(57)【要約】  本発明は、グリセロールからなる滅菌安定液体トロンビン組成物の大規模調製方法、安定した液体トロンビン組成物、並びに止血組成物及びキットを提供する。本発明は、液体トロンビン、グリセロール、及びゼラチンからなる止血組成物を更に提供する。本明細書では、グリセロールからなる滅菌液体トロンビン組成物の大規模生産方法が更に提供される。
2021534171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
止血キットであって、
ａ．５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む液体トロンビン組成物を収容する容器と、
ｂ．ゼラチンを収容する容器と、
を備える、止血キット。
【請求項２】
前記液体トロンビン組成物が、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール、任意選択で約８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む、請求項１に記載の止血キット。
【請求項３】
前記キットが、カルシウムを更に含む、請求項１又は２に記載の止血キット。
【請求項４】
前記液体トロンビン組成物が、塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の止血キット。
【請求項５】
前記液体トロンビン組成物が、約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の止血キット。
【請求項６】
前記液体トロンビン組成物中の前記トロンビンが、約５０℃の温度で約２０時間後に少なくとも７０％活性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の止血キット。
【請求項７】
前記液体トロンビン組成物中の前記トロンビンが、約１００℃の温度で約２分後に少なくとも７０％活性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の止血キット。
【請求項８】
トロンビン、ゼラチン、及びグリセロールを、固形分の３０重量％超の濃度範囲で含む、止血組成物。
【請求項９】
カルシウムを更に含む、請求項８に記載の止血組成物。
【請求項１０】
塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む、請求項８又は９に記載の止血組成物。
【請求項１１】
約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の止血組成物。
【請求項１２】
止血を補助する局所使用のための、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の止血組成物。
【請求項１３】
５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物の大規模生産方法であって、
ａ．トロンビンをグリセロール溶液と混合することによってトロンビン溶液を調製し、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを有する溶液を得る工程と、
ｂ．得られた前記トロンビン溶液を少なくとも約４０℃に加熱する工程と、
ｃ．約０．２２μｍ以下の孔径を有する少なくとも１つのフィルタを通過させることによって、前記トロンビン溶液を滅菌する工程と、
を含むことにより、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物を得る、方法。
【請求項１４】
熱不活性化により実行されるウイルス不活性化の工程を更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記トロンビン溶液が、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール、任意選択で約８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記トロンビン溶液が、カルシウムを更に含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記トロンビン溶液が、塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記トロンビン溶液が、約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記液体トロンビン組成物中の前記トロンビンが、約５０℃の温度で約２０時間後に少なくとも７０％活性である、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記液体トロンビン組成物中の前記トロンビンが、約１００℃の温度で約２分後に少なくとも７０％活性である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法によって得られた５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物。
【請求項２２】
５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物。
【請求項２３】
約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール、任意選択で約８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む、請求項２２に記載の滅菌液体トロンビン組成物。
【請求項２４】
カルシウムを更に含む、請求項２２又は２３に記載の滅菌液体トロンビン組成物。
【請求項２５】
塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の滅菌液体トロンビン組成物。
【請求項２６】
約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の滅菌液体トロンビン組成物。
【請求項２７】
前記トロンビンが、約５０℃の温度で約２０時間後に少なくとも７０％活性である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の滅菌液体トロンビン組成物。
【請求項２８】
前記トロンビンが、約１００℃の温度で約２分後に少なくとも７０％活性である、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の滅菌液体トロンビン組成物。
【請求項２９】
ゼラチンを更に含む、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の滅菌液体トロンビン組成物。
【請求項３０】
トロンビンと５０％ｖ／ｖ超のグリセロールとを含むシーラント配合物。
【請求項３１】
約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール、任意選択で約８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む、請求項３０に記載のシーラント配合物。
【請求項３２】
カルシウムを更に含む、請求項３０又は３１に記載のシーラント配合物。
【請求項３３】
約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【請求項３４】
フィブリノゲン成分を含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載のシーラント配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、グリセロールを含む安定した液体トロンビン組成物、それらの調製、及びその組成物を含む止血キットに関する。本発明は更に、グリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
出血の制御は、失血を最小限に抑え、術後合併症を低減させ、手術室での手術の時間を短くするために、特に外科的処置において必須かつ重要である。トロンビンを含む止血調整物が利用可能であるが、トロンビンは、トロンビンを不安定にする自己触媒機能により、凍結又は粉末形態で提供される。液体トロンビンのいくつかの調製物が現在知られており、例えば、
欧州特許第０２７７０９６号は、安定化量のポリオール及び特定のｐＨの緩衝液を使用して室温で安定したトロンビン配合物を開示している。
米国特許出願第ＵＳ４６９６８１２号は、安定化量の抗自己分解緩衝液を低濃度の生理食塩水及びグリセロールと組み合わせて使用して変成を防止し、保存安定性を付与したトロンビン溶液を開示している。
米国特許出願公開第ＵＳ４９６５２０３号は、安定化量のポリオール及び特定のｐＨの緩衝液を使用して、室温で安定した、改善トロンビン配合物を開示している。
米国特許出願公開第２００６０２７００１５号は、高純度及び高特異的活性を有するトロンビン含有の安定した滅菌液体配合物、並びにそのような配合物を作製及び使用する方法を開示している。
米国特許出願公開第２０１４０１２００７８号は、可塑剤（例えばグリセロール）、及びトロンビンなどの生物活性剤を更に含んでもよい、架橋ヒドロゲル及びそれらを含むキットを開示している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
液体トロンビン調整物から、凍結乾燥医薬調整物を作製することができ、これは使用時に溶解させた後で用いられる。
【０００４】
トロンビンを安定化させるための現在公知の組成物及び方法は、満足のいくものではなく、例えば、以下が挙げられる：様々な非特異的成分（例えば、アルブミン等のバルク担体タンパク質、様々な安定化糖類、一般的なプロテアーゼ阻害剤等）の含有；効率的であり得るが、トロンビンを不活性化又は阻害することによって有効性を低減するトロンビン活性阻害剤を伴うトロンビンの配合；大量の配合物の投与を必要とする低トロンビン濃度溶液の配合。
【０００５】
本発明は、使用前に溶媒に溶解する追加工程なしに、安定した液体トロンビン組成物を容易に投与するという未だ達成されていない需要を満たすという点で、凍結乾燥調製物よりも有利である液体調製物を提供する。加えて、本発明は、保存安定性を有する液体トロンビン組成物を容易かつ迅速に投与するという未だ達成されていない需要を満たすという点で、トロンビンを含む医薬凍結乾燥組成物よりも有利である、液体トロンビンを含む使用し易い医薬液体組成物を提供する。用語「医薬液体」は、治療又は薬効値を有する物質を含む任意の液体を指す。
【０００６】
特定の実施形態では、本発明は、
ａ．５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む液体トロンビン組成物を収容する容器と、
ｂ．ゼラチンを収容する容器と、を備える止血キットを提供する。
【０００７】
止血キットのいくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール、又は８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。
【０００８】
止血キットのいくつかの実施形態では、トロンビン溶液は、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール、又は８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。止血キットの一実施形態では、トロンビン溶液は、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％などの、６０％超、６５％超、７０％超、又は７５％ｖ／ｖ超（それらの間の任意の値及び範囲を含む）のグリセロールを含む。
【０００９】
止血キットのいくつかの実施形態では、キットはカルシウムを更に含む。止血キットのいくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む。止血キットのいくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、１〜約５０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。止血キットのいくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、約１〜約２０００、又は１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。
【００１０】
止血キットのいくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で約２０時間後に少なくとも７０％活性である。止血キットのいくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約１００℃の温度で約２分後に少なくとも７０％活性である。キットは、使用説明書を更に収容してもよい。
【００１１】
別の態様によれば、本発明は、トロンビン、ゼラチン、及びグリセロールを含む止血組成物を提供し、グリセロールは、固形分の３０重量％超である。
【００１２】
止血組成物のいくつかの実施形態では、組成物はカルシウムを更に含む。止血組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む。止血組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、１〜約２５００ＩＵ／ｍｌのトロンビン、又は約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。止血組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、止血を補助する局所使用のためのものである。
【００１３】
更なる態様によれば、本発明は、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物の大規模生産方法（「大規模生産方法」）を提供し、本方法は、
