(57)【要約】  本開示は、改変カスパーゼ−９ポリペプチドと、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９タンパク質とを提供する。本開示はさらに、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、キメラ抗原受容体を共発現する宿主細胞を有するポリヌクレオチドおよびタンパク質を含む操作された宿主細胞と、これらを製造および使用する方法とを提供する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列と、１以上のアミノ酸置換とを含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドであって、
前記アミノ酸置換が、Ｓ２７１、Ｓ２７４、Ｃ２８７、Ｄ３３０、Ｆ３４２、Ｉ３７０、Ｄ３７９、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｆ４０６、およびＫ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる、改変カスパーゼ−９ポリペプチド。
【請求項２】
前記１以上のアミノ酸置換が、Ｓ２７１Ｙ、Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３９０Ｎ、Ｆ４０６Ｗ、およびＫ４０９Ｎからなる群から選択される、請求項１に記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチド。
【請求項３】
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、２以上のアミノ酸置換を含み、
前記２以上のアミノ酸置換が、Ｑ２２１−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ｉ３７０、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｓ２７１、Ｄ３３０−Ｓ２７４、Ｄ３３０−Ｆ３４２、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ａ３９０、およびＤ３３０−Ｋ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる、請求項１に記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチド。
【請求項４】
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｑ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、およびＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチド。
【請求項５】
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか１項に記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１に示す核酸配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６または７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項１から５までのいずれか１項に記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチド、または請求項６もしくは７に記載のポリヌクレオチドを含む、操作された免疫細胞。
【請求項１０】
二量体化ドメインと改変カスパーゼ−９ポリペプチドとを含むキメラタンパク質であって、
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号２に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、および１以上のアミノ酸置換を含み、
前記アミノ酸置換が、Ｓ２７１、Ｓ２７４、Ｄ３３０、Ｆ３４２、Ｉ３７０、Ｄ３７９、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｆ４０６、およびＫ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる、キメラタンパク質。
【請求項１１】
前記１以上のアミノ酸置換が、Ｓ２７１Ｙ、Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３９０Ｎ、Ｆ４０６Ｗ、およびＫ４０９Ｎからなる群から選択される、請求項１０に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、２以上のアミノ酸置換を含み、
前記２以上のアミノ酸置換が、Ｑ２２１−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ｉ３７０、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｓ２７１、Ｄ３３０−Ｓ２７４、Ｄ３３０−Ｆ３４２、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ａ３９０、およびＤ３３０−Ｋ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる、請求項１０に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｑ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、およびＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
前記二量体化ドメインが、ＦＫＢＰポリペプチドおよびシクロフィリンポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１０から１３までのいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
前記二量体化ドメインが、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む、請求項１０から１４までのいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ３６Ｖを含む、請求項１５に記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
前記キメラタンパク質が、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む、請求項１０から１６までのいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
前記二量体化ドメインが、二量体化リガンドＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、二量体化ＦＫ５０６、または二量体化ＦＫ５０６様アナログに結合する、請求項１０から１７までのいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
請求項１０から１８までのいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号８に示す核酸配列を含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２２】
請求項１０から１８までのいずれか１項に記載のキメラタンパク質、または請求項１９もしくは２０に記載のポリヌクレオチドを含む、操作された免疫細胞。
【請求項２３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２２に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２４】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項２２または２３に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２５】
操作された免疫細胞を被験体内で改変する方法であって、
前記方法が、請求項２２から２４までのいずれか１項に記載の操作された免疫細胞を先に投与された被験体に、二量体化リガンドを投与することを含み、
前記二量体化リガンドが、キメラタンパク質の二量体化ドメインに結合し、前記リガンドが前記二量体化ドメインに結合されると、カスパーゼ−９活性が誘導される方法。
【請求項２６】
前記リガンドがＡＰ１９０３である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
操作された免疫細胞を調製する方法であって、
前記方法が、請求項６、７、１９もしくは２０に記載のポリヌクレオチド、または請求項８もしくは２１に記載の発現ベクターを、前記免疫細胞に導入することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６２／５８０，２７６号および２０１７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／５９２，４４７号に対する優先権を主張するものであり、すべての目的のためにその全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
配列表への参照
本願はＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて電子出願されたものであり、電子形式で提出されたｔｘｔ形式の配列表が含まれる。本ｔｘｔファイルには、２０１８年１０月３１日に作成された２４，７８１バイトの配列表「ＡＬＧＮ０１３０２ＷＯ＿Ｓｅｑｔｘｔ．ｔｘｔ」が含まれている。本ｔｘｔファイルに含まれる配列表は明細書の一部をなすものであり、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００３】
本開示は、改変カスパーゼ−９ポリペプチドおよびその用途に関する。本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドには、野生型ヒトカスパーゼ−９タンパク質と比較して、１以上のアミノ酸突然変異が含まれる。
【背景技術】
【０００４】
カスパーゼ９は、哺乳動物細胞のアポトーシスの開始（プログラム細胞死）に関与するタンパク質である。カスパーゼ−９部を含むキメラタンパク質は、当該キメラタンパク質を発現するように操作された宿主細胞においてアポトーシスの誘導を可能にするシステムの一部として使用できる。例えば、リガンド媒介性の二量体化ドメインにリンクしたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質を調製できる。キメラタンパク質を含む宿主細胞を、二量体化ドメインの二量体化を媒介するリガンドに曝露すると、宿主細胞内でカスパーゼ−９のシグナル伝達が活性化され、アポトーシスおよび細胞死がもたらされる。本システムは、例えば、細胞療法の安全機構として使用できる。本システムでは、被験体に投与される宿主細胞をまず操作し、キメラタンパク質を含むカスパーゼ−９を発現させる。次に、操作した宿主細胞を被験体に導入した後、必要に応じて（例えば、宿主細胞が重篤かつ望ましくない作用を被験体に引き起こす場合に）被験体に二量体化誘導リガンドを投与することができる。被験体にリガンドを投与することで、キメラタンパク質を含む宿主細胞内でカスパーゼ−９のシグナル伝達が活性化し、続いて当該宿主細胞が死に至ることで、被験体内における宿主細胞の望ましくない作用を低減する（例えば、Ｇａｒｇｅｔｔ  ＴおよびＢｒｏｗｎ  Ｍ，Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４；５：２３５を参照）。
【０００５】
一定の状況下において、カスパーゼ−９ポリペプチドおよび二量体化ドメインを含むキメラタンパク質は、キメラタンパク質を発現する宿主細胞で、カスパーゼ−９が不所望に高水準の基礎活性を有することがある（すなわち、キメラタンパク質は二量体化を媒介するリガンドがなくても活性を有することがある）。このようなカスパーゼ−９の基礎活性により、例えば、リガンドが存在しない状態で不所望に高水準の細胞死がもたらされることがある。
【０００６】
キメラカスパーゼ−９タンパク質におけるカスパーゼ−９の基礎活性を低減し得る手法の１つとして、キメラカスパーゼ−９タンパク質のカスパーゼ−９部に、１以上の改変を導入する手法がある。例えば、キメラカスパーゼ−９タンパク質におけるカスパーゼ−９ポリペプチドのアミノ酸配列に、１以上の変異を導入することができる。理想的には、このような改変でキメラタンパク質のカスパーゼ−９の基礎活性を低下させる一方、二量体化誘導リガンドに反応するキメラタンパク質のカスパーゼ−９活性は、低減させないか、若干の低下に留めることが望ましい。例えば、米国特許第９，４３４，９３５号に、カスパーゼ−９ポリペプチドの基礎活性を低減させる変異の例がいくつか説明されている。
【０００７】
しかしながら、改変カスパーゼ−９ポリペプチドには、代替および改善の余地がある。代替および改善された改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、例えば、細胞療法のための代替および改善された組成および方法を提供することができる。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書で提供するのは、改変カスパーゼ−９ポリペプチドおよびその用途である。改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、対応する未改変カスパーゼ−９ポリペプチドと比較して、有用な特性を１つ以上有してよい。
【０００９】
例えば、本明細書で提供するいくつかの実施形態によれば、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、その基礎活性が対応する未改変カスパーゼ−９ポリペプチドの基礎活性よりも低減されているが、依然としてカスパーゼ−９のシグナル伝達を効果的に媒介できる。
【００１０】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、カスパーゼ−９ポリペプチドおよびリガンド誘導性二量体化ドメインを含むキメラカスパーゼ−９タンパク質に組み込まれる改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。本開示により提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９タンパク質の基礎活性は、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドを含む対応キメラカスパーゼ−９タンパク質の基礎活性よりも低減されたものであってよい。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、配列番号２に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列と、１以上のアミノ酸置換とを含み、当該アミノ酸置換が、Ｓ２７１、Ｓ２７４、Ｄ３３０、Ｆ３４２、Ｉ３７０、Ｄ３７９、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｆ４０６、およびＫ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。任意にて、アミノ酸置換は、Ｓ２７１Ｙ、Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３９０Ｎ、Ｆ４０６Ｗ、およびＫ４０９Ｎからなる群から選択される。任意にて、上記ポリペプチドが２以上のアミノ酸置換を含み、当該アミノ酸置換が、Ｑ２２１−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ｉ３７０、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｓ２７１、Ｄ３３０−Ｓ２７４、Ｄ３３０−Ｆ３４２、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ａ３９０、およびＤ３３０−Ｋ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる。任意にて、上記ポリペプチドが、Ｑ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、およびＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、配列番号２に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列と、少なくともアミノ酸置換Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ（すなわち、Ｄ３３０ＭおよびＤ３７９Ｅ）とを含む、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、配列番号２に対して、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列と、Ｓ２７１Ｙ、Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３９０Ｎ、Ｆ４０６Ｗ、およびＫ４０９Ｎからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。任意にて、当該改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｑ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、およびＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を含む。任意にて、当該改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列を含む。
【００１４】
任意にて、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドの基礎活性は、配列番号２のアミノ酸配列を含む野生型カスパーゼ−９ポリペプチドの５０％未満である。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。任意にて、ポリヌクレオチドは、配列番号１１に示す核酸配列を含む。
【００１６】
本明細書は、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを更に提供する。
【００１７】
