(57)【要約】本発明は式（Ｉ）化合物の結晶形、及び眼科疾患を治療するための医薬の製造における当該結晶形の使用に関する。【化１】2021524499.tif 000016【選択図】なし
2021524499.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）スペクトルが以下の２θ角：８．６０±０．２°、１５．０６±０．２°及び１７．２２±０．２°において特徴的な回折ピークを有する、式（Ｉ）化合物のＡ結晶形。
【化１】
2021524499.tif 000015
【請求項２】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：８．６０±０．２°、９．３８±０．２°、１０．５７±０．２°、１２．５４±０．２°、１４．４３±０．２°、１５．０６±０．２°、１７．２２±０．２°及び２５．１８±０．２°において特徴的な回折ピークを有する、請求項１に記載のＡ結晶形。
【請求項３】
粉末Ｘ線回折スペクトルが以下の２θ角：４．３５０°、８．５９８°、９．３８３°、１０．５６６°、１２．５４２°、１３．４４８°、１４．４２８°、１４．５９１°、１５．０６３°、１５．４５３°、１５．８２０°、１６．８０３°、１７．２１６°、２０．９８５°、２１．１８１°、２２．２２５°、２２．６０１°、２２．８５６°、２３．７２６°、２４．０３９°、２４．５３４°、２５．１８５°、２５．５１４°、２５．９３５°、２６．５７０°、２７．８６７°、２８．１２５°、２８．４１６°、２９．１１４°、２９．４４５°、３１．９１４°、３３．７１０°、３４．２９７°、３４．３２９°、３６．０１４°、３６．１０８°及び３８．１９６°において特徴的な回折ピークを有する、請求項２に記載のＡ結晶形。
【請求項４】
ＸＲＰＤスペクトルが図１に示す通りである、請求項３に記載のＡ結晶形。
【請求項５】
示差走査熱量曲線（ＤＳＣ）が１５１．７５±３℃において一つの吸熱ピークの開始点を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載のＡ結晶形。
【請求項６】
ＤＳＣスペクトルは図２に示す通りである、請求項５に記載のＡ結晶形。
【請求項７】
熱重量分析曲線は（ＴＧＡ）が１５１．５７±３℃の際に重量が０．０４５４０％減少する、請求項１から４のいずれか１項に記載のＡ結晶形。
【請求項８】
ＴＧＡスペクトルは図３に示す通りである、請求項７に記載のＡ結晶形。
【請求項９】
眼科疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１から８のいずれか１項に記載のＡ結晶形の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は以下の優先権を主張する：中国特許出願番号２０１８１０８２６４２５．６、出願日は２０１８年０７月２５日である。
【０００２】
本発明は式（Ｉ）化合物の結晶形、及び眼科疾患を治療するための医薬の製造における当該結晶形の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
白内障は眼の疾患であり、眼球内の水晶体に発生し、水晶体の混濁を総称して白内障と呼ぶ。老化、遺伝、代謝異常、外傷、放射線、中毒及び局所栄養失調等のいずれも、水晶体嚢の膜の損傷を引き起こす可能性があり、その透過性を増加させ、バリア機能を喪失させるか、又は水晶体代謝障害を引き起こさせて、水晶体タンパク質を変性させ、濁りを引き起す。眼球の水晶体が透明から不透明に変化すると、眼の受ける日光に影響を与えるため、眼の視力に影響する。眼球の不透明度が低いと視力への影響は少ないが、不透明度が徐々に深くなることにつれ、視力への影響も増し、厳重な者は失明につながる。白内障は最も一般的な失明を招く眼疾患の１つであり、失明の主な原因である。白内障形成のメカニズムがまだ不明であるため、いままでのところ薬物治療は突破的な進歩はない。従って、現在確定できる唯一の治療方法は手術治療である。
【０００４】
白内障手術方法の不断的な進歩は、白内障の治療に巨大な助けを提供したが、手術の治癒率はまだ発生率をはるかに下回り、深刻な合併症が存在する可能性があり；又、白内障手術の治療費用は非常に高く、先進国でさえ、白内障は医療保険システムに大きな負担をもたらしている。従って、薬物の予防・治療は極めて重要な役割を果たている。現在、白内障の臨床治療薬には：（１）カタリン（カタリン、カリニョウ、バイネチン）、ファコリシン、ベンタリジンなどのアルドース還元酵素阻害剤；（２）グルタチオン、タウリン、アスピリンなどの抗酸化損傷薬；（３）ビタミン系、カロテノイドなどの栄養代謝薬；（４）セッコク夜光丸、杞菊地黄丸、石決明散などを含む漢方薬が含まれる。しかし、これらの白内障を治療する医薬は長期の臨床試験によって、白内障の悪化を緩和させるだけで、病気を逆転させて白内障を治療することは不可能であることが証明された。同時に、中国の高齢化社会に入るにつれ、白内障患者の人数も増加しており、白内障薬の需要はますます切迫になっている。従って、臨床では、安全で、効果的で、目の中の浸透性が強い、性質が安定している新規な眼科の抗白内障外用薬が非常に必要となっている。
