(57)【要約】【課題】組換え免疫細胞、作製方法、および使用方法に関する。【解決手段】組換え免疫細胞は、異種ＩｇＧ  Ｆｃ受容体を発現する。いくつかの実施形態において、異種ＩｇＧ  Ｆｃ受容体は、キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体であり得る。一般に、キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは一般に、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に結合するのに十分なＣＤ６４の部分を含む。キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体の細胞内ドメインは、Ｆｃ受容体の十分な部分を含み、ＩｇＧ  Ｆｃ領域が細胞外ドメインに結合したときに、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）が細胞シグナル伝達を開始できるようにする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体であって、
ＩｇＧ  Ｆｃ領域に結合するのに十分なＣＤ６４の部分を含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
ＩｇＧ  Ｆｃ領域が前記細胞外ドメインに結合したときに細胞シグナル伝達を開始するのに十分なＦｃ受容体の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）の部分を含む、細胞内ドメインを含む、キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体。
【請求項２】
前記細胞内ドメインは、ＣＤ１６Ａの細胞内領域の少なくとも一部を含む、請求項１に記載のキメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体。
【請求項３】
前記細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＦｃεＲ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、またはＣＤ３ζの細胞内領域の少なくとも一部を含む、請求項１に記載のキメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体。
【請求項４】
前記細胞外ドメインは、ＣＤ１６Ａ切断部位を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体。
【請求項５】
前記細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ受容体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え細胞。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＩｇＧ  Ｆｃキメラ受容体を発現する、組換え細胞。
【請求項９】
前記組換え細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項８に記載の組換え細胞。
【請求項１０】
ＣＤ６４をコードするポリヌクレオチドを含む、組換えナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項１１】
ＣＤ６４を発現するように遺伝子改変されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、組換え細胞。
【請求項１２】
腫瘍細胞を死滅させる方法であって、
前記腫瘍細胞を前記腫瘍細胞に特異的に結合する抗体と接触させること、および
組換え細胞が前記腫瘍細胞を死滅させるのに有効な条件下で、前記腫瘍細胞を請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組換え細胞と接触させること、を含む、方法。
【請求項１３】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、
前記腫瘍の細胞に特異的に結合する抗体を前記対象に投与すること、および
組換え細胞が前記腫瘍細胞を死滅させるのに有効な条件下で、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組換え細胞を含む組成物を前記対象に投与すること、を含む、方法。
【請求項１４】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組換え細胞、および
キメラ受容体に結合した抗体、を含む、組成物。
【請求項１５】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、
請求項１４に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、抗体は前記腫瘍細胞に特異的に結合する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月２６日に提出された米国仮特許出願第６２／５７７，４２５号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府資金
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから授与されたＣＡ２０３３４８の下、政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列リスト
本出願は、２０１８年１０月２６日に作成された、９７キロバイトのサイズを有する「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｌｉｓｔｉｎｇ−０５８９＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋ  Ｏｆｆｉｃｅに電子的に提出された配列リストを含む配列リストの電子申告により、電子的に提出された配列リストは、３７  ＣＦＲ§１．８２１（ｃ）により要求される紙のコピーと、§１．８２１（ｅ）により要求されるＣＲＦの両方として機能する。配列表に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００４】
一態様において、本開示は、異種ＩｇＧ  Ｆｃ受容体を発現する免疫細胞を説明する。
【０００５】
いくつかの実施形態において、異種ＩｇＧ  Ｆｃ受容体は、キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体であり得る。一般に、キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは一般に、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に結合するのに十分なＣＤ６４の部分を含む。キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体の細胞内ドメインは、ＩｇＧ  Ｆｃ領域が細胞外ドメインに結合したときに細胞シグナル伝達を開始するのに十分なＦｃ受容体の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）の部分を含む。
【０００６】
これらの実施形態のいくつかにおいて、細胞内ドメインは、ＣＤ１６Ａの細胞内領域の少なくとも一部を含む。他の実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＦｃＲγ、またはＣＤ３ζの細胞内領域の少なくとも一部を含み得る。
【０００７】
いくつかの実施形態において、キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６Ａ細胞外切断部位を含み得る。他の実施形態において、キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体の細胞外ドメインは、ＣＤ１６Ａ細胞外切断部位を欠いている可能性がある。
【０００８】
いくつかの実施形態において、異種ＩｇＧ  Ｆｃ受容体は、免疫細胞によって本来発現されないＩｇＧ  Ｆｃ受容体を含み得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、免疫細胞は、ＣＤ６４を発現するように遺伝子改変されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり得る。
【０００９】
別の態様において、本開示は、上に要約した異種ＩｇＧ  Ｆｃ受容体の任意の実施形態をコードするポリヌクレオチドを説明する。
【００１０】
別の態様において、本開示は、上に要約した異種ＩｇＧ  Ｆｃ受容体の実施形態をコードするポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変された免疫細胞を説明する。
【００１１】
別の態様において、本開示は、腫瘍細胞を死滅させる方法を説明する。一般に、方法は、腫瘍細胞を該腫瘍細胞に特異的に結合する抗体と接触させること、および組換え免疫細胞が腫瘍細胞を死滅させるのに有効な条件下で、腫瘍細胞を上に要約した組換え免疫細胞の任意の実施形態と接触させることを含む。
【００１２】
別の態様において、本開示は、腫瘍を有する対象を治療する方法を説明する。一般に、方法は、腫瘍の細胞に特異的に結合する抗体を対象に投与すること、および組換え免疫細胞が腫瘍の細胞を死滅させるのに有効な条件下で、上に要約した組換え免疫細胞の任意の実施形態を含む組成物を対象に投与することを含む。
【００１３】
別の態様において、本開示は、治療用抗体と、異種ＩｇＧ  Ｆｃ受容体が治療用抗体のＦｃ部分に結合している、上に要約した組換え免疫細胞の任意の実施形態との間に形成される複合物を含む組成物を説明する。
【００１４】
別の態様において、本開示は、腫瘍を有する対象を治療する方法を説明する。一般に、方法は、治療用抗体が腫瘍の細胞に特異的に結合する、すぐ上に要約した組成物の任意の実施形態を対象に投与することを含む。
【００１５】
上記の要約は、本発明の各開示される実施形態またはあらゆる実施を説明することを意図するものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に例示するものである。本出願の全体にわたるいくつかの箇所で、実施例のリストを通じて指針が提供され、それらの実施例は様々な組み合わせで使用することができる。いずれの場合も、列挙されるリストは代表的な群としてのみ機能するものであって、排他的なリストとして解釈されるべきではない。
【００１６】
特許または出願のファイルには、カラーで作成された図面が少なくとも１つ含まれる。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求に応じて、かつ必要な料金を支払うことにより、官庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）。
【図２】野生型ＣＤ１６Ａ、野生型ＣＤ６４、およびＣＤ６４／１６Ａキメラコンストラクト。ＣＤ１６Ａのハサミおよび破線は、エクトドメイン・シェディングの細胞外タンパク質分解部位を表す。
【図３】野生型ＣＤ１６ＡまたはＣＤ６４／１６Ａを発現するＮＫ９２細胞。（Ａ）ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を抗ＣＤ１６、抗ＣＤ６４、または対照抗体で染色した。（Ｂ）ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞を抗ＣＤ１６、抗ＣＤ６４、または対照抗体で染色した。（Ｃ）ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ、ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ、またはＮＫ９２親細胞を、トラスツズマブ、次いで抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣ第２段階抗体と、または抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣ第２段階抗体のみ（対照）とインキュベートした。全ての抗体染色レベルをフローサイトメトリーにより決定した。
【図４】ＣＤ６４／ＣＤ１６Ａを発現するＮＫ９２細胞は、野生型ＣＤ１６Ａよりも高いレベルのＡＤＣＣを誘導する。（Ａ）トラスツズマブ（ハーセプチン）をアッセイに含めた標準的なＡＤＣＣアッセイを行った。（Ｂ）ＮＫ９２−ＣＤ６４／ＣＤ１６Ａ細胞およびＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞をトラスツズマブとプレインキュベートし、次いでエフェクター細胞をＳＫＯＶ−３標的細胞とインキュベートする前にｍＡｂを洗い流す、標準的なＡＤＣＣアッセイを行った。
【図５】ｉＮＫ−ＣＤ６４／ＣＤ１６Ａ細胞およびｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞によって発現された表現型マーカーを比較するフローサイトメトリーデータ。
【図６】ＳＫＯＶ−３標的細胞を使用して、ｉＮＫ−ＣＤ６４／ＣＤ１６Ａ細胞がｉＮＫ−ＣＤ１６Ａ細胞よりも高いレベルのＡＤＣＣを誘導することを示すデータを含む棒グラフ。
【図７】ｉＮＫ−ＣＤ１６Ａ細胞ではなく、ｉＮＫ−ＣＤ６４／ＣＤ１６Ａ細胞に治療用ｍＡｂをプレロードして、ＡＤＣＣを媒介することができることを示すデータを含む棒グラフ。
【図８】ＭＡ１４８標的細胞を使用して、ｉＮＫ−ＣＤ６４／ＣＤ１６Ａ細胞がｉＮＫ−ＣＤ１６Ａ細胞よりも高いレベルのＡＤＣＣを誘導することを示すデータを含む棒グラフ。
【図９】例示的なＣＤ６４／ＣＤ１６ＡキメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体のアミノ酸配列（配列番号１）。
【図１０】ＣＤ６４  ＩｇＧ  Ｆｃ受容体のアミノ酸配列（配列番号２）。
【図１１】例示的なＣＤ１６Ａ−ＣＤ２８−ＢＢ−ζ鎖キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体のアミノ酸配列（配列番号３）。
【図１２】例示的なＣＤ１６Ａ−ＢＢ−ζ鎖キメラＩｇＧ  Ｆｃ受容体のアミノ酸配列（配列番号４）。
