(57)【要約】  本開示は、胎盤組織成分の皮下注射を介し、しわまたは瘢痕などの欠陥を治療する方法を提供する。本開示はまた、シリンジのバレル内に維持される胎盤組織組成物を提供し、この胎盤組織組成物は、このような欠陥の治療に使用するためのものであってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
欠陥部位に胎盤組織成分を含む組成物を注射することによる、患者の欠陥を治療する方法。
【請求項２】
前記胎盤組織成分が粒子であり、前記粒子が、胎盤円板、ならびに羊膜、絨毛膜および臍帯のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子が、胎盤円板および羊膜を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記粒子が、胎盤円板および絨毛膜を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記粒子が、胎盤円板、羊膜、および絨毛膜を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記粒子が、胎盤円板および臍帯を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子が、胎盤円板、羊膜、絨毛膜および臍帯を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記粒子が再水和される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記胎盤組織成分が凍結乾燥によって脱水されているか、または以前に脱水された、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記粒子が微粒子化される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記粒子が、５０〜１５０μｍである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記粒子が、７０〜１５０μｍである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記欠陥が、瘢痕およびしわからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記胎盤組織成分が、存在する場合には約１〜２０重量％の脱水された羊膜および／または絨毛膜粒子、存在する場合には約１〜３０重量％の脱水された臍帯粒子、および約５０〜９８重量％の脱水された胎盤円板粒子を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記胎盤組織成分が、約１１〜３０％の非胎盤円板成分を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、皮下、皮内および皮膚からなる群から選択される方法によって注射される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は、前の注射後少なくとも６ヶ月まで、治療された欠陥の部位で繰り返されない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
シリンジのバレル内に維持される、胎盤組織組成物。
【請求項１９】
前記胎盤組織組成物は、胎盤円板の粒子、ならびに羊膜、絨毛膜および臍帯のうちの少なくとも１つの粒子を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記粒子が、胎盤円板および羊膜を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記粒子が、胎盤円板および絨毛膜を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記粒子が、胎盤円板、羊膜、および絨毛膜を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記粒子が、胎盤円板および臍帯を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
前記粒子が、胎盤円板、羊膜、絨毛膜および臍帯を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
前記粒子が再水和される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２６】
前記胎盤組織成分が凍結乾燥によって脱水されているか、または以前に脱水された、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２７】
