(57)【要約】巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）および巨核球（ＭＫ）を幹細胞から産生するための方法が提供される。本開示は、さらに、ｐｒｅＭＫおよびＭＫならびにそれらの溶解物を含む組成物を提供し、また、ｐｒｅＭＫ、ＭＫ、それらの溶解物およびその組成物の使用方法も提供する。一局面では、巨核球を産生するための方法が提供され、この方法は、低接着性または非接着性条件下、かつ撹拌下で多能性幹細胞を増大させるステップであって、増大した多能性幹細胞が自己凝集性スフェロイドを形成する、ステップと、上記多能性細胞を第１の培養培地中で造血性内皮細胞に分化させるステップと、上記造血性内皮細胞を第２の培養培地中で巨核球前駆細胞に分化させるステップとを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球を産生するための方法であって、
低接着性または非接着性条件下、かつ撹拌下で多能性幹細胞を増大させるステップであって、増大した多能性幹細胞が自己凝集性スフェロイドを形成する、ステップと、
前記多能性細胞を第１の培養培地中で造血性内皮細胞に分化させるステップと、
前記造血性内皮細胞を第２の培養培地中で巨核球前駆細胞に分化させるステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップを、マトリクス上、接着性条件下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マトリクスが、ラミニンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マトリクスが、２次元表面に付着している、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記マトリクスが、３次元構造に付着している、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップを、前記造血性内皮細胞の自己凝集を可能にするために低接着性または非接着性条件下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の培養培地が、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の培養培地が、ＷＮＴモジュレーターをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の培養培地が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびヘパリンのうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記増大した多能性幹細胞を回収し、解離させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記巨核球前駆細胞を巨核球に分化させるステップの前に、前記巨核球前駆細胞を培養培地中、非接着性表面に播種するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記巨核球前駆細胞を第３の培養培地中で巨核球に分化させるステップをさらに含む、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第３の培養培地が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）およびヘパリンのうちの１つまたは複数を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
巨核球を産生するための方法であって、
多能性細胞を第１の培養培地中で造血性内皮細胞に分化させるステップと、
前記造血性内皮細胞を第２の培養培地中で巨核球前駆細胞に分化させるステップと
を含み、
前記多能性細胞を分化させるステップおよび前記造血性内皮細胞を分化させるステップのうちの少なくとも一方を、マトリクスがコーティングされた３次元構造上で行う、方法。
【請求項１６】
前記３次元構造が、マイクロキャリアである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記３次元構造が、マイクロキャリアである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記マトリクスが、ラミニンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の培養培地が、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のうちの１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の培養培地が、ＷＮＴモジュレーターをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の培養培地が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびヘパリンのうちの１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
多能性幹細胞を前記マトリクスがコーティングされた３次元構造において増大させるステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記巨核球前駆細胞を第３の培養培地中で巨核球に分化させるステップをさらに含む、請求項１５から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第３の培養培地が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）およびヘパリンのうちの１つまたは複数を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
巨核球を産生するための方法であって、
多能性細胞を第１の培養培地中で造血性内皮細胞に分化させるステップと、
前記造血性内皮細胞を第２の培養培地中で巨核球前駆細胞に分化させるステップと
を含み、
前記多能性細胞を分化させるステップおよび前記造血性内皮細胞を分化させるステップのうちの少なくとも一方を、細胞の自己凝集を可能にするために低接着性または非接着性条件下で行う、方法。
【請求項２７】
前記第１の培養培地が、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のうちの１つまたは複数を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の培養培地が、ＷＮＴモジュレーターをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の培養培地が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびヘパリンのうちの１つまたは複数を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記巨核球前駆細胞を第３の培養培地中で巨核球に分化させるステップをさらに含む、請求項２６から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第３の培養培地が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）およびヘパリンのうちの１つまたは複数を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１から１２、１５から２３、または２６から３０に記載のいずれか１つの方法によって産生された巨核球前駆細胞を含む組成物。
【請求項３４】
請求項１から１２、１５から２３、または２６から３０に記載のいずれか１つの方法によって産生された巨核球前駆細胞の溶解物を含む組成物。
【請求項３５】
請求項１３、１４、２４、２５、３１または３２に記載のいずれか１つの方法によって産生された巨核球または巨核球の溶解物を含む組成物。
【請求項３６】
前記巨核球が、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項１３に記載の方法によって産生された巨核球または巨核球の溶解物を含む組成物。
【請求項３８】
前記巨核球が、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
請求項１４に記載の方法によって産生された巨核球または巨核球の溶解物を含む組成物。
【請求項４０】
前記巨核球が、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項２４に記載の方法によって産生された巨核球または巨核球の溶解物を含む組成物。
【請求項４２】
前記巨核球が、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
請求項２５に記載の方法によって産生された巨核球または巨核球の溶解物を含む組成物。
【請求項４４】
前記巨核球が、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
請求項３１に記載の方法によって産生された巨核球または巨核球の溶解物を含む組成物。
【請求項４６】
前記巨核球が、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
請求項３２に記載の方法によって産生された巨核球または巨核球の溶解物を含む組成物。
【請求項４８】
前記巨核球が、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である、請求項４７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援に関する記載
この研究は、以下の国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金、助成金番号：１Ｒ４４ＨＬ１３１０５０−０１、１Ｒ４３ＡＩ１２５１３４−０１Ａ１、および１ＳＢ１ＨＬ１３７５９１−０１により支援されたものである。政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、その全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１月５日出願の米国仮出願第６２／６１４，１１７号の利益および優先権を主張するものである。
【０００３】
本開示は、巨核球前駆細胞および巨核球、巨核球前駆細胞および巨核球の組成物を産生する方法、ならびにそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
血小板は、活発な出血の部位における血餅形成および血管修復に関与する血液細胞である。生理的に、血小板は、骨髄において、骨髄中の細胞の＜０．１％を構成する巨核球（ＭＫ）と称される親細胞によって産生される。成熟ＭＫは、骨髄内の洞様血管の外に位置し、血小板前駆体（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）と称される長い構造が循環中に伸長している。血小板前駆体は、血小板産生のためのアセンブリラインとして機能し、それらの末端から血小板を逐次的に放出させる。
【０００５】
ＭＫは、骨髄中の造血幹細胞から多数の段階的な分化プロセスを通じて産生される。トロンボポエチンを含めた種々のサイトカイン、ケモカイン、および増殖因子への曝露の結果、造血幹細胞の多分化能前駆細胞への分化、次いで、ｐｒｅ−ＭＫとしても公知の拘束された巨核球性前駆細胞への分化がもたらされる。細胞の拡大、ＤＮＡ含有量の増加、核内分裂、および顆粒形成を含めたさらなる分化の際に、成熟ＭＫが産生される。ＭＫは、それらの細胞塊を血小板前駆体の伸長に変換して、無核血小板を産生／放出する。
【０００６】
低血小板数は、種々の疾患、ならびに出血が制御されないことによる死亡を防止するための重要な第一選択治療が血小板であるがん処置、移植、および外科手術を含めた治療の重要な結果である。血小板単位（２００〜４００ｍＬ当たり３×１０１１個の血小板）は、ヒト志願者ドナーに排他的に由来し、不可逆的活性化を回避するために室温で保管しなければならない。しかし、この温度では、細菌が成長するリスクがあり、それにより、血小板単位の貯蔵寿命は５日間に限定され、そのうち２日間は病原体スクリーニングに消費され、１日は輸送に消費される。したがって、血液センターは、一般には、１．５日を超える輸血に利用可能な血小板在庫品を有さず、これは緊急事態の間には、急速に枯渇する。特に危機時に血小板のドナー不足が生じる恐れがある。一般人の使用の需要の高まりだけでも供給を約２０％超え、緊急事態時には備蓄は急速に枯渇する。さらに、単位およびドナーの間で広範に機能的変動があることにより、有効な出血制御を確実にするための過剰輸血が導かれる。したがって、血小板の供給源を提供する巨核球、および、巨核球を生成する新しい、改善された方法が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）および巨核球（ＭＫ）を幹細胞から産生するための方法を提供する。本開示は、さらに、ｐｒｅＭＫおよびＭＫならびにそれらの溶解物を含む組成物を提供し、また、ｐｒｅＭＫ、ＭＫ、それらの溶解物およびその組成物の使用方法も提供する。
【０００８】
一部の実施形態では、本開示は、巨核球を産生するための方法であって、低接着性または非接着性条件下、かつ撹拌下で多能性幹細胞を増大させるステップであって、増大した多能性幹細胞が自己凝集性スフェロイドを形成する、ステップと、多能性細胞を第１の培養培地中で造血性内皮細胞に分化させるステップと、造血性内皮細胞を第２の培養培地中で巨核球前駆細胞に分化させるステップとを含む方法を提供する。多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップは、マトリクス上、接着性条件下で行うことができる。一部の実施形態では、多能性細胞を造血性内皮細胞に分化させるステップを、造血性内皮細胞の自己凝集を可能にするために低接着性または非接着性条件下で行う。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示は、巨核球を産生するための方法であって、多能性細胞を第１の培養培地中で造血性内皮細胞に分化させるステップと、造血性内皮細胞を第２の培養培地中で巨核球前駆細胞に分化させるステップとを含み、多能性細胞を分化させるステップおよび造血性内皮細胞を分化させるステップのうちの少なくとも一方を、マトリクスがコーティングされた３次元構造上で行う、方法を提供する。３次元構造は、マイクロキャリアまたはマイクロキャリアであってよい。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示は、巨核球を産生するための方法であって、多能性細胞を第１の培養培地中で造血性内皮細胞に分化させるステップと、造血性内皮細胞を第２の培養培地中で巨核球前駆細胞に分化させるステップとを含み、多能性細胞を分化させるステップおよび造血性内皮細胞を分化させるステップのうちの少なくとも一方を、細胞の自己凝集を可能にするために低接着性または非接着性条件下で行う、方法を提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、第１の培養培地は、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のうちの１つまたは複数を含む。第１の培養培地は、ＷＮＴモジュレーターをさらに含み得る。一部の実施形態では、第２の培養培地は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびヘパリンのうちの１つまたは複数を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である。
【００１３】
一部の実施形態では、本方法は、多能性幹細胞をマトリクスがコーティングされた３次元構造において増大させるステップをさらに含み得る。
【００１４】
一部の実施形態では、本方法は、巨核球前駆細胞を第３の培養培地中で巨核球に分化させるステップをさらに含み得る。第３の培地は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）およびヘパリンのうちの１つまたは複数を含み得る。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、本開示の方法によって産生される巨核球前駆細胞または巨核球前駆細胞の溶解物の組成物を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、本開示の方法によって産生される巨核球または巨核球の溶解物を提供する。一部の実施形態では、そのような巨核球は、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋である。
【００１７】
本開示の他の特徴および利点は、以下の説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１８】
本開示を、以下の詳細な説明において、例示的な実施形態の非限定的な例として記載されている複数の図を参照して記載し、ここで、同様の参照番号はいくつかの図の表示全体を通して同様の部分を表す。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ｉＰＳＣ株からの巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）、巨核球（ＭＫ）、および血小板（ＰＬＴ）のスケーラブルな分化に関する全体的な概略図を示す。