本明細書は、改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたは本明細書で開示する改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む、宿主細胞を更に提供する。任意にて、宿主細胞は免疫細胞である。任意にて、免疫細胞はＴ細胞である。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、二量体化ドメインおよび改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質であって、上記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号２に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列と、１以上のアミノ酸置換とを含み、当該アミノ酸置換が、Ｓ２７１、Ｓ２７４、Ｄ３３０、Ｆ３４２、Ｉ３７０、Ｄ３７９、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｆ４０６、およびＫ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされるキメラタンパク質を提供する。任意にて、１以上のアミノ酸置換は、Ｓ２７１Ｙ、Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３９０Ｎ、Ｆ４０６Ｗ、およびＫ４０９Ｎからなる群から選択される。任意にて、キメラタンパク質の改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、２以上のアミノ酸置換を含み、２以上の当該アミノ酸置換は、Ｑ２２１−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ｉ３７０、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｓ２７１、Ｄ３３０−Ｓ２７４、Ｄ３３０−Ｆ３４２、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ａ３９０、およびＤ３３０−Ｋ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる。任意にて、キメラタンパク質の改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｑ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、およびＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、二量体化ドメインおよび改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質であって、当該改変カスパーゼ−９ポリペプチドが配列番号２に対して、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性と、Ｓ２７１Ｙ、Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３９０Ｎ、Ｆ４０６Ｗ、およびＫ４０９Ｎからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換とを含むキメラタンパク質を提供する。任意にて、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｑ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、およびＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を含む。任意にて、二量体化ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチドおよびシクロフィリンポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む。任意にて、二量体化ドメインはＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む。任意にて、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｆ３６Ｖを含む。任意にて、上記キメラタンパク質は、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む。任意にて、上記二量体化ドメインは、二量体化リガンドＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、二量体化ＦＫ５０６、または二量体化ＦＫ５０６様アナログに結合する。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、二量体化ドメインおよび改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質であって、当該改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号２に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列と、少なくともアミノ酸置換Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ（すなわち、Ｄ３３０ＭおよびＤ３７９Ｅ）とを含む、キメラタンパク質を提供する。
【００２１】
任意にて、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質の基礎活性は、ＦＫＢＰ１２リガンド結合領域と、カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）を欠き、配列番号２のアミノ酸配列を有するカスパーゼ−９ポリペプチドと、を含むキメラタンパク質の基礎活性の５０％未満である。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。任意にて、ポリヌクレオチドは、配列番号８に示す核酸配列を含む。
【００２３】
本明細書は、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを更に提供する。
【００２４】
本明細書は、キメラカスパーゼ−９タンパク質、または本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞を更に提供する。任意にて、宿主細胞は免疫細胞である。任意にて、免疫細胞はＴ細胞である。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含む免疫細胞、キメラカスパーゼ−９タンパク質、もしくは本明細書で開示する改変カスパーゼ９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、さらにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含んでよい。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、操作された免疫細胞を被験体内で改変する方法であって、キメラカスパーゼ−９タンパク質、または本明細書で開示するキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む免疫細胞を先に投与された被験体に、二量体化リガンドを投与することを含み、当該二量体化リガンドがキメラタンパク質の二量体化ドメインに結合し、当該二量体化ドメインに結合されるとカスパーゼ−９活性が誘導される方法を提供する。任意にて、リガンドはＡＰ１９０３である。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、操作された免疫細胞を調製する方法であって、改変カスパーゼ−９ポリペプチド、または本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む発現ベクターを免疫細胞へ導入することを含む方法を提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、本明細書で説明されるようにキメラカスパーゼ−９タンパク質を発現する、薬剤として使用するための、操作された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態によれば、健康なドナーから免疫細胞を採取する。いくつかの実施形態によれば、患者から免疫細胞を採取する。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、免疫細胞を提供することと、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする１以上のポリヌクレオチドを上記免疫細胞に導入することと、上記ポリヌクレオチドを細胞にて発現させることとを含む方法を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、本明細書で説明されるようにキメラカスパーゼ−９タンパク質を発現させる免疫細胞を提供することと、当該免疫細胞を上記患者に投与することとを含む、被験体を治療する方法を提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供する組成物および方法に用いられる免疫細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞に由来し得る。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、本明細書で説明されるようにキメラカスパーゼ−９タンパク質を含む宿主細胞を含む、医薬組成物を提供する。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、宿主細胞は免疫細胞であり、免疫細胞は１以上の内在性遺伝子の破壊を含んでもよく、当該内在性遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、またはプログラム死−１（ＰＤ−１）などの免疫チェックポイントをコードする。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ−１Ｃ】図１Ａから図１Ｃは、本明細書で提供するいくつかの構築物を示す一連の概略図である。これらの構築物において、カスパーゼ−９および二量体化ドメインの変異体を含むキメラカスパーゼ−９タンパク質は、Ｐ２Ａ（図１Ａ）またはＩＲＥＳ（図１Ｂ）リボソームスキップ部位を使用してＣＡＲと共発現する。また、アポトーシスの程度を評価するために使用する制御の模式図も示されている（図１Ｃ）。
【図２】図２は、ドナー＃１からの宿主細胞内で、各種キメラカスパーゼ−９タンパク質がＡＰ１９０３に反応したことにより誘導されたアポトーシスを示す棒グラフである。
【図３】図３は、ドナー＃２からの宿主細胞内で、各種キメラカスパーゼ−９タンパク質がＡＰ１９０３に反応したことにより誘導されたアポトーシスを示す棒グラフである。
【図４】図４は、プライマリＴ細胞（対の左側の棒）またはジャーカット細胞（対の右側の棒）を形質導入した４日後に、１以上の変異を含む各種キメラカスパーゼ−９タンパク質の発現レベルを示す棒グラフである。
【図５】図５は、ＣＡＲ陽性プライマリＴ細胞（対の左側の棒）またはジャーカット細胞（対の右側の棒）の発現レベルを示す棒グラフである。
【図６】図６は、ＡＰ１９０３を投与した場合または投与しなかった場合に、ドナー＃８からのプライマリＴ細胞に発現された、１以上の変異を含む各種キメラカスパーゼ−９タンパク質の、ＡＰ１９０３投与１日後のアポトーシス活性を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ＡＰ１９０３を投与した場合または投与しなかった場合に、ドナー＃８からのプライマリＴ細胞に発現された、１以上の変異を含む各種キメラカスパーゼ−９タンパク質の、ＡＰ１９０３投与２日後のアポトーシス活性を示す棒グラフである。
【図８】図８は、ＡＰ１９０３を投与した場合または投与しなかった場合に、ドナー＃８からのプライマリＴ細胞に発現された、１以上の変異を含む各種キメラカスパーゼ−９タンパク質の、ＡＰ１９０３投与３日後のアポトーシス活性を示す棒グラフである。
【図９】図９は、ＡＰ１９０３を投与した場合または投与しなかった場合に、ドナー＃８からのプライマリＴ細胞に、ＣＡＲと共発現した、１以上の変異を含む各種キメラカスパーゼ−９タンパク質の、ＡＰ１９０３投与４日後のアポトーシス活性を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本明細書の開示は、改変カスパーゼ−９ポリペプチド、および改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質に関する。本開示は更に、これらのカスパーゼ−９ポリペプチドおよびキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび関連組成物、ならびに被験体に投与するための操作された宿主細胞などにおける、製造方法および使用方法を提供する。
【００３６】
一般的な技法
本開示の実施には、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、免疫学、ウイルス学、およびモノクローナル抗体の作製工学の従来技術を用いることとし、これらは当業者の技術範囲内である。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，編，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，編，１９９３−１９９８）Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，編，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，編，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら，編，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，編，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，  １９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ，編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ，編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，編，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，���９９５）などの文献で完全に説明されている。
【００３７】
定義
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指し、本明細書では同義に用いられる。例えば、鎖長が比較的短い場合もあれば（例えば、１０以上１００以下のアミノ酸）それより長い場合もある。鎖は、線状または分岐状であることがあり、改変アミノ酸を含むことがあり、非アミノ酸が割り込むこともある。これらの用語は更に、自然または介入により改変されたアミノ酸鎖も網羅する。例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合など、その他のあらゆる操作または改変などである。本定義には更に、例えば１以上のアミノ酸アナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、および当業者に公知のその他の改変も含まれる。ポリペプチドは、単鎖または付随鎖として発生し得ることが知られている。
【００３８】
当該技術分野において知られているように、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、本明細書では同義に用いられ、任意の長さのヌクレオチド鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって鎖に組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログなどの改変ヌクレオチドを含んでよい。ヌクレオチド構造の改変がある場合、鎖を構築する前または後に改変がなされてよい。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド成分が介在してもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などにより、重合後にさらに改変されてよい。その他の型の改変としては、例えば、「キャップ」、１以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログによる置換、例えば無荷電結合（例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を含むヌクレチオド間の改変、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）などのペンダント部分を含む改変、介在因子（例えば、アクリジン、ソラレンなど）による改変、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変された結合（例えば、アルファアノマー核酸など）による改変、およびポリヌクレオチド（複数可）の非改変形態が挙げられる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基はいずれも、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置換されるか、標準的な保護基によって保護されるか、またはさらなるヌクレオチドに対するさらなる結合を調製するために活性化されるか、あるいは固体支持体上に結合されてもよい。５’末端および３’末端のＯＨは、リン酸化され得るか、またはアミンもしくは１から２０までの炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化されてよい。ポリヌクレオチドはまた、当業者に公知のリボース糖またはデオキシリボース糖のアナログ形態を含み得、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−Ｏ−アリル−リボース、２’−フルオロ−リボースまたは２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、β−アノマー糖、エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソース）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、および脱塩基性ヌクレオシドアナログ（例えば、メチルリボシド）が挙げられる。１以上のホスホジエステル結合は、代替の結合基によって置換されてよい。これら代替の結合基としては、リン酸が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ2（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ2（「ホルムアセタール」）によって置換される実施形態であって、ＲまたはＲ’がそれぞれ独立してＨであるか、置換されたかもしくは置換されていないアルキル（１〜２０個のＣ）であり、任意でエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルを含む実施形態が挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含め、本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