【図１３】ＮＫ９２細胞によるＣＤ６４／１６Ａの発現。（Ａ）ＣＤ１６Ａ、ＣＤ６４、およびＣＤ６４／１６Ａの細胞膜形態の略図。ＣＤ１６Ａは、示されるように、ＣＤ６４およびＣＤ６４／１６Ａには存在しない膜の近位位置でＡＤＡＭ１７によるエクトドメイン・シェディングを受ける。（Ｂ）ＮＫ９２親細胞、ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞、およびＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を抗ＣＤ１６、抗ＣＤ６４、またはアイソタイプが一致する陰性対照ｍＡｂで染色し、フローサイトメトリーにより調べた。（Ｃ）ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞およびＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を、トラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）を用いてまたは用いずに、ＳＫＯＶ−３細胞と３７℃（Ｅ：Ｔ＝１：１）で２時間インキュベートした。次いで、ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞およびＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を、それぞれ抗ＣＤ１６ｍＡｂまたは抗ＣＤ６４ｍＡｂで染色し、フローサイトメトリーにより調べた。非特異的抗体標識は、適切なアイソタイプ陰性対照ｍＡｂを使用して決定した。データは少なくとも３回の独立した実験の代表値である。
【図１４】ＣＤ６４／１６Ａは、標的細胞結合、ＡＤＣＣ、およびＩＦＮγ産生を促進する。（Ａ）ｅＧＦＰを発現するＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞およびＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識されたＳＫＯＶ−３細胞を、トラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）を用いてまたは用いずに、Ｅ：Ｔ比１：２で混合し、３７℃で６０分間インキュベートし、固定し、次いでフローサイトメトリーにより分析した。少なくとも３回の独立した実験からの代表的なデータが示される。（Ｂ）ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を、ＳＫＯＶ−３細胞（Ｅ：Ｔ＝２０：１）および示される濃度のトラスツズマブ（ｔｒａｓ．）と（左パネル）、またはトラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、示されるＥ：Ｔ比のＳＫＯＶ−３細胞と（右パネル）、３７℃で２時間インキュベートした。データは、特異的放出％として表され、３回の独立した実験の平均±ＳＤが示される。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１として示される。（Ｃ）ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を、示されるように、トラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ６４  ｍＡｂ  １０．１（１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ＳＫＯＶ−３細胞（Ｅ：Ｔ＝２０：１）と３７℃で２時間インキュベートした。データは、特異的放出％として表され、３回の独立した実験の平均±ＳＤが示される。統計的有意性は、＊＊ｐ＜０．０１として示される。（Ｄ）ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を、トラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）を用いてまたは用いずに、ＳＫＯＶ−３細胞（Ｅ：Ｔ＝１：１）と３７℃で２時間インキュベートした。分泌されたＩＦＮγレベルはＥＬＩＳＡによって定量化した。データは２回の独立した実験の平均として示される。
【図１５】ＣＤ６４／１６Ａは、可溶性腫瘍標的化ｍＡｂおよびＩｇＧ融合タンパク質に付着する。（Ａ）ＮＫ９２細胞におけるＣＤ１６ＡおよびＣＤ６４／１６Ａの相対的な発現レベルを、それぞれ抗ＣＤ１６および抗ＣＤ６４  ｍＡｂ（黒いバー）、またはアイソタイプが一致する陰性対照抗体（灰色のバー）による細胞染色によって決定した。棒グラフは、３回の独立した実験の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤを示す。代表的なフローサイトメトリーデータがヒストグラムのオーバーレイで示される。破線のヒストグラムはＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞のＣＤ６４染色を示し、オレンジ色のヒストグラムはＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞のＣＤ１６Ａ染色を示し、緑色のヒストグラムはＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞のアイソタイプ対象抗体染色を示す。（Ｂ）ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞およびＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を、トラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）を用いてまたは用いずに、３７℃で２時間インキュベートし、洗浄し、蛍光色素結合抗ヒト二次抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。データは少なくとも３回の独立した実験の代表値である。（Ｃ）ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞をセツキシマブまたはリツキシマブ（各５μｇ／ｍｌ）とインキュベートし、洗浄し、次いで蛍光色素結合抗ヒト二次抗体で染色した。対照は、抗ヒト二次抗体のみで染色された細胞を表す。ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞をＬ−セレクチン／Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）ともインキュベートし、洗浄し、次いで蛍光色素結合抗Ｌ−セレクチンｍＡｂで染色した。ＮＫ９２細胞は内因性Ｌ−セレクチンの発現を欠いている（データは示さず）。全ての染色はフローサイトメトリーにより分析した。示されるデータは、３回の独立した実験の代表値である。（Ｄ）ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞およびＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を、トラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でインキュベートし、洗浄し、示されるＥ：Ｔ細胞比でＳＫＯＶ−３細胞に３７℃で２時間曝露した。データは３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示される。統計的有意性は、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１として示される。ｂｄ＝検出未満（すなわち、＜陰性対照細胞による自然放出）。（Ｅ）ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞およびＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を、示されるように、トラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ＳＫＯＶ−３細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）と３７℃で２時間インキュベートした。データは３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示される。統計的有意性は、＊＊ｐ＜０．０１として示される。
【図１６】ＣＤ６４／ＣＤ１６Ａを発現するｉＮＫ細胞の生成ｉＰＳＣを形質導入してＣＤ６４／１６Ａを安定して発現させ、ＮＫ細胞に分化させ、Ｋ５６２−ｍｂＩＬ２１−４１ＢＢＬフィーダー細胞を使用して増殖させた。ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞、および成人末梢血から濃縮した、新しく単離した末梢血（ＰＢ）ＮＫ細胞を、示されるように、ＣＤ５６、ＣＤ３、ならびに様々な抑制性および活性化受容体について染色した。ＣＤ６４／１６Ａの発現は、細胞を抗ＣＤ６４  ｍＡｂで染色することにより決定した。少なくとも３回の独立した実験からの代表的なデータが表される。
【図１７】ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞は、ｉＮＫ−ｐＫＴ２対象細胞と比較して、ＡＤＣＣの増強を示す。（Ａ）空のベクター（ｉＮＫ−ｐＫＴ２）またはＣＤ６４／１６Ａ（ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ）で形質導入したｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞を、示されるように、ＣＤ５６、ＣＤ６４、およびＣＤ１６Ａで染色した。（Ｂ）ｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞およびｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を、示されるように、トラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）、機能遮断性抗ＣＤ１６  ｍＡｂ  ３Ｇ８（５μｇ／ｍｌ）、および機能遮断性抗ＣＤ６４  ｍＡｂ  １０．１（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ＳＫＯＶ−３細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）と３７℃で２時間インキュベートした。データは３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示される。統計的有意性は、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として示される。（Ｃ）ｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞およびｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞をトラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でインキュベートし、洗浄して、ＳＫＯＶ−３細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）に３７℃で２時間曝露した。データは３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示される。統計的有意性は、＊＊＊ｐ＜０．００１として示される。
【図１８】イヌＣＤ１６Ａ（配列番号５）、イヌＣＤ６４ｓｐ（配列番号２５）、およびヒトＣＤ１６Ａ（配列番号６）の配列アライメント。
【図１９】イヌＣＤ６４（配列番号７）およびヒトＣＤ６４（配列番号８）の配列アライメント。
【図２０】野生型ヒトＣＤ６４を発現するＮＫ９２細胞はＡＤＣＣを媒介する。（Ａ）ＮＫ９２−ＣＤ６４細胞を、アイソタイプが一致する陰性対照ｍＡｂまたは抗ＣＤ６４  ｍＡｂ（クローン１０．１）で染色し、フローサイトメトリーにより調べた。（Ｂ）ＮＫ９２−ＣＤ６４細胞を、トラスツズマブ（ｔｒａｓ．）（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、（示されたＥ：Ｔ比で）ＳＫＯＶ−３細胞と３７℃で２時間インキュベートした。少なくとも３回の独立した実験からの代表的なデータが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、組換え免疫細胞、組換え免疫細胞を作製する方法、および組換え免疫細胞を使用する方法を説明する。一般に、組換え免疫細胞は、異種ＩｇＧ  Ｆｃ受容体を含むように遺伝子改変されている。場合によっては、異種ＩｇＧ  Ｆｃ受容体は、２つ以上の受容体からのドメインを含むように操作されたキメラ受容体であり得る。他の実施形態において、異種は、免疫細胞によって本来発現されないＩｇＧ  Ｆｃ受容体であり得る。一般に、ＩｇＧ  Ｆｃ受容体によって認識される治療用抗体に標的が結合するため、組換え免疫細胞は、標的、例えば、免疫細胞による殺傷の標的となる腫瘍細胞に対して持続的な細胞傷害性免疫応答を提供する。
【００１９】
細胞介在性免疫防御の機構は、白血球によって発現されるＦｃ受容体によって標的細胞に付着した抗体の結合を伴い、これによって標的細胞の殺傷がもたらされる。このプロセスは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と称される。治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、様々な腫瘍抗原に対して生成され、感染性疾患、慢性疾患、ならびに、例えば、ＡＭＬ、乳癌、卵巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、およびリンパ腫等の癌の治療のための臨床試験でテストされている。臨床的に成功している多くのｍＡｂは、ＡＤＣＣを作用機序として使用している。しかしながら、抗体療法の限界は、患者における耐性の発生および一部の悪性腫瘍の非反応性である。
【００２０】
本開示は、Ｆｃ受容体と治療用抗体との相互作用を増強するための手法を説明する。この手法は、ＣＤ１６ＡドメインおよびＣＤ６４ドメインを含むキメラ受容体に関与する。
【００２１】
ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）は、細胞傷害性リンパ球の集団であるヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって発現されるＩｇＧ  Ｆｃ受容体であり、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に結合したＩｇＧを認識する唯一の手段である。ＣＤ１６Ａは、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣを誘導する強力な活性化受容体である（図１）。ＣＤ１６Ａ膜貫通領域は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（図２；図１３Ａ）を含むＣＤ３ζおよび／またはＦｃＲγ鎖（ＦｃＲγ）との関連を担っており、ＣＤ１６Ａ細胞質ドメインは、受容体機能に不可欠な細胞内分子と相互作用する。ＣＤ１６Ａは、親和性の低いＦｃγＲであり、治療用ｍＡｂでコーティングされた標的細胞に結合する能力が限られている。ＣＤ１６Ａはまた、細胞活性化の際に、細胞表面密度およびＩｇＧに対する結合力を著しく低下させる発現の急速な下方制御を受ける。ＣＤ１６Ａの下方制御は、原形質膜に近接した細胞外部位におけるタンパク質分解事象によって起こり、エクトドメイン・シェディングと称される。この切断部位の位置は報告されており（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１２１７８８）、図２および図１３Ａに概略的に示される。
