(57)【要約】  本発明は、タンパク質薬物、ゼラチンＡ、アルギン酸ナトリウム及び酸を含むコアセルベート組成物、並びにこれを含む創傷治療剤を提供する。本発明のタンパク質薬物、ゼラチンＡ、アルギン酸ナトリウム及び酸を含むコアセルベート組成物は、創傷治療分野でタンパク質薬物、特に、上皮成長因子を創傷部位に効果的に送達する創傷治療物質送達システムとして有用に使用できる。
2021509910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質薬物、ゼラチンＡ、アルギン酸ナトリウム及び酸を含むコアセルベート組成物。
【請求項２】
前記ゼラチンＡが２０〜２５ＫＤａの平均分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載のコアセルベート組成物。
【請求項３】
ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：０．２〜１．２の重量比であることを特徴とする、請求項１に記載のコアセルベート組成物。
【請求項４】
前記酸が酢酸５．４〜１６．３ｍＭの濃度であることを特徴とする、請求項１に記載のコアセルベート組成物。
【請求項５】
ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：１の重量比であり、前記酸が酢酸５．４〜１６．３ｍＭの濃度であることを特徴とする、請求項１に記載のコアセルベート組成物。
【請求項６】
ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：０．８の重量比であり、前記酸が酢酸５．４〜１０．９ｍＭの濃度であることを特徴とする、請求項１に記載のコアセルベート組成物。
【請求項７】
ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：０．４の重量比であり、前記酸が酢酸５．４〜８．２ｍＭの濃度であることを特徴とする、請求項１に記載のコアセルベート組成物。
【請求項８】
ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：１の重量比であり、前記酸が酢酸１６．３ｍＭの濃度であることを特徴とする、請求項１に記載のコアセルベート組成物。
【請求項９】
ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：０．４の重量比であり、前記酸が酢酸８．２ｍＭの濃度であることを特徴とする、請求項１に記載のコアセルベート組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質薬物が、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎ、ＧＨ）及び線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）よりなる群から選ばれた１以上のタンパク質薬物であることを特徴とする、請求項１に記載のコアセルベート組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のコアセルベート組成物を含む創傷治療剤。
【請求項１２】
前記創傷が慢性難治性創傷であることを特徴とする、請求項１１に記載の創傷治療剤。
【請求項１３】
前記創傷が糖尿病性潰瘍であることを特徴とする、請求項１１に記載の創傷治療剤。
【請求項１４】
前記創傷が糖尿病性足部潰瘍であることを特徴とする、請求項１１に記載の創傷治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質薬物を含むコアセルベート組成物及びこれを含む創傷治療剤に係り、より詳細には、タンパク質薬物、ゼラチンＡ、アルギン酸ナトリウム及び酸を含むコアセルベート組成物、並びにこれを含む創傷治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
創傷治癒過程は、複合細胞及び生化学的段階を経て組織の回復と再生につながる(Traversa, B., Sussman G. The australian journal of wound management 2001;9(4):161-167)。創傷に対する生理的及び細胞性反応は、損傷部位の解剖学的及び機能的完全性を完全に回復させる４段階で行われる(Lobamann R., Schultz G., Lehnert H. Diabetes care 2005;28(2):461-471)。すなわち、創傷治癒段階は、古典的に恒常性、炎症（急性期）、増殖（肉芽及び再上皮化）及び再構成と定義される。このような各段階は、部分的に重複し、ほとんどがサイトカイン及び成長因子によって調節される。組織の損傷後６時間以内に、血小板は、好中球、単球及び顆粒球などの炎症細胞を誘引する様々な成長因子であるサイトカインを分泌する。それらは、反応性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）とプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ、タンパク質分解酵素）を放出してバクテリアによる汚染を統制し、細胞残渣から傷をきれいにする。炎症細胞の濃度が炎症段階の末である４８時間後に最大に到達し、創傷治療過程中の増殖段階が重なる。マクロファージは、創傷治癒過程が成長段階に到達するように寄与する。これらは、創傷２日後に血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、マクロファージ血管新生因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）及びＴＧＦ−βを分泌する。ＰＤＧＦ、マクロファージ血管新生因子及びアンジオテンシンは、新しい血管の形成を促進して創傷に特有の肉芽組織を生成する。上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、ケラチン細胞成長因子及びＰＤＧＦは、表皮細胞が移動するように刺激し、分化（角質化）して、乾燥及び感染に対する細胞障壁を有する肉芽組織を生成する。マトリクスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ、ＭＭＰ）は、損傷した細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）タンパク質を除去することにより、細胞が移動して創傷で血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）と脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）を進行させる。
【０００３】
しかし、糖尿病性潰瘍などの慢性創傷は、前記創傷治癒過程へと進まない。多くの研究で機能障害細胞、成長因子、プロテアーゼ及びサイトカインの不均衡によって説明できる創傷治癒の欠陥が確認された(Lobamann R., Schultz G., Lehnert H. Diabetes care 2005;28(2):461-471)。
【０００４】
正常な創傷治癒とは異なり、糖尿病創傷などの難治性創傷における炎症反応が延長されて現れ、それに相応してプロテアーゼ反応が増加する。正常な創傷治癒の間に成長因子、サイトカイン、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）及び細胞外基質（ＥＣＭ）のバランスのとれた相互作用とは対照的に、難治性創傷ではタンパク質分解酵素のレベルが創傷部位に高く維持され、マトリクスタンパク質及び成長因子の分解による創傷治癒の低下につながる。よって、糖尿病性足部潰瘍（Ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｕｌｃｅｒ、ＤＦＵ）などの難治性創傷における効果的な創傷治癒のために成長因子送達システムの開発が必要である。
【０００５】
