(57)【要約】  本発明は、用量感受性知的能力障害などの障害を処置するための内在性調節が可能な標的組織において導入遺伝子の発現を提供する目的のための、フィードバック使用可能合成遺伝子、ポリヌクレオチド標的カセット、ベクター、および医薬組成物、ならびにその作製方法および使用方法に関する。
2021534778.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と１つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドを含む合成遺伝子であって、
ポリヌクレオチドが、それぞれが内在性ｍｉＲＮＡの結合部位として同定されるシードマッチと前記シードマッチに隣接する５’フランキング配列および３’フランキング配列とを含む、１つまたは複数の核酸セグメントをさらに含み、
前記１つまたは複数の核酸セグメントが、前記合成遺伝子が内在性ｍｉＲＮＡを発現する細胞に送達される際の前記目的のタンパク質または核酸の発現が、１つまたは複数の核酸セグメントを含まない合成遺伝子が内在性ｍｉＲＮＡを発現する細胞に送達される際の目的のタンパク質または核酸の発現と比較して低下しているように、前記ポリヌクレオチドの調節領域内に挿入されている、
合成遺伝子。
【請求項２】
目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域が、ＴＣＦ４、ＵＢＥ３Ａ、ＤＹＲＫ１Ａ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＳＤ１、ＺＥＢ２、ＭＢＤ５、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＡＴＲＸ、ＭＥＣＰ２、ＳＬＣ６Ａ１、ＦＯＸＧ１、ＡＫＴ３、またはその活性断片から選択される遺伝子のコード領域を含む、請求項１に記載の合成遺伝子。
【請求項３】
目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域が、遺伝子ＭＥＣＰ２またはその活性断片のコード領域を含む、請求項１に記載の合成遺伝子。
【請求項４】
シードマッチならびに５’および３’フランキング配列が、ｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、ｌｅｔ−７−５ｐ／９８−５ｐ、ｍｉＲ−２９−３ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−９８−５ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−４９４−３ｐ、またはその任意の組合せから選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡと結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
【請求項５】
シードマッチならびに５’および３’フランキング配列が、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
【請求項６】
シードマッチならびに５’および３’フランキング配列が、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−４５１ａ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
【請求項７】
シードマッチが約５〜約１０個のヌクレオチドの長さである、請求項１から６のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
【請求項８】
シードマッチが約６〜約８個のヌクレオチドの長さである、請求項１から６のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
【請求項９】
シードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列がそれぞれ約９〜約１３個のヌクレオチドの長さである、請求項１から６のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
【請求項１０】
シードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列がそれぞれ１１個のヌクレオチドの長さである、請求項１から６のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドが少なくとも２つのシードマッチを含み、シードマッチが約７〜約４０個のヌクレオチドによって隔てられている、請求項１から６のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
【請求項１２】
少なくとも２つのシードマッチが約２０〜約２５個のヌクレオチドによって隔てられている、請求項１１に記載の合成遺伝子。
【請求項１３】
少なくとも２つのシードマッチが２２個のヌクレオチドによって隔てられている、請求項１１に記載の合成遺伝子。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが３〜８個のシードマッチを含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
【請求項１５】
シードマッチならびにシードマッチに隣接するフランキング３’および５’配列が、配列番号１と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
【請求項１６】
シードマッチならびにシードマッチに隣接するフランキング３’および５’配列が、配列番号２と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の合成遺伝子。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の合成遺伝子を含むベクター。
【請求項１８】
プラスミド、ウイルスベクター、発現カセット、形質転換細胞、またはナノ粒子である、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の合成遺伝子または請求項１７もしくは１８に記載のベクターと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２０】
内在性ｍｉＲＮＡの結合部位として同定されるシードマッチと前記シードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列とを含む１つまたは複数の核酸セグメントを含む、合成遺伝子に用量依存的阻害性フィードバックを提供するためのポリヌクレオチド標的カセット。
【請求項２１】
シードマッチならびに５’および３’フランキング配列が、ｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、ｌｅｔ−７−５ｐ／９８−５ｐ、ｍｉＲ−２９−３ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−９８−５ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−４９４−３ｐ、またはその任意の組合せから選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡと結合する、請求項２０に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
【請求項２２】
シードマッチならびに５’および３’フランキング配列が、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する、請求項２０に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
【請求項２３】
シードマッチならびに５’および３’フランキング配列が、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−４５１ａ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する、請求項２０に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
【請求項２４】
シードマッチが約５〜約１０個のヌクレオチドの長さである、請求項２０から２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
【請求項２５】
シードマッチが約６〜約８個のヌクレオチドの長さである、請求項２０から２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
【請求項２６】
シードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列がそれぞれ約９〜約１３個のヌクレオチドの長さである、請求項２０から２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
【請求項２７】
シードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列がそれぞれ１１個のヌクレオチドの長さである、請求項２０から２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
【請求項２８】
シードマッチならびにシードマッチに隣接するフランキング３’および５’配列が、配列番号１と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２０から２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
【請求項２９】
シードマッチならびにシードマッチに隣接するフランキング３’および５’配列が、配列番号２と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２０から２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセット。
【請求項３０】
請求項２０から２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド標的カセットを合成遺伝子の調節領域内に挿入するステップを含む、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と１つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドを含む合成遺伝子を調製する方法。
【請求項３１】
それぞれが内在性ｍｉＲＮＡの結合部位として同定されるシードマッチと前記シードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列とを含む、１つまたは複数の核酸セグメントを、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と１つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドの調節領域内に挿入するステップを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の合成遺伝子を作製する方法。
【請求項３２】
目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域が、ＴＣＦ４、ＵＢＥ３Ａ、ＤＹＲＫ１Ａ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＳＤ１、ＺＥＢ２、ＭＢＤ５、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＡＴＲＸ、ＭＥＣＰ２、ＳＬＣ６Ａ１、ＦＯＸＧ１、ＡＫＴ３またはその活性断片から選択される遺伝子のコード領域を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域が遺伝子ＭＥＣＰ２またはその活性断片のコード領域を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
シードマッチならびに５’および３’フランキング配列が、ｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、ｌｅｔ−７−５ｐ／９８−５ｐ、ｍｉＲ−２９−３ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−９８−５ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−４９４−３ｐ、またはその任意の組合せから選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡと結合する、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
シードマッチならびに５’および３’フランキング配列が、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
シードマッチならびに５’および３’フランキング配列が、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−４５１ａ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
目的のタンパク質または核酸が発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加したｍｉＲＮＡをスクリーニングするステップと、
発現が増加した１つまたは複数のｍｉＲＮＡのシードマッチならびに５’および３’フランキング配列を同定するステップと、
前記ポリヌクレオチドの調節領域内に挿入することとなる前記シードマッチと５’および３’フランキング配列とを含む核酸セグメントを調製するステップと
をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加した１つまたは複数のｍｉＲＮＡのシードマッチならびに５’および３’フランキング配列を同定するステップと、
前記シードマッチと５’および３’フランキング配列とを、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と１つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドを含む合成遺伝子の調節領域内に挿入するステップと
を含む、合成遺伝子中に挿入することとなる１つまたは複数のシードマッチならびに５’および３’フランキング配列を同定する方法。
【請求項３９】
妥当性確認されたまたは推定上のシードマッチならびに５’および３’フランキング配列について核酸データセットをスクリーニングするステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加したｍｉＲＮＡを同定するステップをさらに含む、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加したｍｉＲＮＡについて核酸データセットをスクリーニングするステップをさらに含む、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
目的のタンパク質または核酸を細胞中で発現させるステップと、
ｍｉＲＮＡを細胞から収集するステップと、
前記目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、前記目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを計算し、それによって前記ｍｉＲＮＡの核酸データセットを作成するステップと
をさらに含む、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
核酸データセットが３’ＵＴＲデータセットである、請求項３９、４１、または４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
目的のタンパク質または核酸が、ＴＣＦ４、ＵＢＥ３Ａ、ＤＹＲＫ１Ａ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＳＤ１、ＺＥＢ２、ＭＢＤ５、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＡＴＲＸ、ＳＬＣ６Ａ１、ＦＯＸＧ１、ＡＫＴ３、ＭＥＣＰ２、またはその活性断片から選択される遺伝子の転写産物または翻訳産物である、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
目的のタンパク質または核酸が遺伝子ＭＥＣＰ２またはその活性断片の転写産物または翻訳産物である、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
対象に請求項１から１６のいずれか一項に記載の合成遺伝子、請求項１７もしくは１８に記載のベクター、または請求項１９に記載の医薬組成物を投与し、それによって合成遺伝子を対象に送達するステップを含む、合成遺伝子を対象に送達する方法。
【請求項４７】
内在性遺伝子によってコードされている目的のタンパク質または核酸をコードしている請求項１から１６のいずれか一項に記載の合成遺伝子、請求項１７もしくは１８に記載のベクター、または請求項１９に記載の医薬組成物を投与し、それによって疾患を処置するステップを含む、内在性遺伝子の異常発現または内在性遺伝子によってコードされている突然変異タンパク質の発現に関連する疾患を処置する方法。
【請求項４８】
対象がヒトである、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
対象が知的能力遺伝子用量感受性障害の危険性を有するまたは危険性にある、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
対象が、レット症候群、ＭｅＣＰ２重複症候群、アンジェルマン症候群、ｄｕｐ１５Ｑ、ＤＹＲＫ１Ａハプロ不全、ダウン症候群、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全症候群、ｄｕｐ５Ｑ１４．３、ソトス症候群、逆ソトス症候群、アルファ地中海貧血症Ｘ連鎖知的障害症候群、Ｘｑ１３．２ｑ２１．１重複、コフィン−ローリー症候群、Ｘｐ２２．１２重複、ピット・ホプキンス症候群、モワット−ウィルソン症候群、２ｑ２２．３三重複、２ｑ２３．１重複、２ｑ２３．１微小欠失、ＦＯＸＧ１症候群、ウエスト症候群、巨大脳症−多小脳回−多指症−水頭症症候群、ＡＫＴ３重複、デューズ症候群、ＳＬＣ６Ａ１重複、および１８トリソミーからなる群から選択される障害の危険性を有するまたは危険性にある、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
対象がレット症候群またはＭｅＣＰ２重複症候群の危険性を有するまたは危険性にある、請求項４６から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
合成遺伝子、ベクター、または医薬組成物を、経腸、非経口、くも膜下腔内、大槽内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内、眼周囲、直腸内、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、舌下、皮下、および経皮からなる群から選択された送達経路によって送達する、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
合成遺伝子を静脈内で送達する、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
合成遺伝子をＣＳＦ内で送達する、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
対象において目的のタンパク質または核酸をコードしている内在性遺伝子を遺伝的にノックダウンするステップをさらに含む、請求項４６から５４に記載の方法。
【請求項５６】
内在性遺伝子がＭＥＣＰ２である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
対象の細胞中の内在性遺伝子を遺伝的にノックダウンするステップと、内在性遺伝子によってコードされている目的のタンパク質または核酸をコードしている請求項１から１４のいずれか一項に記載の合成遺伝子、請求項１５もしくは１６に記載のベクター、または請求項１７に記載の医薬組成物を投与し、それによって疾患を処置するステップとを含む、対象において、内在性遺伝子の異常発現または内在性遺伝子によってコードされている突然変異タンパク質の発現に関連する疾患を処置する方法。
【請求項５８】
