(57)【要約】本発明は、アミンで機能化された珪藻土及び架橋剤としてジメチルスベルイミデートを利用した病原体濃縮及び核酸抽出方法に関するものであって、負電荷を帯びる病原体は、架橋剤によって正電荷を帯びる珪藻土表面に電気的に吸収され、細胞溶解後、放出された核酸は、珪藻土のアミン基と可逆的架橋結合を通じて珪藻土上に固定されて分離される。方法は、特別な装備及び電気（電力）の使用なしに一体型装置で同時に病原体濃縮及び核酸抽出が可能であって、現場診断方法として活用され、従来の方法よりも時間及びコスト削減に優れ、抽出された核酸は、疾病の診断及び治療に有用に活用されうるという利点がある。
2021534751.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流入部と、
前記流入部と連結され、前記流入部を通じて導入される病原体が含まれた試料、架橋剤及びシラン化合物で改質された珪藻土を混合させる反応部と、
前記反応部と連結され、病原体が含まれた試料、架橋剤及びシラン化合物で改質された珪藻土を遮断し、核酸に相応するサイズの物質を通過させるフィルター部と、
前記フィルター部と連結され、核酸を分離する流出部と、
を含む、現場診断用病原体濃縮及び核酸抽出装置。
【請求項２】
前記フィルターは、０．５〜１μｍの平均直径を有するポアを備え、１０〜３０ｍｍの範囲の直径及び１〜１０ｍｍの範囲の厚さを有することを特徴とする請求項１に記載の現場診断用病原体濃縮及び核酸抽出装置。
【請求項３】
前記フィルターは、ナノ−及びマイクロ−濾過膜フィルター、逆浸透圧フィルター、中空糸膜フィルター、及び限外濾過膜フィルターからなる群から選択されたことを特徴とする請求項１に記載の現場診断用病原体濃縮及び核酸抽出装置。
【請求項４】
請求項１から請求項３に記載の現場診断用病原体濃縮及び核酸抽出装置を提供する第１段階と、
前記装置の流入部を通じて病原体が含まれた試料、架橋剤及びシラン化合物で改質された珪藻土を導入する第２段階と、
前記装置の反応部で架橋剤によって病原体をシラン化合物で改質された珪藻土表面に固定させる第３段階と、
前記装置の流入部を通じて溶解緩衝液を導入する第４段階と、
前記装置の反応部で病原体から抽出された核酸をシラン化合物で改質された珪藻土表面に固定させる第５段階と、
前記装置の流入部を通じて溶離緩衝液を導入する第６段階と、
前記装置のフィルター部を通じて核酸を分離し、流出部を通じて核酸を獲得する第７段階と、
を含む、病原体濃縮及び核酸抽出方法。
【請求項５】
前記第２段階の病原体が含有された試料は、病原体感染が疑われる客体の糞便、小便、涙、唾液、皮膚の外部分泌物、呼吸管の外部分泌物、腸管の外部分泌物、消化管の外部分泌物、血しょう、血清、血液、脊髄液、リンパ液、体液、及び組織からなるグループから選択された何れか１つであることを特徴とする請求項４に記載の病原体濃縮及び核酸抽出方法。
【請求項６】
前記第２段階の病原体は、微生物であることを特徴とする請求項４に記載の病原体濃縮及び核酸抽出方法。
【請求項７】
前記微生物は、ウイルス、細菌、真菌、原虫、リケッチアまたはスピロヘータであることを特徴とする請求項６に記載の病原体濃縮及び核酸抽出方法。
【請求項８】
前記第２段階の架橋剤は、ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）、ジメチルアジプイミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、及びジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミダート（ＤＴＢＰ）からなる群から選択されたことを特徴とする請求項４に記載の病原体濃縮及び核酸抽出方法。
【請求項９】
前記第２段階のシラン化合物は、３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシラン（ＡＰＤＭＳ）、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、（１−アミノメチル）トリエトキシシラン、（２−アミノエチル）トリエトキシシラン、（４−アミノブチル）トリエトキシシラン、（５−アミノペンチル）トリエトキシシラン、（６−アミノヘキシル）トリエトキシシラン、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］ジエチレントリアミン、［３−（２−アミノエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン（ＡＥＡＰＴＭＳ）、及び３−［（トリメトキシシリル）プロピル］ジエチレントリアミン（ＴＭＰＴＡ）からなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項４に記載の病原体濃縮及び核酸抽出方法。
【請求項１０】
前記第３段階は、負電荷を帯びる病原体が架橋剤によって正電荷を帯びるシラン化合物で改質された珪藻土表面に静電気的結合で固定されることを特徴とする請求項４に記載の病原体濃縮及び核酸抽出方法。
【請求項１１】
前記第５段階は、病原体から抽出された核酸がシラン化合物で改質された珪藻土のアミン基と可逆的架橋結合を通じて珪藻土表面に固定されることを特徴とする請求項４に記載の病原体濃縮及び核酸抽出方法。