一方、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）は、創傷治癒に重要な役割を果たす。ＥＧＦは、Ｃｏｒｈｅｎによってマウスの顎下腺（ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｙ  ｇｌａｎｄ）から最初に単離された５３個のアミノ酸からなるポリペプチドである。ＥＧＦは、表皮細胞、線維芽細胞及び内皮細胞の増殖及び移動を刺激し、表皮再生、血管形成及び肉芽組織形成を促進する。創傷治癒に対するＥＧＦの効能は、急性創傷、慢性創傷及び火傷の傷において実験的及び臨床的に報告されている(Lau, H.C., Kim, A. Jounal of pharmaceutical investigation 2016; 46(5):403-423)。成長因子を使用するＤＦＵ用医薬品が多数市販されている。たとえば、Ｒｅｇｒａｎｅｘは、組換えヒト血小板由来成長因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）を含み、Ｆｉｂｌａｓｔは、組換えヒト線維芽細胞成長因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ｂＦＧＦ）を含む。ＥＧＦは、韓国ではイージーエフ（Ｅａｓｙｅｆ、大熊製薬、ソウル）であって、中国及び南米の一部の国で販売されている。ところが、成長因子を含有した医薬品は、限られた創傷被覆効果と臨床効能、常温保管条件での望ましくない保管／流通中の安定性、及び局所適用後の全身分布による安全性の問題など、いくつかの問題に直面している。限られた効能部分は創傷部位に存在する多数のタンパク質分解酵素に起因するが、成長因子が創傷部位に適用されるや否や、これらによって分解されるためである。よって、ＥＧＦの効能を向上させる一つの方法は、適切な薬物送達システムによってプロテアーゼからＥＧＦを保護する方法である。これにより、軟膏、ハイドロゲル、ナノ／微粒子などの多くの送達システムがＥＧＦのカプセル化及び制御放出用に研究されている。しかし、これらのシステムにおける低いローディング効率及び高い変性率に関する問題は未だ解決されていない(Wu, J., et al., Biomacromolecules 2016;17:2168-2177)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、タンパク質薬物を効果的にカプセル化して、タンパク質分解酵素の濃度が高い難治性創傷部位でタンパク質分解酵素からタンパク質薬物を効果的に保護することにより、創傷治癒効率を極大化することができる薬物送達システムについての研究中、アニオン性高分子電解質とカチオン性高分子電解質が適切な条件に調節されたコアセルベートシステムである、ゼラチンＡ、アルギン酸ナトリウム及び酸を含むコアセルベート組成物において、コアセルベートが効率よく形成されることにより、タンパク質薬物を効果的にカプセル化することができることを見出した。また、コアセルベートを凍結乾燥させた製剤は、創傷部位被覆効果及び持続性薬物放出効果を示して創傷治癒効果の改善を期待することができる。
【０００７】
したがって、本発明は、タンパク質薬物、ゼラチンＡ、アルギン酸ナトリウム及び酸を含むコアセルベート組成物（特に、凍結乾燥剤形）、並びにこれを含む創傷治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一観点によって、タンパク質薬物、ゼラチンＡ、アルギン酸ナトリウム及び酸を含むコアセルベート組成物が提供される。
【０００９】
一実施形態において、ゼラチンＡは、２０〜２５ＫＤａの平均分子量を有することができ、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：０．２〜１．２の重量比であり、前記酸が酢酸５．４〜１６．３ｍＭの濃度であり得る。
【００１０】
一実施形態において、コアセルベート組成物は、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：１の重量比であり、前記酸が酢酸５．４〜１６．３ｍＭの濃度であるか、或いは、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：０．８の重量比であり、前記酸が酢酸５．４〜１０．９ｍＭの濃度であるか、或いは、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：０．４の重量比であり、前記酸が酢酸５．４〜８．２ｍＭの濃度であり得る。好ましくは、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：１の重量比であり、前記酸が酢酸１６．３ｍＭの濃度であるか、或いは、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：０．４の重量比であり、前記酸が酢酸８．２ｍＭの濃度である。
【００１１】
一実施形態において、前記タンパク質薬物は、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎ、ＧＨ）及び線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）よりなる群から選ばれた１以上のタンパク質薬物であり得る。
【００１２】
本発明の他の観点によって、前記コアセルベート組成物を含む創傷治療剤が提供される。
【００１３】
一実施形態において、前記創傷は、慢性難治性創傷であって、糖尿病性潰瘍、特に糖尿病性足部潰瘍であり得る。
【発明の効果】
【００１４】
コアセルベートシステムを創傷治癒に適用するために、上皮成長因子をタンパク質薬物として、アルギン酸ナトリウムをアニオン性高分子として、ゼラチンＡをカチオン性高分子としてそれぞれ選定して、ｐＨ、アルギン酸ナトリウムとゼラチンＡの比率、高分子の分子量の条件変化に伴うコアセルベートの混濁度、粒子サイズ、多分散指数、ゼータ電位などの物理的特性の変化を測定することにより、混濁度と上皮成長因子の捕集能を基準に最適のコアセルベート組成を選定した。これにより得られた、最適化された本発明の上皮成長因子−コアセルベートシステムは、タンパク質薬物、ゼラチンＡ、アルギン酸ナトリウム及び酸を含むコアセルベート組成物であって、高分子量のゼラチンを用いたコアセルベート条件のすべての区間で沈殿が形成されたのに対し、低分子量のゼラチンを用いた本発明のコアセルベート組成物は、高分子量の使用時と同じ条件で沈殿せずにコアセルベートを形成し、高い上皮成長因子カプセル化効率を示した。また、トリプシンを用いたタンパク質分解実験でプロテアーゼから上皮成長因子が効果的に保護され、コアセルベートシステムから上皮成長因子が徐放出されることが確認されたとともに、細胞増殖及び移動促進効能に優れるうえ、創傷動物モデルでは傷を効果的に縫合することが明らかになった。
【００１５】
したがって、本発明のタンパク質薬物、ゼラチンＡ、アルギン酸ナトリウム及び酸を含むコアセルベート組成物は、創傷治療分野でタンパク質薬物、特に上皮成長因子を創傷部位に効果的に送達する創傷治療物質送達システムとして有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】各試料を様々な比率の高分子及び酢酸の濃度（０ｍＭ、１．１ｍＭ、２．７ｍＭ）で製造して形成された高分子複合体混合物の観察結果である。
【図２】各条件におけるＢＳＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果であって、各試料のローディングはウェルあたり２０μＬであり、赤色の四角形は各コアセルベーション状態でカプセル化されたＢＳＡを示す。
【図３】各条件におけるＥＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果であって、試料のローディングはウェルあたり２０μＬであった。
【図４】高分子ゼラチン（Ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇｅｌａｔｉｎ  Ａ、ＨＷＧＡ）と低分子ゼラチン（Ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇｅｌａｔｉｎ  Ａ、ＬＷＧＡ）を用いる複合体相の比較結果であって、様々な比率の高分子と酢酸の濃度から製造された混合物の高分子複合体相を観察した結果である。
【図５】ＨＷＧＡ：ＳＡで形成された凝集体と、ＬＷＧＡ：ＳＡで形成された均一なコロイドとを比較した光学顕微鏡（Ｓｏｍｅｔｅｃｈ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｅｒａ）写真である（３４００ｘ、ｂａｒｓ＝１０μｍ）。
【図６ａ】ウエスタンブロッティングによるタンパク質［ＥＧＦ（図６ａ）、ＧＨ（図６ｂ）、ＦＧＦ（図６ｃ）］の定性分析結果であって、各試料はウェルあたり２０μＬをローディングした（Ｐ：遊離ＥＧＦ１００μｇ／ｍｌ、Ｍ：マーカー、Ｓ：コアセルベート−上澄み液、Ｃ：コアセルベート−ペレット）。
【図６ｂ】ウエスタンブロッティングによるタンパク質［ＥＧＦ（図６ａ）、ＧＨ（図６ｂ）、ＦＧＦ（図６ｃ）］の定性分析結果であって、各試料はウェルあたり２０μＬをローディングした（Ｐ：遊離ＥＧＦ１００μｇ／ｍｌ、Ｍ：マーカー、Ｓ：コアセルベート−上澄み液、Ｃ：コアセルベート−ペレット）。
【図６ｃ】ウエスタンブロッティングによるタンパク質［ＥＧＦ（図６ａ）、ＧＨ（図６ｂ）、ＦＧＦ（図６ｃ）］の定性分析結果であって、各試料はウェルあたり２０μＬをローディングした（Ｐ：遊離ＥＧＦ１００μｇ／ｍｌ、Ｍ：マーカー、Ｓ：コアセルベート−上澄み液、Ｃ：コアセルベート−ペレット）。
