(57)【要約】細胞溶解性免疫細胞において発現されると、（１）腫瘍関連抗原をターゲティングするＣＡＲの発現、ならびに（２）一方では自然および抗原特異的細胞溶解性免疫細胞の両方において発現されるＮＫＧ２Ｄを認識し、他方では腫瘍関連抗原をターゲティングする二重特異性抗体の分泌の両方をもたらす単一ベクターが本明細書中に記載される。予想外のことに、Ｔ細胞へのこれらの改変は、インビボにおける増強された生存および増殖をもたらす。したがって、治療および診断用途が開示される。
2021524731.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターであって、
（ａ）癌または腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメイン；（ｂ）ヒンジドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド；ならびに
ＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド
を含む、ベクター。
【請求項２】
前記ＣＡＲが、（ａ）癌または腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメイン；（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記癌または腫瘍ターゲティング抗体が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）および／またはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）、および／またはそれらの各々の等価物をターゲティングする、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
前記二重特異性抗体が、ＮＫＧ２Ｄのリガンドまたは抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよび抗ＳＬＡＭＦ７抗体（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）の抗原結合ドメイン、および／またはそれらの各々の等価物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５】
前記二重特異性抗体が、ＮＫＧ２Ｄに対する抗体のＣＤＲ領域および抗ＳＬＡＭＦ７抗体（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）の抗原結合ドメイン、および／またはそれらの各々の等価物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
前記二重特異性抗体が、ＮＫＧ２Ｄに対する抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびに抗ＳＬＡＭＦ７抗体（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）の抗原結合ドメイン、ならびに／またはそれらの各々の等価物を含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記二重特異性抗体が、ＮＫＧ２Ｄに対する抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）、必要に応じて、抗ＳＡＬＭＦ７抗体（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、および／またはそれらの各々の等価物を含む、請求項５または６に記載のベクター。
【請求項８】
前記ベクターがプラスミドであって、必要に応じて前記ポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーターを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
前記ベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターであって、必要に応じて前記ポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーターを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１１】
原核細胞または真核細胞である、請求項１０に記載の単離された細胞。
【請求項１２】
真核細胞である、請求項１１に記載の単離された細胞。
【請求項１３】
前記真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、マウス細胞、ウマ細胞またはヒト細胞から選択される、請求項１２に記載の単離された。
【請求項１４】
前記真核細胞が、免疫細胞、必要に応じてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球またはマクロファージである、請求項１２または１３に記載の単離された細胞。
【請求項１５】
前記ＣＡＲを発現し、前記二重特異性抗体を分泌する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の単離された細胞。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のベクターおよび／または請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の単離された細胞と、必要に応じて薬学的に許容され得る担体とを含む、組成物。
【請求項１７】
癌または腫瘍抗原を発現する細胞に結合した請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の単離された細胞を含む単離された複合体であって、必要に応じて、前記癌または腫瘍抗原がＮＫＧ２Ｄおよび／またはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）、および／またはそれらの各々の等価物である、単離された複合体。
【請求項１８】
癌もしくは腫瘍抗原またはそのフラグメントに結合した請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の単離された細胞を含む単離された複合体であって、必要に応じて、前記癌または腫瘍抗原がＢＣＭＡまたはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）、および／またはそれらの各々の等価物である、単離された複合体。
【請求項１９】
ＣＡＲ発現細胞を生産する方法であって、単離された細胞に、請求項１〜９のいずれか一項に記載のベクターを形質導入することを含む、方法。
【請求項２０】
前記単離された細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球またはマクロファージからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
癌または腫瘍抗原を発現する癌細胞または腫瘍腫瘍の成長を阻害する方法であって、前記癌細胞または腫瘍を、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の単離された細胞と接触させることを含む、方法。
【請求項２２】
前記接触させることがインビトロまたはインビボである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記接触させることがインビボであり、前記単離された細胞が、処置されている被験体に対して自己または同種（allogeneic）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記接触させることがインビボであり、前記単離された細胞が、処置されている被験体に対して同種（allogenic）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体に、有効量の細胞減少療法または化学療法、または標的抗原の前記発現をアップレギュレーションする治療を投与することをさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞減少療法が、化学療法、凍結療法、温熱療法、標的療法および／または放射線療法を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体が、哺乳動物、イヌ、ネコ、ウマ、マウスまたはヒト患者である、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
本明細書中に開示される組成物と、必要に応じて、使用説明書とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月１６日に出願された米国仮出願第６２／６４４，３４３号（この内容は、参照により本開示に組み込まれる）に基づく米国特許法第１１９（ｄ）項の下での優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、一般に、ヒト免疫学の分野、具体的には、癌免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
本発明の背景の以下の議論は、本発明の技術を補助するためにのみ提供される。
現在の癌処置レジメンは、化学療法、免疫調節薬１４、モノクローナル抗体１５および自己または同種移植を含む。多くの場合、これらの治療は寛解につながるが、ほぼすべての患者は最終的に再発し、疾患の再発により死亡する。したがって、再発性および／または難治性疾患のための新たな併用免疫療法を含む新たな治療に対する満たされていない需要がある。本開示はこれらの制限に対処し、関連する利点も提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Dimopoulos,  M.A.,  et  al.  Daratumumab,  Lenalidomide,  and  Dexamethasone  for  Multiple  Myeloma.  N  Engl  J  Med  375,  1319-1331  (2016).
【非特許文献２】van  de  Donk,  N.W.,  Kamps,  S.,  Mutis,  T.  &  Lokhorst,  H.M.  Monoclonal  antibody-based  therapy  as  a  new  treatment  strategy  in  multiple  myeloma.  Leukemia  26,  199-213  (2012).
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
開示の概要
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方の処置のために診療で成功裏に使用されており、最近、米国ＦＤＡにより承認された１−４。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）も癌処置についてＦＤＡにより承認されており、ＣＡＲＴ細胞療法の代替免疫療法アプローチとして使用されている５。しかしながら、ＣＡＲおよびＢｓＡｂベースの癌免疫療法は依然として、５つの重要な理由により改善を必要とする。第１に、いくつかの場合では、ＣＡＲＴ細胞はインビボで拡大することができず、患者における腫瘍溶解を開始させるために十分な期間生存し得ない６。ＣＡＲＴ細胞の有効性は、インビボにおけるＣＡＲＴ細胞の量および持続期間と相関することが報告されている６−８。第２に、腫瘍細胞は、特に単一の抗原のみがターゲティングされる場合、標的抗原を脱落させて治療を回避し得る。第３に、製造にコストおよび時間がかかることに加えて、ＢｓＡｂは短い半減期を有し、治癒的であることがこれまでに示されていない９、１０。第４に、ＣＡＲＴ細胞と、２つの異なる腫瘍関連抗原をターゲティングするＢｓＡｂとの併用療法は優れたアプローチであり得る；しかしながら、それぞれを個々にエクスビボで生産することは、労働集約的で費用がかかる；単一の構築物内でＣＡＲおよびＢｓＡｂ（このＢｓＡＢは、すべての細胞溶解性エフェクター細胞に係合する）の両方を発現するようにＴ細胞を操作することは未だに、相加的もしくは相乗的であるかまたはインビボでＴ細胞生存を増強することが報告も示されてもいない。最後に、ＣＡＲ免疫療法に対する現在のアプローチは、１つの免疫細胞タイプ、すなわちＴ細胞に主に焦点を当てており、自然および適応免疫系治療群におけるすべての他の細胞溶解性エフェクター細胞を除外する。ＮＫＧ２Ｄは、ｃレクチンタイプの受容体であり、自然および適応免疫系治療群の両方における実質的にすべての細胞溶解性エフェクター細胞上で発現される１１、１２。
【０００６】
本開示は、これらの２つの治療様式を送達する単一のベクターを感染させたＴ細胞を操作すること（すなわち、ＣＡＲが１つの特定の腫瘍関連抗原をターゲティングするＴ細胞を生産することにより）、これらの問題を部分的または完全に解決するプラットフォームを提供する。
【０００７】
したがって、１つの態様において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、（ａ）癌または腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメイン；（ｂ）ヒンジドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；および（ｄ）細胞内ドメインを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書中で提供される。本開示のさらなる態様は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、（ａ）腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメイン；（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
【０００８】
ある特定の実施形態において、腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメインは、リンカーペプチドにより必要に応じて連結された重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、重および／または軽鎖可変領域は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）および／またはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）および／またはそれらの各々の等価物のいずれか１つに対する抗体の関連ＣＤＲ領域を含むかあるいはそれから本質的になるかまたはさらにそれからなる。１つの態様において、腫瘍ターゲティング抗体はＢＣＭＡをターゲティングする。いくつかの実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変領域は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）および／またはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）および／またはそれらの各々の等価物のいずれか１つに対する抗体のアミノ酸配列を含むかあるいはそれから本質的になるかまたはさらにそれからなる。
【０００９】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域との間に配置されたリンカーポリペプチドをさらに含むかあるいはさらにそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。ある特定の実施形態において、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。さらなる実施形態において、リンカーポリペプチドは、配列（グリシン−セリン）ｎ［配列中、ｎは、１〜６の整数である］を含むかあるいはそれから本質的になるかまたはさらにそれからなる。
【００１０】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲへと接合させた検出可能マーカーおよび／または精製マーカーをさらに含むかあるいはさらにそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなる。
【００１１】
本開示のさらなる態様は、上記ＣＡＲをコードする単離された核酸配列またはその相補体またはそれらの各々の等価物に関する。
【００１２】
ある特定の実施形態において、単離された核酸配列は、癌または腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合性ドメインをコードするポリヌクレオチドの上流に配置されたコザックコンセンサス配列をさらに含むかあるいはさらにそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。
【００１３】
ある特定の態様において、単離された核酸は、単離された核酸へと作動可能にカップリングさせた、抗生物質耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むかあるいはそれから本質的になるかまたはさらにそれからなる。
【００１４】
ＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する二重特異性抗体をコードする単離された核酸も提供される。いくつかの実施形態において、核酸は、必要に応じてコドン最適化されたＮＫＧ２Ｄリガンドおよび必要に応じてＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）リガンドを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる二重特異性抗体をコードする。ある特定の実施形態において、単離された核酸は、必要に応じてコドン最適化されたＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の関連ＣＤＲ領域またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる二重特異性抗体をコードする。いくつかの実施形態において、核酸は、必要に応じてコドン最適化されたＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域および／またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる二重特異性抗体をコードする。いくつかの実施形態において、核酸は、必要に応じてコドン最適化されたＮＫＧ２Ｄに対する抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）および必要に応じてＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）および／またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなる二重特異性抗体をコードする。ある特定の実施形態において、単離された核酸は、抗生物質耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドをさらに含むかあるいはそれから本質的になるかまたはさらにそれからなる。
【００１５】
さらなる態様において、１つの構築物において、上記に開示されるＣＡＲおよび二重特異性抗体をコードする単離された核酸（「ＢｓＡｂ−ＣＡＲ構築物」）が本明細書中で提供される。１つの態様において、単離された核酸は、ＢＣＭＡをターゲティングする抗原結合フラグメントおよび二重特異性抗体、例えば、ヒト筋アルドース由来の非免疫原性タンパク質リンカーをコードする核酸により互いに接続された抗ＣＳ１抗体由来の１つのｓｃＦｖおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体由来の１つのｓｃＦｖをコードする。例示的なＢｓＡｂ−ＣＡＲベクターは、図３Ａに示されている。ベクターは、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサーおよびウイルスＬＴＲを必要に応じて含む。
【００１６】
本開示の態様は、上記単離された核酸の１つまたはそれよりも多くを含むベクターに関する。ある特定の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターの群より選択されるプラスミドまたはウイルスベクターである。単離された核酸およびそれらを含有するベクターは、本明細書中に記載されるＣＡＲを調製するために有用である。
【００１７】
本開示のさらなる態様は、上記組成物：ＣＡＲ、ＣＡＲをコードする単離された核酸もしくはその相補体、ＣＡＲ／ＢｓＡ構築物をコードする単離された核酸または単離された核酸を含有するベクターの１つまたはそれよりも多くを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる単離された細胞に関する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、単離された細胞の表面上で発現される。
【００１８】
ある特定の実施形態において、単離された細胞は、必要に応じてＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる単離された核酸をさらに含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄリガンドまたは抗ＮＫＧ２抗体の抗ＮＫＧ２抗原結合フラグメントおよび必要に応じて、ＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）リガンドを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、必要に応じてコドン最適化されたＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の関連軽鎖および重鎖領域またはＣＤＲ領域またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、必要に応じてコドン最適化されたＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域および／またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、必要に応じてコドン最適化されたＮＫＧ２Ｄに対する抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）および必要に応じてＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）および／またはそれらの各々の等価物を含む。ある特定の実施形態において、単離された核酸は、抗生物質耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドをさらに含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。
【００１９】
単離された細胞の非限定的な例は、細菌細胞、例えば大腸菌などの原核細胞、または真核細胞である。いくつかの実施形態において、単離真核細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ科動物細胞、イヌ科動物細胞、マウス細胞、ウマ細胞またはヒト細胞から選択される。さらなる実施形態において、単離された細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、それらの任意のサブセット、または本明細書中に開示される種のいずれかに由来する任意の他の免疫細胞である。
【００２０】
本開示の態様は、上記組成物、例えばＣＡＲ、単離された核酸、細胞またはベクターの１つまたはそれよりも多くと、担体とを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる組成物に関する。
【００２１】
ある特定の実施形態において、組成物は、必要に応じてＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する二重特異性抗体、および／または必要に応じてＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸をさらに含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄリガンドおよび必要に応じてＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）リガンドを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の関連ＣＤＲ領域またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域および／またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄに対する抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）および必要に応じてＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）および／またはそれらの各々の等価物を含む。
【００２２】
本開示の態様は、ＣＡＲまたは癌もしくは腫瘍抗原もしくはそのフラグメントに結合したＣＡＲを含む細胞および／または癌もしくは腫瘍抗原を発現する細胞を含む単離された複合体に関する。１つの態様において、抗原結合ドメインは、細胞の表面上で発現される。別の態様において、癌または腫瘍抗原は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）および／またはそれらの各々の等価物である。１つの態様において、ＣＡＲを含有または発現する細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、それらの任意のサブセット、または任意の他の免疫細胞である。腫瘍または細胞は、任意の動物、例えば哺乳動物、例えばヒト細胞に由来し得る。
【００２３】
本開示のいくつかの態様は、ＣＡＲ発現細胞またはＢｓＡを分泌するＣＡＲ発現細胞を生産する方法であって、単離された細胞に、本明細書中に記載されるＣＡＲおよびＢｓＡをコードする核酸配列、またはＢｓＡｂ−ＣＡＲをコードする単離された核酸を形質導入することを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる方法に関する。
【００２４】
さらなる態様において、前記方法は、ＣＡＲまたはＢｓＡｂ−ＣＡＲを発現する細胞を選択および単離することをさらに含む。さらなる態様において、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、それらの任意のサブセット、または任意の他の免疫細胞である。細胞は、本明細書中に記載されるウイルスベクターを使用して、あるいはＲｉｅｔら、（２０１３）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９６９：１８７−２０１  ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｍｏｄｉｆｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．”に記載されている技術を使用して形質導入され得る。
【００２５】
ある特定の実施形態において、前記方法は、必要に応じてＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる単離された核酸を細胞に形質導入することをさらに含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、それぞれ必要に応じてコドン最適化されたリガンドであるＮＫＧ２Ｄリガンドおよび必要に応じてＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、必要に応じてコドン最適化されたＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の関連ＣＤＲ領域またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、必要に応じてコドン最適化されたＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域および／またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、必要に応じてコドン最適化されたＮＫＧ２Ｄに対する抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）および必要に応じてＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）および／またはそれらの各々の等価物を含む。細胞は、本明細書中に記載されるようにウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを使用して、あるいはＲｉｅｔら、（２０１３）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９６９：１８７−２０１  ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｍｏｄｉｆｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．”に記載されている技術を使用して形質導入され得る。
【００２６】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲまたはＢｓＡｂ−ＣＡＲ発現細胞を生産する方法は、ＣＡＲ発現細胞の集団を活性化および拡大することをさらに含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。本開示のある特定の態様は、ＣＡＲまたはＢｓＡｂ−ＣＡＲを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなる単離された活性化細胞集団に関する。ある特定の実施形態において、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、それらの任意のサブセット、または任意の他の免疫細胞の１つまたはそれよりも多くである。
【００２７】
本開示の態様は、腫瘍を有効量の上記に開示される単離された細胞または組成物と接触させることにより、癌または腫瘍抗原を発現する腫瘍の成長を阻害する方法に関する。接触は、インビトロまたはインビボであり得る。接触がインビトロである場合、前記方法を使用して、患者の腫瘍に対する個別化療法を試験し得るか、または併用療法についてアッセイし得る。接触がインビボである場合、前記方法は、癌を患っているヒト患者など、それを必要とする被験体における腫瘍または癌細胞の成長を阻害するために有用であり、患者は、有効量の細胞を受ける。ある特定の実施形態において、腫瘍は固形腫瘍である。有効量は単独で、または本明細書中に記載されている他の治療と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態において、ターゲティングされる癌／腫瘍は、固形腫瘍、または血液および／もしくは骨髄に影響を及ぼす癌、例えば多発性骨髄腫（ＭＭ）である。ある特定の実施形態において、単離された細胞は、処置される被験体に対して自己のものである。別の態様において、細胞は、処置されている被験体に対して同種である。別の態様において、前記方法は、有効量の細胞減少療法を被験体に投与することをさらに含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。さらなる態様において、前記方法は、被験体に投与すべき細胞を単離する工程と、本明細書中に記載されるＣＡＲまたはＢｓＡｂ−ＣＡＲをコードする有効量の単離された核酸を細胞に形質導入する工程と、細胞を培養して、必要に応じて拡大および活性化されるＣＡＲまたはＢｓＡｂ−ＣＡＲコード細胞集団を得る工程と、次いで、細胞を患者に投与する工程とをさらに含む。
【００２８】
上記組成物の１つまたはそれよりも多くと、本明細書中に開示される方法においてそれらを使用するための説明書とを含むキットも本明細書中に開示される。
【００２９】
上記組成物および方法はユニークであり、それらが、第２の腫瘍関連抗原をターゲティングするＮＫＧ２ＤベースのＢｓＡｂを同時に分泌するＣＡＲ細胞を提供するという点で、最新技術の制限を克服する。開示されるＣＡＲ  ＮＫＧＤ２ＤベースのＢｓＡｂは単なる例示である。このアプローチは、当技術分野で公知であるように、任意の数の腫瘍抗原、例えばＥＧＦＲＶＩＩＩ；ＣＤ７０、メソセリン、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＥＡ、ＣＤ１３３、Ｈｅｒ２について改変され得る。Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、（２０１８）Ｊ．Ｅｘｐ．＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３７：１６３を参照のこと。
【００３０】
多発性骨髄腫モデル（ＭＭ）において、例示的な構築物を試験した。ＭＭは、クローン形質細胞の蓄積を特徴とする悪性腫瘍である１３。上記のように、化学療法、免疫調節薬１４、モノクローナル抗体１５および自己または同種移植を含む現在の処置レジメンは、多くの場合、寛解につながるが、ほぼすべての患者は最終的に再発し、疾患の再発により死亡する。したがって、再発性および／または難治性疾患のための新たな併用免疫療法を含む新たな治療に対する満たされていない需要がある。
【００３１】
自然免疫系の構成要素であるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍成長の防止において重要な役割を果たすが１６、ＮＫ細胞抗腫瘍活性は、多くのＭＭ患者において抑制されることが見出されている１７。活性化または同種ＮＫ細胞の養子移入は、ＭＭ１８、１９および固形腫瘍を含む多くの血液悪性腫瘍の処置において有効な抗腫瘍応答をもたらす。しかしながら、多くの場合では、ＮＫ細胞媒介性抗腫瘍反応は弱く、これは、阻害性受容体のＮＫ細胞発現、生存能力の低下、または腫瘍部位へのエフェクター細胞の遊走の制限に起因し得る２０−２２。一方、適応免疫の一部として、Ｔ細胞は様々な組織に効率的に遊走し、抗原刺激に反応してよく増殖する傾向があり得る。しかしながら、Ｔ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により決定される厳密な特異性を有する。したがって、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方を従事させて、それら自身の制限を克服するための方法は、癌免疫療法にとって非常に有益なものである。本開示は、この利益を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１二重特異性融合タンパク質を個々にまたは組み合わせて発現するようにＴ細胞を操作した結果を示す。（Ａ）ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータ（ζ）エンドドメインに連結されたＢＣＭＡに対するｓｃＦｖを含有するＢＣＭＡ  ＣＡＲレンチウイルス構築物の概略図。ＥＦ１アルファ（α）プロモーターにより駆動されるＧＦＰ発現により、導入遺伝子の発現を追跡した。ＬＴＲ、長い末端リピート；ＳＰ、シグナルペプチド；ＶＨ、可変Ｈ鎖；Ｌ、リンカー；ＶＬ、可変Ｌ鎖。ＭｙＣ、ＭｙＣタグ；ヒンジ、ヒンジ鎖；ＣＤ２８、Ｔ細胞共刺激分子；ＣＤ３ζ、ＣＤ３ゼータ鎖。（Ｂ）抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の哺乳動物発現のためのレンチウイルス構築物の概略図。抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂは、リンカー（Ｌ）により互いに連結されたＶＨおよびＶＬから構成される抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖと、抗ＣＳ１  ｓｃＦｖとからなっていた。ＢｓＡｂの発現は、レンチウイルスＬＴＲが隣接するＣＭＶプロモーターにより駆動される。（Ｃ）ＣＤ３およびＣＤ２８ビーズで健常ドナー由来のＰＢＭＣ（末梢血単核球）を活性化し、ｐＣＤＨ空ベクター（ＥＶ）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂを形質導入した。また、ＢｓＡｂおよびＢＣＭＡ−ＣＡＲを活性化Ｔ細胞に連続して形質導入し、これらの形質導入細胞を「ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ」と命名した。ＧＦＰ陽性細胞を選別し、ビオチン標識ヤギ抗マウスＦａｂ特異的またはアイソタイプマッチ対照抗体で細胞を染色し、続いて、ストレプトアビジンおよびＣＤ３抗体で染色した。（Ｄ）未改変Ｔ細胞、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞またはＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞の上清を収集し、個々の細胞溶解物を、抗６×Ｈｉｓタグ抗体を用いたイムノブロット分析に供した。
【００３３】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜２Ｅは、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞が、反応でＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞またはＢｓＡｂ  Ｔ細胞よりも高い細胞毒性およびＩＦＮ−ガンマ（γ）産生能力を有することを示す。（Ａ）ＭＭ細胞株の表面上のＢＣＭＡおよびＣＳ１発現のフローサイトメトリー分析。３つのＭＭ細胞株（ＭＭ１．Ｓ、Ｈ９２９およびＲＰＭＩ−８２２６）および１つの慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２）を、抗ＣＳ１  ｍＡｂ抗体（上パネル）または抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ（下パネル）で染色し、異なる色を使用して、３つのＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（緑色）、Ｈ９２９（赤色）およびＲＰＭＩ−８２２６（灰色）ならびにＫ５６２細胞株（青色）またはアイソタイプマッチ対照抗体（黒色実線および白色領域）を区別した。（Ｂ）５１Ｃｒ標識ＭＭ１．Ｓ、Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６ＭＭ細胞株およびＫ５６２細胞株（各細胞株について５×１０３個）を、示されているＥ：Ｔ比で未改変Ｔ細胞（Ｔ、黒色実線）、空ベクター形質導入Ｔ細胞（ＥＶＴ、黒色点線）、抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂを発現するＴ細胞（ＢｓＡｂ  Ｔ、赤色実線）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ、緑色実線）およびＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞（青色実線）と共に４時間共培養し、標的溶解（５１Ｃｒ放出）を測定した。ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ対ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ対ＢｓＡｂ  Ｔ、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１。ＢＣＭＡ−ＣＳ１−陰性対照としてのＫ５６２細胞。（Ｃ）未改変Ｔ細胞（白色四角）、ＥＶＴ細胞（灰色網掛四角）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（赤色四角）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞（緑色四角）またはＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞（青色四角）２×１０５個を単独で培養し（標的なし）、または異なるレベルのＣＳ１およびＢＣＭＡを発現する同数のＭＭ．１Ｓ、Ｈ９２９もしくはＲＰＭＩ−８２２６ＭＭ細胞もしくはＢＣＭＡ−ＣＳ１−Ｋ５６２細胞で２４時間刺激し、上清を収集して、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ分泌を測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし。（ＤおよびＥ）（ｃ）に記載されているように細胞を処理し、無細胞上清中のＩＬ−２またはＴＮＦ−アルファ（α）分泌をそれぞれＥＬＩＳＡにより決定した。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし。
【図２Ｃ−Ｅ】図２Ａ〜２Ｅは、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞が、反応でＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞またはＢｓＡｂ  Ｔ細胞よりも高い細胞毒性およびＩＦＮ−ガンマ（γ）産生能力を有することを示す。（Ａ）ＭＭ細胞株の表面上のＢＣＭＡおよびＣＳ１発現のフローサイトメトリー分析。３つのＭＭ細胞株（ＭＭ１．Ｓ、Ｈ９２９およびＲＰＭＩ−８２２６）および１つの慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２）を、抗ＣＳ１  ｍＡｂ抗体（上パネル）または抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ（下パネル）で染色し、異なる色を使用して、３つのＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（緑色）、Ｈ９２９（赤色）およびＲＰＭＩ−８２２６（灰色）ならびにＫ５６２細胞株（青色）またはアイソタイプマッチ対照抗体（黒色実線および白色領域）を区別した。（Ｂ）５１Ｃｒ標識ＭＭ１．Ｓ、Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６ＭＭ細胞株およびＫ５６２細胞株（各細胞株について５×１０３個）を、示されているＥ：Ｔ比で未改変Ｔ細胞（Ｔ、黒色実線）、空ベクター形質導入Ｔ細胞（ＥＶＴ、黒色点線）、抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂを発現するＴ細胞（ＢｓＡｂ  Ｔ、赤色実線）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ、緑色実線）およびＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞（青色実線）と共に４時間共培養し、標的溶解（５１Ｃｒ放出）を測定した。ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ対ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ対ＢｓＡｂ  Ｔ、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１。ＢＣＭＡ−ＣＳ１−陰性対照としてのＫ５６２細胞。（Ｃ）未改変Ｔ細胞（白色四角）、ＥＶＴ細胞（灰色網掛四角）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（赤色四角）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞（緑色四角）またはＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞（青色四角）２×１０５個を単独で培養し（標的なし）、または異なるレベルのＣＳ１およびＢＣＭＡを発現する同数のＭＭ．１Ｓ、Ｈ９２９もしくはＲＰＭＩ−８２２６ＭＭ細胞もしくはＢＣＭＡ−ＣＳ１−Ｋ５６２細胞で２４時間刺激し、上清を収集して、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ分泌を測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし。（ＤおよびＥ）（ｃ）に記載されているように細胞を処理し、無細胞上清中のＩＬ−２またはＴＮＦ−アルファ（α）分泌をそれぞれＥＬＩＳＡにより決定した。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし。
【００３４】
【図３Ａ−Ｆ】図３Ａ〜３Ｈは、同じ構築物におけるＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の両方を含有するＢｓＡｂ−ＣＡＲベクターの生成、ならびにこの構築物を形質導入したＴ細胞の機能検査を示す。（Ａ）ＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂ（以下ＢｓＡｂ−ＣＡＲと称される）の両方を発現する生成したレンチウイルスベクターの概略図。Ｔ２Ａ、自己切断２Ａ遺伝子。（Ｂ）空ベクター（ＥＶ）形質転換Ｔ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の上清および細胞溶解物を、抗６×Ｈｉｓ−タグ抗体を用いたイムノブロット分析に供した。（Ｃ）５１Ｃｒ標識ＭＭ１．Ｓ細胞（５×１０３個）を、示されているＥ：Ｔ比で未改変Ｔ細胞（Ｔ、黒色実線）、空ベクター形質導入Ｔ細胞（ＥＶＴ、黒色点線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色線）と共に４時間共培養し、標的溶解（５１Ｃｒ放出）を測定した。（Ｄ）示されているＥ：Ｔ比で、健常ドナーから単離した未改変−（黒色実線）、ＥＶ−（黒色点線）、ＢｓＡｂ−（赤色線）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−（緑色実線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲ（紫色実線）形質導入ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を、５１Ｃｒ標識ＭＭ１．ＳＭＭ細胞（５×１０３個）と共に４時間共培養し、標的溶解（５１Ｃｒ放出）を測定した。（Ｅ）１０：１のＥ：Ｔ比のＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞を用いた４時間５１Ｃｒ放出アッセイ。異なる量の正常（未感染）ヒトＰＢＭＣの存在下でこの抗腫瘍効果を評価するために、１倍、１０倍、１００倍および２００倍の量のＭＭ．１Ｓ  ＭＭ標的細胞でＰＢＭＣを添加した。（Ｆ）５：１のＥ：Ｔ比におけるＭＭ．１Ｓ  ＭＭ標的細胞に対する未改変Ｔ細胞（黒色四角）、ＥＶＴ細胞（パターン四角）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（赤色四角）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞（緑色四角）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色正方形）の５１放出アッセイ。図に示されているように、エフェクター細胞およびＭＭ．１Ｓ  ＭＭ標的細胞のインキュベーション時間は、ＰＢＭＣ、ＮＫおよびＮＫＴ細胞（左パネル）については４時間であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞については１６時間である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし。（Ｇ）１時間後のＥＶＴ細胞（ＧＦＰ、緑色）およびＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞（赤色）の共培養の制御、シナプスの共焦点顕微鏡分析を決定した（スケール１０μＬ、上パネル；スケール２０μＬ）、下パネル）；下パネルに示されているより高出力においてさえ、シナプスは認められない。（Ｈ）ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（Ｅ：ＧＦＰ、緑色）およびＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞（Ｔ：赤色）の１時間の共培養；すべてのフレームにおいて、Ｅ／Ｔシナプスが観察され、矢印により示した（Ｓ１は、Ｓ２およびＳ３のように、左から右に移動する各フレームにおける同じコンジュゲートＥ／Ｔペアを示す）。左上のフレームは明視野を示す（Ｂｆ、スケール１０μＬ）；上中央フレームは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（ＧＦＰ、緑色）およびＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞（赤色）共培養の免疫蛍光画像を示す（スケール１０μＬ）。右上フレームは、ＢｓＡｂを識別するさらなる６×−Ｈｉｓタグを用いた重ね合わせ画像である（青色、スケ���ル１０μＬ）。下の３つの行は、拡大視野（スケール２０μＬ）で視覚化された３つの個々のＥ／Ｔコンジュゲート（Ｓ１、Ｓ２およびＳ３）を示す。
【図３Ｇ−Ｈ】図３Ａ〜３Ｈは、同じ構築物におけるＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の両方を含有するＢｓＡｂ−ＣＡＲベクターの生成、ならびにこの構築物を形質導入したＴ細胞の機能検査を示す。（Ａ）ＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂ（以下ＢｓＡｂ−ＣＡＲと称される）の両方を発現する生成したレンチウイルスベクターの概略図。Ｔ２Ａ、自己切断２Ａ遺伝子。（Ｂ）空ベクター（ＥＶ）形質転換Ｔ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の上清および細胞溶解物を、抗６×Ｈｉｓ−タグ抗体を用いたイムノブロット分析に供した。（Ｃ）５１Ｃｒ標識ＭＭ１．Ｓ細胞（５×１０３個）を、示されているＥ：Ｔ比で未改変Ｔ細胞（Ｔ、黒色実線）、空ベクター形質導入Ｔ細胞（ＥＶＴ、黒色点線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色線）と共に４時間共培養し、標的溶解（５１Ｃｒ放出）を測定した。（Ｄ）示されているＥ：Ｔ比で、健常ドナーから単離した未改変−（黒色実線）、ＥＶ−（黒色点線）、ＢｓＡｂ−（赤色線）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−（緑色実線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲ（紫色実線）形質導入ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を、５１Ｃｒ標識ＭＭ１．ＳＭＭ細胞（５×１０３個）と共に４時間共培養し、標的溶解（５１Ｃｒ放出）を測定した。（Ｅ）１０：１のＥ：Ｔ比のＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞を用いた４時間５１Ｃｒ放出アッセイ。異なる量の正常（未感染）ヒトＰＢＭＣの存在下でこの抗腫瘍効果を評価するために、１倍、１０倍、１００倍および２００倍の量のＭＭ．１Ｓ  ＭＭ標的細胞でＰＢＭＣを添加した。（Ｆ）５：１のＥ：Ｔ比におけるＭＭ．１Ｓ  ＭＭ標的細胞に対する未改変Ｔ細胞（黒色四角）、ＥＶＴ細胞（パターン四角）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（赤色四角）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞（緑色四角）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色正方形）の５１放出アッセイ。図に示されているように、エフェクター細胞およびＭＭ．１Ｓ  ＭＭ標的細胞のインキュベーション時間は、ＰＢＭＣ、ＮＫおよびＮＫＴ細胞（左パネル）については４時間であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞については１６時間である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし。（Ｇ）１時間後のＥＶＴ細胞（ＧＦＰ、緑色）およびＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞（赤色）の共培養の制御、シナプスの共焦点顕微鏡分析を決定した（スケール１０μＬ、上パネル；スケール２０μＬ）、下パネル）；下パネルに示されているより高出力においてさえ、シナプスは認められない。（Ｈ）ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（Ｅ：ＧＦＰ、緑色）およびＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞（Ｔ：赤色）の１時間の共培養；すべてのフレームにおいて、Ｅ／Ｔシナプスが観察され、矢印により示した（Ｓ１は、Ｓ２およびＳ３のように、左から右に移動する各フレームにおける同じコンジュゲートＥ／Ｔペアを示す）。左上のフレームは明視野を示す（Ｂｆ、スケール１０μＬ）；上中央フレームは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（ＧＦＰ、緑色）およびＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞（赤色）共培養の免疫蛍光画像を示す（スケール１０μＬ）。右上フレームは、ＢｓＡｂを識別するさらなる６×−Ｈｉｓタグを用いた重ね合わせ画像である（青色、スケ���ル１０μＬ）。下の３つの行は、拡大視野（スケール２０μＬ）で視覚化された３つの個々のＥ／Ｔコンジュゲート（Ｓ１、Ｓ２およびＳ３）を示す。