【００３９】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物を組み込むためのベクター（複数可）のレシピエントとなり得るか、またはレシピエントとなった、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれる。自然的、偶発的、または意図的な変異により、子孫と元の親細胞は（形態またはゲノムＤＮＡ相補体において）必ずしも完全に同一ではない。宿主細胞には、本開示のポリヌクレオチド（複数可）とともに生体内で遺伝子導入された細胞が含まれる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」とは、自然および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「自己」とは、患者を治療するために用いた細胞、細胞株または細胞集団が、上記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーに由来することを意味する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「同種異系」とは、患者を治療するために用いた細胞または細胞集団が、上記患者ではなく、ドナーに由来することを意味する。
【００４３】
「個人」または「被験体」とは、例えばヒトなどの哺乳動物である。哺乳動物には更に、霊長類、馬、犬、猫、マウスおよびラットも含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ベクター」とは、宿主細胞内で１以上の目的遺伝子または配列を送達し、かつ通常は発現することができる構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性凝縮剤に関連づけられたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および特定の真核細胞（例えばプロデューサー細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「発現制御配列」とは、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成型ならびに誘導型プロモーター、またはエンハンサーなどのプロモーターであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に機能的に結合されている。
【００４６】
本明細書において、ある数値またはパラメータに「約」が言及される場合、その数値またはパラメータ自体を対象にした実施形態が網羅される（かつ記述される）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載には「Ｘ」の記載を含む。数値範囲には、当該範囲を定義する数値が含まれる。一般的に「約」という用語は、変数として指示された値に加えて、指示された値の実験誤差内（例えば、平均の９５％信頼区間内）にある全数値か、指示された値の１０％以内にある全数値かの、いずれか大きい方を指す。期間（年、月、週、日など）の文脈で「約」という用語が用いられる場合、「約」という用語は、期間プラスマイナス次の下位期間の１期間（例えば、約１年は１１か月から１３か月、約６か月は６か月プラスマイナス１週間、約１週間は６日から８日など）または指示値の１０％以内の、いずれか大きい方を意味する。
【００４７】
本明細書において、実施形態が「含む」という文言で説明される場合は、常に「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で説明される類似の実施形態も提供する。
【００４８】
本開示の態様または実施形態が、マーカッシュ群または他の代替群の観点から説明される場合、本開示は全体として記載された群全体だけでなく、群の個別要素および主群の下位群すべてに加え、１以上の要素を欠く主群も網羅する。本開示は更に、請求された発明内のいずれかの群の要素を１つ以上明示的に除外することを想定している。
【００４９】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書およびその定義を優先する。本明細書および請求項全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変化形は、記載された完全体または完全体群の包含を意味すると理解されるが、他の完全体または完全体群を除外するものではない。文脈により特に必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。
【００５０】
本明細書には例示的な方法および材料が説明されているが、本明細書で説明されているのと同様または同などの方法および材料も、本開示の実施または試験に用いることができる。材料、方法、および実施例は例示のみであり、限定を意図したものではない。
【００５１】
改変カスパーゼ−９ポリペプチド
本明細書で提供する開示は、改変カスパーゼ−９ポリペプチドに関する。本明細書で使用される場合、「カスパーゼ−９ポリペプチド」とは、野生型ヒトカスパーゼ−９のアミノ酸配列を含むポリペプチド（すなわち、配列番号１）か、野生型ヒトカスパーゼ−９のアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドであって、その一部が、カスパーゼ９媒介のシグナル伝達を誘導できる（例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、カスパーゼリクルートメントドメイン（「ＣＡＲＤ」）のないヒトカスパーゼ−９）ポリペプチドか、または配列番号１もしくは２に示すアミノ酸配列に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、「改変カスパーゼ−９ポリペプチド」とは、ポリペプチドが、対応する野生型ヒトカスパーゼ−９ポリペプチドに対して１以上のアミノ酸変異を有する、上述の通りのカスパーゼ−９ポリペプチドを指す。
【００５２】
野生型ヒトカスパーゼ９タンパク質のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ識別＃Ｐ５５２１１）は、ＭＤＥＡＤＲＲＬＬＲＲＣＲＬＲＬＶＥＥＬＱＶＤＱＬＷＤＡＬＬＳＲＥＬＦＲＰＨＭＩＥＤＩＱＲＡＧＳＧＳＲＲＤＱＡＲＱＬＩＩＤＬＥＴＲＧＳＱＡＬＰＬＦＩＳＣＬＥＤＴＧＱＤＭＬＡＳＦＬＲＴＮＲＱＡＡＫＬＳＫＰＴＬＥＮＬＴＰＶＶＬＲＰＥＩＲＫＰＥＶＬＲＰＥＴＰＲＰＶＤＩＧＳＧＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号１）である。したがって、いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸改変を含む。
【００５３】
ＣＡＲＤドメインがないヒトカスパーゼ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号２）である。したがって、いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸改変を含む。
【００５４】
配列番号２のポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドと同じであるが、配列番号２のポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１から１３４まで（すなわち、野生型カスパーゼ９のＣＡＲＤドメイン）を含まないことだけが異なっている。したがって、配列番号２の１番目のアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸＃１３５と同じとなる。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、１以上のアミノ酸置換を含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドであって、アミノ酸置換が、Ｓ２７１、Ｓ２７４、Ｄ３３０、Ｆ３４２、Ｉ３７０、Ｄ３７９、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｆ４０６、およびＫ４０９からからなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。記載された位置でなされるアミノ酸置換は、保存的置換または非保存的置換であってよい。改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号１または２に示すアミノ酸配列に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有してよい。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、次のアミノ酸置換を１以上含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する：Ｓ２７１Ｙ、Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３９０Ｎ、Ｆ４０６Ｗ、またはＫ４０９Ｎ。いくつかの実施形態によれば、本明細書は、次のアミノ酸置換を１以上含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドであって：Ｓ２７１Ｙ、Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３９０Ｎ、Ｆ４０６Ｗ、またはＫ４０９Ｎ、配列番号１または２に示すアミノ酸配列に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する、改変カスパーゼ−９ポリペプチドである。
【００５７】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、２以上のアミノ酸置換を含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドであって、上記アミノ酸置換が、Ｑ２２１−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ｉ３７０、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｓ２７１、Ｄ３３０−Ｓ２７４、Ｄ３３０−Ｆ３４２、Ｄ３３０−Ｉ３７０、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ａ３９０、およびＤ３３０−Ｋ４０９なる群から選択されるアミノ酸位置でなされる、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。記載された位置でなされるアミノ酸置換は、保存的置換または非保存的置換であってよい。改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号１または２に示すアミノ酸配列に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有してよい。
【００５８】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、２以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態によれば、本明細書では、２以上のアミノ酸置換を含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドであって、上記２のアミノ酸置換がＱ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、またはＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎから選択される、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。
【００５９】
いくつかの実施形態によれば、本明細書では、２以上のアミノ酸置換を含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドであって、上記２のアミノ酸置換がＱ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、またはＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎから選択され、上記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号１または２に示すアミノ酸配列に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、２以上のアミノ酸置換を含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドは次のアミノ酸配列を含む：ＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＭＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＥＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号３）。配列番号３は、Ｄ３３０ＭおよびＤ３７９Ｅの置換を有する配列番号２の配列である。上記の配列番号３内にこれらの置換を下線で示している。
【００６１】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、本明細書の実施例１で説明されるいずれかのアミノ酸置換を含む、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態によれば、本明細書は、本明細書の実施例１で説明される１、２、３、４または５のいずれかの置換位置を有するアミノ酸置換を含む、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態によれば、本明細書は、実施例１に記載されるアミノ酸置換を含む改変カスパーゼ−９ポリペプチド、または実施例１に記載される１、２、３、４、または５のいずれかの置換位置を有するアミノ酸置換を含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドであって、当該改変カスパーゼ−９ポリペプチドが配列番号１または２に示すアミノ酸配列に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する、改変カスパーゼ−９ポリペプチドである。
【００６２】
明確性向上のため、本明細書で示されるアミノ酸置換には次のように注釈が付されている。例えば「Ｄ３７９Ｅ」と記載されている置換において、「Ｄ」は、野生型カスパーゼ９タンパク質のアミノ酸位置３７９のアミノ酸を指す（すなわち、野生型カスパーゼ９アミノ酸配列をＮ末端からＣ末端の方向に数えて３７９番目のアミノ酸）。また、「Ｅ」は、「Ｄ」から置き換わったアミノ酸を指す。また、本明細書で示されるすべてのカスパーゼ−９アミノ酸置換は、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドの全長に対するアミノ酸の位置（すなわち、配列番号１におけるアミノ酸位置）に従って記載されている。したがって、例えば、置換「Ｄ３７９Ｅ」は、配列番号１および配列番号２において、同じアミノ酸置換を指す（配列番号２の配列が配列番号１の配列より短いが）。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「カスパーゼ−９活性」は、カスパーゼ−９によって媒介される、細胞内における１以上の効果を指す（例えば、カスパーゼ−９依存性細胞シグナル伝達事象、アポトーシスの誘導、細胞死など）。カスパーゼ−９活性は直接アッセイすることもできるし（例えば、プロカゼパーゼ−３またはプロカスパーゼ−７などのカスパーゼ−９標的のカスパーゼ−９媒介切断を直接アッセイすることにより）、カスパーゼ−９活性は、細胞内の更に下流のカスパーゼ−９媒介事象によりアッセイすることもできる（例えば、アポトーシスまたは細胞死）。例えば、いくつかの実施形態によれば、カスパーゼ−９活性は、本明細書の実施例１で説明されるようにアッセイすることができる。カスパーゼ−９活性は更に、例えば、カスパーゼ活性のアッセイに関する当業者に公知の方法によりアッセイすることができる。当業者に公知の方法としては、カスパーゼ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、アネキシンＶアッセイ、または分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ（例えば、ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，Ｒ．Ａ．，Ｋ．Ｗ．Ｆｒｅｅｍａｎ，およびＤ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｓｐａｓｅｓ：ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｄｅａｔｈ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９８．９５（７）：ｐ．３６５５−６０を参照）などが挙げられる。また例えば、米国特許第９，４３４，９３５号の実施例８も参照されたい。
【００６４】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドの基礎カスパーゼ９活性は、対応する野生型カスパーゼ−９ポリペプチドよりも小さくてよい。本明細書で使用される場合、「基礎カスパーゼ−９活性」、「基礎活性」などは、特定のカスパーゼ−９誘導因子が存在しない状態下のカスパーゼ−９ポリペプチドの活性を指す（例えば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質の場合、基礎活性は、対応する二量体化リガンドが存在しない状態下のキメラカスパーゼ−９タンパク質のカスパーゼ−９活性を指す）。いくつかの実施形態によれば、改変カスパーゼ−９ポリペプチドの基礎カスパーゼ−９活性は、対応する野生型カスパーゼ−９ポリペプチドの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満であってよい。カスパーゼ−９ポリペプチドの基礎活性は、上述の方法および本明細書の実施例１の方法など、カスパーゼ活性のアッセイに関して当業者に公知の方法によってアッセイしてよい。
