(57)【要約】  本発明により、天然の血管と取り替えるか、またはバイパスを作るのに適しており、静脈内皮細胞を含む移植片と比べて増大した長期開存率および低下した白血球接着を示すヒト動脈内皮細胞を播種したポリマー性血管移植片が提供される。ヒト動脈内皮細胞を播種した血管移植片を生成する方法およびその治療用途も記載される。
2021534906.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）内皮細胞付着剤により少なくとも部分的に被覆されたポリマー性基材、および
（ｂ）前記被覆されたポリマー性基材に接着したヒト動脈内皮細胞
を含む血管移植片。
【請求項２】
ポリマー性基材が延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ＰＧＬＡ（ポリ乳酸−コ−グリコール酸）、ポリウレタン、ポリジオキサノン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、絹、脱細胞化された足場、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）マトリックスタンパク質ベース足場、ヒアルロン酸、キトサン、およびポリヒドロキシアルカノエートから選択される、請求項１に記載の移植片。
【請求項３】
内皮細胞付着剤がドーパミン、フィブリン接着剤、ＲＧＤペプチド、ビトロネクチン、およびラミニンの１種以上を含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項４】
血管移植片が、静脈内皮細胞が播種されたポリマー性基材と比べて低下した白血球接着を示す、請求項１に記載の移植片。
【請求項５】
血管移植片が、ヒト動脈内皮細胞で被覆されてないポリマー性基材と比べて、
（ａ）低下した血栓形成、
（ｂ）増大した長期の開存性、および
（ｃ）低下した血小板付着
の１以上を示す、請求項１に記載の移植片。
【請求項６】
ヒト動脈内皮細胞がヒト多能性幹細胞から生産される、請求項１に記載の移植片。
【請求項７】
ヒト多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項６に記載の移植片。
【請求項８】
人工多能性幹細胞が患者に対して自家性である、請求項７に記載の移植片。
【請求項９】
人工多能性幹細胞が患者に対して少なくとも５０％ＨＬＡ適合している、請求項７に記載の移植片。
【請求項１０】
ヒト動脈内皮細胞が血管移植片の受容者に対して非免疫原性である、請求項１に記載の移植片。
【請求項１１】
ヒト動脈内皮細胞が、ベータ２−ミクログロブリン遺伝子を発現しないように１以上の遺伝子改変を含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項１２】
ヒト動脈内皮細胞が、クラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子によりコードされる１種以上のタンパク質を発現しないように１以上の遺伝子改変を含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項１３】
ヒト動脈内皮細胞が、ＣＤ５８ポリペプチドを発現しないように１以上の遺伝子改変を含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項１４】
ヒト動脈内皮細胞が、ＨＬＡ−Ｅ（ＥＤＩＭＥＲ）およびＣＤ４７の一方または両方を過剰発現するように１以上の改変を含む、請求項１に記載の移植片。
【請求項１５】
細胞が播種された血管移植片を形成する方法であって、
（ａ）ポリマー性基材を内皮細胞付着剤で被覆し；
（ｂ）被覆されたポリマー性基材にヒト動脈内皮細胞を播種し；および
（ｃ）被覆され播種されたポリマー性基材を約２〜約２０日培養し、これにより細胞が播種された血管移植片を得る
ことを含む、方法。
【請求項１６】
１種以上の内皮細胞付着剤で被覆する前にポリマー性基材を脱ガスすることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
脱ガスすることが、ポリマー性基材をアセトンおよびエタノール中で洗浄する、ポリマー性基材を有機溶媒中で洗浄する、または真空を適用することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリマー性基材が延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ＰＧＬＡ（ポリ乳酸−コ−グリコール酸）、ポリウレタン、ポリジオキサノン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、絹、脱細胞化された足場、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）マトリックスタンパク質ベース足場、ヒアルロン酸、キトサン、およびポリヒドロキシアルカノエートから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
細胞が播種された血管移植片を冷凍保存溶液に接触させ、接触させた細胞が播種された血管移植片を凍結することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
凍結することが１℃〜約−１９６℃の温度で貯蔵することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＥＣ細胞が播種された血管移植片を製作する方法であって、
ポリマー性基材の少なくとも一部分を１種以上の内皮付着剤で被覆し；
被覆されたポリマー性基材にヒト動脈内皮細胞を接触させることにより、白血球またはその細胞断片に対して実質的に非接着性のＡＥＣが播種された血管移植片を形成する
ことを含む、方法。
【請求項２２】
ポリマー性基材が延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ＰＧＬＡ（ポリ乳酸−コ−グリコール酸）、ポリウレタン、ポリジオキサノン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、絹、脱細胞化された足場、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）マトリックスタンパク質ベース足場、ヒアルロン酸、キトサン、およびポリヒドロキシアルカノエートから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１種以上の内皮細胞付着剤で被覆する前にポリマー性基材を脱ガスすることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
脱ガスすることが、ポリマー性基材をアセトンおよびエタノール中で洗浄する、ポリマー性基材を有機溶媒中で洗浄する、または真空を適用することを含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１８年８月３１日に出願された米国出願第６２／７２５，４６９号の優先権の利益を主張するものであり、当該出願は参照によりその全体が明記されているごとく本明細書に組み込まれる。
連邦政府資金による研究または開発に関する陳述
本発明は国立衛生研究所により授与されたＨＬ１３４６５５による政府支援の下でなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
心臓血管手術における常習的な処置は、下流組織へのより適切な血流を提供するために血管を取り替えるかまたはバイパスを作ることである。冠状動脈バイパス術において、動脈移植片は静脈移植片よりずっと良好な長期開存率を有する。しかしながら、手術が多数の移植片を必要とする場合、患者は適切な追加の動脈移植片を欠くので静脈が使用されることが多い。末梢動脈障害を処置するバイパス術において、バイパスを作るべき動脈は一般に大きいので適切な動脈移植片が手に入らない。ここでも、比較的高い長期の閉塞率にも関わらず静脈移植片が使用されることが多い。
多くの重大な不利益はバイパス術のための患者自身の血管の移植に関連する。血管を切除し、移植用に調製するのに必要とされる時間は患者の麻酔への曝露を増やし、術後感染症の可能性を増大させ、処置の費用を増大する。多くの患者にとって、適切な動脈または静脈はどうしても、血管障害または以前の手術のために移植に利用できない。
患者自身の血管を移植片として使用することの制限のため、合成材料から血管移植片を作成する数多くの試みがなされている。合成移植片は一般に最も大きい直径の血管（例えば、大動脈）が関与する処置ではうまくいくが、合成移植片に対する長期開存率は血管の大きさが小さくなるにつれて低下する。脚の末梢動脈障害の場合、人工移植片は適切な静脈移植片が入手できないとき最後の手段として使用される。この位置の人工移植片は静脈移植片より高い割合で閉塞するからである。さらにより小さい心臓の動脈（約３〜５ｍｍの直径の血管）が関与するバイパス術の場合、合成移植片は一般に使用されないような高い割合で機能しなくなる。
【０００３】
１つのグループが、合成ｅＰＴＦＥ材料を患者自身の静脈内皮細胞でライニングすることにより、末梢動脈障害におけるｅＰＴＦＥ移植片の長期開存率を静脈移植片の長期開存率とほぼ等しくなるほど改良することができることを見出した（Ｄｅｕｔｓｃｈら、１９９９年）。しかしながら、この手段では、別の手術で患者の静脈を摘出し、静脈内皮細胞を培養して増やし、ｅＰＴＦＥ管を静脈内皮細胞でライニングし、延長した培養中にｅＰＴＦＥ上の細胞を成熟させ、最後にｅＰＴＦＥ／静脈内皮細胞移植片を患者に移植して戻す必要がある。静脈摘出から移植までの全手順には約１か月かかる（Ｄｅｕｔｓｃｈら、２００９年）。このように、この手順は費用がかかり遅い。末梢動脈障害の患者の約１／３は緊急に治療介入を必要とし、ｅＰＴＦＥ／自己移植静脈内皮細胞移植片の生産に必要な時間である３０日を待つことができない。そして、免疫拒絶のため、この手法は個人患者を処置することのみができ、多数の患者の処置にスケールアップすることができない。最後に、静脈内皮細胞をライニングしたｅＰＴＦＥ移植片の標準的なｅＰＴＦＥ移植片と比べた開存率の改良は印象的であったとはいうものの、その比率は動脈移植片ではなくやっと静脈移植片の長期開存率に近づいただけである。
動脈内皮細胞は、血管移植片の長期開存性を維持するのに極めて重大であるより低い白血球接着およびより高い酸化窒素（ＮＯ）産生のような重大な生物学的特性において静脈内皮細胞と異なる。初代動脈内皮細胞を患者から採集することは医学的に実行可能でなく、初代動脈内皮細胞はインビトロ培養の際に脱分化を受けるため、動脈内皮細胞でライニングされたポリマー性移植片はこれまで臨床的に使用されたことがない。従って、当技術分野では、スケーラブルであり、オンデマンドの製品として利用可能であり、多数の患者に適している、動脈内皮細胞を含む改良されたポリマー性の血管移植片に対するニーズが残されている。
【発明の概要】
【０００４】
第１の態様において、（ａ）少なくとも部分的に内皮細胞付着剤により被覆されたポリマー性基材および（ｂ）前記被覆されたポリマー性基材に接着したヒト動脈内皮細胞を含むかまたは本質的にそれらからなる血管移植片が本発明により提供される。ポリマー性基材は、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ＰＧＬＡ（ポリ乳酸−コ−グリコール酸）、ポリウレタン、ポリジオキサノン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、絹、脱細胞化された足場、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）マトリックスタンパク質ベース足場、ヒアルロン酸、キトサン、およびポリヒドロキシアルカノエートから選択することができる。内皮細胞付着剤はドーパミン、フィブリン接着剤、ＲＧＤペプチド、ビトロネクチン、およびラミニンの１種以上を含むことができる。血管移植片は静脈内皮細胞が播種されたポリマー性基材と比べて低減した白血球接着を示すことができる。血管移植片はヒト動脈内皮細胞で被覆されてないポリマー性基材と比べて（ａ）低減した血栓形成、（ｂ）増大した長期開存性、および（ｃ）低下した血小板粘着の１以上を示すことができる。ヒト動脈内皮細胞はヒト多能性幹細胞から生成させることができる。ヒト多能性幹細胞は人工多能性幹細胞であることができる。人工多能性幹細胞は患者に対して自家性であることができる。人工多能性幹細胞は患者に少なくとも５０％ＨＬＡ適合していることができる。ヒト動脈内皮細胞は血管移植片の受容者に対して非免疫原性であることができる。ヒト動脈内皮細胞は、ベータ２−ミクログロブリン遺伝子を発現しないように１以上の遺伝子改変を含むことができる。ヒト動脈内皮細胞は、クラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子によりコードされる１種以上のタンパク質を発現しないように１以上の遺伝子改変を含むことができる。ヒト動脈内皮細胞は、ＣＤ５８ポリペプチドを発現しないように１以上の遺伝子改変を含むことができる。ヒト動脈内皮細胞は、ＨＬＡ−Ｅ（Ｅｄｉｍｅｒ）およびＣＤ４７の一方または両方を過剰発現するように１以上の改変を含むことができる。
【０００５】
別の態様において、細胞が播種された血管移植片を形成する方法が本発明により提供され、この方法は、（ａ）ポリマー性基材を内皮細胞付着剤で被覆し；（ｂ）被覆されたポリマー性基材にヒト動脈内皮細胞を播種し；（ｃ）被覆され播種されたポリマー性基材を約２〜約２０日培養し、これにより細胞が播種された血管移植片を得ることを含むかまたは本質的にそれらの工程からなる。方法はさらに、１種以上の内皮細胞付着剤で被覆する前にポリマー性基材を脱ガスすることを含むことができる。脱ガスはポリマー性基材をアセトンおよびエタノール中で洗浄し、ポリマー性基材を有機溶媒中で洗浄し、または真空を適用することを含むことができる。ポリマー性基材は、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ＰＧＬＡ（ポリ乳酸−コ−グリコール酸）、ポリウレタン、ポリジオキサノン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、絹、脱細胞化された足場、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）マトリックスタンパク質ベース足場、ヒアルロン酸、キトサン、およびポリヒドロキシアルカノエートから選択することができる。方法はさらに、細胞が播種された血管移植片を冷凍保存溶液に接触させ、接触させた細胞が播種された血管移植片を凍結することを含むことができる。凍結は１℃〜約−１９６℃の温度での貯蔵を含むことができる。
