(57)【要約】本発明は、多能性幹細胞または多能性幹細胞誘導体から非免疫原性(バイオ)の操作された組織を製造する方法を提供するものであって、ここで、それぞれの細胞は、MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、本方法は、操作された組織の形成も可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である細胞型への多能性幹細胞の分化を誘導し、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程を含む。本発明はさらに、操作された組織、操作された組織を含む薬学的組成物、操作された組織を使用する医学的処置、および操作された組織の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法であって、該多能性幹細胞が、該多能性幹細胞の細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、
該方法が、
操作された組織の形成を可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの細胞型の存在下で操作された組織を形成し、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程であって、該少なくとも1つの細胞型が、該少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化によって得られたものである、工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記操作された組織が、
(a)エフェクターT細胞によって同種異系と認識されない、かつ／または
(b)NK媒介性溶解に耐性である、
請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記操作された組織が抗HLA抗体に結合しない、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記免疫調節タンパク質が一本鎖融合HLAクラスIタンパク質である、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-FおよびHLA-Gからなる群より選択されるHLAクラスIα鎖の少なくとも一部分へ共有結合されたB2Mの少なくとも一部分を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Aの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項７】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-A0201の少なくとも一部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Eの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項９】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Gの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項１０】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Bの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項１１】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Cの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項１２】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Fの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項１３】
前記多能性幹細胞が、該多能性細胞表面上の一本鎖融合HLAクラスIタンパク質によって提示される標的ペプチド抗原をさらに発現する、請求項4〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記標的ペプチド抗原が、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質へ共有結合されている、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記標的ペプチド抗原が配列VMAPRTLFL (SEQ ID NO: 1)を含む、請求項13または14記載の方法。
【請求項１６】
β-ミクログロブリン2遺伝子の本質的に全てのコピーが多能性幹細胞において破壊されている、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
組織の部分を形成する少なくとも1つの第2の細胞型の存在下で、操作された組織を形成する工程を含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記操作された組織の部分を形成する第2の細胞型が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記操作された組織が、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織、脳組織、膵臓組織、肺組織、骨格筋組織、胃腸組織、神経組織、皮膚組織、骨組織、骨髄、脂肪組織、結合組織、網膜組織および血管組織からなる群より選択される、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記操作された組織が心臓組織であり、前記方法が、
(i)多能性幹細胞を、有効量の、
(a) BMP4、アクチビンA、FGF2、GSK3阻害剤、および
(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)の最終濃度を生じる無血清サプリメント
を含む基本培地中で培養し、それによって、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程；
(ii)工程(i)において得られた細胞を、有効量のWntシグナル伝達経路の阻害剤および(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、細胞の心臓分化を誘導する工程；ならびに
(iii)工程(ii)において得られた細胞を、機械的刺激下で、有効量の(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、心臓成熟を促進する工程
を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記組織の形成が、ヒドロゲル、好ましくは細胞外マトリックスタンパク質含有ヒドロゲル、例えばフィブリンヒドロゲルまたはコラーゲンヒドロゲル、最も好ましくはコラーゲンヒドロゲルの存在下で行われる、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
(iv)1つまたは複数の型の中に無血清再構成混合物を提供する工程であって、該再構成混合物が、
(a)無血清最小必須培地；
(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)および0.2〜2 mg/mlコラーゲンの最終濃度を生じる無血清サプリメント；ならびに
(c)工程(iii)において得られた細胞、および操作された組織の部分を形成する細胞型、好ましくはヒト非筋細胞
を含み、任意で該操作された組織の部分を形成する細胞が多能性幹細胞に由来するものであり、総細胞混合物の20〜80%が工程(iii)において得られた細胞であり；
該再構成混合物が7.2〜7.6のpHを有する、工程；
(v)該1つまたは複数の型の中で無血清再構成混合物を培養し、それによって、無血清再構成混合物を少なくとも15分間圧縮させる工程；
(vi)該1つまたは複数の型の中の工程(v)において得られた混合物がその元の厚さの少なくとも50%へ圧縮するまで、無血清EHM培養培地中で該混合物を培養する工程であって、ここで、該EHM培養培地が、(a)0.5〜3 mmol/L Ca2+を含む基本培地；(b)(i)(b)に定義されるような無血清サプリメント；(c) 0.5〜10 mmol/L L-グルタミン；(d) 0.01〜1.0 mmol/Lアスコルビン酸；(e) 1〜100 ng/ml IGF-1；および(f) 1〜10 ng/ml TGFβ1を含む、工程；
(vii)工程(iii)において得られた混合物を、工程(iii) (a)〜(f)に定義されるような無血清EHM培養培地中で、機械的伸張下で培養し、それによって、力を発生する（force-generating）操作された心臓組織を形成する工程
をさらに含む、請求項20または21記載の方法。
【請求項２３】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および単為発生幹細胞からなる群より選択される、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記多能性幹細胞が、霊長類起源の多能性幹細胞、好ましくはヒト多能性幹細胞である、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記多能性幹細胞が、臍帯血から単離されたCD34陽性細胞から作製される、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記多能性幹細胞が、NINDSヒューマンセルアンドデータリポジトリ（NINDS Human Cell and Data Repository）のND-50039である、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
操作された組織の部分を形成する少なくとも1つの第2の細胞型への多能性幹細胞の分化をさらに誘導する工程であって、操作された組織の機能に必須である細胞型の細胞と操作された組織の部分を形成する第2の細胞型の細胞とを、操作された組織を形成するために分化後に接触させる、工程
をさらに含む、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記操作された組織の部分を形成する第2の細胞型が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞または間葉系幹細胞である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
B2Mの破壊および／または免疫調節タンパク質の挿入が、操作されたヌクレアーゼによって媒介される、請求項1〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR/Cas9)からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記操作されたヌクレアーゼがCRISPR/Cas9であり、crRNAが、
2021534813.tif 000009
からなる群より選択される、請求項29または30記載の方法。
【請求項３２】
操作された組織を形成させている間に、前記多能性幹細胞を前記少なくとも1つの細胞型へ分化させる、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
操作された組織の機能に必須である細胞型を含む、操作された組織であって、
該細胞型が、該細胞型への多能性幹細胞の分化に適した条件下で該細胞型へ多能性幹細胞を分化させることによって得られたものであり、該多能性幹細胞が、MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、
それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする、
前記操作された組織。
【請求項３４】
組織の部分を形成する少なくとも第2の細胞型をさらに含む、請求項33記載の操作された組織。
【請求項３５】
請求項1〜32のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、操作された組織。
【請求項３６】
請求項1〜32のいずれか一項記載の方法によって得られた、操作された組織。
【請求項３７】
細胞外マトリックス生体材料をさらに含む、請求項33〜36のいずれか一項記載の操作された組織。
【請求項３８】
前記細胞外マトリックス生体材料が、アルギネート、ヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、または合成マトリックス、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリグリセロールセバケート(バイオゴム)、およびポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレートであり、好ましくは該細胞外マトリックス生体材料がI型コラーゲンである、請求項37記載の操作された組織。
【請求項３９】
前記合成マトリックス材料がポリ乳酸またはポリグリコール酸である、請求項38記載の操作された組織。
【請求項４０】
前記操作された組織が、
(a)エフェクターT細胞によって同種異系と認識されず、
(b)抗HLA抗体に結合せず、かつ／または
(c)NK媒介性溶解に耐性である、
請求項33〜39のいずれか一項記載の操作された組織。
【請求項４１】
請求項33〜40のいずれか一項記載の操作された組織を含む、薬学的組成物。
【請求項４２】
疾患状態を処置する方法における使用のための、請求項33〜40のいずれか一項記載の操作された組織または請求項41記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
有効量の請求項33〜40のいずれか一項記載の操作された組織または請求項41記載の薬学的組成物をその必要がある対象へ投与する工程を含む、疾患状態を処置する方法。
【請求項４４】
前記疾患状態が、糖尿病、自己免疫疾患、癌、感染症、心筋梗塞、心不全、骨格もしくは関節の状態、骨形成不全症、熱傷、肝不全、腎不全、脳損傷、または軟部組織損傷からなる群より選択される、請求項42記載の使用のための操作された組織もしくは薬学的組成物または請求項43記載の処置する方法。
【請求項４５】
(a)薬物毒性スクリーニングのためのインビトロモデルにおける、および／または
(b)研究ツールとしての、
請求項33〜40のいずれか一項記載の操作された組織の使用。
【請求項４６】
SEQ ID NO: 2〜7からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、核酸。
【請求項４７】
B2M遺伝子の発現を破壊するための、請求項46記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2019年7月13日に出願された欧州出願特許第18183294.0号の優先権の恩典を主張し、この内容は全ての目的について参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、多能性幹細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法であって、多能性幹細胞が、MHCクラスI分子を欠損しておりかつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、ここで、方法が、操作された組織の形成を可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの細胞型の存在下で操作された組織を形成し、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程であって、該少なくとも1つの細胞型が、操作された組織の形成も可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である該少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化を誘導することによって得られたものである、工程を含む、方法を提供する。本発明はさらに、操作された組織、操作された組織を含む薬学的組成物、操作された組織を使用する医学的処置、および操作された組織の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
機能不全の器官または組織を置換するための好適な器官または組織の不足は、特に臓器提供の供給量が医学的必要性を満たすには不十分であり適切に計画することができないことを考慮すると、依然として現代医学において主要な問題である。
【０００４】
克服するための一つのアプローチは、機能性組織中の、多能性幹細胞、特にヒト多能性幹細胞(hPSC)を操作することである。この分野は、最近、様々な非常に有望な結果を見た。例えば、国際特許出願WO 2015/025030（特許文献1）は操作心筋の製造方法を記載し、一方、国際特許出願WO 2015/040142（特許文献2）は心臓組織への改良分化プロトコルを記載する。Rao et al, “Engineering human pluripotent stem cells into functional skeletal muscle tissue” Nature Communications, (2018) 9:126（非特許文献1）は、hPSCから分化された沿軸中胚葉細胞中におけるPax7の一過性過剰発現を介して人工筋原性前駆細胞(iMPC)を誘導する。Raoらは、2D培養において、iMPCは、自然に収縮する多核筋管およびPax7を内因性発現する衛星様細胞のプールへ容易に分化することを報告する。Lancaster and Knoblich, “Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies” Science 345, 1247125 (2014)（非特許文献2）のレビューは、特に、腸、腎臓、脳、および網膜組織のヒトPSCに由来するオルガノイド(幹細胞由来三次元培養物)を記載する。同様に、Llonch et al “Organoid technology for retinal repair” Developmental Biology 433 (2018) 132-143（非特許文献3）のレビューは、潜在的な細胞ベースの療法へ向けてさらに開発され得る、大量の光受容体を作製するために広く使用される、インビトロで網膜組織を作製するための重要なツールとしてのPSC由来網膜オルガノイドを議論する。最後に、Pagliuca et al, “Generation of Functional Human Pancreatic b Cells In Vitro” Cell 159, 428-439 (2014)（非特許文献4）は、インビトロでhPSCから何億ものグルコース応答性b細胞を作製することができる拡張可能な分化プロトコルを報告する。
【０００５】
しかし、上記に記載される方法は、例えば、機能性心臓組織または機能性骨格組織を生じさせる一方、利用される多能性幹細胞が同種異系ドナーに由来しかつ／または組織学的に適合性でない場合、移植片拒絶の課題に依然として直面する。
【０００６】