疾患が、レット症候群、ＭｅＣＰ２重複症候群、アンジェルマン症候群、ｄｕｐ１５Ｑ、ＤＹＲＫ１Ａハプロ不全、ダウン症候群、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全症候群、ｄｕｐ５Ｑ１４．３、ソトス症候群、逆ソトス症候群、アルファ地中海貧血症Ｘ連鎖知的障害症候群、Ｘｑ１３．２ｑ２１．１重複、コフィン−ローリー症候群、Ｘｐ２２．１２重複、ピット・ホプキンス症候群、モワット−ウィルソン症候群、２ｑ２２．３三重複、２ｑ２３．１重複、２ｑ２３．１微小欠失、ＦＯＸＧ１症候群、ウエスト症候群、巨大脳症−多小脳回−多指症−水頭症症候群、ＡＫＴ３重複、デューズ症候群、ＳＬＣ６Ａ１重複、および／または１８トリソミーである、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の記載
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）条の下、その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている、２０１８年８月３０日出願の米国仮出願第６２／７２５，１２６号および２０１９年６月１３日出願の第６２／８６１，０４４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表の電子出願に関する記載
名称が５４７０−８４４ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、１７，３７５バイトのサイズであり、２０１９年８月２２日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出された、米国特許法施行規則１．８２１条の下で提出されたＡＳＣＩＩテキストフォーマットの配列表を、紙コピーの代わりに提供する。この配列表は、これにより、その開示のために本明細書内にこれ中に参考として組み込まれている。
【０００３】
政府支援の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号４Ｔ３２ＨＤ０４０１２７−１５号の下、政府支援によって行われた。政府が本発明の特定の権利を有する。
【０００４】
本発明は、用量感受性知的能力障害などの障害を処置するための内在性調節が可能な標的組織において導入遺伝子の発現を提供する目的のための、フィードバック使用可能（ｆｅｅｄｂａｃｋ−ｅｎａｂｌｅｄ）合成遺伝子、ポリヌクレオチド標的カセット、ベクター、および医薬組成物、ならびにその作製方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
知的障害によって特徴づけられるいくつかの神経発達障害は、厳密に調節しなければならない遺伝子中の突然変異によって媒介される（表１を参照）。内在性遺伝子産物の発現は、既知および未知の分子機構を通じて標的および非標的組織のどちらにおいても慎重に調節されている。不適切または不完全な調節を有する標的組織における遺伝子療法ベクターからの遺伝子産物の過剰および過少発現という、現在の遺伝子療法におけるマイナスの結果が存在する。したがって、当技術分野において、改善された発現の調節を有するベクターの必要性が存在する。本発明は、用量感受性知的能力障害などの障害を処置するための内在性調節が可能な標的組織において導入遺伝子の発現を提供する目的のための、フィードバック使用可能合成遺伝子、ポリヌクレオチド標的カセット、ベクター、および医薬組成物を提供することによって、当技術分野における弱点を克服する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、レット症候群（ＲＴＴ）などの用量感受性知的能力障害等の障害を処置するための内在性調節が可能な標的組織において導入遺伝子の発現を提供する目的のための、フィードバック使用可能合成遺伝子、ポリヌクレオチド標的カセット、ベクター、および医薬組成物の開発に部分的に基づく。本発明は、レット症候群研究トラスト（Ｒｅｔｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｕｓｔ）からの支援で部分的に行われた。
【０００７】
したがって、本発明の一態様は、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と１つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドを含む合成遺伝子であって、ポリヌクレオチドが、それぞれが内在性ｍｉＲＮＡの結合部位として同定されるシードマッチと前記シードマッチに隣接する５’フランキング配列および３’フランキング配列とを含む、１つまたは複数の核酸セグメントをさらに含み、前記１つまたは複数の核酸セグメントが、前記合成遺伝子が内在性ｍｉＲＮＡを発現する細胞に送達される際の前記目的のタンパク質または核酸の発現が、１つまたは複数の核酸セグメントを含まない合成遺伝子が内在性ｍｉＲＮＡを発現する細胞に送達される際の目的のタンパク質または核酸の発現と比較して低下しているように、前記ポリヌクレオチドの調節領域内に挿入されている、合成遺伝子に関する。
【０００８】
本発明のさらなる態様は、本発明の合成遺伝子を含むベクターおよび医薬組成物に関する。
【０００９】
本発明の別の態様は、本発明の合成遺伝子に用量依存的阻害性フィードバックを提供するためのポリヌクレオチド標的カセットに関する。
【００１０】
さらなる態様は、ポリヌクレオチド標的カセットを合成遺伝子の調節領域内に挿入するステップを含む、合成遺伝子を調製する方法に関する。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、シードマッチと５’および３’フランキング配列とを含む１つまたは複数の核酸セグメントを合成遺伝子のポリヌクレオチドの調節領域内に挿入するステップを含む、合成遺伝子を作製する方法に関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、シードマッチおよびフランキング配列を同定するステップと、前記シードマッチおよびフランキング配列を合成遺伝子の調節領域内に挿入するステップとを含む、合成遺伝子内に挿入することとなる１つまたは複数のシードマッチおよびフランキング配列を同定する方法に関する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、対象に、本発明の合成遺伝子、ベクター、または医薬組成物を投与するステップを含む、対象に合成遺伝子を送達する方法に関する。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、本発明の合成遺伝子、ベクター、または医薬組成物を投与し、それによって疾患を処置するステップを含む、内在性遺伝子の異常発現に関連する疾患を処置する方法に関する。
【００１５】
本発明の別の態様は、対象の細胞中の内在性遺伝子を遺伝的にノックダウンするステップと、本発明の合成遺伝子、ベクター、または医薬組成物を投与し、それによって疾患を処置するステップとを含む、対象において、内在性遺伝子の異常発現または内在性遺伝子によってコードされている突然変異タンパク質の発現に関連する疾患を処置する方法に関する。
【００１６】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＭｅＣＰ２駆動のｍｉＲＮＡが、外因性ＭｅＣＰ２の毒性がある過剰発現をどのように弱毒化し得るかを描写する、フィードバックループを示す図である。
【図２】試料のマイクロアレイデータを示す図である。選択されたデータが、ＭｅＣＰ２ヌル対野生型（ＷＴ）の組織中のｍｉＲＮＡ発現レベルを定量する。
【図３】生理食塩水で処置したＷＴマウスにおいて（生理食塩水で処置したＫＯマウスと比較して）平均発現レベルが増加したｍｉＲＮＡを示す図である。（３つの組織型のうちの少なくとも１つにおいて）発現の統計的に有意な増加を有するｍｉＲＮＡを示す（＊）。ＡＡＶ９／ＥＧＦＰに応答して上方調節もされている（任意の組織中）偽陽性ヒットを示す（＊＊）。ｎ＝２回の反復スクリーニング／生体試料、ｎ＝３匹のマウス／処置群。
【図４】内在性ＭｅＣＰ２発現に相関して頚髄（ＣＣ）または髄質のどちらかにおいて発現が増加したｍｉＲＮＡを示す図である。それぞれのデータ点は、１匹のマウスについて２回の反復スクリーニングの平均である。互いに有意差のある群を赤色の四角で囲む。ｎ＝３匹のマウス／処置群。
【図５】ＡＡＶ／ＭＥＣＰ２で処置したＫＯマウスにおいて（生理食塩水で処置したＫＯマウスと比較して）平均発現レベルが増加したｍｉＲＮＡを示す図である。（３つの組織型のうちの少なくとも１つにおいて）発現の統計的に有意な増加を有するｍｉＲＮＡを示す（＊）。ＡＡＶ９／ＥＧＦＰに応答して上方調節もされている（任意の組織中）偽陽性ヒットを示す（＊＊）。ｎ＝２回の反復スクリーニング／生体試料、ｎ＝３匹のマウス／処置群。
【図６】ＡＡＶ／ＭＥＣＰ２で処置したＷＴマウスにおいて（生理食塩水で処置したＷＴマウスと比較して）平均発現レベルが増加したｍｉＲＮＡを示す図である。（３つの組織型のうちの少なくとも１つにおいて）発現の統計的に有意な増加を有するｍｉＲＮＡを示す（＊）。ＡＡＶ９／ＥＧＦＰに応答して上方調節もされている（任意の組織中）偽陽性ヒットを示す（＊＊）。ｎ＝２回の反復スクリーニング／生体試料、ｎ＝３匹のマウス／処置群。
【図７】ＷＴまたはＫＯマウスのどちらかにおいて、外因性ＭｅＣＰ２発現に相関して発現が増加したｍｉＲＮＡを示す図である。
【図８】「Ｖ２」ウイルスゲノム内へのｍｉｒ−４９４−３ｐ標的の挿入が、ＭｅＣＰ２−ＥＧＦＰ（＋）細胞（対ＭｅＣＰ２ヌル細胞）において外因性ＭｅＣＰ２発現をわずかに（有意でなく）減少させることを示す図である。２０１６年のパイロット研究においてｍｉＲ−４９４−３ｐが陽性ヒットとして同定された後、３つのタンデム標的をＭｅＰ４２６−ｈＭＥＣＰ２−ｍｙｃ−ＲＤＨ１ｐＡウイルスゲノムの３’ＵＴＲ中に挿入した（ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１９、およびｍｉＲ−２２の標的は除去した）。改変ウイルスゲノムをＡＡＶ９（ＡＡＶ９／Ｖ２−Ｔ１）内にパッケージングし、モザイクＭＥＣＰ２ＥＧＦＰ−融合／ヌルマウス内に注射した。導入遺伝子の発現は、隣接するヌル細胞において観察されるものと比較して、ＭｅＣＰ２−ＥＧＦＰ（＋）細胞においてわずかに減少していた。
【図９】総計したＭＥＣＰ２発現に相関して上方調節されたｍｉＲＮＡを示す図である。ＭＥＣＰ２（−）群は、生理食塩水およびＡＡＶ９／ＥＧＦＰで処置したＫＯマウスについてのデータ点を示す。ＭＥＣＰ２（＋）群は、生理食塩水、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２、およびＡＡＶ９／ＥＧＦＰで処置したＷＴマウス、ならびにＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２で処置したＫＯマウスについてのデータ点を示す。四角は有意差を示す。
【図１０】パネルＡ〜Ｅは、ＲＴＴ特異的パネルｒｅｇ１が、ＷＴプルキンエ細胞において総ＭｅＣＰ２発現をどのように厳密に調節するかを示す図である。プルキンエ細胞は大槽内注射部位の近くに位置しており、超生理的な導入遺伝子の発現に対して脆弱である。それぞれの核についての補正した総細胞蛍光（抗ＭｅＣＰ２シグナル）を、ｍｙｃ（−）プルキンエ核についての平均ＭｅＣＰ２シグナルのそれに対して正規化した。パネルＡにおいてそれぞれのマウスについて提示した平均は、指定した宿主について定量したすべてのｍｙｃ（＋）核にわたって平均した、正規化したＭｅＣＰ２シグナルを表す。Ｚスタック内の細胞にわたる反復平均化、その後、１匹のマウス内のＺスタックにわたる反復平均化は、同様に総ＭｅＣＰ２発現の有意な減少をもたらす。パネルＡおよびＢは、公開対照（ＡＡＶ９／ＭｅＰ４２６−ミニＭＥＣＰ２−ｍｙｃ−ＲＤＨ１ｐＡ、Ｇａｄａｌｌａら、２０１７年）を用いた処置の後に、形質導入したプルキンエ細胞における平均総ＭｅＣＰ２発現（ミニ＋内在性完全長）は、形質導入していないプルキンエ細胞のものの５×であったことを示す。神経ノックダウンの陽性対照パネル（ｍｉＲ−１２４−３ｐの３つの標的を特長とする）は、過剰発現を半分に減少させた（ｐ＝０．０６）。ｒｅｇ１カセットも過剰発現を半分に減少させた（ｐ＝０．０２）。パネルＣは総ＭｅＣＰ２強度のヒストグラムを示し、ｒｅｇ１が総ＭｅＣＰ２強度の分布を狭めることを示しており、これはより厳密な調節の指標である。パネルＤは、形質導入したプルキンエ細胞の平均総ＭｅＣＰ２強度対局所形質導入効率を示し、それぞれのデータ点は、単一Ｚスタック内のプルキンエ細胞の平均強度および形質導入効率を表す。傾向線は１匹のマウスからのＺスタックを結ぶ。ｒｅｇ１カセットは、高い形質導入効率を有する小脳の領域においてさえも、総ＭｅＣＰ２発現を制限する。対照的に、陰性対照パネルは、高い局所形質導入効率を有する領域において、生理的レベルを大幅に上回る総ＭｅＣＰ２発現を許可する。パネルＥは、ｒｅｇ１カセットがＮｅｕＮ＋細胞において導入遺伝子の発現を許可することを示す。対照的に、神経ノックダウンの陽性対照はＮｅｕＮ＋細胞のパーセンテージを減少させる。データは平均±ＳＥＭである。
【図１１】ｒｅｇ１が、ヘテロ接合性モザイク雌マウスにおけるＡＡＶ９／ミニ−ＭＥＣＰ２−ｒｅｇ１の大槽内投与後に肝臓導入遺伝子の発現を減少させるように見える、予備データを示す図である。示した画像のすべてにおいて同一のゲイン設定を使用した。スケールバーは２０μｍを示す。それぞれの象限は、ＩＤ番号（ＩＤ＃）によって示した１匹のマウスを描写する。
【図１２】ＲＴＴ特異的パネル（他の箇所では「ｒｅｇ１」と呼ぶ）および幅広く適用可能なパネル（他の箇所では「ｒｅｇ２」または「ＵＮＩＶＴ」と呼ぶ）を設計するための戦略を要約する図である。パネルＡは、外因性ＭｅＣＰ２発現をｉｎ  ｖｉｖｏで安全に調節するためのＲＴＴ特異的標的パネルを設計するために使用した、発現データを示す。パネルＢに示すように、同じ発現データが、ｒｅｇ２を設計する目的ためにＵＴＲデータ組を処理するための選択基準を提供した。パネルＣ〜Ｇは、２４９１個のヒト標的のリストを、ｒｅｇ２の中で特長とっている６個の保存的標的まで絞り込むために使用したステップを示す。これらの標的のうちの５個は、ＭｅＣＰ２駆動のｍｉＲＮＡと結合することが予測される（表１を参照）。ｌｅｔ−７標的が多くのｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡシードと塩基対合するため、ｒｅｇ２パネルは１１個までのｍｉＲＮＡと結合し得ることが可能である。
【図１３】ｒｅｇ２が、ＰＨＰ．Ｂ媒介性のミニＭＥＣＰ２遺伝子移入後に、ＷＴ脳において導入遺伝子の発現を減少させることを示す図である。図中に示す頭文字としては、ＣＡ１〜３、海馬の領域；ＣＴＸ、皮質；ＭＩＤ、中脳；ＳＵＢ、海馬台；ＴＨ、視床が挙げられる。実験画像のゲイン設定は対照画像のそれと一致させた。それぞれの象限は、ＩＤ番号（ＩＤ＃）によって示した１匹のマウスを描写する。
【図１４】代表的な小脳のタイルスキャン内のプルキンエ細胞におけるミニＭｅＣＰ２発現のｒｅｇ２依存性阻害を示す図である。左側では（対照：（−ｒｅｇ２））、矢印は対照ベクターで処置したマウスのいくつかの小脳葉中のｍｙｃ（＋）プルキンエニューロンを指し示している。ｒｅｇ２で処置したマウスでは、ほとんどのプルキンエ細胞はｍｙｃ（−）であった。右側では（実験：（＋ｒｅｇ２））、矢印は前庭小脳領域に限定されたミニＭｅＣＰ２発現を示す。ｒｅｇ２で処置したマウスは、０％ｍｙｃ（＋）または１００％ｍｙｃ（＋）のどちらかであった広幅のプルキンエ細胞層を有していたため（前庭小脳領域に限定）、隣接するｍｙｃ（＋）およびｍｙｃ（−）プルキンエ細胞における総ＭｅＣＰ２発現の定量分析は勧められなかった。それぞれの２×２のタイルスキャンは１匹のマウスを描写する。
【図１５Ａ−１５Ｃ】ｒｅｇ２が、複数の脳領域において広範であるが厳密に制御された発現を許可することを示す図である。示した画像は図１３に示すものよりも高い拡大率である。多くのｍｙｃ（＋）細胞の抗ｍｙｃ免疫蛍光シグナルは検出限界をかろうじて上回っていたため、ｒｅｇ２で処置したマウスについて示したｍｙｃ（＋）細胞のパーセンテージ（Ａ）は、形質導入された細胞の実際のパーセンテージの過小評価である可能性が高い。検査した３つの領域のうち、海馬が％ｍｙｃ（＋）細胞の最も急激な減少を実証した（ｒｅｇ２対対照で処置したマウス）。図１５Ａに描写した凡例は図１５Ｃおよび図１６にも適用される。図１５Ｂは視床、海馬、および髄質の代表的な画像を示す。抗ｍｙｃシグナルが容易に見えるように、ｒｅｇ２画像についてゲイン設定を操作した。図１５Ｃは、Ｒｅｇ２が視床における見かけ上の神経向性を増強させることを示す。データは平均±ＳＥＭである。スケールバーは２０μｍを示す。＊ｐ≦０．０５。
【図１６】ｒｅｇ２が肝臓におけるミニＭｅＣＰ２の調節を改善させ得ることを示す図である。代表的な画像を示す代わりに、図はマウスにわたる％ｍｙｃ（＋）肝細胞のばらつきを示す。データは平均±ＳＥＭである。ｐ＞０．０５。左の棒グラフのグループは、図１５Ａに描写した図の凡例に対応する。
【図１７】生理食塩水およびウイルスで処置したＫＯマウスの予備生存データを示す図である。マウスに４〜５週齢で大槽内注射した。ｒｅｇ２は導入遺伝子の発現に対して強力な阻害効果を有していたが、ｒｅｇ２はＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２（１Ｅ１１  ｖｇ／マウス）によって媒介される生存期間中央値の延長を減衰させるようには見えなかった。さらに、ｒｅｇ２処置はより少ない早期死亡をもたらした。それぞれのコホート中のまだ生きているマウスの数を示す。処置したマウスにおける正常な後肢の対応するパーセンテージを表６に作表する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明を以下により詳細に説明する。本説明は、本発明を実行し得る様々な方法のすべて、または本発明に付加し得る特長のすべての詳細なカタログであることを意図しない。たとえば、１つの実施形態に関して例示した特長を他の実施形態内に組み込んでもよく、特定の実施形態に関して例示した特長をその実施形態から削除してもよい。さらに、本明細書中で示唆した様々な実施形態の数々の変形および付加が、本開示に鑑みて当業者には明らかであろう。これらは本発明から逸脱しない。したがって、以下の明細書は本発明の一部の特定の実施形態を例示することを意図し、そのすべての順列、組合せ、および変形を網羅的に特定することを意図しない。
【００１９】
内容によりそうでないと指定されない限りは、本明細書中に記載した本発明の様々な特長を任意の組合せで使用できることが、具体的に意図される。さらに、本発明は、本発明の一部の実施形態では、本明細書中に記載の任意の特長または特長の組合せを排除または省略できることも企図する。例示すると、明細書が、ある複合体が構成要素Ａ、Ｂ、およびＣを含むと記述している場合、これは、Ａ、Ｂ、もしくはＣのうちの任意のもの、またはその組合せを省略し、単独または任意の組合せで放棄できることを具体的に意図する。
【００２０】
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の本発明の説明において使用する専門用語は、特定の実施形態を説明する目的だけのためのものであり、本発明を現地するものであることを意図しない。
【００２１】
ヌクレオチド配列は、そうでないと具体的に指定されない限りは、本明細書中、一本鎖のみで、５’から３’の方向に、左から右へ提示する。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書中、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学的命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される様式で、または（アミノ酸では）文字コードもしくは三文字コードのどちらかによって、どちらの米国特許法施行規則１．８２２条および確立された用法に従って表される。
【００２２】
そうでないと指定された場合以外は、当業者に既知の標準方法を、組換えおよび合成遺伝子、ポリペプチド、抗体、またはその抗原結合断片の生成、核酸配列の操作、形質転換細胞の生成、ベクター構築物の構築、ならびにデータセットの作成および分析に使用し得る。そのような技法は当業者に知られている。たとえば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８９年）、Ｆ．Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、ニューヨーク）を参照されたい。
【００２３】
本明細書中で言及するすべての出版物、特許出願、特許、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、および他の引用は、その全体で参考として組み込まれている。
【００２４】
定義
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容によりそうでないと明白に指示されない限りは、複数形も含むことを意図する。
【００２５】
