(57)【要約】減少したクロロフィルおよび増加した光合成効率を有する変異体光合成生物が提供される。変異または減弱化された、葉緑体ＳＲＰ５４遺伝子およびＳＧＩ１遺伝子；葉緑体ＳＲＰ５４遺伝子およびＳＧＩ２遺伝子；葉緑体ＳＲＰ５４遺伝子、ＳＧＩ１、およびＳＧＩ２遺伝子を有する、変異株が開示される。変異体光合成生物は、野生型株と比較して増加した生産性を示す。また、変異または減弱化された細胞質ゾルＳＲＰ５４遺伝子を有する、変異体光合成生物も提供される。本明細書では、ＳＲＰ５４遺伝子、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２遺伝子、ＳＧＩ１／ＳＲＰ５４の組み合わせ、ならびにＳＧＩ２およびＳＲＰ５４遺伝子の組み合わせに変異を有する株を使用して、バイオマスおよび脂質などの他の産物を生産する方法が提供される。ＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、およびＳＧＩ２遺伝子を減弱化または破壊するための構築物ならびに方法も含まれる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；
変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）と
を含む、変異体光合成生物。
【請求項２】
葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；
変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）と
を含む、変異体光合成生物。
【請求項３】
変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）
を含む、変異体光合成生物。
【請求項４】
葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；
変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）と；
変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）と
を含む、変異体光合成生物。
【請求項５】
前記変異体が、同じ種の対照光合成生物に対して、弱光条件下でのクロロフィルの減少と、１００μＥｍ−２ｓ−１を超えるすべての生理学的に適切な放射照度で、光化学系ＩＩにおける光化学のより高い最大量子収率（Ｆｖ／ＦＭ）とを呈する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項６】
同じ種の対照光合成生物に対して少なくとも２０％減のクロロフィルの減少を呈する、請求項５に記載の変異体光合成生物。
【請求項７】
前記クロロフィルの減少が、同じ種の対照光合成生物に対して少なくとも３０％の減少である、請求項６に記載の変異体光合成生物。
【請求項８】
前記クロロフィルの減少が、同じ種の対照光合成生物に対して少なくとも４０％の減少である、請求項７に記載の変異体光合成生物。
【請求項９】
前記クロロフィルの減少が、同じ種の対照光合成生物に対して少なくとも５０％の減少である、請求項７に記載の変異体光合成生物。
【請求項１０】
前記クロロフィルの減少が、同じ種の対照光合成生物に対して少なくとも６０％の減少である、請求項９に記載の変異体光合成生物。
【請求項１１】
前記クロロフィルの減少が、同じ種の対照光合成生物に対して少なくとも７０％の減少である、請求項１０に記載の変異体光合成生物。
【請求項１２】
前記変異体が、同じ種の対照光合成生物に対して、１００μＥｍ−２ｓ−１を超えるすべての生理学的に適切な放射照度で、より低い非光化学的消光（ＮＰＱ）を呈する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項１３】
前記変異体が、２５０μＥｍ−２ｓ−１を超えるすべての生理学的放射照度で、同じ種の対照光合成生物よりも低いＮＰＱを呈する、請求項１２に記載の変異体光合成生物。
【請求項１４】
前記変異体が、同じ種の対照光合成生物よりも高い、クロロフィル当たりの炭素固定率を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項１５】
前記炭素固定率が、同じ種の対照光合成生物よりも少なくとも５０％高い、請求項１４に記載の変異体光合成生物。
【請求項１６】
前記炭素固定率が、同じ種の対照光合成生物よりも少なくとも１００％高い、請求項１５に記載の変異体光合成生物。
【請求項１７】
酸素発生率が、同じ種の対照光合成生物よりも少なくとも１００％高い、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項１８】
前記酸素発生率が、同じ種の対照光合成生物よりも少なくとも２００％高い、請求項１７に記載の変異体光合成生物。
【請求項１９】
前記変異体の培養物が、同じ種の対照光合成生物の培養物よりも大きいバイオマス生産性を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項２０】
前記変異体が、光合成独立栄養培養においてより大きなバイオマス生産性を示す、請求項１９に記載の変異体光合成生物。
【請求項２１】
前記変異体が、連続光条件下で、より大きなバイオマス活性を示す、請求項２０に記載の変異体光合成生物。
【請求項２２】
前記変異体が、日周条件下で、より大きなバイオマス活性を示す、請求項２０に記載の変異体光合成生物。
【請求項２３】
前記変異体が、光プロファイルが自然の日光プロファイルを模倣する日周条件下で、より大きなバイオマス活性を示す、請求項２０に記載の変異体光合成生物。
【請求項２４】
前記変異体が、ＵＶ照射、ガンマ線照射、または化学的変異誘発によって生成された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項２５】
前記変異体が、遺伝子操作された変異体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項２６】
前記変異体が、挿入変異誘発、遺伝子置換、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、メガヌクレアーゼゲノム編集、１つ以上のリボザイム、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって遺伝子操作された、請求項２５に記載の変異体光合成生物。
【請求項２７】
前記変異体が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって遺伝子操作された、請求項２６に記載の変異体光合成生物。
【請求項２８】
前記ｃｐＳＲＰ５４が、該遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号６８、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、および配列番号８５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の変異体光合成生物。
【請求項２９】
前記ｃｐＳＲＰ５４遺伝子が、該遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号８の核酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する、請求項２６に記載の変異体光合成生物。
【請求項３０】
前記ｃｐＳＲＰ５４が、該遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％を有する、請求項２８に記載の変異体光合成生物。
【請求項３１】
前記ＳＧＩ１ポリペプチドが、該遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する、請求項１または２に記載の変異体光合成生物。
【請求項３２】
前記ＳＲＰ５４タンパク質をコードする遺伝子が、ｃｐＳＲＰ５４  ＧＴＰａｓｅドメインの最初の１６９個のアミノ酸をコードする配列の外側で発生する変異を含む、請求項１または２に記載の変異体光合成生物。
【請求項３３】
前記ＳＲＰ５４タンパク質をコードする遺伝子における前記変異が、ｃｐＳＲＰ５４  ＧＴＰａｓｅドメインをコードする配列の外側で発生する、請求項３２に記載の変異体光合成生物。
【請求項３４】
前記ＳＲＰ５４タンパク質をコードする遺伝子が、ｃｐＳＲＰ５４  ＧＴＰａｓｅドメインに遺伝子破壊変異を含まない、請求項３３に記載の変異体光合成生物。
【請求項３５】
前記ＳＧＩ２遺伝子が、該遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１、３、または４に記載の変異体光合成生物。
【請求項３６】
前記ＳＧＩ２遺伝子が、該遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号７、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、および配列番号６６からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項３５に記載の変異体光合成生物。
【請求項３７】
前記ＳＧＩ２遺伝子が、該遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項３５に記載の変異体光合成生物。
【請求項３８】
前記光合成生物が、藻類であり、前記変異体藻類が、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）、アンフィプロラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、ベケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）、ボロディネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）、ボトリディウム（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、クリコスファエラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エリプソイドン（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ユースティグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、フラギラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハロカフェテリア（Ｈａｌｏｃａｆｅｔｅｒｉａ）、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）、ハイメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、ナビキュラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オエドゴニウム（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、ファグス（Ｐｈａｇｕｓ）、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、シュードスタウラストラム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、アオミドロ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、タラシオシーラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）、ビスケリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）、およびボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）からなる群から選択される属に属する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項３９】
前記光合成生物が藻類であり、前記変異体藻類が、緑藻類（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅ）、珪藻類（ｂａｃｉｌｌａｒｏｐｈｙｔｅ）、プラシノ藻類（ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｔｅ）、灰色藻類（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔｅ）、ハプト藻類（ｈａｐｔｏｐｈｙｔｅ）、クロララクニオン藻類（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅ）、ユーグレナ藻類（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔｅ）、有色植物類（ｃｈｒｏｍｏｐｈｙｔｅｓ）、および渦鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ）変異体からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項４０】
前記光合成生物が、藻類であり、前記藻類変異体が、緑藻類（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項４１】
前記変異体が、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、クリコスファエラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）、ハイメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オエドゴニウム（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、ファグス（Ｐｈａｇｕｓ）、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、シュードスタウラストラム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、アオミドロ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）、およびボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）からなる群から選択される属に属する、請求項３７に記載の藻類変異体。
【請求項４２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物を含む、バイオマス。
【請求項４３】
前記光合成生物が、藻類である、請求項４２に記載のバイオマス。
【請求項４４】
生物学的産物を産生する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体光合成生物を培養する工程と、前記培養物から少なくとも１つの産物を単離する工程とを含む、方法。
【請求項４５】
前記光合成生物が藻類であり、前記生物学的産物が藻類バイオマスである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物学的産物が、脂質、タンパク質、ペプチド、１種類以上のアミノ酸、１種類のアミノ酸、１種類以上のヌクレオチド、ビタミン、補助因子、ホルモン、抗酸化物質、または色素または着色剤である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物学的産物が脂質である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記変異体光合成生物が、脂質の産生に関与するポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性遺伝子を含むように操作されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記変異体光合成生物が、光栄養的に培養される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記変異体光合成生物が藻類であり、前記藻類が池または導水路で培養される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
細胞質ゾルシグナル認識タンパク質５４（ｃｙｔｏＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；
変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）と
を有する、変異体光合成生物。
【請求項５２】
細胞質ゾルシグナル認識タンパク質５４（ｃｙｔｏＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；
変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）と
を有する、変異体光合成生物。
【請求項５３】
細胞質ゾルシグナル認識タンパク質５４（ｃｙｔｏＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；
変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）と；
変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）と
を有する、変異体光合成生物。
【請求項５４】
前記変異体光合成生物の培養物が、同じ種の対照光合成生物の培養物よりも大きい脂質生産性を示す、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項５５】
前記変異体が、光合成独立栄養培養においてより大きな脂質生産性を示す、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項５６】
前記変異体光合成生物が、藻類であり、前記変異体藻類が、日周条件下で、より大きなバイオマス活性を示す、請求項５５に記載の変異体光合成生物。
【請求項５７】
前記変異体藻類が、光プロファイルが自然の日光プロファイルを模倣する日周条件下で、より大きなバイオマス活性を示す、請求項５６に記載の変異体藻類。
【請求項５８】
ＵＶ照射、ガンマ線照射、または化学的変異誘発によって生成された、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項５９】
遺伝子操作された変異体である、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項６０】
挿入変異誘発、遺伝子置換、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、メガヌクレアーゼゲノム編集、１つ以上のリボザイム、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって遺伝子操作された、請求項５８に記載の変異体光合成生物。
【請求項６１】
前記変異体が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって遺伝子操作された、請求項５９に記載の変異体光合成生物。
【請求項６２】
前記変異体光合成生物が、藻類であり、前記変異体藻類が、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）、アンフィプロラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、ベケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）、ボロディネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）、ボトリディウム（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、クリコスファエラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エリプソイドン（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ユースティグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、フラギラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハロカフェテリア（Ｈａｌｏｃａｆｅｔｅｒｉａ）、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）、ハイメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、ナビキュラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オエドゴニウム（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、ファグス（Ｐｈａｇｕｓ）、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、シュードスタウラストラム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、アオミドロ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、タラシオシーラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）、ビスケリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）、およびボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）からなる群から選択される属に属する、請求項５１〜６０のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項６３】
前記変異体光合成生物が藻類であり、前記変異体藻類が、珪藻類（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅ）、ユースティグマトファイト（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅ）、および有色植物類（ｃｈｒｏｍｏｐｈｙｔｅｓ）変異体からなる群から選択される、請求項５１〜６０のいずれか一項に記載の変異体光合成生物。
【請求項６４】
前記変異体が、ユースティグマトファイト（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅ）である、請求項６３に記載の変異体藻類。
【請求項６５】
前記変異体藻類が、エリプソイドン（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｉｏｎ）、ユースティグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）、ビスケリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、およびシュードスタウラストラム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）からなる群から選択される属に属する、請求項６４に記載の変異体藻類。
【請求項６６】
脂質を産生する方法であって、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の藻類変異体を培養する工程と、前記培養物から少なくとも１種類の脂質を単離する工程とを含む、方法。
【請求項６７】
光合成生物のバイオマスを増加させる方法であって、葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）および有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）を調節する工程を含む、方法。
【請求項６８】
光合成生物のバイオマスを増加させる方法であって、遺伝子：葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）；および有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）、を調節する工程を含む、方法。
【請求項６９】
光合成生物のバイオマスを増加させる方法であって、遺伝子：葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）；有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）；および有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）、を調節する工程を含む、方法。
【請求項７０】
前記遺伝子を調節する工程が、前記ｃｐＳＲＰ５４遺伝子および前記ＳＧＩ２遺伝子における、塩基置換変異、挿入変異誘発、遺伝子置換、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、メガヌクレアーゼゲノム編集、１つ以上のリボザイム、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記遺伝子を調節する工程が、前記ｃｐＳＲＰ５４遺伝子および前記ＳＧＩ１遺伝子における、塩基置換変異、挿入変異誘発、遺伝子置換、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、メガヌクレアーゼゲノム編集、１つ以上のリボザイム、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記遺伝子を調節する工程が、前記ｃｐＳＲＰ５４遺伝子、前記ＳＧＩ１遺伝子、および前記ＳＧＩ２遺伝子における、塩基置換変異、挿入変異誘発、遺伝子置換、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、メガヌクレアーゼゲノム編集、１つ以上のリボザイム、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
光合成生物の前記バイオマスを増加させることが、総有機炭素の増加を含む、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
光合成生物の前記バイオマスを増加させることが、総脂質含有量の増加を含む、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
光合成生物の前記バイオマスを増加させることが、総窒素含有量の増加を含む、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記変異体光合成生物が、藻類であり、前記変異体藻類が、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）、アンフィプロラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、ベケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）、ボロディネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）、ボトリディウム（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、クリコスファエラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エリプソイドン（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ユースティグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、フラギラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハロカフェテリア（Ｈａｌｏｃａｆｅｔｅｒｉａ）、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）、ハイメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、ナビキュラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オエドゴニウム（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、ファグス（Ｐｈａｇｕｓ）、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、シュードスタウラストラム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、アオミドロ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、タラシオシーラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）、ビスケリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）、およびボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）からなる群から選択される属に属する、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記変異体光合成生物が、植物である、請求項６７〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）定めにより、２０１７年１２月２９日に出願された米国特許出願シリアル番号６２／６１２，２５１号および２０１８年６月２６日に出願された米国特許出願シリアル番号６２／６９０，２０５号の優先権の利益を主張するものであり、これらの全内容が、参照により本明細書にその全体に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
添付の配列表の内容は、参照により本出願に組み込まれる。添付の配列表テキストファイル、名称ＳＧＩ２１４０＿２ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔは、２０１８年１２月１８日に作成されており、４１９ｋｂである。このファイルには、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＯＳを使用するコンピューターでＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを使用してアクセスすることができる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
光合成生物のバイオマス生産性の向上は、バイオ燃料から高価値製品に至る、様々な商業的応用に関連している。バイオマスの総タンパク質含有量を増加させるための遺伝子操作は非常に望ましいが、そうするための戦略は当技術分野においては明らかではない。
【０００４】
より高い生産性のために光合成効率を高めるために光合成生物を操作することは、植物および藻類生物学者の長年の目標である。ＵＳ２０１４／０２２０６３８（特許文献１）およびＵＳ２０１６／０３０４８９（特許文献２）（どちらも参照により本明細書に組み込まれる）は、弱光順化へのそれらの能力が損なわれている低減したクロロフィルを有する、すなわち、弱光下でも強光順応細胞の低クロロフィル状態を保持する、藻類変異体を得るための変異体スクリーニングについて説明している。ＵＳ２０１４／０２２０６３８（特許文献１）は、光順化調節因子のＬＡＲ１、ＬＡＲ２、およびＬＡＲ３遺伝子中に変異を有する藻類変異体を記載しており、ＵＳ２０１６／０３０４８９６（特許文献２）は、葉緑体ＳＲＰ５４遺伝子中に変異を有する藻類変異体を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳ２０１４／０２２０６３８
【特許文献２】ＵＳ２０１６／０３０４８９６
【発明の概要】
【０００６】
本明細書では、増加した光合成効率および生産性を有する、改変された遺伝子を含む光合成生物、光独立栄養的な条件下での生成物産生におけるそれらの使用、およびそのような光合成生物の産生方法、ならびにそのような遺伝子を改変するための核酸分子および構築物が開示される。
【０００７】
一態様では、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）をコードする、変異または減弱化された遺伝子、を含む、変異体光合成生物が提供される。
【０００８】
一態様では、葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）と、を含む、変異体光合成生物が提供される。
【０００９】
一態様では、葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）をコードする、変異または弱化された遺伝子と；変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）と、を含む変異体光合成生物が提供される。
【００１０】
一態様では、葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）と；変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）と、を含む、変異体光合成生物が提供される。
【００１１】
一態様では、細胞質ゾルシグナル認識タンパク質５４（ｃｙｔｏＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）と、を含む、変異体光合成生物が提供される。
【００１２】
一態様では、細胞質シグナル認識タンパク質５４（ｃｙｔｏＳＲＰ５４）をコードする、変異または弱化された遺伝子と；変異または弱化された、有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）と、を含む、変異体光合成生物が提供される。
【００１３】
一態様では、細胞質ゾルシグナル認識タンパク質５４（ｃｙｔｏＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）と；変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）と、を含む、変異体光合成生物が提供される。
【００１４】
一態様では、葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）、および／または、変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）と、を含む、変異体光合成生物を含む、バイオマスが提供される。
【００１５】
一態様では、生物学的産物を産生する方法が提供される。この方法は、変異体光合成生物が、葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）をコードする、変異または減弱化された遺伝子と；変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）、および／または、変異または減弱化された、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）と、を含む、変異体光合成生物を培養する工程と、少なくとも１つの産物を培養物から単離する工程と、を含む。
【００１６】
一態様では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子の単一のコピーを微生物の選択された遺伝子座に挿入する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子は、微生物での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、挿入されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子は、複数の異種イントロンを含む。いくつかの実施形態では、異種イントロンの数は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０個、またはそれ以上であり得る。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子の非限定的な例には、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子は、微生物に固有のプロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子は、微生物に異種のプロモーターに作動可能に連結され得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、生物学的産物は、脂質、タンパク質、ペプチド、１種類以上のアミノ酸、１種類のアミノ酸、１種類以上のヌクレオチド、ビタミン、補助因子、ホルモン、抗酸化物質、または色素または着色剤である。いくつかの実施形態では、生物学的産物は、バイオマスである。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は藻類であり、バイオマスは藻類バイオマスである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、脂質の産生に関与するポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性遺伝子を含むように操作される。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、光栄養的に培養される。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は藻類であり、藻類は、池または導水路で培養される。
