(57)【要約】  溶液中の、多重の予め選択された核酸標的分子の中から少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法において使用するための、室温保存可能な電気泳動アレイであって、該電気泳動アレイは、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジットを含み、該多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジットの各々は、ローリングサークル増幅の実行と、多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つの結合に適する物質を含んでおり、ミクロゲルデポジットの各々は、その中に予めアンカーされた少なくとも以下の要素、即ち、多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つに特異的なRCAプローブ及び少なくとも1つのプライマー、を含む。【選択図】図1A
2021509278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中の、多重の予め選択された核酸標的分子の中から少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法において使用するための、室温保存可能な電気泳動アレイであって、
多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジットを含み、前記多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジットの各々は、ローリングサークル増幅の実行と、前記多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つの結合に適する物質を含み、前記ミクロゲルデポジットの各々は、その中に予めアンカーされた少なくとも以下の要素、即ち、
前記多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つに特異的なRCAプローブ、及び
少なくとも1つのプライマー
を含むことを特徴とする、電気泳動アレイ。
【請求項２】
前記ミクロゲルデポジットは脱水されているが、少なくとも1つの核酸標的分子を含む溶液に暴露すると再水和できる、請求項1に記載の電気泳動アレイ。
【請求項３】
前記少なくとも1つのプライマーは、少なくとも1つのフォワードプライマーと、少なくとも1つのリバースプライマーを含む、請求項1または2に記載の電気泳動アレイ。
【請求項４】
前記RCAプローブは、前記少なくとも1つのプライマーに予めハイブリダイズされている、請求項1〜3のいずれかに記載の電気泳動アレイ。
【請求項５】
前記ミクロゲルデポジットの各々は、水和時に概して半球形の構成を有する、請求項1〜4のいずれかに記載の電気泳動アレイ。
【請求項６】
前記多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジットは、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域を規定し、かつ、
前記電気泳動アレイは、以下の方法の実施に利用され、前記以下の方法は、
前記多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の各々に前記溶液を導入することと、
前記多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の各々において、前記ローリングサークル増幅の様々な段階中にそこに電場を印加しつつ、少なくとも概して同時にローリングサークル増幅を実行することと、
前記多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つを前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の対応するものの少なくとも1つにおいて検出することを含む方法であって、
ここで、前記検出することは、前記導入することの短時間の間に起こるものであり、前記短時間は、30分未満である
請求項1〜5のいずれかに記載の電気泳動アレイ。
【請求項７】
前記検出することは、光検出を含む、請求項6に記載の電気泳動アレイ。
【請求項８】
前記検出することは、蛍光検出を含む、請求項6に記載の電気泳動アレイ。
【請求項９】
前記そこに電場を印加することは、前記ローリングサークル増幅における、少なくとも2つの異なる段階中に起こる、請求項6〜8のいずれかに記載の電気泳動アレイ。
【請求項１０】
前記電場は、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の各々において、少なくとも概して同じである、請求項6〜9のいずれかに記載の電気泳動アレイ。
【請求項１１】
前記検出することは、20分未満の持続時間内に起こる、請求項6〜10のいずれかに記載の電気泳動アレイ。
【請求項１２】
前記検出することは、15分未満の持続時間内に起こる、請求項6〜11のいずれかに記載の電気泳動アレイ。
【請求項１３】
前記ローリングサークル増幅中に前記電場を印加することは、以下の少なくとも1つ、即ち、
前記溶液中の核酸標的分子を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記溶液中の核酸標的分子-RCAプローブのハイブリッド産物を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットから離れてしまったRCAアンプリコンを再捕捉するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAプローブを前記ミクロゲルデポジット内に移動させて既に前記ミクロゲルデポジットに結合している捕捉プローブ及びプライマーの少なくとも1つとハイブリダイズさせるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域から望ましくない分子を除去するために、前記ミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを延長するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを圧縮するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンの近傍でRCA試薬を攪拌するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAにおける酵素活性の速度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAアンプリコンの前記ミクロゲルデポジットへの結合の強度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に連続して極性を反転させる電場を印加すること
を含む、請求項6〜12のいずれかに記載の電気泳動アレイ。
【請求項１４】
前記ローリングサークル増幅中に前記電場を印加することは、以下の少なくとも2つ、即ち、
前記溶液中の核酸標的分子を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記溶液中の核酸標的分子-RCAプローブのハイブリッド産物を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットから離れてしまったRCAアンプリコンを再捕捉するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAプローブを前記ミクロゲルデポジット内に移動させて既に前記ミクロゲルデポジットに結合している捕捉プローブ及びプライマーの少なくとも1つとハイブリダイズさせるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域から望ましくない分子を除去するために、前記ミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを延長するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを圧縮するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンの近傍でRCA試薬を攪拌するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAにおける酵素活性の速度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAアンプリコンの前記ミクロゲルデポジットへの結合の強度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に連続して極性を反転させる電場を印加すること
を含む、請求項6〜13のいずれかに記載の電気泳動アレイ。
【請求項１５】
前記ローリングサークル増幅中に前記電場を印加することは、以下の少なくとも3つ、即ち、
前記溶液中の核酸標的分子を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記溶液中の核酸標的分子-RCAプローブのハイブリッド産物を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットから離れてしまったRCAアンプリコンを再捕捉するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAプローブを前記ミクロゲルデポジット内に移動させて既に前記ミクロゲルデポジットに結合している捕捉プローブ及びプライマーの少なくとも1つとハイブリダイズさせるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域から望ましくない分子を除去するために、前記ミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを延長するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを圧縮するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンの近傍でRCA試薬を攪拌するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAにおける酵素活性の速度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAアンプリコンの前記ミクロゲルデポジットへの結合の強度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に連続して極性を反転させる電場を印加すること
を含む、請求項6〜14のいずれかに記載の電気泳動アレイ。
【請求項１６】
前記ローリングサークル増幅中に前記電場を印加することは、以下の少なくとも4つ、即ち、
前記溶液中の核酸標的分子を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記溶液中の核酸標的分子-RCAプローブのハイブリッド産物を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットから離れてしまったRCAアンプリコンを再捕捉するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAプローブを前記ミクロゲルデポジット内に移動させて既に前記ミクロゲルデポジットに結合している捕捉プローブ及びプライマーの少なくとも1つとハイブリダイズさせるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域から望ましくない分子を除去するために、前記ミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを延長するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを圧縮するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンの近傍でRCA試薬を攪拌するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAにおける酵素活性の速度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAアンプリコンの前記ミクロゲルデポジットへの結合の強度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に連続して極性を反転させる電場を印加すること
を含む、請求項6〜15のいずれかに記載の電気泳動アレイ。
【請求項１７】
溶液中の、多重の予め選択された核酸標的分子の中から少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法であって、前記方法は、
電気泳動アレイ上の、少なくとも多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に前記溶液を導入することを含むものであって、前記多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の各々は、前記多重の予め選択された核酸標的分子のうち異なるものの結合とローリングサークル増幅の実行に適する物質を含むミクロゲルデポジットを含み、及び、前記方法は、
前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域において、前記ローリングサークル増幅の様々な段階中にそこに電場を印加しつつ、少なくとも概して同時にローリングサークル増幅を行うことと、
前記多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つの存在を前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の対応するものの少なくとも1つにおいて検出することを含み、
ここで、前記検出することは、前記導入することの短時間の間に起こり、前記短時間は30分未満である、少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項１８】
前記検出することは、光検出を含む、請求項17に記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項１９】
前記検出することは、蛍光検出を含む、請求項17に記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項２０】
前記そこに電場を印加することは、前記ローリングサークル増幅における少なくとも2つの異なる段階中に起こる、請求項17〜19のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項２１】
前記電場は、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の各々において、少なくとも概して同じである、請求項17〜20のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項２２】
前記検出することは、20分未満の持続時間内に起こる、請求項17〜21のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項２３】
前記検出することは、15分未満の持続時間内に起こる、請求項17〜22のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項２４】
前記ローリングサークル増幅中に前記電場を印加することは、以下の少なくとも1つ、即ち、
前記溶液中の核酸標的分子を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記溶液中の核酸標的分子-RCAプローブのハイブリッド産物を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットから離れてしまったRCAアンプリコンを再捕捉するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAプローブを前記ミクロゲルデポジット内に移動させて既に前記ミクロゲルデポジットに結合している捕捉プローブ及びプライマーの少なくとも1つとハイブリダイズさせるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域から望ましくない分子を除去するために、前記ミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを延長するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを圧縮するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンの近傍でRCA試薬を攪拌するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAにおける酵素活性の速度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAアンプリコンの前記ミクロゲルデポジットへの結合の強度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に連続して極性を反転させる電場を印加すること
を含む、請求項17〜23のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項２５】
前記ローリングサークル増幅中に前記電場を印加することは、以下の少なくとも2つ、即ち、
前記溶液中の核酸標的分子を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記溶液中の核酸標的分子-RCAプローブのハイブリッド産物を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットから離れてしまったRCAアンプリコンを再捕捉するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAプローブを前記ミクロゲルデポジット内に移動させて既に前記ミクロゲルデポジットに結合している捕捉プローブ及びプライマーの少なくとも1つとハイブリダイズさせるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域から望ましくない分子を除去するために、前記ミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを延長するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを圧縮するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンの近傍でRCA試薬を攪拌するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAにおける酵素活性の速度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAアンプリコンの前記ミクロゲルデポジットへの結合の強度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に連続して極性を反転させる電場を印加すること
を含む、請求項17〜24のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項２６】
前記ローリングサークル増幅中に前記電場を印加することは、以下の少なくとも3つ、即ち、
前記溶液中の核酸標的分子を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記溶液中の核酸標的分子-RCAプローブのハイブリッド産物を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットから離れてしまったRCAアンプリコンを再捕捉するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAプローブを前記ミクロゲルデポジット内に移動させて既に前記ミクロゲルデポジットに結合している捕捉プローブ及びプライマーの少なくとも1つとハイブリダイズさせるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域から望ましくない分子を除去するために、前記ミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを延長するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを圧縮するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンの近傍でRCA試薬を攪拌するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAにおける酵素活性の速度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAアンプリコンの前記ミクロゲルデポジットへの結合の強度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に連続して極性を反転させる電場を印加すること
