(57)【要約】  本発明は大環状ケトンおよび大環状ケトン前駆体を生産するための組換え体微生物および方法に関する。
2021500915.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトンを生産する組換え体ホスト細胞であって：
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からジカルボン酸（ＤＣＡ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ＤＣＡからＣｏＡ活性化されたＤＣＡ（ＤＣＡ−ＣｏＡ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｈ）ＤＣＡからムスコンを合成することができる環化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｉ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができる環化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
遺伝子の少なくとも１つが組換え体遺伝子である、組換え体ホスト細胞。
【請求項２】
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
組換え体ホスト細胞が１つ以上の大環状ケトン前駆体を生産する、
請求項１に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項３】
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｈ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
組換え体ホスト細胞が１つ以上の大環状ケトンを生産する、
請求項１に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項４】
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｉ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
組換え体ホスト細胞が１つ以上の大環状ケトンを生産する、
請求項１に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項５】
組換え体ホスト細胞が、１つ以上のムスコン前駆体を酸化することができるポリペプチドをコードする遺伝子座位の欠失を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項６】
１つ以上のムスコン前駆体を酸化することができるポリペプチドをコードする遺伝子座位が、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ１）遺伝子を含む、請求項５に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項７】
（ａ）アンテイソ脂肪酸が１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、または１６−メチルオクタデカン酸であり；
（ｂ）イソ脂肪酸がパルミチン酸であり；
（ｃ）ＤＣＡがドデカン二酸、ｎ−ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ｎ−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ｎ−ヘキサデカン二酸、ｎ−メチルヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、ｎ−オクタデカン二酸、ｎ−メチルヘキサデカン酸、またはエイコサン酸であり；
（ｄ）ＣｏＡ活性化されたＤＣＡがヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−ヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、オクタデカン二酸ＣｏＡ、またはｎ−オクタデカン二酸ＣｏＡである、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項８】
（ａ）アンテイソ脂肪酸が１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、または１６−メチルオクタデカン酸であり；
（ｂ）イソ脂肪酸がパルミチン酸であり；
（ｃ）ＤＣＡがｎ−メチルヘキサデカン酸またはｎ−ヘキサデカン二酸であり；
（ｄ）ＤＣＡ−ＣｏＡがｎ−ヘキサデカン二酸ＣｏＡまたはｎ−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡである、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項９】
（Ｓ）−２−メチル酪酸が少なくとも８０％ｅｅの光学純度を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項１０】
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドが、配列番号３４または３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドが、配列番号３６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドが、配列番号３７または３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドが、配列番号２３または２４のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドが、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドが、配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、または４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドが、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｈ）ＣｏＡ活性化されたＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド；
（ｉ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項１１】
１つ以上の大環状ケトン前駆体が、１２−メチルテトラデカン酸、（Ｓ）−１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、（Ｓ）−１４−メチルヘキサデカノエート、１６−メチルオクタデカン酸、（Ｓ）−１６−メチルオクタデカン酸、ドデカン二酸（ドデカン−１，１２−二酸）、（Ｅ）−２−ドデセン二酸、ｎ−ドデセン二酸、３−ドデセン二酸（二重結合は特定しない）、テトラデカン二酸（テトラデカン−１，１４−二酸）、５−テトラデセン二酸、（５Ｚ）−ｎ−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸（ヘキサデカン−１，１６−二酸）、７−ヘキサデセン二酸、（７Ｚ）−ｎ−ヘキサデセン二酸、オクタデカン二酸（オクタデカン−１，１８−二酸）、９−オクタデセン二酸、（９Ｚ）−ｎ−オクタデセン二酸、エイコサン二酸、エイコサン酸、９−エイコセン二酸、（９Ｚ）−ヘキサデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−ヘキサデセンジオイルＣｏＡ、オクタデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−オクタデセンジオイルＣｏＡ、ヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−ヘキサデセン二酸ＣｏＡ、オクタデカン二酸ＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブタノイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−二酸、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１０−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−二酸、（Ｒ）−（＋）−３−メチルヘキサデカン酸、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１２−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−二酸、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１４−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１６−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、３−メチルヘキサデカン二酸、３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、またはｎ−オクタデセン二酸ＣｏＡである、請求項１、２、または５〜１０のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項１２】
１つ以上の大環状ケトンがｌ−ムスコン、ノルムスコン、またはシベトンである、請求項１または３〜１０のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項１３】
組換え体ホスト細胞が植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、古細菌細胞、または細菌細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項１４】
遺伝子が発現される条件下で細胞培養物によって請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞を培養することを含み；１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせが組換え体ホスト細胞によって生産される、
細胞培養物によって１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ジカルボン酸（ＤＣＡ）、ＣｏＡ活性化されたＤＣＡ（ＤＣＡ−ＣｏＡ）、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを生産する方法。
【請求項１５】
遺伝子が恒常的に発現されるおよび／または遺伝子の発現が誘導される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
組換え体ホスト細胞が発酵器によってある温度である期間に渡って増殖させられ、温度および期間は１つ以上の大環状ケトン前駆体および／またはその１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせの生産を容易化する、請求項１４または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞の細胞培養物による植物由来のまたは合成のＬ−イソロイシン、（Ｓ）−２−メチル酪酸、３−メチル−２−オキソペンタノエート、（Ｓ）−２−メチルブタナール、（Ｓ）−２−メチル酪酸、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、イソ脂肪酸、ＤＣＡ、またはＤＣＡ−ＣｏＡの全細胞バイオコンバージョンを含み、
（ａ）配列番号３４または３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドと；
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドと；
（ｃ）配列番号３７または３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドと；
（ｄ）配列番号２３または２４のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドと；
（ｅ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドと；
（ｆ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、または４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドと；
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドと；
（ｈ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチドと；
を用い、
ポリペプチドの少なくとも１つが組換え体ポリペプチドである、
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ジカルボン酸（ＤＣＡ）、ＣｏＡ活性化されたＤＣＡ（ＤＣＡ−ＣｏＡ）、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを生産する方法。
【請求項１８】
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせが、透過処理された組換え体ホスト細胞によって生産され、これが：
（ａ）配列番号３４もしくは３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号３７もしくは３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチルブタナールから２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２３もしくは２４のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、もしくは４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｈ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｉ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
によって形質転換されている、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞培養物が：
（ａ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞、または植物由来のもしくは合成のＬ−イソロイシン、（Ｓ）−２−メチル酪酸、３−メチル−２−オキソペンタノエート、（Ｓ）−２−メチルブタナール、（Ｓ）−２−メチル酪酸、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、イソ脂肪酸、ＤＣＡ、もしくはＤＣＡ−ＣｏＡの全細胞バイオコンバージョンによって生産された、大環状ケトン、その１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと；
（ｂ）微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素と、
を含む、
請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
（Ｓ）−２−メチル酪酸が少なくとも８０％ｅｅの光学純度を有する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、１つ以上の大環状ケトン前駆体および／またはその１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを単離することを含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
単離ステップが、生産された大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、もしくはアンテイソ脂肪酸を含む上清を得るために細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離することと：
（ａ）生産された大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、もしくはアンテイソ脂肪酸の少なくともある部分を得るために、上清を１つ以上の吸着樹脂と接触させるか；または
（ｂ）生産された大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、もしくはアンテイソ脂肪酸の少なくともある部分を得るために、上清を１つ以上のイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムと接触させるか；または
（ｃ）生産された大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、もしくはアンテイソ脂肪酸を結晶化もしくは抽出し；
それによって、生産された大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、もしくはアンテイソ脂肪酸を単離することと、
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、大環状ケトン、その１つ以上の大環状前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸単独、またはそれらの組成物を細胞培養物から回収することを含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）配列番号３４もしくは３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチド；
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号３７もしくは３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチルブタナールから２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２３もしくは２４のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６５％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチド；
（ｅ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチド；
（ｆ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、もしくは４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチド；
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチド；
（ｈ）ＣｏＡ活性化されたＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド；および／または
（ｉ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド；ならびに
植物由来のまたは合成のＬ−イソロイシン、（Ｓ）−２−メチル酪酸、３−メチル−２−オキソペンタノエート、（Ｓ）−２−メチルブタナール、（Ｓ）−２−メチル酪酸、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、イソ脂肪酸、ＤＣＡ、またはＤＣＡ−ＣｏＡ；
を反応混合物に追加し、ポリペプチドの少なくとも１つが組換え体ポリペプチドであることと；
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを合成することと、
を含む、
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ジカルボン酸（ＤＣＡ）、ＣｏＡ活性化されたＤＣＡ（ＤＣＡ−ＣｏＡ）、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを生産するためのインビトロの方法。
【請求項２５】
反応混合物が：
（ａ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、および４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドと；
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドと；
を含み、
ポリペプチドの少なくとも１つが組換え体ポリペプチドであり；１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを合成する、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
１つ以上の大環状ケトンがｌ−ムスコン、ノルムスコン、またはシベトンである、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）１つ以上の前駆体が、１２−メチルテトラデカン酸、（Ｓ）−１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、（Ｓ）−１４−メチルヘキサデカノエート、１６−メチルオクタデカン酸、（Ｓ）−１６−メチルオクタデカン酸、ドデカン二酸（ドデカン−１，１２−二酸）、（Ｅ）−２−ドデセン二酸、ｎ−ドデセン二酸、３−ドデセン二酸（二重結合は特定しない）、テトラデカン二酸（テトラデカン−１，１４−二酸）、５−テトラデセン二酸、（５Ｚ）−ｎ−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸（ヘキサデカン−１，１６−二酸）、７−ヘキサデセン二酸、（７Ｚ）−ｎ−ヘキサデセン二酸、オクタデカン二酸（オクタデカン−１，１８−二酸）、９−オクタデセン二酸、（９Ｚ）−ｎ−オクタデセン二酸、エイコサン二酸、エイコサン酸、９−エイコセン二酸、（９Ｚ）−ヘキサデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−ヘキサデセンジオイルＣｏＡ、オクタデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−オクタデセンジオイルＣｏＡ、ヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−ヘキサデセン二酸ＣｏＡ、オクタデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−メチルヘキサデカン酸、ｎ−メチルヘキサデカン酸ＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブタノイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−二酸、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１０−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−＋−３−メチルヘキサデカン酸、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−二酸、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１２−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−二酸、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１４−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１６−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、３−メチルヘキサデカン二酸、３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、またはｎ−オクタデセン二酸ＣｏＡを包含し；
（ｂ）アンテイソ脂肪酸が１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、または１６−メチルオクタデカン酸であり；
（ｃ）イソ脂肪酸がパルミチン酸であり；
（ｄ）ＤＣＡがドデカン二酸、ｎ−ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ｎ−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ｎ−メチルヘキサデカン酸、ｎ−ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、ｎ−オクタデカン二酸、またはエイコサン酸であり；
（ｅ）ＤＣＡ−ＣｏＡがヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−ヘキサデカン二酸ＣｏＡ、オクタデカン二酸ＣｏＡ、またはｎ−オクタデカン二酸ＣｏＡである、
請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）アンテイソ脂肪酸が１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、または１６−メチルオクタデカン酸であり；
（ｂ）イソ脂肪酸がパルミチン酸であり；
（ｃ）ＤＣＡがｎ−メチルヘキサデカン酸またはｎ−ヘキサデカン二酸であり；
（ｄ）ＤＣＡ−ＣｏＡがｎ−メチルヘキサデカン酸ＣｏＡまたはｎ−ヘキサデカン二酸ＣｏＡである、
請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
組換え体ホスト細胞または全細胞が植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、古細菌細胞、または細菌細胞を含む、請求項１４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
細胞培養物が、さらに：
（ａ）組換え体ホスト細胞によって生産された１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと；
（ｂ）微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素と；
を含み、
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせが少なくとも１ｍｇ／細胞培養物のリットルの濃度で存在する、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞を含む細胞培養物。
【請求項３１】
（ａ）組換え体ホスト細胞によって生産された１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと；
（ｂ）微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素と；
を含み、
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせが少なくとも１ｍｇ／細胞培養物のリットルの濃度で存在する、
細胞培養物中の増殖した請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞からの細胞培養物ライセート。
【請求項３２】
（ａ）配列番号３４もしくは３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチド；
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号３７もしくは３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２３もしくは２４のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチド；
（ｅ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチド；
（ｆ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、もしくは４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチド；
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチド；
（ｈ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド；および／または
（ｉ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができるポリペプチド、
をコードする核酸分子。
【請求項３３】
核酸分子がｃＤＮＡである、請求項３２に記載の核酸分子。
【請求項３４】
（ａ）配列番号３４もしくは３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを；
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを；
（ｃ）配列番号３７もしくは３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、（Ｓ）−２−メチルブタナールから２−メチル酪酸を；
（ｄ）配列番号２３もしくは２４のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６５％の配列同一性を有し、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを；
（ｅ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を；
（ｆ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、および４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からＤＣＡを；
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを；
（ｈ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを；および／または
（ｉ）ＤＣＡからムスコンを、
