(57)【要約】本開示は、機能喪失コルヌリン（ＣＲＮＮ）タンパク質をコードする変異を含む、ｃＤＮＡを含む、核酸分子を提供する。本開示はまた、７９位に対応する位置にトランケーションを含む、単離及び組換え型のヒト機能喪失コルヌリンタンパク質バリアントを提供する。トランケーション、及びこの変化をコードする核酸分子は、例えば、乾癬、湿疹、またはアトピー性皮膚炎などの皮膚障害に関連する。本開示はまた、ＣＲＮＮをコードする核酸分子におけるこのような変異の識別に基づいて、対象が皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有するかどうかを判定するための方法を提供する。皮膚障害のリスクまたは皮膚障害を有する対象は、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤で処置され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたコルヌリンタンパク質をコードする核酸配列を含むｃＤＮＡ。
【請求項２】
前記コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項３】
前記コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７６位、７８位、及び７９位に対応する位置のいずれか１つに、野生型コルヌリンタンパク質と比較して異なるアミノ酸を含む、請求項１または請求項２に記載のｃＤＮＡ。
【請求項４】
前記コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載のｃＤＮＡ。
【請求項５】
前記コルヌリンタンパク質が、配列番号８によるアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項６】
前記コルヌリンタンパク質が、配列番号１０によるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のｃＤＮＡ。
【請求項７】
前記ｃＤＮＡが、配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ。
【請求項８】
前記ｃＤＮＡが、配列番号６による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＴ及びＴＧＴを含む、請求項７に記載のｃＤＮＡ。
【請求項９】
前記ｃＤＮＡが、配列番号６を含む、請求項７に記載のｃＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のｃＤＮＡを含む、ベクター。
【請求項１１】
前記ベクターがプラスミドである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記ベクターがウイルスである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のｃＤＮＡを含む、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
前記ｃＤＮＡが、前記宿主細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結している、請求項１３または請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記プロモーターが外来性プロモーターである、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１５または請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有するヒト対象を識別するための方法であって、前記対象から得られた試料中の、
機能喪失コルヌリンタンパク質、及び／または
機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする核酸分子
の存在または非存在を検知することを含み、
前記機能喪失コルヌリンタンパク質及び／または前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子の存在が、前記対象が皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有することを示す、前記方法。
【請求項２０】
前記皮膚障害が、乾癬、湿疹、またはアトピー性皮膚炎である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記皮膚障害が乾癬である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、トランケート型コルヌリンタンパク質である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含み、かつ配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされている、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記トランケート型コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７６位、７８位、及び７９位に対応する位置のいずれか１つに、野生型コルヌリンタンパク質と比較して異なるアミノ酸を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記トランケート型コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、インビトロ方法である、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料中の前記機能喪失コルヌリンタンパク質の存在または非存在が、前記機能喪失コルヌリンタンパク質に対して特異的な抗体を用いて検知される、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質に対して特異的な前記抗体が、
ｉ）配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステイン、または
ｉｉ）配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを生じるフレームシフト突然変異に起因して前記機能喪失コルヌリンタンパク質に作られたエピトープ
に対して特異的である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記検知が、前記機能喪失コルヌリンタンパク質に対して特異的な前記抗体の反応を、野生型コルヌリンに対して特異的な抗体の反応と比較することをさらに含む、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料中の前記機能喪失コルヌリンタンパク質の存在または非存在が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検知される、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８を含む、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料中の前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子の存在または非存在が、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを作るフレームシフト突然変異が前記核酸分子中にあるかどうかを判定することによって検知される、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記検知ステップが、前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子のうちの少なくとも一部分をシーケンシングすることを含み、前記シーケンシングされる核酸分子が、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたコルヌリンタンパク質をコードする、請求項１９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
シーケンシングされる前記核酸分子のうちの前記一部分が、配列番号８による６９位に対応する位置をコードするコドンを包含する複数の位置を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記検知ステップが、前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子全体をシーケンシングすることを含む、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記検知ステップが、
コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子のうちの少なくとも一部分を増幅することであって、前記増幅する核酸分子が、配列番号８による６９位に対応する位置におけるアミノ酸をコードするコドンを包含する、前記増幅することと、
前記増幅した核酸分子を検知可能な標識で標識することと、
前記標識した核酸分子を、プローブを含む支持体と接触させることであって、前記プローブが、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する核酸配列にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、前記接触させることと、
前記検知可能な標識を検知することと
を含む、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料中の前記核酸分子が、ｍＲＮＡであり、前記検知ステップが、前記増幅ステップの前に前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記検知ステップが、
コルヌリンタンパク質をコードする核酸分子を、検知可能な標識を含むプローブと接触させることであって、前記プローブが、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する核酸配列にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、前記接触させることと、
前記検知可能な標識を検知することと
を含む、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸分子が、前記ヒト対象から得られた細胞内に存在する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子が、ゲノムＤＮＡである、請求項１９〜２６及び３３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ゲノムＤＮＡが、配列番号２を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子が、ｍＲＮＡである、請求項１９〜２６及び３３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｍＲＮＡが、配列番号４を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子が、ｃＤＮＡである、請求項１９〜２６及び３３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｃＤＮＡが、配列番号６を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ヒト対象の、皮膚障害を診断するため、または皮膚障害の発症リスクを検知するための方法であって、
前記ヒト対象から得られた機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする核酸分子を検知すること、及び／または
前記ヒト対象から得られた機能喪失コルヌリンタンパク質を検知すること、及び、
前記対象が前記皮膚障害の１つ以上の症状を有する場合に、前記ヒト対象を前記皮膚障害と診断すること、または、前記対象が前記皮膚障害の１つ以上の症状を有しない場合に、前記ヒト対象を皮膚障害の発症リスクがあるものと診断すること
を含む、前記方法。
【請求項４８】
前記皮膚障害が、乾癬、湿疹、またはアトピー性皮膚炎である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記皮膚障害が乾癬である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、トランケート型コルヌリンタンパク質である、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含み、かつ配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされている、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記トランケート型コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７６位、７８位、及び７９位に対応する位置のいずれか１つに、野生型コルヌリンタンパク質と比較して異なるアミノ酸を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記トランケート型コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項５２または請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、前記機能喪失コルヌリンタンパク質に対して特異的な抗体を用いて検知される、請求項４７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質に対して特異的な前記抗体が、
ｉ）配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステイン、または
ｉｉ）配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを生じるフレームシフト突然変異に起因して前記コルヌリンタンパク質に作られたエピトープ
に対して特異的である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記検知が、前記機能喪失コルヌリンタンパク質に対して特異的な前記抗体の反応を、野生型コルヌリンに対して特異的な抗体の反応と比較することをさらに含む、請求項５５または請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検知される、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８を含む、請求項４７〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子が、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを作るフレームシフト突然変異を前記核酸分子中で検知することによって検知される、請求項４７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記検知ステップが、前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子のうちの少なくとも一部分をシーケンシングすることを含む、請求項４７〜５４及び６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
シーケンシングされる前記核酸分子のうちの前記一部分が、配列番号８による６９位に対応する位置をコードするコドンを包含する複数の位置を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記検知ステップが、前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子全体をシーケンシングすることを含む、請求項４７〜５４及び６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記検知ステップが、
前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子のうちの少なくとも一部分を増幅することであって、前記増幅する核酸分子が、配列番号８による６９位に対応する位置におけるアミノ酸をコードするコドンを包含する、前記増幅することと、
前記増幅した核酸分子を検知可能な標識で標識することと、
前記標識した核酸分子を、プローブを含む支持体と接触させることであって、前記プローブが、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する核酸配列にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、前記接触させることと、
前記検知可能な標識を検知することと
を含む、請求項４７〜５４及び６０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記核酸分子が、ｍＲＮＡであり、前記方法が、前記増幅ステップの前に前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記検知ステップが、
前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子を、検知可能な標識を含むプローブと接触させることであって、前記プローブが、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する核酸配列にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、前記接触させることと、
前記検知可能な標識を検知することと
を含む、請求項４７〜５４及び６０〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記核酸分子が、前記ヒト対象から得られた細胞内に存在する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子が、ゲノムＤＮＡである、請求項４７〜５４及び６０〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ゲノムＤＮＡが、配列番号２を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子が、ｍＲＮＡである、請求項４７〜５４及び６０〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ｍＲＮＡが、配列番号４を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸分子が、ｃＤＮＡである、請求項４７〜５４及び６０〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ｃＤＮＡが、配列番号６を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が前記対象において検知され、かつ前記対象が前記皮膚障害を有するものと診断された場合、前記皮膚障害を処置するのに有効な薬剤で前記対象を処置することをさらに含む、請求項４７〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記皮膚障害を処置するのに有効な前記薬剤が、ビタミンを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記ビタミンが、ビタミンＡまたはビタミンＤである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記薬剤がサリチル酸である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記薬剤がエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記薬剤がコルチコステロイドである、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
前記薬剤がソラレンである、請求項７４に記載の方法。
【請求項８１】
前記薬剤がメトトレキサートである、請求項７４に記載の方法。
【請求項８２】
前記薬剤がシクロスポリンである、請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
前記薬剤が抗体である、請求項７４に記載の方法。
【請求項８４】
前記抗体がアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記抗体がブロダルマブ（Ｓｉｌｉｑ（登録商標））である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記抗体がエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗体がイキセキズマブ（Ｔａｌｔｚ（登録商標））である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記抗体がセクキヌマブ（Ｃｏｓｅｎｔｙｘ（登録商標））である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
前記抗体がウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標））である、請求項８３に記載の方法。
【請求項９０】
機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする核酸配列、または前記核酸配列の相補体を含む、単離された核酸分子。
【請求項９１】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、トランケート型コルヌリンタンパク質である、請求項９０に記載の単離された核酸分子。
【請求項９２】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項９０または請求項９１に記載の核酸分子。
【請求項９３】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含み、かつ配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされている、請求項９０〜９２のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項９４】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７６位、７８位、及び７９位に対応する位置のいずれか１つに、野生型コルヌリンタンパク質と比較して異なるアミノ酸を含む、請求項９３に記載の単離された核酸分子。
【請求項９５】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項９３または請求項９４に記載の単離された核酸分子。
【請求項９６】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８によるアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項９０〜９５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項９７】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号１０によるアミノ酸配列を含む、請求項９０〜９６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項９８】
前記核酸分子が、ＤＮＡを含む、請求項９０〜９７のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項９９】
前記核酸分子が、ゲノムＤＮＡであり、配列番号２による３３７５位に対応する位置にチミンを含む、請求項９８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１００】
前記ゲノムＤＮＡが、配列番号２を含む、請求項９９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０１】
前記核酸分子が、ｃＤＮＡであり、配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを含む、請求項９８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０２】
前記ｃＤＮＡが、配列番号６を含む、請求項１０１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０３】
前記核酸分子が、ＲＮＡを含む、請求項９０〜９７のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０４】
前記核酸分子が、ｍＲＮＡであり、配列番号４による２０５位に対応する位置にウラシルを含む、請求項１０３に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０５】
前記核酸分子が、ｍＲＮＡであり、配列番号４による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＵ及びＵＧＵを含む、請求項１０３または請求項１０４に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０６】
前記核酸分子が、配列番号４を含む、請求項１０３〜１０５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０７】
請求項９０〜１０６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１０８】
前記ベクターがプラスミドである、請求項１０７に記載のベクター。
【請求項１０９】
前記ベクターがウイルスである、請求項１０７に記載のベクター。
【請求項１１０】
請求項９０〜１０６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１１１】
請求項１０７〜１０９のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１１２】
前記核酸配列が、前記宿主細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結している、請求項１１０または請求項１１１に記載の宿主細胞。
【請求項１１３】
前記プロモーターが外来性プロモーターである、請求項１１２に記載の宿主細胞。
【請求項１１４】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１１２または請求項１１３に記載の宿主細胞。
【請求項１１５】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１１０〜１１４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１１６】
機能喪失コルヌリンタンパク質を含む、単離または組換えポリペプチド。
【請求項１１７】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、トランケート型コルヌリンタンパク質である、請求項１１６に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項１１８】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項１１６または請求項１１７に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項１１９】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含み、かつ配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされている、請求項１１６〜１１８のいずれか１項に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項１２０】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７６位、７８位、及び７９位に対応する位置のいずれか１つに、野生型コルヌリンタンパク質と比較して異なるアミノ酸を含む、請求項１１９に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項１２１】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１１９または請求項１２０に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項１２２】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８によるアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項１１６〜１２１のいずれか１項に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項１２３】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号１０によるアミノ酸配列を含む、請求項１１６〜１２２のいずれか１項に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項１２４】
前記ポリペプチドが、異種ポリペプチドに融合している、請求項１１６〜１２３のいずれか１項に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項１２５】
前記異種ポリペプチドが、ペプチド精製タグ、蛍光タンパク質、またはペプチド精製タグ及び蛍光タンパク質の両方を含む、請求項１２４に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項１２６】
前記ポリペプチドが、検知可能な標識に連結している、請求項１１６〜１２３のいずれか１項に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項１２７】
前記検知可能な標識が、蛍光標識または放射標識である、請求項１２６に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項１２８】
請求項１１６〜１２７のいずれか１項に記載の単離または組換えポリペプチドと担体とを含む、組成物。
【請求項１２９】
少なくとも約１５ヌクレオチドを含む核酸配列を含むプローブまたはプライマーであって、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを有し、かつ配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされている機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする核酸配列を有する核酸分子に特異的にハイブリダイズするか、または前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズする、前記プローブまたはプライマー。
【請求項１３０】
前記プローブまたはプライマーがＤＮＡを含む、請求項１２９に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１３１】
前記プローブまたはプライマーがＲＮＡを含む、請求項１２９に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１３２】