【請求項１２】
前記病原体濃縮及び核酸抽出は、１５〜３０分の時間内に完了することを特徴とする請求項４に記載の病原体濃縮及び核酸抽出方法。
【請求項１３】
前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、及び細胞遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）からなる群から選択されたことを特徴とする請求項４に記載の病原体濃縮及び核酸抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、現場診断用装置を利用した病原体濃縮及び核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原体診断は、全世界的な健康問題、特に、中央集中化実験室技術のように、資源制限された環境で非常に重要である。現在まで細胞培養、血液化学、流細胞分析、免疫測定法、核酸検査（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ；ＮＡＴ）のような多様な方法が、病原体診断のために開発され、そのうち、細胞培養は、臨床診断に多く使われているが、長時間がかかる手続き、高コスト、種特異プロトコル、実験室環境及び装備を必要とする短所がある。一方、核酸検査は、潜伏期（ｗｉｎｄｏｗ  ｐｅｒｉｏｄ）診断、免疫変異ウイルス検出及び免疫沈黙（ｉｍｍｕｎｏｓｉｌｅｎｔ／ｏｃｃｕｌｔ）感染同定など診断検査のための応用だけではなく、プロトコルが相対的に速く、普遍的な長所を有しており、関心が増大しつつある。しかし、既存の核酸検査基盤の分析は、商業的に利用可能な製品及び実験室で開発した分析法がいずれも一般的に複雑であるという短所がある。したがって、熟練した技術者、特定装備及び多重段階のように、実験室基盤の作業を必要とする複雑な前処理が要求される。このような要求のために、現場診断検査（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ；ＰＯＣＴ）で核酸検査の使用が制限されている。
【０００３】
核酸検査を基盤とする現場診断分析法は、試料準備、鋳型増幅（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び信号検出の３種の主要側面を含む。核酸検査を基盤とする現場診断分析法を改善するための方法で簡単かつ効果的な増幅及び検出部分に重点を置いた研究が行われたが、初期試料準備段階に重点を置いた研究も行われている。試料で直接に増幅され、多くの抽出を要しない核酸基盤の現場診断分析法が開発されたが、低い敏感度及び高コストで依然として制限的である。高品質の核酸は、あらゆる下位分析の基礎であるために、生物学的基質からの核酸抽出及び化学的抑制剤の除去を含む試料準備が非常に重要である。特に、この段階は、無菌実験室で資源制限環境への境界を除去するために、実験室条件よりも開放環境に合わせて調整されなければならない。
【０００４】
先進国とは異なって、大量中央集中化実験室基盤の診断は、永久的な統合施設の高コスト及び熟練した技術者の制限によって資源制限環境に適しない。したがって、使い捨て現場診断分析法は、資源制限環境に解決策になりうる。ここ１０年間、免疫クロマトグラフィーストリップ（ｉｍｍｕｎｅ−ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｉｐ；ＩＣＳ）検査が資源制限環境で成功的に使われた診断分析法の１つであったが、深層試料分析に制限されるという短所があった。
【０００５】
現場診断使用のために、分析は、単純化（すなわち、製造工程及び応用工程、施設または訓練要求がほとんどない）されなければならず、迅速かつ安定的（物流及び貯蔵側面）であり、低コストで最適化されなければならない。特に、小便、血液及び喀痰のような一般的な臨床試料に、この分析法を適用することが必須である。しかし、これは、試料から病原体抽出だけではなく、生体試料にも幅広く刺激されるＰＣＲ抑制剤のために困難がある。したがって、病原体濃縮及び核酸試料準備の統合のための適用可能な解決策が、臨床的検出及び現場診断分析にいずれも寄与することができる。また、アフリカを含めた低開発国家では、電気供給が難しくて、実験室基盤の装備の使用が制限的なので、電気（電力）使用なしに病原体濃縮及び核酸抽出が可能な現場診断分析は、資源制限環境で幅広く活用されうるという利点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、現場診断用病原体濃縮及び核酸抽出装置を提供することである。
【０００７】
本発明のさらに他の目的は、該装置を利用した病原体濃縮及び核酸抽出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を果たすために、本発明は、流入部；前記流入部と連結され、前記流入部を通じて導入される病原体が含まれた試料、架橋剤及びシラン化合物で改質された珪藻土を混合させる反応部；前記反応部と連結され、病原体が含まれた試料、架橋剤及びシラン化合物で改質された珪藻土を遮断し、核酸に相応するサイズの物質を通過させるフィルター部；及び前記フィルター部と連結され、核酸を分離する流出部；を含む現場診断用病原体濃縮及び核酸抽出装置を提供する。