本明細書中で使用する「および／または」とは、関連する列挙した事項のうちの１つまたは複数の任意かつすべての可能な組合せ、および代替物（「または（ｏｒ）」）で解釈した場合は組合せの欠如をいい、それを包含する。
【００２６】
「任意選択の」または「任意選択で」とは、続いて記載した事象または状況が起こることができるまたはできず、説明が、事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。
【００２７】
さらに、本発明は、本発明の一部の実施形態では、本明細書中に記載の任意の特長または特長の組合せを排除または省略できることも企図する。
【００２８】
さらに、本発明の化合物または薬剤の量、用量、時間、温度などの測定可能な値をいう場合に本明細書中で使用する用語「約」とは、指定した量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％のばらつきを包含することを意味する。
【００２９】
本明細書中で使用する移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、列挙した材料またはステップ、ならびに特許請求した発明の基本的および新規の特徴に実質的な影響を与えないものを包含するものとして解釈される。したがって、本明細書中で使用する用語「から本質的になる」とは、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価なものとして解釈されるべきでない。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される用語「から本質的になる」（および文法上の変形）とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的に改変されないように、列挙した配列（たとえば配列番号）と、列挙した配列の５’および／もしくは３’末端またはＮ末端および／もしくはＣ末端上、あるいは２つの末端の間（たとえばドメイン間）の合計１０個以下（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸との両方からなる、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。合計１０個未満の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸は、追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を一緒に足した合計数を含む。本発明のポリヌクレオチドに適用される用語「実質的に改変される」とは、列挙した配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して、コードされているポリペプチドを発現する能力の少なくとも約５０％以上の増加または減少をいう。本発明のポリペプチドに適用される用語「実質的に改変される」とは、列挙した配列からなるポリペプチドの生物活性と比較して、生物活性の少なくとも約５０％以上の増加または減少をいう。
【００３１】
本明細書中で使用する用語「配列同一性」とは、当技術分野におけるその標準の意味を有する。当技術分野で知られているように、いくつかの異なるプログラムを使用して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが既知の配列に対して配列の同一性または類似度を有するかどうかを同定することができる。配列の同一性または類似度は、それだけには限定されないが、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２頁（１９８１年）の局所配列同一性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３頁（１９７０年）の配列同一性アラインメントアルゴリズムによるもの、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４頁（１９８８年）の類似度検索方法によるもの、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行によるもの、好ましくは初期設定を使用した、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１２：３８７頁（１９８４年）によって記載されているＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム、または調査によるものを含めた、当技術分野で知られている標準技法を使用して決定し得る。
【００３２】
有用なアルゴリズムの例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブなペアワイズアラインメントを使用して、関連配列の群から複数配列のアラインメントを作成する。また、これは、アラインメントを作成するために使用されたクラスタリングの関係性を示すツリーもプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、３５：３５１頁（１９８７年）のプログレッシブアラインメント方法の簡易化されたものを使用し、この方法はＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１頁（１９８９年）に記載のものに類似している。
【００３３】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３頁（１９９０年）およびＫａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５８７３頁（１９９３年）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６：４６０頁（１９９６年）、ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、好ましくはその初期設定値に設定されているいくつかの検索パラメータを使用する。パラメータは動的な値であり、プログラム自体によって、目的の特定の配列の構成、および目的の配列をそれに対して検索する特定のデータベースの構成に応じて確立される。しかし、感度を増加させるために値を調節し得る。
【００３４】
追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９頁（１９９７年）によって報告されているギャップ付きＢＬＡＳＴである。
【００３５】
パーセンテージアミノ酸配列同一性の値は、マッチする同一残基の数を、アラインメントした領域中の「より長い」配列の残基の合計数で割ることによって決定する。「より長い」配列とは、アラインメントした領域中に最も多い実際の残基を有するものである（アラインメントスコアを最大にするためにＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって導入されるギャップは無視する）。
【００３６】
同様の様式で、パーセント核酸配列同一性は、本明細書中に具体的に開示したポリヌクレオチド中のヌクレオチドと同一である、候補配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。
【００３７】
アラインメントは、アラインメントすることとなる配列におけるギャップの導入を含み得る。さらに、本明細書中に具体的に開示したより多いまたは少ないヌクレオチドを含有する配列では、一実施形態では、配列同一性のパーセンテージは、ヌクレオチドの合計数に関連する同一ヌクレオチドの数に基づいて決定されるであろうことが理解されよう。したがって、たとえば、本明細書中に具体的に開示した配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施形態では、より短い配列中のヌクレオチドの数を使用して決定される。パーセント同一性の計算においては、相対重量は、挿入、欠失、置換などの配列の変形の様々な徴候に帰されない。
【００３８】
一実施形態では、同一性のみが正のスコア付けであり（＋１）、ギャップを含めた配列変形のすべての形態は「０」の値が割り当てられず、これは、配列類似度の計算について以下に記載したような、重み付けしたスケールまたはパラメータの必要性を除去する。パーセント配列同一性は、たとえば、マッチする同一残基の数を、アラインメントした領域中の「より短い」配列の残基の合計数で割り、１００を掛けることによって計算することができる。「より長い」配列とは、アラインメントした領域中に最も多い実際の残基を有するものである。
【００３９】
本明細書中で使用する「単離した」核酸またはヌクレオチド配列（たとえば「単離したＤＮＡ」または「単離したＲＮＡ」）とは、天然に存在する生物もしくはウイルスの他の構成要素、たとえば細胞もしくはウイルスの構造的構成要素、または一般的に核酸もしくはヌクレオチド配列と会合して見つかる他のポリペプチドもしくは核酸の少なくとも一部から分離された、またはそれを実質的に含まない、核酸またはヌクレオチド配列を意味する。
【００４０】
同様に、「単離した」ポリペプチドとは、天然に存在する生物もしくはウイルスの他の構成要素、たとえば細胞もしくはウイルスの構造的構成要素、または一般的にポリペプチドと会合して見つかる他のポリペプチドもしくは核酸の少なくとも一部から分離された、またはそれを実質的に含まないポリペプチドを意味する。
【００４１】
用語「内在性」とは、導入された構成要素、すなわち「外因性」構成要素から区別した、環境中に天然見つかる構成要素、すなわち、遺伝子、核酸、ｍｉＲＮＡ、タンパク質、細胞、または対象において発現される他の天然の構成要素をいう。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「異種」とは、外来種に由来する、または、同じ種からの場合は、意図的な人の介入によって組成および／もしくはゲノム座位がそのネイティブ形態から実質的に改変されている、ヌクレオチド／ポリペプチドをいう。
【００４３】
本明細書中で使用する用語「核酸」とは、５’から３’末端へと読んだ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーをいう。「核酸」は、天然に存在しないまたは修飾されたヌクレオチド塩基も任意選択で含有し得る。用語「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」とは、個々の一本鎖としてまたは二重鎖中のどちらかの、核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の両方をいう。用語「リボ核酸」（ＲＮＡ）は、ＲＮＡｉ（阻害性ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（低分子（ｓｈｏｒｔ／ｓｍａｌｌ）ヘアピンＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ、対応するアシル化アミノ酸で荷電または放電（ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ）されているかにかかわらない）、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、およびｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を包括し、用語「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡならびにＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを包括する。
【００４４】
マイクロＲＮＡとは、ｍｉＲＮＡ遺伝子によってコードされている一次（ｐｒｉｍａｒｙ）ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）転写物に由来する、非コード低分子ＲＮＡのクラスである。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写物はより小さな１９〜２４個のヌクレオチドのＲＮＡへとプロセッシングされ、これらは、たとえば翻訳阻害または切断によって媒介されるサイレンシング反応を通じて、遺伝子発現を調節することができる。
【００４５】
用語「核酸セグメント」、「ヌクレオチド配列」、またはより一般的には「セグメント」とは、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現する、または発現するように適応され得る、ゲノム配列、リボソームＲＮＡ配列、転移ＲＮＡ配列、メッセンジャーＲＮＡ配列、低分子調節ＲＮＡ、オペロン配列、およびより小さな操作されたヌクレオチド配列を含む機能的用語として当業者に理解されるであろう。また、本開示の核酸は、当技術分野で知られている方法によって、完全にまたは部分的にのどちらかで合成し得る。したがって、選択された宿主によって好まれるコドンを使用して、本開示の核酸のすべてまたは一部分を合成し得る。そのような種に好まれるコドンは、たとえば、特定の宿主種中で発現されるタンパク質において最も頻繁に使用されるコドンから決定し得る。ヌクレオチド配列の他の修飾は、わずかに改変された活性を有する突然変異体をもたらし得る。
【００４６】
核酸に関して本明細書中で使用する用語「断片」とは、参照核酸と比較して長さが減っており、参照核酸の対応する一部分に対して同一またはほぼ同一（たとえば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一）である、近接するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、および／またはそれからなる、核酸をいう。そのような核酸断片は、適切な場合は、それがその構成要素であるより大きなポリヌクレオチド中に含めてもよい。一部の実施形態では、核酸断片は、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００個、またはそれより多くの連続したヌクレオチドを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一部の実施形態では、核酸断片は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００個未満の連続したヌクレオチドを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【００４７】
ポリペプチドに関して本明細書中で使用する用語「断片」とは、参照ポリペプチドと比較して長さが減っており、参照ポリペプチドの対応する一部分に対して同一またはほぼ同一（たとえば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一）である、近接するアミノ酸のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、および／またはそれからなる、ポリペプチドをいう。そのようなポリペプチド断片は、適切な場合は、それがその構成要素であるより大きなポリペプチド中に含めてもよい。一部の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００個、またはそれより多くの連続したアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一部の実施形態では、ポリペプチド断片は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００個未満の連続したアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【００４８】
核酸に関して本明細書中で使用する用語「機能的断片」または「活性断片」とは、ポリペプチドの機能的断片をコードしている核酸をいう。
【００４９】
ポリペプチドに関して本明細書中で使用する用語「機能的断片」または「活性断片」とは、完全長ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性（たとえば、遺伝子発現を上方または下方調節する能力）の、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上を保持するポリペプチド断片をいう。一部の実施形態では、機能的断片は、実際には、より高いレベルの、完全長ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を有する。
【００５０】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される、本明細書中で使用する用語「修飾された」とは、１つまたは複数の欠失、付加、置換、またはその任意の組合せが原因で野生型配列とは異なる配列をいう。
【００５１】
本明細書中で使用する、ウイルスベクターを「単離する」もしくは「精製する」（または文法上の等価物）とは、ウイルスベクターが、出発物質中の他の構成要素の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されていることを意味する。
【００５２】
用語「増強させる」および「増加させる」とは、指定したパラメータの少なくとも約１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、またはさらには１５倍の増加をいう。
【００５３】
本明細書中で使用する用語「阻害する」および「低下させる」またはその文法上の変形とは、指定したレベルまたは活性の少なくとも約１５％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％以上の減少または減弱をいう。特定の実施形態では、阻害または低下は、検出可能な活性がわずかまたは本質的に存在しないことをもたらす（あっても、無意味な量、たとえば約１０％またはさらには５％未満）。
【００５４】
本明細書中で使用する「発現」とは、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ転写物などへと）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスをいう。転写物は「転写産物」と呼ぶ場合があり、コードされているポリペプチドは「翻訳産物」と呼ぶ場合がある。転写物およびコードされているポリペプチドは「遺伝子産物」と総称する場合がある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡスプライシングを含み得る。発現産物自体、たとえば生じる核酸またはタンパク質も、「発現された」という場合がある。発現産物は、細胞内、細胞外、または分泌性として特徴づけることができる。用語「細胞内」とは細胞内にあるものを意味する。用語「細胞外」とは細胞外にあるものを意味する。物質は、細胞上または細胞内のどこかから、有意な尺度で細胞外に出現する場合に、細胞によって「分泌性」である。
【００５５】
本明細書中で使用する用語「合成遺伝子」とは、意図的なヒト設計によって非天然に作製された核酸配列をいい、合成遺伝子は、他の構成要素として、目的のタンパク質または核酸のコード領域、およびコード領域の発現のための調節領域を含む。合成遺伝子の構造的および機能的な構成要素は異なるおよび／または複数の原料物質から取り込まれ得る。合成遺伝子は対象に外因的に送達してよく、これは対応する内在性遺伝子と比較して外因性となるであろう。細胞中で発現された場合、合成遺伝子産物は合成産物（たとえば「合成ＲＮＡ」または「合成ポリペプチド」）と呼び得る。特定の条件下では、合成遺伝子は互換性があるように「導入遺伝子」とも呼び得る。
【００５６】
本明細書中で使用する用語「トランスジェニック」および／または「導入遺伝子」とは、１つまたは複数の外因性核酸を含む遺伝子の機能的コード領域を含有する核酸配列をいう。外因性核酸は、ポリヌクレオチドが代々の細胞分裂に受け継がれるように、ゲノム内に安定に組み込まれることができる。外因性核酸は、ゲノム内に単独で組換え発現カセットの一部として組み込まれることができる。「トランスジェニック」は、その遺伝子型が外因性核酸の存在によって改変された任意の基質を指定するために使用し得る。
【００５７】
用語「フィードバック」とは、基質によって行われる何らかの結果、効果、または機能の結果としてその同じ基質の提供される、分子にコードされる情報をいう。基質は、それだけには限定されないが、遺伝子、またはＲＮＡおよびタンパク質などの遺伝子の転写産物もしくは翻訳産物を含めた、任意の種類のマイクロまたはマクロ分子であり得る。用語「フィードバックループ」とは、機能、効果、および／または結果を行う分子のループをいい、その結果、その機能、効果、および／または結果の情報が受理ソース（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｓｏｕｒｃｅ）に戻される。たとえば、遺伝子（たとえばＭＥＣＰ２）の発現の機能、効果、および／または結果は、その遺伝子の発現の機能、効果、および／または結果が原因で発現された場合に、ｍｉＲＮＡとその遺伝子に由来するｍＲＮＡとの結合を介してフィードバックをもたらすことができる。フィードバックループは阻害性／負（すなわち、さらなる機能、効果、および／もしくは結果の継続を抑制する）、または正（継続を増強させる）であることができる。フィードバックを受けることができる基質は「フィードバック可能」であるといわれる。遺伝子の核酸または転写産物もしくは翻訳産物の発現レベルおよび／または機能に依存して阻害および／または増強の強度が可変であるフィードバックは、「用量依存的な」フィードバックおよび／または「用量依存的なフィードバックループ」ということができる。
