(57)【要約】  本発明は、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防に使用するためのプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。具体的には、本発明は、トリプシンを使用する、ヒトにおけるコロナウイルス感染症の治療または予防に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるコロナウイルス感染症の治療または予防に使用するためのプロテアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記コロナウイルス感染症が気道および／または胃腸管の感染症である、請求項１に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項３】
前記コロナウイルス感染症が、風邪、肺炎、肺臓炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、副鼻腔炎、耳炎、または咽頭炎からなる群から選択される、請求項１または２に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項４】
前記コロナウイルス感染症が、風邪である、請求項３に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項５】
前記コロナウイルスが、
（ａ）アルファコロナウイルス、
（ｂ）ベータコロナウイルス、
（ｃ）ガンマコロナウイルス、および
（ｄ）デルタコロナウイルスからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項６】
前記コロナウイルスが、ヒトコロナウイルスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項７】
前記ヒトコロナウイルスが、
（ａ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、
（ｂ）ヒトコロナウイルスＯＣ４３、
（ｃ）重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）
（ｄ）ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ−ＮＬ６３、ニューヘブンコロナウイルス）、
（ｅ）ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、および
（ｆ）中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）からなる群から選択される、請求項６に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項８】
前記対象が、哺乳動物、例えばヒトである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項９】
プロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１０】
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼである、請求項９に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１１】
前記プロテアーゼが、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分である、請求項１０に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１２】
プロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、低温適応性である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、自然発生的である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、海洋セリンプロテアーゼである、請求項１３に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１５】
前記海洋セリンプロテアーゼが、タラ、スケトウダラ、サケ、またはオキアミから得られるか、または入手可能である、請求項１４に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１６】
前記海洋セリンプロテアーゼが、タイセイヨウダラから得られるか、または入手可能である、請求項１５に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１７】
前記海洋セリンプロテアーゼが、トリプシン、例えばトリプシンＩである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、タイセイヨウダラ由来のトリプシンＩ、トリプシンＸ、またはトリプシンＺＴである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項１９】
前記トリプシンの活性が、前記ポリペプチドの１Ｕ／ｍｇ〜１Ｕ／ｇ、例えば、前記ポリペプチドの５０Ｕ／ｍｇ〜５００Ｕ／ｍｇの範囲である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、非自然発生的である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列の前記プロテアーゼ活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前記フラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含むかまたはそれからなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項２１に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２による前記アミノ酸配列のフラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２４】
前記フラグメントが、配列番号１〜１２のいずれか１つの少なくとも１５連続アミノ酸、例えば、配列番号１〜１２のいずれか１つの少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、または２４０連続アミノ酸を含むかまたはそれからなる、請求項２３に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２のいずれか１つによる前記アミノ酸配列の変異体を含むかまたはそれからなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２６】
前記変異体が、非自然発生的な変異体である、請求項２５に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２７】
前記変異体が、配列番号１〜１２のいずれか１つによる前記アミノ酸配列またはそのフラグメントと少なくとも５０％の同一性、例えば少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２５または２６に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、１５０〜２５０アミノ酸長、例えば２００〜２５０、２１０〜２４０、２２０〜２３０、または２２０〜２２５アミノ酸長である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、組換えポリペプチドである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、浸透活性溶液中に提供される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、グリセロールおよび緩衝液と組み合わせて投与される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、中咽頭への送達に適した形態で提供される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、マウススプレー、薬用キャンディ、トローチ、錠剤、シロップ、またはチューインガムで提供される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、１つ以上の追加の活性剤と組み合わせて使用するためのものである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項３５】
前記追加の活性剤が、抗菌剤（抗生物質、抗ウイルス剤、および抗真菌剤を含む）、抗炎症剤（ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症剤を含む）、ならびに防腐剤からなる群から選択される、請求項３４に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項３６】
前記１つ以上の抗菌剤が、ペニシリン、セファロスポリン、フルオロキノロン、アミノグリコシド、モノバクタム、カルバペネム、およびマクロライドからなる群から選択される抗生物質である、請求項３５に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項３７】
哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための薬剤の調製におけるプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドが、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のとおりである、使用。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分である、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列の前記トリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前記フラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含むかまたはそれからなる、請求項３７または３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記コロナウイルス感染症が、風邪、肺炎、肺臓炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、副鼻腔炎、耳炎、または咽頭炎からなる群から選択される、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４２】
哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための方法であって、プロテアーゼ活性を有する治療有効量のポリペプチドを前記対象に投与することを含み、前記ポリペプチドが、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のとおりである、方法。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列の前記トリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前記フラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含むかまたはそれからなる、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記コロナウイルス感染症が、風邪、肺炎、肺臓炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、副鼻腔炎、耳炎、または咽頭炎からなる群から選択される、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
説明を参照して本明細書に記載されるような、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防に使用するためのポリペプチド。
【請求項４８】
説明を参照して本明細書に記載されるような、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための薬剤の調製におけるポリペプチドの使用。
【請求項４９】
説明を参照した、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象におけるコロナウイルス感染症の治療および予防のためのプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの使用に関する。具体的には、本発明は、トリプシン（例えば、海洋由来の、例えば、タイセイヨウダラ由来のトリプシンなど）を使用する哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
タイセイヨウダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ）トリプシンは、インビトロでヒトライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびインフルエンザウイルスなどのウイルスの感染力を低下させることが示されている（Ｆｏｒｎｂａｃｋｅ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｓｕｎｄ  ２０１３、Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ，Ｈｉｌｍａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。これは、類似の酵素と比較したその高い触媒効率に部分的に基づいていると考えられている（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ，Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．１９８９、Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｋａｎ  ２００６、Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，Ｈｅｌｇａｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。トリプシンは、それらの推定されるアミノ酸配列同一性に基づいて、Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩの３つの主要なグループに分類される（Ｓｐｉｌｌｉａｅｒｔ  ａｎｄ  Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ  １９９９）。最近同定されたタラトリプシンＺＴ（ＷＯ２０１７／０１７０１２および出版のために提出された原稿の未発表データ：Ｓａｎｄｈｏｌｔ  ＧＢ，Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ  Ｂ，Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ  Ａを参照）が、グループＩＩＩのトリプシンのメンバーである一方で、タラトリプシンＩおよびＸは、多くの他のトリプシンのようにグループＩに属している（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ，Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．１９８９、Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ，Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３、Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，Ｈｅｌｇａｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，Ｓａｎｄｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。
