(57)【要約】  本発明は、Ｔ細胞の生存及び増殖を促進するために、エリスロポイエチン受容体（ＥｐｏＲ）の野生型又は切断型形態をコードするベクターに関する。詳細には、本発明は、エクスビボにおける増加がＣＡＲ−Ｔ細胞よりもすぐれており且つインビボにおいて有意に高い抗白血病活性を実証する、抗ＣＤ１９−４１ΒΒ−００３ζキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と切断型ＥｐｏＲを発現するバイシストロニックベクターを例示する。本発明はまた、前記ベクターを発現する細胞を産生するための方法及びＣＤ１９＋腫瘍細胞を死滅させるためのこれらの細胞の使用をも記載する。
2021534770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）受容体；
ｂ）自己切断ペプチド又は配列内リボソーム進入部位；及び
ｃ）細胞表面受容体
をコードする核酸を含むベクター。
【請求項２】
前記Ｅｐｏ受容体は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記Ｅｐｏ受容体は、突然変異型Ｅｐｏ受容体である、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
前記核酸は、前記Ｅｐｏ受容体のエキソン８内に終止コドンをコードする突然変異を有する、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
前記Ｅｐｏ受容体は、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３に記載のベクター。
【請求項６】
前記核酸は、前記Ｅｐｏ受容体に対してＣ末端にあるＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２３））さらにコードする、請求項１に記載のベクター。
【請求項７】
前記核酸は、自己切断ペプチドを含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項８】
前記自己切断ペプチドは、２Ａペプチドである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記細胞表面受容体は、標的細胞抗原に結合する細胞外受容体ドメインを含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項１０】
前記細胞表面受容体は、
ｉ）シグナルペプチド；
ｉｉ）標的細胞抗原に結合する細胞外受容体ドメイン；
ｉｉｉ）細胞の表面上の前期細胞外受容体ドメインを固定するヒンジ及び膜貫通ドメイン；並びに
ｉｖ）エフェクタードメイン
を含むキメラ抗原受容体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
前記細胞外受容体ドメインは、リンカードメインによってつながれる可変免疫グロブリン軽鎖ドメイン及び可変免疫グロブリン重鎖ドメインを含む、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記リンカードメインは、（Ｇ４Ｓ）x（配列番号２４）であり、ｘは、１〜１００の整数である、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記細胞外受容体ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１４】
前記細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１５】
前記細胞外受容体ドメインは、抗ＣＤ１９単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１６】
前記キメラ抗原受容体は、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１７】
トランスジェニック哺乳動物宿主細胞を作製するための方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクターを哺乳動物宿主細胞の中に導入することを含む方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物宿主細胞は、免疫細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球／マクロファージ細胞、又は樹状細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫細胞は、Ｔ細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞は、腫瘍抗原又はウイルス抗原に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに発現する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＴＣＲは、内在性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり、腫瘍から前記腫瘍浸潤リンパ球を抽出すること及びエクスビボにおいて前記ＴＩＬを増加させることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクターを含む哺乳動物免疫細胞。
【請求項２５】
前記哺乳動物免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球／マクロファージ細胞、又は樹状細胞である、請求項２４に記載の哺乳動物免疫細胞。
【請求項２６】
前記哺乳動物免疫細胞は、Ｔ細胞である、請求項２４に記載の哺乳動物免疫細胞。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である、請求項２６に記載の哺乳動物免疫細胞。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞は、ヒト末梢血Ｔリンパ球である、請求項２６に記載の哺乳動物免疫細胞。
【請求項２９】
哺乳動物の中に哺乳動物Ｔ細胞を導入することを含む、前記対象においてＣＤ１９＋細胞の数を低下させるための方法であって、前記哺乳動物Ｔ細胞は、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクターを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月２９日に提出された米国仮特許出願第６２／７２４，４８８号明細書の利益を主張する。上記の出願の全教示は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイル中のデータの参照による援用
本出願は、本出願と同時に提出される以下のＡＳＣＩＩテキストファイル中に含有される配列表を参照によって援用する：
ａ）ファイル名：４４５９＿１１５１−００１＿ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔ；２０１９年８月２６日に作成、サイズ５４，４１９バイト。
【背景技術】
【０００３】
癌を有する患者にとって、免疫細胞の養子移入は、有望で、ますます利用可能になりつつある治療の選択肢であり、これは、すべての標準治療が失敗した場合であっても、臨床効果につながり得る。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により腫瘍関連分子の方へ向けられる腫瘍浸潤リンパ球及びＴリンパ球による治験は、白血病及び固形腫瘍を有する患者におけるこういったアプローチの可能性について説得力のある証拠を提供した。1たとえば、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＢ細胞白血病及びリンパ腫の治療は、従来型の治療に対して抵抗性の疾患を有する患者において持続的な寛解につながった。2-10
【０００４】
注入の前にリンパ球を枯渇させる（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）療法の効力並びに注入されるＴ細胞の増殖能力及び疲弊の傾向を含むいくつかの要因が、全体として、注入されたＴリンパ球の増殖及び寿命に影響を及ぼす。1,9ＣＡＲ操作Ｔ細胞の場合、ＣＡＲの性質は、重要な特徴であり、ＣＡＲが伝えることができる同時刺激のタイプは、重要な役割を果たすと思われる。11-13
【０００５】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、インビボにおいてＴ細胞の増加及び存続を促進し、インターロイキン−２は、この目的のために、いくつかの細胞療法の臨床試験において使用されている。14,15しかしながら、ＩＬ−２の投与は、考慮すべき毒性を有することがある。16,17そのうえ、ＩＬ−２は、特異性を欠き、ＩＬ−２は、ＩＬ−２受容体を発現するすべてのＴ細胞と、それらの抗腫瘍能に関係なく反応する。そのために、ＩＬ−２は、調節性Ｔ細胞を刺激し、これにより免疫応答を弱めてしまう。18
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
注入された細胞の増加及び／又は存続を改善することによって、養子細胞療法の臨床的有効性を改善するために使用することができるベクター、核酸、及びトランスジェニック細胞が、本明細書において記載される。
【０００７】
核酸を含むベクターが、本明細書において記載される。核酸は、エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）受容体；自己切断ペプチド又は配列内リボソーム進入部位；及び細胞表面タンパク質をコードする。
【０００８】
Ｅｐｏ受容体は、配列番号２、４、６、及び８のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｅｐｏ受容体は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｅｐｏ受容体は、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｅｐｏ受容体は、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｅｐｏ受容体は、配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｅｐｏ受容体は、突然変異型Ｅｐｏ受容体である。いくつかの実施形態では、核酸は、Ｅｐｏ受容体のエキソン８内に終止コドンをコードする突然変異を有する。
【０００９】
ヌクレオチドは、Ｅｐｏ受容体に対してＣ末端にあるＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２３））をさらにコードすることができる。核酸は、２Ａペプチド（たとえばＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ）などのような自己切断ペプチドを含むことができる。いくつかの場合では、２Ａペプチドは、Ｔ２Ａペプチドとすることができる。
【００１０】
シグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチドなどのような、表面タンパク質のシグナルペプチドとすることができる。
【００１１】
細胞表面受容体は、標的細胞抗原に結合する細胞外受容体ドメインを含むことができる。
【００１２】
細胞表面受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とすることができる。ＣＡＲは、シグナルペプチド；標的細胞抗原に結合する細胞外受容体ドメイン；細胞の表面上の細胞外受容体ドメインを固定するヒンジ及び膜貫通ドメイン；並びにエフェクタードメインを含むことができる。細胞表面受容体がキメラ抗原受容体である場合、細胞外ドメインは、通常、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【００１３】
細胞外受容体ドメインは、リンカードメインによってつながれる可変免疫グロブリン軽鎖ドメイン及び可変免疫グロブリン重鎖ドメインを含むことができる。リンカードメインは、（Ｇ４Ｓ）x（配列番号２４）とすることができ、ｘは、１〜１００の整数である。リンカードメインは、（Ｇ４Ｓ）3（配列番号２５）とすることができる。
【００１４】
細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体とすることができる。
【００１５】
細胞外ドメインは、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、シングルドメイン抗体、又はその機能的誘導体若しくは変異体若しくは断片を含むことができる。
【００１６】
細胞外受容体ドメインは、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４などのような免疫グロブリンＦｃ受容体を含むことができる。細胞外受容体ドメインは、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−７、又はＩＬ−３などのようなサイトカインを含むことができる。
【００１７】
細胞表面受容体は、免疫細胞を活性化することができる。たとえば、細胞表面受容体は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、ＮＣＲ３、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、又はＩＣＯＳを含むことができる。細胞表面受容体は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、ＮＣＲ３、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、又はＩＣＯＳの断片を含むことができる。細胞表面受容体は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、ＮＣＲ３、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、又はＩＣＯＳのリガンドを含むことができる。
【００１８】
細胞表面受容体は、免疫細胞を阻害することができる。たとえば、細胞表面受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ−１、又はＣＴＬＡ−４を含むことができる。細胞表面受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ−１、又はＣＴＬＡ−４の断片を含むことができる。細胞表面受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ−１、又はＣＴＬＡ−４のリガンドを含むことができる。
【００１９】
細胞表面受容体は、サイトカインに対する受容体とすることができる。たとえば、細胞表面受容体は、ＩＬ−６、ＩＬ−１、又はＴＮＦａｌｐｈａに対する受容体とすることができる。
【００２０】
標的細胞抗原は、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異性抗原とすることができる。標的細胞抗原は、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫関連抗原とすることができる。
【００２１】
標的細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、メソテリン、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、又はジシアロガングリオシド（ＧＤ）−２である。
【００２２】
標的細胞抗原は、ＣＤ１９とすることができる。
【００２３】
細胞外ドメインは、抗ＣＤ１９単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）とすることができる。ヒンジ及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインとすることができる。ヒンジは、複数のアミノ酸残基を含むことができる。膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８β、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ６４、ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、又はＦＧＦＲ２Ｂ由来の膜貫通ドメインとすることができる。
