(57)【要約】  本発明は、ポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライシングを調節するためのアンチセンス分子および方法に関する。１つの態様において、本発明は、ポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡの連続した一続きの少なくとも１２核酸塩基の逆相補鎖である配列を含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞において前記Ｔ抗原プレｍＲＮＡのスプライシングを調節できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡの連続した一続きの少なくとも１２核酸塩基の逆相補鎖である配列を含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞における前記Ｔ抗原プレｍＲＮＡのスプライシングを調節でき、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７の少なくとも１２個連続した核酸塩基を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７の少なくとも１２個連続した核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該少なくとも１２個のヌクレオチドは、それぞれのポリオーマウイルスのラージＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列の逆相補鎖を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二重鎖をＲＮａｓｅＨの作用に対して抵抗性にする改変を含む、請求項１または請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
改変されたポリマー骨格、好ましくは、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｓ−拘束エチル（２’−Ｓ−ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ−ｅｔｈｙｌ；２’−ｃＥｔ）、ロックト核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ（ＰＭＯ）ヌクレオチドを有する少なくとも１つの核酸塩基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７の少なくとも１７個、好ましくは、少なくとも１８個、１９個、好ましくは、少なくとも２０個連続した核酸塩基を含むか、または配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７の少なくとも１７個、好ましくは、少なくとも１８個、１９個、好ましくは、少なくとも２０個連続した核酸塩基を、１つのミスマッチを伴って含み、該ミスマッチは、該連続した一続きの最初または最後のヌクレオチドではない、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
細胞におけるポリオーマウイルスの複製を阻害する方法であって、該方法は、前記ポリオーマウイルスに感染した細胞に、請求項１〜５または１２のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する工程を含む、方法。
【請求項７】
移植のために移植片を準備する方法であって、該方法は、ドナー細胞、好ましくは、ドナー腎細胞に、請求項１〜５または１２のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを特徴とする、方法。
【請求項８】
対象におけるポリオーマウイルス感染症を処置する方法であって、該方法は、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それを必要とする個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項９】
前記個体が、免疫不全個体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記個体が、腎臓移植または腎細胞移植のレシピエントである、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
個体の腎細胞における相補的なＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションのためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記個体に投与する方法であって、該方法は、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、請求項１〜５または１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的ｍＲＮＡとの二重鎖をＲＮａｓｅＨの作用に対して抵抗性にする改変を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７の配列を、ミスマッチなしで、または１つもしくは２つのミスマッチを伴って含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
細胞におけるポリオーマウイルスの複製を阻害する方法であって、該方法は、ポリオーマウイルスラージＴ抗原プレｍＲＮＡの連続した一続きの少なくとも１２核酸塩基の逆相補鎖である配列を含む１２〜３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供する工程を含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ラージＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライシングを調節できる、方法。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、請求項１〜５または１２のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリオーマウイルスＲＮＡに特異的に結合する分子に関する。いくつかの実施形態において、分子は、ポリオーマウイルスのＴ抗原のコード領域を含むプレｍＲＮＡを認識するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ポリオーマウイルスの例は、ヒトポリオーマウイルス、例えば、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）またはメルケル細胞ウイルス（ＭＣＶ）である。
【背景技術】
【０００２】
ポリオーマウイルスは、エンベロープを持たない小型の二本鎖ＤＮＡウイルスであり、その天然の宿主は通常、哺乳動物および鳥類である。成人における感染は、ほとんどが無症候性であるが、免疫系が損なわれている場合は病的になり得る。ヒトポリオーマウイルスの非限定的な例は、ＢＫウイルス、ＪＣウイルスおよびメルケル細胞ウイルスである。
【０００３】
ＪＣＶとＢＫＶは両方とも、ヒト集団が幼児期に感染する日和見病原体である（Ｌｅｐｌｏｅｇ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００１）。成人の血清有病率は高い。両ウイルスは、宿主の腎細胞に潜伏したまま残ると考えられている（Ｗｕｎｄｅｒｉｎｋ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２０１７）。再活性化は、例えば免疫抑制個体において生じ得る（Ｗｕｎｄｅｒｉｎｋ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２０１７；Ｐａｒａｊｕｌｉ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２０１８；Ｇａｒｄ，Ｌ．ｅｔ．ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１７）。
【０００４】
ポリオーマウイルスは、共通のゲノム構造を共有する。ポリオーマウイルスは、感染サイクルの初期と後期の両方で発現される遺伝子を有する。初期遺伝子と後期遺伝子の両方が、異なるスプライシングによって様々なタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを生成する。図１に示されているように、後期ＲＮＡは、通常、３つのキャプシドタンパク質をコードするのに対して、初期遺伝子は、スモールＴ抗原およびラージＴ抗原をコードし、他の１つ以上の選択的スプライシングされるコード領域をコードすることが多い（Ｈｅｌｌｅ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１７）。
【０００５】
ＷＯ２０１５／０４２４６６には、ＪＣウイルスの複製および増殖を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドベースのアプローチが記載されている。そこに開示されているアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）、またはヌクレアーゼ抵抗性骨格を有する１つ以上のヌクレオチドと内部で隣接しているＯＤＮを有するキメラオリゴヌクレオチドであり得る。後者は、ＲＮＡ：オリゴヌクレオチドハイブリッドをＲＮａｓｅＨの作用に対して感受性にする。それらのデオキシリボヌクレオチドは、少なくとも４つのデオキシリボヌクレオチドを内部に有し、２’−糖修飾ヌクレオチドを有するヌクレアーゼ抵抗性領域と隣接している。それらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＪＣウイルスのｍＲＮＡに存在する特定の配列を対象にしている。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本発明は、ポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライシングを調節し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記プレｍＲＮＡにおけるスプライスドナー部位および／またはスプライスアクセプター部位に相補的な配列を有し得る。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソンに隣接する１つ以上のイントロン核酸塩基に相補的な配列を有し得る（図２を参照のこと）。いくつかの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとそのポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡ標的との二重鎖をＲＮａｓｅＨの作用に対して抵抗性にする。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ポリオーマウイルスラージＴ抗原プレｍＲＮＡの連続した一続きの少なくとも１２核酸塩基の逆相補鎖である配列を含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞における前記ラージＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライシングを調節できる（図１を参照のこと）。
【０００８】
本発明のスプライス調節アンチセンスオリゴヌクレオチドには、通常、ポリオーマウイルスラージＴ抗原プレｍＲＮＡに相補的な連続した一続きの少なくとも１７、好ましくは、少なくとも１８、より好ましくは、少なくとも１９、より好ましくは、少なくとも２０核酸塩基が必要である。
【０００９】
本発明は、ポリオーマウイルスラージＴ抗原プレｍＲＮＡの連続した一続きの少なくとも１２核酸塩基の逆相補鎖である配列を含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供し、その一続きは、前記プレｍＲＮＡにおけるスプライスドナー、スプライスアクセプター配列またはそれらの組み合わせを含む。そのスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列は、好ましくは、ポリオーマウイルスラージＴ抗原スプライスアクセプターまたはポリオーマウイルスラージＴ抗原スプライスドナー配列である。
【００１０】
ＮＣ＿００１５３８から取得されたヌクレオチド４５３７−４５９６または４８８１−４９４０に少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、さらに提供される。
【００１１】
ＮＣ＿００１６９９から取得された領域４３９７−４４５６または領域４７４１−４８００におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００１２】
ＮＣ＿００９２３８から取得された領域４２９９−４３５８または領域４６８６−４７４５におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００１３】
ＮＣ＿００９５３９から取得された領域４４７７−４５３６または領域４８７６−４９３５におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００１４】
ＮＣ＿０１０２７７から取得された領域４６９３−４７５２または領域５１２４−５１８３におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００１５】
ＮＣ＿０１４４０６から取得された領域４２６４−４３２３または領域４６５４−４７１３におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００１６】
ＮＣ＿０１４４０７から取得された領域４２７２−４３３１または領域４６７７−４７３６におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００１７】
ＮＣ＿０１４３６１から取得された領域４３５２−４４１１または領域４７６５−４８２４におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００１８】
ＮＣ＿０１５１５０から取得された領域４４０８−４４６７または領域４７６０−４８１９におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００１９】
ＮＣ＿０１８１０２から取得された領域４３０３−４３６２または領域４６５８−４７１７におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００２０】
ＮＣ＿０２０１０６から取得された領域４１５９−４２１８または領域４５０４−４５６３におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００２１】
ＮＣ＿０２０８９０から取得された領域４３９２−４４５１または領域４７９１−４８５０におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００２２】
ＮＣ＿０２４１１８から取得された領域４４７１−４５３０または領域４８５９−４９１８におけるヌクレオチドと好ましくは少なくとも８０％相補的であって、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。
【００２３】
本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７の少なくとも１２個連続した核酸塩基を含み、その少なくとも１２個のヌクレオチドは、好ましくは、標的プレｍＲＮＡのスプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位またはそれらの組み合わせの逆相補鎖、すなわち、それぞれのポリオーマウイルスのラージＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライスドナー／アクセプターの逆相補鎖を含む。好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７；好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４または配列番号２５；好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４または配列番号２５の少なくとも１７、好ましくは、少なくとも１８、好ましくは、少なくとも１９、より好ましくは、少なくとも２０個連続した核酸塩基を含み、それらのヌクレオチドは、好ましくは、標的プレｍＲＮＡのスプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位またはそれらの組み合わせの逆相補鎖、すなわち、それぞれのポリオーマウイルスのラージＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライスドナー／アクセプターの逆相補鎖を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、記載の配列と１つのミスマッチを有することがあるが、ミスマッチは、連続した一続きの最初または最後に存在しない。例えば、１位または１７位にミスマッチを有する連続した一続きの１７ヌクレオチドを有するＡＯＮは、実際には、連続した一続きの１６ヌクレオチドを有することになる。
【００２４】
細胞におけるポリオーマウイルス複製を阻害する方法も提供され、その方法は、前記ポリオーマウイルスに感染した細胞に、そのポリオーマウイルスに特異的な本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する工程を含む。
【００２５】
本発明はさらに、移植のために移植片を準備する方法を提供し、その方法は、ドナー細胞、好ましくは、ドナー腎細胞に、ポリオーマウイルスに特異的な本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを特徴とする。
【００２６】
対象におけるポリオーマウイルス感染症を処置する方法も提供され、その方法は、ポリオーマウイルスに特異的な本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それを必要とする個体に投与する工程を含む。
【００２７】
個体の細胞における相補的なＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションのためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記個体に投与する方法がさらに提供され、その方法は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、第１および第２の領域を含むキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とし、前記第１の領域は、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含み、前記第２の領域は、少なくとも１つの２’−Ｏ−（２−メトキシ−エチル）ヌクレオチドを含む（図７を参照のこと）。
【００２８】
細胞におけるポリオーマウイルスの複製を阻害する方法がさらに提供され、その方法は、ポリオーマウイルスラージＴ抗原プレｍＲＮＡの連続した一続きの少なくとも１２核酸塩基の逆相補鎖である配列を含む１２〜３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に提供する工程を含み、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ラージＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライシングを調節できる。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、好ましくは、本明細書中に記載されるまたは本明細書中で改変されるような、配列番号１〜２５のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】（図１−１）様々なＢＫウイルスゲノムサブタイプのＢＫウイルスゲノムおよび配列類似性の概略図。左：ＢＫウイルスゲノムは、主要な５つのタンパク質、すなわち、スモールｔ抗原およびラージＴ抗原（初期遺伝子）、ならびにアグノプロテインならびに主なキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（後期遺伝子）をコードする。このウイルスゲノムは、複製開始点と、ウイルスゲノムの複製とともに初期遺伝子および後期遺伝子の発現を駆動する転写因子に対するプロモーター領域との両方を含む、非コード領域（ＮＣＣＲ）も含む。注目すべきこととして、生成されるＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の比率を決定する選択的スプライシングとともに、初期および後期プレｍＲＮＡの選択的スプライシングによって、数多くのタンパク質アイソフォームが生じ、それらには、スモールｔ抗原、短縮型Ｔ抗原（２つのイントロン）およびラージＴ抗原（１つのイントロン）が含まれる。しかしながら、後期領域に対して生成される主要なスプライスバリアントが、主にＶＰ１をコードする成熟ｍＲＮＡであることに注意することが重要である。続き（図１−２）：初期領域のゲノム配列は、Ｔ抗原タンパク質、すなわち、スモールｔ（ｔＡｇ）、短縮型Ｔ（ｔｒｕｎｃＴＡｇ）およびラージＴ抗原（ＴＡｇ）をコードする。ｔＡｇは、感染細胞をＳ期に駆動する際に決定的な役割を果たし、ＴＡｇ媒介性のウイルスゲノム複製を可能にする。さらに、ＴＡｇは、ＮＣＣＲに結合して、後期領域のプレｍＲＮＡの発現を駆動する。これにより、ウイルスＤＮＡの被包に不可欠なＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が産生される。
【００３０】
【図２】ＴＡｇの全遺伝子配列（イントロン配列を含む）を、２４５個のユニークなＢＫポリオーマウイルス単離株（公的に利用可能なＮＣＢＩデータベースからダウンロードしたもの）に対して、ｃｌｕｓｔａｌＷ（Ｒにおける「ｍｓａ」パッケージ）を用いてアラインメントした。これらの記録から、全ゲノムが報告されている単離株だけを、ＴＡｇにおけるスプライス部位の保存について使用した。Ｄｕｎｌｏｐ株を参照ゲノムとして使用した。ＵＰＧＭＡ法（Ｒにおける「ｐｈａｎｇｏｒｎ」および「ｇｇｔｒｅｅ」パッケージ）を用いて、系統樹を構築した。サブタイプ間のヌクレオチド特異的保存を示すために、アクセプタースプライス部位およびドナースプライス部位に対してシーケンスロゴを構築した（Ｒにおける「ｍｓａ」パッケージ）。
【００３１】
【図３】ＢＫＰｙＶ  ＴＡｇのスプライシングを調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドの組成。ＢＫＰｙＶ  ＴＡｇのエキソン１−イントロンジャンクション（ＡＯＮ＃１、＃２および＃３）およびイントロン−エキソン２ジャンクション（ＡＯＮ＃４および＃５）を対象にしているアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の配列。
【００３２】
【図４】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＢＫＰｙＶに感染したヒト上皮細胞においてＴＡｇおよびＶＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させる。左：約１００という感染効率でのＢＫＰｙＶウイルスによる感染の７日後の、スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞  対  スプライシング調節ＡＯＮ＃１、＃２、＃３、＃４および＃５で処置されたＨＫ２細胞におけるＴＡｇ  ＲＮＡレベルの低下（ｎ＝５；ｐ＜０．０５）。右：約１００という感染効率でのＢＫＰｙＶウイルスによる感染後の、スクランブルＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞  対  スプライシング調節ＡＯＮ＃１、＃２、＃３、＃４および＃５で処置されたＨＫ２細胞におけるＶＰ１  ＲＮＡレベルの低下（ｎ＝５；ｐ＜０．０５）。
【００３３】