【０００３】
コロナウイルスは、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目のＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ亜科に属するウイルスの種である。コロナウイルスは、プラスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムおよびらせん対称のヌクレオカプシドを有するエンベロープウイルスである。コロナウイルスのゲノムサイズは、約２６〜３２キロベースで、ＲＮＡウイルスに対して最大である。「コロナウイルス」という名前は、王冠またはハローを意味するラテン語のコロナに由来し、王冠または日光冠を連想させるイメージを作る大きい球状の表面突出部のフリンジを伴う、電子顕微鏡法（Ｅ．Ｍ．）の下でのビリオンの特徴的な外観を指す。この形態は、ウイルススパイク（Ｓ）ペプロマーによって作られ、これは、ウイルスの表面に集中し、宿主指向性を決定するタンパク質である。全てのコロナウイルスの全体的な構造に寄与するタンパク質は、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、およびヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である。ＳＡＲＳコロナウイルス（以下を参照）の特定の場合において、Ｓ上の定義された受容体結合ドメインは、ウイルスの、その細胞受容体であるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）への付着を仲介する。一部のコロナウイルス（具体的にはベータコロナウイルスサブグループＡのメンバー）はまた、ヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）と呼ばれるより短いスパイク状タンパク質を有する。
【０００４】
コロナウイルスは主に、哺乳動物および鳥類の気道および胃腸管に感染する。それらは、ライノウイルス、インフルエンザ、および呼吸器合胞体ウイルスと共に、風邪の根底にある感染因子の１つであることが知られている（Ｈｅｉｋｋｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｒｖｉｎｅｎ  ２００３、Ｈｕｌｌ，Ｒｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。風邪の症例の約１０〜１５％は、コロナウイルスによって引き起こされると推定されている（Ｈｕｌｌ，Ｒｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ  ａｎｄ  Ｄｉｊｋｍａｎ  ２０１６）。６つの既知のコロナウイルスのうちの４つは順に、健常者において上気道疾患および風邪を引き起こす（即ち、２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、およびＨＫＵ１）（Ｂｒａｄｂｕｒｎｅ，Ｂｙｎｏｅ  ｅｔ  ａｌ．１９６７、Ｋｒａａｉｊｅｖｅｌｄ，Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８０）。他の２つのコロナウイルスは、重症肺炎を引き起こす可能性がある重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスおよび中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルスである（Ｐａｒｋ，Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。コロナウイルス感染症は、スパイクタンパク質とその同族細胞受容体の付着で始まる（Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ  ａｎｄ  Ｄｉｊｋｍａｎ  ２０１６、Ｌｉｍ，Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。ＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＥＲＳ−ＣｏＶは、細胞侵入にそれらのスパイクタンパク質を使用することによって上皮細胞に感染することが知られている（Ｐａｒｋ，Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。コロナウイルスの細胞指向性および宿主域は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質によって部分的に決定され、これは細胞受容体に結合し、膜融合を仲介する（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｂａｒｉｃ  ２０１０）。
【０００５】
ＭＥＲＳおよびＳＡＲＳは、大流行（ＷＨＯ）を引き起こす可能性が高いため、緊急の研究を必要とするＷＨＯの疾患優先順位リストのトップにある。ＣｏＶファミリーの流行の可能性は、ワクチンおよび抗ウイルス剤の必要性を強調している。現在、ヒトにおけるコロナウイルス誘発性疾患を治療するための一般的な療法はなく、市販のワクチンも入手可能ではない（Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ  ａｎｄ  Ｄｉｊｋｍａｎ  ２０１６）。したがって、コロナウイルスを不活性化することが可能な新しい療法を見つけることが重要である。
【０００６】
したがって、本発明は、コロナウイルスによる感染症を治療および予防するための新しい療法の必要性に取り組もうとする。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第１の態様は、哺乳動物または鳥類などの対象におけるコロナウイルス感染症の治療または予防に使用するためのプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
【０００８】
「プロテアーゼ活性を有するポリペプチド」とは、哺乳動物（例えば、ヒト）の体内においてインビボでタンパク質分解を触媒することが可能である任意のポリペプチド（自然発生的および非自然発生的の両方）を含む。したがって、セリンプロテアーゼ（トリプシン／キモトリプシンなど）、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼを含むがこれらに限定されない、任意のタイプのプロテアーゼが本発明で利用され得る。
【０００９】
「コロナウイルス感染症」とは、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ亜科）の、対象におけるコロナウイルスの成長によって引き起こされるか、または別様にそれに関連する感染症を意味する。
【００１０】
「治療」には、コロナウイルス感染症の症状（例えば、咽頭痛、鼻づまりおよび／もしくは鼻水、咳、ならびに／または風邪に関連する体温の上昇）の緩和が含まれる。そのような治療は、炎症に関連する微生物因子の根絶、または人口増加の遅延を含み得る。
【００１１】
「予防」には、患者におけるコロナウイルス感染症のリスクの低減が含まれる。しかしながら、そのような予防は絶対的ではない可能性があり、すなわち、それは、そのような全ての患者がコロナウイルス感染を発症することを予防しない可能性があるか、または単一の個体における感染症を部分的にのみ予防し得ることが理解される。したがって、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および「予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」という用語は、互換的に使用され得る。
【００１２】
一実施形態では、コロナウイルス感染症は、上気道および／または下気道感染症である。あるいはまたはさらに、コロナウイルス感染症は、胃腸管にあり得る。ＭＥＲＳなどの特定のコロナウイルスは、腎上皮細胞にも感染し得る。
【００１３】
「上気道」には、口、鼻、副鼻腔、中耳、喉、喉頭、および気管が含まれる。
【００１４】
「下気道」には、気管支（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｔｕｂｅ）（気管支（ｂｒｏｎｃｈｉ））および肺（気管支（ｂｒｏｎｃｈｉ）、細気管支、および肺胞）、ならびに肺の間質組織が含まれる。
【００１５】
「胃腸管」とは、口、食道、胃、および腸を含む、口から肛門までの管を意味する。
【００１６】
別の実施形態では、コロナウイルス感染症は、腎感染症である。
【００１７】
一実施形態では、コロナウイルス感染症は、風邪、肺炎、肺臓炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、副鼻腔炎、耳炎、および咽頭炎から群から選択される。
【００１８】
コロナウイルス感染症に関連する他の兆候は、Ｇｒａｌｉｎｓｋｉ＆Ｂａｒｉｃ，２０１５、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２３５：１８５−１９５  ａｎｄ  Ｃａｖａｎａｇｈ，２００５、“Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  Ｆｉｒｓｔ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ  ＳＡＲＳ  １（Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．Ｈ．Ｗｏｌｆｆ  ａｎｄ  Ｏ．Ｗｅｂｅｒ編集）Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄに記載されている（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００１９】
したがって、好ましい一実施形態では、コロナウイルス感染症は、風邪である。
【００２０】
コロナウイルスは、以下から選択され得る。
（ａ）アルファコロナウイルス（ヒトコロナウイルス２２９Ｅなど）、
（ｂ）ベータコロナウイルス（ヒトコロナウイルスＨＫＵ１など）、
（ｃ）ガンマコロナウイルス（トリコロナウイルスなど）、および
（ｄ）デルタコロナウイルス（ヒヨドリコロナウイルスなど）。
【００２１】
アルファコロナウイルスの例としては、アルファコロナウイルス１、コウモリコロナウイルスＣＤＰＨＥ１５、コウモリコロナウイルスＨＫＵ１０、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ミニオプトラスコウモリコロナウイルス１、ミニオプトラスコウモリコロナウイルスＨＫＵ８、ミンクコロナウイルス１、ブタ流行性下痢ウイルス、リノロフスコウモリコロナウイルスＨＫＵ２、およびスコトフィラスコウモリコロナウイルス５１２が挙げられる。
【００２２】
ベータコロナウイルスの例としては、マウスコロナウイルス、ベータコロナウイルス１、ハリネズミコロナウイルス１、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、アブラコウモリコロナウイルスＨＫＵ５、ルーセットコウモリコロナウイルスＨＫＵ９、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、およびタケコウモリコロナウイルスＨＫＵ４が挙げられる。
【００２３】
ガンマコロナウイルスの例としては、トリコロナウイルスおよびシロイルカコロナウイルスＳＷ１が挙げられる。
【００２４】
デルタコロナウイルスの例としては、ヒヨドリコロナウイルスＨＫＵ１１、バンコロナウイルスＨＫＵ２１、コロナウイルスＨＫＵ１５、ムニアコロナウイルスＨＫＵ１３、ゴイサギコロナウイルスＨＫＵ１９、ツグミコロナウイルスＨＫＵ１２、メジロコロナウイルスＨＫＵ１６、およびヒドリガモＨＫＵ２０が上げられる。
【００２５】
したがって、例示的な実施形態では、コロナウイルスは、ヒトコロナウイルスである。
【００２６】
例えば、コロナウイルスは、以下から選択され得る。
（ａ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、
（ｂ）ヒトコロナウイルスＯＣ４３、
（ｃ）重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）
（ｄ）ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ−ＮＬ６３、ニューヘブンコロナウイルス）、
（ｅ）ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、および
（ｆ）中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）。
【００２７】
したがって、一実施形態では、治療される対象は、ヒトである。
【００２８】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼからなる群から選択される。
【００２９】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、セリンプロテアーゼである。「セリンプロテアーゼ」とは、タンパク質中のペプチド結合を開裂することが可能な自然発生的および非自然発生的の両方の触媒ポリペプチドを含み、セリンは、ポリペプチドの活性部位で求核性アミノ酸として機能する（ＥＣ番号３．４．２１に従って定義されるように）。セリンプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼ活性（すなわち、トリプシン、キモトリプシン、およびエラスターゼ）、またはサブチリシン様プロテアーゼ活性を有し得る。
【００３０】
したがって、一実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分である。
【００３１】
したがって、本発明のポリペプチドは、トリプシン活性を示し得る。「トリプシン活性」とは、ポリペプチドがトリプシン酵素（ＥＣ  ３，４，２１，４）または関連ペプチダーゼ（キモトリプシン酵素、ＥＣ  ３，４，２１，１など）のペプチダーゼ活性を示すことを意味する。例えば、プロテアーゼは、真核生物または原核生物起源の自然発生的なトリプシン、またはそのようなトリプシンの変異型であり得る。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、自然発生的または非自然発生的であってもよい。
【００３３】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、自然発生的なプロテアーゼ（海洋、例えば、タラ、または哺乳動物、例えば、ウシ源由来など）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。例えば、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、真核生物または原核生物起源のいずれかの、自然発生的なトリプシンのアミノ酸配列からなり得る。
【００３４】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、低温適応性であり、すなわち、ポリペプチドは好冷性である。「低温適応性」とは、ポリペプチドが低温環境からの生物に由来し、したがって低温で機能するように適応されていることを意味する。例えば、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、２５℃または３７℃などのより高い温度よりも１５℃でより長い期間、プロテアーゼ活性を示し得る（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ：Ｐａｒｔ  Ｂ−Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５５（２）：１８６−１９４を参照（その開示は参照により組み込まれる））。
