(57)【要約】本発明は、ヒトACC2プレmRNAの「エキソン12」の5'スプライス部位を標的とするペプチド核酸誘導体を提供する。本発明におけるペプチド核酸誘導体は、細胞内でヒトACC2 mRNAのスプライスバリアントを強力に誘導し、ヒトACC2タンパク質に関連する皮膚加齢の状態または障害を処置するのに非常に有用である。2021534146.tif 000042
2021534146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iで表されるペプチド核酸（PNA）誘導体、またはその薬学的に許容される塩：
2021534146.tif 000032
式中、
nは10〜21の整数であり；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAにおける
2021534146.tif 000033
の18マープレmRNA配列と少なくとも10マーの相補的重複を有し；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAに対して完全に相補的であるか、またはヒトACC2プレmRNAに対して1もしくは2個のミスマッチで部分的に相補的であり；
S1、S2、・・・、Sn-1、Sn、T1、T2、・・・、Tn-1、およびTnは独立に、ヒドリド、デューテリド、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール基を表し；
XおよびYは独立に、ヒドリド、デューテリド、ホルミル［H-C(=O)-］、アミノカルボニル［NH2-C(=O)-］、アミノチオカルボニル［NH2-C(=S)-］、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換アルキルオキシ、置換もしくは無置換アリールオキシ、置換もしくは無置換アルキルアシル、置換もしくは無置換アリールアシル、置換もしくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換もしくは無置換アリールオキシカルボニル、置換もしくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換もしくは無置換アリールアミノカルボニル、置換もしくは無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは無置換アリールアミノチオカルボニル、置換もしくは無置換アルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは無置換アリールオキシチオカルボニル、置換もしくは無置換アルキルスルホニル、置換もしくは無置換アリールスルホニル、置換もしくは無置換アルキルホスホニル、または置換もしくは無置換アリールホスホニル基を表し；
Zはヒドリド、デューテリド、ヒドロキシ、置換もしくは無置換アルキルオキシ、置換もしくは無置換アリールオキシ、置換もしくは無置換アミノ、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール基を表し；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnは独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から選択され；かつ
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnの少なくとも4つは独立に、核酸塩基部分に共有結合した置換または無置換アミノ基を有する非天然核酸塩基から選択される。
【請求項２】
請求項1記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的塩：
式中、
nは10〜21の整数であり；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAにおける
2021534146.tif 000034
の18マープレmRNA配列と少なくとも10マーの相補的重複を有し；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAに対して完全に相補的であるか、またはヒトACC2プレmRNAに対して1もしくは2個のミスマッチで部分的に相補的であり；
S1、S2、・・・、Sn-1、Sn、T1、T2、・・・、Tn-1、およびTnは独立に、ヒドリド、デューテリド基を表し；
XおよびYは独立に、ヒドリド、デューテリド、ホルミル［H-C(=O)-］、アミノカルボニル［NH2-C(=O)-］、アミノチオカルボニル［NH2-C(=S)-］、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換アルキルオキシ、置換もしくは無置換アリールオキシ、置換もしくは無置換アルキルアシル、置換もしくは無置換アリールアシル、置換もしくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換もしくは無置換アリールオキシカルボニル、置換もしくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換もしくは無置換アリールアミノカルボニル、置換もしくは無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは無置換アリールアミノチオカルボニル、置換もしくは無置換アルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは無置換アリールオキシチオカルボニル、置換もしくは無置換アルキルスルホニル、置換もしくは無置換アリールスルホニル、置換もしくは無置換アルキルホスホニル、または置換もしくは無置換アリールホスホニル基を表し；
Zはヒドリド、ヒドロキシ、置換もしくは無置換アルキルオキシ、置換もしくは無置換アリールオキシ、または置換もしくは無置換アミノ基を表し；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnは独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から選択され；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnの少なくとも4つは独立に、式II、式III、または式IVで表される非天然核酸塩基から選択され：
2021534146.tif 000035
式中、
R1、R2、R3、R4、R5およびR6は独立に、ヒドリドおよび置換または無置換アルキル基から選択され；
L1、L2およびL3は、塩基性アミノ基を核酸塩基部分に共有結合する、式Vで表される共有結合リンカーであり：
2021534146.tif 000036
式中、
Q1およびQmは置換または無置換メチレン（-CH2-）基であり、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結されており；
Q2、Q3、・・・、およびQm-1は独立に、置換または無置換メチレン、酸素（-O-）、硫黄（-S-）、および置換または無置換アミノ基［-N(H)-、または-N(置換基)-］から選択され；かつ、
mは1〜15の整数である。
【請求項３】
請求項2記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的塩：
式中、
nは11〜16の整数であり；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAにおける
2021534146.tif 000037
の18マープレmRNA配列と少なくとも10マーの相補的重複を有し；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAに対して完全に相補的であり；
S1、S2、・・・、Sn-1、Sn、T1、T2、・・・、Tn-1、およびTnはヒドリド基であり；
XおよびYは独立に、ヒドリド、置換もしくは無置換アルキルアシル、または置換もしくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表し；
Zは置換または無置換アミノ基を表し；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnは独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から選択され；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnの少なくとも5つは独立に、式II、式III、または式IVで表される非天然核酸塩基から選択され：
R1、R2、R3、R4、R5およびR6はヒドリド基であり；
Q1およびQmはメチレン基であり、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結されており；
Q2、Q3、・・・、およびQm-1は独立に、メチレンおよび酸素基から選択され；かつ、
mは1〜9の整数である。
【請求項４】
請求項3記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的塩：
式中、
nは11〜16の整数であり；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAにおける
2021534146.tif 000038
の18マープレmRNA配列と少なくとも10マーの相補的重複を有し；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAに対して完全に相補的であり；
S1、S2、・・・、Sn-1、Sn、T1、T2、・・・、Tn-1、およびTnはヒドリド基であり；
Xはヒドリド基であり；
Yは置換または無置換アルキルオキシカルボニル基を表し；
Zは置換または無置換アミノ基を表し；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnは独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から選択され；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnの少なくとも5つは独立に、式II、式III、または式IVで表される非天然核酸塩基から選択され：