【００２２】
ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）は別のＩｇＧ  Ｆｃ受容体であり、単球、マクロファージ、および活性化好中球によって発現される。ＣＤ６４は高親和性ＩｇＧ受容体である。この受容体は、細胞活性化の際にエクトドメイン・シェディングを受けず、ＮＫ細胞におけるＡＤＣＣについてのシグナルを天然では伝達しない。
【００２３】
本開示は、ＣＤ１６ＡドメインおよびＣＤ６４ドメインを含むキメラＦｃγＲを説明する。キメラ受容体は、ヒトＣＤ６４の細胞外領域およびヒトＣＤ１６Ａの細胞質領域を含み、その例示的な実施形態が、図２および図１３ＡにＣＤ６４／１６Ａとして概略的に示される。様々な実施形態において、キメラＣＤ６４／ＣＤ１６Ａ受容体は、ＣＤ６４膜貫通領域またはＣＤ１６Ａ膜貫通領域を含むことができる。ＣＤ６４／１６Ａコンストラクトは、ＣＤ１６Ａ細胞外切断部位を欠くように操作されているため、エクトドメイン・シェディングの影響を受けないが（図２、図１３Ａ）、細胞内シグナル伝達に関与するＣＤ１６Ａ細胞内領域の少なくとも一部を含む。
【００２４】
また、ＣＤ６４ドメインおよびＣＤ１６ＡがそれぞれヒトＣＤ６４およびヒトＣＤ１６Ａのアミノ酸配列を含む例示的な実施形態に関連して本明細書に記載されているが、本明細書に記載されるキメラＦｃγＲは、任意の種によって本来発現される適切なＣＤ６４またはＣＤ１６Ａであるか、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むことができる。図１８および図１９は、ＣＤ１６Ａ（図１８）およびＣＤ６４（図１９）についてのヒトおよびイヌのアミノ酸配列のアミノ酸配列アライメントを提供する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、ドメインのアミノ酸配列が、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して特定の量の配列類似性および／または配列同一性を有する場合、ドメインのアミノ酸配列は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列に「由来する」。配列類似性は、２つのポリペプチド（例えば、ドメインのアミノ酸配列と参照ＣＤ１６ＡまたはＣＤ６４ポリペプチドのアミノ酸配列）の残基を、それらの配列の長さに沿って同一のアミノ酸の数を最適化するように整列させることによって決定することができる。同一のアミノ酸の数を最適化するために、アライメントを作成する際にいずれかまたは両方の配列にギャップが許容されるが、それにもかかわらず、各配列のアミノ酸はそれらの適切な順序のままでなければならない。
【００２６】
ＧＣＧパッケージ（バージョン１０．２、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズムを使用して、アミノ酸配列のペアワイズ比較分析を行うことができる。あるいは、ポリペプチドは、Ｔａｔｉａｎａら（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，１７４，２４７−２５０（１９９９））によって記載されるような、またＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトで利用可能な、ＢＬＡＳＴ  ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを使用して比較されてもよい。以下を含む全てのＢＬＡＳＴ  ２検索パラメータに対してデフォルト値を使用することができる：マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップペナルティ＝１１、伸長ギャップペナルティ＝１、ギャップｘ＿ドロップオフ＝５０、期待値＝１０、ワードサイズ＝３、およびフィルターオン。
【００２７】
ドメインのアミノ酸配列が特定の程度のアミノ酸配列「同一性」またはアミノ酸配列「類似性」を有する場合、ドメインのアミノ酸配列は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列に「由来する」。アミノ酸配列同一性は、同一のアミノ酸の存在を指す。アミノ酸配列類似性は、同一のアミノ酸の存在だけでなく、保存的置換の存在も指す。アミノ酸の保存的置換は、置換されたアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、タンパク質生化学の当業者では周知である、特定のサイズまたは特徴（電荷、疎水性および親水性等）を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸は、特に生物学的活性に直接関連しないタンパク質の領域におけるタンパク質の活性を変化させることなく、別のアミノ酸と置換することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む。負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。保存的置換は、例えば、正電荷を維持するためのＬｙｓからＡｒｇおよびその逆、負電荷を維持するためのＧｌｕからＡｓｐおよびその逆、遊離−ＯＨが維持されるようにＳｅｒからＴｈｒ、ならびに遊離−ＮＨ２を維持するためのＧｌｎからＡｓｎを含む。同様に、ポリペプチドの機能的活性を排除しない１つまたは複数の隣接または非隣接アミノ酸の欠失または付加を含むポリペプチドの生物学的に活性な類似体も企図される。
【００２８】
ドメインのアミノ酸配列が参照アミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列類似性を有する場合、ＣＤ１６ＡドメインまたはＣＤ６４ドメインのアミノ酸配列は参照アミノ酸配列に「由来する」。
【００２９】
ドメインのアミノ酸配列が参照アミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する場合、ＣＤ１６ＡドメインまたはＣＤ６４ドメインのアミノ酸配列は参照アミノ酸配列に「由来する」。
【００３０】
ドメインのアミノ酸配列が特定の参照アミノ酸配列に「由来する」かどうかを決定する目的で、例示的な適切な参照ポリペプチドは、ヒトＣＤ１６Ａ（配列番号６）、イヌＣＤ１６Ａ（配列番号５）、ヒトＣＤ６４（配列番号：８）、イヌＣＤ６４（配列番号：７）、イヌＣＤ６４ｓｐ（配列番号：２５）、または表１に列挙されるコンストラクトのいずれかの対応するドメインを含む。
【００３１】
また、図２および図１３Ａに示される例示的な実施形態に関連して本明細書に記載されているが、キメラ受容体は、ＣＤ１６Ａ切断領域、ＣＤ６４またはＣＤ１６Ａの領域の改変された機能モチーフを含めるように、かつ／または追加のシグナル伝達ドメイン、たとえば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＦｃＲγ、もしくはＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを追加するために、図２および図１３Ａに示されるものとは異なるＣＤ６４とＣＤ１６Ａとの間の異なる融合点を含むように設計され得る。したがって、キメラ受容体は、ＮＫ細胞もしくは他のエフェクター細胞の増殖を増大させ、ＮＫ細胞もしくは他のエフェクター細胞の生存率を高め、ＮＫ細胞もしくは他のエフェクター細胞の効力を増大させ、かつ／またはインビボでのＮＫ細胞の消耗を減少させるように設計され得る。
【００３２】
特定の実施形態において、キメラＦｃγＲは、キメラ受容体に追加の機能を付与する細胞質ドメインまたはシグナル伝達ドメインを含むように改変することができる。例えば、キメラＦｃγＲは、Ｔ細胞増殖、生存、およびサイトカイン産生に関与するシグナルを伝達するＣＤ２８の機能的部分を含み得る。別の例として、キメラＦｃγＲは、造血細胞のクローン拡大、生存、および発達に寄与する４−１ＢＢの機能的部分を含むことができる。別の例として、キメラＦｃγＲは、ＡＤＣＣ細胞内シグナル伝達経路、サイトカイン産生、ならびに細胞の増殖および生存を誘発する３つの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、ＣＤ３ζ細胞質ドメインの機能的部分を含むことができる。別の例として、キメラＦｃγＲは、ＡＤＣＣ細胞内シグナル伝達経路、サイトカイン産生、ならびに細胞の増殖および生存を媒介するためのＳｙｋキナーゼを優先的に動員するＩＴＡＭを含む、ＦｃＲγ細胞質ドメインの機能的部分を含むことができる。別の例として、キメラＦｃγＲは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の細胞傷害性、細胞生存、ならびに増殖のためにホスファチジルイノシトール３−キナーゼ依存性シグナル伝達経路を特異的に活性化するＹｘｘＭモチーフを含む、ＤＡＰ１０細胞質ドメインの機能部分を含むことができる。別の例として、キメラＦｃγＲは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の細胞傷害性、生存、および増殖のためにシグナルを誘発するＩＴＡＭを含む、ＤＡＰ１２細胞質ドメインの機能部分を含むことができる。別の例として、キメラＦｃγＲは、ＤＡＰ１０と特異的に会合してＮＫ細胞およびＴ細胞の細胞傷害性、細胞生存、ならびに増殖のためにシグナル伝達経路を媒介する、ＮＫＧ２Ｄ（またはＣＤ３１４）膜貫通ドメインの機能部分を含むことができる。別の例として、キメラＦｃγＲは、ＮＫ細胞の増強された細胞傷害性に関与する細胞溶解性顆粒の極性化のシグナルを伝達する、２Ｂ４（ＮＫＲ２Ｂ４またはＣＤ２４４）細胞質ドメインの機能的部分を含むことができる。別の例として、キメラＦｃγＲは、そのβサブユニットおよびＦｃＲ  γ鎖（ＦｃＲγ）と構成的に会合し、組換え高親和性ＩｇＧ  Ｆｃ受容体を用いた癌治療に利用することができるアレルギー反応を引き起こす骨髄系細胞におけるもっとも強力な脱顆粒シグナルを媒介する、高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの機能部分を含むことができる。
【００３３】
例示的な細胞質ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインの改変を含む例示的なコンストラクトを表１に列挙する。
【表１】
2021500923.tif 000002
【００３４】
ＣＤ６４／１６Ａキメラ受容体は、組換え細胞を生成するように宿主細胞に導入された発現ベクターから転写および翻訳され得るｃＤＮＡによってコードされ得る。宿主細胞は、適切な白血球様細胞または初代白血球を含むことができる。適切な白血球様細胞は、造血細胞株または人工多能性幹細胞を含むが、これらに限定されない。適切な初代白血球は、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、好中球、またはＴリンパ球を含むが、これらに限定されない。遺伝子改変した白血球によるＣＤ６４／１６Ａの発現は、非改変宿主細胞と比較して、天然および治療用抗体の存在下で、標的細胞、例えば、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を死滅させる際の組換え細胞のエフェクター機能を高めることができる。ＣＤ６４／１６Ａキメラ受容体は高い親和性でＩｇＧに結合するため、患者に投与する前に、コンストラクトを発現するエフェクター細胞に治療用ｍＡｂを結合することも実行可能である。したがって、治療用ｍＡｂが付着したＣＤ６４／１６Ａは、エフェクター細胞に、それらを癌の位置に誘導する標的化要素を提供する。
【００３５】
ＮＫ９２細胞は、内因性ＣＤ１６Ａの発現を欠くヒトＮＫ細胞株である。野生型ＣＤ１６Ａ、野生型ＣＤ６４、または例示的なキメラ受容体ＣＤ６４／１６Ａを安定な様式で発現するＮＫ細胞を生成した。ＣＤ６４／１６Ａを発現するＮＫ９２細胞は、抗ＣＤ６４  ｍＡｂで染色することができたが、抗ＣＤ１６  ｍＡｂでは染色できなかった（図３Ａ）。ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞は、抗ＣＤ１６  ｍＡｂで染色することができたが、抗ＣＤ６４  ｍＡｂでは染色できなかった（図３Ｂ）。ＣＤ６４を発現するＮＫ９２細胞は、抗ＣＤ６４  ｍＡｂで染色することができたが、アイソタイプが一致する陰性対照ｍＡｂでは染色できなかった（図２０Ａ）。
【００３６】
図３Ｃは、ＣＤ６４／１６ＡまたはＣＤ１６Ａを発現するＮＫ９２細胞が、特定の悪性腫瘍によって過剰発現されるＨＥＲ２／ＥＧＦＲ２に特異的な治療用ｍＡｂであるトラスツズマブに結合する能力を示している。形質導入されていないＮＫ９２細胞、ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞、およびＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞をトラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）と室温で２時間インキュベートし、洗浄して未結合の抗体を除去し、蛍光色素に結合した抗ヒトＩｇＧの第２段階の抗体でインキュベートし、次いでフローサイトメトリーにより調べた。ＮＫ９２−ｈＣＤ６４／１６Ａ細胞は、ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞およびＮＫ９２細胞よりもはるかに高いレベルのトラスツズマブに結合した。
【００３７】