【００６５】
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、上述の１または２のアミノ酸置換を有し、各カスパーゼ−９ポリペプチドの特性に有意な影響を与えない、１以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を更に含む、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。各実施形態において、変更は、表１に示すように、１以上の保存的アミノ酸置換であってよい。アミノ酸配列の挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さのアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一および複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。いくつかの実施形態によれば、本明細書は、上記のアミノ酸置換を１または２有し、１以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を更に含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドであって、上記１以上のアミノ酸置換、付加、または欠失により各カスパーゼ−９ポリペプチドの１以上の特性が改善される、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを提供する。
【表１】
2021501580.tif 000003
【００６６】
キメラカスパーゼ−９タンパク質
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、少なくとも２つの成分１）改変カスパーゼ−９ポリペプチド、および２）二量体化ドメイン、を含む操作されたキメラタンパク質を提供する。これら２つの成分を含むキメラタンパク質は、本明細書では「キメラカスパーゼ−９タンパク質」とも呼称される。
【００６７】
いくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質の二量体化ドメインは、改変カスパーゼ−９ポリペプチドのＮ末端にある。任意にて、キメラカスパーゼ−９タンパク質内の二量体化ドメインと改変カスパーゼ−９ポリペプチドとの間にリンカー領域が存在し得る。任意にて、キメラカスパーゼ−９タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、二量体化ドメイン−リンカー領域−改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含んでよい。
【００６８】
キメラカスパーゼ−９タンパク質：カスパーゼ−９ポリペプチド部
キメラカスパーゼ−９タンパク質のカスパーゼ−９ポリペプチド部は、改変カスパーゼ−９ポリペプチドが上記で提供される特性のいずれかを有してよい。
【００６９】
例えば、いくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質のカスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｓ２７１Ｙ、Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３９０Ｎ、Ｆ４０６Ｗ、またはＫ４０９Ｎのアミノ酸置換を１以上含んでよく、改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号１または２に示すアミノ酸配列に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する。別の例として、いくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質のカスパーゼ−９ポリペプチドは、２以上のアミノ酸置換を含んでよく、２以上の当該アミノ酸置換が、Ｑ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、またはＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎから選択され、改変カスパーゼ−９ポリペプチドが配列番号１または２に示すアミノ酸配列に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する。別の例として、いくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質のカスパーゼ−９ポリペプチドは、１以上のアミノ酸置換を含んでよく、当該アミノ酸置換が、Ｓ２７１、Ｓ２７４、Ｄ３３０、Ｆ３４２、Ｉ３７０、Ｄ３７９、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｆ４０６、およびＫ４０９からなる群より選択されるアミノ酸位置でなされ、改変カスパーゼ−９ポリペプチドが配列番号１または２に示すアミノ酸配列に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する。別の例として、いくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質のカスパーゼ−９ポリペプチドは、２以上のアミノ酸置換を含んで良く、当該アミノ酸置換が、Ｑ２２１−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ｉ３７０、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｓ２７１、Ｄ３３０−Ｓ２７４、Ｄ３３０−Ｆ３４２、Ｄ３３０−Ｉ３７０、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ａ３９０、およびＤ３３０−Ｋ４０９からなる群より選択されるアミノ酸位置でなされ、改変カスパーゼ−９ポリペプチドが配列番号１または２に示すアミノ酸配列に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する。
【００７０】
キメラカスパーゼ−９タンパク質：二量体化ドメイン
キメラカスパーゼ−９タンパク質の「二量体化ドメイン」は、二量体化ドメインに結合できる二量体化リガンドなどによって二量体化を誘導できる任意のアミノ酸配列であってよい。例えば、二量体化ドメインは、ＦＫ５０６結合タンパク質（「ＦＫＢＰ」）のアミノ酸配列を含んでよい。ＦＫＢＰタンパク質は、薬剤ＦＫ５０６に特異的に結合する。ＦＫ５０６の多量体アナログ（すなわち、ＦＫ５０６のコピーを２以上含むリガンド、またはその誘導体）であるリガンドは、第１タンパク質および第２タンパク質双方に結合することにより、ＦＫＢＰのアミノ酸配列をそれぞれ含む第１タンパク質および第２タンパク質の二量体化を誘導し、それにより両者を結合する。そのため、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質は、キメラカスパーゼ−９タンパク質の二量体化ドメインに結合する好適な二量体化リガンドに曝露することで、二量体化を誘導できる。
【００７１】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質の二量体化ドメインには、例えば、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、ステロイド結合タンパク質、エストロゲン結合タンパク質、グルココルチコイド結合タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質、またはテトラサイクリン結合タンパク質のアミノ酸配列、またはそれに由来するアミノ酸配列が含まれてもよい。本明細書で使用される場合、「ＦＫＢＰポリペプチド」、「シクロフィリンポリペプチド」などは、各タンパク質のアミノ酸配列、その一部、またはその変異体を有するポリペプチドを指し、当該アミノ酸配列の一部または当該変異体が、対応するリガンド（例えば、ＦＫＢＰポリペプチド、リガンドＦＫ５０６および関連分子）に大きい親和性をもって結合する能力を保持する。
【００７２】
いくつかの実施形態によれば、二量体化ドメインにはＦＫＢＰポリペプチドアミノ酸配列が含まれてもよい。ＦＫＢＰは、プロリルイソメラーゼ活性を有し、薬剤ＦＫ５０６およびその他の関連薬剤に結合するタンパク質群である。
【００７３】
任意にて、ＦＫＢＰはヒトＦＫＢＰ１２（ＦＫＢＰ１Ａとも呼称される；ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＧ４６９６５．１）でもよい。任意にて、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドにはＦ３６Ｖ変異が含まれてよい。Ｆ３６Ｖ変異を含むＦＫＢＰ１２は、高親和性で二量体化リガンドＡＰ１９０３に結合する（Ｊｅｍａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１−９６（２００８）；Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．およびＫｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １１，１５６６−７２（１９９３））。さらに、Ｆ３６Ｖ変異を含むＦＫＢＰ１２は、野生型ＦＫＢＰ１２がＡＰ１９０３に結合するよりも、はるかに大きい親和性でＡＰ１９０３に結合する。
【００７４】
例示的な二量体化ドメインのアミノ酸配列（Ｆ３６Ｖ変異を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む）は、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＳ（配列番号４）である。
【００７５】
いくつかの実施形態によれば、二量体化ドメインはシクロフィリンポリペプチドアミノ酸配列であってよい。シクロフィリンは、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）に結合するタンパク質である。シクロフィリンには、例えばシクロフィリンＡおよびシクロフィリンＤが含まれる。
【００７６】
いくつかの実施形態によれば、二量体化ドメインは、アミノ酸の長さが約２５個、５０個、７５個または１００個以上、かつ約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個、または約４００個以下である。いくつかの実施形態によれば、二量体化ドメインは、米国特許第９，４３４，９３５号（すべての目的のために参照によって本明細書に援用される）に開示されるリガンド結合領域のいずれかの特性を有してよい。
キメラカスパーゼ−９タンパク質：リンカー領域
【００７７】
いくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質のリンカー領域は、アミノ酸の長さが約５個から約１００個までの間である。任意にて、リンカー領域は、アミノ酸の長さが約５個から約２０個までの間であり得る。リンカー領域は通常、柔軟性を有し、グリシを豊富に含む。いくつかの実施形態によれば、リンカー領域は、ＧＧＧＳＧＶＤ（配列番号５）、（ＧＧＧＧＳ）ｘ（配列番号１２）（ここでｘは１から５までの間の整数）、（ＧＧＧＳ）ｘ（配列番号１３）（ここでｘは１から５までの間の整数）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５）、ｘｘｘＧＫＰＧＳＧＥｘｘｘＧＫＰＧＳＧＥｘｘｘ（ここでｘは任意のアミノ酸）（配列番号１６）、ＫＰＧＳＧＥ（配列番号１７）、ＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号１８）、ＧＫＰＧＳＧＧ（配列番号１９）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号２０）、ＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号２１）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＳ（配列番号２３）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＧＧＧＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号２５）、ＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号２６）、ＧＫＰＧＳＧＥＧ（配列番号２７）、ＳＧＫＰＧＳＧＥ（配列番号２８）、ＫＰＧＳＧ（配列番号２９）、ＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴ（配列番号３０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３２）、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号３３）のアミノ酸配列を有し得る。
【００７８】
キメラカスパーゼ−９タンパク質：例
いくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質は次のアミノ酸配列を有し得る。ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＳＧＧＧＳＧＶＤＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＭＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＥＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号６）。この配列では、Ｎ末端からＣ末端の方向に、次の成分が存在する。１）Ｆ３６Ｖ変異を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む二量体化ドメイン、２）リンカー領域（リンカー領域の１番目のアミノ酸を下線で示す）、および３）ＣＡＲＤドメインのないカスパーゼ−９ポリペプチドを含み、かつＤ３３０ＭおよびＤ３７９Ｅ置換を含む改変カスパーゼ−９ポリペプチド（改変カスパーゼ−９ポリペプチドの１番目のアミノ酸を下線で示す）。
【００７９】
いくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質は、本明細書の実施例１で説明されるキメラカスパーゼ−９タンパク質のいずれかであってよい。
【００８０】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質（すなわち、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むもの）は、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドを含む、対応するキメラカスパーゼ−９タンパク質より小さい基礎活性を有してよい。いくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質は、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドを含む対応キメラカスパーゼの基礎活性の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の基礎活性を有してよい。いくつかの実施形態によれば、ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインと、ＣＡＲＤドメインを欠く改変カスパーゼ−９ポリペプチドとを含む、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質は、ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインと、ＣＡＲＤドメインを欠く野生型カスパーゼ−９ポリペプチドとを含む、対応キメラカスパーゼ−９タンパク質の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の基礎活性を有してよい。
【００８１】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質（すなわち、改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むもの）は、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドを含む対応キメラカスパーゼ−９タンパク質よりも小さい基礎活性を有してよい（ＳＥＡＰアッセイ、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ、アネキシンＶアッセイ、または本明細書の実施例１で提供するアッセイを用いた測定による）。いくつかの実施形態によれば、ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインおよび本明細書で提供するＣＡＲＤドメインを欠く改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９タンパク質は、ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインおよびＣＡＲＤドメインを欠く野生型カスパーゼ−９ポリペプチドを含む、対応キメラカスパーゼ−９タンパク質の基礎活性の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の基礎活性を有し得る（ＳＥＡＰアッセイ、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ、アネキシンＶアッセイ、または本明細書の実施例１で提供されるアッセイを用いた測定による）。いくつかの実施形態によれば、ＦＫＢＰ１２二量体化ドメイン、および本明細書で提供するＣＡＲＤドメインを欠く改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９タンパク質は、ＦＫＢＰ１２二量体化ドメイン、およびＣＡＲＤドメインを欠く野生型カスパーゼ−９ポリペプチドを含む、対応キメラカスパーゼ−９タンパク質の基礎活性の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の基礎活性を有してよい（ＳＥＡＰアッセイ、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ、アネキシンＶアッセイ、または本明細書の実施例１で提供するアッセイを用いた測定による）。上記キメラカスパーゼ−９タンパク質はさらに、ＦＫＢＰ１２二量体化ドメイン、およびＣＡＲＤドメインを欠く野生型カスパーゼ−９ポリペプチドを含む、対応キメラカスパーゼ９タンパク質の二量体化リガンドに反応するカスパーゼ活性が、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％以上である（ＳＥＡＰアッセイ、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ、アネキシンＶアッセイ、または本明細書の実施例１で提供するアッセイを用いた測定による）。