前記プローブまたはプライマーが、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する前記核酸分子の一部分に特異的にハイブリダイズする、請求項１２９〜１３１のいずれか１項に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１３３】
前記プローブまたはプライマーが、前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする前記核酸配列またはその相補体にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする、請求項１２９〜１３２のいずれか１項に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１３４】
前記プローブまたはプライマーが標識を含む、請求項１２９〜１３３のいずれか１項に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１３５】
前記標識が、蛍光標識、放射標識、またはビオチンである、請求項１３４に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１３６】
請求項１２９〜１３３のいずれか１項に記載のプローブが結合している基質を含む支持体。
【請求項１３７】
前記支持体がマイクロアレイである、請求項１３６に記載の支持体。
【請求項１３８】
配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされた機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする核酸分子の核酸配列に相補的な核酸配列を含む、変異特異的プローブまたはプライマーであって、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する前記核酸分子の一部分に相補的な核酸配列を含む、前記変異特異的プローブまたはプライマー。
【請求項１３９】
前記変異特異的プローブまたはプライマーが、少なくとも約１５ヌクレオチドを含む、請求項１３８に記載の変異特異的プローブまたはプライマー。
【請求項１４０】
機能喪失コルヌリンタンパク質を有するヒト対象の皮膚障害の処置における使用のための薬剤。
【請求項１４１】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、トランケート型コルヌリンタンパク質である、請求項１４０に記載の使用のための薬剤。
【請求項１４２】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項１４０または請求項１４１に記載の使用のための薬剤。
【請求項１４３】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含み、かつ配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされている、請求項１４０〜１４２のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１４４】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７６位、７８位、及び７９位に対応する位置のいずれか１つに、野生型コルヌリンタンパク質と比較して異なるアミノ酸を含む、請求項１４３に記載の使用のための薬剤。
【請求項１４５】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１４３または請求項１４４に記載の使用のための薬剤。
【請求項１４６】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８によるアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項１４０〜１４５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１４７】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号１０によるアミノ酸配列を含む、請求項１４０〜１４６のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１４８】
前記ヒト対象が、前記機能喪失コルヌリンタンパク質及び／または前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする核酸分子に対して陽性の検査結果を示している、請求項１４０〜１４７のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１４９】
前記処置が、前記ヒト対象が前記機能喪失コルヌリンタンパク質及び／または前記機能喪失コルヌリンタンパク質をコードする核酸分子を有するか否かを判定するステップを含む、請求項１４０〜１４８のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１５０】
前記ヒト対象が、請求項１〜６９のいずれか１項に記載の方法を使用することにより、皮膚障害を有するものとして、または皮膚障害の発症リスクを有するものとして識別されている、請求項１４０〜１４９のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１５１】
前記ヒト対象が、乾癬または乾癬の発症リスクとして識別される、請求項１４０〜１５０のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１５２】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７６位、７８位、及び７９位に対応する位置のいずれか１つに、野生型コルヌリンタンパク質と比較して異なるアミノ酸を含む、請求項１４０〜１５１のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１５３】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項１４０〜１５２のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１５４】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１４０〜１５３のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１５５】
前記機能喪失コルヌリンタンパク質が、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む、請求項１４０〜１５４のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１５６】
前記薬剤が、ビタミンを含む、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１５７】
前記ビタミンが、ビタミンＡまたはビタミンＤである、請求項１５６に記載の使用のための薬剤。
【請求項１５８】
前記薬剤がサリチル酸である、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１５９】
前記薬剤がエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６０】
前記薬剤がコルチコステロイドである、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６１】
前記薬剤がソラレンである、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６２】
前記薬剤がメトトレキサートである、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６３】
前記薬剤がシクロスポリンである、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６４】
前記薬剤が抗体である、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６５】
前記抗体がアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））である、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６６】
前記抗体がブロダルマブ（Ｓｉｌｉｑ（登録商標））である、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６７】
前記抗体がエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））である、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６８】
前記抗体がイキセキズマブ（Ｔａｌｔｚ（登録商標））である、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６９】
前記抗体がセクキヌマブ（Ｃｏｓｅｎｔｙｘ（登録商標））である、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１７０】
前記抗体がウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標））である、請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本願には、２０１８年１０月１４日に作成された１８９２３８００４０２ＳＥＱという名称で２４キロバイトのサイズのテキストファイルとして電子提出された配列表が含まれる。配列表は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は広くは、遺伝学の分野に関するものである。さらに詳細には、本開示は、例えば皮膚障害に関連する、コルヌリン（ＣＲＮＮ）における遺伝子変異及びポリペプチドバリアントに関する。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫障害は、種々の器官に様々な重症度で影響を及ぼし得る。ある特定の自己免疫障害は、炎症のある皮膚症状を示す場合があり、こうした免疫関連皮膚障害、例えば乾癬、湿疹、またはアトピー性皮膚炎を患う患者において、他の異常は、かなりの身体的及び心理的苦悩をもたらし得る。乾癬は、主に皮膚科学的症状を有するが、関節及び身体の一部の粘膜領域にも影響を及ぼし得る免疫関連障害である。この疾患を患う患者は、皮膚の乾燥斑、特有の（ｎａｍｅｄ）鱗屑、または膿疱及び丘疹などの他の病変の出現に加えて、炎症、疼痛、及びそう痒を訴える。家族内での乾癬などの皮膚障害の発生は文書で十分に裏付けられており、したがって、これらの疾患を発症する感受性において遺伝学が重要な役割を果たしていると推論される。しかしながら、主要組織適合遺伝子複合体の他に、疾患発症の重要な誘因となるもの、または疾患発現に対する感受性を与えるものとして識別されている遺伝子は数少ない。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、例えば、乾癬、湿疹、及びアトピー性皮膚炎などの皮膚障害に関連することが本明細書において実証されている、ＣＲＮＮバリアントポリペプチドをコードする核酸分子（すなわち、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡ）、及びＣＲＮＮバリアントポリペプチドを提供する。
【０００５】
本開示は、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）をコードする核酸配列、またはこの核酸配列の相補体を含む、単離された核酸分子を提供する。
【０００６】
本開示はまた、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）のうちの少なくとも一部分をコードする核酸配列、またはこの核酸配列の相補体を含む、ゲノムＤＮＡ分子を提供する。
【０００７】
本開示はまた、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）のうちの少なくとも一部分をコードする核酸配列、またはこの核酸配列の相補体を含む、ｃＤＮＡ分子を提供する。
【０００８】
本開示はまた、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）のうちの少なくとも一部分をコードする核酸配列、またはこの核酸配列の相補体を含む、ｍＲＮＡ分子を提供する。
【０００９】
本開示はまた、本明細書に開示する単離された核酸分子のうちのいずれかを含むベクターを提供する。
本開示はまた、本明細書に開示する単離された核酸分子またはベクターのうちのいずれかと担体とを含む、組成物を提供する。
【００１０】
本開示はまた、本明細書に開示する単離された核酸分子またはベクターのうちのいずれかを含む、宿主細胞を提供する。
本開示はまた、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）のうちの少なくとも一部分を含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。
【００１１】
本開示はまた、本明細書に開示する単離または組換えポリペプチドのうちのいずれかと担体とを含む、組成物を提供する。
本開示はまた、少なくとも約５ヌクレオチドを含む核酸配列を含むプローブまたはプライマーであって、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）をコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズするか、またはヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）をコードする核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズする、プローブまたはプライマーを提供する。
【００１２】
本開示はまた、本明細書に開示するプローブのうちのいずれかがハイブリダイズする基質を含む支持体を提供する。
本開示はまた、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列に相補的な核酸配列を含む変異特異的プローブまたはプライマーであって、配列番号８による６９〜７６位、７８位、または７９位に対応する任意の複数の位置をコードする核酸分子の一部分に相補的な核酸配列を含む、変異特異的プローブまたはプライマーを提供する。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたはプライマーは、配列番号８による６９位に対応する位置をコードする核酸分子の一部分、またはその相補体に特異的にハイブリダイズする。変異特異的プローブまたはプライマーは、野生型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を有する核酸分子にはハイブリダイズしない。
【００１３】
本開示はまた、皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有するヒト対象を識別するための方法であって、対象から得られた試料中の、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子の存在または非存在を検知することを含み、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子の存在が、対象が皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有することを示す、方法を提供する。
【００１４】
本開示はまた、皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有するヒト対象を識別するための方法であって、対象から得られた試料中の、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくは配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくは配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子の存在または非存在を検知することを含み、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子の存在が、対象が皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有することを示す、方法を提供する。
【００１５】
本開示はまた、ヒト対象の、皮膚障害を診断するため、または皮膚障害の発症リスクを検知するための方法であって、ヒト対象から得られたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子において、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする変異を検知すること、及び、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有する場合に、ヒト対象を皮膚障害と診断すること、または、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有しない場合に、ヒト対象を皮膚障害の発症リスクがあるものと診断することを含む、方法を提供する。
【００１６】
本開示はまた、ヒト対象の、皮膚障害を診断するため、または皮膚障害の発症リスクを検知するための方法であって、ヒト対象から得られたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子において、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくは配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードする変異を検知すること、及び、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有する場合に、ヒト対象を皮膚障害と診断すること、または、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有しない場合に、ヒト対象を皮膚障害の発症リスクがあるものと診断することを含む、方法を提供する。
【００１７】
本開示はまた、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質を有するヒト対象の皮膚障害の処置における使用のための薬剤を提供する。
本開示はまた、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質を有するヒト対象の皮膚障害の処置における使用のための薬剤を提供する。
【００１８】
本開示はまた、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質を有するヒト対象の皮膚障害の処置における使用のための薬剤を提供する。
添付の図面は、本明細書に援用され、かつ本明細書の一部を構成し、いくつかの態様を図示するとともに、説明と併せて、本開示の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】乾癬と診断された皮膚障害を有する家族における、フレームシフト及び７９位におけるＣＲＮＮタンパク質の下流トランケーションをもたらすＣＲＮＮ遺伝子における新規の稀な挿入バリアントの識別及び分離を示す。
【図１Ｂ】乾癬と診断された皮膚障害を有する家族における、フレームシフト及び７９位におけるＣＲＮＮタンパク質の下流トランケーションをもたらすＣＲＮＮ遺伝子における新規の稀な挿入バリアントの識別及び分離を示す。
【図１Ｃ】乾癬と診断された皮膚障害を有する家族における、フレームシフト及び７９位におけるＣＲＮＮタンパク質の下流トランケーションをもたらすＣＲＮＮ遺伝子における新規の稀な挿入バリアントの識別及び分離を示す。
【図１Ｄ】乾癬と診断された皮膚障害を有する家族における、フレームシフト及び７９位におけるＣＲＮＮタンパク質の下流トランケーションをもたらすＣＲＮＮ遺伝子における新規の稀な挿入バリアントの識別及び分離を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示のさらなる利点は、以下の説明に部分的に示され、その説明から一部が明らかになるか、または本明細書に開示されている実施形態を実施することによって認識され得る。本開示の利点は、添付の特許請求の範囲で具体的に示される要素及び組み合わせによって実現及び達成される。上記の全般的な説明及び以下の詳細な説明はいずれも、例示及び説明に過ぎず、特許請求される実施形態を制限するものではないことを理解されたい。
【００２１】
乾癬、湿疹、またはアトピー性皮膚炎などの皮膚障害を有する家族における稀なバリアントの研究は、疾患発現を誘発し得る環境的刺激に対する保因者の感受性を高め得る、免疫調節または上皮分化、完全性及び維持に関与するものを含め、疾患発症に関与する新規の遺伝子を明らかにする大きな機会を提供する。本開示は、ＣＲＮＮの生物学的現象の理解を助けるとともに、皮膚障害の対象の診断及び処置を容易にするＣＲＮＮバリアントを提供する。
【００２２】
本明細書全体を通じて、様々な参照文献（特許、特許出願、アクセッション番号、技術論文及び学術論文を含む）が引用されている。各参照文献は、参照により、その全体が、あらゆる目的で、本明細書に援用される。
【００２３】
本開示の態様に関する様々な用語が本明細書及び特許請求の範囲の随所で使用される。別段に示されていない限り、このような用語には、当該技術分野における通常の意味を付与するものとする。具体的に定義されているその他の用語は、本明細書に示されている定義と一致する形で解釈されるものとする。
【００２４】
別段に明示的な定めのない限り、本明細書に示されているいずれの方法または態様も、そのステップを特定の順序で行う必要があるものとして解釈するようには意図されていない。したがって、ステップを特定の順序に限定すべきことが、特許請求の範囲または説明において、方法クレームによって具体的に定められていない場合には、いかなる点においても、順序を定めるようには意図されていない。これは、ステップの配置または作業の流れに関する論理的な問題、文法構成または句読法から派生する明らかな意味、または本明細書に記載の態様の数または種類を含めた、任意のあり得る非明示的な解釈の根拠に対して成り立つ。
【００２５】
本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の参照対象が含まれる。
本明細書で使用する場合、「対象」及び「患者」という用語は、交換可能に使用される。対象には、哺乳動物を含む任意の動物が含まれ得る。哺乳動物としては、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ブタ）、ペット（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ）、及びヒト以外の霊長類動物が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、または「オリゴヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含むことができ、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含んでよく、一本鎖、二本鎖または多重鎖であることができる。核酸の一方の鎖は、その相補体も指す。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「〜に対応する」という語句またはその文法上の変形表現は、所与のアミノ酸または核酸配列または位置の付番との関連で使用する場合、所与のアミノ酸または核酸配列を所定の参照配列と比較したときの、その参照配列の付番を指す（例えば、本明細書における参照配列は、（野生型または完全長）ＣＲＮＮの核酸分子またはポリペプチドである）。換言すると、所与のポリマーの残基（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）の番号または残基（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）の位置は、その所与のアミノ酸または核酸配列におけるその残基の実際の位置番号によってではなく、参照配列を基準に指定されている。例えば、２つの配列間の残基の一致性を最適化するためにギャップを導入することにより、所与のアミノ酸配列を参照配列にアライメントすることができる。これらの場合において、ギャップは存在するものの、所与のアミノ酸または核酸配列における残基の付番は、それをアライメントした参照配列に対して行われる。
【００２８】
例えば、「配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質」という語句（及び同様の語句）は、ＣＲＮＮタンパク質のアミノ酸配列が配列番号８の配列にアライメントされた場合、このＣＲＮＮタンパク質が、配列番号８の７９位に対応する位置でトランケートする（例えば、ＣＲＮＮタンパク質の末端アミノ酸が、７９位におけるアミノ酸である）ことを意味する。または、換言すると、これらの語句は、配列番号８の７９位と相同である位置にトランケーションを有するＣＲＮＮタンパク質を指す。本明細書では、このようなタンパク質を「トランケート型ＣＲＮＮタンパク質」ともいう。「バリアントＣＲＮＮタンパク質」には、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質と機能喪失ＣＲＮＮタンパク質との両方が含まれる。
【００２９】
配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質は、所与のＣＲＮＮタンパク質と配列番号８のアミノ酸配列との間で配列アライメントを行うことによって容易に識別され得る。同様に、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを有するＣＲＮＮタンパク質は、所与のＣＲＮＮタンパク質と配列番号８のアミノ酸配列との間で配列アライメントを行うことによって容易に識別され得る。配列番号８の７９位に対応する位置におけるトランケーションを識別するため、または配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインを識別するために、配列アライメントを行うのに使用され得る種々の計算アルゴリズムが存在する。例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２）またはＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０７９，１０５−１１６）を使用することにより、配列アライメントを行うことができる。しかしながら、配列は、手作業でアライメントすることもできる。
【００３０】
本開示によれば、ＣＲＮＮにおけるある特定の変化は、皮膚障害の発症リスクに関連することが観察された。ヒトの皮膚障害との関連が知られているＣＲＮＮ遺伝子またはタンパク質のバリアントはないと考えられている。罹患家族員における皮膚障害の表現型が分離するＣＲＮＮ遺伝子の稀なバリアントが、本開示によって識別された。例えば、ヒトＣＲＮＮのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ（例えば、それぞれ配列番号４及び配列番号６）の２０５位におけるチミンの挿入をもたらし、これにより、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされている（例えば、末端アミノ酸が７９位に位置する）ＣＲＮＮタンパク質を生じるフレームシフトをもたらす遺伝子変異は、このような変異を有するヒトが乾癬などの皮膚障害を発症し得ることを示すことが観察されている。まとめると、本明細書に記載の遺伝子解析は、ＣＲＮＮ遺伝子、そして特にＣＲＮＮ遺伝子におけるトランケーションまたは機能喪失バリアントが、乾癬などの皮膚障害を発症する感受性の増加に関連することを示唆している。したがって、皮膚障害に関連するＣＲＮＮ変異を有するヒト対象は、皮膚障害が抑制され、その症状が減少し、及び／または症状の発生が抑止されるように処置され得る。したがって、本開示は、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡを含む単離または組換えＣＲＮＮバリアント遺伝子、ならびに単離または組換えＣＲＮＮバリアントポリペプチドを提供する。さらに、本開示は、対象におけるこのようなバリアントの識別を活用して、リスクのある対象または活動性疾患のある対象が処置され得るように、このような対象が皮膚障害を発症するリスクを識別または層別化するか、または対象が皮膚障害を有すると診断するための方法を提供する。
【００３１】
野生型ＣＲＮＮタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７に示されている。配列番号７を有する野生型ＣＲＮＮタンパク質の長さは、４９５アミノ酸である。配列番号７を参照すると、野生型ＣＲＮＮタンパク質の６９〜７９位は、次のアミノ酸：Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ（配列番号９）を、記載した順序で含む。
【００３２】
本開示は、例えば、乾癬、湿疹、及びアトピー性皮膚炎などの皮膚障害に関連することが本明細書において実証されている、ＣＲＮＮバリアントポリペプチドをコードする核酸分子（すなわち、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡ）、及びＣＲＮＮバリアントポリペプチドを提供する。
【００３３】
本開示は、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）をコードする核酸配列、またはこの核酸配列の相補体を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００３４】
本開示はまた、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）のうちの少なくとも一部分をコードする核酸配列、またはこの核酸配列の相補体を含む、ゲノムＤＮＡ分子を提供する。
【００３５】
本開示は、皮膚障害に関連するＣＲＮＮバリアントタンパク質をコードする核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする。例えば、本開示は、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされている）をコードする核酸配列、またはこの核酸配列の相補体を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に配列番号１０のアミノ酸配列を含むトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列、またはこの核酸配列の相補体を含むか、またはそれからなる。本明細書において、配列同一率に言及している場合、配列同一率は、低いよりも高い方が好ましい。
【００３９】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなり、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む。
【００４０】
野生型ＣＲＮＮゲノムＤＮＡの核酸配列は、配列番号１に示されている。配列番号１を含む野生型ＣＲＮＮゲノムＤＮＡの長さは、５，００９ヌクレオチドである。配列番号１を参照すると、野生型ＣＲＮＮゲノムＤＮＡの３３７５位はグアニンである。
【００４１】