【００２４】
エフェクタードメインは、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含むことができる。ＣＡＲは、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζとすることができる。
【００２５】
ベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）レトロウイルスベクターなどのように、レトロウイルスとすることができる。ベクターは、蛍光タンパク質をさらにコードすることができる。ベクターは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードすることができる。ベクターは、核酸の発現のための少なくとも１つの調節エレメントをさらにコードすることができる。
【００２６】
トランスジェニック哺乳動物宿主細胞を作製するための方法が、本明細書において記載される。方法は、本明細書において記載されるベクターのいずれかを哺乳動物宿主細胞の中に導入することを含むことができる。哺乳動物宿主細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球／マクロファージ細胞、樹状細胞、又はＴ細胞などのような免疫細胞とすることができる。Ｔ細胞は、ヒト末梢血Ｔリンパ球とすることができる。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とすることができる。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とすることができる。Ｔ細胞は、腫瘍抗原又はウイルス抗原に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに発現することができる。ＴＣＲは、内在性である。たとえば、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）とすることができ、方法は、腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球を抽出すること及びエクスビボにおいてＴＩＬを増加させることさらに含むことができる。ＴＣＲは、外来性とすることができる。たとえば、方法は、外来性ＴＣＲを発現するベクターをＴ細胞の中に導入することをさらに含むことができる。
【００２７】
本明細書において記載されるベクターのいずれかを含む哺乳動物免疫細胞が、本明細書において記載される。哺乳動物免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球／マクロファージ細胞、樹状細胞、又はＴ細胞とすることができる。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞とすることができる。Ｔ細胞は、ヒト末梢血Ｔリンパ球とすることができる。Ｔ細胞は、前の節において記載されるとおり又は本明細書において別に記載されるとおりのものとすることができる。
【００２８】
哺乳動物においてＣＤ１９＋細胞の数を低下させるための方法が、本明細書において記載される。方法は、対象の中に哺乳動物Ｔ細胞を導入することを含むことができる。哺乳動物Ｔ細胞は、本明細書において記載されるベクターのいずれかを含むことができる。哺乳動物は、ヒトとすることができる。哺乳動物Ｔ細胞は、哺乳動物から単離される自己由来の細胞とすることができる。哺乳動物Ｔ細胞は、ドナーから単離される同種異系の細胞とすることができる。方法は、Ｅｐｏを対象に投与することをさらに含むことができる。方法は、ＩＬ−２を対象に投与することをさらに含むことができる。哺乳動物におけるＣＤ１９＋細胞の数を低下させることにより、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を治療することができる。
【００２９】
癌、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、又は寄生虫の治療又は予防をそれを必要とする哺乳動物においてするための医薬の製造における、本明細書において記載されるベクターのいずれかの使用が、本明細書において記載される。
【００３０】
哺乳動物においてＣＤ１９＋細胞の数を低下させるための、本明細書において記載される哺乳動物免疫細胞のいずれかの使用が、本明細書において記載される。
【００３１】
哺乳動物においてＣＤ１９＋細胞の数を低下させるための方法に使用するためのベクターが、本明細書において記載される。ベクターは、本明細書において記載されるベクターのいずれかとすることができる。
【００３２】
哺乳動物においてＣＤ１９＋細胞の数を低下させるための方法に使用するための哺乳動物免疫細胞が、本明細書において記載される。哺乳動物免疫細胞は、本明細書において記載される哺乳動物免疫細胞のいずれかとすることができる。
【００３３】
突然変異型エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）受容体をコードする核酸を含むベクターが、本明細書において記載される。たとえば、突然変異型Ｅｐｏ受容体は、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有することができる。突然変異型エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）受容体をコードする核酸を含むベクターを哺乳動物宿主細胞の中に導入することによって、トランスジェニック哺乳動物宿主細胞を作製するための方法もまた、本明細書において記載される。突然変異型エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）受容体をコードする核酸を含むベクターを含む哺乳動物免疫細胞もまた、本明細書において記載される。哺乳動物免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球／マクロファージ細胞、又は樹状細胞とすることができる。
【００３４】
Ｅｐｏ受容体は、Ｔ細胞において発現され、シグナルを伝えることができる。
【００３５】
ＥｐｏＲｍは、ＥｐｏＲよりも高いレベルで発現される。
【００３６】
ＥｐｏＲｍは、より強力でより且つ持続的なシグナルを誘発する。
【００３７】
Ｅｐｏは、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を支持することができる。
【００３８】
ＥｐｏＲｍの発現及びＥｐｏへの曝露は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性に干渉しない。
【００３９】
ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、増加し、インビボにおいて細胞傷害性を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
前述のことは、同様の参照記号が様々な図の全体にわたって同じ部分を指す添付の図面において示されるように、例示の実施形態についての以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。図面は、必ずしも一定の縮尺ではなく、その代わりに、実施形態を示すことに重点を置いている。
【００４１】
【図１Ａ−Ｅ】図１Ａ〜Ｅは、ヒト末梢血Ｔ細胞におけるＥｐｏＲの発現が、生存シグナルを与えることを示す図である。図１Ａは、ＰＥコンジュゲート抗ＥｐｏＲ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出されるように、ジャーカット細胞における表面ＥｐｏＲ発現を示すフローサイトメトリーのドットプロットである；ＧＦＰのみを形質導入した細胞は、コントロールとして示す。各四分画領域（ｑｕａｄｒａｎｔ）における細胞のパーセンテージを示す。図１Ｂは、ジャーカット細胞に結合しているＥｐｏを示すフローサイトメトリーのヒストグラムである。細胞は、ビオチンコンジュゲートＥｐｏ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びストレプトアビジン−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により標識した。図１Ｃは、ＧＦＰのみ又はＧＦＰとＥｐｏＲを形質導入したＴリンパ球における表面ＥｐｏＲ発現を示すフローサイトメトリーのドットプロットである。図１Ｄは、１５分間の１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏによる刺激の後にＡＦ６４７コンジュゲート抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により検出されたＳＴＡＴ５  Ｙ６４７のリン酸化を示す、代表的なフローサイトメトリーのドットプロットである；Ｅｐｏ刺激の前に１時間、１０μＭルキソリチニブにより処理した細胞による結果もまた、示す。図１Ｅは、外来性サイトカイン不在の下で（Ｅｐｏなし）又はＥｐｏ（４ＩＵ／ｍＬ）の存在下において培養した、ＥｐｏＲを形質導入したＴ細胞及びＧＦＰのみを形質導入したＴ細胞の生存を示すグラフである。記号は、投入した細胞の数と比較した細胞回収率のパーセンテージを示す。
【図２Ａ−Ｆ】図２Ａ〜Ｆは、ＥｐｏＲｍが、ＥｐｏＲよりも高度で且つ安定した発現を有することを示す図である。図２Ａは、２９３Ｔ細胞におけるＥｐｏＲ発現のウエスタンブロット解析である。ＥｐｏＲ、ＥｐｏＲｍ、又はＧＦＰのみを形質導入した２９３Ｔ細胞の細胞可溶化物を、還元条件下、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ブロットした膜を、マウス抗Ｆｌａｇ抗体（９Ａ３；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧによりプローブした；ウサギ抗ヒトＧＡＰＤＨ（ＥＰＲ１６８９１；Ａｂｃａｍ）、続いてＨＲＰにコンジュゲートされたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）は、ＧＡＰＤＨ（ローディングコントロール）を検出するために使用した。抗体結合は、Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって見えるようにし、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって可視化した。図２Ｂは、ＥｐｏＲ、ＥｐｏＲｍ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴリンパ球のフローサイトメトリー解析である。フローサイトメトリーのドットプロットは、ＰＥコンジュゲート抗ＥｐｏＲ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出されるＥｐｏＲ発現を示す。各四分画領域の細胞のパーセンテージを示す。図２Ｃは、ＥｐｏＲ又はＥｐｏＲｍを形質導入したＴ細胞の、ＥｐｏＲを発現しているＧＦＰ＋Ｔ細胞のパーセンテージ（左）又はＥｐｏＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）（右）を示すチャートである。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。図２Ｄは、ＥｐｏＲを発現している６人のドナー由来のＣＤ４＋（左）又はＣＤ８＋（右）Ｔ細胞のパーセンテージを示すチャートである。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。図２Ｅは、ＥｐｏＲ又はＥｐｏＲｍを形質導入した３人のドナー由来のＴ細胞におけるＧＦＰのＭＦＩ及びＥｐｏＲのＭＦＩの間の関係を示すグラフである。各パネルは、１人のドナーのＴ細胞による結果を示す。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。図２Ｆは、ＥｐｏＲ又はＥｐｏＲｍを形質導入し、次いで１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏにより刺激した、３人のドナー由来のＴリンパ球を示すグラフである。表面ＥｐｏＲの発現は、刺激後、示される時点で、フローサイトメトリーによって評価した。各パネルは、１人のドナーのＴ細胞による結果を示す。
【図３Ａ−Ｅ】図３Ａ〜Ｅは、ＥｐｏＲｍがＥｐｏシグナル伝達を増強させることを示す図である。図３Ａは、１５分間のＥｐｏ（１０ＩＵ／ｍＬ）による刺激後の、ＥｐｏＲ、ＥｐｏＲｍ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴ細胞におけるＳＴＡＴ５のリン酸化を示す、代表的なフローサイトメトリーの等高線図である。図３Ｂは、ＥｐｏＲ又はＥｐｏＲｍを形質導入した３人のドナー由来のＴ細胞における、ＧＦＰのＭＦＩ及びｐＳＴＡＴ５のＭＦＩの間の関係を示すグラフである。各パネルは、１人のドナーのＴ細胞による結果を示す。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。図３Ｃは、１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏによる刺激後の又はＥｐｏ刺激の前に１０μＭルキソリチニブにより処理した、ＥｐｏＲ、ＥｐｏＲｍ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴ細胞における、ｐＳＴＡＴ５を発現しているＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示すプロットである。各記号は、１回の実験の結果を表す。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；＊＊、Ｐ＜０．０１。図３Ｄは、１５分間の様々な濃度のＥｐｏによる刺激後にｐＳＴＡＴ５を発現しているＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示すグラフである。各記号は、２回の実験の平均値を示す。図３Ｅは、１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏにより刺激した、ＥｐｏＲ、ＥｐｏＲｍ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴ細胞を示すグラフであり、ｐＳＴＡＴ５は、示される時点で、フローサイトメトリーによって評価した。各記号は、２回の実験の平均値を示す。
【図４Ａ−Ｄ】図４Ａ〜Ｄは、Ｔ細胞におけるＥｐｏＲｍによって誘発される増殖及び生存シグナルを示す図である。図４Ａは、フローサイトメトリーのドットプロットであり、サイトカインを含まない培地中での３日間の培養後の、非刺激の（上段）又は１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏ（下段）により刺激した、ＥｐｏＲ、ＥｐｏＲｍ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴリンパ球の細胞周期解析を示す。ＦｘＣｙｃｌｅ染色によって検出されるＤＮＡ含有量を、ｘ軸に示す；Ｅｄｕの組み込みによって示されるＤＮＡ合成を、ｙ軸に示す。Ｅｄｕ＋細胞を、それらのパーセンテージと共に、囲み線で示す。図４Ｂは、３週間、外来性サイトカイン不在の下で（Ｅｐｏなし）又はＥｐｏ（１０ＩＵ／ｍＬ）の存在下において培養した、ＥｐｏＲ、ＥｐｏＲｍ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴリンパ球の生存を示すグラフである。記号は、三通りの測定値における、投入した細胞の数と比較した細胞回収率の平均（±ＳＤ）パーセンテージを示す。＊＊＊＊  Ｐ＜０．０００１；＊＊  Ｐ＜０．０１。図４Ｃは、１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２及び／又は１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏあり又はなしでの６〜８日間の培養後に、投入した細胞と比較したＴ細胞回収率のパーセンテージを示すグラフである。各記号は、Ｔ細胞による測定値を、４人のドナーについて１人ずつ示す（３人のドナーについては３つの測定値の平均及び１人のドナーについては１つの測定値）。＊  Ｐ＝０．０２。図４Ｄは、Ｅｐｏ（１０ＩＵ／ｍＬ）不在の下で又はその存在下において、１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２と共に培養した、ＥｐｏＲ、ＥｐｏＲｍ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴリンパ球の生存を示すグラフである。示される日の、投入した細胞と比較したＴ細胞回収率のパーセンテージを示す。
