(57)【要約】  本発明は、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）及びガレクチン−１（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）を標的とする二重標的抗体及びそれを含む血管新生関連疾患の予防または治療用組成物に関する。本発明は、新生血管形成に関与するＳＣＦ及びガレクチン−１を同時に中和させることで新生血管生成を効果的に阻害できるヒト単一クローン抗体由来二重標的抗体と、前記抗体を含む血管新生関連疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。本発明に係る二重標的抗体は、新生血管形成に関与する二つの標的を同時に中和させることで、非正常な血管新生で血管が変化して透過性が増加することで出血を起こす血管新生関連疾患を効果的に予防または治療できる。
2021500928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）及びガレクチン−１（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）に特異的に結合する二重標的抗体であって、
配列番号１のアミノ酸配列で表示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列で表示される軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列で表示される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；及び、配列番号４のアミノ酸配列で表示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列で表示される重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列で表示される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことを特徴とする二重標的抗体。
【請求項２】
前記抗体は、配列番号７のアミノ酸配列で表示される軽鎖可変領域または配列番号８のアミノ酸配列で表示される重鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重標的抗体。
【請求項３】
前記抗体は、配列番号９のアミノ酸配列で表示されることを特徴とする、請求項１に記載の二重標的抗体。
【請求項４】
前記抗体は、ヒトＩｇＧ１由来不変領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重標的抗体。
【請求項５】
配列番号１で表示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表示される軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３で表示される軽鎖ＣＤＲ３をそれぞれコーディングする配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の塩基配列を含む軽鎖可変領域をコーディングするＤＮＡ；及び、配列番号４で表示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表示される重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６で表示される重鎖ＣＤＲ３をそれぞれコーディングする配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の塩基配列を含む重鎖可変領域をコーディングするＤＮＡ；を含むことを特徴とするＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体をコーディングするＤＮＡ。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域をコーディングするＤＮＡは、配列番号１６で表示されることを特徴とする、請求項５に記載の二重標的抗体をコーディングするＤＮＡ。
【請求項７】
前記重鎖可変領域をコーディングするＤＮＡは、配列番号１７で表示されることを特徴とする、請求項５に記載の二重標的抗体をコーディングするＤＮＡ。
【請求項８】
前記二重標的抗体をコーディングするＤＮＡは、配列番号１８で表示されることを特徴とする、請求項５に記載の二重標的抗体をコーディングするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項５乃至８のいずれか一項のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９のベクターで形質転換された細胞。
【請求項１１】
前記細胞は、バクテリアまたは動物細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１のＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を含む血管新生関連疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１３】
前記血管新生関連疾患は、眼血管関連疾患、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、腫瘍（ｃａｎｃｅｒ）、腫瘍転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、慢性創傷（ｄｅｌａｙｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）、慢性炎症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、狭窄症（ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、血管奇形（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、血液透析と関連した血管通路狭窄（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ）、移植後動脈病症（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）、血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、ディジョージ症候群（ＤｉＧｅｏｒｇｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、遺伝性出血性毛細血管拡張症（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、海綿状血管腫（Ｃａｖｅｒｎｏｕｓ  Ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ケロイド性瘢痕（ｋｅｌｏｉｄ  ｓｃａｒ）、化膿性肉芽腫（ｐｙｏｇｅｎｉｃ  ｇｒａｎｕｌｏｍａ）、水疱疾患（ｂｌｉｓｔｅｒ）、カポジ肉腫（ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、増殖性硝子体網膜症（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、原発性肺高血圧症（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、鼻ポリープ（ｎａｓａｌ  ｐｏｌｙｐｓ）、炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、歯周疾患（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、腹膜癒着（Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）、子宮内膜症（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ）、子宮出血（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、卵巣嚢腫（ｏｖａｒｉａｎ  ｃｙｓｔ）、卵巣過剰刺激症候群（Ｏｖａｒｉａｎ  Ｈｙｐｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、滑膜炎（ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ）、骨髄炎（ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、骨増殖（ｏｓｔｅｏｐｈｙｍａ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、感染性疾患（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）及び自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択されたものである、請求項１２に記載の血
管新生関連疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１４】
前記眼血管関連疾患は、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、加齢黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、緑内障性網膜色素変性（ｇｌａｕｃｏｍａ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、角膜異栄養症（ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、網膜層間分離（ｒｅｔｉｎｏｓｃｈｉｓｅｓ）の中から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の血管新生関連疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
前記二重標的抗体は、新生血管生成を阻害するものである、請求項１２に記載の血管新生関連疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１のＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を、それを必要とする個体に投与するステップ；を含む血管新生関連疾患の予防または治療方法。
