(57)【要約】  本開示は、新規ポリペプチド接合体を提供する。本明細書で開示したポリペプチド接合体は、ペプチドおよびα−ヘリックス構造でペプチドを保持する少なくとも１つのステープルを含むステープルペプチド、ならびにステープルペプチドに、直接的または間接的に、接合された環状細胞透過性ペプチド（ｃＣＰＰ）を含む。本開示は、ｃＣＰＰが、ステープルペプチドへ一貫した細胞透過性を付与するために使用可能であることを実証するものである。
2021501201.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ペプチド、および前記ペプチドをα−ヘリックス構造に保持する少なくとも１つのステープルを含む、ステープルペプチド；および
ｂ）前記ステープルペプチドに接合された少なくとも１つの環状細胞透過性ペプチド（ｃｙｃｌｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ｃＣＰＰ）
を含む、ポリペプチド接合体。
【請求項２】
前記ｃＣＰＰは、前記ステープルに接合される、請求項１に記載のポリペプチド接合体。
【請求項３】
前記ｃＣＰＰは、前記ペプチドに接合される、請求項１に記載のポリペプチド接合体。
【請求項４】
前記ｃＣＰＰは、前記ペプチドのＮ末端に接合される、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項５】
前記ｃＣＰＰは、前記ペプチドのＣ末端に接合される、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項６】
前記ｃＣＰＰは、前記ペプチドのアミノ酸の側鎖に接合される、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項７】
さらに、前記ｃＣＰＰ上のアミノ酸、および（ｉ）前記ペプチド上のアミノ酸または（ｉｉ）前記ステープルのいずれかに共有結合されるリンカーを含む、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項８】
前記リンカーは、前記ポリペプチド接合体が細胞の細胞基質に入った後、前記ステープルペプチドを前記ｃＣＰＰから放出することができる、請求項７記載のポリペプチド接合体。
【請求項９】
前記リンカーは、ジスルフィド結合を介して、前記ステープルペプチドと共有結合されている、請求項８記載のポリペプチド接合体。
【請求項１０】
前記ステープルは、前記ペプチド中の第１アミノ酸の側鎖が前記ペプチドの第２アミノ酸の側鎖と共有結合するときに形成される、反応生成物である、請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項１１】
前記ステープルは、２つのアミノ酸を架橋する部分である、請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項１２】
前記ポリペプチド接合体は、式ＩＡ、ＩＢ、またはＩＣによる構造：
【化１】
2021501201.tif 000026
式中、
ＸおよびＺのそれぞれは、各場合において、アミノ酸から独立して選択され；
Ｕは、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択され；
Ｊは、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択され；
Ｚ’は、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択され；
ａは、０〜５００の範囲の数値であり；
ｃは、少なくとも３であり；ｄは、１〜５００の範囲の数値であり；
ｅは、０〜５００の範囲の数値であり；ｇおよびｈのそれぞれは、独立しており、各場合において、０または１であるが、ただし、少なくとも１つの場合においてｇは１という条件とし；
ｉは、０〜１００の範囲の数値であり；
Ｙ１は、前記ステープルに対して第１結合基（ｂ１）を形成する側鎖を有するアミノ酸であり、Ｙ２は、前記ステープルに対して第２結合基（ｂ２）を形成する側鎖を有するアミノ酸である、
を有する、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項１３】
前記ｃＣＰＰは、式ＩＩ：
【化２】
2021501201.tif 000027
式中、
ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、およびＡＡ４のそれぞれは、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸から独立して選択され、
ＡＡｕおよびＡＡｕのそれぞれは、各場合および存在する場合、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸から独立して選択され、
ｍおよびｎは、独立して、０から６の数から選択され；
式中、
ＡＡｕ、各場合および存在する場合、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、およびＡＡｚからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸は、各場合および存在する場合、独立してアルギニンであり、
ＡＡｕ、各場合および存在する場合、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、およびＡＡｚからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸は、各場合および存在する場合、独立して疎水性アミノ酸である、
を含む配列を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項１４】
前記ｃＣＰＰは、式ＩＩＩＡ〜Ｄ：
【化３】
2021501201.tif 000028
式中、
ＡＡＨ１およびＡＡＨ２のそれぞれは、独立してＤ疎水性アミノ酸またはＬ疎水性アミノ酸であり；
各場合および存在する場合、ＡＡＵおよびＡＡＺはそれぞれ、独立してＤアミノ酸またはＬアミノ酸であり；
ｍおよびｎは、独立して、０から６の数から選択される、
のいずれかを含む配列を有する、請求項１〜１３のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項１５】
ｃは、３、６、または１０である、請求項１２〜１４のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項１６】
前記ステープルは、アミド、アルキレン、Ｎ−アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、およびヘテロアリールからなる群から選択され、これらのそれぞれが必要に応じて置換される、請求項１２〜１５のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項１７】
前記リンカーは、少なくとも１つのアミノ酸、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、エーテル、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、これらのそれぞれが必要に応じて置換される、請求項１２〜１６のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項１８】
ｂ１およびｂ２のそれぞれは、独立して、存在しないまたはアリール、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、エステルおよびエーテルからなる群から選択される、請求項１２〜１７のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項１９】
式ＩＢのポリペプチド接合体は、以下の構造
【化４】
2021501201.tif 000029
を有する、請求項１２〜１８のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項２０】
式ＩＣの前記ポリペプチド接合体は、以下の構造
【化５】
2021501201.tif 000030
を有する、請求項１２〜１８のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項２１】
Ｊは存在せず、Ｚは前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかであってもよい、請求項１２〜１９のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項２２】
Ｊは存在し、ｅは１であり、Ｊは前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかであってもよい、請求項１２〜１９のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項２３】
Ｊは存在し、ｅは２以上であり、末端Ｊは前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかである、請求項１２〜１９のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項２４】
Ｕは存在せず、Ｚ’は前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかである、請求項１２〜１８のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項２５】
Ｕは存在し、ａは１であり、Ｕは前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかである、請求項１２〜１８のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項２６】
Ｕは存在し、ａが２以上であり、末端Ｕは前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかである、請求項１２〜１８のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれかに記載のポリペプチド接合体を含む、細胞。
【請求項２８】
細胞と請求項１〜２６のいずれかに記載のポリペプチド接合体とを接触させることを含む、ステープルペプチドの細胞送達のための方法。
【請求項２９】
治療を必要とする患者を治療する方法であって、前記患者に請求項１〜２６のいずれかに記載のポリペプチド接合体を投与することを含む、方法。
【請求項３０】
前記患者が、癌、炎症性の疾患または状態、および自己免疫の疾患または状態から選択される疾患または状態を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ステープルペプチドおよびｃＣＰＰを接合することを含む、請求項１〜２６のいずれかに記載のポリペプチド接合体を作製する方法。
【請求項３２】
ペプチドを少なくとも１つのｃＣＰＰへ接合すること、および前記ペプチドをステープルすることを含む、請求項１〜２６のいずれかに記載のポリペプチド接合体を作製する方法。
【請求項３３】
請求項１〜２６のいずれかに記載のポリペプチド接合体を含む、医薬組成物。
【請求項３４】
式ＩＡ、ＩＢ、またはＩＣによる構造：
【化６】
2021501201.tif 000031
式中、
ＸおよびＺはそれぞれ、各場合において、アミノ酸から独立して選択され；
Ｕは、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択され；
Ｊは、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択され；
Ｚ’は、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択され；
ａは、０〜５００の範囲の数値であり；
ｃは、少なくとも３であり；
ｄは、１〜５００の範囲の数値であり；
ｅは、０〜５００の範囲の数値であり；
ｇおよびｈのそれぞれは、独立しており、各場合において、０または１であるが、ただし、少なくとも１つの場合においてｇは１という条件とし；
ｉは、０〜１００の範囲の数値であり；
Ｙ１は、前記ステープルに対して第１結合基（ｂ１）を形成し得る側鎖を有するアミノ酸であり、Ｙ２は、前記ステープルに対して第２結合基（ｂ２）を形成し得る側鎖を有するアミノ酸であり；
ここで、前記ｃＣＰＰは、式ＩＩ：
【化７】
2021501201.tif 000032
式中、
ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、およびＡＡ４のそれぞれは、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸から独立して選択され、
ＡＡｕおよびＡＡｚのそれぞれは、各場合および存在する場合、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸から独立して選択され、
ｍおよびｎは、独立して、０から６の数から選択される、
を含む配列を有する環状ペプチドであり、
式中、
ＡＡｕ、各場合および存在する場合、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、およびＡＡｚからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸は、各場合および存在する場合、独立してアルギニンであり、
ＡＡｕ、各場合および存在する場合、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４およびＡＡｚからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸は、各場合および存在する場合、独立して疎水性アミノ酸である、
を有する、ポリペプチド接合体。
【請求項３５】
式ＩＡによる構造を有する、請求項３４に記載のポリペプチド接合体。
【請求項３６】
式ＩＢによる構造を有する、請求項３４に記載のポリペプチド接合体。
【請求項３７】
式１Ｃによる構造を有する、請求項３４に記載のポリペプチド接合体。
【請求項３８】
前記ｃＣＰＰは、式ＩＩＩＡ〜Ｄ：
【化８】
2021501201.tif 000033
式中、
ＡＡＨ１およびＡＡＨ２のそれぞれは、独立してＤ疎水性アミノ酸またはＬ疎水性アミノ酸であり；
各場合および存在する場合、ＡＡＵおよびＡＡＺはそれぞれ、独立してＤアミノ酸またはＬアミノ酸であり；
ｍおよびｎは、独立して、０から６の数から選択される、
のいずれかを含む配列を有する、請求項３４〜３７のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項３９】
ｃは、３、６、または１０である、請求項３４〜３８のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項４０】
前記ステープルは、アミド、アルキレン、Ｎ−アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、およびヘテロアリールからなる群から選択され、これらのそれぞれが必要に応じて置換される、請求項３４〜３９のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項４１】
前記リンカーは、少なくとも１つのアミノ酸、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、エーテル、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、これらのそれぞれが必要に応じて置換される、請求項３４〜４０のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項４２】
ｂ１およびｂ２のそれぞれは、独立して、存在しない、またはアリール、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、エステルおよびエーテルからなる群から選択される、請求項３４〜４１のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項４３】
式ＩＢのポリペプチド接合体は、以下の構造を有する、請求項３４、３６、および３８〜４２のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【化９】
2021501201.tif 000034
【請求項４４】
式ＩＣの前記ポリペプチド接合体は、以下の構造を有する、請求項３４または３７〜４２のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【化１０】
2021501201.tif 000035
【請求項４５】
表５、表６、または表７から選択される、請求項１〜４４のいずれかに記載のポリペプチド接合体。
【請求項４６】
式ＩＢの前記ポリペプチド接合体は、以下の構造を有する、請求項４３に記載のポリペプチド接合体。
【化１１】
2021501201.tif 000036
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１７年１０月２７日に出願された米国仮出願番号第６２／５７８，２１３号の利益を主張するものであり、その全体が本明細書に参照として本出願において組み込まれる。
【０００２】
政府資金に関する声明
この発明は、助成金番号Ｒ０１−ＧＭ１１０２０８およびＲ３５−ＧＭ１２２４５９において、政府の支援を得て行われたものであり、それぞれは、米国立総合医科学研究所（ＮＩＧＭＳ）、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与されたものである。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ステープルペプチドは、細胞内タンパク質間相互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：ＰＰＩ）を標的とするための刺激的な種類の治療薬として浮上してきており、そしてこれは、従来の低分子や生物学的製剤における標的に挑戦してきた。Ｖｅｒｄｉｎｅ  Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０３，３−３３（２０１２）；Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５７，６２７５−６２８８（２０１４）。それらは、生理活性α−ヘリックスの構造と特異性を再現し、生体内でのタンパク質分解に抵抗し、また、適切に設計されている場合、哺乳動物細胞の細胞基質と核へアクセスする。アポトーシス促進性タンパク質ＢＩＤのＢＣＬ−２相同性３（ＢＨ３）ドメインの後にモデル化された、炭化水素ステープルα−ヘリックスの最初の細胞への適用により、エネルギー依存性マクロ飲細胞活動のメカニズムによる、これらの細胞内取り込み能力が明らかになり、アポトーシスシグナル伝達カスケードが活性化された。Ｃｈｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．６，１１１−１１９（２０１５）（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２２６４６１３）。
【０００４】
以前は扱いにくかったタンパク質を標的とするための新規な種類の治療法として、ステープルペプチドが注目に値する見通しにもかかわらず、一貫した細胞透過性を有するステープルペプチドの設計には大きな課題が残っている。α−ヘリシティ、正電荷、ペプチド配列、ならびにステープルの組成および配置を含む多くの要因が、細胞の取り込み傾向に影響を与えるように思われる。最近、ＶｅｒｄｉｎｅおよびＷａｌｅｎｓｋｙのラボで、数百のステープルペプチドの包括的な分析により、最適な疎水性、正電荷、ならびにヘリックスの量および適切なステープル配置が、細胞内取り込みの主要な促進力であり、一方、過剰な疎水性および正電荷は、ペプチド投与量が増加するときに、膜溶解の引き金となり得る。Ｃｈｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．６，１１１−１１９（２０１５）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１２，８４５−８５２（２０１６）を参照。これらの研究から明らかなように、多くのステープルペプチドは細胞膜に対して不透過性であるかまたは透過性が低く、そのために治療剤としてのステープルペプチドの適用に限界がある。
【０００５】
したがって、強化された細胞透過性を有する改良ステープルペプチドが当技術分野において求められている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、ステープルペプチドの細胞内送達のためのポリペプチド接合体を提供する。本開示は、環状細胞透過性ペプチド（ｃｙｃｌｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｃＣＰＰ）が、ステープルペプチドへ一貫した細胞透過性を付与するために使用され得ることを実証するものである。加えて、α−ヘリックスペプチドをステープル化してｃＣＰＰに接合する２つの方法を提供する。
【０００７】
実施形態では、本開示は、ペプチドおよびα−ヘリックス構造でペプチドを保持する少なくとも１つのステープルを含むステープルペプチド、ならびにステープルペプチドに、直接的または間接的に、接合され少なくとも１つの環状細胞透過性ペプチド（ｃＣＰＰ）を含む、ポリペプチド接合体を提供する。実施形態では、本開示のｃＣＰＰは、ステープルに、直接的または間接的に接合される。さらなる実施形態では、ｃＣＰＰは、ペプチドに、直接的または間接的に接合される。またさらなる実施形態では、ｃＣＰＰは、ペプチドのＮ末端に、直接的または間接的に接合される。他の実施形態では、ｃＣＰＰは、ペプチドのＣ末端に、直接的または間接的に接合される。さらなる実施形態では、ｃＣＰＰは、ペプチドのアミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に接合される。本発明のポリペプチド接合体において、ステープルは、アミド、アルキレン、Ｎ−アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、およびヘテロアリールからなる群から選択されてよく、これらのそれぞれが必要に応じて置換される。
【０００８】
本発明のポリペプチド接合体は、さらに、ｃＣＰＰ上のアミノ酸、およびペプチド上のアミノ酸またはステープルのいずれかに共有結合されるリンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合を介して、ステープルペプチドと共有結合している。さらなる実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのアミノ酸、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、エーテル、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、これらのそれぞれが必要に応じて置換されてもよい。実施形態では、リンカーは、ポリペプチド接合体が細胞の細胞基質に入った後、ステープルペプチドをｃＣＰＰから放出することができる。
【０００９】
本発明のポリペプチド接合体は、式ＩＡ、ＩＢ、またはＩＣ：
【化１】
2021501201.tif 000003
式中、
ＸおよびＺのそれぞれは、各場合において、アミノ酸から独立して選択され；
Ｕは、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択され；
Ｊは、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択され；
Ｚ’は、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択され；
ａは、０〜５００の範囲の数値であり；
ｃは、少なくとも３であり；
ｄは、１〜５００の範囲の数値であり；
ｅは、０〜５００の範囲の数値であり；
ｇおよびｈのそれぞれは、独立しており、各場合において、０または１であるが、ただし、少なくとも１つの場合においてｇは１という条件とし；
ｉは、０〜１００の範囲の数値であり；
Ｙ１は、ステープルに対して第１結合基（ｂ１）を形成する側鎖を有するアミノ酸であり、Ｙ２は、ステープルに対して第２結合基（ｂ２）を形成する側鎖を有するアミノ酸である、
による構造を有してもよい。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ｃは、３〜３０の範囲の数値である。いくつかの実施形態では、ｃは、３、６、または１０である。さらなる実施形態では、ｂ１およびｂ２のそれぞれは、独立して、結合、アリール、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、エステルおよびエーテルから選択される。