を含む、請求項17〜25のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項２７】
前記ローリングサークル増幅中に前記電場を印加することは、以下の少なくとも4つ、即ち、
前記溶液中の核酸標的分子を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記溶液中の核酸標的分子-RCAプローブのハイブリッド産物を前記ミクロゲルデポジットの方に移動させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットから離れてしまったRCAアンプリコンを再捕捉するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAプローブを前記ミクロゲルデポジット内に移動させて既に前記ミクロゲルデポジットに結合している捕捉プローブ及びプライマーの少なくとも1つとハイブリダイズさせるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域から望ましくない分子を除去するために、前記ミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを延長するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを圧縮するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
前記ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンの近傍でRCA試薬を攪拌するために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAにおける酵素活性の速度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、
RCAアンプリコンの前記ミクロゲルデポジットへの結合の強度を向上させるために、前記不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に連続して極性を反転させる電場を印加すること
を含む、請求項17〜26のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項２８】
前記電気泳動アレイは、室温保存可能な電気泳動アレイを含む、請求項17〜27のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項２９】
前記電気泳動アレイは、
多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジットを含み、前記多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジットの各々は、ローリングサークル増幅の実行と、前記多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つの結合に適する物質を含み、
前記ミクロゲルデポジットの各々は、その中に予めアンカーされた少なくとも以下の要素、即ち、
前記多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つに特異的なRCAプローブ、及び
少なくとも1つのプライマー
を含む、請求項17〜28のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項３０】
前記ミクロゲルデポジットは脱水されているが、少なくとも1つの核酸標的分子を含む溶液に暴露すると再水和できる、請求項29に記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項３１】
前記少なくとも1つのプライマーは、少なくとも1つのフォワードプライマーと、少なくとも1つのリバースプライマーを含む、請求項29または30に記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項３２】
前記RCAプローブは、前記少なくとも1つのプライマーに予めハイブリダイズされている、請求項29〜31のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【請求項３３】
前記ミクロゲルデポジットの各々は、水和時に概して半球形の構成を有する、請求項29〜32のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
本願の主題に関連すると考えられる2018年7月5日付公開の国際公開第WO2018/122856号、2018年7月5日付公開の国際公開第WO2018/122852号及び2018年7月4日付出願の国際特許出願第PCT/IL2018/050726号を本願において参照し、参照することによりその開示が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
また、2017年12月28日付出願の米国仮特許出願第62/610,997号も参照し、参照することによりその開示が本明細書に組み込まれ、また、これに基づき本願の優先権を主張する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般的にローリングサークル増幅に関する。
【０００４】
発明の概要
本発明は、ローリングサークル増幅（RCA）の改良された方法を提供することを目的とする。
【０００５】
したがって、本発明の好ましい実施態様に従えば、溶液中の、多重（multiplicity）の予め選択された核酸標的分子の中から、少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法において使用するための室温保存可能な電気泳動アレイが提供され、該室温保存可能な電気泳動アレイは、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジット（deposit(s)）を含み、これら多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジットの各々は、ローリングサークル増幅の実行と、多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つの結合に適する物質を含んでおり、ミクロゲルデポジットの各々は、その中に予めアンカーされた少なくとも以下の要素、即ち、多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つに特異的なRCAプローブ及び少なくとも1つのプライマー、を含む。
【０００６】
好ましくは、ミクロゲルデポジットは脱水されているが、少なくとも1つの核酸標的分子を含む溶液に暴露すると再水和できる。追加的にまたは代替的に、少なくとも1つのプライマーは、少なくとも1つのフォワードプライマーと、少なくとも1つのリバースプライマーを含む。
【０００７】
本発明の好ましい実施態様に従えば、RCAプローブは、少なくとも1つのプライマーに予めハイブリダイズされている。
【０００８】
本発明の好ましい実施態様に従えば、ミクロゲルデポジットの各々は、水和時に概して半球形の構成を有する。
【０００９】
本発明の好ましい実施態様に従えば、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジットは、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域を規定し、また、電気泳動アレイは、以下の方法、即ち、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の各々に溶液を導入することと、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の各々において、ローリングサークル増幅の様々な段階中にそこに電場を印加しつつ、少なくとも概して同時にローリングサークル増幅を実行することと、多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つの存在を、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の対応するものの少なくとも1つにおいて検出することを含む方法であって、ここで、検出することは、上記導入することの短時間の間に起こり、この短時間は30分未満である、方法の実施に利用される。
【００１０】
また、本発明の他の好ましい実施態様に従えば、溶液中の、多重の予め選択された核酸標的分子の中から少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法が提供され、該方法は、電気泳動アレイ上の、少なくとも多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に溶液を導入することを含むものであって、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の各々は、多重の予め選択された核酸標的分子のうち異なるものの結合とローリングサークル増幅の実行に適する物質を含むミクロゲルデポジットを含み、及び、該方法は、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域において、ローリングサークル増幅の様々な段階中にそこに電場を印加しつつ、少なくとも概して同時にローリングサークル増幅を行うことと、多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つの存在を、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の対応するものの少なくとも1つにおいて検出することを含み、ここで、検出することは、上記導入することの短時間の間に起こり、この短時間は30分未満である。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様に従えば、検出することは、光検出を含む。好ましくは、検出することは、蛍光検出を含む。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様に従えば、そこに電場を印加することは、ローリングサークル増幅における、少なくとも2つの異なる段階中に起こる。
【００１３】
好ましくは、電場は、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の各々において、少なくとも概して同じである。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様に従えば、検出することは、20分未満の持続時間内に起こる。より好ましくは、検出することは、15分未満の持続時間内に起こる。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様に従えば、ローリングサークル増幅中に電場を印加することは、以下の少なくとも1つを含み、即ち、溶液中の核酸標的分子をミクロゲルデポジットの方に移動させるために、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、溶液中の核酸標的分子-RCAプローブのハイブリッド産物をミクロゲルデポジットの方に移動させるために、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、ミクロゲルデポジットから離れてしまったRCAアンプリコンを再捕捉するために、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、RCAプローブをミクロゲルデポジット内に移動させて既にミクロゲルデポジットに結合している捕捉プローブ及びプライマーの少なくとも1つとハイブリダイズさせるために、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域から望ましくない分子を除去するために、ミクロゲル領域に電場を印加することと、ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを延長するために、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンを圧縮するために、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、ミクロゲルデポジットに結合しているRCAアンプリコンの近傍でRCA試薬を攪拌するために、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、RCAにおける酵素活性の速度を向上させるために、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に電場を印加することと、RCAアンプリコンのミクロゲルデポジットへの結合の強度（stringency）を向上させるために、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に連続して極性を反転させる電場を印加することを含む。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様に従えば、電気泳動アレイは、室温保存可能な電気泳動アレイを含む。
【００１７】
好ましくは、電気泳動アレイは、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジットを含み、これら多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジットの各々は、ローリングサークル増幅の実行と、多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つの結合に適する物質を含んでおり、ミクロゲルデポジットの各々は、その中に予めアンカーされた少なくとも以下の要素、即ち、多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つに特異的なRCAプローブ及び少なくとも1つのプライマー、を含む。
【００１８】
図面の簡単な説明
本発明は、以のびる下の図面と合わせて考慮することで、以下の詳細な説明からより完全に理解され認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図1A及び図1Bは、本発明の好ましい実施態様に従って構築されて動作する、ローリングサークル増幅（RCA）実行中の多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域を含む電気泳動アレイアセンブリを簡略化して示す組立図と展開図である。
【図１Ｂ】図1A及び図1Bは、本発明の好ましい実施態様に従って構築されて動作する、ローリングサークル増幅（RCA）実行中の多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域を含む電気泳動アレイアセンブリを簡略化して示す組立図と展開図である。
【図２Ａ】図2A及び図2Bは、脱水されて保存の作業用配置（operative orientation）にある、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域を含む図1A及び図1Bの電気泳動アレイアセンブリを簡略化して示す組立図と展開図である。
【図２Ｂ】図2A及び図2Bは、脱水されて保存の作業用配置（operative orientation）にある、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域を含む図1A及び図1Bの電気泳動アレイアセンブリを簡略化して示す組立図と展開図である。
【図３Ａ】図3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H及び3Iは、一体として、図1A〜図2Bの実施態様において使用される電気泳動アレイを製造する好ましい方法を簡略化した図である。
【図３Ｂ】図3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H及び3Iは、一体として、図1A〜図2Bの実施態様において使用される電気泳動アレイを製造する好ましい方法を簡略化した図である。
【図３Ｃ】図3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H及び3Iは、一体として、図1A〜図2Bの実施態様において使用される電気泳動アレイを製造する好ましい方法を簡略化した図である。
【図３Ｄ】図3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H及び3Iは、一体として、図1A〜図2Bの実施態様において使用される電気泳動アレイを製造する好ましい方法を簡略化した図である。
【図３Ｅ】図3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H及び3Iは、一体として、図1A〜図2Bの実施態様において使用される電気泳動アレイを製造する好ましい方法を簡略化した図である。
【図３Ｆ】図3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H及び3Iは、一体として、図1A〜図2Bの実施態様において使用される電気泳動アレイを製造する好ましい方法を簡略化した図である。
【図３Ｇ】図3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H及び3Iは、一体として、図1A〜図2Bの実施態様において使用される電気泳動アレイを製造する好ましい方法を簡略化した図である。
【図３Ｈ】図3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H及び3Iは、一体として、図1A〜図2Bの実施態様において使用される電気泳動アレイを製造する好ましい方法を簡略化した図である。
【図３Ｉ】図3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H及び3Iは、一体として、図1A〜図2Bの実施態様において使用される電気泳動アレイを製造する好ましい方法を簡略化した図である。