ａ．トロンビンをグリセロール溶液と混合することによってトロンビン溶液を調製し、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを有する溶液を得る工程と、
ｂ．得られたトロンビン溶液を少なくとも約４０℃に加熱する工程と、
ｃ．約０．２２μｍ以下の孔径を有する少なくとも１つのフィルタを通過させることによって、トロンビン溶液を滅菌する工程と、
を含むことにより、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物を得る。
【００１４】
大規模生産方法のいくつかの実施形態では、本方法は、熱不活性化によって実行されるウイルス不活性化の工程を更に含む。大規模生産方法のいくつかの実施形態では、トロンビン溶液は、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール又は８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。本方法の一実施形態では、トロンビン溶液は、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％などの、６０％超、６５％超、７０％超、又は７５％ｖ／ｖ超（それらの間の任意の値及び範囲を含む）のグリセロールを含む。
【００１５】
大規模生産方法のいくつかの実施形態では、トロンビン溶液は、カルシウムを更に含む。大規模生産方法のいくつかの実施形態では、トロンビン溶液は、塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む。
【００１６】
大規模生産方法のいくつかの実施形態では、トロンビン溶液は、１〜約２５００ＩＵ／ｍｌのトロンビン、又は約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。大規模生産方法のいくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で約２０時間後に少なくとも７０％活性である。大規模生産方法のいくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約１００℃の温度で約２分後に少なくとも７０％活性である。
【００１７】
更に別の態様によれば、本発明は、本発明の方法によって得られる５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物を提供する。
【００１８】
更なる態様によれば、本発明は、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物を提供する。
【００１９】
滅菌液体トロンビン組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、滅菌液体トロンビン組成物は、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール又は８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。滅菌液体トロンビン組成物の一実施形態では、トロンビン溶液は、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％などの、６０％超、６５％超、７０％超、又は７５％ｖ／ｖ超（それらの間の任意の値及び範囲を含む）のグリセロールを含む。
【００２０】
滅菌液体トロンビン組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、カルシウムを更に含む。滅菌液体トロンビン組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を含む。滅菌液体トロンビン組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、１〜約２５００ＩＵ／ｍｌのトロンビン、又は約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。滅菌液体トロンビン組成物のいくつかの実施形態では、トロンビンは、約５０℃の温度で約２０時間後に少なくとも７０％活性である。滅菌液体トロンビン組成物のいくつかの実施形態では、トロンビンは、約１００℃の温度で約２分後に少なくとも７０％活性である。滅菌液体トロンビン組成物のいくつかの実施形態では、組成物はゼラチンを更に含む。
【００２１】
更に別の態様によれば、本発明は、トロンビン、ゼラチン、及びグリセロールを、固形分の３０重量％超の濃度範囲で含む止血組成物を提供する。
【００２２】
更に別の態様によれば、本発明は、トロンビンと、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールとを含むシーラント配合物を提供する。シーラント配合物のいくつかの実施形態では、配合物は、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール又は８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。シーラント配合物の一実施形態では、配合物は、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％などの、６０％超、６５％超、７０％超、又は７５％ｖ／ｖ超（それらの間の任意の値及び範囲を含む）のグリセロールを含む。
【００２３】
シーラント配合物のいくつかの実施形態では、配合物は、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール又は８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。シーラント配合物のいくつかの実施形態では、配合物はカルシウムを更に含む。シーラント配合物のいくつかの実施形態では、配合物は、１〜約２５００ＩＵ／ｍｌのトロンビン、又は約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。
【００２４】
更に別の態様によれば、本発明は、固形分の３０重量％超の濃度範囲で、トロンビン、ゼラチン、及びグリセロールを含む滅菌止血組成物を提供する。滅菌止血組成物の一実施形態では、組成物は、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％などの、６０％超、６５％超、７０％超、又は７５％ｖ／ｖ超（それらの間の任意の値及び範囲を含む）のグリセロールを含む。
【００２５】
更に別の態様によれば、本発明は、トロンビンと、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールとを含む滅菌シーラント配合物を提供する。
【００２６】
滅菌シーラント配合物のいくつかの実施形態では、配合物は、６５〜約１００％、６５〜約１００ｖ／ｖのグリセロール、又は８０〜約１００ｖ／ｖのグリセロールを含む。滅菌シーラント配合物の一実施形態では、配合物は、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％などの、６０％超、６５％超、７０％超、又は７５％ｖ／ｖ超（それらの間の任意の値及び範囲を含む）のグリセロールを含む。
【００２７】
シーラント配合物のいくつかの実施形態では、配合物はカルシウムを更に含む。シーラント配合物のいくつかの実施形態では、配合物は、１〜約２５００ＩＵ／ｍｌのトロンビン、又は約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、シーラント配合物は、フィブリノゲン成分を含む。
【００２９】
本明細書に提示されるキット、組成物、配合物、及び方法の任意の態様のいくつかの実施形態では、キット、組成物、及び／又は配合物は、それぞれ、少なくとも２成分キット、２成分組成物、及び２成分配合物である。２成分組成物及び２成分配合物の任意の態様のいくつかの実施形態では、成分のうちの１つはフィブリノゲンを含む。
【００３０】
例えば、キットは、アプリケータ装置を使用して適用されてもよく、少なくとも２成分物質（例えば、ＥＶＩＣＥＬなどのフィブリンシーラント）の複数回の連続注入を投与するために使用されてもよい。一実施形態では、アプリケータ装置は、装置を移動させながら、組織の２次元表面上に固定量の混合構成要素を複数回注入することを可能にする。一実施形態では、アプリケータは、注入針を有し、注入針は任意選択で、注入が完了した後、投与者が注入面から上方に装置を持ち上げる必要なく、患者の皮膚から自動的に後退させられる。一実施形態では、キットは、任意の態様の任意の実施形態において、フィブリノゲン成分及びトロンビン成分を有するフィブリンシーラントを投与するために使用されてもよい。
【００３１】
本明細書及び当該技術分野において使用されるとき、用語「フィブリノゲン」は、血栓マトリクスの前駆体タンパク質を指す。フィブリノゲンは、約３４００００ドルトンの分子量を有し、ジスルフィド結合によって共に結合される、３つの対の異なるポリペプチド鎖Ａα、Ｂβ、及びγからなる。典型的には、フィブリノゲンは、２つの同一のＤ末端球状ドメイン及び１つの中央Ｅ球状ドメインが、高次コイルα−螺旋体によって結合した三節構造を有する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、フィブリノゲンは、フィブリノゲン濃縮物であるか、又はフィブリノゲン濃縮物から発生する。いくつかの実施形態では、フィブリノゲンは、血液由来のフィブリノゲン濃縮物である。
【００３３】
全体的に、用語「発生する」又は「由来する」は、互換的に使用され、天然由来、組み換え、処理、未精製、又は精製された分子（例えば、関連タンパク質）を含み得る、関連成分の起源又はソースを指す。いくつかの実施形態では、フィブリノゲン濃縮物は、寒冷沈降したフィブリノゲンを含む。いくつかの実施形態では、フィブリノゲンは、寒冷沈降したフィブリノゲンから発生する。いくつかの実施形態では、フィブリノゲン溶液成分及びトロンビン溶液は、１：２〜２：１、例えば、約１：１の比（ｖ／ｖ）で組み合わされる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、寒冷沈降したフィブリノゲンは、血漿の生物学的活性成分（ＢＡＣ）と見なされる。いくつかの実施形態では、ＢＡＣは、不活性化されたウイルスである。いくつかの実施形態では、ＢＡＣは、限定されることなく、トラネキサム酸などの抗線維素溶解剤を含む生物学的活性成分である。トラネキサム酸を含む非限定的な例示のＢＡＣは、「Ｑｕｉｘｉｌ」（Ｏｍｒｉｘ、イスラエル）の名称の製品である。これは、第２世代ＢＡＣと考えられ、当該技術分野では「ＢＡＣ２」と呼ばれている。ＢＡＣ２の調製中に、プラスミノゲン（フィブリノゲン及びフィブリンを分解するプラスミンの酵素前駆体）が除去される。ＢＡＣの非限定的な調製経路は、米国特許第６、１２１、２３２号及び／又は国際公開第１９９８０３３５３３号に記載されており、その内容が参照により組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＢＡＣ組成物は、１つ以上の抗線維素溶解剤（例えば、トラネキサム酸）及びアルギニン塩酸塩を含む。ＢＡＣ中のトラネキサム酸などの抗線維素溶解剤の量は、約８０〜約１１０ｍｇ／ｍＬとすることができる。いくつかの実施形態では、ＢＡＣ２は、内容が参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第５３４１７８号の開示に従って調製される。例えば、ＢＡＣ２は、濃縮された寒冷沈降物から調製され得、その後、例えば、溶媒界面活性剤処理及び低温殺菌によって、ウイルスの不活性化を受ける。寒冷沈降物からプラスミン／プラスミノゲンを除去することを考慮すると、トラネキサム酸やアプロチニンなどの抗線溶薬を添加する必要はない。したがって、いくつかの実施形態では、ＢＡＣ２はトラネキサム酸を含まない。
【００３５】
ＳＵＲＧＩＣＥＬ（登録商標）などのいくつかの止血材料が、開示されるキット及び／又はトロンビン配合物と組み合わせて効果的に使用されてもよい。例えば、開示されるトロンビン溶液は、使用前にゼラチン、例えば流動性ゼラチンマトリクスに添加されてもよい。いったんゼラチンがトロンビン配合物と混合されると、適切なアプリケータの先端が、出血部位若しくは組織上への製品送達のため、又は毛細血管及び小静脈からの滲出血液及び小出血にアクセス可能であるときは止血の支援及び出血の制御として、シリンジに取り付けられてもよい。
【００３６】
用語「組織」は、特定の機能を行う上で統合された細胞及び／又は細胞成分の会合を指す。組織中の細胞は、全てが１つの種類であるか複数の種類であり得る。組織は、生体の組織と同様に機能するように細胞を増殖させた人工組織であってもよい。組織は、人体組織又は動物組織であってよい。
【００３７】
２成分組成物は、２つの成分を（例えば、混合時に）組み合わせることによって組成物を得て、同時に、又はその後に、得られた組成物を出血低減又は予防が必要とされる部位に直接塗布することによって提供されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物の塗布は、処理される領域上に組成物を噴霧又は滴下することによって補助される。
【００３８】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法及び材料を、本発明の実施形態の実行又は試験に使用することが可能であるが、代表的な方法及び／又は材料を以下に記載する。矛盾のある場合、定義を含め本特許明細書が適用される。なお、材料、方法、及び実施例は、単に例示的なものであり、必ずしも限定を意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】様々なグリセロール濃度が、５０℃で２４時間（ｈ）のトロンビン活性に及ぼす影響を示すグラフである。トロンビンを、二重蒸留水（ＤＤＷ）中のいくつかの異なる濃度のグリセロールに懸濁させ、５０℃で２４時間置いた。活性は、１、４．５、８及び２４時間で測定し、灰色のドット付き実線は０％グリセロール、黒色の実線が５０％ｖ／ｖのグリセロール、灰色の破線が６０％ｖ／ｖのグリセロール、点線が８０％ｖ／ｖのグリセロール、ｎ＝４とした。
