(57)【要約】  腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ）を識別する１つ以上の形態計測的分類器を開発する方法。該方法は、腫瘍サイズにかかわらず腫瘍にその発症の早期段階で応答性であるＴＭＢを特徴付ける非侵襲的な方法を提供する。該方法は、患者が有し得る癌の特定の特性を標的とする癌療法を可能にすることから、副作用がはるかに少ないより効果的な癌管理が可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ）を識別する１つ以上の形態計測的分類器を開発する方法であって、
形質導入された細胞から選択されたクローンを取得することと、
前記選択されたクローンをＭＬＨ１発現について分析して、親細胞系統と同等のレベルを有するクローンをスクリーニングすることと、
前記選択されたクローンを培養で増殖させることと、
前記選択されたクローンを採取することと、
前記採取されたクローンについてのＴＭＢレベルを求めることと、
前記選択されたクローンを３Ｄ顕微鏡法光トモグラフィーシステムで分析することと、
前記選択されたクローンをコントロール細胞系統のセットと比較することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記コントロール細胞系統のセットは、親ＮＣＩ−Ｈ２３及びスクランブルｓｈＲＮＡを発現するクローンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分析の実行により、各細胞について複数の形態計測的バイオシグネチャーが生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
同質遺伝子細胞系統における各細胞についての細胞分類器を開発し、各細胞分類器についてのＲＯＣの面積を求めるためのグラウンドトゥルースとして、低ＴＭＢ及び高ＴＭＢを使用することを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記同質遺伝子細胞系統における各細胞についてのグラウンドトゥルースと一致するスコアを定義することを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
グラウンドトゥルースに厳密に一致するスコアを生成することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記選択されたクローンの分析は、適応的ブースティング式ロジスティック回帰アルゴリズムを使用することで論理関数を通じて使用される射影軸のセットを定義して、０から１までの範囲のスコアを生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記適応的ブースティング式ロジスティック回帰アルゴリズムを、グラウンドトゥルースと現在のスコアとの間の差による各観測値の重み付けにより連続的な試行を使用して繰り返すことで、適応的に１つの解に集約し、より広い細胞特性のセットをその解に徐々に集約する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記選択されたクローンの分析は、ランダムフォレストアルゴリズムを使用して、特徴分布についてのノンパラメトリック推定を使用して分類器を生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
特徴木の潜在的なセットをプルーニングすることによって分類器の判別を評価することで、判別式を最適化することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
分類器の有効性を判定するためにＲＯＣ曲線下面積ａＲＯＣを使用することを更に含み、ここで、受信者操作特性曲線下面積、またはａＲＯＣは、分類の感度及び特異度に関する二値分類器出力の全性能を表すＲＯＣ曲線の積分をコンピューター処理することによって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
閾値を設定して分類器スコアと共に使用することで、高精度でグラウンドＴＢＭと相関する二値出力を生成することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が標的クラスに属する確率を表す数値スコアを生成することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
スコア分布に閾値を適用することで更にスコアを二値にすることによって、標的細胞を非標的細胞から分離することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記閾値は、低ＴＭＢを有する細胞を、高ＴＭＢを有する細胞から分離するために０．９５以上の精度が得られるように決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ＮＧＳ又はターゲット遺伝子パネルを利用した全エクソームシーケンシング又は標的化エクソームシーケンシングのいずれかを使用して実施されたゲノムプロファイリングからＴＭＢデータを求めることを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ）を識別する１つ以上の形態計測的分類器を訓練する方法であって、
形質導入された細胞から選択されたクローンを取得することと、
前記選択されたクローンをＭＬＨ１発現について分析して、親細胞系統と同等のレベルを有するクローンをスクリーニングすることと、
前記選択されたクローンを培養で増殖させることと、
前記選択されたクローンを採取することと、
ＴＭＢレベルを求めることと、
前記選択されたクローンを３Ｄ顕微鏡法光トモグラフィーシステムで分析することと、
各選択されたクローンについて複数の形態計測的バイオシグネチャーを生成することと、
適応的ブースティング式ロジスティック回帰アルゴリズムを使用することで論理関数を通じて使用される射影軸のセットを定義して、０から１までの範囲のスコアを生成すること、又はランダムフォレストアルゴリズムを使用して、特徴分布についてのノンパラメトリック推定を使用して分類器を生成することと、
前記選択されたクローンをコントロール細胞系統のセットと比較することと、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記コントロール細胞系統のセットは、親ＮＣＩ−Ｈ２３及びスクランブルｓｈＲＮＡを発現するクローンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析の実行により、各細胞について複数の形態計測的バイオシグネチャーが生成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
同質遺伝子細胞系統における各細胞についての細胞分類器を開発し、各細胞分類器についてのＲＯＣの面積を求めるためのグラウンドトゥルースとして、低ＴＭＢ及び高ＴＭＢを使用することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
分類器の有効性を判定するためにＲＯＣ曲線下面積ａＲＯＣを使用することを更に含み、ここで、受信者操作特性曲線下面積、またはａＲＯＣは、分類の感度及び特異度に関する二値分類器出力の全性能を表すＲＯＣ曲線の積分をコンピューター処理することによって計算される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
閾値を設定して分類器スコアと共に使用することで、高精度でグラウンドＴＢＭと相関する二値出力を生成することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
細胞が標的クラスに属する確率を表す数値スコアを生成することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
スコア分布に閾値を適用することで更にスコアを二値にすることによって、標的細胞を非標的細胞から分離することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
免疫療法を使用してヒト被験体における悪性腫瘍を治療する方法であって、
被験者から得られた標本から取得された疑似投影に基づいて細胞の３Ｄ画像を分析することと、
生物学的標本の分類器を動作させて、前記標本からの細胞を正常又は異常として識別することと、
前記異常細胞のそれぞれについてＴＭＢスコアを求めることと、
予め決められた閾値を前記ＴＭＢスコアに適用することと、
癌が見つかった場合には、外科的処置を施して癌病変を取り除くことと、
前記ＴＭＢスコアが予め決められた閾値を超過する場合には、免疫調節剤をヒト被験体に予め決められた期間にわたり投与して、癌細胞の根絶において前記ヒト被験体の免疫系を補助することによって免疫療法を行うための候補として前記被験体をトリアージすることと、
を含む、方法。
【請求項２６】
前記免疫調節剤は、キメラ免疫受容体、プロスタサイクリン類似体、イロプロスト、Ｔ細胞のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ボリノスタット、ＨＤＡＣ阻害剤、コレカルシフェロール、カルシトリオール及びそれらの組合せからなる群から選択される薬剤を含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞及び細胞以下スケールの光トモグラフィー（optical tomography：光断層撮影）に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ）を識別する１つ以上の形態計測的分類器を開発するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核形態の変化は、過去１４０年間にわたって、癌検出のための主要な組織病理学的バイオマーカーであった。細胞核内のクロマチン構成とＤＮＡ複製レベル、翻訳レベル及びタンパク質発現レベルでの細胞機能との間の直接的な関連性は、数多くの発表された研究で実証されている（１〜３）。特に、核の立体構造の基礎となるクロマチン構成は、ヒト癌細胞における地域的及び世界的な突然変異率に影響を与える主要な要因として関与している（４，５）。
