(57)【要約】  シクロホスファミド化合物およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌のような乳癌）の併用治療。また、本明細書では、シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞の併用治療を使用して、免疫記憶を誘導し、および／または腫瘍の再発のリスクを減少させる方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌治療の方法であって、
ａ．それを必要とする対象に有効量のシクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物を投与すること、および
ｂ．対象に有効量のナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞を投与すること
を含む方法。
【請求項２】
前記シクロホスファミド化合物は、シクロホスファミド、マホスファミド、イホスファミドおよびトロホスファミド、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）が少なくとも２用量の前記ＣＴＸ化合物を含み、および／または工程（ｂ）が少なくとも２用量の前記ＮＫ細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）が少なくとも２用量の前記ＣＴＸ化合物を含み、前記ＣＴＸ化合物の連続する２用量の投与は、少なくとも４〜８日空いており、６日空いてもよい、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）における少なくとも１用量の前記ＣＴＸ化合物を工程（ｂ）の前に前記対象に投与する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）における少なくとも１用量の前記ＮＫ細胞を工程（ａ）の前に前記対象に投与する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象は、癌を有する、有すると疑われる、またはそのリスクがあるヒト患者である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記癌は固形癌または血液癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記固形癌は、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌または膀胱癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記固形癌は乳癌であり、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）であってもよい、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記血液癌は、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象は腫瘍切除を受けたことがある、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＴＸ化合物の量およびＮＫ細胞の前記量は、癌の再発のリスクを減少させるのに効果的である、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＫ細胞は、工程（ｂ）の前に、エクスビボでＩＬ−１５およびＩＬ−１２に曝露されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍の再発に対して保護的免疫記憶を誘導し、および／または腫瘍の再発のリスクを減少させる方法であって、
ａ．それを必要とする対象に有効量のシクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物を投与すること、および
ｂ．対象に有効量のナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞を投与すること
を含む方法。
【請求項１６】
前記シクロホスファミド化合物は、シクロホスファミド、マホスファミド、イホスファミドもしくはトロホスファミド、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象は腫瘍を有したヒト患者である、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒト患者は、抗腫瘍治療を受けたことがある、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＫ細胞は、自己または同種異系である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株に由来し、多能性幹細胞に由来し、または誘導多能性幹細胞に由来する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）シクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物および（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、癌治療に使用するためのキット。
【請求項２２】
前記ＮＫ細胞は、エクスビボでＩＬ−１５およびＩＬ−１２に曝露されている、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記シクロホスファミド化合物はシクロホスファミドである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／７２４，３３８号の出願日の利益を主張し、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、抗腫瘍免疫において決定的に重要な役割を担う。ＮＫ細胞の発現または機能が損なわれたヒトおよびマウスは、腫瘍感受性の増加を示し、ＮＫ細胞の内在性の負の調節が欠損したマウスは、抗癌活性の増強を示す。Imai et al., Lancet, 356(9244):1795-1799 (2000)；Paolino et al., Nature, 507(7493):508-512 (2014)；およびWaldhauer et al., Oncogene, 27(45):5932-5943 (2008)。ＩＦＮ−γ産生および腫瘍内ＮＫ細胞のレベルが消化管間質腫瘍を有する患者の生存率に正に関連することが分かった。Menard et al., Cancer Res, 69(8):3563-3569 (2009)；Rusakiewicz et al., Cancer Res, 73(12):3499-3510 (2013)；およびWaldmann et al., J Investig Dermatol Symp Proc, 16(1):S28-30 (2013)。乳癌におけるＮＫ細胞の活性化に関連する分子の発現の増加も好ましい予後に関連する。Ascierto et al., J Transl Med., 12;11:145 (2013)。
ＮＫ細胞は、ＮＫ受容体によって癌細胞を認識することができ、ＮＫ細胞の活性化が生じる。Vivier et al., Science, 331(6013):44-49 (2011)。活性化ＮＫ細胞は、パーフォリン／グラムザイム、ＴＲＡＩＬまたはＦａｓリガンドによって直接的に腫瘍細胞を殺傷するだけでなく、サイトカインおよびケモカインを産生して、１型免疫応答（例えば、ＴH１  ＣＤ８+細胞毒性Ｔ細胞および１型マクロファージの誘導を含む）を誘導し、それにより効果的な抗腫瘍免疫を編成することもできる。Mocikat et al., Immunity, 19(4):561-569 (2003)。ＮＫ細胞産生因子のうち、ＩＦＮ−γは、１型Ｔ細胞およびマクロファージ応答を誘導する顕著な因子である。ＮＫ細胞のこれらのエフェクター機能は、事前に活性化する必要もなく腫瘍細胞を認識すると即座に生じる。
【０００３】
抗腫瘍免疫におけるＮＫ細胞の顕著な役割がある場合、養子ＮＫ細胞の移植の癌免疫治療について試験を実施し（Guillerey et al., Nature immunology 2016, 17(9):1025-1036）、同種異系の状況で、特定の骨髄性白血病の治療に主に効果的であることが分かった（Geller et al., Immunotherapy 2011, 3(12):1445-1459；およびMoretta et al., L,  Blood 2011, 117(3):764-771）。他方、自己ＮＫ細胞の移植は、固形腫瘍の治療にほとんど臨床的利益を示さなかった。Burns et al., Bone marrow transplantation, 32(2):177-186 (2003)；Parkhurst et al., Clin Cancer Res, 17(19):6287-6297 (2011)；およびSakamoto et al., Journal of translational medicine, 13:277 (2015)。
したがって、大きな関心事は、養子ＮＫ細胞の移植治療の有効性を増加させるための適切な治療レジメンを開発することである。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、シクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物が、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）の同系同所性マウスモデルにおいて観察されるように、腫瘍増殖および／または再発に対するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の有効性を増加させたという予想しない知見に少なくとも部分的に基づく。驚くべきことに、ＣＴＸ化合物およびＮＫ細胞の併用治療がＣＴＸ単一治療またはＮＫ細胞単一治療のいずれかに比べて、腫瘍を有するマウスおよび腫瘍を切除したマウスの長期生存率を改善した。さらに、この併用による治療は同腫瘍による再チャレンジを保護する免疫記憶を誘導し、再発の予防を示す。
【０００５】
したがって、本開示の一態様は、癌治療の方法であって、（ａ）治療を必要とする対象に有効量のシクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物（例えば、ＣＴＸ、マホスファミド、イホスファミドもしくはトロホスファミド、またはその薬学的に許容される塩）を投与すること、および（ｂ）対象に有効量のＮＫ細胞を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、工程（ｂ）の前に、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１２にエクスビボに曝露することができる。
【０００６】
いくつかの例において、工程（ａ）は、少なくとも２用量のＣＴＸ化合物を含むことができる。ＣＴＸ化合物の２つの連続した用量を４〜８日空けて、例えば、６日空けて対象に投与することができる。あるいはまたはさらに、工程（ｂ）は、少なくとも２用量のＮＫ細胞を含むことができる。
いくつかの実施形態において、工程（ａ）における少なくとも１用量のＣＴＸ化合物を工程（ｂ）の前に対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、工程（ａ）における全用量のＣＴＸ化合物を工程（ｂ）の前に対象に投与することができる。あるいは、対象にＣＴＸ化合物をＮＫ細胞の投与前および後に投与することができる。
その他の実施形態において、工程（ｂ）における少なくとも１用量のＮＫ細胞を工程（ａ）の前に対象に投与することができる。いくつかの例において、工程（ｂ）における全用量のＮＫ細胞を工程（ａ）の前に対象に投与することができる。あるいは、対象にＮＫ細胞をＣＴＸ化合物の投与前および後に投与することができる。
