(57)【要約】  本発明は、ヒトおよびマウスＲＯＲ１を特異的に認識する抗−ＲＯＲ１抗体を提供する。本発明に係る単クローン抗体は腫瘍を抑制して癌治療剤としてはもちろん、特異的結合によりＲＯＲ１を発現する多様な癌の検出および特定の癌への薬物伝達などを含む癌標的治療に有用に使用できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体またはその抗原結合断片であって、
前記抗体または抗原結合断片は（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３重鎖相補性決定部位および（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の軽鎖相補性決定部位を含み、
前記ＣＤＲＨ１は配列番号１〜５から選択されるいずれか１つであり；
前記ＣＤＲＨ２は配列番号６〜１３および９６から選択されるいずれか１つであり；
前記ＣＤＲＨ３は配列番号１４〜２１および９７から選択されるいずれか１つであり；
前記ＣＤＲＬ１は配列番号２２〜２９から選択されるいずれか１つであり；
前記ＣＤＲＬ２は配列番号３０〜３７から選択されるいずれか１つであり；および
前記ＣＤＲＬ３は配列番号３８〜４２から選択されるいずれか１つである、ＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の配列は、次のうちのいずれか１つの組み合わせである、請求項１に記載のＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、６および１４；
（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、７および１５；
（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、８および１６；
（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、９および１７；
（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、１０および１８；
（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号４、１１および１９；
（ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５、１２および２０；
（ｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、１３および２１；
（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、９６および１５；または
（ｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、９および９７。
【請求項３】
前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の配列は、次のうちのいずれか１つの組み合わせである、請求項１に記載のＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２２、３０および３８；
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１および３９；
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２４、３２および４０；
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３３および４１；
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２６、３４および４１；
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２７、３５および４２；
（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２８、３６および４１；または
（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２９、３７および４１。
【請求項４】
前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３；および前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の配列は、次のうちのいずれか１つの組み合わせである、請求項１に記載のＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、６および１４であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２２、３０および３８；
（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、７および１５であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１および３９；
（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、８および１６であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２４、３２および４０；
（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、９および１７であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３３および４１；
（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、１０および１８であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２６、３４および４１；
（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号４、１１および１９であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２７、３５および４２；
（ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５、１２および２０であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２８、３６および４１；
（ｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、１３および２１であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２９、３７および４１；
（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、９６および１５であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１および３９；または
（ｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、９および９７であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３３、および４１。
【請求項５】
前記抗体または抗原結合断片は、
（１）配列番号４３〜５０、９８および９９から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（２）配列番号５１〜５８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体または抗原結合断片は、
下記配列で表される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む、請求項５に記載のＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体またはその抗原結合断片：
配列番号４３および５１；配列番号４４および５２；配列番号４５および５３、配列番号４６および５４、配列番号４７および５５、配列番号４８および５６、配列番号４９および５７、配列番号５０および５８、配列番号９８および５２、または配列番号９９および５４。
【請求項７】
前記抗体または抗原結合断片は単クローン抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記ＲＯＲ１はヒト、サルまたはマウスＲＯＲ１である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体またはその抗原結合断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦＶ、ｓｃＦＶ−Ｆｃ、ミニボディ、ダイアボディ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、２価抗体または多価抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコーディングする分離された、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコーディングするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された、細胞株。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、ＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患の治療または予防用薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、ＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患の治療または予防用薬学的組成物であって、
前記ＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患は癌である、薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をＲＯＲ１発現の検出を必要とする生物学的試料と接触させる段階を含む、生物学的試料においてのＲＯＲ１の検出方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を生物学的試料と接触する段階、および
前記生物学的試料で、前記抗体またはその抗原結合断片と接触した対照群と比較してＲＯＲ１の存在またはＲＯＲ１の濃度が増加した場合、生物学的試料または前記生物学的試料を採取した患者をＲＯＲ１の過剰発現関連の疾患と判断する段階を含む、
ＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患を診断する方法であって、
前記ＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患は癌である、方法。
【請求項１９】
ＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患の治療または予防方法であって、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を前記疾患の治療または予防を必要とする被験者に投与する段階を含む、方法。
【請求項２０】
前記ＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患は癌である、請求項１９に記載のＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患の治療または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗−ＲＯＲ１抗体またはその抗原結合断片およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＯＲ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ−Ｌｉｋｅ  Ｏｒｐｈａｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、ＲＴＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ）ファミリーの膜貫通タンパク質であって、ＲＯＲ１とＲＯＲ２がある。ＲＯＲ１とＲＯＲ２は５８％のアミノ酸配列相同性を有しており、２つのタンパク質の理論上の分子量は約１０４ｋＤａであるが、ＲＯＲ１の場合多数のＮ−グリコシル化部位によって分子量が約１３０ｋＤａである。ＲＯＲファミリーの細胞外ドメインはＩｇ、システイン−豊富、およびクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメインで構成されており、細胞内ドメインはチロシンキナーゼ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ豊富、プロリン豊富ドメインからなる（Ｂｏｒｃｈｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ，５：４９６，Ｒｅｂａｇａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２：１）。生物学的特徴の側面から、ＲＯＲ２のリガンドはＷｎｔ５ａであるが、ＲＯＲ１のリガンドはまだ明らかになっていない。また、ＲＯＲ２の場合キナーゼ活性がある反面、ＲＯＲ１は偽キナーゼ（ｐｓｅｕｄｏｋｉｎａｓｅ）であると推定される。ＲＯＲ１自体の燐酸化はＭｅｔの活性と緊密な関連があると知られている（Ｇｅｎｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １５：２３０５）。
【０００３】
ＲＯＲ１は、胚芽および胎児発生過程で発現して細胞極性、細胞移動および神経細胞の突起伸長などを調節する。発生の進行に伴って発現が漸次減少し、成体ではほとんど発現せず、Ｂ細胞の発達過程で一時的に発現し、脂肪細胞で若干の発現だけが報告されている（Ｈｕｄｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｌｏｏｄ  １１６：４５３２，Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．１０５：１５３）。
【０００４】
しかし、多様な癌細胞でＲＯＲ１の過剰発現が観察されることによって胎児性発がん遺伝子（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ｇｅｎｅ）に分類された。特に、ＲＯＲ１は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ：ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）に過剰発現することが明らかになり、抗癌抗体ターゲットとして注目をあび始めた（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９４：１６２５，Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９４：１６３９）。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）以外にもＢ細胞白血病、リンパ腫、急性骨髄性白血病（Ａｍｌ）、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）などの血液癌はもちろん、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、皮膚癌、膀胱癌、精巣癌、子宮癌、前立腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、神経芽細胞腫、脳癌、結腸癌、扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、子宮頸癌、甲状腺癌、頭頸部癌および副腎癌などの多様な固形癌でも過剰発現されることが報告された。このような癌でＲＯＲ１の発現は癌患者の予後との関連があり、癌転移にも影響を与えることが知られている。ＲＯＲ１の発現を抑制した癌細胞をマウスに注入すれば生存期間が延長し、転移程度も低くなることが明らかになった（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１８１：１９０３，Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３１１２７，Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３：３６４９，Ｂａｓｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ｍＡｂｓ  ４：３４９，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２１：３４８，Ａｇｈｅｂａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｃｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２２：６５６，Ｄａｎｅｓｈｍａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２３：１１９０，Ｄａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ７：ｅ５２６５５，Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：３０４７）。
【０００５】
このようなＲＯＲ１の癌細胞特異的発現はＲＯＲ１が効果的な癌標的となることができ、これを特異的に認識する抗体を開発することが必要とされる。
米国特許第９、３１６、６４６号は抗−ＲＯＲ１抗体に関し、ヒト細胞外領域ＲＯＲ１を特異的に認識できる単クローン抗体が開示されている。
米国特許第９、２６６、９５２号はＲＯＲ１に対する抗体およびその用途に関し、ＣＬＬ細胞に特異的に結合して、ＣＬＬ死滅を誘導する抗体が開示されている。
同じＲＯＲ１抗原に対する抗体でも各抗体の特性または用途により多様な抗癌抗体に開発が可能であるため、このようなＲＯＲ１の癌特異的発現、多様な癌での発現を考慮すれば、既存の抗体を代替または補完できる多様な抗体の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＲＯＲ１を特異的に認識できるタンパク質、例えば抗体またはその抗原結合断片を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施形態は、ＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する分離された抗体、その抗原結合断片およびその用途を提供する。特に本明細書に開示される抗体は、ヒトＲＯＲ１を特異的に認識し、サルとマウスＲＯＲ１に対する交差反応性を示す。
【０００８】
一実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の重鎖相補性決定領域および／または（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の軽鎖相補性決定領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号１〜５から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなり；前記ＣＤＲＨ２は配列番号６〜１３および９６から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなり；前記ＣＤＲＨ３は配列番号１４〜２１および９７から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなり、前記ＣＤＲＬ１は配列番号２２〜２から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなり；前記ＣＤＲＬ２は配列番号３０〜３７から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなり；前記ＣＤＲＬ３は配列番号３８〜４２から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなる。ＣＤＲＨは、重鎖可変領域に含まれているＣＤＲを示し、ＣＤＲＬは、軽鎖可変領域に含まれているＣＤＲを示す。
【０００９】
本発明の他の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の相補的決定領域を含む重鎖可変領域および／または（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の相補的決定領域を含む軽鎖可変領域を含むことができ、前記ＣＤＲＨ１は配列番号１〜５から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなり；前記ＣＤＲＨ２は配列番号６〜１３および９６から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなり；前記ＣＤＲＨ３は配列番号１４〜２１および９７から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなり、前記ＣＤＲＬ１は配列番号２２〜２９から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなり；前記ＣＤＲＬ２は配列番号３０〜３７から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなり；前記ＣＤＲＬ３は配列番号３８〜４２から選択されるいずれか１つを含むか、必須に含んでなる。
【００１０】
本発明の他の実施形態において、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、以下から選択される組み合わせであってもよい：順に、配列番号１、６および１４；配列番号２、７および１５；配列番号１、８および１６；配列番号３、９および１７；配列番号１、１０および１８；配列番号４、１１および１９；配列番号５、１２および２０；配列番号３、１３および２１；配列番号２、９６および１５；または配列番号３、９および９７。
【００１１】
本発明の他の実施形態において、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、以下から選択される組み合わせであってもよい：順に、配列番号２２、３０および３８；配列番号２３、３１および３９；配列番号２４、３２および４０；配列番号２５、３３および４１；配列番号２７、３５および４２；配列番号２８、３６および４１；または配列番号２９、３７および４１。
【００１２】
本発明の他の実施形態において、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３；および前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の配列は、以下のうちのいずれか１つの組み合わせである：
（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、６および１４であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２２、３０および３８；
（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、７および１５であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１および３９；
（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、８および１６であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２４、３２および４０；
（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、９および１７であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３３および４１；
（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、１０および１８であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２６、３４および４１；
（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号４、１１および１９であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２７、３５および４２；
（ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５、１２および２０であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２８、３６および４１；
（ｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、１３および２１であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２９、３７および４１；
（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、９６および１５であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１および３９；または
（ｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、９および９７であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３３および４１。
【００１３】
本発明の他の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、次の配列で表される重鎖可変領域を含むことができる：配列番号４３〜５０、９８および９９から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列。
【００１４】
本発明の他の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、次の配列で表される軽鎖可変領域を含むことができる：配列番号５１〜５８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列。
【００１５】
本発明の他の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、次の配列で表される重鎖および軽鎖可変領域の組み合わせを含むことができる：配列番号４３および５１；配列番号４４および５２；配列番号４５および５３；配列番号４６および５４；配列番号４７および５５；配列番号４８および５６；配列番号４９および５７；配列番号５０および５８；配列番号９８および５２；または配列番号９９および５４。
【００１６】
本明細書に開示される抗体または抗原結合断片は、ヒト化抗体、ヒト抗体（例えば、完全なヒト抗体）、または抗原結合断片であってもよく、サルＲＯＲ１およびマウスＲＯＲ１に交差反応性を有する。前記抗体または抗原結合断片は、非自然的に発生可能であり、例えば合成または組換えであってもよいが、これに限定されない。
【００１７】
本発明の他の実施形態において、前記抗体は単クローン抗体、特にヒト単クローン抗体であってもよく、サルＲＯＲ１およびマウスＲＯＲ１に交差反応性を有する。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、ヒトＲＯＲ１、サルＲＯＲ１、および／またはマウスＲＯＲ１を特異的に認識することができる。
本発明の他の実施形態において、前記抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型でありうる。
【００１９】
本発明の他の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦＶ、ｓｃＦＶ−Ｆｃ、ミニボディ、ダイアボディ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、２価抗体または多価抗体を含み、これらに限定されない。
【００２０】
本発明の他の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片をコーディングする分離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００２１】
本発明の他の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲで構成される群より選択された少なくとも１つをコーディングするポリヌクレオチドであり、例えば、前記重鎖ＣＤＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含み、および／または前記軽鎖ＣＤＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む。
【００２２】
本発明の他の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、本発明に開示された重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコーディングするポリヌクレオチドでありうる。
【００２３】
本発明の他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本発明に開示された重鎖および／または軽鎖をコーディングするポリヌクレオチドでありうる。他の実施形態においては、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一実施形態において、前記ベクターは、抗体産生のための発現ベクターまたはＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）またはＣＡＲ−ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞のためのベクターを含むことができる。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、前記ベクターによって形質転換された細胞株を提供する。
さらに他の実施形態は、ＲＯＲ１に特異的に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供し、前記製造方法は、前記細胞株から前記抗体またはその抗原結合断片を分離する段階を含む。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、前記抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００２６】
一実施形態において、前記組成物は病気、例えば癌治療および／または予防用組成物である。
【００２７】
さらに他の実施形態は、前記抗体または抗原結合断片をＲＯＲ１発現の検出を必要とする生物学的試料と接触させる段階を含む、生物学的試料でＲＯＲ１の検出方法を提供する。前記方法は、接触段階後に前記抗体または抗原結合断片で処理された（接触された）生物学的試料で抗原−抗体結合を測定する段階をさらに含むことができる。一実施形態において、前記方法は、体外または体内で行うことができる。
【００２８】
他の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片、または前記抗体または抗原結合断片を含む組成物を含むキットを提供する。前記キットは、キットが使用される具体的な目的に応じて、ＲＯＲ１検出用キットまたは癌治療用キットとして提供することができ、その具体的目的に応じて追加の成分を含むことができる。例えば、検出用キットには免疫学的分析のための成分、例えば、バッファーなどの免疫学的分析のための成分をさらに含むことができ、またはＲＯＲ１の過剰発現に関する疾患、例えば、癌治療用キットには投与のための器具および使用説明書をさらに含むことができる。
【００２９】
前記抗体または抗原結合断片は、（１）ヒト、マウスまたはサルに由来する細胞表面に発現したＲＯＲ１を特異的に認識または結合することができ、または（２）細胞表面に発現しないＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識または結合することができる。
【００３０】
前記抗体またはその抗原結合断片は癌を抑制する効能を奏する。一例として、マウス腫瘍異種移植モデルに前記抗体または抗原結合断片を投与すれば腫瘍の成長が有意に抑制される。このような特性は、前記抗体が癌治療に有用に使用できることを意味する。また、細胞株に処理の際、ＲＯＲ１の過剰発現の癌細胞株でアポトーシス（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導することができ、これも癌治療に有用に使用可能である。このような結果は、前記単クローン抗体が癌を抑制する効能を奏することを示唆する。
【００３１】
また、前記抗体は、マウスＲＯＲ１に結合能を示す種間交差結合能を有して薬物などの開発に有用に用いることができる。例えば、前記単クローン抗体または抗体を利用した多様な形態の治療剤は、高費用のサル基盤の実験を行う前に低費用のマウスモデルから初期結果を得ることによって、より経済的で効率的に薬物の開発を進行することができる。既存抗体のマウスＲＯＲ１に対する結合能も報告されているが、本発明の単クローン抗体と比較して結合程度が顕著に低下することが観察された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態により製造された抗−ＲＯＲ１単クローンファージ抗体のＲＯＲ１抗原に対する結合能の分析（ＥＬＩＳＡ）結果である。各抗−ＲＯＲ１単クローン抗体が細胞外領域のＲＯＲ１抗原に特異的に結合することが示された。図１において、ＢＣＭＡ−Ｆｃは陰性対照群で各抗−ＲＯＲ１単クローン抗体がＲＯＲ１抗原にのみ特異的に結合し、ＢＣＭＡタンパク質またはタグとして用いたＦｃには結合しないことが示された。
【図２】本発明の一実施形態による抗−ＲＯＲ１単クローンファージ抗体の細胞表面に発現するＲＯＲ１抗原に対する結合能の測定（ＦＡＣＳ）結果であり、ＲＯＲ１を細胞表面に発現する細胞としてはＪｅＫｏ−１細胞株を使用した。各抗−ＲＯＲ１単クローン抗体が細胞表面に発現するＲＯＲ１に特異的に結合することが示された。
【図３ａ】本発明の一実施形態により製造された抗−ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体のヒトＲＯＲ１抗原に対する結合能の分析（ＥＬＩＳＡ）結果である。各抗体が濃度依存的にヒトＲＯＲ１抗原に結合することが示された。前記結果は、単クローンファージ抗体をＩｇＧ形態に変更した後にもＲＯＲ１に対する結合能を維持することを示している。
【図３ｂ】本発明の一実施形態により製造された抗−ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体のヒトＲＯＲ１抗原に対する結合能の分析（ＥＬＩＳＡ）結果である。各抗体が濃度依存的にヒトＲＯＲ１抗原に結合することが示された。前記結果は、単クローンファージ抗体をＩｇＧ形態に変更した後にもＲＯＲ１に対する結合能を維持することを示している。
【図４】本発明の一実施形態により製造された抗−ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体のマウスＲＯＲ１抗原に対する結合能の分析（ＥＬＩＳＡ）結果である。各抗体が濃度依存的にマウスＲＯＲ１抗原に結合することが示される。本実験により本発明の抗−ＲＯＲ１抗体がマウスＲＯＲ１に対する交差反応性があることを確認した。比較群として用いた２Ａ２抗体はマウスＲＯＲ１に交差反応性があるが、本発明の抗−ＲＯＲ１抗体と比較して結合程度が相対的に微弱であることが示された。
【図５】本発明の一実施形態により製造された抗−ＲＯＲ１抗体の細胞表面に発現するＲＯＲ１抗原に対する結合能の測定（ＦＡＣＳ）結果であり、ＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  ＲＯＲ１細胞株はヒトＲＯＲ１を、ＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  ＲＯＲ２はヒトＲＯＲ２を、ＣＨＯ−ｍｏｕｓｅ  ＲＯＲ１はマウスＲＯＲ１を人為的に過剰発現させた細胞株である。各抗体は、細胞表面に発現するヒトＲＯＲ１に特異的に結合し、ファミリータンパク質のヒトＲＯＲ２には結合しないことが示された。また、マウスＲＯＲ１を人為的に過剰発現させた細胞株にも結合することを確認することによって、本発明の抗−ＲＯＲ１抗体がマウスＲＯＲ１に対する種間交差反応性があることを確認した。比較群として用いた２Ａ２抗体は、マウスＲＯＲ１に交差反応性があるが、本発明の抗−ＲＯＲ１抗体と比較して結合程度が相対的に微弱であることが示された。
【図６】本発明の一実施形態により製造された抗−ＲＯＲ１抗体の細胞表面に発現するＲＯＲ１抗原に対する結合能の測定（ＦＡＣＳ）結果であり、ＲＯＲ１発現陽性細胞株としてＪｅＫｏ−１およびＭｉｎｏ細胞株、ＲＯＲ１陰性細胞株としてＭＣＦ７細胞株を使用した。各抗体は、細胞表面に発現するＲＯＲ１に特異的に結合し、ＲＯＲ１を発現しない細胞株であるＭＣＦ７には結合しないことが示された。
【図７】本発明の一実施形態により製造された抗−ＲＯＲ１抗体の細胞表面に発現するＲＯＲ１抗原に対する結合能の測定（ＦＡＣＳ）結果である。ヒトＲＯＲ１をマウス大腸癌細胞株のＭＣ３８に人為的に過剰発現させたＭＣ３８  ｈｕｍａｎ  ＲＯＲ１細胞株を使用した。各抗体は、ヒトＲＯＲ１を過剰発現した細胞株に濃度依存的に結合することが示される。
【図８】本発明の一実施形態により製造された抗−ＲＯＲ１抗体の細胞発現ＲＯＲ１抗原に対する結合能を多様な癌細胞株で測定した結果である（ＦＡＣＳ）。ＲＯＲ１が過剰発現していると知られている癌腫である胃癌細胞株（ＡＧＳ、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＭＫＮ−２８、ＳＮＵ−１７５０、ＳＮＵ−１６）、乳癌細胞株（ＨＣＣ１１８７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ１１４３、ＢＴ２０、ＨＣＣ１８０６、ＨＣＣ１９３７、ＢＴ４７４、ＭＣＦ７、肺癌細胞株（Ｈ４６０、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、Ｈ１４３７、Ｃａｌｕ−６）、大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１、ＨＴ２９）、急性リンパ性白血病細胞株（６９７、Ｋａｓｕｍｉ−２）、マントル細胞リンパ腫細胞株（Ｍｉｎｏ、ＪｅＫｏ−１）を使用した。測定の結果、本発明の抗−ＲＯＲ１抗体は、ＲＯＲ１が過剰発現していると知られた癌腫由来の多様な癌細胞株に結合することを確認した。
【図９ａ】本発明に係る抗−ＲＯＲ１抗体のマウス腫瘍異種移植モデルでの癌抑制効能を分析した結果である。各抗−ＲＯＲ１抗体は、マントル細胞リンパ腫細胞株であるＪｅＫｏ−１細胞株を移植した重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤ  ｍｏｕｓｅ）で癌の成長を効果的に抑制することが示される。投与した本発明の抗−ＲＯＲ１抗体５種は全て統計的に有意水準で癌成長を抑制し、各抗体クローン別癌抑制の程度は類似に現れた。体重測定の結果、陰性対照群であるヒトＩｇＧ１抗体（ＨｕＩｇＧ１）と比較して本発明の抗−ＲＯＲ１抗体投与群で体重増加の様相は類似に観察された。このような結果は、本発明のＲＯＲ１抗体が生体内で効果的にＲＯＲ１の過剰発現の癌細胞に結合して癌成長を抑制することができ、癌の治療剤として有用に使用できることを意味する。
【図９ｂ】本発明に係る抗−ＲＯＲ１抗体のマウス腫瘍異種移植モデルでの癌抑制効能を分析した結果である。各抗−ＲＯＲ１抗体は、マントル細胞リンパ腫細胞株であるＪｅＫｏ−１細胞株を移植した重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤ  ｍｏｕｓｅ）で癌の成長を効果的に抑制することが示される。投与した本発明の抗−ＲＯＲ１抗体５種は全て統計的に有意水準で癌成長を抑制し、各抗体クローン別癌抑制の程度は類似に現れた。体重測定の結果、陰性対照群であるヒトＩｇＧ１抗体（ＨｕＩｇＧ１）と比較して本発明の抗−ＲＯＲ１抗体投与群で体重増加の様相は類似に観察された。このような結果は、本発明のＲＯＲ１抗体が生体内で効果的にＲＯＲ１の過剰発現の癌細胞に結合して癌成長を抑制することができ、癌の治療剤として有用に使用できることを意味する。
【図１０】本発明により製造された抗−ＲＯＲ１抗体の作用機転を分析した結果である。抗体による癌の成長抑制は、多様な機転、例えばアポトーシス誘導、癌細胞分裂の抑制、癌血管新生の抑制、および／または免疫細胞の活性化などによって現れることができ、抗体別に同じまたは異なる機転を示すことができる。図１０においては、可能な限り１つの機転として細胞の死滅の有無を分析し、ＲＯＲ１を発現する細胞株で本発明に係る抗−ＲＯＲ１抗体を処理した結果、抗体が多量体を形成しながら細胞の死滅を誘導できることが示され、比較群として用いた２Ａ２抗体は多量体を形成する場合でも細胞の死滅を誘導しないことが示された。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の一実施形態により製造された抗−ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体のヒトＲＯＲ１抗原に対する結合能の分析（ＥＬＩＳＡ）結果である。各抗体が濃度依存的にヒトＲＯＲ１抗原に結合することが示された。前記結果は、単クローンファージ抗体をＩｇＧ形態に変更した後にもＲＯＲ１に対する結合能を維持することを示している。
【００３４】
本発明は、ＲＯＲ１に特異的に結合可能な抗体の開発に基づくものである。
本項目で使用されたタイトルは、明細書の記載の便宜性のためのものに過ぎず、これによって制限されるわけではない。
【００３５】
本明細書において、異なって定義しない限り、本発明で使用された科学および技術的用語は、本技術分野における当業者が通常理解する通りの意味を有する。さらに、文脈上特に要求されなければ、単数は複数を含み、複数は単数を含む。
【００３６】
特定の配列番号で表される本発明で開示されたすべてのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、前記特定の配列番号の配列だけでなく、抗−ＲＯ１抗体としての特徴を維持する限り、前記特定の配列番号の配列と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含むか、または必須に前記配列で構成されるか、または前記配列で構成される。
【００３７】
定義
本明細書において、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、単一または二重鎖のヌクレオチドポリマーを含む。このようなポリヌクレオチドを含む前記ヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはこれらの変形した形態であってもよい。
【００３８】
本明細書において、特に断らなければ、前記ポリヌクレオチドの左側末端が５’末端であり、右側末端は３’末端を表す。
【００３９】
本明細書において、「分離された核酸分子」は、その全部または一部が自然に存在するポリヌクレオチドと関連性がなかったり、または自然で観察されないポリヌクレオチドに連結されている、遺伝体起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、または合成起源のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはこれらの組み合わせを意味する。本発明の目的下、特定の核酸配列を含む前記核酸分子は完全な（ｉｎｔａｃｔ）染色体を含まない。代わりに、特定の核酸配列を含む前記分離された核酸分子は、その特定の配列に付加して、少なくとも数個の付加的なタンパク質コーディング配列を含むか、または前記特定の核酸配列の発現のための調節配列および／またはベクターをさらに含むことができる。
【００４０】
本明細書において、「調節配列」は、これに作動可能に連結されてコーディング配列の発現およびプロセッシングに影響を与え得るポリヌクレオチド配列を意味する。このような調節配列の特徴は宿主の種類によって影響を受けられる。例えば、原核細胞に作用できる調節配列はプロモーター、場合によって、オペレーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含むことができる。真核細胞での調節配列は転写因子が結合する複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー、ポリアデニル化配列および転写終結配列を含むことができる。調節配列は、さらにリーダー配列および／または融合パートナー配列を含むことができる。
【００４１】
本明細書において、「ベクター」は、タンパク質をコーディングする核酸分子を宿主細胞に伝達するのに使用される、例えば核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルスを含む任意の分子を意味する。
【００４２】
本明細書において、「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に好適であり、発現ベクターに作動可能に連結されて目的とするタンパク質をコーディングする異種配列の発現を調節する核酸配列を含むベクターを意味する。このような発現ベクターはまた、前記コーディング配列に作動可能に連結されてその転写、翻訳およびイントロンが存在する場合、ＲＮＡスプライシングを調節するかまたはこれに影響を与える配列を含むことができる。
【００４３】
本明細書において、「作動可能に連結された」は、連結される核酸配列が適切な条件で目的とする機能を行うことができるように位置することを意味する。例えば、コーディング配列および調節配列を含むベクターで適切な条件下で前記コーディング配列の転写が前記調節配列によって影響を受ければ、作動可能に連結されることである。
【００４４】
本明細書において、「宿主細胞」は、目的とする核酸配列によって形質転換されるか、または形質転換できる目的の遺伝子を発現できる細胞を意味する。前記用語は、前記宿主細胞と形態および遺伝的同一性に関係なく目的とする遺伝子を発現する限り、前記宿主細胞の子孫も含む。
【００４５】
本明細書において、「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」は、通常、バクテリオファージによってある細菌から他の細菌への核酸の移動を意味する。例えば、複製できないレトロウイルスを用いて真核細胞への核酸の移動を含む。
【００４６】
本明細書において、「伝達移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、細胞が外来または外因性ＤＮＡを得ることを意味し、この場合、ＤＮＡが細胞膜を通して細胞内に導入する。これは、当該技術分野における公知の方法として、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２），Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓを参照することができる。
【００４７】
本明細書において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、細胞が新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含むように変形した、細胞の遺伝的特徴の変化を意味する。例えば、細胞は形質導入、伝達移入、またはその他の技術により新しい遺伝的物質が導入されて、遺伝的特性が変化することによって形質転換される。形質導入または伝達移入を含む方法などによって形質転換されたＤＮＡは、細胞の染色体内に物理的に統合されて存在してもよく、複製のないエピソーム形態または複製可能なプラスミドとして一時的に存在してもよい。前記形質転換されたＤＮＡが宿主細胞の分裂とともに複製される時、安定して形質転換されたものと見なされる。
【００４８】
本明細書において、「アミノ酸」は、当該技術分野で理解される通常の意味を含む。２０個の自然発生したアミノ酸およびこれらの縮約形は当業界に通用するものによる（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．１９９１）。前記アミノ酸は、典型的なアミノ酸、典型的な２０個のアミノ酸（Ｄ−アミノ酸）の立体異性体、非−自然アミノ酸、例えばα−、α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の非−典型的なアミノ酸を含む。非−典型アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニンおよびその他の類似したアミノ酸とイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で使用されたポリペプチド表記において、当業界で一般に通用されるように、配列の左側はアミノ末端であり、配列の右側はカルボキシ末端を表す。
【００４９】