【０００３】
様々な癌を治療する現在のアプローチには、腫瘍の免疫系応答からの逃避に関与するタンパク質であるＣＴＬＡ４、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の免疫系チェックポイント阻害薬を標的とすることが含まれる（６）。多数の固形腫瘍に対する免疫療法を使用して長期間の応答が達成されているが、真の恩恵を受けるのは患者の一部だけである。例えば、単剤ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害に対する応答率は以下の通りである：黒色腫については４０％（７、８）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）については２５％（９、１０）、そして腎細胞癌については１９％（１１）。さらに、現在の免疫療法は有害な副作用への大きなリスクを抱えている（１２〜１４）。結果として、患者に対する炎症性及び免疫関連の有害効果の不必要な負担を減らすために、どの患者が免疫療法治療から恩恵を受けるかを確実に予測することができるロバストなバイオマーカーが必要とされる。免疫療法に対する患者の応答を予測するのに役立つ幾つかのバイオマーカーが特定されている（１５）。そのようなバイオマーカーの１つはＰＤ−Ｌ１の発現であり、これは治療応答のために必要であるが、腫瘍の不均一性及び発現レベルの測定のため応答を決定するには不十分である（１６〜２１）。ごく最近に、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損及び腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ；ゲノムＤＮＡのメガベース当たりの体細胞のコーディング塩基置換及びインデル突然変異の数）が、免疫療法に対する応答の優れた予測因子であることが見出された（１５、２２〜２７）。ＭＭＲの欠損はゲノム不安定性及びマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）並びに高ＴＭＢにつながり、結果としてネオアンチゲンの発現がもたらされ、それにより腫瘍細胞は細胞傷害性Ｔ細胞による攻撃をより受けやすくなる（２３）。固形腫瘍又はｃｔＤＮＡのいずれかからＴＭＢを検出する際の課題には、生検の実施が不可能であることと、早期段階の疾患での検出の感度と、ペア組織及び種々のＮＧＳ（次世代シーケンシング）プラットフォームを使用して取得したデータの不一致とが含まれる（２８、２９）。以下に記載されるようにVisionGate社のＣｅｌｌ−ＣＴテクノロジーを使用する、より迅速で侵襲性が最小限の安価なアプローチは、癌細胞が構造的バイオマーカーに形態計測的変化を与えることができ、それを光学的にサブミクロン空間スケールで立体的に定量することができることに基づいて、癌細胞における低ＴＭＢ対高ＴＭＢを検出することである。クロマチン構成とゲノムＤＮＡ突然変異率との間で実証された関連性は、癌におけるゲノム不安定性及び／又はより特異的な型のゲノム改変を検出するために使用可能な細胞核内の構造的バイオマーカーの存在を示唆している。
【０００４】
構造的バイオマーカーの測定を通じてＭＭＲ欠損及びＴＭＢレベルを検出可能であることは、多くの研究によって裏付けられている。研究では、マイクロサテライト突然変異をもたらすＭＭＲの欠損を伴う結腸直腸癌の組織病理学的差異について報告されている。一般に、これらの腫瘍は、粘液性で、分化が不十分であり、豊富な両親媒性細胞質を伴う比較的大きな、円形で規則的な細胞からなっていた（３０〜３２）。さらに、Alexander et al.（３３）により、ＭＳＩを伴う結腸癌は印環細胞及び篩状化を示すことが報告された。Gisselsson et al.（３４）による研究により、核形状の異常は短期腫瘍細胞培養における遺伝的不安定性の指標であることが見出された。骨、軟部組織及び上皮の５８個の腫瘍からの培養物において、核ブレブ、ストリング（strings）及び小核は、遺伝的不安定性を含む腫瘍において有意により高頻度であった。ＤＮＡ修復と核形態との間の関連性を明らかにした他の細胞培養系には、以下の研究が含まれる。Bai et al.（３５）により、Ｒａｄ９発現がノックダウンされたＨｅＬａ細胞をアルキル化剤で処理すると、異常な核形態が生ずることが報告された。Debes et al.（３６）により、培養物中の前立腺癌細胞にｐ３００をトランスフェクションすると、直径、周囲長及び吸光度等の定量可能な核の変化が誘発されることが示された。ｐ３００遺伝子及び相同性の高いＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）遺伝子は共に、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）陽性の結腸癌細胞系統の８５％超において突然変異しており（３７）、進行した腸型胃癌においてｐ３００遺伝子座でのヘテロ接合性の喪失が観察された（３８）。
【０００５】
腫瘍進行に関連する別の構造的バイオマーカーは中心体である。ＭＭＲにおける欠損及びゲノム不安定性は、構造的に異常な中心体の数の増加と密接に関連している（３９、４０）。中心体は、細胞形状及び細胞極性の確立等の多くの微小管を介したプロセスにおいて重要な役割を果たす（４１〜４４）。
【０００６】
上記のように、ＭＭＲにおける欠損及びＭＳＩに基づく形態学的変化は多数の癌型に関係している。以下に示されるデータにより、Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォームが、種々のドライバー突然変異を有する肺腺癌細胞系統に対して形態計測的ジェノタイピングを実施する能力が確立されるが、この技術の有用性は、様々な癌におけるＭＭＲ欠損及び突然変異負荷を識別するために適用可能であるべきである。
【０００７】
関連する開発技術において、光トモグラフィーを使用する生体細胞の３Ｄ撮像における進歩は、Nelsonによって展開されており、例えば２００３年２月１８日に発行された、「Apparatus and Method for Imaging Small Objects in a Flow Stream Using Optical Tomography」という名称の米国特許第６，５２２，７７５号に開示されており、その全開示は引用することにより本明細書の一部をなす。本分野における更なる主要な開発は、Fauver et al.による、２０１０年６月１５日に発行された、「Method and Apparatus for Pseudo-Projection Formation for Optical Tomography」という名称の米国特許第７，７３８，９４５号（Fauver‘９４５号）及びFauver et al.による、２０１１年３月１５日に発行された、「Focal Plane Tracking for Optical Microtomography」という名称の米国特許第７，９０７，７６５号（Fauver‘７６５号）において教示されており、Fauver‘９４５号及びFauver‘７６５号の全開示も、同様に引用することにより本明細書の一部をなす。これらの明細書の教示に基づいて、早期肺癌検出技術は、VisionGate, Inc.社（アリゾナ州フェニックス）によって完全に開発され、商業化されて、従来の形態学的細胞診分析の操作特性の大幅な改善を立証した測定上の利点を提供した。
【０００８】
こうした光トモグラフィーシステムにおける処理は、標本収集及び調製で始まる。肺疾患における診断用途の場合、患者の標本は、診療所又は家庭で非侵襲的に収集することができる。臨床検査室において、標本は、非診断材料を取除くために処理され、定着され、その後、染色される。染色済み標本は、その後、オプティカルゲルと混合され、懸濁液が、マイクロキャピラリーチューブに注入される。標本内の、細胞等の対象物の画像は、光トモグラフィーシステム内の画像収集光学系に対して細胞が約３６０度回転する間に収集される。結果として得られる画像は、「疑似投影画像（pseudo-projection image）」と呼ばれる、いろいろな視点からの拡張した被写界深度画像のセットを含む。疑似投影画像のセットを、逆投影及びフィルタリング技法を使用して数学的に再構築して、関心の細胞の３Ｄ再構成をもたらすことができる。３つ全ての次元において同寸法の又はほぼ等しい解像度を有することは、３Ｄトモグラフィー細胞撮像における、特に、定量的特徴測定及び画像分析のための３Ｄトモグラフィー細胞撮像における利点である。上記明細書の教示に基づいて、VisionGate, Inc.社（アリゾナ州フェニックス）によって早期肺癌検出技術が開発されたことで、従来の形態学的細胞診分析の操作特性を大幅に改善する可能性を有する測定上の利点が提供される。発表された臨床データ（４５、４６）は、Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォームを使用した非侵襲的喀痰分析により、高い感度（９２％）及び特異度（９５％）で早期肺癌が検出されることを示している。
【０００９】
３Ｄ再構成済みデジタル画像は、関心の亜細胞構造、分子、又は分子プローブの測定を通した定量化を可能にするために、分析のために利用可能なままである。生体細胞等の対象物は、少なくとも１つの吸収性造影剤又はタグ付け分子プローブで染色又はラベル付けすることができ、このバイオマーカーの測定される量及び構造は、限定はしないが、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、胃癌、及び膵臓癌等の種々の癌、並びに異形成の種々のステージを含む、細胞の疾病状態に関する重要な情報をもたらすことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、本明細書の開示以前は、ＴＭＢを検出するために光トモグラフィーを使用する信頼性のある方法は存在しなかった。本明細書で標的細胞におけるＴＭＢを識別する方法及びシステムを提供することによって、患者は、例えばイロプロスト等の免疫調節剤で治療することで、肺癌の発症リスクを低下させるという恩恵を受けることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この要約は、簡略化した形態で、以下で詳細な説明において更に述べられる概念の選択を導入するものである。この要約は、特許請求される主題の重要な特徴を特定することを意図されず、特許請求される主題の範囲を決定する際の補助として使用されることも意図されない。
