(57)【要約】  本発明は、Ｎｒｆ２阻害剤を含む医薬組成物に関する。同様に、本発明は、患者のＡＳＤの治療における使用のための医薬組成物であって、該ＡＳＤの治療が、前記患者がＡＳＤサブタイプ１に罹患しているかどうかを決定すること、及び、前記患者がＡＳＤサブタイプ１に罹患している場合、治療有効量のＮｒｆ阻害剤を投与することを含んでおり、前記患者がＡＳＤサブタイプ１に罹患しているかどうかを決定することが、前記患者にＮｒｆ２活性化剤を投与すること、及び、前記患者がネガティブな反応を示した場合、前記患者をＡＳＤサブタイプ１に罹患していると同定することを含んでいる、医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｒｆ２阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記Ｎｒｆ２阻害剤が、ケルチ様ＥＣＨ関連タンパク質１（Ｎｒｆ２の細胞質ゾル阻害剤、ＩＮＲＦ２、ケルチ様タンパク質１９、ＫＩＡＡ０１３２、ＫＬＨＬ１９）、ケルチ様ＥＣＨ関連タンパク質１ゼブラフィッシュ、Ｍａｆｔタンパク質ゼブラフィッシュ、Ｋｅａｐ１タンパク質ラット、トリゴネリン（Ｎ−メチルニコチン酸）、タミバロテン、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、オウゴミン（Ｗｏｇ）、４−メトキシカルコン、３’，４’，５’，５，７−ペンタトキシフラボン（ＰＭＦ）、エピガロカテキン３−ガラート（ＥＧＣＧ）、イソニアジド（ＩＮＨ）；エチオナミド（ＥＴＨ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、ＡＲＥ発現モジュレーター（ＡＥＭ１）、ブルサトール（Ｂｒｕ）、クリプトアンシノン（ＣｒｙＰ）、ＩＭ３８２９（４−（２−シクロヘキシルエトキシ）アニリン）、メトホルミン（Ｍｅｔ）、マイコトキシンオクラトキシンＡ（Ｏｔａ）、トリプトライド（ＴＰＬ）、ＣＢＲ−０３１−１、ＣＢＲ−０２６−７、ＣＢＲ−１６８−５、チウラムジスルフィド及びジスルフィラムからなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＡＳＤの治療における使用のための、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＡＳＤがＡＳＤサブタイプ１である、請求項３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５】
患者のＡＳＤの治療における使用のための請求項１又は２に記載の医薬組成物であって、該ＡＳＤの治療が、
前記患者がＡＳＤサブタイプ１に罹患しているかどうかを決定すること、及び、前記患者がＡＳＤサブタイプ１に罹患している場合、治療有効量のＮｒｆ阻害剤を投与することを含んでおり、
前記患者がＡＳＤサブタイプ１に罹患しているかどうかを決定することが、前記患者にＮｒｆ２活性化剤を投与すること、及び、前記患者がネガティブな反応を示した場合、前記患者をＡＳＤサブタイプ１に罹患していると同定することを含んでいる、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特発性自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の、特定の分子及び／又は遺伝子の根本的な変異により特徴付けられるサブタイプである表現型１を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、多くの場合、社会的相互作用の障害、言語及びコミュニケーションの障害並びに反復的かつ固執性の行動の存在によって特徴付けられる神経発達障害群である（Abrahams BS, Geschwind DH; Advances in autism genetics: on the threshold of a new neurobiology（自閉症遺伝学の進歩：新しい神経生物学の境界にて） Nat Rev Genet. 2008 Jun;9(6):493）（Zoghbi HY, Bear MF; Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities（自閉症及び知的障害に関連する神経発達障害におけるシナプス機能不全） Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012 Mar 1;4(3)）。ＡＳＤの特徴的な症状又は行動特性は、典型的には生後３年の間に現れ、大多数のＡＳＤにおいて、生涯を通して存在し続ける。症状の強さは患者によって異なり、患者が適応スキルを発達させるにつれて低下することがある。環境的要因、発達又はてんかん等の併存症もまた、症状の悪化の原因となり得る。精神障害の診断と統計マニュアル第５版（ＤＳＭ第５版。ワシントンＤＣ：米国精神医学会；２０１３年。American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders（米国精神医学会による精神疾患の診断と統計マニュアル））によれば、ＡＳＤは２セットの中核的障害を特徴とする：社会的コミュニケーション及び社会的相互作用における持続的な欠損、並びに、限定的かつ反復的な行動、興味又は活動。前版（ＤＳＭ−ＩＶテキスト改訂版）（ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ第４版。ワシントンＤＣ：米国精神医学会；２０００年。American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders（米国精神医学会による精神疾患の診断と統計マニュアル））と比較すると、ＤＳＭ−５では大きな変更点が導入された。診断基準において、社会的コミュニケーションで使用されていない言語能力は重視されないようになっている。さらに、診断サブカテゴリー、すなわち、自閉性障害、アスペルガー障害、レット障害、小児期崩壊性障害、及び、特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ）が、自閉症スペクトラム障害の診断基準に含まれるようになった。