(57)【要約】  Ｆ本発明は、３Ｄプリンティングプロセスによって調製された固体細胞培養媒体形態を使用することによる細胞培養を行うための方法に関する。
2021500053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）３Ｄプリンティング技術を使用することによって固体細胞培養媒体形態を生成すること、
ｂ）前記固体形態を、液体および培養する細胞と混合すること、
ｃ）ステップｂ）の混合物をインキュベートすることによって細胞培養を行うこと、
による細胞を培養するためのプロセス。
【請求項２】
固体形態が、錠剤である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
固体形態が、異なる組成を具備する少なくとも２つの層を含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
固体形態が、異なる組成を具備するコアとシェルとを含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項５】
固体形態を液体と混合させるとき、固体形態の一部分が固体形態の別の一部分と比べてより遅く溶解する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
固体形態が、リン酸４−メチルウンベリフェリル二ナトリウム、アクリフラビン、アムホテリシンＢ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、ブリリアントグリーン、炭酸カルシウム、セフィキシミド（Cefiximide）、セフォペラゾン、セフォテタン、セフスロジン、セフタジディム（Ceftazimide）、セファロチン、セトリミド、コリスチン硫酸塩、−シクロヘキシジン、Ｄ−シクロセリン、ホスホマイシン、フシジン、イルガサン、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール、リチウムムピロシン、ナリジクス酸、ノボビオシン、ウシ胆汁、オキシテトラサイクリン、ポリミキシンＢ硫酸塩、亜テルル酸カリウム、テトラチオン酸カリウム、リファンピシン、トリメトプリム乳酸塩またはバンコマイシン、またはそれらの組み合わせ、を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
固体形態が、１以上のアミノ酸を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
ステップｂ）が、最初に固体形態を液体と混合し、および次いで細胞を加えることによって行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
ステップｂ）が、固体形態を、既に細胞を含んでいる液体と混合することによって行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
ステップｃ）において行われる細胞培養が、フェッドバッチ細胞培養である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
ステップｃ）において行われる細胞培養が、ある細胞の検出および／または計数のための細胞培養である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
ステップａ）において使用される３Ｄプリンティング技術が、非接触３Ｄレーザープリンティングプロセスである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
ステップａ）において使用されるプリンティングプロセスが、以下のステップ
（ａ）レーザーエネルギー吸収層（１）および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）を含む複合層（３）を、レーザーエネルギーの発生源（５）によって活性化されることができるレーザービームについて透過性であるプレート（４）と載置プレート（６）との間に、そこで少なくとも１つの細胞培養媒体成分（２）を含有する複合体の層がレーザーエネルギーの発生源（５）とは反対側に位置させられかつ載置プレート（６）に対面するように、位置させること；
（ｂ）細胞培養媒体成分含有層（２）を含む複合層（３）と、載置プレート（６）と、の間に空間（８）を形作るために載置プレート（６）を下げること；
（ｃ）レーザーエネルギーの発生源（５）からのレーザービームの作用により、複合体（３）の細胞培養媒体成分含有層（２）を載置プレート（６）上へと移動させること；
（ｄ）固体細胞培養媒体形態を築き上げるのに必要なだけの回数、ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返すこと；
（ｅ）載置プレートから固体細胞培養媒体形態を取り去ること
を含む、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
ステップａ）において使用されるプリンティングプロセスが、以下のステップ
（ａ）レーザーエネルギー吸収層（１）および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）を含む複合層（３）を、レーザーエネルギーの発生源（５）によって活性化されることができるレーザービームについて透過性であるプレート（４）と、載置プレートに対して相対的に垂直方向（ｚ軸）に動かすことができる少なくとも１つのエリア（７）を含む載置プレート（６）との間に、そこで少なくとも１つの細胞培養媒体成分（２）を含有する複合体の層がレーザーエネルギーの発生源（５）とは反対側に位置させられかつ載置プレート（６）に対面するように、位置させること；
（ｂ）細胞培養媒体成分含有層（２）を含む複合層（３）と、載置プレート（６）の可動エリア（７）と、の間に空間（８’）を形作るために可動エリア（７）を載置プレート（６）に対して相対的に下げること；
（ｃ）レーザーエネルギーの発生源（５）からのレーザービームの作用により、複合体（３）の細胞培養媒体成分含有層（２）を、載置プレート（６）に対して相対的に下げられた可動エリア（７）によって形作られた空間（８’）中へと移動させること；
（ｄ）固体細胞培養媒体形態を築き上げるのに必要なだけの回数、ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返すこと；
（ｅ）載置プレートから固体細胞培養媒体形態を取り去ること
を含む、請求項１２に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３Ｄプリンティングプロセスによって調製された固体細胞培養媒体形態を使用することによる細胞培養を行うための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養媒体は、哺乳動物細胞、植物細胞、細菌、酵母およびカビのような細胞の長時間の成長および培養のために利用可能である。細胞培養媒体は、成長および／または標的とする生理学的状態を支持すべき生命体のタイプに依存して、構成要素の、時には１００以上の異なる構成要素の複合混合物を含むことがある。哺乳動物、昆虫または植物細胞の繁殖のために要求される細胞培養媒体は、典型的には、細菌、酵母または菌類の成長を支持する媒体よりもはるかに複雑である。
【０００３】
最初に開発された細胞培養媒体は、血漿、血清、胚抽出物などの未定義の構成要素、または他の定義されない生物抽出物またはペプトンからなっていた。大きな進歩は、斯くして、化学的に定義された媒体の開発でなされた。化学的に定義された媒体は、これだけに限られるものではないがしばしば、アミノ酸、ビタミン、金属塩、抗酸化剤、キレーター、成長因子、緩衝剤、ホルモン、および当該技術分野の専門家に知られているさらに数多くの物質を含む。
【０００４】
いくつかの細胞培養媒体が、滅菌された水性の液体として供されている。液体細胞培養媒体の不利な点は、それらの、低減された品質保持期間と、運送および貯蔵の困難性である。その結果、数多くの細胞培養媒体は、現在のところ、微粉砕された乾燥粉末混合物として提供されている。それらは、水および／または水溶液中に溶解させる目的のために製造され、および、溶解した状態においては、しばしば他のサプリメントとともに、成長および／または同細胞からの生物医薬の生産のための実質的な栄養基礎培地（nutrient base）を細胞に供給するように設計されている。
【０００５】
理想的には、細胞培養媒体の全ての構成要素が、使用の前に溶解されるための固体状態か、またはすぐに使用できる液体状態か、のいずれかで混合されている。しかし、これはしばしば可能ではない。
【０００６】
細胞培養媒体の調製および使用にとっての限定因子は、いくつかの構成要素の乏しい安定性であり、これは、例として、保管の間またはオートクレーブされているときに劣化および／または酸化する傾向がある。抗生物質およびビタミンは、しばしば熱に感受性であり、オートクレーブした後に加える必要がある。いくつかの構成要素は、吸湿性であり、これはしばしば、それらの産業上の適用（単数または複数）を制限する安定性および／または他の品質の問題点に至らせる乾燥粉末媒体の集塊を結果としてもたらす。吸湿性化合物によって引き付けられる水は、増加した微生物成長ならびに隣接構成要素の劣化に至らせることが考えられる。加えて、ある構成要素は、不要な副反応および媒体組成の変更に至らせる、他の構成要素との交差反応を示すことが考えられる。
【０００７】
予め混合された媒体を生産することの別の限定は、柔軟性の欠如である。基礎的な媒体組成を有し、それに、次いで必要に応じてある構成要素が供給されることが望ましいと考えられる。
【０００８】
これらの全ての場合において、典型的には、液体か乾燥状態かのいずれかの細胞培養ベース媒体があり、これは、使用の前にまたは細胞培養の間のある時間に、細胞培養のために同様に必要であるが例として安定性または戦略的な理由に起因して、ベース媒体の一部ではない、１以上の構成要素を含む細胞培養媒体を補充される。
それらの媒体サプリメントを加えることは、しばしば複雑であり時間がかかる。ベース媒体の組成は固定であり、使用の前に行わなければならないと考えられるステップは定義された量の媒体中への乾燥媒体の溶解のみである一方で、サプリメントの添加のためにより多くの労力が必要である。それはまた、ある量の液体中に溶解させなければならないということも考えられ、および、技術者は、適用の時間ならびに加えられる量および組成が好適であること、およびベース媒体または細胞培養への添加が不要な副次的影響を引き起こさないことに気を付ける必要がある。
【０００９】
かかる媒体サプリメントの調製もまた、しばしば不便である。媒体サプリメントは、しばしば、異なる溶解性を有する数種の化合物の混合品であり、および通常は、ガラスバイアル中への１以上の別々の溶液の分配とこれに続く凍結乾燥によって製造される。
使用の前に、凍結乾燥された材料は、再構築され（または懸濁され）、およびその後、溶液が、既に滅菌された媒体または細胞培養物に加えられる。サプリメント溶液は、臨界に依存して、添加の前に濾過滅菌されてもよい。個々のサプリメントの溶解性に依存して、フリーズドライのために要求される液体の体積は大きいことがある。ある化合物は、フリーズドライのために許容される溶媒に容易に溶解しないことがある（要求される溶媒はエタノールまたはＤＭＳＯのことがある）。
いくつもの異なるサプリメントミックス中で同じ化合物が使用されることがあるが、製造のためのベース溶液は各々の製造ランのために作りたてのものでなければならない。
現在、サプリメントバイアルは、典型的には５００ｍｌの媒体体積についてのみ製造されており、これは媒体クッカー自動機（Media cooker automats）を使用した媒体のより大規模な（５〜２０ｌ）生産にはとても不便／不適切である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
斯くして、可能な限り簡単に媒体サプリメントの使用および生産を成し遂げ、かつ、他方、必要な全ての柔軟性をユーザーに提供する途を見出すことが有益であるといえる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
固体媒体形態を生成するために３Ｄプリンティング技術を使用することが可能であるということが見出されている。固体細胞培養媒体形態の組成は、３Ｄプリンティングを行っているときに極めて正確に定義することができる。錠剤のような３Ｄプリントされた固体形態は、次いで、それを溶媒と予め混合することによるかまたは液体細胞培養に固体形態で添加するかのいずれかによって、簡単に細胞培養物に適用することができる。ある成分の安定性ならびにある成分の放出に影響して、例として、持続的放出媒体を生成することさえも可能である。
【００１２】
本発明は斯くして、
ａ）３Ｄプリンティング技術を使用することによって固体細胞培養媒体形態を生成すること、
ｂ）前記固体形態を、液体および培養する細胞と混合すること、
ｃ）ステップｂ）の混合物をインキュベートすることによって細胞培養を行うこと、
による細胞を培養するためのプロセスに向けられる。
固体細胞培養媒体形態は、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む。
【００１３】
好ましい態様において、固体形態は、錠剤である。
別の態様において、固体形態は、異なる組成を具備する少なくとも２つの層を含む。
一態様において、固体形態は、異なる組成を具備するコアとシェルとを含む。
【００１４】
別の態様において、固体形態の一部分は、固体形態の別の一部分と比べてより遅く溶解する。より遅く溶解する一部分は、典型的には、その組成に起因してその成分の持続的放出を提供するコアである。
【００１５】
好ましい態様において、固体形態は、リン酸４−メチルウンベリフェリル二ナトリウム、アクリフラビン、アムホテリシンＢ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、ブリリアントグリーン、炭酸カルシウム、セフィキシミド（Cefiximide）、セフォペラゾン、セフォテタン、セフスロジン、セフタジディム（Ceftazimide）、セファロチン、セトリミド、コリスチン硫酸塩、シクロヘキシジン、Ｄ−シクロセリン、ホスホマイシン、フシジン、イルガサン、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール、リチウムムピロシン、ナリジクス酸、ノボビオシン、ウシ胆汁、オキシテトラサイクリン、ポリミキシンＢ硫酸塩、亜テルル酸カリウム、テトラチオン酸カリウム、リファンピシン、トリメトプリム乳酸塩またはバンコマイシン、またはそれらの組み合わせ、を含む。
【００１６】
別の好ましい態様において、固体形態は、１以上のアミノ酸および／またはビタミンを含む。好ましいアミノ酸は、システイン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、トリプトファン、ヒスチジンおよびメチオニンである。好ましいビタミンは、リボフラビン、チアミン、葉酸およびビタミンＢ１２である。
【００１７】
一態様において、ステップｂ）は、最初に前記固体形態を液体と混合し、および次いで細胞を加えることによって、行われる。この場合において、液体は、例として、水もしくは水性緩衝剤またはあらゆるタイプの液体細胞培養媒体であることが考えられる。また、この段階で、例として、ゲル化剤のようなさらなる構成要素を、細胞の添加の前に加えることも可能である。細胞は、典型的には、液体細胞培養媒体中に存在する。
【００１８】
一態様において、ステップｂ）は、前記固体形態を、既に細胞を含んでいる液体と混合することによって行われる。この場合において、細胞は、典型的には、液体細胞培養媒体中に既に存在している。固体形態の添加は、液体細胞培養媒体への細胞の接種の直後にまたは液体細胞培養媒体中で細胞を培養している間のあらゆる時間になされることが考えられる。
【００１９】
一態様において、細胞培養は、フェッドバッチ細胞培養である。
別の態様において、細胞培養は、ある細胞の検出および／または計数のための細胞培養である。かかるタイプの細胞培養は、典型的には微生物学的応用に使用される。
好ましい態様において、ステップａ）において使用される３Ｄプリンティング技術は、非接触３Ｄレーザープリンティングプロセスである。
【００２０】
極めて好ましい態様において、ステップａ）において使用されるプリンティングプロセスは、以下のステップ
（ａ）レーザーエネルギー吸収層（１）および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）を含む複合層（３）を、レーザーエネルギーの発生源（５）によって活性化されることができるレーザービームについて透過性であるプレート（４）と載置プレート（６）との間に、そこで少なくとも１つの細胞培養媒体成分（２）を含有する複合体の層がレーザーエネルギーの発生源（５）とは反対側に位置させられかつ載置プレート（６）に対面するように、位置させること；
（ｂ）細胞培養媒体成分含有層（２）を含む複合層（３）と、載置プレート（６）と、の間に空間（８）を形作るために載置プレート（６）を下げること；
（ｃ）レーザーエネルギーの発生源（５）からのレーザービームの作用により、複合体（３）の細胞培養媒体成分含有層（２）を載置プレート（６）上へと移動させること；
（ｄ）固体細胞培養媒体形態を築き上げるのに必要なだけの回数ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返すこと；
（ｅ）載置プレートから固体細胞培養媒体形態を取り去ること
を含む。
【００２１】
別の極めて好ましい態様において、ステップａ）において使用されるプリンティングプロセスは、以下のステップ
（ａ）レーザーエネルギー吸収層（１）および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）を含む複合層（３）を、レーザーエネルギーの発生源（５）によって活性化されることができるレーザービームについて透過性であるプレート（４）と、載置プレートに対して相対的に垂直方向（ｚ軸）に動かすことができる少なくとも１つのエリア（７）を含む載置プレート（６）との間に、そこで少なくとも１つの細胞培養媒体成分（２）を含有する複合体の層がレーザーエネルギーの発生源（５）とは反対側に位置させられかつ載置プレート（６）に対面するように、位置させること；
（ｂ）細胞培養媒体成分含有層（２）を含む複合層（３）と、載置プレート（６）の可動エリア（７）と、の間に空間（８’）を形作るために可動エリア（７）を載置プレート（６）に対して相対的に下げること；
（ｃ）レーザーエネルギーの発生源（５）からのレーザービームの作用により、複合体（３）の細胞培養媒体成分含有層（２）を、載置プレート（６）に対して相対的に下げられた可動エリア（７）によって形作られた空間（８’）中へと移動させること；
（ｄ）固体細胞培養媒体形態を築き上げるのに必要なだけの回数、ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返すこと；