【００１９】
一態様では、天然に存在するＳＧＩ２タンパク質をコードする光合成生物遺伝子に由来するかまたはそれに隣接するヌクレオチド配列を含む、相同組換えのための核酸分子構築物が提供され、ＳＧＩ２タンパク質は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
一態様では、ｃｐＳＲＰ５４タンパク質をコードするタンパク質をコードする天然に存在する光合成生物遺伝子およびＳＧＩ１タンパク質をコードする光合成生物遺伝子に由来するかまたはそれらに隣接するヌクレオチド配列を含む、相同組換えのための複数の核酸分子構築物が提供され、ｃｐＳＲＰ５４タンパク質は遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号６８、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、および配列番号８５と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＧＩ１遺伝子は、ＳＧＩ１遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【００２１】
一態様では、天然に存在するｃｐＳＲＰ５４タンパク質をコードする光合成生物遺伝子およびＳＧＩ２タンパク質をコードする光合成生物遺伝子に由来するかまたはそれらに隣接するヌクレオチド配列を含む、相同組換えのための複数の核酸分子構築物が提供され、ｃｐＳＲＰ５４タンパク質は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号６８、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＧＩ２タンパク質は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号５６と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２２】
一態様では、天然に存在するＳＧＩ２タンパク質をコードする光合成生物遺伝子の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイムの発現のための核酸分子構築物が提供され、ＳＧＩ２タンパク質は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号５６と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２３】
一態様では、ｃｐＳＲＰ５４タンパク質をコードする天然に存在する光合成生物遺伝子およびＳＧＩ１タンパク質をコードする光合成生物遺伝子の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイムの発現のための複数の核酸分子構築物が提供され、ｃｐＳＲＰ５４タンパク質は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号６８、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＧＩ１遺伝子は、ＳＧＩ１遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、構築物は、ｃｐＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、またはこれらの遺伝子のうちの２つ以上の組み合わせの５’ＵＴＲの少なくとも一部、ｃｐＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、またはこれらの遺伝子のうちの２つ以上の組み合わせのプロモーター領域の少なくとも一部、および／またはｃｐＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、またはこれらの遺伝子のうちの２つ以上の組み合わせの３’ＵＴＲの少なくとも一部を含む。いくつかの例では、構築物は、ＲＮＡｉ、リボザイム、またはアンチセンス構築物であることができ、ｃｐＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、またはこれらの遺伝子のうちの２つ以上の、センスまたはアンチセンス方向のいずれかの組み合わせの転写領域に由来する配列を含むことができる。さらなる例では、構築物は、ｃｐＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、またはこれらの遺伝子のうちの２つ以上の組み合わせを標的とするように設計したガイドＲＮＡのインビトロまたはインビボ発現のために設計することができ、例えば、遺伝子のイントロン、５’ＵＴＲ、プロモーター領域、および／または３’ＵＴＲが含まれる、遺伝子のいずれかの一部に相同な配列を含むことができる。なおさらなる例では、ｃｐＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、またはＳＧＩ２ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を減弱させるための構築物は、ガイドＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであることができ、ここでは、配列は、ｃｐＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、またはアンチセンス方向の２つ以上の遺伝子の組み合わせの転写領域に相同性を有する。
【００２５】
一態様では、天然に存在するｃｐＳＲＰ５４タンパク質をコードする光合成生物遺伝子およびＳＧＩ２タンパク質をコードする光合成生物遺伝子の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイムの発現のための複数の核酸分子構築物が提供され、ｃｐＳＲＰ５４タンパク質は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号６８、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードし、ＳＧＩ２遺伝子は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号５６と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【００２６】
一態様では、ガイドＲＮＡをコードする複数の核酸分子が提供され、このガイドＲＮＡは、天然に存在する光合成生物遺伝子ＳＧＩ２の少なくとも一部を含み、ＳＧＩ２遺伝子は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号５６と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【００２７】
一態様では、少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする複数の核酸分子が提供され、このガイドＲＮＡは、天然に存在するｃｐＳＲＰ５４をコードする光合成生物遺伝子およびＳＧＩ１をコードする光合成生物遺伝子の少なくとも一部を含み、ｃｐＳＲＰ５４は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号６８、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードし、ＳＧＩ１遺伝子は、ＳＧＩ１遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２８】
一態様では、少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする複数の核酸分子が提供され、このガイドＲＮＡは、天然に存在する光合成生物ｃｐＳＲＰ５４遺伝子および光合成生物遺伝子ＳＧＩ２遺伝子の少なくとも一部を含み、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号６８、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードし、ＳＧＩ２遺伝子は、遺伝子の変異または減弱化の前に、少なくとも配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号５６を有するアミノ酸配列を含む。
【００２９】
一態様では、ＳＧＩ２遺伝子を調節することを含む、光合成生物のバイオマスを増加させる方法が提供される。
【００３０】
一態様では、葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）および有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）を調節することを含む、光合成生物のバイオマスを増加させる方法が提供され、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号６８、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードし、ＳＧＩ１遺伝子は、ＳＧＩ１遺伝子の変異または減弱化の前に、少なくとも配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９を有するアミノ酸配列を含む。
【００３１】
一態様では、葉緑体シグナル認識タンパク質５４（ｃｐＳＲＰ５４）および有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）を調節することを含む、光合成生物のバイオマスを増加させる方法が提供され、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号６８、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードし、ＳＧＩ２遺伝子は、遺伝子の変異または減弱化の前に、少なくとも配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号５６を有するアミノ酸配列を含む。
【００３２】
一態様では、細胞質ゾルシグナル認識タンパク質５４（ｃｙｔｏＳＲＰ５４）および有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）を調節することを含む、光合成生物のバイオマスを増加させる方法が提供され、ＳＧＩ２遺伝子は、遺伝子の変異または減弱化の前に、少なくとも配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号５６を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【００３３】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物の培養物は、同じ種の対照光合成生物の培養物よりも大きなバイオマス生産性を呈する。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、光独立栄養培養においてより大きなバイオマス生産性を示す。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、連続光条件下で、同じ種の対照光合成生物の培養物よりも高いバイオマス生産性を呈する。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、日周サイクル条件下で、同じ種の対照光合成生物の培養物よりも高いバイオマス生産性を呈する。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、光プロファイルが自然な昼光プロファイルを模倣する日周サイクル条件下で、同じ種の対照光合成生物の培養物よりも高いバイオマス生産性を呈する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、光合成生物のバイオマスの増加は、総有機炭素の増加を含む。いくつかの実施形態では、光合成生物のバイオマスの増加は、総脂質含有量の増加を含む。いくつかの実施形態では、光合成生物のバイオマスの増加は、総窒素含有量の増加を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物に対して、弱光条件下でのクロロフィルの減少と、１００、１２５、１５０、２００、または２５０μＥｍ−２ｓ−１を超えるすべての生理学的に適切な放射照度において、光系ＩＩにおける光化学のより高い最大量子収率（Ｆｖ／ＦＭ）とを呈する。いくつかの実施形態では、クロロフィルの減少は、同じ種の対照光合成生物に対して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％の減少である。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物に対して、１２５、１５０、２００、または２５０μＥｍ−２ｓ−１を超える生理学的に適切なすべての放射照度において、より低い非光化学的消光（ＮＰＱ）を呈する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物よりも高い、クロロフィル当たりの炭素固定率を呈する。いくつかの実施形態では、炭素固定率は、同じ種の対照光合成生物よりも、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％高い。
【００３７】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物よりも、少なくとも１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％またはそれ以上高い、クロロフィル１ｍｇ当たりの酸素発生率を呈する。いくつかの実施形態において、変異体光合成生物は、少なくとも１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％またはそれ以上高い、全有機炭素（ＴＯＣ）１ｇ当たりの酸素発生率を呈する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物の培養物よりも大きな脂質生産性を呈する。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、光独立栄養培養においてより大きな脂質生産性を呈する。いくつかの実施形態では、変異光合成生物は、藻類である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、生物のＳＧＩ２遺伝子を改変することによって生成される。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、生物のｃｐＳＲＰ５４遺伝子を、ＳＧＩ１遺伝子またはＳＧＩ２遺伝子遺伝子と共に改変することによって生成される。いくつかの実施形態では、遺伝子を改変することは、紫外線、ガンマ線、または化学的変異誘発を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子を改変することは、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子、ＳＧＩ１遺伝子、ＳＧＩ２遺伝子、もしくはこれらの遺伝子の組み合わせにおける、塩基置換変異、挿入変異誘発、遺伝子置換、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、メガヌクレアーゼゲノム編集、１つ以上のリボザイム、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号６８、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするｃｐＳＲＰ５４遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号６８、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００個のアミノ酸と、またはアミノ酸配列の全長と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするｃｐＳＲＰ５４遺伝子を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、ｃｐＳＲＰ５４  ＧＴＰａｓｅドメインの最初の１６９個のアミノ酸をコードする配列の外側で発生する、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子における変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＲＰ５４タンパク質をコードするｃｐＳＲＰ５４遺伝子における変異は、ｃｐＳＲＰ５４  ＧＴＰａｓｅドメインをコードする配列の外側で生じる。いくつかの実施形態では、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子における変異は、ｃｐＳＲＰ５４  ＧＴＰａｓｅドメインにおける遺伝子破壊変異を含まない。
【００４２】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物のＳＧＩ２遺伝子は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物のＳＧＩ２遺伝子は、遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号５、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号５６のアミノ酸配列の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００個のアミノ酸と、またはアミノ酸配列の全長と少なくとも５０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００４３】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物のＳＧＩ１遺伝子は、ＳＧＩ１遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、変異体光合成生物のＳＧＩ１遺伝子は、ＳＧＩ１遺伝子の変異または減弱化の前に、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９のアミノ酸配列の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００個のアミノ酸と、またはアミノ酸配列の全長と少なくとも５０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００４４】
上記の態様のいくつかの実施形態では、光合成生物は、倍数体、例えば、二倍体、三倍体、四倍体である。いくつかの実施形態では、遺伝子：ｃｐＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、またはＳＧＩ２のうちの１つ以上のコピーを変異または減弱化して、遺伝子の他のコピーを変化させずに、または減弱化させずに、変異体光合成生物を生成する。いくつかの実施形態では、このように生成された変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物に対して、弱光条件下でのクロロフィルの減少と、１００、１２５、１５０、２００、または２５０μＥｍ−２ｓ−１を超えるすべての生理学的に適切な放射照度において、光系ＩＩにおける光化学のより高い最大量子収率（Ｆｖ／ＦＭ）とを呈する。いくつかの実施形態では、このようにして生成された変異光合成生物は、同じ種の対照光合成生物よりも大きなバイオマス生産性を呈する。いくつかの実施形態では、このようにして生成された変異光合成生物は、同じ種の対照光合成生物よりも大きな脂質生産性を呈する。
【００４５】
上記の態様のいくつかの実施形態では、変異体光合成生物は藻類である。いくつかの実施形態では、藻類は、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）、アンフィプロラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、ベケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）、ボロディネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）、ボトリディウム（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、クリコスファエラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エリプソイドン（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ユースティグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、フラギラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハロカフェテリア（Ｈａｌｏｃａｆｅｔｅｒｉａ）、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）、ハイメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、ナビキュラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オエドゴニウム（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、ファグス（Ｐｈａｇｕｓ）、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、シュードスタウラストラム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、アオミドロ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、タラシオシーラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）、ビスケリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）、およびボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）の属に属する。いくつかの実施形態では、変異光合成生物は、緑藻類（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓ）または車軸藻類（ｃｈａｒｏｐｈｙｔｅｓ）のメンバーであり、例えば、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅの綱である、緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、トレボウクシア藻綱（Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、クロロデンドロン藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｄｅｎｄｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、アオサ藻綱（Ｕｌｖｏｐｈｙｃｅａｅ）、ペディノ藻綱（Ｐｅｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）、またはプラシノ藻綱（Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）であってもよい。例えば、藻類変異体は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ、またはＣｈｌｏｒｏｄｅｎｄｒｏｐｈｙｃｅａｅに属する種であってもよい。いくつかの実施形態では、変異体藻類細胞は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅ藻類細胞であり、Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ綱のＣｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅ藻類細胞、例えば、クラスの緑藻類藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、オウキセノクロレラ（Ａｕｘｅｎｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ヘベオクロレラ（Ｈｅｖｅｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、マリニクロレラ（Ｍａｒｉｎｉｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ、Ｆｒａｎｃｅｉａ、Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ、またはＰｒｏｔｏｔｈｅｃａなどの属の種の藻類細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、変異体藻類は、Ａｕｘｅｎｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｈｅｖｅｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｍａｒｉｎｉｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ、またはＴｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａの種に属する種であり得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、変異体光合成微生物は、シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である。いくつかの実施形態では、ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、アカリオクロリス（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ）、アグメネラム（Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、アナベノプシス（Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ）、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）、アルスロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）、アステロカプサ（Ａｓｔｅｒｏｃａｐｓａ）、ボルジア（Ｂｏｒｚｉａ）、カロスリクス（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ）、カマエシフォン（Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ）、クロログロエオプシス（Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ）、クロロコクシディオプシス（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ）、クロオコッカス（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ）、クリナリウム（Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ）、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、シアノビウム（Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ）、シアノシスティス（Ｃｙａｎｏｃｙｓｔｉｓ）、シアノスピラ（Ｃｙａｎｏｓｐｉｒａ）、シアノセイス（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）、シリンドロスペルモプシス（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ）、シリンドロスペルマム（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ）、ダクチロコッコプシス（Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ）、デルモカルペラ（Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ）、フィスケレラ（Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ）、フレミエラ（Ｆｒｅｍｙｅｌｌａ）、ゲイトレリア（Ｇｅｉｔｌｅｒｉａ）、ゲイトレリネマ（Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍａ）、グロエオバクター（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）、グロエオカプサ（Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ）、グロエオセイス（Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ）、ハロスピルリナ（Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、イエンガリエラ（Ｉｙｅｎｇａｒｉｅｌｌａ）、レプトリングビヤ（Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ）、リムノスリクス（Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ）、リングビヤ（Ｌｙｎｇｂｙａ）、ミクロコレウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ）、ミクロシスティス（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、ミクソサルシナ（Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ）、ノデュラリア（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ）、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）、ノストコプシス（Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ）、オシラトリア（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ）、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）、プランクトスリックス（Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ）、プレウロカプサ（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ）、プロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロクロロン（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ）、プロクロロスリクス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘ）、シュードアナベナ（Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ）、リブラリア（Ｒｉｖｕｌａｒｉａ）、シゾスリクス（Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ）、サイトネマ（Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ）、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、スタニエリア（Ｓｔａｎｉｅｒｉａ）、スタリア（Ｓｔａｒｒｉａ）、スティゴネマ（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ）、シンプロカ（Ｓｙｍｐｌｏｃａ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サーモシネコシスティス（ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、トリポスリクス（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ）、トリコデスミウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）、チコネマ（Ｔｙｃｈｏｎｅｍａ）、またはキセノコッカス（Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）種である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、変異体光合成微生物は、植物である。植物の非限定的な例としては、単子葉植物および双子葉植物、例えば、穀物作物（例えば、小麦、トウモロコシ、米、キビ、大麦）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物  （例えば、アルファルファ）、根菜類作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、佐藤ビート、ヤムイモ）、葉物野菜作物（例、レタス、ホウレンソウ）、顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹ならびに松（例えば、マツモミ、エゾマツ）、ファイトレメディエーションで使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）、油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）、および実験目的で使用される植物（例えば、シロイヌナズナ）が挙げられる。
【００４８】