従って、例えば機能性心臓組織のような、一般に治療適用のための機能性組織またはオルガノイドについての必要性があるだけでなく、例えば、同種異系ドナーに由来するがレシピエントにおいて拒絶されない改良された心臓組織のような、改良された機能性組織またはオルガノイドについての必要性もある。本発明はこの課題を解決することを目的とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際特許出願WO 2015/025030
【特許文献２】国際特許出願WO 2015/040142
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rao et al, “Engineering human pluripotent stem cells into functional skeletal muscle tissue” Nature Communications, 9:126 (2018)
【非特許文献２】Lancaster and Knoblich, “Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies” Science 345, 1247125 (2014)
【非特許文献３】Llonch et al “Organoid technology for retinal repair” Developmental Biology 433, 132-143 (2018)
【非特許文献４】Pagliuca et al, “Generation of Functional Human Pancreatic b Cells In Vitro” Cell 159, 428-439 (2014)
【発明の概要】
【０００９】
課題は、特許請求の範囲に定義されるような保護対象によって解決される。本発明は、多能性細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法、操作された組織、操作された組織を含む薬学的組成物、操作された組織を使用する医学的処置、および操作された組織の使用を提供する。
【００１０】
従って、本発明は、多能性幹細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法であって、多能性幹細胞が、多能性幹細胞の細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損しておりかつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、ここで、方法が、操作された組織の形成を可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの細胞型の存在下で操作された組織を形成し、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程であって、該少なくとも1つの細胞型が該少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化によって得られたものである、工程を含む、方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、多能性幹細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法であって、多能性幹細胞が、多能性幹細胞の細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、ここで、方法が、操作された組織の形成も可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化を誘導し、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程を含む、方法に関する。
【００１２】
本発明の態様において、操作された組織は、(a)レシピエントのエフェクターT細胞によって同種異系と認識されず、かつ／または、(b)NK媒介性溶解に耐性である。好ましくは、操作された組織は抗HLA抗体に結合せず、好ましくは、組織は抗-HLA-Aまたは抗-HLA-B抗体に結合しない。
【００１３】
免疫調節タンパク質は一本鎖融合HLAクラスIタンパク質であり得、ここで、より好ましくは、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-FおよびHLA-Gからなる群より選択されるHLAクラスIα鎖の少なくとも一部分へ共有結合されたB2Mの少なくとも一部分を含む。最も好ましくは、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Aの少なくとも一部分を含み、または一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-A0201の少なくとも一部分を含み、または一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Eの少なくとも一部分を含み、または一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Gの少なくとも一部分を含み、または一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Bの少なくとも一部分を含み、または一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Cの少なくとも一部分を含み、または一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Fの少なくとも一部分を含む。
【００１４】
本発明の態様において、多能性幹細胞は、多能性細胞表面上の一本鎖融合HLAクラスIタンパク質によって提示される標的ペプチド抗原をさらに発現し、ここで、より好ましくは、標的ペプチド抗原は、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質へ共有結合されており、ここで、標的ペプチド抗原は配列VMAPRTLFL (SEQ ID NO: 1)を含み得る。
【００１５】
本発明の態様において、β-ミクログロブリン2遺伝子の本質的に全てのコピーが多能性幹細胞において破壊されている。
【００１６】
本発明の態様において、方法は、組織の部分（part of the issue）を形成する少なくとも1つの第2の細胞型の存在下で、操作された組織を形成する工程を含む。操作された組織の部分を形成する第2の細胞型は、操作される組織の種類に依存し(例えば、操作心筋組織または肝臓組織が形成される場合)、例えば、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞または間葉系幹細胞であり得る。
【００１７】
操作された組織は、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織、脳組織、膵臓組織、肺組織、骨格筋組織、胃腸組織、神経組織、皮膚組織、骨組織、骨髄、脂肪組織、結合組織、網膜組織および血管組織からなる群より選択され得る。
【００１８】
好ましくは、本発明の方法の一態様において、操作された組織は心臓組織であり、ここで、方法はさらに以下の工程を含む：(i)多能性幹細胞を、有効量の(a) BMP4、アクチビンA、FGF2、GSK3阻害剤、および(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン（triodo-L-thyronine）(T3)の最終濃度を生じる無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程；(ii)工程(i)において得られた細胞を、有効量のWntシグナル伝達経路の阻害剤および(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、細胞の心臓分化を誘導する工程；ならびに(iii)工程(ii)において得られた細胞を、機械的刺激下で、有効量の(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、心臓成熟を促進する工程。
【００１９】
本発明の方法の一態様において、組織の形成は、ヒドロゲル、好ましくは細胞外マトリックスタンパク質、例えばフィブリンヒドロゲルまたはコラーゲンヒドロゲル、最も好ましくはコラーゲンヒドロゲルの存在下で行われる。
【００２０】
本発明の方法の一態様において、方法はさらに以下の工程を含む：(iv)1つまたは複数の型の中に無血清再構成混合物を提供する工程であって、該再構成混合物が、(a)無血清最小必須培地；(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)および0.2〜2 mg/mlコラーゲンの最終濃度を生じる無血清サプリメント；ならびに(c)工程(iii)において得られた細胞、および操作された組織の部分を形成する細胞型、好ましくはヒト非筋細胞を含み、任意で該操作された組織の部分を形成する細胞が多能性幹細胞に由来するものであり、総細胞混合物の20〜80%が工程(iii)において得られた細胞であり；再構成混合物が7.2〜7.6のpHを有する、工程；(v)該1つまたは複数の型の中で無血清再構成混合物を培養し、それによって、無血清再構成混合物を少なくとも15分間圧縮させる工程；(vi)該1つまたは複数の型の中の工程(v)において得られた混合物がその元の厚さの少なくとも50%へ圧縮するまで、無血清EHM培養培地中で該混合物を培養する工程であって、ここで、該EHM培養培地が、(a)0.5〜3 mmol/L Ca2+を含む基本培地；(b)(i)(b)に定義されるような無血清サプリメント；(c) 0.5〜10 mmol/L L-グルタミン；(d) 0.01〜1.0 mmol/Lアスコルビン酸；(e) 1〜100 ng/ml IGF-1；および(f) 1〜10 ng/ml TGFβ1を含む、工程；(vii)工程(iii)において得られた混合物を、工程(iii) (a)〜(f)に定義されるような無血清EHM培養培地中で、機械的伸張下で培養し、それによって、力を発生する（force-generating）操作された心臓組織を形成する工程。
【００２１】
好ましくは、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および単為発生幹細胞からなる群より選択される。
【００２２】
好ましくは、多能性幹細胞は、霊長類起源の多能性幹細胞、好ましくはヒト多能性幹細胞である。好ましくは、多能性幹細胞。好ましくは、多能性幹細胞は、NINDSヒューマンセルアンドデータリポジトリ（NINDS Human Cell and Data Repository）のND50039である。
【００２３】
好ましくは、本発明の方法は、操作された組織の部分を形成する少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化を誘導する工程であって、ここで、操作された組織の機能に必須である細胞と、操作された組織の部分を形成する細胞とを、操作された組織を形成するために分化後に接触させる、工程をさらに含む。操作された組織の部分を形成し得る(第2の)細胞型は、ほんのいくつかの説明例を挙げると、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞または間葉系幹細胞であり得るが、これらに限定されない。
【００２４】
好ましくは、B2Mの破壊および／または免疫調節タンパク質の挿入は、操作されたヌクレアーゼによって媒介される。より好ましくは、操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR/Cas9)からなる群より選択される。最も好ましくは、操作されたヌクレアーゼはCRISPR/Cas9であり、crRNAは、
2021534813.tif 000002
からなる群より選択される。
【００２５】
一態様において、操作された組織を形成させている間に、多能性幹細胞を前記少なくとも1つの細胞型へ分化させる。
【００２６】
本発明はまた、多能性幹細胞を含む操作された組織であって、多能性幹細胞が、MHCクラスI分子を欠損しておりかつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、ここで、多能性幹細胞が、操作された組織の形成も可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である細胞型へ分化されており、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする、操作された組織に関する。
【００２７】
本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる操作された組織に関する。本発明はさらに、本発明の方法によって得られた操作された組織に関する。
【００２８】
好ましくは、操作された組織は細胞外マトリックス生体材料をさらに含む。より好ましくは、細胞外マトリックス生体材料は、アルギネート、ヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、または合成マトリックス、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリグリセロールセバケート(バイオゴム)、およびポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレートであり、最も好ましくは、細胞外マトリックス生体材料はI型コラーゲンである。
【００２９】
好ましくは、操作された組織は、(a)レシピエントのエフェクターT細胞によって同種異系と認識されず、(b)抗HLA抗体に結合せず、かつ／または(c)NK媒介性溶解に耐性である。
【００３０】
本発明はさらに、本発明の操作された組織を含む薬学的組成物に関する。
【００３１】
本発明はさらに、疾患状態を処置する方法における使用のための本発明の操作された組織または本発明の薬学的組成物に関する。
【００３２】
本発明はさらに、有効量の本発明の操作された組織または本発明の薬学的組成物をその必要がある対象へ投与する工程を含む、疾患状態を処置する方法に関する。
【００３３】
疾患状態が、糖尿病、自己免疫疾患、癌、感染症、心筋梗塞、心不全、骨格もしくは関節の状態、骨形成不全症、熱傷、肝不全、腎不全、脳損傷または軟部組織損傷からなる群より選択される、本発明の使用のための操作された組織もしくは薬学的組成物または本発明の処置方法。
【００３４】
本発明はさらに、(a)薬物毒性スクリーニングのためのインビトロモデルにおける；および／または(b)研究ツールとしての本発明のいずれかの操作された組織の使用に関する。
【００３５】
本発明はさらに、SEQ ID NO: 2〜7のうちの少なくとも1つを含む核酸に関する。
【００３６】
本発明はまた、B2M遺伝子の(発現)を破壊するための核酸の使用に関する。
【００３７】
本発明は、詳細な説明を参照して、図面、非限定的な実施例および添付の特許請求の範囲と共に考慮される場合、よりよく理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】B2M遺伝子の配列のエクソン1(灰色、位置201〜327)を囲むセクションを表す。図1に示される550個の塩基対は、例えば、完全な遺伝子を示す、NCBI GenBankエントリーNG_012920、2018年6月3日付けのバージョンNG_012920.2の配列位置4811〜5360に対応する。下線が引かれているのは、遺伝子配列の下に示される3つのcrRNAの結合部位である。SEQ ID NO: 6 (B2M_CR1)は相補鎖の位置287〜299へ結合し、SEQ ID NO: 5 (B2M_CR2)は相補鎖の位置311〜333へ結合し、SEQ ID NO: 7 (B2M_CR3)は位置254〜276へ結合する。関連するPAMは太字かつイタリック体で示される。さらに強調されるのは、翻訳開始シグナルATG(二重下線)である。
【図２】図1に示されるB2M遺伝子セクションの配列位置201〜350でのCRISPR/Cas9ヌクレアーゼによる遺伝子編集後の4つの異なるPSCクローンの結果として生じた配列を表す。各クローンについて、両方の対立遺伝子の結果として生じた配列が示される。下線が引かれているのは、3つのcrRNAの結合部位である。SEQ ID NO: 6 (B2M_CR1)は相補鎖の位置287〜299へ結合し、SEQ ID NO: 5 (B2M_CR2)は相補鎖の位置311〜333へ結合し、SEQ ID NO: 7 (B2M_CR3)は位置254〜276へ結合する。さらに強調されるのは、開始コドン(二重下線)、PAM(太字かつイタリック体)および突然変異(波線)である。欠失は「-」によってマークされる。
【図３−１】野生型PSCおよび非染色対照と比較してのCRIPSR/Cas9ヌクレアーゼによる遺伝子編集後の4つの異なるPSCクローンのフローサイトメトリー解析の結果を表す。B2M (APC、x軸)およびHLA (PE、y軸)の細胞表面発現を、非刺激PSC(左)およびインターフェロンγで24時間刺激されたPSC(右)中において解析した。
【図３−２】図３−１の続きの図である。
【図３−３】図３−２の続きの図である。
【図４−１】多能性幹細胞の表面上における免疫調節タンパク質の過剰発現を可能にし、好適なベクター中へ組み込まれ得る、例示的なDNA配列を表す。一般に、免疫調節タンパク質は、HLA遺伝子へ融合された機能性B2Mを含み得る。図4に示される例示的な態様において、ヒトB2MはHLA-E遺伝子へ融合されている。灰色でマークされた「二量体」のオープンリーディングフレームはSEQ ID NO: 18に示されるタンパク質へ翻訳される。この二量体は、(G4S)4によって融合されたB2MおよびHLA-Eを含む。灰色でマークされた「三量体」のオープンリーディングフレームはSEQ ID NO: 20に示されるタンパク質へ翻訳される。このタンパク質は、B2MおよびHLA-Eに加えて、配列MAPRTLFLGGGGSGGGGSGGGGSIQRTPK (SEQ ID NO: 21)を有する標的ペプチド抗原をさらに含む。一本鎖B2M-HLA-E二量体へ融合されたそのような例示的な標的ペプチド抗原を使用することは、複合体の安定性を増加させ得る。従って、SEQ ID NO: 18および20は免疫調節タンパク質の例示的な態様である。オープンリーディングフレームの前後の灰色でマークされていない配列は、B2M遺伝子中への組込みを媒介するホモロジーアームである。
【図４−２】図４−１の続きの図である。
【図５】HLA-E KI TC1133 hIPSC株の作製を表す。図5(A)は、B2M KO hIPSC中のCrispr/Cas9ターゲッティング誘導HDR媒介性HLA-E二量体および三量体ノックインの略図を示す。図5(B)は、トランスフェクトされていないhIPSC(対照)、ならびにトランスフェクション後48時間でのHLA-E二量体および三量体ドナー配列を含有するプラスミドでトランスフェクトされたhIPSCの明視野像を示す。図5(C)は、pmaxGFPプラスミドでのトランスフェクション後のGFPを発現するhIPSC(左)、およびGFP+細胞のフローサイトメトリー解析(右)を示す。
【図６Ａ】B2M遺伝子座中のHLA-E上流のノックインを表す。図6(A)は、B2M遺伝子座ならびにPCR増幅のための5´-ホモロジーアームおよびドナー配列を包含するプライマーの略図を示す。アガロースゲル電気泳動は、HLA-E二量体および三量体ドナープラスミドでトランスフェクトされたhIPSC中のCrispr/Cas9誘導HDR媒介性遺伝子組込みを示す。