【００５８】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は互換性があるように使用されてよく、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。用語「核酸」、「核酸配列」、および「ポリヌクレオチド」は互換性があるように使用されてよく、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。本明細書中で使用する用語「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸分子」、および「核酸断片」とは、合成、非天然、および／または改変ヌクレオチド塩基を任意選択で含有する、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡのポリマー、および一本鎖または二本鎖であるＤＮＡをいう。
【００５９】
本明細書中で使用する用語「目的遺伝子」、「目的核酸」、および／または「目的タンパク質」とは、具体的な文脈上の条件下で所望される遺伝子／核酸／タンパク質をいう。
【００６０】
用語「調節要素」とは、核酸配列の発現の何らかの側面を制御する遺伝因子をいう。たとえば、プロモーターは、作動可能に連結されたコード領域の転写開始を促進する調節要素である。他の調節要素は、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナルなどである。１つまたは複数の調節要素が見つかる核酸配列またはポリヌクレオチド中の領域を「調節領域」と呼ぶ。
【００６１】
本明細書中で使用する用語コード領域とは、ポリペプチドをコードしている、ポリヌクレオチド、たとえば遺伝子の一部分をいう。
【００６２】
核酸に関して本明細書中で使用する用語「作動可能に連結された」とは、２つ以上の核酸間の機能的な連結をいう。たとえば、プロモーター配列は、プロモーター配列が異種核酸配列の転写を開始および／または媒介することが理由で、異種核酸配列と「作動可能に連結されている」と記載され得る。一部の実施形態では、作動可能に連結された核酸配列は近接しているおよび／または同じリーディングフレーム中にある。
【００６３】
本明細書中で使用する用語「結合部位」とは、構成要素間の結合の位置として働く任意の一般的な構造特徴をいう。核酸またはポリヌクレオチドに適用される用語「結合部位」とは、それだけには限定されないが、他の核酸またはタンパク質を含み得る相互作用分子のための結合位置を提供する、一次、二次、または三次構造の特定のモチーフ中のヌクレオチド配列をいうことができる。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に適用される用語「結合部位」とは、それだけには限定されないが、他の核酸またはタンパク質を含み得る相互作用分子のための結合位置を提供する、一次、二次、三次、または四次構造の特定のモチーフ中のアミノ酸配列をいうことができる。
【００６４】
本明細書中で使用する用語「シードマッチ」とは、より長い内在性ｍＲＮＡ配列内のヌクレオチドの部分組であって、前記シードマッチを含有する対応するｍＲＮＡによるｍｉＲＮＡ種の認識および相補的結合のための、関連性のある標的ヌクレオチド配列であると経験的に同定された、妥当性確認された、または推定的に予測された、ヌクレオチド部分組を具体的にいう。用語「シード」または「シード領域」とは、より長い内在性ｍｉＲＮＡ配列内のヌクレオチドの部分組であって、ｍＲＮＡ種の標的シードマッチの、そのｍｉＲＮＡ種による認識および相補的結合のための、関連性のあるヌクレオチド配列であると経験的に同定された、妥当性確認された、または推定的に予測された、ヌクレオチド部分組をいう。一般に、ｍＲＮＡのシードマッチは、そのそれぞれの３ダッシュ（３’）非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内にコードされているが、他の位置に存在していてもよい。「妥当性確認された」または「経験的に同定された」シードマッチは、当技術分野で現在知られているシードマッチおよび将来同定されるものとして定義される。「推定上の」または「予測された」シードマッチは、未だ経験的に知られていないまたは定義されていないシードマッチとして定義される。
【００６５】
用語「５ダッシュ（５’）フランキング配列」および／または「３’フランキング配列」とは、供給源配列内の目的配列のいずれかの末端（すなわち、５’フランキング末端および／または３’フランキング末端）上の指定した配列（たとえばシードマッチ）に直接隣接して（すなわち「隣接して」）見つかる配列中の、ヌクレオチドの部分組をいう。一部の事例では、５’フランキング配列は、マッチするｍｉＲＮＡとの追加のワトソン−クリック（ＷＣ）相補的結合を提供し得る。一緒になって、５’および３’フランキング配列は、２つ以上のｍｉＲＮＡが隣接するシードマッチと結合することによる協同抑圧を促進し得る、シードマッチ間の間隔に寄与する（Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７年）。また、５’および３’フランキング配列は、有効なシードマッチと相関されている、高い％アデニル酸−ウリジル酸（ＡＵ）ヌクレオチド状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）も提供し得る（Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７年）。
【００６６】
用語「３’ＵＴＲ」とは、翻訳終止コドンに直接続くｍＲＮＡのセクションをいう。一般に、ｍＲＮＡ分子はＤＮＡ配列から転写され、後にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳される。５’キャップ、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、およびポリアデニル化（ポリＡ）テイルを含めた、ｍＲＮＡ分子の配列のいくつかの領域はタンパク質へと翻訳されない。一般に、３’ＵＴＲは、転写後に遺伝子発現に影響を与え得る調節領域を含有する。
【００６７】
本明細書中で使用する用語「遺伝子用量感受性」または「用量感受性」障害とは、疾患または障害であって、その開始、提示、進行、症状、表現型、および他の関連する現象が、疾患または障害の開始、提示、進行、症状、表現型、または他の関連する現象に関与しているその遺伝子（たとえばＲＮＡ種またはタンパク質）の、核酸（たとえば遺伝子）または転写産物もしくは翻訳産物の相対的機能的発現レベルが原因で、およびそれに一致して可変性である、疾患または障害をいう。たとえば、障害は、その表現型が特定の遺伝子の様々な発現レベルに伴って変化する場合に、用量感受性であると記載し得る。別の例として、障害は、障害の開始、提示、進行、症状、表現型、または他の関連する現象に影響を与える機能低下または機能亢進のタンパク質を産生するように遺伝子を突然変異させている場合にも、用量感受性と呼び得る。
【００６８】
本明細書中で使用する用語「知的能力障害」とは、対象の神経発達の知的機能、精神的能力、認知能力、および／または適応機能、すなわち、推論、計画、思考、および意思疎通する能力を含めた、対象の「知的能力」に影響を与える疾患、障害、または身体障害の群をいう。用語「知的能力障害」は「知的障害」と互換性があるように使用されてよい。知的能力障害と共に提示され得る他の総合的症状としては、それだけには限定されないが、発話異常、癲癇発作、小頭症、筋緊張低下、歯ぎしり、および／または常同症が挙げられる。その開始、提示、進行、症状、表現型、または他の関連する現象が変動する知的能力障害は「用量感受性知的能力障害」と呼んでよく、その原因遺伝子は「知的能力を媒介する用量感受性遺伝子」と呼んでよい。
【００６９】
本明細書中で使用する用語「標的組織」および「オフターゲット組織」とは、目的の指定した核酸またはタンパク質が発現される、対象の身体領域、臓器、組織、構造体および／または細胞をいう。「標的組織」とは、目的の内在性核酸またはタンパク質が典型的な健康および／または疾患状態下で発現される、対象の領域、臓器、組織、構造体および／または細胞である。「オフターゲット組織」とは、目的の内在性核酸またはタンパク質が典型的な健康および／または疾患状態下で発現されない、対象の領域、臓器、組織、構造体および／または細胞である。
【００７０】
「ベクター」とは、外来遺伝物質を、そこで複製および／または発現されることができる別の細胞内へと運ぶためのビヒクルとして使用される化合物をいう。外来核酸を含有するクローニングベクターは組換えベクターと呼ばれる。核酸ベクターの例は、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、発現カセット、および人工染色体である。組換えベクターは、典型的には複製起点、マルチクローニング部位、および選択マーカーを含有する。核酸配列は、典型的には、挿入物（組換え核酸または導入遺伝子）とベクターの「主鎖」として役割を果たすより大きな配列とからなる。遺伝情報を別の細胞へと移送するベクターの目的は、典型的には、標的細胞中の挿入物を単離、増殖、または発現することである。発現ベクター（発現構築物または発現カセット）は標的細胞中の外因性遺伝子の発現のためのものであり、一般に、外因性遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列を有する。標的細胞内へのベクターの挿入は、細菌および真核細胞では形質転換または形質移入と呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入はしばしば形質導入と呼ばれる。また、用語「ベクター」は、一般に、それだけには限定されないが形質転換細胞またはナノ粒子など、外来遺伝物質を別の細胞内へと運ぶ役割を果たすための物を説明するためにも使用し得る。
【００７１】
「薬学的に許容される」とは、毒性があるまたは他の様式で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、材料を、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与し得る。
【００７２】
本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオチド標的カセット」とは、１つまたは複数の事前に決定されたシードマッチとそれぞれのシードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列とを含む、ヌクレオチド配列および／またはヌクレオチドカセットをいう。ポリヌクレオチド標的カセットは、カセットを標的遺伝子に挿入した場合に、明白に異なる遺伝的病因を有するが共通の標的組織を有する複数の障害によって共有される過剰発現の表現型に対して保護するために、シードマッチの適切に選択することによって設計し得る。ポリヌクレオチド標的カセットは任意の数のシードマッチと５’および３’フランキング配列とを含むことができる。
【００７３】
用語「処置する」、「処置すること」、および「〜の処置」（または文法的に等価な用語）とは、対象の状態の重篤度が低下するまたは少なくとも部分的に改善もしくは寛解されること、ならびに／あるいは少なくとも１つの臨床症状のいくらかの緩和、軽減、または減少が達成されること、ならびに／あるいは状態の進行の遅延、および／または疾患もしくは障害の発症の防止もしくは遅延が存在することを意味する。
【００７４】
本明細書中で使用する用語「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔｓ）」、および「防止」（ならびにその文法上の等価物）とは、疾患もしくは障害の発症の遅延または疾患もしくは障害の発症の際における症状の軽減をいう。これらの用語は疾患の完全な消滅を暗示することを意味せず、状態の発生率を低下させるまたは状態の発症および／もしくは進行を遅延させる任意の種類の予防的処置を包含する。
【００７５】
本明細書中で使用する「処置有効」量とは、いくらかの改善または利点を対象に提供するために十分な量である。言い換えると、「処置有効」量とは、対象において少なくとも１つの臨床症状のいくらかの緩和、軽減、減少、または安定化をもたらす量である。当業者は、いくらかの利点が対象に提供される限りは、治療効果は完全または治癒的である必要はないことが理解されよう。
【００７６】
本明細書中で使用する「防止有効」量とは、本発明の方法の非存在下において起こるであろうものと比較して、対象において疾患、障害、および／または臨床症状の発症を防止するおよび／もしくは遅延させる、ならびに／または対象において疾患、障害、および／または臨床症状の発症の重篤度を低下および／もしくは遅延させるために十分な量である。当業者は、いくらかの利点が対象に提供される限りは、防止のレベルは完全である必要はないことが理解されよう。
【００７７】
合成遺伝子、発現カセット、ベクター、プラスミド、ウイルスベクター、形質転換細胞、ナノ粒子、または医薬組成物を対象に「投与すること」および「投与」の用語は、化合物を、その意図する機能を行うために対象に導入または送達する任意の経路を含む。投与は、経口、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、大槽内、くも膜下腔内、脳室内、もしくは皮下）、または局所を含めた任意の適切な経路によって実施することができる。投与としては自己投与および他者による投与が挙げられる。
【００７８】
合成遺伝子
本発明は、用量感受性知的能力障害などの障害を処置するために、内在性調節が可能な導入遺伝子の発現を標的組織において提供する目的の、フィードバック使用可能合成遺伝子、ポリヌクレオチド標的カセット、ベクター、および医薬組成物に関する。
【００７９】
したがって、本発明の一態様は、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と１つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドを含む合成遺伝子であって、ポリヌクレオチドが、それぞれが内在性ｍｉＲＮＡの結合部位として同定されるシードマッチと前記シードマッチに隣接する５’フランキング配列および３’フランキング配列とを含む、１つまたは複数の核酸セグメントをさらに含み、前記１つまたは複数の核酸セグメントが、前記合成遺伝子が内在性ｍｉＲＮＡを発現する細胞に送達される際の前記目的のタンパク質または核酸の発現が、１つまたは複数の核酸セグメントを含まない合成遺伝子が内在性ｍｉＲＮＡを発現する細胞に送達される際の目的のタンパク質または核酸の発現と比較して低下しているように、前記ポリヌクレオチドの調節領域内に挿入されている、合成遺伝子に関する。
【００８０】
一部の実施形態では、目的の核酸またはタンパク質をコードしているコード領域は、遺伝子、たとえば知的能力遺伝子用量感受性障害に関連する遺伝子または遺伝子の活性断片のコード領域を含む。知的能力遺伝子用量感受性障害に関連する遺伝子としては、それだけには限定されないが、ＴＣＦ４、ＵＢＥ３Ａ、ＤＹＲＫ１Ａ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＳＤ１、ＺＥＢ２、ＭＢＤ５、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＡＴＲＸ、ＭＥＣＰ２、ＦＯＸＧ１、ＡＫＴ３、ＳＬＣ６Ａ１、またはその活性断片が挙げられる。一部の実施形態では、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域は、遺伝子ＭＥＣＰ２またはその活性断片のコード領域を含む。
【００８１】
シードマッチは、任意のヌクレオチド配列の長さのもの、一般に、約３〜約１０個のヌクレオチド、たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ中の任意の範囲のものであり得る。一部の実施形態では、本発明のシードマッチは約５〜約１０個のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、本発明のシードマッチは約６〜約８個のヌクレオチドの長さである。
【００８２】
本発明の合成遺伝子は、１つまたは複数のシードマッチと５’および３’フランキング配列とを含有し得る。一部の実施形態では、合成遺伝子は、少なくとも２つのシードマッチ、たとえば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、もしくはそれより多く、またはそれ中の任意の範囲を含む。一部の実施形態では、合成遺伝子は３つ以上のシードマッチを含む。一部の実施形態では、合成遺伝子は３つ以上のシードマッチを含む。一部の実施形態では、合成遺伝子は３〜８個のシードマッチを含む。一部の実施形態では、一部またはすべてのシードマッチが３’ＵＴＲ中にある。
【００８３】
５’および／または３’フランキングヌクレオチド配列は、指定した配列（たとえばシードマッチ）のそれぞれ５’および／または３’末端上の、任意の長さのもの、一般に約１〜約３０個のヌクレオチドのものであり得る。一部の実施形態では、本発明のフランキングヌクレオチド配列は、指定した配列（たとえばシードマッチ）のそれぞれ５’および／または３’末端上の約９〜約１３個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、フランキングヌクレオチド配列は、指定した配列（たとえばシードマッチ）のそれぞれ５’および／または３’末端上の約１１個のヌクレオチドである。したがって、本発明の一部の実施形態では、指定した配列（たとえばシードマッチ）の５’および３’フランキング配列のヌクレオチドの合計数は、約７〜約４０個のヌクレオチド、たとえば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０個のヌクレオチド、またはそれ中の任意の範囲である。一部の実施形態では、指定した配列（たとえばシードマッチ）の５’および３’フランキング配列のヌクレオチドの合計数は約２０〜約２５個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、指定した配列（たとえばシードマッチ）の５’および３’フランキング配列のヌクレオチドの合計数は約２２個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、それぞれのシードマッチは、それらの間の３’および５’フランキング配列によって、次の最も近位のシードマッチから隔てられている。したがって、本発明の一部の実施形態では、少なくとも２つのシードマッチは、約７〜約４０個のヌクレオチドによって隔てられている。一部の実施形態では、少なくとも２つのシードマッチは、約２０〜約２５個のヌクレオチドによって隔てられている。一部の実施形態では、少なくとも２つのシードマッチは、約２２個のヌクレオチドによって隔てられている。
【００８４】