生産することができる精製されたポリペプチドまたはその触媒活性部分。
【請求項３５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞または請求項１４〜２９のいずれか１項に記載の方法によって生産される、大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、組換え体ホストによる大環状ケトンおよび大環状ケトン前駆体、例えばムスコン、シベトン、およびそれらの前駆体の組換え体生産に関する。特に、本開示は、組換え体ホストによるｌ−および／またはノルムスコンなどのムスコン分子とヘキサデカン二酸、（Ｓ）−２−メチル酪酸（methylbutyryl acid）ＣｏＡ、１４−メチルヘキサデカン酸、および３−メチルヘキサデカン二酸を含むムスコン前駆体との生産、ならびに／または組換え体ホスト細胞の培養培地中へのかかるムスコン、シベトン、および／またはそれらの前駆体の排出に関する。さらに、本開示は、ムスコン、シベトン、およびそれらの前駆体をバイオコンバージョンまたはインビトロ反応によって生産することに関する。
【背景技術】
【０００２】
大環状ケトンは、フレグランス産業、具体的には香水への用途を有する。大環状ケトンはムスコンおよびシベトンを包含するが、これらに限定されない。ムスコンおよびシベトンは両方ともムスク様の匂いを有すると形容される。シベトンはアフリカジャコウネコから得られる商業的に有用なフェロモンである。ムスコンはジャコウジカの腺分泌物から天然に得られ、これの抽出は多くの場合には動物の死をもたらす。ジャコウジカは絶滅危惧種であるので、ムスコンは合成的に作られなければならない。ムスコンおよびシベトンは大きい分子であるので、それらは不揮発性であり、フレグランス中に見いだされるより軽い分子の蒸発速度を縮減する保留剤として作用する。
【０００３】
ムスコンの回収および精製は労働集約的かつ非効率的であることが判明しており、高収量の所望のムスコンおよびムスコン前駆体、例えばｌ−ムスコン、ノルムスコン、（Ｒ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、および／または（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを生産し得る組換え体生産系の必要が残っている（図１Ａ〜１Ｋ）。商業使用のための組換え体ホストによるムスコンの改善された生産の必要もまた残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上の背景技術とは反対に、本発明は従来技術と比べて一定の利点および進歩を提供する。
【０００５】
本明細書において開示される本発明は具体的な利点または機能性に限定されないが、本発明は１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトンを生産する組換え体ホスト細胞を提供し：
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からジカルボン酸（ＤＣＡ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ＤＣＡからＣｏＡ活性化されたＤＣＡ（ＤＣＡ−ＣｏＡ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｈ）ＤＣＡからムスコンを合成することができる環化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｉ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができる環化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
遺伝子の少なくとも１つは組換え体遺伝子である。
【０００６】
１つの態様では、本明細書において開示される組換え体ホスト細胞は：
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
組換え体ホスト細胞は１つ以上の大環状ケトン前駆体を生産する。
【０００７】
１つの態様では、本明細書において開示される組換え体ホスト細胞は：
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｈ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
組換え体ホスト細胞は１つ以上の大環状ケトンを生産する。
【０００８】
１つの態様では、本明細書において開示される組換え体ホスト細胞は：
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｉ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
組換え体ホスト細胞は１つ以上の大環状ケトンを生産する。
【０００９】
１つの態様では、本明細書において開示される組換え体ホスト細胞は１つ以上のムスコン前駆体を酸化することができるポリペプチドをコードする遺伝子座位の欠失を有する。
【００１０】
本明細書において開示される組換え体ホスト細胞の１つの態様では、１つ以上のムスコン前駆体を酸化することができるポリペプチドをコードする遺伝子座位はペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ１）遺伝子を含む。
【００１１】
本明細書において開示される組換え体ホスト細胞の１つの態様では：
（ａ）アンテイソ脂肪酸は１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、または１６−メチルオクタデカン酸であり；
（ｂ）イソ脂肪酸はパルミチン酸であり；
（ｃ）ＤＣＡはドデカン二酸、ｎ−ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ｎ−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ｎ−ヘキサデカン二酸、ｎ−メチルヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、ｎ−オクタデカン二酸、ｎ−メチルヘキサデカン酸、またはエイコサン酸であり；
（ｄ）ＣｏＡ活性化されたＤＣＡはヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−ヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、オクタデカン二酸ＣｏＡ、またはｎ−オクタデカン二酸ＣｏＡである。
【００１２】
本明細書において開示される組換え体ホスト細胞の１つの態様では：
（ａ）アンテイソ脂肪酸は１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、または１６−メチルオクタデカン酸であり；
（ｂ）イソ脂肪酸はパルミチン酸であり；
（ｃ）ＤＣＡはｎ−メチルヘキサデカン酸またはｎ−ヘキサデカン二酸であり；
（ｄ）ＤＣＡ−ＣｏＡはｎ−ヘキサデカン二酸ＣｏＡまたはｎ−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡである。
【００１３】
本明細書において開示される組換え体ホスト細胞の１つの態様では、（Ｓ）−２−メチル酪酸は少なくとも８０％ｅｅの光学純度を有する。
【００１４】
本明細書において開示される組換え体ホスト細胞の１つの態様では：
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドは、配列番号３４または３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドは、配列番号３７または３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドは、配列番号２３または２４のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドは、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドは、配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、または４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｈ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができるポリペプチド；および
（ｉ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド。
【００１５】
本明細書において開示される組換え体ホスト細胞の１つの態様では、１つ以上の大環状ケトン前駆体は、１２−メチルテトラデカン酸、（Ｓ）−１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、（Ｓ）−１４−メチルヘキサデカノエート、１６−メチルオクタデカン酸、（Ｓ）−１６−メチルオクタデカン酸、ドデカン二酸（ドデカン−１，１２−二酸）、（Ｅ）−２−ドデセン二酸、ｎ−ドデセン二酸、３−ドデセン二酸（二重結合は特定しない）、テトラデカン二酸（テトラデカン−１，１４−二酸）、５−テトラデセン二酸、（５Ｚ）−ｎ−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸（ヘキサデカン−１，１６−二酸）、７−ヘキサデセン二酸、（７Ｚ）−ｎ−ヘキサデセン二酸、オクタデカン二酸（オクタデカン−１，１８−二酸）、９−オクタデセン二酸、（９Ｚ）−ｎ−オクタデセン二酸、エイコサン二酸、エイコサン酸、９−エイコセン二酸、（９Ｚ）−ヘキサデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−ヘキサデセンジオイルＣｏＡ、オクタデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−オクタデセンジオイルＣｏＡ、ヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−ヘキサデセン二酸ＣｏＡ、オクタデカン二酸ＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブタノイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−二酸、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１０−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−二酸、（Ｒ）−（＋）−３−メチルヘキサデカン酸、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１２−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−二酸、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１４−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１６−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、３−メチルヘキサデカン二酸、３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、またはｎ−オクタデセン二酸ＣｏＡである。
【００１６】
本明細書において開示される組換え体ホスト細胞の１つの態様では、１つ以上の大環状ケトンはｌ−ムスコン、ノルムスコン、またはシベトンである。
【００１７】
本明細書において開示される組換え体ホスト細胞の１つの態様では、組換え体ホスト細胞は植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、古細菌細胞、または細菌細胞である。
【００１８】
本発明は、細胞培養によって１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ジカルボン酸（ＤＣＡ）、ＣｏＡ活性化されたＤＣＡ（ＤＣＡ−ＣｏＡ）、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを生産する方法をもまた提供し、遺伝子が発現される条件下で細胞培養によって本明細書において開示される組換え体ホスト細胞を培養することを含み；１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせは組換え体ホスト細胞によって生産される。
【００１９】
本明細書において開示される方法の１つの態様では、遺伝子は恒常的に発現されるおよび／または遺伝子の発現は誘導される。
【００２０】
本明細書において開示される方法の１つの態様では、組換え体ホスト細胞は発酵器によってある温度である期間に渡って増殖させられ、温度および期間は、１つ以上の大環状ケトン前駆体および／またはその１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせの生産を容易化する。
【００２１】
本発明は、１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ジカルボン酸（ＤＣＡ）、ＣｏＡ活性化されたＤＣＡ（ＤＣＡ−ＣｏＡ）、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを生産する方法をもまた提供し、本明細書において開示される組換え体ホスト細胞の細胞培養物による植物由来のもしくは合成のＬ−イソロイシン、（Ｓ）−２−メチル酪酸、３−メチル−２−オキソペンタノエート、（Ｓ）−２−メチルブタナール、（Ｓ）−２−メチル酪酸、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、イソ脂肪酸、ＤＣＡ、またはＤＣＡ−ＣｏＡの全細胞バイオコンバージョンを含み、
（ａ）配列番号３４または３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドと；
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドと；
（ｃ）配列番号３７または３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドと；
（ｄ）配列番号２３または２４のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドと；
（ｅ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドと；
（ｆ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、または４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドと；
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドと；
（ｈ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチドと；
を用い、
ポリペプチドの少なくとも１つは組換え体ポリペプチドである。
【００２２】
本明細書において開示される方法の１つの態様では、１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせは、透過処理された組換え体ホスト細胞によって生産され、これは：
（ａ）配列番号３４もしくは３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号３７もしくは３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチルブタナールから２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２３もしくは２４のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、もしくは４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｈ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｉ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子、
によって形質転換されている。
【００２３】
本明細書において開示される方法の１つの態様では、細胞培養物は：
（ａ）本明細書において開示される組換え体ホスト細胞、または植物由来のもしくは合成のＬ−イソロイシン、（Ｓ）−２−メチル酪酸、３−メチル−２−オキソペンタノエート、（Ｓ）−２−メチルブタナール、（Ｓ）−２−メチル酪酸、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、イソ脂肪酸、ＤＣＡ、もしくはＤＣＡ−ＣｏＡの全細胞バイオコンバージョンによって生産された、大環状ケトン、その１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと；
（ｂ）微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素と、
を含む。
【００２４】
本明細書において開示される方法の１つの態様では、（Ｓ）−２−メチル酪酸は少なくとも８０％ｅｅの光学純度を有する。
【００２５】
１つの態様では、本明細書において開示される方法は、さらに、１つ以上の大環状ケトン前駆体および／またはその１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを単離することを含む。
【００２６】
本明細書において開示される方法の１つの態様では、単離ステップは、生産された大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、またはアンテイソ脂肪酸を含む上清を得るために細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離することと：
（ａ）生産された大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、もしくはアンテイソ脂肪酸の少なくともある部分を得るために、上清を１つ以上の吸着樹脂と接触させるか；または
（ｂ）生産された大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、もしくはアンテイソ脂肪酸の少なくともある部分を得るために、上清を１つ以上のイオン交換もしくは逆相クロマトグラフィーカラムと接触させるか；または
（ｃ）生産された大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、もしくはアンテイソ脂肪酸を結晶化もしくは抽出し；
それによって、生産された大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、もしくはアンテイソ脂肪酸を単離することと、
を含む。
【００２７】
１つの態様では、本明細書において開示される方法は、さらに、大環状ケトン、その１つ以上の大環状前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸単独、またはそれらの組成物を細胞培養物から回収することを含む。
【００２８】
本発明は、さらに、１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ジカルボン酸（ＤＣＡ）、ＣｏＡ活性化されたＤＣＡ（ＤＣＡ−ＣｏＡ）、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを生産するためのインビトロの方法を提供し：
（ａ）配列番号３４もしくは３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチド；
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号３７もしくは３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチルブタナールから２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２３もしくは２４のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６５％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチド；
（ｅ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチド；
（ｆ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、もしくは４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチド；
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチド；
（ｈ）ＣｏＡ活性化されたＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド；および／または
（ｉ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド；ならびに
植物由来のまたは合成のＬ−イソロイシン、（Ｓ）−２−メチル酪酸、３−メチル−２−オキソペンタノエート、（Ｓ）−２−メチルブタナール、（Ｓ）−２−メチル酪酸、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、イソ脂肪酸、ＤＣＡ、またはＤＣＡ−ＣｏＡ；
を反応混合物に追加することを含み、
ポリペプチドの少なくとも１つは組換え体ポリペプチドであり；１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを合成する。
【００２９】
本明細書において開示される方法の１つの態様では、反応混合物は：
（ａ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、および４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドと；
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドと；
を含み、
ポリペプチドの少なくとも１つは組換え体ポリペプチドであり；１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを合成する。
【００３０】
本明細書において開示される方法の１つの態様では、１つ以上の大環状ケトンはｌ−ムスコン、ノルムスコン、またはシベトンである。
【００３１】
本明細書において開示される方法の１つの態様では：
（ａ）１つ以上の前駆体は、１２−メチルテトラデカン酸、（Ｓ）−１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、（Ｓ）−１４−メチルヘキサデカノエート、１６−メチルオクタデカン酸、（Ｓ）−１６−メチルオクタデカン酸、ドデカン二酸（ドデカン−１，１２−二酸）、（Ｅ）−２−ドデセン二酸、ｎ−ドデセン二酸、３−ドデセン二酸（二重結合は特定しない）、テトラデカン二酸（テトラデカン−１，１４−二酸）、５−テトラデセン二酸、（５Ｚ）−ｎ−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸（ヘキサデカン−１，１６−二酸）、７−ヘキサデセン二酸、（７Ｚ）−n−ヘキサデセン二酸、オクタデカン二酸（オクタデカン−１，１８−二酸）、９−オクタデセン二酸、（９Ｚ）−ｎ−オクタデセン二酸、エイコサン二酸、エイコサン酸、９−エイコセン二酸、（９Ｚ）−ヘキサデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−ヘキサデセンジオイルＣｏＡ、オクタデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−オクタデセンジオイルＣｏＡ、ヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−ヘキサデセン二酸ＣｏＡ、オクタデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−メチルヘキサデカン酸、ｎ−メチルヘキサデカン酸ＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブタノイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−二酸、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１０−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−＋−３−メチルヘキサデカン酸、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−二酸、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１２−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−二酸、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１４−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１６−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、３−メチルヘキサデカン二酸、３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、またはｎ−オクタデセン二酸ＣｏＡを包含し；
（ｂ）アンテイソ脂肪酸は１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、または１６−メチルオクタデカン酸を包含し；
（ｃ）イソ脂肪酸はパルミチン酸であり；
（ｄ）ＤＣＡはドデカン二酸、ｎ−ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ｎ−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ｎ−メチルヘキサデカン酸、ｎ−ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、ｎ−オクタデカン二酸、またはエイコサン酸であり；
（ｅ）ＤＣＡ−ＣｏＡはヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−ヘキサデカン二酸ＣｏＡ、オクタデカン二酸ＣｏＡ、またはｎ−オクタデカン二酸ＣｏＡである。
【００３２】
本明細書において開示される方法の１つの態様では：
（ａ）アンテイソ脂肪酸は１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、または１６−メチルオクタデカン酸であり；
（ｂ）イソ脂肪酸はパルミチン酸であり；
（ｃ）ＤＣＡはｎ−メチルヘキサデカン酸またはｎ−ヘキサデカン二酸であり；
（ｄ）ＤＣＡ−ＣｏＡはｎ−メチルヘキサデカン酸ＣｏＡまたはｎ−ヘキサデカン二酸ＣｏＡである。
【００３３】
本明細書において開示される方法の１つの態様では、組換え体ホスト細胞または全細胞は植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、古細菌細胞、または細菌細胞を含む。
【００３４】
本発明は、本明細書において開示される組換え体ホスト細胞を含む細胞培養物をもまた提供し、細胞培養物は、さらに：
（ａ）組換え体ホスト細胞によって生産された１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと；
（ｂ）微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素と；
を含み、
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせは少なくとも１ｍｇ／細胞培養物のリットルの濃度で存在する。
【００３５】
本発明は、細胞培養によって増殖させられた本明細書において開示される組換え体ホスト細胞からの細胞培養物ライセートをもまた提供し、
（ａ）組換え体ホスト細胞によって生産された１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと；
（ｂ）微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素と；
を含み、
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせは少なくとも１ｍｇ／細胞培養物のリットルの濃度で存在する。
【００３６】
本発明は：
（ａ）配列番号３４もしくは３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチド；
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号３７もしくは３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２３もしくは２４のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチド；
（ｅ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチド；
（ｆ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、もしくは４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチド；
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチド；
（ｈ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド；および／または
（ｉ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができるポリペプチド、
をコードする核酸分子をもまた提供する。
【００３７】
本明細書において開示される核酸分子の１つの態様では、核酸分子はｃＤＮＡである。
【００３８】
本発明は：
（ａ）配列番号３４もしくは３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを；
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを；
（ｃ）配列番号３７もしくは３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、（Ｓ）−２−メチルブタナールから２−メチル酪酸を；