【００１１】
実施形態では、Ｊは存在せず、およびＺはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかであってもよい。実施形態では、Ｊは存在し、ｅは１であり、およびＪはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかであってもよい。さらなる実施形態では、Ｊは存在し、ｅは２以上であり、および末端ＪはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかであってもよい。他の実施形態では、Ｕは存在せず、およびＺ’はペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかである。実施形態では、Ｕは存在し、ａは１であり、およびＵはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかである。実施形態では、Ｕは存在し、ａは２以上であり、およびＵ末端はペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかである。
【００１２】
実施形態では、式ＩＢのポリペプチド接合体は、以下の構造であってもよい：
【化２】
2021501201.tif 000004
【００１３】
実施形態では、式ＩＣのポリペプチド接合体は、以下の構造であってもよい：
【化３】
2021501201.tif 000005
【００１４】
実施形態では、ｃＣＰＰは、式ＩＩ：
【化４】
2021501201.tif 000006
式中、
ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、およびＡＡ４のそれぞれは、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸から独立して選択され、
ＡＡｕおよびＡＡｚのそれぞれは、各場合および存在する場合、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸から独立して選択され、
ｍおよびｎは、独立して、０から６の数から選択され；
式中、
ＡＡＵ、各場合および存在する場合、ＡＡｕ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、およびＡＡｚからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸は、各場合および存在する場合、独立してアルギニンであり、
ＡＡｕ、各場合および存在する場合、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、およびＡＡｚからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸は、各場合および存在する場合、独立して疎水性アミノ酸である、
を含む配列を有してもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ｃＣＰＰは、式ＩＩＩＡ〜Ｄ：
【化５】
2021501201.tif 000007
式中、
ＡＡＨ１およびＡＡＨ２のそれぞれは、独立してＤ疎水性アミノ酸またはＬ疎水性アミノ酸であり；
各場合および存在する場合、ＡＡＵおよびＡＡＺはそれぞれ、独立して、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸であり；
ｍおよびｎは、独立して、０から６の数から選択される、
のいずれかを含む配列を有してもよい。
【００１６】
本開示はまた、本明細書にて開示したポリペプチド接合体を含む細胞も提供する。
【００１７】
本開示はさらに、ステープルペプチドの細胞送達のための方法を提供し、この方法は、細胞を本明細書中にて開示したポリペプチド接合体と接触させることを含む。
【００１８】
さらに、本開示は、治療を必要とする患者を治療するための方法を提供し、この方法は本明細書にて開示したポリペプチド接合体を患者に投与することを含む。患者が、癌、炎症性の疾患または状態、および自己免疫の疾患または状態から選択される疾患または状態を有し得る。
【００１９】
さらに、本開示は、本明細書にて開示したポリペプチド接合体を作製するための方法を提供し、この方法は、ステープルペプチドおよびｃＣＰＰを接合することを含む。他の実施形態では、本開示は、本明細書にて開示したポリペプチド接合体を作製するための方法を提供し、この方法は、ペプチドを少なくとも１つのｃＣＰＰに接合すること、およびペプチドをステープル化すること、を含む。
【００２０】
本開示はまた、本明細書にて開示したペプチド接合体を含む医薬組成物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ステープルとしてＤＣＡと接合するｃＣＰＰ−ステープルペプチドを合成するための戦略を示す概略図である。
【００２２】
【図２】図２は、生存曲線であり、ステープルペプチド２（３−１−１−ＤＣＡ）、ＣＰＰ９−ステープルペプチド接合４および５（３−１−１−ＤＣＡ−ＣＰ９  ｐｅａｋ１およびｐｅａｋ２）、ならびにｎｕｔｌｉｎ−３の、野生型ｐ５３細胞株（ＨＣＴ１１６  ＷＴ）およびｐ５３ノックアウト細胞株（ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−）の生存率への効果を示す。
【００２３】
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ―３Ｂは、ステープル／リンカーとしてＢＢＡと接合するｃＣＰＰ−ステープルペプチドを合成するための２つの異なる戦略を示す概略図である。図３Ａは、樹脂上でのステープル化戦略を示し、この戦略では、ヘリックスのペプチド、ＢＢＡステープル／リンカー、およびｃＣＰＰが、樹脂上で順次合成される。図３Ｂは、液相でのステープリング化戦略を示し、この戦略では、ＢＢＡで誘導体化されたｃＣＰＰおよびヘリックスのペプチドが別々に合成され、また次に液相でステープル化／接合される。
【００２４】
【図４】図４は、ＣＰＰ９接合の有無で、ステープルペプチドの細胞全体効率の比較を示す。ＨｅＬａ細胞を、５μＭのＦＩＴＣで標識化したペプチドで、３７℃で２時間処理し、洗浄して過剰なペプチドを除去し、それから生細胞に共焦点顕微鏡法を行った。Ｉ，ＤＩＣ；ＩＩ，ＧＦＰチャネル；およびＩＩＩ，ＩおよびＩＩのオーバーラップ。
【００２５】
【図５】図５は、ステープル化していないペプチド４および５（立体異性体）の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム、および生成物の低解像度ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（保持時間＝３２分）を示す。
【００２６】
【図６】図６は、ステープルペプチド３の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム、および生成物の低解像度ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（保持時間＝３０．５分）を示す。
【００２７】
【図７】図７は、アミノオキシ（ａｍｉｎｏｘｙ）−ｃＣＰＰ９の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム、およびアミノオキシｃＣＰＰ９の低解像度ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル（保持時間＝２２分）を示す。
【００２８】
【図８Ａ】図８Ａは、リンカーおよびＨＰＬＣクロマトグラムを介して、ｃＣＰＰ（ｃＣＰＰ  ９）に接合された、ステープルペプチド４および５（立体異性体）の化学構造を示す。図８Ｂは、アミノオキシｃＣＰＰ９（保持時間のピーク＝２３分）、構造４（保持時間のピーク＝３３．５分）、および構造５（保持時間のピーク＝３４．５分）の低解像度ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを示す。
【００２９】
【図９】図９は、ステープル化され、標識化されたペプチド１０の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム、およびＭＳスペクトルを示す。
【００３０】
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ―１０Ｂは、リンカーを介してｃＣＰＰへ接合された、ステープル化され、標識化されたペプチド１１の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム（図１０Ａ）、およびＭＳスペクトル（図１０Ｂ）を示す。
【００３１】
【図１１Ａ−１Ｂ】図１１Ａ―１Ｂは、ステープル化され、標識化されたペプチド１２の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム（図１１Ａ）、およびＭＳスペクトル（図１１Ｂ）を示す。
【００３２】
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ―１２Ｂは、リンカーを介してｃＣＰＰへ接合された、ステープル化され、標識化されたペプチド１３の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム（図１２Ａ）、およびＭＳスペクトル（図１２Ｂ）を示す。
【００３３】
【図１３】図１３は、ステープル化され、標識化されたペプチド１４の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム、およびＭＳスペクトルを示す。
【００３４】
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ―１４Ｂは、リンカーを介してｃＣＰＰへ接合された、ステープル化され、標識化されたペプチド１５の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム（図１４Ａ）、およびＭＳスペクトル（図１４Ｂ）を示す。
【００３５】
【図１５】図１５は、ステープル化され、標識化されたペプチド１６の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム、およびＭＳスペクトルを示す。
【００３６】
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ―１６Ｂは、リンカーを介してｃＣＰＰへ接合された、ステープル化され、標識化されたペプチド１７の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム（図１６Ａ）、およびＭＳスペクトル（図１６Ｂ）を示す。
【００３７】
【図１７】図１７は、ステープル化され、標識化されたペプチド１８の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム、およびＭＳスペクトルを示す。
【００３８】
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ―１８Ｂは、リンカーを介してｃＣＰＰへ接合された、ステープル化され、標識化されたペプチド１９の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム（図１８Ａ）、およびＭＳスペクトル（図１８Ｂ）を示す。
【００３９】
【図１９】図１９は、リンカーを介してｃＣＰＰへ接合された、ステープル化され、標識化されたペプチド２１の化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム、およびＭＳスペクトルを示す。
【００４０】
【図２０Ａ−２０Ｄ】図２０Ａ―２０Ｄは、ｓＰＤＩペプチド２２（図２０Ａ）、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩペプチド接合体２３（図２０Ｂ）、Ｒ９−ｓＰＤＩペプチド接合体２４（図２０Ｃ）、およびＴａｔ−ｓＰＤＩペプチド接合２５（図２０Ｄ）を含む、アミドステープルペプチドおよび接合体の化学構造を示す。ＣＰＰ９、Ｒ９、およびＴａｔはそれぞれ、Ｃ末端に接続されたリンカーを介して、ペプチドに接合される。
【００４１】
【図２１】図２１は、接合の有無で、ステープルペプチドの細胞全体効率の比較を示す。画像は、構造２２（ｓＰＤＩ）、構造２３（ＣＰＰ９−ｓＰＤＩ）、構造２４（Ｒ９−ｓＰＤＩ）、および構造２５（Ｔａｔ−ｓＰＤＩ）から提供された。Ｎ末端に、Ｌｙｓ（ＦＩＴＣ）を有する類似体が、共焦点画像解析に使用された。
【００４２】
【図２２】図２２は、ｓＰＤＩ（構造２２）、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩ（構造２３）、およびＣＰＰ９−ｓＰＤＩ  Ｆ１０Ａ変異体の機能的細胞基質送達を比較する無細胞拮抗実験のグラフを示す。蛍光偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ＦＰ）プロットのデータは、競合ペプチド濃度の関数として、ＭＤＭ２（１５ｎＭ）および非標識のｓＰＤＩ、ＣＰＰ９が接合したステープルＰＤＩ（ＣＰＰ９−ｓＰＤＩ；構造２３）、またはＣＰＰ９−ｓＰＤＩ  Ｆ１０Ａ変異体（０−５μＭ）の存在下で、ＦＩＴＣで標識化されたＭＤＭ２リガンド（１５ｎＭ）を使用して、得られた。
【００４３】
【図２３】図２３は、ＭＴＴアッセイで測定した１０％ＦＢＳの存在下でのＳＪＳＡ−１細胞株の生存率に関して、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩ（構造２３）、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、Ｒ９−ｓＰＤＩ（構造２４）、ｓＰＤＩ（構造２２）、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩ（Ｆ１０Ａ）およびＴａｔ−ｓＰＤＩ（構造２５、０−２０μＭ）で、７２時間処理の効果を比較した抗増殖アッセイのグラフを示す。ＩＣ５０値（Ｍ）は、各テスト化合物に対して提供される。
【００４４】
【図２４】図２４は、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩ（構造２３）の抗増殖活性が、アポトーシス経路によって媒介されることを示すグラフである。１０％ＦＢＳの存在下で阻害剤を４８時間処理した後、アネキシンＶ＋／ＰＩ＋およびアネキシンＶ＋ＰＩ−ＳＪＳＡ−１細胞の割合を測定した。
【００４５】
【図２５】図２５は、３７℃での２５％ヒト血清におけるＣＰＰ９−ｓＰＤＩ（構造２３）の安定性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明を記載するとき、本明細書で定義されていないすべての用語は、当技術分野において認識されている一般的な意味を有する。本明細書で明確に定義されていない用語または表現は、当業者によって理解される、その一般に受け入れられている定義を有するものとする。以下の説明が本発明の特定の実施形態または特定の使用に関するものであるという程度まで、それは、例示のみを目的とし、請求された発明を限定するものではない。以下の説明は、添付の特許請求の範囲で定義されるように、本発明の趣旨および範囲に含まれるすべての代替形態、変更および等価物に及ぶことを目的としている。
【００４７】
定義
本明細書で使用される「アミノ酸」は、本開示のステープルペプチド接合体に存在する部分を意味する。本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸」は、側鎖に疎水性基（例えば、アルキル鎖）を有するアミノ酸を意味する。同様に、「芳香族アミノ酸」は、側鎖に芳香族基（例えば、フェニル）を有するアミノ酸を意味する。
【００４８】
「アルキレン」または「アルキレン鎖」は、１〜４０個の炭素原子を有し、完全に飽和した、直鎖または分枝の二価炭化水素鎖ラジカルを意味する。Ｃ２〜Ｃ４０アルキレンの非限定的な例としては、エチレン、プロピレン、ｎ−ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ−ブテニレン、プロピニレン、ｎ−ブチニレンなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、アルキレン鎖は、単結合を介して直接的または間接的に、ｃＣＰＰに付着され、そして単結合を介して直接的または間接的に、ステープルまたはペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、アルキレン鎖は、ペプチドの第１アミノ酸およびペプチドの第２アミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に、独立して付着される。本明細書で別段の定めがない限り、アルキレン鎖は、本明細書に記載されているように、必要に応じて置換され得る。
【００４９】
「アルケニレン」または「アルケニレン鎖」は、２〜４０個の炭素原子を有し、１つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有し、直鎖または分枝鎖の二価炭化水素鎖ラジカルを意味する。Ｃ２〜Ｃ４０アルケニレンの非限定的な例としては、エテン、プロペン、ブテンなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、アルケニレンン鎖は、単結合を介して直接的または間接的に、ｃＣＰＰに付着され、そして単結合を介して直接的または間接的に、ステープルまたはペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、アルケニレンン鎖は、ペプチドの第１アミノ酸およびペプチドの第２アミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に、独立して付着される。本明細書で別段の定めがない限り、アルケニレンン鎖は、必要に応じて置換され得る。
【００５０】
「アルキニレン」または「アルキニレン鎖」は、２〜４０個の炭素原子を有し、１つまたは複数の炭素−炭素三重結合を有し、直鎖または分枝鎖の二価炭化水素鎖ラジカルを意味する。Ｃ２〜Ｃ４０アルキニレンの非限定的な例としては、エチニレン、プロパルギレンなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、アルキニレン鎖は、単結合を介して直接的または間接的に、ｃＣＰＰに付着され、そして単結合を介して直接的または間接的に、ステープルまたはペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、アルキニレン鎖は、ペプチドの第１アミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に、およびペプチドの第２アミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に、独立して付着される。本明細書で別段の定めがない限り、アルキニレン鎖は、必要に応じて置換され得る。
【００５１】
「アリール」は、水素、６〜４０個の炭素原子および少なくとも１つの芳香環を含む、炭化水素環構造二価ラジカルを意味する。本発明の目的のために、アリール二価ラジカルは、単環式、二環式、三環式または四環式の環構造とすることができ、これは、縮合または架橋の環構造を含み得る。アリール二価ラジカルとしては、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、フルオランテン、フルオレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、フェナレン、フェナントレン、プレイアデン、ピレン、およびトリフェニレンから誘導されるアリール二価ラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アリール二価ラジカルは、単結合を介して直接的または間接的に、ｃＣＰＰに付着され、そして単結合を介して直接的または間接的に、ステープルまたはペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、アリールは、ペプチドの第１アミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に、およびステープルまたはペプチドの第２アミノ酸の側鎖のいずれかに、直接的または間接的に、独立して付着される。本明細書で別段の定めがない限り、アリールは、必要に応じて置換され得る。
【００５２】
「シクロアルキル」とは、３〜４０個の炭素原子および少なくとも１つの環を有する安定な非芳香族単環式または多環式完全飽和炭化水素二価ラジカルを意味し、環は、炭素原子と水素原子のみで構成され、縮合または架橋の環構造を含み得る。単環式シクロアルキル二価ラジカルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。多環式シクロアルキル二価ラジカルとしては、例えば、アダマンチル、ノルボルニル、デカリニル、７，７−ジメチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタニルなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、シクロアルキル二価ラジカルは、単結合を介して直接的または間接的に、ｃＣＰＰに付着され、そして単結合を介して直接的または間接的に、ステープルまたはペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、シクロアルキルは、ペプチドの第１アミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に、およびステープルまたはペプチドの第２アミノ酸の側鎖のいずれかに、直接的または間接的に、独立して付着される。本明細書で別段の定めがない限り、シクロアルキル基は、必要に応じて置換され得る。
【００５３】
「シクロアルケニル」とは、３〜４０個の炭素原子、および１つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有する少なくとも１つの環を有する、安定な非芳香族単環式または多環式完全飽和炭化水素二価ラジカルを意味し、環は、炭素原子と水素原子のみで構成され、縮合または架橋の環構造を含み得る。単環式シクロアルケニルラジカルとしては、例えば、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロセテニル（ｃｙｃｌｏｃｔｅｎｙｌ）などが挙げられる。多環式シクロアルケニルラジカルとしては、例えば、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エニルなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、シクロアルケニル二価ラジカルは、単結合を介して直接的または間接的に、ｃＣＰＰに付着され、そして単結合を介して直接的または間接的に、ステープルまたはペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、シクロアルケニルは、ペプチドの第１アミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に、およびステープルまたはペプチドの第２アミノ酸の側鎖のいずれかに、直接的または間接的に、独立して付着される。本明細書で別段の定めがない限り、シクロアルケニル基は、必要に応じて置換され得る。
【００５４】
「シクロアルキニル」とは、３〜４０個の炭素原子、および１つまたは複数の炭素−炭素三重結合を有する少なくとも１つの環を有する、安定な非芳香族単環式または多環式完全飽和炭化水素二価ラジカルを意味し、環は、炭素原子と水素原子のみで構成され、縮合または架橋の環構造を含み得る。単環式シクロアルキニルラジカルとしては、例えばシクロヘプチニル、シクロオクチニルなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、シクロアキニル二価ラジカルは、単結合を介して直接的または間接的に、ｃＣＰＰに付着され、そして単結合を介して直接的または間接的に、ステープルまたはペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、シクロアキケニルは、ペプチドの第１アミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に、およびステープルまたはペプチドの第２アミノ酸の側鎖のいずれかに、直接的または間接的に、独立して付着される。本明細書で別段の定めがない限り、シクロアルキニル基は、必要に応じて置換され得る。