図４は、ＡＤＣＣエフェクター機能を有する例示的なキメラ受容体ＣＤ６４／１６Ａが付与されたＮＫ９２細胞を示すデータを表す。ＣＤ６４／１６Ａまたは野生型ＣＤ１６Ａを発現するＮＫ９２細胞を、様々な濃度（０．００５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、または５μｇ／ｍｌ）のトラスツズマブの存在下または非存在下で、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ−３とインキュベートした（２０：１比）。ＣＤ６４／１６Ａまたは野生型ＣＤ１６Ａのいずれかを発現するＮＫ９２細胞は、トラスツズマブの存在下でＳＫＯＶ−３細胞傷害性を示した。ＣＤ６４／１６Ａを発現するＮＫ９２細胞は、調べた全てのトラスツズマブ濃度でＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞よりも高いレベルの標的細胞の殺傷を示した（図４Ａ）。いずれかのＣＤ６４を発現するＮＫ９２細胞もまた、トラスツズマブの存在下でＳＫＯＶ−３細胞傷害性を示した（図２０Ｂ）。さらに、ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞およびＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞を５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブで２時間前処理し、洗浄して未結合の抗体を除去し、次いでＳＫＯＶ−３細胞とインキュベートした。このアッセイにおいて、ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞は、ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞と比較して、標的細胞の殺傷における顕著な増強を示した（図４Ｂ）。
【００３８】
ＣＤ６４／１６ＡをｉＰＳＣでも発現させ、次いで、これらの細胞をＮＫ細胞に分化させた（本明細書においてｉＮＫ細胞と称される）。図５に示すように、ＣＤ６４／１６Ａまたは対照としての空ベクター（ｐＫＴ２）のいずれかで形質導入したｉＮＫ細胞を、いくつかのＮＫ細胞マーカーの発現について比較した。ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞およびｉＮＫ−ＰＫＴ２細胞はＣＤ５６＋およびＣＤ３−であり、それらが確かにＮＫ細胞であることが示唆される。それらはまた、同様のレベルの様々なＮＫ細胞マーカーを発現した。ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞およびｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞は、同様のレベルのＣＤ１６Ａを発現することが分かったが、ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａのみが抗ＣＤ６４  ｍＡｂによって染色された（図５）。
【００３９】
ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞およびｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞を、ＮＫ９２細胞について上述したように、ＡＤＣＣについて評価した。ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞およびｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞を、トラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ＳＫＯＶ−３細胞と１０：１の比でインキュベートした。ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞は、トラスツズマブの存在下でＳＫＯＶ−３細胞傷害性の増加を示し、ｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞と比較してより高いレベルのＡＤＣＣ示した（図６）。
【００４０】
ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞およびｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞は同様のレベルのＣＤ１６Ａを発現したが（図５）、機能遮断性抗ＣＤ１６Ａ  ｍＡｂ  ３Ｇ８は、ｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞によるＡＤＣＣのみをブロックした（図６）。反対に、機能遮断性抗ＣＤ６４  ｍＡｂ  １０．１は、ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞によるＡＤＣＣのみをブロックした（図６）。ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞およびｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞も、１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブで２時間前処理し、洗浄して未結合の抗体を除去し、次いでＳＫＯＶ−３細胞とインキュベートした。このアッセイにおいて、ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞は、ｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞と比較して、標的細胞の殺傷における明確な増強を示した（図７）。ＭＡ１４８は、ＳＫＯＶ−３細胞と比較してかなり低いレベルのＨＥＲ２を発現するヒト卵巣癌細胞株である。トラスツズマブ（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で様々な比でＭＡ１４８細胞に曝露したときのｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞およびｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞において、ＡＤＣＣを評価した。この場合も同様に、ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞は、トラスツズマブの存在下で、全てのエフェクター細胞対標的細胞の比でｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞よりも有意に高いレベルの腫瘍細胞の殺傷を示した（図８）。
【００４１】
キメラ受容体ＣＤ６４／１６Ａ（図２、図１３Ａ）は、ヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２で安定に発現した。これらの細胞は内因性ＦｃγＲを欠いているが、外因性ＣＤ１６Ａを発現する形質導入細胞はＡＤＣＣを媒介することができる。図１３Ｂに示されるように、抗ＣＤ６４  ｍＡｂはＣＤ６４／１６Ａ細胞を発現するＮＫ９２細胞を染色したが、親ＮＫ９２細胞またはＣＤ１６Ａを発現するＮＫ９２細胞は染色しなかった。抗ＣＤ１６  ｍＡｂはＣＤ１６Ａを発現するＮＫ９２細胞を染色したが、ＣＤ６４／１６Ａを発現するＮＫ９２細胞または親ＮＫ９２細胞は染色しなかった（図１３Ｂ）。ＣＤ１６Ａは、ＮＫ細胞の活性化の際にＡＤＡＭ１７によるエクトドメイン・シェディングを受け、その結果として、発現が急速に下方制御される。好中球上のＣＤ１６ＡおよびそのアイソフォームＣＤ１６ＢはＡＤＡＭ１７によって切断されるが、これは細胞膜に近接した細胞外領域で起こる。ＣＤ１６ＡのＡＤＡＭ１７切断領域は、ＣＤ６４またはＣＤ６４／１６Ａには存在しない（図１３Ａ）。ＣＤ１６ＡはＡＤＣＣによるＮＫ９２刺激時に発現が＞５０％減少したが、ＣＤ６４／１６Ａはほとんどまたはまったく下方制御を示さなかった（図１３Ｃ）。
【００４２】
ＣＤ６４／１６Ａの機能を評価するために、ＣＤ６４／１６ＡがＥ：Ｔ結合を開始し、ＡＤＣＣを誘導し、ＮＫ細胞が抗体結合腫瘍細胞に結合した時にサイトカイン産生を刺激する能力を調べた。その顆粒内容物の放出前に、ＮＫ細胞は標的細胞と安定な複合体を形成する。ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞とＳＫＯＶ−３細胞との結合を、２色フローサイトメトリーアプローチを用いて調べた。ＳＫＯＶ−３細胞はＨＥＲ２を発現する卵巣癌細胞株であり、このアッセイは抗ＨＥＲ２治療用ｍＡｂトラスツズマブの非存在下および存在下で行った。ＣＤ６４／１６Ａを含むバイシストロン性ベクターもｅＧＦＰを発現し、その蛍光を使用してＮＫ９２細胞を同定した。ＳＫＯＶ−３細胞を蛍光色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識した。Ｅ：Ｔ結合によって２色の事象がもたらされ、それをフローサイトメトリーにより評価した。ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞をＳＫＯＶ−３細胞とインキュベートすることにより、最初の曝露後に非常に低いレベルの結合がもたらされ、６０分間の曝露後に増加した（図１４Ａ）。しかしながら、トラスツズマブの存在下で、ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞とＳＫＯＶ−３との結合は認識できるほどに増強された（図１４Ａ）。この結合の増加は、より高いレベルの標的細胞の殺傷に対応していた。図１４Ｂに示されるように、ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞によるＳＫＯＶ−３細胞の細胞傷害性は、トラスツズマブ濃度およびＥ：Ｔ比に応じて異なっていた。標的細胞殺傷の誘導におけるＣＤ６４／１６Ａの役割を確認するために、ＩｇＧ結合をブロックする抗ＣＤ６４  ｍＡｂ  １０．１（図１４Ｃ）の存在下および非存在下でＡＤＣＣアッセイを行った。サイトカイン産生はＡＤＣＣ中にも誘導され、ＮＫ細胞はＩＦＮγの主要な産生株である。ＳＫＯＶ−３細胞およびトラスツズマブに曝露されたＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞は、ＳＫＯＶ−３細胞のみに曝露された場合よりもかなり高いレベルのＩＦＮγを産生した（図１４Ｄ）。総合すると、上記の知見は、組換え受容体のＣＤ６４成分が腫瘍結合抗体に結合するため、ＣＤ１６Ａ成分が細胞内シグナル伝達を促進し、脱顆粒およびサイトカイン産生を引き起こすことを示すものである。
【００４３】
ＣＤ６４は、可溶性モノマーＩｇＧへの高い親和性および安定な結合に寄与する、その固有の第３細胞外ドメインによって他のＦｃγＲメンバーと異なる。ＣＤ６４／１６ＡまたはＣＤ１６Ａ−１７６Ｖ高親和性バリアントを発現するＮＫ９２細胞を、可溶性の治療用ｍＡｂを捕捉する能力について比較した。試験したＮＫ９２細胞形質導入体は、同様のレベルのＣＤ６４／１６ＡおよびＣＤ１６Ａを発現した（図１５Ａ）。ＮＫ９２細胞形質導入体をトラスツズマブと２時間インキュベートし、過剰な抗体を洗い流し、蛍光色素結合抗ヒトＩｇＧ抗体で染色し、次いでフローサイトメトリーにより評価した。図１５Ｂに示すように、ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞は、ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞よりもかなり高いレベルのトラスツズマブを捕捉した（８．１倍の増加±１．３、３回の独立した実験の平均±ＳＤ）。さらに、ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞は、腫瘍標的化ｍＡｂであるセツキシマブおよびリツキシマブ、ならびに融合タンパク質Ｌ−セレクチン／Ｆｃを効率的に捕捉した（図１５Ｃ）。
【００４４】
捕捉された腫瘍標的化ｍＡｂを有するＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞を試験して、細胞がＡＤＣＣを媒介するかどうかを決定した。このアッセイのために、等しい数のＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞とＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞を同じ濃度の可溶性トラスツズマブとインキュベートし、洗浄して、ＳＫＯＶ−３細胞に曝露した。捕捉されたトラスツズマブを有するＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞による標的細胞の殺傷は、ＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞のみよりも有意に高く、調査した全てのＥ：Ｔ比でトラスツズマブを用いてまたは用いずに処理したＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞よりも優れていた（図１５Ｄ）。対照的に、トラスツズマブが存在し、洗い流されなかった場合、ＮＫ９２−ＣＤ１６Ａ細胞およびＮＫ９２−ＣＤ６４／１６Ａ細胞によるＳＫＯＶ−３細胞傷害性は有意に異ならず（図１５Ｅ）、両方の形質導入体による同等の細胞傷害性が実証された。総合すると、これらの知見は、ＣＤ６４／１６Ａを発現するＮＫ９２細胞が可溶性抗腫瘍ｍＡｂおよびＩｇＧ融合タンパク質に安定に結合することができ、これらが癌細胞を死滅させるための標的化要素として機能できることを示している。
【００４５】
ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞におけるＣＤ６４／１６Ａの発現および機能
非ランダムな遺伝子挿入および安定な発現のために、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンプラスミドを使用してＣＤ６４／１６Ａを発現するように未分化ｉＰＳＣに形質導入した。実施例２に記載されるように、ｉＰＳＣを造血細胞、次いでｉＮＫ細胞に分化させた。ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋細胞を生成し、さらにｉＮＫ細胞に分化させ、組換えＩＬ−２およびａＡＰＣを使用した分析のためにこれらの細胞を増殖させた。ＣＤ５６＋ＣＤ３−は、ヒトＮＫ細胞の特徴的な表現型であり、これらの細胞は、我々の分化細胞集団の過半数を占めていた（図１６）。ｉＮＫ細胞における活性化受容体および抑制性受容体の発現も評価し、末梢血ＮＫ細胞による発現と比較した。ＣＤ１６Ａ等の特定の受容体は、同様の比率の２つのＮＫ細胞集団によって発現された。しかしながら、増殖したｉＮＫ細胞は、抑制性ＫＩＲ受容体ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ１、およびＫＩＲ３ＤＬ１、ならびに特定の活性化受容体（ＮＫｐ４６およびＮＫＧ２Ｄ）の発現を欠いていた（図１６）。末梢血ＮＫ細胞と比較した別の違いは、ｉＮＫ細胞が抗ＣＤ６４  ｍＡｂで染色されたことであり（図１６）、ＣＤ６４／１６Ａの発現が実証された。
【００４６】