（ｄ）配列番号２３もしくは２４のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６５％の配列同一性を有し、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを；
（ｅ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を；
（ｆ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、および４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有し、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からＤＣＡを；
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを；
（ｈ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを；および／または
（ｉ）ＤＣＡからムスコンを、
生産することができる精製されたポリペプチドまたはその触媒活性部分をもまた提供する。
【００３９】
本発明は、本明細書において開示される組換え体ホスト細胞または方法によって生産された大環状ケトン、１つ以上の大環状ケトン前駆体、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせを含む組成物をもまた提供する。
【００４０】
本発明のこれらのおよび他の特徴および利点は、付随する請求項と一緒になった次の詳細な記載からより充分に理解されるであろう。本明細書において提出される特徴および利点の具体的な議論によってではなく、請求項の範囲はその中の記載によって定義されるということが指摘される。
【００４１】
本発明の実施形態の次の詳細な記載は、次の図面と併せて読まれるときに最も良好に理解され得る。そこでは同類の構造は同類の参照番号によって指示されている。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】図１Ａは、ｌ−ムスコンの生産の生合成経路を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ノルムスコンの生産の生合成経路を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ムスコン中間体の分子構造を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ムスコン中間体の分子構造を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ムスコン中間体の分子構造を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ムスコン中間体の分子構造を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ムスコン中間体の分子構造を示す。
【図１Ｈ】図１Ｈは、ムスコン中間体の分子構造を示す。
【図１Ｉ】図１Ｉは、ムスコン中間体の分子構造を示す。
【図１Ｊ】図１Ｊは、ムスコン中間体の分子構造を示す。
【図１Ｋ】図１Ｋは、ムスコン中間体の分子構造を示す。
【図２】図２は、内在性のＰ４５０モノオキシゲナーゼのみを発現するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株によるジカルボン酸（ＤＣＡ）形成を示す。
【図３】図３は、Ｃ．トロピカリス（tropicalis）シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ５２）遺伝子を発現するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株によるＤＣＡ形成を示す。
【図４】図４は、Ｓ．ボンビコラ（bombicola）ＣＹＰ５２遺伝子を発現するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株によるＤＣＡ形成を示す。
【図５】図５は、Ｃ．マルトーサ（maltosa）ＣＹＰ５２遺伝子を発現するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株によるＤＣＡ形成を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、２４時間におけるｍｇ／ＬでのＳ．セレビシエ（cerevisiae）によるＤＣＡ１６：０形成を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、２４時間のｍｇ／ｇＣＤＷにおけるＳ．セレビシエ（cerevisiae）によるＤＣＡ１６：０形成を示す。
【図７】図７は、アシルＣｏＡシンターゼ（ＭＣＣ０２８）の染色体外およびインテグレーション発現下におけるヘキサデカン二酸ＣｏＡの相対量を示す。
【図８】図８は、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ１）遺伝子欠失を有する、セイヨウカラハナソウ（ＨＩＣＣＬ４）ＣｏＡリガーゼを発現するＳ．セレビシエ（cerevisiae）ＤＣＡ生産株による（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ生産を示す。
【図９】図９は、ＨＩＣＣＬ４−ＣｏＡリガーゼを発現する、ｆａｓ１欠失バックグラウンドを有するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株における脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）活性の回復を示す。
【図１０】図１０は、ＨＩＣＣＬ４およびＣＹＰ５２Ａ−ＣＹＰ５２Ａ９遺伝子を発現するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株によるＣ１７アンテイソ脂肪酸生産を示す。
【図１１】図１１は、アシルＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子を発現するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株によるヘキサデカン二酸ＣｏＡ生産を示す。
【図１２】図１２は、内在性のアシルＣｏＡシンターゼを過剰発現するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株によるジカルボン酸ＣｏＡ（ＤＣＡ−ＣｏＡ）生産を示す。
【００４３】
図中の要素は単純さおよび明瞭性のために例解されており、必ずしも一定縮尺で描かれてはいないということを当業者は了解するであろう。例えば、本発明の実施形態（単数または複数）の理解を改善することを助けるために、図中の要素のいくつかの寸法は他の要素に対して相対的に誇張され得る。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本明細書において引用される全ての公開物、特許、および特許出願は全ての目的のために参照に依ってここに明示的に組み込まれる。
【００４５】
本発明を詳細に記載する前に、いくつもの用語が定義される。文脈が明瞭に別様に述べていない限り、本明細書において用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を包含する。例えば、「核酸」の指示は１つ以上の核酸を意味する。
【００４６】
「好ましくは」、「普通に」、および「典型的に」のような用語は、本明細書においては、請求される発明の範囲を限定するために、または請求される発明の構造もしくは機能にとって一定の特徴が決定的、必須、もしくはさらには重要であるということを含意するようには利用されていないということが指摘される。むしろ、これらの用語は、単に、本発明の特定の実施形態に利用され得るかまたは利用され得ない代替的なまたは追加の特徴を強調することが意図されている。
【００４７】
本発明を記載および定義する目的のために、用語「実質的に」は、本明細書においては、いずれかの定量的比較、値、測定、または他の表現に帰せられ得る固有の不確かさの程度を表現するために利用されるということが指摘される。用語「実質的に」は、本明細書においては、当の主題の基礎的機能の変化をもたらすことなしに、定量的表現が書かれている参照から変動し得る程度を表現するためにもまた利用される。
【００４８】
本発明に従う遺伝子発現構築物および組換え体細胞を構築するためには、当業者に周知の方法が用いられ得る。これらの方法はインビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、インビボ組換え技術、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を包含する。例えばグリーン（Green）およびサンブルック（Sambrook）著，２０１２年，「モレキュラー・クローニング：ラボラトリーマニュアル（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL）」，第４版，コールド・スプリング・ハーバー研究所，ニューヨーク；オースベル（Ausubel）ら著，１９８９年，「分子生物学カレント・プロトコル（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）」，グリーン・パブリッシング・アソシエーツおよびワイリー・インターサイエンス，ニューヨーク、ならびに「ＰＣＲプロトコール：方法および応用のガイド（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications）」（イニス（Innis）ら著，１９９０年，アカデミック・プレス，サンディエゴ，ＣＡ）に記載されている技術参照。
【００４９】
本明細書において用いられる用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、当業者によって理解される通り文脈に依存して、一本鎖のまたは二本鎖の実施形態のどちらかのＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含む核酸を言うために交換可能に用いられ得る。
【００５０】
本明細書において用いられる用語「微生物」、「微生物ホスト」、「微生物ホスト細胞」、「組換え体ホスト」、および「組換え体ホスト細胞」は交換可能に用いられ得る。本明細書において用いられる用語「組換え体ホスト」は、そのゲノムが少なくとも１つのＤＮＡ配列によって拡張されたホストを言うことが意図される。かかるＤＮＡ配列は、天然には存在しない遺伝子、正常ではＲＮＡへと転写または蛋白質へと翻訳（「発現」）されないＤＮＡ配列、およびホストに導入することを望む他の遺伝子またはＤＮＡ配列を包含するが、これらに限定されない。典型的には、本明細書に記載される組換え体ホストのゲノムは１つ以上の組換え体遺伝子の安定な導入によって拡張されるということは了解されるであろう。一般的には、導入されるＤＮＡはＤＮＡのレシピエントであるホストに元々は内在していないが、所与のホストからＤＮＡセグメントを単離し、爾後にそのＤＮＡの１つ以上の追加のコピーを同じホストに導入して、例えば遺伝子の産物の生産を向上させるかまたは遺伝子の発現パターンを変えることは本開示の範囲内である。いくつかの事例では、導入されるＤＮＡは例えば相同組換えまたは部位特異的変異導入によって内在性の遺伝子またはＤＮＡ配列を改変するかまたはさらには置き換えるであろう。好適な組換え体ホストは微生物を包含する。
【００５１】
本明細書において用いられる用語「細胞培養物」は１つ以上の組換え体ホストを含む培養培地を言う。細胞培養物は単一株の組換え体ホストを含み得るか、または２つ以上の別々のホスト株を含み得る。培養培地は組換え体ホストを含み得るいずれかの培地、例えば液体培地（すなわち、培養ブロス）または半固形培地であり得、追加の構成要素、例えばＮ−アセチルグルコサミン、グルコース、フルクトース、スクロース、微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース（ＹＮＢ）などを含み得る。
【００５２】
本明細書において用いられる用語「組換え体遺伝子」は、レシピエントホスト内に導入される遺伝子またはＤＮＡ配列を言い、同じかまたは類似の遺伝子またはＤＮＡ配列がかかるホスト内に既に存在し得るかどうかにかかわらない。当分野においては、この文脈における「導入される」または「拡張される」は人の手によって導入または拡張されることを意味することが公知である。それゆえに、組換え体遺伝子は、別の種からのＤＮＡ配列であり得るか、または同じ種に起源を発するかもしくは存在するが、組換え体ホストを形成するための組換え方法によってホストに組み込まれたＤＮＡ配列であり得る。ホスト内に導入される組換え体遺伝子は、形質転換されようとするホストに正常で存在するＤＮＡ配列と同一であり得、ＤＮＡの１つ以上の追加のコピーを提供するために導入されて、それによってそのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または改変された発現を可能にすることは了解されるであろう。いくつかの態様では、前記組換え体遺伝子はｃＤＮＡによってコードされる。他の実施形態では、組換え体遺伝子は合成であり、および／またはＳ．セレビシエ（cerevisiae）による発現のためにコドン最適化される。
【００５３】
本明細書において用いられる用語「人工の生合成経路」は、本明細書に記載される通り組換え体ホスト内に生起する生合成経路を言う。いくつかの態様では、生合成経路の１つ以上のステップは未改変のホストでは天然には存在しない。いくつかの実施形態では、ある遺伝子の異種バージョンが、遺伝子の内在性のバージョンを含むホスト内に導入される。
【００５４】
本明細書において用いられる用語「内在性の」遺伝子は、特定の生物、組織、または細胞に起源を発し、それの中で生産または合成される遺伝子を言う。いくつかの実施形態では、内在性の遺伝子は酵母遺伝子である。いくつかの実施形態では、遺伝子は、Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）株Ｓ２８８Ｃを包含するがこれに限定されないＳ．セレビシエ（cerevisiae）にとって内在性である。いくつかの実施形態では、内在性の酵母遺伝子が過剰発現される。本明細書において用いられる用語「過剰発現する」は、野生型生物の遺伝子発現のレベルよりも高いレベルでの生物の遺伝子の発現を言うために用いられる。例えばプレリッヒ（Prelich）著，２０１２年，ジェネティクス（Genetics）第１９０巻：ｐ．８４１−５４参照。いくつかの実施形態では、内在性の酵母遺伝子が欠失させられる。例えばジェーバー（Giaever）およびニスロー（Nislow）著，２０１４年，ジェネティクス（Genetics）第１９７巻（２）：ｐ．４５１−６５参照。本明細書において用いられる用語「欠失」、「欠失させられる」、「ノックアウト」、および「ノックアウトされる」は、Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）を包含するがこれに限定されない生物において、もはや発現されないように操作された内在性の遺伝子を言うために交換可能に用いられ得る。
【００５５】
本明細書において用いられる用語「異種配列」および「異種コード配列」は組換え体ホスト細胞以外の種に由来する配列を記載するために用いられる。いくつかの実施形態では、組換え体ホスト細胞はＳ．セレビシエ（cerevisiae）細胞であり、異種配列はＳ．セレビシエ（cerevisiae）以外の生物に由来する。例えば、異種コード配列は、異種配列を発現する組換え体ホスト細胞とは異なる原核微生物、真核微生物、植物、動物、昆虫、または真菌からであり得る。いくつかの実施形態では、コード配列はホストにとって生得である配列である。
【００５６】
「選択可能なマーカー」は、とりわけホスト細胞栄養要求性を相補するか、抗生物質耐性を提供するか、または色変化をもたらすいずれかの数の遺伝子の１つであり得る。当分野において周知の方法を用いて、遺伝子置換ベクターの線状化されたＤＮＡ断片が細胞内に導入される（下記参照）。ゲノム中への線状断片のインテグレーションおよび遺伝子の破壊は選択マーカーに基づいて決定され得、例えばＰＣＲまたはサザンブロット分析によって検証され得る。セレクションへのその使用の爾後に、選択可能なマーカーは例えばＣｒｅ−ＬｏｘＰ系によってホスト細胞のゲノムから取り除かれ得る（例えば、ゴッセン（Gossen）ら著，２００２年，アニュアル・レビュー・オブ・ジェネティクス（Annual Review of Genetics）第３６巻：ｐ．１５３−１７３およびＵ．Ｓ．２００６／００１４２６４参照）。代替的には、遺伝子置換ベクターは、破壊されるべき遺伝子の部分を包含するようなやり方で構築され得る。ここで、部分は、いずれかの内在性の遺伝子プロモーター配列を欠いており、遺伝子のコード配列を全くコードしないかまたはその不活性な断片をコードする。
【００５７】
本明細書において用いられる用語「バリアント」および「変異体」は、特定の蛋白質の野生型配列と比較して１つ以上のアミノ酸を改変された蛋白質配列を記載するために用いられる。例えば、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）変異体、ｆａｓ１  ｍｕｔ１、ｆａｓ１  ｍｕｔ２、ｆａｓ１  ｍｕｔ３などは全て野生型ｆａｓ１のバリアントである。
【００５８】
本明細書において用いられる用語「不活性な断片」は、遺伝子の全長コード配列から生産される蛋白質の活性の例えば約１０％未満（例えば約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）を有する蛋白質をコードする遺伝子の断片である。いかなる公知のプロモーター配列も遺伝子配列に作動可能に連結されていないが、終止コドンおよび転写終結配列が遺伝子配列の部分に作動可能に連結されているようなやり方で、遺伝子のかかる部分はベクター上に挿入される。爾後に、このベクターは遺伝子配列の部分において線状化され、細胞に形質転換され得る。それから、単一の相同組換えによって、この線状化されたベクターは遺伝子の内在性のカウンターパート中にインテグレーションされ、その不活性化を有する。
【００５９】
本明細書において用いられる用語「大環状ケトン」は線状分子から合成された８原子以上の環を含有するケトンを言う。本明細書において考えられる大環状ケトンの限定しない例は、ノルムスコン（シクロペンタデカノンまたはエキサルトン）、Ｌ−ムスコン（シクロペンタデカノン、３−メチル−、（３Ｒ）−、または（Ｒ）−ムスコン）、およびシベトン（（Ｚ）−９−シクロヘプタデセン−１−オン；ｃｉｓ−シベトン；９−シクロヘプタデセン−１−オン；シクロヘプタデカ−９−エン−１−オン；（Ｚ）−９−シクロヘプタデセン−１−オンとしてもまた公知）を包含する。
【００６０】
また、本明細書において用いられる用語「大環状ケトン前駆体」は、大環状ケトンの生産のための大環状ケトン生合成経路上の中間体化合物の生産および／または存在を言うために用いられる。いくつかの実施形態では、大環状ケトン前駆体はＬ−ムスコン前駆体、ノルムスコン前駆体、シベトン前駆体、またはこれらの組み合わせであり得る。大環状ケトン前駆体は、１２−メチルテトラデカン酸、（Ｓ）−１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、（Ｓ）−１４−メチルヘキサデカノエート、１６−メチルオクタデカン酸、（Ｓ）−１６−メチルオクタデカン酸、ドデカン二酸（ドデカン−１，１２−二酸）、（Ｅ）−２−ドデセン二酸、ｎ−ドデセン二酸、３−ドデセン二酸（二重結合は特定しない）、テトラデカン二酸（テトラデカン−１，１４−二酸）、５−テトラデセン二酸、（５Ｚ）−ｎ−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸（ヘキサデカン−１，１６−二酸）、７−ヘキサデセン二酸、（７Ｚ）−ｎ−ヘキサデセン二酸、オクタデカン二酸（オクタデカン−１，１８−二酸）、９−オクタデセン二酸、（９Ｚ）−ｎ−オクタデセン二酸、エイコサン二酸、エイコサン酸、９−エイコセン二酸、（９Ｚ）−ヘキサデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−ヘキサデセンジオイルＣｏＡ、オクタデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−オクタデセンジオイルＣｏＡ、ヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−ヘキサデセン二酸ＣｏＡ、オクタデカン二酸ＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブタノイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−二酸、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１０−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−二酸、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１２−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−二酸、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１４−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１６−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、３−メチルヘキサデカン（hexdecan）二酸、３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、およびｎ−オクタデセン二酸ＣｏＡを包含するが、これらに限定されない（図１Ｃ〜１Ｋ）。
【００６１】
本明細書において用いられる用語「ｌ−ムスコン前駆体」はｌ−ムスコンの合成中に生産される中間体を言う。例えば、ｌ−ムスコン前駆体は（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、１４−メチルヘキサデカン酸、３−メチルヘキサデカン二酸、および３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡを包含するが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書において用いられる用語「ノルムスコン前駆体」はノルムスコンの合成中に生産される中間体を言う。例えば、ノルムスコン前駆体はヘキサデカン二酸およびヘキサデカン二酸ＣｏＡを包含するが、これらに限定されない。
【００６３】
大環状ケトン前駆体はインビボで（すなわち、組換え体ホストによって）、インビトロで（すなわち酵素的に）、または全細胞バイオコンバージョンによって生産され得る。本明細書において用いられる用語「生産する」および「蓄積する」は、インビボの、インビトロの、または全細胞バイオコンバージョンによるムスコンおよびムスコン前駆体の合成を記載するために交換可能に用いられ得る。
【００６４】
本明細書において用いられる用語「長鎖分岐脂肪酸」は、１２個以上の炭素原子をその尾部に有する脂肪酸を言うために用いられる。典型的には、モノメチル長鎖分岐脂肪酸は１２から２０炭素原子のバックボーン上に単一のメチル基を含む。例えば、長鎖分岐脂肪酸は１４−メチルヘキサデカン二酸および３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡを包含するが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書において用いられる用語「短鎖分岐脂肪酸」は、５つまたはより少数の炭素原子を有する脂肪酸を言うために用いられる。例えば、短鎖分岐脂肪酸は（Ｓ）−２−メチル酪酸および（Ｓ）−２−メチル酪酸ＣｏＡを包含するが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書において用いられる用語「モノメチル分岐鎖脂肪酸」および「ＭＭＢＣＦＡ」は、炭素原子の１つから「分岐する」単一のメチル基を有する脂肪酸分子を言うために用いられる。例えば、ＭＭＢＣＦＡは１２−メチルテトラデカン酸（Ｃ１５アンテイソ脂肪酸）、１４−メチルヘキサデカン酸（Ｃ１７アンテイソ脂肪酸）、または１６−メチルオクタデカン酸（Ｃ１９アンテイソ脂肪酸）を包含するが、これらに限定されない（図１Ｂ〜１Ｋ）。
【００６７】
本明細書において用いられる用語「イソ脂肪酸」は、イソ位置の炭素原子の１つから「分岐する」単一のメチル基を有する大環状ケトン生合成経路上の中間体脂肪酸化合物を言うために用いられる。例えば、イソ脂肪酸はパルミチン酸を包含するが、これに限定されない（図１Ｂ）。
【００６８】
本明細書において用いられる用語「アンテイソ脂肪酸」は大環状ケトン生合成経路上の中間体脂肪酸化合物を言うために用いられる。例えば、アンテイソ脂肪酸は１２−メチルテトラデカン酸（Ｃ１５アンテイソ脂肪酸）、１４−メチルヘキサデカン酸（Ｃ１７アンテイソ脂肪酸）、または１６−メチルオクタデカン酸（Ｃ１９アンテイソ脂肪酸）を包含するが、これらに限定されない（図１Ｃ〜１Ｋ）。
【００６９】
本明細書において用いられる用語「エナンチオマー」（単数または複数）は、あるキラルな分子、または互いの鏡像であるキラルな分子同士を言う。これらの分子は互いに重ね合わせ不可能である。
【００７０】
本明細書において用いられる用語「誘導体」は、何らかの化学的または物理的プロセスによって類似の化合物から派生する分子または化合物を言う。
【００７１】
本明細書において用いられるＳ（またはＳ立体配置）は、１の位置から２の位置への曲線矢印が反時計回りに曲がる分子の立体配置を言う。例は（Ｓ）−２−メチル酪酸および（Ｓ）−２−メチル酪酸ＣｏＡを包含するが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書において用いられるＲ（またはＲ立体配置）は、１の位置から２の位置への曲線矢印が時計回りに曲がる分子の立体配置を言う。例は（Ｒ）−２−メチル酪酸および（Ｒ）−２−メチル酪酸ＣｏＡを包含するが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書において用いられる用語「エナンチオマー過剰率（ｅｅ）」および「光学純度」は、交換可能に用いられ得、キラルな物質について用いられる純度の尺度を言う。例えば、エナンチオマー過剰率が１００％である場合には、１つのエナンチオマー（ＳまたはＲどちらか）のみが生産された。加えて、経路が９０％のＳ−２−メチル酪酸および１０％の（Ｒ）−２−メチル酪酸を生産する場合には、Ｓ−２−メチル酪酸のエナンチオマー過剰率は９０％−１０％＝８０％エナンチオマー過剰率（ｅｅ）であるか、または８０％ｅｅの光学純度を有する。
【００７４】
本明細書において用いられる用語「ディークマン縮合反応」は、β−ケトエステルを与えるための塩基とのジエステルの細胞内化学反応を言う。
【００７５】
本明細書において用いられる用語「直鎖脂肪酸」は、大環状ケトン生合成経路上のいかなる分岐も有さない中間体脂肪酸化合物を言うために用いられる。直鎖脂肪酸はパルミチン酸を包含するが、これに限定されない（図１Ａ）。
【００７６】
本明細書において用いられる用語「補酵素Ａ（ＣｏＡ）活性化」は、脂肪酸の末端へのＣｏＡの付加を言うために用いられる。例えば、ジカルボン酸がＣｏＡ活性化を受けるときには、それはジカルボン酸ＣｏＡ（ＤＣＡ−ＣｏＡ）分子を形成する。例えば、ＣｏＡ活性化されたＤＣＡはｎ−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡおよびｎ−ヘキサデカン二酸ＣｏＡを包含するが、これらに限定されない。
【００７７】
本明細書において用いられる用語「アシルＣｏＡリガーゼ」または「ＣｏＡリガーゼ」は、ＣｏＡによって脂肪酸を活性化するリガーゼファミリーの酵素を言うために用いられる。ＣｏＡリガーゼは例えばホップ（セイヨウカラハナソウ）（配列番号３；２３）またはジャガイモ（馬鈴薯）（配列番号４；２４）に由来し得る。
【００７８】
本明細書において用いられる用語「脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）」は脂肪酸合成を触媒する酵素を言うために用いられる。例えば、脂肪酸シンターゼはＦＡＳ１、ＦＡＳ１  ｍｕｔ２、ＦＡＳ１  ｍｕｔ３、ＦＡＳ１  ｍｕｔ４、ＦＡＳ１  ｍｕｔ５、ＦＡＳ１  ｍｕｔ６、およびＦＡＳ１  ｍｕｔ７を包含するが、これらに限定されない。
【００７９】
本明細書において用いられる用語「検出可能な量」、「検出可能な濃度」、「測定可能な量」、および「測定可能な濃度」は、ＡＵＣ、μΜ／ΟＤ６００、ｍｇ／Ｌ、μΜ、またはｍＭによって測定されるムスコンおよび／またはムスコン前駆体のレベルを言う。ムスコンおよびムスコン前駆体生産（すなわち、トータル、上清、および／または細胞内のムスコンおよびムスコン前駆体レベル）は、当業者にとって一般的に利用可能な技術、例えば液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、紫外−可視分光／分光測色（ＵＶ−Ｖｉｓ）、質量分析（ＭＳ）、および核磁気共鳴分光（ＮＭＲ）によって検出および／または分析され得るが、これらに限定されない。
【００８０】
本明細書において用いられる用語「検出不可能な濃度」は、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＵＶ−Ｖｉｓ、ＭＳ、またはＮＭＲなどの技術によって測定および／または分析されるには低すぎる化合物のレベルを言う。いくつかの実施形態では、「検出不可能な濃度」の化合物はムスコンまたはムスコン前駆体組成物中に存在しない。
【００８１】
本明細書において用いられる用語「または」および「および／または」は、組み合わせのまたは互いに排他的な複数の構成要素を記載するために利用される。例えば、「ｘ、ｙ、および／またはｚ」は「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、およびｚ」、「（ｘおよびｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙおよびｚ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を言い得る。いくつかの実施形態では、「および／または」は組換え体細胞が含む外来性の核酸を言うために用いられ、組換え体細胞はある群から選択される１つ以上の外来性の核酸を含む。いくつかの実施形態では、「および／または」は、大環状ケトンおよび／または大環状ケトン前駆体、例えばムスコンおよび／またはムスコン前駆体の生産を言うために用いられる）。いくつかの実施形態では、「および／または」は大環状ケトンまたは大環状ケトン前駆体（例えばムスコンまたはムスコン前駆体）の生産を言うために用いられ、１つ以上の大環状ケトンおよび／または大環状ケトン前駆体が生産される。いくつかの実施形態では、「および／または」は大環状ケトンおよび／または大環状ケトン前駆体（例えば、ムスコンおよび／またはムスコン前駆体）の生産を言うために用いられ、１つ以上の大環状ケトンおよび／または大環状ケトン前駆体は次のステップによって生産される：組換え体微生物を培養すること、大環状ケトンおよび／もしくは大環状ケトン前駆体（例えばムスコンおよび／もしくはムスコン前駆体）を組換え体微生物によって合成すること、ならびに／または１つ以上の大環状ケトンおよび／もしくは大環状ケトン前駆体（例えば、ムスコンおよび／もしくはムスコン前駆体）を単離すること。