本開示は、バリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ分子は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ分子は、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に次のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１０）を含むＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号８を有するバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなり、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号２による３３７５位に対応する位置にチミンを含む核酸配列を含むか、またはそれからなる。対照的に、野生型ＣＲＮＮゲノムＤＮＡは、配列番号１による３３７５位に対応する位置にグアニンを含む。こうしたバリアントＣＲＮＮゲノムＤＮＡへのチミンの挿入は一塩基フレームシフトをもたらし、結果として、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを有するトランケート型ＣＲＮＮタンパク質がもたらされる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号２による３３７５位に対応する位置にチミンを含む、核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号２による核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、ゲノムＤＮＡ配列全体よりも短い配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、または少なくとも約５０００の連続ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の、少なくとも約１０００〜少なくとも約２０００の連続ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０００、少なくとも約１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、または少なくとも約２５００の連続ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、このような連続ヌクレオチドは、本明細書に記載のｃＤＮＡ分子を生成するために、連続ヌクレオチドからなる他の核酸分子と組み合わされ得る。
【００４５】
このような単離された核酸分子は、例えば、バリアントＣＲＮＮのｍＲＮＡ及びタンパク質を発現するために、または外来性ドナー配列として使用することができる。集団内の遺伝子配列は、ＳＮＰなどの多型により変化し得ることが理解される。本明細書において提供する例は、例示的な配列に過ぎず、他の配列も可能である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、バリアントＣＲＮＮミニ遺伝子を含み、この遺伝子では、対応する野生型ＣＲＮＮゲノムＤＮＡを基準として、配列番号８をコードする１つ以上の非必須セグメントが欠失している。いくつかの実施形態では、欠失した非必須セグメント（複数可）には、１つ以上のイントロン配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＲＮＮミニ遺伝子は、配列番号２の一部分と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有し、このミニ遺伝子は、配列番号２による３３７５位に対応する位置にチミンを有する核酸配列を含む。
【００４７】
野生型ＣＲＮＮ  ｍＲＮＡの核酸配列は、配列番号３に示されている。配列番号３を含む野生型ＣＲＮＮ  ｍＲＮＡの長さは、１４８５ヌクレオチドである。配列番号３を参照すると、野生型ＣＲＮＮ  ｍＲＮＡの２０５位はグアニンである。
【００４８】
本開示はまた、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）のうちの少なくとも一部分をコードする核酸配列、またはこの核酸配列の相補体を含む、ｍＲＮＡ分子を提供する。
【００４９】
本開示はまた、バリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に次のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１０）を含むＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８を有するバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなり、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４による２０５位に対応する位置にウラシルを含む核酸配列を含むか、またはそれからなる。対照的に、野生型ＣＲＮＮ  ｍＲＮＡは、配列番号３による２０５位に対応する位置にグアニンを含む。こうしたバリアントＣＲＮＮ  ｍＲＮＡへのウラシルの挿入は一塩基フレームシフトをもたらし、結果として、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを有するトランケート型ＣＲＮＮタンパク質がもたらされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＵ及びＵＧＵを含む核酸配列を含むか、またはそれからなる。対照的に、野生型ＣＲＮＮ  ｍＲＮＡは、配列番号３による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＵ及びＧＵＧを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号４による２０５位に対応する位置にウラシルを含む、核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４による核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、ＣＲＮＮ  ｍＲＮＡ配列全体よりも少ないヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４の、少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、または少なくとも約２００の連続ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４の、少なくとも約１００〜少なくとも約２００の連続ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。この点では、長いｍＲＮＡ分子の方が短いｍＲＮＡ分子よりも好ましい。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４の、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、または少なくとも約２００の連続ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。この点では、長いｍＲＮＡ分子の方が短いｍＲＮＡ分子よりも好ましい。いくつかの実施形態では、このようなｍＲＮＡ分子は、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを含む。いくつかの実施形態では、このようなｍＲＮＡ分子は、配列番号４による２０５位に対応する位置にウラシルを含む。いくつかの実施形態では、このようなｍＲＮＡ分子は、配列番号４による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＵ及びＵＧＵを含む。
【００５２】
野生型ＣＲＮＮ  ｃＤＮＡの核酸配列は、配列番号５に示されている。配列番号５を含む野生型ＣＲＮＮ  ｃＤＮＡの長さは、終止コドンを除いて１４８５ヌクレオチドである。配列番号５を参照すると、野生型ＣＲＮＮ  ｃＤＮＡの２０５位はグアニンである。
【００５３】
本開示はまた、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）のうちの少なくとも一部分をコードする核酸配列、またはこの核酸配列の相補体を含む、ｃＤＮＡ分子を提供する。
【００５４】
本開示はまた、バリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に次のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１０）を含むＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、配列番号８を有するバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を含むか、またはそれからなり、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８による７９位に対応する位置にシステインを含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを含む核酸配列を含むか、またはそれからなる。対照的に、野生型ＣＲＮＮ  ｃＤＮＡは、配列番号５による２０５位に対応する位置にグアニンを含む。こうしたバリアントＣＲＮＮ  ｍＲＮＡへのチミンの挿入は一塩基フレームシフトをもたらし、結果として、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを有するトランケート型ＣＲＮＮタンパク質がもたらされる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、配列番号６による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＴ及びＴＧＴを含む核酸配列を含むか、またはそれからなる。対照的に、野生型ＣＲＮＮ  ｃＤＮＡは、配列番号５による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＴ及びＧＴＧを含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、配列番号６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを含む、核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、配列番号６による核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、バリアントＣＲＮＮ  ｃＤＮＡ分子の配列全体よりも短い配列を含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６の、少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、または少なくとも約２００の連続ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６の、少なくとも約１００〜少なくとも約２００の連続ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。この点では、長いｃＤＮＡ分子の方が短いｃＤＮＡ分子よりも好ましい。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ分子は、配列番号６の、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、または少なくとも約２００の連続ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。この点では、長いｃＤＮＡ分子の方が短いｃＤＮＡ分子よりも好ましい。いくつかの実施形態では、このようなｃＤＮＡ分子は、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを含む。いくつかの実施形態では、このようなｃＤＮＡ分子は、配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを含む。いくつかの実施形態では、このようなｃＤＮＡ分子は、配列番号６による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＴ及びＴＧＴを含む。
【００５７】
本開示はまた、バリアントＣＲＮＮゲノムＤＮＡ（例えば配列番号２）、バリアントＣＲＮＮミニ遺伝子、バリアントＣＲＮＮ  ｍＲＮＡ（例えば配列番号４）、及び／またはバリアントＣＲＮＮ  ｃＤＮＡ（例えば配列番号６）にハイブリダイズする、単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、このような単離された核酸分子は、少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、または少なくとも約５０００のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１５のヌクレオチド〜少なくとも約３５のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、このような単離された核酸分子は、バリアントＣＲＮＮゲノムＤＮＡ（例えば配列番号２）、バリアントＣＲＮＮミニ遺伝子、バリアントＣＲＮＮ  ｍＲＮＡ（例えば配列番号４）、及び／またはバリアントＣＲＮＮ  ｃＤＮＡ（例えば配列番号６）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。このような核酸分子は、本明細書に記載または例示されているように、例えば、プローブとして、プライマーとして、または変異特異的プローブもしくはプライマーとして使用され得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、バリアントＣＲＮＮゲノムＤＮＡ（例えば配列番号２）、バリアントＣＲＮＮミニ遺伝子、バリアントＣＲＮＮ  ｍＲＮＡ（例えば配列番号４）、及び／またはバリアントＣＲＮＮ  ｃＤＮＡ（例えば配列番号６）と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸分子の、少なくとも約１５の連続ヌクレオチドにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、約１５〜約１００のヌクレオチド、または約１５〜約３５のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、約１５〜約１００のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、約１５〜約３５のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する核酸分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子のいずれも、精製されていてもよく、例えば、少なくとも約９０％の純度である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する核酸分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子のいずれも、精製されていてもよく、例えば、少なくとも約９５％の純度である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する核酸分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子のいずれも、精製されていてもよく、例えば、少なくとも約９９％の純度である。精製は、人間の手によって、人間が作った精製技術を用いるものである。
【００６０】
本開示はまた、本明細書に開示する単離された核酸分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子のいずれかの断片を提供する。いくつかの実施形態では、断片は、本明細書に開示する核酸配列のいずれか、またはその任意の相補体の、少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００の連続残基を含むか、またはそれからなる。この点では、長い断片の方が短い断片よりも好ましい。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、または少なくとも約５０の連続残基を含むか、またはそれらからなる。この点では、長い断片の方が短い断片よりも好ましい。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、または少なくとも約３５の連続残基を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも約２０の連続残基を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも約２５の連続残基を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも約３０の連続残基を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも約３５の連続残基を含むか、またはそれからなる。断片は、核酸分子のうち、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするか、または配列番号８による６９〜７９位に対応する位置をコードする部分を含むか、またはそれからなることが想定される。このような断片は、本明細書に記載または例示されているように、例えば、プローブとして、プライマーとして、またはアレル特異的プライマーとして使用され得る。
【００６１】
本開示はまた、少なくとも約５ヌクレオチドを含む核酸配列を含むプローブまたはプライマーであって、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）をコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズするか、またはヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）をコードする核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズする、プローブまたはプライマーを提供する。
【００６２】
本開示はまた、プローブ及びプライマーを提供する。本開示のプローブまたはプライマーは、本明細書に開示する核酸分子のいずれか、またはその相補体に特異的にハイブリダイズする核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、本明細書に開示する核酸分子のいずれかにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。本開示はまた、本明細書に開示する核酸分子のいずれか、またはその相補体に中程度の条件下でハイブリダイズする核酸配列を有する核酸分子を提供する。本開示によるプローブまたはプライマーは、好ましくは、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードする核酸コドン、またはその相補体を包含する。したがって、好ましい実施形態において、本開示は、本明細書上記及び下記により詳細に定義する変異特異的プライマーを提供する。
【００６３】
本開示に係るプローブは、バリアントＣＲＮＮタンパク質（例えば、配列番号８によるもの）をコードするバリアントＣＲＮＮ核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及び／またはｃＤＮＡ）を検知するために使用され得る。さらに、本開示に係るプライマーは、バリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子またはその断片を増幅するために使用されてもよい。本開示はまた、上述のプライマーのうちの１つを含むプライマーペアを提供する。ゲノムのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅のために好適なプライマー配列は、トランケーションをもたらすフレームシフトバリアントを含むＣＲＮＮ断片の領域を含むが、これに限定されない。
【００６４】
いくつかの実施形態では、プライマーは、変異特異的プライマーを含め、次世代シーケンシングまたはハイスループットシーケンシングにおいて使用することができる。いくつかの事例では、プライマーは、変異特異的プライマーを含め、改変してもよい。特に、プライマーは、例えば、大規模並行シグネチャーシーケンシング（Ｍａｓｓｉｖｅ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）、Ｐｏｌｏｎｙシーケンシング、及び４５４パイロシーケンシングの様々なステップにおいて使用される様々な改変を含み得る。ＭＰＳＳは、例えば、ｍＲＮＡの発現レベルを決定するために使用することができる。ｍＲＮＡをまずｃＤＮＡに変換し、これをその後、小さなオリゴヌクレオチド「タグ」に融合させて、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した後にマイクロビーズに結合させることを可能にする。改変されたプライマーは、クローニングステップにおけるビオチン化プライマー、ならびにビーズ負荷ステップ及び検知ステップにおいて使用される蛍光標識プライマーを含め、プロセスのうちのいくつかのステップにおいて使用される。Ｐｏｌｏｎｙシーケンシングは、一般的に、ＤＮＡテンプレートの各分子の長さが約１３５ｂｐであるペアエンドタグライブラリを使用して行われる。ビオチン化プライマーは、ビーズ負荷ステップ及びエマルジョンＰＣＲにおいて使用される。検知ステップでは、蛍光標識された縮重九量体オリゴヌクレオチドが使用される。４５４シーケンシングは、典型的に、ＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍシリーズ試薬を用いたＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸにおける１０時間のラン１回当たりおよそ４００〜６００メガベースのＤＮＡをシーケンシングすることができる大規模並行パイロシーケンシングシステムを使用する。ゲノムＤＮＡが小さな断片（例えば、３００〜８００塩基対）に分割され、洗練される（各末端が平滑化される）。次いで、短いアダプタが断片の末端に連結され得る。これらのアダプタは、サンプルライブラリ断片の増幅及びシーケンシングの両方のためのプライミング配列をもたらす。アダプタは、ストレプトアビジン被覆ビーズにＤＮＡライブラリを固定化するための５’−ビオチンタグを含み得る。
【００６５】
本明細書に開示する核酸分子は、天然に生じるＣＲＮＮのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはｍＲＮＡ転写物の核酸配列を含んでもよいし、または天然に生じない配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、天然に生じる配列は、同義突然変異、またはコードされるＣＲＮＮポリペプチドに影響を及ぼさない突然変異のために、天然に生じない配列と異なり得る。例えば、配列は、同義突然変異、またはコードされるＣＲＮＮポリペプチドに影響を及ぼさない突然変異を除いて同一であり得る。同義突然変異または置換とは、生成されるアミノ酸配列を改変しないような、タンパク質をコードする遺伝子のエクソンにおける、あるヌクレオチドから別のヌクレオチドへの置換である。これは、遺伝暗号の縮重により可能となっており、いくつかのアミノ酸は複数の３塩基対コドンによってコードされる。同義置換は、例えば、コドン最適化のプロセスで使用される。本明細書に開示する核酸分子は、コドン最適化することができる。
【００６６】
本明細書ではまた、開示される核酸分子と相互作用することができる機能性ポリヌクレオチドを提供する。機能性ポリヌクレオチドは、標的分子の結合または特異的反応の触媒など、特定の機能を有する核酸分子である。機能性ポリヌクレオチドの例としては、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、及び外部ガイド配列が挙げられるが、これらに限らない。機能性ポリヌクレオチドは、標的分子が有する特定の活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーター、及び刺激剤として作用することもできるし、または機能性ポリヌクレオチドは、いかなる他の分子とも無関係なデノボ活性を有することもできる。
【００６７】
アンチセンス分子は、カノニカルな塩基対形成または非カノニカルな塩基対形成のいずれかを通じて、標的核酸分子と相互作用するように設計されている。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮａｓｅ−Ｈの媒介によるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの分解を通じて、標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、通常であれば標的分子において起こる、転写または複製などのプロセシング機能を妨げるように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセスしやすい領域を識別することによってアンチセンス効率を最適化するための多くの方法が存在する。例示的な方法としては、インビトロ選択実験ならびにＤＭＳ及びＤＥＰＣを使用したＤＮＡ改変試験が挙げられるが、これらに限らない。アンチセンス分子は、概して、約１０−６以下、約１０−８以下、約１０−１０以下、または約１０−１２以下の解離定数（ｋｄ）で標的分子に結合する。アンチセンス分子の設計及び使用を助ける方法及び技術の代表的サンプルは、次の米国特許の非限定的リスト：第５，１３５，９１７号、第５，２９４，５３３号、第５，６２７，１５８号、第５，６４１，７５４号、第５，６９１，３１７号、第５，７８０，６０７号、第５，７８６，１３８号、第５，８４９，９０３号、第５，８５６，１０３号、第５，９１９，７７２号、第５，９５５，５９０号、第５，９９０，０８８号、第５，９９４，３２０号、第５，９９８，６０２号、第６，００５，０９５号、第６，００７，９９５号、第６，０１３，５２２号、第６，０１７，８９８号、第６，０１８，０４２号、第６，０２５，１９８号、第６，０３３，９１０号、第６，０４０，２９６号、第６，０４６，００４号、第６，０４６，３１９号、及び第６，０５７，４３７号に見出すことができる。アンチセンス分子の例としては、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限らない。
【００６８】
本明細書に開示する単離された核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含み得る。単離された核酸分子を、例えばベクター中の異種核酸配列または異種標識に連結または融合させることもできる。例えば、本明細書に開示する単離された核酸分子は、単離された核酸分子及び異種核酸配列を含むベクターまたは外来性ドナー配列中に存在してもよい。単離された核酸分子を、蛍光標識などの異種標識に連結または融合させることもできる。標識の他の例は、本明細書の他の箇所に開示する。
【００６９】
標識は、直接的に検知可能（例えば、フルオロフォア）であっても間接的に検知可能（例えば、ハプテン、酵素、またはフルオロフォアクエンチャー）であってもよい。このような標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段によって検知可能であり得る。このような標識としては、例えば、放射線計数デバイスを用いて測定することができる放射標識、分光光度計を用いて視覚的に観察または測定することができる顔料、色素、または他の色素源、スピン標識分析器を用いて測定することができるスピン標識、及び、好適な分子付加体の励起によって出力シグナルが生成され、色素に吸収される光による励起によって可視化できるか、または標準的な蛍光光度計もしくはイメージングシステムによって測定できる蛍光標識（例えば、フルオロフォア）が挙げられる。標識はまた、例えば、化学発光物質とすることもでき、その場合、出力シグナルは、シグナル化合物、金属含有物質、または酵素の化学修飾によって生成され、酵素の場合、無色の基質からの有色生成物の形成など、酵素依存性の二次シグナル生成が生じる。「標識」という用語は、「タグ」またはハプテン（コンジュゲート分子に選択的に結合でき、結合後、基質を加えると、そのコンジュゲート分子を利用して、検知可能なシグナルを生成させるようにする）を指す場合もある。例えば、ビオチンをタグとして使用し、次いでアビジンまたはストレプトアビジンの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを使用してタグに結合させ、次いで発色基質（例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））または蛍光発生基質を使用すると、ＨＲＰの存在を検知することができる。精製を促進するためのタグとして使用することができる例示的な標識としては、ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧもしくは３ＸＦＬＡＧ、６ＸＨｉｓもしくはポリヒスチジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、エピトープタグ、または免疫グロブリンのＦｃ部分が挙げられるが、これらに限らない。多数の標識は、粒子、フルオロフォア、ハプテン、酵素、ならびにそれらの発色基質、蛍光発生基質、及び化学発光基質、ならびに他の標識を含むが、これらに限らない。
【００７０】
開示する核酸分子は、例えば、ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体もしくはヌクレオチド置換体などの非天然ヌクレオチドもしくは改変ヌクレオチドを含み得る。このようなヌクレオチドには、修飾された塩基、糖、もしくはリン酸基を含むヌクレオチド、またはその構造内に非天然部分を組み込んだヌクレオチドが含まれる。非天然ヌクレオチドの例としては、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、アミノ化ヌクレオチド、脱アミノ化ヌクレオチド、アルキル化ヌクレオチド、ベンジル化ヌクレオチド、及びフルオロフォア標識ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限らない。
【００７１】
本明細書に開示する核酸分子は、１つ以上のヌクレオチド類似体または置換を含むこともできる。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、またはリン酸部分のいずれかに対する修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分に対する修飾としては、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ／Ｕの天然修飾及び合成修飾、ならびに例えばプソイドウリジン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、及び２−アミノアデニン−９−イルなどの異なるプリンまたはピリミジン塩基が挙げられるが、これらに限らない。修飾塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル誘導体及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル誘導体及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが挙げられるが、これらに限らない。例えば５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、及び５−メチルシトシンを含むがこれらに限らないＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンといった、ある特定のヌクレオチド類似体は、二本鎖形成の安定性を増加させることができる。多くの場合、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの糖修飾と塩基修飾を組み合わせて、増加した二本鎖安定性などのユニークな特性を達成することができる。