【０００７】
いくつかの実施形態において、対象は、癌、例えば、固形癌または血液癌を有する、有すると疑われる、またはそのリスクがあるヒト患者である。例示的な固形癌として、限定されないが、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌または膀胱癌が挙げられる。一例において、固形癌は乳癌であり、ＴＮＢＣであってもよい。例示的な血液癌として、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫が挙げられる。いくつかの実施形態において、対象は、腫瘍切除を受けたことがある。
いくつかの実施形態において、有効量のＣＴＸ化合物および有効量のＮＫ細胞は、組み合わせて、癌の再発のリスクを減少させるのに効果的である。
【０００８】
別の態様において、本開示は、腫瘍の再発に対する保護的免疫記憶を誘導し、および／または腫瘍の再発のリスクを減少させる方法であって、（ａ）それを必要とする対象に有効量のＣＴＸのようなシクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物を投与すること、および（ｂ）対象に有効量のＮＫ細胞を投与することを含む方法を提供する。いくつかの例において、対象は、腫瘍を有したヒト患者である。このような腫瘍を有する患者は、抗腫瘍治療を受けたことがあってもよい。
本明細書に開示される方法のいくつかにおいて、ＮＫ細胞は自己であり得る。あるいは、ＮＫ細胞は同種異系であってもよい。その他の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株に由来し、多能性幹細胞に由来し、または誘導多能性幹細胞に由来し得る。
さらに、本明細書は、（ｉ）ＣＴＸのようなシクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物および（ｉｉ）ＮＫ細胞を含む、癌治療に使用するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、エクスビボでＩＬ−１５およびＩＬ−１２に曝露されている。
癌（例えば、本明細書に記載の癌）治療に使用するための医薬組成物であって、医薬組成物は、本明細書に開示のＣＴＸ化合物およびやはり本明細書に開示のＮＫ細胞（例えば、一緒にまたは別々に製剤化された）を含み、ならびに癌治療のための医薬を製造するためのＣＴＸ化合物およびＮＫ細胞の使用も本開示の範囲にある。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を以下の記述に記載する。本発明のその他の特性または利点は以下の図およびいくつかの実施形態の詳細な記述、添付の特許請求の範囲からも明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】ＥＯ７７１腫瘍を有するマウスに対するシクロホスファミド（ＣＴＸ）治療の治療効果を示す一連のグラフである。図１Ａは、１回の注射あたり１５０ｍｇ／ｋｇで、１回または２回のＣＴＸで治療を受けたＥＯ７７１腫瘍を有するマウスの生存率を示す。図１Ｂは、１回の注射あたり１２５または１５０ｍｇ／ｋｇの用量で、２回のＣＴＸで治療を受けたＥＯ７７１腫瘍を有するマウスの生存率を示す。各治療群におけるマウスは、２〜６個の独立した実験から集めた。****ｐ≦０．０００１、ログランク検定による。
【図１Ｂ】ＥＯ７７１腫瘍を有するマウスに対するシクロホスファミド（ＣＴＸ）治療の治療効果を示す一連のグラフである。図１Ａは、１回の注射あたり１５０ｍｇ／ｋｇで、１回または２回のＣＴＸで治療を受けたＥＯ７７１腫瘍を有するマウスの生存率を示す。図１Ｂは、１回の注射あたり１２５または１５０ｍｇ／ｋｇの用量で、２回のＣＴＸで治療を受けたＥＯ７７１腫瘍を有するマウスの生存率を示す。各治療群におけるマウスは、２〜６個の独立した実験から集めた。****ｐ≦０．０００１、ログランク検定による。
【図２】ＣＴＸおよびＮＫ細胞治療がＥＯ７７１腫瘍を有するマウスの生存率を相乗的に増加させることを示すグラフである。ＥＯ７７１腫瘍を有するマウスに、ＰＢＳ、ＮＫ細胞、ＣＴＸまたはＣＴＸ＋ＮＫ細胞による治療を腫瘍の接種から２１日目から開始し、生存率をモニタリングした。各群におけるデータは、２〜６個の独立した実験から集めた。****ｐ≦０．０００１、ログランク検定による。
【図３】ＣＴＸおよびＮＫ細胞の併用治療はＥＯ７７１腫瘍を有するマウスに免疫記憶を誘導することを示すグラフである。治療後、一次ＥＯ７７１腫瘍から生存した腫瘍を有するマウスをＥＯ７７１細胞で再チャレンジし、その後生存率を分析した。同年齢のナイーブマウスに初めてＥＯ７７１細胞を接種して、対照群とした。データは、２〜５個の独立した実験から集めた。****ｐ≦０．０００１、ログランク検定による。
【図４】ＣＴＸおよびＣＴＸ＋ＮＫ細胞治療が、ＥＯ７７１腫瘍を切除したマウスの生存率に比較可能な有効性を達成することを示すグラフである。マウスに、ＥＯ７７１細胞を同所性に接種させた。１群のマウスは治療を受けなかった（ＰＢＳ群）。その他のマウスは、腫瘍を接種され、２１日後に流入領域リンパ節を切除した。腫瘍を切除したマウスは、さらなる治療を受けない（切除のみ）、またはＣＴＸもしくは／およびＮＫ細胞で治療を受けるかのいずれかであった。全群のマウスをカプランマイヤー法に供した。各群のデータは、２〜７個の独立した実験から集めた。****ｐ≦０．０００１、ログランク検定による。
【図５】ＮＫ細胞治療がＥＯ７７１腫瘍を切除したマウスにおける腫瘍特異的免疫記憶を増強することを示すグラフである。治療後、一次ＥＯ７７１腫瘍から生存した腫瘍を切除したマウスをＥＯ７７１細胞で再チャレンジし、その後生存率を分析した。同年齢のナイーブマウスに初めてＥＯ７７１細胞を接種して、対照群とした。データは、２〜５個の独立した実験から集めた。****ｐ≦０．０００１および**ｐ≦０．０１、ログランク検定による。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、シクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、トリプルネガティブ乳癌の同系同所性動物モデルにおいて例示されるように、腫瘍を根絶し、腫瘍を有するまたは腫瘍を切除した条件のいずれかの下、約７５％のマウスの腫瘍再発に対して、免疫保護を誘導したという予想しない発見に少なくとも部分的に基づく。
【００１１】
ＮＫ細胞は抗腫瘍免疫に欠かせない役割を担うが、ＮＫ細胞の養子移植は、同種異系設定の下、特定の骨髄性白血病を除いて、限定的にしか臨床的利益を示さなかった。可能性のある理由は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）がＮＫ細胞の抗腫瘍活性を抑制することである。確かに、腫瘍細胞および腫瘍内骨髄細胞、間質細胞、および内皮細胞は、ＮＫ細胞の機能を抑制する抑制的因子を産生する。Hasmim et al., Front Immunol, 6:482 (2015)。したがって、免疫抑制的ＴＭＥのＮＫ細胞の抗腫瘍活性を利用する方法を開発することは、効果的な癌免疫治療の開発に重要になると思われる。
【００１２】
本明細書では、いくつかの実施形態において、この限界に対処する方法およびキットを提供する。本明細書に開示の方法は、癌治療におけるＮＫ細胞およびシクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物の併用を含む。本明細書に提供される実験データは、ＣＴＸ化合物がＴＭＥにおいて免疫抑制を減少し得、それによりＮＫ細胞の抗腫瘍効果を容易にすることを示唆する。特定の理論に縛られることはないが、ＣＴＸ化合物は、癌細胞の免疫原性の死を誘導するだけでなく、免疫抑制性免疫細胞を切断し、腸から抗腫瘍免疫応答を増加させ得る二次リンパ組織に細菌移行することを誘導することができる。したがって、新規に開発した免疫細胞は、ＩＦＮ−γの産生を介して１型免疫応答を駆動する移植されたＮＫ細胞の影響下で、非常に少ない免疫抑制性ＴＭＥにおいて、効果的な抗腫瘍応答を生み出す機会を有する。
【００１３】
以下に記載するように、治療効果を２つのレベル、一次腫瘍からの生存率および同腫瘍細胞による再チャレンジからの生存率で評価することができる。後者は、腫瘍の再発のリスクを防ぐまたは減少させる免疫記憶の獲得を示す。推測される治癒率は、２つの生存率の掛け算によって得ることができる。ＮＫ細胞の単一治療は、有効性がほとんどない、低い有効性を示し、ＣＴＸ単一治療は、ＮＫ細胞治療よりも高い有効性を示した。驚くべきことに、ＮＫ細胞およびＣＴＸ化合物の併用治療は、腫瘍を有するおよび腫瘍を切除したマウスの約７５％において、保護的免疫記憶で長期生存を生じた。併用治療の推測される治癒率は、いずれかの単一治療よりも高い。ＥＯ７７１乳癌細胞株は、トリプルネガティブであり、ｐ５３変異を有し、自発的に転移する。Johnstone et al., Disease models & mechanisms, 8(3):237-251 (2015)；およびEwens et al., Anticancer research, 25(6b):3905-3915 (2005)。ｐ５３陽性は、ＴＮＢＣ患者の５６〜７１％に認められ、ｐ５３-癌よりも悪い生存率と相関する。Kim et al., Annals of surgical oncology 23(11):3524-3530 (2016)；およびPan et al., PLoS ONE 12(2) (2017)。本明細書に示されるように、ＮＫ細胞およびＣＴＸ併用治療は、この攻撃的乳癌モデルに有効である。
したがって、例えば、癌を治療し、および／または癌の再発のリスクを減少させることに使用するためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびシクロホスファミド化合物、ならびにＮＫ細胞およびシクロホスファミド化合物を含むキットを本明細書に記述する。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
本開示の一態様は、例えば、養子細胞移植治療において使用するためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびシクロホスファミド（またはその誘導体）を提供する。
【００１４】
ＮＫ細胞は、自然免疫に示された細胞毒性リンパ球であり、先立つ活性化がなくても標的細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞および細菌細胞）を根絶する能力を特徴とし得る。適切なＮＫ細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌおよびヒツジ）を含む任意の種に由来し得る。対象に対する養子移植治療のために使用する場合、ＮＫ細胞の源は、炎症反応（例えば、移植片対宿主病）の誘導を最小限にするために選択され得る。例えば、ＮＫ細胞は、自己であってもよく、すなわち、ＮＫ細胞を投与する同対象に由来してもよい。あるいは、ＮＫ細胞は、同種異系であってもよく、例えば、同種のドナーに由来し、ＮＫ細胞によって治療を受ける対象と同じＨＬＡ型を有してもよい。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、ＨＬＡ抗原が許容可能であるヒトドナーに由来するヒトＮＫ細胞であり、ＮＫ細胞によって治療を受ける対象に適合する。
あるいは、ＮＫ細胞は、細胞株（例えば、ＮＫ−９２）に由来してもよい。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）特性および／または機能を有してもよい。ＮＫ細胞のいずれかは多能性幹細胞に由来してもよい。あるいは、ＮＫ細胞は、誘導多能性幹細胞に由来してもよい。
【００１５】