【０００６】
さらなる態様において、ＡＥＣ細胞が播種された血管移植片を製作する方法が本発明により提供され、この方法はポリマー性基材の少なくとも一部分を１種以上の内皮付着剤で被覆し；被覆されたポリマー性基材にヒト動脈内皮細胞を接触させることにより、白血球またはその細胞断片に対して実質的に非接着性であるＡＥＣが播種された血管移植片を形成することを含むかまたは本質的にそれらの工程からなる。ポリマー性基材は、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ＰＧＬＡ（ポリ乳酸−コ−グリコール酸）、ポリウレタン、ポリジオキサノン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、絹、脱細胞化された足場、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）マトリックスタンパク質ベース足場、ヒアルロン酸、キトサン、およびポリヒドロキシアルカノエートから選択することができる。方法はさらに、１種以上の内皮細胞付着剤で被覆する前にポリマー性基材を脱ガスすることを含むことができる。脱ガスはポリマー性基材をアセトンおよびエタノール中で洗浄し、ポリマー性基材を有機溶媒中で洗浄し、または真空を適用することを含むことができる。
【０００７】
本発明のこれらおよびその他の特徴、態様、および利点は以下の記載からより良く理解されよう。以下の記載において、好ましい実施形態になされる参照は本発明を限定することを意図しない。従って、本発明の範囲を解釈するには添付の特許請求の範囲を参照されたい。
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本明細書中に提供される組成物および方法のいくつかの態様をさらに例示するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と併せてこれらの図面の１以上を参照することによってより良く理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ−１Ｂ】接着剤で被覆された延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）に播種されたＣＤ３１+ＡＥＣを示す像である。（Ａ）ＡＥＣを１×１０6細胞／ｍｌ〜１．５×１０6細胞／ｍｌの細胞密度でｅＰＴＦＥに播種した。染色を行って生細胞を検出した（緑色；細胞透過性色素カルセインＡＭで染色）。細胞密集度の統計データは平均±ＳＤとして示す。ｎ＝３。（Ｂ）コラーゲンＩ、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）ペプチド、フィブロネクチン（ＦＮ）、ラミニン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、およびＶＴＮ（ビトロネクチン）で被覆されたｅＰＴＦＥに播種されたＣＤ３１+（赤色）ＡＥＣ。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）蛍光染色を用いて核を可視化した。細胞密集度の統計データは平均±ＳＤとして示す。ｎ＝３。
【図２Ａ−２Ｄ】ドーパミンコーティングが延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）基材に対するヒト動脈内皮細胞（ＡＥＣ）の接着を改良することを示している。（Ａ）ドーパミンコーティングありまたはなしのｅＰＴＦＥ。（Ｂ）ＡＥＣを１×１０6細胞／ｍｌ〜１．５×１０6細胞／ｍｌの細胞密度でｅＰＴＦＥに播種した。染色を行って生細胞（緑色；細胞透過性色素カルセインＡＭで染色）および死細胞（赤色；核酸染色エチジウムホモダイマー−１で染色）を検出しカウントした。（Ｃ）コントロールおよびドーパミンで被覆された基材上の生および死ＡＥＣの統計学。データは平均±ＳＤとして示す。＊：Ｐ＜０．０５、ｎ＝３。（Ｄ）ドーパミンおよびフィブリン接着剤で被覆されたｅＰＴＦＥに対するＡＥＣ接着の比較。
【図３Ａ−３Ｂ】白血球接着アッセイの結果を示す。（Ａ）ドーパミンで被覆されたｅＰＴＦＥに播種されたＡＥＣおよびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）。播種されたｅＰＴＦＥ基材を３日間培養した後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαまたはコントロールで４〜５時間処理した。白血球を２μＭのカルセインＡＭに約１５分曝露することにより染色した。カルセインＡＭで標識された白血球を次いで約１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度でＡＥＣおよびＨＵＶＥＣが播種されたｅＰＴＦＥに添加した。カルセインＡＭで標識された白血球細胞懸濁液およびｅＰＴＦＥの両方を０．５ｍｌの管に入れ、その管を６０ｒｐｍで１時間回転させた。１時間後、細胞が播種されたｅＰＴＦＥを新鮮な培地で３回穏やかに洗浄した後固定し、画像化のためにＤＡＰＩで染色した。（Ｂ）白血球接着アッセイの統計学。白血球を免疫染色により検出し、各々の像をカウントした。データは平均±ＳＤとして示す。＊：Ｐ＜０．０５、ｎ＝３。
【図４Ａ−４Ｃ】ｅＰＴＦＥの脱ガスが細胞凝集体形成を抑え、ＣＤ３１発現および細胞密度を改良することを示す。（Ａ）動脈内皮細胞を脱ガス処理がされたかまたはされてないｅＰＴＦＥに播種した。２種類のｅＰＴＦＥ、即ち１および２を使用した。細胞播種の２日および８日後免疫染色のために試料を収集した。矢印は、脱ガス処理後は検出できなかった細胞凝集体を示す。（Ｂ）細胞密度の統計学。播種された基材上の細胞密度は脱ガスの前および８日後に核の数を比較することにより決定した。データは平均±ＳＤとして示す。＊：Ｐ＜０．０５、ｎ＝４。（Ｃ）ＣＤ３１の相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）の統計学。データは平均±ＳＤとして示す。＊：Ｐ＜０．０５、ｎ＝４。
【図５Ａ−５Ｃ】凍結培地の分析を示す。（Ａ）グリセロールはＡＥＣ−ｅＰＴＦＥを凍結するのに適していない。（Ｂ）ＡＥＣ−ｅＰＴＦＥを凍結するためのＲｅｃｏｖｅｒｙ（商標）細胞培養凍結培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、１０％のＤＭＳＯ、および血清の比較。（Ｃ）ＤＭＳＯ濃度の最適化。無血清およびＸｅｎｏフリー培地がＡＥＣ−ｅＰＴＦＥを凍結するのに使用され、これは１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦＡ、１０μＭのＳＢ４３１５４２、５μＭのＲＥＳＶ、および２０μｇ／ｍｌのインシュリンを補充したＥ５培地により作成された。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書中で引用される、限定されることはないが特許および特許出願を含めた全ての刊行物は参照によりその全体が本出願中に明記されているかのように本明細書に組み込まれる。
本発明は、少なくともある程度、本発明者らの動脈内皮細胞が播種されたポリマー性の血管移植片の開発に基づいており、ここで血管移植片およびそれを得る方法はスケーラブルであり、オンデマンドの製品として入手可能であり、かつ様々な患者に適している。
【００１０】
Ｉ．組成物
第１の態様において、本発明により、動脈内皮細胞を含むポリマー性血管移植片が提供される。移植片は、内皮細胞付着剤により少なくとも部分的に被覆されたポリマー性基材、および被覆されたポリマー性基材に接着した動脈内皮細胞（ＡＥＣ）を含むかまたは本質的にそれらからなることができる。本明細書に記載されているように、本開示のＡＥＣが播種されたポリマー性移植片は従来のポリマー性血管移植片と比べて増大した開存性を示す。場合によって、本開示のポリマー性血管移植片と共に使用されるヒト動脈内皮細胞は、移植片受容者のＨＬＡ−および血液型に関わりなく、それを必要とする対象に移植するための普遍的なドナー細胞として役立つことができるように改変される。例えば、いくつかの実施形態において、細胞の天然のゲノムは、遺伝子操作された細胞がクラスＩＩまたはクラスＩおよびクラスＩＩの両方のいずれかの主要組織適合複合体遺伝子によりコードされるタンパク質のようなある種の細胞表面マーカーを発現しないように操作される。このように、遺伝子操作された細胞は移植片受容者のＴ細胞による攻撃を回避する可能性がより高く、結果として、受容者に対して非免疫原性である。
【００１１】
用語「移植片」および「血管移植片」は本明細書中において同義で使用されており、流体（例えば、血液）を運搬するための、従って流体と接触する（即ち、「管腔」）表面を有する人工器官として意図される任意の導管またはその一部分を指す。主として管状の形態が意図されているが、移植片はまた生きている血管の周囲の一部分を修理するのに有用な不完全な管またはシート材料であってもよい（これらの材料は一般に心臓血管パッチといわれる）。同様に、血管移植片という用語は生きている血管内に使用される管腔内移植片を含む。例えば、本発明により提供される血管移植片は移植可能な血管ステントの外面、管腔表面、または管腔表面および外面の両方の鞘またはその他の覆いとして使用してもよい。
【００１２】
本明細書で使用されるとき、用語「ＡＥＣが播種された」およびその文法上の変化形は、動脈内皮細胞が供給された基材を指す。好ましくは、用語は動脈内皮細胞（例えば、ヒトＡＥＣ）および内皮細胞接着剤を有するポリマー性血管移植片を指し、これにより播種されたポリマー性血管移植片は対象への移植に適している。
本明細書で使用されるとき、用語「開存性」は血管または血管移植片のような管の開放性の程度を指す。１００％の開存性を有する血管移植片はいかなる閉塞も障害もない。閉塞または障害の程度が増大するにつれて、血管または血管移植片の開存性は低減する。このように、血管または血管移植片の開存性は移植片の成功または失敗の代理である。場合によって、開存性は、制限なく血管移植片の移植後の日、週、月、または年の開存性を含む特定の時点で評価される。好ましくは、本開示のポリマー性血管移植片は従来のポリマー性血管移植片と比べて増大した長期開存率を示す。本明細書で使用されるとき、「長期開存性」とは、血管または移植片が移植後生理的環境で１年より長く、好ましくは３年より長く、より好ましくは５年より長く、最も好ましくは１０年以上の間開存したままであることを意味する。場合によって、本開示のＡＥＣが播種されたポリマー性血管移植片は、自己移植片に匹敵し、好ましくはより優れている開存性を示す。
【００１３】
Ａ．組成物の材料
本発明により提供されるポリマー性血管移植片は、内皮細胞付着剤により少なくとも部分的に被覆されたポリマー性基材、および前記被覆されたポリマー性基材に接着したヒト動脈内皮細胞を含む。本発明により提供される血管移植片に適切なポリマー性材料としては、制限なく、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリウレタン、ポリジオキサノン、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））、ポリエチレン、およびフルオロポリマー、例えばテトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、および延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）がある。ＰＴＦＥはテトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）のホモポリマーである。ＰＴＦＥが延伸され、膨張させられてｅＰＴＦＥになると、そのポリマー性材料は低い血栓形成を示し、管、シート、またはその他適切な移植片形状に押し出すことができるので血管用途に特に適している。場合によって、ポリマー性基材はＧＯＲＥ−ＴＥＸ（登録商標）血管移植片である。
【００１４】
場合によって、生物学的材料が本開示のポリマー性基材に適している。例えば、ポリマー性基材は、制限なく、絹、脱細胞化された構築物（例えば脱細胞化された動脈、静脈、または小腸）、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）マトリックスタンパク質ベース足場（例えばコラーゲン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、フィブリン、エラスチン）、ヒアルロン酸、キトサン、ポリヒドロキシアルカノエートを始めとする生物学的材料を含むことができる。
場合によって、本発明により提供される血管移植片に使用されるポリマー性基材は生体適合性であり、これは基材材料が移植されるかまたは身体と接触させて配置されたとき有害反応を引き起こさないことを意味する。
場合によって、ポリマー性基材は多孔性の基材である。いかなる作用機序または理論にも縛られることはないが、ポリマー性血管移植片内の細孔により、宿主細胞の移植片中への補充および統合が可能になると考えられる。例えば、ｅＰＴＦＥは高い多孔性を示し、節およびフィブリルのマトリックスを含む。フィブリルは節間の細い連結部であり、サブミクロンの大きさである。細いフィブリルは膜内により大きなねじれおよび表面積を作り出すのに使用され、ろ過効率に影響を及ぼす。場合によって、膜内のフィブリルおよび節の形状が改変されて（例えば、細孔の大きさ、細孔分布を増大または低下する）、材料の機能性をカスタマイズする。場合によって、約７μｍ〜約２０μｍのインターモーダル（ｉｎｔｅｒｍｏｄａｌ）間隔が好ましい。場合によって、ポリマー性基材はミクロ多孔性であり、即ち多孔性基材の細孔がマイクロメートル級の大きさであることを意味する。好ましくは、適切なポリマー性基材の細孔の大きさは２μｍ〜８０μｍの範囲内であり、好ましくはそれらの範囲にわたり、好ましくは３μｍ〜４０μｍの範囲内、最も好ましくは５μｍ〜３５μｍの範囲内であり、特におおよそ３０μｍである。
【００１５】
場合によって、開示されている血管移植片は実質的に管状の形状で円形または実質的に円形の横断面である。
開示されている血管移植片は実質的に管状の形状で円形または実質的に円形の横断面である。場合によって、管状構造は約２００μｍ〜約５００μｍ（例えば、約２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００μｍ）の壁厚を有する。他の場合、ポリマー性基材はポリマー性材料の平面状シートまたは「パッチ」である。かかる場合において、厚さは約０．２ｍｍ〜約１．０ｍｍ以上で広く変化し得る。