【００７２】
ヌクレオチド類似体は、糖部分の修飾を含んでもよい。糖部分に対する修飾としては、リボース及びデオキシリボースの天然修飾、ならびに合成修飾が挙げられるが、これらに限らない。糖修飾としては、２’位における次の修飾：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルが挙げられるが、これらに限らず、ここでアルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜１０アルキルまたはＣ２〜１０アルケニル、及びＣ２〜１０アルキニルであり得る。例示的な２’糖修飾としては、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、及び−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎ及びｍは１〜約１０である）も挙げられるが、これらに限らない。
【００７３】
２’位における他の修飾としては、Ｃ１〜１０アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基が挙げられるが、これらに限らない。同様の修飾を、糖における他の位置で、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行ってもよい。修飾された糖は、ＣＨ２及びＳなどの架橋環酸素での修飾を含むものを含み得る。ヌクレオチド糖類似体は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模放物を有することもできる。
【００７４】
ヌクレオチド類似体は、リン酸部分において修飾されていてもよい。修飾リン酸部分としては、２つのヌクレオチド間の結合に、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートならびに３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなどの他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートなどのホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェートが含まれるように修飾することができるものが挙げられるが、これらに限らない。２つのヌクレオチド間のこうしたリン酸結合または修飾リン酸結合は、３’−５’結合または２’−５’結合を介するものとすることができ、結合には、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’などの逆極性が含まれ得る。様々な塩、混合塩、及び遊離酸形態も含まれる。
【００７５】
ヌクレオチド置換体には、ヌクレオチドと同様の機能特性を有するがリン酸部分を含まない分子、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。ヌクレオチド置換体には、ワトソン−クリックまたはフーグスティーン様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して一緒に連結する分子が含まれる。ヌクレオチド置換体は、適切な標的核酸と相互作用する場合に二重らせん型構造に適合することができる。
【００７６】
ヌクレオチド置換体には、リン酸部分または糖部分が置き換えられているヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体も含まれる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換体は、標準的なリン原子を含まない場合がある。リン酸の置換体は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間結合もしくは複素環ヌクレオシド間結合であり得る。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成要素部分を有する他の成分を有するヌクレオチド置換体が含まれる。
【００７７】
ヌクレオチド置換体では、ヌクレオチドの糖及びリン酸部分の両方が、例えば、アミド型結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置換され得ることも理解される。
また、他のタイプの分子（コンジュゲート）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に結合させて、例えば、細胞取り込みを増強することも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に結合させることができる。このようなコンジュゲートとしては、例えば、脂質部分（コレステロール部分など）、コール酸、チオエーテル（ヘキシル−Ｓ−トリチルチオールなど）、チオコレステロール、脂肪族鎖（ドデカンジオールもしくはウンデシル残基など）、リン脂質（ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネートなど）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。
【００７８】
本開示はまた、本明細書に開示する核酸分子のうちのいずれか１つ以上を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に開示する核酸分子のうちのいずれか１つ以上と、異種核酸とを含む。ベクターは、核酸分子を輸送することができるウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドまたはコスミド（例えば、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、それを導入する宿主細胞内で自律的に複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。いくつかの実施形態では、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム内に組み込むことができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結している遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターを本明細書では「組換え発現ベクター」または「発現ベクター」という。このようなベクターは、標的化ベクター（すなわち、外来性ドナー配列）であってもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、開示する遺伝的バリアントをコードする核酸分子を発現ベクターに挿入し、それによって、転写及び翻訳制御配列などの発現制御配列に遺伝子を作動可能に連結することによって、本明細書に開示する様々な遺伝的バリアントによってコードされるタンパク質を発現させる。発現ベクターとしては、プラスミド、コスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス及びタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、エプスタイン−バー（ＥＢＶ）由来エピソーム、及び他の発現ベクターが挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が遺伝的バリアントの転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、開示する遺伝的バリアントを含む核酸分子をベクターにライゲーションすることができる。発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択する。開示する遺伝的バリアントを含む核酸配列は、別々のベクターに挿入してもよいし、バリアントの遺伝情報と同じ発現ベクターに挿入してもよい。開示する遺伝的バリアントを含む核酸配列は、標準的な方法（例えば、開示する遺伝的バリアント及びベクターを含む核酸における相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入することができる。
【００８０】
開示する遺伝的バリアントを含む核酸配列に加えて、組換え発現ベクターには、宿主細胞内での遺伝的バリアントの発現を制御する調節配列を搭載することができる。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得る。哺乳動物宿主細胞発現に望ましい調節配列としては、例えば、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス因子、例えば、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマに由来するプロモーター及び／またはエンハンサー、ならびに強力な哺乳動物プロモーター、例えば、ネイティブ免疫グロブリンプロモーター及びアクチンプロモーターなどを挙げることができる。ポリペプチドは、細菌細胞または真菌細胞（例えば、酵母細胞）において発現させることができる。
【００８１】
プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えばＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができる。
【００８２】
誘導性プロモーターの例としては、例えば、化学的に調節されるプロモーター及び物理的に調節されるプロモーターが挙げられる。化学的に調節されるプロモーターとしては、例えば、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ−Ｏｎプロモーター、またはｔｅｔ−Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、またはエクジソン受容体のプロモーター）、または金属調節プロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的に調節されるプロモーターとしては、例えば、温度調節プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）及び光調節プロモーター（例えば、光誘導性プロモーターまたは光抑制性プロモーター）が挙げられる。
【００８３】
組織特異的プロモーターは、例えば、ニューロン特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋肉細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、または免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーターまたはＴ細胞プロモーター）であり得る。
【００８４】
発生的に調節されるプロモーターとしては、例えば、発生の胚段階の間のみ、または成体細胞においてのみ活性なプロモーターが挙げられる。
開示する遺伝的バリアント及び調節配列を含む核酸配列に加えて、組換え発現ベクターには、追加の配列、例えば、宿主細胞内でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択マーカー遺伝子を搭載することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を容易にすることができる（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、及び同第５，１７９，０１７号参照）。例えば、選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、メトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与することができる。例示的な選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増殖を伴うｄｈｆｒ宿主細胞での使用）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、及びグルタミン酸シンテターゼ（ＧＳ）遺伝子が挙げられるが、これらに限らない。
【００８５】
さらなるベクターは、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる２０１６年７月２８日に出願された米国仮出願第６２／３６７，９７３号に記載されている。
本開示はまた、本明細書に開示する単離された核酸分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子のうちの１つ以上を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本組成物は、医薬組成物である。
【００８６】
本開示はまた、ヒトＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質である）のうちの少なくとも一部分を含む、単離または組換えポリペプチドを提供する。
【００８７】
本開示はまた、バリアントＣＲＮＮポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＲＮＮポリペプチドは、機能喪失タンパク質である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＲＮＮポリペプチドは、トランケートされている。いくつかの実施形態では、バリアントＣＲＮＮポリペプチドは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされている。いくつかの実施形態では、バリアントＣＲＮＮポリペプチドは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＲＮＮポリペプチドは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に複数のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＲＮＮポリペプチドは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に次のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１０）を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＲＮＮポリペプチドは、配列番号８によるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む。いくつかの実施形態では、バリアントＣＲＮＮポリペプチドは、配列番号８によるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８によるアミノ酸配列、または配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む。
【００８８】
本開示はまた、本明細書に開示するポリペプチドのいずれかの断片を提供する。いくつかの実施形態では、断片は、コードされるポリペプチド（例えば、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、または少なくとも約７５の連続アミノ酸残基を含む。この点では、長い断片の方が短い断片よりも好ましい。
【００８９】
本開示はまた、バリアントＣＲＮＮポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを含む二量体を提供し、このポリペプチドは、本明細書に開示するポリペプチドのいずれかから選択される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する単離されたポリペプチドを、異種ポリペプチドもしくは異種分子または標識に連結または融合させる。その多くの例は、本明細書の他の箇所において開示する。例えば、タンパク質を異種ポリペプチドに融合させ、安定性を増加または減少させることができる。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはポリペプチド内部に配置することができる。融合パートナーは、例えば、Ｔヘルパーエピトープの提供を支援することができ（免疫学的融合パートナー）、または天然の組換えポリペプチドよりも高い収率でのタンパク質の発現を支援することができる（発現エンハンサー）。ある特定の融合パートナーは、免疫学的融合パートナーと発現増強融合パートナーとの両方である。ポリペプチドの溶解性を増加させるため、または所望の細胞内区画へのポリペプチドの標的化を容易にするために、他の融合パートナーを選択してもよい。いくつかの融合パートナーは、ポリペプチドの精製を容易にするアフィニティタグを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、異種分子に直接融合しているか、またはペプチドリンカーなどのリンカーを介して異種分子に連結している。好適なペプチドリンカー配列は、例えば、次の要素に基づいて選択することができる：１）柔軟で拡張的な立体構造をとり得る能力、２）第１及び第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造をとることに対する抵抗性、及び３）ポリペプチドの機能的エピトープと反応する可能性のある疎水性または荷電残基の欠如。例えば、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒ残基を含み得る。リンカー配列では、他の中性付近のアミノ酸（Ｔｈｒ及びＡｌａなど）を使用してもよい。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列としては、例えば、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８５，４０，３９−４６、Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６，８３，８２５８−８２６２、ならびに米国特許第４，９３５，２３３号及び同第４，７５１，１８０号に開示されているものが挙げられる。リンカー配列の長さは、概して、例えば１〜約５０アミノ酸であり得る。機能的ドメインを分離し、立体的干渉を防止するために使用され得る非必須Ｎ−末端アミノ酸領域を第１及び第２のポリペプチドが有するときには、リンカー配列は概ね不要である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、細胞透過性ドメインに作動可能に連結している。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来し得る。例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。細胞透過性ドメインは、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはいずれかの位置に配置することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結している。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限らない。タグの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、異種分子は、免疫グロブリンＦｃドメイン、ペプチドタグ、形質導入ドメイン、ポリ（エチレングリコール）、ポリシアル酸、またはグリコール酸である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、非天然であるかまたは改変されたアミノ酸またはペプチド類似体を含む。例えば、Ｄ−アミノ酸、または天然に生じるアミノ酸とは異なる機能的置換基を有するアミノ酸は、数多く存在する。天然に生じるペプチドとは逆の立体異性体、及びペプチド類似体の立体異性体も開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に最適なアミノ酸を負荷し、例えばアンバーコドンを利用する遺伝子構築物を作出して部位特異的な方法でペプチド鎖にアミノ酸類似体を挿入することにより、ポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、ペプチドに類似するように生成され得るが、天然のペプチド結合を介して連結しているものではないペプチド模放物である。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体のための結合としては、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、及び−ＣＨＨ２ＳＯ−が挙げられるが、これらに限らない。ペプチド類似体は、例えばｂ−アラニン、ｇアミノ酪酸など、結合原子間に複数の原子を有し得る。アミノ酸類似体及びペプチド類似体は、多くの場合、増強されたまたは望ましい特性、例えば、より経済的な生産、より高い化学的安定性、より増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性など）、特異性の変化（例えば、広範な生物活性）、抗原性の低下、及び他の望ましい特性を有する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドはＤ−アミノ酸を含み、Ｄ−アミノ酸はペプチダーゼによって認識されないことから、これらを使用してより安定なペプチドを生成することができる。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸を、同じタイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）で体系的に置換して、より安定したペプチドを生成することができる。システイン残基を使用して、２つ以上のペプチドを環化または結合させることができる。これは、ペプチドを特定の立体構造に拘束するのに有益であり得る（例えば、Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，６１，３８７を参照されたい）。
【００９７】
本開示はまた、本明細書に開示するポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子を提供する。これには、特定のポリペプチド配列に関連するすべての縮重配列（１つの特定のポリペプチド配列をコードする配列を有するすべての核酸、及びタンパク質配列の開示するバリアント及び誘導体をコードする縮重核酸を含むすべての核酸）が含まれる。したがって、各々の特定の核酸配列は本明細書に記載し得ないが、各配列はすべて、開示するポリペプチド配列を通じて本明細書に実際に開示及び記載されるものとする。
【００９８】
核酸内の核酸配列またはポリペプチド内のアミノ酸配列の特定の区間同士の間の同一率（または相補率）は、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を使用することによって、またはＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を、デフォルト設定を使用して使用することによって決定することができる。本明細書において、配列同一率に言及している場合、配列同一率は、低いよりも高い方が好ましい。
【００９９】
本開示はまた、本明細書に開示されている核酸分子のうちのいずれか１つ以上及び／または本明細書に開示されているポリペプチドのうちのいずれか１つ以上と、担体及び／または賦形剤とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、担体は、核酸分子及び／またはポリペプチドの安定性を増加させる（例えば、分解生成物を閾値未満（例えば、初期の核酸またはタンパク質の０．５重量％未満など）に保つ所与の保管条件（例えば、−２０℃、４℃、または周囲温度）における期間を延長するか、またはインビボでの安定性を増加させる）。担体の例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフィア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフィア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、及び脂質微小管が挙げられるが、これらに限らない。担体は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどのような緩衝塩溶液を含んでよい。
【０１００】
本開示はまた、本明細書に開示するポリペプチドまたはその断片のいずれかを生成する方法を提供する。このようなポリペプチドまたはその断片は、任意の好適な方法によって生成することができる。例えば、ポリペプチドまたはその断片は、このようなポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子（例えば、組換え発現ベクター）を含む宿主細胞から生成することができる。このような方法は、ポリペプチドまたはその断片を生成するのに十分な条件下で、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子（例えば、組換え発現ベクター）を含む宿主細胞を培養することによって、ポリペプチドまたはその断片を生成することを含み得る。この核酸は、宿主細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結していてよく、培養は、核酸が発現する条件下で行うことができる。このような方法は、発現したポリペプチドまたはその断片を回収することをさらに含み得る。この回収は、ポリペプチドまたはその断片を精製することをさらに含み得る。
【０１０１】
好適なタンパク質発現系の例としては、例えば、細菌細胞発現系（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、酵母細胞発現系（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルスの媒介によるタンパク質発現）、及び哺乳動物細胞発現系などの宿主細胞が挙げられる。
【０１０２】
ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子の例は、本明細書の他の箇所でより詳細に開示する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、宿主細胞での発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、宿主細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結する。プロモーターは、異種プロモーター（例えば、天然に生じるプロモーターではないプロモーター）とすることができる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに好適なプロモーターの例としては、アラビノース、ｌａｃ、ｔａｃ、及びＴ７プロモーターが挙げられるが、これらに限らない。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓに好適なプロモーターの例としては、Ｐ１７０及びナイシンプロモーターが挙げられるが、これらに限らない。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに好適なプロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）もしくはエノラーゼ（ＥＮＯ）プロモーターなどの構成的プロモーター、またはＰＨＯ、ＣＵＰ１、ＧＡＬ１、及びＧ１０などの誘導性プロモーターが挙げられるが、これらに限らない。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに好適なプロモーターの例としては、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ  Ｉ）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーター、及びグルタチオン依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤＩ）プロモーターが挙げられるが、これらに限らない。バキュロウイルス媒介系に好適なプロモーターの例は、後期ウイルス性強力ポリヘドリンプロモーターである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、タンパク質の精製を容易にするように、ポリペプチドまたはその断片とインフレームなタグをコードする。タグの例は、本明細書の他の箇所に開示されている。このようなタグは、例えば、パートナーリガンド（例えば、樹脂に固定化したもの）に結合して、そのタグが付いたタンパク質を他のすべてのタンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質）から単離できるようにすることができる。アフィニティクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）は、発現タンパク質の純度を向上させるために使用することができる方法の例である。
【０１０４】
他の方法を使用して、ポリペプチドまたはその断片を生成することもできる。例えば、タンパク質化学技術により、２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを連結することができる。例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボノイル）のいずれかの化学物質を使用して、ペプチドまたはポリペプチドを化学合成することができる。このようなペプチドまたはポリペプチドは、標準的な化学反応によって合成することができる。例えば、あるペプチドまたはポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切断せずに、他方のペプチドまたはタンパク質の断片を合成し、その後樹脂から切断することにより、この他方の断片上で機能的にブロックされた末端基を露出させることができる。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片を、それぞれカルボキシル末端及びアミノ末端でペプチド結合を介して共有結合することができる。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書に記載するようにインビボで独立して合成してもよい。単離したら、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドを同様のペプチド縮合反応によって連結して、ペプチドまたはその断片を形成することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、クローンまたは合成のペプチドセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチド断片を結合させて、より大きなペプチド断片、ポリペプチド、または全タンパク質ドメインを生成することができる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０，４１５１）。あるいは、合成ペプチドの天然の化学ライゲーションを利用して、短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築することができる。この方法は、２ステップの化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６６，７７６−７７９）。第１のステップは、保護されていない合成ペプチド−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択的反応で、第１の共有結合生成物としてチオエステル結合中間体を生成するものであり得る。反応条件を変更することなく、この中間体は自発的で急速な分子内反応を起こし、ライゲーション部位で天然のペプチド結合を形成することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、化学ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間に形成される結合が非天然（非ペプチド）結合である場合、保護されていないペプチドセグメントを化学的に連結することができる（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５６，２２１）。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば、グリコシル化、アセチル化、及びリン酸化などの発現後修飾と、その他の修飾（天然に生じるものと、天然に生じないものの両方）を有することができる。ポリペプチドは、タンパク質全体であっても、その部分配列であってもよい。