（ｅ）載置プレートから固体細胞培養媒体形態を取り去ること
を含む。
【００２２】
細胞培養は、それにおいて細胞が培養されるあらゆるセットアップである。
細胞培養は、ペトリ皿、コンタクトプレート、瓶、チューブ、ウェル、器（vessel）、袋、フラスコおよび／またはタンクなどの、細胞の培養に適したあらゆる容器の中で行うことができる。典型的には、容器は、使用の前に滅菌される。細胞培養は、典型的には、環境からの外来微生物によるコンタミネーションを制限する、好適な温度、浸透圧、通気、攪拌等々、などの細胞の成長および／または維持に適した条件下の水性細胞培養媒体中での細胞のインキュベーションによって行われる。当業者は細胞の培養のための好適なインキュベーション条件を承知している。
【００２３】
本発明による細胞培養媒体（同義的に使用される：培養媒体）は、細胞のin vitroでの成長を維持および／または支持するかまたは特定の生理的状態を維持する構成要素のあらゆる混合物である。それは、プレエンリッチメント培養のためならびに維持培地（maintenance medium）としての使用のためにもまた適している。
【００２４】
それは、血漿、血清、胚抽出物などの未定義の構成要素、または他の定義されない生物抽出物またはペプトンを含むことが考えられる。それは、化学的に定義された媒体であることもまた、考えられる。細胞培養媒体は、細胞のin vitroでの成長を維持および／または支持するかまたは特定の生理的状態を維持するために必要な全ての構成要素を含むことができるか、あるいは、別途加えられるさらなる構成要素（媒体サプリメント）との組み合わせでのまたはそれとの組み合わせなしでの、選択された構成要素の添加のために使用されることができる。好ましくは、細胞培養媒体は、媒体サプリメントである。細胞培養媒体の構成要素はまた、細胞培養媒体成分とも呼ばれる。
【００２５】
本発明による細胞培養媒体およびプロセスは、細菌細胞のような原核細胞ならびに酵母、菌類、藻類、植物、昆虫および／または哺乳動物細胞のような真核細胞および任意に古細菌を成長させることに、またはその成長を維持／支持することに適するように設計される。原核細胞および真核細胞ならびに任意である古細菌は、以下において、微生物または細胞とも呼ばれる。
【００２６】
本発明の方法または媒体によってその成長が支持されるかまたは維持されることになる微生物は、典型的には、以下のものに見出される：
− 医薬関連の環境モニタリングの間の環境試料
− 医薬関連の原材料、中間体および／または最終製品から得られる試料
− 病院の検査の間の臨床試料
− 獣医学的試料
− 飲料水および／または廃水および／または水泳プール用水の検査のための水試料
− 微生物コンタミネーションの検査のための食品試料
− 化粧品試料
− 生物医薬生産のための細胞培養
【００２７】
例えば、本発明による細胞培養媒体は、ヒト皮膚汚染物質、水質汚染物質、酵母およびカビなどの、グラム陽性微生物およびグラム陰性微生物のような、真核生物および原核生物の成長を支持してもよい。本発明による媒体および方法によってその成長が維持される／支持される／検出される細胞の例は：
Escherichia coli/STEC/EHEC、Salmonella spp、Listeria spp、Campylobacter spp、Bacillus spp、Cronobacter sakazakii、Vibrio spp、Yersinia spp、Legionella spp、Mycobacterium spp、Clostridium spp、Staphylococcus aureus、Candida spp、Aspergillus sppである。
【００２８】
化学的に定義された細胞培養媒体は、化学的によく特徴づけされた「定義された」原材料を含んでなる細胞培養媒体である。これは、媒体に使用される全ての化学品の化学組成が知られていることを意味する。化学的に定義された媒体は、化学的に明瞭に定義されていない酵母、動物または植物組織のような化学的に明瞭に定義されていない物質を含んでなるものではない；それらは、ペプトン、フィーダー細胞、血清、明瞭に定義されていない抽出物または消化物、あるいは、化学的にうまく定義されないタンパク質および／またはペプチドおよび／または加水分解物を媒体に寄与させることがある他の構成要素を含まない。いくつかの場合において、化学的に定義された媒体は、化学的に定義されたタンパク質またはペプチドを含んでもよく、１つの例は、インスリンである（下記でその他のものを参照）。
【００２９】
粉末化された細胞培養媒体または乾燥粉末媒体または脱水された培養媒体は、典型的には、ミリングプロセスまたは凍結乾燥プロセスの結果もたらされた細胞培養媒体である。それは、粉末化された細胞培養媒体は、典型的には、細かい顆粒状の、粒子状媒体であり、液体媒体ではないということを意味する。用語「乾燥粉末」は、用語「粉末」と互換的に使用されることがある；しかしながら、本明細書中で使用する「乾燥粉末」は、単純に材料の肉眼での外観を指し、別様に表示されない限り、材料が、複合化または凝集した溶媒を全く含まないということを意図してはいない。粉末化された細胞培養媒体はまた、顆粒状の細胞培養媒体、例として、圧片造粒法により乾式造粒されたかまたは流動床噴霧造粒法により湿式造粒されたもの、でもあり得る。かかる媒体は、スプレードライによっても調製することができる。
【００３０】
固体形態または固体細胞培養媒体形態とも呼ばれる、細胞培養媒体の固体形態は、３Ｄプリンティングプロセスの結果もたらされる少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含むあらゆる定義された３次元体である。それは乾燥した固体であるが、しかしながら、本明細書中で使用する「乾燥した固体」は、単純に材料の肉眼での外観を指し、別様に表示されない限り、材料が、複合化または凝集した溶媒を全く含まないということを意図してはいない。固体形態は、多孔性または無孔であり得る。それは、例として、円形、楕円形、棒状、魚雷型等々、適用の要求に適合するあらゆる形状を有することができる。固体細胞培養媒体形態の例は、錠剤または丸剤である。
【００３１】
液体細胞培養媒体を調製するのに使用される、液体とも呼ばれる溶媒は、典型的には、水（最も特定的には、蒸留および／または脱イオン水、または精製水、または注射のための水）または水性緩衝剤である。溶媒はまた、生理食塩水、好適なｐＨ範囲（典型的には、ｐＨ１とｐＨ１０との間の範囲における）を提供する可溶性の酸もしくは塩基イオン、安定化剤、界面活性剤、防腐剤、およびアルコールまたはその他の極性有機溶媒、ならびに、半固体媒体の生産のためのゲル化剤、をも含む。
【００３２】
細胞の添加の前の溶解された媒体のｐＨは、典型的には、ｐＨ２と１２との間、より好ましいのはｐＨ４と１０との間、さらにより好ましいのはｐＨ６と８との間、および最も好ましいのはｐＨ６．５と７．５との間、および理想的にはｐＨ７．０と７．５との間である。
【００３３】
細胞のin vitroでの成長を維持および／または支持するのに必要な全ての構成要素を含む細胞培養媒体は、典型的には、少なくとも１以上の糖構成要素、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤構成要素、１以上の補因子および１以上の核酸構成要素（窒素塩基）またはそれらの誘導体を含む。それはまた、例として、ｒインスリン、ｒＢＳＡ、ｒトランスフェリン、ｒサイトカイン等々の組み換えタンパク質などの、化学的に定義されている生化学物質も含んでもよい。
【００３４】
媒体はまた、ピルビン酸ナトリウム、高度に純化されおよびひいては化学的によく定義された抽出物、脂肪酸および／または脂肪酸誘導体および／またはプルロニック製品構成要素（エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドに基づいたブロックコポリマー）、特に、時々Pluronic F 68と呼ばれるPoloxamer 188、またはKolliphor P 188またはLutrol F 68、および／または、化学的に調製された非イオン界面活性剤などの表面活性化構成要素、も含んでもよい。好適な非イオン界面活性剤の一例は、ポロキサマーとも呼ばれる、一級ヒドロキシル基を末端に持つ二官能性ブロックコポリマー界面活性剤であり、例として、BASF、ドイツ国、から商標名pluronic（登録商標）のもとで入手可能である。かかるプルロニック（pluronic）製品の構成要素は、以下においては単に、プルロニックと呼ばれる。キレーター、ホルモンおよび／または成長因子もまた加えられてもよい。
【００３５】
それが含んでもよい他の構成要素は、乳酸、チオグリコール酸、チオ硫酸塩、テトラチオン酸塩、ジアミノブタン、ミオイノシトール、ホスファチジルコリン（レシチン）、スフィンゴミエリン、鉄含有化合物（鉄硫黄クラスターを伴う化合物を包含する）、尿酸、リン酸カルバモイル、コハク酸、チオレドキシン（単数または複数）、オロト酸、ホスファチジン酸、ポリアミン（プトレシン、スペルミジン、スペルミンおよび／またはカダベリンなど）、トリグリセリド、ステロイド（コレステロールを包含するがこれに限られない）、メタロチオニン、酸素、グリセロール、尿素、アルファ−ケトグルタル酸、アンモニア、グリセロリン酸、デンプン、グリコーゲン、グリオキシル酸、イソプレノイド、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、脂質（ミセルにおけるものを包含するがこれに限られない）、トリブチリン、ブチリン、コール酸、デオキシコール酸、ポリリン酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩および／またはシュウ酸塩の純粋化合物、塩、コンジュゲートおよび／または誘導体である。
【００３６】
糖構成要素は、全て、グルコース、ガラクトース、リボースもしくはフルクトース（単糖の例）またはスクロース、ラクトースもしくはマルトース（二糖の例）のような、単糖もしくは二糖、または、糖アルコールのようなそれらの誘導体である。糖構成要素はまた、オリゴ糖または多糖であってもよい。
【００３７】
本発明によるアミノ酸の例は、特に、タンパク質構成アミノ酸、とりわけ必須アミノ酸、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリン、ならびに、Ｄ−アミノ酸などの非タンパク質構成アミノ酸である。
チロシンは、Ｌ−またはＤ−チロシン、好ましくはＬ−チロシンを意味する。
システインは、Ｌ−またはＤ−システイン、好ましくはＬ−システインを意味する。
アミノ酸前駆体およびアナログもまた包含される。
【００３８】
ビタミンの例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナール、様々なレチノイド、および４種のカロテノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）（アスコルビン酸のリン酸塩を包含する）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）およびビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆体およびアナログもまた包含される。
【００３９】
塩の例は、重炭酸塩、カルシウム、クロリド、マグネシウム、リン酸塩、カリウムおよびナトリウムなどの無機イオンまたはＣｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、ＶおよびＺｎなどの微量元素を含む構成要素である。例は、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、リン酸一ナトリウム（無水）（ＮａＨ２ＰＯ４）、硫酸マグネシウム（無水）（ＭｇＳＯ４）、リン酸二ナトリウム（無水）（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）である。
緩衝剤の例は、炭酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳおよびＴＲＩＳである。
【００４０】
補因子の例は、チアミン、ビオチン、ビタミンＣ、カルシフェロール、コリン、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ（還元および／または酸化）、コバラミン、ビタミンＢ１２、フラビンモノヌクレオチドおよび誘導体、フラビンアデニンジヌクレオチドおよび誘導体、グルタチオン（還元および／または酸化および／または二量体として）、ヘム、ヘミン、ヘモグロビン、フェリチン、ヌクレオチドリン酸（nucleotide phophates）および／または誘導体（例として、アデノシンリン酸）、補酵素Ｆ４２０、ｓ−アデノシルメチオニン、補酵素Ｂ、補酵素Ｍ、補酵素Ｑ、アセチルＣｏ−Ａ、モリブドプテリン、ピロロキノリンキノン、テトラヒドロビオプテリンの、化合物、塩、複合体および／または誘導体である。
【００４１】
本発明による核酸構成要素は、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシル、キサンチンおよび／またはヒオキサンチンのような核酸塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、キサントシン、イノシン、グアノシンおよびチミジンのようなヌクレオシド、ならびに、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡのような、そのデオキシ−および／またはリン酸塩誘導体および／または二量体、三量体および／またはポリマーを包含するがこれに限られない、アデノシン一リン酸もしくはアデノシン二リン酸もしくはアデノシン三リン酸などのヌクレオチド、である。
【００４２】
使用される濃度で細胞成長特性に有意に悪影響を及ぼすことなしに、媒体および／またはその構成要素の１以上の清澄性および／または溶解性を増加させるような、しかしこれに限られない、媒体の物理化学的特性を改善する構成要素を添加してもよい。かかる構成要素は、これに限られるものではないが、キレート化剤（例として、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤、洗浄剤、界面活性剤、乳化剤（ポリソルベート８０のような）、中和剤、（ポリソルベート８０のような）、ミセル形成剤、ミセル阻害剤および／またはポリプロピレングリコール、ポリエチレンアルコールおよび／またはカルボキシメチルセルロースを包含する。
【００４３】
媒体は、典型的には、糖および／または糖混合物および／または糖二量体および／または糖ポリマーおよび／またはそれらの誘導体などの炭水化物を含有する。典型的には、グルコースおよび／またはラクトースおよび／またはガラクトースが、主要な炭水化物の糖構成要素になり得る。グルコースは、通例、水性の媒体溶液中に０．００１ｍＭ〜２５０ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭ、さらにより好ましくは５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で、媒体に包含され得る。
【００４４】
典型的には、媒体は、各アミノ酸を、液体媒体のリットルあたり１０ｍｇから３ｇまでの範囲で、好ましくはリットルあたり４０ｍｇから１ｇまでの範囲で含む。
媒体は、典型的にはビタミンを含む。媒体中のビタミンの典型的な量は、液体媒体のリットルあたり５μｇ〜１０ｍｇ、好ましくはリットルあたり５０μｇ〜６ｍｇの範囲にある。
【００４５】
典型的に、媒体は塩を含む。１つのタイプの塩の量は、典型的には、液体媒体のリットルあたり２μｇ〜５ｍｇ、好ましくはリットルあたり１０μｇ〜１．５ｍｇの範囲にある。個別の塩はまた、はるかに高い量で存在していてもよく；ＮａＣｌの濃度は、例えば、液体媒体のリットルあたり３０ｇであり得る。
媒体中に含まれる核酸の典型的な量は、液体媒体のリットルあたり０．５〜１０ｍｇ、好ましくはリットルあたり１〜５ｍｇの範囲にある。
【００４６】
媒体は、典型的には、全てのタンパク新生のアミノ酸（および／またはそれらの誘導体および／またはそれらのコンジュゲートおよび／またはそれらの二量体（純粋および／または混合の））を含有する。
他の定義された構成要素もまた、インジケーター、例として、ｐＨインジケーターのように、微生物の検出または同定を助けるために加えられてもよい。 
【００４７】
本発明による培養媒体は、少なくとも１つの発色性または蛍光発生基質をさらに含むことができる。蛍光発生基質は、微生物により合成された酵素との接触で切断されて蛍光を発する複合分子である。発光した蛍光は、視覚的に、および／または、ＵＶもしくは可視スペクトルでの放射線を使用して成長媒体を照射することによる分析機器で、検出可能である。蛍光発生基質の例は、フルオレセイン誘導体（ＣＦＡ、ＣＦＤＡ）、メチルウンベリフェロン誘導体、またはAldols（商標）（Biosynth社により開発された）である。
【００４８】
発色性基質は、それらが、例として、微生物の個別の酵素によって、変性されたときに、その色を変化させる基質である。発色性基質の例は、ＯＮＰＧ（オルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）またはＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−ガラクト−ピラノシド）である。この場合において、ある興味の対象の微生物の成長の後の媒体の色は変色し、およびかかる微生物を示唆するものとなる。
【００４９】
典型的に好適な細胞培養媒体は、２〜５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜３０ｇ／Ｌの典型的な組成を有する。ゲル化剤を有する媒体は、典型的には、ゲル化剤に起因する１ｇ／Ｌと５０ｇ／Ｌとの間の、より好ましくは２ｇ／Ｌと３０ｇ／Ｌとの間の、追加の重量を有する。
媒体の浸透圧は、典型的には、５０ｍＯｓｍと１０００ｍＯｓｍとの間、より好ましくは１５０ｍＯｓｍと５００ｍＯｓｍとの間である。
【００５０】
媒体サプリメントは、細胞培養を開始することに先立って細胞培養ベース媒体に、または、細胞培養の間に１回以上細胞培養物に加えられる細胞培養媒体である。細胞培養の間に加えられる媒体サプリメントは、典型的には、液体の形式で加えられる。これは、しばしば、粉末はかき混ぜることや攪拌なしには簡単に溶解しないという事実に起因する。しかし、細胞培養の間は、細胞の散乱を引き起こすのでかき混ぜることや攪拌が可能ではないことが考えられる。本発明の３Ｄプリントされた固体細胞培養媒体形態は、実行中の細胞培養にさえも固体形態で添加されるのに適しているということが見出されている。３Ｄプリントされた錠剤の溶解特性は、例として、速いもしくは遅い溶解に至らせるある助剤を使用することにより、および／または、固体形態の溶解のふるまいにもまた影響するある構造を有する３Ｄプリンティング固体形態により、設定することができる。