R1、R2、R3、R4、R5およびR6はヒドリド基であり；
L1は-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-、または-CH2-O-(CH2)5-を表し；かつ、
L2およびL3は独立に、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、および-(CH2)8-から選択される。
【請求項５】
以下に示すペプチド核酸誘導体の群から選択される、請求項4記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩：
2021534146.tif 000039
ここで、
A、G、T、およびCは、それぞれアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの天然核酸塩基を有するペプチド核酸のモノマーであり；
C(pOq)、A(p)、およびG(p)は、それぞれ式VI、式VII、および式VIIIで表される非天然核酸塩基を有するペプチド核酸のモノマーであり；
2021534146.tif 000040
式中、
pおよびqは整数であり、
2021534146.tif 000041
において、pは1または5であり、かつqは2であり；かつ
「Fethoc-」は「[2-(9-フルオレニル)エチル-1-オキシ]カルボニル」の略称である。
【請求項６】
ヒトACC2遺伝子転写に関連する状態または障害を処置する方法であって、請求項1記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩の、対象への投与を含む、方法。
【請求項７】
皮膚加齢を処置する方法であって、請求項1記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩の、対象への投与を含む、方法。
【請求項８】
ヒトACC2遺伝子転写に関連する状態または障害を処置するための薬学的組成物であって、請求項1記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩を含む、組成物。
【請求項９】
ヒトACC2遺伝子転写に関連する状態または障害を処置するための化粧用組成物であって、請求項1記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩を含む、組成物。
【請求項１０】
皮膚加齢を処置するための薬学的組成物であって、請求項1記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩を含む、組成物。
【請求項１１】
皮膚加齢を処置するための化粧用組成物であって、請求項1記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容される塩を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセチルCoAカルボキシラーゼ2によって媒介される皮膚加齢の改善のための、ヒトアセチルCoAカルボキシラーゼ2プレmRNAを相補的に標的とするペプチド核酸誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢の徴候は皮膚で最も明らかであるため、皮膚加齢はかなり注目されてきた。皮膚加齢は20代半ばから後半に始まり、皮膚のコラーゲンおよびエラスチンが減少して、乾燥した弾力性の低い肌やしわさえも生じる。肥満は、過剰に堆積した体内脂肪による血液循環の低下によって引き起こされる炎症反応の一種である。血管上の体内脂肪は、血液循環および様々なホルモンの分泌を阻害して、皮膚を含む全身の加齢を促進する。その意味で、健康で美しい皮膚を得るために、肥満に関連する健康状態および疾患を監視しなければならない。
【０００３】
脂肪酸の生合成および分解は、体の要求を満たすために生理学的状態に応じてうまく調節される。アセチルCoAカルボキシラーゼ（ACC）は、脂肪酸生合成の第1段階における律速段階であるアセチルCoAのカルボキシル化を触媒してマロニルCoAを生成するビオチン依存性酵素である。
2021534146.tif 000003
【０００４】
ACCは、2つのやり方で脂肪酸の代謝を制御する機能を有する。ACCの最も重要な機能は、脂肪酸生合成のための新しい構築ブロックとしてマロニルCoA基質をその活性状態で提供することである。もう一つの機能は、脂肪酸のアシル基移動の阻害を通じてミトコンドリア内の脂肪酸の酸化を阻止することである。
【０００５】
ヒトにおいて、ACCの2つの主なアイソフォーム、アセチルCoAカルボキシラーゼ1（ACC1、ACACA、アセチルCoAカルボキシラーゼα）およびアセチルCoAカルボキシラーゼ2（ACC2、ACACB、アセチルCoAカルボキシラーゼβ）が発現される。2つのACCは互いに異なる機能を有し、すなわち、ACC1は脂肪酸合成の調節を維持し、その一方でACC2は主に脂肪酸酸化を調節する。
【０００６】
脂肪酸の生合成および酸化を調節するACCは、細菌ACCとヒトACCとの構造の違いを利用する新しい抗生物質、糖尿病および肥満の代謝症候群、癌細胞の脂質生成関連成長阻害剤などの、多くの疾患の処置のための潜在的標的である［Recent Patents Cardiovasc. Drug Discov. Vol 2, 162-80 (2007); PLoS One Vol 12, e0169566 (2017)］。
【０００７】
その中でも、ACC2-/-変異マウスに関する研究が多くの注目を集めており、ACC2欠損マウスは、脂肪酸酸化速度が高いために脂肪レベルが低く、より多くの食物消費にもかかわらず体重が減少または維持され、かつ糖尿病のリスクが低減した［Science Vol 291, 2613-6 (2001)］。これらの結果は、ACC2阻害剤が肥満および糖尿病に対して治療効果を有する可能性を示唆した。加えて、皮膚に対するこの阻害剤の処置には、脂肪除去ならびに最終的には皮膚の肥満の予防および皮膚加齢の改善の効果が期待され得る。
【０００８】
皮膚加齢過程における肥満の重要性を考慮して、皮膚加齢状態を改善および予防し得る、ACC2阻害剤またはACC2発現のメカニズムに基づく薬剤もしくは化粧品を開発することが非常に興味深く、必要である。
【０００９】
プレmRNA：遺伝情報はDNA（2-デオキシリボース核酸）上に担持される。DNAは核内で転写されてプレmRNA（プレメッセンジャーリボ核酸）を生成する。哺乳動物のプレmRNAは通常、エキソンおよびイントロンからなり、エキソンおよびイントロンは以下に図示するとおり互いに相互接続される。エキソンおよびイントロンは、以下の図に例示するとおりに番号付けされる。
［プレmRNAの構造］
2021534146.tif 000004
【００１０】
プレmRNAのスプライシング：プレmRNAは、以下の図に概略を示す「スプライシング」と総称される一連の複雑な反応によって、イントロンの欠失後にmRNAへと処理される［Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)］。
2021534146.tif 000005
【００１１】
スプライシングは、プレmRNAとスプライシングアダプター因子との間に「スプライセオソームE複合体」（すなわち、初期スプライセオソーム複合体）を形成することによって開始される。「スプライセオソームE複合体」において、U1はエキソンNとイントロンNとの接合部に結合し、U2AF35はイントロンNとエキソン（N+1）との接合部に結合する。したがって、エキソン/イントロンまたはイントロン/エキソンの接合部は、初期スプライセオソーム複合体の形成に不可欠である。「スプライセオソームE複合体」は、U2とのさらなる複合体形成後に「スプライセオソームA複合体」に進化する。「スプライセオソームA複合体」は、一連の複雑な反応を起こしてイントロンを欠失または切り出し、隣接するエキソンにつながる。
【００１２】
リボソームタンパク質合成：タンパク質はDNA（2-デオキシリボース核酸）によってコードされる。細胞刺激に反応して、または自然に、DNAは、核内で転写されてプレmRNA（プレメッセンジャーリボ核酸）を生成する。プレmRNAのイントロンは、酵素的に切り出されてmRNA（メッセンジャーリボ核酸）を生成し、これは次いで細胞質に移行する。細胞質内で、リボソームと呼ばれる翻訳機構の複合体がmRNAに結合し、コードされた遺伝情報をmRNAに沿ってスキャンして、タンパク質合成を行う［Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)］。
【００１３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）：配列特異的な様式で（すなわち、相補的に）DNA、mRNAおよびプレmRNAを含む核酸に結合するオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）と呼ばれる。
【００１４】
例えば、細胞質内でASOがmRNAに緊密に結合すると、ASOはmRNAに沿ってのリボソームタンパク質合成を阻害することができるであろう。ASOは、その標的タンパク質のリボソームタンパク質合成を阻害するために細胞質内に存在する必要がある。
【００１５】
スプライシングのアンチセンス阻害：核内でASOがプレmRNAに緊密に結合すると、ASOはプレmRNAのmRNAへのスプライシングを阻害または調節することができるであろう。ASOは、プレmRNAのmRNAへのスプライシングを阻害または調節するために核内に存在する必要がある。そのようなスプライシングのアンチセンス阻害は、ASOが標的とするエキソンを欠いたmRNAを生成する。そのようなmRNAは「スプライスバリアント」と呼ばれ、全長mRNAによってコードされるタンパク質よりも小さいタンパク質をコードする。
【００１６】
原理的には、「スプライセオソームE複合体」の形成を阻害することにより、スプライシングを中断することができる。ASOが（5'→3'）エキソン-イントロンの接合部、すなわち「5'スプライス部位」に緊密に結合すると、ASOはプレmRNAとU1因子との間の複合体形成を阻止し、したがって「スプライセオソームE複合体」の形成を阻止する。同様に、ASOが（5'→3'）イントロン-エキソンの接合部、すなわち「3'スプライス部位」に緊密に結合すると、「スプライセオソームE複合体」は形成され得ない。