【図５Ａ−Ｆ】図５Ａ〜Ｆは、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の発現及び機能を示す。図５Ａは、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ構築物の略図である。図５Ｂは、フローサイトメトリーのドットプロットであり、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲを形質導入したＴ細胞におけるＣＡＲ及びＥｐｏＲの表面発現を示す；ＧＦＰのみを形質導入した細胞は、コントロールとして使用した。各四分画領域の細胞のパーセンテージを示す。細胞は、ＥｐｏＲ発現を検出するために、ＥｐｏＲ−ＰＥ抗体で染色した；ＣＡＲ発現は、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）2抗体及びストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により検出した。図５Ｃは、ＣＡＲ、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴリンパ球の中で、ＣＡＲ（左）及びＥｐｏＲ（右）を発現するＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示すプロットである。各記号は、１回の形質導入についての測定値に対応する。水平方向のバーは、中央値を示す。図５Ｄは、１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏによる１５分間の刺激後の又はＥｐｏ刺激の前に１０μＭルキソリチニブにより１時間前処理した後のＣＡＲ、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴリンパ球において、ｐＳＴＡＴ５を発現しているＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示すプロットである。各記号は、１回の形質導入についての測定値に対応する。水平方向のバーは、中央値を示す。図５Ｅは、ＣＤ１９＋細胞株ＯＰ−１、ＲＳ４；１１、及びＮａｌｍ６に対する、ＣＡＲ、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴリンパ球の細胞傷害性を示すチャートである。バーは、１：１のＥ：Ｔ比での４時間の細胞傷害性アッセイにおける三通りの実験の平均値（±ＳＤ）を表す。図５Ｆは、１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏの存在下における、示されるＥ：Ｔ比での、ＯＰ−１  ｍＣｈｅｒｒｙ細胞に対する、ＣＡＲ、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴリンパ球の長期の細胞傷害性を示すグラフである。記号は、示される時点で測定した細胞傷害性の平均（±ＳＤ）パーセンテージを表す。＊  Ｐ＝０．０３；＊＊  Ｐ＜０．０１。
【図６Ａ−Ｆ】図６Ａ〜Ｆは、ＥｐｏがＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を支持することを示す図である。図６Ａは、１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏ不在の下で又はその存在下において、１：１の比で、Ｓｔｒｅｃｋ処理又は照射ＯＰ−１細胞と共培養した、ＣＡＲ、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ、又はＧＦＰのみを形質導入した３人のドナー由来のＴリンパ球の生存及び増加を示すチャートである。各記号は、投入した細胞の数と比較した細胞回収率のパーセンテージを示す。２つの測定値の平均値しか示されない１人のドナーについての１４日目の測定値を除き、三通りの培養の平均値（±ＳＤ）を示す。図６Ｂは、１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏの存在下において、１μＭルキソリチニブあり又はなしでの７日間の培養後に、投入した細胞と比較した、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の回収率を示すプロットである。＊＊＊  Ｐ＜０．００１。図６Ｃは、１０ＩＵ／ｍＬ又は１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏの存在下における１：１の比での照射ＣＤ１９＋ＯＰ−１との共培養の７日後に回収した、ＣＡＲ、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴリンパ球のパーセンテージを示すチャートである。各記号は、三通りの培養の平均値を示す。図６Ｄは、示される時点での、１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏ及び／又は１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２による刺激後の、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５のＭＦＩを示すプロットである。図６Ｅは、示される濃度のＥｐｏ及びＩＬ−２により刺激したｐＳＴＡＴ５を発現するＧＦＰ＋  ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のパーセンテージを示すプロットである。＊  Ｐ＝０．０４５；＊＊  Ｐ＜０．０１。図６Ｆは、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏ又は１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２による刺激の前に、示される用量で１時間、トファシチニブ（ｎ＝２）又はルキソリチニブ（ｎ＝１）により処理したことを示すチャートである。バーは、トファシチニブについての２つの測定値の平均値及びルキソリチニブについての１回の測定値を表す。
【図７Ａ−Ｅ】図７Ａ〜Ｅは、免疫不全マウスにおけるインビボにおける腫瘍の死滅及びＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の増加を示す図である。図７Ａは、５×１０5Ｎａｌｍ６−ルシフェラーゼ細胞をｉ．ｖ．注入したＮＳＧマウスの代表的な画像である。２日後、４匹のマウスに、２×１０7ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射した；そのうちの２匹は、２週間、週に３回、１００ＩＵ  Ｅｐｏのｉ．ｐ．注射を受けた；１匹のマウスは、Ｔ細胞を受けなかった。２日目の腹側の生物発光画像を、Ｎａｌｍ６移植を証明するために感度を増強して示す。図７Ｂは、パネル７Ａに示すマウスにおける１秒当たりの光子として表される白血病細胞成長を示すプロットである。記号は、腹側及び背側画像処理による全生物発光に対応する。腹側及び背側生物発光シグナルの集計が１秒当たり１×１０10光子に達したら、マウスを安楽死させた。図７Ｃは、ＣＡＲ、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ又はＧＦＰのみを形質導入したＴ細胞をｉ．ｖ．注射したマウスの末梢血におけるヒトＣＤ４５＋細胞の絶対数を示すプロットである；何匹かのマウスは、示されるように、２週間、週に３回、１００ＩＵ  Ｅｐｏをｉ．ｐ．で受けた。血液は、Ｔ細胞注入の１３日後に、頬の出血を介して得た。＊  Ｐ＝０．０２；＊＊  Ｐ＜０．０１。図７Ｄは、マウス末梢血におけるヒトＣＤ４５＋ＧＦＰ＋（上）及びヒトＣＤ４５＋（下）Ｔ細胞の存在を示す代表的なフローサイトメトリーの等高線図である。図７Ｅは、１５分間の８０ｎｇ／ｍＬのマウス又はヒトＥｐｏによる刺激後の、ＣＡＲ、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴ細胞におけるｐＳＴＡＴ５  ＭＦＩを示すチャートである。
【図８Ａ−Ｃ】図８Ａ〜Ｃは、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の脱顆粒及びサイトカイン放出プロファイルを示す図である。図８Ａは、４時間の１：１のＥ：Ｔ比でのＯＰ−１細胞との共培養後の、ＣＡＲ、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ、又はＧＦＰのみを形質導入したＴ細胞においてＣＤ１０７ａを発現しているＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示すチャートである。バーは、３人のドナー由来の細胞による三通りの測定値の平均（±ＳＤ）を表す。図８Ｂは、１：１のＥ：Ｔ比でＯＰ−１細胞と６時間共培養した後の、図８Ａのように形質導入されたＴ細胞においてＩＦＮγ（左）及びＴＮＦα（右）を発現しているＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示すグラフである。ＩＦＮγについては３人のドナー及びＴＮＦαについては１人のドナー由来の細胞による三通りの測定値の平均値（±ＳＤ）を示す。＊＊＊  Ｐ＜０．００１。図８Ｃは、１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏ不在の下での又はその存在下における２４時間の１：４のＥ：Ｔ比でのＯＰ−１細胞との共培養後の、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞によるサイトカイン産生のＬｕｍｉｎｅｘ解析のプロットである。
【図９Ａ−Ｆ】図９Ａ〜Ｆは、異種移植モデルにおけるＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗白血病活性を示す図である。図９Ａは、ＣＡＲ、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ、又はＧＦＰのみを形質導入した１×１０7Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射したＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスの画像である；マウスの１つのグループは、Ｔ細胞を受けなかった。２週後、マウスに、ルシフェラーゼを発現している２．５×１０5Ｎａｌｍ６細胞をｉ．ｖ．注射した。腹側の画像は、水溶性のＤ−ルシフェリンカリウム塩（１５０μｇ／ｇ体重）のｉ．ｐ．注射後の発光によって測定されるＮａｌｍ６細胞移植を示す。図９Ｂは、図９Ａに示すマウスのグループにおける発光測定値を示すチャートである。５９日目に１０8光子／秒未満のシグナルを有する各グループにおけるマウスの数を示す。図９Ｃは、図９Ａに示すマウスにおける、注入されたＴ細胞の存続を示すチャートである。マウス血液は、頬の穿刺によって収集し、細胞は、ＡＰＣ（２Ｄ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）又はＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ４５（ＨＩ３０；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＰＥコンジュゲート抗マウスＣＤ４５（３０−Ｆ１１；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）により染色した。すべてのＣＤ４５＋（ヒト及びマウス）リンパ系細胞の中のｈＣＤ４５＋ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す。図９Ｄは、ルシフェラーゼを形質導入したＮａｌｍ６細胞をＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウス（マウス当たり５×１０5細胞）にｉ．ｖ．注射した画像である。４日後、腫瘍移植について評価し、１〜２×１０7Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射した。腹側の画像は、水溶性のＤ−ルシフェリンカリウム塩（１５０μｇ／ｇ体重）のｉ．ｐ．注射後の発光によって測定されるＮａｌｍ６細胞移植を示す。図９Ｅは、図９Ｄに示すマウスのグループにおける発光測定値を示すチャートである。５５日目に１０8光子／秒未満のシグナルを有する各グループにおけるマウスの数を示す。図９Ｆは、２セットの実験に含まれるマウスの長期生存の集計を示すチャートである。
【図１０】図１０は、Ｅｐｏ受容体又はＧＦＰのみを形質導入したジャーカット細胞の成長曲線を示すチャートである。各記号は、３つの測定値の平均値を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
例示の実施形態の説明について以下に記す。
【００４３】
赤血球増加症と関連する野生型エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）受容体及び天然に存在する切断型形態の異所性発現がヒト末梢血リンパ球にＥｐｏ応答性を与えることができるかどうかに関連する実験が、本明細書において記載される。受容体及びＣＡＲをコードする単一の構築物を形質導入したＴ細胞を使用して、ＣＡＲ−Ｔ細胞をインビトロ及びインビボにおいて特異的に増加させるＥｐｏの可能性について評価した。
【００４４】
Ｅｐｏ受容体は、免疫細胞（たとえばＴ細胞）において発現させることができ、機能的である。通常のＥｐｏ受容体と比較して、突然変異型Ｅｐｏ受容体は、高度で且つ持続的な発現、高いシグナル強度、及びＴ細胞活性のよりすぐれた刺激を呈した。Ｔ細胞におけるＥｐｏ受容体の発現及び機能は、突然変異型ＥｐｏＲが優位であるのと同様に、予想外なことである。
【００４５】
急性リンパ性白血病及びＣＤ１９
急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）は、リンパ系血球の癌である。ＡＬＬは、急速に進行し、治療しなければ致命的となる。標準治療は、化学療法及び血液幹細胞移植術を含む。ＣＤ１９は、ＡＬＬの大半の症例において、すべての白血病細胞上に発現されるＢ細胞特異性抗原である。
【００４６】
本明細書において記載されるベクターは、修飾Ｔ細胞を産出するために使用することができ、これは、さらには、ＡＬＬの標的治療に使用することができる。本明細書において記載されるプロセスは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を破壊するために標的にし、それにより、ＡＬＬのリスク及び／又は重症度を減少させることができるトランスジェニックＴ細胞を作り出すために使用することができる。
【００４７】
本明細書において記載される特定の実施例は、典型としてＣＤ１９＋Ｂ細胞を標的にするが、このアプローチは、癌及び他の疾患の病因となる細胞のマーカーとなる他の抗原を標的にすることに適用可能である。
【００４８】
核酸
本明細書において使用されるように、「核酸」という用語は、多数のヌクレオチドモノマー（たとえばリボヌクレオチドモノマー又はデオキシリボヌクレオチドモノマー）を含むポリマーを指す。「核酸」は、たとえば、ＤＮＡ（たとえばゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、並びにＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子を含む。核酸分子は、天然に存在する、組換え、又は合成とすることができる。加えて、核酸分子は、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖とすることができる。ある実施形態では、核酸分子は、修飾することができる。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は、分子の一方又は両方の鎖を指すことができる。
【００４９】
用語「ヌクレオチド」及び「ヌクレオチドモノマー」は、天然に存在するリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドモノマー並びに天然に存在しないその誘導体及びアナログを指す。したがって、ヌクレオチドは、たとえば天然に存在する塩基（たとえばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、又はデオキシシチジン）を含むヌクレオチド及び当技術分野において知られている修飾塩基を含むヌクレオチドを含むことができる。