【０００９】
また、本発明は、前記現場診断用病原体濃縮及び核酸抽出装置を提供する第１段階；前記装置の流入部を通じて病原体が含まれた試料、架橋剤及びシラン化合物で改質された珪藻土を導入する第２段階；前記装置の反応部で架橋剤によって病原体をシラン化合物で改質された珪藻土表面に固定させる第３段階；前記装置の流入部を通じて溶解緩衝液を導入する第４段階；前記装置の反応部で病原体から抽出された核酸をシラン化合物で改質された珪藻土表面に固定させる第５段階；前記装置の流入部を通じて溶離緩衝液を導入する第６段階；及び前記装置のフィルター部を通じて核酸を分離し、流出部を通じて核酸を獲得する第７段階；を含む病原体濃縮及び核酸抽出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、アミンで機能化された珪藻土及び架橋剤としてジメチルスベルイミデートを利用した病原体濃縮及び核酸抽出方法に関するものであって、負電荷を帯びる病原体は、前記架橋剤によって正電荷を帯びる珪藻土表面に電気的に吸収され、細胞溶解後、放出された核酸は、珪藻土のアミン基と可逆的架橋結合を通じて珪藻土上に固定されて分離される。前記方法は、特別な装備及び電気（電力）の使用なしに一体型装置で同時に病原体濃縮及び核酸抽出が可能であって、現場診断方法として活用され、従来の方法よりも時間及びコスト削減に優れ、抽出された核酸は、疾病の診断及び治療に有用に活用されうるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アミンで機能化された珪藻土（ＤＡ）及びジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）を使用して携帯用注射器フィルター装置による病原体濃縮及び核酸抽出方法を図示して示したものであって、（ａ）注射器の内部にＤＡ、病原体及びＤＭＳの混合、（ｂ）病原体がＤＭＳによってＤＡ表面に吸収され、以後にフィルターによって遮断される病原体濃縮過程、（ｃ）ＤＡのアミン基と溶解された病原体から放出された核酸の間の可逆的架橋反応を通じた核酸分離を示した図面である。
【図２】注射器フィルターの上端面及び側面を示した図面である。
【図３】核酸分離工程の最適化のためのリアルタイム定量ＰＣＲ結果を示したものであって、（ａ）ＤＡ製造のためのシラン化合物の最適化、（ｂ）同型２機能性イミドエステルの最適化、（ｃ）ＤＡ濃度の最適化、（ｄ）ＤＭＳ濃度の最適化、（ｅ）ＲＮＡ分離のための培養時間の最適化、（ｆ）最適化された条件で分離されたＤＮＡ鋳型についての評価をＣＴ値で示した図面である。
【図４】最適化された核酸分離工程を利用したＤＮＡ及びＲＮＡの捕獲効率を示した図面である。
【図５】ＤＡ−ＤＭＳチューブシステム評価のためのリアルタイム定量ＰＣＲ結果を示したものであって、（ａ）ＤＡ−ＤＭＳチューブシステム及び商業用キットシステムを用いて病原体試料から分離されたＲＮＡ鋳型についての評価、（ｂ）多様な試料及び体積から分離されたＲＮＡ鋳型についての評価をＣＴ値で示した図面である。
【図６】ＤＡ−ＤＭＳフィルターシステム評価のためのリアルタイム定量ＰＣＲ結果を示したものであって、（ａ）注射器フィルター類型についての評価、（ｂ）ＤＡ−ＤＭＳフィルターシステム及び商業用キットシステムを用いて病原体試料から分離されたＲＮＡ鋳型についての評価をＣＴ値で示した図面である。
【図７】ＤＡ−ＤＭＳフィルターシステムの大容量試料処理能力評価のためのリアルタイム定量ＰＣＲ結果を示したものであって、（ａ）多様な体積の試料から分離されたＲＮＡ鋳型についての評価、（ｂ）異なる試料から分離されたＲＮＡ鋳型についての評価をＣＴ値で示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の発明者らは、他の分析法に容易に統合される病原体濃縮及び核酸抽出方法を提供し、前記方法は、全体工程が単純化されるように設計された一体型装置であって、現場診断に使用が可能である。病原体は、アミンで機能化された珪藻土（ａｍｉｎｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｄｉａｔｏｍａｃｅｏｕｓ  ｅａｒｔｈ；ＤＡ）及びジメチルスベルイミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ；ＤＭＳ）の存在下に注射器フィルターによって濃縮され、別途の装備なしに核酸抽出が可能である。
【００１３】
正電荷を帯びる珪藻土は、水性環境で負電荷を帯びる病原体と電気的に結合されうる。しかし、珪藻土のアミン基と結合されるジメチルスベルイミデートが存在すれば、さらに多くの正電荷が形成されて、病原体濃縮過程が強化される。したがって、負電荷を帯びる病原体は、１ｍＬの試料で珪藻土に直接に吸収されるか、大容量試料（５０ｍＬ）では、短いインキュベーションを通じて直接に吸収される。一方、ジメチルスベルイミデートは、核酸またはタンパク質のアミン基の可逆的な反応に対する架橋結合剤として知られている。反応は、調節されたｐＨで逆転されるために、診断に使われる核酸試料の抽出は、他の緩衝液の注入で容易に達せられ、特に、本発明の診断方法は、多様な臨床試料に適した長所がある。