【００５５】
「ヘテロシクリル」、「複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｒｉｎｇ）」または「複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ）」は、２〜１２個の炭素原子、ならびに窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１〜６個のヘテロ原子からなる安定な３〜２０員芳香環または非芳香環二価ラジカルを意味する。ヘテロシクリルまたは複素環式環には、以下に定義されるヘテロアリールが含まれる。本明細書において具体的に別段の記載がない限り、ヘテロシクリルラジカルは、単環式、二環式、三環式または四環式の環構造であることができ、これは、縮合または架橋の環構造を含み得る。また、ヘテロシクリルラジカル中の窒素、炭素または硫黄原子は、必要に応じて四級化され得る。また、ヘテロシクリルラジカルは、部分的にまたは完全に飽和され得る。このようなヘテロシクリルラジカルの例としては、ジオキソラニル、チエニル［１，３］ジチアニル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１−オキソ−チオノルホリニル、および１，１−ジオキソ−チオモルホリニルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル二価ラジカルは、単結合を介して直接的または間接的に、ｃＣＰＰに付着され、そして単結合を介して直接的または間接的に、ステープルまたはペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、ヘテロシクリルは、ペプチドの第１アミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に、およびステープルまたはペプチドの第２アミノ酸の側鎖のいずれかに、直接的または間接的に、独立して付着される。本明細書で別段の定めがない限り、ヘテロシクリル基は、必要に応じて置換され得る。
【００５６】
「ヘテロアリール」は、水素原子、１〜１３個の炭素原子、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される１〜６個のヘテロ原子、および少なくとも１個の芳香環を含む５〜２０員環系ラジカルを意味する。本発明の目的において、ヘテロアリールラジカルは、単環式、二環式、三環式または四環式の環構造であることができ、これは、縮合または架橋の環構造を含み得る。また、ヘテロアリールラジカル中の窒素、炭素または硫黄原子は、必要に応じて四級化され得る。例としては、アゼピニル、アクリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズインドリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル、１，４−ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフランル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル（ベンゾチオフェニル）、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、フラニル、フラノニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、１−オキシドピリジニル、１−オキシドピリミジニル、１−オキシドピラジニル、１−オキシドピリダジニル、１−フェニル−１Ｈ−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリニル、キヌクリジニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、およびチオフェニル（すなわち、チエニル）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール二価ラジカルは、単結合を介して直接的または間接的に、ｃＣＰＰに付着され、そして単結合を介して直接的または間接的に、ステープルまたはペプチドに付着される。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、ペプチドの第１アミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に、およびステープルまたはペプチドの第２アミノ酸の側鎖のいずれかに、直接的または間接的に、独立して付着される。本明細書で別段の定めがない限り、ヘテロアリール基は、必要に応じて置換され得る。
【００５７】
本明細書で使用される「エーテル」という用語は、式−［（Ｒ１）ｍ−Ｏ−（Ｒ２）ｎ］ｚ−を有する二価のラジカル部分を意味し、ｍ、ｎ、およびｚのそれぞれは、独立して、１〜４０から選択される、またＲ１およびＲ２のそれぞれは、独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、またはヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、独立して、直鎖または分岐のアルキレン基である。特定の実施形態では、エーテルは、式−［（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ］ｚ−を有し、ここで、ｍ、ｎ、およびｚのそれぞれは、独立して、１〜４０から選択される。例として、ポリエチレングリコールが挙げられる。エーテルは、単結合を介して直接的または間接的に、ｃＣＰＰに付着され、そして単結合を介して直接的または間接的に、ステープルまたはペプチドに結合される。本明細書で別段の定めがない限り、エーテルは、必要に応じて置換され得る。
【００５８】
本明細書で使用される「Ｎ−アルキレン」という用語は、少なくとも１つの窒素原子を含む、上記で定義されるアルキレン二価ラジカルを意味し、またアルキレンラジカルの、分子の残りへの付着点は、アルキレンラジカルを介する。いくつかの実施形態では、付着点は、必要に応じて窒素原子であってよい。本明細書で別段の定めがない限り、Ｎ−アルキレン基は、必要に応じて置換され得る。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド（アミド）結合によって合わせて連結されたアミノ酸残基のポリマーを含む。本明細書で使用される用語は、任意の大きさ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを意味する。典型的には、ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸長であろう。ペプチドまたはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の集合を意味してもよい。本発明のペプチドは、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物）を含み得る。当技術分野において周知のアミノ酸類似体を代わりに使用してもよい。ペプチドまたはポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸は、化学物質、例えば、接合、官能化、または他の修飾のために、炭水化物基、ヒドロキシ基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカー、の付加によって修飾され得る。ペプチドまたはポリペプチドはまた、単一分子であってもよく、または多分子複合体、例えばタンパク質であってもよい。ペプチドまたはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単なる断片であってもよい。ペプチドまたはポリペプチドは、天然に存在する、組換え、または合成、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００６０】
「ステープル化」または「ペプチドステープル化」は、典型的にはα−ヘリックス構造のペプチドを束縛するための戦略である。ステープル化は、ペプチド上の２つのアミノ酸の側鎖を共有結合させ、それによってペプチド大員環を形成することによって行われる。ステープル化は一般に、少なくとも２つの部分の間に、少なくとも１つの架橋剤を生成する反応を起こすことができる少なくとも２つの部分を、ペプチドに導入することを含む。この部分は、ペプチド配列に導入される適切な側鎖を有する２つのアミノ酸であってよく、またはこの部分は、側鎖の化学修飾を意味してもよい。ステープル化により、α−ヘリックス構造などの二次構造に束縛を与える。架橋剤の長さと形状を最適化して、所望の二次構造含有量の収率を向上させることができる。この与えられた束縛により、例えば、二次構造がほどけるのを防ぎ、および／または二次構造の形状を補強し得る。ほどけるのを防がれた二次構造は、例えば、より安定する。
【００６１】
「ステープルペプチド」は、（本明細書に詳細に記載されているような）ステープルを含むペプチドである。より具体的には、ステープルペプチドは、ペプチド上の１つまたは複数のアミノ酸が架橋されて、特定の二次構造、例えばα−ヘリックス構造で、ペプチドを保持するペプチドである。ステープルペプチドのペプチドは、選択された数の天然または非天然アミノ酸を含み、少なくとも２つの部分の間に、少なくとも１つの架橋剤を生成する反応を起こす少なくとも２つの部分を、さらに含み、そうして、例えばペプチドの安定性を調節する。
【００６２】
「ステッチド」ペプチドは、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６など）のステープルを含む、ステープルペプチドである。
【００６３】
本明細書で使用される「置換された」という用語は、上記の基のいずれかを意味する（すなわち、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、カルボシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、および／またはエーテル）。ここで、少なくとも１つの水素原子は、以下のような、しかしこれらに限定されない少なくとも１つの非水素原子によって置き換えられる：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩなどのハロゲン原子；水酸基、アルコキシ基、エステル基などの酸素原子；チオール基、チオアルキル基、スルホン基、スルホニル基、およびスルホキシド基などの基における硫黄原子；アミン、アミド、アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン、ジアリールアミン、Ｎ−オキシド、イミド、およびエナミンなどの基における窒素原子；トリアルキルシリル基、ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基、およびトリアリールシリル基などの基におけるケイ素原子；および様々な他の基におけるヘテロ原子。「置換された」はまた、１つまたは複数の水素原子が、ヘテロ原子、例えば、オキソ、カルボニル、カルボキシル、およびエステル基中における酸素；およびイミン、オキシム、ヒドラゾン、およびニトリルなどの基における窒素に、より高次の結合によって置き換えられている上記の基のいずれかを意味する（例：二重結合または三重結合）。例えば、「置換された」は、１つまたは複数の水素原子が、−ＮＲｇＲｈ、−ＮＲｇＣ（＝Ｏ）Ｒｈ、−ＮＲｇＣ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、−ＮＲｇＣ（＝Ｏ）ＯＲｈ、−ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、−ＯＲｇ、−ＳＲｇ、−ＳＯＲｇ、−ＳＯ２Ｒｇ、−ＯＳＯ２Ｒｇ、−ＳＯ２ＯＲｇ、＝ＮＳＯ２Ｒｇ、および−ＳＯ２ＮＲｇＲｈで置き換えられている上記の基のいずれかを含む。「置換された」はまた、１つまたは複数の水素原子が、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｇ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｇ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、−ＣＨ２ＳＯ２Ｒｇ、−ＣＨ２ＳＯ２ＮＲｇＲｈで置き換えられている上記の基のいずれかを含む。上記において、ＲｇおよびＲｈは、同一か異なり、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ヘテロシクリル、Ｎ−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、Ｎ−ヘテロアリールおよび／またはヘテロアルキルアルキルである。「置換された」はさらに、１つまたは複数の水素原子が、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、イミノ、ニトロ、オキソ、チオキソ、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ヘテロシクリル、Ｎ−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、Ｎ−ヘテロアリール、および／またはヘテロアリールアルキル基への結合によって置き換えられている上記の基のいずれかを意味する。加えて、上記の置換基のそれぞれはまた、上記の置換基の１つまたは複数と任意に置換され得る。さらに、当業者は、「置換された」はまた、本明細書に記載された基のいずれかにおける１つまたは複数の水素原子が、官能基で置き換えられる瞬間、および官能基が反応して、ｃＣＰＰ、ステープルまたはペプチドと共有結合を形成する瞬間、も包含することを認識するであろう。反応生成物もまた、置換基と見なされる。例えば、リンカーがステープルに接合される実施形態では、ステープルは、リンカーへの結合を形成することができる基で適切に置換されてもよい。いくつかの実施形態では、上記サンプルは、カルボニル基（例えば、ケトンまたはアルデヒド）で置換されてもよく、これは求核性ヒドロキシルアミンを有するリンカーとのカップリング時に、オキシムを形成する（例えば、図１）。別の例では、上記の基のいずれかは、適切なアミノ酸ＣＰＰ（例えば、リジン）とアミド結合を形成するカルボン酸（すなわち、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）と、最初の位置で、置換され得る。あるいは、または加えて、上記の基のいずれかは、ペプチドのＮ末端と結合を形成する求電子基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−ＣＯ２Ｒｇ、−ハロゲン化物など、ここでＲｇは脱離基である）、またはペプチドのＣ末端と結合を形成する求核基（−ＮＨ２、−ＮＨＲｇ、−ＯＨなど）のいずれかと、置換され得る。他の実施形態では、この基は、ペプチド中のシステイン（またはチオール基を有するアミノ酸類似体）を、ジスルフィド結合を形成するチオール基と、置換される。
【００６４】
上記の基に関して本明細書で使用される「ラジカル」という用語は、それが付着されている部分への結合の形成に関与する電子を意味する。例えば、本明細書に開示されるポリペプチド接合体が、ｃＣＣＰをステープルペプチドに接合するエーテルリンカーを含む場合。接合の前に、このどちらかのリンカーは、二価ラジカルとして定義される。ポリペプチド接合体を形成するために、二価ラジカルの１つの電子は、ｃＣＣＰへの単結合で共有され、もう１つの電子は、ステープルペプチドとの単結合で共有される。
【００６５】
「間接的に」という用語は、付着された、または接合された、と共に使用される場合、リンカーを使用して達成される、基間の接続（例えば、ｃＣＰＰとステープルペプチド）を意味する。例えば、いくつかの実施形態によれば、リンカーを使用して、ｃＣＰＰをステープルに間接的に付着させることができる。
【００６６】
ポリペプチド接合体
本開示は、様々な実施形態では、ペプチドおよびα−ヘリックス構造でペプチドを保持する少なくとも１つのステープルを含むステープルペプチド、ならびにステープルペプチドに、直接的または間接的に、接合され少なくとも１つの環状細胞透過性ペプチド（ｃＣＰＰ）を含む、ポリペプチド接合体を提供する。ｃＣＰＰは、任意の適切な位置で、ステープルペプチドに接合され得る。いくつかの実施形態では、ｃＣＰＰは、ステープルに、直接的または間接的に接合されてもよい。他の実施形態において、ｃＣＰＰは、ペプチド中のアミノ酸の側鎖またはペプチドのＮ末端またはＣ末端を含む、任意の適切な位置で、ペプチドに、直接的または間接的に接合され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｃＣＰＰは、ペプチドのＮ末端に、直接的または間接的に接合され得る。他の実施形態では、ｃＣＰＰは、ペプチドのＣ末端に、直接的または間接的に接合され得る。さらに他の実施形態では、ｃＣＰＰは、ペプチドのアミノ酸の側鎖に、直接的または間接的に接合され得る。
【００６７】
本発明のポリペプチド接合体は、式ＩＡ、ＩＢ、またはＩＣ：
【化６】
2021501201.tif 000008
を有してもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＸおよびＺのそれぞれは、各場合において、アミノ酸から独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｕは、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｊは、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｚ’は、各場合および存在する場合、アミノ酸から独立して選択される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ｄは、１〜５００の範囲の数値である。いくつかの実施形態では、ｅは、０〜５００の範囲の数値である。いくつかの実施形態では、ｉは、０〜１００の範囲の数値である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ｇおよびｈのそれぞれは、独立しており、各場合において、０または１である。ただし、少なくともｇは１という条件とする。したがって、いくつかの実施形態では、ペプチド接合体は、１つのｃＣＰＰ−リンカー部分（例えば、式ＩＢにおいて、ｄ＝１、ｇ＝１、およびｈ＝０場合）、またはｃＣＰＰ−リンカー部分以上（例えば、式ＩＢにおいて、ｄ＝２、ｇ＝２、およびｈ＝０の場合、または式ＩＢにおいて、ｄ＝１０、ｇ＝２、およびｈ＝０の場合）を含み得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ａは、０〜５００の範囲の数値である。いくつかの実施形態では、ｃは少なくとも３である。いくつかの実施形態では、（本明細書に記載される）ステープルがαヘリックスの同じ面であるように、ｃは３以上の任意の数であってよい。いくつかの実施形態では、ｃは、３、６、または１０である。さらなる実施形態では、ｂ１およびｂ２のそれぞれは、結合、アリール、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、エステルおよびエーテルから選択される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、Ｙ１は、ステープルに対して第１結合基（ｂ１）を形成する側鎖を有するアミノ酸であり、Ｙ２は、ステープルに対して第２結合基（ｂ２）を形成する側鎖を有するアミノ酸である。
【００７３】
本開示は、式ＩＡ、ＩＢ、またはＩＣの構造が、ＮからＣ、またはＣからＮの向きを有するものとして、解釈され得るものと想定する。つまり、構造の上部は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかになり得る。同様に、構造の底部は、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかになり得る。実施形態では、Ｊは存在せず、およびＺはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかであってもよい。実施形態では、存在し、ｅは１であり、およびＪはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかであってもよい。さらなる実施形態では、Ｊは存在し、ｅは２以上であり、および末端ＪはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかであってもよい。他の実施形態では、Ｕは存在せず、およびＺ’はペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかである。実施形態では、Ｕは存在し、ａは１であり、およびＵはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかである。実施形態では、Ｕは存在し、ａは２以上であり、およびＵ末端はペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかである。
【００７４】
実施形態では、式ＩＢのポリペプチド接合体は、以下の構造であってもよい。
【化７】
2021501201.tif 000009
【００７５】
実施形態では、式ＩＣのポリペプチド接合体は、以下の構造であってもよい。
【化８】
2021501201.tif 000010
【００７６】
ペプチド
本明細書に開示されるポリペプチド接合体で使用するためのペプチドは、α−ヘリックス構造を有する少なくとも１つの領域を含む任意のペプチドであってよい。α−ヘリックスは、一般的な二次構造モチーフであり、多くのタンパク質で重要な機能的役割を果たしている。実施形態では、ペプチドは、大部分がα−ヘリックス構造であってもよく、またはペプチドは、１つまたは複数のα−ヘリックス領域を含む、より大きなタンパク質の一部であってもよい。上述のように、ステープルは、α−ヘリックス構造を実質的に維持するために適切に配置される。
【００７７】
ペプチドは天然に存在する場合もあるし、または標的と相互作用するように（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用を阻害するように）特別に設計されている場合もある。いくつかの実施形態において、ペプチドは、天然に存在するペプチドから誘導されてよく、これは、ステープル、リンカー、および／またはｃＣＰＰ、またはそれらの組み合わせとの接合を容易にするための適切な修飾である。したがって、ペプチド中のアミノ酸（各場合においておよび存在する場合、Ｘ、Ｚ、Ｕ、Ｊ、Ｙ１、Ｙ２、およびＺ’のそれぞれ）は、任意の天然または非天然アミノ酸から独立して選択される、および独立して、ペプチド中に天然に存在する、またはペプチドに導入されるアミノ酸を意味する。「非天然アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように天然アミノ酸と同様の構造を有するという点で、天然アミノ酸の類似体である有機化合物を意味する。非天然アミノ酸は、２０の通常天然に存在するアミノ酸または希少微量天然アミノ酸であるセレノシステインまたはピロリジンの１つではない、修飾アミノ酸、および／またはアミノ酸類似体であり得る。非天然アミノ酸はまた、天然アミノ酸のＤ−異性体であり得る。好適なアミノ酸の例としては、アラニン、アロソロイシン（ａｌｌｏｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ナフチルアラニン（ｎａｐｔｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）、フェニルアラニン、プロリン、ピログルタミン酸、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、２，３−ジアミノプロピオン酸誘導体、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これら、およびその他は、本明細書で使用されるそれらの略語とともに表１に列挙した。
【表１】
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＊１文字の略語：本明細書で大文字で示した場合はＬ−アミノ酸の形を示し、本明細書で小文字で示した場合はＤ−アミノ酸を示す。
【００７８】
いくつかの実施形態では、Ｙ１は、ステープルに対して第１結合基（ｂ１）を形成する側鎖を有するアミノ酸であり、Ｙ２は、ステープルに対して第２結合基（ｂ２）を形成する側鎖を有するアミノ酸である。したがって、Ｙ１とＹ２それぞれの前駆体は、独立して、ステープルを共有結合するために、好適である、または好適であるように修飾され得る、側鎖を有する任意のアミノ酸であり得る。このようなアミノ酸の非限定例としては、システイン、グルタミン、アスパラギン、およびリジン、ならびにそれらの類似体（例えば、ホモシステインなどの側鎖に追加の炭化水素を有する）が挙げられる。