前記粒子が微粒子化される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２８】
前記微粒子化され、脱水された粒子が、５０〜１５０μｍである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記微粒子化され、脱水された粒子が、７０〜１５０μｍである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記胎盤組織成分が、存在する場合には約１〜２０重量％の脱水された羊膜および／または絨毛膜粒子、存在する場合には約１〜３０重量％の脱水された臍帯粒子、および約５０〜９８重量％の脱水された胎盤円板粒子を含む、請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記胎盤組織成分が、約１１〜３０％の非胎盤円板成分を含む、請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
瘢痕またはしわの治療に使用するための、請求項１７〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１８日に出願された米国仮出願第６２／６７３，５２８号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、一般に、胎盤組織、例えば、羊膜、絨毛膜、臍帯および／または胎盤円板（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｄｉｓｃ）の組み合わせを注射することによって、しわなどの加齢に関連する皮膚状態を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
しわやその他の見苦しい皮膚の状態は、コラーゲンおよびその他の結合組織の喪失などの皮膚科学的破壊の結果であることが多い。このような破壊は、一般的にしわまたは瘢痕（ニキビの瘢痕など）と呼ばれる場合があるが、その発症は、その下にある状態の指標である。結果として生じるしわおよび／または瘢痕は、患者による感情的および／または心理的な懸念を伴うことが多い。
【０００４】
フォーブスは、容姿に関する産業は、昨年の売上高が４４５０億ドルになると概算した。この大量の売上は、患者の外見、特にフェイシャル分野での患者の外見を改善するのに役立ち得る製品への高い需要の強力な証拠である。
【０００５】
容姿に関する製品が特によく売れている特定の分野の１つは、しわや瘢痕療法の分野である。この分野の製品は、一般的に皮膚科学的破壊の自然な影響を減らすことを目的としている。顔面に関して、皮膚科学的破壊は、典型的には、筋肉の緊張の喪失および皮膚の薄化を引き起こし、顔にたるんだ外観または垂れ下がった外観を与える可能性がある。皮膚も加齢とともに乾燥し始め、脂肪を失い、その結果、ふっくらとした滑らかな表面が失われる。喫煙および日光などの環境因子に長時間さらされると、しわの出現が増加し、強くなる傾向がある。しわは、目の角や鼻唇のひだの周りで最も目立つ傾向がある。しみや黒ずみも同様に目立つようになる場合がある。
【０００６】
しわや瘢痕の出現に対抗するために、いくつかの様々な製品が開発されている。これらの製品の中には、皮膚に直接塗布できるものもあれば、しわまたは瘢痕部位に直接注射するものもある。ボトックスは、細菌に由来する毒素であり、皮膚を引っ張ったり、しわの出現を増加させたりしないように特定の顔の筋肉を一時的に麻痺させるために使用することができる。他の注射可能な製品は、しわまたは瘢痕の部位に皮下注射によって投与され、皮下の空隙を埋める充填剤として機能し、しわまたは瘢痕の出現を減らす。北米および欧州の皮膚充填剤の市場は、２０２６年までに２８億ドルの売上高に達すると予想されている。いくつかの一般的なしわ充填剤製品には、ヒアルロン酸、コラーゲン、シリコーンおよび自家脂肪が含まれる。これらの注射可能な充填剤は、様々な程度で効果的であるが、これらの充填剤は、アレルギー反応、腫れ、あざ、変形、神経麻痺および皮膚の変色などの副作用を患者に経験させてしまう場合がある。さらに、これらの注射可能な充填剤の多くは、最終的にはさまざまな速度で体に吸収され、患者の元の結果を維持するために複数回のフォローアップ注射が必要になる。さらに、注射可能な組成物の使用は、ほとんどの患者が注射部位の炎症、腫れ、発赤、および数日まで続く可能性のある不快感に苦しむため、問題がある。
【０００７】
したがって、しわおよび瘢痕を減らし、注射部位の炎症を抑える製品が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、しわ、瘢痕および他の変形を治療すると同時に、注射（複数可）に伴う炎症、腫れおよび発赤に対処する抗炎症特性も提供する注射可能な組成物に関する。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの胎盤組織成分を含む再水和組成物を提供する。一実施形態では、本組成物は、胎盤円板、羊膜組織、絨毛膜組織および臍帯組織からなる群から選択される胎盤および／または臍帯成分を含む。さらなる実施形態では、胎盤および／または臍帯成分は、１５０ミクロン以下のサイズを有する。一実施形態では、上述の組成物は、水溶液を用いて再構成されると、組成物が室温で２７ゲージ針を通過するときに約０．０５ｍＬ／秒〜０．７５ｍＬ／秒の流速を有するような疑似チキソトロピーの性質を有するペーストを提供する。
