(57)【要約】ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するための方法であって、ポリペプチドを含む第１及び第２のサンプルを、それぞれ、第１のプロテアーゼ（例えば、トリプシン）及び第２のプロテアーゼ（例えば、Ｔｒｙｐ−Ｎ）と接触させて、第１及び第２のセットの消化ペプチドフラグメントを生成することと、それらのセットの消化ペプチドフラグメントをフラグメント化して、セットのフラグメント化ペプチドイオンを生成することと、アルギニンまたはリジンアミノ酸残基の質量だけ質量が異なるペプチドイオンの組を、セットのペプチドイオンから選択することと、２セットから選択されたペプチドイオンの組に対してイオンタイプ（Ｎ末端またはＣ末端ペプチドイオン）を対応づけることと、いずれかのセットのペプチドイオンにおいてアミノ酸残基（複数可）の質量だけ質量が増加した同じタイプのペプチドイオンのマスラダーを選択することと、マスラダーから同定されたアミノ酸残基を組み立てて、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列を決定することとを含む方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象とするポリペプチドのアミノ酸配列を決定するための方法であって、
前記対象とするポリペプチドを含む第１のサンプルを、塩基性アミノ酸の後のペプチド結合を切断する第１のプロテアーゼと、前記第１のプロテアーゼが前記対象とするポリペプチドを消化して、第１のセットの消化ペプチドフラグメントを生成するのを可能にする条件下において接触させることと、
前記第１のセットの消化ペプチドフラグメントをフラグメント化して、前記第１のセットの消化ペプチドフラグメント中のペプチドと対応する第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンを生成することと、
前記第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンの質量を測定することと、
前記対象とするポリペプチドを含む第２のサンプルを、塩基性アミノ酸の前のペプチド結合を切断する第２のプロテアーゼと、前記第２のプロテアーゼが前記対象とするポリペプチドを消化して、第２のセットの消化ペプチドフラグメントを生成するのを可能にする条件下において接触させることと、
前記第２のセットの消化ペプチドフラグメントをフラグメント化して、前記第２のセットの消化ペプチドフラグメント中のペプチドと対応する第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンを生成することと、
前記第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンの質量を測定することと、
前記第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び前記第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンから、アルギニンアミノ酸残基の質量またはリジンアミノ酸残基の質量だけ質量が異なるペプチドイオンの組を選択することと、
前記ペプチドイオンの組に対してイオンタイプを対応づけて、同じタイプのペプチドイオンの一覧を形成することと、
アミノ酸残基（複数可）の質量だけ質量が増加したペプチドイオンのマスラダーを選択して、個々のアミノ酸残基を同定することと、
前記同定されたアミノ酸残基を組み立てて、前記対象とするポリペプチドの前記アミノ酸配列を決定することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記第１のプロテアーゼは、トリプシンプロテアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のプロテアーゼは、Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１の消化ペプチドフラグメントを、前記第１のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することと、
前記第１の消化ペプチドフラグメントと同一の質量を有する第２の消化ペプチドフラグメントを、前記第２のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することと
をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第１の消化ペプチドフラグメントを、前記第１のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することと、
リジンアミノ酸残基とアルギニンアミノ酸残基との間の質量差と等しい前記第１の消化ペプチドフラグメントとの質量差を有する質量を有する第２の消化ペプチドフラグメントを、前記第２のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することと
をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のセットの消化ペプチドフラグメントからの前記第１の消化ペプチドフラグメントは、フラグメント化されて、前記第１の消化ペプチドフラグメントと対応する第１のシリーズのフラグメント化ペプチドイオンを生成し、前記第２のセットの消化ペプチドフラグメントからの前記第１の消化ペプチドフラグメントと対応する前記第２の消化ペプチドフラグメントは、フラグメント化されて、前記第２の消化ペプチドフラグメントと対応する第２のシリーズのフラグメント化ペプチドイオンを生成し、
前記ペプチドイオンの組を対応づけて、アミノ酸配列を導き出すことは、
前記ペプチドイオンの組に対してイオンタイプを対応づけ、同じタイプのペプチドイオンの一覧を形成することと、
アミノ酸残基（複数可）の質量だけ質量が増加したペプチドイオンのマスラダーを選択して、前記一覧に対して個々のアミノ酸残基を同定することと、
前記同定されたアミノ酸残基を組み立てて、前記対象とするポリペプチドの前記アミノ酸配列を決定することと
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び前記第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからアルギニンアミノ酸残基の質量だけ質量が異なるペプチドイオンの組が選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び前記第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンの組間におけるアルギニンアミノ酸残基の質量のマイナスの差は、前記ペプチドがＮ末端アルギニン残基を有することを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び前記第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンの組間におけるアルギニンアミノ酸残基の質量のプラスの差は、前記ペプチドがＣ末端アルギニン残基を有することを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び前記第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからリジンアミノ酸残基の質量だけ質量が異なるペプチドイオンの組が選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び前記第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンの組間におけるリジンアミノ酸残基の質量のマイナスの差は、前記ペプチドがＮ末端リジン残基を有することを示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び前記第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンの組間におけるリジンアミノ酸残基の質量のプラスの差は、前記ペプチドがＣ末端リジン残基を有することを示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択された前記フラグメント化ペプチドイオンは、前記第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択された前記フラグメント化ペプチドイオンと対応する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択された前記フラグメント化ペプチドイオンは、ｂイオンであり、前記第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択された前記フラグメント化ペプチドイオンは、アルギニンアミノ酸残基の質量またはリジンアミノ酸残基の質量の差を有するｂイオンである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択された前記フラグメント化ペプチドイオンは、ｙイオンであり、前記第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択された前記フラグメント化ペプチドイオンは、アルギニンアミノ酸残基の質量またはリジンアミノ酸残基の質量の差を有するｙイオンである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
質量は、マススペクトロメトリーを使用して測定される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記フラグメントイオンは、タンデムマススペクトロメトリーを使用して生成される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象とするポリペプチドは、タンパク質を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象とするポリペプチドは、モノクローナル抗体を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象とするポリペプチドは、単一特異性抗体または二重特異性抗体を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、２０１９年８月１６日に作成され、７，７４７バイトを含むファイル１０４７８ＷＯ０１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出した配列表を参照によって組み込む。
【０００２】
発明の分野
本発明は、バイオ医薬品に関し、タンパク質またはポリペプチド配列のｄｏ  ｎｏｖｏ決定に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
