(57)【要約】  ＣＲＴＡＭに対する抗体、そのような抗体をコードする核酸、抗体をコードするそのような核酸を含む宿主細胞、抗ＣＲＴＡＭ抗体を調製する方法、ならびに疾患、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、ならびに血液悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない、ヒト癌の処置方法が本明細書に開示される。
2021501583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＴＡＭに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
配列番号５を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、
配列番号６を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、および
配列番号７を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号８および配列番号１５からなる群から選択される配列を含むＣＤＲ−Ｌ１配列、
配列番号９を含むＣＤＲ−Ｌ２配列、および
配列番号１０および配列番号１６からなる群から選択される配列を含むＣＤＲ−Ｌ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域が、
配列番号８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号９の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号１０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、請求項２に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
前記軽鎖可変領域が、
配列番号１５の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号９の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号１６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、請求項２に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
ＣＲＴＡＭに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片が、
配列番号５を含むＣＤＲ−Ｈ１、
配列番号６を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
配列番号７を含むＣＤＲ−Ｈ３、を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１５を含むＣＤＲ−Ｌ１、
配列番号９を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
配列番号１６を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖可変領域、
またはそれらのバリアントを含み、前記バリアントが、ｉ）独立して、前記ＣＤＲ−Ｈ１、前記ＣＤＲ−Ｈ２、前記ＣＤＲ−Ｈ３、前記ＣＤＲ−Ｌ１、前記ＣＤＲ−Ｌ２、および前記ＣＤＲ−Ｌ３のうちの任意の１つ以上において１、２、３、４、５、もしくは６個のアミノ酸置換、付加、および／または欠失を有し、あるいはｉｉ）集合的に、前記ＣＤＲ−Ｈ１、前記ＣＤＲ−Ｈ２、前記ＣＤＲ−Ｈ３、前記ＣＤＲ−Ｌ１、前記ＣＤＲ−Ｌ２、および前記ＣＤＲ−Ｌ３を含むＣＤＲセットにおいて１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸置換、付加、および／または欠失を有する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片が、
ｉ）配列番号１の３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号２の３つの軽鎖ＣＤＲ、または
ｉｉ）配列番号１３の３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号１４の３つの軽鎖ＣＤＲを含み、
前記ＣＤＲが、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付け方式によって定義される、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
抗体またはその抗原結合断片であって、
配列番号１３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む重鎖可変領域、および
配列番号１４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
配列番号１３を含む重鎖可変領域、および配列番号１４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片によって認識されるＣＲＴＡＭタンパク質上のエピトープに結合するか、または請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体と結合について交差競合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片のヒトＣＲＴＡＭに対する結合親和性の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を保持する、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗体または抗原結合断片が、キメラ、ヒト化、二重特異性、またはヒト抗体もしくは抗原結合断片である、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記抗体または抗原結合断片が、１つ以上のＦｃ受容体への結合が低減されているかまたはそれらに結合しない、Ｆｃをサイレンシングした操作されたＩｇＧ１抗体または抗原結合断片である、１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗体または抗原結合断片が、Ｔ細胞の細胞傷害性を誘導および／または増強することができる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、および単一ドメイン抗体からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
ｉ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片の重鎖可変領域、および／または
ｉｉ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１８】
ｉ．請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または
ｉｉ．請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合部分の前記重鎖可変領域をコードする前記ポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、および請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合部分の前記軽鎖可変領域をコードする前記ポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９】
抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、請求項１８に記載の宿主細胞を、前記抗体または前記抗原結合断片が前記宿主細胞において発現される条件下で培養することと、任意選択により前記抗体または抗原結合断片を単離することと、を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
癌を有する対象を処置する方法であって、有効量の、請求項１〜１５または２０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
癌の処置に使用するための医薬の製造における、請求項１〜１５または２０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物の使用。
【請求項２３】
癌の処置に使用するための、請求項１〜１５または２０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物。
【請求項２４】
前記癌が、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、ならびに血液悪性腫瘍からなる群から選択される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項２５】
前記医薬組成物または医薬が、有効量の第２の治療剤をさらに含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項２６】
治療での使用または医薬としての使用のための、請求項１〜１５または２０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＲＴＡＭタンパク質に結合することができる抗体およびその使用に関する。
【０００２】
導入部
本発明の態様は、ＣＲＴＡＭに対する抗体および他の治療用タンパク質、そのような抗体および治療用タンパク質をコードする核酸、抗体および他の治療用タンパク質を調製する方法、ならびにＣＲＴＡＭに対する抗体および他の治療用タンパク質を使用することによる癌などの疾患の処置方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
標的抗原であるＣＲＴＡＭは、ＶおよびＣ１様Ｉｇドメインを有するネクチンファミリーのシングルパスＩ型膜タンパク質である（Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００８  Ｍａｒ  ７；１３２（５）：８４６−５）。この遺伝子は、マウスおよびヒト活性化ＮＫＴ細胞で最初に同定され（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．２０００  Ｍａｙ；６７（５）：７２５−３４）、その後の研究により、その発現が活性化によって厳密に調節され、ＮＫＴおよびＣＤ８  Ｔ細胞を含む活性化クラスＩ  ＭＨＣ拘束性細胞に限定されることが示された（Ｐａｔｉｎｏ−Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  Ｆｅｂ；１７１（１−２）：１４５−５５）．
【０００４】
ＣＲＴＡＭの唯一の既知のリガンドは、Ｎｅｃｌ２（Ｇａｌｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００５  Ｊｕｎ  １０；２８０（２３）：２１９５５−６４）であり、リガンドと受容体との間の相互作用は、どちらかの分子のホモフィリック相互作用よりも好ましいと考えられている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１３  Ａｕｇ  ６；２１（８）：１４３０−９）。ＣＲＴＡＭ−Ｎｅｃｌ２相互作用は、成熟免疫シナプスの確立を助け、ノンプロフェッショナルＡＰＣによるＴ細胞刺激の増強を助けると仮定されている。この機能は、ＣＲＴＡＭに対する抗体がＮＫ細胞の細胞傷害性を刺激したＮＫ細胞でも見られる（Ｂｏｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００５  Ａｕｇ  １；１０６（３）：７７９−８６）。
【０００５】
ＷＯ２００９／０２９８８３は、ＣＲＴＡＭが特定のＴ細胞セット上でアップレギュレートされ、ＩＦＮγ、ＩＬ２２、およびＩＬ１７を含む特定のサイトカインを選択的に調節することを開示している。
【０００６】
ＷＯ２０１６／１５４３４１は、アゴニスト抗ＣＲＴＡＭ抗体が、ＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞のＡＤＣＣ能力を増大することによって癌の処置に有用であり得ることを開示している。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の態様は、ＣＲＴＡＭに対する特異的抗体、本発明のそのような抗体をコードする核酸、本発明の抗体をコードするそのような核酸を含む宿主細胞、抗ＣＲＴＡＭ抗体を調製するための方法、ならびに疾患、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌および胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、ならびに血液悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない、ヒト癌を処置するための方法が含まれる。
【０００８】
本明細書に記載される、ＣＲＴＡＭ（配列番号１１）に結合する抗体が提供される。好ましくは、上記抗体は、ＣＲＴＡＭの細胞外ドメイン（配列番号１２）に結合する。本発明の態様は、本明細書に記載の抗体によって認識されるＣＲＴＡＭタンパク質上のエピトープに結合するか、または本明細書に記載の抗体と結合について交差競合し、好ましくは、本明細書に記載の抗体のヒトＣＲＴＡＭに対する結合親和性の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を保持する、抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体は単離された抗体である。
【０００９】
本発明の態様は、ＣＲＴＡＭに結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、上記抗体が、配列番号５の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、および配列番号７の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む、重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８または配列番号１５の配列のうちのいずれか１つを含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０または配列番号１６の配列のいずれか１つを含むＣＤＲ−Ｌ３からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む、軽鎖可変領域をさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＣＲＴＡＭに結合する抗体またはその抗原結合断片は、表１に示される重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲの４つの組み合わせのうちの１つを含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【表１】
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【００１１】
いくつかの好ましい実施形態では、ＣＲＴＡＭに結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号７を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号８を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、ＣＲＴＡＭに結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号７を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１５を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１３】
さらなる態様では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載の親抗体と比較して可変ＣＤＲを含む。したがって、本発明は、親抗体のバリアント可変領域を含むバリアント抗体またはその抗原結合断片を提供し、親抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、および配列番号７の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１５の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、１つの態様では、バリアント抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のセットのうちのいずれか１つ以上において１、２、３、４、５、もしくは６個のアミノ酸置換、付加、および／または欠失を有するか、あるいはそれらにおいて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２個のアミノ酸置換、付加、および／または欠失を集合的に有し、１〜５個もしくは１〜４個もしくは１〜３個の特定の使用の置換、付加、または欠失を伴い、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＲＴＡＭへの特異的結合を保持する。好ましくは、変異は、置換であり、好ましくは、置換は、保存的置換または可変領域中のアミノ酸をヒト生殖細胞系列から対応するアミノ酸に戻すための置換である。さらなる実施形態では、本発明のバリアント抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２配列、および配列番号７の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３配列、ならびに配列番号１５の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、上記ＣＤＲ配列のうちの１つ以上は、それが上記の対応するＣＤＲ親配列と約７０、７５、８０、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一であるように改変される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、配列番号１もしくは配列番号１３に記載される可変重鎖領域または配列番号１もしくは配列番号１３と約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一である配列、および／あるいは配列番号２もしくは配列番号１４に記載される可変軽鎖領域または配列番号２もしくは配列番号１４と約８０、８５，９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一である配列を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。さらなる実施形態では、配列番号１または配列番号１３と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２個のアミノ酸置換、付加、および／または欠失を含む重鎖可変領域、ならびに／あるいは配列番号２または配列番号１４と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２個のアミノ酸置換を含む可変軽鎖領域を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。好ましくは、置換、より好ましくは保存的置換。
