(57)【要約】本願は、遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の水稲の有効分げつ数の増加における使用を提供する。遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０は、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示され、水稲におけるＭＯＣ１と相互作用するタンパク質をコードし、水稲に遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０を過剰発現させることにより、水稲の有効分げつ数が増加する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の水稲の有効分げつ数の増加における使用であって、前記遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物分子遺伝学の分野に属し、具体的には、遺伝子の水稲の有効分げつ数の増加における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
水稲の収量・性状は、主に単位面積あたりの有効穂数、一穂籾数及び千粒重などの基本的要素から成り立ち、それらの基本的要素が直接に水稲の単位面積あたりの収量を決定する。水稲の有効穂数は分げつ数に直接関連する。分げつは、水稲などのイネ科植物が地下または地表面付近に枝分れすることであり、穂を出して結実する分げつは有効分げつと呼ばれ、穂を出せずまたは穂を出しても結実できない分げつは無効分げつと呼ばれ、水稲の有効分げつ数は、直接に有効穂数を決定する。
【０００３】
現在、研究により、水稲の分げつは複数の遺伝子によって制御され、その中で転写因子ＭＯＣ１とその相互作用タンパクＴＡＤ１が水稲の分げつを制御する主な制御因子であり、分げつの芽の出現、成長及び発育などの段階を制御することが示されている。研究により、水稲ｍｏｃ１突然変異体は、単一の分げつだけを発生するが、突然変異体ｔａｄ１は、分げつ数が著しく増加する。ＴＡＤ１はＭＯＣ１の上流で作用してＭＯＣ１とタンパク質複合体を形成し、ユビキチンプロテアソーム経路を介してＭＯＣ１を分解することにより、水稲の分げつ数を制御する。
【０００４】
発明名称が「
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（水稲の高光合成効率に関する遺伝子及びその使用）」である中国特許出願第２０１７１１４６９００３Ｘ号では、当該遺伝子が、水稲の光合成促進、具体的には水稲の葉身におけるクロロフィルａ（Ｃｈｌａ）及びクロロフィルｂ（Ｃｈｌｂ）の増加の促進に用いられることが報告されている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の解決しようとする課題は、遺伝子の水稲の有効分げつ数の増加における使用を提供することである。
【０００６】
上記の課題を解決するために、本発明は、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示される遺伝子の水稲の有効分げつ数の増加における使用を提供する。
【０００７】
水稲に当該遺伝子を過剰発現させることにより、水稲の有効分げつ数が大幅に増加する。
【０００８】
本発明の技術案は、具体的に下記の通りである。
【０００９】
本発明は、水稲のｃＤＮＡからＰＣＲによって遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を増幅させ、当該遺伝子の過剰発現ベクターを構築し、アグロバクテリウム媒介導入法によってこのベクターを野生型水稲品種日本晴へ形質転換し、二つの陽性の過剰発現株ＯＥ１とＯＥ２が同定され、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲによってこの二つの過剰発現株における遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の発現量を検出したところ、それらの発現量がいずれも対照の野生型日本晴より有意に高い（図１）。水稲の成熟期において、当該二つの過剰発現株の有効分げつ数はいずれも対照の野生型日本晴より有意に高い（図２、３）。水稲において遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の発現レベルを向上させることにより、水稲の有効分げつ数を効果的に促進させることが示されている。
【００１０】
また、発明名称が「
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」である中国特許出願第２０１７１１４６９００３Ｘ号では、当該遺伝子が、水稲の光合成促進に用いられることが報告されているが、本分野の常識に基づき、水稲の光合成促進による性能上の利点は、一般的に、純光合成速度を高めることにより水稲収量を向上させることであり、水稲の有効分げつ数の増加には必然的な関係がない。
【００１１】
水稲の光合成過程に関与する既存の遺伝子ＰＧＬ１１、ＣＯＩ１ｂは、植物の分げつ数に明らかな影響を及ぼさず、さらにＭＯＣ１、ＭＯＣ２、ＴＡＤ１、ＬＡＸ１、ＬＡＸ２、Ｄ５３及びＤ１４などの水稲分げつの発育の制御に関与する遺伝子も、水稲の葉身の光合成効率に明らかな影響を及ぼさない。よって、発明名称が「
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」である中国特許出願第２０１７１１４６９００３Ｘ号は、本発明に技術的示唆を提供することができない。
【００１２】