【００１２】
本開示に示される発明は、腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ）を識別する１つ以上の形態計測的分類器を開発する方法を記載する。ＴＭＢは、適切な癌療法に対する癌患者のトリアージにおいて重要であることが分かっている。本方法は、腫瘍サイズにかかわらず腫瘍にその発症の早期段階で応答性であるＴＭＢを特徴付ける非侵襲的な方法を提供する。したがって、本発明は、患者が有し得る癌の特定の特性を標的とする癌療法の実施の発展のために大きな重要性を有し、副作用がはるかに少ないより効果的な癌管理が可能となる。
【００１３】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において具体的に述べられるが、本発明は、構成及び内容の両方に関して、図面と併せて行われる以下の詳細な説明から、その他の目的及び特徴と共に、より十分に理解され、認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】標本の分析のための肺癌試験の機能概要を概略的に示す図である。
【図２】肺癌試験システムで使用される３Ｄ光トモグラフィー撮像システムの基本システムコンポーネントを概略的に示す図である。
【図３】腺癌細胞の３Ｄ画像の単一の斜視図である。
【図４】肺円柱細胞上の繊毛を示す図である。
【図５】異常細胞分類器についての感度対特異度のＲＯＣ曲線を示す図である。
【図６】種々の癌型に関連する特定の突然変異を識別する分類カスケードの一例を概略的に示す図である。
【図７】標的細胞についてのＲＯＣ下面積（ａＲＯＣ）並びに感度及び特異度を示す表において実験的研究の結果を表にした図である。
【図８】腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ）を識別する１つ以上の形態計測的分類器を開発する方法の一例についての流れ図を概略的に示す図である。
【図９】腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ）をグラウンドトゥルースとして使用する１つ以上の形態計測的分類器を開発する方法の一例についての流れ図を概略的に示す図である。
【図１０】免疫療法を使用してヒト被験体における悪性腫瘍を治療する方法の一例についての流れ図を概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
図面において、同一の参照符号は、同様の要素又はコンポーネントを指す。図面における要素のサイズ及び相対位置は、必ずしも一定比例尺で描かれていない。例えば、種々の要素の形状及び角度は一定比例尺で描かれておらず、これらの要素の一部は、図面の視認性を改善するために任意に拡大され位置決めされる。さらに、描かれる要素の特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関する何らかの情報を伝えることを必ずしも意図しているわけではなく、単に、図面における認識を容易にするために選択されている。
【００１６】
以下の開示は、腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ）を識別する１つ以上の形態計測的分類器を開発する方法を記載する。例示的な実施形態による方法及びシステムの幾つかの特徴は、図において挙げられ述べられる。他の例示的な実施形態による方法及びシステムが、図に示されるものと異なる更なる手順又は特徴を含み得ることが理解されるであろう。例示的な実施形態は、光トモグラフィー細胞撮像システムに関して本明細書で述べられる。しかし、これらの例が、原理を示すためのものであること、及び、本発明がそれに限定されないことが理解されるであろう。
【００１７】
本発明は、光トモグラフィーシステムによって処理される標本を使用してＴＭＢを検出する早期肺癌検出システムを提供し、光トモグラフィーシステムは、アイソメトリックでサブミクロンの解像度の３Ｄ細胞画像を生成し、その画像は、その後、自動化特徴抽出及び分類アルゴリズムによって処理され、異常細胞を高精度で識別する。異常細胞が、希少であり、非診断汚染物質が豊富であるため、高感度でかつ非常に高い特異度で細胞検出が可能なシステムだけが、標本適正を保証しながら、効率的に肺癌検出を達成することができる。
【００１８】
定義
一般に、本明細書で使用するとき、以下の用語は、文脈における使用が別途指示しない限り、以下の意味を有する。
【００１９】
特許請求の範囲又は明細書における用語「備える（comprising）」と共に使用するときの語「１つの（"a" or "an"）」の使用は、別途文脈が指示しない限り、１つ又は２つ以上を意味する。用語「約（about）」は、述べた値プラス若しくはマイナス測定誤差の余裕度、又は、測定方法が全く示されない場合、プラス若しくはマイナス１０％を意味する。特許請求の範囲における用語「又は（or）」の使用は、単に代替物を挙げることが明示的に指示されない限り、又は、代替物が相互に排他的である場合を除いて、「及び／又は（and/or）」を意味するために使用される。用語「備える（comprise）」、「有する（have）」、「含む（include）」、及び「含む（contain）」（並びにそれらの変形）は、オープンエンド連結動詞であり、特許請求の範囲において使用される場合、他の要素の付加を許容する。
【００２０】
本明細書全体を通して、「一例（one example）」若しくは「例示的な実施形態（an example embodiment）」、「一実施形態（one embodiment）」、「実施形態（an embodiment）」、又はこれらの用語の組合せ及び／又は変形に対する参照は、その実施形態に関連して述べられる特定の特徴、構造、又は特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の場所における、「一実施形態において（in one embodiment）」又は「実施形態において（in an embodiment）」という句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の適した方法で組合されてもよい。
【００２１】
「適正（adequacy）」は、標本の内容物を参照し、十分な細胞ペレットが分析されたかどうかを決定するための標的細胞についての限界を規定する。
【００２２】
「カルシトリオール」は、本明細書で使用されるとき、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）の合成（人工）活性形態である。
【００２３】
「キャピラリーチューブ」は、その一般的に受入れられる意味を有し、概して５００ミクロン以下の内径を有する透明なマイクロキャピラリーチューブ及び等価な物品を含むことを意図される。しかしながら、より大きい直径を使用することができる。
【００２４】
「細胞（cell）」は、ヒト、哺乳類、又は動物の細胞等の生体細胞を意味する。
【００２５】
「Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォーム」は、本明細書において上記で参照したNelson特許及びFauver特許の教示並びにそれらの教示の改良を組込んだ、アリゾナ州フェニックス所在のVisionGate, Inc.社によって製造される光トモグラフィーシステムを指す。Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォームは、フロー中の細胞を撮像するための、自動化された高解像度３Ｄトモグラフィック顕微鏡及びコンピューティングシステムである。Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォームは、全ての次元において等しい空間解像度（すなわち、等方性解像度）を有する３Ｄ細胞画像をコンピューター処理し、従来の光学的撮像法とは対照的に、測定が向きに無関係であることを可能にする。さらに、従来の顕微鏡法に典型的である焦点面曖昧さ及び視点向き依存性をなくすことは、広範囲の細胞タイプを自動的に認識し、主として正常な細胞集団内で希少な異常細胞を明確に識別するための情報コンテンツを提供する。
【００２６】
「ＣｅｌｌＧａｚｅｒ」は、Ｃｅｌｌ−ＣＴによってレンダリングされた細胞の２Ｄ及び３Ｄ画像のレビューを促進するソフトウェアベースユーティリティを指す。細胞レビューの結果は、細胞タイプの詳細な鑑別診断であり、その鑑別診断は、例えば、ＬｕＣＥＤ試験によって処理された症例の最終結果を決定する。
【００２７】
「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：chimeric antigen receptor）」は、本明細書で使用されるとき、人工Ｔ細胞受容体（キメラＴ細胞受容体又はキメラ免疫受容体としても知られている）が改変受容体であり、改変受容体が任意の特異度を免疫エフェクター細胞に与えることを意味する。
【００２８】
「ＣＩＳ」は、本明細書で使用されるとき、上皮内新生物としても知られている上皮内癌の一般的に受入れられる意味を有する。
【００２９】
「被写界深度」は、指定された特徴について許容できない画像ブラーが生成されるまで、焦点面をシフトすることができる光軸に沿う長さである。
【００３０】
「富化（enrichment）」は、未処理標本から標的細胞を取出すプロセスを指す。そのプロセスは、富化したペレットをもたらし、その細胞は、その後、Ｃｅｌｌ−ＣＴシステム上でより効率的に撮像することができる。
【００３１】
