(57)【要約】  本発明は、広義には、クレアチニンの判定の分野に関する。具体的には、本発明は、新規な核酸およびアミノ酸配列ならびに優れた酵素活性を特徴とする新規なクレアチニンデイミナーゼを提供する。本発明はまた、サンプル中のクレアチニンの量を判定するためのアッセイを含む、このクレアチニンデイミナーゼの使用も提供する。これらは、とりわけ、腎臓疾患の検出に有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クレアチニンデイミナーゼ活性を有する、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその少なくとも８０％の配列同一性の変異体を含む単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチド。
【請求項２】
変異体の配列が以下の１つ以上を保持する、請求項１に記載の単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチド：
配列番号４のアミノ酸３６４、
配列番号４のアミノ酸３７１、
配列番号４のアミノ酸３９４、および／または
配列番号４のアミノ酸残基４１０〜４１９のうち１つ以上（好ましくはすべて）。
【請求項３】
Ｍｎ２＋に結合している、請求項１または２に記載の単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項５】
ティシエレラ・クレアチニニクレアチニンデイミナーゼ５’ＵＴＲをさらに含む、請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項６】
ティシエレラ・クレアチニニクレアチニンデイミナーゼ３’ＵＴＲをさらに含む、請求項４または５に記載の単離された核酸。
【請求項７】
少なくとも配列番号３のヌクレオチド１〜１３７４またはその少なくとも８０％の配列同一性の変異体（好ましくは、配列番号３のヌクレオチド１〜１５９４またはその少なくとも８０％の配列同一性の変異体）を含む、請求項４〜６のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項４〜７のいずれかに記載の核酸または請求項８に記載のベクターを含む細胞、ここで該細胞はティシエレラ・クレアチニニ細胞ではなく、好ましくは大腸菌細胞である。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを産生する方法、
（ｉ）請求項４〜７のいずれかに記載の核酸を、請求項９に記載の細胞に発現させる工程、および
（ｉｉ）クレアチニンデイミナーゼポリペプチドを単離する工程。
【請求項１１】
サンプル中のクレアチニンの量を判定するための、請求項１〜３のいずれかに記載のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドの使用。
【請求項１２】
以下の工程を含む、サンプル中のクレアチニンの量を判定する方法、
（ａ）サンプルを請求項１〜３のいずれかに記載のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドと接触させ、サンプル中のクレアチニンをＮ−メチルヒダントインおよびＮＨ３／４＋に変換する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の変換を定量する工程。
【請求項１３】
工程（ｂ）が、工程（ａ）において産生されたＮＨ３／４＋の量を判定することを含み、工程（ａ）が、サンプルをＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ、α−ケトグルタル酸およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼと接触させ、ＮＨ３／４＋、α−ケトグルタル酸およびＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨをグルタミン酸およびＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋にそれぞれ変換させることをさらに含み、工程（ｂ）が、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの消費をそれぞれ定量することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法に従ってサンプル中のクレアチニンの量を判定するのに好適な試薬キットであって、請求項１〜３のいずれかに記載のクレアチニンデイミナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、および任意でｐＨ緩衝液を含む、試薬キット。
【請求項１５】
サンプル中のクレアチニンの量を判定するのに好適なセンサであって、センサ内または上に固定化された請求項１〜３のいずれかに記載のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを含む、センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広義には、クレアチニンの判定の分野に関する。具体的には、本発明は、新規な核酸およびアミノ酸配列ならびに優れた酵素活性を特徴とする新規なクレアチニンデイミナーゼを提供する。本発明はまた、サンプル中のクレアチニンの量を判定するためのアッセイを含む、このクレアチニンデイミナーゼの使用も提供する。これらは、とりわけ、腎臓疾患の検出に有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．５．４．２１）とも称される酵素クレアチニンデイミナーゼは、クレアチニンのＮ−メチルヒダントインへの加水分解を触媒し、それによって、アンモニアが放出される。それは、クレアチニンの分解のための細菌代謝に関与し、尿および血清中のクレアチニンの診断的判定のために関心が持たれている。クレアチニンデイミナーゼは、金属タンパク質であり、Ｚｎ２＋およびＦｅ２＋が、その活性化に優れている。関連する酵素であるシトシンデアミナーゼの３次元構造により、Ｚｎ２＋およびＦｅ２＋イオンが、そのような酵素の触媒金属イオンとして活性部位に存在することが判明した。また、この構造に基づいて、ティシエレラ・クレアチニニ（Tissierella creatinini）に由来するクレアチニンデイミナーゼの３次元構造モデルを生成することができ、そのタンパク質配列は、欧州特許第ＥＰ  １  ３２５  ９５８号Ａ１に配列番号１として記載されている。この構造モデルにおいて、Ｚｎ２＋原子は、活性部位に位置している（Nishiya, Int J Anal Bio-Sci, 1: 55-59, 2013）。
【０００３】
Ｔ．クレアチニニに由来するクレアチニンデイミナーゼは、クレアチニンの診断的分析における適用に関して、優れた特性を有することが公知である。欧州特許第ＥＰ  １  ３２５  ９５８号Ａ１は、この酵素の分子クローニングおよび組換え発現について記載している。しかしながら、現時点で、本発明者が知る限り、科学文献または特許文献に、欧州特許第ＥＰ  １  ３２５  ９５８号Ａ１の組換え酵素の組換え産生または使用についての報告は存在しない。
【０００４】
本発明者は、欧州特許第ＥＰ  １  ３２５  ９５８号Ａ１に記載されている配列情報および発現設定に従ってクレアチニンデイミナーゼの組換え産生プロセスを確立しようと試みた。しかしながら、欧州特許第ＥＰ  １  ３２５  ９５８号Ａ１の教示は酵素的に不活性なクレアチニンデイミナーゼタンパク質をもたらしたため、すべての試みは失敗に終わった。次に、本発明者は、欧州特許第ＥＰ  １  ３２５  ９５８号Ａ１に教示されているものとは異なるクレアチニンデイミナーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、活性なタンパク質をもたらすことを見出した。具体的には、本発明者は、発現および活性の分析実験において、非翻訳領域が、活性なＴ．クレアチニニクレアチニンデイミナーゼの発現を可能にするかまたは促進することを見出した。十分に高い発現レベルは、酵素に基づく適用の商業化にもっとも重要である。
【０００５】
さらに、本発明者は、Ｍｎ２＋を触媒金属イオンとして使用することで、クレアチニンデイミナーゼの活性および安定性が増加することを見出した。Ｍｎ２＋ローディング下において、この酵素は、市販入手可能なクレアチニンデイミナーゼと比較して、優れた挙動を示す。
【発明の概要】
【０００６】
第１の態様において、本発明は、配列番号４によるアミノ酸配列またはその少なくとも８０％の配列同一性の変異体を含む、単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドであって、クレアチニンデイミナーゼ活性を有する、単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに関する。
【０００７】
第２の態様において、本発明は、第１の態様に定義されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。
【０００８】
第３の態様において、本発明は、第２の態様の核酸を含む、ベクターに関する。
【０００９】
第４の態様において、本発明は、第１の態様のポリペプチド、第２の態様の核酸、または第３の態様のベクターを含む、細胞に関する。
【００１０】
第５の態様において、本発明は、第１の態様に定義されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを産生するための方法であって、
（ｉ）第２の態様に定義される核酸を、第４の態様に定義される細胞において発現させる工程と、
（ｉｉ）クレアチニンデイミナーゼポリペプチドを単離する工程と
を含む、方法に関する。
【００１１】
第６の態様において、本発明は、第５の態様に定義される方法を用いて産生されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに関する。
【００１２】
第７の態様において、本発明は、サンプル中のクレアチニンの量を判定するための第１または第６の態様に定義されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドの使用に関する。
【００１３】
第８の態様において、本発明は、サンプル中のクレアチニンの量を判定するのに好適なキットであって、第１または第６の態様に定義されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを含む、キットに関する。
【００１４】
第９の態様において、本発明は、サンプル中のクレアチニンの量を判定するのに好適な組成物であって、第１または第６の態様に定義されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを含む、組成物に関する。
【００１５】
第１０の態様において、本発明は、対象において腎臓疾患を検出するためのインビトロ（in vitro）方法であって、第７の態様に定義される対象から得られたサンプル中のクレアチニンの量を判定することを含み、正常値よりも多いクレアチニンの量は、対象が腎臓疾患を有することを示す、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、クレアチニンデイミナーゼの発現のためのクローニング戦略である（説明については、実施例２を参照されたい）。Ａ：戦略１、Ｂ：戦略２。
【図２】図２は、発現クローンの全細胞ライセートのＳＤＳ  Ｐａｇｅ分析である。合成ＤＮＡに由来するクローン由来のタンパク質が、ゲノムＤＮＡに由来するクローン由来のタンパク質と比較して、速く遊走することが、明らかに理解できる。戦略２のすべてのクローンは、目視確認できる量のクレアチニンデイミナーゼタンパク質を発現しなかった。
【表１】
2021509289.tif 000002
【図３】図３は、遠心分離分画によって得られたタンパク質画分のＳＤＳ  Ｐａｇｅ分析である。
【表２】
2021509289.tif 000003
【図４】図４は、クローンの活性分析である。ａ：クローン１、１６０００ｇ上清、ｂ：ｃｔＨｉｓ、クレアチニンなし、ｃ：ｃｔＨｉｓ、精製、１：１０、ｄ：クローン１、クレアチニンなし、ｅ：ｃｔＨｉｓ  １６０００ｇ上清、ｆ：クローン８、１６０００ｇ上清。クローン１：ゲノムフラグメント、戦略１、配向１；クローン８：合成フラグメント、戦略１、配向１；ｃｔＨｉｓ：ゲノムフラグメント、戦略１、配向１、Ｃ末端Ｈｉｓタグ挿入（図１を参照されたい）。ｃｔＨｉｓ精製：Ｎｉ−キレートクロマトグラフィーによって精製されたタンパク質。
【図５】図５は、Ｈｓタグ化変異体のペレット画分および上清画分のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。非タグ化変異体クローン１およびクローン８は、参照として得た。ライセートの活性は、ＮＡＤＨ消費の傾きから半定量的に推定した。コンストラクトについては、図１（クローン１および８）ならびに図６（クローン３ｈ、４Ｈ、６ｈ、および１１ｈ）を参照されたい。ｎ．ｄ．：未判定。
【表３】
2021509289.tif 000004
【図６】図６は、クローン１ｈのＮｉ−キレートクロマトグラフィー精製から得られたライセートおよび溶出画分のＳＤＳ  ＰＡＧＥである。非タグ化クローン８および１のペレットおよび上清画分は、それぞれ、参照としてロードした。
【表４】
2021509289.tif 000005
【図７】図７は、クレアチニンデイミナーゼタンパク質調製物のＳＤＳ  Ｐａｇｅである。タンパク質濃度の判定に基づいて、０．７μｇのタンパク質を、それぞれのタンパク質についてロードした（クローン１および１１は、参照として使用した）。クローン１（レーン２）は、１６，０００×ｇ上清調製物として適用し、クローン１ｈおよび１１ｈは、Ｎｉ−キレート精製タンパク質調製物として適用した。Ｔｏｙｏｂｏ酵素調製物中に安定剤として存在するものが不明であるため、溶液調製物の酵素量を加重した。
【表５】
2021509289.tif 000006
【図８】図８は、Ｔ．クレアチニニに由来するクレアチニンデイミナーゼおよびＴｏｙｏｂｏの市販調製物を用いた活性アッセイにより得られた反応曲線である。詳細については、実施例５を参照されたい。Ａ：１μｇのクレアチニンデイミナーゼタンパク質。Ｂ：０．１μｇのクレアチニンデイミナーゼタンパク質。ａ：ブランク、ｂ：Ｔｏｙｏｂｏ、ｃ：クローン１ｈ、ｄ：クローン１１ｈ
【図９】図９は、安定性試験により得られたサンプルのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。それぞれのサンプルのタンパク質２０μｇを、ゲルにロードした。
【表６】
2021509289.tif 000007
【図１０】図１０は、Ｔ．クレアチニニに由来するクレアチニンデイミナーゼによるクレアチニンの判定である。ΔＥ値は、２回の独立した判定により得られたものであり、１０分間（三角形および四角形）ならびに２０分間（円形および十字）の反応時間で得られたものである。
【図１１】図１１は、ライセートおよび精製されたタンパク質のＳＤＳゲル分析である。レーン１および５；サイズ標準物（Ｐａｇｅルーラーである事前染色したタンパク質ラダー）、レーン２：細胞ライセート、レーン３：２μｇの精製タンパク質、レーン４：５μｇの精製タンパク質。
