記載通り、実際の体重を使用して計算され得る。いくつかの場合では、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。いくつかの場合では、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤は、対象の５０ｍｇ／ｋｇを超えて投与される。いくつかの場合では、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤は、対象の約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６１ｍｇ／ｋｇ、６２ｍｇ／ｋｇ、６３ｍｇ／ｋｇ、６４ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、６６ｍｇ／ｋｇ、６７ｍｇ／ｋｇ、６８ｍｇ／ｋｇ、６９ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７１ｍｇ／ｋｇ、７２ｍｇ／ｋｇ、７３ｍｇ／ｋｇ、７４ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、７６ｍｇ／ｋｇ、７７ｍｇ／ｋｇ、７８ｍｇ／ｋｇ、７９ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８１ｍｇ／ｋｇ、８２ｍｇ／ｋｇ、８３ｍｇ／ｋｇ、８４ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、８６ｍｇ／ｋｇ、８７ｍｇ／ｋｇ、８８ｍｇ／ｋｇ、８９ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９１ｍｇ／ｋｇ、９２ｍｇ／ｋｇ、９３ｍｇ／ｋｇ、９４ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、９６ｍｇ／ｋｇ、９７ｍｇ／ｋｇ、９８ｍｇ／ｋｇ、９９ｍｇ／ｋｇ、最大約１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。いくつかの場合では、シクロホスファミドなどの免疫抑制剤は、少なくとも約１日間〜約３日間、３日間〜５日間、５日間〜７日間、７日間〜約１０日間、１０日間〜１４日間、１４日間〜約２０日間にわたって投与することができる。いくつかの場合では、シクロホスファミドは、約６０ｍｇ／ｋｇの用量であってよく、２５０ｍｌの５％デキストロース水溶液に希釈され、１時間にわたって注入される。
【０４１９】
[00468]免疫抑制剤は、例えば、シクロホスファミドおよびフルダラビンのレジメンであり得る。例えば、シクロホスファミドフルダラビンレジメンは、操作細胞療法を受ける対象に投与することができる。シクロホスファミドフルダラビンレジメンは、６０ｍｇ／ｋｇ  ｑｄを２日間、および２５ｍｇ／ｃｍ２  ｑｄを５日間のレジメンで投与することができる。化学療法薬レジメン、例えば、シクロホスファミドフルダラビンは、本開示の操作細胞の投与に１時間〜１４日間先行して投与することができる。化学療法レジメンは、異なる用量で投与することができる。例えば、対象は、より高い初回用量に続いてより低い用量を受けることができる。対象は、より低い初回用量に続いてより高い用量を受けることができる。
【０４２０】
[00469]いくつかの場合では、免疫抑制剤は、抗体であり得る。抗体は、治療有効用量で投与することができる。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。投与され得るポリクローナル抗体は、抗リンパ球または抗胸腺細胞抗原であり得る。モノクローナル抗体は、抗ＩＬ−２受容体抗体、抗ＣＤ２５抗体、または抗ＣＤ３抗体であり得る。抗ＣＤ２０抗体を使用することもできる。ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去療法を免疫抑制剤として使用することもできる。
【０４２１】
[00470]免疫抑制剤は、抗イムノフィリンでもあり得る。抗イムノフィリンは、シクロスポリン、タクロリムス、エベロリムス、またはシロリムスであり得る。追加的な免疫抑制剤は、ＩＦＮ−ベータなどのインターフェロン、オピオイド（ｏｐｉｏｄ）、抗ＴＮＦ結合剤、ミコフェノール酸塩またはフィンゴリモドであり得る。
【０４２２】
[00471]免疫抑制剤は、放射線療法も指し得る。放射線療法は、放射線照射を含み得る。全身放射線照射は、１２Ｇｙで投与することができる。放射線量は、健康な組織を含む全身への１２Ｇｙの累積線量を含み得る。放射線量は、５Ｇｙ〜２０Ｇｙを含み得る。放射線量は、５Ｇｙ、６Ｇｙ、７Ｇｙ、８Ｇｙ、９Ｇｙ、１０Ｇｙ、１１Ｇｙ、１２Ｇｙ、１３Ｇｙ、１４Ｇｙ、１５Ｇｙ、１６Ｇｙ、１７Ｇｙ、１８Ｇｙ、１９Ｇｙ、または最大２０Ｇｙであり得る。放射線照射は、全身放射線照射または部分放射線照射であり得る。放射線照射が全身放射線照射である場合、照射は均一であっても均一でなくてもよい。例えば、放射線照射が均一ではなくてよい場合、頸部などの身体のより狭い領域は、臀部などのより広い領域よりも高い線量を受けることができる。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法による標準的な処置に続き、末梢血幹細胞移植を受ける場合がある。ある特定の実施形態では、移植後、対象は、本開示の増殖された細胞（例えば、免疫受容体プログラムレシピエント細胞）の注入を受ける。患者に投与される上述の処置の投与量は、処置されている状態および処置のレシピエントの正確な性質により変わり得る。ヒト投与のための投与量の縮尺調整は、当技術分野で任用されている実務に従って実施することができる。ＣＡＭＰＡＴＨの用量は、例えば、成人患者では、１〜３０日間の期間、通常毎日投与される、１〜約１００ｍｇの範囲内であり得る。１日用量は、１日当たり１〜１０ｍｇであり得るが、一部の場合では、より大容量の１日当たり最大４０ｍｇを使用することができる（米国特許第６，１２０，７６６号に記載）。
【０４２３】
抗生物質
[00472]抗生物質は、治療レジメンの一部として対象に投与することができる。抗生物質は、治療有効用量で投与することができる。抗生物質は、細菌を死滅させるまたは細菌の増殖を阻害することができる。抗生物質は、広範囲の細菌を標的化することができる広域性抗生物質であり得る。広域性抗生物質は、第３または第４世代のいずれかであり、セファロスポリンまたはキノロンであり得る。
【０４２４】
[00473]抗生物質は、特異的なタイプの細菌を標的化することができる狭域性抗生物質でもあり得る。抗生物質は、ペニシリンおよびセファロスポリンなどの細菌細胞壁を標的化することができる。抗生物質は、ポリミキシンなどの細胞膜を標的化することができる。抗生物質は、抗生物質：リファマイシン、リピアルマイシン、キノロンおよびスルホンアミドなどの必須細菌酵素に干渉し得る。抗生物質は、マクロライド、リンコサミド、およびテトラサイクリンなどのタンパク質合成阻害剤でもあり得る。抗生物質は、ダプトマイシンなどの環状リポペプチド、チゲサイクリンなどのグリシルサイクリン、リネゾリドなどのオキサゾリジノン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｏｎｅ）、およびフィダキソマイシンなどのリピアルマイシンでもあり得る。
【０４２５】
[00474]いくつかの場合では、抗生物質は、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代、または第５世代であり得る。第１世代抗生物質は、狭域性を有し得る。第１世代抗生物質の例は、ペニシリン（ペニシリンＧまたはペニシリンＶ）、セファロスポリン（セファゾリン、セファロチン、セファピリン、セファレチン、セフラジン、またはセファドロキシン）であり得る。いくつかの場合では、抗生物質は、第２世代であり得る。第２世代抗生物質は、ペニシリン（アモキシリンまたはアンピシリン）、セファロスポリン（セフロキシム、セファマンドール、セフォキシチン、セファクロル、セフロジル、ロラカルベフ）であり得る。いくつかの場合では、抗生物質は、第３世代であり得る。第３世代抗生物質は、ペニシリン（カルベニシリンおよびチカルシリン）またはセファロスポリン（セフィキシム、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフチゾキシム、およびセフタジジム）であり得る。抗生物質は、第４世代抗生物質でもあり得る。第４世代抗生物質は、セフィピムであり得る。抗生物質は、第５世代でもあり得る。第５世代抗生物質は、セフタロリンまたはセフトビプロールであり得る。
【０４２６】
[00475]いくつかの場合では、抗生物質は、細菌壁標的剤、細胞膜標的剤、細菌酵素干渉剤、殺菌剤、タンパク質合成阻害剤または静菌剤であり得る。細菌壁標的剤は、ペニシリン誘導体（ペナム系）、セファロスポリン（セフェム系）、モノバクタム、およびカルバペネムであり得る。β−ラクタム抗生物質は、殺菌性または静菌性であり、細菌細胞壁のペプチドグリカン層の合成を阻害することにより作用する。いくつかの場合では、抗生物質は、タンパク質合成阻害剤であり得る。タンパク質合成阻害剤は、細菌が細胞壁を作製するのに必要とされる酵素トランスペプチダーゼの不可逆的阻害剤として作用するアンピシリンであり得る。これは、二分裂における細菌細胞壁合成の第３および最終ステージを阻害し、最終的に細胞溶解がもたらされる；したがって、アンピシリンは通常、溶菌性である。いくつかの場合では、殺菌剤は、セファロスポリンまたはキノロンであり得る。他の場合では、静菌剤は、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、またはペンタミジンである。