【００１５】
アミノ酸の置換、付加、および／または欠失がフレームワーク領域内および／またはＣＤＲ内にあり得ることはさらに明らかであろう。
【００１６】
一実施形態では、配列番号１の配列を含む重鎖可変領域および配列番号２の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【００１７】
一実施形態では、配列番号１３の配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４の配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【００１８】
一実施形態では、配列番号１７を含む重鎖配列および配列番号１８を含む軽鎖配列を含む、完全長抗体が提供される。
【００１９】
本発明のさらなる態様では、ＣＲＴＡＭに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供され、上記抗体は、配列番号１または配列番号１３の３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号２または配列番号１４の３つの軽鎖ＣＤＲを含み、ＣＤＲは、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付け方式によって定義される。好ましくは、ＣＲＴＡＭに特異的に結合する上記抗体またはその抗原結合断片は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付け方式によって定義された、配列番号１３の３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号１４の３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【００２０】
配列番号１３〜１８は、配列番号１および２の配列に基づくヒト化抗体配列である。当業者は、配列番号１７〜１８が、完全長機能性抗体、すなわち定常およびＦｃ領域を生成するために必要な可変領域以外の領域を含む完全長重鎖および軽鎖配列であることを容易に理解するであろう。当業者は、抗体がヒト対象に投与されたときに抗体の免疫原性効果を最小化するために、抗体が産生される生物の可変領域由来のアミノ酸をヒト生殖細胞系列配列由来のアミノ酸で置き換えることによって配列をヒト化することを理解するであろう。アミノ酸置換の大部分はフレームワーク領域で生じるが、重要でない位置に存在するＣＤＲ由来の多くのアミノ酸を置換することができ、そのような置換は、好ましくは、保存的であるか、または特定の位置のアミノ酸を対応するヒト生殖細胞系列に存在するアミノ酸に戻す。本場合では、置換がされているＣＤＲ由来のアミノ酸は、ＣＤＲ領域中のパラトープの向きと非パラトープ残基とを区別するための構造モデルを使用して識別されている。これにより、抗体を単純なＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）よりも高度にヒト化することができる。
【００２１】
本発明では、配列番号１４は、配列番号２（配列番号８）のＣＤＲ１と比較した場合、ＣＤＲ１（配列番号１５）に３つのアミノ酸置換を含む。具体的には、配列番号８の１位にＶＳ置換、配列番号８の４位にＥＶ置換、および配列番号８の１０位にＶＡ置換がある。配列番号１４は、配列番号２のＣＤＲ３（配列番号１０）と比較した場合、ＣＤＲ３（配列番号１６）に１個のアミノ酸置換をさらに含む。具体的には、配列番号１０の５位にＳＡ置換がある。
【００２２】
これらのヒト化配列は、親抗体と比較した場合、異なる代替の抗体を表すのではなく、免疫原性を最小化するために、構造モデリングを使用してヒト生殖細胞系列に対してより密に対応するように単に変更されたにすぎない同じ特性を有する同じ抗体に関することを当業者は理解するであろう。
【００２３】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有し、好ましい実施形態では、結合親和性は、０．７５ｎＭ、０．５ｎＭ未満である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、ＣＲＴＡＭへの結合についてそのリガンドｎｅｃｌ２と競合する抗体または抗原結合断片である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、フレームワーク配列を含む。いくつかの実施形態では、フレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、フレームワーク配列を含む。いくつかの実施形態では、フレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＦｃｇＲＩＩａへの結合が増加するように操作されたＦｃバリアントである。好ましい一実施形態では、Ｆｃバリアントは、Ｓ２６７Ｅおよび／またはＬ３２８Ｆアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＦｃはＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。さらなる実施形態では、ＦｃはＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。好ましい実施形態では、Ｆｃ領域がＩｇＧ４  Ｆｃ領域である場合、Ｆｃ領域はＳ２２８Ｐ置換をさらに含む。一実施形態では、重鎖は、配列番号１７を含む配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、１つ以上のＦｃ受容体への結合が低減されているかまたはそれらに結合しない、Ｆｃをサイレンシングした操作されたＩｇＧ１抗体または抗原結合断片である。別の実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、Ｔ細胞の細胞傷害性および／またはＮＫ細胞の細胞傷害性を介在する二重特異性抗体または抗原結合断片である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、免疫細胞の活性化を誘導および／または増強することができる。一実施形態では、免疫細胞は、好ましくはＴ細胞である。別の実施形態では、免疫細胞は、好ましくはＮＫ細胞である。当業者は、誘導および／または増強という用語が、免疫細胞によるサイトカイン放出の誘導および／もしくは増強、ならびに／または上記免疫細胞の増殖の誘導および／もしくは増強、ならびに／または細胞死滅活性の誘導および／もしくは増強を指すことができることを理解するであろう。本文脈で使用される、誘導するまたは誘導という用語は、免疫細胞の活性化を引き起こすこと、または抗体もしくは抗原結合断片の非存在下で見られる活性化のレベルを超えるまで免疫細胞の活性化を増加させることを意味することは当業者に容易に明らかであろう。本文脈で使用される増強という用語は、既に活性化された免疫細胞の活性化レベルを増加させることを指す。
【００３０】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＣＲＴＡＭタンパク質に結合し、１つ以上の追加の結合標的に結合する二重特異性もしくは多重特異性抗体または抗原結合断片であり、好ましくは、上記追加の結合標的は、１つ以上の腫瘍抗原である。さらなる実施形態では、１つ以上の追加の結合標的は免疫調節分子である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、および単一ドメイン抗体からなる群から選択される。
【００３２】
本発明の別の態様では、本発明の抗体の重鎖および／または本発明の抗体の軽鎖をコードする１つ以上の核酸が提供される。本発明の抗体の重鎖および軽鎖は、単一の核酸分子上に一緒にコードされ、または２つの別々の核酸分子によってコードされ得ることが理解されるであろう。
【００３３】
別の態様では、本発明の核酸のうちの１つ以上を含むベクターが提供される。
【００３４】
本発明の別の態様では、本発明の抗体の重鎖および／もしくは軽鎖またはその両方をコードする１つ以上の核酸を含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、上記宿主細胞は、核酸が発現される条件下で増殖される。他の実施形態では、本発明の抗体を回収する方法が提供される。
【００３５】
本発明の態様は、抗体またはその抗原結合断片を作製する方法を含み、該方法は、抗体または抗原結合断片が宿主細胞中で発現される条件下で宿主細胞を培養することと、任意選択により抗体または抗原結合断片を単離することと、を含む。
【００３６】
本発明の態様は、本明細書に記載される抗体または抗原結合断片および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物または医薬は、有効量の第２の治療剤をさらに含む。
【００３８】
本発明のさらなる態様では、障害を処置する方法が提供され、上記方法は、それを必要とする患者に、ＣＲＴＡＭ（配列番号１１）に結合する本発明の抗体または抗原結合断片を投与することを含む。一実施形態では、障害は癌である。
【００３９】
さらなる態様では、癌を処置する方法であって、有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００４０】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号７を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号８または配列番号１５を含むＣＤＲ−１、配列番号９を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１０または配列番号１６を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む。好ましくは、軽鎖可変領域は、配列番号１５を含むＣＤＲ−１、配列番号９を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１６を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、癌を処置する方法であって、それを必要とする患者に本発明の抗体または抗原結合断片が投与されて、本発明の上記抗体または抗原結合断片が、免疫応答、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答および／またはＮＫ細胞応答を誘導および／または増強する、方法が提供される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、ならびに血液悪性腫瘍からなる群から選択される。
【００４３】
本発明のさらなる態様によれば、予防または治療に使用するための本発明の抗体または抗原結合断片が提供される。
【００４４】
好ましくは、抗体または抗原結合断片は、癌の予防または治療に使用するためのものである。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、癌の処置のための医薬の製造における、本発明による抗体または抗原結合断片の使用が提供される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、前述の態様による癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃癌、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、ならびに血液悪性腫瘍からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１ａ】親５Ａ１１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図１ｂ】親５Ａ１１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２ａ】ヒト化抗体５Ａ１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。
【図２ｂ】ヒト化抗体５Ａ１１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【図３】活性化Ｔ細胞への、抗体５Ａ１１および市販の抗ＣＲＴＡＭ抗体ＣＲ２４．１の特異的な用量関連結合を示す。
【図４】抗体５Ａ１１がカニクイザルＣＲＴＡＭ相同体と交差反応するが、抗体ＣＲ２４．１は交差反応しないことを示す。
【図５】Ｔ細胞活性化時における、ＣＲ２４．１と比較してＩＦＮγ産生を介在する抗体５Ａ１１の増強された能力を示す。
【図６ａ】５Ａ１１親抗体配列の重鎖可変領域およびヒト化重鎖可変領域５Ａ１１配列の配列アラインメントを示す。
【図６ｂ】５Ａ１１親抗体配列の軽鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域５Ａ１１配列の配列アラインメントを示す。
【図７】抗体５Ａ１１がインビトロでＴ細胞を活性化して、用量依存的にパーフォリンを産生できることを示す。
【図８】抗体５Ａ１１がインビトロでＴ細胞を活性化して、用量依存的にグランザイムＢを産生できることを示す。
【図９】抗体５Ａ１１が、ＭＣＦ７腫瘍細胞において、インビトロＴ細胞介在性細胞傷害性を誘導できることを示している。
【図１０】抗体５Ａ１１が、エクスビボアッセイにおいて、原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍試料から単離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を誘導して、インターフェロンγを産生できることを示している。このアッセイは、抗体５Ａ１１が、市販の抗体ＣＲ２４．１と比較した場合に向上した活性を有することを示す。
【図１１】抗体５Ａ１１が、エクスビボアッセイにおいて、原発性乳癌試料から単離されたＴＩＬを誘導してインターフェロンγを産生できることを示す。
【図１２】抗体５Ａ１１が、インターフェロンγを用量依存的に産生するようにＴＩＬを誘導することを示している。
【図１３】抗体５Ａ１１が、Ｋ５６２細胞のＮＫ介在性溶解を引き起こすことができることを示す。
【図１４】抗体５Ａ１１が、アイソタイプ対照抗体で処置された動物と比較して、マウスにおける腫瘍増殖を有意に減少させることができることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の態様は、ＣＲＴＡＭに対する抗体、そのような抗体をコードする核酸、本発明の抗体をコードするそのような核酸を含む宿主細胞、抗ＣＲＴＡＭ抗体を調製する方法、ならびにＣＲＴＡＭ介在性障害などの疾患、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、ならびに血液悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない、ヒト癌の処置方法を含む。
【００４９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段で明らかに指示しない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この言明は、特許請求の範囲の要素の記載または「否定的」限定の使用に関連する「単独の」、「のみ」などの排他的な用語を使用するための先行基準として機能することが意図される。
【００５０】
この開示を読んだ当業者には明らかであるように、本明細書に記載されおよび例示される個々の態様のそれぞれは、本発明の範囲または真意から逸脱することなく、他のいくつかの態様の任意の特徴から容易に分離しまたはそれと組み合わせることができる別個の要素および特徴を有する。任意の記載された方法は、記載された事象の順序でまたは論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
【００５１】
定義
本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆もまた同様である。
【００５２】
本明細書で使用される「ＣＲＴＡＭ」という用語は、別段で示されない限り、霊長類（例えば、ヒト、霊長類、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット））などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＲＴＡＭタンパク質を指す。ＣＲＴＡＭタンパク質は、ＣＲＴＡＭ様タンパク質とも称することができる。ヒトＣＲＴＡＭのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１１で提供される。
【００５３】
