(57)【要約】  企図されるシステム及び方法は、テモゾロミドに対する反応予測モデルを使用し、このモデルは、ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報に基づき、且つ少なくとも８５％の予測確度を有する。
2021501422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者においてテモゾロミドに対する治療反応を予測する方法であって、
前記患者の腫瘍からＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報を提供することと、
反応予測モデルによりテモゾロミドに対する反応予測を計算することであって、前記反応予測モデルが、前記ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報を使用する、計算することと、
を含む方法。
【請求項２】
前記反応予測モデルがＫ最近傍アプローチを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報がサブグループ化される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡｓｅｑ情報が、３．５のｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）カットオフ値を用いてサブグループ化される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質定量情報が、２００ａｍｏｌ／ｍＬのカットオフ値を用いてサブグループ化される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記メチル化情報が、６０％プロモーターＣｐＧメチル化のカットオフ値を用いてサブグループ化される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報が、ＦＦＰＥサンプル又はフレッシュ腫瘍サンプルから提供される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍が転移結腸癌、膠芽細胞腫、又は黒色腫である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応予測モデルが少なくとも８５％の予測確度を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報がサブグループ化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡｓｅｑ情報が、３．５のｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）カットオフ値を用いてサブグループ化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質定量情報が、２００ａｍｏｌ／ｍＬのカットオフ値を用いてサブグループ化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記メチル化情報が、６０％プロモーターＣｐＧメチル化のカットオフ値を用いてサブグループ化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報が、ＦＦＰＥサンプル又はフレッシュ腫瘍サンプルから提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が転移結腸癌、膠芽細胞腫、又は黒色腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応予測モデルが少なくとも８５％の予測確度を有する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１７年１０月３０日出願の出願番号６２／５７９，１２７、２０１８年９月５日出願の出願番号６２／７２７，２４５の同時係属米国仮出願（両方ともその全体が本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野は、テモゾロミドに対する患者の薬剤反応を予測するシステム及び方法、とりわけ、患者が癌と診断される場合である。
【背景技術】
【０００３】
背景の説明は、本発明の理解に役立ちうる情報を含む。本明細書に提供されるいずれの情報も、本特許請求の発明の先行技術又は関連技術であると認められたわけではなく、具体的又は黙示的に参照されたいずれの刊行物も、先行技術であると認められたわけではない。
【０００４】
本明細書に記載の刊行物及び特許出願はすべて、各個別の刊行物又は特許出願があたかも参照により具体的且つ個別的に示されて組み込まれたのと同程度に参照により組み込まれる。組み込まれた参照文献中の用語の定義又は使用が本明細書に提供されたその用語の定義と矛盾又は対立する場合、本明細書に提供されたその用語の定義が適用され、参照文献中のその用語の定義は適用されない。
【０００５】
テモゾロミド（ＴＭＺ）は、膠芽細胞腫及び黒色腫の標準的治療として使用される化学療法剤であり、最近、転移結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）の患者で限られてはいるが有望な活性が示された。ＴＭＺは、ＤＮＡのグアニン残基のＮ−７位又はＯ−６位に対してアルキル化／メチル化活性を有する作用剤であり、多くの場合、感受性細胞の細胞死をトリガーする。しかしながら、各種ＤＮＡ損傷修復酵素とりわけＯ−６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）は、腫瘍細胞の少なくともいくつかでテモゾロミドの効果を打ち消すおそれがある。より最近では、ＭＧＭＴ遺伝子のエピジェネティックサイレンシングが報告され、ＭＧＭＴ遺伝子のエピジェネティックサイレンシングを有する腫瘍細胞は、ＴＭＺによる死滅に対してより感受性のあることが見いだされた。
【０００６】
したがって、ＭＧＭＴはＴＭＺの耐性マーカーとみなされる。通常、腫瘍のＭＧＭＴ発現ステータスは、メチル−ＢＥＡＭｉｎｇ（ＭＢ）として知られるディジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により評価可能であり、＞６０％ＭＧＭＴメチル化のカットオフはＴＭＺの奏効を予測する。他の一アプローチでは、質量分析（ＭＳ）プロテオミック解析は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片においてＭＧＭＴタンパク質及び他の利用可能なタンパク質バイオマーカーを客観的に定量可能である。この場合、２００ａｍｏｌ／μｇ（アッセイの検出限界に基づいてあらかじめ規定される）のＭＧＭＴタンパク質カットオフは、ＴＭＺで治療されるｍＣＲＣ患者において奏効の予測因子となる。ＭＧＭＴタンパク質の量は、ＭＧＭＴメチル化ステータスにも相関しうる。
【０００７】
ＴＭＺ治療を受けたｍＣＲＣ患者のうち、腫瘍が低レベル又は検出不能レベルのＭＧＭＴタンパク質を発現したものは、より高いＭＧＭＴタンパク質レベルを有するそのカウンターパートよりも長いｍＰＦＳを有していた。ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（２０１７年６月２〜６日）のアブストラクト＃１１６０１に提示されたように、質量分析により定量されるＭＧＭＴタンパク質発現とＭＢによるＭＧＭＴメチル化ステータスとの間に８０％の相関が観測された。定量プロテオミクスは、ＦＦＰＥ腫瘍サンプルにおいてＭＧＭＴタンパク質を客観的に測定し、ＴＭＺに対するレスポンダー９名中９名をレトロスペクティブに同定した。ディジタルＰＣＲメチル化アッセイ（メチル−ＢＥＡＭｉｎｇ）は、ＴＭＺに対するレスポンダー８名中７名をレトロスペクティブに同定した。したがって、研究者らは、ＭＧＭＴの定量プロテオミック解析がＴＭＺ療法のｍＣＲＣ患者の選択に潜在的に使用可能であると結論付けた。