【図７】ウエスタンブロッティングによるトリプシン消化試験の結果である（Ｐ：遊離ＥＧＦ、Ｔ：トリプシン−ＥＤＴＡ、Ｍ：ＥＧＦ−混合物、Ｃ：ＥＧＦ−コアセルベート）。
【図８】トランスウェル（３２℃、１５０ｒｐｍ）を用いた試験管内放出様相グラフであって、遊離ＥＧＦ、ＥＧＦ−混合物及びＥＧＦ−コアセルベート（ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４の比率）からＥＧＦの放出試験を行い、ＨＰＬＣで測定した。
【図９】ＥＧＦ−コアセルベートがＨＤＦの増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１０】ＥＧＦ−コアセルベートがＨＤＦにおける移動に及ぼす影響を示す定量分析結果である（Ｍ：混合物、Ｃ：コアセルベート、ＶＣ：ビヒクル対照群）。
【図１１】ＥＧＦ−コアセルベートがＨＤＦにおける移動に及ぼす影響を示す写真であって、１０ｎｇ／ｍＬの遊離ＥＧＦ、凍結乾燥試料（ビヒクル対照群、ＥＧＦ−混合物、ＥＧＦ−コアセルベート）が添加された培地で８時間インキュベーションした後、融合性ＨＤＦ単層（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ＨＤＦｓ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）上のスクラッチ損傷の写真である（スケールバー＝５００μｍ）。
【図１２】凍結乾燥したＥＧＦ−コアセルベートまたはＥＧＦ混合物の生体内試験への適用を示す写真である。
【図１３】ＳＴＺ−誘導糖尿病マウスモデルを用いて、生体内試験で創傷に及ぼすＥＧＦ−コアセルベートの効果を示すものであって、ＤＰＢＳ（正常、陰性対照群）、遊離−ＥＧＦ、ＥＧＦ−混合物、ＥＧＦ−コアセルベートで処理した創傷写真である。
【図１４】ＳＴＺ−誘導糖尿病マウスモデルを用いて、生体内試験で創傷に及ぼすＥＧＦ−コアセルベートの効果を示すものであって、ＤＰＢＳ（正常、陰性対照群）、遊離−ＥＧＦ、ＥＧＦ−混合物、ＥＧＦ−コアセルベートで処理した創傷の時間経過に伴う創傷縫合程度を元の創傷面積の％割合で表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、タンパク質薬物、ゼラチンＡ、アルギン酸ナトリウム及び酸を含むコアセルベート組成物を提供する。
【００１８】
コアセルベーション（ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ）は、相補的な巨大分子種の相互作用から溶媒親和性の低い巨大分子溶液を形成する高密度液相の自発的な形成である(Bohidar, H.B. Indian society for surface science and technology 2008;24:105-124)。カチオン及びアニオン高分子電解質由来の複合コアセルベーション反応のために、ｐＨを調整して、高分子に富む相である液体からそれぞれの正味荷電（ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅ）を中和させる。
【００１９】
複合コアセルベートは、水溶液中で非常に低い界面エネルギーとして知られており、これにより、コアセルベートが溶液で様々な粒子をカプセル化することができるようにする。コアセルベート薬物送達システムは、高い用量の薬物をカプセル化し、水性媒質中で自発的に形成される。コアセルベート相にタンパク質薬物がカプセル化されると、外部環境から保護され、生物学的活性が維持され得る。微粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの他のＤＤＳに比べてコアセルベートの特徴的な利点の一つは、コアセルベーションは迅速に進み、タンパク質薬物に有害でありうる有機溶媒を必要としないという点である。天然高分子だけでなく、合成高分子が活性成分のマイクロカプセル化及び制御放出に使用される。ところが、最近では、非毒性及び生分解性により天然高分子に転換される傾向にある。
【００２０】
本発明では、複合コアセルベーションのためのカチオン性及びアニオン性高分子電解質としてゼラチンＡ（ＧＡ）とアルギン酸ナトリウム（ＳＡ）を使用した。コラーゲン由来のゼラチンは、医薬品及び製薬製品に使用されてきたとともに、長期間臨床的に使用されてその安全性が証明された。
【００２１】
ゼラチンには二つのタイプがある。ゼラチンＡは、酸−硬化組織由来であり、タンパク質１００ｇあたり７８〜８０ｍＭの遊離カルボキシル基及び７．０〜９．０のｐＩを有する。ゼラチンＢは、石灰−硬化由来であり、タンパク質１００ｇあたり１００〜１１５ｍＭの遊離カルボキシル基及び４．７〜５．２のｐＩを有する。本発明では、低いｐＨ４〜５でゼラチンの正味荷電が陽性でなければならないので、ゼラチンＡを使用する。アルギン酸ナトリウム塩（ＳＡ）は、高い負電荷高分子であって、様々な投与形態及び製薬業界で広範囲に使用される。
【００２２】
本発明の組成物に使用される酸は、水溶液中で解離して水素イオンを生成し、塩基と中和して塩を作る物質であって、薬学的に用いられる通常の酸であれば可能であり、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、クエン酸、酢酸などが使用でき、好ましくは酢酸が使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明では、ＧＡ及びＳＡを用いたコアセルベート剤形を分子量、高分子比率及び反応ｐＨを変化させてスクリーニングすることにより、本発明の特定のコアセルベート組成物を導出し、導出されたコアセルベートシステムに対して物理的外形、均一性、サイズ分布、タンパク質カプセル化効率及びトリプシン消化の面で特性を評価した。創傷縫合能及び長期安定性を評価するために、ＥＧＦ−コアセルベートを凍結乾燥させて放出及び生体活性試験に使用した。
【００２４】
一実施形態において、ゼラチンＡは、平均分子量が２０〜２５ＫＤａであり、ゲル強度が９０〜１１０ｇであり得るが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明の一実施形態において、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率は１：０．２〜１．２の重量比であり、前記酸は酢酸５．４〜１６．３ｍＭの濃度であり得る。
【００２６】
一実施形態において、前記コアセルベート組成物は、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：１の重量比であり、前記酸が酢酸５．４〜１６．３ｍＭの濃度であるか、或いは、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：０．８の重量比であり、前記酸が酢酸５．４〜１０．９ｍＭの濃度であるか、或いは、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：０．４の重量比であり、前記酸が酢酸５．４〜８．２ｍＭの濃度であり得る。好ましくは、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：１の重量比であり、前記酸が酢酸１６．３ｍＭの濃度であるか、或いは、ゼラチンＡ：アルギン酸ナトリウムの比率が１：０．４の重量比であり、前記酸が酢酸８．２ｍＭの濃度である。
【００２７】
一実施形態において、タンパク質薬物は、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎ、ＧＨ）及び線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）よりなる群から選ばれた１以上のタンパク質薬物であり得る。
【００２８】
前記タンパク質薬物は、コアセルベート組成物に対して１００ｎｇ／ｇ〜１００ｕｇ／ｇの割合で含まれ、ＳＡの場合は１〜２．５ｍｇ／ｇで含まれ得る。
【００２９】
また、本発明は、前記コアセルベート組成物を含む創傷治療剤を提供する。
【００３０】
一実施形態において、創傷は、慢性難治性創傷であって、糖尿病性潰瘍、特に、糖尿病性足部潰瘍であり得る。
【００３１】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
＜実施例＞
Ｉ．試薬及び方法
１．試薬
