(57)【要約】本発明は、環境適合性の界面活性剤を使用して脂質エンベロープウイルスを不活化するための方法、および環境適合性の界面活性剤を使用してバイオ医薬品薬物を調製するための方法に関する。本発明はまた、環境適合性の界面活性剤を提供する。本発明者らは、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１およびＢｒｉｊ  Ｃ１０などの環境適合性の非フェノール性ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤が、Ｓ／Ｄ処理において脂質エンベロープウイルスを効率的に不活化することを見出し、環境適合性の非フェノール性ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を合成した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（ＶＩＩＩ）：
【化４７】
2021501163.tif 000066
の化合物であって、
式中、
Ｒは、２〜１２個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表し、
ｍは、１〜４の整数を表し、
Ａは、ポリオキシエチレン残基を表す、化合物。
【請求項２】
Ａが、４〜１６個のオキシエチレン単位、好ましくは９または１０個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｍが、１に等しい、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒが、２〜６個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表す、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｒが、２〜６個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての２〜４個のメチル基を有する炭化水素基を表す、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｒが、４個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての４個のメチル基を有する炭化水素基を表す、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｒが、２，４，４−トリメチル−ペンタ−２−イル基を表す、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
式（ＶＩＩＩ）の化合物が以下の化合物：
【化４８】
2021501163.tif 000067
であり、式中、ｍおよびｚは、以下の群：
ｍ＝１〜４
ｚ＝１〜５
から独立に選択される整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
ｍが、１に等しい、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
式（ＶＩＩＩ）の化合物が以下の化合物
【化４９】
2021501163.tif 000068
であり、式中、ｎは、４〜１６の間の整数であり、好ましくはｎは、９または１０に等しい、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
以下の構造式
【化５０】
2021501163.tif 000069
を有する２９−［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサノナコサン−１−オールが除外されることを条件とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための方法であって、
ａ）界面活性剤を液体に添加して、前記界面活性剤および前記液体の混合物を調製するステップと、
ｂ）前記混合物をインキュベートして、前記ウイルスを不活化するステップと
を含み、
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンエーテルであり、前記界面活性剤が、非フェノール性界面活性剤である、方法。
【請求項１３】
前記界面活性剤が、環境適合性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリオキシエチレンアルキルエーテルが、ポリオキシエチレンシクロアルキルエーテルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリオキシエチレンシクロアルキルエーテルのシクロアルキル部分が、アルキル置換シクロアルキル部分である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルキル置換シクロアルキル部分が、分岐アルキル置換シクロアルキル部分である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリオキシエチレンシクロアルキルエーテルが、ポリオキシエチレンシクロヘキシルエーテルである、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリオキシエチレンシクロアルキルエーテルが、複素環式ポリオキシエチレンシクロアルキルエーテルではない、請求項１７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記界面活性剤が、式（Ｉ）による以下の構造：
【化５１】
2021501163.tif 000070
を有し、式中、ｘ、ｙおよびｚは、以下の群：
ｘ＝０〜５
ｙ＝０〜５
ｚ＝０〜２０
から独立に選択される整数である、請求項１２〜１４および１６〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記界面活性剤が、式（ＩＩ）による以下の構造：
【化５２】
2021501163.tif 000071
を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記界面活性剤が、式（ＩＩＩ）による以下の構造：
【化５３】
2021501163.tif 000072
を有し、式中、ｎは、４〜１６の間の整数である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｎが、９または１０に等しい、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記界面活性剤が、式（ＩＶ）による以下の構造：
【化５４】
2021501163.tif 000073
を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記界面活性剤が、式（Ｖ）による以下の構造：
【化５５】
2021501163.tif 000074
を有し、式中、ｎは、４〜１６の間の整数である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ｎが、９または１０に等しい、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記界面活性剤が、直鎖ポリオキシエチレンアルキルエーテルである、請求項１２〜１４および１６のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記界面活性剤が、直鎖ポリオキシエチレンヘキサデシルエーテルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記界面活性剤が、式（ＶＩ）による以下の構造：
【化５６】
2021501163.tif 000075
を有し、式中、ｘは、１５に等しい、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記界面活性剤が、式（ＶＩＩ）による以下の構造：
【化５７】
2021501163.tif 000076
を有し、式中、ｘは、１５に等しく、ｎは、５〜１５の間の整数である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｎが、１０に等しい、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記界面活性剤が、前記ウイルスの不活化に適している、請求項１２〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ステップａ）において、有機溶媒が前記液体に添加されない、請求項１２〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ステップａ）が、溶媒を前記液体に添加することをさらに含み、ステップａ）において、前記ウイルスの不活化のための溶媒／界面活性剤の混合物が、前記界面活性剤および前記溶媒を前記液体に添加することによって調製される、請求項１２〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記溶媒が、有機溶媒である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記溶媒が、トリ−ｎ−ブチルホスフェートである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
ステップａ）において、前記界面活性剤以外のさらなる界面活性剤が添加されない、請求項１２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法において、前記界面活性剤以外のさらなる界面活性剤が添加されない、請求項１２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ステップａ）が、さらなる界面活性剤を前記液体に添加することをさらに含む、請求項１２〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記さらなる界面活性剤が、ポリソルベート８０である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記液体が、バイオ医薬生成物を含む、請求項１２〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記液体が、バイオ医薬品薬物を含む、請求項１２〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記バイオ医薬品薬物が、ウイルスワクチンではない、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記バイオ医薬品薬物が、血液因子、免疫グロブリン、例えばモノクローナル抗体、置換え酵素、ワクチン、遺伝子治療ベクター、増殖因子または増殖因子受容体である、請求項４４または４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記バイオ医薬品薬物が、治療用タンパク質である、請求項４４〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記バイオ医薬品薬物が、血液因子であり、前記血液因子が、第Ｉ因子（フィブリノゲン）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、組織因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）、プレカリクレイン、高分子キニノゲン（ＨＭＷＫ）、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンコファクターＩＩ、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ、プラスミノーゲン、アルファ２−抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ１）、またはプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２（ＰＡＩ２）である、請求項４４〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記バイオ医薬品薬物が、第ＶＩＩＩ因子、好ましくは組換えヒト第ＶＩＩＩ因子である、請求項４４〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記バイオ医薬品薬物が、免疫グロブリンであり、前記免疫グロブリンが、ヒト血漿由来の免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体である、請求項４４〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
ステップａ）の前またはステップａ）とステップｂ）の間に、前記液体または混合物をデプスフィルターで濾過するステップをさらに含む、請求項１２〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
ステップｂ）において、前記混合物が、少なくとも１時間インキュベートされる、請求項１２〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
ステップｂ）において、前記混合物が、０℃〜１０℃の間の温度でインキュベートされるか、または前記混合物が、１６℃〜２５℃の間の温度でインキュベートされる、請求項１２〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
ステップｂ）後に、
ｃ）前記バイオ医薬品薬物を精製するステップ
をさらに含む、請求項４４〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記精製するステップが、前記バイオ医薬品薬物を前記界面活性剤から分離することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記精製するステップが、前記バイオ医薬品薬物を前記さらなる界面活性剤から分離することを含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記バイオ医薬品薬物を前記精製するステップが、前記バイオ医薬品薬物を少なくとも１つのクロマトグラフィー精製によって精製することを含む、請求項５４〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも１つのクロマトグラフィー精製が、アニオン交換クロマトグラフィーおよび／またはカチオン交換クロマトグラフィーによるものである、請求項５４〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
バイオ医薬品薬物を調製するための方法であって、請求項４４〜５８のいずれか一項に記載の方法を含み、前記バイオ医薬品薬物が、前記請求項４４〜５８のいずれか一項に記載される通りである、方法。
【請求項６０】
請求項４４〜５８のいずれか一項に記載の前記方法の後、前記バイオ医薬品薬物を含む医薬製剤を調製するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
脂質エンベロープを有するウイルスの不活化のための方法における、請求項１２〜３４のいずれか一項に記載の界面活性剤の使用。
【請求項６２】
前記使用において、前記界面活性剤以外のさらなる界面活性剤が使用されない、請求項６１に記載の使用。
【請求項６３】
前記使用において、有機溶媒が使用されない、請求項６１または６２に記載の使用。
【請求項６４】
前記ウイルスの前記不活化のための前記方法が、溶媒／界面活性剤による処理を使用する方法であり、前記溶媒／界面活性剤による処理が、請求項１２〜３４のいずれか一項に記載の前記界面活性剤の使用を含む、請求項６１に記載の使用。
【請求項６５】
前記ウイルス不活化が、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載のバイオ医薬品薬物を含む液体中でのウイルスの不活化である、請求項６１〜６４のいずれかに記載の使用。
【請求項６６】
請求項１２〜３４のいずれか一項に記載の界面活性剤を含む組成物。
【請求項６７】
請求項１２〜３４のいずれか一項に記載の界面活性剤。
【請求項６８】
請求項４４〜５０のいずれか一項に記載のバイオ医薬品薬物をさらに含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６９】
いかなる有機溶媒も含まない、請求項６６または６８に記載の組成物。
【請求項７０】
請求項３７および３８のいずれか一項に記載の有機溶媒をさらに含む、請求項６６または６８に記載の組成物。
【請求項７１】
前記界面活性剤以外のいかなるさらなる界面活性剤も含まない、請求項６６または６８〜７０のいずれかに記載の組成物。
【請求項７２】
請求項４１および４２のいずれか一項に記載のさらなる界面活性剤をさらに含む、請求項６６または６８〜７０のいずれかに記載の組成物。
【請求項７３】
ウイルス不活化のためのキットであって、請求項６７に記載の界面活性剤または前記請求項のいずれかに記載の組成物を含み、請求項５７〜５８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー精製のためのクロマトグラフィー樹脂をさらに含む、キット。
【請求項７４】
デプスフィルターをさらに含む、請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
以下の一般式（ＶＩＩＩ）：
【化５８】
2021501163.tif 000077
の化合物を合成するための方法であって、
式中、
Ｒは、２〜１２個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表し、
ｍは、１〜４の整数を表し、
Ａは、ポリオキシエチレン残基を表し、
前記方法は、
Ａ）以下の一般式（ＩＸ）のフェノール［式中、Ｒは、先に記載される通りである］を、
【化５９】
2021501163.tif 000078
以下の一般式（Ｘ）のアルコール［式中、Ｒおよびｍは、先に記載される通りである］に変換するステップと、
【化６０】
2021501163.tif 000079
（Ｂ）一般式（Ｘ）の前記アルコールを、先に記載される通りの一般式（ＶＩＩＩ）のポリオキシエチレンエーテルに変換するステップと
を含む、方法。
【請求項７６】
以下の一般式（ＶＩＩＩ）の化合物：
【化６１】
2021501163.tif 000080
を合成するための方法であって、
式中、
Ｒは、２〜１２個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表し、
ｍは、１〜４の整数を表し、
Ａは、ポリオキシエチレン残基を表し、
前記方法は、
（１）トルエンを反応させて、以下の一般式（ＸＩ）の置換トルエン［式中、Ｒは、先に記載される通りである］を得るステップと、
【化６２】
2021501163.tif 000081
（２）一般式（ＸＩ）の前記置換トルエンを、以下の一般式（ＸＩＩ）の化合物［式中、Ｒおよびｍは、先に記載される通りであり、Ｘは、ヒドロキシ基、臭素原子、ヨウ素原子および塩素原子を含む群から選択される］に変換するステップと、
【化６３】
2021501163.tif 000082
（３）一般式（ＸＩＩ）の前記化合物を、先に記載される通りの一般式（ＶＩＩＩ）のポリオキシエチレンエーテルに変換するステップと
を含む、方法。
【請求項７７】
以下の一般式（ＶＩＩＩａ）の化合物：
【化６４】
2021501163.tif 000083
を合成するための方法であって、
式中、
Ｒは、２〜１２個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表し、
Ａは、ポリオキシエチレン残基を表し、
前記方法は、
（Ｉ）ベンジルアルコールを以下の一般式（ＸＩＩＩ）の化合物［式中、Ｒは、先に記載される通りである］に変換するステップと、
【化６５】
2021501163.tif 000084
（ＩＩ）一般式（ＸＩＩＩ）の前記化合物を、先に記載される通りの一般式（ＶＩＩＩａ）のポリオキシエチレンエーテルに変換するステップと
を含む、方法。
【請求項７８】
Ａが、４〜１６個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基を表す、請求項７５〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
Ａが、８〜１０個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基を表す、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
Ａが、９または１０個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基を表す、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
ｍが、１に等しい、請求項７５、７６および７８〜８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
Ｒが、２〜６個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表す、請求項７５〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
Ｒが、２〜６個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての２〜４個のメチル基を有する炭化水素基を表す、請求項７５〜８２のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
Ｒが、４個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての４個のメチル基を有する炭化水素基を表す、請求項７５〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
Ｒが、２，４，４−トリメチル−ペンタ−２−イル基を表す、請求項７５〜８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
式（ＶＩＩＩ）の前記化合物が、以下の化合物：
【化６６】
2021501163.tif 000085
であり、式中、ｍおよびｚは、以下の群：
ｍ＝１〜４
ｚ＝１〜５
から独立に選択される整数である、請求項７５〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
ｍが、１に等しい、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
式（ＶＩＩＩ）の前記化合物が、以下の化合物：
【化６７】
2021501163.tif 000086
であり、式中、ｎは、４〜１６の間の整数であり、好ましくはｎは、９または１０に等しい、請求項７５〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
ステップ（２）の前記変換するステップが、ＡＩＢＮ（アゾビス（イソブチロニトリル）をラジカル開始剤として使用するラジカル反応である、請求項７６および７８〜８８のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
Ｘが、臭素原子である、請求項７６および７８〜８９のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
ステップ（２）の前記変換するステップが、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）を試薬として使用する、請求項７６および７８〜９０のいずれかに記載の方法。
【請求項９２】
ステップ（３）の前記変換するステップが、ＴＢＭＥ（メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル）を溶媒として使用する、請求項７６および７８〜９１のいずれかに記載の方法。
【請求項９３】
ステップ（３）の前記変換するステップが、少なくとも２時間、好ましくは周囲温度で行われる、請求項７６および７８〜９２のいずれかに記載の方法。
【請求項９４】
ステップ（３）の前記変換するステップが、５時間を超えずに、好ましくは周囲温度で行われる、請求項７６および７８〜９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
ステップ（３）の前記変換するステップが、３時間、好ましくは周囲温度で行われる、請求項７６および７８〜９４のいずれかに記載の方法。
【請求項９６】
少なくとも１００ｇ、少なくとも１ｋｇ、少なくとも１０ｋｇ、少なくとも１００ｋｇまたは少なくとも１０００ｋｇの前記式（ＶＩＩＩ）の前記化合物を得る規模で行われる、請求項７５〜９５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、環境適合性の界面活性剤を使用して脂質エンベロープウイルスを不活化するための方法、および環境適合性の界面活性剤を使用してバイオ医薬品薬物を調製するための方法に関する。本発明はまた、環境適合性の界面活性剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
バイオ医薬品薬物の使用は、個体の健康に影響を及ぼす多くの疾患、障害、または状態を処置する方法として、重要性が増し続けている。バイオ医薬品薬物は、典型的には、生物学的流体からの精製によって、または哺乳動物細胞株などの宿主細胞における組換え生成を介して得られる。しかし、このようなバイオ医薬品の生成プロセスでは、ウイルス汚染が著しい問題を引き起こす。ウイルス汚染は、精製を行おうとしている生物学的流体によって、または動物由来の生成物の使用を介して、バイオ医薬品の生成プロセスに導入されるおそれがある。細菌性汚染とは対照的に、ウイルス汚染は、検出困難である。しかし、ウイルス汚染が気付かれず、感染性ウイルスがバイオ医薬品薬物の製剤に組み込まれると、患者にとって著しい健康上の危険性が引き起こされる。したがって、ウイルス不活化は、バイオ医薬品の生成において最も重要である。
【０００３】
多くのバイオ医薬品の生成プロセスにおいて、ウイルス不活化のために界面活性剤が使用される。しばしば、これらの界面活性剤は、いわゆる溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理において溶媒と組み合わされる。界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、市販品のＳ／Ｄ処理のために長年使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、近年の生態学的研究では、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびその分解生成物が、水生生物の内分泌撹乱物質として潜在的に作用するおそれがあり、環境への影響の観点から懸念が生じていることが示唆されている（２０１２年１２月１２日採用の"ECHA  Support  document  for  identification  of  4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol,  ethoxylated  as  substances  of  very  high  concern  because,  due  to  their  degradation  to  a  substance  of  very  high  concern  (4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol)  with  endocrine  disrupting  properties,  they  cause  probable  serious  effects  to  the  environment  which  give  rise  to  an  equivalent  level  of  concern  to  those  of  CMRs  and  PBTs/vPvBs"を参照されたい）。結果として、ウイルスを不活化するための代替の環境適合性の界面活性剤が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の説明
本発明は、下記の実施形態を提供することによって、当技術分野における前述の必要を満たし、前述の問題を解決する。
【０００６】
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の毒性活性は、海洋生物のある特定の内分泌受容体にドッキングする能力を有するフェノール部分から生じる。これと一致して、内分泌撹乱物質の活性のコンピューター予測に確実に基づくと、本発明による非フェノール性ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤のいずれについても、内分泌撹乱物質として活性であるという証拠は見出されていない。
