(57)【要約】  本発明は、細菌メタゲノム分析を通してリンパ腫を診断する方法に関し、より具体的には、正常ヒトおよび被検者由来サンプルを利用して細菌メタゲノム分析を行って、特定細菌由来細胞外小胞の含量増減を分析することによって、リンパ腫を診断する方法などに関する。環境に存在する細菌から分泌される細胞外小胞は、体内に吸収されて癌の発生に直接的な影響を及ぼすことができ、リンパ腫は、症状が現れる前に早期診断が難しいため、効率的な治療が難しいのが現状である。これより、本発明による人体由来サンプルを利用した細菌由来細胞外小胞のメタゲノム分析を通してリンパ腫の発病の危険度をあらかじめ診断することによって、リンパ腫の危険群を早期に診断および予測して、適切な管理により発病時期を遅らせたり、発病を予防することができ、発病後にも早期診断することができるので、リンパ腫の発病率を低減し、治療効果を高めることができる。【選択図】図６
2021500021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む、リンパ腫の診断のための情報提供方法：
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
【請求項２】
前記段階（ｃ）でシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サーミ（Ｔｈｅｒｍｉ）、およびユリアーキオータ（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項３】
前記段階（ｃ）でデイノコッキ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、およびベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項４】
前記段階（ｃ）でデイノコッカレス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、リケッチアレス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、ストレプトフィタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）、オケアノスピリラレス（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、パステウレラレス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、およびナイセリアレス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項５】
前記段階（ｃ）でエリスロバクテラセエ（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ロドスピリルラセエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、デイノコッカセエ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ノカルジオイダセエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、オキサロバクテラセエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ラクトバシルラセエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ルミノコッカセエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ハロモナダセエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、マイクロコッカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、コリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアセエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラセエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、ブルクホルデリアセエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、アクチノミセタセエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ティシエレルラセエ（Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パステウレルラセエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、カルノバクテリアセエ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ナイセリアセエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、およびアルカニボラクサセエ（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項６】
前記段階（ｃ）でクプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アネロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペプトニフィラス（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、およびアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項７】
前記正常ヒトおよび被検者サンプルは、血液であることを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項８】
前記段階（ｃ）でシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サーミ（Ｔｈｅｒｍｉ）、およびユリアーキオータ（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッキ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、およびベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッカレス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、リケッチアレス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、ストレプトフィタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）、オケアノスピリラレス（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、パステウレラレス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、およびナイセリアレス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
エリスロバクテラセエ（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ロドスピリルラセエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、デイノコッカセエ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ノカルジオイダセエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、オキサロバクテラセエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ラクトバシルラセエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ルミノコッカセエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ハロモナダセエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、マイクロコッカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、コリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアセエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラセエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、ブルクホルデリアセエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、アクチノミセタセエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ティシエレルラセエ（Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パステウレルラセエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、カルノバクテリアセエ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ナイセリアセエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、およびアルカニボラクサセエ（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
クプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アネロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペプトニフィラス（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、およびアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項９】
前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
ベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
オケアノスピリラレス（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、パステウレラレス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、およびナイセリアレス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
マイクロコッカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、コリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアセエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラセエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、ブルクホルデリアセエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、アクチノミセタセエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ティシエレルラセエ（Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パステウレルラセエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、カルノバクテリアセエ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ナイセリアセエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、およびアルカニボラクサセエ（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アネロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペプトニフィラス（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、およびアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が増加している場合、リンパ腫と診断することを特徴とする請求項８に記載の情報提供方法。