【図１２】図１２は、金属をロードしたタンパク質調製物（Ｃｄｉ−金属交換）の比活性である。野生型：未処置タンパク質（培地にＭｎ２＋を添加して産生）、Ｍｎ、Ｍｎ＋Ｆｅ、Ｍｎ＋Ｚｎ、Ｆ＋Ｚｎ、およびＭｎ＋Ｆｅ＋Ｚｎ：それぞれの金属２＋イオンで処置したアポタンパク質（野生型の金属抽出調製物）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に本発明を詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の手法、プロトコール、および試薬が変動可能であるため、それらに制限されるものではないことを理解されたい。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のものにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限することを意図するものではないこともまた、理解されたい。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。
【００１８】
好ましくは、本明細書において使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載のように定義される。
【００１９】
いくつかの文書が、本明細書全体を通じて引用されている。本明細書に引用される文書のそれぞれ（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上述または後述に関係なく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書において、先行する発明により本発明がそのような開示に先立つ権利を有さないことを認めると解釈されるものは存在しない。
【００２０】
以下に、本発明の要素を記載する。これらの要素は、特定の実施形態とともに列挙されているが、それらを、任意の様式および任意の数で組み合わせて、さらなる実施形態を作製することができることを理解されたい。様々に説明されている実施例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに制限すると解釈されるものではない。この説明は、明示的に記載されている実施形態を、任意の数の開示される要素および／または好ましい要素と組み合わせた、実施形態を補助および包含すると理解されるものである。さらに、本出願におけるすべての記載される要素のあらゆる順列および組合せが、文脈により別途示されない限り、本出願の説明によって開示されると考えられるべきである。
【００２１】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈により別途要求されない限り、「含む（comprise）」という言葉、および「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」などの変化形は、言及された整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の包含を意味するが、任意の他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の除外は意味しないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈により別途明確に指示されない限り、複数形の参照物を含む。
【００２２】
本発明の態様およびその特定の実施形態
第１の態様において、本発明は、配列番号４によるアミノ酸配列またはその少なくとも８０％の配列同一性の変異体を含む、単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドであって、クレアチニンデイミナーゼ活性を有する、単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに関する。
【００２３】
本明細書における単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドへの参照には、配列番号４によるアミノ酸配列ならびにその変異体を含むポリペプチドが含まれる。
【００２４】
第１の態様によると、単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、酵素的に活性である。配列番号４によるアミノ酸配列を含むクレアチニンデイミナーゼポリペプチドの活性は、０．００２〜０．０２（例えば、０．００５）ｍｇ／ｍｌのクレアチニンデイミナーゼポリペプチド濃度で好ましくは少なくとも１０Ｕ／ｍｇ、より好ましくは少なくとも１５Ｕ／ｍｇであるか、または０．００２ｍｇ／ｍｌのクレアチニンデイミナーゼポリペプチド濃度で少なくとも２０Ｕ／ｍｇ、より好ましくは少なくとも２４Ｕ／ｍｇである。変異体は、単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドの酵素活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、もっとも好ましくは同じ活性（理想的には１００％）を有する。
【００２５】
単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、好ましくは、可溶性である。
【００２６】
好ましい実施形態において、変異体の配列は、配列同一性の最低レベルに関係なく、以下のうちの１つまたは複数を保持する：
−  配列番号４のアミノ酸３６４、
−  配列番号４のアミノ酸３７１、
−  配列番号４のアミノ酸３９４、および／または
−  配列番号４のアミノ酸残基４１０〜４１９のうちの１つもしくは複数、好ましくはすべて。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、例えば、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、およびＭｎ２＋からなる群から選択される、少なくとも１つの金属ジカチオン、好ましくはＭｎ２＋に結合しているか、または結合することができる。一実施形態において、それは、Ｍｎ２＋に結合しており、Ｚｎ２＋またはＦｅ２＋にも結合していてもよい。結合していてもよいＺｎ２＋またはＦｅ２＋のうちでは、Ｚｎ２＋が好ましい。
【００２８】
以下の第５および第６の態様により示されるように、本発明はまた、複数の第１の態様のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに関する。特定の実施形態において、複数のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドのクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに対するＭｎ２＋のモル比は、少なくとも０．０５または０．１０（金属：タンパク質サブユニット）であり、好ましくは少なくとも０．１５（例えば、少なくとも０．１７、０．１９、０．２１、または０．２３）であり、より好ましくは少なくとも０．２５である。本発明によるＭｎ２＋の理論上の上限は、２であり（１つの金属ジカチオンが、２つのタンパク質サブユニットのそれぞれに結合し得る）、これは、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。１つの好ましい実施形態において、Ｍｎ２＋の上限は、１であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。別の好ましい実施形態において、Ｍｎ２＋の上限は、０．５であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。
【００２９】
好ましくは、この特定の実施形態において、複数のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドのクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに対するＺｎ２＋のモル比は、少なくとも０．０５または０．１５（金属：タンパク質サブユニット）であり、好ましくは少なくとも０．２５（例えば、少なくとも０．３、０．４、または０．５）であり、もっとも好ましくは少なくとも０．５２である。本発明によるＺｎ２＋の理論上の上限は、２からＭｎ２＋に選択された最小比を減算したもの、例えば、Ｍｎ２＋の最小比が０．０５の場合は１．９５であるか、またはＦｅ２＋も含まれる場合（以下を参照されたい）、２からＭｎ２＋に選択された最小比およびＦｅ２＋に選択された最小比を減算したものである。これは、前述のＺｎ２＋の下限のそれぞれと組み合わされ得る。１つの好ましい実施形態において、Ｚｎ２＋の上限は、１．６であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。別の好ましい実施形態において、Ｚｎ２＋の上限は、１．３であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。
【００３０】
この特定の実施形態において、複数のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドのクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに対するＦｅ２＋のモル比が、少なくとも０．０５または０．１０（金属：タンパク質サブユニット）であり、好ましくは少なくとも０．１５（例えば、少なくとも０．２、０．２５、または０．３）であり、もっとも好ましくは少なくとも０．４２であることもまた、想定される。本発明によるＦｅ２＋の理論上の上限は、２からＭｎ２＋に選択された最小比を減算したもの、例えば、Ｍｎ２＋の最小比が０．０５の場合は１．９５であるか、またはＺｎ２＋も含まれる場合（上記を参照されたい）、２からＭｎ２＋に選択された最小比およびＺｎ２＋に選択された最小比を減算したものである。これは、前述のＦｅ２＋の下限のそれぞれと組み合わされ得る。１つの好ましい実施形態において、Ｆｅ２＋の上限は、１．２であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。別の好ましい実施形態において、Ｆｅ２＋の上限は、０．７であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。
【００３１】
様々な好ましい実施形態において、複数のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドのクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに対するモル比は、以下の通りである（金属：タンパク質サブユニット；それぞれの実施形態において、モル比の上限は、好ましくは、Ｍｎ２＋については１であり、Ｚｎ２＋については１．５である）：
少なくとも０．０５のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．１０のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．１５のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．１７のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．１９のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．２１のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．２３のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．２５のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）。
【００３２】
Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、および／またはＦｅ２＋の任意の組合せの合計の金属：タンパク質サブユニットの比は、多くとも２であり得ることが理解される。しかしながら、すべての活性部位が、金属によって占有されるわけではないため、これは、より低い、例えば、最大１．９、１．７、または１．５である場合もある。好ましい実施形態において、組み合わされた合計のＭｎ２＋、Ｚｎ２＋および／またはＦｅ２＋：タンパク質サブユニットの比は、１〜２であり、好ましくは１．３〜２であり、より好ましくは１．５（または１．６）〜１．９であり、もっとも好ましくは１．７〜１．８５である。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、複数のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドのクレアチニンデイミナーゼポリペプチドの少なくとも１％、少なくとも２％、または少なくとも３％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも７％、およびもっとも好ましくは少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％または少なくとも１９％）は、Ｍｎ２＋が結合する活性部位を含む。
【００３４】
単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、Ｃ末端またはＮ末端タグ、好ましくはＨｉｓタグを含み得る。
【００３５】
さらに、単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、タグと配列番号４によるアミノ酸配列またはその変異体との間にペプチドリンカーを含み得る。リンカーの長さは、好ましくは、２〜２０、より好ましくは３〜１５または４〜１０アミノ酸、例えば、５アミノ酸である。ペプチドリンカーは、例えば、プロテアーゼ切断部位、すなわち、プロテアーゼによって認識可能かつ切断可能な切断部位を含むことに起因して、切断可能であることが好ましい。プロテアーゼは、好ましくは、切断部位の配列に特異的である、すなわち、プロテアーゼは、単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを、切断部位においてのみ認識し切断する。配列特異的プロテアーゼは、周知である。好ましくは、プロテアーゼは、エンテロペプチダーゼである。例示的な切断部位は、トロンビン切断部位（配列番号９の残基４〜９）である。
【００３６】
第２の態様において、本発明は、第１の態様に定義されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。この単離された核酸は、好ましくは、配列番号３のヌクレオチド１１５〜１３７４によるヌクレオチド配列、またはその少なくとも８０％の配列同一性の変異体を含む。配列番号３のヌクレオチド１３７２〜１３７４は、終止コドンＴＡＡを指し、これは、異なる終止コドンＴＡＧまたはＴＧＡと交換されてもよい。配列同一性の最低レベルに関係なく、変異体の配列は、配列番号３のヌクレオチド１２０４、１２０５、１２２５、１２９５、および／または１３１４のうちの１つまたは複数を保持することが、特に好ましい。
【００３７】