【００５１】
媒体サプリメントは、生物薬品の基礎を形成するタンパク質の生産のためのＣＨＯ細胞培養のような哺乳動物細胞培養においてしばしば使用される。この適用のために媒体サプリメントを使用することの利点は、細胞の成長条件をカスタマイズすること、細胞生存率および成長を改善すること、および細胞をより長い間より健全にしておくことを包含する。
哺乳動物細胞培養のために使用される媒体サプリメントの例は、２−メルカプトエタノール、脂質を含むサプリメント、１以上のアミノ酸を含むサプリメント、１以上のビタミンを含むサプリメント、ウシ血清アルブミン、プルロニックＦ６８、コレステロール、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、トランスフェリンおよびインスリンである。とりわけ好ましいものは、好ましくはシステイン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、ヒスチジンおよび／またはメチオニンのような１以上のアミノ酸、および／または、リボフラビン、チアミン、葉酸および／またはビタミンＢ１２のような１以上のビタミンを含むサプリメントである。
【００５２】
例として微生物学的応用において、使用されるサプリメントは、例えば、全てのまたは選択された細胞の成長を支持するサプリメント、抗生物質サプリメント、または発色性サプリメントである。サプリメントの例は、リン酸４−メチルウンベリフェリル二ナトリウム、アクリフラビン、アムホテリシンＢ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、ブリリアントグリーン、炭酸カルシウム、セフィキシミド（Cefiximide）、セフォペラゾン、セフォテタン、セフスロジン、セフタジディム（Ceftazimide）、セファロチン、セトリミド、コリスチン硫酸塩、−シクロヘキシジン、Ｄ−シクロセリン、ホスホマイシン、フシジン、イルガサン、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール、リチウムムピロシン、ナリジクス酸、ノボビオシン、ウシ胆汁、オキシテトラサイクリン、ポリミキシンＢ硫酸塩、亜テルル酸カリウム、テトラチオン酸カリウム、リファンピシン、トリメトプリム乳酸塩またはバンコマイシン、またはそれらの組み合わせであり、最も好ましいものは、アクリフラビン、アムホテリシンＢ、セフォペラゾン、セフスロジン、セフタジディム（Ceftazimide）、セトリミド、シクロヘキシジン、ナリジクス酸、ノボビオシン、ポリミキシンＢ硫酸塩、亜テルル酸カリウム、トリメトプリム乳酸塩またはバンコマイシン、またはそれらの組み合わせである。
【００５３】
サプリメントは、単一の構成要素として、または上で言及したサプリメント構成要素の１以上の混合物として、または上に挙げた１以上の他の細胞培養媒体成分とのもしくは細胞培養に適しているとみなされるあらゆる他の構成要素との混合物として、本発明による固体形態中に存在し得る。
【００５４】
加法的製造としても知られる３Ｄプリンティングは、該オブジェクトを製作するためのデジタルファイルに基づいてコンピューター制御下で材料の層を形成することによる、３次元固体オブジェクトを製作するために使用するプロセスを指す。３Ｄプリントされた物体の製作は、いわゆる加法的プロセスを使用することによって達成される。加法的プロセスでは、オブジェクトが製作されるまで、連続的な材料の層を敷くことにより、オブジェクトが製作される。これらの層の各々は、最終的な物質の薄くスライスされた水平断面として見ることができる。３Ｄプリンティングは、金属またはプラスチックのピースを事例としてはフライス盤（milling machine）で切り出す／くり抜く減法製造の逆である。
【００５５】
３Ｄプリンティングのための数種の技術が、当業者に知られている。プリントされる構成要素または構成要素の混合物に依存して、ある３Ｄプリンティング技術は、他の物よりもより好適であることが考えられる。３Ｄプリンティングの技術分野の当業者は、所与の組成物についての好適な３Ｄプリンティング技術を選ぶことができる。
好適な３Ｄプリンティング技術の例は、熱溶解積層法、ポリジェット（Polyjet）３Ｄプリンティング、バインダージェッティング、液槽重合、または選択的レーザー焼結である。
【００５６】
溶融フィラメント（ＦＦ）作製およびペースト押出とも呼ばれる熱溶解積層法では、３Ｄプリントされる組成物のフィラメントが溶融され、およびノズルを通して分配される。
組成物、典型的にはポリマー鎖は、加熱されおよび小さなチップ（典型的には５０〜１００□ｍ）を通して押し出され、および次いでビルドプレート上で固化する。ＦＦ技術は、コストの（典型的なシステムは£８００〜２０００のコストがかかる）、中空のオブジェクトを作製する能力の、および広範なポリマーをプリントするユーティリティーの、有意な利点を有する。プリンター原料は、押し出されるポリマーフィラメントであり、典型的には直径１．７５〜３ｍｍである。ＦＦ ３ＤＰの最も重要な利益の１つは、プリントされる剤形に該化合物がロードされるように化合物をポリマーフィラメント中に組み入れることが原則として可能であるということである。
技術についてのさらなる詳細は、当業者に知られており、および例として、Goyanes et al. Int J Pharm. 2014 Dec 10;476(1-2):88-92において見出すことができる。
【００５７】
マルチジェット３Ｄプリンティングとも呼ばれるポリジェット３Ｄプリンティングでは、構築および支持材料が選択的に噴射されおよびＵＶ照射により硬化される。
同時の複数のノズルの使用は、粉末床３Ｄプリンティングおよび熱溶解積層法などの他の技術を超えてこのプロセスのプリンティング速度を改善することができる。速いプリンティングスピードと、光への短い露出に際した迅速な重合との組み合わせは、錠剤の迅速な生産を結果としてもたらす。
技術についてのさらなる詳細は、当業者に知られており、および例として、Acosta-Velez et al. Bioengineering (Basel). 2017 Mar; 4(1): 11において見出すことができる。
【００５８】
粉末床およびインクジェットヘッド３Ｄプリンティングとも呼ばれるバインダージェッティングでは、液体の結合剤が、選択的に積層されて粉末を繋ぎ合わせる。
物体は、コンピューター支援設計（ＣＡＤ）ソフトウェアの使用を通して定義され、および、プロセスを通してプリントされる層の１つずつを描く詳細な情報にデジタル的にスライス化される。各層の堆積の後、粉末床を支持するピストンが下げられ、後続する粉末の層を広げ選択的に結合させることを可能にする。このプロセスは、所定の３Ｄ幾何学的形状が製造されるまで、固化された材料を積み重ねて数回繰り返される。結合しなかった過剰な粉末は、次いで取り去られて最終製品を露出させ、これはその最終的な機械的および物理的特性を整えるためのさらなる加工を経ることができる。技術についてのさらなる詳細は、当業者に知られており、および例として、Acosta-Velez GF, Wu BM. 3D Pharming: Direct Printing of Personalized Pharmaceutical Tablets. Polym Sci. 2016, 1:2において見出すことができる。
【００５９】
ステレオリソグラフィとも呼ばれる液槽重合では、液体のフォトポリマーが重合により選択的に硬化される。コヒーレント光源（通例ではＵＶの範囲で発光するレーザー）が、当初液体である樹脂の重合および架橋を誘導するために使用される。構造の１つのスライスを生産するのに必要な時間は、したがって、レーザービームでスキャンするスピードおよび照射される面積に依存する。レーザービームの横方向の位置は、通例では、ガルバノスキャナー内の１対の鏡によって制御される。他のほとんどの３Ｄプリンティング技術でもそうであるように、プロセスは、１層ずつの様式で遂行される。スライス情報は、平面に沿ったレーザービームの位置を案内する、２つの鏡の傾斜角を定義する１セットの座標の形で提示される。層の１つ１つ全てのピクセルが順次照射されるという事実は、理論上は、１つ１つ全てのピクセルについて別々に、レーザー強度を制御することによる、照射線量の調整を可能にする。
技術についてのさらなる詳細は、当業者に知られており、および例として、Samuel Clark Ligon et al., Chem Rev. 2017 Aug 9; 117(15): 10212‐10290において見出すことができる。
【００６０】
粉末床溶融結合（power-bed fusion）とも呼ばれる選択的レーザー焼結では、材料を融解により融合するために、集中させた（focused）熱エネルギーを使用する。
選択的レーザー焼結（ＳＬＳ）３次元プリンティングは、プラスチック、金属およびセラミックの物体の工業的製造のために今のところ使用されている。ＳＬＳは、数種の技術分野に適用することができる汎用的で実用的な３Ｄプリンティング技術である。技術についてのさらなる詳細は、当業者に知られており、および例として、Fina et al. Int J Pharm. 2017 Aug 30; 529(1-2):285-293において見出すことができる。
【００６１】
３Ｄプリンティングのためのある方法が、３Ｄプリントされた細胞培養媒体の固体形態を作るのにとりわけ適しているということが見出されている。
プロセスは、柔軟な様式で、かつ細胞培養媒体成分の生産に要求される高い品質基準に準拠した固体形態の生産を可能にする、非接触のレーザープリンティングプロセスである。
プロセスは、レーザーエネルギー吸収層と少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層とを含む複合層を使用する。固体細胞培養媒体形態は、後続するレーザービームの手段による１つのものから他のものへの成分含有層の移動により築き上げられる。
【００６２】
様々な波長のレーザービームの助けで、層の上に層を連続的にプリントしおよび組み立てることが可能である。プリンティングおよび組み立ては、ａ）レーザーエネルギー吸収材料そのもの（炭化、発泡に起因する熱増加および体積増加を生じさせる固有反応）への、および、ｂ）複合層から組み立てプラットフォーム上へと移動させられる少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する媒体への、レーザーエネルギーの作用を通して実施される。好適なエネルギーおよび波長のレーザービーム（例えばＮｄ：Ｙａｇレーザー）がレーザーエネルギー吸収材料に衝突し、およびこれが、細胞培養媒体成分を含有する層で覆われている場合には、細胞培養媒体成分含有層は、載置プレートへ移動させられ（プリントされ）、それは、その上へ固定されてもよい（例として、真空によって）。このやり方で繰り返して、３Ｄ形態（例として、錠剤）への１層ずつの組み立てが提供される。プリンティングおよび組み立てのために実際に要求されるレーザーエネルギー吸収材料の量は、レーザーのタイプ、エネルギー出力、プリンティングスピード、レーザーエネルギー吸収層の層厚、フィルム材料厚さおよび細胞培養媒体成分含有層の接着（および移動のための力）、組み立てステップの滞在時間、に依存する。
【００６３】
本発明は、以下のステップ
（ａ）レーザーエネルギー吸収層（１）および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）を含む複合層（３）を、レーザーエネルギーの発生源（５）によって活性化されることができるレーザービームについて透過性であるプレート（４）と載置プレート（６）との間に、そこで少なくとも１つの細胞培養媒体成分（２）を含有する複合体の層がレーザーエネルギーの発生源（５）とは反対側に位置させられかつ載置プレート（６）に対面するように、位置させること；
（ｂ）細胞培養媒体成分含有層（２）を含む複合層（３）と、載置プレート（６）と、の間に空間（８）を形作るために載置プレート（６）を下げること；
（ｃ）レーザーエネルギーの発生源（５）からのレーザービームの作用により、複合体（３）の細胞培養媒体成分含有層（２）を載置プレート（６）上へと移動させること；
（ｄ）固体細胞培養媒体形態を築き上げるのに必要なだけの回数、ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返すこと；
（ｅ）載置プレートから固体細胞培養媒体形態を取り去ること
を含む、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む固体の３Ｄプリントされた細胞培養媒体形態の製造のためのプロセスに向けられる。
【００６４】
本発明の代替的な態様において、載置プレート（６）は、垂直方向に動かすことができるエリアを含む。ステップ（ｂ）においてプロセスを実行しているとき、載置プレート全部ではなく可動エリアのみが下げられる。したがって、本発明は、以下のステップ
（ａ）レーザーエネルギー吸収層（１）および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）を含む複合層（３）を、レーザーエネルギーの発生源（５）によって活性化されることができるレーザービームについて透過性であるプレート（４）と、載置プレートに対して相対的に垂直方向（ｚ軸）に動かすことができる少なくとも１つのエリア（７）を含む載置プレート（６）との間に、そこで少なくとも１つの細胞培養媒体成分（２）を含有する複合体の層がレーザーエネルギーの発生源（５）とは反対側に位置させられかつ載置プレート（６）に対面するように、位置させること；
（ｂ）細胞培養媒体成分含有層（２）を含む複合層（３）と、載置プレート（６）の可動エリア（７）と、の間に空間（８’）を形作るために可動エリア（７）を載置プレート（６）に対して相対的に下げること；
（ｃ）レーザーエネルギーの発生源（５）からのレーザービームの作用により、複合体（３）の細胞培養媒体成分含有層（２）を、載置プレート（６）に対して相対的に下げられた可動エリア（７）によって形作られた空間（８’）中へと移動させること；
（ｄ）固体細胞培養媒体形態を築き上げるのに必要なだけの回数、ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返すこと；
（ｅ）載置プレートから固体細胞培養媒体形態を取り去ること
を含む、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む固体細胞培養媒体形態の製造のためのプロセスに向けられる。
【００６５】
有利に、載置プレート（６）中の可動エリア（７）は、固体細胞培養媒体形態が取り去られる前に載置プレートの上側に対して相対的に同じレベルまで持ち上げられる。
本明細書中で使用する用語「複合体層」は、互いに付着している少なくとも２つの層を含み、該層の各々が異なる機能および組成を有する異なる材料を含んでなる層を意味する。本発明に従って、複合層は、少なくとも、レーザーエネルギー吸収層と、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層とを含む。複合層の一部分として存在することができるさらなる層の例は、本特許出願に定義および／または例証されるとおりの、分離層（単数または複数）および接着層（単数または複数）を包含する。
【００６６】
本明細書中で使用する用語「レーザーエネルギー吸収層」は、本特許出願に定義および／または例証されるとおりのレーザーエネルギー吸収材料を含有する層を意味する。レーザーエネルギー吸収層は、レーザーエネルギー吸収材料が埋め込まれているおよび／または層の全部にわたって分布している１つの層であってもよいが、レーザーエネルギー吸収材料を含有しない層（単数または複数）（支持層）（１’）および／または（１'''）でその片側または両側を覆われたレーザーエネルギー吸収材料を含有する層（１''）を含む、層のアセンブリであってもよい。
【００６７】
レーザービームについて透過性であるプレートは、移動（ステップ（ｃ））の間は載置プレートに対して相対的に固定の位置にあり、および、レーザービームによってトリガーされた複合層の体積膨張の際にレーザー透過プレート表面に対して相対的に垂直方向（下向き）での細胞培養媒体成分含有層の移動のために必要であるバックパワー（back power）を提供するのに十分な機械的強度を有していなければならない。プレートは、レーザービームについて透過性でありかつ移動ステップのために必要なバックパワーを提供するのに十分な機械的強度を有するあらゆる材料からなることができる。好適な材料は、例えば、石英ガラスまたはホウケイ酸ガラスなどのガラスを包含する。
【００６８】
本明細書中で使用するとおり、「a」または「an」は、１以上を意味する。本明細書中で使用するとおり、単語「含む（comprising）」との接続において使用するとき、単語「a」または「an」は、１つまたは１つより多いことを意味する。本明細書中で使用するとおり、「別の（another）」は、少なくとも２つ目またはそれ以上を意味する。そのうえに、文脈によって別様に要求されない限り、単数形の用語は複数形を包含し、および複数形用語は単数形を包含する。
本明細書中で使用するとおり、「約（about）」は、明示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、分数、および百分率を包含する、数値を指す。用語「約」は、列挙されている値と均等である（例として、同じ機能または結果を有する）ものと当業者が考える数値の範囲（例として、列挙されている値の＋／−１〜３％）を一般的に指す。いくつかの事例において、用語「約」は、最も近い有効数字まで丸められた数値を包含することがある。
【００６９】
固体細胞培養媒体形態の形状は、単純にレーザービームの照射エリアを制御することによって簡単に決定することができる。照射エリア、すなわち、レーザービームによって活性化される複合体のエリアが、レーザー活性化によって移動させられる細胞培養媒体成分含有層のエリアを定義する。照射エリア細胞培養媒体成分含有層の形状を制御することによって、矩形、正方形、十字形、円形または楕円形などのあらゆる所望の形状を移動させることができる。異なる形状を有する細胞培養媒体成分含有層を組み立てることによって、あらゆる３次元形状の固体形態を簡単に得ることができる。本発明のプロセスは、固体形態の形状に関して、広い柔軟性を提供する。有利に、固体形態の形は、様々な個別の需要に簡単に適合することができ、および、加えて、従来型の錠剤製造プロセスによっては利用可能とすることができない新たな形状を可能にする。
【００７０】
本発明のプロセスは、細胞培養媒体成分を含有する層を使用する。細胞培養媒体成分が層の中に埋め込まれているので、必ずしも純粋な細胞培養媒体成分を取り扱う必要がなく、そのためかかる取り扱いに関連する問題点が回避される。細胞培養媒体成分含有層は、閉鎖型ハウジングや大掛かりな清掃操作などの保護対策を要するであろう塵の形成および作業環境のコンタミネーションを回避するように、単純に互いに付着している。
【００７１】