【００３５】
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、Ｋ５６２細胞におけるＢＣＭＡおよびＣＳ１の過剰発現が、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞による認識後に、細胞毒性およびサイトカイン分泌の増強をトリガーすることを示す。（Ａ）ＣＳ１（左パネル）またはＢＣＭＡ（右パネル）またはＩｇＧアイソタイプ対照（各パネルにおける黒色点線）抗体で細胞を染色した後の、ＣＳ１およびＢＣＭＡを過剰発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＣＳ１−ＢＣＭＡ、灰色網掛）または空ベクター対照（Ｋ５６２−ＰＣＤＨ、黒色実線）のフローサイトメトリー分析。（Ｂ）４時間５１Ｃｒ放出アッセイにより決定した、Ｋ５６２−ＣＳ１−ＢＣＭＡおよびＫ５６２−ＰＣＤＨ細胞に対する空ベクター（ＥＶ）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の細胞毒性。Ｋ５６２−ＣＳ１−ＢＣＭＡまたはＫ５６２−ＰＣＤＨ細胞を、示されているＥ：Ｔ比でＥＶＴ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞と共にインキュベートした。＊＊ｐ＜０．０１（Ｋ５６２−ＣＳ１−ＢＣＭＡ＋ＢｓＡｂ  Ｔ細胞対．Ｋ５６２−ＰＣＤＨ＋ＢｓＡｂ  Ｔ細胞）。（Ｃ）ＥＶＴ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（１×１０５個）を単独で培養し、または同数のＫ５６２−ＣＳ１−ＢＣＭＡもしくはＫ５６２−ＰＣＤＨ細胞で刺激した。培養物由来の上清を使用して、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ分泌を決定した。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）（Ｃ）のように細胞を処理し、無細胞上清中のＩＬ−２分泌をＥＬＩＳＡにより決定した。＊＊ｐ＜０．０１。
【００３６】
【図５Ａ−Ｄ】図５Ａ〜５Ｅは、分泌抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂが、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を介してＣＡＲＴ細胞増殖を増強することを示す。（Ａ）未改変Ｔ細胞（１）、２−ＥＶＴ細胞（２）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（３）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞（４）、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（５）またはナイーブＴ細胞（６）（非増殖対照）の培養後の中間色を、上パネルに表示した。棒グラフは、各群について６つの個々のサンプルを含む総細胞数の統計分析を提供する。＊＊ｐ＜０．０１（群５対群１、２、４および群３対群１、２、４）。Ｔ細胞増殖またはその欠如を記録するために、ｖｉｏｌｅｔセルトラッカーを使用し、下パネルにおけるヒストグラムにより表示されるＶ４５０希釈として示した。（Ｂ）それぞれ１＋、２＋、４＋または１、２、４として表される、（Ａ）からのＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の無細胞上清の存在下または非存在下における未改変Ｔ細胞、ＥＶＴ細胞およびＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞の５日齢培養培地。細胞を列挙し、データを棒グラフとして示した（上）。＊＊ｐ＜０．０１（４＋対４、２＋対２、１＋対１）。ｖｉｏｌｅｔセルトラッカーを、下パネルにおけるヒストグラムにより表示されるＶ４５０希釈として示した（下）。（Ｃ）２日齢培養培地が示されている。１Ａ−未改変Ｔ細胞、２Ａ−ＥＶＴ細胞、３Ａ−ＢｓＡｂ  Ｔ細胞、４Ａ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞および５Ａ−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞。０日目に、ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）を１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂの培養物に添加し、非反応性アイソタイプ対照抗体（２０μｇ／ｍＬ）を１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａに添加した）。これらのウェルの下に、ＣＤ３、ＮＫＧ２Ｄ、Ｆ（ａｂ）２（ＣＡＲの発現を示す「Ｆａｂ」により示される）および細胞増殖を測定するためのＫｉ６７のフローサイトメトリー染色がある。（Ｄ）イムノブロット分析を実施して、ＡＫＴタンパク質のリン酸化（ｐ）ならびに１Ａ−−−未改変Ｔ、２Ａ−−−ＥＶＴ、３Ａ−−−ＢｓＡｂ  Ｔ、４Ａ−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴおよび５Ａ−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴおよび１Ｂ−未改変Ｔ細胞＋ＮＫＧ２Ｄ遮断、２Ａ−−−ＥＶＴ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断、３Ａ−−−ＢｓＡｂ−Ｔ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断、４Ａ−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断および５Ａ−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断の総ＡＫＴタンパク質を決定した。（Ｅ）また、（Ｃ）に示されているのと同じ細胞（１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａ）をＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞と共に４８時間共培養した。細胞増殖を評価するためのフローサイトメトリー分析を、（Ｃ）における上記のように実施した。
【図５Ｅ−１】図５Ａ〜５Ｅは、分泌抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂが、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を介してＣＡＲＴ細胞増殖を増強することを示す。（Ａ）未改変Ｔ細胞（１）、２−ＥＶＴ細胞（２）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（３）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞（４）、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（５）またはナイーブＴ細胞（６）（非増殖対照）の培養後の中間色を、上パネルに表示した。棒グラフは、各群について６つの個々のサンプルを含む総細胞数の統計分析を提供する。＊＊ｐ＜０．０１（群５対群１、２、４および群３対群１、２、４）。Ｔ細胞増殖またはその欠如を記録するために、ｖｉｏｌｅｔセルトラッカーを使用し、下パネルにおけるヒストグラムにより表示されるＶ４５０希釈として示した。（Ｂ）それぞれ１＋、２＋、４＋または１、２、４として表される、（Ａ）からのＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の無細胞上清の存在下または非存在下における未改変Ｔ細胞、ＥＶＴ細胞およびＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞の５日齢培養培地。細胞を列挙し、データを棒グラフとして示した（上）。＊＊ｐ＜０．０１（４＋対４、２＋対２、１＋対１）。ｖｉｏｌｅｔセルトラッカーを、下パネルにおけるヒストグラムにより表示されるＶ４５０希釈として示した（下）。（Ｃ）２日齢培養培地が示されている。１Ａ−未改変Ｔ細胞、２Ａ−ＥＶＴ細胞、３Ａ−ＢｓＡｂ  Ｔ細胞、４Ａ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞および５Ａ−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞。０日目に、ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）を１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂの培養物に添加し、非反応性アイソタイプ対照抗体（２０μｇ／ｍＬ）を１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａに添加した）。これらのウェルの下に、ＣＤ３、ＮＫＧ２Ｄ、Ｆ（ａｂ）２（ＣＡＲの発現を示す「Ｆａｂ」により示される）および細胞増殖を測定するためのＫｉ６７のフローサイトメトリー染色がある。（Ｄ）イムノブロット分析を実施して、ＡＫＴタンパク質のリン酸化（ｐ）ならびに１Ａ−−−未改変Ｔ、２Ａ−−−ＥＶＴ、３Ａ−−−ＢｓＡｂ  Ｔ、４Ａ−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴおよび５Ａ−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴおよび１Ｂ−未改変Ｔ細胞＋ＮＫＧ２Ｄ遮断、２Ａ−−−ＥＶＴ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断、３Ａ−−−ＢｓＡｂ−Ｔ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断、４Ａ−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断および５Ａ−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断の総ＡＫＴタンパク質を決定した。（Ｅ）また、（Ｃ）に示されているのと同じ細胞（１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａ）をＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞と共に４８時間共培養した。細胞増殖を評価するためのフローサイトメトリー分析を、（Ｃ）における上記のように実施した。
【図５Ｅ−２】図５Ａ〜５Ｅは、分泌抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂが、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を介してＣＡＲＴ細胞増殖を増強することを示す。（Ａ）未改変Ｔ細胞（１）、２−ＥＶＴ細胞（２）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（３）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞（４）、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（５）またはナイーブＴ細胞（６）（非増殖対照）の培養後の中間色を、上パネルに表示した。棒グラフは、各群について６つの個々のサンプルを含む総細胞数の統計分析を提供する。＊＊ｐ＜０．０１（群５対群１、２、４および群３対群１、２、４）。Ｔ細胞増殖またはその欠如を記録するために、ｖｉｏｌｅｔセルトラッカーを使用し、下パネルにおけるヒストグラムにより表示されるＶ４５０希釈として示した。（Ｂ）それぞれ１＋、２＋、４＋または１、２、４として表される、（Ａ）からのＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の無細胞上清の存在下または非存在下における未改変Ｔ細胞、ＥＶＴ細胞およびＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞の５日齢培養培地。細胞を列挙し、データを棒グラフとして示した（上）。＊＊ｐ＜０．０１（４＋対４、２＋対２、１＋対１）。ｖｉｏｌｅｔセルトラッカーを、下パネルにおけるヒストグラムにより表示されるＶ４５０希釈として示した（下）。（Ｃ）２日齢培養培地が示されている。１Ａ−未改変Ｔ細胞、２Ａ−ＥＶＴ細胞、３Ａ−ＢｓＡｂ  Ｔ細胞、４Ａ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞および５Ａ−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞。０日目に、ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）を１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂの培養物に添加し、非反応性アイソタイプ対照抗体（２０μｇ／ｍＬ）を１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａに添加した）。これらのウェルの下に、ＣＤ３、ＮＫＧ２Ｄ、Ｆ（ａｂ）２（ＣＡＲの発現を示す「Ｆａｂ」により示される）および細胞増殖を測定するためのＫｉ６７のフローサイトメトリー染色がある。（Ｄ）イムノブロット分析を実施して、ＡＫＴタンパク質のリン酸化（ｐ）ならびに１Ａ−−−未改変Ｔ、２Ａ−−−ＥＶＴ、３Ａ−−−ＢｓＡｂ  Ｔ、４Ａ−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴおよび５Ａ−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴおよび１Ｂ−未改変Ｔ細胞＋ＮＫＧ２Ｄ遮断、２Ａ−−−ＥＶＴ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断、３Ａ−−−ＢｓＡｂ−Ｔ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断、４Ａ−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断および５Ａ−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ＋ＮＫＧ２Ｄ遮断の総ＡＫＴタンパク質を決定した。（Ｅ）また、（Ｃ）に示されているのと同じ細胞（１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａ）をＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞と共に４８時間共培養した。細胞増殖を評価するためのフローサイトメトリー分析を、（Ｃ）における上記のように実施した。
【００３７】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、分泌抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂが、インビトロでＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を介してＣＡＲＴ細胞生存を増強することを示す。（Ａ）１−−−Ｕｎ．（未改変）Ｔ＋ＩＬ−２、２−−−ＥＶＴ＋ＩＬ−２、３−−−ＢｓＡｂ  Ｔ＋ＩＬ−２、４−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ＋ＩＬ−２、５−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ＋ＩＬ−２の５日齢培養培地を表示した。ＣＤ３（１列目）、Ｆ（ａｂ）２（２列目）、および細胞増殖を観察するためのＫｉ６７（３列目）、および細胞生存を観察するためのアネキシンＶ／Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（４列目）のフローサイトメトリー染色。（Ｂ）１−−−未改変Ｔ、２−−−ＥＶＴ、３−−−ＢｓＡｂ  Ｔ、４−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴおよび５−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴの５日齢培養培地（ＩＬ−２なし）を上パネルに示した。ＣＤ３（１列目）、および細胞増殖を検出するためのＫｉ６７（２列目）、細胞生存を検出するために含めたアネキシンＶ／Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（３列目）のフローサイトメトリー染色。（Ｃ）ＣＤ３、Ｋｉ６７増殖細胞、アネキシンＶ（−）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）生細胞、アネキシンＶ（＋）アポトーシス細胞およびアネキシンＶ（＋）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（＋）死細胞の割合の統計分析を示した。多重ｔ検定、各群の比較。＊＊ｐ＜０．０１。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、分泌抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂが、インビトロでＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を介してＣＡＲＴ細胞生存を増強することを示す。（Ａ）１−−−Ｕｎ．（未改変）Ｔ＋ＩＬ−２、２−−−ＥＶＴ＋ＩＬ−２、３−−−ＢｓＡｂ  Ｔ＋ＩＬ−２、４−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ＋ＩＬ−２、５−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ＋ＩＬ−２の５日齢培養培地を表示した。ＣＤ３（１列目）、Ｆ（ａｂ）２（２列目）、および細胞増殖を観察するためのＫｉ６７（３列目）、および細胞生存を観察するためのアネキシンＶ／Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（４列目）のフローサイトメトリー染色。（Ｂ）１−−−未改変Ｔ、２−−−ＥＶＴ、３−−−ＢｓＡｂ  Ｔ、４−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴおよび５−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴの５日齢培養培地（ＩＬ−２なし）を上パネルに示した。ＣＤ３（１列目）、および細胞増殖を検出するためのＫｉ６７（２列目）、細胞生存を検出するために含めたアネキシンＶ／Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（３列目）のフローサイトメトリー染色。（Ｃ）ＣＤ３、Ｋｉ６７増殖細胞、アネキシンＶ（−）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）生細胞、アネキシンＶ（＋）アポトーシス細胞およびアネキシンＶ（＋）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（＋）死細胞の割合の統計分析を示した。多重ｔ検定、各群の比較。＊＊ｐ＜０．０１。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、分泌抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂが、インビトロでＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を介してＣＡＲＴ細胞生存を増強することを示す。（Ａ）１−−−Ｕｎ．（未改変）Ｔ＋ＩＬ−２、２−−−ＥＶＴ＋ＩＬ−２、３−−−ＢｓＡｂ  Ｔ＋ＩＬ−２、４−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ＋ＩＬ−２、５−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ＋ＩＬ−２の５日齢培養培地を表示した。ＣＤ３（１列目）、Ｆ（ａｂ）２（２列目）、および細胞増殖を観察するためのＫｉ６７（３列目）、および細胞生存を観察するためのアネキシンＶ／Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（４列目）のフローサイトメトリー染色。（Ｂ）１−−−未改変Ｔ、２−−−ＥＶＴ、３−−−ＢｓＡｂ  Ｔ、４−−−ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴおよび５−−−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴの５日齢培養培地（ＩＬ−２なし）を上パネルに示した。ＣＤ３（１列目）、および細胞増殖を検出するためのＫｉ６７（２列目）、細胞生存を検出するために含めたアネキシンＶ／Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（３列目）のフローサイトメトリー染色。（Ｃ）ＣＤ３、Ｋｉ６７増殖細胞、アネキシンＶ（−）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）生細胞、アネキシンＶ（＋）アポトーシス細胞およびアネキシンＶ（＋）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（＋）死細胞の割合の統計分析を示した。多重ｔ検定、各群の比較。＊＊ｐ＜０．０１。
【００３８】
【図７Ａ−１】図７Ａ〜７Ｄは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲ形質導入−Ｔ細胞が、インビボでＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞および対照Ｔ細胞よりも良好な増殖および生存能力を有することを示す。（Ａ）免疫不全ＮＳＧマウスへの未改変Ｔ細胞、ＥＶＴ細胞、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の静脈内注射の設計（ａ、上）。３Ｄヒストグラム（下パネル、１列目）は、注射したヒトＣＤ３Ｔ細胞の割合を示す。青色ヒストグラムは、−１日目にＴ細胞注射されなかったマウスのものであり、オレンジ色ヒストグラムは、Ｔ細胞注射１日後を表し、黒色ヒストグラムは、Ｔ細胞注射１４日後を表す（赤色矢印は、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ群を示す）。輪郭線は、ＣＤ６９の発現を示す（オレンジ色は、静脈内注射後１日のものであり、黒色は、静脈内注射後１４日のものである）。紫色ヒストグラム（４列目）は、静脈内３５日後の注射ＣＤ３Ｔ細胞の割合を示す。紫色輪郭線は、細胞増殖を明らかにするための４つの群のＫｉ６７およびＣＤ６９染色の組み合わせである。赤色輪郭線は、細胞アポトーシスおよび細胞死を明らかにするためのＳｙｔｏｘ  ＢｌｕｅおよびアネキシンＶ染色の組み合わせである。Ｓ−／Ａ−は、Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）／アネキシンＶ（−）を示し、Ｓ−／Ａ＋は、Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ−／アネキシンＶ＋を示し、Ｓ＋／Ａ＋は、Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ＋／アネキシンＶ＋を示す。（Ｂ、Ｃ）（Ａ）に示されているヒトＣＤ３＋（Ｂ）およびＣＤ６９＋（Ｃ）細胞の統計分析。未改変Ｔ（白抜き四角）、ＥＶＴ（パターン塗潰し四角）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ（灰色網掛四角）およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ（黒色四角）。多重検定、各群の比較。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし、ｎ＝マウス５匹／群。（Ｄ）Ｋｉ６７＋ＣＤ６９＋増殖細胞、アネキシンＶ（−）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）生細胞、アネキシンＶ（＋）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）アポトーシス細胞およびアネキシンＶ（＋）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（＋）死細胞の割合の統計分析。多重検定、各群の比較。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし、ｎ＝５／群。
【図７Ａ−２】図７Ａ〜７Ｄは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲ形質導入−Ｔ細胞が、インビボでＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞および対照Ｔ細胞よりも良好な増殖および生存能力を有することを示す。（Ａ）免疫不全ＮＳＧマウスへの未改変Ｔ細胞、ＥＶＴ細胞、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の静脈内注射の設計（ａ、上）。３Ｄヒストグラム（下パネル、１列目）は、注射したヒトＣＤ３Ｔ細胞の割合を示す。青色ヒストグラムは、−１日目にＴ細胞注射されなかったマウスのものであり、オレンジ色ヒストグラムは、Ｔ細胞注射１日後を表し、黒色ヒストグラムは、Ｔ細胞注射１４日後を表す（赤色矢印は、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ群を示す）。輪郭線は、ＣＤ６９の発現を示す（オレンジ色は、静脈内注射後１日のものであり、黒色は、静脈内注射後１４日のものである）。紫色ヒストグラム（４列目）は、静脈内３５日後の注射ＣＤ３Ｔ細胞の割合を示す。紫色輪郭線は、細胞増殖を明らかにするための４つの群のＫｉ６７およびＣＤ６９染色の組み合わせである。赤色輪郭線は、細胞アポトーシスおよび細胞死を明らかにするためのＳｙｔｏｘ  ＢｌｕｅおよびアネキシンＶ染色の組み合わせである。Ｓ−／Ａ−は、Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）／アネキシンＶ（−）を示し、Ｓ−／Ａ＋は、Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ−／アネキシンＶ＋を示し、Ｓ＋／Ａ＋は、Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ＋／アネキシンＶ＋を示す。（Ｂ、Ｃ）（Ａ）に示されているヒトＣＤ３＋（Ｂ）およびＣＤ６９＋（Ｃ）細胞の統計分析。未改変Ｔ（白抜き四角）、ＥＶＴ（パターン塗潰し四角）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ（灰色網掛四角）およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ（黒色四角）。多重検定、各群の比較。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし、ｎ＝マウス５匹／群。（Ｄ）Ｋｉ６７＋ＣＤ６９＋増殖細胞、アネキシンＶ（−）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）生細胞、アネキシンＶ（＋）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）アポトーシス細胞およびアネキシンＶ（＋）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（＋）死細胞の割合の統計分析。多重検定、各群の比較。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし、ｎ＝５／群。
【図７Ｂ−Ｄ】図７Ａ〜７Ｄは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲ形質導入−Ｔ細胞が、インビボでＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞および対照Ｔ細胞よりも良好な増殖および生存能力を有することを示す。（Ａ）免疫不全ＮＳＧマウスへの未改変Ｔ細胞、ＥＶＴ細胞、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の静脈内注射の設計（ａ、上）。３Ｄヒストグラム（下パネル、１列目）は、注射したヒトＣＤ３Ｔ細胞の割合を示す。青色ヒストグラムは、−１日目にＴ細胞注射されなかったマウスのものであり、オレンジ色ヒストグラムは、Ｔ細胞注射１日後を表し、黒色ヒストグラムは、Ｔ細胞注射１４日後を表す（赤色矢印は、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ群を示す）。輪郭線は、ＣＤ６９の発現を示す（オレンジ色は、静脈内注射後１日のものであり、黒色は、静脈内注射後１４日のものである）。紫色ヒストグラム（４列目）は、静脈内３５日後の注射ＣＤ３Ｔ細胞の割合を示す。紫色輪郭線は、細胞増殖を明らかにするための４つの群のＫｉ６７およびＣＤ６９染色の組み合わせである。赤色輪郭線は、細胞アポトーシスおよび細胞死を明らかにするためのＳｙｔｏｘ  ＢｌｕｅおよびアネキシンＶ染色の組み合わせである。Ｓ−／Ａ−は、Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）／アネキシンＶ（−）を示し、Ｓ−／Ａ＋は、Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ−／アネキシンＶ＋を示し、Ｓ＋／Ａ＋は、Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ＋／アネキシンＶ＋を示す。（Ｂ、Ｃ）（Ａ）に示されているヒトＣＤ３＋（Ｂ）およびＣＤ６９＋（Ｃ）細胞の統計分析。未改変Ｔ（白抜き四角）、ＥＶＴ（パターン塗潰し四角）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ（灰色網掛四角）およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ（黒色四角）。多重検定、各群の比較。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし、ｎ＝マウス５匹／群。（Ｄ）Ｋｉ６７＋ＣＤ６９＋増殖細胞、アネキシンＶ（−）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）生細胞、アネキシンＶ（＋）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（−）アポトーシス細胞およびアネキシンＶ（＋）Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ（＋）死細胞の割合の統計分析。多重検定、各群の比較。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし、ｎ＝５／群。
【００３９】
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａ〜８Ｃは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞が、エクスビボでＣＳ１または／およびＢＣＭＡ発現ヒト初代多発性骨髄腫細胞を特異的に認識および排除することを示す。（Ａ）ＭＭ患者の骨髄から単離されたＣＤ１３８＋多発性骨髄腫腫瘍細胞におけるＣＳ１およびＢＣＭＡタンパク質のフローサイトメトリー表面染色。８人の患者からの結果が示されている。８人の患者のＭＭ細胞を、ＰＥコンジュゲート抗ＣＳ１  ｍＡｂ抗体（左パネル）またはＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジンとビオチン標識抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ（右パネル）で染色した。様々な色を使用して、８人の患者またはアイソタイプマッチ対照抗体（灰色の影）の各々を示している。（Ｂ）５×１０３個のＣＤ１３８＋多発性骨髄腫腫瘍細胞を、示されているＥ：Ｔ比でＥＶＴ細胞（黒色点線）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（赤色線）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞（緑色線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色線）と共に４時間共培養し、次いで、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイを使用して特異的溶解を決定した。患者サンプル１および患者サンプル４からの代表的なデータが示されている。８人の患者のデータを分析し、各患者の個々の値として示されている（右パネル）。（Ｃ）示されている形質導入Ｔ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でＣＤ１３８＋多発性骨髄腫腫瘍細胞と共に２４時間共培養し、ＥＬＩＳＡにより無細胞上清中でＩＦＮ−γ分泌を測定した。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞が、エクスビボでＣＳ１または／およびＢＣＭＡ発現ヒト初代多発性骨髄腫細胞を特異的に認識および排除することを示す。（Ａ）ＭＭ患者の骨髄から単離されたＣＤ１３８＋多発性骨髄腫腫瘍細胞におけるＣＳ１およびＢＣＭＡタンパク質のフローサイトメトリー表面染色。８人の患者からの結果が示されている。８人の患者のＭＭ細胞を、ＰＥコンジュゲート抗ＣＳ１  ｍＡｂ抗体（左パネル）またはＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジンとビオチン標識抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ（右パネル）で染色した。様々な色を使用して、８人の患者またはアイソタイプマッチ対照抗体（灰色の影）の各々を示している。（Ｂ）５×１０３個のＣＤ１３８＋多発性骨髄腫腫瘍細胞を、示されているＥ：Ｔ比でＥＶＴ細胞（黒色点線）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（赤色線）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞（緑色線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色線）と共に４時間共培養し、次いで、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイを使用して特異的溶解を決定した。患者サンプル１および患者サンプル４からの代表的なデータが示されている。８人の患者のデータを分析し、各患者の個々の値として示されている（右パネル）。（Ｃ）示されている形質導入Ｔ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でＣＤ１３８＋多発性骨髄腫腫瘍細胞と共に２４時間共培養し、ＥＬＩＳＡにより無細胞上清中でＩＦＮ−γ分泌を測定した。
【００４０】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞が、インビボＭＭ成長を抑制し、ＭＭを有するかまたは腫瘍細胞で再チャレンジされているマウスの生存を延長するために優れていることを示す。（Ａ）示されている各群からの５匹の代表的なＭＭ．１Ｓ腫瘍担持マウスについて、生物発光イメージングを示した。ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼを発現する８×１０６個のＭＭ．１Ｓ細胞を静脈内接種した（０日目）。腫瘍移植後１０、１７および２４日目に、各マウスは、生理食塩水（対照群）またはそれぞれ１０×１０６個のＥＶＴ細胞、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞、ＢＳＭＡ  ＣＡＲＴ細胞、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞もしくはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞のいずれかの静脈内注射を受けた（上パネル、実験スケジュール）。腫瘍移植後１０日目（操作されたＴ細胞または対照Ｔ細胞の注入直前）に、列の画像を撮影した。２４日目（マウスが（１０、１７日目に）２回の処置を既に受けた後であって、３回目の処置の直前）に、中央列の画像を撮影した。下列の画像は、３１日目（（１０、１７および２４日目の）３ラウンドの処置後）のマウスを示す。（Ｂ）腫瘍移植後８０日目に、生存マウス（ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞処置群の３匹のマウス、ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞処置群の４匹のマウス、およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞処置群の５匹のマウス）から末梢血（ＰＢＬ）を収集した。ＰＢＬ総細胞数を計算した（左パネル）。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４５  ｍＡｂ抗体およびＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジンとビオチン標識ヤギ抗マウス（Ｆａｂ）２ポリクローナル抗体または通常ポリクローナルヤギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を用いたフローサイトメトリー染色。中央に示されているように、Ｆａｂ（＋）細胞の割合および数を計算した。（Ｃ）様々な形質導入Ｔ細胞、生理食塩水（黒色実線）、ＥＶＴ細胞（黒色点線）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（赤色線）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞（緑色線）、ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞（青色線）およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色点線）で処置したＭＭ．１Ｓ担持マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。矢印付きの灰色点線垂直線は、４×１０６個のＭＭ．１Ｓ細胞でマウスを再チャレンジした８０日目を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｃは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞が、インビボＭＭ成長を抑制し、ＭＭを有するかまたは腫瘍細胞で再チャレンジされているマウスの生存を延長するために優れていることを示す。（Ａ）示されている各群からの５匹の代表的なＭＭ．１Ｓ腫瘍担持マウスについて、生物発光イメージングを示した。ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼを発現する８×１０６個のＭＭ．１Ｓ細胞を静脈内接種した（０日目）。腫瘍移植後１０、１７および２４日目に、各マウスは、生理食塩水（対照群）またはそれぞれ１０×１０６個のＥＶＴ細胞、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞、ＢＳＭＡ  ＣＡＲＴ細胞、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞もしくはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞のいずれかの静脈内注射を受けた（上パネル、実験スケジュール）。腫瘍移植後１０日目（操作されたＴ細胞または対照Ｔ細胞の注入直前）に、列の画像を撮影した。２４日目（マウスが（１０、１７日目に）２回の処置を既に受けた後であって、３回目の処置の直前）に、中央列の画像を撮影した。下列の画像は、３１日目（（１０、１７および２４日目の）３ラウンドの処置後）のマウスを示す。（Ｂ）腫瘍移植後８０日目に、生存マウス（ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞処置群の３匹のマウス、ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞処置群の４匹のマウス、およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞処置群の５匹のマウス）から末梢血（ＰＢＬ）を収集した。ＰＢＬ総細胞数を計算した（左パネル）。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４５  ｍＡｂ抗体およびＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジンとビオチン標識ヤギ抗マウス（Ｆａｂ）２ポリクローナル抗体または通常ポリクローナルヤギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を用いたフローサイトメトリー染色。中央に示されているように、Ｆａｂ（＋）細胞の割合および数を計算した。（Ｃ）様々な形質導入Ｔ細胞、生理食塩水（黒色実線）、ＥＶＴ細胞（黒色点線）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（赤色線）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞（緑色線）、ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞（青色線）およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色点線）で処置したＭＭ．１Ｓ担持マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。矢印付きの灰色点線垂直線は、４×１０６個のＭＭ．１Ｓ細胞でマウスを再チャレンジした８０日目を示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞が、インビボＭＭ成長を抑制し、ＭＭを有するかまたは腫瘍細胞で再チャレンジされているマウスの生存を延長するために優れていることを示す。（Ａ）示されている各群からの５匹の代表的なＭＭ．１Ｓ腫瘍担持マウスについて、生物発光イメージングを示した。ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼを発現する８×１０６個のＭＭ．１Ｓ細胞を静脈内接種した（０日目）。腫瘍移植後１０、１７および２４日目に、各マウスは、生理食塩水（対照群）またはそれぞれ１０×１０６個のＥＶＴ細胞、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞、ＢＳＭＡ  ＣＡＲＴ細胞、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞もしくはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞のいずれかの静脈内注射を受けた（上パネル、実験スケジュール）。腫瘍移植後１０日目（操作されたＴ細胞または対照Ｔ細胞の注入直前）に、列の画像を撮影した。２４日目（マウスが（１０、１７日目に）２回の処置を既に受けた後であって、３回目の処置の直前）に、中央列の画像を撮影した。下列の画像は、３１日目（（１０、１７および２４日目の）３ラウンドの処置後）のマウスを示す。（Ｂ）腫瘍移植後８０日目に、生存マウス（ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞処置群の３匹のマウス、ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞処置群の４匹のマウス、およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞処置群の５匹のマウス）から末梢血（ＰＢＬ）を収集した。ＰＢＬ総細胞数を計算した（左パネル）。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ４５  ｍＡｂ抗体およびＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジンとビオチン標識ヤギ抗マウス（Ｆａｂ）２ポリクローナル抗体または通常ポリクローナルヤギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を用いたフローサイトメトリー染色。中央に示されているように、Ｆａｂ（＋）細胞の割合および数を計算した。（Ｃ）様々な形質導入Ｔ細胞、生理食塩水（黒色実線）、ＥＶＴ細胞（黒色点線）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（赤色線）、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞（緑色線）、ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞（青色線）およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色点線）で処置したＭＭ．１Ｓ担持マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。矢印付きの灰色点線垂直線は、４×１０６個のＭＭ．１Ｓ細胞でマウスを再チャレンジした８０日目を示す。
【００４１】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｄは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞が、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞よりも有効に、養子移入ヒトＰＢＭＣの存在下でインビボＭＭ成長を抑制し、ＭＭ腫瘍担持マウスの生存を延長することを示す。（Ａ）示されている各群からの３匹の代表的なＭＭ．１Ｓ腫瘍担持マウスについて、生物発光イメージングを示した。ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼを発現する８×１０６個のＭＭ．１Ｓ細胞を静脈内接種した（０日目）。腫瘍移植後１０、１７および２４日目に、各マウスは、生理食塩水（対照群）、ＢＳＭＡ−ＣＡＲＴ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞のいずれかの静脈内注射を受けた。腫瘍移植後１０日目に、同じドナー由来の骨髄細胞枯渇ＰＢＭＣをマウスに静脈内注射した（上パネル、実験スケジュール）。腫瘍移植後１０日目（操作されたＴ細胞または対照Ｔ細胞の注入直前）に、１列目の画像を撮影した。１９日目（マウスが（１０、１７日目に）２回の処置を既に受けた後であって、３回目の処置の投与直前）に、２列目の画像を撮影した。３列目の画像は、２８日目（（１０、１７および２４日目の）３ラウンドの処置後）のマウスを示す。４列目の画像は、３７日目のマウスを示す。（Ｂ）生存ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞注射マウス（ｎ＝５）および未処置ＮＳＧマウス（なし、ｎ＝５）から血液を収集した。ＣＤ１９／２０（＋）ヒト形質細胞、ＣＤ５６（＋）ＮＫ細胞およびＣＤ３（＋）Ｔ細胞のフローサイトメトリー染色。ヒトＣＤ３（＋）Ｆ（ａｂ）２（＋）についてゲーティングした輪郭線の緑色は、生存ヒトＴ細胞内のＣＡＲ発現の割合を示す。（Ｃ）ヒトＣＤ１９／２０（＋）形質細胞、ＣＤ５６（＋）ＮＫ細胞、ＣＤ３（＋）Ｔ細胞およびＣＤ３（＋）Ｆ（ａｂ）２（＋）生存ＣＡＲＴ細胞の割合の統計分析。（ｄ）様々な形質導入Ｔ細胞、生理食塩水（黒色実線）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞（緑色線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色点線）で処置したＭＭ．１Ｓ担持マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。Ｐ＜０．０００１、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞対ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｄは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞が、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞よりも有効に、養子移入ヒトＰＢＭＣの存在下でインビボＭＭ成長を抑制し、ＭＭ腫瘍担持マウスの生存を延長することを示す。（Ａ）示されている各群からの３匹の代表的なＭＭ．１Ｓ腫瘍担持マウスについて、生物発光イメージングを示した。ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼを発現する８×１０６個のＭＭ．１Ｓ細胞を静脈内接種した（０日目）。腫瘍移植後１０、１７および２４日目に、各マウスは、生理食塩水（対照群）、ＢＳＭＡ−ＣＡＲＴ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞のいずれかの静脈内注射を受けた。腫瘍移植後１０日目に、同じドナー由来の骨髄細胞枯渇ＰＢＭＣをマウスに静脈内注射した（上パネル、実験スケジュール）。腫瘍移植後１０日目（操作されたＴ細胞または対照Ｔ細胞の注入直前）に、１列目の画像を撮影した。１９日目（マウスが（１０、１７日目に）２回の処置を既に受けた後であって、３回目の処置の投与直前）に、２列目の画像を撮影した。３列目の画像は、２８日目（（１０、１７および２４日目の）３ラウンドの処置後）のマウスを示す。４列目の画像は、３７日目のマウスを示す。（Ｂ）生存ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞注射マウス（ｎ＝５）および未処置ＮＳＧマウス（なし、ｎ＝５）から血液を収集した。ＣＤ１９／２０（＋）ヒト形質細胞、ＣＤ５６（＋）ＮＫ細胞およびＣＤ３（＋）Ｔ細胞のフローサイトメトリー染色。ヒトＣＤ３（＋）Ｆ（ａｂ）２（＋）についてゲーティングした輪郭線の緑色は、生存ヒトＴ細胞内のＣＡＲ発現の割合を示す。（Ｃ）ヒトＣＤ１９／２０（＋）形質細胞、ＣＤ５６（＋）ＮＫ細胞、ＣＤ３（＋）Ｔ細胞およびＣＤ３（＋）Ｆ（ａｂ）２（＋）生存ＣＡＲＴ細胞の割合の統計分析。（ｄ）様々な形質導入Ｔ細胞、生理食塩水（黒色実線）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞（緑色線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色点線）で処置したＭＭ．１Ｓ担持マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。Ｐ＜０．０００１、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞対ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞。