【０４２７】
[00476]いくつかの場合では、ＰＣＰ肺炎の防止のための薬剤を投与することができる。例えば、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールを投与して、肺炎を防止することができる。トリメトプリムおよびスルファメトキサゾール（ＴＭＰ／ＳＭＸ；例示的なサルファ薬物）の用量は、第１の用量の化学療法の際にまたはその後に、非連続日で１日１錠ＰＯ、１週間に３回であってよく、少なくとも約６か月間、少なくとも２回の連続した実験室研究においてＣＤ４計数が２００を超えるまで続ける。いくつかの場合では、トリメトプリムは、１６０ｍｇで投与することができる。トリメトプリムは、約１００〜約３００ｍｇで投与することができる。トリメトプリムは、約１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、または最大約３００ｍｇで投与することができる。いくつかの場合では、スルファメトキサゾールは、８００ｍｇで投与される。スルファメトキサゾールは、約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇで投与することができる。スルファメトキサゾールは、約５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、または最大約１０００ｍｇで投与することができる。いくつかの場合では、ＴＭＰ／ＳＭＸレジメンは、治療有効量で投与することができる。ＴＭＰ／ＳＭＸは、１日に約１回〜約１０回投与することができる。ＴＭＰ／ＳＭＸは、１日に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、または最大約２０回投与することができる。いくつかの場合では、ＴＭＰ／ＳＭＸは、週ごとで投与することができる。例えば、ＴＭＰ／ＳＭＸは、１週間に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または最大約７回投与することができる。ＴＭＰ／ＳＭＸレジメンは、本明細書に記載のレシピエント細胞などの細胞療法の投与後約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目、または最大約１４日目に投与することができる。
【０４２８】
[00477]いくつかの場合では、サルファアレルギーを有する対象は、ペンタミジンを受けることができる。ペンタミジンは、エアロゾルによって投与することができる。入院前の１週間以内のネブライザー当たりペンタミジン３００ｍｇ、これを２回の連続した追跡実験室研究においてＣＤ４計数が２００を上回るまで、および化学療法後少なくとも６か月間、毎月続けた。ペンタミジンを使用して、ＰＣＰ感染症の出現を防止することができる。これは、凍結乾燥粉末の３００ｍｇバイアル内に供給することができ、ネブライザーにより投与され得る。ペンタミジンは、約３００ｍｇ〜約５００ｍｇで投与することができる。いくつかの場合では、ペンタミジン（ｐｅｔａｍｉｄｉｎｅ）は、約１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇまたは最大約８００ｍｇで投与することができる。
【０４２９】
[00478]いくつかの場合では、抗生物質などの静菌剤は、免疫受容体プログラムレシピエント細胞の投与の前に、これらの細胞と同時に、またはこれらの細胞の後に投与することができる。いくつかの場合では、静菌剤は、免疫受容体プログラムレシピエント細胞の投与の約１４日前〜これらの細胞の投与の約６か月後に投与することができる。
【０４３０】
抗ウイルス剤
[00479]いくつかの場合では、抗ウイルス剤は、処置レジメンの一部として投与することができる。いくつかの場合では、ヘルペスウイルス予防法は、処置レジメンの一部として対象に投与することができる。ヘルペスウイルス予防法は、バラシクロビル（バルトレックス）であり得る。バルトレックスを経口使用して、陽性ＨＳＶ血清学を有する対象におけるヘルペスウイルス感染症の出現を防止することができる。これは、５００ｍｇ錠剤中に供給することができる。バラシクロビルは、治療有効量で投与することができる。例えば、バラシクロビルは、約５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、または最大約７００ｍｇ錠剤で投与することができる。対象が、経口摂取に寛容を示すことができる場合、バラシクロビルは、毎日経口５００ｍｇの用量で、フルダラビンの最後の用量の翌日に開始することができる。抗ウイルス療法は、細胞療法の投与後約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目、または最大約１４日目に投与され得る。
【０４３１】
[00480]いくつかの場合では、対象は、ヘルペスの予防法のための経口薬物療法を服用できない場合がある。そのような場合、アシクロビルを投与することができる。アシクロビルは、５００ｍｇ／バイアルの注射用粉末として供給することができる。いくつかの場合では、アシクロビルは、治療有効量で投与することができる。アシクロビルは、約５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、または最大約７００ｍｇで経口投与することができる。アシクロビルは、１日当たり１回、２回、３回、４回、５回、６回、または最大約７回投与することができる。アシクロビルは、細胞療法の投与後約−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日目、または最大約１４日目に投与され得る。いくつかの場合では、アシクロビルは静脈内投与することができる。例えば、アシクロビルは、１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。いくつかの場合では、アシクロビルは、５０ｍｇ／ｋｇを超えて投与される。アシクロビルは、５０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように１０ｍＬの注射用滅菌水で再構成することができる。再構成した溶液は、１２時間以内に使用するべきである。ＩＶ溶液は、７ｍｇ／ｍＬまたはそれ以下の濃度に希釈し、１時間にわたって注入して、腎損傷を回避することができる。
【０４３２】
投与
[00481]本明細書では、がんなどの状態を有する対象に治療レジメンを投与するための方法が提供され得る。いくつかの例では、細胞組成物（例えば、免疫受容体プログラムレシピエント細胞を含む）は、単位剤形で提供することができる。細胞組成物は、溶液に再懸濁し、注入として投与することができる。本明細書では、免疫刺激薬、免疫抑制剤、抗生物質、抗真菌剤、制吐剤、化学療法剤、放射線療法およびそれらの任意の組合せを含む処置レジメンも提供され得る。上述のいずれかを含む処置レジメンを凍結乾燥し、水溶液（例えば、生理食塩水溶液）中で再構成することができる。いくつかのの例では、処置（例えば、細胞処置）は、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、経皮的投与、静脈内（「ｉ．ｖ．」）投与、鼻腔内投与、リンパ内注射、および経口投与から選択される経路によって投与される。いくつかの例では、対象は、リンパ内のマイクロカテーテルによって免疫受容体プログラムレシピエント細胞を含む細胞組成物を注入される。
【０４３３】
[00482]多くの薬物は、液体、カプセル、錠剤または咀嚼錠として経口投与することができる。経口経路は、最も簡便であり、通常最も安全で最も安価であり得るため、最も高頻度で使用される経路であり得る。しかしながら、薬物が典型的に消化管を通って移動する道のりのため、経口経路には限界があり得る。経口投与される薬物のため、吸収は、口および胃の中で始めることができる。しかしながら、ほとんどの薬物は、小腸から吸収され得る。薬物は、血流を経てその標的部位に輸送される前に、腸管壁を通過し、肝臓に移行する。腸管壁および肝臓は、多くの薬物を化学的に変更（代謝）し、血流に達する薬物の量を低下させる。したがって、これらの薬物は、静脈内注射される場合、同じ効果を生じるように、より少ない用量で与えることができる。
【０４３４】
[00483]皮下経路のため、皮膚直下の脂肪性組織中に針が挿入され得る。薬物は、注射された後に、次いで小血管（毛細血管）内に移動し、血流によって運び出される。あるいは、薬物は、リンパ管を通って血流に達することができる。より大きい体積の薬物製品が必要とされる場合、筋肉内経路が使用され得る。筋肉は、皮膚および脂肪性組織の下に位置するため、より長い針が使用され得る。薬物は通常、上腕、大腿または臀部の筋肉内に注射される。静脈内経路のため、針が静脈内に直接的に挿入され得る。薬物を含有する溶液は、単一用量でまたは持続注入によって与えることができる。注入のため、溶液は、重力によって（折り畳み式のプラスチック袋から）移動され得る、またはより一般的には、通常、前腕における静脈内に挿入された管（カテーテル）へと細い軟性チューブを通って注入ポンプによって移動され得る。いくつかの場合では、細胞または治療レジメンは、注入として投与される。注入は、ある期間にわたって行われ得る。例えば、注入は、約５分間〜約５時間の期間にわたる細胞または治療レジメンの投与であり得る。注入は、約５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間または最大約５時間の期間にわたって行われ得る。
