(57)【要約】本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む成形体用組成物に関する。さらに、本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む成形体、ならびに、当該成形体を調製するためのプロセスに関する。【選択図】図１１
2021534277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む成形体用組成物であって、
前記組成物が、流動可能な状態に誘導され得、
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記流動可能な状態で実質的に分解されない、前記組成物。
【請求項２】
剪断力と圧力とを加えることにより、前記流動可能な状態に誘導され得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
熱を加えずに、剪断力と圧力とを加えることにより、前記流動可能な状態に誘導され得る、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、前記流動可能な状態に誘導され得、かつ、前記組成物内で実質的に分解せずに残存している前記組換えスパイダーシルクタンパク質が複数回押し出され得る、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
熱可塑性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
１．５Ｎｍ〜１３Ｎｍの範囲の剪断力を加えることにより、流動可能な状態に誘導され得る、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
２Ｎｍ〜６Ｎｍの範囲の剪断力を加えることにより、流動可能な状態に誘導され得る、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
１ＭＰａ〜３００ＭＰａの範囲の圧力を加えることにより、流動可能な状態に誘導され得る、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
５ＭＰａ〜７５ＭＰａの範囲の圧力を加えることにより、流動可能な状態に誘導され得る、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
１２０℃未満、８０℃未満、４０℃未満、または、室温で、流動可能な状態に誘導され得る、請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
２．１６ｋｇの荷重で、９５℃で、ＡＳＴＭ  Ｄ１２３８に従って試験した場合に、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、または、少なくとも５のメルトフローインデックスを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
２１．６ｋｇの荷重で、９５℃で、ＡＳＴＭ  Ｄ１２３８に従って試験した場合に、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、または、少なくとも５のメルトフローインデックスを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
実質的に均質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、繰り返し単位を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、６０〜１００アミノ酸の範囲のアミノ酸残基長を、範囲２〜２０個の繰り返し単位で含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質の分子量が、２０〜２０００ｋＤａの範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、少なくとも２回の繰り返し単位の出現を含み、前記繰り返し単位が、
１５０を超えるアミノ酸残基、及び、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有することと、
少なくとも８０％のアラニン含量を含む、６つ以上の連続するアミノ酸を有するアラニンに富む領域と、
少なくとも４０％のグリシン含量、及び、３０％未満のアラニン含量を含む、１２個以上の連続するアミノ酸を有するグリシンに富む領域と、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記可塑剤が、ポリオール、水、及び／または、尿素から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ポリオールが、グリセロールを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記可塑剤が、水を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在し、
可塑剤と組換えシルクポリペプチド粉末との重量比が、０．０５：１〜４：１の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在し、
可塑剤と組換えシルクポリペプチド粉末との重量比が、０．２０：１〜０．７０：１の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在し、
前記組成物中の組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の量が、１〜９０重量％の組換えスパイダーシルクタンパク質の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在し、
前記組成物中の組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の量が、２０〜４１重量％の組換えスパイダーシルクタンパク質の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
可塑剤として、１〜９０重量％の範囲のグリセロールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
可塑剤として、１５〜３０重量％の範囲のグリセロールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
可塑剤として、５〜８０重量％の範囲の水を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
可塑剤として、１９〜２７重量％の範囲の水を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記流動可能な状態で、１０．０重量％未満の量が分解される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記流動可能な状態で、６．０重量％未満の量が分解される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記流動可能な状態で、２．０重量％未満の量が分解される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質の分解が、前記流動可能な状態が誘導される前後の組成物に存在する全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量を測定することによって評価される、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量が、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物を含む成形体。
【請求項３５】
前記成形体が繊維である、請求項３４に記載の成形体。
【請求項３６】
前記繊維が、１００Ｐａ〜１．２ＧＰａの範囲の強度のものである、請求項３５に記載の成形体。
【請求項３７】
前記繊維が、偏光顕微鏡法で測定した場合に、５×１０−５〜約０．０４の範囲の複屈折のものである、請求項３５に記載の成形体。
【請求項３８】
成形体を調製するためのプロセスであって、
（ａ）組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む組成物に対して、圧力及び剪断力を加えて、前記組成物を流動可能な状態に変換するステップと、
（ｂ）流動可能な状態で前記組成物を押し出して、成形体を形成するステップと、
を含む、前記プロセス。
【請求項３９】
前記組成物を押し出して成形体を形成するステップが、前記組成物を押し出して繊維を形成することを含む、請求項３８に記載のプロセス。
【請求項４０】
前記組成物を押し出して繊維を形成することが、紡糸口金を通して前記組成物を押し出すことを含む、請求項３９に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記組成物を押し出して成形体を形成するステップが、前記組成物を型に押し出すことを含む、請求項３８に記載のプロセス。
【請求項４２】
（ａ）前記成形体に対して、圧力及び剪断力を加えて、前記成形体を流動性のある組成物に変換するステップと、
（ｂ）前記流動可能な状態で前記組成物を押し出して、第２の成形体を形成するステップと、
をさらに含む、請求項３８に記載のプロセス。
【請求項４３】
前記第２の成形体に対して、前記ステップ（ａ）及び（ｂ）を少なくとも１回繰り返すことをさらに含む、請求項４２に記載のプロセス。
【請求項４４】
前記剪断力が１．５〜１３Ｎｍである、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記圧力が、１ＭＰａ〜３００ＭＰａである、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４６】
前記剪断力と前記圧力を、毛細管レオメーター、または、二軸スクリュー押出機を使用して前記組成物に加える、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４７】
前記圧力及び前記剪断力を加える間の前記二軸スクリュー押出機のスクリュー速度が、１０〜３００ＲＰＭの範囲である、請求項４６に記載のプロセス。
【請求項４８】
前記剪断力と前記圧力を加えるために使用する器具が、押出チャンバーに結合され、かつ、前記押出チャンバーの近位にある混合チャンバーを含む、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４９】
前記組成物が、前記混合チャンバー内で加熱される、請求項４８に記載のプロセス。
【請求項５０】
前記組成物が、前記押出チャンバー内で加熱される、請求項４８に記載のプロセス。
【請求項５１】
前記組成物が、１２０℃未満の温度にまで加熱される、請求項４９または請求項５０のいずれかに記載のプロセス。
【請求項５２】
前記組成物が、８０℃未満の温度にまで加熱される、請求項４９または請求項５０に記載のプロセス。
【請求項５３】
前記組成物が、４０℃未満の温度にまで加熱される、請求項４９または請求項５０に記載のプロセス。
【請求項５４】
押し出した後の前記成形体が、押し出し前の前記組成物と比較して、１５％未満の水分を損失している、請求項３８〜５３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５５】
押し出した後の前記成形体が、押し出し前の前記組成物と比較して、１０％未満の水分を損失している、請求項３８〜５３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５６】
前記組成物が、３〜７分の範囲の、前記混合チャンバーでの滞留時間を有する、請求項４８に記載のプロセス。
【請求項５７】
前記押出チャンバーが、前記組成物が押し出されるオリフィスの近位で先細になっている、請求項４８に記載のプロセス。
【請求項５８】
前記押出チャンバーが、温度制御される、請求項４８に記載のプロセス。
【請求項５９】
前記成形体が繊維であり、前記繊維が手作業で延伸される、請求項４８〜５８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６０】
前記成形体が繊維であり、前記繊維が複数のステップで延伸される、請求項４８〜５９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６１】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記成形体において、実質的に分解していない、請求項４８〜６０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６２】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記成形体において、１０重量％未満の量が分解される、請求項６１に記載のプロセス。
【請求項６３】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記成形体において、６重量％未満の量が分解される、請求項６１に記載のプロセス。
【請求項６４】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記成形体において、２重量％未満の量が分解される、請求項６１に記載のプロセス。
【請求項６５】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質の分解が、押し出しの前後において前記組成物に存在する全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量を測定して評価される、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６６】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量を測定する、請求項６５に記載のプロセス。
【請求項６７】
前記成形体が、偏光顕微鏡によって測定した場合に、最小の複屈折を有する、請求項３８〜６６のいずれか１項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月１０日に出願した米国仮出願第６２／７１７，６２２号の利益を主張するものであり、同出願の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０００２】
分野
本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む成形体用組成物に関する。さらに、本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む成形体、ならびに、当該成形体を調製するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
石油を原料とする製品の代替物として、生物再生可能な材料、及び、生分解性の材料に対する関心が高まっている。この目的のために、植物や動物に由来する分子から材料や繊維を作り出す方法を開発すべく、多大な努力が払われてきた。再生タンパク質から作り出された繊維の歴史は、１８９０年代にまで遡り、このような繊維は、様々な伝統的湿式紡績技術を使用して作り出されていた。
【０００４】
湿式紡糸は、溶剤と凝固浴槽の両方を使用して繊維を製造する。この手順は、溶媒として化学物質を使用すること、また、凝固浴槽では、紡糸プロセスの後に繊維から抽出を行う必要があり、また、持続可能で信頼性のあるプロセスを提供するためには、閉ループのプロセスに供する必要がある、という点で不利である。溶融紡糸は、溶媒及び凝固浴槽を必要としない点で、湿式紡糸に対して魅力的な選択肢を提供するが、溶融紡糸は、（ｉ）ポリマーを押し出して、業務用品質の繊維を形成することができる均質な溶融組成物を生成すること、及び、（ｉｉ）溶融及び押し出しステップの間にポリマーが分解しないこと、も必要としている。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書で提供しているものは、本発明の一部の実施形態によれば、成形体用組成物、及び、組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む成形体であり、組成物は、溶融または流動可能な状態に変換した後に実質的に均質とされ得るものであり、組換えスパイダーシルクタンパク質は、実質的に分解していないか、または、成形体に形成した後に、６．０重量％未満の量が分解される。
【０００６】
さらに、本開示は、成形体を調製するためのプロセスを提供しており、同プロセスは、組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む組成物に対して、圧力及び／または剪断力を加えて、実質的に均質な溶融組成物を形成するステップ、及び、均質な溶融組成物を成形して、成形体を形成するステップを含む。実質的に均質な溶融組成物は、一般的には、流動可能な状態にあり、また、例えば、繊維を形成するために押し出され得る。
【０００７】
一部の実施形態によれば、本明細書で提供しているものは、組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む成形体用組成物であり、組成物は、流動可能な状態に誘導することができ、組換えスパイダーシルクタンパク質は、流動可能な状態で、実質的に分解していない。
【０００８】
一部の実施形態では、組成物は、剪断力と圧力とを加えることで、流動可能な状態に誘導され得る。一部の実施形態では、組成物は、熱を加えずに、剪断力と圧力とを加えることで、流動可能な状態に誘導され得る。一部の実施形態では、組成物は、流動可能な状態に誘導され得、組成物内で実質的に分解せずに残存している組換えスパイダーシルクタンパク質を、複数回押し出すことができる。
【０００９】
一部の実施形態では、組成物は、熱可塑性である。
【００１０】
一部の実施形態では、組成物は、１．５Ｎｍ〜１３Ｎｍの範囲の剪断力を加えることで、流動可能な状態に誘導され得る。一部の実施形態では、組成物は、２Ｎｍ〜６Ｎｍの範囲の剪断力を加えることで、流動可能な状態に誘導され得る。一部の実施形態では、組成物は、１ＭＰａ〜３００ＭＰａの範囲の圧力を加えることで、流動可能な状態に誘導され得る。一部の実施形態では、組成物は、５ＭＰａ〜７５ＭＰａの範囲の圧力を加えることで、流動可能な状態に誘導され得る。
【００１１】
一部の実施形態では、組成物は、１２０℃未満、８０℃未満、４０℃未満、または、室温で、流動可能な状態に誘導され得る。一部の実施形態では、組成物は、実質的に均質である。
【００１２】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、繰り返し単位を含む。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、６０〜１００アミノ酸の範囲のアミノ酸残基長を、範囲２〜２０の繰り返し単位で含む。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質の分子量は、２０〜２０００ｋＤａの範囲である。
【００１３】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、繰り返し単位を、少なくとも２つ含み、繰り返し単位は；１５０を超えるアミノ酸残基と、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有すること；少なくとも８０％のアラニン含量を含む、６つ以上の連続するアミノ酸を有するアラニンに富む領域；及び、少なくとも４０％のグリシン含量、及び、３０％未満のアラニン含量を含む、１２個以上の連続するアミノ酸を有するグリシンに富む領域、を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、可塑剤は、ポリオール、水、及び／または、尿素から選択される。一部の実施形態では、ポリオールは、グリセロールを含む。一部の実施形態では、可塑剤は、水を含む。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在しており、そして、可塑剤と組換えシルクポリペプチド粉末との重量比は、０．０５〜１．５０：１の範囲である。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在しており、そして、可塑剤と組換えシルクポリペプチド粉末との重量比は、０．２０〜０．７０：１の範囲である。