好ましい実施形態において、第２の態様の単離された核酸は、ティシエレラ・クレアチニニクレアチニンデイミナーゼ５’  ＵＴＲを含む。好ましくは、５’  ＵＴＲは、配列番号３の少なくともヌクレオチド１０５〜１１４（範囲１）、少なくともヌクレオチド９５〜１１４（範囲２）、少なくともヌクレオチド７５〜１１４（範囲３）、少なくともヌクレオチド６５〜１１４（範囲４）、少なくともヌクレオチド５５〜１１４（範囲５）、少なくともヌクレオチド４５〜１１４（範囲６）、少なくともヌクレオチド３５〜１１４（範囲７）、少なくともヌクレオチド２５〜１１４（範囲８）、少なくともヌクレオチド１５〜１１４（範囲９）、少なくともヌクレオチド５〜１１４（範囲１０）、または少なくともヌクレオチド１〜１１４（範囲１１）（それぞれの範囲は、先行するものよりも好ましい）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の変異体を含む。５’  ＵＴＲは、好ましくは、核酸がコードするクレアチニンデイミナーゼポリペプチドの発現および／またはクレアチニンデイミナーゼ活性を改善するかまたは確実にすることを特徴とする。発現を改善するかまたは確実にするとは、例えば、不溶性ポリペプチドを含む合計量に対する比率としての、可溶性形態で発現されるポリペプチドの合計発現レベルおよび／または量を指し得る。
【００３８】
さらに、第２の態様の単離された核酸が、特に前述の５’  ＵＴＲに加えて、ティシエレラ・クレアチニニクレアチニンデイミナーゼ３’  ＵＴＲを含むことが好ましい。好ましくは、３’  ＵＴＲは、配列番号３の少なくともヌクレオチド１３７５〜１３９４（範囲１）、少なくともヌクレオチド１３７５〜１４１４（範囲２）、少なくともヌクレオチド１３７５〜１４３４（範囲３）、少なくともヌクレオチド１３７５〜１４５４（範囲４）、少なくともヌクレオチド１３７５〜１４７４（範囲５）、少なくともヌクレオチド１３７５〜１４９４（範囲６）、少なくともヌクレオチド１３７５〜１５１４（範囲７）、少なくともヌクレオチド１３７５〜１５２４（範囲８）、少なくともヌクレオチド１３７５〜１５４４（範囲９）、少なくともヌクレオチド１３７５〜１５６４（範囲１０）、または少なくともヌクレオチド１３７５〜１５９４（範囲１１）（それぞれの範囲は、先行するものよも好ましい）、またはその少なくとも８０％の配列同一性の変異体を含む。配列同一性の最低レベルに関係なく、変異体の配列は、配列番号３のヌクレオチド１５２４を保持することが、特に好ましい。３’  ＵＴＲは、好ましくは、核酸がコードするクレアチニンデイミナーゼポリペプチドの発現および／またはクレアチニンデイミナーゼ活性を改善することを特徴とする。発現の改善とは、上記に定義されている意味を有する。
【００３９】
第２の態様の単離された核酸が、５’および３’  ＵＴＲの両方を含む実施形態において、前述の５’  ＵＴＲ範囲のそれぞれは、前述の３’  ＵＴＲ範囲のそれぞれと組み合わされ得る。しかしながら、対応する範囲１を、互いに、または１１個のうちの範囲２、３、４、５、６、７、８、９、１０（それぞれの組合せは、先行するものよりも好ましい）と組み合わせることが、好ましい。
【００４０】
１つの好ましい実施形態において、第２の態様の単離された核酸は、少なくとも配列番号３のヌクレオチド１〜１３７４、またはその少なくとも８０％の配列同一性の変異体を含む。より好ましい実施形態において、それは、配列番号３のヌクレオチド１〜１５９４、またはその少なくとも８０％の配列同一性の変異体を含む。
【００４１】
上述の配列のいずれについても、適宜、単離された核酸は、配列番号３のヌクレオチド１１５〜１３７４によるヌクレオチド配列またはその変異体の３’末端または５’末端に挿入される、上述のタグをコードする核酸配列を含んでもよい。この核酸は、タグをコードする核酸配列と配列番号３のヌクレオチド１１５〜１３７４によるヌクレオチド配列またはその変異体との間に挿入される、上述のペプチドリンカーをコードする核酸配列をさらに含んでもよい。
【００４２】
第３の態様において、本発明は、第２の態様の核酸を含む、ベクターに関する。ベクターは、好ましくは、第２の態様の核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。プロモーターは、誘導性であっても構成的であってもよい。
【００４３】
第４の態様において、本発明は、第１の態様のポリペプチド、第２の態様の核酸、または第３の態様のベクターを含む、細胞に関する。細胞は、真核生物細胞であってもよいが、好ましくは、原核生物細胞、より好ましくは細菌細胞である。細菌細胞の好ましい例は、大腸菌細胞である。細胞は、ティシエレラ・クレアチニニ細胞ではない。
【００４４】
第５の態様において、本発明は、第１の態様に定義される単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを産生するための方法であって、
（ｉ）第２の態様に定義される核酸を、第４の態様に定義される細胞において発現させる工程と、
（ｉｉ）クレアチニンデイミナーゼポリペプチドを単離する工程と
を含む、方法に関する。
【００４５】
好ましくは、単離されたクレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、可溶性である。
【００４６】
好ましい実施形態において、本方法は、第１の態様に定義されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを産生するための方法であって、工程（ｉｉ）において、クレアチニンデイミナーゼポリペプチドが単離される、方法である。
【００４７】
好ましくは、第５の態様の方法の工程（ｉ）は、細胞を、１つまたは複数の金属ジカチオンを含む培地中で培養することを含む。一実施形態において、１つまたは複数の金属ジカチオンは、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、およびＭｎ２＋からなる群から選択される。例えば、培地は、Ｚｎ２＋および／またはＦｅ２＋を含み得る。しかしながら、培地は、Ｍｎ２＋を含み、Ｚｎ２＋および／またはＦｅ２＋も含んでもよいことが、好ましい。含まれてもよいＺｎ２＋および／またはＦｅ２＋のうちでは、Ｚｎ２＋が好ましい。培地中のそれぞれの金属ジカチオンの濃度、特に、Ｍｎ２＋のものは、工程（ｉ）において発現されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドの濃度に対して少なくとも等モルであることが想定される。培地中のそれぞれの金属ジカチオンの好まれる濃度、特に、Ｍｎ２＋のものは、少なくとも０．０５ｍＭ、好ましくは少なくとも０．１ｍＭ、または０．０５ｍＭ〜０．２ｍＭの範囲、好ましくは約０．１ｍＭである。
【００４８】
培地は、第４の態様に定義される細胞に添加するときに、１つまたは複数の金属ジカチオンを含んでいてもよく、または１つもしくは複数の金属ジカチオン、特に、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、および／もしくはＭｎ２＋、好ましくはＭｎ２＋（より好ましくはＭｎ２＋、ならびにさらにＺｎ２＋および／もしくはＦｅ２＋、このうちＺｎ２＋が好ましい）が、工程（ｉ）において、好ましくは、核酸の発現を誘導するときもしくはその直前に、培地中に添加されてもよい。培地はまた、第４の態様に定義される細胞に添加するときに、１つまたは複数の金属ジカチオン、特に、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、および／またはＭｎ２＋、好ましくはＦｅ２＋および／またはＺｎ２＋を含んでいてもよく、培地には、特に、工程（ｉ）において、好ましくは、核酸の発現を誘導するときまたはその直前に、培地中にすでに含まれている１つまたは複数の金属ジカチオン（特に、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、および／またはＭｎ２＋、好ましくはＦｅ２＋および／またはＺｎ２＋）が、さらに補充されてもよい。これに関して、直前とは、６０分前まで、好ましくは３０分前まで、およびより好ましくは５分前までであり得る。一実施形態において、Ｍｎ２＋は、上述のように、Ｆｅ２＋および／またはＺｎ２＋を含む培地に添加され、培地には、上述のように、Ｆｅ２＋および／またはＺｎ２＋が補充されてもよい。本発明者は、驚くべきことに、Ｍｎ２＋の添加が、酵素的に活性なクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを産生することに対して、有意な正の作用を有することを発見した。
【００４９】
好ましい実施形態において、第５の態様の方法の工程（ｉｉ）は、細胞を溶解および遠心分離すること、ならびに上清を保持することを含む。クレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、次いで、上清から単離される。
【００５０】
タンパク質単離のための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ、例えば、Ｎｉ−キレートクロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない）が挙げられる。
【００５１】
第５の態様の方法の工程（ｉｉ）が、ＮＡＤＨ消費酵素の量を低減させること、好ましくはそれを排除することを含むことが、さらに好ましい。そのような酵素は、工程（ｉ）の細胞に含まれ得る。
【００５２】
第６の態様において、本発明は、第５の態様に定義される方法を用いて産生されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに関する。また、第５の態様に定義される方法を用いて産生されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを含む単離物にも関する。
【００５３】
好ましくは、クレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、可溶性である。
【００５４】
この様式で産生されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、好ましくは、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、およびＭｎ２＋からなる群から選択される１つまたは複数の金属ジカチオンが結合する活性部位を含む。１つまたは複数の金属ジカチオンのうちの少なくとも１つが、Ｍｎ２＋であることが好ましい。第５の態様に定義される方法によって示されるように、単離物は、複数のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを含む。特定の実施形態において、単離物中、特に複数のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドのクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに対するＭｎ２＋のモル比は、少なくとも０．０５または０．１０（金属：タンパク質サブユニット）であり、好ましくは少なくとも０．１５（例えば、少なくとも０．１７、０．１９、０．２１、または０．２３）であり、より好ましくは少なくとも０．２５である。本発明によるＭｎ２＋の理論上の上限は、２であり（１つの金属ジカチオンが、２つのタンパク質サブユニットのそれぞれに結合し得る）、これは、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。１つの好ましい実施形態において、Ｍｎ２＋の上限は、１であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。別の好ましい実施形態において、Ｍｎ２＋の上限は、０．５であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。
【００５５】
好ましくは、この特定の実施形態において、単離物中、特に複数のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドのクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに対するＺｎ２＋のモル比は、少なくとも０．０５または０．１５（金属：タンパク質サブユニット）であり、好ましくは少なくとも０．２５（例えば、少なくとも０．３、０．４、または０．５）であり、もっとも好ましくは少なくとも０．５２である。本発明によるＺｎ２＋の理論上の上限は、２からＭｎ２＋に選択された最小比を減算したもの、例えば、Ｍｎ２＋の最小比が０．０５の場合は１．９５であるか、またはＦｅ２＋も含まれる場合（以下を参照されたい）、２からＭｎ２＋に選択された最小比およびＦｅ２＋に選択された最小比を減算したものである。これは、前述のＺｎ２＋の下限のそれぞれと組み合わされ得る。１つの好ましい実施形態において、Ｚｎ２＋の上限は、１．６であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。別の好ましい実施形態において、Ｚｎ２＋の上限は、１．３であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。
【００５６】
この特定の実施形態において、単離物中、特に、複数のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドのクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに対するＦｅ２＋のモル比が、少なくとも０．０５または０．１０（金属：タンパク質サブユニット）であり、好ましくは少なくとも０．１５（例えば、少なくとも０．２、０．２５、または０．３）であり、もっとも好ましくは少なくとも０．４２であることもまた、想定される。本発明によるＦｅ２＋の理論上の上限は、２からＭｎ２＋に選択された最小比を減算したもの、例えば、Ｍｎ２＋の最小比が０．０５の場合は１．９５であるか、またはＺｎ２＋も含まれる場合（上記を参照されたい）、２からＭｎ２＋に選択された最小比およびＺｎ２＋に選択された最小比を減算したものである。これは、前述のＦｅ２＋の下限のそれぞれと組み合わされ得る。１つの好ましい実施形態において、Ｆｅ２＋の上限は、１．２であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。別の好ましい実施形態において、Ｆｅ２＋の上限は、０．７であり、これもまた、前述の下限のそれぞれと組み合わされ得る。
【００５７】
様々な好ましい実施形態において、複数のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドのクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに対するモル比は、以下の通りである（金属：タンパク質サブユニット；それぞれの実施形態において、モル比の上限は、好ましくは、Ｍｎ２＋については１であり、Ｚｎ２＋については１．５である）：