【０４３５】
[00484]一部の実施形態では、静脈内投与は、早く、十分に制御された様式で体全体に正確な用量を送達するのに使用される。これは、皮下または筋肉内注射によって与えた場合に疼痛および組織損傷を引き起こすであろう刺激性溶液にも使用することができる。特に、そのヒトが肥満の場合、静脈への針またはカテーテルの挿入が困難になり得るため、静脈内注射は、皮下または筋肉内注射よりも投与が困難になり得る。静脈内に与えた場合、薬物は、血流へと直ちに送達され、他の任意の経路によって与えた場合よりも早く効果を生じる傾向がある。結果的に、医療施術者は、静脈内注射を受ける人を、薬物が働いているまたは望まれない副作用を引き起こしている徴候について密接にモニターすることができる。また、この経路によって与えられた薬物の効果は、より短い時間持続する傾向がある。したがって、いくつかの薬物は、持続注入によって与えて、その効果を一定に維持することができる。くも膜下腔内経路のため、下部脊椎における２つの椎骨の間、および脊髄周りの間隙中に針が挿入され得る。次に、薬物は、脊柱管中に注射され得る。少量の局所麻酔薬が、注射部位を麻痺させるために使用され得る。薬物が、例えば、それらの構造の感染症を処置するために、脳、脊髄、またはこれらを覆う組織の層（髄膜）における急速または局所効果の産生に必要とされる場合、この経路が使用され得る。
【０４３６】
[00485]口を通る吸入によって投与される薬物は、薬物が、気道（気管）を通過して、肺に入ることができるように、経鼻経路によって投与されるものよりも小さい液滴へと微粒化することができる。薬物がどの程度深く肺内に進むかは、液滴のサイズに依存し得る。小さい液滴はより深く進むことができ、これより吸収される薬物の量を増大することができる。肺の内側で、薬物は、血流中に吸収され得る。
【０４３７】
[00486]いくつかの場合では、対象の体重に従って処置レジメンを投薬することができる。肥満（ＢＭＩ＞３５）と決定された対象において、実際の体重が用いられることを必要とする場合がある。ＢＭＩは、次式によって計算される：ＢＭＩ＝体重（ｋｇ）／［身長（ｍ）］２。
【０４３８】
[00487]理想体重は、男性については５０ｋｇ＋２．３×（６０インチを超えるインチ数）として、または女性については４５．５ｋｇ＋２．３×（６０インチを超えるインチ数）として計算することができる。その理想体重の２０％を超える対象に対して、調整された体重を計算することができる。調整された体重は、理想体重＋（０．４×（実際の体重−理想体重））の和であり得る。いくつかの場合では、体表面積を用いて、投与量を計算することができる。体表面積（ＢＳＡ）は、次式によって計算することができる：ＢＳＡ（ｍ２）＝√身長（ｃｍ）×体重（ｋｇ）／３６００。
【０４３９】
[00488]いくつかの場合では、細胞療法を含む医薬組成物は、単独で、または薬学的に許容される担体または賦形剤と併せて、任意の経路により投与することができ、このような投与は単回投与および複数回投与の両方で実行することができる。より詳細には、医薬組成物は、錠剤、カプセル、薬用ドロップ、トローチ、ハンドキャンディー（ｈａｎｄ  ｃａｎｄｉｅｓ）、粉剤、スプレー、水性懸濁液、注射用溶液、エリキシル剤、シロップなどの形態の多様な薬学的に許容される不活性の担体と組み合わせることができる。このような担体は、固体の希釈剤または充填剤、滅菌水性媒体、および多様な非毒性有機溶媒などを含む。さらに、このような経口医薬製剤は、このような目的で一般に利用されるタイプの多様な薬剤により、適切に甘味および／または芳香を添加することができる。
【０４４０】
[00489]いくつかの場合では、治療レジメンは、担体または賦形剤と共に投与することができる。担体および賦形剤の例は、デキストロース、塩化ナトリウム、スクロース、ラクトース、セルロース、キシリトール、ソルビトール、マリトール、ゼラチン、ＰＥＧ、ＰＶＰ、およびそれらの任意の組合せを含み得る。いくつかの場合では、デキストロースまたは塩化ナトリウムなどの賦形剤は、約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、または最大約１５％のパーセントであり得る。いくつかの場合では、対象において疾患を処置する方法は、操作細胞（例えば、免疫受容体プログラムレシピエント細胞）を含む１つまたは複数の細胞（臓器および／または組織を含む）を対象に移植するステップを含み得る。細胞内ゲノム移植によって調製された細胞を使用して、がんを処置することができる。
【実施例】
【０４４１】
実施例１：液滴ベースの単一細胞反応器を使用する、テイル−テイル方向の対合ＴＣＲクローニング
[00490]ステップ１：オリゴヌクレオチド負荷、熱可逆性ヒドロゲルの調製
[00491]オリゴヌクレオチド負荷、熱可逆性ヒドロゲルは、超低温ゲル化温度（ＵＬＧＴ）アガロース（熱可逆性ヒドロゲルとして寄与する）およびオリゴヌクレオチドとの共有結合により改変された線状ポリアクリルアミドポリマーによって作製することができる。ＵＬＧＴアガロースは、ＩＸ−Ａ型であってよく、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手することができる（カタログ＃Ａ２５７６）。
【０４４２】
[00492]オリゴヌクレオチド改変線状ポリアクリルアミドは、オリゴヌクレオチドとアクリルアミドモノマーの共重合によって作製することができる。特に、ＰＢＳ緩衝液中に、約４％アクリルアミド、１００μＭ  Ａｃｒｙｄｉｔｅ−ｄＴ３０、１００μＭ  Ａｃｒｙｄｉｔｅ−Ｔ１ｄを含有する溶液を調製し、適切な量の過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）およびＴＥＭＥＤを溶液に添加し、溶液を室温で約６時間インキュベートし、その間にアクリルアミド、Ａｃｒｙｄｉｔｅ−ｄＴ３０、Ａｃｒｙｄｉｔｅ−Ｔ１ｄ（Ｔ１ｄの配列は５’−ＣＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＡ−３’であり得る）が、高分子量線状ポリマーへと共重合される。
【０４４３】
[00493]この溶液を、ＰＢＳに対して透析し、長鎖線状ポリアクリルアミドに組み込まれないアクリルアミドモノマー、短鎖ポリアクリルアミド、およびオリゴヌクレオチドなどの廃棄物を除去する。この透析は、ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ、それらの反応／分解産物も除去する。次いで、２％溶解ＵＬＧＴアガロースおよびオリゴヌクレオチド改変線状ポリアクリルアミドを含有する溶液を１：１比で混合することによって作製し、オリゴヌクレオチド負荷１％ＵＬＧＴアガロースを得ることができる。
【０４４４】
[00494]この例では、ｄＴ３０は、図４Ａおよび図５Ａに示す、拡散抑制ＴＣＲアルファ定常ドメイン（ＴＲＡＣ）ＲＴプライマーおよび拡散抑制ＴＣＲベータ定常ドメイン（ＴＲＢＣ）ＲＴプライマーとして寄与する。あるいは、遺伝子特異的プライマーターゲティングＴＲＡＣおよびＴＲＢＣは、ＲＴプライマーとして使用することができる。ＴＲＡＣターゲティング遺伝子特異的プライマー配列の例は、５’−ｔｔｇａｇａａｔｃａ  ａａａｔｃｇｇｔｇａ  ａｔａ−３’である。ＴＲＢＣターゲティング遺伝子特異的プライマー配列の例は、５’−ｔｇｔｇｃａｃｃｔｃ  ｃｔｔｃｃｃ−３’である。
【０４４５】
[00495]この例では、Ｔ１ｄは、ＡＲＳを持つ分子（例えば、プライマーおよびＰＣＲ産物）が拡散抑制されるように、図４Ａおよび図５Ｂに示す親和性保持配列（ＡＲＳ）とハイブリダイズすることができる親和性捕捉オリゴ（ＡＣＯ）として寄与する。１％  ＵＬＧＴアガロースゲル中のｄＴ３０およびＴ１ｄの最終濃度が１００ｎＭ〜５００ｎＭの範囲であるように、重合条件を最適化することができる。
【０４４６】
[00496]ステップ２：ヒドロゲル液滴へのＴ細胞のカプセル化
[00497]約１０，０００個のＴ細胞に、約５０μＬの上記の溶解オリゴヌクレオチド負荷、熱可逆性ヒドロゲルを３７℃で添加し、優しく混合し、フローフォーカシング微小流体装置を使用してキャリアオイルによって乳化させ、平均容積約２５０ｐＬの、約２００，０００個の均一サイズの油中水液滴を形成する、またはＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してボルテックスすることによって異種サイズの油中水液滴を形成する。キャリアオイルは、フルオロカーボンオイルを含有する界面活性剤（例えば、ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ＃００８−ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔ−２ｗｔＨ）、またはミネラルオイルを含有する界面活性剤（例えば、７３：２０：７の比で混合したＴｅｇｏｓｏｆｔ  ＤＥＣ、ミネラルオイル、Ａｂｉｌ  ＷＥ０９、Ａｂｉｌら、２０１７年を参照）であり得る。ボルテックス法では、Ｔ細胞の適当な画分（例えば、＞２０％）が、容積が０．１ｎＬと０．５ｎＬの間である液滴中にあるように、ボルテックスの頻度および期間を調整することができる。