【００１７】
3'スプライス部位および5'スプライス部位を、以下の図に概略を示す。
2021534146.tif 000006
【００１８】
非天然オリゴヌクレオチド：DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドは、内因性ヌクレアーゼによる分解を受けやすく、治療的有用性が制限される。今日までに、多くの種類の非天然（天然に存在しない）オリゴヌクレオチドが開発され、集中的に研究されてきた［Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)］。それらのいくつかは、DNAおよびRNAと比較して長期の代謝安定性を示す。以下に示すのは、代表的な非天然オリゴヌクレオチドのいくつかの化学構造である。このようなオリゴヌクレオチドは予想どおり、DNAまたはRNAと同様に相補的核酸に結合する。
2021534146.tif 000007
【００１９】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド：ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（PTO）は、モノマー1個あたり骨格のホスフェート酸素原子の1つが硫黄原子で置き換えられたDNA類縁体である。このような小さい構造変化により、PTOはヌクレアーゼによる分解に比較的抵抗性となった［Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)］。
【００２０】
PTOおよびDNAの骨格の構造的類似性を反映して、これらはいずれもほとんどの哺乳動物細胞型において細胞膜透過性が不良である。しかし、DNAの輸送体を大量に発現する一部の細胞に対して、DNAおよびPTOが良好な細胞透過性を示すこともある。全身投与されたPTOは、肝臓および腎臓に分布しやすいことが公知である［Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)］。
【００２１】
インビトロでのPTOの細胞透過を促進するために、リポフェクションが一般的に実施されている。しかし、リポフェクションは細胞膜を物理的に変化させ、細胞毒性を引き起こし、したがって、長期間のインビボでの治療的使用には理想的ではないであろう。
【００２２】
過去30年にわたり、アンチセンスPTOおよびPTOのバリアントは、癌、免疫障害、代謝疾患などを処置するために臨床評価されてきた［Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002);  Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)］。このようなアンチセンス薬物候補の多くは、一部にはPTOの細胞透過性が悪いためにうまく開発されてこなかった。細胞透過性不良を克服するために、PTOは治療活性のために高用量で投与する必要がある。しかし、PTOは、凝固時間の増大、補体活性化、尿細管性腎症、クッパー細胞活性化、および免疫刺激、例えば脾腫、リンパ組織過形成、単核細胞浸潤を含む、用量制限毒性と関連することが公知である［Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)］。
【００２３】
多くのアンチセンスPTOは、肝臓または腎臓が著しく寄与する疾患に対し、相応の臨床活性を示すことが判明している。ミポメルセンは、LDLコレステロール輸送に関与するタンパク質であるapoB-100の合成を阻害するPTO類縁体である。ミポメルセンは、おそらくは肝臓への優先的な分布により、アテローム性動脈硬化症患者において相応の臨床活性を示した［Circulation vol 118(7), 743-753 (2008)］。ISIS-113715は、タンパク質チロシンホスファターゼ1B（PTP1B）の合成を阻害するPTOアンチセンス類縁体であり、II型糖尿病患者において治療活性を示すことが判明した。［Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)］。
【００２４】
ロックド核酸：ロックド核酸（LNA）では、RNAの骨格リボース環は、構造的に制約されて、RNAまたはDNAに対する結合親和性を増大させる。したがって、LNAは、高親和性DNAまたはRNA類縁体であるとみなされ得る［Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)］。
【００２５】
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド：ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（PMO）では、DNAの骨格ホスフェートおよび2-デオキシリボースがそれぞれホスホロアミデートおよびモルホリンで置き換えられている［Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)］。DNA骨格は負に帯電しているが、PMO骨格は帯電していない。したがって、PMOとmRNAとの間の結合には骨格間の静電反発がなく、DNAとmRNAとの間の結合よりも強い傾向がある。PMOはDNAとは構造的に大きく異なるため、PMOはDNAを認識する肝輸送体によって認識されない。PMOはPTOとは異なる組織分布を示し得るが、PMOは、PTOと同様に、細胞膜を容易に透過しない。
【００２６】
ペプチド核酸：ペプチド核酸（PNA）は、単位骨格としてN-(2-アミノエチル)グリシンを有するポリペプチドであり、Dr. Nielsenらによって発見された［Science vol 254, 1497-1500 (1991)］。PNAの化学構造および略称を以下の図に示す。DNAおよびRNAと同様に、PNAも相補的核酸に選択的に結合する［Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)］。相補的核酸と結合する際に、PNAのN末端はDNAまたはRNAの「5'末端」と等価とみなされ、PNAのC末端はDNAまたはRNAの「3'末端」と等価とみなされる。
2021534146.tif 000008
PMOと同様に、PNA骨格は帯電していない。したがって、PNAとRNAとの間の結合はDNAとRNAとの間の結合よりも強い傾向がある。PNAはDNAとは化学構造が著しく異なるため、PNAはDNAを認識する肝輸送体によって認識されず、DNAまたはPTOとは異なる組織分布特性を示すであろう。しかし、PNAも哺乳動物細胞膜の透過性が悪い［Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280 (2003)］。
【００２７】
PNAの膜透過性を改善するための修飾核酸塩基：PNAは、カチオン性脂質またはその等価物が共有結合した修飾核酸塩基を導入することによって、哺乳動物細胞膜に対し高度に透過性となった。このような修飾核酸塩基の化学構造を以下に示す。このようなシトシン、アデニン、およびグアニンの修飾核酸塩基は予想どおり、それぞれグアニン、チミン、およびシトシンと相補的にハイブリダイズすることが判明した［PCT出願番号PCT/KR2009/001256；EP2268607；US8680253］。
2021534146.tif 000009
【００２８】
PNA上へのこのような修飾核酸塩基の組み込みは、リポフェクションの場合と似ている。リポフェクションにより、リン酸骨格を有するオリゴヌクレオチド分子はリポフェクタミンなどのカチオン性脂質分子で包まれ、そのようなリポフェクタミン/オリゴヌクレオチド複合体は裸のオリゴヌクレオチド分子と比べて容易に膜を透過する傾向がある。
【００２９】
良好な膜透過性に加えて、これらのPNA誘導体は相補的核酸に対して非常に強い親和性を有することが判明した。例えば、11〜13マーPNA誘導体上に4〜5個の修飾核酸塩基を導入すると、相補的DNAとの二本鎖形成において容易に20℃以上のTm値上昇が得られる。このようなPNA誘導体は、単一塩基ミスマッチに対して非常に感受性が高い。単一塩基ミスマッチは、修飾塩基の種類およびPNA配列に応じて11〜22℃のTm低下をきたした。
【００３０】
低分子干渉RNA（siRNA）：低分子干渉RNA（siRNA）は、20〜25塩基対の二本鎖RNAを指す［Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)］。siRNAのアンチセンス鎖は、タンパク質とどうにか相互作用して「RNA誘導サイレンシング複合体」（RISC）を形成する。次いで、RISCは、siRNAのアンチセンス鎖と相補的なmRNAの一定の部分に結合する。RISCと複合体形成したmRNAは切断を受ける。したがって、siRNAは、その標的mRNAの切断を触媒的に誘導し、その結果、mRNAによるタンパク質発現を阻害する。RISCは、その標的mRNA内の完全な相補的配列に必ずしも結合するとは限らず、これはsiRNA療法のオフターゲット効果に関する懸念を引き起こす。DNAまたはRNA骨格を有するオリゴヌクレオチドの他のクラスと同様に、siRNAは細胞透過性が低く、したがって良好な膜透過性を有するように適切に製剤化または化学修飾しない限り、インビトロまたはインビボでの治療活性が低くなる傾向にある。
【００３１】
ACC siRNA：ACC1 siRNAおよびACC2 siRNAの混合物は、それぞれ20nMでのリポフェクション後に、神経膠芽腫癌細胞株におけるACC1およびACC2 mRNAおよびタンパク質の発現を阻害すると報告された［PLoS One Vol 12, e0169566 (2017)］。これらの結果は、ACC関連の脂肪産生（lipogenic）癌転移の研究に有用であり得る。
【発明の概要】
【００３２】
発明の開示
解決すべき課題
肥満は皮膚加齢に重大な影響を与えるため、健康で美しい皮膚を得るために、健康状態および肥満に関連する疾患を監視しなければならない。
【００３３】