少なくとも０．０５のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．１０のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．１５のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．１７のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．１９のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．２１のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．２３のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）；
少なくとも０．２５のＭｎ２＋、上述の比のいずれかのＺｎ２＋（および適宜１以下のＦｅ２＋）。
【００５８】
Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、および／またはＦｅ２＋の任意の組合せの合計の金属：タンパク質サブユニットの比は、多くとも２であり得ることが理解される。しかしながら、すべての活性部位が、金属によって占有されるわけではないため、これは、より低い、例えば、最大１．９、１．７、または１．５である場合もある。好ましい実施形態において、組み合わされた合計のＭｎ２＋、Ｚｎ２＋および／またはＦｅ２＋：タンパク質サブユニットの比は、１〜２であり、好ましくは１．３〜２であり、より好ましくは１．５（または１．６）〜１．９であり、もっとも好ましくは１．７〜１．８５である。また、単離物について言及するとき、単離物は、さらなる金属イオンを含み得るが、これらは、単離の際に除去されなかったとしてもクレアチニンデイミナーゼポリペプチドに結合していないことも理解されたい。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、複数のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドのクレアチニンデイミナーゼポリペプチドの少なくとも１％、少なくとも２％、または少なくとも３％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも７％、およびもっとも好ましくは少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％または少なくとも１９％）は、Ｍｎ２＋が結合する活性部位を含む。
【００６０】
第７の態様において、本発明は、サンプル中のクレアチニンの量を判定するための第１もしくは第６の態様に定義されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドまたは第６の態様の単離物の使用に関する。具体的には、サンプル中のクレアチニンの量を判定するための方法であって、
（ａ）サンプルを、第１もしくは第６の態様に定義されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドまたは第６の態様に定義される単離物と接触させて、サンプル中のクレアチニンを、Ｎ−メチルヒダントインおよびＮＨ３／４＋に変換する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の変換を定量する工程と
を含む、方法に関する。
【００６１】
変換の量、例えば、変換の前駆体の減少または変換の産物の増加は、クレアチニンの量を示す。この目的で、公知のクレアチニン量を有する参照変換の値を使用することができる。
【００６２】
工程（ａ）の接触のときに、ＮＨ３／４＋が産生される。本明細書におけるＮＨ３／４＋は、ＮＨ３もしくはＮＨ４＋、または両方の化合物の混合物（すなわち、ＮＨ３またはＮＨ４＋の両方が産生される）を意味する。水溶液中では、ＮＨ３およびＮＨ４＋は、平衡状態で存在する。平衡のバランスは、ｐＨ依存性であり、ＮＨ３のｐＫａ値は、９．２５である）。９．２５よりも低いｐＨ値では、変換により、ＮＨ３よりも多くのＮＨ４＋が産生され、９．２５を上回るｐＨ値では、ＮＨ４＋よりも多くのＮＨ３が産生される。９．２５のｐＨでは、実質的に同じ量のＮＨ３およびＮＨ４＋が産生される。
【００６３】
サンプルは、通常、対象から得られたサンプル、好ましくは、体液サンプルであるが、必ずしもそうとは限らない。好ましくは、体液サンプルは、血液、血清、血漿、および尿である。
【００６４】
対象は、好ましくは、研究室動物（例えば、マウスもしくはラット）、家畜動物（モルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ラクダ、ネコ、イヌ、海カメ、陸ガメ、ヘビ、もしくはトカゲを含む）、またはチンパンジー、ボノボ、ゴリラ、およびヒトを含む霊長類からなる群から選択される。ヒトが、特に好ましい。
【００６５】
好ましい実施形態において、本方法の工程（ｂ）は、工程（ａ）において産生されるＮＨ３／４＋またはＮ−メチルヒダントインの量を判定することを含む。これは、例えば、工程（ａ）が、サンプルを、ＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）、α−ケトグルタル酸、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼと接触させて、ＮＨ３／４＋（好ましくはＮＨ４＋）、α−ケトグルタル酸、およびＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）を、グルタミン酸およびＮＡＤＰ＋（またはそれぞれＮＡＤ＋）に変換させることをさらに含み、工程（ｂ）が、ＮＡＤＰＨ（またはそれぞれＮＡＤＨ）の消費を定量することを含む実施形態において、達成することができる。このさらなる接触は、サンプルをクレアチニンデイミナーゼポリペプチドまたは単離物と接触させる前、同時、または後に生じ得る。好適なアッセイは、当該技術分野において公知であり、例えば、Tanganelli, Clin. Chem. 28/7, 1461-1484 (1982)によるものがある。好ましくは、添加されるＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）の濃度は、０．０１〜０．２ｍＭであり、より好ましくは、０．０５〜０．１５ｍＭであり、もっとも好ましくは、０．０１ｍＭである。本発明者は、この範囲内では、消費の線形範囲が広いことを見出した。さらに、このＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）濃度に加えて、またはそれとは独立して、添加されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドの濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ以下、５ｍｇ／ｍｌ以下、１ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．０５〜０．０１ｍｇ／ｍｌ（もしくは約０．０２ｍｇ／ｍｌ）、より好ましくは０．０１〜０．００３ｍｇ／ｍｌ（もしくは約０．００５ｍｇ／ｍｌ）、またはもっとも好ましくは０．００３〜０．００１ｍｇ／ｍｌ（もしくは約０．００２ｍｇ／ｍｌ）である。本発明者は、これらの濃度では、酵素活性が、特に有利であることを見出した。
【００６６】
特に好ましい実施形態において、クレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、工程（ａ）においてサンプルと接触させる最後の物質である。換言すると、クレアチニンデイミナーゼポリペプチドの変換反応物への添加により、変換が開始される。
【００６７】
ＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）の消費は、光学的に判定することができ、より具体的には、例えば、測光法または蛍光測定法で判定することができる。測光法による判定には、好ましくは３４０ｎｍまたはその近傍（例えば、±１５ｎｍ）で、反応混合物のＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）光吸収の消失または消失の割合を測定することが含まれ、例えば、Tanganelli, Clin. Chem. 28/7, 1461-1484 (1982)を参照されたい。蛍光測定法による判定には、好ましくは３４０ｎｍまたはその近傍（例えば、±１５ｎｍ）の励起波長を用いて、好ましくは４６０ｎｍまたはその近傍（例えば、±１５ｎｍ）で、ＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）蛍光の消失または消失の割合を測定することが含まれ、例えば、Chen at al., Clin. Chem. Acta, 100 (1980) 21を参照されたい。
【００６８】
ＮＨ３／４＋の産生は、光学センサ、例えば、比色検出用乾式スライドを用いて判定することができる。好適な比色検出用乾式スライドは、当該技術分野において公知であり、例えば、Tofaletti et al., Clin. Chem. 29/4, 684-687, 1983を参照されたい。そのようなセンサにおいて、クレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、乾燥フィルムに埋め込まれている。サンプル中のクレアチニンデイミナーゼポリペプチドによって触媒される変換によって産生されるＮＨ３／４＋は、膜、好ましくは半透過性膜を通じて拡散され、ｐＨ感受性色素との反応によって生成される色によって測定される。「半透過性膜」という用語は、ＮＨ３／４＋を透過するが、クレアチニンデイミナーゼポリペプチドは透過しない膜を指す。これは、好適な細孔サイズの膜によって達成される。好適な膜は、当該技術分野において公知であり、例えば、Tofaletti et al., Clin. Chem. 29/4, 684-687, 1983からのものがある。好ましい実施形態において、細孔サイズは、１０ｎｍ未満であり、好ましくは、１ｎｍ未満である。
【００６９】
工程（ａ）において開始される変換はまた、電気化学的に、例えば、１つまたは複数の電極によって、工程（ｂ）において、例えば水素イオン（例えば、ｐＨの変化）またはアンモニウムイオンを含む、変換の産物を測定することによって、判定することができる。好ましくは、クレアチニンデイミナーゼポリペプチドは、例えば、層の形態で（例えば、層としてまたは層内に）、１つまたは複数の電極の表面に直接固定化されている。好適な電極はまた、当該技術分野にあるようにセンサまたはバイオセンサと記載されることもあり、例えば、Guilbault and Coulet, Anal. Letters 13(B18) 1607-1624、Guilbault and Coulet, Anal. Chim. Acta, 152, 223-228, 1983、Cou et al., IEEE Sensors J, 9, 665-672, 2009、Zinchenko et al., Biosens Bioelectr 35, 466-469, 2012を参照されたい。
【００７０】
第８の態様において、本発明は、好ましくは第７の態様に定義されるように、サンプル中のクレアチニンの量を判定するのに好適な試薬キット（または単純にキット）であって、第１もしくは第６の態様に定義されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドまたは第６の態様に定義される単離物を含む、試薬キットに関する。好ましい実施形態において、キットは、別個の容器において、第７の態様の使用もしくは方法に好適な緩衝液（好ましくは、ｐＨ緩衝液）、第２の酵素および／またはその基質（例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはα−ケトグルタル酸）、ならびにＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）からなる群から選択される１つまたは複数の構成要素をさらに含む。好ましい実施形態において、試薬キットは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸、およびＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨのうちの１つを含む。好ましくは、それは、緩衝液をさらに含む。
【００７１】
第９の態様において、本発明は、好ましくは第７の態様に定義される、組成物、好ましくはサンプル中のクレアチニンの量を判定するのに好適なセンサ組成物であって、第１または第６の態様に定義されるクレアチニンデイミナーゼポリペプチドを含む、組成物に関する。組成物は、クレアチニンデイミナーゼポリペプチドが固定化された、センサ、好ましくは電極または光学センサ（乾式スライド、好ましくは比色検出用乾式スライドを含む）をさらに含む。換言すると、組成物がセンサ組成物として記載される場合、センサは、好ましくは、クレアチニンデイミナーゼポリペプチドが固定化された、電極または光学センサ（乾式スライド、好ましくは比色検出用乾式スライドを含む）である。組成物が電極組成物であること、すなわち、それが、クレアチニンデイミナーゼポリペプチドが固定化された電極を含み、好ましくはそれからなることが、好ましい。センサという用語は、第７の態様の方法の工程（ａ）において開始される変換の１つまたは複数の産物を検出し、好ましくは定量することができる、デバイスを指す。限定することなく、バイオセンサ、化学センサ、および電気センサを含むことが意図される。本明細書における「固定化された」とは、センサ上（その表面上）またはセンサ内、好ましくは層の形態で、例えば、層としてまたは層内への固定化を指す。「層として」とは、クレアチニンデイミナーゼポリペプチドが、層を構成することを意味し、「層内」とは、さらなる物質が層を構成し、クレアチニンデイミナーゼポリペプチド層が、その層内に埋め込まれることを意味する。
【００７２】
第１０の態様において、本発明は、対象において腎臓疾患を検出、好ましくは診断するためのインビトロ方法であって、第７の態様に定義される対象から得られたサンプル中のクレアチニンの量を判定することを含み、正常値よりも多いクレアチニンの量は、対象が腎臓疾患を有することを示す、方法に関する。正常値は、当該技術分野において公知であり得るか、または１つもしくは複数の対照対象サンプルから判定され得る。対照対象は、腎臓疾患を有さない対象である。正常値は、当該技術分野において公知であり、例示的な正常値は、いずれも血清中、男性については５８〜１１０μｍｏｌ／Ｌであり、女性については４６〜９２μｍｏｌ／Ｌであるか、または尿中では、男性については８８４０〜１７６８０μｍｏｌ／日であり、女性については７０７２〜１５９１２μｍｏｌ／日である。正常値は、好ましくは、対象の年齢、人種、性別、および体重のうちの１つまたは複数に関して調整されている。
【００７３】
一実施形態において、腎臓疾患は、ネフロン機能の減少によって特徴付けられる。好ましい実施形態において、腎臓疾患は、ステージＩＩＩの腎臓疾患（糸球体濾過率、ＧＦＲが３０〜５９）、ステージＩＶの腎臓疾患（ＧＦＲが１５〜２９）、またはステージＶの腎臓疾患（ＧＦＲが１５未満）である。
【００７４】
特に好ましい実施形態において、本方法は、サンプル中のアルブミンの量を判定することをさらに含み、ここで、アルブミン対クレアチニンの比（ＡＣＲ）が３０以上、好ましくは３００以上であることは、対象が腎臓疾患を有することを示す。