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１およびＢｒｉｊ  Ｃ１０などの環境適合性の非フェノール性ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤が、Ｓ／Ｄ処理において脂質エンベロープウイルスを効率的に不活化することを見出した。本発明者らはまた、Ｓ／Ｄおよび単一界面活性剤による処理において脂質エンベロープウイルスを効率的に不活化する環境適合性の非フェノール性ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を合成した。したがって、本発明者らは、環境適合性の非フェノール性ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤が、脂質エンベロープウイルスを不活化するための本発明の方法において使用できることを見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、下記の好ましい実施形態を提供することによって、環境適合性の非フェノール性ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤、ならびに脂質エンベロープウイルスを不活化するための改善された手段を提供する。
項目１．  以下の一般式（ＶＩＩＩ）：
【化１】
2021501163.tif 000002
の化合物であって、
式中、
Ｒは、２〜１２個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表し、
ｍは、１〜４の整数を表し、
Ａは、ポリオキシエチレン残基を表す、化合物。
項目２．  Ａが、４〜１６個のオキシエチレン単位、好ましくは９または１０個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基を表す、項目１に記載の化合物。
項目３．  ｍが、１に等しい、項目１または２に記載の化合物。
項目４．  Ｒが、２〜６個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表す、項目１〜３のいずれかに記載の化合物。
項目５．  Ｒが、２〜６個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての２〜４個のメチル基を有する炭化水素基を表す、項目１〜４のいずれかに記載の化合物。
項目６．  Ｒが、４個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての４個のメチル基を有する炭化水素基を表す、項目１〜５のいずれかに記載の化合物。
項目７．  Ｒが、２，４，４−トリメチル−ペンタ−２−イル基を表す、項目１〜６のいずれかに記載の化合物。
項目８．  式（ＶＩＩＩ）の化合物が以下の化合物：
【化２】
2021501163.tif 000003
であり、
式中、ｍおよびｚは、以下の群：
ｍ＝１〜４
ｚ＝１〜５
から独立に選択される整数である、項目１に記載の化合物。
項目９．  ｍが、１に等しい、項目８に記載の化合物。
項目１０．  式（ＶＩＩＩ）の化合物が以下の化合物：
【化３】
2021501163.tif 000004
であり、式中、ｎは、４〜１６の間の整数であり、好ましくはｎは、９または１０に等しい、項目１に記載の化合物。
項目１１．  以下の構造式
【化４】
2021501163.tif 000005
を有する２９−［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサノナコサン−１−オールが除外されることを条件とする、項目１〜１０のいずれかに記載の化合物。
項目１２．  脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための方法であって、
ａ）界面活性剤を液体に添加して、前記界面活性剤および前記液体の混合物を調製するステップと、
ｂ）前記混合物をインキュベートして、前記ウイルスを不活化するステップと
を含み、
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンエーテルであり、前記界面活性剤が、非フェノール性界面活性剤である、方法。
項目１３．  前記界面活性剤が、環境適合性である、項目１２に記載の方法。
項目１４．  前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、項目１２または１３に記載の方法。
項目１５．  前記界面活性剤が、項目１〜１１のいずれかに記載の化合物である、項目１２〜１４のいずれかに記載の方法。
項目１６．  前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである、項目１２〜１４のいずれかに記載の方法。
項目１７．  前記ポリオキシエチレンアルキルエーテルが、ポリオキシエチレンシクロアルキルエーテルである、項目１６に記載の方法。
項目１８．  前記ポリオキシエチレンシクロアルキルエーテルのシクロアルキル部分が、アルキル置換シクロアルキル部分である、項目１７に記載の方法。
項目１９．  前記アルキル置換シクロアルキル部分が、分岐アルキル置換シクロアルキル部分である、項目１８に記載の方法。
項目２０．  前記ポリオキシエチレンシクロアルキルエーテルが、ポリオキシエチレンシクロヘキシルエーテルである、項目１７〜１９のいずれかに記載の方法。
項目２１．  前記ポリオキシエチレンシクロアルキルエーテルが、複素環式ポリオキシエチレンシクロアルキルエーテルではない、項目１７〜２０のいずれかに記載の方法。
項目２２．  前記界面活性剤が、式（Ｉ）による以下の構造：  
【化５】
2021501163.tif 000006
を有し、式中、ｘ、ｙおよびｚは、以下の群：
ｘ＝０〜５
ｙ＝０〜５
ｚ＝０〜２０
から独立に選択される整数である、項目１２〜１４および１６〜２１のいずれかに記載の方法。
項目２３．  前記界面活性剤が、式（ＩＩ）による以下の構造：
【化６】
2021501163.tif 000007
を有する、項目２２に記載の方法。
項目２４．  前記界面活性剤が、式（ＩＩＩ）による以下の構造：  
【化７】
2021501163.tif 000008
を有し、式中、ｎは、４〜１６の間の整数である、項目２３に記載の方法。
項目２５．  ｎが、９または１０に等しい、項目２４に記載の方法。
項目２６．  前記界面活性剤が、式（ＩＶ）による以下の構造：
【化８】
2021501163.tif 000009
を有する、項目２２に記載の方法。
項目２７．  前記界面活性剤が、式（Ｖ）による以下の構造：
【化９】
2021501163.tif 000010
を有し、式中、ｎは、４〜１６の間の整数である、項目２６に記載の方法。
項目２８．  ｎが、９または１０に等しい、項目２７に記載の方法。
項目２９．  前記界面活性剤が、直鎖ポリオキシエチレンアルキルエーテルである、項目１２〜１４および１６のいずれかに記載の方法。
項目３０．  前記界面活性剤が、直鎖ポリオキシエチレンヘキサデシルエーテルである、項目２９に記載の方法。
項目３１．  前記界面活性剤が、式（ＶＩ）による以下の構造：
【化１０】
2021501163.tif 000011
を有し、式中、ｘは、１５に等しい、項目３０に記載の方法。
項目３２．  前記界面活性剤が、式（ＶＩＩ）による以下の構造：
【化１１】
2021501163.tif 000012
を有し、式中、ｘは、１５に等しく、ｎは、５〜１５の間の整数である、項目３１に記載の方法。
項目３３．  ｎが、１０に等しい、項目３２に記載の方法。
項目３４．  前記界面活性剤が、前記ウイルスの不活化に適している、項目１２〜３３のいずれかに記載の方法。
項目３５．  ステップａ）において、有機溶媒が前記液体に添加されない、項目１２〜３４のいずれかに記載の方法。
項目３６．  ステップａ）が、溶媒を前記液体に添加することをさらに含み、ステップａ）において、前記ウイルスの不活化のための溶媒／界面活性剤の混合物が、前記界面活性剤および前記溶媒を前記液体に添加することによって調製される、項目１２〜３４のいずれかに記載の方法。
項目３７．  前記溶媒が、有機溶媒である、項目３６に記載の方法。
項目３８．  前記溶媒が、トリ−ｎ−ブチルホスフェートである、項目３６または３７に記載の方法。
項目３９．  ステップａ）において、前記界面活性剤以外のさらなる界面活性剤が添加されない、項目１２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
項目４０．  前記方法において、前記界面活性剤以外のさらなる界面活性剤が添加されない、項目１２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
項目４１．  ステップａ）が、さらなる界面活性剤を前記液体に添加することをさらに含む、項目１２〜３８のいずれかに記載の方法。
項目４２．  前記さらなる界面活性剤が、ポリソルベート８０である、項目４１に記載の方法。
項目４３．  前記液体が、バイオ医薬生成物を含む、項目１２〜４２のいずれかに記載の方法。
項目４４．  前記液体が、バイオ医薬品薬物を含む、項目１２〜４３のいずれかに記載の方法。
項目４５．  前記バイオ医薬品薬物が、ウイルスワクチンではない、項目４４に記載の方法。
項目４６．  前記バイオ医薬品薬物が、血液因子、免疫グロブリン、例えばモノクローナル抗体、置換え酵素、ワクチン、遺伝子治療ベクター、増殖因子または増殖因子受容体である、項目４４または４５のいずれかに記載の方法。
項目４７．  前記バイオ医薬品薬物が、治療用タンパク質である、項目４４〜４６のいずれかに記載の方法。
項目４８．  前記バイオ医薬品薬物が、血液因子であり、前記血液因子が、第Ｉ因子（フィブリノゲン）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、組織因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子もしくは第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）、プレカリクレイン、高分子キニノゲン（ＨＭＷＫ）、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンコファクターＩＩ、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ、プラスミノーゲン、アルファ２−抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ１）、またはプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２（ＰＡＩ２）である、項目４４〜４７のいずれかに記載の方法。
項目４９．  前記バイオ医薬品薬物が、第ＶＩＩＩ因子、好ましくは組換えヒト第ＶＩＩＩ因子である、項目４４〜４８のいずれかに記載の方法。
項目５０．  前記バイオ医薬品薬物が、免疫グロブリンであり、前記免疫グロブリンが、ヒト血漿由来の免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体である、項目４４〜４７のいずれかに記載の方法。
項目５１．  ステップａ）の前またはステップａ）とステップｂ）の間に、前記液体または混合物をデプスフィルターで濾過するステップをさらに含む、項目１２〜５０のいずれかに記載の方法。
項目５２．  ステップｂ）において、前記混合物が、少なくとも１時間インキュベートされる、項目１２〜５１のいずれかに記載の方法。
項目５３．  ステップｂ）において、前記混合物が、０℃〜１０℃の間の温度でインキュベートされるか、または前記混合物が、１６℃〜２５℃の間の温度でインキュベートされる、項目１２〜５２のいずれかに記載の方法。
項目５４．  ステップｂ）後に、
ｃ）前記バイオ医薬品薬物を精製するステップ
をさらに含む、項目４４〜５３のいずれかに記載の方法。
項目５５．  前記精製するステップが、前記バイオ医薬品薬物を前記界面活性剤から分離することを含む、項目５４に記載の方法。
項目５６．  前記精製するステップが、前記バイオ医薬品薬物を前記さらなる界面活性剤から分離することを含む、項目５４または５５に記載の方法。
項目５７．  前記バイオ医薬品薬物を前記精製するステップが、前記バイオ医薬品薬物を少なくとも１つのクロマトグラフィー精製によって精製することを含む、項目５４〜５６のいずれかに記載の方法。
項目５８．  前記少なくとも１つのクロマトグラフィー精製が、アニオン交換クロマトグラフィーおよび／またはカチオン交換クロマトグラフィーによるものである、項目５４〜５７のいずれかに記載の方法。
項目５９．  バイオ医薬品薬物を調製するための方法であって、項目４４〜５８のいずれか一項に記載の方法を含み、前記バイオ医薬品薬物が、前記項目４４〜５８のいずれか一項に記載される通りである、方法。
項目６０．  項目４４〜５８のいずれか一項に記載の前記方法の後、前記バイオ医薬品薬物を含む医薬製剤を調製するステップをさらに含む、項目５９に記載の方法。
項目６１．  脂質エンベロープを有するウイルスの不活化のための方法における、項目１２〜３４のいずれか一項に記載の界面活性剤の使用。
項目６２．  前記使用において、前記界面活性剤以外のさらなる界面活性剤が使用されない、項目６１に記載の使用。
項目６３．  前記使用において、有機溶媒が使用されない、項目６１または６２に記載の使用。
項目６４．  前記ウイルスの前記不活化のための前記方法が、溶媒／界面活性剤による処理を使用する方法であり、前記溶媒／界面活性剤による処理が、項目１２〜３４のいずれか一項に記載の前記界面活性剤の使用を含む、項目６１に記載の使用。
項目６５．  前記ウイルス不活化が、項目４４〜５０のいずれか一項に記載のバイオ医薬品薬物を含む液体中でのウイルスの不活化である、項目６１〜６４のいずれかに記載の使用。
項目６６．  項目１２〜３４のいずれか一項に記載の界面活性剤を含む組成物。
項目６７．  項目１２〜３４のいずれか一項に記載の界面活性剤。
項目６８．  項目４４〜５０のいずれか一項に記載のバイオ医薬品薬物をさらに含む、項目６６に記載の組成物。
項目６９．  いかなる有機溶媒も含まない、項目６６または６８に記載の組成物。
項目７０．  項目３７および３８のいずれか一項に記載の有機溶媒をさらに含む、項目６６または６８に記載の組成物。
項目７１．  前記界面活性剤以外のいかなるさらなる界面活性剤も含まない、項目６６または６８〜７０のいずれかに記載の組成物。
項目７２．  項目４１および４２のいずれか一項に記載のさらなる界面活性剤をさらに含む、項目６６または６８〜７０のいずれかに記載の組成物。
項目７３．  ウイルス不活化のためのキットであって、項目６７に記載の界面活性剤または前記項目のいずれかに記載の組成物を含み、項目５７〜５８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー精製のためのクロマトグラフィー樹脂をさらに含む、キット。
項目７４．  デプスフィルターをさらに含む、項目７３に記載のキット。
項目７５．  以下の一般式（ＶＩＩＩ）：
【化１２】
2021501163.tif 000013
の化合物を合成するための方法であって、
式中、
Ｒは、２〜１２個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表し、
ｍは、１〜４の整数を表し、
Ａは、ポリオキシエチレン残基を表し、
前記方法は、
Ａ）以下の一般式（ＩＸ）のフェノール［式中、Ｒは、先に記載される通りである］を、
【化１３】
2021501163.tif 000014
以下の一般式（Ｘ）のアルコール［式中、Ｒおよびｍは、先に記載される通りである］に変換するステップと、
【化１４】
2021501163.tif 000015
（Ｂ）一般式（Ｘ）の前記アルコールを、先に記載される通りの一般式（ＶＩＩＩ）のポリオキシエチレンエーテルに変換するステップと
を含む、方法。
項目７６．  以下の一般式（ＶＩＩＩ）：
【化１５】
2021501163.tif 000016
の化合物を合成するための方法であって、
式中、
Ｒは、２〜１２個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表し、
ｍは、１〜４の整数を表し、
Ａは、ポリオキシエチレン残基を表し、
前記方法は、
（１）トルエンを反応させて、以下の一般式（ＸＩ）の置換トルエン［式中、Ｒは、先に記載される通りである］を得るステップと、
【化１６】
2021501163.tif 000017
（２）一般式（ＸＩ）の前記置換トルエンを、以下の一般式（ＸＩＩ）の化合物［式中、Ｒおよびｍは、先に記載される通りであり、Ｘは、ヒドロキシ基、臭素原子、ヨウ素原子および塩素原子を含む群から選択される］に変換するステップと、
【化１７】
2021501163.tif 000018
（３）一般式（ＸＩＩ）の前記化合物を、先に記載される通りの一般式（ＶＩＩＩ）のポリオキシエチレンエーテルに変換するステップと
を含む、方法。
項目７７．  以下の一般式（ＶＩＩＩａ）の化合物：
【化１８】
2021501163.tif 000019
を合成するための方法であって、
式中、
Ｒは、２〜１２個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表し、
Ａは、ポリオキシエチレン残基を表し、
前記方法は、
（Ｉ）ベンジルアルコールを以下の一般式（ＸＩＩＩ）の化合物［式中、Ｒは、先に記載される通りである］に変換するステップと、
【化１９】
2021501163.tif 000020
（ＩＩ）一般式（ＸＩＩＩ）の前記化合物を、先に記載される通りの一般式（ＶＩＩＩａ）のポリオキシエチレンエーテルに変換するステップと
を含む、方法。
項目７８．  Ａが、４〜１６個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基を表す、項目７５〜７７のいずれかに記載の方法。
項目７９．  Ａが、８〜１０個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基を表す、項目７８に記載の方法。
項目８０．  Ａが、９または１０個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基を表す、項目７８に記載の方法。
項目８１．  ｍが、１に等しい、項目７５、７６および７８〜８０のいずれかに記載の方法。
項目８２．  Ｒが、２〜６個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表す、項目７５〜８１のいずれかに記載の方法。
項目８３．  Ｒが、２〜６個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての２〜４個のメチル基を有する炭化水素基を表す、項目７５〜８２のいずれかに記載の方法。
項目８４．  Ｒが、４個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての４個のメチル基を有する炭化水素基を表す、項目７５〜８３のいずれかに記載の方法。
項目８５．  Ｒが、２，４，４−トリメチル−ペンタ−２−イル基を表す、項目７５〜８４のいずれかに記載の方法。
項目８６．  式（ＶＩＩＩ）の前記化合物が、以下の化合物：
【化２０】
2021501163.tif 000021
であり、式中、ｍおよびｚは、以下の群：
ｍ＝１〜４
ｚ＝１〜５
から独立に選択される整数である、項目７５〜７７のいずれかに記載の方法。
項目８７．  ｍが、１に等しい、項目８６に記載の方法。
項目８８．  式（ＶＩＩＩ）の前記化合物が、以下の化合物である、項目７５〜７７のいずれかに記載の方法
【化２１】
2021501163.tif 000022
［式中、ｎは、４〜１６の間の整数であり、好ましくはｎは、９または１０に等しい］。
項目８９．  ステップ（２）の前記変換するステップが、ＡＩＢＮ（アゾビス（イソブチロニトリル）をラジカル開始剤として使用するラジカル反応である、項目７６および７８〜８８のいずれかに記載の方法。
項目９０．  Ｘが、臭素原子である、項目７６および７８〜８９のいずれかに記載の方法。
項目９１．  ステップ（２）の前記変換するステップが、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）を試薬として使用する、項目７６および７８〜９０のいずれかに記載の方法。
項目９２．  ステップ（３）の前記変換するステップが、ＴＢＭＥ（メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル）を溶媒として使用する、項目７６および７８〜９１のいずれかに記載の方法。
項目９３．  ステップ（３）の前記変換するステップが、少なくとも２時間、好ましくは周囲温度で行われる、項目７６および７８〜９２のいずれかに記載の方法。
項目９４．  ステップ（３）の前記変換するステップが、５時間を超えずに、好ましくは周囲温度で行われる、項目７６および７８〜９３のいずれかに記載の方法。
項目９５．  ステップ（３）の前記変換するステップが、３時間、好ましくは周囲温度で行われる、項目７６および７８〜９４のいずれかに記載の方法。
項目９６．  少なくとも１００ｇ、少なくとも１ｋｇ、少なくとも１０ｋｇ、少なくとも１００ｋｇまたは少なくとも１０００ｋｇの前記式（ＶＩＩＩ）の前記化合物を得る規模で行われる、項目７５〜９５のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、１７℃±１℃におけるＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理における低濃度の還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１のウイルス不活化効率を示す。３つの構成成分の混合物を使用して、最終濃度０．０４％〜０．０６％の還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、０．０１％〜０．０２％のポリソルベート８０、０．０１％〜０．０２％のＴｎＢＰを得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、ＨＩＶを用いる２回の実施（それぞれＡおよびＢ）についてウイルスクリアランス指数（ＲＦ:virus  reduction  factor)によって示す。還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００還元型」）または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１（「ＴＮ−１０１還元型」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化と比較した。
【００１０】
【図２】図２は、１７℃±１℃におけるＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理における低濃度の還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１のウイルス不活化効率を示す。３つの構成成分の混合物を使用して、最終濃度０．０４％〜０．０６％の還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、０．０１％〜０．０２％のポリソルベート８０、０．０１％〜０．０２％のＴｎＢＰを得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、ＰＲＶを用いる２回の実施（それぞれＡおよびＢ）についてウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００還元型」）または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１（「ＴＮ−１０１還元型」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化と比較した。
【００１１】
【図３】図３は、１７℃±１℃におけるＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理における低濃度のＢｒｉｊ  Ｃ１０のウイルス不活化効率を示す。３つの構成成分の混合物を使用して、最終濃度０．０４％〜０．０６％のＢｒｉｊ  Ｃ１０、０．０１％〜０．０２％のポリソルベート８０、０．０１％〜０．０２％のＴｎＢＰを得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、ＨＩＶを用いる２回の実施（それぞれＡおよびＢ）についてウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。Ｂｒｉｊ  Ｃ１０を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化と比較した。
【００１２】
【図４】図４は、１７℃±１℃におけるＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理における低濃度のＢｒｉｊ  Ｃ１０のウイルス不活化効率を示す。３つの構成成分の混合物を使用して、最終濃度０．０４％〜０．０６％のＢｒｉｊ  Ｃ１０、０．０１％〜０．０２％のポリソルベート８０、０．０１％〜０．０２％のＴｎＢＰを得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、ＰＲＶを用いる２回の実施（それぞれＡおよびＢ）についてウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。Ｂｒｉｊ  Ｃ１０を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化と比較した。
【００１３】
【図５】図５は、１７℃±１℃におけるＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理における低濃度のＢｒｉｊ  Ｃ１０のウイルス不活化効率を示す。３つの構成成分の混合物を使用して、最終濃度０．０４％〜０．０６％のＢｒｉｊ  Ｃ１０、０．０１％〜０．０２％のポリソルベート８０、０．０１％〜０．０２％のＴｎＢＰを得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、ＢＶＤＶを用いる２回の実施（それぞれＡおよびＢ）についてウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。Ｂｒｉｊ  Ｃ１０を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化と比較した。
【００１４】
【図６】図６は、１℃±１℃におけるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）含有液のＳ／Ｄ処理における低濃度のＢｒｉｊ  Ｃ１０のウイルス不活化効率を示す。３つの構成成分の混合物を使用して、最終濃度０．０８％〜０．１％のＢｒｉｊ  Ｃ１０、０．０２％〜０．０３％のポリソルベート８０、０．０２％〜０．０３％のＴｎＢＰを得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、Ｘ−ＭｕＬＶを用いる２回の実施（それぞれＡおよびＢ）についてウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。Ｂｒｉｊ  Ｃ１０を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化と比較した。
【００１５】
【図７】図７は、１℃±１℃におけるＨＳＡ含有液のＳ／Ｄ処理における低濃度のＢｒｉｊ  Ｃ１０のウイルス不活化効率を示す。３つの構成成分の混合物を使用して、最終濃度０．０８％〜０．１％のＢｒｉｊ  Ｃ１０、０．０２％〜０．０３％のポリソルベート８０、０．０２％〜０．０３％のＴｎＢＰを得た（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００についての既存のデータと比較）。経時的なウイルス不活化を、ＢＶＤＶを用いる２回の実施（それぞれＡおよびＢ）についてウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。Ｂｒｉｊ  Ｃ１０を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化と比較した。
【００１６】
【図８】図８は、１９℃±１℃におけるＨＳＡ含有液のＳ／Ｄ処理における低濃度のＢｒｉｊ  Ｃ１０のウイルス不活化効率を示す。３つの構成成分の混合物を使用して、最終濃度０．０８％〜０．１％のＢｒｉｊ  Ｃ１０、０．０２％〜０．０３％のポリソルベート８０、０．０２％〜０．０３％のＴｎＢＰを得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、Ｘ−ＭｕＬＶを用いる２回の実施（それぞれＡおよびＢ）についてウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。Ｂｒｉｊ  Ｃ１０を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化と比較した。