【００１５】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在しており、組成物中の組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の量は、１〜９０重量％の組換えスパイダーシルクタンパク質の範囲である。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在しており、組成物中の組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の量は、２０〜４１重量％の組換えスパイダーシルクタンパク質の範囲である。一部の実施形態では、組成物は、可塑剤として、１〜６０重量％の範囲のグリセロールを含む。一部の実施形態では、組成物は、可塑剤として、１５〜３０重量％の範囲のグリセロールを含む。一部の実施形態では、組成物は、可塑剤として、５〜８０重量％の範囲の水を含む。一部の実施形態では、組成物は、可塑剤として、１９〜２７重量％の範囲の水を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、流動可能な状態において、１０．０重量％未満の量が分解される。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、流動可能な状態において、６．０重量％未満の量が分解される。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、流動可能な状態において、２．０重量％未満の量が分解される。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質の分解は、流動可能な状態が誘導される前後の組成物に存在する全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量を測定することによって評価される。一部の実施形態では、全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定される。
【００１７】
本明細書では、本発明の一部の実施形態によれば、組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む成形体用組成物を含む成形体も提供しており、組成物は、流動可能な状態に誘導され得、組換えスパイダーシルクタンパク質は、流動可能な状態では実質的に分解されていない。
【００１８】
一部の実施形態では、成形体は、繊維である。一部の実施形態では、繊維は、１００Ｐａ〜１．２ＧＰａの範囲の強度を有する。一部の実施形態では、繊維は、偏光顕微鏡法で測定した場合に、５×１０−５〜約０．０４の範囲の複屈折を有する。
【００１９】
本明細書では、本発明の一部の実施形態によれば、成形体を調製するためのプロセスも提供しており、組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む組成物に対して圧力及び剪断力を加えて、組成物を流動可能な状態に変換するステップ、及び、流動可能な状態で組成物を押し出して成形体を形成するステップ、を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、組成物を押し出して成形体を形成するステップは、組成物を押し出して繊維を形成することを含む。一部の実施形態では、組成物を押し出して繊維を形成することは、組成物を紡糸口金に通して押し出すことを含む。一部の実施形態では、組成物を押し出して成形体を形成するステップは、組成物を型に押し出すことを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、成形体を調製するためのプロセスは、（ａ）成形体に対して圧力及び剪断力を加えて、成形体を流動可能な状態の組成物に変換するステップ、及び、（ｂ）組成物を流動可能な状態で押し出して第２の成形体を形成するステップ、をさらに含む。一部の実施形態では、プロセスは、第２の成形体に対して、ステップ（ａ）及び（ｂ）を、少なくとも１度は繰り返す、ことをさらに含む。
【００２２】
一部の実施形態では、剪断力は、１．５〜１３Ｎ＊ｍである。一部の実施形態では、圧力は、１ＭＰａ〜３００ＭＰａである。一部の実施形態では、剪断力と圧力とを、毛細管レオメーター、または、二軸スクリュー押出機を使用して組成物に加える。一部の実施形態では、二軸スクリュー押出機のスクリュー速度は、当該圧力及び剪断力を加えている間は、１０〜３００ＲＰＭの範囲である。
【００２３】
一部の実施形態では、剪断力と圧力とを加えるために使用する機器は、押出チャンバーに結合され、かつ、押出チャンバーの近位にある混合チャンバーを含む。一部の実施形態では、組成物を、混合チャンバー内で加熱する。一部の実施形態では、組成物を、押出チャンバー内で加熱する。一部の実施形態では、組成物を、１２０℃未満の温度にまで加熱する。一部の実施形態では、組成物を、８０℃未満の温度にまで加熱する。一部の実施形態では、組成物を、４０℃未満の温度にまで加熱する。一部の実施形態では、押し出しチャンバーは、組成物が押し出されるオリフィスの近位で先細になっている。一部の実施形態では、押出チャンバーを、温度制御している。一部の実施形態では、組成物の混合チャンバーでの滞留時間は、３〜７分の範囲である。
【００２４】
一部の実施形態では、押し出した後の成形体は、押し出し前の組成物と比較して、１５％未満の水分を損失する。一部の実施形態では、押し出した後の成形体は、押し出し前の組成物と比較して、１０％未満の水分を損失する。
【００２５】
一部の実施形態では、成形体は、繊維であり、かつ、繊維を、手作業で延伸する。一部の実施形態では、成形体は、繊維であり、かつ、繊維を、複数のステップにわたって延伸する。
【００２６】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、成形体では、実質的に分解していない。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、成形体では、１０重量％未満の量が分解される。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、成形体では、６重量％未満の量が分解される。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、成形体では、２重量％未満の量が分解される。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質の分解を、押し出しの前後に組成物に存在する全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量を測定して評価する。一部の実施形態では、全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定する。
【００２７】
一部の実施形態では、成形体は、偏光顕微鏡法で測定された場合に、最小の複屈折を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
前述した、及び、その他の目的、特徴、ならびに、利点は、添付した図面で例示する、本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。
【００２９】
【図１】本発明の様々な実施形態による、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ４９Ｗ２１Ｇ３０溶融組成物のサイズ排除クロマトグラフィーデータを示す。
【図２】本発明の様々な実施形態による、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ６５Ｗ２０Ｇ１５溶融組成物のサイズ排除クロマトグラフィーデータを示す。
【図３】本発明の様々な実施形態による、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ７１Ｗ１９Ｇ１０溶融組成物のサイズ排除クロマトグラフィーデータを示す。
【図４】本発明の様々な実施形態による、熱重量分析（ＴＧＡ）で測定した、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ４９Ｗ２１Ｇ３０溶融組成物を押し出している間の水分損失のチャートを示す。データは、押出前の出発ペレットと、押出後に選択した条件下で押出した試料との含水率（％）を示す。
【図５】本発明の様々な実施形態による、熱重量分析（ＴＧＡ）で測定した、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ６５Ｗ２０Ｇ１５溶融組成物を押し出している間の水分損失のチャートを示す。データは、押出前の出発ペレットと、押出後に選択した条件下で押出した試料との含水率（％）を示す。
【図６】本発明の様々な実施形態による、熱重量分析（ＴＧＡ）で測定した、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ７１Ｗ１９Ｇ１０溶融組成物を押し出している間の水分損失のチャートを示す。データは、押出前の出発粉末と、押出後に選択した条件下で押出した試料との含水率（％）を示す。
【図７】フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）で測定した、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ４９Ｗ２１Ｇ３０試料のベータシート含量を示す。試料を、出発タンパク質粉末、及び、出発ペレットのリファレンスコントロールと比較した。
【図８】フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）で測定した、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ６５Ｗ２０Ｇ１５試料のベータシート含量を示す。試料は、出発タンパク質粉末、及び、出発ペレットのリファレンスコントロールと比較した。
【図９】フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）で測定した、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ７１Ｗ１９Ｇ１０試料のベータシート含量を示す。試料を、出発タンパク質粉末、及び、出発ペレットのリファレンスコントロールと比較した。
【図１０】偏光顕微鏡を使用して捕捉した、２０ｏＣで、１０、１００、２００、または、３００ＲＰＭで製造した、選択した押出製品の画像を示す。
【図１１】偏光顕微鏡を使用して捕捉した、９５ｏＣで、１０、１００、２００、または、３００ＲＰＭで製造した、選択した押出製品の画像を示す。
【図１２】本発明の様々な実施形態による、ＨＰＬＣによって測定した、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ４９Ｗ２１Ｇ３０押出物を押し出している間のグリセロール損失のチャートを示す。データは、選択した条件下での押出前及び押出後の試料での出発粉末またはペレットのグリセロール含有率（％）を示す。
【図１３】本発明の様々な実施形態による、ＨＰＬＣによって測定した、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ６５Ｗ２０Ｇ１５押出物を押し出している間のグリセロール損失のチャートを示す。データは、選択した条件下での押出前及び押出後の試料での出発粉末またはペレットのグリセロール含有率（％）を示す。
【図１４】本発明の様々な実施形態による、ＨＰＬＣによって測定した、選択した熱条件及びＲＰＭ条件下で押し出したＰ７１Ｗ１９Ｇ１０押出物を押し出している間のグリセロール損失のチャートを示す。データは、選択した条件下での押出前及び押出後の試料での出発粉末またはペレットのグリセロール含有率（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
本発明の様々な実施形態の詳細を、以下の説明に記載する。本発明のその他の特徴、目的、及び、利点は、説明から明らかになるであろう。本明細書中で別段の定義がない限り、本発明との関連で使用される科学用語及び技術用語は当業者が共通して理解する意味を持つものとする。さらに、文脈に別段の必要性がない限り、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」には、文脈上別段の指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。一般に、本明細書に記載する生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質及び核酸化学ならびにハイブリダイゼーションとの関連で使用される術語及びそれらに関する技術は、当該技術分野で周知の一般的に使用されるものである。
【００３１】
定義
別段の指示がない限り、以下の用語は以下の意味を持つものと理解されるべきである。
【００３２】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、少なくとも１０塩基長ある、ヌクレオチドの重合体形態を指す。かかる用語には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびに非天然型ヌクレオチド類似体、非天然ヌクレオシド間結合、またはその両方を含有するＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体が含まれる。核酸は、どのような形態学的コンホメーションにあってもよい。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的二本鎖、分岐鎖、ヘアピン状、環状、またはパドロックドコンホメーションであってもよい。
【００３３】
別段の指示がない限り、「配列番号」という一般形式で本明細書に記載のあらゆる配列についての一例として、「配列番号１を含む核酸」とは、少なくとも一部に、（ｉ）配列番号１に記載の配列を有するか、または（ｉｉ）配列番号１に相補的な配列を有する核酸を指す。二者択一は文脈により決定される。例えば、核酸がプローブとして使用されている場合は、プローブは所望の標的に相補的でなければならないという要件により二者択一が決定される。
【００３４】
「単離した」ＲＮＡ、ＤＮＡ、または、混合ポリマーとは、その天然の宿主細胞において、天然のポリヌクレオチドに自然と付随しているその他の細胞成分、例えば、自然と関連している、リボソーム、ポリメラーゼ、及び、ゲノム配列から実質的に分離したもののことである。
【００３５】
「単離した」有機分子（例えば、シルクタンパク質）とは、それが由来する宿主細胞の細胞成分（膜脂質、染色体、タンパク質）、または、宿主細胞の培養で使った培地から実質的に分離されているものである。この用語は、生体分子が、その他のすべての化学物質から分離されていることを必要としないが、特定の単離した生体分子は、ほぼ均一に精製し得る。
【００３６】
用語「組換え型」とは、生体分子、例えば、遺伝子またはタンパク質であって、（１）その天然に生じる環境から除かれているもの、（２）自然界ではその遺伝子が見られるポリヌクレオチドの全部または一部に会合していないもの、（３）自然界では連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているもの、または（４）自然界では生じないものを指す。「組換え型」という用語は、クローン化ＤＮＡ分離物、化学合成ポリヌクレオチド類似体、または、異種系により生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、ならびにかかる核酸によりコードされるタンパク質及び／またはｍＲＮＡに関して用いてもよい。
【００３７】
生物ゲノムの内在性核酸配列（またはその配列によりコードされるタンパク質産物）の発現が変化するよう、この内在性核酸配列に隣接して異種配列が置かれている場合、その内在性核酸配列は本明細書では「組換え型」とみなされる。この場合、異種配列は、その異種配列がそれ自体内在性（同一宿主細胞またはその子孫由来）または外因性（異なる宿主細胞またはその子孫由来）であるか否かにかかわらず、天然では内在性核酸配列に隣接していない配列である。例として、プロモーター配列は、宿主細胞のゲノムに存在する遺伝子の天然プロモーターを（例えば、相同組換えにより）置換して、この遺伝子の発現パターンが変化するようにすることができる。ここで、この遺伝子は、天然ではそれに隣接している配列の少なくともいくつかの配列から分離されているため「組換え型」と考えられるであろう。
【００３８】
核酸もまた、それが、ゲノム中の対応する核酸に対する、天然では生じない何らかの改変を含有する場合に「組換え型」とみなされる。例えば、内在性コード配列は、それが人為的に、例えば、人の介入などによって導入された挿入、欠失または点変異を含有する場合は「組換え型」とみなされる。「組換え核酸」には、宿主細胞染色体内の非相同部位に組み込まれた核酸、及びエピソームとして存在する核酸構築体も含まれる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」とは、短いポリペプチド、例えば、一般的に約５０アミノ酸長より短い、より一般的には約３０アミノ酸長より短いものを指す。本明細書で使用する用語は、類似体ならびに構造機能を模倣することで生物学的機能を模倣する模倣物を包含する。
【００４０】
用語「ポリペプチド」は、天然に生じるタンパク質と天然に生じないタンパク質の両方、ならびにその断片、変異体、誘導体及び類似体を包含する。ポリペプチドはモノマーでもポリマーでもよい。さらに、ポリペプチドは、各々が１つ以上の別個の活性を有する多数の異なるドメインを含んでよい。
【００４１】
「単離したタンパク質」または「単離したポリペプチド」という用語は、その起源または誘導体源という点で、（１）その天然の状態ではそれに付随する天然の会合成分と会合していないタンパク質またはポリペプチド、（２）自然界では見られない純度で存在するタンパク質またはポリペプチドであり、その場合、純度は、他の細胞物質の存在に関して判定可能である（例えば、同一種由来の他のタンパク質を含まない）、（３）異なる種から得た細胞が発現するタンパク質またはポリペプチド、または（４）自然界では生じないタンパク質またはポリペプチド（例えば、自然界に見られるポリペプチドの断片であるか、または自然界では見られないアミノ酸類似体もしくはアミノ酸誘導体または標準ペプチド結合以外の結合が含まれているもの）である。したがって、化学的に合成されたポリペプチド、または天然での起源となる細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然での会合成分から「単離されている」。ポリペプチドまたはタンパク質は、当該技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して単離することにより、天然での会合成分を実質的に含まないようにしてもよい。このように定義した場合、「単離された」とは、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが必ずしもその天然の環境から物理的に除かれている必要はない。
【００４２】
用語「ポリペプチド断片」とは、全長ポリペプチドと比較して欠失を有する、例えば、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端などの欠失を有するポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、ポリペプチド断片は、その断片のアミノ酸配列が天然に生じる配列での対応する位置と同一な連続配列である。断片は一般的に、少なくとも５、６、７、８、９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０または４５アミノ酸、よりさらに好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、よりさらに好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
【００４３】
あるタンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、そのタンパク質は第２のタンパク質に対し「相同性」を有するかまたは「相同」である。あるいは、あるタンパク質が第２のタンパク質に対する相同性を有するのは、その２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合である。（したがって、「相同タンパク質」という用語は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。本明細書で使用する場合、２つのアミノ酸配列領域間の相同性（特に、予測される構造類似性に関して）は、機能における類似性を意味すると解釈される。
【００４４】