【図４Ａ】図4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I及び4Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図４Ｂ】図4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I及び4Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図４Ｃ】図4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I及び4Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図４Ｄ】図4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I及び4Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図４Ｅ】図4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I及び4Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図４Ｆ】図4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I及び4Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図４Ｇ】図4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I及び4Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図４Ｈ】図4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I及び4Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図４Ｉ】図4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I及び4Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図４Ｊ】図4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I及び4Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図５Ａ】図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I及び5Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図５Ｂ】図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I及び5Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図５Ｃ】図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I及び5Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図５Ｄ】図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I及び5Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図５Ｅ】図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I及び5Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図５Ｆ】図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I及び5Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図５Ｇ】図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I及び5Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図５Ｈ】図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I及び5Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図５Ｉ】図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I及び5Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図５Ｊ】図5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I及び5Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図６Ａ】図6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I及び6Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図６Ｂ】図6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I及び6Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図６Ｃ】図6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I及び6Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図６Ｄ】図6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I及び6Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図６Ｅ】図6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I及び6Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図６Ｆ】図6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I及び6Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図６Ｇ】図6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I及び6Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図６Ｈ】図6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I及び6Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図６Ｉ】図6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I及び6Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図６Ｊ】図6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、6I及び6Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図７Ａ】図7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I及び7Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図７Ｂ】図7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I及び7Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図７Ｃ】図7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I及び7Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図７Ｄ】図7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I及び7Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図７Ｅ】図7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I及び7Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図７Ｆ】図7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I及び7Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図７Ｇ】図7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I及び7Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図７Ｈ】図7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I及び7Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図７Ｉ】図7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I及び7Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図７Ｊ】図7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I及び7Jは、本発明のある実施態様に従う、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における典型的なステップを簡略化した図である。
【図８】図8は、実施例Iの結果をまとめた図である。
【図９】図9は、実施例IIの結果をまとめた図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
好ましい実施形態の詳細な説明
以下、ローリングサークル増幅（RCA）実行中の多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離された標的分子特異的ミクロゲル領域を規定する、本発明の好ましい実施態様に従って構築されて動作する電気泳動アレイアセンブリ100を簡略化して示す組立図と展開図である図1A及び図1Bと、脱水されて保存の作業用配置にある、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域を示す、図1A及び図1Bの電気泳動アレイアセンブリを簡略化して示す組立図と展開図である図2A及び図2Bを参照する。電気泳動アレイアセンブリ100は、図7A〜図7Iを参照して後述する方法における使用に特に適していることが理解される。
【００２１】
図1A及び図1Bに示す通り、電気泳動アレイアセンブリ100は、基板110と、外壁構造120と窓130によって規定される囲い（enclosure）を含む。囲いの内側へのアクセスは、好ましくは基板110に形成される溶液侵入孔140と溶液出口孔150によって提供される。
【００２２】
図3A〜図3Iを参照してより詳細に後述する通り、電気泳動アレイ160が、基板110上に形成される。多重の標的分子特異的ミクロゲルデポジット170（好ましくは異なるRCA円形プローブ、フォワードプライマー及びリバースプライマーを結合させたもの。ここでは概念的な方法で参照番号175によって一般的に示す。）が、電気泳動アレイ160によって規定される、別個独立の作用電極位置180上に不動にされる。図1A及び図1Bにおいて、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170は、ローリングサークル増幅に適した作業用配置に示されている。
【００２３】
図2A及び図2Bにおいて、標的分子特異的ミクロゲルデポジットは、保存に適した脱水状態で示され、参照番号190が付されている。図2A及び図2Bの標的分子特異的ミクロゲルデポジット190は、水和時、電気泳動アレイアセンブリ100の内部に、適した溶液（好ましくは核酸標的分子を含む溶液）を供給することで、好ましくはこれらが参照番号170で示される、図1A及び図1Bに示す作業用配置をとることが理解される。
【００２４】
電気泳動アレイアセンブリ100とその様々な構成要素の好ましい寸法は、計算を容易にするために、溶液に暴露された各ミクロゲルデポジット170は概して半球形をとると想定すると、以下の通りである。
溶液の体積：約100mm3
基板110と窓130の間の内部高さ：0.8mm〜2.0mm
図1A及び1Bの作業用配置における基板110上方の標的分子特異的ミクロゲルデポジット170の高さ：0.5mm〜1.25mm
図2A及び図2Bの作業用配置における基板110上方の標的分子特異的ミクロゲルデポジット190の高さ：0.1mm〜0.3mm
図1A及び図1Bの作業用配置における基板110上方の各標的分子特異的ミクロゲルデポジット170の表面積：.0016〜.009mm2
溶液に暴露された各標的分子特異的ミクロゲルデポジット170の溶液の体積に対する表面積の割合：溶液の1立方ミリメートル当たりのミクロゲルデポジットの暴露された表面積の0.000016〜0.00009mm2
【００２５】
実際の表面積と、表面積の溶液の体積に対する実際の割合は、半球形の簡略化した想定を使用して計算した表面積及び割合と同等以上であることが理解される。
【００２６】
以下、図3A〜図3Iも参照に加えて、電気泳動アレイアセンブリ100の構造と構成を説明する。
【００２７】
まず、図3Aには、典型的にはポリエチレンテレフタレート等のポリエステルシートである、好ましくは厚さ0.1mmの、基板110が示されている。基板110には、溶液侵入孔140と溶液出口孔150がこの段階で、好ましくはレーザー切断により、設けられていてもよい。代替的に、溶液侵入孔140と溶液出口孔150は、後の段階で基板110に形成されてもよい。
【００２８】
次に、図3Bには、基板110は、高伝導性物質の初期パターン層200を有して、好ましくはヘンケル479SSインクのスクリーン印刷により、形成されることが示されている。層200の厚さは、好ましくは0.03mmである。層200は、電気泳動アレイアセンブリ100において、ミクロゲルデポジットの各々に均一の電流伝導性を提供する。
【００２９】
図3Cは、その後の、好ましくはデュポン7102及びBQ221のスクリーン印刷によって形成される、初期パターン層200と位置合わせされる炭素層210の形成を示す。層210の厚さは、好ましくは0.03mmである。層210は作用電極物質として機能し、後述する通り溶液に暴露される。また、層210は、内部作用電極230と外部対電極240の間に印加される電圧を制御する。
【００３０】
相互に位置合わせされる層200及び210は、一緒に、それぞれ電気接点250及び260に接続される外部対電極240と内部作用電極230を規定する。
【００３１】
図3Dを追加的に参照すると、層200及び210と基板100上に、好ましくはCreative Materials, Inc.（マサチューセッツ州エーア）から商業的に入手可能なCMI-101-80 79SSインクのスクリーン印刷によって、パターン誘電層270が形成されることが示される。誘電層270は、好ましくは厚さ0.04mmである。
【００３２】
図3Dに示す通り、誘電層270は、好ましくは溶液侵入孔140と溶液出口孔150の大きさ及び位置に対応する、好ましくは孔272及び274を有して形成される。また、誘電層270には、好ましくは対電極240の一部上に重ねて縦長の孔276及び278が設けられる。縦長の孔276及び278の各々の長さは、好ましくは100mmである。追加的に、誘電層270は、ここでは8個の孔280のアレイとして示される多重の孔280とともに形成され、これは作用電極230上に重なって、それとともに別個独立の作用電極位置180（図1B及び2B）を規定する。好ましくは、孔280は、直径0.2mm〜0.5mmでそれらの間の最小間隔が1mmの、全て同一の円形孔である。
【００３３】
次に、図3Eには、ミクロゲルデポジット300のアレイが、作用電極位置180上にロボットスポッティング等により形成されることが示される。ミクロゲルデポジット300は、互いから相互に物理的に分離されるように、好ましくは、水和時に概して半球形で、誘電層270の平面における直径が0.70mmである。ミクロゲルデポジット300は、好ましくは高さが0.5mm〜1.2mmであり、暴露された表面積が0.0016〜0.009平方ミリメートルである。ミクロゲルデポジット300は、好ましくはストレプトアビジンを含む（ビス）アクリルアミドヒドロゲルで形成される。
【００３４】
次に、図3Fには、ミクロゲルデポジット300は、好ましくはミクロゲルデポジット300の構成要素を重合するためにUV照射されることが示される。ヒスチジンがミクロゲルデポジット300に添加され、その後ミクロゲルデポジット300は洗浄されて過剰のヒスチジンが除去される。
【００３５】
重合に続いて、ミクロゲルデポジット300は、空気乾燥によって乾燥されて、図3Gに示す通り、乾燥ミクロゲルデポジット310を生成する。
【００３６】
次に、図3Hには、異なる核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320、及び好ましくはフォワードプライマー322とリバースプライマー324も、乾燥ミクロゲルデポジット310の対応する異なるものにロボットスポッティング等により結合され、これにより、異なる標的分子特異的ミクロゲルデポジット190を生成することが示される（図2A及び図2B）。図面全体において、核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320、フォワードプライマー322及びリバースプライマー324は、概念的に示されており、規模が示されるのでないことが理解される。
【００３７】
図3H〜3I及び図1A〜2Bに示される実施態様において、核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320、フォワードプライマー322及びリバースプライマー324は、全てミクロゲルデポジット310に結合されて示されているが、代替的な実施態様において、核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320、フォワードプライマー322及びリバースプライマー324の1以上は、ミクロゲルデポジット310に結合されていなくてもよく、核酸標的分子と一緒に溶液中に提供されていてもよいことが理解される。図3H〜3Iに示す実施態様及び上記代替的な実施態様において、核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320、フォワードプライマー322及びリバースプライマー324は、図5A〜図7Jを参照して後述する通り、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離された標的分子特異的ミクロゲル領域内に位置している。
【００３８】
図3Iに示す通り、標的分子特異的ミクロゲル乾燥ミクロゲルデポジット190を洗浄して外壁構造120の保存剤としてラフィノースを添加した後、窓130が基板110上に組み立てられ、これにより、図2A及び図2Bを参照して上述した通り、保存可能な状態の電気泳動アレイアセンブリ100の製造を完了する。電気泳動アレイアセンブリ100は、本発明の好ましい実施態様に従う使用の準備が整い、溶液中の、多重の予め選択された核酸標的分子の中から、少なくとも1つの核酸標的分子の存在を迅速に検出する方法を提供する。この方法は、以下のステップを含み、
電気泳動アレイ上の、少なくとも多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域に溶液を導入するステップであって、ここで、多重の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の各々は、多重の予め選択された核酸標的分子のうち異なるものの結合とローリングサークル増幅の実行に適する物質を含むミクロゲルデポジットを含み、
不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の各々において、ローリングサークル増幅の様々な段階中にそこに電場を印加しつつ、少なくとも概して同時にローリングサークル増幅を実行するステップ、及び
多重の予め選択された核酸標的分子の少なくとも1つの存在を、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域の対応するものの少なくとも1つにおいて検出するステップ、
ここで、検出は、上記導入の短時間の間に起こり、この短時間は、好ましくは30分未満であり、より好ましくは25分未満であり、さらにより好ましくは20分未満である。
【００３９】
以下、図4A〜図4J、図5A〜図5J、図6A〜図6J及び図7A〜図7Jのそれぞれを参照して、上記方法を実行する4種類のバリエーションを詳細に説明する。上述の電気泳動アレイアセンブリ100は、図7A〜図7Jの方法の実行における使用に特に適している。
【００４０】
これらの方法の全てがローリングサークル増幅を使用する。ローリングサークル増幅は既知の技術であり、とりわけ以下の文献に説明されており、それら文献の開示は参照することにより本明細書中に組み込まれる。
米国特許第5,854,033号; Lizardiet al., Nature Genetics 19(3):225-232 (1998)，
Michael G. Mohsen and Eric T. Kool, The Discovery of Rolling Circle Amplification and Rolling Circle Transcription、Acc Chem Res. 2016, 49(11): 2540-2550
Peiying Feng, et al., Identification and Typing of Isolates of Cyphellophora and Relatives by Use of Amplified Fragment Length Polymorphism and Rolling Circle Amplification, Journal of Clinical Microbiology, 2013 Volume 51 Number 3, p. 931-937.
Signal Amplification by Rolling Circle Amplification on DNA Microarrays, G. Nallur et al., Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29,. Vol. 29, No. 123, e118
M. Monsur Ali et al., Rolling Circle Amplification: a versatile tool for chemical biology, materials science and medicine, Chemical Society Review, Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 3324-3341.