【００１０】
ヒト胎盤膜（例えば、羊膜または組織）は、１９００年代初頭以来、様々な種類の再建外科手術に使用されてきた。この膜は、基質材料として、より一般的には、生物包帯またはパッチ移植片と呼ばれるものとして機能する。このような膜は、眼科手術にも広く使用されている。典型的には、このような膜は、手術に必要になるまで保存および保管するために、凍結されるか、または乾燥される。
【００１１】
このような胎盤組織は、典型的には、選択的帝王切開手術後に採取される（ｈａｒｖｅｓｔ）。胎盤は、臍帯と羊膜嚢で構成される。羊膜嚢は、一般的には、羊膜と呼ばれ、羊膜と絨毛膜という２つの主要な組織層を有する。羊膜組織は、羊膜嚢の最内層であり、羊水と直接接触している。羊膜嚢は、羊水を含み、胎児の環境を保護する。組織学的評価は、羊膜の膜層が、上皮細胞の単層、薄い細網線維（基底膜）、厚い緻密層および線維芽細胞層からなることを示している。羊膜の線維層（すなわち、基底膜）には、ＩＶ型、Ｖ型およびＶＩＩ型のコラーゲン、およびフィブロネクチンおよびラミニンなどの細胞接着生物活性因子が含まれる。
【００１２】
採取した後、胎盤組織は、臍帯、羊膜／絨毛膜、および胎盤円板の３つの別個の成分に分離される。全ての成分は、単一のドナーに由来する。この３つの成分はそれぞれ、個々の成分が抗生物質用液ですすがれ、次いで、残留する抗生物質を除去するために再びすすがれるという特定のプロセスにかけられる。
【００１３】
好ましくは、胎盤組織成分は、高等張液で洗浄され、高等張液は、約３０％〜約１０％の範囲のＮａＣｌ濃度を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本方法は、羊膜層から絨毛膜組織層を分離した後、選択された層を物理的に洗浄し、血餅および他の汚染物質を除去する工程をさらに含む。具体的には、天然に存在する胎盤組織中の羊膜層と絨毛膜層の間に見られる海綿状の中間層は、処理中にこれらの層から除去され、いくつかの実施形態では、廃棄される。
【００１５】
臍帯に関しては、静脈と動脈を取り除き、残りの臍帯組織を穏やかに洗浄し、組織内の固有の成長因子とタンパク質を保存するために最小限の操作を行う。臍帯中の注目すべき成長因子としては、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ  ＡＡおよびＢＢ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）１４、１５が含まれ、これらは創傷治癒を制御することが知られている。
【００１６】
羊膜および絨毛膜は穏やかに洗浄され、組織内の固有の成長因子（２００を超える）およびタンパク質を保存するために最小限の操作を行う。羊膜および絨毛膜の注目すべき成長因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子アルファおよびベータ（ＴＧＦ−αおよびβ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ  ＡＡおよびＢＢ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）１４、１５が挙げられる。
【００１７】
胎盤円板組織は、上述の膜および臍帯組織と同じ洗浄プロセスにかけられ、さらなる脱細胞化工程にもかけられる。脱細胞化プロセスは、母体のＤＮＡの存在を大幅に減らすことにより、胎盤組織から抗原剤を取り除くことを目的としている。脱細胞化は、基本的な細胞外マトリックス成分を保持しつつ、成長因子および他の可溶性または細胞内タンパク質の存在も軽減させる。
【００１８】
使用されるそれぞれの成分が除染され、すすがれると（胎盤円板組織の場合には、脱細胞化されると）、成分は再結合され、凍結乾燥によって脱水される。組織が脱水された後、組織は適切な大きさになるまで粉砕され、処理された組織をしわの部位に注射することを可能にする。
【００１９】
完成した製品は、滅菌容器に封入され、エンドユーザによって、許容される賦形剤を用いて再構成される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、得られる注射可能な製品の粘度および安定性に影響を与えるために粒径が変更される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、胎盤円板組織、羊膜／絨毛膜および臍帯組織の相対比率は、得られる注射可能な製品の粘度および安定性に影響を与えるように調整される。