さらに、異なる用量および／または異なる細胞培養媒体成分を有する固体形態を、簡単な様式で製造することができる。例えば、異なる用量であるが同じ細胞培養媒体成分を有する固体形態は、単純に、互いに付着する細胞培養媒体成分含有層の数を制御することによって、製造することができる。同じ細胞培養媒体成分を有するが、細胞培養媒体成分の一部分が即時放出様式で放出され、および細胞培養媒体成分の別の一部分が持続的放出様式で放出される投与形態である、などの異なる放出特性を有する固体形態は、即時放出特性を有する細胞培養媒体成分含有層と持続的放出特性を有する細胞培養媒体成分含有層とを組み立てることによって製造することができる。同様の様式で、異なる細胞培養媒体成分を有する固体形態は、異なる細胞培養媒体成分が細胞培養媒体成分含有層中の混合物として存在する、および／または異なる細胞培養媒体成分が異なる細胞培養媒体成分含有層中に存在する、細胞培養媒体成分含有層を組み立てることによって、提供することができる。細胞培養媒体成分が互いに対して不適合である場合には、後者が好ましい。
【００７２】
個別の細胞培養媒体成分を有する固体形態の製造から、異なる細胞培養媒体成分を有する異なる固体形態への切り替えは、追加のセットアップ時間なしに、単純に１つの細胞培養媒体成分を含む層を含む複合層を別の細胞培養媒体成分を含む層を含む別の複合層に変更することによって行うことができる。異なる放出特性を有する同じ細胞培養媒体成分を１つの形態が含有する、または互いに対して不適合である異なる細胞培養媒体成分が存在する、固体形態もまた、本発明のプロセスを使用して、後から異なる複合層（異なる細胞培養媒体成分および／または細胞培養媒体成分放出特性を有する）をその固体形態の製造において使用することにより、簡単に製造することができる。本発明のプロセスは、最大限の柔軟性を提供し、および、時間のかかる清掃操作の必要なしに速くて簡単な操作を可能にし、よって、分散的な様式での、個別の目的のために適合される、個別的に構成された固体細胞培養媒体形態の製造にも適している。
【００７３】
本発明の好ましい態様によると、固体形態は、載置プレートまたは可動エリアでの組み立ての間、真空によって固定される。よって、本発明は、固体形態を、その組み立ての間、載置プレート（６）またはその可動エリア（７）上に保持するために、真空チャック（９）を介して真空が適用されることを特徴とするプロセスにもまた向けられる。
【００７４】
本発明のプロセスで使用される複合層は、シートまたはテープであり得る。それを簡単に取り扱うことができるので、および、ロール・ツー・ロール移送機構を使用することによってそれの簡単な位置決め（ステップ（ａ））を可能にするので、テープが好ましい。したがって、本発明は、複合層（３）がテープ（３’）として提供されることおよびステップ（ａ）における複合層（３）の位置決めがロール（１１）・ツー・ロール（１１’）移送によって達成されることを特徴とするプロセスにもまた向けられる。
【００７５】
有利に、複合層およびその移送のためのロール（１１）・ツー・ロール（１１’）機構はカセット（１６）中に統合され、これは複合層の簡単な取り扱いおよび本発明のプロセスにおけるその使用を可能にする。したがって、本発明は、ロール（１１）・ツー・ロール（１１’）移送機構を有し、かかるロール（１１）・ツー・ロール（１１’）移送機構が複合層（３）を備えている、カセット（１６）にもまた向けられる。好ましくは、カセットは、垂直方向（ｚ軸）における上下に動かすことができるポジショナーロール（４）、（４''）を含む。これは、その操作の状態に従属して複合層（３）の載置プレート（６）への押し付け／押し下げを可能にする。
【００７６】
本発明のさらに好ましい態様において、載置プレートは、保護テープによって覆われており、これは、固体形態の製造の完了の後、新たな固体形態を組み立てるための空いている場所を提供するために、載置プレート（ｘ軸）に沿って動かされる。よって、本発明は、載置プレートが保護テープ（１０）によって覆われており、およびかかる保護テープ（１０）は、固体形態の製造の完了の後、新たな固体形態を組み立てるための空いている場所を提供するために、載置プレート（６）（ｘ軸）に沿って動かされることを特徴とするプロセスにさらに向けられる。有利に、保護テープは、製造プロセスが１つの固体形態から、異なる細胞培養媒体成分（単数または複数）および／または助剤を含有する別のそれへと変更されるときに、材料の、とりわけ細胞培養媒体成分の、クロスコンタミネーションを回避するために、新しいものに簡単に置き換えられる（交換される）ことができる。
【００７７】
保護テープは、テープとして製造することができ、かつ、複合層、とりわけ細胞培養媒体成分含有層からの材料によるコンタミネーションからの載置プレートの保護を提供する、あらゆる材料で作られることができる。好ましくは、保護材料は、それの上に配置される固体形態がそれの下にあるチャックを通して真空を適用されることにより固定されることができるように、空気に透過性である。保護テープに適した材料は、バージンパルプ紙である。上に記載されたとおり保護テープが使用される場合には、本発明のプロセスを、固体形態の製造から、異なる細胞培養媒体成分（単数または複数）を含有する別の固体形態へ切り替えるときに、清掃操作が必要ない。
【００７８】
本発明の好ましい態様によると、保護テープは、ロール・ツー・ロール移送機構を使用することによって動かされる。よって、本発明は、保護テープ（１０）がロール（１２）・ツー・ロール（１２’）移送機構を使用することによって動かされることを特徴とする本発明のプロセスにもまた向けられる。
【００７９】
本発明のプロセスは、レーザーエネルギー吸収層および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層を含む複合層を要する。したがって、本発明は、レーザーエネルギー吸収層（１）および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）を含む本発明のプロセスのために使用可能な複合層にもまた向けられる。
【００８０】
本発明の態様によると、複合層のレーザーエネルギー吸収層は、プラスチック材料の支持層（単数または複数）でその片側または両側を覆われたレーザーエネルギー吸収材料を含む。プラスチック材料は、レーザーエネルギー吸収材料を環境および細胞培養媒体成分含有層から隔絶し、および、とりわけ成分含有層および組み立てられた固体細胞培養媒体形態のコンタミネーションを防止する。よって、本発明は、レーザーエネルギー吸収層（１）がその片側または両側をプラスチック材料の支持層（１’）、（１'''）で覆われたレーザーエネルギー吸収材料を含む層（１''）を含むことを特徴とする、複合層にさらに向けられる。かかる態様において、支持層（１’）および／または（１'''）とレーザーエネルギー吸収材料を含有する層（１''）とは、ユニットとして互いに接合される。支持層は、層（１’）の材料および／または厚さが、層（１'''）と同じであり得るかまたは異なり得る、プラスチック材料から作ることができる。
【００８１】
本発明の代替的な態様において、レーザーエネルギー吸収材料は、プラスチック材料中に埋め込まれ、およびエネルギー吸収層の全部にわたって分布している。環境および細胞培養媒体成分層のレーザーエネルギー吸収材料によるコンタミネーションは、そのプラスチック材料中への埋め込みによって防止される。斯くして、本発明は、エネルギー吸収層（１）が、レーザーエネルギー吸収材料がプラスチック材料内に分布している１つの層からなることを特徴とする、複合層にさらに向けられる。
【００８２】
レーザーエネルギー吸収層中に存在するレーザーエネルギー吸収材料の被覆および／または埋め込みに適しているプラスチック材料は、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリ（メチルメタクリラート）（ＰＭＭＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、ポリアミド（ＰＡ）、アラミド（ポリアラミド）、（ＰＰＴＡ、Kevlar（登録商標）、Twaron（登録商標））、ポリ（ｍ−フェニレンテレフタルアミド）（ＰＭＰＩ、Nomex（登録商標）、Teijinconex（登録商標））、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）のようなポリケトン、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ、ＰＥＴＥ）、ポリカーボナート（ＰＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリウレタン（ＰＵ）、Kapton KおよびKapton HN（ポリ（４，４’−オキシジフェニレン−ピロメリットイミド）である）、ポリ（オルガノ）シロキサン、メラミン樹脂（ＭＦ）、の群からのポリマーを含む。したがって、本発明は同様に、プラスチック材料が、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチロール（ＰＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリ（メチルメタクリラート）（ＰＭＭＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、ポリアミド（ＰＡ）、アラミド（ポリアラミド）、（ＰＰＴＡ、Kevlar（登録商標）、Twaron（登録商標））、ポリ（ｍ−フェニレンテレフタルアミド）（ＰＭＰＩ、Nomex（登録商標）、Teijinconex（登録商標））、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）のようなポリケトン、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ、ＰＥＴＥ）、ポリカーボナート（ＰＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリウレタン（ＰＵ）、Kapton KおよびKapton HN（ポリ（４，４’−オキシジフェニレン−ピロメリットイミド）である）、ポリ（オルガノ）シロキサン、メラミン樹脂（ＭＦ）、の群からのポリマーの群から選択されることを特徴とする、複合層にも向けられる。
【００８３】
プラスチック材料は、例えば、ポリマー押出、鋳造、カレンダー加工、およびブロー成形によってなど、当技術分野において知られている方法を使用して層へ加工することができる。かる方法を使用して、レーザーエネルギー吸収材料なしの層（支持層）を、およびレーザーエネルギー吸収材料を含有する層と同様に、調製して利用可能にすることができる。
【００８４】
本明細書中で使用する用語「レーザーエネルギー吸収材料」は、レーザー光を吸収してそれをいくらかの熱への広がりに変換するあらゆる材料を意味する。原則として、あらゆるレーザーエネルギー吸収材料を本発明に使用することができる。本発明にとりわけ適しているレーザーエネルギー吸収材料は、酸化インジウム、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、酸化アンチモンスズ（ＡＴＯ）、酸化アンチモン、酸化スズ、酸化亜鉛、酸化アルミニウム亜鉛（ＡＺＯ）、金属酸化物の混合物、硫化亜鉛、硫化スズ、カーボンブラック、グラファイト、金属酸化物、ケイ酸塩、金属酸化物でコーティングされたマイカまたはＳｉＯ２フレーク、導電性顔料、硫化物、リン酸、ＢｉＯＣＩ、アントラセン、ペリレン、リレン、ペンタエリスリトール、またはそれらの２以上の材料の混合物である。
【００８５】
よって、本発明は、レーザーエネルギー吸収材料が酸化インジウム、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、酸化アンチモンスズ（ＡＴＯ）、酸化アンチモン、酸化スズ、酸化亜鉛、酸化アルミニウム亜鉛（ＡＺＯ）、金属酸化物の混合物、硫化亜鉛、硫化スズ、カーボンブラック、グラファイト、金属酸化物、ケイ酸塩、金属酸化物でコーティングされたマイカまたはＳｉＯ２フレーク、導電性顔料、硫化物、リン酸、ＢｉＯＣＩ、アントラセン、ペリレン、リレン、ペンタエリスリトール、またはそれらの２以上の材料の混合物であることを特徴とする、複合層にもまた向けられる。
【００８６】
レーザーエネルギー吸収材料は、加工可能でありプロセスを実行するのに適した熱生成および分布を提供するあらゆる粒子サイズで、レーザーエネルギー吸収層中に存在し得る。本発明の好ましい態様によると、複合層は、エネルギー吸収層中に存在するレーザーエネルギー吸収材料が約５０ｎｍから約１５０ｎｍまでの平均粒径を有することを特徴とする。
レーザーエネルギー吸収材料は、それがプロセスを実行するのに適した量で熱を提供するのに十分である量で、レーザーエネルギー吸収層中に存在し得る。本発明の好ましい態様によると、複合層は、レーザーエネルギー吸収層（１）が０．０１〜２０重量％のレーザーエネルギー吸収材料を含むことを特徴とする。
【００８７】
本発明のプロセスは、その両方ともが細胞培養媒体成分含有層を載置プレートへのまたは載置プレートの可動エリアへの移動に至らせる、レーザービームの活性化の結果としてのレーザーエネルギー吸収層の体積膨張およびレーザーエネルギー吸収材料の熱生成に基づく。体積膨張は、レーザーエネルギー吸収層中に存在するプラスチック材料の発泡から生じ、および、それは熱およびガス発生、とりわけ、プラスチック材料における炭化（ＣＯ２発生）、および後続する冷却に際して生成する気泡の冷凍に誘導される。体積増加は、エチレン／エチレンアクリラートの共重合体、エポキシ樹脂、ポリエステル、ポリイソブチレン、ポリアミド、ポリスチレン、アクリルポリマー、ポリアミド、ポリイミド、メラミン、ウレタン、ベンゾグアナミン（benzoguanine）およびフェノール樹脂、シリコーン樹脂、微粉化セルロース、フッ素化ポリマー（とりわけ、ＰＴＦＥ、ＰＶＤＦ）および充填剤としての微粉化ワックスまたはそれらの混合物、の存在によって促進することができ、これらは分解して発泡、ガス放出および冷凍に起因して体積増加を与える。
【００８８】
したがって、本発明は、レーザーエネルギー吸収層（１）がエチレン／エチレンアクリラートの共重合体、エポキシ樹脂、ポリエステル、ポリイソブチレン、ポリアミド、ポリスチレン、アクリルポリマー、ポリアミド、ポリイミド、メラミン、ウレタン、ベンゾグアナミン（benzoguanine）およびフェノール樹脂、シリコーン樹脂、微粉化セルロース、フッ素化ポリマー（とりわけ、ＰＴＦＥ、ＰＶＤＦ）および充填剤としての微粉化ワックスまたはそれらの混合物を含有することを特徴とする、複合層にさらに向けられる。
【００８９】
体積増加を促進するためのポリマーは、レーザーエネルギー吸収材料を埋め込むためのプラスチック材料へ混和される。それらは、レーザーエネルギー吸収材料を埋め込むためのプラスチック材料とともに均一な材料を形成するためにプラスチック材料中に、例えば溶融押出によって、溶解することができ、または、混和されて粒子としてかかるプラスチック材料内で維持されることができる。混和されて粒子として維持される場合、体積増加を促進するためのポリマーは、好ましくは、約１０ｎｍから約２０μｍまでの範囲にある平均粒子サイズを有する。
【００９０】
エネルギー吸収層中に存在するプラスチック材料は、細胞培養媒体成分含有層からレーザーエネルギー吸収材料を隔絶しおよび／または埋め込み、およびそれのレーザーエネルギー吸収材料とのコンタミネーションを防止するとはいえ、エネルギー吸収層を細胞培養媒体成分含有層からさらに分離することが望ましいことであり得る。細胞培養媒体成分含有層のコンタミネーションからの追加的な防止のほか、エネルギー吸収層を細胞培養媒体成分含有層から分離する層は、複合層の、その本発明のプロセスにおける使用のために必要な特性を向上させることがある。例えば、それは、移動ステップ（ステップ（ｃ））での複合層からの細胞培養媒体成分含有層の脱離特性を改善するということが考えられる。よって、本発明は、エネルギー吸収層（１）と少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）との間に位置する分離層（１３）を含むことを特徴とする複合層にもまた向けられる。
【００９１】
分離層は、層に加工することができ、かつレーザーエネルギー吸収層と細胞培養媒体成分含有層とに付着させることができ、かつ好適な脱離特性などの要求される特性を提供する、あらゆる材料から作ることができる。好適な材料は、スクロースまたはラクトースなどの二糖、でんぷん、セルロースまたはそれらの誘導体などの多糖、微結晶セルロースならびにヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、クロスカルメロースナトリウムなどのセルロースエーテル、などの変性セルロース、キシリトール、ソルビトールまたはマルチトールなどの糖アルコール、グルコース、のような糖、ゼラチンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、架橋ポリビニルＮ−ピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの合成ポリマー、ポロキサマー、トラガカント、アラビアガム（Gummi Arabicum）、蜜蝋、カンデリラワックス、カルナバワックス、セレシンワックス、マイクロクリスタリンワックス、オゾケライトワックス、ステアリン酸マグネシウム、パラフィンワックスなどの低融点ワックス、およびそれらの組み合わせ、を含み、とりわけ好ましいものは、 キシリトール、ソルビトールまたはマルチトールなどの糖アルコール、およびパラフィンワックス、およびそれらの組み合わせである。
【００９２】
よって、本発明は、分離層（１３）が、少なくとも、スクロースまたはラクトースなどの二糖、でんぷん、セルロースまたはそれらの誘導体などの多糖、微結晶セルロースならびにヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、クロスカルメロースナトリウムなどのセルロースエーテル、などの変性セルロース、キシリトール、ソルビトールまたはマルチトールなどの糖アルコール、グルコース、であり得る糖、ゼラチンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、架橋ポリビニルＮ−ピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの合成ポリマー、ポロキサマー、トラガカント、アラビアガム（Gummi Arabicum）、蜜蝋、カンデリラワックス、カルナバワックス、セレシンワックス、マイクロクリスタリンワックス、オゾケライトワックス、ステアリン酸マグネシウム、パラフィンワックスなどの低融点ワックス、およびそれらの組み合わせ、を含むことを特徴とする、複合層にもまた向けられる。分離層は、２μｍから１５０μｍまでの、好ましくは５μｍから１００μｍまでの、より好ましくは１０μｍから３０μｍまでの、および最も好ましくは１０μｍから２０μｍ、とりわけ約１７μｍの、厚さを有し得る。
【００９３】