「ＣＲＴＡＭ」という用語は、「完全長」のプロセシングなしのＣＲＴＡＭおよび細胞でのプロセシングから生じる任意の形態のＣＲＴＡＭを含む。この用語はまた、ＣＲＴＡＭの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント、対立遺伝子バリアント、およびアイソフォームを包含する。この用語は、具体的には、天然に存在する切断型または分泌形態のＣＲＴＡＭポリペプチド（例えば、細胞外ドメイン配列）を含む。本明細書に記載されるＣＲＴＡＭポリペプチドは、ヒト組織種または別の供給源などに由来する様々な供給源から単離されるか、または組換えもしくは合成方法によって調製され得る。「天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチド」は、天然由来の対応するＣＲＴＡＭポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチドは、自然から単離し、または組換えもしくは合成手段によって産生することができる。本明細書で使用される「ＣＲＴＡＭエピトープ」という用語は、本明細書に記載されるＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つ以上を含む抗体によって結合され、および／または実施例に例示される抗ＣＲＴＡＭ抗体の結合プロファイルによって例示されるエピトープを指す。
【００５４】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、単一の抗ＣＲＴＡＭモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、完全長または無傷のモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗ＣＲＴＡＭ抗体組成物、ポリクローナル抗体、多価抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、所望の生物活性を示す限り、二重特異性抗体）、単一鎖抗ＣＲＴＡＭ抗体、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂｓ）を含む抗ＣＲＴＡＭ抗体の抗原結合断片を、それらが所望の生物学的または免疫学的活性を示す限り、包含する。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書では「抗体」という用語と互換的に使用される。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化、および／または親和性成熟であり得る。最小の抗体が本明細書で定義される６つのＣＤＲのセットを含むいくつかの実施形態では、該抗体には、従来の抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を含む）、ヒト化、ヒト、および／またはキメラ抗体、抗体断片、操作された抗体（例えば、以下に概説するアミノ酸修飾を含む）、多重特異性抗体（二重特異性抗体）、ならびに当該技術分野で既知であり、本明細書で論じられる他の類似体が含まれるが、これらに限定されないことを当業者は理解するであろう。
【００５５】
他の実施形態では、本明細書で使用される抗体という用語は、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）（登録商標）、ユニボディ（Ｕｎｉｂｏｄｙ）（登録商標）、およびｓｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない、６つのＣＤＲを含まない構造を指すことが理解されるであろう。
【００５６】
「抗ＣＲＴＡＭ抗体」、「ＣＲＴＡＭ抗体」、または「ＣＲＴＡＭに結合する抗体」という用語は、抗体がＣＲＴＡＭの標的時に診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＣＲＴＡＭに結合することができる抗体を指す。特定の実施形態では、抗ＣＲＴＡＭ抗体は、異なる種由来のＣＲＴＡＭ間で保存されているＣＲＴＡＭのエピトープに結合する。
【００５７】
「単離された抗体」は、その環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その環境の汚染成分は、抗体の治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。
【００５８】
標的分子への抗体の結合に関して、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的な結合」もしくは「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、非特異的な相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般的に結合活性を有さない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定することができる。
【００５９】
「アンタゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、天然ＣＲＴＡＭポリペプチドの生物活性を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する任意の分子を含む。好適なアンタゴニスト分子には、具体的には、アンタゴニスト抗体または抗体断片、天然ＣＲＴＡＭポリペプチドの断片またはアミノ酸配列バリアント、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子などが含まれる。ＣＲＴＡＭポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法は、ＣＲＴＡＭポリペプチドを候補アンタゴニスト分子と接触させること、およびＣＲＴＡＭポリペプチドに通常関連する１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。
【００６０】
「アゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、天然ＣＲＴＡＭポリペプチドの生物活性を増強する任意の分子を含む。好適なアゴニスト分子には、具体的には、アゴニスト抗体または抗体断片、ＣＲＴＡＭリガンドポリペプチドの断片またはアミノ酸配列バリアント、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子などが含まれる。ＣＲＴＡＭポリペプチドのアゴニストを同定する方法は、ＣＲＴＡＭポリペプチドを候補アゴニスト分子に接触させること、およびＣＲＴＡＭポリペプチドに通常関連する１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。
【００６１】
本明細書で使用される「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、すべての新生物細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性細胞および組織を指す。本明細書で使用される「予測」および「予後」という用語はまた、予測または予後のための方法により、方法を実施する人が、抗ＣＲＴＡＭ抗体を含む抗癌剤による処置に反応する可能性が高いとみなされる患者を選択することが可能になる（必ずしもではないが、通常は処置の前に）いう意味で交換可能である。
【００６２】
ＣＲＴＡＭタンパク質
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴによれば、ＣＲＴＡＭはネクチンファミリーのＩ型膜タンパク質である。このタンパク質は、１つのＩｇ様Ｖ型（免疫グロブリン様）ドメイン、１つのＩｇ様Ｃ型（免疫グロブリン様）ドメイン（Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００８  Ｍａｒ  ７；１３２（５）：８４６−５）、１つの膜貫通領域、および配列番号１１のアミノ酸１８〜２８７間の細胞外尾部からなる。
【００６３】
該遺伝子は、マウスおよびヒト活性化ＮＫＴ細胞で最初に同定され（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．２０００  Ｍａｙ；６７（５）：７２５−３４）、その後の研究により、活性化によって厳密に調節され、ＮＫＴおよびＣＤ８  Ｔ細胞を含むクラスＩ  ＭＨＣ制限細胞に限定された発現が示された（Ｐａｔｉｎｏ−Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  Ｆｅｂ；１７１（１−２）：１４５−５５）。
【００６４】
ＣＲＴＡＭの唯一の既知リガンドは、Ｎｅｃｌ２であり（Ｇａｌｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００５  Ｊｕｎ  １０；２８０（２３）：２１９５５−６４）、リガンドと受容体との間の相互作用は、いずれかの分子のホモフィリック（ｈｏｍｏｐｈｙｌｉｃ）相互作用よりも好ましいと考えられている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１３  Ａｕｇ  ６；２１（８）：１４３０−９）。ＣＲＴＡＭ−Ｎｅｃｌ２相互作用は、成熟した免疫シナプスの構築を助け、ノンプロフェッショナルＡＰＣによるＴ細胞刺激の増強を助けると仮定されている。この機能は、ＣＲＴＡＭに対する抗体がＮＫ細胞の細胞傷害性を刺激したＮＫ細胞にも見られる（Ｂｏｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００５  Ａｕｇ  １；１０６（３）：７７９−８６）。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＣＲＴＡＭに結合する。本明細書で使用される「ヒトＣＲＴＡＭ」または「ヒトＣＲＴＡＭタンパク質」は、本明細書で定義される配列番号１１のタンパク質を指す。
【００６６】
本発明の実施形態による抗体は、特定の場合では、ヒト以外の種に由来するＣＲＴＡＭタンパク質と交差反応し得る。例えば、前臨床および毒性試験を容易にするために、本発明の抗体は、マウスまたは霊長類ＣＲＴＡＭタンパク質と交差反応し得る。あるいは、特定の実施形態では、抗体は、ヒトＣＲＴＡＭタンパク質に特異的であり得、種または他のタイプの非ヒト交差反応性を示さないことがあり得る。
【００６７】
抗体
本発明の態様は、本明細書に記載される、抗ＣＲＴＡＭ抗体、一般的には治療および／または診断抗体を含む。本発明の方法での使用が見出される抗体は、本明細書にさらに記載される従来の抗体および抗体誘導体、抗原結合断片ならびに模倣物を含む、本明細書に記載される多くの形式のいずれを取ることもできる。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書で定義される６つのＣＤＲのセット（本明細書で説明される少数のアミノ酸変化を含む）から選択される１つ以上のＣＤＲを有する。上記で概説したように、本明細書で使用される「抗体」という用語は、様々な構造を指す。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧアイソタイプが本発明で使用される。一実施形態では、ＦｃをサイレンシングしたＩｇＧ１アイソタイプ抗体が使用される。別の実施形態では、ＩｇＧ４アイソタイプ抗体が使用される。
【００６９】
抗体の各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。可変領域では、重鎖および軽鎖のＶドメインの各々について３つのループが集まり、抗原結合部位が形成される。各々のループは、相補性決定領域と称され（以下、「ＣＤＲ」と称する）、アミノ酸配列の変動が最も顕著である。「可変」とは、可変領域の特定のセグメントが抗体間で配列において大きく異なるという事実を指す。可変領域内の変動は均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９〜１５個のアミノ酸長またはそれより長い「超可変領域」と呼ばれる非常に可変性の短い領域によって分離された、１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変なストレッチからなる。
【００７０】
各ＶＨおよびＶＬは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）および４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に次の順序で配置される：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。
【００７１】
超可変領域は、一般的に、軽鎖可変領域におけるおよそアミノ酸残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１、「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、および８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）、および重鎖可変領域におけるおよそ３１〜３５Ｂ（ＣＤＲ−Ｈ１、「Ｈ」は重鎖を表す）、５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）、および９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）のアミノ酸残基、ならびに／または超可変ループを形成するアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＣＤＲ−Ｌ１）、５０〜５２（ＣＤＲ−Ｌ２）、および９１〜９６（ＣＤＲ−Ｌ３）、および重鎖可変領域における２６〜３２（ＣＤＲ−Ｈ１）、５３〜５５（ＣＤＲ−Ｈ２）、および９６〜１０１（ＣＤＲ−Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を包含する。本発明の具体的なＣＤＲを以下に記載する。
【００７２】
本明細書全体を通して、可変ドメイン中の残基（軽鎖可変領域の残基約１〜１０７および重鎖可変領域の残基約１〜１１３）を指す場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステムが一般的に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記（１９９１））。
【００７３】
ＣＤＲは、抗体の抗原結合、より具体的にはエピトープ結合部位の形成に寄与する。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。
【００７４】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスでは、重鎖中にいくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書において「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、別個の三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において関心があるのは、定常重（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体の文脈において、ＩｇＧアイソタイプにはそれぞれ３つのＣＨ領域を有する。
【００７５】
重鎖のＩｇドメインの別のタイプはヒンジ領域である。本明細書における「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１および第２定常ドメインの間にアミノ酸を含むフレキシブルなポリペプチドを意味する。
【００７６】
本発明において特に関心があるのは、Ｆｃ領域である。本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、第１定常領域免疫グロブリンドメインおよびいくつかの場合ではヒンジの一部を除いた抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのフレキシブルなヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭでは、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間の下部ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むように定義され、番号付けはＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、例えば、１つ以上のＦｃγＲ受容体またはＦｃＲｎ受容体への結合を変更するために、Ｆｃ領域に対して行われる。いくつかの実施形態では、抗体は完全長である。本明細書における「完全長抗体」とは、可変領域および定常領域を含み、任意選択により本明細書に概説される１つ以上の修飾を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。
【００７７】
あるいは、抗体は、抗原結合断片、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と称される場合もある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（「抗体コンジュゲート」と称される場合もある）、およびそれぞれの抗原結合断片をそれぞれ含むがこれらに限定されない、様々な構造であり得る。ＣＤＲセットの使用に応じた構造は、「抗体」の定義に含まれる。
【００７８】