本明細書において、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を意味し、本明細書において相互交換的に使用される。これはまた、自然的に発生したアミノ酸残基の重合体だけでなく、その類似体または模倣体の重合体も含む。さらに、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、リン酸化またはグリコシル化のための炭水化物の追加などの変形を含むことができる。また、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えまたは自然的に発見される細胞から生成される。さらに、ポリペプチドまたはタンパク質は、野生型配列または前記アミノ酸配列の一部が欠失、添加および／または置換されたものを含む。また、ポリペプチドまたはタンパク質は抗体、例えば、抗−ＲＯＲ１抗体（またはＲＯＲ１抗体と称する）、ＲＯＰ１結合タンパク質、または抗原結合断片、または前記配列で１つ以上のアミノ酸が欠失、付加および／または置換された配列を含む。さらに、「ポリペプチド断片」は、全長タンパク質と比較してアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および／または内部欠失を有するポリペプチドを意味する。このような断片はまた、全長タンパク質と比較して変形したアミノ酸を含むことができる。一実施形態において、前記断片は、長さが約５〜５００個のアミノ酸、例えば、断片は少なくとも長さが５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００または８５０個のアミノ酸またはそれ以上であってもよい。本発明の目的を考慮すれば、有用なポリペプチド断片は、抗原−結合ドメインを含む抗体の免疫学的機能性断片を含む。ＲＯＲ１結合抗体の場合、このような有用な断片は、重鎖または軽鎖の１個、２個または３個を含むＣＤＲ配列、または重鎖または軽鎖の可変領域または不変領域を含む抗原鎖の全部または一部を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本明細書において、「分離されたポリペプチド、抗体またはタンパク質」は、通常これらと共に発見される他のタンパク質が存在せず、自然的にこれらと結合している脂質、炭水化物およびポリヌクレオチドの少なくとも約５０％以上が除去されたものである。通常分離されたタンパク質、ポリペプチドまたは抗体は、特定の組成物において少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％または少なくとも約５０％を含む。このポリペプチドは、合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡまたはこれらの任意の組み合わせによってコーディングされる。特に、分離されたタンパク質ポリペプチドまたは抗体はその治療、診断、予防研究またはその他の用途への適用を妨げる他のタンパク質または他のポリペプチドの汚染物質が実質的に存在しない。
【００５１】
本明細書において、例えば抗原結合断片、タンパク質または抗体などのポリペプチドの「変異体」は、他のポリペプチド配列と比較して１つ以上のアミノ酸残基に挿入、欠失、付加および／または置換されたポリペプチドであり、融合ポリペプチドを含む。また、タンパク質変異体はタンパク質酵素切断、リン酸化または他の後翻訳変形によって変形したものの、前記開示された抗体の生物学的活性、例えばＲＯＲ１に結合および特異性を維持するものを含む。前記変異体は、前記開示された抗体またはその抗原結合断片の配列と約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％同一のものであってもよい。パーセント同一性（％）または相同性は、以下の説明を参照して計算することができる。
【００５２】
一実施形態において、パーセント相同性または同一性は１００×［（同じ位置）／ｍｉｎ（ＴＧＡ、ＴＧＢ）］で計算することができ、上記式中のＴＧＡおよびＴＧＢは、比較される配列ＡおよびＢの残基の数および内部ギャップ位置の合計である（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２４４：３３２−３５０（１９９４）。
【００５３】
本明細書において、前記保存的アミノ酸の置換は、ポリペプチドの活性または抗原性に実質的に影響を与えない置換を意味する。ポリペプチドは、１つ以上の保存的置換を含む。非−制限的例示は下記表３に開示されている。
【００５４】
前記ポリペプチドの「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」は、挿入、欠失、付加または置換変異体とは異なる、他の化学的モイエティとの接合により１つ以上の残基から化学的に変形したポリペプチドを意味する。
【００５５】
本明細書において、ポリペプチド、核酸、宿主細胞などに関連して使用される用語「自然的に発見される」は、自然的に存在する物質を意味する。
本発明に係る抗体が認識するＲＯＲ１（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ−Ｌｉｋｅ  Ｏｒｐｈａｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、ＲＴＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ）ファミリーの膜貫通タンパク質を称する。一実施形態では特に細胞外領域を認識する。本発明に係る抗体が認識するＲＯＲ１は、細胞膜に存在するか、または細胞膜に存在しない状態の細胞外領域である。ＲＯＲ１のヒトタンパク質は９３７個のアミノ酸で構成されており、アミノ酸配列はＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ：ＮＰ_００５００３．２、核酸配列はＮＭ_００５０１２．３である。本発明に使用される文脈から明らかでない限り、ＲＯＲ１はヒトｈＲＯＲ１を称するが、本発明に係る抗体はマウスＲＯＲ１も特異的に結合能を有する。マウスＲＯＲ１アミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ７５４８０．１で表される。
【００５６】
本明細書において、「同一性」は、２個以上のポリペプチドまたは２個以上のポリヌクレオチドの配列を整列し比較して決定される、２個以上のポリペプチドまたは２個以上のポリヌクレオチドの配列の類似性を意味する。このような配列間の同一性は一般に「同一性パーセント」で表され、これは、比較する分子間の同一のアミノ酸またはヌクレオチドの比率を意味し、比較する分子のうち最も小さい分子の大きさを基準として計算される。核酸またはポリペプチドを配列して多くの分子間の前記同一性を計算するのに使用される方法については以下の文書を参照することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３。
【００５７】
同一性パーセントの計算に際して、比較される配列は、配列間における最大限のマッチングを提供する方式で整列され、前記整列された配列にはギャップ、マッチングおよびミス−マッチが存在し、これは特定の数学的モデルまたはコンピュータアルゴリズムで処理される。一実施形態において、この同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて、比較される配列間における前記マッチは最大化し、ギャップの数は最小化する方式で２つの配列を整列するＧＡＰプログラムを含むＧＣＧプログラムパッケージを用いて決定可能である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）。前記コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、比較される２個のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列において、これらの間におけるマッチは最大化し、ギャップの数は最小化する方式で２つの配列を整列して「マッチング区間（ｓｐａｎ）」を決定する。前記アルゴリズムはまた、ギャップ開放ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）［これは３×平均対角線（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉａｇｏｎａｌ）で計算され、前記「平均対角線（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉａｇｏｎａｌ）」は、使用される比較マトリクス（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）の対角線平均であり、前記「対角線」は、特定の比較マトリクスによるそれぞれの完全なアミノ酸のマッチに割り当てられたスコアまたは数字である］およびギャップ拡張ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）（通常、これはギャップ開放ペナルティの１／１０倍である）、そして、例えば、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリクスをともに使用する。一実施形態において、標準比較マトリクス（ＰＡＭ２５０比較マトリクスは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２参照；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリクスは、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９参照）を使用する。一実施形態において、ＧＡＰプログラムを用いたポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同一性パーセントを決定するために推奨されるパラメータは以下の通りである：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；比較マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ｓｕｐｒａ）；ギャップペナルティ：１２（末端ギャップに対するペナルティなし）；ギャップ長さペナルティ：４；類似性閾値：０である。
【００５８】
特定のパラメータを用いて２つの配列を整列する時、２つの配列間で有意な関連性がないにもかかわらず、短い配列領域で高い同一性でマッチングされる結果が導かれる。この場合、２つの配列が最小５０個の連続的アミノ酸にわたって整列されるように、ＧＡＰプログラムなどの使用されるアルゴリズムのパラメータを修正することができる。
【００５９】
本明細書で使用される「実質的に純粋な」は、目的とする対象分子が優勢な種として存在することである。つまり、モル基準で、同一の混合物内で任意の他の個別的な種より濃度がさらに高いことを意味する。一実施形態において、実質的に純粋な分子は、組成物に含まれているすべてのポリマー種類の少なくとも約５０％（モル基準）、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％で含まれる。他の実施形態において、目的とする対象分子は、公知の方法を利用してそれ以上汚染物が検出されない程度まで実質的に均質に精製され、これにより、組成物は均質な１種類のポリマー物質だけを含む。
【００６０】
一態様において、本発明は、ＲＯＲ１タンパク質に特異的に結合する組換え抗体またはその抗原結合断片を提供する。このような側面において、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、つまり、本明細書に記載のような組換え核酸の発現により製造されたタンパク質である。組換えタンパク質の産生のための前記方法および技術は当該技術分野で公知である。
【００６１】
本明細書において、「親和性」または「親和度」は、抗体またはその抗原結合断片と抗体との間の相互作用の強度であり、これは、抗原の大きさ、形状および／または電荷などの抗原の特徴および抗体または抗原結合断片のＣＤＲ配列によって決定される。前記親和度を決定する方法は当該技術分野で公知であり、また下記を参照することができる。
【００６２】
抗体またはその抗原結合断片は、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）が≦１０−６Ｍの時、抗原などのその標的に「特異的に結合する」と言われる。抗体は、ＫＤが≦１ｘ１０−８Ｍの時、「高い親和性」で標的に特異的に結合する。
【００６３】
本明細書において、「抗原結合領域または部位」は、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質またはタンパク質の一部を意味する。これは、例えば抗原と相互作用して、抗体に抗原に対する特異性および親和性を提供するアミノ酸残基を含む抗体の一部がこれに相当する。このような抗原結合領域は通常、１つ以上の「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ、ｏｒ  ＣＤＲ）」を含む。特定の抗原結合領域はまた、１つ以上の「フレームワーク（ＦＲ）」領域を含む。ＣＤＲは、抗原結合の特異性と親和性に寄与するアミノ酸配列である。フレームワーク領域は、これらＣＤＲの適切な形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持するのに役立てて、抗原結合領域と抗原との間に結合を促進することができる。
【００６４】
本明細書において、「抗体」は、任意の完全な（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリン、または標的抗原への結合のために完全な抗体と競争できる抗原結合断片を意味する。例えばキメラ、ヒト化、完全なヒトおよび多重特異的抗体またはこれらの抗原結合断片を含む。前記抗体は、それ自体で抗原結合タンパク質の一種でもある。完全な抗体は、通常少なくとも２個の全長重鎖および２個の全長軽鎖を含むが、ラクダ科動物で自然的に発見される一部のケースのように、抗体は、重鎖だけを含んでもよい。抗体またはその抗原結合断片は、単に単一源（ｓｏｕｒｃｅ）またはキメラに由来するか、またはキメラでもある。キメラ抗体は、２種類の異なる抗体に由来する部分を含み、以下により詳しく説明する。抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマ、組換えＤＮＡ技術または完全な抗体の酵素的または化学的切断によって生成される。他に言及がなければ、本明細書で使用される抗体は、２個の全長重鎖および２個の全長軽鎖を含む抗体は勿論であり、これらの誘導体、変異体、断片および突然変異体を含み、これらの例は後述する。
【００６５】
本明細書において、「軽鎖」は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長軽鎖およびその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む。前記軽鎖の可変領域ドメインは、軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在する。前記軽鎖の種類にはカッパおよびラムダ鎖を含む。
【００６６】
本明細書において、「重鎖」は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖およびその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨと３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは重鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在し、ＣＨドメインはカルボキシ末端に存在し、ＣＨ３ドメインはカルボキシ末端に最も近く位置する。前記重鎖はＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥのアイソタイプを含む。
【００６７】
本明細書で使用される抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）の「抗原結合断片」は、全長鎖と比較して一部のアミノ酸が不足するものの、抗原に特異的に結合できる抗体の一部を含む。この断片は標的抗原に特異的に結合可能であり、または他の抗体または抗原結合断片と特定のエピトープに結合するために競争できるという側面から、生物学的活性があるといえる。一態様において、この断片は、全長軽鎖または重鎖内に存在する少なくとも１つのＣＤＲを含み、一実施形態において、単鎖重鎖および／または軽鎖、またはその一部を含む。このような生物学的活性断片は組換えＤＮＡ技術によって生成するか、または、例えば完全な抗体を酵素的または化学的に切断して生成することができる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦａｂ、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、ｓｃＦＶ−Ｆｃ、ダイアボディ、ミニボディ、ｓｃＡｂおよびｄＡｂを含むが、これらに限定されず、また、ヒト、マウス、ラット、カメリドまたはウサギを含む任意の哺乳動物に由来する。本発明において１つ以上のＣＤＲなどの抗体の機能的な部分は、第２のタンパク質または低分子化合物と共有結合によって連結され、特定の標的に対する標的治療剤として使用できる。
【００６８】
本明細書において、「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２個の重鎖断片を含む。この２個の重鎖断片は、２個以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって互いに結合する。
【００６９】
本明細書において、「Ｆａｂ断片」は、１個の軽鎖と可変領域およびＣＨ１のみを含む１個の重鎖とで構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。ｓｃＦａｂは、２のＦａｂ分子が柔軟なリンカーによって連結されたものである。
【００７０】
本明細書において、「Ｆａｂ’断片」は、Ｆａｂ断片にさらに重鎖のＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間の領域を含み、２のＦａｂ’分子断片の２個の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
【００７１】
本明細書において、「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、上述したように、２個の軽鎖、および可変領域、ＣＨ１およびＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の不変領域の一部を含む２個の重鎖を含み、２個の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、前記Ｆ（ａｂ’）２断片は２個のＦａｂ’断片で構成され、前記２個のＦａｂ’２断片は、これらの間のジスルフィド結合によって互いに融合する。
【００７２】
本明細書において、「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖それぞれの可変領域を含むが、不変領域は含まない抗体の断片である。ｓｄＦＶは、重鎖および軽鎖が二硫化結合によって連結されたものである。ｓｃＦｖは、Ｆｖが柔軟なリンカーによって連結されたものである。ｓｃＦｖ−Ｆｃは、ｓｃＦＶにＦｃが連結されたものである。ミニボディは、ｓｃＦＶにＣＨ３が連結されたものである。ダイアボディは、２分子のｓｃＦＶを含む。
【００７３】
本明細書において、「単鎖抗体（ｓｃＡｂ）」は、重鎖および軽鎖の可変領域が柔軟なリンカーによって連結された重鎖の１つの不変領域または軽鎖不変領域を含む単一ポリペプチド鎖である。単鎖抗体は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号を参照することができ、これは参照によって本明細書に開示される。
【００７４】
本明細書において、「ドメイン抗体（ｄＡｂ）」は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。一実施形態において、２以上のＶＨ領域がペプチドリンカーによって共有結合で連結され、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）のドメイン抗体を形成する。このような２価のドメイン抗体の２個のＶＨ領域は、同一または異なる抗原を標的とすることができる。
【００７５】
本明細書において、「２価抗原−結合タンパク質」または「２価抗体」は、２つの抗原−結合部位を含む。このような２価抗体に含まれている２個の抗原結合部位は、同一の抗原特異性を有するか、またはそれぞれ異なる抗原に結合する二重特異的な抗体である。
【００７６】
本明細書において、「多重特異的抗原結合タンパク質」または「多重特異的抗体」は、２以上の抗原またはエピトープを標的とする。
【００７７】
本明細書において、「二特異的」、「二重特異的」抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二特異的抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種で、公知の多様な方法、例えばハイブリドーマ融合またはＦａｂ’断片の連結などの方法によって生成される。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３などを参照することができる。二特異的抗原結合タンパク質または抗体の２個の抗原結合部位が結合する２個の互いに異なるエピトープは、同一または異なるタンパク質標的に位置する。
【００７８】
本明細書において、「抗原」または「免疫原」は、例えば、抗原結合タンパク質（例えば抗体またはその免疫学的に機能的な抗原結合断片）が結合でき、動物で抗原に結合できる抗体の生成に使用できる分子または分子の一部を意味する。抗原は、異なる抗体またはその断片と相互作用できる１以上のエピトープを含むことができる。一実施形態において、抗原はＲＯＲ１タンパク質の細胞外領域である。
【００７９】
本明細書において、「エピトープ」は、抗原結合タンパク質または抗体によって結合するか、またはこれらが認識する分子の部分であり、例えば、抗体またはＴ細胞受容体などの抗原結合タンパク質に特異的に結合できる任意の決定因子を含む。エピトープは連続的または非連続的であってもよく、例えば、ポリペプチド配列では互いに連続的ではないが、分子の側面からは、構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープのように、１つの抗原結合タンパク質によって結合するが、互いに離れた位置のアミノ酸残基であってもよい。一実施形態において、前記エピトープは、抗体の生成に使用される抗原と類似の３次元的構造を含むが、前記エピトープで発見される残基を全く含まないか、または一部の残基のみを含み得るという側面から、模倣体であってもよい。通常、エピトープはタンパク質であるが、核酸などの他の種類の物質であってもよい。エピトープ決定因子は、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの分子によって表面に形成された化学的活性化基であるか、または特定の３次元的構造特徴および／または特定の電荷特徴を有することができる。通常特定の標的抗原に特異的抗体は、タンパク質および／または高分子複合体内に存在する標的抗原上のエピトープを認識する。
【００８０】
本明細書において、「治療剤」は、目的とする治療効果のために被験者に投与される分子を意味する。前記被験者は、ヒトではない哺乳類、例えば霊長類またはヒトを含む。治療剤の例としてはペプチドおよびポリペプチドを含むタンパク質、核酸、抗体または低分子化合物を含む。他の側面において、前記治療剤は、本発明に係る抗体または抗体と結合して、癌などの関連疾病の治療剤として使用可能である。
【００８１】
本明細書に使用される用語「治療する」は、例えば負傷、疾患または疾患の症状または状態の減少、緩和、軽減、または患者が負傷、疾患または疾患の症状または病的な状態に良く耐えられるようになること、負傷、疾患または疾患の症状または病的な状態の悪化を遅らせること、または患者の精神的または肉体的な生活の質を向上させることを含む任意の客観的または主観的なパラメータを含む、負傷、疾患、または疾患の症状または病的な状態の緩和または治療を意味する。このような負傷、疾患、または疾患の症状または病的な状態の治療または改善は、身体検査、疾病と関連する各種の指標検査および映像学的検査の結果に基づいて判断することができる。
【００８２】