【図５】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＢＫＰｙＶに感染したヒト上皮細胞においてＶＰ１タンパク質の発現レベルを低下させる。約１００という感染効率でのＢＫポリオーマウイルスによる感染の７日後に回収されたＨＫ２細胞溶解産物のウエスタンブロット解析。スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞と比べて、ＡＯＮ＃２、＃３および＃４は、ＶＰ１タンパク質の発現レベルを明らかに抑制する（ｎ＝４）。
【００３４】
【図６】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＢＫウイルスの複製を減少させる。培養上清中のウイルスＤＮＡ濃度を、ＢＫＰｙＶゲノムにおけるＶＰ１に対するＰＣＲ解析法によって測定した。ＡＯＮ＃２、＃３および＃４で処置されたＨＫ２細胞は、スクランブルＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞と比べて、培養上清中に低レベルのＢＫＰｙＶゲノムを一貫して示す。
【００３５】
【図７】ＡＯＮに対する化学修飾。本ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮに適用されているいくつかの化学修飾（ホスホロチオエート骨格およびリボース部分における２’−ＯＭｅ）を描写している。これらのＡＯＮの他の実施形態は、この位置において２’−ＭＯＥまたは２’−ｃＥｔ修飾を使用し得る。これらの修飾は、主にＡＯＮの安定性を改善するように働く。
【００３６】
【図８】ヒト宿主を有すると知られている１３のポリオーマウイルスに対する配列類似性。注目すべきことに、これらの株は、アルファ属、ベータ属およびデルタ属を包含し、その大部分は、最近同定された。この図の左側の系統樹情報に示されているように、ＢＫＰｙＶとＪＣＰｙＶは、かなりの配列類似性を共有していることから、腎臓の近位尿細管上皮細胞にそれらが共局在することは、本明細書中に記載されるスプライシング調節ＡＯＮを用いた標的化に向いていると示唆される。
【００３７】
【図９】他のポリオーマウイルスを標的化するために使用され得るＡＯＮのデザイン。上述のＢＫおよびＪＣウイルスのＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮと並行して、ＡＯＮがヒトポリオーマウイルス３（Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅまたはＫＩ）、ヒトポリオーマウイルス４（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙまたはＷＵ）およびヒトポリオーマウイルス５（メルケル細胞ウイルスまたはＭＣＶ）も標的化し得るという可能性に基づいて、ＡＯＮをデザインした。ヒトポリオーマウイルス３〜５に対しては、エキソン１−イントロン部位における３つのＡＯＮとは対照的に、エキソン１−イントロンジャンクションを標的化する２つのＡＯＮおよびイントロン−エキソン２ジャンクションを標的化する２つを設計した。
【００３８】
【図１０】ＢＫウイルスゲノムおよびＢＫＶ標的化ＡＯＮの概略図。パート１（図１０−１）：ＢＫウイルスゲノムは、主要な６つのタンパク質、すなわち、スモールｔ抗原およびラージＴ抗原（初期遺伝子）、ならびにアグノプロテインならびに主なキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（後期遺伝子）をコードする。このウイルスゲノムは、非コード領域（ＮＣＣＲ）も含み、その配列は、複製開始点と、ウイルスゲノム複製を協調させつつ初期遺伝子および後期遺伝子の発現を駆動する転写因子のリクルートに関与するプロモーター領域との両方を含む。図１に示されたように、生成されるＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の比率を決定する選択的スプライシングとともに、初期および後期プレｍＲＮＡの選択的スプライシングによって、スモールｔ抗原、短縮型Ｔ抗原（２つのイントロン）およびラージＴ抗原（１つのイントロン）をはじめとした数多くのタンパク質アイソフォームが生じる。後期領域に対して生成される主要なスプライスバリアントは、主にＶＰ１の発現をもたらす。パート２（図１０−２）：上のパネルに示されたＢＫＶラージＴ抗原（ＴＡｇ）のエキソン−イントロンジャンクションを標的化するために使用されるＡＯＮ配列。パート３（図１０−３）：ＢＫＶ  ＴＡｇのエキソン−イントロンジャンクションにおけるＡＯＮに対する結合部位を示している概略図。
【００３９】
【図１１】ユニバーサルなＢＫＶ標的化ＡＯＮのデザインに向けた、ＴＡｇスプライス部位保存のバイオインフォマティクス解析。パート１（図１１−１）：ＢＫＶサブグループ間で明らかな違いを示すユニークなＢＫＶ単離株／株に対する全遺伝子ＴＡｇ配列を含む系統樹。パート２（図１１−２）：サブグループ間で高い配列保存を示す、隣接領域を伴うＴＡｇスプライス部位（２０ヌクレオチド）に対するシーケンスロゴ。ＢＫＶ  ＴＡｇのエキソン１−イントロンジャンクション（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０２、ＨＹＢ＿０３、ＨＹＢ＿０６、ＨＹＢ＿０７、ＨＹＢ＿０８、ＨＹＢ＿０９、ＨＹＢ＿１０およびＨＹＢ＿１１）およびイントロン−エキソン２ジャンクション（ＨＹＢ＿０４、ＨＹＢ＿０５、ＨＹＢ＿１２およびＨＹＢ＿１３）を対象にしているアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の配列が提供されている。
【００４０】
【図１２】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたヒト腎臓上皮細胞においてＴＡｇ  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させる。スクランブルＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞  対  ＢＫＶ標的化ＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞におけるＴＡｇ  ＲＮＡレベルの低下（処置後、細胞を約１００という感染効率でＢＫＶに感染させた）（ｎ＝３生物学的反復）。注意：ＨＹＢ＿１４は、ＴＡｇエキソン１のエキソン領域にもっぱら結合し、エキソン−イントロン境界を標的化しない。
【００４１】
【図１３】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたヒト腎臓上皮細胞においてＶＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させる。スクランブルＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞  対  ＢＫＶ標的化ＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞におけるＶＰ１  ＲＮＡレベルの低下（処置後に、細胞を約１００という感染効率でＢＫＶに感染させた）（ｎ＝３生物学的反復）。注意：ＨＹＢ＿１４は、ＴＡｇエキソン１のエキソン領域にもっぱら結合し、エキソン−イントロン境界を標的化しない。
【００４２】
【図１４】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたヒト腎臓上皮細胞においてＶＰ１タンパク質の発現レベルを低下させる。ＢＫＶ標的化ＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞から回収された細胞溶解産物の代表的なウエスタンブロット解析。ブロットは、約１００という感染効率でのＢＫポリオーマウイルスによる感染の７日後に回収された溶解産物のＶＰ１タンパク質レベルを示している（ｎ＝３生物学的反復）。
【００４３】
【図１５】ＢＫＶ標的化ＡＯＮで処置した後、ＢＫＶに感染させたヒト腎臓上皮細胞におけるＶＰ１タンパク質の発現レベルの定量。約１００という感染効率でのＢＫポリオーマウイルスによる感染の７日後に回収されたＨＫ２細胞溶解産物のウエスタンブロット解析の定量。スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞をコントロールとして使用した。すべての値は、ｌｏｇ２スケールを単位とする（ｎ＝３生物学的反復）。注意：ＨＹＢ＿１４は、ＴＡｇエキソン１のエキソン領域にもっぱら結合し、エキソン−イントロン境界を標的化しない。
【００４４】
【図１６】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＢＫＶのＤＮＡ複製を減少させる。感染の７日後の培養上清中のウイルス粒子濃度を、ＢＫＶゲノムにおけるＶＰ１に対するＰＣＲ解析法によって測定した。ＢＫＶ標的化ＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞は、スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞と比べて、培養上清中に低レベルのＢＫＶ粒子を一貫して示す。データは、生物学的ｎ＝３を表す。
【００４５】
【図１７】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＨＫ２再感染のレベルを低下させる。ＢＫＶ標的化ＡＯＮで前処置し、ＢＫＶに感染させたＨＫ２細胞から７日後に培養上清を取り出した。その上清を用いて、未処置のＨＫ２細胞に感染させ（２ｈ）、その後、それらの細胞を７日間培養し、ＴＡｇおよびｈｏｅｃｈｓｔ（核の場合）について免疫組織化学的に染色した。続いて、パーセント陽性細胞を測定し、スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置された細胞と比べて示した。データは、生物学的ｎ＝３の代表である。
【００４６】
【図１８】ＨＫ２細胞のＢＫＶ感染の様々な態様におけるＢＫＶ標的化ＡＯＮによる処置の蓄積効果を表しているヒートマップ。ＴＡｇおよびＶＰ１  ｍＲＮＡ、ＶＰ１タンパク質、ウイルス粒子産生ならびに再感染に対して観察された効果の要約。スケールは、黒色が、ほとんど効果がないことから全く効果がないことを表し、白色が、大きな効果（スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）と比べて２ｌｏｇの倍率変化，ｎ＝３）を表すことを示している。
【００４７】
【図１９】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたヒト腎臓上皮細胞においてＴＡｇ  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させる。スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞  対  ＢＫＶ標的化リードＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）で処置されたＨＫ２細胞におけるＴＡｇ  ＲＮＡレベルの低下（処置後に、細胞を約１００という感染効率でＢＫＶに感染させた）（ｎ＝３生物学的反復）。注意：ＳＡＮ＿７３およびＳＡＮ＿７４は、以前に報告されたＡＯＮ（１６ヌクレオチド長）である。これらのデータは、生物学的ｎ＝３の代表である。
【００４８】
【図２０】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたヒト腎臓上皮細胞においてＶＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させる。スクランブルＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞  対  ＢＫＶ標的化リードＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）で処置されたＨＫ２細胞におけるＶＰ１  ｍＲＮＡレベルの低下（処置後に、細胞を約１００という感染効率でＢＫＶに感染させた）。注意：ＳＡＮ＿７３およびＳＡＮ＿７４は、以前に報告されたＡＯＮ（１６ヌクレオチド長）である。これらのデータは、生物学的ｎ＝３の代表である。
【００４９】
【図２１】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたヒト腎臓上皮細胞においてＶＰ１タンパク質の発現レベルを低下させる。ＢＫＶ標的化リード化合物ＡＯＮで処置され、約１００という感染効率でＢＫポリオーマウイルスに感染させた７日後のＨＫ２細胞から回収された細胞溶解産物におけるＶＰ１タンパク質レベルの代表的なウエスタンブロットの可視化（ｎ＝３生物学的反復）。
【００５０】
【図２２】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたヒト腎臓上皮細胞においてＶＰ１タンパク質の発現レベルを低下させる。スクランブルＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞  対  ＢＫＶ標的化リードＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）で処置されたＨＫ２細胞（処置後に、細胞を約１００という感染効率でＢＫＶに感染させた）におけるＶＰ１タンパク質レベルの低下。注意：ＳＡＮ＿７３およびＳＡＮ＿７４は、以前に報告されたＡＯＮ（１６ヌクレオチド長）である。これらのデータは、生物学的ｎ＝３の代表である。
【００５１】
【図２３】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたヒト腎臓上皮細胞においてウイルス粒子産生を減少させる。スクランブルＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞  対  ＢＫＶ標的化リードＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）で処置されたＨＫ２細胞におけるウイルス粒子レベルの低下（処置後に、細胞を約１００という感染効率でＢＫＶに感染させた）。注意：ＳＡＮ＿７３およびＳＡＮ＿７４は、以前に報告されたＡＯＮ（１６ヌクレオチド長）である。これらのデータは、生物学的ｎ＝３の代表である。
【００５２】
【図２４】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＨＫ２再感染のレベルを低下させる。ＢＫＶ標的化リードＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）で前処置し、ＢＫＶに感染させたＨＫ２細胞から７日後に培養上清を取り出した。その上清を用いて、未処置のＨＫ２細胞に感染させ（２ｈ）、その後、それらの細胞を７日間培養し、ＴＡｇおよびＨｏｅｃｈｓｔ（核用）について免疫組織化学的に染色した。続いて、パーセント陽性細胞を測定し、スクランブルＡＯＮで処置された細胞と比べて示した。データは、生物学的ｎ＝３の代表である。
【００５３】
【図２５】ＨＫ２細胞のＢＫＶ感染の様々な態様におけるＢＫＶ標的化リード化合物ＡＯＮによる処置の蓄積効果を表しているヒートマップ。リード化合物ＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）で前処置されたＨＫ２細胞に対する、ＴＡｇおよびＶＰ１  ｍＲＮＡ、ＶＰ１タンパク質、ウイルス粒子産生ならびに再感染に対して観察された効果の要約。スケールは、黒色が、ほとんど効果がないことから全く効果がないことを表し、白色が、大きな効果（スクランブルと比べて２ｌｏｇの倍率変化，ｎ＝３）を表すことを示している。
【００５４】
【図２６】予めＢＫＶに感染させたＨＫ２においてＴＡｇ  ｍＲＮＡ発現を低下させるＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮの有効性。ＡＯＮによる前処置とは対照的に、本発明者らは、まずＨＫ２細胞をＢＫＶに感染させ、続いてそれを用いて、ＡＯＮがＴＡｇ  ｍＲＮＡ発現レベルを低下させ得る有効性を評価した。左のパネル：後の時点におけるＡＯＮの添加は有効でないとみられるにもかかわらず、感染後にＡＯＮを単回投与することにより、ＴＡｇ  ｍＲＮＡの発現レベルが有意に低下した。右のパネル：ＢＫＶ標的化ＡＯＮの複数回投与は、ＴＡｇ  ｍＲＮＡの発現レベルをより強く低下させる。ＲＮＡ発現レベルは、すべての処置時点について感染後ｔ＝７において測定されたことから、後の時点での処置の場合、早期の処置と比べて、曝露がより短時間になることに注意する。データは、生物学的ｎ＝１の代表である。
【００５５】
【図２７】予めＢＫＶに感染させたＨＫ２においてＶＰ１  ｍＲＮＡ発現を減少させるＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮの有効性。ＡＯＮによる前処置とは対照的に、本発明者らはまず、ＨＫ２細胞をＢＫＶに感染させ、続いてそれを用いて、ＡＯＮがＶＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させ得る有効性を評価した。左のパネル：後の時点におけるＡＯＮの添加は有効でないとみられるにもかかわらず、感染後にＡＯＮを単回投与することにより、ＶＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルが有意に低下した。右のパネル：ＢＫＶ標的化ＡＯＮの複数回投与は、ＶＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルをより強く低下させる。ＲＮＡ発現レベルは、すべての処置時点について感染後ｔ＝７において測定されたことから、後の時点での処置の場合、早期の処置と比べて、曝露がより短時間になることに注意する。データは、生物学的ｎ＝１の代表である。
【００５６】
【図２８】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたヒト初代近位尿細管上皮細胞（ｈＰＴＥＣ）においてＴＡｇ  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させる。スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置されたｈＰＴＥＣ  対  ＢＫＶ標的化リードＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）またはＨＹＢ＿１４で処置されたｈＰＴＥＣにおけるＴＡｇ  ＲＮＡレベルの低下（処置後に、細胞を約１００という感染効率でＢＫＶに感染させた）（ｎ＝３生物学的反復）。これらのデータは、生物学的ｎ＝３の代表である。
【００５７】
【図２９】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたｈＰＴＥＣにおいてＶＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させる。スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置されたｈＰＴＥＣ  対  ＢＫＶ標的化リードＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）またはＨＹＢ＿１４で処置されたｈＰＴＥＣにおけるＶＰ１  ＲＮＡレベルの低下（処置後に、細胞を約１００という感染効率でＢＫＶに感染させた）（ｎ＝３生物学的反復）。これらのデータは、生物学的ｎ＝３の代表である。
【００５８】
【図３０】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたｈＰＴＥＣにおいてＶＰ１およびＶＰ３タンパク質の発現レベルを低下させる。ＢＫＶ標的化リード化合物ＡＯＮで処置し、約１００という感染効率でＢＫポリオーマウイルスに感染させた７日後のｈＰＴＥＣから回収された細胞溶解産物におけるＶＰ１およびＶＰ３タンパク質レベルの代表的なウエスタンブロットの可視化（ＶＰ１およびＧＡＰＤＨ：ｎ＝３生物学的反復，ＶＰ３：ｎ＝１）。
【００５９】
【図３１】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたｈＰＴＥＣにおいてＶＰ１タンパク質の発現レベルを低下させる。スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置されたｈＰＴＥＣ  対  ＢＫＶ標的化リードＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）またはＨＹＢ＿１４で処置されたｈＰＴＥＣにおけるＶＰ１タンパク質レベルの低下（処置後に、細胞を約１００という感染効率でＢＫＶに感染させた）（ｎ＝３生物学的反復）。これらのデータは、生物学的ｎ＝３の代表である。
【００６０】
【図３２】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたｈＰＴＥＣにおいてＶＰ３タンパク質の発現レベルを低下させる。スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置されたｈＰＴＥＣ  対  ＢＫＶ標的化リードＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）またはＨＹＢ＿１４で処置されたｈＰＴＥＣにおけるＶＰ３タンパク質レベルの低下（処置後に、細胞を約１００という感染効率でＢＫＶに感染させた）（ｎ＝３生物学的反復）。これらのデータは、生物学的ｎ＝１の代表である。
【００６１】
【図３３】ＴＡｇスプライシング調節リードＡＯＮは、ＢＫＶに感染させたｈＰＴＥＣにおいてウイルス粒子産生を減少させる。スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置されたｈＰＴＥＣ  対  ＢＫＶ標的化リードＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）またはＨＹＢ＿１４で処置されたｈＰＴＥＣにおけるウイルス粒子レベルの低下（処置後に、細胞を約１００という感染効率でＢＫＶに感染させた）。これらのデータは、生物学的ｎ＝３の代表である。
【００６２】
【図３４】ｈＰＴＥＣのＢＫＶ感染の様々な態様におけるＢＫＶ標的化リード化合物ＡＯＮによる処置の蓄積効果を表しているヒートマップ。リード化合物ＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）またはＨＹＢ＿１４で前処置されたｈＰＴＥＣに対する、ＴＡｇおよびＶＰ１  ｍＲＮＡ、ＶＰ１タンパク質ならびにウイルス粒子産生に対して観察された効果の要約。スケールは、黒色が、ほとんど効果がないか全く効果がないことを表し、白色が、大きな効果（スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）と比べて２ｌｏｇの倍率変化，ｎ＝３）を表すことを示している。
【００６３】
【図３５】ＢＫＶ標的化リードＡＯＮによって誘導されたスプライシング調節のＲＮＡ−ｓｅｑ解析。パネルの上の部分には、一次転写産物およびスプライシング事象を示しており、パネルの下の部分には、観察されたスプライシングパターンおよびｚスコアを示しているが、これらは、本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮが実際にスプライシングを調節することを示している。エキソン１−イントロン部位ならびにエキソン２の３’領域において事象が観察される。まとめると、スプライシングにおいて近位効果と遠位効果の両方に影響するとみられる単一のＡＯＮが存在することは、複雑なスプライシング事象を示唆する。
【００６４】
【図３６】ＢＫＶ標的化リード化合物ＡＯＮによって誘導されるスプライシング調節の長配列リード解析。スクランブルＡＯＮまたは本発明者らのリード化合物ＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１）で前処置されたＨＫ２細胞からのＲＮＡ転写物の長配列リード解析。左：棒グラフが、固定されたアクセプター部位（イントロン−エキソン２）と組み合わせてラージＴもしくはスモールｔドナー部位を使用する転写物またはスプライシングされていない転写物のパーセンテージを表しており、ＢＫＶ標的化ＡＯＮによるスプライシング調節を示している。右：棒グラフが、固定されたドナー部位と組み合わせて短縮型Ｔ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄＴ）または短縮型Ｔ＊（ｔｒｕｎｃａｔｅｄＴ＊）アクセプター部位を使用する転写物のパーセンテージを表しており、ＢＫＶ標的化ＡＯＮによるスプライシング調節を示している。
【００６５】