一実施形態では、抗体は抗原結合断片である。特定の抗原結合抗体断片には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）単一可変領域からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、これは参照により完全に組み込まれる）、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの結合したＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ペプチドリンカーによって結合され、該ペプチドリンカーにより、２つのドメインが結合して抗原結合部位を形成することを可能となる（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３、これは全体が参照により組み込まれる）、（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ（ＷＯ０３／１１１６１、参照により本明細書に組み込まれる）、および（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性断片である「ダイアボディ」または「トリアボディ」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１−４７９；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８（すべて、それらの全体が参照により組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
キメラ抗体およびヒト化抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、異なる種由来の混合物、例えば、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であり得る。すなわち、本発明において、ＣＤＲセットは、本明細書において配列により具体的に記載されたもの以外のフレームワークおよび定常領域ととともに使用され得る。
【００８０】
一般的に、「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」の両方は、２つ以上の種由来の領域を組み合わせた抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、従来、マウス（またはいくつかの場合ではラット）由来の可変領域およびヒト由来の定常領域を含む。「ヒト化抗体」は、一般的に、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に見出される配列と交換された非ヒト抗体を指す。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてそのような抗体と同一である。一部またはすべてが非ヒト生物に由来する核酸によってコードされているＣＤＲは、抗体を作成するためにヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに移植され、その特異性は移植されたＣＤＲによって決定される。そのような抗体の作製は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６に記載されており、それらはすべて参照により完全に組み込まれる。一実施形態では、本発明の抗体は、多重特異性抗体、特に、「ダイアボディ」と称される場合もある二重特異性抗体であり得る。これらは、２つ（またはそれ以上）の異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体である。ダイアボディは、当該技術分野で既知の様々な方法で製造することができ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：４４６−４４９、これは参照により完全に組み込まれる）、例えば化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから調製することができる。
【００８１】
一実施形態では、抗体はミニボディである。ミニボディは、ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含む最小化抗体様タンパク質である。Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１、これは参照により完全に組み込まれる。いくつかの場合では、ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域に結合することができ、ヒンジ領域の一部または全体を含み得る。ミニボディは、完全なＣＤＲセットを有していない事実にもかかわらず、「抗体」の定義に含まれることに留意すべきである。
【００８２】
本発明の抗体は、一般的に、単離されるか、または組換えである。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、組換えタンパク質、単離されたタンパク質、または実質的に純粋なタンパク質である。「単離された」タンパク質は、その天然の状態で通常関連している材料の少なくとも一部を伴わず、例えば、所与の試料中の総タンパク質の少なくとも約５重量％または少なくとも約５０重量％を構成する。単離されたタンパク質は、状況に応じて、総タンパク質含量の５〜９９．９重量％を構成し得ることが理解される。例えば、タンパク質は、該タンパク質が増加した濃度レベルで作られるように、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターの使用によってより有意に高い濃度で作られ得る。組換えタンパク質の場合、定義には、天然では産生されない、当該技術分野で既知である様々な生物および／または宿主細胞における抗体の産生が含まれる。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程により調製される。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。例えば、ＣＲＴＡＭに特異的に結合する単離された抗体は、ＣＲＴＡＭ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。
【００８４】
異なる特異性を有する単離されたモノクローナル抗体は、明確に規定された組成で組み合わせることができる。したがって、例えば、本発明の抗体は、以下でさらに論じるように、任意選択によりかつ個別に製剤に含まれるか、または除外され得る。
【００８５】
特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍまたはそれ以上の抗原またはエピトープに対するＫＤを有する抗原によって示され得、ここで、ＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、対照分子と比較して、抗原またはエピトープに対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍またはそれ以上低いＫＤを有する。
【００８６】
また、特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照と比較して、エピトープに対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍またはそれ以上大きいＫＡまたはＫａを有する抗体によって示され得、ここで、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を指す。
【００８７】
ＣＲＴＡＭに対する抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、タンパク質または細胞レベルで行うことができ、当該技術分野で既知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ、およびフローサイトメトリー分析を含む。好適なアッセイは、実施例に詳細に記載されている。抗体の結合速度論（例えば、結合親和性）はまた、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）またはＯｃｔｅｔ（登録商標）システム分析などの当該技術分野で既知の標準的なアッセイによって評価することができる。
【００８８】
ＣＲＴＡＭ抗体
本発明は、ＣＲＴＡＭポリペプチドまたはその一部に結合するＣＲＴＡＭ抗体を提供する。ＣＲＴＡＭアミノ酸配列の一例は、配列番号１１で提供される。対象ＣＲＴＡＭ抗体は、腫瘍における免疫応答を増強するために、免疫細胞活性化、例えば、Ｔ細胞活性化および／またはＮＫ細胞活性化を誘導または増強することができる。これらの抗体は、本明細書では「抗ＣＲＴＡＭ」抗体または説明を簡単にするための「ＣＲＴＡＭ抗体」のいずれかで称される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、対象ＣＲＴＡＭ抗体は、表面上にＣＲＴＡＭを発現するＴ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞と接触した際に、サイトカインの放出または増殖を誘導および／または増強することができる。この文脈におけるサイトカイン放出またはＴ細胞増殖は、いくつかの方法で測定することができる。一実施形態では、本発明のＣＲＴＡＭ抗体は、ＥＬＩＳＡなどの標準的なアッセイを使用して、活性化Ｔ細胞と接触させる。さらなる実施形態では、対象ＣＲＴＡＭ抗体は、ＮＫ細胞の活性化および死滅を誘導および／または増強することができる。
【００９０】
一実施形態では、抗体は、以下のＣＤＲを含む抗体である。さらに、以下で説明するように、これらのＣＤＲ配列は、前述の限られた数のアミノ酸バリアントを含むこともできる。
【表２】
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【００９１】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５、６、７、１５、９、および１６で提供されるＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号５、６、７、１５、９、および１６で提供されるＣＤＲ配列のうちの１つ以上のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００９２】
本発明のＣＤＲセットを含む可変重鎖および可変軽鎖、ならびに全長重鎖および軽鎖（例えば、定常領域も含む）も本明細書で開示される。当業者によって理解されるように、本発明のＣＤＲセットは、マウス、ヒト化、またはヒト定常領域（フレームワーク領域を含む）に組み込むことができる。本発明の態様には、本明細書に開示される重鎖可変領域配列（配列番号１３）および軽鎖可変領域配列（配列番号１４）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である重鎖可変領域および軽鎖可変領域が含まれる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の本発明のＣＲＴＡＭモノクローナル抗体とヒトＣＲＴＡＭ上の同じエピトープに結合するか、またはそれと交差競合する抗体（すなわち、ＣＲＴＡＭタンパク質への結合について、本明細書に記載の本発明のモノクローナル抗体と交差競合する能力を有する抗体）を提供する。いくつかの実施形態では、交差競合の研究のための参照抗体は、本明細書で定義される５Ａ１１抗体であり得る。そのような交差競合抗体は、５Ａ１１抗体と交差競合する能力に基づいて同定することができる。抗体が交差競合するとみなすためには、参照抗体の結合を必ずしも完全に遮断する必要はないことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、参照抗体の結合は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％低下する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＲＴＡＭへの結合について、リガンドｎｅｃｌ２と競合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００９５】
抗体の修飾
本発明は、「抗体誘導体」または「抗体類似体」と称される場合もあるバリアント抗体をさらに提供する。すなわち、ＣＤＲにおけるアミノ酸修飾（親和性成熟）、Ｆｃ領域におけるアミノ酸修飾、グリコシル化バリアント、および他のタイプの共有結合修飾（例えば、薬物コンジュゲートの結合について）を含むがこれらに限定されない、本発明の抗体に対して行うことができる多くの修飾がある。
【００９６】
「バリアント」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾により親ポリペプチドの配列とは異なるポリペプチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号１もしくは２、１３もしくは１４に列挙される完全長可変重鎖または軽鎖のいずれかであるか、あるいは配列番号５〜１０、１５、もしくは１６のいずれかに開示されるＣＤＲ配列のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、置換、挿入、および／または欠失を含むことができ、前者が多くの場合において好ましい。いくつかの実施形態では、置換は保存的置換であり得る。
【００９７】
一般的に、バリアントは、本明細書に記載されるように、抗体の機能が依然として存在する限り、任意の数の修飾を含むことができる。例えば、抗体は、依然としてヒトＣＲＴＡＭに特異的に結合しなければならない。同様に、例えば、アミノ酸バリアントがＦｃ領域内で生成される場合、バリアント抗体は、抗体の特定の用途または適応に必要な受容体結合機能を維持しなければならない。
【００９８】
対象抗体の「バリアント」は、本明細書に記載されるように、列挙されたＣＤＲ配列のうちの１つ以上、フレームワーク領域のうちの１つ以上、または抗体の定常領域のうちの１つ以上（例えば、Ｆｃ領域）のいずれかにアミノ酸変動を有するように作製することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、親配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸修飾は、目的が最小数の修飾で機能を変更することであることが多いゆえに、一般的に利用される。いくつかの実施形態では、１〜５つ（１、２、３、４または５つ）の修飾（例えば、個々のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失）があり、１〜２つ、１〜３つ、および１〜４つではまた、多くの実施形態での用途が見出される。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗体のＣＤＲ配列のうちの１つ以上は、１つ以上、例えば、１、２、３、４、または５つのアミノ酸修飾、好ましくは１〜４つ、１〜３つ、１つまたは２つの修飾を含む。一般的に、４、５、６、７、８、９、または１０個以下の変更がＣＤＲセット内で行われる。
【０１００】
アミノ酸修飾数は機能性ドメイン範囲内であり得ることに留意すべきである。例えば、野生型または工学操作されたタンパク質のＦｃ領域では１〜５つの修飾、およびＦｖ領域では１〜５つの修飾などを有することが望ましいものであり得る。変異ポリペプチド配列は、好ましくは、親配列（例えば、可変領域配列、定常領域配列、ならびに／または重鎖および軽鎖配列、ならびに／または例えば抗体５Ａ１１のＣＤＲ）と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１０１】
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることを意味する。本明細書で使用される「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸の付加を意味する。本明細書で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸の除去を意味する。
【０１０２】
本明細書で使用される「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」とは、後に修飾されてバリアントを生成する非修飾ポリペプチドを意味する。一般的に、本明細書で使用される親ポリペプチドは、５Ａ１１ポリペプチド、例えば、５Ａ１１ＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖またはＣＤＲ配列を指し得る。したがって、本明細書で使用される「親抗体」とは、修飾抗体を生成するように修飾された抗体を意味する。
【０１０３】
本明細書における「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどは、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【０１０４】
本明細書における「バリアントＦｃ領域」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾により、野生型Ｆｃ配列のものとは異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃバリアントは、Ｆｃポリペプチド自体、Ｆｃバリアントポリペプチドを含む組成物、またはアミノ酸配列を指し得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＲＴＡＭ抗体は、変異Ｆｃドメインから構成される。当該技術分野で既知であるように、抗体のＦｃ領域は多くのＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と称される一連の重要な機能性能力を付与する。好適な修飾は、１つ以上の位置において、特に、Ｆｃ受容体への結合を減少または抑制する特定のアミノ酸置換のために行うことができる。
【０１０６】
上記で概説した修飾に加えて、他の修飾を行うことができる。例えば、分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化され得る（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１４：１２３９−１２４５、これは参照により完全に組み込まれる）。
【０１０７】
さらに、以下でさらに記載するように、システインにおける修飾は、抗体ー薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）用途に特に有用である。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、薬物部分のより特異的かつ制御された配置を可能にするために、特に「チオール反応性」である１つ以上のシステインを含むように工学操作することができる。例えば、米国特許第７，５２１，５４１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０１０８】