本明細書において、「有効量」は、一般に疾患、特にＲＯＲ１と関連する疾患による症状の深刻性および／または発生頻度の減少、疾患、特にＲＯＲ１と関連する疾患による症状および／または疾患発生の根本的な原因の除去、または疾患、特にＲＯＲ１と関連する疾患による症状および／または根本的な原因発生の予防および／または疾患、特にＲＯＲ１と関連する疾患による損傷を改善または矯正するのに十分な量を意味する。一実施形態において、有効量は、治療的有効量または予防的有効量である。「治療的有効量」は、疾患、特にＲＯＲ１と関連する症状または状態を治療するか、または疾患、特にＲＯＲ１と関連する症状または状態の予防、遅延またはその進行を逆転させるほどの十分な量である。「予防的有効量」は、被験者に投与する場合、意図通りに疾患、特にＲＯＲ１と関連する疾患の発病または再発、または疾患、特にＲＯＲ１と関連する疾患または関連する症状を予防または遅延させ、その発生の可能性を減少させる量である。完全な治療的または予防的効果は、服用量の１回投与によって発生するよりは、服用量の数回投与によって発生することができる。したがって、治療的または予防的有効量は、１回以上の投与によって伝達可能である。
【００８３】
抗体または抗原結合断片
本発明は、ＲＯＲ１タンパク質の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を開示している。本発明に係る抗体は、開示されているように、１以上の相補的決定領域または部位（ＣＤＲ）を含むポリペプチドである。
【００８４】
一実施形態において、ＣＤＲは「フレームワーク」領域に含まれ、フレームワークは、このようなＣＤＲが適切な抗原結合特性を有するようにＣＤＲを配向する。
【００８５】
本発明に係る抗体は、ヒトおよびマウス由来のＲＯＲ１細胞外ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）に特異的に結合し、分離された形態の細胞外ドメインまたは細胞表面に発現するＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合することができる。
【００８６】
本発明に係る抗体はＲＯＲ１、特にヒトＲＯＲ１およびマウスＲＯＲ１に結合する。本発明に係る抗体はヒトおよびマウス由来の、ＲＯＲ１細胞外ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）または、細胞表面に発現するＲＯＲ１に特異的に結合することができ、ＲＯＲ１を標的とする癌の標的治療に有用に用いることができる。例えば、本明細書に開示される抗体と抗ガン剤を結合させて、特定癌の治療に用いることができる。また、マウスＲＯＲ１に結合するのでｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｔｏｘをマウス実験を通して確認可能であり、マウスＲＯＲ１を過剰発現するマウス癌細胞株を利用してｓｙｎｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｅｌを通したｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｉｃａｃｙ確認が可能でＲＯＲ１と関連する多様な薬物開発に有用に用いることができる。
【００８７】
一実施形態において、前記抗体は、単クローン抗体、二重特異的抗体、二重抗体、多重特異的抗体、多重抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、キメラ抗体、または抗体融合体（または抗体接合体）およびその断片を含むが、これらに限定されず、本明細書に開示される多様な形態の抗体を含む。
【００８８】
一実施形態において、本明細書に開示される抗体の抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦＶ、ｓｃＦＶ−Ｆｃ、ミニボディ、ダイアボディ、ｓｃＡｂまたはｄＡｂを含む。
さらに他の実施形態において、本明細書に開示される抗体は、表２ａおよび表２ｂに開示された可変領域を含む軽鎖または重鎖のみからなるポリペプチドで構成される。
【００８９】
本発明に係る抗体は、自然で発見される抗体の典型的な構造を有する。このような抗体の構造的な単位体は、ラクダ科動物は単一重鎖からなる抗体を生成するが、一般に４量体ポリペプチドを含み、４量体は、異なる２個のポリペプチド鎖からなる一対のポリペプチド鎖本体を２個含む。典型的な抗体において、前記一対のポリペプチド鎖本体は、１つの全長軽鎖（約２５ｋＤａ）および１つの全長重鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を含む。各鎖は、特徴的な折り畳みパターンを示し、約９０〜１１０個のアミノ酸からなる、数個の免疫グロブリンドメインで構成される。このようなドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位体である。各鎖のアミノ−末端部分は、典型的に抗原を認識する部位である可変領域またはＶ領域と称する部分を含む。カルボキシ−末端部位は、アミノ−末端部位より進化的により多く保存され、不変領域またはＣ領域と称する部分を含む。ヒト軽鎖は、通常カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類され、これらそれぞれは、１つの可変領域および１つの不変領域を含む。前記重鎖は典型的に、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはエプシロン（ε）鎖に分類され、これらは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥアイソタイプで定義される。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない多数のサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプは、ＩｇＭおよびＩｇＭ２を含む。ＩｇＡサブタイプは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む。ヒトにおいて、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは４個の重鎖および４個の軽鎖を含み；ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは２個の重鎖および２個の軽鎖を含み、ＩｇＭアイソタイプは５個の重鎖および５個の軽鎖を含む。重鎖不変領域は、典型的にエフェクター機能を示す１つ以上のドメインを含む。重鎖不変領域ドメインの数は、アイソタイプに応じて異なる。ＩｇＧ重鎖は例えば、それぞれＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で公知の３つのＣ領域ドメインを含む。本発明に係る抗体は、このようなアイソタイプおよびサブタイプのうちの任意の１つである。一実施形態において、本発明に係る抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のサブタイプである。さらに他の一実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧ１−またはＩｇＧ２−型である。さらに他の一実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧ１−型である。
【００９０】
本発明に係る重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ヒト不変領域の少なくとも一部に連結される。不変領域の選択は、部分的に抗体依存性細胞媒介細胞毒性、抗体依存性細胞食菌作用および／または補体依存性細胞毒性が要求されるかによって決定可能である。例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体依存性細胞毒性を持ち、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４はこのような細胞毒性を持たない。また、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりさらに強い細胞媒介エフェクター機能を誘導する。前記軽鎖不変領域はラムダまたはカッパである。
【００９１】
一実施形態において、本発明に係る抗体はヒト抗体であり、重鎖不変領域は、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−またはＩｇＧ４−型である。他の実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧ１−またはＩｇＧ２−型である。
【００９２】
他の実施形態において、本発明に係る抗体はヒト抗体であり、マウスＲＯＲ１を特異的に認識する。
【００９３】
全長の軽鎖および重鎖において、可変領域および不変領域は約１２個以上のアミノ酸の長さである「Ｊ」領域によって結合し、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．）１９８９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓを参照することができる。典型的に、抗体の重鎖／軽鎖対の可変領域が抗体結合部位を形成する。
【００９４】
免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に全体的な構造が同一であり、「相補的決定部位または領域またはドメイン」またはＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）と称される３個の超可変領域によって連結される比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。重鎖／軽鎖対を構成する各鎖由来の可変領域のＣＤＲは、典型的にフレームワーク領域によって整列されて標的タンパク質（ＲＯＲ１）の特定のエピトープに特異的に結合する構造を形成する。自然的に発生した軽鎖および重鎖の可変領域のこのような要素は、Ｎ−末端からＣ−末端まで典型的に次の順に含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。可変領域でこれらそれぞれに相当するアミノ酸配列の位置は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））またはＯＰＡＬライブラリーと関連する方法（Ｈｙｅ  Ｙｏｕｎｇ  Ｙａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，２００９  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ２７：２２５）によって決定可能である。前記各定義によって決定されたＣＤＲは、互いに比較すれば、重なるか、または１つが他の１つを含むサブセットであってもよい。しかし、前記各方法によって定義されるすべてのＣＤＲが本発明の範囲に含まれる。当業者であれば、抗体の可変領域配列が与えられると、ここで、前記各定義によるＣＤＲ配列を容易に選択することができる。
【００９５】
本発明に係る抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖の可変領域に含まれるＣＤＲ配列は、それぞれ表１ａから１ｆに示す。
【表１ａ】
2021524242.tif 000003
【表１ｂ】
2021524242.tif 000004
【表１ｃ】
2021524242.tif 000005
【表１ｄ】
2021524242.tif 000006
【表１ｅ】
2021524242.tif 000007
【表１ｆ】
2021524242.tif 000008
【００９６】
一実施形態において、前記軽鎖および重鎖のＣＤＲ配列を含む抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖の可変領域配列をそれぞれ下記表２ａおよび表２ｂに示す。
【表２ａ】
2021524242.tif 000009
【表２ｂ】
2021524242.tif 000010
【００９７】
一実施形態において、前記表１ａから１ｆに示す軽鎖の各可変領域のＣＤＲおよび重鎖の各可変領域のＣＤＲは自由に組み合わせることができる。
【００９８】
他の実施形態において、前記表２ａおよび表２ｂに示す重鎖および軽鎖の可変領域は多様な形態の抗体の製造のために自由に組み合わせることができ、例えばｓｃＦＶなどの単鎖抗体、またはドメイン抗体を形成することができる。
【００９９】
本明細書に開示されるそれぞれの重鎖および軽鎖の可変領域は、完全な抗体それぞれの重鎖および軽鎖を形成するために、目的とする多様な重鎖および軽鎖の不変領域に結合することができる。また、このように不変領域に結合したそれぞれの重鎖および軽鎖配列はまた、完全な抗体構造を形成するために組み合わせることができる。
【０１００】
本発明に係る抗体の重鎖および軽鎖の任意の可変領域は、不変領域の少なくとも一部に連結される。不変領域は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性、抗体依存性細胞食菌作用および／または補体依存性細胞毒性などが必要であるかによって選択される。例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体依存性細胞毒性を持ち、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は細胞毒性を持たない。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３はまた、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４より強い細胞媒介エフェクター機能を誘導する。例えば、重鎖可変領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むＩｇＧ不変領域に、軽鎖可変領域はカッパまたはラムダ不変領域に結合することができる。前記不変領域は目的とするところにより適切なものが使用可能であり、例えばヒトまたはマウス由来のものが使用可能である。一実施形態において、ヒト重鎖不変領域ＩｇＧ１が使用され、これは配列番号９１の配列で表される。他の実施形態において、軽鎖不変領域はヒトラムダ領域が使用され、これは配列番号９３で表される。
【０１０１】
本明細書に開示される任意の可変領域は、不変領域に結合して重鎖および軽鎖配列を形成することができる。一実施形態において、本明細書に開示される重鎖可変領域はヒトＩｇＧ１不変領域に連結され、これは配列番号５９〜６６、１００および１０１から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、または必須に含んで構成することができる。他の実施形態において、本明細書に開示される軽鎖可変領域はヒトラムダ不変領域に連結され、これはそれぞれ配列番号６７〜７４で表される。本発明に係る軽鎖および重鎖が多様に組み合わされることにより、２個の軽鎖および２個の重鎖で構成される完全な抗体を形成することができる。
【０１０２】
しかし、本明細書に開示される可変領域と組み合わされるこのような不変領域配列は例示的なものであり、当業者であればＩｇＧ１重鎖不変領域、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖不変領域、任意のカッパまたはラムダ軽鎖不変領域、安定性、発現、製造可能性または他の目的とする特徴などのために変形した不変領域を含む他の不変領域を使用できることが分かるであろう。
【０１０３】
本発明はまた、本明細書に開示される１つ以上のアミノ酸と実質的な配列同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含む。実質的同一性とは、配列の変異が存在する本明細書に開示される効果を維持することを意味する。一実施形態において、表２ａに示す重鎖可変領域と約９０％、９５％または９９％の同一性を有する。他の実施形態において、表２ｂに示す軽鎖可変領域と約９０％、９５％または９９％の同一性を有する。例えば、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片の配列と９０％、９５％または９９％同一性を示す変異体の場合、任意の変異はＣＤＲよりは可変領域の骨格で発生する。
【０１０４】
本発明はまた、本明細書に開示される抗体またはその部分をコーディングする核酸を開示する。前記核酸は、抗体の各鎖、または前記抗体の断片、その突然変異、誘導体、または変異体をコーディングするポリヌクレオチド、軽鎖または重鎖の可変領域または単にＣＤＲをコーディングするポリヌクレオチド、混成化プローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを増幅、究明、分析または突然変異の誘発に使用するＰＣＲまたは塩基配列分析プライマーを含む。核酸は任意の長さである。これらは例えば、長さが５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００または２５００個以上のポリヌクレオチドであってもよく／よいか、または１つ以上の追加的な配列、例えば調節配列を含んでもよく／よいか、またはさらに大きい核酸、例えばベクターの一部であってもよい。前記核酸は一本鎖または二本鎖でもよく、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡポリヌクレオチド、およびその人工変異体（例：ペプチド核酸）を含むことができる。
【０１０５】
一実施形態において、本明細書に開示される抗体またはその断片をコーディングする核酸は、本明細書に開示されるＣＤＲ、前記ＣＤＲを含む可変領域、前記可変領域および不変領域を含む全長抗体をコーディングする核酸である。アミノ酸配列が決定されると、核酸配列は、公知の逆転写プログラムおよびコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）などを考慮して容易に決定可能である。ヒトＩｇＧ１をコーディングする重鎖不変領域の例示的な核酸配列は、配列番号９２で表される。ヒトラムダをコーディングする軽鎖不変領域の例示的な核酸配列は、配列番号９４または９５で表される。このような不変領域の核酸配列を含む全長重鎖の例示的な核酸配列は、配列番号７５〜８２、１０２および１０３から選択されるいずれか１つの配列（ヒトＩｇＧ１不変領域を含む重鎖）、全長軽鎖の例示的な核酸配列は、配列番号８３〜９０から選択されるいずれか１つの配列（ヒトラムダ不変領域を含む軽鎖）が挙げられる。
【０１０６】
また、表１ａから表１ｆのＣＤＲ配列、および表２ａおよび表２ｂの可変領域をコーディングする核酸配列が含まれる。このような核酸配列は、前記開示された全長抗体をコーディングする核酸配列に含まれるため、別途に記載せず、当業者であれば本明細書に開示されるＣＤＲおよび可変領域のタンパク質配列に基づいて、これをコーディングする核酸配列を前記配列番号７５〜９０から容易に確認できる。
【０１０７】
本発明はまた、本明細書に開示される１つ以上の核酸配列と実質的な配列同一性を有する１つ以上の核酸配列を含む。実質的同一性とは、核酸の変異がアミノ酸置換を伴わない保存的置換またはアミノ酸変異を誘発する場合にも、前記核酸によってコーディングされる抗体または抗原結合断片が本明細書に開示される効果を維持することを意味する。
【０１０８】
抗体の抗原に対する特異性および親和度
本発明に係る抗体または抗原結合断片は、特にＲＯＲ１抗原に対する特異性および抗体治療剤／診断剤としての使用に適切な親和度を有する。一実施形態において、表６によれば、凝集体に対する親和度はＫＤ＜１．０×１０−９Ｍであり；さらに他の実施形態ではＫＤ≦１．０×１０−１０Ｍである。このような親和度を有する本発明に係る抗体または抗原結合断片は、これより低い親和度、例えば親和度が１０−８Ｍまたは１０−９Ｍの抗体と比較して、さらに少ない投与量で投与できるという利点がある。これは、抗体を例に挙げると、これによって限定するものではないが、皮下注射などのより簡単な方式で投与しても十分な効能が得られるため、臨床的に大きなメリットがある。
【０１０９】
抗体の可変領域
本発明はまた、上述のように、前記表２ａおよび表２ｂに示すような抗体の軽鎖可変領域または抗体の重鎖可変領域およびこのような軽鎖および重鎖の可変領域の免疫機能性断片、誘導体、突然変異タンパク質および変異体を含む抗体（およびこれに相応する核酸配列）に関する。本発明に係る重鎖および軽鎖の可変領域を多様に組み合わせた抗体は「ＶＨｘ／ＶＬｙ」で表され、ここで「ｘ」は重鎖可変領域の配列番号、「ｙ」は軽鎖可変領域の配列番号に相当する。一実施形態において、前記可変領域は以下の組み合わせを含むことができるが、これらに限定されるものではない：ＶＨ４３／ＶＬ５１、ＶＨ４３／ＶＬ５２、ＶＨ４３／ＶＬ５３、ＶＨ４３／ＶＬ５４、ＶＨ４３／ＶＬ５５、ＶＨ４３／ＶＬ５６、ＶＨ４３／ＶＬ５７、ＶＨ４３／ＶＬ５８、ＶＨ４４／ＶＬ５１、ＶＨ４４／ＶＬ５２、ＶＨ４４／ＶＬ５３、ＶＨ４４／ＶＬ５４、ＶＨ４４／ＶＬ５５、ＶＨ４４／ＶＬ５６、ＶＨ４４／ＶＬ５７、ＶＨ４４／ＶＬ５８、ＶＨ４５／ＶＬ５１、ＶＨ４５／ＶＬ５２、ＶＨ４５／ＶＬ５３、ＶＨ４５／ＶＬ５４、ＶＨ４５／ＶＬ５５、ＶＨ４５／ＶＬ５６、ＶＨ４５／ＶＬ５７、ＶＨ４５／ＶＬ５８、ＶＨ４６／ＶＬ５１、ＶＨ４６／ＶＬ５２、ＶＨ４６／ＶＬ５３、ＶＨ４６／ＶＬ５４、ＶＨ４６／ＶＬ５５、ＶＨ４６／ＶＬ５６、ＶＨ４６／ＶＬ５７、ＶＨ４６／ＶＬ５８、ＶＨ４７／ＶＬ５１、ＶＨ４７／ＶＬ５２、ＶＨ４７／ＶＬ５３、ＶＨ４７／ＶＬ５４、ＶＨ４７／ＶＬ５５、ＶＨ４７／ＶＬ５６、ＶＨ４７／ＶＬ５７、ＶＨ４７／ＶＬ５８、ＶＨ４８／ＶＬ５１、ＶＨ４８／ＶＬ５２、ＶＨ４８／ＶＬ５３、ＶＨ４８／ＶＬ５４、ＶＨ４８／ＶＬ５５、ＶＨ４８／ＶＬ５６、ＶＨ４８／ＶＬ５７、ＶＨ４８／ＶＬ５８、ＶＨ４９／ＶＬ５１、ＶＨ４９／ＶＬ５２、ＶＨ４９／ＶＬ５３、ＶＨ４９／ＶＬ５４、ＶＨ４９／ＶＬ５５、ＶＨ４９／ＶＬ５６、ＶＨ４９／ＶＬ５７、ＶＨ４９／ＶＬ５８、ＶＨ５０／ＶＬ５１、ＶＨ５０／ＶＬ５２、ＶＨ５０／ＶＬ５３、ＶＨ５０／ＶＬ５４、ＶＨ５０／ＶＬ５５、ＶＨ５０／ＶＬ５６、ＶＨ５０／ＶＬ５７、ＶＨ５０／ＶＬ５８、ＶＨ９８／ＶＬ５１、ＶＨ９８／ＶＬ５２、ＶＨ９８／ＶＬ５３、ＶＨ９８／ＶＬ５４、ＶＨ９８／ＶＬ５５、ＶＨ９８／ＶＬ５６、ＶＨ９８／ＶＬ５７、ＶＨ９８／ＶＬ５８、ＶＨ９９／ＶＬ５１、ＶＨ９９／ＶＬ５２、ＶＨ９９／ＶＬ５３、ＶＨ９９／ＶＬ５４、ＶＨ９９／ＶＬ５５、ＶＨ９９／ＶＬ５６、ＶＨ９９／ＶＬ５７またはＶＨ９９／ＶＬ５８。
【０１１０】
上述したような前記多様な可変領域の多様な組み合わせは、完全な抗体およびｓｃＦＶなどを含む多様な形態の抗体に使用可能である。
【０１１１】
ＣＤＲ
本明細書に開示される抗体は、１つ以上のＣＤＲがグラフト、挿入および／または連結されたポリペプチドである。一実施形態において、抗体は１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを有することができる。したがって、抗体は、例えば１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を有することができる。
【０１１２】
可変領域において抗体の相補的決定領域（ＣＤＲ）およびフレーム領域（ＦＲ）に相当するアミノ酸配列の位置は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））またはＯＰＡＬライブラリーと関連する方式（Ｈｙｅ  Ｙｏｕｎｇ  Ｙａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，２００９  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ２７：２２５）によって決定可能である。各定義によって決定された前記ＣＤＲは、互いに比較すれば、重なるか、または１つが他の１つを含むサブセットであってもよい。しかし、本明細書では、前記各方法によって定義されるすべてのＣＤＲが本発明の範囲に含まれる。当業者であれば、抗体の可変領域配列が与えられると、ここで、前記各定義によるＣＤＲ配列を容易に選択することができる。
【０１１３】
本発明に係る抗体の重鎖および軽鎖に含まれるＣＤＲは、表１ａから表１ｆ（あるいは、重鎖ＣＤＲＨ１は配列番号１〜５から選択されるいずれか１つ、重鎖ＣＤＲＨ２は配列番号６〜１３および９６から選択されるいずれか１つ、重鎖ＣＤＲＨ３は配列番号１４〜２１および９７から選択されるいずれか１つで表され、軽鎖ＣＤＲＬ１は配列番号２２〜２９から選択されるいずれか１つ、軽鎖ＣＤＲＬ２は配列番号３０〜３７から選択されるいずれか１つ、軽鎖ＣＤＲＬ３は配列番号３８〜４２から選択されるいずれか１つ）に示す。
【０１１４】
本発明はまた、表１ａから表１ｆに示した１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含む。実質的な同一性とは、配列の変異が存在する本発明に開示された効果を維持することを意味する。
【０１１５】