変異した双子葉植物の非限定的な例としては、以下の目：モクレン目（Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ）、ミシアレス目（Ｍｉｃｉａｌｅｓ）、クスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）、コショウ目（Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ）、ウマノスズクサ目（Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ）、スイレン目（Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、ケシ目（Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ）、サラセニア科（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ）、ヤマグルマ目（Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）、マンサク目（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ）、トチュウ目（Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ）、レイトネリア目（Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ）、ヤマモモ目（Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ）、ブナ目（Ｆａｇａｌｅｓ）、モクマオウ目（Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ）、ナデシコ目（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）、バティス目（Ｂａｔａｌｅｓ）、タデ目（Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ）、イソマツ目（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ）、ビワモドキ目（Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ）、ツバキ目（Ｔｈｅａｌｅｓ）、アオイ目（Ｍａｌｖａｌｅｓ）、イラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）、サガリバナ目（Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ）、スミレ目（Ｖｉｏｌａｌｅｓ）、ヤナギ目（Ｓａｌｉｃａｌｅｓ）、フウチョウソウ目（Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、イワウメ目（Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ）、カキノキ目（Ｅｂｅｎａｌｅｓ）、サクラソウ目（Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、マメ目（Ｆａｂａｌｅｓ）、カワゴケソウ目（Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ）、アリノトウグサ目（Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ）、フトモモ目（Ｍｙｒｔａｌｅｓ）、ミズキ目（Ｃｏｒｎａｌｅｓ）、ヤマモガシ目（Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ビャクダン目（Ｓａｎ  ｔａｌｅｓ）、ラフレシア目（Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ）、ニシキギ目（Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ）、トウダイグサ目（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ）、クロウメモドキ目（Ｒｈａｍｎａｌｅｓ）、ムクロジ目（Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）、クルミ目（Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ）、フウロソウ目（Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ）、ヒメハギ目（Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ）、セリ目（Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ）、リンドウ目（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ）、ハナシノブ目（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ）、シソ目（Ｌａｍｉａｌｅｓ）、オオバコ目（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ）、ゴマノハグサ目（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ）、キキョウ目（Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ）、アカネ目（Ｒｕｂｉａｌｅｓ）、マツムシソウ目（Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ）、およびキク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）、に属する植物が挙げられる。
【００４９】
変異した単子葉植物の非限定的な例しては、以下の目：オモダカ目（Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ）、トチカガミ目（Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ）、イバラモ目（Ｎａｊａｄａｌｅｓ）、ホンゴウソウ目（Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ）、ツユクサ目（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ）、ホシクサ目（Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ）、サンアソウ目（Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ）、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、イグサ目（Ｊｕｎｃａｌｅｓ）、カヤツリグサ目（Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ）、ガマ目（Ｔｙｐｈａｌｅｓ）、パイナップル目（Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ）、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、ヤシ目（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、パナマソウ目（Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ）、タコノキ目（Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ）、サトイモ目（Ａｒａｌｅｓ）、ユリ目（Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ）、およびラン目（Ｏｒｃｈｉｄ  ａｌｅｓ）、に属する植物が挙げられ、または裸子植物（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）に属する植物、例えば、以下の目：マツ目（Ｐｉｎａｌｅｓ）、イチョウ目（Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ）、ソテツ目（Ｃｙｃａｄａｌｅｓ）、ナンヨウスギ目（Ａｒａｕｃａｒｉａｌｅｓ）、ヒノキ目（Ｃｕｐｒｅｓｓａｌｅｓ）、およびグネツム目（Ｇｎｅｔａｌｅｓ）、に属するものも挙げられる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、変異した植物は、アラビドプシス・アレニコラ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ）、アラビドプシス・アレノサ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ａｒｅｎｏｓａ）、アラビドプシス・セベネンシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃｅｂｅｎｎｅｎｓｉｓ）、アラビドプシス・クロアティカ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃｒｏａｔｉｃａ）、アラビドプシス・ハレリ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｈａｌｌｅｒｉ）、アラビドプシス・リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ）、アラビドプシス・ネグレクタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｎｅｇｌｅｃｔａ）、アラビドプシス・ペデモンタナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｐｅｄｅｍｏｎｔａｎａ）、アラビドプシス・スエシカ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、アプランドワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、シロバナワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、インドワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｕｍ）、ハワイアンコットン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）、クロガラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）、またはアブラナ属の種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ）であり得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、植物におけるＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、またはこれらの遺伝子のうちの１つ以上の組み合わせの改変は、組織特異的であり得る。いくつかの実施形態では、植物組織は、葉、茎、または根であり得る。いくつかの実施形態では、組織特異的遺伝子の改変は、遺伝子の組織特異的非コード領域、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、３’−または５’−非翻訳領域を改変することにより達成することができる。いくつかの実施形態では、植物におけるＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、またはこれらの遺伝子のうちの１つ以上の組み合わせの改変は、植物の異なる発達段階で行うことができる。
【００５２】
本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、本発明の以下の発明を実施するための形態を添付の図面と併せて読み取ると、より完全に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１Ａは、ＳＧＩ１遺伝子の概略図を示す。ＳＧＩ１遺伝子（ＣＲＩＳＰＲ標的）を破壊するように設計されたｇＲＮＡの推定位置が示されている。図１Ｂは、ＳＰＲ５４遺伝子の概略図を示す。ＳＰＲ５４遺伝子（ＣＲＩＳＰＲ標的）を破壊するように設計されたｇＲＮＡの推定位置が示されている。
【図２】図２Ａは、ＳＧＩ１遺伝子の概略図を示す。ＳＧＩ１遺伝子（ＣＲＩＳＰＲ標的）を破壊するように設計されたｇＲＮＡの推定位置が示されている。図２Ｂは、ＳＧＩ１タンパク質の概略図を示す。図２Ｃは、ＳＰＲ５４遺伝子の概略図を示す。ＳＰＲ５４遺伝子（ＣＲＩＳＰＲ標的）を破壊するように設計されたｇＲＮＡの推定位置が示されている。
【図３】Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ種のＳｇＩ２タンパク質の例示的なドメインアーキテクチャ分析を示す。
【図４】Ｏｏｃｙｓｔｉｓ種のＳｇＩ２タンパク質の例示的なドメインアーキテクチャ分析を示す。
【図５】Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ種のＳｇＩ２タンパク質の例示的なドメインアーキテクチャ分析を示す。
【図６】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＳｇＩ２タンパク質の例示的なドメインアーキテクチャ分析を示す。
【図７】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＳｇＩ２タンパク質の例示的なドメインアーキテクチャ分析を示す。
【図８】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＳｇＩ２タンパク質の例示的なドメインアーキテクチャ分析を示す。
【図９】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａＳｇＩ２タンパク質の例示的なドメインアーキテクチャ分析を示す。
【図１０】図１０Ａは、亜硝酸レダクターゼプロモーターとターミネーターとが隣接したコドン最適化Ｃｒｅ遺伝子を含有するＤＮＡカセットの概略図を示す。図１０Ｂは、ｂｌｅＲおよびＧＦＰ配列を含むＤＮＡカセットの概略図を示す。
【図１１】Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株、ＳＲＰ５４ノックアウト株、ＳＧＩ２ノックアウト株、ＳＧＩ２およびＳＲＰ５４のダブルノックアウト株の、生産性アッセイの結果を示す。
【図１２】図１２Ａは、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株（ＳＴＲ０００１０）、ＳＲＰ５４ノックアウト変異体（ＳＴＲ００６２５）、ＳＧＩ１ノックアウト変異体（ＳＴＲ２４１８３）、ＳＧＩ１／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体（ＳＴＲ２４５３８およびＳＴＲ２４５５０）の、半連続領域ＴＯＣ生産性アッセイの結果を示す。図１２Ｂは、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株（ＳＴＲ０００１０）、ＳＲＰ５４ノックアウト変異体（ＳＴＲ００６２５）、ＳＧＩ１ノックアウト変異体（ＳＴＲ２４１８３）、ＳＧＩ１／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体（ＳＴＲ２４５３８およびＳＴＲ２４５５０）の、バッチＴＯＣ生産性アッセイの結果を示す。
【図１３】Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株（ＳＴＲ０００１０）、ＳＲＰ５４ノックアウト変異体（ＳＴＲ００６２５）、ＳＧＩ１ノックアウト変異体（ＳＴＲ０００１２）、ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体（ＳＴＲ２５７６１）、およびＳＧＩ１／ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４トリプルノックアウト変異体（ＳＴＲ２５７６１およびＳＴＲ２５７６２）の、半連続領域ＴＯＣ生産性を示すアッセイの結果を示す。図１３Ｂは、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株（ＳＴＲ０００１０）、ＳＲＰ５４ノックアウト変異体（ＳＴＲ００６２５）、ＳＧＩ１ノックアウト変異体（ＳＴＲ０００１２）、ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体（ＳＴＲ２５７６１）、およびＳＧＩ１／ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４トリプルノックアウト変異体（ＳＴＲ２５７６１およびＳＴＲ２５７６２）の、バッチＴＯＣ生産性を示すアッセイの結果を示す。
【図１４】Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株（ＳＴＲ０００１０）、ＳＲＰ５４ノックアウト変異体（ＳＴＲ００６２５）、ＳＧＩ１ノックアウト変異体（ＳＴＲ２４１８３）、ＳＧＩ１／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体（ＳＴＲ２４５３８およびＳＴＲ２４５４０）の、バッチＦＡＭＥ生産性アッセイの結果を示す。
【図１５】Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株（ＳＴＲ０００１０）、ＳＧＩ１ノックアウト変異体（ＳＴＲ０００１２）、ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体（ＳＴＲ００５１６）、およびＳＧＩ１／ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４トリプルノックアウト変異体（ＳＴＲ２５７６１およびＳＴＲ２５７６２）の、バッチＦＡＭＥ生産性アッセイの結果を示す。
【図１６】図１６Ａは、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａのＳＰＲ５４をノックアウトするための選択カセットの概略図を示す。図１６Ｂは、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａのＳＧＩ２をノックアウトするための選択カセットの概略図を示す。
【図１７】Ｃａｓ９、ＧＦＰ、ＢｌｅＲ、Ｃｒｅ遺伝子、およびｌｏｘ部位を含む組換えｐＣＣ１ＢＡＣベクターの概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
発明の詳細な説明
本出願の発明者らは、驚くべきことに、かつ予期せぬことに、光合成生物におけるＳＧＩ１およびＳＧＩ２遺伝子の調節が、弱光条件下でのクロロフィルの減少と、すべての生理学的に放射照度における光化学系ＩＩのより高い最大量子収率（Ｆｖ／ＦＭ）とをもたらすことを見出した。いくつかの実施形態では、変異または減弱化されたＳＧＩ１またはＳＧＩ２遺伝子を含む変異体光合成生物は、すべての生理学的に関連する放射照度でより低い非光化学消光（ＮＰＱ）を呈する。いくつかの実施形態では、変異または減弱化されたＳＧＩ１またはＳＧＩ２遺伝子を含む変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物のものよりも、増加したバイオマスを呈する。いくつかの実施形態では、変異または減弱化されたＳＧＩ１またはＳＧＩ２遺伝子を含む変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物のものよりも、クロロフィルに基づく高い炭素固定率を呈する。いくつかの実施形態では、変異または減弱化されたＳＧＩ１またはＳＧＩ２遺伝子を含む変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物のものよりも高い、ＴＯＣ当たりの炭素固定率を呈する。いくつかの実施形態では、変異または減弱化されたＳＧＩ１またはＳＧＩ２遺伝子を含む変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物よりも、より高い、クロロフィル１ｍｇ当たりの酸素発生率を呈する。いくつかの実施形態では、変異または減弱化されたＳＧＩ１またはＳＧＩ２遺伝子を含む変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物のものよりも高い、ＴＯＣ当たりの酸素発生率を呈する。いくつかの実施形態では、変異または減弱化されたＳＧＩ１またはＳＧＩ２遺伝子を含む変異体光合成生物は、同じ種の対照光合成生物の培養物のものよりも、大きな脂質生産性を呈する。いくつかの実施形態では、変異または減弱化されたＳＧＩ１またはＳＧＩ２遺伝子を含む変異体光合成生物は、光独立栄養培地においてより大きな脂質生産性を呈する。
【００５５】
本出願の発明者らはまた、驚くべきことに、光合成生物におけるＳＧＩ１またはＳＧＩ２遺伝子の調節と共に、ＳＲＰ５４遺伝子の調節に対する相乗効果を見出した。いくつかの実施形態では、ＳＲＰ５４およびＳＧＩ１またはＳＧＩ２遺伝子が調節されている変異体光合成生物においては、ＳＧＩ１またはＳＧＩ２遺伝子のみが調節される変異体光合成生物と比べて、クロロフィルはさらに減少し、バイオマスはさらに増加し、クロロフィルに基づく炭素固定が大きくなり、ＴＯＣ当たりの炭素固定が大きくなる。
【００５６】
ＳＧＩ１遺伝子
本明細書に記載されているように、有意な成長改善遺伝子１（ＳＧＩ１）ポリペプチドは、２つのドメイン：応答レシーバーまたは「ＲＲ」ドメイン（Ｐｆａｍ  ＰＦ０００７２）およびＭｙｂドメイン（Ｐｆａｍ  ＰＦ００２４９）、を含むポリペプチドであり、ＲＲドメインは、ＭｙｂドメインのＮ末端側に位置付けられている。本明細書では２つのドメイン間のリンカーと称されることもある、ＳＧＩ１ポリペプチド間で保存性が低いかまたは保存されていないことがわかっているアミノ酸配列によって、ＲＲドメインおよびＭｙｂドメインは隔てられており、このリンカーは、例えば、１〜３００個のアミノ酸、または１０〜２００個のアミノ酸の長さの範囲であってもよい。リンカー領域は、任意で核局在化配列（ＮＬＳ）を含むことができる。
【００５７】
応答レシーバー「ＲＲ」ドメイン（Ｐｆａｍ  ＰＦ０００７２）の存在は、ＣｈｅＹ様ポリペプチドとして、そのバイオインフォマティクスアノテーションに関与する。このＲＲドメインは、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａのＳＧＩ１ポリペプチド（配列番号３）のおよそアミノ酸３６からアミノ酸１４８までにわたっており、保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）において、およそアミノ酸３７からアミノ酸１５４までにわたる「シグナルレシーバードメイン」：ｃｄ００１５６、として特徴付けられる。これはまた、オルソログ遺伝子データベース（Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄａｔａｂａｓｅ）において「ＣｈｅＹ様レシーバー（ＲＥＣ）ドメイン」：ＣＯＧ０７８４、として、かつＩｎｔｅｒｐｒｏ「ＣｈｅＹ様スーパーファミリー」ドメイン：ＩＰＲ０１１００６、としても特徴付けられ、これらの特徴付けられたドメインの両方とも、配列番号３のＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａのＳＧＩ１ポリペプチドのおよそアミノ酸３３からおよそアミノ酸１６１までにわたっている。ＲＲドメインは、センサーパートナーから信号を受信する細菌の二成分調節系（ＣｈｅＹとして知られるポリペプチドを含む細菌の走化性二成分系のような）で見出されている。このような系のＲＲドメインは、多くの場合、ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側にあることが判明しており、その活性化または不活性化に関与する可能性がある、リン酸化され得るリン酸アクセプター部位を含む。
【００５８】
ＳＧＩ１タンパク質内のＲＲドメインは、例えば、Ｐｆａｍ  ＰＦ０００７２として、または「シグナルレシーバードメイン」または単に「レシーバードメイン」として特徴付けることができ、および／または保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）においてｃｄ００１５６として、オルソログ遺伝子データベース（Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄａｔａｂａｓｅ）においてＣＯＧ０７８４として、またはＩｎｔｅｒｐｒｏ「ＣｈｅＹ様スーパーファミリー」ドメイン：ＩＰＲ０１１００６、として分類することができる。ＲＲドメインは、センサーパートナーから信号を受信する細菌の二成分調節系（ＣｈｅＹとして知られるポリペプチドを含む細菌の走化性二成分系のような）で見出されている。このような系のＲＲドメインは、多くの場合、ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側にあることが判明しており、その活性化または不活性化に関与する可能性がある、リン酸化され得るリン酸アクセプター部位を含む。
【００５９】
ＳＧＩ１タンパク質内のｍｙｂドメインは、例えば、ｐｆａｍＰＦ００２４９：「Ｍｙｂ様ＤＮＡ結合ドメイン」と特徴付けることができ、および／または保存ドメインＴＩＧＲ０１５５７「ｍｙｂ様ＤＮＡ結合ドメイン、ＳＨＡＱＫＹＦクラス（配列番号１０２として開示されたＳＨＡＱＫＹＦ）」として、またはＩｎｔｅｒｐｒｏホメオボックス様ドメインスーパーファミリードメイン（ＩＰＲ００９０５７）ならびに／もしくはＩｎｔｅｒｐｒｏＭｙｂドメイン（ＩＰＲ０１７９３０）として特定することができる。
【００６０】
本明細書で提供されるＳＧＩ１タンパク質は、ｍｙｂドメインに対してＮ末端側のＲＲドメインを有することに加えて、藻類のＳＧＩ１ホモログの領域の保存されたアミノ酸とどの程度一致するかに基づいてタンパク質をスコアリングするように設計された、隠れマルコフモデル（Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ）（ＨＭＭ）でスキャンされる場合に（ここでは、スコアに達するために、高度に保存されたアミノ酸の位置が、ポリペプチドの比較領域内の保存性が低いアミノ酸位置よりも重く重み付けされる）、３００以上、３２０以上、３４０以上、３５０以上、３６０以上、または３７０以上のスコアを有することできる。ＲＲドメイン、リンカー、およびｍｙｂドメインを含む単一の連続配列を含む藻類ＳＧＩ１ポリペプチドのタンパク質配列に基づくＨＭＭモデルでスキャンするとき、３５０以上、例えば３７０以上のスコアを有するポリペプチドは、限定されないが、藻類および植物種のポリペプチドＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ種１１８５（配列番号３）、コッコミクサ・サブエリプソイディア（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ｓｕｂｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）（配列番号９）、オストレアコッカス・ルシマリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ）（配列番号１０）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（配列番号１１）、ボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）（配列番号１３）、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ種１０５（配列番号１４、１５および１６）、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ種（配列番号１７）、ミクロモナス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ）種ＲＣＣ２９９（配列番号１８）、ミクロモナス・プシラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）（配列番号１９）、サンカクミズゴケ（Ｓｐｈａｇｎｕｍ  ｆａｌｌａｘ）（配列番号２０）、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（配列番号２１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（（配列番号２２）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｈａｌｌｅｒｉ（配列番号２３）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ（配列番号２４）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（配列番号２５）、ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（配列番号２６）、アンボレラ・トリコポダ（Ａｍｂｏｒｅｌｌａ  ｔｒｉｃｈｏｐｏｄａ）（配列番号２７）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（配列番号２８）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（配列番号２９）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（配列番号３０）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ（配列番号３１）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）（配列番号３２）、フェオリス・ブルガリス（Ｐｈａｅｏｌｉｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（配列番号３３）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（配列番号３４）、キヌア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ）（配列番号３５）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（配列番号３６）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（配列番号３７）、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）（配列番号３８）、およびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（配列番号３９）、ならびに前述のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドが挙げられるポリペプチドを使用して開発し、このポリペプチドは、ＲＲドメインとｍｙｂドメインとを有し、ＲＲドメインは、ｍｙｂドメインに対してＮ末端側にある。様々な実施形態では、ＳＧＩ１ポリペプチドは、植物または藻類種に由来する。本明細書で提供されるＳＧＩ１ポリペプチドをコードする遺伝子、例えば、本明細書で提供される変異体において破壊されるかまたはその発現が減弱される遺伝子は、様々な実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする植物または藻類種の、天然に存在する遺伝子であり得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＳＧＩ１ポリペプチドは、例えば、天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの配列を有する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドであり、藻類ポリペプチドは、ＲＲドメインとｍｙｂドメインとを含み、ＲＲドメインは、ｍｙｂドメインに対してＮ末端側にある。藻類ポリペプチドは、任意で、本明細書に開示される藻類ＳＧＩ１ポリペプチドのいずれかと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＧＩ１遺伝子は、藻類ＳＧＩ１ポリペプチド、例えば、天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの配列を有するポリペプチドなどをコードする遺伝子であり得る。天然に存在する藻類ＳＧＩポリペプチドの配列を有するポリペプチドをコードするＳＧＩ１遺伝子は、遺伝子をコードする配列の天然に存在する遺伝子配列を有する遺伝子であり得るか、または天然に存在する遺伝子の配列とは異なる配列を有し得る。様々な実施形態では、本明細書に開示される変異体光合成生物において減弱化、変異、または破壊されているＳＧＩ１遺伝子は、例えば、本明細書に開示される配列を使用するＢＬＡＳＴを通して、および／またはＨＭＭスキャンによって特定される遺伝子であり得、ＨＭＭは、例えば、少なくとも６つのＳＧＩポリペプチドの比較によって得られる隣接するアミノ酸配列に基づいており、隣接するアミノ酸配列はＲＲドメインとｍｙｂドメインとを含み、ＲＲドメインはｍｙｂドメインに対してＮ末端側にあり、ＲＲドメインとｍｙｂドメインとの間に、どちらのドメインにも属さないリンカー配列がある。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＳＧＩポリペプチドは、藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの配列を有するか、または天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの変異体であり、および／または、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のうちのいずれかと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＳＧＩポリペプチドは、植物ＳＧＩ１ポリペプチドの配列を有するか、または天然に存在する藻類ＳＧＩポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する天然に存在する植物ＳＧＩ１ポリペプチドの変異体であり、および／または、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９のうちのいずれかと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
【００６４】
配列番号１が、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａのＳＧＩ１遺伝子配列として提供され、これは、その両方とも６１９アミノ酸タンパク質のＮ末端の半分に存在する２つの主要な機能ドメインを含むポリペプチド（配列番号３）をコードすることが見いだされた。例示的なＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａのＳＧＩ１  ｃＤＮＡ配列は、配列番号２として提供される。
【００６５】
保存されたタンパク質ドメインは、ｍｙｂドメインに対してＣ末端側のＳＧＩ１ポリペプチドの領域、すなわちタンパク質のＣ末端側の（およそ）半分には見出すことができなかった。一方、ＲＲドメインおよびＭｙｂドメインは、ｍｙｂドメインがＲＲドメインに対してＣ末端側に配置されている場合、緑色植物（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）（緑色植物（ｇｒｅｅｎ  ｐｌａｎｔ）、藻類を包含する）ゲノムでコードされている多くのタンパク質に見出すことができる。バイオインフォマティクス分析を使用して、追加の植物および藻類の種におけるＳＧＩ１のオルソログの可能性を特定した。
【００６６】
追加の光合成生物のＳＧＩ１タンパク質のクラスを同定するために、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａのＳＧＩ１で見出されたｍｙｂドメインアーキテクチャであるＲＲドメイン用の隠れマルコフモデル（Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ）（ＨＭＭ）を構築した。最初の工程として、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａのＳＧＩ１ポリペプチド配列（配列番号３）を使用して、植物および藻類のゲノムを含むＪＧＩ  Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅのデータベースｖ．１２をＢＬＡＳＴ検索した。４つの独自の藻類ゲノム（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、およびＯｏｃｙｓｔｉｓ種）もまた、検索されたデータベースに追加した。検索は、約２，０００ヒットに達したときに停止した。次いで、これらの結果を、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、例えば、ａｔ  ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ］から入手可能）により分析し、選択された結果が、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ  ＣｈｅＹ様スーパーファミリードメイン（ＩＰＲ０１１００６）と、Ｉｎｔｅｒｐｒｏホメオボックス様ドメインもしくはＭｙｂドメイン（ＩＰＲ００９０５７またはＩＰＲ０１７９３０）の両方を有していることを確認した。この工程は、選択されたヒット数を、藻類および高等植物の両方のポリペプチドで明確に同定された２つのドメインアーキテクチャ（ＲＲドメインのＮ末端からｍｙｂドメイン）を有するポリペプチドを備える、９００〜１，０００まで減少させた。得られた配列を使用して、配列相同性に基づいて系統樹を組み立てた。系統樹は、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｖｏｌｖｏｘ、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ、およびコッコミクサ（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ）のＳＧＩ１ホモログを含む、藻類種由来の関連ポリペプチドの明確なグループ化を示した。
【００６７】
（表）藻類種のＳＧＩＩオルソログ
2021509018.tif 000003
【００６８】
次いで、他の光合成生物における可能性のあるＳＧＩ１オルソログについての基準を確立するために、ＳＧＩ１ポリペプチド配列の藻類クラスターに基づいて、隠れマルコフモデル（Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ）（ＨＭＭ）を開発した。ＨＭＭは、２つの保存されたドメイン間のリンカー領域を含む、ＲＲおよびｍｙｂドメインの両方を包含するＳＧＩ１ポリペプチドのＮ末端部分に基づいて開発した。いかなる認識可能な保存された構造も含まない、ｍｙｂドメインに対してＣ末端側のポリペプチドの配列は、モデル構築から除外された。ＨＭＭＥＲ  ３．１ｂ２を、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、およびＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓの独自の配列、ならびにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｖｏｌｖｏｘ  Ｃａｒｔｅｒｉ、クロモクロリス・ゾフィンジエンシス（Ｃｈｒｏｍｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ｓｕｂｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ種のＲＣＣ２９９、およびオストレオコッカス・ルミナリナス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｍｉｎａｒｉｎｕｓ）のポリペプチドの公開データベースの配列から多重配列アラインメント（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（ＭＳＡ）を使用するＨＭＭを構築するために使用した。タンパク質のＮ末端側半分の多重配列アラインメント（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（ＭＳＡ）を、ＥＴＥ３ツールキットおよびｅｇｇｎｏｇ４１ワークフローを使用して生成した。このプログラムは、アラインメントにはＭｕｓｃｌｅ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、Ｍ−ｃｏｆｆｅｅ、アラインメントトリミングにはｔｒｉｍＡＩ、系統発生干渉にはＰｈｙＭＬプログラムを内部的に使用している。例えば、相同性比較に使用される単一のタンパク質配列とは異なり、ＨＭＭは多数のタンパク質配列から情報を得るため、高度に保存された残基を高度に多岐にわたる残基から区別し、配列の関連性を判定するときにそれを考慮に入れることができる。ＨＭＭを使用して配列をスコアリングする場合、高度に保存された残基は、高度に多岐にわたる残基よりも多くの重みを受け取るため、単純なＰＳＡよりも優れた感度および精度を提供する。