【００３５】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、海洋セリンプロテアーゼである。海洋セリンプロテアーゼは、例えば、タラ、スケトウダラ、サケ、またはオキアミから入手可能であり得る。海洋プロテアーゼの他の可能な供給源としては、ナマズ、コダラ、ホキ、メルルーサ、レッドフィッシュ、ラフィー、ティラピア、ホワイティング、チリシーバスが上げられる。具体的には、タイセイヨウダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ）、タイセイヨウおよびタイヘイヨウサケ（例えば、Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒおよびＯｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓの種）、ならびにアラスカスケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ  ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ）のトリプシンなどの低温適応性トリプシンが含まれる。例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下に列記されるように、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸を含むかまたはそれからなってもよい。
【００３６】
したがって、好ましい実施形態では、海洋セリンプロテアーゼは、タイセイヨウダラから入手可能である。
【００３７】
自然発生的なセリンプロテアーゼは、供給源の生物（例えば、タイセイヨウダラ）から精製もしくは単離され得るか、または組換え発現され得る。
【００３８】
したがって、本発明のそのような自然発生的なセリンプロテアーゼポリペプチドが、それらが自然界に見られるものとは異なる形態で提供されることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、本発明のポリペプチドは、組成物またはそれが自然界に見られる形態から、全体的または部分的に単離され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、自然発生的な真核生物トリプシンのアミノ酸配列からなり得るが、それが自然界で発現されるとき、タンパク質と比較して変化した翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を有するように、組換え手段によって発現される。
【００３９】
好ましい実施形態では、海洋セリンプロテアーゼは、トリプシン、例えばトリプシンＩ、トリプシンＸ、トリプシンＹ、またはトリプシンＺＴである（例えば、以下を参照）。
【００４０】
トリプシンの３つの主要なアイソザイムは、元々タイセイヨウダラから特徴付けられ、トリプシンＩ、ＩＩ、およびＩＩＩと指定された（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０：８５−９４を参照（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。例えば、タイセイヨウダラのトリプシンＩは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＯ９０３９７で定義されている（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５５（２），１８６−１９４を参照（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。その後、タイセイヨウダラによって産生されたトリプシンはさらに特徴付けられ、今ではトリプシンＩ、トリプシンＺＴ、トリプシンＸ、およびトリプシンＹを含む多数の異なるアイソフォームが特徴付けられている（以下を参照）。
【００４１】
加えて、タイセイヨウダラは、キモトリプシンＡおよびＢと指定されたキモトリプシンの２つの主要なアイソザイムを発現する（Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ＆Ｂｊａｒｎａｓｏｎ，１９９１，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ  ９９８：３２７−３３５を参照（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ５５２４２．１を参照されたい。
【００４２】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ）由来のトリプシンＩのアミノ酸配列、すなわち、配列番号１もしくは配列番号２、
ＩＶＧＧＹＥＣＴＫＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＲＩＥＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＹＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＮＮＤＩＭＬＩＫＬＳＫＰＡＴＬＮＱＹＶＱＰＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＧＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＡＤＧＤＫＬＱＣＬＳＬＰＩＬＳＨＡＤＣＡＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＨＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＮＹ
［配列番号１］
ＩＶＧＧＹＥＣＴＫＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＶＬＲＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＹＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＮＮＤＩＭＬＩＫＬＴＫＰＡＴＬＮＱＹＶＨＡＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＡＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＡＤＧＤＫＬＱＣＬＳＬＰＩＬＳＨＡＤＣＡＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＨＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＮＹ
［配列番号２］
．Ｂ  ９９８：３２７−３３５（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
あるいは前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を保持する、配列番号１または２のそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（またはフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含むかまたはそれからなる。
【００４３】
トリプシンＩのさらなる詳細は、Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄоｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７（３）：１０９１−７およびＳｔｅｆａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５５（２），１８６−１９４に見られる（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４４】
あるいは、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍｏｒｈｕａ）由来のトリプシンＺＴアイソフォームのアミノ酸配列、例えば、配列番号３〜７を含み得るかまたはそれからなり得る（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａ  ＡＢのＷＯ  ２０１７／０１７０１２を参照（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【００４５】
配列番号３は、以下に示されるＺＴ−アイソフォーム、ＺＴ−１〜ＺＴ−４のコンセンサス配列である。
ＩＸ１ＧＧＸ２Ｘ３ＣＥＰＸ４ＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＸ５ＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＸ６ＶＸ７ＣＸ８ＡＸ９ＹＰＧＭＩＳＰＲＭＸ１０ＣＸ１１ＧＸ１２ＭＤＧＧＲＤＸ１３ＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＸ１４ＧＣＡＸ１５ＰＮＸ１６ＰＧＶＹＶＫＶＹＥＸ１７ＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号３］
ここで、
Ｘ１は、ＩおよびＶから選択され、
Ｘ２は、ＱおよびＨから選択され、
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ４は、ＲおよびＮから選択され、
Ｘ５は、Ｌであり、
Ｘ６は、ＴおよびＰから選択され、
Ｘ７は、ＤおよびＡから選択され、
Ｘ８は、ＥおよびＱから選択され、
Ｘ９は、ＡおよびＳから選択され、
Ｘ１０は、ＶおよびＭから選択され、
Ｘ１１は、ＡおよびＶから選択され、
Ｘ１２は、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ１３は、ＡおよびＶから選択され、
Ｘ１４は、ＱおよびＲから選択され、
Ｘ１５は、ＬおよびＥから選択され、
Ｘ１６は、ＹおよびＳから選択され、
Ｘ１７は、ＹおよびＦから選択される。
タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−１アイソフォーム：
ＩＶＧＧＨＥＣＥＰＮＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＰＶＡＣＱＡＳＹＰＧＭＩＳＰＲＭＭＣＶＧＦＭＤＧＧＲＤＶＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＲＧＣＡＥＰＮＳＰＧＶＹＶＫＶＹＥＦＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号４］
タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−２アイソフォーム：
ＩＶＧＧＨＥＣＥＰＮＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＴＶＤＣＥＡＡＹＰＧＭＩＳＰＲＭＶＣＡＧＹＭＤＧＧＲＤＡＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＱＧＣＡＬＰＮＹＰＧＶＹＶＫＶＹＥＹＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号５］
タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−３アイソフォーム：
ＩＩＧＧＱＤＣＥＰＲＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＰＶＡＣＱＡＳＹＰＧＭＩＳＰＲＭＭＣＶＧＦＭＤＧＧＲＤＶＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＲＧＣＡＥＰＮＳＰＧＶＹＶＫＶＹＥＦＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号６］
タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−４アイソフォーム：
ＩＩＧＧＱＤＣＥＰＲＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＴＶＤＣＥＡＡＹＰＧＭＩＳＰＲＭＶＣＡＧＹＭＤＧＧＲＤＡＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＱＧＣＡＬＰＮＹＰＧＶＹＶＫＶＹＥＹＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号７］
【００４６】
ポリペプチドは、任意にトリプシンＩ、Ｘ、および／またはＹと組み合わせて、上記のトリプシンＺＴアイソフォームのうちの１つ以上の混合物として存在し得ることが、当業者によって理解されるであろう。
【００４７】
あるいは、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ由来のトリプシンＸのアミノ酸配列、例えば、配列番号８〜１１を含み得るかまたはそれからなり得る（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１８６５（１）：１１−１９を参照（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
タイセイヨウダラトリプシンＸ：
ＩＶＧＧＹＥＣＴＲＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＶＬＲＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＦＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＤＮＤＩＭＬＩＫＬＴＥＰＡＴＬＮＱＹＶＨＡＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＡＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＤＤＧＤＫＬＱＣＬＮＬＰＩＬＳＨＡＤＣＡＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＮＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＳＹ
［配列番号８］
タイセイヨウダラトリプシンＸ−１：
ＩＶＧＧＹＥＣＴＲＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＲＩＥＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＦＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＤＮＤＩＭＬＩＫＬＳＥＰＡＴＬＮＱＹＶＱＰＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＧＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＤＤＧＤＫＬＱＣＬＮＬＰＩＬＳＨＡＤＣＡＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＮＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＳＹ
［配列番号９］
タイセイヨウダラトリプシンＸ−２：
ＩＶＧＧＹＥＣＴＲＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＲＩＥＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＦＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＤＮＤＩＭＬＩＫＬＳＫＰＡＴＬＮＱＹＶＱＴＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＧＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＤＤＧＤＫＬＱＣＬＮＬＰＩＬＳＨＡＤＣＳＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＮＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＳＹ
［配列番号１０］
タイセイヨウダラトリプシンＸ−３：
ＩＶＧＧＹＥＣＴＲＨＳＱＡＨＱＶＳＬＮＳＧＹＨＦＣＧＧＳＬＶＳＫＤＷＶＶＳＡＡＨＣＹＫＳＲＩＥＶＲＬＧＥＨＨＩＲＶＮＥＧＴＥＱＦＩＳＳＳＳＶＩＲＨＰＮＹＳＳＹＮＩＤＮＤＩＭＬＩＫＬＳＥＰＡＴＬＮＱＹＶＱＴＶＡＬＰＴＥＣＡＡＤＧＴＭＣＴＶＳＧＷＧＮＴＭＳＳＶＤＤＧＤＫＬＱＣＬＮＬＰＩＬＳＨＡＤＣＳＮＳＹＰＧＭＩＴＱＳＭＦＣＡＧＹＬＥＧＧＫＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＶＶＣＮＧＶＬＱＧＶＶＳＷＧＹＧＣＡＥＲＤＮＰＧＶＹＡＫＶＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡＳＹ
［配列番号１１］
【００４８】
あるいは、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、タイセイヨウダラ由来のトリプシンＹのアミノ酸配列、例えば、配列番号１２を含み得るかまたはそれからなり得る（Ｐａｌｓｄｏｔｔｉｒ＆Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ，２００８，ＦｏｏｄＣｈｅｍ．１１１（２）：４０８−１４を参照（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
タイセイヨウダラトリプシンＹ：
ＩＩＧＧＱＤＣＥＰＲＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＱＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＴＶＤＣＥＡＡＹＰＧＭＩＳＰＲＭＶＣＡＧＹＭＤＧＧＲＤＡＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＱＧＣＡＬＰＮＹＰＧＶＹＶＫＶＹＥＹＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号１２］
【００４９】
したがって、例示的な実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。そのようなポリペプチドは、例えば、Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０：８５−９４（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、タイセイヨウダラから精製され得る。
【００５０】
本発明の好適で例示的なポリペプチド、およびそれらの製造方法はまた、欧州特許第１  ２０２  ７４３  Ｂ号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）にも記載されている。
【００５１】
多くのプロテアーゼと同様に、タイセイヨウダラ由来のトリプシンＩは、開裂されて成熟した活性トリプシンを生成するプロペプチド（または「活性化」）配列を含む、不活性前駆体またはチモーゲンとして産生される。トリプシンの最初の発現産物は、発現後に除去されるシグナル配列も含む。
【００５２】
シグナル配列を含む、配列番号１に対応するタイセイヨウダラ由来のトリプシンＩの変異体のチモーゲン配列が、配列番号１３として以下に示される（Ｇｅｎｂａｎｋデータベースアクセッション番号ＡＣＯ９０３９７．１に対応する）。
【表１】
2021509809.tif 000003
ここで、
シグナルペプチド＝アミノ酸１〜１３（下線）
プロペプチド＝アミノ酸１４〜１９（太字斜体）
成熟トリプシン＝アミノ酸２０〜２４１
【００５３】
シグナル配列を含む、配列番号２に対応するタイセイヨウダラ由来の変異体トリプシンＩのチモーゲン配列が、配列番号１４として以下に示される（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースアクセッション番号Ｐ１６０４９−１に対応する）。
【表２】
2021509809.tif 000004
ここで、
シグナルペプチド＝アミノ酸１〜１３（下線）
プロペプチド＝アミノ酸１４〜１９（太字斜体）
成熟トリプシン＝アミノ酸２０〜２４１
【００５４】
シグナル配列を含む、配列番号８に対応する変異体トリプシンＸのチモーゲン配列が、配列番号１５として以下に示される（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．Ｑ９１０４１．２に対応する）。
【表３】
2021509809.tif 000005
（ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である）。
【００５５】
シグナル配列を含む、配列番号９に対応する変異体トリプシンＸ−１のチモーゲン配列が、配列番号１６として以下に示される（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＡＯＸ１５７６９．１に対応する）。
【表４】
2021509809.tif 000006
（ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である）。
【００５６】
シグナル配列を含む、配列番号１０に対応する変異体トリプシンＸ−２のチモーゲン配列が、配列番号１７として以下に示される（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＡＯＸ１５７７０．１に対応する）。
【表５】
2021509809.tif 000007
（ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である）。
【００５７】
シグナル配列を含む、配列番号１１に対応する変異体トリプシンＸ−３のチモーゲン配列が、配列番号１８として以下に示される（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＡＯＸ１５７７１．１に対応する）。
【表６】
2021509809.tif 000008
（ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である）。
【００５８】
シグナル配列を含む、配列番号１２に対応する変異体トリプシンＹのチモーゲン配列が、配列番号１９として以下に示される（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＣＡＤ３０５６３．１に対応する）。
【表７】
2021509809.tif 000009
（ここで、シグナル配列おおびプロペプチドにはそれぞれ、下線が引かれ、太字斜体である）。
【００５９】
配列番号３〜７によって表されるトリプシンＺＴアイソフォームは、これらのトリプシンの活性変異体、すなわち、トリプシンのＮ末端の開裂によって活性化された変異体を表す。これらのトリプシンは、幽門垂／膵臓（魚の膵臓組織）で発現されるタンパク質であり、細胞外への分泌および酵素を不活性化に保持することに重要である多くのアミノ酸が、Ｎ末端上にある。
【００６０】
例えば、全長トリプシンＺＴアイソフォームはまた、本明細書において以下のように開示される：
非開裂タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−１アイソフォーム：
ＭＩＧＬＡＬＬＭＬＬＧＡＡＡＡＡＶＰＲＤＶＧＫＩＶＧＧＨＥＣＥＰＮＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＰＶＡＣＱＡＳＹＰＧＭＩＳＰＲＭＭＣＶＧＦＭＤＧＧＲＤＶＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＲＧＣＡＥＰＮＳＰＧＶＹＶＫＶＹＥＦＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号２０］
非開裂タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−２アイソフォーム：
ＭＩＧＬＡＬＬＭＬＬＧＡＡＡＡＡＶＰＲＤＶＧＫＩＶＧＧＨＥＣＥＰＮＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＴＶＤＣＥＡＡＹＰＧＭＩＳＰＲＭＶＣＡＧＹＭＤＧＧＲＤＡＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＱＧＣＡＬＰＮＹＰＧＶＹＶＫＶＹＥＹＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号２１］
非開裂タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−３アイソフォーム：
ＭＩＧＬＡＬＬＭＬＬＧＡＡＡＡＶＰＲＥＤＧＲＩＩＧＧＱＤＣＥＰＲＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＰＶＡＣＱＡＳＹＰＧＭＩＳＰＲＭＭＣＶＧＦＭＤＧＧＲＤＶＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＲＧＣＡＥＰＮＳＰＧＶＹＶＫＶＹＥＦＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号２２］
非開裂タイセイヨウダラトリプシンＺＴ−４アイソフォーム：
ＭＩＧＬＡＬＬＭＬＬＧＡＡＡＡＶＰＲＥＤＧＲＩＩＧＧＱＤＣＥＰＲＳＲＰＦＭＡＳＬＮＹＧＹＨＦＣＧＧＶＬＩＮＤＱＷＶＬＳＶＡＨＣＷＹＮＰＹＹＭＱＶＭＬＧＥＨＤＬＲＶＦＥＧＴＥＱＬＶＫＴＮＴＩＦＷＨＥＬＹＤＹＱＴＬＤＹＤＭＭＭＩＫＬＹＨＰＶＥＶＴＱＳＶＡＰＩＳＬＰＴＧＰＰＤＧＧＭＬＣＳＶＳＧＷＧＮＭＡＭＧＥＥＶＮＬＰＴＲＬＱＣＬＤＶＰＩＶＥＴＶＤＣＥＡＡＹＰＧＭＩＳＰＲＭＶＣＡＧＹＭＤＧＧＲＤＡＣＮＧＤＳＧＳＰＬＶＣＥＧＶＬＴＧＬＶＳＷＧＱＧＣＡＬＰＮＹＰＧＶＹＶＫＶＹＥＹＬＳＷＩＱＴＴＬＤＡＮＰ
［配列番号２３］
【００６１】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語には、標準の２０の遺伝的にコードされたアミノ酸およびそれらの対応する「Ｄ」型（天然の「Ｌ」型と比較して）の立体異性体、オメガアミノ酸、およびその他の自然発生的なアミノ、非従来型アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）、ならびに化学的に誘導体化されたアミノ酸が含まれる（以下を参照）。
【００６２】
「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」など、アミノ酸が具体的に列挙されている場合、この用語は、特に明記しない限り、Ｌ−アラニンおよびＤ−アラニンの両方を指す。所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、他の非従来型アミノ酸も本発明のポリペプチドに適した構成成分であり得る。示されるペプチドについて、各コードされたアミノ酸残基は、適切な場合、従来型アミノ酸の慣用名に対応する１文字表記によって表される。
【００６３】
慣例に従って、本明細書に開示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で提供される。
【００６４】
典型的には、本発明のポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含むかまたはそれからなる。
【００６５】
当業者は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドが、上記のアミノ酸配列の１つ、例えば配列番号１〜１２のそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前述のフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含むかまたはそれからなり、ただし、前述のフラグメント、変異体、誘導体、または融合物が、前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を（少なくとも部分的に）保持することを条件とすることを理解するであろう。
【００６６】
トリプシン活性は、当該技術分野で周知の方法を使用して決定され得る。例えば、トリプシンアッセイキットは、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ（カタログ番号ａｂ１０２５３１を参照）および他の供給元から市販されている。一実施形態では、トリプシン活性は、基質としてＣｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｃｂｚ−ＧＰＲ−ｐＮＡ）を使用して測定される（ＥＰ１，２０２，７４３  ＢおよびＳｔｅｆａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１５５（２）：１８６−９４を参照（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【００６７】
典型的には、プロテアーゼポリペプチドは、少なくとも１Ｕ／ｍｇ、例えば少なくとも１０Ｕ／ｍｇ、少なくとも５０Ｕ／ｍｇ、少なくとも１００Ｕ／ｍｇ、少なくとも２００Ｕ／ｍｇ、または５００Ｕ／ｍｇのポリペプチドの比活性を有する。本明細書で使用される場合、「Ｕ」は、酵素単位を意味する（１Ｕは、１分当たりの１マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素の量である）。
【００６８】
したがって、ポリペプチドが配列番号１〜１２のいずれか１つによるアミノ酸配列を含む場合、それは、そのＮ末端および／またはＣ末端に、配列番号１〜１２のものを超える追加のアミノ酸を含み得る。同様に、ポリペプチドが配列番号１〜１２によるアミノ酸配列のフラグメント、変異体、または誘導体を含む場合、それは、そのＮ末端および／またはＣ末端に追加のアミノ酸を含み得る。
【００６９】
あるいは、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１〜１２などのそのような野生型トリプシンのフラグメントに対応し得、ただし、前述のフラグメントが、それが得られる自然発生的なトリプシンタンパク質のトリプシン活性を（少なくとも部分的に）保持することを条件とする。したがって、ポリペプチドは、配列番号１〜１２の少なくとも１０連続アミノ酸、例えば、配列番号１〜１２のいずれか１つの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、または２４０連続アミノ酸を含み得かまたはそれからなり得る。
【００７０】
例えば、フラグメントは、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸残基６１〜７７を含み得るかまたはそれからなり得る。あるいはまたはさらに、フラグメントは、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸残基２２５〜２４１を含み得るかまたはそれらからなり得る。
【００７１】
本発明のポリペプチドが、配列番号１〜１２のいずれか１つによるアミノ酸配列（またはそのフラグメント）の変異体を代替的に含み得るかまたはそれらからなり得ることは、当業者によって理解されるであろう。そのような変異体は、非自然発生的な変異体であり得る。
【００７２】
ポリペプチドの「変異体」とは、保存的または非保存的のいずれかの挿入、欠失、および置換を含む。特に、そのような変化が前述のポリペプチドのトリプシン活性を少なくとも部分的に保持するポリペプチドの変異体を含む。
【００７３】
そのような変異体は、組換えポリヌクレオチドを使用した、当該技術分野で周知のタンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を使用して作製され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照（これは参照により本明細書に組み込まれる））。