ｉＮＫ細胞におけるＣＤ６４／１６Ａの機能を評価するために、ｐＫＴ２空ベクターまたはｐＫＴ２−ＣＤ６４／１６Ａのいずれかで形質導入したｉＰＳＣに由来するｉＮＫ細胞を比較した。上記のＮＫ細胞マーカーは、ＣＤ１６Ａを含む２つのｉＮＫ細胞集団（データは示さず）によって同様のレベルおよび比率で発現されたが（図１７Ａ）、ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞のみが抗ＣＤ６４  ｍＡｂにより染色された（図１７Ａ）。両方のｉＮＫ形質導入体は、トラスツズマブの存在下でＳＫＯＶ−３細胞殺傷の増加を示したが、ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞は、ｉＮＫ−ｐＫＴ２対照細胞よりも有意に高いレベルのＡＤＣＣを媒介した（図１７Ｂ）。抗ＣＤ１６機能遮断性ｍＡｂ  ３Ｇ８は、ｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞によるＡＤＣＣを効果的に抑制したが、抗ＣＤ６４  ｍＡｂ  １０．１はそうではなかった（図１７Ｂ）。反対に、３Ｇ８ではなく１０．１は、ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞によるＡＤＣＣをブロックした（図１７Ｂ）。これらの知見は、ｉＮＫ細胞が抗体結合腫瘍細胞のＣＤ１６ＡおよびＣＤ６４／１６Ａの結合に応答する細胞溶解性エフェクターであることを示している。
【００４７】
また、ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞およびｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞を可溶性トラスツズマブで処理し、過剰な抗体を洗い流し、細胞をＳＫＯＶ−３細胞に曝露した。これらの条件下で、ｉＮＫ−ＣＤ６４／１６Ａ細胞によるＡＤＣＣはｉＮＫ−ｐＫＴ２細胞よりも著しく高く（図１７Ｃ）、ＣＤ６４／１６Ａが腫瘍細胞殺傷の標的化要素として機能する可溶性抗腫瘍ｍＡｂを捕捉できることがさらに確立された。
【００４８】
総合すると、データは、ＣＤ６４／１６ＡがＣＤ１６Ａよりも高い親和性で治療用ｍＡｂに結合することを示している。さらに、ＮＫ９２細胞およびｉＮＫ細胞に発現されるＣＤ６４／１６Ａは、野生型または内因性ＣＤ１６Ａをそれぞれ発現するＮＫ９２細胞およびｉＮＫ細胞よりも高いレベルのＡＤＣＣを媒介する能力を細胞に付与する。ＣＤ６４／１６Ａを発現するＮＫ細胞は、抗体結合腫瘍細胞との細胞結合、細胞傷害性、ＩＦＮγ産生を促進し、組換えＦｃγＲの両方の成分による機能が実証された。ＣＤ６４／１６Ａを発現するＮＫ９２細胞およびｉＮＫ細胞は、標的細胞への曝露前に治療用ｍＡｂを事前にプレロードすることができるキメラ受容体を発現し、治療用抗体がプレロードされた細胞は、複数の種類の癌の要素を標的とするために、異なる治療用ｍＡｂで操作されたＮＫ細胞を改変することを可能にし得る。最後に、ＣＤ６４／１６Ａは、ＣＤ１６Ａに見られるＡＤＡＭ１７切断領域を欠いており、ＡＤＣＣ中に同じレベルの発現の下方制御を受けなかった。
【００４９】
ＣＤ６４／１６Ａは、２つのＮＫ細胞プラットフォームである、ＮＫ９２細胞株およびｉＰＳＣ由来の初代ＮＫ細胞で機能することが示された。ＮＫ９２細胞は抑制性ＫＩＲ受容体を欠いており、患者由来の他のＮＫ細胞株と比較して高いレベルの天然細胞傷害性を示す。ＮＫ９２細胞は、それらの細胞溶解性エフェクター機能を誘導するように改変された遺伝子を発現するために広く使用されており、前臨床研究において評価され、癌患者における臨床試験を受けている。ｉＰＳＣも遺伝子工学に非常に適しており、それらのエフェクター機能を誘導するために様々な受容体を発現するＮＫ細胞に分化させることができるこの研究で生成されたｉＮＫ細胞は、未成熟な状態の指標であるいくつかの抑制性受容体および活性化受容体を欠いていた。いくつかの用途において、抑制性受容体および特定の活性化受容体を欠く治療用ｉＮＫ細胞は、操作された受容体によるより指向性のあるかつ／または効果的な腫瘍細胞の殺傷を可能にする。
【００５０】
ｉＮＫ細胞は、内因性ＣＤ１６Ａを発現し、ＡＤＣＣを媒介したため、それらは細胞傷害性エフェクター細胞であった。個々のＮＫ細胞は、様々な様式で複数の腫瘍細胞を死滅させることができる。これは、連続殺傷と称される連続的な接触および脱顆粒のプロセスによるもの、およびバイスタンダー殺傷と称される周囲の腫瘍細胞を死滅させるその顆粒内容物の局所的な分散によるものを含む。ＣＤ１６Ａのシェディングを抑制すると、標的細胞からのＮＫ細胞の脱離が遅くなり、インビトロでのＮＫ細胞による連続殺傷が減少することが報告されている。ＣＤ６４成分およびそのエクトドメイン・シェディングの欠如により、ＣＤ６４／１６Ａを発現するＮＫ細胞の連続殺傷の効率が低下し、バイスタンダー殺傷の効率が高くなる可能性がある。
【００５１】
ＣＤ６４／１６Ａを発現するＮＫ細胞は、治療用抗体と組み合わせた治療薬としていくつかの潜在的な利点を有する。ＣＤ６４／１６Ａを発現するＮＫ細胞を抗体で改変すると、患者に投与される治療用抗体の投与量を減少することができる。Ｌ−セレクチン／Ｆｃ等のヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む融合タンパク質もＣＤ６４／１６Ａによって捕捉され得、これにより、操作されたＮＫ細胞の組織および腫瘍抗原標的化を誘導するためのさらなる選択肢を提供することができる。養子細胞療法のためのＮＫ９２細胞およびｉＮＫ細胞プラットフォームは、癌免疫療法の既製の治療薬として改善されたエフェクター活性を有する操作されたＮＫ細胞を生成するように、クローンレベルで容易に遺伝子改変することができ、臨床的にスケーラブルな細胞数に増殖させることができる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ＣＤ６４／１６Ａを発現するｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は、治療用ｍＡｂの存在下で増大したインビボ抗癌活性を示すことができる。例えば、ホタルルシフェラーゼを発現するように安定に操作されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスおよびヒト癌細胞株は、癌細胞に対するｉＮＫ細胞活性を調べるために生物発光イメージングに使用することができる。ＳＫＯＶ−３およびＭＡ１４８卵巣癌細胞株は、インビボ標的のモデルとして機能し得る。ＮＳＧ雌マウスを致死量以下の照射に供し、次いで、生物発光イメージングのために腫瘍細胞を腹腔内注射して、腫瘍の増殖または退行を定量化することができるＮＫ細胞のインビボでの生存を促進するために、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を隔日で４週間マウスに投与する。治療用抗体（例えば、トラスツズマブ）は、例えば、週１回、４週間投与することができる。腫瘍の増殖／退行は、例えば生物発光イメージングによって、およびマウスの体重を測定することによって監視することができる。マウスはまた、ヒトＮＫ細胞の生存を定量化するために（例えば、毎週）採血することができ、ＦＡＣＳによって様々なエフェクター機能マーカーの発現／細胞表面レベルをさらに評価することができる。転移の証拠は、例えば、内臓を採取し、転移についてその内臓を検査することによって決定することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、治療用組成物中の細胞の数は、用量当たり、少なくとも０．１×１０５細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも５×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも５×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞、または少なくとも５×１０９細胞である。いくつかの実施形態において、治療用組成物中の細胞の数は、用量当たり約０．１×１０５細胞〜約１×１０６細胞、用量当たり約０．５×１０６細胞〜約１×１０７細胞、用量当たり約０．５×１０７細胞〜約１×１０８細胞、用量当たり約０．５×１０８細胞〜約１×１０９細胞、用量当たり約１×１０９細胞〜約５×１０９細胞、用量当たり約０．５×１０９細胞〜約８×１０９細胞、用量当たり約３×１０９細胞〜約３×１０１０細胞、またはその間の任意の範囲である。一般に、６０ｋｇの患者の場合、１×１０８細胞／用量は１．６７×１０６細胞／ｋｇに相当する。
【００５４】
一実施形態において、治療用組成物中の細胞の数は、部分的もしくは単一の臍帯血中の免疫細胞の数であるか、または少なくとも０．１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．７５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．２５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．７５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２．５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２０×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３０×１０６細胞／ｋｇ体重、１×１０８細胞／ｋｇ体重、５×１０８細胞／ｋｇ体重、もしくは１×１０９細胞／ｋｇ体重である。
【００５５】
一実施形態において、ある用量の細胞が対象に送達される。例示的な一実施形態において、対象に提供される細胞の有効量は、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０６細胞／ｋｇ、もしくは少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞の用量を含む。
【００５６】
別の例示的な実施形態において、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、もしくは約１０×１０６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞の用量を含む。
【００５７】
別の例示的な実施形態において、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、もしくは６×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞の用量を含む。
【００５８】
投与量のいくらかの変動は、治療されている対象の状態に応じて必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いずれの場合も、個々の対象に適切な用量を決定する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、細胞の治療用途は単回投与治療である。いくつかの実施形態において、由来する造血系細胞の治療用途は、複数回投与治療である。いくつかの実施形態において、複数回投与治療は、毎日、３日ごと、７日ごと、１０日ごと、１５日ごと、２０日ごと、２５日ごと、３０日ごと、３５日ごと、４０日ごと、４５日ごと、５０日ごと、またはその間の任意の日数の１回の服用である。
【００６０】
本明細書に記載の細胞集団を含む組成物は、滅菌することができ、ヒト患者への投与に適切であり得、またすぐ投与できる状態である（すなわち、任意のさらなる処理なしに投与することができる）。投与できる状態の細胞ベースの組成物は、対象への移植または投与の前に組成物がさらなる処理または操作を必要としないことを意味する。いくつかの実施形態において、そのような細胞集団は、１つまたは複数の薬剤による投与前に増殖および／または調節される単離された細胞集団を含むことができる。
【００６１】
特定の実施形態において、治療用細胞の一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在してもよいか、または表面に結合させてもよい。表面に結合させる場合、薬剤は、同じ表面に（すなわち、「シス」形態）または別個の表面に（すなわち、「トランス」形態）結合され得る。あるいは、一方の薬剤が表面に結合し、他方の薬剤が溶液中に存在してもよい。一実施形態において、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合させてもよく、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在するかまたは表面に結合される。特定の実施形態において、両方の薬剤が溶液中に存在してもよい。別の実施形態において、薬剤は可溶性形態であり得るため、Ｔリンパ球の活性化および増殖における使用が企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）のために、Ｆｃ受容体を発現する細胞または抗体または米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号に開示されるような薬剤に結合する他の結合剤等の表面に架橋され得る。
【００６２】
患者への投与に適した治療組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体（添加剤）および／もしくは希釈剤（例えば、薬学的に許容される培地、たとえば細胞培養培地）、または他の薬学的に許容される成分を含み得る。薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、投与される特定の組成物によって、ならびに治療用組成物を投与するために使用される特定の方法によって一部決定される。したがって、当業者に周知の治療組成物の多種多様な適切な製剤が存在する（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．１９８５を参照されたい）。
【００６３】
特定の実施形態において、本明細書に記載の単離された細胞集団を有する治療用細胞組成物はまた、薬学的に許容される細胞培養培地、または薬学的に許容される担体および／もしくは希釈剤を有する。本明細書に開示される細胞集団を含む治療組成物は、所望の治療目標に影響を与えるように、静脈内、腹腔内、経腸、もしくは気管投与方法によって別々に、または他の適切な化合物と組み合わせて投与することができる。
【００６４】
これらの薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、治療用組成物のｐＨを約３〜約１０に維持するのに十分な量で存在することができる。したがって、緩衝剤は、全組成物の重量対重量基準で約５％であり得る。限定されないが、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム等の電解質もまた、治療用組成物に含まれ得る。一態様において、治療用組成物のｐＨは、約４〜約１０の範囲である。あるいは、治療用組成物のｐＨは、約５〜約９、約６〜約９、または約６．５〜約８の範囲である。別の実施形態において、治療用組成物は、該ｐＨ範囲のうちの１つのｐＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態において、治療用組成物は、約７のｐＨを有する。あるいは、治療用組成物は、約６．８〜約７．４の範囲のｐＨを有する。さらに別の実施形態において、治療用組成物は、約７．４のｐＨを有する。