【０００８】
しかしながら、かかるアプローチは、レトロスペクティブ方式でのみプロテオミック解析及びメチル化解析とみなされた。さらに、質量分析の検出限界及びメチル化検出の欠損可能性は、潜在的にレスポンダー解析の確度をさらに低減する。実際に、質量分析とメチル化解析との間でＭＧＭＴとの反応関連性の一致は約８０％にすぎないことが観測された。さらに、著者らは、臨床上有用な予測確度で反応予測を支援又は示唆する可能性のあるいずれの解析選択肢も提示しなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、特定の薬剤反応を予測する各種システム及び方法が当技術分野で公知であるとしても、高信頼度で薬剤の単純且つロバストな治療予測を可能にするとともに患者特異的に治療反応の予測を可能にするシステム及び方法の必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主題は、患者の固形腫瘍の治療においてテモゾロミドに対する治療反応を予測する各種デバイス、システム、及び方法に関する。本発明の主題の一態様では、本発明者らは、患者においてテモゾロミドに対する治療反応を予測する方法を企図する。本方法は、患者の腫瘍からＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報を提供する工程と、反応予測モデルによりテモゾロミドに対する反応予測を計算する他の一工程と、を含み、反応予測モデルは、ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報を使用する。
【００１１】
最も好ましくは、反応予測モデルはＫ最近傍アプローチを使用し、且つＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報はサブグループ化される。たとえば、ＲＮＡｓｅｑ情報は３．５のｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）カットオフ値を用いてサブグループ化しうるし、タンパク質定量情報は２００ａｍｏｌ／ｍＬのカットオフ値を用いてサブグループ化しうるし、且つ／又はメチル化情報は６０％プロモーターＣｐＧメチル化のカットオフ値を用いてサブグループ化される。最も典型的には、反応予測モデルは少なくとも８０％又は少なくとも８５％の予測確度を有する。
【００１２】
ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報は、ＦＦＰＥサンプル又はフレッシュ腫瘍サンプルから提供され、且つ腫瘍は固形腫瘍（たとえば、転移結腸癌、膠芽細胞腫、又は黒色腫）であることが、さらに企図される。
【００１３】
本発明の主題の他の一態様は、腫瘍を有する患者の治療方法を含む。本方法は、患者の腫瘍（たとえば固形腫瘍）からＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報を提供する工程と、反応予測モデルによりテモゾロミドに対する反応確率を計算する工程と、を含み、反応予測モデルは、ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報を使用する。次いで、本方法は、＞０．５のテモゾロミド反応確率を有する患者にテモゾロミドを投与する工程を続いて行う。好ましくは、反応予測モデルはＫ最近傍アプローチを使用し、且つ／又は反応予測モデルは少なくとも８５％の予測確度を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報はサブグループ化される。好ましくは、ＲＮＡｓｅｑ情報は３．５のｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）カットオフ値を用いてサブグループ化され、且つ／又はタンパク質定量情報は２００ａｍｏｌ／ｍＬのカットオフ値を用いてサブグループ化され、且つ／又はメチル化情報は６０％プロモーターＣｐＧメチル化のカットオフ値を用いてサブグループ化される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報は、ＦＦＰＥサンプル又はフレッシュ腫瘍サンプルから提供される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、転移結腸癌、膠芽細胞腫、又は黒色腫である。
【００１６】
本発明の主題の各種目的、特徴、態様、及び利点は、添付の図面と併せて好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実験研究に使用したサンプル及びアッセイを示す。
【図２】（図２Ａ）ＭＧＭＴタンパク質ステータス別の及び（図２Ｂ）ＭＧＭＴプロモーター高メチル化ステータス別のＴＭＺ治療患者（ｎ＝４１）間における腫瘍体積の（ベースラインからの）パーセント変化のグラフを示す。
【図３】ＴＭＺ治療患者間における腫瘍体積の（ベースラインからの）パーセント変化のグラフを示す。
【図４】ＭＧＭＴタンパク質発現レベル別のＴＭＺ治療を受けた転移結腸直腸癌患者の無進行生存（ＰＦＳ、図４Ａ）及び全生存（ＯＳ、図４Ｂ）のグラフを示す。
【図５】ＭＧＭＴメチル化ステータスにより層別化されたＴＭＺ治療を受けた転移結腸直腸癌患者のＰＦＳ（図５Ａ）及びＯＳ（図５Ｂ）のグラフを示す。
【図６】ＲＮＡ−ｓｅｑ解析によるＴＭＺ治療を受けた転移結腸直腸癌患者のＰＦＳ（図６Ａ）及びＯＳ（図６Ｂ）のグラフを示す。
【図７】ＭＧＭＴタンパク質発現レベル別のＴＭＺ治療を受けた転移結腸直腸癌患者のグラフを示す。
【図８】ＲＮＡｓｅｑデータのカットオフ値を模式的に例示するグラフである。
【図９Ａ】ＲＮＡｓｅｑ値とプロテオミック値との間の一致を模式的に例示するグラフである。
【図９Ｂ】ＲＮＡｓｅｑ値とプロテオミック値との間の一致を模式的に例示するグラフである。
【図９Ｃ】ＭＧＭＴタンパク質の量とＭＧＭＴメチル化との間の一致の棒グラフを示す。
【図１０】ＭＧＭＴタンパク質レベルサブグループに対してＰＦＳ（無進行生存）及びＯＳ（全生存）を描いたグラフである。
【図１１】ＭＧＭＴ  ＲＮＡｓｅｑレベルサブグループに対してＰＦＳ（無進行生存）を描いたグラフである。
【図１２】ＭＧＭＴサブグループの一組合せに対してＰＦＳ（無進行生存）を描いたグラフである。
【図１３】ＭＧＭＴサブグループの他の一組合せに対してＰＦＳ（無進行生存）及びＯＳ（全生存）を描いたグラフである。
【図１４】各種分類器に対する各種入力変数に基づいてテモゾロミド反応予測確度を描いたグラフである。
【図１５】実施例２のリーブペアアウト交差検証による予測モデルの平均確度のグラフを示す。
【図１６】ＭＧＭＴアセスメント法グループ別の５８予測モデリングストラテジーに対する未知サンプルの平均予測確度のグラフを示す。グループは、実施例２の平均確度により左から右に順序付けられる。
【図１７】各種タイプのデータから薬剤反応を予測するマシンラーニングの模式図を示す。
【図１８】予測モデルの回帰及び分類のパイプラインのフローチャートを示す。
【図１９】各種回帰モデルにより決定された全発現とＭＧＭＴタンパク質との関係のグラフを示す。
【図２０】各種回帰モデルにより決定されたＭＧＭＴタンパク質とＭＧＭＴ遺伝子との関係のグラフを示す。