【００８２】
１つの実施形態では、組換え体ホスト細胞は、大環状ケトンおよび／または大環状ケトン前駆体（例えばムスコンおよびムスコン前駆体）を生産することができるいくつかのポリペプチドをコードする遺伝子を包含し得る。本明細書に記載されるムスコンはノルおよび／またはｌ−ムスコンを包含するが、これらに限定されない。
【００８３】
いくつかの実施形態では、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子と；（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡから１４−メチルヘキサデカン酸または別のアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子と（図１Ｃ〜１Ｋ参照）；１４−メチルヘキサデカン酸から３−メチルヘキサデカン二酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子と；３−メチルヘキサデカン二酸から３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子と；３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡからｌ−ムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子のセットとを発現する組換え体ホストは、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、１４−メチルヘキサデカン酸または別のモノメチル分岐鎖脂肪酸（図１Ｃ〜１Ｋ参照）、３−メチルヘキサデカン二酸、３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、およびｌ−ムスコンをインビボで生産し得る。
【００８４】
いくつかの態様では、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドは、配列番号２３および配列番号２４で提出されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡから１４−メチルヘキサデカン酸または別のアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドは、配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２で提出されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；１４−メチルヘキサデカン酸から３−メチルヘキサデカン二酸を合成することができるポリペプチドは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６で提出されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；３−メチルヘキサデカン二酸から３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡを合成することができるポリペプチドは、配列番号３３で提出されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；ＤＣＡ、例えば（Ｒ）−（＋）−３−メチルヘキサデカン酸からｌ−ムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子。これらの遺伝子はホストにとって内在性であり得、ただしこれらの遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施形態では、全て）は組換え体ホスト細胞内に導入される組換え体遺伝子であるということを、当業者は了解するであろう。
【００８５】
いくつかの実施形態では、パルミチン酸からヘキサデカン二酸または別のジカルボン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子と（図１Ｃ〜１Ｋ参照）；ヘキサデカン二酸からヘキサデカン二酸ＣｏＡまたは別のＣｏＡ活性化されたジカルボン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子と；ヘキサデカン二酸ＣｏＡからノルムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子とを発現する組換え体ホストが、ヘキサデカン二酸または別のジカルボン酸（図１Ｃ〜１Ｋ参照）、ヘキサデカン二酸ＣｏＡまたは別のＣｏＡ活性化されたジカルボン酸（図１Ｃ〜１Ｋ参照）、およびノルムスコンをインビボで生産し得る。
【００８６】
いくつかの態様では、パルミチン酸からヘキサデカン二酸または別のジカルボン酸を合成することができるポリペプチドは（図１Ｃ〜１Ｋ参照）、配列番号２１、配列番号２２、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６で提出されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；ヘキサデカン二酸からヘキサデカン二酸ＣｏＡまたは別のＣｏＡ活性化されたジカルボン酸を合成することができるポリペプチドは、配列番号３３で提出されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み；ジカルボン酸からノルムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子。これらの遺伝子はホストにとって内在性であり得、ただしこれらの遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施形態では、全て）は組換え体ホスト細胞内に導入される組換え体遺伝子であるということを、当業者は了解するであろう。
【００８７】
いくつかの実施形態では、大環状ケトンおよび／または大環状ケトン前駆体（例えばｌ−および／またはノルムスコン）をインビボで生産し得る組換え体ホスト細胞は、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ１）遺伝子を発現し得、これはアシル補酵素Ａオキシダーゼを生産することができるポリペプチドをコードする。アシル補酵素Ａオキシダーゼは脂肪酸ベータ酸化に関わり、１つ以上のムスコン前駆体の酸化をもたらし得る。１つの実施形態では、ムスコン生産組換え体ホストはｐｏｘ１Δ０遺伝子欠失を含み得る。ムスコン生産組換え体ホストのアシル補酵素Ａオキシダーゼの発現の縮減は、ｌ−およびノルムスコン生合成経路上のムスコン前駆体の酸化を縮減するように作用し得る。
【００８８】
大環状ケトン生合成経路
ｌ−ムスコン生合成経路
１つの実施形態では、ｌ−ムスコンおよびｌ−ムスコン前駆体生産はｌ−ムスコン生合成経路によって達成され得、これは（Ｓ）−２−メチル酪酸（methylbutyryl acid）ＣｏＡの生産を包含し、これがそれからアシルＣｏＡリガーゼのプライミング単位または基質として用いられて、モノメチル分岐鎖脂肪酸（ＭＭＢＣＦＡ）またはアンテイソ脂肪酸分子を形成し得る（図１Ａおよび１Ｃ〜１Ｋ参照）。ＭＭＢＣＦＡの酸化、次に３−メチルヘキサデカン二酸などのジカルボン酸のＣｏＡ活性化は、ＣｏＡ活性化されたジカルボン酸の生産をもたらす。爾後に、ＣｏＡ活性化されたジカルボン酸の環化および脱炭酸によって、ｌ−ムスコンが生産される（図１Ａおよび１Ｃ〜１Ｋ参照）。
【００８９】
別の実施形態では、ｌ−ムスコンおよびｌ−ムスコン前駆体生産はｌ−ムスコン生合成経路によって達成され得、これは（Ｓ）−２−メチル酪酸（methylbutyryl acid）ＣｏＡの生産を包含し、これがそれからアシルＣｏＡリガーゼのプライミング単位または基質として用いられて、モノメチル分岐鎖脂肪酸（ＭＭＢＣＦＡ）またはアンテイソ脂肪酸分子を形成し得る（図１Ａおよび１Ｃ〜１Ｋ参照）。爾後に、ジカルボン酸が基質として作用するディークマン縮合反応によって、ｌ−ムスコンが生産される。
【００９０】
１つの実施形態では、ｌ−ムスコン生産組換え体ホストはムスコン中間体の下流生産のために（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを生産する。ｌ−ムスコン生合成経路を含む組換え体ホスト細胞は、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばトランスアミナーゼ（例えばＢＡＴ１／ＢＡＴ２））（配列番号１４および１５；３４および３５）、（Ｓ）−３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばトランスアミノ化アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０））（配列番号１６；３６）；（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ２／ＡＬＤ５））（配列番号１７および１８；３７および３８）；（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばＣｏＡリガーゼ）（配列番号３および４；２３および２４）を含み得る。それから、ｌ−ムスコン生産組換え体ホストによる（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡの生産は、１４−メチルヘキサデカン酸などのモノメチル分岐鎖脂肪酸のインビトロ形成のためのプライミング単位として作用し得る。
【００９１】
１つの実施形態では、ｌ−ムスコン生産組換え体ホストは、さらに、２−メチルブチリルＣｏＡから１４−メチルヘキサデカン酸などのモノメチル分岐鎖脂肪酸（ＭＭＢＣＦＡ）を合成し得るポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ））を含み得る（配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、および１２；２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２）。この反応から形成されるモノメチル分岐鎖脂肪酸またはアンテイソ脂肪酸は１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、および１６−メチルオクタデカン酸を包含し得るが、これらに限定されない（図１Ｃ〜１Ｋ参照）。それから、ｌ−ムスコン生産組換え体ホストによってインビトロで生産されたこれらのアンテイソ脂肪酸は、追加の下流のｌ−ムスコン経路中間体を生産するために用いられ得る（図９および表２参照）。
【００９２】
１つの実施形態では、奇数鎖脂肪酸、例えばＣ１７：０アンテイソ脂肪酸の生産を増大させるために、ｌ−ムスコン生産組換え体ホストは、さらに、外来的に発現されるＦＡＳ１変異体を有し、脂肪酸シンターゼ１（ｆａｓ１）遺伝子欠失を含み得る（図９および１０参照）。ＦＡＳ１変異体は、ｆａｓ１  ｍｕｔ１（Ｉ４８３Ａ）（配列番号６；２６）、ｆａｓ１  ｍｕｔ２（Ｆ４２７Ａ）（配列番号７；２７）、ｆａｓ１  ｍｕｔ３（Ｆ４２７Ａ，Ｉ４８３Ａ）（配列番号８；２８）、ｆａｓ１  ｍｕｔ４（Ｉ２３４Ａ，Ｆ４２７Ｓ）（配列番号９；２９）、ｆａｓ１  ｍｕｔ５（Ｑ１６３Ａ，Ｆ４２７Ａ）（配列番号１０；３０）、ｆａｓ１  ｍｕｔ６（Ｉ３０６Ａ）（配列番号１１；３１）、およびｆａｓ１  ｍｕｔ７（Ｉ３０６Ａ，Ｉ４８３Ａ）（配列番号１２；３２）を包含するが、これらに限定されない。それから、ＦＡＳ活性に従ってｌ−ムスコン生産組換え体ホストによって生産された奇数鎖脂肪酸は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素によって基質として用いられて、ｌ−ムスコン生合成経路上の追加の下流の中間体、例えばジカルボン酸を生産し得る（図９、表２、および図１０参照）。
【００９３】
１つの実施形態では、ｌ−ムスコン生産組換え体ホストは、さらに、ジカルボン酸の形成をもたらすモノメチル分岐鎖脂肪酸の酸化のためのポリペプチドをコードする遺伝子を含み得る（例えばシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（配列番号１、４７、４８、５０、および５１；２１、４１、４２、４４、および４５）、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（配列番号２、４９、および５２；２２、４３、および４６））。ジカルボン酸は３−メチルヘキサデカン二酸を包含し得るが、これに限定されない。
【００９４】
１つの実施形態では、ｌ−ムスコン生産組換え体ホストは、さらに、ジカルボン酸を活性化してジカルボン酸ＣｏＡ分子を生産することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばアシルＣｏＡシンターゼ）を含み得る（配列番号１３；３３）。例えば、組換え体ホスト細胞は、マスクラットの恒常的に発現されるクローニングされた遺伝子ＭＣＣ０２８を含み得る。これはネズミアシルＣｏＡシンターゼ（ＡＣＢＧ１）とアノテーションされた。例えば、ＭＣＣ０２８は３−メチルデカデカン二酸ＣｏＡの形成のための基質として３−メチルヘキサデカン二酸を用いる（図１１参照）。
【００９５】
別の実施形態では、ｌ−ムスコン生産組換え体ホストはジカルボン酸からｌ−ムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含み得る。
【００９６】
１つの実施形態では、ｌ−ムスコン生産組換え体ホストは、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばトランスアミナーゼ（例えば、分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ１／ＢＡＴ２））（配列番号１４または１５；３４または３５）、（Ｓ）−３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばトランスアミノ化アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０））（配列番号１６、３６）；（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ２／ＡＬＤ５））（配列番号１７および１８；３７、または３８）；（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばＣｏＡリガーゼ）（配列番号３または４；２３または２４）；２−メチルブチリルＣｏＡからモノメチル分岐鎖脂肪酸を合成し得るポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）（配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、または１２；２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２）；モノメチル分岐鎖脂肪酸からジカルボン酸への酸化のためのポリペプチドをコードする遺伝子（例えばシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（配列番号１、４７、４８、５０、および５１；２１、４１、４２、４４、および４５）シトクロムＰ４５０レダクターゼ（配列番号２、４９、および５２；２２、４３、および４６））；ジカルボン酸を活性化してジカルボン酸ＣｏＡ分子を生産することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばアシルＣｏＡシンターゼ）（配列番号１３；３３）；ならびにジカルボン酸からｌ−ムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ｌ−ムスコン生合成経路上に見いだされる反応ができる１つ以上の酵素の組換え体ホストによる発現によって、ｌ−ムスコンおよび／またはｌ−ムスコン前駆体がインビボで生産される。例えば、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばトランスアミナーゼ（例えば分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ１／ＢＡＴ２））（配列番号１４または１５；３４または３５）と、（Ｓ）−３−メチル−２オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばトランスアミノ化アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０））（配列番号１６；３６）と；（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ２／ＡＬＤ５））（配列番号１７および１８；３７または３８）と；（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばＣｏＡリガーゼ）（配列番号３または４；２３または２４）と；２−メチルブチリルＣｏＡからモノメチル分岐鎖脂肪酸を合成し得るポリペプチドをコードする遺伝子（例えば脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）（配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、または１２；２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２）と；モノメチル分岐鎖脂肪酸からジカルボン酸への酸化のためのポリペプチドをコードする遺伝子（例えばシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（配列番号１、４７、４８、５０、および５１；２１、４１、４２、４４、および４５）シトクロムＰ４５０レダクターゼ（配列番号２、４９、および５２；２２、４３、および４６））と；ジカルボン酸を活性化してジカルボン酸ＣｏＡ分子を生産することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばアシルＣｏＡシンターゼ）と；ジカルボン酸からｌ−ムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子とを発現するｌ−ムスコン生産組換え体ホストは、ｌ−ムスコンおよび／または１つ以上のｌ−ムスコン前駆体をインビボでおよび／またはインビトロで生産し得る。これらの遺伝子はホストにとって内在性であり得、ただしこれらの遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施形態では、全て）は組換え体ホスト細胞内に導入される組換え体遺伝子であるということを、当業者は了解するであろう。
【００９８】
いくつかの実施形態では、組換え体ホストは、ＣｏＡ基を（Ｓ）−２−メチル酪酸に取り付けることができるポリペプチドをコードする核酸を含む。例えば、セイヨウカラハナソウ（ＨＩＣＣＬ４）（配列番号３；２３）および馬鈴薯（ＳｔＣＣＬ）（配列番号４；２４）。
【００９９】
いくつかの実施形態では、組換え体ホストは、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡから１４−メチルヘキサデカン酸を合成することができるポリペプチドをコードする核酸を含む。例えば、脂肪酸シンターゼ野生型（配列番号５；２５）、またはＦＡＳ１変異体ｆａｓ１  ｍｕｔ１（Ｉ４８３Ａ）（配列番号６；２６）、ｆａｓ１  ｍｕｔ２（Ｆ４２７Ａ）、（配列番号７；２７）、ｆａｓ１  ｍｕｔ３（Ｆ４２７Ａ，Ｉ４８３Ａ）、（配列番号８；２８）、ｆａｓ１  ｍｕｔ４（Ｉ２３４Ａ，Ｆ４２７Ｓ）、（配列番号９；２９）、ｆａｓ１  ｍｕｔ５（Ｑ１６３Ａ，Ｆ４２７Ａ）、（配列番号１０；３０）、ｆａｓ１  ｍｕｔ６（Ｉ３０６Ａ）、（配列番号１１；３１）、およびｆａｓ１  ｍｕｔ７（Ｉ３０６Ａ，Ｉ４８３Ａ）、（配列番号１２；３２）。
【０１００】
いくつかの実施形態では、組換え体ホスト細胞は、１４−メチルヘキサデカン酸から３−メチルヘキサデカン二酸またはパルミチン酸からヘキサデカン二酸を合成することができるポリペプチドをコードする核酸を含む。例えば、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（配列番号１、４７、４８、５０、および５１；２１、４１、４２、４４、および４５）シトクロムＰ４５０レダクターゼ（配列番号２、４９、および５２；２２、４３、および４６）。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、組換え体ホスト細胞は、ヘキサデカン二酸から３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡまたはヘキサデカン二酸ＣｏＡを形成するための３−メチルヘキサデカン二酸のＣｏＡ活性化ができるポリペプチドをコードする核酸を含む（配列番号１３；３３）。
【０１０２】
ノルムスコン生合成経路
１つの実施形態では、ノルムスコンおよびノルムスコン前駆体生産は、パルミチン酸の生産を包含するノルムスコン生合成経路を含む組換え体ホストによって生産され得る。それから、パルミチン酸は酸化されてヘキサデカン二酸などのジカルボン酸を形成する。それから、ジカルボン酸中間体はＣｏＡ分子の付加によって活性化されてジカルボン酸ＣｏＡ分子を形成する。終わりに、ＣｏＡ活性化されたジカルボン酸の環化および脱炭酸によって、ノルムスコンが生産される（図１Ｂおよび１Ｃ〜１Ｋ参照）。
【０１０３】
別の実施形態では、ｌ−ムスコンおよびｌ−ムスコン前駆体生産はｌ−ムスコン生合成経路によって達成され得、これは（Ｓ）−２−メチル酪酸（methylbutyryl acid）ＣｏＡの生産を包含し、これがそれからアシルＣｏＡリガーゼのプライミング単位または基質として用いられて、モノメチル分岐鎖脂肪酸（ＭＭＢＣＦＡ）またはアンテイソ脂肪酸分子を形成し得る（図１Ｂおよび１Ｃ〜１Ｋ参照）。爾後に、ジカルボン酸が基質として作用するディークマン縮合反応によって、ノルムスコンが生産される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ノルムスコン生産組換え体ホストは、アセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（Ｅ．Ｃ．６．２．１．３）（例えばアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ）（配列番号１９；３９）；マロニルＣｏＡからパルミチン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えば脂肪酸シンターゼ）（配列番号５；２５）を含む。ノルムスコン生産組換え体ホストから生産されたパルミチン酸はノルムスコンの生産の出発基質として作用する（図１Ａ参照）。これらの遺伝子はホストにとって内在性であり得、ただしこれらの遺伝子の少なくとも１つ（いくつかの実施形態では、全て）は組換え体ホスト細胞内に導入される組換え体遺伝子であるということを、当業者は了解するであろう。
【０１０５】
１つの実施形態では、パルミチン酸からのヘキサデカン二酸の合成のために、ノルムスコン生産組換え体ホストはさらにシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子（配列番号１、４７、４８、５０、および５１；２１、４１、４２、４４、および４５）とシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子（配列番号２、４９、および５２；２２、４３、および４６）とを含む（図２〜６参照）。
【０１０６】
１つの実施形態では、ノルムスコン生産組換え体ホストは、さらに、ヘキサデカン二酸からヘキサデカン二酸ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばアシルＣｏＡシンテターゼ）（配列番号１３；３３）を含み得る（図７参照）。
【０１０７】
１つの実施形態では、ノルムスコン生産組換え体ホストは、さらに、内在的に発現されるアシルＣｏＡシンテターゼ（例えば脂肪酸活性化遺伝子１（Ｆａａ１）、脂肪酸活性化遺伝子４（Ｆａａ４）、脂肪酸輸送体（Ｆａｔ１）、脂肪酸輸送蛋白質２（ｆａｔ２ｐ））の過剰発現を含み得る。かかる内在性のＣｏＡシンテターゼの過剰発現は、ヘキサデカン二酸ＣｏＡなどのＣｏＡ活性化されたＤＣＡの増大した生産をもたらし得る。ｆａａ１およびｆａａ４はＣ１２−Ｃ１６鎖長からの選好性を有する長鎖脂肪酸アシルＣｏＡシンテターゼであり、ｆａｔ１はＣ２０よりも長い脂肪酸に対して選好性を有し、ｆａｔ２ｐは脂肪酸のベータ酸化に関わるアシルＣｏＡシンテターゼである（図１２参照）。
【０１０８】
別の実施形態では、ノルムスコン生産組換え体ホストは、ジカルボン酸からノルムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子を含み得る。
【０１０９】
１つの実施形態では、ノルムスコン生産組換え体ホストは、さらに、アセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ）（配列番号１９；３９）と；マロニルＣｏＡからパルミチン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えば脂肪酸シンターゼ）（配列番号５；２５）と；パルミチン酸からのヘキサデカン二酸の合成のためのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子（配列番号１、４７、４８、５０、および５１；２１、４１、４２、４４、および４５）およびシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子（配列番号２、４９、および５２；２２、４３、および４６）と；ジカルボン酸からノルムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子とを含み得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ノルムスコンおよび／またはノルムスコン前駆体は、ノルムスコン生合成経路上に見いだされる反応ができる１つ以上の酵素の組換え体ホストによる発現によってインビボで生産される。例えば、ノルムスコン生産組換え体ホストは、アセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（配列番号１９；３９））と；マロニルＣｏＡからパルミチン酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えば脂肪酸シンターゼ）と；パルミチン酸からのヘキサデカン二酸の合成のためのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子（配列番号１；２１）およびシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子（配列番号２；２２）と；ヘキサデカン二酸からのヘキサデカン二酸ＣｏＡの合成のためのアシルＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子（配列番号１３；３３）と；（Ｓ）−（＋）−３−メチルヘキサデカン酸からノルムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子とを発現する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ｌ−および／またはノルムスコンおよび／またはムスコン前駆体は、インビトロにおけるムスコン経路に関わる１つ以上の酵素とのムスコン前駆体の接触によって生産される。例えば、アシルＣｏＡシンターゼポリペプチドと３−メチルヘキサデカン二酸を接触させることは、インビトロの３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡの生産をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ムスコン前駆体は、インビトロにおけるムスコン経路に関わる１つ以上の酵素との上流のムスコン前駆体の接触によって生産される。例えば、２−メチル酪酸から２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチド（例えばアシルＣｏＡリガーゼ）と２−メチル酪酸を接触させることは、インビトロの２−メチルブチリルＣｏＡの生産をもたらし得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ｌ−および／またはノルムスコンおよび／またはムスコン前駆体は、インビトロにおけるムスコン経路に関わる１つ以上の酵素とのムスコン前駆体の接触によって生産される。例えば、ヘキサデカン二酸をアシルＣｏＡシンターゼポリペプチドと接触させることはインビトロのヘキサデカン二酸ＣｏＡの生産をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ムスコン前駆体は、インビトロにおけるムスコン経路に関わる１つ以上の酵素との上流のムスコン前駆体の接触によって生産される。例えば、パルミチン酸からヘキサデカン二酸を合成することができるポリペプチドのセット（例えばシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ／レダクターゼ）とパルミチン酸を接触させることは、インビトロのヘキサデカン二酸の生産をもたらし得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ｌ−および／またはノルムスコンまたはムスコン前駆体は全細胞バイオコンバージョンによって生産される。全細胞バイオコンバージョンが生起するためには、ｌ−ムスコンまたはノルムスコン生合成経路どちらかまたは両方に関わる１つ以上の酵素を発現するホスト細胞がムスコン前駆体を取り込み、細胞内で改変する；インビボの改変後に、ムスコンは細胞内に残り、および／または培養培地中に排出される。例えば、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ／レダクターゼ複合体ポリペプチドをコードする遺伝子を発現するホスト細胞がパルミチン酸を取り込み得る；インビボの酸化後に、ヘキサデカン二酸などのジカルボン酸が培養培地中に排出され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、改変されるべき基質を取り込むおよび／または改変された産物を排出するように透過処理される。別の例では、脂肪酸シンターゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現する組換え体ホスト細胞が（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを取り込み、１４−メチルヘキサデカン酸を合成し得る；インビトロの合成後に、１４−メチルヘキサデカン酸または別のアンテイソ脂肪酸が細胞培養培地中に排出され得る。それから、透過処理された組換え体ホスト細胞が細胞培養培地に追加されて、さらに改変されるべき排出されたアンテイソ脂肪酸を取り込み、さらに改変された産物を排出し得る。