【０００５】
ラノステロールは、水晶体に富む両親媒性分子であり、ラノステロールシンターゼ（ＬＳＳ）のコレステロール合成経路における重要な環化反応によって合成され、水晶体タンパク質の異常な凝集を減らし、再配置・排列させて水晶体の透明度を回復させることができる。研究により、ラノステロールシンターゼは水晶体で検出できることはすでに証明されている。それ以外に、Ｓｈｕｍｉｙａ白内障ラットの研究では、ラウロステロールシンターゼとファルネシル二リン酸トランスフェラーゼ１（ＦＤＦＴ１）のホモ接合突然変異の特定の組み合わせは、水晶体のコレステロール値を低下させ、白内障を引き起こす可能性がある。同時に、私たちの最近の研究では、ラノステロールが、生体外および細胞レベルで事前に形成されたレンズタンパク質凝集体を大幅に減少できることを発見している。生体内レベルも、ラノステロールが白内障の状態を逆転させ、水晶体が清澄で透明になることを証明し、この結果はすでにジャーナル・オブ・ネイチャーに掲載され、世界的に注目され、白内障の予防・治療のための新しい分子である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）スペクトルが以下の２θ角：８．６０±０．２°、１５．０６±０．２°及び１７．２２±０．２°において特徴的な回折ピークを有する、式（Ｉ）化合物のＡ結晶形を提供する。
【０００７】
【化１】
2021524499.tif 000003
【０００８】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルは以下の２θ角：８．６０±０．２°、９．３８±０．２°、１０．５７±０．２°、１２．５４±０．２°、１４．４３±０．２°、１５．０６±０．２°、１７．２２±０．２°及び２５．１８±０．２°において特徴的な回折ピークを有する。
【０００９】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルは以下の２θ角：４．３５０°、８．５９８°、９．３８３°、１０．５６６°、１２．５４２°、１３．４４８°、１４．４２８°、１４．５９１°、１５．０６３°、１５．４５３°、１５．８２０°、１６．８０３°、１７．２１６°、２０．９８５°、２１．１８１°、２２．２２５°、２２．６０１°、２２．８５６°、２３．７２６°、２４．０３９°、２４．５３４°、２５．１８５°、２５．５１４°、２５．９３５°、２６．５７０°、２７．８６７°、２８．１２５°、２８．４１６°、２９．１１４°、２９．４４５°、３１．９１４°、３３．７１０°、３４．２９７°、３４．３２９°、３６．０１４°、３６．１０８°及び３８．１９６°において特徴的な回折ピークを有する。
【００１０】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形のＸＲＰＤスペクトルは図１に示す通りである。
【００１１】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形のＸＲＰＤスペクトル解析データは表１に示す通りである。
【表１】
2021524499.tif 000004
【００１２】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形の示差走査熱量曲線（ＤＳＣ）は１５１．７５±３℃において一つの吸熱ピークの開始点を有する。
【００１３】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形のＤＳＣスペクトルは図２に示す通りである。
【００１４】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形の熱重量分析曲線（ＴＧＡ）は１５１．５７±３℃の際に重量が０．０４５４０％減少する。
【００１５】
本発明の幾つかの実施の態様において、前記Ａ結晶形のＴＧＡスペクトルは図３に示す通りである。
【００１６】
本発明は更に、眼疾患を治療するための医薬の製造における前記Ａ結晶形の使用を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
ラノステロールの新規のプロドラッグとして、本発明の化合物は、良好な透過性を有し、且つ、生体内で効果的にラノステロールに変換され、ラノステロールの薬物使用率を大幅に改善させ；その結晶形は良好な安定性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ａ結晶形のＣｕ−Ｋα線のＸＲＰＤスペクトルである。
【図２】Ａ結晶形のＤＳＣスペクトルである。
【図３】Ａ結晶形のＴＧＡスペクトルである。
【図４】Ａ結晶形のＤＶＳ等温線である。