【００７５】
第１０の態様の方法は、腎臓疾患を処置する工程をさらに含み得る。腎臓疾患を処置する方法であって、対象が、第１０の態様の方法により診断を受けている、方法もまた、想定される。処置には、例えば、血圧を低減する医薬、コレステロールレベルを低減する医薬、貧血を処置する医薬、および浮腫を緩和する医薬からなる群から選択される１つまたは複数の医薬を投与することが含まれ得る。処置にはまた、透析および／または腎臓移植も含まれ得る。
【００７６】
以下、特に、「定義および本発明のさらなる実施形態」という見出し下に記載される定義および実施形態は、上述の本発明の態様のすべてに適用される。また、上述の態様のいずれかに関して提供される定義および記載される実施形態は、適用可能である限り、すべての他の態様にも適用され得る。
【００７７】
定義および本発明のさらなる実施形態
本明細書は、様々な用語および語句を使用するが、これらは、以下に定義されるある特定の意味を有する。好ましい意味は、本明細書に記載される本発明の態様の好ましい実施形態として解釈される。そのため、それらおよび以下に記載されるさらなる実施形態も、本発明の態様の任意の実施形態、および特に上述の本発明の態様の任意の好ましい実施形態と組み合わせることができる。
【００７８】
本明細書において使用されるとき、「単離された」という用語は、分子が、天然に関連している他の分子を実質的に含まないことを指す。具体的には、単離されたとは、分子が、動物の体内または動物の身体サンプル中にないことを意味する。単離された分子は、したがって、動物内にあれば遭遇または接触しているであろう他の分子を含まない。単離されたとは、本明細書に記載されるように、関連する他の成分から単離されていることを意味するものではなく、例えば、分子が含まれる組成物の他の成分から単離されているわけではなく、またそれが含まれるベクターまたは細胞から単離されているわけでもない。
【００７９】
本明細書において使用されるとき、クレアチニンデアミナーゼ、クレアチニンデスアミナーゼもしくはデスイミナーゼ、クレアチニンイミノヒドロラーゼ、またはクレアチニンヒドロラーゼとしても知られている「クレアチニンデイミナーゼ」（ＥＣ番号３．５．４．２１）は、クレアチニンのＬ−メチルヒダントインおよびＮＨ３／４＋への反応を触媒する酵素を指す。
【００８０】
「変異体」という用語は、ポリペプチドに関して、一般に、ポリペプチドの改変形態、例えば、突然変異を指し、そのため、ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸が、欠失、挿入、改変、および／または置換されていてもよい。より具体的な機能は、本明細書において定義され、一般的な定義よりも優先される。「突然変異」または「アミノ酸突然変異」は、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入であり得る（１つを上回る突然変異が存在する場合には、「および」が適用され得る）。好ましくは、それは、置換（すなわち、保存的または非保存的アミノ酸置換）であり、より好ましくは、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態において、置換には、天然に存在するアミノ酸の、天然に存在しないアミノ酸との交換も含まれる。保存的置換は、あるアミノ酸と、その置換されるアミノ酸に類似の化学特性を有する別のアミノ酸との置換を含む。好ましくは、保存的置換は、
（ｉ）塩基性アミノ酸と、別の異なる塩基性アミノ酸との置換、
（ｉｉ）酸性アミノ酸と、別の異なる酸性アミノ酸との置換、
（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸と、別の異なる芳香族アミノ酸との置換、
（ｉｖ）非極性脂肪族アミノ酸と、別の異なる非極性脂肪族アミノ酸との置換、および
（ｖ）極性非荷電アミノ酸と、別の異なる極性非荷電アミノ酸との置換からなる群から選択される置換である。
【００８１】
塩基性アミノ酸は、好ましくは、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンからなる群から選択される。酸性アミノ酸は、好ましくは、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。芳香族アミノ酸は、好ましくは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される。非極性脂肪族アミノ酸は、好ましくは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、およびイソロイシンからなる群から選択される。極性非荷電アミノ酸は、好ましくは、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択される。保存的アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換は、上記に概説された保存的置換（ｉ）から（ｖ）に含まれない、１つのアミノ酸と任意のアミノ酸との交換である。
【００８２】
配列同一性を判定するための手段を、以下に記載する。
【００８３】
タンパク質のアミノ酸はまた、改変、例えば、化学的に改変されていてもよい。例えば、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸の側鎖または遊離アミノもしくはカルボキシ末端が、例えば、グリコシル化、アミド化、リン酸化、ユビキチン化などによって改変されていてもよい。化学的改変はまた、当該技術分野において周知のように、インビボ（in vivo）、例えば、宿主細胞において生じ得る。例えば、タンパク質のアミノ酸配列に存在する好適な化学的改変モチーフ、例えば、グリコシル化配列モチーフにより、タンパク質のグリコシル化が引き起こされる。改変が、改変されたアミノ酸の同一性に変化をもたらさない限り（例えば、置換または欠失）、改変されたポリペプチドは、ある特定の配列番号に関して言及されるポリペプチドの範囲内である、すなわち、それは、本明細書において定義される変異体ではない。
【００８４】
「変異体」という用語は、ポリヌクレオチドに関して、一般に、ポリヌクレオチドの改変形態、例えば、突然変異を指し、そのため、ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチドが、欠失、挿入、改変、および／または置換されていてもよい。より具体的な機能は、本明細書において定義され、一般的な定義よりも優先される。「突然変異」は、ヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入であり得る（１つを上回る突然変異が存在する場合には、「および」が適用され得る）。好ましくは、それは、置換であり、より好ましくは、それは、アミノ酸置換を引き起こし、もっとも好ましくは、保存的アミノ酸置換を引き起こす。
【００８５】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列の文脈における「同一性」または「同一な」という用語は、最大の一致に関してアライメントしたときに、２つの配列における同一な残基の数を指す。具体的には、２つの配列の配列同一性％は、核酸配列かアミノ酸配列かにかかわらず、２つのアライメントされた配列間での厳密な一致の数を、短い方の配列の長さで除し、１００を乗じたものである。２つの配列をアライメントするために使用することができるアライメントツールは、当業者に周知であり、例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上で、例えば、ポリペプチドのアライメントについてはＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、またはポリヌクレオチドのアライメントについてはＭＵＳＣＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）もしくはＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／  ｍａｆｆｔ／）、またはポリヌクレオチドおよびポリペプチドのアライメントについてはＷＡＴＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／  ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／）で入手することができる。２つの配列間でのアライメントは、デフォルトのパラメーター設定、例えば、ＭＡＦＦＴについては、好ましくはマトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップ開始１．５３、ギャップ伸長０．１２３、ＷＡＴＥＲポリヌクレオチドについては、好ましくはマトリックス：ＤＮＡＦＵＬＬ、ギャップ開始：１０．０、ギャップ伸長０．５、ＷＡＴＥＲポリペプチドについては、好ましくはマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ開始：１０．０、ギャップ伸長：０．５を使用して、実行することができる。当業者には、十分なアライメントを得るために、いずれかの配列にギャップを導入する必要があり得ることが理解される。「最良の配列アライメント」は、最小限の数のギャップを有しつつ、アライメントされる最大数の同一な残基が得られる、アライメントとして定義される。好ましくは、それは、グローバルアライメントであり、これには、アライメント内のすべての配列におけるすべての残基が含まれる。
【００８６】
「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸、すなわち、複数のヌクレオチドでできた生物学的分子を指すことを意図する。これには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、おおび合成類似体、例えば、ＰＮＡが含まれる。ＤＮＡが、好ましい。
【００８７】
上記の説明は、一般に、「少なくとも８０％の配列同一性の変異体」を指す。その好ましい実施形態において、変異体は、すべて、それぞれの配列番号またはその参照される一部に対して、少なくとも８３％、少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、またはもっとも好ましくは少なくとも９９％の配列同一性の変異体である。
【００８８】
「クレアチニンデイミナーゼ活性」という用語は、クレアチニン＋Ｈ２Ｏ⇔Ｎ−メチルヒダントイン＋ＮＨ３の反応を触媒する、酵素の能力を指す。この活性は、通常、Ｕ／ｍｌで表され、容量活性アッセイにおいて、例えば、例にあるように、以下の等式に従って、判定することができる：
【００８９】
【数１】
2021509289.tif 000008
式中、
ΔＥ：光学密度の差
ε：使用した波長におけるＮＡＤＨの比吸収係数（６，２２ｍｌ  μｍｏｌ−１ｃｍ−１）
ｄｉｌ：希釈
ｄ：キュベット内のビームの経路長
Ｖｔｏｔａｌ：総容量
Ｖｓａｍｐｌｅ：サンプル容量
【００９０】
「可溶性」という用語は、本明細書において使用されるとき、別途指定されない限り、例えば、以下のプロセスに従って測定した場合に、水溶液（例えば、水）中への少なくとも約４０％（５０％〜１００％を含み、６０％〜９０％、好ましくは９０％〜１００％も含む）のタンパク質可溶性を有するタンパク質を指す：（１）タンパク質を、懸濁液１００ｇ当たり５．００ｇで精製水中に懸濁し、（２）懸濁液のｐＨを、所望されるｐＨ（例えば、７）に調整し、（３）室温（例えば、２０℃〜２２℃）で６０分間、緩徐に撹拌し、（４）任意の好適な技法（例えば、ＨＰＬＣ）によって懸濁液中の総タンパク質を測定し、（５）懸濁液のアリコートを、例えば、１６，０００×ｇにおいて４℃で３０分間、遠心分離し、（６）工程（４）に記載される選択した技法によってタンパク質に関して上清を測定し、（７）総タンパク質に対する上清タンパク質の割合としてタンパク質の可溶性を計算する。好ましい実施形態において、これは、大腸菌において発現させたタンパク質の少なくとも約４０％（５０％〜１００％を含み、６０％〜９０％、好ましくは９０％〜１００％も含む）が、大腸菌細胞ライセートを１６，０００ｇにおいて４℃で３０分間遠心分離したの後に、ペレットではなく水溶液の上清に含まれることを意味する。
【００９１】
「ＵＴＲ」（「非翻訳領域」）という用語は、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに転写されるＤＮＡの、ポリペプチド配列に翻訳されないヌクレオチド配列を指す。
【００９２】
「クレアチニンデイミナーゼ活性を確実にする」という用語は、クレアチニンデイミナーゼ活性に必要とされる特性を指す。「クレアチニンデイミナーゼ活性を改善する」という用語は、クレアチニンデイミナーゼ活性を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加させる特性を指す。特性がクレアチニンデイミナーゼ活性を確実にするか改善するかを含め、クレアチニンデイミナーゼ活性を試験するための方法は、本明細書において開示されている。
【００９３】
「タグ」という用語は、ポリペプチドに組換えにより結合される異種ポリペプチド配列を指す。精製および／または定量を可能にするのに好適なタグが、好ましい。タグは、例えば、親和性タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、または蛍光タグを包含し得る。親和性タグは、親和性技法を使用して生物学的供給源からタンパク質を精製することができるように、タンパク質に付加される。これらには、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる。ポリ（Ｈｉｓ）タグは、広く使用されている、金属マトリックスに結合するタンパク質タグである。クロマトグラフィータグは、タンパク質のクロマトグラフィー特性を、特定の分離技法で異なる分解能を許容するように変更するために使用される。これらは、ポリアニオンアミノ酸、例えば、ＦＬＡＧタグからなることが多い。エピトープタグは、短いペプチド配列であり、これは、高親和性抗体が多数の異なる種において高い信頼性で産生可能であることに起因して選択される。これらは、通常、ウイルス遺伝子に由来し、これが、それらの高い免疫反応性を説明する。エピトープタグとしては、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、およびＨＡタグが挙げられる。これらのタグは、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光、および免疫沈降の実験に特に有用であるが、抗体精製においても利用されている。蛍光タグは、タンパク質の視覚的読み取りをもたらすために使用される。ＧＦＰおよびその変異体（例えば、異なる蛍光スペクトルを有する突然変異型ＧＦＰ）ならびにＲＦＰおよびその変異体（例えば、異なる蛍光スペクトルを有する突然変異型ＲＦＰ）は、もっとも広く使用されている蛍光タグである。ＧＦＰ／ＲＦＰのより進化した用途としては、フォールディングレポーターとしてそれを使用することが挙げられる（フォールディングされていれば蛍光があり、そうでなければ無色となる）。さらに、フルオロフォアの例としては、フルオレセイン、ローダミン、およびスルホインドシアニン色素Ｃｙ５が挙げられる。タグの好ましい例としては、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ（好ましくは、５〜１０個、例えば、６個のヒスチジンが、ニッケルもしくはコバルトキレートに結合している）、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、ＢＣＣＰ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓタグ、チオレドキシンタグ、Ｆｃタグ、またはＴｙタグが挙げられるが、これらに限定されない。Ｈｉｓタグが好ましい。