本開示のポリマー性血管移植片の様々な寸法は所望の用途に応じて変化し得る。原則として、寸法は血管移植片を取り替えるために使用されている宿主組織のものと同様である。一般に、管状の移植片は移植片の長さ全体にわたって伸びる管腔を有する。本発明により提供される血管移植片の管腔は、移植片の意図される外科用途に適したいずれかの適当な直径でよい。例えば、閉塞の発生率のより高いもの（前室間動脈、右冠状動脈、回旋動脈）を含めて冠状動脈の平均管腔寸法は文献に十分に記載されている。場合によって、ポリマー性基材は約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍ（例えば、約０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｍ）の内径を有する。血管移植片は、移植片の意図される外科用途に適したいずれかの適当な長さでよい。通例、移植片は取り替えられる動脈または静脈の長さより少し長いはずである。
場合によって、本発明により提供される血管移植片に使用されるポリマー性基材は疎水性の膜であり、即ち流体（例えば、生物学的流体）による濡れに抵抗し、生物学的流体により化学的に変化したり劣化したりしないことを意味する。場合によって、疎水性の膜は流体に対して不透過性であるが、膜を通過するガスの流れは許容する。
【００１６】
場合によって、ポリマー性基材は内皮細胞接着剤により少なくとも部分的に被覆される。本開示の血管移植片に有用な内皮細胞接着剤としては、制限なく、ドーパミン、フィブリン、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）−ペプチド、および細胞外マトリックスタンパク質、例えばビトロネクチンおよびラミニン、または２種以上の接着剤の混合物がある。従来、血液凝固タンパク質フィブリン（Ｆｂ）のネットワーク（時に「フィブリン粘着剤」または「フィブリン接着剤」といわれる）が血管移植片を被覆するのに使用されて来ている。例えば、Ｚｉｌｌａら（１９８９年）は、フィブリン接着剤を用いて改良された静脈内皮細胞のｅＰＴＦＥへの播種を記載している。しかしながら、フィブリン接着剤法は多数の工程を含み、従って臨床応用にスケールアップするのが困難である。図２Ａ−２Ｂを参照して、本発明者らは、他の細胞接着剤がポリマー性基材に対して同等なレベルのＡＥＣ接着を達成することができるということを示した。有利なことに、これらの作用剤でポリマー性基材を被覆するには単一の工程を要する。他の研究者は、Ｆｂ（ｐ＜０．００１）またはフィブリンおよびフィブロネクチンの混合物（ｐ＜０．０５）で被覆されたものと比べて、ラミニンで被覆された人工血管に対する改良された静脈内皮付着を報告している。Chlupac et al., Physiol. Res. 63:167-177, 2014参照。
【００１７】
好ましくは、内皮細胞接着剤は非免疫原性である。例えば、内皮細胞接着剤は好ましくは非ヒト動物に由来するいかなる成分も含まず、従って異種の物質を含まない（「ゼノフリー」）。本明細書で使用されるとき、用語「異種の物質を含まない」および「ゼノフリー」は同義で使用され、培養細胞または材料の受容者の種以外の種のいかなる細胞または細胞産物も含まない材料（例えば、細胞基質、培養培地）または細胞培養条件を指す。
【００１８】
場合によって、内皮細胞接着剤はドーパミンを含み、ここでドーパミンは約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０ｍｇ／ｍｌのドーパミン）の濃度で緩衝液に溶解される。内皮細胞接着剤がＲＧＤペプチドを含む場合、ペプチドは約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭのＲＧＤペプチド）の濃度で緩衝液中に提供され得る。場合によって、内皮細胞接着剤はビトロネクチンを含む。場合によって、ビトロネクチンは約１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ（例えば、約１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０μｇ／ｍｌのビトロネクチン）の濃度で緩衝液中に提供される。本明細書で使用されるとき、用語「ビトロネクチン」とは、ビトロネクチンポリペプチドまたはその断片もしくはペプチドを指し、組換えビトロネクチンポリペプチドおよびペプチド（例えば、組換えヒトビトロネクチン）およびビトロネクチンポリペプチド変異体、例えば参照によりその全体が明記されているかのように本明細書に組み込まれる米国特許第９，１３３，２６６号に記載されているものを包含する。場合によって、内皮細胞接着剤はラミニンを含む。場合によって、ラミニンは約１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ（例えば、約１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０μｇ／ｍｌのラミニン）の濃度で緩衝液中に提供される。本明細書で使用されるとき、用語「ラミニン」とは、ラミニンポリペプチドまたはその断片もしくはペプチドを指し、組換えラミニンポリペプチドおよびペプチド（例えば、組換えヒトラミニン）を包含する。
【００１９】
場合によって、ポリマー性基材は、内皮細胞接着剤を含む溶液で部分的もしくは完全に被覆するかまたはその溶液に約４〜約２４時間浸漬することができる。内皮細胞接着剤溶液への浸漬による被覆は任意の適当な温度、例えば制限なく４℃、２５℃（室温）、または３７℃で行うことができる。好ましくは、被覆されたポリマー性基材は使用の前に蒸留水または緩衝液で濯ぐ。
場合によって、内皮細胞接着剤で少なくとも部分的に被覆する前にポリマー性基材材料を脱ガスするのが有利である。後述の実施例に記載するように、本発明者らは、使用前にポリマー性基材を脱ガスしたとき、低下した細胞凝集体の形成、改良された細胞密度、および改良された内皮接着剤による被覆を示した。脱ガスは当技術分野で公知の方法により行うことができる。実施例に記載されるように、ポリマー性基材は一連のアセトンおよびエタノール洗浄で脱ガスすることができる。場合によって、脱ガスは、記載されているように、しかしアセトンの代わりにある有機溶媒を用いて行われる。他の場合、使用前に基材に高度の真空を適用して脱ガスすることができる。
【００２０】
場合によって、動脈内皮細胞は脱ガスされ被覆された（例えば、部分的または完全に被覆された）ポリマー性基材に約０．５×１０6細胞／ｍｌ〜約３×１０6細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。場合によって、約１×１０6〜約１．５×１０6細胞／ｍｌの密度のＡＥＣが調製されたポリマー性基材に播種される。
ＡＥＣは、ポリマー性基材に播種するための任意の適当な細胞培養培地に入れて提供することができる。例えば、ＡＥＣはゼノフリー、無血清、かつアルブミンフリーである化学的に定義された細胞培養培地に入れて提供することができる。本明細書で使用されるとき、用語「化学的に定義された培養条件」、「十分に定義された、成長因子を含まない培養条件」、および「十分に定義された条件」は、各々の培地成分の種類と量が知られており、支持する表面の種類と量が知られているということを示す。本明細書で使用されるとき、「無血清」とは、培地が血清を含有しないこと、または本質的に血清を含有しないことを意味する。例えば、本質的に無血清の培地は約１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または０．１％未満の血清を含有することができる。本明細書で使用されるとき、用語「アルブミンフリー」とは、使用される培養培地があらゆる形態（例えば血清代替物）の添加されたアルブミン、例えば制限なくウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはあらゆる形態の組換えアルブミンを含有しないことを示す。好ましくは、ヒトＡＥＣは、いかなる異種の物質も含まない、即ち非ヒト動物に由来するいかなる成分も含まない化学的に定義された細胞培養培地に入れてポリマー性基材に播種される。
【００２１】
場合によって、播種は、ＡＥＣの懸濁液を管状血管移植片の管腔内に注入し、移植片を回転装置に入れることによって行われる。場合によって、播種に続いて、新鮮な培地を入れた培養フラスコ中で回転することなく、例えば室温または好ましくは３７℃のような細胞増殖に適した任意の温度で播種された基材の熟成を行う。例えば、場合によって、播種に続いて、新鮮な培養培地を入れた培養フラスコ中で、回転することなく３７℃の湿ったインキュベーター内において２〜３日熟成させる。場合によって、ＡＥＣが播種された移植片は５％ＣＯ2の存在下で培養される。
【００２２】
場合によって、ポリマー性基材にＡＥＣを播種するための細胞培養培地にＲｈｏ−Ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含ませることが適当であり得る。ＲＯＣＫ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤は、平板効率ならびに単細胞および細胞の小さい凝集体の生存能力を増大させることが知られている。例えば、参照によりその全体が明記されているかのように本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０１７１３８５号；およびWatanabe K, et al., “A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells,” Nat. Biotechnol. 25:681-686 (2007)参照。本発明で使用するのに適したＲＯＣＫ阻害剤としては、限定されることはないが、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン二塩酸塩（非公式名：Ｈ−１１５２）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ピペラジン塩酸塩（非公式名：ＨＡ−１００）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（非公式名：Ｈ−７）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−３−メチルピペラジン（非公式名：ｉｓｏ  Ｈ−７）、Ｎ−２−（メチルアミノ）エチル−５−イソキノリン−スルホンアミド二塩酸塩（非公式名：Ｈ−８）、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（非公式名：Ｈ−９）、Ｎ−［２−ｐ−ブロモ−シンナミルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（非公式名：Ｈ−８９）、Ｎ−（２−グアニジノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド塩酸塩（非公式名：ＨＡ−１００４）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（非公式名：ＨＡ−１０７７）、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（非公式名：ｇｌｙｃｙｌ  Ｈ−１１５２）および（＋）−（Ｒ）−ｔｒａｎｓ−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（非公式名：Ｙ−２７６３２）がある。キナーゼ阻害剤は、細胞が生存し続け、表面に付着したままであるように十分高い濃度で提供することができる。ＡＥＣ培養培地に含まれるとき、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は約３μＭ〜約１０μＭ（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０μＭのＹ−２７６３２）であることができる。
【００２３】
Ｂ．組成物用の細胞
心臓血管インターベンションを必要とする患者からの初代動脈内皮細胞の採集は医学的に実行不可能であり、初代動脈内皮細胞は培養中に脱分化するので、動脈内皮細胞がライニングされたポリマー性移植片はこれまで臨床的に用いられたことがない。従って、本発明により提供されるＡＥＣが播種されたポリマー性移植片は以前に記載された細胞が播種された人工血管より優れている。
ＡＥＣは本明細書に記載されているように細胞のインビトロでの特有の発現プロフィールおよび機能的属性に基づいて静脈内皮細胞および内皮前駆細胞を含めた他の細胞型と区別できる。特に、動脈内皮細胞は、動脈の高流量高圧の環境に適応し、静脈内皮細胞と区別させる明白に異なる生理的特性を示す。静脈内皮細胞と比較して、動脈内皮細胞はより高いレベルの亜酸化窒素を産生し、剪断応力に対してよりしっかりと反応し、より高い代謝率を示し、白血球により弱く接着する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０２４４７１９号参照。静脈内皮細胞と比較して動脈内皮細胞に付着する白血球の低下した能力は、炎症およびその結果としての筋内膜細胞（ｍｙｏｉｎｔｉｍａｌ  ｃｅｌｌ）の増殖が移植片の閉塞（即ち、開存性の損失）および不具合の重大な要因となるので特に重要である。動脈内皮細胞は、これらおよびその他の明白に異なる特性のため、ポリマー性の動脈移植片に播種し、長期開存率を改良するのに静脈内皮細胞より適切になるが、入手可能性の欠如のため、今日まで誰もその目的で臨床的に使用できなかった。動脈を摘出するプロセスは静脈摘出よりずっと侵襲的である。加えて、入手できる動脈は少なく、しかも小さい。入手できる少なく小さい動脈の１つを内皮培養用に摘出したら、その動脈はもはやいかなる将来の心臓バイパス術にも利用できない。
【００２４】
場合によって、本開示のポリマー性血管移植片と共に使用されるヒト動脈内皮細胞は、普遍的なドナー細胞として役立てることができるように改変される。場合によって、細胞は遺伝的に改変される。用語「改変された」とは、本明細書で使用されるとき、本開示の分子または細胞の変化した状態または構造を意味する。分子は多くの方法で、例えば化学的、構造的、および機能的に改変し得る。細胞は核酸の導入によって改変し得る。いくつかの実施形態において、改変された細胞は「遺伝子改変され」または「遺伝子編集され」てもよく、ここでは細胞内の１以上の核酸が変化させられる。用語「遺伝子操作」、「遺伝子編集」、および「遺伝子改変」は本明細書において同義で使用され、細胞内の１以上の核酸が変化している細胞（例えば、原核生物または真核生物細胞）、または人の手により（例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて）作り出されたかもしくは改変されている天然に存在しない核酸分子またはかかる分子から（例えば、転写、翻訳、等により）誘導された分子を含むように改変されている細胞を指す。