【図２】図２は、２Ｄでの多能性幹細胞から巨核球への例示的な定方向分化プロトコール、細胞培養プレートまたはフラスコなどのマトリクス依存性系を示す図である。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、３種の例示的な臨床グレードｈｉＰＳＣ株（本明細書では、ＰＢＧ１、ＰＢＧ２、ＰＢＧ３と称される）の多能性を示す図である。図３Ａは、ビトロネクチンマトリクス上でＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地を用いて培養すると特徴的な成長領域を形成するＰＢＧ１  ｉＰＳＣ、ＰＢＧ２  ｉＰＳＣ、およびＰＢＧ３  ｉＰＳＣの低倍率の位相差画像を示す。図３Ｂは、多能性因子であるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇについて免疫染色し、核色素を用いて対比染色したＰＢＧ１  ｉＰＳＣ、ＰＢＧ２  ｉＰＳＣ、およびＰＢＧ３  ｉＰＳＣの高倍率画像を示す。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、多能性幹細胞から成熟巨核球までの定方向分化のフェーズを進行するＰＢＧ１  ｉＰＳＣ、ＰＢＧ２  ｉＰＳＣ、およびＰＢＧ３  ｉＰＳＣの培養を示す図である。図４Ａは、定方向分化プロセスの一般的な時系列の概略図を示す。図４Ｂは、フェーズ０中（０日目）、フェーズＩ中（２日目および５日目）、フェーズＩＩ中（６＋７日目）、およびフェーズＩＩＩ中（＋２日目および＋４日目）のＰＢＧ１培養物の実際の画像を示す。図４Ｃは、フェーズ０中（０日目）、フェーズＩ中（２日目および５日目）、フェーズＩＩ中（６＋７日目）、およびフェーズＩＩＩ中（＋２日目および＋４日目）のＰＢＧ２培養物の実際の画像を示す。図４Ｄは、フェーズ０中（０日目）、フェーズＩ中（２日目および５日目）、フェーズＩＩ中（６＋７日目）、およびフェーズＩＩＩ中（＋２日目および＋４日目）のＰＢＧ３培養物の実際の画像を示す。
【図５】図５は、ＰＢＧ１  ｉＰＳＣ株、ＰＢＧ２  ｉＰＳＣ株、およびＰＢＧ３  ｉＰＳＣ株の定方向分化のフェーズＩの最後の平均ＣＤ３１＋分化効率を示すグラフである。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａ、図６Ｂ、および図６Ｃは、ＰＢＧ１  ｉＰＳＣ株、ＰＢＧ２  ｉＰＳＣ株、およびＰＢＧ３  ｉＰＳＣ株の定方向分化のフェーズＩＩの間に生成した巨核球前駆細胞（ＣＤ４３＋ＣＤ４１＋）の純度および収量を示す図である。図６Ａは、６＋６日目にフェーズＩＩ培養から回収された懸濁細胞についての代表的なＣＤ４１／ＣＤ４３フローサイトメトリーデータを示す（左から右に：ＰＢＧ１、ＰＢＧ２、ＰＢＧ３）。図６Ｂは、ＰＢＧ１  ｉＰＳＣ株、ＰＢＧ２  ｉＰＳＣ株、およびＰＢＧ３  ｉＰＳＣ株の代表的なフェーズＩＩ分化培養の間に懸濁物中に放出されたＣＤ４１＋ＣＤ４３＋（巨核球前駆細胞）細胞の毎日の出力測定値を示すグラフである。ＰＢＧ１分化培養中およびＰＢＧ２分化培養中でのＣＤ４１＋ＣＤ４３＋巨核球前駆細胞の産生は６＋１７日目まで測定されたが、ＰＢＧ３分化培養中でのＣＤ４１＋ＣＤ４３＋細胞の産生は６＋８日目に停止した。図６Ｃは、臨床グレードｈｉＰＳＣ株のフェーズＩＩ分化培養の間のＣＤ４１＋ＣＤ４３＋細胞の累積的な収量を示し、ウェル当たりのＣＤ４１＋ＣＤ４３＋細胞の数として表している。
【図６Ｃ】同上。
【図７】図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃは、成熟巨核球を最終的に生成する定方向分化プロトコールの最終フェーズであるフェーズＩＩＩを示す図である。図７Ａは、成熟巨核球マーカーＣＤ４２ｂも発現するＣＤ４１＋巨核球系列細胞の割合によって測定された、フェーズＩＩＩ培養下での経時的なＰＢＧ１由来細胞、ＰＢＧ２由来細胞、およびＰＢＧ３由来細胞の成熟化の状態を示す。図６Ｂおよび６Ｃは、フェーズＩＩＩの４日目の、それぞれＰＢＧ１およびＰＢＧ２から分化したｈｉＰＳＣ由来巨核球の光学顕微鏡画像を示す。血小板前駆体伸長の例が矢印で示されている。
【図８Ａ−Ｃ】図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、および図８Ｅは、ＰＢＧ１  ｈｉＰＳＣ、ＰＢＧ２  ｈｉＰＳＣ、およびＰＢＧ３  ｈｉＰＳＣの分化によって引き出された成熟巨核球の特徴付けを示す図である。図８Ａは、β１−チューブリンについて免疫染色し、核を核酸染色によって可視化した、ＰＢＧ１から引き出されたフェーズＩＩＩ細胞を示す（上のパネル）。ＰＢＧ１から引き出された巨核球を電子顕微鏡によっても分析した（下のパネル）。図８Ｂは、ＰＢＧ２  ｈｉＰＳＣの分化によって引き出されたフェーズＩＩＩ細胞を示す。ＰＢＧ２から引き出された巨核球をβ１−チューブリンについて免疫染色し、核を核酸染色によって可視化した（上のパネル）。ＰＢＧ２から引き出された巨核球を電子顕微鏡によっても分析した（下のパネル）。図８Ｃは、ＰＢＧ３  ｈｉＰＳＣの分化によって引き出されたフェーズＩＩＩ細胞を示す。ＰＢＧ３から引き出された巨核球をβ１−チューブリンについて免疫染色し、核を核酸染色によって可視化した（上のパネル）。ＰＢＧ３から引き出された巨核球は電子顕微鏡によって分析しなかった（下のパネル）。図８Ｄは、細胞内フォン・ヴィルブランド因子について陽性染色されたＰＢＧ１  ｉＰＳＣ、ＰＢＧ２  ｉＰＳＣ、およびＰＢＧ３  ｉＰＳＣから引き出されたフェーズＩＩＩ細胞の割合を示す。図８Ｅは、細胞内血小板因子４について陽性染色されたＰＢＧ１  ｉＰＳＣ株、ＰＢＧ２  ｉＰＳＣ株、およびＰＢＧ３  ｉＰＳＣ株から引き出されたフェーズＩＩＩ細胞の割合を示す。
【図８Ｄ−Ｅ】同上。
【図９】図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃは、種々の成長培地を使用した、組換えビトロネクチンでの多能性ＰＢＧ１細胞の増大を示す図である。図９Ａは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地でのＰＢＧ１の成長を示す。図９Ｂは、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地でのＰＢＧ１の成長を示す。図９Ｃは、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ  ＸＦ培地でのＰＢＧ１の成長を示す。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃは、種々の成長培地を使用して組換えビトロネクチンで増大させたＰＢＧ１細胞における多能性マーカーであるＴｒａ−１−６０、ＳＳＥＡ５、および分化マーカーであるＳＳＥＡ１の発現を評価するフローサイトメトリーデータを示すグラフである。図１０Ａは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地中で増大させたＰＢＧ１細胞からの多能性マーカーデータを示す。図１０Ｂは、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地中で増大させたＰＢＧ１細胞からの多能性マーカーデータを示す。図１０Ｃは、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ  ＸＦ培地中で増大させたＰＢＧ１細胞からの多能性マーカーデータを示す。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃは、３Ｄ撹拌槽（マトリクス不含）における自己凝集性スフェロイド培養物中のＰＢＧ１  ｉＰＳＣの増大を示す図である。図１１Ａは、培養物中の経時的なＰＢＧ１スフェロイドの顕微鏡画像を示す。図１１Ｂは、ＰＢＧ１スフェロイド培養物における経時的な細胞密度の増大を示す。図１１Ｃは、３Ｄ培養物中の経時的な平均ＰＢＧ１スフェロイドサイズを示す。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、３Ｄ撹拌槽（マトリクス不含）における自己凝集性スフェロイド培養物中で増大させたＰＢＧ１細胞における、多能性マーカーであるＴｒａ−１−６０、ＳＳＥＡ５、および分化マーカーであるＳＳＥＡ１の発現を評価するフローサイトメトリーデータを示す。図１２Ａは、３Ｄ撹拌槽における単回の７日間にわたる増大後のＰＢＧ１細胞についての多能性マーカーデータを示す。図１２Ｂは、３Ｄ撹拌槽における４回の連続した６〜７日間にわたる増大後のＰＢＧ１細胞についての多能性データを示す。
【図１３】図１３Ａおよび図１３Ｂは、多能性因子であるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇについて免疫染色し、核色素を用いて対比染色したＰＢＧ１  ｉＰＳＣを示す。図１３Ａは、ビトロネクチンで成長させたＰＢＧ−１  ｉＰＳＣの２Ｄコロニーの一部を示す。図１３Ｂは、３Ｄ撹拌条件下（マトリクス不含）で成長させたＰＢＧ−１  ｉＰＳＣのスフェロイドを示す。
【図１４】図１４は、３Ｄ撹拌槽における４回の連続した６〜７日間にわたる増大で成長させたＰＢＧ１  ｉＰＳＣからの中期染色体伝播の核型解析を示す図である。４ラウンドの３Ｄ継代後の核型が正常であることが実証される。
【図１５】図１５は、２Ｄ培養容器中、ＩＶ型コラーゲンマトリクスにおけるＰＢＧ１  ｉＰＳＣから造血性内皮への６日間のフェーズＩ分化にわたって生じた形態学的変化を示す図である。
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＰＢＧ１由来の細胞についての代表的なフェーズＩ分化データを示すグラフである。図１６Ａは、分化の６日目のＰＢＧ１由来の細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。造血性内皮細胞がＣＤ３１およびＣＤ３４の細胞表面発現によって同定される。図１６Ｂは、４１の独立したＰＢＧ１定方向分化にわたるフェーズＩ（６日目）分化効率の平均および範囲を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａ、図１７Ｂおよび図１７Ｃは、ＰＢＧ１分化培養からの代表的なフェーズＩＩデータを示す図である。図１７Ａは、６＋６日目のフェーズＩＩ培養物を示し、造血性内皮（ＨＥ）単層が背景にあり、巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）が単層から懸濁物中に放出されている。図１７Ｂは、フェーズＩＩ懸濁細胞のフローサイトメトリー分析を示し、ＣＤ４３＋造血前駆細胞が同定される。図１７Ｃは、ＣＤ４３＋造血細胞のフローサイトメトリー分析を示し、ＣＤ４３＋ＣＤ４１＋ＣＤ１４−巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）が同定される。混入しているＣＤ４３＋ＣＤ１４＋骨髄系前駆細胞もこの分析で同定される。
【図１７Ｂ−Ｃ】同上。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、フェーズＩＩ懸濁細胞の平均組成特徴を示すグラフである。図１８Ａは、１０日間のフェーズＩＩにわたって放出されたｐｒｅＭＫ（すなわち、生存可能な懸濁細胞の％ＣＤ４１＋ＣＤ４３＋ＣＤ１４−）の毎日の純度の平均を示す。図１８Ｂは、１０日間のフェーズＩＩにわたる、混入している骨髄系前駆細胞（すなわち、生存可能な懸濁細胞の％ＣＤ４３＋ＣＤ１４＋）の中央値、四分位数、および範囲を示す。培養は全て、ＰＢＧ１細胞を用い、２Ｄ容器中、ＩＶ型コラーゲンマトリクスにおいて開始した。データは、４１の独立した分化を表す。
【図１９】図１９Ａおよび図１９Ｂは、放出されたｐｒｅＭＫの収量を示すグラフである。図１９Ａは、ＰＢＧ１  ｉＰＳＣを用いて開始したフェーズＩＩ定方向分化培養の間の６ウェル等価物（すなわち、培地２ｍｌ、表面積９．５ｃｍ２）当たりの毎日の放出されたｐｒｅＭＫ（すなわち、生存可能なＣＤ４１＋ＣＤ４３＋ＣＤ１４−）の収量の平均を示す。図１９Ｂは、ＰＢＧ１  ｉＰＳＣを用いて開始したフェーズＩＩ定方向分化培養の６＋４日目から６＋８日目の間の、６ウェル等価物（すなわち、培地２ｍｌ、表面積９．５ｃｍ２）当たりの放出されたｐｒｅＭＫ（すなわち、生存可能なＣＤ４１＋ＣＤ４３＋ＣＤ１４−）の累積的な収量を示す。各ドットは、２Ｄ培養容器中、ＩＶ型コラーゲンマトリクスにおける独立したＰＢＧ１定方向分化培養を表す。
【図２０】図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、および図２０Ｄは、フェーズＩＩＩにおけるＭＫの分化および血小板前駆体の産生を示す図である。図２０Ａは、フェーズＩＩＩの１日目のＰＢＧ１由来巨核球前駆細胞を示す（上のパネル：高倍率；下のパネル：低倍率）。図２０Ｂは、フェーズＩＩＩの２日目の成熟中の巨核球を示す（上のパネル：高倍率；下のパネル：低倍率）。図２０Ｃは、フェーズＩＩＩの４日目の成熟巨核球を示す（上のパネル：高倍率；下のパネル：低倍率）。図２０Ｄは、４日間のフェーズＩＩＩ培養の後の成熟ＰＢＧ１由来ＭＫからの自発的血小板前駆体形成を例示する。
【図２１】図２１Ａ、図２１Ｂ、および図２１Ｃは、ＰＢＧ１  ｉＰＳＣから開始したフェーズＩＩＩ培養の３日目からの代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図２１Ａは、フェーズＩＩＩ細胞のＣＤ６１＋（巨核球性の）画分を同定する。図２１Ｂは、ＣＤ６１＋巨核球細胞のフローサイトメトリー分析を示し、ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋成熟ＭＫが同定される。アポトーシス性ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ−細胞もこの分析で同定することができる。図２１Ｃは、代表的なフェーズＩＩＩ培養のサブセット分解を示す。非ＭＫはＣＤ６１−であり、未成熟ＭＫはＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ−ＣＤ４２ｂ−であり、アポトーシス性ＭＫはＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ−であり、成熟ＭＫはＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋である。
【図２２】図２２Ａおよび図２２Ｂは、ＰＢＧ１細胞の定方向分化のフェーズＩにおけるラミニン５２１およびＩＶ型コラーゲンの使用を示す図である。図２２Ａは、４．２ｕｇ／ｃｍ２のヒトＩＶ型コラーゲンでのフェーズＩ分化の進行を示す。図２２Ｂは、０．１３ｕｇ／ｃｍ２の組換えヒトラミニン５２１でのフェーズＩ分化の進行を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａ、図２３Ｂ、および図２３Ｃは、ＰＢＧ１細胞の定方向分化のフェーズＩＩにおける巨核球前駆細胞の産生および放出を支持するための、組換えラミニン５２１の使用を示す。図２３Ａは、４．２ｕｇ／ｃｍ２のヒトＩＶ型コラーゲンである支持用マトリクスを利用したＰＢＧ１分化培養のフェーズＩＩからの代表的なフローサイトメトリーデータを示す。図２３Ｂは、０．１３ｕｇ／ｃｍ２の組換えヒトラミニン５２１である支持用マトリクスを利用したＰＢＧ１分化培養のフェーズＩＩからの代表的なフローサイトメトリーデータを示す。図２３Ｃは、ＰＢＧ１  ｉＰＳＣを用いて開始し、４．２ｕｇ／ｃｍ２のヒトＩＶ型コラーゲンまたは０．１３ｕｇ／ｃｍ２の組換えヒトラミニン５２１である支持用マトリクスを利用したフェーズＩＩ定方向分化培養の６＋４日目から６＋８日目の間の６ウェル等価物（すなわち、培地２ｍｌ、表面積９．５ｃｍ２）当たりの放出されたｐｒｅＭＫ（すなわち、生存可能なＣＤ４１＋ＣＤ４３＋ＣＤ１４−）の累積的な収量を示す。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【図２４】図２４Ａおよび図２４Ｂは、ラミニン５２１培養から生成したｐｒｅＭＫから分化したＭＫからの血小板前駆体の産生を示す図である。ＩＶ型コラーゲン培養からのｐｒｅＭＫを用いて開始したフェーズＩＩＩ（６＋６＋３日目）培養物が図２４Ａに示されており、ラミニン５２１培養からのｐｒｅＭＫを用いて開始したフェーズＩＩＩ（６＋６＋３日目）培養物が図２４Ｂに示されている。赤い矢印は、血小板前駆体の例を示す。
【図２５】図２５Ａおよび図２５Ｂは、フェーズＩＩＩ（６＋６＋３日目）培養物のフローサイトメトリーによるサブセット分解を示す図である。図２５Ａは、ＩＶ型コラーゲン培養からのｐｒｅＭＫを用いて開始したフェーズＩＩＩ（６＋６＋３日目）培養物のフローサイトメトリーによるサブセット分解を示す。図２５Ｂは、組換えラミニン５２１培養からのｐｒｅＭＫを用いて開始したフェーズＩＩＩ（６＋６＋３日目）培養物のフローサイトメトリーによるサブセット分解を示す。非ＭＫはＣＤ６１−であり、未成熟ＭＫはＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ−ＣＤ４２ｂ−であり、アポトーシス性ＭＫはＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ−であり、成熟ＭＫはＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋である。
【図２６】図２６Ａ、図２６Ｂ、および図２６Ｃは、６日目のラミニン５２１でのフェーズＩ培養物の免疫蛍光顕微鏡画像を示す図である。図２６Ａは、ＷＮＴアゴニストを伴わない対照培養物を示す。図２６Ｂは、フェーズＩの最初の４８時間にわたって０．６ｕＭのＷＮＴアゴニストＣＨＩＲ９８０１４を分化培養物に添加した培養物を示す。図２６Ｃは、フェーズＩの最初の４８時間にわたって６ｕＭのＷＮＴアゴニストＣＨＩＲ９９０２１を分化培養物に添加した培養物を示す。
【図２７】図２７Ａおよび図２７Ｂは、６＋４日目のラミニン５２１でのフェーズＩＩ培養物の免疫蛍光顕微鏡画像を示す図である。図２７Ａは、ＷＮＴアゴニストを伴わない対照培養物を示す。図２７Ｂは、０．６ｕＭのＷＮＴアゴニストＣＨＩＲ９８０１４をフェーズＩの最初の４８時間にわたって添加した培養物を示す。
【図２８】図２８は、３Ｄのマトリクス依存性方法である充填層バイオリアクター戦略を使用した、ＰＢＧ１から巨核球前駆細胞への例示的な定方向分化プロトコールを示す概略図である。本明細書に記載の実施形態では、ラミニン５２１がコーティングされたＰＴＦＥ製のラシヒリングを、充填層を構成するためのマクロキャリアとして使用する。
【図２９】図２９は、３日目および６日目の、ラミニン５２１がコーティングされたラシヒリングでのＰＢＧ−１  ｉＰＳＣのフェーズＩ分化を示す図である。
【図３０】図３０は、６＋０日目および６＋４日目の、ラミニン５２１がコーティングされたラシヒリングでのＰＢＧ−１  ｉＰＳＣのフェーズＩＩ分化を示す図である。
【図３１】図３１Ａ、図３１Ｂ、および図３１Ｃは、ラシヒリング支持体で効率的に進行するＰＢＧ１分化のフェーズからのフローサイトメトリーデータを示すグラフである。図３１Ａは、フェーズＩ、６日目を示し、造血性内皮マーカーであるＣＤ３１およびＣＤ３４についてのフローサイトメトリー染色を伴う。図３１Ｂは、フェーズＩＩ、６＋２日目を示し、巨核球前駆細胞マーカーであるＣＤ４３およびＣＤ４１についてのフローサイトメトリー染色を伴う。図３１Ｃは、フェーズＩＩＩ、６＋３＋３日目を示し、ＣＤ６１およびＣＤ４２ｂについてのフローサイトメトリー染色を伴う。