【図１０Ｃ−Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｄは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞が、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞よりも有効に、養子移入ヒトＰＢＭＣの存在下でインビボＭＭ成長を抑制し、ＭＭ腫瘍担持マウスの生存を延長することを示す。（Ａ）示されている各群からの３匹の代表的なＭＭ．１Ｓ腫瘍担持マウスについて、生物発光イメージングを示した。ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼを発現する８×１０６個のＭＭ．１Ｓ細胞を静脈内接種した（０日目）。腫瘍移植後１０、１７および２４日目に、各マウスは、生理食塩水（対照群）、ＢＳＭＡ−ＣＡＲＴ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞のいずれかの静脈内注射を受けた。腫瘍移植後１０日目に、同じドナー由来の骨髄細胞枯渇ＰＢＭＣをマウスに静脈内注射した（上パネル、実験スケジュール）。腫瘍移植後１０日目（操作されたＴ細胞または対照Ｔ細胞の注入直前）に、１列目の画像を撮影した。１９日目（マウスが（１０、１７日目に）２回の処置を既に受けた後であって、３回目の処置の投与直前）に、２列目の画像を撮影した。３列目の画像は、２８日目（（１０、１７および２４日目の）３ラウンドの処置後）のマウスを示す。４列目の画像は、３７日目のマウスを示す。（Ｂ）生存ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞注射マウス（ｎ＝５）および未処置ＮＳＧマウス（なし、ｎ＝５）から血液を収集した。ＣＤ１９／２０（＋）ヒト形質細胞、ＣＤ５６（＋）ＮＫ細胞およびＣＤ３（＋）Ｔ細胞のフローサイトメトリー染色。ヒトＣＤ３（＋）Ｆ（ａｂ）２（＋）についてゲーティングした輪郭線の緑色は、生存ヒトＴ細胞内のＣＡＲ発現の割合を示す。（Ｃ）ヒトＣＤ１９／２０（＋）形質細胞、ＣＤ５６（＋）ＮＫ細胞、ＣＤ３（＋）Ｔ細胞およびＣＤ３（＋）Ｆ（ａｂ）２（＋）生存ＣＡＲＴ細胞の割合の統計分析。（ｄ）様々な形質導入Ｔ細胞、生理食塩水（黒色実線）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞（緑色線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色点線）で処置したＭＭ．１Ｓ担持マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。Ｐ＜０．０００１、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞対ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞。
【００４２】
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｃ。（Ａ）３Ｄレインボードットフローサイトメトリーマップ（ＣＤ３染色に基づくものであり、ＣＤ３陽性細胞は黄色および緑色を示し、ＣＤ３陰性細胞は紺青色および紫色を示す）は、ＣＤ３（＋）Ｔ細胞（黒色円、黄色と緑色）、γδＴ細胞（黄色のみ）、ＮＫＴ細胞（オレンジ色円、黄色と緑色）およびＮＫ細胞（青色円、紺青色および紫色）の割合を示す。２Ｄ輪郭線マップは、３Ｄマップの詳細を示す。（Ｂ）Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、パンγδＴ細胞、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ表面発現のフローサイトメトリー染色。示されているデータは、１０人の健常ドナー由来のＰＢＭＣの代表である。（Ｃ）（Ｂ）におけるＮＫＧ２Ｄ＋細胞の割合の統計分析。ｎ＝１０。
【図１１Ｂ−Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃ。（Ａ）３Ｄレインボードットフローサイトメトリーマップ（ＣＤ３染色に基づくものであり、ＣＤ３陽性細胞は黄色および緑色を示し、ＣＤ３陰性細胞は紺青色および紫色を示す）は、ＣＤ３（＋）Ｔ細胞（黒色円、黄色と緑色）、γδＴ細胞（黄色のみ）、ＮＫＴ細胞（オレンジ色円、黄色と緑色）およびＮＫ細胞（青色円、紺青色および紫色）の割合を示す。２Ｄ輪郭線マップは、３Ｄマップの詳細を示す。（Ｂ）Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、パンγδＴ細胞、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ表面発現のフローサイトメトリー染色。示されているデータは、１０人の健常ドナー由来のＰＢＭＣの代表である。（Ｃ）（Ｂ）におけるＮＫＧ２Ｄ＋細胞の割合の統計分析。ｎ＝１０。
【００４３】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｂ。（Ａ）１０：１のＥ：Ｔ比における４時間５１Ｃｒ放出アッセイ［Ｅ、未改変Ｔ細胞（黒色実線）またはＥＶ−（黒色点線）、ＢｓＡｂ−（赤色線）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−（緑色線）もしくはＢｓＡｂ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（紫色線）のエフェクター細胞］。標的細胞の１倍、１０倍、１００倍または２００倍の異なる量のヒトＰＢＭＣ。３つのうちの１つの代表的な実験の特異的溶解曲線はＡに示されており、３つの要約データはＢに示されている。（Ｂ）（ａ）の５１Ｃｒ放出アッセイ結果の統計分析、多重ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし、３回反復。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｂ。（Ａ）１０：１のＥ：Ｔ比における４時間５１Ｃｒ放出アッセイ［Ｅ、未改変Ｔ細胞（黒色実線）またはＥＶ−（黒色点線）、ＢｓＡｂ−（赤色線）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ−（緑色線）もしくはＢｓＡｂ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（紫色線）のエフェクター細胞］。標的細胞の１倍、１０倍、１００倍または２００倍の異なる量のヒトＰＢＭＣ。３つのうちの１つの代表的な実験の特異的溶解曲線はＡに示されており、３つの要約データはＢに示されている。（Ｂ）（ａ）の５１Ｃｒ放出アッセイ結果の統計分析、多重ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．有意差なし、３回反復。
【００４４】
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｄ。（Ａ）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓから注文されたロイコパックからＣＤ３（＋）Ｔ細胞、ＣＤ８（＋）細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞を単離した。プライミングＴの黒色輪郭線図は、ＣＤ３およびパンαβＴＣＲの組み合わせ染色を示す。茶色および緑色輪郭線図は、それぞれ選別ＣＤ８（＋）およびＣＤ４（＋）Ｔ細胞を示す。（Ｂ）活性化ヒトＮＫ細胞をＣＤ３およびＣＤ５６で染色した。（Ｃ）選別パンγδ細胞をＣＤ３およびパンγδＴＣＲ抗体で染色した。ＣＤ３、ＣＤ５６、Ｖγ９およびＶδ２の組み合わせ染色により、活性化Ｖγ９γδ２ＴＣＲＴ細胞の黒色輪郭線図を実施した。（Ｄ）新鮮ＦＡＣＳ選別ヒトＣＤ３（＋）ＣＤ５６（＋）ＮＫＴ細胞をＣＤ３およびＣＤ５６で染色した。
【図１３Ｃ−Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｄ。（Ａ）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓから注文されたロイコパックからＣＤ３（＋）Ｔ細胞、ＣＤ８（＋）細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞を単離した。プライミングＴの黒色輪郭線図は、ＣＤ３およびパンαβＴＣＲの組み合わせ染色を示す。茶色および緑色輪郭線図は、それぞれ選別ＣＤ８（＋）およびＣＤ４（＋）Ｔ細胞を示す。（Ｂ）活性化ヒトＮＫ細胞をＣＤ３およびＣＤ５６で染色した。（Ｃ）選別パンγδ細胞をＣＤ３およびパンγδＴＣＲ抗体で染色した。ＣＤ３、ＣＤ５６、Ｖγ９およびＶδ２の組み合わせ染色により、活性化Ｖγ９γδ２ＴＣＲＴ細胞の黒色輪郭線図を実施した。（Ｄ）新鮮ＦＡＣＳ選別ヒトＣＤ３（＋）ＣＤ５６（＋）ＮＫＴ細胞をＣＤ３およびＣＤ５６で染色した。
【００４５】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｅ。（Ａ）２時間、４時間、８時間および１６時間を含む異なる時点における、５：１のＥ：Ｔ比における未改変Ｔ細胞（黒色実線）、ＥＶＴ細胞（黒色点線）、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞（赤色線）、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞（緑色線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色線）の５１Ｃｒ放出アッセイ。さらなるＰＢＭＣを添加しなかった。（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）バルクＴ細胞またはプライミングＣＤ３（＋）Ｔ細胞、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞およびＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を含む個々のＴ細胞サブセットの存在下または不在下で、上記細胞毒性アッセイを繰り返した。すべての実験について、標的ＭＭ．１Ｓ細胞に対するエフェクター細胞の比は５：１である。
【００４６】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｊは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（緑色）またはＥＶＴ細胞（緑色）のいずれかとＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞（赤色）の２４時間共培養後の共焦点顕微鏡分析を示す。（Ａ〜Ｆ）ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞とＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞の２４時間の共培養は、ＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞の排除を示す。（Ｇ〜Ｊ）ＥＶＴ細胞とＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞の２４時間の共培養は、ＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞の持続性を示す。Ｂｆ＝明視野；スケール、１０μＬ。
【００４７】
【図１６】図１６は、ＣＳ１およびＢＣＭＡ遺伝子を安定発現するＫ５６２細胞の生成を示す。左の疑似カラーフローマップは、非形質導入Ｋ５６２細胞の制御を示す。中央の疑似カラーフローマップは、ＦＡＣＳ選別ｐＣＤＨ−ＣＳ１−ＧＦＰレンチウイルス感染Ｋ５６２細胞を示す。３番目の疑似カラーフローマップは、ＦＡＣＳ選別ＣＳ１（＋）ＢＣＭＡ（＋）Ｋ５６２細胞を示す。
【００４８】
【図１７Ａ−Ｂ】図１７Ａ〜１７Ｄ。（Ａ）４８時間の培養。１Ａ−未改変Ｔ細胞、２Ａ−ＥＶＴ細胞、３Ａ−ＢｓＡｂ  Ｔ細胞、４Ａ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞および５Ａ−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞。ＣＤ３（＋）集団（青色フレーム）、ＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（＋）集団（赤色フレーム）およびＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（−）集団（緑色フレーム）を観察するためのＣＤ３およびＮＫＧ２Ｄのフローサイトメトリー染色。（ｂ）０日目に、ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）を（Ａ）培養物に添加し、１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂと命名した。４８時間後、細胞集団を観察するためのＣＤ３およびＦ（ａｂ）２のフローサイトメトリー染色。ＣＤ３（＋）集団（青色フレーム）。（Ｃ）（Ａ）からの４８時間の培養培地を示した。０日目に、ＣＳ１遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）を（Ａ）培養物に添加し、１Ｃ、２Ｃ、３Ｃ、４Ｃおよび５Ｃと命名した。４８時間後、細胞増殖を観察するために、抗ＣＤ３、抗Ｆ（ａｂ）２、抗ＮＫＧ２Ｄおよび抗Ｋｉ６７で細胞を染色した後、フローサイトメトリー分析を実施した。ＣＤ３（＋）およびＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（＋）集団（赤色フレーム）について細胞をゲーティングし、ＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（−）集団（緑色フレーム）を示した。赤色ドットフローマップは、ＮＫＧ２Ｄ（＋）Ｆａｂ（＋）（上３つ）またはＮＫＧ２Ｄ（＋）Ｆａｂ（−）（下２つ）細胞の増殖を示した。緑色ドットフローマップは、ＮＫＧ２Ｄ（−）Ｆａｂ（＋）（上３つ）またはＮＫＧ２Ｄ（−）Ｆａｂ（−）（下２つ）細胞の増殖を示す。Ｆａｂは、ＣＡＲ発現の抗Ｆ（ａｂ）２染色を示す。（Ｄ）（Ａ）における１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａの細胞をＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞と共に４８時間共培養した。抗ＣＤ３、抗Ｆ（ａｂ）２および抗ＮＫＧ２Ｄ抗体で細胞を染色した後、フローサイトメトリー分析を実施した。Ｆａｂは、ＣＡＲの発現を示すＦ（ａｂ）２染色を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ａ〜１７Ｄ。（Ａ）４８時間の培養。１Ａ−未改変Ｔ細胞、２Ａ−ＥＶＴ細胞、３Ａ−ＢｓＡｂ  Ｔ細胞、４Ａ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞および５Ａ−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞。ＣＤ３（＋）集団（青色フレーム）、ＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（＋）集団（赤色フレーム）およびＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（−）集団（緑色フレーム）を観察するためのＣＤ３およびＮＫＧ２Ｄのフローサイトメトリー染色。（ｂ）０日目に、ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）を（Ａ）培養物に添加し、１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂと命名した。４８時間後、細胞集団を観察するためのＣＤ３およびＦ（ａｂ）２のフローサイトメトリー染色。ＣＤ３（＋）集団（青色フレーム）。（Ｃ）（Ａ）からの４８時間の培養培地を示した。０日目に、ＣＳ１遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）を（Ａ）培養物に添加し、１Ｃ、２Ｃ、３Ｃ、４Ｃおよび５Ｃと命名した。４８時間後、細胞増殖を観察するために、抗ＣＤ３、抗Ｆ（ａｂ）２、抗ＮＫＧ２Ｄおよび抗Ｋｉ６７で細胞を染色した後、フローサイトメトリー分析を実施した。ＣＤ３（＋）およびＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（＋）集団（赤色フレーム）について細胞をゲーティングし、ＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（−）集団（緑色フレーム）を示した。赤色ドットフローマップは、ＮＫＧ２Ｄ（＋）Ｆａｂ（＋）（上３つ）またはＮＫＧ２Ｄ（＋）Ｆａｂ（−）（下２つ）細胞の増殖を示した。緑色ドットフローマップは、ＮＫＧ２Ｄ（−）Ｆａｂ（＋）（上３つ）またはＮＫＧ２Ｄ（−）Ｆａｂ（−）（下２つ）細胞の増殖を示す。Ｆａｂは、ＣＡＲ発現の抗Ｆ（ａｂ）２染色を示す。（Ｄ）（Ａ）における１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａの細胞をＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞と共に４８時間共培養した。抗ＣＤ３、抗Ｆ（ａｂ）２および抗ＮＫＧ２Ｄ抗体で細胞を染色した後、フローサイトメトリー分析を実施した。Ｆａｂは、ＣＡＲの発現を示すＦ（ａｂ）２染色を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ａ〜１７Ｄ。（Ａ）４８時間の培養。１Ａ−未改変Ｔ細胞、２Ａ−ＥＶＴ細胞、３Ａ−ＢｓＡｂ  Ｔ細胞、４Ａ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞および５Ａ−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞。ＣＤ３（＋）集団（青色フレーム）、ＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（＋）集団（赤色フレーム）およびＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（−）集団（緑色フレーム）を観察するためのＣＤ３およびＮＫＧ２Ｄのフローサイトメトリー染色。（ｂ）０日目に、ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）を（Ａ）培養物に添加し、１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂと命名した。４８時間後、細胞集団を観察するためのＣＤ３およびＦ（ａｂ）２のフローサイトメトリー染色。ＣＤ３（＋）集団（青色フレーム）。（Ｃ）（Ａ）からの４８時間の培養培地を示した。０日目に、ＣＳ１遮断抗体（２０μｇ／ｍＬ）を（Ａ）培養物に添加し、１Ｃ、２Ｃ、３Ｃ、４Ｃおよび５Ｃと命名した。４８時間後、細胞増殖を観察するために、抗ＣＤ３、抗Ｆ（ａｂ）２、抗ＮＫＧ２Ｄおよび抗Ｋｉ６７で細胞を染色した後、フローサイトメトリー分析を実施した。ＣＤ３（＋）およびＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（＋）集団（赤色フレーム）について細胞をゲーティングし、ＣＤ３（＋）ＮＫＧ２Ｄ（−）集団（緑色フレーム）を示した。赤色ドットフローマップは、ＮＫＧ２Ｄ（＋）Ｆａｂ（＋）（上３つ）またはＮＫＧ２Ｄ（＋）Ｆａｂ（−）（下２つ）細胞の増殖を示した。緑色ドットフローマップは、ＮＫＧ２Ｄ（−）Ｆａｂ（＋）（上３つ）またはＮＫＧ２Ｄ（−）Ｆａｂ（−）（下２つ）細胞の増殖を示す。Ｆａｂは、ＣＡＲ発現の抗Ｆ（ａｂ）２染色を示す。（Ｄ）（Ａ）における１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａの細胞をＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞と共に４８時間共培養した。抗ＣＤ３、抗Ｆ（ａｂ）２および抗ＮＫＧ２Ｄ抗体で細胞を染色した後、フローサイトメトリー分析を実施した。Ｆａｂは、ＣＡＲの発現を示すＦ（ａｂ）２染色を示す。
【００４９】
【図１８】図１８は、図７のデータの補足データを提供する。図７では、ヒトＣＤ３Ｔ細胞の割合の３Ｄヒストグラム（１列目）が示されている。これらは、元の疑似カラーフローマップである。青色フレームは、−１日目にＴ細胞を注射しなかったマウスのヒトＣＤ３割合を示した（１列目）。オレンジ色フレームは、Ｔ細胞注射１日後のマウスにおける抗ヒトＣＤ３（＋）細胞を表し、抗Ｆ（ａｂ）２で染色した後、フローサイトメトリー分析によりＣＡＲの発現を検出した（２列目、３列目）。黒色フレームは、操作されたまたは対照ヒトＴ細胞の注入１４日後のマウスにおける抗ヒトＣＤ３（＋）細胞を示す（４列目）。紫色フレームは、操作されたまたは対照ヒトＴ細胞の注入３５日後のマウスにおける抗ヒトＣＤ３（＋）細胞を示す（５列目）。ＣＤ３（＋）ヒト細胞の統計分析は図７に示されている。
【００５０】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂは、ＮＳＧマウスに注射した場合に、ヒト健常ドナーのＰＢＭＣにおける骨髄細胞を枯渇させてＧＶＨＤを回避する効果を示す。（Ａ）Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ単離ヒトＰＢＭＣを染色した。番号１はリンパ球の割合を示し、２は顆粒球の割合を示し、３は単球の割合を示す。ＦＡＣＳ選別前に、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ３３およびＣＤ６６ｂを染色して、健常ドナーのＰＢＭＣの骨髄細胞の割合をチェックした。（Ｂ）選別後、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ３３およびＣＤ６６ｂを上記のように染色し、疑似カラーローマップを示した。
【００５１】
【図２０】図２０は、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイによる、自己ＰＢＭＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および形質細胞に対するヒトＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の細胞毒性の評価を提供する。Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ勾配遠心分離により、ＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣからＣＤ３（＋）Ｔ細胞、ＣＤ５６（＋）ＮＫ細胞およびＣＤ１９／２０（＋）形質細胞をＦＡＣＳ選別した。細胞毒性アッセイでは、ＥＶＴ細胞を対照として使用した。
【００５２】
【図２１Ａ−Ｂ】図２１Ａ〜２１Ｄ。（Ａ）様々な時点（１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間）のＢｓＡｂＢＣＭＡ−ＣＡＲ（ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ）レンチウイルス感染健常ドナーのプライミングＴ細胞。同じビューのＢＦ（明視野）ＧＦＰ（緑色）が示されている。（Ｂ）ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の上清中のＢｓＡｂの分泌を示すための、抗Ｈｉｓタグを用いたイムノブロッティング。（Ｃ）ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴレンチウイルス感染プライミングＴ細胞のフローサイトメトリー染色。ＧＦＰ陽性細胞を選別し、ビオチン標識ヤギ抗マウスＦａｂ特異的またはアイソタイプマッチ対照抗体で細胞を染色し、続いて、ストレプトアビジンおよびＣＤ３抗体で染色した。（Ｄ）５１Ｃｒ標識Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６およびＫ５６２標的細胞株（５×１０３個）を、示されているＥ：Ｔ比で未改変Ｔ細胞（黒色実線）、空ベクター形質導入Ｔ細胞（ＥＶＴ、黒色点線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色線）と共に４時間共培養した。標的溶解（５１Ｃｒ放出）を測定した。ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ対未改変ＴまたはＥＶＴ、＊＊Ｐ＜０．０１、３回繰り返し。ＢＣＭＡ（−）ＣＳ１（−）陰性Ｋ５６２は、陰性対照標的細胞として機能した。
【図２１Ｃ−Ｄ】図２１Ａ〜２１Ｄ。（Ａ）様々な時点（１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間）のＢｓＡｂＢＣＭＡ−ＣＡＲ（ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ）レンチウイルス感染健常ドナーのプライミングＴ細胞。同じビューのＢＦ（明視野）ＧＦＰ（緑色）が示されている。（Ｂ）ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の上清中のＢｓＡｂの分泌を示すための、抗Ｈｉｓタグを用いたイムノブロッティング。（Ｃ）ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴレンチウイルス感染プライミングＴ細胞のフローサイトメトリー染色。ＧＦＰ陽性細胞を選別し、ビオチン標識ヤギ抗マウスＦａｂ特異的またはアイソタイプマッチ対照抗体で細胞を染色し、続いて、ストレプトアビジンおよびＣＤ３抗体で染色した。（Ｄ）５１Ｃｒ標識Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６およびＫ５６２標的細胞株（５×１０３個）を、示されているＥ：Ｔ比で未改変Ｔ細胞（黒色実線）、空ベクター形質導入Ｔ細胞（ＥＶＴ、黒色点線）またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（紫色線）と共に４時間共培養した。標的溶解（５１Ｃｒ放出）を測定した。ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ対未改変ＴまたはＥＶＴ、＊＊Ｐ＜０．０１、３回繰り返し。ＢＣＭＡ（−）ＣＳ１（−）陰性Ｋ５６２は、陰性対照標的細胞として機能した。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
詳細な説明
本開示は、記載される特定の態様に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本開示の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されるので、本明細書中で使用される用語は、単に特定の態様を説明する目的であって、限定を意図していないことも理解されるべきである。本開示を通じて、様々な技術刊行物がアラビア数字により参照されている。これらの刊行物の完全な引用は、特許請求の範囲の直前に見ることができ、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００５４】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）およびＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９）は両方とも、優れたＭＭ腫瘍抗原標的であることが示されているが、ＮＫＧ２Ｄは優れた免疫細胞標的である。受容体であるＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞およびγδＴ細胞を含む実質的にすべての細胞溶解性免疫細胞上で発現される２３。ＢＣＭＡは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ１７またはＣＤ２６９）のメンバーであり、形質細胞分化中に選択的に誘導され、ナイーブおよび記憶Ｂ細胞上ではほとんど存在しない２４、２５。抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞の養子移入は、ＭＭを処置するための有望な新たな戦略として報告されている２６−２８。ＣＳ１は、ＭＭ細胞の表面上で高度かつ遍在的に発現されるので、ＣＳ１は、ＭＭにおける別の魅力的な腫瘍関連標的抗原である２９、３０。ＣＳ１は、ＮＫ細胞および一部の活性化ＣＤ８（＋）Ｔ細胞上では低レベルで発現されるが、それは、骨髄細胞および正常造血幹細胞ではほとんど検出不可能である３１。ＣＳ１に対する治療用モノクローナル抗体は、ＭＭの処置についてＦＤＡにより承認されている３２。本出願人の公開研究では、ＣＳ１に対して再指向されたＴ細胞またはＮＫ細胞の遺伝子改変は、骨髄腫細胞の根絶を増強したことが示された２９、３０。最近の前臨床研究では、ＣＳ１  ＣＡＲＴ細胞処置に供された患者ＭＭ細胞は有効に根絶されたが、低レベルのＣＳ１発現を有する正常ＮＫ細胞およびＴ細胞は影響を受けなかった（Ｇｏｇｉｓｈｖｉｌｉ，２０１７  Ｂｌｏｏｄ．２０１７  Ｄｅｃ  ２８；１３０（２６）：２８３８−２８４７．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１７−０４−７７８４２３．Ｅｐｕｂ  ２０１７  Ｏｃｔ  ３１）。活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄは、上記で言及されているように、様々な自然および適応性細胞溶解性細胞上で発現される１１、３３。ＮＫＧ２Ｄのトリガーは、自然および適応細胞免疫の両方の活性化をもたらし得る３４。
【００５５】
本明細書中に開示されるように、本出願人は、（１）ＢＣＭＡ特異的第２世代ＣＡＲを発現し、（２）抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂを同時に分泌するようにＴ細胞を操作した。これらのデータは、これらの細胞（以下、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞と称される）が、再発性および／または難治性ＭＭの有望な治療法であり、次世代ＣＡＲベースの癌免疫療法をもたらすための適切なプラットフォームであり得ることを示唆している。
【００５６】
Ｔ細胞に形質導入される単一のベクターとしてのＣＡＲおよび抗ＮＫＧ２Ｄベースの二重特異性抗体のこのような組み合わせは、文献にまだ記載されていない。本出願人は、このアプローチが、腫瘍に対する強力な細胞溶解性エフェクター細胞として機能するＴ細胞（ＢｓＡｂ  ＣＡＲＴ細胞）を生成することを実証した。ＢＣＭＡと称される多発性骨髄腫（ＭＭ）で周知の標的に対するＴ細胞ＣＡＲの代表例が本明細書中で提供され、抗ＮＫＧ２Ｄベースの二重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄ抗原を担持する自然または適応細胞溶解性エフェクター細胞にそれをごく接近させる十分に記載されているＭＭ腫瘍抗原ＣＳ１を認識する。しかしながら、様々な相補的ＣＡＲおよび抗ＮＫＧ２Ｄベースの二重特異性抗体を単一のベクターに拡大し、次いで抗腫瘍有効性のためにＴおよびＮＫ細胞に感染させることが本明細書中で企図される。このアプローチは、当技術分野で公知であるように、任意の数の腫瘍抗原、例えばＥＧＦＲＶＩＩＩ；ＣＤ７０、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＥＡ、ＣＤ１３３、Ｈｅｒ２について改変され得る。Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、（２０１８）Ｊ．Ｅｘｐ．＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３７：１６３を参照のこと。
【００５７】
以下の実施例に示されているように、ＭＭ細胞上の２つの異なる腫瘍関連抗原に対する２つの相補的モダリティを送達する単一の単一ベクターは、いずれかのモダリティのみよりも優れており、２つの別個の構築物（一方はＣＡＲをコードし、他方は抗ＮＫＧ２Ｄベースの二重特異性抗体をコードする）を逐次感染させたＴ細胞の使用よりも優れている。さらに、（ＣＡＲおよび抗ＮＫＧ２Ｄベースの二重特異性抗体の両方をコードする実験用ベクターを感染させた）Ｔ細胞が、両抗原を発現するＭＭ細胞に遭遇すると、ＢｓＡｂ  ＣＡＲＴ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ媒介性活性化を介して、インビトロおよびインビボで増殖および増強された生存の両方を受ける。このような結果は全く予想外である。
【００５８】
要するに、本出願人は、抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１二重特異性抗体も分泌するＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞を構築した；これらの細胞は、ＢＣＭＡ（＋）および／またはＣＳ１（＋）多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞を有効にターゲティングする。ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞による抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１二重特異性抗体の分泌は、ＮＫＧ２Ｄ媒介性活性化を介して、インビトロにおけるＣＡＲＴ細胞増殖ならびにインビボにおけるＣＡＲＴ細胞生存および増殖の両方を増強する。抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１二重特異性抗体を分泌するＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴまたは抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１二重特異性抗体のみを分泌するＴ細胞を用いた単一療法と比較して有意に優れた、腫瘍細胞標的に対するインビトロおよびインビボ有効性を示す。これらの結果は、同じ方法で用いられる様々なＣＡＲに一般化され得る。
【００５９】
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語が、本技術が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料を本技術の実施または試験において使用できるが、好ましい方法、デバイスおよび材料がここに記載される。本明細書に引用されるすべての技術的刊行物および特許公報は、そのすべてが参照により本明細書中に援用される。本明細書中のいかなる記載も、本技術が、先行発明を理由にそのような開示に先行する権利がないことを自認するものとして解釈されるべきでない。
【００６０】
本技術の実施は、別段示されない限り、当該分野の技術の範囲内である、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の手法を用いる。例えば、Green  and  Sambrook編(2012)  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  4th  edition;  the  series  Ausubel  et  al.編  (2015)  Current  Protocols  in  Molecular  Biology;  the  series  Methods  in  Enzymology  (Academic  Press,  Inc.,  N.Y.);  MacPherson  et  al.  (2015)  PCR  1:  A  Practical  Approach  (IRL  Press  at  Oxford  University  Press);  MacPherson  et  al.  (1995)  PCR  2:  A  Practical  Approach;  McPherson  et  al.  (2006)  PCR:  The  Basics  (Garland  Science);  Harlow  and  Lane編(1999)  Antibodies,  A  Laboratory  Manual;  Greenfield編(2014)  Antibodies,  A  Laboratory  Manual;  Freshney  (2010)  Culture  of  Animal  Cells:  A  Manual  of  Basic  Technique,  6th  edition;  Gait編(1984)  Oligonucleotide  Synthesis;  米国特許第4,683,195号;  Hames  and  Higgins編(1984)  Nucleic  Acid  Hybridization;  Anderson  (1999)  Nucleic  Acid  Hybridization;  Herdewijn編(2005)  Oligonucleotide  Synthesis:  Methods  and  Applications;  Hames  and  Higgins編(1984)  Transcription  and  Translation;  Buzdin  and  Lukyanov編(2007)  Nucleic  Acids  Hybridization:  Modern  Applications;  Immobilized  Cells  and  Enzymes  (IRL  Press  (1986));  Grandi編(2007)  In  Vitro  Transcription  and  Translation  Protocols,  2nd  edition;  Guisan編(2006)  Immobilization  of  Enzymes  and  Cells;  Perbal  (1988)  A  Practical  Guide  to  Molecular  Cloning,  2nd  edition;  Miller  and  Calos編(1987)  Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells  (Cold  Spring  Harbor  Laboratory);  Makrides編(2003)  Gene  Transfer  and  Expression  in  Mammalian  Cells;  Mayer  and  Walker編(1987)  Immunochemical  Methods  in  Cell  and  Molecular  Biology  (Academic  Press,  London);  Lundblad  and  Macdonald編(2010)  Handbook  of  Biochemistry  and  Molecular  Biology,  4th  edition;およびHerzenberg  et  al.  eds  (1996)  Weir's  Handbook  of  Experimental  Immunology,  5th  edition;ならびに出願時に入手可能なその各々のより最新版を参照のこと。
【００６１】
範囲を含むすべての数値の明示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、必要に応じて、１．０または０．１という一定数量ずつ、あるいは＋／−１５％あるいは１０％あるいは５％あるいは２％の変動で（＋）または（−）変動する近似値である。必ずしも明示的に述べられないが、すべての数値の明示は、用語「約」が先行すると理解されるべきである。必ずしも明示的に述べられないが、本明細書中に記載される試薬は、単に例示的なものであることおよびそのような試薬の等価物が当該分野で公知であることも理解されるべきである。
【００６２】
本技術がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関するとき、そのようなものの等価物または生物学的等価物は、明示的な列挙なしに、かつ別段意図されない限り、本技術の範囲内であると意図されると推測されるべきである。
【００６３】
定義
明細書および請求項において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、それらの混合物を含む複数の細胞を含む。
【００６４】
本明細書中で使用されるとき、用語「動物」とは、例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生存している多細胞の脊椎動物のことを指す。用語「哺乳動物」は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を含む。
【００６５】
用語「被験体」、「宿主」、「個体」および「患者」は、ヒト被験体および動物被験体、例えば、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマおよびウシのことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。
【００６６】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗体」とは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子のことを集合的に指し、例として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、それらの組み合わせ、および任意の脊椎動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウス）ならびに非哺乳動物種（例えば、サメ免疫グロブリン）における免疫応答において産生される同様の分子が挙げられるが、これらに限定されない。別段明確に示されない限り、用語「抗体」は、目的の分子（または高度に類似した目的の分子の群）に特異的に結合するインタクトな免疫グロブリンおよび「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」を、他の分子への結合を実質的に排除する程度に含む（例えば、生物学的サンプル中の他の分子に対する結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ−１高い、少なくとも１０４Ｍ−１高いまたは少なくとも１０５Ｍ−１高い、目的の分子に対する結合定数を有する抗体および抗体フラグメント）。用語「抗体」は、遺伝的に操作された形態、例えば、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合体抗体（例えば、二重特異性抗体）も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  １９９４−１９９５  （Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．）；  Ｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ７ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  ２０１３；  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ８ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１４；  Ｍａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｒｏｉｔｔ），  ８ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  ２０１２；  Ｐａｒｈａｍ，  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，  ４ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１４も参照のこと。
【００６７】
本明細書中で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」とは、Ｂリンパ球の単一クローンまたは単一抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体のことを指す。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、ミエローマ細胞と免疫脾臓細胞との融合物からハイブリッド抗体形成細胞を形成することによって、作製される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
【００６８】
抗体構造に関して、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖には、２つのタイプ、ラムダ（λ）およびカッパー（κ）がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ。重鎖および軽鎖の各々は、定常領域および可変領域を含む（これらの領域は、「ドメイン」としても知られる）。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は一体となって抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、定義されている（参照により本明細書に援用される、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照のこと）。Ｋａｂａｔデータベースが、現在、オンラインで維持されている。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成している軽鎖と重鎖とが組み合わさったフレームワーク領域は、主としてβシートコンフォメーションをとり、ＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成し、場合によっては、βシート構造の一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性の相互作用によってＣＤＲを正しい向きに位置決めする骨格を形成するように作用する。
【００６９】
ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、通常、Ｎ末端から順にナンバリングされたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称され、通常、特定のＣＤＲが位置する鎖（ＣＤＨＲと表される重鎖領域およびＣＤＬＲと表される軽鎖領域）によって特定される。したがって、ＣＤＨＲ３は、それが見られる抗体の重鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ３であるのに対して、ＣＤＬＲ１は、それが見られる抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。例えば、ＴＮＴ抗体は、ＴＮＴ関連抗原にユニークな特異的なＶＨ領域配列およびＶＬ領域配列を有し、ゆえに、特異的なＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対して異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは、抗体ごとに異なるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置しか、抗原結合に直接関わらない。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。
【００７０】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗原」とは、特定の液性免疫または細胞性免疫の生成物（例えば、抗体分子またはＴ細胞レセプター）によって特異的に結合され得る化合物、組成物または物質のことを指す。抗原は、任意のタイプの分子であり得、それらとしては、例えば、ハプテン、単純な中間代謝産物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質およびホルモン、ならびに高分子、例えば、複合糖質（例えば、多糖類）、リン脂質およびタンパク質が挙げられる。抗原の通常のカテゴリーとしては、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫および他の寄生生物の抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶反応に関わる抗原、トキシン、ならびに他の多岐にわたる抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原標的に特異的に結合し得る任意のタンパク質ドメインまたはポリペプチドドメインのことを指す。
【００７２】
本明細書中で使用されるとき、細胞に関する用語「自家」とは、単離され、再度同じ被験体（レシピエントまたは宿主）に注入される細胞のことを指す。「同種異系」とは、非自家の細胞のことを指す。
【００７３】
本明細書中で使用されるとき、用語「Ｂ細胞」とは、適応免疫系の体液性免疫におけるリンパ球のタイプのことを指す。Ｂ細胞は主として、抗原相互作用による活性化後に、抗体を産生する、抗原提示細胞として働く、サイトカインを放出する、および記憶Ｂ細胞を発生させる働きをする。Ｂ細胞は、細胞表面上のＢ細胞レセプターの存在によって、Ｔ細胞などの他のリンパ球と区別される。Ｂ細胞は、単離され得るか、または商業的に入手可能な供給源から入手され得る。商業的に入手可能なＢ細胞株の非限定的な例としては、株ＡＨＨ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−８１４６ＴＭ）、ＢＣ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２３０ＴＭ）、ＢＣ−２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２３１ＴＭ）、ＢＣ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２７７ＴＭ）、ＣＡ４６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６４８ＴＭ）、ＤＧ−７５［Ｄ．Ｇ．−７５］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２６２５ＴＭ）、ＤＳ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１１０２ＴＭ）、ＥＢ−３［ＥＢ３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８５ＴＭ）、Ｚ−１３８（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−３００１）、ＤＢ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２８９）、Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３１）、Ｐｆｉｆｆｅｒ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３２）、ＳＲ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６２）、ＪＭ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０４２１）、ＮＦＳ−５  Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９３）；ＮＦＳ−７０  Ｃ１０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９４）、ＮＦＳ−２５  Ｃ−３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９５）およびＳＵＰ−Ｂ１５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９２９）が挙げられる。さらなる例としては、未分化大細胞リンパ腫に由来する細胞株、例えば、ＤＥＬ、ＤＬ−４０、ＦＥ−ＰＤ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ２９９、Ｋｉ−ＪＫ、Ｍａｃ−２Ａ  Ｐｌｙ１、ＳＲ−７８６、ＳＵ−ＤＨＬ−１、−２、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０および−１６、ＤＯＨＨ−２、ＮＵ−ＤＨＬ−１、Ｕ−９３７、Ｇｒａｎｄａ５１９、ＵＳＣ−ＤＨＬ−１、ＲＬ；ホジキンリンパ腫に由来する細胞株、例えば、ＤＥＶ、ＨＤ−７０、ＨＤＬＭ−２、ＨＤ−ＭｙＺ、ＨＫＢ−１、ＫＭ−Ｈ２、Ｌ４２８、Ｌ５４０、Ｌ１２３６、ＳＢＨ−１、ＳＵＰ−ＨＤ１、ＳＵ／ＲＨ−ＨＤ−ｌが挙げられるがこれらに限定されない。そのような商業的に入手可能な細胞株の非限定的な例示的な供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が挙げられる。
【００７４】
本明細書中で使用されるとき、「癌」とは、異常で無制御な複製を示す細胞の被験体における存在を特徴とする疾患状態であり、いくつかの態様において、この用語は、用語「腫瘍」と互換的に使用され得る。用語「癌または腫瘍抗原」とは、癌細胞または腫瘍細胞もしくは組織に関連し、それらの表面上で発現されることが公知の抗原を指し、用語「癌または腫瘍ターゲティング抗体」とは、このような抗原をターゲティングする抗体のことを指す。
【００７５】