【００１４】
図１は、本発明の一体型分析法の概略図を示したものであって、携帯用注射器フィルター装置は、病原体を効果的に濃縮し、核酸を分離することができ、分析製作及び操作手続きが簡素であり、低コストであり、総作業時間を少なくとも２０分に減少させうるという利点がある。また、実験室施設を要さず、多様な臨床試料に対して普遍的なプロトコルを提供することができる。
【００１５】
これにより、本発明は、流入部；前記流入部と連結され、前記流入部を通じて導入される病原体が含まれた試料、架橋剤及びシラン化合物で改質された珪藻土を混合させる反応部；前記反応部と連結され、病原体が含まれた試料、架橋剤及びシラン化合物で改質された珪藻土を遮断し、核酸に相応するサイズの物質を通過させるフィルター部；及び前記フィルター部と連結され、核酸を分離する流出部；を含む現場診断用病原体濃縮及び核酸抽出装置を提供する。
【００１６】
前記フィルターは、０．５〜１μｍの平均直径を有するポアを備え、１０〜３０ｍｍの範囲の直径及び１〜１０ｍｍの範囲の厚さであるが、これに制限されるものではないということを明示する。
【００１７】
前記フィルターは、ナノ−及びマイクロ−濾過膜フィルター、逆浸透圧フィルター、中空糸膜フィルター、及び限外濾過膜フィルターからなる群から選択されうるが、これに制限されるものではないということを明示する。
【００１８】
また、本発明は、前記現場診断用病原体濃縮及び核酸抽出装置を提供する第１段階；前記装置の流入部を通じて病原体が含まれた試料、架橋剤及びシラン化合物で改質された珪藻土を導入する第２段階；前記装置の反応部で架橋剤によって病原体をシラン化合物で改質された珪藻土表面に固定させる第３段階；前記装置の流入部を通じて溶解緩衝液を導入する第４段階；前記装置の反応部で病原体から抽出された核酸をシラン化合物で改質された珪藻土表面に固定させる第５段階；前記装置の流入部を通じて溶離緩衝液を導入する第６段階；及び前記装置のフィルター部を通じて核酸を分離し、流出部を通じて核酸を獲得する第７段階；を含む病原体濃縮及び核酸抽出方法を提供する。
【００１９】
前記第２段階の病原体が含有された試料は、病原体感染が疑われる客体の糞便、小便、涙、唾液、皮膚の外部分泌物、呼吸管の外部分泌物、腸管の外部分泌物、消化管の外部分泌物、血しょう、血清、血液、脊髄液、リンパ液、体液、及び組織からなるグループから選択された何れか１つであるが、これに制限されるものではないということを明示する。
【００２０】
前記第２段階の病原体は、微生物であり、前記微生物は、ウイルス、細菌、真菌、原虫、リケッチアまたはスピロヘータであるが、これに制限されるものではないということを明示する。
【００２１】
前記第２段階の架橋剤は、ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）、ジメチルアジプイミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ；ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ；ＤＭＰ）、及びジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミダート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ；ＤＴＢＰ）からなる群から選択されうるが、これに制限されるものではないということを明示する。
【００２２】
前記第２段階のシラン化合物は、３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ（ｄｉｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ；ＡＰＤＭＳ）、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ；ＡＰＴＥＳ）、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、（１−アミノメチル）トリエトキシシラン（（１−ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、（２−アミノエチル）トリエトキシシラン（（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、（４−アミノブチル）トリエトキシシラン（（４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、（５−アミノペンチル）トリエトキシシラン（（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、（６−アミノヘキシル）トリエトキシシラン（（６−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（Ｎ−［３−（ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］ジエチレントリアミン（Ｎ−［３−（ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ）、［３−（２−アミノエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン（［３−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ；ＡＥＡＰＴＭＳ）、及び３−［（トリメトキシシリル）プロピル］ジエチレントリアミン（３−［（ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ；ＴＭＰＴＡ）からなる群から選択されうるが、これに制限されるものではないということを明示する。