【図３７】ＪＣウイルスゲノムおよびＪＣＶ標的化ＡＯＮの概略図。パート１（図３７−１）：ＢＫウイルスと同様に、ＪＣウイルスゲノムは、スモールｔ抗原およびラージＴ抗原（初期遺伝子）、ならびにアグノプロテインならびに主なキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（後期遺伝子）をコードする。このウイルスゲノムは、複製開始点、ならびに初期遺伝子および後期遺伝子の発現ならびにウイルスゲノム複製を駆動する転写因子結合用のプロモーター領域を有する非コード領域（ＮＣＣＲ）も含む。初期および後期領域のプレｍＲＮＡのＢＫＶスプライシングに関しては幅広く知られているのとは対照的に、ＪＣＶスプライシングに関してはほとんど知られていない。パート２（図３７−２）：上のパネルに示されたようなＪＣＶラージＴ抗原（ＴＡｇ）のエキソン−イントロンジャンクションを標的化するために使用されるＡＯＮ配列。パート３（図３７−３）：ＪＣＶ  ＴＡｇのエキソン−イントロンジャンクションにおけるＡＯＮに対する結合部位を表している概略図。
【００６６】
【図３８】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＪＣＶに感染させたヒト人工多能性幹細胞由来アストロサイトにおいてＴＡｇ  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させる。スクランブルＡＯＮで処置されたｈｉＰＳＣ由来アストロサイト  対  ＪＣＶ標的化ＡＯＮで処置されたｈｉＰＳＣ由来アストロサイトにおけるＴＡｇ  ｍＲＮＡレベルの低下（処置後、細胞をＪＣＶに感染させた）（ｎ＝１）。
【００６７】
【図３９】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＪＣＶに感染させたヒト人工多能性幹細胞由来アストロサイトにおいてＶＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させる。スクランブルＡＯＮで処置されたｈｉＰＳＣ由来アストロサイト  対  ＪＣＶ標的化ＡＯＮで処置されたｈｉＰＳＣ由来アストロサイトにおけるＶＰ１  ｍＲＮＡレベルの低下（処置後、細胞をＪＣＶに感染させた）（ｎ＝１）。
【００６８】
【図４０】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＪＣＶに感染させた初代ヒトアストロサイトにおいてＴＡｇ  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させる。スクランブルＡＯＮで処置された初代アストロサイト  対  ＪＣＶ標的化ＡＯＮで処置された初代アストロサイトにおけるＴＡｇ  ｍＲＮＡレベルの低下（処置後、細胞をＪＣＶに感染させた）（ｎ＝２生物学的反復）。
【００６９】
【図４１】ＴＡｇスプライシング調節ＡＯＮは、ＪＣＶに感染させた初代ヒトアストロサイトにおいてＶＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルを低下させる。スクランブルＡＯＮで処置された初代アストロサイト  対  ＪＣＶ標的化ＡＯＮで処置された初代アストロサイトにおけるＶＰ１  ｍＲＮＡレベルの低下（処置後、細胞をＪＣＶに感染させた）（ｎ＝２生物学的反復）。
【００７０】
【図４２】ＲＮＡ−ｓｅｑ中に増幅されたＲＮＡによるＢＫＶゲノムのカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）。スクランブルコントロール、ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３、ＨＹＢ＿１１、ＨＹＢ＿１４またはＳＡＮ＿７３およびＳＡＮ＿７４で処置された細胞由来のＢＫＶゲノムに対するペアードエンドリードのアラインメントによって、ＢＫＶ  ＲＮＡ発現レベルの半定量的評価が可能になる。データは、生物学的ｎ＝３を示しており、初期および後期遺伝子の発現プロファイルに分かれた。
【００７１】
【図４３】ロングリード高忠実度Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼによって生成されたＴＡｇ（プレ）ｍＲＮＡの電気泳動解析。Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いて、スクランブルコントロールＡＯＮ（レーン１）またはＢＫＶ標的化ＡＯＮ（すなわち、ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３またはＨＹＢ＿１１；それぞれレーン２〜４）で処置されたＨＫ２細胞から回収されたＲＮＡからロングリード高忠実度ｍＲＮＡを生成し、キャピラリー電気泳動によって評価した。データは、生物学的ｎ＝３の代表である。
【００７２】
【図４４】静脈内投与の２４時間後のマウス腎臓におけるＡＯＮ取り込みの蛍光顕微鏡法。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに４０ｍｇ／ｋｇのＨＹＢ＿０１（５’６−ＦＡＭ標識なしの２’ＭＯＥ）を静脈内投与した２４時間後のマウス腎臓切片の色分けされた高拡大率の像。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色したところ、腎臓（近位尿細管）のシカクマメレクチン（ＬＴＬ）陽性細胞との共局在に基づくと、近位尿細管上皮細胞による取り込みは明白である。左のパネルは、１００×拡大率を示している（１０×対物レンズ、スケールバー＝１００μｍ）のに対して、右のパネルは、４００×拡大率を示している（４０×対物レンズ、スケールバー＝２０μｍ）。
【００７３】
【図４５】ＢＫＶ標的化ＡＯＮ取り込みに対するマウス組織の免疫組織化学染色。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに４０ｍｇ／ｋｇのＨＹＢ＿０１（５’６−ＦＡＭ標識なしの２’ＭＯＥ）を静脈内投与した２４時間後に器官を切除し、ＡＯＮの取り込みを免疫組織化学的に評価した。ヘマトキシリン−エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）の後、抗ホスホロチオエート抗体、およびＨＲＰ標識二次抗体を明らかにするペルオキシダーゼ基質としてのジアミノベンジジン（ＤＡＢ）によってＡＯＮ骨格を特異的に検出した。ＡＯＮ染色が陽性のシグナルを、ＩｍａｇｅＪにおけるカラーデコンボリューションおよび閾値化によって可視化したところ、肝臓ではシグナルが著しく低く、心臓組織にはシグナルは無かったが、高レベルのＡＯＮ取り込みを有する陽性尿細管が示された。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーもしくはポリマー、またはそれらの模倣物、キメラ、アナログおよびホモログのことを指す。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合性のヌクレオシド間（骨格）結合から構成されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに同じように機能する天然に存在しない部分を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような改変または置換されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましい特性（例えば、細胞に多く取り込まれること、標的核酸に対して親和性が高いこと、およびヌクレアーゼの存在下でも安定性が高いこと）を有するので、天然の形態よりも好ましいことが多い（図７を参照のこと）。
【００７５】
本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００７６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド位置の１つ以上に異なる塩基が存在する改変されたアンチセンスオリゴヌクレオチドも含む。例えば、１番目のヌクレオチドがアデノシンである場合、この位置にチミジン、グアノシンまたはシチジンを含む改変されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが作製され得る。これは、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの位置のいずれにおいても行われ得る。そして、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｔ抗原ＲＮＡを阻害する能力を測定する本明細書中に記載される方法を用いて試験される。
【００７７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、感受性細胞が感染したときに生成されるポリオーマウイルスＲＮＡにハイブリダイズし得る。したがって、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの（一部の）配列の逆相補鎖である配列を含む。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、部分的に一本鎖または環状のオリゴマー化合物の形態で導入され得る。好ましい実施形態において、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００７８】
本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他の１つ以上の化学構造に連結され得る。他の構造とは、ペプチドもしくはタンパク質、糖、脂質または他の化学構造であり得る。他の構造は、他の１種以上のヌクレオチドでもあり得る。他の１種以上のヌクレオチドは、アンチセンス部分とは異なる機能を果たし得る。例えば、別の核標的配列へのハイブリダイゼーション。他の構造は、いくつかの１つ以上の異なる機能のいずれかを果たし得る。そのような機能の非限定的な例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定、バイオアベイラビリティの増大、細胞透過の増大、核送達の増大、特定の細胞への標的化などである。
【００７９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いったん系に導入されると、標的核酸の改変をもたらすように１つ以上の酵素または構造タンパク質の作用を誘発し得る。「ＤＮＡ様」である一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＨを誘発することは当該分野で公知である。ゆえに、ＲＮａｓｅＨの活性化によって、ＲＮＡ標的が切断される。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド媒介性の遺伝子発現阻害の効率を高める１つの方法である。実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ／アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッドに対するＲＮａｓｅＨの作用をリクルートせず、また、リクルートするようにデザインされていない。ＲＮａｓｅＩＩＩおよびリボヌクレアーゼＬファミリーの酵素などの他のリボヌクレアーゼに対しても、同様の役割が仮定されている。本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的ＲＮＡ／アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッドにヌクレアーゼ抵抗性を付与する改変を有する。標的配列にハイブリダイズしない内部または外部「バルジ」を含むリボザイムは、本明細書中において「アンチセンスオリゴヌクレオチド」の定義から明確に排除される。
【００８０】
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基（すなわち、約１２〜３０個（３０個を含む）の連結ヌクレオシド）を含む。当業者は、本発明が、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを具体的に例示することを認識するだろう。当業者は、これが、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを具体的に例示することを認識するだろう。当業者は、これが、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを具体的に例示することを認識するだろう。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８、１９、２０、２１または２２核酸塩基長であることが多い。本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。
【００８１】
１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その配列が本明細書中に具体的に開示されるオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも１２個連続した核酸塩基を含む。それらの例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチド内から選択される一続きの少なくとも１２個連続した核酸塩基を含む１２〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドも同様に、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドであると考えられる。
【００８２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの配列の逆相補鎖である核酸塩基の配列を含む。本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの少なくとも１２個連続した核酸塩基の配列の逆相補鎖である配列を有する、一続きの少なくとも１２核酸塩基を含む。その一続きは、相補性領域またはハイブリダイゼーション領域とも称される。当業者は、本発明が、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０核酸塩基長の相補性領域を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを具体的に例示することを認識するだろう。当業者は、本発明が、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０核酸塩基長の相補性領域を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを具体的に例示することを認識するだろう。当業者は、本発明が、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６核酸塩基長の相補性領域を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを具体的に例示することを認識するだろう。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８、１９、２０、２１または２２核酸塩基長の相補性領域を有することが多い。本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、１７、１８、１９、２０、２１または２２核酸塩基長の相補性領域を有する。
【００８３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、相補性領域の長さと同等の長さを有する。
【００８４】
本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配列は、ポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡの一部である。プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の未熟な一本鎖である。ポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡは、細胞核において転写によってポリオーマウイルスのＤＮＡ鋳型から合成される。そのプレｍＲＮＡは、プレｍＲＮＡからｍＲＮＡへの成熟の間に切り出される１つ以上のイントロンを含む。スプライシングプロセスによって、転写物からイントロンが除去され、エキソン同士が結合する。イントロンは、通常、ドナー部位（イントロンの５’末端）およびアクセプター部位（イントロンの３’末端）に隣接している。スプライス部位は、スプライシングに必要であり、通常、ほぼ一定の配列ＧＵをイントロンの５’末端に含み、ほぼ一定のＡＧ配列を有するスプライスアクセプター部位をイントロンの３’末端に含む。ＧＵおよびＡＧ配列ならびに介在配列が、プレｍＲＮＡから切り出される。ポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡの特徴は、それが、選択的スプライシングを受けるかまたはスプライシングされずに、少なくとも２つ、しばしば３、４または５つの、異なってスプライシングされたｍＲＮＡが生成され得る点である（図１を参照のこと）。ウイルス伝播は、ウイルスゲノムの入手可能性、ウイルスタンパク質の存在、細胞機構、および特に、様々なステージと構成要素との間の繊細な相互作用に依存する。ウイルスＲＮＡのスプライシングプロセスは、ウイルス伝播プロセスの制御にとって重要な方法であり、細胞において形成されるある特定の生成物のレベルに影響し、おそらくはそのタイミングにも影響する。本発明では、驚くべきことに、本発明のオリゴヌクレオチドをラージＴ抗原ｍＲＮＡのスプライシングのためのスプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位に向けることによって、Ｔ抗原ｍＲＮＡの産生だけでなく、感染細胞によって産生されるキャプシドタンパク質のレベルおよびウイルスの産生に対しても顕著な効果が得られることが見出された。
【００８５】
本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配列は、ポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライスドナー部位、ポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライスアクセプター部位またはそれらの組み合わせを含む。その標的配列は、通常、ポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライスドナー部位またはポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライスアクセプター部位を含む一続きの１２個連続した核酸塩基を含む。その連続した配列は、好ましくは、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター配列に加えて、イントロン配列を含む。好ましい実施形態において、その連続した配列は、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター配列に隣接した１つまたは２つのイントロン核酸塩基を含む。好ましい実施形態において、その連続した配列は、スプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に隣接した３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のイントロン核酸塩基を含む。好ましい実施形態において、その連続した配列は、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター配列に隣接した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のエキソン核酸塩基を含む。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの核酸塩基の連続した配列の逆相補鎖である配列を含む。イントロン、スプライス部位およびエキソンの核酸塩基の数の合計は、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける核酸塩基の総数を超えない。
【００８６】
上記標的配列は、好ましくは、特定のポリオーマウイルスのラージＴ抗原をコードするｍＲＮＡを生成するように切り出されるイントロンを定義するスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列を含む（図８を参照のこと）。
【００８７】
本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、特定のポリオーマウイルスのラージＴ抗原をコードするｍＲＮＡを生成するように切り出されるイントロンを定義するスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を含む（図８を参照のこと）。
【００８８】
好ましい実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドの標的配列は、それぞれのウイルスに対する下記に示される３’スプライス部位の標的領域における配列である。好ましい実施形態において、別のオリゴヌクレオチドの標的配列は、それぞれのウイルスに対する下記に示される５’スプライス部位の標的領域の配列である。下記に示される領域における標的配列を対象にしているオリゴヌクレオチドは、示される配列におけるスプライスドナーまたはスプライスアクセプターの相補的配列を含む。２つ以上のＡＯＮが、本明細書中に記載される方法において使用される場合、それらのＡＯＮは、同じウイルスの標的配列を対象にしていることが好ましい。
【００８９】
【表１】
2021524730.tif 000002
【００９０】
１番目の縦列は、ウイルス名の略号を含んでいる。配列データベースにおける当該配列に対するアクセッションコードとともに、ウイルスのプロトタイプ配列が示されている。３番目および４番目の縦列には、スプライスドナー（縦列４）またはスプライスアクセプター（縦列３）を含む、プロトタイプウイルス配列における領域が示されている。本明細書中に記載されるＡＯＮは、これらのスプライスドナーまたはスプライスアクセプターに対する相補性領域を含み得る。
【００９１】
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、感染細胞においてＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライシングを調節し得る。理論に拘束されるものではないが、本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それが標的としているスプライス部位の使用を阻害すると考えられている。その結果生じるラージＴ抗原産生の減少は、キャプシドタンパク質の発現に影響し、それにより、ウイルスの産生に影響する（図４〜６を参照のこと）。理論に拘束されるものではないが、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによって誘導されるＴ抗原特異的スプライシング産物のアンバランスは、ウイルスの伝播に対して、ＲＮＡｉ様アプローチによるＴ抗原ｍＲＮＡ特異的ｍＲＮＡの減少よりも顕著な影響を及ぼすと考えられている。
【００９２】
本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」は、核酸の相補鎖の対形成を意味する。本発明において、対形成の好ましい機序には、相補的なヌクレオシド塩基またはヌクレオチド塩基（核酸塩基）の間における、ワトソン−クリック水素結合、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合が関わる。例えば、アデニンとチミンが、水素結合の形成によって対形成する相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、様々な状況において生じ得る。相補鎖のハイブリダイゼーションは、通常、その配列の長さが長くなるにつれて良くなる。２本の鎖の特異的なハイブリダイゼーションは、連続した一続きの１２個またはそれ以上の相補的な核酸塩基を用いて達成される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるようにその標的配列に対して１００％相補的であり得るが、必ずしもそうである必要はない。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、介在しているまたは隣接しているセグメントは、ハイブリダイゼーション事象に関わらないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることがある。本発明の１つの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的プレｍＲＮＡ内の標的領域に対して少なくとも７０％または少なくとも７５％または少なくとも８０％または少なくとも８５％の配列相補性を含む。他の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的プレｍＲＮＡ内の標的領域に対して、少なくとも９０％の配列相補性を含み、さらには少なくとも９５％または少なくとも９６％の配列相補性を含む。例えば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基のうちの１８核酸塩基が標的領域に相補的であるがゆえに特異的にハイブリダイズし得るアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性に相当し得る。１８ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ポリオーマウイルスラージＴ抗原プレｍＲＮＡの連続した一続きの少なくとも１２核酸塩基の逆相補鎖である配列を有するとき、残りの相補的な６核酸塩基は、その１２核酸塩基とクラスター形成してもよいし、その１２核酸塩基と連続していなくてもよい。標的プレｍＲＮＡのある領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのパーセント相補性は、当該分野で公知のＢＬＡＳＴプログラム（ベーシックローカルアラインメントサーチツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を用いて常法により測定され得る。ヌクレオチドの数は、必ず整数であるので、実際のパーセンテージは、厳密に９０％ではないまたは厳密に９６％ではないことがある。連続した配列は、好ましくは、標的核酸配列に対してヌクレオチドミスマッチを有しないか、またはヌクレオチドミスマッチを１つだけ有する。