【図２Ａ】様々なグリセロール濃度が、２５℃及び４℃でのトロンビン活性に及ぼす影響を示す棒グラフである。トロンビンを、ＤＤＷ中のいくつかの異なる濃度のグリセロールに懸濁させ、２５℃で６ヶ月間及び４℃で１２ヶ月間置いた。図２Ａは、２５℃で３ヶ月及び６ヶ月で測定された活性を示す。
【図２Ｂ】様々なグリセロール濃度が、２５℃及び４℃でのトロンビン活性に及ぼす影響を示す棒グラフである。トロンビンを、ＤＤＷ中のいくつかの異なる濃度のグリセロールに懸濁させ、２５℃で６ヶ月間及び４℃で１２ヶ月間置いた。。図２Ｂは、４℃で１２ヶ月で測定された活性を示す。本明細書及び棒グラフにおける上記の棒は、標準偏差を示す。
【図３】様々なグリセロール濃度が、１００℃でのトロンビン活性に及ぼす影響（２分後に測定）を示すグラフである。トロンビンを、ＤＤＷ中のいくつかの異なる濃度のグリセロール中に懸濁させ、１００℃で置いた。活性は、２分後に測定した。ドット付きの黒色実線が５０％ｖ／ｖのグリセロール、灰色の実線が６０％ｖ／ｖのグリセロール、点線が８０％ｖ／ｖのグリセロール、ｎ＝２とした。
【図４】様々なグリセロール濃度が、ブタパンチ生検モデルにおける生体内でのトロンビン活性に及ぼす影響を示す棒グラフである。トロンビンをＤＤＷ中のグリセロールの示された濃度に懸濁させ、ゼラチンキット中の再構成トロンビンの代わりに使用して、様々なグリセロール濃度でトロンビンを含むゼラチンペーストを調製した。出血を止めるために必要なタンポナーデの数に従ってトロンビン活性を測定した。左から、０％ｖ／ｖのグリセロール中のトロンビンを含むゼラチンペースト、５０％ｖ／ｖのグリセロール中のトロンビンを含むゼラチンペースト、６０％ｖ／ｖのグリセロール中のトロンビンを含むゼラチンペースト、及び１００％ｖ／ｖのグリセロール中のトロンビンを含むゼラチンペースト、ｎ＝５とした。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
トロンビンは、出血を制御するための止血材料として広く使用されている。しかしながら、トロンビンは自己触媒酵素であり、したがって、液体形態では不安定である。トロンビン濃度が上昇する、及び／又は温度が上昇するにつれて、液体トロンビン安定性の持続時間が減少する。その結果、トロンビンの市販の調製物は、粉末又は凍結液体として存在する。これには、粉末トロンビンの再構成及び凍結トロンビンの解凍の必要性による比較的長い調製時間や、低温での出荷の必要による出荷制約だけでなく、調製が粉末トロンビンの再構成を必要とする場合には、潜在的に損なわれる滅菌性が損なわれる危険性などの、いくつかの欠点がある。
【００４１】
本明細書で使用するとき、用語「粉末」は、典型的には０．１〜１０００マイクロメートルの範囲内の小径を特徴とする固形の複数の粒子を指す。
【００４２】
用語「固形」は、室温（例えば、２５℃）及び大気圧（７６０ｍｍＨｇ）での化合物又は組成物、すなわち、保存中に形態を保持する高粘稠度の化合物又は組成物を特徴とする。本出願におけるこの用語はまた、非流体粒子又は溶解物質にも関連する。「液体」化合物及び組成物とは対照的に、固形はそれ自重下で流動しない。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「トロンビン」は、プロトロンビンのタンパク質分解切断（因子ＩＩ）から生じる活性化酵素を示す。トロンビンは、当該技術分野において既知の様々な製造方法によって生産されてもよく、組み換えトロンビン及び血漿由来トロンビンが含まれるが、これらに限定されない。ヒトトロンビンは、ジスルフィド結合によって接合された２つのポリペプチド鎖からなる、２９５アミノ酸タンパク質である。ヒト及び非ヒト（例えば、ウシ）トロンビンの両方を、本開示の範囲内で使用することができる。
【００４４】
本発明で使用されるトロンビンの起源は、組み換え細菌及び／又は細胞（Ｖｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６、Ｊ．Ｖｉｅｔ．Ｅｎｖ．８（１）：２１〜２５）、全血（いくつかの献血でプールされる又はされない）、及び／又は血液画分（いくつかの献血、例えば血漿からプールされ得る）を含むが、これらに限定されない１つ又は複数のソースから得られ得る。トロンビンは、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｂａｘｔｅｒ、及びＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇなどの製造業者から、スタンドアロン製品、例えばＥＶＩＴＨＲＯＭ（登録商標）として、又はＥＶＩＣＥＬ（登録商標）、ＴＩＳＥＥＬ（登録商標）、Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ（登録商標）などの製品の構成要素として入手可能である。
【００４５】
本発明者らは、驚くべきことに、トロンビン溶液中の５０％ｖ／ｖ超の高濃度グリセロールは、例えば、高温でのトロンビン酵素の安定性の向上、及び生体内でのトロンビン活性の向上をもたらすことを見出した。
【００４６】
図１に示されるように、グリセロールなしで調製されたトロンビンが、５０℃で２４時間後に約９０％の活性を失う一方、５０％グリセロール以上を含むトロンビンの活性は完全に維持される。更に、図３に示されるように、１００℃で２分後、通常は酵素活性が完全に低下するが、７５％の活性が５０％グリセロールを含んで維持され、少なくとも９０％の活性が６０％又は８０％グリセロールを含んで維持される。この高温での安定性の向上により、液体トロンビンを、冷蔵を必要としない液体状態での輸送、取扱い、及び保存のように、これまでは不可能であった方法で使用することが可能になる。更に、以下の実施例３は、一般にフィルタ滅菌にとっては粘性が高すぎると考えられるグリセロールを、４０℃及び５０℃の温度で効果的に濾過することができることを示す。上記の結果を組み合わせることにより、本明細書に記載されるように濾過温度を上昇させることによって、高グリセロール濃度（例えば、６０重量％超）の溶液中での液体トロンビンの濾過による滅菌が可能になる。
【００４７】
用語「フィルタ」、及びその語尾変化は、流体、例えば、液体流における粒子の通過を阻止、邪魔、妨害、又は干渉することを意味する。
【００４８】
しかしながら、潜在的な問題は、グリセロールなどの粘性媒体が、トロンビンとその標的分子との相互作用に干渉する場合があるため、形成される血塊の形成、動態、又は品質に影響を及ぼし得ることである。これに基づいて、当業者であっても、高グリセロール濃度とトロンビンを組み合わせることは思いつかなかったであろう。
【００４９】
それにもかかわらず、驚くべきことに本発明者らによって発見されたように、この状況は生体内では異なる。図３は、グリセロールを含む液体トロンビン溶液で調製されたゼラチンの生体内活性を説明する。ゼラチンキット（Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（登録商標））は、出血部位内／上に塗布する直前に共に混合されたゼラチン及びトロンビン粉末を含む。トロンビンは粉末状態で提供されるため、施術者による再構成を必要とする。
【００５０】
上記の粘度の問題とは対照的に、図４に示されるように、グリセロールで再構成されたトロンビン中のグリセロール濃度の増加は、配合物の出血を低減する能力の向上に対応することが見出された。加えて、本発明の液体トロンビン配合物の重要な利点は、再構成の工程を節約することによって、施術者の煩雑さを防止して時間を節約するだけでなく、汚染リスクを最小限に抑えることである。
【００５１】
用語「液体トロンビン組成物」、「液体トロンビン溶液」、「トロンビン溶液」、及び「液体トロンビン配合物」は、互換的に使用され、トロンビンを含む液体組成物を指す。いくつかの実施形態では、「液体トロンビン組成物」は、水溶液であり、すなわち、１〜５０％未満の水（％ｖ／ｖ）を含む。
【００５２】
用語「液体」は、流動することができ、固定された形状を有さず、固体又は気体ではない物質を指す。
【００５３】
その結果、本発明の安定した液体トロンビン組成物は、粉末又は凍結トロンビンを止血材料として置き換えるために使用することができる。本発明の液体トロンビンは、スタンドアロントロンビン溶液、例えば、滅菌及び安定した単独トロンビン溶液として、又は、Ｓｕｒｆｉｇｌｏ（登録商標）キットなどのキットの一部として、又はこれらのキット中のトロンビン成分の代わりにフィブリンシーラントキットとして提供することができる。
【００５４】
したがって、本発明は、一態様では、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む液体トロンビン組成物を収容する容器と、ゼラチンを含有する容器と、を含む、止血キットを提供する。本発明はまた、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む保存安定滅菌液体トロンビン組成物を収容する容器と、ゼラチンを含有する容器と、を含む、止血キットを提供する。
【００５５】
用語「保存安定」は、配合物や組成物が、予め選択された保存温度、配合物（例えば、流体／液体）の予め選択された物理的状などの、予め選択された保存条件下で、任意選択で容器、例えばバイアル内で安定していることを指すものとして理解すべきである。安定性は、例えば配合物が液体形態であるとき、当該技術において既知な方法、例えば、予め選択された保存条件下で配合物中に視認できる凝集体及び／又はフィブリン凝塊の不在を試験することによって判定することができる。更に、本開示によれば、安定したシーラント配合物に言及するとき、使用時に、配合物の保存条件にかかわらず有効な凝固時間を有すると理解されるべきであり、例えば、シーラント配合物は、室温（例えば、８〜４０℃）で保存されたか又は低温（又は８℃未満）で保存されたかどうかにかかわらずほぼ同じ期間で凝固する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、予め選択された保存条件は、室温（例えば、１０〜３０℃）での保存を含み、シーラント配合物は、少なくとも５分間、少なくとも１５分間、少なくとも１時間、少なくとも１日間、少なくとも２、３、４、５、６、又は更には７日間、時には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は更には２４ヶ月以上（それらの間の任意の値及び範囲を含む）安定している。
【００５７】
いくつかの実施形態において、予め選択された保存条件は、低温（例えば、２〜１０℃）での保存を含み、シーラント配合物は、少なくとも５分間、少なくとも１５分間、少なくとも１時間、少なくとも１日間、少なくとも２、３、４、５、６、又は更には７日間、時には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は更には２４ヶ月以上（それらの間の任意の値及び範囲を含む）安定している。
【００５８】
用語「容器」は、例えば液体を含有し得る容器又はバイアルなどの任意の一般的な構造を指すことができる。
【００５９】
一実施形態では、このキットは、８〜４０℃の範囲の温度など、室温で保存される。
【００６０】
別の態様では、本発明は、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、又は９０％超ｖ／ｖのグリセロール、例えば、６０％〜１００％、又は８０％〜１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む液体トロンビン組成物を収容する容器と、ゼラチンを収容する容器と、を備える、２〜８℃で保存するための止血キットを提供する。
【００６１】
本発明の止血キットは、例えば開放創の血流を低減、遮断、又は停止する際に使用するためのキットであってもよく、例えば、腹腔鏡手術、神経手術、腹部手術、心臓血管手術、胸部手術、頭部及び頸部手術、骨盤手術、並びに皮膚及び皮下組織処置などの外科的処置などの処置中に血流を低減、予防、又は停止するために使用されてもよい。キットは、皮膚から、内部臓器内の血流を低減又は遮断するために使用されてもよい。
【００６２】
用語「液体溶液」は、粘性溶液も包含する。用語「粘性溶液」とは、流に対する抵抗性が高いが、流れることができ、限定ではないが典型的には、約１センチポアズ単位を超え、約１００００センチポアズ単位未満である溶液を指す。
【００６３】
キット用の液体トロンビン組成物は、滅菌であってもよく、以下の工程を含む大規模製造方法から得ることができる。
ａ．トロンビンをグリセロール溶液と混合することによってトロンビン溶液を調製し、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを有する溶液を得る工程と、
ｂ．得られたトロンビン溶液を少なくとも４０℃に加熱する工程と、
ｃ．０．２２μｍ以下の孔径を有する少なくとも１つのフィルタを通過させることによって、トロンビン溶液を滅菌する工程と、
を含むことにより、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む液体滅菌トロンビン溶液を得る。
【００６４】
本明細書で使用するとき、用語「大規模」は、少なくとも１リットルの溶液が生成され、典型的には少なくとも約４００ＩＵのトロンビンを含むプロセスに関する。
【００６５】
本発明のゼラチン源は、合成（例えば、組み換えゼラチン）であってもよく、又はブタなどの動物由来であってもよい。ゼラチン源は滅菌であってもよく、ペースト、粉末、又はスポンジなどの異なる形態であってもよい。本明細書で使用するとき、用語「ペースト」は、室温付近の少なくとも１つの温度における組成物の粘稠度に関し、固形粒子の流体混合物を指すことができる。
【００６６】