【００８２】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質は、二量体化リガンドが存在しない状態よりも、対応する二量体化リガンドが存在する状態の方が、より大きいカスパーゼ−９活性を有してよい。いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質は、二量体化リガンドが存在しない状態よりも、例えば１０ｎＭまたは１０ｍＭの対応二量体化リガンドが存在する状態で、２ｘ（すなわち、「２倍」）、３ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、５０ｘ、または１００ｘ以上のカスパーゼ−９活性を有してよい。例えば、本明細書で提供するいくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質は、ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインを含み、当該ＦＫＢＰ１２タンパク質はＦ３６Ｖ置換を更に含む。この例を続けると、いくつかの実施形態によれば、ＡＰ１９０３が１０ｍＭ存在する状態でのキメラカスパーゼ−９タンパク質のカスパーゼ−９活性は、ＡＰ１９０３が０ｍＭの状態の２ｘ、３ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、５０ｘまたは１００ｘ以上である。
【００８３】
二量体化リガンド
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質は、好適な二量体化リガンドを介して二量体化するように誘導されてよい。二量体化リガンドにより（両タンパク質のコピーの二量体化ドメインを介して）キメラカスパーゼ−９タンパク質の２つのコピーが結合され、それによりキメラカスパーゼ−９タンパク質の二量体化が誘導される。通常、本明細書で提供する実施形態に用いられる二量体化リガンドは、被験体に容易に投与できる３ｋＤａ未満の小分子である。
【００８４】
いくつかの実施形態によれば、二量体化ドメインはＦＫＢＰ１２ポリペプチドであり、対応する二量体化リガンドは、ＡＰ１９０３、ＡＰ２１０８７、ＡＰ１５１０、二量体化ラパマイシン、二量体化ＦＫ１０１２、二量体化ＦＫ５０６、または二量体化ＦＫ５０６様アナログである。
【００８５】
本明細書に開示される二量体化リガンド、ＡＰ１９０３、ＡＰ２１０８７、ＡＰ１５１０、二量体化ＦＫ１０１２、二量体化ＦＫ５０６などは、当業者に公知のものである。例えば、ＡＰ１９０３（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄとも呼称される）は、次の識別情報を有する合成分子である。ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカルボン酸、１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−、１，２エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，−４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ［１（Ｒ*）、２Ｒ*［Ｓ*［Ｓ*［１（Ｒ*）、２Ｒ*］］］］］−（９Ｃｌ）；ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子式：Ｃ78Ｈ98Ｎ4Ｏ20、分子量：１４１１．６５。
【００８６】
ＡＰ１９０３は、Ｆ３６Ｖ変異を伴うＦＫＢＰ１２ポリペプチドに対して、野生型ＦＫＢＰ１２よりもはるかに大きい親和性を有する。そのため、Ｆ３６Ｖ変異およびＡＰ１９０３を有するＦＫＢＰ１２を含む組換えタンパク質を被験体内で使用するシステムでは、組換えタンパク質の被験体内で、ＡＰ１９０３の選択的ターゲティングが可能となる。これは、野生型ＦＫＢＰ１２に対するＡＰ１９０３の親和性が小さいことにより、二量体化リガンドと野生型ＦＫＢＰ１２との結合から生じる得る副作用が最小限に抑えられるため好都合である（すなわち、Ｆ３６Ｖ変異を有するＦＫＢＰ１２のみが標的となる）。Ｆ３６Ｖ変異を含むＦＫＢＰ１２ポリペプチドと共にＡＰ１９０３を用いる方法は、例えば、Ｊｅｍａｌ，Ａ．ら，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１−９６（２００８）；Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．およびＫｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １１，１５６６−７２（１９９３）に説明されている。ＡＰ１９０３のヒトへの投与については試験されている（例えば、Ｉｕｌｉｕｃｃｉ  Ｊ．Ｄ．ら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０−９，２００１を参照のこと）。
【００８７】
いくつかの実施形態によれば、二量体化ドメインは、シクロフィリンポリペプチドを含み、対応する二量体化リガンドは二量体化シクロスポリンＡである。いくつかの実施形態によれば、二量体化ドメインはエストロゲン結合ポリペプチドであり、対応する二量体化リガンドは二量体化エストロゲンである。いくつかの実施形態によれば、二量体化ドメインは、グルココルチコイド結合ポリペプチドであり、対応する二量体化リガンドは二量体化グルココルチコイドである。いくつかの実施形態によれば、二量体化ドメインはテトラサイクリン結合ポリペプチドであり、対応する二量体化リガンドは二量体化テトラサイクリンである。いくつかの実施形態によれば、二量体化ドメインはビタミンＤ結合ポリペプチドであり、対応する二量体化リガンドは二量体化ビタミンＤである。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「二量体化」リガンドは、任意にて好適な結合分子のコピーを２以上含んでよい（すなわち、リガンドは多量体であってよい）。ただし、そのようなリガンドも、対応する結合分子を二量体化する能力に基づき、本明細書で使用されるように「二量体化」とみなされてよい。同様にいくつかの実施形態によれば、本明細書で提供する「二量体化ドメイン」は、多量体化をサポートできるものでもよい（例えば、二量体化ドメインの複数のコピーが同じ分子に提供される場合）。ただしそのようなドメインも、二量体化能力に基づき、本明細書で使用されるように「二量体化ドメイン」であるとみなされてよい。通常、カスパーゼ−９のシグナル伝達は、カスパーゼ−９分子の二量体化により効果的に誘導できる（すなわち、三量体化またはその他の多量体化は不要）。また、本明細書において「リガンド」が言及される場合、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、二量体化リガンドを言及する（例えば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質の二量体化を誘導する「リガンド」を指す場合）。
【００８９】
本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質のリガンド媒介二量体化により、キメラカスパーゼ−９タンパク質を含む宿主細胞におけるカスパーゼ−９媒介シグナル伝達イベントが誘導される。このシグナル伝達により、通常アポトーシスおよび細胞死がもたらされる。
【００９０】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質は、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）の二量体化機能を１つ以上含んでよく、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）のためのシステムで提供されるシステムまたは方法を通じて二量体化するように誘導されてもよい。ＣＩＤシステムは、表面受容体の凝集が、下流のシグナル伝達カスケードを効果的に活性化するという概念に基づく。ＣＩＤシステムは、合成二価リガンドを用いて、リガンド結合ドメインに融合されたシグナル伝達分子を迅速に架橋する。このシステムは、細胞表面（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９−１０２４；Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １９９６，６：８３９−８４７；Ｂｌａｕ，Ｃ  Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７，９４：３０７６−３０８１）または細胞質タンパク質（Ｌｕｏ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８３：１８１−１８５；ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８，９５：３６５５−３６６０）のオリゴマー化および活性化、転写を調節するＤＮＡ要素への転写因子のリクルートメント（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８２：８２２−８２６；Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６，２：１０２８−１０３２）、またはシグナル伝達を刺激する原形質膜へのシグナル伝達分子のリクルートメント（Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｄ．Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９２：９８０５−９８０９；Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９５：９８１０−９８１４）を引き起こすために使用されている。したがって、ＣＩＤシステムは条件付きで制御されたタンパク質またはポリペプチドを生成する。この手法は、誘導性であることに加えて、不安定な二量体化剤の分解またはモノマーの競合阻害剤の投与に起因して、可逆性である。
【００９１】
ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、本明細書で説明する改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを更に提供する。
【００９２】
例えば、いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、核酸配列ＧＧＡＴＴＴＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＧＧＣＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＧＡＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＴＧＴＡＴＧＧＡＡＣＣＧＡＣＧＧＡＴＧＴＣＣＣＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＴＡＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＣＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＴＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＡＧＣ（配列番号７）によってコードされる。配列番号７の核酸配列は、ＣＡＲＤドメインを欠き、かつＤ３３０ＭおよびＤ３７９Ｅの置換を有する改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする。これらの置換をコードするコドンを下線で示している。
【００９３】
更に例えばいくつかの実施形態によれば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質は、核酸配列ＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＡＡＣＡＡＴＣＴＣＡＣＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＡＣＧＧＡＣＡＴＴＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＴＡＣＣＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＣＧＣＧＡＴＣＧＧＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＧＧＣＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＴＡＡＴＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＧＡＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＴＧＴＡＴＧＧＡＡＣＣＧＡＣＧＧＡＴＧＴＣＣＣＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＴＡＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＣＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＧＣＴＴＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＡＧＣ（配列番号８）によってコードされる。配列番号８の核酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の成分を含むキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする。１）Ｆ３６Ｖ変異を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む二量体化ドメイン。２）リンカー領域、および３）ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ−９ポリペプチドを含む改変カスパーゼ−９ポリペプチド、ならびにＤ３３０ＭおよびＤ３７９Ｅ置換を含む改変カスパーゼ−９ポリペプチド。また、配列番号８の核酸配列は、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする。
【００９４】
別の態様によれば、本開示は、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質を含む宿主細胞を含む組成物（医薬組成物など）を提供する。いくつかの実施形態によれば、上記組成物には、本明細書で説明する改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む細胞が含まれる。
【００９５】
発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与については、本明細書で詳説する。
【００９６】
別の態様によれば、本開示は、本明細書で説明される任意のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ポリヌクレオチドは、当業者に公知の手順によって作製および発現させることができる。
【００９７】
本開示には、このような配列に相補的なポリヌクレオチドも含まれる。ポリヌクレオチドは一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）または二本鎖であってもよいし、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってもよい。追加のコード配列または非コード配列が本開示のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、そうである必要はない。また、ポリヌクレオチドが他の分子および／またはサポート材料にリンクされてもよいが、そうである必要はない。
【００９８】
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が「同一」であるとされるのは、以下で説明するように、２つの配列内のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、最大に一致するようにアライメントされている状態で同一であるときである。通常２つの配列の比較は、比較ウインドウで配列を比較し、配列が類似するローカル領域を特定および比較することによって実施される。本明細書で使用される場合、「比較ウインドウ」とは、約２０以上（通常３０から約７５まで、または４０から約５０まで）の近接位置のセグメントを示す。比較ウインドウでは、２つの配列が最適にアライメントされた後、配列を近接位置の同数の参照配列と比較することができる。
【００９９】
比較のための配列最適アライメントは、生命情報科学ソフトであるＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート内のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、初期設定パラメータで用いて実行することができる。本プログラムは次の参考文献に説明されているいくつかのアライメントスキームを具体化する。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８；Ｈｅｉｎ  Ｊ．，１９９０，Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，１９７１，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．，Ｎｅｓ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，１９７３，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０１００】
一般に、配列同一性パーセントは、２０以上の位置の比較ウインドウで、最適に配列された２つの配列を比較することによって判定される。２つの配列の最適アライメントには、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部には、参照配列（付加または欠失を含まない）に対して、２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）が含まれてよい（通常５％以上１５％以下または１０％以上１２％以下）。同一性パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に出現する位置の数を判定することにより一致する位置の数を求め、一致する位置の数を参照配列の位置総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けることで、求めることができる。