タンパク質シークエンシングは、従来、エドマン分解化学を使用した個々に切断されたＮ末端アミノ酸の逐次検出、ならびに例えば、ＨＰＬＣ保持及びＵＶ吸収の差などの技術を使用した異なるアミノ酸エドマン誘導体の検出及び同定に依存してきた。さらに最近では、増した速度、精度及び感度でタンパク質またはポリペプチドをシークエンシング及び／または同定するためにマススペクトロメトリーが使用されてきた。しかしながら、これらの方法は、一般にロースループットであり、依然としてエドマン分解に依存している。同時に多くの異なる核酸分子をシークエンシングすることができるハイスループットな大規模並列ＤＮＡシークエンシングプラットフォームに劇的な改善が行われてきたが、質量分析計の性能の進歩は漸進的であった。個々の単一のアミノ酸残基レベルで全体のタンパク質シークエンシングをするための「次の世代」プラットフォームの開発に対してなされたのは比較的小さな進歩であった。
【０００４】
したがって、単一のポリペプチドをシークエンシングするための新規の方法及びアッセイが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、本発明は、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列のｄｅ  ｎｏｖｏ決定のための方法を提供し、本方法は、対象とするポリペプチドを含む第１のサンプルを、塩基性アミノ酸の後のペプチド結合を切断する第１のプロテアーゼと、第１のプロテアーゼが対象とするポリペプチドを消化して、第１のセットの消化ペプチドフラグメントを生成するのを可能にする条件下において接触させることと、第１のセットの消化ペプチドフラグメントをフラグメント化して、第１のセットの消化ペプチドフラグメント中のペプチドと対応する第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンを生成することと、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンの質量を測定することと、対象とするポリペプチドを含む第２のサンプルを、塩基性アミノ酸の前のペプチド結合を切断する第２のプロテアーゼと、第２のプロテアーゼが対象とするポリペプチドを消化して、第２のセットの消化ペプチドフラグメントを生成するのを可能にする条件下において接触させることと、第２のセットの消化ペプチドフラグメントをフラグメント化して、第２のセットの消化ペプチドフラグメント中のペプチドと対応する第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンを生成することと、第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンの質量を測定することと、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからアルギニンアミノ酸の質量またはリジンアミノ酸の質量だけ質量が異なるペプチドイオンの組を選択することと、２セットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたペプチドイオンの組に対してイオンタイプ（Ｎ末端ペプチドイオンまたはＣ末端ペプチドイオンのいずれか）を対応づけることと、いずれかのセットのフラグメント化ペプチドイオンにおいてアミノ酸残基（複数可）の質量だけ質量が増加した同じタイプのペプチドイオンのマスラダーを選択することと、ペプチドイオンのマスラダーから同定されたアミノ酸残基を組み立てて、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列を決定することとを含む。
【０００６】
本方法のいくつかの実施形態において、第１のプロテアーゼは、トリプシンである。
【０００７】
本方法のいくつかの実施形態において、第２のプロテアーゼＴｒｙｐ−Ｎ。
【０００８】
一部の実施形態において、本方法は、第１の消化ペプチドフラグメントを、第１のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することと、第１の消化ペプチドフラグメントと同一の質量を有する第２の消化ペプチドフラグメントを、第２のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することとをさらに含む。
【０００９】
一部の実施形態において、本方法は、第１の消化ペプチドフラグメントを、第１のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することと、第１の消化ペプチドフラグメントと比較して、リジンアミノ酸残基とアルギニンアミノ酸残基との間の質量差と等しい質量差を有する質量を有する第２の消化ペプチドフラグメントを、第２のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することとをさらに含む。
【００１０】
本方法のさまざまな実施形態において、フラグメント化ペプチドイオンの組を対応づけて、アミノ酸配列を導き出すことは、第１の消化ペプチドフラグメントを、第１のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することと、第１の消化ペプチドフラグメントをフラグメント化して、第１の消化ペプチドフラグメントと対応する第１のシリーズのフラグメント化ペプチドイオンを生成することと、第１の消化ペプチドフラグメントと対応する第２の消化ペプチドフラグメントを、第２のセットの消化ペプチドフラグメントからを選択することと、第２の消化ペプチドフラグメントをフラグメント化して、第２の消化ペプチドフラグメントと対応する第２のシリーズのフラグメント化ペプチドイオンを生成することと、２セットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたペプチドイオンの組に対してイオンタイプ（Ｎ末端ペプチドイオンまたはＣ末端ペプチドイオンのいずれか）を対応づけることと、いずれかのセットのフラグメント化ペプチドイオンにおいてアミノ酸残基（複数可）の質量だけ質量が増加した同じタイプのペプチドイオンのマスラダーを選択することと、第１及び第２の消化ペプチドフラグメントの個々のアミノ酸残基を、ペプチドイオンの選択されたマスラダーから決定して、第１及び／または第２のフラグメント化ペプチドのアミノ酸配列を生成することとを含む。
【００１１】
さまざまな実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからアルギニンアミノ酸残基の質量だけ質量が異なるペプチドイオンの組が選択される。さまざまな実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンの組におけるアルギニンアミノ酸残基の質量のマイナスの差は、ペプチドがＮ末端アルギニン残基を有することを示す。さまざまな各種実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンの組におけるアルギニン残基の質量のプラスの差は、ペプチドがＣ末端アルギニン残基を有することを示す。さまざまな各種実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからリジンアミノ酸残基の質量だけ質量が異なるペプチドイオンの組が選択される。実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンの組におけるリジンアミノ酸残基の質量のマイナスの差は、ペプチドがＮ末端リジン残基を有することを示す。実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンの組におけるリジンアミノ酸残基の質量のプラスの差は、ペプチドがＣ末端リジン残基を有することを示す。
【００１２】
本方法のさまざまな実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンは、第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンと対応する。
【００１３】
本方法のさまざまな実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンは、ｂイオンであり、第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンは、アルギニンアミノ酸残基の質量またはリジンアミノ酸残基の質量の差を有するｂイオンである。
【００１４】
本方法のさまざまな実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンは、ｙイオンであり、第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンは、アルギニンアミノ酸の質量またはリジンアミノ酸の質量の差を有するｙイオンである。
【００１５】
本方法のさまざまな実施形態において、質量は、マススペクトロメトリーを使用して測定される。
【００１６】
本方法のさまざまな実施形態において、フラグメントイオンは、タンデムマススペクトロメトリーを使用して生成される。
【００１７】
本方法のさまざまな実施形態において、対象とするポリペプチドは、タンパク質を含む。
【００１８】
本方法のさまざまな実施形態において、対象とするポリペプチドは、モノクローナル抗体、単一特異性抗体または二重特異性抗体などの抗体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼ消化を使用したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）配列カバレッジを示す。配列カバレッジは、９１．４％である。ＢＳＡのＴｒｙｐ−Ｎ消化物から形成されたさまざまなペプチドフラグメントを、ＢＳＡタンパク質配列（配列番号１）の下に示す。
【図１Ｂ】Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼ消化を使用したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）配列カバレッジを示す。配列カバレッジは、９１．４％である。ＢＳＡのＴｒｙｐ−Ｎ消化物から形成されたさまざまなペプチドフラグメントを、ＢＳＡタンパク質配列（配列番号１）の下に示す。
【図２Ａ】トリプシンプロテアーゼ消化を使用したＢＳＡ配列カバレッジを示す。配列カバレッジは、９４．２％である。ＢＳＡのトリプシン消化物から形成されたさまざまなペプチドフラグメントを、ＢＳＡタンパク質配列（配列番号１）の下に示す。
【図２Ｂ】トリプシンプロテアーゼ消化を使用したＢＳＡ配列カバレッジを示す。配列カバレッジは、９４．２％である。ＢＳＡのトリプシン消化物から形成されたさまざまなペプチドフラグメントを、ＢＳＡタンパク質配列（配列番号１）の下に示す。
【図３】Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼ及びトリプシンプロテアーゼによるモデルポリペプチドの消化物から形成された得られたペプチドフラグメントを示す。４つの異なる主要なタンパク質配列パターンが考えられる。