本明細書で使用される「免疫療法」は、腫瘍学の分野に適用され、ヒト被験体における悪性腫瘍を改善、治療又は予防する方法を意味し、ここで、この方法には、能動免疫応答を発動（又は受動免疫応答を達成）して癌細胞を破壊する細胞、抗体、タンパク質又は核酸の投与を含む癌細胞の根絶において免疫系を補助又は増強させる作用がある。免疫療法はまた、化学療法、放射線又は手術等の癌を治療する従来の療法と組み合わせた生物学的アジュバント（例えば、インターロイキン、サイトカイン、カルメット−ゲラン桿菌、モノホスホリルリピドＡ等）の同時投与、免疫系を活性化して癌細胞成長を防止する又は無効にすることにより機能する任意のワクチンの投与、並びに自己細胞及び／又は異種細胞又は不死化細胞系統を使用した免疫療法を含むｉｎ  ｖｉｖｏ免疫療法、ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫療法及び養子免疫療法を含む。
【００３２】
本明細書で使用される「イロプロスト」は、プロスタサイクリンＰＧＩ２の合成類似体を含む免疫調節剤である。
【００３３】
「ＬｕＣＥＤ（商標）試験」は、本明細書において上記で参照したNelson特許及びFauver特許の教示並びにそれらの教示の改良を組込んだ、アリゾナ州フェニックス所在のVisionGate, Inc.社によって開発されたＣｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォームを使用する早期肺癌検出試験を指す。
【００３４】
「ＬｕＣＥＤ（商標）プロセス」は、３Ｄ細胞再構成、異常細胞を見出すための分類、及び病理確認のメカニズムを指す。
【００３５】
「ＬＤＣＴ」は、低線量コンピュータートモグラフィー（ＣＴ）放射線撮影スキャニングを意味する。
【００３６】
「対象物（object）」は、個々の細胞、ヒトの細胞、哺乳類の細胞、品目、事物、又は他のエンティティを意味する。
【００３７】
「疑似投影図」は、光学系の固有の被写界深度より広い範囲のサンプリングされる容積を表す単一画像を含み、こうして形成される疑似投影画像は、固定視点からの或る範囲の焦点面画像の積算を含む。疑似投影図の概念は、Fauver‘９４５号に教示される。
【００３８】
「標本」は、個々の患者からの単一の試験又は手続きから取得される完全な生成物（例えば、分析用に提出された痰、生検材料又は鼻腔スワブ）を意味する。標本は、１つ以上の対象物で構成されてもよい。標本診断の結果は症例診断の一部になる。
【００３９】
「ＲＯＣ」は、受信者操作特性の一般に受入れられる意味を有する。
【００４０】
「試料」は、アリコート又は標本の全て又は一部を含む、分析の準備ができている完成した細胞調製物を意味する。
【００４１】
「被験者（subject）」は、本明細書で使用するとき、ヒトの患者を意味する。
【００４２】
「標的細胞（target cell）」は、その特徴付け又は列挙が特に所望される標本からの細胞を指す。例えば、ＬｕＣＥＤ試験において、標的細胞は正常気管支上皮細胞である。標本が適正であると考えられるために、試験中に、最小数のこれらが列挙されなければならない。
【００４３】
画像処理の文脈で使用される「閾値（threshold）」は、或る特徴の任意の測定可能な特性についての決定境界値を含む。閾値は、機器の仕様、許容可能な誤り率、統計量、又は受け入れられるパターン認識原理による他の基準に従って予め決定されてもよい又は設定されてもよい。
【００４４】
「腫瘍突然変異負荷」（ＴＭＢ）とは、ゲノムＤＮＡのメガベース当たりの体細胞のコーディング塩基置換及びインデル突然変異の数を意味する。
【００４５】
「ＴＮＭステージ（TNM stage）」は、肺癌の文脈内で一般に受入れられる意味で本明細書において使用され、例えば国際肺癌学会（ＩＡＳＬＣ：International Association for the Study of Lung Cancer）によるように医師会によって規定された、腫瘍、結節、転移（ＴＮＭ：tumor, node, metastasis）ステージを意味する。
【００４６】
スベラニロヒドロキサム酸としても知られているボリノスタットは、バレット食道において使用されるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤としてその通常の意味で使用される。
【００４７】
画像処理の文脈で使用される「ボクセル（voxel）」は、３Ｄグリッド上の体素である。
【００４８】
概要
図１を参照すると、標本を分析するための肺異形成及び癌試験システムの機能概要が概略的に示される。試験システム５は、標本収集１０用の装置及び方法、それに続く、例えばＬｕＣＥＤ（商標）試験等の早期肺癌検出のための試験１２を含む。早期肺癌試験１２は、標本染色及び富化１４、３Ｄ細胞撮像２０、３Ｄ細胞分類２２、及び異常候補細胞の臨床レビュー２５用の装置及び方法を更に含む。
【００４９】
痰を使用する場合、収集は、通常、患者の家庭における自発的咳を通して又は診療所における誘発を通して行われる。例えば、生検等の他の種類の標本収集は、臨床条件下で行われ得る。試料は、例えば、白血球（white cell）及び口腔扁平上皮細胞の大部分を除去することによって汚染物質及び非気管支上皮細胞を除去するために処理される。富化済み標本は、Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォーム上で処理され、Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォームは、例えば、上記で参照したNelson及びFauverに開示されるように、アイソメトリックでサブミクロンの解像度を有する真の３Ｄで細胞をデジタル的に撮像する。癌に関連するバイオシグネチャーは、３Ｄ細胞画像上で測定され、癌特性を有する少数の細胞を識別するために使用されるスコアへと結合される。これらの細胞は、任意選択で、その後、VisionGate, Inc.社（アリゾナ州フェニックス）によって開発されたＣｅｌｌＧａｚｅｒ（商標）レビューステーション等のレビューステーションを使用して細胞学者の人の手によるレビューのために表示される。レビューステーションは、視覚的表示を提供し、細胞学者が、細胞画像を２Ｄ及び３Ｄで観察して、特異的細胞候補について決定的な正常又は異常状態を確立することを可能にする。３次元（３Ｄ）細胞分類２２は、以下で本明細書において開示される技法を使用して実施されてもよい。
【００５０】
細胞撮像システム２０は、例えば、画像取込み中に生じる動きを補正するために、光学機械デバイスとインタフェースするパーソナルコンピューターによって実行されるコンピューターソフトウェアを通して実装されるプロセスを含む。ほとんどの細胞画像は、十分に再構成される方式でフィルタ補正逆投影から現れる。コンピューターに実装されるアルゴリズムの１つは、不十分に再構成された細胞を識別するため、その細胞は更なる処理から排除することができる。こうした不十分な品質の再構成を検出する方法の一例は、２０１２年４月１０日に発行され、「System and Method for Detecting Poor Quality in 3D Reconstructions」という名称の米国特許第８，１５５，４２０号においてMeyer et al.によって教示され、その開示は、引用することにより本明細書の一部をなす。
【００５１】
肺癌スクリーニングプログラムの開発における早期試みは、ヒトの眼による疾病検出に対して不充分な感度である（平均、約６０％）が、非常に良好な特異度を有することを示した喀痰細胞診（sputum cytology）（Schreiber and McCrory (2003) Chest 123 (1 Supplement): 115）に基づいた。この経験は、一部の者に、肺癌の検出にとって痰が、価値がないと結論付けさせた。パラフィンブロックに埋め込まれた痰に関わる注意深い分析（Boecking A, Biesterfeld S, Chatelain R, Gien-Gerlach G, Esser E., Diagnosis of bronchial carcinoma on sections of paraffin-embedded sputum. Sensitivity and specificity of an alternative to routine cytology. Acta Cytol. 1992;36(1):37-47）は、癌患者の８６％以上において標本が異常細胞を実際に含むことを示した。連続する３日にわたる朝の咳による収集が最適結果をもたらした。更なる分析は、異常細胞が、腫瘍組織学的型、サイズ、ステージ、及び場所を含む全ての関連する臨床因子によって層別化された（stratified）痰内に存在することを示した（Neumann T, Meyer M, Patten F, Johnson F, Erozan Y, Frable J, et al. Premalignant and Malignant Cells in Sputum from Lung Cancer Patients. Cancer Cytopathology, 2009; 117(6):473-481.）。これらの標本特性に基づいて、現在開示されている肺癌検出試験は、自発的咳による痰を使用するものである。初期評価は、Ｃｙｔｏｙｔ（Hologic社（マサチューセッツ州マールボロ））又はよく知られているＳａｃｃｏｍａｎｎｏ法による痰固定を使用して満足のいく結果を示した。標本適正の問題は、喀痰細胞診にとっても重要である。痰喀出の容積を増加させる試みは、様々な成功を収めた。痰誘発は、粘液の生成を増加させて、総合的な適正試料を達成するのを助けた。
【００５２】
試料富化及び調製の例
ＴＭＢの検出に適用される肺癌検出試験の一例において、標本は、分析に先立って、処理の３つの段階：１）細胞単離及び凍結保存；２）蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ：fluorescence activated cell sorting）による富化；並びに３）光トモグラフィー撮像システムの光学コンポーネントにインデックスマッチングされる光学オイル内への富化済み細胞の埋め込みを受ける。
【００５３】
凍結保存及びＦＡＣＳ富化（ＦＡＣＳは１つの例である）