ゲル強度３００ゼラチンＡ（高分子量、Ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇｅｌａｔｉｎ  Ａ、ＨＷＧＡ）（平均分子量１００ＫＤａ）、ゲル化強度９０〜１１０ゼラチンＡ（低分子量、Ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇｅｌａｔｉｎ  Ａ、ＬＷＧＡ）（平均分子量２０〜２５ＫＤａ）、及びトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＦＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。アルギン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ａｌｇｉｎａｔｅ、ＳＡ）、酢酸及びアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、ＡＣＮ）は、デゾン社（京畿道）から購入した。上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）は大熊製薬社から提供した。緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＤＰＢＳ）はＷｅｌｇｅｎｅ社（慶尚北道）から購入し、培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）はハイクローン社（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＳＡ）から購入し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）とウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）はＧｉｂｃｏ社（Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）から購入した。ヒト皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦ）はＬｏｎｚａ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）から購入した。細胞計数キット−８（Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８、ＣＣＫ−８）は、同仁化学研究所（Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）から購入した。
【００３３】
標準試薬（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｕａｌ  ｃｏｌｏｒ  ｓｔａｎｄａｒｄ）、ポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ＰＶＤＦ）メンブレン、３０％アクリルアミド／ビス（ａｃｒｙｌａｍｉｄ／Ｂｉｓ）溶液（２９：１）、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）溶液、過硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ、ＡＰＳ）、スタッキングゲルバッファ（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌ  ｂｕｆｆｅｒ）、分離バッファ（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）、１０ｘトリス／グリシン／ＳＤＳ（Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｓｉｎｅ／ＳＤＳ）緩衝液、１０ｘトリス／グリシン緩衝液、１０ｘトリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＴＢＳ）、テトラメチルエチレンジアミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、ＴＥＭＥＤ）は、Ｂｉｏ−ｒａｄ社（カリフォルニア州、米国）から購入した。ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、Ｍｉｌｌｉｏｒｅ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡのＢＳＡ）、０．２μｍのメンブレンフィルタ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ、ＰＡＬＬ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、米国）、ビシンコニン酸アッセイ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙ、ＢＣＡ）キット及び強化化学発光体（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、ＥＣＬ）ウエスタンブロッティング基質（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）、銀染色キット（ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ、Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）、２次抗体としてのウサギ抗マウスＨＲＰ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を購入した。
【００３４】
２．ＨＷＧＡ及びＳＡを用いたＢＳＡコアセルベート
Ａ．ＢＳＡ−コアセルベートの製造及び物理的特性の測定
ＢＳＡ−コアセルベートの製造にＨＷＧＡ、ＳＡ及びＢＳＡを用いた。１％ＨＷＧＡ（ｗ／ｗ、１０ｍｇ／ｇ）と０．５％ＳＡ（ｗ／ｗ、５ｍｇ／ｇ）蒸留水で製造して保存溶液として用いた。製造順序としては、まず、５４３．８ｍＭの酢酸溶液を蒸留水で希釈して酢酸の最終濃度が０ｍＭまたは１．１ｍＭまたは２．７ｍＭとなるようにした。その後、コアセルベートの最終高分子比率がＨＷＧＡ：ＳＡ＝１：０．１、１：０．１２５、１：０．１６７、または１：０．２５となるように計算し、各希釈した酢酸溶液に１％ＨＷＧＡ保存溶液を必要な分だけ添加した後、ＢＳＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を最終濃度１００μｇ／ｇとなるように加えた。最後に所望のＨＷＧＡ：ＳＡの比率に合わせて０．５％ＳＡ保存溶液を添加した後、均一に混ぜられるようにした。ＨＷＧＡ：ＳＡの様々な比率のコアセルベート試料内の最終高分子濃度は９．９、８．１、６．３、または５．４ｍｇ／ｇであった。
【００３５】
状態を肉眼で観察した後、互いに異なる酢酸濃度で３つの比率（１：０．１２５、１：０．１６７、１：０．２５）を用いて、ｐＨメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）によるｐＨ、４５０ｎｍでの混濁度（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、ゼータ電位、粒子サイズ及びＰＤＩ（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ［多分散指数］、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＵＫ）を測定した。
【００３６】
Ｂ．ＢＳＡ−コアセルベートのカプセル化効率
ＢＳＡ−コアセルベートを遠心分離（１４０００ｇ、１０分、４℃、ｘ２）によって上澄み液とペレットに分離した。これらをタンパク質の定量分析と定性分析に使用した。ペレットはコアセルベート相のみを含有したのに対し、上澄み液はほとんどが遊離タンパク質及び高分子であった。上澄み液及びペレットを各チューブに分離し、上澄み液と同じ体積のＰＢＳにペレットを溶解させた。前記各試料をＢＣＡ分析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用した。ＢＳＡ−コアセルベートのカプセル化効率を測定するために、試料を定量分析用ＢＣＡ分析キットで分析し、５６２ｎｍでマイクロプレートリーダーによって検出した。ＢＣＡ分析ではそれぞれのタンパク質濃度を検出することができないため、各試料中のＢＳＡ含有全体タンパク質を同定した。様々な条件でコアセルベート中のＢＳＡのみのカプセル化効率と比較するために、銀染色を用いた１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥを定性分析用として用いた。２０μＬの各試料を５ｘ試料緩衝液（Ｂｉｏ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）と混合し、１００℃で１０分間変性させた。その後、次の２つの段階を行った：（１）３０分間８０Ｖ、（２）１００分間１００Ｖ。完了後、銀染色キットに記載された方法に基づいて、銀染色を行った。
【００３７】
３．ＨＷＧＡ及びＳＡを用いたＥＧＦ−コアセルベート