用語「キメラ抗原レセプター」（ＣＡＲ）は、本明細書中で使用されるとき、抗原に結合することができる細胞外ドメイン、その細胞外ドメインが由来するポリペプチドと異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質のことを指す。「キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）」は、時折、「キメラレセプター」、「Ｔボディ」または「キメラ免疫レセプター（ＣＩＲ）」と呼ばれる。「抗原に結合することができる細胞外ドメイン」は、ある特定の抗原に結合し得る任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」または「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、細胞内の生物学的過程の活性化または阻害を引き起こすシグナルを伝達するドメインとして機能することが公知である、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。ある特定の実施形態において、細胞内ドメインは、一次シグナル伝達ドメインに加えて、１つまたはそれを超える共刺激シグナル伝達ドメインを含み得るかあるいはそれらから本質的になり得るかまたはなおもさらにそれらからなり得る。「膜貫通ドメイン」は、細胞外ドメインとシグナル伝達ドメインとを連結するように機能し得る、細胞膜にまたがると知られている任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。キメラ抗原レセプターは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーとして働く「ヒンジドメイン」を必要に応じて含み得る。このようなドメインの非限定的な例は本明細書中で提供され、例えば：
ヒンジドメイン：ＩｇＧ１重鎖ヒンジコード配列：
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG
さらなる非限定的な例としては、当技術分野で公知のように、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＩｇＤおよびＣＤ８ドメインが挙げられる。
膜貫通ドメイン：ＣＤ２８膜貫通領域コード配列：
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
細胞内ドメイン：４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域コード配列：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
細胞内ドメイン：ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域コード配列：
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
細胞内ドメイン：ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域コード配列：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
【００７６】
例示的な各ドメイン構成要素のさらなる実施形態は、上に開示された核酸配列によってコードされるタンパク質と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他のタンパク質を含む。さらに、そのようなドメインの非限定的な例が、本明細書中に提供される。
【００７７】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤ８αヒンジドメイン」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＣＤ８αヒンジドメイン配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ヒト、マウスおよび他の種のＣＤ８αヒンジドメインの配列例は、Ｐｉｎｔｏ，Ｒ．Ｄ．ら（２００６）Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１１０：１６９−１７７に提供されている。ＣＤ８αヒンジドメインに関連する配列は、Ｐｉｎｔｏ，Ｒ．Ｄ．ら（２００６）Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１１０：１６９−１７７に提供されている。このようなものの非限定的な例としては、
ヒトＣＤ８アルファヒンジドメイン：
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
マウスＣＤ８アルファヒンジドメイン：
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY
ネコＣＤ８アルファヒンジドメイン：
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY
が挙げられる。
【００７８】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤ８α膜貫通ドメイン」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＣＤ８α膜貫通ドメイン配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ヒトＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖のアミノ酸位置１８３〜２０３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１７５９．３）、またはマウスＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖のアミノ酸位置１９７〜２１７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１０７４５７９．１）、およびラットＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖のアミノ酸位置１９０〜２１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿１１３７２６．１）に関連するフラグメント配列が、ＣＤ８α膜貫通ドメインのさらなる配列例を提供する。列挙された各アクセッション番号に関連する配列は、以下のとおり提供される：
ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
マウスＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：
IWAPLAGICVALLLSLIITLI  
ラットＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：
IWAPLAGICAVLLLSLVITLI
【００７９】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤ２８膜貫通ドメイン」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＣＤ２８膜貫通ドメイン配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＭ＿００６７１２８６２．２およびＸＭ＿００９４４４０５６．１に関連するフラグメント配列は、ＣＤ２８膜貫通ドメインのさらなる非限定的な配列例を提供する。列挙された各アクセッション番号に関連する配列は、本明細書中の上で言及された配列のとおり本明細書中で提供される。
【００８０】
本明細書中で使用されるとき、用語「４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるような４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、米国特許出願公開第２０１３０２６６５５１号（米国特許出願第１３／８２６，２５８号として出願）に提供されており、例えば、例示的な配列は下記に提供される：
４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
【００８１】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの配列例は、米国特許第５，６８６，２８１号；Ｇｅｉｇｅｒ，Ｔ．Ｌら、Ｂｌｏｏｄ  ９８：２３６４−２３７１（２００１）；Ｈｏｍｂａｃｈ，Ａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：６１２３−６１３１（２００１）；Ｍａｈｅｒ，Ｊら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：７０−７５（２００２）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｎ．Ｍら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５７８０−５７８６（２００２）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｎ．Ｍら、Ｂｌｏｏｄ  １００：３１５５−３１６３（２００２）に提供されている。非限定的な例としては、下記のＣＤ２８配列の残基１１４〜２２０：
【化１】
2021524731.tif 000003
およびその等価物が挙げられる。
【００８２】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、米国特許出願公開第２０１５／００１７１４１Ａ１号に提供されており、例示的なポリヌクレオチド配列を下記に提供する。
ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域コード配列：
【化２】
2021524731.tif 000004
【００８３】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、米国特許出願公開第２０１２／２０１４８５５２Ａ１号に開示されており、下記に提供される例示的な配列を含む。
ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域コード配列：
【化３】
2021524731.tif 000005
およびその等価物。
【００８４】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性あるいは９０％の配列同一性あるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの配列例は、米国特許第５，６８６，２８１号；Ｇｅｉｇｅｒ，Ｔ．Ｌら、（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：２３６４−２３７１；Ｈｏｍｂａｃｈ，Ａら、（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：６１２３−６１３１；Ｍａｈｅｒ，Ｊら、（２００２）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：７０−７５；Ｈａｙｎｅｓ，Ｎ．Ｍら、（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５７８０−５７８６（２００２）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｎ．Ｍら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ  １００：３１５５−３１６３に提供されている。非限定的な例としては、下記のコード配列の残基１１４〜２２０：
ＣＤ２８配列：
【化４】
2021524731.tif 000006
およびその等価物が挙げられる。
【００８５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン」とは、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、および本明細書中に示されるようなＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン配列と少なくとも７０％あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子のことを指す。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの非限定的な配列例は、米国特許出願ＵＳ１３／８２６，２５８号、例えば、
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
に提供されている。
【００８６】
本明細書中で使用されるとき、ＮＫＧ２Ｄという用語は、相当な関心を最近引き起こしている活性化受容体のことを指す。多くの「ＮＫＧ２Ｄ」標的リガンドが同定されている。これらの中で最も興味深いものは、ＭＩＣＡと称される密接に関連するタンパク質とＭＩＣＢ（主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ鎖関連）とのペアである。
【００８７】
本明細書中で使用されるとき、ＵＬＢＰという用語は、ｅＵＬ１６結合タンパク質ファミリーのメンバーのことを指す。
【００８８】
「組成物」は、一般に、活性な作用物質、例えば、化合物または組成物と、天然に存在するまたは天然に存在しない不活性な（例えば、検出可能な作用物質または標識）または活性なキャリア（例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなど）との組み合わせを意図しており、薬学的に許容され得るキャリアを含む。また、キャリアには、薬学的賦形剤および添加物であるタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および炭水化物（例えば、糖（単糖類、二糖類、三糖類、四糖類およびオリゴ糖を含む）；誘導体化糖（例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖など）；および多糖類または糖ポリマー）が含まれ、これらは、単独でまたは組み合わせて存在し得、単独でまたは組み合わせて１〜９９．９９重量％または容量％を構成する。例示的なタンパク質賦形剤としては、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが挙げられる。緩衝能としても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体構成要素としては、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。炭水化物賦形剤も、本技術の範囲内と意図されており、それらの例としては、単糖類（例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど）；二糖類（例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど）；多糖類（例えば、ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど）；およびアルジトール（例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール  ソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトール）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８９】
本明細書中で使用されるとき、用語「含む」は、組成物および方法が、列挙されるエレメントを含み、他のものを排除しないことを意味すると意図される。「〜から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用されるとき、意図される用途での組み合わせに対して、任意の本質的に重要な他のエレメントを排除することを意味するものとする。例えば、本明細書中で定義されるようなエレメントから本質的になる組成物は、単離方法および精製方法由来の微量の夾雑物および薬学的に許容され得るキャリア（例えば、リン酸緩衝食塩水、保存剤など）を排除しないであろう。「〜からなる」は、微量元素より多い他の成分を排除することおよび本明細書中に開示される組成物を投与するための実質的な方法工程を排除することを意味するものとする。これらの各移行語によって定義される態様は、本開示の範囲内である。
【００９０】
用語「コンセンサス配列」とは、本明細書中で使用されるとき、複数のひと続きの配列をアラインメントすることによって決定され、それらの複数の配列の対応する各位置において優勢なアミノ酸または塩基の選択肢に相当する理想的な配列を定義する、アミノ酸配列または核酸配列のことを指す。それらの複数のひと続きの配列の配列に応じて、それらのひと続きの配列に対するコンセンサス配列は、各配列に０個、１個、数個のまたはそれより多い置換だけ異なり得る。また、それらの複数のひと続きの配列の配列に応じて、それらのひと続きの配列に対して、１つより多いコンセンサス配列が決定され得る。コンセンサス配列の生成は、集中的な数学的解析にかけられた。様々なソフトウェアプログラムを使用して、コンセンサス配列が決定され得る。
【００９１】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＲＩＳＰＲ」とは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート経路に依拠する配列特異的遺伝子操作の技術のことを指す。ＣＲＩＳＰＲは、遺伝子編集および／または遺伝子調節を実施するために、ならびにタンパク質を特定のゲノム位置に単にターゲティングするために使用され得る。遺伝子編集は、ポリヌクレオチド配列への欠失、挿入または塩基置換の導入を介して、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を変化させる遺伝子工学の一種のことを指す。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換えの経路を利用して、編集を実施する。遺伝子調節は、タンパク質またはＲＮＡなどの特定の遺伝子産物の産生を増加または減少させることを指す。
【００９２】
本明細書中で使用されるとき、用語「ｇＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」とは、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いた修正のために特定の遺伝子をターゲティングするために使用されるガイドＲＮＡ配列のことを指す。標的特異性のためのｇＲＮＡおよびドナー治療用ポリヌクレオチドを設計する技術は、当技術分野で周知である。例えば、Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；３２（１２）：１２６２−７、Ｍｏｈｒ，Ｓら、（２０１６）ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２８３：３２３２−３８およびＧｒａｈａｍ，Ｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２０１５；１６：２６０を参照のこと。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む融合ポリヌクレオチド；またはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなる。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは合成のものである（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｍら、（２０１６）Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３３（２０１６）７４−８３）。本明細書中で使用されるとき、ｇＲＮＡの生物学的等価物としては、限定されないが、Ｃａｓ９またはその等価物を細胞のゲノムの特定の領域などの特定のヌクレオチド配列にガイドし得るポリヌクレオチドまたはターゲティング分子が挙げられる。
【００９３】
「細胞減少療法」は、本明細書中で使用されるとき、限定されないが、化学療法、凍結療法、および放射線療法を含む。細胞増殖を低減するように作用する薬剤は当技術分野で公知であり、広く使用されている。分裂する場合にのみ癌細胞を殺傷する化学療法薬は、細胞周期特異的と称される。これらの薬物は、トポイソメラーゼ阻害剤および代謝拮抗物質を含む、Ｓ期において作用する薬剤を含む。
【００９４】
トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素（トポイソメラーゼＩおよびＩＩ）の作用に干渉する薬物である。化学療法の過程において、トポイソメラーゼ酵素は、複製に必要なＤＮＡの構造の操作を制御し、したがって、細胞周期特異的である。トポイソメラーゼＩ阻害剤の例としては、上記で列挙したカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）類似体であるイリノテカンおよびトポテカンが挙げられる。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の例としては、アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、およびテニポシドが挙げられる。
【００９５】
代謝拮抗物質は通常、染色体の複製に関与する過程に干渉することが多い正常代謝基質の類似体である。それらは、周期内の極めて特異的な期にある細胞を攻撃する。代謝拮抗物質としては、葉酸アンタゴニスト、例えば、メトトレキサート；ピリミジンアンタゴニスト、例えば、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン（ｆｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン；プリンアンタゴニスト、例えば、６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニン；アデノシンデアミナーゼ阻害剤、例えば、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、およびペントスタチンなどが挙げられる。
【００９６】
植物アルカロイドは、ある特定の種類の植物に由来する。ビンカアルカロイドは、ツルニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅａ）の植物体から作られる。タキサンは、太平洋イチイ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｙｅｗ  ｔｒｅｅ）（ｔａｘｕｓ）の樹皮から作られる。ビンカアルカロイドおよびタキサンはまた、抗微小管剤としても公知である。ポドフィロトキシンは、ポドフィルムの植物体に由来する。カンプトテシン類似体は、アジア原産の「カンレンボク（Ｈａｐｐｙ  Ｔｒｅｅ）」（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ）に由来する。ポドフィロトキシンおよびカンプトテシン類似体はまた、トポイソメラーゼ阻害剤としても分類される。植物アルカロイドは一般に、細胞周期特異的である。
【００９７】
これらの薬剤の例としては、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビノレルビン；タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル；ポドフィロトキシン、例えば、エトポシドおよびテニポシド（ｔｅｎｉｓｏｐｉｄｅ）；ならびにカンプトテシン類似体、例えば、イリノテカンおよびトポテカンが挙げられる。
【００９８】
凍結療法としては、限定されないが、温度の低下、例えば、低温療法を伴う治療が挙げられる。
【００９９】
放射線療法としては、限定されないが、当技術分野で公知のように、放射線、例えば、電離放射線、ＵＶ放射線への曝露が挙げられる。例示的な投与量としては、限定されないが、少なくとも約２Ｇｙ〜約１０Ｇｙ以下の範囲の電離放射線の線量および／または少なくとも約５Ｊ／ｍ２〜約５０Ｊ／ｍ２以下の範囲の紫外放射線の線量、通常約１０Ｊ／ｍ２が挙げられる。
【０１００】
本明細書中で使用されるとき、用語「検出可能なマーカー」とは、検出可能なシグナルを直接または間接的に生成することができる少なくとも１つのマーカーのことを指す。このマーカーの非網羅的リストとしては、例えば、比色、蛍光、ルミネセンス（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、発色団（例えば、蛍光色素、発光色素）、電子顕微鏡法または電気的特性（例えば、導電率、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、インピーダンス）によって検出される電子密度を有する基、検出可能な基（例えば、物理的特性および／または化学的特性の検出可能な改変を誘導するのに十分なサイズの分子を有するもの）によって検出可能なシグナルを生成する酵素が挙げられ、そのような検出は、光学的方法（例えば、回折、表面プラズモン共鳴、表面変化（ｓｕｒｆａｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）、接触角変化）または物理的方法（例えば、原子間力分光法、トンネル効果）または放射性分子（例えば、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）によって達成され得る。
【０１０１】
「有効量」または「効果的な量」とは、哺乳動物または他の被験体を処置するために投与されたとき、疾患に対してそのような処置をもたらすのに十分である、ある作用物質の量または２つもしくはそれを超える作用物質の合計量のことを指す。「有効量」は、そ（れら）の作用物質、疾患およびその重症度、ならびに処置される被験体の年齢、体重などに応じて変動する。
【０１０２】
用語「コードする」とは、この用語が核酸配列に適用されるとき、天然の状態であっても、当業者に周知の方法によって操作されたときであっても、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドであって、転写および／または翻訳されてポリペプチドおよび／またはそのフラグメントに対するｍＲＮＡを生成し得るポリヌクレオチドのことを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補鎖であり、コード配列は、それから推定され得る。
【０１０３】
本明細書中で使用されるとき、用語「エンハンサー」は、本明細書中で使用されるとき、発現される核酸配列に対する位置および向きに関係なく核酸配列の転写を増強するか、改善するかまたは回復させる配列エレメントを表す。エンハンサーは、単一のプロモーターからの転写または同時に１つより多いプロモーターからの転写を高め得る。転写を改善するというこの機能が保持されるかまたは実質的に保持される限り（例えば、野生型の活性、すなわち、完全長配列の活性の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）、野生型エンハンサー配列の任意の切断された、変異されたまたはその他の方法で改変されたバリアントも、上記の定義の範囲内である。
【０１０４】
１つの態様において、抗体の「等価物」または「生物学的等価物」という用語は、ＥＬＩＳＡまたは他の好適な方法によって測定される、抗体がそのエピトープタンパク質またはそのフラグメントに選択的に結合する能力を意味する。生物学的に等価な抗体としては、参照抗体と同じエピトープに結合する、抗体、ペプチド、抗体フラグメント、抗体バリアント、抗体誘導体および抗体模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
別段意図されない限り、本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関するとき、そのようなものの等価物または生物学的等価物は、本開示の範囲内であると意図されることが、明示的な詳説なしに推測されるべきである。本明細書中で使用されるとき、用語「その生物学的等価物」は、参照タンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸に言及しているとき、「その等価物」と同義であると意図されており、所望の構造または機能性をなおも維持しつつ、最小の相同性を有するものを意図している。明確に本明細書中に列挙されない限り、本明細書中に言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、それらの等価物も含むと企図される。例えば、ある等価物は、少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性、あるいは少なくとも約８５％あるいは少なくとも約９０％あるいは少なくとも約９５％あるいは９８％のパーセント相同性または同一性を意図し、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と実質的に等価な生物学的活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドについて言及しているとき、その等価物は、ストリンジェントな条件下において参照ポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【０１０６】
別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、アラインメントされたとき、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）がそれらの２つの配列を比較したとき同じであることを意味する。アラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ  ７．７．１に記載されているものを用いて決定され得る。好ましくは、デフォルトのパラメータが、アラインメントに使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータを用いるＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；選別＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴに見られる。
【０１０７】
本明細書中で使用されるとき、用語「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスのことを指す。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルが、細胞サンプル中または組織サンプル中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を計測することによって測定され得る。１つの態様では、１つのサンプル由来のある遺伝子の発現レベルは、コントロールサンプルまたは参照サンプル由来のその遺伝子の発現レベルと直接比較され得る。別の態様では、１つのサンプル由来のある遺伝子の発現レベルは、化合物を投与した後の同じサンプル由来のその遺伝子の発現レベルと直接比較され得る。
【０１０８】
句「一次」または「二次」または「三次」とは、患者が受ける処置の順序のことを指す。一次治療レジメンは、最初に行う処置であるのに対して、二次または三次治療は、それぞれ一次治療の後または二次治療の後に行われる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、一次治療を「ある疾患または症状に対する最初の処置」と定義している。癌を有する患者では、主要な処置は、手術、化学療法、放射線療法またはこれらの治療の組み合わせであり得る。一次治療は、当業者には「主な治療および主な処置」とも称されている。２００８年５月１日に最後に訪れたＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照のこと。一般的には、ある患者が一次治療に対してポジティブな臨床反応もしくは亜臨床（ｓｕｂ−ｃｌｉｎｉｃａｌ）反応を示さなかったかまたは一次治療が停止されたことを理由に、その後、その患者には化学療法レジメンが行われる。
【０１０９】
本明細書中で使用されるとき、「相同性」もしくは「同一」、パーセント「同一性」または「類似性」は、２つまたはそれを超える核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において使用されるとき、同じである２つもしくはそれを超える配列もしくは部分配列について言及しているか、または特定の領域にわたって特定のパーセンテージのヌクレオチドもしくはアミノ酸残基が同じである、例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える同一性を有する、２つもしくはそれを超える配列もしくは部分配列について言及している（例えば、本明細書中に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書中に記載される抗体のアミノ酸配列）。相同性は、比較目的でアラインメントされ得る各配列における位置を比較することによって決定され得る。比較される配列におけるある位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占められているとき、それらの分子は、その位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列が共有する一致の数または相同な位置の数の関数である。アラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ  ７．７．１に記載されているものを用いて決定され得る。好ましくは、デフォルトのパラメータが、アラインメントに使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータを用いるＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；選別＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴに見られる。用語「相同性」または「同一」、パーセント「同一性」または「類似性」は、試験配列の相補鎖にも言及するか、または試験配列の相補鎖にも適用され得る。それらの用語は、欠失および／または付加を有する配列ならびに置換を有する配列も含む。本明細書中に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを説明し得る。好ましくは、少なくとも約２５アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは少なくとも５０〜１００アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、同一性が存在する。「無関係な」または「非相同」配列は、本明細書中に開示される配列のうちの１つと４０％未満の同一性あるいは２５％未満の同一性を共有する。
【０１１０】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたはそれを超えるポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応のことを指す。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン結合によってまたは他の任意の配列特異的様式で生じ得る。その複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本またはそれを超える鎖、自己ハイブリダイズしている１本の鎖またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始などのより大きなプロセスまたはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断における工程を構成し得る。
【０１１１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては：約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣの洗浄液が挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては：約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては：約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄液が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分〜２４時間であり、１回、２回またはそれを超える洗浄工程を伴い、洗浄インキュベーション時間は、約１、２または１５分である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を用いるＳＳＣの等価物も使用され得ると理解される。
【０１１２】
用語「単離された」とは、本明細書中で使用されるとき、他の材料を実質的に含まない分子または生物製剤または細胞材料のことを指す。１つの態様において、用語「単離された」とは、天然の起源に存在する他のＤＮＡもしくはＲＮＡまたはタンパク質もしくはポリペプチドまたは細胞もしくは細胞小器官または組織もしくは器官からそれぞれ分離された、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、抗体またはその誘導体）または細胞もしくは細胞小器官または組織もしくは器官のことを指す。用語「単離された」とは、組換えＤＮＡ法によって生成されるとき、細胞材料、ウイルス材料もしくは培養液を実質的に含まない核酸もしくはペプチド、または化学的に合成されるとき化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸もしくはペプチドのことも指す。さらに、「単離された核酸」は、フラグメントとしては天然に存在せず、天然の状態で見られない、核酸フラグメントを含むと意味される。用語「単離された」は、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドのことを指すためにも本明細書中で使用され、精製されたポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含すると意味される。用語「単離された」は、他の細胞または組織から単離された細胞または組織のことを指すためにも本明細書中で使用され、培養された細胞または組織と操作された細胞または組織の両方を包含すると意味される。
【０１１３】
本明細書中で使用されるとき、用語「単離された細胞」とは一般に、組織の他の細胞から実質的に分離された細胞のことを指す。
【０１１４】
「免疫細胞」には、例えば、骨髄において産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）および骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。  
【０１１５】
本明細書中で使用されるとき、用語「リンカー配列」とは、１〜１０回あるいは１〜約８回あるいは１〜約６回あるいは約５もしくは４回あるいは３回あるいは２回反復され得る１〜１０あるいは８アミノ酸あるいは６アミノ酸あるいは５アミノ酸を含む任意のアミノ酸配列に関する。例えば、リンカーは、３回反復されるペンタペプチドからなる、最大で１５アミノ酸残基を含み得る。１つの態様において、リンカー配列は、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒの３つのコピーを含む、（グリシン４セリン）３の可撓性ポリペプチドリンカーである。
【０１１６】
「腫瘍組織タイプに対応する正常細胞」とは、腫瘍組織と同じ組織タイプ由来の正常細胞のことを指す。非限定的な例は、肺腫瘍を有する患者由来の正常な肺細胞または結腸腫瘍を有する患者由来の正常な結腸細胞である。
【０１１７】
本明細書中で使用されるとき、用語「Ｔ細胞」とは、胸腺において成熟するリンパ球の１種のことを指す。Ｔ細胞は、細胞性免疫において重要な役割を果たし、細胞表面上のＴ細胞レセプターの存在によってＢ細胞などの他のリンパ球と区別される。Ｔ細胞は、単離され得るか、または商業的に入手可能な供給源から入手され得る。「Ｔ細胞」には、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびガンマ−デルタＴ細胞をはじめとした、ＣＤ３を発現しているすべてのタイプの免疫細胞が含まれる。「細胞傷害性細胞」には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および好中球が含まれ、これらの細胞は、細胞傷害性の応答を媒介することができる。商業的に入手可能なＴ細胞株の非限定的な例としては、株ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２ＴＭ）、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００ＴＭ）、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１ＴＭ）、ＢＣＬ２  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９ＴＭ）、Ｎｅｏ  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８ＴＭ）、ＴＡＬＬ−１０４細胞傷害性ヒトＴ細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１１３８６）が挙げられる。さらなる例としては、成熟したＴ細胞株、例えば、Ｄｅｇｌｉｓ、ＥＢＴ−８、ＨＰＢ−ＭＬｐ−Ｗ、ＨＵＴ７８、ＨＵＴ１０２、Ｋａｒｐａｓ３８４、Ｋｉ２２５、Ｍｙ−Ｌａ、Ｓｅ−Ａｘ、ＳＫＷ−３、ＳＭＺ−１およびＴ３４；および未熟なＴ細胞株、例えば、ＡＬＬ−ＳＩＬ、Ｂｅ１３、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＭＬ−Ｔ１、ＤＮＤ−４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ−９、ＨＤ−Ｍａｒ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｈ−ＳＢ２、ＨＴ−１、ＪＫ−Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ４５、ＫＥ−３７、ＫＯＰＴ−Ｋ１、Ｋ−Ｔ１、Ｌ−ＫＡＷ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ−１、ＭＯＬＴ３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ１３、ＭＯＬＴ−１６、ＭＴ−１、ＭＴ−ＡＬＬ、Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐｅｅｒ、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ−２５５、ＰＦ−３８２、ＰＦＩ−２８５、ＲＰＭＩ−８４０２、ＳＴ−４、ＳＵＰ−Ｔ１〜Ｔ１４、ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ−１０１、ＴＡＬＬ−１０３／２、ＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０５、ＴＡＬＬ−１０６、ＴＡＬＬ−１０７、ＴＡＬＬ−１９７、ＴＫ−６、ＴＬＢＲ−１、−２、−３および−４、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＣＣＬ−１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８７３）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＲＭ−ＣＣＬ−１１９）；および皮膚Ｔ細胞性リンパ腫株、例えば、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ  ＣＲＭ−ＴＩＢ−１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１６２）が挙げられるがこれらに限定されない。Ｋ５６２赤白血病、ＴＨＰ−１単球性白血病、Ｕ９３７リンパ腫、ＨＥＬ赤白血病、ＨＬ６０白血病、ＨＭＣ−１白血病、ＫＧ−１白血病、Ｕ２６６���エローマなどの他の白血病およびリンパ腫に由来する細胞株と同様に、ＲＥＨ、ＮＡＬＬ−１、ＫＭ−３、Ｌ９２−２２１を含むがこれらに限定されないヌル白血病細胞株も、免疫細胞の別の商業的に入手可能な起源である。このような市販の細胞株の非限定的な例示的供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、すなわちＡＴＣＣ，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が挙げられる。
【０１１８】
本明細書中で使用されるとき、ナチュラルキラー細胞としても公知の用語「ＮＫ細胞」とは、骨髄に由来し、生得性免疫系において極めて重要な役割を果たすリンパ球の種類のことを指す。ＮＫ細胞は、抗体および細胞表面上の主要組織適合性複合体の非存在下であってもなお、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、またはストレスを受けた他の細胞に対して、迅速な免疫反応を提供する。ＮＫ細胞は、単離され得るか、または商業的に入手可能な供給源から入手され得る。市販のＮＫ細胞株の非限定的な例としては、株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７ＴＭ）、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８ＴＭ）が挙げられる。さらなる例としては、ＮＫ株ＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ−１、ＮＫＬ、ＮＫ−ＹＳ、ＮＯＩ−９０およびＹＴが挙げられるがこれらに限定されない。そのような商業的に入手可能な細胞株の非限定的な例示的な供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が挙げられる。
【０１１９】
調節性ポリヌクレオチドに関して本明細書中で使用されるとき、用語「作動可能に連結された」とは、調節性ポリヌクレオチドと、それが連結されるポリヌクレオチド配列との会合であって、特異的なタンパク質が、調節性ポリヌクレオチドに結合すると、連結されたポリヌクレオチドが転写されるような会合のことを指す。
【０１２０】
本明細書中で使用されるとき、細胞、組織または器官に関する用語「過剰発現する」は、コントロール細胞、コントロール組織（ｉｓｓｕｅ）または器官において産生される量を超える量までのタンパク質を表現している。過剰発現されるタンパク質は、宿主細胞にとって内在性であり得るか、または宿主細胞にとって外来性であり得る。
【０１２１】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、任意の長さの多量体型のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかまたはそれらのアナログのヌクレオチドのことを指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を発揮し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在する場合、ポリヌクレオチドの組み立ての前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合体化などによって重合後にさらに修飾され得る。また、この用語は、二本鎖分子と一本鎖分子の両方のことを指す。別段特定されないかまたは要求されない限り、ポリヌクレオチドであるこの技術の任意の態様は、二本鎖型と、二本鎖型を構成すると知られているかまたは予測される２本の相補的な各一本鎖型との両方を包含する。
【０１２２】
本明細書中で使用されるとき、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は、任意の長さの多量体型のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドのことを指すために交換可能に使用される。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖または多重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン塩基およびピリミジン塩基あるいは他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然のまたは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
本明細書中で使用されるとき、用語「プロモーター」とは、遺伝子などのコード配列の発現を調節する任意の配列のことを指す。プロモーターは、例えば、構成性、誘導性、抑制性または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、転写の開始および速度を制御するポリヌクレオチド配列の領域である調節配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および調節分子が結合し得る遺伝的エレメントを含み得る。プロモーターの非限定的な例としては、ＥＦ１アルファプロモーターおよびＣＭＶプロモーターが挙げられる。ＥＦ１アルファ配列は当技術分野で公知である（例えば、ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１１１５４／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／；ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／Ｊ０４６１７（２０１９年３月１３日にそれぞれ最終アクセス）およびＺｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｂａｕｍ（２０１４）Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１１（５）：４０４−４０８を参照のこと）。ＣＭＶプロモーター配列は当技術分野で公知である（例えば、ｓｎａｐｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｌａｓｍｉｄ−ｆｉｌｅｓ／？ｓｅｔ＝ｂａｓｉｃ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ｖｅｃｔｏｒｓ＆ｐｌａｓｍｉｄ＝ＣＭＶ＿ｐｒｏｍｏｔｅｒ（２０１９年３月１３日に最終アクセス）およびＺｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｂａｕｍ（２０１４）、前掲を参照のこと）。
【０１２４】
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、その最も広い意味で交換可能に使用され、２つまたはそれを超えるサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣物の化合物のことを指す。それらのサブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の態様において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル結合、エーテル結合などによって連結され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならないが、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書中で使用されるとき、用語「アミノ酸」とは、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸のことを指し、それらには、グリシンおよびＤ光学異性体とＬ光学異性体の両方、アミノ酸アナログならびにペプチド模倣物が含まれる。
【０１２５】
本明細書中で使用されるとき、用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、相対的な用語と意図されている。したがって、例えば、精製された核酸、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体または他の活性な化合物は、タンパク質または他の夾雑物から全体的または部分的に単離されたものである。一般に、実質的に精製されたペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または本開示の範囲内で使用するための他の活性な化合物は、治療的投与用の完全な薬学的製剤における、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体または他の活性な化合物と、薬学的キャリア、賦形剤、緩衝剤、吸収促進剤、安定剤、保存剤、アジュバントまたは他の副成分（ｃｏ−ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）との混合または製剤化の前の調製物に存在するすべての高分子種の８０％超を構成する。より一般的には、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体または他の活性な化合物は、他の製剤成分との混合の前の精製された調製物に存在するすべての高分子種の９０％超、しばしば９５％超になるように精製される。他の場合、精製された調製物は、本質的に均一であり得、ここで、他の高分子種は、従来の手法では検出不可能である。