【００９３】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿００１５３８から取得された領域４５３７−４５９６または領域４８８１−４９４０におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿００１５３８から取得されたヌクレオチド４５３７−４５９６または４８８１−４９４０に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。好ましい実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長であり、好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７に示されている配列；好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４または配列番号２５に示されている配列；好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４または配列番号２５に示されている配列を含む。
【００９４】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿００１６９９から取得された領域４３９７−４４５６または領域４７４１−４８００におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿００１６９９から取得されたヌクレオチド４３９７−４４５６または領域４７４１−４８００に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【００９５】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿００９２３８から取得された領域４２９９−４３５８または領域４６８６−４７４５におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿００９２３８から取得されたヌクレオチド４２９９−４３５８または領域４６８６−４７４５に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【００９６】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿００９５３９から取得された領域４４７７−４５３６または領域４８７６−４９３５におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿００９５３９から取得されたヌクレオチド４４７７−４５３６または領域４８７６−４９３５に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【００９７】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿０１０２７７から取得された領域４６９３−４７５２または領域５１２４−５１８３におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿０１０２７７から取得されたヌクレオチド４６９３−４７５２または領域５１２４−５１８３に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【００９８】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿０１４４０６から取得された領域４２６４−４３２３または領域４６５４−４７１３におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿０１４４０６から取得されたヌクレオチド４２６４−４３２３または領域４６５４−４７１３に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【００９９】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿０１４４０７から取得された領域４２７２−４３３１または領域４６７７−４７３６におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿０１４４０７から取得されたヌクレオチド４２７２−４３３１または領域４６７７−４７３６に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【０１００】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿０１４３６１から取得された領域４３５２−４４１１または領域４７６５−４８２４におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿０１４３６１から取得されたヌクレオチド４３５２−４４１１または領域４７６５−４８２４に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【０１０１】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿０１５１５０から取得された領域４４０８−４４６７または領域４７６０−４８１９におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿０１５１５０から取得されたヌクレオチド４４０８−４４６７または領域４７６０−４８１９に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【０１０２】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿０１８１０２から取得された領域４３０３−４３６２または領域４６５８−４７１７におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿０１８１０２から取得されたヌクレオチド４３０３−４３６２または領域４６５８−４７１７に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【０１０３】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿０２０１０６から取得された領域４１５９−４２１８または領域４５０４−４５６３におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿０２０１０６から取得されたヌクレオチド４１５９−４２１８または領域４５０４−４５６３に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【０１０４】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿０２０８９０から取得された領域４３９２−４４５１または領域４７９１−４８５０におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿０２０８９０から取得されたヌクレオチド４３９２−４４５１または領域４７９１−４８５０に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【０１０５】
１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＣ＿０２４１１８から取得された領域４４７１−４５３０または領域４８５９−４９１８におけるヌクレオチドに好ましくは少なくとも８０％相補的であり、それぞれの領域におけるスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列に対する相補性を少なくとも含み、好ましくは、ＮＣ＿０２４１１８から取得されたヌクレオチド４４７１−４５３０または領域４８５９−４９１８に少なくとも９０％相補的である。その１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基は、好ましくは、標的プレｍＲＮＡの、一続きの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個連続したヌクレオチドに相補的である。
【０１０６】
本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７、好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４または配列番号２５；好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４または配列番号２５の少なくとも１２個連続した核酸塩基を含み、その少なくとも１２個のヌクレオチドは、好ましくは、標的プレｍＲＮＡのスプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位またはそれらの組み合わせ、すなわち、それぞれのポリオーマウイルスのラージＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライスドナー／アクセプターの逆相補鎖を含む。その逆相補鎖は、それぞれの配列番号に存在する。
【０１０７】
本発明はさらに、少なくとも１２個連続した核酸塩基のヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する（図３および図１０を参照のこと）：
５’ＡＣＣＵＣＵＧＡＧＣＵＡＣＵＣＣＡＧＧＵ３’      配列番号１；
５’ＡＣＡＡＡＣＣＵＣＵＧＡＧＣＵＡＣＵＣＣ３’      配列番号２；
５’ＣＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣＵＣＵＧＡＧＣＵＡ３’      配列番号３；
５’ＵＣＣＡＵＡＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＵＡＧＡ３’      配列番号４；
５’ＵＧＵＵＣＣＡＵＡＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＵ３’      配列番号５；
５’ＡＡＡＣＣＵＣＵＧＡＧＣＵＡＣＵＣＣＡＧ３’      配列番号２０；
５’ＧＣＡＣＡＡＡＣＣＵＣＵＧＡＧＣＵＡＣＵ３’      配列番号２１；
５’ＡＵＣＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣＵＣＵＧＡＧＣ３’      配列番号２２；
５’ＡＡＡＵＣＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣＵＣＵＧＡ３’      配列番号２３；
５’ＧＡＡＡＡＵＣＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣＵＣＵ３’      配列番号２４；
５’ＡＧＧＡＡＡＡＵＣＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣＵ３’      配列番号２５；
５’ＣＡＵＡＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＵＡＵＡＡＡ３’      配列番号２６または
５’ＵＵＣＣＡＵＡＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＵＡＵ３’      配列番号２７。
【０１０８】
本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７；好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４または配列番号２５；好ましくは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４または配列番号２５の少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個連続した核酸塩基を含み、それぞれその少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドは、好ましくは、標的プレｍＲＮＡのスプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位またはそれらの組み合わせの逆相補鎖を含む。本明細書中に示される核酸塩基は、必ずしも量ではなく種類が同じ塩基対形成活性を有する異なる核酸塩基によって置換され得る。そのような代替物の例は、ウラシルの代替物としてのチミジン塩基である。他の核酸塩基が、同じ種類の塩基対形成活性を有する代替物の代わりに用いられ得る。
【０１０９】
別の代替物は、任意の塩基と対形成する塩基である。塩基の例は、イノシンである。そのような塩基は、通常、標的ＲＮＡの中の適切な塩基と対形成する塩基と比べて、オリゴヌクレオチドに対して特異性を追加しない。オリゴヌクレオチドは、当業者に公知であるように、これをある程度受け入れ得る。同じ特異性が望まれる場合、さらなる選択的な塩基が、オリゴヌクレオチドに付加され得、例えば、イノシンまたは他の非選択的塩基の各々に代わる１つのさらなる選択的な塩基であるがこれに限定されない。
【０１１０】
本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、上記ヌクレオチド配列の少なくとも１２個連続した核酸塩基を含む（図９を参照のこと）：
【０１１１】
【表２】
2021524730.tif 000003
【０１１２】
１つの実施形態において、本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの骨格修飾を含む。１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾を含む。ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾は、オリゴのリン酸骨格における非架橋酸素の代わりに硫黄原子を用いる。この修飾によって、ヌクレオチド間結合がヌクレアーゼ分解に対して抵抗性になる。ホスホロチオエート結合は、エキソヌクレアーゼ分解を阻害するために、オリゴの５’または３’末端における最後の３〜５ヌクレオチドの間に導入され得る（図７を参照のこと）。同様に、オリゴ全体にわたってホスホロチオエート結合を含めることによっても、エンドヌクレアーゼによる攻撃の低減が助けられる（図３を参照のこと）。
【０１１３】
別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノ（ホスホロジアミデートモルホリノ）修飾を含む。モルホリノは、標準的な核酸塩基を有するが、それらの塩基は、リン酸の代わりにホスホロジアミデート基によって互いに連結されているモルホリン環に結合されている。モルホリノは、それらの標的ＲＮＡ分子の分解を引き起こさない。
【０１１４】
１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドのリボース部分の２’炭素上に少なくとも１つの糖修飾を含む。１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’糖修飾を含む。アンチセンス目的の糖修飾の概要は、Ｐｒａｋａｓｈ（２０１１；Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓ．Ｓｅｐｔ  ８（９）：１６１６−１６４１．Ｄｏｉ  １０．１００２／ｃｂｄｖ．２０１１０００８１）に記載されている。図７に示されているように、好ましい２’糖修飾は、２’−アルコキシまたは２’−アルコキシアルコキシ修飾、より好ましくは、２’−メトキシエトキシである。好ましい修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｓ−拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）エチル（２’−ｃＥｔ）およびロックト核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；ＬＮＡ）である。
【０１１５】
他の修飾としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、所与のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるすべての位置が、均一に修飾される。他の実施形態では、所与のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるいくつかの位置が、均一に修飾されない。実際に、上述の修飾の２種以上が、単一のアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれ得るか、またはさらには、アンチセンスオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込まれ得る。本発明は、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドであるアンチセンスオリゴヌクレオチドも含む。キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２つ以上の化学的に異なる領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、その各領域は、少なくとも１つのヌクレオチドで構成されている。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの領域を含み、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ分解に対する高い抵抗性、細胞取り込みの増大、および／または標的核酸に対する高い結合親和性を付与するように修飾されている。
【０１１６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる酵素の基質として働き得る。そのような可能性は、ある領域をアンチセンスオリゴヌクレオチドの内部に含めることによって媒介されることが多い。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」とも称される。ギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅＨ切断を誘導するのに十分に長いデオキシリボヌクレオチドモノマーのブロックを中央に含むキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドである。効率的なＲＮａｓｅ切断には、一続きの４つ以上のデオキシリボヌクレオチドが必要である。通常、そのような一続きは、９つ以上のデオキシリボヌクレオチドを有する。本発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる酵素の基質として働き得る領域を含まないことが好ましい。
【０１１７】
本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ホスホロチオエート修飾核酸塩基などの修飾ヌクレオチドおよび／または２’糖修飾を含み、それにより、ヌクレアーゼによる偶発的な分解に対する抵抗性が提供される。図７に示されているように、好ましい２’糖修飾は、２’−アルコキシまたは２’−アルコキシアルコキシ修飾、より好ましくは、２’−メトキシエトキシである。好ましい２’糖修飾には、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｓ−拘束エチル（２’−ｃＥｔ）およびロックト核酸（ＬＮＡ）が含まれる。骨格は、全体にわたってホスホロチオエートを含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の配置も、本発明によって包含される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレアーゼによる標的ＲＮＡの偶発的な分解に対する抵抗性を提供する修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート修飾核酸塩基および／または２’糖修飾）を含む。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内である。したがって、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、標的ＲＮＡに抵抗性のヌクレアーゼを提供する領域を有する。本アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとによって形成される二重鎖は、ＲＮａｓｅＨの作用に対して感受性でない。
【０１１８】
好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、改変されたポリマー骨格を有する１つ以上の核酸塩基を含む。改変されたポリマー骨格は、好ましくは、改変された骨格であり、本明細書中の他の箇所に記載されている。好ましい実施形態において、改変されたポリマー骨格は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｓ−拘束エチル（２’−ｃＥｔ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ（ＰＭＯ）ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、改変されたポリマー骨格におけるヌクレオチドのすべてが、修飾された糖部分を好ましくは２’炭素に含む。好ましい実施形態において、２つのヌクレオチドを連結しているリン酸基は、ホスホロチオエート基に改変される。好ましくは、改変されたポリマー骨格におけるホスホジエステル結合のすべてが、ホスホロチオエート結合である。
【０１１９】
ヒトポリオーマウイルスは、アルファ属、ベータ属およびデルタ属と称されるいくつかの属に分けることができる（Ｈｅｌｌｅ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１７）。好ましい実施形態において、ポリオーマウイルスは、アルファウイルスまたはベータウイルス、好ましくは、ベータウイルスである。いくつかのヒトポリオーマウイルスを本明細書中の下記の表に列挙する。好ましい実施形態において、ポリオーマウイルスは、ＢＫポリオーマウイルス（または本願ではＢＫＰｙＶもしくはＢＫＶとも称される、ＢＫウイルス）、ＪＣポリオーマウイルス（または本願ではＪＣＶとも称される、ＪＣウイルス）またはメルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣポリオーマウイルス、ＭＣウイルス、または本願ではＭＣＶとも称される）である。特に好ましい実施形態において、ポリオーマウイルスは、ＢＫウイルスまたはＪＣウイルス、好ましくは、ＢＫウイルスである。
【０１２０】
【表３】
2021524730.tif 000004
【０１２１】