【図５】細隙灯を使用して観察した、ラノステロール及びそのプロドラッグ０２６（式（Ｉ）化合物）の点眼薬が、亜セレン酸ナトリウムによって誘発された新生ニュージーランドウサギ白内障モデルにおける効果である。ＮＣは正常対照群（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＭＣはモデル対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＰＣは陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＬＴはラノステロール点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）であり；０２６はラノステロールプロドラッグ０２６点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌｐｒｏｄｒｕｇ  ０２６  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）である。
【図６】亜セレン酸ナトリウムによって誘発された新生ニュージーランドウサギ白内障モデルの薬投与４２日後、各群の体外水晶体透明度の検出結果の比較である。ＮＣは正常対照群（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＭＣはモデル対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＰＣは陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＬＴはラノステロール点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）であり；０２６はラノステロールプロドラッグ０２６点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌｐｒｏｄｒｕｇ  ０２６  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）である。グリッドは２．１２×２．１２ｍｍである。
【図７】亜セレン酸ナトリウムによって誘発された新生ニュージーランドウサギ白内障モデルの薬投与４２日後、各群の水晶体グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＧＳＨ−ＰＸ）活性の検出結果の比較である。ＮＣは正常対照群（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＭＣはモデル対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＰＣは陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＬＴはラノステロール点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）であり；０２６はラノステロールプロドラッグ０２６点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌｐｒｏｄｒｕｇ  ０２６  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）である。Ｖ．Ｓ  ＮＣ：＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊はｐ＜０．０５を表し；Ｖ．Ｓ  ＭＣ：＃＃はｐ＜０．０１を表し、＃はｐ＜０．０５を表し；Ｖ．Ｓ  ＰＣ：＋＋はｐ＜０．０１を表し、＋はｐ＜０．０５を表す。
【図８】細隙灯を使用して観察した、紫外線によって誘発されたニュージーランドウサギ白内障モデルにおける、ラノステロール及びそのプロドラッグ０２６点眼薬の効果である。ＮＣは正常対照群（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＭＣはモデル対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＰＣは陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＬＴはラノステロール点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）であり；０２６はラノステロールプロドラッグ０２６点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌｐｒｏｄｒｕｇ  ０２６  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）である。
【図９】紫外線によって誘発されたニュージーランドウサギ白内障モデルの投与４２日後、各群の体外水晶体透明度の検出結果の比較である。ＮＣは正常対照群（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＭＣはモデル対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＰＣは陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＬＴはラノステロール点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）であり；０２６はラノステロールプロドラッグ０２６点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌｐｒｏｄｒｕｇ  ０２６  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）である。グリッドは２．１２×２．１２ｍｍである。