【０４４７】
[00498]ステップ３：ｍＲＮＡの捕捉および逆転写
[00499]上記で産生したエマルジョンを５分間、６５〜７５℃でインキュベートし、細胞を破壊し、ｍＲＮＡを放出させることができる。次いで、エマルジョンを氷上に置き、ｄＴ３０をポリＡテイルとハイブリダイズさせる（図４Ａ、上）。この氷上でのインキュベーションはアガロースのゲル化も促進する。次に、エマルジョンは、水溶液中のヒドロゲルビーズを得るために解乳化される。解乳化方法は、使用するキャリアオイルに依存する。フルオロカーボンオイルでは、エマルジョンは、ＨＦＥ−７５００オイル（２０％  ＰＦＯ）中の２０％（体積／体積）１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクタノールを添加することによって解乳化することができる。ミネラルオイルでは、エマルジョンは、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１；体積／体積／体積；Ｆｉｓｈｅｒ社、カタログ番号ＢＰ１７５２１）によって解乳化することができる。
【０４４８】
[00500]試薬交換を実施し、逆転写（ＲＴ）および鋳型スイッチング（ＴＳ）が起こり得るように、ヒドロゲルビーズの水性内容物に緩衝液および試薬を送達することができる（図４Ａ、矢印（１））。これを行うため、ヒドロゲルビーズは、４℃で十分な量のｄＮＴＰを含有するＲＴ緩衝液（例えば、ＳｍａｒｔＳｃｒｉｂｅ  ＲＴ緩衝液）によって洗浄することができ、次いで十分な量のＲＴ酵素（例えば、ＳｍａｒｔＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素）および鋳型スイッチングオリゴ（ＴＳＯ）をビーズ懸濁液に添加し、ヒドロゲルビーズへの拡散を可能にする。ＴＳＯは、５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴ／ｒＧ／／ｒＧ／／＋Ｇ／−３’の配列を有することができ、ここで／ｒＧ／はリボースＧヌクレオチドを意味し、／＋Ｇ／はＬＮＡ  Ｇヌクレオチドを意味する。次いで、ヒドロゲルビーズを短時間の遠心分離（例えば、５００ｇで１分間）によって圧縮し、上澄み液を除去することができる。次いで、ヒドロゲルビーズを、攪拌方法を使用して再乳化する。これを行うため、少量（例えば、約５００μＬ）のキャリアオイルを、圧縮したヒドロゲルビーズを含有するチューブに添加することができる。チューブを攪拌し（例えば、ボルテックスまたは手ではじくことによって）、ヒドロゲルビーズが、その間に少量の（例えば、５０ｐＬ）水溶液流体または水溶液流体の無いキャリアオイルによって囲まれる、油中水エマルジョンを形成する。このエマルジョンをインキュベートし、ＲＴおよび鋳型スイッチングを終了させ（例えば、４２℃で１時間）、続いて、４℃で５分間インキュベートしてアガロースゲルにする。次いで、エマルジョンは、上記のように再び解乳化することができる。
【０４４９】
[00501]ステップ４：ＰＣＲ増幅ＴＲＡおよびＴＲＢ
[00502]ヒドロゲル中で拡散抑制された第１鎖ｃＤＮＡにより、ヒドロゲル粒子は再び（上記のように）試薬交換され、液滴ベースの単一細胞反応器におけるＴＲＡおよびＴＲＢのＰＣＲ増幅のための緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴａｑまたはＫＯＤ）、およびプライマーを送達することができる。３つのプライマーのセットを使用してＴＲＡＣおよびＴＲＢＣを増幅することができる：プライマー「ＡＲＳ−ｐＴＳＯ」、「１Ｒ」、および「２Ｒ」（図４Ａ、矢印（２）を参照）。プライマーＡＲＳ−ｐＴＳＯは、［Ｔ１ｉ｜３ｘＳｐａｃｅｒ１８｜ｐＴＳＯ｝の配列を有し、Ｔ１ｉはＴ１ｄと相補性であり、３ｘＳｐａｃｅｒ１８は、３つの連続する内側Ｓｐａｃｅｒ１８（すなわち、ヘキサエチレングリコール）改変からなる可動性リンカーであり、ｐＴＳＯは、鋳型スイッチｃＤＮＡを刺激することができるＴＳＯと基本的に同じ配列を有する。ｐＴＳＯは、以下の配列を有し得る：５’−ＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣ−３’。プライマー１Ｒおよび２Ｒは、「対合二分免疫受容体配列の融合：テイル−テイル設計」節に概略した戦略に従って設計することができる。ドメインＴＲＡＣ−５Ａは、配列５’−ＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧ−３’を有することができ；ドメインＴＲＢＣ−５Ａは、配列５’−ＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧ−３’を有することができ；ドメインＯＬ−１は、配列５’−ＡＣＣＡＧ−３’を有することができ；ドメインＯＬ−２は、配列５’−ＣＴＣＴＧＣＴ−３’を有することができる。
【０４５０】
[00503]試薬交換後、ヒドロゲルビーズは、上記の攪拌方法を使用して再び乳化することができる。エマルジョンはＰＣＲにかけることができ（図４Ｂ、矢印（３））、その後、増幅および拡散抑制ＴＲＡおよびＴＲＢを産生することができる。増幅したＴＲＡおよびＴＲＢも、融合を促進するオーバーラップ配列を有する。エマルジョンは、アガロースのゲル化のために再び冷却し、次いで解乳化することができる。
【０４５１】
[00504]ステップ５．ＴＲＡおよびＴＲＢの融合
[00505]増幅したＴＲＡおよびＴＲＢの融合は、「対合二分免疫受容体配列の融合：テイル−テイル設計」節に概略した戦略に従って実行することができる。例えば、ＵＳＥＲ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）およびリガーゼを使用することができる。これを行うため、プライマー１Ｒおよび２Ｒは、選択された位置でデオキシウリジンによって改変される必要がある。例えば、プライマー１Ｒは、配列５’−ＡＧＣＡＧＡＧＣ／ｄＵ／ＧＧ／ｄＵ／ＡＣＡＣＧＧＣＡＧＧＧＴＣ−３’を有することができ、プライマー２Ｒは、配列５’−ＡＣＣＡＧＣＴＣ／ｄＵ／ＧＣ／ｄＵ／ＴＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＣＡＣＡ−３’を有することができ、ここで／ｄＵ／はデオキシウリジン改変を意味する。
【０４５２】
[00506]先のステップでのＰＣＲ増幅後、エマルジョンは解乳化することができ、試薬交換を実行して、アガロースビーズ中の水性内容物へＵＳＥＲ緩衝液および酵素ミックスを送達することができる。ヒドロゲルビーズは、攪拌方法を使用して再び乳化することができ、エマルジョンはＵＳＥＲ消化に適した温度でインキュベートすることができる（例えば、３７℃で１時間）。温度をわずかに上昇させ、アガロースが溶解されるのを確実にすることができ、これはＵＳＥＲ消化ＰＣＲ産物が自由に拡散するのを可能にする。次いで、エマルジョンは、ＵＳＥＲ消化ＴＲＡおよびＴＲＢの突出末端がハイブリダイズできるように、再び３７℃でインキュベートすることができる（図４Ｂ、矢印（４））。次いで、エマルジョンを氷上で冷却し、アガロースゲルにし、解乳化することができる。
【０４５３】
[00507]次に、リガーゼ緩衝液および酵素（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ）をアガロースビーズに導入するために試薬交換を適用することができ、次いでそれは攪拌方法を使用して再乳化することができる。エマルジョンは、次いで、突出末端をライゲートするリガーゼに最適な温度でインキュベートすることができる（図４Ｂ、矢印（５））。エマルジョンは、再び冷却し、解乳化して、水性溶液中でアガロースビーズを回収することができる。
【０４５４】
[00508]アガロースビーズは、約１００μＬの１×ＴＥで希釈し、再び溶解することができ、そのためアガロース濃度は十分に低く、室温でゲル化しない。この混合物に、配列ｐＴＳＯを有するプライマーを、ＰＣＲ緩衝液および酵素と共に添加することができ、バルクＰＣＲを実行し、融合産物をさらに増幅することができる。この新しいＰＣＲ産物は、もはや拡散抑制されず、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅビーズを使用して精製することができる。精製ＰＣＲ産物は、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドのライブラリーを表す。
【０４５５】
実施例２：液滴ベースの単一細胞反応器を使用する、ヘッド−テイル方向の対合ＴＣＲクローニング
[00509]最初の３ステップは、ＴＳＯが必ずしも必要でない以外は実施例１と基本的に同じであってよい（図５Ａ、上および矢印（１））。
【０４５６】
[00510]ステップ４：拡散抑制されたｃＤＮＡの第２の鎖合成