【００５０】
本明細書において使用されるように、用語「配列同一性」は、配列が、パーセンテージとして表される最大レベルの同一性を達成するようにアライメントされた場合に、２つのヌクレオチド配列又は２つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する程度を指す。配列アライメント及び比較のために、典型的に、１つ配列が参照配列として指定され、これと試験配列を比較する。参照配列及び試験配列の間の配列同一性は、参照配列及び試験配列が最大レベルの同一性を達成するように参照配列及び試験配列をアライメントした際に同じヌクレオチド又はアミノ酸を共有する、参照配列の全長にわたる位置のパーセンテージとして表される。一例として、最大レベルの同一性を達成するようにアライメントした際に、試験配列が、参照配列の全長にわたって同じ位置の７０％に同じヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する場合、２つの配列は、７０％の配列同一性を有するとみなされる。
【００５１】
最大レベルの同一性を達成するための比較のための配列のアライメントは、適切なアライメント方法又はアルゴリズムを使用して、当業者によって容易に実行することができる。いくつかの場合では、アライメントは、最大レベルの同一性をもたらすために、導入されたギャップを含むことができる。例として、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実現（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、並びに目視検査（一般にＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）を含む。
【００５２】
配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要であれば、その後の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムにより、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した、試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。配列同一性パーセントを決定するために一般的に使用されるツールは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈで入手可能なＰｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴＰ）である。（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−１０（１９９０））。
【００５３】
様々な実施形態では、２つのヌクレオチド配列又は２つのアミノ酸配列は、少なくとも、たとえば７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有することができる。本明細書において記載される１つ又はそれ以上の配列に対する配列同一性パーセントを確かめる場合、本明細書において記載される配列は参照配列となる。
【００５４】
ベクター
「ベクター」、「ベクター構築物」、及び「発現ベクター」という用語は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（たとえば転写及び翻訳）を促進するように、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（たとえば外来遺伝子）を宿主細胞の中に導入することができる運搬手段を意味する。ベクターは、伝播性の物質であるＤＮＡを典型的に含み、この中に、タンパク質をコードする外来性ＤＮＡが、制限酵素技術によって挿入される。ベクターの一般的なタイプは、「プラスミド」であり、これは、一般に、追加の（外来性の）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二本鎖ＤＮＡの独立した分子であり、適した宿主細胞の中に容易に導入することができる。プラスミド及び真菌ベクターを含む多くのベクターは、様々な真核生物及び原核生物の宿主における複製及び／又は発現について記載されている。
【００５５】
「発現する」及び「発現」という用語は、遺伝子及びＤＮＡ配列中の情報が現れるのを可能にすること又は引き起こすこと、たとえば、対応する遺伝子又はＤＮＡ配列の転写及び翻訳に関与する細胞の機能を活性化することによってタンパク質を産生することを意味する。ＤＮＡ配列は、タンパク質などのような「発現産物」を形成するために、細胞中で又はそのそばで発現される。発現産物自体、たとえば結果として生じるタンパク質は、細胞によって「発現される」と言うこともできる。ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、たとえば、それが、外来性の若しくは本来のプロモーターのコントロール下で外来性の宿主細胞において又は外来性のプロモーターのコントロール下で本来の宿主細胞において発現される又は産生される場合、組換えで発現される。遺伝子送達ベクターは、プロモーターに作動可能に連結される導入遺伝子（たとえば、酵素をコードする核酸）及びベクターが導入される宿主細胞における導入遺伝子の発現に必要とされる他の核酸エレメントを一般に含む。遺伝子発現に適したプロモーター及び送達構築物は、当技術分野において知られている。組換えプラスミドはまた、細胞における酵素の発現のための誘発性の又は調節可能なプロモーターを含むこともできる。
【００５６】
様々な遺伝子送達運搬手段は、当技術分野において知られており、ウイルス及び非ウイルス（たとえばネイキッドＤＮＡ、プラスミド）ベクターを含む。遺伝子送達に適したウイルスベクターは、当業者らに知られている。そのようなウイルスベクターは、たとえば、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、及びマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に由来するベクターを含む。ウイルスベクターは、複製する又は複製しないウイルスベクターとすることができる。そのようなベクターは、本明細書において開示される若しくは引用される又はその他当業者らに知られている方法を使用して、多くの適切な宿主細胞の中に導入することができる。
【００５７】
遺伝子送達のための非ウイルスベクターは、とりわけ、ネイキッドＤＮＡ、プラスミド、トランスポゾン、及びｍＲＮＡを含む。非限定的な例は、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ｐＲＳＥＴ又はｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）を含む。そのようなベクターは、本明細書において開示される若しくは引用される又はその他当業者らに知られている方法を使用して、多くの適切な宿主細胞の中に導入することができる。
【００５８】
ある実施形態では、ベクターは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、アンピシリン抵抗性遺伝子（Ａｍｐ）などのような選択マーカーを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はｍＣｈｅｒｒｙなどのような蛍光タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩの間のｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの中にサブクローニングするのに適している。いくつかの実施形態では、ベクターは、所望の遺伝子の挿入のためのマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含有する。
【００５９】
遺伝子コードは、ほとんどのアミノ酸が多数のコドン（「シノニム」又は「同義」コドンと呼ばれる）によって表されるという点で縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度が、非ランダムであり且つ特定の三つ組コドンに偏っていることは、当技術分野において理解されている。したがって、いくつかの実施形態では、ベクターは、特定のタイプの宿主細胞における発現のために最適化された（たとえばコドン最適化を通して）ヌクレオチド配列を含む。コドン最適化は、興味があるタンパク質をコードしているポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにおける特定のコドンを、同じアミノ酸をコードするが、核酸が発現されている宿主細胞において一般的に使用される／認識されるコドンと交換するように修飾されるプロセスを意味する。いくつかの態様では、本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、Ｔ細胞における発現のためにコドン最適化される。
【００６０】
エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）受容体及びその突然変異体
本明細書において使用されるように、「Ｅｐｏ受容体」という用語は、エリスロポイエチンに結合するタンパク質を指し、これは、糖タンパク質サイトカインである。特定のＥｐｏ受容体及びその突然変異体は、実施例において示される。
【００６１】
突然変異型Ｅｐｏ受容体の例は、切断型Ｅｐｏ受容体を含み、これは、フレームシフト、挿入、及び欠失を含む、いくつかの様々なタイプの突然変異によって形成することができる。Ｃ末端負調節ドメインを欠く突然変異型Ｅｐｏ受容体は、赤血球においてＥｐｏ刺激に対して過感受性を呈する。１つの例は、中途終止コドンをコードするＥｐｏ受容体遺伝子のエキソン８内にナンセンス突然変異を有するＥｐｏ受容体をコードする核酸によって表される。そのような突然変異体は、赤血球前駆細胞においてＥｐｏシグナル伝達が強化された、ＥｐｏＲの切断型形態を産生することができる。ＥｐｏＲ突然変異体の１つの特定の例は、コドン４３９がトリプトファン（ＴＧＧ）の代わりに終止コドン（ＴＡＧ）をコードするように、ヌクレオチド６００２に突然変異を有する。
【００６２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物
図５Ａは、ヒンジ及び膜貫通ドメインに結びつけられた抗ＣＤ１９単鎖可変断片（抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ）である特定の構築物を示す。図５Ａの特定の例において、ヒンジ及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインである。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖは、抗ＣＤ１９可変軽鎖ドメイン、抗ＣＤ１９可変重鎖ドメイン、並びに可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインをつなぐリンカードメインを含む。可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインの相対的位置は、逆転させることができるが、共に、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインとして図５Ａにおいて示される膜貫通ドメインに対してＮ’末端にある。構築物はまた、ＣＤ８αシグナルペプチドなどのようなＮ末端シグナルペプチドを含むこともできる（配列番号２１及び２２を参照）。表面タンパク質のシグナルペプチドは、一般に適している。
【００６３】
様々なリンカードメインが、適している。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、（Ｇ４Ｓ）x（配列番号２４）とすることができ、ｘは、１〜１００の整数である；好ましくは、ｘは、１〜１０の整数である；さらにより好ましくは、ｘは、２〜５の整数である。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、（Ｇ４Ｓ）3（配列番号２５）とすることができる。他の実施形態では、リンカードメインは、１つ又はそれ以上のグリシン残基（たとえば（Ｇ）y（配列番号２６）とすることができ、ｙは、２〜１００の整数である。他の実施形態では、リンカードメインは、（ＥＡＡＡＫ）3（配列番号２７）、（Ｇ４Ｓ）x（配列番号２４）、（Ｇ４Ｓ）3（配列番号２５）、及び（Ｇ）y（配列番号２６）とすることができ、可動性リンカーの例となるが、（ＥＡＡＡＫ）3（配列番号２７）は、より剛性のリンカーの例となる。
【００６４】
様々なヒンジ及び膜貫通ドメインが、適している。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインとすることができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインとすることができる。いくつかの実施形態では、ヒンジ及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインとすることができる。いくつかの実施形態では、ヒンジは、複数のアミノ酸残基とすることができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８β、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ６４、ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、又はＦＧＦＲ２Ｂ由来の膜貫通ドメインとすることができる。
【００６５】
図５Ａの実施形態は抗ＣＤ１９構築物であるが、類似するアプローチを、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、メソテリン、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、又はジシアロガングリオシド（ＧＤ）−２）などのような他の標的抗原に対する構築物を産出するために適用することができる。たとえば、図５Ａにおける模式図に基づいて、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ部分は、様々な標的抗原に特異的に結合する様々なｓｃＦｖと交換することができる。
【００６６】
構築物は、Ｅｐｏ受容体をさらにコードする。図５Ａの構築物において、Ｅｐｏ受容体は、ＴＧＧ（Ｔｒｐ）からＴＡＧ（終止）にアミノ酸４３９についてコドンを改変するために部位特異的突然変異ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して産出された突然変異体（ＥｐｏＲｍ）である。Ｅｐｏ受容体の他の突然変異体は、当技術分野において知られており、自然界に存在していない他のＥｐｏ受容体変異体を作り出すことができる。１つの例は、受容体の細胞内部分に存在する免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＩＭ）を欠くＥｐｏ受容体であり、これは、シグナル伝達特性が増強しているかもしれず、適している可能性がある。他の例は、細胞内部分において多数のＪＡＫ２結合ドメインを有するＥｐｏ受容体である。
【００６７】
構築物において、Ｅｐｏ受容体は、自己切断ペプチドである２Ａペプチドによってキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とつながれている。ＣＡＲとＥｐｏ受容体をつなぐことによって、両方のタンパク質の同時発現を、単一のベクターで達成することができる。２Ａペプチドの例は、Ｐ２Ａ（配列番号１３及び１４）、Ｔ２Ａ（配列番号１５及び１６）、Ｅ２Ａ（配列番号１７及び１８）、並びにＦ２Ａ（配列番号１９及び２０）であるが、他の２Ａペプチドが当技術分野において知られている。
【００６８】
トランスジェニック宿主細胞を作製するための方法
トランスジェニックＴ細胞などのようなトランスジェニック宿主細胞を作製するための方法が、本明細書において記載される。トランスジェニック宿主細胞は、たとえば、宿主細胞の中に、本明細書において記載される１つ又はそれ以上のベクターの実施形態を導入することによって作製することができる。