【図１０】紫外線によって誘発されたニュージーランドウサギ白内障モデルの投与４２日後、各群の水晶体グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＧＳＨ−ＰＸ）活性の検出結果の比較である。ＮＣは正常対照群（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＭＣはモデル対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＰＣは陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）であり；ＬＴはラノステロール点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）であり；０２６はラノステロールプロドラッグ０２６点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌｐｒｏｄｒｕｇ  ０２６  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）である。Ｖ．Ｓ  ＮＣ：＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊はｐ＜０．０５を表し；Ｖ．Ｓ  ＭＣ：＃＃はｐ＜０．０１を表し、＃はｐ＜０．０５を表し；Ｖ．Ｓ  ＰＣ：＋＋はｐ＜０．０１を表し、＋はｐ＜０．０５を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜定義と説明＞
特に説明しない限り、本明細書に用いられる以下の用語と句は下記の意味を含む。一つの特定の句又は用語は、特に定義されていない場合、不確定か不明であると考えられるものではなく、一般的な意味で理解すべきである。本明細書に商品名が現れる場合、その対応する商品又はその活性成分を表すことが意図される。
【００２０】
本発明の中間体化合物は、以下に挙げられる具体的な実施の態様、他の化学合成法と組み合わせた実施の態様、及び当業者に周知である等価の置き換え方式を含む、当業者に周知である複数の合成方法により調製することができ、好ましい実施の態様は、本発明の実施例が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明の具体的な実施の態様の化学反応は適当な溶剤において完成されるものであり、前記溶剤は本発明の化学変化及びその必要な試薬及び材料に適しなければならない。本発明の化合物を得るために、当業者は従来の実施の態様に基づき合成ステップ又は反応フローを変形又は選択する必要があることがある。
【００２２】
以下に実施の形態により本発明を詳しく説明するが、これらの実施の形態は本発明を何らか制限するものではない。
【００２３】
本発明に用いられる全ての溶剤は市販されるものであり、さらに精製することなく使用できる。
【００２４】
本発明に用いられる全ての溶剤は市販で入手できる。本発明は下記の略語を用いる：ＤＣＭはジクロロメタンを表し；ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを表し；ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを表し；ＥｔＯＨはエタノールを表し；ＭｅＯＨはメタノールを表し；ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を表し；ＴｓＯＨはｐ−トルエンスルホン酸を表し；ｍｐは融点を表し；ＥｔＳＯ３Ｈはエタンスルホン酸を表し；ＭｅＳＯ３Ｈはメタンスルホン酸を表し；ＡＴＰはアデノシン三リン酸を表し；ＨＥＰＥＳは４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸を表し；ＥＧＴＡはエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸を表し；ＭｇＣｌ２は塩化マグネシウムを表し；ＭｎＣｌ２は二塩化マンガンを表し；ＤＴＴはジチオトレイトールを表し；ＤＣＣはジシクロヘキシルカルボジイミドを表し；ＤＭＡＰは４−ジメチルアミノピリジンを表し；ラノステロールプロドラッグ０２６は、本発明の式（Ｉ）化合物を表す。
【００２５】
粉末Ｘ線回折計（Ｘ−ｒａｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）
約１０〜２０ｍｇの試料をＸＲＰＤの検出に用いる。
詳細なＸＲＰＤパラメータは下記の通りである：
Ｘ線管：Ｃｕ，ｋα，（λ＝１．５４０５６Å）
管電圧：４０ｋＶ、管電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
センサスリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：４〜４０ｄｅｇ
ステップ角：０．０２ｄｅｇ
ステップ幅：０．１２秒
試料パン回転数：１５ｒｐｍ
【００２６】
動的水蒸気吸着分析（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｖａｐｏｒ  Ｓｏｒｐｔｉｏｎ、ＤＶＳ）
測定方法：約１０〜２０ｍｇの試料をＤＶＳサンプルパンに取って検出する。
温度：２５℃
平衡ｄｍ／ｄｔ：０．０１％／ｍｉｎ（時間：１０ｍｉｎ、最長：１８０ｍｉｎ）
乾燥：０％ＲＨ、１２０ｍｉｎ
ＲＨ（％）測定の勾配：１０％
ＲＨ（％）測定の勾配範囲：０％〜９０％〜０％
吸湿性評価の分類は以下の通りである：
【表２】
2021524499.tif 000005
【００２７】
本発明の内容がよりよく分かるように、以下に具体的な実施の形態を参照しながらさらに説明するが、具体的な実施の態様は本発明の内容を制限するものではない。
【００２８】
参照例１：フラグメントＢＢ−１
【化２】
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【００２９】
合成スキーム：
【化３】
2021524499.tif 000007
【００３０】
工程１：化合物ＢＢ−１の合成。
混合物ＢＢ−１−１を超臨界流体クロマトグラフィー（分離条件カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−３  １５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．，３μｍ；移動相：Ａ：ＣＯ２  Ｂ：エタノール（０．０５％のジエタノールアミン）；勾配：５分間でＢは５％から４０％に達し、Ｂ４０％で２．５分間で、次にＢ５％で２．５分間であり；流速：２．５ｍＬ／ｍｉｎ；カラム：３５℃；波長：２２０ｎｍ）で分離して、化合物ＢＢ−１を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ  ５．０６〜５．１５（ｍ，１Ｈ），５．１０（ｂｒｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．２０〜３．２２（ｍ、１Ｈ）、３．２４（ｄｄ、Ｊ＝１１．５、４．５Ｈｚ、１Ｈ）、１．６４〜２．０９（ｍ、１５Ｈ）、０．７７〜１．５７（ｍ、２９Ｈ）、０．６５〜０．７２ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）。
【００３１】
実施例１：式（Ｉ）化合物の製造
【化４】
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【００３２】
合成スキーム：
【化５】
2021524499.tif 000009
【００３３】
工程１：式（Ｉ）化合物の合成。
基質３５．２ｇの化合物ＢＢ−１を無水ジクロロメタン５５０ｍＬに溶解させ、２２．８ｇのサリチル酸を添加し、次に、３９．２ｇのＤＣＣを添加し、最後に２３．２ｇのＤＭＡＰを添加して、白色の懸濁液を得、３５℃昇温させ、９６時間反応させた。ＴＬＣで、少量の原材料が残っていることを検出し、反応を停止させ、濾過し、１５０ｍＬのジクロロメタンで濾過残留物を洗浄し、濾液を合わせ、スピン乾燥させて粗残留物を得た。粗生成物の残留物に５００ｍＬのメタノールを添加し、１６時間還流させて白色の懸濁液を得、１５℃に冷却させ、濾過して白色の固体を得、ＸＲＰＤで検出して式（Ｉ）化合物のＡ結晶形を得た。
【００３４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１０．８９（ｓ、１Ｈ）、７．７７（ｄｄ、Ｊ＝１．７６、８．０３Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８（ｄｄｄ、Ｊ＝１．７６、７．０９、８．４７Ｈｚ、１Ｈ）、６．９１（ｄｄ、Ｊ＝０．８８、８．４１Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８〜６．８５（ｍ、１Ｈ）、５．００〜５．０７（ｍ、１Ｈ）、４．６８〜４．７４（ｍ、１Ｈ）、１．６４〜２．０４（ｍ、１２Ｈ）、１．６２（ｓ、３Ｈ）、１．５７（ｂｒｓ、２Ｈ）、１．５４（ｓ、３Ｈ）、１．０４〜１．５１（ｍ、９Ｈ）、０．９８（ｓ、３Ｈ）、０．９８（ｓ、３Ｈ）、０．８９（ｓ、３Ｈ）、０．８５（ｄ、Ｊ＝６．２７Ｈｚ、３Ｈ）、０．８２（ｓ、３Ｈ）、０．６３（ｓ、３Ｈ）。
【００３５】
実施例２：式（Ｉ）化合物のＡ結晶形の吸湿性研究
実験材料：
ＳＭＳ  ＤＶＳ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ動的水蒸気吸着計
実験方法：
式（Ｉ）化合物のＡ結晶形１０〜１５ｍｇをＤＶＳサンプルパンに取って測定した。
実験結果：
式（Ｉ）化合物のＡ結晶形のＤＶＳスペクトルは図４に示す通りであり、△Ｗ＝０．７４７％であった。
実験結論：