本発明は、細胞におけるポリオーマウイルスの複製を阻害する方法も提供し、その方法は、前記ポリオーマウイルスに感染した細胞に、本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する工程を含む。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、その感染のポリオーマウイルスを標的化するオリゴヌクレオチドである（図３を参照のこと）。その細胞は、好ましくは、ポリオーマウイルスの複製に感受性の細胞である。その細胞が、ヒトなどの動物の中の細胞であるとき、その動物は、許容宿主、すなわち、ウイルスが宿主の防御を迂回することおよびそのウイルスの複製を可能にする宿主であることが好ましい。ＢＫウイルスおよびＪＣウイルスなどのポリオーマウイルスの場合、複製は、最初に、その動物の尿中のウイルスを検出することによって、検出されることが多い（尿毒症）。その後、その感染が持続すると、ウイルスは、動物の血清中でも検出され得る（ウイルス血症）。ほとんどのヒトが、小児期の間にＢＫウイルスおよびＪＣウイルスに遭遇して、軽度の疾病を引き起こす。しかしながら、免疫無防備状態の宿主において再活性化されるかまたは獲得される場合、ＢＫウイルスおよびＪＣウイルスは、いくつかのヒト臨床疾患状態に関わる。ＢＫは、尿管狭窄症、出血性膀胱炎および腎症などの腎障害に最もよく関連している（Ｌｅｐｌｏｅｇ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００１；Ｈｅｌｌｅ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１７）。宿主の感受性または寛容性は、宿主の免疫系を損なうことによって誘導され得る。様々な状況によって、宿主の免疫力が一時的または永久に低下し得る。免疫不全（Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）（または免疫不全（ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ））は、免疫系が感染症および癌と戦う能力が損なわれているかまたは全く無い状態である。免疫不全のほとんどの症例が、後天的（「続発性」）であり、患者の免疫系に影響する外因に起因する。これらの外因の例としては、ＨＩＶ感染、極端な年齢、および栄養などの環境要因が挙げられる。免疫抑制は、一部の薬物（例えば、糖質コルチコイド、細胞分裂阻害薬、抗体、およびイムノフィリン（例えば、カルシニューリン阻害剤、ベラタセプト（ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを有する免疫グロブリン様分子）および類似の分子に影響を及ぼす化合物）によっても誘導され得る。これは、抗拒絶反応の措置として臓器移植手術などにおける、および自己免疫疾患におけるような過活動の免疫系に苦しんでいる患者における、望ましい効果であり得る。しかしながら、時折、この望ましい効果は、個体がポリオーマウイルス感染などのウイルス感染症と戦う能力を低下させるというさらなる作用を有する。何らかの種類の免疫不全を有する人は、免疫力が低下していると言われている。免疫無防備状態の人は、誰もが発症し得る通常の感染症に加えて、日和見感染症に特にかかりやすいことがある。
【０１２２】
１つの実施形態において、本発明は、移植のために移植片を準備する方法を提供し、その方法は、ドナー細胞、好ましくは、ドナー腎細胞に、本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを特徴とする。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、移植片細胞において複製するポリオーマウイルスを標的化するオリゴヌクレオチドである。腎臓移植片または腎細胞移植片の場合、そのポリオーマウイルスは、好ましくは、ＢＫウイルス、ＪＣウイルスまたはＭＣウイルス特異的オリゴヌクレオチドである。そのように処置された移植片の細胞は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが特異的なポリオーマウイルスの複製に、より感受性でなくなる。これによって、移植の成功率が上昇する。これによって、移植レシピエントの管理が容易になる。移植レシピエントにおける日和見性のポリオーマウイルスの複製および患者における他の薬物誘発免疫抑制を管理する方法の１つは、免疫抑制薬の投与を減少させることであり、それにより、免疫系は、ウイルスの感染およびまたは複製を減少させる程度にまで回復できるようになる。移植片が、本明細書中に記載されるように準備されたとき、患者におけるポリオーマウイルスの感染／複製は、未処置の移植片を移植された患者と比べて、より低頻度であり、検出されたとしても重症度が低いことが多い。移植片レシピエントは、望まれるとき、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた１回以上のさらなる投与を受けることが好ましい。本発明は、対象におけるポリオーマウイルス感染症を処置する方法も提供し、その方法は、本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それを必要とする個体に投与する工程を含む。その個体は、好ましくは、免疫不全個体である。
【０１２３】
移植片は、好ましくは、同種移植片または異種移植片である。そのような移植片のレシピエントは、移植片の生存時間を延長するため、または宿主対移植片効果の発生率および／もしくは重症度を低下させるために、免疫抑制薬で処置されることが多い。現在、多くの組織が移植できる。遺伝的に同一でない別のヒトまたは非ヒト動物から細胞または器官を移植するとき、宿主対移植片効果は、高リスクであることが多い。移植片としては、肺、心臓、心臓弁、腎臓、肝臓、膵臓、腸、胸腺および骨髄が挙げられる。ポリオーマウイルスは、臓器移植後に免疫抑制を受けたこれらの患者の最大３％の血漿中で検出された（Ｄｅ  Ｖｌａｍｉｎｃｋ，Ｉ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３）。移植片は、好ましくは、腎臓または腎細胞を含む。個体は、好ましくは、腎臓移植または腎細胞移植のレシピエントである。
【０１２４】
本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、そのオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとの二重鎖に対して、ＲＮａｓｅＨに対する抵抗性を付与するものである。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ヒト腎細胞に存在し得るＲＮＡ、好ましくは、ヒト腎細胞において複製し得るヒトウイルス、好ましくは、ポリオーマウイルスのＲＮＡの連続した一続きの少なくとも１２、好ましくは、少なくとも１７核酸塩基の逆相補鎖である配列を含む。１つの実施形態において、本発明は、ポリオーマウイルスＴ抗原プレｍＲＮＡの連続した一続きの少なくとも１２核酸塩基の逆相補鎖である配列を含む、１２〜３０、好ましくは、１７、１８、１９または２０〜３０核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞における前記Ｔ抗原プレｍＲＮＡのスプライシングを調節でき、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７の少なくとも１２個連続した核酸塩基を含む。配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７の少なくとも１２個連続した核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが、さらに提供され、その少なくとも１２個のヌクレオチドは、それぞれのポリオーマウイルスのラージＴ抗原プレｍＲＮＡのスプライスドナー配列またはスプライスアクセプター配列の逆相補鎖を含む。
【０１２５】
本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ｍＲＮＡ−オリゴヌクレオチド二重鎖をＲＮａｓｅＨの作用に対して抵抗性にする改変を含む。好ましくは、改変されたポリマー骨格、好ましくは、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｓ−拘束エチル（２’−ｃＥｔ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ（ＰＭＯ）ヌクレオチドを有する少なくとも１つの核酸塩基を含む。好ましくは、それらの核酸塩基のすべてが、改変されたポリマー骨格、好ましくは、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｓ−拘束エチル（２’−ｃＥｔ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ（ＰＭＯ）ヌクレオチドを含む。
【０１２６】
好ましい実施形態において、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７の少なくとも１７、好ましくは、少なくとも１８、１９、好ましくは、少なくとも２０個連続した核酸塩基を含むか、または配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７の少なくとも１７、好ましくは、少なくとも１８、１９、好ましくは、少なくとも２０個連続した核酸塩基を、１つのミスマッチとともに含み、そのミスマッチは、連続した一続きの最初または最後のヌクレオチドではない。
【０１２７】
細胞におけるポリオーマウイルスの複製を阻害する方法も提供され、その方法は、前記ポリオーマウイルスに感染した細胞に本アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する工程を含む。移植のために移植片を準備する方法も提供され、その方法は、ドナー細胞、好ましくは、ドナー腎細胞に、本アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを特徴とする。
【０１２８】
対象におけるポリオーマウイルス感染症を処置する方法がさらに提供され、その方法は、それを必要とする個体に、本明細書中に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を含む。前記個体は、免疫不全個体である。その個体は、好ましくは、腎臓移植または腎細胞移植のレシピエントである。
【０１２９】
個体の腎細胞における相補的なＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションのために、前記個体にアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する方法も提供され、その方法は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする。
【０１３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的ｍＲＮＡとの二重鎖をＲＮａｓｅの作用に対して抵抗性にする改変を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが、さらに提供され、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６または配列番号２７の配列を、ミスマッチなしで、または１つもしくは２つのミスマッチを伴って含む。
【０１３１】
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、動物に投与されたとき、適切な腎細胞に効率的に送達され、それらの腎細胞に取り込まれることが観察された。投与方法は、好ましくは、静脈内（ＩＶ）投与である。血液脳関門を越えて中枢神経系（ＣＮＳ）に入ることができるポリオーマウイルス、例えば、ＪＣウイルスの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドをＣＮＳに投与することが可能である。様々な方法が当該分野で公知である。ＪＣウイルス感染のアンチセンスオリゴヌクレオチド媒介性処置の場合、ＣＮＳ髄腔内送達が好ましい。ＪＣウイルスの初感染は、扁桃または胃腸管を介することが多く、その上で、他の器官（例えば、腎臓の尿細管上皮細胞であるがこれに限定されない）に広がって、そこに潜伏したまま残るかまたは複製し続けて、尿中および脳内にウイルス粒子を排出し得ると考えられているので、ＪＣウイルス感染は、ＩＶ送達によっても対処することができる。
【０１３２】
本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、以下の配列
５’−ＣＡＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡ；
５’−ＡＡＣＣＵＣＵＧＡＡＣＵＡＵＵＣＣＡＵＧＵ；
５’−ＡＣＣＵＣＵＧＡＡＣＵＡＵＵＣＣＡＵＧＵＡ；
５’−ＴＴＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＡ；もしくは
５’−ＴＴＣＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡ、またはそれらの代替物であって、１つ以上のチミジンがウラシルであるかその逆である配列を有しない。
【０１３３】
明確にする目的で、および簡潔に説明する目的で、同じ実施形態または別個の実施形態の一部として特徴を本明細書中に記載するが、しかしながら、本発明の範囲には、記載される特徴の全部または一部の組み合わせを有する実施形態が含まれ得ることが認識される。
【実施例】
【０１３４】
［実施例１］
（材料および方法）
（系統発生解析のために用いられたアクセッション）
ＢＫポリオーマウイルス単離株の全ゲノム配列を、公的に利用可能なＮＣＢＩデータベースからダウンロードした。これらの記録から、全ゲノムが報告されている単離株だけを、ＴＡｇにおけるスプライス部位の保存について使用した。Ｄｕｎｌｏｐ株を参照ゲノムとして使用した。イントロンに大きな欠失がある、またはアクセプタースプライス部位と部分的に一致する重複があるという理由から、それぞれ単離株「ＭＭ」および「ＦＮＬ−９」を除去した。２４５個のユニークなゲノム配列のアクセッション番号を下記に提供する：
AB211369.1; AB211370.1; AB211371.1; AB211372.1; AB211373.1; AB211374.1; AB211375.1; AB211376.1; AB211377.1; AB211378.1; AB211379.1; AB211381.1; AB211382.1; AB211383.1; AB211384.1; AB211385.1; AB211386.1; AB211387.1; AB211388.1; AB211389.1; AB211390.1; AB211391.1; AB213487.1; AB217917.1; AB217918.1; AB217919.1; AB217920.1; AB217921.1; AB260028.1; AB260029.1; AB260030.1; AB260031.1; AB260032.1; AB260033.1; AB263912.1; AB263913.1; AB263914.1; AB263915.1; AB263916.1; AB263917.1; AB263918.1; AB263919.1; AB263920.1; AB263921.1; AB263922.1; AB263923.1; AB263924.1; AB263925.1; AB263926.1; AB263927.1; AB263928.1; AB263929.1; AB263930.1; AB263931.1; AB263932.1; AB263934.1; AB263935.1; AB263936.1; AB263938.1; AB269825.1; AB269826.1; AB269827.1; AB269828.1; AB269829.1; AB269830.1; AB269831.1; AB269832.1; AB269834.1; AB269836.1; AB269837.1; AB269838.1; AB269840.1; AB269841.1; AB269842.1; AB269843.1; AB269844.1; AB269845.1; AB269846.1; AB269847.1; AB269848.1; AB269849.1; AB269850.1; AB269851.1; AB269852.1; AB269853.1; AB269854.1; AB269855.1; AB269856.1; AB269857.1; AB269858.1; AB269859.1; AB269860.1; AB269861.1; AB269862.1; AB269863.1; AB269864.1; AB269865.1; AB269866.1; AB269867.1; AB269868.1; AB269869.1; AB298941.1; AB298942.1; AB298945.1; AB298946.1; AB298947.1; AB301086.1; AB301087.1; AB301089.1; AB301090.1; AB301091.1; AB301092.1; AB301093.1; AB301094.1; AB301095.1; AB301096.1; AB301097.1; AB301099.1; AB301100.1; AB301101.1; AB365130.1; AB365132.1; AB365133.1; AB365134.1; AB365136.1; AB365137.1; AB365138.1; AB365139.1; AB365140.1; AB365141.1; AB365142.1; AB365144.1; AB365145.1; AB365146.1; AB365148.1; AB365149.1; AB365150.1; AB365151.1; AB365153.1; AB365154.1; AB365156.1; AB365157.1; AB365158.1; AB365159.1; AB365160.1; AB365162.1; AB365164.1; AB365165.1; AB365166.1; AB365167.1; AB365168.1; AB365170.1; AB365173.1; AB365174.1; AB365175.1; AB365176.1; AB365178.1; AB369087.1; AB369088.1; AB369089.1; AB369090.1; AB369092.1; AB369093.1; AB369094.1; AB369095.1; AB369096.1; AB369097.1; AB369098.1; AB369099.1; AB369101.1; AB464953.1; AB464954.1; AB464956.1; AB464957.1; AB464958.1; AB464960.1; AB464961.1; AB464962.1; AB485695.1; AB485696.1; AB485697.1; AB485698.1; AB485699.1; AB485700.1; AB485701.1; AB485703.1; AB485704.1; AB485707.1; AB485709.1; AB485710.1; AB485711.1; AB485712.1; AY628224.1; AY628225.1; AY628226.1; AY628227.1; AY628228.1; AY628229.1; AY628230.1; AY628231.1; AY628232.1; AY628233.1; AY628234.1; AY628235.1; AY628236.1; AY628237.1; AY628238.1; DQ305492.1; EF376992.1; FR720308.1; FR720309.1; FR720310.1; FR720311.1; FR720312.1; FR720313.1; FR720315.1; FR720317.1; FR720318.1; FR720320.1; FR720321.1; JF894228.1; JN192431.1; JN192432.1; JN192433.1; JN192435.1; JN192437.1; JN192438.1; JN192439.1; JN192440.1; JQ713822.1; KF055891.1; KF055892.1; KF055893.1; KP412983.1; KP984526.1; KY114802.1; KY114803.1; KY132094.1; KY487998.1; LC029413.1; LC309239.1; LC309240.1; LT960370.1; M23122.1; V01108.1。
【０１３５】
同様に、異なる１３個の基本型のヒトポリオーマウイルスに対する全ゲノム配列をダウンロードした。それらのアクセッション番号を下記に示す：
NC_001538; NC_001699; NC_009238; NC_009539; NC_010277; NC_014406; NC_014407; NC_014361; NC_015150; NC_018102; NC_020106; NC_020890; NC_024118。
【０１３６】
（ラージＴ抗原のスプライス部位の保存）
すべての参照ヒトポリオーマウイルスの全ゲノムヌクレオチド配列を、２０１８年２月２０日にＮＣＢＩウェブサイト（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）からダウンロードし、デフォルトの設定でＷｅｂＰｒａｎｋ（オンラインで利用可能：https://www.ebi.ac.uk/goldman-srv/webprank/）を用いてアラインメントした。ＵＰＧＭＡ系統樹を構築し、すべてのスプライス部位に対してシーケンスロゴを作製して、異なるヒトポリオーマウイルス間の保存を示した。ダウンロードしたすべてのｒｅｆｓｅｑアクセッション番号も下記に示す。
【０１３７】
参照配列：NC_001538, NC_001699, NC_009238, NC_009539, NC_010277, NC_014406, NC_014407, NC_014361, NC_015150, NC_018102, NC_020106, NC_020890, NC_024118
【０１３８】
すべてのヒトポリオーマウイルス単離株の全ゲノムヌクレオチド配列を、２０１８年２月２０日にＮＣＢＩウェブサイトからダウンロードした。ラージＴ抗原の全遺伝子配列を、上記のユニークなゲノム配列のみから検索し、デフォルトの設定でＷｅｂＰｒａｎｋを用いてアラインメントした。ラージＴ抗原におけるすべてのスプライス部位に対してシーケンスロゴを作製して、異なるヒトポリオーマウイルス内および異なるヒトポリオーマウイルス間の保存を示した。
【０１３９】
ダウンロードしたすべてのアクセッション番号を下記に示す：