本開示のＮＫ細胞は、（例えば、対象に投与する前に）エクスビボで増殖させることもできる。いくつかの例において、ＮＫ細胞は、限定されないが、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２を含むサイトカインに曝露される。ＮＫ細胞は、少なくとも１種（例えば、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、または少なくとも１０種）のサイトカインに曝露されてもよい。２種以上のサイトカインを使用する場合、サイトカインは、（任意の順番で）連続的に、または同時に使用してもよい。エクスビボでＮＫ細胞を培養する例示的な方法を実施例６に示す。
【００１６】
例えば、ＮＫ細胞は、通常の方法に従って、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２でエクスビボで増殖および活性化させてもよい。例えば、Fehniger et al., Journal of immunology, 162(8):4511-4520 (1999)を参照のこと。ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の増殖および生存を補助し、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２の両方は、細胞毒性およびＩＦＮ−γの産生を上方調節することによって、ＮＫ細胞の１型機能を刺激する。特定の理論に縛られることはないが、これらの２つのサイトカインにおける新鮮なＮＫ細胞のエクスビボ増殖は、１型免疫応答ドライバーに対するＮＫ細胞の機能とおそらく同調する。
ＩＬ−１５は、サイトカインの４−アルファ−ヘリックス束状ファミリーの一員であり、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の分化および増殖を促進することが示されている（例えば、Mishra et al., Clin Cancer Res., 20(8):2044-50, 2014を参照のこと）。一例として、ヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿７５１９１５．１に提供されている。
【００１７】
ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７およびＩＬ−３５を含むサイトカインのインターロイキン１２ファミリーの一員である。このサイトカインは２つのサブユニットから作製される。ヘテロ二量体として、ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２サブユニットアルファ（ＩＬ−１２  ｐ３５）およびＩＬ−１２サブユニットベータ（ＩＬ−１２  ｐ４０）から構成される。ヒトにおいて、各サブユニットは、異なる遺伝子によってコードされる。例えば、ヒトＩＬ−１２サブユニットアルファ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０００８７３．２、ＮＰ＿００１３４１５１１．１およびＮＰ＿００１３４１５１２．１）は、ＩＬ１２Ａ遺伝子によってコードされ、ヒトＩＬ−１２サブユニットベータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００２１７８．２）は、ＩＬ１２Ｂ遺伝子によってコードされる。
【００１８】
シクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物
本明細書に記載されるように、シクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物（例えば、ＣＴＸ、その薬学的に許容される塩もしくはエステル、またはその誘導体）は、養子細胞移植治療においてＮＫ細胞の有効性を増加させるために使用することができる。シクロホスファミド化合物は、ＤＮＡ架橋剤であり、ホスファミドマスタードに代謝することができる。構造的に、シクロホスファミド化合物は、式Ｉのコア構造を含み：
【化１】
2021534216.tif 000003
(式I)、置換されてもよい。
【００１９】
シクロホスファミド誘導体（例えば、予め活性化したシクロホスファミド類似体）およびその薬学的に許容される塩またはエステルも本開示によって含まれることを理解されたい。例えば、式Ｉの１つ以上の位置は、（例えば、官能基の置換または付加によって）改変されてもよい。官能基の非限定的な例として、炭化水素鎖（例えば、置換または非置換アルキル、アルケニル、またはアルキニル基）、ベンゼン環、アミン基、アルコール、エーテル、ハロゲン化アルキル、チオール、アルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸およびアミドが挙げられる。例えば、式Ｉにおいて、炭素のいずれかは、官能基で修飾されてもよく、アミン基の水素は、官能基で置換されてもよく、塩素は、また、限定されないが、フッ素およびヨウ素を含む任意のハロゲンで置換されてもよい。シクロホスファミド、その薬学的に許容される塩および誘導体は、通常の方法を使用して合成してもよい。例えば、Takamizawa et al., J Med Chem.1975 Apr;18(4):376-83を参照のこと。例示的なシクロホスファミド誘導体として、マホスファミド、イホスファミドもしくはトロホスファミドが挙げられる。
【００２０】
本明細書に記載のＣＴＸ化合物は、適用する場合、１つ以上の非対称中心を含み、そのため、様々な異性体形態、例えば、エナンチオマーおよび／またはジアステレオマーに存在することができる。例えば、本明細書に記載の化合物は、個別のエナンチオマー、ジアステレオマーまたは幾何異性体の形態であってもよく、またはラセミ混合物および１つ以上の立体異性体を富化した混合物を含む立体異性体の混合物の形態であってもよい。異性体は、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ならびにキラル塩の形成および結晶化を含む当業者に周知の方法によって混合物から単離することができ、または好ましい異性体は非対称合成によって調製することができる。例えば、Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981)；Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962)；およびWilen, Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L.Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)を参照のこと。本開示は、その他の異性体から実質的に自由な個別の異性体として、およびあるいは様々な異性体の混合物として、本明細書に記載の化合物を追加的に含む。
いくつかの例において、本明細書に開示の方法で使用されるＣＴＸ化合物は、（Ｒ）−異性体であってもよい。あるいは、ＣＴＸ化合物は、（Ｓ）−異性体であってもよい。いくつかの例において、ＣＴＸ化合物は、（Ｒ）および（Ｓ）異性体の混合物であってもよい。
【００２１】
化学元素は、元素の周期表、CAS版、Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.、カバー内部に従って識別され、特定の官能基は、概して、本明細書に記載されるように 定義される。さらに、有機化学、ならびに特定の機能的部分および反応性の一般原理は、Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999；Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001；Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989；およびCarruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987に記載されている。
【００２２】
本明細書に記載の化合物は、１つ以上の非対称中心を含み、そのため、様々な異性体形態、例えば、エナンチオマーおよび／またはジアステレオマーに存在することができる。例えば、本明細書に記載の化合物は、個別のエナンチオマー、ジアステレオマーまたは幾何異性体の形態であってもよく、またはラセミ混合物および１つ以上の立体異性体を富化した混合物を含む立体異性体の混合物の形態であってもよい。異性体は、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ならびにキラル塩の形成および結晶化を含む当業者に周知の方法によって混合物から単離することができ、または好ましい異性体は非対称合成によって調製することができる。例えば、Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981)；Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977)；Eliel, Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962)；およびWilen, Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L.Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)を参照のこと。本発明は、その他の異性体から実質的に自由な個別の異性体として、およびあるいは様々な異性体の混合物として、本明細書に記載の化合物を追加的に含む。
【００２３】
医薬組成物
いくつかの実施形態において、本開示は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と一緒に、本明細書に開示されるＣＴＸ化合物（例えば、ＣＴＸ）、および／またはやはり本明細書に開示されるＮＫ細胞を含む医薬組成物を提供する。
「薬学的に許容される」担体、希釈剤または賦形剤は、滅菌であり、パイロジェンを含まないものを含む。適切な薬学的担体、希釈剤および賦形剤は当該技術分野で周知である。担体（複数可）は、阻害剤と比較可能な意味で、「許容可能」でなければならず、そのレシピエントに対して有害ではない。
【００２４】
「薬学的に許容される」というフレーズは、本開示の組成物と結び付けて使用する場合、生理学的に容認でき、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与する場合、有害反応が通常生じないこのような組成物の分子実体およびその他の成分を指す。好ましくは、本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、哺乳動物、およびより詳細にはヒトに使用するための連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されている、または米国薬局方もしくはその他の一般的に認識される薬局方に列挙されていることを意味する。「許容される」は、担体が組成物の有効成分（例えば、ＣＴＸ化合物および／またはＮＫ細胞）と比較可能であり、組成物（複数可）が投与される対象に負の影響を与えないことを意味する。本発明の方法に使用される医薬組成物のいずれかは、凍結乾燥形態または水性溶液の形態の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含むことができる。
【００２５】
バッファを含む薬学的に許容される担体は、当該技術分野で周知であり、リン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン等のタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖；二糖；ならびにその他の炭水化物；金属錯体；ならびに／または非イオン界面活性剤を含み得る。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E.Hooverを参照のこと。