ＨＷＧＡ、ＳＡ及びＥＧＦをＥＧＦ−コアセルベートの製造に使用した。ｐＨ、混濁度、ゼータ電位、粒子サイズ及びＰＤＩを測定するために、最終酢酸濃度を３つの条件（０ｍＭ、１．１ｍＭ、２．７ｍＭ）にし、ＨＷＧＡ：ＳＡの比率を３つの比率（１：０．１２５、１：０．１６７、１：０．２５）に選定して製造した。様々な条件の中でＢＳＡ−コアセルベートにおける優れた粒子品質とペレット中の高い量のＢＳＡを示す２つの条件に対して、ＥＧＦ−コアセルベートの上澄み液とペレットの定量及び定性分析を行った。前記分析方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル％以外は２．Ｂと同様にした。この時、ＥＧＦはＢＳＡ（６６ＫＤａ）よりも分子量が少ないので（６．４ＫＤａ）、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した。
【００３８】
分析の後、ＥＧＦのカプセル化効率を増加させるために、ＥＧＦ−コアセルベートの条件を変化させた。最終高分子濃度を５ｍｇ／ｇに固定し、ＨＷＧＡ：ＳＡの比率を１：１、１：０．８、１：０．４に変更し、酢酸の濃度を最終酢酸濃度が０ｍＭ、２．７ｍＭ、５．４ｍＭ、８．２ｍＭ、１０．９ｍＭ、１３．６ｍＭ及び１６．３ｍＭとなるようにして、５４３．８ｍＭの酢酸溶液を各条件の量だけ処理した。製造順序としては、高分子濃度を同一に固定するために、最終酢酸濃度が前記７つの条件となるように５４３．８ｍＭの酢酸を各条件に合わせて蒸留水で希釈した後、０．１％ＨＷＧＡ保存溶液２．５ｍｇを添加した。その後、ＥＧＦ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を最終濃度が１００μｇ／ｇとなるように加えた。最後に、０．５％ＳＡ保存溶液を１ｍｇまたは２ｍｇまたは２．５ｍｇだけ添加した。物理的特性を測定する方法は、混濁度以外は２．Ａに記載された方法と同様にした。混濁度は、紫外線分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）で１ｍＬの使い捨てキュベットを用いて測定した。
【００３９】
４．ＬＷＧＡ及びＳＡを用いたＥＧＦ−コアセルベート
Ａ．ＥＧＦ−コアセルベートの物理的特性
ＬＷＧＡ及びＳＡを用いたＥＧＦ−コアセルベートの条件は、セクション２．Ｂに記載された比率及び酢酸の濃度と同一であった。各試料を製造した後、試料の形成を観察した。物理的特性の測定方法は、２．Ｂと同様にした。
【００４０】
Ｂ．選定されたＥＧＦ−コアセルベートのカプセル化効率
ＬＷＧＡを用いたＥＧＦ−コアセルベートを分析した後、均一なコロイド（ＰＤＩ０．４以下）を形成しながら、４５０ｎｍでの１．５以上の吸光度を示すＥＧＦ−コアセルベートの条件を選定した。ＥＧＦ−コアセルベートの上澄み液及びペレットの定量分析及び定性分析のために、８つの条件のＥＧＦ−コアセルベートを選定した。上澄み液とペレットのタンパク質定量分析方法は３．Ａと同様にした。ＥＧＦの定性分析はウエスタンブロッティングで行った。３．Ａと同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、アクリルアミドゲルのタンパク質をＰＶＤＦ膜に１００Ｖで９０分間移した。室温（ＲＴ）で１時間５％ＢＳＡ（ＴＢＳＴ緩衝液−ＴＢＳ緩衝液中の０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）でブロッキングした後、４℃で１次抗体（ヒトＥＧＦ抗体）を一晩結合させた。前記膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）−接合二次抗体（ウサギ抗−マウスＨＲＰ、Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＨＲＰ）を用いてＲＴで１時間処理した。標識されたタンパク質バンドをＥＣＬウエスタンブロッティング基質と反応させて画像イメージ分析器（ｉｍａｇｅ  ｑｕａｎｔ  ｌａｓ  ４０００；ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）で測定した。
【００４１】
Ｃ．ＧＨ−コアセルベート及びＦＧＦ−コアセルベートの製造
成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎ、ＧＨ）及び線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）に対しても、前記組成で各試料を製造した後、試料の形成を観察し、物理的特性を測定した。
【００４２】
５．最適化されたＥＧＦ−コアセルベートのトリプシン消化試験
ペレット中のＥＧＦのカプセル化効率結果として選定された、ＬＷＧＡ利用ＥＧＦ−コアセルベートを下記最適化された条件で製造してトリプシン消化試験を行った。
【００４３】
（１）遊離ＥＧＦ（ＥＧＦ１０μｇ）
（２）１：１の比率のＥＧＦ混合物（ＥＧＦ１０μｇ、ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ２５０μｇ、酢酸添加なし）［比較例１］
（３）１：１の比率のＥＧＦ−コアセルベート（ＥＧＦ１０μｇ、ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ２５０μｇ、酢酸１６．３ｍＭ）［実施例１］
（４）１：０．４のＥＧＦ−混合物（ＥＧＦ１０μｇ、ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ１００μｇ、酢酸添加なし）［比較例２］
（５）１：０．４のＥＧＦ−コアセルベート（ＥＧＦ１０μｇ、ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ１００μｇ、８．２ｍＭの酢酸）［実施例２］
前記試料をチューブに添加して遠心分離した。０．０４％トリプシン−ＥＤＴＡを試料に添加して、３７℃で１時間または２時間０．０４％トリプシン−ＥＤＴＡとインキュベーションした。消化溶液に残っているＥＧＦの定性分析は、４．Ｂで行われたウエスタンブロッティングと同様の方法で行った。
【００４４】
６．凍結乾燥試料の製造
創傷縫合能及び長期保存性を向上させるために、凍結乾燥を行った。凍結乾燥試料の製造後、ＥＧＦ−コアセルベートの放出様相及び生体活性を測定するために、試験管内放出試験及び生体活性試験を行った。
【００４５】
Ａ．試験管内放出試験用試料の製造
ＥＧＦ−混合物及びＥＧＦ−コアセルベートをＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４（ＬＷＧＡ２．ｍｇ、ＳＡ１ｍｇ及びＥＧＦ１００μｇ）で酢酸添加なし及び８．２ｍＭの酢酸条件で製造した。凍結乾燥後、−８０℃で保管した。
【００４６】
Ｂ．試験管内細胞増殖及び移動試験のための試料の製造
ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：１の混合物（ＬＷＧＡ２５０ｇ、ＳＡ２５０μｇ、酢酸添加なし）、ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：１のコアセルベート（ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ２５０μｇ、酢酸１６．３ｍＭ）、ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４の混合物（ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ１００μｇ、酢酸添加なし）及びＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４のコアセルベート（ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ１００μｇ、酢酸８．２ｍＭ）；ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：１のＥＧＦ−混合物（ＥＧＦ１０ｎｇ、ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ２５０μｇ、酢酸添加なし）［比較例１］、ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：１のＥＧＦ−コアセルベート（ＥＧＦ１０ｎｇ、ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ２５０μｇ、酢酸１６．３ｍＭ）［実施例１］、ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４のＥＧＦ混合物（ＥＧＦ１０ｎｇ、ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ１００μｇ、酢酸添加なし）［比較例２］及びＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４のＥＧＦ−コアセルベート（ＥＧＦ１０ｎｇ、ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ１００μｇ、酢酸８．２ｍＭ）［実施例２］を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。その後、試料を凍結させるために−８０℃に置いた。凍結した試料を凍結乾燥機（Ｏｐｅｒｏｎ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ、Ｋｏｒｅａ）で凍結乾燥させた。凍結乾燥した試料は、使用するまで−２０℃で保管した。