【図３２】図３２は、撹拌槽中で自己凝集性ｉＰＳＣ由来スフェロイドを使用する、定方向分化の例示的な３Ｄのマトリクス非依存性方法の概略図である。
【図３３】図３３Ａおよび図３３Ｂは、ＰＢＧ１  ｉＰＳＣの自己凝集性スフェロイドを用いて開始したフェーズ０およびフェーズＩ分化を示す図である。図３３Ａは、−１日目にＰＢＧ１細胞から解離させた単一の細胞から始まり、０日目の自己凝集したＰＢＧ１  ｉＰＳＣスフェロイド、３日目の部分的に分化したスフェロイド、および６日目の造血性内皮細胞を含有する完全に分化したスフェロイドの一連の顕微鏡写真を示す。図３３Ｂは、この手法を使用したＣＤ３１＋ＣＤ３４＋造血性内皮分化が上首尾であったことを示す６日目のフローサイトメトリーデータを示す。
【図３４Ａ−Ｂ】図３４Ａ、図３４Ｂ、図３４Ｃ、および図３４Ｄは、ＰＢＧ１  ｉＰＳＣの自己凝集性スフェロイドを用いて開始した定方向分化におけるフェーズＩＩを記載する図である。図３４Ａは、定方向分化のフェーズＩＩの間の６＋４日目における自己凝集したＰＢＧ１由来スフェロイドを示し、ｐｒｅＭＫがスフェロイドから懸濁物中に放出されている。図３４Ｂは、ｐｒｅＭＫマーカーであるＣＤ４１およびＣＤ４３について染色した、回収された懸濁細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図３４Ｃは、２つの異なる３Ｄ系、オービタルシェーカー上の超低接着性容器、およびスピナーフラスコでの、フェーズＩＩにおける経時的なｐｒｅＭＫの純度を示す。図３４Ｄは、２つの異なる３Ｄ系、オービタルシェーカー上の超低接着性容器、およびスピナーフラスコでの、フェーズＩＩにおける経時的なｐｒｅＭＫの収量を示す。
【図３４Ｃ−Ｄ】同上。
【図３５Ａ】図３５Ａ、図３５Ｂ、および図３５Ｃは、ＰＢＧ１  ｉＰＳＣの自己凝集性スフェロイドから開始した３Ｄ、マトリクス非依存性培養からのフェーズＩＩＩ  ＭＫ分化を示す図である。図３５Ａは、３日目のフェーズＩＩＩ培養からの代表的なフローサイトメトリー分析を示し、フェーズＩＩＩ細胞のＣＤ６１＋（巨核球）画分が同定され、その後、ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋成熟ＭＫが同定される。アポトーシス性ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ−細胞もこの分析で同定することができる。図３５Ｂは、代表的なフェーズＩＩＩ培養のサブセット分解を示す。非ＭＫはＣＤ６１−であり、未成熟ＭＫはＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ−ＣＤ４２ｂ−であり、アポトーシス性ＭＫはＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ−であり、成熟ＭＫはＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋である。図３５Ｃは、３日目のフェーズＩＩＩ培養物内の成熟ＭＫ画分を２Ｄ（マトリクス依存性）手法と３Ｄ（マトリクス非依存性）手法の間でどのように比較するかを示す。
【図３５Ｂ−Ｃ】同上。
【図３６】図３６は、３Ｄ自己凝集性スフェロイド分化培養から回収された成熟ＭＫの血小板前駆体伸長を示す図である。血小板前駆体伸長の例が矢印で示されている。
【図３７】図３７は、巨核球特異的タンパク質β１−チューブリンについて免疫染色したＰＢＧ１由来巨核球を示す図である。同時に、核を核酸染色によって可視化した。
【図３８】図３８Ａ、図３８Ｂ、図３８Ｃ、図３８Ｄ、図３８Ｅおよび図３８Ｆは、α顆粒特異的タンパク質である血小板因子４（ＰＦ４）、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）について、ならびに巨核球特異的細胞表面マーカーであるＣＤ６１、および核について免疫染色したＰＢＧ１由来巨核球を示す図である。
【図３９】図３９Ａ、図３９Ｂ、図３９Ｃ、図３９Ｄ、図３９Ｅ、および図３９Ｆは、高密度顆粒特異的タンパク質であるＬＡＭＰ１およびセロトニンについて、ならびに巨核球特異的細胞表面マーカーであるＣＤ６１、および核について免疫染色したＰＢＧ１由来巨核球を示す図である。
【図４０】図４０Ａ、図４０Ｂ、図４０Ｃおよび図４０Ｄは、ＰＢＧ１由来巨核球を示す電子顕微鏡画像である。図４０Ａは、微小粒子を産生するＰＢＧ１由来巨核球を示す電子顕微鏡画像である（例えば矢印を参照されたい）。図４０Ｂは、ＰＢＧ１由来巨核球および多小胞体を示す電子顕微鏡画像である（矢印；挿入図において拡大されている）。図４０Ｃは、多形核（ｍｕｌｔｉ−ｌｏｂｅｄ  ｎｕｃｌｅｕｓ）、グリコーゲン顆粒、アルファ顆粒、および陥入膜系を特徴とするＰＢＧ１由来巨核球を示す電子顕微鏡画像である。図４０Ｄは、ＰＢＧ１由来巨核球の小胞体およびミトコンドリアを示す電子顕微鏡画像である。
【図４１Ａ−Ｂ】図４１Ａ、図４１Ｂ、および図４１Ｃは、ＰＢＧ１から巨核球への定方向分化の過程で生じる特徴的な遺伝子発現の変化を例示する図である。全ての発現解析について、多能性ＰＢＧ１細胞における発現を１に設定し、他の発現値は全て相対的に表されている。図４１Ａは、多能性ＰＢＧ１細胞、６日目の細胞（フェーズＩの最後）、６＋４日目および６＋５日目（フェーズＩＩ）、ならびに６＋５＋１日目から６＋５＋４日目まで（フェーズＩＩＩ）における多能性関連遺伝子であるＯｃｔ４の相対的な遺伝子発現を例示する。図４１Ｂは、多能性ＰＢＧ１細胞、６日目の細胞（フェーズＩの最後）、６＋４日目および６＋５日目（フェーズＩＩ）、ならびに６＋５＋１日目から６＋５＋４日目まで（フェーズＩＩＩ）における、巨核球成熟化のために極めて重要な転写因子であるＮＦＥ２の相対的な遺伝子発現を例示する。同様の解析を関連性のある遺伝子のパネルに対して実施し、この解析の結果が図４１Ｃに示されているヒートマップに要約されており、遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＺＦＰ４２は分化の間下方制御され、遺伝子ＺＦＰＭ１、ＮＦＥ２、ＲＵＮＸ１、ＭＥＩＳ１、およびＧＡＴＡ１は、分化の間上方制御され、遺伝子ＰＢＸ１およびＭＹＣは、実質的に一貫したレベルのままである。
【図４１Ｃ】同上。
【図４２】図４２Ａ、図４２Ｂおよび図４２Ｃは、ＰＢＧ１由来巨核球のサイズ分布を提示する図である。図４２Ａは、ＰＢＧ１−ＭＫのサイズ測定値を収集し、ＭＫを他の供給源と比較するために利用したＰＢＧ１由来巨核球のβ１−チューブリン染色の代表的な例を示す。図４２Ｂは、中央値、四分位数、および範囲を含めたＰＢＧ１由来巨核球のサイズ分布を示す。図４２Ｃは、ＰＢＧ１由来ＭＫのサイズ分布データを種々の骨髄供給源に由来する巨核球と比較したものである。
【図４３】図４３Ａおよび図４３Ｂは、ＰＢＧ１由来巨核球に対する倍数性測定を提示する図である。図４３Ａは、ＰＢＧ１由来巨核球に対して実施したＤＮＡ倍数性測定の代表的な例を示す。図４３Ｂは、ＰＢＧ１−ＭＫのＤＮＡ倍数性測定を他の供給源に由来するＭＫと比較したものである。
【図４４】図４４は、本開示の方法およびある特定の条件によって引き出された巨核球のｈｉＰＳＣ−ＭＫ溶解物における、様々な因子の存在または非存在および濃度範囲比較を提示する図である。
【図４５Ａ】図４５Ａ、図４５Ｂ、および図４５Ｃは、ｈｉＰＳＣ血小板産生を示す図である。図４５Ａは、無核細胞および有核細胞のフローサイトメトリー分析を示す（上、左）。有核細胞は多数のＣＤ４１＋ＣＤ４２＋巨核球を含有した（上、右）。ＣＤ４１＋、ＣＤ４２＋、およびカルセインＡＭについて陽性の無核細胞を、フローサイトメトリーを使用して評価し、血小板をサイズ（１〜５ミクロン）によってゲーティングした。図４５Ｂは、電子顕微鏡によって評価した、巨核球培養物から回収された血小板の例を示す。図４５Ｃは、本明細書に記載の定方向分化プロトコールのフェーズＩＩＩの間のウェル当たりのＣＤ４１＋ＣＤ４２＋カルセインＡＭ＋血小板サイズの粒子の累積的な収量を示すグラフである。
【図４５Ｂ−Ｃ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
上で識別されている図は、本開示の実施形態を記載するものであるが、考察に記載の通り他の実施形態も意図されている。本開示は、例示的な実施形態を代表として示し、限定するものではない。当業者は、本開示の実施形態の原理の範囲および主旨内に入る多数の他の改変および実施形態を考案することができる。
【００２１】
本開示は、巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）および巨核球（ＭＫ）を、多能性幹細胞、例えば、臨床グレードヒト人工多能性幹細胞などの幹細胞から産生するための組成物および方法を対象とする。当該方法により、ｐｒｅＭＫを造血性内皮細胞から延長した時間枠にわたって（８日間またはそれよりも長くに至るまで）継続して産生することができ、次いでそれを続いて成熟ＭＫに分化させることができる。本方法によって引き出されたｐｒｅＭＫとＭＫは、以下の１つまたは複数によって区別することができる：サイズ範囲、倍数性プロファイル、バイオマーカーの発現、遺伝子発現、顆粒組成、ならびに増殖因子であるサイトカインおよびケモカインの組成またはこれらの組合せ。本開示は、さらに、ｐｒｅＭＫおよびＭＫならびにそれらの溶解物を含む組成物を提供し、また、ｐｒｅＭＫおよびＭＫならびにそれらの溶解物およびその組成物の使用方法も提供する。
【００２２】
定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する当業者に一般に理解される意味を有する。以下の参考文献により、本開示において使用される用語の多くの一般的な定義が当業者に提供される：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２ｎｄ  ｅｄ．  １９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，  １９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｒ．  Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  （１９９１）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に指定のない限り、以下の当該用語に与えられた意味を有する。
【００２３】
「作用物質」とは、任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
【００２４】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部を指し、インタクトな抗体の抗原性決定可変領域を指す。
【００２５】
「変更」または「変化」とは、増大または低減を意味する。変化は、わずか１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％である、または４０％、５０％、６０％である、またはさらには、７０％、７５％、８０％、９０％、または１００％もの大きさであり得る。
【００２６】
「生物学的試料」は、任意の組織、細胞、流体、または生物体から引き出された他の材料を意味する。
【００２７】
「捕捉試薬」は、核酸分子またはポリペプチドを選択または単離するための当該核酸分子またはポリペプチドに特異的に結合する試薬を意味する。
【００２８】
「細胞組成物」とは、単離された細胞を１つまたは複数含む任意の組成物を意味する。
【００２９】
「細胞生存」とは、細胞生存度を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「臨床グレード」は、ヒトにおける臨床使用を許可する現行の医薬品の製造管理及び品質管理規則（ＧＭＰ）を使用して引き出されたまたは得られた細胞または細胞株を指すものとする。ＧＭＰは、医薬品産業において最終製品が予め設定された仕様を満たすことを確実にするために使用される品質保証システムである。ＧＭＰは、最終製品の製造および試験のどちらにも及ぶ。ＧＭＰでは、原料のトレーサビリティだけでなく、生産が、有効化された標準操作手順（ＳＯＰ）に従ったものであることも要求される。
【００３１】
「検出可能なレベル」とは、分析物の量が、そのような分析を行うために常套的に使用される方法を使用して検出するために十分であることを意味する。
【００３２】
「検出する」は、検出しようとする対象物の存在、不在または量を同定することを指す。
【００３３】
「検出可能な標識」とは、目的の分子に連結した場合に、当該分子を分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段によって検出可能なものにする組成物を意味する。例えば、有用な標識としては、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが挙げられる。
【００３４】
「疾患」とは、細胞、組織、または器官の正常機能に損傷を与えるまたは干渉する任意の状態または障害を意味する。疾患の例としては、脳卒中、心筋梗塞などの虚血性傷害、または組織損傷、末梢血管疾患、創傷、熱傷、骨折、鈍的外傷、関節炎、および炎症性疾患を引き起こす任意の他の虚血性事象を含めた、細胞数または生物学的機能の低減をもたらす任意の疾患または傷害が挙げられる。
【００３５】
「有効量」とは、意図された効果を生じさせるために必要な作用物質の量を意味する。
【００３６】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この一部は、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含有することが好ましい。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。
【００３７】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、材料が、ネイティブな状態で見いだされた場合に通常付随する構成成分を種々の程度に含まないことを指す。「単離する」は、元々の供給源または周囲のものからある程度分離されていることを示す。「純度」は、単離よりも高い程度に分離されていることを示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物も当該タンパク質の生物学的性質に実質的に影響を及ぼさないまたは他の有害な結果を引き起こさないように十分に他の材料を含まない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、当該核酸またはペプチドが細胞性材料、ウイルス材料、または組換えＤＮＡ技法によって作製された場合は培養培地、または化学的に合成された場合は化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなければ、精製されている。純度および均質性は、一般には、分析化学技法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。「精製された」という用語は電気泳動ゲルにおいて、核酸またはタンパク質により基本的に１つのバンドが生じることを示すことができる。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化に供すことができるタンパク質に関しては、異なる修飾により異なる単離されたタンパク質を生じさせることができ、それを別々に精製することができる。
【００３８】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本開示の核酸分子が由来する生物体の天然に存在するゲノム内で当該遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（例えば、ＤＮＡ）を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクター内；自律複製プラスミドもしくはウイルス内；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み入れられる組換えＤＮＡ；または他の配列とは独立した別の分子として存在するもの（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じるｃＤＮＡまたはゲノムまたはｃＤＮＡ断片）を含む。さらに、この用語は、ＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子、ならびに追加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを包含する。
【００３９】
「単離されたポリペプチド」は、天然ではそれに付随する構成成分から分離されている本開示のポリペプチドを意味する。一般には、ポリペプチドは、重量で少なくとも６０％が、天然に付随するタンパク質および天然に存在する有機分子を含まなければ、単離されている。調製物は、本開示のポリペプチドが重量で少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％であることが好ましい。本開示の単離されたポリペプチドは、例えば、天然の供給源の抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはタンパク質の化学的合成によって得ることができる。純度は、任意の妥当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
【００４０】
「造血性内皮細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、分化して造血細胞型または内皮細胞型を生じさせることができ、必要に応じて多能性幹細胞から引き出すことができる細胞を指す。造血性内皮細胞は、通常、細胞外マトリクスタンパク質および／または他の造血性内皮細胞に対して接着性であり、一部の実施形態では、マーカーであるＣＤ３１およびＣＤ３４の発現によって特徴付けることができる。
【００４１】
「マーカー」とは、特徴または状態に関連する発現レベルまたは活性の変化を有する任意のタンパク質または他のエピトープを意味する。
【００４２】
「巨核球」（ＭＫ）という用語は、本明細書で使用される場合、大きな（例えば、直径≧１０μｍ）、血小板前駆体および／または血小板を生じさせる傾向がある倍数体の造血細胞を指す。成熟ＭＫの１つの形態学的特徴は、大きな多形核の発生である。成熟ＭＫは、増殖を停止し得るが、核内分裂を通じてＤＮＡ含有量が増加し続け、並行して細胞サイズが増大し続ける。
【００４３】