【００７９】
本明細書に開示されるペプチドに導入され得るアミノ酸類似体のさらなる例としては、アルケン側鎖、アルキン側鎖またはニトリル側鎖を有するものが含まれる。これは、これらの側鎖が、ステープル（例えば、オレフィン、または２つのアルケン含有側鎖間の閉環メタセシスの間に）を形成するため、またはステープルを接合するために利用され得るためである。さらに他の実施形態では、Ｙ１の前駆体は、Ｙ２の前駆体の側鎖への共有結合（例えば、アミド結合の形成）に好適な側鎖を有するアミノ酸であってよい。このような実施形態では、これらのアミノ酸類似体の側鎖間の「反応生成物」が、ステープルである。例えば、特定の実施形態では、Ｙ１の前駆体はリジンであり、Ｙ２の前駆体はアスパラギン酸である、およびＹ１前駆体の側鎖上のアミノ基は、Ｙ２前駆体の側鎖上のカルボキシル基と反応して、アミドを形成する、そしてこれがステープルである。別の例として、Ｙ１の前駆体は、側鎖上にアルキンを有するアミノ酸類似体であってよく、Ｙ２の前駆体は、側鎖上にアジドを有するアミノ酸であってもよく、これらの基は反応してトリアゾールを形成する。
【００８０】
特に、実施形態では、ペプチドは、チオール基を（すなわち、リンカー、ｃＣＰＰ、および／またはステープルへの接合の前に）含む側鎖を有する、１つまたは複数のアミノ酸を含み得る。チオール基は、チオエーテル、チオエステル、またはジスルフィドを形成することにより、ｃＣＰＰ、リンカー、および／またはステープルと接合するために用いられてよい。チオール基を有するアミノ酸類似体の非限定例としては、システイン、ホモシステイン、および以下のアミノ酸類似体のいずれかが、挙げられる：
【化９】
2021501201.tif 000012
【００８１】
前述のように、上記基は、ステープル、リンカー、および／またはｃＣＣＰの接合を可能にする前駆体である。具体的には、ステープル、リンカー、および／またはｃＣＣＰをペプチドに接合するために、上記基のチオールの水素は、ステープル、リンカー、またはｃＣＰＰへの結合で置換される。
【００８２】
本発明で使用するためのペプチドの一例は、ＭＤＭ２タンパク質のリガンド、例えば、α−ヘリックスペプチドＡｃ−ＬＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ（配列番号１）（「ＰＤＩ」）である。このリガンドは、ＭＤＭ２タンパク質に結合することができ、またそのためにＭＤＭ２とｐ５３との相互作用を妨害する。ＭＤＭ２／ｐ５３相互作用を妨害するペプチドは軟部組織肉腫の制御、（これは野生型ｐ５３の存在下でＭＤＭ２を過剰発現する）、を含むが、これに限定されず、多くの用途に有用であってもよい。これらの癌は、ＭＤＭ２を遮断する低分子による妨害で維持され、それによってｐ５３の抑制を妨げる。本発明のペプチドは、当業者に周知の方法によって合成されてもよい。例えば、ペプチドは、標準的な固相ペプチド合成（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＰＰＳ）を使用して合成されてもよい。
【００８３】
ステープル
本明細書に記載されるステープルは、生理活性の、ペプチドのα−ヘリックス構造を安定化させ、例えば、プロテアーゼ耐性、細胞浸透性、および生物活性を付与する。ステープルは、ペプチドをα−ヘリックス構造で保持することができる任意の人工の固定具であってよい。実施形態では、ステープルは、ペプチドの本来のα−ヘリックス構造を強化し、それにより、このタンパク質標的に対する結合親和性を維持する。
【００８４】
ペプチドステープル化の方法は、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、ペプチドステープル化は、ステープル化に好適な官能基を含めた側鎖を有する、２つの天然または非天然アミノ酸（すなわち、Ｙ１およびＹ２の前駆体）を含むポリペプチドの生成を必要とし得る。特定の実施形態では、Ｙ１およびＹ２の前駆体の側が反応してステープルを形成し得る。他の実施形態では、Ｙ１およびＹ２の前駆体側は、ステープルを接合させるのに好適な側鎖（すなわち、結合基の形成により、ステープルを結合させるための適切な官能基を含めた側鎖、ｂ１またはｂ２）を有する。さらに他の実施形態では、ステープルは、分子内水素結合を共有結合で置き換えることによって形成され、例えば、分子内水素結合相互作用に関与する、向かい合うアミノ酸上の水素原子およびカルボニル基を、上記向かい合うアミノ酸を架橋する基と、置き換えることによって形成される。このような変更の例は、Ｊｏｙ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ．）５２（３３），５７３８−５７４１）、およびＺｈａｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１６，５５，１２０８８−１２０９３、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【００８５】
ステープルを形成する、またはステープルに結合するアミノ酸は、典型的には、それらの側鎖が、折りたたまれたペプチドの実質的に同じ面上にあるように、ペプチド鎖中で隔置されている。したがって、α−ヘリックスペプチドの場合、アミノ酸側鎖は、通常αヘリックスの実質的に同じ面上に配置されている。ヘリックスの１回転あたりのペプチドの同じ面上の向かい合うアミノ酸間の距離は、約５．４Åである。それに応じて、様々な実施形態では、ステープルは、これらの向かい合うアミノ酸を約５．４Åの距離で保持する任意の適切な部分であり、それにより、αヘリックス構造を維持する。したがって、実施形態では、ステープルは、約５Å〜約６Å、約１０Å〜約１２Å、約１５Å〜約１７Å、約２１Å〜約２３Å、約２６Å〜２８Å、および約３１Å〜約３４Åの範囲の大きさを有することができ、この間のすべての値および部分的な範囲を含む。他の実施形態では、ステープル、約５Å、約５．５Å、約６Å、約１０．５Å、約１１Å、約１１．５Å、約１２Å、約１６．５Å、約１７Å、約１７．５Å、約２２Å、約２２．５Å、約２３Å、約２３．５Å、約２５．５Å、約２６Å、約２６．５Å、約２７Å、約２７．５Å、約２８Å、約２８．５Å、約３０．５Å、約３１Å、約３１．５Å、約３２Å、約３２．５Å、約３３Å、約３３．５Å、約３４Å、または約３４．５Åの大きさを有してもよい。
【００８６】
αヘリックス中の１回転ステープル化の場合、ステープルが接合されるアミノ酸は、一般的にｉ、ｉ＋４の位置にある。αヘリックス中の２回転ステープル化の場合、ステープルが接合されるアミノ酸は、一般的にｉ、ｉ＋７の位置にある。αヘリックス中の３回転ステープル化の場合、ステープルが接合されるアミノ酸は、一般的にｉ、ｉ＋１１の位置にある。他の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチド接合体は、２つ以上のステープル（ステッチドペプチドとも呼ばれる）を含むことができる。例えば、ステープルは、ｉ、ｉ＋４の位置、およびｉ＋７、ｉ＋１１に配置され得る。
【００８７】
様々な実施形態において、Ｙ１とＹ２との間のアミノ酸の数、すなわち、式ＩＡ〜ＩＣにおける「ｃ」は、ステープルがαヘリックスの実質的に同じ面に配置されるような適切な数のアミノ酸である。実施形態では、ｃは少なくとも３である。その他の実施形態では、ｃは、３〜３０の範囲の数値である。さらにその他の実施形態では、ｃは、３、６、または１０である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ステープルは、アルキレン、Ｎ−アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、およびヘテロアリールからなる群から選択され、それぞれ必要に応じて置換される。ステープルの非限定例としては、ラクタムステープル、炭化水素ステープル、ＣｕＡＡＣステープル、ビスチオエーテルステープル、パーフルオロベンゼンステープル、およびチオエーテルステープルが挙げられる。
【００８９】
多くの代替ステープリング方法が、当業者に公知であり、それぞれが異なる形態の大環状化の化学的性質を使用し、異なる生理活性特性を持つステープルペプチドを生じさせる。例えば、ステープル化は、一成分ステープル化であってよい。一成分ステープル化は、２つのアミノ酸の側鎖間の直接結合形成反応を伴う。いくつかの実施形態では、一成分ステープル化技術は、ペプチド中のアミノ酸の側鎖間のアミド結合の形成を含んでもよい。いくつかの実施形態では、一成分ステープル化技術は、例えば、閉環メタセシス、ラクタム化、付加環化（例えば、Ｃｕ（Ｉ）触媒を用いたアジドとアルキンとの環化付加（Ｃｕ（Ｉ）−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ：ＣｕＡＡＣ、「クリック反応」）など）、可逆反応（例えば、ジスルフィド架橋またはオキシム連結の形成）、またはチオエーテル形成を含んでもよい。ステープル化技術は、別の方法としては、二成分ステープル化であってもよい。二成分ステープル化は、所望のペプチド中の２つの相補的な天然または非天然アミノ酸と反応してステープルを形成する、二官能性リンカー化合物を含む。二成分ステープル化は、例えば、光スイッチ可能なリンカーまたは機能化された「ダブルクリック」リンカーを使用してもよい。ステープルがクリック反応を使って接合される場合、ｂ１およびｂ２のそれぞれは、トリアゾールであり、必要に応じて置換されてよい。すなわち、いくつかの実施形態では、Ｙ１およびＹ２の前駆体は、独立して、側鎖上にアルキン基を有するアミノ酸類似体、または側鎖上にアジド基を有するアミノ酸であってよく、また、これらの基は、相補的なアルキンおよび／またはアジド基を有するステープルの前駆体と反応して、トリアゾールを形成する。クリック反応を使用して、二成分ステープル化でステープルを作製してもよく、この場合、ステープルはトリアゾールであり、ｂ１およびｂ２は存在しない。したがって、ｂ１  およびｂ２は、上記技術のいずれかを使用して、ペプチドにステープル化するために接合するときに形成される、結合基であってよい。いくつかの実施形態では、ｂ１およびｂ２のそれぞれは、独立して存在しないか、またはアリール（例えば、トリアゾール）、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、エステル、およびエーテルから選択される。
【００９０】
本発明のステープルペプチドでの使用に適切なステープルおよびステープル化方法の追加例は、Ｗａｌｅｎｓｋｙ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５７，６２７５−６２８８（２０１４），Ｌａｕ，Ｙ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，００，１−１２（２０１４），Ｊｏｙ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ．）５２（３３），５７３８−５７４１）、およびＺｈａｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１６，５５，１２０８８−１２０９３に記載されており、それらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
環状細胞透過性ペプチド（ｃＣＰＰ）
環状細胞透過性ペプチドは、他の不透過性ステープルペプチドの送達を可能にして、細胞基質および細胞の核へ効率的に送達される。本明細書に開示されるポリペプチド接合体のｃＣＰＰは、本明細書に開示されるポリペプチド接合体の細胞内取り込みを促進する任意のアミノ配列であってよい、または含んでよい。本明細書に記載されたポリペプチド接合体および方法での使用に好適なｃＣＰＰは、天然に存在する配列、修飾された配列、および合成配列を含み得る。実施形態では、ｃＣＰＰにおけるアミノ酸の総数は、４〜約２０個のアミノ酸の範囲、例えば、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、および約１９個のアミノ酸であってよく、この間のすべての範囲および部分的な範囲を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるｃＣＰＰは、約４〜約１３個までのアミノ酸を含む。特定の実施形態では、本明細書で開示されるＣＰＰは、約６〜約１０個のアミノ酸、または約６〜約８個のアミノ酸を含む。
【００９２】
ｃＣＰＰの各アミノ酸は、独立して、天然または非天然のアミノ酸であってよい。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ｃＣＰＰは、少なくとも２個のアルギニン、および少なくとも２個の疎水性アミノ酸の任意の組み合わせを含んでよい。いくつかの実施形態では、ｃＣＰＰは、２〜３個のアルギニン、および少なくとも２個の疎水性アミノ酸の任意の組み合わせを含んでよい。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたポリペプチド接合体で使用されるｃＣＰＰは、式３を含む構造を有する：
【化１０】
2021501201.tif 000013
式中、
ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、およびＡＡ４のそれぞれは、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸から独立して選択され、
ＡＡｕおよびＡＡｚのそれぞれは、各場合および存在する場合、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸から独立して選択され、ならびに
ｍおよびｎは、独立して、０から６の数から選択され；
式中、
少なくとも２つのＡＡｕで、存在する場合、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、およびＡＡｚが、存在する場合、独立してアルギニンであり、また
少なくとも２つのＡＡｕで、存在する場合、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、およびＡＡｚが、存在する場合、独立して疎水性アミノ酸である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、各疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、チロシン、シクロヘキシルアラニン、ピペリジン−２−カルボン酸、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、３−（３−ベンゾチエニル）−アラニン、３−（２−キノリル）−アラニン、Ｏ−ベンジルセリン、３−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−アラニン、Ｓ−（４−メチルベンジル）システイン、Ｎ−（ナフタレン−２−イル）グルタミン、３−（１，１´−ビフェニル−４−イル）−アラニン、ｔｅｒｔ−ロイシン、またはニコチノイルリジンから独立して選択され、これらはそれぞれ１つ以上の置換基で必要に応じて置換される。これらの非天然芳香族疎水性アミノ酸のいくつかの構造（本明細書に開示されるペプチドに組み込む前）を以下に提供する。特定の実施形態では、各疎水性アミノ酸は、独立して、疎水性芳香族アミノ酸である。いくつかの実施形態では、芳香族疎水性アミノ酸は、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシンであり、これらのそれぞれは、１つまたは複数の置換基で必要に応じて置換される。特定の実施形態では、疎水性アミノ酸は、ピペリジン−２−カルボン酸、ナフチルアラニン、トリプトファン、またはフェニルアラニンであり、これらのそれぞれは、１つまたは複数の置換基で必要に応じて置換される。
【化１１】
2021501201.tif 000014
【００９６】
任意の置換基は、ｃＣＰＰの細胞基質内送達効率を著しく低下させない任意の原子または基、例えば、相対的な細胞基質内送達効率をｃ（ＦФＲＲＲＲＱ）のそれ未満に低下させない置換基、であり得る。いくつかの実施形態では、任意の置換基は、疎水性置換基または親水性置換基であり得る。特定の実施形態では、任意の置換基は、疎水性置換基である。いくつかの実施形態では、置換基は、疎水性アミノ酸の溶媒にアクセス可能な表面積（本明細書で定義される）を増加させる。いくつかの実施形態では、置換基は、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、アルキルカルバモイル、アルキルカルボキサミジル、アルコキシカルボニル、アルキルチオ、またはアリールチオであり得る。いくつかの実施形態では、置換基は１つまたは複数のハロゲン原子である。
【００９７】
より高い疎水性値を有するアミノ酸を選択すると、より低い疎水性値を有するアミノ酸と比較して、ｃＣＰＰの細胞基質送達効率を改善することができる。いくつかの実施形態では、各疎水性アミノ酸は、独立して、グリシンの疎水性値よりも大きい疎水性値を有する。他の実施形態では、各疎水性アミノ酸は、独立して、アラニンの疎水性値より大きい疎水性値を有する疎水性アミノ酸である。さらに他の実施形態では、各疎水性アミノ酸は、独立して、フェニルアラニン以上の疎水性値を有する。疎水性は、当技術分野で周知の疎水性尺度を使用して測定してもよい。以下の表２は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８４；８１（１）：１４０−１４４），Ｅｎｇｌｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．．１９８６；１９８６（１５）：３２１−５３），Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８２；１５７（１）：１０５−１３２），Ｈｏｏｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８１；７８（６）：３８２４−３８２８）、およびＪａｎｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ．１９７９；２７７（５６９６）：４９１−４９２）によって報告された様々なアミノ酸の疎水性値を示すものであり、それぞれの全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、疎水性は、Ｅｎｇｌｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．で報告された疎水性尺度を使用して測定される。
【表２】
2021501201.tif 000015
【００９８】
アミノ酸のキラリティーを選択して、細胞基質への取り込み効率を向上させることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのアミノ酸は、反対のキラリティーを有する。いくつかの実施形態では、反対のキラリティーを有する少なくとも２つのアミノ酸は、互いに隣接し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのアミノ酸は、互いに対して交互の立体化学を有する。いくつかの実施形態では、この互いに対して交互のキラリティーを有する少なくとも３つのアミノ酸は、互いに隣接し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのアミノ酸は、同一のキラリティーを有する。いくつかの実施形態では、同一のキラリティーを有する少なくとも２つのアミノ酸は、互いに隣接し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのアミノ酸は同一のキラリティーを有し、また少なくとも２つのアミノ酸は反対のキラリティーを有する。いくつかの実施形態では、反対のキラリティーを有する少なくとも２つのアミノ酸は、同一のキラリティーを有する少なくとも２つのアミノ酸に隣接し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｃＣＰＰ内の隣接するアミノ酸は、以下の配列のいずれかを有し得る。Ｄ−Ｌ；Ｌ−Ｄ；Ｄ−Ｌ−Ｌ−Ｄ；Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｌ；Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｌ−Ｄ；Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｌ；Ｄ−Ｌ−Ｌ−Ｄ−Ｌ；またはＬ−Ｄ−Ｄ−Ｌ−Ｄ。
【００９９】
いくつかの実施形態では、アルギニンは、疎水性アミノ酸に隣接している。一部の実施形態では、アルギニンは、疎水性アミノ酸と同一のキラリティーを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのアルギニンは、互いに隣接している。さらに他の実施形態では、３つのアルギニンは、互いに隣接している。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの疎水性アミノ酸は、互いに隣接している。他の実施形態では、少なくとも３つの疎水性アミノ酸は、互いに隣接している。他の実施形態では、本明細書に記載されるｃＣＰＰは、少なくとも２つの連続する疎水性アミノ酸および少なくとも２つの連続するアルギニンを含む。さらなる実施形態では、１つの疎水性アミノ酸は、アルギニンの１つに隣接している。さらに他の実施形態では、本明細書に記載されるｃＣＰＰは、少なくとも３つの連続した疎水性アミノ酸、およびそこに連続したアルギニンを含む。さらなる実施形態では、１つの疎水性アミノ酸は、アルギニンの１つに隣接している。これらのアミノ酸の様々な組み合わせは、Ｄアミノ酸およびＬアミノ酸の任意の配置、例えば、上記の配列を有し得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃＣＰＰにおける任意の４つの隣接するアミノ酸（例えば、式２によるｃＣＰＰ）は、以下の配列の１つを有し得る：ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−Ｒ−ｒ、ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−ｒ−Ｒ、Ｒ−ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２、またはｒ−Ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２、ここで、ＡＡＨ１およびＡＡＨ２は、それぞれ独立して、疎水性アミノ酸である。よって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたポリペプチド接合体で使用されるｃＣＰＰは、式４Ａ〜Ｄ：
【化１２】
2021501201.tif 000016
式中、
ＡＡＨ１およびＡＡＨ２のそれぞれは、独立して、疎水性アミノ酸であり；
各場合および存在する場合、ＡＡＵおよびＡＡＺはそれぞれ、独立して、任意のアミノ酸であり；  
ｍおよびｎは、独立して、０から６の数から選択される、