【０１２６】
本明細書中で使用されるとき、用語「精製マーカー」とは、精製または識別に有用な少なくとも１つのマーカーのことを指す。このマーカーの非網羅的リストとしては、Ｈｉｓ、ｌａｃＺ、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＢＣＣＰ、ｃ−ｍｙｃ、ＣａＭ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｃｈｅｒｒｙ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５、Ｓｎａｐ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、ＳｔｒｅｐまたはＳ−タンパク質が挙げられる。好適な直接的または間接的な蛍光マーカーとしては、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｃｈｅｒｒｙ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＮＰ、ＡＭＣＡ、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｔａｍｒａ、テキサスレッド、ローダミン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣまたは他の任意の蛍光色素もしくはハプテンが挙げられる。
【０１２７】
本明細書中で使用されるとき、用語「組換えタンパク質」とは、組換えＤＮＡ法によって作製されたポリペプチドのことを指し、ここで、一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、好適な発現ベクターに挿入され、そしてそれを用いて宿主細胞を形質転換して、異種タンパク質が生成される。
【０１２８】
本明細書中で使用されるとき、用語「特異的結合」は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性での抗体と抗原との接触を意味する。ある特定の態様において、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍの親和性で結合する。
【０１２９】
「固形腫瘍」は、通常は嚢胞または液体領域を含有しない異常な組織塊である。固形腫瘍は、良性または悪性、転移性または非転移性であり得る。種々のタイプの固形腫瘍が、それらを形成する細胞のタイプにちなんで命名されている。固形腫瘍の例としては、肉腫、癌腫およびリンパ腫が挙げられる。
【０１３０】
本明細書中で使用されるとき、用語「自殺遺伝子」とは、細胞アポトーシスを誘導することができる遺伝子である；非限定的な例としては、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシルエステラーゼ、シトクロムＰ４５０もしくはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、切断型ＥＧＦＲまたは誘導性カスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）が挙げられる。自殺遺伝子は、様々な経路に沿って機能し得、いくつかの場合では、小分子などの誘導剤により誘導可能であり得る。例えば、ｉＣａｓｐ自殺遺伝子は、誘導剤に結合するように最適化されたタンパク質に作動可能に連結されたカスパーゼタンパク質の一部を含む；自殺遺伝子を含む細胞への誘導剤の導入は、カスパーゼの活性化およびそれに続いて前記細胞のアポトーシスをもたらす。
【０１３１】
用語「形質導入する」または「形質導入」とは、この用語がキメラ抗原レセプター細胞の作製に適用されるとき、外来ヌクレオチド配列を細胞に導入するプロセスのことを指す。いくつかの実施形態において、この形質導入は、ベクターを介して行われる。
【０１３２】
本明細書中で使用されるとき、被験体において疾患を「処置する」または被験体における疾患の「処置」とは、（１）疾患にかかりやすい被験体または疾患の症候をまだ示していない被験体においてその症候または疾患の発生を予防すること；（２）疾患を阻害することまたはその発症を阻止すること；または（３）疾患または疾患の症候を回復させるかまたは後退させることを指す。当該分野で理解されているように、「処置」は、有益な結果または所望の結果（臨床結果を含む）を得るためのアプローチである。本技術の目的のために、有益な結果または所望の結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかを問わず、１つまたはそれを超える症候の軽減または回復、症状（疾患を含む）の程度の低下、症状（疾患を含む）の安定した（すなわち、悪化しない）状態、症状（疾患を含む）の遅延または緩徐化、症状（疾患を含む）の進行、回復または寛解、過程および緩解（部分的であるか全体的であるかを問わない）のうちの１つまたはそれを超えるものが挙げられ得るが、これらに限定されない。開示される組成物および方法を含有する処置は、一次、二次、三次、四次、五次療法であり得、単独療法として、または他の適切な治療と組み合わせて使用されることが意図される。１つの態様において、用語「処置」または「処置する」は、予防または予防法を除外する。
【０１３３】
本明細書中で使用されるとき、用語「ベクター」とは、種々の宿主間を移動するようにデザインされた（ｄｅｉｇｎｅｄ）核酸構築物のことを指し、それらとしては、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣなどが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターは、商業的に入手可能なベクターから調製され得る。他の実施形態において、ウイルスベクターは、当該分野で公知の手法に従って、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶなどから作製され得る。１つの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【０１３４】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＮＫＧ２Ｄ」とは、Ｃ型レクチン様受容体のＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリーに属する膜貫通タンパク質であって、ＮＫ遺伝子複合体に位置する遺伝子ＫＬＲＫ１遺伝子および／またはその生物学的等価物によりコードされる膜貫通タンパク質のことを指す。このタンパク質または基礎遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ  Ｃａｒｄｓ  ＩＤ：ＧＣ１２Ｍ０１１７２８、ＨＧＮＣ：１８７８８、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：２２９１４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１３８０９、ＯＭＩＭ：６１１８１７およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２６７１８（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）に見られ得る。
【０１３５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＢＣＭＡ」および「Ｂ細胞成熟抗原」とは、ＴＮＦスーパーファミリーに属するタンパク質であって、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）を認識し、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子によりコードされるタンパク質のことを指すために互換的に使用される。このタンパク質または基礎遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ  Ｃａｒｄｓ  ＩＤ：ＧＣ１６Ｐ０１２０５８、ＨＧＮＣ：１１９１３、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：６０８、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００４８４６２、ＯＭＩＭ：１０９５４５およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０２２２３（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）に見られ得る。
【０１３６】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＳＬＡＭＦ７」、「ＣＳ１」および「ＣＤ３１９」とは、多発性骨髄腫における正常形質細胞および悪性形質細胞の強力なマーカーであることが公知のタンパク質であって、ＳＬＡＭＦ７遺伝子によりコードされるタンパク質のことを指すために互換的に使用される。このタンパク質または基礎遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ  Ｃａｒｄｓ  ＩＤ：ＧＣ０１Ｐ１６０７０９、ＨＧＮＣ：２１３９４、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：５７８２３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００２６７５１、ＯＭＩＭ：６０６６２５およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＱ２５（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）に見られ得る。
【０１３７】
各上記ＧｅｎＢａｎｋ受託番号および参考文献に関連する配列は、参照により本明細書中に組み入れられる。
【０１３８】
開示の実施様式
癌治療剤としての、免疫調節性分子の投与が追求されている。しかしながら、全身投与に随伴する重度の副作用（Ｇｉｏｖａｒｅｌｌｉ，Ｍら、（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３２００−３２０６；Ｌａｓｅｋ，Ｗら、（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６３：４１９−４３５）のために、有効な免疫反応を達成するために、対象となる腫瘍内で、高濃度のこれらの免疫調節性分子を得ることは困難であった。
【０１３９】
遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞による自己処置を使用して、Ｂ細胞性リンパ腫および白血病において最近得られつつある、いまだかつてない結果（Ｍａｕｄｅ，Ｓ．Ｌら、（２０１４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７１：１５０７−１５１７；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌら、（２０１１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５−７３３）のために、いくつかの研究室が、この手法を、卵巣癌、前立腺癌、および膵臓腫瘍を含む固形腫瘍に適用し始めている。ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、モノクローナル抗体の、ＨＬＡに依存しないターゲティング特異性を、活性化Ｔ細胞の、細胞溶解活性、増殖、およびホーミング特性と組み合わせるが、チェックポイント抑制に応答しない。抗原を発現する標的を直接殺傷するそれらの能力のために、ＣＡＲＴ細胞は、任意の抗原陽性細胞または組織に対して高度に毒性であることから、高度に腫瘍特異的な抗体を伴うＣＡＲを構築することが要件となっている。これまでに、ヒト固形腫瘍に対するＣＡＲ改変Ｔ細胞は、α−葉酸受容体、メソテリン、およびＭＵＣ−ＣＤ、ＰＳＭＡ、ならびに他の標的に対して構築されているが、大半は、正常組織内で、ある程度の抗原オフターゲット発現を示す。これらの構築物は、患者において、同じ例外的な結果を示していないことから、固形腫瘍に対して使用し得る、新規の標的およびＣＡＲＴ細胞の構築法を同定するためのさらなる研究に対する必要が強調される。
【０１４０】
したがって、本開示は、癌または腫瘍抗原に特異的な結合ドメイン（これは、いくつかの態様において、抗ＢＣＭＡ抗体の抗原結合ドメインである）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、腫瘍または癌抗原をターゲティングして可溶性抗体フラグメントを分泌するＢｓＡ−ＣＡＲ細胞をコードするベクター、ならびにその使用および生産に関する方法および組成物を提供する。
【０１４１】
キメラ抗原受容体およびそれらの使用
構成要素
本開示は、癌または腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、細胞外、膜貫通および細胞内ドメインを含む細胞活性化部分を含むかまたはそれらから本質的になるかまたはそれらからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント（そうでない場合は抗原結合ドメインと称される）を含む。細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびゼータ鎖部分を含む。ＣＡＲは、必要に応じて、最大３００アミノ酸、好ましくは、１０〜１００アミノ酸、より好ましくは、２５〜５０アミノ酸のスペーサードメインをさらに含み得る。
【０１４２】
スペーサードメイン。ＣＡＲは、最大３００アミノ酸、好ましくは１０〜１００アミノ酸、より好ましくは２５〜５０アミノ酸のスペーサードメインを必要に応じてさらに含み得る。例えば、スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０アミノ酸であり得る。スペーサードメインは、例えば、ヒトＦｃドメインの一部、ＣＨ３ドメイン、または任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのヒンジ領域、またはそれらの変異体を含み得る。例えば、いくつかの実施形態は、（カバットナンバリングによる）Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅおよび／またはＮ２９７Ｑ突然変異を有するまたは有しないＩｇＧ４ヒンジを含み得る。さらなるスペーサーとしては、限定されないが、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域が挙げられる。
【０１４３】
抗原結合ドメイン。ある特定の態様において、本開示は、癌または腫瘍抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなるＣＡＲを提供する。抗原結合ドメインは、任意の適切な種、例えばマウス、ヒトまたはヒト化配列に由来し得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗ＢＣＭＡ抗体またはＢＣＭＡ関連抗原に結合する抗体の抗原結合ドメインを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもそれらからなる。これらの抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体は市販されている。抗原結合ドメインは、任意の適切な種、例えばマウス、ヒトまたはヒト化配列に由来し得る。１つの態様において、抗原結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）および／またはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、および／またはそれらの各々の等価物を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、標的特異的抗体（すなわち、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）および／またはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）、および／またはそれらの各々の等価物に対する抗体）のフラグメントを含むか、それからなるかまたはそれから本質的になる。ｓｃＦｖ領域は、短いリンカーペプチドで接続された免疫グロブリンの重（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域を含み得る。リンカーペプチドは、１〜５０アミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーはグリシンリッチであるが、それはまたセリンまたはトレオニンを含有し得る。
【０１４５】
本開示の別の態様において、癌または腫瘍抗体の抗原結合性ドメインは、以下の特徴：
（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のいずれかの軽鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８０％同一である１つまたはそれを超えるＣＤＲを含むこと；
（ｂ）重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のいずれかの重鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８０％同一である１つまたはそれを超えるＣＤＲを含むこと；
（ｃ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のいずれかの軽鎖可変ドメインと少なくとも８０％同一であること；
（ｄ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のいずれかの重鎖可変ドメインと少なくとも８０％同一であること；および
（ｅ）抗体が、開示される配列のいずれかが結合するエピトープと重なり合うエピトープに結合すること
の１つまたはそれよりも多くを含む。
【０１４６】
等価物のさらなる例としては、ペプチドに対して少なくとも８５％あるいは少なくとも９０％あるいは少なくとも９５％あるいは少なくとも９７％のアミノ酸同一性を有するペプチド、または抗原結合性ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体と、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが挙げられ、高ストリンジェンシーの条件は、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１倍濃度のＳＳＣ〜約０．１倍濃度のＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１倍濃度のＳＳＣ、０．１倍濃度のＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。
【０１４７】
膜貫通ドメイン。膜貫通ドメインは、天然の起源または合成の起源のいずれかに由来し得る。起源が天然である場合、そのドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してもよい。本開示において特に有用な膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＣＲに由来し得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。好ましくは、合成の膜貫通ドメインの各末端には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが見られる。必要に応じて、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは、２〜１０アミノ酸長が、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に連結を形成し得る。グリシン−セリンのダブレットは、特に安定したリンカーを提供する。
【０１４８】
細胞質ドメイン。ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置された免疫細胞の少なくとも１つの従来のエフェクター機能の活性化に関与する。細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能のシグナルを伝達し、免疫細胞に対して特定の機能を発揮するように指示するタンパク質の一部分のことを指す。シグナル伝達ドメイン全体を使用してもよいし、シグナル伝達ドメインの切断された部分がエフェクター機能のシグナルを伝達するのに十分である限り、その切断された部分を使用してもよい。ＴＣＲおよびコレセプターならびにそれらの誘導体またはバリアントの細胞質の配列が、ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインとして機能し得る。本開示において特に有用な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲ、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄに由来し得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み得る。
【０１４９】
ＴＣＲを通じて生成されるシグナルは、単独では、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であるので、２次シグナルまたは共刺激シグナルも必要とされ得る。したがって、共刺激シグナル伝達分子（タンパク質ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３の細胞内ドメインまたはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含むがこれらに限定されない）の細胞内領域も、ＣＡＲの細胞質ドメインに含められ得る。例えば、ＣＡＲは、シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）に加えて、１つ、２つまたはそれを超える共刺激ドメインを含み得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体の細胞活性化部分は、ＣＤ８タンパク質、ＣＤ２８タンパク質、４−１ＢＢタンパク質、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ３−ゼータタンパク質からなる群より選択される１つまたはそれを超えるタンパク質またはそのフラグメントを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなるＴ細胞シグナル伝達ドメインである。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターの細胞活性化部分は、ＣＤ８タンパク質、ＣＤ２８タンパク質、４−１ＢＢタンパク質およびＣＤ３−ゼータタンパク質からなる群より選択される１つまたはそれを超えるタンパク質またはそのフラグメントを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなるＴ細胞シグナル伝達ドメインである。
【０１５２】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、癌または腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもそれらからなる。さらなる実施形態において、共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域のいずれかまたは両方を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、検出可能マーカーまたは精製マーカーをさらに含み得る。別の態様において、本明細書中に記載されるＣＡＲは、組成物中、例えば、診断または治療のための薬学的に許容され得る担体中に含有される。
【０１５４】
スイッチ機構。いくつかの実施形態において、ＣＡＲはまた、ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチ機構を含み得る。例えば、ＣＡＲは、細胞外、膜貫通および細胞内ドメインを含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得、細胞外ドメインは、標識結合ドメインに結合する標的特異的結合エレメント、または標的細胞上でもしくはそれにより発現される標的抗原以外の分子に特異的なタグを含む。このような実施形態において、ＣＡＲの特異性は、標的抗原結合ドメインと、標識結合ドメインまたはＣＡＲ上のタグにより認識されるかまたはそれに結合するドメインとを含むか、それらからなるかまたはそれらから本質的になる第２の構築物により提供される。例えば、国際公開第２０１３／０４４２２５号、国際公開第２０１６／０００３０４号、国際公開第２０１５／０５７８３４号、国際公開第２０１５／０５７８５２号、国際公開第２０１６／０７００６１号、米国特許第９，２３３，１２５号、米国特許出願公開第２０１６／０１２９１０９号を参照のこと。このようにして、ＣＡＲを発現するＴ細胞は被験体に投与され得るが、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインを含む第２の組成物が投与されるまで、それは、その標的抗原（すなわち、ＢＣＭＡ）に結合し得ない。
【０１５５】
同様に、本開示のＣＡＲは、それらの機能を活性化するために多量体化（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３６８３４２号、米国特許出願公開第２０１６／０１７５３５９号、米国特許出願公開第２０１５／０３６８３６０号を参照のこと）、および／またはＴ細胞応答を誘発するために外因性シグナル、例えば小分子薬物（米国特許出願公開第２０１６／０１６６６１３号、Ｙｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５）を必要とする。
【０１５６】
さらに、開示されるＣＡＲは、処置後にＣＡＲ細胞の細胞死を誘導するために（Ｂｕｄｄｅｅら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１３）、または標的抗原への結合後にＣＡＲの発現をダウンレギュレートするために（ＷＯ２０１６／０１１２１０）、「自殺スイッチ」（「自殺遺伝子」とも称される）を含み得る。非限定的な例示的な自殺スイッチまたは自殺遺伝子はｉＣａｓｐである。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、検出可能マーカーまたは精製マーカーをさらに含み得る。別の態様において、本明細書中に記載されるＣＡＲは、組成物、例えば、診断または治療のための薬学的に許容され得る担体に含まれる。
【０１５８】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲの腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメインは、リンカーペプチドにより必要に応じて連結された重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、重および／または軽鎖可変領域は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）および／またはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）、および／またはそれらの各々の等価物のいずれかに対する抗体の関連ＣＤＲ領域を含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。１つの態様において、腫瘍ターゲティング抗体は、ＢＣＭＡをターゲティングする。ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に位置するリンカーポリペプチドをさらに含むかあるいはそれからさらに本質的になるかまたはさらにそれからなる。ある特定の実施形態において、リンカーはグリシン−セリンリンカーである。さらなる実施形態において、リンカーポリペプチドは、配列（グリシン−セリン）ｎ（ｎは、１〜６の整数である）を含むかあるいはそれから本質的になるかまたはさらにそれからなる。
【０１５９】
ＣＡＲ構築物をコードする単離された核酸も提供される。核酸は、必要な調節配列、例えば、宿主細胞、例えば哺乳動物またはヒト宿主細胞、例えばＴ細胞における発現のためのプロモーターをさらに含み得る。１つの態様において、プロモーターは、ＣＭＶ、ＭＮＤまたはＥＦ１アルファプロモーターである。さらなる態様において、ＣＡＲポリヌクレオチドは、コードポリヌクレオチドの５’側に位置する第２のプロモーターエレメント、例えばＣＭＶ、ＭＮＤおよびＥＦ１Ａプロモーターから調節され得るマーカーペプチド（例えば、ＧＦＰ）をさらに含む。１つの態様において、第２のプロモーターは、ＥＦ１アルファプロモーターを含む。当業者に明らかであるように、プロモーターは宿主発現系のために選択され、宿主および発現ベクターおよび目的の使用により変動するであろう。
【０１６０】
単離された核酸は、発現ベクター、例えばレンチウイルスベクターもしくはレトロウイルスベクター（５’および３’ＬＴＲの間）、またはアデノウイルスベクター、または遺伝子を発現し得る他の任意のベクターに挿入され得る。図１Ａは、本開示の例示的な構築物である。明らかであるように、ヒト患者において臨床的に使用される場合、マーカーまたは精製タグは構築物から省略されるであろう。
【０１６１】
抗体を調製するためのプロセス
本開示における使用のための抗体は購入され得るか、または本明細書中に簡略に記載される当技術分野で公知の方法を使用して調製され得る。新たな抗原が発見された場合、抗体および抗体の抗原結合ドメインを製造する必要がある。それらの製造および使用については周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９９に開示されている。抗体は、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して生成され得る。抗体の例としては、（限定されないが）モノクローナル抗体、一本鎖抗体、および抗体の機能的フラグメントが挙げられる。
【０１６２】
抗体は、一連の宿主、例えば、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、および他の宿主において生産され得る。それらは、標的抗原または癌または腫瘍関連抗原のＣ末端フラグメントもしくは単離ポリペプチド、例えばＢＣＭＡまたはＮＫＧ２Ｄなど、免疫原特性を有するそのフラグメントもしくはオリゴペプチドを注射することにより免疫化され得る。宿主種に応じて、様々なアジュバントを添加および使用して、免疫学的応答を増加させることができる。このようなアジュバントとしては、限定されないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、ならびにリソレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの界面活性物質が挙げられる。ヒトにおいて使用されるアジュバントでは、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが特に有用である。本開示はまた、単離ポリペプチドおよびアジュバントを提供する。
【０１６３】
ある特定の態様において、本開示の抗体は、ポリクローナル抗体、すなわち、異なるアミノ酸配列を有する、複数種類の抗体の混合物である。１つの態様において、ポリクローナル抗体は、異なるＣＤＲを有する複数のタイプの抗体の混合物を含む。このようなものとして、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、結果として得られる培養物から精製された抗体を使用することができる（国際公開第２００４／０６１１０４号を参照のこと）。
【０１６４】
モノクローナル抗体の生産：癌または腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体は、培養物中の連続的な細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の技術を使用して調製され得る。このような技術としては、限定されないが、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）を参照のこと）；トリオーマ法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を生産するＥＢＶハイブリドーマ法（例えば、Ｃｏｌｅら：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５）を参照のこと）が挙げられる。ヒトモノクローナル抗体は、本技術の実施において利用され得、ヒトハイブリドーマを使用すること（例えば、Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０（１９８３）を参照のこと）により、またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタインバーウイルスで形質転換すること（例えば、Ｃｏｌｅら：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５）を参照のこと）により生産され得る。例えば、抗体の領域をコードする核酸の集団を単離することができる。抗体の保存的領域をコードする配列に由来するプライマーを利用するＰＣＲを使用して、抗体の部分をコードする配列を、集団から増幅し、次いで、抗体または可変ドメインなど、それらのフラグメントをコードするＤＮＡを増幅配列から再構築する。このような増幅配列はまた、ファージまたは細菌上への融合ポリペプチドの発現およびディスプレイのための他のタンパク質（例えば、バクテリオファージコートまたは細菌細胞表面タンパク質）をコードするＤＮＡへと融合され得る。次いで、増幅配列を発現させ、例えば、ＢＣＭＡ関連抗原ポリペプチド上に存在する抗原またはエピトープに対する発現抗体またはそのフラグメントの親和性に基づき、さらに選択または単離することができる。あるいは、関連抗原のモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、被験体を、例えば、関連抗原またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる単離ポリペプチドで免疫化し、次いで、慣例的な方法を使用して、ハイブリドーマを被験体の脾臓から単離することにより調製され得る。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ７３：３−４６（１９８１））を参照のこと。標準的な方法を使用してハイブリドーマをスクリーニングすることにより、特異性（すなわち、異なるエピトープに対する）および親和性を変化させたモノクローナル抗体を生産する。所望の特性、例えば、関連抗原への結合を伴う選択されたモノクローナル抗体は、（ｉ）ハイブリドーマにより発現された形で使用することもでき、（ｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの分子に結合させて、その特性を変更することもでき、（ｉｉ���）モノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡを、単離し、配列決定し、様々な形で操作することができる。１つの態様において、モノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子と、軽鎖導入遺伝子とを含むゲノムを有するトランスジェニックの非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞であって、不死化細胞へと融合させたＢ細胞を含むハイブリドーマにより生産する。ハイブリドーマ技術は当技術分野で公知であり、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３４９（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５６３−６８１（１９８１）に教示されているハイブリドーマ法を含む。
【０１６５】
ファージディスプレイ技術：上記のように、本開示の抗体は、組換えＤＮＡおよびファージディスプレイ技術の適用を介して生産され得る。例えば、ＢＣＭＡ抗体は、当技術分野で公知の、様々なファージディスプレイ法を使用して調製され得る。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面にディスプレイされる。所望の結合特性を有するファージは、抗原、典型的には、固体表面またはビーズに結合させるかまたは捕捉した抗原により、直接選択することにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法において使用されるファージは典型的に、ｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであって、Ｆａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを、組換えにより、ファージ遺伝子ＩＩＩまたはＶＩＩＩタンパク質へと融合させた、糸状ファージである。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１，１９８９を参照のこと）に適応させて、関連抗原ポリペプチド、例えば、ポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、類似体、もしくは相同体に所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ有効な同定を可能であり得る。本開示の単離抗体を作成するために使用され得るファージディスプレイ法の他の例としては、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３（１９８８）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６−１０７０（１９９０）；Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；国際特許出願第／ＧＢ９１／０１１３４号；国際公開第９０／０２８０９号；国際公開第９１／１０７３７号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９２／１８６１９号；国際公開第９３／１１２３６号；国際公開第９５／１５９８２号；国際公開第９５／２０４０１号；国際公開第９６／０６２１３号；国際公開第９２／０１０４７号（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌら）；国際公開第９７／０８３２０号（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）；国際公開第９２／０１０４７号（ＣＡＴ／ＭＲＣ）；国際公開第９１／１７２７１号（Ａｆｆｙｍａｘ）；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，７５０，７５３号、米国特許第５，８２１，０４７号、米国特許第５，５７１，６９８号、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，５１６，６３７号、米国特許第５，７８０，２２５号、米国特許第５，６５８，７２７号および米国特許第５，７３３，７４３号に開示されているものが挙げられる。
【０１６６】
ジスルフィド結合を介してポリペプチドを接合させることにより、バクテリオファージ粒子の表面上にポリペプチドをディスプレイするために有用な方法は、Ｌｏｈｎｉｎｇ、米国特許第６，７５３，１３６号により記載されている。上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、これを使用して、ヒト抗体を含む全抗体、または他の任意の所望の抗原結合フラグメントを生成し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主内で発現させ得る。例えば、国際公開第９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：８６４−８６９（１９９２）；Ｓａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）に開示されているものなどの当技術分野で公知の方法を使用して、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え生産する技術も用いられ得る。
【０１６７】
一般に、抗体または抗体フラグメントは、ファージまたはファージミド粒子の表面上に存在するため、良好な結合活性を維持する改変体を同定するために、ディスプレイベクターへとクローニングされたハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを、適切な抗原に対して選択することができる。例えば、Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）を参照のこと。しかしながら、選択および／またはスクリーニングのために、抗体フラグメントライブラリーを、溶解性のファージベクター（改変Ｔ７またはラムダＺａｐ系）へとクローニングすることなど、他のベクターフォーマットをこのプロセスのために使用し得るであろう。
【０１６８】
代替的な抗体生産方法：抗体はまた、リンパ球集団でインビボ産生を誘導することにより、または組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは高特異的結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより生産され得る（Ｏｒｌａｎｄｉら、ＰＮＡＳ  ８６：３８３３−３８３７（１９８９）；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３−２９９（１９９１））。
【０１６９】
あるいは、一本鎖抗体を生産するための技術が使用され得る。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、リンカーペプチド（典型的には、ほぼ５〜２５アミノ酸の長さ）により接続された、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ｓｃＦｖでは、重鎖および軽鎖の可変領域は、同じ抗体または異なる抗体に由来し得る。ｓｃＦｖは、組換え技術を使用して、例えば、ｓｃＦｖをコードするベクターの、大腸菌などの宿主生物内の発現により合成され得る。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、上述の抗体の重鎖または重鎖の可変領域をコードするＤＮＡと、その軽鎖または軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡとから選択されるＤＮＡの、全アミノ酸配列または所望のアミノ酸配列をコードする部分的ＤＮＡを鋳型として使用し、その両端を規定するプライマー対を使用するＰＣＲにより増幅を実施し、リンカーの両端を、重鎖および軽鎖のそれぞれへとライゲーションするように、ポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡと、その両端を規定するプライマー対とを組み合わせる増幅をさらに実施することにより得ることができる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターと、発現ベクターにより形質転換された宿主とは、当技術分野で公知の従来の方法にしたがって得ることができる。
【０１７０】
抗原結合フラグメントも生成され得、例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化により生産され得、Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得る。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの、迅速かつ簡易な同定を可能にし得る（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２７５−１２８１（１９８９））。
【０１７１】
抗体改変。本開示の抗体は、抗原に対する親和性を増加させるように多量体化され得る。多量体化すべき抗体は１種類の抗体であり得るか、または同じ抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であり得る。抗体の多量体化の方法としては、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインの、２つのｓｃＦｖ分子への結合、ストレプトアビジンへの結合、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフの導入などを例示され得る。
【０１７２】
本明細書中に開示される抗体組成物は、これらの抗体のいずれかと別の薬剤との間で形成されるコンジュゲートの形態（免疫コンジュゲート）であり得る。１つの態様において、本明細書中に開示される抗体を、放射性物質にコンジュゲートされる。別の態様において、本明細書中に開示される抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な種類の分子に結合され得る。
【０１７３】
抗体スクリーニング。所望の特異性を有する抗体を同定するスクリーニングのために、様々なイムノアッセイが使用され得る。確立された特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する競合的結合またはイムノラジオメトリックアッセイのための多数のプロトコールが当技術分野で周知である。このようなイムノアッセイは、典型的には、関連抗原またはその任意のフラグメントもしくはオリゴペプチドと、その特異的抗体との間の複合体の形成についての測定を伴う。２つの非干渉的関連抗原エピトープに特異的なモノクローナル抗体を利用する、２部位型の、モノクローナルベースのイムノアッセイを使用し得るが、競合的結合アッセイも用いられ得る（Ｍａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１−１２１６（１９８３））。
【０１７４】
抗体精製。本明細書中に開示される抗体は、均一性まで精製され得る。抗体の分離および精製は、従来のタンパク質分離および精製法を用いることにより実施され得る。
【０１７５】
ほんの一例として、抗体は、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などの使用を適切に選択し、組み合わせることにより、分離および精製され得る。Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）。
【０１７６】
クロマトグラフィーの例としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーが挙げられる。１つの態様において、クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣなどの液体クロマトグラフィーを利用することにより実施され得る。
【０１７７】
１つの態様において、アフィニティークロマトグラフィーにおいて、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムが使用され得る。他の例示的なカラムとしては、プロテインＡカラムである、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などが挙げられる。
【０１７８】
二重特異性抗体
ＮＫＧ２Ｄまたは腫瘍抗原の任意の抗体（ａｎｔｉｄｉｅｓ）、例えば、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の抗原結合ドメインおよび抗体の腫瘍ターゲティング抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体構築物も本明細書中で提供される。抗原結合ドメインは、任意の適切な種、例えばマウス、ヒトまたはヒト化配列に由来し得る。１つの態様において、腫瘍ターゲティング抗体は、抗ＣＳ１または抗ＢＣＭＡを含む。それはまた、これら２つのタンパク質に結合する任意の分子を含む。例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢおよびＵＬＢＰ。１つの態様において、ＣＡＲはＣＳ１  ＣＡＲであり得、二重特異性部分は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖで置き換えられ得る。１つの態様において、腫瘍ターゲティング抗体は、抗ＣＳ１または抗ＢＣＭＡを含む。このようなものの例は、このようなもののポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を具体的に含む２０１６年２月２２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１８９５５号（これは、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【０１７９】
１つの態様において、２つの抗原結合ドメインの少なくとも１つは、所定の第１の抗原と共発現される抗原に特異的である。例えば、ＭＭの場合、ＢＣＭＡおよびＣＳ１はＭＭ上で共発現され、ＣＡＲ構築物のＢＣＭＡ抗原結合ドメインを補完するようにＣＳ１が選択された。あるいは、ＢＣＭＡは、抗ＣＳ１  ＣＡＲを補完し得る。
【０１８０】
さらなる態様において、抗原結合ドメインは、必要に応じてコドン最適化されたｓｃＦｖフラグメントを含むかまたはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。さらなる態様において、二重特異性抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーにより結合された可変重および軽鎖である。一般に、抗原結合ドメインは、ペプチドリンカー、例えば、ヒトの筋肉アルドース由来の非免疫原性タンパク質リンカー３５により結合され得る。
【０１８１】
二重特異性抗体をコードする単離された核酸も提供される。核酸は、必要な調節配列、例えば、宿主細胞、例えば哺乳動物もしくはヒト宿主細胞、例えばＴ細胞における発現のためのプロモーターおよび／またはエンハンサーをさらに含み得る。１つの態様において、プロモーターは、ＣＭＶまたはＥＦ１アルファプロモーターである。単離された核酸は、ＢｓＡｂコードポリヌクレオチドの下流に位置し得、別個のプロモーターエレメント、例えばＥＦ１アルファプロモーターから調節され得る検出可能マーカー、例えばＧＦＰをコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。当業者に明らかであるように、プロモーターは、宿主発現系のために選択される。
【０１８２】
単離された核酸は、５および３’ＬＴＲの間でレンチウイルスベクターなどの発現ベクターに挿入され得る。図１Ｂは、本開示の例示的なレンチウイルスベクター構築物である。当業者に明らかであるように、構築物は、マーカーペプチドまたは精製マーカーを含まなくてもよい。
【０１８３】
ＢｓＡｂ−ＣＡＲ構築物
さらなる態様において、１つの構築物において、上記に開示されるＣＡＲ構築物および二重特異性抗体をコードする単離された核酸（「ＢｓＡｂ−ＣＡＲ構築物」）が本明細書中で提供される。抗原結合ドメインは、任意の適切な種、例えばマウス、ヒトまたはヒト化配列に由来し得る。１つの態様において、単離された核酸は、例えばヒト筋アルドース由来の免疫原性タンパク質リンカーをコードする核酸により結合された、ＢＣＭＡをターゲティングする抗原結合フラグメントと、二重特異性抗体、例えば、非ＣＳ１抗体由来の１つのｓｃＦｖおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体由来の１つのｓｃＦＶとをコードする。１つの態様において、ＣＡＲ構築物をコードする核酸は、ＢｓＡｂをコードする核酸の５’側に位置する。１つの態様において、Ｔ２Ａエレメントは、５’側に位置するＣＡＲポリヌクレオチドと、３’に位置するＢｓＡｂとの間に位置する。核酸は、必要な調節配列、例えば、宿主細胞、例えば哺乳動物またはヒト宿主細胞、例えばＴ細胞における発現のためのプロモーターをさらに含み得る。１つの態様において、プロモーターは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドの５’側に位置するＥＦ１ａまたはＣＭＶプロモーターである。さらなる態様において、単離された核酸は、ＢｓＡｂポリヌクレオチドの下流に位置し得、別個のプロモーターエレメント、例えばＥＦ１アルファプロモーター下にあり得る検出可能マーカー、例えばＧＦＰをコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。当業者に明らかであるように、プロモーターは、宿主発現系のために選択される。