【図６Ｂ】B2M遺伝子座中のHLA-E上流のノックインを表す。図6(B)はHLA-E二量体についてのクローンの遺伝子型決定を示す。WT: 野生型、PD: プラスミドDNA、HLA-E: HLA-EドナープラスミドでトランスフェクトされたhIPSCプール。
【図６Ｃ】B2M遺伝子座中のHLA-E上流のノックインを表す。図6(C)はHLA-E三量体挿入についての遺伝子型決定を示す。WT: 野生型、PD: プラスミドDNA、HLA-E: HLA-EドナープラスミドでトランスフェクトされたhIPSCプール。
【図７Ａ】B2M遺伝子座中のHLA-E全配列のノックインを表す。図7(A)は、B2M遺伝子座、PCR増幅のための5´および3´-ホモロジーアームならびにドナー配列を包含するプライマーの略図である。
【図７Ｂ】B2M遺伝子座中のHLA-E全配列のノックインを表す。図7(B)はHLA-E二量体についてのクローンの遺伝子型決定を示す。
【図７Ｃ】B2M遺伝子座中のHLA-E全配列のノックインを表す。図7(C)はHLA-E三量体挿入についての遺伝子型決定を示す。
【図８】HLA-E KI hIPSCの多能性を表す。それぞれAPC-AおよびPE-Aチャネルで検出される多能性マーカー；OCT4AおよびNanogの発現についてのWT、B2M KO、HLA-E二量体クローン#5および78、HLA-E三量体クローン#66および100のフローサイトメトリー解析。
【図９−１】HLA-E KI hIPSC中のHLA発現を表す。それぞれAPC-AおよびPacific Blue-Aチャネルで検出されるB2MおよびHLA-Eの発現についてのWT、B2M KO、HLA-E二量体クローン#5および78、HLA-E三量体クローン#66および100のフローサイトメトリー解析。染色無し追跡は黒色で示される。
【図９−２】図９−１の続きの図である。
【図１０Ａ】HLA-E KI CM中のHLA発現を表す。図10(A)は、hIPSCの明視野像、ならびにα-アクチニン、cTnTおよびNucleiを発現するCMへのそれらのその後の分化を示す。フローサイトメトリーによって測定された場合に>90% α-アクチニン+の高純度CM(右)。アイソタイプ対照追跡が空の領域として示される。スケールバー: 50μm。
【図１０Ｂ−１】HLA-E KI CM中のHLA発現を表す。図10(B)は、それぞれAPC-A、PE-AおよびPacific Blue-Aチャネルで検出されるB2M、HLA-B, CおよびHLA-Eの発現についてのWT、B2M KO、HLA-E二量体クローン#5および78、HLA-E三量体クローン#66および100 hIPSC株由来のCMのフローサイトメトリー解析を示す。
【図１０Ｂ−２】図１０Ｂ−１の続きの図である。
【図１１Ａ】本発明の低免疫原性操作ヒト心筋層(EHM)を表す。図11Aは、EHM製造プロセスの略図を示し；ナイーブGMP hiPSC株ND50039 (TC1133としても公知であり、Lonzaから入手可能である)からのおよび本明細書に記載されるように遺伝子改変されたhiPSC株TC1133からのhiPSC由来心筋細胞(CM)を、Tiburcyら2017年に従ってI型コラーゲン中においてヒト皮膚線維芽細胞と混合して、環状EHMを形成した。
【図１１Ｂ】本発明の低免疫原性操作ヒト心筋層(EHM)を表す。図11Bは、鋳型中で3日間のEHMの圧密段階、4週間までのフレキシブルストレッチャー上における機械的荷重下での機能的成熟、およびサーモスタット付き器官浴中における等尺条件下での収縮力(FOC)の測定を示す。
【図１１Ｃ】本発明の低免疫原性操作ヒト心筋層(EHM)を表す。図11Cは、遺伝的にナイーブな(野生型)EHM、ならびにB2M KO、HLAE二量体および三量体KI iPSC由来心筋細胞を含むEHM中における電気刺激下で記録された収縮力(FOC)を示す。FOC反応は漸増カルシウム濃度下で記録された(n=4/群)。
【図１２】本発明の方法によって製造することができる例示的な操作された組織を示す。ここで、心筋細胞および線維芽細胞は「EHMパッチ」としても公知の心臓組織へと形成された。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、機能性β2-ミクログロブリン(B2M)の発現を欠き、それによってMHCクラスI分子を欠損しているが、HLA-E、即ち、免疫調節タンパク質を発現する、多能性幹細胞が、操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性である操作された組織の製造のために使用することができるという驚くべき知見に基づく。MHCクラスI分子を欠損しておりかつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含む多能性幹細胞の使用は、それが、レシピエントの免疫系によって同種異系とはしかしもはや認識されない同種異系操作された組織を提供するという利点を有する。従って、重要なことには、組織の機能に必須である細胞へ分化されている幹細胞によって得られる、そのように得られた同種異系操作された組織(レシピエントの免疫系に対して「ロボチック組織」または「ステルス組織」とも本明細書において呼ばれる)は、組織拒絶または移植片対宿主病のような合併症のリスクを完全に回避するかまたは少なくとも減少させるために、組織のレシピエント(患者)が免疫抑制へ供されることを必要としない。これは、本発明のロボチック組織を、例えば器官または組織置換移植における、操作された心臓組織、肝臓組織、網膜組織または腎組織のような機能性組織の治療適用のための理想的な候補とする。この文脈において、MHCクラスI分子の表面発現を排除してMHCクラスI(HLAクラスI)を欠損している細胞を提供するためのβ2-ミクログロブリン(B2M)遺伝子の破壊は、1992年に国際特許出願WO 92/09688(国際特許出願WO 2012/145384も参照されたい)によって既に記載されており、しかし、このアプローチは、Gornalusse et al “HLA-E-expressing pluripotent stem cells escape allogeneic responses and lysis by NK cells” (2017), Nature Biotechnology, 35(8):765-772によって報告されたように、細胞をナチュラルキラー(NK)細胞による溶解に脆弱にしておくことが注意される。この「自己喪失」応答に取り組むために、Gornalusseらは、最小限に多形性のHLA-E分子の強制発現を使用する。このアプローチによって、Gornalusseらは、同種異系反応およびNK細胞による溶解を免れることができたCD45+造血細胞へ分化させることができる多能性幹細胞を作製する。
【００４０】
本発明の方法において、多能性幹細胞は、所望の操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの細胞型へ分化される。この分化は、操作された組織が形成される前に起こり得るか(この文脈において、例えば、実施例3および図10Aを参照されたい)、または多能性幹細胞の分化は、操作された組織を形成している間に行われ得る。換言すれば、多能性幹細胞は操作された組織の実際の製造が始まる前に分化され得るか、または多能性幹細胞の分化は操作された組織の製造と同時に(同時期に)行うことができる。そのような操作された組織は、1つの細胞型のみ、例えば、例えばRao et al, Nature Communications, (2018), 上記に記載されるようなインスリン産生膵β細胞、またはhPSCから分化された人工筋原性前駆細胞(iMPC)のみを含み得、ここで、iMPCは、自然に収縮する多核筋管へ容易に分化することができ、これは、3D培養条件下にて、電気またはアセチルコリン刺激に応答して正の力-収縮頻度関係およびロバストなカルシウムトランジェントを示す整列した多核筋管を含有する機能性骨格筋組織(iSKM束)を再現性よく形成することができる。上記によれば、操作された組織が、所望の操作された組織の機能に必須である2つ以上の細胞型を含むことも可能である。そのような組織の説明例は、グルカゴンを産生するアルファ細胞(全島細胞の20%)、インスリンおよびアミリンを産生するベータ細胞(約70%)、ソマトスタチンを産生するデルタ細胞(<10%)、膵ポリペプチドを産生するPP細胞(ガンマ細胞またはF細胞)(<5%)、およびグレリンを産生するイプシロン細胞(<1%)を含む、膵臓組織、より具体的には膵島である。あるいは、操作された組織は、2つ以上の細胞型、例えば、操作された組織の機能に必須である1つの細胞型、および(操作)組織の部分も形成する支持(第2)細胞型を含み得る。そのような少なくとも2つの異なる細胞型を含む操作された組織についての説明例は、主に、筋肉である組織の機能を発揮する心筋細胞(第1のまたは少なくとも1つの細胞型として)、および(第2の細胞型として)結合組織を提供する線維芽細胞を含む、心臓組織である(例えば、WO 2015/025030を参照されたい)。WO 2015/025030に従って形成されるそのような心臓組織の説明例において、本発明の操作心臓組織は、ヒト心筋細胞およびヒト非筋細胞の混合物（a mixture of mixture of）から形成され得、ここで、総細胞混合物の20〜80%が心筋細胞(本発明の多能性幹細胞から分化されたもの)であり、残りの細胞は非心筋細胞、例えば、線維芽細胞(即ち、本発明の組織の部分を形成する第2の細胞型の細胞)である。
【００４１】
従って、本発明は、多能性幹細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法であって、多能性幹細胞が、多能性幹細胞の細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損しておりかつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、ここで、方法が、操作された組織の形成を可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの細胞型の存在下で操作された組織を形成し、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程であって、該少なくとも1つの細胞型が該少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化によって得られたものである、工程を含む、方法に関する。
【００４２】
本発明はさらに、多能性幹細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法であって、多能性幹細胞が、MHCクラスI分子を欠損しておりかつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、ここで、方法が、操作された組織の形成も可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの、または例えば、2、3、4、もしくは5つの細胞型への多能性幹細胞の分化を誘導し、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程を含む、方法に関する。
【００４３】
用語「多能性幹細胞」(PSC)は、本明細書において使用される場合、身体のあらゆる細胞型へ分化することができる細胞を指す。従って、多能性幹細胞は、本質的に任意の組織または器官へ分化されるユニークな機会を提供する。現在、最もよく利用される多能性細胞は、胚性幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)である。ヒトESC株は、Thomsonおよび共同研究者によって初めて確立された(Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147)。ヒトESC研究は、最近、ES様細胞へ体細胞を再プログラムする新技術の開発を可能にした。この技術は、2006年にYamanakaおよび共同研究者によって開発された(Takahashi & Yamanaka (2006), Cell, 126:663-676)。得られた人工多能性細胞(iPSC)は、ESCと非常によく似た挙動を示し、重要なことには、あらゆる体細胞へ分化することもできる。さらに、また単為発生幹細胞がマウスモデルにおけるEHM産生に適していることが報告され(Didie et al. (2013), J Clin Invest., 123:1285-1298)；WO 2015/025030に従うヒト単為発生幹細胞の使用はヒトEHMを恐らく生じさせる。従って、本明細書において使用される多能性幹細胞は、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および単為発生幹細胞より選択され得る。本発明の文脈において、これらの多能性幹細胞は、しかし、好ましくは、ヒトの生殖細胞系の遺伝的同一性を改変することを伴うか、または産業もしくは商業目的のためにヒト胚の使用を伴うプロセスを使用して製造されない。好ましくは、多能性幹細胞は、霊長類起源のもの、より好ましくはヒトのものである。人工PSCを含む、好適なPSCは、例えば、ほんのいくつかの供給源を挙げると、NIHヒューマンエンブリオニックステムセルレジストリ(NIH human embryonic stem cell registry)、ヨーロピアンバンクオブインデューストプルリポテントステムセルズ(European Bank of Induced Pluripotent Stem Cells)(EBiSC)、ステムセルリポジトリオブザジャーマンセンターフォーカーディオバスキュラーリサーチ（Stem Cell Repository of the German Center for Cardiovascular Research)(DZHK)、またはATCCから得ることができる。多能性幹細胞はまた、商業用途のために、例えば、米国国立神経疾患・脳卒中研究所(U.S. National Institute of Neurological Disorders and Stroke)(NINDS)によって運営され、学業および産業の研究者へ広くヒト細胞資源を分配する、NINDSヒューマンセルアンドデータリポジトリ (https://stemcells.nindsgenetics.org)から入手可能である。本発明において使用することができる好適な細胞株の一つの説明例は、臍帯血幹細胞から誘導された人工(未編集)多能性幹細胞である、細胞株ND50039である。本発明において使用することができるさらなる例示的なiPSC細胞株としては、Gibco（商標）のHuman Episomal iPSC Line(注文番号A18945, Thermo Fisher Scientific)、またはATTCから入手可能なiPSC細胞株ATCC ACS-1004、ATCC ACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027もしくはATCC ACS-1030が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、再プログラミングの当業者は、Okita et al, “A more efficient method to generate integration-free human iPS cells” Nature Methods, Vol.8 No.5, May 2011, pages 409-411によってまたはLu et al “A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells”, Biomaterials 35 (2014) 2816e2826によって記載されるもののような公知のプロトコルによって、好適なiPSC株を容易に作製することができる。
【００４４】
上記に説明したように、本発明において使用される(人工)多能性幹細胞は、任意の好適な細胞型から(例えば、幹細胞、例えば、間葉系幹細胞、もしくは上皮幹細胞、または分化細胞、例えば、線維芽細胞から)、かつ、任意の好適な供給源(体液または組織)から誘導され得る。そのような供給源(体液または組織)の例としては、ほんのいくつかを挙げると、臍帯血、皮膚、歯肉、尿、血液、骨髄、臍帯の任意の区画(例えば、臍帯の羊膜もしくはワルトン膠様質)、臍帯-胎盤接合部、胎盤または脂肪組織が挙げられる。一つの説明例において、Chou et al. (2011), Cell Research, 21:518-529に記載されているような、例えば、CD34に対して特異的に向けられた抗体を使用する磁気細胞選別による、臍帯血からのCD34陽性細胞の単離、続いての再プログラミングである。Baghbaderani et al. (2015), Stem Cell Reports, 5(4):647-659は、iPSC作製プロセスは、細胞株ND50039を作製するために医薬品適正製造基準の規則を順守し得ることを示す。従って、多能性幹細胞は、好ましくは、医薬品適正製造基準の要件を満たす。
【００４５】
「細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損している」細胞または多能性幹細胞は、その表面上に、即ち、細胞または多能性幹細胞の表面上に、機能性MHCクラスI分子を提示せず、その細胞膜中に機能性MHCクラスI分子を含まない。この文脈において、用語「内因性」は、細胞または多能性幹細胞中に天然に含まれており、かつ、人工的に導入されていない、任意のMHCクラスタンパク質Iを指す。しかし、これは、レシピエントの免疫系の拒絶反応のリスクを増加させ、何故ならば、細胞表面上のMHCクラスI分子の欠如は、免疫系によって「自己喪失」シグナルとして解釈され得るためである。従って、細胞または多能性幹細胞がそれらの表面上においてMHCクラスI分子を欠損しているという限定は、多能性幹細胞中へ導入され得る免疫調節タンパク質および／または組換え免疫調節タンパク質へ適用されない。一態様において、細胞表面上のMHCクラスI分子の欠損は、多能性幹細胞中におけるβ2-ミクログロブリン遺伝子の全てのコピーを破壊することによって達成することができる。MHC複合体は、α-ミクログロブリンおよびβ2-ミクログロブリンのヘテロ二量体である。従って、β2-ミクログロブリンが喪失している場合、機能性MHCクラスI複合体は組み立てられ得ず、結果的に、MHCクラスI分子は細胞膜および／または細胞表面上に存在しない。
【００４６】
MHCクラスI分子を欠損しておりかつ免疫調節タンパク質を含むように、多能性幹細胞のゲノムを改変するための多くの可能な方法が、当業者に公知である。MHCクラスI分子を欠損している、本発明の多能性幹細胞は、たとえそれが本明細書に記載されるHLA-EのようなMHCクラスI分子であったとしても、免疫調節タンパク質を発現し得ることが注意されるべきである。従って、用語「MHCクラスI分子を欠損している」は、内因性MHCクラスI分子に関し得、(組換え)免疫調節タンパク質の存在を除外しない。
【００４７】
本発明の多能性幹細胞において、B2M遺伝子は破壊され得、その結果、機能性内因性B2Mタンパク質は、破壊された遺伝子座から産生されない。ある態様において、破壊は、切断、欠失、点突然変異および挿入を含むがこれらに限定されない、非機能性B2Mタンパク質の発現を生じさせる。他の態様において、破壊は、B2M遺伝子からタンパク質発現を生じさせない。
【００４８】