【請求項１０】
前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サーミ（Ｔｈｅｒｍｉ）、およびユリアーキオータ（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッキ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ）およびクロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッカレス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、リケッチアレス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、ストレプトフィタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、およびリゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
エリスロバクテラセエ（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ロドスピリルラセエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、デイノコッカセエ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ノカルジオイダセエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、オキサロバクテラセエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ラクトバシルラセエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ルミノコッカセエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、およびハロモナダセエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
クプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が減少している場合、リンパ腫と診断することを特徴とする請求項８に記載の情報提供方法。
【請求項１１】
下記の段階を含む、リンパ腫の診断方法：
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
【請求項１２】
前記段階（ｃ）でシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サーミ（Ｔｈｅｒｍｉ）、およびユリアーキオータ（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１１に記載の診断方法。
【請求項１３】
前記段階（ｃ）でデイノコッキ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、およびベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１１に記載の診断方法。
【請求項１４】
前記段階（ｃ）でデイノコッカレス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、リケッチアレス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、ストレプトフィタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）、オケアノスピリラレス（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、パステウレラレス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、およびナイセリアレス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１１に記載の診断方法。
【請求項１５】
前記段階（ｃ）でエリスロバクテラセエ（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ロドスピリルラセエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、デイノコッカセエ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ノカルジオイダセエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、オキサロバクテラセエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ラクトバシルラセエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ルミノコッカセエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ハロモナダセエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、マイクロコッカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、コリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアセエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラセエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、ブルクホルデリアセエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、アクチノミセタセエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ティシエレルラセエ（Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パステウレルラセエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、カルノバクテリアセエ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ナイセリアセエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、およびアルカニボラクサセエ（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１１に記載の診断方法。
【請求項１６】
前記段階（ｃ）でクプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アネロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペプトニフィラス（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、およびアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１１に記載の診断方法。
【請求項１７】
前記正常ヒトおよび被検者サンプルは、血液であることを特徴とする請求項１１に記載の診断方法。
【請求項１８】
前記段階（ｃ）でシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サーミ（Ｔｈｅｒｍｉ）、およびユリアーキオータ（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッキ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、およびベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッカレス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、リケッチアレス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、ストレプトフィタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）、オケアノスピリラレス（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、パステウレラレス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、およびナイセリアレス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
エリスロバクテラセエ（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ロドスピリルラセエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、デイノコッカセエ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ノカルジオイダセエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、オキサロバクテラセエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ラクトバシルラセエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ルミノコッカセエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ハロモナダセエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、マイクロコッカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、コリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアセエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラセエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、ブルクホルデリアセエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、アクチノミセタセエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ティシエレルラセエ（Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パステウレルラセエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、カルノバクテリアセエ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ナイセリアセエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、およびアルカニボラクサセエ（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
クプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アネロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペプトニフィラス（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、およびアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１１に記載の診断方法。
【請求項１９】
前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
ベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
オケアノスピリラレス（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、パステウレラレス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、およびナイセリアレス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
マイクロコッカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、コリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアセエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラセエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、ブルクホルデリアセエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、アクチノミセタセエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ティシエレルラセエ（Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パステウレルラセエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、カルノバクテリアセエ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ナイセリアセエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、およびアルカニボラクサセエ（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アネロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペプトニフィラス（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、およびアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が増加している場合、リンパ腫と診断することを特徴とする請求項１８に記載の診断方法。
【請求項２０】
前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サーミ（Ｔｈｅｒｍｉ）、およびユリアーキオータ（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッキ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ）およびクロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッカレス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、リケッチアレス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、ストレプトフィタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、およびリゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
エリスロバクテラセエ（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ロドスピリルラセエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、デイノコッカセエ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ノカルジオイダセエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、オキサロバクテラセエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ラクトバシルラセエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ルミノコッカセエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、およびハロモナダセエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
クプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が減少している場合、リンパ腫と診断することを特徴とする請求項１８に記載の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌メタゲノム分析を通してリンパ腫を診断する方法に関し、より具体的には、正常ヒトおよび被検者由来サンプルを利用して細菌メタゲノム分析を行って、特定細菌由来細胞外小胞の含量増減を分析することによって、リンパ腫を診断する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ腫は、リンパ系細胞に由来する血液癌の一種であって、主にリンパ節（Ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）に由来するが、リンパ関連組織であれば、どこでも発生しうる。代表的な症状としては、リンパ節腫大、夜間発汗、熱、体重減少、 疲労感などがある。大きくなったリンパ節は、痛みがないが、これを通じて感染によるリンパ節腫大と区分される。基本的に血液癌であるので、手術的治療は、あまり期待することができず、代わりに抗癌化学療法や放射線治療などがよく効く。２０１１年に発表された韓国中央癌登録本部の資料によれば、２００９年に韓国では、年平均１９２，５６１件の癌が発生したが、そのうち悪性リンパ腫は、男女を合わせて年平均４，０９３件であって、全体癌発生の２．１３％を占めた。男女の発生件数は、男性が年平均２，３１３件、女性が年平均１，７８０件であった。男女を合わせてみた年齢帯別には、６０代が２２．１％と最も多く、５０代と７０代が１９．３％、４０代が１５．４％の順である。
【０００３】
リンパ腫の危険要因として感染や非正常免疫調節がリンパ腫発生の原因の一つであると知られている。ＨＴＬＶ−１感染、後天性免疫欠乏ウイルスと関連したリンパ腫、慢性Ｃ型肝炎関連リンパ腫、ＥＢウイルスと関連したバーキットリンパ腫とＮＫ／Ｔリンパ腫、ヘリコバクター菌と関連したリンパ腫などが感染と関連があると知られている。また、免疫が低下した状態でもリンパ腫が発生し得、臓器移植、後天免疫欠乏症、先天免疫欠乏症候群、自己免疫疾患などで発生頻度が増加すると知られている。リンパ腫の診断は、一般的にリンパ節生検で診断することができ、病理組織を得ると、基本的な染色と一緒に免疫組織化学染色を施行して、種類を区分する。他の臓器の関与の有無は、ＰＥＴ−ＣＴなどを用いて知ることができる。
【０００４】
一方、人体に共生する微生物は、１００兆に達してヒト細胞より１０倍多く、微生物の遺伝子数は、ヒト遺伝子数の１００倍を超えると知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）は、与えられた居住地に存在する細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言い、腸内微生物叢は、ヒトの生理現象に重要な役割をし、人体細胞と相互作用を通じてヒトの健康と疾病に大きな影響を及ぼすものと知られている。人体に共生する細菌は、他の細胞への遺伝子、タンパク質、低分子化合物などの情報を交換するために、ナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成して、粘膜に共生する細菌である場合には、粘膜を通過しないが、細菌由来小胞は、サイズが略１００ナノメートルサイズ以下であるので、比較的自由に粘膜を通過して人体に吸収される。
【０００５】
環境ゲノミクスとも呼ばれるメタゲノム学は、環境で採取したサンプルから得られたメタゲノム資料に対する分析学と言える（韓国特許公開第２０１１−００７３０４９号）。最近、１６ｓリボソームＲＮＡ（１６ｓ  ｒＲＮＡ）塩基配列を基盤とした方法でヒトの微生物叢の細菌構成をリスト化することが可能になり、１６ｓリボソームＲＮＡの遺伝子である１６ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を次世代塩基配列分析（ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）プラットフォームを利用して分析する。しかしながら、まだリンパ腫の発病において、血液または尿などの人体由来物から細菌由来小胞に存在するメタゲノム分析を通してリンパ腫の原因因子を同定し、リンパ腫を予測したりあるいは診断する方法については報告されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、リンパ腫の原因因子および発病危険度をあらかじめ診断するために、正常ヒトおよび被検者由来サンプルである血液に存在する細菌由来細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム分析を行い、その結果、リンパ腫の原因因子として作用できる細菌由来細胞外小胞を同定したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【０００７】
これより、本発明は、細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム分析を通してリンパ腫を診断するための情報提供方法、リンパ腫の診断方法、およびリンパ腫の発病危険度の予測方法などを提供することを目的とする。
【０００８】
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されてない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記の段階を含む、リンパ腫診断のための情報提供方法を提供する。
【００１０】
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う段階；および（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
【００１１】
また、本発明は、下記の段階を含む、リンパ腫の診断方法を提供する。
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う段階；および（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
【００１２】
また、本発明は、下記の段階を含む、リンパ腫の発病危険度の予測方法を提供する。
（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および（ｃ）前記ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
【００１３】
本発明の具現例において、前記段階（ｃ）でシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サーミ（Ｔｈｅｒｍｉ）、およびユリアーキオータ（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して、リンパ腫を診断するものでありうる。
【００１４】
本発明の一具現例において、前記正常ヒトおよび被検者サンプルは、血液でありうる。
【００１５】