本明細書に記載のＣＴＸ化合物および／またはＮＫ細胞を含む医薬組成物は、有効成分を含む医薬製剤の形態で、薬学的に許容される剤形の非毒性有機酸もしくは無機酸、または塩基、付加塩の形態であってもよい、非経口投与、経口投与、頬側投与、舌下投与、局所投与または吸引のような当該技術分野で周知の任意の投与経路によって投与することができる。いくつかの実施形態において、投与経路は経口投与であり、製剤は経口投与のために製剤化される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物または製剤は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内投与のような非経口投与のためにある。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞を含む組成物は、静脈内注射のために製剤化することができる。
【００２６】
非経口投与に適した製剤として、抗酸化剤、バッファ、静菌薬、および製剤を意図するレシピエントの血液に等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注入溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。水性溶液は、適切に緩衝されてもよい（好ましくは、３〜９のｐＨ）。滅菌条件下の適切な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技術によって容易に達成される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物または製剤は、錠剤、カプセル剤、腟坐剤（ｏｖｕｌｅ）、エリキシル剤、溶液剤もしくは懸濁剤のような経口、頬側、または舌下投与に適しており、即座の、遅延の、または徐放適用のために、香料または着色剤を含有してもよい。
【００２７】
適切な錠剤として、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびグリシンのような賦形剤、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび特定の複合ケイ酸塩のような崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ショ糖、ゼラチンおよびアカシアのような顆粒結合剤を含有してもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクのような滑沢剤を含んでもよい。
同型の固体組成物もゼラチンカプセルに充填剤として使用してもよい。この点について好ましい賦形剤として、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量のポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液および／またはエリキシル剤について、本発明の化合物は、様々な甘味料または香料、着色物質または染料と、乳化剤および／または懸濁剤と、水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンのような希釈剤と、ならびにその組み合わせと合わせることができる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素またはその他の適切な気体の使用と共に、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーからの乾燥粉末吸入器またはエアロゾルスプレー提示の形態で送達されるように、医薬組成物または製剤は、鼻腔内投与または吸引に適している。加圧エアロゾルの場合、剤形は、秤量を送達するバルブを提供することによって決定することができる。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、例えば、滑沢剤を付加的に含有してもよいエタノールおよび噴霧剤の混合物を溶媒として使用して、活性化合物の溶液または懸濁液を含有してもよい。吸引器または注入器に使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから作製される）は、阻害薬およびラクトースまたはデンプン等の適切な粉末ベースの粉末混合物を含有するように製剤化してもよい。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＣＴＸ化合物を含む医薬組成物または製剤は、対象に局所投与するのに適している。阻害薬をローション、溶液、クリーム、軟膏もしくは粉剤の形態で局所的に適用することができ、または例えば、皮膚パッチの使用により、経皮的に投与することができる。皮膚に局所的に適用することについて、例えば、以下：鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水の１つ以上を有する混合物に懸濁または溶解された活性化合物を含有する適切な軟膏として、阻害薬を製剤化することができる。あるいは、阻害薬は、例えば、以下：鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の１つ以上の混合物に懸濁または溶解された適切なローションまたはクリームとして製剤化することができる。口に局所的に投与するのに適した製剤として、有効成分を含むロゼンジ剤；ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアカシア等の不活性基礎に有効成分を含む錠剤；適切な液体担体に有効成分を含むマウスウォッシュが挙げられる。
製剤は、例えば、封止されたアンプルまたはバイアルのような単一用量または多用量容器に提示することができ、使用前に直ちに無菌液体担体の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件に保存することができる。
【００３０】
治療的適用
本開示は、本明細書に開示されるＣＴＸのようなＣＴＸ化合物およびＮＫ細胞の両方を含む癌のための併用治療も提供する。ＣＴＸ化合物およびＮＫ細胞は、治療を必要とする対象に、同時または連続して（任意の順序で）投与することができる。
【００３１】
本明細書に記載の治療方法を実行するために、治療を必要とする対象に、本明細書に記載の有効量のシクロホスファミド化合物および有効量のＮＫ細胞を適切な経路を介して投与することができる（例えば、ＮＫ細胞の静脈内注入および／またはＣＴＸ化合物の経口投与）。シクロホスファミド化合物および／またはＮＫ細胞を薬学的に許容される担体と混合して、投与する前に医薬組成物を形成することができ、これも本開示の範囲にある。前述のように、ＮＫ細胞は、エクスビボで増殖することができる（例えば、限定されないが、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５を含むサイトカインに曝露される）。
【００３２】
ＮＫ細胞は、対象に自己であってもよく、すなわち、ＮＫ細胞は、治療を必要とする対象から得られる。対象に自己細胞を投与することによって、非自己細胞の投与に比べて、ＮＫ細胞の拒絶を減少させることができる。あるいは、ＮＫ細胞は、同種異系細胞であってもよく、すなわち、細胞を第１の対象から得て、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５）に曝露してもよく、第１の対象と異なるが同種である第２の対象に投与する。例えば、同種異系ＮＫ細胞は、ヒトドナーに由来してもよく、ドナーと異なるヒトレシピエントに投与してもよい。あるいは、ＮＫ細胞は、本明細書に記載のインビトロの細胞培養物に由来してもよい。
【００３３】
治療を受ける対象は哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはサル）であってよい。対象は、癌を有する、有する恐れのある、またはそのリスクがあり得る。例示的な癌として、固形腫瘍（例えば、乳癌）および血液癌が挙げられる。乳癌の種類は、トリプルネガティブ乳癌であってもよい。例示的な血液癌として、限定されないが、白血病、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫）、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉症）、および多発性骨髄腫が挙げられる。例示的な固形腫瘍として、限定されないが、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、乳癌および卵巣癌が挙げられる。いくつかの例において、治療を受ける対象は、癌を有し、癌のために以前に治療を受けたことがある。例えば、対象は、１つ以上の腫瘍を取り除いた（すなわち、切除した）ことがあってもよい。
いくつかの実施形態において、対象は、先行して抗癌治療を受けたことがあるヒト癌患者であってもよい。非限定な例として、化学療法、免疫療法、放射線治療、外科手術、または本明細書に開示の併用療法が挙げられる。先行の抗癌治療は完了していてもよい。あるいは、先行の癌治療は、依然として継続中であってもよい。いくつかの実施形態において、ヒト患者は、先行の治療後に、腫瘍緩解（例えば、完全または部分的）を示し得る。
【００３４】
シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞は、連続して（任意の順序で）対象に投与してもよい。本明細書で使用する場合、「併用治療」という用語は、とりわけ、参照される実体（例えば、ＮＫ細胞およびシクロホスファミド化合物）の連続投与を含む。例えば、シクロホスファミド化合物は、ＮＫ細胞の投与前に、投与してもよい（例えば、少なくとも６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１日前、少なくとも３日前、少なくとも５日前または少なくとも７日前）。１回以上の用量（少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも１０用量）のシクロホスファミド化合物を対象に投与してもよい。同様に、１回以上の用量（少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも１０用量）のＮＫ細胞を対象に投与してもよい。シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞の投与を交替で行うことも本開示に含まれる。
対象に投与するＣＴＸ化合物の量は、対象の身長および体重、全体的な健康またはその他の健康上の問題、ならびに対象の癌または状態の種類を含む多くの因子に依存し得る。厳密な用量およびスケジュールは臨床医によって決定することができる。ＣＴＸ化合物は、用量、治療を受ける条件、および使用目的に依存して様々な投与経路で患者に投与してもよい。例えば、ＣＴＸ化合物は、静脈内（静脈内、ＩＶ）に注射、または任意に食事の後に経口投与（例えば、錠剤形態で）してもよい。あるいは、ＣＴＸ化合物は、筋肉内注射（ＩＭ）、または腹腔膜（腹腔内、ＩＰ）、または肺の内部（胸膜内）に対象に投与してもよい。
【００３５】
ＮＫ細胞は、単回または複数回、適切な経路、例えば、静脈内注射によって、対象に投与してもよい。いくつかの例において、対象（例えば、ヒト患者）は、体重１ｋｇあたり約１０5〜１０10個以上の細胞（細胞／Ｋｇ）の範囲で、治療有効量のＮＫ細胞を注射することによって治療することができる。注射は、所望の反応を達成するまで、患者が認容できるだけの回数で繰り返すことができる。適切な注射用量およびスケジュールは、患者ごとに異なるが、特定の患者のために、治療臨床医によって決定することができる。典型的には、約１０6細胞／Ｋｇの初回用量を注射し、１０8以上の細胞／Ｋｇに漸増する。
シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞の対象への投与は、腫瘍増殖を予防し、腫瘍増殖を阻害し、および／または腫瘍後退を誘導することができる。例えば、シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞の対象への投与は、腫瘍量（例えば、腫瘍の容量）を少なくとも１０％（少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）減少させることができる。