【図２１】メチル化値を用いた確度値のグラフを示す。
【図２２】メチル化値を用いた確度値の他の一グラフを示す。
【図２３】予測モデルのトレーニングデータセット及び試験データセットのヒートマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明者は、このたび、腫瘍の（好ましくはサブグループ化された）ＲＮＡｓｅｑ情報とタンパク質定量情報とプロモーターメチル化情報との組合せに基づくモデルを用いて予想外に高い確度で臨床上有用なテモゾロミド予測モデルを確立可能であることを発見した。とくに好ましい態様では、モデルはＫ最近傍アプローチに基づく。
【００１９】
ＭＧＭＴタンパク質レベル又はプロモーターメチル化とテモゾロミド反応との間の事後関連性は一般に知られているが、かかる関連性は必ずしも予測されるとは限らず、もちろん高い確度で予測されることはないことを認識すべきである。本発明者は、このたび、患者の腫瘍から定量された且つ好ましくはサブグループ化されたパラメーター：（１）ＲＮＡｓｅｑ情報とくにＴＰＭ単位で測定されるものと（２）タンパク質定量情報とくに質量分析により測定されるものと（３）メチル化情報とくにＭＧＭＴプロモーター領域で測定されるものとの組合せにより患者治療反応を予測するきわめて正確な予測モデルを確立可能であることを観測した。
【００２０】
したがって、本発明者は、腫瘍を有する患者においてテモゾロミドに対する治療反応を予測する方法を企図する。本方法は、患者の腫瘍からＲＮＡｓｅｑ情報とタンパク質定量情報とメチル化情報とを提供する工程を含む。次いで、ＲＮＡｓｅｑ情報とタンパク質定量情報とメチル化情報とを考慮に入れた反応予測モデルを用いて、テモゾロミドに対する反応予測を確立する。容易に分かるであろうが、情報のタイプは、サンプルの性質を少なくともある程度決定するであろう。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「腫瘍」という用語は、人体の１つ以上の解剖学的位置に配置されうる又は見いだされうる１つ以上の癌細胞、癌組織、悪性腫瘍細胞、又は悪性腫瘍組織を意味し、それらと同義的に用いられる。本明細書で用いられる「患者」という用語は、病態（たとえば癌）を有すると診断された者さらには病態の検出又は同定を目的として検査及び／又は試験を受けている者の両方を含むことに留意すべきである。そのため、腫瘍を有する患者とは、癌を有すると診断された者さらには癌を有することが疑われる者の両方を意味する。本明細書で用いられる場合、「ｐｒｏｖｉｄｅ（提供する）」又は「ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ（提供する）」という用語は、製造する、生成する、配置する、使用可能にする、移動する、又は即使用可能にするいずれかの行為を意味及び包含する。
【００２２】
したがって、本発明の主題のほとんどの態様では、すべての関連情報を得るために腫瘍サンプルが使用されるであろう。患者の腫瘍サンプル（腫瘍細胞若しくは腫瘍組織）（又は比較として患者若しくは健常者の健常組織）を得るいずれかの好適な方法が企図される。最も典型的には、腫瘍サンプルは、生検を介して患者から得ることが可能であり（液体生検を含めて、又は手術や独立生検手順などの際に組織切除を介して得られる）、フレッシュな状態でありうるか又は組織のオミクスデータを得るためのさらなるプロセスまで処理した状態（たとえば凍結したホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルなど）でありうる。たとえば、腫瘍細胞又は腫瘍組織は、新鮮な状態又は凍結した状態でありうる。他の例では、腫瘍細胞又は腫瘍組織は、細胞／組織の抽出物の形態でありうる。いくつかの実施形態では、腫瘍サンプルは、単一の組織若しくは解剖学的領域又は複数の異なる組織若しくは解剖学的領域から得られうる。たとえば、転移乳癌組織は、患者の乳房から、さらには転移した乳癌組織に対しては他の器官（たとえば、肝臓、脳、リンパ節、血液、肺など）から得ることが可能である。好ましくは、患者の健常組織若しくは対応正常部組織（たとえば患者の非癌性乳房組織）を得ることが可能であるか、又は比較として類似の方法を介して健常者（患者以外）の健常組織を得ることも可能である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、腫瘍サンプルは、関連期間にわたり腫瘍サンプルのいずれかの変化を決定するために複数の時点で患者から取得可能である。たとえば、腫瘍サンプル（又は腫瘍が疑われるサンプル）は、サンプルが癌性として決定又は診断される前及びその後に得られうる。他の一例では、腫瘍サンプル（又は腫瘍が疑われるサンプル）は、１回又は一連の抗腫瘍治療（たとえば、放射線療法、化学療法、免疫療法など）の前、その時、及び／又はその後（たとえば終了時など）に得られうる。さらに他の一例では、腫瘍サンプル（又は腫瘍が疑われるサンプル）は、新たな転移した組織又は細胞を同定する際に腫瘍の進行中に得られうる。
【００２４】
得られた腫瘍細胞又は腫瘍組織から、ＤＮＡ（たとえば、ゲノミックＤＮＡ、染色体外ＤＮＡなど）、ＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、及び／又はタンパク質（たとえば、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質など）を単離し、そしてさらに解析することによりオミクスデータを得ることが可能である。代替的及び／又は追加的に、オミクスデータを得る工程は、１名以上の患者及び／又は健常者のオミクス情報を記憶するデータベースからオミクスデータを受け取ることを含みうる。たとえば、患者の腫瘍のオミクスデータは、患者の腫瘍組織から単離されたＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はタンパク質から得られうるとともに、得られたオミクスデータは、同一型の腫瘍又は異なる型の腫瘍を有する他の患者の他のオミクスデータセットと共にデータベース（たとえば、クラウドデータベース、サーバーなど）に記憶しうる。健常者又は患者の対応正常部組織（又は健常組織）から得られたオミクスデータはまた、解析時に関連データセットをデータベースから検索できるようにデータベースに記憶可能である。同様に、タンパク質データを得る場合、これらのデータはまた、とりわけタンパク質が酵素活性を有する場合（たとえば、ポリメラーゼ、キナーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、オキシドレダクターゼなど）、タンパク質活性を含みうる。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、オミクスデータは、限定されるものではないが、ゲノミクス、プロテオミクス、及びトランスクリプトミクスに関連する情報、さらには特異的な遺伝子発現又は転写物の解析、並びに細胞の他の特性及び生物学的機能を含む。ゲノミクスデータに関して、好適なゲノミクスデータは、腫瘍サンプル及び対応正常部サンプルの両方の全ゲノムシーケンシング及び／又はエキソームシーケンシング（典型的には少なくとも１０×、より典型的には少なくとも２０×のカバレッジデプス）により取得可能なＤＮＡ配列解析情報を含む。代替的に、ＤＮＡデータは、先行する配列決定からすでに確立された配列レコード（たとえば、ＳＡＭ、ＢＡＭ、ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＱ、又はＶＣＦファイル）からも提供しうる。