本発明で使用されるゼラチンは、使用前に架橋されてもよい。ゼラチンの架橋は、当該技術分野において開示される任意の数の好適な方法によって実施することができる。例えば、ゼラチンは、１５０℃まで３時間加熱することによって架橋することができる（Ｎａｇｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３４：７６１〜７６６）。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ゼラチンは溶媒中に溶解してゼラチンペーストを形成する。いくつかの実施形態では、ゼラチンペーストはグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、ゼラチンペーストは、固形分の３０重量％超でグリセロールを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は滅菌である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％ｖ／ｖのグリセロールを含む（それらの間の任意の値及び範囲を含む）。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、約５０％〜約８０％ｖ／ｖのグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、約６０％〜約８０％ｖ／ｖのグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、約６０％〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、約７０％〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、約８０％〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、６５％超、６７％超、又は７０％超、及び最大約１００％（溶媒体積）％ｖ／ｖのグリセロールを含む。
【００７０】
別途記載のない限り、グリセロールの状況におけるグリセロール濃度の「％ｖ／ｖ」又は「％」の定義は、液体トロンビン組成物中の溶媒（例えば、水）の総体積におけるグリセロール体積の割合に関する。本明細書で使用するとき、用語「溶媒」は、その物理的状態を変化させずに、別の物質を溶解又は分散させる材料を指す。
【００７１】
カルシウムは、凝固カスケードにおいて重要な要素である。因子ＸＩＩＩの因子ＸＩＩＩａへの活性化にはカルシウムが必要であり、これにより、フィブリンを架橋し安定化させて、不溶性血塊を生成する。
【００７２】
したがって、いくつかの実施形態では、開示されるキット及び／又はその実施形態における組成物は、カルシウムを更に含む。本発明で使用されるカルシウムは、塩、例えば塩化カルシウム塩の形態であってもよい。あるいは、酢酸カルシウム及び／又はクエン酸カルシウムなどの追加の塩を使用してもよい。キットにおいて、カルシウム塩は、液体トロンビン組成物中に提供することができる。あるいは、カルシウム塩は、別個の容器内のキットに提供されてもよく、又はカルシウム塩は、ゼラチン成分を収容する同じ容器内のキットに提供されてもよい。
【００７３】
本明細書に開示される任意の態様における液体トロンビン組成物は、以下の賦形剤：カルシウム、アルブミン、糖類、糖類誘導体、ポリオール、酢酸塩、クエン酸塩、アミノ酸、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、及び水のうちの１つ以上を含んでもよい。カルシウム源は、塩化カルシウムであってもよく、２〜６０ｍＭの濃度範囲であってもよい。アルブミンは、０．０５〜１％（ｗ／ｖ）の濃度範囲、又は０．５〜１％（ｗ／ｗ）の範囲であってもよい。糖類源は、サッカロースであってもよく、５ｇ／ｌの濃度であってもよい。糖類誘導体源は、グルコン酸であってもよい。ポリオールは、マンニトールであってもよく、２％（ｗ／ｗ）の濃度であってもよい。酢酸源は、酢酸ナトリウムであってもよく、１０ｍＭの濃度であってもよい。クエン酸塩源は、クエン酸ナトリウムであってよい。アミノ酸はヒスチジンであってもよく、１０ｍＭの濃度であってもよい。ポリエチレングリコール源は、ＰＥＧ−３３５０であってもよく、例えば、０．０３％の濃度であってもよい。塩化ナトリウムは、５０〜１７５ｍＭの範囲であってもよい。
【００７４】
トロンビン溶液は、約５．０〜８．５．のｐＨ範囲であってもよい。
【００７５】
本明細書で使用するとき、用語「賦形剤」は、所望の粘稠度又は安定化効果を提供するために配合物に添加される非治療薬を表す。
【００７６】
トロンビン溶液の例は、限定はしないが、８００〜１２００ＩＵのトロンビン／ｍｌ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、４０ｍＭのＣａＣｌ２、１１０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ｗ／ｗのヒトアルブミン、及びｐＨ６．８〜７．２の２％ｗ／ｗのマンニトール；塩化カルシウム（４０μｍｏｌ／ｍｌ）、アルブミン（ヒト）、塩化ナトリウム、注射用の水；５００ＩＵ／ｍｌのタンパク質トロンビン、１％のアルブミン、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、及び７５ｍＭの塩化ナトリウム；５００ＩＵ／ｍｌのトロンビン、２％のマンニトール、１０ｍＭのヒスチジン、０．０３％のＰＥＧ−３３５０、及び１７５ｍＭの塩化ナトリウム；５００ＩＵのトロンビン／ｍｌ、０．１％〜１％（ｗ／ｖ）の濃度のヒトアルブミン、ｐＨ５．０〜８．５で０．０５Ｍの濃度の塩化ナトリウム、を含む。
【００７７】
アルブミンは、例えば、ヒトアルブミンである。しかしながら、アルブミンは、非ヒト源又は組み換えアルブミンであってもよい。本明細書に開示される任意の態様のいくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、注入用の水を含む。
【００７８】
したがって、いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、これに限定されることなく、塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムから選択される賦形剤を更に含む。
【００７９】
液体形態の濃縮精製トロンビンは、主に自己触媒開裂の結果、長期間の保存中に活性の低下を示す。例えば、１０００国際単位（ＩＵ）／ｍｌの濃度の水性液体トロンビンは、室温で自己触媒開裂を起こし、トロンビン活性の有意な損失を引き起こす場合がある。
【００８０】
いくつかの実施形態では、トロンビン溶液又は組成物は、１００〜４０００又は１００〜２５００ＩＵトロンビン／ｍｌなどの１〜１００００又は１００〜１００００ＩＵトロンビン／ｍｌを含む。本発明で使用する場合、用語「ＩＵ」は「国際単位（International Units）」を示し、例えば、世界保健機関（ＷＨＯ）のトロンビンに関する第２国際規格０１／５８０に対して較正された、効力濃度測定のための内部参照標準に対して、凝固アッセイによって測定され得る。単位（Ｕ）は、国際単位（ＩＵ）と同等である。
【００８１】
市販の調整物では、トロンビンは、典型的には約４００〜１２００ＩＵ／ｍｌで使用される。
【００８２】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の液体トロンビン組成物は、１〜２５００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、１００〜２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、４００〜１２００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、８００〜１２００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、４００〜８００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、４００〜６００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、約１〜約２０μＭである。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、約５〜約１５μＭである。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、約５〜約１０μＭである。
【００８４】
上述したように、トロンビンは、自己触媒酵素であり、したがって液体形態では不安定である。トロンビン濃度又は温度が上昇すると共に、安定性が低下する。驚くべきことに、５０％超のグリセロールを含む本発明の液体トロンビン組成物は、本明細書に記載されるように非常に高温で安定であり、これは、冷蔵なしでの液体トロンビンの滅菌、熱によるウイルス不活性化、輸送、保存、及び取扱いを助ける。
【００８５】
本明細書で使用するとき、用語「安定性」又は「安定」は、特定の温度への曝露後のトロンビン酵素の活性に関する。一般に、液体トロンビン組成物は、トロンビンが少なくとも７０％活性である場合、特定の温度で特定の持続時間後に安定したものとして定義される。
【００８６】
したがって、いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で２４時間後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で２４時間後に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％活性である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、５０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で２４時間後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、６０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で２４時間後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、８０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で２４時間後に少なくとも７０％活性である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、５０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で２４時間後に少なくとも８０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも６０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で２４時間後に少なくとも８０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも８０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で２４時間後に少なくとも８０％活性である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、５０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で２４時間後に少なくとも９０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも６０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で２４時間後に少なくとも９０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも８０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約５０℃の温度で２４時間後に少なくとも９０％活性である。
【００９０】
ここで、様々なグリセロール濃度が、様々な温度でのトロンビン活性に及ぼす影響を示す図２Ａ〜Ｂを参照する。したがって、いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約２５℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約２５℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％活性である。
【００９１】
「少なくとも６ヶ月」とは、例えば、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、又はそれ以上（それらの間の任意の値及び範囲を含む）を指す。
【００９２】
「少なくとも５０％」とは、任意の値及びそれらの間の範囲を含む、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（それらの間の任意の値及び範囲を含む）を指す。