【００６９】
ＳＧＩ１のＨＨＭを使用して、ＢＬＡＳＴ検索で特定された２つの保存されたドメイン（ＲＲおよびｍｙｂ）を有することが確認されたポリペプチドにスコアを割り当てた。バイオインフォマティクス検索において藻類種および単一の植物ポリペプチドのほとんどで見出された最高のスコアにより、他の藻類種で対象とするタンパク質の同定を可能にした（表１）。これらは、他の生物に高生産性変異体を提供するために遺伝子が減弱化またはノックアウトされ得る可能性のあるオルソログを表している。
【００７０】
（表２）藻類種におけるＳＧＩ１オルソログ
2021509018.tif 000004
【００７１】
ＳＧＩ１遺伝子の概略図を図１Ａに示す。
【００７２】
いくつかの実施形態では、藻類種におけるＳＧＩ１遺伝子の変異、減弱化、またはノックアウトなどのＳＧＩ１遺伝子の調節は、それらが由来した野生型株と比較して、減少されたアンテナサイズ（すなわち、機能的吸収断面積）を呈しながら、例えば、光化学系ＩＩの光化学の最大量子収率（Ｆｖ／ＦＭ）を（約１０〜１４％分）増加させる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＳＧＩ１遺伝子の調節はまた、光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）および光化学系Ｉ（ＰＳＩ）のアンテナサイズ（すなわち、機能的吸収断面積）の減少（野生型に対して４０〜５０％減少）、飽和光下でのＰＳＩＩのアクセプター側の高電子輸送率（１／τ’Ｑａ）（操作された変異体において、野生型に対して約３５％〜約１３０％、および少なくとも約１００％分の増加）、および高炭素固定率（Ｐｍａｘ）（野生型に対して少なくとも３０〜４０％）を引き起こすことができ、一方では、多重反応モニタリングタンパク質定量法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）によって決定されるように、ＴＯＣごとの光化学系の数は維持される。
【００７４】
ＳＧＩ２遺伝子
本願の発明者らは、有意な成長改善遺伝子２（ＳＧＩ２）を、光合成生物、例えば、藻類、植物中に存在する、二成分系（ＴＣＳ）と呼ばれるある部類の制御遺伝子のオルソログとして特定した。なぜなら、これらは、細菌細胞周期の進行ならびに発達（Ｓｋｅｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ：ａ  ｓｙｓｔｅｍ−ｌｅｖｅｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．３（１０）：ｅ３３４）、窒素感知（Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ＮｔｒＣ，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｗｈｏｓｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１７４  （１５）：５１１７−２２）、および細菌の走化性（Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８９；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣｈｅＹ；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６４（３６）：２１７７０−８）を含む、重要な細胞過程を制御することが知られているためである。細菌では、これらのタンパク質は通常、特定の環境刺激を感知するヒスチジンキナーゼと；主に標的遺伝子の異なる発現を通じて細胞応答を仲介する対応する応答レギュレータードメイン（ＰＦ０００７２）と、からなる。しかしながら、光合成生物では、ＳＧＩ２遺伝子は対応する応答レギュレータードメイン（ＰＦ０００７２）を含むが、二成分系の他のドメインを欠いている。
【００７５】
ＳＧＩ１遺伝子の概略図を図２Ａに示し、対応するタンパク質の概略図を図２Ｂに示す。
【００７６】
例示的なＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａのＳＧＩ２遺伝子配列は、配列番号４として提供され、応答レギュレータードメイン（配列番号６）を含むポリペプチド（配列番号５）をコードすることが判明した。
【００７７】
様々な光合成生物における例示的なオルソロガスポリペプチド配列を、下表３に以下に示す。
【００７８】
（表３）様々な光合成生物におけるオルソロガスＳＧＩ２配列
2021509018.tif 000005
【００７９】
例示的なＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａのＳＧＩ２  ｃＤＮＡ配列は、配列番号７として提供される。他の光合成生物におけるＳＧＩ２遺伝子のオルソロガスｃＤＮＡ配列を以下の表４に示す。
【００８０】
（表４）他の光合成生物におけるＳＧＩ２遺伝子のオルソロガスｃＤＮＡ配列
2021509018.tif 000006
【００８１】
いくつかの実施形態では、光合成生物のＳＧＩ２ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、光合成生物のＳＧＩ２ポリペプチドは、配列番号５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、または５６の少なくとも１００、１５０、２００、２５０個のアミノ酸と、またはこれらの全長と少なくとも３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、光合成生物は、ポリヌクレオチドの核酸配列が、配列番号４、７、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、または６７の少なくとも１００、１５０、２００、２５０個のヌクレオチドと、またはこれらの全長と少なくとも３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５パーセント同一である、ＳＧＩ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、藻類種などの光合成生物におけるＳＧＩ２遺伝子の変異、減弱化、またはノックアウトなどのＳＧＩ２遺伝子の調節が、光化学系ＩＩの光化学の最大量子収率（Ｆｖ／ＦＭ）を（約１０〜１４％分）増加させ、全有機炭素（ＴＯＣ）あたりのクロロフィルを減少させ、バイオマスを増加させた。
【００８４】
ＳＰＲ５４遺伝子
ＳＰＲ５４遺伝子の調節は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０３０４８９６号に記載されている。例示的なＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ葉緑体ＳＲＰ５４（ｃｐＳＲＰ５４）ｃＤＮＡ配列は、配列番号６８を有するポリペプチドをコードする配列番号８として提供される。
【００８５】
他の非限定的な例示的ｃｐＳＲＰ５４オルソログポリペプチドとしては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（配列番号７５）ではＥＤＰ００２６０；Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ（配列番号７６）ではＥＥＨ５９５２６；Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ種（配列番号７７）ではＥＥＨ５９５２６；ビンカムリ（Ｐａｕｌｉｎｅｌｌａ  ｃｈｒｏｍａｔｏｐｈｏｒａ）（配列番号７８）ではＡＣＢ４２５７７；Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ（配列番号７９）ではＡＢＯ９４０３８；オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）（配列番号８０）ではＱ０１Ｈ０３；Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ（配列番号８１）ではＥＦＪ４１７９７；フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）（配列番号８２）ではＥＥＣ４８５９９；タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）（配列番号８３）ではＥＥＤ９４７５５；オーレオコッカス・アノファージフェレンス（Ａｕｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｏｐｈａｇｅｆｆｅｒｅｎｓ）（配列番号８４）ではＥＧＢ１２５０１；シオミドロ（Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ  ｓｉｌｉｃｕｌｏｓｕｓ）（配列番号８５）ではＣＢＮ７６２６３が挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、光合成生物のｃｐＳＲＰ５４遺伝子は、上記に開示されたｃｐＳＲＰ５４と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性であるポリペプチドをコードする。
【００８７】
光合成生物のＳＧＩ２の調節、ＳＧＩ１とＳＲＰ５４との組み合わせ、ＳＧＩ２とＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、または光合成生物のＳＧＩ１、ＳＧＩ２、およびＳＲＰ５４遺伝子の組み合わせ。
【００８８】
光合成生物のＳＧＩ２の調節、ＳＧＩ１とＳＲＰ５４との組み合わせ、ＳＧＩ２とＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ１、ＳＧＩ２、およびＳＲＰ５４遺伝子の組み合わせは、変異体光合成生物をもたらす。ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ＳＲＰ５４遺伝子は、ＵＶ変異誘発、ガンマ線照射、または遺伝子編集技術によって調節することができる。遺伝子配列を変更することができ、遺伝子配列を部分的または完全に欠失することができ、遺伝子の発現を変更することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、および／またはＳＲＰ５４遺伝子は、その全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／００５８３０３号に記載されるように、藻類プロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結され得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物、例えば植物、藻類は、対照細胞に対して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、または少なくとも７０％の総クロロフィルの減少を有し、任意でさらに、変異体は、少なくとも対照細胞に対して増加したクロロフィルｂに対するクロロフィルａの比率を有し、さらに任意で、クロロフィルｂに対するクロロフィルａの比は、少なくとも約２．８：１、少なくとも約３：１、少なくとも約３．２：１、約３．３：１、少なくとも約３．５：１、少なくとも約３．７：１、少なくとも約３．９：１、少なくとも約４：１、または少なくとも約４．３：１である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物、例えば、植物または藻類は、以下を呈する：
（ａ）約１００〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約１５０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約７５〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約４０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、または約１０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１の全ての放射照度において、同じ種の対照光合成生物に対して、より高いｑＰ；
（ｂ）約１００〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約１５０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約７５〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約４０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、または約１０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１の全ての放射照度において、対照藻類に対して、より低いＮＰＱ；
（ｃ）約１００〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約１５０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約７５〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約４０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、または約１０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１の全ての放射照度において、光合成生物、例えば藻類に対して、より高いＹ（ＩＩ）；
（ｄ）約１００〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約１５０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約７５〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約４０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、または約１０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１の対照藻類に対するより高いＦｖ／ＦＭ；
（ｅ）約２５０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約１５０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約７５〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、約４０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１、または約１０〜約２８００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１の対照藻類に対するより高いＥＳＲ（ＩＩ）；
（ｆ）対照藻類に対して、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、または少なくとも４００％分増加した、クロロフィルに基づく酸素発生；および
（ｇ）同じ種の対照光合成生物に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％分増加した、クロロフィルに基づく炭素固定。
【００９２】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物は、同一条件下で培養された対照藻類よりも、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも８％、または少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％大きいバイオマス生産性を示す。
【００９３】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物、例えば、植物、藻類は、自然光を模倣する可変光強度を有する日周サイクル培養において、対照の藻類に対してより高い生産性を示し、任意で、光強度は、約１９００〜約２０００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１でピークに達する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、変異体光合成生物、例えば植物または藻類は、より高い脂質生産性、例えば、変更または減弱された遺伝子（複数可）を有さない同じ種の対照光合成生物に対して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％高い脂質生産性を有する。
【００９５】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本出願が優先する。文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、およびその他の参考文献は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、あらゆる目的でその全体が参照により組み込まれる。
【００９６】
本開示および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」はまた、文脈が明らかに他に指示しない限り、複数形も含む。
【００９７】
本出願内で提供されるすべての範囲には、範囲の上限値および下限値が含まれる。
【００９８】
本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、および「Ｂ」を含むことが意図される。
【００９９】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードする核酸分子（典型的には、ＤＮＡであるが、任意でＲＮＡ）または発現されたＲＮＡの任意のセグメントを指すために広く使用される。したがって、遺伝子は、発現されたＲＮＡをコードする配列を含む（これは、ポリペプチドコード配列または、例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイムなどの機能的ＲＮＡを含み得る）。遺伝子は、それらの発現に必要なまたは影響を与える制御配列、ならびに例えば、イントロン配列、５’または３’非翻訳配列などの、天然の状態のタンパク質またはＲＮＡコード配列に関連する配列をさらに含み得る。いくつかの例では、「遺伝子」は、イントロンを含んでも含まなくてもよい、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のタンパク質をコードする部分のみを指してもよい。遺伝子は、好ましくは５０ヌクレオチド超の長さ、より好ましくは１００ヌクレオチド超の長さであり、例えば、５０ヌクレオチド〜５００，０００ヌクレオチドの長さ、例えば１００ヌクレオチド〜１００，０００ヌクレオチドの長さ、または約２００ヌクレオチド〜約５０，０００ヌクレオチドの長さ、または約２００ヌクレオチド〜約２０，０００ヌクレオチドの長さとすることができる。遺伝子は、対象とする供給源からのクローニング、または既知もしくは予測された配列情報からの合成など、様々な供給源から得ることができる。
【０１００】
「核酸」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のセグメントを指し、修飾された骨格鎖（例えば、ペプチド核酸、ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸）、または修飾された、もしくは天然に存在しない核酸塩基を有する核酸も含む。核酸分子は、二本鎖、部分的二本鎖、または一本鎖であり得、遺伝子またはその一部を含む一本鎖核酸は、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。
【０１０１】
核酸分子は、示された供給源「に由来する」ことができ、これには、示された供給源からの核酸セグメントの（全体的または部分的な）単離物が含まれる。核酸分子はまた、例えば、示されたポリヌクレオチド源からの、または示されたポリヌクレオチド源に関連する配列に基づく、直接クローニング、ＰＣＲ増幅、または人工合成によって、示された供給源に由来し得る。特定の供給源または種に由来する遺伝子または核酸分子は、供給源の核酸分子に対して配列修飾を有する遺伝子または核酸分子も含む。例えば、供給源（例えば、特定の参照遺伝子）に由来する遺伝子または核酸分子は、意図しない、または意図的に導入された、供給源遺伝子または核酸分子に対して１つ以上の変異を含むことができ、置換、欠失、または挿入を含む、１つ以上の変異が意図的に導入される場合、配列の変更は、細胞もしくは核酸のランダムなもしくは標的化された変異によって、増幅もしくは他の遺伝子合成もしくは分子生物学技術によって、または化学合成によって、またはこれらの組み合わせによって導入することができる。機能的ＲＮＡもしくはポリペプチドをコードする参照遺伝子または核酸分子に由来する遺伝子または核酸分子は、参照された、または供給源の機能的ＲＮＡもしくはポリペプチドと、またはその機能的断片と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する機能的ＲＮＡもしくはポリペプチドをコードすることができる。例えば、機能的ＲＮＡもしくはポリペプチドをコードする参照遺伝子または核酸分子に由来する遺伝子または核酸分子は、参照された、または供給源の機能的ＲＮＡもしくはポリペプチドと、またはその機能的断片と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する機能的ＲＮＡもしくはポリペプチドをコードすることができる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「単離された」核酸またはタンパク質は、その天然の環境または核酸もしくはタンパク質が自然界に存在する状況から取り出されている。例えば、単離されたタンパク質または核酸分子は、それがその天然または自然環境で関連している細胞または生物から取り出されている。単離された核酸またはタンパク質は、場合によっては、部分的にまたは実質的に精製され得るが、単離のために特定のレベルの精製は必要とされない。したがって、例えば、単離された核酸分子は、染色体、ゲノム、またはエピソームから切り出された、自然界では組み込まれている核酸配列であり得る。
【０１０３】
「精製された」核酸分子もしくはヌクレオチド配列、またはタンパク質もしくはポリペプチド配列は、細胞物質および細胞成分を実質的に含まない。精製された核酸分子またはタンパク質は、例えば、緩衝液または溶媒以外の化学物質を実質的に含まなくてもよい。「実質的に含まない」は、新規の核酸分子以外の他の成分が検出不可能であることを意味することを意図しない。
【０１０４】
「天然に存在する」および「野生型」という用語は、自然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在する、または野生型の核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質は、天然源からの単離物中に存在する可能性があり、ヒトの操作によって意図的に改変されていない。
【０１０５】
本明細書で使用される「減弱化された」とは、量、程度、強度、または強さの低下を意味する。減弱化された遺伝子発現は、問題になっている遺伝子の転写、またはコードされたタンパク質の翻訳、折りたたみ、またはアセンブリの大幅に減少した量および／または速度を指すことができる。非限定的な例として、減弱化遺伝子は、遺伝子調節配列の変更または破壊により発現が低下した、変異または破壊された遺伝子（例えば、部分的もしくは完全な欠失、切断、フレームシフト、または挿入変異により破壊された遺伝子）であり得るか、または例えば、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、またはリボザイムなどの、遺伝子の発現を低下させる構築物によって標的とされる遺伝子であり得る。
【０１０６】
「外因性核酸分子」または「外因性遺伝子」は、細胞に導入された（「形質転換を起こす」）核酸分子または遺伝子を指す。形質転換細胞は、組換え細胞と呼ばれてもよく、その中に追加の外因性遺伝子（複数可）が導入され得る。核酸分子で形質転換された細胞の子孫は、それが外因性核酸分子を受け継いでいる場合、「形質転換された」とも称される。外因性遺伝子は、形質転換される細胞と比較して、異なる種から（したがって「異種」）、または同じ種から（したがって「相同」）であってもよい。「内因性」核酸分子、遺伝子またはタンパク質は、それが宿主で発生するか、または宿主によって天然に産生されるため、天然の核酸分子、遺伝子またはタンパク質である。
【０１０７】
「天然の」という用語は、本明細書では、宿主で自然に発生する核酸配列またはアミノ酸配列を指すために使用される。「非天然の」という用語は、本明細書では、宿主で自然に発生しない核酸配列またはアミノ酸配列を指すために使用される。細胞から取り出され、実験室で操作され、宿主細胞に導入または再導入された核酸配列またはアミノ酸配列は、「非天然」と見なされる。宿主細胞に導入される合成または部分的合成遺伝子は「非天然」である。非天然の遺伝子はさらに、宿主ゲノムに組換えられている１つ以上の異種制御配列に作動可能に連結された、宿主微生物に対して内因性の遺伝子を含む。
【０１０８】
「組換え」または「操作された」核酸分子は、ヒトの操作によって変更された核酸分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子は、以下のいずれかの核酸分子を含む：（１）例えば、化学的または酵素的手法を使用して（例えば、核酸分子の化学的核酸合成の使用により、またはインビトロで部分的もしくは完全に合成または修飾されている、または核酸の複製、重合、消化（エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる）、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化を含む）、組込み、組換え（相同組換えおよび部位特異的組換えを含む）の使用により）、インビトロで部分的もしくは完全に合成もしくは修飾された核酸分子；（２）本来結合していない結合ヌクレオチド配列を含む核酸分子；（３）天然に存在する核酸分子配列に対して１つ以上のヌクレオチドを欠くように分子クローニング手法を使用して操作された核酸分子；および／または（４）天然に存在する核酸配列に対して１つ以上の配列変化または再構成を有するように分子クローニング手法を使用して操作された核酸分子。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、インビトロポリメラーゼ反応（複数可）によって生成された、またはリンカーが結合された、またはクローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子と同様に、組換えＤＮＡ分子である。
【０１０９】
本明細書で使用される「組換えタンパク質」という用語は、遺伝子編集によって生成されたタンパク質を指す。
【０１１０】
生物に適用される場合、組換え、操作された、または遺伝子操作された、という用語は、異種または外因性の組換え核酸配列の生物への導入によって操作された生物を指し、遺伝子ノックアウト、標的変異、遺伝子置換、およびプロモーター置換、欠失、または挿入、ならびに生物への導入遺伝子または合成遺伝子の導入が挙げられる。組換えまたは遺伝子操作された生物はまた、遺伝子「ノックダウン」のための構築物が導入された生物であり得る。このような構築物には、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、およびリボザイム構築物が挙げられるが、これらに限定されない。また、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣａｓ／ＣＲＩＳＰＲ系の活性によって、それらのゲノムが変更された生物も挙げられる。外因性または組換え核酸分子は、組換え／遺伝子操作された生物のゲノムに組み込むことができ、または他の例では、宿主ゲノムに組み込まれなくてもよい。本明細書で使用される場合、「組換え微生物」または「組換え宿主細胞」は、本発明の組換え微生物の子孫または派生物を含む。変異または環境の影響により後継世代で特定の変更が発生する可能性があるため、このような子孫または派生物は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書で使用される用語の範囲内になお含まれる。
【０１１１】
「プロモーター」という用語は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができる核酸配列を指す。プロモーターには、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントが含まれている。プロモーターは、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）を含み得る。真核生物のプロモーターは、多くの場合、いつもそうとは限らないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。原核生物プロモーターは、−１０および−３５の原核生物プロモーターコンセンサス配列を含み得る。様々な異なる供給源からの構成的、誘導性および抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターが当技術分野において周知である。代表的な供給源には、例えば、藻類、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母、および細菌の細胞型が含まれ、これらの供給源からの適切なプロモーターは、容易に入手可能であるか、またはオンラインで公開されている配列に基づいて、または例えば、ＡＴＣＣなどの受託機関ならびにその他の商業的もしくは個別の供給源から合成的に作製することができる。プロモーターは、単方向性（一方向に転写を開始する）または双方向性（いずれかの方向に転写を開始する）であり得る。プロモーターは、構成的プロモーター、抑制性プロモーター、または誘導性プロモーターであり得る。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する遺伝子近位プロモーターに加えて、遺伝子の転写開始部位の１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ以上の範囲内にあり得る遺伝子の上流の追加の配列を含むことができ、この追加の配列は、下流遺伝子の転写の速度に影響を及ぼし得、任意で、発生的、環境的、または生化学的（例えば、代謝）条件に対するプロモーターの応答性に影響を及ぼし得る。
【０１１２】
「異種」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素に関して使用される場合、宿主生物種以外の供給源からであるかまたはそれに由来する、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素を指す。対照的に、「相同な」ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素は、宿主生物種に由来する、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素を表すために本明細書で使用される。遺伝子制御配列または遺伝子配列の維持もしくは操作に使用される補助核酸配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列、イントロン配列、スプライス部位、リボソーム結合部位、内部リボソーム進入配列、ゲノム相同領域、組換え部位など）に言及する場合、「異種」とは、制御または補助核酸配列が、構築物、ゲノム、染色体、またはエピソーム中に並置されている遺伝子と、制御配列または補助配列が自然に関連していないことを意味する。したがって、その天然の状態で（すなわち、非遺伝子操作生物のゲノムで）作動可能に連結されていない遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、本明細書では、プロモーターが、それが連結されている遺伝子と同じ種に（または、場合によっては、同じ生物に）由来する場合であっても、「異種プロモーター」と称される。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）を指し、産物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すために使用される何らかの他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語のいずれかと互換的に使用することができる。
【０１１４】
本明細書において遺伝子または種の名称の後ろの括弧内に一般的に提供される遺伝子またはタンパク質の受託番号は、合衆国国立衛生研究所によって維持される国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で公開されている配列レコードの独自の識別子である。「ＧｅｎＩｎｆｏ識別子」（ＧＩ）配列同定番号は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に特有である。配列が何らかの形で変更されると、新しいＧＩ番号が割り当てられる。配列改訂履歴ツールは、特定のＧｅｎＢａｎｋレコードに表示される配列の様々なＧＩ番号、バージョン番号、および更新日を追跡するために利用可能である。受託番号およびＧＩ番号に基づく核酸もしくは遺伝子配列またはタンパク質配列の検索および取得は、例えば、細胞生物学、生化学、分子生物学、および分子遺伝学の技術分野において周知である。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチド配列に関する「同一性パーセント」または「相同性」という用語は、最大相同性パーセントを達成するために、配列を最大同一性パーセントに整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、既知のポリペプチドと同一である候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセントとして定義される。Ｎ末端またはＣ末端の挿入または欠失は、相同性に影響を与えると解釈されるべきではなく、ポリペプチド配列に対する約３０個未満、約２０個未満、または約１０個未満のアミノ酸残基の内部欠失および／または挿入は、相同性に影響を与えると解釈されるべきではない。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルでの相同性もしくは同一性は、配列類似性検索用に適合された、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘによって利用されるアルゴリズムを使用したＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２，ａｎｄ  Ｋａｒｌｉｎ（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，２２６４−２２６８）分析によって決定することができる。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチは、まず類似しているセグメントについて、クエリ配列とデータベース配列の間のギャップの有無を検討し、その後、特定されたすべての一致の統計的有意性を評価し、最後に予め選択された有意性の閾値に適合するそうした一致のみを集計することである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の解説に関しては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ６，１１９−１２９を参照されたい。ヒストグラム、説明、アライメント、期待値（すなわち、データベース配列に対する一致を報告するための統計的有意性の閾値）、カットオフ、マトリックス、およびフィルター（低複雑性）の検索パラメータは、デフォルト設定にすることができる。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘによって利用されるデフォルトのスコア行列は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１０９１５−１０９１９）であり、長さが８５を超えるクエリ配列（ヌクレオチド塩基またはアミノ酸）において推奨される。