のいずれかを含む配列を有する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、式４−Ａ〜４−ＤのｃＣＰＰにおけるアミノ酸（ｒ、Ｒ、ＡＡＨ１、ＡＡＨ２を含む）の総数は、６〜１０の範囲である。いくつかの実施形態では、アミノ酸の総数は６である。いくつかの実施形態では、アミノ酸の総数は７である。いくつかの実施形態では、アミノ酸の総数は８である。いくつかの実施形態では、アミノ酸の総数は９である。いくつかの実施形態では、アミノ酸の総数は１０である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ｍとｎの合計は２〜６である。いくつかの実施形態では、ｍとｎの合計は２である。いくつかの実施形態では、ｍとｎの合計は３である。いくつかの実施形態では、ｍとｎの合計は４である。いくつかの実施形態では、ｍとｎの合計は５である。いくつかの実施形態では、ｍとｎの合計は６である。いくつかの実施形態では、ｍは０である。いくつかの実施形態では、ｍは１である。いくつかの実施形態では、ｍは２である。いくつかの実施形態では、ｍは３である。いくつかの実施形態では、ｍは４である。いくつかの実施形態では、ｍは５である。いくつかの実施形態では、ｍは６である。いくつかの実施形態では、ｎは０である。いくつかの実施形態では、ｎは１である。いくつかの実施形態では、ｎは２である。いくつかの実施形態では、ｎは３である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは５である。いくつかの実施形態では、ｎは６である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、各疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、チロシン、シクロヘキシルアラニン、ピペリジン−２−カルボン酸、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、３−（３−ベンゾチエニル）−アラニン、３−（２−キノリル）−アラニン、Ｏ−ベンジルセリン、３−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−アラニン、Ｓ−（４−メチルベンジル）システイン、Ｎ−（ナフタレン−２−イル）グルタミン、３−（１，１´−ビフェニル−４−イル）−アラニン、ｔｅｒｔ−ロイシン、またはニコチノイルリジンから独立して選択され、これらはそれぞれ１つ以上の置換基で必要に応じて置換される。特定の実施形態では、各疎水性アミノ酸は、独立して、疎水性芳香族アミノ酸である。いくつかの実施形態では、芳香族疎水性アミノ酸は、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシンであり、これらのそれぞれは、１つまたは複数の置換基で必要に応じて置換される。特定の実施形態では、疎水性アミノ酸は、ピペリジン−２−カルボン酸、ナフチルアラニン、トリプトファン、またはフェニルアラニンであり、これらのそれぞれは、１つまたは複数の置換基で必要に応じて置換される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＡＡＨ１およびＡＡＨ２のそれぞれは、独立して、グリシンの疎水性値より大きい疎水性値を有する疎水性アミノ酸である。他の実施形態では、ＡＡＨ１およびＡＡＨ２のそれぞれは、独立して、アラニンの疎水性値より大きい疎水性値を有する疎水性アミノ酸である。さらに他の実施形態では、ＡＡＨ１およびＡＡＨ２のそれぞれは、独立して、例えば、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８４；８１（１）：１４０−１４４），Ｅｎｇｌｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９８６；１９８６（１５）：３２１−５３），Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８２；１５７（１）：１０５−１３２），Ｈｏｏｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８１；７８（６）：３８２４−３８２８）、およびＪａｎｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ．１９７９；２７７（５６９６）：４９１−４９２）、（上記表１を参照）を含む、上記疎水性尺度を使用して測定されるような、フェニルアラニンの値よりも大きい疎水性値を有する疎水性アミノ酸である。特定の実施形態では、疎水性は、Ｅｎｇｌｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．で報告された疎水性尺度を使用して測定される。
【０１０５】
Ｄ−ＡｒｇもしくはＬ−ＡｒｇのＮ末端またはＣ末端に疎水性アミノ酸が存在するか、または、またはこの組み合わせはまた、ｃＣＰＰ（および付属のカーゴ）の細胞基質への取り込みを改善することもわかっている。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃＣＰＰは、ＡＡＨ１−Ｄ−ＡｒｇまたはＤ−Ａｒｇ−ＡＡＨ１を含んでよい。他の実施形態では、本明細書で開示されるｃＣＰＰは、ＡＡＨ１−Ｌ−ＡｒｇまたはＬ−Ａｒｇ−ＡＡＨ１を含んでよい。
【０１０６】
Ｄ−ＡｒｇまたはＬ−ＡｒｇのＮ末端またはＣ末端、またはそれらの組み合わせ（すなわち、ＡＡＨ１）上の、疎水性アミノ酸のサイズは、ＣＰＰの細胞基質送達効率を改善するように選択されてもよい。例えば、Ｄ−ＡｒｇまたはＬ−ＡｒｇのＮ末端またはＣ末端のより大きい疎水性アミノ酸、またはそれらの組み合わせは、より小さい疎水性アミノ酸を有する他の点では同一の配列と比較して、細胞基質送達効率を改善する。疎水性アミノ酸の大きさは、疎水性アミノ酸の分子量、疎水性アミノ酸の立体効果、側鎖の溶媒接触表面積（ｓｏｌｖｅｎｔ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ：ＳＡＳＡ）、またはそれらの組み合わせによって測定できる。いくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸の大きさは、疎水性アミノ酸の分子量の観点から測定され、すると、より大きな疎水性アミノ酸は、少なくとも約９０ｇ／ｍｏｌ、または少なくとも約１３０ｇ／ｍｏｌ、または少なくとも約１４１ｇ／ｍｏｌの分子量をもつ側鎖を有する。他の実施形態では、アミノ酸の大きさは、疎水性側鎖のＳＡＳＡの観点から測定され、すると、より大きな疎水性アミノ酸は、ＳＡＳＡがアラニンよりも大きい、またはグリシンよりも大きい側鎖を有する。他の実施形態では、ＡＡＨ１は、約ピペリジン−２−カルボン酸以上、約トリプトファン以上、約フェニルアラニン以上、または約ナフチルアラニン以上のＳＡＳＡをもつ疎水性側鎖を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＨ１は、少なくとも約２００Å２、少なくとも約２１０Å２、少なくとも約２２０Å２、少なくとも約２４０Å２、少なくとも約２５０Å２、少なくとも約２６０Å２、少なくとも約２７０Å２、少なくとも約２８０Å２、少なくとも約２９０Å２、少なくとも約３００Å２、少なくとも約３１０Å２、少なくとも約３２０Å２、または少なくとも約３３０Å２のＳＡＳＡをもつ側鎖側を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡ２は、少なくとも約２００Å２、少なくとも約２１０Å２、少なくとも約２２０Å２、少なくとも約２４０Å２、少なくとも約２５０Å２、少なくとも約２６０Å２、少なくとも約２７０Å２、少なくとも約２８０Å２、少なくとも約２９０Å２、少なくとも約３００Å２、少なくとも約３１０Å２、少なくとも約３２０Å２、または少なくとも約３３０Å２のＳＡＳＡをもつ側鎖側を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡ１およびＡＡ２  の側鎖は、少なくとも約３５０Å２、少なくとも約３６０Å２、少なくとも約３７０Å２、少なくとも約３８０Å２、少なくとも約３９０Å２、少なくとも約４００Å２、少なくとも約４１０Å２、少なくとも約４２０Å２、少なくとも約４３０Å２、少なくとも約４４０Å２、少なくとも約４５０Å２、少なくとも約４６０Å２、少なくとも約４７０Å２、少なくとも約４８０Å２、少なくとも約４９０Å２、約５００Å２を超える、少なくとも約５１０Å２、少なくとも約５２０Å２、少なくとも約５３０Å２、少なくとも約５４０Å２、少なくとも約５５０Å２、少なくとも約５６０Å２、少なくとも約５７０Å２、少なくとも約５８０Å２、少なくとも約５９０Å２、少なくとも約６００Å２、少なくとも約６１０Å２、少なくとも約６２０Å２、少なくとも約６３０Å２、少なくとも約６４０Å２、約６５０Å２より大きい、少なくとも約６６０Å２、少なくとも約６７０Å２、少なくとも約６８０Å２、少なくとも約６９０Å２、または少なくとも約７００Å２、の組み合わせたＳＡＳＡをもつ。いくつかの実施形態では、ＡＡＨ２は、ＡＡＨ１の疎水性側鎖のＳＡＳＡ以下であるＳＡＳＡをもつ側鎖を有する疎水性アミノ酸である。限定ではなく例として、Ｎａｌ−Ａｒｇモチーフを有するｃＣＰＰは、Ｐｈｅ−Ａｒｇモチーフを有する他の点では同一のＣＰＰと比較して、改善された細胞基質送達効率を示す；Ｐｈｅ−Ｎａｌ−Ａｒｇモチーフを有するｃＣＰＰは、Ｎａｌ−Ｐｈｅ−Ａｒｇモチーフを有する他の点では同一のｃＣＰＰと比較して、改善された細胞基質送達効率を示す；そして、ｐｈｅ−Ｎａｌ−Ａｒｇモチーフは、ｎａｌ−Ｐｈｅ−Ａｒｇモチーフを有する他の点では同一のｃＣＰＰと比較して、改善された細胞基質送達効率を示す。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「疎水性表面積」または「ＳＡＳＡ」は、溶媒に到達可能なアミノ酸側鎖の表面積（平方オングストロームとして報告される；Å２）を意味する。特定の実施形態では、ＳＡＳＡは、Ｓｈｒａｋｅ＆Ｒｕｐｌｅｙ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．７９（２）：３５１−７１）によって開発された「ローリングボール」アルゴリズムを使用して計算され、これは、すべての目的でこの全体が参照により本明細書に組み込まれる。このアルゴリズムは、特定半径の溶媒の「領域」を使用して、分子の表面を精査する。領域の一般的な値は、１．４Åで、これは水分子の半径に近似する。
【０１０８】
特定の側鎖についてＳＡＳＡ値を以下の表３に示す。特定の実施形態では、本明細書に記載されたＳＡＳＡ値は、Ｔｉｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ８（１１）：ｅ８０６３５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８０６３５によって報告された、以下の表３に列挙した理論値を基準とし、これはすべての目的でその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【表３】
2021501201.tif 000017
【０１０９】
いくつかの実施例では、ｃＣＰＰは、ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−Ｒ−ｒ、ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−ｒ−Ｒ、Ｒ−ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２、またはｒ−Ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２のＮ末端および／またはＣ末端上の疎水性アミノ酸を含まない。代替の実施形態では、ｃＣＰＰは、ＡＡＨ１またはＡＡＨ２の少なくとも１つよりも大きい（本明細書に記載されるような）側鎖をもつ疎水性アミノ酸を含まない。さらに他の実施例では、ｃＣＰＰは、ＡＡＨ１よりも大きい表面積を有する疎水性アミノ酸を含まない。例えば、ＡＡＨ１またはＡＡＨ２の少なくとも１つがフェニルアラニンである実施形態では、（ｃＣＰＰは、ＡＡＨ１またはＡＡＨ２よりも小さい、少なくとも１つの疎水性アミノ酸、例えばロイシンを含むが）ｃＣＰＰは、ナフチルアラニンをさらに含まない。さらに他の実施形態では、ｃＣＰＰは、ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−Ｒ−ｒ、ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−ｒ−Ｒ、Ｒ−ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２、またはｒ−Ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２の疎水性アミノ酸に加えて、ナフチルアラニンを含まない。
【０１１０】
ｃアミノ酸（すなわち、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸）のキラリティーを選択して、ｃＣＰＰ（および以下に説明する付属のカーゴ）の細胞基質送達効率を改善することができる。いくつかの実施形態では、アルギニン（例えば、ＡＡＨ１）のＮまたはＣ末端の疎水性アミノ酸は、隣接するアルギニンと同一または反対のキラリティーを有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＨ１は、隣接するアルギニンとは反対のキラリティーを有する。例えば、アルギニンがＤ−ａｒｇ（すなわち、「ｒ」）である場合、ＡＡＨ１はＤ−ＡＡＨ１であり、またアルギニンがＬ−Ａｒｇ（すなわち、「Ｒ」）である場合、ＡＡＨ１はＬ−ＡＡＨ１である。よって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるｃＣＰＰは、以下のモチーフの少なくとも１つを含んでもよい：Ｄ−ＡＡＨ１−Ｄ−ａｒｇ、Ｄ−ａｒｇ−Ｄ−ＡＡＨ１、Ｌ−ＡＡＨ１−Ｌ−Ａｒｇ、またはＬ−Ａｒｇ−ＬＡＡＨ１。特定の実施形態では、アルギニンがＤ−ａｒｇである場合、ＡＡＨはＤ−ｎａｌ、Ｄ−ｔｒｐ、またはＤ−ｐｈｅであり得る。別の非限定例では、アルギニンがＬ−Ａｒｇである場合、ＡＡＨはＬ−Ｎａｌ、Ｌ−Ｔｒｐ、またはＬ−Ｐｈｅであり得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃＣＰＰは、３つのアルギニンを含む。よって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃＣＰＰは、以下の配列の１つを含む：ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−Ｒ−ｒ−Ｒ、ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−Ｒ−ｒ−ｒ、ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−ｒ−Ｒ−Ｒ、ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−ｒ−Ｒ−ｒ、Ｒ−Ｒ−ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２、ｒ−Ｒ−ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２、ｒ−ｒ−Ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２、または、Ｒ−ｒ−Ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２。特定の実施形態では、ｃＣＰＰＳは、以下の配列ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−Ｒ−ｒ−Ｒ、ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−ｒ−Ｒ−ｒ、ｒ−Ｒ−ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２、またはＲ−ｒ−Ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２の１つを有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＨ１およびＡＡＨ２は、例えば、上記のように、細胞基質の取り込み効率を改善するために選択されることができる。ここで、ＡＡＨ１は隣接するアルギニンと同一のキラリティーを有し、ＡＡＨ１およびＡＡＨ２は、その反対のキラリティーを有する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃＣＰＰは、３つの疎水性アミノ酸を含む。よって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃＣＰＰは、以下の配列の１つを含む：ＡＡＨ３−ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−Ｒ−ｒ、ＡＡＨ３−ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−Ｒ−ｒ、ＡＡＨ３−ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−ｒ−Ｒ、ＡＡＨ３−ＡＡＨ２−ＡＡＨ１−ｒ−Ｒ、Ｒ−ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２−ＡＡＨ３、Ｒ−ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２−ＡＡＨ３、ｒ−Ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２−ＡＡＨ３、またはｒ−Ｒ−ＡＡＨ１−ＡＡＨ２−ＡＡＨ３は、ここでＡＡＨ３は、上記の任意の疎水性アミノ酸、例えば、ピペリジン−２−カルボン酸、ナフチルアラニン、トリプトファン、またはフェニルアラニンである。いくつかの実施形態では、ＡＡＨ１、ＡＡＨ２、およびＡＡＨ３  のキラリティー、例えば、上記のように、細胞基質の取り込み効率を改善するために選択され得る。ここで、ＡＡＨ１は隣接するアルギニンと同一のキラリティーを有し、ＡＡＨ１およびＡＡＨ２は、その反対のキラリティーを有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＨ１、ＡＡＨ２、およびＡＡＨ３の大きさは、例えば、上記のように、細胞基質の取り込み効率を改善するために選択され得る。ここで、ＡＡＨ３は、ＡＡＨ１およびＡＡＨ２以下のＳＡＳを有する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＡＡＨ１およびＡＡＨ２は、同一または反対のキラリティーを有する。特定の実施形態では、ＡＡＨ１およびＡＡＨ２は、反対のキラリティーを有する。よって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃＣＰＰは、以下の配列のうちの少なくとも１つを含む：Ｄ−ＡＡＨ２−Ｌ−ＡＡＨ１−Ｒ−ｒ；Ｌ−ＡＡＨ２−Ｄ−ＡＡＨ１−ｒ−Ｒ；Ｒ−ｒ−Ｄ−ＡＡＨ１−Ｌ−ＡＡＨ２；またはｒ−Ｒ−Ｌ−ＡＡＨ１−Ｄ−ＡＡＨ１、ここで、Ｄ−ＡＡＨ１およびＤ−ＡＡＨ２のそれぞれは、Ｄ配置を有する疎水性アミノ酸であり、Ｌ−ＡＡＨ１およびＬ−ＡＡＨ２のそれぞれは、Ｌ配置を有する疎水性アミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｄ−ＡＡＨ１およびＤ−ＡＡＨ２のそれぞれは、Ｄ−ｐｉｐ、Ｄ−ｎａｌ、Ｄ−ｔｒｐ、およびＤ−ｐｈｅからなる群から、独立して選択される。特定の実施形態では、Ｄ−ＡＡＨ１またはＤ−ＡＡＨ２は、Ｄ−ｎａｌである。他の特定の実施形態では、Ｄ−ＡＡＨ１はＤ−ｎａｌである。いくつかの実施形態では、Ｌ−ＡＡＨ１およびＬ−ＡＡＨ２のそれぞれは、Ｌ−ｐｉｐ、Ｌ−Ｎａｌ、Ｌ−Ｔｒｐ、およびＬ−Ｐｈｅからなる群から、独立して選択される。特定の実施形態では、Ｌ−ＡＡＨ１またはＬ−ＡＡＨ２はそれぞれ、Ｌ−Ｎａｌである。
【０１１４】
上述のように、本開示は、環状ペプチド配列への様々な修飾を提供し、これは細胞基質送達効率を改善してもよい。いくつかの実施形態では、改善された細胞基質の取り込み効率は、適切なコントロール配列に修飾された配列をもつＣＰＰの細胞基質送達を比較することによって、測定することができる。いくつかの実施形態では、コントロール配列は、特定の修飾（例えば、ＲおよびＡＡＨ１の一致するキラリティー）を含まないが、他の点では修飾配列と同一である。他の実施形態では、コントロールは以下の配列を有する：環状（ＦФＲＲＲＲＱ）。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、細胞基質送達効率は、細胞膜を通過して細胞基質に入るｃＣＰＰの能力を意味する。実施形態では、ｃＣＰＰの細胞基質送達効率は、受容体または細胞型に依存しない。細胞基質送達効率は、絶対的細胞基質送達効率または相対的細胞基質送達効率を意味し得る。
【０１１６】
絶対細胞基質送達効率は、増殖培地中のｃＣＰＰ（またはポリペプチド接合体）の濃度に対する、ｃＣＰＰ（またはポリペプチド接合体）の細胞基質濃度の比率である。相対的細胞基質送達効率は、細胞基質中のコントロールｃＣＰＰの濃度と比較した、細胞基質中のｃＣＰＰの濃度を意味する。定量化は、ｃＣＰＰを（例えば、ＦＩＴＣ色素で）蛍光標識し、当技術分野で周知の技術を使用して、蛍光強度を測定することによって達成することができる。
【０１１７】
特定の実施形態では、相対的細胞基質送達効率は、（ｉ）細胞型（例えば、ＨｅＬａ細胞）により内部移行された本発明のｃＣＰＰの量と、（ｉｉ）同じ細胞型により内部移行されたコントロールｃＣＰＰの量を比較することにより決定される。相対的細胞基質送達効率を測定するために、細胞型は、本発明の細胞透過性ペプチドの存在下で、特定の期間（例えば、３０分、１時間、２時間など）インキュベートされ、この後、細胞によって内部移行されたｃＣＰＰの量を、当技術分野で周知の方法、例えば、蛍光顕微鏡法を使用して、定量化される。これとは別に、同じ濃度のコントロールｃＣＰＰを、細胞型の存在下で、同じ時間インキュベートし、そして細胞によって内部移行されたコントロールｃＣＰＰの量を定量化する。
【０１１８】
他の実施形態では、相対的細胞基質内送達効率は、細胞内標的の修飾された配列を有するｃＣＰＰのＩＣ５０を測定し、修飾された配列を有するｃＣＰＰのＩＣ５０を、適切なコントロール配列と比較することにより、決定することができる（本明細書に記載されるように）。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、例えば、環状（ＦФＲＲＲＲＱ）または線状細胞透過性ペプチド配列（例えば、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ポリアルギニン配列など）と比較して、本明細書に記載されるｃＣＰＰの相対的細胞基質送達効率は、約１％〜約１０００％の範囲であり、例えば、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、約３００％、約３１０％、約３２０％、約３３０％、約３４０％、約３５０％、約３６０％、約３７０％、約３８０％、約３９０％、約４００％、約４１０％、約４２０％、約４３０％、約４４０％、約４５０％、約４６０％、約４７０％、約４８０％、約４９０％、約５００％、約５１０％、約５２０％、約５３０％、約５４０％、約５５０％、約５６０％、約５７０％、約５８０％、または約５９０％、約６００％、約６１０％、約６２０％、約６３０％、約６４０％、約６５０％、約６６０％、約６７０％、約６８０％、約６９０％、約７００％、約７１０％、約７２０％、約７３０％、約７４０％、約７５０％、約７６０％、約７７０％、約７８０％、または約７９０％、約８００％、約８１０％、約８２０％、約８３０％、約８４０％、約８５０％、約８６０％、約８７０％、約８８０％、約８９０％、約９００％、約９１０％、約９２０％、約９３０％、約９４０％、約９５０％、約９６０％、約９７０％、約９８０％、または約１０００％、これらの間のすべての値および部分の範囲を含む。
【０１２０】
他の態様において、約４０％〜約１００％の絶対細胞基質送達効率、例えば、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、これらの間のすべての値および部分の範囲を含む。
【０１２１】
適切な環状細胞透過性ペプチドの非限定例を、表４において提供する。
【表４】
2021501201.tif 000018
【表５】
2021501201.tif 000019
【表６】
2021501201.tif 000020
【表７】
2021501201.tif 000021
Φ、Ｌ−２−ナフチルアラニン；Ｐｉｍ、ピメリン酸；Ｎｌｙｓ、リジンペプトイド残基；Ｄ−ｐＴｈｒ、Ｄ−ホスホスレオニン；Ｐｉｐ、Ｌ−ピペリジン−２−カルボン酸；Ｃｈａ、Ｌ−３−シクロヘキシルアラニン；Ｔｍ、トリメシン酸；Ｄａｐ、Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｓａｒ、サルコシン；Ｆ２Ｐｍｐ、Ｌ−ジフルオロホスホノメチルフェニルアラニン；Ｄｏｄ、ドデカノイル；Ｐｒａ、Ｌ−プロパルギルグリシン；ＡｚＫ、Ｌ−６−アジド−２−アミノ−ヘキサン酸；Ａｇｐ、Ｌ−２−アミノ−３−グアニジニルプロピオン酸；ｂＰｉｍとＮｌｙｓの間の環化；ｃＬｙｓとＧｌｕ間の環化；ｄアジリジンアルデヒドおよびイソシアニドとの多成分反応による大環状化；ｅＧｌｎ残基の主鎖間の環化；ｆＴｍで二環化した２つのＤａｐ残基のＮ末端アミンおよび側鎖；ｇトリス（ブロモメチル）ベンゼンで二環化された３つのＣｙｓ側鎖；ｈＰｒａとＡｚｋの間のクリック反応による環化。
【０１２２】