【００２２】
いくつかの態様では、本開示は、患者のしわの出現を減らすために胎盤組織に基づく注射剤を投与するための治療方法を提供する。
【００２３】
いくつかの態様では、本開示は、患者のしわの出現を減らすために胎盤組織に基づく注射剤を投与するための装置（ａｐｐａｒａｔｕｓ）を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ−１Ｂ】注射前に、許容される賦形剤を乾燥胎盤組織に基づく注射剤と混合するために使用可能な再構成装置の一実施形態を示す。図１Ａは、２本のシリンジ、ルアーコネクタおよびマイクロバイアルを示す。図１Ｂは、組み立てられた装置を示す。
【００２５】
【図２Ａ−２Ｂ】胎盤組織に基づく注射剤を投与する前（図２Ａ）および投与した後（図２Ｂ）のしわの外観を示すブタの死体の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、当然変わり得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものでしかなく、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００２７】
本発明の詳細な説明は、読者の便宜のためにのみ、様々なセクションに分けられ、いずれかのセクションに見られる開示は、別のセクションのものと組み合わされてもよい。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料も本発明の製造、実施または検査において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、刊行物が引用されている方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により組み込まれる。
【００２８】
本明細書に開示された各実施形態は、他の開示された実施形態それぞれに適用可能であることが想定される。本明細書に記載の様々な要素の全ての組み合わせおよび部分的な組み合わせは、実施形態の範囲内にある。
【００２９】
パラメータ範囲が提供される場合、その範囲内の全ての整数および範囲、ならびにその１０分の１および１００分の１も、実施形態によって提供されることが理解される。例えば、「５〜１０％」は、５％、６％、７％、８％、９％および１０％；５．０％、５．１％、５．２％、・・・９．８％、９．９％および１０．０％；および５．００％、５．０１％、５．０２％、・・・９．９８％、９．９９％および１０．００％、ならびに例えば、６〜９％、５．１％〜９．９％および５．０１％〜９．９９％を含む。
【００３０】
本明細書で使用される場合、数値または範囲の文脈における「約」は、列挙されるか、または請求される数値または範囲の±１％、±５％または１０％以内を意味する。
【００３１】
本明細書に例示的に開示されている本発明は、適切には、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素が存在しない状態で実施されてもよい。
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。このため、例えば、「多能性幹細胞（ａ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の多能性幹細胞を含む。
【００３３】
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は以下の意味を有する。
【００３４】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、組成物（例えば、媒体）および方法が、列挙された要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味することが意図される。「〜から本質的になる」は、方法を定義するために使用される場合、記載された目的のために、組み合わせに対してあらゆる本質的な意義を有する他の要素を排除することを意味する。「〜からなる」とは、実質的な方法の工程を排除することを意味するものとする。これらの移行語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００３５】
「任意選択の」または「任意選択で」は、後に記載される事象または状況が生じ得るかどうかを意味し、その記載は、事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含む。
【００３６】
「再水和」とは、以前は脱水されていたが、現在は脱水されていない組成物、粒子または他の物質を指す。再水和は、脱水された物質を水溶液（０．９％生理食塩水など）に入れることによって、または当技術分野で知られている他の手段によって達成することができる。
【００３７】