[00511]ＲＴ後、ヒドロゲルビーズを試薬交換に供し、第２の鎖合成（ＳＳＳ）プライマーの群を送達することができる（図５Ａ、矢印（２））。群は２つのパネルを含み得る：ＴＲＡパネルおよびＴＲＢパネル。各パネルは、種によって１０〜１００個のプライマーを含有し得る。ヒトでは、４５プライマーのＴＲＡパネルおよび４８プライマーのＴＲＢパネルを使用して、ＩＭＧＴデータベースで注釈をつけられた、全ての機能性Ｖ遺伝子バリアントをカバーすることができる。ＴＲＡパネルの各プライマーは、［ＡｄｐｔＡ｜ＣＤＳＴＲＡ｝の一般構造を有することができ、ＴＲＢパネルの各プライマーは、一般構造［ＡｄｐｔＢ｜ＣＤＳＴＲＢ｝を有することができる。ＡｄｐｔＡおよびＡｄｐｔＢは、本開示に記載する。ＡｄｐｔＡは、Ｐ２Ａ−３Ａの配列を有し得る。Ｐ２Ａ−３Ａは、Ｐ２Ａ「自己切断」ペプチドのコード配列の連続する約２０塩基であり得る。Ｐ２Ａのコード配列は、「ｇｃｇａｃｇａａｔｔ  ｔｔａｇｔｔｔｇｃｔ  ｔａａｇｃａａｇｃｃ  ｇｇａｇａｔｇｔｇｇ  ａｇｇａａａａｔｃｃ  ｔｇｇａｃｃｇ」であり得る。ＡｄｐＢは、ａｔｔＢ１−Ｋの配列を有することができ、そのヌクレオチド配列は「ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴ  ｔａｃｃ」であり得る。ＣＤＳＴＲＡは、各ＴＲＡ−Ｌ１遺伝子（ＴＲＡＶ遺伝子のリーダー配列をコードする）のコード配列の最初の２０〜４５塩基であり得る。ＣＤＳＴＲＢは、各ＴＲＢ−Ｌ１遺伝子（ＴＲＢＶ遺伝子のリーダー配列をコードする）のコード配列の最初の２０〜４５塩基であり得る。この場合、ＣＤＳＴＲＡおよびＣＤＳＴＲＢは、それぞれＴＲＡＶ−Ｌ１ＵＥおよびＴＲＢＶ−Ｌ１ＵＥとも呼ぶことができる（ここで、Ｕは上流を意味し、Ｅは正確を意味し、配列が確かに開始コドンから開始することを意味している）。全てのＣＤＳＴＲＡおよびＣＤＳＴＲＢ配列は、類似のＴｍを有するように設計されるべきであり、それによりそれらが適度に良い効率および特異性でｃＤＮＡ上のそれらの標的部位に全て結合することができる。
【０４５７】
[00512]試薬交換後、ヒドロゲルビーズ中のプライマーの濃度は、各プライマーにつき約１０ｎＭであり得る（全部で約１μＭ）。ＡｄｐｔＡおよびＡｄｐｔＢの存在が、ＳＳＳプライマーの非特異的結合を引き起こし得るため、ＡｄｐｔＡおよびＡｄｐｔＢに相補的な配列を有するブロッカーオリゴヌクレオチド（ここでは、それぞれＢｌｏｃｋｅｒ  ＡおよびＢｌｏｃｋｅｒ  Ｂと呼ばれる）を添加し、ＡｄｐｔＡおよびＡｄｐｔＢにハイブリダイズさせることができる。Ｂｌｏｃｋｅｒ  ＡおよびＢｌｏｃｋｅｒ  Ｂの３’末端は、伸長ブロッカーによって改変され得る（例えば、アミン、Ｃ３スペーサー、ジデオキシ改変、または逆位ｄＴ）。Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａの濃度が、ＴＲＡパネルＳＳＳプライマーの総濃度と等しいまたはより高く、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｂの濃度が、ＴＲＢパネルＳＳＳプライマーの総濃度と等しいまたはより高いことを確実にすることができる。
【０４５８】
[00513]試薬交換後、ヒドロゲルビーズは、攪拌方法を使用して再乳化することができる。エマルジョンは、まず、３〜１０分間、約９５℃に加熱し、ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡ二量体を変性させ、次いでアニーリング温度に冷却することができ、それは、典型的なＣＤＳＴＲＡおよびＣＤＳＴＲＢ配列のＴｍよりも３〜１０℃低くてよい。アニーリングは、３〜６時間続けることができる。次いで、エマルジョンは、冷却し、アガロースゲルにさせ、解乳化することができ、ヒドロゲルビーズを室温で洗浄し、未結合のＳＳＳプライマーを除去することができる。必要に応じて、ｓｓＤＮＡ３’〜５’エキソヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩ）をアガロースビーズに添加し（試薬交換を介して）、残りのおよびハイブリダイズしなかったＳＳＳプライマーを分解することができる。エキソヌクレアーゼが、アガロースの溶解温度よりも高いインキュベーション温度を必要とする場合、このエキソヌクレアーゼ処置ステップは別の乳化→反応→解乳化→試薬交換を必要とし得る。
【０４５９】
[00514]次に、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｐｈｉ２９、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔａｑ等）および適当な緩衝液を、試薬交換を介してアガロースに添加することができる。アガロースビーズは、攪拌方法によって再び乳化することができ、エマルジョンは、ＳＳＳを実行するために１０〜６０分間、ＤＮＡポリメラーゼの最適な温度でインキュベートすることができる（図５Ｂ、矢印（３））。
【０４６０】
[00515]ステップ５：ＴＲＡおよびＴＲＢのＰＣＲ増幅、融合
[00516]ＳＳＳ後、エマルジョンを、冷却し、アガロースゲルにさせ、解乳化、およびＰＣＲ緩衝液で洗浄することができる。プライマーｈｔ１Ｆ、ｈｔ１Ｒ、ｈｔ２Ｆ、ｈｔ２Ｒならびに熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｈｏｔｓｔａｒｔ  Ｔａｑ）を、試薬交換を介してヒドロゲルに添加することができる（図５Ｂ、矢印（４））。プライマーｈｔ１Ｆは、配列［Ｔ１ｉ｜３ｘＳｐａｃｅｒ１８｜ＡｄｐｔＡ｝を有することができ、Ｔ１ｉは親和性保持配列（ＡＲＳ）として寄与する。プライマーｈｔ２Ｒは、配列［Ｔ１ｉ｜３ｘＳｐａｃｅｒ１８｜ＴＲＢＣ−３Ａ＊｝を有することができ、ＴＲＢＣ−３Ａ＊は、ＴＲＢＣのリバースプライマーであり、配列５’−ＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＣＡＣＡ−３’を有し得る。プライマーｈｔ１Ｒおよびｈｔ２Ｆを、本明細書に記載する。ドメイン［ｈｔＴＲＡＣ−５Ａ｝は、配列５’−ｇａｃｃｃｔｇｃｃｇｔｇｔａｃｃａｇｃ−３’を有し得る。
【０４６１】
[00517]ヒドロゲルビーズは、攪拌方法を使用して乳化し、ＰＣＲにかけることができる（図５Ｂおよび５Ｃ、矢印（５））。ＴＲＡおよびＴＲＢ  ＰＣＲ産物は、オーバーラップ配列を有し、実施例１に記載の方法を使用して融合することができる（図５Ｃ）。融合産物は、融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドのライブラリーを表す。
【０４６２】
実施例３：二方向プロモーターによるテイル−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドの免疫受容体発現ベクターへの変換
[00518]実施例１から得られたテイル−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドは、部分Ｃ領域配列のみを含有し得る。残りのＣ領域配列を、プロモーターと共に添加し、発現ベクター内の全発現カセットを形成することができる。図６Ａおよび図６Ｂは、これを達成する例示的な戦略を概略する。まず、上鎖を選択的に捕捉し、放出させることができる（図６Ａ、矢印（１））。これは、上鎖の保存配列（例えば、［ＯＬ−１｜ＯＬ−２｝）を特異的に認識する捕捉オリゴヌクレオチドを使用して行うことができる。次に、反対方向に向かう２つのヒトプロモーターを含む線状ＤＮＡ構築物（ここではプロモーターセグメントと名付けた）を、捕捉した上鎖と融合することができる（図６Ａ、矢印（２）および（３））。融合を促進するため、プロモーターセグメントの下鎖（図６Ａに示す）は、捕捉した上鎖にハイブリダイズする配列［ＴＳＯ｝を有する一本鎖領域を含み得る。一本鎖領域は、ＵＳＥＲ消化によって作製することができる。これを行うため、プロモーターセグメントを増幅するために使用するフォワードプライマーは、少ない（例えば、１〜５）デオキシウリジン改変を有することができ、ＰＣＲ産物は、ＵＳＥＲ酵素ミックスによって処置することができる。ｄｓＤＮＡを得るため（図６Ａ、矢印（３））、強い鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ）を使用することができる。あるいは、リガーゼは、上鎖をシースするために使用することができる。
【０４６３】
[00519]この融合産物は、ＰＣＲによってさらに増幅することができる。フォワードプライマー（基本的に［ＴＳＯ｝の配列を有する）が、上鎖の中央の［ＴＳＯ＊｝（本発明者らは、干渉するプライマー結合部位と呼ぶ）にハイブリダイズしないことを確実にするため、ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用することができる。このブロッカーオリゴヌクレオチドは、配列［ＰＢ３｜ＴＳＯ｝を有することができ、［ＰＢ３｝は、［プロモーターＢ｝の連続する１０〜２０塩基の配列を有する。結果として、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、フォワードプライマーよりも実質的に高いＴｍを有し得る。ＰＣＲ反応では、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、フォワードプライマーの濃度よりも低い濃度で使用することができる。２ステップアニーリングを、熱サイクリングプログラムに適用することができる。各ＰＣＲサイクルでは、変性ステップ後、比較的高い温度での第１のアニーリングステップ（例えば、６８℃）を使用して、ブロッカーが上鎖にハイブリダイズするが、フォワードプライマーが上鎖または下鎖のいずれにもハイブリダイズしないことを確実にすることができる。次に、比較的低い温度での第２のアニーリングステップ（例えば、５８℃）を使用して、フォワードプライマーが下鎖に結合することを確実にすることができる。上鎖の［ＴＳＯ＊｝配列は、第１のアニーリングステップ中にブロッカーによって既に占領されているため、フォワードプライマーはこの配列に効果的に結合できない。第２のアニーリングステップでは、ブロッカーが下鎖の［ＴＳＯ＊｝（フォワードプライマー結合部位）にも結合できるが、フォワードプライマーがより高い濃度を有するため、ブロッカーよりもより効果的に下鎖の［ＴＳＯ＊｝部位に結合することができる。