自然的に生じる抗体のＣＤＲの構造および特徴は上述した通りである。簡単に説明すると、典型的な抗体に対してＣＤＲは、抗原結合および認識に関与する領域を構成する重鎖および軽鎖の可変領域中のフレームワーク内に含まれる。可変領域は、フレームワーク領域内に少なくとも３個の重鎖または軽鎖のＣＤＲを含む。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））またはＯＰＡＬライブラリーと関連する方式（Ｈｙｅ  Ｙｏｕｎｇ  Ｙａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，２００９  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ２７：２２５）。しかし、本明細書に開示されるＣＤＲは、典型的な抗体構造の抗原結合ドメインを定義するために使用され、また、本明細書に開示されるように、他の多様なポリペプチド構造に含まれて使用することができる。
【０１１６】
当業者であれば、抗体が本明細書に開示される１つ以上のＣＤＲを含む場合、開示された各ＣＤＲは、互いに独立して選択され組み合わされることを理解するであろう。したがって、１、２、３、４、５または６個の独立して選択されるＣＤＲを有する抗体を生成することができる。また、組み合わせのためにＣＤＲが選択される場合、同じ種類のＣＤＲを繰り返し使用せず、例えば、抗体は一般に２個のＣＤＲＨ２領域を含んで製造しないことは当業者であれば分かることであろう。
【０１１７】
単クローン抗体
本明細書に開示される抗体は、ＲＯＲ１に結合する単クローン（モノクローナル）抗体を含む。特に、ＲＯＲ１を特異的に認識するヒト単クローン抗体を含み、ヒトおよびマウスＲＯＲ１に対する交差反応性を示す。
【０１１８】
単クローン抗体は、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて製造可能である。また、例えば抗原に対する多様な親和度を有する抗体のような異なる特性を有する抗体を製造する技術も公知である。このような技術は、例えば、ファージディスプレイといわれるフィラメントバクテリオファージの表面に免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーを表示して行われるチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）が挙げられる。例えば、実施形態に開示されたものを参照するか、または追加技術は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２２：５８１−５９７；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３に記載のものを参照することができる。
【０１１９】
また、単クローン抗体は当該技術分野で公知の任意の技術を用いて製造することができる。例えば、免疫化された形質転換動物から収集された脾臓細胞を不滅化させることで産生できる。脾臓細胞は、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて、例えば、これを骨髄腫細胞に融合してハイブリドーマを産生することで不滅化される。ハイブリドーマ−産生融合過程に使用するための骨髄腫細胞は好ましくは、非−抗体−産生性であり、高い融合効率を有し、特定の酵素が欠如してこれらが目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支援する特定の選択培地中で成長できないようにする。マウス融合に使用するための好適な細胞株の例としては、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸＯ  Ｂｕｌを含み、ラット融合に使用される細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０を含む。細胞融合のために使用される他の細胞株としては、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６を含むことができる。いくつかの場合には、ハイブリドーマ細胞株は、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有する形質転換動物、ＲＯＲ１免疫原によって免疫化された動物）から脾臓細胞を収集し；収集された脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合してハイブリドーマ細胞を産生し；ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を確立し、ＲＯＲ１に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を識別することで産生される。ハイブリドーマ細胞株によって分泌された単クローン抗体は、当該技術分野で公知の技術を用いて精製することができる。
【０１２０】
キメラ抗体
また、抗体は、多様な目的のために多様な方式で変形可能である。キメラ抗体は、異なる抗体に由来するポリペプチド断片が共有結合で連結されて免疫学的に機能的な軽鎖、重鎖またはその断片を形成する抗体である。一般に、前記キメラ抗体の軽鎖および／または重鎖の一部分は、特定の種または特定の綱またはサブタイプに属する配列であり、残りの配列は、他の種または他の綱またはサブタイプに属する。キメラ抗体の製造方法について、例えば米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１−６８５５を参照することができる。ＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）は、例えば米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号および同第５，５３０，１０１号を参照することができる。
【０１２１】
一般に、キメラ抗体を製造する目的は、抗体が使用される生物体から発見されるアミノ酸の数を最大化することである。一例としては「ＣＤＲ−移植（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ）」抗体であるが、前記抗体は、特定の種または特定の綱またはサブタイプ由来の１つ以上のＣＤＲを含み、残りの部分は他の種または他の綱またはサブタイプの抗体由来である。例えばヒトに使用するために、齧歯類抗体の可変領域または選択されたＣＤＲがヒト抗体内に移植されてヒト抗体の自然的に現れる可変領域またはＣＤＲを代替するか、またはその逆であってもよい。
【０１２２】
また、一実施形態において、ヒト以外の種に由来する不変領域は、ヒト由来の可変領域と組み合わされたハイブリッド抗体が使用可能である。
【０１２３】
完全ヒト抗体
また、本発明は完全ヒト抗体が開示される。ヒトを抗原に露出させずに所定の抗原（「完全ヒト抗体」）に特異的な完全ヒト抗体を製造することができる。
また、完全ヒト抗体は、ファージ−ディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）に由来する（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。ファージディスプレイ技術は、フィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）バクテリオファージの表面上で抗体レパートリーを表示し、これから目的とする抗原に結合するファージを選別する一種の免疫選択（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を模倣した方法である。このような1つの技術は、本実施形態または国際公開第ＷＯ９９／１０４９４号を参照することができる。一実施形態において、本発明の完全ヒトＲＯＲ１抗体はファージディスプレイ方法により選別される。この技術は、例えば本実施形態または国際公開第ＷＯ２００５／０１２３５９号を参照することができる。
【０１２４】
完全ヒト抗体を製造する他の方法は、マウス体液性免疫系を「ヒト化」することである。内因性Ｉｇ遺伝子は、活性化されていないマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入して、マウスで完全ヒト単クローン抗体（ｍＡｂ）を産生することができる。完全ヒト抗体を使用すれば、マウスまたはマウス由来のｍＡｂをヒトに投与することで誘発できる免疫原性反応およびアレルギー反応を最小化できる。このような完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリンの産生が欠乏してヒト抗体を産生できる形質転換動物（通常、マウス）を免疫化させることで産生可能である。このような目的のための抗原は典型的に、６個またはそれ以上の連続したアミノ酸を有し、任意に担体、例えば、ハプテンに接合される。例えば、次を参照することができる；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５−２５８；およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３。一例として、このような方法で、形質転換動物はマウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖をコーディングする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無力化させ、ヒトの重鎖および軽鎖タンパク質をコーディングするヒトゲノムＤＮＡを含む遺伝子座（ｌｏｃｉ）断片がマウスゲノム内に挿入されて産生される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を部分的に含む部分的に変形したマウスを交差交配して完全ヒト免疫グロブリン遺伝子座が導入されたマウスが産生される。前記動物に免疫原が投与されると、前記免疫原に免疫特異的であるものの、可変領域を含む抗体がミュリンではないヒトのアミノ酸配列を有する。このような方法は、例えば、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９４／０２６０２を参照する。ヒト抗体を製造するための形質転換マウスに関する方法は、米国特許第５，５４５，８０７号；同第６，７１３，６１０号；同第６，６７３，９８６号；同第６，１６２，９６３号；同第５，５４５，８０７号；同第６，３００，１２９号；同第６，２５５，４５８号；同第５，８７７，３９７号；同第５，８７４，２９９号および同第５，５４５，８０６号；ＷＯ９１／１０７４１号、ＷＯ９０／０４０３６号、およびＥＰ第５４６０７３Ｂ１号を参照することができる。
【０１２５】
多様な他の形態の抗体
本明細書に開示される抗体はまた、本明細書に開示される抗体の変異体である。例えば、抗原の一部は、前記開示された重鎖または軽鎖、可変領域またはＣＤＲ配列の1つ以上の残基に保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、ポリペプチドの活性または抗原性に実質的に影響を与えない置換を意味する。一実施形態において、保存的アミノ酸置換は、下記のアミノ酸分類のうち同一の分類に属する他の残基への置換を意味する。自然的に発生するアミノ酸は、側鎖特性の共通特性により次のように分類される：１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；２）中性、親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；５）鎖方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。保存的アミノ酸置換はまた、ペプチド模倣体のような非−自然的−発生アミノ酸残基を含むことができ、この残基は、通常細胞ではなく、化学的合成によって導入される。
【０１２６】
非限定的な例示的な保存的アミノ酸置換の例は表３に示すが、これによって限定されるものではない。
【表３】
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【０１２７】
非保存的置換は、前記分類のうち他の分類に属する残基への置換を含む。このような置換は、ヒト抗体と相同性である抗体領域または非相同性領域に導入可能である。
【０１２８】
このような置換を導入するために、一実施形態において、アミノ酸の疎水性または親水性を示す指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考えられる。タンパク質の指数プロファイル（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ）は、各アミノ酸の指数を指定し、その後、ポリペプチドによりこれらの値を繰り返し平均して計算する。各アミノ酸の指数は、疎水性と電荷特性に基づいて次のように指定される：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０１２９】
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与するために、指数プロファイルの重要性は当業界で公知である（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１）。特定のアミノ酸はこれと類似した数値指数または点数を有する他のアミノ酸に置換されてもよく、類似した生物学的活性が維持できることが知らされている。一実施形態において、指数に基づいて変化を施す際には、指数が±２以内、±１以内または±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。
【０１３０】
また、類似アミノ酸間の置換、特に置換によって産生されるタンパク質が本明細書に記載されるような免疫学的活性を有するタンパク質の場合、親水性を基準として行われる。一実施形態において、隣接するアミノ酸の親水性によって決定されるタンパク質の最大局所平均親水性値は、免疫原性および抗原結合特性のようなタンパク質の生物学的特性に関連する。
【０１３１】
アミノ酸残基の親水性値は次の通りである：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。類似した親水性値に基づいて置換する場合、一実施形態において、親水性値が±２以内、±１以内または±０．５以内であるアミノ酸置換が含まれる。また、親水性に基づいて１次アミノ酸配列からエピトープを識別することもできる。さらに、これらの領域は「エピトープコア領域」と称する。
【０１３２】
当業者であれば、公知の技術を用いて、本明細書に開示されたポリペプチドの適切な変異体を決定することができる。当業者であれば、ポリペプチドにおいて活性に重要とされない領域を変異体の標的として、活性を破壊せずともタンパク質を変化させられる部位を探すことができる。当業者であれば、また、類似ポリペプチド間で保存される残基または部分を識別することができる。さらに他の実施形態において、生物学的活性または構造に重要とされる部分も生物学的活性を破壊せず、またはポリペプチド構造に否定的な影響を与えずに保存的アミノ酸置換を行うことができる。
【０１３３】
さらに、当業者であれば、類似ポリペプチドにおいて活性または構造に重要な残基を識別するために構造−機能的な分析を行うことができる。このような分析により、1つのタンパク質からこれと類似のタンパク質の活性または構造に重要なアミノ酸残基に相応する残基を探して、目的とするタンパク質において重要なアミノ酸残基を予測できる。当業者はこのように予測された重要なアミノ酸残基を化学的に類似したアミノ酸に置換することができる。
【０１３４】
当業者はまた、前記類似ポリペプチドの３次元構造およびこれと関連するアミノ酸配列の分析に基づいて抗体の３次元構造と関連するアミノ酸残基を予測できる。当業者は、タンパク質の表面に存在すると予測されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与できるため、急激な変化を導入しない。しかも、当業者はそれぞれの目的とするアミノ酸残基において単一のアミノ酸置換を含む試験変異体を産生することができる。これらの変異体はその後、抗原に対する結合力を利用してスクリーニングされて、どのアミノ酸置換が目的に合うかに関する情報を得ることができる。このような情報を利用して、当業者は、置換されてもよい位置、回避すべき位置を容易に決定することができる。
【０１３５】
また、タンパク質の２次構造に基づいて置換される位置を決定することができる。例えば、２次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）に基づく。例えば、３０％超過の配列同一性または４０％超過の類似性を有する２個のポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造的位相を有することができる（Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７）。２次構造を予測する付加的な方法には、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９７７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−３８７；Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ４：１５−１９）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：１６４−１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８）、および「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，１９９９，ｉｂｉｄ；ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，１９９７，ｉｂｉｄ）が含まれる。
【０１３６】
一実施形態において、アミノ酸置換は、（１）タンパク質の分解に対する敏感性の減少、（２）酸化に対する敏感性の減少、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和度の変更、（４）抗原結合親和度の変更および／または、（５）タンパク質に他の物理化学的または機能的特性を付与するように変更を行う。例えば、保存的置換を含む単一または複数のアミノ酸置換は、抗体において、分子間接触に関与するドメインではなく、その他の部分で置換を行うことができる。このような実施形態において、親配列の構造的特徴を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換、例えば、親抗体の２次構造を変更させない１つ以上のアミノ酸への置換が使用可能である。当該技術分野で公知のポリペプチド２次および３次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．），１９８４，Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ３５４：１０５）を参照することができる。
【０１３７】
さらに好ましい抗体変異体は、親配列内で１つ以上のシステイン残基が欠失するか、またはシステイン残基がセリンなどの他のアミノ酸に置換された変異体が含まれる。システイン変異体は、特に、抗体が生物学的活性を有する構造に再びフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）されてこそ有用である。システイン変異体は、親抗体と比較して少ない数のシステイン残基を有することができ、対のないシステインによる相互作用を最小化させるために、一般に偶数で含まれる。
【０１３８】
本明細書に開示された重鎖および軽鎖、可変領域ドメインおよびＣＤＲは、ＲＯＲ１に特異的に結合できる抗原結合領域を含むポリペプチドを製造するのに使用可能である。例えば、表１ａ〜表１ｆに示すＣＤＲのうちの１つ以上は、ポリペプチドのような分子に非共有または共有結合して、免疫接着分子として使用される。このような免疫接着分子は、ＣＤＲが大きなポリマー内に統合されたものであるか、またはＣＤＲが他のポリペプチドに連結されたものである。このような免疫接着分子は、これに連結されたポリペプチドまたはその他の物質を目的とする抗原、例えばＲＯＲ１またはエピトープに特異的結合可能にする。
【０１３９】
また、本明細書に開示された可変領域およびＣＤＲに基づいたペプチド模倣体が提供される。このような模倣体は、ペプチド、非−ペプチド、またはペプチドおよび非−ペプチドの組み合わせであってもよく、次を参照することができる：Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ  ｐ．３９２；およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９。１つの有用なポリペプチドと構造的に類似のペプチド模倣体は、元のポリペプチドと類似した効果を有する。このような化合物は、コンピュータ分子モデリング（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）を利用して開発できる。一般に、前記ペプチド模倣体は目的とする生物的な活性、例えば、本発明のＲＯＲ１に特異的に結合する能力を示す抗体と構造的に類似しているが、１つ以上のペプチド結合は、当該技術分野で広く公知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ−ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−およびＣＨ２ＳＯ−からなる群より選択される結合に代替できる。より安定したタンパク質の産生のために、１つ以上の保存配列の残基を同じ類型のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）に置換されてもよい。また、ペプチドを環化できる分子は、内部に架橋形成システイン残基を導入して保存配列に構造的に制限を加えるペプチドを産生することができる（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）。
【０１４０】
本発明はまた、本明細書に開示された抗体の誘導体を提供する。誘導化された抗体は、抗体またはその断片に目的とする特性、例えば、特定の用途で増加した半減期を提供する任意の分子または物質を含むことができる。前記誘導化された抗体は、検出可能な（または標識）残基（例：放射性、比色計、抗原性または酵素分子、検出可能なビーズ（例：磁気ビーズまたは電子密度（例：金）ビーズ））、または他の分子（例：ビオチンまたはストレプトアビジンに結合する分子）、治療的または診断的残基（例：放射性、細胞毒性、または薬学的活性残基）、または特別な用途（例えば被験者、例えばヒト被験者に投与、またはその他の生体内または試験管内使用）のための抗体の適合性を増加させる分子を含むことができる。抗体を誘導化させるために使用される分子の例には、アルブミン（例：ヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。抗体のアルブミン結合およびペギル化された誘導体は、当該技術分野で広く公知の技術を用いて製造することができる。一実施形態において、ペギル化された単鎖ポリペプチドを含む。他の実施形態において、抗体は、トランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ、ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体に接合または連結される。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される化学物質で化学的に変形可能である。
【０１４１】
他の誘導体は、例えば、ＲＯＲ１タンパク質のＮ−末端またはＣ−末端に融合された異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現によって製造できるＲＯＲ１結合タンパク質および他のタンパク質またはポリペプチドの共有または凝集接合体を含む。例えば、前記接合されたペプチドは、異種信号（またはリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母アルファ−因子リーダー、またはペプチド、例えば、エピトープタグであってもよい。ＲＯＲ１抗体ベース融合タンパク質は、ＲＯＲ１結合タンパク質（例：ポリ−Ｈｉｓ）の精製または識別を容易にするために追加されたペプチドを含むことができる。ＲＯＲ１結合タンパク質はまた、Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４；および米国特許第５，０１１，９１２号に開示されたようなＦＬＡＧペプチドに連結されてもよい。ＦＬＡＧペプチドは、抗原性に優れて、特定の単クローン抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合できるエピトープとして作用して、組換えタンパク質の迅速な確認および容易な精製を可能にする。
【０１４２】
一実施形態において、ＲＯＲ１結合タンパク質に融合されたペプチド残基間の共有または非共有相互作用により結合する複数のＲＯＲ１結合ポリペプチドを含むオリゴマーを提供する。このように結合するペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサ）またはオリゴマー化を促進する性質を有するロイシンジッパー（ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ）などのペプチドであってもよい。一実施形態において、オリゴマーは、２個または４個のＲＯＲ１結合タンパク質を含む。オリゴマーのＲＯＲ１結合タンパク質残基は、上記のような任意の形態、例えば変形体または断片であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、ＲＯＲ１結合活性を有するＲＯＲ１結合タンパク質を含む。