【００２５】
外因性、組換え、合成、および／またはその他改変されたポリヌクレオチドを含有する動脈内皮細胞は遺伝子改変された細胞と考えられ、従って天然に存在する対応するものに対して天然に存在しない。場合によって、遺伝子改変された細胞は１以上の組換え核酸を含有する。他の場合、遺伝子改変された細胞は１以上の合成または遺伝子操作された核酸（例えば、その天然に存在する対応するものに見られる配列に対して少なくとも１つの人工的に作り出された挿入、欠失、逆位、または置換を含有する核酸）を含有する。遺伝子操作された細胞を生産する手順は当技術分野で一般に知られており、参照により本明細書に組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。
【００２６】
場合によって、細胞のゲノムは、改変された細胞が治療応用に「普遍的に許容できる」ように改変される（例えば、遺伝子操作される）。本明細書で使用されるとき、用語「普遍的に許容できる」とは、患者と細胞の交差適合試験が必要とされず、免疫抑制が必要ない細胞産物の免疫学的な意味での全面的容認を意味する。場合によって、細胞は、クラスＩＩまたはクラスＩとクラスＩＩとの両方のいずれかの主要組織適合複合体遺伝子によりコードされる機能性のタンパク質が細胞の表面に現れないように改変される。このように、改変された細胞は移植片受容者のＴ細胞による攻撃を回避する可能性がより高い。場合によって、ヒト動脈内皮細胞は米国特許第６，９１６，６５４号に記載されているように遺伝子改変される（遺伝子操作される）。他の場合、米国特許出願公開第２０１４／０１３４１９５号によって記載されているようにベータ−２ミクログロブリンを破壊することによりｉＰＳ細胞から免疫非反応性の細胞を生産するのが有利であり得る。例えば、細胞は、細胞の内因性ベータ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に遺伝子操作された分裂を含むように改変することができる。米国特許出願公開第２０１４／０１３４１９５号に記載されているように、遺伝子操作された分裂は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ｉ鎖の少なくとも一部分に直接またはリンカー配列を介して共有結合したＢ２Ｍタンパク質の少なくとも一部分を含む単一鎖融合ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩタンパク質をコードすることができる１以上のポリヌクレオチド配列を導入することを含むことができる。しかしながら、「普遍的な」ヒトＡＥＣを得る方法はＨＬＡタンパク質を改変することに限定されないと理解されるだろう。場合によって、ＡＥＣは血管移植片を受容するために患者に少なくとも５０％ＨＬＡ適合している人工多能性幹細胞に由来する。
【００２７】
また、免疫反応を最小化するために他の方策を使用して細胞を遺伝学的に改変することもできる。例えば、Ｒｉｏｌｏｂｏｓら（Molecular Therapy 2013, 21(6):1232-1241）は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）−媒介遺伝子編集を用いてベータ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子の両方の対立遺伝子に標的化分裂を作ることによる安定なＨＬＡ−Ｉ陰性ヒト多能性細胞の生産を記載している。得られたＢ２Ｍ-/-多能性幹細胞は米国特許出願公開第２０１６／０２４４７１９号の化学的に定義された方法に従ってヒトＡＥＣに分化して本開示のポリマー性血管移植片と共に使用される非免疫原性の「普遍的」ヒトＡＥＣを生産することができよう。別の例において、細胞表面のＣＤ５８の発現を全体的または部分的に破壊する遺伝子改変は細胞性免疫の両方の腕による免疫認識からの逃避を増大することが示されている。例えば、Ｃｈａｌｌａ−Ｍａｌｌａｄｉら（Cancer Cell 2011; 20(6):728-740）参照。また、ＨＬＡ−Ｅを発現する多能性幹細胞（Ｅｄｉｍｅｒ細胞）も同種免疫反応およびＮＫ細胞による溶解を回避する（Gornalusse et al., Nat Biotechnol. 2017; 35(8):765-772）。
【００２８】
場合によって、本発明により提供される血管移植片のための細胞は導入遺伝子を細胞のゲノムに導入することなく改変される。場合によって、例えば、ＡＥＣは内因性遺伝子の発現を調節する（例えば、コントロールの未改変細胞と比べて発現を増大するかまたは発現を低減する）ように遺伝子編集される。任意の適切な遺伝子編集の手段を使用することができる。様々な遺伝子編集技術が当業者に公知である。遺伝子編集技術として、制限なく、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）ゲノム編集システム、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１ゲノム編集システムがある。ホーミングエンドヌクレアーゼは一般にＤＮＡ基質を二量体として開裂し、明白に異なる結合および開裂ドメインを有していない。ＺＦＮはＦｏｋＩ開裂ドメインにより認識される５〜７塩基対（ｂｐ）のスペーサー配列がフランクする２つのジンクフィンガー結合部位からなる標的部位を認識する。ＴＡＬＥＮはＦｏｋＩ開裂ドメインにより認識される１２〜２０ｂｐのスペーサー配列がフランクする２つのＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合部位からなる標的部位を認識する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＤＮＡらせんのいずれかのストランドに存在し得る適合性のプロトスペーサーに隣接したモチーフ（ＰＡＭ）の直ぐ上流に位置する単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）内の標的化配列に相補的なＤＮＡ配列を標的とする。従って、当業者は本発明に対して適当な遺伝子編集技術を選択することができよう。
【００２９】
場合によって、遺伝子編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集システム）を使用して、ヒト多能性幹細胞が免疫システムに対して機能的に「目に見えない」ようにこれらの細胞を改変することができる。かかる「普遍的に許容できる」多能性幹細胞は本開示の血管移植片に使用されるＡＥＣに分化することができる。場合によって、ＡＥＣは先天性の免疫システムによる検出を回避する手段としてＣＤ４７の過剰発現を誘発するように改変される。ＣＤ４７は、腫瘍細胞で高度に発現され、腫瘍細胞を宿主の免疫監視に対して耐性があるようにする重大な免疫チェックポイントとして知られている。場合によって、ＣＤ４７の過剰発現は、遺伝子の追加のコピーを細胞に送達する、ＣＤ４７遺伝子を含有するウイルスの導入により誘発される。例えば、Deuse et al., Nature Biotechnology 37, 252-258 (2019)参照。本明細書で使用されるとき、用語「過剰発現する」および「過剰発現」は、遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質）の発現を、細胞が通常産生するより高いレベルに増大することを指す。これらの用語は内因性ならびに外因性のタンパク質の過剰発現を包含することが意図されている。場合によって、過剰発現は参照基準に対して決定される。
【００３０】
場合によって、ＡＥＣは選択可能なマーカーを発現するように遺伝子改変される。かかる場合において、選択可能なマーカーの発現は改変された細胞を特定し、および／または未改変細胞から単離するのに使用される。このようにして、選択可能なマーカーの発現は、本開示の血管移植片に使用される改変された細胞の純粋または実質的に純粋な集団を得るのに使用される。場合によって、ＡＥＣは選択可能なマーカーカセットを含むように改変される。選択可能なマーカーカセットは抗生物質のような薬剤に対する耐性を付与することができる。当業者には分かるように、追加の選択可能なマーカーまたは選択可能なマーカーの組合せも使用することができる。抗生物質耐性以外の増殖優位性または比色分析選択を提供するマーカーのような他の形態の選択可能なマーカーを使用してもよい。好ましくは、選択可能なマーカーカセットは、より好ましくは内皮細胞内で特異的に選択可能なマーカーの転写を誘発することができるプロモーターまたは調節領域に動作可能に連結された選択可能なマーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。内皮細胞に特異的なプロモーターの使用は、遺伝子を発現しない汚染細胞からの内皮または動脈内皮細胞の精製を可能にする。本発明の実施に有用なプロモーターとしては、限定されることはないが、構成的、誘発性、一時的に調節される、および化学的に調節されるプロモーターがある。好ましくは、プロモーターは誘発性である。
【００３１】
改変に続いて、ＡＥＣを調製されたポリマー性基材に適用して、即時使用、後の使用、または貯蔵のためのＡＥＣが播種された血管移植片を調製することができる。本明細書で使用されるとき、用語「調製された」とは、ＡＥＣが播種された血管移植片を構築するための調製において処理されたポリマー性基材を指す。「調製された」は以前に被覆された（部分的または完全）および／または脱ガスされたポリマー性基材を包含する。場合によって、ＡＥＣは、特定の患者の処置に必要とされるまで、例えば液体窒素タンクに貯蔵することができる。短期貯蔵（例えば、約６〜１２か月）の場合、ＡＥＣは−８０℃以下（例えば、−８０°、−９０°、−１００°、−１１０°、−１２０℃、−１３０℃、−１４０℃、−１５０℃、−１６０℃、−１７０℃、−１８０℃、−１９０℃、−１９６℃、またはそれ以下）で貯蔵することができる。場合によって、ＡＥＣは、調製されたポリマー性基材に播種する前、０℃より高い温度、例えば制限なく４℃、室温（約２５℃）、および約３７℃に維持される。普遍的なＡＥＣを含むポリマー性血管移植片を前もって調製し、必要とされるまで貯蔵する能力は、特に緊急の必要性がある患者の処置にとって重要な利点である。かかる場合において、ＡＥＣが播種されたポリマー性血管移植片は対象に移植するかまたは対象内に植え付けるのに適しており、ここで移植片は対象において誘発される移植片拒絶反応が低下しているか、または全くない。
【００３２】
場合によって、本発明により提供される血管移植片のためのＡＥＣは細胞バンクから得られる。一般に、細胞バンクは多数の起源から細胞の試料を収集し、それらを少なくとも１つの所定の特徴に応じてカタログに載せ、細胞を生存させたまま保つ条件下で細胞を貯蔵する。従って、特定の所定の特徴を有する貯蔵または「バンクに保存された」細胞は要望により入手できる。好ましくは、特定の集団における全ての潜在的な受容者に対してハプロタイプ適合を提供するために、健康な個人に由来する多くのＨＬＡ型を示すバンクに保存された細胞が細胞バンクに貯蔵される。場合によって、本発明により提供される血管移植片および方法に有用なバンクに保存された細胞はスクリーニングされＨＬＡ型で分類されたドナーに由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。他の場合、バンクに保存された細胞はＨＬＡ型で分類されたｉＰＳＣから誘導されたＡＥＣである。例えば、ＡＥＣは、米国特許出願公開第２０１６／０２４４７１９号に記載されている方法に従ってＨＬＡ型で分類されたｉＰＳＣから得ることができる。個々のＨＬＡ型は、各々がＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＩＡ−ＤＰ、およびＨＬＡ−ＤＲからなる一対の共発現されたハプロタイプを含む。他の場合、ＨＬＡ適合したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）が使用される。個人の所与の集団の人種構成に応じて、一定のＨＬＡ対立遺伝子の組合せの頻度は変化する。アルゴリズムを用いて、組織ドナーのプール内の各々のＨＬＡ対立遺伝子の組合せの頻度および潜在的な受容者の１００％に対するＨＬＡ適合を提供するために細胞バンク内に必要とされるホモ接合およびヘテロ接合のＨＬＡ型の数を決定することが可能である。概論としては、例えば、de Rham & Villard, J. Immunology Res. 2014参照。好ましくは、バンクに保存された細胞は、抗−ＡＢＯ凝集素により媒介される同種免疫反応の潜在的な危険性を低減するために血液型Ｏを有する健康なドナーから生成される（Zimmermann et al., Stem Cells and Development 2012; 21(13):2364-2373）。
【００３３】
臨床応用に有用なＡＥＣ細胞を含む調製品はアメリカ食品医薬品局のような政府機関によって課される規制に合致して得られなければならない。従って、代表的な実施形態において、本発明により提供される方法は適正製造基準（ＧＭＰ）、Ｇｏｏｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＴＰ）、および優良試験所基準（ＧＬＰ）に従って実施される。動物由来成分を含む試薬は使用せず、全ての試薬はＧＭＰに適合した出所から購入する。本発明により提供される血管移植片のためのヒト動脈内皮細胞のインビトロ集団のような細胞療法製品の臨床製造に関連して、ＧＴＰはドナーの同意、追跡可能性、および感染症のスクリーニングを規定しており、一方ＧＭＰはヒトに使用するのに一貫して安全で有効な製品を生産するための施設、プロセス、試験、および慣行に関連する。Lu et al., Stem Cells 27: 2126-2135 (2009)参照。適当な場合、インフォームドコンセントが得られ；製品の安全性、生物活性、適当な用量、および効力が段階的に調査され；結果が統計的に有意であり；倫理指針が守られることを保証するために、機関および機関のパネルによる患者プロトコルの監視が考えられる。
【００３４】