さらに、以下に概説するように行うことができる抗体の様々な共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ）修飾がある。
【０１０９】
抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれ、常にではないが一般的に翻訳後に行われる。例えば、抗体の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより、抗体のいくつかのタイプの共有結合修飾が分子に導入される。
【０１１０】
さらに、当業者によって理解されるように、標識（蛍光、酵素、磁気、放射性などを含む）はすべて、抗体（および本発明の他の組成物）に付加することができる。
【０１１１】
二重特異性分子
別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＲＴＡＭ抗体またはその断片を含む二重特異性および多重特異性分子を含む。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に誘導体化または連結することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも３つの異なる結合部位または標的分子に結合する多重特異性分子を生成するために、少なくとも２つの機能性分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド）に誘導体化または連結することができる。本発明の二重特異性または多重特異性分子を作製するために、本発明の抗体は、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣物などの１つ以上の他の結合分子に機能的に連結できることができ（例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有結合などにより）、その結果、二重特異性または多重特異性分子が生じる。
【０１１２】
したがって、本発明は、第１の標的エピトープ（すなわち、ＣＲＴＡＭ）に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。第２の標的エピトープは、第１の結合特異性によって結合されるものと同じ標的タンパク質上に存在し得るか、あるいは、第２の標的エピトープは、第１の結合特異性によって結合されたものとは異なる標的タンパク質上に存在し得る。第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープ（すなわち、ＣＲＴＡＭ）と同じ細胞上に存在し得るか、あるいは、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープを提示する細胞によって提示されない標的上に存在し得る。本明細書で使用する場合、「結合特異性」という用語は、少なくとも１つの抗体可変ドメインを含む部分を指す。
【０１１３】
本発明の別の実施形態では、第２の標的エピトープは腫瘍細胞上に存在する。したがって、本発明の態様は、ＣＲＴＡＭ発現エフェクター細胞（例えば、ＣＲＴＡＭ発現細胞傷害性Ｔ細胞）および第２の標的エピトープを発現する腫瘍細胞の両方に結合することができる二重特異性分子を含む。
【０１１４】
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、合計で２つまたは３つのいずれかの抗体可変ドメインを有することができ、二重特異性抗体の第１の部分は、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原に特異的に結合することによってヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができ、該エフェクター抗原は、ＣＲＴＡＭであり、１つの抗体可変ドメインからなる上記第１の部分および二重特異性抗体の第２の部分は、エフェクター抗原以外の標的抗原に特異的に結合することができ、上記標的抗原は、上記ヒト免疫エフェクター細胞以外の標的細胞上に位置し、上記第２の部分は、１つまたは２つの抗体可変ドメインを含む。
【０１１５】
結合タンパク質が多重特異性である本発明の実施形態では、分子は、抗腫瘍結合特異性および抗ＣＲＴＡＭ結合特異性に加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができる。一実施形態では、第３の結合特異性は、抗増強因子（ＥＦ）部分、例えば、細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより、標的細胞に対する免疫応答を増加させる分子である。「抗増強因子部分」は、所与の分子、例えば、抗原または受容体に結合し、それにより、標的細胞抗原に対する結合決定因子の効果の増強をもたらす、抗体、機能性抗体断片、またはリガンドであり得る。「抗増強因子部分」は、標的細胞抗原に結合することができる。あるいは、抗増強因子部分は、第１および第２の結合特異性が結合する部分とは異なる部分に結合することができる。例えば、抗増強因子部分は、（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１、または標的細胞に対する免疫応答の増加をもたらす他の免疫細胞を介して）細胞傷害性Ｔ細胞に結合することができる。
【０１１６】
一実施形態では、本発明の二重特異性タンパク質は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、または単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖二量体、または米国特許第４，９４６，７７８号（その内容は参照により明示的に組み込まれる）に記載されるＦｖもしくは単鎖構築物などのその任意の最小断片であり得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性分子において使用することができる抗体は、マウス、ヒト、キメラ、またはヒト化モノクローナル抗体である。
【０１１８】
特定の標的への二重特異性分子の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば増殖阻害）、またはウエスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイの各々は、一般的に、目的の複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体）を使用することにより、特に目的のタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０１１９】
グリコシル化
別のタイプの共有結合修飾は、グリコシル化における変更である。例えば、非グリコシル化抗体（すなわち、グリコシル化を欠く抗体）を作製することができる。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めるために変更することができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内におけるグリコシル化の１つ以上の部位を変更することによって達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を排除し、それにより、その部位におけるグリコシル化を排除する、１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。そのような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高め得る。このようなアプローチは、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されており、２９７位のアスパラギンを除去することによって達成することができる。
【０１２０】
抗体の別のタイプの共有結合修飾は、例えば、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの２００５−２００６  ＰＥＧカタログ（Ｎｅｋｔａｒウェブサイトで入手可能）米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号（これらはすべて、参照により完全に組み込まれる）に示される様式で、抗体をポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなどの様々なポリオールを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーに連結することを含む。さらに、当該技術分野で既知であるように、ＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために、アミノ酸置換を抗体内の様々な位置において行うことができる。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１１４０３７Ａ１号（参照により完全に組み込まれる）を参照のこと。
【０１２１】
追加の実施形態では、例えば、診断または検出目的での本発明の抗体の使用において、抗体は標識を含み得る。本明細書で「標識される」とは、化合物が、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋの第６版（参照により本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されるような化合物の検出を可能にするために付加される少なくとも１つの部分、元素、同位体、または化合物を有することを意味する。
【０１２２】
本発明の抗体を作製するための方法
本発明は、開示された抗ＣＲＴＡＭ抗体を産生するための方法をさらに提供する。これらの方法は、本発明の抗体をコードする単離された核酸を含む宿主細胞を培養することを包含する。当業者によって理解されるように、これは、抗体の性質に応じて様々な方法で行うことができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体が完全長の従来抗体である場合、例えば、宿主細胞は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸を含み、抗体が産生され、かつ単離することができるような条件下で培養することができる。
【０１２３】
本発明の抗体の可変重鎖および軽鎖（タンパク質および核酸配列の両方）は、本明細書に開示されており、これらは、当該技術分野で理解されるように、全長重鎖および軽鎖を生成するように容易に拡張することができる。すなわち、本明細書で概説されるＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片を提供し、これらのＤＮＡ断片を、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するように、標準的な組換えＤＮＡ技術でさらに操作することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域またはフレキシブルなリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈で使用される「作動可能に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームであるように、２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味する。
【０１２４】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。マウス重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で既知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって取得することができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域であり得る。好ましい一実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。
【０１２５】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。マウス軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で既知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって取得することができる。好ましい一実施形態では、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域である。
【０１２６】
ｓｃＦｖ抗体断片をコードするポリヌクレオチド配列を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片をフレキシブルなリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結し、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列は、連続する単鎖タンパク質として発現でき、ＶＬおよびＶＨ領域はフレキシブルなリンカーによって連結されている（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４を参照のこと）。
【０１２７】
本発明の態様は、本発明の抗体をコードする核酸を含む。そのようなポリヌクレオチドは、重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域および定常領域の両方をコードするが、他の組み合わせもまた、本明細書に記載される組成物に従って本発明によって企図される。本発明の態様は、開示されたポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチド断片、およびこれらのポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。
【０１２８】
本発明の実施形態によるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体、および合成ＤＮＡの形態であり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖である場合、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。ポリペプチドをコードするコード配列は、本明細書で提供されるコード配列と同一であるか、または遺伝子コードの冗長性または縮重の結果として、本明細書で提供されるＤＮＡと同じポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体をコードする核酸は、染色体外であり得るか、またはそれが導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計され得る発現ベクターに組み込まれる。発現ベクターは、任意の数の適切な調節配列（転写および翻訳制御配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点などを含むがこれらに限定されない）または他の成分（選択遺伝子など）を含むことができ、これらはすべて、当該技術分野で周知であるように作動可能に連結される。いくつかの場合では、２つの核酸が使用され、それぞれが異なる発現ベクターに入れられ（例えば、第１の発現ベクターには重鎖、第２の発現ベクターには軽鎖）、あるいは同じ発現ベクターに入れることができる。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者に理解されるであろう。
【０１３０】
一般的に、核酸および／または発現は、選択された宿主細胞に適切な任意の方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）を使用して、好適な宿主細胞に導入して組換え宿主細胞を作製することができ、その結果、分子が（例えば、ベクター中の、細胞でのプロセスによって作成された構築物中の、宿主細胞ゲノムに組み込まれた）１つ以上の発現制御エレメントに作動可能に連結される。得られた組換え宿主細胞は、発現に好適な条件下で（例えば、誘導物質の存在下で、好適な非ヒト動物において、適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤などが補充された好適な培地中で）維持することができ、それにより、コードされたポリペプチドが産生される。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖は同じ宿主細胞で産生される。いくつかの実施形態では、重鎖は１つの宿主細胞で産生され、軽鎖は別の宿主細胞で産生される。
【０１３１】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野で既知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐＧ２）、および多くの他の細胞株を含むがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、マナサス、バージニア州から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。細菌、酵母、昆虫、および植物を含むがこれらに限定されない非哺乳動物細胞も、組換え抗体を発現するために使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、ウシまたはニワトリなどのトランスジェニック動物で産生することができる。
【０１３２】