これに加えて、ＤＳＭ−５は、（１）（「サポートが必要」）から（２）（「多くのサポートが必要」）、（３）（「非常に多くのサポートが必要」）まで高くなる３段階のＡＳＤ重症度のうちどれに該当するかを特定することを要求している。自閉症についての他の関連する行動ベースの定義は、他の診断マニュアル及び分類システムの様々な用語で提案されており、これらには、ＷＨＯ−ＩＣＤ−１０の自閉性障害の定義（２０１７／１８ ＩＣＤ−１０−ＣＭ 診断コードＦ８４．０）（世界保健機関（１９９２））が含まれる（The ICD-10 classification of mental and behavioural disorders: clinical descriptions and diagnostic guidelines（ＩＣＤ−１０精神及び行動の障害：臨床記述と診断ガイドライン）（ジュネーブ：世界保健機構））。ＡＳＤは、中核領域の症状によって定義され得るが、遺伝、表現型、臨床像及び関連する併存症には、かなりの異質性が存在する（Persico AM, Bourgeron T; Searching for ways out of the autism maze: genetic, epigenetic and environmental clues（自閉症の迷路から脱出する道の探索：遺伝的、後成的及び環境的手がかり）; Trends Neurosci. 2006 Jul;29(7):349-358）。自閉症の原因／素因についての遺伝的関与は、一卵性双生児における高い一致率に基づき大きいと考えられている（Folstein S. Rutter M; Infantile autism: a genetic study of 21 twin pairs（２１組の双子の遺伝学的研究）; J Child Psychol Psyquiatry;1977 Sep;18(4): 297-321）。近年公表された、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の家族性リスクに関するこれまでの研究によるデータの再分析は、遺伝がＡＳＤリスクの８３％に関与することを示唆するこれらの初期の知見をさらに支持している。したがって、ＡＳＤの発達病因において、環境要因が果たす役割は重要だが１７％と比較的小さい（Sandin S, Lichtenstein P, Kuja-Halkola R, Hultman C, Larsson H, Reichenberg A. The Heritability of Autism Spectrum Disorder（自閉症スペクトラム障害の遺伝性） JAMA. 2017;318(12):1182-1184. doi:10.1001/jama.2017.12141）。しかしながら、問題をさらに複雑にすることに、遺伝的因子及び後成的因子は、出生前及び生涯にわたる動的環境因子と絡まり合って、各々の患者の病因を引き起こす。科学界においては、現在の行動ベースの診断アプローチでは分子や遺伝子の変化について患者の効率的な分類ができず、むしろ、そのようなアプローチは、種々異なる病因を有する神経発達障害の大集団についての行動の総称として役立つという認識が高まっている。近年における新しい遺伝子スクリーニング法（例えば、マイクロアレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーションアッセイ（ａ−ＣＧＨ）、全ゲノム又はエクソームシーケンシング技術等）の進歩によって、ありふれた遺伝的変異体や珍しい遺伝的変異体を含む、ＡＳＤの可能性を高め得る何百もの遺伝的リスク因子を検出することが可能になった（Ronemus M. et al; The role of the novo mutations in the genetics of autism spectrum disorders（自閉症スペクトラム障害の遺伝におけるｎｏｖｏ突然変異の役割）; Nat Rev Genet. 2014 Feb; 15(2): 133-41）。それにもかかわらず、原因となる遺伝因子は、スクリーニングされる患者の１５〜２０％でしか同定することができず、したがって、大多数のＡＳＤ患者は、依然として特発性と考えられている。
【０００３】
多くの自閉症感受性遺伝子は、脳の発達において重要な役割を果たすことが知られており、その機能はシナプス伝達からＲＮＡプロセシングや神経発生にまで及ぶ(Gilman SR et al; Rare de novo variants associated with autism implicate a large functional network of genes involved in information and function of synapses（自閉症に関連する稀なde novo変異体は、シナプスの情報及び機能に関与する遺伝子の大規模な機能ネットワークに関係する）; Neuron. 2011 Jun 9;70(5):898-907、O'Roak BJ. et al; Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations（散発性自閉症エクソームが、de novo変異の高度に相互接続されたタンパク質ネットワークを明らかにする）; Nature. 2012 Apr 4;485(7397):246- 50、De Rubeis S. et al; Synaptic, transcriptional and chromatin genes disrupted in autism（自閉症において破壊されるシナプス、転写及びクロマチン遺伝子）; Nature. 2014 Nov 13;515 (7526): 209-15)。しかしながら、ＡＳＤ研究コミュニティは、ＡＳＤに関連する遺伝子が一般的な細胞及び発達プロセスに収束するかどうかを理解するためには、大量の遺伝的標的を必要としていることを強調している。
【０００４】