上記のように、本発明は、水稲において、遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０でコードされる、ＭＯＣ１と相互作用するタンパク質を新たに同定し、水稲に遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０を過剰発現させることにより、水稲の有効分げつ数が大幅に増加し、水稲の高収量育種において潜在的な応用価値があることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
以下、図面と併せて、本発明の具体的な実施形態をさらに詳しく説明する。
【図１】水稲の遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０過剰発現株における遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の発現量の解析を示す図である。
【図２】水稲の遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０過剰発現株の植物の表現型を示す図である。
【図３】水稲の遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０過剰発現株の有効分げつ数の統計を示す図である。
【００１４】
ここで、ＷＴは対照の野生型日本晴であり、ＯＥ１とＯＥ２はそれぞれ遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の二つの過剰発現株である。＊とはｔ検定に有意差（ｐ＜０．０５）があることを示し、＊＊とはｔ検定に顕著な有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
工程１、水稲の全ＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）を用いて、製品の説明書に従って、水稲野生型品種日本晴の葉身から全ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ、日本）によってｃＤＮＡに逆転写し、その方法については製品の説明書に従って操作する。
【００１６】
工程２、ＰＣＲによる遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の増幅
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ、日本）を用いて、ＰＣＲを行って増幅させる。遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０のＰＣＲの上流プライマー、下流プライマーの配列は、Ｆ１：５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＡＧＣＡＧＴＧＡＧ−３’とＲ１：５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＣＧＧＣＡＣＡＴ−３’である。反応系の設定は、製品の説明書に従って操作し、ＰＣＲ法のプログラムについては、９５℃で５ｍｉｎのプレ変性を行う；９８℃で１０ｓｅｃの変性、５５℃で１５ｓｅｃのアニーリング、７２℃で３０ｓｅｃの伸長を３０サイクル行う；７２℃で５ｍｉｎの伸長を行う。
【００１７】
工程３、遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０のＰＣＲ産物の酵素切断及びホモ接合
まず、ＡｘｙＰｒｅｐ  ＰＣＲクリンナップキット（Ａｘｙｇｅｎ、アメリカ）でＰＣＲ産物を精製し、その方法については製品の説明書に従って行う。次に、ＴａＫａＲａ社（日本）の制限酵素Ｋｐｎ  ＩとＰｓｔ  Ｉでダブルダイジェスト（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を行う。酵素切断反応系については、Ｋｐｎ  ＩとＰｓｔ  Ｉそれぞれ１μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ（ＴａＫａＲａ社製制限酵素Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ）３μＬ、ＰＣＲ産物１０μＬ、ｄｄＨ２Ｏで２０μＬにメスアップし、３７℃で４ｈ酵素切断する。最後、ＡｘｙＰｒｅｐ  ＰＣＲクリンナップキット（Ａｘｙｇｅｎ、アメリカ）でＰＣＲ産物を精製し、その方法については製品の説明書に従って行う。
【００１８】
工程４、ｐＣＡＭＢＩＡ−１３００−２×３５Ｓベクターの酵素切断及びホモ接合
工程３の方法に従ってｐＣＡＭＢＩＡ−１３００−２×３５Ｓベクタープラスミドに対してダブルダイジェスト及び精製を行う。
【００１９】
工程５、遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０過剰発現ベクターの構築
１、Ｐｒｏｍｅｇａ社（アメリカ）製Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、工程３及び工程４で得られた精製物を連結し、連結反応系については、酵素切断されたベクタープラスミド１μＬ、酵素切断された標的遺伝子の断片２μＬ、Ｔ４リガーゼ０．５μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ１μＬ、ｄｄＨ２Ｏで１０μＬにメスアップし、４℃で一晩放置する（１２時間）。
２、ステップ１で得られた連結産物１０μＬを取って、ＪＭ１０９コンピテントセルと氷上で３０ｍｉｎコインキュベートし、４２℃で９０ｓｅｃヒートショックをし、すぐに１０ｍｉｎ氷浴する。抗生物質を含まないＬＢ培地を８００μＬ添加してから、３７℃の恒温で１ｈ振盪培養した後、菌液を均一にカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）耐性含有固体平板培地に塗り付け、３７℃で一晩放置する。