【００９４】
本明細書において使用されるとき、「ベクター」という用語は、導入されることが可能であるか、中に含まれるポリヌクレオチドを細胞に導入することができ、ポリヌクレオチドを細胞において発現することが可能であってもよい、タンパク質もしくは核酸またはそれらの混合物を指す。本発明の文脈においては、第２の態様の核酸が、ベクターの導入により細胞内で発現されることが、好ましい。好適なベクターは、当該技術分野において公知であり、例えば、プラスミド、コスミド、人工染色体（例えば、細菌、酵母、もしくはヒト）、バクテリオファージ、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、もしくはバキュロウイルス）、またはナノ操作型物質（例えば、オルモシル（ormosil））が挙げられる。必要とされるベクター技術は、当該技術分野において周知である（例えば、Lodish et al., Molecular Cell Biology, W. H. Freeman; 6th edition, June 15, 2007またはGreen and Sambrook, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2012 Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい）。この用語には、クローニングベクター、特に発現ベクターが含まれる。
【００９５】
「プロモーター」という用語は、本明細書において使用されるとき、遺伝子の転写を誘導するＤＮＡの配列を指す。プロモーターは、プロモーター活性化剤に応答して転写を開始する「誘導性」であってもよく、または転写の調節がそのような薬剤とは独立している「構成的」であってもよい。細菌またはウイルス起源のプロモーターが、好ましい。好適なプロモーターは、当該技術分野において公知である。
【００９６】
「作動可能に連結された」という用語は、本明細書において使用されるとき、核酸配列における要素または構造が、物理的位置ではなく作動性能力によって連結されていることを指す。要素または構造は、所望される操作を達成することができるか、またはそれを特徴とする。当業者には、核酸配列における要素または構造が、作動可能に連結されるために、タンデムとなっていることも、隣接した順序となっていることも必要とされないことが、認識される。
【００９７】
上記で言及されている細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。原核生物細胞は、組換えＤＮＡ技術、例えば、クローニングまたはタンパク質発現における適用に好適な任意の種類の細菌または古細菌生物のものであり得、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方が含まれる。好適な細菌は、例えば、大腸菌属（Escherichia）（特に、大腸菌（E. coli）、これがもっとも好ましい）、アナベナ属（Anabaena）、カウロバクター属（Caulobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、ロドバクター属（Rhodobacter）、シュードモナス属（Pseudomonas）、パラコッカス属（Paracoccus）、バチルス属（Bacillus）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、カプリアビダス属（Cupriavidus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、リゾビウム属（Rhizobium）（シノリゾビウム属（Sinorhizobium））、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、クレブシエラ属（Klebsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、またはストレプトマイセス属（Streptomyces）から選択され得る。
【００９８】
真核生物細胞は、具体的には、真菌細胞または動物細胞である、真菌細胞は、広義には、真菌生物の任意の細胞、例えば、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルシアヌス変種マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus var.marxianus）、クルイベロマイセス・テルモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）、カンジダ・ユチリス（Candida utilis）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・リポリチカ（Candida lipolytica）、およびカンジダ・ベルサチリス（Candida versatilis）、ピキア属（Pichia）ではピキア・スチピディス（Pichia stipidis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピキア・ソルビトフィラ（Pichia sorbitophila）など、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、デバロマイセス属（Debaromyces）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、サッカロマイセコプシス属（Saccharomycecopsis）、サッカロマイコデス属（Saccharomycodes）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、ウィッケルハミア属（Wickerhamia）、デバヨマイセス属（Debayomyces）、ハンセニアスポラ属（Hanseniaspora）、クロエケラ属（Kloeckera）、ジゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、オガタエア属（Ogataea）、クライシア属（Kuraishia）、コマガタエラ属（Komagataella）、メチニコビア属（Metschnikowia）、ウィリオプシス属（Williopsis）、ナカザワエア属（Nakazawaea）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、トルラスポラ属（Torulaspora）、ブレラ属（Bullera）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、ウィロプシス属（Willopsis）、またはスポロボロマイセス属（Sporobolomyces）に由来する細胞であり得る。しかしながら、好ましくは、真菌細胞は、サッカロマイセス属またはピキア属の細胞であり、特に、サッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア・パストリスの細胞である。
【００９９】
動物細胞は、霊長類、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ハムスター、ウシ、昆虫（例えば、Ｓｆ９もしくはＳｆ２１）など、好ましくは、ヒトの細胞であり得る。
【０１００】
「細胞培養」という用語は、細胞を、それらの天然の環境から離れて、細胞培養培地中または上で、制御された条件下において成長させるプロセスを指す。「細胞培養培地」という用語は、細胞、特に、上記に定義される細胞の生存または成長を補助するための液体またはゲルを指す。そのような培地は、そのような細胞の生存または成長を補助するのに必要とされるすべての栄養素を含む。細胞培養培地組成物は、乾燥粉末組成物、液体組成物、または固体（例えば、ゲルもしくは寒天）組成物であってもよい。好適な細胞培養物および培養技法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Peterson et al., Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 1988;11(2):93-8を参照されたい。
【０１０１】
金属ジカチオンの培地への添加に関して、「培地に添加される」という表現は、同じ金属ジカチオンが、すでに培地中に含まれている場合またはまだ含まれていない場合の実施形態を含む。好ましくは、それは、まだ培地中に含まれていない。金属ジカチオンの培地への添加に関して、「補充される」という表現は、培地中の金属ジカチオン（すでに培地中に含まれている）の量が、増加することを意味する。これに関して、「まだ含まれていない」とは、微量を含み、「含まれている」とは、微量よりも多いことを意味する。本明細書において使用されるとき、「微量」という用語は、フェムトモル（ｆＭ）以下のレベルの量を指す。具体的には、「微量」は、５００ｆＭ以下、より具体的には１００ｆＭ以下、もっとも具体的には５０ｆＭ以下の量を指し得る。
【０１０２】
「サンプル中のクレアチニンの量」という表現には、絶対量、例えば、ｍｏｌ単位の量、またはグラム単位の質量、ならびに相対量（すなわち、濃度）例えば、容量当たりのｍｏｌ単位の量またはグラム単位の質量が含まれる。
【０１０３】
「変換する」という用語は、酵素反応を用いた１つまたは複数の試薬の化学的変換を指す。
【０１０４】
「実質的に同じ量のＮＨ３またはＮＨ４＋」という表現は、ＮＨ３またはＮＨ４＋のうちの一方が、他方と同じ量±１０％（好ましくは±５％、より好ましくは±１％）で存在することを指す。
【０１０５】
「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」という用語は、「ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ」を意味し、「ＮＡＤ（Ｐ）＋」という用語は、「ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋」を意味する。
【０１０６】
「乾式スライド」という用語は、水性流体（例えば、本明細書に記載されるサンプル）の添加によって水和される、積層されコーティングされた乾燥フィルムを指す。コーティングは、好ましくは、クレアチニンデイミナーゼ（本明細書に記載される）コーティングである。
【０１０７】
本明細書において言及される配列番号
本出願は、配列番号１〜４に言及する。これらの配列番号の概要を、以下に提供する。
【０１０８】
配列番号１は、欧州特許第ＥＰ  １  ３２５  ９５８号Ａ１のクレアチニンデイミナーゼのアミノ酸配列を表す。
【０１０９】
配列番号２は、欧州特許第ＥＰ  １  ３２５  ９５８号Ａ１のクレアチニンデイミナーゼの核酸配列を表す。
【０１１０】
配列番号３は、本発明のクレアチニンデイミナーゼの核酸配列を表す（コーディング領域の開始コドンおよび終止コドンを下線で示し、配列番号１とは異なるヌクレオチドを、灰色で強調した太字で示す）：
2021509289.tif 000009
【０１１１】
配列番号４は、本発明のクレアチニンデイミナーゼのアミノ酸配列を表す（配列番号２とは異なるアミノ酸を、灰色で強調した太字で示す）。
2021509289.tif 000010
【０１１２】
配列番号５は、例示的なリンカーのアミノ酸配列を表す。配列番号６は、配列番号５によるリンカーの例示的なヌクレオチド配列を表す。配列番号７は、トロンビン切断部位を含む例示的なアミノ酸配列を表す。配列番号８は、配列番号７によるアミノ酸配列の例示的なヌクレオチド配列を表す。さらなる詳細については、表１の凡例を参照されたい。
【実施例】
【０１１３】
本発明を、以下の実施例により説明するが、これらは、本発明の単純な例示と解釈されるものであり、その範囲を制限すると解釈されるものではない。
【実施例１】
【０１１４】
ティシエレラ・クレアチニニのゲノムＤＮＡからのクレアチニンデイミナーゼをコードするＤＮＡフラグメントの単離
ＤＳＭＺの株コレクション［ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／］において、番号ＤＳＭ  ９５０８（基準株（type strain））のもとに受託されているティシエレラ・クレアチニニ株から単離したゲノムＤＮＡを、ＤＳＭＺから購入した。このＤＮＡを鋳型として使用し、公開されているＤＮＡ配列（配列番号２）のそれぞれの末端の同一な配列を有し、さらに５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含むフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用して、欧州特許第ＥＰ  １  ３２５  ９５８号Ａ１に記載されている対応するＤＮＡフラグメントを増幅させた。Ｑ５Ｒ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼおよびそれぞれの緩衝液は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから購入した。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった。
ゲノムＤＮＡ（２５ｎｇ／μＬ）、１μＬ
フォラードプライマー（１０μＭ）、２．５μＬ
リバースプライマー（１０μＭ）、２．５μＬ
ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭ）、１μＬ
緩衝液（５×Ｑ５反応緩衝液）、１０μＬ
ポリメラーゼＱ５、０．２μＬ
Ａｑｕａ  ｄｅｓｔ、３２．８μＬ
温度プログラムのパラメーターは、９８℃で１０分間の変性、３５回のサイクル（９８℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間）、および７２℃で４分間の最終伸長であった。
【０１１５】
予測したサイズのＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動による分析の通りに得た。５回の反応のフラグメントを、ゲル抽出キット（ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、アガロースゲルから抽出した。得られたＤＮＡを、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にライゲーションし、得られたクローンを、制限分析によって分析した。１つの選択した適正なクローンのインサートを、シーケンシングした。得られたＤＮＡ配列を、配列番号３に示す。配列番号２および配列番号３の配列の比較および分析により、ゲノムＤＮＡが、４つの塩基置換以外に、追加の塩基（Ｃ、配列番号３におけるヌクレオチド１３１４位）をコーディング領域に有していたことが判明した。これは、配列番号４に示されるＣ末端部分のアミノ酸配列に有意な差をもたらす（欧州特許第ＥＰ  １  ３２５  ９５８号Ａ１のクレアチニンデイミナーゼのアミノ酸配列である配列番号１と比較して）。