式（Ｉ）化合物のＡ結晶形が２５℃及び８０％のＲＨ下における吸湿性重量増加は０．７４７％であり、吸湿性はややあった。
【００３６】
実施例３：式（Ｉ）化合物のＡ結晶形の予備安定性実験
式（Ｉ）化合物のＡ結晶形を以下の３つの条件下に置き、異なる時点でサンプリングして特性、ＸＲＰＤ、含有量及び関連物質を検出して調査した。研究条件と検出項目は表３に示す通りであった。
【表３】
2021524499.tif 000010
【００３７】
実験工程：
式（Ｉ）化合物のＡ結晶形１０ｍｇを正確に秤量して、サンプルボトルに置き、薄層に広げた。６０℃、９２．５％ＲＨの条件下でサンプリングし、ボトル口を直接的にアルミホイルで包み、アルミホイルに小さな穴を開けて、サンプルが環境の空気と十分に接触できることを保証し、それぞれ乾燥箱と飽和硝酸カリウム溶液を入れたグラス缶に入れた。光照射させたサンプル（開口、アルミホイルで覆われていない）と光照射させた対照品（開口、サンプルボトル全体がアルミホイルで覆われている）を光照射箱に入れた。各時点でそれぞれ２部を秤量し、正式的の試験サンプルにした。又、式（Ｉ）化合物のＡ結晶形を約５ｍｇ秤量してＸＲＰＤで検出し、サンプルボトルをアルミホイルで包み、アルミホイルに小さな穴を開け、同じく対応する乾燥箱と飽和硝酸カリウム溶液を入れたグラス缶に入れた。
【００３８】
含有量の分析方法：
カラムモデル：Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＸＢ−Ｃ１８  ３．０＊５０ｍｍ、３ｕｍ；移動相：０．５ｍｌのＴＦＡを１Ｌの水（溶媒Ａ）に添加し、及び０．４ｍｌのＴＦＡを１Ｌのアセトニトリル（溶媒Ｂ）に添加し、９５％〜１００％（溶媒Ｂ）の溶出勾配を２分以上使用し、１００％で１３分間保持させた。流速は１．５ｍｌ／分であり；カラム温度は３０℃であった。
実験結果と結論：結晶形は実験後変化しておらず、その安定性は良好であった。
【００３９】
生物活動試験
【００４０】
実施例一：生体内における眼部薬の浸透及び薬のラノステロールへの転換に関する研究
本研究では、ニュージーランド白ウサギ（体重は２ｋｇを超え、年齢は１２週齢を超える）を実験動物として使用し、各化合物の研究では、２匹のニュージーランド白ウサギを使用し、各ウサギには、左右両眼に５０μＬの点眼薬を点眼し、３つの眼は眼房水を収集するために使用し、もう１つの眼はスペアとして使用した。点眼薬の配合は、１．２％のヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｅ５仕様）、２０．５％のポロキサマー（Ｐ４０７仕様）、１．６％のポロキサマー（Ｐ１８８仕様）であり、化合物の調製濃度は５ｍＭであり、点眼薬は均一な懸濁液であった。点眼薬をウサギの眼に点眼した後、それぞれ投与後０．５、２、４及び６時間後で前眼房水を採取し、毎回サンプルを採取する体積は５０μＬを超えず、動物は毎回サンプルを採取する前に、軽度の麻酔をかけ、各時点は３つのサンプルであった。採取した眼房水サンプルは採取後直ちにドライアイスに入れて保存するか、又は−８０±１０℃の冷蔵庫に入れて保存した。サンプル採取完了後、動物を安楽死させた。サンプルはトリプル四重極質量分析計（ＡＰＩ４０００）を使用して化合物の濃度を分析した。表４及び表５は、生体内ＤＭＰＫの分析・検出方法を示し；表６及び表７は、化合物ラノステロール（親薬物）とプロドラッグ化合物（各眼で２５０ｎＭ）を点眼した後の眼房水中の薬物濃度を示した。
【００４１】
実験結果及び結論：ラノステロール自体と本発明のプロドラッグ化合物はいずれも、角膜から又は他の経路を介して眼房水に浸透することができ；且つ、プロドラッグ化合物は、浸透過程で親薬物ラノステロールに転換され得、眼房水においてより高いラノステロール濃度と暴露量を示すことができた。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
【表５】
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【００４４】
【表６】
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【００４５】
【表７】
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【００４６】
実施例二：亜セレン酸ナトリウムによって誘発されたニュージーランド新生ウサギの白内障モデルにおけるラノステロール点眼薬及びそのプロドラッグの薬力学的研究
【００４７】
１．実験動物
新生ニュージーランドウサギＰ７日齢、普通のグレード、毎腹５匹の赤ちゃんウサギに１匹の母ウサギを配置して授乳させた。
【００４８】
２．群分け及び処理
実験ウサギはランダムで５つの群に分け、毎群には５匹の赤ちゃんウサギがあった。
【００４９】
１）正常対照群（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ、ＮＣ）：Ｐ１０日目に、０．２５ｍｌの生理食塩水を赤ちゃんウサギの首に皮下注射し、Ｐ１５日後に投与を終止した。