近年では、拡大を続けるＡＳＤ感受性遺伝子の数が、実際には、限られた数の分子経路へと収束し得るという理論を支持する証拠が蓄積している。この増加する仮定からは、シナプス形成及び回路形成を媒介する分子経路が、適応免疫応答及び先天性免疫応答の調節（Myka L. Estes ML, McAllister AK (2015), Nature Reviews Neuroscience 16, 469-486）、細胞の増殖、生存及びタンパク質合成（Subramanian M, Timmerman CK, Schwartz JL, Pham DL and Meffert MK (2015), Front. Neurosci. 9:313. Tang G. et al. (2014), Neuron. 83, 1131-1143）を含む他の生理学的プロセスにも関与するといった重要な解釈を行う機会が得られる。
【０００５】
ＡＳＤ患者をより小さく、より均質なサブグループに層別化するこれまでの試みは、特定の遺伝子シグネチャを利用することによって（Bernier et al; Disruptive CHD8 mutations define a subtype of autism early in development（破壊的ＣＨＤ８変異が、発達の早期に自閉症のサブタイプを定義する）; Cell 2014 Jul 17; 158 (2): 263-276）、又は、行動及び臨床上の中間表現型を利用することによって（Eapen V. and Clarke R.A.; Autism Spectrum Disorders: From genotypes to phenotypes（自閉症スペクトラム障害：遺伝子型から表現型へ）; Front Hum Neurosci. 2014;8:914）行われた。しかしながら、これらの戦略は、ＡＳＤの遺伝子及び表現型の不均一性を取り巻く困難性に直面しており、疾患の根本にある特定の神経生物学的経路を識別する助けとならない可能性がある。
【０００６】
分子についてのアッセイによって、ＡＳＤ患者を分類する方法が提供される可能性がある。しかしながら、ＡＳＤの本質的な複雑さや、その不均一性、遺伝的要因及び環境的要因の複雑な絡み合いのため、そのようなアッセイを確立するために使用可能なＡＳＤの特定のバイオマーカーは、未だ特定されていない。さらに、そのようなバイオマーカーは、それらの特異性のため、ＡＳＤ患者の大規模なグループを包含することができない。しかしながら、このようなアッセイは、短期的には、遺伝子型サブグループ、表現型サブグループ又は治療反応の事前に特定されたサブグループの特徴付けを支援し得る。
【０００７】
したがって、ＡＳＤサブグループの根本的な分子機能障害に対処する標的化された薬学的介入の恩恵を受けることが可能な、ＡＳＤの特定のサブタイプの患者を診断するための効率的かつ簡易な方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、解決しようとする課題は、複数の根本的な遺伝的原因及び／又は分子的原因に関して区別されるサブタイプを示すＡＳＤ患者のサブグループを効率的に治療する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、Ｎｒｆ２阻害剤を含む医薬組成物を提供することにより、上記問題を解決する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一態様では、本発明は、Ｎｒｆ２阻害剤を含む医薬組成物に関する。本発明の別の態様では、医薬組成物は、ＡＳＤ又はＡＳＤサブタイプ１患者の治療における使用のためのものである。本発明によれば、ＡＳＤサブタイプ１患者は、Ｎｒｆ２活性化剤の投与に対してネガティブな反応を示す。したがって、ＡＳＤサブタイプ１患者は、Ｎｒｆ２阻害剤に対してポジティブな反応を示し、Ｎｒｆ２阻害剤によって治療され得る。
【００１１】
本発明に係るＮｒｆ２阻害剤は、Ｎｒｆ２を阻害又は下方制御する、あるいはＮｒｆ２の活性を低下させる任意の分子として定義され得る。
【００１２】
Ｎｒｆ２阻害剤には、以下の分子が含まれる：Ｎｒｆ２の活性化をネガティブに制御する任意の分子。好ましくは、細胞質内のＮｒｆ２に結合し、Ｎｒｆ２をプロテアソーム消化に送り、細胞内Ｎｒｆ２濃度を低く保つ任意の天然又は合成分子。Ｋｅａｐ１を脱ユビキチン化してＫｅａｐ１−Ｃｕ１３−Ｅ３リガーゼ複合体を安定化する、及び／又は、Ｅ３リガーゼ活性を増強する任意の分子。それによって、Ｋｅａｐ１とＮｒｆ２が結合して、結果的にＮｒｆ２が分解される（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ１５（ＵＳＰ１５））；Ｎｒｆ２タンパク質の核内蓄積を減少させ、プロテアソーム遺伝子（例えば、ｓ５ａ／ｐｓｍｄ４及びａｌｐｈａ−５／ｐｓｍａ５）の発現をブロックし、Ｎｒｆ２によって制御されるプロテアソーム活性を減少させる任意の分子（すなわち、アルカロイド、好ましくはコーヒーアルカロイド、特にトリゴネリン）；高いＲＯＳ捕捉能力を有する、及び／又は、細胞内のＲＯＳレベルを低く保ち、それによって細胞内のＮｒｆ２活性を低く維持する任意の分子（例えば、水溶性ビタミン、特にビタミンＣ（アスコルビン酸）又はビタミンＥ）；Ｎｒｆ２シグナル伝達を阻害し、それによって細胞内酸化ストレスを増加させる任意の分子（例えば、ブルサトール）。
【００１３】