【実施例２】
【０１１６】
クレアチニンデイミナーゼの組換え発現−基本的コンストラクト
配列番号２に定義される合成ＤＮＡフラグメントを、購入した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｉｎｃ．）。このフラグメントは、欧州特許第ＥＰ  １  ３２５  ９５８  号Ａ１に記載されるクレアチニンデイミナーゼのコーディング領域ならびに５’上流領域および３’下流領域からなっていた。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋へのクローニングのために、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を、３’末端および５’末端に付加した（上記の配列番号２の表示において下線で示されている）。クローニング、培養、ＤＮＡ、およびタンパク質分析は、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, Print ISSN: 1934-3639に記載されている標準的な方法に従って行った。戦略１では、５’および３’非コーディング領域を含むフラグメント全体を、ＨｉｎｄＩＩＩを介してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋２クローニングした。大腸菌株ＸＬ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、宿主生物として、すべてのクローニングおよび発現作業に使用した。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する選択的ＬＢ−寒天プレートから単離した１０個の形質転換体１セットの制限分析の後に、図１に示される配向の１つのクローンを選択した（本明細書において、配向１とも称される）。対照目的で、逆の配向のクローンを、発現能力について試験した（本明細書において、配向２とも称される）。同じクローニング戦略を使用して、配列番号３に定義されるＴ．クレアチニニのゲノムＤＮＡに由来する対応するフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にクローニングした。さらなるクローンを、戦略１に従って構築した。ここでは、３’非コーディング領域を、クレアチニンデイミナーゼのＣ末端に融合されるＨｉｓ６コーディング領域を含むそれぞれのプライマーを使用してＰＣＲによって導入したＨｉｓタグに置き換えた（長いバージョン、実施例３、クローン４ｈの概要を参照されたい）。
【０１１７】
さらに、戦略２に従って、コーディング領域のみを、ｔａｃ−プロモーターに基づく大腸菌発現ベクターｐＭＳ４７０Δ８にクローニングし、Ｎ末端およびＣ末端Ｈｉｓタグ化（Ｈｉｓ６）タンパク質として２つのさらなるバージョンでクローニングした。したがって、コーディング領域のＮ末端部分またはＣ末端部分に適合し、６つのＨｉｓコドンを含むプライマーを使用して、標準的な条件下において、コーディング領域をＰＣＲ増幅した。鋳型として、配列番号２または配列番号３による合成またはゲノムＤＮＡフラグメントを、それぞれ、使用した。
【０１１８】
すべての戦略から、１つの適正なクローンを、制限分析に基づいて選択し、すべての発現クローンの精度を、シーケンシングによって検証した。これらのクローニング戦略によって得られたコンストラクトの概要を、図１に示す。
【０１１９】
構築したすべての発現株を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを補充した２×ＴＹ培養液（５００ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中５０ＭＬ）において、培養した。植付けは、終夜培養物（同じ培地）を用いて行い、細胞を、３７℃で、０．２〜１．４のＯＤまで成長せた。次いで、誘導を、０．１ｍＭでのＩＰＴＧの添加によって行い、誘導時に、ＭｎＣｌ２（最終濃度０．１ｍＭ）も、培養物に添加した。培養物を、次いで、２５℃または２８℃でさらに１０時間インキュベートし、細胞を、遠心分離によって採取した。ペレットは、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５（ＰＰＢ）中に直接再懸濁したか、または−２０℃で凍結させ、解凍後に再懸濁したかのいずれかであった。細胞を、超音波処理によって破壊し、ライセートを、さらに、２つの工程において、遠心分離によって可溶性画分およびペレット画分に分画した。第１の工程では、不溶性材料を、３，０００×ｇでペレットにし、残りの上清から、第２の工程において、不溶性材料を、１６，０００×ｇでペレットにした。不溶性ペレット画分を、ＰＰＢ中に再懸濁させ、すべての画分を、発現したタンパク質について、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した。インサートなしのベクターを含むクローンも、対照として、同じ様式で処理した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析により、予測したサイズのタンパク質が、戦略１のクローンから産生された事が判明した（赤色の矢印）。逆の配向の戦略１のクローン（対照、配向２）および戦略２のクローンでは、予測されたサイズの有意なタンパク質バンドは確認できなかった（図２）。
【０１２０】
組換えクレアチニンデイミナーゼタンパク質を発現するクローンの可溶性画分およびペレット画分を分析したときに（戦略１）、ゲノムＤＮＡ（配列番号３）に基づくクローン１に由来するタンパク質は、主として上清画分において見出され、良好な可溶性のタンパク質であることを示すことが認識された。対照的に、配列番号２によるＤＮＡに基づくクローンに由来するタンパク質は、ほとんどが３０００×ｇでのペレット画分中に存在しており、完全に不溶性のタンパク質であることを示した（図３）。
【０１２１】
可溶性画分を、ＮＡＤＨに基づく酵素カップリングアッセイを使用して、酵素活性に関しても試験した。原理を、以下に概説する。
【０１２２】
【化１】
2021509289.tif 000011
【０１２３】
クレアチニンデイミナーゼ活性の判定のためのこのアッセイにおいて、ＮＡＤＨの消費を、３４０ｎｍにおいて分光光度法で測定する。ＧｌＤＨ（ウシ肝臓由来）を、Ｓｉｇｍａ（製品コードＧ２６２６）から入手した。以下の反応設定を使用した（添加はこの順序で行った）：
０．７５ｍｌのクレアチニン溶液（５０ｍＭのＫ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５中、５０ｍＭ）
０．１ｍｌのα−ケトグルタル酸溶液（５０ｍＭのＫ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５中、１０ｍＭ）
８μＬのＧｌＤＨ（約１Ｕ／μＬ）
ブランクを設定
０．１ｍＬのＮＡＤＨ（３ｍＭ）、新しく調製
０．０５ｍＬのクレアチニンデイミナーゼ調製物（必要であれば、５０ｍＭのＫ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５中に希釈）
【０１２４】
アッセイは、３７℃で行った。ブランク作製は、ＮＡＤＨの添加前に行い、反応を、クレアチニンデイミナーゼ調製物の添加によって開始させた。活性分析の結果（図４）は、クローン８（配列番号２によるＤＮＡに基づく）由来のライセートが、活性を示さず、ライセートに存在する非特異的バックグラウンド（対照、ラインｄを参照されたい）しか確認できないことを、明確に示した。クローン１（配列番号３によるＤＮＡに基づく）のライセートでは、強力な活性を、明確に確認することができた。ゲノムＤＮＡに由来するＣ末端Ｈｉｓタグ化タンパク質でも、弱い活性を確認することができたが、ＳＤＳ  ＰＡＧＥではクレアチニンデイミナーゼのサイズ範囲には明らかな強いバンドは確認できなかった（データは示されないが、合成ＤＮＡに由来するｈｉｓタグ化変異体と同程度、図２）。Ｎｉ−キレートクロマトグラフィーを使用して、このＨｉｓタグ化クローンの精製されたタンパク質が、容易に得られ、良好な活性を示した。活性結果は、クローン１（配列番号３によるＤＮＡに由来）から発現されたタンパク質が、良好な可溶性を示し、したがって活性状態にあるが、クローン８（配列番号２によるＤＮＡに由来）に由来するタンパク質は、完全に不溶性であり、したがってフォールディングが不良な不活性状態にあることが示されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果と一致している。Ｃ末端におけるアミノ酸の欠如が、酵素触媒機序において重要な機能を有することも可能である。
【実施例３】
【０１２５】
５’上流および３’下流に位置するクレアチニンデイミナーゼの非翻訳ゲノム領域を含むクローンに基づくＨｉｓタグ化クレアチニンデイミナーゼの発現
実施例２の結果から、５’上流および３’下流に位置するクレアチニンデイミナーゼの非翻訳ゲノム領域が、大腸菌におけるこの酵素の効率的な組換え発現に重要であることが明らかとなった。Ｈｉｓタグ化タンパク質は、Ｎｉ−キレートクロマトグラフィーによる効率的な精製を可能にする。したがって、Ｈｉｓタグ化変異体を発現し、５’上流および３’下流の両方に位置するクレアチニンデイミナーゼの非翻訳ゲノム領域を含む、発現クローンを、オーバーラップ伸長ＰＣＲ戦略およびＨｉｓタグのアミノ酸をコードするそれぞれの配列を含むプライマーを使用して、構築した。Ｎ末端およびＣ末端のタグのそれぞれついて、２つの変異体を構築した。１つのセットは、Ｎ末端またはＣ末端に付加された６つのヒスチジンのみを有した。第２のセットは、ペプチドリンカーを含み、Ｎ末端Ｃタグの場合には、精製後のタグの除去を可能にするトロンビン切断部位を含んだ。表１に要約されているすべてのコンストラクトを、転写が誘導性ｌａｃプロモーターによって作動され得る配向で、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にクローニングした。
【０１２６】
表１：構築したＨｉｓタグ化クレアチニンデイミナーゼ変異体の概要。すべてのコンストラクトは、Ｔ．クレアチニニのゲノムＤＮＡに基づいており、５’上流および３’下流の領域を、配列番号３に示される通りにした。短いバージョンは、Ｍｅｔ開始コドンの後に６つのＨｉｓコドン（ＣＡＣまたはＣＡＴ）を含むか（Ｎ末端Ｈｉｓタグ）、または終止コドンの前に６つのＨｉｓコドン（ＣＡＣまたはＣＡＴ）を含む（Ｃ末端Ｈｉｓタグ）。Ｃ末端リンカーは、配列Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ（配列番号５、ヌクレオチド配列ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧ、配列番号６）を有し、クレアチニンデイミナーゼコーディング領域とＣ末端Ｈｉｓタグとの間に挿入される。Ｎ末端リンカーは、配列Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ（ヌクレオチド配列ＧＧＣＡＧＣＡＧＣ）を有し、クレアチニンデイミナーゼ５’上流ＵＴＲとＮ末端の６つのＨｉｓコドンとの間に挿入され、これに続いて、トロンビン切断部位を含むペプチド配列（Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ（配列番号７；ヌクレオチド配列ＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧ  ＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴ、配列番号８）があり、これが、そのＣ末端（Ｈｉｓ）において、クレアチニンデイミナーゼコーディング領域に融合されている。
【０１２７】
【表７】
2021509289.tif 000012
【０１２８】
構築したクローンを、振盪フラスコ培養物中で培養し、後処理し、実施例２において上述のものと同じ様式で、クレアチニンデイミナーゼ活性について分析した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析（図５）により、５’上流および３’下流の両方の領域を含むＨｉｓタグ化変異体（クローン１ｈ、６ｈ、および１１ｈ）が、両方の領域を含まない変異体と比較して、より良好な様式でクレアチニンデイミナーゼタンパク質を発現した（より多くの量の可溶性クレアチニンデイミナーゼタンパク質）ことが判明した。３’下流領域を含まない２つのＣ末端タグ化変異体は、発現効率が低く、少量の可溶性クレアチニンデイミナーゼタンパク質しか１６，０００×ｇ上清（クローン３ｈおよび４ｈ）において確認することができなかったが、これらのクローンの可溶性画分は、活性を示した。５’上流および３’下流の両方の領域を含むＨｉｓタグ化変異体（クローン１ｈ、６ｈ、および１１ｈ）は、より多くの量の可溶性タンパク質を産生し、可溶性画分は、良好な酵素活性を示したが、レベルは、ライセート中に存在する少量の可溶性タンパク質に相関して、クローン１と比較して低かった。これらの結果によっても、Ｔ．クレアチニニに由来するクレアチニンデイミナーゼが、Ｃ末端またはＮ末端Ｈｉｓタグ化変異体として良好に活性であることが確認された。
【実施例４】
【０１２９】
クレアチニンデイミナーゼのＨｉｓタグ化変異体の精製および比活性の判定
Ｈｉｓタグ化クレアチニンデイミナーゼの精製を、以下のプロトコールに従って行った：５０ｍｌの培養物の発酵ペレットを、３０ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５；１０ｍＭ  イミダゾール、１ｍＭ  ＤＴＴ）中に再懸濁させ、超音波処理によって破壊した。新しくパッケージングしたカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、滅菌濾過した（０．２μｍ）ライセート（１６，０００×ｇ上清）をロードし、続いて、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５、２０ｍＭ  イミダゾール、１  ｍＭ  ＤＴＴ）で洗浄した。タンパク質を、次いで、溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  イミダゾール、１ｍＭ  ＤＴＴ）で溶出させた。溶出したタンパク質を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ５２−１３０８−００  ＢＢ  ＰＤ−１０脱塩カラムを使用して、脱塩した。タンパク質を、５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴで、製造業者のプロトコールに従って、このカラムから溶出した。最終画分中のタンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐで分光光度法により測定した。比消衰係数は、ＰｒｏｔＰｒａｍソフトウェアを用いて判定した。図６において、クローン１ｈの精製を、例として示す。