B2M発現が欠けている多能性幹細胞は、細胞表面上にHLAクラスIタンパク質を発現することができない。HLAクラスI欠損はさらなる利点を提供し；例えば、HLAクラスI発現を有さない細胞は、自己抗原を提示することができず、これは、そうでなければ、糖尿病および関節リウマチのような自己免疫疾患についての首尾よい細胞療法を妨げるだろう。同様に、ある遺伝病(例えば筋ジストロフィー)を有する患者中において喪失している、本発明の細胞療法によって導入される治療用遺伝子産物(例えばジストロフィン)は、補充療法において新生抗原として免疫系によって提示および認識されないだろう。
【００４９】
B2M遺伝子の1、2または全てのコピーを破壊するための任意の好適な技術が使用され得；例示的な技術は、本出願の全体にわたって開示されており、本明細書中の教示および当技術分野において公知の教示に基づいて当業者のレベル内にある。例示的な他の技術は、例えば、2008年9月11日に公表された、米国特許出願公開第US 2008/0219956号中に見られ得る。これらの技術は、B2M遺伝子破壊後に細胞から非ヒトDNA配列を除去する工程を任意で含み得る。
【００５０】
この方法の例示的な態様は、以下に記載されるもののような技術によってターゲッティングのために使用されたトランスジーンを除去すること、またはCre媒介性loxP組換え、もしくは他の好適な組み換え技術によってターゲッティングのために使用されたトランスジーンを除去することを任意で含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)遺伝子ターゲッティングベクターを使用することである。Khan et al. (2011), Protocol, 6:482-501を参照されたい。本発明の、B2M-/-多能性幹細胞、即ち、MHCクラスI分子を欠損している多能性幹細胞、好ましくはヒト細胞を作製するための様々な技術を用いることは、本明細書中のおよび当技術分野において公知の教示に基づいて、当業者のレベル内にある。
【００５１】
B2Mの破壊および／または免疫調節タンパク質をコードする遺伝子の挿入はまた、操作されたヌクレアーゼの使用によって行われ得る。これらのヌクレアーゼは、DNA中に一本鎖および／または二本鎖切断を導入することができる。操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR/Cas9)からなる群より選択され得る。
【００５２】
CRISPRは細菌中のDNA配列のファミリーを記載する。配列は、細菌を攻撃したウイルス由来のDNAの断片を含有する。これらの断片は、その後の攻撃中に同様のウイルス由来のDNAを検出および破壊するために細菌によって使用される。これらの配列は細菌防衛システムにおいて重要な役割を果たし、生物内の遺伝子を効果的にかつ特異的に変更するCRISPR/Cas9として公知の技術の基礎を形成する。CRISPR/Casシステムは、元は、獲得免疫の形態を提供する、プラスミドおよびファージ内に存在するもののような外来遺伝要素に対して耐性を与える原核生物免疫系である。スペーサー配列を抱くRNAは、Cas(CRISPR関連)タンパク質が外因性DNAを認識および切断するのを助ける。他のRNAガイドCasタンパク質は外来RNAを切断する。CRISPR/Casシステムの単純なバージョン、CRISPR/Cas9は、ゲノムを編集するように改変された。細胞中へ合成ガイドRNA(gRNA)と複合体化されたCas9ヌクレアーゼを送達することによって、細胞のゲノムは所望の場所で切断され得、既存の遺伝子が除去されかつ／または新しい遺伝子が付加されることを可能にする。
【００５３】
タンパク質Cas9に依存する化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のCRISPRシステムもある。Cas9エンドヌクレアーゼは、CRISPR RNA (crRNA)およびトランス活性化CRISPR RNA (tracrRNA)と命名された2つの小さなRNA分子を含む四成分系である。S.サーモフィルス（S. thermophilus）CRISPRシステム由来のCas9は、そのcrRNAの配列を変更することによってそれらの選択部位を標的化するように再プログラムされ得ることが示された。従って、本発明はまた、B2Mの破壊および／または免疫調節タンパク質の挿入は、操作されたヌクレアーゼによって媒介され、操作されたヌクレアーゼがCRISPR/Cas9である、本発明の方法に関する。この方法において、crRNAは、
2021534813.tif 000003
からなる群より選択され得る。化膿性連鎖球菌のCas9エンドヌクレアーゼは、この指定されるDNA配列への結合を可能にするために認識配列に対して3’のcrRNA中にプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を必要とする。このPAMはコンセンサス配列XGGを有し、ここでXは任意の核酸であり得る。従って、SEQ ID NO: 2〜4は3’プライム末端で配列XGGをさらに有し得、ここでXは任意の核酸であり得る。従って、crRNAはまた
2021534813.tif 000004
であり得る。
【００５４】
多能性幹細胞がMHCクラスI分子を欠損しているかどうかを決定することは、当業者の能力内にある。解析はゲノム、転写および／または翻訳のレベルで行われ得る。例えば、MHCクラスI分子の欠損が、CRIPSRのようなヌクレアーゼによって、B2M遺伝子のようなMHCクラスI分子を形成するために必須である遺伝子を破壊することによって達成された場合、B2M遺伝子内の機能性B2Mタンパク質の発現を妨げる突然変異が、それぞれのヌクレオチド配列のシーケンシングによって解析され得る。シーケンシング技術についての例としては、サンガーシーケンシング、ならびに次世代シーケンシング、例えば、一分子リアルタイムシーケンシング(Pacific Biosciences)、イオン半導体(Ion Torrentシーケンシング)、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング(Illumina)、ライゲーションによるシーケンシング(SOLiDシーケンシング)およびナノポアシーケンシングが挙げられる。あるいは、突然変異される領域中のプライマー結合を伴うPCRまたはサザンブロット解析を行うことができる。MHCクラスI分子の少なくとも部分をコードする遺伝子の転写は、例えば、突然変異される領域に広がるプライマー対を使用する定量的PCRによって解析され得る。最後に、タンパク質発現または翻訳の解析が行われてもよい。多能性幹細胞がMHCクラスI分子を欠損しているかどうかを解析するための例示的な方法としては、従って、イムノアッセイ、例えばウェスタンブロット、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴などが挙げられ得る。
【００５５】
本発明はまた、SEQ ID NO: 2〜7の配列のうちの少なくとも1つを含む核酸に関する。一態様において、核酸は、宿主細胞において核酸の過剰発現を可能にする発現制御配列へ機能的に連結され得る。例示的な発現制御配列としては、U6プロモーターまたはCMVプロモーターのような、プロモーターが挙げられる。本発明の核酸はまたベクター中に含まれ得る。ベクターは、トランス活性化crRNa (tracrNA)および／またはCas9ヌクレアーゼをさらにコードし得る。本発明はまた、B2Mを破壊するための本発明の核酸またはベクターの使用に関する。
【００５６】
用語「非免疫原性」は、本明細書において使用される場合、免疫反応を本質的に誘発しない組織、即ち、レシピエントによって拒絶されない組織を指す。非免疫原性の操作された組織のさらなる特徴は、組織が、エフェクターT細胞によって同種異系と認識されず、かつ／または抗HLA抗体に結合せず、かつ／またはNK媒介性(ナチュラルキラー細胞)溶解に耐性であることを含み得る。これらの特徴を調べるためのアッセイは当業者に周知であり、Gornalusse et al. (2017), Nature Biotechnology, 35(8):765-772およびWO 2012/145384に例示されている。
【００５７】
エフェクターT細胞による同種異系であるとしての組織の認識およびNK媒介性溶解に対する耐性は、例えば、NK細胞を用いるクロム放出アッセイを行うことによって分析され得る。そのようなアッセイは、51Crへの分析される組織または細胞の曝露、CD8+ T細胞またはNK細胞との組織または細胞のその後の接触、およびシンチレーションによる上澄み中の放射能の最終測定に基づく(例えば、Gornalusse et al (2017), Nature Biotechnology, 35(8):765-772およびWO 2012/145384を再び参照されたい)。
【００５８】
用語「エフェクターT細胞」は、本明細書において使用される場合、共刺激のような刺激に対して直ちに能動的に応答する様々なT細胞型に関する。これはヘルパーT細胞およびキラーT細胞を含む。ヘルパーT細胞(TH細胞)は、形質細胞およびメモリーB細胞へのB細胞の成熟、ならびに細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスにおいて他の白血球を支援する。これらの細胞はまた、それらの表面上にCD4糖タンパク質を発現するため、CD4+ T細胞としても公知である。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞(APC)の表面上に発現されるMHCクラスII分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。活性化されると、それらは急速に分裂し、活発な免疫反応を調節または支援するサイトカインと呼ばれる小タンパク質を分泌する。細胞傷害性T細胞(TC細胞、CTL、T-キラー細胞、キラーT細胞)は、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞を破壊し、さらに移植片拒絶に関与する。これらの細胞はまた、それらの表面上にCD8糖タンパク質を発現するため、CD8+ T細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するMHCクラスI分子と会合された抗原へ結合することによってそれらの標的を認識する。IL-10、アデノシン、および制御性T細胞によって分泌される他の分子を通して、CD8+細胞は、自己免疫疾患を予防する、アネルギー状態へ不活性化され得る。
【００５９】
本発明の組織への抗HLA抗体、好ましくは抗-HLA-Aまたは抗-HLA-B抗体の結合は、補体依存性細胞傷害(CDC)に関する。HLA-AまたはHLA-B分子を発現する細胞は、抗-HLA-Aまたは抗-HLA-Bによる検出の傾向がある。補体系の全ての成分ならびに抗-HLA-Aおよび／または抗-HLA-B抗体を含む環境において、それらの表面上にHLA-Aおよび／またはHLA-Bを発現する組織は、それらのHLAがレシピエントのそれと不適合である場合、補体系によって死滅させられる。そのような組織はレシピエント中において拒絶される可能性が高い。そのようなアッセイの例は再びGornalusse et al. (2017), Nature Biotechnology, 35(8):765-772中に見られ得る。
【００６０】
「免疫調節タンパク質」は、本明細書に記載される場合、操作された組織に対して標的化された免疫反応を防ぐことができる、任意のタンパク質を指す。細胞表面上の喪失している機能性B2Mを含む文脈において、操作された組織の細胞はそれらの表面上にいかなるMHC I分子も提示せず、これは、ナチュラルキラー細胞の作用に主に起因する、レシピエントの免疫系によるそれらの破壊に至る「自己喪失」シグナルである。好適な免疫調節遺伝子としては、非限定的に、抗原提示を阻害するウイルスタンパク質をコードする遺伝子、および好ましくは、本明細書に記載されるような一本鎖(SC)融合ヒト白血球抗原(HLA)クラスIタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。本発明の免疫調節タンパク質は、組換えであり得、かつ／または、多能性幹細胞において天然に存在しない場合がある。従って、多能性幹細胞は組換え免疫調節タンパク質を発現し得る。
【００６１】
本発明において使用されるSC-HLAクラスI融合タンパク質の融合タンパク質は、多能性幹細胞および／または操作された組織を形成する細胞によって発現され得る。融合タンパク質の利点は、機能性HLAクラスIタンパク質が、他のHLA単量体とさらに会合して次いで拒絶反応を再び誘発するB2Mを発現する必要なく、操作された組織の細胞の細胞表面上に提示され得ることである。本発明において使用される細胞は機能性B2Mの発現を欠く一方、そのようなSC-HLAクラスI融合タンパク質は、Gornalusse et al. (2017), Nature Biotechnology, 35(8):765-772 (例えば、その図1を参照されたい)の開示によれば、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-FおよびHLA-Gからなる群より選択される（selected group）HLAクラスIα鎖の少なくとも一部分へ共有結合されたB2Mの一部分を含み得る。一態様において、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの(少なくとも)一部分およびHLA-Aの少なくとも一部分を含む。一態様において、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-A0201の少なくとも一部分を含む(この点においてWO 2012/145384も参照されたい)。一態様において、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Eの少なくとも一部分を含む。一態様において、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Gの少なくとも一部分を含む。一態様において、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Bの少なくとも一部分を含む。一態様において、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Cの少なくとも一部分を含む。一態様において、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質は、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Fの少なくとも一部分を含む。一態様において、免疫調節タンパク質は、B2MおよびHLA-Eの融合タンパク質でありかつ／またはSEQ ID NO: 18を含む。B2MおよびHLA-Eの融合タンパク質の発現のためのベクターはSEQ ID NO: 17を含み得る。
【００６２】
多能性幹細胞は、細胞表面上の一本鎖融合HLAクラスIタンパク質によって提示される標的ペプチド抗原をさらに発現し得る。そのような標的ペプチド抗原は、HLAクラスIタンパク質を安定化し得、さらに「自己」シグナルを増強し得る。ある特定の態様において、標的ペプチド抗原は、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質へ共有結合されている。HLA-E一本鎖二量体は、フレキシブル(G4S)4リンカーを通してB2Mへ共有結合的に融合されたHLA-E重鎖からなり得、その結果、それは抗原提示のためにペプチドの通常のレパートリーに結合することができる(例えば、Gornalusse et al. (2017), Nature Biotechnology, 35(8):765-772の図1Cを参照されたい)。そのようなHLA-E二量体はSEQ ID NO: 18において例示される。「HLA-E二量体」は、抗原提示のために異なるまたは「通常の」ペプチドに結合し得る。しかし、加えてまたは代わりに、ペプチドはHAL-E二量体へ融合され得る。説明例として、HLA-E一本鎖三量体は、CD94/NGK2Aへのその結合を通してNK細胞依存性溶解を阻害するHLA-Eによって通常提示される非多形性ペプチドである、HLA-G(別のHLAクラスI分子)のシグナル配列に由来する配列VMAPRTLFL (SEQ ID NO: 1)を含むペプチドへ融合された追加の(G4S)3リンカーを含有し得る。一態様において、免疫調節タンパク質は、B2MおよびHLA-Eの融合タンパク質へ(G4S)3リンカーを介して融合された標的ペプチド抗原VMAPRTLFL (SEQ ID NO: 1)の融合タンパク質であり、かつ／または、SEQ ID NO: 20を含む。
【００６３】
遺伝子配列のCRISPR媒介性ノックインについて、宿主細胞の相同組換えDNA修復システムが活用され得る。ここで、挿入される配列を含む核酸は、「ホモロジーアーム」によって隣接されており、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼおよびcrRNAと同時に宿主細胞中へ導入され得る。次いで、ヌクレアーゼは二本鎖切断を誘導し得、これは宿主細胞のDNA修復システムによって修復され得る。相同組換えの場合、DNA修復システムは相同配列、通常は第2の対立遺伝子を使用する。ホモロジーアームを含む核酸を導入することによって、宿主細胞のDNA修復システムは、第2のゲノム対立遺伝子の代わりに、導入された核酸をテンプレートとして使用し、それによって、挿入される配列を組込む。「ホモロジーアーム」は、本明細書において使用される場合、そのDNA配列が標的ゲノム配列と同一である核酸配列に関する。典型的に、挿入される遺伝子配列は、3’および5’末端において各々1つのホモロジーアームによって隣接されている。「左」ホモロジーアーム、即ち、挿入される配列の3’のホモロジーアームは、SEQ ID NO: 22または23に示されるような配列を有し得る。「右」ホモロジーアーム、即ち、挿入される配列の5’のホモロジーアームは、SEQ ID NO: 24に示されるような配列を有し得る。これらの例示されるホモロジーアームは、ヒトB2M遺伝子中への組込みを媒介する(図5Aも参照されたい)。
【００６４】
3’および5’末端の各々上において1つのホモロジーアームによって隣接され得（me be flanked）、かつ、HLA-E二量体またはHLA-E三量体をコードする、挿入される遺伝子配列は、発現および／または機能を促進し得るさらなるエレメントを含み得る。これらの追加のエレメントとしては、例えばSEQ ID NO: 25に表されるような、T2A自己切断ペプチド、例えばSEQ ID NO: 26に表されるような、B2Mターゲッティングシグナル、またはpBHGAエレメント(SEQ ID NO: 27)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
HLA-E二量体の組込みのための例示的なベクターはSEQ ID NO: 17(B2MおよびHLA-Eの融合タンパク質を含む)を含み得、HLA-E三量体(標的ペプチド抗原、(G4S)3リンカー、B2MおよびHLA-Eの融合タンパク質を含む)の組込みのための例示的なベクターはSEQ ID NO: 19を含み得る。SEQ ID NO: 17および19は両方とも、本明細書に記載されるようにノックアウトされる、B2M遺伝子中への組込みへ向けられているホモロジーアームを含む。組込みのための例示されるベクターは全て、本明細書に記載されるような全ての追加のエレメントを含む。
【００６６】