【０１１６】
ヌクレオチド配列を比較するために設計されたｂｌａｓｔｎの場合、スコア行列は、Ｍ（すなわち、一致する残基のペアのリワードスコア）とＮ（すなわち、一致しない残基のペナルティスコア）との比によって設定され、ＭおよびＮのデフォルト値は、それぞれ＋５および−４であり得る。４つのｂｌａｓｔｎパラメータは、以下のように調整することができる：Ｑ＝１０（ギャップ作成ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（クエリに沿ってｗｉｎｋ番目の位置ごとにワードヒットを生成する）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップを含むアライメントを生成する範囲内のウィンドウ幅を設定する）。アミノ酸配列を比較するための同等のＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１、およびｇａｐｗ＝３２であり得る。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較では、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ作成ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を使用することができ、タンパク質比較での同等の設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【０１１７】
したがって、本発明のポリペプチドまたは核酸配列に言及する場合、完全長ポリペプチドもしくは核酸配列との、または全タンパク質のうち少なくとも５０個、少なくとも７５個少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個以上のアミノ酸残基の連続配列を含むその断片との、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％の配列同一性が含まれ；例えば、挿入および置換を含む開示された配列（複数可）に対してＮ末端側におよび／もしくはＣ末端側にならびに／またはその中に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されている、そのような配列の変異体が含まれる。企図される変異体としては、追加的にまたは代替的に、例えば、相同組換えまたは部位特異的もしくはＰＣＲ変異誘発による所定の変異を含有するもの、および本明細書に記載されているものを含むがこれらに限定されない他の種の対応するポリペプチドもしくは核酸、または挿入および置換を含有するポリペプチドもしくは核酸のファミリーの対立遺伝子または他の天然に存在する変異体、および／または挿入および置換を含む天然アミノ酸以外の部分（例えば、酵素などの検出可能な部分）で、ポリペプチドが置換、化学的、酵素的、または他の適切な手段によって、共有結合的に修飾されている誘導体を挙げることができる。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」または「保存的変異」という語句は、１つのアミノ酸の、共通の特性を有する別のアミノ酸による置き換えを指す。個々のアミノ酸間の共通の特性を定義する機能的な方法は、相同生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化された頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ（１９７９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このような分析に従って、群内のアミノ酸が互いに優先的に交換され、従って、全体的なタンパク質構造に対する影響において互いに最も似ているアミノ酸の群が、定義され得る（Ｓｃｈｕｌｚ（１９７９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。この方法で定義されたアミノ酸群の例として、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓを含む「荷電／極性群」；Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐを含む「芳香族または環状群」ならびにＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＣｙｓを含む「脂肪族群」を挙げることができる。各群内に、亜群も同定され得る。例えば、荷電／極性アミノ酸の群は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓを含む「正電荷を有する亜群」；ＧｌｕおよびＡｓｐを含む「負電荷を有する亜群」およびＡｓｎおよびＧｌｎを含む「極性亜群」を含む亜群に細分され得る。別の例では、芳香族または環状群は、Ｐｒｏ、ＨｉｓおよびＴｒｐを含む「窒素環亜群」ならびにＰｈｅおよびＴｙｒを含む「フェニル亜群」を含む亜群に細分され得る。別のさらなる例では、脂肪族群は、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅを含む「大きな脂肪族の非極性亜群」；Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＣｙｓを含む「脂肪族のわずかに極性の亜群」ならびにＧｌｙおよびＡｌａを含む「小さい残基の亜群」を含む亜群に細分され得る。保存的な突然変異の例として、それだけには限らないが：正電荷が維持され得るようなＬｙｓのＡｒｇとの、または逆も同様；負電荷が維持され得るようなＧｌｕのＡｓｐとの、または逆も同様；遊離-ＯＨが維持され得るようなＳｅｒのＴｈｒとの、または逆も同様；および遊離-ＮＨ２が維持され得るようなＧｌｎのＡｓｎとの、または逆も同様といった上記の亜群内のアミノ酸のアミノ酸置換が挙げられる。「保存的変異体」とは、参照ポリペプチド（例えば、配列が刊行物または配列データベースにおいて開示されているか、または配列が核酸シークエンシングによって決定されているポリペプチド）の１個または複数のアミノ酸を、共通の特性を有する、例えば、上記で描写されたような同一アミノ酸群または亜群に属するアミノ酸と置き換えるよう置換されている１つ以上のアミノ酸を含むポリペプチドである。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、遺伝子を「調節する」または遺伝子の「調節」という用語は、遺伝子の核酸配列を変更し、遺伝子を完全にまたは部分的に欠失させ、遺伝子の断片化を引き起こし、遺伝子の発現を変更し、遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングすることを指す。いくつかの実施形態では、遺伝子の配列の変更は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの置換による。配列の変更は、紫外線、ガンマ線、遺伝子編集によって達成することができる。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子の発現を減弱化する」とは、完全に機能的なタンパク質の産生を減少させる任意の方法で、遺伝子の発現を減少または排除することを意味する。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、「発現」は、少なくともＲＮＡ産生のレベルでの遺伝子の発現を含み、「発現産物」は、得られた産物、例えば、発現された遺伝子の、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡ（例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムなど）を含む。「発現の増加」という用語は、ｍＲＮＡ産生の増加および／またはポリペプチド発現の増加を促進するための遺伝子発現における変更を含む。「生産の増加」は、ポリペプチドの天然の生産または酵素活性と比較した場合の、ポリペプチド発現の量、ポリペプチドの酵素活性のレベル、または両方の組み合わせの増加を含む。
【０１２２】
本発明のいくつかの態様は、特定のポリヌクレオチド配列の発現の部分的、実質的、もしくは完全な欠失、サイレンシング、不活性化、またはダウンレギュレーションを含む。遺伝子は、酵素の活性など、それらがコードするポリペプチドによって行われる活性に影響を与えるために、遺伝子は、部分的、実質的、または完全に欠失され、サイレンシングされ、不活性化されるか、またはそれらの発現はダウンレギュレートされ得る。遺伝子は、遺伝子の機能および／または発現を破壊する核酸配列の挿入（例えば、ウイルス挿入、トランスポゾン変異誘発、メガヌクレアーゼエンジニアリング、相同組換え、または当技術分野において既知の他の方法）により、部分的、実質的、もしくは完全に欠失され、サイレンシングされ、不活性化され、またはダウンレギュレートされ得る。「排除する」、「排除する」、および「ノックアウト」という用語は、「欠失」、「部分的な欠失」、「実質的な欠失」、または「完全な欠失」という用語と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態では、対象とする微生物は、特定の対象とする遺伝子をノックアウトするための部位特異的相同組換えによって操作され得る。さらに他の実施形態では、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＤＮＡ（ａｓＤＮＡ）構築物を使用して、対象とする特定の遺伝子を部分的、実質的、または完全にサイレンシングし、不活性化し、またはダウンレギュレートすることができる。
【０１２３】
ある特定の核酸分子または特定のポリヌクレオチド配列のこれらの挿入、欠失、または他の改変は、「遺伝子改変（複数可）」または「形質転換（複数可）」を包含すると理解され得るので、得られた微生物または宿主細胞の株が、「遺伝子改変された」、「遺伝子操作された」または「形質転換された」と理解することができる。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「アップレギュレートされた」または「アップレギュレーション」は、アップレギュレートされていない、他の点では同一の遺伝子または酵素における発現または活性と比べた、対象とする遺伝子もしくは核酸分子の発現、または酵素活性の増加、例えば、遺伝子発現または酵素の活性の増加を含む。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「ダウンレギュレートされた」または「ダウンレギュレーション」は、ダウンレギュレートされていない、他の点では同一の遺伝子または酵素における発現または活性と比べた、対象とする遺伝子もしくは核酸分子の発現、または酵素活性の減少、例えば、遺伝子発現または酵素活性の減少を含む。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「変異体」は、天然に存在せず、例えば、ガンマ線照射、ＵＶ、または化学変異原を使用した古典的な変異誘発の結果として生じた、遺伝子に変異を有する生物を指す。本明細書で使用される「変異体」はまた、非限定的な例として、異なる時間的、生物学的、もしくは環境的制御下での、および／もしくは天然に生じるものとは異なる程度までの、遺伝子の発現、ならびに／または組換え細胞における天然には発現されない遺伝子の発現、を含む過剰発現；ノックアウトおよびノックインを含む相同組換え（例えば、野生型ポリペプチドよりも大きいまたは小さい活性を有するポリペプチドおよび／またはドミナントネガティブポリペプチドをコードする遺伝子による遺伝子置換）；ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムなどによる遺伝子減弱化；およびメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ手法などを使用したゲノム編集、を挙げることができる、遺伝子編集の結果として遺伝子の構造または発現が変化した組換え細胞を指す。対象とする変異体生物は通常、変異を欠く対応する野生型または前駆株のものとは異なる表現型を有し、この表現型は、成長アッセイ、産物分析、光合成特性、生化学的アッセイなどによって評価することができる。遺伝子に言及する場合、「変異体」とは、その遺伝子が、天然のまたは野生型遺伝子に対して、少なくとも１つの塩基（ヌクレオチド）の変化、欠失、または挿入を有することを意味する。変異（１つ以上のヌクレオチドの変化、欠失、および／または挿入）は、遺伝子のコード領域にあり得るか、またはイントロン、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、もしくはプロモーター領域、例えば、転写開始部位の２ｋｂ以内、または翻訳開始部位の３ｋｂ以内にあり得る。非限定的な例として、変異体遺伝子は、遺伝子の発現を増加または減少させることができるプロモーター領域内に挿入を有する遺伝子とすることができ；欠失を有し、その結果、機能しないタンパク質、短縮型タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質の産生、タンパク質の非産生をもたらす遺伝子とすることができ；コードされたタンパク質のアミノ酸の変化をもたらすか、または遺伝子転写物の異常なスプライシングなどを引き起こす１つ以上の点突然変異を有する遺伝子とすることができる。本明細書で使用される場合、「変異体」は、天然に存在せず、例えば、ガンマ線照射、ＵＶ、または化学変異原を使用した古典的な変異誘発の結果として生じた、遺伝子に変異を有する生物を指す。本明細書で使用される「変異体」はまた、非限定的な例として、異なる時間的、生物学的、または環境的制御下での、および／もしくは、天然に生じるものとは異なる程度までの、遺伝子の発現、ならびに／または組換え細胞における天然には発現されない遺伝子の発現、を含む過剰発現、を挙げることができる、遺伝子編集の結果として遺伝子の構造または発現が変化した組換え細胞を指す。
【０１２７】
「Ｐｆａｍ」という用語は、Ｐｆａｍコンソーシアムによって維持され、Ｗｅｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ、Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ｐｆａｍ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ；Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆａｒｍ，Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ）で利用可能なタンパク質ドメインおよびタンパク質ファミリーの多くの収集物を指す。Ｐｆａｍの最新リリースは、ＵｎｉＰｒｏｔタンパク質データベースリリース２０１２．０６をベースとするＰｆａｍ  ２７．０（２０１３年３月）である。Ｐｆａｍドメインおよびファミリーは、多重配列アラインメントおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を使用して同定される。Ｐｆａｍ-Ａファミリーまたはドメイン割り当ては、タンパク質ファミリーの代表的なメンバーを使用する精選されたシードアラインメントによって作製される高品質割り当てであり、シードアラインメントに基づいて隠れマルコフモデルをプロファイルする。（特に断りのない限り、Ｐｆａｍドメインまたはファミリーに対するクエリされたタンパク質の一致は、Ｐｆａｍ-Ａの一致である）。次いで、ファミリーに属するすべての同定された配列を使用して、ファミリーの全アラインメントを自動的に作製する（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ２６，３２０−３２２；Ｂａｔｅｍａｎ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ２６，２６３−２６６；Ｂａｔｅｍａｎ（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ３２，Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１３８−Ｄ１４１；Ｆｉｎｎ（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ３４，Ｄ２４７−２５１；Ｆｉｎｎ（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ  ３８，Ｄ２１１−２２２）。例えば、上記の参考ウェブサイトのいずれかを使用してＰｆａｍデータベースにアクセスすることによって、ＨＭＭＥＲ相同性検索ソフトウェア（例えば、ＨＭＭＥＲ２、ＨＭＭＥＲ３、またはより高いバージョン）を使用して、タンパク質配列をＨＭＭに対してクエリできる。クエリされたタンパク質を、ｐｆａｍファミリーにあると（または特定のＰｆａｍドメインを有すると）同定する有意な一致は、ビットスコアがＰｆａｍドメインの収集閾値以上であるものである。期待値（ｅ値）も、クエリされたタンパク質をＰｆａｍ中に含めるための、またはクエリされたタンパク質が特定のＰｆａｍドメインを有するかどうかを決定するための基準として使用され得、低いｅ値（１．０よりもかなり低い、例えば、０．１未満または０．０１以下）は、一致が偶然に起因する確率が低いことを表す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「光合成生物」という用語は、光エネルギーを化学エネルギーに変換することができる生物を指す。いくつかの実施形態では、化学エネルギーは、後に放出されて、生物の活動を促進することができる（エネルギー変換）。いくつかの実施形態では、この化学エネルギーは、二酸化炭素と水とから合成される、糖などの炭水化物分子に貯蔵される。
【０１２９】
光合成生物の非限定的な例には、植物、藻類、およびシアノバクテリアが挙げられる。藻類の非限定的な例は、Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ、Ａｍｐｈｏｒａ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ、Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ、Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃａｒｔｅｒｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ、Ｅｍｉｌｉａｎｉａ、Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ、Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ、Ｆｒａｎｃｅｉａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ、Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｌｏｃａｆｅｔｅｒｉａ、Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ、Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ、Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ、Ｍｏｎｏｄｕｓ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｖｌｏｖａ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐａｓｃｈｅｒｉａ、Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ、Ｐｈａｇｕｓ、Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ、Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ、Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ、Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ、Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ、Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ、Ｖａｕｃｈｅｒｉａ、Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ、Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ、およびＶｏｌｖｏｘの属に属する。
【０１３０】
植物の非限定的な例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ａｒｅｎｏｓａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃｅｂｅｎｎｅｎｓｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃｒｏａｔｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｈａｌｌｅｒｉ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｎｅｇｌｅｃｔａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｐｅｄｅｍｏｎｔａｎａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ、Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｅｒｂａｃｅｕｍ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｕｍ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）、およびアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種が挙げられる。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「変異体光合成生物」または「変異体藻類」という用語は、少なくともＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ＳＧＩ１とＳＲＰ５４との組み合わせ、ＳＧＩ２とＳＲＰ５４との組み合わせ、またはＳＧＩ１、ＳＧＩ２、およびＳＲＰ５４の組み合わせ、が調節されている光合成生物または藻類を指す。このような調節には、核酸配列の変化または遺伝子（複数可）の発現の変更が挙げられる。
【０１３２】
本明細書中で使用される場合、ＳＧＩ１とＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの調節は、同じ光合成生物におけるＳＧＩ１の調節およびＳＲＰ５４遺伝子の調節を指す。同様に、ＳＧＩ２とＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの調節は、同じ光合成生物におけるＳＧＩ２の調節およびＳＲＰ５４遺伝子の調節を指す。同様に、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、およびＳＲＰ５４遺伝子の組み合わせの調節は、同じ光合成生物におけるＳＧＩ１の調節、ＳＧＩ２の調節、およびＳＲＰ５４遺伝子の調節を指す。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、対照光合成生物という用語は、対照光合成生物が、変異または減弱化されたＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、またはこれらの遺伝子の２つ以上の組み合わせを有さないことを除いては、変異体光合成生物に対して全ての関連する点で遺伝学的に実質的に同一である光合成生物を指す。例えば、対照光合成生物は、変異体に存在するｃｐＳＲＰ５４、細胞質ゾルＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、またはＳＧＩ２遺伝子を減弱化するための、ｃｐＳＲＰ５４、細胞質ゾルＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、またはＳＧＩ２遺伝子もしくは構築物への変更を除いて同じ種のものであり、正常な繁殖による変異誘発の際に発生し得る細胞生理機能に影響を与えない小さなゲノム変化（例えば、「ＳＮＰ」）を除いて、遺伝的に同一である。様々な実施形態では、対照光合成生物は、細胞質ゾルＳＲＰ５４、ｃｐＳＲＰ５４、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、または少なくとも２つの遺伝子の組み合わせの、減弱化した発現を有する変異体光合成生物が由来する株である。
【０１３４】
藻類などの光合成生物に言及する場合、「弱光に順化する」という用語は、弱光条件において安定化するために、クロロフィルおよび光合成特性における変化に十分な時間、弱光強度に曝された後、光合成生物の増加したクロロフィルおよび光合成特性を有することを意味する。弱光は、例えば、２００μＥ・ｍ−２・秒−１未満、および好ましくは約１００μＥ・ｍ−２・秒−１以下または５０μＥ・ｍ−２・秒−１以下とすることができ、および順化のための期間は、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、または少なくとも約１２時間、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間とすることができ、２、３、４、または５日程度に長くなってもよい。
【０１３５】
「ｃＤＮＡ」は、ＤＮＡ分子が、ｍＲＮＡ配列に存在するウリジンすなわちＵの代わりに、核酸塩基チミンすなわちＴを置換することを除いて、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むＤＮＡ分子である。ｃＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、例えば、ｍＲＮＡ配列の相補体であり得る。好ましい例では、ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡが相応する天然に存在する遺伝子（すなわち、生物のゲノムに存在する遺伝子）に存在する１つ以上のイントロン配列を含まない。例えば、ｃＤＮＡは、天然に存在する遺伝子のイントロンの下流の配列に並置される、天然に存在する遺伝子のイントロンの上流からの配列を有することができ、上流および下流配列は、自然界ではＤＮＡ分子内に並置されない（すなわち、天然に存在する遺伝子では、配列は並置されない）。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡ分子の逆転写によって生成することができるか、または、例えば、化学合成によって、および／またはｃＤＮＡ配列の知識に基づいて、化学的合成によって、および／もしくは、１つ以上の制限酵素、１つ以上のリガーゼ、１つ以上のポリメラーゼ（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用され得る高温耐性ポリメラーゼを含むが、これらに限定されない）、１つ以上のリコンビナーゼなどを使用することによって、合成することができ、ｃＤＮＡ配列の知識は、任意で、ゲノム配列からのコード領域の識別に基づくか、または多数の部分的ｃＤＮＡの配列からコンパイルされ得る。
【０１３６】
「弱光順化で制限緩和された」藻類変異体（または「強光順化でロックされた」またはＬＩＨＬＡ変異体）は、クロロフィルの実質的な増加および集光性複合体タンパク質（ＬＨＣＰ）遺伝子の大部分の発現における実質的な増加を含む、弱光順化野生型藻細胞に特徴的な表現型および遺伝子発現における変化を示さない変異体である。弱光順化で調節緩和された藻類変異体は、弱光に順化すると、野生型細胞の弱光順化中にアップレギュレートされている多数の遺伝子（例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０個の遺伝子）について、弱光順化された野生型細胞に対して、発現の減少を有する。さらに、弱光順化で制御緩和された藻類変異体は、野生型細胞の弱光順化中にダウンレギュレートされている遺伝子（例えば、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の遺伝子）の、弱光順化された野生型細胞に対して、発現の増加を有する。さらに、本明細書に開示されるように、弱光順化で制御緩和された藻類変異体は、変異体および野生型細胞の両方が弱光に順化されるとき、野生型細胞の光合成特性とは著しく異なる光合成特性を有する可能性がある。
【０１３７】
「光合成特性」、「光合成特性」、「光生理学的特性」、または「光生理学的パラメータ」には、最大光合成速度、Ｐｍａｘ（細胞あたりまたはクロロフルに基づいて計算）、光合成が飽和する強度、酸素発生によって測定されるようなＥｋ、およびα（「アルファ」）、光合成（酸素の発生）対放射照度（Ｐ／Ｉ）曲線の初期勾配が挙げられるが、これらに限定されない。追加の光合成特性は、例えば、光化学系ＩＩにおける光化学の最大量子収率、ＦＶ／ＦＭ；光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）の光合成量子収率、φＰＳＩＩ；光化学的消光、または開いたＰＳＩＩ中心の比率、ｑＰ；非光化学的消光、ＮＰＱ；ＰＳＩＩ電子輸送速度、ＥＴＲＰＳＩＩ；ＰＳＩ電子輸送速度、ＥＴＲＰＳＩ；ＰＳＩの機能的吸収断面サイズ（σＰＳＩ）、およびＰＳＩＩの機能的吸収断面積（σＰＳＩＩ）が挙げられる、蛍光検出を使用して測定され得る様々なパラメータが含まれる。ここでの列挙は完全に網羅しているわけではなく、用語は光合成の様々な態様を測定する他のパラメータを除外するものではない。
【０１３８】
「実質的に同じ」である特性への言及は、特性が基準値の１０％以内、好ましくは５％以内であることを意味することを意図している。
【０１３９】
本明細書に記載のものと同様もしくは同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【０１４０】
遺伝子の減弱化
変異体光合成生物は、ＵＶ照射、ガンマ線照射、または化学的変異誘発を含むがこれらに限定されない任意の実行可能な方法によって、および本明細書に開示された光合成特性を有する低クロロフィル変異体をスクリーニングすることによって生成された変異体であり得る。微生物株の変異体を生成する方法は、周知である。変異体は、例えば、ゲノム配列決定、ＰＣＲ、ｃｐＳＲＰ５４またはｃｙｔｏＳＲＰ５４タンパク質の免疫検出、および発現分析（例えば、逆転写／ＰＣＲ）を含む、当該分野において既知の公知の方法によって同定され得る。
【０１４１】
本明細書で提供される変異体光合成生物は、例えば、ノックアウトまたは遺伝子置き換えのために相同組換えによって標的とされた（例えば、野生型ポリペプチドに対して低下した活性を有するポリペプチドをコードし得る遺伝子の変異型を用いて）、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４との組み合わせにおいて、遺伝子操作されることもできる。さらなる例では、対象とする藻類株を部位特異的相同組換えによって操作して、プロモーターなどの発現制御配列と共に、またはプロモーターを伴わずに、特定の対象とする遺伝子を特定のゲノム遺伝子座に挿入するか、あるいはプロモーターを宿主微生物の遺伝子座に挿入して、遺伝子座での特定の遺伝子または遺伝子セットの発現に影響を与えることができる。
【０１４２】
例えば、相同組換えによる遺伝子ノックアウトまたは置き換えは、変更されるべきゲノムの領域に相同な配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）断片による形質転換によるものであり得、ここで、相同配列は外来配列、典型的には、組み込まれた構築物の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子により中断されている。外来配列または変異遺伝子配列のいずれかの側のゲノム相同フランキング配列は、例えば、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００、少なくとも１，２００、少なくとも１，５００、少なくとも１，７５０、または２，０００ヌクレオチドの長さとすることができる。外来配列が標的遺伝子配列に隣接している遺伝子ノックアウトまたは遺伝子「ノックイン」構築物は、例えば相同組換えを受ける領域の外側に、任意で線状化することができるベクターで提供することができるか、または、ベクターに関連しない線状断片として提供されることができ、例えば、ノックアウトまたはノックイン構築物は、ＰＣＲ産物を含むがこれに限定されない、単離または合成された断片であり得る。場合によっては、スプリットマーカーシステムを使用して、相同組換えによって遺伝子ノックアウトを生成することができ、ここでは、選択可能マーカーを再生成し、かつ３つのクロスオーバーイベントを介して対象とする遺伝子座を破壊することができる２つのＤＮＡ断片が導入される（Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ２７３：１５７−１６３）。
【０１４３】
一態様では、本発明は、遺伝子改変生物、例えば、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの発現を減弱化するための１つ以上の遺伝子改変を有する微生物を提供する。本明細書で使用される場合、「ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの発現を減弱化する」とは、１つ以上の上記の遺伝子の発現を、完全に機能的なタンパク質の産生を低減させる任意の方法で低下または排除することを意味する。
【０１４４】
例えば、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの、減弱化された発現を有するように操作された組換え光合成生物は、破壊されたＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせを有することができ、ここでは、組換え微生物は、完全に機能的なＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子、もしくはｃｙｔｏＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせが産生されないか、または同じ種の対照光合成生物によって産生されるものよりも低い量で産生されるように、遺伝子の発現を低減または無効にし、少なくとも１つの挿入、変異、または欠失を含む、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせを有することができる。破壊されたＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、ＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４、もしくはｃｙとＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせは、例えば、相同組換えによって、および／またはメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１６：２６８−２７７）、ＴＡＬＥＮ（ＷＯ２０１４／２０７０４３；ＷＯ  ２０１４／０７６５７１）、またはＣＲＩＳＰＲ系のｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）などのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの活性によって媒介される挿入または遺伝子置き換えよって破壊することができる。
【０１４５】
Ｈｓｕらによって最近検討されたＣＲＩＳＰＲ系（Ｃｅｌｌ１５７：１２６２−１２７８，２０１４）は、Ｃａｓヌクレアーゼポリペプチドまたは複合体に加えて、標的部位配列との相補性によってゲノム標的部位と相互作用する、（しばしば「ｃｒＲＮＡ」と呼ばれる）標的指向ＲＮＡ；Ｃａｓポリペプチドと複合体を形成し、かつ標的指向ｃｒＲＮＡと（相補性によって）結合する領域もまた含む、トランス活性化（「ｔｒａｃｒ」）ＲＮＡを含む。
【０１４６】
本発明は、ゲノム編集のためにｃａｓタンパク質を発現するか、またはｃａｓタンパク質をトランスフェクトされる宿主株を同時形質転換し得る（または宿主株において発現され得る）２つのＲＮＡ分子（「ｃｒＲＮＡ」および「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）の使用、または標的配列に相補的な配列ならびにｃａｓタンパク質と相互作用する配列を含む単一のガイドＲＮＡの使用を企図する。すなわち、一部の戦略では、本明細書で使用されるＣＲＩＳＰＲ系は、２つの別々のＲＮＡ分子（ＲＮＡポリヌクレオチド：「ｔｒａｃｒ−ＲＮＡ」；および「標的指向型（ｔａｒｇｅｔｅｒ）ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」。以下を参照されたい。）を含み、本明細書では、「二重分子ＤＮＡ標的指向ＲＮＡ」または「二分子ＤＮＡ標的指向ＲＮＡ」と称することができる。あるいは、実施例に示されているように、ＤＮＡ標的指向ＲＮＡは、（標的に対して相同な（「ｃｒ」）配列に加えて）Ｃａｓタンパク質との相互作用のためのトランス活性化配列も含めることができ、すなわち、ＤＮＡ標的指向ＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）とすることができ、本明細書中で「キメラガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」として称される。「ＤＮＡ標的指向ＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は包括的であり、二重分子ＤＮＡ標的指向ＲＮＡおよび単一分子ＤＮＡ標的指向ＲＮＡ（すなわちｓｇＲＮＡ）の両方を指す。単一分子ガイドＲＮＡおよび２つのＲＮＡシステムの両方は、文献に、および例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第ＵＳ  ２０１４／００６８７９７号に詳細に記載されている。