「巨核球前駆細胞」（ｐｒｅＭＫ）という用語は、本明細書で使用される場合、巨核球系列に拘束されており、成熟巨核球の前駆体である単核造血細胞を指す。巨核球前駆細胞は、通常、（これだけに限定されないが）骨髄および他の造血場所において見いだされるが、多能性幹細胞からも、それら自体も多能性幹細胞から引き出された造血性内皮細胞のさらなる分化によってなどで生成され得る。
【００４４】
「微小粒子」という用語は、巨核球または他の細胞から脱落される非常に小さな（＜１ミクロン）リン脂質小胞を指す。微小粒子は、ＲＮＡなどの遺伝子材料を含有し得、それらの親細胞の細胞外マーカーを発現し得る。巨核球由来微小粒子および血小板由来微小粒子は、止血および炎症を含めた多数の経路において役割を有し得る。
【００４５】
「血小板」（ＰＬＴ）という用語は、直径が１〜３ミクロンであり、核を有さないがＲＮＡは含有する細胞を指す。血小板は、細胞表面上にＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、およびＣＤ６１を発現し得る。血小板は、内部に、アルファ顆粒および高密度顆粒を含有し、これらは、それぞれＰ−セレクチンおよびセロトニンなどの因子を含有する。血小板はまた、開放小管系も有し、これは、細胞外材料の細胞内への輸送および顆粒から細胞外環境への材料の放出のための経路であるチャネルを指す。これらは、血液凝固に関与することによって止血の調節において主に機能するが、炎症における役割を有することも示されている。
【００４６】
「プレ血小板」という用語は、直径が３〜１０ミクロンであり、核を有さないがＲＮＡは有する細胞を指す。プレ血小板は、他の点では形態学的かつ超微細構造的に血小板と類似しており、細胞骨格再構成によってばらばらになって、個々の血小板を形成する巨核球によって産生される中間細胞期を構成する。
【００４７】
「血小板前駆体」という用語は、巨核球からの細胞質ゾル伸長または巨核球からちょうど放出されたものを指す。血小板前駆体は、細胞骨格再構成によってばらばらになって、個々のプレ血小板および血小板を形成する。
【００４８】
「多能性幹細胞」という用語は、多能性幹細胞を引き出す方法にかかわらず、胚性幹細胞、胚由来幹細胞、および人工多能性幹細胞、ならびに体の３つ全ての胚葉に由来する細胞を形成する能力を有する他の幹細胞を含む。多能性幹細胞は、機能的には以下の特徴の１つまたは複数を有し得る幹細胞と定義される：（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植した場合に奇形腫を誘導することができる；（ｂ）３つ全ての胚葉の細胞型に分化することができる（例えば、外胚葉系の細胞型、中胚葉系の細胞型、および内胚葉系の細胞型に分化することができる）；または（ｃ）胚性幹細胞の１つまたは複数のマーカーを発現する（例えば、Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３表面抗原、ＳＳＥＡ−４表面抗原、ＳＳＥＡ−５表面抗原、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１などを発現する）。
【００４９】
「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）という用語は、再プログラミング因子の組合せを発現させることによる体細胞の再プログラミングによって生成される多能性幹細胞の一種を指す。ｉＰＳＣは、胎児体細胞、出生後体細胞、新生児体細胞、若年体細胞、または成人体細胞を使用して生成することができる。体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用することができる因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（時にはＯｃｔ３／４と称される）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の組合せが挙げられる。他の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用することができる因子として、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８の組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、体細胞を再プログラミングするために、少なくとも２種、３種、または４種の再プログラミング因子を体細胞において発現させる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、「予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）処置」などという用語は、障害または状態を有さないが、そのリスクがあるまたはそれにかかりやすい被験体において障害または状態が発生する確率を低減することを指す。
【００５１】
「低減する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の負の変化を意味する。
【００５２】
「細胞死を低減すること」とは、細胞が死滅する傾向または確率を低減することを意味する。細胞死は、アポトーシス性、壊死性、または任意の他の手段によるものであり得る。
【００５３】
「低減したレベル」とは、試料中の分析物の量が対応する対照試料中の分析物の量よりも少ないことを意味する。
【００５４】
「参照」とは、標準または対照条件を意味する。
【００５５】
「特異的に結合する」とは、化合物または抗体が本開示のポリペプチドを認識し、それに結合するが、本開示のポリペプチドを天然に含む試料、例えば生体試料中の他の分子は実質的に認識せず、それに結合しないことを意味する。
【００５６】
「被験体」または「患者」という用語は、処置、観察、または実験の対象物である動物を指す。単に例として、被験体は、これだけに限定されないが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ウマ科の動物、イヌ科の動物、ヒツジ、またはネコ科の動物を含めた哺乳動物を含むが、これだけに限定されない。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語などは、障害またはそれに付随する症状を低減するまたは好転させることを指す。防がれなくても、障害または状態の処置は、障害、状態またはそれに付随する症状を完全に排除するものである必要はないことが理解されよう。
【００５８】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに与えられた意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る；「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、同様に、米国特許法において与えられた意味を有し、この用語は、無制限のものであり、記載されている基本的なまたは新規の特徴が、記載されているよりも多くのものが存在することによって変化しない限りは、記載されているよりも多くのものが存在することが許容されるが、先行技術の実施形態は除外される。
【００５９】
特に明記されていないかまたは文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、「または（ｏｒ）」という用語は、包括的なものと理解される。特に明記されていないかまたは文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、単数または複数であることが理解される。
【００６０】
特に明記されていないかまたは文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容度の範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内に入ると理解される。約は、明示された値の１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、０．５％以内、０．１％以内、０．０５％以内、または０．０１％以内と理解することができる。別段文脈から明らかでない限り、本明細書に提示される全ての数値は約という用語で修飾される。
【００６１】
本明細書における変数のあらゆる定義における化学基の一覧の列挙は、その変数が単一の基または列挙された基の組合せであるという定義を含む。本明細書における変数または態様についてのある実施形態の列挙は、その実施形態が単一の実施形態または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せであるという定義を含む。
【００６２】
本明細書に提示される任意の組成物または方法を本明細書に提示される他の組成物および方法のいずれか１つまたは複数と組み合わせることができる。
【００６３】
巨核球
ヒトの体内では、巨核球は、骨髄に主に存在するＣＤ３４＋造血幹細胞から引き出されるが、初期発生の間には卵黄嚢、胎児肝臓、および脾臓においても見いだされる。ＭＫ分化の間、ＭＫ前駆体はある期間の核内分裂を受け、それによって、ＭＫは、細胞分裂を伴わないＤＮＡ複製の多数のサイクルを通じて倍数体になり、それにより、最大１２８ｎコピーのＤＮＡを有する多形化した核がもたらされる。ＭＫは、サイズが増大するにつれ、それらの転写およびプロテオミクスプロファイルの精密化、α顆粒および高密度顆粒を含めた高度に特殊化された顆粒の数の増加、ならびに、高度陥入膜系の発生も生じ、これらは、ＭＫの成熟化および発達の特質である。
【００６４】
血小板を産生するために、ＭＫは、骨髄中の血管の付近に移動し、それを通じて血小板前駆体と称される長い構造を循環中に伸長させる。血小板前駆体は、血小板産生のためのアセンブリラインとして機能し、末端から多数の無核血小板を逐次的に放出する。
【００６５】
血小板は活発な出血の部位における血餅形成に主に関与するが、創傷治癒、血管形成、および自然免疫においても血小板が重要な役割を果たすことがますます明らかになっている。幹細胞に基づく治療的展望の中でも、血小板は、理想的な初期関与物質であり、その理由は以下の通りである：１）在庫貯蔵寿命が短いことに起因して臨床的需要が大きい；２）無核であり、安全に照射処理してあらゆる混入有核細胞を死滅させることができ、それにより、奇形腫発生のリスクが低減する；３）血小板輸血の大多数（＞９０％）についてＨＬＡまたは血液型の適合を必要とせず、それにより、同種異系ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の共通に使える治療のための大規模製造が容易になる；４）寿命が短く、よく特徴付けられており、それにより、計画される臨床試験が単純化される；５）容易に移植される、かつ、６）現行のドナーに基づく血小板輸血は本質的に細菌およびウイルス混入しやすいので、無菌製造が非常に有効である。
【００６６】
現行の血小板需要は供給を約２０％超えており、成長および老化している集団により、血小板に基づく手順、血小板数を低減する新しい薬物適用、および治癒時間を改善するための血小板輸血の既存の使用の増大がより大きく必要とされていることに起因して、未対処の需要は２０２２年までに２倍よりも大きくなることが予想される。米国では、血液市場は寡占として有効に運用されており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  ＣｒｏｓｓおよびＡｍｅｒｉｃａ’ｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒｓがそれぞれ市場のほぼ半分を支配しており、ＨｅｍｅＸｃｅｌが第３位の主要な血液提供者である。
【００６７】
ｐｒｅＭＫおよびＭＫならびにそれらの増殖因子に関しては多数の他の潜在的市場が存在する。例えば、ｐｒｅＭＫ、ＭＫおよびそれらの溶解物は、細胞培養、組織再生、創傷治癒、薬物送達のために、および化粧品産業において皮膚の若返りのために使用することができる。本明細書に記載の方法によって産生される巨核球は多くの増殖因子を含有するので、治療用組成物の供給源とすることができ、かつ／または多くの治療目的のために使用することができる。本開示は、ヒトｉＰＳＣ由来ヒト巨核球およびその産物を生産するための、スケーラブルな、現行の医薬品の製造管理及び品質管理規則（ｃＧＭＰ）に準拠した商業的プラットフォームを確立することによってこれらの必要性に対処する。
【００６８】
体外では、ＭＫは、種々の主要な供給源幹細胞、例えば、多能性幹細胞、造血幹細胞、または他の幹細胞型から合理的に引き出すことができる。
【００６９】
一部の実施形態では、ＭＫを、これだけに限定されないが、胚性幹細胞（ＥＳＣ）（例えば、ヒト胚性幹細胞）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えば、ヒト人工多能性幹細胞）を含めた多能性幹細胞から引き出すことができる。ＥＳＣは、胚盤胞と称される初期の着床前胚の内部細胞塊から引き出された多能性幹細胞である。ｉＰＳＣは、成体細胞から、特定の転写因子の時限発現を誘導することによって生成することができる多能性幹細胞の一種である。ｉＰＳＣは、培養下で無制限に増大させ、維持し、操作してＭＫを産生することができる。
【００７０】
一部の実施形態では、ＭＫを、これだけに限定されないが、ＣＤ３４＋臍帯血幹細胞（ＵＣＢ細胞）（例えば、ヒトＣＤ３４＋臍帯血幹細胞）、ＣＤ３４＋動員末梢血液細胞（ＭＰＢ細胞）（例えば、ＣＤ３４＋ヒト動員末梢血）、またはＣＤ３４＋骨髄細胞を含めた造血幹細胞から引き出すことができる。ＵＣＢ細胞は、血液から引き出される多分化能幹細胞であり、分娩後に胎盤および付着臍帯に留まる。ＭＰＢ細胞は、Ｇ−ＣＳＦまたは同様の作用物質の投与によって幹細胞が血流中に動員された志願者から引き出される多分化能幹細胞である。
【００７１】
一部の実施形態では、ＭＫを、これだけに限定されないが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（例えば、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡｄＭＳＣ）など）または他の供給源由来の間葉系幹細胞を含めた他の幹細胞型から引き出すことができる。
【００７２】
ＡｄＭＳＣは、白色脂肪組織から引き出され、白色脂肪組織は、胚発生の間に中胚葉から引き出され、すべての哺乳動物種に存在し、全身に位置する。ＡＳＣは、それらの広い利用可能性ならびに骨、軟骨、筋肉、および脂肪を含めた中胚葉の他の組織型に分化する能力に起因して、多種多様な適用に役立つことができる。
【００７３】
本開示では、幹細胞培養物を、異種病原体が潜在的に混入しており、ヒトにおける免疫原性反応のリスクが増大する胚性線維芽細胞フィーダー細胞および／または動物血清とは独立して維持する。したがって、本方法では、本方法に従って引き出されるｐｒｅＭＫおよびＭＫへの動物産物の導入を回避して、安全かつ動物産物を含まない条件および産物を確実にするために、無血清の、フィーダー細胞を含まない代替物を利用する。
【００７４】
産生方法
図１は、１つまたは複数の多能性幹細胞から巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）、巨核球（ＭＫ）、および血小板（ＰＬＴ）へのスケーラブルな分化についての全体的な概略図を示す。しかし、本プロセスは多能性幹細胞に関連して記載されているが、種々の実施形態では、多能性幹細胞を他の型の幹細胞で置換することまたは他の型の幹細胞を補充することができることに留意するべきである。
【００７５】
フェーズ０：ヒト人工多能性幹細胞の増大および分化の準備
マトリクス依存性増大培養
マトリクス依存性増大培養に関しては、臨床グレード多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、多能性幹細胞培養培地中、支持用マトリクス上でフィーダー細胞を伴わずに培養することによってコロニーとして増大させることができる。支持用マトリクスは、２次元表面であっても３次元構造であってもよい。一部の実施形態では、臨床グレードヒト人工多能性幹細胞は、ＰＢＧ１、ＰＢＧ２、またはＰＢＧ３などのヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってよいが、胚性幹細胞などの他の型の多能性幹細胞、または他の幹細胞を使用することもできる。
【００７６】
一部の実施形態では、支持用マトリクスは、非限定的な例として、組換えビトロネクチン、組換えラミニン、マトリゲルまたは前述のものの任意の組合せであってよい。一部の実施形態では、多能性幹細胞培養培地は、例えば、これだけに限定されないが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄａｓｔｒｉｅｓ）、または当技術分野で公知の多能性細胞の維持および成長を支持することが可能な他の培地であってよい。一部の実施形態では、細胞をコンフルエンシーに達するまで培養することができる。一部の実施形態では、細胞を３０％から９０％までの％コンフルエンシーに達するまで培養することができる。一部の実施形態では、細胞を最大６０％、最大６５％、最大７０％、最大７５％のコンフルエンシーに達するまで培養する。例えば、細胞を約７０％のコンフルエンシーに達するまで培養する。所定の最大パーセントコンフルエンシーに達したら、細胞を回収する。一部の実施形態では、細胞を、０．１ｍＭから５ｍＭまでのＥＤＴＡまたは同様のキレート剤または試薬を使用して解離させることにより、凝集塊として回収することができる。例えば、細胞を、約０．５ｍＭのＥＤＴＡを使用して回収することができる。一部の実施形態では、細胞を、例えば、タンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、またはこれらの組合せを用いて解離させることによってなどで、単一の細胞として回収することができる。例えば、細胞を、例えば、ＴｒｙｐＬＥ（商標）、またはＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）などの組換えトリプシンを用いて解離させることにより、単一の細胞として回収することができる。ＰＳＣの維持／増大のために、回収された細胞を多能性幹細胞培養培地中に再懸濁させることができる。
【００７７】
マトリクス非依存性３Ｄ増大培養
マトリクス非依存性３Ｄ増大培養に関しては、臨床グレードＰＳＣを自己凝集性スフェロイドとして増大させることができる。一部の実施形態では、これを、単一の細胞を１ｍｌ当たり約１０万個から約１５０万個までの密度で播種することによって達成することができる。例えば、一部の実施形態では、単一の細胞を１ｍｌ当たり５０万個で播種することができる。
【００７８】