好ましい実施形態では、ＡＳＤ又はＡＳＤサブタイプ１の治療における使用のためのＮｒｆ２阻害剤は、ケルチ様ＥＣＨ関連タンパク質１（Ｎｒｆ２の細胞質ゾル阻害剤、ＩＮＲＦ２、ケルチ様タンパク質１９、ＫＩＡＡ０１３２、ＫＬＨＬ１９）、ケルチ様ＥＣＨ関連タンパク質１ゼブラフィッシュ、Ｍａｆｔタンパク質ゼブラフィッシュ、Ｋｅａｐ１タンパク質ラット、トリゴネリン（Ｎ−メチルニコチン酸）、タミバロテン、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ルテオリン（Ｌｕｔ）、アピゲニン（ＡＰｉ）、クリシン（Ｃｈｒｙ）、オウゴミン（Ｗｏｇ）、４−メトキシカルコン、３’，４’，５’，５，７−ペンタトキシフラボン（ＰＭＦ）、エピガロカテキン３−ガラート（ＥＧＣＧ）、イソニアジド（ＩＮＨ）；エチオナミド（ＥＴＨ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、ＡＲＥ発現モジュレーター（ＡＥＭ１）、ブルサトール（Ｂｒｕ）、クリプトアンシノン（ＣｒｙＰ）、ＩＭ３８２９（４−（２−シクロヘキシルエトキシ）アニリン）、メトホルミン（Ｍｅｔ）、マイコトキシンオクラトキシンＡ（Ｏｔａ）、トリプトライド（ＴＰＬ）、ＣＢＲ−０３１−１、ＣＢＲ−０２６−７、ＣＢＲ−１６８−５、チウラムジスルフィド及びジスルフィラムからなる群より選択される。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、ＡＳＤ又はＡＳＤサブタイプ１の治療のための方法であって、該治療が、治療有効量のＮｒｆ２阻害剤を投与することを含んでいる、方法に関する。一実施形態では、Ｎｒｆ２阻害剤は、ケルチ様ＥＣＨ関連タンパク質１（Ｎｒｆ２の細胞質ゾル阻害剤、ＩＮＲＦ２、ケルチ様タンパク質１９、ＫＩＡＡ０１３２、ＫＬＨＬ１９）、ケルチ様ＥＣＨ関連タンパク質１ゼブラフィッシュ、Ｍａｆｔタンパク質ゼブラフィッシュ、Ｋｅａｐ１タンパク質ラット、トリゴネリン（Ｎ−メチルニコチン酸）、タミバロテン、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ルテオリン（Ｌｕｔ）、アピゲニン（ＡＰｉ）、クリシン（Ｃｈｒｙ）、オウゴミン（Ｗｏｇ）、４−メトキシカルコン、３’，４’，５’，５，７−ペンタトキシフラボン（ＰＭＦ）、エピガロカテキン３−ガラート（ＥＧＣＧ）、イソニアジド（ＩＮＨ）；エチオナミド（ＥＴＨ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、ＡＲＥ発現モジュレーター（ＡＥＭ１）、ブルサトール（Ｂｒｕ）、クリプトアンシノン（ＣｒｙＰ）、ＩＭ３８２９（４−（２−シクロヘキシルエトキシ）アニリン）、メトホルミン（Ｍｅｔ）、マイコトキシンオクラトキシンＡ（Ｏｔａ）、トリプトライド（ＴＰＬ）、ＣＢＲ−０３１−１、ＣＢＲ−０２６−７、ＣＢＲ−１６８−５、チウラムジスルフィド及びジスルフィラムからなる群より選択され得る。
【００１５】
本明細書にて使用される場合、用語「自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）」は、社会的コミュニケーション及び社会的相互作用における持続的な欠損、並びに、行動、興味又は活動の限定的かつ反復的な様式を特徴とする神経発達障害群を包含するものと理解される。以下では、用語「自閉症スペクトラム障害」、「自閉症」及び「ＡＳＤ」は、同じ意味で使用される。用語「特発性ＡＳＤ」は、報告された徴候及び症状を引き起こす明確な分子的又は遺伝的変化のないＡＳＤを称する。したがって、特発性ＡＳＤの診断は除外診断であり、自閉症の主な分子的及び遺伝的に知られる原因が除外される必要がある。本明細書において、用語「ＡＳＤ表現型１」及び「表現型１」は、同じ意味で使用される。用語「患者」は「ＡＳＤ患者」のことを示し、ＡＳＤを有すると診断された人だけでなく、ＡＳＤを有する疑いのある人も意味する（i.e.以降未訳）
【００１６】
当業者は、どのようにして患者がＡＳＤと診断され得るかについて、よく認識している。例えば、当業者は、「米国精神医学会、精神疾患の診断と統計マニュアル（ＤＳＭ−５）第５版」に設定された基準に従って、被験者にＡＳＤの診断を下してもよい。同様に、ＡＳＤ患者は、標準化された評価ツールに従って診断されてもよい。そのような評価ツールとしては、以下に限定されないが、ＤＳＭ ＩＶ、ＩＣＤ−９、ＩＣＤ−１０、ＤＩＳＣＯ、ＡＤＩ−Ｒ、ＡＤＯＳ、ＣＨＡＴが挙げられる。
【００１７】
他の場合において、患者は、自閉性障害、アスペルガー症候群又は特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）の確立したＤＳＭ−ＩＶ診断を有し得る。
【００１８】
さらに、本発明は、ＡＳＤの臨床徴候、すなわち、以下を示す被験者にとって有用であり得る：複数の状況で社会的コミュニケーション及び社会的相互作用における持続的な欠損があり、現時点又は病歴によって、以下により明らかになる；行動、興味又は活動の限定された反復的な様式で、現時点又は病歴によって、以下の少なくとも２つにより明らかになる；症状は早期発達段階に存在している（しかしながら、社会的要求が能力の限界を超えるまで症状が完全に明らかにならないかもしれず、その後の生活で学んだ対応の仕方によって隠されている場合もある）；症状は、社会的、職業的又は他の重要な領域における現在の機能に臨床的に有意な障害を引き起こしている；これらの障害は、知的能力障害（知的発達障害）又は全般的発達遅延ではうまく説明できない。
【００１９】
ＡＳＤは、知的障害及び／又は言語障害を伴って起こることもあり、それらを伴わずに起こることもある。そのような障害は、既知の健康状態、遺伝子状態若しくは環境因子、又は、他の神経発達障害、精神障害若しくは行動障害に関連し得る。
【００２０】
ＡＳＤは、社会的コミュニケーションの障害に応じて、かつ、限定された反復的な行動の検知から分類され得る異なる重症度で起こることがある。重要なことに、用語「ＡＳＤ表現型１」は、ＡＳＤの特定の重症度とは関係ない。本発明は、任意の重症度のＡＳＤ罹患者に適用され得る。
【００２１】