【０１８４】
単離された核酸は、レンチウイルスベクターなどの発現ベクターの５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に挿入できる。図３Ａは、本開示の例示的なレンチウイルスベクター構築物である。当業者に明らかであるように、構築物は、マーカーペプチドまたは精製マーカーを含まなくてもよい。
【０１８５】
ＣＡＲを調製するための宿主細胞およびプロセス
本開示の態様は、ＣＡＲ、ＢｓＡｂおよびＢｓＡｂ  ＣＡＲを含む単離された細胞、ならびにこのような細胞を生産する方法に関する。細胞は、原核細胞または真核細胞である。１つの態様において、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、それらの任意のサブセット、または任意の他の免疫細胞である。真核細胞は、任意の好ましい種、例えば動物細胞、哺乳動物細胞、例えばヒト、ネコまたはイヌ細胞に由来し得る。細胞は、患者、ドナーまたは細胞株、例えば既製の入手可能なものに由来し得る。細胞は、処置されている被験体に対して自己または同種であり得る。
【０１８６】
特定の実施形態において、単離された細胞は、癌または腫瘍抗体の抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなる外因性ＣＡＲまたはＢｓＡｂ  ＣＡＲを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなる。別個の実施形態において、単離された細胞は、本明細書中に開示されるＢｓＡｂをさらに含む。なおさらなる態様において、細胞は、本明細書中に開示されるＢｓＡｂを含む。ある特定の実施形態において、単離された細胞は、Ｔ細胞、例えば、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコＴ細胞、イヌＴ細胞またはヒトＴ細胞である。ある特定の実施形態において、単離された細胞は、ＮＫ細胞、例えば、動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコＮＫ細胞、イヌＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞である。ある特定の実施形態において、単離された細胞は、Ｂ細胞、例えば動物Ｂ細胞、哺乳動物Ｂ細胞、ネコＢ細胞、イヌＢ細胞またはヒトＢ細胞である。各種に関する同じまたは類似の実施形態は、樹状細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、これらの任意のサブセット、または記載されるＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞および／または任意の他の免疫細胞に関して適用されることが認識される。１つの態様において、細胞は、遺伝子編集技術、例えばＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用して、ＣＤ５２発現を除去するように改変されたＴ細胞である。
【０１８７】
ある特定の実施形態において、ＢｓＡｂ、ＣＡＲおよび／またはＢｓＡｂ  ＣＡＲ発現細胞を生産する方法は、ＢｓＡｂ、ＣＡＲ、ＢｓＡｂおよびＣＡＲならびに／またはＢｓＡｂ  ＣＡＲをコードする核酸配列を、単離された細胞の集団に形質導入することを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる開示される方法である。さらなる態様において、核酸配列が成功裏に形質導入された細胞のサブ集団が選択される。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、Ｔ細胞、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコＴ細胞、イヌＴ細胞またはヒトＴ細胞であり、それにより、ＢｓＡｂ、ＣＡＲ、ＢｓＡｂおよびＣＡＲならびに／またはＢｓＡｂ  ＣＡＲＴ細胞が産生される。ある特定の実施形態において、単離された細胞は、ＮＫ細胞、例えば動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコＮＫ細胞、イヌＮＫ細胞またはヒトＮＫ細胞であり、それにより、ＢｓＡｂ、ＣＡＲ、ＢｓＡｂおよびＣＡＲならびに／またはＢｓＡｂ  ＣＡＲＴ  ＮＫ細胞が産生される。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、Ｂ細胞、動物Ｂ細胞、哺乳動物Ｂ細胞、ネコＢ細胞、イヌＢ細胞またはヒトＢ細胞であり、それにより、ＢｓＡｂ、ＣＡＲ、ＢｓＡｂおよびＣＡＲならびに／またはＢｓＡｂ  ＣＡＲＴ  Ｂ細胞が産生される。各種に関する同じまたは類似の実施形態は、樹状細胞、骨髄細胞、単球、マクロファージ、これらの任意のサブセット、または記載されるＴ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞ならびに／または任意の他の免疫細胞に関して適用されることが認識される。１つの態様において、細胞は、遺伝子編集技術、例えばＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用して、ＣＤ５２発現を除去するように改変されたＴ細胞である。１つの態様において、細胞は、処置されている被験体に対して自己または同種であり得る。
【０１８８】
単離された細胞の供給源。本明細書中に開示される細胞の拡大および遺伝子改変の前に、細胞は、被験体−例えば、自己療法を含む実施形態において−または市販の細胞株もしくは培養物、または幹細胞、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得られ得る。
【０１８９】
細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、被験体におけるいくつかの起源から得ることができる。
【０１９０】
妥当な細胞を単離する方法は、当該分野で周知であり、本願に容易に適用できる；例示的な方法は、下記の実施例に記載されている。本開示に対して使用するための単離方法としては、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ；ＳＴＥＭｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＥａｓｙＳｅｐＴＭ、ＲｏｂｏＳｅｐＴＭ、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭ、ＳｅｐＭａｔｅＴＭ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳＴＭ細胞分離キットならびに他の商業的に入手可能な細胞分離キットおよび細胞単離キットが挙げられるが、これらに限定されない。免疫細胞の特定の部分集団が、ユニークな細胞表面マーカーに特異的な、そのようなキットにおいて利用可能なビーズまたは他の結合剤を使用することによって単離され得る。例えば、ＭＡＣＳＴＭＣＤ４＋およびＣＤ８＋マイクロビーズは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するために使用され得る。公知の技術にしたがって単離され得る細胞の代替的な非限定的な例としては、バルクＴ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞およびガンマデルタＴ細胞が挙げられる。
【０１９１】
あるいは、細胞は、限定されないが、Ｔ細胞については株ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１（商標））、ＢＣＬ２  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９（商標））、Ｎｅｏ  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８（商標））；Ｂ細胞については株ＡＨＨ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−８１４６（商標））、ＢＣ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２３０（商標））、ＢＣ−２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２３１（商標））、ＢＣ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２７７（商標））、ＣＡ４６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６４８（商標））、ＤＧ−７５［Ｄ．Ｇ．−７５］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２６２５（商標））、ＤＳ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１１０２（商標））、ＥＢ−３［ＥＢ３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８５（商標））、Ｚ−１３８（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−３００１）、ＤＢ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２８９）、Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３１）、Ｐｆｉｆｆｅｒ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３２）、ＳＲ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６２）、ＪＭ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０４２１）、ＮＦＳ−５  Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９３）；ＮＦＳ−７０  Ｃ１０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９４）、ＮＦＳ−２５  Ｃ−３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９５）およびＳＵＰ−Ｂ１５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９２９）；ならびにＮＫ細胞については株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７（商標））、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８（商標））を含む市販の細胞培養物を通じて得られ得る。さらなる例としては、限定されないが、成熟Ｔ細胞株、例えばＤｅｇｌｉｓ、ＥＢＴ−８、ＨＰＢ−ＭＬｐ−Ｗ、ＨＵＴ  ７８、ＨＵＴ  １０２、Ｋａｒｐａｓ  ３８４、Ｋｉ  ２２５、Ｍｙ−Ｌａ、Ｓｅ−Ａｘ、ＳＫＷ−３、ＳＭＺ−１およびＴ３４；未成熟Ｔ細胞株、例えばＡＬＬ−ＳＩＬ、Ｂｅ１３、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＭＬ−Ｔ１、ＤＮＤ−４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ−９、ＨＤ−Ｍａｒ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｈ−ＳＢ２、ＨＴ−１、ＪＫ−Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ  ４５、ＫＥ−３７、ＫＯＰＴ−Ｋ１、Ｋ−Ｔ１、Ｌ−ＫＡＷ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ−１、ＭＯＬＴ  ３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ  １３、ＭＯＬＴ−１６、ＭＴ−１、ＭＴ−ＡＬＬ、Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐｅｅｒ、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ−２５５、ＰＦ−３８２、ＰＦＩ−２８５、ＲＰＭＩ−８４０２、ＳＴ−４、ＳＵＰ−Ｔ１〜Ｔ１４、ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ−１０１、ＴＡＬＬ−１０３／２、ＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０５、ＴＡＬＬ−１０６、ＴＡＬＬ−１０７、ＴＡＬＬ−１９７、ＴＫ−６、ＴＬＢＲ−１、−２、−３および−４、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＣＣＬ−１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６３）、ＲＳ４；１１（���ＴＣＣ  ＣＲＬ−１８７３）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＲＭ−ＣＣＬ−１１９）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫株、例えばＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ  ＣＲＭ−ＴＩＢ−１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１６２）；未分化および大細胞リンパ腫由来のＢ細胞株、例えばＤＥＬ、ＤＬ−４０、ＦＥ−ＰＤ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ  ２９９、Ｋｉ−ＪＫ、Ｍａｃ−２Ａ  Ｐｌｙ１、ＳＲ−７８６、ＳＵ−ＤＨＬ−１、−２、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０および−１６、ＤＯＨＨ−２、ＮＵ−ＤＨＬ−１、Ｕ−９３７、Ｇｒａｎｄａ    ５１９、ＵＳＣ−ＤＨＬ−１、ＲＬ；ホジキンリンパ腫、例えばＤＥＶ、ＨＤ−７０、ＨＤＬＭ−２、ＨＤ−ＭｙＺ、ＨＫＢ−１、ＫＭ−Ｈ２、Ｌ  ４２８、Ｌ  ５４０、Ｌ１２３６、ＳＢＨ−１、ＳＵＰ−ＨＤ１およびＳＵ／ＲＨ−ＨＤ−ｌ；ならびにＮＫ株、例えばＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ−１、ＮＫＬ、ＮＫ−ＹＳ、ＮＯＩ−９０およびＹＴが挙げられる。他の白血病およびリンパ腫、例えばＫ５６２赤白血病、ＴＨＰ−１単球性白血病、Ｕ９３７リンパ腫、ＨＥＬ赤白血病、ＨＬ６０白血病、ＨＭＣ−１白血病、ＫＧ−１白血病、Ｕ２６６骨髄腫由来の細胞株と同様に、限定されないが、ＲＥＨ、ＮＡＬＬ−１、ＫＭ−３、Ｌ９２−２２１を含むヌル白血病細胞株は、免疫細胞の別の市販の供給源である。このような市販の細胞株の非限定的な例示的な供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、すなわちＡＴＣＣ，（ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が挙げられる。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、開示されるＣＡＲを発現するＴ細胞は、内因性ＴＣＲの発現を低減または排除するようにさらに改変され得る。内因性ＴＣＲの低減または排除は、オフターゲット効果を減少させ、Ｔ細胞の有効性を増加させ得る。機能的ＴＣＲの発現を安定的に欠如するＴ細胞は、様々なアプローチを使用して生産され得る。Ｔ細胞は内面化し、選別し、休止Ｔ細胞では約１０時間および刺激Ｔ細胞では３時間の半減期で複合体としてＴ細胞受容体全体を分解する（ｖｏｎ  Ｅｓｓｅｎ，Ｍら、２００４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：３８４−３９３）。ＴＣＲ複合体の適切な機能は、ＴＣＲ複合体を構成するタンパク質の適切な化学量論比を必要とする。ＴＣＲ機能はまた、ＩＴＡＭモチーフを有する２つの機能ＴＣＲゼータタンパク質を必要とする。そのＭＨＣペプチドリガンドの係合によるＴＣＲの活性化は、同じＴ細胞上へのいくつかのＴＣＲの係合を必要とする（これらはすべて、適切にシグナル伝達しなければならない）。したがって、適切に会合しないかまたは最適にシグナル伝達し得ないタンパク質でＴＣＲ複合体が不安定化される場合、Ｔ細胞は、細胞応答を開始するために十分に活性化されなくなるであろう。
【０１９３】
したがって、いくつかの実施形態において、ＴＣＲ発現は、ＲＮＡ干渉（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、ＣＲＩＳＰＲ、または初代Ｔ細胞における特定のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β）および／もしくはＣＤ３鎖をコードする核酸をターゲティングする他の方法を使用して排除され得る。これらのタンパク質の１つまたはそれよりも多くの発現を遮断することにより、Ｔ細胞はもはや、ＴＣＲ複合体の重要な構成要素の１つまたはそれよりも多くを産生せず、それにより、ＴＣＲ複合体を不安定化し、機能的ＴＣＲの細胞表面発現を妨げるであろう。ＲＮＡ干渉を使用すると、いくつかのＴＣＲ複合体は細胞表面にリサイクルされ得るとしても、ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）は、ＴＣＲタンパク質の新たな産生を妨げ、ＴＣＲ複合体全体の分解および除去をもたらし、機能的ＴＣＲ発現の安定欠損を有するＴ細胞をもたらすであろう。
【０１９４】
初代Ｔ細胞における阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）の発現は、任意の従来の発現系、例えばレンチウイルス発現系を使用して達成され得る。レンチウイルスは、休止初代Ｔ細胞をターゲティングするために有用であるが、すべてのＴ細胞がｓｈＲＮＡを発現するわけではない。これらのＴ細胞のいくつかは、十分な量のＲＮＡを発現せず、ＴＣＲ発現の十分な阻害を可能にして、Ｔ細胞の機能的活性を変化させ得る。したがって、残りのＴ細胞は細胞表面ＴＣＲまたはＣＤ３を欠損し、機能的ＴＣＲまたはＣＤ３の発現が欠損したＴ細胞の単離された集団の拡大を可能にするように、ウイルス形質導入後に中等度から高度のＴＣＲ発現を保持するＴ細胞は、例えば、細胞選別または分離技術により除去され得る。
【０１９５】
初代Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲの発現は、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および標的ＴＣＲに特異的なガイドＲＮＡを使用して達成され得る。適切な発現系、例えばレンチウイルスまたはアデノウイルスの発現系は当技術分野で公知である。阻害剤ＲＮＡの送達と同様に、ＣＲＩＳＰＲ系は、休止初代Ｔ細胞またはＣＡＲ細胞療法のための他の適切な免疫細胞を特異的にターゲティングするために使用され得る。さらに、ＣＲＩＳＰＲ編集が失敗する程度に、細胞は、上記に開示される方法にしたがって成功のために選択され得る。例えば、上記のように、残りのＴ細胞は細胞表面ＴＣＲまたはＣＤ３を欠損し、機能的ＴＣＲまたはＣＤ３の発現が欠損したＴ細胞の単離された集団の拡大を可能にするように、ウイルス形質導入後に中等度から高度のＴＣＲ発現を保持するＴ細胞は、例えば、細胞選別または分離技術により除去され得る。さらに、ＣＲＩＳＰＲ編集構築物は、内因性ＴＣＲのノックアウト、および本明細書中に開示されるＣＡＲ構築物のノックインの両方において有用であり得ることが認識される。したがって、ＣＲＩＳＰＲ系は、これらの目的の一方または両方を達成するために設計され得ることが認識される。
【０１９６】
ベクター。ＣＡＲ細胞は、ベクターを使用して調製され得る。本開示の態様は、（ｉ）ＣＡＲまたは（ｉｉ）免疫調節分子をコードするポリヌクレオチドをコードする単離された核酸配列、ならびにこれらの核酸のいずれか一方もしくは両方および／またはその各々の補体および／もしくは等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなるベクターに関する。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、単離された核酸配列は、癌または腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなるＣＡＲをコードする。特定の実施形態において、単離された核酸配列は、（ａ）癌または腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメインに続いて、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン、それに続いて（ｄ）ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、それに続いて（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする配列を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなる。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、単離された核酸配列はＣＡＲをコードし、癌または腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメインをコードする配列の上流のコザックコンセンサス配列を含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。
【０１９９】
１つの態様において、抗原結合ドメインはＢＣＭＡをターゲティングする。
【０２００】
いくつかの実施形態において、単離された核酸は、二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、必要に応じてコドン最適化されたＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の関連ＣＤＲ領域またはそれらの各々の等価物をあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、（必要に応じてコドン最適化された）ＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の関連ＣＤＲ領域またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、（必要に応じてコドン最適化された）ＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域および／またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、（必要に応じてコドン最適化された）ＮＫＧ２Ｄに対する抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）および必要に応じてＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）および／またはそれらの各々の等価物を含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、上記に開示される方法にしたがって生成され得るプロモーターに作動可能に連結された二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、単離された核酸は、検出可能な標識および／または抗生物質耐性を付与するポリヌクレオチドを含む。１つの態様において、標識またはポリヌクレオチドは、単離された核酸の形質導入に成功した細胞を選択するために有用である。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、単離された核酸配列は、ベクター内に含まれる。ある特定の実施形態において、ベクターはプラスミドである。他の実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。このようなベクターの非限定的な例としては、限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。特定の実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【０２０３】
例示的なベクターの調製および前記ベクターを用いたＣＡＲを発現している細胞の作製は、下記の実施例において詳細に論じられる。要約すると、ＣＡＲまたは免疫調節分子をコードする天然の核酸または合成の核酸の発現は一般に、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸またはその一部をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって、達成される。同様の方法は、免疫調節分子をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸配列を構築するために使用され得る。それらのベクターは、真核生物における複製およびインテグレーションに好適であり得る。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【０２０４】
１つの態様において、用語「ベクター」は、非分裂細胞および／またはゆっくり分裂する細胞に感染するおよび形質導入する能力ならびに標的細胞のゲノムにインテグレートする能力を保持する組換えベクターを意図している。いくつかの態様において、ベクターは、野生型ウイルスに由来するかまたは野生型ウイルスに基づく。さらなる態様において、ベクターは、野生型レンチウイルスに由来するかまたは野生型レンチウイルスに基づく。そのようなウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの他のレトロウイルスが、ベクター骨格のための基礎として使用され得ることが企図される。本開示に係るウイルスベクターは、特定のウイルスの構成要素に限定される必要がないことが明らかであり得る。ウイルスベクターは、２つまたはそれを超える異なるウイルスに由来する構成要素を含み得、合成の構成要素も含み得る。ベクターの構成要素は、所望の特徴、例えば、標的細胞の特異性が得られるように操作され得る。
【０２０５】
本開示の組換えベクターは、霊長類および非霊長類に由来する。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルスの群には、原型である「スローウイルス」のビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連のヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ならびに最近報告されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。従来技術の組換えレンチウイルスベクターは、当該分野で公知であり、例えば、参照により本明細書中に援用される、米国特許第６，９２４，１２３号；同第７，０５６，６９９号；同第７，４１９，８２９号および同第７，４４２，５５１号を参照のこと。
【０２０６】
米国特許第６，９２４，１２３号は、ある特定のレトロウイルス配列が標的細胞のゲノムへのインテグレーションを容易にすることを開示している。この特許は、各レトロウイルスゲノムが、ビリオンタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含むことを教示している。これらの遺伝子は、両端において、末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域に隣接している。ＬＴＲは、プロウイルスのインテグレーションおよび転写に関与する。ＬＴＲは、エンハンサー−プロモーター配列としても働く。換言すれば、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を制御し得る。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するプサイ配列によって生じる。ＬＴＲ自体は、全く同じ配列であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つのエレメントに分けられ得る。Ｕ３は、そのＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、そのＲＮＡの両端において繰り返される配列に由来し、Ｕ５は、そのＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。それらの３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルスの間で大幅に異なり得る。ウイルスゲノムの場合、そしてポリ（Ａ）付加（終止）の部位は、右側のＬＴＲにおけるＲとＵ５との境界に存在する。Ｕ３は、プロウイルスの転写性調節領域の大部分を含み、それらの領域は、細胞の転写活性化タンパク質および場合によってはウイルスの転写活性化タンパク質に応答するプロモーター配列および複数のエンハンサー配列を含む。
【０２０７】
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ自体に関して、ｇａｇは、ウイルスの内部構造タンパク質をコードする。Ｇａｇタンパク質は、タンパク分解性にプロセシングされて、成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（キャプシド）およびＮＣ（ヌクレオカプシド）になる。ｐｏｌ遺伝子は、ゲノムの複製を媒介する、ＤＮＡポリメラーゼ、関連するＲＮａｓｅＨおよびインテグラーゼ（ＩＮ）を含む逆転写酵素（ＲＴ）をコードする。
【０２０８】
ウイルスベクター粒子の産生のために、ベクターＲＮＡゲノムは、宿主細胞において、それをコードしているＤＮＡ構築物から発現される。ベクターゲノムによってコードされないそれらの粒子の構成要素は、宿主細胞において発現されるさらなる核酸配列（通常、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子のいずれかまたは両方を含む「パッケージングシステム」）によってトランスで提供される。ウイルスベクター粒子の産生のために必要な配列セットは、一過性のトランスフェクションによって宿主細胞に導入されてもよいし、宿主細胞ゲノムにインテグレートされてもよいし、または方法の組み合わせで提供されてもよい。関連する手法は、当業者に公知である。
【０２０９】
本開示において使用するためのレトロウイルスベクターとしては、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．製のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＬｅｎｔｉシリーズバージョン４、６および６．２「ＶｉｒａＰｏｗｅｒ」システム；Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが研究室で作製し使用するｐＨＩＶ−７−ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製の「Ｌｅｎｔｉ−Ｘ」レンチウイルスベクターｐＬＶＸ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ；Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のｐＬｅｍｉＲ；およびＣｈａｒｉｔe  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＣＢＦ），Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙが研究室で作製し使用するｐＬＶが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１０】
外因性核酸を導入するさらなる方法は当技術分野で公知であり、限定されないが、ＲＮＡエレクトロポレーション、ナノテクノロジー、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙベクター、レトロウイルスおよび／またはアデノウイルスの１つまたはそれよりも多くを使用する遺伝子送達が挙げられる。
【０２１１】
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法またはそうでない場合は本開示の阻害剤に細胞を曝露するために使用される方法に関係なく、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、種々のアッセイが行われ得る。そのようなアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；「生化学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬｌＳＡおよびウエスタンブロット）または本開示の範囲内に入る作用物質を特定するための本明細書中に記載されるアッセイによる、例えば、特定のペプチドの有無の検出が挙げられる。
【０２１２】
パッケージングベクターおよび細胞株。単離された核酸は、パッケージングベクターおよび細胞株を用いることによって、レトロウイルスパッケージングシステムにパッケージングされ得る。そのパッケージングベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。パッケージングベクターは、細胞への遺伝物質の送達を容易にするエレメントおよび配列を含む。例えば、レトロウイルス構築物は、複製不能レトロウイルスベクターをパッケージングするために必要なすべてのビリオンタンパク質をトランスでコードする複製不能レトロウイルスゲノムに由来する、複製可能ヘルパーウイルスを生成せずに複製不能レトロウイルスベクターを高力価でパッケージングできるビリオンタンパク質を生成するための、少なくとも１つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含むパッケージングベクターである。そのレトロウイルスＤＮＡ配列は、そのウイルスのウイルス５’ＬＴＲの天然のエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠き、ヘルパーゲノムのパッケージングに関与するプサイ機能配列と３’ＬＴＲの両方を欠くが、外来のポリアデニル化部位、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化部位、ならびにウイルスの産生が望まれる細胞型において効率的な転写を指示する外来のエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする。レトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）などの白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）である。外来のエンハンサーおよびプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期（ＩＥ）エンハンサーおよびプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、または天然のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターに結合されたＨＣＭＶ  ＩＥエンハンサーであり得る。レトロウイルスパッケージングベクターは、プラスミドベースの発現ベクターによってコードされる２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなり得、例えば、第１のヘルパー配列は、エコトロピックなＭＭＬＶまたはＧＡＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含み、第２のヘルパー配列は、ｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。Ｅｎｖ遺伝子は、宿主範囲を決定し、ゼノトロピック、アンフォトロピック、エコトロピック、ポリトロピック（ミンクフォーカス形成）または１０Ａ１マウス白血病ウイルスのｅｎｖタンパク質、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質、水胞性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｕｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、ヒトＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ）ＩおよびＩＩ型ｅｎｖ遺伝子産物、１つまたはそれを超える上述のｅｎｖ遺伝子の組み合わせに由来するキメラエンベロープ遺伝子または上述のｅｎｖ遺伝子産物の細胞質および膜貫通をコードするキメラエンベロープ遺伝子、ならびに所望の標的細胞上の特異的な表面分子に対するモノクローナル抗体をコードする遺伝子に由来し得る。
【０２１３】
パッケージングプロセスでは、パッケージングベクターおよびレトロウイルスベクターを、ウイルスを産生できる哺乳動物細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞、例えば、２９３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３，ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．））の第１の集団に一過性にコトランスフェクトして、高力価の組換えレトロウイルス含有上清を生成する。本開示の別の方法では、次いで、この一過性にトランスフェクトされた第１の細胞集団を、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトリンパ球と共培養して、標的細胞に外来遺伝子を高効率で形質導入する。本発明のなおも別の方法では、上に記載された一過性にトランスフェクトされた第１の細胞集団の上清を、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトリンパ球または造血幹細胞とともにインキュベートして、標的細胞に外来遺伝子を高効率で形質導入する。
【０２１４】
別の態様において、パッケージングベクターは、ウイルスを産生できる哺乳動物細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞、例えば、２９３細胞）の第１の集団において安定に発現される。レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、選択可能マーカーとのコトランスフェクションまたは偽型ウイルスによる感染のいずれかによって細胞に導入される。両方の場合において、ベクターはインテグレートする。あるいは、ベクターは、エピソームとして維持されるプラスミドとして導入され得る。高力価の組換えレトロウイルス含有上清が生成される。
【０２１５】
ＣＡＲ細胞の活性化および拡大。所望のＣＡＲを発現させる細胞の遺伝子改変の前または後にかかわらず、細胞は、米国特許第６，３５２，６９４号；米国特許第６，５３４，０５５号；米国特許第６，９０５，６８０号；米国特許第６，６９２，９６４号；米国特許第５，８５８，３５８号；米国特許第６，８８７，４６６号；米国特許第６，９０５，６８１号；米国特許第７，１４４，５７５号；米国特許第７，０６７，３１８号；米国特許第７，１７２，８６９号；米国特許第７，２３２，５６６号；米国特許第７，１７５，８４３号；米国特許第５，８８３，２２３号；米国特許第６，９０５，８７４号；米国特許第６，７９７，５１４号；米国特許第６，８６７，０４１号ならびにＬａｐａｔｅｖａら、（２０１４）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｇ  １９（１−２）：１２１−３２；Ｔａｍら、（２００３）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ５（３）：２５９−７２；Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｑｕｅｚら、（２０１４）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １６（１１）：１５３７−４４などの参考文献に記載されている方法など、一般に公知の方法を使用して活性化および拡大され得る。エクスビボにおける腫瘍関連抗原による刺激は、選択ＣＡＲを発現する細胞サブ集団を活性化および拡大し得る。あるいは、細胞は、腫瘍関連抗原との相互作用により、インビボで活性化され得る。
【０２１６】
ある特定の免疫細胞の場合、さらなる細胞集団、可溶性リガンドおよび／もしくはサイトカイン、または刺激剤は、細胞を活性化および拡大するために必要とされ得る。関連試薬は当技術分野で周知であり、公知の免疫学的原理にしたがって選択される。例えば、可溶性ＣＤ−４０リガンドは、ある特定のＢ細胞集団の活性化および拡大において有益であり得；同様に、照射フィーダー細胞は、ＮＫ細胞の活性化および拡大のための手順において使用され得る。
【０２１７】
妥当な細胞を活性化する方法は、当該分野で周知であり、本願に容易に適合され得る；例示的な方法は、下記の実施例に記載されている。本開示に関して使用するための単離方法としては、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ活性化および拡大キット；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰｈｏｓｆｌｏｗＴＭ活性化キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳＴＭ活性化／拡大キット、および妥当な細胞の活性化部分に特異的な他の商業的に入手可能な細胞キットが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなキットにおいて利用可能なビーズまたは他の作用物質を使用することによって、免疫細胞の特定の部分集団が、活性化または拡大され得る。例えば、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）が、単離されたＴ細胞の集団を活性化し、拡大するために使用され得る。
【０２１８】
使用方法
治療適用。本開示の方法の態様は、インビトロもしくはインビボで腫瘍もしくは癌細胞（例えば、ＭＭ細胞）の成長を阻害するための、および／またはそれを必要とする癌患者を処置するための方法に関する。いくつかの実施形態において、腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、癌は、血液および／または骨髄に影響を与える癌、例えばＭＭである。いくつかの実施形態において、癌または腫瘍細胞は、癌または腫瘍抗原、例えばＢＣＭＡおよび／またはＣＳ１を発現または過剰発現する。インビトロで実施される場合、前記方法は、精密医療用途のためのインビトロアッセイ、および新たな組み合わせおよび治療を試験するための有用なアッセイを提供する。
【０２１９】
ある特定の実施形態において、これらの方法は、被験体または患者に、ＣＡＲを含む有効量の単離された細胞を投与することを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。さらなる実施形態において、この単離された細胞は、ＣＡＲおよび／または二重特異性抗体を含むかまたは発現する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）および／またはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）および／またはそれらの各々の等価物のいずれか１つに対する抗体の関連ＣＤＲ領域を含むかあるいはそれから本質的になるかまたはさらにそれからなる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）および／またはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）および／またはそれらの各々の等価物のいずれか１つに対する抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。なおさらなる実施形態において、単離された細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄリガンドおよび必要に応じてＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）リガンドを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）またはそれらの各々の等価物に対する抗体の関連ＣＤＲ領域を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄおよび必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）および／またはそれらの各々の等価物に対する抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＮＫＧ２Ｄに対する抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）および必要に応じてＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）および／またはそれらの各々の等価物を含む。いくつかの実施形態において、単離された細胞は、処置されている被験体または患者に対して自己である。さらなる態様において、腫瘍は癌または腫瘍抗原を発現し、被験体は、ＣＡＲによりターゲティングされる腫瘍または癌関連抗原を認識してそれに結合する抗体の使用などの診断による治療のために選択されたものである。被験体は、動物、哺乳動物、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、マウスまたはヒト患者である。
【０２２０】
本明細書中に開示されるＣＡＲ細胞は単独で投与され得るか、または本明細書中に開示される二重特異性抗体、希釈剤、公知の抗癌治療剤、および／もしくはサイトカインもしくは免疫調節性である他の細胞集団などの他の構成要素と組み合わせて投与され得る。それらは、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、またはさらなる治療として投与され得る。さらなる治療の非限定的な例としては、放射線療法、凍結療法、もしくは化学療法などの細胞減少療法、または生物学的薬剤が挙げられる。さらなる非限定的な例としては、非改変免疫細胞、１つまたはそれを超える免疫調節性分子を発現するベクターを含む改変免疫細胞、または本明細書中に開示される抗原とは異なる抗原に対して特異的なＣＡＲ細胞などの他の関連する細胞型が挙げられる。本開示のＣＡＲ細胞のように、いくつかの実施形態において、これらの細胞は自己または同種のものであり得る。適切な処置レジメンは、主治医または主治獣医により決定されるであろう。
【０２２１】
本開示の医薬組成物は、処置または予防される疾患に適切な形で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定されるであろう。１つの態様において、それらは、直接的な注射により直接投与されるか、または静脈内注射などで全身投与される。
【０２２２】
本開示の態様は、患者がＣＡＲ療法に応答する可能性が高いか、またはこれに応答する可能性が高くないのかを決定するための例示的な方法を提供する。前記方法は、患者から単離された腫瘍試料中の壊死の存在または非存在を決定することと、癌または腫瘍抗原の癌または腫瘍細胞発現の量を定量することとを含むかあるいはそれから本質的になるかまたはさらにそれからなるからなる。ある特定の実施形態において、前記方法は、有効量のＣＡＲ療法を、ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いと決定された患者に投与することをさらに含むかあるいはそれから本質的になるかまたはなおもさらにそれからなる。ＣＡＲ療法は、患者に対して自己または同種のものであり得、患者は、固形腫瘍を患っている被験体、動物またはヒトであり得る。
【０２２３】
壊死のための組織学的染色の技術は当技術分野で周知である。例えば、「Ｈ＆Ｅ染色」とも称されるヘマトキシリンおよびエオシン染色は、とりわけ、腫瘍形成性または癌性成長において、組織中の壊死の存在を同定するための一般的な技術である。細胞質Ｈ＆Ｅ染色は、部分的には、細胞質におけるＲＮＡの喪失に帰せられ、部分的には、細胞質におけるタンパク質の変性に帰せられる好酸球増加症の増加を実証する。壊死組織の染色では、細胞質は、細胞質小器官の酵素消化のために、「虫食い状態」に見えることが多い。ミエリン形態、石灰化、および他の細胞への食作用の証拠もまた、組織学的染色により検出され得る、壊死組織の特徴である。壊死組織はまた、細胞死の結果としての核溶解、核濃縮、および核崩壊を裏付けることが多い、核染色における特定の特徴を有する。顕微鏡法と、このような壊死性特徴についての、手動式または自動式の定量とを使用して、ＣＡＲ療法の妥当性を決定し得る。限定されないが、バイオマーカーベースまたはイメージングベースの診断法を一般に含む腫瘍形成性もしくは癌性成長または壊死組織を検出する代替的な手段もまた、患者が、ある特定のタイプのＣＡＲ療法に応答するかを決定するために同等に妥当であり、したがって使用され得る。
【０２２４】
担体
本開示のさらなる態様は、担体と、本明細書中に開示される実施形態に記載される生成物（例えば、本明細書中に開示されるＣＡＲ、ＣＡＲを含む単離された細胞、単離された核酸、ベクター、ＣＡＲおよび二重特異性抗体を含有する単離された細胞ならびに／またはこのようなものをコードする核酸）の１つまたはそれよりも多くとを含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなる組成物に関する。さらなる態様において、組成物は、免疫調節性分子、および／または二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ＢＣＭＡおよび／またはＮＫＧ２Ｄ、必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の関連ＣＤＲ領域またはそれらの各々の等価物をあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、（必要に応じてコドン最適化された）ＮＫＧ２Ｄ、必要に応じてＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）に対する抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域および／またはそれらの各々の等価物を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、（必要に応じてコドン最適化された）ＮＫＧ２Ｄに対する抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、必要に応じてＳＡＬＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）および／またはそれらの各々の等価物を含む。
【０２２５】
簡潔には、１つまたはそれを超える薬学的にまたは生理的に許容され得るキャリア、希釈剤もしくは賦形剤と組み合わせた、本明細書に記載される本願組成物のうちのいずれか１つを含むがこれらに限定されない、本開示の薬学的組成物。そのような組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など）；炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；酸化防止剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本開示の組成物は、経口投与、静脈内投与、局所投与、経腸投与および／または非経口投与のために製剤化され得る。ある特定の実施形態において、本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
【０２２６】
細胞または組成物の投与は単回用量で行うこともでき、処置の過程を通して持続的または間欠的に行うこともでき、所望の治療利益を達成するための有効量が提供される。最も有効な投与手段および投与量を決定する方法は当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、治療目的、および処置される被験体により変動するであろう。単回投与または複数回投与は、主治医により選択される用量レベルおよびパターンにより行われ得る。適切な投与製剤および薬剤を投与する方法は当技術分野で公知である。さらなる態様において、本開示の細胞および組成物は、他の処置と組み合わせて投与され得る。
【０２２７】