タンパク質またはペプチドに関して「相同」を使用する場合、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なることが多いと認識される。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、化学的性質（例えば、電荷または疎水性）が類似する側鎖（Ｒ基）を持つ別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換ではタンパク質の機能特性は実質的に変化しない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なっている場合、配列同一性（％）または相同性の程度を上方修正してその置換の保存的性質について補正してよい。こうした修正を行う手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１及び２５：３６５−８９（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００４５】
２０種の従来のアミノ酸及びそれらの略語は慣例に従う。参照により本明細書に援用されるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｇｒｅｎ  ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，２ｎｄ  ｅｄ．１９９１）を参照のこと。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然型アミノ酸、例えば、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など、及び他の非従来型アミノ酸も本発明のポリペプチドの適切な構成成分である場合がある。非従来型アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で使用するポリペプチド表記では、標準的使用及び慣例に従って左側末端はアミノ末端に対応し、右側末端はカルボキシ末端に対応する。
【００４６】
以下の６群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００４７】
配列同一性（％）とも呼ばれることがあるポリペプチドの配列相同性は一般的に、シークエンス解析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５を参照のこと。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めて、さまざまな置換、欠失及び他の改変に対して割り当てられた相同性尺度を使用して類似配列を一致させる。例えば、ＧＣＧには、「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムが同梱されており、それらをデフォルトのパラメータで使用して、密接に関連するポリペプチド同士、例えば、異なる種の生物に由来する相同ポリペプチド同士などの配列相同性または配列同一性を、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧ  バージョン６．１を参照のこと。
【００４８】
異なる生物由来の配列を多数含むデータベースと特定のポリペプチド配列とを比較する際に有用なアルゴリズムはＢＬＡＳＴというコンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、Ｇｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）、Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７））、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））である。
【００４９】
ＢＬＡＳＴｐの好ましいパラメータは、期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くコスト：１１（デフォルト）；ギャップを伸長するコスト：１（デフォルト）；最大アラインメント：１００（デフォルト）；文字列サイズ：１１（デフォルト）；表示件数：１００（デフォルト）；ペナルティー行列：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
【００５０】
ＢＬＡＳＴｐの好ましいパラメータは、期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くコスト：１１（デフォルト）；ギャップを伸長するコスト：１（デフォルト）；最大アラインメント：１００（デフォルト）；文字列サイズ：１１（デフォルト）；表示件数：１００（デフォルト）；ペナルティー行列：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。相同性を比較するポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より一般には少なくとも約２４残基、一般的に少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基より多くになる。多数の異なる生物に由来する配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を使用したデータベース検索は、ｂｌａｓｔｐ以外の当該技術分野で公知のアルゴリズムにより測定することができる。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧ  バージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列の間で最も重複している領域のアラインメント及び配列同一性（％）を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）（参照により本明細書に援用されるものとする）。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性（％）は、参照により本明細書に援用されるＧＣＧ  バージョン６．１で提供されるＦＡＳＴＡをそのデフォルトのパラメータで使用して決定することができる（文字列サイズは２、またスコア行列はＰＡＭ２５０）。
【００５１】
本明細書全体及び請求項を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語句、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述されている整数または整数群が包含されることを意味し、他のいかなる整数または整数群も除外されないことを意味することを理解されるであろう。
【００５２】
本明細書で定義する用語「成形体」とは、型と呼ばれる剛性フレームを使用して、液体または柔軟な原材料を成形する成形プロセスを経て製造する物体を指すものであり、同成形プロセスとして、押出成形、射出成形、圧縮成形、ブロー成形、積層、マトリックス成形、回転成形、スピンキャスティング、トランスファー成形、熱成形などがあるが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書で定義する用語「繊維」とは、細長い成形体のことを指し、一般的には、繊維は、フィラメントの形態を有する。
【００５４】
本明細書で使用する用語「溶融紡糸」とは、ポリマーから繊維を形成する方法のことを指し、このポリマーは、溶融可能または流動可能な状態に変換され、次に、紡糸口金から押し出した後に冷却して固化する。
【００５５】
繊維に関して本明細書で使用する用語「延伸」とは、繊維を押し出している間、または、押し出した後に、紡糸した繊維を、その長手方向軸に沿って延伸する力を加えることを指す。用語「未延伸繊維」とは、押し出しは行ったが、延伸を受けていない繊維のことを指す。用語「延伸倍率」とは、一般的に、回収率と供給率との間の比率として定義する技術用語である。一定の体積では、繊維の初期直径（Ｄｉ）と最終直径（Ｄｆ）の比率（つまり、Ｄｉ／Ｄｒ）から決定する。
【００５６】
本明細書で使用する用語「ガラス転移」とは、物質または組成物の硬い、堅い、または「ガラス状」状態から、より柔軟な「ゴム状」または「粘性」状態への転移のことを指す。
【００５７】
本明細書で使用する用語「ガラス転移温度」とは、物質または組成物が、ガラス転移を受ける温度のことを指す。
【００５８】
本明細書で使用する用語「溶融転移」とは、物質または組成物が、ゴム状状態から、より秩序の無い液相、または、流動可能な状態へ転移することを指す。
【００５９】
本明細書で使用する用語「溶融温度」とは、物質が、溶融転移を起こす温度範囲のことを指す。
【００６０】
本明細書で使用する用語「可塑剤」とは、ポリペプチド配列と相互作用して、ポリペプチド配列が、三次構造、及び、結合を形成することを妨げ、及び／または、ポリペプチド配列の移動度を増加させるあらゆる分子のことを指す。
【００６１】
本明細書で使用する用語「流動可能な状態」とは、液体と実質的に同じ特性を有する（すなわち、ゴム状状態から液体状態へとさらに移行している）組成物のことを指す。
【００６２】
例示的な方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載の方法及び材料と類似または同等のものも本発明を実施する際に使用可能であり、当業者には明らかとなるであろう。本明細書で言及される刊行物及び他の参考文献はいずれも、参照によりその全体が援用される。矛盾がある場合は、定義も含め、本明細書が優先する。材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定的ではないことが意図される。
【００６３】
概説
本明細書では、組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む成形体用組成物を提供しており、組成物は、溶融状態または流動可能な状態で均質であるか、または、実質的に均質である。そして、組換えスパイダーシルクタンパク質は、それを成形体に形成した後は、実質的に分解されない（例えば、１０重量％未満、または、しばしば６重量％未満の量が分解される）。
【００６４】
組換えシルクタンパク質
本開示は、合成タンパク質性コポリマー（すなわち、組換えポリペプチド）から合成した繊維を含む本発明の実施形態を説明する。適切なタンパク質性コポリマーは、本明細書の一部を構成するものとして、それらの各々の全内容を援用する、２０１６年８月４５日に公開された米国特許公開第２０１６／０２２２１７４号、２０１８年４月２６日に公開された米国特許公開第２０１８／０１１１９７０号、及び、２０１８年３月１日に公開された米国特許公開第２０１８／００５７５４８号に記載されている。
【００６５】
一部の実施形態では、合成タンパク質コポリマーは、シルク様ポリペプチド配列から作り出す。一部の実施形態では、上記したシルク様ポリペプチド配列は、１）シルクポリペプチド配列由来の反復ドメインを混合して一致させて生成したブロックコポリマーポリペプチド組成物、及び／または、２）工業的に拡張可能な微生物の分泌によって、有用な成形体組成物を形成するのに十分な大きさ（約４０ｋＤａ）のブロックコポリマーポリペプチドの組換え発現である。公開されているスパイダーシルクポリペプチドのアミノ酸配列のほぼすべてに由来する配列を含め、シルクの反復ドメイン断片を遺伝子操作した大きな（約４０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ）ブロックコポリマーポリペプチドは、本明細書に記載の改変微生物で発現させることができる。一部の実施形態では、シルクポリペプチド配列は、成形体形成能のある、高発現かつ高分泌のポリペプチドを産生するよう一致させ、デザインされる。
【００６６】
一部の実施形態では、ブロックコポリマーを、シルクポリペプチド配列空間の全体にわたって、シルクポリペプチドドメインを組み合わせて混合して遺伝子操作する。一部の実施形態では、ブロックコポリマーを、測定が可能な生物（例えば、酵母、真菌類、及び、グラム陽性菌）で発現、及び、分泌をさせて作り出す。一部の実施形態では、ブロックコポリマーポリペプチドは、０以上のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、１つ以上の反復ドメイン（ＲＥＰ）、及び、０以上のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含む。実施形態の一部の態様では、ブロックコポリマーポリペプチドは、１００個を超えるアミノ酸の一本鎖ポリペプチドである。一部の実施形態では、ブロックコポリマーポリペプチドは、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、国際公開公報第ＷＯ／２０１５／０４２１６４号、‘‘Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｉｌｋ  Ｆｉｂｅｒｓ’’に開示されたブロックコポリマーポリペプチドの配列と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％が同一であるドメインを含む。
【００６７】
数種の天然スパイダーシルクが、これまでに同定されている。自然に出糸されたシルクの各種の機械的性質は、そのシルクの分子組成と密接な関係があると考えられている。例えば、Ｇａｒｂ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ，ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：２４３（２０１０）；Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ，ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．，１１：３（２０１２）；Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ．１６９−１８４（２０１１）；及び、Ｈｕｍｅｎｉｋ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｆｉｂｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｓｃｉ．，１０３，ｐｇ．１３１−８５（２０１１）を参照されたい。例えば：
【００６８】
房状（ＡｃＳｐ）シルクは、適度に高い強度と適度に高い伸縮性とを組み合わせた結果、靭性が高い傾向がある。ＡｃＳｐシルクは、しばしばポリセリンとＧＰＸのモチーフが組み込まれている大きいブロック（「集合体の反復」）サイズを特徴とする。管状（ＴｕＳｐ、または、円筒状）シルクは、直径が大きく、中程度の強度と高い伸縮性を有する傾向がある。ＴｕＳｐシルクは、そのポリセリンとポリスレオニンの含量、及び、短いポリアラニン配列を特徴とする。大瓶状（ＭａＳｐ）シルクは、高い強度と中程度の伸縮性を有する傾向がある。ＭａＳｐシルクは、２つのサブタイプであるＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２のいずれかである。ＭａＳｐ１シルクは、一般的に、ＭａＳｐ２シルクより低伸縮性であり、ポリアラニン、ＧＸ、及び、ＧＧＸのモチーフを特徴とする。ＭａＳｐ２シルクは、ポリアラニン、ＧＧＸ、及び、ＧＰＸのモチーフを特徴とする。小瓶状（ＭｉＳｐ）シルクは、中程度の強度と中程度の伸縮性を有する傾向がある。ＭｉＳｐシルクは、ＧＧＸ、ＧＡ、及び、ポリＡのモチーフを特徴とし、しばしば約１００のアミノ酸からなるスペーサーエレメントを含有する。鞭毛状（Ｆｌａｇ）シルクは、非常に高い伸縮性と中程度の強度を有する傾向がある。Ｆｌａｇシルクは、通常、ＧＰＧ、ＧＧＸ、及び、短いスペーサーのモチーフを特徴とする。
【００６９】
それぞれのシルク種の性質は、種ごとに異なる場合があり、また、ライフスタイルが異なるクモ（例えば、動き回らずに巣を張る造網性のクモと、徘徊して捕食するクモ）または、進化的に古い方のクモは、上記した説明とは異なるシルクを産生し得る（クモの多様性、及び、分類についての記載に関しては、Ｈｏｒｍｉｇａ，  Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｓｗｏｌｄ，  Ｃ．Ｅ．，  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，  ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ，  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｂ−ｗｅａｖｉｎｇ  ｓｐｉｄｅｒｓ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｅｎｔｏｍｏｌ．  ５９，  ｐｇ．４８７−５１２（２０１４）；及び、Ｂｌａｃｋｅｄｇｅ，  Ｔ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｗｅｂ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｉｄｅｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｒａ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １０６：１３，  ｐｇ．  ５２２９−５２３４（２００９）を参照されたい）。しかしながら、天然シルクタンパク質の反復ドメインに対する配列類似性、及び／または、アミノ酸組成類似性を有する合成ブロックコポリマーポリペプチドを使用して、天然シルクポリペプチドから作り出した対応する成形体の特性を再現する、一貫性のある成形体を商業規模で製造することができる。
【００７０】
一部の実施形態では、推定シルク配列の一覧は、例えば、「ｓｐｉｄｒｏｉｎ」、「ｆｉｂｒｏｉｎ」、「ＭａＳｐ」などの関連用語を、ＧｅｎＢａｎｋで検索して収集することができ、それらの配列を、独立した配列決定で得たさらなる配列と一緒にプールすることができる。その後、これらの配列を、アミノ酸に翻訳して重複エントリーをフィルタリングし、そして、手作業で、各ドメイン（ＮＴＤ、ＲＥＰ、ＣＴＤ）に分割する。一部の実施形態では、候補アミノ酸配列を、Ｐｉｃｈｉａ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）ｐａｓｔｏｒｉｓでの発現用に最適化したＤＮＡ配列に逆翻訳する。ＤＮＡ配列を、それぞれ発現ベクターにクローニングし、そして、Ｐｉｃｈｉａ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換する。一部の実施形態では、発現及び分泌の成功を示した各種のシルクドメインは、その後、組み合わせ様式でアセンブルされ、成形体形成能のあるシルク分子を構築する。
【００７１】
シルクポリペプチドは、特徴的に、反復ドメイン（ＲＥＰ）に、非反復領域（例えば、Ｃ末端ドメイン、及び、Ｎ末端ドメイン）が隣接して構成される。ある実施形態では、Ｃ末端ドメイン、及び、Ｎ末端ドメインのいずれも７５〜３５０アミノ酸長である。上記した反復ドメインは、図１に示すように、階層構造を示す。上記した反復ドメインは、一連のブロック（別名、繰り返し単位）を含む。上記したブロックは、シルクの反復ドメイン全体にわたり、ときに完全に、ときに不完全に繰り返す（準繰り返しドメインを構成する）。ブロックの長さ、及び、組成は、異なるシルクの種類間、また、異なる種間で変化する。表１Ａは、選択した種、及び、シルク種のブロック配例の一覧であり、さらなる例が、Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ  １６９−１８４（２０１１）；及び、Ｇａｔｅｓｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｆｉｂｒｏｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：５５１３，ｐｇ．２６０３−２６０５（２００１）に記載されている。一部の事例では、ブロックを、通常、パターンで並べ、シルク配列の反復ドメインに複数回（通常、２〜８回）出現する、より大きなマクロリピートを形成し得る。反復ドメインまたはマクロリピートの内側で繰り返されるブロックと、反復ドメイン内で繰り返されるマクロリピートとを、間隔エレメントで分離し得る。一部の実施形態では、ブロック配列は、グリシンに富む領域と、それに続くポリＡ領域とを含む。一部の実施形態では、短い（約１〜１０）アミノ酸モチーフが、ブロック内に複数回出現する。本発明の目的上、円順列とは関係なく、異なる天然シルクポリペプチドに由来するブロックを選択することができる（すなわち、同定したブロックが、他の点においてシルクポリペプチド間で類似する場合に、円順列のため整列しないことがある）。したがって、例えば、ＳＧＡＧＧ（配列番号４９４）という「ブロック」は、本発明の目的上、ＧＳＧＡＧ（配列番号４９５）と同一であり、また、ＧＧＳＧＡ（配列番号４９６）と同一であり；それらは、いずれも互いに円順列にすぎない。所与のシルク配列について選択した特定順列は、その他の何よりも利便性によって決定することができる（通常、Ｇで開始する）。ＮＣＢＩデータベースから得たシルク配列は、ブロック及び非反復領域に分割することができる。