ＡＳＤ表現型１患者は、以下の臨床徴候及び症状を有することによって定義され得る：１）少なくとも１つの必須特性：対照集団に対して拡大した頭のサイズ。２４ヶ月時点における平均頭囲（ＨＣ）より大きい標準偏差及び／又は外形的な巨頭症（頭囲が一般集団の９７％より大きい）のうち少なくとも１つを特徴とする、及び／又は、自閉症の中核症状又は付随症状の周期的な悪化であって、感染事象の期間、乳歯の喪失、外傷後傷害、内因性及び外因性の温度変化によって増強される；２）以下の２０の特徴から少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つ：対照母集団に対して高速な毛髪及び爪の成長；同じ民族の人と比較して、より明るい色の肌及び眼を示す高い傾向；同じ民族の対照被験者よりも実質的に長いまつげ；色素脱失した皮膚の少なくとも５つの不連続領域。特に患者の背中に現れる；感染事象の期間、乳歯の喪失、外傷後傷害又は体温変化の内因性要因及び外因性要因の間における浮腫の徴候；より詳細には、眼窩周囲領域及び額領域に位置する顔面浮腫；同じ年齢及び民族の定型発達者と比較した、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の高い血中レベル；先天性泌尿生殖器系奇形及び／又は排尿開始機能障害；膝蓋骨の過形成；下痢の頻発。特に５歳より前；耳鳴りの頻発；脳梁の薄化；血液悪性腫瘍（特に、骨髄腫及び急性前骨髄球性白血病だが、これらに限定されない）の家族歴陽性；リウマチ性関節炎の家族歴陽性。すなわち、２世代続けて少なくとも２人の影響を受けた第一度近親者；アセチルサリチル酸又はその誘導体に応答する有害事象；虹彩欠損。片側又は両側のいずれか；睡眠多汗症。特に新生児、幼児及び小児（幼児期及び小児期における夜間発汗の著しい増加。ベッドリネンの交換が必要になると近親者より報告されることが多い）；Ｔｈ１／Ｔｈ２比の増加（すなわち、インターロイキン１β、インターロイキン６、ＴＮＦ−α、インターフェロンγのレベル上昇）；先天性の副脾又は重複した脾臓；乳糜槽の先天性欠損；妊娠中にウイルス性又は細菌性感染症に罹患した母親及び／又は生物学的に確認された母親の妊娠中の免疫活性化の報告歴。
【００２２】
当業者は、Ｎｒｆ２阻害剤を投与する手段及び方法について、よく認識している。例えば、Ｎｒｆ２阻害剤は、経口的、経鼻的又は非経口的に投与されてもよい。好ましい実施形態では、Ｎｒｆ２阻害剤は、経口投与され得る。
【００２３】
所望の用量レベルを達成するため、Ｎｒｆ２阻害剤は、１日１回又は１日複数回の服用により投与され得る。好ましい実施形態では、Ｎｒｆ２阻害剤は、１日３回投与される。別の実施形態では、Ｎｒｆ２阻害剤は、１日２回投与される。別の実施形態では、Ｎｒｆ２阻害剤は、１日１回投与される。
【実施例】
【００２４】
実施例１
材料及び方法
全ての患者は、以前にＡＤＩ−Ｒ又はＡＤＯＳ−２スコアのいずれかによってサポートされるＤＳＭ−ＩＶ又はＤＳＭ−５基準に従うＡＳＤの診断を受けていた。年齢、性別又は民族性についての除外基準は考慮しなかったが、交絡因子を避けるために、非症候性又は孤立したＡＳＤを呈する症例のみを研究に含めた。
【００２５】
以下を示す特発性ＡＳＤの人を、表現型１と分類した：
・少なくとも１つの必須基準：
・対照集団に対して拡大した頭のサイズ。生後２４ヶ月の間における平均頭囲（ＨＣ）より大きい標準偏差及び／又は外形的な巨頭症（頭囲が一般集団の９７％より大きい）のうち少なくとも１つを特徴とする。
及び／又は
・自閉症の中核症状の周期的な悪化。感染事象の期間、乳歯の喪失、外傷後傷害、内因性及び外因性の温度変化によって増強される。
並びに、
・以下の２０の特徴から少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つ：
・対照母集団に対して高速な毛髪及び爪の成長。
・同じ民族の人と比較して、より明るい色の肌及び眼を示す高い傾向。
・同じ民族の対照被験者よりも実質的に長いまつげ。
・色素脱失した皮膚の少なくとも５つの不連続領域。特に患者の背中に現れる。
・感染事象の期間、乳歯の喪失、外傷後傷害又は体温変化の内因性要因及び外因性要因の間における浮腫の徴候；より詳細には、眼窩周囲領域及び額領域に位置する顔面浮腫。
・同じ年齢及び民族の定型発達者と比較した、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の高い血中レベル。
・先天性泌尿生殖器系奇形及び／又は排尿開始機能障害。
・膝蓋骨の過形成。
・下痢の頻発。特に５歳より前。
・耳鳴りの頻発。
・脳梁の薄化又は欠損。
・血液悪性腫瘍（特に、骨髄腫及び急性前骨髄球性白血病だが、これらに限定されない）の家族歴陽性。
・リウマチ性関節炎の家族歴陽性。すなわち、２世代続けて少なくとも２人の影響を受けた第一度近親者。
・アセチルサリチル酸又はその誘導体に応答する有害事象。
・虹彩欠損。片側又は両側のいずれか。
・睡眠多汗症。特に乳児、幼児及び小児（幼児期及び小児期における夜間発汗の著しい増加。ベッドリネンの交換が必要になると近親者より報告されることが多い）。
・Ｔｈ１／Ｔｈ２比の増加（すなわち、インターロイキン１β、インターロイキン６、ＴＮＦ−α、インターフェロンγのレベル上昇）。
・先天性の副脾又は重複した脾臓。
・乳糜槽の先天性欠損。
・妊娠中にウイルス性又は細菌性感染症に罹患した母親及び／又は生物学的に確認された母親の妊娠中の免疫活性化の報告歴。
【００２６】
結果
２０の表現型１及び２０の非表現型１を選択するために、グリーンウッド遺伝子センター（ＧＧＣ、ＳＣ、ＵＳＡ）データベース内に完全な臨床データがある３１３人のＡＳＤ患者のコホートについて検討を行った。
【００２７】
ＧＧＣデータベース内のこれら３１３人のＡＳＤ患者のうち、９０人（２８．８％）が、生後２４ヶ月内に訓練を受けた医師によって採寸された少なくとも２つの十分に記録された頭囲の測定値を有していた。これらの９０人の患者のうち、４７人（５２．２％）が少なくとも１つの主要基準（すなわち、頭囲）に適合していた。
【００２８】
ＨＣ＞７５であった４７人の患者の家族に対して電話による接触を行い、ＡＳＤ表現型１の第２の必須基準があるかどうかについて尋ねた。ＧＧＣは、４７人の患者のうち５人（１０．６％）の家族との接触を確立できなかった。さらなる臨床情報を収集することができた残りの４２人の患者のうち、２１人（５０％）がＡＳＤ表現型基準を満たしていた。全体として、追跡調査できなかった５つのケースを除外すると、８５人のうち２１人（２４．７％）がＡＳＤ表現型１の基準に適合し、３〜８個の副次特徴を示していた。
【００２９】
実施例２
材料及び方法