本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）でデイノコッキ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、およびベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して、リンパ腫を診断するものでありうる。
【００１６】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でデイノコッカレス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、リケッチアレス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、ストレプトフィタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）、オケアノスピリラレス（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、パステウレラレス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、およびナイセリアレス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して、リンパ腫を診断するものでありうる。
【００１７】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でエリスロバクテラセエ（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ロドスピリルラセエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、デイノコッカセエ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ノカルジオイダセエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、オキサロバクテラセエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ラクトバシルラセエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ルミノコッカセエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ハロモナダセエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、マイクロコッカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、コリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアセエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラセエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、ブルクホルデリアセエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、アクチノミセタセエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ティシエレルラセエ（Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パステウレルラセエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、カルノバクテリアセエ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ナイセリアセエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、およびアルカニボラクサセエ（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して、リンパ腫を診断するものでありうる。
【００１８】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でクプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アネロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペプトニフィラス（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、およびアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較して、リンパ腫を診断するものでありうる。
【００１９】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）でシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サーミ（Ｔｈｅｒｍｉ）、およびユリアーキオータ（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッキ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、およびベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッカレス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、リケッチアレス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、ストレプトフィタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）、オケアノスピリラレス（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、パステウレラレス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、およびナイセリアレス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
エリスロバクテラセエ（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ロドスピリルラセエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、デイノコッカセエ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ノカルジオイダセエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、オキサロバクテラセエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ラクトバシルラセエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ルミノコッカセエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ハロモナダセエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、マイクロコッカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、コリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアセエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラセエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、ブルクホルデリアセエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、アクチノミセタセエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ティシエレルラセエ（Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パステウレルラセエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、カルノバクテリアセエ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ナイセリアセエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、およびアルカニボラクサセエ（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
クプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アネロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペプトニフィラス（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、およびアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較するものでありうる。
【００２０】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
ベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
オケアノスピリラレス（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、パステウレラレス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、およびナイセリアレス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
マイクロコッカセアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、コリネバクテリアセエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアセエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラセエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、ブルクホルデリアセエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、アクチノミセタセエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ティシエレルラセエ（Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ）、パステウレルラセエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、カルノバクテリアセエ（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ナイセリアセエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、およびアルカニボラクサセエ（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アネロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペプトニフィラス（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、カプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）、グラニュリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、およびアルカニボラックス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が増加している場合、リンパ腫と診断することができる。