【００２３】
前記第３段階は、負電荷を帯びる病原体が架橋剤によって正電荷を帯びるシラン化合物で改質された珪藻土表面に静電気的結合で固定される。
【００２４】
前記第５段階は、病原体から抽出された核酸がシラン化合物で改質された珪藻土のアミン基と可逆的架橋結合を通じて珪藻土表面に固定される。
【００２５】
前記病原体濃縮及び核酸抽出は、１５〜３０分の時間内に完了する。
【００２６】
前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ；ｃｔＤＮＡ）、及び細胞遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ＤＮＡ；ｃｆＤＮＡ）からなる群から選択されうるが、これに制限されるものではないということを明示する。
【００２７】
前記ｃｆＤＮＡは、循環遊離核酸で血液で循環し、存在するＤＮＡを意味する。前記循環遊離核酸は、具体的に循環遊離ＤＮＡ、循環遊離ＲＮＡなどを含み、望ましくは、循環遊離ＤＮＡであるが、これに制限されるものではないということを明示する。前記循環遊離核酸は、一般的に血しょうまたは血清に１０００ｂｐ以下（ＤＮＡ）、１００ｎｔ以下（ＲＮＡ）の長さを示すが、これに制限されるものではないということを明示する。
【００２８】
前記ｃｔＤＮＡは、癌細胞から分離されて血液を循環し、存在するＤＮＡを意味する。腫瘍特異的突然変異及び後成遺伝学的変異をいずれも有しており、血液内全体循環ＤＮＡの非常に少ない量を占める。循環腫瘍ＤＮＡのサイズは、５０ｂｐから２５０ｂｐに多様であるが、これに制限されるものではないということを明示する。
【００２９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これらの実施例によって制限されないということは当業者にとって自明である。
【００３０】
実施例１：物質
【００３１】
珪藻土（ｄｉａｔｏｍａｃｅｏｕｓ  ｅａｒｔｈ；ＤＥ）、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ、９９％）、３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシラン（ＡＰＤＭＳ、９７％）、［３−（２−アミノエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン（ＡＥＡＰＴＭＳ、８０％）及びＮ１−（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン［Ｎ１−（３−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ；ＴＰＤＡ］は、シグマアルドリッチから購入した。
【００３２】
実施例２：アミンで機能化された珪藻土の製造
【００３３】
珪藻土（ＤＥ）は、蒸留水（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ；ＤＷ）で３０分間激しく撹拌して洗浄した後、遠心分離して不純物が含まれた堆積物を除去した。アミンで機能化された珪藻土（ａｍｉｎｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ＤＥ；ＤＡ）は、濃縮及び抽出マトリックスとして利用し、洗浄されたＤＥの表面は、シラン化合物のアミン基と反応させて合成した。ＤＡの製造方法は、次の通りである。簡略に、５ｍＬのシランを５％（ｖ／ｖ）蒸留水１００ｍＬが含まれたエタノール混合物に滴加し、酢酸（ｐＨ５）で酸性化させた。２ｇの洗浄されたＤＥを強力な撹拌下に添加し、室温で４時間反応させた。ＤＡをエタノールで洗浄した後、一晩中真空乾燥させ、追加分析に使われる前まで保管した。
【００３４】
実施例３：細胞培養
【００３５】
ブルセラ・オビス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｏｖｉｓ、ＡＴＣＣ  ２５８４０）は、病原性診断の評価に使われた。ブルセラ・オビスは、５％脱繊維量（ｄｅｆｉｂｒｉｎａｔｅｄ  ｓｈｅｅｐ）血液（ＭＢｃｅｌｌ，Ｋｏｒｅａ）を用いてブルセラ寒天（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３７℃、５％  ＣＯ２条件で培養した。サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、ＡＴＣＣ  １４０２８）は、トリプチケースソイ培地（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ、ＴＳＢ、ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）に接種した後、好気性大気下に３７℃の条件で２４時間培養した。培養後、寒天平板法でバクテリア懸濁液を定量した後、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を用いて異なる濃度に希釈した。