本発明のシードマッチならびに５’および３’フランキング配列は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡと結合し得る。一部の実施形態では、シードマッチならびに５’および３’フランキング配列は、ｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、ｌｅｔ−７−５ｐ／９８−５ｐ、ｍｉＲ−２９−３ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−９８−５ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−４９４−３ｐ、またはその任意の組合せを含めた、１つまたは複数のｍｉＲＮＡと結合する。さらに、理論に束縛されることを望まずに、未だ同定されていないｍｉＲＮＡがＭｅＣＰ２フィードバックループに寄与する場合があることが、概念的に可能である。特定のｍｉＲＮＡシードと標的パネル中のｍｉＲＮＡシードマッチとの間のワトソン−クリック（ＷＣ）塩基対合を許可するシード配列を含有する任意のｍｉＲＮＡが、目的の外因性標的の核酸またはタンパク質、すなわち目的の核酸またはタンパク質をコードしているコード領域の産物の内在性調節を媒介することを助け得る。したがって、一部の実施形態では、シードマッチならびに５’および３’フランキング配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と本発明のシードマッチとの間のＷＣ塩基対合を許可するシード配列を含む、１つまたは複数のｍｉＲＮＡと結合する。一部の実施形態では、シードマッチならびに５’および３’フランキング配列は、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する。一部の実施形態では、シードマッチならびに５’および３’フランキング配列は、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−４５１ａ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する。一部の実施形態では、シードマッチならびに５’および３’フランキング配列は、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１３２、および／またはｍｉＲ−１２４と結合しない。一部の実施形態では、シードマッチとシードマッチに隣接するフランキング５’および３’配列とは、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、およびｌｅｔ−７−５ｐのシードマッチを含有する、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれに少なくとも７０％同一である、たとえば、それに少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるヌクレオチドを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。シードマッチに下線が引かれている。
配列番号１．「Ｒｅｇ２」標的シードマッチならびに５’および３’フランキング配列
５’ＣＴＧＴＴＣＴＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＡＴＡＧＣＡＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＴＴＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴＡＡＴＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＧＡＴＡＡＣ−３’
【００８５】
一部の実施形態では、シードマッチとシードマッチに隣接するフランキング５’および３’配列とは、ｍｉＲ−４５１ａ、ｌｅｔ−７−５ｐ、およびｍｉＲ−６９０のシードマッチを含有する、配列番号２のヌクレオチド配列、またはそれに少なくとも７０％同一である、たとえば、それに少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるヌクレオチドを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。シードマッチに下線が引かれている。
配列番号２．「Ｒｅｇ１」標的シードマッチならびに５’および３’フランキング配列
５’ＡＴＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＡＣＡＴＴＣＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＡＧＣＣＴＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＡＴ−３’
【００８６】
一部の実施形態では、本発明は、合成遺伝子を含むベクターを含む。ベクターは、ポリヌクレオチドを細胞に送達するための任意の適切な手段であることができる。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、発現カセット、形質転換細胞、またはナノ粒子である。
【００８７】
特定の実施形態では、本発明は、本発明の合成遺伝子またはベクターを薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本発明の合成遺伝子またはベクターを薬学的に許容される担体中に含み、任意選択で、他の薬用剤、製薬、安定化剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注射用には、担体は典型的には液体となる。他の投与方法には、担体は固体または液体のどちらであってもよい。吸入投与には、担体は呼吸用となり、好ましくは固体または液体の粒子状形態となる。
【００８８】
特定の実施形態では、本発明は、合成遺伝子に用量依存的阻害性フィードバックを提供するためのポリヌクレオチド標的カセットを提供し、カセットは、それぞれが内在性ｍｉＲＮＡの結合部位として同定されるシードマッチと前記シードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列とを含む、１つまたは複数の核酸セグメントを含む。ポリヌクレオチド標的カセットは、合成遺伝子のポリヌクレオチドの調節領域内へのカセットの挿入を介して合成遺伝子を作製するために使用し、それによって、ポリヌクレオチド標的カセット内の提供されたシードマッチと結合することができるｍｉＲＮＡが合成遺伝子の発現を調節することができる、用量依存的阻害性フィードバックの能力を合成遺伝子にもたらすことができる。
【００８９】
ポリヌクレオチド標的カセットは、任意の数のシードマッチと５’および３’フランキング配列とを含むことができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つのシードマッチならびに５’および３’フランキング配列、たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、もしくはそれより多く、またはそれ中の任意の範囲を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、３つ以上のシードマッチと５’および３’フランキング配列とを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、３〜８個のシードマッチと５’および３’フランキング配列とを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、目的の標的核酸またはタンパク質、すなわち目的の核酸またはタンパク質をコードしているコード領域の産物の外因性調節を媒介することを助け得る１つまたは複数のｍｉＲＮＡと結合する、シードマッチと５’および３’フランキング配列とを含み、前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡシード配列とシードマッチとの間のＷＣ塩基対合を許可するシード配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、ｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、ｌｅｔ−７−５ｐ、またはその任意の組合せから選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡと結合する、シードマッチと５’および３’フランキング配列とを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する、シードマッチと５’および３’フランキング配列とを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−４５１ａ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する、シードマッチと５’および３’フランキング配列とを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、約５〜約１０個のヌクレオチドの長さであるシードマッチを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、約６〜約８個のヌクレオチドの長さであるシードマッチを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、それぞれ約９〜約１３個のヌクレオチドの長さである、シードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、それぞれ約１１個のヌクレオチドの長さである、シードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれに少なくとも７０％同一である、たとえば、それに少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるヌクレオチドを含む、それから本質的になる、またはそれからなる、シードマッチならびにシードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド標的カセットは、配列番号２のヌクレオチド配列、またはそれに少なくとも７０％同一である、たとえば、それに少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるヌクレオチドを含む、それから本質的になる、またはそれからなる、シードマッチならびにシードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列を含む。
【００９０】
合成遺伝子を作製する方法
本発明は、用量依存的阻害性フィードバックを示す合成遺伝子を作製する方法をさらに提供する。一実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド標的カセットを合成遺伝子の調節領域内に挿入するステップを含む、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と１つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドを含む合成遺伝子を調製する方法を提供する。
【００９１】
一部の実施形態では、本発明は、核酸セグメントを合成遺伝子の調節領域内に挿入する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、目的ｍｉＲＮＡと結合することが知られているまたは新しく同定されたシードマッチを、合成遺伝子のポリヌクレオチドの調節領域内に挿入する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチド標的カセットを合成遺伝子のポリヌクレオチドの調節領域内に挿入し、それによってポリヌクレオチド標的カセット内の提供されたシードマッチと結合することができるｍｉＲＮＡが合成遺伝子の発現を調節することができる、用量依存的阻害性フィードバックの能力を合成遺伝子にもたらすことによって、合成遺伝子を調製する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、シードマッチと５’および３’フランキング配列とを含む１つまたは複数の核酸セグメントを合成遺伝子のポリヌクレオチドの調節領域内に挿入するステップを含む、合成遺伝子を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、合成遺伝子のポリヌクレオチドの調節領域内に見つかる１つまたは複数の内在性シードマッチを除去することを含み得る。
【００９２】
一部の実施形態では、合成遺伝子中に挿入されたシードマッチならびに５’および３’フランキング配列は、標的組織および／またはオフターゲット組織中で発現されたｍｉＲＮＡと結合し、それによって、オフターゲット組織中で合成遺伝子の発現を阻害し、標的組織中で合成遺伝子の内在性調節を提供するフィードバック使用可能性を合成遺伝子にもたらすことができる。一部の実施形態では、本発明の合成遺伝子は、シードマッチならびに５’および３’フランキング配列を、オフターゲット組織中で発現されたｍｉＲＮＡから排除する。一部の実施形態では、本発明の合成遺伝子は、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１３２、および／またはｍｉＲ１２４のシードマッチならびに５’および３’フランキング配列を排除する。
【００９３】
別の実施形態では、本発明は、目的のタンパク質または核酸が発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加したｍｉＲＮＡをスクリーニングするステップと、発現が増加した１つまたは複数のｍｉＲＮＡについて、シードマッチおよびフランキング領域を同定するステップと、前記ポリヌクレオチドの調節領域内に挿入することとなる前記シードマッチとフランキング領域とを含む核酸セグメントを調製するステップと、内在性ｍｉＲＮＡの結合部位として同定されるシードマッチと前記シードマッチに隣接する５’および３’フランキング配列とを含む核酸セグメントのうちの１つまたは複数を、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と１つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドの調節領域内に挿入するステップとを含む、合成遺伝子を作製する方法を提供する。
【００９４】
合成遺伝子を作製する方法の一部の実施形態では、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域は、ＴＣＦ４、ＵＢＥ３Ａ、ＤＹＲＫ１Ａ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＳＤ１、ＺＥＢ２、ＭＢＤ５、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＡＴＲＸ、ＭＥＣＰ２、ＳＬＣ６Ａ１、ＦＯＸＧ１、ＡＫＴ３、またはその活性断片から選択される遺伝子のコード領域を含む。活性断片としては、それだけには限定されないが、完全長ＭｅＣＰ２のそれぞれ８８％、５２％、および３２％を占めるが、メチルＣｐＧ結合の保存的機能性、およびＤＮＡとＮＣｏＲ／ＳＭＲＴ複合体との物理的接続を可能にするための、レチノイン酸と甲状腺ホルモン受容体（ＮＣｏＲ／ＳＭＲＴ）との相互作用の核内受容体コリプレッサー／サイレンシング媒介物質を保持する、ΔＮ、ΔＮＣ、および／またはΔＮＩＣ活性ＭｅＣＰ２断片などのＭｅＣＰ２の活性断片を挙げ得る。これらの活性断片は完全長ＭｅＣＰ２タンパク質の切断片であり、その開示が本明細書中に参考として組み込まれているＴｉｌｌｏｔｓｏｎら（Ｔｉｌｌｏｔｓｏｎら、２０１７年、Ｎａｔｕｒｅ、５５０（７６７６）：３９８〜４０１頁）に記載のように、ΔＮは、完全長ＭｅＣＰ２アイソフォームｅ２のメチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）、残基７２〜１７３）のＮ末端側の残基１３〜７１の欠失を含有し、ΔＮＣは、追加で、ＮＣｏＲ−ＳＭＲＴ相互作用ドメイン（ＮＩＤ、残基２７２〜３１２）のＮ末端側の残基３１３〜４８４の欠失を含有し、ΔＮＩＣは、追加で、ＭＢＤとＮＩＤドメインの間の介在アミノ酸を、短い柔軟なリンカーによって接続されたＳＶ４０ウイルスからの核移行シグナルで置き換える。ＲＴＴの処置に使用されるＭｅＣＰ２の活性断片はＭｅＣＰ２のｅ１アイソフォームに由来する。本明細書中に記載のアミノ酸の付番は、慣例によりＭｅＣＰ２  ｅ２アイソフォームアミノ酸配列に基づく。
【００９５】
一部の実施形態では、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域は、遺伝子ＭＥＣＰ２またはその活性断片のコード領域を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸セグメントは、ｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、ｌｅｔ−７−５ｐ／９８−５ｐ、およびｍｉＲ−４９４−３ｐからなる群から選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡと結合する。一部の実施形態では、シードマッチならびに５’および３’フランキング配列は、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する。一部の実施形態では、シードマッチならびに５’および３’フランキング配列は、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−４５１ａ、およびｌｅｔ−７−５ｐと結合する。
【００９６】
別の態様では、本発明は、目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加した１つまたは複数のｍｉＲＮＡのシードマッチならびに５’および３’フランキング配列を同定するステップと、前記シードマッチと５’および３’フランキング配列とを、目的のタンパク質または核酸をコードしているコード領域と１つまたは複数の調節領域とを含むポリヌクレオチドを含む合成遺伝子の調節領域内に挿入するステップとを含む、合成遺伝子中に挿入することとなる１つまたは複数のシードマッチならびに５’および３’フランキング配列を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、合成遺伝子内に挿入することとなる１つまたは複数のシードマッチならびに５’および３’フランキング配列を同定する方法は、目的のタンパク質または核酸を細胞中で発現させるステップと、ｍｉＲＮＡを細胞から収集するステップと、前記目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、前記目的のタンパク質または核酸が細胞中で発現されている場合の、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを計算し、それによって前記ｍｉＲＮＡの核酸データセットを作成するステップとをさらに含む。一部の実施形態では、同定方法は、目的のタンパク質もしくは核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質もしくは核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加したｍｉＲＮＡについて核酸データセット（たとえば既存のデータセット）をスクリーニングするステップ、および／または目的のタンパク質もしくは核酸が細胞中で発現されていない場合と比較して、目的のタンパク質もしくは核酸が細胞中で発現されている場合の、発現が増加したｍｉＲＮＡを同定するステップ、および／または妥当性確認されたもしくは推定上のシードマッチならびに５’および３’フランキング配列について核酸データセットをスクリーニングするステップを含むことができる。
【００９７】
本明細書中で使用する用語「データセット」とは、それだけには限定されないが核酸配列またはアミノ酸配列を含めた任意の種類のデータを含む、実験またはコンピュータ分析から獲得された情報、すなわちデータの関連する組のコレクションをいう。データセットは、それぞれの特定のデータセットによって定義された変数パラメータに応じて、目的の特定のデータについてスクリーニングおよび／または他の様式で検索し得る。一部の実施形態では、データセットは核酸データセット、すなわち核酸配列を含むデータセットである。一部の実施形態では、データセットは３’ＵＴＲデータセットである。
【００９８】
一部の実施形態では、目的のタンパク質または核酸は、ＴＣＦ４、ＵＢＥ３Ａ、ＤＹＲＫ１Ａ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＳＤ１、ＺＥＢ２、ＭＢＤ５、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＡＴＲＸ、ＳＬＣ６Ａ１、ＦＯＸＧ１、ＡＫＴ３、ＭＥＣＰ２、またはその活性断片から選択される遺伝子の転写産物または翻訳産物である。一部の実施形態では、目的のタンパク質または核酸は、遺伝子ＭＥＣＰ２またはその活性断片の転写産物または翻訳産物である。
【００９９】
合成遺伝子を使用する方法
本発明の別の態様では、対象に本発明の合成遺伝子、ベクター、および／または医薬組成物を投与し、それによって合成遺伝子を対象に送達することを含む、合成遺伝子を送達する方法を提供する。
【０１００】