【００１７】
【図９】図９は、１７℃±１℃におけるＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理における低濃度の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートのウイルス不活化効率を示す。３つの構成成分の混合物を使用して、最終濃度０．０４％〜０．０６％の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレート、０．０１％〜０．０２％のポリソルベート８０、０．０１％〜０．０２％のＴｎＢＰを得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、ＰＲＶを用いる２回の実施（それぞれＡおよびＢ）についてウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化と比較した。（Ａ）では、両方の界面活性剤が同一の不活化動態を示すことに留意されたい。黒塗り記号は、残りの感染力の値を示し、黒塗りでない記号は、検出限界未満のクリアランス指数を示す。
【００１８】
【図１０】図１０は、１℃±１℃におけるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）含有液のＳ／Ｄ処理における低濃度の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートのウイルス不活化効率を示す。３つの構成成分の混合物を使用して、最終濃度０．０８％〜０．１％の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレート、０．０２％〜０．０３％のポリソルベート８０、０．０２％〜０．０３％のＴｎＢＰを得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、Ｘ−ＭｕＬＶを用いる２回の実施（それぞれＡおよびＢ）についてウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化と比較した。黒塗り記号は、残りの感染力の値を示し、黒塗りでない記号は、検出限界未満のクリアランス指数を示す。
【００１９】
【図１１】図１１は、１９℃±１℃におけるＨＳＡ含有液のＳ／Ｄ処理における低濃度の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートのウイルス不活化効率を示す。３つの構成成分の混合物を使用して、最終濃度０．０８％〜０．１％の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレート、０．０２％〜０．０３％のポリソルベート８０、０．０２％〜０．０３％のＴｎＢＰを得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、Ｘ−ＭｕＬＶを用いる２回の実施（それぞれＡおよびＢ）についてウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用するＳ／Ｄ処理のウイルス不活化と比較した。黒塗り記号は、残りの感染力の値を示し、黒塗りでない記号は、検出限界未満のクリアランス指数を示す。
【００２０】
【図１２】図１２（Ａ）は、１４℃±１℃におけるＨＳＡ含有緩衝液の界面活性剤処理における低濃度の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＢｒｉｊ  Ｃ１０のウイルス不活化効率を示す。単一界面活性剤による処理を使用して、最終濃度０．０９％〜０．１１％の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＢｒｉｊ  Ｃ１０を得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、ＢＶＤＶを用いる２回の実施について平均ウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００還元型」）またはＢｒｉｊ  Ｃ１０を使用する単一界面活性剤による処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用する単一界面活性剤による処理のウイルス不活化と比較した。４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートおよび還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と同じ不活化動態を有することに留意されたい。黒塗り記号は、残りの感染力の値を示し、黒塗りでない記号は、検出限界未満のクリアランス指数を示す。図１２（Ｂ）は、１４℃±１℃におけるＨＳＡ含有緩衝液の界面活性剤処理における低濃度の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のウイルス不活化効率を示す。単一界面活性剤による処理を使用して、最終濃度０．０２％〜０．０４％の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、ＢＶＤＶを用いる２回の実施について平均ウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００還元型」）を使用する単一界面活性剤による処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用する単一界面活性剤による処理のウイルス不活化と比較した。黒塗り記号は、残りの感染力の値を示し、黒塗りでない記号は、検出限界未満のクリアランス指数を示す。
【００２１】
【図１３】図１３（Ａ）は、１７℃±１℃におけるＩＶＩＧ含有液の界面活性剤処理における低濃度の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のウイルス不活化効率を示す。単一界面活性剤による処理を使用して、最終濃度０．０９％〜０．１１％の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、ＢＶＤＶを用いる２回の実施について平均ウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００還元型」）を使用する単一界面活性剤による処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用する単一界面活性剤による処理のウイルス不活化と比較した。黒塗り記号は、残りの感染力の値を示し、黒塗りでない記号は、検出限界未満のクリアランス指数を示す。図１３（Ｂ）は、１７℃±１℃におけるＩＶＩＧ含有液の界面活性剤処理における低濃度の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のウイルス不活化効率を示す。単一界面活性剤による処理を使用して、最終濃度０．０２％〜０．０４％の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、ＢＶＤＶを用いる２回の実施について平均ウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００還元型」）を使用する単一界面活性剤による処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用する単一界面活性剤による処理のウイルス不活化と比較した。黒塗り記号は、残りの感染力の値を示し、黒塗りでない記号は、検出限界未満のクリアランス指数を示す。
【００２２】
【図１４】図１４は、２３℃±１℃における第ＶＩＩＩ因子含有液の界面活性剤処理における低濃度の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のウイルス不活化効率を示す。単一界面活性剤による処理を使用して、最終濃度０．０９％〜０．１１％の４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を得た（同濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いる対照比較）。経時的なウイルス不活化を、ＢＶＤＶを用いる２回の実施について平均ウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって示す。４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００還元型」）を使用する単一界面活性剤による処理のウイルス不活化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（「ＴＸ−１００」）を使用する単一界面活性剤による処理のウイルス不活化と比較した。黒塗り記号は、残りの感染力の値を示し、黒塗りでない記号は、検出限界未満のクリアランス指数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
以下で別段定義されない限り、本発明において使用される用語は、当業者に公知のそれらの一般的な意味に従って理解されよう。
【００２４】
本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的でそれら全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２５】
定義
用語「脂質エンベロープを有するウイルス」、「脂質エンベロープウイルス」および「エンベロープウイルス」は、本明細書において交換可能に使用され、当業者に公知の意味を有する。例えば、脂質エンベロープウイルスは、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、例えば仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスもしくはエプスタイン−バーウイルス；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、例えばＢ型肝炎ウイルス；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、例えばシンドビスウイルス、風疹ウイルスもしくはアルファウイルス；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、例えばリンパ球性（lmphocytic）脈絡髄膜炎ウイルス；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、例えばウエストナイルウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスもしくは黄熱病ウイルス；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、例えばインフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、イサウイルスもしくはソゴトウイルス；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、例えばセンダイウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、牛疫ウイルスもしくはイヌジステンパーウイルス；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、例えばカリフォルニア脳炎ウイルスもしくはハンタウイルス；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、例えば水疱性口内炎ウイルスもしくは狂犬病ウイルス；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、例えばエボラウイルスもしくはマールブルグウイルス；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、例えばコロナウイルスもしくは重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス；Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、例えばボルナ病ウイルス；またはＡｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ、例えばアルテリウイルスもしくはウマ動脈炎ウイルス；Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ好性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）もしくは異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、例えばワクシニアウイルスもしくはＯｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｖａｒｉｏｌａｅ（痘瘡ウイルス）であり得る。
【００２６】
用語「脂質エンベロープを有するウイルスを不活化する」は、本明細書で使用される場合、脂質エンベロープウイルスが細胞に感染する能力を撹乱することを指す。当業者に理解される通り、脂質エンベロープウイルスが細胞に感染する能力、すなわち、脂質エンベロープウイルスの感染力は、典型的に、液体中の感染性ウイルス粒子の数を決定することによってアセスメントされる。したがって、用語「脂質エンベロープを有するウイルスを不活化する」または「脂質エンベロープウイルスを不活化する」は、本明細書で使用される場合、溶液中の感染性ウイルス粒子の数を低減することを指す。
【００２７】
本明細書において、用語「Ｌｏｇ１０低減値」または「ＬＲＶ」は、用語「ウイルスクリアランス指数」、「クリアランス指数」、「ＲＦ」または「Ｒ」と交換可能に使用される。一実施形態では、「Ｌｏｇ１０低減値」または「ＬＲＶ」は、液体中の感染性ウイルス粒子の低減尺度として使用することができる。本明細書で使用される場合、「Ｌｏｇ１０低減値」または「ＬＲＶ」は、ウイルス不活化前の感染性ウイルス粒子の、ウイルス不活化後の感染性ウイルス粒子に対する比の対数（底１０）として定義される。ＬＲＶ値は、所与のタイプのウイルスに特異的である。０を超える任意のＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）は、バイオ医薬品の生成方法およびプロセスなどの方法およびプロセスの安全性の改善にとって有益であることが当業者には明らかである。本発明による方法によって達成されるＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）は、当業者に公知の通り決定される。例えばＬＲＶは、本発明によるウイルス不活化のための方法に液体を供する前および供した後の、液体中の感染性ウイルス粒子の数を決定することによって決定され得る。
【００２８】
当業者は、液体中の感染性ウイルス粒子を測定するための数々の方法を認識されよう。例えば、限定されるものではないが、液体中の感染性ウイルス粒子の濃度は、好ましくは、プラークアッセイまたはＴＣＩＤ５０アッセイによって、より好ましくはＴＣＩＤ５０アッセイによって測定され得る。「ＴＣＩＤ５０アッセイ」は、本明細書で使用される場合、組織培養感染用量アッセイを指す。ＴＣＩＤ５０アッセイは、終点希釈試験であり、ここでＴＣＩＤ５０値は、接種細胞培養物の５０％に細胞死または病理学的変化を誘導するのに必要なウイルス濃度を表す。
【００２９】
用語「サーファクタント(surfactant)」は、本明細書で使用される場合、２種の液体の間または液体と固体の間の表面張力を低減する化合物を指す。サーファクタントは、界面活性剤(detergent)、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、および分散剤として作用することができる。
【００３０】
本発明と関連して、最初および２番目に言及される溶媒、界面活性剤および／または液体と関連する、「に添加する」、「に添加される」または「に添加された」などの用語は、最初に言及される溶媒、界面活性剤および／または液体が、２番目に言及される溶媒、界面活性剤および／または液体に添加される状況を包含する。しかし、これらの用語は、２番目に言及される溶媒、界面活性剤および／または液体が、最初に言及される溶媒、界面活性剤および／または液体に添加される状況を包含することも意味する。したがって、「に添加する」、「に添加される」または「に添加された」などの用語は、最初に言及される溶媒、界面活性剤および／もしくは液体が、２番目に言及される溶媒、界面活性剤および／もしくは液体に添加されるべきか、またはその逆であるかを特定することを意味しない。
【００３１】
当業者に公知の通り、用語「界面活性剤」は、当技術分野で公知のその全般的な意味に従って使用され、特に、脂質膜を透過することができるサーファクタントを含む。例えば、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびデオキシコール酸塩は、タンパク質の疎水性セグメントに結合することによって、両親媒性膜タンパク質を可溶化することが示唆されている（Simons  et  al.,  1973を参照されたい）。界面活性剤は、それらの電荷に応じて３つの広範な群に分類される。アニオン性界面活性剤は、アニオン性の、すなわち負電荷の親水性基を含む。例示的なアニオン性界面活性剤は、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ラウレス硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、セトリミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドである。カチオン性界面活性剤は、カチオン性の、すなわち正電荷の親水性基を含む。例示的なカチオン性界面活性剤は、塩化ベンザルコニウム、セチルトリメチルアンモニウム（trimethlammonium）ブロミド（ＣＴＡＢ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）および塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）である。用語「非イオン性界面活性剤」は、本明細書で使用される場合、正電荷も負電荷も有していない界面活性剤を指す。例示的な非イオン性界面活性剤は、ソルビタンエステル（ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート）、ポリソルベート（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレン（Polyoxyethylen）（２０）−ソルビタン−モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０／ポリソルベート８０））、ポロキサマー（ポロキサマー４０７、ポロキサマー１８８）およびクレモフォールである。本発明による界面活性剤は、好ましい実施形態において特定される通りであり、それには、限定されるものではないが、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＢｒｉｊ  Ｃ１０が含まれる。
【００３２】
用語「非フェノール性」は、本明細書で使用される場合、用語「フェノールを含まない」と交換可能に使用される。本発明において使用される場合、非フェノール性界面活性剤は、いかなるフェノール官能基も含有していない界面活性剤を指す。用語「芳香族」は、当業者に公知の意味を有する。芳香族でない界面活性剤は、本発明において使用される場合、いかなる芳香環も含有していない界面活性剤を指す。
【００３３】
用語「環境適合性の」は、本明細書で使用される場合、当業者に公知の意味を有する。本発明の好ましい実施形態では、界面活性剤に関する用語「環境適合性の」は、界面活性剤が内分泌撹乱物質として作用しないことを示す。内分泌撹乱物質は、内分泌系の機能を変え、結果的に、無傷生物もしくはその子孫、または（亜）集団の健康に悪影響を引き起こす外因性物質である。当業者は、内分泌撹乱物質を特定する様々な方法を認識されよう。内分泌撹乱物質およびそれらの評価に関するさらなる情報は、例えば、その全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる、２０１２年１２月１２日採用の"ECHA  Support  document  for  for  identification  of  4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol,  ethoxylated  as  substances  of  very  high  concern  because,  due  to  their  degradation  to  a  substance  of  very  high  concern  (4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol)  with  endocrine  disrupting  properties,  they  cause  probable  serious  effects  to  the  environment  which  give  rise  to  an  equivalent  level  of  concern  to  those  of  CMRs  and  PBTs/vPvBs"、またはその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる、世界保健機関の国際化学物質安全性計画によって刊行された冊子"Global  Assessment  of  the  Sate-of-the-Science  of  Endocrine  Disruptors"(WHO/PCS/EDC/02.2)に見出すことができる。
【００３４】
用語「溶媒」は、本明細書で使用される場合、当業者に公知の意味を有する。本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法において有機溶媒が使用される。特に有用な有機溶媒は、界面活性剤と脂質エンベロープウイルスのリポタンパク質エンベロープとの接触を促進する環境を作り出す。したがって、このような接触を促進する、限定されるものではないが、エーテル、アルコール、ジアルキルホスフェートもしくはトリアルキルホスフェートのようなアルキルホスフェート、またはそれらの任意の組合せを含めた有機溶媒は、本発明の方法において好ましく使用される。
【００３５】
本明細書に開示される方法において有用なエーテル溶媒には、式Ｒ１−Ｏ−Ｒ２［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立に、酸素原子または硫黄原子を含有することができるＣ１〜Ｃ１８アルキルまたはＣ１〜Ｃ１８アルケニル、好ましくはＣ１〜Ｃ１８アルキルまたはＣ１〜Ｃ１８アルケニルである］を有する溶媒が含まれる。エーテルの非限定的な例として、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチル−ブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテルおよびメチルイソブチルエーテルが挙げられる。本明細書に開示される方法において有用なアルコール溶媒には、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基またはＣ１〜Ｃ８アルケニル基を有する溶媒が含まれる。アルコールの非限定的な例として、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｎ−ペンタノールおよびイソペンタノールが挙げられる。本明細書に開示される方法において有用なアルキルホスフェート溶媒には、いずれも酸素原子または硫黄原子を含有することができるＣ１〜Ｃ１８アルキル基またはＣ１〜Ｃ１８アルケニル基を有する溶媒が含まれる。アルキルホスフェートの非限定的な例として、ジ−（ｎ−ブチル）ホスフェート、ジ−（ｔ−ブチル）ホスフェート、ジ−（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、ジ−（２−エチルヘキシル）ホスフェート、ジ−（ｎ−デシル）ホスフェートまたはエチルジ（ｎ−ブチル）ホスフェートのようなジアルキルホスフェート、およびトリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート、トリ−（ｔ−ブチル）ホスフェート、トリ−（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、トリ−（２−エチルヘキシル）ホスフェートまたはトリ−（ｎ−デシル）ホスフェートのようなトリアルキルホスフェートが挙げられる。
【００３６】
用語「バイオ医薬生成物」は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知であり、その活性物質が、生物学的物質、例えば哺乳動物細胞または微生物によって生成される生物学的物質である、生成物を指す。本明細書で使用される場合、本発明の方法において使用されるバイオ医薬生成物は、最終的に製造された生成物に限定されず、好ましくは製造プロセスの任意の段階の中間生成物も含む。
【００３７】
用語「バイオ医薬品薬物」は、本明細書で使用される場合、当業者に公知の意味を有する。バイオ医薬品薬物は、組換えバイオ医薬品薬物および他の供給源由来のバイオ医薬品薬物、例えばヒト血漿から得られたバイオ医薬品薬物の両方を含む。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「デプスフィルター」は、当技術分野で公知の意味を有する。特に、このようなフィルター（例えば、勾配密度デプスフィルター）は、フィルター材料の厚み内で濾過を達成する。このようなフィルターの一般的なクラスは、複雑な蛇行状迷路の流路を形成するように結合した（またはそうでなければ固定された）繊維の無作為マトリックスを含むものである。これらのフィルターによる粒子の分離は、一般に、繊維マトリックスによる捕捉または繊維マトリックスへの吸着によって生じる。細胞培養ブロスおよび他の原料のバイオ処理のために最も頻繁に使用されているデプスフィルター媒体は、セルロース繊維、ＤＥなどのフィルター助剤、および正電荷樹脂バインダーである。デプスフィルター媒体は、絶対フィルターとは異なり、細孔径よりも大きい粒子および小さい粒子の両方を保持することができる多孔質媒体にわたって粒子を保持する。粒子の保持には、サイズ排除と、疎水性、イオン性および他の相互反応を介する吸着との両方が伴うと考えられる。
【００３９】
用語「バイオ医薬品薬物を精製する」は、本明細書で使用される場合、当業者に公知の意味を有し、本発明の混合物に含まれ得る他の物質からバイオ医薬品薬物を分離することを指す。本発明の好ましい実施形態では、用語「バイオ医薬品薬物を精製する」は、本発明の界面活性剤からバイオ医薬品薬物を分離することを指す。
【００４０】
用語「クロマトグラフィー」は、当技術分野で公知のその意味に従って使用される。その用語は、混合物中に存在する他の分子から目的の分析物（例えば、バイオ医薬品薬物などの標的分子）を分離する、任意のクロマトグラフィー技術を含む。通常、目的の分析物は、混合物の個々の分子が移動相の影響下で固定媒体中を移動する速度、または結合および溶出プロセスの差異の結果として、他の分子から分離される。
【００４１】
用語「クロマトグラフィー樹脂」および「クロマトグラフィー媒体」は、本明細書において交換可能に使用され、混合物中に存在する他の分子から目的の分析物（例えば、バイオ医薬品薬物などの標的分子）を分離する、任意の種類の相（例えば、固相）を指す。通常、目的の分析物は、混合物の個々の分子が移動相の影響下で固定固体相中を移動する速度、または結合および溶出プロセスの差異の結果として、他の分子から分離される。様々なタイプのクロマトグラフィー媒体の例として、例えば、カチオン交換樹脂、カチオン交換膜、親和性樹脂、アニオン交換樹脂、アニオン交換膜、疎水性相互作用樹脂およびイオン交換モノリスが挙げられる。
【００４２】
用語「医薬製剤」は、本明細書で使用される場合、当業者に公知の意味を有し、患者に投与するのに適した任意の製剤を指す。医薬製剤は、当技術分野で公知の方法に従って調製することができる。例えば、製剤に存在する任意のバイオ医薬品薬物について、当業者は、緩衝液、安定剤、サーファクタント、抗酸化剤、キレート剤および／または防腐剤等を含めた好ましい追加の成分を選択し、添加することができよう。
【００４３】
用語「溶媒／界面活性剤の混合物」は、本明細書で使用される場合、当業者に公知の意味を有する。好ましい実施形態では、本発明に従って使用される溶媒／界面活性剤の混合物は、水以外の少なくとも１つの溶媒および少なくとも１つの界面活性剤を含有する。本発明に従って使用される溶媒は、好ましくは有機溶媒であり、最も好ましくはトリ−ｎ−ブチルホスフェートである。混合物に含有される様々な溶媒および／または界面活性剤の数は、特に限定されない。例えば、溶媒／界面活性剤の混合物は、トリ−ｎ−ブチルホスフェート、ポリソルベート８０および本発明によるポリオキシエチレンエーテル界面活性剤から構成され得る。