細胞および細胞集団は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６４１９１号に記載されている当技術分野で公知の方法を使用して宿主に投与される。本開示の細胞または組成物のこの投与は、実験的アッセイおよびスクリーニングアッセイのための、所望の疾患、障害、または症状についての動物モデルを生成するために行われ得る。
【０２２８】
併用療法
本明細書中に記載される組成物は、一次、二次、三次、四次または他の治療として投与され得、細胞減少介入と組み合わせられ得る。処置医師により決定されるように、逐次投与または同時投与され得る。１つの態様において、それらは、ＣＡＲおよび／またはＢｓＡｂが結合する腫瘍または他の抗原の発現をアップレギュレートし得る治療と組み合わされ得る。１つの態様において、いくつかの臨床薬は、標的抗原を増加させ得る。例えば、ＣＳ１表面発現は、ＦＤＡ承認されている多発性骨髄腫の免疫調節薬であるレナリドマイドにより増加され得る。Ｗａｎｇら、（２０１８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｊａｎ  １；２４（１）：１０６−１１９を参照のこと。別の例は、ＣＡＲ−ＢｓＡｂがＦＬＴ３抗原をターゲティングする場合にＦＬＴ３発現を増加させるＦＤＡ承認薬ミドスタウリンである。
【０２２９】
キット
本明細書中に示されているように、本開示は、ＣＡＲおよび／またはＢｓＡｂ  ＣＡＲ細胞を生産および投与するための方法を提供する。１つの特定の態様において、本開示は、これらの方法を実施するためのキット、ならびに本開示の方法を行う、例えば、細胞および／もしくは組織を回収する、および／またはスクリーニング／形質導入／などを実施する、および／または結果を分析するための説明書を提供する。
【０２３０】
１つの態様において、キットは、本明細書中に開示される単離された核酸および／または前記核酸を含むベクターおよび／または単離された同種細胞、好ましくはＴ細胞もしくはＮＫ細胞のいずれか１つ、ならびに／または患者由来の自己細胞の生産に関する説明書を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなる。このようなキットはまた、本明細書中に開示されるものなどのＣＡＲおよび／またはＢｓＡｂ  ＣＡＲ発現細胞の形質導入および／もしくは選択ならびに／または活性化および／もしくは拡大に適切な培地および他の試薬を含み得るかあるいはそれらから本質的になり得るかまたはなおもさらにそれらを含み得る。
【０２３１】
１つの態様において、キットは、単離されたＣＡＲおよび／またはＢｓＡｂ  ＣＡＲ発現細胞またはその集団を含むかあるいはそれらから本質的になるかまたはなおもさらにそれらからなる。いくつかの実施形態において、このキットの細胞は、それを必要とする被験体への投与前に活性化および／または拡大を必要とし得る。さらなる実施形態において、キットは、単離されたＣＡＲおよび／またはＢｓＡｂ  ＣＡＲ発現細胞を活性化および／または拡大するための培地および試薬、例えば上記本開示でカバーされるものをさらに含み得るか、またはこれらから本質的になり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＡＲ療法のために使用されるものである。さらなる実施形態において、キットは、ＣＡＲ療法を必要とする患者への単離された細胞の投与に関する説明書を含む。
【０２３２】
本開示のキットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤、またはタンパク質安定化剤を含み得る。キットは、検出可能な標識を検出するために必要な構成要素、例えば、酵素または基質をさらに含み得る。キットはまた、アッセイされて試験試料と比較され得る対照試料または一連の対照試料を含有し得る。キットの各構成要素は個々の容器内に封入され得、様々な容器はすべて、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための説明書と共に、単一のパッケージ内にあり得る。本開示のキットは、キット容器上にまたはその中に書面を含有し得る。書面は、キット内に含有される試薬の使用方法を記載する。
【０２３３】
適宜、これらの提案されるキット構成要素は、当業者による使用に好都合なようにパッケージングされ得る。例えば、これらの提案されるキット構成要素は、溶液中でまたは分散液などとして提供され得る。
【０２３４】
以下の実施例は、本開示を行う上で様々な場合において使用され得る手順の例示である。
【実施例】
【０２３５】
実施例１−ＢｓＡｂ  ＣＡＲＴ細胞の生成および有効性
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞および二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）はＦＤＡ承認治療であり、癌に対して優れた治癒可能性を示す。しかしながら、ほとんどの場合、いずれも、治癒的であることがまだ示されていない。これは、部分的には治療期間によるものであり得、すなわち、ＣＡＲＴ細胞はインビボで十分長く生存し得ず、ＢｓＡｂは非常に短い半減期を有し、製造プロセスは高価で時間がかかるので、その有効性および幅広い用途を限定する。本明細書中では、本出願人は、ＣＡＲＴ細胞療法をＢｓＡｂ療法（これらは両方とも、長期効果の可能性を有する）と組み合わせるプラットフォームの作成に成功した。本出願人は、現在ＦＤＡ承認治療後に高い再発率を有する不治の癌である多発性骨髄腫（ＭＭ）の状況でこのプラットフォームを試験した。本出願人は、２つのＭＭ標的抗原ＣＳ１およびＢＣＭＡを利用するコンセプトを検証し、ＣＳ１（＋）ＭＭに対する細胞毒性活性を促進する目的で、ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現して可溶性抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂを分泌するＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（前者は、ＢＣＭＡ（＋）ＭＭ腫瘍細胞を攻撃し、後者は、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含むすべてのＮＫＧ２Ｄ（＋）細胞溶解性細胞に係合する）を生成するための新規かつ有効な単一レンチウイルス構築物を作成した。このオールインワンな多面的免疫モダリティは、２つの「生薬」、すなわちＣＡＲＴ細胞およびＢｓＡｂを同時に提供し、同じ悪性集団上の異なる標的抗原に対する自然および適応免疫エフェクター細胞の両方を捕捉する。本出願人は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞またはＢｓＡｂ形質導入Ｔ細胞と比較して、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞がより多くのＩＦＮ−を分泌し、ＭＭ細胞株および原発性ＭＭ腫瘍細胞を含むＭＭ腫瘍細胞をターゲティングすることにより、増強されたインビトロ細胞毒性を示しながら、より高い脱顆粒能力を示したことを見出した。これら２つの抗原の内因性発現を欠く標的細胞におけるＢＣＭＡおよびＣＳ１の異所性強制発現は、標的細胞溶解を増強した。重要なことに、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞から分泌された抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂは自己分泌的に作用して、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の活性化を通じて、インビトロにおけるＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞増殖、ならびに、インビボにおける増強された増殖および生存をトリガーする。これらの多面的効果は、インビボで強力な抗腫瘍活性をもたらした。まとめると、持続時間の増加および有効性の増強のためにＣＡＲＴ細胞療法および抗ＮＫＧ２Ｄ二重特異性抗体療法を単一のプラットフォームに組み合わせる能力、ならびに自然および適応細胞溶解性エフェクター細胞の両方の特異的抗腫瘍活性を補足する能力と共に、次世代癌免疫療法を生成するための証拠が本明細書中で提供される。
【０２３６】
細胞培養：細胞株ＭＭ．１Ｓ、Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６（ヒト多発性骨髄腫細胞株）およびＫ５６２（ヒト赤白血病細胞株）は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。これらの細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）および１％抗生物質−抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）と共に培養した。ＡＴＣＣから購入してレンチウイルス生産に使用した２９３Ｔ細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０と同じサプリメントを加えたＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。健常ドナーおよびＭＭ患者由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者の指示にしたがって、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）密度勾配遠心分離により単離した。ヒトＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞およびＣＤ３＋γｏｅＴＣＲ＋Ｔ細胞を、製造業者の指示にしたがって、それぞれヒトＮＫ、ＮＫＴおよびγｏｅＴ細胞単離キット（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して単離した。原発性ＭＭ患者サンプルは、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＯＳＵ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒおよびＪａｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌより提供された。ヒト被験体を用いたすべての研究を、Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより承認されたプロトコールにしたがって実施した。
【０２３７】
マウス：６〜８週齢のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入し、すべてのインビボ研究に使用した。すべての動物研究を、Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコールにしたがって実施した。ＭＭ病の進行を注意深くモニタリングし、生存データを記録した。後肢麻痺、嗜眠および明白な体重減少の観察時点で、マウスを屠殺にした。
【０２３８】
ＢＣＭＡ−ＣＡＲ、抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂおよびＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲレンチウイルス構築物の生成：ＢＣＭＡ  ＣＡＲの場合、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域のＢＣＭＡコードドメイン配列は、ハイブリドーマ由来のものであり、リンカーを使用して再結合させた。ＶＨ−リンカー−ＶＬフラグメントを、ＣＤ２８−ＣＤ３ゼータ部分とインフレームで組み込んだ。抗ＢＣＭＡ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ゼータフラグメントをレンチウイルスベクターｐＣＤＨにサブクローニングして、第２世代ｐＣＤＨ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物を作成した。抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂレンチウイルス構築物を作成するために、ヒト筋肉アルドース由来の非免疫原性タンパク質リンカー３５により接続した、抗ＣＳ１モノクローナル抗体２９および抗ＮＫＧ２Ｄ抗体由来の２つのコドン最適化一本鎖可変フラグメントを、ｐＣＤＨレンチウイルスベクターにクローニングした。「オールインワン」ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの場合、抗ＢＣＭＡ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ−Ｔ２ＡカセットをｐＣＤＨ抗ＣＳ１−ＮＫＧ２Ｄ  ＢｓＡｂ−ＥＦ１ａ−ＧＦＰに組み込んで、完全ｐＣＤＨ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ２Ａ−ＢｓＡｂ−ＥＦ１ａ−ＧＦＰレンチウイルス構築物を構築した。
【０２３９】
Ｔ細胞のレチウイルス産生および形質導入：以前に報告されているプロトコール３６、３７に記載されているように、レンチウイルストランスフェクションおよび感染を実施した。
【０２４０】
ＣＳ１およびＢＣＭＡ遺伝子を安定発現するＫ５６２細胞の生成：ヒトＣＳ１コード配列を含有する全長ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＣＳ１−ＥＦ１α−ＧＦＰ構築物は、以前に報告されているものであった３０。レンチウイルスを生産するために、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐＣＤＨ−ＣＳ１プラスミドまたはｐＣＤＨ空ベクタープラスミド＋パッケージングプラスミドｐＣＭＶ−ＶＳＶＧおよびｐＣＭＶ−δｒ９で２９３Ｔ細胞をコトランスフェクトした。次いで、レンチウイルス上清を回収し、以前に公開されているプロトコール３６、３８を使用してＫ５６２細胞を感染させるために使用した。次いで、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＧＦＰ陽性細胞を選別した。ＢＣＭＡ−Ｋ５６２は、全長ＢＣＭＡ  ｃＤＮＡを有するベクターを形質導入したＫ５６２細胞である。上記の方法を使用して、レンチウイルス生産、感染および選別を実施した。ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＢＣＭＡ−ＥＦ１α−ＧＦＰレンチウイルス構築物を上記ＣＳ１−Ｋ５６２細胞に形質導入することにより、ＣＳ１＋ＢＣＭＡ＋Ｋ５６２細胞を生成した。二重形質導入細胞をＡＰＣ抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂで染色し、ＧＦＰ＋ＢＣＭＡ＋集団について選別した。実験に使用する前に、これらのＧＦＰ＋ＢＣＭＡ＋二重陽性細胞を培養物に数回通して、抗ＢＣＭＡ  ｍＡｂ結合細胞の喪失を確実にした。
【０２４１】
フローサイトメトリー分析：以前に報告されているのように３０、細胞表面上のＣＡＲ発現の検出を実施した。この研究で使用した抗体としては、ＦＩＴＣおよびビオチン標識ヤギ抗マウス（Ｆａｂ）２ポリクローナル抗体または通常ポリクローナルヤギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５コンジュゲートストレプトアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５およびＢＶ４２１抗ヒトＣＤ３（ｈＣＤ３、クローンＵＣＨＴ１およびＳＫ７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣおよびＰＥ抗ｈＣＤ５６（クローンＴＵＬＹ５６およびＣＭＳＳＢ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＦＩＴＣおよびＰＣ５．５抗ＴＣＲパンγ／δ（クローンＩＭＭＵ５１０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰＣ５抗ＴＣＲパンα／β（クローンＩＰ２６Ａ、Ｂｅｃｋｍａｎ）、ＦＩＴＣ抗ＴＣＲ  Ｖγ９（クローンＩＭＭＵ  ３６０、Ｂｅｃｋｍａｎ）およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ抗ＴＣＲ  Ｖδ２（クローンＩＭＭＵ  ３８９、Ｂｅｃｋｍａｎ）、非コンジュゲートおよびＡＰＣ抗ｈＮＫＧ２Ｄ（クローン１Ｄ１１ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−Ｃｙ７抗ｈＣＤ８（クローンＳＫ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ−Ｃｙ７抗ｈＣＤ４（クローンＳＫ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ１ｄ（クローンＣＤ１ｄ４２、ＢＤ  ＯｐｔｉＢｕｉｌｄ）、Ｖ４５０抗ｈＣＤ１１ｃ（クローンＢ−ｌｙ６、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ）、ＡＰＣ−Ｈ７抗ｈＣＤ１９（クローンＨＩＢ１９、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、  ＡＰＣ−Ｈ７抗ｈＣＤ２０（クローン２Ｈ７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、  ＦＩＴＣ抗ｈＣＤ４５（クローンＪ．３３、Ｂｅｃｋｍａｎ）、ビオチンおよびＦＩＴＣ抗ｈＣＤ１４（クローン６３Ｄ３およびＭ５Ｅ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ビオチンおよびＰＥ抗ｈＣＤ３３（クローンＰ６７．６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，およびＷＭ５３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ビオチン抗ｈＣＤ６６ｂ（クローンＧ１０Ｆ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、非コンジュゲートおよびＰＥ抗ｈＣＳ１（クローン１６２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ抗ｈＢＣＭＡ（クローン１９Ｆ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ抗Ｋｉ６７（クローンＳｏｌＡ１５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−ｈＣＤ６９（クローンＦＮ５０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。細胞を、４％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳで１回洗浄し、抗体を用いて室温で２０分間染色し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
【０２４２】
イムノブロッティング：二重特異性抗体の細胞内発現および分泌を検出するために、ＢｓＡｂ形質導入Ｔ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞と、これらの細胞の培養物由来の無細胞上清とを、６ｘ−ｈｉｓタグ付きｍＡｂ（クローン４Ａ１２Ｅ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してイムノブロッティングのために収集した。本出願人が以前に報告した標準的なイムノブロッティングプロトコール３０、３７にしたがって、イムノブロッティングを実施した。ＣＡＲ発現の検出のために、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を溶解し、以前に報告されているように３０，３７、マウス抗ヒトＣＤ３ζ  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてイムノブロッティングのためにタンパク質を抽出した。
【０２４３】
細胞毒性アッセイ：細胞を５１Ｃｒで標識し、９６ウェルＶ底プレートのウェル中、様々なエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）で形質導入Ｔ細胞と共に：３７℃で４時間共培養し、続いて、上清を回収して、ＴｏｐＣｏｕｎｔカウンター（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、標的細胞からの５１Ｃｒの放出を測定した。ＰＢＭＣに係合するＢｓＡｂの能力を研究する場合、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞を、アメリカ赤十字社から注文したロイコパックから単離した。上記標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイの前に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ−アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（４×１０４／μＬ、ビーズ：Ｔ＝１：１）とＩＬ−２（５００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（５００Ｕ／ｍＬ）でＴ細胞を５〜１４日間プライミングした。細胞毒性アッセイの前に、ヒトＮＫ細胞をＩＬ−２（５００Ｕ／ｍＬ）により活性化した。単離されたヒトＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞を、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）を含むα−ＧａｌＣｅｒ（α−ガラクトシルセラミド、ＫＲＮ７０００，Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．ＮＹ，ＵＳＡ．１００ｎｇ／ｍＬ）３９により７〜１０日間活性化した。ＣＤ３＋γδＴＣＲ＋Ｔ細胞活性化の場合、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）を含むＨＭＢＰＰ（（Ｅ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル４−ピロリン酸、Ｓｉｇｍａ．１０ｎＭ）４０，４１を使用し、１４日間培養した。ロイコパックからこれらの細胞の単離のためのプロトコールは、Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより承認された。
【０２４４】
ＥＬＩＳＡ：製造業者のプロトコールにしたがってＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）のキットを使用して酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により、培養上清中のヒトＩＦＮ−γの存在をアッセイした。ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）により、培養上清中のヒトＩＬ−２およびＴＮＦ−αのレベルもアッセイした。これらのＥＬＩＳＡ分析では、骨髄腫細胞株または患者由来の初代ＭＭ細胞のいずれかの２．５×１０５個の細胞を、９６ウェルＶ底プレート中で、２．５×１０５個の操作されたまたは対照Ｔ細胞と共に２４時間インキュベートした。Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）を使用して、４５０ｎｍでデータを読み取った。
【０２４５】
ＭＭ担持マウスのインビボ処置および生物発光イメージング：ホタルルシフェラーゼ遺伝子ＭＭ．１Ｓ−ＧＬ３を発現するＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞は、以前に記載されている３０。異種移植同所性ＭＭモデルを構築するために、０日目に、ＮＳＧマウス（雄性）に、尾静脈を通じて２００μＬの生理食塩水中８×１０６個のＭＭ．１Ｓ−ＧＬ３細胞を静脈内注射した。１０、１７および２４日目に、マウスに、（１）ビヒクル対照（生理食塩水）またはそれぞれ２００μＬの生理食塩水中（２）空ベクター形質導入Ｔ細胞、（３）ＢｓＡｂ形質導入Ｔ細胞、（４）ＢＣＭＡ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞、（５）ＢｓＡｂおよびＢＣＭＡ−ＣＡＲで逐次形質導入されたＴ細胞もしくは（６）ＢｓＡｂ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を含む１０×１０６個のエフェクター細胞を、尾静脈静脈内注射により投与した。ＭＭ．１Ｓ−ＧＬ３細胞の接種後１０日、２４日、３１日に、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ体重；Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をすべてのマウスに腹腔内注射した。Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ）とＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、イメージングを実施した。８０日目に、本発明者らは、２００μｌの生理食塩水中４×１０６個のＭＭ１．Ｓ細胞／マウスの尾静脈静脈内注射により、生存マウスをチャレンジし、１４０日目に、生存データを収集し、終了した。ＢｓＡｂの効果を調査するために、ＰＢＭＣの存在下で上記実験を繰り返し、ヒト骨髄細胞を枯渇させた。この目的のために、０日目に、ＮＳＧマウスに、尾静脈を介して２００ｍＬの生理食塩水中８×１０６個のＭＭ．１Ｓ−ＧＬ３細胞を静脈内注射した。１０日目に、マウスに３×１０６個の様々な形質導入Ｔ細胞を投与し、続いて、３×１０６個のＣＤ３３−ＣＤ１４−ＣＤ６６ｂ−ヒトＰＢＭＣを投与した（すべて静脈内投与）。１７および２４日目に、マウスに、同じドナーから生成した３×１０６個の操作されたＴ細胞を静脈内投与した。１０日目、１９日目、２８日目および３７日目に、マウスにＤ−ルシフェリンを注入し、上記のようにイメージングした。
【０２４６】
免疫蛍光顕微鏡法により検出された免疫シナプス：分泌抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂを主に標識するために、ＢｓＡｂ  ＣＡＲＴ細胞由来の上清を収集し、１：５００の希釈で６×−ＨｉｓタグｍＡｂ（クローン４Ｅ３Ｄ１０Ｈ２／Ｅ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により３７℃インキュベーションで１時間染色し、次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０（ｂｌｕｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）で標識した。ＭＭ．１Ｓ細胞を回収し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  Ｄｙｅ（２０μＭ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて成長条件下で４５分間インキュベートした。免疫シナプスを見るために、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（ＧＦＰ、緑色）または空ベクター形質導入対照Ｔ細胞（ＧＦＰ、緑色）をＭＭ．１Ｓ細胞（赤色）およびＨｉｓタグ標識上清と共に１時間または２４時間共培養した。Ｚｅｉｓｓ顕微鏡システム（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＵＳＡ）により、生細胞蛍光イメージングを観察した。ビデオ撮影の場合、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞（ＧＦＰ、緑色）または空ベクター形質導入Ｔ細胞（ＧＦＰ、緑色）をＭＭ．１Ｓ細胞（赤色）と共に１時間共培養し、免疫シナプスを２時間観察するために顕微鏡を使用した。
【０２４７】
結果：ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲおよび／または抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１二重特異性抗体を発現する初代Ｔ細胞の生成：本出願人は、シグナルペプチド（ＳＰ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、グリシン−セリン（ＧＳ）リンカー、軽鎖可変領域（ＶＬ）、Ｍｙｃタグ、ヒンジ、ＣＤ２８およびＣＤ３ζから連続的になるレンチウイルスベクター骨格を有する特異的ＢＣＭＡ−ＣＡＲ構築物を生成した（図１Ａ）。次に、本出願人は、レンチウイルスベクター骨格を有する抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１二重特異性抗体（「ＢｓＡｂ」と称される）構築物を設計した。それは、ヒト筋肉アルドース由来の非免疫原性タンパク質リンカーにより互いに結合された、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体および抗ＣＳ１モノクローナル抗体由来の２つのコドン最適化一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）からなるものであった。各ｓｃＦｖは、グリシン−セリン（ＧＳ）リンカーにより接続された対応する重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）を含有する（図１Ｂ）。健常ドナーから単離された同じドナーＴ細胞であって、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８抗体ビーズにより活性化された同じドナーＴ細胞を、空ベクター（ＥＶ）、ＢｓＡｂ構築物、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ構築物を形質導入し、または最初にＢｓＡｂ構築物を形質導入し、続いてＢＣＭＡ−ＣＡＲ構築物を連続して形質導入した（以下、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ構築物と称される）。形質導入Ｔ細胞を抗Ｆａｂで染色することにより、細胞表面上のＢＣＭＡ  ＣＡＲの発現を実証し、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物またはＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞構築物のいずれかを形質導入したＦＡＣＳ濃縮Ｔ細胞の８０％超では、ｓｃＦｖの発現が検出されたのに対して、未改変Ｔ細胞、ＥＶ形質導入Ｔ細胞およびＢｓＡｂ  Ｔ細胞では、発現は依然としてほぼ検出されなかった（図１Ｃ）。ＢｓＡｂ  Ｔ細胞およびＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞が成功裏に形質導入されたかを決定するために、４日間培養物由来の無細胞上清を回収し、４日間培養由来の細胞ペレットを溶解した。次いで、上清および細胞溶解物を両方とも、６ｘ−ｈｉｓタグ付きＡｂを使用したイムノブロッティングに供した。結果は、ＢｓＡｂ−Ｔ細胞およびＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞が細胞性およびと分泌ＢｓＡｂの両方を産生したが、未改変Ｔ細胞上清および溶解物由来の対照はＢｓＡｂを産生しなかったこと示した（図１Ｄ）。
【０２４８】
ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞は、インビトロにおいて各ベクターのみを形質導入したＴ細胞よりも有効なＭＭキラーである：ＢｓＡｂは、抗ＮＫＧ２Ｄ受容体部分および抗ＣＳ１部分を含有していたので、本出願人は、ＮＫＧ２Ｄ＋細胞溶解性免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ活性化をトリガーしようとし、それが、ＭＭ関連抗原ＣＳ１を介してＭＭ細胞に同時に係合したかを試験した。最初に、本出願人は、フローサイトメトリー分析により、３つの一般的に使用されるＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ、Ｈ９２９、ＲＰＭＩ−８２２６およびヒト赤白血病細胞株Ｋ５６２におけるＣＳ１およびＢＣＭＡの表面発現を評価した。結果は、４つのＭＭ細胞株上では、ＢＣＭＡおよびＣＳ１発現のレベルが異なることを示した。ＭＭ１．ＳＭＭ細胞株はＢＣＭＡおよびＣＳ１の両方の高レベルの発現を有し；Ｈ９２９ＭＭ細胞株は、高レベルのＢＣＭＡおよび中（ｉｎｔ）レベルのＣＳ１発現を有し；ＲＰＭＩ−８２２６ＭＭ細胞株は、中レベルのＢＣＭＡ発現を有するが、ＣＳ１発現は非常に低い。陰性対照として、Ｋ５６２赤白血病細胞株は、細胞表面上でＣＳ１もＢＣＭＡも発現しなかった（図２Ａ）。（ＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂを連続して形質導入した）前述のＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞が、ＭＭ細胞株のより効率的な腫瘍細胞溶解をもたらし得るかを決定するために、陰性標的対照としてＫ５６２赤白血病細胞株を使用して、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを実施した。単一の構築物操作ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞を生成する前に、本出願人は、５つのＴ細胞群におけるＭＭ腫瘍細胞殺傷を比較した：（１）未改変Ｔ細胞、（２）空ベクター（ＥＶ）形質導入Ｔ細胞（ＥＶＴ）、（３）抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１−ＢｓＡｂ形質導入Ｔ細胞（以下、ＢｓＡｂ  Ｔと称される）、（４）ＢＣＭＡ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（以下、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴと称される）および（５）抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂおよびＢＣＭＡ−ＣＡＲ連続形質導入Ｔ細胞（ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔと称される）。標的ＭＭ細胞株ＢＣＭＡｈｉｇｈＣＳ１ｈｉｇｈＭＭ．１ＳおよびＢＣＭＡｈｉｇｈＣＳ１ｉｎｔＨ９２９の場合、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞は、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞またはＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞よりも有意に優れた殺傷をもたらした。標的ＭＭ細胞株ＢＣＭＡｉｎｔＣＳ１ｌｏｗＲＰＭＩ−８２２６の場合、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞は、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞よりも優れた性能であったが、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞よりも優れた性能ではなかった；重要なことに、単一または組み合わせの抗原ターゲティングはいずれも、陰性対照Ｋ５６２赤白血病標的細胞株に対して活性を有しなかった（図２Ｂ）。注目すべきことに、ＭＭ標的細胞の溶解において、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞は、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞、ＥＶＴ細胞および未改変Ｔ細胞の効果と比較して有効であった。統計分析により、エフェクター細胞のＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞集団を用いて行った細胞毒性アッセイでは、標的ＭＭ細胞株が中〜高レベルのＣＳ１およびＢＣＭＡを発現した場合に（すなわち、ＭＭ１．Ｓおよ���Ｈ９２９）相乗効果が観察されたが、標的細胞が低または中レベルの２つの抗原を発現した場合（すなわち、ＲＰＭＩ―８２２６）にはこの効果は観察されなかったことが示された（図２Ｂ）。
【０２４９】
ＣＳ１およびＢＣＭＡを内因的に発現するＭＭ細胞の認識による上記形質導入Ｔ細胞の活性化をさらに決定するために、本出願人は、ＥＬＩＳＡを介して、未改変Ｔ細胞、ＥＶＴ細胞、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞およびＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞由来の上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α分泌を測定した。ＢＣＭＡｈｉｇｈＣＳ１ｈｉｇｈＭＭ．１ＳまたはＢＣＭＡｈｉｇｈＣＳ１ｉｎｔＨ９２９  ＭＭ細胞株と共に共培養した場合、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌は、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞またはＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞のみよりも有意に高かった。ＢＣＭＡｉｎｔＣＳ１ｌｏｗＲＰＭＩ−８２２６ＭＭ細胞株との共培養条件では、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌は、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞よりも有意に高かったが、ＢＣＭＡＴ細胞と比較して有意に高くなかった。ＣＳ１−ＢＣＭＡ−Ｋ５６２赤白血病細胞株との共培養条件または腫瘍標的細胞なしでは、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞は、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞またはＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞のいずれかを用いた単一抗原ターゲティングよりも優れていなかった（図２Ｃ）。ＭＭ．１Ｓ、Ｈ９２９またはＲＰＭＩ−８２２６ＭＭ細胞株と共に共培養した場合、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞、ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞またはＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞におけるＩＬ−２産生は、未改変Ｔ細胞またはＥＶＴ細胞よりも劇的に高かった（図２Ｄ）。興味深いことに、陰性対照Ｋ５６２赤白血病細胞株との共培養または標的細胞なしの場合であっても、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞およびＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞（図２Ｄ）で見られるＩＬ−２分泌よりも有意に高い高レベルのＩＬ−２を分泌したが、これは、少なくともこの例では、前記効果が、ＭＭ標的細胞ではなく分泌ＢｓＡｂそれ自体の存在に起因するようであることを示唆している。ＴＮＦ−α分泌は、ＩＦＮ−γ分泌と一致していた（図２Ｅ）。全体として、これらの結果は、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞またはＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞と比較して、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞がＭＭ標的細胞をより特異的に認識することができ、これらのＭＭ細胞の認識後により活性化されることを示した。また、他の条件と比較して、本出願人はまた、ＢｓＡｂ構築物を発現しないＴ細胞と比較してＩＬ−２産生が非常に豊富であることから明らかであるように、ＭＭ細胞の存在または非存在にかかわらず、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞またはＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞から分泌されたＢｓＡｂがＴ細胞活性化をトリガーするようであることを発見した（図２Ｄ）。これは、細胞傷害性ＣＤ８（＋）Ｔ細胞上で発現されたＮＫＧ２Ｄ受容体が、分泌ＢｓＡｂの存在により活性化されていることを示唆していた。
【０２５０】
ＭＭにおけるＢＣＭＡおよびＣＳ１の両方をターゲティングする単一構築物操作ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の生成：本出願人は、２つの別個の構築物により送達されるＢＣＭＡ−ＣＡＲおよび抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂを共発現するＴ細胞（すなわち、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞）が、ＢＣＭＡ−ＣＡＲまたはＢｓＡｂのいずれかを発現するＴ細胞と比較して、ＭＭ細胞の殺傷において優れていたことを認めた。ＢｓＡｂおよびＣＡＲの両方を発現する単一の構築物（以下、ＢｓＡｂ−ＣＡＲと称される）は、（１）単一のＴ細胞で両構築物の有効な発現をもたらし；（２）製造コストを削減し；（３）時間を節約する上でより実用的であろう。したがって、本出願人は、Ｔ２Ａにより接続されたレンチウイルスベクター骨格において両部分を含有する単一のＢｓＡｂ−ＣＡＲ構築物を生成した（図３Ａ）。ＢｓＡｂ−ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞を生成するために、本出願人は上記と同じ方法を利用し、次いで、ＢｓＡｂ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞が成功裏に形質導入されたかを決定した。フローサイトメトリー分析により、ＣＡＲの表面発現を確認した（図２１Ｃ）。４日目に、細胞溶解物および無血清培地の両方において、６ｘ−ｈｉｓタグ付きＡｂを使用して、ＢｓＡｂ融合タンパク質を成功裏に検出した（図３Ｂ）。加えて、ＢｓＡｂ分泌を動的に測定するために、本出願人は、５日目に、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞を無血清培地に再播種し、次いで、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間の時点で無細胞上清を収集した。結果は、発現が１２時間前に始まり、時間依存的に増加し続けたように、ＢｓＡｂ分泌が強力であったことを示した（図２１Ａ〜Ｂ）。次いで、本出願人は、未分画ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞が、ＥＶＴ細胞および未改変Ｔ細胞による殺傷と比較して、ＢＣＭＡｈｉｇｈＣＳ１ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓの有意に優れた殺傷を示したことを実証した細胞（図３Ｃ）。ＢＣＭＡｈｉｇｈＣＳ１ｉｎｔＨ９２９およびＢＣＭＡｉｎｔＣＳ１ｌｏｗＲＰＭＩ−８２２６ＭＭ標的細胞株に対して同様の結果が得られたが、陰性対照Ｋ５６２赤白血病細胞株に対する殺傷はなかった（図２１Ｄ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の約８０％が高い表面密度のＮＫＧ２Ｄ発現を有するので（未分画Ｔ細胞の３０％との対比；図１１Ａ）、本出願人は、ＢｓＡｂ−ＣＡＲ構築物を高濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入した。おそらく予想どおり、本出願人は、これらの細胞が、ＢＣＭＡｈｉｇｈＣＳ１ｈｉｇｈＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞株に対して、ＣＤ８＋ＢｓＡｂ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞ならびに２つの陰性対照未改変Ｔ細胞およびＥＶＴ細胞よりも高い細胞毒性を有することを見出した（図３Ｄ）。
【０２５１】
ＣＡＲＴ細胞により分泌されるＢｓＡｂは、機能的であるために、２つの抗原（腫瘍細胞上で発現されるＣＳ１および免疫細胞上で発現されるＮＫＧ２Ｄ）を必要とする。最初に、本出願人は、ＰＢＭＣ間でＴＣＲパンαβＣＤ３＋Ｔ、ＴＣＲパンγδＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＮＫＴおよびＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を評価したところ、それぞれＰＢＭＣの約５０％、１％、８％および１５％に相当する（図１１Ａ）。さらに、本出願人は、Ｔ細胞の約３０％、ＣＤ８＋Ｔ細胞の８０％、γδＴ細胞の７０％、ＮＫＴ細胞の６０％およびＮＫ細胞の９０％において、ＮＫＧ２Ｄが発現されることを確認した。注目すべきことに、γδＴ細胞のサブセットであるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞のほぼ９０％は、ＮＫＧ２Ｄを発現した（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂがＮＫＧ２Ｄ＋免疫細胞をトリガーするかを決定するために、本出願人は、１個の標的細胞（ＭＭ．１Ｓ）に対して１０個のエフェクター（形質導入または未改変Ｔ細胞）の比で上記４時間クロム−５１放出アッセイを行ったが、異なる量のヒトＰＢＭＣ（すなわち、腫瘍細胞の１、１０、１００または２００倍）を添加した。本出願人は、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞および／またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞のいずれか由来の分泌ＢｓＡｂが、非形質導入ＮＫＧ２Ｄ＋細胞溶解性エフェクター細胞をＣＳ１＋ＭＭ細胞株標的に動員する場合、非形質導入ＰＢＭＣの添加から希釈が大きくなるにつれて、標的の殺傷が上昇すると仮説した。本出願人の仮説を支持して、非形質導入ＰＢＭＣが増加するにつれて、ＢｓＡｂを分泌する形質導入Ｔ細胞（すなわち、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞）を含有する培養物のみが、ＢＣＭＡｈｉｇｈＣＳ１ｈｉｇｈＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞株に対する細胞毒性の増加を示した（図３Ｅ）。予想どおり、前記効果は、より低いＣＳ１発現を有するＢＣＭＡｈｉｇｈＣＳ１ｉｎｔＨ９２９細胞株に対しては、ＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞株よりも控えめであり、ＢＣＭＡｉｎｔＣＳ１ｌｏｗＲＰＭＩ−８２２６  ＭＭ標的細胞株に対しては存在しなかった（図１２Ａ、１２Ｂ）。
【０２５２】
次に、本出願人は、ＰＢＭＣの各サブセット、すなわちＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびγ９Ｖδ２Ｔ細胞をほぼ９８％の純度に濃縮し（図１３）、それぞれＩＬ−２、ＣａｌＣｅｒ＋ＩＬ−２、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ＋ＩＬ−２およびＨＭＢＰＰ＋ＩＬ−２でそれらをプライミングし、対照または実験ベクターの１つでそれぞれ形質導入し、続いて、それぞれについて５：１のＥ：Ｔ比でＢＣＭＡｈｉｇｈＣＳ１ｈｉｇｈＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞株に対して５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイを４時間（図３Ｆ、左）または１６時間（図３Ｆ、右）行った。４時間またはそれを超えるインキュベーションでは、結果は、ＢｓＡｂ  ＣＡＲＴ細胞が、Ｔ細胞サブセットまたは活性化方法にかかわらず、他の構築物を形質導入した同一の細胞よりも有意に高い細胞毒性を有することを示した（図３Ｆおよび１４）。重要なことに、検討したＢｓＡｂ  ＣＡＲＴ細胞集団の中では、対照細胞と比較して、活性化ＣＤ４＋ＢｓＡｂ  ＣＡＲＴ細胞は、細胞毒性活性の最小増加を有していた（図３Ｆ、右および図１４）が、これはおそらく、少なくとも部分的には、この集団におけるＮＫＧ２Ｄの比較的低い表面密度発現によるものである。
【０２５３】
ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞により分泌されたＢｓＡｂが、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞とＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞との間のシナプス形成を誘導し得るかを決定するために、１時間のコインキュベーション後に共焦点顕微鏡分析を行った。ＥＶＴ細胞とＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞との共培養の対照を観察したところ、シナプスは見られなかった（図３Ｇ）。対照的に、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞とＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞との共培養中には、シナプスが観察された（図３Ｈ）。
【０２５４】
さらに、ＢｓＡｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞（緑色）と標的ＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞（赤色）との２４時間共培養を観察したところ、本出願人は、ＢｓＡｂ  ＣＡＲ−Ｔ集団（緑色）のみが存在していたことを発見した（図１５Ａ〜Ｆ）；ＥＶＴ細胞とＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞との共培養では、標的ＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞およびエフェクターＥＶＴ細胞（緑色）は両方とも依然として存在していた（図１５Ｇ〜Ｍ）。
【０２５５】
ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の機能的に強化された認識および活性化は、ＣＳ１およびＢＣＭＡ依存的である：ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の増強された細胞毒性効果が腫瘍抗原のターゲティングに依存していたことを証明するために、本出願人は次に、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞耐性Ｋ５６２細胞株におけるＣＳ１およびＢＣＭＡの強制過剰発現が、このエフェクター集団に対する溶解の閾値を低下させ得るかを調査した。この目的のために、本出願人は、ヒトＣＳ１およびＢＣＭＡ（または対照として空ベクターＰＣＤＨ）をコードするレンチウイルスでＫ５６２細胞に連続して形質導入して、ＣＳ１およびＢＣＭＡを異所性発現するＫ５６２細胞株を生成した（図１６）。標的細胞株の生成の成功を確認した後（図４Ａ）、本出願人は、５１Ｃｒ放出アッセイを実施したところ、結果は、Ｋ５６２赤白血病細胞株におけるＣＳ１およびＢＣＭＡの過剰発現が、ＥＶＴ細胞を使用した細胞毒性と比較して、このＫ５６２細胞株に対するＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の細胞毒性活性の有意な増加をもたらしたことを示した（図４Ｂ、紫色線）。次に、本出願人は、ＥＬＩＳＡアッセイを実施したところ、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞とＫ５６２−ＣＳ１−ＢＣＭＡ細胞との共培養では、ＥＶＳＴ細胞とＫ５６２−ＣＳ１−ＢＣＭＡ細胞との共培養と比較して、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌の増加が示された（図４Ｃ、４Ｄ）。しかしながら、Ｋ５６２−ＰＣＤＨと共にインキュベートした場合、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞とＥＶＴ細胞との間で細胞毒性、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生の差異はなかった（図４Ｂ〜Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞による標的細胞の認識、殺傷およびサイトカイン分泌の増加が、ＣＳ１およびＢＣＭＡ依存的に発生したことを示唆した。
【０２５６】