【００７４】
一実施形態では、変異体は、配列番号１〜１２のいずれか１つによるアミノ酸配列またはそのフラグメントと少なくとも５０％の同一性、例えば少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００７５】
２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、好適なコンピュータプログラム、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定され得、同一性パーセントが、その配列が最適にアライメントされたポリペプチドに関して計算されることが理解されるであろう。
【００７６】
あるいは、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０に記載されるような（これは参照により本明細書に組み込まれる））を使用して実施されてもよい。
【００７７】
使用されるパラメータは、以下のとおりであってもよい。
高速ペアワイズアライメントパラメータ：Ｋタプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、トップダイアゴナル数；５。スコアリング方法：ｘパーセント。
複数のアライメントパラメータ：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップ延長ペナルティ；０．０５である。
スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【００７８】
あるいは、局所配列アライメントを決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムが使用されてもよい。
【００７９】
プロテアーゼ活性を有する変異体ポリペプチドの例は、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａ  ＡＢのＷＯ２０１５／１５０７９９に開示されており、その開示は参照により組み込まれる。
【００８０】
本発明の第１の態様のさらなる実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、融合タンパク質を含むかまたはそれからなる。
【００８１】
ポリペプチドの「融合」とは、他の任意のポリペプチドに融合したプロテアーゼ活性を有するポリペプチドに対応するアミノ酸配列（配列番号１〜１２などまたはそのフラグメントもしくは変異体）を含む。例えば、前述のポリペプチドは、前述のポリペプチドの精製を容易にするために、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはプロテインＡなどのポリペプチドに融合されてもよい。そのような融合の例は、当業者に周知である。同様に、前述のポリペプチドは、Ｈｉｓ６などのオリゴ−ヒスチジンタグ、または周知のＭｙｃタグエピトープなどの抗体によって認識されるエピトープに融合されてもよい。前述のポリペプチドの任意の変異体または誘導体への融合もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００８２】
融合物は、本発明の前述のポリペプチドに望ましい特徴を与えるさらなる部分を含んでもよく、例えば、その部分は、治療効果を増大または延長するのに有用であり得る。例えば、一実施形態では、融合物は、ヒト血清アルブミンまたは類似のタンパク質を含む。
【００８３】
あるいは、融合部分は、当業者に周知のように、例えば、ビオチン部分、放射性部分、蛍光部分、例えば、小フルオロフォアまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）フルオロフォアであってもよい。その部分は、当業者に既知のように、免疫原性タグ、例えば、Ｍｙｃタグであってもよく、または当業者に既知のように、ポリペプチドの細胞取り込みを促進することが可能である親油性分子またはポリペプチドドメインであってもよい。
【００８４】
本発明の第１の態様のさらなる実施形態では、ポリペプチド、またはそのフラグメント、変異体、融合物、もしくは誘導体は、修飾または誘導体化された１つ以上のアミノ酸を含むかまたはそれからなる。
【００８５】
１つ以上のアミノ酸の化学的誘導体は、官能性側基との反応によって達成され得る。そのような誘導体化分子には、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成した分子が含まれる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて塩、メチル、およびエチルエステル、または他のタイプのエステルおよびヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されてＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。化学的誘導体としては、２０の標準アミノ酸の自然発生的なアミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換してもよく、５−ヒドロキシリジンでリジンを置換してもよく、３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換してもよく、ホモセリンでセリンを、オルニチンでリジンを置換してもよい。誘導体には、必要な活性が維持される限り、１つ以上の付加または欠失を含むペプチドも含まれる。他に含まれる修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンによる）、および同様の末端修飾である。
【００８６】
ペプチド模倣化合物もまた有用であり得ることが当業者によってさらに理解されるであろう。したがって、「ポリペプチド」には、配列番号１〜１２のいずれかのポリペプチドのプロテアーゼ活性を有するペプチド模倣化合物が含まれる。「ペプチド模倣物」という用語は、治療薬としての特定のペプチドの配座および望ましい特徴を模倣する化合物を指す。
【００８７】
例えば、本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって結合されている分子だけでなく、ペプチド結合が逆転されている分子も含む。そのようなレトロ−インベルソペプチド模倣物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７に記載されているものなど、当該技術分野で既知の方法を使用して作製され得る。このアプローチは、側鎖の配向ではなく、主鎖を伴う変化を含む疑似ペプチドを作製することを含む。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含むレトロ−インバースペプチドは、タンパク質分解に対してはるかに耐性がある。あるいは、本発明のポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基が従来のアミド結合の代わりに−ｙ（ＣＨ２ＮＨ）−結合によって結合されているペプチド模倣化合物であってもよい。
【００８８】
さらなる代替において、ペプチド結合は、完全に省かれてもよく、ただし、アミノ酸残基の炭素原子間の間隔を保持する適切なリンカー部分が使用されるということを条件とし、リンカー部分がペプチド結合と実質的に同じ電荷分布および実質的に同じ平面性を有することが有利であり得る。
【００８９】
ポリペプチドは、Ｎ−またはＣ−末端で好都合にブロックされて、エキソタンパク質分解消化に対する感受性の低下を助け得ることが理解されるであろう。
【００９０】
ポリペプチドを修飾するために、ｄ−アミノ酸およびＮ−メチルアミノ酸などの様々な非コードまたは修飾アミノ酸も使用されている。加えて、推定される生物活性配座は、環化などの共有結合修飾によって、またはラクタムもしくは他のタイプの架橋の組み込みによって安定化され得、例えば、Ｖｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：２６３６およびＴｈｏｒｓｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１１：１６６を参照されたい（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９１】
しかしながら、好ましい一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、および／またはアルキル化によって修飾または誘導体化された１つ以上のアミノ酸を含む。
【００９２】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、任意の適切な長さであり得ることが、当業者によって理解されるであろう。一実施形態では、ポリペプチドは、１０〜３０アミノ酸長、例えば１０〜２０、１２〜１８、１２〜１６、または１５〜２０アミノ酸長である。あるいは、ポリペプチドは、１５０〜２５０アミノ酸長、例えば、２００〜２５０、２１０〜２４０、２２０〜２３０、または２２０〜２２５アミノ酸長であり得る。
【００９３】
典型的には、ポリペプチドは直鎖状である。
【００９４】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドが自然発生的なプロテアーゼである場合、タンパク質は、当該技術分野で既知の方法を使用して、その天然源から抽出および／または精製（例えば、単離）され得る。
【００９５】
例えば、タイセイヨウダラ由来のトリプシンなどの海洋由来のトリプシンは、Ｊｏｎ  Ｂｒａｇｉ  ＢｊａｒｎａｓｏｎのＥＰ１  ２０２  ７４３  Ｂ（その開示は参照により組み込まれる）に記載される抽出方法を使用して産生され得る。
【００９６】
代替の実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、組換え法によって産生され得る。
【００９７】
したがって、本発明で使用するためのポリペプチド、ならびにそれを産生するための核酸分子、ベクター、および宿主細胞は、当該技術分野で周知の方法を使用して作製され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照（その文書内の関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる））。
【００９８】
トリプシンなどのプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを産生するための組換え方法は、ＥｎｚｙｍａｔｉｃａのＷＯ２０１５／１５０７９９に開示されており、その開示は参照により組み込まれる。
【００９９】
さらなる代替の実施形態では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、液相および固相合成（例えば、ｔ−Ｂｏｃ固相ペプチド合成およびＢＯＰ−ＳＰＰＳ）などの既知の手段によって合成されてもよい。
【０１００】
本発明はまた、上記のポリペプチドの薬学的に許容される酸または塩基付加塩の使用を含むことが、当業者によって理解されるであろう。本発明において有用な上記のベース化合物の薬学的に許容される酸付加塩を調製するために使用される酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち、薬理学的に許容されるアニオンを含有する塩、例えば、とりわけ、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、重酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩［すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３ナフトエート）］塩を形成するものである。
【０１０１】
薬学的に許容される塩基付加塩はまた、ポリペプチドの薬学的に許容される塩形態を産生するために使用され得る。本来酸性である本化合物の薬学的に許容される塩基塩を調製するための試薬として使用され得る化学塩基は、そのような化合物と非毒性の塩基塩を形成するものである。そのような非毒性の塩基塩としては、とりわけ、アルカリ金属カチオン（例えば、カリウムおよびナトリウム）ならびにアルカリ土類金属カチオン（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）などの薬理学的に許容されるカチオン、アンモニウムまたは水溶性アミン付加塩、例えば、Ｎ−メチルグルカミン−（メグルミン）、ならびに低級アルカノールアンモニウムおよび薬学的に許容される有機アミンの他の塩基塩由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
本発明のポリペプチドは、保存のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体中で再構成され得ることがさらに理解されるであろう。任意の好適な凍結乾燥方法（例えば、噴霧乾燥、ケーキ乾燥）および／または再構成技術が用いられ得る。凍結乾燥および再構成は、様々な程度の活性損失をもたらす可能性があり、補償するために使用レベルを上方に調整する必要があり得ることは、当業者によって理解されるであろう。好ましくは、凍結乾燥（フリーズドライ）ポリペプチドは、再水和した場合にその活性（凍結乾燥前）の約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下を損失する。
【０１０３】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、典型的には、ポリペプチドが薬学的に許容される緩衝液、希釈剤、担体、補助剤、または賦形剤と一緒に製剤化される治療用組成物の形態で提供される。ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ＥＧＴＡ、またはグルタチオンなどのキレート剤を含む追加の化合物が、組成物に含まれ得る。抗菌用／治療用組成物は、十分に貯蔵安定性があり、ヒトおよび動物への投与に適している、当該技術分野で既知の方法で調製され得る。治療用組成物は、例えば、フリーズドライ、噴霧乾燥、噴霧冷却を通して、または超臨界粒子形成からの粒子形成の使用を通して凍結乾燥され得る。
【０１０４】
本発明のポリペプチドはまた、製品（例えば、点耳剤、洗浄組成物など）に治療的、予防的および／または美容的利点を与えるために、局所適用のための製剤に、例えば、化粧品組成物、医薬組成物、または医療デバイスとして加えられてもよい。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」および「薬剤」という用語は、それに応じて解釈されるべきである。
【０１０５】
「薬学的に許容される」とは、本発明のポリペプチドのトリプシン活性の有効性を低下させない非毒性物質を意味する。そのような薬学的に許容される緩衝液、担体、または賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）およびｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１０６】
「緩衝液」という用語は、ｐＨを安定化する目的で酸−塩基混合物を含有する水溶液を意味することを意図している。緩衝液の例は、トリズマ、ビシン、トリシン、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス、ヘペス、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ、およびＴＥＳである。
【０１０７】
「希釈剤」という用語は、治療用調製物中のペプチドを希釈する目的で水性または非水性溶液を意味することを意図している。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、または油（ベニバナ油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、もしくはゴマ油など）のうちの１つ以上であり得る。
【０１０８】