細胞培養媒体成分含有層中に存在する細胞培養媒体成分の要求および固体細胞培養媒体形態の所望の放出特性に従属して、いくつかの場合には、本発明のプロセスにおける組み立ての間の細胞培養媒体成分含有層の１つのものの別のものへの十分な付着のために要求される物理化学的特徴、とりわけ接着特性を有する細胞培養媒体成分含有層を、提供することが困難なことがある。かかる場合においては、接着特性を有する追加の層、すなわち接着層を、複合体のエネルギー吸収層の外側へかつ反対側に位置する細胞培養媒体成分含有層状に配置することができる。
【００９４】
したがって、本発明は同様に、エネルギー吸収層（１）の外側へかつ反対側に位置する接着層（１４）を含むことを特徴とする複合層にも向けられる。移動ステップにおいて（ステップ（ｃ））、接着層はレーザーエネルギー吸収層から切り離されて、細胞培養媒体成分含有層と一緒に、載置プレートまたはそれの上の可動エリアへ移動させられる。
【００９５】
接着層に使用することができる材料は、細胞培養への悪影響を有さず、かつ、要求される接着特性を提供する、あらゆる材料とすることができる。接着層に使用することができる材料は、メチルセルロース、液体グルコース、トラガカント、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、デンプンペースト、ヒドロキシプロピルセルロース、アルファ化（pregelanized）デンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、アルギン酸（algenic acid）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、セルロース、アラビアガム（gummi arabicum）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはそれらの組み合わせを含む。好ましいものは、メチルセルロース、液体グルコース、トラガカント、ゼラチン、デンプンペースト、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、アルギン酸（algenic acid）、セルロース、アラビアガム（gummi arabicum）、およびそれらの組み合わせであり、とりわけ好ましいものは、ゼラチン、デンプンペーストおよびアルギン酸（algenic acid）である。
【００９６】
よって、本発明は、接着層（１４）がメチルセルロース、液体グルコース、トラガカント、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、デンプンペースト、ヒドロキシプロピルセルロース、アルファ化（pregelanized）デンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、アルギン酸（algenic acid）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、セルロース、アラビアガム（gummi arabicum）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、複合層にさらに向けられる。
【００９７】
本明細書中で使用する用語「少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層」および「細胞培養媒体成分含有層」は同義的に使用され、および、両方とも、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層を意味する。細胞培養媒体成分のほか、好適な助剤が、細胞培養媒体成分の分布のためのマトリックスを提供するために、ならびに、細胞培養媒体成分含有層の製造、それの本発明のプロセスにおける使用、および、固体形態がベース媒体である場合には溶媒への、固体形態が媒体サプリメントである場合には液体の細胞培養ベース媒体または細胞培養物への、固体形態の適用の後の細胞培養媒体成分の安定性および放出特性、のために必要であるフレームワークおよび特性を提供するために、層中に存在することが考えられる。少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層は、通例では、連続した途切れのない層である。
【００９８】
代替的には、しかしながら、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層は、定義された幾何学的形状（１９ｅ）〜（１９ｉ）、（２０ａ）〜（２０ｈ）（例として、四角形、矩形、六角形等々）を有する多数のピース（２’）に分割された層であって、例えば、レーザーエネルギー吸収層（１）または支持層（１'''）などの別の層によって互いに分離される層をもまた、網羅する。層が多数のピースに分割された細胞培養媒体成分含有層は、最初に、ピースの幾何学的形状を形作るための定義された幾何学的形状を有する彫り込まれたキャビティ（１''''）のあるレーザーエネルギー吸収層（１）を提供し、その後、例えばドクターブレードを使用することによって、エネルギー吸収層中のキャビティを、細胞培養媒体成分含有層を構成する材料で充填することにより、提供され得る、細胞培養媒体成分含有層は、５μｍから１０００μｍまでの、好ましくは、１０μｍから５００μｍまでの、より好ましくは３０μｍから２００μｍまでの、および最も好ましくは５０μｍから１００μｍの、とりわけ約７０μｍの、厚さを有し得る。
【００９９】
連続した途切れのない層（２）として形成された細胞培養媒体成分含有層を含む複合層（３）が本発明のプロセスにおいて使用された場合、連続した均質物体からなる固体形態が製造される。少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層が多数のピースに分割された複合層が使用される場合、固体形態は、それぞれ図２２および２３に例証されるとおり、閉じた構造を有するか、または開いた、多孔性の構造を有するかの、いずれのようにも製造することができる。固体形態からの細胞培養媒体成分の溶解および放出は、とりわけ、その幾何学的形状、および適用の後に環境に曝される表面に、従属する。
【０１００】
よって、多数のピースに分割された少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層を含む複合層を使用することによって、および固体形態への細胞培養媒体成分含有層の組み立ての間のそれらの配列の変化によって、その適用の後で溶媒へ露出する固体形態の形状および表面積を変更することは、固体形態の溶解／放出特性をニーズに適合させるための良い機会を提供する。
【０１０１】
よって、本発明は、多数のピースに分割された少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２’）を特徴とする複合層にもまた向けられる。本明細書中で使用する「多数の」または「複数の」は、ｃｍ２あたり少なくとも９ピースを意味する。好適な態様によると、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層は、ｃｍ２あたり１０〜２０、２０〜１０００または１０００〜１００００ピースに分割されている。
【０１０２】
本発明のさらなる適当な態様によると、多数のピースに分割された少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２’）は、四角形および／または矩形および／または丸形および／または楕円形でパターン化される。
本発明のさらなる適当な態様によると、多数のピースに分割された少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２’）は、１０μｍから２５００μｍまでの辺長さを有する複数の四角形、または１０μｍから３０００μｍまでの直径を有する複数の丸いドット、および１０μｍから２０００μｍまでの隣接する四角形までのギャップからなる。
【０１０３】
本発明のプロセスはまた、細胞培養媒体成分を含有しない層によって取り囲まれる細胞培養媒体成分含有層を含み、それによって、コア−シェル構造を形成する、固体細胞培養媒体形態の製造のためにも使用することができる。かかる態様において、細胞培養媒体成分含有層は、多数のピース（２’）に分割されており、細胞培養媒体成分を含まない層も同様に多数のピース（２''）に分割されている。
【０１０４】
代替的な態様において、シェルは、同じ細胞培養媒体成分を、例えばより高い用量などの異なる量で含有し、それは固体形態の投与の後に、（外側の）シェルの最初の溶解に起因して迅速に放出され、それが液体細胞培養媒体中の初期の高いレベルをコアからの同じ細胞培養媒体成分の放出の前に築き上げ、あるいは、異なる細胞培養媒体成分を含有し、それは固体形態の投与の後に、（外側の）シェルの最初の溶解に起因して、最初に、かつ、コアに存在する（異なる）細胞培養媒体成分の前に、放出され、それによって、異なる細胞培養媒体成分の、後続のおよび時間制御された放出を達成する。かかるコアシェル構造を有する固体形態の例は、図３０〜３３に例証されている。
【０１０５】
コア−シェル構造の細胞培養媒体成分の溶解および放出プロファイルは、需要に依存して広い範囲にわたって変化させられることができる。例えば、溶解プロファイルの調整は、系のシェルを築き上げる材料（例として、Eudragit L 100-55もしくはポリ酢酸ビニルフタラートなどの腸溶性コーティングまたはヒドロキシエチルセルロースなどの非腸溶性コーティング）および／またはシェル材料の厚さの精選によって、行うことができる。
【０１０６】
本発明のプロセスは、互いに付着している１以上の追加のシェルによってコア−シェル構造が取り囲まれた、１つより多いシェルを有するコア−シェル構造などのより複雑な系の製造をもまた可能にする。需要に依存して、内側のシェルは、しかしまた外側のシェルも、細胞培養媒体成分が同じであっても異なるものであってもよい１以上の細胞培養媒体成分を含有してもよい。この原則を適用することによって、その細胞培養媒体成分（単数または複数）は、個別の需要に従って所定の様式で放出される、様々な固体形態 が提供され得る。
【０１０７】
これは、現在のところ複雑なフィード戦略により、プロセスの間の時点で度々異なる媒体サプリメント（フェッドバッチにおいてはフィード培地とも呼ばれる）の添加を必然とする、フェッドバッチ細胞培養にとりわけ適している。これは、選択された細胞培養媒体成分の直接的および／または、および持続的放出を引き起こす本発明による固体形態を使用することにより、単純化することができる。
【０１０８】
本発明のプロセスは、固体形態内でのコミュニケーションデバイスの厳密な配置をもまた可能にする。コミュニケーションデバイスは、細胞培養における複合層の条件について情報を与えるために、固体細胞培養媒体形態中で使用されることがある。例えば、細胞培養媒体成分が放出される時間に関する情報を与えてもよい。この情報により、例として、フェッドバッチプロセスにおいて添加される固体形態のフィード戦略および組成は、さらに最適化されることができる。固体形態中配置することができるコミュニケーションデバイスの例は、ＲＦＩＤ（無線自動識別）タグ、および電磁信号デバイス、磁気デバイス、赤外線発光デバイスまたは超音波デバイスである。好ましくは、コミュニケーションデバイスは、ＲＦＩＤタグである。
【０１０９】
提供される情報に従属して、コミュニケーションデバイスを、固体形態の各層のあらゆる位置に配置することができる。以下では、コア・シェル系として配列された固体形態中に１以上のＲＦＩＤタグ（単数または複数）（２'''）が配置されたいくつかの態様が示されている（図３１〜３３）。勿論、ＲＦＩＤタグを、それぞれの配列内であらゆる他の場所にも配置することができる。
【０１１０】
細胞培養媒体成分含有層のための材料として使用することができる好適な助剤は、必要な構造および特性を提供し、および、例として錠剤化のための、助剤として適する、当技術分野において知られているすべての助剤である。かかる助剤は、例えば、例えばポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルセルロースなどの、マトリクス構築ポリマー、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウムなどの、崩壊剤、例えば塩化ベンザルコニウムまたはセトリミドなどの、界面活性剤、例えばポリメタクリラートなどの、接着剤、例えばポリ（β−ピネン）などの、粘着付与剤、等々を包含する。
【０１１１】
一例として、細胞培養媒体成分含有層のための材料は、細胞培養媒体成分、以下のリストからのバインダー、充填剤および接着剤の、高濃度の混合物であり得る：タルカム（Talkum）、炭酸マグネシウム、メチルセルロース、液体グルコース、トラガカント、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、デンプンペースト、ヒドロキシプロピルセルロース、アルファ化（Pregelanized）デンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、アルギン酸（Algenic Acid）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、セルロース、アラビアガム（Gummi Arabicum）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポロキサマー。好ましい態様において、細胞培養媒体成分が全ての必要な特性を有するので、追加の助剤が必要ない。これは、例えば、細胞培養媒体成分の１つがポロキサマーである場合である。
【０１１２】
本発明の適当な態様によると、複合層中に存在する少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層は、細胞培養媒体成分を、０．１重量％から１００重量％までの量で含む。好ましくは、固体形態は、可能な限り少ない助剤を含むか、または助剤を含まない。
本発明の適当な態様によると、複合層中に存在する少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層は、２５％を超えない水分を含む。
【０１１３】
上に記載されたとおり、複合層は好ましくはテープの形態で本発明のプロセスで使用され、これはロール・ツー・ロール移送システムを使用したプロセス中で簡単に取り扱うことができる。プロセス中の複合層の取り扱いを改善および単純化するために、複合層を、ロールディスペンサー中で巻き戻された形態で提供することができる。ディスペンサー中に巻き戻されると、複合層は、物理的な損傷および他の有害な環境の影響から保護され、および簡単に移送し及び保管することができる。複合層をプロセスにおいて使用する必要があるとき、それは、例えばディスペンサーを製造設備と接続する単純なドッキング機構を使用することにより、簡単に利用可能にすることができる。したがって、本発明は、ロールディスペンサー（１１''）中で巻き戻された形態で提供されることを特徴とする本発明の複合層にもまた向けられる。
【０１１４】
複合層（３）は、押し出しおよび／またはラミネート加工技術などの当技術分野において知られている様々な技術を包含する複数のプロセスステップを使用して調製することができる。
例えば、１つの層中に含有される材料（例として、レーザーエネルギー吸収材料およびプラスチック材料、あるいは、レーザーエネルギー吸収材料、プラスチック材料、および、レーザーエネルギー吸収層を構成するレーザービームによる活性化の際に体積増加を促進するポリマー、または、細胞培養媒体成分含有層、接着層もしくは分離層中に含有される成分）の混合は、例えば高速ミキサーまたはロールミキサーなどの適当なミルを使用して行うことができる。
【０１１５】
原理的に、複合層は、最終的な複合体が作り上げられるまで連続的に１つの層を別の層へ適用していくことによって調製される。例えば、図４または５による複合層は、細胞培養媒体成分含有層（１）をレーザーエネルギー吸収層（２）へ適用することにより製造され、および、図８による複合層は、最初に分離層（１３）をレーザーエネルギー吸収層（２）へ適用し、次いで細胞培養媒体成分含有層（１）、分離層を適用し、および最終的に接着層（１４）を適用することにより調製される。
【０１１６】
１つの層を他の層へ適用するために使用することができる技術は、例えばドクターブレードを使用するコーティング技術、溶融押出コーティング、および様々なプリンティング技術、例として、スクリーンプリンティング、ステンシルプリンティング、シルクスクリーンプリンティング、パッドプリンティング、スタンププリンティング、グラビアプリンティング、マイクロジェットプリンティング、およびインクジェットプリンティングなどの、当技術分野において知られているあらゆる方法とすることができる。技術に従属して、ドクターブレードでのコーティングの後の乾燥ステップ、または溶融押出の後の冷却などの、さらなるステップが必要であり得る。スクリーンプリンティング、シルクスクリーンプリンティング、パッドプリンティング、スタンププリンティング、グラビアプリンティング、マイクロジェットプリンティング、およびインクジェットプリンティングは、複合層（３）を形成するために１つの層を別の層へ適用するための好ましい方法である。
【０１１７】
通例では、複合層の製造は、レーザーエネルギー吸収層（１）を提供することから始まる。かかるレーザーエネルギー吸収層は、レーザーエネルギー吸収材料（例として、カーボンブラック、ＡＴＯ）のプラスチック材料中への均一な分布、および後続する押し出しでのフィルム製造(例として、ブローフィルム押し出し)によって調製することができる。レーザーエネルギー吸収層（１）が１つまたは２つの支持層（１’）および／または（１''）を含有する場合、かかる層（単数または複数）を、ラミネート加工によって、例として、ロールラミネート機を使用することによって、それに適用することができる。
【０１１８】
一例において、複合層（３）の調製は、レーザーエネルギー吸収材料のための混合プロセスから始まる複数のプロセスステップを包含する。選択された材料の混合ステップの間の均一な分布は、例えば、高速溶解機および／または３ロールミルによって達成される。レーザーエネルギー吸収層の、ポリマーフィルム上への定義された厚さでのコーティングは、ドクターブレード技術またはプリンティングプロセスによって実現可能である。対流式オーブンまたはベルト炉が、コーティングされた基材の乾燥のために使用される。乾燥したレーザーエネルギー吸収層は、上にある第２のポリマーフィルムのラミネート加工に起因して完全に封入されることになる。高速溶解機および３ロールミルを用いた別の混合ステップは、細胞培養媒体成分ビヒクルのために使用される。細胞培養媒体成分層の、複合層（１）上への定義された厚さおよびパターンでのコーティングは、プリンティングプロセス（例として、スクリーンプリンティングまたはステンシルプリンティング）で実現可能である。