３、平板培地で成長したシングルコロニーを選取し、試験管に入れたカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）耐性含有ＬＢ液体培地４ｍＬに、振とう機に３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養する。２×Ｔａｑ  ＰＣＲプレミックス試薬（天根、北京）でＰＣＲによって菌液を検証し、反応系については、菌液１μＬ、２×Ｔａｑ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘＩＩ１０μＬ、Ｆ１＋Ｒ１プライマー（１０μＭ）１μ、ｄｄＨ２Ｏで２０μＬにメスアップする。ＰＣＲ法のプログラムについては、９４℃で５ｍｉｎのプレ変性を行う；９４℃で３０ｓｅｃの変性、５５℃で３０ｓｅｃのアニーリング、７２℃で３０ｓｅｃの伸長を３０サイクル行う；７２℃で５ｍｉｎの伸長を行う。反応終了後、反応液を５μＬ取ってアガロースゲル電気泳動により検出する。
４、ＰＣＲによって同定された陽性クローンコロニーをバイオテック会社へ郵送し、ｐＣＡＭＢＩＡ−１３００のユニバーサルプライマーとしてのＰ１：５’−ＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣ−３’とＰ２：５’−ＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣ−３’を用いてシークエンスを行い、挿入されたすべての遺伝子に対してシークエンスを行うことにより、遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０過剰発現ベクターを得る。
即ち、当該遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０過剰発現ベクターには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
工程６、水稲への形質転換
Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ、２００６）などの方法によって上記のように構築された過剰発現ベクターを水稲野生型品種日本晴へ形質転換し、遺伝子組み換え水稲を得る。
【００２１】
工程７、遺伝子組み換え水稲の同定
工程１の方法に従って、遺伝子組み換え株の葉身から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成する。遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０のＰＣＲプライマーとしてのＦ２：５’−ＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＧＴＣ−３’、Ｒ２：５’−ＴＡＧＣＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＧ−３’を用いて、遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の発現に対してＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ解析をする。ＴａＫａＲａ社製ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  ＩＩキットを用いる。反応系については、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）  ＩＩ１０μＬ、ｃＤＮＡテンプレート２μＬ、Ｆ２＋Ｒ２プライマー１０μＭ  １μＬ、ＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ０．４μＬ、ｄｄＨ２Ｏで２０μＬにメスアップする。水稲遺伝子Ａｃｔｉｎを内部標準とし、ＰＣＲプライマーが、Ｆ２’：５’−ＴＧＧＣＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣ−３’、Ｒ２’：５’−ＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡ−３’である。ＰＣＲプログラムについては、９５℃で３０ｓｅｃのプレ変性を行う；９５℃で５ｓｅｃの変性、６０℃で３０ｓｅｃのアニーリング／伸長を４０サイクル行う。サンプルごとに３回繰り返し、２−ΔΔＣＴ方法によりデータを処理し、ｔ検定法で遺伝子組み換え水稲と対照の野生型との有意差を分析する。
【００２２】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ解析により、遺伝子組み換え株に二つの遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の高発現株ＯＥ１とＯＥ２が同定され、それらの発現量はいずれも対照の野生型日本晴より有意に高い（図１）。
【００２３】
工程８、遺伝子組み換え水稲の有効分げつ数の統計
金華の水田に、５月上旬に播種し、６月上旬に田植えを行い、通常のように水稲を栽培する。水稲の成熟期（同年１０月）に、ＯＥ１遺伝子組み換え株、ＯＥ２遺伝子組み換え株、及び対照の野生型日本晴を、それぞれ２０株無作為に選取し、それらの有効分げつ数を統計し、統計の結果では、ｔ検定法で遺伝子組み換え株と対照の野生型との有意差を分析する。
【００２４】
その結果として、ＯＥ１とＯＥ２遺伝子組み換え株の有効分げつ数は、いずれも対照の野生型株より有意に高い（図２、図３）。
【００２５】
最後、上記に例示されたものは、本発明のいくつかの具体的な実施例にすぎずない。本発明は上記実施例に限定されるものではなく、いろいろな変形が可能である。当業者は本発明の開示内容から直接推定または想到しうる全ての変形は、いずれも本発明の保護範囲に属すものであることにご注意ください。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月24日(2021.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