抗体分子生物学、発現、精製、およびスクリーニングの一般的な方法は周知であり、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、同第４，８１６，３９７号、同第６，３３１，４１５号、および同第７，９２３，２２１号、ならびにＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｄｕｂｅｌによって編集されたＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００１  ａｎｄ  ２０１０  Ｈａｙｈｕｒｓｔ  ＆  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２００１，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５：６８３−６８９、Ｍａｙｎａｒｄ  ＆  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２０００，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ２：３３９−７６、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２を参照のこと。
【０１３３】
医薬組成物
本発明の態様は、薬学的に許容される担体ととともに製剤化された、本発明の１つ以上のＣＲＴＡＭ抗体もしくはその抗原結合部分（またはＣＲＴＡＭ抗体もしくはその抗原結合部分の組み合わせ）を含む組成物、例えば医薬組成物を含む。このような組成物は、本発明の（例えば２つ以上の異なる）抗体または二重特異性分子のうちの１つまたはそれらの組み合わせを含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するかまたは補体活性を有する抗体の組み合わせを含むことができる。
【０１３４】
本発明の医薬組成物は、併用療法において、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗腫瘍剤または抗炎症剤もしくは免疫抑制剤と組み合わせた本発明の抗体を含むことができる。併用療法で使用することができる治療剤の例は、本発明の抗体の使用に関するセクションで以下により詳細に記載される。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性である任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に好適である。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体または抗体断片は、化合物を不活性化し得る酸および他の自然条件の作用から化合物を保護するための材料でコーティングされ得る。
【０１３６】
本発明の医薬化合物は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持し、任意の望ましくない毒性効果をもたらさない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤も含み得る。本発明の医薬組成物で使用され得る好適な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、オリーブオイルなどの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。好適な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１３７】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含み得る。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順、ならびに例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤を含有させることの両方によって確保し得る。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含有させることが望ましいこともあり得る。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含有させることによって、注射可能な医薬形態の吸収を延ばすことができる。
【０１３８】
薬学的に許容される担体には、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で既知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物中の該活性化合物の使用が企図される。補足的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０１３９】
投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急要件によって示されるのに従って用量を比例して減少または増加させることができる。投与の容易性および投与量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、処置される対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成される特定の治療効果、および（ｂ）個人における過敏性の処置のためにそのような活性化合物を調合する技術分野に特有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
【０１４０】
抗体の投与において、投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、より通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲であり得る。例えば、投与量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、４ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、７．５ｍｇ／ｋｇ体重、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１〜５ｍｇ／ｋｇもしくは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。処置計画の例には、毎日、隔日、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月に１回、３ヶ月に１回、または３〜６ヶ月に１回の投与が包含される。本発明の抗ＣＲＴＡＭ抗体の好ましい投与計画には、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ体重が含まれ、抗体は以下の投与スケジュールのうちの１つを使用して与えられる：（ｉ）毎週６回投与、その後は毎月、（ｉｉ）毎週、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回投与、続いて１ｍｇ／ｋｇ体重を毎週投与。
【０１４１】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、その場合、投与される各抗体の投与量は示された範囲内である。いくつかの実施形態では、抗体は複数時に投与される。単回投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３ヶ月毎、または毎年であり得る。患者の標的抗原に対する抗体の血中レベルの測定によって示されるのに従って、間隔は不規則であり得る。いくつかの実施形態では、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度、いくつかの方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌを達成するように調整される。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、抗体は持続放出製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要である。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変動する。一般的に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変動し得る。予防的用途では、比較的低い投与量が比較的低い頻度の間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、余生において処置を受け続ける。治療的用途では、疾患の進行が低減または終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投与量が必要になる場合がある。その後、患者に予防計画を施すことができる。
【０１４３】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性のない、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変動し得る。選択された投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄率、処置期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態、および以前の病歴、ならびに医学の分野で周知の要因などを含む様々な薬物動態因子に依存する。
【０１４４】
本発明の抗ＣＲＴＡＭ抗体の「治療有効投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の軽減、疾患無症状期間の頻度および期間の増加、または疾患の苦しみに起因する障害（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）もしくは障害（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）の防止をもたらす。例えば、「治療有効投与量」は、未処置の対象と比較して、細胞増殖または腫瘍増殖を好ましくは少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系で評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、化合物が細胞増殖を阻害する能力を調べることによって評価することができ、そのような阻害は、当業者に既知のアッセイによってインビトロで測定することができる。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、またはその他では対象における症状を改善することができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および特定の組成物または選択された投与経路などの要因に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
【０１４５】
本発明の組成物は、当該技術分野で既知の様々な方法のうちの１つ以上を使用して、１つ以上の投与経路を介して投与することができる。当業者によって理解されるように、投与経路および／または投与様式は所望の結果に応じて変動するであろう。本発明の抗体の好ましい投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または例えば注射もしくは注入による他の非経口投与経路が含まれる。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、ならびに胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射および注入が含まれるが限定されない。
【０１４６】
あるいは、本発明の抗体は、局所、表皮、または粘膜投与経路などの非経口経路を介して、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下、または局所で投与することができる。
【０１４７】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの、急速な放出から化合物を保護する担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法は、特許を取得しているか、または当業者に一般的に既知である（例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９７８）Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙを参照のこと）。
【０１４８】
特定の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物が確実にＢＢＢを通過することを確実にするために（所望の場合）、該治療用化合物は、例えば、リポソームに製剤化され得る。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号、および同第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つ以上の部分を含み、したがって、標的化薬物送達を増強することができる（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照のこと）。例示的な標的化部分には、葉酸またはビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）、マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）、抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）、界面活性剤プロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）、ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０；Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；ＪＪ  Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３も参照のこと）が含まれる
【０１４９】
使用および方法
本発明の抗体、抗体組成物、および方法は、免疫介在性障害の診断および処置を含む、多くのインビトロおよびインビボでの診断および治療有用性を有する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、これらの分子は、培養中の細胞にインビトロもしくはエクスビボで投与するか、またはヒト対象に例えばインビボで投与して、様々な障害を処置、予防、および／または診断することができる。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。好ましい対象には、ヒト患者が含まれる。ＣＲＴＡＭに対する抗体が別の薬剤と一緒に投与される場合、この２つはいずれかの順序でまたは同時に投与することができる。
【０１５１】
ＣＲＴＡＭに対する本発明の抗体の特異的結合が与えられると、本発明の抗体は、免疫細胞の表面上のＣＲＴＡＭ発現を特異的に検出するために使用することができ、さらに、免疫親和性精製によってＣＲＴＡＭを精製するために使用することができる。
【０１５２】
さらに、免疫細胞上でのＣＲＴＡＭの発現を所与として、本発明の抗体、抗体組成物、および方法は、腫瘍形成障害、例えば、腫瘍細胞の存在を特徴とする障害、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌腫、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍を有する対象を処置するために使用することができる。
【０１５３】
一実施形態では、本発明の抗体は、癌、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、ならびに血液悪性腫瘍の処置に使用される。
【０１５４】
さらなる実施形態では、本発明の抗体は、癌、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃癌、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、ならびに血液悪性腫瘍の処置のための医薬の製造において使用される。
【０１５５】
一実施形態では、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体、抗体断片、ナノボディ、多重特異性および二重特異性分子および組成物など）は、ＣＲＴＡＭのレベルまたは膜上にＣＲＴＡＭを含む免疫細胞のレベルを検出するために使用することができ、次いで、このレベルは、診断のために特定の疾患症状と結び付けることができる。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および組成物）は、インビトロでの治療または診断使用に関連する結合活性について最初に試験することができる。例えば、本発明の組成物は、以下の実施例に記載されるフローサイトメトリーアッセイを使用して試験することができる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および組成物）は、疾患の治療および診断において追加の有用性を有する。例えば、モノクローナル抗体、多重特異性または二重特異性分子は、以下の生物活性のうちの１つ以上をインビボまたはインビトロで誘発するために使用することができる：免疫細胞活性を誘導および／または増強すること、ＣＲＴＡＭを発現するヒトエフェクター細胞の存在下で細胞の食作用もしくはＡＤＣＣを媒介すること、またはＣＲＴＡＭリガンドがＣＲＴＡＭに結合するのを遮断すること。
【０１５８】
特定の実施形態では、抗体（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および組成物）は、様々な疾患を処置、予防、または診断するためにインビボで使用される。関連する疾患の例には、特に、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、ならびに血液悪性腫瘍を表すヒト癌組織が含まれる。
【０１５９】
本発明の抗体組成物（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および組成物）をインビボおよびインビトロで投与する好適な経路は、当該技術分野で周知であり、当業者によって選択され得る。例えば、抗体組成物は、注射（例えば、静脈内または皮下）によって投与することができる。使用される分子の好適な投与量は、対象の年齢および体重、ならびに抗体組成物の濃度および／または製剤化に依存する。