【００６９】
一実施形態では、方法は、Ｅｐｏ受容体及び抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζなどのようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞の中に導入することを含む。いくつかの実施形態では、バイシストロニックベクターなどのような核酸は、Ｅｐｏ受容体及びＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、２つの別々のベクターは、Ｅｐｏ受容体及びＣＡＲを発現する、トランスジェニックＴ細胞などのようなトランスジェニック細胞を作り出すために使用することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、１つ又はそれ以上の核酸は、宿主細胞のゲノムの中に統合される。いくつかの実施形態では、宿主ゲノムの中に統合される核酸は、たとえば相同組換え、ＣＲＩＳＰＲベースのシステム（たとえばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）、及びＴＡＬＥＮシステムを含む、当技術分野において知られている様々な適した手法のいずれかを使用して、宿主細胞の中に導入することができる。
【００７１】
様々な宿主細胞が適しており、免疫細胞が最も典型的である。Ｔ細胞（Ｔリンパ球）に加えて、ＥｐｏＲの発現は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、及び他の免疫細胞を活性化することが期待される。いくつかの場合では、Ｔ細胞は、ヒト末梢血Ｔリンパ球とすることができる。いくつかの場合では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とすることができる。いくつかの場合では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とすることができる。
【００７２】
いくつかの場合では、Ｔ細胞はまた、腫瘍抗原又はウイルス抗原に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をも発現することができる。いくつかの場合では、ＴＣＲは、内在性とすることができる。たとえば、Ｔ細胞は、腫瘍から抽出し、エクスビボにおいて増加させる腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）とすることができる。いくつかの場合では、ＴＣＲは、外来性とすることができる。たとえば、ＴＣＲは、ウイルス形質導入又は他の手段によってＴ細胞において発現させることができる。ＴＣＲは、ウイルスペプチド、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルスに由来する又は黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）などのように腫瘍細胞に由来するペプチドなどに対して特異的である。
【００７３】
値及び範囲
特に明記しない限り又は特に文脈及び当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、特に文脈が明確に指示しない限り、様々な実施形態において指定される範囲内の任意の特定の値又は部分範囲と考えることができる。数値に関する「約」は、特に指定のない限り又は特に文脈から明白でない限り、その値の±８％、いくつかの実施形態では±６％、いくつかの実施形態では±４％、いくつかの実施形態では±２％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％以内にある値の範囲を一般に指す。
【実施例】
【００７４】
材料及び方法
細胞
白血病細胞株ジャーカット、Ｎａｌｍ６、及びＲＳ４；１１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。ＣＤ１９＋Ｂ系列ＡＬＬ細胞株ＯＰ−１は、発明者らの研究室において発生させた。19緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はｍＣｈｅｒｒｙ及び内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有するマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）レトロウイルスベクターは、それぞれＮａｌｍ６においてホタルルシフェラーゼ遺伝子及びＯＰ−１においてｍＣｈｅｒｒｙを発現させるために使用した。細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ−１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で維持した。ヒト胚腎臓線維芽細胞２９３Ｔ（ＨＥＫ  ２９３Ｔ）細胞は、１０％  ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）中で培養した。
【００７５】
末梢血試料は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ又はＨｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅで健康な成人ドナーから寄付された、廃棄され且つ個人識別できないようにされた血小板の副産物から得た。単核細胞は、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度ステップ（Ｎｙｃｏｍｅｄ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）で遠心分離によって分離し、ＲＰＭＩ−１６４０中で２回洗浄した。Ｔ細胞は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により豊富にし、ＲＰＭＩ−１６４０、１０％  ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、及びインターロイキン−２（ＩＬ−２；１２０ＩＵ／ｍＬ；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で培養した。
【００７６】
遺伝子クローニング及びレトロウイルス形質導入
Ｅｐｏ受容体（ＥｐｏＲ）のｃＤＮＡは、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。突然変異型ＥｐｏＲ（ＥｐｏＲｍ）は、ＴＧＧ（Ｔｒｐ）からＴＡＧ（終止）にアミノ酸４３９についてコドンを改変するために部位特異的突然変異ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して産出した。20いくつかの実験では、Ｆｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２３））を、ＥｐｏＲ及びＥｐｏＲｍのＣ末端に追加した。抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲは、発明者らの研究室において以前に作製したものである。21ＥｐｏＲｍ−２Ａ−ＣＡＲは、フュージョンＰＣＲ（ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ）によって産出し、２Ａペプチド配列を通してＥｐｏＲｍ及び抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζを組み合わせた。22構築物及び発現カセットは、ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩ部位及びＸｈｏＩ部位の中にサブクローニングした。
【００７７】
レトロウイルス上清の調製及び形質導入は、以前に記載されるとおり実行した。23簡単に述べると、ｐＭＳＣＶレトロウイルスベクター−条件培地を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）コートポリプロピレンチューブに追加した；上清の遠心分離及び除去の後、Ｔ細胞（５×１０5）をチューブに追加し、１２時間３７℃で放置した；新しいウイルス上清を、別の日に２日連続で追加した。Ｔリンパ球は、次いで、形質導入の７〜２１日後の実験の時まで、ＦＢＳ、抗生物質、及び２００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を有するＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。
【００７８】
ＥｐｏＲ及びＣＡＲの発現の検出
ＥｐｏＲの表面発現は、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ヒトＥｐｏＲ抗体（３８４０９；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）により検出した。いくつかの実験では、ＥｐｏＲの表面染色を、サイトカインを含まない培地中で２時間培養し、続いて、１５〜６０分間３７℃で１０ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＥｐｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にインキュベーションした細胞に対して実行した。ＣＡＲの発現は、ビオチンコンジュゲートヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）、続いて、アロフィコシアニン（ＡＰＣ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）にコンジュゲートされたストレプトアビジンを使用して検出した。ＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ４（ＳＫ３）抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）からのものとした；ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ８（ＢＷ１３５／８０）抗体は、Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのものとした。すべての試験において、非反応性のアイソタイプマッチ抗体をコントロールとして使用した。細胞染色は、Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）と、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター又はＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して解析した。
【００７９】
２９３Ｔ細胞におけるＥｐｏＲ発現のウエスタンブロット解析は、以前に記載されるとおり実行した。24簡単に述べると、細胞可溶化物を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるタンパク質定量化の前に、ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｍ細胞溶解試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して抽出した。細胞可溶化物を、還元条件下での電気泳動法による１０％ポリアクリルアミドゲル上での分離の前に、４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファー（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により希釈した。ブロットした膜を、マウス抗Ｆｌａｇ（９Ａ３；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧによりプローブした；ウサギ抗ヒトグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（ＥＰＲ１６８９１；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、続いて、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ）をローディングコントロールとして使用した。抗体結合は、Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって見えるようにし、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって可視化した。
【００８０】
Ｅｐｏの結合及びシグナル伝達の検出
ＥｐｏＲへのＥｐｏの結合を決定するために、細胞を、室温で２時間、ビオチン化Ｅｐｏ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共にインキュベートした。ビオチン化Ｅｐｏは、ストレプトアビジン−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により可視化した。
【００８１】
Ｅｐｏシグナル伝達を検出するために、細胞を、１５分〜２４時間３７℃でＥｐｏ（０．０１〜１０ＩＵ／ｍＬ）により刺激する前に２時間、サイトカインを含まない培地中でインキュベートした。いくつかの実験では、細胞は、Ｅｐｏ刺激の前に１時間、０．１〜１０μＭのルキソリチニブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）又は０．５〜５ｎＭトファシチニブ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）により処理した。細胞を、次いで、１×ｌｙｓｅ／ｆｉｘバッファー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により固定し、Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により透過処理し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＡＦ６４７）（４７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にコンジュゲートされた抗ＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）により染色した。いくつかの実験では、ヒトＥｐｏの効果を、マウスＥｐｏ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の効果と比較した。
【００８２】
細胞増殖アッセイ
細胞周期に対するＥｐｏの効果を決定するために、細胞を、３日間、サイトカインを含まない培地中で培養し、続いて、１日間、１０ＩＵ／ｍＬのＥｐｏにより刺激した。ＤＮＡ合成を、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  ＡＦ６４７  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定し、ＤＮＡ含有量を、ＦｘＣｙｃｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定した。
【００８３】
細胞生存を評価するために、Ｔ細胞を、平底９６ウェル又は２４ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ）中でＥｐｏ（４〜１０ＩＵ／ｍＬ）あり又はなしで外来性サイトカイン不在の下で培養した。細胞増殖のために、Ｔ細胞を、平底９６ウェルプレートにおいて１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、標的細胞（ＯＰ−１細胞）と共培養した；Ｅｐｏ（１０ＩＵ／ｍＬ）を、２日毎に追加した。成長を阻害するために照射した（１００Ｇｙ）又はＳｔｒｅｃｋ細胞保存液（Ｓｔｒｅｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｏｍａｈａ、ＮＥ）により処理した標的細胞を、培養の初めに追加し、その後７日毎に追加した。いくつかの実験では、低用量（１０ＩＵ／ｍＬ）又は高用量（１００ＩＵ／ｍＬ）のＩＬ−２を、同様に培養物に追加した。ＧＦＰ＋Ｔ細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定した。
【００８４】
細胞傷害性及びサイトカイン産生