【００４４】
用語「の間」は、本発明において数値範囲を示すために使用される場合、それぞれの範囲の示されている下限および上限を含むことを理解すべきである。例えば、温度が０℃〜１０℃の間であると示される場合、これは、０℃および１０℃の温度を含む。同様に、変数ｘが、例えば４〜１６の間の整数であると示される場合、これは、整数４および１６を含む。
【００４５】
用語「１時間」は、本明細書で使用される場合、正確に６０分に限定されないことを理解すべきである。本明細書で使用される場合、用語「１時間」は、６０分±５分、好ましくは６０分±２分に関すると理解すべきである。
【００４６】
実施形態
脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法は、界面活性剤を液体に添加して、前記界面活性剤および前記液体の混合物を調製するステップと、前記混合物をインキュベートして、前記ウイルスを不活化するステップとを含む。前述の通り、用語「脂質エンベロープを有するウイルスを不活化する」は、本明細書で使用される場合、溶液中の感染性ウイルス粒子の濃度を低減することを指す。脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法では、その方法が、少なくとも１つのウイルスについて少なくとも１のＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）、または少なくとも１つのウイルスについて少なくとも２のＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）、または少なくとも１つのウイルスについて少なくとも３のＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）、または少なくとも１つのウイルスについて少なくとも４のＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）、または少なくとも１つのウイルスについて少なくとも５のＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）、または少なくとも１つのウイルスについて少なくとも６のＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）、または少なくとも１つのウイルスについて少なくとも７のＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）、または少なくとも１つのウイルスについて少なくとも８のＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）、最も好ましくは少なくとも１つのウイルスについて少なくとも４のＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）を達成することが好ましい。当然のことながら、少なくとも１つのウイルスについていかなるＬｏｇ１０低減値（ＬＲＶ）も、例えばバイオ医薬品の生成プロセスの安全性を改善するので、有益であることが当業者に明らかである。本発明に従って言及されるＬＲＶは、エンベロープウイルスのＬＲＶである。
【００４７】
本発明の方法は、一般に、脂質エンベロープウイルスを不活化するためのものであるが、本発明による界面活性剤は、例えば非エンベロープウイルスがそれらの複製サイクル中の一部の段階で脂質エンベロープを獲得する場合には、このような非エンベロープウイルスも不活化し得ることを理解すべきである。したがって、用語「脂質エンベロープを有するウイルスを不活化する」は、本発明の方法において、脂質エンベロープを有するウイルスに加えて、非エンベロープウイルスも不活化され得る可能性を排除することを意味しない。
【００４８】
脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法では、界面活性剤を液体に添加して、前記界面活性剤および前記液体の混合物を調製し、前記混合物をインキュベートして、前記ウイルスを不活化する。本発明の方法の前記液体は、溶液、懸濁液、またはいくつかの懸濁液および／もしくは溶液の混合物を含めた、任意の種類の液体またはいくつかの液体の混合物であり得ることを理解すべきである。例えば、それに限定されるものではないが、本発明による前記液体は、血液であってよく、または血液もしくは血液画分を含有することができ、血漿であってよく、または血漿もしくは血漿画分を含有することができ、血清であってよく、または血清もしくは血清画分を含有することができ、細胞培養培地であってよく、または細胞培養培地を含有することができ、緩衝液であってよく、または緩衝液を含有することができる。液体は、プロセス中間体、例えばバイオ医薬品薬物の調製におけるプロセス中間体であってもよい。
【００４９】
本発明による液体は、脂質エンベロープを有するウイルスを含有していてよく、または脂質エンベロープを有するウイルスを含有することが疑われ得る（例えば、液体が血液であるか、または血液もしくは血液画分を含有する場合、血漿であるか、または血漿もしくは血漿画分を含有する場合、血清であるか、または血清もしくは血清画分を含有する場合、あるいは液体が、細胞培養で生成されたバイオ医薬品薬物を含有する場合）。本発明のすべての他の実施形態による本発明の好ましい実施形態では、本発明による前記液体は、脂質エンベロープを有するウイルスを含有する。本発明による前記液体における脂質エンベロープを有する前記ウイルスの起源は、特に限定されない。例えば、ウイルスは、本発明による液体を調製するために使用され得るヒト血液に由来してよく、または本発明による液体を調製するために使用され得るヒト血漿に由来してよく、または本発明による液体を調製するために使用され得るヒト血清に由来してよく、または本発明による液体を調製するために使用され得る細胞培養培地に由来してよい。特に、ウイルスが、本発明による液体を調製するために使用される細胞培養培地に由来する場合、そのウイルスは、ウシ血清アルブミンなどの前記細胞培養培地の動物由来の構成成分に由来し得る。
【００５０】
脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法では、界面活性剤を液体に添加して、前記界面活性剤および前記液体の混合物を調製する。前記界面活性剤は、ポリオキシエチレンエーテルである。
【００５１】
ポリオキシエチレンエーテルは、当業者に公知であり、式Ａによる以下の構造を有する
【化２２】
2021501163.tif 000023
［式中、ｎは、１に等しいか、または１よりも大きい］。
【００５２】
当業者に明らかであるように、ポリオキシプロピレンエーテルは、本発明によるポリオキシエチレンエーテルと非常に類似した特性を有することができる。したがって、本発明の他のすべての実施形態に従って、例えば、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための本発明の方法では、ポリオキシエチレンエーテルは、ポリオキシプロピレンエーテルによって置き換えることができる。
【００５３】
ポリオキシプロピレンエーテルも、当業者に公知であり、式Ｂによる以下の構造を有する
【化２３】
2021501163.tif 000024
［式中、ｎは、１に等しいか、または１よりも大きい］。
【００５４】
本明細書で言及される場合、本発明による「ポリオキシエチレンエーテル」は、好ましくは、当技術分野におけるその一般的な意味に従うポリオキシエチレンエーテルである。あるいは、本発明によるポリオキシエチレンエーテルは、ポリオキシエーテル分子の総数の一部、好ましくは大部分がポリオキシエチレンエーテル分子であるが、ポリオキシエーテル分子の総数の別の一部、好ましくは少数が、オキシエチレンおよびオキシプロピレン単位を含む混合ポリマー、ならびに／またはオキシプロピレン単位を含むポリマーである、ポリオキシエーテルであってもよい。この場合、用語「ポリオキシエーテル分子の総数の大部分が、ポリオキシエチレンエーテル分子である」は、ポリオキシエーテル分子の総数の少なくとも５０％が、ポリオキシエチレンエーテル分子であることを意味する。好ましくは、ポリオキシエーテル分子の総数の少なくとも６０％が、ポリオキシエチレンエーテル分子である。より好ましくは、ポリオキシエーテル分子の総数の少なくとも７０％が、ポリオキシエチレンエーテル分子である。さらにより好ましくは、ポリオキシエーテル分子の総数の少なくとも８０％が、ポリオキシエチレンエーテル分子である。さらにより好ましくは、ポリオキシエーテル分子の総数の少なくとも９０％が、ポリオキシエチレンエーテル分子である。最も好ましくは、ポリオキシエーテル分子の総数の少なくとも９５％が、ポリオキシエチレンエーテル分子である。しかしあるいは、本発明によるポリオキシエチレンエーテルは、大部分（例えば、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％）のオキシエチレン単位および少数のオキシプロピレン単位を含む、混合ポリオキシエーテルであってもよい。
【００５５】
本発明の方法に従って使用するための界面活性剤は、非フェノール性である。本発明のすべての他の実施形態による別の実施形態では、本発明の方法に従って使用するための界面活性剤は、芳香族ではない。
【００５６】
本発明によるポリオキシエチレンエーテル界面活性剤は、エトキシル化反応によって合成することができる。エトキシル化は、アルコールエトキシレート（別名ポリオキシエチレンエーテル）を作製するために、アルコール（あるいはアミンを使用することができる）で実施される工業プロセスである。反応は、エチレンオキシドを、高温（例えば、約１８０℃）および高圧下（例えば、１〜２バールの圧力下）で、触媒として働く塩基（例えば、水酸化カリウム、ＫＯＨ）を用いてアルコールに通すことによって進行する。このプロセスは、非常に発熱性である。
【化２４】
2021501163.tif 000025
【００５７】
この反応によって、広い多分散性の繰り返し単位長を有する生成物が形成される（先の式におけるｎの値は、平均ポリマー長である）。
【００５８】
実験室規模では、最初に、アルコールのヒドロキシ基から良好な脱離基（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｓまたはＯＴｆ）を形成し、次に、この基質をモノ脱プロトン化ポリエチレングリコールと反応させることによって、ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を生成することができる。あるいは、良好な脱離基（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｓまたはＯＴｆ）をポリエチレングリコール鎖上に導入することができ、それを第２のステップで脱プロトン化アルコールと反応させる。
【化２５】
2021501163.tif 000026
【００５９】
ポリオキシエチレンエーテルを合成するための例示的な方法は、例えば、それらの全体があらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第１，９７０，５７８号およびDi  Serio  et  al.  (2005)に詳説されている。
【００６０】
ＴＸ−１００、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＢｒｉｊ  Ｃ１０は、ポリオキシエチレンアルキルエーテルであるが（すなわち、エトキシル化反応がエチレンオキシドガスを用いて実施される）、プロピレンオキシドを使用して工業規模で類似の反応（すなわち、プロポキシル化）を実施することも可能である。その差は、ＰＥＧ鎖におけるメチル基の置換だけであろう。
【化２６】
2021501163.tif 000027
【００６１】
エトキシル化およびプロポキシル化は、同じプロセスで合わせることもでき、オキシエチレン単位およびオキシプロピレン単位を含む混合ポリマーであるポリオキシエーテルなどの混合生成物を生じる。
【００６２】
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の毒性活性は、海洋生物のある特定の内分泌受容体にドッキングする能力を有するフェノール部分から生じる。芳香環とＰＥＧ鎖の間にメチレン基を挿入することによって、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００のフェノール官能基は、新しい構造にはもはや存在しない。さらに、環境に放出された後、ＰＥＧ鎖が切断されると、曝露されたベンジルアルコールは、対応する安息香酸に容易に酸化する。この代謝産物は、フェノール誘導体とは完全に異なる極性および幾何構造を有し、それによって、内分泌受容体の任意の阻害を防止する。
【００６３】
先の考察に基づいて、本発明者らは、非フェノール性ポリオキシエチレンエーテルを合成し、それらの抗ウイルス活性を試験した（実施例４〜１０を参照されたい）。したがって、本発明はまた、以下の一般式（ＶＩＩＩ）の非フェノール性ポリオキシエチレンエーテルを提供する。
【化２７】
2021501163.tif 000028
【００６４】
式（ＶＩＩＩ）において、Ｒは、２〜１２個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表し、ｍは、１〜４の整数を表し、Ａはポリオキシエチレン残基を表し、但し、必要に応じて、以下の構造式を有する２９−［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサノナコサン−１−オールが除外されることを条件とする。
【化２８】
2021501163.tif 000029
【００６５】
式（ＶＩＩＩ）において、Ｒは、２〜１２個、好ましくは２〜８個、より好ましくは２〜６個、最も好ましくは４個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数の、好ましくは２〜６個、最も好ましくは４個のメチル基を有する炭化水素基を表す。
【００６６】
好ましくは、Ｒは、２〜１２個、好ましくは２〜８個、より好ましくは２〜６個、最も好ましくは４個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての２個のメチル基を有する炭化水素基；２〜１２個、好ましくは２〜８個、より好ましくは２〜６個、最も好ましくは４個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての４個のメチル基を有する炭化水素基；または２〜１２個、好ましくは２〜８個、より好ましくは２〜６個、最も好ましくは４個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての６個のメチル基を有する炭化水素基を表す。
【００６７】
最も好ましくは、Ｒは、２，４，４−トリメチル−ペンタ−２−イル基を表す。
【００６８】
式（ＶＩＩＩ）において、ｍは、１〜４の整数、好ましくは１〜２の整数、最も好ましくは整数１を表す。
【００６９】
式（ＶＩＩＩ）において、Ａは、ポリオキシエチレン残基、好ましくは２〜２０個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基、より好ましくは４〜１６個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基、さらにより好ましくは８〜１２個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基、最も好ましくは９または１０個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基を表す。
【００７０】
一般式（ＶＩＩＩ）の化合物の好ましい実施形態は、Ｒが、２〜６個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての２〜４個のメチル基を有する炭化水素基を表し、ｍが、１〜２の整数を表し、Ａが、８〜１２個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基を表す、化合物である。
【００７１】
一般式（ＶＩＩＩ）の化合物の別の好ましい実施形態は、Ｒが、２〜６個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての２〜４個のメチル基を有する炭化水素基を表し、ｍが、整数１を表し、Ａが、８〜１２個のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレン残基を表す、化合物である。
【００７２】
一般式（ＶＩＩＩ）の化合物の特に好ましい実施形態は、以下の化合物：
【化２９】
2021501163.tif 000030
であり、式中、ｍおよびｚは、以下の群：
ｍ＝１〜４、好ましくはｍは、１に等しく、
ｚ＝１〜５
から独立に選択される整数である。
【００７３】
一般式（ＶＩＩＩ）の化合物の別の特に好ましい実施形態は、以下の化合物：
【化３０】
2021501163.tif 000031
であり、式中、ｎは、４〜１６の間の整数であり、好ましくはｎは、９または１０に等しい。
【００７４】
式（ＶＩＩＩ）の化合物は、一般に公知の合成法、例えばVogel's  Textbook  of  Practical  Organic  Chemistry  (5th  Edition,  1989,  A.I.  Vogel,  A.R.  Tatchell,  B.S.  Furnis,  A.J.  Hannaford,  P.W.G.  Smith)に記載されているものによって合成され得る。例えば、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートは、一般式（ＶＩＩＩ）の基Ｒに対応する置換基を含むフェノールを、対応する安息香酸またはホモ安息香酸に変換し、アルコール基に酸基を還元し、アルコールを反応させてポリエチレングリコールエーテル（ポリオキシエチレンエーテル；ＰＯＥエーテルとしても公知）を形成することによって調製することができる。本明細書では、エチレンオキシドまたは適切なポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコールエーテル官能基を導入するための基礎として働くことができる（スキーム１；個々の転換を行うのに有効な実験手順の代表例は、例えば、Bioorganic  &  Medicinal  Chemistry,  16(9),  4883-4907,  2008、Journal  of  Medicinal  Chemistry,  48(10),  3586-3604,  2005、Journal  of  Physical  Chemistry  B,  107(31),  7896-7902;  2003、Journal  of  Nanoparticle  Research,  15(11),  2025/1-2025/12,  12  pp.,  2013、およびＰＣＴ国際出願第２００５０１６２４０号、２００５年２月２４日に見出すことができる）。
【００７５】
【化３１】
2021501163.tif 000032
【００７６】
あるいは、一般式（ＶＩＩＩ）の化合物は、トルエンをアルキル化した後、ベンジル位のメチル基の官能化およびさらなる反応によってポリエチレングリコールエーテルを形成することによって入手することができる（スキーム２；個々の転換を行うのに有効な実験手順の代表例は、例えば、Russian  Journal  of  Applied  Chemistry,  82(6),  1029-1032,  2009、Journal  of  Organic  Chemistry,  79(1),  223-229,  2014、およびChemistry  -  A  European  Journal,  23(60),  15133-15142,  2017)に見出すことができる）。ベンジルアルコールを直接的にアルキル化して、ポリエチレングリコールエーテル官能基を導入するのに適した中間体を得ることも想定される（スキーム３；対応する転換のための実験手順の代表例は、例えば、Russian  Journal  of  Organic  Chemistry,  51(11),  1545-1550,  2015に見出すことができる）。
【００７７】
【化３２】
2021501163.tif 000033
【００７８】
【化３３】
2021501163.tif 000034
【００７９】
式（ＶＩＩＩ）による構造を有する先のポリオキシエチレンエーテルは、脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法において使用することができる。
【００８０】
前述の通り、当業者に明らかであるように、ポリオキシエチレンエーテルの合成では、通常、広い多分散性のポリオキシエチレン（polyoxytheylene）繰り返し単位長を有する生成物が得られる。したがって、ポリオキシエチレン繰り返し単位の数が、本発明のポリオキシエチレンエーテルについて示されている場合、この数は、平均ポリオキシエチレン繰り返し単位長を指す。平均ポリオキシエチレン繰り返し単位長は、試料のすべてのポリオキシエチレンエーテル分子のポリオキシエチレン繰り返し単位の平均数を指す。例えば、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための本発明の方法の一実施形態では、界面活性剤を液体に添加して、前記界面活性剤および前記液体の混合物を調製し、前記界面活性剤は、式（ＩＩＩ）による以下の構造を有するポリオキシエチレンエーテルであり得る
【化３４】
2021501163.tif 000035
［式中、ｎは、１０に等しい］。
【００８１】
脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための本発明の方法のこの実施形態では、先の式（ＩＩＩ）のｎ＝１０は、本発明による液体に添加されるすべてのポリオキシエチレンエーテル分子のポリオキシエチレン繰り返し単位の平均数である。
【００８２】
脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法において使用されるポリオキシエチレンエーテル界面活性剤は、平均数２〜１００、２〜５０、２〜２０、または４〜１６、または９もしくは１０のポリオキシエチレン繰り返し単位を有する。好ましくは、ポリオキシエチレン繰り返し単位の平均数は、４〜１６、より好ましくは９または１０、最も好ましくは１０である。
【００８３】
当業者に明らかであるように、本発明によるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンエーテル界面活性剤において、メチル基は、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン部分の末端ヒドロキシ基に付加され得る（すなわち、末端ヒドロキシ基はブロックされ得る）。末端ヒドロキシ基のこのようなブロックにより、合成を容易にすることができる。このことは、エトキシル化またはプロポキシル化によって作製されていない化合物、例えば先のスキーム１またはスキーム２に従って作製された化合物にとって、特に有用である。メチルでブロックされたポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン部分を有する構造は、以下の例示的な構造によって示される通り、通常、ｍＰＥＧ誘導体と呼ばれる。
【化３５】
2021501163.tif 000036
【００８４】
当業者に明らかであるように、ポリオキシプロピレンエーテルの合成では、通常、やはり広い多分散性のポリオキシプロピレン繰り返し単位長を有する生成物が得られる。したがって、ポリオキシプロピレン繰り返し単位の数が、本発明によるポリオキシプロピレンエーテルについて示されている場合、この数は、平均ポリオキシプロピレン繰り返し単位長を指す。ポリオキシエチレンエーテルについて先に記載される通り、平均ポリオキシプロピレン繰り返し単位長は、試料のすべてのポリオキシプロピレンエーテル分子のポリオキシプロピレン繰り返し単位の平均数を指す。
【００８５】
本発明に従って使用されるポリオキシプロピレンエーテル界面活性剤は、平均数２〜１００、２〜５０、２〜２０、または５〜１５、または９もしくは１０のポリオキシプロピレン繰り返し単位を有する。好ましくは、ポリオキシプロピレン繰り返し単位の平均数は、５〜１５、より好ましくは９または１０、最も好ましくは１０である。
【００８６】
本発明の一実施形態では、脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法において使用されるポリオキシエチレンエーテルは、式（ＩＩ）による以下の構造を有する。
【化３６】
2021501163.tif 000037
【００８７】
本発明の好ましい実施形態では、先の式（ＩＩ）によって表される化合物は、商業的に利用可能な還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＣＡＳ番号９２０４６−３４−９）である。
【００８８】
本発明の一実施形態では、脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法において使用されるポリオキシエチレンエーテルは、式（ＩＶ）による以下の構造を有する。
【化３７】
2021501163.tif 000038
【００８９】
本発明の好ましい実施形態では、先の式（ＩＶ）によって表される化合物は、商業的に利用可能な還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１（ＣＡＳ番号１２３３５９−４１−１）である。
【００９０】
本発明の一実施形態では、脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法において使用されるポリオキシエチレンエーテルは、式（ＶＩ）による以下の構造を有する
【化３８】
2021501163.tif 000039
［式中、ｘは、１５に等しい］。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態では、先の式（ＶＩ）によって表される化合物は、商業的に利用可能なＢｒｉｊ  Ｃ１０（ＣＡＳ番号９００４−９５−９）である。
【００９２】
脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための本発明の方法における本発明の他のすべての実施形態によれば、ポリオキシエチレンエーテルは、モノオキシエチレンエーテルによって置き換えることもできる。本発明の好ましい実施形態では、前記モノオキシエチレンエーテルは、式Ｃによる以下の構造：
【化３９】
2021501163.tif 000040
を有し、式中、ｘ、ｙおよびｚは、以下の群：
ｘ＝０〜５
ｙ＝０〜５
ｚ＝０〜２０
から独立に選択される整数である。
【００９３】
好ましくは、前記モノオキシエチレンエーテルは、式Ｄによる以下の構造、
【化４０】
2021501163.tif 000041
または式Ｅによる以下の構造
【００９４】
【化４１】
2021501163.tif 000042
を有する。
【００９５】
本発明の他のすべての実施形態によれば、本発明はまた、本発明によって提供されるポリオキシエチレンエーテルに対応するモノオキシエチレンエーテルを提供する。本発明の好ましい実施形態では、前記モノオキシエチレンエーテルは、式Ｆによる以下の構造を有する
【化４２】
2021501163.tif 000043
［式中、Ｒは、２〜１２個の炭素原子の直鎖、および前記直鎖上の置換基としての１つまたは複数のメチル基を有する炭化水素基を表し、ｍは、１〜４の整数を表し、Ａは、ポリオキシエチレン残基を表す］。
【００９６】
別の好ましい実施形態では、式Ｆのモノオキシエチレンエーテルは、以下の化合物である。
【化４３】
2021501163.tif 000044
【００９７】
式Ｆによる構造を有する先のモノオキシエチレンエーテルは、脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法において使用することができる。
【００９８】
脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法では、界面活性剤を液体に添加して、前記界面活性剤および前記液体の混合物を調製する。本発明の一実施形態では、ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を液体に添加して、液体中、最終濃度約０．０３％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．０５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは約０．５％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは約０．５％（ｗ／ｗ）〜２％（ｗ／ｗ）のポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を得る。