【００９３】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、５０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約２５℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、６０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約２５℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、８０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約２５℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも７０％活性である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、５０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約２５℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも８０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも６０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約２５℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも８０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも８０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約２５℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも８０％活性である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約０℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約０℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％活性である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、５０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約０℃の温度で少なくとも６ヶ月の少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、６０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約０℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、８０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約０℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも７０％活性である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、５０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約０℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも８０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも６０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約０℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも８０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも８０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約０℃の温度で少なくとも６ヶ月後に少なくとも８０％活性である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約１００℃の温度で２分後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約１００℃の温度で２分後に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％活性である。いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、５０％超のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約１００℃の温度で２分後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも６０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約１００℃の温度で２分後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも８０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約１００℃の温度で２分後に少なくとも７０％活性である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、少なくとも６０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約１００℃の温度で２分後に少なくとも８０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも８０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約１００℃の温度で２分後に少なくとも８０％活性である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、液体トロンビン組成物は、少なくとも６０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約１００℃の温度で２分後に少なくとも９０％活性である。いくつかの実施形態では、トロンビン組成物は、少なくとも８０％のグリセロールを含み、液体トロンビン組成物中のトロンビンは、約１００℃の温度で２分後に少なくとも９０％活性である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、開示される液体トロンビン組成物中のトロンビンは、室温（例えば、約２５℃）で２４ヶ月後に少なくとも７０％活性である。いくつかの実施形態では、開示される液体トロンビン組成物中のトロンビンは、室温で２４ヶ月後に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％活性である。いくつかの実施形態では、本発明の液体トロンビン組成物中のトロンビンは、２〜８℃の温度で２４ヶ月後に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％活性である。いくつかの実施形態では、開示される液体トロンビン組成物中のトロンビンは、２〜８℃の温度で２４ヶ月後に少なくとも７０％活性である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明の液体トロンビン組成物中のトロンビンは、−２０℃で２年後に少なくとも７０％活性である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明の液体トロンビン組成物中のトロンビンは、−２０℃で３年後に少なくとも７０％活性である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、止血キットは、液体トロンビン組成物を収容するシリンジと、ゼラチンを含有するシリンジと、を含む。いくつかの実施形態では、キット内の容器の少なくとも１つは、予め充填されたシリンジである。いくつかの実施形態では、キットの容器に加えてシリンジが提供される。いくつかの実施形態では、容器は、バイアル又はアプリケータなどの特定の種類である。
【０１０５】
上記のキットは、トロンビン成分と、塗布前に一緒に混合されるゼラチン成分と、を含んでもよい。例えば、成分は、例えば手術中に出血を低減する必要がある場合、外科医又は別の施術者によって混合される。キットの成分の混合は、止血組成物を形成する。
【０１０６】
したがって、追加の態様では、本発明は、止血組成物中の固形分の３０重量％超の範囲のトロンビン、ゼラチン、及びグリセロールを含む止血組成物を提供する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、止血組成物は、グリセロールを、固形の３１重量％超、３５重量％超、４０重量％超、４５重量％超、５０重量％超、５５重量％超、６０重量％超、６５重量％超、７０重量％超、７５重量％超、８０重量％超、８５重量％超、９０重量％超、９５重量％超、又は約１００重量％含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の止血組成物中の顕著な固形は、ゼラチンである。
【０１０９】
更なる態様では、本発明は、止血を補助する局所使用のための止血組成物を提供する。
【０１１０】
止血（又は血液停止）は、創傷治癒の第１段階である。止血は、出血を止めさせるプロセスである。「止血を補助する」とは、出血の低減又は停止を助けることを意味する。
【０１１１】
更なる態様では、本発明は、トロンビン及びゼラチンと、固形物の３０重量％超のグリセロールと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【０１１２】
例えば、医薬組成物用の賦形剤は、本明細書で上記に記載されており、塩化カルシウム、ヒトアルブミン、マンニトール、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、グルコン酸緩衝液、サッカロース、グリシン、酢酸ナトリウム、ヒスチジン、及びＰＥＧなどの任意の薬学的に好適な賦形剤を更に含んでもよい。
【０１１３】
治療用途のための調製は、滅菌でなければならない。特に、血液製品を取り扱うとき、滅菌性の問題は重要であり、具体的にはウイルス不活性化の問題である。一般に、ウイルス不活性化は、例えば、溶媒洗剤、熱不活性化、照射、及びナノ濾過、又はこれらの任意の組み合わせを含む任意の方法によって実行することができる。典型的には、ウイルス不活性化の基準は、２つの異なる方法の使用を要求している。また、滅菌性のための食品医薬品局（ＦＤＡ）基準は、濾過を要求する。
【０１１４】
しかしながら、液体トロンビンは、特に高温で不安定であるため、熱不活性化又は照射を使用する液体トロンビンの滅菌は、トロンビン活性に悪影響を及ぼすために非実用的である。一方、高濃度のグリセロールを含むためにより安定したトロンビンの調製物は、室温での濾過による滅菌には粘度が高すぎる。本発明の驚くべき発見は、グリセロールを含むトロンビン調製物が、高温で安定するだけでなく、グリセロールを含まない調製物よりも生体内での活性を向上させ、グリセロールの粘性が低い高温での濾過による滅菌を促進することである。これにより、グリセロールを含む滅菌及び安定した液体トロンビン組成物の大規模生産が可能になる。また、高温でのグリセロールを含む液体トロンビンの安定性も、熱処理によるウイルス不活性化を可能にする。
【０１１５】
本明細書で使用するとき、用語「滅菌」は、バイオバーデンが低く、効果的に細菌を含まないこと、例えば、細菌及びウイルスなどの微生物を含まないことを意味する。滅菌は、効果的に細菌を含まないレベルまでバイオバーデンを低減するプロセスである。滅菌液体は、一般に、滅菌濾過を受けた液体として定義される。したがって、いくつかの実施形態では、滅菌トロンビン溶液又は滅菌液体トロンビン組成物は、例えば、０．２２μｍ以下のフィルタを通過させることによって滅菌濾過で滅菌されたトロンビン溶液又は液体トロンビン組成物である。
【０１１６】
上述したように、安定した滅菌液体トロンビン組成物の大規模調製方法は存在しない。これは、一方ではトロンビン（特に高温で）の安定性の欠如、他方では必要な濾過工程を困難で時間がかかるものにする可能性があるグリセロールの高粘度に起因する。グリセロールを含む液体トロンビン配合物が、高温で安定するだけでなく、出血を低減する能力を向上させるという驚くべき発見は、グリセロールの粘度が低い高温での濾過を含む、滅菌液体トロンビン組成物の大規模調製方法への道を開くものである。
【０１１７】
用語「調製」は、治療用途に適し生理学的に許容可能なことを指す。
【０１１８】
いくつかの態様では、トロンビンと５０％ｖ／ｖ超のグリセロールとを含むシーラント配合物が提供される。
【０１１９】
本発明の状況において、用語「シーラント配合物」は、単一成分／一成分の接着剤／糊／止血剤として理解されるべきであり、当該配合物は、組織及び／又は血液と接触すると、例えば組織に近接すると反応し、その後凝塊を形成して組織接着剤として作用し、それによって、出血を防止、低減、又は停止し、組織を接合する、及び／又は例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、胆汁、胃腸（ＧＩ）内容物、肺からの漏気などの生理学的漏出を封止する成分を有する。いくつかの実施形態では、シーラント配合物は治療薬も含む結果、体内で形成された凝塊が自然に分解したときに治療薬が放出される。治療薬は、抗生物質、鎮痛剤、抗炎症薬、制癌薬などの薬物、例えば、ヒト又は他の起源由来の任意の種類の幹細胞、例えば胚幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などを含む細胞であってよいが、これらに限定されない。
【０１２０】
フィブリンシーラントは、Ｃａ、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）などの凝塊の形成を促す成分を含むことも可能であり、これらの成分は、別々の成分として提供されるか又は液体組成物と配合され得る。
【０１２１】
時に、シーラント配合物は「トロンビン系シーラント」と称され、本明細書に開示される状況では、フィブリン糊、フィブリンシーラント、フィブリン接着剤、フィブリン膜、フィブリン網状組織、フィブリン格子、フィブリンメッシュ、フィブリングリード、及びフィブリンゲルを形成する又は意味するものとして理解されるべきである。
【０１２２】
任意の態様の開示される配合物、例えば、液体シーラント配合物は、エアスプレーを用いるか又は用いずに、例えば滴らせることによってシーラントを組織又は他の基材又は作用面上に直接吐出するディスペンサーを使用して組織に塗布することができる。本発明の一実施形態では、シーラントは、１５ＰＳＩの空気圧で噴霧される。組織シーラントディスペンサーの例は、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６３１，０５５号、同第４，８４６，４０５号、同第５，１１６，３１５号、同第５，５８２，５９６号、同第５，６６５，０６７号、同第５，９８９，２１５号、同第６，４６１，３６１号、及び同第６，５８５，６９６号、同第６，６２０，１２５号、及び同第６，８０２，８２２号、並びに国際特許出願公開第ＷＯ９６／３９２１２号、同第ＷＯ２００７／０５９８０１号、及び同第２０１０／０９５１２８号に示されている。