【００４７】
Ｃ．生体内試験用試料の製造
ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４のＥＧＦ−混合物（ＥＧＦ１μｇ、ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ１００μｇ、酢酸添加なし）［比較例２］及びＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４のＥＧＦ−コアセルベート（ＥＧＦ１μｇ、ＬＷＧＡ２５０μｇ、ＳＡ１００μｇ、酢酸８．２ｍＭ）［実施例２］を９６ウェルプレートにそれぞれ添加した。その後、試料を凍結させるために、−８０℃に置いた。冷凍試料を凍結乾燥機で凍結乾燥させた。凍結乾燥した試料は、使用するまで−２０℃で保管した。
【００４８】
７．試験管内放出試験
前記各試料をトランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）インサートに入れ、試料の水和のために、７０μＬのＤＷを添加し、２４ウェルプレートに７００μＬのＤＰＢＳを入れた。１ｍｇ／ｇのＥＧＦ溶液を７０μＬだけ取ってトランスウェルインサートに入れ、７００μＬのＤＰＢＳの２４ウェルプレートを浸漬した。各サンプリング時点（１、２、４、６、８時間）の試料を製造した後、３２℃、１５０ｒｐｍでインキュベーションした。各サンプリング時点の後に、２４ウェルプレートから放出培地を取ってＥ−チューブに移し、終了時点まで４℃で保存した。放出が完了した後、試料のＥＧＦを０．４５μｍのシリンジフィルタで濾過し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｋｎａｕｅｒ、ベルリン、ドイツ）及びＨＰＬＣカラム（００Ｇ−４１６７−Ｅ０  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ５μｍ  Ｃ４  ３００Ａ  ２５０ｘ４．６ｍｍ、ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＵＳＡ）を用いて計算した。移動相は、溶液Ａ（ＤＷ中の０．１％ＴＦＡ）及び溶液Ｂ（ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ）を混合して使用した。
【００４９】
８．試験管内細胞活性の研究
Ａ．細胞増殖分析
細胞増殖及び移動能力を比較するためのヒト皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＨＤＦｓ）をＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳで培養した。細胞を６回継代培養時点に１００πディッシュで８０％密集度に到達するまで培養した。細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて分離した後、２４ウェルプレートにウェルあたり１ｘ１０４細胞を接種した。細胞を３７℃で２４時間インキュベーションした。その後、次の群［陽性対照群（１０％ＦＢＳ１ｍＬ）、陰性対照群（１％ＦＢＳ１ｍＬ）、ＥＧＦ（１％ＦＢＳ中の１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ  １ｍＬ）］を除いて、ＤＭＥＭに１％ＦＢＳを含有した培地をウェルあたり８００μＬに置き換えた。凍結乾燥試料をトランスウェルインサートに仕込み、１％ＦＢＳが含有された２００μＬの培地をインサートに添加した。インサートをウェルに入れた後、３７℃で４８時間インキュベーションした。ＨＤＦの増殖はＣＣＫ−８分析によって測定した。すべての結果は４５０ｎｍで測定し、陰性対照群に標準化した。
【００５０】
Ｂ．細胞移動分析
ＨＤＦを７回継代培養時点に１００πディッシュで８０％密集度に到達するまで培養した。２４ウェルプレートでウェルの中央に表示した後、０．１％ゼラチン溶液を添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベーションした後、ＤＰＢＳで１回洗浄し、ゼラチンでコーティングされた２４ウェルプレートを準備した。細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて分離した後、コーティングされたプレートにウェルあたり９×１０４細胞を接種した。細胞を一晩３７℃でインキュベーションした。その後、２００μＬのピペットチップを用いて細胞をスクラッチし残骸を除去するために、ウェルをＤＰＢＳで２回洗浄した。０．５％ＦＢＳが含有された１ｍＬの培地をウェルあたり添加し、スクラッチ０時間の時点を測定するために、顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で写真を撮った。次の群［陽性対照群（１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ  １ｍＬ）、陰性対照群（０．５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ  １ｍＬ）、ＥＧＦ（０．５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中の１０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ  １ｍＬ）］を除いては、０．５％ＦＢＳを含有した培地をウェルあたり８００μＬに置き換えた。凍結乾燥試料をトランスウェルインサートに仕込み、ＤＭＥＭに１％ＦＢＳが含有された２００μＬの培地をインサートに添加した。細胞を３７℃で８時間インキュベーションした後、スクラッチされた部分を撮った。スクラッチ幅は、イメージ−プロプラスソフトウェア（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、ＵＳＡ）を用いて測定し、下記計算式１によって計算した。
【００５１】
［計算式１］
創傷面積の倍数＝｛（Ａ０−Ａｔ）／Ａ０｝／陰性対照群の結果値
（式中、Ａ０は元の創傷面積であり、Ａｔは８時間後の創傷面積である。）
９．生体内研究
Ａ．ストレプトゾシン（ＳＴＺ）−誘発糖尿病マウスモデル
６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ほとんどの比較群でｎ＝５）を実験に使用した。すべての動物実験は、歯・医科大学の機関動物ケア及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ  Ｎｏ：１７００２８）の規定に基づいて行った。すべてのマウスは、実験前一週間の間、風通しの良い部屋の環境に順応するようにした。ストレプトゾシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ、Ｔｏｃｒｉｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）を投与する前に１２〜１４時間絶食させた後、マウスに１００ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）中のストレプトゾシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ、Ｔｏｃｒｉｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）を１００ｍｇ／ｋｇ、２回腹腔内注射してＳＴＺ糖尿病を誘導した後、１２時間絶食させて実験した。ＳＴＺ処理後の血糖値をアキュチェック活性キット（Ａｃｃｕ−ｃｈｅｃｋ  ａｃｔｉｖｅ  ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて３〜４日ごとに測定した。一般的に、２５０ｍｇ／ｄＬよりも高い血糖値を有するマウスが糖尿病誘発モデルとして使用される。これにより、本実験では、一定用量のＳＴＺ処理２週間後に２５０ｍｇ／ｄＬ以上の血糖値を有するマウスを選別して創傷治癒評価に使用した。
【００５２】
Ｂ．マウスの皮膚創傷治癒の分析