したがって、データセットは、未処理又は処理済みのデータセットを含みうるとともに、模範的データセットは、ＢＡＭフォーマット、ＳＡＭフォーマット、ＦＡＳＴＱフォーマット、又はＦＡＳＴＡフォーマットを有するものを含む。しかしながら、データセットは、ＢＡＭフォーマットで又はＢＡＭＢＡＭ差分オブジェクトとして提供されることがとりわけ好ましい（たとえば、米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２０１２／００６６００１Ａ１号明細書）。オミクスデータは、全ゲノムシーケンシング、エキソームシーケンシング、トランスクリプトームシーケンシング（たとえばＲＮＡ−ｓｅｑ）、又は遺伝子特異的解析（たとえば、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、ＬＣＲなど）に由来しうる。同様に、配列データのコンピューター解析は、多くの方式で実施しうる。しかしながら、最も好ましい方法では、解析は、たとえば、米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２０１２／００６６００１Ａ１号明細書に開示されるように、ＢＡＭファイル及びＢＡＭサーバーを用いて腫瘍サンプル及び正常サンプルの位置ガイド同期アライメントによりｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで実施される。かかる解析は、偽陽性ネオエピトープを有利に低減し、且つメモリー及びコンピューター資源に対する要件を有意に低減する。
【００２６】
代替的又は追加的に、関連情報は腫瘍から直接得ることが好ましいが、データの１つ以上はデータベースからも得られうる。たとえば、全ゲノムシーケンシング及びＲＮＡ解析の達成にフレッシュ腫瘍サンプルを使用する場合、関連情報は、データベース又は最適にはシーケンシングセンターから提供されうる。プロテオミクス解析は、レーザーマイクロダイセクションを用いてＦＦＰＥサンプルから実施しうるとともに、質量分析は、かかるサンプルを用いて実施可能である。したがって、情報源は、必ずしも単一源に由来する必要があるとは限らず、各種源からアセンブルしうる。同様に、企図される解析は、異なる時点、たとえば、手術前及びテモゾロミドの投与前、又は手術後及びテモゾロミドの投与前などのデータを利用しうる。
【００２７】
したがって、好ましくは、好適なゲノム情報は、たとえば、ＭＧＭＴ遺伝子の突然変異、重複、又は欠失、並びに転写（及びスプライス変異又は存在する場合は他の突然変異）の定量情報を提供するＭＧＭＴのＲＮＡ配列情報とくにＲＮＡｓｅｑ情報を同定しうる全ゲノムシーケンシング又はエキソームシーケンシングを含む。代替的に、定量情報は、ハイブリダイゼーション法及び／又は他のＰＣＲベース法によっても得られうる。同様に、タンパク質情報は、選択された反応モニタリング法、抗体ベース情報、及び／又は染色法を含めて、好ましくは質量分析法を用いて得られる。
【００２８】
ＤＮＡ損傷アルキル化剤テモゾロミド（ＴＭＺ）は、膠芽細胞腫、黒色腫、及びリンパ腫の治療が承認されている。ＭＧＭＴ酵素は、アルキル化剤由来の損傷の修復に関与する。ＭＧＭＴエピジェネティックサイレンシングは、黒色腫研究でＴＭＺ耐性に関連し、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の約１／３で起こる。しかしながら、困ったことに、低いＭＧＭＴタンパク質発現は、ＴＭＺ反応の予測を増加させうるとともに、ｍＣＲＣ患者においてＭＧＭＴメチル化よりもさらに増加させうることが、従来の研究により実証された。各種ＭＧＭＴアッセイとアウトカムとの関係は依然として不明である。
【００２９】
したがって、本発明者らは、予測モデルの構築では単一分子エンティティーに対して２タイプ以上のデータセットの使用を企図する。有利には、好適なタイプのデータセットは、ＤＮＡコピー数データ、ＤＮＡ突然変異データ、ＲＮＡスパイス変異体データ、ＲＮＡ発現レベルデータ、プロモーターメチル化データ、エピジェネティック修飾データ、タンパク質データ、及びタンパク質活性データを含む。最も典型的には、かかるデータは、容易に入手可能であり、且つ／又は各種経路モデル（たとえばＰＡＲＡＤＩＧＭ）から推測可能である。２タイプ以上のデータセットが使用される場合、少なくとも３つの異なるタイプのデータセットが利用されるであろうことも企図される。容易に分かるであろうが、分類アルゴリズムの選択は、少なくともある程度、データセットのタイプの関数であろうし、当業者であれば、所与のデータセットに対して適切な分類アルゴリズムを決定可能であろう。さらに、以下にも模範的に記されるように、カットオフ値はあらかじめ決めうるか、又は独立してさらなるマシンラーニングを用いて学習しうる。
【００３０】
定量メトリックを得るために使用される特定の方法にかかわらず、ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報の１つ以上は、１つ以上の閾値を用いてサブグループ化することが一般に好ましいことが企図される。たとえば、以下でより詳細に説明されるように、ＲＮＡｓｅｑ情報はＴＰＭ（転写物百万分率）閾値によりサブグループ化しうるし、タンパク質定量情報は検出閾値又は２００ａｍｏｌなどの特定の値によりサブグループ化しうるし、且つメチル化情報は、メチル−ＢＥＡＭｉｎｇにより決定される閾値（たとえば、６０％メチル化ＭＧＭＴプロモーター配列）によりサブグループ化しうる。
【００３１】
本発明者らはさらに、かかるＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報の１つ以上、及び／又はサブグループ化された情報の１つ以上の閾値を用いることにより、予測モデルをトレーニングして予測モデルの確度を検証することが可能であることを企図する。反応予測モデルに関して、当技術分野で公知のモデル構築方法が多数存在すること、且つ企図されるモデルは、ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報の１つ以上をグループ化して又はグループ化せずに及びそれらのいずれかを組み合わせて使用しうることに留意すべきである。しかしながら、以下でより詳細にさらに記載されるように、モデルは、ＲＮＡｓｅｑ情報、タンパク質定量情報、及びメチル化情報をサブグループ化して使用することが好ましい。
【００３２】
同様に、当技術分野で公知の予測タスク用の各種多変量分類アルゴリズムが存在し、模範的分類器としては、エクストラツリー分類器、ＫＮＮ分類器、ＲＢＦ又は線形サポートベクトル分類器、ディシジョンツリー分類器、ナイーブベイズ分類器、クアッドディスクリミナント分類器、リッジ分類器、ガウスプロセス分類器、ランダムフォレスト分類器、ランダムフォレストベース又はデシジョンツリーベースの推定量のいずれかを用いたアダブースト分類器が挙げられる。当技術分野で公知の予測タスク用の各種単変量分類アルゴリズムが存在し、例としてユーデン解析を用いて最適分類閾値が見いだされている。以下に示されるように、かかるアルゴリズムはさまざまな確度メトリックを提供するであろう。また、反応予測モデルの作成には最高確度（又は確度ゲイン）を有する分類器を使用することが一般に好ましい。とくに相対的に高い確度のものでは、企図される方法は、未知癌患者（たとえばｍＣＲＣ患者など）で検証したとき、使用した分類器のタイプに依存して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％の予測確度を可能にした。最も好ましくは、Ｋ最近傍分類器を使用した場合、約８６％の確度が達成された。
【実施例】
【００３３】