【００６５】
本開示はまた、本明細書に記載されるような特定の組成物および／または細胞の培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に適している。一般的に言えば、ｉＰＳＣ由来の免疫細胞の維持、成長、および／または健康を支持するいずれの培地も、薬学的な細胞培養培地としての使用に適している。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清および／または無フィーダー培地である。様々な実施形態において、無血清培地は動物質を含まず、任意選択的に無タンパク質であり得る。任意選択的に、培地は、生物薬剤学的に許容される組換えタンパク質を含み得る。動物質を含まない培地は、成分が非動物供給源に由来する培地を指す。組み換えタンパク質は、動物質を含まない培地で天然の動物タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成、植物性、または微生物性の供給源から得られる。対照的に、無タンパク質培地は、タンパク質を実質的に含まないと定義される。当業者は、上記の培地の例が例示であり、適切な培地の配合を決して限定するものではなく、当業者に既知であり利用可能な多くの代替の適切な媒体が存在することを理解するであろう。
【００６６】
前述の説明および特許請求の範囲において、「および／または」という用語は、列挙される要素の１つもしくは全て、または列挙される要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、およびそれらの変形は、制限のないものとして解釈されるべきであり、すなわち、追加の要素またはステップは任意選択的であり、存在してもしなくてもよい。別段の規定のない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「少なくとも１つ」は互換的に使用され、１つまたは１つより多くを意味する。エンドポイントによる数値範囲の列挙は、その範囲内に含まれる全ての数を含む（例えば、１〜５は１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等）。
【００６７】
前述の説明では、明確にするために、特定の実施形態を単独で説明することがある。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と互換性がないことが特に明記されない限り、特定の実施形態は、１つまたは複数の実施形態に関連して本明細書に記載される互換性のある特徴の組み合わせを含み得る。
【００６８】
個別のステップを含む本明細書に開示される任意の方法について、ステップは、任意の実行可能な順序で実行され得る。また、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組み合わせが同時に実施されてもよい。
【００６９】
本発明は、以下の実施例により説明される。特定の実施例、材料、量、および手順は、本明細書に記載される本発明の範囲および主旨に従って広く解釈されるべきであることを理解されたい。
【実施例】
【００７０】
実施例１
ヒトＣＤ６４／１６Ａ発現コンストラクトの作成
ＴＲＩｚｏｌ全ＲＮＡ単離試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して末梢血白血球（ＰＢＬ）から全ＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてヒトＰＢＬ  ｃＤＮＡを合成した。ＣＤ６４／１６Ａは、ヒトＣＤ６４細胞外ドメイン（ＣＤ６４−ＥＣ）、ならびにＣＤ１６Ａ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（ＣＤ１６Ａ−ＴＭ−ＣＹ）を含む。キメラコンストラクトは、ＰＣＲを重ね合わせることにより生成され、キメラｃＤＮＡのＥｃｏＲ  Ｉ−隣接ＲＴ−ＰＣＲ産物を作成した。ＣＤ６４−ＥＣ  ｃＤＮＡ断片（８８５ｂｐｓ）は、フォワードプライマー
【化１】
2021500923.tif 000003
およびリバースプライマー５’−ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＣＡＣ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＡ−３’、配列番号２９）を使用してヒトＰＢＬ  ｃＤＮＡから増幅した。ＣＤ１６Ａ−ＴＭ−ＣＹ  ｃＤＮＡ断片（１９５ｂｐｓ）は、フォワードプライマー５’−ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＣＡＡ−３’（配列番号３０）およびリバースプライマー（配列番号３１）
【化２】
2021500923.tif 000004
を使用してヒトＰＢＬ  ｃＤＮＡから増幅した。ＣＤ６４−ＥＣ  ｃＤＮＡおよびＣＤ１６Ａ−ＴＭ−ＣＹ  ｃＤＮＡのＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製し、フォワードプライマー
【化３】
2021500923.tif 000005
およびリバースプライマー
【化４】
2021500923.tif 000006
と一緒に混合した。上に列挙した全てのプライマーについて、下線が引かれたヌクレオチドは、キメラ受容体のＲＴ−ＰＣＲ産物を生成するためのＥｃｏＲ  Ｉ切断部位である。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｐｆｘ５０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて行った。得られたＣＤ６４／ＣＤ１６ａ  ｃＤＮＡをレトロウイルス発現ベクターｐＢＭＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）およびｐＫＴ２  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターに挿入した（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１２１７８８；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１６．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３４：９３−１０１）。ＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシーケンスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、ＡＢＩ  ３７７シーケンサーで両方向から直接配列決定することにより、クローン化された全てのコンストラクトの配列を確認した。
【００７１】
ＮＫ細胞におけるＣＤ６４／１６Ａの安定な発現
内因性ＣＤ１６Ａ発現が欠損したヒトＮＫ細胞株であるＮＫ９２細胞は、以前に記載されたレトロウイルス感染手順（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１２１７８８）を用いて、ＣＤ６４／１６Ａを含むｐＢＭＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰレトロウイルス発現コンストラクトまたは野生型ＣＤ１６Ａ  ｃＤＮＡで安定に形質導入した。以前に記載されたように（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１２１７８８）、ヒトｉＰＳＣ（ＵＣＢｉＰＳ７、臍帯血ＣＤ３４細胞に由来）は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムを使用してＣＤ６４／１６Ａ−ｐＫＴ２発現コンストラクトで安定に形質導入した。形質導入したｉＰＳＣ細胞を、造血細胞に分化させ、次いで、以前に記載されたように、成熟ＮＫ細胞に分化させた（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１２１７８８）。ＣＤ６４、ＣＤ１６、および様々なＮＫ細胞表現型マーカーのｅＧＦＰ蛍光および表面発現は、フローサイトメトリー分析を使用して決定した。
【００７２】
実施例２
抗体
ヒトの造血および白血球の表現型マーカーに対する全てのｍＡｂを表２に示す。アイソタイプが一致する全ての陰性対照ｍＡｂは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＡＰＣ結合Ｆ（ａｂ’）２ロバ抗ヒトまたはヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）によって製造されるヒトＩｇＧ１  ｍＡｂであるトラスツズマブ／ハーセプチンおよびリツキシマブ／リツキサン、ならびにＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＮＪ）によって製造されるセツキシマブ／エルビタックスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｂｏｙｎｔｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｙを通して購入した。組換えヒトＬ−セレクチン／ＩｇＧ１  Ｆｃキメラは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。
【表２】
2021500923.tif 000007
【００７３】
ヒトＣＤ６４／１６Ａの生成
ＴＲＩｚｏｌ全ＲＮＡ単離試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してヒト末梢血白血球から全ＲＮＡを単離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてｃＤＮＡを合成した。組換えＣＤ６４／１６Ａは、ヒトＣＤ６４細胞外ドメイン、ならびにＣＤ１６Ａ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインで構成される。ＣＤ６４（８８５ｂｐｓ）およびＣＤ１６Ａ（１９５ｂｐｓ）のＰＣＲ断片は、生成されたｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ断片を精製し、フォワードプライマー
【化５】
2021500923.tif 000008
、リバースプライマー
【化６】
2021500923.tif 000009
、およびＰｆｘ５０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に混合して、組換えＣＤ６４／１６Ａ受容体を生成した。どちらのプライマーについても、下線が引かれたヌクレオチドはＥｃｏＲ  Ｉ部位である。ＣＤ６４／ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ａ  ｃＤＮＡ（ＣＤ１６Ａ−１７６Ｖバリアント）をレトロウイルス発現ベクターｐＢＭＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰに挿入し、以前に記載されたように、ＮＫ９２細胞形質導入のためにウイルスを生成した（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０（３）：ｅ０１２１７８８）。さらに、ＣＤ６４／ＣＤ１６Ａ  ｃＤＮＡをｐＫＴ２  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターに挿入し、以前に記載されたように、ｉＰＳＣ形質導入のためにＳＢ１００Ｘトランスポサーゼとともに使用した（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０（３）：ｅ０１２１７８８）。ＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシーケンスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、ＡＢＩ  ３７７シーケンサーで両方向から直接配列決定することにより、全てのコンストラクトのヌクレオチド配列を確認した。
【００７４】
細胞
この研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉｎｎｅｓｏｔａのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄに従って実施され、承認された。全ての対象は、ヘルシンキ宣言に従って、書面によるインフォームドコンセントを提出した。血小板アフェレーシスからの新鮮なヒト末梢血白血球は、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して末梢血単核球をさらに濃縮し、製造業者の指示に従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＮＫ細胞キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して陰性枯渇によりＮＫ細胞を精製し、ＣＤ５６＋ＣＤ３−リンパ球の＞９５％の生存率および９０〜９５％濃縮とした。生細胞のカウントは、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ自動セルカウンター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を使用して行った。ヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２および卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ−３はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、製造業者の指示に従って培養した。ＮＫ９２細胞は、増殖のためにＩＬ−２を必要としたため（５００ＩＵ／ｍｌ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。後述の全てのアッセイに、対数増殖期にある細胞を使用した。
【００７５】