【図４】図３のケース（１）に記載されるとおりに形成されたＢＳＡのペプチドの分析を示す。配列ＫＬＶＮＥＬＴＥＦＡＫ（配列番号２）を含むポリペプチドに対するトリプシンによる消化は、ペプチドＬＶＮＥＬＴＥＦＡＫ（配列番号３）をもたらす。Ｔｒｙｐ−Ｎによる消化は、ペプチドＫＬＶＮＥＬＴＥＦＡ（配列番号４）をもたらす。この２つのペプチドは、同じ質量を有する。しかしながら、マススペクトロメトリー分析の間にフラグメント化されると、各ペプチドから得られたｂイオンまたは各ペプチドからのｙイオンは、１つのリジンアミノ酸残基の質量だけ異なる。
【図５Ａ】トリプシン消化物に対する図４に示した分析から得られたマススペクトルを示す。図５Ａは、検出されたｂ及びｙイオンを示す、タンデムマススペクトロメトリーに供されたペプチドＬＶＮＥＬＴＥＦＡＫ（配列番号３）の例となるマススペクトルである。
【図５Ｂ】Ｔｒｙｐ−Ｎ消化物に対する図４に示した分析から得られたマススペクトルを示す。図５Ｂは、検出されたｂ及びｙイオンを示す、タンデムマススペクトロメトリーに供されたペプチドＫＬＶＮＥＬＴＥＦＡ（配列番号４）の例となるマススペクトルである。
【図５Ｃ】マススペクトルから形成されたトリプシン及びＴｒｙｐ−Ｎイオンマップからのペプチドの一次配列の形成を示す。図５Ｃは、トリプシン消化物及びＴｒｙｐ−Ｎ消化物に対して決定されたイオンマップを使用した一次配列ＬＶＮＥＬＴＥＦＡ（配列番号５）の形成を示す。
【図６】図３のケース（２）に記載されているとおりに形成されたＢＳＡのペプチドの分析を示す。配列ＲＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲ（配列番号６）を含むポリペプチドに対するトリプシンによる消化は、ペプチドＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲ（配列番号７）をもたらす。Ｔｒｙｐ−Ｎによる消化は、ペプチドＲＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬ（配列番号８）をもたらす。この２つのペプチドは、同じ質量を有する。しかしながら、マススペクトロメトリー分析の間にフラグメント化されると、各ペプチドから得られたｂイオンまたは各ペプチドからのｙイオンは、１つのアルギニンアミノ酸残基の質量だけ異なる。
【図７Ａ】トリプシン消化物に対する図６に示した分析から得られたマススペクトルを示す。図７Ａは、検出されたｂ及びｙイオンを示す、タンデムマススペクトロメトリーに供されたペプチドＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲ（配列番号７）の例となるマススペクトルである。
【図７Ｂ】Ｔｒｙｐ−Ｎ消化物に対する図６に示した分析から得られたマススペクトルを示す。図７Ｂは、検出されたｂ及びｙイオンを示す、タンデムマススペクトロメトリーに供されたペプチドＲＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬ（配列番号８）の例となるマススペクトルである。
【図７Ｃ】マススペクトルから形成されたトリプシン及びＴｒｙｐ−Ｎイオンマップからのペプチドの一次配列の形成を示す。図７Ｃは、トリプシン消化物及びＴｒｙｐ−Ｎ消化物に対して決定されたイオンマップを使用した一次配列ＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬ（配列番号９）の形成を示す。
【図８】図３のケース（３）に記載されているとおりに形成されたＢＳＡのペプチドの分析を示す。配列ＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲ（配列番号１０）を含むポリペプチドに対するトリプシンによる消化は、ペプチドＣＣＴＥＳＬＶＮＲ（配列番号１１）をもたらす。Ｔｒｙｐ−Ｎによる消化は、ペプチドＫＣＣＴＥＳＬＶＮ（配列番号１２）をもたらす。この場合、この２つのペプチドは、同じ質量を有していない。しかしながら、マススペクトロメトリー分析の間にフラグメント化されると、各ペプチドから得られたｂイオンまたは各ペプチドからのｙイオンは、１つのリジンアミノ酸残基（ｂイオン）または１つのアルギニンアミノ酸残基（ｙイオン）の質量だけ異なる。
【図９Ａ】トリプシン消化物に対する図８に示した分析から得られたマススペクトルを示す。図９Ａは、検出されたｂ及びｙイオンを示す、タンデムマススペクトロメトリーに供されたペプチドＣＣＴＥＳＬＶＮＲ（配列番号１１）の例となるマススペクトルである。
【図９Ｂ】Ｔｒｙｐ−Ｎ消化物に対する図８に示した分析から得られたマススペクトルを示す。図９Ｂは、検出されたｂ及びｙイオンを示す、タンデムマススペクトロメトリーに供されたペプチドＫＣＣＴＥＳＬＶＮ（配列番号１２）の例となるマススペクトルである。
【図９Ｃ】マススペクトルから形成されたトリプシン及びＴｒｙｐ−Ｎイオンマップからのペプチドの一次配列の形成を示す。図９Ｃは、トリプシン消化物及びＴｒｙｐ−Ｎ消化物に対して決定されたイオンマップを使用した一次配列ＣＣＴＥＳＬＶＮ（配列番号１３）の形成を示す。
【図１０】図３のケース（４）に記載されているとおりに形成されたＢＳＡのペプチドの分析を示す。配列ＲＦＫＤＬＧＥＥＨＦＫ（配列番号１４）を含むポリペプチドに対するトリプシンによる消化は、ペプチドＦＫＤＬＧＥＥＨＦＫ（配列番号１５）をもたらす。Ｔｒｙｐ−Ｎによる消化は、ペプチドＲＦＫＤＬＧＥＥＨＦ（配列番号１６）をもたらす。この場合、この２つのペプチドは、同じ質量を有していない。しかしながら、マススペクトロメトリー分析の間にフラグメント化されると、各ペプチドから得られたｂイオンまたは各ペプチドからのｙイオンは、１つのリジンアミノ酸残基（ｙイオン）または１つのアルギニンアミノ酸残基（ｂイオン）だけ質量が異なる。
【図１１Ａ】トリプシン消化物に対する図１０に示した分析から得られたマススペクトルを示す。図１１Ａは、検出されたｂ及びｙイオンを示す、タンデムマススペクトロメトリーに供されたペプチドＦＫＤＬＧＥＥＨＦＫ（配列番号１５）の例となるマススペクトルである。
【図１１Ｂ】Ｔｒｙｐ−Ｎ消化物に対する図１０に示した分析から得られたマススペクトルを示す。図１１Ｂは、検出されたｂ及びｙイオンを示す、タンデムマススペクトロメトリーに供されたペプチドＲＦＫＤＬＧＥＥＨＦ（配列番号１６）の例となるマススペクトルである。
【図１１Ｃ】マススペクトルから形成されたトリプシン及びＴｒｙｐ−Ｎイオンマップからのペプチドの一次配列の形成を示す。図１１Ｃは、トリプシン消化物及びＴｒｙｐ−Ｎ消化物に対して決定されたイオンマップを使用した一次配列ＦＫＤＬＧＥＥＨＦ（配列番号１７）の形成を示す。
【図１２】特定の例となる実施形態によるポリペプチドの配列を決定するための方法を示すブロック図である。
【図１３】特定の例となる実施形態によるｄｅ  ｎｏｖｏポリペプチドシークエンシングの方法のさまざまなステップを実施するために使用され得る例となるコンピューティングシステムである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明を記載する前に、本発明は、記載されている特定の方法及び実験条件に限定されず、したがって、方法及び条件は変化する場合もあることが理解されるべきである。本明細書中で使用される術語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図しないことも理解されるべきである。任意の実施形態または実施形態の特徴が互いに組み合されてもよく、そのような組み合わせは、本発明の範囲内に明白に包含される。
【００２１】
別に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で使用される場合、挙げられた特定の数値に対する言及に使用される場合の「約」という用語は、その値が挙げられた値から１％を超えない量だけ変化してもよいことを意味する。例えば、本明細書中で使用される場合、「約１００」という表現は、９９及び１０１ならびにその間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００２２】
本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法及び材料が本発明の実施または試験に使用されてもよいが、好ましい方法及び材料をこれから記載する。本明細書において述べられているすべての特許、出願及び非特許出版物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２３】
本明細書中で使用される略語
ＭＳ／ＭＳ：タンデムマススペクトロメトリー
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＬＣ：軽鎖
ＨＣ：重鎖
ＭＳ：マススペクトロメトリー
【００２４】
定義
「抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ジスルフィド結合によって相互に結合した２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖である４つのポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「完全な抗体分子」）、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合フラグメントを指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）及び（ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される）重鎖定常領域から構成される。さまざまな実施形態において、重鎖は、ＩｇＧアイソタイプであってもよい。場合によっては、重鎖はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される。いくつかの実施形態において、重鎖は、任意にアイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を含む、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４のものである。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、組み換え手段によって作製された、発現された、作り出された、または単離された抗体分子、例えば、その抗体を発現するようトランスフェクションされた宿主細胞から単離された抗体を含む。抗体構造に関する概説については、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，  ２７（１）  Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５５−７７  （２００３）；及びＭ．  Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ２（１）  Ｓｕｒｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．  ２７−４２  （１９８３）を参照のこと。