ＢＫＰｙＶ：AB211369.1, AB211370.1, AB211371.1, AB211372.1, AB211373.1, AB211374.1, AB211375.1, AB211376.1, AB211377.1, AB211378.1, AB211379.1, AB211380.1, AB211381.1, AB211382.1, AB211383.1, AB211384.1, AB211385.1, AB211386.1, AB211387.1, AB211388.1, AB211389.1, AB211390.1, AB211391.1, AB213487.1, AB217917.1, AB217918.1, AB217919.1, AB217920.1, AB217921.1, AB260028.1, AB260029.1, AB260030.1, AB260031.1, AB260032.1, AB260033.1, AB260034.1, AB263912.1, AB263913.1, AB263914.1, AB263915.1, AB263916.1, AB263917.1, AB263918.1, AB263919.1, AB263920.1, AB263921.1, AB263922.1, AB263923.1, AB263924.1, AB263925.1, AB263926.1, AB263927.1, AB263928.1, AB263929.1, AB263930.1, AB263931.1, AB263932.1, AB263933.1, AB263934.1, AB263935.1, AB263936.1, AB263937.1, AB263938.1, AB269822.1, AB269823.1, AB269824.1, AB269825.1, AB269826.1, AB269827.1, AB269828.1, AB269829.1, AB269830.1, AB269831.1, AB269832.1, AB269833.1, AB269834.1, AB269835.1, AB269836.1, AB269837.1, AB269838.1, AB269839.1, AB269840.1, AB269841.1, AB269842.1, AB269843.1, AB269844.1, AB269845.1, AB269846.1, AB269847.1, AB269848.1, AB269849.1, AB269850.1, AB269851.1, AB269852.1, AB269853.1, AB269854.1, AB269855.1, AB269856.1, AB269857.1, AB269858.1, AB269859.1, AB269860.1, AB269861.1, AB269862.1, AB269863.1, AB269864.1, AB269865.1, AB269866.1, AB269867.1, AB269868.1, AB269869.1, AB298940.1, AB298941.1, AB298942.1, AB298943.1, AB298944.1, AB298945.1, AB298946.1, AB298947.1, AB301086.1, AB301087.1, AB301088.1, AB301089.1, AB301090.1, AB301091.1, AB301092.1, AB301093.1, AB301094.1, AB301095.1, AB301096.1, AB301097.1, AB301098.1, AB301099.1, AB301100.1, AB301101.1, AB301102.1, AB301103.1, AB365130.1, AB365131.1, AB365132.1, AB365133.1, AB365134.1, AB365135.1, AB365136.1, AB365137.1, AB365138.1, AB365139.1, AB365140.1, AB365141.1, AB365142.1, AB365143.1, AB365144.1, AB365145.1, AB365146.1, AB365147.1, AB365148.1, AB365149.1, AB365150.1, AB365151.1, AB365152.1, AB365153.1, AB365154.1, AB365155.1, AB365156.1, AB365157.1, AB365158.1, AB365159.1, AB365160.1, AB365161.1, AB365162.1, AB365163.1, AB365164.1, AB365165.1, AB365166.1, AB365167.1, AB365168.1, AB365169.1, AB365170.1, AB365171.1, AB365172.1, AB365173.1, AB365174.1, AB365175.1, AB365176.1, AB365177.1, AB365178.1, AB369087.1, AB369088.1, AB369089.1, AB369090.1, AB369091.1, AB369092.1, AB369093.1, AB369094.1, AB369095.1, AB369096.1, AB369097.1, AB369098.1, AB369099.1, AB369100.1, AB369101.1, AB464953.1, AB464954.1, AB464955.1, AB464956.1, AB464957.1, AB464958.1, AB464959.1, AB464960.1, AB464961.1, AB464962.1, AB464963.1, AB485694.1, AB485695.1, AB485696.1, AB485697.1, AB485698.1, AB485699.1, AB485700.1, AB485701.1, AB485702.1, AB485703.1, AB485704.1, AB485705.1, AB485706.1, AB485707.1, AB485708.1, AB485709.1, AB485710.1, AB485711.1, AB485712.1, AY628224.1, AY628225.1, AY628226.1, AY628227.1, AY628228.1, AY628229.1, AY628230.1, AY628231.1, AY628232.1, AY628233.1, AY628234.1, AY628235.1, AY628236.1, AY628237.1, AY628238.1, DQ305492.1, EF376992.1, FR720308.1, FR720309.1, FR720310.1, FR720311.1, FR720312.1, FR720313.1, FR720314.1, FR720315.1, FR720316.1, FR720317.1, FR720318.1, FR720319.1, FR720320.1, FR720321.1, FR720322.1, FR720323.1, JF894228.1, JN192431.1, JN192432.1, JN192433.1, JN192434.1, JN192435.1, JN192436.1, JN192437.1, JN192438.1, JN192439.1, JN192440.1, JN192441.1, JQ713822.1, KF055891.1, KF055892.1, KF055893.1, KP412983.1, KP984526.1, KY114802.1, KY114803.1, KY132094.1, KY487998.1, LC029411.1, LC029412.1, LC029413.1, LC029414.1, LC309239.1, LC309240.1, LT934539.1, LT960370.1, M23122.1, MF627830.1, MF627831.1, V01108.1, V01109.1
【０１４０】
ＪＣＰｙＶ：AB038249.1, AB038250.1, AB038251.1, AB038252.1, AB038253.1, AB038254.1, AB038255.1, AB048545.1, AB048546.1, AB048547.1, AB048548.1, AB048549.1, AB048550.1, AB048551.1, AB048552.1, AB048553.1, AB048554.1, AB048555.1, AB048556.1, AB048557.1, AB048558.1, AB048559.1, AB048560.1, AB048561.1, AB048562.1, AB048563.1, AB048564.1, AB048565.1, AB048566.1, AB048567.1, AB048568.1, AB048569.1, AB048570.1, AB048571.1, AB048572.1, AB048573.1, AB048574.1, AB048575.1, AB048576.1, AB048577.1, AB048578.1, AB048579.1, AB048580.1, AB048581.1, AB048582.1, AB074575.1, AB074576.1, AB074577.1, AB074578.1, AB074579.1, AB074580.1, AB074581.1, AB074582.1, AB074583.1, AB074584.1, AB074585.1, AB074586.1, AB074587.1, AB074588.1, AB074589.1, AB074590.1, AB074591.1, AB077855.1, AB077856.1, AB077857.1, AB077858.1, AB077859.1, AB077860.1, AB077861.1, AB077862.1, AB077863.1, AB077864.1, AB077865.1, AB077866.1, AB077867.1, AB077868.1, AB077869.1, AB077870.1, AB077871.1, AB077872.1, AB077873.1, AB077874.1, 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【０１４１】
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【０１４３】
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ＨＰｙＶ９：HQ696595.1 , KC831440.1
【０１４８】
ＭＷＰｙＶ：JQ898291.1, JQ898292.1, KC549586.1, KC549587.1, KC549588.1, KC549589.1, KC549590.1, KC549591.1, KC549592.1, KC549593.1, KC549594.1, KC571700.1, KC571701.1, KC571702.1, KC571703.1, KC571704.1, KC571705.1, KC690147.1, KR338953.1
【０１４９】
ＳＴＬＰｙＶ：JX463183.1, JX463184.1, KF525270.1, KF530304.1, KF651951.1, KM893862.1, KR090571.1, NC_020106.1
【０１５０】
ＨＰｙＶ１２：JX308829.1, NC_020890.1
【０１５１】
ＮＪＰｙＶ：KF954417.1, NC_024118.1
【０１５２】
（スプライス部位の保存および系統樹）
イントロン配列を含むＴＡｇの全遺伝子配列を、異なる１３個のポリオーマウイルス参照配列およびすべてのユニークなＢＫポリオーマウイルス単離株に対して、ｃｌｕｓｔａｌＷ（Ｒにおける「ｍｓａ」パッケージ）を用いてアラインメントした。ＵＰＧＭＡ法（Ｒにおける「ｐｈａｎｇｏｒｎ」および「ｇｇｔｒｅｅ」パッケージ）を用いて系統樹を構築した。アクセプタースプライス部位およびドナースプライス部位に対してシーケンスロゴを構築して、サブタイプ間のヌクレオチド特異的保存を示した（Ｒにおける「ｍｓａ」パッケージ）。
【０１５３】
（ＡＯＮのデザイン）
ＴＡｇにおけるスプライス部位を標的化するように、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）をデザインした。それらのＡＯＮにおけるリボ核酸は、２’−ＯＭｅ修飾を含む。ＡＯＮは、２０ヌクレオチド長であり、全体にホスホロチオエート骨格（＊）を有する。インビトロ研究の場合、ＡＯＮは、５’−ＦＡＭ標識を含む。ＡＯＮの二次構造および結合エネルギーを、ＲＮＡ構造を用いて予測した。すべてのＡＯＮ配列を下記に示す：
【０１５４】
【表４】
2021524730.tif 000005
【０１５５】
（細胞培養）
不死化された近位尿細管腎臓上皮ＨＫ２細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２１９０ＴＭ）をＡＴＣＣから入手し、１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ）を含み、トリヨードチロニン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン（ＩＴＳ−Ｘ）、ヒドロコルチゾンおよび１００Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンが補充された、ダルベッコ改変イーグル培地−Ｆ１２、１：１混合物中、３７℃、５％ＣＯ２にて維持した。ＢＫポリオーマウイルス（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−８３７ＴＭ）をＡＴＣＣから入手し、完全ＨＫ２培養液で希釈して、感染量（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｌｏａｄ）を減少させた。処置実験に向けて、６または１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に３２，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞を播種し、一晩生育させた。それらの細胞をリポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）とともに５０ｎＭのＡＯＮ濃度で５時間インキュベートすることによって、ＡＯＮ処置を行い、その後、リポフェクタミンを洗浄除去した。細胞を洗浄した２４時間後に、それらの細胞をＢＫポリオーマウイルス含有培養液とともに２時間インキュベートすることによって、ＢＫポリオーマウイルスによる感染を行い、その後、ウイルスを洗浄除去した。洗浄後ならびに感染の３、５および７日後に上清を回収して、ウイルス粒子の産生を、ＰＣＲを用いて測定した。ウイルス負荷サンプルを感染前に回収して、感染量を測定した。７日目にＲＮＡおよびタンパク質を収集して、ＴＡｇおよびＶＰ１の発現を測定した。
【０１５６】
（ウイルス量の測定）
培養上清中のウイルス量を測定するために、すべての時点においてすべてのウェルから２００μＬを回収した。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｎｕｃｌｅａｓｅをすべてのサンプルに加えることにより、パッケージされていないＤＮＡを室温において１５分間分解し、次いで、５ｍＭ  ＥＤＴＡで失活させた。ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて上清からウイルスＤＮＡを単離し、下記に記載されるＴａｑｍａｎ  ＰＣＲ（Ｗｕｎｄｅｒｉｎｋ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１７）を用いてウイルス量を測定した。ＤＮＡ抽出の品質およびＰＣＲ阻害の可能性をモニターするために、溶解緩衝液に低濃度のアザラシヘルペスウイルスを加えた。ＤＮＡを１００μＬの最終体積の溶出緩衝液に溶出し、そのうちの１０μＬをリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に対するインプットとして用いた。プライマー４４０ＢＫＶｓ  ５’−ＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧ−３’および４４１ＢＫＶａｓ  ５’−ＧＡＡＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＡＴＴＡＧＴ−３’ならびにＴａｑｍａｎプローブ５７６ＢＫＶ−ＴＱ−ＦＡＭ  ＦＡＭ５’−ＣＣＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣＣ−３’−ＢＨＱ１を用いて、ＢＫＰｙＶ  ＶＰ１遺伝子内の９０ｂｐのフラグメントを増幅した。ＤＮＡの品質およびＰＣＲ阻害の可能性をモニターするために、ＢＫＰｙＶ  ｑＰＣＲおよびアザラシヘルペスウイルスＰＣＲを二重で行った。さらに、ＢＫＰｙＶ  ｑＰＣＲを検証して、ＢＫＰｙＶ遺伝子型Ｉ〜ＩＶを検出した。
【０１５７】
２５μＬのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、０．３５μｍｏｌ／Ｌ  ＢＫＰｙＶプローブおよび３．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２を含む５０μＬの総体積において、定量的ＰＣＲ反応を行った。ＣＦＸ９６リアルタイム検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を以下のサイクル条件で用いて、反応を行った：９５℃１５分の後、４５サイクルの増幅（９５℃３０秒；５５℃３０秒；７２℃３０秒）。定量の場合は、標準物質である定量済みＢＫＰｙＶ陽性尿サンプルを使用した。ＢＫＰｙＶ  ｑＰＣＲの分析感度は、約１０コピー／ｍＬであった。各プレートにおいて、３つのネガティブコントロールを含めた；これらのコントロールは、すべてのＰＣＲアッセイにおいてネガティブであると試験された。≧４０のサイクル閾値を有するＰＣＲの結果をネガティブとみなした。
【０１５８】
（抗体およびウエスタンブロット）
ＢＣＡ法を用いて、タンパク質濃度を測定した。サンプルを４〜１５％ＴＧＸゲルにおいて泳動し、ニトロセルロースメンブレンまたはＰＶＤＦメンブレンに転写した。使用した抗体は、ウサギポリクローナル抗アクチン−ＨＲＰ（ローディングコントロール）、ウサギポリクローナル抗ＳＶ４０  ＶＰ１（ａｂ５３９７７，Ａｂｃａｍ）、マウスモノクローナル抗ＳＶ４０  Ｔ抗原［ＰＡｂ４１６］（ａｂ１６８７９，Ａｂｃａｍ）およびマウスモノクローナル抗ＳＶ４０  Ｔ抗原（ＰＡｂ１０８，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）であった。１次抗体を、ＴＡｇおよびＶＰ１の場合は４℃で一晩、アクチンの場合はＲＴで３０分、インキュベートした。ＴＡｇおよびＶＰ１に対して使用した二次抗体は、それぞれヤギポリクローナル抗マウス−ＨＲＰ（Ｐ０４４７０１−２，Ａｇｉｌｅｎｔ）およびヤギポリクローナル抗ウサギ−ＨＲＰ（Ｐ０４４８０１−２，Ａｇｉｌｅｎｔ）であった。上記メンブレンをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＴＭ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）とともにインキュベートし、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてタンパク質バンドを可視化した。
【０１５９】
（リアルタイムｑＰＣＲ）
ＢＫに感染させたＨＫ２細胞をＴｒｉｚｏｌで溶解し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを単離した。その単離中にＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）処置を行って、過剰なＤＮＡを除去し、Ｐｒｏｍｅｇａ逆転写酵素、ＤＴＴ、ｄＮＴＰおよびランダムプライマーを用いて、ｃＤＮＡを合成した。ＣＦＸ３８４  ＴｏｕｃｈＴＭＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）においてＳＹＢＲＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）および以下のプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った：
【０１６０】
【表５】
2021524730.tif 000006
【０１６１】
（結果）
（ＢＫ標的化アンチセンスオリゴヌクレオチドのデザイン）
ＢＫＰｙＶラージＴ抗原（ＴＡｇ）を標的化する有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、宿主のＲＮＡ種には特異的でないという意味において、ＢＫＰｙＶに特異的でなければならないが、好ましくは、他の異なるＢＫＰｙＶ単離株および異なるポリオーマウイルス全般に対して可能な限りユニバーサルでである必要がある。ｄｓＲＮＡ／ｓｓＲＮＡウイルスと比べてｄｓＤＮＡウイルス（この場合、ポリオーマウイルス）は、遺伝的浮動が少ないことを特徴とする。それにもかかわらず、多数のＢＫＰｙＶ血清型をもたらす多数のＢＫＰｙＶ遺伝子型および亜遺伝子型が残っている（図２の系統樹を参照のこと）。ＴＡｇは、２つのエキソンを含むので、本発明者らはまず、ＡＯＮ候補を特定するために、エキソン−イントロンジャンクションのゲノム配列を特定した（図２を参照のこと）。これを達成するために、本発明者らは、入手可能なユニークなＢＫＰｙＶ  ＴＡｇゲノム配列（ｎ＝２４５の材料および方法の項で提示したアクセッション番号）をＮＣＢＩデータベースから抽出し、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてこれらをアラインメントした。高レベルの配列類似性（または保存）を示した領域を標的化した。これらの研究は、エキソン１および隣接するイントロン配列に高い保存度を示した（図２を参照のこと）。エキソン２も、高レベルの配列保存を示した。隣接するイントロン配列は、Ｔヌクレオチドリッチであると同時に、エキソンの境界から４ヌクレオチド以内ではあまり保存されていなかった。ＡＯＮを、ＢＫＰｙＶ  ＴＡｇのエキソン１およびエキソン１におけるイントロン配列の架橋部分に対して標的化した。エキソン２の場合、ＡＯＮを、エキソン２のイントロン領域および隣接するエキソン２配列における４〜６ヌクレオチドに対して標的化した。
【０１６２】
図３に示されているように、本発明者らは、ＢＫＰｙＶ  ＴＡｇを標的化する５つのＡＯＮをデザインすることにし、そのうちの３つが、エキソン１−イントロン部分を標的化し（ＡＯＮ＃１、＃２および＃３と命名）、２つのＡＯＮが、エキソン２−イントロン部分を標的化する（ＡＯＮ＃４および＃５と命名）。それらのＡＯＮは、エキソン１標的化ＡＯＮ（ＡＯＮ１〜３）の場合、主にエキソン配列から、重要なイントロン結合配列を含むところまで徐々にシフトしている。材料および方法の項、および厳密な配列ならびに骨格および糖部分の修飾については図３を参照のこと。このデザインによって、腎臓移植患者における異なるＢＫＰｙＶ遺伝子型に対してユニバーサルでもありつつ、ＢＫＰｙＶのＴＡｇを特異的に標的化することが可能になった。
【０１６３】
（ＡＯＮによって媒介されるＢＫＰｙＶ  ＴＡｇ  ＲＮＡの減少）
本発明者らは、リポフェクタミンベースのＡＯＮ送達を用いたところ、トランスフェクション後の５時間以内にＡＯＮの取り込みが顕著に改善された。さらに、本発明者らは、ＡＯＮ投与量を、細胞のＦＡＭ標識強度に基づいておよそ５０ｎＭで最大になるまで漸増した。ＡＯＮ投与の２４時間（２４ｈ）後、ＨＫ２細胞をＢＫＶに２時間感染させ、その後、それらの細胞を洗浄し、３、５および７日間培養した。これらの時点において、それらの細胞からＲＮＡを回収し、ｑＲＴ−ＰＣＲを行って、どのＡＯＮがＴＡｇの発現レベルに影響できたかを明らかにした。ＡＯＮをトランスフェクトされなかったＨＫ２細胞（未処置）は、スクランブルＡＯＮ（Ｓｃｒ）で処置された細胞と類似のＴＡｇ発現レベルを示した（データ示さず）。
【０１６４】
所与の標的ＲＮＡの発現レベルまたはスプライシングを調節するようにデザインされたかなりの比率のＡＯＮが、有効であることが立証される。ＡＯＮ＃２、＃３または＃４を用いた本発明者らの研究は、ＴＡｇ  ＲＮＡレベルを繰り返し有意に低下させ、概して、このウイルスＤＮＡ駆動物質（ｄｒｉｖｅｒ）のＲＮＡレベルの５〜１０倍の減弱を示した（図４、左のパネルを参照のこと）。ＡＯＮ＃２、＃３、＃４または＃５で処置されたＢＫＰｙＶに感染した培養物は、繰り返しＴＡｇ  ＲＮＡ発現レベルの低下を示した。これにより、これらのＡＯＮによって標的化される部位が、ＴＡｇの生成を減少させることによるＢＫウイルス産生の減少にとって好ましい標的部位と立証された。注目すべきこととして、この減少は、高ＭＯＩ、すなわち、１００という範囲の設定において観察される。
【０１６５】
（ＡＯＮによって媒介されるＶＰ１  ＲＮＡおよびタンパク質の減少）
ポリオーマウイルスに潜伏感染した細胞（例えば、ＢＫＶに感染した腎臓近位尿細管細胞）では、低レベルのＴＡｇ  ＲＮＡおよびタンパク質の発現が維持されている。免疫系が損なわれている個体では、それが天然のものであるかまたは免疫抑制レジメンによって誘導されるかにかかわらず、ウイルスの複製およびＴＡｇ発現の誘導が観察される（Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，２０１４；Ｎｉｃｋｅｌｅｉｔ，Ｖ．ｅｔ．ａｌ．，ＪＡＳＮ，２０１８）。ＴＡｇレベルの増大は、ＢＫＶゲノムの非コード／プロモーター領域に対するアクセサリー転写因子との相互作用とともに、ＢＫゲノムの複製と（後期領域）主要キャプシドタンパク質の発現との両方を駆動する。まとめると、ＴＡｇによって媒介される、ウイルスＤＮＡの複製およびキャプシドタンパク質によるカプセル化の活性化によって、尿中（ウイルス尿症）と血清中（ウイルス血症）の両方で検出され得る感染性ウイルス粒子が生成される（Ｈｅｌｌｅ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１７）。
【０１６６】
ＡＯＮがＢＫＶ産生の減少に有効であるかを試験するために、本発明者らは、ＶＰ１を含むＴＡｇによって活性化されるタンパク質の発現プロファイルを測定した。ＶＰ１は、正二十面体のウイルスキャプシドの主要な構造的構成要素である。この外殻は、５：１という化学量論でＶＰ２またはＶＰ３と結合した７２個の五量体を有する。そのため、本発明者らは、ＶＰ１に対するｑＲＴ−ＰＣＲを行い、それにより、ＧＡＰＤＨの１コピーあたりのＶＰ１の発現レベルが、ＴＡｇよりもかなり高いことが明らかになった（データ示さず）。これは、ＴＡｇが他の転写因子とともにＶＰ１  ｍＲＮＡの発現を誘導するという事実と一致する。さらに、すべての研究において、本発明者らのＡＯＮ＃２、＃３、＃４および＃５は、ＶＰ１  ＲＮＡの発現レベルを低下させるとともに、ＶＰ１タンパク質も著しく減少させた（図５、右のパネルを参照のこと）。