【００９９】
脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための本発明の方法の好ましい実施形態では、その方法において使用されるポリオキシエチレンエーテルは、脂質エンベロープを有する前記ウイルスを不活化するのに適している。不活化は、本明細書で使用される場合、脂質エンベロープウイルスが細胞に感染する能力を撹乱することを指す。当業者に明らかであるように、脂質エンベロープウイルスが細胞に感染する能力、すなわち、脂質エンベロープウイルスの感染力は、典型的に、溶液中の感染性ウイルス粒子の数を決定することによってアセスメントされる。溶液中の感染性ウイルス粒子の数を決定するための例示的な方法は、本明細書に記載される。
【０１００】
脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための本発明の方法における一実施形態では、界面活性剤および溶媒を液体に添加するステップは、前記ウイルスを不活化するための溶媒／界面活性剤の混合物を調製するやり方で行われる。好ましくは、前記溶媒は、有機溶媒であり、さらにより好ましくは、前記溶媒は、トリ−ｎ−ブチルホスフェートである。界面活性剤の濃度、ならびに溶媒のタイプおよび濃度は、例えば、液体中に存在する潜在的なウイルス、所望のＬＲＶ、液体中に存在し得るバイオ医薬品薬物の特性、および液体中に存在し得るバイオ医薬品薬物の製造プロセスの特徴（例えば、不活化が行われる温度）を考慮することによって、当業者により適切に選択され得ると理解される。典型的に、本発明によるインキュベーション中の有機溶媒および単一界面活性剤の最終濃度は、約０．０１％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の有機溶媒および約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）の界面活性剤、好ましくは約０．１％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の有機溶媒および約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）の界面活性剤、より好ましくは約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１％（ｗ／ｗ）の有機溶媒および約０．５％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の界面活性剤、最も好ましくは約０．１％（ｗ／ｗ）〜約０．５％（ｗ／ｗ）の有機溶媒および約０．５％（ｗ／ｗ）〜約２％（ｗ／ｗ）の界面活性剤である。
【０１０１】
脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための本発明の方法における別の実施形態では、界面活性剤（および必要に応じて溶媒も）を液体に添加するステップは、さらなる界面活性剤を液体に添加するやり方で行われる。好ましくは、前記さらなる界面活性剤は、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレエート（例えば、ポリソルベート８０またはＴＷＥＥＮ（登録商標）  ８０としても公知である）である。好ましくは、前記溶媒は、有機溶媒であり、さらにより好ましくは、前記溶媒は、トリ−ｎ−ブチルホスフェートである。本発明による界面活性剤の濃度、さらなる界面活性剤のタイプおよび濃度、ならびに溶媒のタイプおよび濃度は、例えば、液体中に存在する潜在的なウイルス、所望のＬＲＶ、液体中に存在し得るバイオ医薬品薬物の特性、および液体中に存在し得るバイオ医薬品薬物の製造プロセスの特徴（例えば、不活化が行われる温度）を考慮することによって、当業者により適切に選択され得ると理解される。典型的に、有機溶媒の最終濃度は、約０．０１％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）であり、本発明による界面活性剤の最終濃度は、約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）であり、さらなる界面活性剤の最終濃度は、約０．０１％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）である。好ましくは、有機溶媒の最終濃度は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）であり、本発明による界面活性剤の最終濃度は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）であり、さらなる界面活性剤の最終濃度は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）である。より好ましくは、有機溶媒の最終濃度は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１％（ｗ／ｗ）であり、本発明による界面活性剤の最終濃度は、約０．５％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）であり、さらなる界面活性剤の最終濃度は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１％（ｗ／ｗ）である。最も好ましくは、有機溶媒の最終濃度は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約０．５％（ｗ／ｗ）であり、本発明による界面活性剤の最終濃度は、約０．５％（ｗ／ｗ）〜約２％（ｗ／ｗ）であり、さらなる界面活性剤の最終濃度は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約０．５％（ｗ／ｗ）である。
【０１０２】
本発明による別の実施形態では、１つの界面活性剤だけが使用される。例えば、本発明の方法の一実施形態では、ステップａ）において、本発明の界面活性剤以外のさらなる界面活性剤は添加されない。本発明の方法の別の実施形態では、その方法において、本発明の界面活性剤以外のさらなる界面活性剤は添加されない。本発明による別の実施形態では、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための方法における本発明の界面活性剤の使用において、本発明の界面活性剤以外のさらなる界面活性剤は使用されない。これらの実施形態の利点の１つは、単一界面活性剤が、その後の（方法）ステップでより容易に除去され得ることである。例えば、単一界面活性剤は、標準の溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理で使用される、２つの界面活性剤および１つの溶媒、特に有機溶媒を典型的に含む３つの構成成分と比較して、より容易に除去することができる。したがって、本発明による別の実施形態では、本発明の界面活性剤を含む組成物は、前記界面活性剤以外のいかなるさらなる界面活性剤も含まない。
【０１０３】
本発明による別の実施形態では、有機溶媒は使用されない。例えば、本発明の方法の一実施形態では、ステップａ）において、有機溶媒は添加されない。本発明による別の実施形態では、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための方法における本発明の界面活性剤の使用において、有機溶媒は使用されない。本発明による別の実施形態では、本発明の界面活性剤を含む組成物は、いかなる有機溶媒も含まない。
【０１０４】
先に概説される通り、脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法は、特に、バイオ医薬品の生成プロセスにおいて有用であり、患者の安全性を保障するためには、最終生成物に活性な（すなわち、感染性）ウイルスが存在しないことが確保されなければならない。したがって、脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法における一実施形態では、界面活性剤は、バイオ医薬生成物またはバイオ医薬品薬物、好ましくはバイオ医薬品薬物を含む液体に添加される。本発明の好ましい実施形態では、前記バイオ医薬品薬物は、ウイルスワクチンではない。本発明によるバイオ医薬品薬物は、特に限定されない。本発明によるバイオ医薬品薬物は、組換えバイオ医薬品薬物および他の供給源由来のバイオ医薬品薬物、例えばヒト血漿から得られたバイオ医薬品薬物の両方を含む。本発明によるバイオ医薬品薬物は、限定されるものではないが、血液因子、免疫グロブリン、置換え酵素、ワクチン、遺伝子治療ベクター、増殖因子およびそれらの受容体を含む。好ましい実施形態では、バイオ医薬品薬物は、治療用タンパク質である。好ましい血液因子には、第Ｉ因子（フィブリノゲン）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、組織因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）、プレカリクレイン、高分子キニノゲン（ＨＭＷＫ）、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンコファクターＩＩ、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ、プラスミノーゲン、アルファ２−抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ１）、ならびにプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２（ＰＡＩ２）が含まれる。第ＶＩＩＩ因子は、特に好ましい血液因子であり、組換え第ＶＩＩＩ因子がさらにより好ましい。本発明に従って使用され得る血液因子は、機能的ポリペプチド変異体、および血液因子をコードするか、またはこのような機能的変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを意味する。好ましい免疫グロブリンには、ヒト血漿由来の免疫グロブリン、モノクローナル抗体および組換え抗体が含まれる。本発明によるバイオ医薬品薬物は、好ましくはそれぞれのヒトもしくは組換えヒトタンパク質、またはそれらの機能的変異体である。
【０１０５】
先に示される通り、本発明によるバイオ医薬品薬物は、ウイルス遺伝子治療ベクターを含めた遺伝子治療ベクターであってもよい。当業者に明らかであるように、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための本発明の方法は、一般に、非エンベロープウイルスを不活化しない。したがって、本発明によるバイオ医薬品薬物がウイルス遺伝子治療ベクターである好ましい実施形態では、このようなウイルス遺伝子治療ベクターは、非エンベロープウイルスに基づく。好ましい実施形態では、このようなウイルス遺伝子治療ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。
【０１０６】
本発明の他のすべての実施形態によれば、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための本発明の方法は、前記混合物をインキュベートして前記ウイルスを不活化するステップ後に、前記バイオ医薬品薬物を精製するステップを含むことができる。好ましくは、前記精製するステップは、前記バイオ医薬品薬物を前記界面活性剤から分離することを含む。当業者は、バイオ医薬品薬物を界面活性剤から分離するための様々な方法を認識されよう。このような方法は、バイオ医薬品薬物の特性、バイオ医薬品薬物が得られる供給源（例えば、組換えにより、または他の供給源から、例えばヒト血漿から）、および所望のバイオ医薬品の適用（例えば、皮下または静脈内に投与されるかどうかなど）を考慮して、当業者によって選択され得る。例えば、バイオ医薬品薬物は、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを使用して、界面活性剤から分離され得る。一実施形態では、前記界面活性剤から前記精製するステップは、２つ以上のクロマトグラフィー精製を含む。
【０１０７】
本発明の他のすべての実施形態によれば、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための本発明の方法は、好ましくはデプスフィルターを用いて前記混合物を濾過するステップを含むことができる。この濾過するステップは、界面活性剤を液体に添加して、前記界面活性剤および前記液体の混合物を調製するステップの前に行うことができる。あるいは、この濾過するステップは、界面活性剤を液体に添加して、前記界面活性剤および前記液体の混合物を調製するステップと、前記混合物をインキュベートして、前記ウイルスを不活化するステップとの間に行うことができる。
【０１０８】
本発明の他のすべての実施形態による別の実施形態では、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための方法において、前記混合物をインキュベートして前記ウイルスを不活化するステップは、前記混合物を、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも１２時間または少なくとも２４時間インキュベートするやり方で行うことができる。
【０１０９】
本発明の他のすべての実施形態による別の実施形態では、前記混合物をインキュベートして前記ウイルスを不活化するステップにおいて、前記混合物は、０℃〜１５℃の間、０℃〜１０℃の間、０℃〜８℃の間、０℃〜６℃の間、０℃〜４℃の間、または０℃〜２℃の間、好ましくは０℃〜１０℃の間の温度などの低温でインキュベートされる。本発明の他のすべての実施形態による代替の実施形態では、前記混合物をインキュベートして前記ウイルスを不活化するステップにおいて、前記混合物は、１６℃〜２５℃の間、１８℃〜２４℃の間、または２０℃〜２３℃の間の温度などの室温または室温に近い温度でインキュベートされる。
【０１１０】
本発明の方法のステップを行うべきやり方は、特に限定されないことを理解すべきである。特に、方法ステップは、バッチ方式で行うことができる。あるいは、方法ステップは、半連続または連続方式で行うこともできる。
【０１１１】
先に概説される通り、脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法は、バイオ医薬品の生成プロセスにおいて特に有用である。したがって、本発明はまた、バイオ医薬品薬物を調製するための方法であって、脂質エンベロープを有するウイルスを、本発明およびその任意の実施形態に従って不活化するための方法の方法ステップを含む、方法に関する。好ましくは、本発明に従ってバイオ医薬品薬物を調製するための方法は、前記バイオ医薬品薬物を含む医薬製剤を調製するステップを含み、このステップは、脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法のステップに続いて実施される。このような医薬製剤は、医薬製剤を調製するための公知の標準に従って調製することができる。例えば、製剤は、例えば担体、賦形剤または安定剤などの薬学的に許容される構成成分を使用することによって、適切に保存し、投与することができるやり方で調製することができる。このような薬学的に許容される構成成分は、患者に医薬製剤を投与する場合に使用される量では毒性がない。
【０１１２】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明によるポリオキシエチレンエーテル界面活性剤が、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するのに特に有用であることを見出した。したがって、本発明はまた、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するための任意の方法における、本発明による開示されるポリオキシエチレンエーテル界面活性剤の使用に関する。好ましくは、前記ウイルスの前記不活化のための前記方法は、溶媒／界面活性剤による処理を使用する方法であり、前記溶媒／界面活性剤による処理は、本発明の前記界面活性剤の使用を含む。別の実施形態では、前記ウイルス不活化は、バイオ医薬品薬物を含む液体におけるウイルスの不活化である。
【０１１３】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明による非フェノール性ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤が、脂質エンベロープを有するウイルスを不活化するのに特に有用であることを見出したので、本発明はまた、本発明によるポリオキシエチレンエーテル界面活性剤、および本発明によるポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を含む組成物に関する。別の実施形態では、本発明によるポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を含む組成物は、バイオ医薬品薬物および／または有機溶媒および／またはさらなる界面活性剤をさらに含む。
【０１１４】
本発明はまた、本発明によるポリオキシエチレンエーテル界面活性剤、または本発明によるポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を含む組成物を含み、さらに、クロマトグラフィー精製のためのクロマトグラフィー樹脂を含む、ウイルス不活化のためのキットを提供する。別の実施形態では、前記キットは、デプスフィルターをさらに含む。
【０１１５】
本発明は、非フェノール性ポリオキシエチレンエーテルを提供する。前述の通り、これらのポリオキシエチレンエーテルは、脂質エンベロープを有するウイルスを本発明に従って不活化するための方法において使用することができる。しかし、これらの非フェノール性ポリオキシエチレンエーテル、ならびに本発明による他のすべての非フェノール性ポリオキシエチレンエーテルは、他の様々な目的で、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が一般に使用される目的で使用することもできる。例えば、本発明による非フェノール性ポリオキシエチレンエーテルは、実験室において使用することができる。実験室中では、本発明による非フェノール性ポリオキシエチレンエーテルは、例えば、細胞を溶解してタンパク質もしくは小器官を抽出するため、または生細胞の膜を透過処理するため、固定されていない（または軽度に固定された）真核細胞膜を透過処理するため、ＣＨＡＰＳなどの双性イオン性界面活性剤と共に膜タンパク質をそれらの天然状態で可溶化するため、ＤＮＡ抽出における溶解緩衝液（通常、アルカリ溶解緩衝液中の５％溶液における）の一部として、免疫染色（通常、ＴＢＳまたはＰＢＳ緩衝液中０．１〜０．５％の濃度における）中の水溶液の表面張力を低減するため、微生物学においてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのコロニー増殖を制限するため、動物由来の組織を脱細胞化するため、あるいはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからＳＤＳを除去した後に、ゲル内でタンパク質を再生させるために使用することができる。別の実施形態では、本発明による非フェノール性ポリオキシエチレンエーテルは、電子工業において、例えば、一部の手順および操作を改善し、加速するための、薄板（ｓｌａｔ）のための湿潤剤として使用することができる。別の実施形態では、本発明による非フェノール性ポリオキシエチレンエーテルは、医療用途を有することができ、例えば、殺精子薬であるノノキシノール（Nonoxinol）９のための代替物として、または医薬賦形剤として、またはインフルエンザワクチン（Ｆｌｕｚｏｎｅ）における成分として使用することができる。さらなる実施形態では、本発明による非フェノール性ポリオキシエチレンエーテルは、高耐久性の工業生成物から低刺激の界面活性剤にわたって、いくつかのタイプの清浄用化合物において使用することができ、蒸留水およびイソプロピルアルコールと一緒に自家製ビニルレコードの清浄液の成分として使用することができ、ダイヤモンド刃の清浄中に使用することができ、エマルジョンの重合のための配合物において使用することができ、タイヤにおいて使用することができ、洗浄剤および清浄剤において使用することができ、ポリマーもしくは接着剤の生成のための出発化学物質として工業において使用することができ、塗料もしくはコーティングにおける、パルプもしくは紙における、油田上の、織物における、農芸化学品における、金属加工油における家庭用もしくは工業用界面活性剤において使用することができ、軟質複合材料のための炭素材料の分散のために使用することができ、または金属めっきにおいて使用することができる。
【０１１６】
以下、本発明を、実施例によってそれに限定することなく例示する。
【実施例】
【０１１７】
先に概説される通り、近年の生態学的研究は、バイオ医薬品の生成プロセスにおけるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の使用に関する環境上の懸念を提起している。本発明者らは、構造的考察に基づいて、環境への負の影響とは関連しないとされてきたＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の有用な代替としての候補界面活性剤を特定した。特に本発明者らは、驚くべきことに、バイオ医薬品の生成中の溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理によって脂質エンベロープウイルスを不活化するためのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の適切な代替として、ポリオキシエチレンエーテルを特定した。以下の実験では、Ｓ／Ｄ処理についての例示的な候補界面活性剤の適切性を、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）含有液およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）含有液で試験した。さらに、以下の実験では、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを合成し、Ｓ／Ｄ処理についての４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートおよび他のポリオキシエチレンエーテルの適切性、ならびに単一界面活性剤による処理を、様々な試験項目で試験した。
【０１１８】
（実施例１）
静脈内免疫グロブリンを含む液体中での還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１を使用するＨＩＶおよびＰＲＶの不活化
静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）を含む液体中で、脂質エンベロープウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を不活化するためのＳ／Ｄ処理についての還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１の適切性を試験し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較した。この目的を達成するために、ウイルスを、ＩＶＩＧを含む液体に添加した。次に、ＩＶＩＧを含むウイルス含有液を、低濃度の還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＳ／Ｄ混合物と共に様々な期間にわたってインキュベートし、ウイルスの残りの感染力を決定した。ウイルス不活化動態、すなわちウイルス不活化効率（ＲＦによって表される）を経時的に評価するために、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を低濃度で使用した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１を含む本発明の界面活性剤は、著しくより高濃度で使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することも期待される。
【０１１９】
材料
ＩＶＩＧを含む液体
ＩＶＩＧを含む液体（ＩＶＩＧ含有液）を、ドライアイス上で凍結させ、収集日後１年以内に使用するまで、≦−６０℃で保存した。
【０１２０】
ウイルス
仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科；エンベロープ；ｄｓＤＮＡ；
【数１】
2021501163.tif 000045
）を、大型エンベロープＤＮＡウイルスのモデルとして使用した。
【０１２１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科；エンベロープ；ｓｓＲＮＡ；
【数２】
2021501163.tif 000046
）を、関連する標的ウイルスとして、ＨＩＶ−２のような他の脂質エンベロープＲＮＡ（リボ核酸）ウイルスのためのモデルとして使用した。
【表１】
2021501163.tif 000047
【０１２２】
ウイルスストックを、使用前に特徴付けた。この特徴付けには、少なくとも１０回の独立な滴定によるウイルス力価の決定および陽性対照として使用するための許容ウイルス力価範囲の特定、ウイルスストックタンパク質含量の決定、ウイルスの特定ならびに他のウイルスおよびマイコプラズマによる汚染についてのＰＣＲ試験、ならびに大型ウイルス凝集体を通過させないフィルターを用いるウイルス凝集についての試験が含まれていた。著しい凝集がなくＰＣＲによる特定／汚染試験に合格したウイルスストック（すなわち、ウイルスストックと濾過ストックとの感染力価の差が、１．０ｌｏｇよりも小さかった）だけを使用した。
【０１２３】
還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１の試薬ミックス
Ｓ／Ｄ構成成分であるポリソルベート８０（ＰＳ８０、Ｃｒｉｌｌｅｔ  ４  ＨＰ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０）およびトリ−ｎ−ブチル−ホスフェート（ＴｎＢＰ）を、以下の比で、それぞれの界面活性剤（すなわち、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１）と合わせた（表２〜表４を参照されたい）。
【表２】
2021501163.tif 000048
【０１２４】
【表３】
2021501163.tif 000049
【０１２５】
【表４】
2021501163.tif 000050
【０１２６】
各混合物を、少なくとも１５分間撹拌した。Ｓ／Ｄ試薬ミックスを、使用のために室温で１年以内保存した。使用前に、各Ｓ／Ｄ試薬ミックスを少なくとも１５分間再び撹拌して、均質性を保証した。
【０１２７】
方法
Ｓ／Ｄ処理のウイルス不活化能力およびロバスト性を、ウイルス不活化にとって不利な条件下で、すなわち短いインキュベーション時間および相対的に低温で評価した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、より長いインキュベーション時間およびより高い温度を使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することもできる。さらに、既に先に述べた通り、低濃度のＳ／Ｄ構成成分を使用した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、より高濃度のＳ／Ｄ構成成分を使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することもできる。
【０１２８】
タンパク質濃度は、Ｓ／Ｄ処理中にウイルス不活化に対して著しい影響を及ぼさないので（Dichtelmuller  et  al.,  2009も参照されたい）、タンパク質含量に関するロバスト性は調査しなかった。
【０１２９】
ＩＶＩＧ含有液を解凍し、すべてのさらなるステップを、バイオセイフティクラスＩＩのキャビネット内で行った。ＩＶＩＧ含有液を、インキュベーションのためにクリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、＋１７℃±１℃の温度における撹拌下でインキュベートした。次に、ＩＶＩＧ含有液を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（ＳＭ１６２４９）ステンレス鋼フィルターホルダーに接続した、有効なフィルター面積２５ｃｍ２を有する０．２μｍのデプスフィルター（Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）ＶＲ０６、Ｃｕｎｏ／３Ｍまたは等価物）を介して、加圧窒素を使用して標的圧力０．９バール（限界：０．５バール〜１．５バール）で濾過した。調整のために、フィルター材料を、５５ｌ／ｍ２のＨｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒｃｅｌ懸濁液（１Ｌ当たり５．０ｇ±０．０５ｇのＨｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒｃｅｌ；３ＭのＮａＣｌを使用して伝導率を３．５ｍＳ／ｃｍに調整（特定範囲：２．５〜６．０ｍＳ／ｃｍ））（圧力≦０．５バールで）で予めコーティングした後に、液体を濾過した。濾過中、フィルターホルダーを冷却し、濾液を、クリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、≦１８℃の標的温度で収集した。濾液のための容器を冷却した。フィルターが詰まった場合、残りの液体を濾過し続けるために、新しい事前調整フィルターを使用した。濾過後、温度（標的：≦１８℃）および体積を測定した。