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト、家畜、愛玩動物などのような哺乳動物対象を含むがこれに限定されない、任意の脊椎動物生物である。「患者」という用語は、「対象」と互換的に使用され得る。
【００３８】
「胎盤組織」という用語は、限定されないが、羊膜、絨毛膜、中間層、ホウォートンゼリー、胎盤円板、臍帯などを含む、胎盤のよく知られた成分のいずれかおよび全てを指す。
【００３９】
欠陥に関する「治療」という用語は、欠陥の重症度を軽減すること、または欠陥を完全に排除することを意味する。
【００４０】
「欠陥」という用語は、特に患者の顔の領域に患者に存在する可能性があるしわ、畝、折りじわ、線または瘢痕を含むがこれらに限定されない、望ましくない美的特徴を指す。このような欠陥、しわの種類、しわの重症度の詳細については、「Ａ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｃｉａｌ  Ｗｒｉｎｋｌｅｓ」Ｇｏｔｔｒｉｅｄら；Ｃｏｓｍｅｔｉｃ；２００１の中に見出すことができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４１】
製造方法
最初の組織採取
胎盤組織の回収は、病院で始まり、帝王切開での出産時に採取される（ｃｏｌｌｅｃｔ）。ドナーは、出産しようとしている母親を指しており、移植のために可能な限り最も安全な組織を提供するように設計された包括的なスクリーニングプロセスに自発的に従う。このスクリーニングプロセスは、好ましくは、従来の血清学的検査を使用して、ヒト免疫不全ウイルス１型および２型に対する抗体（抗ＨＩＶ−１および抗ＨＩＶ−２）、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体（抗ＨＣＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型およびＨ型に対する抗体（抗ＨＴＬＶ−Ｉおよび抗ＨＴＬＶ−ＩＩ）、ＣＭＶおよび梅毒に対する抗体を検査する。上述の検査の列挙は単なる例示であり、当業者によって理解されるように、時間の経過とともに、または移植片の意図された使用に基づいて、より多くの検査、より少ない検査、または異なる検査が望まれるか、または必要になる場合がある。
【００４２】
ドナーの情報とスクリーニング検査の検討に基づいて、ドナーは、受け入れ可能とみなされるか、またはみなされない。さらに、送達時に、培養を行い、例えば、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの存在を決定する。ドナーの情報、スクリーニング検査および送達培養がすべて陰性である場合（すなわち、何らリスクを示さないか、または許容可能なリスクレベルを示す場合）、ドナーは承認され、組織標本は、さらなる処理および評価のための初期の適格物として指定される。
【００４３】
上述の選択基準を満たすヒト胎盤は、好ましくは、滅菌出荷袋内に生理食塩水で個別に袋詰めされ、さらなる処理のために処理場所または実験室に運搬するために氷水の容器内で保管される。
【００４４】
材料のチェックインおよび評価
処理センターまたは実験室に到着すると、運搬物が開かれ、滅菌出荷袋／容器が密封されたままであり、無傷であること、氷または他の冷却剤が存在すること、内容物が冷やされていること、適切なドナー書類が存在すること、その書類のドナー番号が、組織の入った滅菌出荷袋の番号と一致していることが確認される。次いで、組織の入った滅菌出荷袋は、さらなる処理の準備ができるまで、冷蔵庫に保管される。適切なフォームが全て記入され、書類受け渡し記録の管理および処理ログも記入される。
【００４５】
全組織の処理工程
組織をさらに処理する準備ができたら、胎盤組織をさらに処理するために必要な滅菌用品が、制御された環境内のステージングエリアで組み立てられ、重要な環境に導入するために準備される。重要な環境が製造フードである場合、滅菌用品が開かれ、従来の滅菌技術を使用してフード内に配置される。重要な環境がクリーンルームである場合、滅菌用品が開かれ、滅菌ドレープで覆われたカート上に置かれる。全ての作業面は、従来の滅菌技術を使用して一枚の滅菌ドレープで覆われ、滅菌用品および処理装置（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）は、再び従来の滅菌技術を使用して、この滅菌ドレープ上に配置される。
【００４６】
胎盤組織が、スクリーニング検査および送達培養の完了または結果の取得の前に採取された場合、そのような組織はラベル付けされ、検疫に保管される。この組織は、取り扱いおよび使用に安全な組織であると宣言するのに必要なスクリーニング評価および送達培養を満たした場合にのみ、さらなる処理が承認される。
【００４７】