場合によって、ヒト動脈内皮細胞は、米国特許出願公開第２０１６／０２４４７１９号に記載されている方法に従って得ることができる。かかる方法に従って得られるＡＥＣは、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＤＬＬ４、Ｈｅｙ−２、ｊａｇｇｅｄ−１、およびｊａｇｇｅｄ−２のような動脈内皮マーカーの発現の高いレベルにより特徴付けられる。ＡＥＣはまた、低い白血球接着、高めのＮＯ産生および酸素消費、剪断応力に対する反応、ならびに血管ネットワークでの動脈内マーカーの発現を維持しながらインビトロおよびインビボでかかるネットワークを形成する能力によっても特徴付けられる。方法は、中胚葉細胞を、実質的にインシュリンを含まず、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ならびにＮｏｔｃｈアゴニスト、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤のうちの少なくとも１種を含む無血清、アルブミンフリー、化学的に定義された培養培地で培養することを含むか、またはその培養から本質的になり、ここで培養は培養した中胚葉細胞が動脈内皮細胞に分化するのに十分な長さの時間行う。ヒト中胚葉細胞（多能性幹細胞に由来する中胚葉細胞を含む）をＡＥＣに分化させるのに有用なＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｎｏｔｃｈアゴニスト、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、およびイノシトールモノホスファターゼの阻害剤の量は米国特許出願公開第２０１６／０２４４７１９号に記載されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＡＥＣ分化方法に使用される細胞培養培地はこれらの成分の各々を含む。他の場合、培養培地はこれらの成分の１種以上を実質的に含まない。培養は、任意の適当な表面上で（例えば、二次元または三次元培養において）行うことができる。
【００３５】
ＡＥＣは特徴として発現プロフィール：ＣＤ３１+／ＣＤ１４４+／ＣＤ４１-／ＣＤ４５-を有する。好ましくは、ＡＥＣは動脈内皮細胞マーカー：Ｅｐｈｒｉｎ  Ｂ２（ＥＦＮＢ２）、Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１（ＮＲＰ−１）／ＣＤ３０４、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ４（ＤＬＬ４）、およびＣＤ１８４（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １８４）の１種以上を発現する。Ｅｐｈｒｉｎ  Ｂ２（ＥＦＮＢ２）遺伝子はＥＰＨＢ４およびＥＰＨＡ３受容体に結合するＥＦＮＢクラスＥｐｈｒｉｎをコードする。血管内皮細胞成長因子１６５受容体（ＶＥＧＦ１６５Ｒ）としても知られているＮｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１（ＮＲＰ１）は主として動脈内皮細胞で発現される。ＤＬＬ４は動脈内皮細胞で発現されたＮｏｔｃｈリガンドである（Shutter et al., Genes & Dev. 14:1313-18 (2000)）。ＣＤ１８４はＣＸＣＲ４（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４）またはフュージンとしても知られている。任意の適当な方法を使用して、本明細書に記載されている細胞型に特徴的な生物学的マーカーの発現を検出することができる。例えば、１種以上の生物学的マーカーの存在または不在は、例えば、ＲＮＡシークエンシング（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑ）、免疫組織化学、ポリメラーゼ連鎖反応、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、または他の遺伝子発現を検出または測定する技術を使用して検出することができる。ＲＮＡ−ｓｅｑは、有機体、組織、または細胞のＲＮＡ含量のゲノム規模での評価を提供するハイスループットのシークエンシング技術である。あるいは、またはさらに、例えば、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開された国際公開第９８／４５４７９号参照）、サザンブロット法、ノーザンブロット法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＡＥＣの１種以上の生物学的マーカーの存在または不在を検出し、またはそのレベルを測定してもよい。細胞集団におけるタンパク質レベルでマーカーの発現を評価する定量的な方法も当技術分野で公知である。例えば、フローサイトメトリーは、所与の細胞集団において興味のある生物学的マーカーを発現するかまたは発現しない細胞の割合を決定するのに使用される。
【００３６】
好ましくは、ＡＥＣ集団は少なくとも８０％の動脈内皮細胞を含む。場合によって、得られる細胞集団における少なくとも約８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上）の細胞が動脈内皮細胞である。
中胚葉細胞はＢｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、ＥＭＯＳ、ＦＯＸＡ２、ＭＩＸＬ１、ＭＳＸ１、およびＭＳＸ２からなる群から選択される１種以上の中胚葉のマーカーを発現することができる。本明細書に記載されている方法の場合、中胚葉細胞は通例、インシュリン、アルブミン、または非ヒト動物に由来するあらゆる成分を含まない（即ち、異種の物質を含まない）、実質的に含まない、または本質的に含まない培養培地で培養される。本明細書で使用されるとき、用語「実質的に含まない」は、ある種の成分または試薬を実質的に欠いている細胞培養条件を指す。インシュリンを実質的に含まないとは、培地が質量で元々の濃度の１％未満のインシュリン、または２×１０-5％未満のインシュリンを含有し、好ましくは１×１０-5％未満、０．５×１０-5％未満、０．２×１０-5％未満または０．１×１０-5％未満のインシュリンを含有することを意味する。
【００３７】
本発明の方法で使用するのに適当なＴＧＦβ受容体阻害剤としては、制限なく、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５２５３３４、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ２１０９７６、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＢ−５０５１２４、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＳＤ２０８、およびＥＷ−７１９７がある。好ましくは、ＴＧＦ−ベータシグナリングの阻害剤はＳＢ−４３１５４２、内因性アクチビンの小分子阻害剤およびＩ型受容体である（ＴＧＦβ受容体Ｉ）（Inman et al., Mol Pharmacol. 62(1):65-74 (2002)。
Ｎｏｔｃｈは、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅおよびＪａｇｇｅｄファミリーを含む細胞−表面リガンドのファミリーに結合するシングルパス細胞−表面受容体である。本明細書で使用されるとき、用語「Ｎｏｔｃｈアゴニスト」および「Ｎｏｔｃｈアクチベーター」とは、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合し、Ｎｏｔｃｈ活性化に関連するシグナリング事象を開始または媒介する分子（例えば、生体分子、小分子、化学薬品）を指す。レスベラトロール（３，４’，５−トリヒドロキシスチルベン）は、スチルベンと呼ばれるポリフェノール系化合物の１クラスに属し、Ｎｏｔｃｈシグナリングのアクチベーター（アゴニスト）である。本発明により提供される動脈分化を促進する方法に従って使用するのに適当な他のＮｏｔｃｈアゴニストとしてバルプロ酸およびスベロイルビスヒドロキサム酸がある。加えて、固定化または多量体化された可溶性のＮｏｔｃｈリガンド、例えば固定化されたＤＬＬ４および固定化されたＪａｇｇｅｄ−１ペプチドもＮｏｔｃｈアクチベーターとして使用することができる。
【００３８】
イノシトールモノホスファターゼ（ＩＭＰａｓｅ）は、ホスホイノシチド細胞シグナリング経路において必要とされるミオイノシトールモノホスフェートからミオイノシトールへの加水分解を触媒する。場合によって、ＩＭＰａｓｅの阻害剤はビホスホネートＬ−６９０，３３０（［１−（４−ヒドロキシフェノキシ）エチリデン］ビスホスホン酸）である。リチウムもＩＭＰａｓｅを阻害してホスホイノシチドシグナリングを減衰させる（Berridge et al., Cell 59:411-419 (1989)）。ホスホイノシチドシグナリング経路の他の阻害剤としては、制限なく、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤Ｌｙ２９４００２、Ｐｉｃｔｉｌｉｓｉｂ、ＨＳ−１７３、ＧＳＫ２６３６７７１、デュベリシブ、ＴＧ１００−１１５、ＧＳＫ１０５９６１５、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＩＫ−９３、ＢＧＴ２２６、ＡＺＤ６４８２、ＳＡＲ２４５４０９、ＢＹＬ７１９、ＣＵＤＣ−９０７、ＩＣ−８７１１４、ＴＧ１００７１３、ゲダトリシブ、ＣＨ５１３２７９９、ＰＫＩ−４０２、ＢＡＹ  ８０−６９４６、ＸＬ１４７、ＰＩＫ−９０、ＰＩＫ−２９３、ＰＩＫ−２９４、クェルセチン、ウォルトマンニン、ＺＳＴＫ４７４、ＡＳ−２５２４２４、ＡＳ−６０４８５０、およびアピトリシブがある。
【００３９】
本明細書に記載されているＩＭＰａｓｅ、ＴＧＦβ受容体、およびその他のものの化学的阻害剤の適切な作動濃度範囲は約０．１μＭ〜約１００μＭ、例えば、約２μＭ、５μＭ、７μＭ、１０μＭ、１２μＭ、１５μＭ、１８μＭであり、または以上の１種以上の化学的阻害剤の別の作動濃度の約０．１μＭ〜約１００μＭである。
好ましくは、中胚葉細胞は、得られる細胞集団内の少なくとも約８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはそれ以上）の細胞が動脈内皮細胞となるまで、ＡＥＣ分化培地で培養される。
【００４０】
本明細書に記載されている生物学的マーカーのいくつかについては、発現のレベルはより低いかまたは中間である。特定のマーカーに対して「陽性」または「陰性」として細胞に言及するのが通常であるが、現実の発現レベルは定量的な特質である。細胞表面上の分子の数はいくつかの対数で変化することができるが、それでもまだ「陽性」と特徴付けられる。従って、染色レベルの特性評価は細胞集団間の微妙な区別を許容する。発現レベルは、レーザーが（抗体により結合された細胞表面抗原の量に比例する）蛍光色素の定量的なレベルを検出するフローサイトメトリーにより検出またはモニターすることができる。フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）は、抗体染色の強度、ならびにその他のパラメーター、例えば細胞の大きさおよび光散乱に基づいて細胞集団を分離するのに使用することができる。染色の絶対的なレベルは特定の蛍光色素および抗体調製品と共に異なり得るが、データはコントロールに対して規格化することができる。
場合によって、動脈内皮細胞はヒト多能性幹細胞に由来する。米国特許出願公開第２０１６／０２４４７１９号に記載されているように、ヒト多能性幹細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビンＡ、およびＷｎｔ／β−カテニンシグナリングのアクチベーターを含む無血清アルブミンフリーの化学的に定義された細胞培養培地で約２日の期間培養し、これにより中胚葉細胞を含む細胞集団が得られる。中胚葉細胞はＢｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、ＥＭＯＳ、ＦＯＸＡ２、ＭＩＸＬ１、ＭＳＸ１、およびＭＳＸ２からなる群から選択される１種以上の中胚葉マーカーを発現することができる。
【００４１】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、胚性であっても誘発されたにしても、ヒト発生の最も初期の段階へ近づく手段をもたらし、細胞療法および組織工学のための多数の細胞を導出するためのプラットフォームを提供する。従って、代表的な実施形態において、本発明により提供される方法はさらに、中胚葉幹細胞の動脈内皮細胞への分化を促進する条件下でヒト多能性幹細胞を分化させることを含む。場合によって、動脈内皮細胞を生産する方法は、中胚葉分化を促進する無血清アルブミンフリーの化学的に定義された培養培地でヒト多能性幹細胞を培養することを含む。多能性幹細胞に由来する中胚葉細胞を次いでＡＥＣ分化方法（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２４４７１９号に記載されているもの）に従って分化させ、このようにして多能性幹細胞誘導ＡＥＣを生産する。代表的な実施形態において、中胚葉分化を促進する無血清アルブミンフリーの化学的に定義された培養培地はアクチビンＡ、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ＦＧＦ２、およびＷｎｔ／β−カテニンシグナリングのアクチベーターを含む。多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞であることができる。本明細書で使用されるとき、本発明の方法に従って使用するのに適当な「多能性幹細胞」は３つの胚葉全ての細胞に分化する能力を有する細胞である。本発明で使用するのに適切な多能性細胞としては、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞がある。本明細書で使用されるとき、「胚性幹細胞」または「ＥＳＣ」は胚盤胞の内細胞塊から誘導された多能性細胞または多能性細胞の集団を意味する。Thomson et al., Science 282:1145-1147 (1998)参照。これらの細胞はＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を発現する。多能性幹細胞は高い核対細胞質比および突起核小体を有する細胞を含む密集したコロニーとして出現する。ＥＳＣはＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）のような出所から市販されている。