【００３６】
実施例４：病原体濃縮−チューブ基盤
【００３７】
ＤＡとジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とを最適化された工程によって濃縮及び抽出マトリックスとして選択した。まず、１２０μＬのＡＰＤＭＳ−ＤＥ懸濁液（５０ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＤＷ）及び１００μＬのＤＭＳ溶液（２００ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＤＷ）を試料に添加した。９９ｒｐｍの回転混合機（Ｔｏｐｓｃｉｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｎｉｎｇｂｏ，Ｃｈｉｎａ）を用いて常温で１〜３０分間反応させることにより、同型２機能性イミドエステル（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｉｄｏｅｓｔｅｒ；ＨＩ）グループを通じた可逆的交差架橋反応に基づいてＡＰＤＭＳ−ＤＥ表面に病原体を付着させた。病原体が吸収されたＡＰＤＭＳ−ＤＥを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離して収集し、上澄み液を除去した。引き続き１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、もう一回遠心分離して上澄み液を除去し、病原体が含まれた試料１００μＬを獲得した。
【００３８】
実施例５：核酸抽出−チューブ基盤
【００３９】
濃縮された試料からの核酸を分離するために、試料に２０μＬのプロテイナーゼＫ、１５０μＬの自体溶解緩衝液［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  エチレンジアミンテトラ酢酸、１％  ドデシル硫酸ナトリウム及び１０％  トリトンＸ−１００］、３０μＬのリゾチーム溶液（３０ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＤＷ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１０μＬのＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ溶液（ＲＮＡ用、Ｑｉａｇｅｎ）を添加した。引き続き８５０ｒｐｍの撹拌機を用いて５６℃で３０分（ＤＮＡの場合）または常温で１０分（ＲＮＡの場合）間培養し、遠心分離して上澄み液を除去した。核酸が結合されたＡＰＤＭＳ−ＤＥを２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、あらゆる溶液を柔らかにピペッティングして混合した。引き続き溶液に１００μＬの溶離緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ；ＥＢ）（１０ｍＭ  重炭酸ナトリウム、ｐＨ＞１０、ＮａＯＨで調節、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、常温で１分間培養した後、遠心分離して核酸が含まれている上澄み液を１．５ｍＬのチューブに移して、−２０℃で保管した。また、陽性対照群として同一の試料は、市販用キット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ及びＱＮａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を使用して推奨プロトコルによって核酸抽出した。
【００４０】
実施例６：病原体濃縮−フィルター基盤
【００４１】
注射器フィルター及びＤＡ−ＨＩシステムを使用した病原体濃縮手続きの概略図は、図１の（ｂ）に図示した。１２０μＬのＡＰＤＭＳ−ＤＥ懸濁液（５０ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＤＷ）及び１００μＬのＤＭＳ溶液（２００ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＤＷ）を試料に添加した。９９ｒｐｍの回転混合機（Ｔｏｐｓｃｉｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｎｉｎｇｂｏ，Ｃｈｉｎａ）を用いて常温で１〜３０分間反応させることにより、ＨＩグループを通じた可逆的交差架橋反応に基づいてＡＰＤＭＳ−ＤＥ表面に病原体を付着させた。病原体が吸収されたＡＰＤＭＳ−ＤＥ混合物を１．０μｍの空隙を有するポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ；ＰＴＦＥ）注射器フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，ＵＳＡ）に通過させた。次いで、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水を通過させて病原体が捕獲されたフィルターを洗浄した。最後に、空気が注入された注射器のプランジャーを強く押してフィルターに溶液を除去した。