「補助剤」という用語は、本発明のポリペプチドの生物学的効果を増大させるために製剤に添加される任意の化合物を意味することを意図している。補助剤は、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、および異なるアシル組成物の酢酸塩を含むがこれらに限定されない、異なるアニオンを有する亜鉛、銅、または銀塩のうちの１つ以上であり得る。補助剤はまた、カチオン性ポリマー、例えば、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー、カチオン性合成ポリマー、例えば、ポリ（ビニルイミダゾール）、ならびにカチオン性ポリペプチド、例えば、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、およびこれらのアミノ酸を含有するペプチドであり得る。
【０１０９】
賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質、およびミネラルのうちの１つ以上であり得る。炭水化物の例としては、例えば、凍結乾燥を容易にするために組成物に添加される、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、およびシクロデキストリンが挙げられる。ポリマーの例は、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる程度の加水分解のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、ならびにポリビニルピロリドンであり、全て分子量が異なり、これらは例えば、粘度制御のため、生体接着を達成するため、または化学分解およびタンパク質分解から脂質を保護するために、組成物に添加される。脂質の例は、脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、およびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質、および糖脂質（全てアシル鎖長および飽和が異なる）、卵レシチン、大豆レシチン、水素添加卵および大豆レシチンであり、これらは、ポリマーと同様の理由で組成物に添加される。ミネラルの例は、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛および酸化チタンであり、これらは、液体蓄積の低減または有利な顔料特性などの利点を得るために組成物に添加される。
【０１１０】
一実施形態では、ポリペプチドは、塩化カルシウムなどの安定剤と共に提供されてもよい。
【０１１１】
本発明のポリペプチドは、ポリペプチド剤の送達に適していることが当該技術分野で既知の任意のタイプの治療用組成物に製剤化されてもよい。
【０１１２】
一実施形態では、ポリペプチドは、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、または油（ベニバナ油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、もしくはゴマ油など）、トラガカントガム、および／または様々な緩衝液中に単純に溶解され得る。
【０１１３】
一実施形態では、本発明は、浸透活性溶液中で上記のプロテアーゼポリペプチドを提供する。例えば、ポリペプチドは、グリセロールまたはグリセリン中で製剤化され得る。
【０１１４】
さらなる実施形態では、本発明の治療用組成物は、リポソームの形態であってもよく、ポリペプチドは、他の薬学的に許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単層、および液晶として凝集形態で存在する、脂質などの両親媒性薬剤と組み合わされる。リポソーム製剤に適した脂質としは、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられるが、これらに限定されない。好適な脂質はまた、血流循環時間を延長するために極性頭部基のポリ（エチレングリコール）によって修飾された上記の脂質を含む。そのようなリポソーム製剤の調製は、例えばＵＳ４，２３５，８７１に見られ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
本発明の治療用組成物はまた、生分解性ミクロスフェアの形態であり得る。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡのコポリマー（ＰＬＧＡ）、またはポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）などの脂肪族ポリエステル、およびポリ無水物は、ミクロスフェアの産生において生分解性ポリマーとして広く使用されている。そのようなミクロスフェアの調製は、ＵＳ５，８５１，４５１およびＥＰ０  ２１３  ３０３に見られ、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
さらなる実施形態では、本発明の治療用組成物は、ポリマーゲルの形態で提供され、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる程度の加水分解のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、およびポリビニルピロリドンなどのポリマーは、ペプチドを含有する溶液の増粘に使用される。ポリマーはまた、ゼラチンまたはコラーゲンを含み得る。
【０１１７】
本発明の治療用組成物は、ポリペプチドの作用を増強するためのイオンおよび規定のｐＨを含み得ることが理解されるであろう。加えて、組成物は、滅菌などの従来の治療操作に供されてもよく、かつ／または防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、充填剤などの従来の補助剤を含有してもよい。
【０１１８】
好ましい一実施形態では、治療用組成物は、ＥＤＴＡ、キシリトール、ソルビトール、プロピレングリコール、およびグリセロールのうちの１つ以上と共に、トリスまたはリン酸緩衝液中にポリペプチドを含む。
【０１１９】
一実施形態では、ポリペプチドは、グリセロールおよび緩衝液と組み合わせて投与するためのものである。
【０１２０】
本発明による治療用組成物は、当業者に既知の任意の好適な経路を介して投与され得る。したがって、可能な投与経路としては、経口、口腔、非経口（静脈内、皮下、および筋肉内）、局所、眼、鼻、肺、非経口、膣、および直腸が含まれる。また、インプラントからの投与も可能である。ポリペプチドは、投与のためのスプレー、ゲル、クリーム、または液体もしくは従来の液体として製剤化され得る。
【０１２１】
好ましい一実施形態では、治療用組成物は、中咽頭への送達に適した形態で局所投与される。例えば、ポリペプチドは、マウススプレー、薬用キャンディ、トローチ、錠剤、シロップ、またはチューインガムとして製剤化され得る。
【０１２２】
代替の実施形態では、治療用組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、脳室内、関節内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、もしくは皮下に投与されるか、または注入技術によって投与され得る。それらは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有し得る滅菌水溶液の形態で都合よく使用される。水溶液は、必要に応じて好適に緩衝化されるべきである（好ましくは３〜９のｐＨに）。滅菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。
【０１２３】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の無菌注射液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供されてもよく、使用直前に、例えば注射用水などの滅菌液体担体の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時注射液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【０１２４】
治療用組成物は、薬学的に有効な用量で患者に投与される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」または「有効量」または「治療上有効な」は、所与の条件および投与レジメンに対して治療効果を提供する量を指す。これは、必要とされる添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与ビヒクルに関連して所望の治療効果をもたらすように計算された、活性材料の所定の量である。さらに、宿主の活性、機能、および応答の臨床的に有意な欠損を低減させ、最も好ましくは防止するために十分な量を意味することが意図される。あるいは、治療有効量は、宿主の臨床的に有意な状態を改善させるために十分である。当業者によって理解されるように、化合物の量は、その特異的活性に応じて変化し得る。好適な投与量は、必要とされる希釈剤に関連して、所望される治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性組成物を含有し得る。本発明の化合物の製造のための方法および使用において、治療有効量の活性成分が提供される。治療有効量は、当該技術分野において周知であるように、年齢、体重、性別、病態、合併症、他の疾患などの患者の特徴に基づいて、通常の技能を有する医療または獣医学従事者によって決定され得る。薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位または複数のより小さい用量単位の形態における単回投与によって、または特定の間隔での細分用量の複数回投与によって行われ得る。あるいは、用量は、長期間にわたる連続注入として提供されてもよい。
【０１２５】
プロテアーゼポリペプチドは、使用されているポリペプチドの有効性／毒性に応じて、様々な濃度で製剤化され得る。
【０１２６】
一実施形態では、製剤は、プロテアーゼポリペプチドを、製剤の０．０１〜１００Ｕ／ｇ、例えば製剤の１〜１０Ｕ／ｇの濃度で含む。例えば、製剤（例えば、マウスウォッシュ、ゲル、軟膏など）は、製剤中に少なくとも０．１Ｕ／ｇ、少なくとも０．５Ｕ／ｇ、少なくとも１Ｕ／ｇ、少なくとも５Ｕ／ｇ、少なくとも１０Ｕ／ｇ、または少なくとも５０Ｕ／ｇのプロテアーゼポリペプチドを含んでもよい。したがって、製剤（例えば、マウスウォッシュ、ゲル、軟膏など）は、製剤中に５０Ｕ／ｇ以下、２０Ｕ／ｇ以下、１０Ｕ／ｇ以下、５Ｕ／ｇ以下、１Ｕ／ｇ以下、または０．１Ｕ／ｇ以下のプロテアーゼポリペプチドを含んでもよい。
【０１２７】
したがって、治療製剤は、耳内のウイルス、細菌、および酵母などの微生物を死滅させるか、またはその成長を遅らせるのに十分な量のポリペプチド、またはそのフラグメント、変異体、融合物、もしくは誘導体を含み得る。
【０１２８】
ポリペプチドが中咽頭への投与のために（例えば、スプレーまたはゲルとして）製剤化される場合、治療用組成物は、水およびグリセロール中に溶解されたポリペプチドを含んでもよい。例示的なマウススプレーおよびゲル製剤は、Ｃｏｌｄｚｙｍｅ（登録商標）（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａ  ＡＢ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ製）およびＰｒｅＣｏｌｄ（登録商標）（Ｚｙｍｅｔｅｃｈ  ｅｈｆ，Ｒｅｙｋｊａｖｉｋ，Ｉｃｅｌａｎｄ製）として販売されている。
【０１２９】
一実施形態では、ポリペプチドは、中咽頭への送達を容易にするように構成され得る、送達デバイス、例えばスプレー容器で提供され得る。
【０１３０】
一実施形態では、ポリペプチドは、１つ以上の追加の活性剤と組み合わせて使用するためのものである。
【０１３１】
例えば、追加の活性剤は、抗菌剤（抗生物質、抗ウイルス剤、および抗真菌剤を含む）、抗炎症剤（ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症剤を含む）、ならびに防腐剤からなる群から選択され得る。
【０１３２】
一実施形態では、活性剤は、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、フルオロキノロン、アミノグリコシド、モノバクタム、カルバペネム、およびマクロライドからなる群から選択される１つ以上の抗菌剤である。
【０１３３】
例えば、抗生物質は、アミカシン、アモキシシリン、アンピシリン、アジスロマイシン、カルベニシリン、カルバペネム、セフォタキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、ダラシン、ダルホプリスチン、ダプトマイシン、ドキシシクリン、エンロフロキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、フルオロキノロン、ゲンタマイシン、マルボフロキサシン、メロペネム、メトロニダゾール、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ナフシリン、オフロキサシン、オキサシリン、ペニシリン、キヌプリスチン、リファンピン、スルファジアジン銀、スルファメトキサゾール、テイコプラニン、テトラサイクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、バンコマイシン、バシトラシン、およびポリミキシンＢ、またはそれらの混合物からなる群から選択され得る。
【０１３４】
好ましい一実施形態では、１つ以上の抗生物質化合物は、テトラサイクリン、セフォタキシム、バンコマイシン、エリスロマイシン、およびオキサシリンからなる群から選択される。
【０１３５】
本発明の併用療法は、単一の抗生物質化合物または複数の抗生物質化合物を含み得ることが当業者によって理解されるであろう。
【０１３６】
本発明の併用療法で使用される抗生物質の濃度は、当該分野の一般的な知識に従って、使用される特定の抗生物質ならびに治療されるバイオフィルムの兆候および／または位置に依存するであろう。典型的には、抗生物質は、０．１〜５％（重量で）、例えば０．１〜１％（重量で）の濃度で製剤化される。
【０１３７】
一実施形態では、追加の抗生物質は、局所または経口投与用であってもよい。
【０１３８】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドで含浸、コーティング、または別様に処理される埋め込み型医療デバイスを提供する。
【０１３９】
本発明の第２の関連する態様は、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための薬剤の調製に使用するための、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
【０１４０】
プロテアーゼ活性を有する好適なポリペプチドの例は、本発明の第１の態様に関連して上記で詳述されている。特に、ポリペプチドは、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分であり得る。
【０１４１】
本発明の第２の態様の一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列、あるいは前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前述のフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含むかまたはそれからなる。
【０１４２】
したがって、一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【０１４３】
一実施形態では、コロナウイルス感染症は、風邪、肺炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、副鼻腔炎、耳炎、および咽頭炎から群から選択される。
【０１４４】
本発明の第３の関連する態様は、プロテアーゼ活性を有する治療的有効量のポリペプチドを対象に投与することを含む、哺乳動物におけるコロナウイルス感染症の治療または予防のための方法を提供する。
【０１４５】
プロテアーゼ活性を有する好適なポリペプチドの例は、本発明の第１の態様に関連して上記で詳述されている。特に、ポリペプチドは、トリプシンもしくはキモトリプシン、またはそれらの混合物の構成成分であり得る。