【０１０８】
本開示は、本明細書に開示するポリペプチドのいずれかを生成する方法であって、本明細書に開示するポリペプチドのうちの１つ以上をコードすることができるポリヌクレオチドを含む核酸分子またはその相補体を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって、ポリペプチドを生成することを含む方法も提供する。
【０１０９】
本開示はまた、本明細書に開示する、核酸分子のうちのいずれか１つ以上（核酸分子を含むベクターを含む）、及び／またはポリペプチドのうちのいずれか１つ以上を含む、細胞（例えば、組換え宿主細胞）を提供する。この細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。核酸分子は、発現してコードタンパク質が生成されるように、プロモーター及び他の調節配列に連結していてもよい。さらに、このような細胞の細胞株を提供する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、細胞は、全能性細胞または多能性細胞（例えば、げっ歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）である。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、複数の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。このような多能性及び／または全能性細胞は、例えば、ＥＳ細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ様細胞であり得る。ＥＳ細胞には、胚への導入時に発生中の胚の任意の組織に寄与し得る胚由来の全能性または多能性細胞が含まれる。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊に由来する場合があり、３つの脊椎動物の胚葉（内胚葉、外胚葉、及び中胚葉）のいずれかの細胞に分化することができる。本開示によれば、胚性幹細胞は、ヒト以外の胚性幹細胞であってよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、細胞は、初代体細胞、または初代体細胞ではない細胞である。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、細胞は初代細胞とすることもできる。初代細胞には、生物、器官、または組織から直接単離した細胞または細胞の培養物が含まれる。初代細胞には、形質転換も不死化もしていない細胞が含まれる。初代細胞には、組織培養で以前に継代されていないか、または組織培養で以前に継代されているが組織培養で無期限に継代することができない生物、器官、または組織から得られた任意の細胞が含まれる。このような細胞は、従来技術により単離することができ、例えば、体細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、単球、単核細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、肝細胞、骨格筋芽細胞、及び平滑筋細胞を含む。例えば、初代細胞は、結合組織、筋肉組織、神経系組織、または上皮組織に由来し得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、細胞は通常、無期限に増殖できないが、突然変異または変異により、正常な細胞老化が回避され、それどころか分裂をし続けることができる。このような突然変異または変異は、天然に生じる場合もあれば、意図的に誘導される場合もある。不死化細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）、及びマウス胎児線維芽細胞（例えば３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限らない。多数のタイプの不死化細胞が使用され得る。不死化細胞または初代細胞には、組換え遺伝子または組換えタンパク質の培養または発現に通常使用される細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）などの分化細胞である。
【０１１３】
細胞は、任意の供給源に由来し得る。例えば、細胞は、真核細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌（例えば、酵母）細胞とすることができる。このような細胞は、魚細胞もしくはトリ細胞であってもよいし、または、このような細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、ヒト以外の哺乳動物細胞、齧歯類動物細胞、マウス細胞もしくはラット細胞であってもよい。哺乳動物としては、ヒト、ヒト以外の霊長類動物、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、未去勢の雄牛、シカ、バイソン、ヒツジ、齧歯類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、家畜（例えば、ウシ亜科の種（ウシ、去勢雄牛など）、ヒツジ類（ヒツジ、ヤギなど）、ブタ類（ブタ、イノシシなど）が挙げられるが、これらに限らない。トリとしては、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが挙げられるが、これらに限らない。飼育動物及び畜産動物も含まれる。「ヒト以外の動物」という用語には、ヒトは含まれない。
【０１１４】
さらなる宿主細胞は、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる２０１６年７月２８日に出願された米国仮出願第６２／３６７，９７３号に記載されている。
本明細書に開示する核酸分子及びポリペプチドは、任意の手段によって細胞に導入することができる。トランスフェクションプロトコールならびに核酸またはタンパク質を細胞に導入するためのプロトコールは様々であり得る。非限定的なトランスフェクション方法としては、リポソーム、ナノ粒子、カルシウム、デンドリマー、及びＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学ベースのトランスフェクション方法が挙げられる。非化学的方法としては、電気穿孔法、ソノポレーション、及び光トランスフェクションが挙げられる。粒子ベースのトランスフェクション方法としては、遺伝子銃の使用、または磁石補助型トランスフェクションが挙げられる。ウイルスによる方法もトランスフェクションに使用することができる。
【０１１５】
細胞への核酸またはタンパク質の導入は、電気穿孔法、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質を介したトランスフェクション、またはヌクレオフェクションによっても媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核内に送達できるようにする改良された電気穿孔法である。さらに、本明細書に開示する方法におけるヌクレオフェクションの使用は、典型的に、通常の電気穿孔法よりもはるかに少ない細胞しか必要としない（例えば、通常の電気穿孔法が７００万であるのに対して約２００万で済む）。いくつかの実施形態では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して行われる。
【０１１６】
細胞への核酸またはタンパク質の導入は、マイクロインジェクションによって達成することもできる。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは通常、細胞質内に行い（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）、一方、タンパク質またはＤＮＡのマイクロインジェクションは通常、核内に行う。あるいは、マイクロインジェクションは、核と細胞質の両方への注射により行うこともできる：針を最初に核に導入し、第１の量を注射し、細胞から針を取り出しながら第２の量を細胞質に注射することができる。ヌクレアーゼ剤タンパク質を細胞質に注射する場合、確実に核／前核へ送達するために、核局在化シグナルをタンパク質に含ませてもよい。
【０１１７】
核酸またはタンパク質を細胞に導入するための他の方法としては、例えば、ベクター送達、粒子を介した送達、エキソソームを介した送達、脂質ナノ粒子を介した送達、細胞透過性ペプチドを介した送達、または埋め込み型デバイスを介した送達が挙げられる。核酸またはタンパク質を対象に投与してインビボで細胞を改変する方法を、本明細書の他の箇所に開示する。細胞への核酸及びタンパク質の導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によっても達成することができる。
【０１１８】
核酸またはタンパク質を細胞に導入するための他の方法としては、例えば、ベクター送達、粒子を介した送達、エキソソームを介した送達、脂質ナノ粒子を介した送達、細胞透過性ペプチドを介した送達、または埋め込み型デバイスを介した送達が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸またはタンパク質を、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフィア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフィア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、または脂質微小管などの担体中で、細胞に導入することができる。
【０１１９】
本開示はまた、プローブ及びプライマーを提供する。プローブ及びプライマーの例は、例えば上記に開示されている。本開示は、本明細書に開示する核酸分子のいずれかに特異的にハイブリダイズする核酸配列を含むプローブ及びプライマーを提供する。例えば、プローブまたはプライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする本明細書に記載の核酸分子のいずれかにハイブリダイズするか、またはこの核酸分子の相補体にハイブリダイズする、核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号８によるバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子にハイブリダイズするか、またはこの核酸分子の相補体にハイブリダイズする、核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮポリペプチドをコードする核酸分子にハイブリダイズするか、またはこの核酸分子の相補体にハイブリダイズする、核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に複数のアミノ酸を含むバリアントＣＲＮＮポリペプチドをコードする核酸分子にハイブリダイズするか、またはこの核酸分子の相補体にハイブリダイズする、核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に次のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１０）を含むバリアントＣＲＮＮポリペプチドをコードする核酸分子にハイブリダイズするか、またはこの核酸分子の相補体にハイブリダイズする、核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号８によるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮポリペプチドをコードする核酸分子にハイブリダイズするか、またはこの核酸分子の相補体にハイブリダイズする、核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号８によるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなるバリアントＣＲＮＮポリペプチドをコードする核酸分子にハイブリダイズするか、またはこの核酸分子の相補体にハイブリダイズする、核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する核酸分子の一部分に特異的にハイブリダイズする。
【０１２０】
プローブまたはプライマーは、任意の好適な長さを含んでよく、その非限定的な例としては、少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、または少なくとも約２５のヌクレオチド長が挙げられる。好ましい実施形態では、プローブまたはプライマーは、少なくとも約１８のヌクレオチド長を含む。プローブまたはプライマーは、約１０〜約３５、約１０〜約３０、約１０〜約２５、約１２〜約３０、約１２〜約２８、約１２〜約２４、約１５〜約３０、約１５〜約２５、約１８〜約３０、約１８〜約２５、約１８〜約２４、または約１８〜約２２のヌクレオチド長を含み得る。好ましい実施形態では、プローブまたはプライマーは、約１８〜約３０のヌクレオチド長である。
【０１２１】
本開示はまた、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列に相補的な核酸配列を含む変異特異的プローブまたはプライマーであって、配列番号８による６９〜７６位、７８位、または７９位に対応する任意の複数の位置をコードする核酸分子の一部分に相補的な核酸配列を含む、変異特異的プローブまたはプライマーを提供する。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたはプライマーは、配列番号８による６９位に対応する位置をコードする核酸分子の一部分、またはその相補体に特異的にハイブリダイズする。変異特異的プローブまたはプライマーは、野生型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列を有する核酸分子にはハイブリダイズしない。
【０１２２】
本開示はまた、変異特異的プローブ及び変異特異的プライマーを提供する。変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列もしくはその相補体に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。
【０１２３】
本開示の文脈における「特異的にハイブリダイズする」とは、プローブまたはプライマー（例えば、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマー）が、野生型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子にハイブリダイズしないことを意味する。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブは、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードする核酸コドン、またはその相補体に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、変異特異的プライマー、またはプライマーペアは、生成されるいずれの転写物にも、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンが包含されるように、バリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子のうちのある領域（複数可）に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する核酸分子の一部分に特異的にハイブリダイズする。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、バリアントＣＲＮＮタンパク質（このタンパク質は、配列番号８による７９位に対応する位置にトランケーションを含む）をコードする核酸配列もしくはその相補体に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子もしくはその相補体に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に次のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１０）を含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８を有するバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含するゲノムＤＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズする。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号２による３３７５位に対応する位置にチミンを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるゲノムＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号２による３３７５位に対応する位置にチミンを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるゲノムＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号２による核酸配列を含むかもしくはそれからなるゲノムＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に次のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１０）を含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８を有するバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含するｍＲＮＡ分子の一部分に特異的にハイブリダイズする。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号４による２０５位に対応する位置にウラシルを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるｍＲＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号４による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＵ及びＵＧＵを含むｍＲＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号４と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号４による２０５位に対応する位置にウラシルを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるｍＲＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号４による核酸配列を含むかもしくはそれからなるｍＲＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に次のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１０）を含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号８を有するバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含するｃＤＮＡ分子の一部分に特異的にハイブリダイズする。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるｃＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号６による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＴ及びＴＧＴを含むｃＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるｃＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーは、配列番号６による核酸配列を含むかもしくはそれからなるｃＤＮＡ分子に相補的であり、及び／またはこれにハイブリダイズもしくは特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。
【０１３１】
本開示のプローブまたはプライマーに関して上述した長さは、本開示の変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーにも準用される。
本開示はまた、上述の変異特異的プライマーのうちの２つを含む変異特異的プライマーペアを提供する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマー（例えば、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマー）は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマー（例えば、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマー）は、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、プローブまたはプライマー（例えば、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマー）は、バリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列に、高ストリンジェンシー条件などのストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、プローブは標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、蛍光標識、放射標識、またはビオチンである。いくつかの実施形態では、プローブの長さは上述されている。あるいは、いくつかの実施形態では、プローブは、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。プローブ（例えば、アレル特異的プローブ）は、例えば、本明細書に開示する核酸分子のいずれかを検知するために使用され得る。好ましい実施形態では、プローブは、少なくとも約１８ヌクレオチド長を含む。プローブは、約１０〜約３５、約１０〜約３０、約１０〜約２５、約１２〜約３０、約１２〜約２８、約１２〜約２４、約１５〜約３０、約１５〜約２５、約１８〜約３０、約１８〜約２５、約１８〜約２４、または約１８〜約２２のヌクレオチド長を含み得る。好ましい実施形態では、プローブは、約１８〜約３０ヌクレオチド長である。
【０１３４】
本開示はまた、本明細書に開示するプローブのうちのいずれか１つ以上が結合している基質を含む支持体を提供する。固体支持体は、本明細書に開示するプローブのいずれかなどの分子が会合し得る固体状態の基質または支持体である。固体支持体の一形態は、アレイである。固体支持体の別の形態は、アレイ検知器である。アレイ検知器は、複数の異なるプローブがアレイ状、グリッド状またはその他の組織化されたパターンで結合している固体支持体である。
【０１３５】
固体支持体に使用される固体状態の基質には、分子が結合し得る任意の固体物質が含まれ得る。この物質としては、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸などの物質が挙げられる。固体状態の基質は、薄いフィルム、膜、ボトル、ディッシュ、繊維、織り繊維、成形ポリマー、粒子、ビーズ、微小粒子または組み合わせたものを含むいずれかの有用な形態であることができる。固体状態の基質及び固体支持体は、多孔性であることも、非多孔性であることもできる。固体状態の基質の一形態は、標準的な９６ウェルタイプのようなマイクロタイターディッシュである。いくつかの実施形態では、１ウェル当たりに１つのアレイを通常含むマルチウェルスライドガラスを用いることができる。この機能は、アッセイ再現性の制御の向上、スループット及び試料取り扱いの増加、ならびに容易な自動化を可能にする。いくつかの実施形態では、支持体は、マイクロアレイである。
【０１３６】
本明細書に開示するポリペプチドのいずれも、１つ以上の置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入、または欠失をさらに有することができる。挿入としては、例えば、アミノ末端融合またはカルボキシル末端融合、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位で置換を行うための技術としては、Ｍ１３プライマー突然変異誘発及びＰＣＲ突然変異誘発が挙げられるが、これらに限らない。アミノ酸置換は、典型的には単一の残基に関するが、一度にいくつかの異なる位置で発生する場合もあり、挿入は通常、約１〜１０個のアミノ酸残基であり、欠失は、約１〜３０個の残基の範囲である。欠失または挿入は、隣接する対で行うことができる（すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入）。置換、欠失、挿入、または任意のそれらの組み合わせを組み合わせて、最終構築物に到達してもよい。いくつかの実施形態では、これらの突然変異によって、配列がリーディングフレーム外に配置されることはなく、ｍＲＮＡの二次構造をもたらし得る相補領域が生じることもない。
【０１３７】
本開示はまた、本明細書に記載の組成物を作製し、本明細書に記載の方法を利用するためのキットを提供する。本明細書に記載のキットは、対象の試料中の１つ以上の遺伝的バリアントを検知するための１つのアッセイまたは複数のアッセイを含むことができる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＣＲＮＮバリアントをヒトで識別するためのキットにおいて、上述の組成物及び方法を用いる。いくつかの実施形態では、基本的なキットは、本明細書に開示する核酸分子のいずれか（例えば、配列番号２、配列番号４、及び／または配列番号６など）における遺伝子座に対する、変異特異的プローブまたは変異特異的プライマーなどのオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが少なくとも一対入った容器を含むことができる。キットは、任意選択により、使用説明書を含んでもよい。キットは、例えば、増幅される各座位に対するアレリックラダー、充分な量の増幅用酵素、増幅を促す増幅用緩衝液、酵素活性を高める二価カチオン溶液、増幅の際の鎖伸長用のｄＮＴＰ、電気泳動用増幅物質を調製するためのローディング溶液、テンプレートコントロールとしてのゲノムＤＮＡ、物質が分離媒体において見込みどおりに移動することを確実にするためのサイズマーカー、ならびにユーザに説明するとともに使用時のエラーを限定的にするためのプロトコール及びマニュアルのうちの１つ以上など、他の任意選択によるキット構成要素も含むことができる。キット内の様々な試薬の量は、プロセスの最適感度など、いくつかの要因に応じて異なってもよい。手作業での応用において使用するためのテストキット、または自動化された試料調製、反応セットアップ、検知器もしくは分析器とともに使用するためのテストキットを提供することは、これらの教示の範囲内である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子もしくはその相補体の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に次のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１０）を含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８を有するバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号２による３３７５位に対応する位置にチミンを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるゲノムＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号２による３３７５位に対応する位置にチミンを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるゲノムＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号２による核酸配列を含むかもしくはそれからなるゲノムＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に次のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１０）を含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８を有するバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号４による２０５位に対応する位置にウラシルを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるｍＲＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号４による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＵ及びＵＧＵを含むｍＲＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号４と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号４による２０５位に対応する位置にウラシルを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるｍＲＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号４による核酸配列を含むかもしくはそれからなるｍＲＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に次のアミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１０）を含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号８を有するバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるｃＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号６による２０２〜２０４位及び２０５〜２０７位に対応する位置にそれぞれコドンＡＣＴ及びＴＧＴを含むｃＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、かつ配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを含む核酸配列を含むかもしくはそれからなるｃＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号６による核酸配列を含むかもしくはそれからなるｃＤＮＡ分子の増幅のための、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、変異特異的プライマー）、またはその検知のための、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、変異特異的プローブ）を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示するキットのいずれも、ヌクレオチドラダー、プロトコール、酵素（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅で使用する酵素など）、ｄＮＴＰ、緩衝液、１つの塩または複数の塩、及び対照核酸試料のうちのいずれか１つ以上をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示するキットのいずれも、検知可能な標識、アニーリング反応を行うのに必要な生成物及び試薬、ならびに説明書のうちのいずれか１つ以上をさらに含んでよい。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示するキットは、配列番号２の３３７５位に対応する位置あるいは配列番号４及び／または配列番号６の２０５位に対応する位置におけるチミンに直接ハイブリダイズする３’末端ヌクレオチドを含む、プライマーもしくはプローブまたは変異特異的プライマーもしくは変異特異的プローブを含み得る。