【００３６】
併用治療を受けている対象は、シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞を投与されていない対象よりも長く生存することができる。シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞の組み合わせは、未治療に比べて、１未満のハザード比になり得る。例えば、組み合わせのハザード比は、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１未満であり得る。ハザード比の測定値の非限定的な例を表１および表３に提供する。
【００３７】
いくつかの例において、シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞の投与は、腫瘍の再発に対する適応免疫を誘導することができる。例えば、シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞の投与は、特定の種類の腫瘍（例えば、当該技術分野で周知のおよび／または本明細書に開示の乳癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、メラノーマ、または膵臓癌のような固形腫瘍、または血液癌）に対して適応免疫を誘導することができる。前述のように、乳癌は、トリプルネガティブ乳癌を含む。シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞による治療は、癌の再発のリスクを減少させることができる。例えば、シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞の併用治療は、無病生存期間の確率を増加させることができる（例えば、５年の無病生存確率、または１０年の無病生存確率）。無病生存期間の確率は、少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％）増加させることができる。
【００３８】
本明細書に記載のシクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞は、化学療法、外科手術、放射線治療、遺伝子治療、標的薬等を含むその他の種類の癌治療と組み合わせて使用することができる。追加の有用な薬および治療は、Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.；Gennaro et al., Eds.Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.；Braunwald et al., Eds.Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY；Berkow et al., Eds.The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.Jに見つけることができる。
いくつかの例において、シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞は、腫瘍の切除前に（例えば、乳癌の対象に）投与される。いくつかの例において、シクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞は、腫瘍の切除後に投与される。
【００３９】
「有効量」という用語は、本明細書で使用する場合、単独または１種以上の活性薬と組み合わせて、対象に治療効果をもたらすのに必要とされる各活性薬の量を指す。有効量は、当業者に認識されているように、治療する特定の病態、病態の重症度、年齢、身体状態、大きさ、性別および体重を含む個別の患者のパラメータ、治療期間、投与経路、賦形剤の使用、その他の活性薬の共使用（ある場合）、ならびに保健開業医の知識および専門性における要因に依存して変化する。投与量は、例えば、個体の細胞媒介免疫応答を生み出す免疫系の許容力を含む治療を受ける対象に依存する。投与に必要な有効成分の正確な量は、開業医の判断に依存する。しかしながら、適切な容量範囲は、当業者によって容易に決定される。
「治療すること」という用語は、本明細書で使用する場合、１種以上の活性薬を含む組成物を、標的疾患、標的疾患の症状または標的疾患の素因を有する対象に、疾患、疾患の症状または標的疾患の素因を治療、治癒、軽減、緩和、改変、回復、緩解、改善し、またはそれに影響を与える目的で、適用または投与することを指す。
【００４０】
治療使用のためのキット
本開示は、本明細書に記載の任意の癌に使用するためのキットも提供する。本明細書に記載の治療使用のためのキットは、（ｉ）シクロホスファミド化合物（例えば、ＣＴＸ）、および（ｉｉ）サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５）でエクスビボで培養されてもよいＮＫ細胞を含む１つ以上の容器を含んでいてもよい。シクロホスファミド化合物および／またはＮＫ細胞は、薬学的に許容される担体に製剤化することができる。キットは、さらにＩＬ−１２およびＩＬ−１５を含んでもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかにおけるシクロホスファミド化合物およびＮＫ細胞を使用するための説明書を追加的に含むことができる。含まれる説明書は、対象に意図した作用を達成するために、ＮＫ細胞、シクロホスファミド化合物、またはこれらを含む医薬組成物を対象に投与する記述を含んでもよい。キットは、対象がこの治療を必要としているかどうかを判定することに基づいて、治療に適した対象を選択する記述をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、説明書は、シクロホスファミド化合物、ＮＫ細胞、またはこれらを含む医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与する記述を含む。
シクロホスファミド化合物、ＮＫ細胞、または本明細書に記載のこれらを含む医薬組成物の使用に関係する説明書は、概して、意図した治療のための用量、投与スケジュール、および投与経路を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、多用量パッケージ）、またはサブユニット用量であってもよい。本開示のキットに供給される説明書は、通常、ラベルまたは添付文書に記載の説明である。ラベルまたは添付文書は、対象の疾患または障害を治療、発症の遅延、および／または改善するために、医薬組成物を使用することを示す。
【００４２】
本明細書に提供されるキットは、適切なパッケージにある。適切なパッケージとして、限定されないが、バイアル、容器、ジャー、可撓性パッケージ等が挙げられる。吸引器、鼻腔投与装置または注入装置のような特定の装置と組み合わせて使用するためのパッケージも考慮している。キットは、滅菌アクセスポートを有する（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアル）。容器は滅菌アクセスポートを有してもよい。ＮＫ細胞およびシクロホスファミド化合物は、活性薬と考えることができる。
キットは、バッファおよび判断情報のような追加の要素を提供してもよい。通常、キットは、容器、およびラベルまたは添付文書（複数可）または容器に関連するものを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、前述のキットの内容物を含む製造物品を提供する。
【００４３】
一般的技術
本発明の実行は、他に断りの無い限り、（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の通常の技術を使用し、これらは当該技術分野の範囲にある。Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M. J.Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook (J. E.Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I.Freshney, ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E.Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B.Griffiths, and D. G.Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D. M.Weir and C. C.Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M.Miller and M. P. Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M.Ausubel, et al., eds., 1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E.Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C. A.Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D.Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)。さらなる労苦がなくとも、当業者は、前述に基づいて、充分な範囲で本発明を利用することができると考えられる。以下の特定の実施形態は、したがって、単なる例示と考えられ、いかなる場合も本開示の残りを限定しない。本明細書に記載の全ての刊行物は、本明細書に示される目的または主題について、参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４４】
（実施例１）
ＥＯ７７１腫瘍を有するマウスに対するＣＴＸ治療の治療効果
同系同所性ＥＯ７７１トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）マウスモデル（Johnstone et al., Disease models & mechanisms, 8(3):237-251 (2015)）を使用して、インビボの治療有効性を評価した。
【００４５】
材料および方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌ雌マウスをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｔａｉｗａｎから購入し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ、Ｔａｉｗａｎの動物施設において、特定の病原菌のない条件下に収容した。使用したマウスは８〜１２週齢であった。
【００４６】
細胞株および細胞培養物
ＥＯ７７１  ＴＮＢＣ細胞株（ＣＨ３  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）を完全培地（２０ｍＭのｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ社）ならびに１％のペニシリンおよびストレプトマイシンＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ；Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ））に培養した。Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマはＤｒ．Ｒｏｆｆｌｅｒ、Ｓｔｅｖｅ  Ｒ．（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ、Ｔａｉｗａｎ）によって供給され、完全培地（１０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社）および１％のＰＳ（Ｇｉｂｃｏ社）ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社））に培養した。腫瘍細胞を５％のＣＯ2を有する３７℃のインキュベーターに培養した。