肥満に関するACC2-/-変異マウスでの研究は、多くの注目を集めている。加えて、ACC siRNAは癌細胞株中のACC mRNAおよびタンパク質の発現を阻害すると報告されたが、siRNAは、皮膚への送達において問題があるのみならず、皮膚の抗加齢剤として製造および開発するには高価すぎる。したがって、ACC2発現のメカニズムに基づいて薬剤または化粧品を開発する必要があり、これらは皮膚加齢状態を改善し、予防する可能性がある。
【００３４】
課題を解決するための手段
本発明は、式Iで表されるペプチド核酸（PNA）誘導体、またはその薬学的に許容される塩を提供する：
2021534146.tif 000010
式中、
nは10〜21の整数であり；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAにおける
2021534146.tif 000011
の18マープレmRNA配列と少なくとも10マーの相補的重複を有し；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAに対して完全に相補的であるか、またはヒトACC2プレmRNAに対して1もしくは2個のミスマッチで部分的に相補的であり；
S1、S2、・・・、Sn-1、Sn、T1、T2、・・・、Tn-1、およびTnは独立に、ヒドリド、デューテリド、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール基を表し；
XおよびYは独立に、ヒドリド、デューテリド、ホルミル［H-C(=O)-］、アミノカルボニル［NH2-C(=O)-］、アミノチオカルボニル［NH2-C(=S)-］、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換アルキルオキシ、置換もしくは無置換アリールオキシ、置換もしくは無置換アルキルアシル、置換もしくは無置換アリールアシル、置換もしくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換もしくは無置換アリールオキシカルボニル、置換もしくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換もしくは無置換アリールアミノカルボニル、置換もしくは無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは無置換アリールアミノチオカルボニル、置換もしくは無置換アルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは無置換アリールオキシチオカルボニル、置換もしくは無置換アルキルスルホニル、置換もしくは無置換アリールスルホニル、置換もしくは無置換アルキルホスホニル、または置換もしくは無置換アリールホスホニル基を表し；
Zはヒドリド、デューテリド、ヒドロキシ、置換もしくは無置換アルキルオキシ、置換もしくは無置換アリールオキシ、置換もしくは無置換アミノ、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール基を表し；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnは独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から選択され；かつ
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnの少なくとも4つは独立に、核酸塩基部分に共有結合した置換または無置換アミノ基を有する非天然核酸塩基から選択される。
【００３５】
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAにおいて「エキソン12」のスキッピングを誘導し、「エキソン12」を欠くヒトACC2 mRNAスプライスバリアントを生じ、したがってヒトACC2プレmRNAを転写する遺伝子の機能的活性を阻害するのに有用である。
【００３６】
「nが10〜21の整数である」状態は文字通り、nが11、12、13、14、15、16、17、18、19、および20の整数の群から選択可能な整数であることを意味する。
【００３７】
式IのPNA誘導体中の天然または非天然核酸塩基の化学構造を、図1a〜1cに例示する。本発明の天然（すなわち自然発生の）または非天然（自然に発生しない）核酸塩基は、図1a〜1cに提供する核酸塩基を含むが、これらに限定されない。このような非天然核酸塩基の提供は、許容される核酸塩基の多様性を例示するためであり、したがって本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００３８】
式IのPNA誘導体を記載するために採用された置換基を、図2a〜2eに例示する。図2aは、置換または無置換アルキル基の例を提供する。置換または無置換アルキルアシルおよび置換または無置換アリールアシル基を図2bに例示する。図2cは、置換または無置換アルキルアミノ、置換または無置換アリールアミノ、置換または無置換アリール、置換または無置換アルキルスルホニルまたはアリールスルホニル、および置換または無置換アルキルホスホニルまたはアリールホスホニル基の例を示す。図2dは、置換または無置換アルキルオキシカルボニルまたはアリールオキシカルボニル、置換または無置換アルキルアミノカルボニルまたはアリールアミノカルボニル基の例を提供する。図2eでは、置換または無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換または無置換アリールアミノチオカルボニル、置換または無置換アルキルオキシチオカルボニル、および置換または無置換アリールオキシチオカルボニル基の例を提供する。このような例示的置換基の提供は、許容される置換基の多様性を例示するためであり、したがって本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。当業者であれば、オリゴヌクレオチド配列は、N末端またはC末端の置換基よりも、標的プレmRNA配列へのオリゴヌクレオチドの配列特異的結合の優先因子であることを容易に理解するであろう。
【００３９】
式Iの化合物は、先行技術［PCT/KR2009/001256］に例示するとおり、相補的DNAに緊密に結合する。式IのPNA誘導体とその全長相補的DNAまたはRNAとの間の二本鎖のTm値は高すぎて水性緩衝液中で確実に決定することができない。式IのPNA化合物は、長さが短い相補的DNAと高いTm値を生じる。
【００４０】
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAの「エキソン12」の5'スプライス部位に相補的に結合する。［NCBI Reference Sequence: NG_046907］。
2021534146.tif 000012
の16マー配列は、ヒトACC2プレmRNAの「エキソン12」と「イントロン12」との接合部にまたがり、「エキソン12」からの8マーおよび「イントロン12」からの8マーからなる。したがって、16マープレmRNA配列は、慣習的に
2021534146.tif 000013
と表示してもよく、ここでエキソンおよびイントロンの配列はそれぞれ「大文字」および「小文字」で提供し、エキソン-イントロン接合部は「｜」で表す。プレmRNAの通常の表示は、ヒトACC2プレmRNAの「エキソン12」と「イントロン12」との接合部にまたがる
2021534146.tif 000014
の30マー配列でさらに示される。
【００４１】
式Iの化合物は、ヒトACC2遺伝子から転写されたヒトACC2プレmRNAの標的5'スプライス部位に緊密に結合し、「スプライセオソーム初期複合体」の形成を妨害して、「エキソン12」を欠く（エキソン12スキッピング）ACC2 mRNAスプライスバリアントを生じる。
【００４２】
強力なRNA親和性により、式Iの化合物は、PNA誘導体がACC2プレmRNA内の標的5'スプライス部位と1つまたは2つのミスマッチを有する場合でも、ACC2「エキソン12」のスキッピングを誘導することが可能となる。同様に、式IのPNA誘導体は、標的スプライス部位に1つまたは2つのSNP（一塩基多型）を有するACC2変異型プレmRNAにおいても、ACC2「エキソン12」のスキッピングを誘導し得る。
【００４３】
式Iの化合物は良好な細胞透過性を有し、先行技術［PCT/KR2009/001256］に例示するとおり、「裸」のオリゴヌクレオチドとして細胞内に容易に送達することができる。したがって、本発明の化合物は、ACC2プレmRNA内で「エキソン12」のスキッピングを誘導し、「裸」のオリゴヌクレオチドとしての式Iの化合物で処理した細胞において、ACC2「エキソン12」を欠くACC2 mRNAスプライスバリアントを生じる。式Iの化合物は、細胞内の標的エキソンのスキッピングを強力に誘導するために、細胞内に送達するためのいかなる手段または製剤化も必要としない。式Iの化合物は、「裸」のオリゴヌクレオチドとしての本発明の化合物によりフェムトモル以下の濃度で処理した細胞において、ACC2「エキソン12」のスキッピングを容易に誘導する。
【００４４】
良好な細胞または膜透過性により、式IのPNA誘導体を「裸」のオリゴヌクレオチドとして局所投与して、皮膚においてACC2「エキソン12」のスキッピングを誘導することができる。式Iの化合物は、意図する治療または生物活性のために標的組織への経皮送達を増大させるための製剤化を必要としない。通常、式Iの化合物は、水および共溶媒に溶解し、ピコモル以下の濃度で局所または経皮投与して、標的皮膚において所望の治療または生物活性を誘発する。本発明の化合物は、局所治療活性を誘発するために、大量にまたは侵襲的に製剤化する必要はない。それにもかかわらず、式IのPNA誘導体は、局所クリームまたはローションとして化粧用成分または補助剤と共に製剤化することができる。このような局所化粧用クリームまたはローションは、皮膚加齢を処置するのに有用であり得る。
【００４５】
本発明の化合物は、1aMから1nMを超えるまでの範囲の治療的または生物学的に有効な濃度で、対象に局所投与することができ、これは投与スケジュール、対象の状態または状況などに応じて変動し得る。
【００４６】
式IのPNA誘導体は、注射剤、鼻スプレー、経皮パッチなどを含むが、それらに限定されない、様々な製剤にすることができる。加えて、式IのPNA誘導体は、治療的有効な用量で対象に投与することができ、投与量は、適応症、投与経路、投与スケジュール、対象の状態または状況などに応じて多様化し得る。