様々な組織が本発明の方法で製造され得る。例としては、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織、脳組織、膵臓組織、肺組織、筋組織、胃腸組織、神経組織、皮膚組織、骨組織、骨髄、脂肪組織、結合組織または血管組織が挙げられるが、これらに限定されない。操作された組織の形成も任意で可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である細胞型へ多能性幹細胞を分化させる例示的な方法は、以下の実施例セクションにおいて見られ得る。多能性幹細胞の分化および操作された組織の形成は同時に起こり得るか、または分化は形成が始まる前に行われ得る。
【００６７】
操作された組織を製造する異なるアプローチが当業者に公知である。以下の技術が、例えば、本発明において使用され得る：1)組織工学：多能性幹細胞から分化された細胞をヒドロゲル環境中において規定の割合で混合する、例えば、Tiburcy et al. (2017), Circulation, 135:1832-1847を参照されたい；2)オルガノイド技術：出発材料は典型的に未分化多能性幹細胞(HES、iPSCまたはPaSC)であり、これらは、いわゆるマイクロ組織へ凝集されており(Ewart et al. (2018), Annu Rev Pharmacol Toxicol, 58:65-82を参照されたい)、これらは、原則としてさらにマクロ組織へ融合されるかまたはヒドロゲル/マトリックス環境中に埋め込まれ得る(Lancaster et al. 2013, Nature, 501:373-379およびWO2015/040142を参照されたい)；3)3Dプリンティング：結局は注型成形技術と同様の、組織の3Dプリンティング(Sudo (2014), Organogenesis, 10(2):216-224; Tiburcy et al. (2017), Circulation, 135:1832-1847も参照されたい)；4)脱細胞化器官の再細胞化：概念は、ヒト使用について再細胞化するためにブタ器官を使用することである(心臓についてはOtt et al. (2008), Nature medicine, 14(2):213-221も参照されたいが、概念は多くの他の器官について試みられる)；5)細胞シート技術：基本的には、細胞のいくつかの単層が積み重ねられ、器官を形成する(例えば、Shimizu et al. (2002), Circ Res 90:e40-e48; Sawa et al. (2015), Circ J 79 :991-999を参照されたい)。
【００６８】
第1の説明例として機能性心臓組織の製造を見て、国際特許出願WO 2015/040142(本明細書において「バイオ操作心筋」と呼ばれる)は、多能性幹細胞から操作心臓組織を製造するための方法を開示している。WO 2015/040142に記載される条件は、従って、機能性心臓組織の形成に関して、操作された組織の機能に必須である前記少なくとも1つの細胞型へ分化されている多能性幹細胞を得るための条件である。WO 2015/040142に記載されるこれらの条件は、機能性心臓組織の形成に関して、操作された組織の形成も可能にする、操作された組織の機能に必須である細胞型への多能性幹細胞の分化のための条件としても見なされ得る。従って、操作心臓組織の形成について、本発明の方法は以下の工程を含み得る：(i)多能性幹細胞を、有効量の(a) BMP4、アクチビンA、FGF2、GSK3阻害剤、および(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)の最終濃度をもたらす無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程；(ii)工程(i)において得られた細胞を、有効量のWntシグナル伝達経路の阻害剤および(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、細胞の心臓分化を誘導する工程；ならびに(iii)工程(ii)において得られた細胞を、機械的刺激下で、有効量の(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、心臓成熟を促進する工程。この文脈において、本出願の実施例セクションの実施例2も参照されたい。心臓組織の作製に関し、かつ、操作(心臓)組織の形成も任意で可能にする、操作された組織の機能に必須である細胞型への多能性幹細胞の分化についての条件を提供する、他の刊行物としては、Ogle et al. (2016), Sci Trans Med, 8(342), 1-7; Tiburcy et al. (2017), Circulation, 135:1832-1847; Ye et al. (2013), Cir Res, 113:922-932; Zimmermann (2009), Antioxidant & Redox Signaling, 11(8):2011-2023; Ott et al. (2008), Nature Medicine, 14(2):213-221; またはShimizu et al. (2002), 90:e40-e48が挙げられるが、これらに限定されない。多能性幹細胞の分化および操作された組織の形成は、同時に起こり得るか、または分化は形成が始まる前に行われ得る。WO 2015/040142の方法によって得られた心筋細胞は、その後、国際特許出願WO 2015/025030に記載される操作心臓組織(操作心筋(EHM)としても公知)を製造する方法によって処理され得る。従って、本発明の方法は、(iv)1つまたは複数の型の中に無血清再構成混合物を提供する工程であって、該再構成混合物が、(a)無血清最小必須培地；(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)および0.2〜2 mg/mlコラーゲンの最終濃度をもたらす無血清サプリメント；ならびに(c)工程(iii)において得られた細胞、および任意で多能性幹細胞に由来する、操作された組織の部分を形成する細胞型、好ましくはヒト非筋細胞を含み、ここで、総細胞混合物の20〜80%が工程(iii)において得られた細胞であり；ここで、再構成混合物が7.2〜7.6のpHを有する、工程；(v)該1つまたは複数の型の中で無血清再構成混合物を培養し、それによって、無血清再構成混合物を少なくとも15分間圧縮させる工程；(vi)該1つまたは複数の型の中の工程(v)において得られた混合物がその元の厚さの少なくとも50%へ圧縮するまで、無血清EHM培養培地中で該混合物を培養する工程であって、ここで、該EHM培養培地が、(a)0.5〜3 mmol/L Ca2+を含む基本培地；(b)(i)(b)に定義されるような無血清サプリメント；(c) 0.5〜10 mmol/L L-グルタミン；(d) 0.01〜1.0 mmol/Lアスコルビン酸；(e) 1〜100 ng/ml IGF-1；および(f) 1〜10 ng/ml TGFβ1を含む、工程；(vii)工程(iii)において得られた混合物を、工程(iii) (a)〜(f)に定義されるような無血清EHM培養培地中で、機械的伸張下で培養し、それによって、力を発生する操作された心臓組織を形成する工程をさらに含み得る。この操作心臓組織は操作心筋(EHM)としても公知である。あるいは、WO 2015/040142の方法は本発明の多能性幹細胞を用いて行うことができ、ここで、多能性幹細胞は、前に、I型コラーゲンのようなヒドロゲルにコロニーを作った。このアプローチは、オルガノイドとして記載され得るいわゆるバイオ操作心筋(BHM)の作製をもたらす。
【００６９】
当業者はまた、操作された組織の形成も任意で可能にする、操作された組織の機能に必須である細胞型への多能性幹細胞の分化についての条件下で、肝臓組織、腎臓組織、脳組織、膵臓組織、肺組織、筋組織、胃腸組織、神経組織、皮膚組織、骨組織、骨髄、脂肪組織、結合組織または血管組織のような他の操作された組織を製造することを知っている。多能性幹細胞の分化および操作された組織の形成は、同時に起こり得るか、または分化は形成が始まる前に行われ得る。肝臓組織の作製のためのそのような条件の例は、WO 2013/047639またはSudo (2014), Organogenesis, 10(2):216-224に開示されている。腎臓組織の作製のための好適な条件についての例は、Morizane et al. (2017), Stem Cells, 35:2209-2217に開示されている。脳組織または神経組織の作製のための好適な条件についての例は、Yang et al. (2011), Cell Stem Cell 9:517-525またはLancaster et al. (2013), Nature, 501:373-379に開示されている(本出願の実施例4も参照されたい)。膵臓組織の作製のための好適な条件についての例は、Pagliuca et al. (2014), Cell, 159:428-439に開示されている(本出願の実施例6も参照されたい)。機能性骨格筋組織の作製についての例は、Rao et al. (2018), Nature Communications, 9(126):1-12に開示されている(本出願の実施例5も参照されたい)。血管組織の作製のための好適な条件の例は、例えば、Song et al. (2018), Cell Stem Cell, 22:340-354に開示されている。最後に、網膜組織の作製のための好適な条件についての例は、例えば、Llonch et al, Developmental Biology 433 (2018) 132-143に記載されている。
【００７０】
多くの生物学的組織は1つの単一の細胞型のみを含まない。例えば、心筋は心筋細胞および細胞存在度においてより大きな非筋細胞コンポーネントを含み、これは主に線維芽細胞および内皮細胞を含む。心筋細胞は、組織の機能に、即ち心拍に必須である細胞型である一方、線維芽細胞は、組織を安定させる細胞外マトリックスを提供し、即ち、組織の部分を形成する細胞と見なされ得る。内皮細胞および平滑筋細胞は心臓血管に関与する。従って、本発明の方法は、少なくとも1つの第2の細胞型への多能性幹細胞の分化を誘導する工程をさらに含み得、ここで、第2の細胞型は操作された組織の部分を形成する。組織の機能に必須である細胞、および組織の部分を形成する細胞は、操作された組織を形成するために分化後に組み合わされ得る。そのような方法は、例えば、WO 2015/025030に記載されている。ここで、ヒト心筋細胞およびヒト非筋細胞、例えば、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞または間葉系幹細胞は、組織の部分を形成する細胞についての例であり、心筋細胞は、組織の機能に必須である細胞である。組織の機能に必須である細胞についておよび組織の部分を形成する(第2の)細胞について供給源として同じ多能性幹細胞を使用することによって、細胞は、同じ遺伝子改変を有し、即ち、B2Mを欠きかつ細胞表面上において免疫調節タンパク質を発現し、組み合わされた操作された組織を非免疫原性にする。
【００７１】
本発明はまた、非免疫原性の操作された組織を製造する方法に関するだけでなく、非免疫原性の操作された組織自体にも関する。従って、本発明は、操作された組織の機能に必須である細胞型を含む、操作された組織であって、該細胞型が、該型への多能性幹細胞の分化に適した条件下で該細胞型へ多能性幹細胞を分化させることによって得られたものであり、該多能性幹細胞が、MHCクラスI分子を欠損しておりかつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする、操作された組織に関する。本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる操作された組織に関連する。一つのそのような態様において、本発明は、多能性幹細胞を含む操作された組織であって、該多能性幹細胞が、MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、該多能性幹細胞が、操作された組織の形成も可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である細胞型へ分化され、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする、操作された組織に関する。
【００７２】
操作された組織は細胞外マトリックス材料をさらに含み得る。細胞外マトリックス(ECM)は、周囲の細胞へ構造的および生化学的サポートを提供する支持細胞によって分泌される細胞外分子の集団である。多細胞性は異なる多細胞系列において独立して進化したため、ECMの組成は多細胞構造間で異なり；しかし、細胞接着、細胞間コミュニケーションおよび分化はECMの共通の機能である。細胞外マトリックスは間質マトリックスおよび基底膜を含む。間質マトリックスは様々な細胞間に（即ち、細胞間隙中に）存在する。多糖類および線維性タンパク質のゲルは、間質腔を満たし、ECM上に置かれるストレスに対する圧縮緩衝材として作用する。基底膜は、例えば組織内の固定のためにおよび細胞外環境との連絡を可能にするために心筋細胞および内皮細胞を囲む、ECMのシート様堆積物である。各タイプの組織は特定のタイプのECMを有する：コラーゲン線維および骨塩は骨組織のECMを構成し；細網線維および基質は疎性結合組織のECMを構成し；血漿は血液のECMである。心臓の主なECM成分は、IおよびIII型コラーゲンであり、ヒアルロン酸ならびにラミニン、IV型コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチンおよびニドジェンのさらなる寄与を伴い、後者は基底膜の重要な成分である。I型コラーゲンは最も豊富なECM材料であり、従って、組織工学および生体工学における好ましい材料である。従って、細胞外マトリックス生体材料は、好ましくはI型コラーゲンである。一態様において、組織の形成は、ヒドロゲル、好ましくは、細胞外マトリックスタンパク質含有ヒドロゲル、例えば、フィブリンヒドロゲルまたはコラーゲンヒドロゲル、最も好ましくはコラーゲンヒドロゲルの存在下で行われる。
【００７３】
ECM材料はまた、通常は天然ECMの部分ではない、材料も含み得る。そのような非天然ECM材料は、好ましくは生体適合性であり、即ち、有毒ではなく、免疫反応を引き起こさない。そのような非天然ECM材料についての例としては、アルギネート、ヒドロゲル、または合成マトリックス、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリグリセロールセバケート(バイオゴム)、およびポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
操作された組織はまた、本発明の方法のプロダクトと同じ特性を有し得る。好ましくは、操作された組織は、CD8+ T細胞によって同種異系と認識されず、抗HLA抗体に結合せず、かつ／またはNK媒介性溶解に耐性である。そのような操作された組織は、対象中の損傷組織の少なくとも部分を置換し得る。好ましくは、操作された組織は抗-HLA-Aまたは抗-HLA-B抗体に結合しない。
【００７５】
本発明はさららに、本発明の操作された組織を含有する薬学的組成物に関する。薬学的組成物はまた、操作された組織を安定化するために緩衝液のような材料を含有し得る。
【００７６】
本発明の操作された組織または薬学的組成物は、様々な疾患の処置において有用である。それは、組織の不全または機能障害によって特徴付けられる疾患の処置における使用について特に好ましい。しかし、本発明はまた、疾患状態を処置する方法における使用のための本発明の操作された組織または薬学的組成物に関する。本発明はまた、有効量の本発明の操作された組織または薬学的組成物をその必要がある対象へ投与する工程を含む、疾患状態を処置する方法に関する。
【００７７】
多能性幹細胞は奇形腫を形成するリスクをもたらすため、操作された組織は、特に本発明の操作された組織が治療適用のためである場合、好ましくは、いかなる多能性幹細胞も含有しない。
【００７８】
疾患状態は、例えば、糖尿病、自己免疫疾患、癌、感染性疾患、心臓疾患、例えば心筋梗塞もしくは心不全、骨格もしくは関節の状態、筋ジストロフィー、骨形成不全症、熱傷、肝不全、腎不全、脳損傷、または軟部組織損傷であり得る。ここで、操作された組織は、ほんのいくつかの説明例を挙げると、自己免疫反応、外傷、不十分な血液供給、または熱傷によって、冒されたかまたは破壊された組織を置換し得る。
【００７９】
本発明はさらに、薬物毒性スクリーニングのためのインビトロモデルにおけるおよび／または研究ツールとしての本発明の操作された組織の使用に関する。この点に関して、操作された組織は、例えば、動物モデルの使用を回避するためにヒトの器官または組織の代用物として役立ち得る。
【００８０】
本発明のおよびその利点のよりよい理解は、説明目的のためにのみ提供される、以下の実施例から得ることができるだろう。実施例は決して本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【実施例】
【００８１】
実施例1：MHCクラスI分子を欠損しておりかつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含む多能性幹細胞の作製
β2-ミクログロブリン(B2M)のノックアウト
多能性幹細胞株50039をNINDSヒューマンセルアンドデータリポジトリから得た。この細胞株はまたLonzaから入手可能であり、Baghbaderani et al. (2015), Stem Cell Reports, 5:647-6659において特徴付けられた。Baghbaderaniらはまたこの細胞株を維持するための標準条件を開示している。これとは異なり、多能性細胞をStemMACS（商標）iPS-Brew培地中に維持した。細胞外マトリックスの提供について、CTGラミニン-521 (Biolamina)またはGeltrex (Thermo Scientific)を使用した。
【００８２】
B2M遺伝子の全てのコピーを破壊するために、Integrated DNA TechnologiesのAlt-R（登録商標）CRISPR/Cas技術を製造業者の説明書に従って使用した。CRISPR-Cas9 crRNAの配列に依存して、Alt-R Cas9ヌクレアーゼは二本鎖切断を特異的に導入することができ、これは非相同末端結合を生じさせ得、これは、遺伝子の機能を破壊する突然変異を最終的に導入する。3つの異なるcrRNAを使用した：
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図1Aは、エクソン1を囲むB2M遺伝子および異なるcrRNA(下線)の結合部位の概要を示す。全ての3つのcrRNAを、B2M遺伝子のB2M翻訳産物のN末端を形成する領域の近くに結合するように設計した。これらのcrRNAのうちの1つ、Alt-R Cas9ヌクレアーゼおよびAlt-R Cas9エレクトロポレーションエンハンサーを使用して、リボ核タンパク質複合体を形成し、これをPSC中へエレクトロポレーションした。異なるcrRNAの各々について、crRNA:tracRNA:Cas9 RNP複合体を製造業者の説明書に従って調製した。crRNA:tracRNA:Cas9 RNP複合体を、プログラムCB-150を使用するLonza 4Dヌクレオフェクターシステム(X-ユニット)およびP3溶液キット(Lonza, V4XP-3012)を使用してPSC中へトランスフェクトした。トランスフェクション後、PSCをプレーティングし、コロニーが現われるまで培養した。個々のコロニーを手動で取り、標準プロトコルを使用して継代した。ゲノム編集をシーケンシングによって確認した。60個の配列決定されたコロニーから、15個がB2Mのエクソン1内の突然変異を示した。