Ali MM, Li F, Zhang Z, Zhang K, Kang D, Ankrum JA, Le XC, Zhao W. Rolling Circle Amplification: a versatile tool for chemical biology, materials science and medicine. Chem Soc Rev. 2014; 43:3324.
Kool, ET. Rolling circle synthesis of oligonucleotides and Amplification of select randomized circular oligonucleotide s. US. 5714320. Feb 3. 1998.
Fire A, Xu S. Rolling replication of short DNA circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92:4641- 4645.
Nilsson M, MalmgrenH, Samiotaki M, Kwiatkowski M, Chowdhary BP, Landegren U. Padlock Probes: Circularizing Oligonucleotide s for Localized DNA Detection. Science. 1994; 265:2085- 2088.
【００４１】
後述する様々な方法は、先行技術のローリングサークル増幅技術に照らして新規かつ非自明の特徴を含んでいる。
【００４２】
以下、本発明のある好ましい実施態様に従う、多重の予め選択された核酸標的分子の中からの少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における主な段階を示す、図4A〜図4Jを参照する。
【００４３】
図4A〜図4Jの方法は、図2A及び図2Bを参照して上述した通り、好ましくは保存可能な状態の電気泳動アレイアセンブリ100を使用して行われ、ここでは、捕捉プローブだけが不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジット190に結合されている。簡潔にする目的のため、図1A〜図2Bを参照して上述した通りの基板110、外壁構造120及び窓130、並びに電気泳動アレイ160を構成する様々な層は、図4A〜図4Jには具体的に示されないことが理解される。図4A〜図4Jの各々は、図2Aにおける直線4−4に概して沿って簡略化した側面断面図である。
【００４４】
図4Aは、規模ではなく概念で示す様々な異なるオリゴヌクレオチド核酸特異的捕捉プローブ400、例えば乾燥ミクロゲルデポジット190のうちの対応する異なるものに結合する、髄膜炎の感染症病原体あるいはその他の疾患に特異的であるがその識別に限定されないものであるが、これらのプローブとともに図2Aに示す保存可能な状態の電気泳動アレイアセンブリ100を示している。図4Aは、ミリメートル単位で、電気泳動アレイアセンブリ100の好ましい実施態様の内部の寸法と、不動にされた乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190の一般的な寸法（作用電極位置180を中心とするが、ある程度これをはみ出る）を示している（図1A〜図3I）。
【００４５】
図4Bは、矢印401によって概念的に示される、1以上の異なる型の核酸標的分子403を含む溶液402を電気泳動アレイアセンブリ100の内部を満たすように導入することを示す図である。溶液402は、好ましくは、核酸標的分子403に加えて、フォワードプライマー322及び核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320を含む。
【００４６】
溶液402の調製は、本発明の一部ではなく、「Nasir Ali, Rita de Cassia Pontello Rampazzo, Alexandre Dias Tavares Costa, and Marco Aurelio Krieger, Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics, BioMed Research International Volume 2017, Article ID 9306564, 13 pages」に記載されるもの等の従来技術に従って行われる。溶液402は、好ましくは低伝導性溶離剤液（典型的には溶液402の調製中に導入される）を含み、核酸の電子的アドレス指定（addressing）を容易にし、かつ、溶液402中の制限酵素の活性を促進する。好ましい溶離剤液は、ヒスチジンと制限酵素緩衝液を含む。図4Bは、脱水状態における乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190を示す。溶液402が乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190と接触するように電気泳動アレイアセンブリ100に溶液402を導入することは、時間T0を規定し、また、乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190が、参照番号170で示す（図1A及び1B）水和状態になるようにする。
【００４７】
図4Cは、核酸標的分子403を含む溶液402の導入の結果としての、電気泳動アレイアセンブリ100の内部を満たす、水和状態の不動にされた標的分子特異的ミクロゲルデポジット170を示す。図4Cは、水和標的分子に特異的な、電気的に分離されたミクロゲルデポジット170の典型的な最大高さが1.25mmであることを示す。標的分子特異的ミクロゲルデポジット170の図4Cに示す状態への水和は、好ましくは約10秒かかり、また好ましくは時間T = T0 + 10秒で完了する。
【００４８】
図4Dは、作用電極230上の作用電極位置180と対電極240の間に印加される（図1A及び1B）、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下における、水和不動にされ、相互に電気的に分離されたミクロゲルデポジット170への電気泳動による核酸のアドレス指定を示している。電界線の部分は参照番号410で示し、また、電場の方向は矢印412で示している。電界線は、3次元の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離された標的分子特異的ミクロゲル領域420であって、その各々が異なる標的分子特異的ミクロゲルデポジット170を中心にするものを規定していることが理解されてもよい。
【００４９】
上記アドレス指定も、また、図4E〜4Jを参照して後述する様々なステップも、ミクロゲルデポジット170の表面上だけでなく、ミクロゲルデポジット170の体積内においても起こることが理解される。
【００５０】
図4Dに示す通り、3次元の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離された標的分子特異的ミクロゲル領域420に対するDC電場の印加は、核酸標的分子403、核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320及びフォワードプライマー322の、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170への迅速な輸送を起こし、これは、順に、核酸標的分子403と核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320の間の特異的なハイブリダイゼーションと、フォワードプライマー322と核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320の間の特異的なハイブリダイゼーションと、標的分子特異的捕捉プローブ400による核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320の捕捉を促進し、この捕捉プローブ400は、水和標的分子に特異的な電気的に分離されたミクロゲルデポジット170に結合されている。
【００５１】
図4Dに示す段階の持続時間は、30秒〜120秒である。図4Dに示す段階は、好ましくは、時間T = T0 + [40〜130]秒で完了する。
【００５２】
以下、通常は図4Dに示すアドレス指定段階の次の段階であり、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において、好ましくは図4Dのステップと同一方向に起こるライゲーション段階を示す図4Eを参照する。ライゲーション段階は、好ましくは、例えばT-4リガーゼ等の、溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ100に導入されるライゲーション酵素428の存在下で起こる。ライゲーション段階の持続時間は、典型的には120〜240秒である。ライゲーション段階は、好ましくはT = T0 + [160〜370]秒で完了する。
【００５３】
以下、通常は図4Eに示すライゲーション段階の次の段階であり、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において、好ましくは図4Eのステップと同一方向に起こるRCA重合段階を示す図4Fを参照する。
【００５４】
RCA重合段階は、好ましくは溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ100に導入されるBstポリメラーゼ酵素429、dNTP（図示せず）及びリバースプライマー324と、RCA円形プローブ320に結合されたフォワードプライマー322（これは順に、捕捉プローブ400に結合され、これは順に、標的分子に特異的なミクロゲルデポジット170に結合される）の存在下で、好ましくは摂氏65度の温度で起こる。RCA重合段階の結果は、長いRCAアンプリコン440の生成である。図4Fに示す通り、ポリメラーゼ酵素429の核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320への結合に続いて、矢印442が示す通り、核酸標的分子403が核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320から移動する。RCA重合段階の持続時間は、典型的には300〜720秒である。RCA重合段階は、好ましくはT = T0 + [460〜1090]秒で完了する。
【００５５】
以下、通常図4FのRCA重合段階中に起こり、そして好ましくは矢印444が示す通り図4Fのステップの電場の方向と反対方向の、センチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において好ましくは起こる、アンプリコン延長段階を示す図4Gを参照する。図の実施態様において、アンプリコン440の延長は、矢印448が示す方向に起こる。アンプリコン延長段階は、好ましくはBstポリメラーゼ酵素429、dNTP（図示せず）及びリバースプライマー324の存在下、摂氏65度の温度で起こる。アンプリコン延長段階の持続時間は、典型的には5〜15秒である。RCA重合段階は、好ましくはT = T0 + [465〜1105]秒で完了する。
【００５６】
図4F及び4Gに示す段階は、断続的に複数回繰り返されてもよく、図4Fに示す複数の段階は、各々が上記のものよりも短い持続時間であり、かつ図4Gに示す段階によって分離されていることが理解される。
【００５７】
以下、通常図4FのRCA重合段階及び図4Gのアンプリコン延長段階中に起こり、そして好ましくは矢印412が示す通り図4Gのステップの電場の方向と通常反対方向の、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において起こるが、好ましくは電場の極性が反転する短時間を含む、指数関数的RCA増幅段階を示す図4Hを参照する。この段階において、追加のアンプリコン450がリバースプライマー324を使用して生成される。
【００５８】
指数関数的RCA増幅段階は、好ましくはBstポリメラーゼ酵素429、dNTP（図示せず）及びリバースプライマー324の存在下、摂氏65度の温度で起こる。図4FのRCA重合段階及び図4Gのアンプリコン延長段階中に起こる指数関数的RCA増幅段階の持続時間は、典型的には5〜15秒である。図4FのRCA重合段階と、図4Gのアンプリコン延長段階と、図4Hの指数関数的RCA増幅段階は、好ましくはT = T0 + [465〜1105]秒で完了する。
【００５９】
以下、通常図4FのRCA重合段階と、図4Gのアンプリコン延長段階と、図4Hの指数関数的RCA増幅段階の完了後に起こり、また、通常図4Hのステップの電場の方向と同じ方向に、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において好ましくは起こる、RCA重合後アドレス指定段階を示す図4Iを参照する。RCA重合後アドレス指定段階は、溶液402中の、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170から離れたアンプリコン440の濃縮と、矢印460で示す通り標的分子特異的ミクロゲルデポジット170でのそれらの再捕捉と、好ましくは各ミクロゲル領域420内の1カ所にアンプリコン440の収集に特に有用である。RCA重合後アドレス指定段階の持続時間は、典型的には10〜30秒である。RCA重合後アドレス指定段階は、好ましくはT = T0 + [475〜1135]秒で完了する。
【００６０】
以下、通常RCA重合後アドレス指定段階に続く段階である、レポート段階を示す図4Jを参照する。レポート段階は、溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ100に導入されるアンプリコン440及び450に相補的な蛍光レポーター470の存在下で好ましくは起こる。レポート段階の持続時間は、典型的には10〜30秒である。レポート段階は、好ましくはT = T0 + [485〜1165]秒で完了する。
【００６１】
レポート段階と、図示しないその後の洗浄段階の完了後、多重の予め選択された核酸標的分子の中から、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の検出が、従来の蛍光検出技術によって行われる。したがって、少なくとも1つの核酸標的分子の検出が、好ましくは、電気泳動アレイアセンブリ100の内部への溶液402の最初の供給の8分〜20分以内に完了することが理解される。