ＦＥＬＤＳＰＡＲコホートの３つの第ＩＩ相臨床試験の１つでＴＭＺを摂取した４１名の転移結腸直腸癌患者からアーカイブＦＦＰＥ組織切片を得た。表１に示されるように、解析のために４１名のＴＭＺ治療患者から腫瘍サンプルを入手可能であった。これらの患者は６９歳のメジアン年齢を有し、ＴＭＺ前にメジアンで３回の化学療法レジメンを受けていた。患者の大多数は、０又は１のＥＣＯＧステータス（８５％）及び少なくとも２つの転移部位（５６％）を有し、最頻発部位は肝臓であった。ｍＣＲＣで予想されるように、患者はすべて、ＴＭＺで最終的に進行した。ＯＲＲは次の通りであった。すなわち、２６名の患者（６３％）は進行性疾患を有し、９名（２２％）は部分反応を有し、６名（１５％）は安定性疾患を有していた。図１に示されるように、これらの４１サンプルのうち、３９はＲＮＡｓｅｑシーケンシングの品質管理標準に首尾よく合格し、且つ３５はメチルＢＥＡＭｉｎｇ（ディジタルＭＢ）の品質管理標準に首尾よく合格した。以下はこの選択されたサンプルの簡単な解析である。
【００３４】
【表１】
2021501422.tif 000003
【００３５】
４１アーカイブサンプルはすべてＬＣ−ＭＳにより評価可能であり、３５はディジタルＭＢにより解析され、且つ３９はＲＮＡ−ｓｅｑによるＭＧＭＴアセスメントに十分な品質であった（図１、表１）。ＬＣ−ＭＳベースプロテオミクスにより評価された患者のうち、１８名（４４％）はＭＧＭＴタンパク質試験で陰性であったので（＜２００ａｍｏｌ／μｇの腫瘍タンパク質）、ＴＭＺに反応する可能性が高いとみなされた。残り（ｎ＝２３）はＭＧＭＴタンパク質陽性であり、ＴＭＺ療法に反応する可能性が低いとみなされた。臨床試験参加者のこの分子富化集団では、ＭＧＭＴレートは高く４４％であった。比較すると、１年間にわたるプロテオミック試験のために我々の実験室に渡された全ＣＲＣ患者サンプル（ｎ＝１１４）では、ＭＧＭＴ陰性の出現率１６％が見いだされた。ＭＢにより、６３％カットオフを超えるＭＧＭＴプロモーターメチル化は、１２名（３４％）の患者で観測され、残りは非メチル化ＭＧＭＴステータスを有していた（表２）。ＭＢ及びＬＣ−ＭＳの両方により解析された３５腫瘍では、方法間の一致レートは７７％、ｐ＝０．００４であった。
【００３６】
【表２】
2021501422.tif 000004
【００３７】
反応及び生存を予測するＭＧＭＴアッセイの能力：  定量プロテオミクスは、ＴＭＺに対するＲＥＣＩＳＴ規定レスポンダー９名中９名をレトロスペクティブに同定し、９名のレスポンダーはすべて、ＬＣ−ＭＳにより陰性ＭＧＭＴタンパク質発現を有していた。ＭＧＭＴ陰性タンパク質を有する追加の９名の患者は、ＴＭＺに対するＲＥＣＩＳＴ規定反応を有していなかった（ＯＲＲ、ＭＧＭＴ陰性患者：５０％）。陽性ＭＧＭＴタンパク質発現を有する患者は誰も、ＴＭＺに反応しなかった（ＯＲＲ、ＭＧＭＴ陽性患者：０％、ｐ＝０．０００１、表２、図２Ａ）。
【００３８】
ＭＢ（ｎ＝３５）により解析された患者のうち、ＭＧＭＴ高メチル化ステータスは、ＴＭＺに対するレスポンダー８名中６名をレトロスペクティブに同定し、ＭＢによりＭＧＭＴ高メチル化を有する追加の６名の患者は、ノンレスポンダーであった（ＯＲＲ、ＭＧＭＴ高メチル化患者：５０％）。陰性メチル化ステータスを有する２名の患者は、ＴＭＺに反応した（ＯＲＲ：９％、ｐ＝０．０１１、表２、図２Ｂ）。図３は、メチル化ステータス及びＭＧＭＴタンパク質発現レベルのデータを組み合わせたグラフを示す（ＭＧＭＴタンパク質＜２００ａｍｏｌ／μｇ（ｎ＝１８、暗青色）及びＭＧＭＴ≧２００ａｍｏｌ／μｇ（ｎ＝２３、薄青色）を有する患者ごとの腫瘍体積の（ベースラインからの）パーセント変化）。陽性ステータスが＞６０％（赤線）として規定されるＭＢによるＭＧＭＴメチル化ステータス（赤色バー、ｎ＝３５）。
【００３９】
生存分析では、ＬＣ−ＭＳにより陰性ＭＧＭＴタンパク質発現を有する患者は、プロテオミック陽性患者よりも長いメジアンＰＦＳ（ｍＰＦＳ）を有していた（３．７ヶ月間対１．８ヶ月間、ＨＲ：０．５０４［９５％ＣＩ  ０．２７〜０．９４］、ｐ＝０．０１４）（図４Ａ）。ＭＧＭＴレベルは、二変量コックス比例ハザードモデルで１２潜在交絡因子（ＢＲＡＦ及びＫＲＡＳ突然変異ステータス、性別、ＥＣＯＧ、前治療回数、ＬＤＨベースラインレベル、転移部位数、好中球対リンパ球比、腹膜疾患、原発腫瘍位置、アーカイブ組織部位、並びに年齢）とペアにしたとき、ＰＦＳの統計学的に有意な予測因子を維持した。
【００４０】
これらの臨床変量のいくつかはアウトカムに関連したが（たとえばＬＤＨ）、ＭＧＭＴタンパク質発現は、ＰＦＳの最も統計学的に有意な予測因子であった（表３）。ＭＧＭＴタンパク質発現によるＯＳの差はＰＦＳ差に類似していたが、統計的有意性に達しなかった（８．７対７．４ヶ月間、ＨＲ：０．５９３［９５％ＣＩ：０．３２〜１．１２］、ｐ＝０．０７８）（図４Ｂ）。ＭＧＭＴ  ＭＢにより層別化された患者間ではＰＦＳ又はＯＳの統計学的有意差は存在しなかった（図５Ａ及び５Ｂ）。
【００４１】
【表３】
2021501422.tif 000005
【００４２】
ＲＮＡシーケンシングによるＭＧＭＴ：  データに当てはめたｍＲＮＡ発現に対して実験的カットポイントを用いて（≦３．５ｌｏｇ２［ＴＰＭ＋１］）、サンプルの大多数で低ＭＧＭＴｍＲＮＡ発現が観測された（ｎ＝２３、５９％）（表２）。ＲＮＡ−ｓｅｑにより低ＭＧＭＴ  ＲＮＡ発現を有する患者の腫瘍は、より高いｍＲＮＡエクスプレッサーよりも非有意に高いＯＲＲを有していた（３５％対６％、ｐ＝０．１１５、表２）。ＭＧＭＴｍＲＮＡ発現により層別化された患者間に統計的に有意な生存差は存在しない（図６Ａ及び図６Ｂ）。図７Ａ及び図７Ｂは、ＴＭＺ治療患者（ｎ＝４１）間で、ＭＧＭＴタンパク質レベル＜２００ａｍｏｌ／μｇ（ｎ＝１８）を有するものは、より高いＭＧＭＴタンパク質レベルを有する患者よりも長いメジアンＰＦＳ（ｍＰＦＳ）を有していたことを示す他のグラフを示す。患者はすべて、ＴＭＺで最終的に進行する。（図７Ａ）臨床反応を反映するＲＥＣＩＳＴ基準により進行を再定義し、≧６ヶ月間にわたり部分反応又は安定性疾患を有する患者をレスポンダー（ｎ＝１８）又はノンレスポンダー（ｎ＝２３）として規定した。全生存の結果は一貫性があり、ほぼ統計的に有意であった（８．７対７．４ヶ月間、ＨＲ＝０．６、ｐ＝０．０７７）（図７Ｂ）。
【００４３】
ＲＮＡｓｅｑのカットオフとＭＳ−プロテオミックカットオフとの間の相関：  観測／実用ＭＳ−プロテオミクスカットオフ値に対するＲＮＡｓｅｑの対応するカットオフ値を同定する試みで、本発明者は、すべてのＣＯＡＤ及びＲＥＡＤ  ＴＣＧＡサンプルでＭＧＭＴ発現レベルを得て、先行プロテオミック解析により提案された２００ａｍｏｌカットオフとマッチしうるナチュラルブレイクを発現パターンで探索した。図８Ａ及び８Ｂから分かるように、ＭＧＭＴ  ＴＰＭの分布は、３．５ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）（垂直線で示される）の近傍にナチュラルブレイクを有する２モードで現れる。３．５ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）のカットオフでは、以下の表４からも明らかなように、２００ａｍｏｌ／ｍＬ  ＭＳプロテオミクスカットオフとＲＮＡｓｅｑクラスとの間で良好な一致が観測される。タンパク質閾値とＲＮＡ閾値との間のこの関連レベルに対するフィッシャー正確ｐ値は、ｐ＜０．０００８２である。
【００４４】
【表４】
2021501422.tif 000006
【００４５】