【０１４６】
本発明の第３の態様の一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列、あるいは前述のアミノ酸配列のトリプシン活性を保持するそのフラグメント、変異体、誘導体、もしくは融合物（または前述のフラグメント、変異体、もしくは誘導体の融合物）を含むかまたはそれからなる。
【０１４７】
したがって、一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【０１４８】
一実施形態では、コロナウイルス感染症は、風邪、肺炎、気管支炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、副鼻腔炎、耳炎、および咽頭炎から群から選択される。
【０１４９】
本発明の所与の態様、特徴、またはパラメータの選好およびオプションは、文脈がそうでないことを示さない限り、本発明の他の全ての態様、特徴、およびパラメータのありとあらゆる選好およびオプションと組み合わせて開示されたと見なされるべきである。例えば、一実施形態では、本発明は、ヒトにおけるコロナウイルス感染症の治療に使用するための、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
【０１５０】
本明細書内の明らかに以前に発行された文書の列挙または考察は、必ずしも、その文書が、先端技術の一部であるか、または一般共通の知識であると認識されるべきではない。
【０１５１】
請求項および／または本明細書において「含む」という用語と組み合わせて使用される場合の「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「２つ以上」の意味とも一致する。
【０１５２】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、上記の説明と併せて考慮した場合、よりよく認識および理解されるであろう。しかしながら、上記の説明は、本発明の様々な実施形態およびその多くの特定の詳細を示しているが、限定ではなく例示として与えられていることを理解されたい。本発明の精神から逸脱することなく、本発明の範囲内で多くの置換、修正、追加、および／または再配置が行われ得、本発明は、そのような置換、修正、追加、および／または再配置を全て含む。
【０１５３】
ここで、本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例が説明される。
【０１５４】
本明細書内の明らかに以前に発行された文書の列挙または考察は、必ずしも、その文書が、先端技術の一部であるか、または一般共通の知識であると認識されるべきではない。
【０１５５】
本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例を、以下の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】タラトリプシンによるコロナウイルス（ＣｏＶ−２２９Ｅ−ｌｕｃ）の不活性化。この図は、タラトリプシンがコロナウイルスのヒト肝細胞（Ｈｕｈ７）への感染能力を低下させることを示す。Ｙバーは、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイからの結果に基づいて、対数スケールでコロナウイルスによる感染レベルを示す（方法を参照）。Ｘバーは、Ｕ／ｍＬで使用したタラトリプシンの量を示す。
【図２】タラトリプシンによるコロナウイルス（ＣｏＶ−２２９Ｅ）の不活性化。この図は、タラトリプシンがコロナウイルスのヒト胎児肺線維芽細胞様細胞（ＭＲＣ５）への感染能力を低下させることを示す。Ｙバーは、対数スケールでコロナウイルスによる感染症の減少を示す。使用したタラトリプシンの濃度は、１．２２Ｕ／ｍＬ（パネルＡ）および２．４４Ｕ／ｍＬ（パネルＢ）であった。各濃度および時点は２連で行った。
【図３】異なる濃度のタラトリプシンとインキュベートしたコロナウイルス試料中のコロナウイルスタンパク質のウエスタンブロット分析。この図は、タラトリプシン処理コロナウイルスを含む試料において、コロナウイルスタンパク質が分解されることを示す。タラトリプシン処理コロナウイルス試料内のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、コロナウイルスタンパク質に対する抗体を使用してウエスタンブロット分析に供した（方法を参照）。使用したタラトリプシンの濃度は、ゲルの各レーンの上に示されている。レーン標識されたコロナウイルスは、タラトリプシンを含まなかった試料である。
【図４】異なる濃度のタラトリプシンとインキュベートした組換えＣｏＶ−２２９Ｅスパイクタンパク質のウエスタンブロット分析。この図は、組換えコロナウイルススパイクタンパク質がタラトリプシンによって分解されることを示す。異なる濃度のタラトリプシンとインキュベートした組換えコロナウイルススパイクタンパク質を含む試料内のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ウエスタンブロット分析に供した。サイズ標準の移動は、右側のバーおよび数字（ｋＤａ）によって示される。対照として、タラトリプシンを含む試料およびＳ１スパイクタンパク質を含む試料をゲルに装填した。組換えコロナウイルススパイクタンパク質とインキュベートしたタラトリプシンの量は、ゲルの各レーンの上に示されている。
【図５】トリプシンＺＴまたはトリプシンＩと３３℃で１０分間インキュベートした組換えＳＡＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。この図は、組換えＳＡＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質がトリプシンＺＴおよびトリプシンＩによって分解されることを示す。異なる濃度のタラトリプシンとインキュベートした組換えＳＡＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質を含む試料内のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解した。ゲルをクマシーブルーで染色し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステムで撮像した。サイズ標準の移動は、右側のバーおよび数字（ｋＤａ）によって示される。対照として、ＳＡＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質を含む試料をゲルに装填した。インキュベートしたトリプシンＺＴおよびトリプシンＩの量は、ゲルの各レーンの上に示されている。
【実施例】
【０１５７】
材料および方法
細胞、ウイルス、および酵素
Ｈｕｈ７細胞およびＣｏＶ−２２９Ｅ−ｌｕｃ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｗｏｒｍ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｒｎ，ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのＰｒｏｆ．Ｄｒ．Ｖｏｌｋｅｒ  Ｔｈｉｅｌから入手した。ベンズアミジン精製タラトリプシンを、Ｚｙｍｅｔｅｃｈ（Ｒｅｙｋｊａｖｉｋ，Ｉｃｅｌａｎｄ）から入手した。トリプシンＺＴ（出版のために提出された原稿の未発表データ：Ｓａｎｄｈｏｌｔ  ＧＢ，Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ  Ｂ，Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ  Ａ）およびトリプシンＩを、以前に記載されたように精製した（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，Ｈｅｌｇａｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。タラトリプシンの活性は、基質ＣＢＺ−ＧＰＲ−ｐＮＡを使用して測定した（Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，Ｈｅｌｇａｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【０１５８】
タラトリプシンによるＣｏＶ−２２９Ｅ−ｌｕｃの不活性化およびウミシイタケルシフェラーゼアッセイ
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含まないダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で希釈したタラトリプシンを、１ｍＬ当たりＣｏＶ−２２９Ｅ−ｌｕｃ（ＯＲＦ  ４はウミシイタケルシフェラーゼによって置き換えられる）と３３℃で３時間インキュベートした。前もって、１ウェル当たり約１５．０００のＨｕｈ７細胞を９６ウェルプレートに播種し、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、タラトリプシン処理ＣｏＶ−２２９Ｅ−ｌｕｃの０．１の感染の多重度（ＭＯＩ）で感染させた。ウイルスを細胞に２時間吸着させ、細胞をＰＢＳおよび細胞培地で洗浄した。細胞を５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中でインキュベートした。細胞生存率を、感染の２２時間、１０％（ｖ／ｖ）ＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用することによって評価した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを、５９５ｎｍにおいてルミノメーターで評価する前に、３３℃および５％ＣＯ２でさらに２４時間インキュベートした。ウイルス複製のレベルを、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用して、製造元の指示に従い、推奨される基質濃度の半分およびルミノメーターを使用して決定した。対数スケールを、測定されたルミネセンスの対数を計算することによって構築した。
【０１５９】
タラトリプシンによるＣｏＶ−２２９Ｅの非活性化
タラトリプシンを、殺ウイルス効果懸濁液試験の２つの時点、１０分および６０分における懸濁液中の、攻撃ウイルス（ヒトコロナウイルス、株２２９Ｅ、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７４０）に対して評価した。試験は、Ｅ１０５２−１１“Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ａｓｓｅｓｓ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ”と指定されたＡＳＴＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ試験方法に従った。各実行について、２つの別個の希釈物を作製した。１部のトリプシンおよび１部の希釈剤（１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））による１つの希釈物、ならびに１部のトリプシンおよび３部の希釈剤によるもう１つの希釈物。各希釈物（２．７ｍＬ）を０．３ｍＬの攻撃ウイルス懸濁液（０％血清を含む）と混合し、ボルテックスで混合した。反応混合物を３５〜３７℃で１０分間および６０分間（接触時間）インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物のアリコートを直ちに等体積の中和剤と混合した。中和剤は、最小必須培地（ＭＥＭ）＋１０％  ＦＢＳ＋１％ポリソルベート８０であった。中和剤による中和後、試験物質およびウイルス回収対照（以下を参照）について、ウイルスをタラトリプシンから分離するためにセファクリルカラムを使用した。カラムからのクエンチした試料を培地で１０倍ずつ段階希釈し、宿主細胞（ＭＲＣ−５細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）に接種して、感染性ウイルスについてアッセイした。接種したプレートを３３±２℃で５±１％ＣＯ２において５〜７日間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルス誘発性細胞変性効果（ＣＰＥ）を決定することによって、ウイルス感染について培養物をスコアリングした。ウイルスの力価（ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を、スピアマン―カーバー式（Ｋａｒｂｅｒ  １９３１）を使用して計算した。ウイルス負荷（ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０）は、ウイルス力価（ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）をｌｏｇ１０（ｍＬでの反応混合物の体積×体積補正）に追加することによって計算した。体積補正は、接触時間後の試料の中和を説明した。ｌｏｇ１０減少係数を、入力ウイルス負荷（ｌｏｇ１０）から出力ウイルス負荷（ｌｏｇ１０）を引くことによって計算した。入力負荷は５．９２であったが、これは接種前に培地でウイルスをインキュベートした後に回収されたウイルス単位（ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０）を表す（ウイルス回収対照、以下を参照）。出力負荷は、ウイルスをタラトリプシンと混合およびインキュベートした後に回収されたウイルス単位（ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０）を表す。
【０１６０】
対照は、ウイルス回収対照、中和剤有効性／ウイルス干渉対照、細胞毒性対照、細胞生存率対照、ウイルスストック力価対照、および参照生成物対照を含んだ。中和剤有効性／ウイルス干渉対照を実施して、中和後に残留有効成分が存在したかどうか、および中和された試験物質がウイルス感染力を妨げたかどうかを判断した。１．３５ｍＬのタラトリプシンと１．３５ｍＬの１ｘＰＢＳの混合物を０．３ｍＬの培地（攻撃ウイルスの代わりに）と完全に混合し、６０分間保持し、中和し、セファクリルカラムに通した。クエンチした試料を、１つは中和剤有効性／ウイルス干渉対照、およびもう１つは細胞毒性対照の２つの部分に分け、各部分を１０倍に段階希釈した。中和剤有効性／ウイルス干渉対照のために、０．１ｍＬの低力価ウイルスを４．５ｍＬの各希釈物に添加し、６０分以上の期間にわたって保持した。インキュベーション後、ウイルスをスパイクした希釈物を宿主細胞に接種した。細胞毒性対照について、中和剤有効性／ウイルス干渉対照実行から得られた試料を段階希釈し、宿主細胞に接種した。宿主細胞の状態を、インキュベーション期間の終わりに記録した。ウイルス回収対照について、２．７ｍＬの希釈培地（ＭＥＭ＋５％ＦＢＳ）を０．３ｍＬの攻撃ウイルス懸濁液と混合した。混合物を６０分間保持し、中和し、試験生成物の実行に関してセファクリルカラムに通した。クエンチした試料を希釈培地で１０倍ずつ段階希釈し、選択した希釈物を宿主細胞に接種して、感染性ウイルスについてアッセイした。細胞生存率対照について、各アッセイで少なくとも４つのウェルに培地を接種して、細胞が生存可能なままであり、培地がアッセイ全体を通して滅菌であったことを実証した。ウイルスストック力価対照について、ウイルスのアリコートを段階希釈し、宿主細胞に直接接種した。これは、ストックウイルスの力価が使用に適していたこと、およびウイルス感染力アッセイを適切に実施したことを実証するためであった。参照生成物対照について、約１０００ｐｐｍ  ＮａＯＣｌ含有漂白剤溶液の２．７ｍＬアリコートを０．３ｍＬの攻撃ウイルス懸濁液と混合した。混合物を２回の接触時間にわたって保持し、次いで中和した。クエンチした試料を希釈培地で１０倍ずつ段階希釈し、選択した希釈物を宿主細胞に接種して、感染性ウイルスについてアッセイした。各アッセイのウイルスストック力価対照は、実験で適切な力価が使用され、ウイルス回収対照のために十分な量のウイルスが回収されたことを確認した。細胞生存率対照ウェルにおいてウイルスは検出されず、細胞は生存可能なままであり、培地は滅菌であった。全ての中和剤有効性／ウイルス干渉対照ウェルにおいて、ウイルスは検出されなかった。細胞毒性は、試験したいかなる希釈物または細胞株においても検出されなかった。ウイルス誘発性ＣＰＥは、非感染細胞と区別可能であった。したがって、全ての対照が有効な試験の基準を満たした。参照試験物質である１０００ｐｐｍ  ＮａＯＣｌは、試験した全てのウイルスに対して４．３１以上の対数減少を有した。