【００８３】
表1は結果の概要を示す。4つのコロニーのみがクローンであると確認された(クローン3、18、20、および34)。図2に示されるように、ゲノム編集は、1つ(クローン3)または2つの対立遺伝子(クローン18、20および34)中においてフレームシフトを生じさせた。
【００８４】
（表１）シーケンシング結果の概要。首尾よい欠失を示すクローン3、18、20および34が太字および下線で強調される。
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【００８５】
クローン3、18、20および34のFACS解析ならびに野生型iPSC細胞株50039との比較を行った(図3)。ここで、B2M (APC標識抗ヒトB2M、Biolegend)およびHLA-A,B,C (PE標識抗ヒトHLA-,B,C、Biolegend)の発現を解析した。図3から分かり得るように、野生型およびヘテロ接合クローン3は、非刺激およびインターフェロンγでの24時間刺激後の両方において、細胞表面上にHLAおよびB2Mを示す。両方の対立遺伝子上に突然変異を含む、3つの他のクローン18、20および34は、インターフェロンγでの24時間刺激後でさえそれらの細胞表面上においていかなるHLAおよびB2Mも示さず、それによって、全てのクローンが、以下に記載されるようなHLA融合タンパク質のノックインについての好適な出発細胞であることを確認する。
【００８６】
HLA-E融合タンパク質のノックイン
HLA-E融合タンパク質のノックインは、上記に記載されるクローン18、20および34のいずれかから出発して国際特許出願WO 2012/145384と同様に行われ得る。組込みフォーミーウイルスベクターを使用して、一本鎖B2M/HLA-E融合タンパク質をヒトPSC中において発現させ得る。フォーミーウイルスベクターは、B2M/HLA-E一本鎖融合構築物(「二量体」)を駆動するプロモーターを有する発現カセットを含み得る。B2M/HLA-E一本鎖融合タンパク質(「二量体」)は、SEQ ID NO: 18に表されるようなアミノ酸配列を有し得る。二量体の組込みのためのベクターはSEQ ID NO: 17を含み得る。三量体一本鎖融合構築物は、共有結合されたHLA-Gペプチド
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をさらに含み得る(「三量体」)。三量体の組込みのためのベクターはSEQ ID NO: 19を含み得る。B2M/HLA-E融合タンパク質を過剰発現するクローンは、融合タンパク質に結合する抗体を用いてフローサイトメトリーを使用することによって単離され得る。
【００８７】
そのようなアプローチをここで行ってもよい。Crispr/Cas9ターゲッティングが両方の対立遺伝子中に2 bp (CT)挿入を生じさせ、遺伝子発現においてフレームシフトを引き起こした、B2M KO TC1133 hIPSCクローン#34を、HLA-E遺伝子をノックインするための親B2M KO株として選択した。
【００８８】
B2M遺伝子はまたB2M Crispr 2/Cas9で首尾よく標的化され得るという概念実証を有して、B2M KOクローン#34中のエクソン1領域を、次にここで、B2M Crispr 2/Cas9、ならびに記載されたようなKO株の改変ゲノム配列に従って設計されたホモロジーアームを有するHLA-E-二量体(SEQ ID NO: 17)およびHLAE-三量体(SEQ ID NO: 19)配列を含有するドナープラスミドで標的化した(図5A)。相対的により高い細胞死が、未処置野生型細胞と比較した場合、予想通りに、エレクトロポレーション後に観察された。しかし、hIPCSはそれらの適切な形態を保持した(図5B)。pmaxGFPプラスミドで並行してトランスフェクトされたGFP+細胞のフローサイトメトリー解析によって実証されたように、80%を超えるトランスフェクション効率が得られた(図5C)。
【００８９】
HLA-E KI hIPSCクローンの特徴付け
HLA-E二量体および三量体プラスミドでトランスフェクトされたhIPSCを、コロニー形成のために96-ウェルプレート中へ単一細胞で播種した。加えて、トランスフェクトされたhIPSCプールからのゲノムDNAを同時に単離した。次に、PCRを、示されるように5’-ホモロジーアームおよびドナー配列内のプライマーを用いて行った(図6A)。予想されたように、親B2M KO株中において産物は検出されなかったが、トランスフェクトされたプール中において対応する領域が特異的に増幅され、これは、B2M遺伝子座中における首尾よい遺伝子組込みを示している(図6A)。予備データを考慮して、100個までのクローンをスクリーニングし、それらのうちのおよそ50個がHLA-E二量体(図6B)および三量体組込み(図6C)の両方の上流について陽性であると分かった。
【００９０】
次に、HLA-E挿入について潜在的に陽性であったクローンを遺伝子型決定した。5’から3’へのホモロジーアームのPCR増幅が、全配列の組込みを実証するために考えられた(図7A)。興味深いことに、正確な増幅(HLA-E二量体: 2.6 kbおよびHLA-E三量体: 2.8 kb)が、限られた数のクローン中において検出され、それらのうち、HLA-E二量体クローン#5および78ならびにHLA-E三量体クローン#66および100が、0.9 kbでの野生型対立遺伝子の排除を伴って明瞭なバンドを示した(図7BおよびC)。
【００９１】
HLA-E KI hIPSC中のHLA発現
次に、HLA-E二量体クローン#5および78ならびにHLA-E三量体クローン#66および100を培養し、先ず、多能性マーカー(OCT4AおよびNanog)の発現についてそれらを解析した。WTおよびB2M KO株を含む全てのクローンが、フローサイトメトリー解析によって実証されたように、OCT4AおよびNanogの両方の発現について90%を超えて二重陽性であることがわかった(図8)。
【００９２】
その後、hIPSCを、24時間のインターフェロン(IFN)-γでの刺激でのB2MおよびHLA-Eタンパク質発現について解析した。WT細胞は陽性対照としてB2Mを発現し、一方、B2M KO hIPSCは、予想通りに、B2MおよびHLA-Eについて陰性であった。加えて、>95%のHLA-E二量体(#5および#78)ならびに三量体クローン(#66および#100)が、B2MおよびHLA-E発現について陽性であった(図9)。
【００９３】
実施例2：バイオ操作心筋組織を作製するための改変PSCの使用
操作心筋は、WO 2015/040142およびTiburcy et al. (2017), Circulation, 135:1832-1847 ならびにWO 2015/025030に記載されるプロトコルを使用してPSCから出発して作製することができる。実施例1の、多能性幹細胞、特にクローン18、20および34がこの実施例において使用され得る。このプロトコルは、WO 2015/040142に記載されるような中胚葉分化、心臓分化および心臓成熟を誘導する工程、続いてのWO 2015/025030に記載されるようなI型コラーゲンヒドロゲル中における指向された組織の形成を含む。
【００９４】
第1の工程において、PSCは心筋細胞へ分化されなければならない。これは、例えば、Tiburcy et al. (2017), Circulation, 135:1832-1847に記載されるように、WO 2015/040142に元は開示されるように、行うことができる。実施例1の多能性幹細胞(PSC)を、リン酸緩衝食塩水(PBS)中1:30マトリゲルコートプレート上に5×104〜1×105細胞/cm2でプレーティングし得、10 ng/mL線維芽細胞増殖因子-2 (FGF2)またはTeSR-E8 (STEMCELL Technologies)を含む照射ヒト包皮線維芽細胞(HFF)馴化培地と1:1混合された、ノックアウトDMEM、20%ノックアウト血清代替物、2 mmol/Lグルタミン、1%非必須アミノ酸、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン(全てLife Technologies)中において培養し得る。1日後、細胞は、ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地でリンスされ得、次いで、3日間、RPMI、2% B27、200μmol/L l-アスコルビン酸-2-リン酸セスキマグネシウム塩水和物(Sigma-Aldrich)、9 ng/mLアクチビンA (R&D Systems)、5 ng/mL BMP4 (R&D Systems)、1μmol/L CHIR99021 (Stemgent)、および5 ng/mL FGF-2 (Miltenyi Biotec)で処理され得る。RPMI培地でのさらなる洗浄後、細胞を、5μmol/L IWP4 (Stemgent)、続いてRPMI、2% B27、200μmol/L l-アスコルビン酸-2-リン酸セスキマグネシウム塩水和物と共に、4日目から13日目まで培養し得る。示される場合、心筋細胞は、グルコースおよびグルタミンを含まないRPMI(Biological Industries)、2.2 mmol/L乳酸ナトリウム(Sigma-Aldrich)、100μmol/L β-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich)、100 U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン中において、13日目から17日目まで、グルコース除去によって代謝的に精製することができる。
【００９５】
Tiburcy et al. (2017), Circulation, 135:1832-1847に記載され、WO 2015/025030に元は記載されたような、定義される無血清EHMを作製するために、細胞は、pH中和医療等級ウシコラーゲン(LLC Collagen Solutions, 0.4 mg/EHM)、濃縮無血清培地(2x RPMI、8% B27(インスリン無し)、200 U/mlペニシリン、および200μg/mlストレプトマイシン)の混合物中に再構成し、4% B27(インスリン無し)、1%非必須アミノ酸、2 mmol/lグルタミン、300μmol/lアスコルビン酸、100 ng/ml IGF1 (AF-100-11)、10 ng/ml FGF-2 (AF-100-18B)、5 ng/ml VEGF165 (AF-100-20)、5 ng/ml TGFβ1 (AF-100-21C; 培養0〜3日目中に必須)、100 U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを含むIscove培地中で培養することができる(無血清プロトコル、表2)。全ての増殖因子は、「動物質を含まない組換えヒト増殖因子」としてPeprotechから購入され、円形の型(内/外径: 2/4 mm; 高さ: 5 mm)中に移され得る。ヒト心筋組織は、次いで、鋳型内で急速に圧縮することができ、培養3日目に、増負荷性収縮を促進するために好ましくはフレキシブルストレッチデバイス上へ移してもよい(Zimmermann et al. (2006), Nat Med, 12:452-458; Soong et al. (2012), Curr Protoc Cell Biol 55:23.8.1.-23.8.21; Tiburcy et al. (2014) Methods Mol Biol 1181:167-176; 参照により本明細書に組み入れられ、WO 2007/054286に開示される)。培地を一日おきに交換した。伸張下での心筋組織培養を少なくとも7日間行う。図12はこのプロトコルの例示的な結果を示す。
【００９６】
（表２）EHMプロトコルの概要
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DMEMはダルベッコ変法イーグル培地を示す；EHM、操作ヒト心筋層；FGF-2、線維芽細胞増殖因子-2；IGF-1、インスリン様増殖因子1；RPMI、ロズウェルパーク記念研究所培地；TGF-β1、トランスホーミング増殖因子-β1；およびVEGF165、血管内皮増殖因子165。
＊あるいは≧1.2mmol/Lカルシウムを含む他の基本培地。
【００９７】
実施例3：バイオ操作心筋組織を作製するための改変PSCの使用
本明細書において得られたhIPSC(実施例1を参照されたい)を、上記実施例2において記載されたプロトコルに基づいて心筋細胞(CM)へ分化させた(Tiburcy et al. 2017ならびにWO 2015/025030)。HLA-E KI hIPSC由来CMは、>90%のアクチニン+細胞の高純度を伴って、筋節タンパク質；アルファ-アクチニンおよび心筋トロポニンT(cTnT)の発現を示した(図10A)。
【００９８】
フローサイトメトリー解析は、WT CMは、基本条件下にてB2MならびにHLAクラスI分子；HLA-BおよびCを発現するが、HLA-Eを発現しないことを明らかにした。IFN-γ処理は、B2MおよびHLA-B, C分子におけるさらにより強い発現ならびに僅かにより少ないHLA-E発現(約60%)を誘導した。陰性対照として、B2M KO CMは、予想通りに、HLA発現を示さなかった。HLA-E KIクローン(二量体および三量体の両方)は、IFN-γ処理後にのみB2MおよびHLA-Eを発現し、いかなる他のHLAクラスI発現も示さなかった。HLA-E三量体hIPSC株から分化されたCMは、初期解析についてHLA-E二量体中のそれらの相当物と比較した場合にHLA-Eの僅かにより高い発現を示した(HLA-E二量体CM: >85%およびHLA-E三量体CM: >95% HLA-E陽性；図10B)。
【００９９】
従って、この実施例において、心筋細胞(操作心臓組織の機能に必須である細胞型として)が、多能性幹細胞の細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損しており、かつ、それらの表面上に免疫調節タンパク質を含む多能性幹細胞から実験的に提供された。
【０１００】
この実施例は、本明細書に記載されるような得られた心筋細胞から非免疫原性操作心臓組織を作製することをさらに目的とし、本明細書に記載されるTiburcy et al. 2017およびWO 2015/025030のプロトコルを使用した(実施例2を参照されたい)。図11Aは採用したアプローチの略図を示し、図11Bは製造プロセス中のEHMの画像を示す。図12は例示的なEHMの写真である。
【０１０１】
線維芽細胞を、操作された組織の部分を形成する第2の細胞型として使用した。これらの細胞は結合組織を提供する。この実施例において、非改変線維芽細胞、即ち、免疫原性の改変を有さない線維芽細胞を使用した。処置における使用のために、操作された組織の部分を形成する線維芽細胞は、多能性幹細胞の細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損しており、かつ、それらの表面上に免疫調節タンパク質を含む、多能性幹細胞から得ることもできる。
【０１０２】
本明細書に記載されるようなEHMの製造の完了後、野生型EHM、B2MノックアウトEHM、HLA-E二量体EHMおよびHLA-E三量体EHMの収縮力(FOC)の比較を行った(図10Cを参照されたい)。結果から明らかであるように、全ての解析されたEHMは、Ca2+濃度の増加で収縮力の増加を示す。興味深いことに、遺伝子改変されたPSCに由来するEHMは、非改変(WT)EHMよりもより高い収縮力を示した。
【０１０３】
要するに、本実施例は、EHM(本発明の非免疫原性の操作された組織の説明例として)が、前記少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化によって得られた心筋細胞から製造され得ることを示し、ここで、多能性幹細胞は、多能性幹細胞の細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損しており(B2Mノックアウト)、かつ、それらの表面上に免疫調節タンパク質(HLA-E二量体/三量体)を含む。
【０１０４】
実施例4：操作脳組織/ニューロンを作製するための改変PSCの使用
ヒト脳組織の作製についての例がLancaster et al. 2013, Nature, 501:373-379に開示されている。ここで、脳オルガノイドが作製される。実施例1の多能性幹細胞がこの実施例において使用され得る。
【０１０５】
PSCは、WiCellプロトコルに従ってCF-1-ガンマ線照射マウス胚性幹細胞(MEF)(Global Stem)上に維持され得る。オルガノイド培養の0日目に、継代50未満のPSCをディスパーゼ処理によってMEFから解離してもよく、MEFを幹細胞コロニーの重力分離によって除去し、その後、単一細胞を生じさせるためにPSCをトリプシン処理することができる。合計で、4,500個の細胞を、次いで、低濃度塩基性線維芽細胞増殖因子(4 ng/ml)および50 mM Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤(Calbiochem)を含むヒトES培地中の超低結合96-ウェルプレート(Corning)の各ウェル中にプレーティングし得る。胚様体に6日間一日おきに供給し、次いで、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)/F12、1:100 N2サプリメント(Invitrogen)、Glutamax (Invitrogen)、最小必須培地-非必須アミノ酸(MEM-NEAA)および1 mg/mlヘパリン50 (Sigma)を含有する神経誘導培地中の低接着24-ウェルプレート(Corning)へ移し得る。細胞は次いで神経上皮組織を形成し始め得、これに5日間一日おきに供給した。プロトコルの11日目に、組織を、小さな3mmのくぼみを有するパラフィルムのシート上の冷マトリゲル中へピペッティングすることによって、マトリゲル(BD Biosciences)の液滴へ移し得る。これらの液滴は37℃でゲル化させることが可能であり得、その後、パラフィルムから除去し、DMEM/F12の1:1混合物ならびに1:200 N2サプリメント(Invitrogen)、1:100 ビタミンAを含まないB27サプリメント(Invitrogen)、3.5μl/l 2-メルカプトエタノール、1:4,000インスリン(Sigma)、1:100 Glutamax (Invitrogen)および1:200 MEM-NEAAを含有するNeurobasalを含有する分化培地中で増殖させた。4日間の定常増殖後、組織液滴を、ビタミンAを含むB27サプリメント(Invitrogen)が使用され得ることを除いて上記のような分化培地を含有するスピニングバイオリアクターへ移し得る。レチノイン酸はインビボでの神経分化に重要であることが示されたため、それは、脳オルガノイドを分化させるために使用される最終培地中に含まれ得る。
【０１０６】
実施例5：操作骨格筋組織を作製するための改変PSCの使用
骨格筋組織へのPSCの分化を誘導するための例示的な方法はRao et al. (2018), Nature Communications, 9(126):1-12に開示されている。実施例1の多能性幹細胞がこの実施例において使用され得る。分化プロトコルはいくつかの工程に分割される：
【０１０７】
iMPCへのhPSCの筋分化