現在、研究により、水稲の分げつは複数の遺伝子によって制御され、その中で転写因子ＭＯＣ１とその相互作用タンパクＴＡＤ１が水稲の分げつを制御する主な制御因子であり、分げつの芽の出現、成長及び発育などの段階を制御することが示されている。研究により、水稲ｍｏｃ１突然変異体は、単一の分げつだけを発生するが、ｔａｄ１突然変異体は、分げつ数が著しく増加する。ＴＡＤ１はＭＯＣ１の上流で作用してＭＯＣ１とタンパク質複合体を形成し、ユビキチンプロテアソーム経路を介してＭＯＣ１を分解することにより、水稲の分げつ数を制御する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明は、水稲のｃＤＮＡからＰＣＲによって遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を増幅させ、当該遺伝子の過剰発現ベクターを構築し、アグロバクテリウム媒介導入法によってこのベクターを野生型水稲品種日本晴へ形質転換し、二つの陽性の過剰発現株ＯＥ１とＯＥ２が同定され、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲによってこの二つの過剰発現株における遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の発現量を検出したところ、それらの発現量がいずれも対照の野生型水稲品種日本晴より有意に高い（図１）。水稲の成熟期において、当該二つの過剰発現株の有効分げつ数はいずれも対照の野生型水稲品種日本晴より有意に高い（図２、３）。水稲において遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の発現レベルを向上させることにより、水稲の有効分げつ数を効果的に増加させることが示されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
ここで、ＷＴは対照の野生型水稲品種日本晴であり、ＯＥ１とＯＥ２はそれぞれ遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の二つの過剰発現株である。＊とはｔ検定に有意差（ｐ＜０．０５）があることを示し、＊＊とはｔ検定に顕著な有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
工程１、水稲の全ＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）を用いて、製品の説明書に従って、野生型水稲品種日本晴の葉身から全ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ、日本）によってｃＤＮＡに逆転写し、その方法については製品の説明書に従って操作する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
工程３、遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０のＰＣＲ産物の酵素切断及び精製
まず、ＡｘｙＰｒｅｐ  ＰＣＲクリンナップキット（Ａｘｙｇｅｎ、アメリカ）でＰＣＲ産物を精製し、その方法については製品の説明書に従って行う。次に、ＴａＫａＲａ社（日本）の制限酵素Ｋｐｎ  ＩとＰｓｔ  Ｉでダブルダイジェスト（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を行う。酵素切断反応系については、Ｋｐｎ  ＩとＰｓｔ  Ｉそれぞれ１μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ（ＴａＫａＲａ社製制限酵素Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍ）３μＬ、ＰＣＲ産物１０μＬ、ｄｄＨ２Ｏで２０μＬにメスアップし、３７℃で４ｈ酵素切断する。最後、ＡｘｙＰｒｅｐ  ＰＣＲクリンナップキット（Ａｘｙｇｅｎ、アメリカ）でＰＣＲ産物を精製し、その方法については製品の説明書に従って行う。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
工程４、ｐＣＡＭＢＩＡ−１３００−２×３５Ｓベクターの酵素切断及び精製
工程３の方法に従ってｐＣＡＭＢＩＡ−１３００−２×３５Ｓプラスミドベクターに対してダブルダイジェスト及び精製を行う。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
工程５、遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０過剰発現ベクターの構築
１、Ｐｒｏｍｅｇａ社（アメリカ）製Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、工程３及び工程４で得られた精製物を連結し、連結反応系については、酵素切断されたプラスミドベクター１μＬ、酵素切断された標的遺伝子の断片２μＬ、Ｔ４リガーゼ０．５μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ１μＬ、ｄｄＨ２Ｏで１０μＬにメスアップし、４℃で一晩放置する（１２時間）。
２、ステップ１で得られた連結産物１０μＬを取って、ＪＭ１０９コンピテントセルと氷上で３０ｍｉｎコインキュベートし、４２℃で９０ｓｅｃヒートショックをし、すぐに１０ｍｉｎ氷浴する。抗生物質を含まないＬＢ培地を８００μＬ添加してから、３７℃の恒温で１ｈ振盪培養した後、菌液を均一にカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）含有固体平板培地に塗り付け、３７℃で一晩放置する。