【０１４７】
当業者は、用いられる検知技術が一般的に限定的でないことを理解している。むしろ、アンプリコンの存在または非存在の判定を可能にするものである限り、広範な検知手段が本開示の方法及びキットの範囲内である。
【０１４８】
いくつかの態様では、キットは、本明細書に開示するプライマーまたはプローブのうちの１つ以上を含むことができる。例えば、キットは、開示されている遺伝的バリアントのうちの１つ以上にハイブリダイズする１つ以上のプローブを含むことができる。
【０１４９】
いくつかの態様では、キットは、開示されている細胞または細胞株のうちの１つを含むことができる。いくつかの態様では、キットは、トランスジェニック細胞または細胞株を作るために必要な物質を含み得る。例えば、いくつかの態様では、キットは、細胞と、開示されている遺伝的バリアントのうちの１つ以上を含む核酸配列を含むベクターとを含み得る。キットは、細胞培養のための培地をさらに含むことができる。
【０１５０】
本開示はまた、ヒト対象由来の生体試料中のＣＲＮＮバリアントゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及び／またはポリペプチドの存在を検知するための方法を提供する。集団内の遺伝子配列、ならびにそのような遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質は、一塩基多型などの多型により異なり得ることが理解される。本明細書において提供するＣＲＮＮゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びポリペプチドの配列は例示的な配列に過ぎない。ＣＲＮＮゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びポリペプチドの他の配列も可能である。
【０１５１】
生体試料は、対象の任意の細胞、組織、または生体液に由来し得る。この試料は、骨髄試料、腫瘍生検標本、細針吸引生検標本、または体液（血液、歯肉溝滲出液、血漿、血清、リンパ、腹水、嚢胞液もしくは尿など）の試料といった任意の臨床的に関連する組織を含んでよい。いくつかの場合では、試料には口腔スワブが含まれる。本明細書に開示する方法において使用する試料は、アッセイ形式、検知方法の性質、及び試料として使用する組織、細胞、または抽出物に基づいて様々に異なる。生体試料には、用いるアッセイに応じて、異なる処理を行うことができる。例えば、バリアントＣＲＮＮ核酸分子を検知する場合、ゲノムＤＮＡの試料を単離または濃縮するように設計した予備処理を用いることができる。この目的では、種々の技術を使用してもよい。バリアントＣＲＮＮ  ｍＲＮＡのレベルを検知する場合、様々な技術を使用して生体試料のｍＲＮＡを濃縮することができる。ｍＲＮＡの存在もしくはレベル、または特定のバリアントゲノムＤＮＡ遺伝子座の存在を検知するための様々な方法を使用することができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本開示は、バリアントＣＲＮＮタンパク質の存在または非存在を検知する方法であって、生体試料中のタンパク質のうちの少なくとも一部分をシーケンシングして、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードするアミノ酸配列がタンパク質に含まれるかどうかを判定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはバリアントＣＲＮＮタンパク質の存在または非存在を検知する方法であって、生体試料中のタンパク質のうちの少なくとも一部分をシーケンシングして、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードするアミノ酸配列がタンパク質に含まれるかどうかを判定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、バリアントＣＲＮＮタンパク質の存在または非存在を検知する方法であって、生体試料中のタンパク質のうちの少なくとも一部分をシーケンシングして、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むＣＲＮＮタンパク質をコードするアミノ酸配列がタンパク質に含まれるかどうかを判定することを含む方法を提供する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本開示は、バリアントＣＲＮＮ核酸分子の存在または非存在を検知する方法であって、生体試料中の核酸のうちの少なくとも一部分をシーケンシングして、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列が核酸に含まれるかどうかを判定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、バリアントＣＲＮＮ核酸分子の存在または非存在を検知する方法であって、生体試料中の核酸のうちの少なくとも一部分をシーケンシングして、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列が核酸に含まれるかどうかを判定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、バリアントＣＲＮＮ核酸分子の存在または非存在を検知する方法であって、生体試料中の核酸のうちの少なくとも一部分をシーケンシングして、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列が核酸に含まれるかどうかを判定することを含む方法を提供する。本明細書に開示するバリアント核酸分子のいずれも、本明細書に記載のプローブ及びプライマーのいずれかを使用して検知され得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、対象の皮膚障害に関連するバリアントＣＲＮＮ核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）の存在または非存在を検知する方法であって、本明細書に開示するバリアントＣＲＮＮ核酸配列のいずれか（例えば、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子）が生体試料中の核酸分子に含まれるかどうかを判定するアッセイを、対象から得られた生体試料に行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、生体試料には、細胞または細胞溶解物が含まれる。このような方法は、例えば、ＣＲＮＮゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む生体試料を対象から得ることであり、ｍＲＮＡである場合、任意選択により、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写すること、及び、ＣＲＮＮゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡのうちのある位置が、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードするかどうかを判定するアッセイを、生体試料に行うことをさらに含んでもよい。このような方法は、例えば、ＣＲＮＮゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む生体試料を対象から得ることであり、ｍＲＮＡである場合、任意選択により、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写すること、及び、ＣＲＮＮゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡのうちのある位置が、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードするかどうかを判定するアッセイを、生体試料に行うこと、または、ＣＲＮＮゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡのうちのある位置が、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むＣＲＮＮタンパク質をコードするかどうかを判定するアッセイを、生体試料に行うことをさらに含み得る。このようなアッセイは、例えば、特定のＣＲＮＮ核酸分子のこれらの位置の同一性を判定することを含み得る。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、アッセイは、対象の生体試料中の核酸分子のＣＲＮＮゲノムＤＮＡ配列のうちの少なくとも一部分をシーケンシングすることであって、シーケンシングされる部分には、配列番号８によるＣＲＮＮタンパク質の６９位におけるシステインをコードする位置に対応する位置が含まれる、シーケンシングすること、対象の生体試料中の核酸分子のＣＲＮＮ  ｍＲＮＡ配列のうちの少なくとも一部分をシーケンシングすることであって、シーケンシングされる部分には、配列番号８によるＣＲＮＮタンパク質の６９位におけるシステインをコードする位置に対応する位置が含まれる、シーケンシングすること、または、対象の生体試料中の核酸分子のＣＲＮＮ  ｃＤＮＡ配列のうちの少なくとも一部分をシーケンシングすることであって、シーケンシングされる部分には、配列番号８によるＣＲＮＮタンパク質の６９位におけるシステインをコードする位置に対応する位置が含まれる、シーケンシングすることを含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、アッセイは、ａ）生体試料をプライマーと接触させることであって、プライマーが、ｉ）配列番号８による６９位におけるシステインをコードする位置に対応する位置におけるＣＲＮＮゲノム配列の位置に近接するＣＲＮＮゲノムＤＮＡ配列の一部分、ｉｉ）配列番号８による６９位におけるシステインをコードする位置に対応する位置におけるＣＲＮＮ  ｍＲＮＡ配列の位置に近接するＣＲＮＮ  ｍＲＮＡ配列の一部分、またはｉｉｉ）配列番号８による６９位におけるシステインをコードする位置に対応する位置におけるＣＲＮＮ  ｃＤＮＡ配列の位置に近接するＣＲＮＮ  ｃＤＮＡ配列の一部分にハイブリダイズする、接触させることと、ｂ）プライマーを、少なくとも、ｉ）配列番号８による６９位におけるシステインをコードするコドンを超えるヌクレオチド位置に対応するＣＲＮＮゲノムＤＮＡ配列の位置、ｉｉ）配列番号８による６９位におけるシステインをコードするコドンを超えるヌクレオチド位置に対応するＣＲＮＮ  ｍＲＮＡ配列の位置、またはｉｉｉ）配列番号８による６９位におけるシステインをコードするコドンを超えるヌクレオチド位置に対応するＣＲＮＮ  ｃＤＮＡ配列の位置を通じて伸長させることと、ｃ）配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするヌクレオチドがプライマーの伸長産物に含まれるかどうかを判定することとを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＮＮゲノムＤＮＡのみを分析する。いくつかの実施形態では、ＣＲＮＮ  ｍＲＮＡのみを分析する。いくつかの実施形態では、ＣＲＮＮ  ｍＲＮＡから得られたＣＲＮＮ  ｃＤＮＡのみを分析する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、アッセイは、ａ）生体試料を変異特異的プライマーと接触させることであって、変異特異的プライマーが、ｉ）配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするヌクレオチドを含むＣＲＮＮゲノムＤＮＡ配列の一部分、ｉｉ）配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするヌクレオチドを含むＣＲＮＮ  ｍＲＮＡ配列の一部分、またはｉｉｉ）配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするヌクレオチドを含むＣＲＮＮ  ｃＤＮＡ配列の一部分にハイブリダイズする、接触させることと、ｂ）変異特異的ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用してプライマーを伸長させることと、ｃ）伸長が生じたかどうかを判定することとを含む。核酸配列内の欠失などの突然変異を検知するためには、変異特異的ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用することができる。テンプレートとのミスマッチが存在する場合はＤＮＡポリメラーゼが伸長しないため、変異特異的プライマーが使用される。当業者であれば、基本的な変異特異的ポリメラーゼ連鎖反応技術のいくつかのバリエーションを自由に使うことができる。
【０１５８】
変異特異的プライマーは、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列またはこの核酸配列の相補体に相補的な核酸配列を含み得る。例えば、変異特異的プライマーは、配列番号８をコードする核酸配列またはこの核酸配列の相補体に相補的な核酸配列を含み得る。変異特異的プライマーは、好ましくは、バリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列が、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードする場合、この核酸配列に特異的にハイブリダイズする。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、アッセイは、ストリンジェントな条件下でバリアントＣＲＮＮゲノムＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ配列、またはｃＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし、対応する野生型ＣＲＮＮ配列にはハイブリダイズしないプライマーまたはプローブに生体試料を接触させることと、ハイブリダイゼーションが生じたかどうかを判定することとを含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、アッセイは、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を含む。いくつかの実施形態では、アッセイは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することも含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本方法は、標的核酸配列に結合し、バリアントＣＲＮＮゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドを特異的に検知及び／または識別するのに十分なヌクレオチド長のプローブ及びプライマーを利用する。ハイブリダイゼーション条件または反応条件は、この結果を達成するように作業者が決定することができる。このヌクレオチド長は、本明細書に記載または例示する任意のアッセイを含む最適な検知方法において使用するのに十分な任意の長さであり得る。一般的には、例えば、約８、約１０、約１１、約１２、約１４、約１５、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、または約７００ヌクレオチド以上、または約１１〜約２０、約２０〜約３０、約３０〜約４０、約４０〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜約２００、約２００〜約３００、約３００〜約４００、約４００〜約５００、約５００〜約６００、約６００〜約７００、または約７００〜約８００、またはこれ以上のヌクレオチド長のプライマーまたはプローブが使用される。好ましい実施形態では、プローブまたはプライマーは、少なくとも約１８のヌクレオチド長を含む。プローブまたはプライマーは、約１０〜約３５、約１０〜約３０、約１０〜約２５、約１２〜約３０、約１２〜約２８、約１２〜約２４、約１５〜約３０、約１５〜約２５、約１８〜約３０、約１８〜約２５、約１８〜約２４、または約１８〜約２２のヌクレオチド長を含み得る。好ましい実施形態では、プローブまたはプライマーは、約１８〜約３０のヌクレオチド長である。
【０１６２】
このようなプローブ及びプライマーは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる。プローブ及びプライマーは、標的配列に対して連続ヌクレオチドの完全な核酸配列同一性を有していてもよいが、標的核酸配列とは異なり、かつ標的核酸配列を特異的に検知及び／または識別する能力を保持するプローブを、従来の方法により設計してもよい。したがって、プローブ及びプライマーは、標的核酸分子と、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の配列同一性または相補性を共有することができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、特異的プライマーを使用して、バリアントＣＲＮＮ遺伝子座及び／またはＣＲＮＮバリアントｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡを増幅してアンプリコンを生成することができ、このアンプリコンは、生体試料中のバリアントＣＲＮＮ遺伝子座を識別するため、または特定のＣＲＮＮ  ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡのレベルを判定するために、特異的プローブとして使用してもよく、またはそれ自体を検知してもよい。ＣＲＮＮバリアント遺伝子座は、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードする位置に対応する位置を含むゲノム核酸配列を示すために使用され得る。プローブが核酸分子に結合できるようにする条件下でプローブが生体試料中の核酸分子にハイブリダイズする場合、この結合を検知し、生体試料中のバリアントＣＲＮＮ遺伝子座の存在またはバリアントＣＲＮＮ  ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡの存在もしくはレベルを示すようにすることができる。このような結合したプローブの識別については既に説明されている。特異的プローブは、バリアントＣＲＮＮ遺伝子の特定の領域と少なくとも約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、及び約９５％〜約１００％同一（または相補的）である配列を含んでいてもよい。特異的プローブは、バリアントＣＲＮＮ  ｍＲＮＡの特定の領域と少なくとも約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、及び約９５％〜約１００％同一（または相補的）である配列を含んでいてもよい。特異的プローブは、バリアントＣＲＮＮ  ｃＤＮＡの特定の領域と少なくとも約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、及び約９５％〜約１００％同一（または相補的）である配列を含んでいてもよい。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、バリアントＣＲＮＮタンパク質（例えば、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質、トランケート型ＣＲＮＮタンパク質、または配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを有するバリアントＣＲＮＮタンパク質）をコードする核酸配列が生体試料の核酸相補体に含まれるかどうかを判定するためには、配列番号８による６９位に対応する位置におけるセリンをコードする位置に隣接する５’フランキング配列に由来する第１のプライマーと、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードする位置に隣接する３’フランキング配列に由来する第２のプライマーとを含む、プライマーペアを使用した核酸増幅方法に生体試料を供して、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードする位置におけるヌクレオチドの存在の診断に関するアンプリコンを生成することができる。いくつかの実施形態では、アンプリコンの長さは、プライマーペアの長さに１ヌクレオチド塩基対を足した合計の長さから、ＤＮＡ増幅プロトコールによって生成可能なアンプリコンの任意の長さまで様々であり得る。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から増幅反応の限界、すなわち約２万ヌクレオチド塩基対までの範囲であり得る。任意選択により、プライマーペアは、配列番号８による６９位におけるシステインをコードする位置と、配列番号８による６９位におけるシステインをコードする位置の各側の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチドとを含む領域にフランキングする。同様のアンプリコンは、ｍＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡ配列から生成され得る。
【０１６５】
プローブ及びプライマーの調製及び使用のための代表的方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９（以下「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９」という）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２（定期的更新を含む）（以下「Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２」という）、及びＩｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０）に記載されている。ＰＣＲプライマーペアは、既知の配列から導出することができ、これは例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩバージョン１０（Ｉｎｆｏｒｍａｘ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．）、ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、及びＰｒｉｍｅｒ３（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．４．０．ＣＯＰＹＲＧＴ．，１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）におけるＰＣＲプライマー分析ツールなど、その目的のために意図されたコンピュータプログラムを使用して行われる。さらに、配列を視覚的にスキャンし、プライマーを手作業で識別することができる。
【０１６６】
任意の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅またはシーケンシング方法を使用して、バリアントＣＲＮＮ遺伝子座の存在及び／またはバリアントＣＲＮＮ  ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡのレベルを特異的に検知することができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＮＮ核酸のある領域を増幅させるためのプライマーとして核酸分子を使用してもよく、あるいは、例えば、バリアントＣＲＮＮ遺伝子座を含む核酸分子またはバリアントＣＲＮＮ  ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡを含む核酸分子にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするプローブとして核酸分子を使用してもよい。
【０１６７】
当該技術分野では、例えば、核酸シーケンシング、核酸ハイブリダイゼーション、及び核酸増幅を含め、種々の技術が利用可能である。核酸シーケンシング技術の実例としては、チェーンターミネーター（サンガー）シーケンシング及びダイターミネーターシーケンシングが挙げられるが、これらに限らない。
【０１６８】
他の方法には、精製ＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、及び固定細胞調製物に対する標識プライマーまたはプローブの使用（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））を含め、シーケンシング以外の核酸ハイブリダイゼーション法が含まれる。いくつかの方法では、標的核酸を、検知の前または検知と同時に増幅してもよい。核酸増幅技術の実例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換型増幅法（ＳＤＡ）、及び核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限らない。他の方法としては、リガーゼ連鎖反応、鎖置換型増幅法、及び好熱ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）が挙げられるが、これらに限らない。
【０１６９】
増幅されていないポリヌクレオチドまたは増幅されたポリヌクレオチドの検知のためには、例えば、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）、リアルタイムでの増幅プロセスの定量的評価、及びリアルタイム増幅に基づかない、試料中に最初に存在する標的配列の量の判定を含む、任意の方法を使用することができる。
【０１７０】
また、配列の増幅を必ずしも必要とせず、例えば、染色体物質のサザン（ＤＮＡ：ＤＮＡ）ブロットハイブリダイゼーション法、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法、及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法に基づく、核酸を識別するための方法が提供される。サザンブロッティングは、特定の核酸配列を検知するために使用され得る。このような方法では、試料から抽出される核酸を断片化し、マトリックスゲル上で電気泳動分離し、メンブレンフィルターに転写する。フィルターに結合した核酸を、目的の配列に相補的な標識プローブとのハイブリダイゼーションに供する。フィルターに結合したハイブリダイズしたプローブを検知する。このような方法のいずれにおいても、本明細書に記載または例示されるプローブのいずれかを使用したハイブリダイゼーションがプロセスに含まれ得る。
【０１７１】
ハイブリダイゼーション技術では、プローブまたはプライマーがその標的にハイブリダイズするように、ストリンジェントな条件が用いられ得る。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件下のポリヌクレオチドプライマーまたはプローブは、その標的配列（例えば、バリアントＣＲＮＮ遺伝子座、バリアントＣＲＮＮ  ｍＲＮＡ、またはバリアントＣＲＮＮ  ｃＤＮＡ）に、他の配列（例えば、対応する野生型ＣＲＮＮ遺伝子座、野生型ｍＲＮＡ、または野生型ｃＤＮＡ）よりも検知可能に高い程度まで、例えばバックグラウンドの少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍またはそれ以上、例えばバックグラウンドの１０倍高い程度までハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件下のポリヌクレオチドプライマーまたはプローブは、その標的配列に、他の配列よりも検知可能に高い程度（少なくとも２倍）でハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件下のポリヌクレオチドプライマーまたはプローブは、その標的配列に、他の配列よりも検知可能に高い程度（少なくとも３倍）でハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件下のポリヌクレオチドプライマーまたはプローブは、その標的配列に、他の配列よりも検知可能に高い程度（少なくとも４倍）でハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件下のポリヌクレオチドプライマーまたはプローブは、その標的配列に、他の配列よりも検知可能に高い程度（バックグラウンドの１０倍）でハイブリダイズする。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、状況が異なれば異なることになる。ハイブリダイゼーション及び／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに１００％相補的な標的配列を識別することができる（相同的探索）。あるいは、より低い程度の同一性が検知されるように、ストリンジェンシー条件を調整して配列の一部のミスマッチを許容することができる（非相同的探索）。
【０１７２】
ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件としては、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後、５０℃で２×ＳＳＣによって洗浄する条件、及び例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に開示されている条件が挙げられるが、これらに限らない。典型的には、ハイブリダイゼーション及び検知のためのストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３においてＮａイオン約１．５Ｍ未満、典型的にはＮａイオン濃度（またはその他の塩）約０．０１〜１．０Ｍであり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、それよりも長いプローブ（例えば５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃である条件となる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成することもできる。例示的な低ストリンジェンシー条件は、３０〜３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）からなる緩衝液を用いた３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）における５０〜５５℃での洗浄を含む。例示的な中ストリンジェンシー条件は、４０〜４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳにおける３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．５×〜１×ＳＳＣにおける５５〜６０℃での洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳにおける３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣにおける６０〜６５℃での洗浄を含む。任意選択により、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％のＳＤＳを含んでもよい。ハイブリダイゼーションの持続期間は、概して約２４時間未満、通常約４〜約１２時間である。洗浄持続期間は、少なくとも、平衡に達するのに十分な長さの時間である。