PSCはE8培地(Stemcell Technologies)中においてフィーダーフリー条件で維持され得る。PSCコロニーは、Accutase (Stemcell Technologies)で単一細胞へ解離され、1 × 103/cm2の細胞密度でマトリゲル(Corning)コート6-ウェルプレート上へ播種され得る。PSCは、増大のためにE8中に維持され、次いでAccutaseで単一細胞へ解離され、3.3 × 104細胞/cm2で、Y27632 (5μM, Tocris)が補われたE8中のマトリゲルコート6-ウェルプレート上へ播種され得る。翌日、E8培地はE6培地と交換され得、細胞は、CHIR99021 (10μM, Selleck Chemical)が補われて2日間培養され得、この後、CHIR99021は除去され得、人工筋原性前駆細胞(iMPC)が下記に記載されるようにFACSによって選別され得るまで、18日間、1μg/mL Dox (Sigma)がE6培地に補われ得る。
【０１０８】
フローサイトメトリー解析
細胞は、0.25%トリプシン-EDTAで解離され、カウントされ、PBSで洗浄され得、次いで、2 × 106〜1 × 107細胞/mlの濃度でフローバッファー中に再懸濁され得る。Tra-1-81またはCD56を発現する細胞をカウントするために、抗-Tra-1-81 (Stemgent, 09-0011)または抗-CD56 (PE, R&D, FAB2408P)抗体およびアイソタイプ一致対照が、製造業者の説明書に従って適用され得、細胞は、FACSCanto（商標）IIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して解析され得る。関心対象の細胞集団は、先ず、細胞サイズおよび粒状性について、次いでTra-1-81またはCD56の発現レベルについて、ゲーティングされ得る。
【０１０９】
iMPCの選別
分化20日目に、細胞を0.25%トリプシン-EDTA (Thermo)で解離し、中和培地中で洗浄し得る。分離された細胞を300 gで5分間遠心分離し得、次いで選別溶液中に再懸濁させ、クラスターおよび砕片を除去するために30μMフィルター(SYSMEX)で濾過し得る。単一細胞懸濁液は選別まで氷上に維持され得、未分化hPSCが陰性対照として使用される。細胞を、MoFlo（登録商標）Astrios（商標）セルソーター(Beckman Coulter)を使用してGFPについて選別し得る。
【０１１０】
iMPCの増大
選別後、iMPCは収集溶液中の氷上に維持され、300 gで5分間遠心沈殿され、Y27632、Dox、およびbFGFが補われた新鮮なE6培地中に再懸濁され得、次いでマトリゲルコートフラスコ中に4 × 104/cm2で播種され得る。選別後の24〜48時間後、細胞を、DoxおよびbFGFが補われた、増大培地(EM)中においてインキュベートし得、80%コンフルエンスに達した後3〜4日毎に1:3〜1:6比で継代し得る。
【０１１１】
iMPCの2D分化
iMPCを、マトリゲルコート皿上に1 × 105/cm2の密度で播種し得、100%コンフルエンスに達した後、EMをPBSで洗い落とし、分化培地(DM)へ切り替え得、これを一日おきに交換し得る。
【０１１２】
iSKM束の製作および分化
三次元操作骨格筋(iSKM束)は、3D機械加工テフロンマスターからキャストされた、2つの半円筒形ウェル(長さ7 mm、直径2 mm)を含有するポリジメチルシロキサン(PDMS)型内で形成され得る。PDMS型は、ヒドロゲル接着を防ぐために、室温で1時間、0.2% (w/v)プルロニック(Invitrogen)でコーティングされ得る。2つのウェル周りに配置されたLaser-cut Cerex（登録商標）フレーム(9 × 9 mm2、1 mm幅の縁)は、束末端を固定しそして取り扱いおよび移植を容易にするために役立つ。細胞/ヒドロゲル混合物をPDMSウェル中へ注入し、37℃で30分間重合してもよい。形成されたiSKM束を、4日間、1μg/mL Doxおよび1.5 mg/mL 6-アミノカプロン酸(ACA, Sigma)が補われたEM中のロッキングプラットフォーム上において維持してもよい。培地は、次いで、2 mg/mL ACAおよび50μg/mLアスコルビン酸(Sigma)が補われたDMへ切り替えられ得、培地は毎日交換される。
【０１１３】
実施例6：操作膵臓組織を作製するための改変PSCの使用
膵臓組織、またはより具体的には、インスリン分泌β細胞を作るための例示的な方法は、Pagliuca et al. (2014), Cell, 159:428-439に開示されている。ここで、多能性幹細胞はインスリン産生膵β細胞(SC-β)へ分化される：
【０１１４】
SC-β細胞分化の開始のために、多能性幹細胞は、mTeSR1培地+10 mM Y27632中に6 x 105細胞/mlで播種され得る。分化は、培地を日培地へ変更することによって始めてもよい。培地変更は以下の通りであった。1日目：S1 + 100 ng/mlアクチビンA (R&D Systems) + 3 mMChir99021 (Stemgent)。2日目：S1 + 100 ng/mlアクチビンA。4, 6日目：S2 + 50 ng/ml KGF (Peprotech)。7、8日目：S3 + 50 ng/ml KGF + 0.25 mM Sant1 (Sigma) + 2 mM RA (Sigma) + 200 nM LDN193189 (7日目のみ) (Sigma) + 500 nM PdBU (EMD Millipore)。9、11、13日目：S3 + 50 ng/ml KGF + 0.25 mM Sant1 + 100 nM RA。14、16日目：S5 + 0.25 mM Sant1 + 100 nM RA + 1 mM XXI (EMD Millipore) + 10 mM Alk5i II (Axxora) + 1 mM T3 (EMD Millipore) + 20 ng/mlベータセルリン(Thermo Fisher Scientific)。18、20日目：S5 + 25 nM RA + 1 mM XXI + 10 mM Alk5i II + 1 mM T3 + 20 ng/ mlベータセルリン。21〜35日目(一日おきに変更する)：S6 + 10 mM Alk5i II + 1 mM T3。それによってSC-β細胞への多能性幹細胞の分化を誘導する。
【０１１５】
本明細書中における以前に公表された文書の列挙または議論は、文書が最先端技術の一部であるかまたは共通の一般知識であるという認識として必ずしも見なされるべきではない。
【０１１６】
本明細書に説明的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されない、任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の限定の非存在下で適切に実施され得る。従って、例えば、用語「含む」、「包含する」、「含有する」などは、拡張的にかつ非限定的に読まれるものとする。加えて、本明細書に用いられる用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用され、表示および記載される特徴またはその部分の等価物を排除するというそのような用語および表現の使用における意図はなく、しかし、様々な改変が、特許請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。従って、本発明は例示的な態様および任意選択の特徴によって具体的に開示されたが、本明細書に開示されるその中において具体化される本発明の改変および変更が、当業者によって想到され得ること、ならびにそのような改変および変更は本発明の範囲内にあると見なされることが、理解されるべきである。
【０１１７】
本発明は本明細書において広くかつ一般的に記載されている。一般的な開示内に入るより狭い種および下位概念の群の各々もまた本発明の部分を形成する。これは、除去される材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の構成要素を除去する但し書きまたは否定的限定を伴う、本発明の一般的な記載を含む。
【０１１８】
他の態様は、添付の特許請求の範囲内にある。加えて、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群によって記載される場合、当業者は、本発明はまた、それによって、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループによって記載されていることを認識するだろう。
【図１】
2021534813.tif 000010
【図２】
2021534813.tif 000011
【図３−１】
2021534813.tif 000012
【図３−２】
2021534813.tif 000013
【図３−３】
2021534813.tif 000014
【図４−１】
2021534813.tif 000015
【図４−２】
2021534813.tif 000016
【図５】
2021534813.tif 000017
【図６Ａ】
2021534813.tif 000018
【図６Ｂ】
2021534813.tif 000019
【図６Ｃ】
2021534813.tif 000020
【図７Ａ】
2021534813.tif 000021
【図７Ｂ】
2021534813.tif 000022
【図７Ｃ】
2021534813.tif 000023
【図８】
2021534813.tif 000024
【図９−１】
2021534813.tif 000025
【図９−２】
2021534813.tif 000026
【図１０Ａ】
2021534813.tif 000027
【図１０Ｂ−１】
2021534813.tif 000028
【図１０Ｂ−２】
2021534813.tif 000029
【図１１Ａ】
2021534813.tif 000030
【図１１Ｂ】
2021534813.tif 000031
【図１１Ｃ】
2021534813.tif 000032
【図１２】
2021534813.tif 000033
【配列表】
2021534813000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年6月25日(2021.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法であって、該多能性幹細胞が、該多能性幹細胞の細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、
該方法が、
操作された組織の形成を可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの細胞型および該組織の部分を形成する少なくとも1つの第2の細胞型の存在下で操作された組織を形成し、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程であって、該少なくとも1つの細胞型が、該少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化によって得られたものであり、かつ該少なくとも1つの第2の細胞型が、該少なくとも1つの第2の細胞型への多能性幹細胞の分化によって得られたものである、工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記操作された組織が、
(a)エフェクターT細胞によって同種異系と認識されない、かつ／または
(b)NK媒介性溶解に耐性である、
請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記操作された組織が抗HLA抗体に結合しない、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記免疫調節タンパク質が一本鎖融合HLAクラスIタンパク質である、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-FおよびHLA-Gからなる群より選択されるHLAクラスIα鎖の少なくとも一部分へ共有結合されたB2Mの少なくとも一部分を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Aの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項７】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-A0201の少なくとも一部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Eの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項９】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Gの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項１０】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Bの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項１１】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Cの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項１２】
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Fの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
【請求項１３】
前記多能性幹細胞が、該多能性細胞表面上の一本鎖融合HLAクラスIタンパク質によって提示される標的ペプチド抗原をさらに発現する、請求項4〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記標的ペプチド抗原が、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質へ共有結合されている、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記標的ペプチド抗原が配列VMAPRTLFL (SEQ ID NO: 1)を含む、請求項13または14記載の方法。
【請求項１６】
β-ミクログロブリン2遺伝子の本質的に全てのコピーが多能性幹細胞において破壊されている、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記操作された組織の部分を形成する第2の細胞型が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
前記操作された組織が、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織、脳組織、膵臓組織、肺組織、骨格筋組織、胃腸組織、神経組織、皮膚組織、骨組織、骨髄、脂肪組織、結合組織、網膜組織および血管組織からなる群より選択される、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記操作された組織が心臓組織であり、前記方法が、
(i)多能性幹細胞を、有効量の、
(a) BMP4、アクチビンA、FGF2、GSK3阻害剤、および
(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)の最終濃度を生じる無血清サプリメント
を含む基本培地中で培養し、それによって、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程；
(ii)工程(i)において得られた細胞を、有効量のWntシグナル伝達経路の阻害剤および(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、細胞の心臓分化を誘導する工程；ならびに
(iii)工程(ii)において得られた細胞を、機械的刺激下で、有効量の(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、心臓成熟を促進する工程
を含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記組織の形成が、ヒドロゲル、好ましくは細胞外マトリックスタンパク質含有ヒドロゲル、例えばフィブリンヒドロゲルまたはコラーゲンヒドロゲル、最も好ましくはコラーゲンヒドロゲルの存在下で行われる、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
(iv)1つまたは複数の型の中に無血清再構成混合物を提供する工程であって、該再構成混合物が、
(a)無血清最小必須培地；
(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)および0.2〜2 mg/mlコラーゲンの最終濃度を生じる無血清サプリメント；ならびに
(c)工程(iii)において得られた細胞、および操作された組織の部分を形成する細胞型、好ましくはヒト非筋細胞
を含み、任意で該操作された組織の部分を形成する細胞が多能性幹細胞に由来するものであり、総細胞混合物の20〜80%が工程(iii)において得られた細胞であり；
該再構成混合物が7.2〜7.6のpHを有する、工程；
(v)該1つまたは複数の型の中で無血清再構成混合物を培養し、それによって、無血清再構成混合物を少なくとも15分間圧縮させる工程；
(vi)該1つまたは複数の型の中の工程(v)において得られた混合物がその元の厚さの少なくとも50%へ圧縮するまで、無血清EHM培養培地中で該混合物を培養する工程であって、ここで、該EHM培養培地が、(a)0.5〜3 mmol/L Ca2+を含む基本培地；(b)(i)(b)に定義されるような無血清サプリメント；(c) 0.5〜10 mmol/L L-グルタミン；(d) 0.01〜1.0 mmol/Lアスコルビン酸；(e) 1〜100 ng/ml IGF-1；および(f) 1〜10 ng/ml TGFβ1を含む、工程；
(vii)工程(iii)において得られた混合物を、工程(iii) (a)〜(f)に定義されるような無血清EHM培養培地中で、機械的伸張下で培養し、それによって、力を発生する（force-generating）操作された心臓組織を形成する工程
をさらに含む、請求項19または20記載の方法。
【請求項２２】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および単為発生幹細胞からなる群より選択される、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記多能性幹細胞が、霊長類起源の多能性幹細胞、好ましくはヒト多能性幹細胞である、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記多能性幹細胞が、臍帯血から単離されたCD34陽性細胞から作製される、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記多能性幹細胞が、NINDSヒューマンセルアンドデータリポジトリ（NINDS Human Cell and Data Repository）のND-50039である、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