【００７２】
（表１Ａ）ブロック配列の試料
2021534277.tif 000003
2021534277.tif 000004
2021534277.tif 000005
2021534277.tif 000006
【００７３】
本発明特定の実施形態による、ブロック、及び／または、マクロリピートドメイン由来の繊維形成ブロックコポリマーポリペプチドは、本明細書の一部を構成するものとして援用する、国際公開公報第ＷＯ／２０１５／０４２１６４号に記載されている。ＧｅｎＢａｎｋなどのタンパク質データベースから得た天然シルク配列、または、新規に行った配列決定により得た天然シルク配列は、ドメイン（Ｎ末端ドメイン、反復ドメイン、及び、Ｃ末端ドメイン）により破壊される。合成後に集合させて繊維または成形体を構築するために選択されるＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの配列として、天然アミノ酸配列情報、及び、本明細書に記載のその他の改変がある。反復ドメインを、反復配列に分解するが、この反復配列は、重要なアミノ酸情報を獲得する代表的ブロック、通常は、シルクの種類によって、１〜８個を含有する一方で、アミノ酸をコードするＤＮＡの大きさを、容易に合成可能な断片まで小さくする。一部の実施形態では、適切に形成されたブロックコポリマーポリペプチドは、少なくとも１つの反復配列を含む少なくとも１つの反復ドメインを含み、任意に、Ｎ末端ドメイン、及び／または、Ｃ末端ドメインを隣接させる。
【００７４】
一部の実施形態では、反復ドメインは、少なくとも１つの反復配列を含む。一部の実施形態では、反復配列は、１５０〜３００アミノ酸残基である。一部の実施形態では、反復配列は、複数のブロックを含む。一部の実施形態では、反復配列は、複数のマクロリピートを含む。一部の実施形態では、ブロックまたはマクロリピートは、複数の反復配列全体において分割する。
【００７５】
一部の実施形態では、反復配列は、ＤＮＡアセンブリ要件を満たすために、グリシンで始まり、かつ、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、メチオニン（Ｍ）、または、アスパラギン酸（Ｄ）で終わることはできない。一部の実施形態では、幾つかの反復配列は、天然配列と比べて変化させることができる。一部の実施形態では、反復配列は、ポリペプチドのＣ末端に対するセリン付加などで変化させることができる（Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｍ、または、Ｄでの終止を回避するため）。一部の実施形態では、反復配列は、不完全ブロックに別のブロック由来の相同配列を充当して改変することができる。一部の実施形態では、反復配列は、ブロックまたはマクロリピートの順序を再構成して改変することができる。
【００７６】
一部の実施形態では、合成のために、非反復のＮ末端及びＣ末端のドメインを選択することができる。一部の実施形態では、Ｎ末端ドメインを、例えば、ＳｉｇｎａｌＰで同定したリーディングシグナル配列を除去して作り出すことができる（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ．Ａｌ．，ＳｉｇｎａｌＰ  ４．０：ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：１０，ｐｇ．７８５−７８６（２０１１）。
【００７７】
一部の実施形態では、Ｎ末端ドメイン配列、反復配列、または、Ｃ末端ドメイン配列は、アゲレノプシス・アペルタ（Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ）、アリアチプス・グロサス（Ａｌｉａｔｙｐｕｓ  ｇｕｌｏｓｕｓ）、アフォノペルマ・シーマニー（Ａｐｈｏｎｏｐｅｌｍａ  ｓｅｅｍａｎｎｉ）、アプトスチチュス種（Ａｐｔｏｓｔｉｃｈｕｓ  ｓｐ．）ＡＳ２１７、アプトスチチュス種（Ａｐｔｏｓｔｉｃｈｕｓ  ｓｐ．）ＡＳ２２０、アラネウス・ディアデマツス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）、アラネウス・ゲムモイデス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｇｅｍｍｏｉｄｅｓ）、アラネウス・ヴェントリコサス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｓ）、アルギオペ・アモエナ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｍｏｅｎａ）、アルギオペ・アルゲンタタ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｒｇｅｎｔａｔａ）、ナガコガネグモ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）、アルギオペ・トリファスシアタ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ）、アチポイデス・リヴェルシ（Ａｔｙｐｏｉｄｅｓ  ｒｉｖｅｒｓｉ）、アヴィキュラリア・ジュルエンシス（Ａｖｉｃｕｌａｒｉａ  ｊｕｒｕｅｎｓｉｓ）、ボスリオシルツム・カリフォルニカム（Ｂｏｔｈｒｉｏｃｙｒｔｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、デイノピス・スピノサ（Ｄｅｉｎｏｐｉｓ  Ｓｐｉｎｏｓａ）、ディグエチア・カニチエス（Ｄｉｇｕｅｔｉａ  ｃａｎｉｔｉｅｓ）、ドロメデス・テネブロサス（Ｄｏｌｏｍｅｄｅｓ  ｔｅｎｅｂｒｏｓｕｓ）、エウアグルス・キソセウス（Ｅｕａｇｒｕｓ  ｃｈｉｓｏｓｅｕｓ）、エウプロスセノプス・オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ガステラキャンタ・マンモサ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｍａｍｍｏｓａ）、ヒポキルス・トレルリ（Ｈｙｐｏｃｈｉｌｕｓ  ｔｈｏｒｅｌｌｉ）、ククルカニア・ヒベルナリス（Ｋｕｋｕｌｃａｎｉａ  ｈｉｂｅｒｎａｌｉｓ）、ラトロデクツス・ヘスペルス（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、メガヘクスラ・フルヴァ（Ｍｅｇａｈｅｘｕｒａ  ｆｕｌｖａ）、メテペイラ・グランディオサ（Ｍｅｔｅｐｅｉｒａ  ｇｒａｎｄｉｏｓａ）、ネフィラ・アンチポディアナ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ａｎｔｉｐｏｄｉａｎａ）、ネフィラ・クラヴァタ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ）、ネフィラ・クラヴィペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）、ネフィラ・マダガスカリエンシス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）、ネフィラ・ピリペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｐｉｌｉｐｅｓ）、ネフィレンギス・クルエンタタ（Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔａ）、パラウィキシア・ビストリアタ（Ｐａｒａｗｉｘｉａ  ｂｉｓｔｒｉａｔａ）、ペウセチア・ヴィリダンス（Ｐｅｕｃｅｔｉａ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）、プレクトレウリス・トリスチス（Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｔｒｉｓｔｉｓ）、ポエシロセリア・レガリス（Ｐｏｅｃｉｌｏｔｈｅｒｉａ  ｒｅｇａｌｉｓ）、テトラグナタ・カウアイエンシス（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ  ｋａｕａｉｅｎｓｉｓ）、または、ウロボルス・ディヴェルサス（Ｕｌｏｂｏｒｕｓ  ｄｉｖｅｒｓｕｓ）に由来することができる。
【００７８】
一部の実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、アルファ接合因子ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結することができる。一部の実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、別の内在性または異種の分泌シグナルコード配列に作動可能に連結することができる。一部の実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、３Ｘ  ＦＬＡＧヌクレオチドコード配列に作動可能に連結することができる。一部の実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、６〜８個のＨｉｓ残基などのその他のアフィニティータグに作動可能に連結する。
【００７９】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、ナガコガネグモ種などのＭａＳｐ２に由来する組換えスパイダーシルクタンパク質断片配列に基づいている。一部の実施形態では、合成繊維は、２〜２０個の繰り返し単位を含むタンパク質分子を含んでおり、それぞれの繰り返し単位の分子量は、約２０ｋＤａよりも大きい。コポリマーのそれぞれの繰り返し単位内には、約６０個を超えるアミノ酸残基があり、大抵は、６０〜１００個のアミノ酸の範囲であり、幾つかの「準繰り返し単位」に組織化されている。一部の実施形態では、本開示に記載するポリペプチドの繰り返し単位は、ＭａＳｐ２ドラッグラインシルクタンパク質配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００８０】
良好な機械的特性を有する繊維を形成するタンパク質性ブロックコポリマーの繰り返し単位は、シルクポリペプチドの一部を使用して合成することができる。これらのポリペプチド繰り返し単位は、アラニンに富む領域と、グリシンに富む領域とを含み、また、長さは、１５０アミノ酸以上である。本開示のタンパク質性ブロックコポリマーでの繰り返しとして使用することができる一部の例示的な配列は、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、共有に係るＰＣＴ公報ＷＯ２０１５／０４２１６４に提供されており、また、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現システムを使用して発現することを実証した。
【００８１】
一部の実施形態では、スパイダーシルクタンパク質は：繰り返し単位の少なくとも２つの出現を含み、繰り返し単位は：１５０個超のアミノ酸残基と、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有すること；少なくとも８０％のアラニン含量を含む、６つ以上の連続するアミノ酸を有するアラニンに富む領域；少なくとも４０％のグリシン含量と、３０％未満のアラニン含量とを含む、１２個以上の連続するアミノ酸を有するグリシンに富む領域を含み；繊維は、５５０ｃＮ／ｔｅｘを超える弾性係数、少なくとも１０％の伸長性、及び、少なくとも１５ｃＮ／ｔｅｘの最大抗張力からなる群から選択される少なくとも１つの特性を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、繰り返し単位を含み、それぞれの繰り返し単位は、２〜２０個の準繰り返し単位を含む配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有しており；それぞれの準繰り返し単位は、｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝を含み、式中、それぞれの準繰り返し単位について；Ｘ１は、ＳＧＧＱＱ、ＧＡＧＱＱ、ＧＱＧＯＰＹ、ＡＧＱＱ、及び、ＳＱからなるグループから独立して選択され；ｎ１は、４〜８であり、ｎ２は、６〜１０である。繰り返し単位は、複数の準繰り返し単位から構成されている。
【００８３】
一部の実施形態では、３つの「長い」準繰り返しには、３つの「短い」準繰り返し単位が続く。上記した通り、短い準繰り返し単位は、ｎ１＝４、または、５のものである。長い準繰り返し単位は、ｎ１＝６、７、または、８のものと定義する。一部の実施形態では、短い準繰り返しのすべてが、繰り返し単位のそれぞれの準繰り返し単位内の同一の位置に、同一のＸ１モチーフを有する。一部の実施形態では、６つの準繰り返し単位の内の３つ未満の準繰り返し単位が、同一のＸ１モチーフを共有する。
【００８４】
さらなる実施形態では、繰り返し単位は、繰り返し単位内で、同一のＸ１を続けて３回以上出現させない準繰り返し単位で構成されている。さらなる実施形態では、繰り返し単位は、準繰り返し単位で構成されており、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または、２０の準繰り返しは、繰り返し単位の単一の準繰り返し単位内において、同一のＸ１を続けて３回以上使用しない。
【００８５】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、配列番号１のポリペプチド配列（すなわち、１８Ｂ）を含む。一部の実施形態では、繰り返し単位は、配列番号２を含むポリペプチドである。これらの配列を表１Ｂに示す。
【００８６】
（表１Ｂ）組換えタンパク質、及び、繰り返し単位の例示的なポリペプチド配列
2021534277.tif 000007
【００８７】
一部の実施形態では、説明をしてきた組換えスパイダーシルクポリペプチドから形成された繊維の構造は、ベータシート構造、ベータターン構造、または、アルファヘリックス構造を形成する。一部の実施形態では、形成した繊維の二次、三次、及び、四次タンパク質構造は、ナノ結晶ベータシート領域、アモルファスベータターン領域、アモルファスアルファヘリックス領域、非晶質マトリックスに埋め込まれてランダムに空間的に分布したナノ結晶領域、または、非晶質マトリックスに埋め込まれてランダムに配向したナノ結晶領域を有する、と説明をしている。理論に拘束されることを望むものではないが、スパイダーシルク内のタンパク質の構造特性は、繊維の機械的特性に関連していると考えられている。繊維の結晶領域は、繊維の引張強度に関連しており、一方で、アモルファス領域は、繊維の伸展性に関連している。主な嚢状（ＭＡ）シルクは、鞭毛状シルクよりも強度が高く、伸展性が低い傾向があり、同様に、ＭＡシルクは、鞭毛状シルクと比較して、結晶領域の体積分率が大きい。さらに、スパイダーシルクタンパク質の結晶領域とアモルファス領域の分子動力学とに基づいた理論モデルは、結晶領域が、繊維の引張強度に関連しており、その一方で、アモルファス領域が、繊維の伸長性に関連している、との主張を支持している。さらに、理論的モデリングは、ＲＰＦの機械的特性に対する二次、三次、及び、四次構造の重要性を支持している。例えば、ランダムで、平行に、及び、連続する空間分布でのナノ結晶ドメインの集合、それに、アモルファス領域内の絡み合った鎖の間、及び、アモルファス領域とナノ結晶領域との間の相互作用力の強さの両方が、得られた繊維の理論的な機械的特性に影響を与える。
【００８８】
一部の実施形態では、シルクタンパク質の分子量を、２０ｋＤａ〜２０００ｋＤａ、または、２０ｋＤａ超、または、１０ｋＤａ超、または、５ｋＤａ超、または、５〜４００ｋＤａ、または、５〜３００ｋＤａ、または、５〜２００ｋＤａ、または、５〜１００ｋＤａ、または、５〜５０ｋＤａ、または、５〜５００ｋＤａ、または、５〜１０００ｋＤａ、または、５〜２０００ｋＤａ、または、１０〜４００ｋＤａ、または、１０〜３００ｋＤａ、または、１０〜２００ｋＤａ、または、１０〜１００ｋＤａ、または、１０〜５０ｋＤａ、または、１０〜５００ｋＤａ、または、１０〜１０００ｋＤａ、または、１０〜２０００ｋＤａ、または、２０〜４００ｋＤａ、または、２０〜３００ｋＤａ、または、２０〜２００ｋＤａ、または、４０〜３００ｋＤａ、または、４０〜５００ｋＤａ、または、２０〜１００ｋＤａ、または、２０〜５０ｋＤａ、または、２０〜５００ｋＤａ、または、２０〜１０００ｋＤａ、または、２０〜２０００ｋＤａの範囲とし得る。
【００８９】
組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の不純物と分解の特性評価
異なる組換えスパイダーシルクポリペプチドは、タンパク質が形成する二次及び三次構造の強度と安定性に基づいた、融解温度やガラス転移温度などの異なる物理化学的特性を有する。シルクポリペプチドは、モノマーの形態で、ベータシート構造を形成する。その他のモノマーの存在下で、シルクポリペプチドは、ベータシート構造の三次元結晶格子を形成する。ベータシート構造は、ポリペプチド配列のアモルファス領域から分離しており、また、散在している。
【００９０】
ベータシートの構造は、高温でも非常に安定しており、ベータシートの融解温度は、高速走査熱量測定で、約２５７℃である。Ｃｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｅａｔ−Ｆａｓｔ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｅｌｔｓ  Ｓｉｌｋ  Ｂｅｔａ  Ｓｈｅｅｔ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ３：１１３０（２０１３）を参照されたい。ベータシート構造は、シルクポリペプチドのガラス転移温度を超えてもそのままであると考えられているので、組換えシルクポリペプチドのガラス転移温度で認められる構造変化は、ベータシート間のアモルファス領域の移動度の増大に起因すると仮定している。
【００９１】
可塑剤は、アモルファス領域の移動度を高め、そして、ベータシートの形成を妨げる可能性があるため、シルクタンパク質のガラス転移温度と溶融温度を下げてしまう。この目的に使用する適切な可塑剤として、水、それに、グリセロール、トリグリセロール、ヘキサグリセロール、及び、デカグリセロールなどの多価アルコール（ポリオール）があるが、これらに限定されない。その他の適切な可塑剤として、ジメチルイソソルバイト；ジメチルアミノプロピルアミンとアジプチン酸とのビスアマイド；２，２，２−トリフルオロエタノール；ジメチルアミノプロピルアミンとカプリル酸／カプリン酸とのアミド；ＤＥＡアセトアミド、及び、それらのあらゆる組み合わせがあるが、これらに限定されない。その他の適切な可塑剤は、Ｕｌｌｓｔｅｎ  ｅｔ．ａｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５：Ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｓｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｖｉｓｃｏｅｌｅａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｃｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１６）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ／ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ−ａｎｄ−ｖｉｓｃｏｐｌａｓｔｉｃ−ｍａｔｅｒｉａｌｓ／ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｒｓ−ｆｏｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ−ｍａｔｅｒｉａｌｓにて入手可能）、及び、Ｖｉｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ−ｂａｓｅｄ  ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｒｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｉｌｍｓ：Ａ  ｒｅｖｉｅｗ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４７（３）：２５４−６３（２０１１）で検討が加えられており、それらの全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【００９２】