【０１３０】
ＩＶＩＧ含有液の体積を測定した後、それを冷却した（＋２℃〜＋８℃）希釈緩衝液（標的伝導率３．５ｍＳ／ｃｍ（範囲：２．５ｍＳ／ｃｍ〜６．０ｍＳ／ｃｍ）のＮａＣｌ溶液）と共に撹拌下で、算出標的吸光度２８．９ＡＵ２８０〜３２０／ｃｍ（範囲：１４．５〜７２．３ＡＵ２８０〜３２０／ｃｍ）に調整した。後の１：３１ウイルススパイクを考慮すると、これによって、濾過後のＳ／Ｄ試薬とのインキュベーションでは２８ＡＵ２８０〜３２０／ｃｍ（範囲：１４〜７０ＡＵ２８０〜３２０／ｃｍ）の標的吸光度の算出値が得られた。
【０１３１】
濾過し、タンパク質調整したＩＶＩＧ含有液を、クリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、撹拌下で＋１７℃±１℃に再び調整した。この温度範囲を、Ｓ／Ｄ試薬との濾過したＩＶＩＧ含有液のインキュベーションの最後まで撹拌下で維持し、継続的に記録した。風袋重量を決定したスクリューキャップ付きフラスコに移した、決定された体積の濾過したＩＶＩＧ含有液を、１：３１の比においてウイルスでスパイクし、例えば、ＩＶＩＧを含む液体３０ｍＬを、ウイルスストック溶液１ｍＬでスパイクした。スパイクしたＩＶＩＧ含有液を、継続的な撹拌下で、１７℃±１℃でさらにインキュベートした。スパイク後１〜２分以内に、ウイルス滴定のための試料（０．５ｍＬのスパイク対照、ＳＣ、および２ｍＬのホールド対照、ＨＣ）を採取した。
【０１３２】
抜き出した後、ホールド対照（ＨＣ）を、Ｓ／Ｄ試薬の添加後にスパイクしたプロセス材料と同じ温度で、すなわち＋１７℃±１℃で維持し、すなわちＳ／Ｄ処理の最後まで、ＩＶＩＧ含有液を入れた容器と同じ冷却サイクルで保存した。ホールド対照試料を挿入する前、およびホールド対照をＳ／Ｄ処理後の滴定のために除去する直前に再び、冷却液の温度を決定した。
【０１３３】
スパイクしたＩＶＩＧ含有液の重量を、添加すべきＳ／Ｄ試薬ミックスの量を算出するために決定した。秤量した材料を、必要に応じて撹拌下で＋１７℃±１℃に再調整した。それぞれのＳ／Ｄ試薬ミックスを、ＩＶＩＧ含有液に添加して、最終濃度０．０５％のそれぞれのポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を得た。Ｓ／Ｄ試薬ミックスを、撹拌下でシリンジを使用して１分以内に添加し、添加したＳ／Ｄ試薬ミックスの実際の量を、シリンジを逆秤量（ｂａｃｋ−ｗｅｉｇｈ）することによって決定した。スパイクしたＩＶＩＧ含有液を、＋１７℃±１℃で５９±１分間、継続的な撹拌下で、Ｓ／Ｄ試薬と共にさらにインキュベートした。インキュベーション中、ウイルス滴定のための試料１ｍＬを、１〜２分後、１０±１分後、３０±１分後および５９±１分後に採取した。試料を抜き出した後のＳ／Ｄ試薬によるウイルスのさらなる不活化を防止するために、試料を、冷却した（＋２℃〜＋８℃）細胞培養培地ですぐに１：２０希釈した（すなわち、１体積の試料と１９体積の細胞培養培地）。
【０１３４】
試料を滴定するために、試料の連続０．５ｌｏｇ希釈物を、適切な組織培養培地で調製し、各希釈物１００μＬを、それぞれの指標細胞株を播種したマイクロタイタープレートの８ウェルのそれぞれに添加した。細胞を、３６．０℃で７日間インキュベートした（セットポイント）後、細胞変性作用を、顕微鏡下で視覚的点検によって評価した。組織培養の感染用量中央値（ＴＣＩＤ５０）を、ポアソン分布に従って算出し、ｌｏｇ１０［ＴＣＩＤ５０／ｍＬ］として表した。
【０１３５】
ウイルスクリアランス能力の算出を、次式に従って行った。
【数３】
2021501163.tif 000051
式中、
Ｒ＝ウイルスクリアランス指数
Ｖ１＝出発材料の体積［ｍＬ］
Ｔ１＝出発材料におけるウイルス濃度［ＴＣＩＤ５０／ｍＬ］
Ｖ２＝ウイルス不活化後の材料の体積［ｍＬ］
Ｔ２＝ウイルス不活化後のウイルス濃度［ＴＣＩＤ５０／ｍＬ］
【０１３６】
スパイクした各試料の、処理前および処理後の体積および力価を使用して、Ｒを算出した。ウイルスが検出されなかった場合はいつでも、算出のためのウイルス力価として検出限界を取った。
【０１３７】
結果
ＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理を、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物、または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物を使用して実施した場合、ＨＩＶは、１０分以内に少なくとも４のウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって不活化された（図１Ａ）。反復実験では、類似の結果が得られた（図１Ｂ）。
【０１３８】
追加実験では、ＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理を、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物、または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物を使用して実施した場合、ＰＲＶは、１０分以内に約４のＲＦによって不活化された（図２Ａ）。反復実験では、類似の結果が得られた（図２Ｂ）。
【０１３９】
これらの実験は、バイオ医薬品薬物含有液のＳ／Ｄ処理のために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１によって置き換えると、低濃度の界面活性剤でも、脂質エンベロープウイルスが効率的に不活化されることを示している。
【０１４０】
（実施例２）
静脈内免疫グロブリンを含む液体中でのＢｒｉｊ  Ｃ１０を使用するＨＩＶ、ＰＲＶおよびＢＶＤＶの不活化
材料および方法
実験を、先の実施例１に記載される通り実施した。しかし、Ｓ／Ｄ処理では、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０を含むＳ／Ｄ混合物を試験し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＳ／Ｄ混合物と比較した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＳ／Ｄ混合物の組成物を、先の実施例１に記載される通り調製した。Ｂｒｉｊ  Ｃ１０を含むＳ／Ｄ混合物の組成物を、以下の通り調製した。
【０１４１】
Ｓ／Ｄ構成成分であるポリソルベート８０（ＰＳ８０、Ｃｒｉｌｌｅｔ  ４  ＨＰ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０）およびトリ−ｎ−ブチル−ホスフェート（ＴｎＢＰ）を、以下の比で界面活性剤Ｂｒｉｊ  Ｃ１０と合わせた（表５を参照されたい）。
【表５】
2021501163.tif 000052
【０１４２】
混合物を少なくとも１５分間撹拌した。Ｓ／Ｄ試薬ミックスを、使用のために室温で１年以内保存した。使用前に、Ｓ／Ｄ試薬ミックスを少なくとも１５分間再び撹拌して、均質性を保証した。
【０１４３】
それぞれのＳ／Ｄ試薬ミックスをＩＶＩＧ含有液に添加して、最終濃度０．０５％のそれぞれのポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を得た。
【０１４４】
さらに、ウイルスＢＶＤＶの不活化も試験した。
【表６】
2021501163.tif 000053
【０１４５】
結果
ＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理を、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物を使用して実施した場合、ＨＩＶは、１０分以内に４を超えるウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって不活化された（図３Ａ）。反復実験では、類似の結果が得られた（図３Ｂ）。
【０１４６】
追加実験では、ＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理を、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物を使用して実施した場合、ＰＲＶは、１０分以内に約４のＲＦによって不活化された（図４Ａ）。反復実験では、類似の結果が得られた（図４Ｂ）。
【０１４７】
追加実験では、ＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理を、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物を使用して実施した場合、ＢＶＤＶは、１０分以内に約５のＲＦによって不活化された（図５Ａ）。反復実験では、類似の結果が得られた（図５Ｂ）。
【０１４８】
これらの実験は、バイオ医薬品薬物含有液のＳ／Ｄ処理のために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００をＢｒｉｊ  Ｃ１０によって置き換えると、低濃度の界面活性剤でも、脂質エンベロープウイルスが効率的に不活化されることを示している。
【０１４９】
（実施例３）
ヒト血清アルブミンを含む液体中でのＢｒｉｊ  Ｃ１０を使用するＸ−ＭｕＬＶおよびＢＶＤＶの不活化
バイオ医薬品薬物のためのモデルタンパク質としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む液体中で、脂質エンベロープウイルスである異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）およびウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）を不活化するためのＳ／Ｄ処理についてのＢｒｉｊ  Ｃ１０の適切性を試験し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較した。この目的を達成するために、ウイルスを、ＨＳＡを含む液体に添加した。次に、ＨＳＡを含むウイルス含有液を、低濃度のＢｒｉｊ  Ｃ１０を含むＳ／Ｄ混合物と共に様々な期間にわたってインキュベートし、ウイルスの残りの感染力を決定した。ウイルス不活化動態、すなわちウイルス不活化効率（ＲＦによって表される）を経時的に評価できるようにするために、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０を低濃度で使用した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０は、著しくより高濃度で使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＲＦを増大することもできる。
【０１５０】
材料
ＨＳＡを含む液体
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）含有液を、バイオ医薬品薬物を含有する液体のモデルとして使用した。
【０１５１】
ウイルス
異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科；エンベロープｓｓＲＮＡウイルス；Φ＝８０〜１１０ｎｍ）を、内因性レトロウイルス粒子およびエンベロープＲＮＡウイルスのモデルとして使用した。さらに、ＢＶＤＶを使用した。
【表７−１】
2021501163.tif 000054
【表７−２】
2021501163.tif 000055
【０１５２】
ウイルスストックを、使用前に特徴付けた。この特徴付けには、少なくとも１０回の独立な滴定によるウイルス力価の決定および陽性対照として使用するための許容ウイルス力価範囲の特定、ウイルスストックタンパク質含量の決定、ウイルスの特定ならびに他のウイルスおよびマイコプラズマによる汚染についてのＰＣＲ試験、ならびに大型ウイルス凝集体を通過させないフィルターを用いるウイルス凝集についての試験が含まれていた。著しい凝集がなくＰＣＲによる特定／汚染試験に合格したウイルスストック（すなわち、ウイルスストックと濾過ストックとの感染力価の差が、１．０ｌｏｇよりも小さかった）だけを使用した。
【０１５３】
Ｂｒｉｊ  Ｃ１０の試薬ミックス
Ｓ／Ｄ構成成分であるポリソルベート８０（ＰＳ８０、Ｃｒｉｌｌｅｔ  ４  ＨＰ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０）およびトリ−ｎ−ブチル−ホスフェート（ＴｎＢＰ）を、以下の比で、それぞれの界面活性剤（すなわち、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＢｒｉｊ  Ｃ１０）と合わせた（表８〜表９を参照されたい）。
【表８】
2021501163.tif 000056
【０１５４】
【表９】
2021501163.tif 000057
【０１５５】
各混合物を、少なくとも１５分間撹拌した。Ｓ／Ｄ試薬ミックスを、使用のために室温で１年以内保存した。使用前に、各Ｓ／Ｄ試薬ミックスを少なくとも１５分間再び撹拌して、均質性を保証した。
【０１５６】
方法
Ｓ／Ｄ処理のウイルス不活化能力およびロバスト性を、ウイルス不活化にとって不利な条件下で、すなわち短いインキュベーション時間および相対的に低温で評価した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、より長いインキュベーション時間およびより高い温度を使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することもできる。さらに、既に先に述べた通り、低濃度のＳ／Ｄ構成成分を使用した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、より高濃度のＳ／Ｄ構成成分を使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することもできる。
【０１５７】
タンパク質濃度は、Ｓ／Ｄ処理中にウイルス不活化に対して著しい影響を及ぼさないので（Dichtelmuller  et  al.,  2009も参照されたい）、タンパク質含量に関するロバスト性は調査しなかった。
【０１５８】
以下のすべてのステップを、バイオセイフティクラスＩＩのキャビネット内で行った。出発材料を、インキュベーションのためにクリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、＋１℃±１℃の温度における撹拌下でインキュベートした。次に、ＨＳＡ含有液を、０．２μｍのＰＶＤＦ膜シリンジフィルター（親水性ＰＶＤＦフィルター、Ｍｉｌｌｉｐａｋ  ６０または等価物）を介して濾過した。濾過後、温度および体積を測定した。
【０１５９】
濾過したＨＳＡ含有液を、クリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、撹拌下で＋１℃±１℃に再び調整した。この温度範囲を、Ｓ／Ｄ試薬との濾過したＨＳＡ含有液のインキュベーションの最後まで撹拌下で維持し、継続的に記録した。風袋重量を決定したスクリューキャップ付きフラスコに移した、決定された体積の濾過したＨＳＡ含有液を、１：３１の比でスパイクし、例えば、ＨＳＡ含有液４８ｍＬを、ウイルスストック溶液１．６ｍＬでスパイクした。スパイクしたＨＳＡ含有液を、継続的な撹拌下で、１℃±１℃でさらにインキュベートした。スパイク後１〜２分以内に、ウイルス滴定のための試料（０．５ｍＬのスパイク対照、ＳＣ、および２ｍＬのホールド対照、ＨＣ）を採取した。
【０１６０】
抜き出した後、ホールド対照（ＨＣ）を、Ｓ／Ｄ試薬の添加後にスパイクしたＨＳＡ含有液と同じ温度で、すなわち＋１℃±１℃で維持し、すなわちＳ／Ｄ処理の最後まで、ＨＳＡ含有液を入れた容器と同じ冷却サイクルで保存した。ホールド対照試料を挿入する前、およびホールド対照をＳ／Ｄ処理後の滴定のために除去する直前に再び、冷却液の温度を決定した。
【０１６１】
スパイクしたＨＳＡ含有液の重量を、添加すべきＳ／Ｄ試薬ミックスの量を算出するために決定した。秤量した材料を、必要に応じて撹拌下で＋１℃±１℃に再調整した。それぞれのＳ／Ｄ試薬ミックスを、ＨＳＡ含有液に添加して、最終濃度０．０８％〜０．１％（ｗ／ｗ）のそれぞれのポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を得た。Ｓ／Ｄ試薬ミックスを、撹拌下でシリンジを使用して１分以内に添加し、添加したＳ／Ｄ試薬ミックスの実際の量を、シリンジを逆秤量することによって決定した。スパイクしたＨＳＡ含有液を、＋１℃±１℃で５９±１分間、継続的な撹拌下で、Ｓ／Ｄ試薬と共にさらにインキュベートした。インキュベーション中、ウイルス滴定のための試料１ｍＬを、１〜２分後、１０±１分後、３０±１分後および５９±１分後に採取した。試料を抜き出した後のＳ／Ｄ試薬によるウイルスのさらなる不活化を防止するために、試料を、冷却した（＋２℃〜＋８℃）細胞培養培地ですぐに１：２０希釈した（すなわち、１体積の試料と１９体積の細胞培養培地）。
【０１６２】
試料の滴定およびウイルスクリアランス能力の算出を、先の実施例１に記載される通り実施した。
【０１６３】
結果
ＨＳＡ含有液のＳ／Ｄ処理を、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物を使用して１℃±１℃で実施した場合、Ｘ−ＭｕＬＶは、６０分以内に２を超えるウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって不活化された（図６Ａ）。反復実験では、類似の結果が得られた（図６Ｂ）。
【０１６４】
追加実験では、ＨＳＡ含有液のＳ／Ｄ処理を、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物を使用して１℃±１℃で実施した場合、ＢＶＤＶは、１０分以内に約４のウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって不活化された（図７Ａ）。反復実験では、類似の結果が得られた（図７Ｂ）。
【０１６５】
ＨＳＡ含有液のＳ／Ｄ処理を１℃±１℃の代わりに１９℃±１℃で実施したことのみを除き、追加実験を、この実施例の材料および方法の節に記載される通り正確に実施した。ＨＳＡ含有液のＳ／Ｄ処理を、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０、ＰＳ８０およびＴｎＢＰ（Ｂｒｉｊ  Ｃ１０）の混合物を使用して１９℃±１℃で実施した場合、Ｘ−ＭｕＬＶは、１０分以内に３を超えるウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって不活化された（図８Ａ）。反復実験では、類似の結果が得られた（図８Ｂ）。
【０１６６】
これらの実験は、バイオ医薬品薬物含有液のＳ／Ｄ処理のために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００をＢｒｉｊ  Ｃ１０によって置き換えると、低濃度の界面活性剤でも、室温またはおよそ室温および１℃±１℃もの低温で脂質エンベロープウイルスが効率的に不活化されることを示している。
【０１６７】
（実施例４）
４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートＩの合成（方法１）
【化４４】
2021501163.tif 000058
【０１６８】
中間体ＩＩＩの合成
フェノールＩＩ（１７０．３ｇ、８００ｍｍｏｌ）を、内部温度計および撹拌子を備えた３つ口の２Ｌフラスコに入れた。無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０００ｍＬ）をフラスコに添加し、撹拌し始めた。出発材料が溶解した後、溶液を０℃に冷却した。全体が溶解した後、ＮＥｔ３（２２５ｍＬ、１．６ｍｏｌ）を１０分以内に添加した。Ｔｆ２Ｏ（２５６ｇ、９０７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１８０ｍＬ）溶液を、０℃で１２０分間にわたって反応混合物に添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（４００ｍＬ）を添加し、反応混合物を抽出した。有機相を、水（２×４００ｍＬ）およびブライン（５００ｍＬ）で繰り返し洗浄した。次に、有機相を真空中で濃縮した。トルエン（３００ｍＬ）を残留物に添加し、粗製生成物を濃縮して、黒色の粗製液体３１４ｇを得た。この残留物を、ＳｉＯ２プラグの上部に加え、石油エーテル／ＥｔＯＡｃ（０〜２％）で溶出した。純粋な画分を濃縮することにより、透明な無色の油状物２６９．５ｇ（収率：９９．６％）を得た。Ｒｆ＝０．７４（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ  ５％）。
【０１６９】
中間体ＩＶの合成
トリフレートＩＩＩ（２６９ｇ、７９５ｍｍｏｌ）を、脱気した無水ＤＭＦ（１．３Ｌ）およびＺｎ（ＣＮ）２（９５．３ｇ、７９５ｍｍｏｌ）に溶解させ、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（２５ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）を順次添加した。反応混合物を８０℃に３時間加温した後、ＤＭＦを真空下で除去した。トルエン（３００ｍＬ）を残留物に添加し、粗製生成物を濃縮して、黒色の残留物４３２ｇを得た。この粗製生成物を、ＳｉＯ２プラグの上部に加え、石油エーテル／ＥｔＯＡｃ（０〜１０％）で溶出した。純粋な画分を濃縮することにより、透明な無色の油状物１２８．１ｇ（収率：７４．８％）を得た。Ｒｆ＝０．２３（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ  ２％）
【０１７０】
中間体Ｖの合成
ニトリルＩＶ（１２７．６ｇ、５９２．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５００ｍＬ）に溶解させ、４ＭのＮａＯＨ水溶液（７５０ｍＬ）を添加し、混合物を還流させ、この温度で（８０℃）一晩維持した。さらなる１０ＭのＮａＯＨ水溶液（１５０ｍＬ）を、加温した混合物に添加し、その溶液をさらに２０時間加熱した。周囲温度に冷却した後、反応容器の内容物を大型ビーカーに移し、氷浴中で冷却した。４ＭのＨＣｌ水溶液（１．１Ｌ）を３０分以内に添加し、この時点でｐＨは、ｐＨ紙によって示される通り酸性になり、白色の固体が沈殿した。沈殿物を濾過し、水（５００ｍＬ）ですすいだ。湿潤ケーキを２Ｌのフラスコに移し、真空下で３日間乾燥させて、白色の粉末１２７．５ｇ（収率：９１．９％）を得た。Ｒｆ＝０．４２（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ  ２：１）。
【０１７１】
中間体ＶＩの合成
カルボン酸Ｖ（１２７ｇ、５４２ｍｍｏｌ）を、乾燥ｍＴＨＦ（１．２Ｌ）に懸濁させ、−１０℃に冷却した。ＬｉＡｌＨ４のＴＨＦ（１Ｍ、５７５ｍＬ、５７５ｍｍｏｌ）溶液を６０分間にわたって添加し、次に反応物を周囲温度にゆっくり加温し、さらに一晩撹拌した。反応容器の内容物を大型ビーカーに移し、過剰の水素化物を氷（１５ｇ）で注意深くクエンチした。３ＭのＨＣｌ水溶液（５００ｍＬ）を、２０分以内に添加し、この時点でｐＨは、ｐＨ紙によって示される通り酸性になった。ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）を粗製混合物に添加し、２つの相を激しくかき混ぜた。水相をＥｔＯＡｃで２回（３００ｍＬおよび５００ｍＬ）、逆抽出した。合わせた有機相を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３００ｍＬ）、水（３００ｍＬ）およびブライン（５００ｍＬ）で逐次的に洗浄した。次に、有機相を真空中で濃縮した。トルエン（３００ｍＬ）を残留物に添加し、粗製生成物を濃縮して、透明の黄色がかった油状物１２３．３ｇを得た。この残留物を、ＳｉＯ２プラグの上部に加え、石油エーテル／ＥｔＯＡｃ（０〜１５％）で溶出した。純粋な画分を濃縮することにより、白色の非晶質固体８５．３ｇ（収率：７１．４％）を得た。Ｒｆ＝０．３７（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ  ４：１）。
【０１７２】
中間体ＶＩＩの合成
ベンジルアルコールＶＩ（８４．８ｇ、３８５ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）に溶解させ、氷／水浴中で冷却した。ＮＥｔ３（１１０ｍＬ、７７０ｍｍｏｌ）を添加した後、ＭｓＣｌ（４５ｍＬ、５７７ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）溶液を６０分間にわたってゆっくり添加した。反応物を周囲温度にゆっくり加温し、さらに一晩撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（４２０ｍＬ）を添加し、反応混合物を激しくかき混ぜた。有機相を、水（２×５００ｍＬ）およびブライン（３００ｍＬ）で繰り返し洗浄した。次に、有機相を真空中で濃縮した。トルエン（２００ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）を残留物に添加し、粗製生成物を濃縮して、オレンジ色の半固体９０ｇ（収率：７８．４％）を得た。Ｒｆ＝０．７１（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ  ４：１）。
【０１７３】
Ｉの合成
ＰＥＧ４００（３６０ｇ、９００ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１Ｌ）に溶解させ、ｔＢｕＯＫ（９０ｇ、８０２ｍｍｏｌ）を周囲温度で１５分間にわたって少しずつ添加し、混合物を周囲温度で６０分間撹拌し、氷浴中で冷却した。その間に、メシレートＶＩＩ（８９．５ｇ、３００ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３００ｍＬ）に懸濁させ、乳濁したオレンジ色の溶液を、冷却した脱プロトン化ＰＥＧ４００溶液に２０分間にわたって添加した。反応物を周囲温度にゆっくり加温し、さらに一晩撹拌した。氷（５００ｇ）ならびに１ＭのＨＣｌ水溶液（８２０ｍＬ）を添加した。ＴＨＦを真空下で除去し、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）を添加した。相をかき混ぜ、有機相を水（２×５００ｍＬ）で逐次的に洗浄した。各水相をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機相を水（５００ｍｌ）で洗浄し、真空中で濃縮した。トルエン（２５０ｍＬ）を残留物に添加し、粗製生成物を濃縮して、透明の黄色がかった油状物１２５．２ｇを得た。この残留物を、ＳｉＯ２プラグの上部に加え、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（０〜８％）で溶出した。純粋な画分を濃縮することにより、淡褐色の透明油状物１０７．５ｇ（収率：５９．５％）を得た。Rf  =  0.37-0.22  (CH2Cl2/MeOH  20:1).  MS  (ESI):  m/z  =[M+H]+=  573.5,  617.5  (100%),  661.6;  [M+Ac]-  =  631.4,  675.4  (100%),  719.5.  1H-NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  =  7.33  (d,  J  =  8.3  Hz,  2H),  7.23  (d,  J  =  8.3  Hz,  2H),  4.52  (s,  2H),  3.72-3.58  (m,  33H),  2.54  (br  s,  1H),  1.72  (s,  2H),  1.34  (s,  6H),  0.70  (s,  9H).  13C-NMR  (150  MHz,  CDCl3):  δ  =  149.7,  135.1,  127.4  (2C),  126.2  (2C),  73.2,  72.6,  70.7  (m),  70.5,  69.4,  61.9,  57.0,  38.6,  32.5,  31.9  (3C),  31.6  (2C).