【０１４３】
一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて製造される。抗体由来のポリペプチドの多様な部位（Ｆｃドメインを含む）に融合された異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の製造は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５３５；Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ３４４：６７７；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ１０．１９．１−１０．１９．１１を参照することができる。
【０１４４】
他の実施形態は、抗体のＦｃ領域にＲＯＲ１結合タンパク質が融合された２個の融合タンパク質を含む二量体を提供する。前記二量体は、例えば、融合タンパク質をコーディングする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターによって形質転換された宿主細胞内で遺伝子融合体を発現し、発現した融合タンパク質が抗体分子と類似して組み合わせることができるようにすることで製造でき、鎖間の二硫化結合がＦｃ残基間に形成されて二量体が得られる。
【０１４５】
本明細書で使用される用語「Ｆｃポリペプチド」は、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドで、野生型または突然変異形態を含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含む切断された形態のポリペプチドも含まれる。Ｆｃ残基を含む融合タンパク質およびこれから形成されるオリゴマーは、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇカラムを用いた親和性クロマトグラフィーで容易に分離できるという利点がある。
【０１４６】
好適なＦｃポリペプチドの例としては、米国特許第５，４２６，０４８号および同第５，２６２，５２２号、同第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３９９２−４００１に記載のものが挙げられる。このような突然変異タンパク質のアミノ酸配列において、野生型アミノ酸１９番残基がＬｅｕからＡｌａに置換され、アミノ酸２０番残基がＬｅｕからＧｌｕに置換され、アミノ酸２２番がＧｌｙからＡｌａに置換される。突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対する親和度が減少する。
【０１４７】
他の実施形態において、本明細書に記載のようなＲＯＲ１結合タンパク質の重鎖および／または軽鎖の可変領域は、他の抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域に置換されてもよい。
【０１４８】
標識およびエフェクターグループ
一実施形態において、本発明に係る抗体または抗原結合断片は、１つ以上の標識（ｌａｂｅｌ）を含むことができる。「標識」は、任意の検出可能な物質を意味する。好適な標識グループの例は、放射線同位元素または放射線核種（例：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光性基（例：ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタン族蛍光体）、酵素基（例：ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光性基、ビオチニル基、または２次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、標識基は、潜在的な立体障害（ｓｔｅｒｉｃ  ｈｉｎｄｅｒａｎｃｅ）を減少させるために多様な長さのスペースアーム（ａｒｍ）を介して抗体にカップリングされる。タンパク質を標識化するための多様な方法は当該技術分野で公知であり、当業者であれば、特定の目的のために適切な標識および適切な方法を選択することができる。
【０１４９】
用語「エフェクターグループ」は、抗体にカップリングまたはコンジュゲーション可能な物質または合成物質である。一実施形態において、合成物質は治療用として機能する任意の物質を意味する。一実施形態において、適切な治療用物質の例は、放射線同位元素または放射線核種（例：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）などの治療用放射線物質を含む。他の適切な例は、細胞毒性剤または抗癌剤を含み、例えば、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）誘導体、カリケアマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、デュオカルマイシン（Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、アマニチン（ａｍａｎｉｔｉｎ）、ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ、ＰＢＤ）二量体、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（１−（Ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−１Ｈ−ｂｅｎｚｏ［ｅ］ｉｎｄｏｌｅ、ＣＢＩ）二量体およびＣＢＩ−ＰＢＤ異種二量体を含むことができるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、エフェクターグループは、潜在的な立体障害を減少させるために多様な長さのスペーサアームを介して抗体にカップリングされる。
【０１５０】
一般に、標識は検出方法により分類される：ａ）放射性または同位元素標識；ｂ）磁気標識（例：磁気粒子）；ｃ）酸化−還元活性残基；ｄ）光学染料；酵素グループ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）；ｅ）ビオチニルグループ；およびｆ）２次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例：ロイシンジッパー対配列、２次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。一実施形態において、前記標識基は、潜在的な立体障害を減少させるために多様な長さのスペーサアームを介して抗体にカップリングされる。タンパク質を標識化するための多様な方法が当該技術分野で公知である。
【０１５１】
一実施形態において、標識は、発色団、燐光体および蛍光体を含む光学性染料を含むが、これらに限定されるものではない。蛍光体は、低分子蛍光物質またはタンパク質性蛍光物質であってもよい。
【０１５２】
「蛍光標識」は、物質が有する蛍光特性により検出可能な任意の分子を意味する。蛍光標識の例としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ（ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅＪ）、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣレッド７０５、オレゴングリーン、アレクサ−フルオル染料（アレクサフルオル３５０、アレクサ−フルオル４３０、アレクサ−フルオル４８８、アレクサ−フルオル５４６、アレクサ−フルオル５６８、アレクサ−フルオル５９４、アレクサ−フルオル６３３、アレクサ−フルオル６４７、アレクサ−フルオル６６０、アレクサ−フルオル６８０）、カスケードブルー、カスケードイエローおよびＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）、ＦＩＴＣ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７などが含まれるが、これらに限定されるものではない。多様な光学的染料はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄを参照することができる。
【０１５３】
タンパク質蛍光標識物質は、レニルラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、プチロサルカス（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ）またはエクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）種のＧＦＰを含む緑色蛍光物質（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ；Ｓｔａｕｂｅｒ、１９９８  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、向上した黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１５４】
核酸
一態様において、本発明は、特定の混成化条件で本明細書に開示された核酸に混成される核酸を提供する。前記核酸の混成化方法は、当該技術分野で広く公知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６を参照することができる。本明細書において、厳しい混成化条件は５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を含む前洗浄溶液、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）；約５０％ホルムアミドの混成化緩衝剤、６ｘＳＳＣおよび５５℃の混成化温度（または他の類似した混成化溶液、例えば５０％ホルムアミドを含む溶液、４２℃の混成化温度）および０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６０℃の洗浄条件を使用する。厳しい混成化条件は、４５℃で６ｘＳＳＣ、その後に６８℃で０．１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１回以上の洗浄によって混成化される。さらに、当業者は、配列間で少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸が典型的に互いに混成化された状態を維持するのに必要な適切な混成化条件を選択することができる。
【０１５５】
混成化条件の選択に影響を与える基本パラメータおよび適切な条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，前記；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎ２．１０および６．３−６．４．を参照することができる。このような条件は、例えば、核酸の長さおよび／または塩基組成（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ（Ｕ）の構成）などに基づいて、当業者によって容易に決定可能である。
【０１５６】
また、本明細書に開示された核酸は突然変異変異体を含む。核酸内に突然変異により、前記核酸がコーディングするポリペプチド（抗体または抗体誘導体）のアミノ酸配列の変化を誘導することができる。突然変異は、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて導入できる。例えば、部位−指示された突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法、ランダム突然変異誘発（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法が使用可能である。このように製造された核酸の突然変異は、目的とする特徴を有するポリペプチドに対して選別される。
【０１５７】
前記核酸によってコーディングされるポリペプチドの生物学的活性を顕著に変化させずに、突然変異が核酸内に導入可能である。例えば、非−必須アミノ酸残基でアミノ酸置換を誘発するヌクレオチド置換を行うことができる。代案的に、核酸によってコーディングされるポリペプチドの生物学的活性を選択的に変化させる１つ以上の突然変異が前記核酸に導入可能である。例えば、突然変異は、生物学的活性を定量的にまたは定性的に変化させることができる。定量的な変化の例は、活性の増加、減少または除去を含む。定性的な変化の例は、抗体の抗原に対する特異性の変化を含む。
【０１５８】
また、核酸によってコーディングされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させずに、例えば、細胞内発現のためのコドン最適化のための変異が核酸内に導入可能である。この場合、コドンの重畳性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）によって同一のポリペプチドをコーディングする多数の核酸が製造可能である。
【０１５９】
本明細書に開示される任意の抗体またはその断片をコーディングする核酸は、当該技術分野で広く公知の分子生物学技術を用いてアミノ酸配列が変更されるように突然変異化される。
【０１６０】
他の態様においてまた、本発明は、本明細書に開示される核酸配列の検出のためのプライマーまたは混成化プローブへの使用に適した核酸分子を提供する。このような核酸は、例えば、プローブまたはプライマーとして使用可能な全長ポリペプチドをコーディングする核酸の断片、またはポリペプチドの活性部分（ＲＯＲ１結合部分）をコーディングする断片核酸などの全長核酸配列の部分を含むことができる。
【０１６１】
核酸配列に基づいて製造されたプライマーおよびプローブは、本明細書に開示される核酸または類似の核酸、またはポリペプチドをコーディングする転写体を検出するために使用することができる。一実施形態において、このようなプローブは、ポリペプチドを発現する細胞を識別するのに使用可能である。プライマーまたはプローブは、放射線同位元素、蛍光性化合物、酵素または酵素補助因子などの標識物質によって標識される。
【０１６２】
他の態様においてまた、本発明に係るポリペプチドまたはその一部分（例えば、１つ以上のＣＤＲまたは１つ以上の可変領域ドメインを含む断片）をコーディングする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例は、プラスミド、ウイルスベクター、非−エピソーム哺乳動物ベクターおよび（組換え）発現ベクターなどを含むが、これらに限定されるものではない。組換え発現ベクターは、宿主細胞で核酸の発現に適した形態の核酸を含むことができる。組換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞ベースの１つ以上の調節配列を含み、このような調節配列は、発現する核酸配列に作動可能に連結される。調節配列には、多くの種類の宿主細胞でヌクレオチド配列の発現を調節できる、例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーターなどのプロモーター；または特定の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を調節する、例えば組織−特異的調節配列（Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２３７）、および特別な処理または条件に反応してヌクレオチド配列の誘導性発現を指示する、哺乳動物細胞で作用するメタロチオネインプロモーター、および原核生物および真核生物システムの両方ともで作用するｔｅｔ−反応性および／またはストレプトマイシン反応性プロモーターを含む。当業者であれば、形質転換される宿主細胞の種類、目的とするタンパク質の発現程度などの要因を考慮して、適切なベクターおよび調節配列を選択することができる。選択された発現ベクターは宿主細胞に伝達され、本明細書に記載のような核酸によってコーディングされるタンパク質の産生に使用可能である。
【０１６３】
また他の側面において、本発明は、組換えベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核生物（例えばＥ．ｃｏｌｉ）または真核生物（例えば酵母、昆虫または哺乳動物細胞）であってもよい。ベクターＤＮＡは、公知の形質転換または形質感染技術により原核生物または真核生物に導入可能である。哺乳動物細胞で安定した形質感染の場合、使用される発現ベクターの種類および形質転換手法により少数の細胞だけが形質感染によって伝達されるＤＮＡをそのゲノムに統合できることが知られている。したがって、形質感染した細胞を識別し選択するために、一般に抗生剤耐性マーカーなどの選択可能なマーカーをコーディングする遺伝子が目的とする遺伝子とともに宿主細胞内に導入される。好ましくは、選択可能なマーカーには薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートへの耐性を提供するものが含まれる。目的とする核酸が安定して導入された細胞の選別は、薬物処理により生存する細胞だけを選択することで達成できる。
【０１６４】
治療方法：薬学的剤形、投与経路
抗体を用いた治療方法も提供される。一実施形態において、抗体は患者に提供される。抗体は、癌細胞表面に発現するヒトＲＯＲ１に結合することで、癌細胞の成長を抑制する。一実施形態において、抗体は細胞毒性剤と結合した形態で癌細胞表面に発現するヒトＲＯＲ１に結合することで、抗体に結合した細胞毒性剤を癌細胞に特異的に伝達して、癌細胞の死滅を誘導する。一実施形態において、抗体は、同じ標識または他の標識に特異的な抗体と二重抗体などの多重抗体の形態で癌細胞表面に発現するヒトＲＯＲ１に結合することで、多重抗体の癌細胞に対する特異性を高めるか、または癌細胞と免疫細胞などの他の種類の細胞間の結合を誘導して癌細胞の死滅を誘導する。一実施形態において、抗体はＣＡＲ−Ｔなどの細胞治療剤の表面に発現して抗体がヒトＲＯＲ１に結合することで、細胞治療剤を癌細胞に特異的に伝達して癌細胞の死滅を誘導する。
【０１６５】
抗体の治療的有効量、および薬学的に許容可能な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／または補助剤を含む薬学的組成物も提供される。また、例えば、このような薬学的組成物を投与することで癌患者を治療する方法を含む。用語「患者」は、ヒト患者を含む。
【０１６６】
許容可能な剤形物質は、使用された用量および濃度で受容者に毒性がない。特定の一実施形態において、治療的有効量のヒトＲＯＲ１抗体を含む製薬組成物が提供される。
【０１６７】
以下、本発明の理解のために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明の理解のために提供されるものであり、本発明は下記の実施例によって制限されない。
【実施例】
【０１６８】
実施例１：ＲＯＲ１抗体の製造
実施例１−１：抗原
抗原としてはヒトＲＯＲ１の細胞外領域（ＥＣＤ）のＣ−末端にＦｃが連結されたＲＯＲ１  ＥＣＤ−Ｆｃ形態のタンパク質を使用した。
前記抗原の製造のために、具体的にはＲＯＲ１の細胞外ドメインを含むタンパク質としてＮＣＢＩ参照番号ＮＰ_００５００３．２で表されるＲＯＲ１アミノ酸配列番号１〜４０６のアミノ酸に相当する残基を利用した。前記ＲＯＲ１の細胞外ドメインをコーディングする遺伝子は、Ｏｒｉｇｅｎｅ社製のｃＤＮＡを購入して使用した（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製、ＲＣ２１４９６７）。また、以後にＲＯＲ１細胞外ドメインを精製するため、ＲＯＲ１細胞外ドメインをコーディングする遺伝子の３’末端にはヒトＩｇＧ１由来のＦｃタンパク質をコーディングする遺伝子を合成して連結した（下記「ＲＯＲ１−Ｆｃ」と称する）。前記遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ベクターに導入して、哺乳動物細胞株でＲＯＲ１−Ｆｃ核酸を暗号化するベクターを確保した。
【０１６９】
前記発現ベクターをＨＥＫ  ２９３Ｅ細胞に一時的にトランスフェクションさせ、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に８％ＣＯ２、３７℃の条件で培養することによってＲＯＲ１−Ｆｃ発現し、７２時間ごとに培地を収集し、次いで、培地を合わせてタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを使用してＦｃ−ＲＯＲ１  ＥＣＤタンパク質を精製した。
【０１７０】
実施例１−２：ファージライブラリースクリーニングによる抗体の選別製造
ライブラリーファージ（Ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｈａｇｅ）の製造
多様な抗原に対する結合の可能性を有しているヒト由来ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリー（Ｙａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，２００９  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ２７：２２５）遺伝子を有する大腸菌２ｘ１０１０を２Ｘ  ＹＴ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｊ９０２−５００Ｇ）、カルベニシリン（Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｃ０１０９．００２５）１００μｇ／ｍｌ、２％のグリコース（ｓｉｇｍａ、Ｇ７０２１）を含む培地に３７℃で２時間〜３時間培養した後（ＯＤ６００＝０．５〜０．７）、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を感染させ、２Ｘ  ＹＴ［２Ｘ  ＹＴ、カルベニシリン、カナマイシン（Ｄｕｃｈｆａ、Ｋ０１２６）７０μｇ／ｍｌ、１  ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｉ１４０１）］培地に３０℃で１６時間培養してファージパッケージングを誘導した。次いで、培養した細胞を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）した後、上澄液に４％  ＰＥＧ８０００（ｓｉｇｍａ、Ｐ２１３９）と３％  ＮａＣｌ（Ｓａｍｃｈｕｎ、Ｓ２０９７）を添加してよく溶かした後、氷上で１時間反応させた。再び遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）した後、ペレットにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、Ｇｉｂｃｏ  １００１０−０２３）を添加して懸濁した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）してライブラリーファージを含む上澄液を新しいチューブに入れて使用時まで４℃で保管した。
【０１７１】
ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）によるパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
ヒトＲＯＲ１タンパク質と結合する抗体を選別するために、実施例１−１で製造されたＲＯＲ１−Ｆｃタンパク質を用いて、下記のようなパニングを総３回進行させた。
具体的には、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ｍａｘｉｓｏｒｐ４４４２０２）に１０μｇ／ｍｌ濃度のＲＯＲ１−Ｆｃと陰性対照群−Ｆｃ（ＢＣＭＡ−Ｆｃ）をＰＢＳに添加して、４℃で一晩試験管の表面にタンパク質を吸着させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）３％溶液を試験管に添加してＲＯＲ１−Ｆｃが吸着しない表面を保護した。試験管を空けた後、ＢＳＡ３％溶液に分散した１０１２ＣＦＵの抗体ファージライブラリーを対照群Ｆｃタンパク質が吸着している免疫試験管に入れて常温で１時間反応させた（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）。次いで、陰性対照群Ｆｃに非結合ファージを回収してＲＯＲ１−Ｆｃが吸着した免疫試験管に結合した。非特異的に結合したファージをＰＢＳ−Ｔ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）溶液で５〜３０回洗浄して除去し、残っている抗原特異的ファージ抗体を１００Ｍｍのトリエチルアミン溶液を用いて回収した。回収したファージを１Ｍ  トリス緩衝溶液（ｐＨ７．４）で中和させた後、ＥＲ２５３７大腸菌に、３７℃で１時間感染させ、感染した大腸菌をカルベニシリンを含む２Ｘ  ＹＴ寒天培地に塗抹して、３７℃で一晩培養した。翌日、培養された大腸菌を４ｍｌの２Ｘ  ＹＴカルベニシリン培養液に懸濁し、１５％グリセロールを添加して、一部は−８０℃に保管し、残りは次の実験のためのファージを製造した。このような過程を総３回繰り返しＲＯＲ１抗原特異的ファージプール（ｐｈａｇｅ  ｐｏｏｌ）を増幅および濃縮した。