【００４２】
場合によって、動脈内皮細胞はヒト人工多能性幹細胞から誘導される。例えば、緊急の必要がない患者の場合、人工多能性幹細胞は患者に由来して患者に特異的な動脈内皮細胞を生産することができる。本明細書で使用されるとき、用語「人工多能性幹細胞」（「ｉＰＳ細胞」）とは、元の分化した体細胞の起源に関して変化し得、特定の組の有効性決定因子に関して変化し得、単離するのに使用された培養条件に関して変化し得るが、それにも関わらず元のそれぞれの分化した体細胞の起源と遺伝学的に実質的に同一であり、本明細書に記載されているＥＳＣのようなより高い有効性の細胞と同様な特徴を示す多能性の細胞または多能性細胞の集団をいう。例えば、Yu et al., Science 318:1917-1920 (2007)参照。
【００４３】
人工多能性幹細胞はＥＳＣと同様な形態学的特性（例えば、円形形状、大きい核小体および乏しい細胞質）および成長特性（例えば、約１７〜１８時間の倍化時間）を示す。加えて、ｉＰＳ細胞は多能性細胞に特異的なマーカー（例えば、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０またはＴｒａ−１−８１、しかしＳＳＥＡ−１はない）を発現する。しかし、人工多能性幹細胞は胚から直ぐに誘導されない。本明細書で使用されるとき、「胚から直ぐ誘導されない」とは、ｉＰＳ細胞を生産するための出発細胞型が非多能性の細胞、例えば多分化能細胞または最終分化した細胞、例えば出生後の個人から得られた体細胞であることを意味する。
ヒトｉＰＳ細胞を本明細書に記載されている方法に従って使用して、特定のヒト対象の遺伝的相補性を有するＡＥＣを得ることができる。例えば、特定の哺乳類対象の特定の疾患または障害に関連するかまたはそれから生ずる１以上の特定の表現型を示すＡＥＣを得ることが有利であり得る。かかる場合において、ｉＰＳ細胞は、当技術分野で公知の方法に従って特定のヒト対象の体細胞を再プログラミングすることにより得られる。例えば、Yu et al., Science 324(5928):797-801 (2009)、Chen et al., Nat. Methods 8(5):424-9 (2011)、Ebert et al., Nature 457(7227):277-80 (2009)、Howden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108(16):6537-42 (2011)参照。ｉＰＳ細胞に再プログラミングするための対象に特異的な体細胞は生検またはその他の組織試料採取方法により興味のある標的組織から取得または単離することができる。場合によって、対象に特異的な細胞は使用前にインビトロで操作または改変される。例えば、対象に特異的な細胞は、再プログラミングする前に増やし、分化させ、化学的に処理し、遺伝子改変し、ポリペプチド、核酸、またはその他の因子に接触させ、凍結保存し、またはその他改変し、その後再プログラミングした細胞の分化を導いて対象に特異的なＡＥＣを生産することができる。
【００４４】
特定の個人に由来するｉＰＳ細胞から生産した動脈内皮細胞と同じ個人から単離された初代動脈内皮細胞との間の重要な相違点は、ｉＰＳ細胞から誘導された細胞が無限にスケーラブルであり、Ｈａｙｆｌｉｃｋの限界（一定数の細胞分裂）を上回ることができるということである。本明細書で使用されるとき、用語「Ｈａｙｆｌｉｃｋの限界」とは、細胞がもはや増殖できなくなり、老境に入る前のインビトロでの有限の数の集団倍化を指す（Hayflick L. Exp Cell Res 37:614-36, 1965）。初代の培養動脈内皮細胞の固有の自己再生能力は制限されているが、本発明により提供される方法に従って動脈内皮細胞のほとんど無尽蔵の供給を単一の起源（例えば、個人の体細胞）から得ることができる。従って、本発明の一実施形態において、ＡＥＣは組織培養実験室内で拡大することができて、得られる細胞の数は一人より多くの患者を処置するのに十分であり、好ましい実施形態においては細胞バンクに適している。
【００４５】
本明細書に記載されている方法で使用される、多能性幹細胞を培養するための定義された培地および基質条件は当技術分野で公知である。好ましくは、本発明で使用される培地は化学的に定義され、アルブミンフリーかつゼノフリーである。場合によって、本明細書に開示されている方法に従って分化させられる多能性幹細胞は化学的に定義された無血清のアルブミンフリー培地で培養される。
いくつかの実施形態において、細胞の集団内の動脈内皮細胞の割合は細胞分離、細胞選別、またはその他の富化方法、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、磁気ビーズ、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、非内皮細胞のレーザー標的化アブレーション、およびこれらの組合せを用いて富化される。好ましくは、ＦＡＣＳを使用して、細胞表面抗原発現に基づいて細胞を特定し分離する。場合によって、本明細書に記載されている方法に従ってヒトＡＥＣを含む細胞集団を得た後、ヒトＡＥＣ集団は、制限なく、ヒト内皮無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１１１１−０４４）、ＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ−３１６２）、および内皮細胞培養培地（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５５０５４）を含む、ヒトＡＥＣを増殖させるのに適当な培養培地で増やすことができる。
【００４６】
Ｃ．追加の血管移植片成分
本明細書に記載されているポリマー性血管移植片が適用される特定の使用に応じて、場合によって移植片がさらに１種以上の生物活性剤を含むことは有利であろう。本明細書で使用されるとき、用語「生物活性剤」または「活性剤」とは、治療上、予防上、および／または診断上の作用剤を指し、制限なく、ヒトまたは動物の身体で局所的または全身的に作用する生物学的、生理学的、または薬理学的に活性な物質を包含する。例として、制限なく、小分子薬剤、ペプチド、タンパク質、抗体、糖類、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、核酸、およびこれらの組合せを挙げることができる。「生物活性剤」には、単一の作用剤または複数の生物活性剤を含み、例えば、２種以上の生物活性剤の組合せを含む。
本開示のポリマー性移植片と共に使用するのに適当な生物活性剤として、制限なく、薬剤組成物、ポリペプチド（例えば、ケモカイン、サイトカイン）、および／または追加の治療剤または薬剤、例えば、制限なく、抗血栓剤、抗増殖剤、再狭窄もしくは動脈瘤の形成を予防、阻害、または低減する作用剤、抗腫瘍／抗増殖／抗有糸分裂剤、血管細胞増殖促進剤、血管細胞増殖阻害剤、および血管拡張剤がある。サイトカインおよびケモカインとして、制限なく、インターロイキン（ＩＬ）１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、エオタキシン、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、ＲＡＮＴＥＳ、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＢＢ、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、およびこれらの組合せがある。場合によって、生物活性剤は血管移植片内に組み込まれるか、または血管移植片に塗布される。
場合によって、ポリマー性血管移植片は１種以上の追加の細胞型を含む。例えば、平滑筋細胞（ＳＭＣ）をＡＥＣに加えてポリマー性血管移植片に播種することができる。ＳＭＣは初代平滑筋細胞またはヒト多能性幹細胞由来ＳＭＣであることができる。ＳＭＣは野生型、遺伝子改変、または遺伝子編集であることができる。
【００４７】
方法
本明細書に記載されているポリマー性血管移植片はあらゆる血管または心臓血管外科用途向けの動脈または動脈−静脈シャントとして有用である。代表的な用途として、制限なく、先天性心臓外科、冠状動脈バイパス術、および末梢血管外科がある。従って、別の態様において、本発明により、本発明により提供されるポリマー性血管移植片を生産し使用して、それを必要とする対象において血管の欠陥を処置する方法が提供される。かかる方法は本明細書に開示されているポリマー性血管移植片をそれを必要とする対象に移植することを含み得る。用語「個人」、「宿主」、「対象」、および「患者」は本明細書において同義で使用されている。様々な実施形態において、ポリマー性血管移植片は、病気のまたは損傷した血管の一部分と取り替えるために、例えば、外傷によって損傷したかまたは血管障害のために損傷した大動脈または血管の弱まった一部分と取り替えるために移植される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ポリマー性血管移植片は、例えば、冠動脈または末梢動脈バイパス移植術において、血管の狭窄または一部閉塞した部分にバイパスを作るため、および／または取り替えるために使用される。例えば、本開示のＡＥＣが播種されたポリマー性血管移植片は心臓または脚のバイパス術に有用である。別の例において、本開示のＡＥＣが播種されたポリマー性血管移植片は再建術において、例えば発育異常を矯正するため、または重篤な損傷を修復するのに有用である。また血管移植片は動脈−静脈シャントにおいて血液透析アクセスを提供するのにもよく適している。
【００４９】
場合によって、処置する方法は、ポリマー性血管移植片を移植するために吻合術（即ち、管状部分の外科的連結）を実行することを含む。通例、ｉｎ  ｓｉｔｕの動脈または静脈とポリマー性血管移植片との吻合は移植片をｉｎ  ｓｉｔｕの血管に縫合糸で縫い付けることによって行われる。一般に使用される縫合糸材料としてＰＲＯＬＥＮＥ（登録商標）ポリプロピレン縫合糸およびｅＰＴＦＥがある。従って、本開示の血管移植片はＰＴＦＥまたはｅＰＴＦＥのような縫い合わせ可能な材料を含む。
現存する自己移植静脈内皮細胞術に伴う主要な問題の１つは、細胞を採集し、成長させ、移植片の細胞に播種し、培養するのに約１か月かかるということである。患者の約３０％は、医学上の緊急の必要性が自己移植性静脈内皮細胞移植片を得るのに３０日待つことを許さないので、そのような処置を受けることができない。従って、本開示は、従来の方法と比べて特に有利な材料および方法を提供する。特に、本発明により、ＡＥＣが播種されたポリマー性血管移植片が約１０日以内に調製され臨床使用の準備が整う方法が提供される。かかる移植片は大規模に生産されるヒトＡＥＣを用いて調製され、必要になるまで凍結される。場合によって、従って、方法は、ヒトＡＥＣを解凍し、ポリマー性基材、好ましくは少なくとも部分的に１種以上の内皮細胞接着剤で被覆されているポリマー性基材に播種することを含む。要請により、凍結したヒトＡＥＣは、移植片を必要とする患者に対する適合性に基づいて選択されるか、または移植片受容者（患者）に対して免疫応答を引き起こし難い「普遍的な」ＡＥＣである。好ましくは、選択された細胞は解凍され、調製されたポリマー性基材に播種され、そしてＡＥＣが播種されたポリマー性基材は１０日未満、好ましくは７日未満（例えば、２、３、４、５、または６日程度）培養される。培養されたポリマー性基材はその後最初の要請から約１０日以内、好ましくは約７日以内に患者に送達されるか、または治療用に提供される。ＡＥＣが例えば米国特許出願公開第２０１６／０２４４７１９号に記載されているＡＥＣ分化プロトコルに従ってバンクに保存されたｉＰＳＣ細胞に由来する場合、最初の要請から調製されたＡＥＣが播種された血管移植片の送達までの時間は分化過程を完了する時間を含まなければならない。本出願は、場合によって、ヒト多能性幹細胞が約２〜３日で中胚葉細胞に分化され、得られた中胚葉細胞がおよそ３日で内皮細胞に分化するように誘発される有向分化プロトコルを提供する。場合によって、方法は、普遍的細胞株の細胞をポリマー性血管移植片に播種することを含む。かかる場合において、播種された血管移植片は、要望により「直ぐに使える」製品として調製し準備しておくことができる。この場合、ＡＥＣが播種された血管移植片は、必要とされたらすぐにそれを必要とする患者に提供することができる。例えば、調製された「普遍的な」ＡＥＣが播種された血管移植片は翌朝またはより迅速な配達を使用して提供することができる。もし地元で生産されれば、調製された血管移植片の送達はたった数分または数時間を要するのみかもしれない。場合によって、調製された「普遍的な」ＡＥＣが播種された血管移植片は購入し、凍結保存された冷凍製品として地元に貯蔵することができ、その場合ＡＥＣが播種された移植片は最小の遅延で患者が使用するために入手可能であり得る。
【００５０】
任意の適当な方法を使用して、本開示のポリマー性血管移植片の移植後の機能的および形態学的変化を検出し測定することができる。例えば、血管超音波検査法を実行して身体の動脈および静脈内の流体の流れを評価し、疾患の存在、重症度、および／または特定の位置を検出することができる。血管超音波検査法は、身体の血管内の循環を検査するのに使用される非侵襲的な超音波法である（デュプレックス超音波検査法ともいわれる）。場合によって、血管超音波検査法は本明細書に記載されているポリマー性血管移植片による血管の処置の前後の血管内の流体の流れの速さを計算するのに使用される。場合によって、造影超音波検査法（ＣＥＵＳ）は治療介入前後の血管病変を検出および／またはモニターするのに使用される。血管超音波検査法およびＣＥＵＳは特に治療介入後再狭窄を検出し特徴付けるのに有用である。「再狭窄」とは、本明細書で規定される場合、以前の狭窄部位（即ち、血管形成術中のバルーン拡張の部位）における血管の管腔の狭小化、または治療介入処置後の血管または合成移植片の管腔の狭小化（例えば、移植片を使用したバイパス形成術後の動脈−静脈吻合の静脈側の狭小化）を意味する。再狭窄は、本明細書で使用されるとき、閉塞を包含する。再狭窄は血管壁への損傷後起こるあらゆる管腔の狭小化を含む。再狭窄を引き起こす損傷は、従って、アテローム硬化性病変に対する外傷（血管形成術で見られる）、病変の切除（動脈内膜切除で見られる）、外部の外傷（例えば、ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｍｐｉｎｇ損傷）、または外科吻合を含むことができる。
【００５１】