【０１０１】
本開示のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを用いて取得できる。化学ポリヌクレオチド合成の方法は周知技術であり、本明細書で詳説する必要はない。当業者であれば本明細書で提供する配列、および市販のＤＮＡ合成装置を用いて、所望のＤＮＡ配列を生成できる。
【０１０２】
組換え法を用いてポリヌクレオチドを調製するには、所望の配列を含むポリヌクレオチドを好適なベクターに挿入し、本明細書で更に説明するように、ベクターを好適な宿主細胞へ導入し、複製および増幅を行う。ポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の手段によって宿主細胞に挿入することができる。細胞は、直接摂取、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ接合、またはエレクトロポレーションによって外因性ポリヌクレオチドを導入することにより形質転換される。一旦導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター（プラスミドなど）として細胞内で維持されるか、宿主細胞ゲノムに組み込まれることができる。このように増幅されたポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法により宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照すること。
【０１０３】
あるいは、ＰＣＲでＤＮＡ配列を複製することができる。ＰＣＲ技術は周知技術であり、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，８００，１５９号、米国特許第４，７５４，０６５号および米国特許第４，６８３，２０２号ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら，編，Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）に説明されている。
【０１０４】
ＲＮＡは、適切なベクター内で単離されたＤＮＡを使用し、それを好適な宿主細胞に挿入することによって取得できる。細胞が複製され、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、例えば前述のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されるように、当業者に周知の方法を用いて、次いでＲＮＡを単離できる。
【０１０５】
好適なクローニングベクターは、標準技法によって構築してもよいし、当該分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択してもよい。選択するクローニングベクターは、使用される宿主細胞によって異なるが、有用なクローニングベクターは、一般に自己複製能力があり、特定の制限酵素に単一のターゲットを持つことができ、かつ／またはベクターを含むクローンの選択に使用できるマーカー用遺伝子を保有することができる。好適な例としては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターなどのプラスミドおよび細菌ウイルスが挙げられる。これらおよびその他多くのクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの民間業者から入手できる。
【０１０６】
発現ベクターとは一般的に、本開示のポリヌクレオチドを含む複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとして、あるいは染色体ＤＮＡの不可欠要素として、宿主細胞内で複製可能でなければならないことが示唆されている。好適な発現ベクターには、プラスミドと、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスを含むウイルスベクターと、コスミドと、ＰＣＴ公報第ＷＯ８７／０４４６２号に開示される発現ベクター（複数可）とが含まれるが、これらに限定されない。ベクトル成分には、一般的に、シグナル配列、複製の起点、１以上のマーカー遺伝子、およびベクター内のポリヌクレオチドを転写する好適な転写制御要素（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）の１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。例えば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質または改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、宿主細胞内で核酸の転写を誘導するプロモーターを有してよい。発現（すなわち、翻訳）には、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンなど、１つ以上の翻訳制御要素も通常は必要である。
【０１０７】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウムＤＥＡＥ−デキストラン、またはその他の物質を使用したトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染病原体である場合）を含む、いずれかの適切な手段によって細胞に導入できる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入するための選択肢は、宿主細胞の機能に依存することが多い。
【０１０８】
本明細書で説明される改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレチオドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞に導入するためのプラスミド、または昆虫宿主細胞にトランスフェクションするためのバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞にトランスフェクションするためのレンチウイルスなどのプラスミドまたはウイルスベクター）に存在し得る。いくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドまたはベクターは、例えば２Ａペプチドをコードする配列などを含むがそれに限定されない、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含んでもよい。ピコルナウイルスのアフトウイルス属で同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされる２つのアミノ酸間にペプチド結合を形成することなく、リボソームをあるコドンから次のコドンへ「スキップ」させる（ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＥｌｌｉｏｔｔ（２００１）；Ａｔｋｉｎｓ，Ｗｉｌｌｓら（２００７）；Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕら（２００８）参照）。「コドン」とは、リボソームによって１つのアミノ酸残基に翻訳されるｍＲＮＡ上（またはＤＮＡ分子のセンス鎖上）の３つのヌクレオチドを意味する。したがって、２つのポリペプチドは、フレーム内の２Ａオリゴペプチド配列によって分離されている場合、ｉｍＲＮＡ内の単一近接翻訳領域から合成できる。このようなリボソームのスキップ機構は、周知技術であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされるいくつかのタンパク質を発現させる目的でいくつかのベクターによって用いられることが知られている。
【０１０９】
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くために、いくつかの実施形態によれば、分泌シグナル配列（シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列とも呼称される）が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的にリンクしている。すなわち、２つの配列は、正しい翻訳領域で結合され、新しく合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くように配置される。分泌シグナル配列は、通常、当該ポリペプチドをコードする核酸配列の５’に位置するが、一定の分泌シグナル配列は、当該核酸配列の別の場所に位置する場合がある（例えばＷｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号を参照）。当業者であれば、遺伝暗号の縮重を考慮すると、これらのポリヌクレオチド分子間でかなりのバリエーションの配列が可能であることを認識するであろう。いくつかの実施形態によれば、本開示の核酸配列は、哺乳動物細胞での発現（例えば、ヒト細胞での発現）のために、コドンが最適化されている。コドンの最適化とは、特定の種の高発現遺伝子では一般的に稀である当該コドンの配列を、その種の高発現遺伝子で一般的なコドンに交換することを指し、交換コドンは被交換コドンと同一のアミノ酸をコードする。
【０１１０】
宿主細胞を操作する方法
いくつかの実施形態によれば、本明細書は、宿主細胞を調製する方法を提供する。
【０１１１】
いくつかの実施形態によれば、上記方法は、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを含む。任意により、上記方法は更に細胞を増殖することを含んでもよい。
【０１１２】
いくつかの実施形態によれば、宿主細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態によれば、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態によれば、免疫細胞は例えば幹細胞に由来し得るが、これに限定されない。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞はＣＤ３４＋細胞である。単離細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、記憶Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されたＴ細胞でもあり得る。いくつかの実施形態によれば、細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが導入される宿主細胞は、更にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含んでよい。あるいは、いくつかの実施形態によれば、改変キメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする核酸配列が宿主細胞に導入された後、ＣＡＲをコードする核酸を含むポリヌクレオチドが細胞に導入されてもよい。上記のどちらの実施形態においても、キメラカスパーゼ−９タンパク質およびＣＡＲの両方を含む宿主細胞が生成される。本明細書の別の場所で説明されているように、例えばＣＡＲを含む免疫細胞を操作して本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質を更に含め、必要に応じてこれらの細胞内でアポトーシスの誘導を可能にすることが望ましい場合がある。
【０１１４】
免疫細胞およびＣＡＲ−Ｔ細胞を操作する方法は、例えばＰＣＴ特許出願公報ＷＯ／２０１４／０３９５２３、ＷＯ／２０１４／１８４７４１、ＷＯ／２０１４／１９１１２８、ＷＯ／２０１４／１８４７４４、およびＷＯ／２０１４／１８４１４３に説明されており、本明細書の一部を構成するものとし各公報の全体が参照によって援用される。またいくつかの実施形態によれば、ＣＡＲおよび、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質を含むＣＡＲならびにＣＡＲ−Ｔ細胞は、通常、例えばＪａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１３，３７０−３８３（２０１６）；Ｍａｕｓら，Ｂｌｏｏｄ，１２３，２６２５−２６３５（２０１４）；Ｄａｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．７（２０１６）；Ｗａｎｇ＆Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ，３，１６０１５（２０１６）；Ｌｉｅｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎら，Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ），５（３），８１５−８３７（２０１３）で提供されるような方法および当該文献が引用する方法で調製してもよい。いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質、およびＣＡＲ含有免疫細胞は、２０１６年３月３０日に出願された米国特許出願第１５／０８５，３１７号（すべての目的のためにその内容が参照によって本明細書に援用される）で提供されるＣＡＲおよびＣＡＲ含有免疫細胞の特徴を有してよいし、上記特許出願に記載されるいずれかの方法によって調製してよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供する方法は、ｉ）本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチド、およびＣＡＲをコードする１以上のポリヌクレオチドにより免疫細胞を形質転換することと、ｉｉ）ポリヌクレオチドを細胞内に発現させることとを含む。
【０１１６】
ＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを導入する方法および技法は、キメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを導入するためにも使用できる。いくつかの実施形態によれば、キメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細胞内での安定発現のためにレンチウイルスベクターに存在してもよい。
【０１１７】
いくつかの実施形態によれば、改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有する宿主細胞を操作する方法は、１以上の遺伝子発現（例えばＴＣＲの成分、免疫抑制剤の標的、ＨＬＡ遺伝子、および／またはＰＤＣＤ１もしくはＣＴＬＡ−４などの免疫チェックポイントタンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない）を不活性化することで宿主細胞を遺伝的に改変する工程を更に含んでもよい。遺伝子の不活性化により、目的の遺伝子が機能的タンパク質の形で発現しないよう意図されている。いくつかの実施形態によれば、不活性化される遺伝子は、例えばＴＣＲα、ＴＣＲβ、ｄＣＫ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４からなる群から選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、上記方法は、選択的ＤＮＡ切断により遺伝子を選択的に不活性化できる希少切断エンドヌクレアーゼを細胞に導入することで１以上の遺伝子を不活性化させることを含む。いくつかの実施形態によれば、希少切断エンドヌクレアーゼは、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼであってよい。
【０１１８】
いくつかの実施形態によれば、本開示によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーションによって、細胞に直接導入されるｍＲＮＡであってよい。いくつかの実施形態によれば、ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ技術を用いて生細胞を一時的に透過性にし、物質を細胞内に送達できる。最小限の死亡率かつ高い導入効率を実現する条件を判断するため、パラメータを変更してもよい。
【０１１９】
操作された宿主細胞
本開示は更に、本明細書で提供する改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む操作された宿主細胞も提供する。いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供するカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、導入遺伝子としてプラスミドベクターを介して宿主細胞に導入できる。いくつかの実施形態によれば、プラスミドベクターは更に、例えばベクターを受け取った細胞の識別および／または選択を行う選択マーカーを含んでもよい。通常、本明細書で提供する宿主細胞は免疫細胞であり、例えばプライマリＴ細胞である（例えば、図４から図９までを参照）が、他の種類の宿主細胞も可能である。
【０１２０】
本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質が宿主細胞で発現される場合、通常、キメラカスパーゼ−９タンパク質は、二量体化ドメインが細胞外になるように配向され（したがって二量体化リガンドとの相互作用が容易である）、上記タンパク質のカスパーゼ−９ポリペプチドの少なくとも一部が細胞内となる（したがって細胞内のカスパーゼ−９シグナル伝達経路を容易に媒介できる）。
【０１２１】
改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入した後、当該細胞内でｉｎ  ｓｉｔｕで合成されてもよい。あるいは、改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、細胞外で作製され、その後細胞内に導入されても良い。ポリヌクレオチド構築物を細胞内に導入する方法は、当業者に公知のものである。いくつかの実施形態によれば、安定したトランスフェクション法を用いてポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むことができる。その他の実施形態においては、一過性トランスフェクション法を用いてポリヌクレオチド構築物を一時的に発現させ、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込まないこともできる。更に他の実施形態においては、ウイルス媒介方法を用いることができる。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）およびリポソームなどの好適な手段によって細胞に導入されてもよい。一過性トランスフェクション法には、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または微粒子銃が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクターなどのベクターに含まれてもよい。