【０１６０】
前述のように、本発明の抗ＣＲＴＡＭ抗体は、１つ以上の追加の治療剤、例えば、免疫刺激剤、細胞傷害性剤、放射性毒性剤、または免疫抑制剤と共投与することができる。抗体は、（免疫複合体として）薬剤に連結することができ、または薬剤とは別に投与することができる。後者の場合（別々の投与）では、抗体は、薬剤の前、薬剤の後、もしくは薬剤と同時に投与することができ、または他の既知の治療、例えば抗癌治療、例えば放射線治療と共投与することができる。そのような治療剤には、特に、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドヒドロキシウレアなどの抗悪性腫瘍剤が含まれ、これらはそれ自体、患者にとって毒性または準毒性のレベルでのみ有効である。本発明の抗体との共投与に好適な他の薬剤には、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標）、５ＦＵ、およびゲムシタビンなどの癌の処置に使用される他の薬剤が含まれる。本発明の抗ＣＲＴＡＭ抗体またはその抗原結合断片と化学療法剤との共投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞傷害性効果をもたらす異なる作用機構を介して作用する２つの抗癌剤を提供する。そのような共投与は、薬物に対する耐性の発生または腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決することができる。
【０１６１】
標的特異的エフェクター細胞、例えば、本発明の組成物（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子）に連結されたエフェクター細胞はまた、治療剤として使用され得る。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球、または単球などのヒト白血球であり得る。他の細胞には、好酸球、ナチュラルキラー細胞、および他のＩｇＧまたはＩｇＡ受容体保有細胞が含まれる。所望の場合、エフェクター細胞を処置される対象から得ることができる。標的特異的エフェクター細胞は、生理学的に許容される溶液中の細胞の懸濁液として投与することができる。投与される細胞の数は、１０８〜１０９のオーダーであり得るが、治療目的に応じて変化するであろう。
【０１６２】
標的特異的エフェクター細胞による治療は、他の技術と組み合わせて行うことができる。例えば、本発明の組成物（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子）および／またはこれらの組成物とともに用いるエフェクター細胞を使用する抗腫瘍療法は、化学療法と組み合わせて使用することができる。さらに、併用免疫療法は、２つの別個の細胞傷害性エフェクター集団を腫瘍細胞拒絶に対して指向性にし得る。
【０１６３】
本発明の二重特異性および多重特異性分子はまた、細胞表面上の受容体を捕捉および排除することなどによってエフェクター細胞上のＦｃγＲまたはＦｃγＲレベルを調節するために使用することができる。抗Ｆｃ受容体の混合物もこの目的のために使用することができる。
【０１６４】
本発明の態様は、本発明の抗体組成物（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性または多重特異性分子）および例えば癌の処置におけるその使用のための説明書を含むキットを含む。キットは、免疫抑制試薬、細胞傷害性剤もしくは放射線毒性剤などの１つ以上の追加の試薬、または本発明の１つ以上の追加の抗体（例えば、第１抗体とは別個のＣＲＴＡＭ抗原のエピトープに結合する補体活性を有する抗体）をさらに含むことができる。
【０１６５】
したがって、本発明の抗体組成物で処置された患者は、（本発明の抗体の投与の前、それと同時、またはその後に）抗体の治療効果を増強または増大する、細胞傷害性剤または放射線毒性剤などの別の治療剤をさらに投与できる。
【０１６６】
他の実施形態では、対象は、例えば対象をサイトカインで処置することによってＦｃγまたはＦｃγ受容体の発現または活性を調節する、例えば増強または阻害する薬剤でさらに処置することができる。多重特異性分子による処置中の投与に好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。
【０１６７】
本発明の組成物（例えば、抗体、多重特異性および二重特異性分子）はまた、ＦｃγＲまたはＣＲＴＡＭを発現する細胞を、例えばそのような細胞を標識するために標的化するために使用することができる。そのような使用のため、検出することができる分子に結合剤を連結することができる。したがって、本発明は、ＦｃγＲなどのＦｃ受容体またはＣＲＴＡＭを発現するエクスビボまたはインビトロ細胞を局在化させる方法を提供する。検出可能な標識は、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。
【０１６８】
特定の実施形態では、本発明は、抗体またはその部分とＣＲＴＡＭとの間での複合体の形成を可能にする条件下で、試料および対照試料をＣＲＴＡＭに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させることを含む、試料中のＣＲＴＡＭ抗原の存在を検出するための方法またはＣＲＴＡＭ抗原の量を測定するための方法を提供する。次いで、複合体の形成が検出され、対照試料と比較した試料間の複合体形成の差異が試料中のＣＲＴＡＭ抗原の存在を示す。
【０１６９】
他の実施形態では、本発明は、対象における免疫介在性障害、例えば、ヒト癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、および血液悪性腫瘍を治療するための方法を提供する。
【０１７０】
すべての論文、刊行物、特許、特許出願、発表物、テキスト、レポート、原稿、パンフレット、書籍、インターネット投稿、ジャーナル記事、定期刊行物、製品ファクトシートなどを含むが限定されない、本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書での参考文献の議論は、その著者による主張を単に要約することを意図しており、いかなる参考文献も先行技術を構成することを認めるものではなく、本出願人は、引用された参考文献の正確性および妥当性に異議を申し立てる権利を留保する。
【０１７１】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および例としていくらか詳細に記載したが、従属請求項の真意または範囲から逸脱することなく、本発明に対して特定の変更および修正が可能であることは、本発明の教示に照らして、当業者に容易に明らかであろう。
【０１７２】
本発明は、さらなる限定として解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。以下の実施例、配列、および図は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の真意から逸脱することなく、示された手順において修正を行うことができることが理解される。
【実施例】
【０１７３】
実施例１：抗体の産生およびスクリーニング
ハイブリドーマの生成
ラットモノクローナル抗ＣＲＴＡＭ抗体を遺伝子免疫により産生した。ＣＲＴＡＭ  ＥＣＤ（配列番号１２）を使用して、免疫化のためのプラスミドｐＢ８−ＣＲＴＡＭ−ｈｕｍ．ＥＣＤ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、フライブルク）を作成した。プラスミドｐＢ８−ＣＲＴＡＭ−ｈｕｍ．ＥＣＤを使用して、３匹のラットを免疫化した。免疫化したラット由来の脾細胞を骨髄腫細胞株と融合させ、業界の標準的手法を使用してハイブリドーマを生成した。
【０１７４】
ラットの免疫化および力価試験
動物をベクター（ｐＢ８−ＣＲＴＡＭ−ｈｕｍ．ＥＣＤ）で免疫化した。免疫化動物の血清中の標的特異的抗体（「抗体力価」）の存在を検出するために、フローサイトメトリーに基づくアッセイ（ＦＡＣＳ試験）を行った。
【０１７５】
ハイブリドーマスクリーニング
ＦＡＣＳアッセイを使用して、過剰発現しているハイブリドーマ細胞を同定した。一次スクリーニングから、１０８個のハイブリドーマクローンが陽性であると同定された。
【０１７６】
二次スクリーニング
組換えｈＣＲＴＡＭ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ１６９５−ＣＲ）を、１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（カタログ番号１２−５６５−１３６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈した高結合アッセイプレート（カタログ番号ＳＨ３００２８−０３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１００ｎｇ／ウェルでコーティングした。Ｔｅｃａｎ  Ｈｙｄｒｏ  ｓｐｅｅｄ  ９６ウェルプレートウォッシャーを使用して、プレートを洗浄用緩衝液、１×ＤＰＢＳ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（カタログ番号ＢＰ３３７−５００、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３回洗浄した。
【０１７７】
抗原でコーティングしたプレートを、洗浄後、スーパーブロック（ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒから入手可能）溶液で室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。
【０１７８】
１００μｌのハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡ緩衝液（ＥＬＩＳＡ緩衝液、１×ＤＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、および１％ウシ血清アルブミン、カタログ番号ＳＨ３０５７４．０２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に１：５で希釈して、各ウェルに添加した。一次抗体のインキュベーション後、プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した。ＨＲＰ結合二次抗体、ヤギ抗ラットＩｇＧを、ＥＬＩＳＡ緩衝液（Ｈ＆Ｌ  ｃｈａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１２−０３５−１６７）で１：５０００希釈し、プレートに室温で１時間添加した。プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した。１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（カタログ番号３４０２８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加して、検出可能なシグナルを発生させた。信号が完全に発生した後、２Ｎ硫酸（カタログ番号８１４０−１６、Ｒｉｃｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）をすべてのウェルに添加して反応を停止させた。各試料の光学密度（ＯＤ）を、ＶＥＲＳＡ  ｍａｘマイクロプレートリーダーを使用して、波長４５０ｎｍにおいて決定した。
【０１７９】
実施例２：ＣＲＴＡＭに対するモノクローナル抗体の構造的特徴
モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を標準的なＰＣＲ技術を使用して得て、標準的なＤＮＡ配列決定技術を使用して配列決定した。スクリーニングから選択された５Ａ１１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を図１に示す。
【０１８０】
５Ａ１１の重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および１に示されている。
【０１８１】
５Ａ１１の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４および２に示されている。
【０１８２】
ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用した５Ａ１１  ＶＨ配列のさらなる分析により、配列番号５、６、および７にそれぞれ示される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の描写が得られた。図１ａは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３が四角で囲まれた５Ａ１１  ＶＨ配列を示す。
【０１８３】
ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを使用した５Ａ１１  ＶＬ配列のさらなる分析により、配列番号８、９、および１０にそれぞれ示される、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の描写が得られた。図１ｂは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３が四角で囲まれた５Ａ１１  ＶＬ配列を示す。
【０１８４】
実施例３：フローサイトメトリー分析により決定されたＣＲＴＡＭに対するモノクローナル抗体の特異性
インビトロ活性化Ｔ細胞の調製
上記のように、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒトバフィーコートから単離した。２Ｅ６細胞／ｍｌ  ＰＢＭＣを、Ｔ細胞培養培地（５％ＦＢＳを含むＡＩＭ  Ｖ培地、カタログ＃ＳＨ３００８７０３、Ｆｉｓｈｅｒ、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）および３００ｕ  ＩＬ２（カタログ＃２００−０２、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ニュージャージー州）において、１００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）の存在下で４日間培養した。この後、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化ビーズ（カタログ＃１１１３２Ｄ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州）で２４時間培養した後、ＦＡＣＳ分析を行った（データは示していない）。
【０１８５】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を標準プロトコルに従って９６ウェルプレート形式で実施した。活性化Ｔ細胞を上記のようにして調製した。染色プロトコルの後続のすべてのステップは、室温で行った遠心分離ステップを除いて、氷冷試薬を用いて氷上で実施した。抗体の３倍連続希釈液をＦＡＣＳ緩衝液中に調製し、１３３ｎＭ〜１ｐＭの範囲の最終濃度での１２点の滴定曲線を得た。対応するハイブリドーマ上清、アイソタイプ対照、および陽性対照抗体を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中で希釈して、最終濃度３０ｎＭの単一点で試験した。抗体希釈液を、各細胞株について１つのウェルにそれぞれ分注した（１００μＬ／ウェル）。１つのウェルはＦＡＣＳ緩衝液で未染色のままであった。一次抗体または対照とともに３０分間インキュベーションした後、ＦＡＣＳ緩衝液を添加することによって細胞を２回洗浄し、続いて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを保持した。二次抗体、ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＲＰＥを１μｇ／ｍＬの作用（ｗｏｒｋｉｎｇ）濃度に希釈し、一次抗体で染色されていないウェルのうちの１つを除くすべてのウェルに適用した。二次抗体を細胞とともに３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液を添加することによって２回洗浄し、続いて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。最終細胞ペレットを、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液＋５０μｌの４％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、フローサイトメーターで取得する準備をするまで固定した。取得するまでプレートを４℃で放置した。Ｇｕａｖａ  Ｅａｓｙｃｙｔｅ  Ｐｌｕｓハイスループットフローサイトメーター（９６ウェルプレート）を使用して、各試料の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩまたは幾何平均（Ｇｅｏ  Ｍｅａｎ））を決定し、Ｇｕａｖａ  Ｃｙｔｏｓｏｆｔ  Ｐｒｏソフトウェアモジュール、バージョン２．２．２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）を使用して、生データを分析した。Ｇｅｏ  Ｍｅａｎを抗体濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、非線形回帰、シグモイド用量反応分析を行い、活性化Ｔ細胞への抗体結合についてのＥＣ５０を計算した。
【０１８６】
図３は、市販の抗ＣＲＴＡＭ抗体ＣＲ２４．１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と比較した、活性化Ｔ細胞への５Ａ１１特異的用量関連結合を示す。見て分かるように、抗体５Ａ１１は活性化Ｔ細胞への優れた結合を示す。
【０１８７】
実施例４：抗ＣＲＴＡＭ抗体の交差反応性