処理装置は、従来の業界で承認された除染手順に従って除染され、次いで、重要な環境に導入される。この装置は、組織標本に近接したり、組織標本によって不注意に汚染されたりする可能性を最小限に抑えるために、重要な環境内に戦略的に配置される。
【００４８】
次に、胎盤を滅菌出荷袋から取り出し、重要な環境内の滅菌処理槽に無菌状態で移す。滅菌槽には、好ましくは、室温または室温に近い１８％のＮａＣｌ（高等張生理食塩水）溶液が含まれている。胎盤を穏やかに揉み、血餅を分離し、胎盤組織の温度を室温にさせ、このことにより、以下で説明するように、羊膜層と絨毛膜層を互いに分離しやすくする。周囲温度まで温度を上げた後（約１０〜３０分後）、胎盤を滅菌処理槽から取り出し、羊膜層を下に向けて検査のために処理トレイの上に平らに置く。
【００４９】
次に、胎盤組織がさらなる処理に受け入れ可能とみなされた場合、胎盤組織の羊膜層と絨毛膜層を注意深く分離する。この手順で使用される材料と装置には、処理トレイ、１８％生理食塩水、滅菌４×４スポンジおよび２つの滅菌ナルゲン瓶が含まれる。次に、胎盤組織を綿密に調べ、羊膜層を絨毛膜層から分離することができる領域（通常は角）を見つける。羊膜は、絨毛膜上に薄く不透明な層として現れる。
【００５０】
羊膜層が下を向いた状態で処理トレイ内の胎盤組織を使用して、羊膜の裂けを防ぐように注意しながら、絨毛膜層をゆっくりとした連続的な動作で、羊膜層からゆっくりと持ち上げる。裂け始めた場合には、組織のいずれかの層の裂けを最小限に抑えるために、別の場所から分離プロセスを再開することを推奨する。分離プロセスは、羊膜層または絨毛膜層のいずれかを引き裂かないように注意しながら、スポンジを使用せずに手作業で続けられる。
【００５１】
次に、羊膜組織と絨毛膜がきれいになり、さらなる処理の準備ができるまで、組織の各層から血餅やその他の外来組織を取り除くように注意が払われる。より具体的には、羊膜および絨毛膜組織を処理トレイに置き、先の尖っていない器具、指、または無菌の非粒子化ガーゼを使用して、血餅が羊膜の間質組織および絨毛膜の栄養膜組織から遊離するまで血餅を穏やかにこすることによって、血餅を注意深く取り除く。羊膜の間質層は、羊膜のうち、母体に面する側にある。対照的に、基底膜層は、羊膜のうち、胎児に面する側にある。
【００５２】
先の尖っていない器具、セルスクレーパーまたは滅菌ガーゼを使用して、残っている破片や汚染物質も取り除く。この工程も、羊膜または絨毛膜組織を引き裂かないように、十分な注意を払って行わなければならない。羊膜組織が滑らかで不透明な白色になったら、羊膜の洗浄は完了である。羊膜組織の洗浄を行い過ぎると、不透明な層が除去される場合がある。羊膜の領域があまりにも乱暴に洗浄され、透明に見える場合は、受け入れ不可能であり、最終的には廃棄される。
【００５３】
羊膜と絨毛膜が胎盤から分離された後、胎盤の残りの成分も処理される。具体的には、臍帯が胎盤から取り除かれる。臍帯を切り開き、臍帯静脈と動脈（母体のＤＮＡと抗原を含む）を取り除く。残りの組織は保持され、臍帯とホウォートンゼリーで構成される。臍帯および羊膜／絨毛膜が胎盤から取り除かれた後、残りの胎盤円板組織も保持され、さらなる処理のために取っておく。保持された組織成分は全て、化学除染工程を受ける。
【００５４】
化学除染工程
次いで、保持された胎盤組織成分（羊膜／絨毛膜、胎盤円板および臍帯）は、次の工程の化学除染のために滅菌ナルゲン瓶に入れられる。望ましくない胎盤組織成分は、適切なバイオハザード容器に廃棄される。
【００５５】
次いで、各ナルゲン瓶に１８％生理食塩水を無菌状態で充填し、密封する（または上部で閉じる）。次いで、この瓶をロッカープラットフォーム上に置き、３０〜９０分間撹拌し、組織の汚染物質がさらに除去される。
【００５６】
ロッカープラットフォームが重要な環境（例えば、製造フード）内にない場合、ナルゲン瓶は、重要な／滅菌環境に戻され、開封される。滅菌鉗子を使用して、胎盤組織成分を、１８％高等張生理食塩水溶液が入ったナルゲン瓶から静かに取り出し、空のナルゲン瓶に入れる。次いで、組織が入ったこの空のナルゲン瓶に、あらかじめ混合しておいた抗生物質溶液を無菌状態で充填する。好ましくは、あらかじめ混合しておいた抗生物質溶液は、硫酸ストレプトマイシンおよび硫酸ゲンタマイシンなどの抗生物質のカクテルで構成される。硫酸ポリミキシンＢおよびバシトラシンなどの他の抗生物質、または現在入手可能であるか、または将来的に入手可能な同様の抗生物質も適している。さらに、抗生物質溶液は、組織の温度を変化させたり、組織を損傷したりしないように、添加するときは室温であることが好ましい。次いで、組織および抗生物質が入ったこの瓶または容器を密閉するか、または閉じ、ロッカープラットフォーム上に置き、好ましくは、６０〜９０分間撹拌する。抗生物質溶液中の組織のこのようなロッキングまたは撹拌は、汚染物質および細菌の胎盤組織成分をさらに洗浄する。
【００５７】