【０１１４】
例えば、アシルＣｏＡシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現するホスト細胞が３−メチルヘキサデカン二酸を取り込み、細胞内の３−メチルヘキサデカン二酸を活性化し得る；インビボの活性化後に、細胞は、改変されるべき基質を取り込むかまたは改変された産物を排出するように透過処理される。別の例では、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現する組換え体ホスト細胞がパルミチン酸を取り込み、細胞内のパルミチン酸を酸化し得る；インビボでの酸化後に、ヘキサデカン二酸が細胞培養培地中に排出され得る。いくつかの実施形態では、ムスコンまたはムスコン前駆体は、インビボにおけるｌ−またはノルムスコン経路どちらかに関わる１つ以上の酵素との上流のムスコン前駆体の接触によって生産される。例えば、２−メチル酪酸から２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチド（例えばアシルＣｏＡリガーゼ）と２−メチル酪酸を接触させることは、インビボの２−メチルブチリルＣｏＡの生産をもたらし得る。それから、透過処理された組換え体ホスト細胞が細胞培養培地に追加されて、さらに改変されるべき排出されたムスコン前駆体を取り込み、さらに改変された産物を排出し得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ムスコン、シベトン、および／またはその１つ以上の前駆体が２つ以上のホストの共培養によって生産される。いくつかの実施形態では、ｌ−および／またはノルムスコン生合成経路に関わる１つ以上の酵素をそれぞれが発現する１つ以上のホストが、ムスコンおよび１つ以上のムスコン前駆体を生産する。例えば、ホストは、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばトランスアミナーゼ（例えば分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ１／ＢＡＴ２））（配列番号１４または１５；３４または３５）と、（Ｓ）−３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばトランスアミノ化アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＲＯ１０））（配列番号１６；３６）と；（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ２／ＡＬＤ５））（配列番号１７または１８；３７または３８）と；（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばＣｏＡリガーゼ）（配列番号３または４；２３または２４）と；２−メチルブチリルＣｏＡからモノメチル分岐鎖脂肪酸を合成し得るポリペプチドをコードする遺伝子（例えば脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）（配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、または１２；２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２）と；モノメチル分岐鎖脂肪酸からジカルボン酸への酸化のためのポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（配列番号１、４７、４８、５０、および５１；２１、４１、４２、４４、および４５）、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（配列番号２、４９、および５２；２２、４３、および４６））と；ジカルボン酸を活性化してジカルボン酸ＣｏＡ分子を生産することができるポリペプチドをコードする遺伝子（例えばアシルＣｏＡシンターゼ）（配列番号１３；３３）と；ジカルボン酸からノルムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子とを含む。
【０１１６】
機能的なホモログ
上に記載されているポリペプチドの機能的なホモログもまた、組換え体ホストによってムスコン、シベトン、および／またはその前駆体を生産することへの使用に好適である。機能的なホモログは、参照ポリペプチドに対する配列類似性を有し、かつ参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能（単数または複数）の１つ以上を実行するポリペプチドである。機能的なホモログおよび参照ポリペプチドは天然の存在するポリペプチドであり得、配列類似性は収斂または分岐進化的事象が原因であり得る。そのため、機能的なホモログは場合によっては文献中ではホモログまたはオーソログまたはパラログと呼称される。天然に存在する機能的なホモログのバリアント、例えば野生型コード配列の変異体によってコードされるポリペプチドは、それら自体が機能的なホモログであり得る。機能的なホモログは、ポリペプチドのコード配列の部位特異的変異導入によって、または異なる天然に存在するポリペプチドのコード配列からのドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）によってもまた作り出され得る。本明細書に記載される機能的なポリペプチドをコードする遺伝子を改変するための技術は公知であり、とりわけ、指向的進化技術、部位特異的変異導入技術、およびランダム変異導入技術を包含し、所望の様式でポリペプチドの比活性を増大させるか、基質特異性を変えるか、発現レベルを変えるか、細胞内の所在を変えるか、またはポリペプチド−ポリペプチド相互作用を改変するために有用であり得る。かかる改変されたポリペプチドは機能的なホモログと考えられる。場合によっては、用語「機能的なホモログ」は機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。
【０１１７】
機能的なホモログはヌクレオチドおよびポリペプチド配列アラインメントの分析によって同定され得る。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースに対してクエリを行うことは、ムスコン前駆体生合成ポリペプチドのホモログを同定し得る。配列分析には、ＵＧＴアミノ酸配列を参照配列として用いる非冗長データベースのＢＬＡＳＴ、レシプロカルＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ分析が関わり得る。いくつかの事例では、アミノ酸配列はヌクレオチド配列から推測される。４０％よりも多大な配列同一性を有するデータベース中のポリペプチドは、ムスコン前駆体生合成ポリペプチドとしての好適性についてのさらなる評価のための候補である。アミノ酸配列類似性は、保存的なアミノ酸置換、例えば１つの疎水性残基の別のものからの置換または１つの極性残基の別のものからの置換を許す。所望の場合には、さらに評価されるべき候補の数を狭めるために、かかる候補の手動検査が実行され得る。ムスコン生合成ポリペプチドに存在するドメイン、例えば保存された機能的なドメインを有するように見える候補を選択することによって、手動検査が行われ得る。いくつかの実施形態では、核酸およびポリペプチドは、ＢＬＡＳＴ分析を用いることによるよりもむしろ発現レベルに基づくトランスクリプトームデータから同定される。
【０１１８】
保存された領域は、繰り返し配列であるか、何らかの二次構造（例えばヘリックスおよびベータシート）を形成するか、正もしくは負荷電のドメインを確立するか、または蛋白質モチーフもしくはドメインにあたるムスコン生合成ポリペプチドの一次アミノ酸配列中の領域を位置づけることによって同定され得る。例えば、sanger.ac.uk/Software/Pfam/およびpfam.janelia.org/において、ワールドワイドウェブ上の様々な蛋白質モチーフおよびドメインについてコンセンサス配列を記載しているＰｆａｍウェブサイト参照。Ｐｆａｍデータベースに包含される情報はソンハンマー（Sonnhammer）ら著，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），第２６巻：ｐ．３２０−３２２（１９９８年）；ソンハンマー（Sonnhammer）ら著，プロテインズ（Proteins），第２８巻：ｐ．４０５−４２０（１９９７年）；およびベイトマン（Bateman）ら著，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），第２７巻：ｐ．２６０−２６２（１９９９年）に記載されている。保存された領域は、近縁種からの同じまたは関連ポリペプチドの配列をアラインメントすることによってもまた決定され得る。近縁種は好ましくは同じファミリーからである。いくつかの実施形態では、２つの異なる種からの配列のアラインメントはかかるホモログを同定するために充分である。
【０１１９】
典型的には、保存された領域を同定するためには、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を見せるポリペプチドが有用である。関連ポリペプチドの保存された領域同士は少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性を見せる（例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）。いくつかの実施形態では、保存された領域は少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を見せる。
【０１２０】
例えば、組換え体ホストによってムスコン（例えばｌ−およびノル）ならびに／またはｌ−およびノルムスコン前駆体を生産するための好適なポリペプチドはシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの機能的なホモログを包含する。
【０１２１】
例えばシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質特異性を改変するための方法は当業者には公知であり、限定なしに、部位特異的／理論的変異導入アプローチ、指向的ランダム進化アプローチ、およびランダム変異導入／飽和技術が酵素の活性部位の近くで行われる組み合わせを包含する。
【０１２２】
典型的には、候補配列は、参照配列の長さの８０％から２５０％、例えば参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０％である長さを有する。典型的には、機能的なホモログポリペプチドは、参照配列の長さの９５％から１０５％、例えば参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、もしくは１２０％、または間のいずれかの範囲である長さを有する。参照核酸またはポリペプチドに対して相対的ないずれかの候補核酸またはポリペプチドの％配列同一性は、次の通り決定され得る。コンピュータプログラムＣｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａ（バージョン１．２．１、デフォルトパラメータ）を用いて、参照配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列またはアミノ酸配列）が１つ以上の候補配列に対してアラインメントされ、これは核酸またはポリペプチド配列のアラインメントがそれらの全長に渡って実行されることを許す（グローバルアラインメント）。チェナ（Chenna）ら著，２００３年，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）第３１巻（１３）：ｐ．３４９７−５００。
【０１２３】
Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａは、同一性、類似性、および違いが決定され得るように、参照と１つ以上の候補配列との間のベストマッチを計算し、それらをアラインメントする。配列アラインメントを最大化するために、１残基以上のギャップが参照配列、候補配列、または両方の中に挿入され得る。核酸配列の高速ペアワイズアラインメントでは、次のデフォルトパラメータが用いられる：ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；スコア方法：パーセンテージ；トップダイアゴナル数：４；およびギャップペナルティー：５。核酸配列のマルチプルアラインメントでは、次のパラメータが用いられる：ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：５．０；およびトランジション重み：イエス。蛋白質配列の高速ペアワイズアラインメントでは、次のパラメータが用いられる：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；スコア方法：パーセンテージ；トップダイアゴナル数：５；ギャップペナルティー：３。蛋白質配列のマルチプルアラインメントでは、次のパラメータが用いられる：重み行列：ｂｌｏｓｕｍ；ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；残基特異的ギャップペナルティー：オン。Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａ出力は配列間の関係を反映する配列アラインメントである。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａはワールドワイドウェブ上のベイラー医科大学検索ランチャーサイト（searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html）上およびhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/の欧州バイオインフォマティクス研究所サイト上で走らせられ得る。
【０１２４】
参照配列に対する候補核酸またはアミノ酸配列の％配列同一性を決定するためには、配列はＣｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａを用いてアラインメントされ、アラインメント中の同一のマッチの数が参照配列の長さによって除算され、結果が１００によって乗算される。％配列同一性値は小数第１位に丸められ得るということが指摘される。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は７８．１に丸められ、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は７８．２に丸められる。
【０１２５】
機能的なＣｏＡリガーゼ、ＦＡＳ、およびシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ／レダクターゼ蛋白質は、酵素によって実行される酵素活性に関わらない追加のアミノ酸を包含し得るということは了解されるであろう。いくつかの実施形態では、ＣｏＡリガーゼ、ＦＡＳ、およびシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ／レダクターゼ蛋白質は融合蛋白質である。用語「キメラ」、「融合ポリペプチド」、「融合蛋白質」、「融合酵素」、「融合構築物」、「キメラ蛋白質」、「キメラポリペプチド」、「キメラ構築物」、および「キメラ酵素」は、本明細書においては、異なる蛋白質をコードする２つ以上の遺伝子の連結によって人工される蛋白質を言うために交換可能に用いられ得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、キメラ酵素は、第１のポリペプチド蛋白質ＡのＣ末端を第２のポリペプチド蛋白質ＢのＮ末端にリンカー「ｂ」を介して連結すること、すなわち「蛋白質Ａ−ｂ−蛋白質Ｂ」によって構築される。いくつかの態様では、キメラ酵素のリンカーはアミノ酸配列「ＫＬＶＫ」であり得る。いくつかの態様では、キメラ酵素のリンカーはアミノ酸配列「ＲＡＳＳＴＫＬＶＫ」であり得る。いくつかの態様では、キメラ酵素のリンカーはアミノ酸配列「ＧＧＧＧＳ」であり得る。いくつかの態様では、キメラ酵素のリンカーはアミノ酸配列「ＧＧＧＧＳ」の２つの繰り返し（すなわち「ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」）であり得る。いくつかの態様では、キメラ酵素のリンカーはアミノ酸配列「ＧＧＧＧＳ」の３つの繰り返しであり得る。いくつかの態様では、キメラ酵素のリンカーは第１のポリペプチドのＣ末端と第２のポリペプチドのＮ末端との間の直接的な結合である。いくつかの実施形態では、キメラ酵素は、第１のポリペプチド蛋白質ＡのＣ末端を第２のポリペプチド蛋白質ＢのＮ末端にリンカー「ｂ」を介して連結すること、すなわち「蛋白質Ａ−ｂ−蛋白質Ｂ」によって、かつ第２のポリペプチド蛋白質ＢのＣ末端を第３のポリペプチド蛋白質ＣのＮ末端に第２のリンカー「ｄ」を介して連結すること、すなわち「蛋白質Ａ−ｂ−蛋白質Ｂ−ｄ−蛋白質Ｃ」によって構築される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼまたはアシルＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、コードされるポリペプチドの爾後の操作（例えば、精製または検出を容易化するように）、可溶性、分泌、または局在を容易化するように設計された「タグ」をコードするタグ配列を包含し得る。コードされるタグがポリペプチドのカルボキシまたはアミノ末端どちらかに位置づけられるように、タグ配列はポリペプチドをコードする核酸配列中に挿入され得る。コードされるタグの限定しない例は、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ）、ジスルフィドオキシドレダクターゼ（ＤｓｂＡ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、Ｎ利用物質（ＮｕｓＡ）、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、およびＦｌａｇ（商標）タグ（コダック（Kodak），ニューヘイブン，コネチカット州）を包含する。タグの他の例は葉緑体トランジットペプチド、ミトコンドリアトランジットペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、または分泌タグを包含する。いくつかの実施形態では、タグがポリペプチドに取り付けられる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、融合蛋白質はドメインスワッピングによって変えられた蛋白質である。本明細書において用いられる用語「ドメインスワッピング」は、第１の蛋白質のドメインを第２の蛋白質のドメインによって置き換えるプロセスを記載するために用いられる。いくつかの実施形態では、第１の蛋白質のドメインおよび第２の蛋白質のドメインは機能的に同一または機能的に類似である。いくつかの実施形態では、第２の蛋白質のドメインの構造および／または配列は第１の蛋白質のドメインの構造および／または配列とは異なる。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼまたはアシルＣｏＡリガーゼポリペプチドがドメインスワッピングによって変えられる。
【０１２９】
大環状ケトンおよび大環状ケトン前駆体生合成核酸
本明細書に記載されるポリペプチドをコードする組換え体遺伝子は、ポリペプチドを発現することにとって好適な１つ以上の制御領域にセンスの向きで作動可能に連結されたそのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物は複数の遺伝子産物をポリシストロン性ｍＲＮＡから発現することができるので、それらの微生物では、所望の場合には、複数のポリペプチドが単一の制御領域のコントロール下で発現され得る。制御領域が配列の転写または翻訳を制御するために有効であるように制御領域およびコード配列が位置するときには、コード配列および制御領域は作動可能に連結されていると考えられる。典型的には、コード配列の翻訳読み枠の翻訳開始部位はモノシストロン性遺伝子の制御領域の下流の１および約５０ヌクレオチドの間に位置する。
【０１３０】
多くのケースでは、本明細書に記載されるポリペプチドのコード配列は組換え体ホスト以外の種において同定され、すなわち異種核酸である。それゆえに、組換え体ホストが微生物である場合には、コード配列は他の原核もしくは真核微生物、植物、または動物からであり得る。しかしながら、いくつかのケースでは、コード配列は、ホストにとって生得であり、かつその生物内に再導入されようとする配列である。多くの場合には、生得の配列は、外来性の核酸に連結された非天然配列、例えば組換え体核酸構築物中において生得の配列をフランキングしている生得ではない制御配列の存在によって、天然に存在する配列から見分けられ得る。加えて、典型的には、安定に形質転換された外来性の核酸は生得の配列が見いだされる位置以外の位置にインテグレーションされる。「制御領域」は、転写または翻訳開始および速度ならびに転写または翻訳産物の安定性および／または移動性に影響するヌクレオチド配列を有する核酸を言う。制御領域は、限定なしに、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、蛋白質認識部位、誘導性エレメント、蛋白質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、およびそれらの組み合わせを包含する。典型的には、制御領域は少なくともコア（基本）プロモーターを含む。制御領域は、少なくとも１つのコントロールエレメント、例えばエンハンサー配列、上流エレメント、または上流活性化領域（ＵＡＲ）をもまた包含し得る。制御領域が配列の転写または翻訳を制御するために有効であるように制御領域およびコード配列を位置させることによって、制御領域はコード配列に作動可能に連結される。例えば、典型的には、コード配列およびプロモーター配列を作動可能に連結するためには、コード配列の翻訳読み枠の翻訳開始部位はプロモーターの下流の１および約５０ヌクレオチドの間に位置する。しかしながら、制御領域は、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチド上流にまたは転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流にまでも位置し得る。
【０１３１】
包含されるべき制御領域の選択肢はいくつかの因子に依存し、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および一定の培養ステージにおける選好的発現を包含するが、これらに限定されない。コード配列に対して相対的に制御領域を適当に選択することおよび位置させることによってコード配列の発現を調節することは、当業者にとっては慣行的事項である。１つよりも多くの制御領域、例えばイントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーター、および誘導性エレメントが存在し得るということは理解されるであろう。
【０１３２】
１つ以上の遺伝子が、（ｌ−およびノル）ムスコンならびに（ｌ−およびノル）ムスコン前駆体生産の個別の態様にとって有用な「モジュール」としてある組換え体核酸構築物へと組み合わせられ得る。複数の遺伝子をあるモジュール、特にポリシストロン性モジュールへと組み合わせることは、様々な種へのモジュールの使用を容易化する。例えば、好適な制御領域の挿入後に、モジュールが幅広い様々な種に導入され得るように、ｌ−ムスコン前駆体生合成遺伝子クラスターがあるポリシストロン性モジュールへと組み合わせられ得る。別の例としては、各アシルＣｏＡコード配列は別個の制御領域に作動可能に連結されてアシルＣｏＡモジュールを形成するように、アシルＣｏＡ遺伝子クラスターが組み合わせられ得る。かかるモジュールは、モノシストロン性発現が必要であるかまたは望ましい種に用いられ得る。（ｌ−およびノル）ムスコンおよび（ｌ−およびノル）ムスコン前駆体生産に有用な遺伝子に加えて、典型的には、組換え体構築物は適当な種における構築物の維持のための複製起点および１つ以上の選択可能なマーカーをもまた含有する。
【０１３３】
遺伝子コードの縮重ゆえに、いくつもの核酸がある特定のポリペプチドをコードし得るということは了解されるであろう；すなわち、多くのアミノ酸では、アミノ酸のコドンとしての用をなす１つよりも多くのヌクレオチドトリプレットがある。それゆえに、特定のホストによる最適な発現が得られるように、そのホスト（例えば微生物）の適当なコドンバイアス表を用いて、所与のポリペプチドのコード配列中のコドンは改変され得る。単離された核酸として、これらの改変された配列は精製された分子として存在し得、組換え体核酸構築物のためのモジュールを構築することへの使用のためのベクターまたはウイルス中に組み込まれ得る。
【０１３４】
いくつかのケースでは、代謝中間体をムスコンまたはムスコン前駆体生合成の方へ導くために、内在性のポリペプチドの１つ以上の機能を阻害することが望ましい。例えば、ムスコンまたはムスコン前駆体生産をさらに増大させるために、例えばスクアレンエポキシダーゼを下方制御することによって、酵母株によるステロールの合成を下方制御することが望ましくあり得る。別の例としては、本明細書において論じられている通り、一定の内在性の遺伝子産物、例えば二次代謝物質からグルコース部分を取り除くグリコヒドロラーゼまたはホスファターゼの分解機能を阻害することが望ましくあり得る。かかるケースでは、ポリペプチドまたは遺伝子産物を過剰発現する核酸が、株に形質転換される組換え体構築物中に包含され得る。代替的には、機能を増大または向上させることが所望である遺伝子の変異体を作出するために、変異導入が用いられ得る。
【０１３５】
大環状ケトン組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え体ホスト細胞および方法は大環状ケトンおよび大環状ケトン前駆体の組成物を提供し得、組成物中の大環状ケトンの相対レベルは組換え体ホスト細胞中の大環状ケトンの相対レベルに対応し、例えば、組成物中の大環状ケトンの相対レベルは組換え体ホスト細胞中の大環状ケトンの相対レベルから１０％、または９％、または８％、または７％、または６％、または５％、または４％、または３％、または２％、または１％以内である。
【０１３６】
蓄積した個々の大環状ケトン（例えばｌ−ムスコン、ノルムスコン、またはシベトン）の量は、約１から約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約１から約１０ｍｇ／Ｌ、約３から約１０ｍｇ／Ｌ、約５から約２０ｍｇ／Ｌ、約１０から約５０ｍｇ／Ｌ、約１０から約１００ｍｇ／Ｌ、約２５から約５００ｍｇ／Ｌ、約１００から約１，５００ｍｇ／Ｌ、または約２００から約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約少なくとも１，４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，６００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，８００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２，８００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌであり得る。いくつかの態様では、個々の大環状ケトン（例えばｌ−ムスコン、ノルムスコン、またはシベトン）の量は７，０００ｍｇ／Ｌを超え得る。蓄積した大環状ケトンの組み合わせ（例えばｌ−ムスコン、ノルムスコン、およびシベトン）の量は、約１ｍｇ／Ｌから約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば約２００から約１，５００、少なくとも約２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６，０００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌであり得る。いくつかの態様では、大環状ケトンの組み合わせの量は７，０００ｍｇ／Ｌを超え得る。一般的に、より長い培養時間はより多大な量の産物に至るであろう。それゆえに、組換え体微生物は１日から７日、１日から５日、３日から５日、約３日、約４日、または約５日に渡って培養され得る。
【０１３７】
本明細書において論じられる様々な遺伝子およびモジュールは、単一の微生物よりもむしろ２つ以上の組換え体微生物に存在し得るということは了解されるであろう。複数の組換え体微生物が用いられるときには、それらは混合培養によって増殖させられてムスコンおよび／またはムスコン前駆体を生産し得る。例えば、第１の微生物はムスコン前駆体を生産するための１つ以上の生合成遺伝子を含み得、第２の微生物はムスコン生合成遺伝子を含む。それから、第２のまたは最後の微生物によって生産された産物は回収される。いくつかの実施形態では、組換え体微生物は、培養培地以外の栄養源を用いて、発酵器以外の系を利用して増殖させられるということもまた了解されるであろう。
【０１３８】
本明細書において開示される方法によって得られる大環状ケトンおよび組成物はフレグランス組成物を作るために用いられ得る。
【０１３９】
例えば、ｌ−ムスコンおよびノルムスコンなどの実質的に大環状のケトンがフレグランス中に包含され得る。大環状ケトンの混合物は、それぞれが大環状ケトンまたは大環状ケトン前駆体を生産する組換え体微生物を別個に培養することと、大環状ケトンまたは大環状ケトン前駆体を各微生物から回収することと、それから化合物を組み合わせて各化合物を所望の割合で含む混合物を得ることとによって作られ得る。
【０１４０】
代替的には、２つ以上の微生物はそれぞれが別個の培養培地によって増殖させられ得、第１の培養培地の産物、例えばヘキサデカン二酸が第２の培養培地中に導入されて、爾後の中間体へと、または大環状ケトン、ｌ−ムスコン、ノルムスコン、もしくはシベトンなどの最終産物へと変換され得る。それから、第２のまたは最後の微生物によって生産された産物は回収される。いくつかの実施形態では、組換え体微生物は、培養培地以外の栄養源を用いて、発酵器以外の系を利用して増殖させられるということもまた了解されるであろう。
【０１４１】
ホスト微生物