分泌抗ＮＫＧ２Ｄ−抗ＣＳ１  ＢｓＡｂは、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を通じて、インビトロにおけるＣＡＲＴ細胞増殖、ならびにインビボにおける生存および増殖の両方を増強する：いくつかの患者では、ＣＡＲＴ細胞は、限定的な拡大および生存能力により非常に長く生存しないので、これは、これらの細胞の有効性を制限し得る４２。予想外のことに、本出願人は、同様の時点で、ＢｓＡｂ形質導入Ｔ細胞およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の培養培地が、ＢｓＡｂなしの他の条件と比較してより酸性であったことを見出したが、これは、より高い細胞代謝速度を示唆している（図５Ａ、上）。この観察結果は、標的細胞なし、またはＢＣＭＡ−ＣＳ１−標的細胞の場合であっても、これらのＢｓＡｂ形質導入細胞がより多くのサイトカインを分泌し得るという上記データと一致する（図２Ｄ）。本出願人は、ＢｓＡｂの発現および分泌が、Ｔ細胞増殖、生存および／またはその活性化を誘導し得ると推測した。細胞の計数により、他の培養条件と比較して、ＢｓＡｂまたはＢｓＡｂ−ＣＡＲ構築物を形質導入したＴ細胞を含有するものは、実際に、有意に多量の細胞を含有していたことが確認されたが（図５Ａ、棒グラフ）、これは、ｖｉｏｌｅｔセルトラッカーにより実証されているように、および下パネルのヒストグラムに示されているＶ４５０希釈として示されているように、Ｔ細胞増殖に起因していた（図５Ａ、ヒストグラム）。
【０２５７】
これらの予想外の結果を確認するために、本出願人は、図５Ａに示されているＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞培養物由来の上清を、ＢｓＡｂなしの細胞培養条件（すなわち、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞、ＥＶＴ細胞および未改変Ｔ細胞）に添加した。実際、５日間のインキュベーション後、細胞ターンオーバーの際に発生する黄色の培地により明らかであるように、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞培養物由来の上清の添加は、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞培地由来の上清を補充しなかったＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞、ＥＶＴ細胞および未改変Ｔ細胞の培養物と比較して有意に大きい程度の細胞代謝をもたらした（示さず）。細胞の計数により、他の培養条件と比較して、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞由来の培地を補充したものは、実際に、有意に多量の細胞を含有していたことが確認されたが（図５Ｂ、上）、これは、ｖｉｏｌｅｔセルトラッカーにより実証されているように、および下パネルのヒストグラムに示されているＶ４５０希釈として示されているように、Ｔ細胞増殖に起因していた（図５Ｂ、下）。Ｋｉ６７染色は、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞のいずれかを含有する培養物では、ＮＫＧ２Ｄ＋細胞の大部分およびＮＫＧ２Ｄ−細胞のほぼ半分が増殖していたことを示したが（図５Ｃおよび図１７Ａ）、これは、ＢｓＡｂ活性化ＮＫＧ２Ｄ＋細胞が今度は、より小さい程度ではあるが、ＮＫＧ２Ｄ−細胞を活性化し得ることを示している。また、ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体は、分泌ＢｓＡｂの増殖効果を軽減した（図５Ｃ青色フレーム、図１７Ｂ）。イムノブロット分析を実施してＡＫＴタンパク質のリン酸化（ｐ）を決定したところ、ＢｓＡｂ  ＴおよびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞培養条件は、より高レベルのｐ−ＡＫＴを有するので、これらの条件下では、分泌ＢｓＡｂは、ＮＫＧ２Ｄ＋細胞増殖および活性化をトリガーし得ることが確認された（図５Ｄ）。
【０２５８】
これまでに提示したデータは、ＢｓＡｂによるＮＫＧ２Ｄ＋免疫細胞の活性化が、ＮＫＧ２Ｄ経路を通じて発生しているという考えを裏付けていた。次に、本出願人は、ＭＭ細胞だけではなくＮＫ、ＮＫＴ、ＣＤ８＋ＴおよびＢ細胞またはそれらのサブセットでも発現されるＣＳ１を介して、その活性化が発生しているかを調べた。（Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｇｕｏ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１３  Ｏｃｔ；８８（１）：１６８−７７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｒｉｔｒｅｖｏｎｃ．２０１３．０４．００３．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｊｕｎ  ２；Ｇｏｇｉｓｈｖｉｌｉら、Ｂｌｏｏｄ．２０１７  Ｄｅｃ  ２８；１３０（２６）：２８３８−２８４７．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１７−０４−７７８４２３．Ｅｐｕｂ  ２０１７  Ｏｃｔ  ３１．）分泌ＢｓＡｂもまた、それらのＣＳ１発現を介して、およびＣＳ１＋シグナル伝達経路を介して、ＮＫＧ２Ｄ＋免疫細胞を刺激しているかを決定するために、本出願人は次に、抗ＣＳ１遮断抗体を使用してこの経路を遮断した。本出願人は、ＣＳ１遮断が免疫細胞の活性化状態に影響を及ぼさなかったことを見出した（図１７Ｃ）。また、本出願人は、ＮＫＧ２ＤおよびＣＳ１二重遮断を実施したところ、結果は、ＮＫＧ２Ｄ単一遮断と比較して差異がなかったことを実証した（データは示さず）。まとめると、これらのデータは、ＢｓＡｂを分泌する免疫細胞の活性化が、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達経路を通じてのみ発生することを示唆している。
【０２５９】
上記知見に基づいて、本出願人は、Ｔ細胞と標的集団ＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞との共培養では、免疫活性化がＮＫＧ２Ｄに厳密に依存せず、Ｔ細胞のＮＫＧ２Ｄ＋サブセットに限定されないと予測した。例えば、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞をＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞と共に共培養したところ、ＣＤ３＋Ｔ細胞のＮＫＧ２Ｄ＋（図５Ｅの赤色；８３％〜９４％）およびＮＫＧ２Ｄ−（図５Ｅの緑色；７９％〜８７％）画分は両方とも、Ｋｉ６７染色により測定した場合に広範な増殖を示した。同様に、ＢＣＭＡ  ＣＡＲのみを発現するＣＤ３＋Ｔ細胞（図５ＥではＦａｂ＋と表記されている）の場合、ＣＤ３＋Ｔ細胞のＮＫＧ２Ｄ＋（赤色；９０．４％）およびＮＫＧ２Ｄ−（緑色；８５．８％）画分は両方とも、ＮＫＧ２Ｄ＋およびＮＫＧ２Ｄ−ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の両方で見られたよりもわずかに小さい程度ではあるが、Ｋｉ６７染色により測定した場合に広範な増殖を示した。
【０２６０】
インビトロで生存する形質導入Ｔ細胞の能力を調査するために、本出願人は、ＩＬ−２の存在下または非存在下で様々な形質導入Ｔ細胞を培養した。ＩＬ−２条件下では、すべての細胞が、高いＫｉ６７発現ならびに低いアネキシンＶおよび／またはＳｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ発現を示した（図６ａ）。興味深いことに、ＩＬ−２欠乏条件（図６ｂ）では、（ＢｓＡｂを分泌し、ＮＫＧ２Ｄを介してＴ細胞を活性化する）ＢｓＡｂ  Ｔ細胞およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞のみが、約８０％のＫｉ６７発現として、良好な増殖能力を示したが、これは、図２Ｄに示されているデータと一致し、アネキシンＶおよび／またはＳｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ染色の低発現により示されている細胞アポトーシスおよび細胞死の減少と一致する（図６ｂ）。また、図６ｃにおいて、これらの結果は、他の３つの群（未改変Ｔ細胞、ＥＶＴ細胞およびＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞）と比較されている。したがって、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴは、おそらくＮＫＧ２Ｄシグナル伝達経路を介して、細胞増殖を増強し、細胞生存を増大させた。
【０２６１】
インビボにおける未改変Ｔ細胞、ＥＶＴ細胞、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の生存および増殖を比較するために、本出願人は、これらのヒト細胞を免疫不全ＮＳＧマウスに（静脈内）注射した（図７Ａ、上）。−１日目に、ヒト細胞の静脈内注射前のバックグラウンド染色も評価した（図７Ａおよび図１８）。＋１日目に、各ヒトＴ細胞注射を受けたマウスは同等のヒトＣＤ３発現を示し、Ｆ（ａｂ）２発現により、２つのＣＡＲＴ細胞集団も同定した。また、ＮＳＧマウスから単離された４つすべてのＴ細胞集団の９７％において、活性化マーカーＣＤ６９が検出された（図７Ａおよび図１８）。興味深いことに、Ｔ細胞注入の１４日後、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞群のみが、それらの高いＣＤ３およびＣＤ６９共発現を保持していたが、他の３つの群では、ＣＤ６９発現が実質的に減少していた（図７Ａおよび図１８）。統計分析は、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞群におけるＣＤ３およびＣＤ３＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞の両方の＋１４日目の割合が、他の３つの群よりも有意に高かったことを示した（図７Ｂおよび７Ｃ）。様々な形質導入Ｔ細胞注射の３５日後、ヒストグラムは、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞を注射したマウスのみが依然として、高割合のｈＣＤ３Ｔ細胞を有していたことを示した（図７Ｂ）。インビボ増殖データは、Ｋｉ６７＋ＣＤ６９＋の割合が約６１．１％であったことを示したが、これは、非形質導入または形質導入Ｔ細胞を受けた他の３つの群よりも有意に高かった（図７ａ紫色のコートパネル、図７ｃ）。また、本出願人はまた、インビボにおけるＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の生存を決定し、生存（アネキシンＶ−Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ−）ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の割合が約８７％であり、死（アネキシンＶ＋Ｓｙｔｏｘ  Ｂｌｕｅ＋）ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の割合が約５％であったことを観察した。統計分析は、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞が、他の３つの群と比較して高い割合の生細胞および低い割合の死細胞を有していたことを示した（図７Ｄ）。まとめると、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞は、注射細胞（ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞を含む）の他の群と比較して、インビトロでＮＫＧ２Ｄシグナル伝達経路を介して増強された細胞増殖を示すだけではなく、インビボで増強された増殖および生存を示す。
【０２６２】
エクスビボにおけるＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞による原発性骨髄腫細胞の改善された認識および殺傷：ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の臨床的関連性を評価するために、本出願人は、それらが、患者から単離されたＭＭ細胞を効率的に認識および殺傷し、エクスビボでＩＦＮ−γ産生を増強し得るかを調査した。正の磁気選択を使用して、８人の患者の骨髄から得られた初代ＣＤ１３８＋ＭＭ細胞を単離し、フローサイトメトリーを使用して、ＢＣＭＡおよびＣＳ１の表面発現を評価した（図８Ａ）。自己ＰＢＭＣの非存在下で実施した５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、本出願人は、患者由来のＭＭ細胞が、８人すべての患者においてＥＶ形質導入Ｔ細胞媒介性溶解に対して非常に耐性であったことを観察した。ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞またはＢｓＡｂ  Ｔ細胞と比較して、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞は、試験した８人すべての患者（その腫瘍細胞が非常に低いＣＳ１表面密度発現を有していた患者１を含む）において有意に高い細胞毒性を示した。ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞とＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞との間では、細胞溶解活性に有意差はない（図８Ｂ）。本出願人はまた、同様の共培養アッセイで、２４時間後のＩＦＮ−γを測定した。ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞はまた、ＥＶ形質導入Ｔ細胞、ＢｓＡｂ  Ｔ細胞またはＢＣＭＡ−ＣＡＲＴ細胞よりも有意に高いレベルのＩＦＮ−を分泌した（図８Ｃ）。これらの知見は、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞が、エクスビボで患者ＭＭ細胞を根絶する優れた能力を有することを実証している。
【０２６３】
ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞はＭＭ腫瘍成長を阻害し、同所性異種移植ＭＭモデルで腫瘍担持マウスの生存を延長する：ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の治療適用可能性にさらに取り組むために、本出願人は、ＭＭ．１Ｓ  ＭＭ生着ＮＳＧマウスモデルでそれらの抗腫瘍活性を調べた。ＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞の静脈内注射は、ＭＭのマウス異種移植モデルを確立するために広く使用されているが、これは、骨髄移植と、ヒトＭＭを厳密に再現する多巣性骨溶解病変の一貫した確立とにつながり得るためである４３、４４。腫瘍成長のモニタリングを容易にするために、本出願人は、レトロウイルス感染によりＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼの両方を発現するようにＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞を操作し、以前に報告されているように３０、０日目に、８×１０６個のこれらのＭＭ細胞の静脈内注射を使用してＮＳＧマウスに移植した。次いで、これらのマウスに、生理食塩水または１×１０７個のＥＶＴ細胞、１×１０７個のＢｓＡｂ  Ｔ細胞、１×１０７個のＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞、１×１０７個のＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞または１×１０７個のＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞を３回（１０日目、１７日目および２４日目）静脈内注入した。８０日目まで生存したマウスについて、本出願人は末梢血リンパ球を収集し、１×１０４個のＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞でマウス（ｎｉｃｅ）を再チャレンジした。生物発光イメージングを使用してＭＭ．１Ｓ  ＭＭ成長をモニタリングしたところ、６つすべての処置群において、３１日目まで初期疾患進行を示した（図９Ａ）。抗Ｆ（ａｂ）２抗体を使用してＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞を同定したところ、本出願人は、８０日目に、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞およびＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の割合が、ＭＭ．１Ｓ  ＭＭマウスの血中では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴよりも有意に高かったが（図９Ｂ）、各マウスにおける総リンパ球数は類似していたことを認めた（データは示さず）。イムノブロッティングは、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞で処置した８０日目のＭＭ．１Ｓ  ＭＭマウス由来の血清が依然として、分泌ＢｓＡｂを含有していたことを示した（図示せず）。８０日目までに、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞で処置したＭＭ．１Ｓ  ＭＭマウスは、生理食塩水対照、ＥＶＴ細胞またはＢｓＡｂ  Ｔ細胞で処置した同様のマウスと比較して有意に延長した生存を有していた。ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞で処置したＭＭ．１Ｓ  ＭＭマウスは、ＢｓＡｂ−ＢＣＭＡ  ｓｅｑ．ｔｒａｎｓ．Ｔ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞で処置したＭＭ．１Ｓ  ＭＭマウスよりもわずかに悪化した（図９Ｄ）。１４０日目（最初の腫瘍再チャレンジの６０日後）に、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ群で処置したＭＭ．１Ｓ  ＭＭマウスの５匹すべてが生存していた（図９Ｄ）。腫瘍再チャレンジ後のこれらの生存データはおそらく、図７における上記ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の増強されたインビボ生存および増強されたインビボ増殖を証明している。全体として、これらの結果は、ＭＭ腫瘍成長を阻害し、同所性異種移植ＭＭモデルで腫瘍担持マウスの生存を延長する能力において、ＢｓＡｂ−ＣＡＲ��細胞が、他の非形質導入または形質導入Ｔ細胞集団よりも優れていることを示している。
【０２６４】
同所性異種移植ＭＭモデルにおけるヒト非形質導入ＮＫＧ２Ｄ＋リンパ球の関連性を決定するために（すなわち、図３Ｅに示されているインビトロ実験のインビボカウンターパート）、本出願人は次に、同じドナーから単離された骨髄細胞枯渇ＰＢＭＣを同時注射しながら、ＭＭ．１Ｓ  ＭＭ担持ＮＳＧマウスにおける生理食塩水対照、ＥＶＴ細胞、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞またはＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍有効性を調べた。選別による骨髄細胞の枯渇を行って、ＧＶＨＤを回避した（図１０Ａ、１０Ｂ）。３７日目までのＭＭ進行を記録したイメージングと同様に、ＭＭ．１Ｓ  ＭＭ細胞、正常ヒトリンパ球および様々な形質導入Ｔ細胞の注射スキームは図１０Ａに示されている。図１０Ｂおよび１０Ｃは、これらのマウスの血中で検出されたヒトリンパ球の割合を示す。これらの条件下でさらに時間を費やして、本出願人は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞で処置したマウス（ＢｓＡｂを分泌しない；１００日目までの生存０％）と、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞で処置したマウス（ＢｓＡｂを分泌する；１４０日目までの生存１００％；図１０Ｄ）との間の劇的な差異を見出した。これらのデータは、腫瘍根絶については、関与するＮＫＧ２Ｄ＋免疫細胞が多いほど、ＢｓＡｂ−ＣＡＲＴ細胞の有効性が良好であることを示唆している。
【０２６５】
等価物
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、この技術が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。
【０２６６】
本明細書中に例証的に記載された本技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメント、限定の非存在下において適切に実施され得る。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、拡張的に無制限に解釈されるものとする。さらに、本明細書中で使用される用語および表現は、説明の用語として使用されているのであって、限定の用語としては使用されておらず、そのような用語および表現の使用には、示されるおよび記載される特徴またはその一部の任意の等価物を排除する意図はなく、様々な改変が、特許請求される本技術の範囲内で可能であることが認識される。
【０２６７】
したがって、本明細書中に提供される材料、方法および例は、好ましい態様の代表であり、例示的なものであり、本技術の範囲に対する限定と意図されていないことが理解されるべきである。
【０２６８】
本技術は、本明細書中で広く一般的に説明された。その一般的な開示の範囲内に入るより狭い種および亜属の分類の各々も、本技術の一部を形成する。これには、削除される材料が本明細書に明確に列挙されているか否かに関係なく、条件付きでの、またはその属から任意の主題を除くネガティブな限定付きでの本技術の一般的な説明が含まれる。
【０２６９】
さらに、本技術の特徴または態様が、マーカッシュ群で説明されている場合、当業者は、本技術が、そのマーカッシュ群の任意の個別のメンバーまたはメンバーのサブグループでも説明されていると認識する。
【０２７０】
本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、各々が個別に参照により援用されたのと同一程度に、それらの全体が参照により明白に援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【０２７１】
他の態様は、以下の特許請求の範囲に示される。
参考文献
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部分配列表
【０２７２】
例示的なＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ：
【０２７３】
抗ＢＣＭＡ配列１  ｓｃＦｖ重鎖
ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACCAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCCGGCACTACAGCATGAACTGGGTGAAACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCCGGATCAACACCGAGAGCGGCGTGCCCATCTACGCCGACGACTTCAAGGGCAGATTCGCCTTCAGCGTGGAAACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGGTGATCAACAACCTGAAGGACGAGGATACCGCCAGCTACTTCTGCAGCAACGACTACCTGTACAGCCTGGACTTCTGGGGCCAGGGCACCGCCCTGACCGTGTCCAGC
【０２７４】
抗ＢＣＭＡ配列１  ｓｃＦｖ軽鎖
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCTACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCCAGCTGGCTAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAGCCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGAACAAAGCTGGAAATCAAG
【０２７５】
抗ＢＣＭＡ配列２  ｓｃＦｖ重鎖
ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACCAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATCAACTGGGTGAAAAGAGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAGACAAGAGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCAGATTCGCCTTCAGCCTGGAAACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTTTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGC
【０２７６】
抗ＢＣＭＡ配列２  ｓｃＦｖ軽鎖
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCCAGCTCGCCAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAGCCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAG
【０２７７】
抗ＣＳ−１ｓｃＦｖ重鎖ＤＮＡ配列
【化５】
2021524731.tif 000007
【０２７８】
抗ＣＳ−１ｓｃＦｖ軽鎖ＤＮＡ配列
【化６】
2021524731.tif 000008
【０２７９】
抗ＮＫＧ２Ｄ重鎖ＤＮＡ配列
【化７】
2021524731.tif 000009
【０２８０】
抗ＮＫＧ２Ｄ軽鎖ＤＮＡ配列
【化８】
2021524731.tif 000010
【０２８１】
リンカー
GGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCT
【０２８２】
抗ＮＫＧ２Ｄ重鎖
CAAGTGCAGCTGGTTGAATCCGGTGGCGGTCTGGTCAAGCCGGGCGGCTCTTTGCGTCTGAGCTGTGCCGCGTCGGGTTTTACCTTCAGCTCTTATGGTATGCATTGGGTGCGTCAGGCGCCTGGCAAAGGTCTGGAGTGGGTTGCGTTCATCCGCTACGATGGGTCTAACAAATATTATGCCGACTCAGTAAAAGGACGCTTCACTATTAGCCGCGACAATAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAAATGAATAGCCTGCGCGCCGAAGATACCGCCGTTTACTATTGCGCTAAAGATCGTGGCCTGGGTGATGGTACGTACTTCGATTACTGGGGTCAGGGCACCACCGTTACCGTTAGTTCAGGTGGGGGCGGCTCT
【０２８３】
抗ＮＫＧ２Ｄ軽鎖
CAGCGCTTACGCAGCCGGCGTCGGTGTCGGGTTCCCCGGGTCAGTCGATCACGATCAGCTGTAGTGGGAGCAGCTCCAACATCGGTAACAACGCAGTGAACTGGTATCAGCAACTGCCGGGAAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTACTATGATGATTTGCTGCCAAGTGGAGTTAGTGACCGCTTTTCCGGCAGTAAATCGGGTACCTCGGCTTTTCTGGCTATTTCGGGTCTCCAGAGCGAGGATGAAGCTGATTATTATTGCGCCGCATGGGATGATAGCTTAAATGGCCCAGTTTTTGGCGGCGGTACTAAACTGACCGTGCTG
【０２８４】
ＨＭＡ配列
CCGAGCGGCCAGGCGGGCGCGGCGGCATCGGAGTCCCTGTTTGTGTCAAATCACGCCTAC
【０２８５】
抗ＣＳ１重鎖
CTCCGTGACGGTGTCGACGGGCCAAGGATGGTACGATATGGCACGGACCGCGATTATGACATCGCGGGCGTGCTATTACGTGGCCAGCGATGAGTCGACCCCTTCCTCTCTGCAAATGTATGCCACCTCCTCTTCAAAAGACGTGACTCTGACTGCGAAAGACAAATTTAAACAGAATCTGCGCACCGAAAGCGATAGCCCACATATCATGGGCATCTGGGAACTGGGCCAGGGCCCCCGCCAGAAAGTGTGGAACATGTGGTACACCACCTTCAGCTATGGTTCGGCCAAATGTTCCCTGAAGGTATCAGCCGGCCCGCGCGTTCTTGAGGCGGGTCCGCAGCAGCTGCAGGTACAGAGC
【０２８６】
抗ＣＳ１軽鎖
AAACTGGAACTCAAGACGGGTGCGGGATTTACCCTCCCTACGAGCTATCACCAGCAGTGCTATTACGTGGCGCTTGACGAAGCGCAGGTGAACTCTATTACCTTTACCTTTGATACAGGATCAGGCAGCGGTACGTTCCGTGATCCGGTAGGTACGTACCGGTATAGTGCAAGCTATATCCTTCTGAAACCTTCTCAGGGTCCGAAACAGCAGTACTGGGCGGTGGGAACGATCGTGGACCAGTCTGCCAAATGTACAATTTCAGTTCGCGACGGAGTTAGCACCTCCATGAGCAAGCAGTCCCAAACCATGGTGATTGACTCT
【０２８７】
抗ＢＣＭＡ重鎖配列２
CAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATCAACTGGGTGAAAAGAGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATCAACACCGAGACAAGAGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCAGATTCGCCTTCAGCCTGGAAACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTTTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGC
【０２８８】
抗ＢＣＭＡ軽鎖配列２
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCGGGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCCAGCTCGCCAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCAGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAGCCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAG
【図１】
2021524731.tif 000011
【図２Ａ−Ｂ】
2021524731.tif 000012
【図２Ｃ−Ｅ】
2021524731.tif 000013
【図３Ａ−Ｆ】
2021524731.tif 000014
【図３Ｇ−Ｈ】
2021524731.tif 000015
【図４】
2021524731.tif 000016
【図５Ａ−Ｄ】
2021524731.tif 000017
【図５Ｅ−１】
2021524731.tif 000018
【図５Ｅ−２】
2021524731.tif 000019
【図６Ａ】
2021524731.tif 000020
【図６Ｂ】
2021524731.tif 000021
【図６Ｃ】
2021524731.tif 000022
【図７Ａ−１】
2021524731.tif 000023
【図７Ａ−２】
2021524731.tif 000024
【図７Ｂ−Ｄ】
2021524731.tif 000025
【図８Ａ−Ｂ】
2021524731.tif 000026
【図８Ｃ】
2021524731.tif 000027
【図９Ａ】
2021524731.tif 000028
【図９Ｂ】
2021524731.tif 000029
【図９Ｃ】
2021524731.tif 000030
【図１０Ａ】
2021524731.tif 000031
【図１０Ｂ】
2021524731.tif 000032
【図１０Ｃ−Ｄ】
2021524731.tif 000033
【図１１Ａ−Ｂ】
2021524731.tif 000034
【図１１Ｂ−Ｃ】
2021524731.tif 000035
【図１２Ａ】
2021524731.tif 000036
【図１２Ｂ】
2021524731.tif 000037
【図１３Ａ−Ｂ】
2021524731.tif 000038
【図１３Ｃ−Ｄ】
2021524731.tif 000039
【図１４】
2021524731.tif 000040
【図１５】
2021524731.tif 000041
【図１６】
2021524731.tif 000042
【図１７Ａ−Ｂ】
2021524731.tif 000043
【図１７Ｃ】
2021524731.tif 000044
【図１７Ｄ】
2021524731.tif 000045
【図１８】
2021524731.tif 000046
【図１９】
2021524731.tif 000047
【図２０】
2021524731.tif 000048
【図２１Ａ−Ｂ】
2021524731.tif 000049
【図２１Ｃ−Ｄ】
2021524731.tif 000050
【配列表】
2021524731000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月25日(2021.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸であって、
（ａ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）をターゲティングする抗原結合ドメイン；（ｂ）ヒンジドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；および（ｄ）細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド；ならびに
ＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する抗原結合ドメインおよびＳＬＡＭＦ７を認識してそれに結合する抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド
を含む、単離された核酸。
【請求項２】
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αヒンジドメインを含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む、請求項１または２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記細胞内ドメインが、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域または４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域；ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項５】
前記ＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２７の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列番号２８の３つのＣＤＲ，または配列番号３０の３つのＣＤＲおよび配列番号３１の３つのＣＤＲを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項６】
前記ＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する抗原結合ドメインが、
配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
それらの各々の、少なくとも９０％の配列同一性を含む抗原結合ドメイン
を含む、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項７】
前記ＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する抗原結合ドメインが、
配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項８】
前記ＳＬＡＭＦ７を認識してそれに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２５の３つのＣＤＲおよび配列番号２６の３つのＣＤＲ，または配列番号３３の３つのＣＤＲおよび配列番号３４の３つのＣＤＲを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項９】
前記ＳＬＡＭＦ７を認識してそれに結合する抗原結合ドメインが、
配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
それらの各々の、少なくとも９０％の配列同一性を含む抗原結合ドメイン
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
前記ＳＬＡＭＦ７を認識してそれに結合する抗原結合ドメインが、
配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
前記ＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する抗原結合ドメインが、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）であり、前記ＳＬＡＭＦ７を認識してそれに結合する抗原結合ドメインが、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
前記ＢＣＭＡをターゲティングする抗原結合ドメインが、配列番号２１の３つのＣＤＲおよび配列番号２２の３つのＣＤＲ、配列番号２３の３つのＣＤＲおよび配列番号２４の３つのＣＤＲ、または配列番号２０の３つのＣＤＲおよび配列番号２４の３つのＣＤＲを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
前記ＢＣＭＡをターゲティングする抗原結合ドメインが、
配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
それらの各々の、少なくとも９０％の配列同一性を含む抗原結合ドメイン
を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
前記ＢＣＭＡをターゲティングする抗原結合ドメインが、
配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１５】
前記ヒンジドメインが、配列番号３もしくはその等価物を含み、前記膜貫通ドメインが、配列番号４もしくはその等価物を含み、前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号７もしくはその等価物を含み、必要に応じて、前記細胞内ドメインが、配列番号６もしくはその等価物を含むＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域または配列番号５もしくはその等価物を含む４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１７】
前記ベクターがプラスミドであって、必要に応じて前記ポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーターをさらに含む、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
前記ベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より必要に応じて選択されるウイルスベクターであって、必要に応じて前記ポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーターをさらに含む、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項２０】
原核細胞または真核細胞である、請求項１９に記載の単離された細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、免疫細胞、必要に応じてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球またはマクロファージである、請求項１９または２０に記載の単離された細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、幹細胞、必要に応じて人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１９または２０に記載の単離された細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の単離された細胞と、必要に応じて薬学的に許容され得る担体とを含む、組成物。
【請求項２４】
ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合した請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の単離された細胞を含む単離された複合体。
【請求項２５】
癌もしくは腫瘍抗原またはそのフラグメントに結合した請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の単離された細胞を含む単離された複合体であって、前記癌または腫瘍抗原がＢＣＭＡまたはＳＬＡＭＦ７である、単離された複合体。
【請求項２６】
ＣＡＲ発現細胞を生産する方法であって、単離された細胞に、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のベクターを形質導入することを含む、方法。
【請求項２７】
前記単離された細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球またはマクロファージからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
癌または腫瘍抗原を発現する癌細胞または腫瘍の成長を阻害するための組成物であって、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の単離された細胞を含む、組成物。
【請求項２９】
前記組成物がインビトロで使用されることを特徴とする、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物がインビボで使用されることを特徴とし、前記単離された細胞が、処置されている被験体に対して自己または同種（allogeneic）である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物がインビボで使用されることを特徴とし、前記単離された細胞が、処置されている被験体に対して同種（allogenic）である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項２３に記載の組成物と、必要に応じて、使用説明書とを含む、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
自然免疫系の構成要素であるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍成長の防止において重要な役割を果たすが１６、ＮＫ細胞抗腫瘍活性は、多くのＭＭ患者において抑制されることが見出されている１７。活性化または同種ＮＫ細胞の養子移入は、ＭＭ１８、１９および固形腫瘍を含む多くの血液悪性腫瘍の処置において有効な抗腫瘍応答をもたらす。しかしながら、多くの場合では、ＮＫ細胞媒介性抗腫瘍反応は弱く、これは、阻害性受容体のＮＫ細胞発現、生存能力の低下、または腫瘍部位へのエフェクター細胞の遊走の制限に起因し得る２０−２２。一方、適応免疫の一部として、Ｔ細胞は様々な組織に効率的に遊走し、抗原刺激に反応してよく増殖する傾向があり得る。しかしながら、Ｔ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により決定される厳密な特異性を有する。したがって、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方を従事させて、それら自身の制限を克服するための方法は、癌免疫療法にとって非常に有益なものである。本開示は、この利益を提供する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ベクターであって、
（ａ）癌または腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメイン；（ｂ）ヒンジドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；（ｄ）および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド；ならびに
ＮＫＧ２Ｄを認識してそれに結合する抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド
を含む、ベクター。
（項目２）
前記ＣＡＲが、（ａ）癌または腫瘍ターゲティング抗体の抗原結合ドメイン；（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、項目１に記載のベクター。
（項目３）
前記癌または腫瘍ターゲティング抗体が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）および／またはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）、および／またはそれらの各々の等価物をターゲティングする、項目１または２に記載のベクター。
（項目４）
前記二重特異性抗体が、ＮＫＧ２Ｄのリガンドまたは抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよび抗ＳＬＡＭＦ７抗体（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）の抗原結合ドメイン、および／またはそれらの各々の等価物を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
（項目５）
前記二重特異性抗体が、ＮＫＧ２Ｄに対する抗体のＣＤＲ領域および抗ＳＬＡＭＦ７抗体（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）の抗原結合ドメイン、および／またはそれらの各々の等価物を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
（項目６）
前記二重特異性抗体が、ＮＫＧ２Ｄに対する抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびに抗ＳＬＡＭＦ７抗体（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）の抗原結合ドメイン、ならびに／またはそれらの各々の等価物を含む、項目５に記載のベクター。
（項目７）
前記二重特異性抗体が、ＮＫＧ２Ｄに対する抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）、必要に応じて、抗ＳＡＬＭＦ７抗体（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、および／またはそれらの各々の等価物を含む、項目５または６に記載のベクター。
（項目８）
前記ベクターがプラスミドであって、必要に応じて前記ポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーターを含む、項目１〜７のいずれか一項に記載のベクター。
（項目９）
前記ベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターであって、必要に応じて前記ポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーターを含む、項目１〜７のいずれか一項に記載のベクター。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか一項に記載のベクターを含む、単離された細胞。
（項目１１）
原核細胞または真核細胞である、項目１０に記載の単離された細胞。
（項目１２）
真核細胞である、項目１１に記載の単離された細胞。
（項目１３）
前記真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、マウス細胞、ウマ細胞またはヒト細胞から選択される、項目１２に記載の単離された。
（項目１４）
前記真核細胞が、免疫細胞、必要に応じてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球またはマクロファージである、項目１２または１３に記載の単離された細胞。
（項目１５）
前記ＣＡＲを発現し、前記二重特異性抗体を分泌する、項目１０〜１４のいずれか一項に記載の単離された細胞。
（項目１６）
項目１〜９のいずれか一項に記載のベクターおよび／または項目１０〜１５のいずれか一項に記載の単離された細胞と、必要に応じて薬学的に許容され得る担体とを含む、組成物。
（項目１７）
癌または腫瘍抗原を発現する細胞に結合した項目１０〜１５のいずれか一項に記載の単離された細胞を含む単離された複合体であって、必要に応じて、前記癌または腫瘍抗原がＮＫＧ２Ｄおよび／またはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）、および／またはそれらの各々の等価物である、単離された複合体。
（項目１８）
癌もしくは腫瘍抗原またはそのフラグメントに結合した項目１０〜１５のいずれか一項に記載の単離された細胞を含む単離された複合体であって、必要に応じて、前記癌または腫瘍抗原がＢＣＭＡまたはＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９としても公知）、および／またはそれらの各々の等価物である、単離された複合体。
（項目１９）
ＣＡＲ発現細胞を生産する方法であって、単離された細胞に、項目１〜９のいずれか一項に記載のベクターを形質導入することを含む、方法。
（項目２０）
前記単離された細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄細胞、単球またはマクロファージからなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
癌または腫瘍抗原を発現する癌細胞または腫瘍腫瘍の成長を阻害する方法であって、前記癌細胞または腫瘍を、項目１０〜１５のいずれか一項に記載の単離された細胞と接触させることを含む、方法。
（項目２２）
前記接触させることがインビトロまたはインビボである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記接触させることがインビボであり、前記単離された細胞が、処置されている被験体に対して自己または同種（allogeneic）である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記接触させることがインビボであり、前記単離された細胞が、処置されている被験体に対して同種（allogenic）である、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記被験体に、有効量の細胞減少療法または化学療法、または標的抗原の前記発現をアップレギュレーションする治療を投与することをさらに含む、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞減少療法が、化学療法、凍結療法、温熱療法、標的療法および／または放射線療法を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記被験体が、哺乳動物、イヌ、ネコ、ウマ、マウスまたはヒト患者である、項目２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
本明細書中に開示される組成物と、必要に応じて、使用説明書とを含む、キット。
【国際調査報告】
2021524731.tif 000051
2021524731.tif 000052