【０１４７】
本明細書の方法では、任意のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、またはそれらの修飾されたバージョンを使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はクラスＩＩ  Ｃａｓタンパク質である。Ｃａｓタンパク質は、非限定的な例として、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、または髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９タンパク質などのＣａｓ９タンパク質であり得る。他の対象とするＣａｓタンパク質としては、Ｃｐｆ１  ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６３：１−１３）ならびにＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３  ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ６０：１−１３）が挙げられる。米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／００６８７９７号において配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として提供されるＣａｓ９タンパク質、ならびに複数のＣａｓ９タンパク質からのドメインを組み合わせることができるキメラＣａｓ９タンパク質、ならびに識別されたｃａｓ９タンパク質のバリアントおよび変異体もまた考慮される。（例えば、宿主細胞に導入された核酸分子によってコードされるＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質に関して少なくとも１つの変異を含むことができ；例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、タンパク質の切断ドメインの１つで不活性化され、「ニッカーゼ」バリアントをもたらす。変異の非限定的な例には、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、対象とする宿主細胞用にコドン最適化され得る。
【０１４８】
Ｃａｓヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を生成する。これらの切断は、２つの方法：非相同末端結合または相同組換え修復のうちの１つで細胞によって修復される。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）では、二重鎖切断は、切断末端を互いに直接ライゲーションすることによって修復される。この場合、一部の核酸物質が失われるが、新しい核酸物質がその部位に挿入されることはなく、欠失または変更がもたらされ、多くの場合変異が生じる。相同組換え修復では、切断された標的ＤＮＡ配列と相同性を有し得るドナーポリヌクレオチド（「ドナーＤＮＡ」または「編集ＤＮＡ」として称されることもある）は、切断された標的ＤＮＡ配列を修復するためのテンプレートとして使用され、ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝情報の伝達をもたらす。そのため、新しい核酸物質を部位に挿入／コピーすることができる。ＮＨＥＪおよび／または相同組換え修復による標的ＤＮＡの改変（例えば、ドナーＤＮＡ分子を使用して）は、例えば、遺伝子修正、遺伝子置き換え、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、遺伝子変異などをもたらし得る。
【０１４９】
場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ）によるＤＮＡの切断は、標的ＤＮＡ配列を切断し、外因的に提供されたドナーポリヌクレオチドの非存在下で細胞が配列を修復できるようにすることにより、標的ＤＮＡ配列から核酸物質を欠失させるために使用され得る。このようなＮＨＨＥＪ事象は、切断された末端の再結合の部位での変異（「誤修復」）を引き起こす可能性があり、それが遺伝子破壊を引き起こす可能性がある。
【０１５０】
あるいは、ＤＮＡ標的指向ＲＮＡが、ドナーＤＮＡと共にｃａｓヌクレアーゼを発現する細胞に同時に施与される場合、主題の方法は、核酸物質を標的ＤＮＡ配列に付加、すなわち挿入または置き換えることができる（例えば、挿入変異誘発による「ノックアウト」、またはタンパク質（例えば、選択可能マーカーおよび／または対象とする任意のタンパク質）をコードする核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの「ノックイン」により、核酸配列を改変する（例えば、変異を導入する）など）。
【０１５１】
特定の実施形態では、ドナーＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ標的指向を使用して、遺伝子のコード領域の上流および遺伝子の推定される近位プロモーター領域の上流、例えば、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子のコード領域の開始ＡＴＧの少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも３５０ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも４５０ｂｐ、または少なくとも５００ｂｐの上流に挿入され得る、遺伝子制御配列（例えば、プロモーター）を含み得る。ドナーＤＮＡは、例えば、選択可能マーカーまたは任意の好都合な配列などの、天然のプロモーターを妨害し得る配列を含み得る。ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、これらの遺伝子の組み合わせ、またはオープンリーディングフレームの組み合わせ（例えば、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子の５’ＵＴＲまたは転写開始部位の上流）の開始ＡＴＧの上流に挿入された追加の配列は、内因性ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、これらの遺伝子の組み合わせの発現を、減少、またはさらには排除することさえできる。代替的または追加的に、天然のＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、またはこれらの遺伝子の組み合わせは、その内因性プロモーターを全体的または部分的に、弱いまたは異なって制御されたプロモーター、または非プロモーター配列に置き換えることができる。
【０１５２】
いくつかの例では、高効率ゲノム編集細胞株を生成するために宿主細胞に導入された核酸分子は、変異したＣａｓ９酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方の鎖または両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に対して変異したＣａｓ９酵素をコードする。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメインのアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する酵素）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする変異の他の例としては、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＤＮＡ標的のそれぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖を標的とするガイド配列（複数可）、例えば、２つのガイド配列と組み合わせて使用され得る。この組み合わせにより、両方の鎖にニックを入れ、ＮＨＥＪを誘導するために使用することができる。２つのニッカーゼ標的（ごく近接しているが、ＤＮＡの異なる鎖を標的とする）を使用して、変異誘発性ＮＨＥＪを誘導することができる。ゲノム変異を達成するために両方の鎖を正確かつ特異的に切断する必要があるため、対向する鎖を、ずれた位置（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）で切断する酵素を使用した遺伝子座のこのような標的化は、非標的切断も低減させることができる。
【０１５３】
追加の実施例では、ＤＮＡを切断する能力が損なわれた変異体Ｃａｓ９酵素を細胞内で発現させることができ、ここでは、標的遺伝子の転写または翻訳開始部位の上流の配列を標的とする１つ以上のガイドＲＮＡも導入される。この場合、Ｃａｓ酵素は標的配列に結合し、標的遺伝子の転写をブロックし得る（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ１５２：１１７３−１１８３）。
【０１５４】
場合によっては、Ｃａｓ９ポリペプチドなどのＣａｓポリペプチドは、例えば、（ｉ）Ｃａｓ９ポリペプチド（任意で、上記の変異形Ｃａｓ９ポリペプチドとすることができる）；および（ｂ）共有結合した異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも称される）を含む融合ポリペプチドである。異種核酸配列は、別の核酸配列に（例えば、遺伝子編集によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９融合ポリペプチドは、細胞内局在化を提供する異種配列とＣａｓ９ポリペプチドを融合することによって生成される（すなわち、異種配列は、細胞内局在化配列、例えば：核を標的とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアを標的とするミトコンドリア局在シグナル；葉緑体を標的とする葉緑体局在化シグナル；ＥＲ保持シグナル、などである）。いくつかの実施形態では、異種配列は、追跡および／または精製を容易にするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；血球凝集素（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ；など）を提供することができる（すなわち、異種配列は検出可能な標識である）。
【０１５５】
宿主細胞は、例えば、宿主細胞のＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子座の組み合わせ、もしくはそれらに隣接する領域に相同な核酸配列を含む相同組換えのためのベクターとすることができるか、またはＣａｓタンパク質（例えば、クラスＩＩ  Ｃａｓタンパク質）、ＣＲＩＳＰＲキメラガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ、ＲＮＡｉ構築物（例えば、ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムのいずれかまたは組み合わせの発現のための発現ベクターとすることができる、ベクター構築物を用いて、遺伝子操作する（例えば、形質導入または形質転換もしくはトランスフェクトする）ことができる。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。ゲノム編集のためのポリペプチドまたはＲＮＡの発現用のベクターはまた、例えば、相同組換えによって、宿主への組み込みのために設計され得る。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、例えば、宿主ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子配列との組み合わせ（ｃｐＳＲＰ５４またはｃｙｔｏＳＲＰ５４をコードする配列の上流および下流の配列を含む）と相同性を有する配列、ならびに、任意で、選択可能マーカーまたはレポーター遺伝子を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換し、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの減弱化を引き起こすために利用することができる。
【０１５６】
いくつかの例における組換え光合成生物は、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの発現を低減させることはできるが、無効にすることはできず、組換え光合成生物は、約１０％から約９０％まで低減したクロロフィル、例えば、約２０％から約８０％まで低減した総クロロフィルを有し得る。本明細書で提供される遺伝子改変微生物は、いくつかの例では、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの発現を減弱化するための核酸構築物を含み得る。例えば、宿主微生物は、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの発現を低減させる、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、またはアンチセンス分子を発現するための構築物を含み得る。いくつかの例では、本明細書で提供される遺伝子改変微生物は、いくつかの例では、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの発現を低減させるための、少なくともの１つの導入された（外因性または非天然の）構築物を含み得る。
【０１５７】
操作された株は、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子発現との組み合わせを減弱化するための遺伝子改変を含まない対照細胞に対して減少されているが、無効にされてはいないＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの発現のために、例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑまたは逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などの当該技術分野において既知の方法を使用して、選択することができる。
【０１５８】
本明細書で提供される遺伝子操作された株は、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせをコードする遺伝子のｍＲＮＡの量、安定性、または翻訳能力を低減させることにより、遺伝子発現を減弱化するための構築物を含むように操作され得る。例えば、植物もしくは藻類、または不等毛類（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔ）株などの光合成生物は、当該技術分野において既知の方法を使用して、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせのｍＲＮＡを標的とするアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはリボザイム構築物で形質転換することができる。例えば、遺伝子の転写領域の全部または一部を含むアンチセンスＲＮＡ構築物を微生物に導入して、遺伝子発現を減少させることができる（Ｓｈｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ１１：１１６５−７８；Ｎｇｉａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：７７５−７８２；Ｏｈｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ２３６：１０７−１１２；Ｌａｖａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ７：ｅ３６８０６）。あるいはまたはさらに、ｃｐＳＲＰ５４またはｃｙｔｏＳＲＰ５４遺伝子を標的とするＲＮＡｉ構築物（例えば、短いヘアピンＲＮＡをコードする構築物）を、ｃｐＳＲＰ５４またはｃｙｔｏＳＲＰ５４遺伝子の発現を低減させるために藻類または不等毛類などの微生物に導入することができる（例えば、Ｃｅｒｒｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ（２０１１）１０：１１６４−１１７２；Ｓｈｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．４９：６９−８４を参照されたい）。
【０１５９】
リボザイムは、核酸を部位特異的に切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号は、ある特定のリボザイムが既知のリボヌクレアーゼよりも配列特異性が高く、ＤＮＡ制限酵素に近いエンドヌクレアーゼとして機能することができることを報告している。触媒ＲＮＡ構築物（リボザイム）は、ｍＲＮＡ標的を切断するために、本明細書に提供されるような遺伝子をコードするｍＲＮＡと塩基対を形成するように設計され得る。いくつかの例では、リボザイム配列をアンチセンスＲＮＡ構築物内に組み込んで、標的の切断を媒介することができる。様々なタイプのリボザイムを検討することができ、それらの設計および使用は当技術分野において既知であり、例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３４：５８５−５９１に記載されている。
【０１６０】
リボザイムは、相補的な塩基対相互作用による部位へのアニーリングにより、所定の配列を標的とする。この標的化は、２つの相同性ストレッチを必要とする。相同配列のこれらのストレッチは、上で定義された触媒リボザイム構造に隣接する。相同配列の各ストレッチの長さは７から１５ヌクレオチドまで変化することができる。相同配列を定義するための唯一の要件は、標的ＲＮＡ上で、それらが切断部位である特異的な配列によって分離されていることである。ハンマーヘッドリボザイムの場合、切断部位は標的ＲＮＡ上のジヌクレオチド配列であり、ウラシル（Ｕ）の後にアデニン、シトシン、またはウラシル（Ａ、Ｃ、またはＵ）のいずれかが続くＴｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２３：２２５０−６８）。いかなるＲＮＡでも発生するこのジヌクレオチドの頻度は、統計的には、１６のうち３である。したがって、１，０００個の塩基の所与の標的のメッセンジャーＲＮＡでは、１８７個のジヌクレオチド切断部位が統計的には可能である。
【０１６１】
リボザイム特異的ＲＮＡ切断活性の一般的な設計および最適化は詳細に議論されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ  （１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１；Ｓｙｍｏｎｓ（１９９２）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６１：６４１−７１；Ｃｈｏｗｒｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：２５８５６−６４；上記のＴｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５））。標的ＲＮＡの効率的な切断のためのリボザイムの設計および試験は、当業者に周知のプロセスである。リボザイムを設計および試験するための科学的方法の例は、上記のＣｈｏｗｒｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）およびＬｉｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ（１９９５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：５４０−５１に記載されている（それぞれが参照により組み込まれる）。所与の遺伝子をダウンレギュレートする際に使用するための有効かつ好ましい配列の同定は、所与の配列を調製および試験することであり、当業者に既知の日常的に実施される「スクリーニング」方法である。
【０１６２】
ＲＮＡｉ構築物の使用は、上に引用した文献、ならびに例えばＵＳ２００５／０１６６２８９およびＷＯ２０１３／０１６２６７に記載されている。標的遺伝子と相同性を有する二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉ構築物、例えばＲＮＡｉショートヘアピン（ｓｈ）構築物の発現により細胞に送達されるか、または細胞内で産生される。この構築物は、標的遺伝子と同一であるか、または標的遺伝子の配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９５％〜１００％同一である配列を含むことができる。この構築物は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１ｋｂの標的遺伝子と相同な配列を有することができる。発現ベクターは、ｓｈＲＮＡを産生する構築物などのＲＮＡｉ構築物の連続的または誘導可能な発現のために選択されたプロモーターを使用して操作することができる。
【０１６３】
遺伝子減弱化のための核酸構築物、例えば、リボザイム、ＲＮＡｉ、またはアンチセンス構築物は、操作される微生物の内因性ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせの配列の少なくとも一部と、少なくとも８０％の同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の、または少なくとも９９％の同一性もしくは相補性を有する、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、または少なくとも６０個のヌクレオチドを含むことができる。遺伝子減弱化のための核酸構築物、例えば、リボザイム、ＲＮＡｉ、またはアンチセンス構築物は、内因性ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、少なくとも９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子などの、天然に存在する遺伝子の配列と、少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも９５％または約１００％の配列同一性もしくは相補性を有する、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、または少なくとも６０個のヌクレオチドを含むことができる。遺伝子減弱化のための核酸構築物、例えば、リボザイム、ＲＮＡｉ、またはアンチセンス構築物は、本明細書に提供される任意のものなどの、天然に存在するｃｐＳＲＰ５４遺伝子の配列と、少なくとも８０％の同一性もしくは相補性を有する、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、または少なくとも６０個のヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチド配列は、例えば、約３０個のヌクレオチド〜約３キロベース以上、例えば、３０〜５０個のヌクレオチドの長さ、５０〜１００個のヌクレオチドの長さ、１００〜５００個ヌクレオチドの長さ、５００個のヌクレオチド〜１ｋｂの長さ、１ｋｂ〜２ｋｂの長さ、または２〜５ｋｂとすることができる。例えば、アンチセンス配列は、約１００個のヌクレオチドから約１ｋｂの長さであり得る。例えば、遺伝子減弱化のための核酸構築物、例えば、リボザイム、ＲＮＡｉ、またはアンチセンス構築物は、内因性ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、もしくはそれらの一部と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、または少なくとも９５％の配列同一性もしくは相補性を有する、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、または少なくとも１００個のヌクレオチドを含むことができる。
【０１６４】
アンチセンス、ＲＮＡｉ、またはリボザイム構築物で使用されるプロモーターは、宿主生物において機能的であり、かつ標的遺伝子の発現を所望の量に低減させるために必要な発現レベルに好適である任意のものであり得る。藻類および不等毛類で機能するプロモーターは、当技術分野において既知であり、かつ本明細書に開示されている。この構築物は、本明細書に開示される任意のものを含む、実行可能な任意の方法を使用して藻類に形質転換することができる。ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子の組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４遺伝子発現の組み合わせを弱めるための核酸分子（これらに限定されないが、アンチセンス、ＲＮＡｉなど）またはリボザイム構築物で形質転換された組換え生物または微生物は、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子の組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４変異体の組み合わせについて、弱められた遺伝子発現をもたらす外因性核酸分子を含まない宿主生物または微生物に対して、例えば：クロロフィルの減少；光合成効率の向上；培養における生産性の増加などの特性を持つことができる。
【０１６５】
核酸分子および構築物
当業者であれば、微生物の遺伝子形質転換のために多くの形質転換法を使用することができ、したがって、本発明の方法のために展開することができることを理解するであろう。「安定した形質転換」とは、生物に導入された核酸構築物が生物のゲノムに組み込まれるか、または安定なエピソーム構築物の一部であり、その子孫に受け継がれることができることを意味することを意図する。「一過性形質転換」とは、ポリヌクレオチドが生物に導入され、ゲノムに組み込まれないか、ないしは別の方法で連続世代によって確立されかつ安定的に受け継がれるようにはならないことを意味することを意図する。
【０１６６】
遺伝子形質転換は、導入遺伝子、核もしくはプラスミドのいずれかからの構築物の安定した挿入および／または発現をもたらし、場合によっては導入遺伝子の一過性の発現をもたらすことができる。形質転換法は、ガイドＲＮＡの導入またはＤＮＡの編集にも使用することができる。微細藻類の遺伝子形質転換は、少なくとも約２２種の緑、赤、茶色の藻類、珪藻類、ユーグレナ、および渦鞭毛藻類に属する、３０種類超の微細藻類で成功したと報告されている（例えば、Ｒａｄａｋｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，２０１０；ａｎｄ  Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１を参照されたい）。このような有用な形質転換法の非限定的な例としては、例えば、Ｄｕｎａｈａｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５（３）：４５２−４６０，１９９３；Ｋｉｎｄｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９０；Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１３，４２７−４３５，１９９８によって報告されているガラスビーズまたは炭化ケイ素ウィスカーの存在下での細胞の攪拌が挙げられる。電気穿孔法の手法は、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ種（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，４４：７６８−７６，２００８を参照されたい）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ種（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３９：３６５−３７０，２００１；Ｃｈｏｗ  ａｎｄ  Ｔｕｎｇ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．９，７７８−７８０，１９９９を参照されたい）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（Ｓｈｉｍｏｇａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４８：１８２１−１８２８，１９９８）、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０（３）：１８５−１９２，２００５）を含むいくつかの微細藻類種の遺伝子形質転換に成功裏に使用されている。微粒子銃、遺伝子銃変換、または微粒子銃などとも称されるマイクロプロジェクタイルボンバードメント（Ｍｉｃｒｏ−ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）は、例えば、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ（Ａｐｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５２：５７２−５７９，１９９６）、ＣｙｃｌｏｔｅｌｌａとＮａｖｉｃｕｌａ（（Ｄｕｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３１：１００４−１０１２，１９９５）、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  （Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３５：１１３−１２０，１９９９）、およびＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ種（Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．５９：１１３−１１９，２０１１）などの珪藻種、ならびにＣｈｌｏｒｅｌｌａ（Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈ，Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．２：２０９−２１６，１９９９）、およびＶｏｌｖｏｘ種（Ｊａｋｏｂｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｉｓｔ，１５５：３８１−９３，２００４）などの緑藻類を含む、いくつかの藻類種で成功裏に使用されている。さらに、例えば、Ｋｕｍａｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，１６６（３）：７��１−７３８，２００４およびＣｈｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，Ｖｏｌ．３７，Ｓｕｐｐｌ．１１，２００１によって報告されているように、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を媒介した遺伝子導入技術も微細藻類の遺伝子形質転換に有用であり得る。
【０１６７】
本明細書に記載の形質転換ベクターまたは構築物は、典型的には、標的宿主細胞、例えば、藻類細胞に選択可能もしくはスコアリング可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含み、またはマーカーを含む構築物で同時形質転換され得る。藻類の遺伝子形質転換体を効率的に単離するために、多くの選択可能マーカーが開発されている。一般的な選択可能なマーカーとしては、抗生物質耐性、蛍光マーカー、および生化学マーカーが挙げられる。いくつかの異なる抗生物質耐性遺伝子は、ブラストシジン、ブレオマイシン（例えば、上記のＡｐｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；上記のＦｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｆｕｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１９，３５３−６１，１９９９，Ｌｕｍｂｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１４（４）：４４１−４４７，１９９８；Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３６：３７９−３８６，２０００）、スペクチノマイシン（Ｃｅｒｕｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４５：９７−１１０，１９９７；Ｄｏｅｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３９，４９−６０，２００１；Ｆａｒｇｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９：６９８０−９０，１９９９）、ストレプトマイシン（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｉｓｔ，１５３：４０１−４１２，２００２）、パロモマイシン（上記のＪａｋｏｂｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｉｓｔ；Ｓｉｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２７７：２２１−２２９，２００１）、ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ（上記のＺａｓｌａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、Ｇ４１８（上記のＤｕｎａｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２７２：３４１３−３４２３，２００５，上記のＺａｓｌａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ハイグロマイシン（上記のＢｅｒｔｈｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、クロラムフェニコール（上記のＰｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒ，２００５）、および他の多くを含む、微細藻類形質転換体の選択に成功裏に使用されてきた。クラミドモナスなどの微細藻類で使用するための追加の選択可能マーカーは、カナマイシンおよびアミカシン耐性（Ｂａｔｅｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６３：４０４−１０，２０００）、ゼオマイシンおよびフレオマイシン（例えば、ＺＥＯＣＩＮ（商標）フェオマイシンＤ１）耐性（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１：２３−３０，１９９６）、ならびにパラモマイシンおよびネオマイシン耐性（上記のＳｉｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）への耐性を提供するマーカーとすることができる。使用されている他の蛍光または発色マーカーとしては、ルシフェラーゼ（ａｌｃｉａｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：２３９−２５１，１９９９；Ｆｕｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００４；Ｊａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：３１７−３２２，１９９１）、β−グルクロニダーゼ（上記のＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；上記のＣｈｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１���上記のＣｈｏｗ  ａｎｄ  Ｔｕｎｇ，１９９９；上記のＥｌ−Ｓｈｅｅｋｈ，１９９９；上記のＦａｌｃｉａｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｕｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｒ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：１６５−１６９，１９９４）、β−ガラクトシダーゼ（Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１５：３４５−３４９，２００３；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，２１：１２１１−１２１６，２００３；Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１３：８７−８９，２００３）、および、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（上記のＣｈｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２００２，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２００２；５６，１４８，２１０）が挙げられる。