【００２１】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｃ）で、正常ヒト由来サンプルと比較して、
シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、サーミ（Ｔｈｅｒｍｉ）、およびユリアーキオータ（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッキ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ）およびクロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
デイノコッカレス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、リケッチアレス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、ストレプトフィタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、およびリゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
エリスロバクテラセエ（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ロドスピリルラセエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、デイノコッカセエ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ノカルジオイダセエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、オキサロバクテラセエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ラクトバシルラセエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ルミノコッカセエ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、およびハロモナダセエ（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
クプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量が減少している場合、リンパ腫と診断することができる。
【００２２】
本発明のさらに他の具現例において、前記血液は、全血、血清、血しょう、または、血液単核球でありうる。
【発明の効果】
【００２３】
環境に存在する細菌から分泌される細胞外小胞は、体内に吸収されて癌の発生に直接的な影響を及ぼすことができ、リンパ腫は、症状が現れる前に早期診断が難しいため、効率的な治療が難しいのが現状である。これより、本発明による人体由来サンプルを利用した細菌由来細胞外小胞のメタゲノム分析を通してリンパ腫の原因因子および発病の危険度をあらかじめ診断することによって、リンパ腫の危険群を早期に診断して適切な管理により発病時期を遅らせたり、発病を予防することができる。これに加えて、発病後にも早期診断することができるので、リンパ腫の発病率を低減し、治療効果を高めることができると共に、リンパ腫と診断された患者においてメタゲノム分析を通して原因因子を診断して露出を避けることによって、疾病の経過を良くしたり、再発を防止することかできる長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１ａは、マウスに腸内細菌と細菌由来小胞（ＥＶ）を口腔で投与した後、時間別に細菌と小胞の分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、口腔で投与した後１２時間目に、血液および様々な臓器を摘出して、細菌と小胞の体内分布様相を評価した図である。
【図２】図２は、リンパ腫患者および正常ヒト血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
【図３】図３は、リンパ腫患者および正常ヒト血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、綱（ｃｌａｓｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
【図４】図４は、リンパ腫患者および正常ヒト血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、目（ｏｒｄｅｒ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
【図５】図５は、リンパ腫患者および正常ヒト血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
【図６】図６は、リンパ腫患者および正常ヒト血液から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、属（ｇｅｎｕｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、細菌メタゲノム分析を通してリンパ腫を診断する方法に関し、本発明者らは、正常ヒトおよび被検者由来サンプルを利用して細菌由来細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム分析を行い、リンパ腫の原因因子として作用できる細菌由来細胞外小胞を同定した。
【００２６】
これより、本発明は、（ａ）正常ヒトおよび被検者サンプルに存在する細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来サンプルと細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を含むリンパ腫を診断するための情報提供方法を提供する。
【００２７】
本発明において使用される用語「リンパ腫診断」とは、患者に対してリンパ腫が発病する可能性があるか、リンパ腫が発病する可能性が相対的に高いか、または、リンパ腫がすでに発病したか否かを判別することを意味する。本発明の方法は、任意の特定患者に対するリンパ腫の発病危険度が高い患者にとって特別かつ適切な管理を通じて発病時期を遅らせたり発病しないようにするのに使用することができる。また、本発明の方法は、リンパ腫を早期に診断して、最も適切な治療方式を選択することによって、治療を決定するために臨床的に使用することができる。
【００２８】
本発明において使用される用語「メタゲノム（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）」とは、「群遺伝体」とも言い、土、動物の腸など孤立した地域内のすべてのウイルス、細菌、かびなどを含む遺伝体の総和を意味するものであって、主に培養にならない微生物を分析するために、配列分析器を使用して一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝体の概念に使用される。特に、メタゲノムは、一種のゲノムまたは遺伝体をいうものではなく、一つの環境単位のすべての種の遺伝体であって、一種の混合遺伝体をいう。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で一つの種を定義するとき、機能的に既存の一つの種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から出た用語である。技術的には、速い塩基配列分析法を利用して、種に関係なく、すべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、一つの環境内でのすべての種を同定し、相互作用、代謝作用を糾明する技法の対象である。本発明では、好ましくは血清から分離した細菌由来細胞外小胞を利用してメタゲノム分析を実施した。
【００２９】
本発明において、前記正常ヒトおよび被検者サンプルは、血液または尿であり得、前記血液は、好ましくは全血、血清、血しょう、または血液単核球でありうるが、これに制限されるものではない。
【００３０】
本発明の実施例では、前記細菌由来細胞外小胞に対するメタゲノム分析を実施し、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、および属（ｇｅｎｕｓ）レベルでそれぞれ分析して、実際にリンパ腫発生の原因として作用できる細菌由来小胞を同定した。
【００３１】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，ＴｈｅｒｍｉおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ門細菌由来細胞外小胞の含量がリンパ腫患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【００３２】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ，ＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔおよびＢｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ綱細菌由来細胞外小胞の含量がリンパ腫患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【００３３】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ，Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ，Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ，ＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ目細菌由来細胞外小胞の含量がリンパ腫患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【００３４】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ，Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ，Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ，Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ，Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，ＮｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅおよびＡｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ科細菌由来細胞外小胞の含量がリンパ腫患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【００３５】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ，Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ，Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ，Ｒｏｔｈｉａ，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ，Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ，Ｌａｕｔｒｏｐｉａ，Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ，Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，ＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓおよびＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ属細菌由来細胞外小胞の含量がリンパ腫患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【００３６】