細胞傷害性について試験するために、ＣＤ１９＋標的細胞（ＯＰ−１、ＲＳ４；１１、及びＮａｌｍ６）を、カルセインレッド−オレンジＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により標識し、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）の中に置いた。Ｔ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比で追加し、３７℃及び５％ＣＯ２インキュベーターで４時間、標的細胞と共培養した。生存可能な標的細胞を、フローサイトメトリーによってカウントした。25長期の細胞傷害性については、ＯＰ−１  ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を９６ウェル平底プレートの中に置き、Ｔ細胞を様々なＥ：Ｔ比で追加し、１０ＩＵ／ｍＬのＥｐｏと共に３日間培養した。プレートは、データ収集（ウェル全体の画像処理）を４時間毎に収集するように設定したＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）中に置いた。
【００８５】
溶解性の顆粒のエキソサイトーシスを測定するために、Ｔ細胞を、９６ウェル丸底プレートにおいて４時間、１：１のＥ：Ｔ比でＯＰ−１細胞と共培養した。ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ１０７ａ抗体（Ｈ４Ａ３；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培養の始めに追加し、１時間後モネンシン（ＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ）を追加した。
【００８６】
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）産生を測定するために、１：１のＥ：Ｔ比の標的細胞及びエフェクター細胞を、上記のように平板培養した。１時間後に、ブレフェルジンＡ（ＢＤ  ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）を培養物に追加し、さらに５時間インキュベートした。その後に、ＰＥコンジュゲート抗ＩＦＮ−γ（クローン２５７２３．１１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は抗ＴＮＦ−α（クローン６４０１．１１１１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による細胞内染色を、フローサイトメトリーによる解析の前に行った。サイトカインプロファイルを評価するために、標的細胞及びエフェクター細胞を、２４時間、１０ＩＵ／ｍＬ  Ｅｐｏ不在の下で又はその存在下において１：４のＥ：Ｔ比で共培養した。培養上清を、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって解析するために収集した。
【００８７】
異種移植実験
インビボにおけるＴ細胞の生存を決定するために、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に、ＧＦＰだけ、ＣＡＲ、又はＥｐｏＲｍ−ＣＡＲを形質導入した１×１０7Ｔ細胞を静脈内注射した（ｉ．ｖ．）。何匹かのマウスでは、１００ＩＵのＥｐｏを、２週間２日毎に腹腔内注射した（ｉ．ｐ）。１３日目に、血液細胞を、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）によりカウントした。赤血球溶解溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による処理の後、細胞を、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４５（２Ｄ１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＰＥコンジュゲートマウス抗ＣＤ４５（３０−Ｆ１１；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）により染色した。
【００８８】
抗白血病活性を評価するために、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスに、１×１０7Ｔ細胞をｉ．ｖ．で、その２週後、ルシフェラーゼを発現する２．５×１０5Ｎａｌｍ６細胞をｉ．ｖ．で注射した。ＡＬＬ細胞移植は、水溶性のＤ−ルシフェリンカリウム塩のｉ．ｐ．注射後（１５０μｇ／ｇ体重；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−２００  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により発光シグナルを測定することによって決定した；シグナルは、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３．０ソフトウェアにより分析した。他のモデルでは、５×１０5Ｎａｌｍ６−ルシフェラーゼ細胞をｉ．ｖ．で、その４日後、１〜２×１０7Ｔ細胞をｉ．ｖ．で注射した。発光が１秒当たり１×１０10光子に達したら又は安楽死を正当化する身体的徴候がある場合それより前にマウスを安楽死させた。
【００８９】
Ｔ細胞の抗白血病活性を試験するための他のモデルでは、ルシフェラーゼを形質導入したＮａｌｍ６細胞をｉ．ｖ．注射し（マウス当たり５×１０5細胞）、その２日後、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲを発現しているＴ細胞を注射したが（マウス当たり２×１０7細胞、ｉ．ｖ．）、コントロールマウスはＴ細胞を受けなかった；何匹かのマウスは、週当たり３回、Ｅｐｏ（１００ＩＵ）をｉ．ｐ．で受けた。腫瘍細胞負荷量は、水溶性のＤ−ルシフェリンカリウム塩をｉ．ｐ．で注射した後（１５０μｇ／ｇ体重；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ−２００  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により決定した。発光は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３．０ソフトウェアにより分析した。発光が１秒当たり１×１０10光子に達したら又は安楽死を正当化する身体的徴候がある場合それより前にマウスを安楽死させた。
【００９０】
ジャーカット細胞成長曲線
細胞成長に対するＥｐｏＲ及びＥｐｏＲｍの発現の効果を決定するために、ＧＦＰのみ、ＥｐｏＲ、及びＥｐｏＲｍを形質導入し且つ同じ培養条件下で維持したジャーカット細胞の数を、定期的にカウントした。
【００９１】
結果
ＥｐｏＲはＴ細胞において発現され、Ｅｐｏ生存シグナルを媒介することができる
ＥｐｏＲ遺伝子によるジャーカット細胞のレトロウイルス形質導入は、受容体の高度な発現をもたらした（図１Ａ）。ＥｐｏＲを発現する細胞は、Ｅｐｏに結合することができたが、ＧＦＰだけを形質導入した細胞において検出可能な結合はなかった（図１Ｂ）。次に、発明者らは、ＥｐｏＲが末梢血Ｔリンパ球において発現され得るかどうかを決定した。この目的のために、発明者らは、抗ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体並びにＩＬ−２により末梢血単核細胞を刺激し、ＥｐｏＲ遺伝子又はＧＦＰだけでそれらを形質導入した。４人のドナー由来のＴ細胞による５回の実験において、ＥｐｏＲを発現する形質導入Ｔリンパ球（ＧＦＰ＋）のパーセンテージは、７４．９％±４．８％であった；ＥｐｏＲは、ＧＦＰのみを形質導入した細胞において検出不可能であった（図１Ｃ）。
【００９２】
ＥｐｏＲが機能的であるかどうかを試験するために、発明者らは、１５分間、Ｅｐｏ（１０ＩＵ／ｍＬ）に、ＥｐｏＲを形質導入したＴリンパ球を曝露し、赤血球系細胞においてＥｐｏＲライゲーションによって引き起こされる下流の活性化シグナルの１つであるＳＴＡＴ５  Ｙ６４７のリン酸化を測定した。26,27３人のドナー由来のＴ細胞による実験では、ＧＦＰ＋ＥｐｏＲを形質導入したＴリンパ球の中のｐＳＴＡＴ５ポジティブ細胞のパーセンテージは、Ｅｐｏ曝露後に１．０％±０．９％から８５．９％±５．１％に増えた；それは、ＧＦＰのみを形質導入したＴリンパ球において本質的に不変のままであった（１．３％±０．４％から１．５％±０．７％）（図１Ｄ）。赤血球系細胞におけるＥｐｏＲライゲーションの後、ＪＡＫ２キナーゼは、ＳＴＡＴ５をリン酸化する。28ＪＡＫ１／２阻害剤ルキソリチニブへのＥｐｏＲ  Ｔリンパ球の曝露後に、29Ｅｐｏによって誘発されるＳＴＡＴ５リン酸化は、抑止された（図１Ｄ）。最後に、ＥｐｏＲを形質導入したＴ細胞へのＥｐｏ（４ＩＵ／ｍＬ）の追加は、外来性ＩＬ−２不在の下で、培養中のそれらの生存を支持した（図１Ｅ）。全体として、これらの結果は、ＥｐｏＲをＴリンパ球において発現させることができること及びＥｐｏへの曝露によってＥｐｏＲ発現Ｔリンパ球において生存シグナルを伝達することができることを示す。
【００９３】
ＥｐｏＲ突然変異体はＴ細胞においてＥｐｏＲ発現を増強させる
ＥｐｏＲエキソン８におけるナンセンス突然変異によって、赤血球前駆細胞におけるＥｐｏシグナル伝達が強化されたＥｐｏＲの切断型形態が産生され、結果として赤血球の生産が増えたことが以前に報告された。20,30発明者らは、トリプトファンをコードするコドン４３９（ＴＧＧ）の突然変異を挿入し、コドン４３９を終止コドンＴＡＧに変化させたＥｐｏＲ突然変異体（「ＥｐｏＲｍ」）をコードするｃＤＮＡを産出した。２９３Ｔ細胞においてｃＤＮＡを発現させた後に、発明者らは、コードされたタンパク質が、ＥｐｏＲの６２ｋＤａと比較して、ウェスタンブロッティングによって５４ｋＤａの予測サイズを有することを明らかにした（図２Ａ）。発明者らは、活性化末梢血Ｔリンパ球においてＥｐｏＲ及びＥｐｏＲｍを発現させ、ＥｐｏＲｍの発現のレベルが、同じＴ細胞において、野生型ＥｐｏＲ構築物について測定されるレベルよりも、一貫して高かったことを観察した（図２Ｂ）。したがって、７人のドナー由来のＴリンパ球による１８回の実験において、ＥｐｏＲを発現するＧＦＰ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＥｐｏＲｍについての９３．１±６．１％と比較して、７１．９％±１４．１％であった（対応のあるｔ検定によりＰ＜０．０００１）；平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、それぞれ３，６２０±２，４４９及び８，７７３±５，８５１であった（Ｐ＜０．０００１）（図２Ｃ）。ＥｐｏＲｍ発現は、細胞がＣＤ４＋であるか又はＣＤ８＋であるかどうかにかかわらず、より高度であった（図２Ｄ）。
【００９４】
ＥｐｏＲ又はＥｐｏＲｍを形質導入したＴ細胞における全体的なＧＦＰ発現に有意差はなかった：ＧＦＰ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＥｐｏＲで７５．２％±８．４％及びＥｐｏＲｍで８０．４％±７．５％であった；ＭＦＩは、それぞれ７，００３±２，８２０及び８，３３１±３，３４３であった（いずれの比較についてもＰ＞０．０５）。そのため、２つの受容体の間の発現における差異が、単に形質導入効率が異なることによるものであるといった可能性は低い。それでもやはり、発明者らは、この可能性について検討し、３回の実験において、所定のレベルのＧＦＰ発現に関する受容体発現のレベルについて詳細な解析を実行した。これらの測定値によると、ＥｐｏＲｍ発現は、ＥｐｏＲの発現よりも高度であった（図２Ｅ；３回の比較すべてについてＰ＜０．０００１）。
【００９５】
ＥｐｏＲｍのより高度な発現は、Ｅｐｏへの曝露後のより長い存続と関連した。３人のドナー由来のＴ細胞による実験において、ＥｐｏＲポジティブ細胞のパーセンテージにおける低下は、ＥｐｏＲｍを形質導入した細胞よりもＥｐｏＲを形質導入した細胞において、明確に大きかった（図２Ｆ）。
【００９６】
ＥｐｏＲｍのシグナル伝達特性
ＥｐｏＲｍのより高度で且つより長期の発現と一致して、ＥｐｏへのＴ細胞の曝露は、これらの細胞がＥｐｏＲｍを発現する場合、より活発な活性化をもたらした。ＥｐｏＲｍ  Ｔ細胞は、ＥｐｏＲ  Ｔ細胞よりもｐＳＴＡＴ５  Ｙ６４７リン酸化が高度で、これは、ＪＡＫ１／２阻害剤ルキソリチニブ（１０μＭ）への曝露によって抑制された（図３Ａ、Ｂ、Ｃ）。ＥｐｏＲｍによって引き起こされるより高度なＳＴＡＴ５リン酸化は、ＧＦＰのレベルに従うｐＳＴＡＴ５  Ｙ６４７  ＭＦＩの解析によって確証された。ＧＦＰによって測定されるレトロウイルス形質導入の任意の所定のレベルで、ｐＳＴＡＴ５  ＭＦＩは、ＥｐｏＲｍでより高く、これは、低レベルの形質導入でのｐＳＴＡＴ５シグナル伝達では、ほぼ横ばいであった（図３Ｂ）。Ｅｐｏによって引き起こされるＳＴＡＴ５リン酸化は、用量依存的であり、ＥｐｏＲｍは、ＳＴＡＴ５リン酸化を誘発するのに必要とするＥｐｏレベルが、より低かった。したがって、２回の実験において、０．１ＩＵ／ｍＬの用量による平均ｐＳＴＡＴ５  Ｙ６４７は、ＥｐｏＲｍで２９．１％であるのに対してＥｐｏＲについて８．９％であった；これは、１ＩＵ／ｍＬのＥｐｏでは６６．１％対８８．６％であった（図３Ｄ）。ＳＴＡＴ５リン酸化はまた、ＥｐｏＲを発現する細胞よりも、ＥｐｏＲｍを発現する細胞において、より持続的であった（図３Ｅ）。
【００９７】
２４時間のＥｐｏへの曝露は、Ｅｐｏ受容体を持つＴ細胞において、ＤＮＡ合成を誘起し、刺激は、ＥｐｏＲｍを発現するＴ細胞において、より高度であった（図４Ａ）。ＩＬ−２不在の下で、Ｔ細胞は、Ｅｐｏ受容体発現に関係なく急速に死滅した。しかしながら、Ｅｐｏを培養物に追加すると、Ｅｐｏ受容体を発現するＴ細胞は、少なくとも２週間存続し、ＥｐｏＲｍを発現するＴ細胞の培養物は、生じる細胞の数がより多かった（図４Ｂ）。
【００９８】
発明者らは、細胞が１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２の存在下において培養される場合、Ｅｐｏ刺激がＴ細胞回収率をさらに改善するかどうかを決定した。４人のドナー由来の細胞による実験では、ＥｐｏＲｍを形質導入したＴ細胞の回収率は、Ｅｐｏ（１０ＩＵ／ｍＬ）をＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）に追加した場合、７日間の培養後に有意に高かった（Ｐ＝０．０２０）；これらの条件下では、細胞回収率は、ＥｐｏＲを形質導入した細胞でよりも良好であった（Ｐ＝０．０１９）（図４Ｃ）。１４日間の長期にわたる別々の培養において、Ｅｐｏ受容体を発現するＴ細胞は、ＧＦＰのみを形質導入したＴ細胞よりも、大きく且つ持続的な増加を示す；ここでも、ＥｐｏＲｍ細胞は、ＥｐｏＲ細胞よりも、回収率が良かった（図４Ｄ）。
【００９９】
同時に発現されたＥｐｏＲｍ及びＣＡＲの機能的活性
前の実験は、ＥｐｏＲｍがより高度な発現を有し、Ｔ細胞において野生型Ｅｐｏ受容体よりも強力で且つ持続的なシグナルを産生することを示した。そのため、発明者らは、発明者らの研究室で開発した抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲをコードする遺伝子をさらに含有するバイシストロニックベクター中に、ＥｐｏＲｍをコードする遺伝子を組み込んだ（図５Ａ）。21Ｔリンパ球中へのこの構築物の形質導入は、ＥｐｏＲｍ及びＣＡＲの両方の発現をもたらし（図５Ｂ）、どちらの遺伝子も、単一遺伝子ベクターを形質導入した細胞のレベルに類似したレベルで発現された（図５Ｃ）。ＥｐｏＲｍが単独で発現されるかＣＡＲと組み合わせて発現されるかどうかにかかわらず、ＥｐｏＲｍの機能性は維持された（図５Ｄ）。
【０１００】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の機能は、ＥｐｏＲｍを発現する細胞においても保持された。したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞がＥｐｏＲｍを発現するかどうか又はＥｐｏが培養物中にあったかどうかに関係なく、ＣＤ１９＋ＡＬＬ細胞株ＯＰ−１細胞との共培養の４時間後にＣＤ１０７ａ発現によって測定されるように、細胞傷害性顆粒のエキソサイトーシスにおける差異はなかった（図８Ａ）。同じ培養条件下でＣＡＲ刺激によって引き起こされるＩＦＮγの分泌もまた、Ｅｐｏシグナル伝達によって影響を与えられなかったが、発明者らは、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＥｐｏＲｍを欠くＣＡＲ−Ｔ細胞よりも、Ｅｐｏの存在下において、より多くのＴＮＦαを分泌することを観察した（Ｐ＜０．００１）（図８Ｂ）。Ｅｐｏあり及びなしでＯＰ−１細胞と共培養したＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、概して類似したが、発明者らは、Ｅｐｏと培養した細胞においてＩＬ−６及びＩＬ−４のレベルが高く、ＩＬ−２のレベルが低かったことに注目した（図８Ｃ）。