この場合も、ロッカープラットフォームが重要な環境（例えば、製造フード）内にない場合、組織または抗生物質が入った瓶または容器は、重要な／滅菌環境に戻され、開封される。滅菌鉗子を使用して、胎盤組織成分を、瓶または容器から静かに取り出し、滅菌水または通常の生理食塩水（０．９％生理食塩水溶液）が入った滅菌槽に入れる。胎盤組織成分を、滅菌水／通常の生理食塩水溶液中、所定の場所で少なくとも１０〜１５分間浸す。胎盤組織成分は、抗生物質溶液および任意の他の汚染物質の胎盤組織成分からの除去を容易にするために、わずかに撹拌してもよい。少なくとも１０〜１５分後、組織は、脱水され、さらに処理される準備が整う。
【００５８】
胎盤円板成分の脱細胞化
化学除染工程の後、胎盤組織成分の胎盤円板部分は、好ましくは、エンドユーザ患者からの望ましくない免疫反応を引き起こし得るこの組織中の母体抗原の存在に起因して、脱細胞化されるべきである。当業者に知られている任意の脱細胞化プロセス、例えば、米国出願公開第２００２／０１６０５１０号または米国特許第８，０７１，１３５号に開示される脱細胞化方法を使用してもよい。脱細胞化は、温度方法、電気的破壊、化学的脱細胞化または酵素的脱細胞化などの方法によっても行うことができる。好ましくは、胎盤円板組織を脱細胞化するために使用されるプロセスは、胎盤円板組織を構成するタンパク質の天然の構成を破壊しない。
【００５９】
脱水／凍結乾燥工程
（胎盤円板成分の必要に応じて）全ての成分が適切に除染され、脱細胞化された後、成分が再結合され、脱水工程が行われる。
【００６０】
好ましくは、別個の胎盤成分は、個々に密閉されたタイベックポーチ（または他の市販のポーチ）に入れられ、市販の凍結乾燥チャンバに入れられる。凍結乾燥プロセスが終了したときに胎盤成分が実質的に脱水される限り、当業者に知られている凍結乾燥プロセスを使用してもよい。
【００６１】
他の方法を使用して、成分を十分に脱水してもよい。このような技術としては、限定されないが、化学的脱水、または成分の最適な脱水が達成されるまでの適切な期間、成分を低湿／高温環境におくことが挙げられるだろう。このような脱水技術は、一般に、当業者によく知られている。
【００６２】
再結合と粉砕の工程
胎盤成分が完全に脱水されると、胎盤成分は再結合され、次いで、より小さな粒子に粉砕される。一実施形態では、再結合される胎盤成分の比率は、上述の流速を有するペーストを提供するように選択される。これらの成分の特定の比率は、組成物が容易に注射可能であるだけではなく、注射されると静止したままであるように得られる流速よりも重要ではないことが理解される。再結合される胎盤成分は、市販の粉砕装置に供給される。次いで、胎盤成分を、約８，０００ｒｐｍの速度で、５０〜１５０μｍの範囲のふるいサイズで粉砕する。「組織」という用語は、本明細書で使用される「成分」という用語と同じであることが理解される。
【００６３】
この粉砕工程により、最適には、胎盤成分の粒径は７０〜１５０μｍの範囲になる。
【００６４】
好ましい実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、約５０〜９８重量％の胎盤円板組織と、存在する場合には約１〜３０重量％の臍帯組織と、存在する場合には約１〜２０重量％の羊膜／絨毛膜組織で構成されるべきである。一実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、約６０〜９５重量％、約６５〜９０重量％、約７０〜８５重量％または約７５〜８０重量％の胎盤円板組織で構成されるべきである。一実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、約１〜２５重量％、約５〜２０重量％または約１０〜１５重量％の臍帯組織で構成されるべきである。一実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、約１〜１５重量％、約４〜１２重量％または約８〜１０重量％の羊膜／絨毛膜組織で構成されるべきである。一実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、約１〜１５重量％、約４〜１２重量％または約８〜１０重量％の羊膜組織で構成されるべきである。一実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、約１〜１５重量％、約４〜１２重量％または約８〜１０重量％の絨毛膜組織で構成されるべきである。
【００６５】
単一のドナーから胎盤円板、羊膜、絨毛膜および臍帯の全てが得られる場合、再結合され、脱水され、得られた再結合済の胎盤組織成分は、約１１〜３０重量％の非胎盤円板成分（すなわち、羊膜、絨毛膜および／または臍帯）を含む。
【００６６】
一実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、約１１〜３０重量％の非胎盤円板成分を含む。一実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、約１５〜２５重量％または約１８〜２２重量％の非胎盤円板成分を含む。