本発明のさらなる態様では、内在性遺伝子によってコードされている目的のタンパク質または核酸をコードしている本発明の合成遺伝子、ベクター、および／または医薬組成物を投与し、それによって疾患を処置するステップを含む、標的組織における内在性遺伝子の異常発現、または標的組織における内在性遺伝子によってコードされている突然変異タンパク質の発現に関連する疾患を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明を標的組織に投与することができる。一部の実施形態では、本発明を標的およびオフターゲット組織に投与し、それによって、オフターゲット組織における合成遺伝子の発現を阻害し、標的組織における合成遺伝子の発現を内在的に調節することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、疾患を処置する方法は、対象において目的のタンパク質または核酸をコードしている内在性遺伝子を遺伝的にノックダウンおよび／またはノックアウトするステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、目的のタンパク質または核酸をコードしている内在性遺伝子はＭＥＣＰ２である。内在性遺伝子を遺伝的にノックダウンすることもしくはその「ノックダウン」、またはノックアウトすることもしくはその「ノックアウト」は、それだけには限定されないが、ＲＮＡｉ、転写活性化剤様エフェクターおよびヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＴＡＬＥおよびＴＡＬＥＮ）、またはクラスター形成の規則的に空間をあけた短い回文構造反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９）方法を使用して、マッチするｓｈＲＮＡ、ＴＡＬＥもしくはＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９発現ベクターを、内在性遺伝子を発現する対象、組織、および／または細胞内に導入し、それによって、ＲＮＡｉ、ＴＡＬＥ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９の処置がない場合の内在性核酸またはタンパク質の発現と比較して、目的の内在性核酸またはタンパク質の発現を除去または低下させることを含めた、当技術分野において現在知られているまたは後に同定される任意の技法または方法を用いて行うことができる。これらの技法および他のものは、それぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、ＢｏｅｔｔｃｈｅｒおよびＭｃＭａｎｕｓ、２０１５年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、５８（４）：５７５〜５８５頁、ならびにＱｉｎらの米国特許第７，１９５，９１６号、Ｖｏｙｔａｓらの第８，４４０，４３１号、Ｚｈａｎｇの第８，８８９，３５６号、Ｃｏｎｇらの第８，８７１，４４５号、およびＤｏｕｄｎａらの第１０，０００，７７２号中に総説されている。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態では、対象の細胞中の内在性遺伝子を遺伝的にノックダウンするステップと、内在性遺伝子によってコードされている目的のタンパク質または核酸をコードしている本発明の合成遺伝子、ベクター、医薬組成物を投与し、それによって疾患を処置するステップとを含む、対象において、内在性遺伝子の異常発現または内在性遺伝子によってコードされている突然変異タンパク質の発現に関連する疾患を処置する方法を提供する。
【０１０３】
用語「患者」、「対象」、「個体」などは本明細書中で互換性があるように使用され、任意の動物、または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｓｉｔｕにかかわらず、本明細書中に記載の方法を受け入れられるその細胞をいう。好ましい実施形態では、患者、対象、または個体は哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、モルモット、非ヒト霊長類、犬、猫、または家畜（たとえば、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ）である。一部の実施形態では、患者、対象、または個体はヒトである。一部の実施形態では、患者、対象、または個体は知的能力遺伝子用量感受性障害の危険性にある。一部の実施形態では、患者、対象、または個体はレット症候群の危険性にある。さらなる選択肢として、対象は実験動物および／または疾患の動物モデルであることができる。
【０１０４】
本発明のさらなる態様は、対象に治療上有効な量の本発明の合成遺伝子、ベクター、および／または医薬組成物を送達し、それによって対象において目的の核酸またはタンパク質の異常な発現に関連する障害を処置するステップを含む、それを必要としている対象において、目的の核酸またはタンパク質の異常な発現に関連する障害を処置する方法に関する。
【０１０５】
一部の実施形態では、目的の核酸またはタンパク質は知的能力遺伝子用量感受性障害に関連している。知的能力遺伝子用量感受性障害に関連する目的の核酸またはタンパク質としては、それだけには限定されないが、ＴＣＦ４、ＵＢＥ３Ａ、ＤＹＲＫ１Ａ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＳＤ１、ＺＥＢ２、ＭＢＤ５、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＡＴＲＸ、ＦＯＸＧ１、ＡＫＴ３、ＳＬＣ６Ａ１、ＭＥＣＰ２、またはその任意の活性断片が挙げられる。
【０１０６】
知的能力遺伝子用量感受性障害としては、それだけには限定されないが、レット症候群、ＭｅＣＰ２重複症候群、アンジェルマン症候群、ｄｕｐ１５Ｑ、ＤＹＲＫ１Ａハプロ不全、ダウン症候群、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全症候群、ｄｕｐ５Ｑ１４．３、ソトス症候群、逆ソトス症候群、アルファ地中海貧血症Ｘ連鎖知的障害症候群、Ｘｑ１３．２ｑ２１．１重複、コフィン−ローリー症候群、Ｘｐ２２．１２重複、ピット・ホプキンス症候群、モワット−ウィルソン症候群、２ｑ２２．３三重複、２ｑ２３．１重複、２ｑ２３．１微小欠失、ＦＯＸＧ１症候群、ウエスト症候群、巨大脳症−多小脳回−多指症−水頭症症候群、ＡＫＴ３重複、デューズ症候群、ＳＬＣ６Ａ１重複、および１８トリソミーが挙げられる。一部の実施形態では、目的の核酸またはタンパク質はＭＥＣＰ２またはその任意の活性断片であり、ＭＥＣＰ２に関連する知的能力遺伝子用量感受性障害はレット症候群および／またはＭｅＣＰ２重複症候群である。
【０１０７】
特定の実施形態では、合成遺伝子、ベクター、および／または医薬組成物を対象に、たとえば、全身的に（たとえば静脈内）、または対象の中枢神経系に直接（たとえば、くも膜下腔内、大槽内、もしくは脳室内注射によって脳脊髄液に）送達する。一部の実施形態では、合成遺伝子、ベクター、および／または医薬組成物は、経腸、非経口、くも膜下腔内、大槽内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内、眼周囲、直腸内、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、舌下、皮下、および経皮から選択された送達経路によって送達する。一部の実施形態では、合成遺伝子、ベクター、および／または医薬組成物は静脈内で送達する。一部の実施形態では、合成遺伝子、ベクター、および／または医薬組成物は、静脈内、大槽内、くも膜下腔内、および／または脳室内で送達し、脳脊髄液（「ＣＳＦ内」）に直接送達される。
【０１０８】
本発明の一態様は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成遺伝子を細胞へと移す方法である。本発明の合成遺伝子および／またはベクターは、適切な量で細胞に導入し得る。ウイルスベクターの実施形態では、ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適した標準の形質導入方法に従って、適切な感染多重度で細胞に導入し得る。投与するウイルスベクターまたはカプシドの力価は、標的細胞の種類および数、ならびに特定のウイルスベクターまたはカプシドに応じて変動する場合があり、当業者によって、必要以上の実験を行わずに決定することができる。特定の実施形態では、少なくとも約１０２感染単位、より好ましくは少なくとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、または１０１３感染単位を細胞に導入する。
【０１０９】
本発明の合成遺伝子および／またはベクター、たとえばウイルスベクターを導入することができる細胞は、それだけには限定されないが、神経細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に、ニューロン、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、星細胞などの脳細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、上皮細胞（たとえば、腸および気道上皮細胞）、骨格筋細胞（筋芽細胞、筋管、および筋原線維を含む）、横隔膜筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、胃腸管の細胞（平滑筋細胞、上皮細胞を含む）、心細胞（心筋細胞を含む）、骨細胞（たとえば骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、関節細胞（たとえば、軟骨、半月板、滑膜、および骨髄を含む）、生殖細胞等を含めた任意の種類のものであり得る。あるいは、細胞は任意の前駆細胞であり得る。さらなる代替として、細胞は幹細胞（たとえば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であることができる。さらに、上述のように、細胞は任意の種の起源であることができる。
【０１１０】
本発明の合成遺伝子およびベクター、たとえばウイルスベクターは、改変した細胞を対象に投与する目的のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に導入し得る。特定の実施形態では、細胞が対象から取り出され、本発明の合成遺伝子および／またはベクター、たとえばウイルスベクターがそれ中に導入され、その後、細胞が対象に戻される。ｅｘ  ｖｉｖｏでの処置のために細胞を対象から取り出し、次いで対象内に導入して戻す方法は、当技術分野で知られている（たとえば米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。あるいは、本発明合成遺伝子および／またはベクター、たとえばウイルスベクターを、別の対象からの細胞内、培養細胞内、または任意の他の適切な供給源からの細胞内に導入し、細胞を、それを必要としている対象に投与する。
【０１１１】
ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法のための適切な細胞は上述のとおりである。対象に投与する細胞の用量は、対象の年齢、状態、および種、細胞の種類、細胞によって発現される核酸、投与様式などに応じて変動する。典型的には、１用量あたり少なくとも約１０２〜約１０８または約１０３〜約１０６個の細胞を薬学的に許容される担体中で投与する。特定の実施形態では、ベクターで形質導入した細胞を、対象に、有効量で、製薬担体と組み合わせて投与する。
【０１１２】
ヒト対象は、たとえば、対象が本明細書中に記載したものを含めた障害の危険性にあるもしくはそう考えられている、または、本明細書中に記載したものを含めた合成遺伝子の送達から恩恵を受けるであろうことが理由で、新生児、乳児、青少年、および成人を含む。任意選択で、対象は本発明の方法を「必要としている」。
【０１１３】
特定の実施形態では、本発明の合成遺伝子は、それを必要としている対象に、対象の生命中のできるだけ早期に、たとえば対象が目的の核酸またはタンパク質の異常な発現または活性を診断されたらすぐに、投与する。一部の実施形態では、合成遺伝子は、新生児対象に、たとえば新生児スクリーニングにより目的の核酸またはタンパク質の異常な発現または活性が同定された後に投与する。一部の実施形態では、合成遺伝子は、胎児に子宮内で、たとえば出生前スクリーニングにより異常な発現または活性が同定された後に投与する。一部の実施形態では、合成遺伝子は、対象に、対象が目的の核酸もしくはタンパク質の異常な発現もしくは活性に関連する症状を発生したら、または目的の核酸もしくはタンパク質の異常な発現もしくは活性を有することが疑われるもしくは診断されたらすぐに投与する。一部の実施形態では、合成遺伝子は、対象に、対象が目的の核酸またはタンパク質の異常な発現または活性に関連する症状を発生する前に、たとえば異常な発現または活性有することが疑われるまたは診断されるが症状を示し始めていない対象に投与する。
【０１１４】
本発明のさらなる態様は、本発明の合成遺伝子、ベクター、および／または医薬組成物、たとえば本発明の合成遺伝子を対象に送達する方法である。特定の実施形態では、この方法は、有効量の本発明による合成遺伝子を動物対象に投与するステップを含む、合成遺伝子を動物対象に送達する方法を含む。本発明の合成遺伝子の、それを必要としているヒト対象または動物への投与は、当技術分野で知られている任意の手段によるものであることができる。任意選択で、合成遺伝子および／またはベクターは、有効用量で、薬学的に許容される担体中で送達する。
【０１１５】
対象に投与するベクターの用量は、投与様式、処置する疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター、および送達する核酸に依存し、ルーチン的な様式で決定することができる。ウイルスベクターの実施形態では、治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０３、１０１４、１０１５、１０１６形質導入単位またはそれより多くのウイルス力価である。用量およびウイルス力価形質導入単位はベクターまたはウイルスゲノム（ｖｇ）として計算し得る
【０１１６】
特定の実施形態では、様々な間隔の期間、たとえば、１日１回、週に１回、月に１回、年に１回などにわたって所望のレベルの遺伝子発現を達成するために、複数回の投与（たとえば、２回、３回、４回、またはそれより多い投与）を用い得る。
【０１１７】
例示的な投与様式としては、経口、直腸、経粘膜、局所、鼻腔内、吸入（たとえばエアロゾルを介して）、頬側（たとえば舌下）、経膣、くも膜下腔内、眼内、経皮、子宮内（または卵内）、非経口（たとえば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格、横隔膜および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、ならびに関節内）、局所（たとえば、気道表面を含めた皮膚および粘膜の両方の表面へ、ならびに経皮投与）、リンパ管内など、また、直接の組織または臓器の注射（たとえば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋、または脳へ）が挙げられる。投与は、腫瘍（たとえば、腫瘍またはリンパ節中またはその付近）へのものであることもできる。任意の所定の事例における最も適切な経路は、処置する状態の性質および重篤度、ならびに使用する特定のベクターの性質に依存する。
【０１１８】
一部の実施形態では、ベクターをＣＮＳ、末梢神経系、または両方に投与する。
【０１１９】
一部の実施形態では、ベクターをＣＮＳ、たとえば脳または脊髄に直接投与する。直接投与は、たとえば形質導入した細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％以上がＣＮＳ細胞であるような、ＣＮＳ細胞の形質導入の高い特異性をもたらすことができる。ベクターをＣＮＳに直接投与する、当技術分野で知られている任意の方法を使用することができる。ベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、および前頭葉を含めた大脳、皮質、大脳基底核、海馬、扁桃体）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、ならびに下丘内に導入し得る。ベクターは、網膜、角膜、または視神経などの眼の様々な領域にも投与し得る。ベクターは、ベクターのより分散された投与のために脳脊髄液（たとえば腰椎穿刺による）内に送達し得る。
【０１２０】
送達ベクターは、それだけには限定されないが、くも膜下腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内（たとえば、硝子体内、網膜下、前房）、および眼周囲（たとえば、テノン嚢下の領域）の送達、またはその任意の組合せを含めた、当技術分野で知られている任意の経路によって、ＣＮＳの所望の領域に投与し得る。
【０１２１】
送達ベクターは、ＣＮＳ、末梢神経系、および／または他の組織を含めた組織のより広範な散在性の形質導入を生じる様式で投与し得る。
【０１２２】
典型的には、ベクターは、ＣＮＳおよび／または他の組織中の所望の領域または区画への直接注射（たとえば定位注射）によって、液体配合物中で投与する。一部の実施形態では、ベクターはリザーバーおよび／またはポンプを介して送達することができる。他の実施形態では、ベクターは、所望の領域への局所施用によって、またはエアロゾル配合物の鼻腔内投与によって提供し得る。眼または耳内への投与は、液滴の局所施用によるものであり得る。さらなる代替として、ベクターは固形の徐放配合物として投与し得る。たとえば、パルボウイルスおよびＡＡＶベクターの徐放は国際公開公報ＷＯ０１／９１８０３号に記載されている。
【０１２３】
注射剤は、慣用の形態で、液体溶液もしくは懸濁液、注射前に液体中に溶解もしくは懸濁させるために適した固体形態、または乳濁液のいずれかとして、調製することができる。あるいは、ベクターを、全身性ではなく局所的な様式で、たとえば、デポーまたは持続放出配合物中で投与し得る。さらに、ウイルスベクターは、骨移植代用物、縫合糸、ステントなどの外科的に埋め込み可能なマトリックスに、乾燥させて送達することができる（たとえば米国特許第７，２０１，８９８号に記載）。
【０１２４】
経口投与に適した医薬組成物は、それぞれが事前に決定した量の本発明の組成物を、粉末もしくは顆粒として、水性もしくは非水性の液体中の溶液または懸濁液として、または水中油もしくは油中水の乳濁液として含有する、カプセル、カシェ剤、ロゼンジ、または錠剤などの別個の単位中で提示することができる。経口送達は、本発明のウイルスベクターを、動物の腸において消化酵素による分解に耐えることができる担体と複合体形成させることによって行うことができる。そのような担体の例としては、当技術分野で知られているプラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。そのような配合物は、組成物と適切な担体（上述のように１つまたは複数の副成分を含有し得る）とを会合させるステップを含む、任意の適切な薬学的方法によって調製される。一般に、本発明の実施形態による医薬組成物は、組成物を液体もしくは微粉固形の担体または両方と均一かつ念入りに混合し、その後、必要な場合は、生じた混合物を成形するによって調製する。たとえば、錠剤は、組成物を含有する粉末または顆粒を、任意選択で１つまたは複数の副成分と共に圧縮または成型することによって調製することができる。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、および／または界面活性／分散剤と任意選択で混合した粉末または顆粒などの易流動性形態の組成物を、適切な機械において圧縮することによって調製する。すりこみ錠は、不活性液体結合剤で湿らせた粉末化合物を適切な機械において成型することによって作製する。
【０１２５】
頬側（舌下）投与に適した医薬組成物としては、本発明の組成物を香味付けした基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に含むロゼンジ、ならびに組成物をゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に含むパステル錠が挙げられる。
【０１２６】
非経口投与に適した医薬組成物は、本発明の組成物の無菌的な水性および非水性の注射溶液を含むことができ、調製物は、意図するレシピエントの血液と任意選択で等張である。これらの調製物は組成物を意図するレシピエントの血液と等張にさせる、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および溶質を含有することができる。水性および非水性の無菌的な懸濁液、溶液、および乳濁液は、懸濁剤および増粘剤を含むことができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水および緩衝媒体を含めた、水、アルコール溶液／水溶液、乳濁液、または懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養素補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）等が挙げられる。たとえば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在し得る。
【０１２７】
組成物は、単位／用量または複数用量の容器中で、たとえば密封したアンプルおよびバイアル中で提示することができ、使用の直前に無菌的液体担体、たとえば生理食塩水または注射用水を加えることのみを必要とする凍結乾燥状態で保管することができる。
【０１２８】