実験動物は５つの群に分類した。第１群（正常）は対照群（糖尿病のないマウス）であり、第２群（陰性対照群）、第３群（遊離ＥＧＦ）、第４群（１：０．４のＥＧＦ−混合物）及び第５群（１：０．４のＥＧＦ−コアセルベート）は糖尿病マウス群であった。ケタミン／ロムプン（ｋｅｔａｍｉｎｅ／ｒｏｍｐｕｎ、３：１）カクテルを腹腔内投与して弱く麻酔した状態で、マウス６匹の洗浄された背中の皮膚を剃った後、７０％エタノールで拭いた。その後、生検パンチ（ｂｉｏｐｓｙ  ｐｕｎｃｈ、Ｋａｉ  ｍｅｄｉｃａｌ、Ｏｙａｎａ、Ｊａｐａｎ）を用いて、各マウスの背中に創傷（ｆｕｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｗｏｕｎｄ、全層厚さの傷、直径５ｍｍ）を作った。第１群（正常）と第２群（陰性）はＤＰＢＳを対照群として処理した。第３群は１μｇ／１０μＬの遊離ＥＧＦを投与した。第４群は凍結乾燥したＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４のＥＧＦ−混合物を投与した。第５群は凍結乾燥したＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４のＥＧＦ−コアセルベートを投与した。第１群、第２群及び第３群は各試料１０μＬを創傷に適用した。第４群及び第５群は、各凍結乾燥試料を創傷に塗布し、試料の水和のために５μＬのＤＷを添加した。創傷を作った後、試料を２回（０日、３日）処理した。各マウスは、食べ物と水を備えた個別空間に維持させた。創傷面積を基準に創傷縫合率を計算するために、手術後の各時点（０、３、５、７、１０、１２、１４日）の創傷を写真撮影した。創傷面積は次の計算式２によって計算した。
【００５３】
［計算式２］
創傷部位（％）＝｛（Ａ０−Ａｔ）／Ａ０｝×１００
（式中、Ａ０は元の創傷面積であり、Ａｔは各時点の創傷面積である。）
ＩＩ．結果
１．ＨＷＧＡ、ＳＡ及びＢＳＡ間の相互作用
Ａ．ＢＳＡ−コアセルベートの物理的特性
ゼラチンＡ及びアルギン酸ナトリウムの比率を１：０．２５（ＨＷＧＡ：ＳＡ−１：０．２５）にして実験を開始した。同じ比率の高分子においてｐＨが減少すると、混濁度が増加し、均一なコアセルベートが形成された。沈殿を発生させず、コアセルベーションを形成するｐＨをｐＨｃと定義した。しかし、ＳＡの比率が減少するにつれて、同じ酢酸濃度で液状のコアセルベート相（ｐｈａｓｅ）ではなく、固体沈殿相が現れた。沈殿相では、凝集した形態の不均一な粒子が見られた（図１参照）。
【００５４】
ＨＷＧＡ：ＳＡ−１：０．１の比率を除いた群で、粒子品質評価指標に使用されるゼータ電位、粒子サイズ及びＰＤＩを測定し、その結果を下記表１に示した。表１に示すように、ＳＡの比率及びｐＨが低いほどゼータ電位が０に近く、粒子サイズが大きくなった。条件のＰＤＩが０．４よりも低く測定されたとき、均一なコアセルベートが形成された。
【００５５】
【表１】
2021509910.tif 000003
【００５６】
Ｂ．ＢＳＡ−コアセルベートのカプセル化効率
ＢＣＡ分析法を用いたタンパク質の定量分析結果、酢酸の濃度が高いほど、各割合でのペレットのタンパク質含有量が上澄み液でのそれよりも高かった（表２参照）。
【００５７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ＰＤＩが０．４未満で、混濁度が１以上であるコアセルベート（ＨＷＧＡ：ＳＡ−１：０．２５、２．７ｍＭの酢酸及びＨＷＧＡ：ＳＡ−１：０．１６７、２．７ｍＭの酢酸）は、他の場合よりもカプセル化効率が高かった。ＨＷＧＡ：ＳＡ−１：０．１２５、２．７ｍＭの酢酸試料も、高いカプセル化効率を示したが、固体沈殿物であった（図２参照）。
【００５８】
【表２】
2021509910.tif 000004
【００５９】
２．ＨＷＧＡ、ＳＡ及びＥＧＦ間の相互作用
Ａ．ＢＳＡ−コアセルベートの同一条件におけるＥＧＦの低いカプセル化効率
ＢＳＡ−コアセルベートシステムとの同一条件で、ＥＧＦ−コアセルベートの物理的特性は、ＢＳＡ−コアセルベートの条件と同様であった。同じ割合の高分子でｐＨが減少すると、混濁度が増加し、均一なコアセルベートが形成された。ところが、同じ酢酸濃度でＳＡの割合が低くなると、液体−コアセルベート相ではなく、固体−沈殿相を形成した。ＳＡの割合及びｐＨが低いほど、ゼータ電位が０に近く、粒子サイズがさらに大きかった。混濁度が１以上、ＰＤＩが０．４以下であることは、均一で高いカプセル化効率を示すＢＳＡ−コアセルベートの条件と同様であった（表３参照）。ＥＧＦ複合相を有するＨＷＧＡ及びＳＡの測定結果を下記表３に示した。
【００６０】
【表３】
2021509910.tif 000005
【００６１】
実験条件中、ＥＧＦのカプセル化効率を測定するために、２つの条件（［ＨＷＧＡ：ＳＡ−１：０．２５、２．７ｍＭの酢酸］及び［ＨＷＦＡ：ＳＡ−１：０．１６７、２．７ｍＭの酢酸］）を選定した。ＢＣＡ分析によって測定されたペレット中の総タンパク質量は、ＨＷＧＡ：ＳＡ−１：０．２５、２．７ｍＭの酢酸及びＨＷＧＡ：ＳＡ−１：０．１６７、２．７ｍＭの酢酸の場合において、それぞれ７６．０６％と８０．５９％であった（表４参照）。ところが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果ではペレット中のＥＧＦが上澄み液よりも低いことが分かった（図３参照）。下記表４に各条件におけるタンパク質のＢＣＡ分析結果を示した。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
Ｂ．ＥＧＦを含むＨＷＧＡ及びＳＡベースの変形コアセルベート剤形
より広い範囲でコアセルベートの形成有無を測定するために、ＨＷＧＡ及びＳＡの比率を１：１、１：０．８、１：０．４に固定し、酢酸の濃度を０ｍＭ、２．７ｍＭ、５．４ｍＭ、８．２ｍＭ、１０．９ｍＭ、１３．６ｍＭ及び１６．３ｍＭに設定した。ＥＧＦ−コアセルベートの最適条件を選定するために、各条件の混濁度、ゼータ電位、粒子サイズ及びＰＤＩを測定して評価した。ＨＷＧＡ：ＳＡコアセルベートの物理的特性を最適化するために、互いに異なる濃度の酢酸でＨＷＧＡ及びＳＡを試験した。混濁度が略０である０ｍＭ酢酸群は、透明な溶液状態であり、ＨＷＧＡ：ＳＡ−１：１、５．４ｍＭとＨＷＧＡ：ＳＡ−１：０．８、５．４ｍＭ、ＨＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４、２．７ｍＭでは、均一な混濁液を確認した。ところが、その他の試料はいずれも凝集し、ＰＤＩは０．４よりも高かった（表５参照）。均一なコアセルベートだけでなく、ＥＧＦの高いカプセル化効率を得ることができるコアセルベート条件をより広い条件で最適化するためには、高分子の割合及びｐＨ以外の他の要因を考慮しなければならない。下記表５にＨＷＧＡ及びＳＡを用いた変形剤形の測定結果を示した。これらは、様々な割合の高分子と酢酸の濃度で製造された。
【００６４】
【表５】
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【００６５】
これらは、様々な割合の高分子と酢酸の濃度で製造された。均一なコアセルベート（ＰＤＩ０．４以下）の条件と高い混濁度（１．５以上）は濃く表示した。
【００６６】
３．ＬＷＧＡを用いたＥＧＦ−コアセルベート剤形
Ａ．ＬＷＧＡを用いた均一なＥＧＦ−コアセルベート相の評価
より広い区間でコアセルベートを形成する条件を選定するために、ＨＷＧＡの代わりに低分子ゼラチンＡ（ゲル強度９０〜１１０（約２０〜２５ＫＤａ）、ＬＷＧＡ）を用いてコアセルベートを製造した。
【００６７】
ＬＷＧＡ及びＳＡを用いた濃度条件は、２．Ｂに記載された内容と同一である。様々な割合の高分子と酢酸の濃度で製造された混合物の高分子複合体相を観察した結果を図４に示した。図４に示すように、ＨＷＧＡ及びＳＡの使用時に固体沈殿を形成する一部の条件でＬＷＧＡ及びＳＡを使用すると、液状のコアセルベートを生成することが分かる。また、ＨＷＧＡ：ＳＡで形成された凝集体とＬＷＧＡ：ＳＡで形成された均一なコロイドの光学顕微鏡写真を図５に示した。
【００６８】
様々な条件の中で、均一でありながらもＰＤＩが０．４以下、混濁度が１．５以上である高混濁度条件のコアセルベートをコアセルベート条件の優れた特性として選択した。ｐＨが低いほど、ゼータ電位は０に近くなった（表６参照）。このような結果に基づいて、選択された条件でＥＧＦのカプセル化効率を測定するための定量及び定性分析を行った。ＬＷＧＡ及びＳＡを用いた変形剤形の測定結果を下記表６に示した。
【００６９】
【表６】
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【００７０】
これらは、様々な割合の高分子と酢酸の濃度で製造された。均一なコアセルベート（ＰＤＩ０．４以下）の条件と高い混濁度（１．５以上）は濃く表示した。
【００７１】
Ｂ．ＥＧＦ−コアセルベートの選定された条件での高いカプセル化効率
カプセル化効率を測定するために、ＰＤＩが０．４、混濁度が１．５以上である８つの条件（ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：１、８．２ｍＭ、１０．９ｍＭ、１３．６ｍＭ、１６．３ｍＭの酢酸、ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．８、８．２ｍＭ、１０．９ｍＭの酢酸、ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４、５．４ｍＭ、８．２ｍＭの酢酸）を選定した。ＢＣＡ分析で酢酸の濃度が高いほど（ｐＨが低いほど）、各ペレットでタンパク質のカプセル化効率が高くなった（表７参照）。ＢＣＡ分析に基づいたＥＧＦの定量分析結果を下記表７に示した。