【請求項１７】
請求項１のＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を含むＳＣＦ及びガレクチン−１の同時検出用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）及びガレクチン−１（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）を標的とする二重標的抗体及びそれを含む血管新生関連疾患の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＣＦ（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）は、血液細胞、精子、メラニン細胞の分化に深く関与する因子と知られている。主に線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）と内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）で生産され、低酸素症（ｈｙｐｏｘｉａ）状態で発現及び分泌が増加することで血管新生を促進するものと知られている。また、ガレクチン−１（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）は、低酸素症（ｈｙｐｏｘｉａ）状況で分泌されて血管形成を調節する代表的なタンパク質であるＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、血管内皮細胞成長因子）受容体に結合して血管形成を誘導する因子であり、ＶＥＧＦを抑制しても新たなリガンドであるガレクチン−１により血管が誘導されるものと知られている。
【０００３】
血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、体内の血管生成因子により既に存在する既存の血管から新たな微細血管が生成されることを意味する。細胞がある程度成長をすると、血管生成を刺激する物質を分泌し、逆に過度に多く分泌されると、それを抑制する物質を分泌する。フィードバックを利用して血管生成のバランスを維持するようになる。
【０００４】
大人の大半の血管はほとんど分裂せず、正常な血管新生は、ごく稀に起こる。非正常な血管新生は、血管が変化して透過性が増加することで出血を生じる疾病を引き起こす。その例として、加齢黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、緑内障性網膜色素変性（ｇｌａｕｃｏｍａ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、角膜異栄養症（ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、網膜層間分離（ｒｅｔｉｎｏｓｃｈｉｓｅｓ）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、腫瘍転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、慢性創傷（ｄｅｌａｙｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）等の疾患が発生する。
【０００５】
特に、前記疾病のうち角膜での新生血管生成は、眼球の透明性を阻害して視力の損失をもたらし、網膜での新生血管生成は、非正常な血管が生成されることで血液の滲出現象が起こり、網膜細胞の変性を通した失明を誘導する。従って、目での新生血管生成は、好ましい現象ではなく、最大限抑制されることが好ましく、このように非正常な血管新生に起因した疾病は、新生血管を抑制して初めて該当疾患の治療効果を高めることができる。
【０００６】
このような理由で血管新生抑制剤を利用して血管新生関連疾病の治療に関する研究がなされており、血管内皮細胞の成長、移動、分化、毛細血管形成等のような血管形成過程に関与する多くの血管新生促進因子と血管新生抑制因子が見出された。血管新生抑制因子は、血管新生時に必要な血管新生促進因子の活性に反対して活性化される。体内に自然的に存在する血管新生抑制剤は、毒性が少なく、病理的な血管新生抑制に使用され得るので、それと関連した多くの薬物が開発中である。
【０００７】
本発明者らは、血管新生関連疾患の治療物質を見出すために鋭意努力した結果、ＳＣＦ（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）及びガレクチン−１が血管新生を促進するのに対し、ＳＣＦ及びガレクチン−１の発現を抑制する場合、新生血管発現が阻害されることを確認し、ＳＣＦ及びガレクチン−１を同時に中和させることのできる二重標的抗体を製造することで本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）及びガレクチン−１（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）に特異的に結合する二重標的抗体を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、ＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体をコーディングするＤＮＡを提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、前記ＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を含む血管新生関連疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、前記ＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を、それを必要とする個体に投与するステップ；を含む血管新生関連疾患の予防または治療方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のまた他の目的は、前記ＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を含むＳＣＦ及びガレクチン−１の同時検出用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記のような目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列で表示される軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列で表示される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；及び、配列番号４のアミノ酸配列で表示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列で表示される重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列で表示される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことを特徴とするＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）及びガレクチン−１（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）に特異的に結合する二重標的抗体を提供する。
【００１４】
また、本発明は、配列番号１で表示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表示される軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３で表示される軽鎖ＣＤＲ３をそれぞれコーディングする配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の塩基配列を含む軽鎖可変領域をコーディングするＤＮＡ；及び、配列番号４で表示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表示される重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６で表示される重鎖ＣＤＲ３をそれぞれコーディングする配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の塩基配列を含む重鎖可変領域をコーディングするＤＮＡ；を含むことを特徴とするＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体をコーディングするＤＮＡを提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクター及び前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記ＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を含む血管新生関連疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記ＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を、それを必要とする個体に投与するステップ；を含む血管新生関連疾患の予防または治療方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、前記ＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を含むＳＣＦ及びガレクチン−１の同時検出用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、新生血管形成に関与するＳＣＦ及びガレクチン−１を同時に中和させることで新生血管生成を効果的に阻害できるヒト単一クローン抗体由来二重標的抗体と、前記抗体を含む血管新生関連疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。本発明に係る二重標的抗体は、新生血管形成に関与する二つの標的を同時に中和させることで、非正常な血管新生で血管が変化して透過性が増加することで出血を起こす血管新生関連疾患を効果的に予防または治療できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】酵素免疫測定法を通して選択された計９種の単一クローン抗体３Ｃ６、３Ａ２、３Ｃ３、３Ａ４、３Ｅ７、３Ｃ８、３Ｃ４、３Ｆ７及び３Ｆ３を示した図である。