【００２５】
抗体という用語は、２つ以上の異なるエピトープと結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む、「二重特異性抗体」も包含する。１つの重鎖及び１つの軽鎖及び６つのＣＤＲを含む、二重特異性抗体の半分は、１つの抗原またはエピトープと結合し、抗体の残りの半分は、異なる抗原またはエピトープと結合する。場合によっては、二重特異性抗体は、同じ抗原だが異なるエピトープまたは重複しないエピトープで結合することができる。場合によっては、二重特異性抗体の両半分は、二重特異性を保持しながら同一の軽鎖を有する。二重特異性抗体については、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）に概して記載されている。
【００２６】
抗体（または「抗体フラグメント」）の「抗原結合部分」という用語は、抗原と特異的に結合する能力を保持した抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結びつけられた２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ′）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ２４１：５４４−５４６）、（ｖｉ）単離ＣＤＲ、ならびに（ｖｉｉ）合成リンカーによって連結されて、単一のタンパク質鎖を形成するＦｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨからなり、その中でＶＬ及びＶＨ領域が対になって、一価の分子を形成するｓｃＦｖが挙げられる。ダイアボディなどの単鎖抗体のその他の形態も「抗体」という用語に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｔ．  （１９９３）  ９０  ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ６４４４−６４４８；ａｎｄ  Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｔ．  （１９９４）  ２  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １１２１−１１２３を参照）。
【００２７】
さらに、抗体及びその抗原結合フラグメントは、当該技術分野において一般的に知られている標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９参照）。
【００２８】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒトｍＡｂは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボにおける体細胞変異によって組み込まれる変異）を、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含んでもよい。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列にグラフトされたｍＡｂを含むことは意図されない。この用語は、非ヒト哺乳動物において、または非ヒト哺乳動物の細胞において組み換えで作製された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離されたか、またはヒト対象において形成された抗体を含むことは意図されない。
【００２９】
「サンプル」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば、分離、分析、抽出、濃縮またはプロファイリングを含む、本発明の方法による操作を受けた、少なくとも対象とするポリペプチド、例えば、モノクローナル抗体を含む分子の混合物を指す。
【００３０】
「分析」または「分析すること」という用語は、本明細書中で使用される場合、同義に使用され、目的とする分子（例えば、モノクローナル抗体などのポリペプチド）を分離する、検出する、単離する、精製する、可溶化する、検出する及び／または特徴づける任意の各種方法を指す。例としては、固相抽出、固相マイクロ抽出、電気泳動、マススペクトロメトリー、例えば、タンデムマススペクトロメトリー、液体クロマトグラフィー、例えば、高性能、例えば、逆相、順相、またはサイズ排除、イオン対液体クロマトグラフィー、液体液体抽出、例えば、加速流体抽出、超臨界流体抽出、マイクロ波支援抽出、膜抽出、ソックスレー抽出、沈殿、浄化、電気化学検出、染色、元素分析、核磁気共鳴、赤外分析、フローインジェクション分析、キャピラリー電気クロマトグラフィー、紫外検出、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
「クロマトグラフィー」は、本明細書中で使用される場合、混合物、例えば、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド及び／または抗体、例えば、モノクローナル抗体を含む混合物を分離するプロセスを指す。これは、混合物を固定相を通過させることを含み、この固定相は、混合物中の他の分子から対象とする分子を分離し、１つ以上の対象とする分子が単離されるのを可能にする。クロマトグラフィー分離の方法の例としては、毛細管現象クロマトグラフィー、例えば、中でもペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、カラムクロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどのゲルクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、及び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）が挙げられる。
【００３２】
「接触させること」は、本明細書中で使用される場合、少なくとも２つの物質を溶液または固相中で一緒にすることを含み、例えば、サンプルをプロテアーゼと接触させることである。
【００３３】
「対応する」という用語は、位置、目的または構造における類似性を示す相対語であり、ＮまたはＣ末端のアルギニンまたはリジンアミノ酸残基の有無は別として同一の構造のペプチドを含んでもよい。一部の実施形態において、ＮまたはＣ末端のアルギニンまたはリジンアミノ酸残基の有無は別として同一の構造の対応するペプチドによるマススペクトルにおけるマススペクトル信号は、「対応する」マススペクトル信号である。特定のペプチドによるマススペクトル信号は、ペプチドと対応する信号とも言及される。特定の実施形態において、特定のペプチド配列またはアミノ酸のセットを、対応するペプチド質量に対応づけることができる。
【００３４】
「フラグメントペプチド」または「ペプチドフラグメント」という用語は、本明細書中で使用される場合、フラグメント化、酵素的タンパク質分解、または化学的加水分解を含むプロセスにより完全長ポリペプチド、例えば、タンパク質及び／またはモノクローナル抗体から誘導されるペプチドを指す。そのようなタンパク質分解ペプチドとしては、トリプシンまたはＴｒｙｐ−Ｎなどの１つ以上のプロテアーゼによるタンパク質の処理によって生成されるペプチドが挙げられる。フラグメントペプチド、またはペプチドフラグメントは、消化ペプチドであってもよい。
【００３５】
「単離された」という用語は、本明細書中で使用される場合、成分が天然に生じるか、または遺伝子導入で発現される生物の細胞中の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質、脂質、ならびに代謝産物から実質的に分離されたか、それらとは別に生成されたか、またはそれらから精製された生物学的成分（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、または代謝産物）を指す。したがって、「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質、脂質及び代謝産物としては、標準的または非標準的な精製方法によって精製された核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、及び代謝産物が挙げられる。この用語は、宿主細胞において組み換え発現によって作製された核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、及び代謝産物ならびに化学合成ペプチド、脂質、代謝産物、及び核酸も包含する。
【００３６】
「マススペクトロメトリー」は、後で、質量対電荷比（ｍ／ｚ）に従って分離され、検出される気相イオンをサンプルから発生させることによってサンプルが分析される方法である。気相イオンをサンプルから発生させる方法としては、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、化学イオン化、及び電子衝撃イオン化（ＥＩ）が挙げられる。ｍ／ｚ比によるイオンの分離は、四重極質量分析器（Ｑ）、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析器、磁場型質量分析器、３Ｄ及び線形イオントラップ（ＩＴ）、オービトラップ質量分析器、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）分析器、ならびにそれらの組み合わせ（例えば、四重極飛行時間型分析器、またはＱ−ＴＯＦ分析器）含む、任意のタイプの質量分析器を用いて成し遂げられてもよい。分離に先立って、サンプルは、一次元以上のクロマトグラフィー分離、例えば、一次元以上の液体またはサイズ排除クロマトグラフィーに供されてもよい。
【００３７】
タンデムマススペクトロメトリーまたはＭＳ／ＭＳは、選択されたイオン（プレカーサーイオン）をフラグメント（プロダクトイオン）に分解する技術である。その結果、フラグメントは、プレカーサーイオンの化学構造の特徴を明らかにする。タンデムマススペクトロメトリーにおいて、サンプルが、（例えば、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ、ＥＩなどによって）イオン化されて、イオンの混合物を生じると、特定の質量対電荷比（ｍ／ｚ）のプレカーサーイオン、例えば、消化物からのペプチドが選択され（ＭＳ１）、その後、フラグメント化されて（ＭＳ２）、検出のためのプロダクトイオンを形成する。典型的なタンデムＭＳ機器としては、ＱｑＱ、ＱＴＯＦ、及びハイブリッドイオントラップ／ＦＴＭＳなどが挙げられる。タンデムマススペクトロメトリーの用途の一例は、タンパク質同定である。第１の質量分析器は、イオン源に導入された後、そこから出てくる多くのペプチドのうち単一のペプチド種を表す特定のｍ／ｚ値のイオンを分離する。そうしたイオンは、その後、アルゴンなどの不活性ガスが入っている衝突室へ加速して入れられて、イオンフラグメント化を誘起する。このプロセスは、衝突誘起解離（ＣＩＤ）または衝突活性化解離（ＣＡＤ）と呼ばれる。その後、フラグメントイオンのｍ／ｚ値が第２の質量分析器において測定されて、アミノ酸配列情報を得る。タンデムマススペクトロメトリーは、本明細書中で開示されている方法によりペプチド、したがって、完全長または部分長タンパク質の配列を同定するために使用することができる。タンデムマススペクトルから生じたペプチドフラグメントを示すための表示法が開発された。本明細書中で使用される場合、ペプチドフラグメントイオンは、Ｎ末端に電荷が保持される場合、ｂによって示され、Ｃ末端に電荷が保持される場合、ｙによって示される。ｂまたはｙの後に続く数は、フラグメント中のアミノ酸の番号を示す。プレカーサーイオンは、多くの異なる方法で活性化することができる（内部エネルギーの増加を伴い）。フラグメント化パターンは、プレカーサーイオンにエネルギーが移される方法、移されたエネルギーの量、及び移されたエネルギーが内部に分散させられる方法により決まる。衝突誘起解離及び赤外多光子解離は、イオンのボルツマン温度を高めることにより、最も弱い結合を選択的に切断して、主にｂ及びｙイオンを生成する「緩加熱」技術である。