本発明は、図面において例示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１Ａ−１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは、複合層（３）を使用した請求項１に従う本発明のプロセスの構成およびプロセスステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を示す。構成は、それが載置プレート（６）の可動エリアを含まないという点で図２の構成とは異なる。その代わり、載置プレート全部が下へ（ｚ軸で）動かされることができる。さらに、それは、複合層（３）の下部に配列されておりロール・ツー・ロールシステム（１２）、（１２’）によって動かすことができる保護テープ（１０）を含む。複合層（３）は、載置プレート（６）上へと位置させられ、およびガラスプレート（４）で載置プレート（６）の上部に固定される（ステップ（ａ））。載置プレート（６）は、細胞培養媒体成分含有層と同じ厚さを有するギャップ（８）を提供するために下方（ｚ−方向）へ動かされる（図１Ａ）。プログラムされたレーザー（５）は、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）の、載置プレート（６）への移動ステップを活性化させている（ステップ（ｃ））（図１Ｂ）。少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する第１の層（２）の、載置プレート（６）上への移動の後、複合層（３）は、載置プレート（６）上の（第１の）層の上部に新たな細胞培養媒体成分含有層を提供するためにｘ軸および／またはｙ軸に沿って動かされ、および、ステップ（ｂ）および（ｃ）が繰り返される（図１ＣおよびＤ）。載置プレート上の組み立てられた層の上部の新たな細胞培養媒体成分含有複合層（３）の配置（ステップ（ａ））、およびステップ（ｂ）および（ｃ）は、固体形態を組み立てるために必要なだけの回数繰り返される。載置プレート（６）上の細胞培養媒体成分含有層（単数または複数）の接着は、真空チャック（９）で真空を適用することにより支持することができる。固体形態の完全な組み立ての後、それは、ロール・ツー・ロールシステム（１２）、（１２’）の活性化によって保護テープ（１０）をｘ軸に沿って動かすことにより、動かされることができ、および取り去られる（ステップ（ｅ））。
【０１２０】
【図２Ａ−２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、複合層（３）を使用した請求項２に従う本発明のプロセスの構成およびステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を示す。複合層（３）は、載置プレート（６）の可動エリア（７）上へと位置させられ、およびガラスプレート（４）で上部に固定される（ステップ（ａ））。載置プレート（６）のエリアが、細胞培養媒体成分含有層と同じ厚さを有するギャップ（８’）を提供するために下方へ動かされる（ステップ（ｂ））（図２Ａ）。プログラムされたレーザー（５）は、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）の、載置プレート（６）の可動エリア（７）上への移動ステップを活性化させている（ステップ（ｃ））（図２Ｂ）。少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する第１の層（２）の、載置プレート（６）の可動エリア（７）上への移動の後、複合層（３）は、載置プレート（６）の可動エリア（７）上の（第１の）層の上部に新たな細胞培養媒体成分含有層を提供するためにｘ軸および／またはｙ軸に沿って動かされ、および、ステップ（ｂ）および（ｃ）が繰り返される（図２ＣおよびＤ）。載置プレート（６）の可動エリア（７）上の組み立てられた層の上部の新たな細胞培養媒体成分含有複合層（３）の配置（ステップ（ａ））、およびステップ（ｂ）および（ｃ）は、固体形態を組み立てるために必要なだけの回数繰り返される。載置プレート（６）の可動エリア（７）上の細胞培養媒体成分含有層（単数または複数）の接着は、真空チャック（９）で真空を適用することにより支持することができる。完全な組み立ての後、形態は取り去られる（ステップ（ｅ））。有利に、載置プレート（６）中の可動エリア（７）は、固体細胞培養媒体形態が取り去られる前に載置プレートの上側に対して相対的に同じレベルまで持ち上げられる。
【０１２１】
【図３】図３は、複合層（３）がテープ（３’）として提供され、およびロール・ツー・ロール分配システム（１１）、（１１’）によって移送される、本発明のプロセスのために使用することができる有利な構成を示す。載置プレート（６）は、ｚ−方向に動かすことができ、および、別のロール・ツー・ロールシステム（１２）、（１２’）の活性化によってｘ軸に沿って動かすことができる保護テープ（１０）を敷かれている。プログラムされたレーザー（５）は、載置プレート（６）上への細胞培養媒体成分のプリントステップを活性化している。組み立ての間、固体形態は、真空チャック（９）によって固定される。
【図４】図４は、レーザーエネルギー吸収層（１）および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）からなり、ここで、レーザーエネルギー吸収層（１）は、レーザーエネルギー吸収材料を含有せずかつ透明でありレーザー光に対して安定である支持層（１’）および（１'''）で、両側を覆われた、レーザーエネルギー吸収材料を含む層（１''）を含む、複合層（３）を示す。
【図５】図５は、レーザーエネルギー吸収材料を含有する１層からなるレーザーエネルギー吸収層（１）、および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）からなる、複合層（３）を示す。
【図６】図６は、分離層（１３）が、支持層（１'''）と少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）との間に存在する、図４におけるとおりの複合層（３）を示す。
【図７】図７は、分離層（１３）が、レーザーエネルギー吸収層（１）と少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）との間に存在する、図５におけるとおりの複合層（３）を示す。
【０１２２】
【図８】図８は、接着層（１４）が、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）の底部側に存在する、図６におけるとおりの複合層（３）を示す。
【図９】図９は、接着層（１４）が、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）の底部側に存在する、図７におけるとおりの複合層（３）を示す。
【図１０】図１０は、接着層（１４）が、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）の底部側に存在する、図４におけるとおりの複合層（３）を示す。
【図１１】図１１は、接着層（１４）が、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）の底部側に存在する、図５におけるとおりの複合層（３）を示す。
【０１２３】
【図１２】図１２は、レーザーエネルギー吸収材料を有する層（１''）と支持層（１'''）とからなるレーザーエネルギー吸収層（１）、分離層（１３）、および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）からなる、複合層（３）を示す。
【図１３】図１３は、接着層（１４）が、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）の底部側に存在する、図１２におけるとおりの複合層（３）を示す。
【図１４】図１４は、図１２におけるとおりであるが、ただし分離層（１３）のない、複合層（３）を示す。
【図１５】図１５は、接着層（１４）が、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）の底部側に存在する、図１４におけるとおりの複合層（３）を示す。
【０１２４】
【図１６】図１６は、支持層（１’）、レーザーエネルギー吸収材料を含む層（１''）、および底部側にある少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）からなる、複合層（３）を示す。
【図１７】図１７は、分離層（１３）が、レーザーエネルギー吸収材料を含む層（１''）と少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層（２）との間に存在する、図１６におけるとおりの複合層（３）を示す。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａは、支持層（１’）、レーザーエネルギー吸収材料を含む層（１''）、および支持層（１'''）を含有する、レーザーエネルギー吸収層（１）を含む、複合層の進歩的な変形を示し、ここで支持層（１'''）は、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む材料を充填されることができ、および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む層のピース（２’）を構成する、彫り込まれたキャビティ（１''''）を有する。図１８は、キャビティ（１''''）が、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する材料を充填されており、および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む層のピース（２’）を構成している、かかる複合層（３）を示す。少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層は、多数のピース（２’）に分割されている。キャビティサイズ深さは、５０μｍから５００μｍまでであり得る（１８Ａ）。キャビティサイズ径は、５０μｍから５ｍｍまでであり得る。
【０１２５】
【図１９】図１９は、５つの異なる行に配列されている、四角形のサイズを持ったキャビティを有する複合層（３）の底部側を示し、かかるキャビティが、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する材料を充填されまたは刷り込まれており、および少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む層のピース（２’）を構成しており、および、異なる行（１９ｅ）、（１９ｆ）、（１９ｇ）、（１９ｈ）、（１９ｉ）の各々が、他とは異なる細胞培養媒体成分を伴う材料を含有する。様々な細胞培養媒体成分が、多数のピース（２’）に分割された少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する層中に存在し得る。キャビティ／ピースの間のギャップは、約５０μｍから約１ｍｍまでであり得る（１９ａ、１９ｄ）。細胞培養媒体成分のキャビティまたはプリントされた層の辺長は、５０μｍから５ｍｍまでであり得る（１９ｂ、１９ｃ）。
【図２０】図２０は、支持材料（１'''）に彫り込まれたかまたは刷り込まれた、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む材料で充填することができる、キャビティの形状（１''''）についての異なる選択肢、すなわち、四角形（２０ａ）、矩形（２０ｂ）、楕円形（２０ｃ）、クロス（２０ｄ）、三角形（２０ｅ）、六角形（２０ｆ）、五角形（２０ｇ）、円盤（２０ｈ）、を示す。
【０１２６】
【図２１】図２１は、本発明のプロセスおよび図１９に開示された複合層を使用して順次形成される固体形態の断面図を示す。
【図２２】図２２および２３は、本発明のプロセスおよび図１８Ｂに示された複合層を使用して調製することができる固体形態の横断面図を示す。１層中に存在する少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む材料のピース（２’）は、かかる層の上の層中に存在する少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含有する材料のピース（２’）に対して、相対的にオフセットされた位置にある。図２２は、層中に存在する少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む材料の各ピース（２’）が互いに隣接して配列され、それによって固体形態の閉じた構造を構成している、固体形態を示す。
【図２３】図２３は、層中に存在する少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む材料の各ピース（２’）が互いに離間して配列され、それによって固体形態の開いた構造を形成している、固体形態を示す。図２２に示された、限られた細胞培養媒体成分（２）の溶解速度を提供する高密度配列と比較して、図２３に示された低密度配列は、向上された細胞培養媒体成分（２）の溶解速度を提供する。
【０１２７】
【図２４】図２４は、支持層（１'''）が、彫り込まれ、および少なくとも細胞培養媒体成分を含む層のピース（２’）を構成している少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む材料で満たされるキャビティを包含している、図４におけるとおりの複合層を示す。キャビティには、例えば、圧縮された細胞培養媒体成分、粘性の、または液体細胞培養媒体成分さえも（追加のフィルム層に起因する閉じたキャビティについての選択肢）、充填される。
【図２５】図２５は、エネルギー吸収層（１）が、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む層のピース（２’）を構成している少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む材料で満たされる彫り込まれたキャビティを有する、図５におけるとおりの複合層を示す。
【図２６】図２６は、支持層（１'''）および分離層（１３）が、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む層のピース（２’）を構成している少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む材料で満たされる彫り込まれたキャビティを有する、図６におけるとおりの複合層を示す。
【図２７】図２７は、レーザーエネルギー吸収層（１）および分離層（１３）が、少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む層のピース（２’）を構成している少なくとも１つの細胞培養媒体成分を含む材料で満たされる彫り込まれたキャビティを有する、図７におけるとおりの複合層を示す。
【図２８】図２８は、ピースへと分割された細胞培養媒体成分含有層（２’）の底部側に接着層（１４）が付着している、図２６におけるとおりの複合層を示す。
【図２９】図２９は、ピースへと分割された細胞培養媒体成分含有層（２’）の底部側に接着層（１４）が付着している、図２７におけるとおりの複合層を示す。
【０１２８】
【図３０】図３０は、コアが、細胞培養媒体成分を含有する多数のピース（２’）で作られ、これが、細胞培養媒体成分を含有しない多数のピース（２''）で作られたシェルによって取り囲まれている、コア−シェル系として配列された固体形態を示す。コアおよびシェルは、互いに隣接して配列され、それによって、固体形態の閉じた構造（closed structure）を形成する。
【図３１】図３１は、ＲＦＩＤタグ（２'''）が、細胞培養媒体成分を含有しない多数のピース（２''）で作られたシェルの中に配置された、図３０におけるとおりの固体形態を示す。幾何学的配置に起因して、固体形態の溶解の際に、最初にシェルの溶解と一緒にＲＦＩＤタグ（２'''）が放出され、細胞培養媒体成分（２’）の溶解および放出がこれに続く。
【図３２】図３２は、ＲＦＩＤタグ（２'''）が、細胞培養媒体成分を含有する多数のピース（２’）で作られたコアの中に配置された、図３０におけるとおりの固体形態を示す。幾何学的配置に起因して、固体形態の溶解の際に、コアを取り囲むシェルが最初に溶解するので、ＲＦＩＤタグ（２'''）および細胞培養媒体成分（２’）の液体への露出および放出は遅延する。
【図３３】図３３は、細胞培養媒体成分を含有しない多数のピース（２''）で作られたシェル中に、細胞培養媒体成分を含有する多数のピース（２’）で作られたコアの外表面に、および中間に、３つのＲＦＩＤタグ（２'''）を含有する、図３０におけるとおりの固体形態を示す。１よりも多いＲＦＩＤタグの統合により、調査(トラッキング)期間が増加し、およびそれによって溶解の始めから最終的な崩壊および／または溶解まで固体形態のふるまいをモニターすることができる。
【０１２９】
【図３４】図３４は、レーザーエネルギー吸収層（１）と中央にピンホール（１５）を有する四角形状のピースに分割された細胞培養媒体成分含有層（２’）との間に分離層（１３）が存在する複合層であって、接着層（１４）が該細胞培養媒体成分含有層の底部側に付着しているものを示す。
【図３５】図３５は、同じ複合層を断面図として示す図３４におけるとおりの複合層の、上面図を示す。
【図３６】図３６は、複合層（３）がテープ（３’）として提供され、およびカセットボックス（１６）中でロール・ツー・ロール分配システム（１１）、（１１’）によって移送される、本発明のプロセスのために使用することができる好ましい構成を示す。カセットシステムは、変更可能である。ポジショナーロール（４）、（４''）は、垂直方向に動かすことができ、それによって、その操作の状態に従属して複合層（３）の載置プレート（６）上への押し付け／押し下げを可能にする。載置プレート（６）は、ｚ−方向に動かすことができ、および保護テープ（１０）を敷かれている。レーザー（５）は、載置プレート（６）上への細胞培養媒体成分のプリントステップを活性化している。組み立ての間、固体形態は、真空チャック（９）によって固定される。
【図３７】図３７は、図３５に示したとおりの同じ構成を３次元図として示す。
【図３８】図３８は、例１３による細胞培養アッセイの結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【０１３０】
本発明は、３Ｄプリントされた固体細胞培養媒体形態が使用される、細胞を培養するための方法にさらに向けられる。
斯くして本発明は、
ａ）３Ｄプリンティング技術を使用することによって固体細胞培養媒体形態を生成すること、
ｂ）前記固体形態を、液体および培養する細胞と混合すること、
ｃ）ステップｂ）の混合物をインキュベートすることによって細胞培養を行うこと、
による細胞を培養するための方法に向けられる。
【０１３１】