細胞は、多能性幹細胞培養培地中、低接着性または非接着性条件下で、ゆっくり撹拌することまたは穏やかに振とうすることによる連続的な運動に供すことができる。一部の実施形態では、フィーダーフリーの無血清培地を使用することができる。多能性幹細胞培養培地は、例えば、これだけに限定されないが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、または当技術分野で公知の多能性細胞の維持および成長を支持することが可能な他の同様の培地であってよい。一部の実施形態では、ＰＳＣスフェロイドを、全体的な細胞密度が１ｍｌ当たり細胞約３００万個から約１０００万個までに達するまで、かつ／または約１５０〜約３５０μｍのスフェロイドサイズ中央値が達成されるまで、およそ５〜７日間にわたって培養する。一部の実施形態では、ＰＳＣスフェロイドを、全体的な細胞密度が１ｍｌ当たり細胞５００万個に達するまで培養する。一部の実施形態では、ＰＳＣスフェロイドを、細胞により約２５０μｍのスフェロイドサイズ中央値が達成されるまで培養する。培養ステップは、４日間、５日間、６日間、７日間、または８日間続き得る。適用可能な場合、ＰＳＣを、タンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、またはこれらの組合せを用いて解離させることによって単一の細胞として回収することができる。例えば、細胞を、これだけに限定されないが、トリプシン、組換えトリプシン、例えば、ＴｒｙｐＬＥ（商標）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、または当技術分野で公知の同様の試薬を用いて解離させることによって単一の細胞として回収することができる。一部の実施形態では、単一の細胞を使用して、別の３Ｄ増大培養および／または定方向分化培養を開始する。
【００７９】
分化の準備
一部の実施形態では、分化の準備をするために、マトリクス依存性２Ｄ培養物からＰＳＣコロニーを部分的に解離させることによって、マトリクス非依存性３Ｄ培養からＰＳＣスフェロイドを部分的に解離させることによって、または当技術分野で公知の任意の方法によって生成された単一のＰＳＣの自己凝集によって、ＰＳＣ凝集体を生成することができる。一部の実施形態では、分化を開始する前に、これらの凝集体を多能性幹細胞培養培地、例えば、これだけに限定されないが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、またはＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）に再懸濁させ、培養することができる。一部の実施形態では、培地は、例えば、これだけに限定されないが、Ｙ２７６３２、Ｈ１１５２、またはこれらの組合せなどのＲＯＣＫ阻害剤を含み得る。一部の実施形態では、細胞を、分化を開始する前に、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で０時間から７２時間の間培養することができる。
【００８０】
マトリクス依存性培養に関しては、凝集体を表面に付着させることができる。一部の実施形態では、付着させるステップを約２４時間にわたって進行させることができるが、１時間から２４時間の間の任意の時間またはより長い時間を使用することができる。一部の実施形態では、表面を、コラーゲン、ラミニン、または任意の他の細胞外マトリクスタンパク質で予めコーティングすることができる。一部の実施形態では、表面をコーティングするためにヒトＩＶ型コラーゲンを使用することができる。一部の実施形態では、マトリクスがコーティングされた表面は、２Ｄであってよい（例えば、プラスチックディッシュまたはフラスコの底部）。一部の実施形態では、マトリクスがコーティングされた表面は、３Ｄであってよい（例えば、平滑なまたはきめのある球状マイクロキャリア、マクロキャリア、例えば、ラシヒリングなど）であってよい。次いで、３Ｄマトリクスコーティング表面上の細胞を、連続的な運動を伴ってまたは伴わずに培養することができる。例えば、細胞を、超低接着性静置条件下、ローラーボトル、スピナーフラスコ、撹拌槽バイオリアクター、垂直ホイールバイオリアクター、充填層バイオリアクター、または流動層系において培養することができる。
【００８１】
マトリクス非依存性培養に関しては、凝集体を、低接着容器中、ゆっくり撹拌することまたは穏やかに振とうすることによる連続的な運動に供すことができる。０時間後から７２時間後の間、例えば、約２４時間後に、細胞を分化のフェーズＩに移行することができる。
【００８２】
フェーズＩ．造血性内皮細胞の生成
フェーズＩにおいて、調製されたＰＳＣを造血性内皮細胞に分化させることができる。簡単に述べると、多能性幹細胞培養培地を取り出し、フェーズＩ分化培地に置き換える。一部の実施形態では、フェーズＩ分化培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）−ＡＣＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号０９８５５）を基本培地として含み、例えば、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含めた１つまたは複数の増殖因子を補充した、動物構成成分を含まない培地（ＡＣＦ）であってよい。一部の実施形態では、基本培地に、それぞれ１ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの間の、ＢＭＰ４（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＶＥＧＦ（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）の１つまたは複数を補充する。細胞を、低酸素条件で（例えば、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２）２日間から６日間の間インキュベートし、その後、正常酸素下（３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２）で２日間から６日間の間インキュベートすることができる。一部の実施形態では、例えばＷＮＴアゴニストまたはアンタゴニストなどのＷＮＴモジュレーターを分化の最初の期間にわたって添加することができる。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤を分化の最初の期間にわたって添加することができる。一部の実施形態では、例えば、ＣＨＩＲ９９９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１またはこれらの組合せなどのＧＳＫ３阻害剤またはＷＮＴアゴニストを、分化の最初の期間にわたって、例えば、１日間から２日間の間などにわたって添加することができる。一部の実施形態では、ＷＮＴモジュレーターを、フェーズＩの少なくとも一部分にわたって増殖因子の１つまたは複数に置き換えることができる。例えば、一部の実施形態では、ＷＮＴモジュレーターが存在する一方で、ＢＭＰ４を最初の４８時間にわたって添加することができ、フェーズＩの残りに対しては不必要であり得る。一部の実施形態では、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦは最初の４８時間には不必要であり得るが、一方でＷＮＴモジュレーターが存在する。一部の実施形態では、フェーズＩ全体を通して、毎日の培地全体の交換を、消費された培地を取り出し、新鮮なフェーズＩ培地に置き換えることによって実施することができる。一部の実施形態では、消費された培地の１０〜９５％を取り出し、等体積の新鮮なフェーズＩ培地に置き換えることで、部分的な培地交換を実施することができる。一部の実施形態では、追加的な体積の新鮮な培地を添加することができ、培養物の総体積が増大するという正味の影響が伴う。一部の実施形態では、新鮮なフェーズＩ培地に置換えるまたはそれを添加する代わりに、特定の培地構成成分を培養物にスパイクする。
【００８３】
２Ｄマトリクス依存性培養では、２日目までに、コロニーの形態が散在する伸長した細胞集塊に変化する（図１５）。５〜６日目までに、造血性内皮細胞のコンフルエントな接着層が観察され、付着細胞層内にいくつかの三次元構造が伴う（図１５）。マトリクス非依存性３Ｄ培養では、フェーズＩが進行するにつれ、スフェロイドがより大きく、より濃く、かつより不均一に成長する（図３３Ａ）。フェーズＩ分化の開始からおよそ６日後に、造血性内皮への分化が完了する。一部の実施形態では、造血性内皮細胞のコンフルエントな接着層が観察され、付着細胞層内にいくつかの三次元構造が伴えば、分化が完了したとみなすことができる（図４）。上首尾のフェーズＩ分化を確認するために、細胞の一部を、タンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、またはこれらの組合せ、例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号０７９２０）、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ番号１２５６３０２９）など、または当技術分野で公知の同様の試薬を使用して単一の細胞として回収し、その後、造血性内皮特異的マーカーであるＣＤ３１およびＣＤ３４についてフローサイトメトリー分析を行うことができる。一部の実施形態では、造血性内皮細胞は、ＣＤ３０９およびＣＤ１４４またはＣＤ３０９、ＣＤ１４４、ＣＤ１４０ａおよびＣＤ２３５ａも発現することができる。一部の実施形態では、フェーズＩを撹拌槽バイオリアクターにおいて行って、自己凝集性スフェロイドを形成することができる。
【００８４】
フェーズＩＩ．造血性内皮細胞からの剥離された巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）の生成
一部の実施形態では、４日間から８日間の間のフェーズＩ後に、巨核球前駆細胞（フェーズＩＩ）分化を開始することができる。簡単に述べると、フェーズＩ培地を取り出し、等体積のフェーズＩＩ培地、例えば、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬ（商標）２基本培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号０５２７５）などに置き換える。そのようなフェーズＩＩ培地に、それぞれ１ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌの、幹細胞因子（ＳＣＦ）（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、およびヘパリン（例えば、５単位／ｍｌ）のうちの１つまたは複数を補充することができる。一部の実施形態では、フェーズＩＩ培地に、ＵＭ１７１、ＵＭ７２９、ＳＲ−１、ＳＵ６６５６、またはこれらの任意の組合せをさらに補充することができる。
【００８５】
次いで、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で少なくとも７日間、および１２日間まで、またはそれよりも多くの日数にわたってインキュベートする。例えば、細胞を、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間インキュベートすることができる。一部の実施形態では、毎日の部分的な培地交換を、消費された培地の１０〜９５％を取り出し、等体積の新鮮なフェーズＩＩ培地に置き換えることで実施することができる。一部の実施形態では、追加的な体積の新鮮な培地を添加することができ、培養物の総体積が増大するという正味の影響が伴う。一部の実施形態では、新鮮なフェーズＩ培地に置換えるまたはそれを添加する代わりに、特定の培地構成成分を培養物にスパイクすることができる。
【００８６】
フェーズＩＩの開始後２〜３日以内に、接着性造血性内皮細胞内に小さな円形の屈折性の細胞が出現し、最終的に上清中に放出される（図１７Ａ）。これらの放出された細胞は、ＣＤ４３およびＣＤ４１の細胞表面発現ならびにＣＤ１４の発現の欠如によって定義されるｐｒｅＭＫを含み得る。２Ｄ培養では、付着細胞層の上部に出現する浮遊し、弱く付着しているフェーズＩＩ細胞を、毎日、穏やかにすすぎ、培地をコニカルチューブに採取することによって回収することができる。培地半分の取換えを、元の体積の半分の新鮮なフェーズＩＩ培地をすすいだ付着細胞層の上部に添加することによって開始することができる。培地中に収集された細胞のアリコートを、生存細胞の数え上げおよびフローサイトメトリーによるバイオマーカー分析のために取り出すことができる。次いで、細胞の残りを２００×ｇで５分間遠心分離することができる。遠心分離後、元の体積の半分の上清を付着細胞層に添加し戻すことによって培地の取換えを完了することができる。マトリクス非依存性３Ｄ培養では、放出された細胞を、撹拌を休止して、スフェロイドを容器の底部に静置させ、次いで、培地の最大９０％を懸濁細胞と一緒に、遠心分離用の管（例えば、コニカルチューブ）に収集することによって回収することができる。次いで、元の体積の半分の新鮮な培地を容器に添加し、遠心分離された細胞の上清からの馴化培地をつぎ足すことができる。一部の実施形態では、追加的な体積の新鮮な培地を添加することができ、培養物の総体積が増大するという正味の影響が伴う。一部の実施形態では、新鮮なフェーズＩＩ培地に置き換えるまたはそれを添加する代わりに、特定の培地構成成分を培養物にスパイクすることができる。上清の残りを廃棄し、ｐｒｅＭＫを含有する細胞ペレットを、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  １０凍結保存培地中、−１８０℃で保管することもでき、フェーズＩＩＩに直接移行することもできる。フェーズＩＩの間に収集された巨核球前駆細胞は、ＣＤ４３およびＣＤ４１を発現し、ＣＤ１４の発現を欠く、小さな円形の屈折性の細胞である。
【００８７】
フェーズＩＩＩ．巨核球前駆細胞からの成熟巨核球（ＭＫ）の生成
一部の実施形態では、成熟巨核球の分化を、上記の通り生成したＰＳＣ由来ｐｒｅＭＫを使用して開始することができる。新鮮なまたは解凍した巨核球前駆細胞を、例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）−ＡＣＦを含むフェーズＩＩＩにおける非接着性表面培地に播種することができる。非接着性表面とは、大多数の細胞がそのような表面に固着または粘着することが意図されておらず、その代わりに大部分が懸濁物中に留まるような表面を指す。例えば、そのような表面は、表面への細胞の接着を防止するまたは最小限にするために、「超低粘着性プラスチック」製であってもよく、細胞外マトリクスタンパク質でコーティングされていないものであってもよい。一部の実施形態では、フェーズＩＩＩ培地に、それぞれ０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの間の、ＴＰＯ（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−９（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、およびヘパリン（例えば、５単位／ｍｌ）のうちの１つまたは複数を補充することができる。一部の実施形態では、フェーズＩＩＩ培地にＵＭ１７１、ＵＭ７２９、ＳＲ−１、ＳＵ６６５６、またはこれらの任意の組合せも補充することができる。
【００８８】
次いで、細胞を、３７℃から４０℃の間（例えば、３９℃）、５％ＣＯ２から２０％ＣＯ２の間（例えば、７％〜１０％）、および５％Ｏ２から２０％Ｏ２の間で最大５日間インキュベートすることができる。一部の実施形態では、毎日の部分的な培地交換を、消費された培地の１０〜９５％を取り出し、等体積の新鮮なフェーズＩＩＩ培地に置き換えることで実施する。一部の実施形態では、非接着性表面は、６ウェル超低接着性プレートである。一部の実施形態では、非接着性表面は、気体透過性膜（例えば、Ｇ−Ｒｅｘ（登録商標）など）である。一部の実施形態では、非接着性表面は、穏やかな撹拌を伴う細胞培養バッグまたは容器である。
【００８９】
一部の実施形態では、フェーズＩＩＩの間に、数日以内に巨核球前駆細胞を成熟ＭＫに分化させることができる。一部の実施形態では、最初に均一に小さな円形であり、屈折性の細胞（図２１）は、２〜４日目までにサイズおよび倍数性が増大し始める（図２０）。同時に、血小板前駆体を産生するＭＫを容易に観察することができる（図２０）。フェーズＩＩＩの３〜４日目までに、成熟ＭＫマーカーであるＣＤ４２ａおよびＣＤ４２ｂを同時発現するＣＤ６１＋（巨核球系列）細胞の割合が劇的に増大し、出発ｈｉＳＰＣ細胞株に応じて、８０〜９０％という高さのレベルに達し得る（図２１）。フェーズＩＩＩの４〜５日目までに、成熟ＭＫによって血小板が培養培地中に放出される。これらの血小板を収集し、定量化し、フローサイトメトリーおよび電子顕微鏡によって評価し、それにより、それらの真正な血小板としての正体を確認することができる（図４５）。
【００９０】
３Ｄ系
充填層バイオリアクター
一部の実施形態では、ｐｒｅＭＫ、巨核球、血小板、または巨核球および血小板のうちの１つまたは複数の産生のために３Ｄスケーラブル充填層バイオリアクターを使用することができる。一部の実施形態では、フェーズＩおよびフェーズＩＩ培養のために充填層バイオリアクターを使用することができる。例えば、ＰＳＣを造血性内皮細胞に分化させ、その後、ｐｒｅＭＫを産生させるために充填層リアクターを使用することができる。充填層リアクターキャリアは、マイクロサイズまたはマクロサイズのいずれであってもよく、生体適合性プラスチック、金属、ガラス、またはアルギネートなどの天然材料から形成されたものであってよい。一部の実施形態では、キャリアは、ＰＴＦＥから形成された、ラシヒリング、例えば、１ｍｍのラシヒリングの形状である。一部の実施形態では、キャリアを上記のマトリクスでコーティングすることができる。一部の実施形態では、キャリアを、ラミニン、例えば、組換えヒトタンパク質ラミニン５２１などでコーティングすることができる。一部の実施形態では、多能性細胞を凝集塊としてキャリアに播種することができる。一部の実施形態では、毎日の培地交換で、培地を取り出し、フェーズＩ培地に置き換えることができる。一部の実施形態では、フェーズＩの間、多能性細胞は、充填層リアクター内のキャリアの内側に成長領域を示し得る。一部の実施形態では、多能性細胞から造血性内皮への最初の分化（すなわち、定方向分化のフェーズＩ）、ならびにさらなる分化およびｐｒｅＭＫの放出（すなわち、定方向分化のフェーズＩＩ）を同じ容器内で行うことができる。例えば、充填層バイオリアクターは、多能性細胞、例えば、ＰＢＧ−１  ｉＰＳＣが播種された、ラミニン−５２１がコーティングされたマクロキャリアを含み得る。次いで、充填層を培地の連続流に暴露させて、造血性内皮へのフェーズＩ分化を可能にすることができる。充填層に浸透させた後、培地を、新鮮な培地構成成分を添加することができ、スパージングまたは他の手段によって酸素／ＣＯ２濃度を調整することができる馴化チャンバーを循環させた後に、培地を細胞に再循環させることができる。