【００３８】
「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、同義に、ペプチド結合またはペプチド結合模倣物によって連結されたアミノ酸及び／またはアミノ酸アナログの重合体を指す。２０の天然に存在するアミノ酸ならびにその１文字及び３文字の呼称は、以下のとおりである：アラニン  Ａ  Ａｌａ；システイン  Ｃ  Ｃｙｓ；アスパラギン酸  Ｄ  Ａｓｐ；グルタミン酸  Ｅ  Ｇｌｕ；フェニルアラニン  Ｆ  Ｐｈｅ；グリシン  Ｇ  Ｇｌｙ；ヒスチジン  Ｈ  Ｈｉｓ；イソロイシン  Ｉ  Ｈｅ；リジン  Ｋ  Ｌｙｓ；ロイシン  Ｌ  Ｌｅｕ；メチオニン  Ｍ  Ｍｅｔ；アスパラギン  Ｎ  Ａｓｎ；プロリン  Ｐ  Ｐｒｏ；グルタミン  Ｑ  Ｇｉｎ；アルギニン  Ｒ  Ａｒｇ；セリン  Ｓ  Ｓｅｒ；トレオニン  Ｔ  Ｔｈｒ；バリン  Ｖ  Ｖａｌ；トリプトファン  ｗ  Ｔｒｐ；及びチロシン  Ｙ  Ｔｙｒ。
【００３９】
アミノ酸の質量に対する言及は、天然の存在量などの所与の同位体の存在量におけるアミノ酸のモノアイソトピック質量または平均質量を意味する。いくつかの例において、アミノ酸の質量は、例えば、同位元素でアミノ酸を標識することによって歪められることがある。アミノ酸の正確な同位体組成に基づいて、個々の単一のアミノ酸に関して、アミノ酸の平均質量を中心にある程度のばらつきが予想される。アミノ酸に関するモノアイソトピック及び平均質量を含む質量を、当業者は容易に得ることができる。
【００４０】
同様に、ペプチドの質量に対する言及は、天然の存在量などの所与の同位体の存在量におけるペプチドのモノアイソトピック質量または平均質量を意味する。いくつかの例において、ペプチドの質量は、例えば、同位元素でペプチド中の１つ以上のアミノ酸を標識することによって歪められることがある。ペプチドの正確な同位体組成に基づいて、個々の単一のペプチドに関して、ペプチドの平均質量を中心にある程度のばらつきが予想される。特定のペプチドの質量を、当業者は求めることができる。
【００４１】
概括的な説明
本開示の態様は、対象とするモノクローナル抗体またはその他のタンパク質などの対象とするポリペプチドのアミノ酸配列を決定するための方法に関する。ＤＮＡシークエンシングと酷似して、本開示の方法は、ポリペプチドの配列についての事前情報を必要としない。参考のために、図１２は、限定するものではないが、例となる本開示の方法に関するワークフローを示す。本開示の方法の特有の特徴の１つは、それぞれ、塩基性アミノ酸の前後のペプチド結合を切断または開裂するプロテアーゼの組の使用である。トリプシンなどの第１のプロテアーゼは、アルギニンまたはリジン残基の後などの塩基性アミノ酸の直後のペプチド結合を切断する一方で、Ｔｒｙｐ−Ｎなどの第２のプロテアーゼは、アルギニンまたはリジン残基の前などの塩基性アミノ酸の直前のペプチド結合を切断する（各プロテアーゼによるウシ血清アルブミン消化物中に生成されるペプチドのマップが図１及び２に示される）。本発明者らは、そのようなセットのプロテアーゼをマススペクトロメトリー技術とともに使用して、２つの酵素により別々に消化されたポリペプチドの配列を決定することができることを認識した。
【００４２】
したがって、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列を決定する方法が本明細書中で開示されている。方法の実施形態において、（例えば、未知の配列の）対象とするポリペプチドを含む第１のサンプルなどのサンプルは、第１のプロテアーゼと、第１のプロテアーゼが対象とするポリペプチドを消化し、消化ペプチドフラグメント、例えば、第１のセットの消化ペプチドフラグメントを生成するのを可能にする条件下において接触させられる。例えば、重複するフラグメントを生成するための消化物は、完全な消化物または不完全な消化物であってもよい。同時、または任意の順序で連続的になどの並行した実施形態において、対象とするポリペプチドを含む、第１のサンプルから分割された第２のサンプルなどのサンプルは、Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼなどの第２のプロテアーゼと、第２のプロテアーゼが対象とするポリペプチドを消化し、消化ペプチドフラグメント、例えば、第２のセットの消化ペプチドフラグメントを生成するのを可能にする条件下において接触させられる。例えば、重複するフラグメントを生成するための消化物は、完全な消化物または不完全な消化物であってもよい。
【００４３】
図３は、示されるとおり、リジン残基及び／またはアルギニン残基が結合したなどの、２つの塩基性アミノ酸が結合したポリペプチドの部分に対して形成される消化ペプチドフラグメントを示す。図３に示されるとおり、示されるとおり、リジン残基またはアルギニン残基がＮまたはＣ末端のいずれかに結合した（各酵素対して４つ）８種が形成され得る。ケース（１）では、ペプチド配列（より大きなペプチドまたはタンパク質の文脈で）は、リジン（Ｋ）アミノ酸残基がＮ及びＣ末端に結合している。トリプシンプロテアーゼは、リジンアミノ酸の後のペプチド鎖（すなわち、リジンアミノ酸のＣ末端）を切断するため、トリプシンプロテアーゼによる消化は、Ｃ末端リジンアミノ酸残基を有するフラグメントペプチドをもたらす。Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼは、リジンアミノ酸の前のペプチド鎖（すなわち、リジンアミノ酸のＮ末端）を切断するため、Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼによる消化は、Ｎ末端リジンアミノ酸残基を有するフラグメントペプチドをもたらす。ケース（２）では、ペプチド配列（より大きなペプチドまたはタンパク質の文脈で）は、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基がＮ及びＣ末端に結合している。トリプシンプロテアーゼは、アルギニンアミノ酸の前のペプチド鎖（すなわち、アルギニンアミノ酸のＣ末端）を切断するため、トリプシンプロテアーゼによる消化は、Ｃ末端アルギニンアミノ酸残基を有するフラグメントペプチドをもたらす。Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼは、アルギニンアミノ酸の前のペプチド鎖（すなわち、アルギニンアミノ酸のＮ末端）を切断するため、Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼによる消化は、Ｎ末端アルギニンアミノ酸残基を有するフラグメントペプチドをもたらす。ケース（３）では、ペプチド配列（より大きなペプチドまたはタンパク質の文脈で）は、リジンアミノ酸残基がＮ末端に、アルギニンアミノ酸残基がＣ末端に結合している。トリプシンプロテアーゼによる消化は、Ｃ末端アルギニンアミノ酸残基を有するフラグメントペプチドをもたらす。Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼによる消化は、Ｎ末端リジンアミノ酸残基を有するフラグメントペプチドをもたらす。ケース（４）では、ペプチド配列（より大きなペプチドまたはタンパク質の文脈で）は、アルギニンアミノ酸残基がＮ末端に、リジンアミノ酸残基がＣ末端に結合している。トリプシンプロテアーゼによる消化は、Ｃ末端リジンアミノ酸残基を有するフラグメントペプチドをもたらす。Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼによる消化は、Ｎ末端アルギニンアミノ酸残基を有するフラグメントペプチドをもたらす。
【００４４】
本発明者らは、例えば、タンデム質量分析計において、フラグメント化の間に、個々の消化ペプチドフラグメント（前述のケース１〜４を参照）から生成されるｂ及びｙイオンが、トリプシンまたはＴｒｙｐ−Ｎによって消化されたかに応じてアルギニンアミノ酸残基またはリジンアミノ酸残基のいずれかの質量だけ質量が異なることになることを認識した。本発明者らは、この差をフラグメントイオンに関してＮ末端またはＣ末端イオンタイプを決定し、アミノ酸残基（複数可）の質量だけ質量が増加した同じタイプのフラグメントイオンのマスラダーから同定されたアミノ酸残基を特定のペプチドの配列に組み立てるために活用することができること、ならびにこうしたペプチド配列自体をモノクローナル抗体などのポリペプチドの完全長アミノ酸配列に組み立てることができることをさらに認識した。表１は、特定のトリプシンフラグメントイオンの質量から特定のＴｒｙｐ−Ｎフラグメントイオンの質量を引くことによってトリプシン消化物及びＴｒｙｐ−Ｎ消化物に関するｂ及びｙフラグメントイオンの質量の差を示す。
【００４５】
（表１）ｂ及びｙフラグメントイオンの質量の差。
2021534408.tif 000003
【００４６】
例として、ケース（１）に関して、Ｔｒｙｐ−Ｎ消化物のｂ７フラグメントイオンの質量を引いた、トリプシン消化物のｂ６フラグメントイオンの質量は、マイナスリジン残基の質量である質量になるであろう。あるいは、Ｔｒｙｐ−Ｎ消化物のｂ７フラグメントイオンの質量からのトリプシン消化物のｂ６フラグメントイオンの質量の引き算は、プラスリジン残基の質量である質量になるであろう。同様に、Ｔｒｙｐ−Ｎ消化物のｙ５フラグメントイオンの質量を引いた、トリプシン消化物のｙ６フラグメントイオンの質量は、プラスリジン残基の質量である質量になるであろう。あるいは、Ｔｒｙｐ−Ｎ消化物のｙ５フラグメントイオンの質量からのトリプシン消化物のｙ６フラグメントイオンの質量の引き算は、マイナスリジン残基の質量である質量になるであろう。
【００４７】