【００４７】
マウスＮＫ細胞の調製
骨髄（ＢＭ）細胞を脛骨および大腿骨から得た。赤血球細胞をＡＣＫ溶解バッファ（０．１５ＭのＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭのＮａＨＣＯ3、１ｍＭの二ナトリウムＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））によって溶解した。ＢＭ細胞をｒｍＩＬ−１５を含有する１０％のＦＢＳ  ＲＰＭＩ培地に７日間培養し、ＩＬ−１２を回収する前に１６時間加えた。回収したＢＭ細胞をＣＤ１９、Ｈ５７、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ｃおよびＢ２２０に特異的な抗体で染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ  ＳＯＲＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；ＦＡＣＳ  Ｃｏｒｅ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ、Ｔａｉｗａｎ）を使用して、ＣＤ１１ｃ+Ｂ２２０+ＮＫ細胞についてソートした。
【００４８】
腫瘍モデルおよび治療レジメン
ＥＯ７７１細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの自発的乳房の髄様腺癌に由来する。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌ雌マウスの第４の乳房の厚いパッドにＥＯ７７１細胞を注入することによって、同系同所性ＴＭＢＣモデルを実施した。腫瘍を有するモデルについて、各マウスに０．５ｘ１０6の細胞を接種させ、２１日後に、ＣＴＸの第１の腹腔内注射を受けた。第２のＣＴＸ注射は６日後に行った。ソートしたＣＤ１１ｃ+Ｂ２２０+ＮＫ細胞を第２のＣＴＸ治療から約２４時間で、静脈内に移植し、別のＮＫ細胞を３〜４日後に移植した。腫瘍切除モデルについて、各マウスに０．３ｘ１０6のＥＯ７７１細胞を接種させ、腫瘍および流入領域リンパ節を２１日後に切除した。腫瘍を有するモデルにおいて記載されるように、切除から４８時間でＣＴＸ／ＮＫ治療を開始した。指示されるように再チャレンジのために、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（０．０７５ｘ１０6細胞／マウス）を静脈内に接種した。マウスの生存、体重、および腫瘍量をモニタリングした。
【００４９】
統計解析
カプランマイヤー法をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７を使用して実施し、対数順位検定を使用して有意性を決定した。コックス比例ハザードモデルを使用して、ハザード比および相関［２４］を分析した。Ｐ値≦０．０５は、統計的に有意であると考えられた（*ｐ≦０．０５**ｐ≦０．０１、***ｐ≦０．００１、****ｐ≦０．０００１）。
結果
効果的なレジメンを開発するために、１回対２回のシクロホスファミド（ＣＴＸ）治療の腫瘍を有するマウスに対する影響を調査した。ＣＴＸを腫瘍接種から２１日目に投与した。２回のＣＴＸ治療群は、第１の治療から６日で第２のＣＴＸ注射を受けた。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を負対照として使用した。
【００５０】
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を投与したマウスは全て、５３日の中央生存期間で死亡した。他方、ＣＴＸ１回の治療を受けた８匹のマウスのうち１匹およびＣＴＸ２回の治療を受けた８匹のマウスのうち５匹が少なくとも１２０日間生存した。図１Ａ。結果は、ＣＴＸがＴＮＢＣの治療に効果的であり、および複数回（例えば、６日の間隔で）は、より良い結果を示した。
【００５１】
２回の投与（６日間の間隔）のＣＴＸ治療レジメンを、ＣＴＸ用量の注射につき１２５ｍｇ／ｋｇおよび１５０ｍｇ／ｋｇを使用して、以下の実験に使用した。生存率が１５０ｍｇ／ｋｇの投与によって、１１％〜６２％有意に改善したことが分かった。（図１Ｂ）。これらの結果に基づいて、６日間の間隔を開けて投与した１５０ｍｇ／ｋｇ／注射の用量の２回のＣＴＸ治療を使用して、養子ＮＫ細胞移植による併用治療の試験を行った。
【００５２】
（実施例２）
ＣＴＸおよびＮＫ細胞治療がＥＯ７７１腫瘍を有するマウスの生存率を相乗的に増加させる。
最初に、ＣＴＸ単一治療、ＮＫ単一治療、またはＣＴＸおよびＮＫ細胞併用治療のＥＯ７７１腫瘍を有するマウスに対する効果を調査し、前述の実施例１の記載のように分析をした。治療を腫瘍接種後２１日目に開始した。ＮＫ細胞単一治療を受けたマウスは全て、負対照（ＰＢＳ）群と同様の中央生存率で死亡した。図２。他方、ＣＴＸ単一治療群のマウスの６２％ならびにＣＴＸおよびＮＫ細胞併用治療におけるマウスの８０％が少なくとも１２０日間生存した。図２。
【００５３】
コックス比例ハザードモデルによる分析は、ＣＴＸ単一治療ならびにＣＴＸおよびＮＫ細胞の併用治療について、ＰＢＳ対照に比べて、有意に低いハザード比を示した。ＣＴＸ単一治療に比べて、併用治療群に有意な利益を観察した。結果を以下の表１に示す。さらに、ＣＴＸおよびＮＫ細胞の併用治療は、０．３５３（ｐ＝０．０２８）のハザード比と相乗交互作用を示し、ＥＯ７７１  ＴＮＢＣモデルに例示されるように、腫瘍を有するマウスの治療について、長期間の生存率効果の達成に、ＣＴＸおよびＮＫ細胞の相乗効果を示す。
【表１】
2021534216.tif 000004
したがって、ＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療は、腫瘍を有する条件下で、ＣＴＸ単一治療に比べて、有意な利益を示した。ＣＴＸおよびＮＫ細胞併用治療は、腫瘍を有するマウスにおいて、相乗交互作用を示し、２つの治療薬の相乗効果を示す。さらに、ＮＫ細胞単一治療ではなく、ＣＴＸ単一治療およびＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療は、腫瘍を有するマウスの生存率を促進した。
【００５４】
（実施例３）
ＣＴＸおよびＮＫ細胞の併用治療はＥＯ７７１腫瘍を有するマウスに保護的免疫記憶を誘導する。
癌の再発は、癌治療において大きな問題である。ＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療が腫瘍の再発のリスクを予防または減少するかどうかを決定するために、治療後に一次腫瘍を生き延びたマウスに同腫瘍細胞で再チャレンジして、癌の再発を模倣した。この実施例に使用した分析を前述の実施例１に提供する。
【００５５】
ＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療群の１００％およびＣＴＸ単一治療群の９０％は、ＥＯ７７１の再チャレンジ後、少なくとも１２０日間生存し、ＥＯ７７１細胞を接種した全ての同年齢のナイーブマウスは、再チャレンジ後、最大７０日で死亡した。図３。これらの結果は、ＣＴＸとＮＫ細胞の両方による一次腫瘍の治療が腫瘍再発からマウスを保護する免疫記憶を誘導することを示唆した。
【００５６】
腫瘍を有するモデルにおいて、ＣＴＸおよびＮＫ細胞併用治療は、一次生存調査において、ＣＴＸ単一治療よりも高い有効性を示し、同腫瘍細胞による再チャレンジに対する比較可能な保護を誘導した。治癒率は、一次および再チャレンジ生存率を掛けることによって推定した。以下の表２に示すように、治癒率は、ＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療については８０％であり、ＣＴＸ単一治療については５６％であった。
【表２】
2021534216.tif 000005
まとめると、養子ＮＫ細胞移植およびＣＴＸ併用治療は、ＥＯ７７１腫瘍を有するマウスに相乗的な抗腫瘍効果を示し、推定される治癒率が８３％に達した。結果は、ＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療およびＣＴＸ単一治療が腫瘍を有する条件下で、腫瘍の再発に対して保護する免疫記憶を誘導すると思われることも示唆している。
【００５７】
（実施例４）
ＣＴＸ単一治療およびＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療は、ＥＯ７７１腫瘍を切除したマウスの生存率に比較可能な有効性を達成した。
次に、ＣＴＸ単一治療およびＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療の効果を、腫瘍を外科手術的に切除した患者を模倣するＥＯ７７１腫瘍切除マウスモデルにおいて調査した。この実施例に使用した分析を前述の実施例１に提供する。
【００５８】
腫瘍および流入領域リンパ節を腫瘍接種後２１日目に切除し、ＣＴＸ単独またはＮＫ細胞との併用を切除から２日後に開始した。切除も治療（ＰＢＳ対照群）も受けていないマウスは、５１日の中央生存期間で死亡し、切除のみは６８日の中央生存期間で１８％の生存率であった。図４。腫瘍切除マウスにおいて、ＮＫ細胞単一治療は３５％、ＣＴＸ単一治療は８６％に生存率を改善した。図４。ＣＴＸおよびＮＫ細胞併用治療は、ＣＴＸ単独に比べて、生存率をさらに増加させなかった。図４。コックス比例ハザードモデルによる分析は、ＣＴＸ単一治療およびＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療群について、切除のみの群に比べて、有意に低いハザード比を示し、ＣＴＸ単一治療およびＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療は有意差を示さなかった。表３。
【表３】
2021534216.tif 000006
まとめると、ＣＴＸ単独ならびにＣＴＸおよびＮＫ細胞の併用は、腫瘍切除マウスの生存率を改善した。これらの結果は、ＣＴＸ単一治療およびＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療が腫瘍切除マウスの一次生存率に比較可能な高い有効性を達成したことを示す。
【００５９】
（実施例５）
ＮＫ細胞治療がＥＯ７７１腫瘍を切除したマウスにおける腫瘍特異的免疫記憶を増強する。
前述の実施例１に記載されるアッセイ後、この実施例では、ＣＴＸ単一治療およびＣＴＸ／ＮＫ細胞併用治療が腫瘍切除条件下で保護的免疫記憶を誘導するかどうかを調査した。一次ＥＯ７７１腫瘍の治療後に生き延びたマウスにＥＯ７７１細胞で再チャレンジした。ＣＴＸ群は、３０％の生存率、ＮＫ細胞群は６７％の生存率を示した。図５。ＣＴＸおよびＮＫ細胞の併用は、８３％の生存率という最も高い保護を示した。図５。他方、Ｂ１６Ｆ１０で再チャレンジしたマウスは全て、一次ＥＯ７７１腫瘍についての治療種類にもかかわらず死亡した。ＥＯ７７１一次および再チャレンジ生存率に基づいて、腫瘍切除マウスについての推定される治癒率は、ＮＫ治療では２３％、ＣＴＸ治療では２６％、ＣＴＸ＋ＮＫ治療では７５％であった。以下の表４。
【００６０】
【表４】
2021534216.tif 000007
まとめると、ＣＴＸおよびＮＫ細胞併用治療は、７５％の推定される治癒率を達成し、これは、対応する単一治療よりも有意に高い。ＣＴＸおよびＮＫ細胞併用治療は、腫瘍切除条件下で再発に対する腫瘍特異的保護を誘導した。
【００６１】
その他の実施形態
本明細書に開示される特徴は全て、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴は、同一、同等、または同様の目的を提供する代替の特徴によって置き換えることができる。したがって、他に明示的に示されない限り、開示される特徴はそれぞれ、一般的な一連の同等または同様の特徴の一例にすぎない。