【０１７４】
（実施例５ａ）
４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートＩの合成（方法２）
【化４５】
2021501163.tif 000059
【０１７５】
トルエン（３５ｍＬ、３２８ｍｍｏｌ）および濃縮Ｈ２ＳＯ４（１０ｍＬ）を、丸底フラスコ内で０℃に冷却した。トルエン（２７ｍＬ、２５６ｍｍｏｌ）およびジイソブチレン（２，４，４−トリメチル−１−ペンテン＋２，４，４−トリメチル−２−ペンテンの３：１混合物として、１０ｍＬ、６４ｍｍｏｌ）の混合物を、２時間にわたって反応混合物にゆっくり添加した。反応物を０℃でさらに２時間撹拌した。水（１００ｍＬ）を添加した。相を分離した後、有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、透明な無色の油状物１４ｇを得た。油状物を１００ｍＬの丸底フラスコに入れ、短経路蒸留装置（１・１０−１ｍｂａｒ）で蒸留した。６２〜７０℃の間で蒸留した画分（８．１ｇ、収率６１．９％）を収集した。Ｒｆ＝０．６５（石油エーテル４０〜６０、１００％）。
【０１７６】
ｐ−置換トルエンＸ（５００ｍｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（ＡＣＮ）（５ｍＬ）に溶解させた。Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）（４６０ｍｇ、２．５７ｍｍｏｌ）を添加し、溶解した後、２５ｍＬのＤｕｒａｎ丸底フラスコを、ハロゲンランプ（３００Ｗ）から１５ｃｍ離して置いた。６０分間照射した後（反応温度＝４５℃）、溶媒を除去した。石油エーテル４０〜６０（２５ｍＬ）を添加すると、固体が沈殿した。液体相を水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、黄色がかった粗製油状物５４０ｍｇ（収率：７７．９％）を得た。Ｒｆ＝０．４３（石油エーテル４０〜６０、１００％）。
【０１７７】
ＰＥＧ４００（２．２５ｇ、５．６１ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）に周囲温度で溶解させた。ｔＢｕＯＫ（４２０ｍｇ、３．７４ｍｍｏｌ）を、１分間にわたって少しずつ添加し、混合物を９０分間撹拌し、次に氷／水浴中で０℃に冷却した。その間に、臭化ベンジル中間体ＸＩ（５３０ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍＬ）に懸濁させ、その溶液を、冷却した脱プロトン化ＰＥＧ４００溶液に添加した。反応物を周囲温度にゆっくり加温し、さらに一晩撹拌した。ＨＣｌ（１Ｍ、２０ｍＬ）、ならびにＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を反応混合物に添加した。その溶液を、分液漏斗に移し、勢いよく抽出した。相を分離した後、有機相を、水（５×１５ｍＬ）で逐次的に洗浄し、最後にＭｇＳＯ４で乾燥させて、粗製油性残留物０．８ｇを得た。この残留物を、ＳｉＯ２カラムの上部に加え、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（０〜８％）で溶出した。純粋な画分を濃縮することにより、透明の黄色がかった油状物５８８ｍｇ（収率：５２．２％）を得た。Rf  =  0.37-0.22  (CH2Cl2/MeOH  20:1).
【０１７８】
（実施例５ｂ）
４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートＩの合成（方法２の変形法）
【化４６】
2021501163.tif 000060
【０１７９】
ステップ１
このステップを、以下の通り行った。
トルエン（７５０ｍＬ、７．０４ｍｏｌ）および濃縮Ｈ２ＳＯ４（２０ｍＬ、０．３７５ｍｏｌ）を、丸底フラスコ内で０℃に冷却した。トルエン（２５０ｍＬ、２．３５ｍｏｌ）およびジイソブチレン（２，４，４−トリメチル−１−ペンテン＋２，４，４−トリメチル−２−ペンテンの３：１混合物として、２００ｍＬ、１．２８ｍｏｌ）の混合物を、９０分間にわたって反応混合物にゆっくり添加した。反応物を０℃でさらに撹拌し、周囲温度に一晩加温した。氷（４００ｇ）を添加し、混合物を分液漏斗に移した。相を分離した後、有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３００ｍＬ）および水（２×２５０ｍＬ）で逐次的に洗浄した。有機相を濃縮して、透明な無色の油状物１９９．１ｇを得た。油状物を５００ｍＬの丸底フラスコに入れ、短経路蒸留装置（２０ｍｂａｒ）で蒸留した。１３８℃〜１６１℃の間で蒸留した画分を収集した（１３４．１ｇ、収率５１．４％）。Ｒｆ＝０．６５（石油エーテル４０〜６０、１００％）。1H-NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  =  7.28  (d,  J  =  8.2  Hz,  2H),  7.10  (d,  J  =  8.2  Hz,  2H),  2.34  (s,  3H),  1.75  (s,  2H),  1.38  (s,  6H),  0.75  (s,  9H).  13C-NMR  (150  MHz,  CDCl3):  δ  =  147.3,  134.7,  128.6  (2C),  126.1  (2C),  57.1,  38.4,  32.5,  31.9  (3C),  31.7  (2C),  21.0.
【０１８０】
あるいは、このステップを以下の通り行った。
トルエン（４００ｍＬ、３．８３ｍｏｌ）およびノナフルオロ−１−ブタンスルホン酸（４ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内で周囲温度において撹拌した。トルエン（２００ｍＬ、１．９２ｍｏｌ）およびジイソブチレン（２，４，４−トリメチル−１−ペンテン＋２，４，４−トリメチル−２−ペンテンの３：１混合物として、１００ｍＬ、０．６４ｍｏｌ）の混合物を、６０分間にわたって反応混合物にゆっくり添加した。反応物を周囲温度で一晩さらに撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍＬ）を添加し、混合物を２０分間撹拌した。混合物を分液漏斗に移し、水相を破棄した。有機相を水（３×３００ｍＬ）で逐次的に洗浄した。有機相を濃縮して、透明な無色の油状物１３２．５ｇを得た。油状物を５００ｍＬの丸底フラスコに入れ、短経路蒸留装置（２６〜１６ｍｂａｒ）で蒸留した。１１５℃〜１３５℃の間で蒸留した画分を収集した（８０．５ｇ、収率６２％）。Rf  =  0.65  (Petrol  ether  40-60  100%).  1H-NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  =  7.28  (d,  J  =  8.2  Hz,  2H),  7.10  (d,  J  =  8.2  Hz,  2H),  2.34  (s,  3H),  1.75  (s,  2H),  1.38  (s,  6H),  0.75  (s,  9H).  13C-NMR  (150  MHz,  CDCl3):  δ  =  147.3,  134.7,  128.6  (2C),  126.1  (2C),  57.1,  38.4,  32.5,  31.9  (3C),  31.7  (2C),  21.0.
【０１８１】
ステップ２
このステップを、以下の通り行った。
ｐ−置換トルエンＸ（６３．６ｇ、３１１ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（ＡＣＮ）（６５０ｍＬ）に溶解させた。Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）（５８．２ｇ、３２７ｍｍｏｌ）を添加し、溶解した後、２ＬのＤｕｒａｎ丸底フラスコを、ハロゲンランプ（３００Ｗ）から５〜２５ｃｍ離して置くと同時に、撹拌した（３５０ｒｐｍ）。６時間照射した後（反応温度＝４６℃まで）、溶媒を真空下で除去した。石油エーテル４０〜６０（４５０ｍＬ）を添加すると、暗色の固体が沈殿した。液体相を濃縮して、暗褐色の残留物（７５ｇ）を得た。この残留物を、ＳｉＯ２プラグの上部に加え、石油エーテル４０〜６０（１００％）で溶出した。純粋な画分を濃縮することにより、オレンジ色の透明油状物４３．８ｇ（収率：４９．７％）を得た。Ｒｆ＝０．４３（石油エーテル４０〜６０、１００％）。1H-NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  =  7.34  (d,  J  =  8.4  Hz,  2H),  7.30  (d,  J  =  8.4  Hz,  2H),  4.50  (s,  2H),  1.74  (s,  2H),  1.36  (s,  6H),  0.72  (s,  9H).  13C-NMR  (150  MHz,  CDCl3):  δ  =  150.9,  134.8,  128.6  (2C),  126.7  (2C),  57.0,  38.7,  33.9,  32.5,  31.9  (3C),  31.6  (2C).
【０１８２】
あるいは、このステップを以下の通り行った。
ｐ−置換トルエンＸ（８５．２ｇ、４１７ｍｍｏｌ）を、トリフルオロトルエン（８３０ｍＬ）に溶解させた。エステルまたはアルカン（ＥｔＯＡｃおよびヘキサン）などの他の溶媒も有効である。Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）（７４．２ｇ、４１７ｍｍｏｌ）、ならびにＡＩＢＮ（アゾビス（イソブチロニトリル）（３．４ｇ、２１ｍｍｏｌ）を添加すると同時に、撹拌した（４５０ｒｐｍ）。混合物を８０℃に５時間加熱した。溶媒を真空下で除去した。石油エーテル４０〜６０（３５０ｍＬ）を添加すると、白色の固体が沈殿した。液体相を濃縮して、透明なオレンジ色の残留物（１０８ｇ）を得た。この残留物を、ＳｉＯ２プラグの上部に加え、石油エーテル４０〜６０（１００％）で溶出した。純粋な画分を濃縮することにより、透明なほぼ無色の油状物６４．１ｇ（収率：５４．３％）が得られ、それを結晶化すると無色の針状物が形成され、高純度の生成物を示した。Ｒｆ＝０．４３（石油エーテル４０〜６０、１００％）1H-NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  =  7.34  (d,  J  =  8.4  Hz,  2H),  7.30  (d,  J  =  8.4  Hz,  2H),  4.50  (s,  2H),  1.74  (s,  2H),  1.36  (s,  6H),  0.72  (s,  9H).  13C-NMR  (150  MHz,  CDCl3):  δ  =  150.9,  134.8,  128.6  (2C),  126.7  (2C),  57.0,  38.7,  33.9,  32.5,  31.9  (3C),  31.6  (2C).ラジカル開始剤としてのＡＩＢＮ（アゾビス（イソブチロニトリル）の使用は、この反応ステップで得られる生成物の高純度に寄与すると期待される。
【０１８３】
ステップ３
このステップを、以下の通り行った。
ＰＥＧ４００（１８４．１ｇ、４６０ｍｍｏｌ）を周囲温度で無水ＴＨＦ（５５０ｍＬ）に溶解させた。ｔＢｕＯＫ（２７．２ｇ、２４５ｍｍｏｌ）を少しずつ１５分間にわたって添加し、混合物を９０分間撹拌した。その間に、臭化ベンジル中間体ＸＩ（４３．５ｇ、１５３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３００ｍＬ）に懸濁させ、その溶液を、冷却した脱プロトン化ＰＥＧ４００溶液に添加した。反応物を周囲温度で一晩撹拌した。ＨＣｌ（１Ｍ、２７０ｍＬ）を反応混合物に添加した。揮発物を除去し、ＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）を添加した。溶液を分液漏斗に移し、勢いよく抽出した。相を分離した後、水相をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）でさらに抽出した。合わせた有機相を、水／ブライン（１：１、３×３００ｍＬ）で逐次的に洗浄し、最後に濃縮して、オレンジ色の粗製油状残留物９０．４ｇを得た。この残留物を、ＳｉＯ２カラムの上部に加え、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（０〜８％）で溶出した。純粋な画分を濃縮することにより、透明な淡褐色の油状物８２．２ｇ（収率：８９．０％）を得た。Rf  =  0.37-0.22  (CH2Cl2/MeOH  20:1).  MS  (ESI):  m/z  =[M+H]+=  573.5,  617.5  (100%),  661.6;  [M+Ac]-  =  631.4,  675.4  (100%),  719.5.  1H-NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  =  7.33  (d,  J  =  8.3  Hz,  2H),  7.23  (d,  J  =  8.3  Hz,  2H),  4.52  (s,  2H),  3.72-3.58  (m,  33H),  2.54  (br  s,  1H),  1.72  (s,  2H),  1.34  (s,  6H),  0.70  (s,  9H).  13C-NMR  (150  MHz,  CDCl3):  δ  =  149.7,  135.1,  127.4  (2C),  126.2  (2C),  73.2,  72.6,  70.7  (m),  70.5,  69.4,  61.9,  57.0,  38.6,  32.5,  31.9  (3C),  31.6  (2C).
【０１８４】
あるいは、このステップを以下の通り行った。
ＰＥＧ４００（４７５ｇ、１．１９ｍｏｌ）を、ＴＢＭＥ（メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル）（１．０Ｌ）に周囲温度で溶解させた。ｔＢｕＯＫ（４３．２ｇ、３８５ｍｍｏｌ）を、２０分間にわたって少しずつ添加し、混合物を９０分間撹拌した。その間に、臭化ベンジル中間体ＸＩ（８４ｇ、２９７ｍｍｏｌ）をＴＢＭＥ（２５０ｍＬ）に懸濁させ、その溶液を脱プロトン化ＰＥＧ４００溶液に周囲温度で添加した。反応物を周囲温度で３時間撹拌した。氷（２００ｇ）およびＨＣｌ（１Ｍ、４００ｍＬ）を反応混合物に添加した。溶液を分液漏斗に移し、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）および水（５００ｍＬ）を添加し、勢いよく抽出した。相を分離した後、有機相を水／ブライン（１：１、３×５００ｍＬ）で逐次的に洗浄し、最後に濃縮して、オレンジ色の粗製油状残留物１６５ｇを得た。この残留物を、ＳｉＯ２カラムの上部に加え、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（０〜１０％）で溶出した。純粋な画分を濃縮することにより、透明な淡褐色の油状物１５１．７ｇ（収率：８４．９％）を得た。Rf  =  0.37-0.22  (CH2Cl2/MeOH  20:1).  MS  (ESI):  m/z  =[M+H]+=  573.5,  617.5  (100%),  661.6;  [M+Ac]-  =  631.4,  675.4  (100%),  719.5.  1H-NMR  (600  MHz,  CDCl3):  δ  =  7.33  (d,  J  =  8.3  Hz,  2H),  7.23  (d,  J  =  8.3  Hz,  2H),  4.52  (s,  2H),  3.72-3.58  (m,  33H),  2.54  (br  s,  1H),  1.72  (s,  2H),  1.34  (s,  6H),  0.70  (s,  9H).  13C-NMR  (150  MHz,  CDCl3):  δ  =  149.7,  135.1,  127.4  (2C),  126.2  (2C),  73.2,  72.6,  70.7  (m),  70.5,  69.4,  61.9,  57.0,  38.6,  32.5,  31.9  (3C),  31.6  (2C).溶媒としてのＴＢＭＥ（メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル）の使用、３時間の中程度の反応時間（反応副生成物を最小限に抑えると期待される）、より大きい製造規模、および出発材料（すなわち臭化ベンジル中間体ＸＩ）の純度は、すべてこの反応ステップで観測される高い収率に寄与すると期待される。
【０１８５】
（実施例６）
静脈内免疫グロブリンを含む液体中での４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを使用するＰＲＶの不活化
材料および方法
実験を、先の実施例１に記載される通り実施した。しかし、Ｓ／Ｄ処理では、実施例５ａで生成した４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを含むＳ／Ｄ混合物を試験し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＳ／Ｄ混合物と比較した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＳ／Ｄ混合物の組成物を、先の実施例１に記載される通り調製した。４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを含むＳ／Ｄ混合物の組成物を、以下の通り調製した。
【０１８６】
Ｓ／Ｄ構成成分であるポリソルベート８０（ＰＳ８０、Ｃｒｉｌｌｅｔ  ４  ＨＰ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０）およびトリ−ｎ−ブチル−ホスフェート（ＴｎＢＰ）を、以下の比で、実施例５ａで生成した界面活性剤である４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートと合わせた（表１０を参照されたい）。
【表１０】
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【０１８７】
混合物を少なくとも１５分間撹拌した。Ｓ／Ｄ試薬ミックスを、使用のために室温で１年以内保存した。使用前に、Ｓ／Ｄ試薬ミックスを少なくとも１５分間再び撹拌して、均質性を保証した。
【０１８８】
それぞれのＳ／Ｄ試薬ミックスをＩＶＩＧ含有液に添加して、最終濃度０．０５％ｗ／ｗのそれぞれのポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を得た。
【０１８９】
ウイルスＰＲＶの不活化だけを試験した。
【０１９０】
結果
ＩＶＩＧ含有液のＳ／Ｄ処理を、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレート、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物を使用して実施した場合、ＰＲＶは、１〜２分以内に約４のウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって不活化された（図９Ａ）。反復実験では、類似の結果が得られた（図９Ｂ）。
【０１９１】
これらの実験は、バイオ医薬品薬物含有液のＳ／Ｄ処理のために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートによって置き換えると、低濃度の界面活性剤でも、脂質エンベロープウイルスが効率的に不活化されることを示している。
【０１９２】
（実施例７）
ヒト血清アルブミンを含む液体中での４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを使用するＸ−ＭｕＬＶの不活化
材料および方法
実験を、先の実施例３に記載される通り実施した。しかし、Ｓ／Ｄ処理では、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを含むＳ／Ｄ混合物を試験し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＳ／Ｄ混合物と比較した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＳ／Ｄ混合物の組成物を、先の実施例３に記載される通り調製した。４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを含むＳ／Ｄ混合物の組成物を、以下の通り調製した。
【０１９３】
Ｓ／Ｄ構成成分であるポリソルベート８０（ＰＳ８０、Ｃｒｉｌｌｅｔ  ４  ＨＰ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０）およびトリ−ｎ−ブチル−ホスフェート（ＴｎＢＰ）を、以下の比で、界面活性剤である４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートと合わせた（表１１を参照されたい）。
【表１１】
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【０１９４】
混合物を少なくとも１５分間撹拌した。Ｓ／Ｄ試薬ミックスを、使用のために室温で１年以内保存した。使用前に、Ｓ／Ｄ試薬ミックスを少なくとも１５分間再び撹拌して、均質性を保証した。
【０１９５】
それぞれのＳ／Ｄ試薬ミックスをＨＳＡ含有液に添加して、最終濃度０．１％のそれぞれのポリオキシエチレンエーテル界面活性剤を得た。
【０１９６】
ウイルスＸ−ＭｕＬＶの不活化だけを試験した。
【０１９７】
結果
ＨＳＡ含有液のＳ／Ｄ処理を、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレート、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物を使用して１℃±１℃で実施した場合、Ｘ−ＭｕＬＶは、１０分以内に２を超えるウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって不活化された（図１０Ａ）。反復実験では、類似の結果が得られた（図１０Ｂ）。
【０１９８】
ＨＳＡ含有液のＳ／Ｄ処理を１℃±１℃の代わりに１９℃±１℃で実施したことのみを除き、追加実験を、この実施例の材料および方法の節に記載される通り正確に実施した。ＨＳＡ含有液のＳ／Ｄ処理を、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレート、ＰＳ８０およびＴｎＢＰの混合物を使用して１９℃±１℃で実施した場合、Ｘ−ＭｕＬＶは、１０分以内に２を超えるウイルスクリアランス指数（ＲＦ）および３０分以内に約４のＲＦによって不活化された（図１１Ａ）。反復実験では、類似の結果が得られた（図１１Ｂ）。
【０１９９】
これらの実験は、バイオ医薬品薬物含有液のＳ／Ｄ処理のために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートによって置き換えると、低濃度の界面活性剤でも、室温またはおよそ室温および１℃±１℃もの低温で脂質エンベロープウイルスが効率的に不活化されることを示している。
【０２００】
（実施例８）
ＨＳＡを含有する緩衝液中での４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレート、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＢｒｉｊ  Ｃ１０を使用するＢＶＤＶの不活化
治療用抗体のためのモデルタンパク質としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する緩衝液中で、脂質エンベロープウイルスであるウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）を不活化するための単一界面活性剤による処理についての４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレート、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＢｒｉｊ  Ｃ１０の適切性を試験し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較した。この目的を達成するために、低濃度のそれぞれの界面活性剤を、ＨＳＡを含有する緩衝液に添加し、次に、その混合物を、ウイルスでスパイクした。様々な期間にわたってインキュベートした後、ウイルスの残りの感染力を決定した。ウイルス不活化動態、すなわちウイルス不活化効率（ＲＦによって表される）を経時的に評価できるようにするために、それぞれの界面活性剤を低濃度で使用した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、本発明の界面活性剤は、著しくより高濃度で使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＲＦを増大することもできる。
【０２０１】
材料
ＨＳＡを含有する緩衝液
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する緩衝液を、治療用抗体のモデルとして使用した。
ウイルス
【表１２】
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【０２０２】