実施形態において、第１のプロテアーゼ消化物からの消化ペプチドフラグメント、例えば、第１のセットの消化ペプチドフラグメントは、例えば、タンデム質量分析計を使用して、フラグメント化されて、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンを生成する。その後、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンの質量が、例えば、マススペクトロメトリーによって測定される。実施形態において、第２のプロテアーゼ消化物からの消化ペプチドフラグメント、例えば、第２のセットの消化ペプチドフラグメントは、例えば、タンデム質量分析計を使用して、フラグメント化されて、第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンを生成する。その後、第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンの質量が、例えば、マススペクトロメトリーによって測定される。第１及び第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンの質量を使用して、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからアルギニンアミノ酸残基の質量またはリジンアミノ酸残基の質量だけ質量が異なる対応するペプチドイオンの組が選択される。対応するペプチドイオンの組とは、第１のセットから選択されたもの及び第２のセットから選択されたものを意味することが意図される。実施形態において、フラグメント化ペプチドイオンから選択されたペプチドイオンの組からイオンタイプが決定され、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンまたは第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンのいずれかからアミノ酸残基（複数可）の質量だけ質量が増加した同じタイプのペプチドイオンのマスラダーが形成される。個々の２０のアミノ酸の質量に対するマスラダーにおいて２つの隣接するペプチドイオンの質量差を調べることによって、当業者は、特定のフラグメント化ペプチドイオンを構成する個々のアミノ酸を決定することができる。特定の実施形態において、特定の消化ペプチドに対応する複数のフラグメント化ペプチドイオン、例えば、ｂシリーズのフラグメント化ペプチドイオン及び／またはｙシリーズのフラグメント化ペプチドイオン（例えば、ｂ１、ｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ５など、またはｙ１、ｙ２、ｙ３、ｙ４など）を使用することによって、特定の消化ペプチドの一次配列を、高い信頼度で決定することができる。上記のとおりのケース１〜４におけるマススペクトロメトリー生成イオンマップからのペプチドの組み立てが図４〜１１Ｃに示される。本方法のいくつかの実施形態において、フラグメント化ペプチドイオンの組を対応づけて、アミノ酸配列を導き出すことは、第１の消化ペプチドフラグメントを、第１のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することと、第１の消化ペプチドフラグメントをフラグメント化して、第１の消化ペプチドフラグメントと対応する第１のシリーズのフラグメント化ペプチドイオンを生成することと、第１の消化ペプチドフラグメントと対応する第２の消化ペプチドフラグメントを、第２のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することと、第２の消化ペプチドフラグメントをフラグメント化して、第２の消化ペプチドフラグメントと対応する第２のシリーズのフラグメント化ペプチドイオンを生成することと、２つのシリーズのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたペプチドイオンの組に対してイオンタイプを決定することと、いずれかのセットのフラグメント化ペプチドイオンからアミノ酸残基（複数可）の質量だけ質量が増加した同じタイプのペプチドイオンのマスラダーを選択することと、ペプチドイオンのマスラダーから第１及び第２の消化ペプチドフラグメントの個々のアミノ酸残基を決定して、第１及び／または第２のフラグメント化ペプチドのアミノ酸配列を生成することとを含む。消化物中のペプチドまたはその一部のアミノ酸配列が決定されたら、ペプチドの対応づけられたアミノ酸配列は、例えば、重複または部分重複配列の配列アライメントを使用して、組み立てられて、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列を形成してもよい。例えば、ＢＳＡに関する図１及び２を参照。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本方法は、第１の消化ペプチドフラグメントを、第１のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することと、第１の消化ペプチドフラグメントと同一の質量を有する第２の消化ペプチドフラグメントを、第２のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することとを含む（図４〜７Ｃのケース（１）及び（２）を参照）。実施形態において、本方法は、第１の消化ペプチドフラグメントを、第１のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することと、リジンアミノ酸残基とアルギニンアミノ酸残基との間の質量差と等しい第１の消化ペプチドフラグメントとの質量差を有する質量を有する第２の消化ペプチドフラグメントを、第２のセットの消化ペプチドフラグメントから選択することとを含む（図８〜１１Ｃのケース（３）及び（４）を参照）。実施形態において、本方法は、第１のフラグメント化ペプチドを、第１のセットのフラグメントペプチドから選択することと、選択されたフラグメント化ペプチドをフラグメント化して、選択されたフラグメント化ペプチドと対応するフラグメント化ペプチドイオンを生成することとを含む。実施形態において、第１のフラグメント化ペプチドイオンは、フラグメント化ペプチドイオンの質量に基づいてアミノ酸配列が対応づけられる。実施形態において、各セットのフラグメント化ペプチドイオンにおいてアミノ酸残基（複数可）の質量だけ質量が増加した同じタイプのペプチドイオンのマスラダーが形成される。実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンまたは第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンのいずれかから同定された個々のアミノ酸残基は、組み立てられて、第１及び／または第２のフラグメント化ペプチドのアミノ酸配列を生成する。
【００４９】
特定の実施形態において、本方法は、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからアルギニンアミノ酸残基の質量だけ質量が異なるペプチドイオンの組を選択することを含む。特定の実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンと第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンとの間におけるアルギニンアミノ酸残基の質量のマイナスの差は、ペプチドがＮ末端アルギニン残基を有することを示す。特定の実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンと第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンとの間におけるアルギニンアミノ酸残基の質量のプラスの差は、ペプチドがＣ末端アルギニン残基を有することを示す。特定の実施形態において、本方法は、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオン及び第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからリジンアミノ酸残基の質量だけ質量が異なるペプチドイオンの組を選択することを含む。特定の実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンと第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンとの間におけるリジンアミノ酸残基の質量のマイナスの差は、ペプチドがＮ末端リジン残基を有することを示す。特定の実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンと第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンからのペプチドイオンとの間におけるリジンアミノ酸残基の質量のプラスの差は、ペプチドがＣ末端リジン残基を有することを示す。特定の実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンは、第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンと対応する。特定の実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンは、ｂイオンであり、第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンは、アルギニンアミノ酸残基の質量またはリジンアミノ酸残基の質量の差を有するｂイオンである。特定の実施形態において、第１のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンは、ｙイオンであり、第２のセットのフラグメント化ペプチドイオンから選択されたフラグメント化ペプチドイオンは、アルギニンアミノ酸残基の質量またはリジンアミノ酸残基の質量の差を有するｙイオンである。
【００５０】
いくつかの例において、サンプルは、例えば、マススペクトル分析のために、例えば、対象とする生体分子を精製するためのサンプル前処理に供される。いくつかの例において、サンプル前処理は、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、等電点電気泳動クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ナノフロークロマトグラフィー、マイクロフロークロマトグラフィー、高流率クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、多孔性グラファイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、チップを使用したマイクロ流体高速液体クロマトグラフィー、超高圧液体クロマトグラフィーまたはフロー圧力液体クロマトグラフィーのうちの１つ以上を含む。一部の実施形態において、サンプルは、ペプチド及び／またはペプチドイオンの質量の測定を複雑にすることもあるグリコシル化などの任意の翻訳後修飾を除去するためのサンプル前処理に供される。
【００５１】
本明細書中で開示されている方法の特定の態様及び／またはステップは、１つ以上の計算機において実施することができることが想定され、この計算機は、質量分析計の一部であっても、または質量分析計と分離していてもよい。
【００５２】