【０１２２】
本明細書は、本明細書で提供する上記の細胞を操作する方法によって得られる単離細胞および細胞株を更に提供する。いくつかの実施形態によれば、単離細胞は、本明細書で説明されるように、改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質を１以上含む。本明細書は、上記のいずれかの方法によって得られる単離された免疫細胞を更に提供する。
【０１２３】
拡張および遺伝子改変に先立って、様々な非限定的な方法を通じて細胞源を被験体から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍など、多くの非限定的な細胞源から得ることができる。いくつかの実施形態によれば、当業者に周知であり、かつ当業者が利用可能な任意数のＴ細胞株を用いることができる。いくつかの実施形態によれば、細胞は、健康なドナー、癌と診断された患者、または感染症と診断された患者に由来してよい。いくつかの実施形態によれば、細胞は、異なる表現型形質を示す細胞の混合集団の一部であってよい。
【０１２４】
本明細書は、上記のいずれかの方法によって遺伝子導入された免疫細胞から得られた細胞株を更に提供する。
【０１２５】
いくつかの実施形態によれば、本開示による単離細胞は、例えば図１Ａから図１Ｃの概略的に示されるように、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１２６】
本明細書で提供する組成物および方法に用いる免疫細胞は、例えば米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号（ただしこれらに限定されない）に概して説明されている方法を用いて、細胞の遺伝子改変の前または後に活性化および増殖できる。Ｔ細胞は、試験管内または生体内で増殖できる。一般的にＴ細胞の増殖は、例えばＣＤ３−ＴＣＲ複合体および共刺激分子をＴ細胞の表面上で刺激し、Ｔ細胞の活性化シグナルを発生させる媒介物と接触することにより実現できる。たとえば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ）、またはマイトジェンレクチン様フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの化学物質を用いてＴ細胞の活性化シグナルを発生させることができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態によれば、本開示の細胞は、組織または細胞と共培養することで増殖させることができる。本開示の細胞は、生体内（例えば、細胞を被験体に投与した後、被験体の血液中にて）で増殖させることもできる。
【０１２８】
いくつかの実施形態によれば、宿主細胞内のＴＣＲα遺伝子および／またはＴＣＲβ遺伝子（複数可）を不活性化することで、本明細書で提供する宿主Ｔ細胞内でＴＣＲを機能させない状態にする。
【０１２９】
治療適用
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質、または改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、治療目的で被験体に導入するために用いることができる。例えば、宿主細胞は免疫細胞であってもよく、被験体内の癌を治療するために免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）を被験体に導入してもよい。宿主細胞を被験体に投与する前に、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に組み込むことにより、本明細書で提供するシステムおよび方法に従い宿主細胞を被験体内で（必要に応じて）改変できる。例えば、宿主細胞を被験体に導入した後、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質を含む宿主細胞でアポトーシスを誘導することが必要であるか望ましい場合、宿主細胞のキメラカスパーゼ−９タンパク質の二量体化ドメインに結合する好適な二量体化リガンドを被験体に投与できる。導入した細胞を排除するかどうかの判断は、例えば、許容できないレベルの毒性が検出された場合、または細胞が望ましくない状態で増殖している場合など、導入された細胞に起因して患者に望ましくない影響が検出された際に必要となることがある。例えば、本明細書で提供するキメラカスパーゼ−９タンパク質を含む宿主細胞を被験体に投与した後、いくつかの実施形態によれば、被験体に宿主細胞を投与した後、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、または１４４時間以内に、対応する二量体化リガンドを被験体に投与することができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で説明されるキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または当該細胞に由来する細胞株は、医薬品として用いることができる。いくつかの実施形態によれば、上記医薬品は、固形腫瘍および液性腫瘍を含めた癌の治療に用いることができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供する治療用宿主細胞は、Ｆ３６Ｖ変異二量体化ドメインを有するＦＫＢＰ１２を含んでよい。上記宿主細胞を被験体内中で改変するために、被験体にＡＰ１９０３を投与してもよい。ＡＰ１９０３は、各種治療計画に従って被験体に投与できる。例えば、任意により、２時間のＩＶ点滴による注射を通じて、被験体に０．４ｍｇ／ｋｇの量のＡＰ１９０３を投与できる。ＡＰ１９０３はヒトで研究されており（例えば、Ｉｕｌｉｕｃｃｉ  Ｊ．Ｄ．ら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０−９，２００１を参照のこと）、少なくとも１ｍｇ／ｋｇの投与量まで良好な耐容性を示す。任意にて、被験体の血流内のＡＰ１９０３濃度が、例えば、約１０ｎＭから１００ｎＭまで、約１００ｎＭから１０００ｎＭまで、または約１ｍＭから１００ｍＭまでの範囲になるように、ＡＰ１９０３を被験体に投与してもよい。
【０１３２】
本開示の治療方法は、回復、治療または予防目的であってよい。被験体内の自己宿主細胞および同種宿主細胞の両方でアポトーシスを誘導することが望ましい場合、または（状況によって）必要な場合があるため、本明細書で提供する組成物および方法は、自己免疫療法の一部または同種免疫療法の一部のいずれかであってよい。
【０１３３】
本明細書で提供する方法で用いることのできる細胞は、例えば前項に記載されている。治療は、例えば、癌、または治療用宿主細胞を被験体に導入することが望ましい他の疾患が診断された患者を治療するために用いることができる。宿主細胞は、静脈内投与などの任意かつ便利な方法で被験体に投与できる。
【０１３４】
キット
本開示は更に、本方法で用いるためのキットも提供する。本開示のキットには、ｉ）本明細書で説明されるように改変カスパーゼ−９ポリペプチドまたはキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または改変カスパーゼ−９ポリペプチドもしくはキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む操作された免疫細胞と、ｉｉ）本明細書で説明される開示の方法のいずれかに従って使用するための説明書とを含む。一般的に説明書には、上記の治療処置のために操作された免疫細胞を投与するための説明が含まれる。任意にて、キットには更に、キメラカスパーゼ−９タンパク質の二量体化ドメインに結合する好適な（例えば、ＡＰ１９０３などの）二量体化リガンドと、例えば必要とする被験体に二量体化リガンドを投与する必要性と時期を含めた説明書とが含まれてよい。
【０１３５】
操作された免疫細胞および二量体化リガンドを本明細書で説明されるように用いるための説明書には、通常、意図する治療での投与量、投与日程、および投与経路に関する情報が含まれている。容器は、投与量単位、大量包装（例えば、複数投与量包装）、または投与量サブユニットであってよい。本開示のキットで提供される説明書は、通常ラベル、または添付文書に記載された説明（例えば、キットに含まれる紙シート）であるが、機械可読媒体による説明（例えば、磁気または光学保存ディスクに記載された説明）でもよい。
【０１３６】
本開示のキットには好適な包装がなされている。好適な包装には、バイアル、瓶、ジャー、柔軟性のある包装（例えば、密封されたマイラーまたはビニール袋）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアルであってよい）。容器もまた、滅菌接近ポートを有してよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアルであってよい）。
【０１３７】
キットは、任意選択により、バッファーおよび判断用の情報などの追加的な構成要素を提供してもよい。通常、キットは、容器と、容器上の、または容器に関連する、ラベルまたは添付文書（複数可）を含む。
【０１３８】
例示的実施形態
本明細書で説明される開示および発明は、番号が付された以下の例示的実施形態を参照することにより定義することができる。
【０１３９】
１．配列番号２に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列と、１以上のアミノ酸置換とを含む改変カスパーゼ−９ポリペプチドであって、前記アミノ酸置換がＳ２７１、Ｓ２７４、Ｃ２８７、Ｄ３３０、Ｆ３４２、Ｉ３７０、Ｄ３７９、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｆ４０６、およびＫ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる、改変カスパーゼ−９ポリペプチド。
【０１４０】
２．前記１以上のアミノ酸置換が、Ｓ２７１Ｙ、Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３９０Ｎ、Ｆ４０６Ｗ、およびＫ４０９Ｎからなる群から選択される、請求項１に記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチド。
【０１４１】
３．前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが２以上のアミノ酸置換を含み、前記２以上のアミノ酸置換が、Ｑ２２１−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ｉ３７０、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｓ２７１、Ｄ３３０−Ｓ２７４、Ｄ３３０−Ｆ３４２、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ａ３９０、およびＤ３３０−Ｋ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる、実施形態１に記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチド。
【０１４２】
４．前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドがＱ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、およびＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチド。
【０１４３】
５．前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、実施形態１から４までのいずれか１つに記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチド。
【０１４４】
６．実施形態１から５までのいずれか１つに記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【０１４５】
７．前記ポリヌクレオチドが配列番号１１に示す核酸配列を含む、実施形態５に記載のポリヌクレオチド。
【０１４６】
８．実施形態６または７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【０１４７】
９．実施形態１から５までのいずれか１つに記載の改変カスパーゼ−９ポリペプチド、または請求項６もしくは７に記載のポリヌクレオチドを含む、操作された免疫細胞。
【０１４８】
１０．二量体化ドメインと改変カスパーゼ−９ポリペプチドとを含むキメラタンパク質であって、前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号２に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列および１以上のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が、Ｓ２７１、Ｓ２７４、Ｄ３３０、Ｆ３４２、Ｉ３７０、Ｄ３７９、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｆ４０６、およびＫ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる、キメラタンパク質。
【０１４９】
１１．前記１以上のアミノ酸置換が、Ｓ２７１Ｙ、Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３９０Ｎ、Ｆ４０６Ｗ、およびＫ４０９Ｎからなる群から選択される、実施形態１０に記載のキメラタンパク質。
【０１５０】
１２．前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、２以上のアミノ酸置換を含み、前記２以上のアミノ酸置換が、Ｑ２２１−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ｉ３７０、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｓ２７１、Ｄ３３０−Ｓ２７４、Ｄ３３０−Ｆ３４２、Ｄ３３０−Ｄ３７９、Ｄ３３０−Ｖ３８７、Ｄ３３０−Ａ３９０、およびＤ３３０−Ｋ４０９からなる群から選択されるアミノ酸位置でなされる、実施形態１０に記載のキメラタンパク質。
【０１５１】
１３．前記改変カスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｑ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ、Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、およびＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１０に記載のキメラタンパク質。
【０１５２】
１４．前記二量体化ドメインが、ＦＫＢＰポリペプチドおよびシクロフィリンポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む、実施形態１０から１３までのいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
【０１５３】
１５．前記二量体化ドメインが、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む、実施形態１０から１４までのいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
【０１５４】
１６．前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ３６Ｖを含む、実施形態１５に記載のキメラタンパク質。
【０１５５】
１７．前記キメラタンパク質が、配列番号６に示すアミノ酸配列を含む、実施形態１０から１６までのいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
【０１５６】
１８．前記二量体化ドメインが、二量体化リガンドＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、二量体化ＦＫ５０６、または二量体化ＦＫ５０６様アナログに結合する、実施形態１０から１７までのいずれか１つに記載のキメラタンパク質。
【０１５７】
１９．実施形態１０から１８までのいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【０１５８】
２０．配列番号８に示す核酸配列を含む、実施形態１９に記載のポリヌクレオチド。
【０１５９】
２１．実施形態１９または２０に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【０１６０】
２２．実施形態１０から１８までのいずれか１つに記載のキメラタンパク質、または実施形態１９もしくは２０に記載のポリヌクレオチドを含む、操作された免疫細胞。
【０１６１】
２３．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態２２に記載の操作された免疫細胞。
【０１６２】
２４．前記免疫細胞がＴ細胞である、実施形態２２または２３に記載の操作された免疫細胞。
【０１６３】
２５．操作された免疫細胞を被験体内で改変する方法であって、前記方法が、実施形態２２から２４までのいずれか１つに記載の操作された免疫細胞を先に投与された被験体に、二量体化リガンドを投与することを含み、前記二量体化リガンドが、キメラタンパク質の二量体化ドメインに結合し、前記リガンドが、前記二量体化ドメインに結合されるとカスパーゼ−９活性が誘導される方法。
【０１６４】
２６．前記リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態２５に記載の方法。
【０１６５】
２７．操作された免疫細胞を調製する方法であって、前記方法が、実施形態６、７、１９、もしくは２０に記載のポリヌクレオチド、または実施形態８もしくは２１に記載の発現ベクターを前記免疫細胞に導入することを含む方法。
【０１６６】
以下の実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、決して本開示の範囲を限定することを意図したものではない。実際、当業者であれば、前述の説明により、本明細書に示される内容および本明細書で説明される内容の他にも、本開示に様々な変更を加えることが可能であることが明らかになるであろうし、またそのような変更も添付の請求の範囲内に属する。
【実施例】
【０１６７】
実施例１
各種改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９タンパク質のアポトーシス誘導活性の判定