フォローアップ解析では、本発明者は、選択されたカットオフ（３．５ｌｏｇ２［ＴＰＭ＋１］）が、図９Ａ及び９Ｂから得られるユーデン解析によりこのコホートにおいてＲＮＡｓｅｑとプロテオミック値との間の一致に関して最適であることを見いだした。この３．５のカットポイントでは、プロテオミックＭＧＭＴクラスと比較したとき、このコホートで０．７１のＴＰＲ及び０．１１のＦＰＲが得られる。図９Ｃは、ＴＭＺに対するノンレスポンデント及びレスポンデントのＲＮＡｓｅｑ値を示す棒グラフを示す（統計量＝−１．０４、ｐ値＝０．３０５）。図９Ｄは、ＭＧＭＴプロテオミックアッセイとＭＢとの間の一致レートが８０％、ｐ＝０．００１１フィッシャー検定であったことを示唆する棒グラフを示す（ＭＢにより解析された３５腫瘍）。
【００４６】
アウトカムに関連するＭＧＭＴサブグループの規定：  第１の解析では、本発明者は、前の研究を再現して＜２００ａｍｏｌ／ｍＬ  ＭＧＭＴタンパク質を有する患者のＰＦＳ奏効を実証した。典型的な結果は図１０Ａに示される。プロテオミッククラス間のログランク検定はｐ≦０．０１８６を有し、コックス比例ハザード結果は表５に示される。
【００４７】
【表５】
2021501422.tif 000007
【００４８】
ログランク検定はこれらの２つのサブグループでｐ＜０．０１８６を与えるが（前の研究に示される）、コックス比例ハザード比はｐ＜０．０２１を与えることに留意すべきである。コックスモデルはわずかに保存的であり、アーム内のアンバランスを考慮に入れる。両方の統計について以下の結果で考察する。このスプリットは、図１０Ｂから分かるように、生存メトリックとしてＯＳ及びエンドポイントとして死を用いたとき、ｐ＜０．０５の有意性を失うことにも、留意すべきである。この場合、プロテオミッククラス間のログランク検定はｐ≦０．０８７９であり、コックス比例ハザードは表６に示される通りであった。
【００４９】
【表６】
2021501422.tif 000008
【００５０】
次いで、本発明者は、ＲＮＡｓｅｑサブグループを用いて観測される関連を調べた。この場合、ＴＧＣＡ  ＣＯＡＤ／ＲＥＡＤデータで確立された３．５ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）のＲＮＡｓｅｑカットオフを用いて、図１１に示されるようにサブグループを規定した。これはｐ≦０．１７３１のＲＮＡｓｅｑクラス間のログランク検定を提供し、コックス比例ハザードは表７に示される。容易に分かるように、ＲＮＡｓｅｑクラスはプロテオミックサブグループほど予測的ではなく、このコホートサイズでは有意性を達成しなかった。同様に、生存メトリックとしてＯＳを用いても有意性を達成しなかった。
【００５１】
【表７】
2021501422.tif 000009
【００５２】
次いで、本発明者は、ＲＮＡｓｅｑサブグループとプロテオミッククラスとの組合せを用いて観測される関連を調べた。サンプルがＲＮＡｓｅｑ又はタンパク質のどちらかで高いＭＧＭＴを有していた場合、それはＭＧＭＴが高いとみなされた。かかる解析の典型的な結果は図１２に示される。この場合、組合せＲＮＡ＋タンパク質クラス間のログランク検定はｐ≦０．０３５０であり、コックス比例ハザード結果は表６に示される。この場合、示差的生存性は有意であり且つＲＮＡｓｅｑ単独を改善したが、プロテオミック２００ａｍｏｌスプリット単独ほど有意ではなかったことに留意すべきである。
【００５３】
【表８】
2021501422.tif 000010
【００５４】
さらなる解析では、本発明者は、以上の組合せ＋ＭＧＭＴプロモーターＣｐＧメチル化サブグループを用いて観測される関連を調べた。より具体的には、＞６０％メチル化を有するサンプルはＭＧＭＴ発現阻害を有すると予想され、最適組合せは次の通りであった。すなわち、高ＭＧＭＴ：低メチル化且つ高ＲＮＡ又は高タンパク質のどちらか、及び低ＭＧＭＴ：高メチル化又は低ＲＮＡ若しくは低タンパク質のどちらか。
【００５５】
図１３Ａは、かかる解析の模範的結果を示す。この場合、３元組合せクラス間のログランク検定はｐ≦０．０３７８であり、コックス比例ハザードは表９に示される。
【００５６】
【表９】
2021501422.tif 000011
【００５７】
この分離は、ＲＮＡ＋タンパク質又はタンパク質単独ほど識別可能ではなかったが、図１３Ｂに示されるように、ＯＳが生存メトリックであるとき、ログランク検定及びコックスＰＨ検定の両方で有意性を維持した。その場合、３元組合せクラス間のログランク検定はｐ≦０．０４１９であり、コックス比例ハザードは表１０に示される。
【００５８】
【表１０】
2021501422.tif 000012
【００５９】
テモゾロミド反応予測例Ｉ：  本発明者は、ＭＧＭＴ−オミクス値に基づいてテモゾロミド反応の予測モデルを構築する複数の方法を評価した。より具体的には、本発明者は、ＭＧＭＴアッセイの各々、すなわち、ＲＮＡｓｅｑ発現ＴＰＭ、タンパク質ａｍｏｌ／ｍＬ、及びメチル化パーセント、並びにそれらの組合せ及び部分的組合せを用いて、テモゾロミド反応の予測モデルを構築した。これらの特徴の各々の生の連続値さらにはそれらのサブグループ化値（それぞれ、３．５ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）、２００ａｍｏｌ／ｍＬ、及び６０％ＣｐＧメチル化）のいずれも用いて、さらなるモデルを構築した。組み合わせて、これは１０の異なる「データセット」をもたらした：
１．発現単独
２．タンパク質単独
３．メチル化単独
４．発現＋タンパク質
５．発現＋タンパク質＋メチル化
６．発現（サブグループ化）＋タンパク質
７．発現（サブグループ化）＋タンパク質（サブグループ化）
８．発現（サブグループ化）＋タンパク質（サブグループ化）＋メチル化（サブグループ化）
９．発現＋タンパク質＋メチル化（サブグループ化）
１０．発現＋タンパク質（サブグループ化）＋メチル化（サブグループ化）
【００６０】
予測性能を評価するために、本発明者はリーブペアアウト交差検証（ＬＰＯＣＶ）を使用した。この検証方法は、３７／３９サンプルで予測モデルを構築してから１つの未知陽性サンプル及び１つの未知陰性サンプルで予測性能を試験するのに必要である。これは、陽性サンプルと陰性サンプルとのすべての可能な組合せで繰り返され、このコホートで３０８性能評価をもたらす。これらの３０８未知試験セット全体にわたる平均性能は、所与の予測アルゴリズムに対して報告された確度である。
【００６１】
すべてのマルチ特徴データセット（以上の４〜１０）で、本発明者は、この予測タスクに対して１３の異なる分類アルゴリズムを評価した。シングル特徴データセット（以上の１、２、及び３）で、ユーデンＪ統計量を用いてトレーニングサンプルにより新しい最適カットオフを確立し、新しいカットオフの性能を未知サンプルペアで試験した。
【００６２】
これらの１０データセット及び１４分類アルゴリズムを組み合わせて、１４０の異なるモデリングストラテジーとした。ＬＰＯＣＶを用いてこれらの１４０ストラテジーの予測性能を未知サンプルで評価するために、追加の２７７２ユニーク予測サブモデルを構築する必要があった。図１４は、これらのモデリングストラテジーの各々で未知サンプルの平均確度を示す。
【００６３】
計算及び図１４から分かるように、全体で最良のモデリングストラテジーは、未知サンプルでテモゾロミド反応の予測確度が８７％であった。この性能（確度８７％）は、マジョリティー分類ストラテジー（すなわち、すべてのサンプルが耐性であると推定する：７１％）よりもかなり良好であり、タンパク質値単独使用（８０％）よりも向上することを認識すべきである。このモデリングストラテジーを選択して最終予測モデルを提案した。
【００６４】