臍帯血ＣＤ３４細胞に由来するｉＰＳＣ  ＵＣＢｉＰＳ７は以前に特徴付けられており、いくつかの変更を伴って記載されるように培養し、造血前駆細胞に分化させた（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１２１７８８；Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０２９：３３−４１；Ｋｎｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２（４）：２７４−２８３；Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３２（４）：１０２１−１０３１；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３４（１）：９３−１０１）。ｉＰＳＣの培養および造血分化は、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地およびＳＴＥＭｄｉｆｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して行ったが、マウス胚線維芽細胞フィーダー細胞の使用、ＴｒｙｐＬＥ適応、スピン胚様体形成、またはＣＤ３４＋細胞濃縮は必要としなかった。継代中のｉＰＳＣ細胞をＧｅｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で解離し、直径≧５０μｍのｉＰＳＣ凝集体を血球計算盤でカウントし、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地を用いて２０〜４０凝集体／ｍｌに希釈した。１２ウェルプレートの各ウェルにＭａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）をプレコートし、４０〜８０個の凝集体を２ｍｌのＴｅＳＲ−Ｅ８培地に播種した。製造業者の指示に従ってＳＴＥＭｄｉｆｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて分化する前に、細胞凝集体を２４時間培養した。造血前駆細胞分化の１２日目に、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ４５、および抗ＣＤ４３  ｍＡｂを用いたフローサイトメトリー分析を使用して造血前駆細胞の割合を決定した。ＮＫ細胞の分化は、以前に説明されているように行った（Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｂｌｏｏｄ  １１３（２４）：６０９４−６１０１）。以前に記載されたように、細胞増殖培地［６０％ＤＭＥＭ、３０％ハムのＦ１２、１０％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）、２０μＭ  ２−メルカプトエタノール、５０μＭエタノールアミン、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１００〜２５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）］中のγ線を照射したＫ５６２−ｍｂＩＬ２１−４１ＢＢＬフィーダー細胞（１：２の比率）を使用して、ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞（本明細書においてｉＮＫ細胞と称される）を増殖させた（Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１２１７８８；Ｋｎｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２（４）：２７４−２８３；Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３２（４）：１０２１−１０３１；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ���  ３４（１）：９３−１０１）。
【００７６】
細胞染色、フローサイトメトリー、およびＥＬＩＳＡ
細胞染色のために、非特異的抗体結合部位をブロックし、示される抗体で細胞を染色し、以前に記載されたように、フローサイトメトリーにより調べた（Ｒｏｍｅｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１３．Ｂｌｏｏｄ  １２１（１８）：３５９９−３６０８；Ｊｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１２１７８８；Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ６７（９）：１４０７−１４１６）。該当する細胞がＦｃＲを発現したため、対照には、蛍光マイナス１および適切なアイソタイプが一致する抗体を使用した。ＦＳＣ−Ａ／ＳＳＣ−Ａプロットを使用して白血球集団に電子ゲートを設定し、ＦＳＣ−Ａ／ＦＳＣ−Ｈプロットを使用して単一細胞に電子ゲートを設定した。製造業者の指示（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って、Ｚｏｍｂｉｅ生存率キットを使用して生細胞対死細胞を評価した。
【００７７】
可溶性トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、またはＬ−セレクチン／Ｆｃキメラの捕捉を評価するために、形質導入したＮＫ細胞をＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍｌ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、および２−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）を補充したＭＥＭ−α基本培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で５μｇ／ｍｌの抗体と３７℃で２時間インキュベートし、ＭＥＭ−α基本培地で洗浄し、次いで、希釈率１：２００のＡＰＣ結合Ｆ（ａｂ’）２ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で氷上で３０分間染色した。組換えヒトＬ−セレクチン／Ｆｃ結合を検出するために、細胞を抗Ｌ−セレクチンｍＡｂ  ＡＰＣ結合Ｌａｍ１−１１６で染色した。
【００７８】
ＮＫ９２細胞におけるＣＤ１６Ａ、ＣＤ６４、およびＣＤ６４／１６Ａ染色レベルを比較するために、それぞれの形質導入体を飽和濃度の非結合抗ＣＤ１６（３Ｇ８）または抗ＣＤ６４（１０．１）ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）で染色し、２％ヤギ血清および２ｍＭアジ化ナトリウムを含むｄＰＢＳ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）で十分に洗浄し、次いでＡＰＣ結合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で染色した。直接結合した抗ＣＤ１６および抗ＣＤ６４  ｍＡｂは蛍光色素の標識レベルが異なる可能性があるため、このアプローチが使用された。ＥＬＩＳＡは、製造業者の指示に従って、ヒトＩＦＮγ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のサイトメトリービーズベースのＦｌｅｘ  Ｓｅｔアッセイによって行った。全てのフローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。データはＦＡＣＳＤＩＶＡ  ｖ８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析した。
【００７９】
細胞間結合アッセイおよびＡＤＣＣ
ＮＫ９２細胞でＣＤ６４／１６Ａを発現させるために使用されるｐＢＭＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクターもｅＧＦＰを発現する。これらの細胞を、ＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍｌ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、および２−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）を補充したＭＥＭ−α基本培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で３７℃で２時間インキュベートした。ＳＫＯＶ−３細胞を製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識し、５μｇ／ｍｌトラスツズマブと３０分間インキュベートし、ＭＥＭ−α基本培地で洗浄した。次いで、ＮＫ９２細胞およびＳＫＯＶ−３細胞を、補充されたＭＥＭ−α基本培地にそれぞれ１×１０６および２×１０６／ｍｌで再懸濁した。１：２のＥ：Ｔ比の場合、１００μｌの各細胞型を一緒に混合し、２０×ｇで１分間遠心分離し、３７℃で指定の時間インキュベートした。各時点の後、細胞を３秒間穏やかにボルテックスし、４℃のｄＰＢＳ中１％のパラホルムアルデヒドで直ちに固定した。試料はフローサイトメトリーにより直ちに分析した。結合したＮＫ細胞の割合は、ｅＧＦＰとＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔのダブルポジティブ事象にゲートをかけることにより計算した。
【００８０】
ＡＤＣＣを評価するために、製造業者の指示（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に従って、ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡベースの細胞傷害性アッセイを使用した。簡潔に述べると、標的細胞を培養培地中でビス（アセトキシメチル）−２−２：６，２テルピリジン６，６ジカルボキシレート（ＢＡＴＤＡ）で３０分間標識し、培養培地中で洗浄し、８×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルの非組織培養処理Ｕ底プレートにピペットで移した。腫瘍を標的とするｍＡｂを５μｇ／ｍＬの示された濃度で加え、ＮＫ細胞を示されたエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で加えた。プレートを４００×ｇで１分間遠心分離し、次いで３７℃の加湿５％ＣＯ２雰囲気で２時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、プレートを５００×ｇで５分間遠心分離し、上清を９６ウェルのＤＥＬＦＩＡ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｐｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に移し、ユウロピウムと合わせた。蛍光は、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダー（Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して、時間分解蛍光分光法により測定した。治療用抗体の有無にかかわらず、ＢＡＴＤＡ標識された標的細胞を並行して培養して自然溶解を評価し、２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの存在下で最大溶解を測定した。各試料のＡＤＣＣのレベルは、次の式を使用して計算した。特異的放出の割合＝（実験的放出カウント−自然放出カウント）／（最大放出−自然放出カウント）×１００％。各実験について、３つの複製ウェルを使用して測定を３回実施した。
【００８１】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して統計分析を行った。おおよその正規分布を評価した後、全ての変数を平均±ＳＤとしてまとめた。２つの群間の比較はスチューデントのｔ検定を用いて行い、ｐ＜０．０５が統計的に有意であると見なした。
【００８２】
本明細書で引用した全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に入手可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列の提出、ならびに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きのコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書の開示（複数可）との間にいずれかの矛盾が存在する場合、本出願の開示が優先するものとする。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明確にするためだけに与えられている。そこから不必要な制限が理解されるべきではない。本発明は、当業者に明らかな変形が特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれるため、示されるかつ説明される正確な詳細に限定されない。
【００８３】
別段の指定のない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量等を表す全ての数は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって別段の指定のない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る概算である。少なくとも、また特許請求の範囲への均等論の適用を制限しようとする試みとしてでもなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告される有効数字の数に照らして、また通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。
【００８４】
本発明の広範な範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、全ての数値は、それぞれの試験の測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる範囲を本質的に含む。
【００８５】
全ての見出しは読者の便宜のためのものであり、特に指定のない限り、その見出しに続く本文の意味を制限するために使用されるべきではない。
【００８６】
配列リストのフリーテキスト
ｒＣＤ６４＃１（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４）ペプチド配列（配列番号９）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGLQLPTPVW FHVLFYLAVG IMFLVNTVLW VTIRKELKRK KKWDLEISLD SGHEKKVISS LQEDRHLEEE LKCQEQKEEQ LQEGVHRKEP QGAT
【００８７】
ｒＣＤ６４＃２（ｐＣＤＨ−ｍｕｔＣＤ６４）ペプチド配列（配列番号１０）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGLQLPTPVW FHVLFYLAVG IMFLVNTVLW VTIRKELKRK KKWNLEISLD SGHEKKVISS LQEDRHLEEE LKCQEQKEEQ LQEGVHRKEP QGAT