シルクポリペプチドの親水性部分は、湿度として空気中に存在する周囲の水に結合できるので、ほとんど常に水は存在していることとなり、結合した周囲の水は、シルクポリペプチドを可塑化し得る。一部の実施形態では、適切な可塑剤として、単独で存在する、または、水またはその他の可塑剤と組み合わせて存在するグリセロールとし得る。その他の適切な可塑剤は、上記した通りである。
【００９３】
加えて、発酵によって組換えスパイダーシルクポリペプチドを生成し、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末として回収する場合には、可塑剤として作用するか、さもなければ、三次構造の形成を阻害する不純物が、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在し得る。例えば、残留脂質と糖類は、可塑剤として機能し、そして、三次構造の形成を妨げることで、タンパク質のガラス転移温度に影響を与え得る。
【００９４】
組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末または組成物の純度及び相対的組成を評価するために、確立された様々な方法を使用し得る。サイズ排除クロマトグラフィーは、相対的なサイズに基づいて分子を分離し、そして、全長のポリマー及びモノマーの形態の組換えスパイダーシルクポリペプチドの相対量、及び、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末中の高分子量、低分子量、及び、中分子量の不純物の量を分析するために使用することができる。同様に、迅速高性能液体クロマトグラフィーは、組換えスパイダーシルクポリペプチドのモノマー型など、溶液中に存在する様々な化合物を測定するために使用し得る。イオン交換液体クロマトグラフィーは、脂質や糖類などの不純物を含む溶液での様々な微量分子の濃度を評価するために使用し得る。質量分析などの様々な分子のクロマトグラフィー、及び、定量のためのその他の方法は、当該技術分野で十分に確立されている。
【００９５】
実施形態に応じて、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末でのその他の成分に関する重量の割合を用いて、モノマー形態での組換えスパイダーシルクポリペプチドの量に基づいて算出をした純度を有し得る。様々な事例では、純度は、組換えスパイダーシルクポリペプチドのタイプ、及び、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末を回収、分離、及び、後処理するために使用する技術に応じて、５０重量％〜９０重量％の範囲とすることができる。
【００９６】
サイズ排除クロマトグラフィーと、逆相高速液体クロマトグラフィーとの双方は、全長組換えスパイダーシルクポリペプチドの測定に有用であり、これにより、処理前後の組成物でのポリペプチドにおける全長スパイダーシルクの量を比較することで、処理ステップでの組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解の有無を判断する上で有用である。本発明の様々な実施形態では、処理前後の組成物に含まれる全長組換えスパイダーシルクポリペプチドの量は、最小限の分解を受け得る。分解の量は、０．００１重量％〜１０重量％、または、０．０１重量％〜６重量％、例えば、１０重量％、または、８重量％または６重量％未満、または、５重量％未満、３重量％未満、または、１重量％未満の範囲であり得る。
【００９７】
溶融レオロジー、二次、及び、三次構造
レオロジーは、ポリマーなどの繊維に紡糸する材料の物理化学的特性を分析するために、繊維紡糸において一般的に使用されている。異なるレオロジー特性は、材料を繊維に紡糸する能力、及び、紡糸した繊維の機械的特性に影響を与え得る。レオロジーは、様々な圧力、温度、及び、条件下で、組換えスパイダーシルクポリペプチド、及び／または、可塑剤が形成する二次、及び、三次構造を間接的に研究するために使用することもできる。実施形態に応じて、剪断レオメーター、及び／または、伸長レオメーターを使用して、振動及び伸長レオロジーによって、異なるレオロジー特性を分析し得る。
【００９８】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末と、可塑剤とを含む組成物のガラス転移、及び／または、溶融転移の特徴決定を行うために、毛細管レオメトリーを使用する。溶融状態または流動可能な状態に変換する前のこれらの組成物を、本明細書では「組換えスパイダーシルク組成物」と称する。さらに、組換えスパイダーシルク組成物が、溶融状態または流動可能な状態にあると、これらの組成物を、本明細書では「組換えスパイダーシルク溶融組成物」と称する。
【００９９】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルク組成物の溶融転移、及び／または、ガラス転移は、異なる範囲の圧力で組換えスパイダーシルク組成物を押し出す毛細管レオメーターと、剪断速度を大きくしながら得た「傾斜面」とを使用して特徴づけることができる。実施形態及び事例に応じて、この傾斜面は、約３００ｍ／秒から始まって、１５００ｍ／秒に至る。実施形態に応じて、圧力は、１ＭＰａ〜１２５ＭＰａ、大抵は６ＭＰａ〜５０ＭＰａで調整し得る。
【０１００】
一部の実施形態では、示差走査熱量測定を使用して、組換えスパイダーシルクポリペプチド、及び／または、それを含む繊維のガラス転移温度、及び／または、溶融転移温度を決定する。特定の実施形態では、変調示差走査熱量測定を使用して、ガラス転移温度、及び／または、溶融転移温度を測定する。
【０１０１】
実施形態、及び、組換えスパイダーシルクポリペプチドのタイプに応じて、ガラス転移温度、及び／または、溶融転移温度は、数値範囲を有し得る。しかしながら、固体形態の組換えスパイダーシルクポリペプチドについて通常認められるよりも遙かに低いガラス転移温度、及び／または、溶融転移温度の測定値は、不純物、または、その他の可塑剤の存在を示し得る。
【０１０２】
加えて、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法データを、レオロジーデータと組み合わせて、組換えシルク粉末、及び／または、それを含む組成物の双方の三次構造の直接的な特徴決定を提供し得る。ＦＴＩＲは、「フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法」という標題のセクションで後述するように、シルクポリペプチド、及び／または、シルクポリペプチドを含む組成物の二次構造を定量するために使用することができる。
【０１０３】
実施形態に応じて、ＦＴＩＲを使用して、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、及び／または、それを含む組成物に存在するベータシート構造を定量し得る。加えて、一部の実施形態では、ＦＴＩＲを使用して、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在する糖類や脂質などの不純物を定量し得る。しかしながら、異なるタンパク質前処理方法で使用する様々なカオトロピック、及び、可溶化剤は、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、または、それを含む組成物の三次構造の数を減らし得る。したがって、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末を繊維に成形または紡糸する前後において、同粉末でのベータシート構造の量には対応関係は存在し得ない。同様に、粉末を成形または紡糸して繊維にする前後において、同粉末のガラス転移温度には、ほとんど対応関係が存在しない場合がある。
【０１０４】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチドを特徴づけるレオロジーデータをＦＴＩＲと組み合わせて、ポリペプチドに形成した二次及び三次構造を分析し得る。特定の実施形態では、レオロジーデータは、ＦＴＩＲスペクトルと併せて捕捉し得る。レオロジーとＦＴＩＲとを組み合わせる例示的な方法は、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、Ｂｏｕｌｅｔ−Ａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｒｈｅｏ−ＩＲ，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  １０：７７６−７８４（２０１４）を参照されたい。
【０１０５】
フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルを使用して、ポリペプチド粉末、及び／または、繊維に存在するタンパク質の三次構造を評価することができる。具体的には、ＦＴＩＲスペクトルを使用して、様々な紡糸及び後処理条件に供する繊維に存在するベータシートの量を決定することができる。したがって、ＦＴＩＲスペクトルを使用して、様々な手法に基づいてベータシート構造の相対量を決定し得る。あるいは、ＦＴＩＲスペクトルは、天然の昆虫シルクと比較し得る。
【０１０６】
実施形態に応じて、異なる波数でＦＴＩＲスペクトルを使用して、繊維に存在する異なる三次構造を評価することができる。様々な実施形態では、アミドＩ、及び、アミドＩＩバンドに対応する波数を使用して、ターン、ベータシート、アルファヘリックス、及び、側鎖などの様々なタンパク質構造を評価し得る。これらの構造に対応する波数は、当該技術分野で周知である。
【０１０７】
大半の実施形態では、ベータシートに対応する波数でＦＴＩＲスペクトルを使用して、ポリペプチド粉末、及び／または、繊維でのベータシート構造の量を評価する。特定の実施形態では、９８２〜９４９ｃｍ−１（ＣＨ２ロッキング（Ａ）ｎ）、１６９５〜１６９０ｃｍ−１（アミドＩ）１６２０〜１６２５ｃｍ−１（アミドＩ）、１４４０〜１４４５ｃｍ−１（非対称ＣＨ３曲げ）、及び／または、１５０８ｃｍ−１（アミドＩＩ）でのＦＴＩＲスペクトルは、存在するベータシートの量を決定するために使用する。実施形態に応じて、異なる波数及び範囲を測定して、存在するベータシートの量を決定することができる。一部の実施形態では、対応するピークからの干渉を排除するために、９８２〜９４９ｃｍ−１でのＦＴＩＲスペクトルを使用する。これらの波数でスペクトルを取得する例示的な方法は、、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、Ｂｏｕｄｅｔ−Ａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｌｋｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１８：３１３８−３１４９（２０１５）で詳述されている。
【０１０８】
同様に、組換えシルク粉末での不純物を特徴づける様々な方法を、レオロジー、及び／または、ＦＴＩＲデータと組み合わせて、不純物の存在と、二次、及び／または、三次構造の形成との間の関係を分析し得る。
【０１０９】
組換えスパイダーシルク溶融組成物
本発明の目的は、本明細書に記載の方法に従って、溶融状態または流動可能な状態に変換することができる（すなわち、組換えスパイダーシルク溶融組成物に変換することができる）様々な組換えスパイダーシルク組成物を作り出すことである。様々な実施形態では、組成物での組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末と可塑剤の濃度は、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の特性（例えば、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の純度）、使用する可塑剤のタイプ、及び、繊維の望ましい特性に基づいて変化し得る。一部の実施形態では、濃度は、毛細管レオメーターからのデータなど、レオロジーデータに基づいて調整し得る。
【０１１０】
一部の実施形態では、メルトフローインデクサーを使用して、組換えスパイダーシルク溶融組成物を、繊維に引き入れることができるか否かを決定する。具体的には、メルトフローインデクサーを使用して、組換えスパイダーシルク溶融組成物の「溶融強度」、または、押し出す際に組換えスパイダーシルク溶融組成物を引き抜く能力を測定し得る。様々な実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチドと可塑剤との濃度は、所望の溶融強度に基づいて変化し得る。
【０１１１】
一部の実施形態では、様々な作用物質を、組換えスパイダーシルク組成物に添加して、伸長粘度、剪断粘度、及び、線形粘弾性などの組換えスパイダーシルク組成物のレオロジー特性を変更し得る。伸長粘度を変えるために使用する適切な作用物質として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート）、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレン、または、それらのあらゆる組み合わせがある。その他の適切な作用物質は、当該技術分野で周知である。
【０１１２】
一部の実施形態では、第２のポリマーを添加して、組換えスパイダーシルク組成物を有するポリマーブレンド、または、二成分繊維を作り出し得る。これらの事例では、組換えスパイダーシルクポリペプチドのアモルファス領域を分解せずに、組換えスパイダーシルク組成物自体と並行して、溶融に適した溶融温度を有する第２のポリマーを含めると有用な場合がある。様々な実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチドとのブレンドに適したポリマーは、２００℃、１８０℃、１６０℃、１４０℃、１２０℃、または、１００℃未満の融解温度（Ｔｍ）を有する。大抵の場合、組換えスパイダーシルクポリペプチドの融解温度は、２０℃、または、２５℃、または、５０℃を超える。例示的なポリマーと、その溶融温度を、以下の表に示しているが、これらに限定されない。
【０１１３】
（表１Ｃ）ポリマー
2021534277.tif 000008
【０１１４】
実施形態に応じて、組換えスパイダーシルク組成物での組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の適切な濃度は：１〜９０重量％、３〜８０重量％、５〜７０重量％、１０〜６０重量％、１５〜５０重量％、１８〜４５重量％、または、２０〜４１重量％の範囲である。
【０１１５】
グリセリンを可塑剤として使用する事例では、組換えスパイダーシルク組成物でのグリセリンの適切な重量濃度は：１〜６０重量％、１０〜６０重量％、１０〜５０重量％、１０〜４０重量％、１５〜４０重量％、１０〜３０重量％、または、１５〜３０重量％の範囲である。
【０１１６】
水を可塑剤として使用する事例では、組換えスパイダーシルク組成物での水の適切な重量濃度は：５〜８０重量％、１５〜７０重量％、２０〜６０重量％、２５〜５０重量％、１９〜４３重量％、または、１９〜２７重量％の範囲である。水を別の可塑剤と組み合わせて使用する場合、水は、５〜５０重量％、１５〜４３重量％、または、１９〜２７重量％の範囲で存在し得る。
【０１１７】
一部の実施形態では、水は、使用する処理、及び／または、型の大きさに応じて、押し出し、及び／または、冷却プロセスの間に蒸発し得る。一部の実施形態では、成形後の水分損失は、水の総量に基づいた、１〜５０重量％、３〜４０重量％、５〜３０重量％、７〜２０重量％、８〜１８重量％、または、１０〜１５重量％の範囲とし得る。大抵の場合、損失は、１５％未満であり、一部の事例では、１０％未満、例えば、１〜１０重量％である。蒸発は、意図的なものであってもよく、または、適用された処理の結果であってもよい。蒸発の程度は、例えば、当該技術分野で理解されているように、適用する使用温度、流量、及び、圧力の選択によって容易に制御することができる。
【０１１８】
一部の実施形態では、適切な可塑剤として、ポリオール（例えば、グリセロール）、水、乳酸、メチルヒドロペルオキシド、アスコルビン酸、１，４−ジヒドロキシベンゼン（１，４ベンゼンジオール）ベンゼン−１，４−ジオール、リン酸、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリエタノールアミン、酸アセテート、プロパン−１，３−ジオール、または、それらのあらゆる組み合わせがある。
【０１１９】
様々な実施形態では、可塑剤の量は、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の純度、及び、相対的組成に従って変化させることができる。例えば、高純度の粉末は、可塑剤として作用し得る低分子量化合物などの不純物を少なくし得るので、大きな重量パーセントで可塑剤を添加する必要がある。
【０１２０】
特定の実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に対する可塑剤（例えば、グリセロールと水との組み合わせ）の様々な比率（重量による）は、０．５または０．７５〜３５０重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、１または５〜３００重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、１０〜３００重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、３０〜２５０重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、５０〜２２０重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクタンパク質、７０〜２００重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、または、９０〜１８０重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の範囲とし得る。本明細書で使用する０．５〜３５０重量％の可塑化剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末とは、０．５：１〜３５０：１の比率に相当する。
【０１２１】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の様々な実施形態では、組換えスパイダーシルク組成物を、流動可能な状態に誘導させる（例えば、組換えスパイダーシルク溶融組成物を誘導する）ことは、組換えスパイダーシルクポリペプチドをモノマーの形態で含めることが有益である状況下において、あらゆる製剤での前処理ステップとして使用し得る。より具体的には、組換えスパイダーシルク溶融組成物の誘導は、モノマーの組換えスパイダーシルクポリペプチドが凝集して、結晶性ポリマー形態になることを防止すること、または、組換えスパイダーシルクポリペプチドが、処理の後の段階で、結晶性ポリマー形態へと転移することを制御することが望ましい用途で使用し得る。ある特定の実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融組成物は、組換えスパイダーシルクポリペプチドと第２のポリマーとを混合する前に、組換えスパイダーシルクポリペプチドの凝集を防ぐために使用し得る。別の特定の実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融組成物を使用して、組換えスパイダーシルクポリペプチドがモノマー形態で基剤に存在している化粧品またはスキンケア製品の基剤を作リ出し得る。この実施形態では、基剤にモノマー形態の組換えスパイダーシルクポリペプチドを含めることで、皮膚との接触時に、または、様々なその他の化学反応を介して、モノマーの凝集から結晶性ポリマー形態への制御が可能になる。
【０１２２】
溶融状態または流動可能な状態の誘導
本発明の一部の実施形態によれば、組換えスパイダーシルク組成物は、剪断力、及び／または、圧力、一般的には両方を加えて、溶融状態または流動可能な状態に変換される。剪断力と圧力の組み合わせを生み出すための適切な手段として、一軸押出機、二軸押出機、メルトフロー押出機、及び、毛細管レオメーターがあるが、これらに限定されない。
【０１２３】
一部の実施形態では、二軸押出機を使用して、組換えスパイダーシルク組成物を溶融または流動性組成物に変換するために必要な圧力及び剪断力を提供する。一部の実施形態では、二軸スクリュー押出機は、１．５ニュートンメートル（Ｎｍ）〜１３ニュートンメートル、２ニュートンメートル〜１０ニュートンメートル、２ニュートンメートル〜８ニュートンメートル、または、２ニュートンメートル〜６ニュートンメートルの範囲の剪断力を提供すべく構成されている。一部の実施形態では、二軸スクリュー押出機が提供する剪断力は、一部は、二軸スクリュー押出機の回転数／分によって定まる。様々な実施形態及び構成では、二軸スクリュー押出機の毎分回転数（ＲＰＭ）は、１０ＲＰＭ〜３００ＲＰＭの範囲とし得る。様々な実施形態では、二軸押出機は、剪断力と併せて、１ＭＰａ〜３００ＭＰａの範囲の圧力を提供するように構成されている。