最高性能モデリングストラテジーは、３つすべての特徴（ＲＮＡ、タンパク質、及びメチル化）をそれらのサブグループ化変換に利用してＫ最近傍アプローチを使用する。このアプローチは、以下のように新規なサンプルに対してテモゾロミド反応予測を行う。１．以上に記載のあらかじめ規定されたカットオフを用いて、ＭＧＭＴｍＲＮＡ発現ステータス、タンパク質レベル、及びプロモーターメチル化ステータスを規定し、２．３つすべてのＭＧＭＴ関連特徴を用いて予測されるトレーニングインスタンス及び新規なサンプルの各々の間でペアワイズミンコフスキー距離を計算し（すなわちブルートツリー）、３．各新規サンプルで５つの最近接マッチングを同定し、４．新規なサンプルを最近接トレーニングサンプルのマジョリティーの反応クラスに帰属する。
【００６５】
新規サンプルにおける予測性能が交差検証設定条件のものに類似するという強い確信をもって、すべての利用可能なサンプルをトレーニングに使用する最終モデルを本願で提案する。３つのバイナリー特徴でトレーニングされるので、最終モデルは、８つの識別可能な状態でテモゾロミド感受性の確率を記述する（表１１）。新規なサンプルは、以上に記載のものと同一のカットオフを用いてサブグループ化しうるとともに、これらの８状態の１つに割り当てうる。＞０．５の感受性予測確率は、状態が約８７％の確度でテモゾロミドに対して感受性であることを示唆する。逆に言えば、＜０．５のテモゾロミド反応確率はテモゾロミドに対する耐性に関連付けられる。
【００６６】
【表１１】
2021501422.tif 000013
【００６７】
テモゾロミド反応予測例ＩＩ：  本発明者らは、３つの個別の定量ＭＧＭＴアッセイ（プロモーター定量メチル化、ＲＮＡ発現、及びタンパク質存在量）に基づいてＴＭＺ反応のロバスト予測モデルをトレーニングして、未知ｍＣＲＣ患者においてその確度を検証するように努めた。単一タイプの予測因子を同定するのではなく、さまざまな観点から見て、本発明者らは、各種変数を組み込んで高い感度及び確度で予測モデルを導くように、マシンラーニング設定条件で複数の予測因子を同定するように企てた。
【００６８】
一例では、３つのＴＭＺ安全性試験（ＩＮＴ試験ｎ．２０／１３、ＩＮＴ試験２０／１３、及びＥｕｄｒａＣＴ２０１２−００２７６６−１３）に由来する４１アーカイブ腫瘍サンプルを用いてモデルをトレーニングした。ＴＭＺに対する反応は、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ．１．１基準により規定した。ＭＧＭＴステータスは、３つの方法、すなわち、ディジタルＰＣＲ／メチル−ＢＥＡＭｉｎｇ（ＭＢ）、ＲＮＡｓｅｑ、及び液体クロマトグラフィー質量スペクトルにより評価した。トレーニングセット内で交差検証（ＣＶ）を用いて、いくつかの多変量モデリングストラテジー（ｋＮＮ、ＳＶＭ、ディシジョンツリーなど）を評価した。臨床グレードメチル化試験の欠如が理由で、最初にＭＧＭＴメチル化（全ＲＮＡｓｅｑに基づいて）を予測し、次いで、予測されたメチル化を用いてＴＭＺ反応を分類するモデルも探究した。同様にアッセイされたフォローアップ研究に由来する１４未知腫瘍サンプルで、ＣＶで最も正確なモデルを検証した。各ＭＧＭＴアッセイにおけるあらかじめ規定された閾値を比較の基準として使用した。
【００６９】
以下の表１の模範的結果から分かるように、複数の変数をトレーニング及び検証に使用したとき、単一変数（すなわち、個別に使用されるメチル化又はタンパク質又は発現）と比較して、テモゾロミドに対する反応予測が有意に改善された。実際に、複数の変数の組込みに基づいて、難治性ｍＣＲＣにおけるＴＭＺ反応はほぼ予測可能である。予測されたメチル化、転写レベル、及びタンパク質存在量を組み合わせると、最も正確且つロバストな反応予測方法が得られる（８２％〜８７％の確度）。
【００７０】
【表１２】
2021501422.tif 000014
【００７１】
１セットの実験では、本発明者らは、ＭＧＭＴタンパク質（ＬＣ−ＭＳにより測定される）、ＭＧＭＴ発現（ＴＰＭにより測定される）、及びＭＧＭＴプロモーターメチル化（ディジタルＰＣＲ／メチル−ＢＥＡＭｉｎｇ（ＭＢ）により測定される）に関してトレーニングコホート予測性能を調べた。より具体的には、ＴＭＺに対する反応を予測するあらかじめ規定されたカットオフの能力を評価するために、我々は、リーブペアアウト交差検証ストラテジーを使用した。あらかじめ規定された探索カットオフは、未知サンプルで、ＬＣ−ＭＳ、ＲＮＡｓｅｑ、及びＭＢデータにより、それぞれ、３３０、３０８、及び２５０回評価した。ＬＣ−ＭＳ及びＲＮＡ−ｓｅｑにおけるあらかじめ規定されたカットオフは、ＭＢモデル（６８．０％）よりも良好な平均予測性能（それぞれ、８２．１％及び７２．２％）を示し、典型的な結果は図１５に示される。
【００７２】
各種分類アルゴリズム及びトレーニングデータ（すなわち、シングル変数対マルチ変数）の影響をさらに調べるために、本発明者らは、タンパク質、ＲＮＡ、及びメチル化のデータを単独又は組合せで及びあらかじめ規定された閾値を用いて又は用いずに、いくつかのラーニングアプローチを実施した。図１６から分かるように、タンパク質ベースモデルは、相対的に高い予測確度を有しており、３つすべての変数を用いたモデルは、それよりもさらに優れていた。確度を向上させるとともに臨床要件又はサンプル要件を単純化するさらなる試みで、本発明者らは、トレーニングデータとして前のＴＭＺ試験を用いて１０候補モデル（＋３つのあらかじめ規定されたカットオフ）を構築し、測定されたメチル化を全ＲＮＡｓｅｑに基づいて回帰モデルを用いて「予測されたメチル化」で置き換えた。次いで、図１７に模範的に示されるように、未知試験コホート（ＴＥＭＩＲＩ）で性能を試験した。この場合、トレーニングデータセットはＴＭＺコホートであり、３つの第ＩＩ相試験に由来するＴＭＺの治療を受けた４１名のｍＣＲＣ患者を含んでいた。質量スペクトルによる連続ＭＧＭＴタンパク質レベルさらにはＲＮＡｓｅｑによるＲＮＡ発現データ及び連続ＭＧＭＴメチル化パーセントデータは、すべての患者で入手可能であった。薬剤反応は２元薬剤反応データとして記した。試験データセットは、ＴＭＺ＋イリノテカンの治療を受けた３２名のｍＣＲＣ患者を含んでいた。２元薬剤反応データは３名の患者で欠落しており。遺伝子発現値は１４名の患者で利用可能であり、ＭＧＭＴタンパク質発現データは２１名の患者で利用可能であった。表１３を参照されたい。
【００７３】
【表１３】
2021501422.tif 000015
【００７４】
本発明者らはさらに、メチル化を説明する及び／又は断定されたメチル化値を使用するより高い確度のマシンラーニング用回帰モデルを構築可能であることを企図する。図１８は、回帰モデルを構築するための回帰及び分類のパイプラインを示す。表１４に示されるように、ＭＧＭＴタンパク質発現レベル及びＭＧＭＴ  ＲＮＡｓｅｑの両方をデータセットとして使用したとき、リグレッサーモデルのＲＭＳＥ（残差の分散の平方根であり、データへのモデルの絶対的当てはまり、すなわち、観測データ点がモデルの予測値にどの程度近いかを表す）はより小さい（より良好に当てはまる）。
【００７５】
【表１４】
2021501422.tif 000016
【００７６】
図１９は、全発現（すべてのＲＮＡの発現レベル）及びＭＧＭＴタンパク質発現レベルをデータセットとしたときの各種リグレッサーモデルの平均確度値を示しており、これは表１５にもまとめられる。
【００７７】
【表１５】
2021501422.tif 000017
【００７８】
図２０は、ＭＧＭＴ遺伝子発現及びＭＧＭＴタンパク質発現のレベルをデータセットとしたときの各種リグレッサーモデルの平均ＲＭＳＥ値を示しており、これは表１６にもまとめられる。
【００７９】
【表１６】
2021501422.tif 000018
【００８０】