実施例１で同定された２１人のＡＳＤ表現型１患者のうち１５人を、生体外（in-vitro）分析のために検討した。２０人のＡＳＤ患者は、実施例１で引用された基準に適合しなかった場合、非表現型１として選択した。２０人の対照群は、神経行動障害の兆候又は症状が検出されなかった者として同定されたため、定型発達者（ＴＤ）とみなした。
【００３０】
生体外実験のために選択された表現型１コホート（Ｐｈ１）は、男性１４人及び女性１人（比率１４：１）により構成され、年齢範囲は２〜１７歳（平均７．７）であった。比較として、非表現型１（非ｐｈ１）コホートは、男性１９人及び女性１人（比率１９：１）により構成され、年齢範囲は２〜２０歳（平均５．２５）であり、ＴＤコホートは、男性１５人及び女性５人（比率３：１）により構成され、サンプル収集時の年齢範囲は３〜８歳（平均５．１）であった。全ての被験者から血液サンプルを収集し、リンパ芽球様細胞株を生成した。簡潔に説明すると、血液細胞が代謝的に活性なままであることを確認するために、抗凝固剤クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）を含有するチューブを使用して、血液サンプルを静脈血より収集した。これらのチューブを室温に保持し、２４時間以内に処理した。
【００３１】
細胞株は、エプスタイン・バーウイルスを使用して、血液サンプルからのリンパ球を不死化することによって得た。リンパ芽球様細胞株は、シグマRPMI-1640でのAtlanta Biologicals社（Lawrenceville, GA, USA）製のウシ胎仔血清７５ｍＬと、Sigma-Aldrich社（セントルイス、ミズーリ州、米国）製のＬ−グルタミン５ｍＬ及び抗生物質／抗真菌薬５ｍＬとを使用して、Sigma社製RPMI-1640内に採取した。
【００３２】
細胞のエネルギー産生を、市販の表現型哺乳類マイクロアレイ（PM-M、Biolog社製、Hayward, CA, USA）を使用して測定した。
【００３３】
各ウェル内の配合は、単一のエネルギー源として、又は、細胞懸濁液内に添加されるエネルギー源（α−Ｄ−グルコース）の利用に影響を与える代謝エフェクターとして、細胞に使用されるよう設計した。ウェル毎のＮＡＤＨの産生を、比色分析のレドックス色素化学を使用して監視した（Bochner et al. Assay of the multiple energy-producing pathways of mammalian cells（哺乳類細胞における複数のエネルギー産生経路のアッセイ）. PLoS One 2011, 6(3):e18147）。播種の前に、BioRad社製セルカウンターとトリパンブルー色素とを使用して、細胞生存率及び細胞数を評価した。播種に必要な生細胞の濃度は４×１０5細胞／ｍＬであり、これは５０μＬの容量にて１ウェルあたり２０，０００細胞に相当する。生存率が５５％以上の細胞株のみを実験に使用し、形質転換細胞を長期間細胞培養したことに起因するアーティファクト及びバイアスを最小限にするため、ＬＣＬの継代数が１５に達した場合には該ＬＣＬを使用しなかった。修正されたBiolog社製ＩＦ−Ｍ１培地を使用して、５％ＣＯ２中３７℃で細胞を４８時間インキュベートした。
【００３４】
プレートＰＭ−Ｍ１〜Ｍ４について、Biolog社製IF-M1 １００ｍＬに対して以下を添加することにより、Biolog社製IF-M1培地を修正した：１００×ペニシリン／ストレプトマイシン溶液１．１ｍＬ、２００ｍＭグルタミン０．１６ｍＬ（最終濃度０．３ｍＭ）、及び、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）５．３ｍＬ（最終濃度５％）。ＰＭ−Ｍ５〜Ｍ８のプレートについては、ＦＢＳの代わりに５．５ｍＭのα−Ｄ−グルコースが添加される。
【００３５】
４８時間のインキュベートの間、細胞が有していた唯一のエネルギー源は、ウェル内の化学物質であった。この最初のインキュベートの後、Biolog社製Redox Dye Mix MBを添加して（１０μＬ／ウェル）、プレートを同じ条件下でさらに２４時間インキュベートした。細胞がエネルギー源を代謝すると、培地中のテトラゾリウム色素が減少し、ＮＡＤＨの産生量に応じて紫色になる。
【００３６】
実験の最後の２４時間、プレートをOmnilogシステム内でインキュベートし、１５分毎に光学密度の読取値を収集して、各ウェルに９６データポイントを生成した。該システムはまた、各ウェル内における代謝反応の速度曲線と、勾配、最高点、エンドポイント、曲線下面積（ＡＵＣ）、ラグ等の外挿パラメータとを算出した。
【００３７】
２４時間のインキュベートの最後に、マイクロプレートリーダーを使用してプレートを５９０及び７５０ｎｍにおける読取値により分析した。第１の値（Ａ590）は酸化還元色素の最高の吸収ピークを示しており、第２の値（Ａ750）はバックグラウンドノイズの測定値を示していた。ウェル毎に、相対吸光度（Ａ590-750）を計算した。
【００３８】
結果
表現型１細胞の代謝所見は特有のプロファイルを示し、これらのサンプルにおいて検出された分子異常は、ＡＳＤ表現型１で予測されるＮｒｆ２及びＮｒｆ２シグナル伝達経路の活性化と一致し、結局のところ、表現型１で予測される異常と一致した。
【００３９】
表現型１細胞における抗酸化活性の増加の明確な証拠について、表１に示す。細胞が高エネルギー産生を促進する代謝エフェクターに暴露された時は常に（グラフのＹ軸上における曲線下領域ＡＵＣ）、非表現型１及び対照群の細胞は高いＮＡＤＨレベルを産生していたが、表現型１細胞はＮＡＤＨ産生の較差が小さく安定したプロファイルを保持していた。
【００４０】