【０１２４】
任意の実施形態では、二軸押出機は、組換えスパイダーシルク溶融組成物が、組換えスパイダーシルク組成物に変換される前、及び／または、後に、組換えスパイダーシルク溶融組成物を加熱するように構成されている。一部の実施形態では、二軸スクリュー押出機のバレル（すなわち、二軸スクリューが組成物を混合するシリンダー）に熱を加える。その他の実施形態では、紡糸口金の近位にある二軸スクリュー押出機の一部（すなわち、押し出された組換えスパイダーシルク溶融組成物が通るオリフィス）を加熱する。あるいは、加熱をせず、溶融／流動可能な状態は、二軸押出機において組換えスパイダーシルク組成物に対して加えられた剪断力に起因する熱で、全体的に誘発される。例えば、一部の実施形態では、溶融／流動可能な状態を得るために加える熱量は、周囲の室温に等しい（例えば、約２０℃超である）。
【０１２５】
様々な実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融組成物を加熱する温度は、組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解を最小限にする、または、完全に防止するために最低限のものにする。特定の実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融を、１２０℃未満、１００℃未満、８０℃未満、６０℃未満、４０℃未満、または、２０℃未満の温度に加熱する。大抵の場合、溶融物は、処理を行っている間は、１０℃〜１２０℃、１０℃〜１００℃、１５℃〜８０℃、１５℃〜６０℃、１８℃〜４０℃、または、２０±２℃の範囲の温度になる。
【０１２６】
その他の実施形態では、その他の機器を使用して、必要な圧力、及び、剪断力を提供して、組換えスパイダーシルク組成物を、溶融状態または流動可能な状態に変換し得る。上記した通り、毛細管レオメーターを使用して、必要な剪断力、及び、圧力を提供して、組換えスパイダーシルク組成物を、流動可能な状態または溶融状態に変換し得る。
【０１２７】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルク組成物を溶融または流動可能な状態とした後に、及び／または、溶融または流動可能な組換えスパイダーシルク溶融物組成物を押し出す前に、任意に加熱する。組換えスパイダーシルク組成物のガラス転移温度が高いため、加熱がおそらく必要であることから、組換えスパイダーシルク組成物を、溶融状態または流動可能な状態に変換するための剪断力と圧力とを提供するために使用する装置を、加熱した押出装置に対して直接的または間接的に接続し得る。特定の実施形態では、二軸スクリューシリンダーミキサーを、加熱した押出装置に対して（直接的または間接的に）接続する。加熱押出装置の実施形態及び構成に応じて、加熱押出装置を、２０〜１２０℃、８０〜１１０℃、８５〜１００℃、８５〜９５℃、及び／または、９０〜９５℃の範囲の温度に維持し得る。
【０１２８】
押し出した組換えスパイダーシルク溶融組成物を、本明細書では、組換えスパイダーシルク押出物と称する。組換えスパイダーシルク押出物の用途に応じて、押出物を押し出す紡糸口金の直径を調整し得る。例えば、組換えスパイダーシルク押出物を、型に押し出して成形体を形成する実施形態では、紡糸口金は、２００ｍｍ超、１５０ｍｍ超、１００ｍｍ超、５０ｍｍ超、例えば、１００ｍｍ〜５００ｍｍ、１５０ｍｍ〜４００ｍｍ、または、２００ｍｍ〜３００ｍｍの範囲の直径を有し得る。後述する通り、一部の実施形態では、組換えスパイダーシルク押出物は、ペレットに加工することができ、これらは、ペレットに対して、スパイダーシルク押出物を、組換えスパイダーシルク溶融組成物に変換するのに十分な剪断力と圧力とを改めて加えることで再処理し得る。組換えスパイダーシルク押出物をペレットに加工する実施形態では、紡糸口金は、２ｍｍ超、１．５ｍｍ超、または、１ｍｍ超、例えば、１ｍｍ〜５ｍｍ、１．５ｍｍ〜４ｍｍ、または、２ｍｍ〜３ｍｍの範囲の直径を有し得る。
【０１２９】
組換えスパイダーシルク押出物を繊維にする実施形態では、紡糸口金は、５００μｍ未満（例えば、１０μｍ〜５００μｍの範囲）のオリフィスを有し得る。押し出した繊維に求められる初期デニールに応じて、組換えスパイダーシルクタンパク質溶融組成物は、様々な大きさのオリフィスを有する紡糸口金を通して押し出し得る。特定の実施形態では、オリフィスは、２５μｍ〜５００μｍ、５０μｍ〜２５０μｍ、または、７５μｍ〜１２５ｐｍの範囲とし得る。一部の実施形態では、理想的なオリフィスの大きさは、繊維の最終的な延伸比に基づく。例えば、押し出した繊維の初期デニールが大きい場合、より高い延伸比を供し得る。
【０１３０】
本発明の大半の実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融組成物、及び、組換えスパイダーシルク押出物の両方は、光学顕微鏡で検査した場合に、材料が介在物や沈殿物を有していないことを意味する、実質的に均質なものとなる。一部の実施形態では、光学顕微鏡を使用して複屈折を測定することができ、複屈折は、組換えスパイダーシルクを、三次元格子に整列させるための代理として使用することができる。複屈折は、光の偏光と伝搬に依存する屈折率を有する材料の光学特性である。具体的には、複屈折によって測定する高度の軸方向秩序は、大きな引張強度に関連付けることができる。一部の実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融押出物は、最小の複屈折を有する。
【０１３１】
本発明によれば、均質な流動可能な状態を、任意に加熱してもよいが、剪断力及び圧力を加えるだけで誘発できる。熱を加えずに、または、任意に熱を加えると、剪断力、及び、圧力の組み合わせだけで、組換えスパイダーシルク溶融組成物、及び、組換えスパイダーシルク押出物での組換えスパイダーシルクポリペプチドの処理の間に分解しない組成物を提供することが判明している。このことは、全長組換えスパイダーシルクポリペプチドを押出組成物に保持することで、結晶化度などの最適な材料特性をもたらし、より高品質な製品が得られるので、望ましく、かつ、有益である。本発明の実施形態では、剪断力及び圧力（及び、任意に熱）を使用して達成する組換えスパイダーシルク溶融押出物は、最小限の、または、無視できる低度の分解を示す。
【０１３２】
組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解量は、様々な技術を使用して測定することができる。上記した通り、組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解量を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定して、存在する全長組換えスパイダーシルクポリペプチドの量を測定し得る。様々な実施形態では、組成物を成形体に形成した後に、同組成物の６．０重量％未満の量が分解される。別の実施形態では、組成物を成形した後に、同組成物の４．０重量％未満、３．０重量％未満、２．０重量％未満、または、１．０重量％未満の量が（分解量が、０．００１重量％〜１０重量％、８重量％、６重量％、４重量％、３重量％、２重量％、または、１重量％、または、０．０１重量％〜６重量％、４重量％、３重量％、２重量％、または、１重量％の範囲内となるように）分解される。別の実施形態では、押出物、及び／または、溶融組成物での組換えスパイダーシルクタンパク質は、実質的に分解されていない。
【０１３３】
繊維を延伸する
押出物を繊維形成に使用する場合、繊維の配向を改善し、そして、三次元結晶構造を促すために、前駆体繊維を延伸し得る。延伸力を加えると、分子が繊維の軸に整列するようになる。ポリペプチドなどのポリマー分子を紡糸口金の穴を流通するように力を与えると、その一部が整列する。繊維は、手作業、または、機械で延伸することができる。大抵の場合、手作業で延伸すると、複屈折が低く、なおかつ、繊維径の減少が最小限である、首尾良く整列した繊維が得られる。
【０１３４】
本発明において、繊維を延伸している間に、均一な高温表面に前駆体繊維を通すと、整列状態は最適化し得る。本明細書で使用する用語「高温表面」とは、実質的に均一な熱と、実質的に均一な表面の両方を提供する表面のことを指す。熱源として高温表面を使用すると、周囲の熱源を使用した場合に認められる変動が解消され、結果の均一性が高まり、そして、繊維の商業的大量生産プロセスの拡張性が向上する。一部の実施形態では、高温表面は、金属棒、または、その他の金属表面である。その他の実施形態では、高温表面は、セラミック、または、その他の材料から作り出し得る。実施形態に応じて、高温表面は、繊維の高温表面上での移動を容易ならしめるように、湾曲させたり、または、その他の方法で構成したりすることができる。
【０１３５】
本発明の実施形態では、未延伸の押し出した繊維は、延伸と同時に高温表面上を移動させ得る。実施形態に応じて、高温表面の温度は、１６０〜２１０℃、１８０〜２１０℃、１９０〜２１０℃、１９５〜２１０℃、１９５〜２０５℃、または、２００〜２０５℃の範囲とすることができる。
【０１３６】
実施形態に応じて、未延伸の押し出した繊維は、高温の表面上で延伸する間、異なる延伸比とすることができる。実施形態に応じて、延伸比は２〜７の範囲とし得る。一部の実施形態では、最大安定延伸比は、高温表面の温度によって変化し得る。
【０１３７】
一部の実施形態では、高温表面の温度は、未延伸の押し出した繊維のガラス転移温度の関数として計算される。例えば、高温表面の温度は、組換えシルクタンパク質粉末、及び／または、未延伸の押し出した繊維のガラス転移温度よりも、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、または、２５℃高いものと計算することができる。換言すれば、組換えシルクタンパク質粉末のガラス転移温度よりも、０、または、０．１℃〜２５℃の範囲で高く、大抵の場合、０〜１０℃、１５℃、２０℃の範囲で高い。
【０１３８】
実施形態、及び、均一な高温表面上を通過する繊維の速度（本明細書では「リール速度」と称する）に応じて、高温表面は、長さ（すなわち、繊維が集まってくる高温表面のｃｍ単位のサイズ）を変化させることができるので、未延伸の押し出した繊維が、熱及び変形の影響を受ける期間を変えることになる。大半の実施形態では、高温の棒の幅は、１ｃｍ以上である。しかしながら、様々な実施形態では、高温表面の幅を、１〜５０ｃｍ、１〜２ｃｍ、１〜３ｃｍ、１〜５ｃｍ、５から３８ｃｍ、３８から５０ｃｍの範囲とすることができる。実施形態に応じて、リール速度を、１〜６０メートル／分の範囲とすることができる。
【０１３９】
リール速度と高温表面の長さに応じて、高温表面での総滞留時間は変化し得る。大半の実施形態では、総滞留時間は、０．２秒〜３秒の範囲とすることができる。
【０１４０】
加えて、未延伸の繊維は、異なる延伸比を提供する様々な作用力を受け得る。大半の実施形態では、ゴデットが引張力を提供する。一部の実施形態では、高温表面上を通過する繊維が、高温表面に対してある角度を形成するように、ゴデットを配置する。例えば、高温表面が湾曲している事例では、高温表面上を通過する繊維が、高温表面に対して１０〜４０度の角度を形成するように、ゴデットを配置し得る。
【０１４１】
様々な実施形態では、未延伸の繊維の変形速度（すなわち、繊維が熱及び延伸によって受ける変形の量）を、上記した要因に基づいて変化させることができる。変形速度を、未延伸の繊維を高温表面に供給する速度、及び、繊維を高温表面から回収する速度に基づいて計算することができる。例えば、繊維を、１メートル／分の速度で高温表面に供給し、そして、５メートル／分の速度で高温表面から回収し得る。特定の実施形態では、変形速度を、次式を使用して計算するものとし、式中、繊維を高温表面に供給する速度をｖ１で表し、繊維を高温表面から回収する速度がｖ２であり、そして、変形に関与する長さがＬ０である。
式１：
2021534277.tif 000009
【０１４２】
実施形態に応じて、高温表面上への延伸は、１つのステップ、または、複数（すなわち、２つ、３つ、または、４つ）のステップで実行し得る。ひずみ速度、変形速度、リール速度、高温表面の温度、及び、高温表面の長さなどのパラメータは、それぞれのステップで変化または相違し得る。複数のステップで延伸を実行すると、繊維の全体的なひずみ速度に影響を及ぼし、そして、結晶性ベータシート構造の形成を促し、往々にして、繊維強度を改善し得る。
【０１４３】
繊維を後処理する
繊維の分子配列を改善するために、様々な後処理方法を採用し得る。繊維に存在する可塑剤、及び／または、組換えスパイダーシルクの量に応じて、繊維を、熱処理し得る（例えば、蒸気または熱を使用して、アニールする）。その他の事例では、繊維を、様々な溶媒で処理をして繊維をアニールし、そして、繊維内のタンパク質（例えば、１８Ｂタンパク質）の結晶化度を改善し得る。一部の事例では、繊維は、メタノールなどのアルコールを使用してアニールされ得る。特定の実施形態では、繊維は、アルコール蒸気を使用してアニールされ得る。
【０１４４】
一部の事例では、繊維を水で処理する前に、繊維または織物を、１つ以上のコンディショナー、潤滑剤、界面活性剤、乳化剤、抗凝集剤、または、アニーリング剤で処理すると、水で処理した後の織物の手触り、または、ドレープが変化する。特定の実施形態では、シクロペンタシロキサン、または、ＰＤＭＳを、コンディショナーとして使用する。特定の実施形態では、繊維、または、繊維から形成した織物を、アルコールでアニールすることで、水処理した繊維または織物の手触り、及び、ドレープが改善される。
【０１４５】
押出物の再溶融、及び、再押し出し
本発明の一部の実施形態では、組換えスパイダーシルク押出物を調製するためのプロセスは、組換えスパイダーシルク押出物を含む成形体（例えば、組換えスパイダーシルク押出物から形成したペレット、繊維、または、その他の成形品）を再処理することをさらに含み得る。これらの実施形態では、組換えスパイダーシルク押出物は、組換えスパイダーシルク押出物を、溶融状態または流動可能な状態に変換するのに十分な剪断力と圧力とを受ける。
【０１４６】
理論に拘束されることを望むものではないが、グリセロールなどの可塑剤の存在下で、組換えスパイダーシルクポリペプチドに剪断力と圧力とを加えると、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、組換えスパイダーシルクポリペプチドを展開し、かつ、グリセロールとの相互作用を示す「オープンフォーム組換えスパイダーシルクポリペプチド」へと変換される。グリセロールとの相互作用に起因して、この「オープンフォーム組換えスパイダーシルクポリペプチド」では、分子間、及び、分子内のベータシート相互作用が減少する。具体的には、オープンフォームの組換えスパイダーシルクポリペプチドは、分子間相互作用を形成して、不可逆的な三次元格子の形成を妨げる。
【０１４７】
溶融及び押し出しプロセスの間の組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解（もし、あれば）が最小限であるので、組換えスパイダーシルク押出物を、組換えスパイダーシルク溶融組成物に戻し、そして、何度でも再押し出しし得る。この意味で、組成物は、タンパク質または組成物を著しく分解せずに、加熱され、何度も冷却及び硬化し得るので「熱可塑性」である。様々な実施形態では、組換えスパイダーシルク押出物は、少なくとも２０回、少なくとも１０回、または、少なくとも５回、再溶融、及び、再押し出しされ得る。これらの実施形態では、複数の再溶融、及び、再押し出しのステップで認められる分解は、１０％程度の低さである。分解せずに再押し出しする選択肢は、実質的に均質な組成物の製造を可能にし、また、組成物から形成した製品の転用または再設計を可能にする。例えば、品質が不十分な成形体は、再押出成形、及び、再成形し得る。使用済み製品のリサイクルも可能である。
【実施例】
【０１４８】
実施例１：組換え１８Ｂポリペプチド粉末の純度
組換えスパイダーシルク−ＦＬＡＧタグを含む１８Ｂポリペプチド配列（配列番号１）−を、様々なロットの大規模発酵で製造し、粉末（「１８Ｂ粉末」）で回収し、そして、乾燥させた。逆相高速液体クロマトグラフィー（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）を使用して、粉末での１８Ｂポリペプチドモノマーの重量量を測定した。５Ｍグアニジンチオシアン酸塩（ＧｄＳＣＮ）試薬を使用して、試料を溶解し、そして、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ  Ｃ３  ２．１ｘ７５ｍｍ  ５μｍカラムに注入して、疎水性に基づいて成分を分離した。検出モダリティは、２１５ｎｍ（３６０ｎｍリファレンス）でのペプチド結合のＵＶ吸光度であった。１８Ｂ−ＦＬＡＧモノマーの試料濃度を、事前に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用して１８Ｂ−ＦＬＡＧモノマー濃度を決定した１８Ｂ−ＦＬＡＧ粉末標準と比較して決定した。
【０１４９】
試料粉末には、５７．９６４質量％の１８Ｂモノマーが含まれていた。
【０１５０】
実施例２：組換えシルク粉末押出物の生成
実施例１の組換えシルク粉末を、家庭用スパイスグラインダーを使用して混合した。水とグリセロールを、以下の表２に示す比率で、組換えシルク粉末（「１８Ｂ粉末」）に加えて、タンパク質粉末と可塑剤との比率が異なる組換えスパイダーシルク組成物を生成した。
【０１５１】
以下の表２に記載の１０〜１００グラムの組換えスパイダーシルク組成物（すなわち、「製剤」）のバッチを、すべてのＴＳＥ実験で使用した、Ｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｔｗｉｎ  Ｓｃｒｅｗ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（ＴＳＥ）（品目番号  ＴＴ−ＺＥ５−ＭＳＭＳ−３ＨＴ）を使用して混合した。ステンレス鋼（Ｓ３１６）押出機バレルは、それぞれ、長さが約５ｃｍの３つの加熱ゾーンを有していた。使用したスクリューは、長さ１８０ｍｍ、直径９ｍｍ、そして、（２０：１のＬ／Ｄ比）の標準的な一対のステンレス鋼（Ｓ３１６）製の共回転スクリューであった。スクリューのピッチは、９ｍｍであった。
【０１５２】
以下に記載したＰ２５Ｗ０５Ｇ７０、Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０、及び、Ｐ６５Ｗ２０Ｇ１５製剤に関して、まず、組換えスパイダーシルク組成物を押し出してペレットとし、後続の実験で、同ペレットを改めて押し出して再処理した。ペレットを作リ出すために、１８Ｂ／水／グリセロール混合物を含む組換えスパイダーシルク組成物を、金属漏斗を使用してＴＳＥに導入し、そして、開始、中間、及び、終了のバレル領域を含む３つすべてのバレル領域を、約９０〜９５℃の温度で、３００ＲＰＭで、ＴＳＥを稼働させている間に、充填機器を使用して、二軸スクリューに押し込んで、数分間、連続的に接触させた。この材料を、スクリュー軸に対して１８０°の角度でオリフィスを有する０．５ｍｍの型を介して溶融状態で押し出し（すなわち、組換えスパイダーシルク溶融組成物）、組換えスパイダーシルク押出物を形成した。
【０１５３】
０．５ｍｍの組換えスパイダーシルク押出物は、約１０メートル超の長さの連続したエラストマーの「麺」として型から出現した。５〜１０ｇの量の対応する押出物組成物を、台所用スパイスグラインダーに順次投入し、そして、それらに対して、５秒パルスで、合計６のパルス（合計３０秒）にさらすことによって、ペレットを生成した。ペレットを検査して、ペレットの長さが５ｍｍ以下であり、ペレットの平均長さが約２．５ｍｍであることを確認した。
【０１５４】
以下のＰ７１Ｗ１９Ｇ１０製剤について、１８Ｂ／水／グリセロール組換えスパイダーシルク混合物を、実施例２に記載の条件下で、事前に混合し、そして、直接（すなわち、始めに、ペレットとして押し出さずに）押し出して、組換えスパイダーシルク押出物を形成した。
【０１５５】
（表２）重量による組換えスパイダーシルク製剤の組成
2021534277.tif 000010
【０１５６】
実施例３：分解が最小限である組換えシルク押出物の生成
幾つかの異なる条件における分解を評価するために、実施例２に記載した組換えスパイダーシルク製剤を、押し出しをしている間の様々な温度、ならびに、様々な圧力及び剪断力に供した。具体的には、二軸スクリュー押出ペレットの毎分回転数を変化させて、可変量のトルク及び剪断力を加えた。組換えスパイダーシルク製剤を溶融状態に変換し、そして、多様な試料を押し出すために使用した様々な温度とＲＰＭの組み合わせを、以下に示す。
【０１５７】