ウイルスストックを、使用前に特徴付けた。この特徴付けには、少なくとも１０回の独立な滴定によるウイルス力価の決定および陽性対照として使用するための許容ウイルス力価範囲の特定、ウイルスストックタンパク質含量の決定、ウイルスの特定ならびに他のウイルスおよびマイコプラズマによる汚染についてのＰＣＲ試験、ならびに大型ウイルス凝集体を通過させないフィルターを用いるウイルス凝集についての試験が含まれていた。著しい凝集がなくＰＣＲによる特定／汚染試験に合格したウイルスストック（すなわち、ウイルスストックと濾過ストックとの感染力価の差が、１．０ｌｏｇよりも小さかった）だけを使用した。
【０２０３】
界面活性剤
それぞれの界面活性剤、またはその１：１０希釈物（すなわち、１ｇ±２％のそれぞれの界面活性剤と９ｇ±２％のＡｑｕａ  Ｄｅｓｔ）を使用する前に、少なくとも１５分間撹拌して、均質性を保証した。
【０２０４】
方法
単一界面活性剤による処理のウイルス不活化能力およびロバスト性を、ウイルス不活化にとって不利な条件下で、すなわち短いインキュベーション時間および相対的に低温で評価した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、より長いインキュベーション時間およびより高い温度を使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することもできる。さらに、既に先に述べた通り、低濃度のそれぞれの界面活性剤を使用した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、より高濃度のそれぞれの界面活性剤を使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することもできる。
【０２０５】
タンパク質濃度は、ウイルス不活化に対して著しい影響を及ぼさないので（Dichtelmuller  et  al.,  2009も参照されたい）、タンパク質含量に関するロバスト性は調査しなかった。
【０２０６】
以下のすべてのステップを、バイオセイフティクラスＩＩのキャビネット内で行った。出発材料を、インキュベーションのためにクリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、＋１４℃±１℃の温度における撹拌下でインキュベートした。
【０２０７】
ＨＳＡを含有する緩衝液を、風袋重量を決定したスクリューキャップ付きフラスコに移した。ＨＳＡを含有する緩衝液の重量（閉じたフラスコ中）を、添加すべき単一の界面活性剤の量を算出するために決定した。ＨＳＡを含有する緩衝液１ｇ当たり必要な量（［ｍｇ］）の界面活性剤、またはそれぞれの量のその１：１０希釈物を添加して、以下の最終濃度０．１％±０．０１％（ｗ／ｗ）または０．０３％±０．０１％（ｗ／ｗ）のそれぞれの界面活性剤を得た。界面活性剤を、撹拌下でシリンジを使用して１分以内に添加し、添加した実際の量を、シリンジを逆秤量することによって決定した。界面活性剤の添加が完了した後、ＨＳＡを含有する緩衝液を少なくとも１０分間さらに撹拌した。界面活性剤と混合したＨＳＡを含有する緩衝液を、０．２μｍのＳｕｐｏｒシリンジ膜フィルター（または等価物）を介して濾過し、濾液を、クリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、１４℃±１℃の標的温度で収集した。濾液のための容器を冷却した。フィルターが詰まった場合、ＨＳＡを含有する緩衝液を濾過し続けるために、新しいフィルターを使用した。濾過後、温度（標的：１４℃±１℃）および体積を測定した。
【０２０８】
それぞれの界面活性剤を含む、ＨＳＡを含有する濾過した緩衝液を、クリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、撹拌下で１４℃±１℃に調整した。この温度範囲を、ＨＳＡを含有する緩衝液の界面活性剤とのインキュベーションの最後まで撹拌下で維持し、継続的に記録した。界面活性剤を含む、ＨＳＡを含有する決定された体積の緩衝液を、１：３１の比でスパイクし、例えば、ＨＳＡを含有する緩衝液４８ｍＬを、ウイルスストック溶液１．６ｍｌでスパイクした。ＨＳＡを含有するスパイクした緩衝液を、継続的な撹拌下で、１４℃±１℃で５９±１分間、さらにインキュベートした。インキュベーション中、ウイルス滴定のための試料を、１〜２分、５±１分、２９±１分および５９±１分に採取した。試料を抜き出した後の界面活性剤によるウイルスのさらなる不活化を防止するために、試料を、冷却した（＋２℃〜＋８℃）それぞれの細胞培養培地ですぐに１：２０希釈した（すなわち、１体積の試料と１９体積の細胞培養培地）。
【０２０９】
スパイク対照およびホールド対照を、同日に実施した。ＨＳＡを含有する緩衝液を、界面活性剤を事前に添加しなかったことを除き、前述の通り濾過した。次に、濾液を、前述の通り撹拌下で１４℃±１℃に調整した。ＨＳＡを含有する緩衝液を、前述の通り、１：３１の比でスパイクし、１４℃±１℃で５９±１分間、さらにインキュベートした。スパイク後１〜２分以内に、ウイルス滴定のための試料（スパイク対照）を採取した。５９±１分間インキュベートした後、ウイルス滴定のための試料（すなわちホールド対照試料）（ＨＣ）を採取した。
【０２１０】
試料の滴定およびウイルスクリアランス能力の算出を、先の実施例１に記載される通り実施した。
【０２１１】
結果
ＨＳＡを含有する緩衝液の単一界面活性剤による処理を、０．１％±０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して１４℃±１℃で実施した場合、ＢＶＤＶは、５分以内に約５のウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって不活化された（図１２Ａ）。ＨＳＡを含有する緩衝液の単一界面活性剤による処理を、０．０３％±０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して１４℃±１℃で実施した場合、ＢＶＤＶは、５分以内に３を超えるウイルスクリアランス指数（ＲＦ）および２９分以内に４を超えるウイルスクリアランス指数によって不活化された（図１２Ｂ）。
【０２１２】
これらの実験は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｂｒｉｊ  Ｃ１０、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用するバイオ医薬品薬物含有液の単一界面活性剤による処理によって、低濃度の界面活性剤でも、脂質エンベロープウイルスが効率的に不活化されることを示している。
【０２１３】
（実施例９）
ＩＶＩＧ含有液中での４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用するＢＶＤＶの不活化
静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）を含む液体中で、脂質エンベロープウイルスであるウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）を不活化するための単一界面活性剤による処理についての４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の適切性を試験し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較した。この目的を達成するために、ウイルスを、ＩＶＩＧを含む液体に添加した。次に、ＩＶＩＧを含むウイルス含有液を、低濃度の還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に、様々な期間にわたってインキュベートし、ウイルスの残りの感染力を決定した。ウイルス不活化動態、すなわちウイルス不活化効率（ＲＦによって表される）を経時的に評価するために、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を低濃度で使用した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを含む本発明の界面活性剤は、著しくより高濃度で使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することも期待される。
【０２１４】
材料
ＩＶＩＧを含む液体
ＩＶＩＧを含む液体（ＩＶＩＧ含有液）を、ドライアイス上で凍結させ、収集日後１年以内に使用するまで、≦−６０℃で保存した。
ウイルス
【表１３】
2021501163.tif 000064
【０２１５】
ウイルスストックを、使用前に特徴付けた。この特徴付けには、少なくとも１０回の独立な滴定によるウイルス力価の決定および陽性対照として使用するための許容ウイルス力価範囲の特定、ウイルスストックタンパク質含量の決定、ウイルスの特定ならびに他のウイルスおよびマイコプラズマによる汚染についてのＰＣＲ試験、ならびに大型ウイルス凝集体を通過させないフィルターを用いるウイルス凝集についての試験が含まれていた。著しい凝集がなくＰＣＲによる特定／汚染試験に合格したウイルスストック（すなわち、ウイルスストックと濾過ストックとの感染力価の差が、１．０ｌｏｇよりも小さかった）だけを使用した。
【０２１６】
界面活性剤
それぞれの界面活性剤、またはその１：１０希釈物（すなわち、１ｇ±２％のそれぞれの界面活性剤と９ｇ±２％のＡｑｕａ  Ｄｅｓｔ）を使用する前に、少なくとも１５分間撹拌して、均質性を保証した。
【０２１７】
方法
単一界面活性剤による処理のウイルス不活化能力およびロバスト性を、ウイルス不活化にとって不利な条件下で、すなわち短いインキュベーション時間および相対的に低温で評価した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、より長いインキュベーション時間およびより高い温度を使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することもできる。さらに、既に先に述べた通り、低濃度のそれぞれの界面活性剤を使用した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、より高濃度のそれぞれの界面活性剤を使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することもできる。
【０２１８】
タンパク質濃度は、ウイルス不活化に対して著しい影響を及ぼさないので（Dichtelmuller  et  al.,  2009も参照されたい）、タンパク質含量に関するロバスト性は調査しなかった。
【０２１９】
ＩＶＩＧ含有液を解凍し、すべてのさらなるステップを、バイオセイフティクラスＩＩのキャビネット内で行った。ＩＶＩＧ含有液を、インキュベーションのためにクリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、＋１７℃±１℃の温度における撹拌下でインキュベートした。次に、ＩＶＩＧ含有液を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（ＳＭ１６２４９）ステンレス鋼フィルターホルダーに接続した、有効なフィルター面積２５ｃｍ２を有する０．２μｍのデプスフィルター（Ｃｕｎｏ  ＶＲ０６または等価物）を介して、加圧窒素を使用して標的圧力０．９バール（限界：０．５バール〜１．５バール）で濾過した。調整のために、フィルター材料を、５５Ｌ／ｍ２のＨｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒｃｅｌ懸濁液（１Ｌ当たり５．０ｇ±０．０５ｇのＨｙｆｌｏ  Ｓｕｐｅｒｃｅｌ；３ＭのＮａＣｌを使用して伝導率を３．５ｍＳ／ｃｍに調整（特定範囲：２．５〜６．０ｍＳ／ｃｍ））（圧力≦０．５バールで）で予めコーティングした後に、液体を濾過した。濾過中、フィルターホルダーを冷却し、濾液を、クリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、＋１７℃±１℃の標的温度で収集した。濾液のための容器を冷却した。フィルターが詰まった場合、残りの液体を濾過し続けるために、新しい事前調整フィルターを使用した。濾過後、体積を測定した。
【０２２０】
ＩＶＩＧ含有液の体積を測定した後、それを冷却した（＋２℃〜＋８℃）希釈緩衝液（標的伝導率３．５ｍＳ／ｃｍ（範囲：２．５ｍＳ／ｃｍ〜６．０ｍＳ／ｃｍ）のＮａＣｌ溶液）と共に、撹拌下で、算出標的吸光度２８．９ＡＵ２８０〜３２０／ｃｍ（範囲：１４．５〜７２．３ＡＵ２８０〜３２０／ｃｍ）に調整した。後の１：３１ウイルススパイクを考慮すると、これによって、濾過後の界面活性剤とのインキュベーションでは２８ＡＵ２８０〜３２０／ｃｍ（範囲：１４〜７０ＡＵ２８０〜３２０／ｃｍ）の標的吸光度の算出値が得られた。
【０２２１】
濾過し、タンパク質調整したＩＶＩＧ含有液を、クリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、撹拌下で＋１７℃±１℃に再び調整した。この温度範囲を、界面活性剤との濾過したＩＶＩＧ含有液のインキュベーションの最後まで撹拌下で維持し、継続的に記録した。風袋重量を決定したスクリューキャップ付きフラスコに移した、決定された体積の濾過したＩＶＩＧ含有液を、１：３１の比においてウイルスでスパイクし、例えば、ＩＶＩＧ含有液３０ｍＬを、ウイルスストック溶液１ｍＬでスパイクした。スパイクしたＩＶＩＧ含有液を、継続的な撹拌下で、１７℃±１℃でさらにインキュベートした。スパイク後１〜２分以内に、ウイルス滴定のための試料（スパイク対照、ＳＣ、およびホールド対照、ＨＣ）を採取した。
【０２２２】
抜き出した後、ホールド対照（ＨＣ）を、界面活性剤の添加後にスパイクしたＩＶＩＧ含有液と同じ温度で、すなわち＋１７℃±１℃で維持し、すなわち界面活性剤処理の最後まで、ＩＶＩＧ含有液を入れた容器と同じ冷却サイクルで保存した。ホールド対照試料を挿入する前、およびホールド対照を界面活性剤処理後の滴定のために除去する直前に再び、冷却液の温度を決定した。
【０２２３】
スパイクしたＩＶＩＧ含有液の重量を、添加すべき界面活性剤の量を算出するために決定した。秤量した材料を、必要に応じて撹拌下で＋１７℃±１℃に再調整した。ＩＶＩＧ含有液１ｇ当たり必要な量（［ｍｇ］）の界面活性剤、またはそれぞれの量のその１：１０希釈物を添加して、以下の最終濃度０．１％±０．０１％（ｗ／ｗ）または０．０３％±０．０１％（ｗ／ｗ）のそれぞれの界面活性剤を得た。界面活性剤を、撹拌下でシリンジを使用して１分以内に添加し、添加した界面活性剤の実際の量を、シリンジを逆秤量することによって決定した。スパイクしたＩＶＩＧ含有液を、＋１７℃±１℃で５９±１分間、継続的な撹拌下で、それぞれの界面活性剤と共にさらにインキュベートした。インキュベーション中、ウイルス滴定のための試料１ｍＬを、１〜２分後、１０±１分後、３０±１分後および５９±１分後に採取した。試料を抜き出した後のＳ／Ｄ試薬によるウイルスのさらなる不活化を防止するために、試料を、冷却した（＋２℃〜＋８℃）細胞培養培地ですぐに１：２０希釈した（すなわち、１体積の試料と１９体積の細胞培養培地）。
【０２２４】
試料の滴定およびウイルスクリアランス能力の算出を、先の実施例１に記載される通り実施した。
【０２２５】
結果
ＩＶＩＧ含有液の単一界面活性剤による処理を、０．１％±０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して１７℃±１℃で実施した場合、ＢＶＤＶは、１０分以内に約５のウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって不活化された（図１３Ａ）。ＩＶＩＧ含有液の単一界面活性剤による処理を、０．０３％±０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して１７℃±１℃で実施した場合、ＢＶＤＶは、１０分以内に３を超えるウイルスクリアランス指数（ＲＦ）および３０分以内に４を超えるウイルスクリアランス指数によって不活化された（図１３Ｂ）。
【０２２６】
これらの実験では、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用するバイオ医薬品薬物含有液の単一界面活性剤による処理によって、低濃度の界面活性剤でも、脂質エンベロープウイルスが効率的に不活化されることが確認される。
【０２２７】
（実施例１０）
ＦＶＩＩＩ含有液中での４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用するＢＶＤＶの不活化
【０２２８】
血漿由来第ＶＩＩＩ因子（ｐｄＦＶＩＩＩ）を含む液体中で、脂質エンベロープウイルスであるウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）を不活化するための単一界面活性剤による処理についての４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の適切性を試験し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較した。この目的を達成するために、ウイルスを、ｐｄＦＶＩＩＩを含む液体に添加した。次に、ｐｄＦＶＩＩＩを含むウイルス含有液を、低濃度の還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に、様々な期間にわたってインキュベートし、ウイルスの残りの感染力を決定した。ウイルス不活化動態、すなわちウイルス不活化効率（ＲＦによって表される）を経時的に評価するために、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を低濃度で使用した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートを含む本発明の界面活性剤は、著しくより高濃度で使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することも期待される。
【０２２９】
材料
ｐｄＦＶＩＩＩを含む液体
ｐｄＦＶＩＩＩを含む液体（ｐｄＦＶＩＩＩ含有液）を、ドライアイス上で凍結させ、収集日後１年以内に使用するまで、≦−６０℃で保存した。
ウイルス
【表１４】
2021501163.tif 000065
【０２３０】
ウイルスストックを、使用前に特徴付けた。この特徴付けには、少なくとも１０回の独立な滴定によるウイルス力価の決定および陽性対照として使用するための許容ウイルス力価範囲の特定、ウイルスストックタンパク質含量の決定、ウイルスの特定ならびに他のウイルスおよびマイコプラズマによる汚染についてのＰＣＲ試験、ならびに大型ウイルス凝集体を通過させないフィルターを用いるウイルス凝集についての試験が含まれていた。著しい凝集がなくＰＣＲによる特定／汚染試験に合格したウイルスストック（すなわち、ウイルスストックと濾過ストックとの感染力価の差が、１．０ｌｏｇよりも小さかった）だけを使用した。
【０２３１】
界面活性剤
それぞれの界面活性剤、またはその１：１０希釈物（すなわち、１ｇ±２％のそれぞれの界面活性剤と９ｇ±２％のＡｑｕａ  Ｄｅｓｔ）を使用する前に、少なくとも１５分間撹拌して、均質性を保証した。
方法
【０２３２】
単一界面活性剤による処理のウイルス不活化能力およびロバスト性を、ウイルス不活化にとって不利な条件下で、すなわち短いインキュベーション時間で評価した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、より長いインキュベーション時間を使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することもできる。さらに、既に先に述べた通り、低濃度のそれぞれの界面活性剤を使用した。当業者に明らかであるように、バイオ医薬品の生成などの商業生成プロセスでは、より高濃度のそれぞれの界面活性剤を使用することができ、それによって、ウイルス不活化動態を促進し、達成されるＬＲＶを増大することもできる。
【０２３３】
タンパク質濃度は、ウイルス不活化に対して著しい影響を及ぼさないので（Dichtelmuller  et  al.,  2009も参照されたい）、タンパク質含量に関するロバスト性は調査しなかった。
【０２３４】
ｐｄＦＶＩＩＩ含有液を解凍し、すべてのさらなるステップを、バイオセイフティクラスＩＩのキャビネット内で行った。存在し得る目に見える凝集体を除去するために、ｐｄＦＶＩＩＩ含有液を、０．４５μｍの膜フィルター（例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ＳａｒｔｏＳｃａｌｅ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎまたは等価物）を介して濾過した。ｐｄＦＶＩＩＩ含有液を、風袋重量を決定したスクリューキャップ付きフラスコに移し、クリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、撹拌下で＋２３℃±１℃の標的温度に調整した。決定された体積のｐｄＦＶＩＩＩ含有液を、１：３１の比でスパイクし、例えば、ｐｄＦＶＩＩＩ含有液４８ｍＬを、ウイルスストック溶液１．６ｍＬでスパイクした。その後、ウイルス滴定のための試料（スパイク対照、ＳＣ）およびホールド対照（ＨＣ）のための試料を採取した。
【０２３５】
ホールド対照を、界面活性剤の添加後にスパイクしたｐｄＦＶＩＩＩ含有液と同じ温度で、すなわち＋２３℃±１℃で維持し、すなわち界面活性剤処理の最後まで、ｐｄＦＶＩＩＩ含有液を入れた容器と同じ冷却サイクルで保存した。ホールド対照試料を挿入する前、およびホールド対照を界面活性剤処理後の滴定のために除去する直前に再び、冷却液の温度を決定した。
【０２３６】
スパイクしたｐｄＦＶＩＩＩ含有液の重量を、添加すべき界面活性剤の量を算出するために決定した。秤量した材料を、クリオスタットに接続した二重壁容器を使用して、撹拌下で＋２３℃±１℃に調整した。この温度範囲を、界面活性剤とのスパイクしたｐｄＦＶＩＩＩ含有液のインキュベーションの最後まで撹拌下で維持し、継続的に記録した。ｐｄＦＶＩＩＩ含有液１ｇ当たり必要な量（［ｍｇ］）の界面活性剤、またはそれぞれの量のその１：１０希釈物を添加して、最終界面活性剤濃度０．１％±０．０１％（ｗ／ｗ）を得た。界面活性剤を、撹拌下でシリンジを使用して１分以内に添加し、添加した界面活性剤の実際の量を、シリンジを逆秤量することによって決定した。界面活性剤の添加が完了した後、スパイクしたｐｄＦＶＩＩＩ含有液を＋２３℃±１℃で５９±１分間、継続的な撹拌下でさらにインキュベートした。
【０２３７】
インキュベーション中、ウイルス滴定のための試料１ｍＬを、１〜２分後、５±１分後、３０±１分後および５９±１分後に採取した。
【０２３８】
試料を抜き出した後の界面活性剤によるウイルスのさらなる不活化を防止するために、試料を、冷却した（＋２℃〜＋８℃）それぞれの細胞培養培地ですぐに１：２０希釈した（すなわち、１体積の試料と１９体積の細胞培養培地）。
【０２３９】
試料の滴定およびウイルスクリアランス能力の算出を、先の実施例１に記載される通り実施した。
【０２４０】
結果
ｐｄＦＶＩＩＩ含有液の単一界面活性剤による処理を、０．１％±０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して２３℃±１℃で実施した場合、ＢＶＤＶは、５分以内に約５のウイルスクリアランス指数（ＲＦ）によって不活化された（図１４）。
【０２４１】
これらの実験では、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４−ｔｅｒｔ−オクチルベンジルアルコールポリエトキシレートまたは還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用するバイオ医薬品薬物含有液の単一界面活性剤による処理によって、低濃度の界面活性剤でも、脂質エンベロープウイルスが効率的に不活化されることが確認される。
【０２４２】
（実施例１１）
毒性試験
コンピューターデータに基づくと、本発明による界面活性剤のいずれについても、内分泌撹乱物質として活性であるという証拠は見出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０２４３】
本発明の方法、プロセスおよび生成物は、例えば、工業製造プロセスにおける脂質エンベロープウイルスの環境適合性の不活化のために商業的に有用である。例えば、本発明は、バイオ医薬品の工業生成において使用することができる。したがって、本発明は、産業上利用可能である。
【０２４４】
参考文献
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【図１】
2021501163.tif 000087
【図２】
2021501163.tif 000088
【図３】
2021501163.tif 000089
【図４】
2021501163.tif 000090
【図５】
2021501163.tif 000091
【図６】
2021501163.tif 000092
【図７】
2021501163.tif 000093
【図８】
2021501163.tif 000094
【図９】
2021501163.tif 000095
【図１０】
2021501163.tif 000096
【図１１】
2021501163.tif 000097
【図１２】
2021501163.tif 000098
【図１３】
2021501163.tif 000099
【図１４】
2021501163.tif 000100
【国際調査報告】
2021501163.tif 000101
2021501163.tif 000102
2021501163.tif 000103
2021501163.tif 000104
2021501163.tif 000105