【００６７】
一実施形態では、重量％は、脱水前に決定される。別の実施形態では、重量％は、脱水後に決定される。
【００６８】
一実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、胎盤円板および羊膜組織を含む。一実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、胎盤円板および絨毛膜組織を含む。一実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、胎盤円板、羊膜組織および絨毛膜組織を含む。
【００６９】
一実施形態では、再結合済の胎盤組織成分は、胎盤円板および臍帯組織を含む。
ふるい分け工程
【００７０】
次いで、粉砕された粒子には、ふるい分け工程が行われる。粉砕された粒子は、市販のシフターの上に置かれ、ふるいの上に置かれる。ふるいのサイズは、５０〜１５０μｍの範囲である。シフターの電源を入れ、粒子を５〜２０分の期間、ふるい分けする。このふるい分けプロセスによって、５０〜１５０μｍの均一な粒径を有する粒子の粉末が得られる。所望な粒径が得られたら、粉末を無菌状態でバイアルに移し、７５〜６００ｍｇの用量を保持し、密封してもよい。
【００７１】
代替的な実施形態では、粒子は、５０〜５００μｍ、１００〜４００μｍ、１５０〜３００μｍまたは２００〜２５０μｍであってもよい。代替的な実施形態では、粒子は、≦５０μｍ、≦１００μｍ、≦１５０μｍ、≦２００μｍ、≦２５０μｍ、≦３００μｍ、≦３５０μｍ、≦４００μｍ、≦４５０μｍ、および≦５００μｍであってもよい。代替的な実施形態では、粒子は、≧５０μｍ、≧１００μｍ、≧１５０μｍ、≧２００μｍ、≧２５０μｍ、≧３００μｍ、≧３５０μｍ、≧４００μｍ、または≧４５０μｍであってもよい。一実施形態では、粒子は、ある範囲の粒径を有していてもよい。
【００７２】
再構成
粒子状の胎盤成分を対象に投与するために、エンドユーザは、最初に、粉末を再水和することによって粉末を再構成しなければならない。最適には、再水和剤は、０．９％生理食塩水であるが、任意の適切な賦形剤を使用してもよい。
【００７３】
粉末は、０．９％生理食塩水溶液１ｃｃあたり１００〜１５０ｍｇの粉末の比率で、０．９％生理食塩水溶液と合わされる。一実施形態では、所望な体積の０．９％生理食塩水溶液が、最初に、１８ゲージ針のシリンジに移される。０．９％生理食塩水溶液を移したら、針先を外す。次いで、所望な量の脱水された粉末を、そのバイアルから第２のシリンジに移す。この２つのシリンジを、メス−メス型のルアーコネクタによって互いに接続する。
【００７４】
シリンジを接続したら、生理食塩水溶液および脱水された粉末を、各シリンジのプランジャーを交互に押すことによって混合する。完全な再構成には、１０回の混合ストロークが必要なはずである（ストロークは、生理食塩水のプランジャーを１回完全に圧縮し、その後、粉末のプランジャーを１回完全に圧縮することと定義される）。この再構成装置の実施形態の個々の成分は、図１Ａに示され、組み立てられた再構成装置の実施形態は、図１Ｂに示される。
【００７５】
粉末が十分に再水和されたら、２つのシリンジの間のコネクタを取り外し、空のシリンジは廃棄される。次いで、２７ゲージ針が、再構成された粉末を含むシリンジに取り付けられる。
【００７６】
一実施形態では、本組成物は、ヒアルロン酸をさらに含む。
【００７７】
対象への胎盤成分の投与
粉末が再水和され、２７ゲージ針が取り付けられたら、胎盤成分を対象に投与することができる。しわの部位の大きさと重症度に応じて、７５〜６００ｍｇの用量を投与することができる。この用量が投与された後、対象のしわは、埋められた外観を有するはずである。図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、０．９％生理食塩水溶液１ｍＬ中の１００ｍｇの粉末で構成される用量が投与される前および投与された後のブタの死体のしわの外観を示す。結果に応じて、患者は、フォローアップ注射のために、投与から６〜９ヶ月後に戻るべきである。
【００７８】
一実施形態では、胎盤成分は、欠陥を治療するための従来の製品、例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、シリコーンおよび自家脂肪と組み合わせて投与される。胎盤成分は、従来の製品と同時に投与されてもよく（すなわち、単一の組成物で）、または同時期に（すなわち、別個にではあるが同時に、または相加効果または相乗効果を生み出すように十分に接近して）投与されてもよい。一実施形態では、本発明の注射可能な組成物と従来の製品の併用投与によって、相乗効果が生じる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際調査報告】
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