別の態様において、本発明により、ポリマー性血管移植片を製作する方法が提供される。方法は、ポリマー性基材の少なくとも一部分を１種以上の内皮付着剤で被覆し；被覆されたポリマー性基材にヒト動脈内皮細胞を接触させることにより、白血球またはその細胞断片に対して実質的に非接着性のＡＥＣが播種されたポリマー性血管移植片を形成することを含むか、または本質的にそれらの工程からなる。本明細書で使用されるとき、用語「被覆する」とは、任意の適切なプロセスにより、本開示の内皮付着剤をポリマー性材料（例えば、ｅＰＴＦＥ）に付着または堆積させて、堆積した作用剤が材料のいくらかまたは全ての表面を覆うようにすることを指す。場合によって、被覆は、ポリマー性材料の内側の管腔表面積を少なくとも部分的に覆うことを含む。ポリマー性材料の被覆は完全である必要はない。特に、場合によって、被覆されるポリマー性材料の一部分またはいくらかの部分のみに組成物を提供し、その結果として１種以上の内皮付着剤により少なくとも部分的に被覆されたポリマー性材料を得るのが好ましい。場合によって、コーティングは１以上のコーティング層を含む。コーティングは実質的に一定または変化する厚さを有することができる。
【００５２】
場合によって、ポリマー性基材の少なくとも一部分の被覆は室温または動脈内皮細胞に生理学的に関連する温度、例えば３７℃で行われる。場合によって、被覆は、ポリマー性基材の少なくとも一部分を１種以上の内皮付着剤と、任意の適当な長さの時間、例えば、制限なく、数分、数時間、または約１２時間〜約２４時間接触させることを含み、それにより部分的または完全に被覆された基材が得られる。
場合によって、方法は、１種以上の内皮細胞付着剤で被覆する前にポリマー性基材を脱ガスすることを含んでいてもよい。
【００５３】
別の態様において、本発明により、ＡＥＣが播種されたポリマー性血管移植片を冷凍保存する方法が提供される。冷凍保存は、細胞、組織、細胞外マトリックス、器官、またはその他調節されない化学的動力学により引き起こされる損傷を受け易いあらゆる生物学的構築物のような生物学的材料を非常に低い温度（通例−４０℃または−８０℃）に冷却することによって保存するプロセスである。方法は、ＡＥＣが播種されたポリマー性血管移植片を抗凍結剤（凍結防止剤、凍結保護剤、および凍結保存剤ともいわれる）と接触させ、次いで接触させた材料を凍結温度に曝露することを含むかまたは本質的にそれらの工程からなることができる。抗凍結剤は血管移植片上の生物学的材料を凍結の損傷効果（例えば氷の結晶形成および生物学的材料中の水分子が凍るための増大した溶質濃度）から保護する。場合によって、凍結保存された血管移植片は、凍結し解凍した後、処理前の移植片組織の細胞計数および凍結解凍後の移植片の細胞計数により決定されるＡＥＣ細胞生存能力の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を保持する。
【００５４】
別の態様において、本発明により、動脈内皮細胞を播種した血管移植片を送達する方法が提供され、この方法は、動脈内皮細胞を播種した血管移植片の要請を受領したら、ヒト動脈内皮細胞を選択し；選択されたヒトＡＥＣを内皮細胞付着剤により少なくとも部分的に被覆されたポリマー性基材に播種し；播種されたポリマー性基材を約２〜約１０日培養することにより、血管移植片として移植するのに適したＡＥＣが播種されたポリマー性基材を生産し；ＡＥＣが播種された血管移植片を要請の受領から約１０日以内に送達することを含む。ポリマー性基材は、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ＰＧＬＡ（ポリ乳酸−コ−グリコール酸）、ポリウレタン、ポリジオキサノン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、絹、脱細胞化された足場、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）マトリックスタンパク質ベース足場、ヒアルロン酸、キトサン、およびポリヒドロキシアルカノエートから選択することができる。内皮細胞付着剤はドーパミン、フィブリン接着剤、ＲＧＤペプチド、ビトロネクチン、およびラミニンの１種以上を含むことができる。
場合によって、血管移植片は静脈内皮細胞が播種されたポリマー性基材と比べて低下した白血球接着を示す。場合によって、血管移植片は静脈内皮細胞が播種されたポリマー性基材または裸の被覆されてないポリマー性基材と比べて低下した血栓形成を示す。場合によって、血管移植片は内皮細胞付着剤で被覆されてないポリマー性基材と比べて増大した長期開存率を示す。場合によって、方法はさらに、内皮細胞付着剤で被覆する前にポリマー性基材を脱ガスすることを含む。場合によって、脱ガスは、ポリマー性基材をアセトンおよびエタノール中で洗浄すること、ポリマー性基材を有機溶媒中で洗浄すること、または真空を適用することを含む。好ましくは、ヒト動脈内皮細胞は血管移植片の受容者に対して非免疫原性である。場合によって、ヒト動脈内皮細胞は、ベータ２−ミクログロブリン遺伝子を発現しないように１以上の遺伝子改変を含む。場合によって、ヒト動脈内皮細胞は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子によりコードされる１種以上のタンパク質を発現しないように１以上の遺伝子改変を含む。場合によって、ヒト動脈内皮細胞は、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子によりコードされる１種以上のタンパク質を発現しないように１以上の遺伝子改変を含む。場合によって、ヒト動脈内皮細胞はＣＤ５８ポリペプチドを発現しないように１以上の遺伝子改変を含む。場合によって、ヒト動脈内皮細胞はＨＬＡ−Ｅ（ＥＤＩＭＥＲ）およびＣＤ４７の一方または両方を過剰発現するように１以上の遺伝子改変を含む。
【００５５】
別の態様において、本発明により、動脈内皮細胞を播種した血管移植片を送達する方法が提供され、この方法は、動脈内皮細胞を播種した血管移植片の要請を受領したら、それを必要とする対象に適切な凍結保存された動脈内皮細胞（ＡＥＣ）が播種された血管移植片を選択し；選択した凍結保存されたＡＥＣが播種された血管移植片を解凍し；解凍したＡＥＣが播種された血管移植片から、存在するならば冷凍保存溶液を除去し；要請の受領から約１〜２日以内（例えば、約２４〜約４８時間以内）にＡＥＣが播種された血管移植片を送達することを含む。重要なことに、これらの方法は、患者のケアに関する極めて重大な必要性に対する解決策、特に移植片材料の要請の受領から１〜２日以内（例えば、約２４〜約４８時間以内）に患者への準備が整ったＡＥＣが播種された血管移植片を提供する能力を提供する。このように、これらの方法は、患者の自家性静脈内皮細胞が播種された血管移植片を提供するのに約３０日を要する従来の方法に対して重大な改良を提供する。本明細書で使用されるとき、用語「患者への準備が整った」とは、移植片が事前構成されており、最小の遅延または追加の調製で患者に使用する準備が整うことを意味する。
【００５６】
場合によって、適切な凍結保存されたＡＥＣが播種された血管移植片は、対象に対して非免疫原性のヒト動脈内皮細胞を含む。ヒト動脈内皮細胞は、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子によりコードされる１種以上のタンパク質を発現しないように１以上の遺伝子改変を含むことができる。場合によって、ヒト動脈内皮細胞は、ＣＤ５８ポリペプチドを発現しないように１以上の遺伝子改変を含む。場合によって、ヒト動脈内皮細胞は、ＨＬＡ−Ｅ（ＥＤＩＭＥＲ）およびＣＤ４７の一方または両方を過剰発現するように１以上の遺伝子改変を含む。
【００５７】
製造品
別の態様において、本発明により製造品が提供される。例えば、本発明により、凍結保存された組合せ製品および冷凍保存溶液を含む容器が提供され、ここで凍結保存された組合せ製品は、内皮細胞付着剤により少なくとも部分的に被覆された移植可能なポリマー性基材に播種されたヒト動脈内皮細胞集団を含む。場合によって、内皮細胞付着剤はドーパミンを含む。本明細書に記載されているように、ヒト動脈内皮細胞は好ましくは、ポリマー性移植片が「普遍的」で、それを必要とするあらゆるヒト対象に使用するのに適しているように非免疫原性である。例えば、ヒト動脈内皮細胞は、ベータ２−ミクログロブリン遺伝子および／またはクラスＩもしくはクラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子によりコードされる１種以上のタンパク質を発現しないように１以上の遺伝子改変を含むことができる。容器はバイアル、クライオチューブ、バッグ、またはその他ポリマー性血管移植片および冷凍保存溶液を収容するのに適したいずれかの器であることができる。好ましくは、容器は凍結温度、例えば制限なく１℃〜約−１９６℃またはそれ以下（例えば、１°、０°、−１°、−５、−１０°、−２０°、−３０°、−４０°、−５０°、−６０°、−７０°、−８０°、−９０°、−１００°、−１１０°、−１２０°、−１３０°、−１４０°、−１５０°、−１６０°、−１７０°、−１８０°、−１９０°、−１９６℃、またはそれ以下）の温度で貯蔵することができる。
【００５８】
場合によって、ヒト動脈内皮細胞集団を、移植可能なポリマー性基材に播種する前に冷凍保存溶液と接触させる。他の場合、ヒト動脈内皮細胞により播種した後移植可能なポリマー性基材を冷凍保存溶液と接触させる。適切な冷凍保存溶液の例には、制限なく、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。場合によって、１０％ＤＭＳＯ溶液を冷凍保存に使用する。場合によって、冷凍保存溶液は移植の前に播種された移植可能なポリマー性基材から除去される。溶液の接触および除去工程は一般に無菌、好ましくは殺菌した条件下で行われる。
【００５９】
もう１つ別の態様において、本発明により、凍結保存された組合せ製品および冷凍保存溶液を含む容器が提供され、ここで凍結保存された組合せ製品はヒト動脈内皮細胞を播種した移植可能なポリマー性基材を含み、移植可能なポリマー性基材は１種以上の内皮細胞付着剤により少なくとも部分的に被覆される。ポリマー性基材は、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ＰＧＬＡ（ポリ乳酸−コ−グリコール酸）、ポリウレタン、ポリジオキサノン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（Ｄａｃｒｏｎ（登録商標））、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、絹、脱細胞化された足場、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）マトリックスタンパク質ベース足場、ヒアルロン酸、キトサン、およびポリヒドロキシアルカノエートから選択することができる。場合によって、ヒト動脈内皮細胞は移植可能なポリマー性基材の受容者に対して非免疫原性である。場合によって、ヒト動脈内皮細胞は、ベータ２−ミクログロブリン遺伝子を発現しないように１以上の遺伝子改変を含む。ヒト動脈内皮細胞は、クラスＩおよび／またはクラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子によりコードされる１種以上のタンパク質を発現しないように１以上の遺伝子改変を含むことができる。他の場合、ヒト動脈内皮細胞は、ＣＤ５８ポリペプチドを発現しないように１以上の遺伝子改変を含む。あるいは、またはさらに、ヒト動脈内皮細胞は、ＨＬＡ−Ｅ（ＥＤＩＭＥＲ）およびＣＤ４７の一方または両方を過剰発現するように１以上の遺伝子改変を含むことができる。容器はバイアル、クライオチューブ、またはバッグであることができる。冷凍保存溶液は約１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むことができる。場合によって、ヒト動脈内皮細胞集団を、移植可能なポリマー性基材に播種する前に冷凍保存溶液と接触させる。好ましくは、冷凍保存溶液は、移植の前に播種された移植可能なポリマー性基材から除去される。好ましくは、組合せ製品は、３７℃〜約−１９６℃（例えば、約３７°、３０°、２５°、１５°、１０°、４°、１°、０°、−１°、−５、−１０°、−２０°、−３０°、−４０°、−５０°、−６０°、−７０°、−８０°、−９０°、−１００°、−１１０°、−１２０°、−１３０°、−１４０°、−１５０°、−１６０°、−１７０°、−１８０°、−１９０°、−１９６℃、またはそれ以下）の温度で、かかる条件下で貯蔵されなかったコントロールと比べて細胞生存能力をあまり損失することなく貯蔵されるように構成される。
【００６０】
他に規定されない限り、本明細書で使用されている全ての技術および科学用語は本開示が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本出願が律する。状況により他に必要とされない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数を包含する。本明細書中で述べられている全ての刊行物、特許およびその他の参考文献は、特許または特許刊行物の特定の部分のみが参照により組み込まれると指示されない限り、各個々の刊行物または特許出願が参照により特に個別に組み込まれると指示されているかのように、参照によりその全体があらゆる目的のために組み込まれる。
本開示をさらに明らかにするために、以下の用語、略語および定義が提供される。
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、明らかに反対のことが示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されたい。本明細書中「ｏｒ」へのいかなる言及も特に明記しない限り「および／または」を包含することが意図されている。
【００６１】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき「ｏｒ」は上で定義されている通り「ａｎｄ／ｏｒ」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト中の項目を区切るとき、「ｏｒ」または「ａｎｄ／ｏｒ」は、包括的である、即ち多くの要素または要素のリストのうちの少なくとも１つを包含するばかりでなく、１つより多くも包含し、追加のリストに挙げられていない項目を包含してもよいと解釈される。明らかに反対に指示されている用語、例えば「１つだけ」もしくは「ちょうど１つ」または特許請求の範囲で使用されるときの「からなる」のみが、多くの要素または要素のリストのうちのちょうど１つの要素を含むことを指す。一般に、用語「ｏｒ」は、本明細書で使用されるとき、「どちらか」、「一方」、「１つのみ」、または「ちょうど１つ」のような排他性の用語により先行されているときだけ、排他的な選択肢を示す（即ち「一方もしくは他方、しかし両方ではない」）と解釈するべきである。「本質的に、からなる」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有する。