図１３は、モノクローナル抗体またはその他のタンパク質などのポリペプチドのアミノ酸配列の決定のための特定の例となる実施形態による計算機２０００及びモジュール２０５０を示す。計算機２０００は、任意の各種コンピュータ、サーバ、モバイル機器、組み込みシステム、またはコンピューティングシステムに相当していもよい。モジュール２０５０は、計算機２０００が、本明細書において提示されている各種方法及び処理機能を実行するのを促進するよう構成された１つ以上のハードウェアまたはソフトウェア要素を含んでもよい。計算機２０００は、プロセッサ２０１０、システムバス２０２０、システムメモリ２０３０、記憶媒体２０４０、入／出力インタフェース２０６０、及びネットワーク２０８０と通信するためのネットワークインタフェース２０７０などのさまざまな内部または接続コンポーネントを含んでもよい。いくつかの例において、計算機は、質量分析計の一部であってもよく、質量分析計に接続されていてもよく、及び／またはネットワークを介してなど、質量分析計からデータを受信すること、例えば、タンデム質量分析計において生成されたｂ及びｙフラグメントイオンと対応するマススペクトルデータを受信することができてもよい。
【００５３】
計算機２０００は、従来のコンピュータシステム、組み込み型コントローラ、ラップトップ、サーバ、モバイル機器、スマートフォン、テレビと関連づけられたもう１つのプロセッサ、カスタマイズされたマシン、任意の他のハードウェアプラットフォーム、またはその任意の組み合わせもしくは多様性として実装されてもよい。計算機２０００は、データネットワークまたはバスシステムを介して相互接続した複数の計算機を使用して機能するよう構成された分散システムであってもよい。
【００５４】
プロセッサ２０１０は、本明細書に記載されている機能としてオペレーションを実施するためにコードまたは命令を実行し、要求フロー及びアドレスマッピングを管理し、計算を実行し、コマンドを生成するよう構成されてもよい。プロセッサ２０１０は、計算機２０００におけるコンポーネントのオペレーションを監視及び制御するよう構成されてもよい。プロセッサ２０１０は、汎用プロセッサ、プロセッサコア、マルチプロセッサ、再構成可能型プロセッサ、マイクロコントローラ、デジタル信号プロセッサ（「ＤＳＰ」）、特定用途向け集積回路（「ＡＳＩＣ」）、グラフィックプロセッシングユニット（「ＧＰＵ」）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（「ＦＰＧＡ」）、プログラマブル論理デバイス（「ＰＬＤ」）、コントローラ、状態機械、ゲートロジック、ディスクリートハードウェアコンポーネント、任意の他の処理ユニット、またはその任意の組み合わせもしくは多様性であってもよい。プロセッサ２０１０は、単一の処理ユニット、複数の処理ユニット、単一のプロセッシングコア、複数のプロセッシングコア、特殊目的プロセッシングコア、コプロセッサ、またはその任意の組み合わせであってもよい。特定の例の実施形態によると、計算機２０００の他のコンポーネントとともにプロセッサ２０１０は、１つ以上の他の計算機内で動作する仮想計算機であってもよい。
【００５５】
システムメモリ２０３０としては、読み出し専用メモリ（「ＲＯＭ」）、プログラマブル読み出し専用メモリ（「ＰＲＯＭ」）、消去可能プログラマブル読み出し専用メモリ（「ＥＰＲＯＭ」）、フラッシュメモリ、または電源の有無にかかわらずプログラム命令もしくはデータを記憶することが可能な任意の他のデバイスなどの不揮発性メモリを挙げることができる。システムメモリ２０３０としては、ランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」）、スタティックランダムアクセスメモリ（「ＳＲＡＭ」）、ダイナミックランダムアクセスメモリ（「ＤＲＡＭ」）、及び同期ダイナミックランダムアクセスメモリ（「ＳＤＲＡＭ」）などの揮発性メモリも挙げることができる。他のタイプのＲＡＭもまた、システムメモリ２０３０を実装するために使用されてもよい。システムメモリ２０３０は、単一のメモリモジュールまたは複数のメモリモジュールを使用して実装されてもよい。システムメモリ２０３０は、計算機２０００の一部として示されているが、当業者は、システムメモリ２０３０が主題の技術の範囲から逸脱することなく計算機２０００から分離されてもよいことを認識するであろう。システムメモリ２０３０が、記憶媒体２０４０などの不揮発性記憶デバイスを含んでもよく、またはそれとともに動作してもよいことが理解されるべきである。
【００５６】
記憶媒体２０４０としては、ハードディスク、フロッピーディスク、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（「ＣＤ−ＲＯＭ」）、デジタル多目的ディスク（「ＤＶＤ」）、ブルーレイディスク、磁気テープ、フラッシュメモリ、その他の不揮発性メモリデバイス、ソリッドステートドライブ（「ＳＳＤ」）、任意の磁気記憶デバイス、任意の光記憶デバイス、任意の電気記憶デバイス、任意の半導体記憶デバイス、任意の物理記憶デバイス、任意のその他のデータ記憶デバイス、またはその任意の組み合わせもしくは多様性を挙げることができる。記憶媒体２０４０は、１つ以上のオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム及びモジュール２０５０などのプログラムモジュール、データ、または任意のその他の情報を記憶してもよい。記憶媒体２０４０は、計算機２０００の一部であってもよく、またはそれと接続されてもよい。サーバ、データベースサーバ、クラウドストレージ、ネットワークアタッチドストレージなどの記憶媒体２０４０はまた、計算機２０００と通信する１つ以上の他の計算機の一部であってもよい。
【００５７】
モジュール２０５０は、計算機２０００が、本明細書において提示されている各種方法及び処理機能を実行するのを促進するよう構成された１つ以上のハードウェアまたはソフトウェア要素を含んでもよい。モジュール２０５０は、システムメモリ２０３０、記憶媒体２０４０、またはその両方と関連づけられたソフトウェアまたはファームウェアとして記憶された１つ以上の一連の命令を含んでもよい。記憶媒体２０４０は、したがって、命令またはコードがプロセッサ２０１０による実行のために記憶されてもよいマシンまたはコンピュータ可読媒体の例を表すこともある。マシンまたはコンピュータ可読媒体は、プロセッサ２０１０に命令を与えるために使用される任意の媒体（複数可）を一般に指す場合もある。モジュール２０５０と関連づけられたそのようなマシンまたはコンピュータ可読媒体は、コンピュータソフトウェア製品を含んでもよい。モジュール２０５０を含むコンピュータソフトウェア製品はまた、ネットワーク２０８０、任意の信号伝達媒体、または任意のその他の通信もしくは送達技術によりモジュール２０５０を計算機２０００に送達するための１つ以上のプロセスまたは方法と関連づけられてもよいことが理解されるべきである。モジュール２０５０はまた、ハードウェア回路またはＦＰＧＡもしくはその他のＰＬＤのためのマイクロコードもしくは構成情報などのハードウェア回路を構成するための情報を含んでもよい。
【００５８】
入／出力（「Ｉ／Ｏ」）インタフェース２０６０は、１つ以上の外部デバイスからデータを受信するため、及び１つ以上の外部デバイスにデータを送信するために１つ以上の外部デバイスと結合するよう構成されてもよい。そのような外部デバイスはさまざまな内部デバイスとともに周辺デバイスとしても知られている場合もある。Ｉ／Ｏインタフェース２０６０は、さまざまな周辺デバイスを計算機２０００またはプロセッサ２０１０と動作可能に結合するために電気接続及び物理接続の両方を含んでもよい。Ｉ／Ｏインタフェース２０６０は、周辺デバイス、計算機２０００、またはプロセッサ２０１０間でデータ、アドレス、及び制御信号を通信するよう構成されてもよい。Ｉ／Ｏインタフェース２０６０は、スモールコンピュータシステムインタフェース（「ＳＣＳＩ」）、シリアルアタッチドＳＣＳＩ（「ＳＡＳ」）、ファイバーチャネル、ペリフェラルコンポーネントインターコネクト（「ＰＣＩ」）、ＰＣＩエクスプレス（ＰＣＩｅ）、シリアルバス、パラレルバス、アドバンスドテクノロジーアタッチド（「ＡＴＡ」）、シリアルＡＴＡ（「ＳＡＴ  Ａ」）、ユニバーサルシリアルバス（「ＵＳＢ」）、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｏｌｔ、Ｆｉｒｅ  Ｗｉｒｅ、さまざまなビデオバスなどの任意の標準的なインタフェースを実装するよう構成されてもよい。Ｉ／Ｏインタフェース２０６０は、１つのインタフェースまたはバス技術のみを実装するよう構成されてもよい。あるいは、Ｉ／Ｏインタフェース２０６０は、複数のインタフェースまたはバス技術を実装するよう構成されてもよい。Ｉ／Ｏインタフェース２０６０は、システムバス２０２０の一部として、そのすべてとして、またはそれとともに動作するよう構成されてもよい。Ｉ／Ｏインタフェース２０６０は、１つ以上の外部デバイス、内部デバイス、計算機２０００、またはプロセッサ２０１０間の送信をバッファリングするための１つ以上のバッファーを含んでもよい。
【００５９】
Ｉ／Ｏインタフェース２０６０は、マウス、タッチスクリーン、スキャナー、電子ディジタイザー、センサー、レシーバ、タッチパッド、トラックボール、カメラ、マイク、キーボード、任意のその他のポインティングデバイス、または任意のそれらの組み合わせを含む、さまざまな入力デバイスと計算機２０００を結合してもよい。Ｉ／Ｏインタフェース２０６０は、ビデオディスプレイ、スピーカー、プリンタ、プロジェクタ、触覚フィードバックデバイス、自動化制御、ロボットコンポーネント、アクチュエータ、モーター、ファン、ソレノイド、バルブ、ポンプ、トランスミッタ、信号エミッタ、光などを含む、さまざまな出力デバイスを計算機２０００と結合してもよい。
【００６０】
計算機２０００は、ネットワーク２０８０を介してネットワークインタフェース２０７０を通じた１つ以上の他のシステムまたは計算機との論理接続を使用してネットワーク接続環境において動作してもよい。ネットワーク２０８０としては、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、イントラネット、インターネット、無線アクセスネットワーク、有線ネットワーク、モバイルネットワーク、電話ネットワーク、光ネットワーク、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。ネットワーク２０８０は、パケット交換方式であっても、回路交換方式であっても、任意の形態のものであってもよく、任意の通信プロトコルを使用してもよい。ネットワーク２０８０内の通信リンクは、光ファイバーケーブル、自由空間光通信、導波管、導電体、無線リンク、アンテナ、電波通信などのさまざまなデジタルまたはアナログ通信媒体を伴ってもよい。
【００６１】
プロセッサ２０１０は、計算機２０００の他の要素またはさまざまな周辺機器とシステムバス２０２０を介して接続されてもよい。システムバス２０２０がプロセッサ２０１０内、プロセッサ２０１０外、またはその両方にあってもよいことが理解されるべきである。一部の実施形態によると、本明細書において述べられている任意のプロセッサ２０１０、計算機２０００の他の要素、またはさまざまな周辺機器は、システムオンチップ（「ＳＯＣ」）、システムオンパッケージ（「ＳＯＰ」）、またはＡＳＩＣデバイスなどの単一デバイスに組み込まれてもよい。