一態様において、細胞培養媒体の固体形態、または固体細胞培養媒体形態は、ベース媒体である。この場合において、固体形態は、水または水性緩衝剤のような好適な溶媒中に溶解している。ゲル化剤などのさらなる構成要素が加えられることも考えられる。次いで、培養される細胞が加えられる。細胞は、それを好適な条件下において細胞培養媒体中でインキュベートすることによって培養される。固体細胞培養媒体形態は、ベース媒体として、とりわけ、異なる組成のベース媒体が試験される適用に、適している。３Ｄプリンティングに起因して、固体細胞培養媒体形態の組成は、正確に定義され、および必要に応じて変化させられることができる。例えば、ある成分の量の変化の効果は、該成分の量を異にした数種の固体形態をプリントすることによって試験することができる。加えて、１つの成分は他で置き換えることができる。固体形態を、持続的放出特性を有するベース媒体として使用することもまた、可能でありかつ好ましい。容易に溶解する外側のシェルは、細胞培養を開始するために存在する必要がある全ての構成要素を含む。内側のコアは、細胞培養の後半の段階で放出されることになる細胞培養媒体成分を含む。
【０１３２】
固体細胞培養媒体形態を、細胞培養を開始するためのベース媒体として、または、異なる組成の細胞培養媒体成分を含む少なくとも２つの層を含む媒体サプリメントとして使用することもまた、可能でありかつ好ましい。上に記載されたとおり、ある細胞培養媒体成分は互いと相互作用し、および、典型的には、細胞培養へ別々に、例として、１つをベース媒体中に、および１つを媒体サプリメントに包含することによって、加えられる必要がある。本発明による３Ｄプリントされた固体形態を使用することによって、媒体サプリメントの形態である構成要素の１つの添加は、もはや必ずしも必要ではなくなる。両方の構成要素は、それらが互いと相互作用しないがそれでもなお１ステップで適用されることができるように、固体形態の異なる層中に存在することができる。
【０１３３】
別の態様において、固体細胞培養媒体形態は、少なくとも２つの異なる層を含む。それは、ベース媒体として、または媒体サプリメントとして使用されることが考えられる。少なくとも２つの層は、異なる組成を有する。いくつかの細胞培養媒体成分は、きわめて異なる溶解特性を有する。いくつかの成分が水に容易に溶解可能である一方で、他の成分は、水にはほぼ不溶性であるがしかし、例として、エタノールまたはＤＭＳＯのような他の媒体には簡単に溶解可能である。２以上の層を有する固体細胞培養媒体形態を調製することにより、類似の溶解性を有する全ての成分は、１層中に入れることができる。このアプローチで、溶媒の量は、全ての成分が大量の単一のタイプの溶媒中に溶解されるアプローチと比較して有意に低減され得る。
【０１３４】
別のとりわけ好ましい態様において、固体細胞培養媒体形態は、好ましくは媒体サプリメントである。媒体サプリメントは、最初に液体ベース媒体もしくは液体および乾燥粉末または固体形態のベース媒体と混合されることができるか、あるいはそれが細胞培養の間のあらゆる時間に細胞培養へ加えられることができるか、のいずれかであり得る。
【０１３５】
一態様において、媒体サプリメントは、典型的には定義された量で加えることが困難である細胞培養媒体成分を含む。３Ｄプリントされた固体形態で媒体サプリメントを提供することにより、成分の量を正確に定義することができる。固体形態をベース媒体または細胞培養にただ加えることは、ユーザーにとって極めて簡単である。かかる成分の例は、微量元素である。
【０１３６】
別の態様において、媒体サプリメントは、少なくとも１つの、安定でないか、溶解することが困難であるか、または注意が必要な他の個別の特性を有する成分を含む。成分が安定でないかまたは吸湿性である場合には、固体形態は、前記の成分を含有しないが前記の成分を含むコアを環境からシールドする、シェルを含むことが考えられる。ひとたび固体形態が水性溶液と接触すると、シェルは溶解し、および、コアを自由な状態にする。
【０１３７】
別の態様において、媒体サプリメントは、その溶解特性を調整することが必要な成分を含む。粉末または粒子として適用される場合には十分に溶解性でなく、および典型的には別途事前に溶解させることが必要である成分は、固体形態が該成分の溶解を支持する構造および／または組成を含むことによって、固体形態として添加されることができる。かかる成分の例は、システインおよびチロシンのようなあるアミノ酸、ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンのような分岐鎖アミノ酸である。
【０１３８】
別の好ましい態様において、固体形態の媒体サプリメントは、少なくとも、異なる組成を有するコアとシェルとを含む。それはまた、１つより多いシェル層を含むことも考えられる。この構成は、成分の制御された放出を可能にする。外側の層中の細胞培養媒体成分が最初に放出される。内側の層中および／またはコア中の成分の放出は、その組成および構造によって制御される。全ての単回用量が１つの固体形態中に含まれているので、コアシェル構造を含む３Ｄプリントされた固体形態の形態である媒体サプリメントを１度加えることによって、数回の同一のまたは異なる媒体サプリメントの単回用量の添加をカバーすることができる。これは、従来型の媒体サプリメントの複数用量の代わりに、理想的には１つの固体細胞培養媒体形態を加えることができるので、細胞培養物にフィードまたは供給する戦略をはるかに簡単にする。このアプローチは、フェッドバッチプロセスならびに微生物学的適用のために価値がある。例えば、ＦＤＡ−ＢＡＭ法による食品および環境試料中のListeria monocytogenesの検出のため、ならびにＭＰＮによる食品試料中のListeria monocytogenesの計数のためには、選択的な剤の添加は、典型的には、細胞培養を開始した後約４時間後になされる。
【０１３９】
このために、媒体サプリメントが加えられる。選択的な剤を含む持続的放出のコアを含む本発明による固体形態のベース媒体を使用することによっても、または、細胞培養を始めるときに選択的な剤を含む持続的放出のコアを含む固体形態の媒体サプリメントを加えることによっても、いずれでも、４時間後に選択的な剤を加える追加のステップを、省略することができる。食品および環境試料中のListeria monocytogenesの検出のための、ならびに食品試料中のListeria monocytogenesの計数のための、プロセスについての詳細は、FDA Bacteriological Analytical Manual Chapter 10「Detection of Listeria monocytogenes in Foods and Environmental Samples, and Enumeration of Listeria monocytogenes in Foods」、著者：Anthony D. Hitchins (ret.)およびKaren JinnemanおよびYi Chen、改定日：２０１７年３月、において見出すことができる。
【０１４０】
細胞培養を行うことは、当業者に知られている。典型的には、媒体が好適な容器の中に配置され、細胞をまたは該細胞を潜在的に含む試料を接種される。好適な容器は、上に定義されている。試料は、細胞培養媒体と接触することができるあらゆる液体、気体または固体の物であり得る。試料は、例として、細胞培養媒体を含むコンタクトプレートと接触した表面であり得る。それは、例えば、細胞培養媒体かまたは媒体中に入れられもしくはその上に置かれたあらゆる液体もしくは固体と接触した、スワップ（swap）であり得る。
【０１４１】
細胞の成長を可能にするための媒体のインキュベーションの温度は、典型的には０℃と１００℃との間、より典型的には１５℃と５０℃との間、なおより典型的には２０と４５℃との間である。細胞培養は、例えば、室温（２０度前後）で、または約３２．５℃で、インキュベートされることがある。
一般的には、接種の後、媒体は、細胞のいくらかの成長を可能にするためにの一時期の間インキュベートされる。
細胞の検出または計数を狙いとする適用のためには、この時間は、最低数時間から数週間までの範囲であり得る。一般的には、インキュベーション時間は、約１日と１４日との間である。
【０１４２】
生物医薬生産における適用のためには、典型的にはフェッドバッチ細胞培養が行われる。これはまた、数週間にわたることもある。生物医薬生産における狙いは、典型的には、増加する市場の需要を満たしおよび製造コストを低減させるための、高力価の細胞培養プロセスを開発することである。高パフォーマンスな組み換え細胞株の使用のほか、細胞培養媒体およびプロセスパラメーターの改善が、最大生産力を実現するためには要求される。
【０１４３】
フェッドバッチプロセスにおいて、ベース媒体は初期の成長および生産を支持し、および、細胞培養の間の１回以上の、フィード培地とも呼ばれる媒体サプリメントの添加は、栄養の枯渇を防止し、および生産フェーズを持続させる。媒体は、異なる生産フェーズの間の区別される代謝要求に対応するように選ばれる。フィード戦略および制御パラメーターを包含するプロセスパラメーター設定は、細胞成長およびタンパク質生産に適した化学的および物理的環境を定義する。
【０１４４】
本発明による固体形態の媒体サプリメントを使用することは、初めて、全てのタイプの細胞培養のための代替的な細胞培養媒体の戦略を提供する。媒体は、それらの組成に関して極めて個別的に設計することができる。それらは、異なる溶解性を有するある成分を組み合わせるときまたは他のやり方では組み合わせることができないものを固体形態の異なる層として組み合わせるとき、より柔軟性を提供する。持続的放出アプローチの包含は、フィード戦略のための新たな可能性を提供する。加えて、固体形態は、求められるいかなる用量および組成でもせいさんすることができる。より高用量を必要とするユーザーは、単純により大きな固体形態を生産するかまたは２以上の固体形態を加えることができ、これは２以上のバイアルを開けて２用量以上の液体加えることよりもはるかに簡単である。
【０１４５】
本発明は、以下の例により、それによって限定されることなしに、さらに例示される。
上記および下記で引用した全ての出願、特許、および刊行物、とりわけ２０１７年１０月２６日に出願された欧州特許出願EP 17198564.1の開示の全体は、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１４６】
例１（レーザーエネルギー吸収材料を含有する層（１）または（１''）の生産）
１９５ｇの酢酸ブチル
１６ｇのＰＶＢ（ポリビニルブチラール、Pioloform、Wacker）
１１ｇ Vestosint 2070
３ｇ Aerosil 200
３０ｇのＳｎ（Ｓｂ）Ｏ〜（ｄ５ｏ値＜1．1μｍ）（Du Pont）
ポリビニルブチラールを、当初の導入された溶媒の酢酸ブチル中に溶解させ、よくかき混ぜる。レーザーエネルギー吸収材料Ｓｎ（Ｓｂ）Ｏ２をその後かき混ぜ入れ、および、均一なペーストを調製する。レーザーエネルギー吸収材料の量は、エネルギー吸収に依存するものであり、およびそこに設定されるべきである。ペーストを、５〜２５０μｍ、好ましくは２３μｍの厚さを有するポリエステルフィルムに３０μｍドクターブレード（ハンドコーター）を使用して適用し、および乾燥させる。ホットラミネート加工は、例えば、ＰＥ（ポリエチレン）コートされたポリプロピレンフィルム（PiitzからのWalotenフィルム）を使用して約１４０℃で実施することができる。
【０１４７】
例２（レーザーエネルギー吸収材料を含有する層（１）または（１''）の生産）
２００ｇの酢酸ブチル
２０ｇのＰＶＢ（ポリビニルブチラール、Piolo form、Wacker）
８ｇ Vestosint 2070
３ｇ Aerosil 200
２５ｇのガスブラック（ｄ５Ｏ値＆１７ｎｍ）（DegussaからのSpecial Black 6）
加工処理は、実施例１におけるとおりに実施される。採用するレーザーエネルギー吸収材料は、ガスブラックである。ペーストを、５〜２５０μｍの厚さを有するポリエステルフィルムに９０μｍハンドコーターを使用して適用し、および乾燥させる。
さらなるポリエステルフィルムまたはポリプロピレンフィルムを、ホットラミネート加工によって吸収体層へ適用することができる（実施例１に記載されたとおり）。
【０１４８】
例３（レーザーエネルギー吸収材料を含有する層（１）または（１''）の生産）
２００ｇのε−カプロラクタム
５ｇのＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）
１０ｇのNatrosol 250 GR
１５ｇ Vestosint 2070
１５ｇ Vestosint 2070
２５ｇのカーボンブラック粉末
加工処理は、例１におけるとおりに実施される。ペーストを、９０μｍハンドコーター、または、２５０メッシュ／インチ、２５μｍワイヤー径、２５μｍエマルジョン厚さのステンレス製のスクリーンを使用したスクリーンプリンターを使用して、５〜２５０μｍの厚さを有するポリエステルフィルムに適用する。および最終的に、対流式オーブン中で５０℃にて１時間乾燥させる。
さらなるポリエステルフィルムまたはポリプロピレンフィルムを、ホットラミネート加工によって吸収体層へ適用することができる（実施例１に記載されたとおり）。
【０１４９】
例４（レーザーエネルギー吸収材料を含有する層（１）または（１''）の生産）
２００ｇのMasterblend 50（SICPA-AARBERG AG）
１０ｇのIriodin Lazerflair 825（粒子サイズ２０μｍ）（Merck KGaA）
１００ｇの酢酸エチル／エタノール（１：１）
５ｇ Vestosint 2070
穏やかな条件下でレーザーエネルギー吸収材料Iriodin Lazerflair 825をMasterblend 50中に組み入れ、および、５〜２５０μｍ、好ましくは２３μｍの厚さを有するポリエステルフィルム上へのグラビアプリンティングによりプリントする。所望の粘度は、溶媒混合物の酢酸エチル／エタノールを使用することで設定することができる。適用率は、０．５〜１ｇ／ｃｍである。
【０１５０】
例５（レーザーエネルギー吸収材料を含有する層（１）または（１''）の生産）
層は、ポリエステルマスターバッチ（１０ｋｇ）への＜１μｍの粒子サイズを有する３００ｇのＳｎ（Ｓｂ）Ｏ２の添加により、レーザーエネルギー吸収材料をすでに含有しているポリエステルから生産される。５〜２００μｍの層厚を有するフィルムを、その後生産する。出来上がったフィルムは、層厚に依存して０．０５〜１０重量％のレーザーエネルギー吸収材料を含有する。
【０１５１】
例６（レーザーエネルギー吸収材料を含有する層（１）または（１''）の生産）
層は、ポリエステルマスターバッチ（１０ｋｇ）への＜０．５μｍの粒子サイズを有する３３０ｇのカーボンブラックの添加により、レーザーエネルギー吸収材料をすでに含有しているポリエステルから生産される。５〜２００μｍの層厚を有するフィルムを、その後生産する。出来上がったフィルムは、層厚に依存して０．０５〜１０重量％のレーザーエネルギー吸収材料を含有する。
【０１５２】
例７（細胞培養媒体成分含有層（２）、この場合においてはｍＣＣＤ寒天サプリメント、を有するテープの調製）
２．１ｇのSoluplus（登録商標）、３ｇのセフォペラゾンナトリウム塩、１ｇのアムホテリシンＢおよび４３ｇのＰＥＧ６０００を、４５ｇの水と１５ｇのエタノールとの液体混合物中へと順次加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを結果としてもたらす。このペーストを、１００ミクロンハンドコーターを使用してＰＥＴフィルム上へと適用し、次いで対流式オーブン中で５０℃、１０１３ｍｂａｒにて１０分間乾燥させる。
【０１５３】
例８（細胞培養媒体成分含有層（２）、この場合においてはプレストンブロス選択サプリメント、を有するテープの調製）
２．１ｇのSoluplus（登録商標）、２ｇのセフォペラゾンナトリウム塩、２ｇのバンコマイシン塩酸塩、２ｇのトリメトプリム乳酸塩、１ｇのアムホテリシンＢおよび４３ｇのＰＥＧ６０００を、４５ｇの水と１５ｇのエタノールとの液体混合物中へと順次加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを結果としてもたらす。このペーストを、１００ミクロンハンドコーターを使用してＰＥＴフィルム上へと適用し、次いで対流式オーブン中で５０℃、１０１３ｍｂａｒにて１０分間乾燥させる。
【０１５４】
例９（細胞培養媒体成分含有層（２）、この場合においてはプレストンブロス選択サプリメント、を有するテープの調製）
２．１ｇのSoluplus（登録商標）、ポリミキシンＢ硫酸塩 ２５００ ＩＵ、１ｇのリファンピシン、１ｇのトリメトプリム乳酸塩、１ｇのアムホテリシンＢおよび４３ｇのＰＥＧ６０００を、４５ｇの水と１５ｇのエタノールとの液体混合物中へと順次加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを結果としてもたらす。このペーストを、１００ミクロンハンドコーターを使用してＰＥＴフィルム上へと適用し、次いで対流式オーブン中で５０℃、１０１３ｍｂａｒにて１０分間乾燥させる。
【０１５５】
例８および９のサプリメントを供給されるブロスは、しばしば、２２５ｍｌの体積で使用され、およびサプリメントは使用の直前に加えられる（液体懸濁液の形態で）。ひいては、２２５ｍｌ（または２２５ｍｌの倍数）のためのサイズの錠剤は、バイアルよりも便利である。リファンピシンおよびアムホテリシンＢは、水溶性ではなく、これは、従来型の液体サプリメントを調製するための有機溶媒（例として、エタノール）の使用を必要にする。この溶解性の問題は、本発明による３Ｄプリンティング技術を使用しているときには浮上しない。
【０１５６】
例１０（ポリミキシンを含む細胞培養媒体成分含有層（２）を有するテープの調製）
３．２ｇのSoluplus（登録商標）、０．１ｇのポリミキシンＢ硫酸塩、８．５ｇのＰＥＧ６０００、８．５ｇのＰＥＧ２０００、０．５ｇのステアリン酸マグネシウム、および０．５ｇのＳｉＯ２を、１４ｇの水と０．５ｇのエタノールとの液体混合物中へと順次加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを結果としてもたらす。このペーストを、１００ミクロンハンドコーターを使用してＰＥＴフィルム上へと適用し、次いで対流式オーブン中で５０℃、１０１３ｍｂａｒにて１０分間乾燥させる。
テープを用いた１つの錠剤の調製は１００層を必要とする。各層は、３０μｍの層厚および１．２ｃｍ2（１．７ｃｍ×０．７ｃｍ）の矩形領域を有する。
各層の、ビルディングプラットフォーム上への移動は、Ｎｄ−ＹＡＧレーザーによって実現されている。
【０１５７】
例１１（液体培養媒体の調製）
従来型の液体サプリメントと本発明によるサプリメントとの性能を比較するために、２つのサプリメントおよび最終媒体が調製される：
１．ＭＹＰ＋卵黄エマルジョン＋Bacillus cereus選択サプリメント（当技術の水準による）
２１．５ｇのＭＹＰ ＤＣＭを、４５０ｍｌの脱塩水中に溶解させる。沸騰水中で加熱し、１５分間１２１℃でオートクレーブし、水浴中で４７〜５０℃まで冷却し、５０ｍｌの卵黄エマルジョン（滅菌）を加え、混合し（マグネットスターラー）、１バイアル（５ｍｇ）のBacillus cereus選択サプリメント（１ｍｌの滅菌脱塩水中に再溶解されている）を加える。混合する。プレートを手で調製する。