【０１６８】
本実施例では、各種キメラカスパーゼ−９タンパク質がＴ細胞でアポトーシスを誘導する能力を判定する。各キメラカスパーゼ−９タンパク質は、ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインおよび改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含有する。
【０１６９】
実施例１（パートＡ）
各種キメラカスパーゼ−９タンパク質を含むＴ細胞の調製
形質導入のためのＴ細胞の調製
次のように、４つの異なるヒト血液ドナー（「ドナー１」、「ドナー２」、「ドナー３」、および「ドナー８」）から、それぞれプライマリＴ細胞を調製した。
【０１７０】
ＳｅｐＭａｔｅ−５０チューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１５４５０）およびＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ、カタログ番号１７−１４４０−０３）を用いて、スタンフォード血液細胞バンクの全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｐａｎ  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９６−５３５）でプライマリＴ細胞を単離し、必要時まで−８６℃で凍結した。
【０１７１】
ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインおよび改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスの調製
異なるレンチウイルスベクターを複数生成した。各レンチウイルスベクターには、ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインおよび改変カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれた。異なるレンチウイルスベクターは、同じアミノ酸配列を有するキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードしたが、カスパーゼ−９ポリペプチドに１、２、または３つの異なるアミノ酸変異を有した点のみが異なった。生成されたレンチウイルスベクターには、カスパーゼ−９ポリペプチドに以下の各種改変を含むキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドが含まれた。
単一置換：Ｒ１９２Ｋ、Ｅ２０２Ｋ、Ｃ２３９Ｎ、Ｇ２４８Ｌ、Ｅ２６１Ｓ、Ｎ２６５Ｅ、Ｓ２７１Ａ、Ｓ２７１Ｙ、Ｃ２７２Ｄ、Ｃ２７２Ｍ、Ｓ２７４Ｅ、Ｌ２７５Ｈ、Ｌ２７５Ｉ、Ｌ２７５Ｋ、Ｋ２８０Ｇ、Ｃ２８７Ａ、Ｇ２８８Ｐ、Ｇ２８９Ｄ、Ｄ３３０Ｌ、Ｄ３３０Ｍ、Ｄ３３０Ｑ、Ｓ３３４Ｖ、Ｐ３３８Ｗ、Ｆ３４２Ｈ、Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３７９Ｖ、Ｓ３８２Ｉ、Ｌ３８５Ｗ、Ｖ３８７Ａ、Ａ３８８Ｗ、Ａ３９０Ｎ、Ｙ３９７Ｉ、Ｋ３９８Ｄ、Ｑ３９９Ｉ、Ｐ４０１Ｉ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ｄ、Ｆ４０６Ｗ、Ｌ４０７Ｈ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｎ
二重置換：Ｑ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ、Ｑ２２１Ｒ−Ｃ２８７Ａ、Ｓ２４２Ｍ−Ｇ２８９Ｄ、Ｓ２７１Ｙ−Ｄ３３０Ｍ、Ｄ２７４Ｅ−Ｄ３３０Ｍ、Ｓ２７５Ｅ−Ｄ３３０Ｍ、Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ、Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ、Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ、Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ、Ｄ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎ、Ｇ３６０Ｄ−Ｌ３８０Ｖ、Ｖ３８７Ａ−Ｋ４０９Ｎ
三重置換：Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ−Ｋ４０９Ｎ
【０１７２】
この実験で用いたキメラカスパーゼ−９タンパク質の例示的なアミノ酸配列を以下に提示する。この配列は、カスパーゼ−９ポリペプチド部にＤ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ二重変異を含有するキメラカスパーゼ−９タンパク質の場合である。
ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＳＧＧＧＳＧＶＤＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＭＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＥＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号６）
【０１７３】
上記のキメラタンパク質において、次の構成要素が表記されている（Ｎ末端からＣ末端の順に）。
下線部：Ｆ３６Ｖ変異を有するＦＫＢＰ１２二量体化ドメイン。ＦＫＢＰ１２二量体化ドメインのアミノ酸配列も、ここに別途提供する：ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＳ（配列番号４）。直前の配列において、Ｆ３６Ｖ変異のＶに下線が引かれている。
斜体部：リンカー領域。リンカーのアミノ酸配列も、ここに別途提供する：ＧＧＧＳＧＶＤ（配列番号５）。
太字部：改変カスパーゼ−９ポリペプチド。改変カスパーゼ−９ポリペプチドのアミノ酸配列も、ここで別途提供する：
ＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＭＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＥＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号３）。直前の配列において、Ｄ３３０Ｍ変異のＭ、およびＤ３７９Ｅ変異のＥに下線が引かれている。配列番号３の改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、全長野生型カスパーゼ９タンパク質のＣＡＲＤドメインを含まない。
【０１７４】
この実施例で使用される他のキメラカスパーゼ−９タンパク質は、各タンパク質がそれぞれのアミノ酸置換（複数可）を有する点を除いて、配列番号６に示すキメラカスパーゼ−９タンパク質と同じ構造を有する。
【０１７５】
上記のキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードする例示的な核酸配列（すなわち、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ二重変異を含む）、およびその一部を表２に示す。
【表２】
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【０１７６】
各種レンチウイルスベクターを、次のように生成した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ゲノムプラスミドｐＬＶＸ−ＥＦ１ａ−ＧＦＰ−Ｐ２Ａ−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃａｓｐ９、ｇａｇ／ｐｏｌプラスミドｐｓＰＡＸ２、およびエンベローププラスミドｐＭＤ．２Ｇ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を含む、３つのレンチウイルスプラスミドを形質移入した。ゲノムプラスミドは、目的のカスパーゼ９置換（複数可）をそれぞれ有するキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。ゲノムプラスミドはまた、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしており、これはキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレチオドにより形質移入された細胞の識別を容易にする。生成された各レンチウイルスベクターを、異なる各ＨＥＫ２９３Ｔ細胞トランスフェクション培養液の上澄部に放出した。
【０１７７】
キメラカスパーゼ−９タンパク質を含むＴ細胞を生成するための、キメラカスパーゼ−９タンパク質構造物をコードするポリヌクレチオドによる、レンチウイルスを媒介したＴ細胞の形質転換
キメラカスパーゼ−９タンパク質を含むＴ細胞を、次のように生成した。
【０１７８】
予め凍結されたプライマリＴ細胞を解凍し、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞アクティベーターで活性化した（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、カタログ番号１０９７１）。４８時間後、上述のようにキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを活性化されたプライマリＴ細胞に加え、形質導入を実施した。異なるレンチウイルスベクターを異なるプライマリＴ細胞のサンプルに加え、異なるキメラカスパーゼ−９タンパク質の活性を試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのろ過された上澄液内で、それぞれのレンチウイルスベクターをＴ細胞に導入した。キメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されたＴ細胞では、その後それぞれのキメラカスパーゼ−９タンパク質が発現した。
【０１７９】
以下の表３から表７に示すように、複数の異なるキメラカスパーゼ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ドナー１、２、および３の各Ｔ細胞に遺伝子導入した。
【０１８０】
また比較目的で、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラカスパーゼ−９タンパク質の調製を試みた。しかしこれらの取り組みは成功しなかった。なぜなら、野生型カスパーゼ−９ポリペプチド構築物を含むプラスミドで形質転換したＨＥＫ２９３Ｔ細胞は生き残らず、Ｔ細胞に遺伝子導入するためのレンチウイルスが生成されなかったためである。特定の理論に縛られることなく、これは野生型カスパーゼ−９ポリペプチド（プラスミドを細胞に導入する際にＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現され得る）の基礎活性が比較的大きいためと考えられ、また表３から表７に記載される全てのカスパーゼ−９変異体が、野生型カスパーゼ−９よりも小さい基礎活性を有することを示している。
【０１８１】
実施例１（パートＢ）
異なるキメラカスパーゼ−９タンパク質を含むＴ細胞で誘導したアポトーシスのアッセイ
異なるキメラカスパーゼ−９タンパク質を含むＴ細胞を、上記パートＡで説明したように調製し、二量体化リガンドＡＰ１９０３により誘導されたアポトーシスをアッセイした。
【０１８２】
各アッセイにおいて、特定のキメラカスパーゼ−９タンパク質を含む約１，０００，０００個の細胞を、１０ｎＭのＡＰ１９０３がある状態、またはない状態で、３日間または４日間培養した。３日目または４日目に、フローサイトメトリーで細胞を測定し、ＧＦＰ陽性（＋）の細胞の割合を判定した。（ＧＦＰとは、キメラカスパーゼ−９タンパク質のマーカーである。）したがって、ＧＦＰ＋の生細胞の割合が大きくなるほど、このアッセイの各キメラカスパーゼ−９タンパク質のアポトーシス活性が小さくなると推定できる。
【０１８３】
アッセイされたドナー細胞とキメラカスパーゼ−９タンパク質とのさまざまな組み合わせを以下の表３から表７に、アッセイ結果とともに記載する。
【０１８４】
以下の表３および表４に記載される結果は、それぞれ図１および図２のグラフ形式でも示されている。図１および図２では、Ｘ軸に異なったキメラカスパーゼ−９タンパク質を示し、Ｙ軸にＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示している。また、異なるキメラカスパーゼ−９タンパク質が、それぞれ隣接する２つの棒を有している。左側の棒がＡＰ１９０３を用いずに培養した細胞であり、右側の棒がＡＰ１９０３を用いて培養した対応する細胞である。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【０１８５】
上記の表に示されているように、本明細書で提供する複数の異なる改変カスパーゼ−９ポリペプチドは、ＡＰ１９０３によって誘導されるアポトーシス活性を有する。これは、例えば、ＡＰ１９０３が０ｍＭである場合のＧＦＰ陽性細胞の割合と、ＡＰ１９０３が１０ｍＭである場合のＧＦＰ陽性細胞の割合とを、異なる改変カスパーゼ−９それぞれにおいて比較することで確認できる。また、通常、ＡＰ１９０３のない状態でＧＦＰ陽性細胞の割合が大きい（キメラカスパーゼ−９タンパク質の基礎活性が小さいことを示す）ことが望ましく、また、ＡＰ１９０３が１０ｍＭの状態で培養された細胞のＧＦＰ陽性細胞の割合と、ＡＰ１９０３が０ｍＭの状態で培養された細胞のＧＦＰ陽性細胞の割合との差が大きいことが望ましい。これら２集団間のＧＦＰ陽性細胞の割合の差が大きいということは、キメラカスパーゼ−９タンパク質の活性が誘導できることを示している。２つの集団の差が大きくない場合、ｉ）キメラカスパーゼ−９タンパク質の基礎活性が比較的大きいことを示すか（リガンドなしでＧＦＰ陽性割合が小さい場合）またはｉｉ）ＡＰ１９０３が存在する状態においても、キメラカスパーゼ−９タンパク質の基礎活性が比較的小さいことを示す（リガンドありでＧＦＰ陽性割合が大きい場合）。例えば、上記に示すような魅力的な活性特性を有するキメラカスパーゼ−９タンパク質の一部としては、例えば、単一変異としてＳ２７１Ｙ，Ｓ２７４Ｅ，Ｄ３３０Ｌ，Ｄ３３０Ｍ，Ｆ３４２Ｈ，Ｉ３７０Ｅ，Ｄ３７９Ｅ，Ｖ３８７Ａ，Ａ３９０Ｎ，Ｆ４０６Ｗ，およびＫ４０９Ｎ、二重変異としてＱ２２１Ｒ−Ｖ３８７Ａ，Ｄ３３０Ｌ−Ｉ３７０Ｅ，Ｄ３３０Ｌ−Ｄ３７９Ｅ，Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７１Ｙ，Ｄ３３０Ｍ−Ｓ２７４Ｅ，Ｄ３３０Ｍ−Ｆ３４２Ｈ，Ｄ３３０Ｍ−Ｉ３７０Ｅ，Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ，Ｄ３３０Ｍ−Ｖ３８７Ａ，Ｄ３３０Ｍ−Ａ３９０Ｎ，およびＤ３３０Ｍ−Ｋ４０９Ｎが挙げられる。
【０１８６】
実施例２
異なるキメラカスパーゼ−９タンパク質およびＣＡＲを含むＴ細胞で発現したアポトーシスの誘導および発現レベルのアッセイ
各種キメラカスパーゼ−９タンパク質を含むドナー＃８に由来するＴ細胞（その一部はさらにＣＡＲを含む）を上記のパート１Ａで説明したように調製し、キメラカスパーゼ−９タンパク質の発現および二量体化リガンドＡＰ１９０３に反応して誘導されたアポトーシスをアッセイした。
【０１８７】
各アッセイにおいて、特定のキメラカスパーゼ−９タンパク質を含む約１，０００，０００個の細胞を、１０ｎＭのＡＰ１９０３がある状態、またはない状態で、３日間または４日間培養した。ＡＰ１９０３後１日目、２日目、および３日目（それぞれ図６、７、および８）に、フローサイトメトリーで細胞を測定し、ＧＦＰ陽性（＋）の細胞の割合を判定した。（ＧＦＰとは、キメラカスパーゼ−９タンパク質のマーカーである。）したがって、ＧＦＰ＋の生細胞の割合が大きくなるほど、このアッセイの各キメラカスパーゼ−９タンパク質のアポトーシス活性が小さくなると推定できる。
【０１８８】
結果を図４から図９に示す。図４から図９では、Ｘ軸に異なったキメラカスパーゼ−９タンパク質を示し、Ｙ軸にＧＦＰ陽性細胞の割合またはＣＡＲ陽性細胞の割合を示している。図４では、異なるキメラカスパーゼ−９タンパク質がそれぞれ隣接する２つの棒を有している。左側の棒がプライマリＴ細胞での発現を表し、右側の棒がジャーカット細胞での発現を表す。
【０１８９】
図５では、棒グラフがＣＡＲ陽性のプライマリＴ細胞（対の左側の棒）またはジャーカット細胞（対の右側の棒）の発現レベルを示している。
【０１９０】
図６から図９では、ＣＡＲなしまたはＣＡＲありで発現した各種キメラキメラカスパーゼ−９タンパク質が、それぞれ隣接する２つの棒を有している。左側の棒はＡＰ１９０３を用いずに培養した細胞であり、右側の棒はＡＰ１９０３を用いて培養した対応する細胞である。図６は、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ構築物によるアポトーシスが、Ｎ４０５Ｑ構築物によるアポトーシスよりも、１日目で約３倍速く誘導されたことを示している。この観察結果は、Ｄ３３０Ｍ−Ｄ３７９Ｅ構築物をＣＡＲ−Ｔ療法の速効型「安全スイッチ」として適用することとつじつまが合う。
【０１９１】
開示された教示は、様々な適用、方法、キット、および組成を参照して説明されたが、本明細書の教示、および以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変を行うことができることが理解されよう。前述の例は、開示された教示をよりよく説明するために提供されたものであって、本明細書で提供された教示の範囲を限定することを意図していない。本教示をこれらの例示的な実施形態の観点から説明してきたが、当業者は、不要な実験をすることなくこれらの例示的実施形態に多くの変形および改変が可能であることを容易に理解するであろう。そのようなすべての変形および改変は、本教示の範囲内に属する。
【０１９２】
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書に引用される全ての参考文献、および当該参考文献に引用される参考文献は、まだ援用範囲に含まれていない場合、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。定義された用語、用語の用法、説明された技術など（を含むがこれらに限定されない）において、援用された１以上の文献および類似の資料と本願とが矛盾する場合、本願が優先するものとする。
【０１９３】
前述の説明および実施例は、本発明の特定の実施形態を詳述しており、発明者によって企図された最良の形態を説明している。しかし、前述の内容がどれほど詳細に記載されていようとも、本発明は多くの方法で実施することができ、かつ本発明は添付の特許請求の範囲およびその均等物に従って解釈されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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