【００６２】
実施形態は、本明細書に記載及び図示されている機能を具現化するコンピュータプログラムを含んでもよく、このコンピュータプログラムは、マシン可読媒体に格納された命令と、この命令を実行するプロセッサとを備えるコンピュータシステムに実装される。しかしながら、コンピュータプログラミングにおいて実施形態を実装する多くの異なる方法が存在するであろうことは明らかであり、この実施形態は、コンピュータプログラム命令のいずれか１セットに限定されるものと解釈されるべきではない。さらに、技能のあるプログラマーは、添付のフローチャート及び／または明細書中の関連する説明に基づいて本開示の実施形態の実施形態を実装するためのそのようなコンピュータプログラムを書くことができるであろう。よって、特定のセットのプログラムコード命令の開示は、実施形態をどのように作製し、使用するかを十分に理解するために必須であるとは考えられない。さらに、本明細書中に記載されている実施形態の１つ以上の態様が、ハートウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせによって実施されてもよく、それが、１つ以上のコンピューティングシステムに具現化されてもよいことは、当業者であれば理解するであろう。その上、コンピュータによって実施される行為に対するいかなる言及も、２つ以上のコンピュータが行為を実施してもよいため、単一のコンピュータによって実施されるものと解釈されるべきではない。
【００６３】
本明細書に記載されている例の実施形態は、前に記載された方法及び処理機能を実施するコンピュータハードウェア及びソフトウェアとともに使用することができる。本明細書に記載されているシステム、方法、及び手順は、プログラマブルコンピュータ、コンピュータ実行可能なソフトウェア、またはデジタル回路に具現化されてもよい。ソフトウェアは、コンピュータ可読媒体に記憶されてもよい。例えば、コンピュータ可読媒体としては、フロッピーディスク、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク、リムーバブルメディア、フラッシュメモリ、メモリスティック、光媒体、光磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭなどを挙げることができる。デジタル回路としては、集積回路、ゲートアレイ、ビルディングブロック論理、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などを挙げることができる。
【００６４】
前で提示された実施形態に記載されている例のシステム、方法、及び行為は、例示的なものであり、代替的実施形態において、特定の行為は、異なる順序で、互いに並行して、完全に省かれて、及び／または異なる例の実施形態間で組み合わされて実施されてもよく、及び／または特定の追加的な行為が、各種実施形態の範囲及び趣旨から逸脱することなく実施されてもよい。したがって、そのような代替的実施形態は、本明細書に記載されている例に含まれる。
【００６５】
特定の実施形態が上で詳細に記載されてきたが、その記載は単に説明を目的とするものである。したがって、上記の多くの態様は、特に明記されていない限り、必要とされる要素または必須の要素と意図されていないことが理解されるべきである。上記のものに加えて、本開示の利益を有し、添付の請求項において定義される実施形態の趣旨及び範囲から逸脱することなく、例の実施形態の開示されている態様の改変、及びそれに対応する等価の構成要素または行為が当業者によって行われてもよく、その範囲は、そのような改変物及び等価の構造を包含するよう最も広い解釈が与えられるべきである。
【００６６】
以下の例は、特定の実施形態の特定の特徴を説明するために提供される。ただし、以下に記載される特定の特徴は、本発明の範囲に対する限定と見なされるべきではなく、むしろ例と見なされるべきであり、その等価物は、当業者によって認識されるであろう。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は、当業者に本発明の方法の作製及び使用の方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくらかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別のことが示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、示されない限り平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、室温は、約２５℃であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。
【００６８】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む２つのサンプルを、謹んでトリプシン及びＴｒｙｐ−Ｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで開発され、Ｐｒｏｔｉｆｉ，  ＬＬＣから商業的に入手可能なアルギニン及びリジンに対するＮ末端特異性を有する耐熱性メタロプロテアーゼ）による消化に供した。得られたペプチド消化物を、個別にタンデムマススペクトロメトリーに供して、ＢＳＡの消化ペプチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した。図１は、Ｔｒｙｐ−Ｎプロテアーゼ消化を使用したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）配列カバレッジを示す。配列カバレッジは、９１．４％である。Ｔｒｙｐ−Ｎ消化物から形成されたさまざまなペプチドフラグメントを、ＢＳＡタンパク質配列（配列番号１）の下に示す。図２は、トリプシンプロテアーゼ消化を使用したＢＳＡ配列カバレッジを示す。配列カバレッジは、９４．２％である。トリプシン消化物から形成されたさまざまなペプチドフラグメントを、ＢＳＡタンパク質配列（配列番号１）の下に示す。
【００６９】
各消化サンプル中のペプチドの配列を決定するために、個々のペプチドを、四重極から選択し、衝突誘起フラグメント化に供して、ｂ及びｙペプチドフラグメントイオンを生成した（例えば、図５Ａ、５Ｂ、７Ａ、７Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１１Ａ及び１１Ｂを参照）。
【００７０】
その後、個々のイオンマップを使用して、それぞれ、図４、６、８、及び１０に示されている手順に従って、図５Ｃ、７Ｃ、９Ｃ、及び１１Ｃに示されるとおり個々のペプチドの一次配列を決定した。簡単にいえば、図４に示されるとおり、配列ＫＬＶＮＥＬＴＥＦＡＫ（配列番号２）を含むポリペプチドに対するトリプシンによる消化は、ペプチドＬＶＮＥＬＴＥＦＡＫ（配列番号３）をもたらした。Ｔｒｙｐ−Ｎによる消化は、ペプチドＫＬＶＮＥＬＴＥＦＡ（配列番号４）をもたらす。この２つのペプチドは、同じ質量を有する。しかしながら、マススペクトロメトリー分析の間にフラグメント化されると、トリプシン消化物からのｂイオン及びｙイオンは、Ｔｒｙｐ−Ｎ消化物からのｂイオン及びｙイオンと１つのリジン残基だけ質量が異なっていた。同様に、図６に示されるとおり、配列ＲＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲ（配列番号６）を含むポリペプチドは、トリプシンで消化されると、ペプチドＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲ（配列番号７）をもたらした。Ｔｒｙｐ−Ｎによる消化は、ペプチドＲＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬ（配列番号８）をもたらした。この２つのペプチドは、同じ質量を有する。しかしながら、マススペクトロメトリー分析の間にフラグメント化されると、トリプシン消化物からのｂイオン及びｙイオンは、Ｔｒｙｐ−Ｎ消化物からのｂイオン及びｙイオンと１つのアルギニン残基だけ質量が異なっていた。アルギニン及びリジン残基の混ざった物が結合したペプチドに関してはわずかに異なる状態が確認された。図８に示されるとおり、配列ＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲ（配列番号１０）を含むポリペプチドに対するトリプシンによる消化は、ペプチドＣＣＴＥＳＬＶＮＲ（配列番号１１）をもたらした。Ｔｒｙｐ−Ｎによる消化は、ペプチドＫＣＣＴＥＳＬＶＮ（配列番号１２）をもたらした。この場合、この２つのペプチドは、同じ質量を有していない。しかしながら、マススペクトロメトリー分析の間にフラグメント化されると、各ペプチドから得られたｂイオンまたは各ペプチドからのｙイオンは、１つのリジンアミノ酸残基（ｂイオン）または１つのアルギニンアミノ酸残基（ｙイオン）の質量だけ異なる。図１０は、配列ＲＦＫＤＬＧＥＥＨＦＫ（配列番号１４）を含むポリペプチドに対するトリプシンによる消化が、ペプチドＦＫＤＬＧＥＥＨＦＫ（配列番号１５）をもたらしたことを示す。Ｔｒｙｐ−Ｎによる消化は、ペプチドＲＦＫＤＬＧＥＥＨＦ（配列番号１６）をもたらした。この場合、この２つのペプチドは、同じ質量を有していない。しかしながら、マススペクトロメトリー分析の間にフラグメント化されると、各ペプチドから得られたｂイオンまたは各ペプチドからのｙイオンは、１つのリジンアミノ酸残基（ｙイオン）または１つのアルギニンアミノ酸残基（ｂイオン）だけ質量が異なる。
【００７１】
ｂ及びｙイオンタイプが決定されると、同じタイプのペプチドイオンの一覧が、各セットのフラグメントペプチドイオンにおいて形成され、アミノ酸残基（複数可）の質量だけ質量が増加したペプチドイオンのマスラダーが一覧から形成される。マスラダーの２つの隣接するペプチドイオン間の質量差を、個々の２０のアミノ酸の質量に基づいて特定のアミノ酸残基（複数可）に対応づけた。配列番号２、６、１０、及び１４に示されているものなど、トリプシン消化物及びＴｒｙｐ−Ｎ消化物の両方からのペプチドに対するｂ及びｙイオンのセットを使用して、そこから同定された個々のアミノ酸残基を使用して、それが由来するペプチドに関する一次配列を組み立てた。その後、その個々のペプチドを使用して、ＢＳＡの一次配列を組み立てた。
【００７２】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されているものに加えて、前述の説明及び添付の図面から本発明のさまざまな改変物が当業者には明らかになるであろう。そのような改変物は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１Ａ】
2021534408.tif 000004
【図１Ｂ】
2021534408.tif 000005
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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