【図２】本発明の計９種の単一クローン抗体をＨＵＶＥＣ（血管内皮細胞）に処理して各抗体の血管内皮細胞のチューブ形成抑制能を確認した図である。
【図３】ＰＣＲにより増幅された３Ｃ４抗体可変部位のうち軽鎖ドメインのＤＮＡを１％アガロースゲルで電気泳動した結果を示した図である。
【図４】ＰＣＲにより増幅された３Ｃ４抗体可変部位のうち重鎖ドメインのＤＮＡを１％アガロースゲルで電気泳動した結果を示した図である。
【図５】３Ｃ４抗体軽鎖部位の塩基配列、アミノ酸配列及びそのＣＤＲ領域を示した図である。
【図６】３Ｃ４抗体重鎖部位の塩基配列、アミノ酸配列及びそのＣＤＲ領域を示した図である。
【図７】動物細胞株で発現されたヒト３Ｃ４抗体を分離精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示した図である。
【図８】本発明に係るヒト３Ｃ４抗体のＳＣＦ結合能を確認するためにＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を実施した結果を示した図である。
【図９】本発明に係るヒト３Ｃ４抗体の血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のチューブ形成抑制能を確認した図である。
【図１０】本発明に係るヒト３Ｃ４抗体のｃ−ｋｉｔリン酸化抑制効能分析結果を示した図である。
【図１１】本発明に係るヒト３Ｃ４抗体を用いたタンパク質マイクロアレイ分析結果を示した図である。
【図１２】ヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−１遺伝子を大腸菌で過発現させた後、分離精製した結果を示した図である。
【図１３】本発明に係るヒト３Ｃ４抗体のｇａｌｅｃｔｉｎ−１結合能を確認するためにＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）を実施した結果を示した図である。
【図１４】本発明に係るヒト３Ｃ４抗体の血管内皮細胞のチューブ形成抑制能を確認した図である。
【図１５】本発明に係るヒト３Ｃ４抗体のｇａｌｅｃｔｉｎ−１（Ａ）及びＳＣＦ（Ｂ）による細胞増殖抑制能を確認した図である。
【図１６】本発明に係るヒト３Ｃ４抗体と市販中のＳＣＦ抗体の中和能を比較するために各抗体の血管内皮細胞のチューブ形成抑制能を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書において別に定義されていない用語は、本発明の属する技術の分野において通常使用される意味を有するものである。
【００２２】
本発明者らは、血管新生関連疾患において新生血管生成を阻害して前記疾患を効果的に予防または治療できる二重標的抗体を最初に生産した。
【００２３】
前記二重標的抗体の場合、二つの信号を同時に抑制または増幅させることができるため、一つの信号を抑制／増幅する場合よりさらに効果的であり得、それぞれの信号をそれぞれの信号抑制剤で処理する場合と比較すると、低用量投薬が可能であり、同じ時間及び空間での二つの信号を抑制／増幅させることができる長所がある。
【００２４】
本発明において、二重標的抗体は、「多クローン」または「単クローン」抗体であってよいが、単クローン抗体がより好ましい。単クローン抗体は、実質的に均質な抗体集団から収得された抗体をいうが、即ち、このような集団を構成する個々の抗体は、少量で存在することもある可能な自然発生突然変異を除いては同一である。単クローン抗体は、単一抗原性部位に対して高度に特異的である。さらに、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む多クローン抗体とは反対に、それぞれの単クローン抗体は、抗原上の単一エピトープに対して誘導される。単クローンは任意の特定の方法で抗体を生成することを必要とするという意味に解釈されてはならない。例えば、本発明において有用な単クローン抗体は、文献［Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６:４９５（１９７５）］に記載のハイブリドーマ方法で製造するか、組換えＤＮＡ方法［米国特許第４，８１６，５６７号参照］で製造できる。また、単クローン抗体は、例えば、文献［Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）］に記載の技術を利用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００２５】
一様態として、本発明は、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）及びガレクチン−１（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）に特異的に結合する二重標的抗体であって、配列番号１のアミノ酸配列で表示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列で表示される軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列で表示される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；及び、配列番号４のアミノ酸配列で表示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列で表示される重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸配列で表示される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことを特徴とする二重標的抗体を提供する。
【００２６】
本明細書において、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、完全な抗体形態だけではなく、抗体分子の抗原結合断片を含む。
【００２７】
完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｏｎｓｉｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｊ．，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４５，ｐｐ．４１−５０，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９１）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，ｐｐ．４５−６５，ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４））。
【００２８】
本明細書において、用語「抗原結合断片」は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ等を含む。抗体断片のうちＦａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の第一の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなして生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位だけを有している最小の抗体断片であり、二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、一般にペプチドリンカーを通して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されるか、またはＣ−末端ですぐ連結されているので二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、または遺伝子組換え技術を通して作製できる。
【００２９】
本発明において、抗体は、Ｆａｂ形態または完全な抗体形態である。また、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはエプシロン（ε）のうちのいずれか一つのイソタイプから選択され得る。軽鎖不変領域は、カッパまたはラムダ型であってよく、本発明の一具現例によれば、カッパ型である。
【００３０】
本明細書において、用語「重鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片をいずれも意味する。また、本明細書において、用語「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片をいずれも意味する。
【００３１】
本明細書において、用語「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））。重鎖及び軽鎖には、それぞれ３個のＣＤＲ（重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３））が含まれている。ＣＤＲは、抗原の認識に関与する環状の部位であって、抗体が抗原またはエピトープに結合するにあたって主要な接触残基を提供し、この部位の配列が変わることで抗体の抗原に対する特異性が決定される重要な部位である。
【００３２】
本発明において、用語「フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）」とは、抗体の可変領域を構成する構成要素であって、前記ＣＤＲの間に位置してＣＤＲの環構造を支持する役割を果たす部位を意味する。
【００３３】
本発明において、「ＳＣＦ及びガレクチン−１（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）に特異的に結合する二重標的抗体」は、「抗−ＳＣＦ抗体」または「二重標的抗体」と相互交換的に使用され得る。
【００３４】
本発明において、前記抗体は、配列番号７のアミノ酸配列で表示される軽鎖可変領域または配列番号８のアミノ酸配列で表示される重鎖可変領域を含むことができる。
【００３５】
また、本発明において、前記抗体は、配列番号９のアミノ酸配列で表示されることを特徴とし得る。