【００４２】
実施例７：核酸抽出−フィルター基盤
【００４３】
濃縮された試料からの核酸を分離するために、注射器フィルターに２０μＬのプロテイナーゼＫ、１５０μＬの自体溶解緩衝液、３０μＬのリゾチーム溶液及び１０μＬのＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ溶液を注入した。次いで、シリンジフィルターを軽くボルテックシングし、５６℃（ＤＮＡの場合）または常温（ＲＮＡの場合）で培養した後、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水でフィルターを２回通過させて、核酸が捕獲されたフィルターを洗浄した。空気が注入された注射器のプランジャーを強く押してフィルターの溶液を除去し、１００μＬの溶離緩衝液をフィルターに注入した後、常温で１分間反応させた。最後に、空気が注入された注射器のプランジャーを強く押して核酸が含まれている溶液を溶離させ、−２０℃で保管した。
【００４４】
実施例８：リアルタイムＰＣＲ
【００４５】
分離されたＤＮＡの品質を確認するために、ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲを行い、抽出されたＲＮＡの品質を検証するために、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
実験に使われたプライマーは、下記表１のようである。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
実験例１：一体型（ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅ）携帯用分析装置の製造
【００４８】
多様な試料から核酸鋳型の収集に使われた分析は、商業用ＰＴＦＥ注射器フィルターを基盤とし、図１の（ａ）のように、注射器でポンピングされた。ＤＡとＤＭＳとの使用は、病原体濃縮を向上させた。イミドエステルであるＤＭＳは、ＤＡのアミン基と連結されて負電荷を帯びる病原体を直接引き付けることができる正電荷を帯びるイミジン結合を生成することができる。さらに、ナノ多孔性構造が付与されたＤＡは、非常に強い吸収能と非常に高い反応領域とを示し、これは、向上した性能に寄与する。シリンジフィルターは、吸収された病原体とＤＡとの隔離に使われた。したがって、図１の（ｂ）のような濃縮過程は、ＤＭＳとＤＡとを溶液にある病原体と混合した後、フィルターに注入して容易に行われる。
【００４９】
洗浄後、フィルターの病原体を現場で溶解させた。ＤＮＡとＲＮＡは、可逆的架橋反応で分離されると知られている。ＤＭＳは、核酸とＤＡのアミン基との間の架橋剤としての役割を果たす。すなわち、反応緩衝液ｐＨ下で架橋反応を通じてＤＡの表面上に核酸が固定される一方、高いｐＨの溶離緩衝液は反応を逆転させ、引き続き捕獲された核酸を放出させる。したがって、図１の（ｃ）のように、注入された緩衝液のｐＨのみを調節して容易に核酸鋳型を抽出することができる。特に、本発明の分析は、ＲＮＡ分離で卓越な効能を示す。ＲＮＡとＤＡとの間の強力な共有結合によって捕獲されたＲＮＡは、分解に耐える程度に十分に安定している。本発明の分析法は、現場診断システムに容易に適用可能なＲＮａｓｅを除去するための追加装備または前処理を要しない。
【００５０】
実験例２：一体型携帯用分析法の最適化
【００５１】
分析法を統合する前にあらゆる関連要因は、個別的に最適化されなければならない。これにより、図３において、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）のサイクル臨界値（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ；ＣＴ）を通じてチューブで培養時間だけではなく、ＤＡ及びＤＭＳ条件の抽出効率を評価した。あらゆる最適化工程に１ｍＬのブルセラ・オビス試料（１０４ＣＦＵｍＬ−１  ｉｎ  ＰＢＳ）を使用した。レファレンスとして商業用キット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ及びＱＮａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を用いて同一の試料から核酸を抽出した。ＤＡのアミン機能化は、初期段階であり、病原体濃縮及びＲＮＡ抽出工程に寄与する。
【００５２】