【００６２】
溶液402の調製が、患者から血液サンプルを採取すること等によるサンプルの取得から4〜5分以内に完了した場合、少なくとも1つの核酸標的分子の検出は、サンプルの取得から12〜25分以内に完了してもよいことが理解される。
【００６３】
以下、本発明の他の好ましい実施態様に従う、多重の予め選択された核酸標的分子の中からの、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における主な段階である図5A〜図5Jを参照する。
【００６４】
図5A〜図5Jの方法は、好ましくは、図2A及び図2Bを参照して上述した通り、好ましくは保存可能な状態の電気泳動アレイアセンブリ500を使用して行われ、ここでは、フォワードプライマー322が、不動にされて相互に間隔をあけたミクロゲルデポジット190に結合されている。簡潔にする目的のため、基板110、外壁構造120及び窓130、並びに電気泳動アレイ160を構成する様々な層は具体的に示されないことが理解される。図5A〜図5Jの各々は、図2Aにおける直線4−4に概して沿って簡略化した側面断面図である。
【００６５】
図5Aは、乾燥ミクロゲルデポジット190の対応する異なるものに結合される、規模ではなく概念で示す様々な異なるオリゴヌクレオチドフォワードプライマー322とともに、図2Aに示すものと同様の、乾燥され脱水されて作業用配置にある電気泳動アレイアセンブリ500を示す。
【００６６】
図5Aは、ミリメートル単位で、不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット190の一般的な寸法とともに、電気泳動アレイアセンブリ500の好ましい実施態様の内寸を示す。
【００６７】
図5A〜図5Jの方法は、図4A〜図4Jの方法において不動にされ乾燥された標的分子に特異的なミクロゲルデポジット190に結合されている捕捉プローブ400に替えて、図5A〜図5Jの方法では、捕捉プローブとしての役割も果たすフォワードプライマー322が、不動にされ乾燥された標的分子に特異的なミクロゲルデポジット190に結合されている点において、図4A〜図4Jの方法と異なることが理解される。
【００６８】
図5Bは、矢印501によって概念的に、電気泳動アレイアセンブリ500の内部を満たすように核酸標的分子503を含む溶液502を導入することを示す。この溶液は、好ましくは、核酸標的分子503に加えて、核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320も含む。
【００６９】
溶液502の調製は、本発明の一部ではなく、「Nasir Ali, Rita de Cassia Pontello Rampazzo, Alexandre Dias Tavares Costa, and Marco Aurelio Krieger, Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics, BioMed Research International Volume 2017, Article ID 9306564, 13 pages」に記載されるもの等の従来技術に従って行われる。溶液502は、好ましくは低伝導性溶離剤液（典型的には該溶液の調製中に導入される）を含み、核酸の電子的アドレス指定を容易にし、かつ、溶液502中の制限酵素の活性を促進する。好ましい溶離剤液は、ヒスチジンと制限酵素緩衝液を含む。図5Bは、脱水状態における乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190を示す。溶液502が乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190と接触するように電気泳動アレイアセンブリ500に溶液502を導入することは、時間T0を規定し、また、乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190（図2A及び図2B）が、参照番号170で示す（図1A及び1B）水和状態になるようにする。
【００７０】
図5Cは、核酸標的分子503を含む溶液502の導入の結果としての、電気泳動アレイアセンブリ500の内部を満たす、水和状態の不動にされた標的分子特異的ミクロゲルデポジット170を示す。図5Cは、水和標的分子に特異的な、電気的に分離されたミクロゲルデポジット170の典型的な最大高さが1.25mmであることを示す。標的分子特異的ミクロゲルデポジット170の図5Cに示す状態への水和は、好ましくは約10秒かかり、また好ましくは時間T = T0 + 10秒で完了する。
【００７１】
図5Dは、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下における、水和不動にされ、相互に電気的に分離された標的分子特異的ミクロゲルデポジット170への電気泳動による核酸のアドレス指定を示している。電界線の部分は参照番号510で示し、また、電場の方向は矢印512で示している。電界線は、3次元の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域520であって、その各々が異なる標的分子特異的ミクロゲルデポジット170を中心にするものを規定していることが理解されてもよい。
【００７２】
アドレス指定も、また、図5E〜5Jを参照して後述する様々なステップも、ミクロゲルデポジット170の表面上だけでなく、ミクロゲルデポジット170の体積内においても起こることが理解される。
【００７３】
図5Dに示す通り、3次元の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離された標的分子特異的ミクロゲル領域520に対するDC電場の印加は、核酸標的分子503及び核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320の、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170への迅速な輸送を起こし、これは、順に、核酸標的分子503と核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320との間に特異的なハイブリダイゼーションを促進する。核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320の、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170への迅速輸送は、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170に結合するフォワードプライマー322と、核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320との間の特異的なハイブリダイゼーションも促進する。
【００７４】
図5Dに示す段階の持続時間は、30秒〜120秒である。図5Dに示す段階は、好ましくは、時間T = T0 + [40〜130]秒で完了する。
【００７５】
以下、通常は図5Dに示すアドレス指定段階の次の段階であり、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において、好ましくは図5Dのステップと同一方向に起こるライゲーション段階を示す図5Eを参照する。ライゲーション段階は、好ましくは、例えばT-4リガーゼ等の、溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ500に導入されるライゲーション酵素528の存在下で起こる。ライゲーション段階の持続時間は、典型的には120〜240秒である。ライゲーション段階は、好ましくはT = T0 + [160〜370]秒で完了する。
【００７６】
以下、通常は図5Eに示すライゲーション段階の次の段階であり、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において、好ましくは図5Eのステップと同一方向に起こるRCA重合段階を示す図5Fを参照する。RCA重合段階は、好ましくは溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ500に導入されるBstポリメラーゼ酵素529、dNTP（図示せず）及びリバースプライマー324と、標的分子に特異的なミクロゲルデポジット170に結合されるフォワードプライマー322の存在下、好ましくは摂氏65度の温度で起こる。RCA重合段階の結果は、長いRCAアンプリコン540の生成である（図5G）。図5Fに示す通り、ポリメラーゼ酵素529の核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320への結合に続いて、矢印542が示す通り、核酸標的分子503が核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320から移動する。RCA重合段階の持続時間は、典型的には300〜720秒である。RCA重合段階は、好ましくはT = T0 + [460〜1090]秒で完了する。
【００７７】
以下、通常図5FのRCA重合段階中に起こり、そして好ましくは矢印544が示す通り図5Fのステップの電場の方向と反対方向の、センチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において好ましくは起こる、アンプリコン延長段階を示す図5Gを参照する。アンプリコン540の延長は、矢印548が示す方向に起こる。アンプリコン延長段階は、好ましくはBstポリメラーゼ酵素529、dNTP（図示せず）及びリバースプライマー324の存在下、摂氏65度の温度で起こる。アンプリコン延長段階の持続時間は、典型的には5〜15秒である。RCA重合段階は、好ましくはT = T0 + [565〜1105]秒で完了する。
【００７８】
図5F及び5Gに示す段階は、断続的に複数回繰り返されてもよく、図5Fに示す複数の段階は、各々が上記のものよりも短い持続時間であり、かつ図5Gに示す段階によって分離されていることが理解される。
【００７９】
以下、通常図5FのRCA重合段階及び図5Gのアンプリコン延長段階中に起こり、そして好ましくは矢印512が示す通り図5Gのステップの電場の方向と通常反対方向の、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において起こるが、好ましくは電場の極性が反転する短時間を含む、指数関数的RCA増幅段階を示す図5Hを参照する。この段階において、追加のアンプリコン550がリバースプライマー324を使用して生成される。
【００８０】
指数関数的RCA増幅段階は、好ましくはBstポリメラーゼ酵素529、dNTP（図示せず）及びリバースプライマー324の存在下、摂氏65度の温度で起こる。図5FのRCA重合段階及び図5Gのアンプリコン延長段階中に起こる指数関数的RCA増幅段階の持続時間は、典型的には5〜15秒である。図5FのRCA重合段階と、図5Gのアンプリコン延長段階と、図5Hの指数関数的RCA増幅段階は、好ましくはT = T0 + [465〜1105]秒で完了する。
【００８１】
以下、通常図5FのRCA重合段階と、図5Gのアンプリコン延長段階と、図5Hの指数関数的RCA増幅段階の完了後に起こり、また、通常図5Hのステップの電場の方向と同じ方向に、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において好ましくは起こる、RCA重合後アドレス指定段階を示す図5Iを参照する。RCA重合後アドレス指定段階は、溶液502中の、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170から離れたアンプリコン540を収集して矢印560が示す通り標的分子特異的ミクロゲルデポジット170で再捕捉したり、また、好ましくは各ミクロゲル領域520内の1カ所にアンプリコン540を濃縮させたりするのに特に有用である。RCA重合後アドレス指定段階の持続時間は、典型的には10〜30秒である。RCA重合後アドレス指定段階は、好ましくはT = T0 + [475〜1135]秒で完了する。
【００８２】
以下、通常RCA重合後アドレス指定段階に続く段階である、レポート段階を示す図5Jを参照する。レポート段階は、溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ500に導入されるアンプリコン540及び550に相補的な蛍光レポーター570の存在下で好ましくは起こる。レポート段階の持続時間は、典型的には10〜30秒である。レポート段階は、好ましくはT = T0 + [585〜1165]秒で完了する。
【００８３】
レポート段階と、図示しないその後の洗浄段階の完了後、多重の予め選択された核酸標的分子の中から、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の検出が、従来の蛍光検出技術によって行われる。したがって、少なくとも1つの核酸標的分子の検出が、好ましくは、電気泳動アレイアセンブリ100の内部への溶液502の最初の供給の8分〜20分以内に完了することが理解される。
【００８４】
溶液502の調製が、患者から血液サンプルを採取すること等によるサンプルの取得から4〜5分以内に完了した場合、少なくとも1つの核酸標的分子の検出は、サンプルの取得から12〜25分以内に完了してもよいことが理解される。
【００８５】
以下、本発明の他の好ましい実施態様に従う、多重の予め選択された核酸標的分子の中からの、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における主な段階である図6A〜図6Jを参照する。
【００８６】
図6A〜図6Jの方法は、好ましくは、図2A及び図2Bを参照して上述した通り、好ましくは保存可能な状態の電気泳動アレイアセンブリ600を使用して行われ、ここでは、フォワードプライマー322と核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320が、不動にされて相互に間隔をあけたミクロゲルデポジット190に結合されている。簡潔にする目的のため、基板110、外壁構造120及び窓130、並びに電気泳動アレイ160を構成する様々な層は具体的に示されないことが理解される。図6A〜図6Jの各々は、図2Aにおける直線4−4に概して沿って簡略化した側面断面図である。