操作された組織の部分を形成する少なくとも1つの第2の細胞型への多能性幹細胞の分化をさらに誘導する工程であって、操作された組織の機能に必須である細胞型の細胞と操作された組織の部分を形成する第2の細胞型の細胞とを、操作された組織を形成するために分化後に接触させる、工程
をさらに含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記操作された組織の部分を形成する第2の細胞型が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞または間葉系幹細胞である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
B2Mの破壊および／または免疫調節タンパク質の挿入が、操作されたヌクレアーゼによって媒介される、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
免疫調節タンパク質の挿入が、SEQ ID NO: 17または19に示される核酸配列を含むベクターを用いて、CRISPR/Cas9によって媒介される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR/Cas9)からなる群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
前記操作されたヌクレアーゼがCRISPR/Cas9であり、crRNAが、
2021534813.tif 000034
からなる群より選択される、請求項28〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
操作された組織を形成させている間に、前記多能性幹細胞を前記少なくとも1つの細胞型へ分化させる、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
操作された組織の機能に必須である細胞型であって、該細胞型が、該細胞型への多能性幹細胞の分化に適した条件下で該細胞型へ多能性幹細胞を分化させることによって得られたものであり、該多能性幹細胞が、MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含む、細胞型と
該組織の部分を形成する少なくとも1つの第2の細胞型であって、該少なくとも1つの第2の細胞型が、該少なくとも1つの第2の細胞型への多能性幹細胞の分化によって得られたものである、少なくとも１つの第2の細胞型と
を含み、
それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする、
操作された組織。
【請求項３４】
請求項1〜32のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、操作された組織。
【請求項３５】
請求項1〜32のいずれか一項記載の方法によって得られた、操作された組織。
【請求項３６】
細胞外マトリックス生体材料をさらに含む、請求項33〜35のいずれか一項記載の操作された組織。
【請求項３７】
前記細胞外マトリックス生体材料が、アルギネート、ヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、または合成マトリックス、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリグリセロールセバケート(バイオゴム)、およびポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレートであり、好ましくは該細胞外マトリックス生体材料がI型コラーゲンである、請求項36記載の操作された組織。
【請求項３８】
前記合成マトリックス材料がポリ乳酸またはポリグリコール酸である、請求項37記載の操作された組織。
【請求項３９】
前記操作された組織が、
(a)エフェクターT細胞によって同種異系と認識されず、
(b)抗HLA抗体に結合せず、かつ／または
(c)NK媒介性溶解に耐性である、
請求項32〜37のいずれか一項記載の操作された組織。
【請求項４０】
請求項33〜39のいずれか一項記載の操作された組織を含む、薬学的組成物。
【請求項４１】
疾患状態を処置するための、請求項33〜39のいずれか一項記載の操作された組織または請求項40記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記疾患状態が、糖尿病、自己免疫疾患、癌、感染症、心筋梗塞、心不全、骨格もしくは関節の状態、骨形成不全症、熱傷、肝不全、腎不全、脳損傷、または軟部組織損傷からなる群より選択される、請求項41記載の操作された組織もしくは薬学的組成物。
【請求項４３】
(a)薬物毒性スクリーニングのためのインビトロモデルにおける、および／または
(b)研究ツールとしての、
請求項33〜39のいずれか一項記載の操作された組織の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明は、詳細な説明を参照して、図面、非限定的な実施例および添付の特許請求の範囲と共に考慮される場合、よりよく理解されるだろう。
[本発明1001]
多能性幹細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法であって、該多能性幹細胞が、該多能性幹細胞の細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、
該方法が、
操作された組織の形成を可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの細胞型の存在下で操作された組織を形成し、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程であって、該少なくとも1つの細胞型が、該少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化によって得られたものである、工程
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記操作された組織が、
(a)エフェクターT細胞によって同種異系と認識されない、かつ／または
(b)NK媒介性溶解に耐性である、
本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記操作された組織が抗HLA抗体に結合しない、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記免疫調節タンパク質が一本鎖融合HLAクラスIタンパク質である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-FおよびHLA-Gからなる群より選択されるHLAクラスIα鎖の少なくとも一部分へ共有結合されたB2Mの少なくとも一部分を含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Aの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1007]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-A0201の少なくとも一部分を含む、本発明1004〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Eの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1009]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Gの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1010]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Bの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1011]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Cの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1012]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Fの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1013]
前記多能性幹細胞が、該多能性細胞表面上の一本鎖融合HLAクラスIタンパク質によって提示される標的ペプチド抗原をさらに発現する、本発明1004〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記標的ペプチド抗原が、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質へ共有結合されている、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記標的ペプチド抗原が配列VMAPRTLFL (SEQ ID NO: 1)を含む、本発明1013または1014の方法。
[本発明1016]
β-ミクログロブリン2遺伝子の本質的に全てのコピーが多能性幹細胞において破壊されている、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
組織の部分を形成する少なくとも1つの第2の細胞型の存在下で、操作された組織を形成する工程を含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記操作された組織の部分を形成する第2の細胞型が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記操作された組織が、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織、脳組織、膵臓組織、肺組織、骨格筋組織、胃腸組織、神経組織、皮膚組織、骨組織、骨髄、脂肪組織、結合組織、網膜組織および血管組織からなる群より選択される、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記操作された組織が心臓組織であり、前記方法が、
(i)多能性幹細胞を、有効量の、
(a) BMP4、アクチビンA、FGF2、GSK3阻害剤、および
(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)の最終濃度を生じる無血清サプリメント
を含む基本培地中で培養し、それによって、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程；
(ii)工程(i)において得られた細胞を、有効量のWntシグナル伝達経路の阻害剤および(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、細胞の心臓分化を誘導する工程；ならびに
(iii)工程(ii)において得られた細胞を、機械的刺激下で、有効量の(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、心臓成熟を促進する工程
を含む、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記組織の形成が、ヒドロゲル、好ましくは細胞外マトリックスタンパク質含有ヒドロゲル、例えばフィブリンヒドロゲルまたはコラーゲンヒドロゲル、最も好ましくはコラーゲンヒドロゲルの存在下で行われる、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
(iv)1つまたは複数の型の中に無血清再構成混合物を提供する工程であって、該再構成混合物が、
(a)無血清最小必須培地；
(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)および0.2〜2 mg/mlコラーゲンの最終濃度を生じる無血清サプリメント；ならびに
(c)工程(iii)において得られた細胞、および操作された組織の部分を形成する細胞型、好ましくはヒト非筋細胞
を含み、任意で該操作された組織の部分を形成する細胞が多能性幹細胞に由来するものであり、総細胞混合物の20〜80%が工程(iii)において得られた細胞であり；
該再構成混合物が7.2〜7.6のpHを有する、工程；
(v)該1つまたは複数の型の中で無血清再構成混合物を培養し、それによって、無血清再構成混合物を少なくとも15分間圧縮させる工程；
(vi)該1つまたは複数の型の中の工程(v)において得られた混合物がその元の厚さの少なくとも50%へ圧縮するまで、無血清EHM培養培地中で該混合物を培養する工程であって、ここで、該EHM培養培地が、(a)0.5〜3 mmol/L Ca2+を含む基本培地；(b)(i)(b)に定義されるような無血清サプリメント；(c) 0.5〜10 mmol/L L-グルタミン；(d) 0.01〜1.0 mmol/Lアスコルビン酸；(e) 1〜100 ng/ml IGF-1；および(f) 1〜10 ng/ml TGFβ1を含む、工程；
(vii)工程(iii)において得られた混合物を、工程(iii) (a)〜(f)に定義されるような無血清EHM培養培地中で、機械的伸張下で培養し、それによって、力を発生する（force-generating）操作された心臓組織を形成する工程
をさらに含む、本発明1020または1021の方法。
[本発明1023]
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および単為発生幹細胞からなる群より選択される、本発明1001〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記多能性幹細胞が、霊長類起源の多能性幹細胞、好ましくはヒト多能性幹細胞である、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記多能性幹細胞が、臍帯血から単離されたCD34陽性細胞から作製される、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記多能性幹細胞が、NINDSヒューマンセルアンドデータリポジトリ（NINDS Human Cell and Data Repository）のND-50039である、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
操作された組織の部分を形成する少なくとも1つの第2の細胞型への多能性幹細胞の分化をさらに誘導する工程であって、操作された組織の機能に必須である細胞型の細胞と操作された組織の部分を形成する第2の細胞型の細胞とを、操作された組織を形成するために分化後に接触させる、工程
をさらに含む、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記操作された組織の部分を形成する第2の細胞型が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞または間葉系幹細胞である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
B2Mの破壊および／または免疫調節タンパク質の挿入が、操作されたヌクレアーゼによって媒介される、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR/Cas9)からなる群より選択される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記操作されたヌクレアーゼがCRISPR/Cas9であり、crRNAが、
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からなる群より選択される、本発明1029または1030の方法。
[本発明1032]
操作された組織を形成させている間に、前記多能性幹細胞を前記少なくとも1つの細胞型へ分化させる、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
操作された組織の機能に必須である細胞型を含む、操作された組織であって、
該細胞型が、該細胞型への多能性幹細胞の分化に適した条件下で該細胞型へ多能性幹細胞を分化させることによって得られたものであり、該多能性幹細胞が、MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、
それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする、
前記操作された組織。
[本発明1034]
組織の部分を形成する少なくとも第2の細胞型をさらに含む、本発明1033の操作された組織。
[本発明1035]
本発明1001〜1032のいずれかの方法によって得ることができる、操作された組織。
[本発明1036]
本発明1001〜1032のいずれかの方法によって得られた、操作された組織。
[本発明1037]
細胞外マトリックス生体材料をさらに含む、本発明1033〜1036のいずれかの操作された組織。
[本発明1038]
前記細胞外マトリックス生体材料が、アルギネート、ヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、または合成マトリックス、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリグリセロールセバケート(バイオゴム)、およびポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレートであり、好ましくは該細胞外マトリックス生体材料がI型コラーゲンである、本発明1037の操作された組織。
[本発明1039]
前記合成マトリックス材料がポリ乳酸またはポリグリコール酸である、本発明1038の操作された組織。
[本発明1040]
前記操作された組織が、
(a)エフェクターT細胞によって同種異系と認識されず、
(b)抗HLA抗体に結合せず、かつ／または
(c)NK媒介性溶解に耐性である、
本発明1033〜1039のいずれかの操作された組織。
[本発明1041]
本発明1033〜1040のいずれかの操作された組織を含む、薬学的組成物。
[本発明1042]
疾患状態を処置する方法における使用のための、本発明1033〜1040のいずれかの操作された組織または本発明1041の薬学的組成物。
[本発明1043]
有効量の本発明1033〜1040のいずれかの操作された組織または本発明1041の薬学的組成物をその必要がある対象へ投与する工程を含む、疾患状態を処置する方法。
[本発明1044]
前記疾患状態が、糖尿病、自己免疫疾患、癌、感染症、心筋梗塞、心不全、骨格もしくは関節の状態、骨形成不全症、熱傷、肝不全、腎不全、脳損傷、または軟部組織損傷からなる群より選択される、本発明1042の使用のための操作された組織もしくは薬学的組成物または本発明1043の処置する方法。
[本発明1045]
(a)薬物毒性スクリーニングのためのインビトロモデルにおける、および／または
(b)研究ツールとしての、
本発明1033〜1040のいずれかの操作された組織の使用。
[本発明1046]
SEQ ID NO: 2〜7からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、核酸。
[本発明1047]
B2M遺伝子の発現を破壊するための、本発明1046の核酸の使用。
【国際調査報告】
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