ベースラインレベルよりも多くのエネルギーを産生するため、ヒトの細胞は、好気性代謝の速度を上げる必要がある。この好気性代謝は、主にミトコンドリア内で起こり、酸化反応に基づくものであるが、この酸化反応において、しばしば副産物として活性酸素種（ＲＯＳ）が生じる。細胞の抗酸化活性は、構成的に活性化されたＮｒｆ２シグナル伝達経路が原因となり、表現型１細胞内で増加する。Ｎｒｆ２は、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素１）、ＨＯ−１（ヘムオキシゲナーゼ１）、ＧＣＳ（グルタミン酸−システインリガーゼ触媒サブユニット）等の一連の抗酸化及び解毒遺伝子、及び、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、カタラーゼ等のフリーラジカルスカベンジャーをコードする遺伝子を活性化する（Dreger et al., Nrf2-dependent upregulation of antioxidative enzymes: a novel pathway for proteasome inhibitor-mediated cardioprotection.（抗酸化酵素のＮｒｆ２依存の上方制御：プロテアソーム阻害剤を介する心保護の新規な経路） Cardiovasc Res, 2009. 83(2): p. 354-61; Higgins et al., Transcription factor Nrf2 mediates an adaptive response to sulforaphane that protects fibroblasts in vitro against the cytotoxic effects of electrophiles, peroxides and redox-cycling agents.（転写因子Ｎｒｆ２による、求電子剤、過酸化物及び酸化還元サイクリング剤の細胞毒性効果から線維芽細胞を生体外で保護するスルホラファンへの適応応答の仲介） Toxicol Appl Pharmacol, 2009. 237(3): p. 267-80; Shin et al. Role of the Nrf2-ARE pathway in liver diseases.（Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路の肝疾患における役割） Oxid Med Cell Longev, 2013. 2013: p. 763257）。したがって、Ｎｒｆ２抗酸化活性の主要な影響は、ＲＯＳ及びミトコンドリアの有酸素代謝にある。Ｎｒｆ２は酸化反応の阻害を促進し、ミトコンドリアの好気性代謝によってエネルギー産生を低下させる。このことは、表現型１により産生されるＮＡＤＨのレベルが低いことに反映され、本明細書に記載される代謝アッセイにおいて観察される。
【００４１】
ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路は、Ｎｒｆ２シグナル伝達経路によって調節される。図１（曲線下の面積、ＡＵＣ）及び表１（エンドポイントの吸光度値）は、リンパ芽球の膜で発現される受容体チロシンキナーゼ（ＴＲＫ）に結合することによってＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲを選択的に標的とする２つの成長因子であるＦＧＦ−１又はｈＧＨに細胞が曝露された際に、ＡＳＤ表現型１細胞におけるＮＡＤＨの産生が、ＴＤ及び非表現型１細胞と比較して有意に減少していることを示す。逆に、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）や血小板由来成長因子ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）のような、ＬＣＬのＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路をさほど特異的に標的としない成長因子に細胞が曝露された際には、有意差は検出されなかった。
【００４２】
Ｎｒｆ２はＮＦ−κＢに刺激効果を及ぼし、Ｔｈ１サイトカインの産生を増強することによって、炎症誘発性プロファイルを誘発する。図１に示すように、表現型１細胞は、ＩＬ−１やＩＬ−６等のＴｈ１サイトカインに暴露された際には、ＩＬ−２やＩＬ−８等のＴｈ２サイトカインにさらされた際よりも、他の細胞より有意に低いレベルのＮＡＤＨを産生する。同様の傾向は、細胞がＴｈ１サイトカインＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αに曝露された際に、ＰＭ−Ｍ８プレートにおいて認められた。
【００４３】
これら全ての結果は、ＡＳＤ非表現型１患者と比較した際の、ＡＳＤ表現型１に特異的な代謝プロファイルを示している。この代謝フィンガープリントによって、特定のＡＳＤ表現型１の存在が検証される。
【００４４】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【００４５】
実施例３
以下を示す特発性ＡＳＤの人を、表現型１と分類した：
・少なくとも１つの必須特性：
・対照集団に対して拡大した頭のサイズ。生後２４ヶ月の間における平均頭囲（ＨＣ）より大きい標準偏差及び／又は外形的な巨頭症（頭囲が一般集団の９７％より大きい）のうち少なくとも１つを特徴とする。
及び／又は
・感染事象の期間、乳歯の喪失、外傷後傷害、内因性及び外因性の温度変化によって増強される、自閉症中核症状の周期的な悪化。
並びに、
・以下の２０の特徴の少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つ：
・対照母集団に対して高速な毛髪及び爪の成長。
・同じ民族の人と比較して、より明るい色の肌及び眼を示す高い傾向。
・同じ民族の対照被験者よりも実質的に長いまつげ。
・色素脱失した皮膚の少なくとも５つの不連続領域。特に患者の背中に現れる。
・感染事象の期間、乳歯の喪失、外傷後傷害又は体温変化の内因性要因及び外因性要因の間における浮腫の徴候；より詳細には、眼窩周囲領域及び額領域に位置する顔面浮腫
・同じ年齢及び民族の定型発達者と比較した、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の高い血中レベル。
・先天性泌尿生殖器系奇形及び／又は排尿開始機能障害。
・膝蓋骨の過形成。
・下痢の頻発。特に５歳より前。
・耳鳴りの頻発。
・脳梁の薄化又は欠損。
・血液悪性腫瘍（特に、骨髄腫及び急性前骨髄球性白血病だが、これらに限定されない）の家族歴陽性。