加えて、本明細書に記載されるポリペプチド接合体および方法で使用されるｃＣＰＰは、以下に開示されている任意の配列を含み得る：米国特許出願第１５／３１２，８７８号明細書（米国特許出願公開第２０１７／０１９０７４３  Ａ１号明細書）；米国特許出願第１５／３６０，７１９号明細書（（米国特許出願公開第２０１７／０３５５７３０号明細書）；国際出願／ＵＳ２０１７／０６０８８１号明細書（および結果として生じる米国公開）；および国際出願／ＵＳ２０１７／０６２９５１号明細書（および結果として生じる米国公開）。これらのそれぞれは、すべての目的でこの全体が参照により組み込まれる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ｃＣＰＰは、線状細胞透過性ペプチド配列（例えば、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ポリアルギニンなど）と比較して、細胞基質送達効率を約１．１倍〜約３０倍改善する。例えば、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約１０、約１０．５、約１１．０、約１１．５、約１２．０、約１２．５、約１３．０、約１３．５、約１４．０、約１４．５、約１５．０、約１５．５、約１６．０、約１６．５、約１７．０、約１７．５、約１８．０、約１８．５、約１９．０、約１９．５、約２０、約２０．５、約２１．０、約２１．５、約２２．０、約２２．５、約２３．０、約２３．５、約２４．０、約２４．５、約２５．０、約２５．５、約２６．０、約２６．５、約２７．０、約２７．５、約２８．０、約２８．５、約２９．０、または約２９．５倍、これらの間のすべての値および部分の範囲を含む。
【０１２４】
リンカー
上記のように、ｃＣＰＰは、ステープルペプチドに直接接合でき（例えば、ｃＣＰＰ上のアミノ酸の側鎖およびステープルペプチド上の適切な基の間の共有結合によって）、またはリンカーを使用してステープルペプチドへｃＣＰＰを接合してもよい。本明細書で使用される場合、「リンカー」は、本明細書で開示されるポリペプチド接合体の２つ以上の成分（例えば、ｃＣＰＰ、およびステープルまたはペプチドを介したステープルペプチド）の間に共有結合を形成する部分を意味する。
【０１２５】
様々な実施形態では、リンカーは、ｃＣＰＰ上のアミノ酸、およびペプチドまたはステープル上のアミノ酸のいずれかに共有結合する。リンカーは、ｃＣＰＰ部分、ペプチド、およびステープルの２つ以上を接合する任意の部分であってよい。いくつかの実施形態では、リンカーはアミノ酸であり得る。他の実施形態では、リンカーの前駆体は、ｃＣＰＰ、ペプチド、ステープル、およびそれらの組み合わせにおけるアミノ酸と２つ以上の結合を形成することができる、任意の適切な分子であり得る。したがって、様々な実施形態では、リンカーの前駆体は、２つ以上の官能基を有し、このそれぞれは、ｃＣＰＰ部分、ペプチド、およびステープルの少なくとも２つに共有結合を形成することができる。例えば、リンカーは、ｃＣＰＰ部分、ペプチド、またはステープル中の任意のアミノ酸のＮ末端、Ｃ末端、または側鎖、またはそれらの組み合わせに共有結合することができる。特定の実施形態では、リンカーは、ｃＣＰＰとペプチドとの間に共有結合を形成する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのアミノ酸、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、エーテルからなる群から選択され、これらはそれぞれ、上記定義のように、任意に置換され得る。リンカーの非限定例には、任意にリジン残基に接合されたポリエチレングリコールが含まれる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、リンカーは、ステープルペプチド上のアミノ酸のＮ末端もしくはＣ末端と、またはｃＣＰＰ、ペプチド、またはステープル上のグルタミン、アスパラギン、もしくはリジンの側鎖、またはグルタミンもしくはアスパラギンの修飾側鎖（例えば、アミノ基を持つ還元側鎖）と、共有結合する。特定の実施形態では、リンカーは、ｃＣＰＰ上のグルタミンの側鎖との結合を形成する。他の特定の実施形態では、本明細書に記載されるリンカーは、Ｌ−１またはＬ−２の構造：
【化１３】
2021501201.tif 000022
式中、
ＡＡｓは、ペプチドまたはステープル上のアミノ酸の側鎖または末端であり；
ＡＡｃは、ｃＣＰＰのアミノ酸の側鎖または末端であり；
ｐは、０〜１０の整数であり；
ｑは、１〜５０までの整数である、
を有する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリペプチド接合体が細胞の細胞基質に入った後、ステープルペプチドをｃＣＰＰから放出することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、基を含む、またはｃＣＰＰ、ペプチド、ステープル、またはそれらの組み合わせに結合した後に基を形成する。すなわち、ポリペプチド接合体の細胞基質への取り込み後に切断され、それによりペプチドを放出する。生理学的に切断可能な連結基の非限定例としては、カーボネート、チオカーボネート、トリエステル、ジスルフィド、スルホキシド、ヒドラジン、プロテアーゼで切断可能なジペプチドリンカーなどが挙げられる。
【０１２９】
例えば、実施形態では、リンカーは、例えば、ジスルフィド結合を介して、例えば、ステープルペプチドまたはｃＣＰＰに配置されたシステインまたはシステイン類似体の側鎖とともに、ステープルペプチドに共有結合される。いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合は、リンカーの前駆体上のチオール基、およびペプチド上のチオール基を有するシステインまたはアミノ酸類似体の側鎖との間に形成され、各チオール基上の水素への結合は、硫黄原子への結合により置換される。本明細書に開示されるポリペプチド接合体と共に使用され得るチオール基を有するアミノ酸類似体の非限定例は、上述している。
【０１３０】
治療法
上述のように、本明細書に記載されるポリペプチド接合体は、それを必要とする患者の疾患、障害、または状態を、治療または予防するために使用することができる。いくつかの実施形態では、治療とは、患者の疾患、障害、または状態の、部分的または完全な緩和、改善、軽減、抑制、発症の遅延、重症度および／または発生率の低下を意味する。
【０１３１】
本明細書で使用される「改善する」、「増加する」、「低減する」、「減少する」などの用語は、コントロールと比べた値を示す。いくつかの実施形態では、好適なコントロールは、基準の測定、例えば、本明細書に記載される治療の開始前の、同じ個体における測定、または本明細書に記載される治療がない状態で、コントロール個体（または複数のコントロール個体）における測定、である。
【０１３２】
治療される個体（「患者」とも呼ばれる）は、疾患、障害、もしくは状態を有する、または疾患、障害、もしくは状態を発症する可能性を有する、個体（胎児、幼児、子供、若者、または成人）である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、個体は、疾患、障害または状態があると最近診断された個体である。典型的には、疾患、障害または状態の影響を最小限に抑え、治療の利点を最大化するには、早期治療（診断後できるだけ早い治療の開始）が、重要である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド接合体を使用して、癌があると診断された個体を治療することができる。本発明のポリペプチド接合体は、例えば、以下の癌を治療するために使用してもよい：脳腫瘍、例えば、聴神経鞘腫、星状細胞腫、例えば、原線維性、原形質性、大円形細胞性（ｇｅｍｉｓｔｏｃｙｔａｒｙ）、未分化、毛様細胞性星状細胞腫、神経膠芽腫、膠肉腫、多形黄色星状細胞腫、上衣下大細胞巨細胞星状細胞腫および線維形成性乳児星状細胞腫；脳リンパ腫、脳腫瘍転移、下垂体性腫瘍、例えばプロラクチノーマ、下垂体性偶発腫瘍、ＨＧＨ（ヒト成長ホルモン）産生腺腫、および副腎皮質刺激ホルモン産生腺腫（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈｉｃ  ａｄｅｎｏｍａ）、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫（ｍｅｎｉｎｇｅｏｍａ）および乏突起神経膠腫；神経腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、神経節細胞腫、傍神経節腫（褐色細胞腫、クロム親和性細胞腫）および頸動脈小体腫瘍などの自律神経系腫瘍など、切断神経腫、神経線維腫、神経鞘腫（ｎｅｕｒｉｎｏｍａ）（神経鞘腫（ｎｅｕｒｉｌｅｍｍｏｍａ）、シュワン腫）、悪性シュワン腫などの末梢神経系腫瘍、ならびに、中枢神経系の腫瘍、例えば、脳腫瘍や骨髄腫瘍；腸癌、例えば、直腸、結腸、肛門、十二指腸などの癌腫；眼瞼腫瘍（眼瞼器官の基底細胞腫または腺癌）；網膜芽腫；膵臓の癌腫；膀胱の癌腫；肺腫瘍（気管支癌腫−小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：ＮＳＣＬＣ）、例えば、紡錘細胞板上皮性癌腫、腺癌（腺房、乳頭、細気管支肺胞）および大細胞気管癌腫（巨細胞癌腫、明細胞癌腫））；乳管癌、例えば、乳管癌腫、小葉癌腫、粘液癌腫、管状癌腫、パジェット癌腫；非ホジキンリンパ腫（Ｂリンパ性またはＴリンパ性ＮＨＬ）、例えば、毛様細胞性白血病、バーキットリンパ腫、菌状息肉腫（ｍｕｃｏｓｉｓ  ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ）など；ホジキン病；子宮癌（体癌腫または子宮内膜癌腫）；ＣＵＰ（Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  Ｕｎｋｎｏｗｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ）症候群（原発不明癌）；卵巣癌（卵巣癌腫−粘液性または漿液性嚢腫、子宮内膜腫瘍、明細胞腫瘍、ブレナー腫瘍）；胆のう癌；胆管癌、例えば、クラッツキン腫瘍；精巣癌（胚性または非胚性の胚細胞腫瘍）；喉頭癌、例えば、声帯の声門上、声門、声門下腫瘍；骨癌、例えば、骨軟骨腫、軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液性線維腫、軟骨肉腫、骨腫、類骨骨腫、骨芽細胞腫、骨肉腫、非骨化骨線維腫、骨線維腫、線維形成性骨線維腫、骨線維肉腫、悪性線維性組織球腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｈｉｓｔｉｏｃｙｏｍａ）、破骨細胞腫または巨細胞腫瘍、ユーイング肉腫、および形質細胞腫、頭頸部腫瘍（ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｔｕｍｏｒｓ：ＨＮＯ腫瘍）、例えば、唇の腫瘍、および口腔（唇、舌、口腔の癌腫）、鼻咽頭癌腫（鼻の腫瘍、リンパ上皮腫）、咽頭癌腫、中咽頭癌腫、扁桃腺癌腫（扁桃腺癌（ｍａｌｉｇｎｏｍａ））および舌（基部の）癌腫、下咽頭癌腫、喉頭癌腫（喉頭の癌）、副鼻腔および鼻腔の腫瘍、唾液腺および耳の腫瘍；肝細胞癌腫（肝細胞性癌腫（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＣＣ）；白血病、例えば急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ／ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＭＬ）などの急性白血病；慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）；胃癌（乳頭状、管状または粘液性の腺癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮癌または未分化癌腫）；悪性黒色腫、例えば、表在性拡散（ＳＳＭ）、結節性（ＮＭＭ）、黒子性悪性腫瘍（ＬＭＭ）、末端黒斑性（ＡＬＭ）、無色素性悪性黒色腫（ＡＭＭ）など；腎癌、例えば、腎細胞癌腫（副腎腫またはグラウィッツ腫瘍）など；食道癌；陰茎癌；前立腺癌；膣癌、または膣癌腫；甲状腺癌腫、例えば、乳頭癌、濾胞癌、骨髄癌、または組織非形成性甲状腺など；胸腺癌腫（胸腺腫）；尿道癌（尿道癌腫、尿路上皮癌腫）と外陰部癌。
【０１３５】
その他の実施形態では、ポリペプチド接合体を使用して、炎症性疾患または障害を治療してもよい。炎症性疾患または障害は、呼吸器疾患、例えば、喘息や慢性閉塞性肺疾患、慢性変性疾患、慢性関節リウマチ、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、骨粗しょう症、皮膚科学的な状態、例えば、乾癬、強皮症、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、天疱瘡、にきび、皮膚の老化またはしわ、慢性脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症、炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病；歯科疾患、例えば歯周病や歯肉炎；爪乾癬などの炎症性爪疾患；扁平苔癬、円形脱毛症、全身性エリテマトーデス、糖尿病性腎症、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症または糸球体腎炎、移植片対宿主病または眼の状態、であってよい。
【０１３６】
その他の実施形態では、ポリペプチド接合体を使用して、自己免疫性の疾患または状態を治療する。自己免疫疾患または状態は、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、悪性貧血、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、炎症性腸疾患、セリアック病、橋本病などの自己免疫甲状腺疾患、自己免疫性肝疾患、アジソン病、移植拒絶反応、移植片対宿主病、宿主対移植片病、強直性脊椎炎、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、化膿性汗腺炎、川崎病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、混合性結合組織病、モルフェア、ナルコレプシー、神経筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎性滑膜炎、再発多発性軟骨炎、サルコイドーシス、統合失調症、全身硬直症候群、側頭動脈炎、潰瘍性大腸炎、血管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症、およびそれらの組み合わせ、であってもよい。
【０１３７】
本明細書で提供されるポリペプチド接合体は、例えば、天然のタンパク質−タンパク質、タンパク質−リガンド、および／またはタンパク質−受容体相互作用を妨害することにより、上記の疾患、障害、または状態を治療することができる。例えば、生物学的に重要な多くのタンパク質／タンパク質相互作用、例えば、ｐ５３／ＭＤＭ２およびＢｃｌ−Ｘｌ／Ｂａｋは、ヘリックスを受容するパートナーの裂け目に、ヘリックスを供与する１つのタンパク質によって媒介される。ｐ５３およびＭＤＭ２の相互作用、ならびにｐ５３遺伝子の変異は、報告されているすべての癌症例の実質上半分で確認されている（Ｓｈａｉｒ  Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．１９９７，４．７９１を参照。この全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ストレスが細胞にかかると、ｐ５３は、細胞周期の停止およびＤＮＡの修復、またはプログラムされた細胞死のいずれかにつながる応答を調整すると考えられている。ｐ５３タンパク質の機能を直接変更する、ｐ５３遺伝子における変異と同様に、ｐ５３はＭＤＭ２の変化によって変えられ得る。ＭＤＭ２タンパク質は、ｐ５３に結合し、ｐ５３の転写促進ドメインと連携することにより、転写活性化を妨害することが示される。例えば、ｐ５３の転写促進ドメインに由来する１１アミノ酸ペプチドは、ＭＤＭ２の凹部に挿入される２．５回転の両親媒性α−ヘリックスを形成する。
【０１３８】
治療法の組合せ
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチド接合体は、他の治療法と組み合わせて投与され得る。ポリペプチド接合体は、同じ治療用投薬計画の一部として、同時に、連続して、または異なる時点で、投与され得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチド接合体は、１つまたは複数の化学療法剤と組み合わせて投与される。本発明による化合物と組み合わせて投与されてもよい化学療法剤には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ホルモン、ホルモン類似体および抗ホルモン（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、フイベストラント、酢酸メゲストロール、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、アミノグルテチミド、酢酸シプロテロン、フィナステリド、酢酸ブセレリン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、メドロキシプロゲステロン、オクトレオチド）、アロマターゼ阻害剤（例：アナストロゾール、レトロゾール、リアロゾール（ｌｉａｒｏｚｏｌｅ）、ボロゾール、エキセメスタン、アタメスタン（ａｔａｍｅｓｔａｎｅ））、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、酢酸ゴセレリン、リュープロリド（ｌｕｐｒｏｌｉｄｅ））、成長因子の阻害剤（例えば、「血小板由来成長因子」や「肝細胞成長因子」などの成長因子、阻害剤は、例えば「成長因子」抗体、「成長因子受容体」抗体、およびチロシンキナーゼ阻害剤、例えばゲフィチニブ、ラパチニブおよびトラスツズマブ）；シグナル伝達阻害剤（例えば、イマチニブおよびソラフェニブ）；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド（ｐｒｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、およびラルチトレキセドなどの葉酸拮抗薬、５−フルオロウラシル、カペシタビンおよびゲムシタビン、メルカプトプリンなどのピリミジン類似体、チオグアニン、クラドリビンおよびペントスタチン、シタラビン、フルダリンなどのアデノシン類似体）；抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンなどのアントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカニシン、ストレプトゾシン）；白金誘導体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）；アルキル化剤（例えば、エストラムスチン、メクロレタミン（ｍｅｃｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ダカルバジン、シクロホスファミド、イフォスファミド、テモゾロマイド、カルムスチンおよびロムスチン、チオテパなどのニトロソウレア）、抗有糸分裂剤（例えば、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビンおよびビンクリスチンなどのビンカアルカロイド；およびパクリタキセル、ドセタキセルなどのタキサン）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびエトポフォス、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ミトキサントロンなどのエピポドフィロトキシン）、ならびにアミフォスチン、アナグレリド、クロドロネート、フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｎ）、インターフェロンアルファ、ロイコボリン、リツキシマブ、プロカルバジン、レバミゾール、メスナ、ミトタン、パミドロネートおよびポルフィマーなどの様々な化学療法剤。
【０１４０】
作製方法
本明細書に記載されるポリペプチド接合体は、当業者に理解されるように、有機合成における当業者に周知の様々な方法、またはそのバリエーションにおいて、調製され得る。本明細書に記載される化合物は、容易に入手可能な出発物質から調製され得る。最適な反応条件は、使用される特定の反応物または溶媒によって異なり得るが、このような条件は、当業者によって決定され得る。
【０１４１】
本明細書に記載される化合物のバリエーションには、各化合物について記載されているような様々な構成要素の追加、減算、または移動が含まれる。同様に、分子内に１つ以上のキラル中心が存在する場合、分子のキラリティーは変更され得る。加えて、化合物の合成には、様々な化学基の保護と脱保護が含まれ得る。保護および脱保護の使用、および適切な保護基の選択は、当業者により決定され得る。保護基の化学は、例えば、Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００６に見出すことができ、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれている。
【０１４２】
開示された化合物および組成物を調製する際に使用される出発物質および試薬は、例えば以下の商業的供給業者から入手可能である：Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（ニュージャージー州モリスプレーンズ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ペンシルベニア州ピッツバーグ）、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）、Ｐｆｉｚｅｒ（ニューヨーク州ニューヨーク）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（ノースカロライナ州ローリー）、Ｍｅｒｃｋ（ニュージャージー州ホワイトハウスステーション）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ（ニュージャージー州ニューブランズウィック）、Ａｖｅｎｔｉｓ（ニュージャージー州ブリッジウォーター）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（デラウェア州ウィルミントン）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（スイス、バーゼル）、Ｗｙｅｔｈ（マディソン、ニュージャージー州）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ（ニューヨーク州ニューヨーク）、Ｒｏｃｈｅ（スイス、バーゼル）、Ｌｉｌｌｙ（インディアナ州インディアナポリス）、Ａｂｂｏｔｔ（アボット・パーク、イリノイ州）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ（ケニルワース、ニュージャージー州）、もしくはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（ドイツ、インゲルハイム）、または以下の参考文献に記載されている手順に従って、当業者に周知の方法によって調製される：Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｒｏｄｄ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４０（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；およびＬａｒｏｃｋ’ｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，１９８９）。他の材料、例えば、本明細書に開示される医薬担体は、商業的供給源から入手することができる。
【０１４３】
本明細書に記載される化合物を生成するための反応は、有機合成の当業者によって選択され得る溶媒中で行われ得る。溶媒は、反応が行われる条件（すなわち温度および圧力）下、出発物質（反応物）、中間体、または生成物と実質的に非反応性であり得る。反応は、１の溶媒または２以上の溶媒の混合物中で行われ得る。生成物または中間体の形成は、当技術分野で周知の任意の好適な方法によって、制御され得る。例えば、生成物の形成は、分光法、例えば、核磁気共鳴分光法（例えば、１Ｈまたは１３Ｃ）、赤外分光法、分光光度法（例えば、ＵＶ−可視）、もしくは質量分析法、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーによって、制御され得る。
【０１４４】