植物内で増殖させられる植物細胞を含む植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞を包含するがこれらに限定されない組換え体ホストが、ムスコン、シベトン、および／またはそれらの前駆体の生産のためのポリペプチドを発現するために用いられ得る。
【０１４２】
いくつもの原核生物および真核生物、例えばグラム陰性細菌、酵母、および真菌もまた、本明細書に記載される組換え体微生物を構築することへの使用にとって好適である。ムスコン生産株としての使用のために選択される種および株は、第１に、どの生産遺伝子が株にとって内在性であるか、およびどの遺伝子が存在しないかを決定するために分析される。有利には、欠けている機能（単数または複数）を供給するために、内在性のカウンターパートが株中に存在しない遺伝子が１つ以上の組換え体構築物としてアセンブリされ、これらがそれから株に形質転換される。
【０１４３】
典型的には、組換え体微生物は発酵器によってある温度（単数または複数）である期間に渡って増殖させられ、温度および期間はムスコンの生産を容易化する。本発明によって提供される構築および遺伝子操作された微生物は従来の発酵プロセスを用いて培養され得、とりわけケモスタット、バッチ、フェッドバッチ培養、半連続発酵、例えばドロー・アンド・フィル、連続灌流発酵、ならびに連続灌流細胞培養を包含する。方法に用いられる特定の微生物に依存して、（ｌ−およびノル）ムスコン生合成遺伝子などの他の組換え体遺伝子もまた存在しかつ発現され得る。基質および中間体、例えば（Ｓ）−メチルブチリルＣｏＡ、パルミチン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、およびヘキサデカン二酸のレベルは、公開された方法に従って分析のために培養培地からサンプルを抽出することによって決定され得る。
【０１４４】
本方法への使用の炭素源は、増殖ならびに／またはムスコンおよび／もしくはムスコン前駆体の生産を容易化するために組換え体ホスト細胞によって代謝され得るいずれかの分子を包含する。好適な炭素源の例は、スクロース（例えばモラセスに見いだされる通り）、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、グルコース、セルロース、澱粉、セロビオース、または他のグルコース含有ポリマーを包含するが、これらに限定されない。例えば、酵母をホストとして採用する実施形態では、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、およびグルコースなどの炭素源が好適である。炭素源は培養期間に渡ってホスト生物に提供され得るか、または代替的には、生物はある期間に渡って別のエネルギー源、例えば蛋白質の存在下で増殖させられ、それからフェッドバッチ相においてのみ炭素源を提供され得る。
【０１４５】
温度および期間がムスコンおよび／またはムスコン前駆体の生産を容易化し、組換え体微生物が期間に渡って培養によって増殖させられた後に、それらは当分野において公知の様々な技術を用いて培養物から回収され得る。いくつかの実施形態では、透過処理剤が追加されて、フィードストックがホストに入ることおよび産物が出ることを支援し得る。例えば、上清を得るために、培養された微生物のクルードなライセートが遠心され得る。それから、もたらされた上清はクロマトグラフィーカラム、例えばＣ−１８カラムにかけられ、水によって洗浄されて親水性化合物を取り除き、次にメタノールなどの溶媒による目当ての化合物（単数または複数）の溶出をし得る。それから、化合物（単数または複数）は分取ＨＰＬＣによってさらに精製され得る。
【０１４６】
本明細書において論じられる様々な遺伝子およびモジュールは単一のホストよりもむしろ２つ以上の組換え体ホストに存在し得るということは了解されるであろう。複数の組換え体ホストが用いられるときには、それらは混合培養によって増殖させられてムスコンおよび／またはムスコン前駆体を蓄積し得る。
【０１４７】
代替的には、２つ以上のホストは別個の培養培地によってそれぞれ増殖させられ得、第１の培養培地の産物、例えば１４−メチルヘキサデカン酸が第２の培養培地中に導入されて、爾後の中間体へと、または例えば３−メチルヘキサデカン二酸などの最終産物へと変換され得る。それから、第２のまたは最後のホストによって生産された産物は回収される。いくつかの実施形態では、組換え体ホストは、培養培地以外の栄養源を用いて、発酵器以外の系を利用して増殖させられるということもまた了解されるであろう。
【０１４８】
例示的な原核および真核種が下により詳細に記載される。しかしながら、（ｌ−およびノル）ムスコンおよび／または（ｌ−およびノル）ムスコン前駆体を生産するためのポリペプチドを発現するためには、他の種が好適であり得るということは了解されるであろう。例えば、好適な種は、アガリクス（Agaricus）、アスペルギルス（Aspergillus）、バシラス（Bacillus）、カンジダ（Candida）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、エレモテシウム（Eremothecium）、エスケリキア（Escherichia）、フザリウム（Fusarium）／ジベレラ（Gibberella）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、ラエティポルス（Laetiporus）、レンチヌス（Lentinus）、ファフィア（Phaffia）、ファネロケーテ（Phanerochaete）、ピキア（Pichia）（正式にはハンゼヌラ（Hansuela）として公知）、シェフェルソマイセス（Scheffersomyces）、フィスコミトレラ（Physcomitrella）、ロドトルラ（Rhodoturula）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、スキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、スファセロマ（Sphaceloma）、キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）、フミコラ（Humicola）、イサチェンキア（Issatchenkia）、ブレタノマイセス（Brettanomyces）、ヤマダザイマ（Yamadazyma）、ラカンセア（Lachancea）、ザイゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）、コマガタエラ（Komagataella）、カザフスタニア（Kazachstania）、キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）、ジオトリカム（Geotrichum）、ブラケスレア（Blakeslea）、ドナリエラ（Dunaliella）、ヘマトコッカス（Haematococcus）、クロレラ（Chlorella）、ウンダリア（Undaria）、サルガッスム（Sargassum）、ラミナリア（Laminaria）、セネデスムス（Scenedesmus）、パキソレン（Pachysolen）、トリコスポロン（Trichosporon）、アクレモニウム（Acremonium）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、コリナスカス（Corynascus）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、フィロバシディウム（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、マグナポルテ（Magnaporthe）、モナスカス（Monascus）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、モルティエレラ（Mortierella）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピロミセス（Piromyces）、パキソレン（Pachysolen）、ファネロケーテ（Phanerochaete）、ポドスポラ（Podospora）、ピクノポラス（Pycnoporus）、リゾプス（Rhizopus）、スキゾフィラム（Schizophyllum）、ソルダリア（Sordaria）、タラロマイセス（Talaromyces）、ラサムソニア（Rasmsonia）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、クロエケラ（Kloeckera）、パキソレン（Pachysolen）、シュワニオマイセス（Schwanniomyces）、トラメテス（Trametes）、トリコデルマ（Trichoderma）、アシネトバクター（Acinetobacter）、ノカルディア（Nocardia）、キサントバクター（Xanthobacter）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、エルウィニア（Erwinia）、クレブシエラ（Klebsiella）、セラチア（Serratia）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、クロロフレクサス（Choroflexus）、クロロネマ（Chloronema）、クロロビウム（Chlorobium）、ペロディクティオン（Pelodictyon）、クロマチウム（Chromatium）、ロドスピリルム（Rhodespirillum）、ロドバクター（Rhodobacter）、ロドミクロビウム（Rhodomicrobium）、またはヤロウィア（Yarrowia）などの属であり得る。
【０１４９】
かかる属からの例示的な種は、レンチヌス・チグリヌス（Lentinus tigrinus）、ラエティポルス・スルフレウス（Laetiporus sulphureus）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・クドリアブゼビ（Pichia kudriavzevii）、シベルリンドネラ・ジャディニ（Cyberlindnera jadinii）、フィスコミトレラ・パテンス（Physcomitrella patens）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodoturula glutinis）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（Rhodoturula mucilaginosa）、ファフィア・ロドザイマ（Phaffia rhodozyma）、キサントフィロマイセス・デンドロルス（Xanthophyllomyces dendrorhous）、イサチェンキア・ オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansuela polymorpha）、ブレタノマイセス・アノマルス（Brettanomyces anomalus）、ヤマダザイマ・フィロガエア（Yamadazyma philogaea）、フザリウム・フジクロイ（Fusarium fujikuroil）／ジベレラ・フジクロイ（Gibberella fujikuroi）、カンジダ・ユティリス（Candida utilis）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、カンジダ・クルーセイ（Candida krusei）、カンジダ・レブカウフィ（Candida revkaufi）、カンジダ・プルケリマ（Candida pulcherrima）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）、アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、ラサムソニア・エメルソニ（Rasamsonia emersonii）（過去にはタラロマイセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）として公知）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Chrysosporium lucknowense）、ミセリオフトラ・サーモフィリア（Myceliophtora thermophyla）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillius licheniformis）、バシラス・プンティス（Bacillus puntis）、バシラス・メガテリウム（Bacillius megaterium）、バシラス・ハロデュランス（Bacillius halofurans）、バシラス・プミルス（Baciilius punilus）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcessans）、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、ブラケスレア・トリスポラ（Blakeslea trispora）、ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、クロレラ（Chlorella）ｓｐ．、ウンダリア・ピンナティフィダ（Undaria pinnatifida）、サルガッスム（Sargassum）、ラミナリア・ジャポニカ（Laminaria japonica）、セネデスムス・アルメリエンシス（Scenedesmus almeriensis）、サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）、クロロフレクサス・アウランティアクス（Choroflexus aurantiacus）、クロロネマ・ギガンテウム（Chloronema gigateum）、クロロ���ウム・リミコーラ（Chlorobium limicola）、ペロディクティオン・ルテオルム（Pelodictyon luteolum）、クロマチウム・オケニ（Chromatium okenii）、ロドスピリルム・ルブルム（Rhodespirillum rubrum）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter spaeroides）、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドミクロビウム・バネリ（Rhodomicrobium vanellii）、パキソレン・タンノフィラス（Pachysolen tannophilus）、トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii）、およびヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）を包含する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、微生物は、原核生物、例えばエスケリキア（Escherichia）細菌細胞、例えばエスケリキア・コーライ（Escherichia coli）細胞；ラクトバシラス（Lactobacillus）細菌細胞；ラクトコッカス（Lactococcus）細菌細胞；コリネバクテリウム（Cornebacterium）細菌細胞；アセトバクター（Acetobacter）細菌細胞； アシネトバクター（Acinetobacter）細菌細胞；またはシュードモナス（Pseudomonas）細菌細胞であり得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、微生物は、藻類細胞、例えばブラケスレア・トリスポラ（Blakeslea trispora）、ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、クロレラ（Chlorella）ｓｐ．、ウンダリア・ピンナティフィダ（Undaria pinnatifida）、サルガッスム（Sargassum）、ラミナリア・ジャポニカ（Laminaria japonica）、セネデスムス・アルメリエンシス（Scenedesmus almeriensis）種であり得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、微生物は、アクレモニウム（Acremonium）、アークスラ（Arxula）、アガリクス（Agaricus）、アスペルギルス（Aspergillus）、アガリクス（Agaricus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブレタノマイセス（Brettanomyces）、カンジダ（Candida）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、コリナスカス（Corynascus）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、デバリオマイセス（Debaromyces）、フィロバシディウム（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、ジベレラ（Gibberella）、フミコラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、モナスカス（Monascus）、ムコール（Mucor）、ミセリオフトラ（Myceliophthora）、モルティエレラ（Mortierella）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピロミセス（Piromyces）、ファネロケーテ（Phanerochaete）、ポドスポラ（Podospora）、ピクノポラス（Pycnoporus）、リゾプス（Rhizopus）、スキゾフィラム（Schizophyllum）、スキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、ソルダリア（Sordaria）、シェフェルソマイセス（Scheffersomyces）、タラロマイセス（Talaromyces）、ロドトルラ（Rhodotorula）、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）、ラサムソニア（Rasmsonia）、ザイゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリコスポロン（Trichosporon）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、およびトリコデルマ（Trichoderma）を包含するがこれらに限定されない属からの真菌であり得る。真菌種は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）、アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、ラサムソニア・エメルソニ（Rasamsonia emersonii）（過去にはタラロマイセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）として公知）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Chrysosporium lucknowense）、ミセリオフトラ・サーモフィリア（Myceliophtora thermophyla）を包含するが、これらに限定されない。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、微生物は、子嚢菌、例えばジベレラ・フジクロイ（Gibberella fujikuroi）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、スキゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ジオトリカム（Geotrichum）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、アシュビア・ゴシピ（Ashbya gossypii）、ヤマダザイマ・フィロガエア（Yamadazyma philogaea）、ラカンセア・クルイベリ（Lachancea kluyveri）、コダマエア・オーメリ（Kodamaea ohmeri）、またはＳ．セレビシエ（cerevisiae）であり得る。
【０１５４】
アガリクス（Agaricus）、ジベレラ（Gibberella）、およびファネロケーテ（Phanerochaete）ｓｐｐ．
アガリクス（Agaricus）、ジベレラ（Gibberella）、およびファネロケーテ（Phanerochaete）ｓｐｐ．は可食の組成物の生産に普通に用いられる真菌属である。
【０１５５】
アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）（ブラストボトリス・アデニニボランス（Blastobotrys adeninivorans））
アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）は二形性酵母であり（それは最高で４２℃の温度まではパン酵母のような出芽酵母として増殖し、この閾値よりも上では、それは糸状形態で増殖する）、珍しい生化学的特徴を有する。それは幅広い範囲の基質によって増殖し得、硝酸を同化し得る。それは、天然プラスチックを生産し得る株の作出または環境サンプル中のエストロゲンのバイオセンサーの開発に首尾よく適用されている。
【０１５６】
ロドトルラ（Rhodotorula）ｓｐ．
ロドトルラ（Rhodotorula）は有色の単細胞酵母である。油脂赤色酵母ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）はクルードなグリセロールから脂質およびカロテノイドを生産することが示されている（ゼンゲ（Saenge）ら著，２０１１年，プロセス・バイオケミストリー（Process Biochemistry）第４６巻（１）：ｐ．２１０−８）。ロドトルラ・トルロイデス（Rhodotorula toruloides）株は改善されたバイオマスおよび脂質生産性のための効率的なフェッドバッチ発酵系であることが示されている（リー（Li）ら著，２００７年，エンザイム・アンド・マイクロバイアルテクノロジー（Enzyme and Microbial Technology）第４１巻：ｐ．３１２−７）。
【０１５７】
スキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）ｓｐｐ．
スキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）は分裂酵母の属である。Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）に類似に、スキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）は真核細胞生物学の研究のモデル生物である。それはＳ．セレビシエ（cerevisiae）に対する進化距離比較を提供する。種はＳ．クリオフィルス（cryophilius）およびＳ．ポンベ（pombe）を包含するが、これらに限定されない（ホフマン（Hoffman）ら著，２０１５年，ジェネティクス（Genetics）第２０１巻（２）：ｐ．４０３−２３参照）。
【０１５８】
フミコラ（Humicola）ｓｐｐ．
フミコラ（Humicola）は糸状菌の属である。種はＨ．アロパロネラ（alopallonella）およびＨ．シアメンシス（siamensis）を包含するが、これらに限定されない。
【０１５９】
ブレタノマイセス（Brettanomyces）ｓｐｐ．
ブレタノマイセス（Brettanomyces）は酵母の非胞子形成性の属である。それはサッカロミケス（Saccharomycetaceae）科からであり、醸造およびワイン産業に普通に用いられる。ブレタノマイセス（Brettanomyces）は、ワイン、具体的には赤ワインの複雑さに寄与するいくつかの感覚系化合物を生産する。ブレタノマイセス（Brettanomyces）種はＢ．ブリュセレンシス（bruxellensis）およびＢ．クラウセニ（claussenii）を包含するが、これらに限定されない。例えばフーゲルサング（Fugelsang）ら著，１９９７年，「ワインの微生物学（Wine Microbiology）」参照。
【０１６０】
トリコスポロン（Trichosporon）ｓｐｐ．
トリコスポロン（Trichosporon）は真菌科の属である。トリコスポロン（Trichosporon）種は普通に土壌から単離される酵母であるが、ヒトおよび動物の皮膚微生物叢にもまた見いだされ得る。種は例えばＴ．アクアタイル（aquatile）、Ｔ．ベイゲリ（beigelii）、およびＴ．デルマティス（dermatis）を包含するが、これらに限定されない。
【０１６１】
デバリオマイセス（Debaromyces）ｓｐｐ．
デバリオマイセス（Debaromyces）は子嚢菌酵母科の属であり、それらの種は耐塩性海洋種と表現される。種はＤ．ハンゼニイ（hansenii）およびＤ．ハンゼニウス（hansenius）を包含するが、これらに限定されない。
【０１６２】
フィスコミトレラ（Physcomitrella）ｓｐｐ．
フィスコミトレラ（Physcomitrella）苔は、懸濁培養によって増殖させられるときには、酵母または他の真菌培養物に類似の特徴を有する。この属は植物二次代謝物質を生産するために用いられ得、これらは他の型の細胞によって生産することは困難であり得る。
【０１６３】
サッカロマイセス（Saccharomyces）ｓｐｐ．
サッカロマイセス（Saccharomyces）は合成生物学の幅広く用いられているシャシー生物であり、組換え体微生物プラットフォームとして用いられ得る。例えば、Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）について利用可能な変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報のライブラリーがあり、産物収量を向上させるための様々なモジュールの理論的設計を許す。組換え体微生物を作るための方法は公知である。サッカロマイセス（Saccharomyces）種の例はＳ．カステリ（castellii）を包含し、ナウモボザイマ・カステリ（Naumovozyma castelli）としてもまた公知である。
【０１６４】
ザイゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）ｓｐｐ．
ザイゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）は酵母の属である。元々はサッカロマイセス（Saccharomyces）属に分類され、その後、それは再分類された。いくつかの種は商業的に用いられている食品保存技術に対して極めて耐性であるので、それは食品産業において幅広く公知である。種はＺ．ビスポラス（bisporus）およびＺ．シドリ（cidri）を包含するが、これらに限定されない（バーネット（Barnett）ら著，「酵母：特徴と同定（Yeasts: Characteristics and Identification）」，１９８３年参照）。
【０１６５】
ジオトリカム（Geotrichum）ｓｐｐ．
ジオトリカム（Geotrichum）は世界中の土壌、水、および下水に普通に見いだされる真菌である。多くの場合には、それは植物、穀物、および乳産物から同定される。種は、例えばＧ．カンジダム（candidum）およびＧ．クレバニ（klebahnii）を包含するが、これらに限定されない（カーマイケル（Carmichael）ら著，マイコロジカ（Mycologica），１９５７年，第４９巻（６）：ｐ．８２０−８３０参照）。
【０１６６】
カザフスタニア（Kazachstania）ｓｐ．
カザフスタニア（Kazachstania）はサッカロミケス（Sacchromycetaceae）科の酵母属である。
【０１６７】
トルラスポラ（Torulaspora）ｓｐｐ．
トルラスポラ（Torulaspora）は酵母の属であり、種はＴ．フランシスカ（franciscae）およびＴ．グロボーサ（globosa）を包含するが、これらに限定されない。
【０１６８】
アスペルギルス（Aspergillus）ｓｐｐ．
アスペルギルス（Aspergillus）種、例えばＡ．オリゼー（oryzae）、Ａ．ニガー（niger）、およびＡ．ソーヤ（sojae）は食品生産において幅広く用いられている微生物であり、組換え体微生物プラットフォームとしてもまた用いられ得る。Ａ．ニデュランス（nidulans）、Ａ．フミガタス（fumigatus）、Ａ．オリゼー（oryzae）、Ａ．クラバタス（clavatus）、Ａ．フラバス（flavus）、Ａ．ニガー（niger）、およびＡ．テレウス（terreus）のゲノムについては、ヌクレオチド配列が利用可能であり、フラックスを向上および産物収量を増大させるための内在性の経路の理論的設計および改変を許す。アスペルギルス（Aspergillus）については、トランスクリプトミクス研究およびプロテオミクス研究、ならびに代謝モデルが開発されている。
【０１６９】
ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）
ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）は二形性酵母であり（アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）参照）、半子嚢菌科に属する。ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）の全ゲノムは公知である。ヤロウィア（Yarrowia）種は好気性であり、非病原性であると考えられている。ヤロウィア（Yarrowia）は疎水性基質（例えば、アルカン、脂肪酸、および油）を用いることにおいて効率的であり、糖によって増殖し得る。それは産業用途への高いポテンシャルを有し、油脂微生物である。ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolyptica）はその乾燥細胞重量のおよそ４０％までの脂質含量を蓄積し得、脂質蓄積および再移動のモデル生物である。例えば、ニコー（Nicaud）著，２０１２年，イースト（Yeast）第２９巻（１０）：ｐ．４０９−１８；ベオプーロス（Beopoulos）ら著，２００９年，ビオシミー（Biochimie）第９１巻（６）：ｐ．６９２−６；バンカー（Bankar）ら著，２００９年，アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Microbiology and Biotechnology）第８４巻（５）：ｐ．８４７−６５参照。
【０１７０】
ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）
ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）は油脂酵母であり、脂質生産経路を人工するために有用である（例えばシュー（Zhu）ら著，２０１３年，ネイチャー・コミュニケーションズ（Nature Communications）第３巻：ｐ．１１１２；アヘイトス（Ageitos）ら著，２０１１年，アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Microbiology and Biotechnology）第９０巻（４）：ｐ．１２１９−２７参照）。
【０１７１】
カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）
カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）はメチロトローフ酵母である（それはメタノールによって増殖し得る）。ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの他のメチロトローフ種のように、それは異種蛋白質を生産するための優れたプラットフォームを提供する。分泌される異種蛋白質のマルチグラム範囲での収量が報告されている。最近、コンピュテーション方法ＩＰＲＯは、カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）キシロースレダクターゼの補因子特異性をＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへと実験的に切り替える変異を予測した。例えば、マタノビッチ（Mattanovich）ら著，２０１２年，メソッズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Methods in Molecular Biology）第８２４巻：ｐ．３２９−５８；コーリー（Khoury）ら著，２００９年，プロテイン・サイエンス（Protein Science）第１８巻（１０）：ｐ．２１２５−３８参照。
【０１７２】
ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（ピキア・アングスタ（Pichia angusta））
ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）はメチロトローフ酵母である（カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）参照）。さらにその上、それは幅広い範囲の他の基質によって増殖し得る；それは耐熱性であり、硝酸を同化し得る（また、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）参照）。それは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリン、およびＣ型肝炎の処置のためのインターフェロンアルファ−２ａを生産するために、さらにその上、広範囲の工業用酵素に適用されている。例えば、シュー（Xu）ら著，２０１４年，バイロロジカ・シニカ（Virologica Sinica）第２９巻（６）：ｐ．４０３−９参照。
【０１７３】
カンジダ・クルーセイ（Candida krusei）（イサチェンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis））
カンジダ・クルーセイ（Candida krusei）（科学名イサチェンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis））はチョコレート生産に幅広く用いられる。Ｃ．クルーセイ（krusei）は、カカオ豆の苦味を取り除き、分解するために用いられる。チョコレート生産へのこの種の関わりに加えて、Ｃ．クルーセイ（krusei）は真菌院内病原体として免疫低下者に普通に見いだされる（マストロマリノ（Mastromarino）ら著，ニュー・マイクロバイオロジカ（New Microbiologica），第３６巻：ｐ．２２９−２３８；２０１３年参照）。
【０１７４】
クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）
クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）はケフィアの生産によく適用される酵母である。それは、いくつかの糖、最も重要には牛乳および乳清中に存在するラクトースによって増殖し得る。それは、中でも、チーズを生産するためのキモシン（牛の胃に通常存在する酵素）を生産するために首尾よく適用されている。生産は発酵器によって４０，０００Ｌスケールで起こる。例えばファン・オーイェン（van Ooyen）ら著，２００６年，ＦＥＭＳイースト・リサーチ（FEMS Yeast Research）第６巻（３）：ｐ．３８１−９２参照。
【０１７５】
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）はメチロトローフ酵母である（カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）参照）。それは普通にはコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）ともまた言われる。それは異種蛋白質を生産するための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォームの要素はキットとして利用可能であり、それは世界中で蛋白質を生産するためにアカデミアにおいて用いられている。複雑なヒトＮグリカンを生産し得る株が人工されている（酵母グリカンはヒトに見いだされるものに類似であるが、同一ではない）。例えばピーライネン（Piirainen）ら著，２０１４年，ニュー・バイオテクノロジー（New Biotechnology）第３１巻（６）：ｐ．５３２−７参照。
【０１７６】
シェフェルソマイセス・スティピティス（Scheffersomyces stipitis）
シェフェルソマイセス・スティピティス（Scheffersomyces stipitis）（ピキア・スティピティス（Pichia stipites）としてもまた公知）は半数体形態で見いだされるホモタリック酵母である。代替的な呼吸系からもたらされるその向上した呼吸能が原因で、Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）の代わりに普通に用いられる（パピーニ（Papini）ら著，マイクロバイアル・セル・ファクトリーズ（Microbial Cell Factories），第１１巻：ｐ．１３６（２０１２年）参照）。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、微生物は、ドロソフィラ（Drosophila）、具体的にはドロソフィラ・メラノガスター（Drosophilia melanogaster）などの昆虫細胞であり得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、微生物は、例えばブラケスレア・トリスポラ（Blakeslea trispora）、ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、クロレラ（Chlorella）ｓｐ．などの藻類細胞であり得るが、これらに限定されない。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、微生物は、例えばブラケスレア・トリスポラ（Blakeslea trispora）、ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、クロレラ（Chlorella）ｓｐ．、ウンダリア・ピンナティフィダ（Undaria pinnatifida）、サルガッスム（Sargassum）、ラミナリア・ジャポニカ（Laminaria japonica）、およびセネデスムス・アルメリエンシス（Scenedesmus almeriensis）などのシアノバクテリア細胞であり得るが、これらに限定されない。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、微生物は細菌細胞であり得る。細菌の例は、バシラス（Bacillus）属（例えばＢ．サブチリス（subtilis）、Ｂ．アミロリケファシエンス（amyloliquefaciens）、Ｂ．リケニフォルミス（licheniformis）、Ｂ．プンティス（puntis）、Ｂ．メガテリウム（megaterium）、Ｂ．ハロデュランス（halodurans）、Ｂ．プミルス（pumilus））、アシネトバクター（Acinetobacter）、ノカルディア（Nocardia）、キサントバクター（Xanthobacter）、エスケリキア（Escherichia）（例えばＥ．コーライ（coli））、ストレプトマイセス（Streptomyces）、エルウィニア（Erwinia）、クレブシエラ（Klebsiella）、セラチア（Serratia）（例えばＳ．マルセッセンス（marcessans））、シュードモナス（Pseudomonas）（例えばＰ．エルギノーザ（aeruginosa））、サルモネラ（Salmonella）（例えばＳ．ティフィムリウム（typhimurium）およびＳ．ティフィ（typhi））を包含するが、これらに限定されない。細菌細胞は、光合成細菌（例えば緑色非硫黄細菌（例えばクロロフレクサス（Choroflexus）細菌（例えばＣ．アウランティアクス（aurantiacus））、クロロネマ（Chloronema）（例えばＣ．ギガンテウム（gigateum））、緑色硫黄細菌（例えばクロロビウム（Chlorobium）細菌（例えばＣ．リミコーラ（limicola））、ペロディクティオン（Pelodictyon）（例えばＰ．ルテオルム（luteolum））、紅色硫黄細菌（例えばクロマチウム（Chromatium）（例えばＣ．オケニ（okenii）））、および紅色非硫黄細菌（例えばロドスピリルム（Rhodespirillum）（例えばＲ．ルブルム（rubrum））、ロドバクター（Rhodobacter）（例えばＲ．スフェロイデス（sphaeroides）、Ｒ．カプスラタス（capsulatus））、およびロドミクロビウム（Rhodomicrobium）細菌（例えばＲ．バネリ（vanellii）））をもまた包含し得るが、これらに限定されない。
【０１８１】
Ｅ．コーライ（coli）
合成生物学の別の幅広く用いられているプラットフォーム生物、Ｅ．コーライ（coli）もまた組換え体微生物プラットフォームとして用いられ得る。サッカロマイセス（Saccharomyces）に類似に、Ｅ．コーライ（coli）について利用可能な変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報のライブラリーがあり、産物収量を向上させるための様々なモジュールの理論的設計を許す。組換え体Ｅ．コーライ（coli）微生物を作るためには、サッカロマイセス（Saccharomyces）について上に記載されているものに類似の方法が用いられ得る。
【０１８２】
本明細書において開示される組換え体ホスト細胞は、植物内で増殖させられる植物細胞を含む植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、アスペルギルス（Aspergillus）属からの真菌細胞；サッカロマイセス（Saccharomyces）（例えばＳ．セレビシエ（cerevisiae）、Ｓ．バヤヌス（bayanus）、Ｓ．パストリアヌス（pastorianus）、およびＳ．カールスベルゲンシス（carlsbergensis））、スキゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）（例えばＳ．ポンベ（pombe））、ヤロウィア（Yarrowia）（例えばＹ．リポリティカ（lipolytica））、カンジダ（Candida）（例えばＣ．グラブラタ（glabrata）、Ｃ．アルビカンス（albicans）、Ｃ．クルーセイ（krusei）、Ｃ．レブカウフィ（revkaufi）、Ｃ．プルケリマ（pulcherrima）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、Ｃ．ユティリス（utilis）、およびＣ．ボイジニ（boidinii））、アシュビア（Ashbya）（例えばＡ．ゴシピ（gossypii））、シベルリンドネラ（Cyberlindnera）（例えばＣ．ジャディニ（jadinii））、ピキア（Pichia）（例えばＰ．パストリス（pastoris）およびＰ．クドリアブゼビ（kudriavzevii））、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）（例えばＫ．ラクティス（lactis））、ハンゼヌラ（Hansenual）（例えばＨ．ポリモルファ（polymorpha））、アークスラ（Arxula）（例えばＡ．アデニニボランス（adeninivorans））、キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）（例えばＸ．デンドロルス（dendrorhous））、イサチェンキア（Issatchenkia）（例えばＩ．オリエンタリス（orientalis））、トルラスポラ（Torulaspora）（例えばＴ．フランシスカ（franciscae）およびＴ．グロボーサ（globosa））、ジオトリカム（Geotrichum）（例えばＧ．カンジダム（candidum）およびＧ．クレバニ（klebahni））、ザイゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）（例えばＺ．ビスポラス（bisporus）およびＺ．シドリ（cidri））、ヤマダザイマ（Yamadazyma）（例えばＹ．フィロガエア（philogaea））、ラカンセア（Lanchancea）（例えばＬ．クルイベリ（kluyveri））、コダマエア（Kodamaea）（例えばＫ．オーメリ（ohmeri））、ブレタノマイセス（Brettanomyces）（例えばＢ．アノマルス（anomalus））、トリコスポロン（Trichosporon）（例えばＴ．アクアタイル（aquatile）、Ｔ．ベイゲリ（beigelii）、およびＴ．デルマティス（dermatis））、デバリオマイセス（Debaromyces）（例えばＤ．ハンゼニウス（hansenuis）およびＤ．ハンゼニイ（hansenii））、シェフェルソマイセス（Scheffersomyces）（例えばＳ．スティピティス（stipis））、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）（例えばＲ．トルロイデス（toruloides））、パキソレン（Pachysolen）（例えばＰ．タンノフィラス（tannophilus））、ならびにフィスコミトレラ（Physcomitrella）、ロドトルラ（Rhodotorula）、カザフスタニア（Kazachstania）からの酵母細胞、ジベレラ（Gibberella）、アガリクス（Agaricus）、およびファネロケーテ（Phanerochaete）属；ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophilia melanogaster）を包含するがこれに限定されない昆虫細胞、ブラケスレア・トリスポラ（Blakeslea trispora）、ドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、クロレラ（Chlorella）ｓｐ．、ウンダリア・ピンナティフィダ（Undaria pinnatifida）、サルガッスム（Sargassum）、ラミナリア・ジャポニカ（Laminaria japonica）、およびセネデスムス・アルメリエンシス（Scenedesmus almeriensis）種を包含するがこれに限定されない藻類細胞；あるいはバシラス（Bacillus）属（例えばＢ．サブチリス（subtilis）、Ｂ．アミロリケファシエンス（amyloliquefaciens）、Ｂ．リケニフォルミス（licheniformis）、Ｂ．プンティス（puntis）、Ｂ．メガテリウム（megaterium）、Ｂ．ハロデュランス（halodurans）、およびＢ．プミルス（pumilus））、アシネトバクター（Acinetobacter）、ノカルディア（Nocardia）、キサントバクター（Xanthobacter）属、エスケリキア（Escherichia）（例えばＥ．コーライ（coli））、ストレプトマイセス（Streptomyces）、エルウィニア（Erwinia）、クレブシエラ（Klebsiella）、セラチア（Serratia）（例えばＳ．マルセッセンス（marcessans））、シュードモナス（Pseudomonas）（例えばＰ．エルギノーザ（aeruginosa））、サルモネラ（Salmonella）（例えばＳ．ティフィムリウム（typhimurium）およびＳ．ティフィ（typhi））からの細菌細胞を含み得、さらに、クロロフレクサス（Choroflexus）細菌（例えばＣ．アウランティアクス（aurantiacus））、クロロネマ（Chloronema）（例えばＣ．ギガンテウム（gigateum））、緑色硫黄細菌（例えばクロロビウム（Chlorobium）細菌（例えばＣ．リミコーラ（limicola））、ペロディクティオン（Pelodictyon）（例えばＰ．ルテオルム（luteolum）））、紅色硫黄細菌（例えばクロマチウム（Chromatium）（例えばＣ．オケニ（okenii）））、および紅色非硫黄細菌（例えばロドスピリルム（Rhodespirillum）（例えばＲ．ルブルム（rubrum））、ロドバクター（Rhodobacter）（例えばＲ．スフェロイデス（sphaeroides）およびＲ．カプスラタス（capsulatus））、およびロドミクロビウム（Rhodomicrobium）細菌（例えばＲ．バネリ（vanellii））を包含するということは了解され得る。
【０１８３】
本発明は次の例によってさらに記載される。これらは請求項に記載されている本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１８４】
次の例は本発明の具体的な実施形態およびそれらの様々な使用を例解している。それらは説明目的でのみ提出されており、本発明を限定すると取られるべきではない。
【０１８５】
例１：（超高速高分離）ＬＣ−ＭＳ分析手続き
ＬＣ−ＭＳ分析はウォーターズＡＣＱＵＩＴＹ−ＵＰＬＣ（超高速高分離液体クロマトグラフィー系）によるウォーターズＡＣＱＵＩＴＹ−ＵＰＬＣ（超高速高分離液体クロマトグラフィー系；ウォーターズ・コーポレーション（Waters Corporation））によって行った。ＵＰＬＣ−ＭＳによる化合物の定量：５μｌの抽出物を、質量検出器のウォーターズＸｅｖｏ−Ｇ２−ＸＳ−ＴとカップリングされたウォーターズＡｃｑｕｉｔｙ超高速高分離液体クロマトグラフィー系（ミルフォード，マサチューセッツ，ＵＳＡ）に注入した。化合物の分離は５０℃にキープされたウォーターズＡｃｑｕｉｔｙ−ＵＰＬＣ（登録商標）ＨＳＳ−Ｔ３−Ｃ１８カラム（１．７μｍ，２．１ｍｍ×５０ｍｍ）によって達成した。移動相は１％アセトニトリル、９９％水、５ｍＭ酢酸アンモニウム（Ａ）、および１０％アセトニトリル、９０％イソプロパノール、５ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｂ）であった。１分以内の１００％Ａから９０％Ａの溶出勾配、次に０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量での別の１分以内の０％Ａへのｒａｍｐを用いた。質量分析器はエレクトロスプレー源を備え、ネガティブモードで作動した。キャピラリー電圧は１．０ｋＶであり；ソースは１５０℃にキープし、脱溶媒和温度は５００℃であった。脱溶媒和およびコーンガス流はそれぞれ８００ｌ／ｈおよび１００ｌ／ｈであった。０．０５Ｄａの質量ウィンドウ内のそれぞれの［Ｍ−Ｈ］−イオンの抽出されたイオンクロマトグラムを計算することによって、目当ての化合物をトラッキングした。各化合物のピーク面積を計算し、正規の標準による直線状の検量線（０．０３１２５ｍｇ／ｌから４ｍｇ／ｌの範囲である）を用いて化合物を定量した。
【０１８６】
例２：ＧＣ−ＭＳ分析手続き
アジレント５９７５Ｃ−ＭＳＤを有しかつレステック（Restek）Ｒｘｉ−５ｍｓカラム２５ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍを備えたアジレント７８９０Ａ−ＧＣ系を用いて、ペレットおよび上清の有機抽出物をガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）分析に付した）。ＧＣ分析に用いたプログラムは次の通りであった：４５℃における３ｍｉｎの初期ホールド；５℃／ｍｉｎでの５０℃へのｒａｍｐおよび３ｍｉｎのホールド；１００℃／ｍｉｎでの３００℃へのｒａｍｐおよび３ｍｉｎのホールド。ヘリウムをキャリアガスとして用い、７．１４ｐｓｉの定圧で流した。インジェクターは２５０℃に維持し、イオン源温度は２３０℃にセットした。注入体積はスプリットレスモードで１．０μｌであった。脂肪酸アシルメチルエステル標準の保持時間および質量スペクトルとの比較ならびに／または公開されたデータ（ＮＩＳＴ／ＥＰＡ／ＮＩＨ質量スペクトルライブラリーバージョン２．０ｇ）との質量スペクトルの比較によって、該当のＧＣピークを同定した。データ分析はアジレントＥｎｈａｎｃｅｄ−Ｄａｔａ−ＡｎａｌｙｓｉｓおよびＭａｓｓＦｉｎｄｅｒ−４（ドクター・ホッホムート・サイエンティフィック・コンサルティング（Dr. Hochmuth Scientific Consulting））ソフトウェアを用いて行った。
【０１８７】
ジカルボン酸（ＤＣＡ）の生産のための経路の確立は、酵母によるムスコンおよびムスコン前駆体、具体的にはヘキサデカン二酸の生産にとって必須である。異種のおよび種特異的なＰ４５０モノオキシゲナーゼおよびそれらの対応するレダクターゼの発現はパルミチン酸からのヘキサデカン二酸の合成を許す。
【０１８８】
例３：ＤＣＡおよびＤＣＡ−ＣｏＡの分析
インビボサンプル
ＤＣＡおよびＤＣＡ−ＣｏＡ分子のインビボ生産後に、脂肪酸鎖長および濃度を分析した。１：５０希釈の最終ΟＤ６００を測定し、１００ＯＤ単位相当の細胞を収穫した。５００μｌのメタノールをペレットに追加することと、この懸濁液を１０分に渡って６０℃でインキュベーションすることとによって、ＤＣＡおよびＤＣＡ−ＣｏＡを抽出した。４０００ｇでの５分の遠心後に、上清をＵＰＬＣ−ＭＳ分析に付した。
【０１８９】
インビトロサンプル
ＤＣＡおよびＤＣＡ−ＣｏＡ分子のインビボ生産後に、脂肪酸鎖長および濃度を分析した。１００μｌメタノールを追加することによって１００μｌのインビトロアッセイサンプルを抽出した。上清を１２０００×ｇでの手早い遠心によって回収し、分析に先行して注入バイアル中に置いた。
【０１９０】
例４：インビボサンプルからの分岐および非分岐長鎖脂肪酸メチルエステルの定性分析
いくつかの分岐および非分岐長鎖脂肪酸メチルエステル分子を生産した。生産された脂肪酸の型を決定するために、インビボサンプルに対する分析を行った。１：５０希釈の最終ＯＤ６００を測定し、１００ＯＤ単位相当の酵母細胞を６０００ｒｐｍでの１０ｍｉｎの遠心によって収穫した。上清を捨てた。１ｍＬの１０％塩酸−メタノール（ｖ／ｖ）を残りの細胞ペレットに追加し、１ｍｉｎに渡ってボルテックスし、６２℃で３時間に渡ってインキュベーションしてＦＡをメチル化した。室温への冷却後に、反応混合物を４ｍｉｎに渡って１４ｋｒｐｍで遠心した。細胞ペレットを取り除き、爾後に、もたらされた脂肪酸メチルエステルを、１ｍｌヘキサンによって、１ｍｉｎのボルテックスによって上清から抽出した（２回）。上側の有機相を取り除き、組み合わせ、１ｍｌのＭＱ水によって洗浄し、硫酸ナトリウムによって乾燥した。
【０１９１】
それから、アジレント５９７５Ｃ−ＭＳＤを有しかつレステック（Restek）Ｒｘｉ−５ｍｓカラム（２５ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍ）を備えたアジレント７８９０Ａ−ＧＣ系を用いて、有機抽出物をガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）分析に付した。ＧＣ分析に用いたプログラムは次の通りであった：８０℃における２ｍｉｎの初期ホールド；１００℃／ｍｉｎでの２００℃へのｒａｍｐ；５℃／ｍｉｎでの２７０℃へのｒａｍｐ；１００℃／ｍｉｎでの３００℃へのｒａｍｐおよび３ｍｉｎのホールド。ヘリウムをキャリアガスとして用い、７．１４ｐｓｉの定圧で流した。インジェクターは２５０℃に維持し、イオン源温度は２３０℃にセットした。注入体積はスプリットレスモードで１．０μＬであった。脂肪酸アシルメチルエステル標準の保持時間および質量スペクトルとの比較ならびに／または公開されたデータ（ＮＩＳＴ／ＥＰＡ／ＮＩＨ質量スペクトルライブラリーバージョン２．０ｇ）との質量スペクトルの比較によって、該当のＧＣピークを同定した。データ分析はアジレントＥｎｈａｎｃｅｄ−Ｄａｔａ−ＡｎａｌｙｓｉｓおよびＭａｓｓＦｉｎｄｅｒ−４（ドクター・ホッホムート・サイエンティフィック・コンサルティング（Dr. Hochmuth Scientific Consulting））ソフトウェアを用いて行った。
【０１９２】
例５：インビボサンプルからの短鎖脂肪酸メチルエステルの定性分析
酵母細胞を例４に記載されている通り収穫した。ペレットおよび上清を短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の存在について分析した。ペレットをパラグラフ０００５に記載されている通り処置した。上清をキープし、上清の１ｍＬを１．１ｍＬの１０％塩酸−メタノール（ｖ／ｖ）によって希釈し、１ｍｉｎに渡ってボルテックスし、６２℃で３時間に渡ってインキュベーションしてＳＣＦＡをメチル化した。爾後に、メチル化反応上清を、１ｍＬヘキサンによって、１ｍｉｎのボルテックスによって抽出した（２回）。上側の有機相を取り除き、組み合わせ、１ｍＬのＭＱ水によって洗浄し、硫酸ナトリウムによって乾燥した。穏やかな窒素流を用いて溶媒を蒸発させることによって、有機相中のＳＣＦＡメチルエステルを濃縮した。
【０１９３】
アジレント５９７５Ｃ−ＭＳＤを有しかつレステック（Restek）Ｒｘｉ−５ｍｓカラム２５ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍを備えたアジレント７８９０Ａ−ＧＣ系を用いて、ペレットおよび上清の有機抽出物をガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）分析に付した）。ＧＣ分析に用いたプログラムは次の通りであった：４５℃における３ｍｉｎの初期ホールド；５℃／ｍｉｎでの５０℃へのｒａｍｐおよび３ｍｉｎのホールド；１００℃／ｍｉｎでの３００℃へのｒａｍｐおよび３ｍｉｎのホールド。ヘリウムをキャリアガスとして用い、７．１４ｐｓｉの定圧で流した。インジェクターは２５０℃に維持し、イオン源温度は２３０℃にセットした。注入体積はスプリットレスモードで１．０μＬであった。脂肪酸アシルメチルエステル標準の保持時間および質量スペクトルとの比較ならびに／または公開されたデータ（ＮＩＳＴ／ＥＰＡ／ＮＩＨ質量スペクトルライブラリーバージョン２．０ｇ）との質量スペクトルの比較によって、該当のＧＣピークを同定した。データ分析はアジレントＥｎｈａｎｃｅｄ−Ｄａｔａ−ＡｎａｌｙｓｉｓおよびＭａｓｓＦｉｎｄｅｒ−４（ドクター・ホッホムート・サイエンティフィック・コンサルティング（Dr. Hochmuth Scientific Consulting））ソフトウェアを用いて行った。
【０１９４】
例６：酵母株によるα，ω−ジカルボン酸（ＤＣＡ）形成
シベトン、ｌ−およびノルムスコン経路上のＤＣＡ形成はシベトン、ｌ−およびノルムスコン最終産物の下流の生産を許す。Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ（例えばＣ．マルトーサ（maltose）ＣＹＰ５２Ａ３−Ａ（配列番号４７；４１）、Ｃ．マルトーサ（maltosa）ＣＹＰ５２Ａ９、Ｃ．ボンビコラ（bombicola）ＣＹＰ５２Ｎ１（配列番号４８；４２）、Ｃ．トロピカリス（tropicalis）ＣＹＰ５２Ａ１（配列番号５０；４４）、およびＣ．トロピカリス（tropicalis）ＣＹＰ５２Ａ１７（配列番号５１；４５））ならびにそれらの対応するレダクターゼ（Ｃ．マルトーサ（maltose）ＮＣＰ１、Ｓ．ボンビコラ（bombicola）ＮＣＰ１、Ｃ．トロピカリス（tropicalis）ＮＣＰ１（（配列番号５２；４６）、およびＳ．ボンビコラ（bombicola）ＣＰＲ（配列番号４９；４３））をコードする異なる種特異的な遺伝子の共発現を有する、自律複製配列（ＡＲＳ）および酵母セントロメア（ＣＥＮ）を含有するプラスミド（ＡＲＳ−ＣＥＮプラスミド）によって、組換え体ＳＣ２８８Ｃ酵母株を共形質転換した（表１）。遺伝子は、恒常的プロモーターのグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ１、ＧＰＤ１のコントロール下にあった。
【０１９５】
上の酵素をコードする遺伝子を含有する酵母株の生産と平行して、ｐｏｘ１Δ０欠失を含有する組換え体酵母株を人工した。酵母のｐｏｘ１Δ０欠失はムスコン前駆体のβ酸化を減少させた。
【０１９６】
ジカルボン酸の形成のために酵母を培養するために、ロイシン（ＬＥＵ）またはウラシル（ＵＲＡ）の補助なしの２％グルコースを含有するＳＣ選択培地を用いた。それから、培養物をバッフルなしの２５０ｍＬ振盪フラスコによって２４時間に渡って増殖させ、上に記載されている通り、細胞ペレット抽出物をＬＣ／ＭＳを用いて分析した。
【０１９７】