【００３６】
本発明の二重標的抗体またはその抗原結合断片は、ＳＣＦ及びガレクチン−１を特異的に認識できる範囲内で添付した配列目録に記載のアミノ酸配列の変異体を含むことができる。例えば、抗体の結合親和度および／またはその他の生物学的特性を改善させるために抗体のアミノ酸配列に変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入および／または置換を含む。
【００３７】
このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシンとヒスチジンは、いずれも正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンとセリンは、類似した大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、類似した形状を有するということが分かる。従って、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、生物学的に機能均等物といえる。
【００３８】
変異を導入するにあたって、アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。それぞれのアミノ酸は、疎水性と電荷によって疎水性インデックスが付与されている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００３９】
タンパク質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を付与するにあたって、疎水性アミノ酸インデックスは非常に重要である。類似した疎水性インデックスを有するアミノ酸に置換して初めて類似した生物学的活性を保有できるということは公知になった事実である。疎水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらにより好ましくは±０．５以内の疎水性インデックス差を示すアミノ酸の間で置換をする。
【００４０】
一方、類似した親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸の間の置換が均等な生物学的活性を有するタンパク質を招くということもよく知られており、次の親水性値がそれぞれのアミノ酸残基に付与されている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００４１】
親水性値を参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらにより好ましくは±０．５以内の親水性値差を示すアミノ酸の間で置換をする。
【００４２】
また、分子の活性を全体的に変更させないタンパク質でのアミノ酸交換は、当該分野に公知になっている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も通常起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
【００４３】
また、本発明において、本発明のＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体は、ヒトＩｇＧ１由来不変領域を含むことを特徴とし得る。本発明の一具現例によれば、本発明は、上記した軽鎖可変部位及び重鎖可変部位にさらにヒトＩｇＧ１由来不変領域を含む二重標的抗体である３Ｃ４抗体を提供する。
【００４４】
本発明の二重標的抗体は、「ヒト化抗体」であることが好ましい。ヒト化抗体とは、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を保有する抗体の配列を変更させることで一部または全体がヒト抗体生殖細胞系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）から誘導されたアミノ酸配列で構成された抗体を意味する。より好ましくは、本発明の抗体は、「ヒト抗体」であってよい。本発明において、用語「ヒト抗体（ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、広範囲にはヒトの免疫グロブリンから由来した可変領域（ＣＤＲ及びＦＲ）を含む抗体を意味し、より狭い範囲ではヒトの免疫グロブリンから由来した可変領域及び不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む抗体を意味する。前記ヒト抗体は、全体抗体（ｗｈｏｌｅ）形態であるだけではなく、抗体分子の機能的な断片を含むことができる。ヒト抗体は、当業界に知られた多様な技術を利用して製造できる。
【００４５】
前記ヒト抗体は、全ての構成要素がヒトから由来したため、既存のヒト化抗体またはマウス抗体に比して免疫化反応が起こる確率が少なく、ヒトに投与した場合、所望しない免疫反応が起こらない長所があるので、ヒトを対象とする治療用抗体として非常に有用に使用され得る。
【００４６】
本発明の目的上、前記ヒト抗体は、発明のＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体として見なされ得、前記ヒト抗体は、ＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合してＳＣＦ及びガレクチン−１により誘導される新生血管発現を顕著に阻害させる機能を果たすものとも見なされ得るが、特にこれに制限されることはない。
【００４７】
併せて、前記ヒト抗体は、特にこれに制限されないが、投与された生体内での滞留時間を増進させるために、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）および／またはペギル化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）され得る。
【００４８】
本発明の用語「糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」は、グリコシル基をタンパク質に転位させる加工方法を意味する。前記糖化は、グリコシル伝達酵素によりグリコシル基が標的タンパク質のセリン、トレオニン、アスパラギンまたはヒドロキシリシン残基に結合されて遂行されるが、前記糖化されたタンパク質は、生体組織の構成物質として使用され得るだけではなく、細胞表面で細胞認識にも重要な役割を果たす。従って、本発明においては、ヒト抗体の糖化または前記糖化のパターンを変化させてヒト抗体の効果を向上させることができる。
【００４９】
本発明の用語「ペギル化（ＰＥＧｌａｔｉｏｎ）」は、前記ヒト抗体にポリエチレングリコールを導入することで、前記ヒト抗体の血中滞留時間を向上させる加工方法を意味する（Ａｎｎａ  Ｍ．Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３（９）：１１３７−１１４６，２００５；Ｄａｖｉｄ  Ｓｃｈｒａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５：１４７−１５９，２００６；Ａｌａｉｎ  Ｂｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０：３４５−３５２，２０１０）。具体的に、ポリエチレングリコールで高分子ナノ粒子をペギル化することにより、ナノ粒子の表面の親水性が増加し、病原菌、老廃物及び外部流入物質を捕食して消化させる人体内の貪食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）等を含む免疫機能からの認識を防止するいわゆるステルス効果（ｓｔｅａｌｔｈ  ｅｆｆｅｃｔ）を通した身体内での速い分解が防止され得る。従って、前記ペギル化によってヒト抗体の血中滞留時間が向上し得る。本発明において使用されるペギル化は、ヒアルロン酸のカルボキシルグループとポリエチレングリコールのアミングループの結合によりアミドグループを形成する方法で形成され得る。しかし、これに制限されず、多様な方法でペギル化を遂行することができる。このとき、使用されるポリエチレングリコールは、特にこれに制限されないが、好ましくは１００−１，０００の間の分子量を有し、線状または分枝状の構造を有するものを使用することが好ましい。
【００５０】
前記糖化および／またはペギル化は、本発明の抗体の機能を維持する限り、当業界の公知になった方法により多様な糖化および／またはペギル化パターンが変形され得、本発明のヒト抗体は、多様な糖化および／またはペギル化パターンが変形された変異ヒト抗体を全て含む。
【００５１】
また、本発明は、配列番号１で表示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表示される軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３で表示される軽鎖ＣＤＲ３をそれぞれコーディングする配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の塩基配列を含む軽鎖可変領域をコーディングするＤＮＡ；及び、配列番号４で表示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表示される重鎖ＣＤＲ２及び配列番号６で表示される重鎖ＣＤＲ３をそれぞれコーディングする配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の塩基配列を含む重鎖可変領域をコーディングするＤＮＡ；を含むことを特徴とするＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体をコーディングするＤＮＡを提供する。
【００５２】
本発明において、前記軽鎖可変領域をコーディングするＤＮＡは、配列番号１６で表示されることを特徴とし得る。
【００５３】
また、本発明において、前記重鎖可変領域をコーディングするＤＮＡは、配列番号１７で表示されることを特徴とし得る。
【００５４】
また、本発明において、前記二重標的抗体をコーディングするＤＮＡは、配列番号１８で表示されることを特徴とし得る。
【００５５】