この開示された化合物は、アミノ酸のα−Ｎ末端が、酸または塩基の保護基によって保護されている、固相ペプチド合成によって調製され得る。このような保護基は、ペプチド連結形成の条件に対して安定であると同時に、成長中のペプチド鎖の破壊またはそこに含まれるキラル中心のラセミ化なしで、容易に除去できる、特性を有するべきである。好適な保護基は、９−フルオレンイルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニルなどである。９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基は、開示された化合物の合成において、特に好ましい。他の好ましい側鎖保護基は、リジンおよびアルギニンのような側鎖アミノ基の場合、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、４−メトキシベンゼンスルホニル、Ｃｂｚ、Ｂｏｃ、およびアダマンチルオキシカルボニル；チロシンの場合、ベンジル、ｏ−ブロモベンジルオキシ−カルボニル、２，６−ジクロロベンジル、イソプロピル、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、シクロヘキシル、シクロペニルおよびアセチル（Ａｃ）；セリンの場合、ｔ−ブチル、ベンジル、およびテトラヒドロピラニル：ヒスチジンの場合、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、ｐ−トルエンスルホニル、および２，４−ジニトロフェニル；トリプトファンの場合、ホルミル；アスパラギン酸とグルタミン酸の場合、ベンジルおよびｔ−ブチル、ならびにシステインの場合、トリフェニルメチル（トリチル）である。固相ペプチド合成法では、α−Ｃ末端アミノ酸は、好適な固体支持体または樹脂に付着される。上記合成に有用な好適な固体支持体は、段階的な縮合−脱保護反応の試薬および反応条件に対して不活性であり、ならびに使用される媒体に不溶性である物質である。Ｃ末端カルボキシペプチドの合成のための固体支持体は、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル−ｃｏｐｏｌｙ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）または４−（２´，４´−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシアセトアミドエチル（ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔａｍｉｄｏｅｔｈｙｌ）樹脂で、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｉｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）から入手できる。α−Ｃ末端アミノ酸は、Ｎ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）またはＯ−ベンゾトリアゾール−１−ｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）によって樹脂に連結され、この場合、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、またはビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィンクロライド（ＢＯＰＣＩ）の有無にかかわらず、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの溶媒中、１０℃〜５０℃の温度で、約１〜約２４時間カップリングするのを媒介する。固体支持体は、４−（２´，４´−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂の場合、Ｆｍｏｃ基は、上記のように、α−Ｃ末端アミノ酸とカップリングする前に、２級アミン、好ましくはピペリジンで切断される。この脱保護された４−（２´，４´−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂にカップリングする１つの方法は、ＤＭＦ中、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−ｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。連続的に保護されたアミノ酸のカップリングは、自動ポリペプチド合成機で行うことができる。一例では、成長するペプチド鎖のアミノ酸中のα−Ｎ末端は、Ｆｍｏｃで保護される。成長するペプチドのα−Ｎ末端側からのＦｍｏｃ保護基の除去は、第二級アミン、好ましくはピペリジンでの処理により達成される。次に、保護されたアミノ酸それぞれを約３倍モル過剰で導入し、カップリングをＤＭＦ中で行うことが好ましい。カップリング剤は、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−ｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）であり得る。固相合成の最後に、連続的または単一の操作のいずれかで、ポリペプチドは樹脂から除去されて、それから脱保護される。ポリペプチドの除去および脱保護は、樹脂に結合したポリペプチドを、チオアニソール、水、エタンジチオールおよびトリフルオロ酢酸を含む切断試薬で処理することにより、単一の操作で達成することができる。ポリペプチドのα−Ｃ末端がアルキルアミドである場合、樹脂は、アルキルを用いたアミノ分解により切断される。あるいは、ペプチドは、エステル交換（例えばメタノールを用いる）、続いてアミノ分解または直接的アミノ基転移によって、除去することができる。この保護されたペプチドは、この時点で精製する、または次のステップに直接使用することができる。側鎖保護基の除去は、上記切断カクテルを使用して達成することができる。この完全に脱保護されたペプチドは、次のタイプのいずれかまたはすべてを使用する、一連のクロマトグラフィー手順により精製できる：弱塩基性樹脂（酢酸塩型）でのイオン交換；非誘導体化ポリスチレン−ジビニルベンゼン（例えば、Ａｍｂｅｒｉｉｔｅ  ＸＡＤ）の疎水性吸着クロマトグラフィー；シリカゲル吸着クロマトグラフィー；カルボキシメチルセルロースのイオン交換クロマトグラフィー；分配クロマトグラフィー、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、ＬＨ−２０、または向流分配；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、特に、オクチルまたはオクタデシルシリル−シリカ結合相カラム充填剤での逆相ＨＰＬＣ。
【０１４５】
投与方法
開示されたポリペプチド接合体、およびそれらを含有する組成物の生体内への適用は、当業者に現在または将来的に周知の任意の好適な方法および技術によって、達成することができる。例えば、この開示される化合物は、生理学的または薬学的に許容可能な形態で処方することができ、そして例えば、経口および非経口投与の経路を含む、当技術分野において周知の任意の好適な経路によって投与され得る。本明細書で使用する場合、非経口という用語には、例えば注射による皮下、皮内、静脈内、筋肉内、腹腔内、および胸骨内投与が含まれる。この開示される化合物または組成物の投与は、単回投与、または、当業者により容易に決定され得るような、連続的または別個の間隔とすることができる。
【０１４６】
本明細書に開示される化合物、およびそれらを含む組成物はまた、リポソーム技術、徐放性カプセル、埋め込み型ポンプ、および生分解性容器を利用して投与することもできる。これらの送達方法は、有利なことに、長期間にわたって均一な投与量を提供することができる。化合物はまた、これらの塩誘導体形または結晶形で投与され得る。
【０１４７】
本明細書に開示される化合物は、薬学的に許容される組成物を調製するための周知の方法によって、処方することができる。処方は、当業者に公知、かつ容易に入手できる多くの情報源に詳細に記載されている。例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）は、開示された方法とともに使用され得る製剤について記載する。一般に、本明細書に開示される化合物は、化合物の効果的な投与を助けるために、化合物の有効量が、好適な担体と組み合わされるように、処方することができる。使用される組成物はまた、様々な形態であり得る。これらには、固体、半固体、および液体剤形、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液または懸濁液、坐剤、注射および注入可能な溶液、ならびにスプレーなど、が含まれる。好ましい形態は、目的の投与方法および治療用途に依存する。組成物はまた、好ましくは従来の薬学的に許容される担体、および当業者に周知の希釈剤を含む。化合物と共に使用するための担体または希釈剤の例として、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、アルミナ、デンプン、生理食塩水、ならびに同等の担体および希釈剤が挙げられる。所望の治療的処置のため、このような用量の投与を提供するために、本明細書に開示される組成物は、担体または希釈剤を含む全組成物の重量に基づいて、１または複数の対象化合物の合計の約０．１重量％〜１００重量％を有利に含み得る。
【０１４８】
投与に好適な製剤としては、例えば、水性無菌注射溶液、これは抗酸化剤、緩衝液、細菌発育阻止剤、および製剤を対象のレシピエントの血液と等張にする溶質を含みうる；ならびに、水性および非水性無菌懸濁液であって、懸濁剤および増粘剤、が挙げられる。製剤は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルで、提供することができ、無菌液体担体の状態、例えば、使用前に、注射用の水のみを必要とする、凍結乾燥（凍結乾燥した）状態で保存することができる。即時の注射液および懸濁液は、無菌の散剤、顆粒、錠剤などから調製することができる。特に上記で言及した成分に加えて、本明細書に開示する組成物は、問題になっている製剤のタイプを考慮して、当技術分野で従来のその他薬剤を含み得ることを理解すべきである。
【０１４９】
本明細書に開示される化合物、およびそれらを含む組成物は、細胞との直接の接触を介して、または担体手段を介して、細胞に送達され得る。化合物および組成物を細胞に送達するための担体手段は、当技術分野で周知であり、例えば、組成物をリポソーム部分に封入することが挙げられる。本明細書に開示される化合物および組成物の細胞への送達における他の手段は、その標的細胞への送達のために標的化されるタンパク質または核酸に、化合物を付着させることを含む。米国特許第６，９６０，６４８号明細書および米国特許出願公開第２００３／００３２５９４号明細書および第２００２／０１２０１００号明細書は、別の組成物に連結することができ、それからその組成物が生体膜を超えて移動することを可能にする、アミノ酸配列を開示する。米国特許出願公開第２００２００３５２４３号明細書はまた、細胞内送達のために、細胞膜を越えて生物学的部分を輸送するための組成物を記載する。化合物はまた、ポリマーに組み込むこともでき、この例としては、頭蓋内腫瘍用のポリ（Ｄ−Ｌ  ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマー、；ポリ［ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン：セバシン酸］、モル比２０：８０（ＧＬＩＡＤＥＬで使用されているとおり）；コンドロイチン；キチン、およびキトサン、が挙げられる。
【０１５０】
本明細書に開示される化合物および組成物は、薬学的に許容されるこれらの塩またはプロドラッグを含み、注入または注射によって静脈内、筋肉内、または腹腔内に投与され得る。この活性剤またはこの塩の溶液は、水中で調製することができ、任意に無毒の界面活性剤と混合することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。通常の保管および使用条件下では、これらの調製物は、防腐薬を含み、微生物の増殖を防ぐことができる。
【０１５１】
注射または注入に好適な薬剤の投薬形態としては、活性成分を含む無菌水溶液または分散液または無菌散剤が挙げられ、これらは、任意にリポソームに封入された、無菌の注射可能なもしくは注入可能な溶液または分散液の、即時の調製に適している。最終的な剤形は、製造および保管の条件下で、無菌で流動性があり、かつ安定していていなければならない。この液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、およびそれらの適切な混合物、を含む溶媒または液体分散媒体であり得る。この適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、または界面活性剤の使用により、維持され得る。必要に応じて、微生物の活動の防止は、様々な他の抗菌剤および抗カビ剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張性剤、例えば、糖、緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの封入によって引き出し得る。
【０１５２】
無菌の注射可能溶液は、本明細書に開示された化合物および／または薬剤を必要量で、上に列挙した様々な他の成分と共に、適切な溶媒に組み込み、続いて、必要に応じてフィルター滅菌することにより、調製される。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌散剤の場合、この好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分の粉末と、前もって無菌フィルターにかけられた溶液中に存在する任意の追加の所望の成分が得られる。
【０１５３】
本明細書に開示されている化合物および薬剤ならびに医薬組成物の有用な投与量は、それらの生体外活性、および動物モデルにおける生体内活性を比較することにより、決定することができる。マウス、および他の動物における有効用量をヒトに外挿する方法は、当技術分野で周知である。
【０１５４】
組成物の投与のための投与量範囲は、症状または障害が影響を受ける所望の効果を生み出すのに、十分大きいものである。用量は、有害な副作用、例えば、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などを引き起こすほど多くすべきではない。一般に、用量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度によって異なり、当業者が決定することができる。用量は、何らかの禁忌が生じた場合、個々の医師によって調整され得る。用量は、変動する可能性があり、１日または数日間、毎日１回または複数回の投与において、投与することができる。
【０１５５】
薬学的に許容される担体と組み合わされた本明細書に開示される化合物を含む医薬組成物もまた、開示される。経口、局所または非経口の投与に適した医薬組成物は、好ましい態様を構成する化合物の量を含む。患者、特にヒトに投与される用量は、致死毒性なしに、そして好ましくは許容できるレベルを超えた副作用または病的状態を引き起こさずに、妥当な時間枠にわたり、患者の治療効果を達成するために十分でなければならない。当業者は、用量が、対象の状態（健康）、対象の体重、併用治療の種類、もしあれば、治療の頻度、治療可能比、および病理学的症状の重症度と段階、含む様々な要因に、依存することを認識するであろう。
【０１５６】
１つまたは複数の容器に本明細書に開示される化合物を含む、キットもまた開示される。開示されたキットは、薬学的に許容される担体、および／または希釈剤を任意に含み得る。１つの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような、１または複数の他の構成成分、添加剤、または補助剤を含む。別の実施形態では、キットは、１つまたは複数の抗癌剤、例えば、本明細書に記載される薬剤を含む。１つの実施形態では、キットは、キットの化合物または組成物を投与する方法を説明する説明書または包装材料を含む。キットの容器は、任意の好適な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属など、および任意の好適なサイズ、形状、または構成であり得る。１つの実施形態では、本明細書に開示される化合物および／または薬剤は、固体、例えば錠剤、丸剤、または粉末形態として、キットで提供される。別の実施形態では、本明細書に開示される化合物および／または薬剤は、液体または溶液としてキットで提供される。１つの実施形態では、キットは、本明細書に開示される化合物および／または薬剤を液体または溶液の形態で含む、アンプルまたはシリンジを含む。
【０１５７】
本発明のいくつかの実施形態が説明した。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行ってもよいことが理解されるであろう。よって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【０１５８】
本明細書では、いくつかの刊行物、特許、および特許出願が引用される。引用された刊行物、特許、および特許出願のそれぞれは、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願のそれぞれが、その全体において参照により組み込まれると、具体的かつ個別に示されたように、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１５９】
実施例１  環状ＣＰＰステープルペプチド接合体の設計戦略および合成
収束合成法を使用して、ｃＣＰＰ−ステープルペプチド接合体を調製することを選択した（図１）。最初に、カーゴペプチドは、２つのホモシステイン残基がｉおよびｉ＋４位置に組み込まれた標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって合成された。この樹脂からの切断および側鎖の脱保護の後、このペプチドを１．５当量の１，３−ジクロロアセトン（ＤＣＡ）で処理して、ペプチドをα−ヘリックス構造にステープル化した。このステープル化手順では、次のｃＣＰＰとの生体直交型接合のために、ステープルペプチドにケトン基も組み込まれる。次に、ｃＣＰＰ［例えば、ＣＰＰ９］が、ＳＰＰＳによって合成され、Ｇｌｎ側鎖にｍｉｎｉＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）リンカーを付着した。樹脂上にある間、このＬｙｓ側鎖のＭｔｔ基は、５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理により、選択的に除去され、それから露出したアミンは、Ｂｏｃ−アミノオキシアセチル（ａｍｉｎｏｘｙａｃｅｔｙｌ）部分でアシル化された。樹脂からの切断およびＴＦＡによる側鎖の脱保護により、求核性ヒドロキシルアミン基（ａｍｉｎｏｘｙ−ＣＰＰ９；図１）で誘導体化されたＣＰＰ９を得た。最後に、ＤＣＡステープルペプチドとアミノオキシ−ＣＰＰ９は、オキシイン結合の形成を通じて水溶液（ｐＨ４．７）で接合した。オキシインの形成により、２つの異なる立体異性体（ＺおよびＥ異性体）が生成されることに注意してください。
【０１６０】
実施例２  ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用に対するセリ周辺のステープルペプチド
概念の証明として、ＭＤＭ２−ｐ５３相互作用に対する細胞透過性のステープルペプチドを合成した。ｐ５３タンパク質の活性化は、発がん性変異の可能性がある損傷したＤＮＡを運ぶ細胞の増殖から、その生物を保護する。ＭＤＭ２、つまりｐ５３固有のＥ３ユビキチンリガーゼは、ｐ５３の主要な細胞性拮抗薬であり、癌細胞におけるｐ５３成長抑制機能を制限する働きをする。ＭＤＭ２は、ｐ５３のモノユビキチン化とプロテアソーム分解を媒介する。低分子およびステープルペプチドによるｐ５３−ＭＤＭ２複合体の破壊は、ＷＴ  ｐ５３タンパク質で癌を治療するための一般的なアプローチである。Ｗａｄｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １３，８３−９６（２０１３）を参照。
【０１６１】
以前に報告されたＭＤＭ２リガンドであるＡｃ−ＬＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ（配列番号１）（「ＰＤＩ」；Ｐｈａｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，２１７４−２１８３（２０１０）を参照）を選択し、また、そのＣ末端に、ｍｉｎｉＰＥＧ−Ｌｙｓリンカーを介して、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した。このＦＩＴＣで標識したペプチド（表５、ペプチド１）は、報告された値と同様に、８０ｎＭのＫＤ値で、ＭＤＭ２に結合した。ステープル化のため、Ｇｌｕ−４およびＡｌａ−８またはＨｉｓ−５とＧｌｎ−９を、それぞれホモシステイン残基で置き換え、上記のように２つの得られたペプチドをＤＣＡでステープル化した（表５、ペプチド２および３）。ペプチド２および３は、それぞれ１４４および１７１ｎＭのＫＤ値でＭＤＭ２に結合した。そのやや高い作用強度のため、上記のようにＣＰＰ９との接合のためにペプチド２が選択され、２つの立体異性体、ペプチド４と５を与えた。そしてこれらは、オキシム部分での実際のＺ／Ｅ配置は決定されなかったが、ＨＰＬＣで分離された（図５）。ＭＤＭ２に対するペプチド４および５の結合親和性は、蛍光異方性（ＦＡ）ベースのアッセイで、ＭＤＭ２への結合についてＦＩＴＣ標識ペプチド１と競合するこれらの能力を調べることによって決定された。ペプチド４と５は、それぞれ２２０と２０１ｎＭのＩＣ５０値を示し（表１）、ＣＰＰ９への結合は、ＭＤＭ２へのステープルペプチドの結合に著しい影響を及ぼさないことを示唆する。
【表８】
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ａｍｉｎｉＰＥＧ、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸；ｈｏｍｏＣ、ホモシステイン；ＤＣＡ、１，３−ジクロロアセトン。報告値は、ＦＩＴＣ−ペプチド１〜３のＫＤ値および非標識ペプチド４および５のＩＣ５０値である。
【０１６２】
ペプチド４および５は、ＭＴＴ生存率アッセイを使用して、ＷＴ（ＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋）および変異型ｐ５３遺伝子（ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−）を内部に持つヒト結腸癌細胞株に対する抗癌活性についてテストされた。ペプチド４および５は、用量依存的にＷＴ  ｐ５３細胞の生存率を低下させたが、ｐ５３変異細胞は低下させなかった（図２）。以前に報告されているように、Ｎｕｔｌｉｎ−３、つまりＭＤＭ２の低分子阻害剤は、用量依存的にＷＴ  ｐ５３細胞を選択的に殺した。Ｖａｓｓｉｌｅｖ，Ｌ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，８４４−８４８（２００４）を参照のこと。
【０１６３】
一方、ＣＰＰ９を含まないステープルペプチド（ペプチド２）は、おそらく細胞膜に浸透できないため（以下を参照）、どちらの細胞株に対しても有意な効果を示さなかった。
【０１６４】
実施例３  ペプチドのステープル化および３，５−ビス（ブロモメチル）安息香酸との接合
オキシムベースの接合法の主な制限は、２つの異なる立体異性体の形成であり、これにより、生成物の分離およびさらなる臨床的開発が複雑になる。この制限を克服するために、次に、３，５−ビス（ブロモメチル）安息香酸（「ＢＢＡ」）を、ステープル化剤として使用した。構造的に類似した化合物である、ｍ−キシレンジブロミドは、先にα−ヘリックスペプチドをステープル化するために使用されていた。Ｊｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１３４，１７７０４−１７７１３（２０１２）を参照のこと。ｍ−キシレンジブロミドは、空間的に近接した中で、２つのシステインと迅速に反応して、高収率かつ低試薬／ペプチドの化学量論をもって、単一のステープルペプチド生成物を形成する。ＢＢＡを使って、α−ヘリックスペプチドをステープル化／接合させる２つの方法を開発した。最初の方法（図３Ａ）では、２つのアセトアミドエチル（Ａｃｍ）に保護されたシステインを含むカーゴペプチドが、標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって、まず固体支持体上で合成される。Ａｃｍ基は、Ｈｇ（ＯＡｃ）２で除去され、この露出した遊離チオールは、ＢＢＡでアルキル化される。樹脂上にある間、安息香酸基は、カップリング剤（例えば、ＨＡＴＵ）の存在下で、Ｎ−Ｆｍｏｃ−１，３−ジアミノプロパンのリンカーと反応して、ミン部分を生成し、それは、ＳＰＰＳによって、β−Ａｌａ−ＣＰＰ９の次の合成において、ハンドルとして働く。