３、平板培地で成長したシングルコロニーを選取し、試験管に入れたカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢ液体培地４ｍＬに接種し、振とう機に３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養する。２×Ｔａｑ  ＰＣＲプレミックス試薬（天根、北京）でＰＣＲによって菌液を検証し、反応系については、菌液１μＬ、２×Ｔａｑ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘＩＩ１０μＬ、Ｆ１＋Ｒ１プライマー（１０μＭ）１μＬ、ｄｄＨ２Ｏで２０μＬにメスアップする。ＰＣＲ法のプログラムについては、９４℃で５ｍｉｎのプレ変性を行う；９４℃で３０ｓｅｃの変性、５５℃で３０ｓｅｃのアニーリング、７２℃で３０ｓｅｃの伸長を３０サイクル行う；７２℃で５ｍｉｎの伸長を行う。反応終了後、反応液を５μＬ取ってアガロースゲル電気泳動により検出する。
４、ＰＣＲによって同定された陽性クローンコロニーをバイオテック会社へ郵送し、ｐＣＡＭＢＩＡ−１３００のユニバーサルプライマーとしてのＰ１：５’−ＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣ−３’とＰ２：５’−ＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣ−３’を用いてシークエンスを行い、挿入された遺伝子配列を双方向シーケンシングにより検証し、遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０過剰発現ベクターを得る。
即ち、当該遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０過剰発現ベクターには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列を含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
工程６、水稲への形質転換
Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ、２００６）などの方法によって上記のように構築された過剰発現ベクターを野生型水稲品種日本晴へ形質転換し、遺伝子組み換え水稲を得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
工程７、遺伝子組み換え水稲の同定
工程１の方法に従って、遺伝子組み換え株の葉身から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成する。遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０のＰＣＲプライマーとしてのＦ２：５’−ＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＧＴＣ−３’、Ｒ２：５’−ＴＡＧＣＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＧ−３’を用いて、遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の発現に対してＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ解析をする。ＴａＫａＲａ社製ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  ＩＩキットを用いる。反応系については、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）  ＩＩ１０μＬ、ｃＤＮＡテンプレート２μＬ、Ｆ２＋Ｒ２プライマー（１０μＭ）１μＬ、ＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ０．４μＬ、ｄｄＨ２Ｏで２０μＬにメスアップする。水稲遺伝子Ａｃｔｉｎを内部標準とし、ＰＣＲプライマーが、Ｆ２’：５’−ＴＧＧＣＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣ−３’、Ｒ２’：５’−ＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡ−３’である。ＰＣＲプログラムについては、９５℃で３０ｓｅｃのプレ変性を行う；９５℃で５ｓｅｃの変性、６０℃で３０ｓｅｃのアニーリング／伸長を４０サイクル行う。サンプルごとに３回繰り返し、２−ΔΔＣＴ方法によりデータを処理し、ｔ検定法で遺伝子組み換え水稲と対照の野生型水稲品種日本晴との有意差を分析する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ解析により、遺伝子組み換え株に二つの遺伝子ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３８６８０の高発現株ＯＥ１とＯＥ２が同定され、それらの発現量はいずれも対照の野生型水稲品種日本晴より有意に高い（図１）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
工程８、遺伝子組み換え水稲の有効分げつ数の統計
金華の水田に、５月上旬に播種し、６月上旬に田植えを行い、通常のように水稲を栽培する。水稲の成熟期（同年１０月）に、ＯＥ１遺伝子組み換え株、ＯＥ２遺伝子組み換え株、及び対照の野生型水稲品種日本晴を、それぞれ２０株無作為に選取し、それらの有効分げつ数を統計し、統計の結果では、ｔ検定法で遺伝子組み換え株と対照の野生型水稲品種日本晴との有意差を分析する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
その結果として、ＯＥ１とＯＥ２遺伝子組み換え株の有効分げつ数は、いずれも対照の野生型水稲品種日本晴より有意に高い（図２、図３）。
【国際調査報告】
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