２）モデル対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ、ＭＣ）：Ｐ１０日目に、赤ちゃんウサギの首に２０μｍｏｌ／ｋｇ体重で亜セレン酸ナトリウム溶液（生理食塩水の中で）を皮下注射し、Ｐ１５日後、右眼に薬物を含まないブランク点眼薬を１日３回、４２日間連続して滴下した。
３）陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ、ＰＣ）：Ｐ１０日目に、赤ちゃんウサギの首に２０μｍｏｌ／ｋｇ体重で亜セレン酸ナトリウム溶液（生理食塩水の中で）を皮下注射し、Ｐ１５日後、右眼にカリニョウ点眼薬（日本参天製薬）を１日３回、４２日間連続して滴下した。
４）ラノステロール点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ、ＬＴ）：Ｐ１０日目に、赤ちゃんウサギの首に２０μｍｏｌ／ｋｇ体重で亜セレン酸ナトリウム溶液（生理食塩水の中に）を皮下注射し、Ｐ１５日後、右眼にラノステロール点眼薬を１日３回、４２日間連続して滴下した。
５）ラノステロールプロドラッグ０２６点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌｐｒｏｄｒｕｇ  ０２６  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ、０２６、式（Ｉ）化合物）：Ｐ１０日目に、赤ちゃんウサギの首に２０μｍｏｌ／ｋｇ体重で亜セレン酸ナトリウム溶液（生理食塩水の中で）を皮下注射し、Ｐ１５日後、右眼にラノステロールプロドラッグを１日３回、４２日間連続して滴下した。
【００５０】
３．実験試験
１）細隙灯顕微鏡写真：各群の亜セレン酸ナトリウムによって誘発されたニュージーランドウサギの各群に、それぞれ投与前、投与後７日目、１４日目、２１日目及び４２日目で細隙灯顕微鏡で観察した；
２）体外水晶体透明度試験：最終日、動物の眼球を解剖して包被膜を含む水晶体を完全に分離し、水晶体を正方形の紙（２．１２×２．１２ｍｍ）に置き、写真は水晶体を通して撮影した正方形の鮮明さを示した。
３）グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＧＳＨ−ＰＸ）活性の検出：ＧＳＨ−ＰＸ活性検出キット（ＮａｎＪｉｎｇ  ＪｉａｎＣｈｅｎｇ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の説明書に記載されている方法を参照して分離された各群のウサギ水晶体のＧＳＨ−ＰＸ活性を検出した。実験データはＳＰＳＳ統計ソフトウェアを利用してＯｎｅ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ分析を行い、ＬＳＤ法で各群間の比較を行い、統計学的差異レベルはｐ＜０．０５であった。
【００５１】
４．実験結果
１）細隙灯顕微鏡観察：図５は、亜セレン酸ナトリウムがニュージーランド新生ウサギの水晶体に白内障を誘発できることを示した。細隙灯顕微鏡で観察し、ラノステロールプロドラッグ０２６点眼液投与４２日目（図５−Ｉ）は投与前（図５−Ｊ）と比較して白内障の症状を有意に減少させた。しかし、カリニョウ点眼薬の投与前後（図５−Ｅ、５−Ｆ）及びラノステロール点眼薬の投与前後（図５−Ｇ、５−Ｈ）の白内障の症状には有意な変化がなかった。
２）体外水晶体透明度検出：図６は、投与４２日後、亜セレン酸ナトリウムによって誘発されたニュージーランド新生ウサギ白内障モデルの各群の水晶体透明度を比較した。各写真の左側は左眼の水晶体（左眼は薬を投与せず、自己対照とした）であり、右側は右眼の水晶体（右眼は異なる群に従って投与した）であった。ラノステロールプロドラッグ０２６点眼液を４２日間投与した後、右眼水晶体の透明度は自体の左眼よりも有意に高く、ＭＣ群の水晶体よりも有意に高かったが、ＮＣ群よりは依然として低かった。ＬＴ群の右眼の水晶体透明度は投与後有意な変化はなかった。
３）ＧＳＨ−ＰＸ活性検出：４２日間の投与後の各群の水晶体のＧＳＨ−ＰＸ活性検出結果（図７を参照）は、亜セレン酸ナトリウムを皮下注射した後、ウサギ水晶体のＧＳＨ−ＰＸ活性が有意に低下し、ＮＣ群と比較して統計学的差異（ｐ＜０．０１）があった。ラノステロールプロドラッグ０２６点眼液と陽性対照薬カリニョウ点眼液は水晶体ＧＳＨ−ＰＸ活性を高めることができ、ＭＣ群と比較して統計学的差異（ｐ＜０．０１）があり、且つ、０２６の改善効果はカリニョウよりも有意（ｐ＜０．０１）であった。水晶体ＧＳＨ−ＰＸ活性に対するラノステロール点眼薬の効果は、０２６及びカリニョウほど良くなく、ＭＣ群と比較して統計学的差異がなかった（ｐ＞０．０５）。
【００５２】
５．結論
上記の結果は、ラノステロールプロドラッグ０２６点眼薬が、亜セレン酸ナトリウムによって誘発されるニュージーランド新生ウサギの白内障症状を緩和でき、水晶体の透明度と水晶体のＧＳＨ−ＰＸ活性を改善できることを示した。
【００５３】
実験三、紫外線によって誘発されたニュージーランドウサギの白内障モデルにおけるラノステロール点眼薬及びそのプロドラッグの薬力学的研究
【００５４】
１．実験動物
ニュージーランド成体ウサギ２．０〜２．５ｋｇ、普通グレード、オス又はメス、合計２５匹。