痰は、粘液溶解薬ジチオトレイトール（ＤＴＴ：dithiothreitol）（Fisher Scientific社（マサチューセッツ州ウォルサム））によって処理される。１つの例において、長期貯蔵の場合、標本は、４１μｍナイロンネットを通してろ過され、１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：dimethyl sulfoxide）（Fisher Scientific社（マサチューセッツ州ウォルサム））内で−８０℃に維持された。ろ過後、保存される標本の最大１００μＬのアリコートが、肺癌検出試験分析のために取り出される。最初に、痰細胞は、下流の肺癌検出試験撮像のためにヘマトキシリン（Electron Microscopy Sciences社（ペンシルベニア州ハットフィールド））で染色された。細胞は、その後、気管支上皮細胞について富化させると共に、汚染性炎症細胞（好中球及びマクロファージ）を枯渇させるために選択される蛍光コンジュゲートを含む抗体カクテルで処理された。抗サイトケラチンＦＩＴＣコンジュゲートカクテル（Cell Signaling社（マサチューセッツ州ダンバース））は、正常及び悪性の両方の上皮細胞において発現するサイトケラチンを標的にする。抗ＣＤ４５−ＡＰＣコンジュゲート（Mylteni社（ドイツ、ベルギッシュ  グラッドバッハ（Bergisch Gladbach）））は、陰性選択のために炎症細胞を標的にする。細胞は、細胞ソーティングに先立って、ＤＡＰＩ（Life Technologies社（ニューヨーク州グランドアイランド））によっても染色される。ＦＡＣＳ富化の場合、ＤＡＰＩ陽性のマザーゲートが作成されて、ダブレット細胞及びデブリを排除し、それに続いて、高い側方散乱事象を排除した。ダブレット細胞は、主に口腔扁平上皮細胞である。その後、高サイトケラチン（高ＦＩＴＣ）及び低ＣＤ４５（低ＡＰＣ）のドーターゲートが引かれる。このドーターゲート内の細胞の集合は、Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）光トモグラフィーシステム等の光トモグラフィーシステムを使用する、より効率的でかつ下流の肺癌検出試験分析についてソーティングされた富化済み標的上皮細胞であった。
【００５４】
富化済み細胞の埋め込み
ＦＡＣＳ富化（又は富化の任意の他の処理）に続いて、細胞は、エタノール中で脱水され、それに続いて、キシレン中で懸濁される。細胞は、その後、適した容積の光媒体に移送され、そこに埋め込まれる。光媒体は、光トモグラフィーシステムのために、整合する屈折率を有する粘性オイルである。埋め込まれると、細胞は、光トモグラフィーシステム上で撮像するために、使い捨てカートリッジ内に注入される。
【００５５】
ここで、図２を参照すると、肺癌試験システムにおいて使用される３Ｄ光トモグラフィー撮像システムの基本システムコンポーネントが示される。細胞撮像システム２０は、フロー中の細胞を撮像するための、自動化された高解像度３Ｄトモグラフィック顕微鏡及びコンピューティングシステムである。コンデンサーレンズ９２に光学的に結合される照明源９０が含まれ、コンデンサーレンズ９２は、対物レンズ９４と光学的に協働して、キャピラリーチューブ９６内に含まれる対象物１の画像をスキャンする。画像は、振動ミラー１０２によって対象物が占める容積をスキャンすることによって取得され、ビームスプリッター１０４を通して高速度カメラ１０６に伝達される。高速度カメラは、複数の疑似投影画像１１０を生成する。多数のアキシャルチューブ回転位置について疑似投影画像のセットが、各対象物について生成される。
【００５６】
試験システムは任意の１つのコントラスト法に限定されないが、一例において、肺癌検出試験は、伝統的に使用されるヘマトキシリン染色に基づく細胞形態学を特に標的にする。肺癌検出試験用途において、光トモグラフィーシステムは、全ての次元において等しい解像度（すなわち、等方性解像度）を有する３Ｄ細胞画像をコンピューター処理し、測定が向きに無関係であることを可能にする。さらに、従来の顕微鏡法に典型的である焦点面曖昧さ及び視点向き依存性をなくすことは、広範囲の細胞タイプを自動的に認識し、支配的に正常な細胞集団内で希少な異常細胞を明確に識別するための情報コンテンツを提供する。光トモグラフィーシステム出力は、全ての細胞の約０．５％を、ＣｅｌｌＧａｚｅｒ（商標）（VisionGate, Inc.社（アリゾナ州フェニックス））ワークステーション、焦点面及び向き曖昧さのない画像の人間によるレビューを可能にする撮像ソフトウェアツールを使用して確認される異常候補として識別する。
【００５７】
光トモグラフィーシステム撮像は、小容積液体懸濁液に関して実施される。肺癌検出試験の場合、これらの細胞は、上記で述べた富化済み上皮細胞集団からのものである。光トモグラフィーシステムは密接に一致する対象物を分離することができるため、単一ファイル細胞フローの狭く収束されたコアは、標準的なフローサイトメトリーにおける要件ではあるが、必要でない。
【００５８】
肺癌試験システムの例の動作は、本明細書において上記で参照によって組込まれたNelson及びFauverの参考文献、並びに、２０１２年８月２８日に発行された、「Optical Tomography System with High-Speed Scanner」という名称の、Watson et al.に対する米国特許第８，２５４，０２３号を含む他の特許に記載され、それらの特許も同様に、引用することにより本明細書の一部をなす。動作中、生体細胞１の染色済み核は、光媒体１１２内で懸濁され、また、例えば、６２μｍ内径を有するキャピラリーチューブ９６内に注入される。キャピラリーシステムは、使い捨てであるように設計されており、したがって、標本間の相互汚染の可能性をなくす。流体に印加された圧力１１４は、チューブが回転するにつれて３Ｄデータが収集される前に、対象物１を撮像用の所定の位置に移動させる。ミラー１０２が作動されて、対象物を通して焦点面をスイープし、画像が、カメラによって積算されて、それぞれの単一視点からの疑似投影図を作成する。光トモグラフィーシステムに対してキャピラリーチューブ９６をインタフェースするガラスホルダーは示されない。ホルダーは、キャピラリーの外径よりわずかに大きい中央部を通してカットされた穴を有し、ガラスは、両側が平坦であって（図の簡略化のために示さない）、対物レンズ及びコンデンサーレンズに対する光学結合を可能にする。輸送媒体内に埋め込まれる細胞がロードされたキャピラリーチューブは、ホルダーを通してねじ込まれる。細胞を保持する輸送媒体、ガラスキャピラリー、キャピラリーホルダー、レンズにインタフェースするオイル、及びレンズそれ自身は、同じ光学指数の材料から作られる。結果として、光線は、光トモグラフィーシステム光学系、キャピラリー、及び細胞を、屈折なしで通過し、一方、細胞は、回転して、キャピラリーが３６０度を回転するにつれて撮影される５００の疑似投影図のセットの取込みを可能にしてもよい。細胞は、流体媒体内に懸濁されるため、疑似投影画像１１０が収集されている間に、少量の移動を生じ易い。
【００５９】
したがって、疑似投影図内の細胞画像は、細胞特徴が再構成中に互いに強化されるように共通センターに登録されなければならない。「Method for Image Processing and Reconstruction of Images for Optical Tomography」という名称の米国特許第７，８３５，５６１号は、疑似投影図についての誤差補正技術を開示している。米国特許第７，８３５，５６１号は引用することにより本明細書の一部をなす。補正済み疑似投影図のセットは、従来のＸ線ＣＴで使用中のアルゴリズムと同様のフィルタ補正逆投影アルゴリズムを使用して処理されて、トモグラフィック３Ｄ細胞再構成をコンピューター処理する。３つの角度位置：０ｇ、９０ｇ、及び１８０ｇで撮影された疑似投影画像１１０が示される。５８５ｎｍ波長の光源９０による照明が提供されて、ヘマトキシリン吸収スペクトルに基づく画像コントラストを最適化する。再構成において、３Ｄピクセル又はボクセルは立方体であり、各寸法が約７０ｎｍのサイズである。再構成容積は、画像収集容積が対象物の周りでクロップされるため、サイズが変動する。通常、容積は、側部上で約２００ピクセル〜３００ピクセルである。
【００６０】
ここで、図３Ａ〜図３Ｃを参照すると、腺癌細胞の３Ｄ画像の斜視図が示される。図３Ａは、最大値投影法における腺癌細胞を示す（１３）。３Ｄ画像のグレー値が種々の細胞特徴に関連するため、細胞構造をカラー及び透明度の値にマッピングするルックアップテーブルは、中央（図３Ｂに示す）及び右（図３Ｃに示す）の細胞画像を生成するために確立された。これらの画像のカラー再生において、細胞質は乳白色４０２で表され、核はオパックブルー４０４で表され、ルースなクロマチン及びヌクレオプラズムは半透明グリーン４０６で表され、凝縮クロマチン及び核小体はオパックレッド４０８で表される。白黒のみの図面を提供するという国際特許規則に関する制約が与えられる場合、これらのカラーは、対応する参照符号４０４、４０６、及び４０８で識別される境界によって識別された（破線境界として示す）。
【００６１】
ここで、図４を参照すると、肺円柱細胞上の繊毛が示される。撮像済み正常気管支上皮細胞は、個々の繊毛ストランドの径が約２５０ｎｍであることを特徴とする。これは、３Ｄ細胞撮像システムの解像度を更に証明する。
【００６２】
ここで、図５を参照すると、異常細胞分類器についてのＲＯＣ曲線が示される。ＲＯＣ曲線７００は、水平軸７０３上の特異度に対する、垂直軸７０１上の異形成細胞への感度のプロットである。ポイント７０７は、異形成細胞分類器が、ほぼ１００％特異度において７５％感度で働く領域を示す。分類器は、中等度〜高度異形成及び幾つかの異型細胞状態からなる異常肺プロセスを示す細胞を含むデータセットを使用して構築された。分類器の訓練は、約１５０の知られている異形成細胞及び約２５０００の知られている正常細胞のセットを使用して実装された。精度は、異形成細胞のほぼ完全な検出を示す単一細胞ＲＯＣ曲線７００によって立証される。分類器精度は、しばしば、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＲＯＣ：area under the ROC curve）として表される。完全な判別は、ＡＲＯＣが１であるときに生じる。ＬｕＣＥＤ  ＡＲＯＣ値は０．９９１である。単一細胞検出の場合、７５％感度及び１００％特異度を提供する動作ポイントが選択された。細胞分類は、以下のリストに示す症例の検出に関連する。例えば、ＬｕＣＥＤ分析中に１つの異常細胞に遭遇する場合、症例検出確率は、０．７５、すなわち７５％であることになる。ＬｕＣＥＤによって２つの異常細胞に遭遇する場合、症例検出確率は、（１−（１−０．７５）２）＝０．９３７５、すなわち、ほぼ９４％の症例感度であることになる、等である。