【００６２】
用語「含む」、および「からなる」は、本明細書で使用されるとき、「包含する」、または「含有する」と同意義であり、包括的または無制限であって、追加の、列挙されてないメンバー、要素、または方法工程を排除しない。本明細書で使用されている用語および術語は説明のためのものであり、制限すると考えるべきではない。「包含する」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含有する」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」およびそれらの変化形の使用は、その後に挙げられている項目および追加の項目を包含することを意味する。言い換えると、これらの用語は非排他的または無制限であることが意図されている。例えば、リストに挙げられている要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は必ずしもそれらの要素のみに限定されることはなく、明白にリストに挙げられてないかまたはかかる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を包含してもよい。特許請求の範囲において請求項の要素を修飾するための「第１」、「第２」、「第３」、等のような序数用語の使用は、それ自体が１つの請求項の要素と別の要素との何らかの優先性、上位性、もしくは順序、または方法の行為が行われる時間的な順序を暗示するものではない。序数の用語は、請求項の要素を区別するために、単に、ある名称を有する１つの請求項の要素を（序数の用語の使用を除いて）同一の名称を有するもう１つ別の要素と区別する標識として使用される。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、数に関連した用語「およそ」または「約」は一般に、特に明記されるかまたはその他状況から明らかでない限り、その数（より大きいまたはより小さい）どちらかの方向に５％の範囲内に入る数を包含すると考えられる（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。範囲が示されている場合、特に明記されるかまたはその他状況から明らかでない限り、終点はその範囲内に包含される。
本開示において、単語「約」、「実質的に」または「およそ」により先行されているあらゆる数値、範囲、またはどちらかの範囲の終点（例えば、「およそなし」、「ほぼなし」、「ほとんど全て」、等を含む）は、単語「約」、「実質的に」または「およそ」により先行されてない同じ数値、範囲、またはどちらかの範囲の終点も記載または開示していると理解される。
以下の実施例は、様々な実施形態をよりよく説明するために提供され、本開示の範囲を制限するように解釈するべきでない。
【実施例】
【００６４】
ｅＰＴＦＥの表面改変による細胞接着の改良
Ｍｅｉｎｈａｒｔらは（ASAIO J 43:M515-521, 1997）、静脈内皮細胞のないｅＰＴＦＥと比べて改良されたインビボ開存性を示す静脈内皮で被覆されたｅＰＴＦＥ（延伸ポリテトラフルオロエチレン）血管移植片の構築を報告した。動脈バイパス術には静脈移植片より動脈移植片が好ましいので、我々は開存性をさらに改良するために動脈内皮細胞をｅＰＴＦＥに播種した。ｅＰＴＦＥは疎水性であり、従って低い細胞接着を示す。細胞接着を改良するために、我々はプラズマ処理を行ってｅＰＴＦＥを親水性にした。結果は、プラズマ処理が細胞密度を増進したがコンフルエンスの約２０％だけであることを示しており（図１Ａ）、細胞付着をさらに改良するには細胞接着分子が必要とされることを示唆している。ＲＧＤペプチド、コラーゲン、フィブロネクチン（ＦＮ）、ラミニン、ビトロネクチン（ＶＴＮ）、およびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は細胞接着に広く使用されているので、我々はこれらの細胞付着剤でｅＰＴＦＥを被覆した。次いで、細胞播種装置を使用して細胞をｅＰＴＦＥに播種した。播種後細胞を、化学的に定義されたＦＶＩＲ培地（表１参照）を形成するためにＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）、およびレスベラトロール（ＲＥＳＶ）を補充した基礎培地を含む培養培地中でさらに２〜２０日培養した。驚くべきことに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびＶＴＮのみが９５％超の細胞コンフルエンスを達成することができた（図１Ｂ）。
【００６５】
次に、我々はｅＰＴＦＥをドーパミンで被覆したところ（図２Ａ）、自己重合を経てｅＰＴＦＥの表面に堆積することができた。結果は、ドーパミンコーティングが細胞密度を改良し、合成基材上の細胞死を低減した（図２Ｂ−２Ｃ）ことを示していた。ｅＰＴＦＥへの内皮細胞播種を改良するためにフィブリン接着剤が使用された（Ｚｉｌｌａら、１９８９年）。しかしながら、この方法は多数の工程を含んでおり、従って大規模の臨床応用にスケールアップすることが困難である。従って、我々は、ドーパミンのような他の内皮細胞接着剤をフィブリン接着剤の代わりに細胞播種に使用することができるかどうか検討した。我々は、ドーパミンで被覆されたｅＰＴＦＥへの細胞播種を比較した。図２Ｄに示されているように、免疫染色は、ＡＥＣ密度がドーパミンおよびフィブリン接着剤で被覆されたｅＰＴＦＥで同等であったことを明らかにした。これらのデータは、様々な内皮細胞接着剤を、ヒトＡＥＣをポリマー性基材に播種するのに使用することができることを示している。
【００６６】
【表１】
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ドーパミンおよびフィブリン接着剤で被覆されたｅＰＴＦＥの細胞播種効率の比較
フィブリン接着剤はｅＰＴＦＥへの内皮細胞播種を改良するのに使用された（Ｚｉｌｌａら、１９８９年）。しかしながら、この方法は多数の工程を含んでおり、従って大規模の臨床応用にスケールアップすることが困難である。従って、我々は、ドーパミンならびに細胞外マトリックスペプチドおよびタンパク質のような他の内皮細胞接着剤をフィブリン接着剤の代わりに細胞播種に使用することができるかどうか検討した。我々は、ドーパミン、フィブリン接着剤、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）ペプチド、ＶＴＮ（ビトロネクチン）、およびラミニンで被覆されたｅＰＴＦＥに対する細胞播種を比較した。図２Ａに示されているように、免疫染色は、ＡＥＣ密度がドーパミンおよびフィブリン接着剤で被覆されたｅＰＴＦＥで同等であったことを明らかにした。図２Ｂに示されているように、ＡＥＣはＲＧＤペプチド、ビトロネクチン、およびラミニンで被覆されたｅＰＴＦＥによく接着した。これらのデータは、様々な内皮細胞接着剤を、ヒトＡＥＣをポリマー性基材に播種するのに使用することができることを示している。
【００６７】
ＡＥＣ−ｅＰＴＦＥはより低い白血球接着を示す
増大した白血球接着はアテローム性動脈硬化症の始まりの特質である（Ｄｅ  Ｃａｔｅｒｉｎａら、１９９５年；Ｌｅｇｅｉｎら、２０１３年）。動脈内皮細胞（ＡＥＣ）は、静置培養で静脈内皮細胞と比較したときより低い白血球接着を示したが（Ｚｈａｎｇら、２０１７年）、これはＡＥＣがアテローム性動脈硬化に対してより耐性であることを示唆している。ヒトＡＥＣが播種されたｅＰＴＦＥ材料（「ＡＥＣ−ｅＰＴＦＥ移植片」）が動脈の特定の機能を流れと共に維持するかどうか検討するために、我々はそれぞれＡＥＣおよびＨＵＶＥＣが播種されたｅＰＴＦＥ（ヒト臍帯静脈内皮細胞；「ＨＵＶＥＣ−ｅＰＴＦＥ移植片」）の白血球接着を比較した。白血球を、２μＭのカルセインＡＭに約１５分曝露することにより染色した。カルセインＡＭで標識された白血球を次いで、ＡＥＣおよびＨＵＶＥＣが播種されたｅＰＴＦＥに約１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度で添加した。カルセインＡＭで標識された白血球細胞懸濁液およびｅＰＴＦＥを両方共０．５ｍｌの管に入れ、管を６０ｒｐｍで１時間回転した。１時間後、細胞が播種されたｅＰＴＦＥを新鮮な培地で３回穏やかに洗浄した後画像化のために固定し、ＤＡＰＩで染色した。血管を通る流体の流れを模倣するために、剪断応力下で白血球接着アッセイを行った。
【００６８】
ＴＮＦα処置の前には、ＡＥＣが播種されたおよびＨＵＶＥＣが播種された基材に付着した白血球はほとんど観察されなかった（図３Ａ）。ＴＮＦα処置の後、多くの白血球がＨＵＶＥＣ−ｅＰＴＦＥ移植片に付着したが、ずっと少ない白血球がＡＥＣ−ｅＰＴＦＥ移植片に付着した（図３Ａ−３Ｂ）。結果は、ＡＥＣ−ｅＰＴＦＥが静脈内皮で被覆されたｅＰＴＦＥと比較して血管障害に対してより耐性であり得ることを示唆していた。
【００６９】
ｅＰＴＦＥの脱ガスは細胞凝集体の形成を防ぎ、ＣＤ３１の発現および細胞密度を改良する
ｅＰＴＦＥ血管移植片は７０容量％の空気を含む（Ｂｅｎｓｅｎら、１９９１年）。流体が流れると、ｅＰＴＦＥの表面に泡またはガスの核が発生し（Ｂｅｎｓｅｎら、１９９１年）、これはドーパミンコーティング、従って内皮被覆を傷つけ得る。我々は、アセトンおよびエタノールを使用して脱ガスを行った。ｅＰＴＦＥをアセトンに１０〜６０分沈めた後、１００％のＥｔＯＨ、９０％のＥｔＯＨ、および７０％のＥｔＯＨの各々で３０分濯いだ。脱ガスしたｅＰＴＦＥは使用前にＨ2Ｏ中に保った。脱ガス後ｅＰＴＦＥをドーパミンで被覆し、次いでＡＥＣを播種した。ＣＤ３１発現（赤色染色）の平均蛍光強度が脱ガス後増大したのが観察された（図４Ａ、４Ｃ）。脱ガスはまた、脱ガスの前および８日後の核の数を比較することにより決定される播種された基材上の細胞密度も増大させた（図４Ａ、４Ｂ）。加えて、ＣＤ３１の蛍光強度により測定されるようにＣＤ３１発現も増大した（図４Ａ、４Ｃ）。ＡＥＣが播種されたｅＰＴＦＥ試料２に細胞凝集体が形成された（図４Ａ）が、脱ガス処理が細胞凝集体の数を低減する（図４Ａ）ことが観察された。全体として、これらのデータは脱ガスがｅＰＴＦＥの内皮被覆を改良したことを示していた。
【００７０】
「直ぐに購入可能な」製品を開発するために、我々はＡＥＣ−ｅＰＴＦＥ血管移植片と共に使用される様々な冷凍保存溶液を試験した。グリセロールは臨床使用されるヒト代用皮膚の冷凍保存に使用された（米国特許出願公開第２０１４０２７１５８３号）。しかし、我々の結果は、グリセロールがＡＥＣ−ｅＰＴＦＥ血管移植片の冷凍保存に適していないことを示した（図５Ａ）。Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（商標）細胞培養凍結培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）は５つの異なる接着および浮遊細胞株の冷凍保存において細胞生存能力を改良したが、Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（商標）を使用してＡＥＣ−ｅＰＴＦＥ血管移植片を凍結したときほとんどの細胞が死んだ（図５Ｂ）。ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）と組み合わせたＤＭＳＯは一般に冷凍保存に広く使用されている（Ｈａら、２００５年）。興味深いことに、我々の結果は、ＦＢＳが凍結させたＡＥＣ−ｅＰＴＦＥ移植片上の細胞生存を低減したことを示していた（図５Ｂ）。対照的に、１０％のＤＭＳＯを含有する無血清培地は、最も高い細胞生存率を示し、これは凍結させてないコントロール試料での細胞生存に匹敵していた（図５Ｂ）。ＤＭＳＯ濃度を低下または上昇すると細胞生存に負の影響を及ぼし（図５Ｃ）、１０％のＤＭＳＯがＡＥＣ−ｅＰＴＦＥ血管移植片の冷凍保存によく適していることを示した。
【００７１】
方法および材料
フィブリン接着剤コーティング：フィブリノーゲン成分（Ｂａｘｔｅｒ、ＴＩＳＳＥＥＬ）を、フィブリノーゲンの２ｍｌ部分を４ｍｌの加熱された繊維素溶解阻害剤で希釈した後１ｍｌのトラネキサム酸（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって調製した。トロンビン成分を、２ｍｌのフィブリノーゲンを４ｍｌのＣａＣｌ2、７５ｍｌのＨ2Ｏ、および４ｍｌのトラネキサム酸（２０ｍｇ／ｍｌ）中に希釈することによって調製した。フィブリノーゲン成分をｅＰＴＦＥに通して三回流した。次に、トロンビン成分をｅＰＴＦＥに通してｅＰＴＦＥに通して５分間流した。ｅＰＴＦＥを蒸留水で３回濯いだ。被覆工程を一回繰り返した後、ｅＰＴＦＥを５ｍｌの５０Ｕ／ｍｌヘパリンでフラッシュした。
ドーパミンコーティング：ドーパミンを１０ｍＭのＴｒｉｓ溶液（ｐＨ＝８．５）に２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。直ぐにｅＰＴＦＥを溶液に浸け、溶液中室温または３７℃で４〜２４時間インキュベートした。被覆されたｅＰＴＦＥを蒸留水で５回洗浄した。
【００７２】
細胞をｅＰＴＦＥに播種する：内皮細胞を、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を含む細胞培養培地に（１．５×１０6細胞／ｍｌ）の密度で懸濁させ、ｅＰＴＦＥに播種した。ｅＰＴＦＥを管に入れた後、細胞播種装置（Ｅｎｄｏｓｔｒａｄｉｌｉｓａｔｏｒ  ＩＩＩ、Ｂｉｇｇｌｅｒ）に載せた。ｅＰＴＦＥ（管内）を３時間４ｒｐｈで回転させた。あるいは、ｅＰＴＦＥを１時間インキュベートした後、手動で９０°回し、もう１時間インキュベートすることができる。９０°回転を４回繰り返した。
ｅＰＴＦＥの脱ガス：脱ガスを、ｅＰＴＦＥをアセトンに３時間浸けた後アセトンで処理したｅＰＴＦＥを７０％エタノールで３０分洗浄することにより行った（３回繰り返した）。脱ガスしたｅＰＴＦＥを蒸留水で３０分濯いだ（３回繰り返した）。この時点から、ｅＰＴＦＥは再ガス化を避けるために蒸留水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に浸ける必要がある。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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