【００７２】
【表７】
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【００７３】
ウエスタンブロッティングによるＥＧＦの定性分析結果、酢酸の濃度が高いほど各ペレットにおけるＥＧＦの封入効率が高いことが分かった。ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：１剤形中の１６．３ｍＭの酢酸条件でＥＧＦの封入効率が最も高く、ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．８及びＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４剤形中で、ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４  ８．２ｍＭの酢酸条件がカプセル化効率の面で最も優れた（図６ａ参照）。
【００７４】
Ｃ．ＧＨ−コアセルベートの物理的特性及びカプセル化効率
成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎ、ＧＨ）でコアセルベートを製造し、その形成有無及び物理的特性の測定結果を下記表８に示した。
【００７５】
【表８】
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【００７６】
表８に示すように、ＬＷＧＡ：ＳＡ＝１：０．２（酢酸２．７ｍＭ）剤形は、肉眼で均質に見えたが、ＰＤＩ値が０．４以上と測定され、多分散されていることを確認することができる（実験の経験から推定する）。
【００７７】
ＬＷＧＡ：ＳＡ＝１：０．２（酢酸５．４ｍＭ）剤形は、肉眼でも均質ではなく、凝集したことが分かった。ＰＤＩ値もやはり良くなく、Ｚ−平均サイズも２３９９．７と大きく測定された。混濁度は、沈殿物が下方に沈むことにより、他の試料に比べて低いことが測定された。
【００７８】
しかし、ＬＷＧＡ：ＳＡ＝１：０．４（酢酸５．４、８．２ｍＭ）、ＬＷＧＡ：ＳＡ＝１：０．８（酢酸８．２、１０．９ｍＭ）、ＬＷＧＡ：ＳＡ＝１：１（酢酸１３．６、１６．３ｍＭ）の場合、混濁度が１．５以上であり、ＰＤＩ値は０．４以下であって大量のコアセルベートがナノ単位の粒子に均質に製造されたことを確認した。
【００７９】
成長ホルモン（ＧＨ）のカプセル化効率を測定した結果、すべての区間でコアセルベート内によく捕集されたことを確認した（図６ｂ参照）。
【００８０】
Ｄ．ＦＧＦ−コアセルベートの物理的特性
線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）でコアセルベートを製造し、その形成有無及び物理的特性の測定結果を下記表９に示した。
【００８１】
【表９】
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【００８２】
表９に示すように、ｂＦＧＦの場合は、ＬＷＧＡ：ＳＡ＝１：１、１：０．８でのみコアセルベートを形成した。コアセルベートを形成する均質な４つの区間で物理的特性及びカプセル化効率を測定した。
【００８３】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のカプセル化効率を測定した結果、ＬＷＧＡ：ＳＡ＝１：１の条件で酢酸の濃度が高いほどコアセルベート捕集能が高くなることを確認した。また、ＥＧＦと同様に最大７０〜８０％のレベルで捕集されたことを確認した（１：１−４．４ｍＭ）（図６ｃ参照）。
【００８４】
４．トリプシン消化からのＥＧＦの保護効能評価
８つの条件のうち、ＥＧＦのカプセル化効率が相対的に高い２つの条件（ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：１、１６．３ｍＭの酢酸［実施例１］及びＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４、８．２ｍＭの酢酸［実施例２］）を選定し、コアセルベートがＥＧＦをプロテアーゼから保護するか否かを確認した。１時間〜２時間の間、３７℃、１００ｒｐｍで４１７μｇ／ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡでインキュベーションした後、遊離−ＥＧＦとＥＧＦ−混合物でＥＧＦをほとんど消化させた。ところが、ＥＧＦ−コアセルベート中のＥＧＦは２時間まで保護された（図７参照）。
【００８５】
５．ＥＧＦ−コアセルベートからの試験管内放出
創傷が治癒される間に持続的な方式で局所的送達を容易にするために、ＥＧＦ−コアセルベート及びＥＧＦ混合物を凍結乾燥させた。凍結乾燥した試料がトランスウェルと接触すると、直ちに水和してフィルムが形成される（図１２参照）。図８に示すように、ＥＧＦ−コアセルベートは、凍結乾燥ＥＧＦ−混合物及び遊離ＥＧＦ溶液と比較して、凍結乾燥したＥＧＦ−コアセルベートから徐放出を示した。
【００８６】
６．最適化されたＥＧＦ−コアセルベートの細胞生体活性促進
Ａ．細胞増殖分析
コアセルベートの２つの異なる条件で遊離−ＥＧＦ、剤形対照群（製剤の組成が同一であるが、薬物は含まれていない）、ＥＧＦ−混合物、ＥＧＦ−コアセルベートがＨＤＦの細胞増殖能力に及ぼす影響を細胞計数キット−８分析によって測定した。１０ｎｇ／ｍＬの遊離−ＥＧＦは、陰性対照群と比較してＨＤＦの増殖に有意な影響を及ぼさなかった。ところが、ＥＧＦ−混合物及びＥＧＦ−コアセルベートは、陰性対照群及び遊離ＥＧＦと比較してＨＤＦの増殖活性を有意に増加させた（図９参照）。
【００８７】
Ｂ．細胞移動分析
遊離−ＥＧＦ、剤形対照群（製剤の組成が同一であるが、薬物は含まれていない）、ＥＧＦ−混合物、ＥＧＦ−コアセルベート（２つの異なる条件のコアセルベート）がＨＤＦの細胞移動能力に及ぼす影響を、スクラッチ分析で試験館内の創傷縫合を誘導する活性で測定した。１０ｎｇ／ｍＬの遊離−ＥＧＦは、陰性対照群と比較してＨＤＦで有意な移動効果を示した。同じ濃度で、ＥＧＦ−コアセルベートは、陰性対照群、遊離−ＥＧＦ及びＥＧＦ混合物と比較しても、ＨＤＦの移動活性を有意に増加させた（図１０及び図１１を参照）。
【００８８】
７．最適化されたＥＧＦ−コアセルベートの創傷治癒促進
遊離−ＥＧＦ、ＥＧＦ−混合物及びＥＧＦ−コアセルベートが創傷縫合に及ぼす影響を、糖尿病誘発マウスモデルを用いて創傷から調べた。効能試験のために選ばれた２つの条件のうち、ＬＷＧＡ：ＳＡ−１：０．４、８．２ｍＭの酢酸ＥＧＦ−コアセルベート（以下、「最適化されたＥＧＦ−コアセルベート」という）がＬＷＧＡ：ＳＡ−１：１、１６．３ｍＭの酢酸ＥＧＦ−コアセルベートよりも高いカプセル化効率を示したので、生体内試験用に選定した。正常及び陰性対照群は、創傷にＤＰＢＳを投与した。遊離−ＥＧＦ群の場合は１μｇ／１０μＬ、ＥＧＦ−混合物及びＥＧＦ−コアセルベート群の場合は１μｇのＥＧＦ／凍結乾燥物質だけ投与した。凍結乾燥したＥＧＦ−混合物とＥＧＦ−コアセルベートを創傷部位に塗布し、５μＬのＤＷに浸した（図１２参照）。試料は、創傷後０日及び３日に２回処理した。創傷部位は１４日間観察した（ｎ＝５）。ＥＧＦ−コアセルベートで処理された創傷縫合は、試験期間にわたって陰性対照群、遊離−ＥＧＦ、ＥＧＦ−混合物に比べて効果的に加速化された。７日後、ＥＧＦ−コアセルベートの創傷は、糖尿病誘発群ではなく、正常群とほぼ同一であった。正常群及びＥＧＦ−コアセルベート群は、創傷縫合が１２日以内に加速化された（図１３及び図１４参照）。
【００８９】
ＩＩＩ．結論
本発明では、天然高分子を用いたＥＧＦ−コアセルベートシステムが、慢性創傷で増加したプロテアーゼによるタンパク質分解からＥＧＦを保護することにより、創傷治癒過程を向上させるか否かを確認した。これを確認する過程で、ゼラチンＡ及びアルギン酸ナトリウムを基本とするＥＧＦ−コアセルベート送達システムのコアセルベーション組成物及び反応条件を成功的に導出した。最適化されたＥＧＦ−コアセルベートにカプセル化されたＥＧＦは、トリプシン消化から保護された。コアセルベートをベースに送達されたＥＧＦは、試験管内ＨＤＦ増殖及び移動試験だけでなく、生体内糖尿病マウス創傷モデルにおいても遊離ＥＧＦよりも優れた活性を示した。このような結果に基づいて、ＤＦＵなどの慢性創傷で創傷治癒過程を加速化させる潜在的なＥＧＦ送達システムとしてＥＧＦ−コアセルベートを提案する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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