【０１６１】
殺ウイルス効果懸濁液試験を、独立した試験機関、Ｍｉｃｒｏｂａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，１０５  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｄｒｉｖｅ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ  ２０１６４，ＵＳＡによって実施した。
【０１６２】
タラトリプシン処理ＣｏＶ−２２９Ｅ−ｌｕｃのウイルスタンパク質分析
ＤＭＥＭ（ＦＢＳなし）で希釈したタラトリプシンをＣｏＶ−２２９Ｅ−ｌｕｃウイルスと混合した。混合物を３３℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、レムリ緩衝液（４Ｘ）を添加し、混合物を９５℃で５分間インキュベートした。試料を１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲル（Ｂａｃｈｏｆｅｎ，Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）に装填し、ウエスタンブロット分析を実施した（以下を参照）。
【０１６３】
組換えＣｏＶ−２２９Ｅ  Ｓ１スパイクタンパク質のタラトリプシンによる処理
無血清ＤＭＥＭで希釈したタラトリプシンを使用して、組換えＣｏＶ−２２９Ｅ  Ｓ１スパイクタンパク質を８６μｇ／ｍＬの最終濃度で処理した。混合物を３３℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、レムリ緩衝液（４Ｘ）を添加し、９５℃で５分間インキュベートして酵素を不活性化した。試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂａｃｈｏｆｅｎ，Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）に装填し、ウエスタンブロット分析を実施した（以下を参照）。組換えＣｏＶ−２２９Ｅ  Ｓ１スパイクタンパク質を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｒｎ，ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのＰｒｏｆ．Ｄｒ．Ｖｏｌｋｅｒ  Ｔｈｉｅｌから入手した。
【０１６４】
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）を実施し、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。転写後、膜を、５％ミルクと０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０とを含有するＰＢＳで６０分間、室温（ＲＴ）においてブロックした。一次抗体（ＮＰ−４０分散ＣｏＶ−２２９Ｅから産生された抗コロナウイルスポリクローナルヤギ抗体（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｅｓ  ２００１））を、０．５％ミルクを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）で１：１０００に希釈し、４℃で穏やかに撹拌しながら一晩インキュベートした。膜をＰＢＳで洗浄し、続いてＲＴで６０分間、二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼに共役した抗ヤギＩｇＧ、０．５％ミルクで１：１０００）とインキュベートした。免疫ブロットを、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを使用して行った。
【０１６５】
組換えＳＡＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質のトリプシンＺＴまたはトリプシンＩによる処理
組換えスパイクタンパク質（Ｂｅｉｊｉｎｇ０２）（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）（ｅＥｎｚｙｍｅ、カタログ番号：ＳＳ−００１−００５Ｐ）（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、トリプシンＺＴまたはトリプシンＩと、１７ｍＭのＴｒｉｓ、１２．５ｍＭのＣａＣｌ２、２．５ｍＭのエタノールアミン中ｐＨ８．５で、３３℃において１０分間インキュベートした。試料を４Ｘ  ＬＤＳ試料緩衝液で９５℃において１０分間インキュベートした。陽性対照として、スパイクタンパク質を、トリプシンアイソエンザイムなしで３３℃において１０分間インキュベートした。混合物を、ＭＯＰＳ−ＳＤＳランニングバッファーを使用して、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ，Ｎｏｖｅｘ  ｂｙ  ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で泳動させた。ゲルをクマシーブルー（ＰａｇｅＢｌｕｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステムで撮像した。
【０１６６】
結果
タラトリプシンによるコロナウイルスの不活性化
タラトリプシンがコロナウイルスの感染力を低下させる能力を研究するために、ウミシイタケルシフェラーゼを利用するＣｏＶ−２２９Ｅ−ｌｕｃを用いたアッセイを使用した（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｗｏｒｍ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。コロナウイルスをタラトリプシンありまたはなしでインキュベートし（１８０分）、ヒト肝細胞（Ｈｕｈ７）上に置いた。ウイルス吸着期間後、細胞を２日間インキュベートし、コロナウイルス感染のレベルを測定した（方法を参照）。感染のレベルを、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイを使用して測定した（図１）。
【０１６７】
１．４および２．８Ｕ／ｍＬのタラトリプシンで処理すると、コロナウイルス感染のレベルが対照（未処理コロナウイルス）と比較して約３ｌｏｇ単位低下した（図１）。
【０１６８】
タラトリプシンがコロナウイルスを不活性化する能力をさらに試験するために、コロナウイルス２２９Ｅを使用した標準化された殺ウイルス効果懸濁液試験を使用して実験を実施した。コロナウイルスを、１．２２Ｕ／ｍＬまたは２．４４Ｕ／ｍＬの濃度のタラトリプシンと２連で１０分間または６０分間インキュベートした。各インキュベーションからの試料を、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）エンドポイントアッセイで滴定した（方法を参照）。ｌｏｇ１０減少係数を計算し、平均値を報告した（図２）。
【０１６９】
コロナウイルスのタラトリプシン処理の結果として、両方の濃度で６０分間のインキュベーション後、ウイルスの感染力が４ｌｏｇ超減少した。１０分間のインキュベーションでは、１．２２Ｕ／ｍＬおよび２．４４Ｕ／ｍＬのそれぞれで２．５および３ｌｏｇの減少が観察された。
【０１７０】
タラトリプシン処理コロナウイルス試料におけるウイルスタンパク質の分解
タラトリプシンが伝染性コロナウイルスを含む試料中のコロナウイルスタンパク質を分解する能力を試験した。コロナウイルスの原液を、１．４〜５．６Ｕ／ｍＬの濃度のタラトリプシンで３３℃において３時間処理し、試料をウエスタンブロット分析に供した（図３）。図３からわかるように、タラトリプシンは、１．４〜５．６Ｕ／ｍＬの濃度において３時間でコロナウイルスタンパク質を分解することが可能である。抗体によって認識されるタンパク質のサイズ（５０ｋＤａ）は、ＣｏＶ−２２９Ｅヌクレオカプシドタンパク質のサイズと一致する（Ｌｏ，Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【０１７１】
タラトリプシンがコロナウイルスからタンパク質を分解する能力をさらに研究するために、組換えＣｏＶ−２２９Ｅスパイクタンパク質を異なる濃度のタラトリプシンと３３℃において２時間インキュベートし、ウエスタンブロット分析に供した（図４）。
【０１７２】
図４からわかるように、タラトリプシンは、試験した全ての濃度で組換えコロナウイルススパイクタンパク質を分解する。
【０１７３】
タラトリプシンアイソエンザイムであるトリプシンＺＴおよびトリプシンＩが組換えＳＡＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質を分解する能力をテストすることは興味深いことであった。両方のアイソエンザイムが研究で使用したタラトリプシン分離株に見られる。図５では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質が約１８０ｋＤａに見られる。スパイクタンパク質は、試験した両方の濃度（０．３５および０．７Ｕ／ｍＬ）で、トリプシンＺＴおよびトリプシンＩによって３３℃において１０分で分解される。
【０１７４】
考察
この研究では、タラトリプシンがコロナウイルスの感染レベルを６０分間で４ｌｏｇ単位超、わずか１０分で最大３ｌｏｇ単位まで低下させたことが実証された（図２）。タラトリプシンがコロナウイルスを不活性化する能力を、コロナウイルス（ＣｏＶ−２２９Ｅ−ｌｕｃ）を使用しても確立し、ウイルス力価を、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイで監視した（図１）。コロナウイルスに対するタラトリプシンの不活性化有効性は、コロナウイルススパイクタンパク質を分解するその能力に基づいていると考えられている。これは、コロナウイルスが感染に重要なヒト細胞受容体に結合する能力を低下させる（Ｌｉｍ，Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６、Ｐａｒｋ，Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。この作用機序の裏付けとして、タラトリプシンによるコロナウイルスタンパク質の分解を分析した。タラトリプシンで処理したＣｏＶ−２２９Ｅ−ｌｕｃウイルスを、ＣｏＶ−２２９Ｅに対して作られたポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット分析に供した（図３）。結果は、ヌクレオカプシドタンパク質の分解とよく相関している５０ｋＤａのサイズ範囲のタンパク質の分解を明らかに実証している（Ｌｏ，Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。さらに、図４に示されるように、精製された形態の組換えＣｏＶ−２２９Ｅスパイクタンパク質は、タラトリプシンによって分解された。コロナウイルスタンパク質分解について得られたデータは、タラトリプシンとウイルスの２時間のインキュベーションに基づいている（図３）。スパイクタンパク質は、コロナウイルスの表面に位置するため、タラトリプシン分解の影響を最も受けやすいと推測される。我々の研究結果に基づいて、タラトリプシンとコロナウイルスのインキュベーションは、スパイクタンパク質の分解から始まる（図４および図５）。しかしながら、長いインキュベーション期間の後、ヌクレオカプシドタンパク質は分解される（図３）。
【０１７５】
研究で使用したベンズアミジン精製タラトリプシン画分は、トリプシンＩ、トリプシンＺＴ、およびトリプシンＸなどの異なるタラトリプシンアイソエンザイムを含有する（上記を参照）。これら全てのトリプシンアイソエンザイムは、アルギニンおよびリジンで開裂するが、トリプシンＩおよびトリプシンＺＴは、異なるサブサイト特異性を有することが示されている（未公開データ；Ｓａｎｄｈｏｌｔ  ＧＢ，Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ  Ｂ，Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ  Ａ）。したがって、これらのアイソエンザイムがコロナウイルスからスパイクタンパク質を開裂できるかどうかを試験することは興味深いことであった。この目的のために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶからの組換えスパイクタンパク質を選択した。これは、ＭＥＲＳおよびＳＡＲＳは主要な流行を引き起こす可能性が高いため、死亡率が高く、緊急の研究を必要とするＷＨＯの疾患優先順位リストのトップにあることから、非常に重要である（Ｇｒａｌｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｂａｒｉｃ  ２０１５、Ｍａｃｋａｙ  ａｎｄ  Ａｒｄｅｎ  ２０１５）。
【０１７６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、組換えＳＡＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質は、タラトリプシンＩおよびトリプシンＺＴの両方によって低濃度においてわずか１０分で効果的に分解された（図５）。研究結果は、ＳＡＲＳコロナウイルスが低濃度のタラトリプシンによる不活性化の影響を受けやすい可能性が高いことを示す。これは、ヒトにおける感染症を引き起こす異なるコロナウイルスがタラトリプシンによって不活生化され得ることを示唆する。トリプシンアイソエンザイムがＳＡＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質を１０分で開裂するのに効果的であったという事実（図５）は、タラトリプシンがコロナウイルスの感染レベルを１０分で低下させた図２の結果とよく一致している。
【０１７７】
タラトリプシンがコロナウイルスを不活性化する能力に関するこの研究で示された結果は、異なる呼吸器ウイルスに対するタラトリプシンの有効性を示す他の研究の結果を拡張する（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ，Ｈｉｌｍａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。興味深いことに、リジンおよびアルギニンに富むアミノ酸配列は、ウイルスタンパク質で頻繁に見られる（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｏｒｂａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｊｉａｎｇ，Ｃｕｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２、Ｇａｌｌａｈｅｒ  ａｎｄ  Ｇａｒｒｙ  ２０１５）。これらの正に帯電した塩基性アミノ酸残基は、主にタンパク質表面に曝露され、静電相互作用を形成することによるタンパク質安定性に重要である（Ｓｏｋａｌｉｎｇａｍ，Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。アルギニンおよびリジン残基がウイルスタンパク質によく見られるという事実は、タラトリプシンがこの研究で試験したコロナウイルススパイクタンパク質を効率的に開裂する能力を説明することができる（図４および図５）。
【０１７８】
結論として、結果は、タラトリプシンがコロナウイルスの細胞への付着を防止する表面スパイクタンパク質の分解を介して、コロナウイルスを不活性化する能力を確認している。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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