１細胞−７５％症例感度、
２細胞−９４％症例感度、及び、
３細胞−９８％症例感度。
【００６３】
ここで、図６を参照すると、種々の癌型に関連する特定の突然変異を識別するように適合された分類器を訓練する分類カスケードの一例が示されている。訓練を進めることで、第１の分類器６０２、第２の分類器６０４、第３の分類器６０８、第４の分類器６０９、第５の分類器６１１及び第６の分類器６１５を含む、所望の細胞を分離するための一連の二値分類器が生成された。
【００６４】
一例では、第１の分類器６０２を、悪性細胞を他の正常細胞から分離するために訓練した。第１の分類器６０２は、悪性細胞系統からの全てのデータをグループ化し、そのデータを１つのクラス、例えば悪性細胞のセットに割り当てる。悪性細胞のセットとネガティブコントロールとしての正常細胞とを使用して、正常細胞を悪性細胞から分離するように第１の分類器を訓練した。痰において悪性細胞は稀であるため、この工程は特に重要である。訓練の間に、痰中の細胞の非常に少ない部分に対してのみ人の手によるレビューを行う。人の手によるレビューはプロセスの一部であるため、該プロセスから浮かび上がる異常細胞のみが真に悪性であると想定することができ、次いで、以下に記載される分類器を使用してサブタイピングすることができる。
【００６５】
第２の分類器６０４は、悪性のサブタイプを分離する。どの臓器系もそれに関連する種々の組織型を有する。例えば、肺組織は扁平上皮と気管支からの腺腫様組織とから構成されている。神経内分泌腺からの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞も時々はっきり見える。したがって、所望のドライバー突然変異が発生する特定の癌サブタイプを分離するためには、分類器が必要とされる。これは、最初に小細胞肺癌を腺癌及び扁平上皮癌から分離した後に、腺癌を扁平上皮癌から分離することによって行われる。腺癌内の所望の突然変異サブタイプの更なる分離は段階的に進む。この例のために訓練セットとして選択された細胞系統のグループ化を以下の表１に示す。特定のドライバー突然変異の分離は、第３の分類器から第６の分類器６０８、６０９、６１１及び６１５の形態学的因子に基づいて決定される。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
更に図６を参照すると、一例では、突然変異ドライバーの段階的分離は、細胞のセットを正常クラスと悪性又は異形成のクラスとに分離する第１の分類器６０２で始まる。悪性として識別された全ての細胞は、更に第２の分類器６０４で処理され、第２の分類器６０４は、ＳＣＬＣ：ＮＣＩ−Ｈ６９タイプの細胞を他の悪性細胞から分離し、他の悪性細胞は第３の分類器６０８に渡される。第３の分類器６０８は、腺癌：ＳＷ９００を他の腺癌タイプの細胞から分離し、他の細胞は第４の分類器６０９に渡される。第４の分類器６０９は、腺癌：ＡＬＫ陽性のＮＣＩ−Ｈ２２２８の細胞タイプを他の残りの細胞タイプから分離し、残りの細胞タイプは第５の分類器６１１に渡される。第５の分類器６１１は、腺癌：野生型のＡ５４９をＥＧＦＲ陽性腺癌の細胞タイプから分離し、ＥＧＦＲ陽性腺癌サブタイプは第５の分類器６１５に渡される。第６の分類器６１５は、腺癌：Ｔ７９０ＭのＮＣＩ−Ｈ１９７５を腺癌：ＥＧＦＲ−ｐ．Ｅ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌから分離する。
【００６８】
当業者であれば、これが本発明の適用の一例にすぎず、他の細胞タイプ及び突然変異ドライバーを使用して、本明細書に記載される方法に従ってＴＭＢ分類器を含む分類器を構築及び訓練することができることを認識するであろう。本発明は、決してこの例に限定されるものではない。分類器の決定は、分類器の訓練の間に或る特徴の任意の測定可能な特性の決定境界値を確立することによって実行される。閾値は、機器の仕様、許容可能な誤り率、統計量、又は受け入れられるパターン認識原理による他の基準に従って選択又は設定され得る。
【００６９】
実験結果
ここで、図７を参照すると、１つの実験的研究の結果が表にまとめられている。表６５０は、上記の訓練方法に従って訓練された分類器によって分類された標的細胞についての、ＲＯＣ下面積（ａＲＯＣ）６５２並びに感度６５４及び特異度６５６を示す。特異度は、特定のドライバー突然変異を分離することを目的とした分類器による悪性細胞の誤識別に関連する。例えば、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）腫瘍由来の細胞の識別についての特異度は、９９．９８％である。ＳＣＬＣと呼ばれる少数の細胞は実際、表６５０に列記される他の細胞系統の幾つかに由来する。悪性細胞の０．０２％しか誤識別されないので、陽性的中率は、ＳＣＬＣの識別についてはＰＰＶ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）＝１００×０．７４８／（０．７４８＋０．００２）＝９９．７としてコンピューター処理され得る。
【００７０】
ＬｕＣＥＤ（商標）プロセスについての証拠と細胞のゲノムシグネチャーに相関する悪性細胞についての形態計測的変化を示す発表された証拠との組合せにおける正常細胞と異常細胞との間の優れた判別により、癌プロセスを駆動する原因となる遺伝子突然変異が、純粋に形態学的な方法によって識別され得ることが示唆される（５２）。
【００７１】
本開示では、形態計測的ゲノミクスの概念が拡張され、癌ドライバーを検出するために腫瘍突然変異負荷のドメインへと使用される。Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）システムは、ＴＭＢを特徴付ける非侵襲的な手段を提供するという考えで、腫瘍突然変異の程度に関する形態計測的な根拠をもたらすために制作されている。ＬｕＣＥＤ（商標）アルゴリズムは、腫瘍の組織学、ステージ及びサイズを問わず、等しい感度で癌を検出する（４６）。したがって、Ｃｅｌｌ−ＣＴに基づくＴＭＢ測度は、組織学、ステージ及びサイズの要因を問わず、ＴＭＢを非侵襲的に特徴付ける可能性を有する。
【００７２】
ここで、図８を参照すると、腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ）を識別する１つ以上の形態計測的分類器を開発する方法の一例についての流れ図が示されている。本方法は、
形質導入された細胞から選択されたクローンを取得すること（８３０）と、
選択されたクローンをＭＬＨ１発現について分析して、親細胞系統と同等のレベルを有するクローンをスクリーニングすること（８３２）と、
選択されたクローンを培養で増殖させること（８４２）と、
選択されたクローンを採取すること（８４３）と、
採取されたクローンについてのＴＭＢレベルを求めること（８５０）と、
選択されたクローンを３Ｄ顕微鏡法光トモグラフィーシステム（3D microscopy optical tomography system）で分析すること（８５２）と、
選択されたクローンをコントロール細胞系統のセットと比較すること（８５４）と、
を含む。
【００７３】
一例では、コントロール細胞系統のセットは、親ＮＣＩ−Ｈ２３及びスクランブルｓｈＲＮＡを発現するクローンを含む。さらに、分析の実行により、各細胞について複数の形態計測的バイオシグネチャーが生成される。ＴＭＢデータは、ＮＧＳ又はターゲット遺伝子パネルを利用した全エクソームシーケンシング又は標的化エクソームシーケンシングのいずれかを使用して実施されたゲノムプロファイリングから求められ得る。
【００７４】
ここで、図９を参照すると、腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ）をグラウンドトゥルースとして使用するための１つ以上の形態計測的分類器を開発する方法の一例についての流れ図が示されている。該方法は、図８に関して上記した方法と組み合わせて使用することができる。同質遺伝子細胞系統における各細胞についての細胞分類器を開発し、各細胞分類器についてのＲＯＣの面積を求めるためのグラウンドトゥルースとして、低ＴＭＢ及び高ＴＭＢを使用することができる（９３０）。同質遺伝子細胞系統における各細胞について、グラウンドトゥルースと一致するスコアを定義する（９３２）。適応的ブースティング式ロジスティック回帰（Adaptively boosted logistic regression）アルゴリズムを使用することで論理関数を通じて使用される射影軸のセットを定義して、０から１までの範囲のスコアを生成することによって、分類器をグラウンドトゥルースに厳密に一致するスコアを生成するように訓練することができる。適応的ブースティング式ロジスティック回帰アルゴリズムを、グラウンドトゥルースと現在のスコアとの間の差による各観測値の重み付けにより連続的な試行を使用して繰り返すことで、適応的に１つの解に集約し、より広い細胞特性のセットをその解に徐々に集約することができる。あるいは、選択されたクローンの分析は、ランダムフォレストアルゴリズムを使用して、特徴分布についてのノンパラメトリック推定を使用して分類器を生成することを含み得る。さらに、分類器判別の評価は、特徴木の潜在的なセットをプルーニングして判別式を最適化することによって改善され得る（９５０）。ＲＯＣ曲線下面積ａＲＯＣは分類器の有効性を判定するために使用され、ここで、受信者操作特性曲線下面積、すなわちａＲＯＣは、分類の感度及び特異度に関する二値分類器出力の全性能を表すＲＯＣ曲線の積分をコンピューター処理することによって計算される（９５２）。閾値を設定して分類器スコアと共に使用することで、高精度でグラウンドＴＢＭと相関する二値出力を生成する（９５４）。細胞が標的クラスに属する確率を表す数値スコアが生成され得る。スコア分布に閾値を適用することで更にスコアを二値にすることによって、標的細胞を非標的細胞から分離することができる。有用な一例では、閾値は、低ＴＭＢを有する細胞を、高ＴＭＢを有する細胞から分離するために０．９５以上の精度が得られるように決定され得る。