【０１７３】
ハイブリダイゼーション反応において、特異性は通常、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８４，１３８，２６７−２８４：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌの式から概算することができ、式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは塩基対のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、完全に一致するプローブに対して、相補的な標的配列の５０％がハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨの下で）である。Ｔｍは、１％のミスマッチごとに約１℃ずつ低下する。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び／または洗浄条件を調整して、所望の同一性の配列にハイブリダイズさせることができる。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍを１０℃低下させることができる。概して、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで特定の配列及びその相補体の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、厳密にストリンジェントな条件では、熱融点（Ｔｍ）より１℃、２℃、３℃、または４℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができ、中程度にストリンジェントな条件では、熱融点（Ｔｍ）より６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェンシー条件では、熱融点（Ｔｍ）より１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができる。当業者であれば、この式、ハイブリダイゼーション組成物及び洗浄組成物、ならびに所望のＴｍを使用して、ハイブリダイゼーション及び／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションが本質的に説明されることを理解するであろう。所望される程度のミスマッチの結果、Ｔｍが４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満である場合、より高い温度を使用することができるようにＳＳＣ濃度を上げることが最適である。
【０１７４】
また、例えばタンパク質シーケンシング及びイムノアッセイを含む、生体試料中のバリアントＣＲＮＮポリペプチドの存在の検知またはそのレベルの定量化のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト対象におけるバリアントＣＲＮＮタンパク質（例えば、配列番号８）の存在を検知する方法は、生体試料中のバリアントＣＲＮＮタンパク質（例えば、配列番号８）の存在を検知するアッセイを、ヒト対象から得られた生体試料に行うことを含む。
【０１７５】
タンパク質シーケンシング技術の非限定的な実例としては、質量分析法及びエドマン分解が挙げられるが、これらに限らない。イムノアッセイの実例としては、免疫沈降、ウエスタンブロット、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、及び免疫ＰＣＲが挙げられるが、これらに限らない。様々な技術（例えば、発色性、蛍光性、化学発光性、または放射性）を使用して検知可能に標識したポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、イムノアッセイでの使用に好適である。イムノアッセイに関しては、バリアントＣＲＮＮタンパク質は野生型ＣＲＮＮタンパク質と比較してサイズが異なるため、異なる分子量でタンパク質ゲル上を泳動する。したがって、例えばウェスタンブロットアッセイにおいて、同じ抗体を使用することにより、野生型ＣＲＮＮタンパク質をバリアントＣＲＮＮタンパク質と区別することができる。
【０１７６】
本開示はまた、ヒト対象の、皮膚障害を診断するため、または皮膚障害の発症リスクを検知するための方法であって、ヒト対象から得られたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子において、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする変異を検知すること、及び、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有する場合に、ヒト対象を皮膚障害と診断すること、または、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有しない場合に、ヒト対象を皮膚障害の発症リスクがあるものと診断することを含む、方法を提供する。
【０１７７】
本開示はまた、ヒト対象の、皮膚障害を診断するため、または皮膚障害の発症リスクを検知するための方法であって、ヒト対象から得られたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子において、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくは配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードする変異を検知すること、及び、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有する場合に、ヒト対象を皮膚障害と診断すること、または、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有しない場合に、ヒト対象を皮膚障害の発症リスクがあるものと診断することを含む、方法を提供する。
【０１７８】
本開示はまた、ヒト対象の、皮膚障害を診断するため、または皮膚障害の発症リスクを検知するための方法であって、ヒト対象から得られた核酸分子において、本明細書に記載のＣＲＮＮ核酸分子のいずれかにおける変異のいずれかを検知すること、及び、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有する場合に、ヒト対象を皮膚障害と診断すること、または、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有しない場合に、ヒト対象を皮膚障害の発症リスクがあるものと診断することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、このような診断を必要とするものである。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、皮膚障害と診断されたことがある親族を有し得る。
【０１７９】
皮膚障害の症状としては、乾癬性発疹、皮膚における痒みのある赤い乾燥斑の形成、皮膚における痒みのある乾燥した鱗屑の形成、皮膚の銀白色の鱗状斑の出現、皮膚の斑状の炎症、皮膚の広範な炎症または剥脱、炎症した皮膚の隆起及び疼痛、皮膚における膿疱または丘疹の出現、手指及び足指の凹み、手指及び足指の爪の変色または白化、手指及び足指の爪下の皮膚の肥厚、手指及び足指の爪の緩みまたは崩壊、関節及び周囲組織の炎症が挙げられるが、これらに限らない。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本方法は、対象から得られた生体試料から得られた、バリアントＣＲＮＮゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡの存在を検知することを含む。集団内の遺伝子配列、及びそのような遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、一塩基多型（ＳＮＰ）などの多型により異なり得ることが理解される。本明細書で提供するＣＲＮＮゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びポリペプチドの配列は、例示的な配列に過ぎず、さらなるＣＲＮＮアレルを含め、他のかかる配列も可能である。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、検知ステップは、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子のうちの少なくとも一部分をシーケンシングすることを含む。いくつかの実施形態では、検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子のうちの少なくとも一部分をシーケンシングすることを含み、シーケンシングされる核酸分子は、配列番号８による６９位に対応する位置を含むアミノ酸配列をコードする。本明細書に開示する核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）のいずれがシーケンシングされてもよい。いくつかの実施形態では、検知ステップは、核酸分子全体をシーケンシングすることを含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、検知ステップは、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子のうちの少なくとも一部分を増幅することと、核酸分子を検知可能な標識で標識することと、標識した核酸を、プローブを含む支持体と接触させることであって、プローブが、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む、接触させることと、検知可能な標識を検知することとを含む。いくつかの実施形態では、検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子のうちの少なくとも一部分を増幅することであって、増幅する核酸分子が、配列番号８による６９位に対応する位置を含むアミノ酸配列をコードする、増幅することと、核酸分子を検知可能な標識で標識することと、標識した核酸を、プローブを含む支持体と接触させることであって、プローブが、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードする核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む、接触させることと、検知可能な標識を検知することとを含む。本明細書に開示する核酸分子のいずれも増幅することができる。例えば、本明細書に開示するゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ分子のいずれを増幅してもよい。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｍＲＮＡであり、本方法は、増幅ステップの前にｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することをさらに含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子を、検知可能な標識を含むプローブと接触させることであって、プローブが、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む、接触させることと、検知可能な標識を検知することとを含む。いくつかの実施形態では、検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子を、検知可能な標識を含むプローブと接触させることであって、プローブが、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む、接触させることと、検知可能な標識を検知することとを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、検知がインサイチュハイブリダイゼーション技術によって行われるように、ヒト対象から得られた細胞内に存在する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子を変異特異的プライマーと接触させることと、変異特異的ＰＣＲ技術を使用して核酸分子を増幅することとを含む。変異特異的プライマーは、本明細書に記載の任意のかかるプライマーであってよく、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするバリアントＣＲＮＮタンパク質に対して特異的であってよい。
【０１８５】
本明細書に開示する方法で使用することができる他のアッセイとしては、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。本明細書に開示する方法で使用することができるさらに他のアッセイとしては、例えば、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）ならびにそれに続く生体試料中のバリアントｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの存在及び量の検知が挙げられる。
【０１８６】
本開示はまた、皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有するヒト対象を識別するための方法であって、対象から得られた試料中の、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子の存在または非存在を検知することを含み、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子の存在が、対象が皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有することを示す、方法を提供する。
【０１８７】
本開示はまた、皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有するヒト対象を識別するための方法であって、対象から得られた試料中の、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくは配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくは配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子の存在または非存在を検知することを含み、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子の存在が、対象が皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有することを示す、方法を提供する。
【０１８８】
本開示はまた、皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有するヒト対象を識別するための方法を提供する。本方法は、概して、対象から得られた試料中の、バリアントＣＲＮＮタンパク質の存在もしくは非存在、及び／またはバリアントＣＲＮＮタンパク質をコードする本明細書に記載の核酸分子のいずれかの存在もしくは非存在を検知することを含む。機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質の存在は、対象が皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有することを示す。配列番号２（例えば、ゲノムＤＮＡ）による３３７５位に対応する位置におけるチミン、または配列番号４（例えば、ｍＲＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるウラシル、または配列番号６（例えば、ｃＤＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるチミンの存在は、それぞれ、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をもたらし、対象が皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有することを示す。本方法は、インビトロ、インサイチュ、またはインビボで行ってもよい。
【０１８９】
本開示はまた、皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有するヒト対象を識別するための方法であって、対象から得られた試料中の、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを有し、かつ配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされているＣＲＮＮタンパク質、及び／または配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを有し、かつ配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされているＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子の存在または非存在を検知することを含み、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子の存在が、対象が皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有することを示す、方法を提供する。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８による６９〜７６位、７８位、及び７９位に対応する位置のいずれか１つに、野生型ＣＲＮＮタンパク質と比較して異なるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、試料中の機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質の存在または非存在は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質に対して特異的な抗体を用いて検知される。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮに対して特異的な抗体は、ｉ）配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステイン、またはｉｉ）配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを生じるフレームシフト突然変異に起因してＣＲＮＮタンパク質に作られたエピトープに対して特異的である。いくつかの実施形態では、検知は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮに対して特異的な抗体の反応を、野生型ＣＲＮＮに対して特異的な抗体の反応と比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料中の機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質の存在または非存在は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検知される。いくつかの実施形態では、試料中の機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子の存在または非存在は、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを作るフレームシフト突然変異が核酸分子中にあるかどうかを判定することによって検知される。いくつかの実施形態では、シーケンシングされる核酸分子のうちの一部分は、配列番号８による６９位に対応する位置をコードするコドンを包含する複数の位置を含む。
【０１９１】
本方法のいくつかの実施形態では、検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子のうちの少なくとも一部分をシーケンシングすることを含む。本方法のいくつかの実施形態では、検知ステップは、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子のうちの少なくとも一部分をシーケンシングすることを含む。シーケンシングされる核酸分子は、配列番号８による６９位に対応する位置を含むアミノ酸配列をコードし得る。配列番号２（例えば、ゲノムＤＮＡ）による３３７５位に対応する位置におけるチミン、または配列番号４（例えば、ｍＲＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるウラシル、または配列番号６（例えば、ｃＤＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるチミンの存在は、それぞれ、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をもたらす。検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質全体をコードする核酸分子をシーケンシングすることを含み得る。
【０１９２】
本方法のいくつかの実施形態では、検知ステップは、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子のうちの少なくとも一部分を増幅することと、増幅した核酸分子を検知可能な標識で標識することと、標識した核酸分子を、プローブを含む支持体と接触させることであって、プローブが、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸配列に、例えばストリンジェントな条件下などで、特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、接触させることと、検知可能な標識を検知することとを含む。本方法のいくつかの実施形態では、検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子のうちの少なくとも一部分を増幅することと、増幅した核酸分子を検知可能な標識で標識することと、標識した核酸分子を、プローブを含む支持体と接触させることであって、プローブが、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードする核酸配列（または、配列番号２（例えば、ゲノムＤＮＡ）による３３７５位に対応する位置におけるチミン、もしくは配列番号４（例えば、ｍＲＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるウラシル、もしくは配列番号６（例えば、ｃＤＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるチミン（これらはそれぞれ、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をもたらす）を有する核酸配列）に、例えばストリンジェントな条件下などで、特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、接触させることと、検知可能な標識を検知することとを含む。増幅する核酸分子は、好ましくは、配列番号８による６９位に対応する位置を含むアミノ酸配列をコードする。核酸がｍＲＮＡを含む場合、本方法は、増幅ステップの前にｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、判定ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子を、検知可能な標識を含むプローブと接触させることと、検知可能な標識を検知することとを含む。プローブは、好ましくは、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列（または、配列番号２（例えば、ゲノムＤＮＡ）による３３７５位に対応する位置におけるチミン、または配列番号４（例えば、ｍＲＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるウラシル、または配列番号６（例えば、ｃＤＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるチミン（これらはそれぞれ、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による７９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をもたらす）を有する核酸配列）に、例えばストリンジェントな条件下などで、特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む。核酸分子は、ヒト対象から得られた細胞内に存在し得る。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子のうちの少なくとも一部分を増幅することであって、増幅する核酸分子が、配列番号８による６９位に対応する位置におけるアミノ酸をコードするコドンを包含する、増幅することと、増幅した核酸分子を検知可能な標識で標識することと、標識した核酸分子を、プローブを含む支持体と接触させることであって、プローブが、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する核酸配列にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、接触させることと、検知可能な標識を検知することとを含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子を、検知可能な標識を含むプローブと接触させることであって、プローブが、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する核酸配列にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、接触させることと、検知可能な標識を検知することとを含む。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、皮膚障害または皮膚障害の発症リスクを有するものとして識別される。
【０１９５】
本開示はまた、ヒト対象の、皮膚障害を診断するため、または皮膚障害の発症リスクを検知するための方法であって、ヒト対象から得られた機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質を検知すること、及び、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有する場合に、ヒト対象を皮膚障害と診断すること、または、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有しない場合に、ヒト対象を皮膚障害の発症リスクがあるものと診断することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、このような診断を必要とするものである。本開示はまた、ヒト対象の、皮膚障害を診断するため、または皮膚障害の発症リスクを検知するための方法であって、ヒト対象から得られた、配列番号８を含むタンパク質などのバリアントＣＲＮＮタンパク質を検知すること、及び、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有する場合に、ヒト対象を皮膚障害と診断すること、または、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有しない場合に、ヒト対象を皮膚障害の発症リスクがあるものと診断することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、このような診断を必要とするものである。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、皮膚障害と診断されたことがある親族を有し得る。
【０１９６】
本開示はまた、ヒト対象の、皮膚障害診断するため、または皮膚障害のリスクを検知するための方法であって、ヒト対象から得られたバリアントＣＲＮＮタンパク質（このＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを有し、かつ配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされている）をコードする核酸分子を検知すること、及び／または、ヒト対象から得られたＣＲＮＮタンパク質（このＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを有し、かつ配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされている）を検知すること、及び、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有する場合に、ヒト対象を皮膚障害と診断すること、または、対象が皮膚障害の１つ以上の症状を有しない場合に、ヒト対象を皮膚障害のリスクがあるものと診断することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、バリアントＣＲＮＮタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質である。いくつかの実施形態では、バリアントＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８による６９〜７６位、７８位、及び７９位に対応する位置のいずれか１つに、野生型ＣＲＮＮタンパク質と比較して異なるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮに対して特異的な抗体を用いて検知される。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮに対して特異的な抗体は、ｉ）配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステイン、またはｉｉ）配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを生じるフレームシフト突然変異に起因してＣＲＮＮタンパク質に作られたエピトープに対して特異的である。いくつかの実施形態では、検知は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮに対して特異的な抗体の反応を、野生型ＣＲＮＮに対して特異的な抗体の反応と比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検知される。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを作るフレームシフト突然変異を核酸分子中で検知することによって検知される。いくつかの実施形態では、シーケンシングされる核酸分子のうちの一部分は、配列番号８による６９位に対応する位置をコードするコドンを包含する複数の位置を含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子のうちの少なくとも一部分を増幅することであって、増幅する核酸分子が、配列番号８による６９位に対応する位置におけるアミノ酸をコードするコドンを包含する、増幅することと、増幅した核酸分子を検知可能な標識で標識することと、標識した核酸分子を、プローブを含む支持体と接触させることであって、プローブが、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する核酸配列にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、接触させることと、検知可能な標識を検知することとを含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、検知ステップは、ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子を、検知可能な標識を含むプローブと接触させることであって、プローブが、配列番号８による６９位に対応する位置におけるシステインをコードするコドンを包含する核酸配列にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む、接触させることと、検知可能な標識を検知することとを含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかは、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤で対象を処置することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、変異が対象において検知され、かつ対象が皮膚障害を有するものと診断された場合、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤で対象を処置することをさらに含む。