前記実施例の結果を通じて前記同定された細菌由来細胞外小胞の分布変数がリンパ腫の発生の予測に有用に利用され得ることを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
［実施例］
実施例１．腸内細菌および細菌由来小胞の体内吸収、分布、および排泄様相の分析
腸内細菌と細菌由来小胞が胃腸管を介して全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管で投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウス全体イメージを観察した結果、図１ａに示されたように、前記細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）である場合には、全身的に吸収されないが、細菌由来小胞（ＥＶ）である場合には、投与後５分に全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった。
【００３９】
腸内細菌と腸内細菌由来小胞が全身的に吸収された後、様々な臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来小胞を前記の方法のように投与した後、１２時間目にマウスから血液（Ｂｌｏｏｄ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、肺（Ｌｕｎｇ）、肝（Ｌｉｖｅｒ）、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、脂肪組織（Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ）、および筋肉（Ｍｕｓｃｌｅ）を摘出した。前記摘出した組織で蛍光を観察した結果、図１ｂに示されたように、前記腸内細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）は、各臓器に吸収されていない反面、前記腸内細菌由来細胞外小胞（ＥＶ）は、血液、心臓、肺、肝、腎臓、脾臓、脂肪組織、および筋肉に分布することを確認した。
【００４０】
実施例２．血液から細胞外小胞の分離およびＤＮＡ抽出
血液に存在する小胞を分離し、ＤＮＡを抽出するために、まず、１０ｍｌチューブに血液を入れ、遠心分離（３，５００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を実施して浮遊物を沈めて上澄み液だけを回収した後、新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍフィルターを使用して前記回収した上澄み液から細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ  ５０ｋＤ）に移し、１，５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質は捨て、１０ｍｌまで濃縮させた。再び０．２２μｍフィルターを使用してバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ  ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を使用して上澄み液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かして小胞を収得した。
【００４１】
前記方法により血液から分離した小胞１００μｌを１００℃で沸かして、内部のＤＮＡを脂質外に出るようにした後、氷に５分間冷ました。次に、残った浮遊物を除去するために、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄み液だけを集めた後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを利用してＤＮＡ量を定量した。以後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６ｓ  ｒＤＮＡ  ｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行って、前記抽出された遺伝子に細菌由来遺伝子が存在することを確認した。
【００４２】
【表１】
2021500021.tif 000003
【００４３】
実施例３．血液から抽出したＤＮＡを利用したメタゲノム分析
前記実施例２の方法で遺伝子を抽出した後、前記表１に示した１６Ｓ  ｒＤＮＡプライマーを使用してＰＣＲを実施して遺伝子を増幅させ、シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を行った。結果をＳｔａｎｄａｒｄ  Ｆｌｏｗｇｒａｍ  Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力し、ＧＳ  ＦＬＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を利用してＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ  ｃａｌｌ  ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ  ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。質が低い部分を除去した後、リードの長さが３００ｂｐｓ以上であるものだけを利用し（Ｓｉｃｋｌｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３３）、結果分析のために、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）は、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを利用してシークエンス類似度によりクラスタリングを行った。具体的に、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％シークエンス類似度を基準としてクラスタリングを行い、各ＯＴＵの門、綱、目、科、属レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ  ＤＮＡシークエンスデータベース（１０８，４５３シークエンス）を利用して９７％以上のシークエンス類似度を有するバクテリアを分析した（ＱＩＩＭＥ）。
【００４４】
実施例４．血液から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤リンパ腫の診断模型
前記実施例３の方法で、リンパ腫患者６３人と年齢と性別をマッチングした正常ヒト５３人の血液から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ−ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
【００４５】
血液内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，ＴｈｅｒｍｉおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ門細菌バイオマーカーにて診断模型を開発したとき、リンパ腫に対する診断的性能が有意に現れた（表２および図２参照）。
【００４６】
【表２】
2021500021.tif 000004
【００４７】
血液内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ，ＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔおよびＢｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ綱細菌バイオマーカーにて診断模型を開発したとき、リンパ腫に対する診断的性能が有意に現れた（表３および図３参照）。
【００４８】
【表３】
2021500021.tif 000005
【００４９】
血液内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ，Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ，Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ，ＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ目細菌バイオマーカーにて診断模型を開発したとき、リンパ腫に対する診断的性能が有意に現れた（表４および図４参照）。
【００５０】
【表４】
2021500021.tif 000006
【００５１】
血液内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ，Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ，Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ，Ｔｉｓｓｉｅｒｅｌｌａｃｅａｅ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ，Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，ＮｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅおよびＡｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ科細菌バイオマーカーにて診断模型を開発したとき、リンパ腫に対する診断的性能が有意に現れた（表５および図５参照）。
【００５２】
【表５】
2021500021.tif 000007
【００５３】
血液内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ，Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ，Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ，Ｒｏｔｈｉａ，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ，Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ，Ｌａｕｔｒｏｐｉａ，Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ，Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，ＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓおよびＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ属細菌バイオマーカーにて診断模型を開発したとき、リンパ腫に対する診断的性能が有意に現れた（表６および図６参照）。
【００５４】
【表６】
2021500021.tif 000008
【００５５】
上記に記述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明による細菌メタゲノム分析を通してリンパ腫の診断に関する情報を提供する方法は、正常ヒトおよび被検者由来サンプルを利用して細菌メタゲノム分析を行って、特定細菌由来細胞外小胞の含量増減を分析することによって、リンパ腫の発病危険度を予測し、リンパ腫を診断するのに利用することができる。
【図１ａ】
2021500021.tif 000009
【図１ｂ】
2021500021.tif 000010
【図２】
2021500021.tif 000011
【図３】
2021500021.tif 000012
【図４】
2021500021.tif 000013
【図５】
2021500021.tif 000014
【図６】
2021500021.tif 000015
【配列表】
2021500021000001.app
【国際調査報告】
2021500021.tif 000016
2021500021.tif 000017
2021500021.tif 000018
2021500021.tif 000019
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