【００７５】
ここで、図１０を参照すると、免疫療法を使用してヒト被験体における悪性腫瘍を治療する方法の一例についての流れ図が示されている。本方法は、
被験者から得られた標本から取得された疑似投影に基づいて細胞の３Ｄ画像を分析すること（１０３０）と、
生物学的標本の分類器を動作させて、標本からの細胞を正常又は異常として識別すること（１０３２）と、
異常細胞のそれぞれについてＴＭＢスコアを求めること（１０４２）と、
予め決められた閾値をＴＭＢスコアに適用すること（１０５２）と、
癌が見つかった場合には、外科的処置を施して癌病変を取り除くことと、
ＴＭＢスコアが予め決められた閾値を超過する場合には、免疫調節剤をヒト被験体に予め決められた期間にわたり投与して、癌細胞の根絶においてヒト被験体の免疫系を補助することによって免疫療法を行うための候補として被験体をトリアージすること（１０５４）と、
を含む。
【００７６】
免疫調節剤は、有利には、キメラ免疫受容体、プロスタサイクリン類似体、イロプロスト、Ｔ細胞のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ボリノスタット、ＨＤＡＣ阻害剤、コレカルシフェロール、カルシトリオール及びそれらの組合せからなる群から選択される薬剤であり得る。
【００７７】
この概念を支持するデータは現在開発中である。本方法はこれらの行動を含む：
１．Bailis et al.（５３）（PLoS One. 2013 Oct 29;8(10):e78726）は、ＮＣＩ−Ｈ２３肺腺癌細胞におけるＭＬＨ１遺伝子の発現をノックダウンして、ＭＭＲ欠損のない（proficient）細胞及びＭＭＲ欠損細胞の直接比較のために同質遺伝子系統を作製している。Bailis et al.の論文では、数週間の培養後に、ＭＭＲ欠損細胞が、癌細胞が高ＴＭＢを獲得し得る一般的な機構であるマイクロサテライト不安定性を示すことが報告された。ＮＣＩ−Ｈ２３細胞をＭＬＨ１  ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子（Santa Cruz Biotechnology社、ｓｃ−３５９４３−Ｖ）又はスクランブルｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子（Santa Cruz Biotechnology社、ｓｃ−１０８０８０）のいずれかで形質導入し、ピューロマイシンを使用して組込みに関して選択することによって、同様のアプローチを使用することができる。単一のピューロマイシン耐性細胞に由来するＭＬＨ１  ｓｈＲＮＡ形質導入クローンをウェスタンブロット分析により分析することで、ＭＬＨ１発現における９０％超の減少を伴うクローンをスクリーニングすることができる。コントロールのスクランブルｓｈＲＮＡ形質導入細胞からクローンを得ることもでき、ＭＬＨ１発現について分析することで、親ＮＣＩ−Ｈ２３細胞系統と同等のレベルを有するクローンをスクリーニングすることもできる。選択されたクローンを、培養で増殖させると共にアリコートを毎週採取し、更なる分析のためにエタノールベースの固定液中に固定することができる。固定された細胞の初期分析を使用することで、３００個を上回る癌関連遺伝子の包括的なゲノムプロファイルを生成するＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅアッセイ（Foundation Medicine, Inc.社）を使用してＴＭＢレベルを求めることができる。様々なＴＭＢレベルを有する細胞系統が識別されたら、それらをＶｉｓｉｏｎＧａｔｅ  Ｃｅｌｌ−ＣＴプラットフォームで分析し、コントロール細胞系統（親ＮＣＩ−Ｈ２３及びスクランブルｓｈＲＮＡを発現するクローン）と比較することで、識別された細胞の精度を検証することができる。
【００７８】
２．Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォームで処理することで、各同質遺伝子細胞系統について１細胞当たり７０４個の形態計測的バイオシグネチャーが生成される。これは、画像処理及び細胞分類について本明細書で記載された訓練技術及び特徴を使用して、３Ｄ顕微鏡法光トモグラフィーシステムプラットフォームを用いて行うことができる。
【００７９】
３．低ＴＭＢ及び高ＴＭＢをグラウンドトゥルースとして使用して、各同質遺伝子細胞系統についての細胞分類器を開発することができ、ＲＯＣの面積を各分類器について求めることができる。一般に、このプロセスは、対象の細胞についてのグラウンドトゥルースに一致するスコアを定義することを含む。この適用において、グラウンドトゥルースは、上記の項目２で定義されているように高ＴＭＢ及び低ＴＭＢである。分類プロセスは、グラウンドトゥルースに厳密に一致するスコアを生成することを目的としている。これを実現するために使用することができる幾つかの方法があり、それには以下のものが含まれる：
ａ．適応的ブースティング式ロジスティック回帰（５０）。この方法は主成分射影を使用して、射影軸を定義し、次いでロジット関数を通じてそれを使用することで、０〜１の範囲のスコアを生成する。このアルゴリズムは、グラウンドトゥルースと現在のスコアとの間の差による各観測値の重み付けにより連続的な試行を使用して繰り返される。この適応的プロセスは、１つの解に集約し、より広い細胞特性のセットを徐々にその解に集約する。
ｂ．ランダムフォレスト（５１）。このアプローチでは、特徴分布についてのノンパラメトリック推定を使用して分類器が生成される。適応的ブースティングの１つの限定は、主成分プロセスの背後にある特徴分布の推定にある。特徴は推定された分布に厳密に合致せず、射影を不正確にし得るので、これが問題となる可能性がある。このアプローチでは、ランダムなベクトルはランダムな長さで定義される。判別を評価し、特徴木の潜在的なセットをプルーニングして判別式を最適化する。
【００８０】
４．ＲＯＣ曲線下面積ａＲＯＣは、分類器の有効性を判定するために使用することができる。受信者操作特性曲線下面積、すなわちａＲＯＣは、分類の感度及び特異度に関する二値分類器出力の全性能を表すＲＯＣ曲線の積分をコンピューター処理することによって計算される。「感度」という用語は、分類器が「標的」又は陽性対象物として検出するように訓練された特性（又は特性のセット）を有する対象物を分類器が正しく分類する能力を指す。同様に、特異度は、分類器が標的特性を有しない対象物を「非標的」又は「陰性」として正しく分類する能力を表す。感度及び特異度はどちらも０〜１の範囲であり得て、できる限り１に近い両方のパラメーターで実行する分類器を有することが望ましい。分類器は各対象物（この場合には細胞）について出力として連続数（スコア、すなわち対象物が標的クラスに属する確率）を生成するが、陽性クラスと陰性クラスとを分離する閾値をスコアに適用することによって、更に該出力は二値化される。分類器が開発されたら、２つの対象物クラスを分離するために適用される閾値の関数として感度及び特異度の値を計算することによって、ＲＯＣ曲線が生成され得る。０〜１の範囲であり得るａＲＯＣ値は、分類器によって正しく分類された真陽性及び真陰性の対象物のパーセンテージを表す。一例では、真陽性の対象物は高ＴＭＢを有する細胞であり、真陰性は低ＴＭＢを有する細胞である。したがって、ａＲＯＣ＞０．９５は、低ＴＭＢ又は高ＴＭＢを有する全ての細胞の９５％超が、分類器によってそれ自体として正しく分類されることを意味する。
【００８１】
５．閾値を設定して分類器スコアと共に使用することで、高精度でグラウンドＴＢＭと相関する二値出力が生成される。
【００８２】
先の節で記載されたように、分類器は、典型的には、細胞が標的クラスに属する確率を表す数値スコアを生成する。標的細胞を非標的細胞から分離するために、スコア分布に閾値を適用することで更にスコアを二値にする。典型的には、閾値を超えるスコアは「陽性」又は標的細胞と考えられ、一方で、閾値を下回るスコアを有する対象物は「陰性」又は非標的細胞である。分類器の閾値の値はスコア分布の範囲全体にわたって変動し得るので、適切な数値を選択するための最終的なメトリックは、細胞を正しく区別（分類）するための分類器のできる限り高い精度である。本発明の場合には、閾値は、低ＴＭＢを有する細胞を、高ＴＭＢを有する細胞から分離するために０．９５以上の精度が得られるように決定される。ＴＭＢデータは、ＮＧＳ又はターゲット遺伝子パネルを利用した全エクソームシーケンシング又は標的化エクソームシーケンシングのいずれかを使用して実施されたゲノムプロファイリングから求められる。高ＴＭＢ値及び低ＴＭＢ値は、ＴＭＢ分布に基づいて求められる。典型的には、分布の８０パーセンタイルを超えるＴＭＢは高いと考えられるが、分布特性に応じて他のメトリックを適用することもできる。
【００８３】
分類器訓練−入力及び方法
細胞検出分類器の作成及び最適化は、そのプロセスが、参照又はグラウンドトゥルースに従って細胞を正確に診断することを目指すため、一般に、「分類器訓練（classifier training）」と呼ばれる。本明細書に記載される分類方法を使用して、細胞を、限定されるものではないが、正常、癌性及び異形成を含むタイプに分類することができる。精度に対して２つの主要な態様が存在する：第１は特異度であり（正常細胞は分類器によって正常と呼ばれる）、第２は感度である（異常細胞は分類器によって異常であると呼ばれる）。アルゴリズム訓練法は、適応的ブースティング式ロジスティック回帰及びランダムフォレストを含む。当業者は、テンプレート法、適応的処理等のような他の古典的な訓練技法を分類器にどのように適用するかをよく知っているであろう。
【００８４】
分類器を訓練するために使用される方法は、データが入力として使用される場合、著しく良好な成果を保証する。主に、分類器精度は、分類器訓練プロセスに対する入力が、細胞の臨床的に重要な態様を正確に記述し、光トモグラフィーシステム結果に影響を及ぼす可能性がある環境因子に対してロバストであるときに保証される：
１．Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）光トモグラフィーシステムによって生成される３次元細胞画像は、高い解像度を有し、正しい分類をサポートするクリティカルな特徴の的確な測定を可能にする。