【００５５】
２．群分け及び処理
実験動物をランダムに５つの群に分け、各群に５匹であった。
１）正常対照群（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ、ＮＣ）：通常の飼育、薬は投与しなかった。
２）モデル対照群（Ｍｏｄｅｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ、ＭＣ）：３１３ｎｍの紫外線を２４時間照射してモデルを構築した後、右眼に薬物を含まないブランクの点眼薬を１日３回、４２日間連続して滴下した。
３）陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ、ＰＣ）：３１３ｎｍの紫外線を２４時間照射してモデルを構築した後、右眼にカリニョウ点眼薬（日本参天製薬）を１日３回、４２日間連続して滴下した。
４）ラノステロール点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ、ＬＴ）：３１３ｎｍの紫外線を２４時間照射してモデルを構築した後、右眼にラノステロール点眼薬を１日３回、４２日間連続して滴下した。
５）ラノステロールプロドラッグ０２６点眼薬処理群（Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌｐｒｏｄｒｕｇ  ０２６  ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ、０２６）：３１３ｎｍの紫外線を２４時間照射してモデルを構築した後、右眼にラノステロールプロドラッグ点眼薬を１日３回、４２日間連続して滴下した。
【００５６】
３．実験検出
１）細隙灯顕微鏡写真：各群はモデルを構築した後、それぞれ投与前、投与後７日目、１４日目、２１日目及び４２日目で細隙灯顕微鏡で観察した；
２）体外水晶体透明度検出：最終日、動物の眼球を解剖して包被膜を含む水晶体を完全に分離し、水晶体を正方形の紙（２．１２×２．１２ｍｍ）に置き、写真は水晶体を通して撮影した正方形の鮮明さを示した。
３）グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＧＳＨ−ＰＸ）活性の検出：ＧＳＨ−ＰＸ活性検出キット（ＮａｎＪｉｎｇ  ＪｉａｎＣｈｅｎｇ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の説明書に記載されている方法を参照して分離された各群のウサギ水晶体のＧＳＨ−ＰＸ活性を検出した。実験データはＳＰＳＳ統計ソフトウェアを利用してＯｎｅ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ分析を行い、ＬＳＤ法で各群間の比較を行い、統計学的差異レベルはｐ＜０．０５であった。
【００５７】
４．実験結果
１）細隙灯顕微鏡観察：図８は、紫外線がニュージーランドウサギの水晶体に白内障を誘発できることを示した。細隙灯顕微鏡で観察し、ラノステロールプロドラッグ０２６点眼液投与４２日目（図８−Ｉ）は投与前（図８−Ｊ）と比較して白内障の症状を有意に減少させた。しかし、カリニョウ点眼薬の投与前後（図８−Ｅ、８−Ｆ）及びラノステロール点眼薬の投与前後（図８−Ｇ、８−Ｈ）の白内障の症状には有意な変化がなかった。
２）体外水晶体透明度検出：図９は、投与４２日後、紫外線によって誘発されたニュージーランドウサギ白内障モデルの各群の水晶体透明度を比較した。各写真の左側は左眼の水晶体（左眼は薬を投与せず、自己対照とした）であり、右側は右眼の水晶体（右眼は異なる群に従って投与した）であった。ラノステロールプロドラッグ０２６点眼液を４２日間投与した後、右眼水晶体の透明度は自体の左眼よりも有意に高く、ＭＣ群の水晶体よりも有意に高かったが、ＮＣ群よりは依然として低かった。ＬＴ群の右眼の水晶体透明度は投与後有意な変化がなかった。
３）ＧＳＨ−ＰＸ活性検出：４２日間の投与後の各群の水晶体のＧＳＨ−ＰＸ活性検出結果（図１０を参照）は、紫外線を照射した後、ウサギ水晶体のＧＳＨ−ＰＸ活性が有意に低下し、ＮＣ群と比較して統計学的差異（ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５）があった。ラノステロールプロドラッグ０２６点眼液と陽性対照薬カリニョウ点眼液は水晶体ＧＳＨ−ＰＸ活性を高めることができ、ＭＣ群と比較して統計学的差異（ｐ＜０．０１）があり、且つ、０２６の改善効果はカリニョウよりも有意（ｐ＜０．０５）であった。水晶体ＧＳＨ−ＰＸ活性に対するラノステロール点眼薬の効果は、０２６及びカリニョウほど良くなく、ＭＣ群と比較して統計学的差異はなかった（ｐ＞０．０５）。
【００５８】
５．結論
上記の結果は、ラノステロールプロドラッグ０２６点眼薬がニュージーランドウサギの紫外線によって誘発される白内障症状を緩和し、水晶体の透明度と水晶体のＧＳＨ−ＰＸ活性を改善できることを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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