【０２００】
いくつかの実施形態では、皮膚障害は、乾癬、湿疹、またはアトピー性皮膚炎である。いくつかの実施形態では、皮膚障害は乾癬である。いくつかの実施形態では、皮膚障害は湿疹である。いくつかの実施形態では、皮膚障害はアトピー性皮膚炎である。いくつかの実施形態では、乾癬は、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、または乾癬性関節炎である。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ビタミンであるか、またはビタミンを含む。いくつかの実施形態では、ビタミンは、ビタミンＡまたはビタミンＤである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、サリチル酸である。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、コルチコステロイドである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ソラレンである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、メトトレキサートである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、シクロスポリンである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、抗体、または少なくともその抗原結合ドメインである。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ブロダルマブ（Ｓｉｌｉｑ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、イキセキズマブ（Ｔａｌｔｚ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、セクキヌマブ（Ｃｏｓｅｎｔｙｘ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。
【０２０３】
治療剤の投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含むがこれらに限らない任意の好適な経路によるものとすることができる。投与用の医薬組成物は、望ましくは無菌であり、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は、単位投与形態（すなわち、単回投与の用量）で提供することができる。医薬組成物は、１つ以上の生理学的及び薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択した投与経路に依存する。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤が製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに実質的に有害ではないことを意味する。
【０２０４】
本開示はまた、皮膚障害を患う患者を皮膚障害の治療剤で処置するための方法を提供する。本方法は、本明細書に記載のバリアントＣＲＮＮ核酸分子のいずれか（例えば、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子や、配列番号２（例えば、ゲノムＤＮＡ）による３３７５位に対応する位置におけるチミン、もしくは配列番号４（例えば、ｍＲＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるウラシル、もしくは配列番号６（例えば、ｃＤＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるチミン（これらはそれぞれ、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をもたらす）を有する核酸配列を含む核酸分子）、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質が、対象の試料に含まれるか否かを判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子が、対象の試料に含まれるか否かを判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号２による３３７５位に対応する位置にチミンを有する核酸配列を含む核酸分子が、対象の試料に含まれるか否かを判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号４による２０５位に対応する位置にウラシルを有する核酸配列を含む核酸分子が、対象の試料に含まれるか否かを判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを有する核酸配列を含む核酸分子が、対象の試料に含まれるか否かを判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質が、対象の試料に含まれるか否かを判定することを含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、この判定は、患者から生体試料を得ること、または既に得ていることによって行われる。いくつかの実施形態では、本方法は、生体試料にジェノタイピングアッセイを行うこと、または既に行っていることにより、本明細書に記載のバリアントＣＲＮＮ核酸分子のいずれか（例えば、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子や、配列番号２（例えば、ゲノムＤＮＡ）による３３７５位に対応する位置におけるチミン、もしくは配列番号４（例えば、ｍＲＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるウラシル、もしくは配列番号６（例えば、ｃＤＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるチミン（これらはそれぞれ、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をもたらす）を有する核酸配列を含む核酸分子）を患者が有するかどうかを判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生体試料にジェノタイピングアッセイを行うこと、または既に行っていることにより、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子を患者が有するかどうかを判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生体試料にジェノタイピングアッセイを行うこと、または既に行っていることにより、配列番号２による３３７５位に対応する位置にチミンを有する核酸配列を含む核酸分子を患者が有するかどうかを判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生体試料にジェノタイピングアッセイを行うこと、または既に行っていることにより、配列番号４による２０５位に対応する位置にウラシルを有する核酸配列を含む核酸分子を患者が有するかどうかを判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生体試料にジェノタイピングアッセイを行うこと、または既に行っていることにより、配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを有する核酸配列を含む核酸分子を患者が有するかどうかを判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生体試料にアッセイを行うこと、または既に行っていることにより、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質を患者が有するかどうかを判定することをさらに含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバリアントＣＲＮＮ核酸分子のいずれか（例えば、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子や、配列番号２（例えば、ゲノムＤＮＡ）による３３７５位に対応する位置におけるチミン、もしくは配列番号４（例えば、ｍＲＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるウラシル、もしくは配列番号６（例えば、ｃＤＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるチミン（これらはそれぞれ、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をもたらす）を有する核酸配列を含む核酸分子）を患者が有する場合、本方法は、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤を患者に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子を患者が有する場合、本方法は、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤を患者に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、配列番号２による３３７５位に対応する位置にチミンを有する核酸配列を含む核酸分子を患者が有する場合、本方法は、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤を患者に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、配列番号４による２０５位に対応する位置にウラシルを有する核酸配列を含む核酸分子を患者が有する場合、本方法は、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤を患者に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、配列番号６による２０５位に対応する位置にチミンを有する核酸配列を含む核酸分子を患者が有する場合、本方法は、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤を患者に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質を患者が有する場合、本方法は、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤を患者に投与することをさらに含む。
【０２０７】
本開示はまた、本明細書に記載のバリアントＣＲＮＮ核酸分子のいずれか（例えば、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子や、配列番号２（例えば、ゲノムＤＮＡ）による３３７５位に対応する位置におけるチミン、もしくは配列番号４（例えば、ｍＲＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるウラシル、もしくは配列番号６（例えば、ｃＤＮＡ）による２０５位に対応する位置におけるチミン（これらはそれぞれ、配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質をもたらす）を有する核酸配列を含む核酸分子）、または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされ、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含むバリアントＣＲＮＮタンパク質を有するヒト対象の皮膚障害を処置するための医薬の製造における使用のための治療剤（例えば本明細書に記載のもののいずれか）を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子に対して陽性の検査結果を示しているものである。いくつかの実施形態では、処置は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子をヒト対象が有するか否かを判定するステップを含む。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、本明細書に記載の方法のいずれかを使用することにより、皮膚障害を有するもの、または皮膚障害の発症リスクを有するものとして識別されているものである。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８による６９〜７６位、７８位、及び７９位に対応する位置のいずれかに、野生型ＣＲＮＮタンパク質と比較して異なるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ビタミンであるか、またはビタミンを含む。いくつかの実施形態では、ビタミンは、ビタミンＡまたはビタミンＤである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、サリチル酸である。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、コルチコステロイドである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ソラレンである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、メトトレキサートである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、シクロスポリンである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、抗体、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ブロダルマブ（Ｓｉｌｉｑ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、イキセキズマブ（Ｔａｌｔｚ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、セクキヌマブ（Ｃｏｓｅｎｔｙｘ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。
【０２０８】
本開示はまた、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質または配列番号８による７９位に対応する位置でトランケートされたＣＲＮＮタンパク質を有するヒト対象の皮膚障害の処置における使用のための皮膚障害治療剤を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子に対して陽性の検査結果を示しているものである。いくつかの実施形態では、処置は、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質、及び／または機能喪失ＣＲＮＮタンパク質もしくはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質をコードする核酸分子をヒト対象が有するか否かを判定するステップを含む。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、本明細書に定義される方法のいずれかを使用することにより、皮膚障害を有するもの、または皮膚障害の発症リスクを有するものとして識別されているものである。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８による６９〜７６位、７８位、及び７９位に対応する位置のいずれか１つに、野生型ＣＲＮＮタンパク質と比較して異なるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８による６９〜７９位に対応する位置に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、機能喪失ＣＲＮＮタンパク質またはトランケート型ＣＲＮＮタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８による６９位に対応する位置にシステインを含む。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ビタミンであるか、またはビタミンを含む。いくつかの実施形態では、ビタミンは、ビタミンＡまたはビタミンＤである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、サリチル酸である。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、コルチコステロイドである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ソラレンである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、メトトレキサートである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、シクロスポリンである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、抗体、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ブロダルマブ（Ｓｉｌｉｑ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、イキセキズマブ（Ｔａｌｔｚ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、セクキヌマブ（Ｃｏｓｅｎｔｙｘ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、皮膚障害を処置するのに有効な薬剤は、ウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標））、または少なくともその抗原結合ドメインである。
【０２０９】
本開示はまた、皮膚障害の診断または皮膚障害の発症リスクの診断における、本明細書に開示するバリアントＣＲＮＮゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、及びハイブリダイズする核酸分子のいずれかの使用を提供する。
【０２１０】
上記または下記で引用するすべての特許文書、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、あたかも個々の項目をそのように参照により援用するかのように具体的かつ個別に示すことと同じ程度に、あらゆる目的のためにその全体を参照により援用するものとする。あるアクセッション番号と関連付けられている配列のバージョンが、時期によって異なる場合には、本願の有効出願日に、そのアクセッション番号に関連付けられているバージョンを意味する。有効出願日とは、該当する場合、そのアクセッション番号について言及している実際の出願日と、優先権主張出願の出願日のうちの早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが異なる時間に公開されている場合、特に明記しない限り、出願の有効出願日において最後に公開されたバージョンを意味するものとする。本開示のいずれの特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様も、特に明記しない限り、任意の他の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様と組み合わせて使用することができる。本開示を、明確化及び理解を目的として、例示及び例としてある程度詳細に説明してきたが、ある特定の変更及び改変が添付の特許請求の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。
【０２１１】
本明細書に挙げるヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な略語、及びアミノ酸の１文字コードを使用して示される。ヌクレオチド配列では、配列の５’末端から３’末端の方に（すなわち、各列において左から右に）進むという標準的な慣例に従っている。各ヌクレオチド配列の片方の鎖のみが示されているが、示されている鎖の参照によって相補鎖が含まれるものと理解される。アミノ酸配列では、配列のアミノ末端から（すなわち、各列において左から右に）カルボキシ末端まで進むという標準的な慣例に従っている。
【０２１２】
以下の実施例は、実施形態をより詳細に説明するために提供される。これらは、特許請求する実施形態を例示することを意図しており、限定することを意図していない。
【実施例】
【０２１３】
以下の実施例は、本開示で特許請求する化合物、組成物、物品、装置及び／または方法がどのように作製され評価されるかについての完全な開示及び説明を当業者に行うために示されるものであり、単に例示的なものであるように意図されており、本発明者が本発明としてみなす範囲を限定するようには意図されていない。数字（例えば、量、温度など）については、精度を確保するように努めてあるが、ある程度の誤差と偏差は考慮されたい。別段に示されていない限り、部は、重量部であり、温度は、℃または周囲温度であり、圧力は、大気圧または大気圧近傍である。
【０２１４】
実施例１：患者の募集及びフェノタイピング
Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＲＧＣ）とＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈとの間の共同研究により、６名の罹患者及び２名の非罹患者で優性遺伝パターンにおいて乾癬を分離する８員の家族（図１参照）に対して、全エクソームシーケンシング及びトリオベースのバリアント分析を行った。乾癬を有する家族内で分離するＣＲＮＮ（コルヌリン）遺伝子において、過去に観察されていない新規の挿入突然変異（ｃ．２０３＿２０４ｉｎｓＴ；ｐ．Ｖ６９Ｃｆｓ＊１２）が識別された。
【０２１５】
実施例２：ゲノム試料
末梢血試料からゲノムＤＮＡを抽出し、全エクソームシーケンシングのためにＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＲＧＣ）に移送し、自動バイオバンク内にて−８０℃で保管した。シーケンシング目的のために適切なＤＮＡの量及び質を確保するため、蛍光ベースの定量化を行った。
【０２１６】
平均断片長が１５０塩基対になるように１μｇのＤＮＡをせん断し（Ｃｏｖａｒｉｓ  ＬＥ２２０）、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのカスタム試薬キットを用いてエクソーム捕捉のために調製した。ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  ＳｅｑＣａｐ  ＶＣＲｏｍｅ  ２．１またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｘＧｅｎのエクソーム標的設計を使用して試料を捕捉した。試料にバーコードを付け、プールし、ｖ４ケミストリーを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００での７５ｂｐペアエンドシーケンシングを使用したシーケンシングのためにマルチプレックス化した。２０倍以上の適用範囲で最低８５％の標的塩基のカバーが達成されるように、捕捉された断片をシーケンシングした。シーケンシングの後、ＤＮＡｎｅｘｕｓ及びＡＷＳを使用して試料レベルのデータ生成及び分析のために標準的ツールを実行する、ＲＧＣにおいて開発されたクラウドベースのパイプラインを使用して、データを処理した。簡潔に述べると、ＩｌｌｕｍｉｎａのＣＡＳＡＶＡソフトウェアを使用して配列データを生成し、デマルチプレックス化した。ＢＷＡ−ｍｅｍを使用して、シーケンシングリードをＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９ヒトゲノム参照アセンブリにマッピングし、アライメントした。アライメント後、Ｐｉｃａｒｄツールを使用して重複リードのマーキング及びフラグ付けを行い、バリアントのコール品質を向上させるためにＧＡＴＫを使用してインデルを再アライメントした。ＧＡＴＫのＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを使用して、ＳＮＰ及びＩＮＤＥＬバリアントならびに遺伝子型をコールし、ＧＡＴＫのＶａｒｉａｎｔ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ  Ｒｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ（ＶＱＳＲ）を適用して、全体的なバリアント品質スコアをアノテートした。各試料について、シーケンシング及びデータ品質のメトリック統計を捕捉して、捕捉性能、アライメント性能、及びバリアントコール結果を評価した。
【０２１７】
実施例３：ゲノムデータ分析
最小リード長（＞１０）、遺伝子型品質（＞３０）、及びアレルバランス（＞２０％）のための標準的な品質管理フィルターを、コールされたバリアントに適用した。ＲＧＣが開発したアノテーション及び分析パイプラインを使用して、通過したバリアントを、それらの潜在的な機能的効果（同義バリアントか、非同義バリアントか、スプライシングバリアントか、フレームシフトバリアントか、または非フレームシフトバリアントか）に基づいて分類及びアノテートした。遺伝子データにおける家系由来のメトリックによる同一性によって家族関係を確認し、ＰＲＩＭＵＳ（Ｓｔａｐｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．，２０１４，９５，５５３−５６４）を使用し、この家族の報告されている系図と相互参照することでコホート内の関連性及び関係性を推論した。
【０２１８】
報告されている家族歴を所与として、常染色体性優性遺伝パターンに基づいて候補疾患遺伝子を識別するために、系図に基づくバリアント分析及び分離を行った。その後、全罹患者間で共通したバリアントを、ｄｂＳＮＰ、１０００  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、ＮＨＬＢＩ  Ｅｘｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｅｘｏｍｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＥｘＡｃ）、及び内部ＲＧＣデータベースなどの集団対照データベースにおいて観察された頻度によってアノテート及びフィルタリングして、一般的な多型及び高頻度でおそらく良性のバリアントをフィルタリングアウトした。複数種のアライメントに基づく保存スコア（すなわち、ＧＥＲＰ、ＰｈａｓｔＣｏｎｓ、ＰｈｙｌｏＰ）とともに、バリアントの機能的効果の生物情報学的予測のためのアルゴリズム、例えばＬＲＴ、Ｐｏｌｙ−ｐｈｅｎ２、ＳＩＦＴ、ＣＡＤＤ、及びＭｕｔａｔｉｏｎ  Ｔａｓｔｅｒを、バリアントのアノテーションプロセスの一部として組み込み、識別された候補バリアントの潜在的な有害性について通知するために使用した。
【０２１９】
乾癬疾患表現型で分離し、当該家族のうち２名の非罹患者には存在しないＣＲＮＮ遺伝子において、下流トランケーションをもたらすと予測される稀なフレームシフト性の１塩基対挿入バリアントが識別された（ＣＲＮＮ：ｃ．２０３＿２０４ｉｎｓＴ；ｐ．Ｖ６９Ｃｆｓ＊１２）。図１（パネルＡ、Ｂ、及びＣ）を参照すると、乾癬を有する家族において優性分離を示すＣＲＮＮ遺伝子のトランケート性バリアントの識別が示されている。パネルＡは、常染色体性優性遺伝を示すｃ．２０３＿２０４ｉｎｓＴ；ｐ．Ｖ６９Ｃｆｓ＊１２におけるＣＲＮＮのトランケート性バリアントを表現する表を示す。このバリアント部位は、６９位の保存されたバリン残基に影響してシステインに変化させ、タンパク質の早期トランケーションをもたらし、タンパク質機能を損傷させ、ＣＲＮＮの機能喪失をもたらす可能性が高いと予測される。この家族において識別されたバリアントは稀であり、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＴＧＰ）、Ｅｘｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＥＳＰ）、またはＥｘｏｍｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥｘＡＣ）の各データベースを含め、公的に利用可能なデータベースにおいてこれまでに観察されていない。パネルＢは、調査された家族の系図を示す。黒い記号は乾癬罹患者を示し、白い記号は非罹患者を示し、円形は女性を表し、四角は男性を表す。パネルＣは、タンパク質の早発性トランケーションをもたらし、１コピーのＣＲＮＮのナンセンス媒介性崩壊及び機能喪失をもたらす可能性が高い稀なバリアントの位置を示す。パネルＤは、ＣＲＮＮタンパク質の６９位におけるバリン残基の複数種における保存を示す。
【０２２０】
実施例４：検知
対象におけるある特定の遺伝的バリアントの存在は、対象が乾癬、湿疹、またはアトピー性皮膚炎などの皮膚障害を有するリスクまたは発症するリスクが高いことを示し得る。血液試料などの試料を対象から得ることができる。一般的な核酸抽出キットを使用して試料から核酸を単離することができる。対象から得た試料から核酸を単離した後、遺伝的バリアントが存在するかどうかを判定するために核酸をシーケンシングする。核酸の配列を対照配列（野生型配列）と比較することができる。対象から得た試料から得た核酸と対照配列との間の差異が見出されれば、遺伝的バリアントの存在が示される。これらのステップは、上記及び本開示随所に記載したように行うことができる。１つ以上の遺伝的バリアントの存在は、対象が乾癬、湿疹、またはアトピー性皮膚炎などの皮膚障害を有するリスクまたは発症するリスクが高いことを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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