異なるシラン化合物も、図３の（ａ）から分析された。ＣＴが低いほど核酸鋳型の品質がさらに高いので、ＡＰＤＭＳが最終的に選択された。一方、架橋結合制として、多様なイミドエステルが図３の（ｂ）から分析され、ＤＭＳが他のイミドエステル（ＤＭＡ、ＤＭＰ）よりもさらに優れた性能を示した。特に、常温で安定したＤＭＳのみが分析の貯蔵と輸送とに助けになる。引き続き図３の（ｃ）〜（ｄ）のように、ＤＡとＤＭＳとの濃度がそれぞれ最適化された。これにより、病原体濃縮の最適化が完了する。細胞溶解後、ＲＮＡが放出され、ＤＭＳのＤＡに同時に結合される。また、培養時間による性能を分析した。図３の（ｅ）のように、培養時間５分で最も高い効率を示した。また、最適化されたシステムは、図３の（ｆ）のように、ＤＮＡ抽出の分析に使われた。捕獲効率は、ＣＴ値を比較して評価された。同一の濃度の病原体を含有する１００μＬの試料（ブルセラ・オビス  ｉｎ  ＰＢＳ、１０５ＣＦＵｍＬ−１）をキットで分離し、レファレンスとして使用した。ＲＮＡ及びＤＮＡ分離に対する捕獲効率は、それぞれ９５％及び８１％であった（図４）。引き続き最適化されたシステムは、注射器フィルターと統合された。捕獲効率は、レファレンスに比べて８５％以上を示した。すなわち、病原体濃縮及び核酸抽出に対する一体型携帯用分析は、試薬の種類（図３の（ａ）〜図３の（ｂ））、濃度（図３の（ｃ）〜図３の（ｄ））及び培養時間（図３の（ｅ））で最適化された。
【００５３】
実験例３：チューブを利用した一体型接近法の評価
【００５４】
本発明のシステムを使用して現場試料準備能力を確認するために、病原体であるブルセラ・オビス試料１ｍＬ（１００〜１０４ＣＦＵｍＬ−１）を使用した。本発明のシステム及び商業用キットを用いて同時にＲＮＡ鋳型を抽出し、病原体検出のためのｑＰＣＲ分析を行った。本発明のシステムの検出限界は、図５の（ａ）のように、１００ＣＦＵｍＬ−１と観察され、キットシステム（１０２ＣＦＵｍＬ−１）よりも１００倍敏感であった。また、本発明の分析法は、図５の（ｂ）のように、ＰＢＳ、小便及び血清のような多様なマトリックスから試料を５０ｍＬまで処理することができる。図５の（ｂ）のように、１０３ＣＦＵｍＬ−１ブルセラ・オビスが互いに異なる体積の媒質に添加され、１０ｍＬの希釈液で本発明の分析法で抽出したＲＮＡ鋳型が非常に効果的な増幅を示した。ＰＢＳ及び小便試料から鋳型は、それぞれ２．３及び０．８サイクルが遅延された。特に、血清試料のあらゆる鋳型が初期サイクルに観察されたが、これは、血清試料には遥かに多くのＲＮａｓｅが含まれているために、放出されたＲＮＡは、一般的な方法で容易に分解される一方、本分析法から抽出されたＲＮＡは、堅固な共有結合によってＲＮａｓｅ分解に強い抵抗性を示す。したがって、本発明の分析法は、大量の低濃度試料だけではなく、病原体検出の限界を向上させうる。
【００５５】
実験例４：一体型携帯用分析法の性能評価
【００５６】
実験室依存性を完全に克服するために、本発明の分析法を注射器フィルターと統合した。最適化された条件で幾つかの常用フィルターを分析し、多様なフィルター類型［酢酸セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ；ＣＡ）、ポリエーテルスルホン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ；ＰＥＳ）、フッ化ポリビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＶＤＦ）及びポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）］による濃縮結果を図６の（ａ）に示した。特に、最も高いアルカリ飽和度及び低いタンパク質結合率に寄与したＰＴＦＥフィルターで速いＣＴサイクルが観察された。次いで、注射器フィルターを用いて多様な濃度の病原体試料でＲＮＡ鋳型を準備し、引き続きｑＰＣＲで検出分析を行った。図６の（ｂ）から分かるように、本発明の分析法は、チューブを使用するプロトコルと類似にキットシステム（１０２ＣＦＵｍＬ−１）よりも１００倍高い１００ＣＦＵｍＬ−１に非常に低い検出限界を示した。チューブ及びキットシステムいずれも病原体濃縮及び現場核酸抽出で高い効率を示したが、これは、本発明のプロトコルが現場で高品質のＲＮＡ鋳型を抽出するために、他の分析法と容易に統合されるということを意味する。
【００５７】
また、本発明の分析法は、注射器を利用した簡単なローディング段階で大量の試料を容易に処理することができる。最大５０ｍＬの試料をテストし、図７の（ａ）のように、多様な体積の試料から濃縮及び核酸抽出が安定して行われることを確認した。また、図７の（ｂ）のように、他の生物学的マトリックスで本発明の分析性能を検証し、小便試料でも、濃縮及び核酸抽出に優れていることを確認した。
【００５８】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい具現例に過ぎず、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とその等価物とによって定義される。
【００５９】
本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、そして、その均等概念から導出される、あらゆる変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されねばならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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