【００４７】
式Iの化合物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、メタンスルホン酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸などを含むが、それらに限定されない、薬学的に許容される酸または塩基と組み合わせて用いてもよい。
【００４８】
式IのPNA誘導体またはその薬学的に許容される塩は、クエン酸、塩酸、酒石酸、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、炭酸水素ナトリウム、蒸留水、保存剤などを含むが、それらに限定されない、薬学的に許容される補助剤との組み合わせで、対象に投与することができる。
【００４９】
興味深いのは、式IのPNA誘導体、またはその薬学的に許容される塩である：
式中、
nは10〜21の整数であり；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAにおける
2021534146.tif 000015
の18マープレmRNA配列と少なくとも10マーの相補的重複を有し；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAに対して完全に相補的であるか、またはヒトACC2プレmRNAに対して1もしくは2個のミスマッチで部分的に相補的であり；
S1、S2、・・・、Sn-1、Sn、T1、T2、・・・、Tn-1、およびTnは独立に、ヒドリド、デューテリド基を表し；
XおよびYは独立に、ヒドリド、デューテリド、ホルミル［H-C(=O)-］、アミノカルボニル［NH2-C(=O)-］、アミノチオカルボニル［NH2-C(=S)-］、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換アルキルオキシ、置換もしくは無置換アリールオキシ、置換もしくは無置換アルキルアシル、置換もしくは無置換アリールアシル、置換もしくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換もしくは無置換アリールオキシカルボニル、置換もしくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換もしくは無置換アリールアミノカルボニル、置換もしくは無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは無置換アリールアミノチオカルボニル、置換もしくは無置換アルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは無置換アリールオキシチオカルボニル、置換もしくは無置換アルキルスルホニル、置換もしくは無置換アリールスルホニル、置換もしくは無置換アルキルホスホニル、または置換もしくは無置換アリールホスホニル基を表し；
Zはヒドリド、ヒドロキシ、置換もしくは無置換アルキルオキシ、置換もしくは無置換アリールオキシ、または置換もしくは無置換アミノ基を表し；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnは独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から選択され；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnの少なくとも4つは独立に、式II、式III、または式IVで表される非天然核酸塩基から選択され：
2021534146.tif 000016
式中、
R1、R2、R3、R4、R5およびR6は独立に、ヒドリドおよび置換または無置換アルキル基から選択され；
L1、L2およびL3は、塩基性アミノ基を核酸塩基部分に共有結合する、式Vで表される共有結合リンカーであり：
2021534146.tif 000017
式中、
Q1およびQmは置換または無置換メチレン（-CH2-）基であり、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結されており；
Q2、Q3、・・・、およびQm-1は独立に、置換または無置換メチレン、酸素（-O-）、硫黄（-S-）、および置換または無置換アミノ基［-N(H)-、または-N(置換基)-］から選択され；かつ、
mは1〜15の整数である。
【００５０】
非常に興味深いのは、式IのPNAオリゴマー、またはその薬学的に許容される塩である：
式中、
nは11〜16の整数であり；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAにおける
2021534146.tif 000018
の18マープレmRNA配列と少なくとも10マーの相補的重複を有し；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAに対して完全に相補的であり；
S1、S2、・・・、Sn-1、Sn、T1、T2、・・・、Tn-1、およびTnはヒドリド基であり；
XおよびYは独立に、ヒドリド、置換もしくは無置換アルキルアシル、または置換もしくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表し；
Zは置換または無置換アミノ基を表し；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnは独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から選択され；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnの少なくとも5つは独立に、式II、式III、または式IVで表される非天然核酸塩基から選択され：
R1、R2、R3、R4、R5およびR6はヒドリド基であり；
Q1およびQmはメチレン基であり、かつQmは塩基性アミノ基に直接連結されており；
Q2、Q3、・・・、およびQm-1は独立に、メチレンおよび酸素基から選択され；かつ、
mは1〜9の整数である。
【００５１】
さらに非常に興味深いのは、式IのPNA誘導体、またはその薬学的に許容される塩である：
式中、
nは11〜16の整数であり；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAにおける
2021534146.tif 000019
の18マープレmRNA配列と少なくとも10マーの相補的重複を有し；
式Iの化合物は、ヒトACC2プレmRNAに対して完全に相補的であり；
S1、S2、・・・、Sn-1、Sn、T1、T2、・・・、Tn-1、およびTnはヒドリド基であり；
Xはヒドリド基であり；
Yは置換または無置換アルキルオキシカルボニル基を表し；
Zは置換または無置換アミノ基を表し；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnは独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から選択され；
B1、B2、・・・、Bn-1、およびBnの少なくとも5つは独立に、式II、式III、または式IVで表される非天然核酸塩基から選択され：
R1、R2、R3、R4、R5およびR6はヒドリド基であり；
L1は-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-、または-CH2-O-(CH2)5-を表し；かつ、
L2およびL3は独立に、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、および-(CH2)8-から選択される。
【００５２】
特に興味深いのは、以下に示す化合物の群から選択される式IのPNA誘導体（以下、それぞれASO1、2、3、4、5および6と呼ぶ）、またはその薬学的に許容される塩である：
2021534146.tif 000020
ここで、
A、G、T、およびCは、それぞれアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの天然核酸塩基を有するPNAモノマーであり；
C(pOq)、A(p)、およびG(p)は、それぞれ式VI、式VII、および式VIIIで表される非天然核酸塩基を有するPNAモノマーであり；
2021534146.tif 000021
式中、
pおよびqは整数であり、例えば、ASO4の場合、pは1または5であり、かつqは2であり；かつ
「Fethoc-」は「[2-(9-フルオレニル)エチル-1-オキシ]カルボニル」の略称であり、かつ「-NH2」は無置換「-アミノ」基の略称である。
【００５３】
図3は、A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、およびG(p)と略記したPNAモノマーの化学構造をまとめて明確に提供する。先行技術［PCT/KR2009/001256］において論じるとおり、C(pOq)は「グアニン」に対するそのハイブリダイゼーションにより、「修飾シトシン」PNAモノマーとみなされる。A(p)は「チミン」に対するそのハイブリダイゼーションにより、「修飾アデニン」PNAモノマーとみなされ、G(p)は「シトシン」に対するそのハイブリダイゼーションにより、「修飾グアニン」PNAモノマーとみなされる。加えて、このようなPNA誘導体に対して使用される略称を例示するために、図4にASO1「(N→C) CTG(6)-ACG(6)-AA(5)A-TG(6)G-C(1O2)C-NH2」の化学構造を示す。
【００５４】
ASO1は、プレmRNAへの相補的結合について「(5'→3') CTG-ACG-AAA-TGG-CC」のDNA配列と等価である。14マーPNAは、ヒトACC2プレmRNAにおける「エクソン12」と「イントロン12」との接合部にまたがる
2021534146.tif 000022
の30マーRNA配列内に「太字」および「下線付き」で記される14マー配列と14マーの相補的重複を有する。
【００５５】
いくつかの態様において、本発明は、対象のヒトACC2遺伝子転写に関連する状態または障害を処置する方法であって、対象に本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容される塩を投与する段階を含む方法を提供する。