【０１７２】
単クローンファージ抗体の選別（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｌｏｎｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
前記パニングにより得られたファージプール（ｐｈａｇｅ  ｐｏｏｌ）からＲＯＲ１に特異的に結合する単クローン抗体を選別するために、下記のような実験を行った。
【０１７３】
濃縮されたプールから単クローンを分離するために、ＬＢ−テトラサイクリン／カルベニシリン寒天培地に前記ファージプールを塗抹した後、培養して、単一コロニーを得た。次に、単クローンをウェルあたり４００μｌの２Ｘ  ＹＴ−テトラサイクリン／カルベニシリン培地が入った９６−ディープウェルプレートに接種して一晩培養した後、培養液１０μｌを新たな３９０μｌの２Ｘ  ＹＴ−テトラサイクリン／カルベニシリン培地が含まれている９６−ディープウェルプレートに入れて３７℃で４時間培養した。前記培養液に１ｍＭ  ＩＰＴＧとなるように入れて３０℃で一晩培養した。一晩培養した培養液を遠心分離して上澄液を取った。
【０１７４】
次いで、次のようにＥＬＩＳＡ方法を使用して、ヒトＲＯＲ１−Ｆｃ抗原に結合する単クローン可溶性ｓｃＦｖを発現するクローンを選択した（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ．Ｒａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ．２０００．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１ｓｔｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ．ＮＹ．ＵＳＡ．ｐｐ．１１．９−１１．１２）。具体的には、９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅｓ、ＮＵＮＣ、ＵＳＡ）に実施例１で用意した組換えヒトＲＯＲ１−ＦｃまたはＢＣＭＡ−Ｆｃをウェルあたり１００μｌを入れて、４℃で一晩コーティングした。ＢＣＭＡ−Ｆｃは陰性対照群として用いたタンパク質で、ヒトＢＣＭＡタンパク質の細胞外ドメイン領域をヒトＦｃに連結した組換えタンパク質である。３％ＢＳＡを各ウェルあたり２００μｌずつ入れて、３７℃で２時間ブロッキングした。前記単クローンファージ上澄液は３％ＢＳＡと１：１で混合して用意し、この混合液を１００μｌずつ前記ウェルにローディングした後、３７℃で２時間反応させた。ＰＢＳＴ３００μｌで５回洗浄した後、抗−ＨＡ  ＨＲＰ結合抗体を入れて３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳＴで５回洗浄した。ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）１００μｌを入れて発色した後、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μｌを入れて反応を中止した後、４５０ｎｍおよび６５０ｎｍで吸光度を測定して、ＲＯＲ１  １μｇ／ｍＬコーティングした時に吸光度値（４５０ｎｍ〜６５０ｎｍ）が１．０以上のクローンを選別した（図１）。
【０１７５】
次いで、ＲＯＲ１を発現する細胞株に結合するクローンは柔細胞分析で選別した。具体的には、前記単クローンｓｃＦｖ上澄液１００μｌをＲＯＲ１を過剰発現する癌細胞株（ＪｅＫｏ−１）と反応させた後、ＰＢＳで２回洗浄した。抗−ＨＡ−ＦＩＴＣ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｈ７４１１）と４℃で３０分間反応した後、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ  ２００μｌで懸濁してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いてＪｅＫｏ−１細胞株に結合するクローンを選別した（図２）。
【０１７６】
これから組換えヒトＲＯＲ１タンパク質およびＲＯＲ１を発現する細胞株に結合する１０個の抗体クローン（ＡＢ４、Ａ２Ｆ２、Ａ２Ｆ３、ＢＡ６、ＣＣ９、Ｃ２Ｅ３、ＤＧ６、Ｄ２Ｂ１２、Ａ２Ｆ２  Ｍ１およびＢＡ６  Ｍ１）を選別し、前記各抗体の重鎖可変および軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびＣＤＲ配列は下記表の通りである。
【表４】
2021524242.tif 000012
【表５】
2021524242.tif 000013
【０１７７】
前記可変領域およびＣＤＲ配列をコーディングする核酸配列は、ＡＢ４、Ａ２Ｆ２、Ａ２Ｆ３、ＢＡ６、ＣＣ９、Ｃ２Ｅ３、ＤＧ６、Ｄ２Ｂ１２、Ａ２Ｆ２  Ｍ１およびＢＡ６  Ｍ１の順に以下の重鎖および軽鎖全長をコーディングする核酸配列の一部として含まれている：配列番号７５（重鎖）および８３（軽鎖）；配列番号７６（重鎖）および８４（軽鎖）；配列番号７７（重鎖）および８５（軽鎖）；配列番号７８（重鎖）および８６（軽鎖）；配列番号７９（重鎖）および８７（軽鎖）；配列番号８０（重鎖）および８８（軽鎖）；配列番号８１（重鎖）および８９（軽鎖）；配列番号８２（重鎖）および９０（軽鎖）；配列番号１０２（重鎖）および８４（軽鎖）；および配列番号１０３（重鎖）および８６（軽鎖）。前記核酸配列で不変領域をコーディングする核酸配列は配列番号９２（重鎖）、および配列番号９４（軽鎖）または９５（軽鎖）である。
【０１７８】
実施例２：抗ＲＯＲ１  ｓｃＦｖの全体ＩｇＧ形態に変換および産生
実施例２−１：抗ＲＯＲ１  ｓｃＦｖの全体ＩｇＧ形態へのクローニング
実施例１で確保した各ＲＯＲ１特異的単クローンファージ抗体の配列を全体ＩｇＧ（ｆｕｌｌ  ＩｇＧ）形態に変換するために、実施例１で確保した各クローンの重鎖および軽鎖可変領域をコーディングする核酸を合成した（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ社製、Ｋｏｒｅａ）。ヒトＩｇＧ１のサブタイプの重鎖と軽鎖の不変領域（それぞれ配列番号９１および９３）タンパク質をコーディングする遺伝子を合成して前記各重鎖と軽鎖の可変領域をコーディングする核酸と連結した。各抗体の軽鎖と重鎖を暗号化する核酸は、それぞれｐｃＤＮＡ３．１ベースの発現ベクターにクローニングし、ＣＨＯ−Ｓ哺乳動物細胞株で抗体核酸を暗号化するベクターを確保した。
【０１７９】
比較群抗体としては、既存の抗−ＲＯＲ１抗体である２Ａ２（ＵＳ  ９，３１６，６４６）の可変領域にヒトＩｇＧ１を連結したキメラ抗体を比較群抗体として使用した。
【０１８０】
ＩｇＧ形態の本発明に係る抗体は、ＡＢ４、Ａ２Ｆ２、Ａ２Ｆ３、ＢＡ６、ＣＣ９、Ｃ２Ｅ３、ＤＧ６、Ｄ２Ｂ１２、Ａ２Ｆ２  Ｍ１およびＢＡ６  Ｍ１の順に以下の重鎖および軽鎖の全長配列が開示される：配列番号５９（重鎖）および６７（軽鎖）；配列番号６０（重鎖）および６８（軽鎖）；配列番号６１（重鎖）および６９（軽鎖）；配列番号６２（重鎖）および７０（軽鎖）；配列番号６３（重鎖）および７１（軽鎖）；配列番号６４（重鎖）および７２（軽鎖）；配列番号６５（重鎖）および７３（軽鎖）；配列番号６６（重鎖）および７４（軽鎖）；配列番号１００（重鎖）および６８（軽鎖）；および配列番号１０１（重鎖）および７０（軽鎖）。
【０１８１】
実施例２−２：抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体の発現
ＣＨＯ−Ｓ細胞をＣＤ−ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ、１０７４３）培地に１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に合わせた後、８％ＣＯ２、３７℃で１日間培養した。ＤＮＡトランスフェクション当日、２．５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった細胞を１％ＤＭＳＯが含まれているＣＤ−ＣＨＯ培地を用いて２．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に用意した後、８％ＣＯ２、３７℃で３ｈｒ培養した。３０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離した後、上澄液を除去した後、２．５％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁した。次いで、実施例２−１の重鎖と軽鎖を発現する各ベクターをそれぞれ培地ｍｌあたり１μｇずつＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に希釈し、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６、ｓｔｏｃｋ濃度：１mg／ｍｌ）は、培養培地ｍｌあたり８μｇに希釈した。前記ベクターおよびＰＥＩ混合物を混合して常温で１０ｍｉｎ定置した後、上記のように用意した細胞が含まれているフラスコに入れた後、５％ＣＯ２、３７℃、１００ｒｐｍで４ｈｒ培養した後、培養体積と同じ体積のＣＤ−ＣＨＯ培地を入れた後、８％ＣＯ２、３７℃、１１０ｒｐｍで４日間培養した。
【０１８２】
実施例２−３：抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体の分離精製
平衡緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）をＭａｂ選択器（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、５ｍｌ）に通過させて平衡化させた後、実施例２−２の培養液をカラム（Ｍａｂ  ｓｅｌｅｃｔｓｕｒｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、５ｍｌ））に通過させて発現した抗体がカラムに結合するようにした。この後、５０ｍＭ  Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で溶出させた後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いて中和させて、最終ｐＨが７．２となるようにした。緩衝液をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）に交換した。
【０１８３】
実施例３：抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体のＲＯＲ１に対する結合特異性の分析
実施例３−１：抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体のＲＯＲ１抗原（細胞外領域）に対する結合能の分析（ＥＬＩＳＡ）
前記実施例１および２で製造し選別した各クローンのＩｇＧ抗体の抗原に対する特異的結合能を以下のように分析した。
【０１８４】
抗−ＲＯＲ１抗体−抗原の結合親和度は、ＥＬＩＳＡ法で溶液結合試験を用いて評価した。具体的には、９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅｓ、ＮＵＮＣ）を４℃で１６時間、ＰＢＳ溶液中の１μｇ／ｍｌ濃度の以下のＲＯＲ１タンパク質でコーティングし、非特異的結合部位は、３％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）で２時間遮断させた。この時、ＲＯＲ１タンパク質は、ヒトＲＯＲ１の場合実施例１のＲＯＲ１−Ｆｃまたは組換えヒトＲＯＲ１−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１３９６８−Ｈ０８Ｈ）を使用した。ＥＬＩＳＡ法で用いたＲＯＲ１−Ｈｉｓは、上記と同様にｓｉｎｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製（１３９６８−Ｈ０８Ｈ）のタンパク質で実施例１のＲＯＲ１−Ｈｉｓ、または組換えマウスＲＯＲ１タンパク質を使用した（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＯ１−Ｍ５２２１−１００μｇ）。
【０１８５】
次いで、９６−ウェルマイクロタイタープレート上に実施例３で用意した抗−ＲＯＲ１抗体を、図２に示す濃度にマイクロタイタープレートに追加した後、結合能を次の通りＥＬＩＳＡ法で分析した。具体的には、２時間恒温処理した後、前記プレートを０．０５％のツイン２０（ｔｗｅｅｎ２０）を含むＰＢＳで５回洗浄した後、ＨＲＰ接合Ｆａｂ多重クローナル抗体試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、３１４１４）を１：１０，０００の比率で希釈して前記洗浄したマイクロタイタープレートに入れて、１時間、３７℃で反応させてプレートに結合したＲＯＲ１抗体を検出した。反応後、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）を用いて発色させた。酵素反応を０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸により中止させ、マイクロプレートリーダー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて４５０ｎｍおよび６５０ｎｍで吸光度を測定した（４５０ｎｍ〜６５０ｎｍ）。
【０１８６】
その結果は図３ａ、図３ｂおよび図４に示しており、本発明の抗−ＲＯＲ１抗体は、ヒトＲＯＲ１とマウスＲＯＲ１に濃度依存的に結合したことを確認した。また、マウスＲＯＲ１タンパク質に対する交差反応性を比較したとき、本発明のＲＯＲ１抗体が、比較群として用いた２Ａ２対照抗体に比べて結合力に優れていることが示された。
【０１８７】
実施例３−２：抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体の細胞表面に発現するＲＯＲ１抗原に対する特異的結合能の測定（ＦＡＣＳ）
特定の抗原に対する抗体を治療用抗体など生体内で使用するためには、細胞表面に発現する抗原に結合することが必須要素である。一部の抗体の場合、精製された抗原には結合するが、細胞表面に発現する抗原には結合しない。この場合、生体内に抗体を投与しても抗原に対する結合が不可能なので、抗原を発現している細胞に抗体が結合せず、治療用抗体など生体内での活性を示すことができない。
【０１８８】
そこで本発明の抗−ＲＯＲ１抗体が細胞表面に発現するＲＯＲ１に結合するか否かをＦＡＣＳ分析により確認した。
【０１８９】
この実験のためにＲＯＲ１遺伝子を一時的に（ＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  ＲＯＲ１、ＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  ＲＯＲ２、ＣＨＯ−ｍｏｕｓｅ  ＲＯＲ１）または安定して（ＭＣ３８−ｈｕｍａｎ  ＲＯＲ１）トランスフェクションさせてＲＯＲ１タンパク質の発現を人為的に過剰発現させた細胞株（それぞれ図５および図７）またはＲＯＲ１を発現する細胞株（ＪｅＫｏ−１、Ｍｉｎｏ）（図６）またはＲＯＲ１を発現しない細胞株（ＭＣＦ７）（図６）とＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器を用いて抗−ＲＯＲ１抗体とＲＯＲ１の結合した程度を次の通り測定した。ＭＣＦ７は、ＲＯＲ１を発現しない陰性対照群であり、ＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  ＲＯＲ２は、ヒトＲＯＲ２を発現する陰性対照群である。ＪｅＫｏ−１、Ｍｉｎｏ、ＣＨＯ−ｈｕｍａｎ  ＲＯＲ１、ＣＨＯ−ｍｏｕｓｅ  ＲＯＲ１、ＭＣ３８−ｈｕｍａｎ  ＲＯＲ１は全てヒトＲＯＲ１またはマウスＲＯＲ１を発現する細胞株である。
【０１９０】
具体的には、各細胞株を解離させＰＢＳで洗浄した後、細胞数を計数して２×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ  ＰＢＳで合わせた後、実施例３で用意した各ＲＯＲ１単クローン抗体を１０μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌから５倍ずつ希釈して処理した後、４℃で１時間反応した。反応後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＦＩＴＣ標識された不変領域（Ｆｃ）特異的抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａ、Ｆ９５１２、濃度：２．０ｍｇ／ｍｌ）を２μｌ／１×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ  ＰＢＳで懸濁して４℃で１時間反応させた。一時的に過剰発現させたヒトＲＯＲ１、ヒトＲＯＲ２、マウスＲＯＲ１の発現程度の確認は商業的に販売されるＦＡＣＳ分析用抗体（ａｎｔｉ−ＲＯＲ１：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ２０００Ｇ、ａｎｔｉ−ＲＯＲ２：Ｒ＆Ｄ、ＦＡＢ２０６４１Ｐ）を用いて分析した。反応後、細胞をＰＢＳで洗浄しＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を用いて読み取った。陰性対照群（２ｎｄ  Ａｂ）は、ＦＩＴＣ標識された不変領域（Ｆｃ）特異的抗体のみを処理した。それぞれのＲＯＲ１単クローン抗体を処理した実験群で移動された読取結果を対照群の移動された読取結果と比較した（Ｍｅａｎ  Ｆｏｌｄ  Ｒａｔｉｏ  ＭＦＩ  Ｒａｔｉｏ：ＭＦＩ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＲＯＲ１／ＭＦＩ  ｏｆ  ２ｎｄ  Ａｂ）。
【０１９１】
その結果は図５、図６および図７に示す。その結果、本発明の抗−ＲＯＲ１抗体は、細胞自体で発現されるヒトＲＯＲ１（図６）および細胞で人為的に過剰発現されるヒトＲＯＲ１（図５、図７）の細胞外領域に特異的に、濃度依存的な様相で結合することを確認した。また、ファミリータンパク質のヒトＲＯＲ２には結合せず、マウスＲＯＲ１に対しては種間交差反応性があることを確認した（図５）。細胞表面に発現するマウスＲＯＲ１に対する交差反応性を比較した時、本発明のＲＯＲ１抗体が、比較群として用いた抗体である２Ａ２に比べて結合程度がさらに優れていることを確認した（図５）。
【０１９２】
実施例３−３：抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体の多様な癌腫での細胞表面に発現するＲＯＲ１抗原に対する結合能の測定（ＦＡＣＳ）
次に、ＦＡＣＳ分析を通して本発明の抗−ＲＯＲ１抗体が多様な種類の癌細胞株で細胞表面に発現するＲＯＲ１に結合するか否かを確認した。ＲＯＲ１は多様な癌細胞で発現するが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞白血病、リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）などの血液癌はもちろん、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、皮膚癌、膀胱癌、精巣癌、子宮癌、前立腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、神経芽細胞腫、脳癌、結腸癌、扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、子宮頸癌、甲状腺癌、頭頸部癌および副腎癌などの多様な固形癌でも過剰発現されることが報告された。
【０１９３】
この実験のため、次のような多様な種類の癌細胞株を使用した：ＡＧＳ（ＡＴＣＣＲＣＲＬ−１７３９ＴＭ，ｈｕａｍｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＮＣＩ−Ｎ８７（ＡＴＣＣＲＣＲＬ−５８２２ＴＭ，ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＭＫＮ−２８（ＫＣＬＢ８０１０２、ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＳＮＵ−１７５０（ＫＣＬＢ０１７５０、ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＳＮＵ−１６（ＡＴＣＣＲＣＲＬ５９７４ＴＭ，ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＨＣＣ１１８７（ＡＴＣＣＲＣＲＬ−２３２２ＴＭ，ｈｕａｍｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｃｅｒ  ＴＮＭ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＡ  ｇｒａｄｅ３）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＡＴＣＣＲＨＴＢ−２６ＴＭ，ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣＲＨＴＢ−１３２ＴＭ，ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、ＨＣＣ７０（ＡＴＣＣＲＣＲＬ２３１５ＴＭ，ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ＴＮＭ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩＡ、ｇｒａｄｅ３）、ＨＣＣ１１４３（ＡＴＣＣＲＣＲＬ−２３２１ＴＭ，ＴＮＭ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＡ、ｇｒａｄｅ３，ｐｒｉｍａｒｙｄｕｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＢＴ２０（ＡＴＣＣＲＨＴＢ−１９ＴＭ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、ＨＣＣ１８０６（ＡＴＣＣＲＣＲＬ−２３３５ＴＭ，ｈｕａｍｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｃｅｒ  ＴＮＭ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＢ  ｇｒａｄｅ２）、ＨＣＣ１９３７（ＡＴＣＣＲＣＲＬ２３３６ＴＭ，ＴＮＭ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＢ、ｇｒａｄｅ３，ｐｒｉｍａｒｙｄｕｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＢＴ４７４（ＡＴＣＣＲＨＴＢ−２０ＴＭ，ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣＲＨＴＢ−２２ＴＭ，ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｉｔｅ）、Ｈ４６０（ＡＴＣＣＲＨＴＢ−１７７ＴＭ，ｌａｒｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、Ａ５４９（ＡＴＣＣＲＣＣＬ−１８５ＴＭ，ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＡＴＣＣＲＣＲＬ−５９０８ＴＭ，ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、Ｈ１４３７（ＡＴＣＣＲＣＲＬ５８７２ＴＭ，ｓｔａｇｅ１、ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ）、Ｃａｌｕ−６（ＡＴＣＣＲＨＴＢ−５６ＴＭ，ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣＲＣＣＬ−２４７ＴＭ，ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＤＬＤ−１（ＡＴＣＣＲＣＣＬ−２２１ＴＭ，Ｄｕｋｅｓ’ｔｙｐｅ  Ｃ，ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＨＴ２９（ＡＴＣＣＲＨＴＢ−３８ＴＭ，ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、６９７（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ４２、ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、Ｋａｓｕｍｉ−２（ＡＴＣＣＲＣＲＬ−２７２４ＴＭ，ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、Ｍｉｎｏ（ＡＴＣＣＲＣＲＬ３０００ＴＭ，ＭａｎｔｌｅＣｅｌｌＬｙｍｐｈｏｍａ）ＪｅＫｏ−１（ＡＴＣＣＲＣＲＬ３００６ＴＭ，��ａｎｔｌｅＣｅｌｌＬｙｍｐｈｏｍａ）、およびＪｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣＲＴＩＢ−１５２ＴＭ，ａｃｕｔｅ  Ｔｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）。前記細胞株に対して、本発明の抗−ＲＯＲ１抗体を利用してＲＯＲ１に対する結合をＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０１９４】