表１に記載のＰ４９Ｗ２１Ｇ３０、及び、Ｐ６５Ｗ２０Ｇ１５製剤を押し出して得たペレットを、Ｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＴＳＥを使用して、様々なＲＰＭ、及び、温度で押し出した。Ｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＴＳＥの動作のためのその他のパラメータは、実施例２に関して説明したものと同じであった。
【０１５８】
実施例２に記載したように、Ｐ７１Ｗ１９Ｇ１０製剤も、Ｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＴＳＥを使用して、様々なＲＰＭ及び温度で押し出した。Ｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＴＳＥの動作のためのその他のパラメータは、実施例２に関して説明したものと同じであった。
【０１５９】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、高分子量、低分子量、中分子量の不純物、モノマー１８Ｂ、及び、凝集体１８Ｂの相対量を特徴づけるデータを、次のように収集した。１８Ｂ粉末を、５Ｍグアニジンチオシアン酸塩に溶解し、そして、Ｙａｒｒａ  ＳＥＣ−３０００  ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムに注入して、分子量に基づいて成分を分離した。検出モダリティとして、屈折率を使用した。１８Ｂ凝集体、１８Ｂモノマー、低分子量（１〜８ｋＤａ）不純物、中分子量不純物（８〜５０ｋＤａ）、及び、高分子量不純物（１１０〜１５０ｋＤａ）を定量した。関連する組成は、質量％、及び、面積％として報告した。すべてのタンパク質の９０％超が、互いに約７％以内のｄｎ／ｄｃ値（屈折率の応答係数）を示すという仮定の下で、ＢＳＡを、一般的なタンパク質標準として使用した。保持時間の標準として、ポリ（エチレンオキシド）を使用し、そして、方法の一貫した性能を確保するためのチェック標準として、ＢＳＡ較正器を使用した。
【０１６０】
以下の表３〜５に、様々なＲＰＭと温度下で生成した押出物の様々なＳＥＣ分析を示す。５番目の列には、出発ペレットと押出物（Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０、及び、Ｐ６５Ｗ２０Ｇ１５）で報告された１８Ｂモノマー（面積％）の差異、または、出発粉末と押出物（Ｐ７１Ｗ１９Ｇ１０）で報告された１８Ｂモノマー（面積％）の差異のいずれかを記載されている。図１〜３については、以下に詳述しており、それぞれ、表３〜５に対応するグラフを含んでいる。これらから、試験したすべての温度とＲＰＭで分解が最小限となっていることが認められ、このことは、処理条件の柔軟性と、押し出し法を使用した処理に対する一般的なロバスト性を示している。
【０１６１】
（表３）Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０のＳＥＣ分析
2021534277.tif 000011
【０１６２】
（表４）Ｐ６５Ｗ２０Ｇ１５のＳＥＣ分析
2021534277.tif 000012
【０１６３】
（表５）Ｐ７１Ｗ１９Ｇ１０のＳＥＣ分析
2021534277.tif 000013
【０１６４】
図１は、２０、４０、６０、８０、９５、または、１２０℃の押出条件下での前出の表３に記載したＰ４９Ｗ２１Ｇ３０試料のＳＥＣデータを示しており、押出物は、１０、１００、２００、または、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。１８Ｂモノマー（黒色の棒）、中分子量不純物（灰色の棒）、及び、低分子量不純物（斜交平行模様の棒）を、面積％として示している。
【０１６５】
図２は、２０、４０、６０、９５、または、１４０℃の押出条件下での前出の表４に記載したＰ６５Ｗ２０Ｇ１５試料のＳＥＣデータを示しており、押出物は、１０、１００、２００、または、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。１８Ｂモノマー（黒色の棒）、中分子量不純物（灰色の棒）、及び、低分子量不純物（斜交平行模様の棒）を、面積％として示している。
【０１６６】
図３は、９０、または、１２０℃の押出条件下での前出の表５に記載したＰ７１Ｗ１９Ｇ１０試料のＳＥＣデータを示しており、押出物は、１０、１００、２００、または、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。１８Ｂモノマー（黒色の棒）、中分子量不純物（灰色の棒）、及び、低分子量不純物（斜交平行模様の棒）を、面積％として示している。
【０１６７】
実施例４：熱重量分析−Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０
押し出しの間の水分損失を分析するために、押し出し前の組換えスパイダーシルク組成物、及び、押し出した後の組換えスパイダーシルク押出物の水分を、ＴＡブランドＴＧＡＱ  ５００機器を使用して、ＴＧＡ（熱重量分析）によって分析した。Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０、及び、Ｐ６５Ｗ２０Ｇ１５試料については、実施例３に記載の押し出し実験で使用したペレットの水分を、水分損失を測定するためのリファレンス試料として使用した。Ｐ７１Ｗ１９Ｇ１０試料については、実施例３に記載した押し出し実験に使用した組換えスパイダーシルク組成物の水分を、水分損失を測定するためのリファレンス試料として使用した。
【０１６８】
それぞれの試料について、上掲の製剤を含む１０ｍｇ、＋／−１ｍｇの粉末、または、ペレットを分析した。水分含量を測定するために、試料を「窒素中」ではなく「空気中」で使用した。装備されていたオートサンプラーを使用して、ＴＧＡ炉に試料を順次導入した。ＴＡブランドのソフトウェアスイートを使用して、温度が、室温から２０℃／分の速度で、１１０℃に達するまで上昇するようにプログラムした。次に、これらの試料を、この温度で、４５分間保持した。次いで、これらの試料を、炉から取り出し、そして、次の作業を開始する前に、１５分間、炉に空気を送って清浄した。
【０１６９】
以下の表６〜８には、リファレンス試料（つまり、出発ペレットまたは粉末）と、押し出した試料に関する様々な測定値が示されている。図４〜６には、それぞれ、表６〜８に含まれるデータのグラフが描かれている。このデータから、押し出しの間の水分損失は少なく、押し出しプロセスの許容範囲内に十分に収まっていることが認められる。一般的に、水の損失は、２〜１８％の範囲である。
【０１７０】
（表６）Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０の水分損失
2021534277.tif 000014
【０１７１】
（表７）Ｐ６５Ｗ２０Ｇ１５の水分損失
2021534277.tif 000015
【０１７２】
（表８）Ｐ７１Ｗ１９Ｇ１０の水分損失
2021534277.tif 000016
【０１７３】
図４は、２０、４０、９５、及び、１２０℃の押し出し条件下で生成した前出の表６に記載の試料に関するＴＧＡデータを示しており、押出物は、１０、１００、２００、及び、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。図４は、これらの試料を生成するために使用した出発ペレットのリファレンス試料のＴＧＡデータも示している。このデータは、すべての処理における試料の水分率(％)を示しており、出発ペレットと比較した場合に、水分損失は、約１〜１３％の範囲である。
【０１７４】
図５は、２０、４０、６０、及び、１４０℃の押し出し条件下で生成した前出の表７に記載の試料に関するＴＧＡデータを示しており、押出物は、１０、１００、２００、及び、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。図５は、これらの試料を生成するために使用した出発ペレットのリファレンス試料のＴＧＡデータも示している。このデータは、すべての処理における試料の水分率(％)を示しており、出発ペレットと比較した場合に、水分損失は、約１〜８％の範囲である。
【０１７５】
図６は、９０、及び、１２０℃の押し出し条件下で生成した前出の表８に記載の試料に関するＴＧＡデータを示しており、押出物は、１０、１００、２００、及び、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。図５は、これらの試料を生成するために使用した出発粉末のリファレンス試料のＴＧＡデータも示している。このデータは、すべての処理における試料の水分率(％)を示しており、出発粉末と比較した場合に、水分損失は、約１．５〜４％の範囲である。
【０１７６】
実施例５：フーリエ変換赤外分光法を使用したベータシート含量分析
押出物での二次及び三次構造の形成を評価するために、ベータシート含量をＦＴＩＲ（フーリエ変換赤外分光法）で測定した。ワイヤーグリッド偏光子を前方に配置したダイヤモンド減衰全反射アクセサリーを具備しており、主としてＳ（垂直）偏光を選択するＢｒｕｋｅｒ  Ａｌｐｈａ分光計を使用して、押出物に関してＦＴＩＲを行った。組換えポリペプチド粉末、及び、前駆体繊維を、対照として使用した。分子アライメントを定量するために、それぞれの配向の３つのスペクトル（分極電場に対して０及び９０°）を、４０００〜６００ｃｍ−１を、４ｃｍ−１の分解能で、３２回のスキャンを行って収集した。
【０１７７】
９８２〜９４９ｃｍ−１に対応するピークの平均値を、次の手順に基づいて計算した。吸光度の値は、バンドが無い状態で、１９００〜１８００ｃｍ−１の平均を差し引いて相殺した。次に、等方性（非配向）側鎖振動バンドに対応する１３５０〜１３１５ｃｍ−１の平均を除算して、スペクトルを正規化した。ベータシート含量の測定基準を、９８２〜９４９ｃｍ−１の積分吸光度値の平均とみなした。
【０１７８】
組換えスパイダーシルク押出物のベータシート含量（すなわち、「試料ベータシート」）を、ｉ）組換えスパイダーシルク組成物を生成するために使用する出発組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末でのベータシート含量（すなわち、「リファレンス水和前粉末」）、及び、ｉｉ）出発ペレット（Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０、及び、Ｐ６５Ｗ２０Ｇ１５）（すなわち「リファレンスペレット」）でのベータシート含量、と比較した。以下の表９〜１１には、表に示した条件下で生成したリファレンス試料と、押出物の測定値を記載している。図７〜９には、表９〜１１に示したデータのグラフが記載されている。そこに記載されている通り、開始組換えシルクポリペプチド粉末から組換えスパイダーシルク押出物に至るまでの材料でのベータシート含量に有意な変化は認められず、このことは、この方法が、溶剤処理を使用したときのように、ベータシートを破壊することなく、アモルファスタンパク質ドメインの可塑化と移動を可能ならしめることを示している。
【０１７９】
（表９）Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０でのベータシート形成
2021534277.tif 000017
【０１８０】
（表１０）Ｐ６５Ｗ２０Ｇ１５でのベータシート形成
2021534277.tif 000018
【０１８１】
（表１１）Ｐ７１Ｗ１９Ｇ１０でのベータシート形成
2021534277.tif 000019
【０１８２】
図７は、２０、４０、６０、８０、９５、または、１２０℃の押出条件下で生成した前出の表９に記載の試料のＦＴＩＲデータを示しており、押出物は、１０、１００、２００、または、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。データは、９４９〜９８２バンドから抽出したものであり、また、出発ペレットと比較して、明確な傾向は認められなかった。
【０１８３】
図８は、２０、４０、６０、９５、または、１４０℃の押出条件下で生成した前出の表１０に記載の試料のＦＴＩＲデータを示しており、押出物は、１０、１００、２００、または、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。データは、９４９〜９８２バンドから抽出したものであり、また、出発ペレットと比較して、明確な傾向は認められなかった。
【０１８４】
図９は、９０、または、１２０℃の押出条件下で生成した前出の表１１に記載の試料のＦＴＩＲデータを示しており、押出物は、１０、１００、２００、または、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。データは、水の存在に起因する影響を回避するために９４９〜９８２バンドから抽出しており、また、出発ペレットと比較して、明確な傾向は認められなかった。
【０１８５】
実施例６：偏光顕微鏡
偏光顕微鏡（ＰＬ）を使用して、様々な押出物の平滑性と均一性を調べた。光学、及び、偏光（ＰＬ）画像を、４Ｘ  ＰＬ対物レンズを装備したＬｅｉｃａ  ＤＭ７５０Ｐ偏光顕微鏡を使用して得た。この顕微鏡に、補完的なＰＣをベースとした画像分析Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ、ＬＡＳ  Ｖ４．９を接続した。約２０〜３０ｍｍの長さのＴＳＥ押出物を、標準的な顕微鏡スライドの長軸に沿って注意深く配置し、そして、顕微鏡の開口部に水平（東西；すなわち、０°）に配置した。まず、試料の端部に焦点を合わせ、次いで、試料の全体的な焦点を合わせた。始めに、試料を白色光の下で観察し、照明制御ノブで制御を行い、そして、適切なスケールバーを含んだ状態で画像を捕捉した。すべての事例で、ＬＡＳ  Ｖ４．９ソフトウェアの自動輝度機能を、オフに切り替えた。
【０１８６】
次に、Ａｎａｌｙｚｅｒ／Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｌｅｎｓモジュールの上部ロッカーが、左（「Ｏ」位置／Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｌｅｎｓアウト）に反転していることを確認しながら、Ａｎａｌｙｚｅｒ／Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｌｅｎｓモジュールの下部ロッカーを右（「Ａ」位置／Ａｎａｌｙｚｅｒイン）に反転させて、同モジュールを嵌め込んだ。このような設定は、偏光子とアナライザーとを通過する光の許容振動方向が９０°である光学的位置合わせの状態で、「交差偏光モード」での分析を可能にする。
【０１８７】
光強度の背景の変動を制御するために、まず、すべての試料を表示し、そして、照明制御ノブを、背景の明るさが完全に黒くなるまで下げた。次に、それぞれの接眼レンズを、接眼レンズ遮光アクセサリーで覆って、画像捕捉シーケンスへの周囲光の通過を防いだ。画像は、ＬＡＳ  Ｖ４．９ソフトウェアパッケージを使用して、０°及び４５°の方向で捕捉した。この顕微鏡に装備されている円形回転台を使用して、ガラス側を４５°の角度がつくように回転させて、４５°の画像を得た。
【０１８８】
図１０及び１１は、偏光顕微鏡を使用して捕捉した例示的な試料の画像である。これらは、特許請求したプロセスを使用して、溶融破壊が少なく、平滑な繊維が得られることを示している。したがって、この条件は、明らかに、メルトフローと押し出しに適している。加えて、数多くの条件下で、軸方向のアライメントと同様に、定性的な複屈折が認められた。
【０１８９】
図１０は、試料Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０−１、Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０−２、Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０−３、及び、Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０−４について得た写真を示しており、それらはすべて、２０℃で、様々なＲＰＭＳで作り出されたものである。これらの条件下では、押出物は平滑で、溶融破壊は僅かであった。偏光顕微鏡法は、条件に応じて優先的な軸方向のアライメントを示しており（差異については４５°で調べる）、１００ＲＰＭで、軸方向の最良のアライメントを得た。
【０１９０】
図１１は、試料Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０−１７、Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０−１８、Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０−１９、及び、Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０−２０について得た写真を示しており、それらはすべて、９５℃で、様々なＲＰＭＳで作り出されたものである。押出物は、中程度の溶融破壊／不完全表面を示した。偏光顕微鏡は、１０〜１００ＲＰＭで、軸方向での良好なアライメントを示した。１００〜３００ＲＰＭの試料は、０°と４５°で調べたときに、互いに同様の特徴を示した。
【０１９１】
実施例７：グリセロール含量の代謝産物分析
押し出しの間の組換えスパイダーシルク組成物でのグリセロールの損失を決定するために、グリセロール含量を、０．００４Ｍ硫酸の移動相を使用した、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｇｕａｒｄ  Ｃａｒｂｏ  Ｈ＋  Ｇｕａｒｄ  Ｃｏｌｕｍｎを備えたＢｅｎｓｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  １５０ｘ７．８ｍｍ  Ｈ＋  ７１１０−０  ＨＰＬＣカラムを使用して分析した。定量を可能ならしめるために、グリセロールキャリブラント（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｃａｌｉｂｒａｎｔ）を行った。１８Ｂをベースとした試料中のグリセロールの量を測定するために、組成物に含まれるグリセロールを、押し出す前（すなわち、ペレットまたは粉末として）、及び、押し出した後に測定した。それぞれの試料について、２５ｍｇの粉末またはペレットを、１ｍｌの０．００４Ｍ硫酸に溶解し、そして、１時間、超音波処理した。次に、試料をボルテックス撹拌し、そして、ＨＰＬＣバイアルに入れて、それぞれの条件／処理での後続の分析に供した。
【０１９２】
以下の表１２〜１４に、以下の表の条件下で作り出した押出物の様々な測定値を示す。図１２〜１４には、同じ試料のグラフを記載している。これらのことから、試験にて最小の損失が証明されているように、組成物のグリセロール含量は、試験した条件の範囲において安定していることが認められる。
【０１９３】
（表１２）押出物でのグリセロール損失−Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０
2021534277.tif 000020
【０１９４】
（表１３）押出物でのグリセロール損失−Ｐ６５Ｗ２０Ｇ１５
2021534277.tif 000021
【０１９５】
表１４−押出物でのグリセロール損失−Ｐ７１Ｗ１９Ｇ１０
2021534277.tif 000022
＊試験機器の誤差範囲内の結果。
【０１９６】
図１２は、２０、４０、６０、８０、９５、及び、１２０℃の押出条件下で生成した前出の表１２に記載の試料の代謝産物データを示しており、押出物は、１０、１００、２００、及び、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。グリセロールの損失は、すべての処理において、ごく僅かであった。
【０１９７】
図１３は、２０、４０、６０、９５、及び、１４０℃の押出条件下で生成した前出の表１３に記載の試料の代謝産物データを示しており、押出物は、１０、１００、２００、及び、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。グリセロールの損失は、すべての処理において、ごく僅かであった。
【０１９８】
図１４は、９０、及び、１２０℃の押出条件下で生成した前出の表１４に記載の試料の代謝産物データを示しており、押出物は、１０、１００、２００、及び、３００ＲＰＭの動作パラメータを使用して、それぞれの温度で得られた。グリセロールの損失は、すべての処理において、ごく僅かであった。
【０１９９】
実施例８：グリセロール含量の代謝産物分析
Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０、及び、Ｐ２５Ｗ０５Ｇ７０シルク粉末組成物を混合し、そして、実施例２に記載のようにして、二軸スクリュー押し出しに供した。押出物を細かく刻んでペレットにし、そして、メルトフローインデックス（ＭＦＩ）試験を行った。ＭＦＩ試験は、Ｇｏｅｔｔｆｅｒｔ  Ｍｅｌｔ  Ｉｎｄｅｘｅｒ、モデル番号ＭＩ−４０、シリアル番号１０００５５６３で実施した。バレルの直径は、９．５３２０ｍｍであり、型の長さは、８．０１５ｍｍで、オリフィスの直径は、２．０９ｍｍであった。２分間の予熱を利用した。試験は、ＡＳＴＭ  Ｄ１２３８標準試験法に従って、熱可塑性プラスチックの流量について、押出可塑度計で実施した。試験は、９５℃で、２．１６ｋｇまたは２１．６ｋｇの力をかけて行った。