【０１２３】
上記の液体トロンビン組成物及び滅菌液体トロンビン組成物の実施形態は、開示されるシーラント配合物の態様に組み込まれる。
【０１２４】
したがって、いくつかの実施形態では、シーラント配合物は、トロンビンと５０％ｖ／ｖ超のグリセロールとを含む。いくつかの実施形態では、シーラント配合物は、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。一部の実施形態では、シーラント配合物は、カルシウムを更に含む。いくつかの実施形態において、シーラント配合物は、約１〜約５０００ＩＵ／ｍｌ、約１〜約２０００ＩＵ／ｍｌ、又は約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む。
【０１２５】
したがって、更なる態様では、本発明は、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物の大規模生産方法を提供し、該方法は、
ａ．トロンビンをグリセロール溶液と混合することによってトロンビン溶液を調製し、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを有する溶液を得る工程と、
ｂ．得られたトロンビン溶液を少なくとも４０℃に加熱する工程と、
ｃ．０．２２μｍ以下の孔径を有する少なくとも１つのフィルタを通過させることによって、トロンビン溶液を滅菌する工程と、
を含むことにより、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む液体滅菌トロンビン溶液を得る。
【０１２６】
本明細書で使用するとき、用語「大規模」は、少なくとも１リットルの溶液が生成され、典型的には少なくとも約４００ＩＵのトロンビンを含むプロセスに関する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、溶液は、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃、又は約１００℃まで加熱される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、フィルタは疎水性フィルタであってもよい。
【０１２９】
一部の実施形態においては、２つ以上のフィルタが使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのフィルタが使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのフィルタが使用される。
【０１３０】
典型的には、濾過は滅菌濾過であり、これは、有効濾過面積１ｃｍ２当たり少なくとも１０７の生物で試験したときに微生物を通過させない濾過プロセスとして定義される。このようなフィルタは通常、０．２２μｍ以下の定格孔径を有する（２００４  ＦＤＡ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｓｅｐｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（無菌操作法で製造される無菌医薬品に関する２００４ＦＤＡガイダンス）を参照されたい）。
【０１３１】
トロンビン溶液及び／又はフィルタなどの濾過要素は、濾過プロセスの前及び／又は濾過プロセス中に温度制御さすることができる。温度制御は、制御された循環温度浴などの様々な手段によって実行することができる。
【０１３２】
より大きな容量（数キログラムの濾液など）へのアップスケールのために、膜フィルタカートリッジ（例えば、Ｐａｌｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標）のＳｕｐｏｒ  ＥＸ  Ｇｒａｄｅ  ＥＣＶ、５”部品番号ＡＢ０５ＵＥＣＶ２ＰＨ４、１０”ＡＢ１ＵＥＣＶ７ＰＨ４、２０”ＡＢ２ＵＥＣＶ２ＰＨ４、又は３０”ＡＢ３ＵＥＣＶ２ＰＨ４のサイズ）を使用することができる。例示的な実施形態では、以下の実施例３で言及されるＭｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）カプセル（表面積０．０２３ｍ２）が、濾液と、前述したようにフィルタカートリッジを使用することによってより大きなスケールで複製され得るフィルタ表面積との間の既知の比率を有するために使用される。
【０１３３】
高いグリセロール含有量を含む液体トロンビン配合物は、高圧下でより安定することも理解される。この特徴は、通常、トロンビンの活性の喪失を引き起こすシステム内のランダムな圧力上昇時、又は処理時間を短縮するために圧力を上昇させる必要があるときに役立ち得る。
【０１３４】
濾過される溶液を含む容器は、エネルギー源に接続されて、液体をフィルタに通過させることができる。エネルギー源は、圧縮空気であってもよい。容器は、エネルギー出力を監視及び／又は制御する１つ以上の要素を介してエネルギー源に接続されてもよい。このような要素は、圧力弁及び圧力計であってもよい。トロンビン溶液に加えられ得る可能なエネルギーの量は制限することができる。制限は、トロンビン溶液への最大１バールの圧力であってもよい。
【０１３５】
したがって、いくつかの実施形態では、濾過は、約１バールの圧力下で実行される。いくつかの実施形態では、濾過は、１バール超の圧力下で実行される。いくつかの実施形態では、濾過は、１．５バール超、２バール超、２．５バール超、３バール超、３．５バール超、４バール超、４．５バール超、又は５バール超の圧力下で実行される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、濾過速度は、１ｋｇ溶液当たり１時間未満である。いくつかの実施形態では、濾過速度は、１ｋｇ溶液当たり３０分未満である。いくつかの実施形態では、濾過速度は、１ｋｇ溶液当たり約２０〜約３０分である。
【０１３７】
ウイルス安全性は、ヒト由来の産物のリスクに由来する場合、重要な問題である。ウイルスは、ヒト由来の産物のプロセスにおいてそのまま残るため、これらの産物は、ウイルス不活性化工程を経て安全性を保証しなければならない。従来、２つのウイルス不活性化方法が、ウイルスの潜在的負荷の効果的な低減を確保するために、個々に使用される。使用されるウイルス不活性化方法のいくつかの例を、以下に記載する。
【０１３８】
ナノ濾過によるウイルス不活性化−この方法は、エンベロープ及び非エンベロープウイルスの両方をフィルタ除去するためにサイズ排除を利用することができる。使用されるフィルタは、典型的には、Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ  ３５Ｎ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ７０、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  １８０など、７０ｎｍ未満の孔径を有する。
【０１３９】
溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）によるウイルス不活性化−この方法は、洗剤及び／又は溶媒を利用して、エンベロープ又は脂質被覆ウイルス中に見出される脂質を除去することができる。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又はポリソルベート８０、トリ（ｎ−ブチル）リン酸塩（ＴｎＢＰ）、ジ−又はトリアルキルホスフェートなどの、使用される洗剤及び／又は溶媒は、エンベロープ又は脂質被覆ウイルスを不活性化する。従来、１０〜１００ｍｇ／ｍｌの溶媒洗剤が、ｐＨレベル５〜８、３０分〜２４時間、２〜３７℃の温度範囲で使用される。製品をＳ／Ｄで処理した後、Ｓ／Ｄは通常、製品から除去される。使用される洗剤及び溶媒の組み合わせ及び濃度は、当該技術分野において既知である。例えば、０．１％未満のＴｎＢＰ及び０．１％未満のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の組み合わせを使用することができる。別の例では、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．３％ＴｎＢＰの組み合わせを使用してもよい。
【０１４０】
加熱活性化によるウイルス不活性化−加熱殺菌としても知られる熱不活性化は、エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスを含むいくつかの種類の病原体を害し得る高温を利用する。加熱殺菌は、通常、温度レベルと曝露時間をトレードするいくつかの技術によって達成され得る。例えば、温度は、１０時間にわたって６０℃であってもよい。別の実施例では、高熱短時間技術、例えば、１００℃で２秒未満の持続時間が採用される。
【０１４１】
しかしながら、少なくとも熱によるウイルス不活性化に関しては、そのような選択肢は、安定性の欠如が理由で、液体トロンビンに対して利用可能ではなかった。にもかかわらず、本開示に記載の発見を考慮に入れて、高含有量のグリセロールを含む開示された液体トロンビン組成物は、熱不活性化を経ることができる。
【０１４２】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明によるグリセロールを５０％ｖ／ｖ超含む滅菌液体トロンビン組成物の大規模生産方法は、熱不活性化によるウイルス不活性化の工程を更に含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、熱不活性化は、約６０〜１００℃で実行することができる。いくつかの実施形態では、熱不活性化は、約６０℃で約１０時間実行することができる。いくつかの実施形態では、熱不活性化は、約１００℃で２秒未満実行することができる。
【０１４４】
更なる態様では、本発明は、上記の方法によって得られる５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物を提供する。
【０１４５】
更に別の態様では、本発明は、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物を提供する。
【０１４６】
本発明の液体トロンビン組成物は、出血を低減又は停止するために単独で使用することができる。液体トロンビン組成物は、凍結トロンビン又は粉末トロンビンに代えて、又は他の止血剤に加えて、キットの一部として使用されてもよい。
【０１４７】
本発明の別の態様では、必要とする対象の創傷上及び／又は内に任意の態様及び実施形態の液体組成物を塗布する（例えば、接触させる）工程を含む、創傷を治療する方法が提供される。
【０１４８】
「創傷を治療する」とは、例えば、手術を受ける患者における、組織の出血部位での出血の低減を含むことを更に意味する。
【０１４９】
したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、手術を受ける患者において、組織の出血部位での出血を低減するためのものであり、実施形態の開示された組成物又は配合物を、出血部位と接触させることを含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、組織の出血部位における出血を低減するために使用される組成物又は配合物は、トロンビンと、少なくとも５０％のグリセロール、例えば、約６０％〜約１００％、又は約８０％〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、組成物又は配合物は、例えば、補助量でゼラチン及び／又は水を更に含む。
【０１５１】
本明細書で使用するとき、用語「対象」は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、又は任意の他の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の動物を意味するものとする。いくつかの実施形態では、対象はヒト、例えば、ヒトの患者である。対象は、男性であっても又は女性であってもよい。
【０１５２】
少なくとも、％グリセロール、カルシウム及び賦形剤、トロンビン源及び濃度、並びに上述のトロンビン安定性に関する実施形態が、本出願の全ての態様に含まれることが意図される。
【０１５３】
本明細書で使用するとき、用語「約」は、示された値の１０％上又は下の値も含まれることを意味する。一般に、本出願における全ての値は、用語「約」を含むことを意図する。
【０１５４】
用語「〜を含む（comprises）」、「〜を含んだ（comprising）」、「〜を有する（has）」、「〜を有した（having）」、「〜を含有する（contain）」、「〜を含有した（containing）」及びそれらの同根語は、「〜を含むが、それらに限定されない（including but not limited to）」ことを意味する。用語「〜からなる（consisting of）」は、「包含し、限定される（including and limited to）」ことを意味する。用語「〜から本質的になる（consisting essentially of）」とは、組成物、方法又は構成が、追加の成分、工程及び／又は部分を含み得ることを意味するが、追加の成分、工程及び／又は部分が、特許請求される組成物、方法又は構成の基本的かつ新規の特性を実質的に変えない場合に限る。
【０１５５】
単語「代表的な」とは、本明細書では、「実例、事例又は例証としての役割を果たす」ことを意味する。「代表的な」として記載される任意の実施形態は、その他の実施形態よりも好ましい又は有利であると必ずしも解釈される必要はない、及び／又はその他の実施形態からの特徴の組み込みを必ずしも排除する必要はない。
【０１５６】
本明細書では、単語「任意選択で（optionally）」は、いくつかの実施形態では提供され、その他の実施形態では提供されないことを意味する。本発明の任意の特定の実施形態は、このような特徴が矛盾しない限り、複数の「任意の」特徴を含んでもよい。
【０１５７】