【００８７】
図6Aは、乾燥ミクロゲルデポジット190の対応する異なるものに結合される、規模ではなく概念で示す様々な異なるオリゴヌクレオチドフォワードプライマー322及び核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320とともに、図2Aに示すものと同様の、乾燥され脱水されて作業用配置にある電気泳動アレイアセンブリ600を示す。
【００８８】
図6Aは、ミリメートル単位で、不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット190の一般的な寸法とともに、電気泳動アレイアセンブリ600の好ましい実施態様の内寸を示す。
【００８９】
図6A〜図6Jの方法は、図4A〜図4Jの方法において不動にされ乾燥された標的分子に特異的なミクロゲルデポジット190に結合されている捕捉プローブ400に替えて、核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320が、図6A〜図6Jの方法において不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット190に結合される、フォワードプライマー322に特異的にハイブリダイズされている点において、図4A〜図4Jの方法と異なることが理解される。
【００９０】
図6Bは、矢印601によって概念的に、電気泳動アレイアセンブリ600の内部を満たすように核酸標的分子603を含む溶液602を導入することを示す。
【００９１】
溶液602の調製は、本発明の一部ではなく、「Nasir Ali, Rita de Cassia Pontello Rampazzo, Alexandre Dias Tavares Costa, and Marco Aurelio Krieger, Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics, BioMed Research International Volume 2017, Article ID 93065」に記載されるもの等の従来技術に従って行われる。溶液 602は、好ましくは低伝導性溶離剤液（典型的には該溶液の調製中に導入される）を含み、核酸の電子的アドレス指定を容易にし、かつ、溶液602中の制限酵素の活性を促進する。好ましい溶離剤液は、ヒスチジンと制限酵素緩衝液を含む。図6Bは、脱水状態における乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190を示す。溶液602が乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190と接触するように電気泳動アレイアセンブリ100に溶液602を導入することは、時間T0を規定し、また、乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190が、参照番号170で示す（図1A及び1B）水和状態になるようにする。
【００９２】
図6Cは、核酸標的分子603を含む溶液602の導入の結果としての、電気泳動アレイアセンブリ600の内部を満たす、水和状態の不動にされた標的分子特異的ミクロゲルデポジット170を示す。図6Cは、水和標的分子に特異的な、電気的に分離されたミクロゲルデポジット170の典型的な最大高さが1.25mmであることを示す。標的分子特異的ミクロゲルデポジット190の図6Cに示す状態への水和は、好ましくは約10秒かかり、また好ましくは時間T = T0 + 10秒で完了する。
【００９３】
図6Dは、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下における、水和不動にされ、相互に電気的に分離された標的分子特異的ミクロゲルデポジット170への電気泳動による核酸のアドレス指定を示している。電界線の部分は参照番号610で示し、また、電場の方向は矢印612で示している。電界線は、3次元の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域620であって、その各々が異なる標的分子特異的ミクロゲルデポジット170を中心にするものを規定していることが理解されてもよい。
【００９４】
アドレス指定も、また、図6E〜6Jを参照して後述する様々なステップも、ミクロゲルデポジット170の表面上だけでなく、ミクロゲルデポジット170の体積内においても起こることが理解される。
【００９５】
図6Dに示す通り、3次元の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離された標的分子特異的ミクロゲル領域620に対するDC電場の印加は、核酸標的分子603の、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170への迅速な輸送を起こし、これは、順に、核酸標的分子603と核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320との間に特異的なハイブリダイゼーションを促進し、このRCA円形プローブ320はフォワードプライマー322に結合し、このフォワードプライマー322は、水和標的分子に特異的な電気的に分離されたミクロゲルデポジット170に結合する。
【００９６】
図6Dに示す段階の持続時間は、30秒〜120秒である。図6Dに示す段階は、好ましくは、時間T = T0 + [40〜130]秒で完了する。
【００９７】
以下、通常は図6Dに示すアドレス指定段階の次の段階であり、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において、好ましくは図6Dのステップと同一方向に起こるライゲーション段階を示す図6Eを参照する。ライゲーション段階は、好ましくは、例えばT-4リガーゼ等の、溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ600に導入されるライゲーション酵素628の存在下で起こる。ライゲーション段階の持続時間は、典型的には120〜240秒である。ライゲーション段階は、好ましくはT = T0 + [160〜370]秒で完了する。
【００９８】
以下、通常は図6Eに示すライゲーション段階の次の段階であり、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において、好ましくは図6Eのステップと同一方向に起こるRCA重合段階を示す図6Fを参照する。RCA重合段階は、好ましくは溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ600に導入されるBstポリメラーゼ酵素629、dNTP（図示せず）及びリバースプライマー324と、標的分子に特異的なミクロゲルデポジット170に結合されるフォワードプライマー322の存在下で、好ましくは摂氏65度の温度で起こる。RCA重合段階の結果は、長いRCAアンプリコン640の生成である（図6G）。図6Fに示す通り、ポリメラーゼ酵素629の核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320への結合に続いて、矢印642が示す通り、核酸標的分子603が核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320から移動する。RCA重合段階の持続時間は、典型的には300〜720秒である。RCA重合段階は、好ましくはT = T0 + [460〜1090]秒で完了する。
【００９９】
以下、通常図6FのRCA重合段階中に起こり、そして好ましくは矢印644が示す通り図6Fのステップの電場の方向と反対方向の、センチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において好ましくは起こる、アンプリコン延長段階を示す図6Gを参照する。アンプリコン640の延長は、矢印648が示す方向に起こる。アンプリコン延長段階は、好ましくはBstポリメラーゼ酵素629、dNTP（図示せず）及びリバースプライマー324の存在下、摂氏65度の温度で起こる。アンプリコン延長段階の持続時間は、典型的には5〜15秒である。RCA重合段階は、好ましくはT = T0 + [465〜1105]秒で完了する。
【０１００】
図6F及び6Gに示す段階は、断続的に複数回繰り返されてもよく、図6Fに示す複数の段階は、各々が上記のものよりも短い持続時間であり、かつ図6Gに示す段階によって分離されていることが理解される。
【０１０１】
以下、通常図6FのRCA重合段階及び図6Gのアンプリコン延長段階中に起こり、そして好ましくは矢印612が示す通り図6Gのステップの電場の方向と通常反対方向の、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において起こるが、好ましくは電場の極性が反転する短時間を含む、指数関数的RCA増幅段階を示す図6Hを参照する。この段階において、追加のアンプリコン650がリバースプライマー324を使用して生成される。
【０１０２】
指数関数的RCA増幅段階は、好ましくはBstポリメラーゼ酵素629、dNTP（図示せず）及びリバースプライマー324の存在下、摂氏65度の温度で起こる。図6FのRCA重合段階及び図6Gのアンプリコン延長段階中に起こる指数関数的RCA増幅段階の持続時間は、典型的には5〜15秒である。図6FのRCA重合段階と、図6Gのアンプリコン延長段階と、図6Hの指数関数的RCA増幅段階は、好ましくはT = T0 + [465〜1105]秒で完了する。
【０１０３】
以下、通常図6FのRCA重合段階と、図6Gのアンプリコン延長段階と、図6Hの指数関数的RCA増幅段階の完了後に起こり、また、通常図6Hのステップの電場の方向と同じ方向に、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において好ましくは起こる、RCA重合後アドレス指定段階を示す図6Iを参照する。RCA重合後アドレス指定段階は、溶液602中の、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170から離れたアンプリコン640を収集して矢印660が示す通り標的分子特異的ミクロゲルデポジット170で再捕捉したり、また、好ましくは各ミクロゲル領域620内の1カ所にアンプリコン640を濃縮させたりするのに特に有用である。RCA重合後アドレス指定段階の持続時間は、典型的には10〜30秒である。RCA重合後アドレス指定段階は、好ましくはT = T0 + [475〜1135]秒で完了する。
【０１０４】
以下、通常RCA重合後アドレス指定段階に続く段階である、レポート段階を示す図6Jを参照する。レポート段階は、溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ600に導入されるアンプリコン640及び650に相補的な蛍光レポーター670の存在下で好ましくは起こる。レポート段階の持続時間は、典型的には10〜30秒である。レポート段階は、好ましくはT = T0 + [485〜1165]秒で完了する。
【０１０５】
レポート段階と、図示しないその後の洗浄段階の完了後、多重の予め選択された核酸標的分子の中から、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の検出が、従来の蛍光検出技術によって行われる。したがって、少なくとも1つの核酸標的分子の検出は、好ましくは、電気泳動アレイアセンブリ600の内部への溶液602の最初の供給の8分〜20分以内に完了することが理解される。
【０１０６】
溶液602の調製が、患者から血液サンプルを採取すること等によるサンプルの取得から4〜5分以内に完了した場合、少なくとも1つの核酸標的分子の検出は、サンプルの取得から12〜25分以内に完了してもよいことが理解される。
【０１０７】
以下、以下、本発明のまた他の好ましい実施態様に従う、多重の予め選択された核酸標的分子の中からの、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の迅速検出における主な段階である図7A〜図7Jを参照する。簡潔にする目的のため、基板110、外壁構造120及び窓130、並びに電気泳動アレイ160を構成する様々な層は具体的に示されないことが理解される。図7A〜図7Jの各々は、図2Aにおける直線4−4に概して沿って簡略化した側面断面図である。
【０１０８】
図7Aは、乾燥ミクロゲルデポジット190の対応する異なるものに結合される、規模ではなく概念で示す様々な異なるオリゴヌクレオチドフォワードプライマー322、核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320及びリバースプライマー324とともに、図2Aに示すものと同様の、乾燥され脱水されて作業用配置にある電気泳動アレイアセンブリ700を示す。図7Aは、ミリメートル単位で、不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット190の一般的な寸法とともに、電気泳動アレイアセンブリ700の好ましい実施態様の内寸を示す。
【０１０９】
図7A〜図7Jは、図4A〜図4Jの方法において不動にされ乾燥された標的分子に特異的なミクロゲルデポジット190に結合されている捕捉プローブ400に替えて、核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320が、不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット190に結合される、フォワードプライマー322に特異的にハイブリダイズされている点、及びリバースプライマー324も図7A〜図7Jの方法における不動にされた乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190に結合される点において、図4A〜図4Jの方法と異なることが理解される。
【０１１０】
図7Bは、矢印701によって概念的に、電気泳動アレイアセンブリ700の内部を満たすように核酸標的分子703を含む溶液702を導入することを示す。
【０１１１】