【０４６４】
[00520]次に、増幅産物は、公知の方法を使用して環状化させることができる（図６Ａ、矢印（４））。環状化産物は、基本的に［ＯＬ−１｝と［ＯＬ−２｝の間を切断するステップによって線状化することができる。これは、基本的に配列［ＯＬ−２｝を有するフォワードプライマーおよび基本的に配列［ＯＬ−１＊｝を有するリバースプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、簡単に達成することができる。両プライマーは、３’末端で伸長し、ＰＣＲの正確なＴｍに達することができる。線状化産物では、プロモーターセグメント（例えば、プロモーターＡ）の第１のプロモーターは、ＴＲＡを転写するように配置および方向付けられ、プロモーターセグメント（例えば、プロモーターＢ）の第２のプロモーターは、ＴＲＢを転写するように配置および方向付けられる。
【０４６５】
[00521]線状化産物は、既存の方法を使用して、プラスミド骨格にクローニングすることができる（図６Ｂ、矢印（６））。線状化産物は、ＴＲＡまたはＴＲＢのいずれのＣ領域の全配列を含有しなくてもよい。これらの定常配列（ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣの完全または部分配列）は、プラスミド骨格に含むことができ、それによりＴＲＡおよびＴＲＢの翻訳産物は機能性である。プラスミド骨格は、ＴＲＡ（例えば、ｐＡ１）およびＴＲＢ（例えば、ｐＡ２）の転写終結配列を有し得る。プラスミド骨格は、ベクターの増殖および機能のための他の要素、例えば、複製オリジン、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、レトロウイルスベクター機能のためのＬＴＲ、またはトランスポザーゼ依存性挿入のための配列エレメントなども有し得る。
【０４６６】
実施例４：テイル−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドの二分免疫受容体発現ベクターへの変換
[00522]ＴＣＲ発現ベクターでは、ＴＲＡおよびＴＲＢのコード配列は、ヘッド−テイル方向に、インフレーム様式で融合することができ、それにより、１つのプロモーターは、ＴＲＡとＴＲＢの両方をコードするｍＲＮＡを転写するために使用することができ、リボソームは、連続するポリペプチド、または、Ｐ２Ａなどの「自己切断ペプチド」を使用する場合、２つのポリペプチドのいずれかとして、ＴＲＡおよびＴＲＢを転写することができる。ＴＲＡとＴＲＢの間のリンカー配列を挿入することができる。
【０４６７】
[00523]この例では、本発明者らは、図４Ａおよび図４Ｂ、ならびに実施例１に記載の方法を使用して生成されたテイル−テイル融合ＴＣＲ遺伝子を、ＴＣＲ発現ベクターに変換する方法を示し、ここで、ＴＲＡおよびＴＲＢはヘッド−テイル方向に、インフレームで融合し、ＴＲＡとＴＲＢの間にリンカーを有する。戦略は、図７Ａ〜７Ｄに図示する。
【０４６８】
[00524]この例では、ＴＲＡとＴＲＢの開始部位が制御され得る。この例では、配列を記載するために、より正確なネーミングシステムが使用される。図７Ａの上は、図４Ａおよび図４Ｂ、ならびに実施例１に記載の方法を使用して生成された融合産物を示す。ＴＲＡ配列は、５’ＵＴＲ、ＴＲＡのＬドメイン、ＴＲＡの再配置ＶＤＪ配列、およびＴＲＡのＣ領域の５’末端の短い配列（本発明者らは、ミニＣまたはｍＣと呼ぶ）を含有し得る。したがって、ＴＲＡ配列は、ＴＲＡＵＴＲ−Ｌ−ＶＤＪｍＣと呼ばれる。同様に、ＴＲＢ配列は、ＴＲＢＵＴＲ−Ｌ−ＶＤＪｍＣと呼ばれる。
【０４６９】
[00525]実施例２に記載した［Ｐ２Ａ−３Ａ｜ＴＲＡＶ−Ｌ１ＵＥ｝パネルは、上鎖を「トリム」するために使用することができ、それにより（１）ＴＲＡ配列は、ＴＲＡのＬ１領域の開始コドンから正確に開始することができ、（２）共通配列［Ｐ２Ａ−３Ａ｝が導入され、増幅などの操作をさらに促進する（図７Ａ、矢印（１））。反応は、テイル−テイル融合ＴＣＲ遺伝子が鋳型として使用される以外は、実施例２記載のＳＳＳ反応に類似し得る。類似の様式で、［ａｔｔＢ１−Ｋ｜ＴＲＢＶ−Ｌ１ＵＥ｝パネルを使用して、下鎖をトリムすることができる（図７Ａ、矢印（２））。配列［Ｐ２Ａ−３Ａ｝および［ａｔｔＢ１−Ｋ｝を有するプライマーを使用するさらなるＰＣＲ増幅は、平滑末端ｄｓＤＮＡをもたらすことができる（図７Ａ、矢印（３））。この例では、トリミング後、ＵＴＲ配列がトリムされるため、［ＴＲＡＵＴＲ−Ｌ−ＶＤＪｍＣ｝は「ＴＲＡＬ−ＶＤＪｍＣ」になる；ＴＲＢも同様である。
【０４７０】
[00526]次いで、ＰＣＲ産物は、［ＴＲＢＬ−ＶＤＪｍＣ＊｝の下流のｄｓ［Ｌｏｘ６６｜Ｐ２Ａ−５｝と呼ばれる別のｄｓＤＮＡ（後述の説明を参照）と融合することができる（図７Ｂ、矢印（４））。これは、図６Ａの矢印（２）〜（３）に記載のものと類似のプロセスを使用して達成することができる。
【０４７１】
[00527]次に、図６Ａの矢印（４）に記載のものと類似のプロセスを使用して、融合ｄｓＤＮＡを環状化させることができる（図７Ｂ、矢印（５））。環状化後、［Ｐ２Ａ−５｝を［Ｐ２Ａ−３Ａ｝とライゲートし、［Ｐ２Ａ−５｜Ｐ２Ａ−３Ａ｝を形成することができ、それは［Ｐ２Ａ｝の正確な配列を有し得る。環状化ＤＮＡは、ＴＲＡとＴＲＢの間のブレークポイントで線状化することができる（図７Ｂ、矢印（６））。これは、例えば、本明細書に記載のようにプライマー［ＴＲＡＣ−５Ａ＊｝および［ＴＲＢＣ−５Ａ＊｝を使用して、環状化ＤＮＡをＰＣＲ増幅することによって達成することができる。この線状化産物は、ｄｓ［Ｌｏｘ７１＊｜ＦＦ＊｜ＴＲＢＣ−３＊｝を［ＴＲＢＬ−ＶＤＪｍＣ｝の上流に融合することができる（図７Ｃ、矢印（７））。ここで、ＴＲＢＣ−３は、［ＴＲＢＣ−５Ａ｝の下流のＴＲＢＣの配列であり（注：ヒトでは、これはＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかであってよい）、ＦＦはフューリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位に続いて可動性（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）リンカーである、ポリペプチド配列をコードする。Ｌｏｘ６６およびＬｏｘ７１は、不可逆的な組換えが起こるＣｒｅ組換え部位の対である。［ＴＲＢＬ−ＶＤＪｍＣ｜ＴＲＢＣ−３｝はＴＲＢの全長配列であるため、本発明者らは、［ＴＲＢＬ−ＶＤＪｍＣ｜ＴＲＢＣ−３｝を［ＴＲＢＬ−ＶＤＪ｜ＴＲＢｃ｝と上書きすることができ、［ＴＲＢＬ−ＶＤＪ｝は、Ｌ領域の開始コドンから再配置ＶＤＪセグメントの終わりまでのＴＲＢの配列であり、ＴＲＢｃはＴＲＢＣの配列である。（図７Ｃの縦の「＝」印を参照されたい）。
【０４７２】
[00528]上記の融合産物をＣｒｅリコンビナーゼによって処置するステップは、Ｌｏｘ６６とＬｏｘ７１の間のＤＮＡ配列の反転を起こし、二重変異体Ｌｏｘ部位［ｄｍＬｏｘ｝および［ＬｏｘＰ｝部位の形成をもたらし得る（図７Ｃ、矢印（８））。［Ｌｏｘ６６｝および［Ｌｏｘ７１｝の配列は、変換後、ＦＦ、ｄｍＬｏｘ、およびＰ２Ａが、停止コドン無しで、インフレームに接続されるように設計される（図７Ｄの矢印（８）後のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を参照されたい）。
【０４７３】
[00529]この反転産物は、［ａｔｔＢ１−Ｋ｝および［ＴＲＡＣ−５Ａ＊｝によってＰＣＲ増幅することができ、ＰＣＲ産物はベクター骨格にクローニングすることができる（図７Ｄ、矢印（９））。骨格は、ＴＲＡＣを完成するのに十分な配列を有してよく、プロモーター、ターミネーター、および上記のようにベクターの機能に必要な他のエレメントも有し得る。
【０４７４】
実施例５：ヘッド−テイル融合二分免疫受容体ポリヌクレオチドの二分免疫受容体発現ベクターへの変換
[00530]その配列構築物が図８Ａに記載される、実施例２に記載の方法によって生成されたヘッド−テイル融合ＴＣＲ遺伝子は、先の実施例と類似の戦略を使用して、ＴＣＲ発現ベクターへと変換することができる。命名規則は、実施例４と同じである。まず、融合ＴＣＲ遺伝子は、従来のオーバーラップＰＣＲまたは図６Ａの矢印（２）〜（３）に記載の他の方法を使用して、ｄｓ［ＴＲＢＣ−３｜Ｐ２Ａ−５｝を融合することができる（図８Ａ、矢印（１））。この融合は、「ＴＲＢＬ−ＶＤＪ｝の下流に完全なＴＲＢｃ配列を作成する（図８Ａの縦の「＝」印）。この融合産物は、前述のように環状化させることができ（図８Ａ、矢印（２））、プライマー［ａｔｔＢ１−Ｋ｝および［ＴＲＡＣ−５Ａ＊｝を使用するＰＣＲ増幅によって線状化することができる（図８Ｂ、矢印（３））。線状化産物は、前述のようにベクター骨格にクローニングし、ＴＲＡｃ配列を完成し、他の必要なエレメントを取り入れることができる（図８Ｃ）。
【０４７５】
実施例６：ＯＥ−ＰＣＲを使用する対合ＴＣＲクローニング