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の抗体またはそれをコーディングする核酸分子は、配列目録に記載の配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、上記した本発明の配列と任意の他の配列を最大限対応するように整列（ａｌｉｇｎ）し、当業界において通常利用されるアルゴリズムを利用して整列された配列を分析した場合に、最小６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、さらにより好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のための整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）方法は、当業界に公知になっている。
【００５６】
本明細書において用語「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、そしてＲＮＡ分子を包括的に含む意味であり、核酸分子で基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけではなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）を含む。本発明の前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコーディングする核酸分子配列は変形され得る。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失または非保存的置換または保存的置換を含む。
【００５７】
本発明の二重標的抗体をコーディングする本発明の核酸分子は、上記したヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、上記した本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限対応するように整列し、当業界において通常利用されるアルゴリズムを利用して整列された配列を分析した場合に、８０％、９０％または９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
【００５８】
また、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクター及び前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００５９】
本明細書において、用語「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクター等を含む。
【００６０】
本発明のベクターで二重標的抗体をコーディングするＤＮＡは、プロモーターと作動可能に結合された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）ものであってよい。
【００６１】
本明細書において、用語「作動可能に結合された」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／または解毒を調節するようになる。
【００６２】
本発明の組換えベクターシステムは、当業界に公知になった多様な方法を通して構築され得、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築され得る。また、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築され得る。
【００６３】
一方、本発明の発現ベクターは、選択標識として、当業界において通常利用される抗生物質耐性遺伝子を含むことができ、前記抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンのうち選択された一つ以上であってよい。
【００６４】
また、本発明において、前記細胞は、バクテリアまたは動物細胞であってよい。
【００６５】
前記ベクターで形質転換された細胞は、本発明のベクターを安定に、かつ連続的にクローニング及び発現させることのできる宿主細胞であり、当業界に公知になっているいかなる宿主細胞も利用できる。例えば、前記ベクターの適した真核細胞宿主細胞は、サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ  ７８細胞及びＨＥＫ−２９３細胞であってよく、好ましくはＣＨＯ細胞であってよいが、これに限定されない。
【００６６】
また、本発明は、本発明のＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を含む血管新生関連疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００６７】
本発明の薬学的組成物は、上述した本発明の二重標的抗体またはその抗原結合断片を有効成分として利用するため、この二つの間に共通した内容は、繰り返し記載による本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００６８】
本発明において、前記血管新生関連疾患は、血管の生成から引き起こされる疾患を意味する。本発明の血管新生関連疾患は、眼血管関連疾患、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、腫瘍（ｃａｎｃｅｒ）、腫瘍転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、慢性創傷（ｄｅｌａｙｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）、慢性炎症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、狭窄症（ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、血管奇形（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、血液透析と関連した血管通路狭窄（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ）、移植後動脈病症（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）、血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、ディジョージ症候群（ＤｉＧｅｏｒｇｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、遺伝性出血性毛細血管拡張症（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、海綿状血管腫（Ｃａｖｅｒｎｏｕｓ  Ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ケロイド性瘢痕（ｋｅｌｏｉｄ  ｓｃａｒ）、化膿性肉芽腫（ｐｙｏｇｅｎｉｃ  ｇｒａｎｕｌｏｍａ）、水疱疾患（ｂｌｉｓｔｅｒ）、カポジ肉腫（ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、増殖性硝子体網膜症（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、原発性肺高血圧症（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、鼻ポリープ（ｎａｓａｌ  ｐｏｌｙｐｓ）、炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、歯周疾患（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、腹膜癒着（Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）、子宮内膜症（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ）、子宮出血（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、卵巣嚢腫（ｏｖａｒｉａｎ  ｃｙｓｔ）、卵巣過剰刺激症候群（Ｏｖａｒｉａｎ  Ｈｙｐｅｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、滑膜炎（ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ）、骨髄炎（ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、骨増殖（ｏｓｔｅｏｐｈｙｍａ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、感染性疾患（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）及び自己免疫疾患（ａｕｔ
ｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）等を含み、好ましくは眼血管関連疾患であってよいが、必ずしもこれに制限されるものではない。
【００６９】
また、本発明において、前記眼血管関連疾患は、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、加齢黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、緑内障性網膜色素変性（ｇｌａｕｃｏｍａ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、角膜異栄養症（ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）及び網膜層間分離（ｒｅｔｉｎｏｓｃｈｉｓｅｓ）であってよく、好ましくは加齢黄斑変性または糖尿病性網膜症であってよい。
【００７０】
下記実施例において立証したように、本発明の二重標的抗体は、血管内皮細胞の新生血管形成を阻害でき、血管新生関連疾患の予防または治療に効果的である。
【００７１】
本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイル等を含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤等をさらに含むことができる。適した薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００７２】
本発明の薬学的組成物は、非経口で投与でき、例えば、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与等で投与できる。
【００７３】