２．分類において有用である幾つかの特徴は、３Ｄ画像においてのみ出現する。その結果、３Ｄ特徴セットは、細胞をより多く記述するだけでなく、３次元撮像に基づく分類を、２Ｄ撮像に対してより正確にする。
３．３次元画像区画化アルゴリズムは、背景から全細胞を、また、細胞から核を分離するために開発された。これらの区画化アルゴリズムの精度は、区画化済みトレースを、人間が導出する細胞又は核エンベロープトレースと比較することによって確認された。
４．特徴測定は、細胞、細胞核、細胞質、及び細胞核小体の種々の態様を記述する。試験システムの一例において、５９４の特徴が、各３Ｄ細胞画像についてコンピューター処理され、その特徴は、対象物の形状、容積、クロマチンの分布、及び、他のより微妙な形態計測的要素を表す。これらの特徴のコンピューター処理は、細胞の向きに無関係であると確認された。
５．分類器訓練についての診断的真理（病理学の至適基準）は、典型的には２人の細胞検査技師及び１人の細胞病理学者によって提供される階層的細胞診断に基づく。
【００８５】
分類器訓練−統計的考察
第２に、本明細書の発明者らによって実施される１つの試験において、分類器訓練プロセスの精度は、３つの態様を包含した厳密なプロセスを通して保証された：
１．分類器を訓練するために使用されたデータベースは、２項分布９５％信頼区間が、許容可能な限度内で性能推定の変動を維持することを保証するのに十分な材料を含むように形成された。
２．過剰訓練（over-training：過学習）は、訓練プロセスの考えられる１つの落とし穴であり、そこでは、多過ぎる情報が分類器内に含まれる可能性があるため、結果は、訓練において使用されるデータに過剰に専用化される可能性がある。この状況は、分類器性能について過剰に楽観的な推定を生成する。過剰訓練のリスクは、訓練データの一部を取得するとともにこれを試験データとして使用することを伴う交差検証によって軽減することができる。分類器において使用することができる情報量の限界は、訓練データに基づく性能推定が試験データによる推定を超える場合に達せられる。
３．最後に、過剰訓練に対する更なる保証として、分類器は、訓練プロセスの一部でなかった細胞の第２のセットによるデータに対して試験された。
【００８６】
異常細胞分類器訓練概要
以下の考察は、異常細胞分類器についての訓練を左右するパラメーターを規定するために使用された：
１．異常細胞試料が十分でなく、非診断要素が十分であるため、分類器は、高い感度及び非常に高い特異度で動作しなければならない。表２において述べるように、高い症例検出感度は、単一細胞分類器感度が７５％であり、標本が２つ以上の異常細胞を含むときに維持される。
２．ワークロードを保証することは、妥当な限界内で維持され、特異度についての目標は９９％に設定された。
３．下限２項分布９５％信頼限界（２１）についての区間は、感度について７０％超に、及び、特異度について９８．５％超に維持された。
【００８７】
最後に、高い検出率が、各陽性症例について所望される。単一細胞検出の感度は、表２に示す異常症例の検出につながる。
【００８８】
【表２】
2021509581.tif 000004
【００８９】
表２の示唆は、肺癌検出試験にとって重要である。この表に示す結果は、異常細胞が、肺癌検出試験によって分析される群内にある場合、異常細胞が確信をもって検出されるため、症例は高感度で識別されることになることを示す。これは、肺癌検出試験分析における異常細胞存在の問題を、癌検出率を決定する残りの因子として残す。
【００９０】
分類器開発及び特徴
一般に、特徴は、３Ｄトモグラムの種々の態様の数値表現を提供するためにコンピューター処理される。コンピューター処理される特徴は、対象物のエキスパート診断と共に使用されて、対象物タイプを区別することができる分類器を開発する。例えば、Ｍ個の３Ｄトモグラムを有するデータセットは、第１のタイプ、タイプ１の対象物についてコンピューター処理されてもよく、Ｎ個の３Ｄトモグラムを有するデータセットは、第２のタイプ、タイプ２の対象物についてコンピューター処理されてもよく、第１及び第２のタイプの対象物は、正常細胞及び異常細胞等である。ここで、「Ｍ」及び「Ｎ」はタイプ１及びタイプ２の値の数をそれぞれ表す。データセットは、好ましくは、光トモグラフィーシステムによって生成される。光トモグラフィーシステムは、例えば、細胞等の対象物の３Ｄ画像を含む３Ｄトモグラムを提供する。細胞は、通常、核小体等の細胞小器官を有する核等の他の特徴を含む。対象物タイプは、様々なタイプの細胞、細胞小器官、選択された疾病状態を示す細胞、プローブ、正常細胞、又はＴＭＢに関連する特徴等の対象の他の特徴を含んでもよい。ｘの３Ｄ画像特徴のセットは、全てのＭ＋Ｎの対象物についての３Ｄトモグラムに基づいてコンピューター処理される。次に、対象物タイプを最もよく判別するｙの３Ｄ画像特徴の洗練された特徴セットが見出される。ここで、「ｘ」及び「ｙ」は、各段階における３Ｄ画像特徴の数を表す。ｙの３Ｄ画像特徴の洗練された３Ｄ画像特徴セットが使用されて、その出力が対象物タイプに相関する分類器を構築する。１つの例示的な実施形態において、段階１０２において、３Ｄトモグラムのセットが組立てられ、組立てられたセットは、３Ｄ生物学的対象物タイプを区別するためにエキスパートによって使用されることになる実質的に全ての重要なマーカーを表す。３Ｄトモグラムの代表的なセットを組立てて、３Ｄ画像特徴セットは、重要なマーカーを特徴付ける各対象物についてコンピューター処理されてもよい。
【００９１】
特徴
細胞等の生物学的対象物のトモグラムは、複数の観測可能でかつ測定可能な特性を示し、その特性の一部は、分類用の特徴として使用されてもよい。以下の表３は、特徴、すなわち分類目的を果たすために使用される重要なマーカーの概要を提供する。
【００９２】
【表３】
2021509581.tif 000005
【００９３】
更なる説明として、１つの有用な例において、３Ｄ生物学的対象物内で発生するボイドは、計算済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここで分かった。ボイドに関連する別の特性は、対象物内のボイドの数を含んでもよい。ボイドに関連する別の特性は、ボイドの容積又はボイドの数を含む。更に別の特性は、ボイドの表面積又はボイドの数を含む。核間ボイドの形状及び場所も同様に、有用な特徴特性として使用されてもよい。さらに、特徴特性の組合せも同様に、本明細書において上記で述べた分類器を構築するために使用されてもよい。
【００９４】
同様に、３Ｄ生物学的対象物内で発生する陥入は、計算済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここで分かった。陥入に関連する別の特性は、対象物内の陥入の数を含んでもよい。陥入に関連する別の特性は、陥入の容積又は陥入の数を含む。更に別の特性は、陥入のサイズ又は陥入の数を含む。核陥入の場所も同様に、有用な特徴特性を含む。さらに、特徴特性の組合せも同様に、本明細書において上記で述べた分類器を構築するために使用されてもよい。
【００９５】
３Ｄ生物学的対象物内で発生する陥入は、計算済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここで分かった。陥入ボイドの容積、表面積、形状、陥入に接続されるボイドの場所、及び陥入特徴の組合せも同様に、有利には、本明細書において上記で述べた分類器を構築するために使用されてもよい。
【００９６】
３Ｄ生物学的対象物内で発生する核小体は、計算済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここで分かった。核小体又はクロマチン凝縮である可能性がある対象物の容積、表面積、形状、場所、及び上記特性の組合せも同様に、有利には、本明細書において上記で述べた分類器を構築するために使用されてもよい。３Ｄ生物学的対象物内で発生する核テキスチャ特徴は、有用な分類特徴であることがここで分かった。種々のサイズに作られた構造要素を使用して、ブラーレジデュー技法が使用されて、核内の種々のサイズに作られた特徴を分離する。ブラーレジデュー技法は、通常、フィルタを使用して画像をブラー処理し、マーキング操作を適用することによって、結果として得られるブラーレジデューを測定することを必要とする。全体の３Ｄ容積は、その後、離散的コンポーネントの数、容積ヒストグラム、平均容積及び分散、並びに形状ヒストグラムであるとしてコンピューター処理される。
【００９７】
核小体と、陥入と、ボイドと、核エンベロープとの間の空間的関係を記述する距離メトリックは、有用な分類特徴であることがここで分かった。例えば、３つの核小体が見出される場合、平均及び分散の、また、最小及び最大の核小体間距離が見出される場合がある。同様に、核小体のクラスタについての平均座標と対象物全体についての質量中心との間の距離も見出される場合がある。同様の計算は、核小体及び核の質量中心を上記エンティティのうちの任意のエンティティに置き換えることによって形成されてもよい。
【００９８】
高速フーリエ変換（ＦＦＴ：Fast Fourier Transform）特徴は、同様に有用な分類特徴であることがここで分かった。ＦＦＴ特徴は、３Ｄトモグラムの高速フーリエ変換によって形成される。ＦＦＴ特徴は、ＦＦＴ分類の顕著な、また平均的な特性を特徴付ける。
【００９９】
本発明は、特許法に適合し、本発明の新規な原理を適用するために必要とされる情報を当業者に提供し、必要とされる例示的でかつ専用のこうしたコンポーネントを構築し使用するために、本明細書でかなり詳細に述べられた。しかし、本発明が異なる機器及びデバイスによって実施されてもよいこと、及び、機器の詳細及び動作手順の両方について、種々の修正が、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく達成されてもよいことが理解される。
【０１００】
以下の出版物の開示は、引用することにより本明細書の一部をなす。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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