具体的には、各細胞株を解離させＰＢＳで洗浄した後、細胞数を計数して２×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ  ＰＢＳで合わせた後、実施例３で用意した各ＲＯＲ１単クローン抗体中のクローン名Ｃ２Ｅ３抗体を１０μｇ／ｍｌで処理した後、４℃で１時間反応させた。反応後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＦＩＴＣ標識された不変領域（Ｆｃ）特異的抗体（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａ、Ｆ９５１２、濃度：２．０mg／ｍｌ）を２μｌ／１×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ  ＰＢＳで懸濁して４℃で１時間反応させた。反応後、細胞をＰＢＳで洗浄しＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を用いて読み取った。陰性対照群は、ＦＩＴＣ標識された不変領域（Ｆｃ）特異的抗体のみを処理した。各癌細胞株間のＲＯＲ１の発現程度を比較するために本発明のＲＯＲ１単クローン抗体（Ｃ２Ｅ３）を処理した実験群で移動された読取結果を対照群で移動された読取結果で割った値（Ｍｅａｎ  Ｆｏｌｄ  Ｒａｔｉｏ  ＭＦＩ  Ｒａｔｉｏ：ＭＦＩ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＲＯＲ１／ＭＦＩ  ｏｆ  ２ｎｄ  Ａｂ）を表記した。
【０１９５】
その結果は図８に示す。その結果、本発明の抗−ＲＯＲ１抗体は、胃癌、乳癌、肺癌、大腸癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）およびマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）由来の多様な癌細胞株で発現されるＲＯＲ１に結合することが確認された。
【０１９６】
実施例４：抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体のＲＯＲ１に対する親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）の測定
バイオセンサートレイケースに９６  ｗｅｌｌ  ｂｌａｃｋ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ）を装着し、８個のｗｅｌｌそれぞれに１０Ｘ  ＫＢまたはＤ．Ｗに２００μｌを入れた後、Ａｎｔｉ  Ｐｅｎｔａ  Ｈｉｓ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒまたはＡＲ２Ｇ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）８個を挿しこんで１０分間水和した。分析試料は希釈する濃度に合わせて６００μｌずつ２倍または３倍に希釈した。分析濃度は３０〜０．０２１ｎＭまで１Ｘ  ＫＢまたは１０Ｘ  ＫＢを使用して希釈した。抗原の固定のために組換えヒトＲＯＲ１−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１３９６８−Ｈ０８Ｈ）を１μｇ／ｍｌに１０Ｘ  ＫＢまたは酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ）緩衝液（ｐＨ５）に希釈した。固定化はローディング段階でしきい値０．３ｎｍａｔに固定した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎは３分〜１０分、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎは２０分間実験を行った。Ｏｃｔｅｔ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｅｍｐｌａｔｅに合わせて新たな９６  ｗｅｌｌ  ｂｌａｃｋ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに用意したｂｕｆｆｅｒを順序に合わせて入れた。Ｂａｓｅｌｉｎｅ１に使用される１０Ｘ  ＫＢまたはＤ．Ｗに２００μｌを入れた。Ｌｏａｄｉｎｇする抗原ＲＯＲ１−Ｈｉｓタンパク質、１μｇ／ｍｌを２００μｌずつ入れた。Ｂａｓｅｌｉｎｅ２に使用される１０Ｘ  ＫＢまたは１Ｘ  ＫＢ、２００μｌを入れた。希釈した抗体３０〜０．０２１ｎＭ、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｌａｎｋに該当する１０Ｘ  ＫＢ  ｂｕｆｆｅｒまたは１Ｘ  ＫＢを各ｗｅｌｌに２００μｌずつ入れた。実験ｐｌａｔｅの温度は３０℃に固定した。試料を全て入れた後、機器を作動した後、実験が終了してＯｃｔｅｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ９．０  ｓｏｆｔｗａｒｅで結果をアップロードした後、１：１ピッティンでＫＤ値を分析し、その結果は下記表６に示す。Ｏｃｔｅｔ分析法を利用して得られたＫＤ値により、抗−ＲＯＲ１抗体がＲＯＲ１抗原に対する強い結合力を有することを確認した。
【表６】
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【０１９７】
実施例５：抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体のマウス腫瘍異種移植モデルでの癌成長抑制効能分析
重症複合免疫不全マウス（Ｔｈｅ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍｏｕｓｅ、ＳＣＩＤ）にＲＯＲ−１を発現するヒトマントル細胞リンパ腫であるＪｅＫｏ−１細胞株を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ移植してヒト癌移植腫瘍マウスを製作した。移植後、腫瘍の大きさが平均１７０ｍｍ３に到達した（Ｄａｙ１）際に群分離を実施し、抗ＲＯＲ−１抗体５種を１０ｍｇ／ｋｇずつ週２回、総５回１ｍｌシリンジを利用してマウス腹腔内に投与した（Ｄａｙ１、４、７、１０および１４）。陰性対照群は、抗ＲＯＲ−１抗体の構造と類似したヒトＩｇＧ１（ＩｎＶｉｖｏＰｌｕｓ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＢＰ０２９７）を１０ｍｇ／ｋｇずつ週２回、総５回腹腔内に投与した。マウスに移植した腫瘍の大きさおよび体重は最初投与（Ｄａｙ１）直前に測定し、その後、各投与日の投与直前および最後の投与から２日後（Ｄａｙ１６）に測定した。
【０１９８】
その結果は図９ａおよび図９ｂに示す。本発明に係る抗ＲＯＲ−１抗体は癌の成長を抑制し、陰性対照群であるヒトＩｇＧ１抗体（ＨｕＩｇＧ１）に比べて本発明に係る癌の成長抑制効果（％  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、％ＴＧＩ）は実験終了日のＤａｙ１６を基準にしてＣ２Ｅ３  ３６．０％、Ａ２Ｆ２  ２８．９％、ＡＢ４  ３６．１％、ＢＡ６  ３１．７％、ＣＣ９  ２９．４％であることが示された。本発明に係る抗−ＲＯＲ１抗体は、ＨｕＩｇＧ投与群に比べて統計的有意差があることが示された（一元配置分散分析、Ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５）（図９ａ）。体重の測定結果（図９ｂ）、投与群間に有意差は観察されなかった。実施例３−１と３−２でのように、本発明の抗−ＲＯＲ１抗体はマウスＲＯＲ１抗原に交差反応性を有する。したがって、投与した本発明の抗−ＲＯＲ１抗体は、異種移植したヒトマントル細胞リンパ腫であるＪｅＫｏ−１細胞株が発現するヒトＲＯＲ１と共にマウスが同調的に発現するマウスＲＯＲ１に結合することも可能である。体重の測定結果、陰性対照群（ＨｕＩｇＧ１）と本発明の抗−ＲＯＲ１抗体間の体重の増加様相は類似していた。これは、本発明の抗−ＲＯＲ１抗体の投与によって毒性を誘導しないことを意味する。前記の結果は、本発明に係る抗体が、癌の治療剤として有用に使用できることを示す。
【０１９９】
マウス腫瘍異種移植モデルでは、本発明のＲＯＲ１抗体５種全てが癌の成長を抑制することが示された。これらのうちの一部の抗体（Ｃ２Ｅ３、ＡＢ４）は、以下の実施例６および図１０に示すように、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体によって多量体化されるとき、ＲＯＲ１の過剰発現の癌細胞株のアポトーシスを誘導できることが示された。しかし、癌の阻害機転は、アポトーシス誘導、癌細胞の分裂および成長抑制、癌血管新生の抑制、免疫細胞の活性化など多様な機転により可能であるため、後述する図１０の結果は、本発明に係る抗−ＲＯＲ１抗体が各抗体別に異なる作用機作によって生体内で癌細胞の成長を抑制する可能性があることを意味する。
【０２００】
実施例６：抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体のアポトーシス誘導能の分析
実施例５と同様に、腫瘍抑制能を示す本発明に係る抗体の可能な機転を分析するために、アポトーシス誘導能を分析した。
【０２０１】
そのため、ＲＯＲ１高発現細胞株のＪｅＫｏ−１を遠心分離して血清が含まれている培地を除去し、ＰＢＳを用いて１回洗浄した後、６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに各ｗｅｌｌあたり５×１０６個の細胞を血清のないＲＰＭＩ１６４０培地を利用してｓｅｅｄｉｎｇした。本発明の抗−ＲＯＲ１抗体１００μｇ／ｍｌとａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、３１１２５）３００μｇ／ｍｌを１：１で同量ｔｕｂｅに入れた後、常温で１０分間反応させ、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体によって抗−ＲＯＲ１抗体が多量体（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）を形成するようにした。１．５ｍｌの培地が入っている各ｗｅｌｌに前記混合物を１５０μｌ入れて、最終抗体の処理量がＲＯＲ１の抗体の場合１０μｇ／ｍｌ、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体は３０μｇ／ｍｌとなるようにした後、５％ＣＯ２、３７℃の条件で２４ｈｒ培養して反応させた。
【０２０２】
次いで、ＲＯＲ１抗体の単独処理および多量体化した抗−ＲＯＲ１抗体がアポトーシスするか否かを確認するため、各ｗｅｌｌの細胞を回収してＰＢＳで１回洗浄した。その後、アポトーシス標識Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖと死細胞標識ＰＩを各群に反応させて染色された程度をＦＡＣＳ分析を通して確認した。
【０２０３】
その結果は図１０に示す。実験の結果、抗−ＲＯＲ１抗体の単独処理によってはアポトーシスが観察されなかったが、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体によって多量体化した一部の抗−ＲＯＲ１抗体クローン（Ｃ２Ｅ３、ＡＢ４）の場合、対照群に比べてＡｎｎｅｘｉｎ  ＶとＰＩの染色程度が増加したことを確認し、特に、アポトーシス標識Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖの染色程度の場合、対照群に比べてＣ２Ｅ３クローンは２３％、ＡＢ４クローンは１０％増加したことを確認した。このようなアポトーシスがＲＯＲ１による特異的な反応であるか否かを確認するために、ＲＯＲ１非発現細胞株のＵ２６６にＣ２Ｅ３クローンを利用して、このような方法でＡｎｎｅｘｉｎ  ＶとＰＩの染色程度を確認し、ＲＯＲ１非発現細胞株のＵ２６６にはアポトーシスが誘導されないことを確認し、多量体化した抗−ＲＯＲ１の抗体によるアポトーシスがＲＯＲ１を通した特異的な反応であることを証明した。抗体は、生体内でＦｃ領域を通してＦｃγ受容体と結合しながら多量体を形成するので、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体を利用した抗−ＲＯＲ１抗体の多量体の形成は、生体内での現象を類似して作った条件であるといえる。前記分析結果は一機転で、本発明に係る抗−ＲＯＲ１抗体によってＲＯＲ１を過剰発現する癌細胞株でアポトーシスが誘導できることを意味する。
【０２０４】
付加して、ＲＯＲ１抗体の多量体化による癌細胞株のアポトーシス誘導はすべての種類のＲＯＲ１抗体に現れる現象ではない。例として、本発明のＲＯＲ１抗体中のＢＡ６クローンおよび比較群として用いた抗体の２Ａ２はａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体によって多量体化してもＲＯＲ１過剰発現癌細胞株のアポトーシスを誘導しなかった。これは、本発明に係るＲＯＲ１抗体が互いに異なる作用機作によって癌細胞の増殖能を有することを意味する。このような差は、本理論に限定するものではないが、各ＲＯＲ１抗体が結合するエピトープの違いに起因する。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月2日(2021.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片であって、
前記抗体または抗原結合断片は（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３重鎖相補性決定領域および（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の軽鎖相補性決定領域を含み、
前記ＣＤＲＨ１は配列番号１〜５から選択されるいずれか１つであり；
前記ＣＤＲＨ２は配列番号６〜１３および９６から選択されるいずれか１つであり；
前記ＣＤＲＨ３は配列番号１４〜２１および９７から選択されるいずれか１つであり；
前記ＣＤＲＬ１は配列番号２２〜２９から選択されるいずれか１つであり；
前記ＣＤＲＬ２は配列番号３０〜３７から選択されるいずれか１つであり；および
前記ＣＤＲＬ３は配列番号３８〜４２から選択されるいずれか１つである、ＲＯＲ１の細胞外領域を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の配列は、次のうちのいずれか１つの組み合わせである、請求項１に記載のＲＯＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、６および１４；
（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、７および１５；
（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、８および１６；
（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、９および１７；
（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、１０および１８；
（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号４、１１および１９；
（ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５、１２および２０；
（ｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、１３および２１；
（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、９６および１５；または
（ｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、９および９７。
【請求項３】
前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の配列は、次のうちのいずれか１つの組み合わせである、請求項１または２に記載のＲＯＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２２、３０および３８；
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１および３９；
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２４、３２および４０；
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３３および４１；
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２６、３４および４１；
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２７、３５および４２；
（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２８、３６および４１；または
（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２９、３７および４１。
【請求項４】
前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３；および前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の配列は、次のうちのいずれか１つの組み合わせである、請求項１に記載のＲＯＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、６および１４であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２２、３０および３８；
（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、７および１５であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１および３９；
（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、８および１６であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２４、３２および４０；
（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、９および１７であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３３および４１；
（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、１０および１８であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２６、３４および４１；
（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号４、１１および１９であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２７、３５および４２；
（ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号５、１２および２０であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２８、３６および４１；
（ｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、１３および２１であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２９、３７および４１；
（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、９６および１５であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２３、３１および３９；または
（ｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、９および９７であり、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２５、３３、および４１。
【請求項５】
前記抗体または抗原結合断片は、
（１）配列番号４３〜５０、９８および９９から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（２）配列番号５１〜５８から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＲＯＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体または抗原結合断片は、
下記配列で表される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む、請求項５に記載のＲＯＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片：
配列番号４３および５１；配列番号４４および５２；配列番号４５および５３、配列番号４６および５４、配列番号４７および５５、配列番号４８および５６、配列番号４９および５７、配列番号５０および５８、配列番号９８および５２、または配列番号９９および５４。
【請求項７】
前記抗体または抗原結合断片はモノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＲＯＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＲＯＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記ＲＯＲ１はヒト、サルまたはマウスＲＯＲ１である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＲＯＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体またはその抗原結合断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦＶ、ｓｃＦＶ−Ｆｃ、ミニボディ、ダイアボディ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、２価抗体または多価抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＯＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、ＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患の治療または予防のための薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患は癌である、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、生物学的試料におけるＲＯＲ１の検出のための組成物。
【請求項１５】
ＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患を診断するための組成物であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含み、前記ＲＯＲ１の過剰発現と関連する疾患は癌である、組成物。
【国際調査報告】
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