即時の注射溶液および懸濁液は、既に記載した種類の無菌的な粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。たとえば、単位剤形の、密封容器中の、本発明の注射用の安定した無菌的組成物を提供することができる。組成物は、適切な薬学的に許容される担体中で再構成して対象内への注射に適した液体組成物を形成することができる、凍結乾燥物の形態で提供することができる。単位剤形は、約１μｇ〜約１０グラムからの本発明の組成物であることができる。組成物が実質的に非水溶性である場合、十分な量の生理的に許容される乳化剤を、組成物を水性担体中で乳化させるために十分な量で含めることができる。１つのそのような有用な乳化剤はホスファチジルコリンである。
【０１２９】
直腸投与に適した医薬組成物は、単位用量の坐薬として提示することができる。これらは、組成物を、たとえばカカオ脂などの１つまたは複数の慣用の固形担体と混合し、その後、生じた混合物を成形することによって調製することができる。
【０１３０】
皮膚への局所施用に適した本発明の医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油の形態をとることができる。使用することができる担体としては、それだけには限定されないが、石油ゼリー、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮エンハンサー、およびその２つ以上の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、たとえば、局所送達は、本発明の医薬組成物を、皮膚内へと通過することができる親油性試薬（たとえばＤＭＳＯ）と混合することによって行うことができる。
【０１３１】
経皮投与に適した医薬組成物は、対象の表皮と長期間密着したまま保たれるよう適応された別個のパッチの形態であることができる。経皮投与に適した組成物はイオン泳動によって送達することもでき（たとえばＰｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、３：３１８頁（１９８６年）を参照）、典型的には、本発明の組成物の任意選択で緩衝化した水溶液の形態をとる。適切な配合物は、クエン酸もしくはビス／トリス緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含むことができる。
【０１３２】
本明細書中に開示されているベクターは、任意の適切な手段によって、たとえば、対象が吸入する、ベクターからなる呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液を投与することによって対象の肺に投与し得る。呼吸用粒子は液体または固体であり得る。ウイルスベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に知られている圧力駆動のエアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いてなど、任意の適切な手段によって生成し得る。たとえば米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ベクターを含む固形粒子のエアロゾルも同様に、任意の固形粒子状医薬品エアロゾル発生器を用いて、製薬分野で知られている技法によって生成し得る。
【０１３３】
ここまで本発明を説明し、これを、例示目的のみで本明細書中に含み、本発明を限定することを意図しない以下の実施例においてより詳細に説明する。
【実施例】
【０１３４】
【実施例１】
【０１３５】
ＭＥＣＰ２発現によって上方調節されるｍｉＲＮＡの同定
超生理的なＭｅＣＰ２発現によって上方調節される内在性ｍｉＲＮＡを同定するために、毒性用量のＭＥＣＰ２ベクターで処置したマウスからの小脳および髄質のＲＮＡをスクリーニングした。Ｍｅｃｐ２＋／ｙおよびＭｅｃｐ２−／ｙマウスに、生理食塩水または１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ９／ＭｅＰ４２６−ｈＭＥＣＰ２−ｍｙｃ−ＲＤＨ１ｐＡのどちらかを大槽内注射した（出生後２８日目［ＰＮＤ２８］、１０μＬの注射体積、ｎ＝２匹のマウス／処置）。処置の２週間後、致死的用量のトリブロモエタノールでマウスを安楽死させた。小脳および脳幹を解剖し、ドライアイス上で凍結し、貯蔵のためにすぐに−８０℃に移した。Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、全ＲＮＡを解凍した小脳および脳幹（合わせた）から精製した。精製したＲＮＡを−８０℃で保管し、後に、スクリーニングのためにドライアイス上でＬＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓへと発送した（マイクロアレイパート番号ＭＲＡ−１００２、ｍｉＲＢａｓｅバージョン２１）。
【０１３６】
生データはＬＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって、その技術告示に従って処理された（Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌ．マイクロＲＮＡマイクロアレイデータ分析（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ））。パイロット研究において使用した小さな試料サイズにより、処置群間の統計的に有意な差にのみ基づいた陽性ヒットの同定を妨げられた。したがって、統計的検出力を改善させるために、統計的有意性を計算する前にデータを３つすべてのＭＥＣＰ２（＋）群（すなわち、ウイルスで処置したＭｅｃｐ２−／ｙマウスならびに生理食塩水およびウイルスで処置したＭｅｃｐ２＋／ｙマウス）について総計した。ＭＥＣＰ２（＋）マウスの中でレベルが上昇していた１０個の中等度から高度に発現されたｍｉＲＮＡの中で、１つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−４９４−３ｐ）が内在性ＭＥＣＰ２  ３’ＵＴＲ内に標的を有しており（ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ、Ａｇａｒｗａｌら、２０１５年、Ｅｌｉｆｅ、（４）、マウスおよびヒト）、ＭｅＣＰ２およびｍｉＲ−４９４−３ｐによって媒介される負のフィードバックループがｉｎ  ｖｉｖｏで存在し得ることを示唆している。さらに、正規化したシグナル強度により、Ｍｅｃｐ２＋／ｙおよびＭｅｃｐ２−／ｙマウスのどちらにおいても、増加したｍｉＲ−４９４−３ｐの発現と外因性ＭｅＣＰ２の発現との間に説得力のある傾向が実証された。
【実施例２】
【０１３７】
ＭｅＣＰ２発現によって上方調節される追加のｍｉＲＮＡの同定
ＭｅＰ４２６−ｈＭＥＣＰ２−ｍｙｃ−ＲＤＨ１ｐＡウイルスゲノム中の３つのｍｉＲＮＡ標的（すなわち、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−１９−３ｐ、およびｍｉＲ−１３２−３ｐ）をｍｉＲ−４９４−３ｐの標的配列で置き換えた（Ｓｉｎｎｅｔｔら、２０１７年、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．、（５）：１０６〜１１５頁、Ｇａｄａｌｌａら、２０１７年、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．、（５）：１８０〜１９０頁）。その後、改変ウイルスゲノムをＡＡＶ９内にパッケージングし、モザイクＭＥＣＰ２−ＥＧＦＰ−融合／ヌル雌内に大槽内注射した。導入遺伝子の発現は、ＭｅＣＰ２−ＥＧＦＰ発現に応答して、隣接するヌル細胞において観察されるものと比較してわずかに減少していた（図８）。
【実施例３】
【０１３８】
上方調節されたｍｉＲＮＡの大スケールスクリーニング
上述のパイロット研究の制限に対処するために、大スケールスクリーニングを完了した。より詳細には、さらなる対照群を追加し、より多くのマウスを処置し、ＲＮＡ精製前に脳領域を細かく解剖した（合わせない）。Ｍｅｃｐ２＋／ｙおよびＭｅｃｐ２−／ｙマウスに、生理食塩水、１×１０１２ｖｇのＡＡＶ９／ＭｅＰ４２６−ｈＭＥＣＰ２−ｍｙｃ−ＲＤＨ１Ｐａ、または１×１０１２ｖｇのＡＡＶ９／ＣＢＨ−ＥＧＦＰのいずれかを大槽内注射した（ＰＮＤ  Ｐ２８〜Ｐ３５、１０μＬの注射体積、ｎ＝３匹のマウス／処置）。処置の２〜３週間後、致死的用量のトリブロモエタノールでマウスを安楽死させた。頚髄、小脳、および脳幹を解剖し、ドライアイス上で凍結し、貯蔵のためにすぐに−８０℃に移した。その後、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、全ＲＮＡを解凍した組織から精製した。脳領域はＲＮＡ精製の前に合わせなかった。ＲＮＡを−８０℃で保管し、後に、スクリーニングのためにドライアイス上でＬＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓへと発送した（マイクロアレイパート番号ＭＲＡ−１００２、ｍｉＲＢａｓｅバージョン２１）。
【０１３９】
生データはＬＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって、その技術告示に従って処理された。内在性ＭｅＣＰ２、ＡＡＶ９／ＭＥＣＰ２、またはＡＡＶ９／ＥＧＦＰ処置に相関して有意に上方調節されたｍｉＲＮＡを同定した（図２〜７）。ｍｍｕ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−４５１ａ、およびｍｍｕ−ｍｉＲ−６９０の平均発現レベルは、Ｍｅｃｐ２＋／ｙおよびＭｅｃｐ２−／ｙマウスの組織型にわたって外因性および内在性のＭｅＣＰ２に相関して最も頻繁に増加し、ＡＡＶ９／ＥＧＦＰに相関して最も低い頻度で増加した。
【０１４０】
総計した処置群（ＭＥＣＰ２（−）対ＭＥＣＰ２（＋））の分析により、少なくとも１つの組織型においてＭｅＣＰ２発現によって有意に上方調節されたさらなるｍｉＲＮＡが明らかとなった（図９）。ｍｉＲ−６９０に関しては、頚髄においてＭＥＣＰ２（−）と（＋）群との間に有意差があり、髄質において生理食塩水で処置したＫＯとＷＴマウスとの間に有意差があった。ｍｉＲ−４５１ａに関しては、髄質においてＭＥＣＰ２（−）と（＋）群との間に有意差があり、頚髄において生理食塩水で処置したＫＯとＷＴマウスとの間に有意差があった。ｌｅｔ−７ｅ５ｐに関しては、頚髄においてＭＥＣＰ２（−）と（＋）群との間に有意差があり、頚髄において生理食塩水で処置したＫＯとＷＴマウスとの間にも有意差があった。ｌｅｔ−７ｅ−５ｐは、有意性を隠す相対的な発現レベルおよび潜在的な異常値データ点を考慮すると、小脳の合理的な標的であり得る。これら３つの標的（ｍｉＲ−６９０、ｍｉＲ−４５１ａ、およびｌｅｔ−７ｅ−５ｐをＭｅＰ４２６−ΔＮＩＣ−ＲＤＨ１ｐＡに加えた。ｍｉＲ−１２４−３ｐに関しては、頚髄における総計ＭＥＣＰ２（＋）群でより低く、生理食塩水で処置したＫＯおよびＷＴマウスの頚髄における以前の分析と一貫していた。この逆の関係性にもかかわらず、脳全体における比較的高い発現は、この標的が、注射経路にかかわらず発現をキャッピングするために合理的であり得ることを意味する。ｍｉＲ−１３２−３ｐに関しては、総計分析のみにおいて髄質において上方調節されていることが見出された。ｍｉＲ−１２４−３ｐおよびｍｉＲ−１３２−３ｐはＲＤＨ１ｐＡにおける公開されている標的である。ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、およびｍｉＲ−２７ａ−３ｐはユニバーサルパネルの一部である（ｌｅｔ−７ｅ−５ｐも）。ｍｉＲ−９−５ｐおよびｍｉＲ−２７ａ−３ｐに関しては、これらは総計分析のみにおいて頚髄において上方調節されていた。ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐに関しては、頚髄においてＭＥＣＰ２（−）と（＋）群との間に有意差があり、頚髄において生理食塩水で処置したＫＯとＷＴマウスとの間にも有意差があった。図９のｍｉＲＮＡのほとんどは、ｍｉＲ−４９４−３ｐよりも高いレベルで通常は発現され、新しいパネル設計が導入遺伝子の発現のより頑強な阻害をもたらし得ることを示唆している。
【０１４１】
スクリーニングからのデータを使用して２種類のｍｉＲＮＡ標的パネルを設計した。実施例４にさらに記載するように、第１のパネルは、その発現レベルがｉｎ  ｖｉｖｏのＭｅＣＰ２発現に相関して増加するｍｉＲＮＡと結合する。第２のパネル設計を以下に記載する。
【０１４２】
生理食塩水およびウイルスで処置したマウスからのＲＮＡ試料をスクリーニングして、中枢神経系（ＣＮＳ）において発現されたＭｅＣＰ２駆動のｍｉＲＮＡを同定した。これらのｍｉＲＮＡの標的をＭＥＣＰ２ウイルスゲノムの３’ＵＴＲ内に挿入することは、ｉｎ  ｖｉｖｏの外因性ＭｅＣＰ２の毒性がある過剰発現を弱毒化するための内在性ＲＮＡ干渉機構の使用を可能にする（図１）。最近のスクリーニングからのデータを使用して２種類のｍｉＲＮＡ標的パネルを設計した。第１のパネルは、その発現レベルがｉｎ  ｖｉｖｏのＭｅＣＰ２発現に相関して増加するｍｉＲＮＡと結合する。第２のパネル設計は、文献および実験データの両方によって正当化される標的を含む。重要なことに、この第２のパネル中の標的は、知的能力を媒介する用量感受性遺伝子の多くの３’ＵＴＲにおいて保存されている。したがって、このパネルは、レット症候群（ＲＴＴ）のおよび他の神経発達障害のマウスモデルにおいて試験するために理想的な可能性があり、治療的設定における導入遺伝子の改善されたフィードバック調節を媒介する可能性がある。
【０１４３】
完全なパネル配列を以下に列挙する。シードマッチに下線が引かれている。１つおきのシードマッチおよびフランキング配列のセクションを斜体で示す。結合部位キー（５’−３’の順序）：ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６−５ｐ、ｍｉＲ−２３−３ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、ｌｅｔ−７−５ｐ：
５’ＣＴＧＴＴＣＴＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＧＣＡＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＡＴＡＧＣＡＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＴＴＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴＡＡＴＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＧＡＴＡＡＣ−３’（配列番号１）
【０１４４】
知的障害によって特徴づけられるいくつかの神経発達障害は、厳密に調節しなければならない遺伝子中の突然変異によって媒介される（表１を参照）。これらの遺伝子の３’ＵＴＲ間の類似性は、遺伝的病因学にかかわらず、過剰発現に誘導される知的障害から脳を保護することを助けるための、ｉｎ  ｖｉｖｏ阻害機構が存在し得ることを示唆している（表２を参照）。
【０１４５】
2021534778.tif 000003
【０１４６】
同様の表現型（たとえば、知的障害、発話異常、癲癇発作、小頭症、および／または常同症）を媒介する欠失および相互重複障害としては、それだけには限定されないが表１に列挙したものが挙げられる。これらの重複障害の重篤な表現型は、遺伝子療法後に導入遺伝子の発現を調節するための、幅広く適用可能なｍｉＲＮＡ標的パネルの必要性を正当化している。
【０１４７】
表１の欠失または突然変異障害のヒトおよび動物モデルを記載している参考文献：ＴＣＦ４（Ａｇａｒｗａｌ、２０１５年、Ｄｅａｎ  Ｌ．、２０１２年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｍｍａｒｉｅｓ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｓｗｅｅｔｓｅｒら、１９９３年、ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（（Ｒ））、ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ、ｄｅ  Ｗｉｎｔｅｒら、２０１６年、Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊ．Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．、１１：３７）、ＭＥＣＰ２（Ｌｅｏｎａｒｄら、２０１７年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１３（１）：３７〜５１頁、ＣｈａｈｉｌおよびＢｏｌｌｕ、２０１８年、ＳｔａｔＰｅａｒｌｓ：フロリダ州Ｔｒｅａｓｕｒｅ  Ｉｓｌａｎｄ、ＳｅｌｔｚｅｒおよびＰａｃｉｏｒｋｏｗｓｋｉ、２０１４年、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ｃ．Ｓｅｍｉｎ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、１６６Ｃ（２）：１４０〜１５５頁、Ｆｕｅｒｔｅｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｓら、２０１１年、Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ  Ｐａｔｏｌ．Ｏｒａｌ  Ｃｉｒ．Ｂｕｃａｌ．、１６（１）：ｅ３７〜４１頁）、ＵＢＥ３Ａ（Ｄａｇｌｉら、１９９３年、ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（（Ｒ））：ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｐｅｌｃら、２００８年、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｄｉｓ．Ｔｒｅａｔ．、４（３）：５７７〜５８４頁、Ｐｅｌｃら、２００８年、Ｓｌｅｅｐ  Ｍｅｄ．、９（４）：４３４〜４４１頁）、ＤＹＲＫ１Ａ（Ｌｕｃｏら、２０１６年、ＢＭＣ  Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、１７：１５）、ＭＥＦ２Ｃ（Ｖｒｅｃａｒら、２０１７年、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇｅｎｅｔ．、６（３）：１２９〜１４１頁）、ＮＳＤ１（Ｔａｔｔｏｎ−Ｂｒｏｗｎら、１９９３年、ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（（Ｒ））：ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ）、ＡＴＲＸ（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｒ．Ｅ．、１９９３年、ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（（Ｒ））：ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｂｏｕａｚｚｉら、２０１６年、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．、１４３（１）：４３〜４８頁）、ＲＰＳ６ＫＡ３（Ｍｉｙａｔａら、２０１８年、Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖ．、４０（７）：５６６〜５６９頁、Ｍｏｒｉｎｏら、２０１６年、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、９５（３１）：ｅ４４６８、Ｔｏｕｒａｉｎｅら、２００２年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、１６１（４）：１７９〜１８７頁、Ｔｏｓら、２０１５年、Ｇｅｎｅｔ．Ｃｏｕｎｓ．、２６（１）：４７〜５２頁）、ＭＢＤ５（Ｔａｌｋｏｗｓｋｉら、２０１１年、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、８９（４）：５５１〜５６３頁）、ＺＥＢ２（Ｈｅｇａｒｔｙら、２０１５年、Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３２：８１〜９５頁）。
【０１４８】