【００５６】
いくつかの態様において、本発明は、対象の皮膚加齢を処置する方法であって、対象に本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容される塩を投与する段階を含む方法を提供する。
【００５７】
いくつかの態様において、本発明は、ヒトACC2遺伝子転写に関連する状態または障害を処置するための薬学的組成物であって、本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容される塩を含む組成物を提供する。
【００５８】
いくつかの態様において、本発明は、ヒトACC2遺伝子転写に関連する状態または障害を処置するための化粧用組成物であって、本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容される塩を含む組成物を提供する。
【００５９】
いくつかの態様において、本発明は、皮膚加齢を処置するための薬学的組成物であって、本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容される塩を含む組成物を提供する。
【００６０】
いくつかの態様において、本発明は、皮膚加齢を処置するための化粧用組成物であって、本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容される塩を含む組成物を提供する。
【００６１】
発明の効果
ヒトACC2遺伝子転写に関連する状態または障害は、式IのPNA誘導体またはその薬学的に許容される塩を投与することによって処置することができる。
【００６２】
皮膚加齢は、式IのPNA誘導体またはその薬学的に許容される塩を投与することによって処置することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１Ａ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な天然または非天然（修飾）核酸塩基の例を示す。
【図１Ｂ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な天然または非天然（修飾）核酸塩基の例を示す。
【図１Ｃ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な天然または非天然（修飾）核酸塩基の例を示す。
【図２Ａ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な置換基の例を示す。
【図２Ｂ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な置換基の例を示す。
【図２Ｃ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な置換基の例を示す。
【図２Ｄ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な置換基の例を示す。
【図２Ｅ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な置換基の例を示す。
【図３】天然または修飾核酸塩基を有するPNAモノマーの化学構造を示す。
【図４】「ASO1」の化学構造を示す。
【図５】本発明のPNA誘導体を合成するために用いるFmoc-PNAモノマーの化学構造を示す。
【図６Ａ】HPLC精製の前の「ASO1」のC18逆相HPLCクロマトグラムを示す。
【図６Ｂ】HPLC精製の後の「ASO1」のC18逆相HPLCクロマトグラムを示す。
【図７】C18-逆相分取HPLCによって精製した「ASO1」のESI-TOF質量スペクトルを示す。
【図８】C2C12における「ASO1」によるACC2 mRNAのエキソンスキッピングを示す。
【図９】C2C12における「ASO1」によるACC2 mRNAレベルの阻害を示す。
【図１０】C2C12における「ASO6」によるACC2 mRNAレベルの阻害を示す。
【図１１】C2C12における「ASO5」によるACC2 mRNAレベルの阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
発明を実施するための最良の形態
PNAオリゴマーの調製のための一般手順
PNAオリゴマーは、先行技術［US6,133,444；WO96/40685］で開示した方法に従い、わずかであるが、相応の改変を伴って、Fmoc化学に基づく固相ペプチド合成（SPPS）により合成した。Fmocは{(9-フルオレニル)メチルオキシ}カルボニルである。本研究で用いた固体支持体は、PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canada)から購入したH-Rink Amide-ChemMatrixであった。修飾核酸塩基を有するFmoc-PNAモノマーは、先行技術［PCT/KR 2009/001256］に記載のとおり、またはわずかな改変を伴って合成した。このような修飾核酸塩基を有するFmoc-PNAモノマーおよび天然核酸塩基を有するFmoc-PNAモノマーを用いて、本発明のPNA誘導体を合成した。PNAオリゴマーは、C18逆相HPLC（0.1％TFAを含む水/アセトニトリルまたは水/メタノール）により精製し、ESI/TOF/MSを含む質量分析によって特徴付けた。
【００６５】
スキーム1は、本研究のSPPSで採用した典型的なモノマー伸長サイクルを示しており、合成の詳細は以下に示す。しかし、当業者には、このようなSPPS反応を自動ペプチド合成機または手動ペプチド合成機で効果的に実行する際に、多くの小さい変動が明らかに可能である。スキーム1の各反応段階を、以下のとおりに簡単に提示する。
2021534146.tif 000023
【００６６】
［H-Rink-ChemMatrix Resinの活性化］樹脂上のアミンがFmocで保護されていない場合、20％ピペリジン/DMF 1.5mL中のChemMatrix樹脂0.01mmol（樹脂約20mg）をライブラチューブ中で20分間ボルテックス処理し、脱Fmoc溶液をろ過した。樹脂を、塩化メチレン（MC）1.5mL、ジメチルホルムアミド（DMF）1.5mL、MC 1.5mL、DMF 1.5mL、およびMC 1.5mLでそれぞれ30秒間連続して洗浄した。固体支持体上の得られた遊離アミンをFmoc-PNAモノマーとのカップリングに供した。
【００６７】
［脱Fmoc］樹脂上のアミンがFmocで保護されている場合、20％ピペリジン/DMF 1.5mL中の樹脂0.01mmol（約20mg）を7分間ボルテックス処理し、脱Fmoc溶液をろ過した。樹脂を、MC 1.5mL、DMF 1.5mL、MC 1.5mL、DMF 1.5mL、およびMC 1.5mLでそれぞれ30秒間連続して洗浄した。固体支持体上の得られた遊離アミンをただちにFmoc-PNAモノマーとのカップリングに供した。
【００６８】
［Fmoc-PNAモノマーとのカップリング］固体支持体上の遊離アミンをFmoc-PNAモノマーと、以下のとおりにカップリングさせた。PNAモノマー0.04mmol、HATU 0.05mmol、およびDIEA 0.1mmolを無水DMF 1mL中で2分間インキュベートし、遊離アミンを有する樹脂に加えた。樹脂溶液を1時間ボルテックス処理し、反応媒質をろ過した。次いで、樹脂を、MC 1.5mL、DMF 1.5mL、およびMC 1.5mLでそれぞれ30秒間連続して洗浄した。本発明において使用する修飾核酸塩基を有するFmoc-PNAモノマーの化学構造を図5に示す。図5に示す修飾核酸塩基を有するFmoc-PNAモノマーは、例とみなされるべきであり、したがって本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。当業者であれば、式IのPNA誘導体を合成するためのFmoc-PNAモノマーの多くの変種を容易に理解するであろう。
【００６９】
［キャッピング］カップリング反応の後、未反応の遊離アミンをキャッピング溶液1.5mL（DMF中5％無水酢酸および6％2,6-ロイチジン（2,6-leutidine））中で5分間振盪してキャッピングした。次いで、キャッピング溶液をろ過し、MC 1.5mL、DMF 1.5mL、およびMC 1.5mLでそれぞれ30秒間連続して洗浄した。
【００７０】
［N末端における「Fethoc」基の導入］「Fethoc」基を、以下の方法により、樹脂上の遊離アミンを「Fethoc-OSu」と反応させることによりN末端に導入した。無水MDF 1mL中Fethoc-OSu 0.1mmolおよびDIEA 0.1mmolの溶液中の樹脂の懸濁液を1時間ボルテックス処理し、溶液をろ過した。樹脂をMC 1.5mL、DMF 1.5mL、およびMC 1.5mLでそれぞれ30秒間連続して洗浄した。本発明において使用する「Fethoc-OSu」［CAS No. 179337-69-0、C20H17NO5、MW 351.36］の化学構造を以下に示す。
2021534146.tif 000024
【００７１】
［樹脂からの切断］樹脂に結合したPNAオリゴマーを、切断溶液（トリフルオロ酢酸中2.5％トリイソプロピルシランおよび2.5％水）1.5mL中で3時間振盪することにより樹脂から切断した。樹脂をろ過し、ろ液を減圧下で濃縮した。逆相HPLCによる精製のために、得られた残渣をジエチルエーテルで粉砕し、得られた沈殿をろ取した。
【００７２】
［HPLC分析および精製］樹脂からの切断に続いて、PNA誘導体の粗生成物を、C18逆相HPLCにより、0.1％TFAを含む水/アセトニトリルまたは水/メタノール（勾配法）を溶出させて精製した。図6aおよび6bは、それぞれHPLC精製の前および後の「ASO1」の例示的HPLCクロマトグラムである。
【００７３】
式IのPNA誘導体の合成実施例
ヒトACC2プレmRNAにおける「エキソン12」の5'スプライス部位を相補的に標的とするために、本発明のPNA誘導体を、前述の合成手順に従い、またはわずかな改変を伴って調製した。ヒトACC2プレmRNAを標的とするこのようなPNA誘導体の提供は、式IのPNA誘導体を例示するためであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００７４】
（表１）ヒトACC2プレmRNAにおける「エキソン12」の5'スプライス部位を相補的に標的とするPNA誘導体および質量分析による構造的特徴付けデータ