【０１６８】
当業者であれば、本発明に従って、微細藻類種の形質転換系のために、様々な既知のプロモーター配列を有効に展開できることを容易に理解するであろう。例えば、微細藻類で導入遺伝子の発現を促進するために一般的に使用されるプロモーターとしては、渦鞭毛藻類と緑藻類の両方で使用されている、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）の様々なバージョンが挙げられる（Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１８：７７８−７８０，１９９９；Ｊａｒｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３１７−３２１，１９９１；Ｌｏｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１３：４２７−４３５，１９９８）。シミアンウイルスのＳＶ４０プロモーターは、いくつかの藻類でも活性があると報告されている（Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１５１  ３４５−３４９，２００３；Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ  ３９８−３９９，４６９−４７２，１９９９）。ＲＢＣＳ２（リブロース二リン酸カルボキシラーゼ、小サブユニット）のプロモーター（Ｆｕｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１９：３５３−３６１，１９９９）およびクラミドモナスのＰｓａＤ（光化学系Ｉ複合体の豊富なタンパク質；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｃｈａｉｘ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８１：５５５５−５５６０，２００１）もまた有用である。ＨＳＰ７０Ａ／ＲＢＣＳ２およびＨＳＰ７０Ａ／β２ＴＵＢ（チューブリン）の融合プロモーター（Ｓｃｈｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２１：１２１−１３１，２０００）もまた、ＨＳＰ７０Ａプロモーターが他のプロモーターの上流に配置されたときに、転写活性化因子として機能する可能性がある、導入遺伝子の発現の改善に有用であり得る。対象とする遺伝子の高レベルの発現は、珪藻フコキサンチン−クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするｆｃｐ遺伝子のプロモーターの制御下で（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：２３９−２５１，１９９９；Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３６：３７９−３８６，２０００）またユースティグマトファイトビオラキサンチン−クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするｖｃｐ遺伝子のプロモーターの制御下で（米国特許番号第８，３１８，４８２号を参照されたい）、例えば、珪藻種でも達成することができる。必要に応じて、誘導性プロモーターはトランスジェニック微細藻類における遺伝子の迅速かつ厳密に制御された発現を提供することができる。例えば、硝酸レダクターゼをコードするＮＲ遺伝子のプロモーター領域を、そのような誘導性プロモーターとして使用することができる。ＮＲプロモーター活性は通常、アンモニウムによって抑制され、アンモニウムが硝酸塩に置き換えられたときに誘導され（Ｐｏｕｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｅｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ２７２：３４１３−３４２３，２００５）、したがって、遺伝子発現は、微細藻類細胞がアンモニウム／硝酸塩の存在下で成長するときにオフまたはオンに切り替えることができる。本明細書に提供される構築物および形質転換系において用途を見��すことができる追加の藻類プロモーターとしては、米国特許第８，８８３，９９３号；米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／００２３０３５号；米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０３２３７８０号；および米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３６３８９２号に開示されているものが挙げられる。
【０１６９】
宿主細胞は、形質転換されていない細胞、または少なくとも１つの核酸分子で既にトランスフェクトされている細胞のいずれかであり得る。例えば、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子の減弱化された発現を有するように操作された藻類宿主細胞は、さらに、限定されないが、対象とする生物分子、例えば、１つ以上のタンパク質、色素、アルコール、または脂質の増加した産生などの任意の所望の形質を付与し得る１つ以上の遺伝子を含み得る。
【０１７０】
光合成生物から産物を生産する方法
本明細書では、本明細書に開示されるＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４変異体との組み合わせなど、向上した光合成効率を有する光合成生物を培養することにより、藻類などの光合成生物から産物を産生する方法も提供される。この方法には、光合成生物の変異体ＳＧＩ１、ＳＧＩ２、ｃｐＳＲＰ５４、ｃｙｔｏＳＲＰ５４、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４遺伝子との組み合わせ、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４との組み合わせを好適な培地で培養して、光合成生物培養物を提供することと、培養物からバイオマスまたは少なくとも１つの産物を回収することと、を含む。いくつかの実施形態では、産物は脂質である。光合成生物を含む培養物は、好ましくは光合成独立栄養培養物であり、培養培地は、好ましくは、相当量の還元炭素を含まない、すなわち、培養物は、藻類が成長のために使用できる形態またはレベルの還元炭素を含まない。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、光合成生物は、フラスコまたはバイオリアクターを含む任意の好適な容器で培養されてもよく、ここで、光合成生物は、人工光または自然光に露光され得る。変異体光合成生物を含む培養物は、例えば、自然のまたはプログラムされた明／暗周期であり得る明／暗周期で培養されてもよく、例示的な例として、１２時間の明から１２時間の暗、１４時間の明から１０時間の暗、１６時間の明から８時間の暗などを提供してもよい。
【０１７２】
培養とは、選択および／または制御された条件の使用による、１つ以上の細胞の成長（例えば、細胞サイズ、細胞内容物、ならびに／もしくは細胞活性の増加）および／または繁殖（例えば、有糸分裂を介した細胞数の増加）の意図的な促進を指す。成長と繁殖との両方の組み合わせは、増殖と呼ばれてもよい。本明細書の実施例で実証されるように、弱光強度への調節緩和された適応性を呈する本明細書で提供される変異体は、弱光順応で制限緩和されていない同じ株の野生型藻細胞培養物に対して、培養物のより高い細胞密度を経時的に、例えば、１週間以上の期間にわたって達成することができる。例えば、ｃｐＳＲＰ５４変異体は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５日間、もしくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間培養され得る。
【０１７３】
組換え微生物の培養に使用できる選択および／または制御された条件の非限定的な例としては、定義された培地（ｐＨ、イオン強度、および／または炭素源などの既知の特性）、規定温度、酸素分圧、二酸化炭素レベル、バイオリアクターでの成長など、またはこれらの組み合わせの使用を挙げることができる。いくつかの実施形態では、微生物または宿主細胞は、光および還元された炭素源の両方を使用して、混合栄養的に成長させることができる。あるいは、微生物または宿主細胞は、光栄養的に培養させることができる。光栄養的に成長するとき、藻類株は、エネルギー源として光を有利に使用することができる。微生物による生体分子の合成には、ＣＯ２または重炭酸塩などの無機炭素源を使用することができる。本明細書で使用される「無機炭素」には、生物が持続可能なエネルギー源として使用することができない炭素含有化合物または分子が含まれる。典型的には「無機炭素」は、ＣＯ２（二酸化炭素）、炭酸、重炭酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩など、またはこれらの組み合わせの形態であり、持続可能なエネルギーのためにさらに酸化することも、生物による還元力の供給源として使用することもできない。光独立栄養的に成長した微生物は、無機炭素が実質的に唯一の炭素源である培養培地上で成長させることができる。例えば、無機炭素が実質的に唯一の炭素源である培養物では、培養培地中に提供され得るいかなる有機（還元）炭素分子または有機炭素化合物も、細胞によってエネルギーとして取り込まれることも、および／もしくは代謝されることもできず、ならびに／もしくは細胞培養の成長および増殖のための持続可能なエネルギーを提供するのに十分な量で存在していない。
【０１７４】
本発明の方法に従って有用であり得る微生物および宿主細胞は、世界中の様々な場所および環境において見出すことができる。脂質および／または他の産物の最適な繁殖および生成のための特定の成長培地は変化する可能性があり、バイオマスまたは脂質、タンパク質、色素、抗酸化物質などの産物の成長、繁殖、または産生を促進するために最適化され得る。固体および液体の成長培地は、一般に、多種多様な微生物株に好適な特定の培地の調製に関する説明と同様に、多種多様な供給源から入手可能である。例えば、様々な淡水および塩水培地は、Ｂａｒｓａｎｔｉ（２００５）Ａｌｇａｅ：Ａｎａｔｏｍｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉａ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ａｌｇａｅに記載されているものを含むことができる。藻類培地のレシピは、非限定的な例として、ＵＴＥＸ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ（ｗｗｗ．ｓｂｓ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／ｕｔｅｘ／ｍｅｄｉａ．ａｓｐｘ）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ｗｗｗ．ｃｃａｐ．ａｃ．ｕｋ）；およびＫａｔｅｄｒａ  Ｂｏｔａｎｉｋｙ（ｂｏｔａｎｙ．ｎａｔｕｒ．ｃｕｎｉ．ｃｚ／ａｌｇｏ／ｃａｕｐ−ｍｅｄｉａ．ｈｔｍｌ）が含まれる、様々な藻類培養コレクションのウェブサイトでも見出すことができる。
【０１７５】
培養方法は、任意で、限定されないが、脂質、１種類以上のタンパク質、抗酸化物質、または色素の産生に関与するタンパク質などの、産物の産生のための１つ以上の遺伝子の発現を誘導すること、および／または微生物の代謝経路を調節することを含み得る。発現の誘導には、培養物へ栄養素または化合物を添加すること、培養培地からの１つ以上の成分を除去すること、光ならびに／または温度を増加または減少させること、および／もしくは対象とする遺伝子の発現を促進する他の操作を行うことを含み得る。このような操作は、対象とする遺伝子に作動可能に連結された（異種）プロモーターの性質に大きく依存し得る。
【０１７６】
本発明のいくつかの実施形態では、弱光強度への順化で制限緩和された微生物は、許容可能な微生物成長および増殖を可能にし、促進し、および／または維持するために、人工光源を備えた、かつ／または太陽光を含む光に対して十分に透明な１つ以上の壁を有する、「光バイオリアクター」で培養することができる。脂肪酸産物またはトリグリセリドの産生のために、光合成微生物または宿主細胞は、追加的または代替的に、振盪フラスコ、試験管、バイアル瓶、マイクロタイター皿、ペトリ皿など、またはこれらの組み合わせで培養することができる。
【０１７７】
追加的または代替的に、組換え光合成微生物または宿主細胞は、池、運河、海上の成長容器、溝、導水路、水路など、またはそれらの組み合わせで成長させることができる。このようなシステムでは、温度は調整されない場合があり、または様々な加熱もしくは冷却方法または装置が使用される場合がある。標準的なバイオリアクターと同様に、空気、ＣＯ２富化空気、煙道ガスなど、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない無機炭素源（限定されないが、ＣＯ２、重炭酸塩、炭酸塩など）が、培養物に供給することができる。煙道ガスおよび／またはＣＯ２に加えてＣＯを含有し得る他の無機源を供給するとき、（光）バイオリアクターに導入されたＣＯレベルが、微生物の成長、増殖、および／または生存に関して危険な量および／または致死量を構成しないように、このような供給源を前処理する必要があり得る。
【０１７８】
変異体光合成生物は、限定されないが、脂質、着色剤もしくは色素、抗酸化物質、ビタミン、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ホルモン、サイトカイン、ペプチド、タンパク質、またはポリマーなどの産物の産生のためのポリペプチドをコードする１つ以上の非天然遺伝子を含むことができる。例えば、コードされるポリペプチドは、酵素、代謝調節因子、補助因子、担体タンパク質、またはトランスポーターであり得る。この方法は、産物の産生に関与するポリペプチドをコードする少なくとも１つの非天然遺伝子を含むｃｐＳＲＰ５４変異体またはｃｙｔｏＳＲＰ５４変異体を培養して、バイオマスまたは少なくとも１つの藻類産物を産生することを含む。脂質およびタンパク質などの産物は、例えば、有機溶媒を使用する全培養物抽出によるなど、当業者に既知の回収手段によって培養物から回収することができる。場合によっては、細胞の均質化によって脂肪酸産物の回収率を向上させることができる。例えば、脂肪酸、脂肪酸誘導体、および／またはトリグリセリドなどの脂質は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、同時係属中の同一出願人による米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０２２５８４６号に記載されているように、高温および／または高圧で溶媒を使用して藻類を抽出することにより、藻から単離することができる。
【０１７９】
他の代替の実施形態および方法は、この開示を検討すれば、当業者には明らかであろう。本明細書に提供される一般的な方法の説明は、例示の目的を意図しているにすぎない。以下の非限定的な例を以下に提供する。
【実施例】
【０１８０】
実施例１
ＣＡＳ９を過剰発現するＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ株の生成
Ｃａｓ９を過剰発現するＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ株の生成は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０３０４８９６号に記載されている。
【０１８１】
簡単に言うと、ベクターｐＳＧＥ−６７０９を、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａにおける化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９遺伝子の発現のために遺伝子操作した。ベクターには、次の３つの要素が含まれていた：
（１）Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ用にコドン最適化された操作されたＣａｓ９遺伝子を含有し、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａからのイントロンを含有する、Ｃａｓ９発現カセットであって、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ１７プロモーターに作動可能に連結された、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ、核局在化シグナル、およびペプチドリンカーも含み、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ１７ターミネーターで終結した、Ｃａｓ９発現カセット；
選択可能マーカー発現カセットであって、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ用にコドン最適化されたアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）からのブラストサイジン耐性遺伝子を含み、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４プロモーターに作動可能に連結されたＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａイントロンを含有し、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４ターミネーターによって終結する、選択可能マーカー発現カセット；
ＧＦＰレポーター発現カセットであって、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＡＣＰ１プロモーターによって駆動されるＴｕｒｂｏＧＦＰ遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）を含有し、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＡＣＰ１ターミネーターによって終結する、ＧＦＰレポーター発現カセット。
【０１８２】
このベクターにより、バイオリスティックでＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａを形質転換した。Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株ＷＴ−１１８５の形質転換は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許公開第２０１４／０１５４８０６号に本質的に記載されているように、ＢｉｏＲａｄ  Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して達成した。形質転換用のＤＮＡを金粒子上に沈着させた。金粒子がチューブ長の内側に付着し、Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ内に配置されたチューブを通してヘリウムガスのバーストが発射され、ＤＮＡでコーティングされた金粒子を、固体非選択培地（ＰＭ０７４藻類成長培地を含有する、２％の寒天平板培地）に接着しているＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ株ＷＴ−１１８５細胞中に推進させた。Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎを使用して、プレートから３〜６ｃｍの距離から６００ｐｓｉで、細胞サークルあたり２つの弾丸を発射した。翌日、細胞を形質転換コロニーの成長のための選択培地に移した。
【０１８３】
コロニーは、フローサイトメトリーによって完全ＧＦＰ浸透度についてスクリーニングし、野生型蛍光ピークよりも高い値にシフトした単一の蛍光ピークを有する形質転換株の同定を行った。非形質転換細胞に対して明らかにシフトした蛍光ピークを示す完全浸透性Ｃａｓ９株を、Ｃａｓ９発現の証拠に対する抗Ｃａｓ９のウエスタンブロッティングによって、Ｃａｓ９発現について試験した。これらのスクリーニングに基づいて、６７０９−２の単離を繰り返し、株識別子ＧＥ−１５６９９を付与した。
【０１８４】
実施例２：
完全浸透性ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＣＡＳ９エディターラインを使用したＣＰＳＲＰ５４のノックアウト
完全浸透性ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＣａｓ９エディターラインを使用するｃｐＳＲＰ５４のノックアウトは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０３０４８９６号に記載されている。簡単に言うと、キメラｇＲＮＡ（配列番号１０３）が設計され、最後の３つのヌクレオチドはＰＡＭであり、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａコード配列中の葉緑体ＳＲＰ５４遺伝子を標的にするために、インビトロで合成した。
【０１８５】
ＧＥ−１５６９９を、１〜２μｇの精製されたキメラガイドＲＮＡ、およびＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ用にコドン最適化されたブレオマイシン耐性「ＢｌｅＲ」遺伝子を含有しかつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａからのイントロン（配列番号７０）を含有している１μｇの選択可能マーカーＤＮＡ用いて、電気穿孔法によって形質転換した。ＢｌｅＲ遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４プロモーター（配列番号７１）に作動可能に連結され、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４ターミネーター（配列番号７２）によって終結していた。
【０１８６】
電気穿孔法は、形質転換の６日前に、１×１０６細胞／ｍＬに接種した１００ｍＬの種培養を接種することによって行い、形質転換の２日前に、１Ｌの培養物を１×１０６細胞／ｍＬに接種するために用いた。形質転換の当日に、細胞を５０００×ｇで２０分間遠心分離することによりペレット化し、０．１ｕｍで濾過した３８５ｍＭのソルビトールで３回洗浄し、３８５ｍＭのソルビトール中で５×１０９細胞／ｍＬに再懸濁させた。１００μＬの濃縮細胞の電気穿孔法は、様々な条件下で、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（商標）の０．２ｃｍのキュベットで実施した。電気穿孔法の最適化に使用されたＤＮＡは、ｂｌｅＲおよびＴｕｒｂｏＧＦＰ発現カセットを含む線状化ｐＳＧ６６４０であった。ＴｕｒｂｏＧＦＰカセットは、ＴｕｒｂｏＧＦＰ遺伝子（配列番号２４）に作動可能に連結されたＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＡＣＰ１プロモーター（配列番号６７）と、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＡＣＰ１ターミネーター（配列番号６８）とを含んでいた。事前に冷却した細胞およびキュベットで電気穿孔した直後に、１ｍＬの冷ソルビトールを添加し、１０ｍＬのＰＭ０７４に細胞を移すために使用した。一晩の回復後、細胞を濃縮し、２５０ｍｇ／Ｌのゼオシンを含む直径１３ｃｍのＰＭ０７４培地に広げ、バイオリスティックのセクションに記載されている条件下で成長させた。
【０１８７】
電気穿孔条件は、１．０〜１．２ｋＶ（５０００〜６０００Ｖ／ｃｍ）２００〜３００オーム、および２５〜５０μＦであった。大量のＤＮＡを使用すると、結果としてゼオシン耐性コロニーの数が増加したが、効果は４μｇを超える量で定常に達した。電気穿孔法に続いて、細胞を２５０μｇ／ｍｌのゼオシンを含有する寒天培地（ＰＭ１３０）に播種して、ｂｌｅカセットを組み込んだ形質転換体を選択した。形質転換体を、天然の標的遺伝子座（オリゴ−ＡＥ５９６およびオリゴ−ＡＥ５９７）にわたって増幅するように設計されたプライマーを使用したコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。プライマーは、遺伝子座への組み込み（例えば、ＢｌｅＲカセットの「ノックイン」）がない場合に７００ｂｐバンド、または単一のｂｌｅカセットが標的遺伝子座に組み込まれた場合は４．３ｋｂバンドを生成するように設計された。加えて、コロニーＰＣＲはまた、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子から選択可能マーカーまで伸長する断片を増幅するように設計されたプライマー（オリゴ−ＡＥ５９７）を使用して行われた。組み込まれたｂｌｅカセットの配向に応じて、１．２ｋｂのバンドは、ｂｌｅカセット内からｃｐＳＲＰ５４遺伝子に及ぶプライマー４０５／５９７またはプライマー４０６／５９７によるいずれかの増幅から生じる。結果は、相同性アームがない場合、標的遺伝子座へのＢｌｅＲカセットの高頻度（この試料では４０〜４５％）のノックインを示した。ｃｐＳＲＰ５４ノックアウトは、淡い緑色の表現型をもたらした。
【０１８８】
実施例３
完全浸透性ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＣＡＳ９エディターラインを使用したＳＧＩ２のノックアウト
完全浸透性のＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＣａｓ９エディターラインを使用したＳＧＩ２のノックアウトを、本質的に上記のｃｐＳＲＰ５４で説明したように行った。簡単に言うと、キメラｇＲＮＡ（配列番号１０４）が設計され、最後の３つのヌクレオチドはＰＡＭであり、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａコード配列中の葉緑体ＳＧＩ２遺伝子を標的にするために、インビトロで合成した。
【０１８９】
ＧＥ−１５６９９を、１〜２μｇの精製されたキメラガイドＲＮＡ、およびＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ用にコドン最適化されたブレオマイシン耐性「ＢｌｅＲ」遺伝子を含有しかつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａからのイントロン（配列番号７０）を含有している１μｇの選択可能マーカーＤＮＡ用いて、電気穿孔法によって形質転換した。ＢｌｅＲ遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４プロモーター（配列番号７１）に作動可能に連結され、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４ターミネーター（配列番号７２）によって終結していた。
【０１９０】
Ｂｌｅ耐性コロニーが選択された。ノックアウトをＰＣＲで確認する。
【０１９１】
実施例４
完全浸透性ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＣＡＳ９エディターラインを使用したＳＧＩ１のノックアウト
ＳＧＩ１ノックアウト株２４１８３は、Ｃａｓ９を発現する母株ＧＥ−１５６９９から作製された。ＧＥ−１５６９９細胞に、キメラｇＲＮＡ（配列番号１０５、配列番号１０５の最後の３つのヌクレオチドはＰＡＭである）、および亜硝酸レダクターゼプロモーターとターミネーターとに隣接するコドン最適化Ｃｒｅ遺伝子を含有するＤＮＡカセット（図１０Ａに示した）を電気穿孔した。このカセットには、以前に使用されたｂｌｅおよびＧＦＰ遺伝子も含まれていた。ＢｌｅおよびＧＦＰは、ｌｏｘ２２７２部位に隣接していた。Ｃｒｅが発現すると、ｌｏｘ部位が再結合し、これらの配列間のＤＮＡをループアウトする。単一コピー組み込みを向上させるために、ＣＲＩＳＰＲターゲットを取り巻く、ＳＧＩ１遺伝子に対する相同配列もまた、カセットの端にあった。配列を、ＳＧＩ１遺伝子座のカセットの存在について、ＤＮＡ塩基配列決定法によって確認した。ｄｄＰＣＲを使用して、コピー数により、単一のコピー組み込み体であることを確認した。次に、この株をアンモニウム非含有培地で培養し、Ｃｒｅを発現させた。Ｃｒｅが発現すると、ｌｏｘ部位が再結合し、これらの配列間のＤＮＡをループアウトする。
【０１９２】
実施例５
完全浸透性ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＣＡＳ９エディターラインを使用したＳＧＩ２およびＣＰＳＲＰ５４のダブルノックアウト
完全浸透性のＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＣａｓ９エディターラインを使用したＳＧＩ２およびＳＲＰ５４のダブルノックアウトを、本質的に上記のｃｐＳＲＰ５４で説明したように行った。簡単に言うと、２つのキメラｇＲＮＡ：１つはｃｐＳＲＰ５４に対するもの（配列番号６９）；およびもう１つはＳＧＩ２に対するもの（配列番号７３）、が設計され、最後の３つのヌクレオチドはＰＡＭであり、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａコード配列中の葉緑体ＳＧＩ１遺伝子を標的にするために、インビトロで合成された。
【０１９３】
ＧＥ−１５６９９を、１〜２μｇの精製されたキメラガイドＲＮＡ、およびＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ用にコドン最適化されたブレオマイシン耐性「ＢｌｅＲ」遺伝子を含有しかつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａからのイントロン（配列番号７０）を含有している１μｇの選択可能マーカーＤＮＡ用いて、電気穿孔法によって形質転換した。ＢｌｅＲ遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４プロモーター（配列番号７１）に作動可能に連結され、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４ターミネーター（配列番号７２）によって終結していた。
【０１９４】
Ｂｌｅ耐性コロニーが選択された。ノックアウトをＰＣＲで確認する。
【０１９５】
実施例６
完全浸透性ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＣＡＳ９エディターラインを使用したＳＧＩ１およびＣＰＳＲＰ５４のダブルノックアウト
ｃｐＳＲＰ５４を標的とするキメラｇＲＮＡ（配列番号６９）と共に、ｂｌｅおよびＧＦＰ配列を含むＤＮＡカセット（図１０Ｂ）を使用して、上記のＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＳＧＩ１ノックアウト株２４１８３に電気穿孔し、ＳＧＩ１およびｃｐＳＲＰ５４のダブルノックアウトを生成した。Ｂｌｅ耐性コロニーが選択された。ノックアウトをＰＣＲで確認する。３つのダブルノックアウト株：ＳＴＲ２４５３８、ＳＴＲ２４５４０、およびＳＴＲ２４５４１が生成され、これらの光生理学的特性および物理的表現型は同一であった。
【０１９６】
実施例７
単一コピーＣＡＳ９遺伝子を含むＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＳＧＩ１ノックアウト株の生成
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ用にコドン最適化されたブレオマイシン耐性「ＢｌｅＲ」遺伝子、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａからのイントロン（配列番７０）、ＧＦＰ遺伝子、Ｃｒｅ遺伝子、ｌｏｘ部位、およびＣａｓ９遺伝子を含むものを、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターにクローニングした。Ｃａｓ９遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ１７プロモーターに作動可能に連結され、２９個の天然のＰＢＰイントロンを含み、ｌｏｘ２２７２部位の外側にあった。Ｃａｓ９遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ１７ターミネーターによって終結した。ＢｌｅＲ遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４プロモーター（配列番号７１）に作動可能に連結され、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４ターミネーター（配列番号７２）によって終結していた。ＧＦＰ遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＡＣＰ１プロモーターに作動可能に連結され、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＡＣＰ１ターミネーターによって終結していた。Ｃｒｅ遺伝子は、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ亜硝酸レダクターゼプロモーターおよびＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ亜硝酸レダクターゼターミネーターに作動可能に連結されていた。これらの遺伝子は、相同組換え部位として機能するＳＧＩ１（ＣｈｅＹ）配列の部分に隣接している。組換えｐＣＣ１ＢＡＣベクターの概略図を、図１７に示している。
【０１９７】
形質転換ＷＴＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ宿主株：ＳＴＲ０００１０
Ｃａｓ９遺伝子、ＷＴＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ宿主株を、ＳＧＩ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡ（配列番号７４）、およびＰｖｕＩ消化されスピン精製された選択カセット（ＮＡＳ００４６０、配列番号８６）を用いて同時形質転換した。
【０１９８】
選択カセット（ＮＡＳ００４６０）は、ＳＧＩ１相同組換え（ＨＲ）アップアームの上流には１．７ｋｂのベクターバックボーン（配列番号８６の配列１〜１７６１に相当する）を含むがＳＧＩ１  ＨＲダウンアームの下流にはベクターの一部を含まない断片、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ用にコドン最適化されたブレオマイシン耐性「ＢｌｅＲ」遺伝子、およびＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａからのイントロン（配列番号７０）と、ＧＦＰ遺伝子（配列番号８６の配列８２６０〜８９６１に相当する）と、Ｃａｓ９遺伝子とを含む。選択カセットには、Ｌｏｘ部位内にｂｌｅおよびＧＦＰを含有する。ＣＲＥ遺伝子（配列番号８６の配列１０４１８〜１３３２６に相当する）は、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａにコドン最適化した６つの亜硝酸レダクターゼ、イントロンを含み、これは、亜硝酸レダクターゼ誘導性プロモーター下にあった（配列番号８６の配列９９０６〜１０４１７に相当する）。Ｃｒｅ遺伝子は、亜硝酸レダクターゼターミネーター（配列番号８６の配列１３３２７〜１５１４０に相当する）により終結される。２９個の天然のＰＢＰイントロンを含むＣａｓ９遺伝子は、配列番号８６の配列１５７５４〜配列２５９１８に相当する。Ｃａｓ９遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ１７プロモーター（配列番号８６の配列１５１６６〜１５７５３に相当する）の下にあり、２９個の天然のＰＢＰイントロンを含有しており、ｌｏｘ部位の外側にあった。Ｃａｓ９遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ１７ターミネーター（配列番号８６の配列２５９１９〜２６３７３に相当する）により終結される。
【０１９９】
ＢｌｅＲ遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４プロモーター（配列番号７１）に作動可能に連結され、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４ターミネーター（配列番号７２）によって終結していた。ＧＦＰ遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＡＣＰ１プロモーター（配列番号８６の配列７６８８〜８２５９に相当する）に作動可能に連結され、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＡＣＰ１ターミネーター（配列番号８６の配列８６９２〜９８３０に相当する）によって終結していた。ＳＧＩ１相同組換え（ＨＲ）アップアームは、配列番号８６の配列１７６２〜３５７８に相当する。ＳＧＩ１相同組換え（ＨＲ）ダウンストリームアームは、配列番号８６の配列２６４４８〜２８４４７に相当する。５’ｌｏｘ２２７２部位は、配列番号８６の配列３８３１〜３８６４に相当し、３’ｌｏｘ２２７２は、配列番号８６の配列９８３９〜９８７２に相当する。すべての配列は、ＳＧＩ１  ＣＲＩＳＰＲ標的の上流および下流の２ｋｂ相同領域内にある。