【０１６５】
２番目の方法（図３Ｂ）では、ＣＰＰ９は、ｍｉｎｉＰＥＧ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）リンカーを使用して、固相上で合成される。リジン側鎖上のＭｔｔ基は、５％ＴＦＡで選択的に除去され、露出したアミンは、ＨＡＴＵをカップリング剤として使用して、ＢＢＡに連結される。樹脂からの切断およびＴＦＡによる側鎖の脱保護、それに続くＨＰＬＣ精製により、ＢＢＡで誘導体化されたＣＰＰ９が得られ、これは、中性水溶液中でこの２つのペプチドを混合するだけで、完全に脱保護されたシステイン含有ペプチドに接合される。
【０１６６】
最初の方法の利点は、このＣＰＰ−ステープルペプチド接合体全体を固相上で合成でき、生成物を一度精製する必要があるだけということである。一方、２番目の方法は、モジュール形式でかつ収束的であり、最適なＣＰＰ−カーゴ接合体を特定するために、テストをするために多数の異なるＣＰＰ／カーゴの組み合わせを迅速に生成するために適用され得る。
【０１６７】
実施例４  ＣＰＰ９は、ステープルペプチドに一貫した細胞透過性を与える。
私たちは、公知のＭＤＭ２リガンドである、Ａｃ−ＬＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ（配列番号１）（「ＰＤＩ」）に、ステープル化／接合法（図３Ｂ）を適用した。Ｈｕ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７，８８１０−８８１７（２００７）を参照のこと。このＧｌｕ−４およびＡｌａ−８残基を、システイン（ペプチド６および７）またはホモシステイン（ペプチド８および９）で置換して、その結果として得られたペプチドをＢＢＡでステープル化し、ＣＰＰ９に接合した（表２、ペプチド７および９）。コントロール（ＣＰＰなし）として、中性の疎水性ステープル（ペプチド６および８）を得るために、ｍ−キシレンジブロミドで、ペプチドをステープル化した。ペプチドの細胞基質移行効率は、柔軟なｍｉｎｉＰＥＧ−Ｌｙｓリンカーを介して、５（６）−カルボキシナフトフルオレセイン（ＮＦ）で、Ｃ末端を標識して、それからフローサイトメトリーで細胞内蛍光を定量化することによって、評価した。ｐＫａ７．８で、ＮＦは、その細胞基質および核（ｐＨ７．４）の中性環境で蛍光を発するが、酸性エンドソーム／リソソーム（ｐＨ≦６．０）での蛍光は最小となる。予想どおり、両方のＣＰＰ９接合ペプチド（ペプチド７と９）は、細胞透過性が高く、これまでに報告された最も有効なＣＰＰの１つである、ＣＰＰ９（１００％）に比べて、４９７％と３０％の細胞基質移行効率を有する。残念ながら、非接合ペプチド６および８は、溶解度が低く、この細胞内取り込み効率を確実に測定できなかった。水性溶解度を高めるために、ペプチド６のＮ末端ロイシンをグルタミン酸で置換して、ペプチド１０を得て、それから、２番目のグルタミン酸残基をペプチド１０のＮ末端に付加してペプチド１２を生成した（表６）。ペプチド１０および１２の、ＣＰＰ９との接合により、それぞれペプチド１１および１３を生成した。注目すべきことに、ＨｅＬａ細胞を５μｌのペプチド１０または１２（ＣＰＰなし）で３７℃で２時間処理すると、細胞内取り込みは最小（両方とも２．８％）である一方、ペプチドのＣＰＰ９との接合により、細胞基質移行効率は、それぞれ４８倍および８６倍に増加した（表６、ペプチド１１および１３）。
【０１６８】
細胞透過性におけるこの劇的な改善が、他のステープルペプチドにおいて一般的であるかどうかをテストするために、ＣＰＰ９への接合の有無にかかわらず、ステープルペプチドの４つの追加ペアを合成し、それらの細胞基質移行効率を比較した（表６、ペプチド１４−２１）。２００を超えるステープルペプチドを分析した後、Ｖｅｒｄｉｎｅと同僚は、以前にペプチド１４を最も細胞透過性のあるステープルペプチドの１つとして報告したが、ペプチド１６、１８、および２０は、最も透過性の低いものであった。Ｃｈｕ，Ｑ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．６，１１１−１１９（２０１５）を参照のこと。Ｖｅｒｄｉｎｅの発見と一致して、キシレン−ステープルペプチド１４（ＣＰＰなし）は、優れた細胞透過性（ＣＰＰ９の４７％）を示したが、ペプチド１６および１８はそうではなかった（それぞれ２．５％および８．９％）。溶解度が限られるため、ペプチド２０の細胞基質移行効率は測定できなかった。ここでも、ＣＰＰ９との接合後、４つすべてのペプチド（１５、１７、１９、および２１）は、細胞透過性が高く、非接合相当物よりも、１１〜１５２倍の改善を示した。ＣＰＰ９接合ペプチド（３０−５０８％）間の細胞透過性の変動は、おそらく少なくとも部分的には、血清タンパク質への異なる結合によって引き起こされる（この作業におけるすべてのフローサイトメトリー実験は、１０％ウシ胎児血清の存在下で行われた）。一般に、疎水性カーゴは、血清タンパク質および／または凝集に結合する傾向があり、この結果、細胞内取り込み効率が大幅に低下する。
【０１６９】
表６のペプチドの４つのペアも、ＦＩＴＣで標識化され、またこれらのＨｅＬａ細胞への移行は、生細胞共焦点顕微鏡法によってモニターされた（図４）。４つの場合すべてで、ステープルペプチドのみ（ＣＰＰなし）は、最小限の取り込みを示したのに対し、ＣＰＰ９−ペプチド接合体は、効率的に細胞に移行した。フローサイトメトリーのデータと一致して、拡散蛍光は、細胞全体に存在し、取り込まれたペプチドのかなりの割合が、エンドソームから細胞基質および核にエスケープしたことを示す。総合すれば、私たちのデータは、ｃＣＰＰ（ＣＰＰ９など）への接合が、ステープルペプチドへ高くかつ一貫性のある細胞透過性を賦与することができることを示唆する。
【表９】
2021501201.tif 000024
ａΦΦ、Ｌ−２−ナフチルアラニン；βΑ、ベータアラニン；ｒ、Ｄ−アルギニン；ＮＦ、５（６）−カルボキシナフトフルオレセイン；ｈＣ、ホモシステイン；ＢＢＡ、３，５−ジメチルベンゾイル；ｍｉｎｉＰＥＧ、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸
ｂ報告されているすべての値は、１００％として定義されているＣＰＰ９の値を基準にしている。ＮＤ、水性溶解度が限られるため未決定
【０１７０】
実施例５  ステープルペプチドの生化学的および生物学的活性
ＭＤＭ２リガンドＰＤＩの変異体であるペプチド６〜１３の、ＭＤＭ２への結合について、テストした。Ｇｌｕ−４およびＡｌａ−８残基をシステインで置換し、ＢＢＡでステープル化すると、ＭＤＭ２結合親和性が、約２．５倍低下した（ペプチド１および６の場合、それぞれＫＤ＝８０および１９０ｎＭ）。ＣＰＰ９との接合により、ＭＤＭ２結合親和性は、さらに約２倍低下した（ペプチド７の場合、ＫＤ約３００ｎＭ）（表７）。Ｇｌｕ−４とＡｌａ−８のホモシステインの置換と、それに続くＢＢＡステープル化により、ＭＤＭ２結合親和性が、５倍向上した（ペプチド８の場合、ＫＤ＝１４ｎＭ）、しかし、さらにＣＰＰ９との接合により親和性は約８倍低下した（ペプチド９の場合、ＫＤ＝１１４ｎＭ）。Ｌｅｕ−１をＧｌｕで置換すると、ペプチド６の結合親和性が５倍向上し（ペプチド１０の場合、ＫＤ＝３６ｎＭ）、これは、おそらくペプチドリガンドのＮ末端近くの正に帯電したＭＤＭ２表面との静電相互作用によるものである。この場合も、ＣＰＰ９との結合により、ＭＤＭ２結合親和性が、６倍低下した（ペプチド１１の場合、ＫＤ＝２２５ｎＭ）。しかし、ペプチド１１のＮ末端に２番目のＧｌｕを追加しても、結合親和性はさらに改善されなかった（ペプチド１３の場合、ＫＤ＝３６５ｎＭ）。
【表１０】
2021501201.tif 000025
ａｈＣ、ホモシステイン；ＢＢＡ、３，５−ジメチルベンゾイル；ｍｉｎｉＰＥＧ、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸。
【０１７１】
実施例６  様々なペプチド伝達ドメイン（ＰＴＤ）に接合されたステープルペプチドの細胞基質送達
一連のステープルペプチド接合体を評価して、ステープルＭＤＭ２阻害剤ｓＰＤＩの細胞基質送達に影響を与える様々なペプチド伝達ドメイン（ＰＴＤ）の能力を比較した（図２０Ａ〜図２０Ｄ）。構造２２は、ＰＤＩ配列は、アスパラギン酸とリジン残基の間に形成されるアミド基によって、ステープル化されていることを示す。各接合（図２０Ｂ〜図２０Ｄ）には、ＣＰＰ９（構造２３）、Ｒ９（構造２４）、またはＴａｔ（構造２５）のいずれかに付着されたＣ末端リンカーがさらに含まれる。
【０１７２】
各接合体の送達適性を評価するために、ペプチド２２−２５をＦＩＴＣで標識し、それからＨｅＬａ細胞への移行を生細胞共焦点顕微鏡法でモニタリングした（図２１）。ＨｅＬａ細胞を５μｌのＦＩＴＣで標識されたペプチドで３７℃で２時間処理し、洗浄して過剰なペプチドを除去した。処理後に得られた画像によれば、ステープルペプチドのみ（構造２２）では最小限の取り込みを行ったのに対し、接合体は、様々な程度で細胞に移行したことを示す。ｓＰＤＩを送達するのに最も効果的な接合体は、ＣＰＰ９が接合したペプチド２３であった。Ｒ９およびＴａｔは、ＭＤＭ２阻害剤を細胞基質に送達可能だったが、効率は著しく低下した。先と同様に、このデータも、ｃＣＰＰ（ＣＰＰ９など）への接合が、ステープルペプチドへ高くかつ一貫性のある細胞透過性を賦与することができることを示唆する。
【０１７３】
実施例７  ＣＰＰ９に接合されたステープルＭＤＭ２阻害剤ｓＰＤＩの機能的送達
蛍光偏光を測定する無細胞拮抗実験を使用して、ＣＰＰ９がステープルＭＤＭ２阻害剤を標的に、どれほど効果的に送達できるかを判定した。この研究では、ｓＰＤＩは、９８．４ｎＭのＩＣ５０での競合ペプチド濃度の関数として、ＭＤＭ２を効果的に阻害した。ＣＰＰ９−ｓＰＤＩは、効果的な阻害剤としても作用し、６３．３ｎＭのＩＣ５０で、改善された活性を示す。どんな特定の理論にも縛られずに、接合を有効とするためには、他の部分からの干渉を受けずに、ｓＰＤＩペプチドがＭＤＭ２に到達する必要がある。この結果は、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩが、ｓＰＤＩとＭＤＭ２間の相互作用が妨げられないように、構成されることを示す。これは、活性が実質的に低下しているＦ１０Ａ変異体の場合ではない。−これは、ＭＤＭ２阻害に対するペプチド配列の重要性を確認する発見である。
【０１７４】
実施例８  ＣＰＰＳ９−ｓＰＤＩの抗増殖効果の評価
さらに、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩ（構造２３）の抗増殖効果を評価した。図２３は、ＭＴＴアッセイで測定した１０％ＦＢＳの存在下で７２時間の処理後の、ＳＪＳＡ−１細胞株の生存率に対する、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩ、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、Ｒ９−ｓＰＤＩ、ｓＰＤＩ、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩ（Ｆ１０Ａ）およびＴａｔ−ｓＰＤＩ（０−２０μＭ）の効果を比較するものである。公知のＭＤＭ２阻害剤Ｎｕｔｌｉｎ−３ａと比較して、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩは、３．８６μＭのＩＣ５０値で、細胞毒性の増大を示した。他の接合体の活性は、著しく低く（＞２０μＭ）、これは、ＰＴＤ、例えばＲ９やＴａｔが、阻害剤を標的へと効果的に送達しにくいことを示す。Ｆ１０Ａペプチド変異体は、ＣＰＰ９−ｓＰＤＴと比較して、５倍を超える細胞毒性の低下につながる；ＭＤＭ２は、ｓＰＤＩによって阻害され、ＣＰＰ９またはそのフラグメントによって阻害されないことを強固にする結果。とりわけ、このペプチドは、無細胞結合アッセイで、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩに匹敵する効果を示したにもかかわらず、ｓＰＤＩは、実質的に低下した細胞毒性を有していた（図２２）。
【０１７５】
ＭＤＭ２阻害剤の細胞基質送達時に、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩの作用機序（ＭＯＡ）も考慮した。図２４のグラフは、アネキシンＶ＋／ヨウ化プロピジウム＋（ＰＩ＋）ＳＪＳＡ−１細胞を検出するためのフローサイトメトリーアッセイを使用して、ＣＰＰ９−ＳＰＤＩの抗増殖活性が、アポトーシス経路によって媒介されることを示す。この挙動は、特定の癌細胞株でｐ５３依存性アポトーシスを誘発することが知られている、Ｎｕｔｉｉｎ−３ａに類似している。この研究では、１０％ＦＢＳの存在下で、阻害剤を４８時間処理した後、アネキシンＶ＋／ＰＩ＋およびアネキシンＶ＋／ＰＩ−ＳＪＳＡ−１細胞の割合を測定した。
【０１７６】
ＣＰＰ９−ｓＰＤＩの血清安定性は、接合体を２５％ヒト血清中で３７℃で２４時間インキュベートすることによって、評価した。図２５は、化合物の２５％が研究の終了時に検出されたように、この期間にわたり、ＣＰＰ９−ｓＰＤＩが着実に減少することを示した。この観察された血清安定性のレベル（カーゴ領域）は、この化合物について測定されたＩＣ５０値に影響を与える可能性がある。
【０１７７】
実験の詳細
ペプチドの合成および標識ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学およびカップリング剤として２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）を使用することにより、Ｒｉｎｋアミド樹脂上でＳＰＰＳによって手作業で合成した。カップリング反応は、通常、５当量のＦｍｏｃ−アミノ酸、５当量のＨＡＴＵ、および１０当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含み、室温で４５分間行われた。ペプチドを樹脂から切断し、９２．５％のＴＦＡ、２．５％の水、２．５％のトリイソプロピルシラン、および２．５％の１，３−ジメトキシベンゼンで３時間、ＲＴで処理することにより、脱保護した。溶媒は、溶液上にＮ２流を流すことにより除去して、それから残留物を冷ジエチルエーテルで粉砕した。この粗ペプチドを、ｄｄＨ２Ｏ（０．０５％のＴＦＡを含む）中のアセトニトリル（０．０５％のＴＦＡを含む）の直線勾配で溶出されるＣ１８カラムを備えた、逆相ＨＰＬＣで精製した。ペプチドの蛍光標識は、液相中で行った。凍結乾燥したペプチドを、５当量の活性化蛍光標識試薬（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、または５（６）−カルボキシナフトフルオレセインスクシンイミジルエステル）、および５当量のＤＩＰＥＡとともに、ＤＭＦ中で２時間インキュベートした。ＴＦＡによって反応を停止させ、それから、その標識されたペプチドをＨＰＬＣによって再度精製し、これらの確実性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって確認した。
【０１７８】
ＤＣＡによるペプチドのステープル化。システイン含有ペプチドを、１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ＝８．１）、および１．１当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む、１ｍＬのＤＭＦに溶解して、約０．１ｍＭのペプチド濃度とした。この溶液を、回転式振とう培養機で混合しながら、室温で１時間インキュベートした。その後、ＤＭＦ中で１．５当量のジクロロアセトンを混合物に加え、溶液を室温で３時間（混合しながら）インキュベートした。この反応生成物を逆相ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析した。
【０１７９】
アミノオキシ（Ａｍｉｎｏｘｙ）−ＣＰＰ９の合成
ＣＰＰ９は、標準のＳＰＰＳによって合成され、Ｃ末端にｍｉｎｉＰＥＧ−Ｎｅ−４−メトキシトリチル−Ｌ−リジン部分が付加された。まだ樹脂上にある間に、リジン側鎖のＭｔｔ基は、ＤＣＭ中で、２％（ｖ／ｖ）のＴＦＡを１時間処理することにより選択的に除去された。次に、この樹脂を、５当量の（Ｂｏｃ−ａｍｉｎｏｘｙ）酢酸、５当量のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、および５当量のＨＯＢＴと共に、ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１  ｖ／ｖ）中で、１時間（２回）インキュベートした。この得られたアミノキシ−ＣＰＰ９ペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣにより精製し、そして先に記載したようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した。
【０１８０】
オキシム形成によるＣＰＰ９−ステープルペプチド接合体の合成
ＤＣＡ−ステープルペプチド（０．５ｍＭ）を、１００ｍＭのアニリンを含む１００ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ溶液（ｐＨ  ４．５）１０ｍＬに溶解した。アミノオキシ（ａｍｉｎｏｘｙ）−ＣＰＰ９（２．０当量）を上記溶液に加え、混合物を室温で、一晩（混合しながら）インキュベートした。この反応生成物は、Ｃ１８カラムを備えた逆相ＨＰＬＣによって精製され、これは、ｄｄＨ２Ｏ（０．０５％のＴＦＡを含む）中の１０〜６０％アセトニトリルの直線勾配で溶出された。この反応生成物の確実性は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって確認された（例えば、図Ｓ１を参照のこと）。
【０１８１】
ＧＳＴ−ＭＤＭ２の発現と精製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ヒトＭＤＭ２遺伝子（残基１７−１２５）をコードする、原核生物ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−２で形質転換した。細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬ培地中で、ＯＤ６００が０．６になるまで、３７℃で増殖させ、それから１ｍＭのＩＰＴＧを添加することで、タンパク質の発現を３０℃で５時間誘導した。細胞を２，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によりペレット化した。この細胞ペレットを５０ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ３、および２ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁し、氷上で超音波処理によって溶解した。この溶解物を、ＳＳ−３４固定角度ローターで、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清を、グルタチオン−セファロースのカラムに充填して、結合したタンパク質を１０ｍＭのＧＳＨを含む溶解バッファーで、溶出させた。
【０１８２】
ＭＴＴアッセイ
ＨＣＴ１１６  ｐ５３野生型およびＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞を、９６−ウェルプレートに３ｘ１０３細胞／ウェルで播種し、一晩増殖させた。異なる濃度（０−１２．５μＭ）のペプチドを、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したマッコイ５Ａ培地中の細胞に添加し、５％ＣＯ２の存在下で、３７℃で４８時間インキュベートした。その後、１０μＬのＭＴＴ保存液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加して、そのプレートを３７℃で４時間インキュベートした。１００μＬのＳＤＳ−ＨＣｌ可溶化溶液を添加して、そのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。形成されたホルマザン生成物の吸光度を、Ｔｅｃａｎマイクロタイタープレートリーダー上で、５７０ｎｍで測定した。
【０１８３】
フローサイトメトリー
ＨｅＬａ細胞を、１２−ウェルプレートに１．５ｘ１０５細胞／ウェルで、２４時間播種した。翌日、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中の細胞に、ナフトフルオレセインで標識されたペプチド（５μＭ）を添加し、それからこの細胞を３７℃で２時間、５％ＣＯ２の存在下でインキュベートした。そのペプチドを含む培地を除去し、その細胞をＤＰＢＳで２回洗浄した。その細胞を０．２５％トリプシンを用いてプレートから分離し、２５０ｇで５分間の遠心分離によりペレット化し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、ＤＰＢＳに再懸濁し、それからＢＤ  ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩまたはＡｒｉａ  ＩＩＩフローサイトメーターで分析した。ＮＦで標識されたペプチドの場合は、６３３−ｎｍレーザーが励起に使用され、その蛍光発光をＡＰＣチャネルで分析した。データは、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して分析した。
【図１】
2021501201.tif 000037
【図２】
2021501201.tif 000038
【図３Ａ】
2021501201.tif 000039
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2021501201.tif 000042
【図５−２】
2021501201.tif 000043
【図６】
2021501201.tif 000044
【図６−２】
2021501201.tif 000045
【図７】
2021501201.tif 000046
【図７−２】
2021501201.tif 000047
【図８Ａ】
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【図８Ａ−２】
2021501201.tif 000049
【図８Ｂ】
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【図８Ｂ−２】
2021501201.tif 000051
【図９】
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【図９−２】
2021501201.tif 000053
【図１０Ａ】
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【図１０Ａ−２】
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【図１０Ｂ】
2021501201.tif 000056
【図１１Ａ】
2021501201.tif 000057
【図１１Ａ−２】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
2021501201.tif 000060
【図１２Ａ−２】
2021501201.tif 000061
【図１２Ｂ】
2021501201.tif 000062
【図１３】
2021501201.tif 000063
【図１３−２】
2021501201.tif 000064
【図１４Ａ】
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【図１４Ａ−２】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１５−２】
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【図１６Ａ】
2021501201.tif 000070
【図１６Ａ−２】
2021501201.tif 000071
【図１６Ｂ】
2021501201.tif 000072
【図１７】
2021501201.tif 000073
【図１７−２】
2021501201.tif 000074
【図１８Ａ】
2021501201.tif 000075
【図１８Ａ−２】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図１９−２】
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【図２０Ａ】
2021501201.tif 000080
【図２０Ｂ】
2021501201.tif 000081
【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
2021501201.tif 000089
2021501201.tif 000090