2021534146.tif 000025
a）理論上の精密質量、b）観測上の精密質量
【００７５】
表1は、ヒトACC2遺伝子［NCBI Reference Sequence: NG_046907］から読み出されたヒトACC2プレmRNAにおける「エキソン12」の5'スプライス部位を相補的に標的とするPNA誘導体を、質量分析による構造的特徴付けデータと共に提供する。表1における本発明のペプチド核酸誘導体の提供は、式IのPNA誘導体を例示するためであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００７６】
「ASO1」は、ヒトACC2プレmRNAにおける「エキソン12」と「イントロン12」との接合部にまたがる
2021534146.tif 000026
の30マーRNA配列内に「太字」および「下線付き」で記される14マー配列と14マーの相補的重複を有する。したがって、「ASO1」は、ヒトACC2プレmRNA内に「エキソン12」との9マーの重複および「イントロン12」との5マーの重複を有する。
【００７７】
相補的DNAに対する「ASO」の結合親和性
式IのPNA誘導体を、N末端またはC末端のいずれかを相補的に標的とする10マーDNAに対するその結合親和性について評価した。結合親和性は、PNAと10マー相補的DNAとの間の二本鎖のTm値によって評価した。PNA誘導体と完全相補的DNAとの間の二本鎖が示すTm値は高すぎて、Tm測定中に緩衝溶液が沸騰する傾向があるため、水性緩衝溶液中では確実に決定することができない。全長PNAのTm値は、PNAと10マー相補的DNAとの間の二本鎖のTm値に基づいて予測および比較することができる。
【００７８】
Tm値を、UV/Vis分光計で以下のとおりに決定した。水性緩衝液（pH7.16、10mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl）4mL中4μM PNAオリゴマーおよび4μM相補的10マーDNAの混合溶液を、15mLポリプロピレンファルコンチューブ中、90℃で数分間インキュベートし、周囲温度までゆっくり冷却した。次いで、溶液を気密キャップを備えた3mL石英UVキュベットに移し、キュベットをAgilent 8453 UV/Visible分光光度計に固定した。260nmでの吸光度変化を、キュベットの温度を毎分0.5または1℃上昇させて記録した。吸光度-温度曲線から、吸光度の最大上昇率を示す温度を、PNAと10マーDNAとの間のTmとして読み出した。Tm測定用のDNAは、Bioneer（www.bioneer.com, Dajeon, Republic of Korea）から購入し、それ以上精製せずに使用した。
【００７９】
式IのPNA誘導体のTm観測値は、表2に示すとおり、10マーDNAへの相補的結合に対して非常に高い。
【００８０】
（表２）PNAのN末端またはC末端のいずれかを標的とするPNAと10マー相補的DNAとの間のTm値
2021534146.tif 000027
【００８１】
例えば、「ASO1」は、[(N→C) Fethoc-CTG(6)-ACG(6)-AA(5)A- TG(6)G-C(1O2)C-NH2]において「太字」および「下線付き」で記されるPNA中のN末端10マーを標的とする10マー相補的DNAとの二本鎖について、72.80℃のTm値を示した。一方、「ASO1」は、[(N→C) Fethoc-CTG(6)-ACG(6)- AA(5)A- TG(6)G-C(1O2)C-NH2]において「太字」および「下線付き」で記されるPNA中のC末端10マーを標的とする10マー相補的DNAとの二本鎖について、79.60℃のTm値を示した。
【実施例】
【００８２】
式IのPNA誘導体の生物活性の実施例
本発明におけるPNA誘導体を、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）などを用いてC2C12骨格筋細胞におけるインビトロACC2アンチセンス活性について評価した。生物学的実施例は、式IのPNA誘導体の生物学的特性を示す例として提供し、したがって本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００８３】
実施例1.  C2C12において「ASO1」により誘発されるエキソンスキッピング
「ASO1」を、以下に記載するとおり、C2C12細胞におけるACC2「エキソン12」のスキッピングを誘発する能力について評価した。
【００８４】
［細胞培養＆ASO処理］C2C12細胞（2×105）（Cat. No. CRL-1772、ATCC）を、10％FBS（ウシ胎児血清）（Cat. No. 10099-41、GIBCO）および1％ストレプトマイシン/ペニシリン（Cat. No. 15140-122、GIBCO）を補足したDMEM培地（ダルベッコ改変イーグル培地：DMEM）（Cat. No. 12-604F、Lonza）を含む60mm培養皿で、37℃、5％CO2雰囲気下で培養した。細胞を、何もなし（陰性対照）、または100zM〜1fMの「ASO1」の水性保存溶液の一定量により5時間処理した。
【００８５】
［RNA抽出＆ネステッドPCR］「ASO1」処理した細胞から、RNeasy Miniキット（Qiagen、Cat. No. 714106）を製造者の指示に従って用いて、全RNAを抽出し、200ngのRNAから、SuperScript(商標) III One-Step RT-PCR System（Cat. No. 12574-018、Invitrogen）を用いて、cDNAを調製した。PCRチューブ中、RNA 200ng、2X Reaction Mix緩衝液25マイクロリットル、SuperScript III(商標) RT/Platinum Taq Mix 2マイクロリットル、10μM（マイクロモル濃度）エクソン9フォワードプライマー
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1マイクロリットル、および10μMエクソン15リバースプライマー
2021534146.tif 000029
1マイクロリットルの混合物に、オートクレーブにかけた蒸留水を全量50マイクロリットルまで添加した。60℃で30分間と94℃で2分間の反応後、94℃で15秒、50℃で30秒、および68℃で1分のPCRプロセス30サイクルにより、最初の粗生成物を得た。粗生成物1マイクロリットル、10μMエクソン10フォワードプライマー（5'-GAG TAC TTA TAC AGC CAG G-3'）1マイクロリットル、および10μMエクソン14リバースプライマー（5'-TTC TGA ACA TCG CGT CTG-3'）1マイクロリットルの混合物を、PyroHostStart Taq Polymerase Kit（Cat. No. K-2611-FCG）を製造者の指示に従って用い、95℃で2分間反応させ、次いで95℃で30秒、47℃で1分、および72℃で20秒のPCRプロセスにかけた。
【００８６】
［エキソンスキッピング生成物電気泳動の同定］PCR生成物（10マイクロリットル）を、2％アガロースゲル上での電気泳動分離にかけた。「ASO1」処理からの標的バンドを回収し、Sanger Sequencingにより分析して、エキソンスキッピング配列を評価した。
【００８７】
［「ASO1」によって誘発されるエキソンスキッピング］図8に示すとおり、0.1aM〜1fMで「ASO1」処理した細胞は、エキソン11を欠くスプライスバリアントACC2 mRNAを濃度依存的に生じた。
【００８８】
実施例2.  C2C12における「ASO1」によるACC2 mRNA形成の阻害
「ASO1」を、以下に記載するとおり、C2C12におけるACC2 mRNA形成をダウンレギュレートする能力について、リアルタイムqPCRにより評価した。
【００８９】
［細胞培養＆ASO処理］C2C12細胞（Cat. No. CRL-1772、ATCC）を、10％ウシ胎児血清（Cat. No. 10099-41、GIBCO）および1％ストレプトマイシン/ペニシリン（Cat. No. 15140-122、GIBCO）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Cat. No. 12-604F、Lonza）中、37℃、5％CO2条件下で培養し、維持した。60mm培養皿で24時間安定化させたC2C12細胞（2×105）を、0（陰性対照）および100zM〜1fMの「ASO1」と共に24時間インキュベートした。
【００９０】
［RNA抽出＆cDNA合成］「ASO1」処理した細胞から、RNeasy Miniキット（Qiagen、Cat. No. 714106）を製造者の指示に従って用いて、全RNAを抽出し、400ngのRNAから、PrimeScript(商標) 1st strand cDNA Synthesis Kit（Takara、Cat. No. 6110A）を用いて、cDNAを調製した。PCRチューブ中、RNA 400ng、ランダムヘキサマー1マイクロリットル、およびdNTP（10mM）1マイクロリットルの混合物に、DEPC処理水を全量10マイクロリットルまで加え、65℃で5分間反応させた。反応混合物にPrimeScript RTase 10マイクロリットルを加え、30℃で10分間および42℃で60分間逐次反応させることにより、cDNAを合成した。
【００９１】
［定量的リアルタイムPCR］ヒトACC2 mRNAの発現レベルを評価するために、リアルタイムqPCRを、合成したcDNAでTaqmanプローブを用いて実施した。PCRチューブ中、cDNA、Taqmanプローブ（Thermo、Mm01204651）、IQスーパーミックス（BioRad、Cat. No. 170-8862）、およびヌクレアーゼを含まない水の混合物を、CFX96 Touch Real-Timeシステム（BioRad）を用い、以下のとおりに指定されたサイクル条件に従って反応させた：95℃で3分（一次変性）と、続いて95℃で10秒（変性）および60℃で30秒（アニーリングおよび重合）の50サイクル。蛍光強度を、各サイクル終了時に測定し、PCRの結果を融解曲線で評価した。各遺伝子の閾サイクル（Ct）をGAPDHのものによって標準化した後、Ctの変化を比較し、解析した。
【００９２】