【０１３０】
比活性の判定は、実施例２に記載される活性アッセイによって行った。２つの変異体のクローンは、１ｈである。サンプルの容量活性を、以下の等式に従って計算した：
【０１３１】
【数２】
2021509289.tif 000013
ε：使用した波長におけるＮＡＤＨの比吸収係数（６，２２ｍｌ  μｍｏｌ−１ｃｍ−１）
ｄｉｌ：希釈
ｄ：キュベットにおけるビームの経路長
Ｖｔｏｔａｌ：総容量
Ｖｓａｍｐｌｅ：サンプル容量
【０１３２】
アッセイ当たり０．５μｇのタンパク質を使用した場合、いずれの変異体も、タンパク質１ｍｇ当たり最大４０Ｕの範囲の比活性値を有した。活性値は、調製物に依存し、Ｈｉｓタグ精製タンパク質では２０〜４０Ｕ／ｍｇで変動した。
【実施例５】
【０１３３】
Ｔ．クレアチニニのクレアチニンデイミナーゼ活性と市販入手可能な酵素との比較
指定なしの微生物を起源とするクレアチニンデイミナーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ、製品コードＣＮＩ−３１１）を購入した。特許文献（Ｔｏｙｏｂｏ、例えば、Ｔｏｙｏｂｏ  ＪＰＳ６１２１９３８３ＡおよびＪＰ１９８５００００６２９００の特許）およびその酵素のデータによると、この酵素は、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）を起源とし、したがって、Ｔ．クレアチニニに由来する酵素とは異なる起源のものであると見られる。仕様データは、酵素調製物が、３０％の指定されていない安定剤を含有すると報告している。購入したロットは、１３．４Ｕ／ｍｇの比活性を有すると申告されていた。Ｔｏｙｏｂｏによって提供されている酵素活性値は、実施例４に記載のものと類似の様式で判定されたと報告されており、Ｔｏｙｏｂｏ酵素では、ＮＡＤＰＨ依存性ＧｌＤＨが使用されたという違いがあった。
【０１３４】
比較可能な状況を有するために、純粋な酵素のタンパク質濃度を、クローン１ｈに由来する高度に精製したＨｉｓタグ化クレアチニンデイミナーゼを使用して、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのバンド強度によって比較し、そのタンパク質濃度を、ＮａｎｏｄｒｏｐまたはＢｒａｄｆｏｒｄ法によって分光光度法で判定した（高度に精製されたタンパク質では同じ結果が得られる）。この比較のＳＤＳ  ＰＡＧＥを、図７に示す。
【０１３５】
図７から確認することができるように、Ｔｏｙｏｂｏ酵素の強度は、より低く、含量が７０％しかない（３０％の安定剤が存在する）ことに良好に対応していた。したがって、比活性の比較のために、Ｔｏｙｏｂｏ酵素で得られた値を、この係数で補正した。
【０１３６】
活性アッセイを、両方の酵素源、Ｔｏｙｏｂｏ、ならびにＴ．クレアチニニ由来のクローン１ｈおよびクローン１１ｈに由来する調製物に、異なる濃度の酵素を使用して行った。反応は、範囲全体にわたって完全に線形ではなく、低いＮＡＤＨ濃度ではわずかに緩やかになるため、活性値は、傾きが長期間にわたって十分に一定であった範囲から判定した（図８を参照されたい）。得られたデータを、表２に示す。シトシンに対する交差反応性の可能性を判定するために、並列アッセイにおいて、クレアチニンを、同じ濃度のシトシンで置き換えた。結果は、両方の酵素で、反応がバックグラウンド対照（酵素添加なし）と同じように挙動した。
【０１３７】
【表８】
2021509289.tif 000014
表２：クレアチニンデイミナーゼ調製物の比活性の判定。この実験では、０．３ｍＭ  ＮＡＤＨの代わりに０．１ｍＭ  ＮＡＤＨを使用した標準アッセイを使用した。これらの条件下では、線形範囲が広かった。Ｔ．クレアチニニ由来の調製物の説明およびタンパク質含量の平衡化に関するさらなる詳細については、図７を参照されたい。補正した活性値は、Ｔｏｙｏｂｏ酵素調製物の実際の酵素含量（７０％）の推定に基づく（上記を参照されたい）
【０１３８】
表２から理解できるように、本発明の酵素は、Ｔｏｙｏｂｏ酵素の約２倍活性である。別の興味深い点としては、本発明の酵素が、酵素濃度が低いほど活性が高いと見られること、ならびにＮ末端およびＣ末端タグ化変異体では活性レベルに有意差がないことである。
【０１３９】
図８において、活性アッセイの反応曲線を示し、そこから理解できるように、高いタンパク質濃度は、早期反応ステージにおいて反応の遅延をもたらす。低いタンパク質濃度において、より長い範囲の線形反応速度も観察される。
【実施例６】
【０１４０】
酵素活性および忠実性に対する二価カチオンの作用
配列番号４のクレアチニンデイミナーゼをコードするクローン１（実施例２を参照されたい）を、培養し、実施例２に記載されるように、組換えタンパク質産生を誘導した。１つのセットの培養は、０．１ｍＭ  Ｍｎ＋＋を補充したかまたは補充していないＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）培地を使用して行った。細胞を採取し、超音波処理によって破壊させ、１６，０００×ｇ上清を、クレアチニンデイミナーゼ活性に関して分析した。得られた結果を、表３に示す。
【０１４１】
表３．成長培地へのＭｎ＋＋添加（培地中０．１％のＭｎ＋＋）の、Ｔ．クレアチニニに由来するクレアチニンデイミナーゼの得られる比活性に対する作用。Ｃｄｉ：クローン１に由来する酵素、−２０℃でおよそ１年間保管（参照酵素として使用）。Ｔ＋Ｍｎ：０．１ｍＭ  Ｍｎ＋＋ありでＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈにおいて培養。ＴＢ−Ｍｎ：Ｍｎ＋＋の添加なしでＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈにおいて培養。
【表９】
2021509289.tif 000015
【０１４２】
表３から理解できるように、Ｍｎ＋＋の添加は、クレアチニンデイミナーゼの比活性に対して明らかな正の作用を有する。
【０１４３】
第２のセットでは、クローン１ｈ（Ｈｉｓタグ化タンパク質）を、所定の無機塩培地（適切なアミノ酸およびチアミンを補充した標準Ｍ９）において、炭素源としてグルコース（１０ｇ／Ｌ）とともに培養した。この培地の予備培養物を、マスター種ロットから植え付け、主培養物の植付けに使用した。クレアチニンデイミナーゼの発現を、およそＯＤ＝１で、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって誘導した。培養物には、誘導の時点で、以下の金属イオン（０．１ｍＭ）を補充した：Ｆｅ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｚｎ＋＋、およびこれらの組合せ。細胞を採取し、破壊させ、クレアチニンデイミナーゼタンパク質を、Ｎｉ−キレートクロマトグラフィーによって、１６，０００×ｇ上清から精製した。精製したクレアチニンデイミナーゼタンパク質を、活性に関して試験した。一般的な傾向として、Ｍｎ＋＋およびＦｅ＋＋の添加は、活性なタンパク質をもたらしたが、Ｚｎ＋＋の添加は、負の作用を有したと理解することができた（容量活性比較に基づく）。
【実施例７】
【０１４４】
クレアチニンデイミナーゼタンパク質の金属分析
クローン１ｈ（Ｈｉｓタグ化）に由来するクレアチニンデイミナーゼを、実施例２に記載されるように、ＴＢ培地および誘導の時点における０．１ｍＭ  Ｍｎ＋＋の添加を使用して、標準的な発酵により得た。ＦｅおよびＺｎは、使用した複合ＴＢ培地中に十分な量で存在していたため、補充しなかった。Ｍｎは、相当量で培地中に存在していないため、添加した。タンパク質を、実施例４に記載されるように、Ｎｉ−キレートクロマトグラフィーによって精製した。１３ｍｇ／ｍｌのタンパク質含量を有する精製した調製物を、原子吸収分光法による金属含量の分析に供した（Ｇｒａｚ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて実施）。結果を、表４に示す。
【０１４５】
表４：精製したＨｉｓタグ化クレアチニンデイミナーゼの金属分析。泳動１および２において、同じタンパク質調製物を分析し、泳動２は、４℃で４日間保管した後に行った。酵素の触媒活性に関与する関連する金属のみを示す。
【表１０】
2021509289.tif 000016
【実施例８】
【０１４６】
Ｔ．クレアチニニに由来するクレアチニンデイミナーゼの安定性
５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５で溶出した、実施例７に記載されるクローン１ｈの精製されたタンパク質（ＴＢ培地における培養および誘導時の０．１ｍＭ  Ｍｎの補充により得た）を、主として、−２０℃で凍結保管した。サンプルを、氷上でゆっくりと解凍し、０．１μｇ／μＬに希釈した後、４℃で７日間保管した。次いで、サンプルを分割し、アリコートを、４℃、２３℃、および３７℃で保管した。活性を、時間間隔で測定した。結果は、４℃で２５日間にわたった。すべての条件下で、活性に有意な違いは観察されなかった。２５日目からのサンプルも、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した（図９）。この分析により、タンパク質含量の低下または減衰の兆候も観察されなかった。
【実施例９】
【０１４７】
クレアチニンの定量判定
実施例７に記載される配列番号４による精製されたＨｉｓタグ化クレアチニンデイミナーゼ（クローン１ｈ）（ＴＢ培地における培養および誘導時の０．１ｍＭのＭｎの補充により得た）を、クレアチニンの定量判定に使用した。以下のアッセイ条件を使用した：
すべての溶液：５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５中
アッセイは以下の順序で設定した：
７５０μＬのクレアチニン溶液（異なる濃度）
１００μＬのα−ケトグルタル酸（１０ｍＭ）
１０μＬのＧｌＤＨ
ブランクを設定
５０μＬのＮＡＤＨ（５ｍＭ）
１００μＬの酵素溶液（３．６μｇ／μＬ、反応を開始させる）
【０１４８】
反応を、分光光度法により３４０ｎｍで測定し、２０分間にわたって追跡した。結果を、図１０に示すが、これは、２０ｍｇ／Ｌ  クレアチニンまで、クレアチニン濃度に対するＮＡＤＨの減衰に十分に線形な依存が得られることを示す。反応は、１０分で完了し、２０分の時点で測定したΔＥ値に有意差はなかった。
【実施例１０】
【０１４９】
Ｍｎ２＋の培地への添加、およびＭｎ２＋を含む二価金属の組合せの添加の作用。
酵素調製物
クレアチニンデイミナーゼ遺伝子の非タグ化野生型バージョンを含有する発現プラスミドを有する組換え大腸菌Ｗ３１１０株の培養、および無細胞ライセートの調製を、実施例２に記載されるように行った。細胞ライセートを使用し、ＱＦＦアニオン交換樹脂カラムおよびＡＫＴＡクロマトグラフィー系を使用して、イオン交換クロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。精製したタンパク質を、最後に、１ｍＭ  ＤＤＴを含有する５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に入れた。得られたタンパク質調製物（１８．７ｍｇ／ｍＬ）を、ＳＤＳゲル電気泳動によって分析し（図１１）、最低約７５％のクレアチニンデイミナーゼ含量が推定された。
【０１５０】
この調製物の金属含量を、Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ（ＩＣＰ−ＯＥＳ）によって判定した。タンパク質サンプルは、したがって、希釈によって約９ｍｇ／ｍＬの濃度に設定した。結果を、表５に要約する。
【０１５１】
表5: 金属分析の結果。モル比は、47.5kDaのクレアチニンデイミナーゼの分子量および試験した調製物中75%のクレアチニンデイミナーゼタンパク質の含量(図11)に基づき、タンパク質のサブユニット当たりで提供する(このタンパク質は2つのサブユニットを含む)。
【表１１】
2021509289.tif 000017
【０１５２】
得られたタンパク質調製物を、後続の金属交換研究に使用した：
タンパク質からの金属の除去
２ｍＬのタンパク質調製物を、２ｍＬのＰＤＣＡ透析緩衝液（１０ｍＭ  ２．６  ピリジンカルボン酸、６６ｍＭ  Ｎａ−アセテート、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）と混合した。溶液を、透析チューブ（Ｚｅｌｌｕｔｒａｎｓ／Ｒｏｔｈ  ６．０）に充填し、２５０ｍＬのＰＣＤＡ透析緩衝液中で１．５時間で３回透析した。最後の透析工程は、１．２５Ｌの５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５中で終夜行った後、０．２μｍの濾過膜を通して濾過した。最終的なタンパク質溶液（アポタンパク質）は、８．６５ｍｇ／ｍＬ（４ｍＬ容量）の濃度を有していた。
【０１５３】
金属交換
アポタンパク質調製物を、１ｍＭ  ＤＤＴを含有する５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で最終容量１３．３ｍＬまで希釈した。これにより、約０．０５ｍＭのタンパク質モル濃度が得られた（クレアチニンデイミナーゼの分子量は、４７１２４Ｄａである）。１．９ｍＬの画分に、以下の金属イオンのＨ２Ｏ中１００ｍＭ  ストック溶液を使用して、図１２に示されるように、０．１ｍＭまで金属イオン（それぞれのイオン、およそ２倍モル過剰）を補充した：
Ｍｎ（ＩＩ）Ｃｌ２．４×Ｈ２Ｏ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４．７×Ｈ２Ｏ、Ｚｎ（ＩＩ）Ｃｌ２。
【０１５４】
タンパク質−金属混合物を、４℃で２．５時間インキュベートし（手でチューブを振盪させることによって数回わずかに混合した）、その後、卓上型遠心分離装置（１２，０００ｒｐｍ）において遠心分離して、可能性のある沈殿物を除去した（観察されていない）。上清（それぞれ１．９ｍＬ）を、次いで、１ｍＭ  ＤＤＴを含有する５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で事前平衡させたＰＤ−１０ゲル濾過カラムにロードした。カラムを、次いで、０．６ｍＬの同じ緩衝液で流し、最終的に、タンパク質を、３ｍＬの同じ緩衝液で溶出させた。すべての調製物の比活性を、これらの溶液において判定した。結果を、図１２に要約し、酵素活性に対するＭｎ２＋単独またはＺｎ２＋、Ｆｅ２＋、もしくは両方との組合せでの正の作用が明確に判明した。
【図１】
2021509289.tif 000018
【図２】
2021509289.tif 000019
【図３】
2021509289.tif 000020
【図４】
2021509289.tif 000021
【図５】
2021509289.tif 000022
【図６】
2021509289.tif 000023
【図７】
2021509289.tif 000024
【図８】
2021509289.tif 000025
【図９】
2021509289.tif 000026
【図１０】
2021509289.tif 000027
【図１１】
2021509289.tif 000028
【図１２】
2021509289.tif 000029
【配列表】
2021509289000001.app
【国際調査報告】
2021509289.tif 000030
2021509289.tif 000031
2021509289.tif 000032