本発明で使用する場合、その内容に別段の明確な指示がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示物を含むものとする。例えば、用語「化合物（compound）」又は「少なくとも１つの化合物（at least one compound）」は、これらの混合物を含む複数の化合物を含んでよい。
【０１５８】
本出願全体を通して、本発明の種々の実施形態が範囲形式にて提示されてもよい。範囲形式の説明は単に便宜上及び簡潔さのためのものであり、本発明の範囲上の確固とした制限として解釈されるべきではない、と理解すべきである。したがって、範囲の説明は、全ての可能な部分範囲、並びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示される部分範囲、並びにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６を有すると見なされるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。
【０１５９】
数値範囲が本明細書に示される場合はいつでも、示された範囲内の任意の引用された数字（分数又は整数）を含むことを意味する。用語、第１の表示番号と第２の表示番号との「間の範囲（ranging）／範囲（ranges）」、及び第１の表示番号「から」第２の表示番号「までの範囲（ranging）／範囲（ranges）」が本明細書で互換的に使用されるが、これは、第１及び第２の表示番号並びにこれらの間の全ての分数及び整数を含むことを意味する。
【０１６０】
本発明で使用する場合、用語「方法」とは、所与のタスクを達成するための方法、手段、技術及び手順を意味し、化学的、薬理学的、生物学的、生化学的及び医学的分野の施術者による周知の方法、手段、技術及び手順として知られるか、又は容易に開発されるか、のいずれかの方法、手段、技術及び手順のようなものを含むが、これらに限定されない。
【０１６１】
本明細書で使用するとき、医療の文脈での用語「治療する」は、病状の進行を抑制すること、実質的に阻害すること、緩徐化すること、若しくは逆行させること、状態の臨床症状若しくは審美的症状を実質的に改善すること、又は状態の臨床症状若しくは審美的症状の外観を実質的に予防することを含む。
【０１６２】
本明細書で使用するとき、用語「出血」は、循環系の任意の構成要素からの血液の滲出を指す。よって、「出血」は、望ましくない、制御されない、多くの場合、手術、外傷、又は他の形態の組織損傷に関連する過剰な出血、並びに出血性障害を有する患者における望ましくない出血を包含する。
【０１６３】
本明細書で使用するとき、用語「制御する」、「防止する」、又は「低減する」は、本明細書では、その語形変化を含め、出血の状況において互換的に使用されてもよく、出血速度がほぼゼロになる、又は開示される組成物が出血部位内／上に接触していない状況と比較して、出血の初期速度の１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は更には１００％低下することを示す。出血の出現レベルを判定するための方法は、当該技術分野において既知である。
【０１６４】
更に、いくつかの実施形態では、出血の文脈において、用語「制御する」、「防止する」、又は「低減する」は、出血部位、例えば軟組織において血管を少なくとも部分的に封止することを意味する。
【０１６５】
「Ａ、Ｂ、及びＣなどのうちの少なくとも１つ」に類する表記が用いられる場合、一般に、このような構文は、当業者がその表記を理解するであろう意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、限定するものではないが、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方及び／又はＡとＢとＣの全てなどを有するシステムを含む）。更に、実質上、２つ若しくはそれ以上の選択的な用語を表すあらゆる選言的な語及び／又は句は、明細書内であろうと、請求の範囲内であろうと、あるいは図面内であろうと、それら用語のうちの１つ、それらの用語のうちのいずれか、又はそれらの用語の両方を含む可能性を意図すると理解されるべきであることが、当業者には理解されよう。例えば、語句「Ａ又はＢ」は、「Ａ」若しくは「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むものと理解されよう。
【０１６６】
本発明の特定の特徴は、明確性のために別個の実施形態の文脈において記載されているが、これはまた、単一の実施形態において組み合わせて提示されてもよいことが理解されている。逆に、本発明の様々な特徴は、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈において記載されているが、これはまた、別個に、若しくは任意の好適な部分的組み合わせで、又は本発明の任意のその他の記載される実施形態において好適にもたらされてもよい。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしには動作不可能である場合を除き、それらの実施形態の必須特徴であるとして考慮されるべきではない。
【０１６７】
本明細書の上記で詳述され、以下の特許請求の範囲において特許請求されるような、本発明の種々の実施形態及び態様は、以下の実施例における実験的な支持を見出す。
【実施例】
【０１６８】
以下の実施例を参照すると、上記の説明と併せて、非限定的な方法で本発明のいくつかの実施形態が例示されている。
【０１６９】
材料及び方法
様々なグリセロール濃度の調製：グリセロール濃度毎に、ある量のＤＤＷを５ｍＬシリンジ（Ｙｏｅｌ  Ｎａｉｍ  ５ｍｌシリンジロット：２０１３０８１５）に引き込み、バイアルに添加した。ある量のグリセロールの体積（Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ  ５００ｍＬ無水グリセロールバッチ：００００１３６６９７）を５ｍＬシリンジに引き込み、同じバイアルに添加した。次いで、ＤＤＷ及び／又はグリセロールを収容する各バイアルを、周囲温度で３０秒間、ボルテックス（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｖｏｒｔｅｘ−ｇｅｎｉｅ  ２モデルＧ５６０Ｅ．速度セット５）を用いて混合した。
【０１７０】
トロンビン再構成：グリセロール濃度毎に、異なるグリセロール濃度の２ｍＬの液体を、５ｍＬシリンジに引き込んだ。２ｍＬの液体を、約２０００ＩＵを収容する凍結乾燥トロンビンバイアルに注入し、周囲温度で再構成するためにローラ（Ｓｔｕａｒｔ、ローラミキサーモデルＳＲＴ６）上に２４〜７２時間（ｈ）置いた。
【０１７１】
簡潔に述べると、トロンビン標準曲線を、４〜１０国際単位（ＩＵ）／ｍｌで作成した。次いで、４０ｍｌのトロンビン又は希釈サンプルを、試験キュベット内の１６０ｍＬの０．１％フィブリノゲン溶液に添加した。凝固までの時間を自動凝固機（Ｓｔａｔ４、Ｓｔａｇｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）で分析した。該凝固機は、キュベット内で小さな金属ボールを移動させる振動電磁界を生成する。凝固は、ボール移動の停止が検出されたときに生じたと判定される。試験サンプル中のトロンビン濃度は、標準曲線に対して凝固時間から外挿される。
【０１７２】
実施例１：液体トロンビンの安定性
５０℃での２４時間安定性：いくつかのグリセロール濃度を、様々なグリセロール濃度のトロンビン溶液の調製を示す以下の表１に従って上述したように調製した。
【０１７３】
【表１】
2021534171.tif 000003
【０１７４】
トロンビンを上記のように再構成し、３００μｌのサンプルを、１ｍＬシリンジ（Ｔｅｒｕｍｏ  １ｍｌシリンジロット：１００１０１５）を使用してエッペンドルフチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、１．５マイクロチューブ７２．６９０．００１）中に採取し、時点０（０時間）として、以降の分析のために凍結した（−２０℃）。再構成されたトロンビンの残りを収容するバイアルを、指定時間（例えば、２４時間）及び指定温度（例えば、５０℃）で必要に応じてオーブン（ｖｅｎｔｉｃｅｌｌ  ２２２、ＳＮ：Ｂ０２０２５１）に入れた。１、４．５、８、及び２４時間後の各時点で、３００μｌのサンプルを、１ｍＬシリンジを用いてエッペンドルフチューブ内に採取し、各時点での以降の分析のために凍結させた。試験サンプル中のトロンビン活性を、上述の標準曲線に基づいて評価した。
【０１７５】
５０℃での２４時間安定性試験における、異なるグリセロール濃度に対するトロンビン活性の４回反復の平均結果を図１に示す。図１に示されるように、トロンビンの活性は、５０％、６０％、及び８０％のグリセロール濃度で、５０℃で２５時間完全に維持された。
【０１７６】
長期安定性：様々なグリセロール濃度が、様々な温度（℃）でのトロンビン活性に及ぼす影響が、更に試験された。トロンビンを、ＤＤＷ中のいくつかの異なる濃度のグリセロール中に懸濁させ、２５℃で６ヶ月間及び４℃で１２ヶ月間配置した。図２Ａは、２５℃で３ヶ月及び６ヶ月後に測定された活性を示す。図２Ｂは、４℃で１２ヶ月後に測定された活性を示す。結果では、指定時間のそれぞれで、約９０％〜約１００％の活性が維持されたため、試験されたグリセロールサンプルの長期安定性が実証された。
【０１７７】
実施例２：１００℃での液体トロンビン２分間安定性
上記の表１に従って上述したようにいくつかのグリセロール濃度（５０％、６０％、及び８０％）を調製した。
【０１７８】
トロンビンを上記のように再構成し、３００μｌのサンプルを、１ｍＬシリンジ（Ｔｅｒｕｍｏ  １ｍＬシリンジロット：１００１０１５）を使用してエッペンドルフチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、１．５マイクロチューブ７２．６９０．００１）中に、時点０（０分）として、以降の分析のために採取した。再構成されたトロンビンの残りを収容するバイアルを、１００℃で２分間に設定したオーブン（Ｖｅｎｔｉｃｅｌｌ  ２２２、ＳＮ：Ｂ０２０２５１）に入れた。２分後、各濃度から３００μｌのサンプルを、１ｍＬシリンジを用いてエッペンドルフチューブ内に採取した。試験サンプル中のトロンビン活性が、上記の標準曲線に基づいて評価され、時点０での０％グリセロールの結果によって正規化された。
【０１７９】
１００℃での２分間安定性試験における、異なるグリセロール濃度に対するトロンビン活性の２回反復の平均結果を図３に示す。図３から分かるように、１００℃での２分間後、７５％未満のトロンビン活性が５０％のグリセロールで維持される一方、９０％のトロンビン活性が６０％及び８０％のグリセロールの溶液中で維持された。
【０１８０】
実施例３：様々な温度での無水グリセロールの濾過速度
濾過を使用して滅菌液体を製造するために、液体は、０．２２μＭ以下の孔径を有するフィルタを通過しなければならない（２００４  ＦＤＡ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｓｅｐｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（無菌操作法で製造される無菌医薬品に関する２００４ＦＤＡガイダンス））。しかしながら、グリセロールなどの粘性液体は、このようなフィルタを通過することが困難であり、その結果、処置が非常に長くなり、最善でも効果的でないことが分かっている。したがって、本発明者らは、濾過温度の上昇が、グリセロールの粘性を低下させ、濾過をより効果的にすることができるか否かを試験した。しかしながら、これは、トロンビン活性がプロセスに影響を受けない場合にのみ実行することができる。上記の実施例１に示すように、本発明者らは、５０％超のグリセロール中のトロンビンが５０℃で２４時間後も安定していることを確定した。また、実施例２に示すように、本発明者らは、５０％超のグリセロールの溶液中のトロンビンが１００℃で２分間後も安定していることを確定した。したがって、濾過プロセスには高温を使用することもできる。この実施例では、本発明者らは、グリセロールの濾過速度に対する温度の影響を調べた。
【０１８１】
例示的な手順では、グリセロール（Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ無水グリセロールバッチ：００００１３６６９７）を、圧力容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍモデル１７５３０）に入れ、プロセス中に０．９〜１ｂａｒの圧力を維持するためにシリコーンチューブと圧力計（最大１バール）に接続された圧縮空気（ＣＡ）システムとを使用して、０．２μＭ  Ｍｉｎｉ  Ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）カプセルフィルタ（ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標）ＲＥＦ  ＫＡ０２ＥＣＶ２ＦＴ、ロットＩＢ２６１６）を介して濾過した。グリセロールを入れた圧力容器とフィルタは、制御された循環温度浴内で濾過プロセスの前及び間に４５分間インキュベートした。濾過速度に対する温度の影響を評価するために、制御された循環温度浴を、試験毎に３つの異なる温度のうちの１つに設定した。試験温度は、２５℃、４０℃、及び５０℃とした。
【０１８２】
濾過速度は、経時的に濾液を秤量することによって測定した。濾過速度に対する濾過温度の影響を以下の表２に示す。
【０１８３】
【表２】
2021534171.tif 000004
【０１８４】
表２から分かるように、２５℃でのグリセロールの濾過流速は、比較的低く、すなわち０．５ｋｇ／時間未満であり、有効ではない。しかしながら、４０℃及び５０℃でのグリセロールの濾過流速は、室温でのプロセスと比較して、それぞれ約２．５倍及び約５倍速く、高温で実施された場合にプロセスをはるかに有効にする。したがって、大規模調製に必要とされる約１ｋｇのグリセロールの濾過は、２５℃で約２．５時間と比較して、５０℃では３０分で達成され得る。
【０１８５】
実施例４：安定した滅菌液体トロンビン溶液の大規模調製