前述から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を容易に確かめることができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適合させるために、本発明の様々な変更形態および修正形態を作成することができる。したがって、その他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【００６２】
均等物
本明細書においていくつかの本発明の実施形態を記載し、説明してきたが、当業者は、機能を実行し、ならびに／または本明細書に記載の結果および／または１つ以上の利点を得るために、様々なその他の手段および／または構造を容易に想像し、このような変化例および／または修正のそれぞれが本明細書に記載の本発明の実施形態の範囲にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のパラメータ、寸法、材料および構成の全てが例示であり、実際のパラメータ、寸法、材料および／または構成が本発明の教示を使用する特定の適用に依存することを意味することを容易に理解する。当業者は、通常の実験法にすぎないものを使用して、本明細書に記載の特定の本発明の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができる。したがって、前述の実施形態は、例示にすぎないものとして提示され、添付の請求項およびその均等物の範囲内において、本発明の実施形態が、特に記載し、請求する以外の別の方法で実行することができることが理解される。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載のそれぞれ個別の特性、システム、物品、材料、キットおよび／または方法に関する。さらに、このような特性、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が相互に矛盾しない場合、２つ以上の特性、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせが本開示の本発明の範囲に含まれる。
本明細書に規定し、使用する定義の全ては、参照により組み込まれる辞書の定義、文献の定義、および／または定義される用語の通常の意味を管理することが理解されるはずである。
本明細書に開示の参考文献、特許および特許出願の全てが、それぞれが記載される主題について参照により組み込まれ、いくつかの場合、文献の全体を含み得る。
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明細書および請求項において使用する場合、反対のことを明白に示さない限り、「少なくとも１つ」を意味することが理解されるはずである。
【００６３】
「および／または」というフレーズは、明細書および特許請求の範囲において使用する場合、それによって結合する要素、すなわち、接続的に存在する場合もあれば、非接続的に存在する場合もある要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるはずであり。「および／または」で列挙される複数の要素は、同じように、すなわち、それによって結合する要素の「１つ以上」と解釈されるはずである。「および／または」という句によって具体的に識別される要素以外に、具体的に識別されるのこれらの要素に関係するか無関係であるかにかかわりなく、他の要素が存在してもよい。したがって、非限定な例として、「Ａおよび／またはＢ」に対する言及は、「含む」のようなオープンエンドの語句と合わせて使用する場合、一実施形態においてＡのみ（Ｂ以外の要素を含んでもよい）、別の実施形態においてＢのみ（Ａ以外の要素を含んでもよい）、さらに別の実施形態においてＡとＢの両方（その他の要素を含んでもよい）を指すことができる。
【００６４】
本明細書および請求項において使用する場合、「または」は、前述で定義されたように「および／または」と同じ意味を有することが理解されるはずである。例えば、リストにおいて項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括するものとして解釈され、すなわち、要素、および任意に追加の列挙していないいくつかの項目またはリストの少なくとも１つを含むが、１つ以上も含む。「たった１つの」または「厳密に１つの」、または請求項で使用する場合の「〜からなる」のような反対のことを明白に示す用語だけが、いくつかの要素または要素のリストの厳密に１つの要素を含むことを指す。一般的に、「または」という用語は、本明細書で使用する場合、「いずれか」、「〜の１つ」、「たった１つの」または「厳密に１つの」のような排他性の用語によって先行される場合、排他的な代替物（すなわち、「どれか１つであり、両方ではない」）を示すものとして解釈されるにすぎない。「〜から本質的になる」は、請求項に使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有する。
【００６５】
明細書および請求項において使用される場合、１つ以上の要素のリストを参照して「少なくとも１つ」というフレーズは、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリストに特に挙げられるそれぞれおよび全ての要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリストにおける要素の任意の組み合わせを除外しないことを意味することが理解されるはずである。この定義は、また、要素が、「少なくとも１つの」というフレーズが指す要素のリストに特に特定される要素以外の要素として存在してもよく、これらの要素に関係するまたは無関係であるかどうかが特に識別される。したがって、非限定な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または等価に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または等価に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態において、Ｂが存在しない（Ｂ以外の要素を含んでもよい）少なくとも１つの、任意に１つ以上を含むＡを指すことができ、別の実施形態において、Ａが存在しない（Ａ以外の要素を含んでもよい）少なくとも１つの、任意に１つ以上を含むＢを指すことができ、さらに別の実施形態において、少なくとも１つの、任意に１つ以上のＡを含んでもよい、少なくとも１つの、任意に１つ以上のＢを含んでもよい（その他の要素を含んでもよい）ことなどを指すことができる。
また、反対のことを明白に示さない限り、１つ以上の工程または行為を含む本明細書に請求される任意の方法において、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為を記載する順序に必ずしも限定されないことが理解されるはずである。
【図１Ａ】
2021534216.tif 000008
【図１Ｂ】
2021534216.tif 000009
【図２】
2021534216.tif 000010
【図３】
2021534216.tif 000011
【図４】
2021534216.tif 000012
【図５】
2021534216.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月22日(2021.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌治療に使用されるキットであって、
（ｉ）シクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物と、
（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、
を備える、
キット。
【請求項２】
前記ＣＴＸ化合物は、シクロホスファミド、マホスファミド、イホスファミド若しくはトロホスファミド、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
少なくとも２用量の前記ＣＴＸ化合物が投与される、かつ／又は、少なくとも２用量の前記ＮＫ細胞が投与される、請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
少なくとも２用量の前記ＣＴＸ化合物が投与され、
前記ＣＴＸ化合物の連続する２用量の投与が、少なくとも４〜８日空いており、６日空いてもよい、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
少なくとも１用量の前記ＣＴＸ化合物が、前記ＮＫ細胞が投与される前に、前記対象に投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６】
少なくとも１用量の前記ＮＫ細胞が、前記ＣＴＸ化合物が投与される前に、前記対象に投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７】
前記対象は、癌を有する、有すると疑われる、またはそのリスクがあるヒト患者である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８】
前記癌は固形癌または血液癌である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記固形癌は、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌または膀胱癌である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記固形癌は乳癌であり、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）であってもよい、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記血液癌は、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫である、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
前記対象は腫瘍切除を受けたことがある、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
前記ＣＴＸ化合物の量および前記ＮＫ細胞の量は、癌の再発のリスクを減少させるのに効果的である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
前記ＮＫ細胞は、エクスビボでＩＬ−１５およびＩＬ−１２に曝露されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
対象において、腫瘍の再発に対して保護的免疫記憶を誘導し、かつ／または腫瘍の再発のリスクを減少させる方法において使用されるキットであって、
（ｉ）シクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物と、
（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、
を含むキット。
【請求項１６】
前記ＣＴＸ化合物は、シクロホスファミド、マホスファミド、イホスファミドもしくはトロホスファミド、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記対象は腫瘍を有したヒト患者である、請求項１５または請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記ヒト患者は、抗腫瘍治療を受けたことがある、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記ＮＫ細胞は、自己または同種異系である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株に由来し、多能性幹細胞に由来し、または誘導多能性幹細胞に由来する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