次いで、本発明者らは、断定されたメチル化値を用いてリグレッサーモデルを構築した。図２１及び２２は、断定されたメチル化値をデータセットとして使用したときの各種リグレッサーモデルの平均確度値を示しており、それぞれ、これは表１７及び表１８にもまとめられる。
【００８１】
【表１７】
2021501422.tif 000019
【００８２】
【表１８】
2021501422.tif 000020
【００８３】
図２３は、記載のごとくあらかじめ設定された閾値を用いて４４サンプルにわたり１，０００のほとんどの可変遺伝子について反応予測の模範的結果を有するヒートマップを示し、表１４は、選択されたデータセット及びデータセットの組合せで使用した模範的分類アルゴリズムのリストである。再度分かるであろうが、ＭＧＭＴ  ＲＮＡｓｅｑ、ＭＧＭＴタンパク質、及びＭＧＭＴプロモーターメチル化の使用は、テモゾロミドに対する反応予測の優れたトレーニング及び試験の確度を提供した。同様に、感度、特異度、及びＦ１スコアはすべて、他の分類器及び個別データセットよりも実質的に増加した。表１９の最良モデルのサンプルレベル予測は表２０に列挙されており、これから、他のモデルと比較したとき、タンパク質、ＭＧＭＴメチル化、及びｍＲＮＡを同時に考慮したモデルはより良好に機能することが示唆される。
【００８４】
【表１９】
2021501422.tif 000021
【００８５】
【表２０】
2021501422.tif 000022
【００８６】
ＴＭＺの治療を受けた難治性ｍＣＲＣ患者のこのレトロスペクティブ解析では、ＭＧＭＴタンパク質に対するＭＳベース試験は、５０％の感度及び１００％の特異度を有していた。この小さな患者コホートでは、プロテオミック試験は、ＴＭＺに対する反応を予測するうえでディジタルＭＢ及びＲＮＡ−ｓｅｑのいずれよりも優れていた。さらに、あらかじめ規定された閾値（２００ａｍｏｌ／μｇ）未満のＭＧＭＴタンパク質発現は、ｍＰＦＳの２倍増加に関連し、この関連は１２の予測変数に依存しなかった。興味深いことに、ＬＣ−ＭＳにより陽性ＭＧＭＴタンパク質発現を有する患者は、ＴＭＺの臨床試験に参加したｍＣＲＣ患者で報告されたものに類似したＰＦＳを有していた。かかる試験の期待外れの結果は、ＴＭＺに対する最適候補者を選択するＭＳＰなどの標準的ＭＧＭＴアセスメント法の能力の限定を反映している可能性がある。本研究は、プロスペクティブ試験でＬＣ−ＭＳなどの代替ＭＧＭＴプラットフォームのアセスメントを支援する。
【００８７】
ＴＭＺ反応の予測因子としてのＭＧＭＴアッセイの確度及びロバスト性を交差検証設定条件で厳しく試験した。この実行時、プロテオミックＭＧＭＴ試験は、８２．１％の平均確度を有して他方の試験プラットフォームよりも優れていた。
【００８８】
ＴＭＺに対する潜在的レスポンダーを同定する重要性は、ＴＭＺ治療ｍＣＲＣのＤＮＡミスマッチ修復が損なわれるときに認識されることに留意されたい。この場合、ＴＭＺレスポンダーは、安定マイクロサテライトから不安定マイクロサテライト（ＭＳＩ）に切り替わることにより、免疫チェックポイント阻害剤による療法に適格となる。言い換えると、ＴＭＺで再発する患者は免疫療法を開始しうる。
【００８９】
ＴＭＺに対する潜在的レスポンダーを同定する重要性は、ＴＭＺ治療ｍＣＲＣのＤＮＡミスマッチ修復の障害に関する最近発表された知見により強調され、この場合、ＴＭＺレスポンダーは、安定マイクロサテライトから不安定マイクロサテライト（ＭＳＩ）に切り替わることにより、免疫チェックポイント阻害剤による療法に適格となる。このことから、ＴＭＺで再発する患者は免疫療法を開始しうることが示唆される。したがって、本発明者らはさらに、予測結果に基づいて患者に対する癌治療を推奨したり又は更新したりすることが可能であることを企図する。たとえば、患者がＴＭＺに反応すると反応予測モデルにより予測される場合、腫瘍の治療に有効な用量及びスケジュールで患者にＴＭＺを投与可能である。他の一例では、患者がもはやＴＭＺに反応しないか又はＴＭＺに対する反応性を実質的に低減している（たとえば、ＴＭＺの治療前と比較して又は癌の類似の予後を有する他の個体などと比較して少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％低減している）と反応予測モデルにより予測される場合、患者に免疫療法剤（たとえば、チェックポイント阻害剤、癌ワクチンなど）を投与可能である。
【００９０】
本明細書で用いられる場合、薬剤又は癌治療剤を「投与する」という用語は、薬剤又は癌治療剤の直接投与及び間接投与の両方を意味する。薬剤又は癌治療剤の直接投与は、典型的には、ヘルスケア専門家（たとえば、医師、看護師など）により実施され、且つ間接投与は、直接投与（たとえば、注射、経口摂取、局所適用などを介して）のために薬剤又は癌治療剤をヘルスケア専門家に提供する工程又はヘルスケア専門家が利用できるようにする工程を含む。
【００９１】
本明細書及び以下の特許請求の範囲全体で用いられる場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、とくに文脈上明確に規定されない限り、複数形の参照語を含む。また、本明細書で用いられる場合、文脈上明確に規定されない限り、「ｉｎ」の意味は「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。また、本明細書で用いられる場合、文脈上とくに規定されない限り、「〜に結合される」という用語は、直接結合（互いに結合された２つの要素が互いに接触する）及び間接結合（少なくとも１つの追加の要素が２つの要素間に位置する）の両方を含むことが意図される。したがって、「〜に結合される」及び「〜と結合される」という用語は同義的に用いられる。最後に、文脈上逆の規定がない限り、本明細書に示される範囲はすべて、その端点を含むと解釈すべきであり、且つオープンエンドの範囲は、商業的に実用的な値を含むと解釈すべきである。同様に、値のリストはすべて、文脈上逆のことが示唆されない限り、中間値を含むとみなすべきである。
【００９２】
本明細書に記載の本発明の概念から逸脱することなく、すでに説明したもの以外のより多くの変更が可能であることは、当業者には明らかなはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲内でない限り制限すべきではない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈する際、用語はすべて、文脈に矛盾しない可能な限り最広義に解釈すべきである。特定的には、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（〜を含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」という用語は、要素、成分、又は工程を非排他的に参照するものとして解釈すべきであり、参照された要素、成分、又は工程が存在しうるか、又はそれらを利用しうるか、又は明示的に参照されない他の要素、成分、又は工程と組み合わせうることを示唆する。本明細書の特許請求の範囲がＡ、Ｂ、Ｃ．．．．及びＮからなる群から選択される何かの少なくとも１つのものを参照する場合、その文言は、Ａ＋Ｎ、Ｂ＋Ｎなどではなくその群の１つの要素のみを必要とすると解釈すべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２３−１】
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【図２３−１−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【国際調査報告】
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