本発明の薬学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因により多様であり、普通に熟練した医師は所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。例えば、本発明の薬学的組成物の１日投与量は、０．０００１−１００ｍｇ／ｋｇであってよい。本明細書において用語「薬学的有効量」は、血管新生関連疾患を予防または治療するのに十分な量を意味する。
【００７４】
本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法に従って、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を利用して製剤化することで単位容量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造され得る。このとき、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００７５】
また、本発明の薬学的組成物は、ＶＥＧＦをターゲットする他の治療剤と並行または混合して使用することができ、これによって非正常な新生血管形成のより効果的な抑制のような相乗作用が存在し得る。前記ＶＥＧＦをターゲットする治療剤は、好ましくはアイリーア（ｅｙｌｅａ、Ａａｆｉｂｅｒｃｅｐｔ）またはルセンティス（ｌｕｃｅｎｔｉｓ、Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）であってよいが、これに制限されるものではない。
【００７６】
また、本発明は、本発明に係るＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を、それを必要とする個体に投与するステップ；を含む血管新生関連疾患の予防または治療方法を提供する。
【００７７】
前記個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、ヒトを含む哺乳類であることが好ましく、血管新生関連疾患の治療を必要とする患者で、血管新生関連疾患の治療中である患者、血管新生関連疾患の治療を受けたことのある患者、血管新生関連疾患の治療を受ける必要がある患者を全て含み、血管新生関連疾患の治療のために外科的手術を施行した患者もまた含まれ得る。本発明に係る薬学的組成物を個体に投与することで、血管新生関連疾患を緩和または治療できる。
【００７８】
本明細書において、用語「緩和」は、本発明に係る薬学的組成物の投与で血管新生関連疾患が好転するか有益になる全ての行為をいう。前記本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。
【００７９】
本明細書において、用語「投与」は、ある適切な方法で対象に本発明の薬学的組成物を導入することをいい、投与経路は、目的組織に達することができる限り、経口または非経口の多様な経路を通して投与され得る。
【００８０】
また、本発明に係るＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を含む血管新生関連疾患の予防または治療用薬学的組成物は、この他、既存の血管新生関連疾患の治療のための薬物または治療方法と併用して同時に／順次に処理され得る。このような投与は、単一または多重投与であってよい。前記要素を全て考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることのできる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定され得る。
【００８１】
また、本発明は、本発明に係るＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を、それを必要とする個体に投与するステップ；を含む新生血管生成阻害方法を提供する。
【００８２】
具体的に、前記方法は、ＳＣＦだけではなく、ガレクチン−１を同時に中和させることで、ＳＣＦ及びガレクチン−１により誘導される新生血管生成を抑制する方法に関するものである。前記方法は、ＳＣＦによるｃ−ｋｉｔリン酸化を抑制し、下位（ｄｏｗｎ−ｓｔｒｅａｍ）信号伝達経路であるＡＫＴ及びＥＲＫのリン酸化を抑制して、ＳＣＦ及びガレクチン−１により誘導される血管内皮細胞のチューブ形成を効果的に抑制する方法であり得る。
【００８３】
また、本発明は、本発明に係るＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合する二重標的抗体を含むＳＣＦ及びガレクチン−１の同時検出用組成物及び前記組成物を含むキットを提供する。
【００８４】
本発明の検出用組成物及びキットは、上述した本発明の二重標的抗体またはその抗原結合断片を含み、ＳＣＦ及びガレクチン−１に特異的に結合し、その同時検出が可能である。
【００８５】
本発明の検出用組成物及びキットは、抗体を含むため、基本的に多様な免疫分析（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）または免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）に適するように作製され得る。前記免疫分析または免疫染色は、放射能免疫分析、放射能免疫沈殿、免疫沈殿、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、キャプチャー−ＥＬＩＳＡ、抑制または競争分析、サンドイッチ分析、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色及び免疫親和性精製を含むが、これに限定されるものではない。
【００８６】
本発明の検出用組成物及びキットに適用され得る試料は、細胞、組織または組織−由来抽出物、破砕物（ｌｙｓａｔｅ）または精製物、血液、血漿、血清、リンパまたは腹水を含むが、これに制限されるものではない。
【発明の実施のための形態】
【００８７】
以下、本発明の理解を助けるために、好ましい実施例を通して具体的に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の内容が限定されるものではない。
【００８８】
実施例１．ＳＣＦ及びＧａｌｅｃｔｉｎ−１を標的する二重標的抗体生成細胞株の作製
１−１．マウスの免疫化
Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購買した組換えＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）タンパク質（ｃａｔ＃  ７４６６−ＳＣ）５０ｕｇを同じ体積の完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と混合してエマルションを製造した（マウス１匹基準）。エマルションを７週齢の雌ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋細胞注射で作製されたヒト化ＮＳＧマウス４匹の腹腔内に注入した。以後、抗原５０μｇを総体積５００μｌでそれぞれのマウスに注入して抗体生成を誘導した。それから１週及び２週経過後、それぞれ不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と抗原を混合したエマルションをマウスの腹腔内にさらに注入した。
【００８９】
１−２．抗体−生成細胞の確認及び選別
前記方法を通して免疫化されたマウスの眼球から血液を採取し、１．５ｍｌ微細遠心分離チューブに入れて１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を分離し、抗体生成を確認する実験を実施するまで−２０℃で保管した。抗原タンパク質を利用した酵素免疫測定法を実施して抗体生成の有無を確認した後、細胞融合３日前にもう一度不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と抗原を混合したエマルションをマウスの腹腔内に注入した。
【００９０】
１−３．ハイブリドーマの製造
抗体生成を確認した後、マウスを犠牲にさせて脾臓細胞を分離し、骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）と融合させてハイブリドーマを製造した。
【００９１】
まず、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を使用して培養プレート内でマウスのＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を培養した。細胞融合を実施するために、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）で２回洗滌し、１×１０７細胞濃度となるように調整した。マウスを頚椎脱臼により犠牲にさせて脾臓を採取した後、メッシュ容器（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）に入れて細胞を分離した。脾臓細胞の懸濁液を製造した後、懸濁液を遠心分離を利用して洗滌した。脾臓細胞溶液をトリス−ＮＨ４Ｃｌ（トリス２０．６ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ８．３ｇ／Ｌ）に露出させて赤血球細胞を溶解した。完全に分離された抗体生成細胞を４００×ｇで５分間遠心分離した後、無血清培地で２回洗滌し、１０ｍｌ培地で再懸濁させた。血球計を利用してリンパ細胞を計数し、リンパ球１×１０８を無血清培地内でＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞１×１０（１０：１）と混合した。遠心分離は、４００×ｇで５分間実施した。以後、３７℃で温められた５０％（Ｍ／Ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ））溶液１ｍｌを１分間ゆっくり添加して混合した。
【００９２】
前記で製造した融合混合溶液を無血清ＲＰＭＩ１６４０で希釈し、４００×ｇで３分間遠心分離した。細胞を２０％ウシ胎児血清及びＨＡＴ（１００ｕＭヒポキサンチン、０．４ｕＭアミノプテリン、１６ｕＭチミジン）を補充したＲＰＭＩ１６４０選択培地３５ｍｌで懸濁した。懸濁液１００ｕｌを１日前にフィーダー細胞（ＲＰＭＩ１６４０を使用した腹腔から分離された大食細胞）をコーティングした９６−ウェルプレートにローディングし、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。５日後、ＨＡＴ培地は２−３日おきに取り替え、細胞を１４日間培養した。１４日後、２０％ウシ胎児血清及びＨＴ（ＨＡＴから０．４ｕＭアミノプテリンを除去した培地）補充したＲＰＭＩ１６４０培地を取り替えて２次培養した。このようにＳＣＦを免疫注射したリンパ節から分離したリンパ球を骨髄腫細胞と融合して得たハイブリドーマコロニーの上層液を使用して、以後、実験に使用した。