【００９１】
フェーズＩの完了時に、培地を切り換えてフェーズＩＩ分化ならびにｐｒｅＭＫの産生および放出を可能にすることができる。１ｍｍのラシヒリングなどの、適切なサイズおよび形状にしたキャリアにより、収集および凍結貯蔵のために、放出された細胞が充填層を通ってリアクターの外まで浸透することを可能にするために十分な培地の流動およびチャネル幅を可能にすることができる。一部の実施形態では、この設計により、細胞が受けるせん断力を減少させることができ、灌流に基づく設計に起因して効率的な培地使用が可能になり得、また、ｐｒｅＭＫが放出されるにしたがってそれらを連続的に収集することが可能になる。
【００９２】
撹拌槽バイオリアクターにおける自己凝集性スフェロイド
一部の実施形態では、スケーラブル３Ｄ解決策を使用し、撹拌または振とうされた容器内に懸濁させた自己凝集性スフェロイドを使用して分化を実施することを伴い得るある特定のプロセスのステップを行うことができる（図３２）。一部の実施形態では、そのような容器は、低接着性表面または非接着性表面、すなわち、表面への特異的および非特異的な細胞固定化を阻害し、それにより細胞を懸濁状態に強制するために親水性または中性に荷電したコーティングでコーティングされた表面を含み得る。多能性細胞を単一の細胞に解離させ、多能性維持培地中に再懸濁させることができる。一部の実施形態では、維持培地に、Ｈ１１５２または他のＲＯＣＫ阻害剤などのＲｏｃｋ阻害剤を補充することができる。次いで、多能性細胞を低接着性または非接着性容器内でインキュベートし、標準の培養条件下（例えば、３７Ｃ、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２）で撹拌に供することができる。一部の実施形態では、撹拌をもたらすために、インキュベーション容器を、オービタルシェーカーに置くことができる、または、一定の撹拌を伴う振とうフラスコもしくはスピナーフラスコ、もしくは制御された撹拌槽バイオリアクターを使用することができる。２４時間以内に、多能性細胞が自己凝集して、直径およそ５０〜１５０ｕｍのスフェロイドが形成し得る。撹拌を休止すると、スフェロイドが容器の底部に静置し得る。
【００９３】
次いで、造血性内皮への分化を促進するために培地をフェーズＩ分化培地と交換することができ、低酸素条件下（例えば、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２）でのインキュベーションと共に撹拌を再開することができる。スフェロイドがより大きく成長し、特徴的な構造および形状が発生し得る期間中、培地交換を定期的に（例えば、毎日）実施することができる。例えば、図３３Ａに示されている通り、スフェロイドを合計で６日間（３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２で４日間、その後、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で２日間）培養することができる。図３３Ａに示されている通り、６日目に、スフェロイドは、より大きく、より濃く、不規則な表面を有する。
【００９４】
フェーズＩＩに移行するために、撹拌を休止することができ、スフェロイドを容器の底部に静置させることができる。次いで、懸濁細胞の分化および放出を促進するために、培地をフェーズＩＩ分化培地と交換することができる。その後、定期的に（例えば、毎日）、懸濁細胞を収集することができ、部分的な培地交換を実施することができる。培地を収集し、遠心分離することができる。作業体積のおよそ半分の新鮮なフェーズＩＩ分化培地を、十分な体積の馴化培地（すなわち、遠心分離後の上清）と一緒にスフェロイドに添加して、元の作業体積に戻すことができる。細胞ペレットを凍結保存することもでき、成熟ＭＫへの成熟化のためにフェーズＩＩＩに移行することもできる。
【００９５】
静的なフェーズＩＩＩ培養に移行したら、３Ｄ自己凝集性スフェロイド培養からのｐｒｅＭＫにより、２Ｄ培養系からのｐｒｅＭＫと同様のＭＫ純度が生じ得る。さらに、３Ｄ自己凝集性スフェロイド培養から生成されたフェーズＩＩＩ分化培養物は、サイズが劇的に増大し、また、血小板前駆体を生成することができる細胞を含み得、真正な巨核球としてのそれらの正体と一致する。
【００９６】
フェーズＩＩＩのためのスケーラブルな系への移行
一部の実施形態では、上記の通り、新鮮なまたは解凍した巨核球ｐｒｅＭＫをフェーズＩＩＩ培地における低接着性または非接着性表面に播種することができる。一部の実施形態では、そのような非接着性表面は、気体透過性膜（Ｇ−Ｒｅｘ（登録商標）など）であってよい。一部の実施形態では、低接着性または非接着性表面は、穏やかな撹拌を伴う細胞培養バッグまたは容器である。いずれの場合も、ｐｒｅＭＫ（フェーズＩＩ培養物から新鮮に回収したもの、または凍結保存ストックから解凍したもののいずれか）をフェーズＩＩＩ培地に１ｍｌ当たり５０万〜１０００万個の密度で懸濁させ、容器に導入する。例えば、ｐｒｅＭＫは、１ｍｌ当たり１００万〜１５０万個、１ｍｌ当たり１００万〜２００万個、１ｍｌ当たり１００万〜３００万個、１ｍｌ当たり１００万〜４００万個、１ｍｌ当たり２００万〜５００万個、１ｍｌ当たり２００万〜６００万個、１ｍｌ当たり３００万〜７００万個、１ｍｌ当たり３００万〜８００万個、１ｍｌ当たり５００万〜９００万個、または１ｍｌ当たり８００万〜１０００万個の密度であってよい。細胞を、合計１〜５日間（例えば、３日間）培養して、成熟ＭＫへの分化を可能にする。一部の実施形態では、消費された培地の１０〜９５％を取り出し、等体積の新鮮なフェーズＩＩＩ培地に置き換えることで、毎日の培地半分の交換を実施する。フェーズＩＩＩ培養の最後に、得られた細胞はサイズおよび倍数性が増大しており、成熟巨核球を示す多くの特色を示す（例として、図３４〜４２に示されており、また、以下に記載されている）。
【００９７】
巨核球およびその産物
一部の実施形態では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＰＳＣ細胞または細胞株から引き出された巨核球前駆細胞、巨核球、プレ血小板、血小板前駆体または血小板を提供する。本開示の態様によると、ＰＳＣ細胞または細胞株から引き出された巨核球前駆細胞、巨核球、プレ血小板、血小板前駆体または血小板は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７６３，９８４号の方法または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２１３５４号に開示されているバイオリアクターを使用して産生される。
【００９８】
一部の実施形態では、本開示は、巨核球または巨核球前駆細胞を含む単離された細胞の集団を提供する。
【００９９】
一部の実施形態では、本開示は、巨核球または巨核球前駆細胞を含有する組成物を提供する。本開示の一部の実施形態では、巨核球、巨核球前駆細胞またはそれらの産物を含む組成物が開示される。
【０１００】
本開示の一部の実施形態によると、巨核球、巨核球前駆細胞またはそれらの産物は、形状、サイズおよび／または表現型が均質である。本開示の巨核球、巨核球前駆細胞またはそれらの産物は、バイオマーカーの発現、サイズ、倍数性、数および純度に、対応するヒト細胞における変動性とは特徴的に異なる変動性を含み得ることが理解されるべきである。一部の実施形態では、そのような変動性を有意に低下させることができる。一部の実施形態では、細胞集団を、天然に存在する細胞の変動性よりも低いまたは高い所望の変動性を有するように創出することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、巨核球前駆細胞（ｐｒｅＭＫ）は、マーカーであるＣＤ４３およびＣＤ４１の発現、およびＣＤ１４の欠如（すなわち、ＣＤ１４−、ＣＤ４１＋、ＣＤ４３＋）を特徴とする。ＣＤ４２ｂの追加的な発現により、巨核球前駆細胞が成熟巨核球への最終的な成熟化の過程にあることが示され得る。ある特定の実施形態では、分化培養下で生成した巨核球前駆細胞は非接着性であり、培養培地中を自由に浮遊し得る。
【０１０２】
一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ６１＋、ＧＰＶＩ＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ４１＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋のうちのうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ４２ａ＋、ＣＤ４１＋、およびＤＮＡ＋のうちのうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、巨核球は、ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＣＤ４２ｂ＋ＧＰＶＩ＋である。一部の実施形態では、巨核球は、ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＧＰＶＩ＋である。
【０１０３】
一部の実施形態では、本巨核球は、ＣＤ６１＋およびＤＮＡ＋であり、直径が約１０〜５０μｍである。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される巨核球の平均サイズは、１０μｍから２０μｍの間、１１μｍから１９μｍの間、１２μｍから１８μｍの間、１３μｍから１７μｍの間、１４μｍから１６μｍの間、１４μｍから１５μｍの間である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される巨核球の平均サイズは、１４．５μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約１０〜２０μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約１０〜３０μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約１０〜４０μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約１０〜５０μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約２０〜４０μｍである。一部の実施形態では、本巨核球の直径は、約２５〜４０μｍである。
【０１０４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される本巨核球の倍数性は、２Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、本巨核球の倍数性は、少なくとも４Ｎ、８Ｎ、または１６Ｎである。一部の実施形態では、本巨核球の倍数性は４Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される本巨核球は、フェーズＩＩＩ培養の７２時間時点でＣＤ６１＋細胞が１６％＋／−１１．４％であり、４Ｎ  ＤＮＡよりも高次である。
【０１０５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される巨核球集団の少なくとも５０％がＣＤ６１＋およびＤＮＡ＋であり、倍数性は２Ｎ〜１６Ｎである。例えば、代表的なＰＢＧ１分化培養からの巨核球（すなわち、ベータ−１−チューブリン陽性フェーズＩＩＩ細胞）はサイズが約９μｍから約２７μｍまでにわたり、中央値は１５μｍである。この平均サイズは、種々の骨髄供給源に由来する「正常な」巨核球と同様に匹敵する（図４１）。
【０１０６】
一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９８％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。
【０１０７】
一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９８％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。
【０１０８】
一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも５５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも６０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも７５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも８５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９０％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９５％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、少なくとも９８％のＣＤ４２ｂ＋ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ＋細胞を含有する。
【０１０９】
一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、倍数性が４Ｎまたはそれよりも大きい巨核球を少なくとも５０％含有する。一部の実施形態では、少なくとも５０％の巨核球の倍数性が４Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、少なくとも６０％の巨核球の倍数性が４Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、少なくとも７０％の巨核球の倍数性が４Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、少なくとも８０％の巨核球の倍数性が４Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、少なくとも９０％の巨核球の倍数性が４Ｎ〜１６Ｎである。一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、平均倍数性が４Ｎである巨核球を含有する。
【０１１０】
一部の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、本開示の巨核球から生成された血小板前駆体、プレ血小板または血小板を含有する。一部の実施形態では、血小板前駆体、プレ血小板または血小板は、ＣＤ４２ｂ＋ＣＤ６１＋ＤＮＡ−細胞である。一部の実施形態では、巨核球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｈｉＰＳＣ細胞または細胞株の分化によって産生される。
【０１１１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される巨核球は、以下の１つまたは複数を含む：（ａ）免疫蛍光顕微鏡によるＭＫ顆粒の含有量：アルファ顆粒についてはＰＦ４およびＶＦＷ、高密度顆粒についてはＬＡＭＰ−１およびセロトニン；（ｂ）遺伝子発現データ：Ｏｃｔ４−、Ｎａｎｏｇ−、Ｓｏｘ２−、Ｚｆｐ４２−、Ｚｆｐｍ１＋、Ｎｆｅ２＋、Ｒｕｎｘ１＋、Ｍｅｉｓ１＋、Ｇａｔａ１＋；（ｃ）低フィブリノーゲン、セロトニン、およびＬＤＬを有する／フィブリノーゲン、セロトニン、およびＬＤＬを有さない、ならびに（ｄ）血漿と一緒にインキュベートすると、フィブリノーゲン、セロトニン、およびＬＤＬを取り込むことができる。
【０１１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される巨核球は、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、および関連因子の特徴的な発現プロファイルを有する（図４４）。一部の実施形態では、本開示は、血小板由来増殖因子アイソフォームＰＤＧＦ−ＡＡまたはＰＤＧＦ−ＢＢ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、造血成長因子であるＦｌｔ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−８、もしくはＩＬ−１６）、ＣＸＣケモカインファミリーメンバーであるＣＸＣＬ１（ＧＲＯアルファ）もしくはＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるｓＣＤ４０ＬもしくはＴＲＡＩＬ、またはＣＣケモカインファミリーメンバーであるＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＣＬ２１（６ＣＫｉｎｅ）もしくはＣＣＬ２４（エオタキシン−２）などの因子を含み得る本巨核球を含む組成物または医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本巨核球の溶解物を含む組成物または医薬組成物を提供する。そのような溶解物は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、ｐｒｅＭＫまたはＭＫの膜を、その完全性を損なうウイルス、酵素的、または浸透圧機構によって破壊することによって調製することができる。溶解物は、一部の実施形態では、特定の適用の必要性に応じて、追加的な作用物質を含み得る、または異なる組成物（液体、ペーストなど）として調製することができる。一部の実施形態では、そのような組成物は、血小板由来増殖因子アイソフォームＰＤＧＦ−ＡＡまたはＰＤＧＦ−ＢＢ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、造血成長因子であるＦｌｔ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−８、またはＩＬ−１６）、ＣＸＣケモカインファミリーメンバーであるＣＸＣＬ１（ＧＲＯアルファ）もしくはＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるｓＣＤ４０ＬもしくはＴＲＡＩＬ、またはＣＣケモカインファミリーメンバーであるＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＣＬ２１（６ＣＫｉｎｅ）もしくはＣＣＬ２４（エオタキシン−２）などの因子を含み得る。