【０１０１】
発明者らは、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ１９＋標的細胞を死滅させる能力を決定した。３つのＡＬＬ細胞株（ＯＰ−１、ＲＳ４；１１、及びＮａｌｍ６）による実験では、１：１のＥ：ＴでのこれらのＴ細胞の４時間の細胞傷害性は、Ｅｐｏ（１０ＩＵ／ｍＬ）を培養物に追加したかどうかに関係なく、ＣＡＲのみを形質導入したＴ細胞の細胞傷害性と区別がつかなかった（図５Ｅ）。しかしながら、細胞傷害性についてＥｐｏの存在下において７２時間にわたって試験した場合、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞による死滅は、低いＥ：Ｔ比（１：４、１：８）で、ＣＡＲ−Ｔ細胞よりも有意に高度であった（図５Ｆ）。
【０１０２】
ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＥｐｏ及びＩＬ−２の増殖シグナル
長期の培養においてＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞によって発揮されるより高度な死滅は、これらの細胞の増殖のより速い速度、それにより作り出されるより高いＥ：Ｔ比によって、説明されるかもしれない。この見解について試験するために、発明者らは、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ、ＣＡＲのみ、又はＧＦＰを形質導入したＴ細胞を、Ｓｔｒｅｃｋ処理又は照射ＯＰ−１細胞と共培養し、２週間にわたってＴ細胞成長をモニターした。発明者らは、培養物にＥｐｏ（１０ＩＵ／ｍＬ）を追加したが、外来性ＩＬ−２は追加しなかった。図６Ａに示されるように、３人のドナー由来のＴ細胞の増加は、ＣＡＲ−Ｔ細胞がＥｐｏＲｍを発現した場合、より大きく、ＣＡＲ駆動性の細胞増殖が、ＥｐｏＲｍシグナル伝達によって増強されることを示す。ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖は、ルキソリチニブ（１μＭ）によって抑止された（図６Ｂ）。Ｅｐｏ刺激が、外来性ＩＬ−２によってもたらされる刺激を大きくすることができるかどうかを決定するために、発明者らは、１０ＩＵ／ｍＬ（４人のドナー）又は１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（３人のドナー）の存在下において、７日後に、照射ＯＰ−１との共培養におけるＴ細胞回収率を評価した。ＩＬ−２及びＥｐｏの両方と共に培養したＣＡＲ刺激ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＩＬ−２のみと培養したものよりも、増加がかなり大きかった（図６Ｃ）。
【０１０３】
ＩＬ−２及びＥｐｏにより引き起こされるシグナル伝達の間の関係についてさらに決定するために、発明者らは、ＳＴＡＴ５  Ｙ６４７リン酸化を測定した。図６Ｄに示されるように、Ｅｐｏ及びＩＬ−２に曝露された細胞は、いずれかの成長因子に曝露された細胞よりも高いｐＳＴＡＴ５  ＭＦＩを有した。横方向の比較では、１ＩＵ／ｍＬのＥｐｏによって誘発されるｐＳＴＡＴ５レベルは、５０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２によって誘発されるものよりも有意に高く（Ｐ＝０．００１９）、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２によって誘発されるものを上回った（図６Ｅ）。最後に、発明者らは、Ｅｐｏ（１０ＩＵ／ｍＬ）又はＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）のいずれかに曝露されたＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ  Ｔ細胞のＪＡＫ阻害剤に対する相対的感受性を決定した。発明者らは、ＪＡＫ３を主に阻害するトファシチニブ並びにＪＡＫ１及びＪＡＫ２シグナル伝達を主に阻害するルキソリチニブを使用した。29,31ＩＬ−２によって引き起こされるＳＴＡＴ５  Ｙ６４７リン酸化を完全に抑止した濃度では、阻害剤は、Ｅｐｏシグナル伝達に対する効果を有していなかった（図６Ｆ）。したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＥｐｏＲｍシグナル伝達は、ＩＬ−２とは別個であるシグナル伝達カスケードを引き起こし、ＩＬ−２の増殖刺激を増強させる。
【０１０４】
異種移植モデル
インビボにおけるＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗白血病活性の評価を開始するために、発明者らは、ルシフェラーゼ標識ＣＤ１９＋Ｎａｌｍ６  ＡＬＬ細胞を５匹のＮＳＧマウスにｉ．ｖ．で注入した。２日後に移植を確認した後、４匹のマウスはＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞をｉ．ｖ．で受け、１匹は未処理のままにした。図７Ａ及びＢに示されるように、ＡＬＬ細胞は、未処理のマウスにおいて急速に増加したが、処理したマウスは、白血病細胞注入の２ヵ月後に寛解状態にあった。注目すべきことに、２週間の週に３回のこれらのマウスのうちの２匹における１００ＩＵ  Ｅｐｏのｉ．ｐ．での注射は、ＥｐｏＲ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗白血病活性に影響を与えなかった（図７Ａ）。
【０１０５】
実験の第２のセットでは、ＣＡＲ又はＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ又はＧＦＰだけを形質導入したＴリンパ球を、ＮＳＧマウスの中にｉ．ｖ．注射した。注射後１３日目に、末梢血を、ＧＦＰ及びヒトＣＤ４５を発現する細胞の存在について検査した。図７Ｃ及びＤに示されるように、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を注射したマウスにおけるＧＦＰ＋／ｈＣＤ４５＋細胞のレベルは、ＧＦＰのみを又はＥｐｏＲｍを欠くＣＡＲを形質導入した細胞を注射したマウスにおいて測定されたレベルよりも高かった；後者のグループにおける２週間週に３回の１００ＩＵ  Ｅｐｏのｉ．ｐ．での注射は、細胞数を有意には増やさなかった。ＧＦＰ＋／ｈＣＤ４５＋細胞のレベルは、Ｅｐｏ  ｉ．ｐ．注射を受けたＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を注射したマウスにおいて最も高かった。しかしながら、特記される点として、ＧＦＰ＋／ｈＣＤ４５＋細胞において有意に増えたことは、Ｅｐｏ注射を受けなかったマウスにおいて明白であったが、レベルは、Ｅｐｏを補足したものよりも低かった。この結果は、内在性マウスＥｐｏが、ヒトＥｐｏＲｍを発現する細胞を刺激するかもしれないことを示唆した。実際に、マウス及びヒトＥｐｏの遺伝子の間にかなりの相同性がある。32マウスＥｐｏがＴ細胞においてヒトＥｐｏＲｍを通してのシグナルを誘発することができるかどうかを決定するために、発明者らは、マウス及びヒトＥｐｏ刺激後のｐＳＴＡＴ５  Ｙ６４７について検査した。図７Ｅに示されるように、いずれも、ｐＳＴＡＴ５が同様に増え、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞がヒトＥｐｏの補足なしで注入された場合に、ＧＦＰ＋／ｈＣＤ４５＋細胞が相対的に増えることが観察されることについての説明を提供する。
【０１０６】
ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の数がインビボにおいて増えることがＡＬＬ移植に対するすぐれた保護をもたらすかどうかを評価するために、発明者らは、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスにおいてＴ細胞をｉ．ｖ．で注射し、その１４日後、Ｎａｌｍ６細胞をｉ．ｖ．注射した。ＡＬＬ細胞の移植は、ＣＡＲ−Ｔ細胞によっては遅延したのみであったが、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞によって完全に抑止された（図９Ａ及び９Ｂ）。ＡＬＬ細胞注入の２ヵ月後、ＡＬＬ移植が、ＣＡＲ−Ｔ細胞を注射した５匹すべてのマウスにおいて見られたが、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を注射した５匹のマウスのいずれも、ＡＬＬを有していなかった（フィッシャーの直接検定によってＰ＝０．００７９）。１３日目、ＡＬＬ細胞接種の１日前、外来性Ｅｐｏなしの状態で、末梢血リンパ系細胞の中のＣＡＲ−Ｔ細胞のパーセンテージは、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞に対して１８．８％±６．７％対４８．９％±１７．０％であった（Ｐ＝０．００６２）（図９Ｃ）。ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞のレベルは、その後の時点で、ＣＡＲ−Ｔ細胞よりもより高いままであった。
【０１０７】
別のモデルでは、Ｎａｌｍ６細胞を、最初に、ｉ．ｖ．注射によってＮＯＤ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスに移植した。４日目に、マウスは、類似する腫瘍量を有する４つのグループに割り当てた；３つのグループは、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はＧＦＰのみを形質導入したＴ細胞のいずれかをｉ．ｖ．注射によって受けた；第４のグループは、組織培養培地のみを受けた。ＡＬＬ細胞は、未処理のマウスにおいて及びＣＡＲを有していないコントロールＴ細胞を受けたマウスにおいて急速に増加した。ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は共に、白血病シグナルを著しく低下させた（図９Ｄ及び９Ｅ）。しかしながら、注入後の５５日目に、ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を受けた９匹のいずれも再発しなかったのに対して、ＣＡＲ−Ｔ細胞により処理した１０匹のマウスのうち５匹は、再発した（フィッシャーの直接検定によってＰ＝０．０３２５）。図９Ｆは、２つのコホートの長期生存について組み合わせたものを示す；ＥｐｏＲｍ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞よりも有意に高い全体的な抗白血病効果をもたらした（ログランク検定によってＰ＝０．００７６）。
【０１０８】
ジャーカット細胞成長曲線
ＥｐｏＲ又はＥｐｏＲｍのいずれの発現も、ジャーカット細胞の長期の細胞成長に悪影響を与えない（図１０）。
【０１０９】
実施形態
実施形態１．ａ）エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）受容体；ｂ）自己切断ペプチド又は配列内リボソーム進入部位；及びｃ）細胞表面受容体をコードする核酸を含むベクター。
【０１１０】
実施形態２．Ｅｐｏ受容体は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１のベクター。
【０１１１】
実施形態３．Ｅｐｏ受容体は、突然変異型Ｅｐｏ受容体である、実施形態１のベクター。
【０１１２】
実施形態４．核酸は、Ｅｐｏ受容体のエキソン８内に終止コドンをコードする突然変異を有する、実施形態３のベクター。
【０１１３】
実施形態５．Ｅｐｏ受容体は、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態３のベクター。
【０１１４】
実施形態６．核酸は、Ｅｐｏ受容体に対してＣ末端にあるＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２３））をさらにコードする、実施形態１〜５のいずれかのベクター。
【０１１５】
実施形態７．核酸は、自己切断ペプチドを含む、実施形態１〜６のいずれかのベクター。
【０１１６】
実施形態８．自己切断ペプチドは、２Ａペプチドである、実施形態７のベクター。
【０１１７】
実施形態９．２Ａペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである、実施形態８のベクター。
【０１１８】
実施形態１０．シグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチドである、実施形態１〜９のいずれか１つのベクター。
【０１１９】
実施形態１１．細胞表面受容体は、標的細胞抗原に結合する細胞外受容体ドメインを含む、実施形態１０のベクター。
【０１２０】
実施形態１２．細胞表面受容体は、ｉ）シグナルペプチド；ｉｉ）標的細胞抗原に結合する細胞外受容体ドメイン；ｉｉｉ）細胞の表面上の細胞外受容体ドメインを固定するヒンジ及び膜貫通ドメイン；並びにｉｖ）エフェクタードメインを含むキメラ抗原受容体である、実施形態１〜１０のいずれか１つのベクター。
【０１２１】
実施形態１３．細胞外受容体ドメインは、リンカードメインによってつながれる可変免疫グロブリン軽鎖ドメイン及び可変免疫グロブリン重鎖ドメインを含む、実施形態１１又は１２のベクター。
【０１２２】
実施形態１４．リンカードメインは、（Ｇ４Ｓ）x（配列番号２４）であり、ｘは、１〜１００の整数である、実施形態１３のベクター。
【０１２３】
実施形態１５．リンカードメインは、（Ｇ４Ｓ）3（配列番号２５）である、実施形態１３のベクター。
【０１２４】
実施形態１６．細胞外受容体ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態１２のベクター。
【０１２５】
実施形態１７．細胞表面受容体は、Ｔ細胞受容体である、実施形態１〜１０のいずれか１つのベクター。
【０１２６】
実施形態１８．細胞外受容体ドメインは、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、シングルドメイン抗体、又はその機能的誘導体若しくは変異体若しくは断片を含む、実施形態１１のベクター。
【０１２７】
実施形態１９．細胞外受容体ドメインは、免疫グロブリンＦｃ受容体を含む、実施形態１１のベクター。
【０１２８】
実施形態２０．免疫グロブリンＦｃ受容体は、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４である、実施形態１９のベクター。
【０１２９】
実施形態２１．細胞外受容体ドメインは、サイトカインを含む、実施形態１１のベクター。
【０１３０】
実施形態２２．サイトカインは、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−７、又はＩＬ−３である、実施形態２１のベクター。
【０１３１】
実施形態２３．細胞表面受容体は、免疫細胞を活性化する、実施形態１１のベクター。
【０１３２】
実施形態２４．細胞表面受容体は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、ＮＣＲ３、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、若しくはＩＣＯＳ又はその断片若しくはリガンドを含む、実施形態２３のベクター。
【０１３３】
実施形態２５．細胞表面受容体は、免疫細胞を阻害する、実施形態１１のベクター。
【０１３４】
実施形態２６．細胞表面受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ−１、若しくはＣＴＬＡ−４又はその断片若しくはリガンドを含む、実施形態２５のベクター。
【０１３５】
実施形態２７．細胞表面受容体は、サイトカインに対する受容体である、実施形態１１のベクター。
【０１３６】
実施形態２８．細胞表面受容体は、ＩＬ−６、ＩＬ−１、又はＴＮＦａｌｐｈａに対する受容体である、実施形態２７のベクター。
【０１３７】
実施形態２９．標的細胞抗原は、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異性抗原である、実施形態１〜２８のいずれか１つのベクター。