【００９３】
１−４．抗体生成融合細胞の選択及び分離
実施例１−３で製造したハイブリドーマコロニーの上層液を収集し、酵素免疫測定法を実施して、前記製造された抗原に特異的な抗体の製造を確認した。陰性対照群に比して４倍以上の適正濃度を示した融合細胞の培養液を選択し、２４−ウェル培養プレートに移して培養した。さらに９６−ウェルプレートに１ウェル当たり１個の細胞が入るように希釈して（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）培養した後、培養液を回収した。以後、９６−ウェルプレートに抗原として使用したＳＣＦタンパク質を１ウェル当たり０．１ｕｇでコーティングした後、酵素免疫測定法を実施した。その結果、４５０ｎｍ波長で吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ  ｖａｌｕｅ）を測定して最終的に９個の単クローン抗体（３Ｃ６、３Ａ２、３Ｃ３、３Ａ４、３Ｅ７、３Ｃ８、３Ｃ４、３Ｆ７及び３Ｆ３）を生産する融合細胞を選択した。これを図１に示した。
【００９４】
実施例２．二重標的抗体のＳＣＦ中和能決定
マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）３００ｕｌを１２−ウェルプレートに分注した後、ＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ）をＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）＋抗−ＳＣＦ抗体（１０ｕｇ／ｍｌ）を混ぜた後、マトリゲルに分注してｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＵＶＥＣのチューブ（ｔｕｂｅ）形成を観察した（ｎ＝１０）。その結果を図２に示した。
【００９５】
図２に示したように、９個の単クローン抗体のうち３Ｃ３及び３Ｃ４抗体が効果的にＳＣＦにより誘導されるＨＵＶＥＣのチューブ形成を抑制することを確認した。前記結果を通して、本発明の３Ｃ３及び３Ｃ４抗体は、新生血管生成を抑制して血管新生関連疾患の予防または治療に使用され得ることを確認した。
【００９６】
実施例３．ＩｇＧ可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）の塩基配列分析
３−１．融合細胞からｃＤＮＡ合成
実施例１及び２で得た融合細胞３Ｃ４クローン５×１０５個から全体ＲＮＡを分離し、それからＲａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ（ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）と逆転写酵素を利用して逆転写反応を実施した。
【００９７】
３−２．マウスＩｇＧ可変ドメインのＰＣＲ増幅
逆転写反応で得るようになったｃＤＮＡに対し、可変領域特異プライマーを使用して抗体の軽鎖及び重鎖の該当部位を増幅した。使用したプライマーを下記表１に示した。
【００９８】
【表１】
2021500928.tif 000003
【００９９】
まず、配列番号１、２で表示されるプライマーを利用してｃＤＮＡからカッパ軽鎖ドメインを増幅した。増幅されたＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動で確認し、その結果を図３に示した。また、配列番号３、４で表示されるプライマーを利用してｃＤＮＡからＩｇＧ１重鎖ドメインを増幅した。同様に、増幅されたＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動で確認し、その結果を図４に示した。
【０１００】
図３及び４に示したように、カッパ軽鎖ドメイン（４１４  ｂｐ）と重鎖ドメイン（４８３  ｂｐ）との間でバンドが見出され、予想された大きさのＰＣＲ産物が生成されることを確認した。陰性対照群として利用した他のＰＣＲでは、ＰＣＲ産物が現れなかった。
【０１０１】
以後、前記ＰＣＲ産物をアガロースゲルに展開してバンドを切断し、アガロースゲルを６０℃に溶かした後、スピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を利用してＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡをＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、大腸菌ＤＨ５ａに形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）させてコロニーを得た後、コロニーを培養してプラスミドを抽出後、再びＰＣＲを実施した結果、４個のプラスミドを得た後、３Ｃ４抗体の塩基配列分析を遂行した。塩基配列分析を通して同定された配列を表２に示した。一方、配列分析の結果、３Ｃ３クローンは、３Ｃ４クローンと同じ塩基配列を保有するものと確認された。３Ｃ４抗体の塩基配列、アミノ酸配列及びそのＣＤＲ領域を図５及び図６に示した。
【０１０２】
図５に示したように、３Ｃ４の軽鎖は、青色文字の順に軽鎖のＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号２）及びＣＤＲ３（配列番号３）を含み、図６に示したように、３Ｃ４の重鎖は、青色文字の順に重鎖のＣＤＲ１（配列番号４）、ＣＤＲ２（配列番号５）及びＣＤＲ３（配列番号６）を含む。
【０１０３】
また、３Ｃ４の軽鎖アミノ酸配列を配列番号７に、重鎖アミノ酸配列を配列番号８に示し、３Ｃ４の全体アミノ酸配列を配列番号９に示した。３Ｃ４の軽鎖（配列番号１６）及び重鎖（配列番号１７）塩基配列を表２に示し、３Ｃ４の全体塩基配列を配列番号１８に示した。
【０１０４】
【表２】
2021500928.tif 000004
2021500928.tif 000005
【０１０５】
実施例４．ヒト抗体クローニング
実施例３で得られた抗−ＳＣＦ抗体３Ｃ４（以下、３Ｃ４）の可変ドメインをヒトＦｃアミノ酸配列にｇｒａｆｔｉｎｇし、ｐＣＨＯ  ｖｅｃｔｏｒ（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）内にクローニングした。
【０１０６】
軽鎖可変ドメインは、ヒトカッパ不変領域に対するフレーム内に融合させ、重鎖可変ドメインは、ヒトＩｇＧ１不変領域に対するフレーム内に融合させた。全長ＩｇＧ１抗体の培地内分泌のためのリーダーペプチド配列を二つの遺伝子に添加して遺伝子を合成後、配列分析を通してもう一度検証した。ＣＨＯ細胞内で発現試験のために３個のクローンを選択した。３個のクローンに対するグリセロールストックを製造し、エンドトキシンのないプラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞内で発現試験するために製造した。
【０１０７】
実施例５．ＣＨＯ細胞に形質感染後、抗体の分離精製
実施例４で得たプラスミドＤＮＡをＣＨＯ−Ｓ細胞内に形質感染させた。形質感染の１週間前にＣＨＯ−Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０７４３−０２９）をＤＭＥＭ補充血清内の単層培養物内に移した。形質感染の１日前に細胞を分注した後、形質感染試料に対してＤＮＡ−リポフェクタミン複合体を準備した。一夜インキュベーターで５％ＣＯ２、３７℃で細胞をインキュベーションした後、培地を２−３日に一回ずつ添加しながら１週間培養した後、培養液を回収してＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ  ａｇａｒｏｓｅ（会社）に結合させた後、ＰＢＳで洗滌した。以後、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．８）で溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）した後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和させた。再びＰＢＳで透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）した後、−７０℃で保管した。その結果を図７に示した。
【０１０８】
図７に示したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、５０ｋＤａ程度の重鎖と２５ｋＤａ程度の軽鎖バンドが観察され、これを通して抗体が正確に合成されて生産されていることを確認した。
【０１０９】
実施例６．３Ｃ４抗体の親和力の検証
本発明の３Ｃ４抗体がＳＣＦに結合する能力を数値化を通して正確に確認するために、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、表面プラズモン共鳴）を実施した。ＳＲ７５００ＤＣ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、ＵＳＡ）を利用して、抗体の作製のために使用されたヒト抗原ＳＣＦタンパク質２０ｕｇをＰＥＧ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、ＵＳＡ）チップに固定した後、本発明の抗−ＳＣＦ抗体を濃度別に（０、７．８１２５ｎＭ、１５．６２５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１ｕＭ及び２ｕＭ）流した。ＳＣＦに対する親和度であるＫＤ値をＳｃｒｕｂｂｅｒ２プログラムを利用して分析した結果を図８に示した。ＫＤ値は、ｋｄ値をｋａ値で除した値であり、低いほど該当物質に対する結合能が大きい。
【０１１０】
図８に示したように、ＫＤ値は、約１８．８±２×１０−９Ｍと示され、本発明の３Ｃ４抗体は、ＳＣＦに対して強い親和度を示すことを確認した。
【０１１１】
実施例７．３Ｃ４抗体のＳＣＦによる血管形成誘導抑制能の再検証
マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）３００ｕｌを１２−ウェルプレートに分注した後、ＨＵＶＥＣをＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）＋３Ｃ４抗体（１０ｕｇ／ｍｌ）を混ぜた後、マトリゲル上に分注した。以後、ＨＵＶＥＣのチューブ形成を観察し（ｎ＝１０）、その結果を図９に示した。
【０１１２】
図９に示したように、本発明の３Ｃ４抗体は、ＳＣＦにより誘導されるＨＵＶＥＣのチューブ形成を効果的に抑制することを確認した。前記結果を通して、本発明の３Ｃ４抗体は、新生血管生成を抑制して血管新生関連疾患の予防または治療に有用に使用され得ることを確認した。
【０１１３】
実施例８．３Ｃ４抗体のＳＣＦによるｃ−ｋｉｔリン酸化抑制効能の分析
細胞６×１０４個を１２時間の間培養後、４時間の間血清枯渇させ、本発明の３Ｃ４抗体を１５分間前処理し、ＳＣＦを処理した後、細胞を収穫した。ウェスタンブロットを通したｃ−Ｋｉｔ発現を通して３Ｃ４抗体がＳＣＦによる信号伝達を効果的に抑制するか否かを分析した。その結果を図１０に示した。
【０１１４】
図１０に示したように、本発明の３Ｃ４抗体は、効果的にＳＣＦを中和することでＳＣＦによるｃ−ｋｉｔリン酸化を抑制するだけではなく、下位（ｄｏｗｎ−ｓｔｒｅａｍ）信号伝達経路にも影響を及ぼし、ＡＫＴ及びＥＲＫのリン酸化を抑制させることを確認した。
【０１１５】
実施例９．タンパク質マイクロアレイ分析を通したＳＣＦ及びＧａｌｅｃｔｉｎ−１に対する結合能の確認
ＨｕＰｒｏｔＴＭｖ３．１  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ＣＤＩ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）タンパク質チップを利用してタンパク質マイクロアレイ分析を遂行した。まず、タンパク質チップに２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０が含まれたＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）で常温で２時間ブロッキングした。ビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）された３Ｃ４抗体２ｕｇを２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０が含まれたＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）に溶かして４℃で８時間の間結合を誘導した後、ＰＢＳＴで３回洗滌した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ５３２ｎｍ）１ｕｇ（１８．９ｐｍｏｌ）をタンパク質チップにまき、４℃で１時間の間結合を誘導した後、再びＰＢＳＴで３回洗滌した。残ったバッファ液を完全に除去した後、タンパク質チップを−２０℃に凍らせ、ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）でスキャンした。その結果を図１１に示した。
【０１１６】
図１１に示したように、本発明の３Ｃ４抗体は、ＳＣＦの他にＧａｌｅｃｔｉｎ−１（ＬＧＡＬＳ１）に対しても高い結合力を示すことを確認した。
【０１１７】
実施例１０．３Ｃ４抗体のＧａｌｅｃｔｉｎ−１に対する親和力の検証
本発明の３Ｃ４抗体がｇａｌｅｃｔｉｎ−１に結合する能力を数値化を通して正確に確認するために、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、表面プラズモン共鳴）を実施した。まず、ヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−１（ＮＰ＿００２２９６．１）遺伝子をｐＥＴ−３ａのＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩにクローニングして大腸菌で過発現させた後、イオン−交換クロマトグラフィーで分離精製した後、ＰＢＳで透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）して−７０℃で保管した。精製されたサンプルを利用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを通してタンパク質がｇａｌｅｃｔｉｎ−１であるかを確認した。その結果を図１２に示した。
【０１１８】
その次に、ＳＲ７５００ＤＣ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、ＵＳＡ）を利用して、ヒト抗原ｇａｌｅｃｔｉｎ−１タンパク質２０ｕｇをＰＥＧ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、ＵＳＡ）チップに固定した後、本発明の３Ｃ４抗体を濃度別に（０、２３．４３７５ｎＭ、４６．８７５ｎＭ、９３．７５ｎＭ、１８７．５ｎＭ、３７５ｎＭ、７５０ｎＭ、１．５ｕＭ、３ｕＭ、及び６ｕＭ）流した。Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１に対する親和度であるＫＤ値をＳｃｒｕｂｂｅｒ２プログラムを利用して分析した結果を図１３に示した。
【０１１９】
図１３に示したように、ＫＤ値は、約４６．９±９×１０−９Ｍと示され、本発明の３Ｃ４抗体は、ＳＣＦだけではなく、ｇａｌｅｃｔｉｎ−１に対しても強い親和度を示すことを確認した。
【０１２０】
実施例１１．Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１による血管形成誘導抑制能の検証
マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）３００ｕｌを１２−ウェルプレートに分注した後、ＨＵＶＥＣをｇａｌｅｃｔｉｎ−１（５ｕｇ／ｍｌ）またはｇａｌｅｃｔｉｎ−１（５ｕｇ／ｍｌ）＋３Ｃ４抗体（５ｕｇ／ｍｌまたは１０ｕｇ／ｍｌ）を混ぜた後、マトリゲル上に分注した。以後、ＨＵＶＥＣのチューブ形成を観察し（ｎ＝１０）、その結果を図１４に示した。
【０１２１】
図１４に示したように、本発明の３Ｃ４抗体は、ｇａｌｅｃｔｉｎ−１により誘導されるＨＵＶＥＣのチューブ形成を効果的に抑制することを確認した。前記結果を通して、本発明の３Ｃ４抗体は二重標的抗体であって、ＳＣＦだけではなく、ｇａｌｅｃｔｉｎ−１により誘導される新生血管生成を抑制して血管新生関連疾患の予防または治療に有用に使用され得ることを確認した。
【０１２２】
実施例１２．ＳＣＦ及びｇａｌｅｃｔｉｎ−１による細胞増殖抑制能の検証
５×１０３個のＨＵＶＥＣ細胞を９６−ウェルプレートに分注し、ＥＧＭ２培地を利用して１２時間の間培養した。以後、本発明の３Ｃ４抗体を処理してＳＣＦ及びｇａｌｅｃｔｉｎ−１による細胞増殖抑制効果をＣｅｌｉｇｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を利用してスキャンし、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染色を通して細胞数を確認した。その結果を図１５に示した。
【０１２３】
図１５に示したように、３Ｃ４抗体処理時、ＳＣＦ及びｇａｌｅｃｔｉｎ−１により誘導されるＨＵＶＥＣの増殖が濃度依存的に抑制されることを確認した。前記結果を通して、本発明の３Ｃ４抗体は、ＳＣＦだけではなく、ｇａｌｅｃｔｉｎ−１により誘導される新生血管生成を効果的に抑制することをもう一度確認した。
【０１２４】
比較例１．本発明の３Ｃ４抗体とＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ抗体の中和能の比較
市販中のＳＣＦ抗体と本発明の３Ｃ４抗体の中和能を比較するための実験を遂行した。マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）３００ｕｌを１２−ウェルプレートに分注した後、５分間放置して固めた。ＨＵＶＥＣをＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）＋３Ｃ４抗体またはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓの抗−ＳＣＦ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ抗体（ｃａｔ＃、ＡＦ−２５５−ＮＡ）と濃度別に混ぜた後、マトリゲル上に分注した。以後、ＨＵＶＥＣのチューブ形成を観察し（ｎ＝７）、その結果を図１６に示した（＊ｐ＜０．０５）。
【０１２５】
図１６に示したように、本発明の３Ｃ４抗体は、全ての濃度においてＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓの抗−ＳＣＦ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ抗体に比してＳＣＦにより誘導されるＨＵＶＥＣのチューブ形成抑制能が有意的に高いことを確認した。前記比較例を通して、市販中のＳＣＦ抗体より、本発明の３Ｃ４抗体を使用する場合、新生血管発現が顕著に阻害され、血管新生関連疾患をより効率的に治療できることをもう一度確認した。
【０１２６】
眼血管疾患の場合、主な治療剤がＶＥＧＦをターゲットとする薬物が主になっているが、患者の約２０％は、ＶＥＧＦ無反応群であり、新たな治療剤の開発が必要な実情である。前記実施例及び比較例において確認したように、本発明の二重標的抗体は、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）及びガレクチン−１（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）に特異的に結合し、ＳＣＦ及びガレクチン−１により誘導される血管形成をそれぞれ効果的に抑制するだけではなく、既存の治療剤に対する無反応群患者に対しても効果的な治療が可能であり、ＶＥＧＦをターゲットする既存の薬物と共に併用投与して非正常な新生血管形成を効果的に抑制できるものと予想される。
【０１２７】
本発明は、前記に言及された好ましい実施例として説明されたが、発明の要旨と範囲から外れることなく多様な修正や変形をすることが可能である。また、添付の請求の範囲は、本発明の要旨に属するこのような修正や変形を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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