【０１６７】
本発明者らは、ＡＯＮ＃２と＃４との併用療法がＴＡｇおよびＶＰ１のＲＮＡレベルをより効果的に低下させ得るかについても試験した。この組み合わせは、ＡＯＮで処置された細胞におけるＶＰ１に対する上述のウエスタンブロット（図５）が、これらの２つのＡＯＮによってＶＰ１タンパク質が最も強く減少したことを示唆したという事実に基づいて選択された。ＴＡｇおよびＶＰ１のｍＲＮＡ発現レベルに基づくと、この併用処置は、それらがより有効であったと示唆するエビデンスをもたらさなかった（図４）。
【０１６８】
この観察されたＶＰ１の減少は、ＴＡｇスプライシング標的化ＡＯＮが有効であることを示している。ＴＡｇ  ＲＮＡ（および潜在的にはタンパク質発現）を減少させることによって、ＢＫＰｙＶ後期領域遺伝子および対応するタンパク質の発現レベルが低下する。さらに、ＶＰ１は、ウイルスＤＮＡの被包におけるＶＰ１の役割とともに、近くおよび／または遠くの細胞の細胞表面に、グリカン上のシアル酸において結合することによって、新しく形成されたウイルス粒子の感染性において中心的な媒介性の役割も果たす（Ｈｅｌｌｅ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１７）。したがって、ＢＫＰｙＶの感染性は、ＶＰ１タンパク質が減少する（または存在しない）場合に損なわれる可能性がある。
【０１６９】
（ＴＡｇスプライシング標的化ＡＯＮはＢＫウイルス価を低下させる）
本発明者らのＴＡｇスプライシング標的化ＡＯＮで前処置されたＨＫ２細胞におけるＴＡｇおよびＶＰ１  ＲＮＡおよびタンパク質のレベル（７日目）に対してスクリーニングを行うのと同時に、本発明者らは、ＢＫＰｙＶ感染の３、５および７日後の培養上清中のウイルス量を評価した。ＴＡｇ発現の減少は、ウイルスゲノムの複製とＶＰ１タンパク質の生成の両方に潜在的に影響し得るので、本発明者らは、ＶＰ１の減少が、カプセル化されたウイルスＤＮＡの生成に影響するか否かを判定した。本発明者らは、カプセル化されたＤＮＡを定量することによって、培養上清中のウイルス粒子を測定した。カプセル化されたＤＮＡとカプセル化されていないＤＮＡとを識別するために、本発明者らは、（エンド）ヌクレアーゼ処置を適用して、カプセル化されていないＤＮＡを消化した。図６に示されているように、これらの研究は、ＡＯＮ＃１が３日目にウイルスＤＮＡレベルを低下させたが、７日目には低下しなくなり、このレベルは、スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ＡＯＮで処置された細胞におけるウイルスＤＮＡレベルに対して正規化され、そのレベルと似ていることを明らかにした（図６）。ＡＯＮ＃２、＃３および＃４は、両方の時間間隔においてウイルス価の低下を特徴とし、ＡＯＮ＃２、＃３および＃４は、特に、被包されたウイルスＤＮＡを６倍まで減弱させた（図６）。上述のＡＯＮ＃２と＃４との併用は、３および７日目にウイルス量をわずかに低下させただけだった（図６）。
【０１７０】
したがって、ＡＯＮによって媒介されるＴＡｇおよびＶＰ１  ＲＮＡおよびタンパク質の減少によって、ウイルス産生が減少する。
【０１７１】
（リボース糖の２’位におけるアルキル修飾）
ＡＯＮ上のリボース糖の２’位の変化は、ＴＡｇおよびＶＰ１  ＲＮＡおよびタンパク質のレベルを低下させる能力、ならびにＢＫＶ  ＤＮＡ生成に影響する（図７）。上述のデータは、アンチセンスオリゴヌクレオチド内の各ヌクレオチド上のリボース糖の２’−Ｏメチル（２’−ＯＭｅ）修飾に基づいている。ＲＮＡおよびタンパク質を、２’−ＯＭｅヌクレオチドまたは２’−メトキシ（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドの両方で前処置されたＨＫ２細胞から回収した（図７を参照のこと）。
【０１７２】
（他のポリオーマウイルスに対するＴＡｇスプライシング標的化ＡＯＮ）
ＢＫＶのほかに、本発明者らは、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）に対するＴＡｇを同様に標的化するＡＯＮも開発した。ＪＣＶは、ＢＫＶに対して７５％の配列類似性（エキソン１−イントロンジャンクションで観察される保存レベルである）を有するのに対し、イントロン−エキソン２ジャンクションにおける配列類似性は、実質的に１００％である（図８）。ゆえに、ＢＫＶのエキソン２を標的化するＡＯＮは、ＪＣＶ量も減少させ得る。ＪＣＶも、扁桃および／または消化管を介した初感染後に近位尿細管細胞などの腎細胞（これらは二次感染部位であると考えられている）に感染し得る。したがって、ＴＡｇスプライシング標的化ＡＯＮ、特に、イントロン−エキソン２スプライス部位を標的化するＡＯＮは、ＢＫＶとＪＣＶの産生を同時に抑制し得る。さらに、本発明者らは、ユニークなＪＣＶエキソン１−イントロン配列を標的化する新規ＡＯＮを作製している。
【０１７３】
公知のあらゆるポリオーマウイルスに対して、ＴＡｇのエキソン１−イントロンおよびイントロン−エキソン２ジャンクションにおけるゲノム配列が決定されたことを考えると、これらのあらゆるポリオーマウイルスにおけるＴＡｇのスプライシングに影響するＡＯＮをデザインすることが可能である（図９）。
他のポリオーマウイルスに適したＡＯＮの例を図９に示す。
【０１７４】
［実施例２］
（材料および方法）
（ＢＫＶサブタイプの系統発生学的保存）
【０１７５】
ＢＫポリオーマウイルス単離株の全ゲノム配列を公的に利用可能なＮＣＢＩデータベースからダウンロードした（０７−０９−２０１８より前に）。これらの記録から、全ゲノムが報告されている単離株だけを、解析に使用した。イントロンに大きな欠失がある、またはアクセプタースプライス部位と部分的に一致する重複があるという理由から、それぞれ単離株「ＭＭ」および「ＦＮＬ−９」を除去した。同一の配列を除去することにより、２４８個のユニークなゲノム配列が得られ、それらのアクセッション番号を下記に提供する：
AB211369, AB211370, AB211371, AB211372, AB211373, AB211374, AB211375, AB211376, AB211377, AB211378, AB211379, AB211381, AB211382, AB211383, AB211384, AB211385, AB211386, AB211387, AB211388, AB211389, AB211390, AB211391, AB213487, AB217917, AB217918, AB217919, AB217920, AB217921, AB260028, AB260029, AB260030, AB260031, AB260032, AB260033, AB263912, AB263913, AB263914, AB263915, AB263916, AB263917, AB263918, AB263919, AB263920, AB263921, AB263922, AB263923, AB263924, AB263925, AB263926, AB263927, AB263928, AB263929, AB263930, AB263931, AB263932, AB263934, AB263935, AB263936, AB263938, AB269825, AB269826, AB269827, AB269828, AB269829, AB269830, AB269831, AB269832, AB269834, AB269836, AB269837, AB269838, AB269840, AB269841, AB269842, AB269843, AB269844, AB269845, AB269846, AB269847, AB269848, AB269849, AB269850, AB269851, AB269852, AB269853, AB269854, AB269855, AB269856, AB269857, AB269858, AB269859, AB269860, AB269861, AB269862, AB269863, AB269864, AB269865, AB269866, AB269867, AB269868, AB269869, AB298941, AB298942, AB298945, AB298946, AB298947, AB301086, AB301087, AB301089, AB301090, AB301091, AB301092, AB301093, AB301094, AB301095, AB301096, AB301097, AB301099, AB301100, AB301101, AB365130, AB365132, AB365133, AB365134, AB365136, AB365137, AB365138, AB365139, AB365140, AB365141, AB365142, AB365144, AB365145, AB365146, AB365148, AB365149, AB365150, AB365151, AB365153, AB365154, AB365156, AB365157, AB365158, AB365159, AB365160, AB365162, AB365164, AB365165, AB365166, AB365167, AB365168, AB365170, AB365173, AB365174, AB365175, AB365176, AB365178, AB369087, AB369088, AB369089, AB369090, AB369092, AB369093, AB369094, AB369095, AB369096, AB369097, AB369098, AB369099, AB369101, AB464953, AB464954, AB464956, AB464957, AB464958, AB464960, AB464961, AB464962, AB485695, AB485696, AB485697, AB485698, AB485699, AB485700, AB485701, AB485703, AB485704, AB485707, AB485709, AB485710, AB485711, AB485712, AY628224, AY628225, AY628226, AY628227, AY628228, AY628229, AY628230, AY628231, AY628232, AY628233, AY628234, AY628235, AY628236, AY628237, AY628238, DQ305492, EF376992, FR720308, FR720309, FR720310, FR720311, FR720312, FR720313, FR720315, FR720317, FR720318, FR720320, FR720321, JF894228, JN192431, JN192432, JN192433, JN192435, JN192437, JN192438, JN192439, JN192440, JQ713822, KF055891, KF055892, KF055893, KP412983, KP984526, KY114802, KY114803, KY132094, KY487998, LC029413, LC309239, LC309240, LT960370, M23122, MF358970, MF627830, MF627831, V01108。
【０１７６】
（スプライス部位の保存および系統樹）
イントロン配列を含むＴＡｇの全遺伝子配列を、Ｐｒａｎｋ（ｖ．１４０６０３）を用いてアラインメントした。アラインメントされた配列に対して手作業で調整を行うことにより、欠失をアラインメントする際の不備を調整した。ブートストラッピング（１０００回反復）による近隣結合法（ＭＥＧＡバージョン１０．０．５）およびＫｉｍｕｒａ２−パラメータモデルを用いて、系統樹を構築した。その系統樹をさらにＲ（「ｇｇｔｒｅｅ」）において可視化し、アクセプタースプライス部位およびドナースプライス部位に対してシーケンスロゴを構築して（「ｇｇｓｅｑｌｏｇｏ」）、サブタイプ間のヌクレオチド特異的保存を示した。配列のサブタイプを、Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ（Ｚｈｏｎｇ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，２００９）が報告した参照配列を用いて決定した。
【０１７７】
（オリゴヌクレオチドのデザイン）
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、実施例１に記載したようにデザインした。インビボ研究の場合、５’６−ＦＡＭ標識なし２’−ＭＯＥ  ＡＯＮ（ＨＹＢ＿０１）を使用した。
【０１７８】
（動物）
６〜１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、４０ｍｇ／ｋｇの５’６−ＦＡＭ標識のない２’−ＭＯＥ  ＡＯＮまたは生理食塩水（体重に対して＋−１００ｕＬの体積を補正した）を静脈内注射した。ＡＯＮまたは生理食塩水を投与した２４後に、動物をイソフルラン麻酔下、静脈放血により屠殺した。臓器を取り出し、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。
【０１７９】
（細胞培養）
ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＨＫ２，ＡＴＣＣ（登録商標））を、３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン（ＩＴＳ−Ｘ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＰＴＥＣ，Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、完全ＲＥＧＭＴＭ腎上皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）中で維持した。初代ヒトアストロサイト（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、完全Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ）中で維持した。ｉＰＳｃ由来のアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを、完全ＢｒａｉｎＰｈｙｓＴＭＮｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。すべての細胞を３７℃、５％ＣＯ２において培養した。
【０１８０】
（細胞のＡＯＮによる処置およびウイルス感染）
細胞を、必要な細胞密度で播種し、一晩培養した。リポフェクタミン２０００とともに４時間（ヒトアストロサイトおよびｉＰＳｃアストロサイト／オリゴデンドロサイト，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはリポフェクタミン３０００とともに５時間（ＨＫ２およびＰＴＥＣ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｎＭ  ＡＯＮの存在下において細胞を培養することによって、ＡＯＮの細胞取り込みを行い、その後、それらの細胞を通常の培養液で洗浄した。ＨＫ２上皮細胞またはヒト腎臓上皮細胞のＢＫＶ感染を、実施例１に記載したように行った。アストロサイト／オリゴデンドロサイトをＪＣポリオーマウイルス（ＭＡＤ−４株，ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１５８３ＴＭ）の存在下において一晩培養することによって、それらの細胞のＪＣＶ感染を行った。過剰なウイルス粒子を除去するために、それらの細胞を感染後、しっかりと洗浄した。培養液を部分的に新しくし、ウイルス粒子産生を調べるために、感染後の特定の時点において上清サンプルを採取した。処置後の感染細胞を含むウェルの上清を採取することによって、細胞の再感染を行った。次いで、この上清を２倍希釈し、未感染かつ未処置の細胞を含む新しいウェルに２時間移し、その後、それらの細胞をしっかりと洗浄した。７日後に、感染した細胞を、４％ＰＦＡを用いて洗浄した。
【０１８１】
（ウイルス量の測定）
培養上清中のウイルス量を、以下のことを除いては実施例１に記載したように行った。１）１００μＬのサンプルを、すべての時点においてすべてのウェルから回収した。２）パッケージされていないＤＮＡを単離前に、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡフリーキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分解した。
【０１８２】
（リアルタイムｑＰＣＲ）
ＲＮＡの単離、ｃＤＮＡの合成およびリアルタイムｑＰＣＲを、実施例１に記載したように行った。ただし、ＲＮＡの単離後、残留ＤＮＡを、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡフリーキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分解した。Ｔ抗原スプライスバリアントを増幅には、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを、ＨＦ緩衝液および以下のプライマーを使用した：フォワードＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＴＴＡＧＧ、リバースＴＧＣＡＡＣＴＣＴＴＧＡＣＴＡＴＧＧＧＧＧ。ＪＣウイルスＲＮＡのｑＰＣＲ検出を、以下のプライマーを用いて行った：
【０１８３】
【表６】
2021524730.tif 000007
【０１８４】
（抗体）
以下の１次抗体を使用した：ウサギ抗ＳＶ４０  ＶＰ１（ａｂ５３９７７）、マウス抗ＳＶ４０  Ｔ抗原（ＰＡｂ４１６）、マウス抗ＳＶ４０  Ｔ抗原（ＰＡｂ１０８）、ウサギ抗ＧＡＰＤＨ（Ｄ１６Ｈ１１）、ビオチン化Ｌｏｔｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ（ＬＴＬ，Ｂ−１３２５）。ウサギ抗ホスホロチオエート抗体は、Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｗａｔｔｓ（ＵＭＡＳＳ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）から厚意により提供された。以下の二次抗体を使用した：ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（Ａ１１００８）、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ５６８（Ａ１１０１１）、ヤギ抗ウサギＨＲＰ（Ｐ０４４８０１−２）およびストレプトアビジンＡｌｅｘａ５３２（Ｓ１１２２４）。
【０１８５】
（タンパク質の定量）
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコレート、０．５％トリトンＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液（ｐＨ７．５）中で細胞を溶解することによって、タンパク質溶解産物を生成した。ＰｉｅｒｃｅＴＭ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、サンプルのタンパク質濃度を測定した。１２〜２３０ｋＤａ分離マトリックスおよび抗ウサギ検出モジュール（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を備えたＷｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ自動化イムノアッセイシステムを用いて、タンパク質発現の定量を行った。
【０１８６】
（免疫組織化学）
再感染実験の場合、細胞を４％ＰＦＡで固定し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／３％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ，Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）／１％ＮＧＳ（Ｄａｋｏ，Ａｍｓｔｅｌｖｅｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）／１％ＦＣＳのＰＢＳ溶液中、ＲＴにおいて１時間、透過処理した。１次抗体を、３％ＢＳＡ／１％ＮＧＳ／１％ＦＣＳのＰＢＳ溶液中、４℃において一晩インキュベートし、その後、細胞をしっかりと洗浄し、二次抗体とともにＲＴにおいて１時間インキュベートした。再感染した細胞の画像収集および定量を、（ＴＡｇ＋）核を特定し、カウントするカスタムモジュールを使用して、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍおよびＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアを用いて行った。インビボ画像のさらなる処理（カラーデコンボリューションおよび閾値化）を、ＩｍａｇｅＪを用いて行った。
【０１８７】
マウス臓器をパラフィンに包埋し、切断し、スライドを脱脂し、再水和し、内因性ペルオキシダーゼを、３％Ｈ２Ｏ２のメタノール溶液中、室温において１０分間クエンチした。プロテイナーゼＫ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ａｍｓｔｅｌｖｅｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を室温において１０分間用いて、抗原回復を行った後、バックグラウンドバスター（Ｉｎｎｏｖｅｘ，Ｇｕｊａｒａｔ，Ｉｎｄｉａ）を用いてブロッキング工程を行った。工程間に、スライドをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で洗浄した。１次抗体インキュベーション（抗ホスホロチオエートまたはＬＴＬ）を、２％ＢＳＡ／５％ＮＧＳのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液中、４℃において行った。二次抗体インキュベーションを室温において９０分間行った。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で核を染色し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてスライドをマウントした。Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ  ＭＩＤＩ  ＩＩ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）を用いて画像収集を行った。
【０１８８】
（次世代シーケンシング）
ＡＯＮで処置された感染ＨＫ２細胞に由来するＲＮＡサンプルに対してＲＮＡ−ｓｅｑを、Ｉｌｌｕｍｉｎａのシーケンシング技術を用いて行った。手短に言えば、サンプルの品質を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定し、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａを用いて、それらのサンプルを処理した。そのサンプル調製は、「ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ」（ＮＥＢ  ＃Ｅ７７６０Ｓ／Ｌ）のプロトコルに従って行った。簡潔には、ｒＲＮＡ枯渇キット（ＮＥＢ＃Ｅ６３１０）を用いて、全ＲＮＡからｒＲＮＡを枯渇させた。ｒＲＮＡが減少したＲＮＡの断片化の後、ｃＤＮＡ合成を行った。これをシーケンシングアダプターとのライゲーションおよび得られた産物のＰＣＲ増幅に用いた。サンプル調製後の品質および収率を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。得られた産物のサイズは、予想したサイズ分布（３００〜５００ｂｐという広範なピーク）と一致した。ＮｏｖａＳｅｑ６０００を用いたクラスタリングおよびＤＮＡシーケンシングを、製造者のプロトコルに従って行った。１．１ｎＭという濃度のＤＮＡを使用した。ＮｏｖａＳｅｑコントロールソフトウェアＮＣＳ  ｖ１．５を使用した。画像解析、塩基判定（ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ）および品質検査を、Ｉｌｌｕｍｉｎａデータ解析パイプラインＲＴＡ３．３．５およびＢｃｌ２ｆａｓｔｑ  ｖ２．２０を用いて行った。
【０１８９】
ヒトリファレンスＨｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．ＧＲＣｈ３８．ｄｎａ．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙを、ウイルス参照ＬＣ０２９４１１．１と組み合わせた。その組み合わされたゲノムを、各サンプルに対するリードのアラインメントに使用した。それらのリードを、デフォルトの設定のＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（Ｔｏｐｈａｔ  ｖ２．０．１４）に基づくショートリードアライナーを用いて参照配列にマッピングした。アラインメントファイルにおけるマッピングされた位置に基づいて、リードが転写物上にマッピングされる頻度を、ＨＴＳｅｑ  ｖ０．６．１ｐ１を用いて測定した。
【０１９０】
（Ｅｖｅｎｔｐｏｉｎｔｅｒを用いたスプライシング事象の特定）
ＮＧＳデータにおける選択的スプライシング事象を特定するために、ウイルス参照ゲノムにマッピングされたリードに対して「Ｅｖｅｎｔｐｏｉｎｔｅｒ」を適用した。得られたスプライシング事象を、Ｋａｌｌｉｓｔｏを用いて定量することにより、各事象に対するパーセントスプライシング（ＰＳＩ）値を得た。統計的検定のために、スクランブルＡＯＮをコントロール条件として使用した。
【０１９１】
（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのロングリードシーケンシング）
まず、ＲＮＡの完全性をバイオアナライザーにおいて評価した。ｃＤＮＡ合成を、ＳＭＡＲＴｅｒ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ）を用いて行い、特定のラージＴ産物を、Ｋａｐａ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて増幅した。ｃＤＮＡ産物をサイズ選択し、その後、ＳＭＲＴｂｅｌｌ  Ｂａｒｃｏｄｅｄ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＰａｃＢｉｏ）を用いて、アンプリコンをサンプル毎にバーコード付与し、次いで、等モルでプールし、ＰａｃＢｉｏ  Ｓｅｑｕｅｌ  １Ｍ  ｖ３  ＬＲ  ＳＭＲＴセルにおいてシーケンシングした。
【０１９２】
転写物の同定、ポリッシングおよびアノテーションを、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓが公にしたＩｓｏ−Ｓｅｑ３バイオインフォマティクスパイプライン（https://github.com/PacificBiosciences/IsoSeq3）を用いて行った。まず、サンプル特異的バーコードの存在に基づいて、リードを完全長と非完全長に分けた。転写物クラスターを見つけるために、アイソフォームレベルのクラスタリングアルゴリズム（ＩＣＥ）が、完全長リードのペアワイズアラインメントおよび反復割当を行うことにより、尤度に基づいてクラスター形成した。ＩＣＥの後、部分的リードをアイソフォームクラスターに付加して、Ａｒｒｏｗアルゴリズムを用いて、最終的なコンセンサスのためにカバレッジを上げる。上記バイオインフォマティクスパイプラインからの出力は、参照配列にマッピングされることによりＧＦＦ形式のアノテーションファイルを構築し得る完全長転写物配列のセットである。Ａｒｒｏｗアルゴリズムの予測コンセンサス精度に基づいて、＞９９％の予測精度を有する転写物の配列（精度の正確な推定にとって時折カバレッジが不十分であることから、最初の１００ｂｐおよび最後の３０ｂｐからＱＶを除外する）をＨＱ転写物とみなし、さらなる解析に用いた。ＨＱ転写物の配列を、参照配列にマッピングし直し、＞９９％のアラインメントカバレッジおよび＞８５％のアラインメント同一性についてフィルタリングした。冗長な転写物は、本研究に使用される最終的なデータセットを作成するために崩した。
【０１９３】
（結果）
（新規ＢＫＶ標的化ＡＯＮの開発）
図１０および１１に示されているように、本発明者らの以前のＡＯＮと並行して、本発明者らは、ＢＫＶ  ＴＡｇを標的化する９つの新しいＡＯＮをデザインすることにした。その９つのうちの６つが、エキソン１−イントロン部分を標的化し（ＨＹＢ＿０６、＿０７、＿０８、＿０９、＿１０および＿１１と命名）、２つの新しいＡＯＮが、エキソン２−イントロン部分を標的化する（ＨＹＢ＿１２および＿１３と命名）。これらの９つの新しいＴＡｇエキソン−イントロンジャンクション標的化ＡＯＮとともに、本発明者らは、Ｓａｎｔａｒｉｓ  Ｐｈａｒｍａが以前に報告した２つのＡＯＮ（ＷＯ２０１２／１４３４２７Ａ１）も試験し、この２つのＡＯＮは、本発明者らのＡＯＮとは異なる組成を有するが、エキソン１−イントロンジャンクションの一部（ＳＡＮ＿７４）または単にエキソン２の一部（ＳＡＮ＿７３）に相補的である。さらに、本発明者らは、もっぱらエキソン１のコード領域に結合するＡＯＮ、すなわちＨＹＢ＿１４もデザインし、試験した。それらのＡＯＮは、エキソン１標的化ＡＯＮ（ここでは総称される）（ＨＹＢ＿０１、＿０２、＿０３、＿０６、＿０７、＿０８、＿０９、＿１０、＿１１）およびエキソン２標的化ＡＯＮ（ＨＹＢ＿０４、＿０５、＿１２および＿１３）の場合、主にエキソン配列から、重要なイントロン結合配列を含むところまで徐々にシフトしている。
【０１９４】
（ＡＯＮによって媒介されるＢＫＶ  ＴＡｇ  ＲＮＡの減少）
ＢＫＶ標的化ＡＯＮは、ＴＡｇ  ｍＲＮＡレベルの低下において様々な範囲の効力を示した。図１２および１９に示されているように、ＴＡｇのエキソン−イントロンジャンクションを標的化するようにデザインされた１４個のＡＯＮのうち、ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３およびＨＹＢ＿１１が、ＴＡｇ  ｍＲＮＡ発現の最も大きな低下を誘導し、それは概して、このウイルスＤＮＡ駆動物質のＲＮＡレベルで、感染の７日後に、８倍またはそれを越える範囲のものであった。
【０１９５】
さらに、本発明者らのデータは、エキソン１−イントロンジャンクションを標的化するＡＯＮが、エキソン２−イントロンジャンクションを標的化するＡＯＮ（ＨＹＢ＿０４、ＨＹＢ＿０５、ＨＹＢ＿１２およびＨＹＢ＿１３）よりもＴＡｇ  ｍＲＮＡレベルの低下に有効であることも示唆する。この傾向は、図１８および２５においてバイオインフォマティクス的に示されており、ＨＹＢ＿０５だけが、エキソン１−イントロンジャンクションを標的化するＡＯＮとクラスター形成している。同様に、ＳＡＮ＿７３およびＳＡＮ＿７４が、ＴＡｇ  ｍＲＮＡ発現レベルの低下にほとんど効果がないと判明した。注目すべきこととして、これらのＴＡｇ  ｍＲＮＡの減少は、高ＭＯＩ、すなわち、１００という範囲の設定において観察される。
【０１９６】
ＨＫ２細胞とともに、本発明者らは、初代近位尿細管上皮細胞（ｈＰＴＥＣ）においても、本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮを試験した。ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３およびＨＹＢ＿１１を用いたときの、ＨＫ２細胞において観察されたＴＡｇ  ｍＲＮＡの発現レベルの有意かつ一貫した低下に基づいて、本発明者らは、この段階を進めることにし、これらの３つを本発明者らの「リード化合物」と呼んだ。図２８に示されているように、ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３およびＨＹＢ＿１１はすべて、ｈＰＴＥＣにおいてＴＡｇ  ｍＲＮＡの発現を劇的に減少させたが（ｎ＝３生物学的反復）、ＨＹＢ＿１４は、ｈＰＴＥＣにおいてＴＡｇ  ｍＲＮＡレベルの低下に効果がないことが判明した。
【０１９７】
興味深いことに、本発明者らの研究の大部分が、ＢＫＶに感染させる前にＡＯＮによる前処置を含む。まずＨＫ２細胞をＢＫＶに感染させ、続いて、それらの細胞をＡＯＮ（すなわちＨＹＢ＿０１）で処置した予備的研究は、本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮが、感染の７日後に、ＢＫＶを有する細胞においてＢＫＶ  ＴＡｇ発現を効率的に抑制し得ること（図２６、左のパネル）、および感染後の複数回投与が、潜在的に、ＴＡｇ  ｍＲＮＡの発現レベルをさらに抑制し得ること（図２６、右のパネル）を明らかにした。
【０１９８】
（ＡＯＮによって媒介されるＶＰ１  ＲＮＡおよびタンパク質の減少）
興味深いことに、ＶＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルは、ＨＹＢ＿０４、ＨＹＢ＿１２、ＨＹＢ＿１３およびＨＹＢ＿１４を除くＢＫＶ標的化ＡＯＮのほとんどによって低下した（図１３および２０）。ＴＡｇ  ｍＲＮＡに対して得られた本発明者らの結果と同様に、ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３およびＨＹＢ＿１１は、特に、ＨＫ２細胞においてＶＰ１  ＲＮＡ発現を著しく減少させた（図１３）。さらに、ＨＹＢ＿０１が、ＢＫウイルスによるＨＫ２細胞の感染前に投与されたのかそれとも感染後に投与されたのかに関係なく、そのＡＯＮは、ＶＰ１  ｍＲＮＡレベルを効率的に低下させた（図２６、左および右のパネル）。重要なことに、観察されたＶＰ１  ｍＲＮＡの減少は、ＨＫ２細胞においてＶＰ１タンパク質レベルの劇的な減弱をもたらした（図１４〜１５および２１〜２２）。ＴＡｇ  ｍＲＮＡレベルに対する本発明者らの観察結果と一致して、ＳＡＮ＿７３およびＳＡＮ＿７４は、ＶＰ１のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルに対して有意に影響しなかった。
【０１９９】
図２９〜３１に示されているように、ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３およびＨＹＢ＿１１はすべて、ｈＰＴＥＣにおいてＶＰ１のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を劇的に減少させた（ｎ＝３生物学的反復）。さらに、ＨＹＢ＿１４は、ＶＰ１のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルに影響しなかった。さらに、本発明者らは、本発明者らのＡＯＮがＶＰ３タンパク質レベルも効果的に低下させるという予備的なエビデンスも得た（図３０および３２）。
【０２００】
（ヒト近位尿細管上皮細胞の感染および再感染）
本発明者らは、次に、本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮの幅広い組合せが、ＨＫ２細胞におけるＢＫＶによる感染および再感染の程度に影響し得るかを評価した。これを達成するために、本発明者らは、まず、ＨＫ２細胞をＢＫＶ標的化ＡＯＮで処置し、それらの細胞をＢＫＶに感染させた。７日後、本発明者らは、ウイルス粒子含有上清を回収し、これを用いて、未処置ＨＫ２細胞の新しいバッチに感染させた。７日後、本発明者らは、ＴＡｇに感染した細胞に対して蛍光免疫染色を行い、これをパーセント陽性としてスコアリングした（核をＨｏｅｃｈｓｔで対比染色することによって）。図１７および２４に示されているように、これらの研究は、本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮで予め処置された細胞が、有意に低い再感染レベルを示すことを明らかにした。対照的に、ＳＡＮ＿７３およびＳＡＮ＿７４によるＨＫ２細胞の前処置は、ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３およびＨＹＢ＿１１で観察された程度まで再感染レベルを低下させなかった。
【０２０１】
（ＢＫＶ標的化ＡＯＮはウイルス粒子産生に影響する）
ＢＫウイルスＤＮＡをパッケージングするために必要なタンパク質であるＶＰ１タンパク質の観察された減少は、新しいウイルス粒子の形成および上清への放出に大きく影響するはずである。実際に、図１６、２３および３３に示されているように、本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮの大部分は、感染の７日後にウイルス粒子産生を減少させ、ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３およびＨＹＢ＿１１が最も大きな減少をもたらした。対照的に、ＳＡＮ＿７３およびＳＡＮ＿７４は、ウイルス粒子産生をほんのわずかにしか減少させないと見出された。この機構は、インビトロでは局所および遠位の細胞の（再）感染の減少に関わっている可能性があることから、腎臓移植後の腎臓近位尿細管上皮細胞における本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮの取り込みが、ＢＫＶの活性化および／または伝播の予防に有効な治療様式になり得ることを強く示唆する。
【０２０２】
（ＢＫＶ標的化ＡＯＮはＴＡｇのスプライシングを調節する）
どのようにして本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮが、本明細書中に記載されるＴＡｇおよびＶＰ１  ｍＲＮＡの減少をもたらすのかに関する機構的な洞察を得るために、本発明者らは、スクランブルＡＯＮ、ＨＹＢ＿０１、ＨＹＢ＿０３、ＨＹＢ＿１１、ＨＹＢ＿１４、ＳＡＮ＿７３またはＳＡＮ＿７４で処置したＨＫ２細胞（その後、これらの細胞をＢＫＶに２時間感染させた）から回収したＲＮＡのＲＮＡ−ｓｅｑを行った。洗浄後、それらの細胞を７日間培養し、その後、ＲＮＡを回収し、バイオアナライザーにおいて分解の徴候について評価した。続いて、等量のＲＮＡをリボ枯渇させ（ｒｉｂｏ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）、ライブラリー調製を経て、その後、ＲＮＡ−ｓｅｑを行った。本発明者らの上述の、ＨＫ２細胞におけるＴＡｇおよびＶＰ１  ｍＲＮＡの減少と一致して、スクランブルコントロール（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）、ＨＹＢ＿１４またはＳＡＮ＿７３およびＳＡＮ＿７４で処置された細胞由来のＢＫＶゲノムのカバレッジは、ＢＫＶ標的化ＡＯＮで処置された場合よりも明らかに高かった（図４２）。ＢＫＶスプライシングの変化を解析するために、ヒトゲノムとＢＫＶゲノムの両方を配列のアラインメントに提供し、Ｂｏｗｔｉｅを使用してペアードエンドリードをアラインメントした。
【０２０３】
サンプル中の選択的スプライシングを定量するために、ＥｖｅｎｔＰｏｉｎｔｅｒを適用した。上記ウイルスの異なる転写物を含む特定のＧＴＦファイルを使用した。このアルゴリズムは、可能性のある選択的スプライシング事象を同定しようとするものであり、各転写物をその可能性のある代替経路に関係づける。ＴＡｇなどの非常に複雑なプレｍＲＮＡにおけるスプライシングを評価するために、そのプレｍＲＮＡをユニークなスプライシング事象に分解し、ＴＡｇプレｍＲＮＡをはじめに７つのフラグメントに分離した。各ジャンクションにおいて、スプライシング事象が検出される頻度によって定義される、（ＰＳＩ）を単位とするスプライシングパーセントを測定した。これにより、ＥｖｅｎｔＰｏｉｎｔｅｒによって測定したとき、すべての条件において高頻度で生じる４つのユニークな選択的スプライシング事象がもたらされた。これらの事象の頻度を、Ｋａｌｌｉｓｔｏソフトウェアを用いてスコアリングしたところ、転写物毎に定量がもたらされた（単位は１００万あたりの転写物）。有意性についての統計的検定の後、ＴＡｇのエキソン１−イントロンジャンクション、正確には、本発明者らのＡＯＮが結合し、スプライシングに影響すると予測された部位におけるスプライシングの有意な変化が観察された（図３５）。ここで、上のパネルは、下のパネル示されるようなユニークなスプライシング事象に後に分解される、ＴＡｇプレｍＲＮＡにおける適切なスプライシング事象の概略図を提供している。スプライシング事象１の場合、スクランブルコントロールＡＯＮで処置されたＨＫ２細胞と比べて、選択的スプライスアクセプター部位が、優先的に使用されるので（Ｚ値＝２．５４８４）、ＨＹＢ＿０１は、短縮型Ｔ抗原に対してスプライシングパターンの高度に有意な調節をもたらす（Ｐ＝０．０１０８）。同様に、スプライシング事象２の場合、スプライシングの高度に有意な変化が検出される（ｐ＝０．０１４９）が、ＨＹＢ＿０１は、ＴＡｇとは違い、スモールｔ抗原（ｔＡｇ）の優先的な生成をもたらす（Ｚ値−２．４３４２）。対照的に、ＨＹＢ＿１４、ＳＡＮ＿７３またはＳＡＮ＿７４で処置された細胞では、有意なスプライシングの変化は検出されない。ＳＡＮ＿７４に対してスプライシング調節が無いことは、このＡＯＮもエキソン１−イントロンジャンクションを架橋することを考えると、特に印象的である。これは、本発明者らのＡＯＮのサイズ（１６ｎｔ長とは対照的に２０ｎｔ）が、潜在的には立体障害の結果として、ＴＡｇのスプライシングに影響する能力の決定において役割を果たすことを強く示唆する。
【０２０４】
さらに、図３５に示されているデータは、エキソン１−イントロンジャンクションにおけるスプライシング（スプライシング事象２）の調節が、エキソン２内で起きるスプライシングの決定（スプライシング事象１）に影響することも示唆する。ゆえに、本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮは、ＴＡｇプレｍＲＮＡの下流において相互排他的または複雑なスプライシング事象を引き起こしているとみられる。これらの研究は、生物学的ｎ＝３に基づく。
【０２０５】
本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮが、ＴＡｇのスプライシングの変化を媒介するというエビデンスの裏付けを、高忠実度Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いてロングレンジＰＣＲを行うことによって得た。図４３に示されているように、スクランブルコントロールで処置された細胞と比べて、短縮型Ｔ抗原アクセプター部位の使用（図３５におけるスプライシング事象１）の劇的な変化が、ＨＹＢ＿０１およびＨＹＢ＿１１に対して観察され、よりわずかな変化がＨＹＢ＿０３に対して明らかになった。これらのデータから、エキソン１−イントロンジャンクションを標的化するＡＯＮは、エキソン２内のスプライシングの決定に著しく影響することが確かめられた。
【０２０６】
ＢＫＶ  ＴＡｇに対する本発明者らのＡＯＮのスプライシング媒介効果に関するさらなる洞察を得るために、本発明者らは、ＰａｃＢｉｏシーケンシングを用いて、ＴＡｇの長配列リードを生成し、ここで、ＴＡｇの５’末端および３’末端に結合するプライマーを使用して、完全長ＴＡｇプレｍＲＮＡを増幅した。これらの研究は、ＴＡｇ内の個々のスプライス部位の厳密な使用、ならびに本発明者らのＲＮＡ−ｓｅｑデータに示される潜在的な相互排他的または複雑な事象に関する的確な洞察をもたらし得る。ＲＮＡ分解をバイオアナライザーにおいて評価し、ＰＣＲによる標的の濃縮後、ＰＣＲ産物をサイズ選択した。ｃＤＮＡライブラリーを調製し、末端を修復し、アダプターをライゲートし、ＤＮＡを精製し、ＳＭＲＴｂｅｌｌでＤＮＡ配列決定した。続いて、サブリードを環状のコンセンサスリード（挿入配列リード）に変換した。図３６に示されているように、本発明者らのＲＮＡ−ｓｅｑデータと一致して、これらの研究は、ＴＡｇエキソン１−イントロンアクセプターを対象にするＡＯＮが、このスプライス部位に対する使用またはアクセスに影響することを示唆する。本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮ、特にＨＹＢ＿０１は、生成されるＴＡｇのレベルを低下させ（左のパネル；左のバー）、スモールｔ抗原およびスプライシングされていないラージＴ抗原を高レベルにシフトさせる（左のパネル；それぞれ中央および右のバー）。さらに、そのデータは、短縮型Ｔ抗原スプライシングのＡＯＮ媒介性調節に対するさらなる裏付けを提供する（右のパネル）。
【０２０７】
エキソン１−イントロンジャンクションにおけるＴＡｇスプライシングの調節における本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮの本明細書中で示される有効性が、（選択的）潜在スプライスドナー部位の使用をもたらし得ることに注意することが重要である。上流の潜在スプライス部位（エキソン１のコード配列部分）または下流の潜在スプライス部位（エキソン２の前のイントロン部分）の使用の可能性は、通常は中途終止コドンの導入をもたらすフレームシフトしたｍＲＮＡをもたらし得る。これらの異常な転写物は、ナンセンス変異依存分解機構によって細胞内で速やかに分解され得ることが立証されている（Ｈｕｇ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６）。重要なことに、おそらく、この迅速な処理のおかげで、これらの異常な形態の転写物の大部分が検出されない。
【０２０８】
それにもかかわらず、残りのＴＡｇ転写物の本発明者らの定量的および定性的な解析は、本発明者らのＢＫＶ標的化ＡＯＮが、ＴＡｇ  ｍＲＮＡレベルの著しい低下を誘発し、同時に、プレｍＲＮＡスプライシングの結果として形成されるｍＲＮＡのバランスに影響することを明らかに示唆する。これらのデータは、ＴＡｇの発現とスプライシングとの二重調節を、ＢＫＶの粒子産生および感染性を減弱させる強力な手段として意味づける。
【０２０９】
（ＢＫＶ標的化ＡＯＮのインビボでの取り込み）
ＢＫＶ標的化ＡＯＮについてインビトロで生成された本発明者らのデータは、アンチセンスオリゴヌクレオチド内の各ヌクレオチド上のリボース糖の２’−Ｏメチル（２’−ＯＭｅ）修飾を含むように化学的に改変された。重要なことには、インビボにおけるＡＯＮの取り込みは、２’ヒドロキシ基が２’−メトキシ（２’−ＭＯＥ）基で置換されている場合、顕著に改善されると一貫して見出された。ゆえに、本発明者らは、本発明者らのリード化合物であるＨＹＢ＿０１を、全体がホスホロチオエート骨格を有し、かつ２’−ＭＯＥ基を有するように改変し、このＡＯＮを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに尾静脈を通じて静脈内注射した。注射の２４時間後、マウスを屠殺し、腎臓、肝臓、脾臓、脳および筋肉を回収し、切片にした。図４４および図４５の免疫組織化学染色に示されているように、ＨＹＢ＿０１は、腎皮質、特に腎臓の近位尿細管上皮細胞において優れた取り込みを示した（腎臓のシカクマメレクチン（ＬＴＬ）陽性細胞における取り込みによって証明されるように）。さらに、ＨＹＢ＿０１は、肝臓のクッパー細胞においても検出可能であったが、脳では検出不可能であった（図４５を参照のこと）。さらに、それらのＡＯＮは、脾臓の白脾髄において検出可能であったが、心臓では最小限度にしか検出可能でなく、筋肉では検出不可能であった（データ示さず）。
【０２１０】
（他のポリオーマウイルスに対するＴＡｇスプライシング標的化ＡＯＮ）
ＪＣウイルス（ＪＣＶ）は、ヒト腎臓の近位尿細管上皮細胞に感染すると立証されているにもかかわらず、本発明者らは、これを達成するように繰り返し試みたが成功しなかった。ゆえに、本発明者らは、ＪＣウイルスに感受性であると知られていて、ＪＣＶ関連の病態生理の発生において役割を果たすと知られている他のヒト細胞、すなわちアストロサイトに感染させることにした。これらの研究のために、本発明者らは、ヒト人工多能性幹細胞由来のアストロサイトまたはヒト初代アストロサイト細胞株を、本発明者らの５つのＪＣＶ標的化ＡＯＮのうちの１つ（図３７）、すなわちＨＹＢ＿１５〜１９で前処置し（ＡＯＮ１つあたり５０ｎＭの濃度で４時間）、続いて、それらの細胞にＪＣＶを１０４．５ＴＣＩＤ５０／０．２ｍＬ（感染の７日後の、Ｃｏｓ−７細胞の感染に基づく、サプライヤーが提供する情報）の力価で一晩感染させた。図３８および３９に示されているように、ＢＫＶ  ＴＡｇのエキソン１−イントロンジャンクションの標的化によって、ＴＡｇおよびＶＰ１のｍＲＮＡ発現レベルが低下したという本発明者らの観察結果と一致して、ＨＹＢ＿１５、ＨＹＢ＿１６およびＨＹＢ＿１７は、ｉＰＳ細胞由来のアストロサイトにおいてＪＣＶ  ＴＡｇとＶＰ１の両方のｍＲＮＡ発現レベルを著しく低下させた（ｎ＝１）。さらに、初代ヒトアストロサイトにおいても、本発明者らは、様々な力価のＪＣＶ投与において、ＪＣＶ  ＴＡｇおよびＶＰ１のｍＲＮＡ発現レベルの著しい低下を観察した（図４０および４１；ｎ＝２）。
【０２１１】
【表７】
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【図１−１】
2021524730.tif 000009
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2021524730.tif 000049
【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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