溶液702の調製は、本発明の一部ではなく、「Nasir Ali, Rita de Cassia Pontello Rampazzo, Alexandre Dias Tavares Costa, and Marco Aurelio Krieger, Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics, BioMed Research International Volume 2017, Article ID 93065」に記載されるもの等の従来技術に従って行われる。溶液702は、好ましくは低伝導性溶離剤液（典型的には溶液402の調製中に導入される）を含み、核酸の電子的アドレス指定を容易にし、かつ、溶液702中の制限酵素の活性を促進する。好ましい溶離剤液は、ヒスチジンと制限酵素緩衝液を含む。図7Bは、脱水状態における乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190を示す。溶液702が乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190と接触するように電気泳動アレイアセンブリ700に溶液702を導入することは、時間T0を規定し、また、乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190が、参照番号170で示す（図1A及び1B）水和状態になるようにする。
【０１１２】
図7Cは、核酸標的分子703を含む溶液702の導入の結果としての、電気泳動アレイアセンブリ700の内部を満たす、参照番号170（図1A及び1B）によって示される水和状態の不動にされた標的分子特異的ミクロゲルデポジットを示す。図7Cは、水和標的分子に特異的な、電気的に分離されたミクロゲルデポジット170の典型的な最大高さが1.25mmであることを示す。標的分子特異的ミクロゲルデポジット170の図7Cに示す水和状態への水和は、好ましくは約10秒かかり、また好ましくは時間T = T0 + 10秒で完了する。
【０１１３】
図7Dは、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下における、水和不動にされ、相互に電気的に分離された標的分子特異的ミクロゲルデポジット170への電気泳動による核酸のアドレス指定を示している。電界線の部分は参照番号710で示し、また、電場の方向は矢印712で示している。電界線は、3次元の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離されたミクロゲル領域720であって、その各々が異なる標的分子特異的ミクロゲルデポジット170を中心にするものを規定していることが理解されてもよい。
【０１１４】
アドレス指定も、また、図7E〜7Jを参照して後述する様々なステップも、ミクロゲルデポジット170の表面上だけでなく、ミクロゲルデポジット170の体積内においても起こることが理解される。
【０１１５】
図7Dに示す通り、3次元の、不動にされ、相互に間隔をあけ、かつ相互に電気的に分離された標的分子特異的ミクロゲル領域720に対するDC電場の印加は、核酸標的分子703の、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170への迅速な輸送を起こし、これは、順に、核酸標的分子703と核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320との間に特異的なハイブリダイゼーションを促進し、このRCA円形プローブ320はフォワードプライマー322に結合し、このフォワードプライマー322は標的分子特異的ミクロゲルデポジット170に結合する。
【０１１６】
図7Dに示す段階の持続時間は、30秒〜120秒である。図7Dに示す段階は、好ましくは、時間T = T0 + [40〜130]秒で完了する。
【０１１７】
任意の除去段階（図示せず）が、7E〜7Jを参照して後述する段階より前に、図7Dに示すアドレス指定段階の次に追加されてもよいこと、及び図7Dのステップにおける電場と反対方向の、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において、好ましくは起こることが理解される。この取り除く段階は、好ましくはRCA円形プローブ320にハイブリダイズした非特異的標的分子を除去するように作用する。
【０１１８】
以下、通常は図7Dに示すアドレス指定段階の次の段階であり、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において、好ましくは図7Dのステップと同一方向に起こるライゲーション段階を示す図7Eを参照する。ライゲーション段階は、好ましくは、例えばT-4リガーゼ等の、溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ700に導入されるライゲーション酵素728の存在下で起こる。ライゲーション段階の持続時間は、典型的には120〜240秒である。ライゲーション段階は、好ましくはT = T0 + [160〜370]秒で完了する。
【０１１９】
以下、通常は図7Eに示すライゲーション段階の次の段階であり、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において、好ましくは図7Eのステップと同一方向に起こるRCA重合段階を示す図7Fを参照する。RCA重合段階は、好ましくは溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ700に導入されるBstポリメラーゼ酵素729及びdNTP（図示せず）と、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170に結合されるフォワードプライマー322及びリバースプライマー324の存在下で、好ましくは摂氏65度の温度で起こる。RCA重合段階の結果は、長いRCAアンプリコン740の生成である（図7G）。図7Fに示す通り、ポリメラーゼ酵素729の核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320への結合に続いて、矢印742が示す通り、核酸標的分子703が核酸標的分子に特異的なRCA円形プローブ320から移動する。RCA重合段階の持続時間は、典型的には300〜720秒である。RCA重合段階は、好ましくはT = T0 + [460〜1090]秒で完了する。
【０１２０】
以下、通常図7FのRCA重合段階中に起こり、そして好ましくは矢印744が示す通り図7Fのステップの電場の方向と同一及び反対の両方の方向の、センチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において好ましくは起こる、アンプリコン延長圧縮段階を参照する。アンプリコン740の延長は、矢印748が示す方向に起こる。圧縮は、典型的には、矢印748が示すものとは反対方向に起こる。アンプリコンの延長と圧縮は、標的分子特異的ミクロゲルデポジット170に結合するリバースプライマー324のアンプリコン740へのハイブリダイゼーションを強化する。アンプリコンの延長と圧縮の段階は、好ましくはBstポリメラーゼ酵素729、dNTP（図示せず）の存在下、摂氏65度の温度で起こる。の持続時間は、典型的には5〜15秒である。RCA重合段階は、好ましくはT = T0 + [465〜1105]秒で完了する。
【０１２１】
図7F及び7Gに示す段階は、断続的に複数回繰り返されてもよく、図7Fに示す複数の段階は、各々が上記のものよりも短い持続時間であり、かつ図7Gに示す段階によって分離されていることが理解される。
【０１２２】
以下、通常図7FのRCA重合段階及び図7Gのアンプリコン圧縮延長段階中に起こり、そして好ましくは図7Gのステップの電場の方向と通常反対方向の、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において起こるが、好ましくは電場の極性が反転する短時間を含む、指数関数的RCA増幅段階を示す図7Hを参照する。この段階において、追加のアンプリコン750がリバースプライマー324を使用して生成される。
【０１２３】
指数関数的RCA増幅段階は、好ましくはBstポリメラーゼ酵素729、dNTP（図示せず）及びリバースプライマー324の存在下、摂氏65度の温度で起こる。図7FのRCA重合段階及び図7Gのアンプリコン延長段階中に起こる指数関数的RCA増幅段階の持続時間は、典型的には5〜15秒である。図7FのRCA重合段階と、図7Gのアンプリコン延長段階と、図7Hの指数関数的RCA増幅段階は、好ましくはT = T0 + [465〜1105]秒で完了する。
【０１２４】
以下、通常図7FのRCA重合段階と、図7Gのアンプリコン延長圧縮段階と、図7Hの指数関数的RCA増幅段階の完了後に起こり、また、通常図7Hのステップの電場の方向と同じ方向に、好ましくはセンチメートル当たり10〜300ボルトのDC電場存在下において好ましくは起こる、RCA重合後アンプリコン濃縮段階を示す図7Iを参照する。アンプリコン濃縮段階は、矢印760が示す通り、各ミクロゲル領域720内の1か所においてアンプリコン740及び750を濃縮するのに特に有用である。アンプリコン濃縮段階の持続時間は、典型的には10〜30秒である。RCA重合後アドレス指定段階は、好ましくはT = T0 + [475〜1135]秒で完了する。
【０１２５】
以下、通常RCA重合後アドレス指定に続く、レポート段階を示す図7Jを参照する。レポート段階は、溶液を通して電気泳動アレイアセンブリ700に導入されるアンプリコン740及び750に相補的な蛍光レポーター770の存在下で好ましくは起こる。レポート段階の持続時間は、典型的には10〜30秒である。レポート段階は、好ましくはT = T0 + [485〜1165]秒で完了する。
【０１２６】
レポート段階と、図示しないその後の洗浄段階の完了後、多重の予め選択された核酸標的分子の中から、少なくとも1つの核酸標的分子の存在の検出が、従来の蛍光検出技術によって行われる。したがって、少なくとも1つの核酸標的分子の検出は、好ましくは、電気泳動アレイアセンブリ100の内部への溶液702の最初の供給の8分〜20分以内に完了することが理解される。
【０１２７】
溶液701の調製が、患者から血液サンプルを採取すること等によるサンプルの取得から4〜5分以内に完了した場合、少なくとも1つの核酸標的分子の検出は、サンプルの取得から12〜25分以内に完了してもよいことが理解される。
【０１２８】
実施例
実施例1
図7A〜図7Jの方法を採用してNeisseria meningitidisを表す合成DNA標的分子を使用する髄膜炎病原体の検出
100個の不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット190を含む、電気泳動アレイアセンブリ700（図7A）と同様の、ベースの直径が0.45mmで高さが約0.2mm〜0.3mmの電気泳動アレイアセンブリが提供された。48個の不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット190が、フォワードプライマー322に予めハイブリダイズされたRCA円形プローブ320と、各々が髄膜炎の検出に関係がある、異なる9病原体のDNA標的（とりわけ、Neisseria meningitidisのものを含む）に特異的なリバースプライマー324でスポットされた。このようにしてスポットされた48の不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット190は、以下の通り標的分子特異的であった。
デポジット1−Neisseria meningitidis特異的
デポジット2−Neisseria meningitidis特異的
デポジット3−Neisseria meningitidis特異的
デポジット4−Escherichia coli特異的
デポジット5−Escherichia coli特異的
デポジット6−Escherichia coli特異的
デポジット7−Neisseria meningitidis特異的
デポジット8−Neisseria meningitidis特異的
デポジット9−Neisseria meningitidis特異的
デポジット10−Enterovirus特異的
デポジット11−Enterovirus特異的
デポジット12−Neisseria meningitidis特異的
デポジット13−Neisseria meningitidis特異的
デポジット14−Neisseria meningitidis特異的
デポジット15−B群Streptococcus
デポジット16−B群Streptococcus
デポジット17−B群Streptococcus
デポジット18−Neisseria meningitidis特異的
デポジット19−Neisseria meningitidis特異的
デポジット20−Neisseria meningitidis特異的
デポジット21−Haemophilus influenzae特異的
デポジット22−Haemophilus influenzae特異的
デポジット23−Haemophilus influenzae特異的
デポジット24−Neisseria meningitidis特異的
デポジット25−Neisseria meningitidis特異的
デポジット26−Neisseria meningitidis特異的
デポジット27−Human herpes virus特異的
デポジット28−Human herpes virus特異的
デポジット29−Human herpes virus特異的
デポジット30−Human herpes virus特異的
デポジット31−Neisseria meningitidis特異的
デポジット32−Neisseria meningitidis特異的
デポジット33−Neisseria meningitidis特異的
デポジット34−Human parechovirus特異的
デポジット35−Human parechovirus特異的
デポジット36−Human parechovirus特異的
デポジット37−Neisseria meningitidis特異的
デポジット38−Neisseria meningitidis特異的
デポジット39−Neisseria meningitidis特異的
デポジット40−Lysteria monocytogenes特異的
デポジット41−Lysteria monocytogenes特異的
デポジット42−Lysteria monocytogenes特異的