・リウマチ性関節炎の家族歴陽性。すなわち、２世代続けて少なくとも２人の影響を受けた第一度近親者。
・アセチルサリチル酸又はその誘導体に応答する有害事象。
・虹彩欠損。片側又は両側のいずれか。
・睡眠多汗症。特に乳児、幼児及び小児（幼児期及び小児期における夜間発汗の著しい増加。ベッドリネンの交換が必要になると近親者より報告されることが多い）。
・Ｔｈ１／Ｔｈ２比の増加（すなわち、インターロイキン１β、インターロイキン６、ＴＮＦ−α、インターフェロンγのレベル上昇）。
・先天性の副脾又は重複した脾臓。
・乳糜槽の先天性欠損。
・妊娠中にウイルス性又は細菌性感染症に罹患した母親及び／又は生物学的に確認された母親の妊娠中の免疫活性化の報告歴。
【００４６】
スルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物の効果を、ＡＳＤに罹患しており、以前に表現型１患者として分類されていた５人において、観察及び定量化した。
【００４７】
手順
ブロッコリースプラウト抽出物の投与前後にＡＳＤ患者を評価することにより構成される手順について説明する。抽出物は、スルホラファンの収量が高いことが知られている選択されたブロッコリーの種子から調製した。このブロッコリーの種子は、表面消毒されて、商業用発芽施設内にて制御された光と湿度の条件下で３日間成長（発芽）させられたものである。沸騰水抽出物を調製して、ろ過、冷却し、酵素のミロシナーゼ（大根スプラウト）で処理して、前駆体のグルコシノレートをイソチオシアナートへと変換した。患者の行動評価は、スルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物の投与前、投与中及び投与後に行った。患者のベースライン評価は、標準の臨床エンドポイント（ＡＤＩ−ＲサブスケールＡＤＩ−ＳＩ、ＡＤＩ−Ｃ及びＡＤＩ−ＲＩ）を使用して行った。
【００４８】
負荷レジメンは、スルホラファンの１日の総投与量４μｍｏｌ／ｋｇに対応するブロッコリースプラウト抽出物の投与量で、１日の間に３回投与することにより構成した。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
計算ステップ：
・乾燥ブロッコリー抽出物５０ｇ中における推定スルホラファン含有量：１０２〜１８６ｍｇ
・スルホラファン１ｍｇを得るための乾燥ブロッコリー抽出量：２７０〜５００ｍｇ
・スルホラファンの分子量：１７７．２９ｇ／ｍｏｌ
・スルホラファンのミリグラムあたりのモル数：５．６４μｍｏｌ
・スルホラファン１μｍｏｌを得るための乾燥ブロッコリー抽出物の推定量：４８〜８９ｍｇ
・乾燥ブロッコリー抽出物の新鮮な生後３日目のブロッコリーの芽に対する相対重量：１０％（９０％は水）
・スルホラファン１μｍｏｌを得るための新鮮な３日齢のブロッコリースプラウトの推定量：４８０〜８９０ｍｇ
ベースラインスコア及び負荷後の試験スコアの評価は、ＡＳＤ臨床評価の実施を豊富に経験した２人の経験豊富な臨床医によって行った。ベースライン時に又は負荷試験での投与後に、試験サブスケールにおけるスコアが異なる場合、最も低い重症度スコアを保持した。臨床試験の評価は、負荷試験での投与の３日目に行った。行動的アウトカムの測定：（主要有効性エンドポイント）：ＡＢＣ、ＳＲＳ；ＣＧＩ−Ｓ、ＣＧＩ−Ｉ及びＡＤＩ−Ｒ（ＡＤＩ−ＳＩ、ＡＤＩ−Ｃ、ＡＤＩ−ＲＩ）
【００５１】
表現型１の患者であることを確認するために、患者にスルホラファンを投与することにより負荷を与えた（challenging）後、以下の主要アウトカムの少なくとも１つを達成する必要があった。
・ＡＤＩ−Ｒ：ＡＤＩ−Ｒスコア（限定されないが、好ましくはサブスケールＡＤＩ−ＳＩ、ＡＤＩ−Ｃ）の少なくとも１０％の増加。
・ＣＧＩ−Ｉ：患者の中等度悪化又は著名悪化との評価。
【００５２】
結果
患者背景（demographics）：男性患者５人。自閉症スペクトラム障害の厳格なＤＳＭ−５基準を使用して経験豊富な臨床精神科医によって診断された。患者５は神経疾患の病歴があり、リチウム（併用薬）を用いて治療された。
【００５３】
全ての患者が、非症候性タイプの自閉症スペクトラム障害に罹患していると分類された。いずれの患者も、自閉症に関係する既知の単一遺伝子障害若しくはコピー数多型（ＣＮＶ）、又は、その他の構造的変異を有するとは報告されていなかった。４人の患者は機能的言語を使用したが、残りの１人は使用しなかった（患者２）。したがって、その最後の被験者には、「コミュニケーションにおける質的異常」ドメインのＢ１及びＢ４モジュールのみを行った。
【００５４】
全ての患者が、ＡＳＤ表現型１基準に適合した。
【００５５】
ＡＳＤの既存の臨床診断を検証した全ての被験者において、全てのサブドメインのＡＤＩ−Ｒのスコアが自閉症カットオフ値を上回っていた（ＡＤＩ−Ｒ−ＳＩカットオフ値＝１０、ＡＤＩ−Ｒ Ｃ 言語的カットオフ値＝８、非言語的カットオフ値＝７；ＡＤＩ−Ｒ−ＲＩカットオフ値＝３）。ＡＤＩ−Ｒベースライン評価は、介入の変更又は補助（医薬品及び／又は行動）の前に行った。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
以下の標準化されたスコアの概要によれば、５人全ての患者におけるブロッコリースプラウト抽出物（スルホラファン）投与の効果が示されている。
【００５８】
【表４】
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【００５９】
負荷試験のコンテクストにおけるブロッコリースプラウト抽出物（スルホラファン）を投与した患者の５人全てにおいて、ＡＤＩ−ＲサブスケールＡＤＩ−ＳＩ、ＡＤＩ−Ｃ及びＡＤＩ−ＲＩの著しい悪化が報告された。経験豊富な臨床医及び親／主介護者に報告された観察によって、ブロッコリースプラウト抽出物（スルホラファン）の３日間投与後におけるＣＧＩ−Ｉスコアを決定した。
【００６０】
【表５】
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【国際調査報告】
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