明細書および請求項において使用される場合、１つ以上の要素のリストを参照して「少なくとも１つ」というフレーズは、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリストに特に挙げられるそれぞれおよび全ての要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリストにおける要素の任意の組み合わせを除外しないことを意味することが理解されるはずである。この定義は、また、要素が、「少なくとも１つの」というフレーズが指す要素のリストに特に特定される要素以外の要素として存在してもよく、これらの要素に関係するまたは無関係であるかどうかが特に識別される。したがって、非限定な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または等価に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または等価に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態において、Ｂが存在しない（Ｂ以外の要素を含んでもよい）少なくとも１つの、任意に１つ以上を含むＡを指すことができ、別の実施形態において、Ａが存在しない（Ａ以外の要素を含んでもよい）少なくとも１つの、任意に１つ以上を含むＢを指すことができ、さらに別の実施形態において、少なくとも１つの、任意に１つ以上のＡを含んでもよい、少なくとも１つの、任意に１つ以上のＢを含んでもよい（その他の要素を含んでもよい）ことなどを指すことができる。
また、反対のことを明白に示さない限り、１つ以上の工程または行為を含む本明細書に請求される任意の方法において、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為を記載する順序に必ずしも限定されないことが理解されるはずである。
本発明は以下の事項を含んでいるともいえる。
（付記１）
癌治療の方法であって、
ａ．それを必要とする対象に有効量のシクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物を投与すること、および
ｂ．対象に有効量のナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞を投与すること
を含む方法。
（付記２）
前記シクロホスファミド化合物は、シクロホスファミド、マホスファミド、イホスファミドおよびトロホスファミド、またはその薬学的に許容される塩である、付記１に記載の方法。
（付記３）
工程（ａ）が少なくとも２用量の前記ＣＴＸ化合物を含み、および／または工程（ｂ）が少なくとも２用量の前記ＮＫ細胞を含む、付記１または２に記載の方法。
（付記４）
工程（ａ）が少なくとも２用量の前記ＣＴＸ化合物を含み、前記ＣＴＸ化合物の連続する２用量の投与は、少なくとも４〜８日空いており、６日空いてもよい、付記３に記載の方法。
（付記５）
工程（ａ）における少なくとも１用量の前記ＣＴＸ化合物を工程（ｂ）の前に前記対象に投与する、付記１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（付記６）
工程（ｂ）における少なくとも１用量の前記ＮＫ細胞を工程（ａ）の前に前記対象に投与する、付記１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（付記７）
前記対象は、癌を有する、有すると疑われる、またはそのリスクがあるヒト患者である、付記１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（付記８）
前記癌は固形癌または血液癌である、付記７に記載の方法。
（付記９）
前記固形癌は、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌または膀胱癌である、付記８に記載の方法。
（付記１０）
前記固形癌は乳癌であり、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）であってもよい、付記９に記載の方法。
（付記１１）
前記血液癌は、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫である、付記８に記載の方法。
（付記１２）
前記対象は腫瘍切除を受けたことがある、付記１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（付記１３）
前記ＣＴＸ化合物の量およびＮＫ細胞の前記量は、癌の再発のリスクを減少させるのに効果的である、付記５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（付記１４）
前記ＮＫ細胞は、工程（ｂ）の前に、エクスビボでＩＬ−１５およびＩＬ−１２に曝露されている、付記１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（付記１５）
腫瘍の再発に対して保護的免疫記憶を誘導し、および／または腫瘍の再発のリスクを減少させる方法であって、
ａ．それを必要とする対象に有効量のシクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物を投与すること、および
ｂ．対象に有効量のナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞を投与すること
を含む方法。
（付記１６）
前記シクロホスファミド化合物は、シクロホスファミド、マホスファミド、イホスファミドもしくはトロホスファミド、またはその薬学的に許容される塩である、付記１５に記載の方法。
（付記１７）
前記対象は腫瘍を有したヒト患者である、付記１５または付記１６に記載の方法。
（付記１８）
前記ヒト患者は、抗腫瘍治療を受けたことがある、付記１７に記載の方法。
（付記１９）
前記ＮＫ細胞は、自己または同種異系である、付記１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（付記２０）
前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株に由来し、多能性幹細胞に由来し、または誘導多能性幹細胞に由来する、付記１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（付記２１）
（ｉ）シクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物および（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、癌治療に使用するためのキット。
（付記２２）
前記ＮＫ細胞は、エクスビボでＩＬ−１５およびＩＬ−１２に曝露されている、付記２１に記載のキット。
（付記２３）
前記シクロホスファミド化合物はシクロホスファミドである、付記２１〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【手続補正書】
【提出日】令和3年8月13日(2021.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌治療に使用されるキットであって、
（ｉ）シクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物と、
（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、
を備え、
前記ＣＴＸ化合物は、前記ＮＫ細胞が投与される前に、前記対象に投与され、
前記癌は、固形癌又は血液癌である、
キット。
【請求項２】
前記ＣＴＸ化合物は、シクロホスファミド、マホスファミド、イホスファミド若しくはトロホスファミド、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
少なくとも２用量の前記ＣＴＸ化合物が投与される、かつ／又は、少なくとも２用量の前記ＮＫ細胞が投与される、請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
少なくとも２用量の前記ＣＴＸ化合物が投与され、
前記ＣＴＸ化合物の連続する２用量の投与が、少なくとも４〜８日空いている、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記対象は、癌を有する、有すると疑われる、またはそのリスクがあるヒト患者である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６】
前記固形癌は、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、メラノーマ、膵臓癌または膀胱癌である、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記固形癌は乳癌である、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記血液癌は、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫である、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
前記対象は腫瘍切除を受けたことがある、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０】
前記ＣＴＸ化合物の量および前記ＮＫ細胞の量は、癌の再発のリスクを減少させるのに有効な量である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
前記ＮＫ細胞は、エクスビボでＩＬ−１５およびＩＬ−１２に曝露されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２】
対象において、腫瘍の再発に対して防護免疫記憶を誘導し、かつ／または腫瘍の再発のリスクを減少させる方法において使用されるキットであって、
（ｉ）シクロホスファミド（ＣＴＸ）化合物と、
（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、
を含み、
前記ＣＴＸ化合物は、前記ＮＫ細胞が投与される前に、前記対象に投与され、
前記癌は、固形癌又は血液癌である、
キット。
【請求項１３】
前記ＣＴＸ化合物は、シクロホスファミド、マホスファミド、イホスファミドもしくはトロホスファミド、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記対象は腫瘍を有していたヒト患者である、請求項１２または請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記ヒト患者は、抗腫瘍治療を受けたことがある、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記ＮＫ細胞は、自己または同種異系である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
前記ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株に由来し、多能性幹細胞に由来し、または誘導多能性幹細胞に由来する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【国際調査報告】
2021534216.tif 000014
2021534216.tif 000015
2021534216.tif 000016
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