２．ＭＹＰ＋卵黄エマルジョン＋ポリミキシンＢ硫酸塩錠（例１０により調製される）
５．５７ｇのＭＹＰ ＤＣＭを、１１６．６４ｍｌの脱塩水中に溶解させる。沸騰水中で加熱し、１５分間１２１℃でオートクレーブし、水浴中で４７〜５０℃まで冷却し、１錠（１．２９６ｍｇ）のポリミキシンＢ硫酸塩を加え、フラスコを水浴中で４７〜５０℃に保ち永久的に混合し、錠剤の溶解の後、１２．９６ｍｌの卵黄エマルジョンを加える。混合する。プレートを手で調製する。
【０１５８】
成分／媒体の入手元：
ＭＹＰは、ＤＣＭ ＭＹＰ寒天基礎培地（マンニトール卵黄ポリミキシン）acc. ISO 7932；ISO 21871およびＦＤＡ−ＢＡＭ（Merck、ドイツ国、商品番号1.05267.0500）を意味する
卵黄エマルジョン（Merck、ドイツ国、商品番号1.03784.0001）
Bacillus Cereus選択サプリメント（Merck、ドイツ国、商品番号1.09875.0010）
錠剤の調製のためのポリミキシンＢ硫酸塩（Xellia Pharmaceut.、商品番号2.77426.0000）
２つの媒体の外観およびｐＨ値（目標ｐＨ値７．２±０．２）：
【０１５９】
【表１】
2021500053.tif 000003
【０１６０】
例１２（細菌の調製）
細菌株の前培養が５ｍｌ ＴＳＢ中で行われる。
以下の菌株が使用される：
− Bacillus cereus ATCC11778  期待される結果：成長および回復 ＞５０％ 
− Bacillus subtilis ATCC6633  期待される結果：成長および回復。無制限
− E.coli ATCC 8739   期待される結果：完全阻害
− E.coli ATCC25922   期待される結果：完全阻害
【０１６１】
例１３（細胞培養アッセイの実行および結果）
例１２による細胞前培養物の接種が、以下のとおり行われる：
Bacillus cereus ATCC11778：−４および−５希釈物から５０μｌをSpiralplaterを用いて寒天プレート上へ
Bacillus subtilis ATCC6633：元の前培養物から１：１００希釈物を作り、および１０μｌループを用いて寒天プレート上に塗る
E.coli ATCC 8739：元の前培養物から１０μｌループを用いて寒天プレート上に塗る
E.coli ATCC25922：元の前培養物から１０μｌループを用いて寒天プレート上に塗る
希釈媒体：塩化ナトリウムペプトンブロス（緩衝化された）
プレートを、４４時間３１℃で好気的にインキュベートする。詳細な結果は、図３８に示される。本発明による媒体錠剤を用いて調製されたサプリメントは、技術水準による液体サプリメントと比較して同等の性能を発揮するということが読み取れる。
【０１６２】
例１４（分離層（１３）のための媒体の調製）
１２５ｇの１，２−プロパンジオール
１ｇ ＰＥＧ４００
１５ｇ カルナバワックス
５ｇのウイテプゾール Ｅ８５
３４ｇのラクトース
１ｇのポビドン Ｋ９０
１３ｇのカルボキシメチルセルロース
０．７ｇのステアリン酸マグネシウム
０．５ｇの二酸化ケイ素（Aerosil 200 Pharma）
物質を１，２−プロパンジオールの液体混合物中へと連続的に加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを調製する。ペースト状の混合物を、３ロールミルによって均一化させる。ペーストを、５〜２５０ｐｍの厚さを有するポリエステルフィルムに９０ｐｍハンドコーターを使用して適用し、および対流式オーブン中で１０ｍｂａｒ（乾燥室の内部圧力）にて１時間乾燥させる。
【０１６３】
例１５（分離層（１３）のための媒体の調製）
１２５ｇの１，２−プロパンジオール
１ｇ ＰＥＧ４００
１５ｇ カルナバワックス
３４ｇのラクトース
１ｇのポビドン Ｋ９０
１３ｇのカルボキシメチルセルロース
０．７ｇのステアリン酸マグネシウム
０．５ｇの二酸化ケイ素（Aerosil 200 Pharma）
物質を１，２−プロパンジオールの液体混合物中へと連続的に加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを調製する。ペースト状の混合物を、３ロールミルによって最終的に均一化させる。ペーストを、５〜２５０ｐｍの厚さを有するポリエステルフィルムに９０ｐｍハンドコーターを使用して適用し、および対流式オーブン中で１０ｍｂａｒ（乾燥室の内部圧力）にて１時間乾燥させる。
【０１６４】
例１６（分離層（１３）のための媒体の調製）
１２５ｇの１，２−プロパンジオール
１ｇ ＰＥＧ４００
２０ｇ カルナバワックス
５ｇのウイテプゾール Ｈ３７
３４ｇのラクトース
１ｇのポビドン Ｋ９０
１３ｇのカルボキシメチルセルロース
０．７ｇのステアリン酸マグネシウム
０．５ｇの二酸化ケイ素（Aerosil 200 Pharma）
物質を１，２−プロパンジオールの液体混合物中へと連続的に加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを調製する。ペースト状の混合物を、３ロールミルによって均一化させる。ペーストを、５〜２５０ｐｍの厚さを有するポリエステルフィルムに９０ｐｍハンドコーターを使用して適用し、および対流式オーブン中で１０ｍｂａｒ（乾燥室の内部圧力）にて１時間乾燥させる。
【０１６５】
例１７（分離層（１３）のための媒体の調製）
１２５ｇの１，２−プロパンジオール
１ｇ ＰＥＧ４００
２５ｇ カルナバワックス
１０ｇのウイテプゾール Ｗ３１
３４ｇのラクトース
１ｇのポビドン Ｋ９０
１３ｇのカルボキシメチルセルロース
０．７ｇのステアリン酸マグネシウム
０．５ｇの二酸化ケイ素（Aerosil 200 Pharma）
物質を１，２−プロパンジオールの液体混合物中へと連続的に加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを調製する。ペースト状の混合物を、３ロールミルによって均一化させる。ペーストを、５〜２５０ｐｍの厚さを有するポリエステルフィルムに９０ｐｍハンドコーターを使用して適用し、および対流式オーブン中で１０ｍｂａｒ（乾燥室の内部圧力）にて１時間乾燥させる。
【０１６６】
例１８（分離層（１３）のための媒体の調製）
１５０ｇの１，２−プロパンジオール
１ｇ ＰＥＧ４００
１５ｇ カルナバワックス
５ｇのウイテプゾール Ｅ８５
３４ｇのラクトース
５ｇのポビドン Ｋ９０
１３ｇのカルボキシメチルセルロース
０．７ｇのステアリン酸マグネシウム
０．５ｇの二酸化ケイ素（Aerosil 200 Pharma）
物質を１，２−プロパンジオールの液体混合物中へと連続的に加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを調製する。ペースト状の混合物を、３ロールミルによって均一化させる。ペーストを、５〜２５０ｐｍの厚さを有するポリエステルフィルムに９０ｐｍハンドコーターを使用して適用し、および対流式オーブン中で１０ｍｂａｒ（乾燥室の内部圧力）にて１時間乾燥させる。
【０１６７】
例１９（接着層（１４）のための媒体の調製）
１５０ｇの１，２−プロパンジオール
１ｇ ＰＥＧ４００
１５ｇ カルナバワックス
３４ｇのラクトース
６ｇのポビドン Ｋ９０
１３ｇのカルボキシメチルセルロース
０．７ｇのステアリン酸マグネシウム
０．５ｇの二酸化ケイ素（Aerosil 200 Pharma）
物質を１，２−プロパンジオールの液体混合物中へと連続的に加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを調製する。ペースト状の混合物を、３ロールミルによって均一化させる。ペーストを、５〜２５０ｐｍの厚さを有するポリエステルフィルムに９０ｐｍハンドコーターを使用して適用し、および対流式オーブン中で１０ｍｂａｒ（乾燥室の内部圧力）にて１時間乾燥させる。
【０１６８】
例２０（接着層（１４）のための媒体の調製）
１５０ｇの１，２−プロパンジオール
１ｇ ＰＥＧ４００
２０ｇ カルナバワックス
５ｇのウイテプゾール Ｈ３７
３４ｇのラクトース
７ｇのポビドン Ｋ９０
１３ｇのカルボキシメチルセルロース
０．７ｇのステアリン酸マグネシウム
０．５ｇの二酸化ケイ素（Aerosil 200 Pharma）
物質を１，２−プロパンジオールの液体混合物中へと連続的に加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを調製する。ペースト状の混合物を、３ロールミルによって均一化させる。ペーストを、５〜２５０ｐｍの厚さを有するポリエステルフィルムに９０ｐｍハンドコーターを使用して適用し、および対流式オーブン中で１０ｍｂａｒ（乾燥室の内部圧力）にて１時間乾燥させる。
【０１６９】
例２１（接着層（１４）のための媒体の調製）
１５０ｇの１，２−プロパンジオール
１ｇ ＰＥＧ４００
２５ｇ カルナバワックス
１０ｇのウイテプゾール Ｗ３１
３４ｇのラクトース
７ｇのポビドン Ｋ９０
１３ｇのカルボキシメチルセルロース
０．７ｇのステアリン酸マグネシウム
０．５ｇの二酸化ケイ素（Aerosil 200 Pharma）
物質を１，２−プロパンジオールの液体混合物中へと連続的に加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを調製する。ペースト状の混合物を、３ロールミルによって均一化させる。ペーストを、５〜２５０ｐｍの厚さを有するポリエステルフィルムに９０ｐｍハンドコーターを使用して適用し、および対流式オーブン中で１０ｍｂａｒ（乾燥室の内部圧力）にて１時間乾燥させる。
【０１７０】
例２２（複合層（３）（図４）の生産）
支持フィルム（１’）およびレーザーエネルギー吸収層（１''）（例１〜６）が、支持フィルム（１'''）と一緒に配置され、およびホットラミネーターの助けによって一緒にラミネート加工される。加熱可能なロールが、ここでは１４０〜１７５℃の温度に設定される。ホットラミネート加工の後、２つのフィルムは互いに強固に接合される。ＰＥコートされたポリプロピレンフィルム（PutzからのWalotenフィルム）を使用する場合、ラミネート加工を約１４０℃で実施することができる。最後に、細胞培養媒体成分含有層（２）（例７〜１３）を、ラミネートされた支持フィルム（１'''）の下部側へ適用する。
【０１７１】
例２３（複合層（３）（図６）の生産）
支持フィルム（１’）およびレーザーエネルギー吸収層（１''）（例１〜６）が、支持フィルム（１'''）と一緒に配置され、およびホットラミネーターの助けによって一緒にラミネート加工される。加熱可能なロールが、ここでは１４０〜１７５℃の温度に設定される。ホットラミネート加工の後、２つのフィルムは互いに強固に接合される。ＰＥコートされたポリプロピレンフィルム（PutzからのWalotenフィルム）を使用する場合、ラミネート加工を約１４０℃で実施することができる。分離層（１３）（例１４〜１７）を、ラミネートされた支持フィルム（１'''）の下部側へ適用する。細胞培養媒体成分含有層（２）（例７〜１３）を、分離層へ適用する。最後に、接着層（１４）（例１８〜２１）を、細胞培養媒体成分含有層（２）へ適用する。
【０１７２】
例２４（複合層（３）（図５）の生産）
細胞培養媒体成分含有層（２）（例７〜１３）のための媒体を、２２５μｍの層厚でレーザーエネルギー吸収層（１）へ適用し（例５〜６）、および乾燥させる。
【０１７３】
例２５（複合層（３）（図１４）の生産）
細胞培養媒体成分含有層（２）（例７〜１３）のための媒体を、ＰＥＴフィルム（厚さ：５、１２、１５、１９、２３、３６、５０および２００μｍ）の下部側に、１０μｍから５００μｍまでの層厚で適用し、および、レーザーエネルギー吸収層（例１〜６）を、レーザー側（上側）の上へと０．７〜１５μｍの層厚でプリントする。
【０１７４】
例２６（分離層（１３）のための媒体の調製）
１５ｇの水
５ｇのエタノール
１０ｇのポビドン
６ｇのポリエチレングリコール６０００
６ｇのKolliphor P188
０．２ｇのステアリン酸マグネシウム
０．１ｇの二酸化ケイ素（Aerosil 200 Pharma）
物質を水／エタノールの液体混合物中へと連続的に加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを調製する。ペーストを、５〜１００ミクロンの厚さを有するポリエステルフィルムに３０ミクロンハンドコーターを使用して適用し、および対流式オーブン中で５０℃、１０ｍｂａｒ（乾燥室の内部圧力）にて５分間乾燥させる。
【０１７５】
例２８（本発明のプロセスのために使用可能な装置の好ましい態様（図３６）の操作の詳細な記載）
ステップ１
カセットシステムを、図７に示した複合層（３）のテープ（３’）を包含する３Ｄプリンターデバイス中へと実装する。
ステップ２
保護テープ（１０）を載置プレート（６）上に配置する。
ステップ３
載置プレート（６）を開始位置のためのゼロレベルに調整する。
ステップ４
複合層（３）をステップエンジンによって開始位置まで進める。
ステップ５
ポジショナーロール（４）および（４''）が、複合層（３）を載置プレート（６）上に押し付けるために降下する。
ステップ６
２つのロール（１１）と（１１’）との間の複合層の張力を適当な張力に調整し、および、真空ポンプ（９）をスイッチオンする。
【０１７６】
ステップ７
定義されたエリアをレーザーがスキャンし、それによって、細胞培養媒体成分含有層（２）を載置プレート（６）上へと移動させる。
ステップ８
ポジショナーロール（４）および（４''）を、細胞培養媒体成分層（２）の完全なリフトオフのために上方へ動かす。
ステップ９
複合層（３）（テープ（３’）として提供される）をステッピングモーターによって前方へスクロールし、それによって、新たな（無傷である）複合層（３）をスキャニングエリアへ位置させる。
ステップ１０
載置プレート（６）を、細胞培養媒体成分層（２）の厚さと同一の高さで下方へ動かす。
ステップ１１
ポジショナーロール（４）および（４''）が、複合層（３）を載置プレート（６）上に押し付けるために降下する。
ステップ１２
固体細胞培養媒体形態を築き上げるのに必要なだけの回数、プロセスステップ６〜１１を繰り返す；
ステップ１３
真空ポンプ（９）をスイッチオフし、および載置プレート（６）から固体細胞培養媒体形態を取り去る。
【０１７７】
例２９（例２８に従った固体形態の生産）
複合層（３）（図７）の生産から始まる
ステップ１
分離層（１３）のための媒体の調製
１５ｇの水
５ｇのエタノール
１０ｇのポビドン
６ｇのポリエチレングリコール６０００
６ｇのKolliphor P188
０．１ｇの二酸化ケイ素（Aerosil 200 Pharma）
物質を水／エタノールの液体混合物中へと連続的に加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを調製する。ペーストを、５０ミクロンの厚さを有するポリエステルフィルムに３０ミクロンハンドコーターを使用して適用し、および対流式オーブン中で５０℃、１０１３ｍｂａｒにて５分間乾燥させる。
【０１７８】
ステップ２
細胞培養媒体成分含有層（２）のための媒体の調製
４５ｇの水
1５ｇのエタノール
９ｇのポビドン
１２ｇのソルビトール
２４ｇの乳酸トリメトプリム
９ｇのステアリン酸マグネシウム
０．１ｇの二酸化ケイ素（Aerosil 200 Pharma）
物質を水／エタノールの液体混合物中へと連続的に加え、および高速溶解機でよくかき混ぜて、均一なペーストを調製する。細胞培養媒体成分含有層（２）のためのペーストを、７０ミクロンの厚さを有する分離層に２００ミクロンハンドコーターを使用して適用し、および対流式オーブン中で５０℃、１０１３ｍｂａｒにて１０分間乾燥させる。
【０１７９】
ステップ３
複合層（３）の２ｃｍ幅のストライプへの切断、それによって、コアロール（１１）上に巻かれたテープ（３’）を得ること。
ステップ４
コアロール（１１）をカセットシステム（１６）中に組み立て、およびそれをリコイルロール（１１’）と接続すること。
ステップ５
図３６に示した構成へのカセットシステム（１６）の実装。
さらなるステップ
例２８に規定されたステップ２〜１３を実施すること。結果として、３９％（ｗ／ｗ）イブプロフェンを含有する４００ｍｇの総重量を有する固体形態が得られる。
【０１８０】
実験条件
分離層（１３）、細胞培養媒体成分含有層（２）および接着層（１４）を伴う複合層（１）（図４〜１７および２４〜２９）を、本発明の方法のために、以下のレーザータイプおよびパラメーターの助けとともに採用する：
ａ）Ｎｄ：      ＹＡＧ（ｃｗモード）
１２ワットレーザー    Trumpfレーザー
Ｎｄ：            ＹＡＧ（１０６４および５３２ｎｍ）
レーザー強度：    １０〜１００％、ｃｗモード
スピード：        １００〜５０００ｍｍ／ｓ
ライン幅：        ０．１ｍｍ
ラインギャップ：  ０．０５ｍｍ
ｂ）Ｎｄ：      ＹＶＯａレーザー（ｃｗモード、パルスされた）
１６ワットレーザー    Rofin Sinar
Ｎｄ：            ＹＶＯ４（１０６４ｎｍ）
レーザー強度：    ２０〜９０％、ｃｗモード、パルスされた
パルス周波数：    １０〜１００ｋＨｚ
スピード：        ４００〜２０００ｍｍ／ｓ
【０１８１】
ｃ）Ｎｄ：      ＹＡＧレーザー（パルスされた）
６０ワットレーザー    Baasel
Ｎｄ：            ＹＡＧ（１０６４ｎｍ）
ｄ）Ｎｄ：      ＹＡＧ（パルスモード）
１２ワットレーザー    Trumpfレーザー
Ｎｄ：            ＹＡＧ（１０６４ｎｍ）
レーザー強度：    １０〜１００％、パルスモード
スピード：        １００〜５０００ｍｍ／ｓ
パルス周波数：    ５ｋＨｚ
ライン幅：        ０．１ｍｍ
ラインギャップ：  ０．０５ｍｍ
【０１８２】
ランプ電流  １６Ａ、パルスモード
パルス周波数：    ２０，０００Ｈｚ
スピード：        ２００ｍｍ／ｓ
揺動周波数：      １６Ｈｚ
パルス持続時間：  ０．０５ｍｓ
小さな構造（ライン幅＜１ｍｍまたはドット径＜１ｍｍ）のｃｗモードでのプリンティングと比較して、パルスモードでの最終３Ｄプリンティング結果は、より大きなエッジシャープネスおよびレーザープリンティングポイントでのより滑らかな表面によって差別化される。
【図１Ａ−１Ｄ】
2021500053.tif 000004
【図２Ａ−２Ｄ】
2021500053.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2021500053.tif 000016
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2021500053.tif 000019
【図１７】
2021500053.tif 000020
【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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