【０２００】
表１５は、それぞれの材料組成から得たメルトフローインデックス値を示す。Ｐ４９Ｗ２１Ｇ３０に関してはｎ＝３で、Ｐ２５Ｗ０５Ｇ７０に関してはｎ＝６で、それぞれ、２．１、及び、２１．１Ｋｇで試験した。「＋／−」は、ｎ個の試料の間での標準偏差を示す。このデータは、タンパク質／グリセロール／水をベースとしたペレットが、ポリプロピレンと同様の範囲内のＭＦＩ値、例えば、（２０ｇ／１０分）である、ことを示している。タンパク質の組成が小さいほど、流速は大きくなる。
【０２０１】
（表１５）メルトフローインデックス値
2021534277.tif 000023
【図１】
2021534277.tif 000024
【図２】
2021534277.tif 000025
【図３】
2021534277.tif 000026
【図４】
2021534277.tif 000027
【図５】
2021534277.tif 000028
【図６】
2021534277.tif 000029
【図７】
2021534277.tif 000030
【図８】
2021534277.tif 000031
【図９】
2021534277.tif 000032
【図１０】
2021534277.tif 000033
【図１１】
2021534277.tif 000034
【図１２】
2021534277.tif 000035
【図１３】
2021534277.tif 000036
【図１４】
2021534277.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月14日(2021.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
一部の実施形態では、成形体は、偏光顕微鏡法で測定された場合に、最小の複屈折を有する。
[本発明1001]
組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む成形体用組成物であって、
前記組成物が、流動可能な状態に誘導され得、
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記流動可能な状態で実質的に分解されない、前記組成物。
[本発明1002]
剪断力と圧力とを加えることにより、前記流動可能な状態に誘導され得る、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
熱を加えずに、剪断力と圧力とを加えることにより、前記流動可能な状態に誘導され得る、本発明1002の組成物。
[本発明1004]
前記組成物が、前記流動可能な状態に誘導され得、かつ、前記組成物内で実質的に分解せずに残存している前記組換えスパイダーシルクタンパク質が複数回押し出され得る、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
熱可塑性である、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
1．5Ｎｍ〜13Ｎｍの範囲の剪断力を加えることにより、流動可能な状態に誘導され得る、本発明1002の組成物。
[本発明1007]
2Ｎｍ〜6Ｎｍの範囲の剪断力を加えることにより、流動可能な状態に誘導され得る、本発明1002の組成物。
[本発明1008]
1ＭＰａ〜300ＭＰａの範囲の圧力を加えることにより、流動可能な状態に誘導され得る、本発明1002の組成物。
[本発明1009]
5ＭＰａ〜75ＭＰａの範囲の圧力を加えることにより、流動可能な状態に誘導され得る、本発明1002の組成物。
[本発明1010]
120℃未満、80℃未満、40℃未満、または、室温で、流動可能な状態に誘導され得る、本発明1006〜1009のいずれかの組成物。
[本発明1011]
2．16ｋｇの荷重で、95℃で、ＡＳＴＭ  Ｄ1238に従って試験した場合に、少なくとも0．5、少なくとも1、少なくとも2、または、少なくとも5のメルトフローインデックスを有する、本発明1001〜1010のいずれかの組成物。
[本発明1012]
21．6ｋｇの荷重で、95℃で、ＡＳＴＭ  Ｄ1238に従って試験した場合に、少なくとも0．5、少なくとも1、少なくとも2、または、少なくとも5のメルトフローインデックスを有する、本発明1001〜1010のいずれかの組成物。
[本発明1013]
実質的に均質である、本発明1001の組成物。
[本発明1014]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、繰り返し単位を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1015]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、60〜100アミノ酸の範囲のアミノ酸残基長を、範囲2〜20個の繰り返し単位で含む、本発明1001の組成物。
[本発明1016]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質の分子量が、20〜2000ｋＤａの範囲である、本発明1001の組成物。
[本発明1017]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、少なくとも2回の繰り返し単位の出現を含み、前記繰り返し単位が、
150を超えるアミノ酸残基、及び、少なくとも10ｋＤａの分子量を有することと、
少なくとも80％のアラニン含量を含む、6つ以上の連続するアミノ酸を有するアラニンに富む領域と、
少なくとも40％のグリシン含量、及び、30％未満のアラニン含量を含む、12個以上の連続するアミノ酸を有するグリシンに富む領域と、
を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1018]
前記可塑剤が、ポリオール、水、及び／または、尿素から選択される、本発明1001の組成物。
[本発明1019]
前記ポリオールが、グリセロールを含む、本発明1016の組成物。
[本発明1020]
前記可塑剤が、水を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1021]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在し、
可塑剤と組換えシルクポリペプチド粉末との重量比が、0．05：1〜4：1の範囲である、本発明1001の組成物。
[本発明1022]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在し、
可塑剤と組換えシルクポリペプチド粉末との重量比が、0．20：1〜0．70：1の範囲である、本発明1001の組成物。
[本発明1023]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在し、
前記組成物中の組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の量が、1〜90重量％の組換えスパイダーシルクタンパク質の範囲である、本発明1001の組成物。
[本発明1024]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在し、
前記組成物中の組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の量が、20〜41重量％の組換えスパイダーシルクタンパク質の範囲である、本発明1001の組成物。
[本発明1025]
可塑剤として、1〜90重量％の範囲のグリセロールを含む、本発明1001の組成物。
[本発明1026]
可塑剤として、15〜30重量％の範囲のグリセロールを含む、本発明1001の組成物。
[本発明1027]
可塑剤として、5〜80重量％の範囲の水を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1028]
可塑剤として、19〜27重量％の範囲の水を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1029]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記流動可能な状態で、10．0重量％未満の量が分解される、本発明1001の組成物。
[本発明1030]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記流動可能な状態で、6．0重量％未満の量が分解される、本発明1001の組成物。
[本発明1031]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記流動可能な状態で、2．0重量％未満の量が分解される、本発明1001の組成物。
[本発明1032]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質の分解が、前記流動可能な状態が誘導される前後の組成物に存在する全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量を測定することによって評価される、本発明1029〜1031のいずれかの組成物。
[本発明1033]
全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量が、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定される、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
本発明1001〜1033のいずれかの組成物を含む成形体。
[本発明1035]
前記成形体が繊維である、本発明1034の成形体。
[本発明1036]
前記繊維が、100Ｐａ〜1．2ＧＰａの範囲の強度のものである、本発明1035の成形体。
[本発明1037]
前記繊維が、偏光顕微鏡法で測定した場合に、5×10−5〜約0．04の範囲の複屈折のものである、本発明1035の成形体。
[本発明1038]
成形体を調製するためのプロセスであって、
（ａ）組換えスパイダーシルクタンパク質と可塑剤とを含む組成物に対して、圧力及び剪断力を加えて、前記組成物を流動可能な状態に変換するステップと、
（ｂ）流動可能な状態で前記組成物を押し出して、成形体を形成するステップと、
を含む、前記プロセス。
[本発明1039]
前記組成物を押し出して成形体を形成するステップが、前記組成物を押し出して繊維を形成することを含む、本発明1038のプロセス。
[本発明1040]
前記組成物を押し出して繊維を形成することが、紡糸口金を通して前記組成物を押し出すことを含む、本発明1039のプロセス。
[本発明1041]
前記組成物を押し出して成形体を形成するステップが、前記組成物を型に押し出すことを含む、本発明1038のプロセス。
[本発明1042]
（ａ）前記成形体に対して、圧力及び剪断力を加えて、前記成形体を流動性のある組成物に変換するステップと、
（ｂ）前記流動可能な状態で前記組成物を押し出して、第2の成形体を形成するステップと、
をさらに含む、本発明1038のプロセス。
[本発明1043]
前記第2の成形体に対して、前記ステップ（ａ）及び（ｂ）を少なくとも1回繰り返すことをさらに含む、本発明1042のプロセス。
[本発明1044]
前記剪断力が1．5〜13Ｎｍである、本発明1038〜1043のいずれかのプロセス。
[本発明1045]
前記圧力が、1ＭＰａ〜300ＭＰａである、本発明1038〜1043のいずれかのプロセス。
[本発明1046]
前記剪断力と前記圧力を、毛細管レオメーター、または、二軸スクリュー押出機を使用して前記組成物に加える、本発明1038〜1045のいずれかのプロセス。
[本発明1047]
前記圧力及び前記剪断力を加える間の前記二軸スクリュー押出機のスクリュー速度が、10〜300ＲＰＭの範囲である、本発明1046のプロセス。
[本発明1048]
前記剪断力と前記圧力を加えるために使用する器具が、押出チャンバーに結合され、かつ、前記押出チャンバーの近位にある混合チャンバーを含む、本発明1038〜1045のいずれかのプロセス。
[本発明1049]
前記組成物が、前記混合チャンバー内で加熱される、本発明1048のプロセス。
[本発明1050]
前記組成物が、前記押出チャンバー内で加熱される、本発明1048のプロセス。
[本発明1051]
前記組成物が、120℃未満の温度にまで加熱される、本発明1049または本発明1050のいずれかのプロセス。
[本発明1052]
前記組成物が、80℃未満の温度にまで加熱される、本発明1049または本発明1050のプロセス。
[本発明1053]
前記組成物が、40℃未満の温度にまで加熱される、本発明1049または本発明1050のプロセス。
[本発明1054]
押し出した後の前記成形体が、押し出し前の前記組成物と比較して、15％未満の水分を損失している、本発明1038〜1053のいずれかのプロセス。
[本発明1055]
押し出した後の前記成形体が、押し出し前の前記組成物と比較して、10％未満の水分を損失している、本発明1038〜1053のいずれかのプロセス。
[本発明1056]
前記組成物が、3〜7分の範囲の、前記混合チャンバーでの滞留時間を有する、本発明1048のプロセス。
[本発明1057]
前記押出チャンバーが、前記組成物が押し出されるオリフィスの近位で先細になっている、本発明1048のプロセス。
[本発明1058]
前記押出チャンバーが、温度制御される、本発明1048のプロセス。
[本発明1059]
前記成形体が繊維であり、前記繊維が手作業で延伸される、本発明1048〜1058のいずれかのプロセス。
[本発明1060]
前記成形体が繊維であり、前記繊維が複数のステップで延伸される、本発明1048〜1059のいずれかのプロセス。
[本発明1061]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記成形体において、実質的に分解していない、本発明1048〜1060のいずれかのプロセス。
[本発明1062]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記成形体において、10重量％未満の量が分解される、本発明1061のプロセス。
[本発明1063]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記成形体において、6重量％未満の量が分解される、本発明1061のプロセス。
[本発明1064]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記成形体において、2重量％未満の量が分解される、本発明1061のプロセス。
[本発明1065]
前記組換えスパイダーシルクタンパク質の分解が、押し出しの前後において前記組成物に存在する全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量を測定して評価される、本発明1061〜1064のいずれかのプロセス。
[本発明1066]
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、全長組換えスパイダーシルクタンパク質の量を測定する、本発明1065のプロセス。
[本発明1067]
前記成形体が、偏光顕微鏡によって測定した場合に、最小の複屈折を有する、本発明1038〜1066のいずれかのプロセス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
シルクポリペプチドは、特徴的に、反復ドメイン（ＲＥＰ）に、非反復領域（例えば、Ｃ末端ドメイン、及び、Ｎ末端ドメイン）が隣接して構成される。ある実施形態では、Ｃ末端ドメイン、及び、Ｎ末端ドメインのいずれも７５〜３５０アミノ酸長である。上記した反復ドメインは、図１に示すように、階層構造を示す。上記した反復ドメインは、一連のブロック（別名、繰り返し単位）を含む。上記したブロックは、シルクの反復ドメイン全体にわたり、ときに完全に、ときに不完全に繰り返す（準繰り返しドメインを構成する）。ブロックの長さ、及び、組成は、異なるシルクの種類間、また、異なる種間で変化する。表１Ａは、選択した種、及び、シルク種のブロック配例の一覧であり、さらなる例が、Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ  １６９−１８４（２０１１）；及び、Ｇａｔｅｓｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｆｉｂｒｏｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：５５１３，ｐｇ．２６０３−２６０５（２００１）に記載されている。一部の事例では、ブロックを、通常、パターンで並べ、シルク配列の反復ドメインに複数回（通常、２〜８回）出現する、より大きなマクロリピートを形成し得る。反復ドメインまたはマクロリピートの内側で繰り返されるブロックと、反復ドメイン内で繰り返されるマクロリピートとを、間隔エレメントで分離し得る。一部の実施形態では、ブロック配列は、グリシンに富む領域と、それに続くポリＡ領域とを含む。一部の実施形態では、短い（約１〜１０）アミノ酸モチーフが、ブロック内に複数回出現する。本発明の目的上、円順列とは関係なく、異なる天然シルクポリペプチドに由来するブロックを選択することができる（すなわち、同定したブロックが、他の点においてシルクポリペプチド間で類似する場合に、円順列のため整列しないことがある）。したがって、例えば、ＳＧＡＧＧ（配列番号３）という「ブロック」は、本発明の目的上、ＧＳＧＡＧ（配列番号４）と同一であり、また、ＧＧＳＧＡ（配列番号５）と同一であり；それらは、いずれも互いに円順列にすぎない。所与のシルク配列について選択した特定順列は、その他の何よりも利便性によって決定することができる（通常、Ｇで開始する）。ＮＣＢＩデータベースから得たシルク配列は、ブロック及び非反復領域に分割することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
（表１Ａ）ブロック配列の試料
2021534277.tif 000038
2021534277.tif 000039
2021534277.tif 000040
2021534277.tif 000041
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
一部の実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、アルファ接合因子ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結することができる。一部の実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、別の内在性または異種の分泌シグナルコード配列に作動可能に連結することができる。一部の実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、３Ｘ  ＦＬＡＧヌクレオチドコード配列に作動可能に連結することができる。一部の実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、６〜８個のＨｉｓ残基（配列番号３３）などのその他のアフィニティータグに作動可能に連結する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
一部の実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、繰り返し単位を含み、それぞれの繰り返し単位は、２〜２０個の準繰り返し単位を含む配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有しており；それぞれの準繰り返し単位は、｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝（配列番号３４）を含み、式中、それぞれの準繰り返し単位について；Ｘ１は、ＳＧＧＱＱ（配列番号３５）、ＧＡＧＱＱ（配列番号３６）、ＧＱＧＰＹ（配列番号３７）、ＡＧＱＱ（配列番号３８）、及び、ＳＱからなるグループから独立して選択され；ｎ１は、４〜８であり、ｎ２は、６〜１０である。繰り返し単位は、複数の準繰り返し単位から構成されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021534277000001.app
【国際調査報告】
2021534277.tif 000042
2021534277.tif 000043
2021534277.tif 000044