シベトンもまた次の酵母株を用いて生産され得る：ＥＶＳＴ２６０８８；ＥＶＳＴ２７９２２；ＥＶＳＴ２６０８８／ｐＥＶ２５９４２／ｐＥＶ２４１３６（ＦＡＳ１ｗｔ；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．１；ＥＶＳＴ２６０８８／ｐＥＶ２５９４２／ｐＥＶ２４１３６（ＦＡＳ１ｗｔ；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．２；ＥＶＳＴ２６０８８／ｐＥＶ２５９４２／ｐＥＶ２４１３６（ＦＡＳ１ｗｔ；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．３；ＥＶＳＴ２６０８８／ｐＥＶ２５９４４／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ２；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．１；ＥＶＳＴ２６０８８／ｐＥＶ２５９４４／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ２；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．２；ＥＶＳＴ２６０８８／ｐＥＶ２５９４４／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ２；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．３；ＥＶＳＴ２６０８８／ｐＥＶ２５９４６／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ４；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．１；ＥＶＳＴ２６０８８／ｐＥＶ２５９４６／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ４；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．２；ＥＶＳＴ２６０８８／ｐＥＶ２５９４６／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ４；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．３；ＥＶＳＴ２７９２２／ｐＥＶ２５９４２／ｐＥＶ２４１３６（ＦＡＳ１ｗｔ；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．１；ＥＶＳＴ２７９２２／ｐＥＶ２５９４２／ｐＥＶ２４１３６（ＦＡＳ１ｗｔ；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．２；ＥＶＳＴ２７９２２／ｐＥＶ２５９４２／ｐＥＶ２４１３６（ＦＡＳ１ｗｔ；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．３；ＥＶＳＴ２７９２２／ｐＥＶ２５９４４／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ２；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．１；ＥＶＳＴ２７９２２／ｐＥＶ２５９４４／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ２；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．２；ＥＶＳＴ２７９２２／ｐＥＶ２５９４４／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ２；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．３；ＥＶＳＴ２７９２２／ｐＥＶ２５９４６／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ４；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．１；ＥＶＳＴ２７９２２／ｐＥＶ２５９４６／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ４；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．２；およびＥＶＳＴ２７９２２／ｐＥＶ２５９４６／ｐＥＶ２４１３６（ｆａｓ１  ｍｕｔ４；ＦＡＳ２ｗｔ）ｃｌ．３（例えば、表３ａおよび３ｂに列記されている酵母株参照）。
【０１９８】
酵母コントロールによるＤＣＡ形成
ｐｏｘ１Δ０欠失、野生型、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）ｍｕｔ−ＧＰＤ１−ＣＹＣｌｔ、またはｐｏｘ１Δ０欠失およびＸＤＨｍｕｔ−ＧＰＤ１−ＣＹＣｌｔを有するコントロール酵母株では、ＤＣＡ形成は複数の実験のうち単一の事例において検出限界ぎりぎりで観察された。この結果は偽陽性であると思われ、偽陽性の読取値よりも２００倍多大なＤＣＡを一貫して生産する株と比較して有意だとは考えられない。最も高いＤＣＡ１６：０形成はＸＤＨｍｕｔ−ＧＰＤ１−ＣＹＣｌｔを発現する酵母株で見られ（２．７μｇ／ｇＣＤＷ）、他の条件では、検出不可能な量のＤＣＡが観察された（図２）。
【０１９９】
Ｃ．トロピカリス（tropicalis）ＣＹＰ５２遺伝子を発現する酵母によるＤＣＡ形成
表１のＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする様々な遺伝子の発現は、異なるレベルのＤＣＡ形成をもたらした。ｐｏｘ１Δ０欠失ならびにＣ．トロピカリス（tropicalis）ＣＹＰ５２遺伝子（ＣＹＰ５２Ａ１７またはＣＹＰ５２Ａ１）およびＣ．トロピカリス（tropicalis）＿ＣＰＲ遺伝子を有する人工された酵母によるＤＣＡ形成は、最も高い量のＤＣＡ１４：０、ＤＣＡ１６：０（ヘキサデカン二酸）、およびＤＣＡ１６：１脂肪酸を生産した。他のＤＣＡ；ＤＣＡ１８：０（オクタデカン二酸）およびＤＣＡ１８：１（オクタデセン二酸）の発現はほとんどから全くまでなかった。ｐｏｘ１Δ０欠失を有しかつＣＹＰ５２Ａ１７およびその対応するレダクターゼを発現する酵母株は、５μｇ／ｇＣＤＷ未満のＤＣＡ１４：０、ＤＣＡ１６：０、およびＤＣＡ１６：１を生産した。他の条件では、検出不可能な量のＤＣＡが見られた（図３）。
【０２００】
Ｓ．ボンビコラ（bombicola）ＣＹＰ５２遺伝子を発現する酵母によるＤＣＡ形成
ＰＯＸ１野生型またはｐｏｘ１Δ０欠失、Ｓ．ボンビコラ（bombicola）ＣＹＰ５２遺伝子（ＣＹＰ５２Ｎ１）およびＳ．ボンビコラ（bombicola）＿ＣＰＲを有する人工された酵母によるＤＣＡ形成は、ＤＣＡ１４：０、ＤＣＡ１６：０、ＤＣＡ１６：１、ＤＣＡ１８：０、ＤＣＡ１８：１の生産をもたらした。ｐｏｘ１Δ０の欠失ありおよびなしの人工された酵母株は両方とも、ＤＣＡ１６：０の増大した生産（それぞれ〜４０μｇ／ＣＤＷおよび３２μｇ／ＣＤＷ）、次にＤＣＡ１６：１の形成（それぞれ〜２８μｇ／ＣＤＷおよび〜２０μｇ／ＣＤＷ）を見せた。両方の酵母株によるＤＣＡ１４：０の形成は〜５μｇ／ＣＤＷであった（図４）。
【０２０１】
Ｃ．マルトーサ（maltosa）ＣＹＰ５２遺伝子を発現する酵母によるＤＣＡ形成
ＰＯＸ１野生型またはｐｏｘ１Δ０欠失、Ｃ．マルトーサ（maltosa）ＣＹＰ５２遺伝子（ＣＹＰ５２Ａ３またはＣＹＰ５２Ａ９）、およびＣ．マルトーサ（maltosa）＿ＣＰＲを有する人工された酵母によるＤＣＡ形成は、ＤＣＡ１４：０、ＤＣＡ１６：０、ＤＣＡ１６：１、ＤＣＡ１８：０、ＤＣＡ１８；１の生産をもたらした。ＤＣＡ１６：０は各条件において最も高かった。ＣＹＰ５２Ａ３およびＣｍ＿ＣＰＲの共発現は〜３００μｇ／ｇＣＤＷのＤＣＡ１６：０を生産し、ＣＹＰ５２Ａ９およびＣｍ＿ＣＰＲは〜５００μｇ／ｇＣＤＷを生産した。ｐｏｘ１Δ０欠失下においては、ＣＹＰ５２Ａ３およびＣｍ＿ＣＰＲの共発現は〜１００μｇ／ｇＣＤＷのＤＣＡ１６：０の優位な形成をもたらし、ＣＹＰ５２Ａ９およびＣｍ＿ＣＰＲの共発現は〜４００μｇ／ｇＣＤＷのＤＣＡ１６：０の形成をもたらした（図５）。
【０２０２】
ＤＣＡのＣ１６：０、Ｃ１７：０アンテイソ、およびＣ１８：１はそれぞれノルムスコン、ｌ−ムスコン、およびシベトンの生産にとって好ましいＤＣＡであり得る。
【０２０３】
例７：Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）にインテグレーションされたＤＣＡ経路
様々なＤＣＡを生産するために、ＤＣＡ経路を、酵母、例えばＳ．セレビシエ（cerevisiae）にインテグレーションし得る。ＤＣＡ１６：０（ヘキサデカン二酸）の生産はムスコンの下流生産のために必要とされる上流分子である。
【０２０４】
双方向発現カセットを持つ安定な酵母インテグレーションベクター上に、ＣＹＰ５２Ａ９およびレダクターゼ遺伝子をクローニングした。Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ５２Ａ９）はＴＥＦ１プロモーターによって駆動され、ＣＰＲの発現はＰＧＫ１プロモーターによって駆動された。発現カセットは酵母ゲノム中への特異的インテグレーションのためのフランキング領域を含有した。酵母細胞を、相同配列が構築物をゲノム中の適当な座位へとターゲティングした陽性クローンについてセレクションした。安定なインテグレーションがＰＯＸ１野生型およびｐｏｘ１Δ０欠失株両方において行われた。ヘキサデカン二酸の形成はＬＣ−ＭＳによって検出した。
【０２０５】
ヘキサデカン二酸の生産によって証明された通り、ＤＣＡ経路インテグレーションは機能的であった。ＣＹＰ５２Ａ９およびＣｍ＿ＣＰＲをインテグレーションされたＰＯＸ１ｗｔおよびｐｏｘ１Δ０欠失酵母株は〜１．７５ｍｇ／Ｌおよび〜０．５５ｍｇ／ｇＣＤＷのヘキサデカン二酸を生産した（図６）。
【０２０６】
例８：ＤＣＡのＣｏＡ活性化
ｌ−およびノルムスコン生産の形成のための基質として利用されるためには、ジカルボン酸分子はＣｏＡ活性化されなければならない。ヘキサデカン二酸からのヘキサデカン二酸ＣｏＡの合成はＣｏＡ分子による活性化を要求する。
【０２０７】
ＤＣＡを安定に生産する酵母株を、さらに、ゲノムインテグレーションのための相同なフランキング領域および優性選択マーカーを持つインテグレーションプラスミドによって形質転換した。インテグレーション構築物はマスクラットのクローニングされた遺伝子ＭＣＣ０２８を恒常的に発現した。これはネズミアシルＣｏＡシンターゼＡＣＢＧ１とアノテーションされた。それから、組換え体株を２４ｈｒに渡って３０℃で選択培地による２５０ｍｌ振盪フラスコ培養によって増殖させた。それから、培養物をＬＣ−ＭＳによって分析してＤＣＡ−ＣｏＡ形成の違いを評価し、同じ遺伝学的バックグラウンドにおいて染色体外のＣｏＡリガーゼを発現する株と比較した。
【０２０８】
染色体外ＭＣＣ０２８を発現するＤＣＡ株およびインテグレーションされたＭＣＣ０２８を有するＤＣＡ株は同じ量のヘキサデカン二酸ＣｏＡを生産した（〜３５，０００相対ピーク面積）（図７）。
【０２０９】
【表１】
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【０２１０】
例９：酵母株による（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡの生産
ＣｏＡリガーゼ活性による２−メチル酪酸からの（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡの形成は、下流の脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）活性のためのプライミング単位または出発材料を許す。
【０２１１】
セイヨウカラハナソウ（ＨＩＣＣＬ４）（ホップ）（配列番号３）または馬鈴薯（ＳｔＣＣＬ）（ジャガイモ）（配列番号４）どちらかからのアシルＣｏＡリガーゼをコードする組換え体遺伝子を組み込むことによって、モノメチル分岐脂肪酸の生産のための組換え体ＰＯＸ１ｗｔおよびｐｏｘ１Δ０欠失を保有するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株を人工した。ＡＲＳ−ＣＥＮプラスミドおよびＨＩＣＣＬ４（配列番号３）またはＳｔＣＣＬ（配列番号４）からの異種ＣｏＡリガーゼの発現カセットを含有する染色体外プラスミドによって、ＤＣＡ生産酵母株を形質転換した。ＡＲＳ−ＣＥＮプラスミド上の遺伝子は恒常的プロモーターＴＥＦ１のコントロール下に置かれた。形質転換後にロイシン栄養要求性を回復させるための追加の選択マーカーを追加した。これは原栄養株の分析を許した。
【０２１２】
ロイシン（ＬＥＵ）補助なしの２％グルコースを含有するＳＣ選択培地を培養に用いた。培養物をバッフルなしの２５０ｍｌ振盪フラスコによって３０℃で２４時間に渡って増殖させ、細胞ペレット抽出物を分析した。ＬＣ／ＭＳを用いて、２−（Ｓ）−メチルブチリルＣｏＡの形成を検出した。
【０２１３】
ＨＩＣＣＬ４からのＣｏＡリガーゼの異種発現（配列番号３）は、酵母による分岐脂肪酸のターゲティングされた合成のための分岐プライミング単位の有意な生産に至った。対照的に、平行してのＳｔＣＣｌのリガーゼのインビボ発現（配列番号４）はより有効でなかった。例えば、ＨＩＣＣＬ４を発現するｐｏｘ１Δ０欠失を有するＤＣＡ生産株は〜４０，０００相対ピーク面積の２−メチルブチリルＣｏＡを生産したが、ＳｔＣＣｌを発現する株は５０，０００未満の相対ピーク面積の２−メチルブチリルＣｏＡを生産した（図８）。
【０２１４】
例１０：安定な（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ生産酵母株の人工
天然にはＳ．セレビシエ（cerevisiae）に内在的に存在しない２−（Ｓ）−メチルブチリルＣｏＡを生産する能力は、ｆａｓ１欠失バックグラウンドにおいてこれらの遺伝子を安定に発現する酵母株を人工することによって達成された。ＦＡＳ１の不在は、酵母のモノメチル分岐脂肪酸組み立て経路を確立するための追加の遺伝子のさらなる改変およびインテグレーションのための第１ステップであった。
【０２１５】
恒常的なＴＥＦ１プロモーターおよびＥｎｏ２ターミネーターを含有する安定な酵母インテグレーションベクターの発現カセット内に、ＨＩＣＣＬ４（配列番号３）およびＳｔＣＣｌ（配列番号４）をクローニングした。これらの発現カセットは形質転換後の相同組換えによる酵母ゲノム中への特異的インテグレーションのためのフランキング領域を含有した。優性選択マーカーの存在が原因で、形質転換された酵母細胞を、相同配列がインテグレーション構築物をゲノム中の適当な座位へとターゲティングした陽性クローンについてセレクションした。もたらされた株およびｐｏｘ１Δ０欠失誘導体の２５０ｍｌ振盪フラスコ分析スクリーニングを選択条件を有する培地で行い、プライミング単位の存在を確認した。
【０２１６】
ＨＩＣＣＬ４からのＣｏＡリガーゼを安定発現するｆａｓ１変異体におけるＦＡＳ１活性の回復は、１４−メチルヘキサデカン酸（Ｃ１７アンテイソＦＡ）の生産をもたらした。具体的には、ｆａｓ１  ｍｕｔ２およびＦＡＳ２ｗｔの発現はＣ１７アンテイソＦＡの最も高い形成（〜０．３１ｍｇ／Ｌ）に至った（図９；表２）。
【０２１７】
【表２】
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【０２１８】
例１１：ＦＡＳ１変異体酵母によるモノメチル分岐鎖脂肪酸（ＭＭＢＣＦＡ）の生産
奇数鎖脂肪酸合成の経路のためのプライミング単位として２−（Ｓ）−メチルブチリルＣｏＡを作出するｆａｓ１欠失バックグラウンドを有する酵母株を、インシリコ設計されたＳ．セレビシエ（cerevisiae）脂肪酸シンターゼ変異体を持ついくつかのプラスミドの導入のために選んだ。ＦＡＳ１遺伝子の改変を行って、代替的なプライミング単位の最も良好な受容性および結合特性とＦＦＡ−Ｃ１７：０を生産する能力とを評価した。
【０２１９】
変異がＰＣＲによって導入される酵母ＦＡＳ１の具体的なアミノ酸配列を定義した。ＧＰＤ１によって駆動される酵母脂肪酸シンターゼ野生型（配列番号５）またはＦＡＳ１変異体ｆａｓ１  ｍｕｔ（Ｉ４８３Ａ）（配列番号６）、ｆａｓ１  ｍｕｔ２（Ｆ４２７Ａ）、（配列番号７）、ｆａｓ１  ｍｕｔ３（Ｆ４２７Ａ，Ｉ４８３Ａ）、（配列番号８）、ｆａｓ１  ｍｕｔ４（Ｉ２３４Ａ，Ｆ４２７Ｓ）、（配列番号９）、ｆａｓ１  ｍｕｔ５（Ｑ１６３Ａ，Ｆ４２７Ａ）、（配列番号１０）、ｆａｓ１  ｍｕｔ６（ｌ３０６Ａ）、（配列番号１１）、およびｆａｓ１  ｍｕｔ７（Ｉ３０６Ａ，Ｉ４８３Ａ）、（配列番号１２）をコードする一連の染色体外２ミクロンプラスミドによって、奇数鎖プライミング単位を生産することができる適当な組換え体株を形質転換した。全ての変異体バリアントは、同じ恒常的プロモーターのコントロール下のＦＡＳ２ｗｔをコードする２ミクロンプラスミドによって共形質転換して、合成される脂肪酸の十分な供給が作出されるということを保証した。ヒスチジンおよびロイシン原栄養株が陽性クローンの単離を許すように、爾後のセレクションを形質転換されたマーカーについて行った。加えて、形質転換された細胞の増殖およびセレクションを支持するために、１ｍＭミリスチン酸を培地に追加した。なぜなら、ｆａｓ１ヌル表現型そのものは細胞増殖に対する重度の阻害（致死）効果を見せたからである。
【０２２０】
選択条件下におけるスクリーニングは、奇数鎖脂肪酸の生産に関して最も良好な性能のｆａｓ１変異体のキャラクタリゼーションおよび単離を許した。これのためには、適当な選択培地による２５０ｍｌ振盪フラスコ培養物を２４時間に渡って３０℃で増殖させ、爾後にＬＣ／ＭＳによって分析した。これらの改変されたＦＡＳ１変異体を発現するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株は、内在的に生産された２−メチルブチリルＣｏＡを利用して異なるレベルのＦＦＡ−Ｃ１７：０を形成する能力があった。ＬＣ／ＭＳによるこれらの奇数鎖ＦＡの検出および様々な種の分布をＧＣ分析によって詳細にキャラクタリゼーションした（表３）。
【０２２１】
Ｃ１７：０の３つの種をＧＣ分析から同定した。Ｆａｓ１  ｍｕｔ２の発現は１４−メチルヘキサデカン酸の最も高い生産（〜６２％）をもたらしたが、ＦＡＳ１ｗｔ発現は１４−メチルヘキサデカン酸の最も低い生産（〜２．５％）に至った（図１０）。
【０２２２】
例１２：モノメチル分岐鎖脂肪酸（ＭＭＢＣＦＡ）を生産するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株における安定なＤＣＡ経路インテグレーション
ＭＭＢＣＦＡを生産するために、ＤＣＡ生産経路をＳ．セレビシエ（cerevisiae）にインテグレーションした。Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ／レダクターゼ複合体およびｆａｓ１変異体の組み合わせを酵母株に組み込んで、有意な量のＤＣＡを生産した。
【０２２３】
ＣＹＰ５２ファミリーの好適なシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ／レダクターゼ複合体の以前の同定を用いて、最も高い量の３−メチルヘキサデカン二酸を生産する最も良好な性能のｆａｓ１変異体（ｆａｓ１  ｍｕｔ２（Ｆ４２７Ａ）、（配列番号７）およびｆａｓ１  ｍｕｔ４（Ｉ２３４Ａ，Ｆ４２７Ｓ）、（配列番号９））を有するＳ．セレビシエ（cerevisiae）株を人工した。よって、Ｃｙｐ５２Ａ９遺伝子（配列番号１；２１）を、双方向発現カセットを持つ安定な酵母インテグレーションベクター上にクローニングした。それによって、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼはＴＥＦ１プロモーターのコントロール下に置かれ、ＰＧＫ１プロモーターがレダクターゼＣｍ＿ＣＰＲの発現を駆動する。それから、１４−メチルヘキサデカン酸を安定に生産する組換え体酵母株をインテグレーションプラスミドによって形質転換した。発現カセットは形質転換後の相同組換えによる酵母ゲノム中への特異的インテグレーションのためのフランキング領域を含有した。構築物上の選択可能なマーカーの存在が原因で、それから、酵母細胞を、相同配列がインテグレーション構築物をゲノム中の適当な座位へとターゲティングした陽性クローンについてセレクションした。
【０２２４】
もたらされた株による２５０ｍｌ振盪フラスコ分析スクリーニングを行い、メチル分岐ヘキサデカン二酸の形成をＬＣ／ＭＳによって検出し（図１０参照）、ＧＣ分析を用いてより詳細に検討した（表３ａおよび３ｂ参照）。
【０２２５】
安定なＨＩＣＣＬ４およびＣＹＰ５２Ａ９発現酵母株によるｆａｓ１  ｍｕｔ４／ＦＡＳ２発現は最も高い量のＤＣＡ１７：０を生産したが（〜０．４０μｇ／ＯＤ６００）、ｆａｓ１  ｍｕｔ２／ＦＡＳ２の発現は〜０．３７μｇ／ＯＤ６００のＤＣＡ１７：０を生産した（図１１）。
【０２２６】
【表３】
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【０２２７】
【表４】
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【０２２８】
【表５】
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【０２２９】
【表６】
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【０２３０】
例１３：ＭＣＣ０２８発現はＤＣＡのＣｏＡ活性化を増大させた
上流のムスコン中間体ＤＣＡ１６：０−ＣｏＡの増大した生産は最終産物ムスコンの向上した生産をもたらし得る。
【０２３１】
ＤＣＡコントロール酵母株およびＭＣＣ０２８またはＭＣＣ０４７（アシルＣｏＡシンターゼ）を発現するＤＣＡ酵母株を、ＤＣＡ１６：０−ＣｏＡを生産するそれらの能力に基づいて評価した。
【０２３２】
野生型コントロール株によるＤＣＡ１６：０生産は検出不可能であり、ＭＣＣ０４７を発現するＤＣＡ株およびＤＣＡ株単独は類似の量のＤＣＡ１６：０−ＣｏＡを生産した（〜５０００相対ピーク面積）。対照的に、ＤＣＡ株がＭＣＣ０２８を発現するときには、ＤＣＡ１６：０−ＣｏＡの有意な生産があった（〜５０，０００相対ピーク面積）。これは本明細書において詳述される他の実験で観察されるＤＣＡ１６：０−ＣｏＡの生産の１０倍よりも多かった（図１２）。
【０２３３】
例１４：内在性のアシルＣｏＡシンターゼを過剰発現する酵母株によるＤＣＡ形成
Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）には、脂肪酸の搬入、活性化、および代謝に関わる４つの内在性の長鎖アシルＣｏＡシンターゼ酵素がある。内在性の酵母アシルＣｏＡシンターゼを過剰発現する酵母によるＤＣＡのＣｏＡ活性化を決定することは、異なる量のＤＣＡ１６：０−ＣｏＡをもたらした。
【０２３４】
Ｆａａ１、Ｆａａ４、またはＦａａ１およびＦａａ４の組み合わせを、野生型酵母株、ＤＣＡコントロール酵母株、およびｐｏｘ１Δ０欠失を有するＤＣＡ酵母株によって過剰発現した。ＤＣＡ１６：０−ＣｏＡ形成はＦａａ１およびＦａａ４を共発現するＤＣＡコントロール酵母株において最も高かった（〜３００００ＲＰＵ）。
【０２３５】
例１５：インビボサンプル中の分岐短鎖脂肪酸（ＳＢＣＦＡ）エチルエステルの定性およびキラル分析
（Ｒ）および（Ｓ）−２−メチル酪酸などの分岐短鎖脂肪酸はムスコンを生産するための出発分子として用いられ得るので、追加の定性およびキラル分析を行って、どのキラルな２−メチル酪酸サンプルが最も高い量の２−メチル酪酸エチルエステルを生産するかを同定した。
【０２３６】
各エチルエステル標準の５μＬを５００μＬの１０％塩酸−エタノール（ｖ／ｖ）と反応させた。それから、反応混合物を１５００ｒｐｍで６０℃において２時間に渡って振盪して、ＳＢＣＦＡをエチル化した。６００μｌのｎ−ヘキサンを追加し、次にＭＱ水中の６００μｌの飽和ＫＨＣＯ３溶液の追加をした。それから、サンプルを１分に渡ってボルテックスし、有機層を吸い取り、６００μｌのｎ−ヘキサンを用いて抽出を繰り返した。組み合わせた有機相をＭＱ水によって６００μｌで洗浄し、それから吸い取り、硫酸ナトリウムによって乾燥した。
【０２３７】
およそ４０ｍｌの酵母（ＦＡＳ１  ＷＴ  ｃｌ．２）培養上清を１０ｍｌの酢酸エチルによって２回抽出した。有機溶媒を収集し、硫酸ナトリウムによって乾燥し、窒素の穏やかな流れを用いて蒸発させた。揮発性のＳＢＣＦＡの損失を最小化するために、サンプルは氷浴の手段によって冷却した。５００μｌの１０％塩酸−エタノール（ｖ／ｖ）を上清抽出物に追加し、サンプルを上に記載されている通り処置した。
【０２３８】
１００ＯＤ単位（６００ｎｍで）に対応する酵母（ＦＡＳ１  ＷＴ  ｃｌ．２）ペレットを収集した。酵母細胞を１ｍｌエタノールおよび１５００ｒｐｍでの振盪を用いて１時間に渡って６０℃で破裂させた。細胞断片を遠心して除き（１４０００ｒｐｍ、４ｍｉｎ）、エタノール性の上清を収集した。１００μｌ塩酸（３７％）をペレット抽出物に追加し、混合物を反応させ、上で例５に記載されている通り処置した。
【０２３９】
それから、アジレント５９７５Ｃ−ＭＳＤを有しかつレステック（Restek）Ｒｘｉ−５ｍｓカラム２５ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍを備えたアジレント７８９０Ａ−ＧＣ系を用いて、誘導体化された標準サンプルならびにペレットおよび上清からの有機抽出物をアキラル品質コントロール分析のためのガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）に付した）。ＧＣ分析に用いたプログラムは次の通りであった：４５℃での３分の初期ホールド；５℃／分での５０℃へのｒａｍｐおよび３ｍｉｎのホールド；１００℃／ｍｉｎでの３００℃へのｒａｍｐおよび３ｍｉｎのホールド。ヘリウムをキャリアガスとして用い、７．１４ｐｓｉの定圧で流した。インジェクターは２５０℃に維持し、イオン源温度は２３０℃にセットした。注入体積はスプリットレスモードで１．０μｌであった。脂肪酸アシルメチルエステル標準の保持時間および質量スペクトルとの比較ならびに／または公開されたデータ（ＮＩＳＴ／ＥＰＡ／ＮＩＨ質量スペクトルライブラリーバージョン２．０ｇ）との質量スペクトルの比較によって、該当のＧＣピークを同定した。データ分析はアジレントＥｎｈａｎｃｅｄ−Ｄａｔａ−ＡｎａｌｙｓｉｓおよびＭａｓｓＦｉｎｄｅｒ−４（ドクター・ホッホムート・サイエンティフィック・コンサルティング（Dr. Hochmuth Scientific Consulting））ソフトウェアを用いて行った。
【０２４０】
品質コントロール後に、それから、レステック（Restek）Ｒｔ−β−ＤＥＸ３２５カラム（３０ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×０．２５μｍ）を備えた水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を有する島津ＧＣ−２０１０ＧＣ系を用いて、誘導体化されたサンプルをキラルガスクロマトグラフィーに付した。ＧＣ分析に用いたプログラムは次の通りであった：５０℃における１分の初期ホールド；０．２０℃／分での５５℃へのｒａｍｐ；３．００℃／分での１００℃へのｒａｍｐ；６０℃／分での２５０℃へのｒａｍｐおよび最後に２５０℃における１分のホールド。ヘリウムをキャリアガスとして用いた（カラム入口圧力：１００．０ｋＰａ）。インジェクターは２５０℃に保った。水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）は２５０℃にキープした（Ｈ２流：４０ｍｌ／分、メークアップ：３０ｍｌ／分（Ｎ２）、空気流：４００ｍｌ／分）。
【０２４１】
（Ｓ）および（Ｒ）−２−メチル酪酸エチルエステルの定量から、エナンチオマー純度（％ｅｅ）を計算した（表４）。（Ｓ）−２−メチル酪酸エチルエステルの測定値は酵母上清では少なくとも８０％ｅｅ、具体的には８４．８％、酵母ペレットでは７７．４％を示した。
【０２４２】
【表７】
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【０２４３】
例１５：（Ｒ）−（＋）−３−メチルヘキサデカン酸からのｌ−ムスコンの生産
ジカルボン酸からムスコンなどの大環状化合物を生産するためのいくつかの方法が公知であり、例えば照沼ら（ザ・ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（The Journal of Organic Chemistry），Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．８，１９８７年，ｐ．１６３０−１６３２）に記載されている。１つのかかる方法はディークマン縮合反応である。縮合反応の具体的なジカルボン酸基質の慎重な提供または選択によって、価値ある大環状ケトンの様々な種が生産され得る。
【０２４４】
無水エタノール中の（Ｒ）−（＋）−３−メチルヘキサデカン二酸の溶液を１〜６時間に渡ってＰＯＣｌ３の存在下で還流して、エチルエステルを与える。溶媒の蒸発後に、ジエチルエーテル、酢酸エチル、またはジクロロメタンなどの好適な溶媒を残渣に追加し、得られた溶液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液および水によって洗浄する。それから、蒸発に先行して、溶液をＮａ２ＳＯ４またはＭｇＳＯ４によって乾燥する。純粋な（Ｒ）−（＋）−ジエチル３−メチルヘキサデカノエートがフラッシュクロマトグラフィーまたは蒸留によって得られる。
【０２４５】
［（ＣＨ３）３Ｓｉ］２ＮＬｉ（ＬｉＨＭＤＳ）または［（ＣＨ３）３Ｓｉ］２ＮＮａ（ＮａＨＭＤＳ）の存在下における高希釈法を用いることによって、窒素雰囲気下で、（Ｒ）−（＋）−ジエチル３−メチルヘキサデカノエートのディークマン環化を実行する。レオナード（Leonard）らの装置の改変バージョンを採用して（米国化学会誌，１９５２年，第７４巻，ｐ．１７０４）、高希釈を達成する。それから、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の（Ｒ）−（＋）−ジメチル３−メチルヘキサデカノエートの溶液を、乾燥ＴＨＦ中の［（Ｍｅ３Ｓｉ）２ＮＮａ］または［（Ｍｅ３Ｓｉ）２ＮＬｉ］の穏やかな還流溶液に、４〜８時間の期間に渡って激しくかき混ぜながら不活性雰囲気下で追加する。この追加が完了した後に、混合物を追加の０．２５〜３時間に渡って還流する。混合物への酢酸の追加後に、溶液を水によって洗浄し、それからＮａ２ＳＯ４またはＭｇＳＯ４によって乾燥する。薄層クロマトグラフィーまたはフラッシュクロマトグラフィーによる産物の蒸発および単離はエチル（４Ｒ）−４−メチル−２−オキソシクロペンタデカン−１−カルボキシレートおよびエチル（２Ｒ）−２−メチル−１５−オキソシクロペンタデカン−１−カルボキシレートの混合物を生産する。
【０２４６】
エチル（４Ｒ）−４−メチル−２−オキソシクロペンタデカン−１−カルボキシレートおよびエチル（２Ｒ）−２−メチル−１５−オキソシクロペンタデカン−１−カルボキシレート、Ｍｅ２ＳＯ４、ならびに水の混合物を、撹拌しながら１４０〜１８６℃で不活性雰囲気下において２〜８時間に渡って維持する（テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters），１９７３年，Ｎｏ．１２，ｐ．９５７−９６０）。冷却後に、水を混合物に追加し、混合物をペンタン、ヘプタン、またはシクロヘキサンなどの炭化水素溶媒によって抽出する。それから、組み合わせた抽出物をＮａ２ＳＯ４またはＭｇＳＯ４によって乾燥する。蒸留またはフラッシュクロマトグラフィーによる蒸発および単離はｌ−ムスコンの生産をもたらす。
【０２４７】
その具体的な実施形態を参照して詳細に本発明を記載した。添付の請求項によって定義される本発明の範囲から外れることなしに、改変および変形が可能であるということは明らかであろう。より具体的には、本発明のいくつかの態様が特に有利として本明細書において同定されているが、本発明は必ずしも本発明のこれらの特定の態様に限定されないということが企図される（図１３）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2021500915.tif 000023
【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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