【０１１３】
使用方法
一部の実施形態では、本ｐｒｅＭＫおよびＭＫならびにそれらの構成成分は、ヒト増殖因子などの増殖因子の供給源になり得る。一部の実施形態では、そのような増殖因子を、細胞培養物、組織再生、創傷治癒、骨再生、機能性化粧品、および止血用絆創膏のために使用することができる。一部の実施形態では、本巨核球またはそれらの溶解物またはその組成物を細胞培養に使用することができる。一部の実施形態では、本巨核球またはそれらの溶解物またはその組成物を機能性化粧品として使用することができる。一部の実施形態では、本巨核球またはそれらの溶解物またはその組成物を治療剤として使用することができる。例えば、本巨核球またはそれらの溶解物またはその組成物を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞の増大を増加させるため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける骨髄再生を改善するため、組織再生および血管新生を増大させるため、ならびに放射線試験における動物の生存率を上昇させるために使用することができる。
【０１１４】
一部の実施形態では、本ｐｒｅＭＫおよびＭＫを、現在の輸血必要性（例えば、外科手術、化学療法、妊娠／出産、外傷）を支持するための血小板を生成するために使用することができる。国防および安全保障構想は、米国内では優先権が高く、放射線対策として、ＭＫおよび得られる産物の大きな潜在的市場である。核事故または攻撃後に生じるものなどの放射線曝露により、血小板産生が阻害される。大きな放射線事象により、緊急事態による外傷を処置するための既存の地域の在庫を枯渇させる血小板の即時需要が誘発されることになり、その後、曝露後６＋日間の生存者における血小板の持続的需要が続く。我々の軍備ギャップは、最前線から、影響を受けた集団が血小板減少性になる事後２４〜４８時間までシフトするので、血小板の国家戦略的備蓄は非常に重要になる。米国は、戦略的な国家備蓄として血小板の在庫を維持しておらず、また、血小板数をすぐに増加させる治療薬は認可されていない。一部の実施形態によると、ｐｒｅ−ＭＫおよびＭｋを、要望に応じた血小板産生のために使用することができる。ｐｒｅ−ＭＫを長期間にわたってバンキングでき、要望に応じたｈｉＰＳＣ−血小板産生能を開発できることにより、ｈｉＰＳＣ−血小板の戦略的な国家備蓄を確立することが可能になり、これはこの予測される必要性に応えるために極めて重大になる。
【０１１５】
自己多血小板血漿（ＰＲＰ）補充培地は、微小血管内皮細胞を育てて、移植のために灌流された器官内の血管完全性の保存を改善することが示されている。血小板は、巨核球から獲得する生物活性因子を分泌顆粒中に貯蔵する。内容物としては、血小板由来増殖因子アイソフォーム（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢおよび−ＢＢ）、形質転換増殖因子−ｂ（ＴＧＦ−ｂ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）および骨形成タンパク質２、骨形成タンパク質４および骨形成タンパク質６（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６）などの種々のケモカインおよび増殖因子が挙げられる。ヒト血小板溶解物により、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞の増大が劇的に増加し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける骨髄再生が改善され、放射線試験における動物の生存率が上昇する。一部の実施形態では、本開示は、本巨核球から生成された血小板前駆体、プレ血小板または血小板の溶解物を含む組成物または医薬組成物を提供し、そのような組成物は、血小板由来増殖因子アイソフォームＰＤＧＦ−ＡＡまたはＰＤＧＦ−ＢＢ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、造血成長因子であるＦｌｔ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−８、もしくはＩＬ−１６）、ＣＸＣケモカインファミリーメンバーであるＣＸＣＬ１（ＧＲＯアルファ）もしくはＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるｓＣＤ４０ＬもしくはＴＲＡＩＬ、またはＣＣケモカインファミリーメンバーであるＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＣＬ２１（６ＣＫｉｎｅ）もしくはＣＣＬ２４（エオタキシン−２）などの因子を含み得る。
【０１１６】
キット
本開示は、本開示の巨核球または分化細胞を含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、単離された巨核球を含む組成物を含む。特定の実施形態では、本開示は、本開示の巨核球またはその前駆体を分化させる、培養する、かつ／または単離するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、血小板を産生するためのキットを提供する。
【０１１７】
一部の実施形態では、キットは、細胞組成物を含有する滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、ビン、バイアル、管、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野で公知の他の適切な容器形態であってよい。そのような容器は、プラスチック、ガラス、積層紙、金属箔、または医薬の保持に適した他の材料製のものであってよい。
【０１１８】
所望であれば、キットは、巨核球を生成するための指示と共に提供される。指示は、一般に、巨核球またはその前駆体の分化、培養、および／または単離に必要な条件および因子に関する情報を含む。一部の実施形態では、血小板を産生させるための指示を含める。指示は、容器（存在する場合）に直接印刷されていてもよく、容器に貼られたラベルとして印刷されていてもよく、容器中にまたは容器と一緒に供給される別のシート、小冊子、カード、もしくはフォルダとして印刷されていてもよい。
【０１１９】
本開示の実施では、別段の指定のない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を使用し、これらは、当業者の能力の範囲内に十分に入る。そのような技法は、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  １９８９）；”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  （Ｇａｉｔ，  １９８４）；”Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  （Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  １９８７）；”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  ”Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （Ｗｅｉｒ，  １９９６）；”Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”  （Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，  １９８７）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  （Ａｕｓｕｂｅｌ，  １９８７）；”ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，  （Ｍｕｌｌｉｓ，  １９９４）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （Ｃｏｌｉｇａｎ，  １９９１）などの文献において十分に説明されている。これらの技法は、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本開示の作製および実施において検討することができる。特定の実施形態に特に有用な技法を以下の節において考察する。
【０１２０】
以下の実施例は、本開示のアッセイ、スクリーニング、および治療方法をどのように作製し、使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが自身の開示であると考える範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１２１】
（実施例１）
臨床グレードｈｉＰＳＣ細胞株からの巨核球前駆細胞、巨核球および血小板の産生の拡大
臨床グレードｈｉＰＳＣ細胞株を、巨核球に分化する潜在性について、図２の定方向分化プロトコールを使用して試験した。図２は、多能性幹細胞から巨核球への分化の時間経過を示す概略図であり、分化の各フェーズ（フェーズ０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）が示されている。フェーズ０〜ＩＩＩにおける細胞型および細胞マーカーが時系列の上に示されている。培地組成、マトリクス、温度および気体条件を含めた培養条件が時系列の下に示されている。
【０１２２】
異なるｉＰＳＣ株は機能的に別個のものであり、分化プロトコールを真に最適化するためには、プロセスに最適な臨床グレード細胞株を同定することが重要である。ＰＢＧ１、ＰＢＧ２、およびＰＢＧ３と称される３種の臨床グレードｈｉＰＳＣ細胞株を入手した。ＰＢＧ１は、ＮＩＮＤＳ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ）／ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のＮＩＮＤＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＨＣＤＲ）受託所から入手した。ＰＢＧ１（ＮＩＮＤＳ  ＩＤ：ＬｉＰＳＣ−Ｇｒ１．１）は、男性ＣＤ３４＋臍帯血から引き出されたものであった（Ｌｏｎｚａ）。ＰＢＧ２およびＰＢＧ３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｆ−ＣＤＩ）から入手した。ＰＢＧ２およびＰＢＧ−３は、それぞれ男性成体血液細胞および女性成体血液細胞から引き出されたものであった（Ｆ−ＣＤＩ  ＭｙＣｅｌｌｓ  ｉＰＳＣ  ＩＤ番号：２１５２５および２１５２６）。
【０１２３】
分化の開始前に、３種全てのｈｉＰＳＣ株が、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地を用いてビトロネクチンで成長させると特徴的なコロニーを形成し（図３Ａ）、多能性バイオマーカーであるＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの発現を示した（図３Ｂ、図１３Ａ）。図２に要約されている多フェーズプロトコールを使用して、３種の臨床グレードｈｉＰＳＣ細胞株を巨核球に分化するように方向付けた。細胞を定方向分化の間の様々な時点で観察した（図４Ａ〜４Ｄ）。造血性内皮のマーカーであるＣＤ３１＋の発現をモニタリングすることにより、フェーズＩの間の分化効率を最初に観察した（図５）。分化効率は、フェーズＩの間、３種のｈｉＰＳＣ細胞株について同様であった。理論に束縛されることなく、分化プロセスの間の後期に巨核球の出力／品質において見られた差異は、必ずしもフェーズＩにおける分化効率と相関するとは限らなかった。フェーズＩＩでは、ＣＤ４１＋ＣＤ４３＋細胞の産生をモニタリングすることにより、巨核球前駆細胞へのさらなる分化が観察された（図６Ａ）。著しいことに、臨床グレード細胞株の一部について、フェーズＩＩの間の巨核球前駆細胞の産生は、異なるｈｉＰＳＣ細胞株を使用した以前の方法と比較してより長く延長された（１７日間に至るまで）（図６Ｂ）。累積的な収量は、ＰＢＧ−１  ｉＰＳＣおよびＰＢＧ−２  ｉＰＳＣについて特に頑強であり、独立した分化間でいくらかの変動性が示された（図６Ｃ）。細胞を定方向分化プロトコールのフェーズＩＩＩに移行すると、ＣＤ４２ｂ＋の発現が１日目〜５日目にわたって増大し、４日目〜５日目には、ＣＤ４２ｂ＋を発現するＣＤ４１＋細胞のパーセンテージが少なくとも約８０％であった（図７Ａ）。３種の臨床グレードｉＰＳＣ株から得られたフェーズＩＩＩ細胞を光学顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡、および電子顕微鏡によって分析し、それにより、ＰＢＧ１およびＰＢＧ２が、サイズ、形態、血小板前駆体伸長、巨核球特異的タンパク質発現、および超微細構造を含め、成熟巨核球の特徴と一致する特徴を示すことが明らかになった（図７Ｂ〜７Ｃ、図８Ａ〜８Ｅ）。
【０１２４】
（実施例２）
多能性ＰＢＧ−１細胞の大規模増大
高密度シードバンクに必要な多数の細胞を産生させるため、ならびに臨床産生のために妥当な規模で分化を開始させるために十分な細胞数を生成するために、分化の前に多能性ＰＢＧ−１を増大させることが必要である。ＰＢＧ−１は、組換えビトロネクチン（ＶＴＮ）と、それに加えて、動物構成成分を含まない（ＡＣＦ）ｃＧＭＰ適合試薬、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ、またはＳｔｅｍＦｌｅｘなどを使用して２Ｄ培養下で維持し、増大させることができる。３種の成長条件の全てで多能性マーカーの特徴的なコロニー成長および維持が観察された（図９Ａ〜９Ｃ、図１０Ａ〜１０Ｃ）。大規模増大を可能にするために、ＰＢＧ−１細胞を、ＴｒｙｐＬＥを使用して２Ｄ培養物から単一の細胞として回収し、撹拌３Ｄ容器内、この場合は３００ｍｌのＤａｓＢＯＸ  ｍｉｎｉバイオリアクター系で自己凝集させた。最初の２４時間にわたって、Ｙ２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤を細胞に添加して、撹拌槽における６〜７日間にわたる最初の凝集の間の細胞生存を促進し、得られたスフェロイドは、その期間内で、直径が５０ミクロンから２５０ミクロンまで増大し、全体的な細胞密度が４０倍に至るまで増大した（図１１Ａ〜１１Ｃ）。このように成長させたＰＢＧ−１細胞は、繰り返し継代することでき、少なくとも４回の連続した増大のラウンドにわたって多能性を維持することができ（図１２Ａ〜１２Ｂ、図１３Ｂ）、かつ、正常な核型を維持することができた（図１４）。
【０１２５】
（実施例３）
２Ｄ培養容器内でＩＶ型コラーゲンマトリクスを使用したｐｒｅＭＫおよびＭＫへのＰＢＧ−１定方向分化の詳細な特徴付け
ＰＢＧ−１細胞は、０．５ｍＭのＥＤＴＡを用いて回収し、小さな凝集塊として４．２ｕｇ／ｃｍ２のヒトＩＶ型コラーゲンにプレーティングすると、６日間のフェーズＩ分化の過程中、特徴的な一連の形態学的変化を示す（図１５）。フェーズＩの最後に、代表的なウェルを、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して単一の細胞として回収し、フローサイトメトリーによって造血性内皮マーカーであるＣＤ３１およびＣＤ３４について評価する（図１６Ａ）。複数の独立したＰＢＧ−１分化（ｎ＝４１）にわたって、６日目の分化効率の平均はおよそ４０％のＣＤ３１＋（範囲：約２０〜６０％）およびおよそ３０％のＣＤ３１＋ＣＤ３４＋（範囲、約１５％〜４５％）であることが決定された（図１６Ｂ）。
【０１２６】
フェーズＩＩの開始後２〜３日以内に（すなわち、６＋２日目〜６＋３日目）、接着性造血性内皮細胞内に小さな円形の屈折性の細胞が出現し、最終的に、接着性造血性内皮単層の上の上清中に放出される（図１７Ａ）。これらの放出された細胞は、ＣＤ４３およびＣＤ４１の細胞表面発現、ならびにＣＤ１４の発現の欠如によって定義されるｐｒｅＭＫを含有する（図１７Ｂ、図１７Ｃ）。これらの付着細胞層の上部に出現する浮遊し弱く付着しているフェーズＩＩ細胞を、穏やかにすすぎ、培地をコニカルチューブに採取することによって毎日回収し、ＣＤ４３、ＣＤ４１、およびＣＤ１４の発現について毎日分析する。放出された細胞の純度は、フェーズＩＩの最初の数日は低く、その後プラトーになり、６＋６日目までの平均ピークｐｒｅＭＫ純度は５０〜６０％であった（図１８Ａ）。ＣＤ１４＋骨髄細胞はフェーズＩＩの最初の６〜７日間はＰＢＧ−１定方向分化培養の主要な夾雑物ではなかったが、その後、いくらかの変動性があった（図１８Ｂ）。ｐｒｅＭＫ産生の動態は平均して６＋６日目および６＋７日目にピークに達し、その後低下した（図１９Ａ）。複数の独立したＰＢＧ−１分化（ｎ＝４１）にわたって、累積的なｐｒｅＭＫ（ＣＤ４３＋ＣＤ４１＋ＣＤ１４−）収量の平均は、およそウェル当たり１００万個（範囲：１０万〜３３０万個）であることが決定された（図１９Ｂ）。
【０１２７】
これらの培養物からのｐｒｅＭＫをフェーズＩＩＩ条件に移すと、これらのｐｒｅＭＫは、数日以内に成熟ＭＫに分化する。最初に均一に小さな円形であり、屈折性の細胞（図２０Ａ）は２〜４日目までにサイズが増大し始める（図２０Ｂおよび図２０Ｃ）。同時に、血小板前駆体を産生するＭＫを容易に観察することができる（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）。フェーズＩＩＩの３〜４日目までに、成熟ＭＫマーカーであるＣＤ４２ａおよびＣＤ４２ｂを同時発現するＣＤ６１＋（巨核球系列）細胞の割合をＦＡＣＳによって決定し（図２１Ａおよび図２１Ｂ）、成熟ＭＫの純度（ＣＤ６１＋ＣＤ４２ａ＋ＣＤ４２ｂ＋細胞）は、培養物中の全ての有核細胞の７０〜９０％までの高さのレベルに達し得る（図２１Ｃ）。
【０１２８】
（実施例４）
ＰＢＧ−１からＭＫへの定方向分化を支持するために、ＩＶ型コラーゲンを組換えラミニン５２１に置き換えることができる。