【００８８】
ｒＣＤ６４＃３（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４／１６）ペプチド配列（配列番号１１）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGFFPPGYQV SFCLVMVLLF AVDTGLYFSV KTNIRSSTRD WKDHKFKWRK DPQDK
【００８９】
ｒＣＤ６４＃４（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４／１６−２８−ＢＢ−Ｚ）ペプチド配列（配列番号１２）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVISLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGFFPPGYQV SFCLVMVLLF AVDTGLYFSV KTNIRSSTRD WKDHKFKWRK DPQDKRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKRGR KKLLYIFKQP FMRPVQTTQE EDGCSCRFPE EEEGGCELRV KFSRSADAPA YQQGQNQLYN ELNLGRREEY DVLDKRRGRD PEMGGKPRRK NPQEGLYNEL QKDKMAEAYS EIGMKGERRR GKGHDGLYQG LSTATKDTYD ALHMQALPPR
【００９０】
ｒＣＤ６４＃５（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４／１６−２８−ＢＢ−Ｇ）ペプチド配列（配列番号１３）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGFFPPGYQV SFCLVMVLLF AVDTGLYFSV KTNIRSSTRD WKDHKFKWRK DPQDKRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKRGR KKLLYIFKQP FMRPVQTTQE EDGCSCRFPE EEEGGCELRL KIQVRKAAIT SYEKSDGVYT GLSTRNQETY ETLKHEKPPQ
【００９１】
ｒＣＤ６４＃６（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４／１６−２８−ＢＢ−Ｄ１０）ペプチド配列（配列番号１４）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGFFPPGYQV SFCLVMVLLF AVDTGLYFSV KTNIRSSTRD WKDHKFKWRK DPQDKRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKRGR KKLLYIFKQP FMRPVQTTQE EDGCSCRFPE EEEGGCELAR PRRSPAQEDG KVYINMPGRG
【００９２】
ｒＣＤ６４＃７（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４／１６−２８−ＢＢ−Ｄ１２）ペプチド配列（配列番号１５）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGFFPPGYQV SFCLVMVLLF AVDTGLYFSV KTNIRSSTRD WKDHKFKWRK DPQDKRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKRGR KKLLYIFKQP FMRPVQTTQE EDGCSCRFPE EEEGGCELGR LVPRGRGAAE AATRKQRITE TESPYQELQG QRSDVYSDLN TQRPYYK
【００９３】
ｒＣＤ６４＃８（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４−２８−２８−ＢＢ−Ｚ）ペプチド配列（配列番号１６）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGLQLPTPFW VLVVVGGVLA CYSLLVTVAF IIFWVRSKRS RLLHSDYMNM TPRRPGPTRK HYQPYAPPRD FAAYRSKRGR KKLLYIFKQP FMRPVQTTQE EDGCSCRFPE EEEGGCELRV KFSRSADAPA YQQGQNQLYN ELNLGRREEY DVLDKRRGRD PEMGGKPRRK NPQEGLYNEL QKDKMAEAYS EIGMKGERRR GKGHDGLYQG LSTATKDTYD ALHMQALPPR
【００９４】
ｒＣＤ６４＃９（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４−ＦｃｅＲ）ペプチド配列（配列番号１７）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGAPREKYWL QFFIPLLVVI LFAVDTGLFI STQQQVTFLL KIKRTRKGFR LLNPHPKPNP KNN
【００９５】
ｒＣＤ６４＃１０（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４／１６−ＰＫＣ−）ペプチド配列（配列番号１８）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGFFPPGYQV SFCLVMVLLF AVDTGLYFSV KTNIRGAGRD WKDHKFKWRK DPQDK
【００９６】
ｒＣＤ６４＃１１（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４−Ｇ２Ｄ−２Ｂ４−Ｚ）ペプチド配列（配列番号１９）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGSNLFVASW IAVMIIFRIG MAVAIFCCFF FPSGGSGGGS GWRRKRKEKQ SETSPKEFLT IYEDVKDLKT RRNHEQEQTF PGGGSTIYSM IQSQSSAPTS QEPAYTLYSL IQPSRKSGSR KRNHSPSFNS TIYEVIGKSQ PKAQNPARLS RKELENFDVY SGGSGGGSGR VKFSRSADAP AYKQGQNQLY NELNLGRREE YDVLDKRRGR DPEMGGKPRR KNPQEGLYNE LQKDKMAEAY SEIGMKGERR RGKGHDGLYQ GLSTATKDTY DALHMQALPP R
【００９７】
ｒＣＤ６４＃１２（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４／１６−２Ｂ４−Ｚ）ペプチド配列（配列番号２０）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGFFPPGYQV SFCLVMVLLF AVDTGLYFSV KTNIRSSTRD WKDHKFKWRK DPQDKWRRKR KEKQSETSPK EFLTIYEDVK DLKTRRNHEQ EQTFPGGGST IYSMIQSQSS APTSQEPAYT LYSLIQPSRK SGSRKRNHSP SFNSTIYEVI GKSQPKAQNP ARLSRKELEN FDVYSGGSGG GSGRVKFSRS ADAPAYKQGQ NQLYNELNLG RREEYDVLDK RRGRDPEMGG KPRRKNPQEG LYNELQKDKM AEAYSEIGMK GERRRGKGHD GLYQGLSTAT KDTYDALHMQ ALPPR
【００９８】
ｒＣＤ６４＃１３（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４／１６−２Ｂ４−Ｇ）ペプチド配列（配列番号２１）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGFFPPGYQV SFCLVMVLLF AVDTGLYFSV KTNIRSSTRD WKDHKFKWRK DPQDKWRRKR KEKQSETSPK EFLTIYEDVK DLKTRRNHEQ EQTFPGGGST IYSMIQSQSS APTSQEPAYT LYSLIQPSRK SGSRKRNHSP SFNSTIYEVI GKSQPKAQNP ARLSRKELEN FDVYSGGSGG GSGRLKIQVR KAAITSYEKS DGVYTGLSTR NQETYETLKH 
EKPPQ
【００９９】
ｒＣＤ６４＃１４（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４／１６−２Ｂ４−Ｄ１０）ペプチド配列（配列番号２２）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGFFPPGYQV SFCLVMVLLF AVDTGLYFSV KTNIRSSTRD WKDHKFKWRK DPQDKWRRKR KEKQSETSPK EFLTIYEDVK DLKTRRNHEQ EQTFPGGGST IYSMIQSQSS APTSQEPAYT LYSLIQPSRK SGSRKRNHSP SFNSTIYEVI GKSQPKAQNP ARLSRKELEN FDVYSGGSGG GSGARPRRSP AQEDGKVYIN MPGRG
【０１００】
ｒＣＤ６４＃１５（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４／１６−２Ｂ４−Ｄ１２）ペプチド配列（配列番号２３）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGFFPPGYQV SFCLVMVLLF AVDTGLYFSV KTNIRSSTRD WKDHKFKWRK DPQDKWRRKR KEKQSETSPK EFLTIYEDVK DLKTRRNHEQ EQTFPGGGST IYSMIQSQSS APTSQEPAYT LYSLIQPSRK SGSRKRNHSP SFNSTIYEVI GKSQPKAQNP ARLSRKELEN FDVYSGGSGG GSGGRLVPRG RGAAEAATRK QRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YK
【０１０１】
ｒＣＤ６４＃１６（ｐＣＤＨ−ＣＤ６４−６４−２Ｂ４−Ｚ）ペプチド配列（配列番号２４）
MWFLTTLLLW VPVDGQVDTT KAVITLQPPW VSVFQEETVT LHCEVLHLPG SSSTQWFLNG TATQTSTPSY RITSASVNDS GEYRCQRGLS GRSDPIQLEI HRGWLLLQVS SRVFTEGEPL ALRCHAWKDK LVYNVLYYRN GKAFKFFHWN SNLTILKTNI SHNGTYHCSG MGKHRYTSAG ISVTVKELFP APVLNASVTS PLLEGNLVTL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLRGRN TSSEYQILTA RREDSGLYWC EAATEDGNVL KRSPELELQV LGLQLPTPVW FHVLFYLAVG IMFLVNTVLW VTIRKELKRK KKWDLEISLD SGHEKKVISS LQEDRHLEEE LKCQEQKEEQ LQEGVHRKEP QGATGWRRKR KEKQSETSPK EFLTIYEDVK DLKTRRNHEQ EQTFPGGGST IYSMIQSQSS APTSQEPAYT LYSLIQPSRK SGSRKRNHSP SFNSTIYEVI GKSQPKAQNP ARLSRKELEN FDVYSGGSGG GSGRVKFSRS ADAPAYKQGQ NQLYNELNLG RREEYDVLDK RRGRDPEMGG KPRRKNPQEG LYNELQKDKM AEAYSEIGMK GERRRGKGHD GLYQGLSTAT KDTYDALHMQ ALPPR
【０１０２】
イヌＣＤ１６＃１７（ｐＣＤＨ−ｃａＣＤ１６）ペプチド配列（配列番号２５）
MWQLVSSTAL LLLVSAGTQA DVPKAVVVLE PKWNRVLTMD SVTLKCQGDH LLRDNYTWLH NGRPISNQIS TYIIKNASIK NSGEYRCQTD QSKLSDPVQL EVHTGWLLLQ VPRLVFQEGE LIQLKCHSWK NTPVRNVQYF QNGRGKKFFY NNSEYHIPAA TSEHNGSYFC RGIIGKKNES SEAVNIIIQG SSLPSTSLLL SHWPQIPFSL VMALLFAVDT GLYFAVQRDL RSSMGNLKNS KVIWSQGS
【０１０３】
イヌＣＤ６４＃１８（ｐＣＤＨ−ｃａＣＤ６４）ペプチド配列（配列番号２６）
MWLLTVLLLW VPAGAQTDPV KAVITLQPPW VSVFQEESVT LWCEGPHLPG DSSTQWFLNG TATQTLTPRY RIAAASVNDN GEYRCQTGLS VLSDPIQLGI HRDWLILQVS GRVFTEGEPL TLRCHGWNNK LVYNVLFYQN GTVLKFSPQN SEFTILKTTL HHNGIYHCSA MGKHRYESAG VSITIKELFP APVLKASLSS PILEGHVVNL SCETKLLLQR PGLQLYFSFY MGSKTLLSRN TSSEYQILTA KKEDSGLYWC EATTEDGNVV KRSPELELQV VGPQTLTPVW FHVLFYVAMG MIFLVDTIFC MIIHKELQRK KKWNLEISLY SGLEKRVDSY LQKERDLEEP KYQELEQLQE KTPQKPPEGE QQ
【０１０４】
イヌＣＤ６４ｓｐ＃１９（ｐＣＤＨ−ｃａＣＤ６４ｓｐ）ペプチド配列（配列番号２７）
MWLLTVLLLW VPAGAQTDWL ILQVSGRVFT EGEPLTLRCH GWNNKLVYNV LFYQNGTVLK FSPQNSEFTI LKTTLHHNGI YHCSAMGKHR YESAGVSITI KELFPAPVLK ASLSSPILEG HVVNLSCETK LLLQRPGLQL YFSFYMGSKT LLSRNTSSEY QILTAKKEDS GLYWCEATTE DGNVVKRSPE LELQVVGPQT LTPVWFHVLF YVAMGMIFLV DTIFCMIIHK ELQRKKKWNL EISLYSGLEK RVDSYLQKER DLEEPKYQEL EQLQEKTPQK PPEGEQQ
【図１】
2021500923.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021500923.tif 000031