[00531]実施例１および２は、ＵＳＥＲ媒介突出末端生成およびライゲーションを使用して前もって増幅したＴＲＡおよびＴＲＢを融合する方法を記載する。あるいは、前もって増幅したＴＲＡおよびＴＲＢは、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）を使用して融合することができる。いくつかの場合では、内側プライマー（例えば、実施例１のプライマー１Ｒおよび２Ｒ、または実施例２のプライマーｈｔ１Ｒおよびｈｔ２Ｆ）を除去するステップは、融合を促進し得る。内側プライマーの除去は、先に記載のように達成することができる。他の場合では、ＯＥ−ＰＣＲは、内側プライマーを除去するステップ無しで実施することができる。これらの場合では、前もって増幅した産物は、拡散抑制される必要がない。したがって、外側プライマー（例えば、実施例１のｐＴＳＯ、または実施例２の［Ａｄｐｔ１｝および［ＴＲＢＣ−５Ａ＊｝）は、ＡＲＳに連結される必要がない。
【０４７６】
[00532]図９Ａおよび９Ｂは、ＯＥ−ＰＣＲを使用して、テイル−テイル方向でＴＲＡとＴＲＢを融合する方法を記載する。ステップ１〜３は、実施例１と同一である（図９Ａ、矢印（１））。ステップ４では、試薬交換を適用し、高濃度のｐＴＳＯ（例えば、４００ｎＭ）、低濃度のプライマー１Ｒおよび２Ｒ（例えば、各８０ｎＭ）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰＣＲ緩衝液をアガロースビーズに送達することができる（図９Ａ、矢印（２））。アガロースビーズは、攪拌方法を使用して、フルオロカーボンオイルを含有する界面活性剤によって再乳化することができる（図９Ｂ、矢印（３））。次いで、エマルジョンＰＣＲを、ＯＥ−ＰＣＲ熱サイクルプログラムを使用して実行することができる。熱サイクルプログラムは、３つのステージを有することができる。第１のステージのゴールは、ＴＲＡおよびＴＲＢを増幅することである。第２のステージのゴールは、プライマーとしてｐＴＳＯを使用して、ＴＲＡおよびＴＲＢならびに３'末端オーバーラップ領域のセンス配列を有するｓｓＤＮＡ産物を生成することである。第３のステージのゴールは、ｓｓＤＮＡ産物を融合することである。
【０４７７】
[00533]図１０Ａおよび１０Ｂは、ＯＥ−ＰＣＲを使用して、ヘッド−テイル方向でＴＲＡおよびＴＲＢを融合する方法を記載する。ステップ１〜４は、実施例２と同一である（図１０Ａ、矢印（１）〜（３））。ステップ５では、試薬交換を適用し、高濃度の外側プライマー［ＡｄｐｔＡ｝および［ＴＲＢＣ−５Ａ＊｝（例えば、各４００ｎＭ）、低濃度のプライマー１Ｒおよび２Ｒ（例えば、各８０ｎＭ）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰＣＲ緩衝液をアガロースビーズに送達することができる（図１０Ｂ、矢印（４））。次いで、ＯＥ−ＰＣＲを、上記のように実施することができる（図１０Ｂ、矢印（５））。
【０４７８】
実施例７：プライマー改変アガロース
[00534]プライマー改変アガロースを調製する方法の２つの例を、本明細書で提供する。第１の方法では、約４％のアガロースおよび１００〜５００ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を含有する溶液を７０℃で調製した。７０℃での短いインキュベーション後、溶液は、ボルテックスを使用して界面活性剤含有オイルで乳化した。安定な油中水エマルジョンを作製する当技術分野で使用される、実質上任意の界面活性剤含有オイルをここで使用することができる。エマルジョンを氷上で約２０分間インキュベートし、次いで２０％〜１００％のＰＦＯを使用して解乳化した。生じたアガロースビーズ懸濁液を水中で洗浄し、遠心分離および上澄み液の除去によって圧縮し、再び溶解し、０．１〜１ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）の存在下で、アミン標識ＲＴプライマーを含有する等量の溶液と混合した。３７℃で終夜のインキュベーション後、上記のように、溶液を乳化し、氷上でインキュベートし、解乳化および洗浄し、ＲＴプライマーを共有結合により結合した２％アガロースビーズの懸濁液を生じた。固定化ＲＴプライマーの濃度は、ＤＮＡ結合色素またはＲＴプライマーに相補的な蛍光標識オリゴヌクレオチドで染色することによって測定することができる。１００ｎＭ〜１０μＭの固定化ＲＴプライマーを有するアガロースビーズを得た。
【０４７９】
[00535]第２の方法では、ＲＴプライマーは、線状ポリアクリルアミドに共有結合により連結される。これを行うため、アミン改変線状ポリアクリルアミドを、先ず、アクリルアミドとＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩を共重合するステップによって調製し、次いでＮＨＳ−アジドおよびＤＢＣＯ改変プライマーと反応させた。プライマー改変線状ポリアクリルアミドを、上記のように、２％アガロースと混合し、乳化し、氷上でインキュベートし、解乳化し、洗浄した。
【０４８０】
[00536]多くの商標名の多くのアガロース源がある。ゲル化温度は多様であり、改変はゲル化温度に影響し得る。性質制御ステップとして、生じるプライマー改変アガロースは、約３７℃で溶解したまま、室温ではゲル化したままであるように制御することができる。
【０４８１】
実施例８：ヘッド−テイル様式での、末梢Ｔ細胞由来のＴＣＲアルファおよびベータ鎖物理的に連結ならびにＮＧＳベース特徴付け
[00537]健康なドナー由来の末梢Ｔ細胞を使用して、物理的に連結した（ヘッド−テイル方向）、自然対合ＴＣＲ（すなわち融合ＴＣＲポリヌクレオチド）のＤＮＡライブラリーを調製した。典型的なランでは、以下の成分を混合することによって、細胞懸濁液（ＣＳ）を作製した：末梢Ｔ細胞（典型的には終濃度μＬあたり１０００〜５０００個の細胞）、１つはヒトＴＲＡＣ  ｍＲＮＡをターゲティングし、他はヒトＴＲＢＣ  ｍＲＮＡをターゲティングする、２つのＲＴプライマーを含む、１％プライマー改変アガロース（この例では：ＴＲＢＣターゲティングＲＴプライマーはＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２を区別しない）、およびＰＢＳ。
【０４８２】
[00538]以下の成分を含む、Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｘ（ＲＣＭ）と呼ばれる溶液を調製した：１％アガロース、ＳＳＩＶ反応緩衝液（製造業者のユニット定義テストに従って調製）、Ｍａｘｉｍａ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素（終濃度：５〜５０Ｕ／μＬ）、Ｑ５  ＤＮＡポリメラーゼ（終濃度：０．０２〜０．２Ｕ／μＬ）、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（終濃度：製造業者によって規定されたように１×）、ｄＮＴＰ（各０．１〜１ｍＭ）、ＲＮａｓｅＯＵＴ（終濃度：１０×ストックからの希釈）、［ＡｄｐｔＡ｜ＣＤＳＴＲＡ｝パネル（終濃度：各１〜５ｎＭ）、および［ＡｄｐｔＢ｜ＣＤＳＴＲＢ｝パネル（終濃度：各１〜５ｎＭ）。
【０４８３】
[00539] ［ＡｄｐｔＡ｜ＣＤＳＴＲＡ｝および［ＡｄｐｔＢ｜ＣＤＳＴＲＢ｝パネルを調製する場合、各プライマーをまずブロッカーＡ／ＢおよびＶ特異的ブロッカー（ＶＳＢ）と呼ばれる追加のブロッカーとアニールさせることができる。ＶＳＢは、相当するＣＤＳＴＲＡまたはＣＤＳＴＲＢ領域の３'部分に相補的であり得るが、相当するＣＤＳＴＲＡまたはＣＤＳＴＲＢ領域より１０〜１５ヌクレオチド短い。言い換えると、各［ＡｄｐｔＡ｜ＣＤＳＴＲＡ｝および［ＡｄｐｔＢ｜ＣＤＳＴＲＢ｝の３'末端はＶＳＢと平滑末端を形成し得る。３'ＶＳＢは、ＶＳＢを伸長不能にするようにも改変され得る。
【０４８４】
[00540]典型的な実行では、ＲＣＭおよびＣＳは、標準的な入口２つの液滴生成マイクロ流体チップ（例えば、Ｚｉｌｉｏｎｉｓら、２０１７年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１６．１５４のヒドロゲルビーズ生成装置）の２つのインポートへと等しい流速で注入し、およそ３０〜７０μｍの直径を有する液滴を産生した。熱安定性界面活性剤含有フルオロカーボンオイル（例えば、ＲＡＮ００８−ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔ−２ｗｔＦ、ＲＡＮ００８−ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔ−５ｗｔＨ、またはＢｉｏ−Ｒａｄ液滴オイル）を油相として使用することができる。図１１Ａは、液滴生成プロセスのスナップ写真を示す。生じたエマルジョンは、５０℃で１〜２時間インキュベートした。インキュベーション中、エマルジョンの小さい画分は、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄがプライマーおよび細胞核を染色できるため、蛍光顕微鏡によって調べることができる。画像の例を図１１Ｂに提供する。次いで、エマルジョンを、９３℃で２分間、６５℃で２０分間、および７２℃で１分間インキュベートした。９３℃で３０秒、６０℃で１分間、７２℃で１分間、８０℃で１分間の５〜８サイクルを加えることができる。
【０４８５】