ＩＶ型コラーゲンは、ヒト胎盤材料から精製され、研究用（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｕｓｅ  Ｏｎｌｙ）試薬としてのみ入手可能である。したがって、ＩＶ型コラーゲンは、ＰＢＧ−１由来巨核球のｃＧＭＰ生産には適合せず、これらの細胞を臨床使用のために用いることができるようにする前に代替戦略を開発しなければならない。１つの潜在的な解法は、ＩＶ型コラーゲンを組換え供給源から産生される組換えマトリクス構成成分に置き換えることである。ここで、組換えラミニン−５２１をＩＶ型コラーゲンの適切な代替としてｉＰＳＣからＭＫへの定方向分化のために利用できることが示されている。０．５ｍＭのＥＤＴＡを用いて回収することによって生成されたＰＢＧ−１凝集塊は、０．１３ｕｇ／ｃｍ２の組換えラミニン−５２１での６日間のフェーズＩ分化の過程中、４．２ｕｇ／ｃｍ２のヒトＩＶ型コラーゲンにおけるものと同じ特徴的な一連の形態学的変化を示した（図２２Ａ〜２２Ｂ）。フェーズＩＩに移行させると、ラミニン−５２１培養により、対応するＩＶ型コラーゲン培養と同様の収量および純度のｐｒｅＭＫが産生された（図２３Ａ〜２３Ｃ）。３日間の追加的な分化で、フェーズＩＩＩにおける細胞は、ＩＶ型コラーゲンで生成されたかラミニン−５２１で生成されたかにかかわらず、血小板前駆体の産生について同様のサイズ、形態、および傾向を示した（図２４Ａ〜２４Ｂ）。成熟ＭＫマーカーであるＣＤ４２ａおよびＣＤ４２ｂを同時発現するＣＤ６１＋（巨核球系列）細胞の割合も測定し、いずれのマトリクスで生成された細胞でも同様であることが見いだされた（図２５Ａ〜２５Ｂ）。
【０１２９】
（実施例５）
ＷＮＴモジュレーターは、フェーズＩおよびＩＩ分化効率に影響を及ぼし得る。
ＷＮＴシグナル伝達は、発生の間に重要なものである。ＧＳＫ３キナーゼ阻害剤であるＣＨＩＲ９８０１４およびＣＨＩＲ９９０２１は、ＷＮＴアゴニストとして作用する。本明細書に記載のフェーズＩ分化条件（ラミニン５２１マトリクスを使用する）を、分化の最初の４８時間だけ０．６ｕＭのＣＨＩＲ９８０１４または６ｕＭのＣＨＩＲ９９０２１を用いて強化した場合、ＣＤ３１およびＣＤ３４の免疫蛍光染色によって決定された通り、６日目にフェーズＩ分化効率の劇的な増大が観察された（図２６Ａ〜２６Ｃ）。次いで、対照およびＣＨＩＲ９８０１４培養をフェーズＩＩに移行し、そこで、ｐｒｅＭＫの産生および放出をＣＤ４１およびＣＤ４３の免疫蛍光染色によって追跡した。ＣＤ４１＋細胞の数の目測により、最初の４８時間にＷＮＴモジュレーターによって生み出されたより高いフェーズＩ効率が、フェーズＩＩの間の出力がより高いことに対応し得ることが示唆される（図２７Ａ〜２７Ｂ）。したがって、ＷＮＴモジュレーターを短期間添加することが、その後の分化フェーズ全体を通した分化効率に影響を及ぼし得る。
【０１３０】
（実施例６）
ラミニン５２１がコーティングされたマクロキャリアを用いた充填層バイオリアクター。
巨核球および血小板の臨床生産に必要な収量を可能にするためには、分化プロセス全体を小規模組織培養プラスチックウェア（２Ｄ、マトリクス依存性）から３Ｄスケーラブル解決策に移行することが極めて重要である。ここで、本発明者らは、１ｍｍのラシヒリングの形状の、ラミニン５２１がコーティングされたＰＴＦＥマクロキャリアにより、ＰＢＧ−１細胞の分化に対する支持をもたらすことができ、概略図（図２８）に例示されている通り、このマクロキャリア材料が充填層バイオリアクターでの使用に適するという証拠を提供する。ＰＴＦＥリングをまず１．２５ｕｇ／ｍｌのラミニン−５２１と一緒に揺動機において４℃で終夜インキュベートした。使用前に、ＰＴＦＥリングを６ウェルプレート中、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地およびＲＯＣＫ阻害剤Ｈ１１５２を用いて平衡化した。多能性ＰＢＧ−１  ｉＰＳＣを、０．５ｍＭのＥＤＴＡを使用して回収し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地およびＨ１１５２中に再懸濁させ、凝集塊としてＰＴＦＥリング上に播種した。１０分ごとに、プレートをオービタルシェーカーに７５ｒｐｍで３０秒かけた。１時間後、プレートを７５ｒｐｍで終夜、連続して振とうした。２４時間後、培地の９０％を取り出し、フェーズＩ培地に置き換え、毎日培地交換した。フェーズＩの間、ＰＢＧ−１細胞は、ラシヒリングの内側に成長領域を示し（図２９）、成長領域では２Ｄ培養において見られるものと同様の形態学的特徴が生じた（図２２）。これらの細胞のフローサイトメトリー分析により、高い割合の造血性内皮細胞が示され、細胞の約８０％がＣＤ３１を発現し、これらの細胞の半分よりも多くがＣＤ３４＋についてダブルポジティブであった（図３１Ａ）。フェーズＩＩ培地に切り換え、毎日の培地半分の交換を開始すると、概して平らなコロニーから３Ｄスフェロイド型構造に形態が変化したが、これらの構造はなおリング形状のマクロキャリアの内側のラミニン５２１コーティングに付着していたことに留意すべきである（図３０）。フェーズＩＩの間に放出された細胞は、６＋２日目の早さで高いｐｒｅＭＫ含有量を有し、細胞の約７５％がＣＤ４３とＣＤ４１を同時発現しており（図３１Ｂ）、純度は２Ｄマトリクス依存性培養に好都合に匹敵するものであった（図１８Ａ）。６＋３日目に放出された細胞を収集し、超低接着性プレート中、フェーズＩＩＩ培地でさらに３日間培養し、これらの細胞の約８０％がＣＤ６１とＣＤ４２ｂを同時発現し（図３１Ｃ）、これにより、効率的なＭＫ分化が起こったことが示される。そのようなマクロキャリアは、ｉＰＳＣから造血性内皮への最初の分化（すなわち、定方向分化のフェーズＩ）、ならびにさらなる分化およびｐｒｅＭＫの放出（すなわち、定方向分化のフェーズＩＩ）を同じ容器内で行うことができる充填層バイオリアクターの材料としての使用に適する（図２８）。この設計では、充填層バイオリアクターを、多能性ＰＢＧ−１  ｉＰＳＣを新鮮に播種した、ラミニン−５２１がコーティングされたマクロキャリアを用いて設定する。次いで、充填層を、培地の連続流に暴露させて、造血性内皮へのフェーズＩ分化を可能にする。充填層に浸透させた後、培地は馴化チャンバーを循環し、そこで、新鮮な培���構成成分を添加し、酸素／ＣＯ２濃度をスパージングまたは他の手段によって調整した後、培地を細胞に再循環させる。フェーズＩの完了時に、培地を切り換えてフェーズＩＩ分化ならびにｐｒｅＭＫの産生および放出を可能にする。１ｍｍのラシヒリングなどの、適切なサイズおよび形状にしたマクロキャリア支持体により、収集および凍結貯蔵のために、放出された細胞が充填層を通ってリアクターの外まで浸透することを可能にするために十分な培地の流動およびチャネル幅が可能になる。この設計では、細胞が受けるせん断力が低減し、その灌流に基づく設計に起因して効率的な培地使用が可能になり、また、ｐｒｅＭＫが放出されるにしたがってそれらを連続的に収集することが可能になる。
【０１３１】
（実施例７）
撹拌槽バイオリアクターにおける自己凝集性ｉＰＳＣ由来スフェロイド
スケーラブル３Ｄ解決策の別の例は、撹拌または振とう超低接着性容器内に懸濁させた自己凝集性スフェロイドを使用した分化の実行を伴う（図３２）。本実施例では、多能性ＰＢＧ−１  ｉＰＳＣを、ＴｒｙｐＬＥを使用して単一の細胞に解離させ、多能性維持培地（例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ、ＳｔｅｍＦｌｅｘ、他の同様の培地、またはこれらの組合せなど）およびＨ１１５２または他のＲＯＣＫ阻害剤中に１ｍｌ当たり細胞５０万〜１００万個で再懸濁させ、９０ｒｐｍのオービタルシェーカー、または一定の撹拌を伴うスピナーフラスコ（１２５ｍｌのスピナーフラスコ中５０ｍｌ体積に対して９０ｒｐｍ）において、６ウェル超低接着性プレート中、３７Ｃ、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２でインキュベートした。いずれかの系においても、２４時間以内に、ＰＢＧ−１細胞が自己凝集して、直径およそ５０〜１５０ｕｍのスフェロイドが形成された（図３３Ａ、異なる容器での同様の例に関して図１１Ａも参照されたい）。次いで、撹拌を停止し、スフェロイドを容器の底部に静置させた（およそ５分間）。次いで、培地の５０％〜１００％を、造血性内皮への分化を促進するためにフェーズＩ分化培地に交換し、低酸素条件下（３７Ｃ、５％ＣＯ２、５％Ｏ２）でのインキュベーションと共に撹拌を再開した。培地交換を毎日、合計で６日間、同様に実施し（３７Ｃ、５％ＣＯ２、５％Ｏ２で４日間、その後、３７Ｃ、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で２日間）、その期間中に、スフェロイドはより大きく成長し、６日目までに特徴的な構造および形状が生じた（図３３Ａ）。６日目のこれらのスフェロイドの試料を解離させ、フローサイトメトリーによって評価したところ、細胞の約４４％が造血性内皮マーカーであるＣＤ３１およびＣＤ３４を発現することが見いだされ（図３３Ｂ）、純度は２Ｄマトリクス依存性培養と好都合に匹敵した（図１６Ｂ）。フェーズＩＩに移行するために、撹拌を停止し、スフェロイドを容器の底部に静置させた（およそ５分間）。次いで、懸濁細胞の分化および放出を促進するために培地の５０〜１００％をフェーズＩＩ分化培地と交換した（図３４Ａ）。その後毎日、懸濁細胞を収集し、部分的な培地交換を実施した。これを行うために、撹拌を停止し、造血性内皮スフェロイドを容器の底部に静置させた（およそ５分間）。培地のおよそ８０％（懸濁細胞と一緒に）を収集し、遠心分離した。作業体積の半分の新鮮なフェーズＩＩ分化培地を、十分な体積の馴化培地（すなわち、遠心分離後の上清）と一緒にスフェロイドに添加して、元の作業体積に戻した。次いで、残りの上清を廃棄し、細胞ペレットの一部をＦＡＣＳ分析のために使用し（図３４Ｂ）、残りを凍結保存したかまたは成熟ＭＫへの成熟化のためにフェーズＩＩＩに移した。懸濁細胞のフローサイトメトリー分析により、６＋２日目から６＋６日目の間に放出された大多数の細胞がｐｒｅＭＫマーカーであるＣＤ４３およびＣＤ４１を同時発現することが明らかになった（図３４Ｂ、図３４Ｃ）。３Ｄ自己凝集性スフェロイド培養からの全体的なｐｒｅＭＫの純度および収量（図３４Ｃ、図３４Ｄ）は、２Ｄ培養からの純度および収量に好都合に匹敵した（図１８Ａ、図１９Ａ）。静的なフェ��ズＩＩＩ培養に移行したら、３Ｄ自己凝集性スフェロイド培養からのｐｒｅＭＫにより、２Ｄ培養系からのｐｒｅＭＫと同様のＭＫ純度が生じた（図３５Ａ〜３５Ｃ）。さらに、３Ｄ自己凝集性スフェロイド培養から生成されたフェーズＩＩＩ分化培養物は、サイズが劇的に増大した細胞を含有し、血小板前駆体を生成することができ（図３６）、これは、それらの真正な巨核球としての正体と一致した。
【０１３２】
（実施例８）
ＰＢＧ１  ｉＰＳＣ由来巨核球の詳細な特徴付け
本明細書に記載の方法を使用して生成される巨核球は、ＭＫ特異的タンパク質ベータ−１−チューブリン（図３７）、ならびにアルファ顆粒（ＰＦ４およびＶＷＦ、図３８Ａ〜３８Ｆ）および高密度顆粒（ＬＡＭＰ１およびセロトニン、図３９Ａ〜３９Ｆ）に関連するタンパク質について免疫蛍光顕微鏡により画像化した場合のものを含め、機能的な成熟ＭＫに関連する多くの特徴を示す。ＰＢＧ１由来ＭＫの電子顕微鏡画像から、多小胞体、グリコーゲン顆粒、および陥入膜系を含めた特徴的な超微細構造的特性が明らかになる（図４０Ａ〜４０Ｄ）。遺伝子発現解析により、ＯＣＴ４などの多能性遺伝子の下方制御（図４１Ａ）およびＮＦＥ２などの巨核球系列遺伝子の上方制御（図４１Ｂ）が明らかになった。同様の分析を関連性のある遺伝子のパネルに対して実施し、この解析の結果は、多能性幹細胞シグネチャーの喪失および巨核球シグネチャーの獲得と一致する（図４１Ｃ）。
【０１３３】
骨髄ＣＤ３４＋細胞、末梢血ＣＤ３４＋細胞、または臍帯血ＣＤ３４＋細胞に由来する初代巨核球（天然物）と比較すると、ＰＢＧ１  ｉＰＳＣ由来ＭＫであることが見いだされたＰＢＧ１由来ＭＫは、同様の平均サイズを有したが（図４２Ａ〜４２Ｃ）、それにもかかわらず、ＣＤ３４＋骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、または臍帯血幹細胞に由来する初代巨核球（天然物）（図４２Ｃ、図４３Ｂ）と比較して特徴的な低倍数性分布を有した（図４３Ａ〜４３Ｂ）。ＰＢＧ１  ｈｉＰＳＣ由来巨核球はまた、以前に巨核球において報告されていない多数の因子の存在を含めた、ヒト血小板に存在するものと同様の因子の特徴的な増殖因子、サイトカイン、およびケモカイン発現プロファイルも有した（図４４）。データを準備するために、１×ＰＢＳ中２５００万個／ｍＬのｈｉＰＳＣ−ＭＫを、細胞を−８０℃で終夜凍結させ、次いで、３７℃で解凍することによって溶解させた。この凍結／解凍サイクルを４回繰り返した。得られた懸濁物を、０．２２μｍのシリンジフィルターを使用して濾過した。溶解物を増殖因子、サイトカイン、およびケモカインの選択パネルについて多重化レーザービーズ技術（Ｅｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して試験した。データをバックグラウンド（ＰＢＳ、ｈｉＰＳＣ−ＭＫと同様に処理したもの）について補正し、次いで、市販のヒト血小板溶解物（ＨＰＬ）、新鮮なＭＫ分化培地（分化の最終段階で使用したもの）、および馴化培地、すなわち、ｈｉＰＳＣ−ＭＫから溶解前に取り出したＭＫ分化培地と比較した。ｈｉＰＳＣ−ＭＫとＨＰＬの間には強力な重複が観察されたが、以前に巨核球または血小板において記載されていないタンパク質もいくつかｈｉＰＳＣ−ＭＫにおいて測定された（「」で示されている）。
【０１３４】
本明細書に記載の結果から、臨床グレードヒトｉＰＳＣ由来巨核球を生成するための頑強なプロセスが実証される。ヒトｉＰＳＣ由来巨核球を、単離し、さらに特徴付けるため、またはヒト血小板の生成などの下流の適用において使用するために濃縮することができる（図４５Ａ〜４５Ｃ）。
【０１３５】
他の実施形態
本明細書に記載の通り、本開示は、巨核球前駆細胞および巨核球を産生するための組成物および方法を特色とする。一態様では、本開示は、臨床グレードｈｉＰＳＣ細胞または細胞株から分化させた巨核球または巨核球前駆細胞を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に描写されている任意の態様による巨核球または巨核球前駆細胞を含む単離された細胞の集団を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に描写されている任意の態様による巨核球または巨核球前駆細胞を含む組成物を提供する。
【０１３６】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に描写されている任意の態様による巨核球の溶解物を含む組成物または医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に描写されている任意の態様による巨核球から生成した血小板の溶解物を含む組成物または医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、巨核球を産生する方法であって、臨床グレードｈｉＰＳＣ細胞または細胞株を分化させることを含む方法を提供する。本明細書に描写されている任意の態様の種々の実施形態では、巨核球は、ＣＤ４２ｂ＋、ＣＤ６１＋、およびＤＮＡ＋のうちの１つまたは複数である。本明細書に描写されている任意の態様の種々の実施形態では、巨核球の直径は約１０〜３０μｍである。ある特定の実施形態では、巨核球の直径は約１０〜２０μｍである。本明細書に描写されている任意の態様の種々の実施形態では、巨核球の倍数性は少なくとも４Ｎ、８Ｎ、または１６Ｎである。本明細書に描写されている任意の態様の種々の実施形態では、巨核球前駆細胞は、ＣＤ１４−、ＣＤ４１＋、およびＣＤ４３＋である。本明細書に描写されている任意の態様の種々の実施形態では、巨核球前駆細胞を造血内皮前駆細胞からの分化の開始後少なくとも１０日目（すなわち、フェーズＩＩ、６＋１０日目）まで連続的に産生させることができる。本明細書に描写されている任意の態様の種々の実施形態では、巨核球前駆細胞を造血内皮前駆細胞からの分化の開始後少なくとも１７日目（すなわち、フェーズＩＩ、６＋１７日目）まで連続的に産生させることができる。本明細書に描写されている任意の態様の種々の実施形態では、臨床グレードｈｉＰＳＣ細胞または細胞株は、ＰＢＧ１、ＰＢＧ２、およびＰＢＧ３からなる群より選択される。
【０１３７】
本明細書に描写されている任意の態様の種々の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、本開示の巨核球から生成された血小板を含有する。本明細書に描写されている任意の態様の種々の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋細胞のうちＣＤ４２ｂ＋を少なくとも５０％含有する。本明細書に描写されている任意の態様の種々の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、倍数性が４Ｎまたはそれよりも大きい巨核球を少なくとも５０％含有する。ある特定の実施形態では、少なくとも５０％の巨核球の倍数性が４Ｎ〜１６Ｎである。本明細書に描写されている任意の態様の種々の実施形態では、単離された細胞の集団または組成物は、平均倍数性が４Ｎまたはそれよりも大きい巨核球を含有する。
【０１３８】
前述の説明から、本明細書に記載の本開示を種々の用法および条件に適合させるために、本明細書に記載の本開示に変形および改変をなすことができることが明らかになろう。そのような実施形態も以下の特許請求の範囲の範囲内に入る。
【０１３９】
本明細書における変数のいずれの定義における要素の一覧の列挙にも、その変数の定義が、列挙されている要素のあらゆる単一の要素または組合せ（または副組合せ）として含まれる。本明細書におけるある実施形態の列挙には、その実施形態が、あらゆる単一の実施形態または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せとして含まれる。
【０１４０】
本明細書において言及される特許および刊行物は全て、それぞれ独立した特許および刊行物が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図８Ｄ−Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ−Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ−Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ−Ｃ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ−Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ−Ｃ】
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【国際調査報告】
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