デポジット43−Neisseria meningitidis特異的
デポジット44−Neisseria meningitidis特異的
デポジット45−Neisseria meningitidis特異的
デポジット46−Varicella zoster特異的
デポジット47−Varicella zoster特異的
デポジット48−Varicella zoster特異的
【０１２９】
Neisseria meningitidisを表す核酸標的分子703（濃度100nM）を含む溶液702をT0として定義された時間に電気泳動アレイの内部容積に供給した。溶液702は、迅速なDNA輸送と、ミクロゲル上に堆積されるRCAプローブへのハイブリダイゼーションをサポートする低伝導性緩衝液も含んでいた。
【０１３０】
溶液702の供給により、乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190が10秒の持続時間後、参照番号170で示す水和状態になった（図7B〜7C）。
【０１３１】
時間T = T0 + 10秒に、1.6mAの定電流を作用電極接点と対電極接点260及び250のそれぞれに印加して、4.5Vの電圧を生じさせて、電気泳動アレイ全体に及ぶ12.5V/cmの電場を得て、電気泳動アドレス指定を生成させた（図7D）。電気泳動アドレス指定の持続時間は、40秒であった。
【０１３２】
時間T = T0 + 50秒に、ライゲーション反応酵素T4リガーゼ（Blunt T/A，New England Biolabsより入手）を含むライゲーション反応溶液を電気泳動アレイの内部容積に供給して、持続時間約180秒で溶液702と交換した（図7E）。
【０１３３】
時間T = T0 + 230秒に、Bstポリメラーゼ酵素729及びdNTP（New England Biolabsから入手）を含むポリメラーゼ溶液を電気泳動アレイの内部容積に供給して、持続時間約720秒でライゲーション反応溶液と交換した（図7F）。
【０１３４】
時間T = T0 + 950秒に、1.6mAの定電流を作用電極接点と対電極接点260及び250のそれぞれに印加して、4.5Vの電圧を生じさせて、電気泳動アレイ全体に及ぶ12.5V/cmの電場を得て、ポリメラーゼ溶液からRCAアンプリコンの再捕捉を提供した。このステップの持続時間は約20秒であった（図7I）。
【０１３５】
時間T = T0 + 970秒に、蛍光標識したオリゴヌクレオチドを含む赤色のレポーター溶液（Alexa647，カリフォルニア州サンノゼIntegrated Device Technology, Inc.から入手）を電気泳動アレイの内部容積に供給して、持続時間約30秒でポリメラーゼ溶液と交換した（図7J）。赤色のレポーター溶液を洗い落としてから、電気泳動アレイアセンブリ700の蛍光画像を窓130越しに取得すると、不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット170のうち、1、2、3、7、8、9、13、14、15、19、20、21、25、26、27、31、32、33、37、38、39、43、44及び45からNeisseria meningitidisを表す核酸標的分子703の存在が検出された。不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット170のうち4、5、6、10、11、12、16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35、36、40、41、42、46、47及び48からはNeisseria meningitidisを表す核酸標的分子703の存在は検出されなかった。
【０１３６】
検出結果を図8にまとめる。デポジット1、2、3、7、8、9、13、14、15、19、20、21、25、26、27、31、32、33、37、38、39、43、44及び45から得られた蛍光シグナルのデポジット4、5、6、10、11、12、16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35、36、40、41、42、46、47及び48から得られた蛍光シグナルに対する強度の平均比率は約8.5であったことが留意される。
【０１３７】
実施例2
図7A〜図7Jの方法を採用して脳脊髄液サンプルにスパイクしたNeisseria meningitides病原体から抽出したゲノムDNA標的分子を使用する髄膜炎病原体の検出
100個の不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット190を含む、電気泳動アレイアセンブリ700（図7A）と同様の、ベースの直径が0.45mmで高さが約0.2mm〜0.3mmの電気泳動アレイアセンブリが提供された。21の不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット190が、フォワードプライマー322に予めハイブリダイズされたRCA円形プローブ320と、各々が髄膜炎の検出に関係がある、異なる9病原体のDNA標的（とりわけ、Neisseria meningitidisのものを含む）に特異的なリバースプライマー324でスポットされた。このようにしてスポットされた21の不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット190は、以下の通り標的分子特異的であった。
デポジット1−Escherichia coli特異的
デポジット2−Escherichia coli特異的
デポジット3−Neisseria meningitidis特異的
デポジット4−Neisseria meningitidis特異的
デポジット5−Neisseria meningitidis特異的
デポジット6−Enterovirus特異的
デポジット7−Enterovirus特異的
デポジット8−Neisseria meningitidis特異的
デポジット9−Neisseria meningitidis特異的
デポジット10−Neisseria meningitidis特異的
デポジット11−B群Streptococcus
デポジット12−B群Streptococcus
デポジット13−Haemophilus influenzae特異的
デポジット14−Haemophilus influenzae特異的
デポジット15−Neisseria meningitidis特異的
デポジット16−Neisseria meningitidis特異的
デポジット17−Neisseria meningitidis特異的
デポジット18−Lysteria monocytogenes特異的
デポジット19−Lysteria monocytogenes特異的
デポジット20−Varicella zoster特異的
デポジット21−Varicella zoster特異的
【０１３８】
脳脊髄液（CSF）の臨床サンプルをNeisseria meningitides 病原体でスパイクして、ゲノムDNA抽出を一般的なビーズベースのDNA抽出法を使用して行った。脳脊髄液におけるDNA標的のインプット濃度は、脳脊髄液の臨床サンプル中のNeisseria meningitides病原体濃度が、CSFマイクロリットルあたりDNAの720コピーが得られたリファレンスリアルタイムPCR法によって決定した。
【０１３９】
スパイクした臨床サンプルから調製した溶液702をT0として定義された時間に、電気泳動アレイの内部容積に供給した。溶液702702は、迅速なDNA輸送と、ミクロゲル上に堆積されるRCAプローブへのハイブリダイゼーションをサポートする低伝導性緩衝液も含んでいた。
【０１４０】
溶液702の供給により、乾燥標的分子特異的ミクロゲルデポジット190が10秒の持続時間後、参照番号170で示す水和状態になった（図7B〜7C）。
【０１４１】
時間T = T0 + 10秒に、1.6mAの定電流を作用電極接点と対電極接点260及び250のそれぞれに印加して、4.5Vの電圧を生じさせて、電気泳動アレイ全体に及ぶ12.5V/cmの電場を得て、電気泳動アドレス指定を生成させた（図7D）。電気泳動アドレス指定の持続時間は、40秒であった。
【０１４２】
時間T = T0 + 50秒に、-1.6mAの定電流を作用電極接点と対電極接点260及び250のそれぞれを通して印加することにより、逆極性電場を印加して、4.5Vの電圧を生じさせて、電気泳動アレイ全体に渡る12.5V/cmの電場を得て、非特異的に結合されたDNA標的の除去を向上させた。電気泳動アドレス指定の持続時間は、10秒であった（図7G）。
【０１４３】
時間T = T0 + 60秒に、ライゲーション反応酵素T4リガーゼ（Blunt T/A，New England Biolabsから入手）を含むライゲーション反応溶液を電気泳動アレイの内部容積に供給して、持続時間約180秒で溶液702と交換した（図7E）。
【０１４４】
時間T = T0 + 240秒に、Bstポリメラーゼ酵素729及びdNTP（New England Biolabsから入手）を含むポリメラーゼ溶液を電気泳動アレイの内部容積に供給して、持続時間約720秒でライゲーション反応溶液と交換した（図7F）。
【０１４５】
時間T = T0 + 960秒に、1.6mAの定電流を作用電極接点と対電極接点260及び250のそれぞれに印加して、4.5Vの電圧を生じさせて、電気泳動アレイ全体に及ぶ12.5V/cmの電場を得て、ポリメラーゼ溶液からRCAアンプリコンの再捕捉を提供した。このステップの持続時間は約20秒であった（図7I）。
【０１４６】
時間T = T0 + 980秒に、蛍光標識したオリゴヌクレオチドを含む赤色のレポーター溶液（Alexa647，カリフォルニア州サンノゼIntegrated Device Technology, Inc.から入手）を電気泳動アレイの内部容積に供給して、持続時間約30秒でポリメラーゼ溶液と交換した（図7J）。赤色のレポーター溶液を洗い落としてから、電気泳動アレイアセンブリ700の蛍光画像を窓130越しに取得すると、不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット170のうち3、4、5、8、9、10、15、16及び17からNeisseria meningitidisを表す核酸標的分子703の存在が検出された。不動にされ乾燥された標的分子特異的ミクロゲルデポジット170のうち1、2、6、7、11、12、13、14、18、19、20及び21からはNeisseria meningitidisを表す核酸標的分子703の存在は検出されなかった。
【０１４７】
検出結果を図9にまとめる。デポジット3、4、5、8、9、10、15、16及び17から得られた蛍光シグナルのデポジット1、2、6、7、11、12、13、14、18、19、20及び21から得られた蛍光シグナルに対する強度の平均比率は約4.3であったことが留意される。
【０１４８】
本発明は、本明細書中で具体的に説明したり図示したりしたものに限定されず、先行技術に存在しない、本明細書中で説明した特徴の組合せまたは個々の特徴の組合せ及び改変も含むことが当業者に理解されるであろう。
【図１Ａ】
2021509278.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
2021509278.tif 000005
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2021509278.tif 000007
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
2021509278.tif 000013
【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021509278.tif 000017
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
2021509278.tif 000022
【図４Ｈ】
2021509278.tif 000023
【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
2021509278.tif 000025
【図５Ａ】
2021509278.tif 000026
【図５Ｂ】
2021509278.tif 000027
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2021509278.tif 000029
【図５Ｅ】
2021509278.tif 000030
【図５Ｆ】
2021509278.tif 000031
【図５Ｇ】
2021509278.tif 000032
【図５Ｈ】
2021509278.tif 000033
【図５Ｉ】
2021509278.tif 000034
【図５Ｊ】
2021509278.tif 000035
【図６Ａ】
2021509278.tif 000036
【図６Ｂ】
2021509278.tif 000037
【図６Ｃ】
2021509278.tif 000038
【図６Ｄ】
2021509278.tif 000039
【図６Ｅ】
2021509278.tif 000040
【図６Ｆ】
2021509278.tif 000041
【図６Ｇ】
2021509278.tif 000042
【図６Ｈ】
2021509278.tif 000043
【図６Ｉ】
2021509278.tif 000044
【図６Ｊ】
2021509278.tif 000045
【図７Ａ】
2021509278.tif 000046
【図７Ｂ】
2021509278.tif 000047
【図７Ｃ】
2021509278.tif 000048
【図７Ｄ】
2021509278.tif 000049
【図７Ｅ】
2021509278.tif 000050
【図７Ｆ】
2021509278.tif 000051
【図７Ｇ】
2021509278.tif 000052
【図７Ｈ】
2021509278.tif 000053
【図７Ｉ】
2021509278.tif 000054
【図７Ｊ】
2021509278.tif 000055
【図８】
2021509278.tif 000056
【図９】
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【国際調査報告】
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