［「ASO1」によるACC2 mRNA減少］図9に示すとおり、対照実験と比較して、ACC2 mRNAの量は100zM〜1fMの「ASO1」処理で濃度依存的に減少し、統計的に有意な30％の減少が1fMの「ASO1」処理で観察された（スチューデントT検定を行って、結果の統計的有意性を確認した）。
【００９３】
実施例3.  C2C12における「ASO6」によるACC2 mRNA形成の阻害
「ASO6」を、以下に記載するとおり、C2C12におけるACC2 mRNA形成をダウンレギュレートする能力について、リアルタイムqPCRにより評価した。
【００９４】
［細胞培養＆ASO処理］C2C12細胞（Cat. No. CRL-1772、ATCC）を、10％ウシ胎児血清（Cat. No. 10099-41、GIBCO）および1％ストレプトマイシン/ペニシリン（Cat. No. 15140-122、GIBCO）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Cat. No. 12-604F、Lonza）中、37℃、5％CO2条件下で培養し、維持した。60mm培養皿で24時間安定化させたC2C12細胞（2×105）を、0（陰性対照）および100zM〜1fMの「ASO6」と共に24時間インキュベートした。
【００９５】
［RNA抽出＆cDNA合成］「ASO6」処理した細胞からRNeasy Miniキット（Qiagen、Cat. No. 714106）を製造者の指示に従って用いて、全RNAを抽出し、400ngのRNAから、PrimeScript(商標) 1st strand cDNA Synthesis Kit（Takara、Cat. No. 6110A）を用いて、cDNAを調製した。PCRチューブ中、RNA 400ng、ランダムヘキサマー1マイクロリットル、およびdNTP（10mM）1マイクロリットルの混合物に、DEPC処理水を全量10マイクロリットルまで加え、65℃で5分間反応させた。反応混合物にPrimeScript RTase 10マイクロリットルを加え、30℃で10分間および42℃で60分間逐次反応させることにより、cDNAを合成した。
【００９６】
［定量的リアルタイムPCR］ヒトACC2 mRNAの発現レベルを評価するために、リアルタイムqPCRを、合成したcDNAでTaqmanプローブを用いて実施した。PCRチューブ中、cDNA、Taqmanプローブ（Thermo、Mm01204651）、IQスーパーミックス（BioRad、Cat. No. 170-8862）、およびヌクレアーゼを含まない水の混合物を、CFX96 Touch Real-Timeシステム（BioRad）を用い、以下のとおりに指定されたサイクル条件に従って反応させた：95℃で3分（一次変性）と、続いて95℃で10秒（変性）および60℃で30秒（アニーリングおよび重合）の50サイクル。蛍光強度を、各サイクル終了時に測定し、PCRの結果を融解曲線で評価した。各遺伝子の閾サイクル（Ct）をGAPDHのものによって標準化した後、Ctの変化を比較し、解析した。
【００９７】
［「ASO6」によるACC2 mRNA減少］図10に示すとおり、ACC2 mRNAの量は100zM〜1fMの「ASO6」処理で濃度依存的に減少した。対照実験と比較して、統計的に有意な30％および50％の減少が、それぞれ1aMおよび1fMの「ASO6」処理で観察された（スチューデントT検定を行って、結果の統計的有意性を確認した）。
【００９８】
実施例4.  C2C12における「ASO5」によるACC2 mRNA形成の阻害
「ASO5」を、以下に記載するとおり、同じ方法で評価した。
【００９９】
［細胞培養＆ASO処理］C2C12細胞（Cat. No. CRL-1772、ATCC）を、10％ウシ胎児血清（Cat. No. 10099-41、GIBCO）および1％ストレプトマイシン/ペニシリン（Cat. No. 15140-122、GIBCO）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Cat. No. 12-604F、Lonza）中、37℃、5％CO2条件下で培養し、維持した。60mm培養皿で24時間安定化させたC2C12細胞（2×105）を、0（陰性対照）および100zM〜1fMの「ASO5」と共に24時間インキュベートした。
【０１００】
［RNA抽出＆cDNA合成］「ASO5」処理した細胞から、RNeasy Miniキット（Qiagen、Cat. No. 714106）を製造者の指示に従って用いて、全RNAを抽出し、400ngのRNAから、PrimeScript(商標) 1st strand cDNA Synthesis Kit（Takara、Cat. No. 6110A）を用いて、cDNAを調製した。PCRチューブ中、RNA 400ng、ランダムヘキサマー1マイクロリットル、およびdNTP（10mM）1マイクロリットルの混合物に、DEPC処理水を全量10マイクロリットルまで加え、65℃で5分間反応させた。反応混合物にPrimeScript RTase 10マイクロリットルを加え、30℃で10分間および42℃で60分間逐次反応させることにより、cDNAを合成した。
【０１０１】
［定量的リアルタイムPCR］ヒトACC2 mRNAの発現レベルを評価するために、リアルタイムqPCRを、合成したcDNAでTaqmanプローブを用いて実施した。PCRチューブ中、cDNA、Taqmanプローブ（Thermo、Mm01204651）、IQスーパーミックス（BioRad、Cat. No. 170-8862）、およびヌクレアーゼを含まない水の混合物を、CFX96 Touch Real-Timeシステム（BioRad）を用い、以下のとおりに指定されたサイクル条件に従って反応させた：95℃で3分（一次変性）と、続いて95℃で10秒（変性）および60℃で30秒（アニーリングおよび重合）の50サイクル。蛍光強度を、各サイクル終了時に測定し、PCRの結果を融解曲線で評価した。各遺伝子の閾サイクル（Ct）をGAPDHのものによって標準化した後、Ctの変化を比較し、解析した。
【０１０２】
［「ASO5」によるACC2 mRNA減少］図11に示すとおり、ACC2 mRNAの量は100zM〜1fMの「ASO5」処理で濃度依存的に減少した。対照実験と比較して、統計的に有意な30％および42％の減少が、それぞれ1aMおよび1fMの「ASO5」処理で観察された（スチューデントT検定を行って、結果の統計的有意性を確認した）。
【０１０３】
実施例5.  式Iの化合物（重量％）を含むボディローションの調製
式Iの化合物、例えば「ASO1」を、対象への局所適用用のボディローションとして製剤化した。ボディローションを以下に記載のとおりに調製した。可能なボディローションの変種が多くあることを考慮して、本製剤は一例とみなされるべきであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１０４】
別のビーカーで、部分Aおよび部分Bの混合物質をそれぞれ80℃で溶解した。部分Aおよび部分Bを、3,600rpmのホモジナイザーを用い、80℃で5分間混合し、乳化した。乳化した部分Cを50メッシュを通してろ過し、ろ液を部分AとBの混合物に加えた。得られた混合物を、3,600rpmのホモジナイザーを用い、80℃で5分間乳化した。部分A、B、およびCの混合物に部分Dを35℃で加えた後、得られた混合物を、2,500rpmのホモジナイザーを用い、25℃で3分間乳化した。最後に、均質な分散と完全な消泡を確認する。
【０１０５】
（表３）式Iの化合物（重量％）を含むボディローションの組成例
2021534146.tif 000030
【０１０６】
実施例6.  式Iの化合物（重量％）を含むフェイスクリームの調製
式Iの化合物、例えば「ASO1」を、対象への局所適用用のフェイスクリームとして製剤化した。フェイスクリームを以下に記載のとおりに調製した。可能な局所クリームの変種が多くあることを考慮して、本製剤は一例とみなされるべきであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１０７】
（表４）式Iの化合物（重量％）を含むフェイスクリームの組成例
2021534146.tif 000031
【０１０８】
別のビーカーで、部分Aおよび部分Bの混合物質をそれぞれ80℃で溶解した。部分Aおよび部分Bを、3,600rpmのホモジナイザーを用い、80℃で5分間混合し、乳化した。部分Cを部分AとBの混合物に加えた後、得られた混合物を、3,600rpmのホモジナイザーを用い、80℃で5分間乳化した。部分A、B、およびCの混合物に部分Dを35℃で加えた後、得られた混合物を、3,600rpmのホモジナイザーを用い、35℃で5分間乳化した。最後に、25℃で均質な分散と完全な消泡を確認する。
【図１Ａ】
2021534146.tif 000043
【図１Ｂ】
2021534146.tif 000044
【図１Ｃ】
2021534146.tif 000045
【図２Ａ】
2021534146.tif 000046
【図２Ｂ】
2021534146.tif 000047
【図２Ｃ】
2021534146.tif 000048
【図２Ｄ】
2021534146.tif 000049
【図２Ｅ】
2021534146.tif 000050
【図３】
2021534146.tif 000051
【図４】
2021534146.tif 000052
【図５】
2021534146.tif 000053
【図６Ａ】
2021534146.tif 000054
【図６Ｂ】
2021534146.tif 000055
【図７】
2021534146.tif 000056
【図８】
2021534146.tif 000057
【図９】
2021534146.tif 000058
【図１０】
2021534146.tif 000059
【図１１】
2021534146.tif 000060
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月19日(2021.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021534146000001.app
【国際調査報告】
2021534146.tif 000061
2021534146.tif 000062
2021534146.tif 000063