表１の過剰発現（一遺伝子性または多遺伝子性）のヒトおよび動物モデルを記載する参考文献：１８トリソミー（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２０１６年、Ｃｌｉｎ．Ａｎａｔ．、２９（５）：６２８〜６３２頁、ｄｅ  Ｑｕｅｉｒｏｚら、２００７年、Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｃｈｉｌｄ（Ｃｈｉｃ）、７４（１）：６７〜７２頁）、ＭｅＣＰ２重複症候群（Ｍｉｇｕｅｔら、２０１８年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、５５（６）：３５９〜３７１頁）、Ｄｕｐ１５Ｑ（Ｆｉｎｕｃａｎｅら、１９９３年、ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（（Ｒ））：ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｃｏｐｐｉｎｇら、２０１７年、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、２６（２０）：３９９５〜４０１０頁、Ｗｅｇｉｅｌら、２０１２年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、７１（５）：３８２〜３９７頁）、ダウン症候群（ＤｕｃｈｏｎおよびＨｅｒａｕｌｔ、２０１６年、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１０：１０４頁、ＫｅｎｔおよびＶｏｒｐｅｒｉａｎ、２０１３年、Ｊ．Ｓｐｅｅｃｈ  Ｌａｎｇ．Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．、５６（１）：１７８〜２１０頁、Ａｒａｕｊｏら、２０１５年、Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｂｅｈａｖ．、５３：１２０〜１２５頁、Ｇｕｅｄｊら、２０１２年、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．、４６（１）：１９０〜２０３頁、Ｃａｒｔｅｒら、２００８年、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、１９（６）：６５３〜６５６頁）、ｄｕｐ５Ｑ１４．３（Ｃｅｓａｒｅｔｔｉら、２０１６年、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ、１７０Ａ（５）：１３５２〜１３５７頁）、逆ソトス症候群（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、２０１３年、Ｍｏｌ．Ｓｙｎｄｒｏｍｏｌ．、３（６）：２４７〜２５４頁）、Ｘｑ１３．２ｑ２１．１（Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒｇら、２００９年、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ、１４９Ａ（４）：７６０〜７６６頁、Ｂｅｒｕｂｅら、２００２年、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１１（３）：２５３〜２６１頁）、Ｘｐ２２．１２（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、２０１３年、Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、５８（１１）：７５５〜７５７頁、Ｔｅｊａｄａら、２０１１年、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１２８（４）：ｅ１０２９〜１０３３頁）、２ｑ２３．１重複（Ｍｕｌｌｅｇａｍａら、２０１４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、２２（１）：５７〜６３頁）、２ｑ２２．３三重複（Ｙｕａｎら、２０１５年、Ｍｏｌ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．、８：９９頁）。
【０１４９】
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【０１５０】
内在性３’ＵＴＲ中の標的の完全なリストはｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇに見つかる。表２のそれぞれの細胞において、コンテキスト＋＋パーセンタイルスコアを２つの種（ヒト／マウス）について列挙する。高いスコアは好都合なゲノムコンテキストを有する標的を示す。合成パネルは、上に列挙した内在性３’ＵＴＲの多くと結合すると予測されるｍｉＲＮＡの標的を含む。６つの選択した標的のうち、４つの標的は、ＭｅＣＰ２発現に相関して発現の増加を実証したｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−９−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７−３ｐ、およびｌｅｔ−７−５ｐ）と結合するはずである（図９中のＨＴＳデータを参照）。さらに、ＭｅＣＰ２発現とｌｅｔ−７との間（Ｕｒｄｉｎｇｕｉｏら、２０１０年、Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、５（７）：６５６〜６６３頁、Ｗｕら、２０１０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０７（４２）：１８１６１〜１８１６６頁）、ＴＣＦ４発現とｍｉＲ−２１８との間（Ｈａｓｓａｎら、２０１２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８７（５０）：４２０８４〜４２０９２頁）、およびｍｉＲ−２３ａ−３とＭＥＦ２Ｃ発現との間の相関が公開されている（Ｋａｌｓｏｔｒａら、２０１４年、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、６（２）：３３６〜３４５頁）。未公開ＨＴＳデータは、頚髄におけるｍｉＲ−２３ａ−３ｐ発現およびＭｅＣＰ２発現の増加の傾向を実証した。他の標的は以下の理由から排除した：（１）標的が導入遺伝子の発現に対して控えめな効果を与える（すなわちｍｉＲ−４９４−３ｐ、図８を参照）、（２）標的が上記で検査したＵＴＲ中に出現しない（すなわちｍｉＲ−４５１ａ）、（３）対応するｍｉＲＮＡがＡＡＶ９／ＥＧＦＰに相関して上方調節されている（すなわちｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ）、または（４）標的が公開されたＭＥＣＰ２ウイルスゲノムにおいて合成遠位ＭＥＣＰ２  ｐＡの構成要素として既に存在する（すなわちｍｉＲ−１２４−３ｐ）（Ｓｉｎｎｅｔｔら、２０１７年、Ｇａｄａｌｌａら、２０１７年）。Ｘは、ヒトまたはマウスの３’ＵＴＲのいずれ中にも標的が存在しないことを示す。−−／−−を含有するボックスは、標的がヒト（／−−）またはマウス（−−／）の３’ＵＴＲのどちらかにのみあることを示す。残りの標的はどちらの種においても出現する。種間で同様または同一である５’フランキング配列を有する標的を＃記号で示す。保存的５’フランキング配列を有さない標的はβ記号で示す。太字で縁取りした標的（およびそのフランキング配列）を合成パネル用に選択した。最後に、ｍｉＲ−２９−３ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−９８−５ｐ、およびｍｉＲ−７−５ｐの標的も、これらのｍｉＲＮＡの結合部位は上に列挙した遺伝子の多くにおいて存在し（ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇを参照）、これらのｍｉＲＮＡの発現の増加がＭｅＣＰ２発現に相関して観察されたため、ユニバーサル標的パネル内に挿入する候補であり得る。
【０１５１】
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2021534778.tif 000007
【０１５２】
ヒト３’ＵＴＲに出現する標的およびそのフランキング配列を、表３中にそれぞれの遺伝子の隣に示す。合成パネル用に選択した配列を「ｖｇ」（ウイルスゲノム）の隣に列挙する。所定のｍｉＲＮＡについて２つ以上の標的がヒト３’ＵＴＲ中に存在していた場合、種間で保存されていた標的配列を選択し、上記表中に列挙した。合成パネル用の５’フランキング配列を選択する際は以下のパラメータを考慮した：（１）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ヌクレオチド１３〜１６（Ｍ１３〜Ｍ１６）での優先的な対合を有する必然のワトソン−クリック（ＷＣ）塩基対合（Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎによって予測）（Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２７（１）：９１〜１０５頁）、（２）種間の５’フランキング配列の保存（表２を参照）、（３）Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ上に列挙されるコンテキスト＋＋パーセンタイルスコア、および（４）配列複雑さ（商業的遺伝子合成は合成パネル全体について３５％以上の％ＧＣ含有率を必要とする）。選択されたそれぞれの５’フランキング配列について、同じＵＴＲからの３’フランキング配列を標的パネル内に挿入するために選択した。（３）１つの突然変異（蛍光ペンおよび太字）を導入して、ｍＲＮＡ−アルゴノートの相互作用を促進するためのＴ１Ａアンカーを作製した（Ｓｃｈｉｒｌｅら、２０１５年、Ｅｌｉｆｅ、（４）、Ｓｃｈｉｒｌｅら、２０１４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４６（６２０９）：６０８〜６１３頁）。ｍｉＲＮＡ配列における類似度が原因で、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐの標的は他のｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡとも結合し得る。ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、およびｌｅｔ−７ｇ−５ｐは、総計データ分析においてＭＥＣＰ２（＋）頚髄組織の発現の増加を示した。ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、およびｌｅｔ−７ｇ−５ｐは、Ｍｅｃｐ２−／ｙマウスにおいてＭＥＣＰ２ウイルスで処置した後に発現の増加を示した。さらに、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ標的は、その発現レベルが頚髄組織の総計データ分析において増加したｍｉＲ−９８−５ｐと結合し得る。Ｔ１Ａアンカーを、標的カラムにおいて下線を引いている。アルゴノート相互作用のコンホメーションに最適化されていると考えられるＴ９Ａ／Ｕｓを、５’フランキング配列のカラムにおいて下線を引いている（Ｌｅｗｉｓら、２００５年、Ｃｅｌｌ、１２０（１）：１５〜２０頁）。
【０１５３】
表２と比較。表４に示すように、ハウスキーピング遺伝子の３’ＵＴＲは検査した標的のうちのいくつかを有する。表４の表示は表２に記載したものに従う。したがって、知的能力を媒介する遺伝子間の標的の保存は生理的に有意であり得る。内在性３’ＵＴＲ中の標的の完全なリストはｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇに見つけることができる。表４のそれぞれの細胞において、コンテキスト＋＋パーセンタイルスコアを２つの種（ヒト／マウス）について列挙する。高いスコアは好都合なゲノムコンテキストを有する標的を示す。ＡＣＴＢ、ベータアクチン；ＡＴＦ１、活性化転写因子１；ＤＡＤ１、細胞死に対する防御因子１；ＤＡＲＳ、アスパルチル−ｔＲＮＡ合成酵素；ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ＨＳＰＡ４、熱ショックタンパク質ファミリーＡ（Ｈｓｐ７０）メンバー４；ＭＲＰＬ９、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｌ９；ＰＯＬＲ１Ｃ、ＲＮＡポリメラーゼＩおよびＩＩＩサブユニットＣ；ＰＲＫＡＧ１、プロテインキナーゼＡＭＰ活性化非触媒性サブユニットガンマ１；ＲＰＬ５、リボソームタンパク質Ｌ５。
【０１５４】
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【実施例４】
【０１５５】
ＲＴＴ特異的構築物の開発。
さらなる構築物をＲＴＴに特異的となるように開発し、本明細書中で「ｒｅｇ１」と呼ぶ。この配列中の標的は、脳および脊髄ＲＮＡの高スループットスクリーニングにおいてＭｅＣＰ２発現に相関して上方調節されていることが示されているｍｉＲＮＡに対応する。
【０１５６】
ｒｅｇ１の配列は以下のとおりである。シードマッチに下線が引かれている。１つおきのシードマッチおよびフランキング配列のセクションを斜体で示す。結合部位キー（５’−３’の順序）：ｍｉＲ−４５１ａ、ｌｅｔ−７−５ｐ、ｍｉＲ−６９０。
５’ＡＴＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＡＣＧＧＴＴＣＡＣＡＴＴＣＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＡＧＣＣＴＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＡＴ−３’（配列番号２）
【０１５７】
図１０に示すように、Ｒｅｇ１をＷＴマウスにおいて試験し、ＷＴプルキンエ細胞において厳密に調節された総ＭｅＣＰ２発現が示された。プルキンエ細胞は大槽内注射部位の近くに位置しており、超生理的な導入遺伝子の発現に対して脆弱である。それぞれの核についての補正した総細胞蛍光（抗ＭｅＣＰ２シグナル）を、ｍｙｃ（−）プルキンエ核についての平均ＭｅＣＰ２シグナルのそれに対して正規化した。図１０のパネルＡ中にそれぞれのマウスについて提示した平均は、指定した宿主について定量したすべてのｍｙｃ（＋）核にわたって平均した、正規化したＭｅＣＰ２シグナルを表す。Ｚスタック内の細胞にわたる反復平均化、その後、１匹のマウス内のＺスタックにわたる反復平均化は、同様に総ＭｅＣＰ２発現の有意な減少をもたらした（公開対照ＡＡＶ９／ＭｅＰ４２６−ミニＭＥＣＰ２−ｍｙｃ−ＲＤＨ１ｐＡについて観察されたものに対する、Ｇａｄａｌｌａら、２０１７年）。図１０のパネルＡおよびＢに示すように、形質導入したプルキンエ細胞における平均総ＭｅＣＰ２発現（ミニ＋内在性完全長）は、形質導入していないプルキンエ細胞のものの５×であった。神経ノックダウンの陽性対照パネル（ｍｉＲ−１２４−３ｐの３つの標的を特長とする）は、過剰発現を半分に減少させた（ｐ＝０．０６）。ｒｅｇ１カセットも過剰発現を半分に減少させた（ｐ＝０．０２）。図１０のパネルＣは総ＭｅＣＰ２強度のヒストグラムを示し、これは、ｒｅｇ１が総ＭｅＣＰ２強度の分布を狭めることを例示しており、これはより厳密な調節の指標である。局所形質導入効率は小脳全体にわたって変動するため、形質導入したプルキンエ細胞の平均総ＭｅＣＰ２強度対局所形質導入効率を図１０のパネルＤにプロットし、それぞれのデータ点は、単一Ｚスタック内のプルキンエ細胞の平均強度および形質導入効率を表す。傾向線は１匹のマウスからのＺスタックを結ぶ。ｒｅｇ１カセットは、高い形質導入効率を有する小脳の領域においてさえも、総ＭｅＣＰ２発現を制限した。対照的に、陰性対照パネルは、高い局所形質導入効率を有する領域において、生理的レベルを大幅に上回る総ＭｅＣＰ２発現を許可した。図１０のパネルＥは、ｒｅｇ１カセットがＮｅｕＮ＋細胞において導入遺伝子の発現を許可したことを示す。対照的に、神経ノックダウンの陽性対照はＮｅｕＮ＋細胞のパーセンテージを減少させた。同様に、図１１は、ｒｅｇ１がヘテロ接合性モザイク雌マウスにおけるＡＡＶ９／ミニ−ＭＥＣＰ２−ｒｅｇ１の大槽内投与後に肝臓導入遺伝子の発現を減少させた予備データを示す。
【実施例５】
【０１５８】
一般化したパネル設計戦略および実験研究
図１２は、ＲＴＴ特異的パネル「ｒｅｇ１」および幅広く適用可能なパネル（他の箇所では「ｒｅｇ２」または「ＵＮＩＶＴ」と呼ぶ）を設計するための戦略を要約する。図１２パネルＡは、外因性ＭｅＣＰ２発現をｉｎ  ｖｉｖｏで安全に調節するためのＲＴＴ特異的標的パネルを設計するために元々使用したマイクロＲＮＡ発現データを示す。図１２のパネルＢに示すように、同じ発現データが、ｒｅｇ２を設計する目的ためにＵＴＲデータ組を処理するための選択基準を提供した。図１２パネルＣ〜Ｇに例示したステップを通じて、２４９１個のヒト標的のリストを、ｒｅｇ２の中で現在特長となっている６個の保存的標的まで絞り込んだ。これらの標的のうちの５個は、ＭｅＣＰ２駆動のｍｉＲＮＡと結合することが予測される（表１を参照）。ｌｅｔ−７標的が多くのｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡシードと塩基対合するため、ｒｅｇ２パネルは１１個までのｍｉＲＮＡと結合し得ることが可能である。Ｒｅｇ１および／またはＲｅｇ２に含まれるｍｉＲＮＡシードと結合し得る潜在的なｍｉＲＮＡの非限定的なリストを表５に示す。
【０１５９】
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【０１６０】
ｍｉＲＮＡ発現に対する内在性ＭｅＣＰ２発現、外因性ＭｅＣＰ２発現、ならびに／または総計（内在性および外因性）ＭｅＣＰ２発現との間の相関を同定する。さらに、ＭｅＣＰ２フィードバックループに寄与する場合がある、未だ同定されていないｍｉＲＮＡが存在することが概念的に可能である。ｍｉＲＮＡシードとｍｉＲＮＡ標的パネルとの間のワトソン−クリック（ＷＣ）塩基対合を許可するシード配列を含有する任意のｍｉＲＮＡが、外因性ＭｅＣＰ２の調節の媒介を助け得る。
【０１６１】
ｒｅｇ１のＲＴＴ特異的構築物およびｒｅｇ２の広く幅広く適用可能な構築物の両方を用いてさらなる実験を続行した。図１３は、ｒｅｇ２が、ＰＨＰ．Ｂ媒介性のミニＭＥＣＰ２遺伝子移入後に、ＷＴ脳のｉｎ  ｖｉｖｏにおける導入遺伝子の発現レベルを減少させることを示す。図１４は、代表的な小脳のタイルスキャン内のプルキンエ細胞におけるミニＭｅＣＰ２発現のｒｅｇ２依存性阻害を示す。図１３の左側では、矢印は対照ベクターで処置したマウスのいくつかの小脳葉中のｍｙｃ（＋）プルキンエニューロンを指し示している。ｒｅｇ２で処置したマウスでは、ほとんどのプルキンエ細胞はｍｙｃ（−）であった。図１３の右側では、矢印は前庭小脳領域に限定されたミニＭｅＣＰ２発現を示す。ｒｅｇ２で処置したマウスは、０％ｍｙｃ（＋）または１００％ｍｙｃ（＋）のどちらかであった広幅のプルキンエ細胞層を有していたため（前庭小脳領域に限定）、隣接するｍｙｃ（＋）およびｍｙｃ（−）プルキンエ細胞における総ＭｅＣＰ２発現の定量分析は勧められなかった。
【０１６２】
図１５Ａ〜１５Ｃは、ｒｅｇ２が、複数の脳領域において広範であるが厳密に制御された発現を許可することを示す。多くのｍｙｃ（＋）細胞の抗ｍｙｃ免疫蛍光シグナルは検出限界をかろうじて上回っていたため、ｒｅｇ２で処置したマウスについて示した図１５Ａ中のｍｙｃ（＋）細胞のパーセンテージは、形質導入された細胞の実際のパーセンテージの過小評価であった可能性が最も高い。検査した３つの領域のうち、海馬が％ｍｙｃ（＋）細胞の最も急激な減少を実証した（ｒｅｇ２対対照で処置したマウス）。図１５Ｂは視床、海馬、および髄質の代表的な画像を示す。図１５Ｃは、Ｒｅｇ２が視床における見かけ上の神経向性を増強させたことを示す。図１６は、ｒｅｇ２が肝臓におけるミニＭｅＣＰ２の調節も改善させ得ることを示す。
【０１６３】
図１７に示すように、生理食塩水およびウイルスで処置したＫＯマウスにおいて予備生存研究を行った。マウスに４〜５週齢で大槽内注射した。ｒｅｇ２は導入遺伝子の発現に対して強力な阻害効果を有していたが、ｒｅｇ２はＰＨＰ．Ｂ／ミニＭＥＣＰ２（１Ｅ１１  ｖｇ／マウス）によって媒介される生存期間中央値の延長を減衰させるようには見えなかった。さらに、ｒｅｇ２処置はより少ない早期死亡をもたらした。それぞれのコホート中のまだ生きているマウスの数を示す。表６は、その寿命全体にわたって正常な後肢機能を保持する、処置したＫＯマウスのパーセンテージを示す。調節したベクターで処置したＫＯマウスは、その寿命全体にわたって正常な後肢表現型を保持する可能性がより高い（対未調節のベクター）。
【０１６４】
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【０１６５】
前述の実施例は本発明の例示的なものであり、それを限定するものと解釈されるべきでない。本発明を、好ましい実施形態を参照して詳述したが、以下の特許請求の範囲において記載および定義するように、変形および改変が本発明の範囲および精神内に存在する。
【図１】
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【図２】
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【図２−ＣＯＮＴ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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