[00541]次いで、エマルジョンを冷却し、アガロースゲルビーズを形成し、十分な量の２０％ＰＦＯとインキュベートすることによって解乳化した。アガロースゲルビーズをＬｏｗ−ＥＤＴＡ  ＴＥ中で洗浄し、次いでプライマーＡｄｐｔＡ、ｈｔ１Ｒ、ｈｔ２ＦおよびＴＲＢＣ−５Ａ＊（図１０Ａおよび１０Ｂに記載のように）、ならびにホットスタートＫＯＤ、市販のＫＯＤ反応緩衝液、および十分なｄＮＴＰと混合し、ビーズ懸濁液を形成した。ビーズ懸濁液を、ＤｒｏｐＳｅｑまたはｉｎＤｒｏｐチップ（例えば、Ｚｉｌｉｏｎｉｓら、２０１７年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１６．１５４の細胞カプセル化装置）の水相入口へと注入した。ビーズ以外のビーズ懸濁液の全ての成分を含有する担体溶液を、他の水相入口へと注入した。ビーズ懸濁液および担体溶液の流速を調整し、それにより大半の液滴にアガロースビーズが０または１個だけである。前述のように、ここでは、同じ界面活性剤含有フルオロカーボンオイルを油相として使用した。図１２は、アガロースビーズを含有する液滴をハイライトした、典型的なエマルジョンの顕微鏡画像を示す。
【０４８６】
[00542]エマルジョンを、ＯＥ−ＰＣＲ熱サイクルプログラムにかけた。ＯＥ−ＰＣＲ熱サイクルプログラムの例は、以下の通りである：９３℃で２分、［９３℃で１５秒、６３℃で３０秒、７０℃で１分］の３５サイクル、および７０℃で３分。次いで、エマルジョンは、２０％ＰＦＯを使用して解乳化し、ＳＰＲＩ精製し、ＡｄｐｔＡおよびＴＲＢＣ−５Ａ＊のネステッドバージョンを使用してさらに増幅した。増幅産物は、物理的に連結した（ヘッド−テイル方向で）、自然対合ＴＣＲのＤＮＡライブラリーと考えることができる。このライブラリーの各メンバーは、図１３−（１）に示す構造を有し、１Ｆおよび２Ｆは、それぞれアダプター配列ＡｄｐｔＡおよびＡｄｐｔＢであり、ＡＣ−５およびＢＣ−５は、それぞれＴＲＡＣおよびＴＲＢＣの５’セグメントである。増幅産物を、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴキットによって処置し、ＴＲＡＶ配列の一部を除去し（ＰＣＲ産物を過剰に切断しない、図１３−（２）参照）、次いでネステッドＴＲＢＣ−５Ａ＊およびＮｅｘｔｅｒａアダプターをターゲティングする別のプライマー（Ｔｎ５ＭＥＡまたはＴｎ５ＭＥＢ）を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、６５０ｂｐと８００ｂｐの間の長さを有するＤＮＡ断片を回収し、図１３−（３）に示す戦略を使用するＭｉＳｅｑ（６００サイクルキット）を使用して分析した。
【０４８７】
[00543]この断片化およびサイズ選択戦略により、ペアエンドリードの実質的な画分は、ＭｉＸＣＲソフトウェアパッケージを使用して、ＴＲＡＶ、ＴＲＡＪ、ＴＲＢＶ、ＴＲＢＪ遺伝子ならびに同じ物理的に連結した分子のＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３β配列を同定するのに十分な情報を含有する。典型的なＮＧＳランでは、ＴＣＲアルファ鎖（ＴＲＡ）配列を、１０００〜１００，０００個のクローンにクラスター化することができる（注入細胞数およびリード深度に依存する）。同様に、ＴＣＲベータ鎖（ＴＲＢ）配列は、１０００〜１００，０００個のクローンにクラスター化することができる。ＴＲＡおよびＴＲＢクローンにマッピングされるリードのみが保存されることに注意されたい。残りは、無視された。
【０４８８】
[00544]Ｍ０と呼ばれる数値マトリクスを作成することができ、各横列はＴＲＡクローンであり、各縦列はＴＲＢクローンであり、マトリクスのエレメント（ｉ,ｊ）の値は、リードの総数を示し、Ｒｅａｄ１配列はｉ−ｔｈ  ＴＲＡクローンにマッピングされ、Ｒｅａｄ２配列はｊ−ｔｈ  ＴＲＢクローンにマッピングされる。Ｍ０マトリクスの部分のヒートマップ可視化は、図１４に示す。
【０４８９】
[00545]１つのＴＲＡクローンが主に１つのＴＲＢクローンと対合するかどうか、および１つのＴＲＢクローンが主に１つのＴＲＡクローンと対合するかどうか評価するため、３つのＴＲＡクローンがシーケンシングデータセットから無作為に選ばれ（図１５Ａ〜Ｃ）、全てのＴＲＢクローンとの対合のリード数をプロットした。これらのＴＲＡクローンの各々は、１つのＴＲＢクローンと主に対合することが分かった。同じことが、３つの無作為に選ばれたＴＲＢクローンについても真であった（図１５Ｄ〜Ｆ）。
【０４９０】
[00546]無作為に選んだクローンを超えて全体的な概要を提供するため、本発明者らは、各ＴＲＡクローンについて（すなわち、Ｍ０マトリクスの各横列について）、上位１、２、３位の対合によって与えられる画分のリードを計算した。これらの画分は、それぞれＦＴｏｐ１、ＦＴｏｐ２、およびＦＴｏｐ３と呼ばれる。例としてＴＲＡクローン＃１４８を使用して（図１５Ａ）、全部で１５８１リードがこのＴＲＡクローンにマッピングされ、その１３４９リードがＴＲＢクローン＃７３にマッピングされ、１７５リードがＴＲＢクローン＃２１８にマッピングされ、５７リードがＴＲＢクローン＃９８５にマッピングされ、他のＴＲＢクローンにはマッピングされなかった。したがって、ＦＴｏｐ１（ＴＲＡ＃１４８）＝１３４９／１５８１＝０．８５、ＦＴｏｐ２（ＴＲＡ＃１４８）＝（１３４９＋１７５）／１５８１＝０．９６、ＦＴｏｐ３（ＴＲＡ＃１４８）＝（１３４９＋１７５＋５７）／１５８１＝１。この方法を使用して、全てのＴＲＡクローンをＦＴｏｐ１値によってランク付けすることができる。各ＴＲＡクローンの降順のランクおよび相当するＦＴｏｐ１値をプロットすることができる（図１６Ａ、データ系列Ａ１）。同様に、ＴＲＡクローンをＦＴｏｐ２値によってランク付けすることができる。各ＴＲＡクローンの降順のランクおよび相当するＦＴｏｐ２値をプロットすることができる（図１６Ａ、データ系列Ａ２）。同様に、ＴＲＡクローンをＦＴｏｐ３値によってランク付けすることができる。各ＴＲＡクローンの降順のランクおよび相当するＦＴｏｐ３値をプロットすることができる（図１７Ａ、データＡ３）。これらのプロットでは、円のサイズは、このＴＲＡクローンにマッピングした総リード数を反映する。類似のプロットを、ＴＲＢクローンについても作成することができ（図１６Ｂ）、データ系列Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３は、それぞれＦＴｏｐ１、ＦＴｏｐ２、およびＦＴｏｐ３のランク順および値を示す。ＴＲＡクローンの半分より多くについて、リードの７０％より多くが１つの単一対合によって与えられることが分かった。同じ結論がＴＲＢクローンについても示された。
【０４９１】
[00547]ライブラリー全体にわたる対合の正確性を表す計量を作成することができる。優性対合は自然対合よりも起こりやすいため、優性対合によって与えられるリードの画分を計算することができる。いくつかのクローンが他よりもより提示されることを考慮して、優性対合を定義するため、マトリクスＭ０をノーマライズし、マトリクスＭ１を作成した。Ｍ１は、Ｍ０と同じ次元を有する。Ｍ１の各エレメントの値は、以下のように計算される：
【０４９２】
【数１】
2021534245.tif 000003
【０４９３】
[00548]したがって、Ｍ１の全ての値が０と１の間である。Ｍ１ｉ,ｊが、前もって決定された閾値（優性閾値と呼ばれる）より大きい場合、対合は優性であると定義され得る。予測されるように、優性閾値が増加すると優性対合の数は減少する（図１７Ａ）。同様に、優性閾値が増加すると、優性対合によって与えられるリードの画分が減少する（図１７Ｂ、実線）。この例のライブラリーについて、優性閾値が０．７である場合、２９７の優性対合が同定され、全リードの６３％がこれらの優性対合によって与えられる。対照として、シーケンシングデータからのＴＲＡ−ＴＲＢ対合が無作為に再編成される場合、優性対合によって与えられるリードの画分は、ほぼ０％である（図１７Ｂ、点線）。
【０４９４】
[00549]本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されるが、そのような実施形態は例示のためのみに提供されることは当業者には明らかであろう。本発明が、本明細書内で提供される特定の実施例によって制限されることを意図しない。本発明は、前述の明細書を参照して記載されるが、本明細書の実施形態の説明および例示は、限定の意味と解釈されることを意味しない。多くのバリエーション、変更、および置換が、現在、本発明から逸脱することなく当業者に考えられるであろう。さらに、本発明の全ての態様が、様々な条件および変数に依存する本明細書に記載の特定の描写、形状または相対的な割合に限定されないことが理解されるべきである。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な代替物が、本発明を実施するステップで用いられ得ることが理解されるべきである。したがって、本発明が、任意のそのような代替物、改変、変形、または等価物もカバーすると考えられる。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの等価物がそれらによってカバーされることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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