高温でのトロンビンの安定性を示す実施例１及び２と、高温でのグリセロールの速い濾過速度を示す実施例３とを組み合わせた発見に基づくと、５０％超のグリセロールを含む液体トロンビン溶液は、溶液温度を上昇させ、０．２２μＭ以下の孔径を有するフィルタを通過させることによって滅菌濾過することができるであろう。
【０１８６】
例示的な手順では、トロンビンをグリセロール（Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ無水グリセロール）及びＤＤＷと混合して、８０％グリセロールｖ／ｖ中に１０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む最終量２リットルのトロンビン溶液を得る。トロンビン溶液を、０．２μＭ  Ｍｉｎｉ  Ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）カプセルフィルタ（ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標）ＲＥＦ  ＫＡ０２ＥＣＶ２ＦＴ、ロットＩＢ２６１６）及び圧縮空気（ＣＡ）システムに圧力計及び圧力弁を介して接続されるＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍモデル１７５３０内に配置する。トロンビン溶液を収容する圧力容器と濾過要素とを、５０℃に設定された制御された循環温度浴内に配置する。トロンビン溶液及び濾過要素が５０℃に達した後、圧力弁及び圧力計によって圧縮された空気流を制御することによって圧力を０．９〜１バールに調整する。１時間当たり０．５ｋｇ超の流速が予想される結果、２時間未満で１ｋｇの濾過滅菌トロンビン溶液が得られる。実際に、実施例３の実験に基づいて、１時間当たり約２ｋｇの流速が予想される結果、３０分未満で１ｋｇの濾過滅菌トロンビン溶液が得られる。温度を更に上昇させると、濾過速度は更に速くなると予想されることが理解される。
【０１８７】
実施例５：生体内試験におけるゼラチンと組み合わせた液体トロンビン
表１に示されるものと同様に、表３に従って上述したようにいくつかのグリセロール濃度を調製した。
【０１８８】
【表３】
2021534171.tif 000005
【０１８９】
各グリセロール濃度について、（キットに従って水で再構成されたトロンビンの代わりに）２ｍＬの様々なグリセロール濃度で再構成された１６００〜２４００ＩＵのトロンビンを使用して、（Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（登録商標）キットから）８ｍＬのゼラチンペーストを調製した。試験した全ての止血組成物は、トロンビン、ゼラチン、及びグリセロールからなり、グリセロールは、固形分の３０重量％超の濃度であった。
【０１９０】
各調製されたシリンジを、トロンビン再構成に使用されるグリセロール濃度で標識付けした。トロンビン活性は、以下に記載する生体内ブタパンチ生検モデルを使用して試験した。
【０１９１】
使用される動物処置は、以下の変更を伴って、ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０：２７３〜２７９に報告される処置に類似する。
−４ｍｍに設定された止め部を備えた使い捨て８ｍｍ生検パンチを使用した。
−試験物品塗布後にタンポナーデを１０秒間適用し、流動性血液の存在を２分間監視した。
−流動性血液をなくすのに必要なタンポナーデの数を記録した。
【０１９２】
簡潔に述べると、腹側正中腹部切開を実施し、正中切開の頭蓋部分を延長して肝臓の曝露を改善した。試験表面の利用能を最大化するために、必要に応じて肝臓を位置付けた。処置全体を通じて、生理食塩水及び生理食塩水に浸した腹腔切開スポンジで腹部臓器を湿らせた。深さ止め部が４ｍｍに設定された使い捨ての８ｍｍ生検パンチを使用して、左、右及び方形葉のアクセス可能領域の横隔膜表面上に、肝実質欠損を生じさせた。生検のコア部分を掴んで、下にある表面に軽度から中程度の出血を生じさせることなく、鋭く切開した。
【０１９３】
得られた出血の特性評価を可能にするために、製品適用に先立って欠損部位を数秒間出血させた。各欠損部位での出血は、創傷形成時及び治療前に０〜５の範囲で分類した。欠損は、除外される場合に１以下に分類され、それらの上で試験を実施しなかった。試験部位をガーゼで拭き取り、次に試験物品の１つを適用した。本研究の目的のために、有効な止血は、易流動性出血の停止として定義された。出現していたが成長しなかった少量出血又は点状出血は、易流動性出血であるとは考えられなかった。試験物品を、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（登録商標）アプリケータによって欠損（出血部位）上に投与した。最初のタンポナーデは、ガーゼ上のデジタル圧力を使用して約１０秒間行った。最初の１０秒間のタンポナーデに続いて、被覆剤を除去した。止血が１２０秒後に達成されなかった場合、タンポナーデを再実行して更に１０秒間維持し、その後、別の観察期間を設けた。このプロセスを、有効な止血が達成されるまで繰り返し、必要なタンポナーデの数を記録した。
【０１９４】
ブタパンチ生検生体内モデルにおいて、ゼラチンと組み合わせたグリセロールで再構成されたトロンビンの有効性結果の５回反復の平均を図４に示す。
【０１９５】
図４から分かるように、トロンビン溶液中のグリセロール％は、結果に直接影響を与え、５０％グリセロールは平均約２．８のタンポナーデ反復となり、６０％グリセロールは平均約１．８のタンポナーデ反復となり、１００％グリセロールは平均１．５未満のタンポナーデ反復となる。
【０１９６】
比較のために、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）（吸収性止血粉末）は、類似モデルでは、ＡＲ（Ａｒｉｓｔａ（商標）ＡＨ吸収性止血粒子）及びＰＣ（ＰｅｒＣｌｏｔ（登録商標）多糖類止血系）よりも優れていることが報告されている（上述のＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７）。このモデルでは、Ａｒｉｓｔａ（商標）及びＰｅｒＣｌｏｔ（登録商標）の両方が、４．７５分間以上の止血時間を有した。各タンポナーデ後の各観察時間は最大２分であるため、Ａｒｉｓｔａ及びＰｅｒＣｌｏｔ（登録商標）の結果は、２．３タンポナーデ以上と同等である。
【０１９７】
したがって、この研究の結果は、グリセロールを含まない水中で再構成されたトロンビンの既存の製品と比較して、６０％超のグリセロール中で再構成されたトロンビンの有効性の向上を実証している。
【０１９８】
本発明は、その特定の実施形態と共に記載されてきたが、多くの代替、変更及び変形形態が当業者には明白となることは明らかである。したがって、これは、添付の特許請求の趣旨及び広義の範囲内にある、このような代替、変更及び変形形態の全てを包含することを目的としている。
【０１９９】
〔実施の態様〕
（１）  止血キットであって、
ａ．５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む液体トロンビン組成物を収容する容器と、
ｂ．ゼラチンを収容する容器と、
を備える、止血キット。
（２）  前記液体トロンビン組成物が、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール、任意選択で約８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む、実施態様１に記載の止血キット。
（３）  前記キットが、カルシウムを更に含む、実施態様１又は２に記載の止血キット。
（４）  前記液体トロンビン組成物が、塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む、実施態様１〜３のいずれかに記載の止血キット。
（５）  前記液体トロンビン組成物が、約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、実施態様１〜４のいずれかに記載の止血キット。
【０２００】
（６）  前記液体トロンビン組成物中の前記トロンビンが、約５０℃の温度で約２０時間後に少なくとも７０％活性である、実施態様１〜５のいずれかに記載の止血キット。
（７）  前記液体トロンビン組成物中の前記トロンビンが、約１００℃の温度で約２分後に少なくとも７０％活性である、実施態様１〜６のいずれかに記載の止血キット。
（８）  トロンビン、ゼラチン、及びグリセロールを、固形分の３０重量％超の濃度範囲で含む、止血組成物。
（９）  カルシウムを更に含む、実施態様８に記載の止血組成物。
（１０）  塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む、実施態様８又は９に記載の止血組成物。
【０２０１】
（１１）  約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、実施態様８〜１０のいずれかに記載の止血組成物。
（１２）  止血を補助する局所使用のための、実施態様８〜１１のいずれかに記載の止血組成物。
（１３）  ５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物の大規模生産方法であって、
ａ．トロンビンをグリセロール溶液と混合することによってトロンビン溶液を調製し、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを有する溶液を得る工程と、
ｂ．得られた前記トロンビン溶液を少なくとも約４０℃に加熱する工程と、
ｃ．約０．２２μｍ以下の孔径を有する少なくとも１つのフィルタを通過させることによって、前記トロンビン溶液を滅菌する工程と、
を含むことにより、５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物を得る、方法。
（１４）  熱不活性化により実行されるウイルス不活性化の工程を更に含む、実施態様１３に記載の方法。
（１５）  前記トロンビン溶液が、約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール、任意選択で約８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む、実施態様１３又は１４に記載の方法。
【０２０２】
（１６）  前記トロンビン溶液が、カルシウムを更に含む、実施態様１３〜１５のいずれかに記載の方法。
（１７）  前記トロンビン溶液が、塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む、実施態様１３〜１６のいずれかに記載の方法。
（１８）  前記トロンビン溶液が、約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、実施態様１３〜１７のいずれかに記載の方法。
（１９）  前記液体トロンビン組成物中の前記トロンビンが、約５０℃の温度で約２０時間後に少なくとも７０％活性である、実施態様１３〜１８のいずれかに記載の方法。
（２０）  前記液体トロンビン組成物中の前記トロンビンが、約１００℃の温度で約２分後に少なくとも７０％活性である、実施態様１３〜１９のいずれかに記載の方法。
【０２０３】
（２１）  実施態様１３〜２０のいずれかに記載の方法によって得られた５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物。
（２２）  ５０％ｖ／ｖ超のグリセロールを含む滅菌液体トロンビン組成物。
（２３）  約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール、任意選択で約８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む、実施態様２２に記載の滅菌液体トロンビン組成物。
（２４）  カルシウムを更に含む、実施態様２２又は２３に記載の滅菌液体トロンビン組成物。
（２５）  塩化ナトリウム、マンニトール、アルブミン、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む、実施態様２２〜２４のいずれかに記載の滅菌液体トロンビン組成物。
【０２０４】
（２６）  約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、実施態様２２〜２５のいずれかに記載の滅菌液体トロンビン組成物。
（２７）  前記トロンビンが、約５０℃の温度で約２０時間後に少なくとも７０％活性である、実施態様２２〜２６のいずれかに記載の滅菌液体トロンビン組成物。
（２８）  前記トロンビンが、約１００℃の温度で約２分後に少なくとも７０％活性である、実施態様２２〜２７のいずれかに記載の滅菌液体トロンビン組成物。
（２９）  ゼラチンを更に含む、実施態様２２〜２８のいずれかに記載の滅菌液体トロンビン組成物。
（３０）  トロンビンと５０％ｖ／ｖ超のグリセロールとを含むシーラント配合物。
【０２０５】
（３１）  約６０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロール、任意選択で約８０〜約１００％ｖ／ｖのグリセロールを含む、実施態様３０に記載のシーラント配合物。
（３２）  カルシウムを更に含む、実施態様３０又は３１に記載のシーラント配合物。
（３３）  約１００〜約２０００ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含む、実施態様３０〜３２のいずれかに記載のシーラント配合物。
（３４）  フィブリノゲン成分を含む、実施態様３０〜３３のいずれかに記載のシーラント配合物。
【図１】
2021534171.tif 000006
【図２Ａ】
2021534171.tif 000007
【図２Ｂ】
2021534171.tif 000008
【図３】
2021534171.tif 000009
【図４】
2021534171.tif 000010
【国際調査報告】
2021534171.tif 000011
2021534171.tif 000012
2021534171.tif 000013