【０２００】
ＳＧＩ１  ｇＲＮＡ（配列番号１０５）と選択カセット（配列番号８６）で同時形質転換すると、ＳＧＩ１遺伝子がノックアウトされ、Ｃａｓ９、ＢｌｅＲ、およびＧＦＰ遺伝子を含む選択カセットが、相同組換えによって、ＳＧＩ１部位に挿入される。ＢｌｅＲ、およびＧＦＰ遺伝子はｌｏｘ２２７２部位に隣接しており、一方、選択カセットのＣａｓ９およびＣｒｅ遺伝子はｌｏｘ２２７２部位の外側にあるが、相同組換え部位として機能するＳＧＩ１配列の部分内にある。
【０２０１】
選択カセットがＳＧＩ１遺伝子座に挿入されると、Ｃｒｅ遺伝子は誘導性亜硝酸レダクターゼプロモーターに作動可能に連結される。したがって、微生物が亜硝酸塩を含む成長培地で成長すると、Ｃｒｅ遺伝子発現が誘発される。Ｃｒｅ遺伝子の発現時に、Ｃｒｅ酵素はＬｏｘ２２７２部位に作用し、Ｌｏｘ部位内に隣接するＢｌｅＲおよびＧＦＰ配列を除去する。これは、選択可能なマーカー（例えば、ＧＦＰ、他の抗生物質マーカー、例えば、ＢｌｅＲ）が他の配列のサブ配列形質転換中に再導入され得る系をもたらす。
【０２０２】
Ｃａｓ９挿入のための形質転換されたＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ株のスクリーニング
形質転換されたＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ細胞を、アンモニウムを含有する選択プレート上の単一コロニーに播種してＣＲＥ発現を抑制し、選択的抑制プレート上でコロニーに再度パッチし、ＰＣＲおよびＧＦＰシフトを使用してノックアウトをスクリーニングした。ノックアウトの確認に使用したＰＣＲプライマーを以下に示す。
2021509018.tif 000007
【０２０３】
ＰＣＲ陽性反応を示したものは、ノックアウト（カセットの挿入）および完全なＨＲを確認するために配列決定に送られた。本出願の発明者らは、驚くべきことに、かつ予期せぬことに、単一のコピーが、ＳＧＩ１遺伝子座に挿入されたＣａｓ９遺伝子であることを見出した。
【０２０４】
実施例８
完全浸透性Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ単一コピーＣＡＳ９エディターラインを使用したＳＧＩ１、ＳＧＩ２、およびＣＰＳＲＰ５４のトリプルノックアウト
上記のＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＳＧＩ１ノックアウト株ＳＴＲ２４１２９が作製され、この株は、マーカー（ｂｌｅ／ＧＦＰ）がＳＧＩ１ノックアウトガイド配列：
2021509018.tif 000008
を使用してフロックアウトされた状態で、ＳＧＩ１遺伝子座に挿入されたＣａｓ９およびＣｒｅの単一コピーを有する。
【０２０５】
ＳＧＩ１ノックアウト株ＳＴＲ２４１２９は、ＳＧＩ２およびＳＲＰ５４遺伝子をノックアウトするための形質転換宿主として使用された。宿主株ＳＴＲ２４１２９を、ＳＧＩ２およびＳＲＰ５４遺伝子を標的とするｇＲＮＡと、各標的（例えば、ＳＲＲＰ５４およびＳＧＩ２）に対する相同組換え（ＨＲ）アームを含む、Ｕｌｔｒａｍｅｒを含む選択カセット（ｐＳＧＥ０６８６６）と、で同時形質転換した。ＢｌｅＲ遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４プロモーター（配列番号７１）に作動可能に連結され、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＲＰＳ４ターミネーター（配列番号７２）によって終結していた。ＧＦＰ遺伝子は、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＡＣＰ１プロモーターに作動可能に連結され、かつＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＡＣＰ１ターミネーターによって終結していた。選択カセットは、マーカーリサイクルの可能性があるｌｏｘ部位に囲まれたｂｌｅおよびＧＦＰマーカーを含む。Ｃｒｅが発現すると、ｌｏｘ部位が再結合し、これらの配列間のＤＮＡをループアウトする。
【０２０６】
形質転換された宿主細胞を選択プレートに播種し、コロニーをパッチし、単一のコロニーを拾い上げ、ＰＣＲを使用してノックアウトについてスクリーニングした。ＰＣＲ陽性反応を示したものは、各標的のノックアウト（カセットの挿入）を確認するために配列決定に送られた。
【０２０７】
図１６Ａおよび１６Ｂは、ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＳＲＰ５４およびＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＳＧＩ２をノックアウトするための選択カセットの概略図を示す。ｇＲＮＡ、ＨＲアームを有するＵｌｔｒａｍｅｒの配列を以下に示す。
【０２０８】
ＳＲＰ５４−ＥＭＲＥ３ＥＵＫＴ５９２６５０
ｇＲＮＡ配列：
2021509018.tif 000009
【０２０９】
ｐＳＧＥ０６８６６を増幅するＨＲアームを有するＵｌｔｒａｍｅｒ：
2021509018.tif 000010
【０２１０】
プライマー配列：
2021509018.tif 000011
【０２１１】
スクリーニングに使用される他のプライマー（選択カセット内に位置する）：
2021509018.tif 000012
【０２１２】
ＳＧＩ２−ＥＭＲＥ３ＥＵＫＴ５９０４８５
ｇＲＮＡ配列：
2021509018.tif 000013
【０２１３】
ＨＲアームをＰＳＧＥ０６８６６に配置するためのＵｌｔｒａｍｅｒ配列
2021509018.tif 000014
【０２１４】
プライマー配列：
2021509018.tif 000015
【０２１５】
プライマー配列：
プライマーＪＶ９４６およびＡＥ６０８もスクリーニングプライマーとして使用された。
【０２１６】
実施例９
ＳＧＩ２タンパク質のドメインアーキテクチャのバイオインフォマティクス分析
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ種、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ種、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからの例示的なＳＧＩ２タンパク質のドメインアーキテクチャは、オンラインツールＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＣＢ１０  １ＳＤ，ＵＫからのツールバージョン５．２７、データベースバージョン６６．０）を使用して分析した。
【０２１７】
図３〜９に示すように、ＳＧＩ２タンパク質のＮ末端に単一の保存された応答レシーバードメインを特定した。
【０２１８】
実施例１０
ＳＧＩ２タンパク質の応答レシーバードメインのバイオインフォマティクス分析
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ応答レシーバードメイン（配列番号６）の局所アライメントを、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、１０のギャップペナルティおよび０．５の伸長（Ｅｘｔｅｎｄ）ペナルティを使用して、他の藻類種および様々な植物からオルソロガスタンパク質で行った。Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ応答レシーバードメイン（配列番号６）と様々な光合成生物の局所アライメントを以下の表５に示す。
【０２１９】
（表５）Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ応答レシーバードメインと様々なオルソロガスタンパク質の局所アラインメントの結果
2021509018.tif 000016
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2021509018.tif 000018
【０２２０】
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ種の応答レシーバードメインは、他の藻類種との高い同一性割合、および様々な植物種との高い類似度を示した。
【０２２１】
実施例１１
低クロロフィルＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ種株ＷＴ−１１８５変異体のためのスクリーニング
上記のような、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ種遺伝子の、ＳＧＩ１、ＳＧＩ２のノックアウト、ＳＧＩ１とｃｐＳＲＰ５４とのダブルノックアウト、またはＳＧＩ２とｃｐＳＲＰ５４とのダブルノックアウトに続いて、淡色のコロニーから細胞を選択し、弱光（１００μｍｏｌの光子ｍ−２秒−１）において１〜５日間成長させ、その後ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してフローサイトメトリーで選別し、低クロロフィル蛍光を有する細胞を選択した。一般に、細胞の全集団に対しておよそ０．５〜２％の、最低のクロロフィル蛍光を有する細胞の部分を選択した。選別された細胞を播種した後、フローサイトメトリーで分離されたアンテナ低減系統のさらなる一次スクリーニングを、淡緑色または黄色のコロニーを目視での選択を通して行った。他の色素低減変異体および偽陽性からの推定アンテナ低減系統をスクリーニングするために、選択したコロニーを中程度スループットの二次培養スクリーニングにかけ、光生理学的測定の前に分離株を弱光条件に順化させた。強光順化状態の、低減されたクロロフィル蛍光特性を保持するクローンを選択するために、弱光順化中にクロロフィル蛍光を監視した。選択されたクローンは、強光から弱光に移されたときに、（野生型細胞と比較して）クロロフィルのわずかな増加のみを示した。
【０２２２】
７５ｃｍ２の組織培養フラスコで１６５ｍｌの培養物を使用して、一定の強光（約１，７００μｍｏｌの光子ｍ−２秒−１）で半連続培養アッセイを実施し、野生型前駆体株ＷＴ−１１８５に対して、生産性（全有機炭素（ＴＯＣ）蓄積として測定された、バイオマス産生の増加率）が増加した株を特定した。２つの７５ｃｍ２のフラスコに、所定の変異株の種培養を接種した。フラスコは、バブリングされたＣＯ２富化空気（１％のＣＯ２）を培養物を通して送達するための、シリンジフィルターに接続されたチューブを有するストッパーを有した。フラスコをＬＥＤライトバンクに対して幅（最も狭い寸法）に揃えた。培養物の深さ（光源に最も近いフラスコの壁からフラスコの後ろの壁までの距離）は、約８．０ｃｍであった。培養物量の６５％を取り出して、それを、培養物で発生する蒸発に起因する塩分の増加を調整するために希釈された新鮮なＰＭ１１９培地（２１２ｍｌの脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）を１ＬのＰＭ１１９培地に加える）と交換することにより、培養物を明期の開始時に毎日希釈した。ＴＯＣ分析用の試料は、希釈のために取り出した培養物から採取した。
【０２２３】
実施例１２
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ種変異体の半連続生産性アッセイ
弱光条件下で低減したクロロフィルを有することが判明したＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ株ので、生産性の向上を分析した。生産性アッセイでは、変異体の光独立栄養培養物を、一定光の半連続モード（ＣＬ−ＳＣＰＡ）で数日間にわたって成長させて、バイオマス測定のために、培養試料を毎日取り出した。光は、一定の１９００〜２０００μｍｏｌの光子ｍ−２秒−１で１日２４時間維持した。このアッセイでは、２２５ｃｍ２フラスコ内のＰＭ１１９培養培地に、所定の変異株の種培養を接種した。株ごとに３つの培養を開始した。フラスコは攪拌棒を含み、バブリングされたＣＯ２富化空気（１％のＣＯ２）を培養物を通して送達するための、シリンジフィルターに接続されたチューブを有するストッパーを有した。フラスコをＬＥＤライトバンクに対して幅（最も狭い寸法）に揃えた。光源から後方に延びるフラスコの「深さ」寸法は、１３．７ｃｍであった。フラスコの配置を考慮に入れると、光源の表面からフラスコ内の細胞の最も遠い距離は、約１５．５ｃｍであった。培養物量の６５％を取り出して、それを、培養物で発生する蒸発に起因する塩分の増加を調整するために、希釈された新鮮なＰＭ１１９培地と交換することにより、培養物を毎日希釈した。ＴＯＣ分析用の試料は、希釈のために取り出した培養物から採取した。培養が定常状態に達したら、半連続生産性アッセイを、１２日間実行した。
【０２２４】
アッセイの生産性は、毎日取り出された試料からの全有機炭素（ＴＯＣ）を測定することによって評価した。全有機炭素（ＴＯＣ）は、２ｍＬの細胞培養物をＤＩ水で２０ｍＬの総量に希釈することによって決定した。全炭素（ＴＣ）および全無機炭素（ＴＩＣ）を測定するために、測定ごとに３回の注入を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＴＯＣ−Ｖｃｓｊアナライザーに注入した。燃焼炉を７２０℃に設定し、ＴＯＣを、ＴＣからＴＩＣを差し引いて求めた。４点の校正範囲は、非希釈培養の２０〜２０００ｐｐｍに相当する２ｐｐｍ〜２００ｐｐｍであった（相関係数：ｒ２＞０．９９９）。
【０２２５】
本発明の多数の実施形態が説明されてきた。それでもなお、本明細書に記載の実施形態の要素を組み合わせて追加の実施形態を作製することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態、代替物および同等物は、本明細書で説明および主張される本発明の範囲内である。
【０２２６】
実施例１３
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ種変異体の半連続尿素バッチアッセイ
ＳＣＵＢＡ（半連続尿素バッチアッセイ）では、変異体の光合成独立栄養培養物を、一昼夜の、窒素が豊富な半連続モードで数日間成長させ、その後、窒素が枯渇したバッチモードで成長させた。光は、暗闇から、正午での２０００μｍｏｌ光子ｍ−２秒−１までの範囲の、Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａの平均的な５月４日を模倣するようにプログラムされた。試料は、毎日「夕暮れ時」に採取した。このアッセイにおいて、５００ｍｌの四角フラスコ中の尿素ベースのＰＭ１５３培養培地４２０ｍｌに、所与の変異株の種培養を接種した。
【０２２７】
ＰＭ１５２は、ＰＭ０７４に基づく栄養素枯渇培地であるが、窒素源として硝酸塩の代わりに尿素を含む。これは、１．３ｍｌのＰＲＯＬＩＮＥ（登録商標）Ｆ／２藻類供給部分Ａ（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１．３ｍｌの「溶液Ｃ」を、１リットルの最終容量のＩｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ塩の溶液（１７．５ｇ／Ｌ）（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｏｐｋａ，ＦＬ）に添加することによって作製される。溶液Ｃは、３８．７５ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、７５８ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ、３．８８ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２、および３．８４ｍｇ／Ｌのビオチンである。
【０２２８】
株ごとに３つの培養を開始した。フラスコは攪拌棒を含み、バブリングされたＣＯ２富化空気（１％のＣＯ２）を培養物を通して送達するための、シリンジフィルターに接続されたチューブを有するストッパーを有した。フラスコは、０．０８７５ｍ２の、光に向かう開口部と位置合わせされ、光源から後方に延びるフラスコの「深さ」寸法は、８ｃｍであった。半連続バイオマス測定では、培養物量の４０％を取り出して、それを、培養物で発生する蒸発に起因する塩分の増加を調整するために希釈された新鮮なＰＭ１５３培地と交換することにより、培養物を毎日希釈した。ＴＯＣ分析用の試料は、希釈のために取り出した培養物から採取した。培養が定常状態に達するまで、半連続生産性アッセイを実行した。半連続的な培養の後、培養物をアッセイから取り出し、遠心分離を使用してペレット化し、４２０ｍｌの窒素枯渇ＰＭ１５２培地に再懸濁した。半連続モードと同じ成長条件を使用して、培養物を４〜５日間バッチで成長させた。バッチモード中に、脂質生産性を決定するためにＦＡＭＥ試料を採取し、ＦＡＭＥ／ＴＯＣを決定するためにＴＯＣ試料を採取した。
【０２２９】
実施例１４
ＳＧＩ１、ＳＧＩ２遺伝子のＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａノックアウト変異体、ＳＧＩ１およびＳＲＰ５４、ならびにＳＧＩ２およびＳＲＰ５４遺伝子の、ダブルノックアウトのクロロフィル含有量、アンテナサイズ、および光生理学
高生産性変異体のクロロフィル含有量を、メタノールで細胞を抽出し、分光光度法で上清を分析することによって決定した。簡単に言えば、培養物の５００μｌのアリコートを、２．０ｍｌのツイストトップチューブにピペットで移し、テーブルトップマイクロ遠心機を使用して、１５，０００ｒｐｍで１０分間ペレット化した。上清をペレットから吸引し、各ペレットを１．５ｍｌの９９．８％メタノール（前もって炭酸マグネシウムで中和した）に再懸濁した。０．２ｍｌのガラスビーズ（０．１ｍｍの直径）を各バイアル瓶に添加し、ビーズを３分間強くかき混ぜた。１．０ｍｌの上清を新しい１．７ｍｌのフリップトップチューブに移し、テーブルトップマイクロ遠心機内で、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られたペレットは白色であり、完全な抽出が行われたことを示している。０．８ｍｌの各上清を、ピペットで光学ガラスキュベットに移し、すぐに、７２０ｎｍ、６６５ｎｍおよび６５２ｎｍの波長で、吸収波長を読み取った。分光光度測定は、９９．８％のメタノールブランクを使用して、デュアルビームモードで実行した。次の等式を使用して、クロロフィルの濃度を計算した：クロロフィルａ［ｇｍ−３］＝１６．７２（Ａ６６５−Ａ７２０）＋９．１６（Ａ６５２−Ａ７２０）およびクロロフィルｂ［ｇｍ−３］＝３４．０９（Ａ６５２−Ａ７２０）−１５．２８（Ａ６６５−Ａ７２０）。クロロフィルａおよびｂの量は、細胞ごとおよびＴＯＣごとに標準化された。細胞ごとの総クロロフィルの量はＳＧＩ１−２２６１変異体間で多少異なったが、観測されたアンテナサイズの減少と一致して、約３０％から約６５％の範囲の量で、野生型細胞に対して普遍的に減少した。ＴＯＣごとに、野生型細胞に対するＳＧＩ１変異体の総クロロフィルの減少は、約３０％から約５０％まで範囲であった。
【０２３０】
クロロフィル含有量に加えて、ＳＧＩ１およびＳＧＩ２ノックアウト変異体と、ＳＧＩ１およびＳＲＰ５４ならびにＳＧＩ２およびＳＲＰ５４のダブルノックアウトを、ＰＳＩＩの機能的吸収断面積、ＰＳＩの機能的吸収断面積、１／τ’Ｑａ（光飽和における光化学系ＩＩのアクセプター側の電子輸送の飽和速度、線形光合成電子輸送の効率の尺度）、ならびに炭素固定の最大速度、Ｐｍａｘについて分析した。野生型および変異株の細胞を、上記の一定光の半連続培養アッセイ（ＣＬ−ＳＣＰＡ）で培養した。
【０２３１】
様々な光合成パラメータの分析を、光合成生物の包括的な一連の光合成および生理学的特性を測定するために開発された蛍光誘導および緩和（ＦＩＲｅ）手法を使用して行った（Ｇｏｒｂｕｎｏｖ  ａｎｄ  Ｆａｌｋｏｗｓｋｉ（２００５）“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ（ＦＩＲｅ）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ”ｉｎ：Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｔｏ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｐｒｏｃ．１３ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ａｕｇ．２９−Ｓｅｐｔ．３，２００４．（Ｅｄｓ：Ａ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｓｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ｂｒｕｃｅ），Ａｌｌｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｖ．２，ｐｐ．１０２９−１０３１）。ＦＩＲｅ手法は、クロロフィルの「可変蛍光」プロファイルの測定および分析に依存し（Ｆａｌｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ．ａｌ．，２００４“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ”ｉｎ：Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：Ａ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｃ．Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕ  ａｎｄ  Ｇｏｖｉｎｇｊｅｅ，ｅｄｓ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ｐｐ．７５７−７７８により検討）、「可変蛍光」プロファイルは、クロロフィル蛍光と光合成プロセスの効率との間の関係に依存する。この手法は、光合成の集光プロセス、光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）における光化学、および炭素固定までの光合成電子輸送を特徴付ける一連のパラメータを提供する。ここで実行された測定は、Ｍａｘｉｍ  Ｇｏｒｂｕｎｏｖ  ｏｆ  Ｒｕｔｇｅｒｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｅａｓｔ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪによって製造されたｍｉｎｉ−ＦＩＲｅデバイスを使用した。市販のＦＩＲｅデバイスは、Ｓｅａ−Ｂｉｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈａｌｉｆａｘ，Ｃａｎａｄａ，ｓａｔｌａｎｔｉｃ．ｃｏｍ  ａｎｄ  ｐｌａｎｅｔ−ｏｃｅａｎ．ｃｏ．ｕｋ）から入手可能である。ＦＩＲｅデバイスの使用に関するさらなる情報は、会社のマニュアルで利用可能である。すべての測定は、一定の光（２０００μｍｏｌ光子・ｍ−２・秒−１）の半連続培養（ＣＬ−ＳＣＰＡ）培養を使用して行われた（実施例３を参照）。ＦＶ／ＦＭおよびσＰＳＩＩを得るために、蛍光誘導および緩和（ＦＩＲｅ）速度論の測定を暗黒下で行った。表６に提示したＦｖ／ＦＭおよびσＰＳＩＩの値は、６つの測定値の平均として計算し（２つの生物的反復のそれぞれの３つの測定値）、これらのパラメータの誤差は、５％を超えなかった。
【０２３２】
ＰＳＩ断面積の測定は、特注のシングルターンオーバーフラッシャー（ＳＴＦ）を搭載した、５２０ｎｍでエレクトロクロミックシフト（ＥＣＳ）を測定するフィルターセットを備えた改造ＪＴＳ−１０分光計を使用して行った。試料チャンバーのピークパワー密度は、約１０μｓ（マイクロ秒）以内に反応中心を完全に閉じるのに十分な高さであった。結果として生じる励起率は、１０μｓごとに反応中心あたり約１〜３ヒットであった（光化学系の機能的吸収断面積に応じる）。ＳＴＦは青色光の短い超高輝度パルス（４５５ｎｍ、３０ｎｍの半値幅を有する）を生成し、パルスのタイミングはＪＴＳ−１０分光計からのトリガーによって制御された。パルス持続時間は、ＳＴＦパルス制御ボックスによって制御され、フロントパネルのポテンショメータを使用して１μｓ〜５０μｓの範囲で調整可能であった。ＰＳＩ断面積を測定するために、積分球を備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ６５０分光光度計を使用した細胞懸濁液の吸収スペクトルの測定に基づいて、クロロフィルの最大値（約４４０ｎｍ）で培養物を約０．２のＯＤに希釈した。ＥＣＳを、ＤＣＭＵおよびヒドロキシルアミンの存在下で、４０００から１２０，０００μｍｏｌの光子ｍ−２ｓ−１の範囲の強度の１０μｓのフラッシュを使用して測定した。実験曲線を、単純な指数関数でフィッティングさせた。
2021509018.tif 000019
式中、ＥＣＳＭＥＣＳＭは、最大ＥＣＳ信号であり、ＩｔＩｔは、光子／ｍ２の光子密度であり、σＰＳＩσＰＳＩは、ＰＳＩの機能的断面積である。野生型のＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ（ＷＴ−１１８５）のＰＳＩの機能的断面積について得られた値は、（４．０±０．５）×１０−１８（４．０±０．５）×１０−１８ｍ２であった。これらの値は、同じ条件下で成長させたＰＳＩＩの機能的断面積について得られたもの（σＰＳＩＩ＝（４．３±０．１）×１０−１８σＰＳＩＩ＝（４．３±０．１）×１０−１８ｍ２）に近い。これらのパラメータの誤差は、２０％を超えないと推定した。
【０２３３】
炭素固定率（Ｃ１４Ｐｍａｘ）は、０．５ｇｌ−１（５．９５ｍＭ）の重炭酸ナトリウムを含有する培地で５μｇ  ｃｈｌ  ｍｌ−１に正規化された培養物を使用して測定された。２０．４μＣｉ  ｍｌ−１  Ｃ１４標識重炭酸ナトリウムを各培養物に添加し、２５００μＥに１０分間の持続時間で曝露させた。試料を、２ＮのＨＣｌで直ちに酸性化し、一晩オフガスにした。翌日、試料をＢｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６５００シンチレーションカウンターを使用して測定し、定量化した。
【０２３４】
τ’Ｑａ（飽和光条件下で測定されたＰＳＩＩのアクセプター側の電子輸送時間−線形光合成電子輸送の最も遅い工程によって効果的に決定）は、ＦＩＲｅ光度曲線および暗黒誘起緩和速度論（ＤＩＲＫ）プロファイルから測定された。野生型と比較した体積ＰＳＩＩ濃度を、（Ｆｖ／σ５３０ＰＳＩＩ）と推定した。これらのパラメータの誤差は、１５％を超えないと推定した。光吸収断面積（光源の発光スペクトル全体の平均）を、次の等式を使用して推定した。
2021509018.tif 000020
式中、［Ｃｈｌ／ＴＯＣ］は、試料のクロロフィル／ＴＯＣであり、ＯＤ（λ）ＯＤ（λ）は、試料の波長λλで測定された光学密度であり、ΔｌΔｌは、キュベット内の測定ビーム経路長（１ｃｍ）であり、Ｉ（λ）Ｉ（λ）は、波長λλで藻類を成長させるために使用された光源の強度である。
【０２３５】
（表６）ＦＩＲｅ手法で測定された蛍光および光合成パラメータ
2021509018.tif 000021
【０２３６】
野生型ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＷＴ−１１８５株の光生理学的データ、クロロフィル含有量および生産性データ、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａにおける、ＳＲＰ５４およびＳＧＩ２遺伝子の単一ノックアウト、ならびにＳＧＩ２およびＳＲＰ５４遺伝子のダブルノックアウトを評価した。すべての測定値は、ＣＬ−ＳＣＰＡ培養物を使用して採取した。ＦＶ／ＦＭおよびσＰＳＩＩを得るために、蛍光誘導および緩和（ＦＩＲｅ）速度論の測定を暗黒下で行った。Ｆｖ／ＦＭおよびσＰＳＩＩの提示された値は、６つの測定値の平均として計算し（２つの生物的反復のそれぞれの３つの測定値）、これらのパラメータの誤差は、５％を超えなかった。τ’Ｑａ（飽和光条件下で測定されたＰＳＩＩのアクセプター側の電子輸送時間−線形光合成電子輸送の最も遅い工程によって効果的に決定）は、ＦＩＲｅ光度曲線およびＤＩＲＫプロファイルから測定された。上述のように、ＰＳＩ断面積の測定を行った。結果を以下の表７にまとめる。
【０２３７】
（表７）光生理学、クロロフィル、および生産性データ
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【０２３８】
ＰＳＩＩの機能的吸収断面積が大幅に減少し（５０％）、機能的ＰＳＩＩ複合体の数がいくらか減少している。細胞は炭素固定能力が向上した（Ｐｍａｘの２６％の増加）。ＳＧＩ２またはＳＲＰ５４の単一ノックアウトは、野生型株と比較して、ＴＯＣ生産性の少なくとも１７％の増加を示した。全体的に、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａについて観察された生産性の最も高い増加の中でも、ダブルＳＧＩ２／ＳＲＰ５４ノックアウト株は、ＴＯＣ生産性の３２％の向上を示し（ダブルＳＧＩ２／ＳＲＰ５４ノックアウト株をＣＬ−ＳＣＰＡアッセイで実行した二回とも、生産性は４０ｇ／ｍ２／日を超えた）、図１１に示すように、ＳＲＰ５４またはＳＧＩ２のいずれかの単一ノックアウトの平均改善よりも高かった。結果は、ＳＧＩ２とＳＲＰ５４の両方の遺伝子をノックアウトすると、生産性に相乗効果があるように見えることを示している。
【０２３９】
野生型ＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａＷＴ−１１８５株の光生理学的データ、ＳＲＰ５４およびＳＧＩ１遺伝子の単一ノックアウト、ならびにＰａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａにおけるＳＧＩ１およびＳＲＰ５４遺伝子のダブルノックアウトを有する３つの株を評価した。すべての測定値は、ＣＬ−ＳＣＰＡ培養物を使用して採取した。ＦＶ／ＦＭおよびσＰＳＩＩを得るために、蛍光誘導および緩和（ＦＩＲｅ）速度論の測定を暗黒下で行った。Ｆｖ／ＦＭおよびσＰＳＩＩについて提示した値は、６つの測定値の平均として計算し（２つの生物的反復のそれぞれの３つの測定値）、これらのパラメータの誤差は、５％を超えなかった。τ’Ｑａ（飽和光条件下で測定されたＰＳＩＩのアクセプター側の電子輸送時間−線形光合成電子輸送の最も遅い工程によって効果的に決定）は、ＦＩＲｅ光度曲線およびＤＩＲＫプロファイルから測定された。結果を以下の表８にまとめる。
【０２４０】
（表８）Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ株の光生理学
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【０２４１】
単一のＳＧＩ１またはＳＲＰ５４遺伝子ノックアウトと比較して、ＳＧＩ１／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト株のＰＳＩＩの機能的断面積が実質的に減少し、ならびに電子輸送の光飽和率が減少し、光合成の速度が向上していることを示している。機能的ＰＳＩＩ複合体の数もある程度増加している。ＳＲＰ５４またはＳＧＩ１のみの単一ノックアウトと比較して、ダブルノックアウト株では、光化学系ＩＩの光化学の最大量子収率（ＦＶ／ＦＭ）が改善されている。
【０２４２】
実施例１５
ＳＧＩ１／ＳＧＩ２、ＳＧＩ１／ＳＲＰ５４、およびＳＧＩ１／ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４ノックアウト変異体のマイクロ近似分析
ＳＧＩ１／ＳＧＩ２、ＳＧＩ１／ＳＲＰ５４、およびＳＧＩ１／ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４ノックアウト変異体の全体的なバイオマス組成を決定するために、４０％の毎日の希釈で半連続モードで成長させた培養物の試料の定量分析を行って、半連続培養における細胞の全有機炭素（ＴＯＣ）および脂質含有量を決定した。培養物が定常状態に達した後、毎日の希釈のために取り出した培養物のアリコートを、脂質、タンパク質、および炭水化物の分析に使用した。藻類培養物試料の全有機炭素（ＴＯＣ）は、２ｍＬの細胞培養物をＤＩ水で２０ｍＬの総量に希釈することによって決定した。全炭素（ＴＣ）および全無機炭素（ＴＩＣ）を測定するために、測定ごとに３回の注入を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＴＯＣ−Ｖｃｓｊアナライザーに注入した。燃焼炉を７２０℃に設定し、ＴＯＣを、ＴＣからＴＩＣを差し引いて求めた。４点の校正範囲は、非希釈培養の２０〜２０００ｐｐｍに相当する２ｐｐｍ〜２００ｐｐｍであった（相関係数：ｒ２＞０．９９９）。
【０２４３】
脂質含有量を測定するために、ＧｅｎｅＶａｃ  ＨＴ−４Ｘを使用して乾燥させた２ｍＬの試料に対してＦＡＭＥ分析を行った。乾燥したペレットに、以下を添加した：５００μＬの、メタノール中５００ｍＭのＫＯＨ；２００μＬの、０．０５％のブチル化ヒドロキシルトルエンを含有するテトラヒドロフラン；４０μＬの、２ｍｇ／ｍｌのＣ１１：０遊離脂肪酸／Ｃ１３：０トリグリセリド／Ｃ２３：０脂肪酸メチルエステル内部標準ミックス；および５００μＬのガラスビーズ（直径４２５〜６００μｍ）。バイアル瓶を、オープントップのＰＴＦＥセプタムで裏打ちされたキャップで蓋をし、ＳＰＥＸ  ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ内に、１．６５ｋｒｐｍで７．５分間置いた。次に、試料を８０℃で５分間加熱し、冷却した。誘導体化のために、５００μＬのメタノール中の１０％三フッ化ホウ素を試料に添加し、その後、８０℃で３０分間加熱した。チューブを冷却して、その後、２ｍＬのヘプタンと、５００μＬの５ＭのＮａＣｌとを添加した。次いで、試料を２ｋｒｐｍで５分間ボルテックスし、最後に１ｋｒｐｍで３分間遠心分離した。ヘプタン層を、Ｇｅｒｓｔｅｌ  ＭＰＳオートサンプラーを使用してサンプリングした。定量には、８０μｇのＣ２３：０  ＦＡＭＥ内部標準を使用した。
【０２４４】
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株（ＳＴＲ０００１０）、ＳＲＰ５４ノックアウト変異体（ＳＴＲ００６２５）、ＳＧＩ１ノックアウト変異体（ＳＴＲ２４１８３）、ＳＧＩ１／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体（ＳＴＲ２４５３８およびＳＴＲ２４５４０）の半連続領域ＴＯＣ生産性およびバッチＴＯＣを示すアッセイの結果を、それぞれ図１２Ａおよび１２Ｂに示す。ＳＲＰ５４ノックアウト変異体、ＳＧＩ１ノックアウト変異体、ＳＧＩ１／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体は、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株を超えるＴＯＣ生産性の増加を示した。
【０２４５】
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株（ＳＴＲ０００１０）、ＳＲＰ５４ノックアウト変異体（ＳＴＲ００６２５）、ＳＧＩ１ノックアウト変異体（ＳＴＲ０００１２）、ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体（ＳＴＲ００５１６）、およびＳＧＩ１／ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４トリプルノックアウト変異体（ＳＴＲ２５７６１およびＳＴＲ２５７６２）の半連続領域ＴＯＣ生産性およびバッチＴＯＣを示すアッセイの結果を、それぞれ図１３Ａおよび１３Ｂに示す。ＳＧＩ１ノックアウト変異体、ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体、ＳＧＩ１／ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４トリプルノックアウト変異体は、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株を超えるＴＯＣ生産性の増加を示した。
【０２４６】
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株（ＳＴＲ０００１０）、ＳＲＰ５４ノックアウト変異体（ＳＴＲ００６２５）、ＳＧＩ１ノックアウト変異体（ＳＴＲ２４１８３）、ＳＧＩ１／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体（ＳＴＲ２４５３８およびＳＴＲ２４５４０）のバッチＦＡＭＥ生産性アッセイの結果を、図１４に示す。ＳＧＩ１ノックアウト変異体およびＳＧＩ１／ＳＲＰ５４ノックアウト変異体は、Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株を超えるＦＡＭＥ生産性の増加を示した。
【０２４７】
Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ野生型株（ＳＴＲ０００１０）、ＳＧＩ１ノックアウト変異体（ＳＴＲ０００１２）、ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４ダブルノックアウト変異体（ＳＴＲ００５１６）、およびＳＧＩ１／ＳＧＩ２／ＳＲＰ５４トリプルノックアウト変異体（ＳＴＲ２５７６１およびＳＴＲ２５７６２）のバッチＦＡＭＥ生産性アッセイの結果を、図１５に示す。
【０２４８】
本出願内の見出しは、読者の便宜のためだけのものであり、本発明またはその実施形態の範囲を多少なりとも限定するものではない。
【０２４９】
本明細書で言及されたすべての刊行物および特許出願は、あたかも各刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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