【０１３８】
実施形態３０．標的細胞抗原は、ウイルス、細菌、真菌、若しくは寄生虫関連抗原又はウイルス、細菌、真菌、若しくは寄生虫特異性抗原である、実施形態１〜２８のいずれか１つのベクター。
【０１３９】
実施形態３１．標的細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、メソテリン、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、又はジシアロガングリオシド（ＧＤ２）である、実施形態１〜２８のいずれか１つのベクター。
【０１４０】
実施形態３２．標的細胞抗原は、ＣＤ１９である、実施形態１〜２８のいずれか１つのベクター。
【０１４１】
実施形態３３．細胞外ドメインは、抗ＣＤ１９単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態１〜３２のいずれか１つのベクター。
【０１４２】
実施形態３４．ヒンジ及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインである、実施形態１〜３３のいずれか１つのベクター。
【０１４３】
実施形態３５．ヒンジは、複数のアミノ酸残基を含む、実施形態１〜３４のいずれか１つのベクター。
【０１４４】
実施形態３６．膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８β、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ６４、ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、又はＦＧＦＲ２Ｂ由来の膜貫通ドメインである、実施形態１〜３５のいずれか１つのベクター。
【０１４５】
実施形態３７．エフェクタードメインは、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含む、実施形態１〜３６のいずれか１つのベクター。
【０１４６】
実施形態３８．ＣＡＲは、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζである、実施形態１〜３７のいずれか１つのベクター。
【０１４７】
実施形態３９．突然変異型エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）受容体をコードする核酸を含むベクター。
【０１４８】
実施形態４０．核酸は、Ｅｐｏ受容体のエキソン８内に終止コドンをコードする突然変異を有する、実施形態３９のベクター。
【０１４９】
実施形態４１．突然変異型Ｅｐｏ受容体は、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態３９のベクター。
【０１５０】
実施形態４２．ベクターは、レトロウイルスである、実施形態１〜４１のいずれか１つのベクター。
【０１５１】
実施形態４３．ベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）レトロウイルスベクターである、実施形態１〜４２のいずれか１つのベクター。
【０１５２】
実施形態４４．ベクターは、蛍光タンパク質をさらにコードする、実施形態１〜４３のいずれか１つのベクター。
【０１５３】
実施形態４５．ベクターは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする、実施形態１〜４４のいずれか１つのベクター。
【０１５４】
実施形態４６．ベクターは、核酸の発現のための少なくとも１つの調節エレメントをさらにコードする、実施形態１〜４５のいずれか１つのベクター。
【０１５５】
実施形態４７．トランスジェニック哺乳動物宿主細胞を作製するための方法であって、実施形態１〜４６のいずれかのベクターを哺乳動物宿主細胞の中に導入することを含む方法。
【０１５６】
実施形態４８．哺乳動物宿主細胞は、免疫細胞である、実施形態４７の方法。
【０１５７】
実施形態４９．免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球／マクロファージ細胞、又は樹状細胞である、実施形態４８の方法。
【０１５８】
実施形態５０．免疫細胞は、Ｔ細胞である、実施形態４８の方法。
【０１５９】
実施形態５１．Ｔ細胞は、ヒト末梢血Ｔリンパ球である、実施形態５０の方法。
【０１６０】
実施形態５２．Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、実施形態５０の方法。
【０１６１】
実施形態５３．Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態５０の方法。
【０１６２】
実施形態５４．Ｔ細胞は、腫瘍抗原又はウイルス抗原に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに発現する、実施形態５０の方法。
【０１６３】
実施形態５５．ＴＣＲは、内在性である、実施形態５４の方法。
【０１６４】
実施形態５６．Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり、方法は、腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球を抽出すること及びエクスビボにおいてＴＩＬを増加させることをさらに含む、実施形態５５の方法。
【０１６５】
実施形態５７．ＴＣＲは、外来性である、実施形態５４の方法。
【０１６６】
実施形態５８．方法は、外来性ＴＣＲを発現するベクターをＴ細胞の中に導入することをさらに含む、実施形態５７の方法。
【０１６７】
実施形態５９．実施形態１〜４６のいずれか１つのベクターを含む哺乳動物免疫細胞。
【０１６８】
実施形態６０．哺乳動物免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球／マクロファージ細胞、又は樹状細胞である、実施形態５９の哺乳動物免疫細胞。
【０１６９】
実施形態６１．哺乳動物免疫細胞は、Ｔ細胞である、実施形態５９の哺乳動物免疫細胞。
【０１７０】
実施形態６２．Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である、実施形態６１の哺乳動物免疫細胞。
【０１７１】
実施形態６３．Ｔ細胞は、ヒト末梢血Ｔリンパ球である、実施形態６１の哺乳動物免疫細胞。
【０１７２】
実施形態６４．対象の中に哺乳動物Ｔ細胞を導入することを含む、哺乳動物においてＣＤ１９＋細胞の数を低下させるための方法であって、哺乳動物Ｔ細胞は、実施形態１〜４６のいずれかのベクターを含む方法。
【０１７３】
実施形態６５．哺乳動物は、ヒトである、実施形態６４に記載の方法。
【０１７４】
実施形態６６．哺乳動物Ｔ細胞は、哺乳動物から単離される自己由来の細胞である、実施形態６４〜６５のいずれかの方法。
【０１７５】
実施形態６７．哺乳動物Ｔ細胞は、ドナーから単離される同種異系の細胞である、実施形態６４〜６５のいずれかの方法。
【０１７６】
実施形態６８．対象にＥｐｏを投与することをさらに含む、実施形態６４〜６７のいずれかの方法。
【０１７７】
実施形態６９．対象にＩＬ−２を投与することをさらに含む、実施形態６４〜６８のいずれかの方法。
【０１７８】
実施形態７０．哺乳動物においてＣＤ１９＋細胞の数を低下させることにより、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を治療する、実施形態６４〜６９のいずれかの方法。
【０１７９】
実施形態７１．癌、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、又は寄生虫の治療又は予防をそれを必要とする哺乳動物においてするための医薬の製造における、実施形態１〜４６のいずれかに記載のベクターの使用。
【０１８０】
実施形態７２．哺乳動物においてＣＤ１９＋細胞の数を低下させるための、実施形態５９〜６３のいずれか１つに記載の哺乳動物免疫細胞の使用。
【０１８１】
実施形態７３．哺乳動物においてＣＤ１９＋細胞の数を低下させるための方法に使用するための、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載のベクター。
【０１８２】
実施形態７４．哺乳動物においてＣＤ１９＋細胞の数を低下させるための方法に使用するための、実施形態５９〜６３のいずれか１つに記載の哺乳動物免疫細胞。
【０１８３】
実施形態７５．トランスジェニック哺乳動物宿主細胞を作製するための方法であって、実施形態３９〜４６のいずれかのベクターを哺乳動物宿主細胞の中に導入することを含む方法。
【０１８４】
実施形態７６．哺乳動物宿主細胞は、免疫細胞である、実施形態７５の方法。
【０１８５】
実施形態７７．免疫細胞は、Ｔ細胞である、実施形態７６の方法。
【０１８６】
実施形態７８．Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、実施形態７７の方法。
【０１８７】
実施形態７９．免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞である、実施形態７６の方法。
【０１８８】
実施形態８０．実施形態３９〜４６のいずれか１つのベクターを含む哺乳動物免疫細胞。
【０１８９】
実施形態８１．哺乳動物免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球性／マクロファージ細胞、又は樹状細胞である、実施形態８０の哺乳動物免疫細胞。
【０１９０】
参考文献
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１０．Ｍａｕｄｅ  ＳＬ，Ｌａｅｔｓｃｈ  ＴＷ，Ｂｕｅｃｈｎｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１８；３７８（５）：４３９−４４８．
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【０１９１】
配列
配列番号１：Ｅｐｏ受容体（ＥｐｏＲ）のｃＤＮＡ：
【化１】
2021534770.tif 000003
【０１９２】
配列番号２：Ｅｐｏ受容体（ＥｐｏＲ）のアミノ酸：
【化２】
2021534770.tif 000004
【０１９３】
配列番号３：Ｆｌａｇタグを有するＥｐｏＲのｃＤＮＡ：
【化３】
2021534770.tif 000005
【０１９４】
配列番号４：Ｆｌａｇタグを有するＥｐｏＲのアミノ酸：
【化４】
2021534770.tif 000006
【０１９５】
配列番号５：突然変異型ＥｐｏＲ（ＥｐｏＲｍ）のｃＤＮＡ：
【化５】
2021534770.tif 000007
【０１９６】
配列番号６：突然変異型ＥｐｏＲ（ＥｐｏＲｍ）のアミノ酸：
【化６】
2021534770.tif 000008
【０１９７】
配列番号７：Ｆｌａｇタグを有するＥｐｏＲｍのｃＤＮＡ：
【化７】
2021534770.tif 000009
【０１９８】
配列番号８：Ｆｌａｇタグを有するＥｐｏＲｍのアミノ酸：
【化８】
2021534770.tif 000010
【０１９９】
配列番号９：抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲのｃＤＮＡ：
【化９】
2021534770.tif 000011
【０２００】
配列番号１０：抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲのアミノ酸：
【化１０】
2021534770.tif 000012
【０２０１】
配列番号１１：ＥｐｏＲｍ−２Ａ−ＣＡＲのｃＤＮＡ：
【化１１】
2021534770.tif 000013
【化１２】
2021534770.tif 000014
【化１３】
2021534770.tif 000015
【０２０２】
配列番号：１２：ＥｐｏＲｍ−２Ａ−ＣＡＲのアミノ酸：
【化１４】
2021534770.tif 000016
【０２０３】
配列番号１３：Ｐ２ＡのｃＤＮＡ：
【化１５】
2021534770.tif 000017
【０２０４】
配列番号１４：Ｐ２Ａのアミノ酸：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
【０２０５】
配列番号１５：Ｔ２ＡのｃＤＮＡ：
【化１６】
2021534770.tif 000018
【０２０６】
配列番号１６：Ｔ２Ａのアミノ酸：ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
【０２０７】
配列番号１７：Ｅ２ＡのｃＤＮＡ：
【化１７】
2021534770.tif 000019
【０２０８】
配列番号１８：Ｅ２Ａのアミノ酸：ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
【０２０９】
配列番号１９：Ｆ２ＡのｃＤＮＡ：
【化１８】
2021534770.tif 000020
【０２１０】
配列番号２０：Ｆ２Ａのアミノ酸：ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
【０２１１】
配列番号２１：ＣＤ８αシグナルペプチドのｃＤＮＡ：
【化１９】
2021534770.tif 000021
【０２１２】
配列番号２２：ＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
【０２１３】
参照による援用；等価物
本明細書において引用されるすべての特許、公開出願、及び参考文献の教示は、それらの全体が参照によって援用される。
【０２１４】
例示の実施形態について詳細に示し、記載したが、添付の特許請求の範囲によって包含される実施形態の範囲から逸脱することなく、形態及び細部において様々な変更を実施形態において行うことができることが、当業者らによって理解されるであろう。
【図１−１】
2021534770.tif 000022
【図１−２】
2021534770.tif 000023
【図１−３】
2021534770.tif 000024
【図１−４】
2021534770.tif 000025
【図２−１】
2021534770.tif 000026
【図２−２】
2021534770.tif 000027
【図２−３】
2021534770.tif 000028
【図２−４】
2021534770.tif 000029
【図２−５】
2021534770.tif 000030
【図３−１】
2021534770.tif 000031
【図３−２】
2021534770.tif 000032
【図３−３】
2021534770.tif 000033
【図４−１】
2021534770.tif 000034
【図４−２】
2021534770.tif 000035
【図４−３】
2021534770.tif 000036
【図５−１】
2021534770.tif 000037
【図５−２】
2021534770.tif 000038
【図５−３】
2021534770.tif 000039
【図５−４】
2021534770.tif 000040
【図５−５】
2021534770.tif 000041
【図５−６】
2021534770.tif 000042
【図６−１】
2021534770.tif 000043
【図６−２】
2021534770.tif 000044
【図６−３】
2021534770.tif 000045
【図６−４】
2021534770.tif 000046
【図７−１】
2021534770.tif 000047
【図７−２】
2021534770.tif 000048
【図７−３】
2021534770.tif 000049
【図７−４】
2021534770.tif 000050
【図８−１】
2021534770.tif 000051
【図８−２】
2021534770.tif 000052
【図９−１】
2021534770.tif 000053
【図９−２】
2021534770.tif 000054
【図９−３】
2021534770.tif 000055
【図９−４】
2021534770.tif 000056
【図９−５】
2021534770.tif 000057
【図９−６】
2021534770.tif 000058
【図１０】
2021534770.tif 000059
【配列表】
2021534770000001.app
【国際調査報告】
2021534770.tif 000060
2021534770.tif 000061
2021534770.tif 000062