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析を標準的なプロトコルに従って９６ウェルプレート形式で行った。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号１２−５６５−１３６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、４℃で一晩、１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中の１μｇ／ｍＬ  ｃｙｎｏ  ＣＲＴＡＭ  ＨＩｇＧ１−Ｆｃタンパク質１００μｌ（カタログ番号ＳＨ３００２８−０３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でコーティングした。プレートを洗浄用緩衝液、１×ＤＰＢＳ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（カタログ番号ＢＰ３３７−５００、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３回洗浄し、２５０μｌのスーパーブロック緩衝液（カタログ番号３７５１５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で室温で３０分間ブロッキングした後、洗浄用緩衝液で再度３回洗浄した。
【０１８８】
抗ＣＲＴＡＭ抗体をＥＬＩＳＡ緩衝液、１×ＤＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、および１％ウシ血清アルブミン（カタログ番号ＳＨ３０５７４．０２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１：３に段階希釈し、濃度は０．００３〜２μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度での８点の滴定曲線を得て、２つ組でウェルに適用した。最後のウェルはＥＬＩＳＡ緩衝液でブランクのままとした。一次抗体とともに６０分間インキュベーションした後、プレートを洗浄用緩衝液中で３回洗浄した。
【０１８９】
二次抗体、ペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をＥＬＩＳＡ緩衝液で１：５０００に希釈し、ＣＲＴＡＭ抗体およびアイソタイプ対照を含むウェルに６０分間適用した。ペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）もＥＬＩＳＡ緩衝液で１：５０００に希釈し、ＣＲ２４．１を含むウェルに６０分間適用した。
【０１９０】
プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した。１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（カタログ番号３４０２８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加して、検出可能なシグナルを発生させた。信号が完全に発生した後、２Ｎ硫酸（カタログ番号８１４０−１６、Ｒｉｃｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）をすべてのウェルに添加して反応を停止させた。各試料の光学密度（ＯＤ）を、ＶＥＲＳＡ  ｍａｘマイクロプレートリーダーを使用して、波長４５０ｎｍにおいて決定した。各試料の吸光度を２つ組のウェルから平均し、抗体濃度に対してプロットし、非線形回帰およびシグモイド用量反応分析を使用してＥＣ５０を計算した。
【０１９１】
抗ＣＲＴＡＭ抗体５Ａ１１は、カニクイザルＣＲＴＡＭタンパク質への結合を用量依存的に示したが、ＣＲ２４．１は、カニクイザルＣＲＴＡＭタンパク質に結合しないことが見出された。図４は、５Ａ１１の交差反応性を示す。
【０１９２】
実施例５：Ｔ細胞を活性化し、ＩＦＮγ産生を刺激する抗ＣＲＴＡＭ抗体の能力
抗ＣＲＴＡＭおよび抗ＣＤ３抗体によるインビトロ活性化Ｔ細胞の調製
９６ウェル非組織培養プレートを２μｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３および異なる濃度の抗ＣＲＴＡＭ抗体／アイソタイプ（１：２希釈で２０μｇ／ｍｌから１１回滴定）で４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳで２回洗浄し、続いてＡＩＭＶおよび５％ＦＢＳで３０分間ブロッキングした。ブロッキング後、実施例３に記載されるように産生された１０万個のＯＫＴ３プライミング（ＯＫＴ３−ｐｒｉｍｅｄ）Ｔ細胞（４日目）を新鮮なＡＩＭＶ培地に再懸濁し、プレート上に添加した。３７℃で１日インキュベーションした後、上清を回収し、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡアッセイでの使用のために希釈した。
【０１９３】
ＩＦＮγ決定のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＩＦＮγを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの対応するＲｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！ＥＬＩＳＡキット（カタログ＃５０−１７３−２４  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。製造元の説明書に従って、高結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６９０）を捕捉抗体（コーティング用緩衝液で１：２５０に希釈）で４℃で一晩コーティングし、次いで洗浄用緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。プレートを、Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔを使用してシェーカー上で１時間ブロッキングした。細胞培養上清を適切な希釈（ＩＦＮγについては１：４００）でプレートに添加し、シェーカー上で２時間インキュベートし、続いて３回洗浄した。Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１：２５０に希釈したビオチン化検出抗体（キットに付属）を添加し、プレートシェーカー上で１時間インキュベートした。プレートを洗浄用緩衝液で洗浄し、アッセイ希釈液で１：１０００に希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジン（キットに付属）を添加した。プレートシェーカー上で３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質溶液（キット中に提供）を添加した。約５〜１０分後に２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４溶液を添加して発色反応を停止し、プレートリーダーで４５０ｎｍ（ＯＤ４５０）において吸光度を読み取った。
【０１９４】
結果
５Ａ１１抗体は、抗体ＣＲ２４．１と比較した場合、ＯＫＴ３で予め活性化されたＴ細胞において増強された活性を示し、ＩＦＮγ産生の増加を反映した（図５）。これは、ＣＲＴＡＭに対する抗体が、免疫系が阻害されている患者において治療効果があることを示す。
【０１９５】
実施例６：抗体５Ａ１１のヒト化
ＣＤＲ移植技術を使用して、ラット５Ａ１１モノクローナル抗体のヒト化を行った。ヒト化プロセスを先導し、親ラット残基を保存するか、または該親ラット残基をそのヒト生殖細胞系列対応物と置き換えるかの決定を助けるために、５Ａ１１ラットモノクローナル抗体のＦｖの相同性分子モデルを構築した。
【０１９６】
ＣＤＲの定義は、Ｋａｂａｔ命名法に基づく。５Ａ１１ラットＣＤＲ領域を移植するヒトフレームワーク受容体領域の選択は、免疫グロブリンＶ領域配列の分析を容易にするためのＮＣＢＩで開発されたＩｇＢＬＡＳＴを使用して、５Ａ１１ラット可変領域配列を入力として、ＩＭＧＴラットおよびヒトのＶ遺伝子データベースを検索することによって達成された。適用した戦略は、個々のヒト抗体配列に見出される特有の体細胞変異を含まない天然ヒト配列であるヒト生殖細胞系列配列を使用することであった。
【０１９７】
５Ａ１１ラット抗体の相同性分子モデル
相同性モデル構築の方法論
抗体ＢＵＨ−５Ａ１１−Ｆ２（「５Ａ１１」）のモデルを、確立されたプロトコル（Ｒａｍｏｓ  ＯＨＰ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１２；９０７：３９−５５）に従って構築した。可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）配列は、フレームワークおよびＣＤＲ配列を分けるために、ＩＭＧＴ規則に従って別々に番号付け／注釈付けした。
【０１９８】
Ｖｌフレームワーク残基を使用して、解析される（ｓｏｌｖｅｄ）抗体構造の配列をタンパク質ＢＬＡＳＴにより検索した。トップヒットは、４ＡＩＺの構造のＶＬ（１．７５Ａの解像度）によって提供された（１０８個の同一残基のうち６５個）。これを鋳型として選択したが、構造３Ｇ６ＤのＶＬ（３．２０Ａの解像度）によって提供されたわずかに低いランクのヒット（１０７個の同一残基のうち６４個）を使用して、４ＡＩＺから失われたＮ末端セリンのコンフォメーションを修正した。ＶＬ  ＣＤＲ２配列は４ＡＩＺの配列と完全一致した。したがって、ＣＤＲ２鋳型について検索する必要はなかった。各端に２つの残基が付加されたＶＬ  ＣＤＲ１およびＣＤＲ３の配列を使用して、解析される抗体構造の配列をタンパク質ＢＬＡＳＴにより検索した。ＶＬ  ＣＤＲ３についてのトップヒットは、構造１ＮＦＤ（解像度２．８０Ａ）であった（１５個の同一残基のうちの１１個）。各端に２つの残基が付加されたＣＤＲ１の配列と一致するマウスまたはラットの抗体構造はなく、ＶＬフレームワークを有するマウスまたはラットの抗体構造の検索を行っても、良好な近似ヒットは得られなかった。ＣＤＲ１についての最良の一致は、ヒトの構造全体を検索すると、ＶＬ鋳型として使用された４ＡＩＺ中のヒトＶ−λとなった（１０個の同一残基のうちの５個）。ＰｙＭｏｌ（ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、バージョン１．３ｒ１、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）を使用して、ＣＤＲ３鋳型をフレームワーク鋳型にフィッティングさせ、端上の２つの残基の突出を使用してＣＤＲ鋳型断片をＶＬフレームワーク鋳型に固定した。５Ａ１１  ＶＬ配列と一致させるために、組み立てられたＶＬ部分モデルに、最適な回転異性体を選択して手作業で（ＰｙＭｏｌにおける）突然変異誘導を享受させた。
【０１９９】
ＶＨフレームワーク残基を使用して、解析される抗体構造の配列をタンパク質ＢＬＡＳＴにより検索した。トップヒットは、ラット抗体構造５ＡＵＭのＶＨ（２．０５Ａの分解能）によって提供された（１１６個の同一残基のうちの８５個）。この抗体は、５Ａ１１と同じＩＧＨＶ１０−５生殖細胞系列であり、したがって鋳型として選択された。各端に２つの残基が付加されたＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を使用して、解析される抗体構造の配列をタンパク質ＢＬＡＳＴにより検索した。ＶＨ  ＣＤＲ１についてのトップヒットは、４ＨＰＹの構造（１．５０Ａの分解能）によって提供された（１１個の同一残基のうちの９個）。ＶＨ  ＣＤＲ２についてのトップヒットは、５ＡＵＭの構造によって提供された（１４個の同一残基のうちの１１個）。アラインメント中の４つのギャップの存在により、ＶＨ  ＣＤＲ３のトップヒット１Ｑ７２を鋳型として選択しなかった。代わりに、ランクの低いヒット構造４ＢＺ１（１．５０Ａの解像度）（１４個の同一残基のうちの７個）を選択した。これは、１Ｑ７２および４ＢＺ１  ＣＤＲ３断片の重複により、Ｎ末端およびＣ末端部分がフレームワーク鋳型および相互によく一致する一方、４ＢＺ１が１Ｑ７２に見出される配列挿入の満足のいく閉鎖を提供することが示されたためであった。ＣＤＲ鋳型を（ＰｙＭｏｌ中の）フレームワーク鋳型とフィッティングさせ、端上の２つの残基の突出を使用して各ＣＤＲ鋳型断片をフレームワーク鋳型に固定した。最後に、５Ａ１１  ＶＨ配列と一致するように、組み立てられたＶＨ部分モデルを最適な回転異性体を選択して手作業で（ＰｙＭｏｌで）突然変異誘導に享受させた。その後、最終モデルを組み立てるために、ＶＨおよびＶＬ部分モデルの最良の３次元アラインメントを選択した。最適な（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）予測３次元アラインメントを見出すために、ＶＨおよびＶＬ鋳型配列をＰＡＰＳ（Ｐａｃｋｉｎｇ  Ａｎｇｌｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｅｒ−Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ＫＲ，Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣＲ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｈ／ｖｌ  ｐａｃｋｉｎｇ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０；２３：６８９−６９７）に提示した。ＰＡＰＳサーバーは、−４４．５度の相対パッキング角度を有する解析される抗体構造１Ｄ５ＢがＶＨおよびＶＬの最適な３次元アラインメントを提供すると予測した。したがって、ＶＨおよびＶＬ部分モデルの保存されたアンカーセグメント（残基４１〜４４および１０１〜１０４）の骨格座標を１Ｄ５Ｂ（ＰｙＭｏｌ中）にフィッティングすることにより、最終モデルを組み立てた。最後に、この最終モデルの座標を、１ラウンドのＧＲＯＭＡＣＳ（Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｓｐｏｅｌ  Ｄ，Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｅ，Ｈｅｓｓ  Ｂ，Ｇｒｏｅｎｈｏｆ  Ｇ，Ｍａｒｋ  ＡＥ，Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ  ＨＪＣ．Ｇｒｏｍａｃｓ：ｆａｓｔ，ｆｌｅｘｉｂｌｅ，ａｎｄ  ｆｒｅｅ．Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ  ２００５；２６：１７０１−１７１８）をＧＲＯＭＯＳ９６（Ｓｃｏｔｔ  ＷＲＰ，Ｈｕｎｅｎｂｅｒｇｅｒ  ＰＨ，Ｔｉｒｏｎｉ  ＩＧ，Ｍａｒｋ  ＡＥ，Ｂｉｌｌｅｔｅｒ  ＳＲ，Ｆｅｎｎｅｎ  Ｊ���Ｔｏｒｄａ  ＡＥ，Ｈｕｂｅｒ  Ｔ，Ｋｒｕｇｅｒ  Ｐ，ｖａｎ  Ｇｕｎｓｔｅｒｅｎ  ＷＦＴｈｅ  ｇｒｏｍｏｓ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ．Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  Ａ  １９９９；１０３：３５９６−３６０７）力場を伴って使用したエネルギー最小化に享受させた。
【０２００】
重鎖の設計
最も相同なラット生殖細胞系列ＩＧＨＶ１０−５＊０１とのアミノ酸の違い
ラット５Ａ１１ハイブリドーマから単離されたＶＨのアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ番号付けスキームによるＣＤＲ領域は太字で示されている）。
【化１】
2021501583.tif 000005
５Ａ１１ラット重鎖可変（ＶＨ）領域とラット生殖細胞系列免疫グロブリンＶＨ１０−５＊０１（ＩＧＨＶ１０−５＊０１）との間の９１％の同一性（合計１００個のアミノ酸のうちの９１個の同一残基）。
【化２】
2021501583.tif 000006
【０２０１】
ヒトフレームワーク受容体ＶＨ領域の選択
５Ａ１１ラットＣＤＲ領域が移植されるヒトフレームワーク受容体ＶＨ領域の選択は、ＩｇＢＬＡＳＴを使用し、ラットＶＨ領域のアミノ酸配列を入力として用いて、ＩＭＧＴヒトＶＨ遺伝子データベースを検索することによって行われた。ヒト生殖細胞系列に対する親抗体の配列アラインメントに基づいて、最も近似する一致（ｍａｔｃｈｉｎｇ）エントリーを同定した。受容体としての最適なヒト生殖細胞系列の同定は、以下の順序付けられた基準：Ｋａｂａｔによって定義されたフレームワーク全体の配列同一性、ならびに鎖間インターフェース残基および親ＣＤＲの標準的コンフォメーションを有する支持（ｓｕｐｐｏｒｔ）ループの同一性および／または適合性に基づいた。この分析から、ヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ３−７３＊０１は、ヒトフレームワーク受容体領域として最良の選択であるようと思われ、全体の同一性割合は７５％であった（合計１００個のうちの７５個の残基）。したがって、このヒト生殖細胞系列をヒト化形態の設計に使用した。ラット生殖細胞系列Ｊ２遺伝子（ＩＧＨＪ２＊０１）は、対応するラット５Ａ１１  ＶＨＪ遺伝子と最も相同なセグメント遺伝子として同定された。ＦＲ４では、５Ａ１１  ＶＨの配列はラットＩＧＨＪ２＊０１生殖細胞系列遺伝子の配列と同一である。ラットＪ２セグメント遺伝子をＣＤＲ３およびＦＲ４を上回るヒトＪセグメント遺伝子と比較し、ヒトＪセグメントＩＧＨＪ４（ＩＧＨＪ４＊０１）を選択した。
【０２０２】
フレームワーク受容体領域としてＩＧＨＶ３−７３＊０１ヒト生殖細胞系列を使用した設計
ヒト化形態Ａ
Ｋａｂａｔ命名法によって定義されたラットＣＤＲ（太字）をＩＧＨＶ３−７３＊０１に移植して、以下の詳細な配列を取得した。下線が引かれている残基は、フレームワークラット残基（ＣＤＲ残基の外にある）、すなわち、親ラット５Ａ１１  ＶＨ配列から保存されている。それらの残基は、抗体の完全な活性を維持するために構造的に重要であり得るために保存されてきた。
形態Ａ
【化３】
2021501583.tif 000007
ＩＧＨＶ３−７３＊０１ヒト生殖細胞系とのヒト化形態Ａの８５％同一性（８５／１００）
【化４】
2021501583.tif 000008
【０２０３】
フレームワーク２（ＦＲ２）では、Ｋａｂａｔ残基Ｈ４９  Ａｌａは「Ｖｅｒｎｉｅｒ残基」として既知であり、ＶＨ−ＣＤＲ２に隣接し、ＣＤＲコンフォメーションおよび抗原認識の微調整に影響を与え得る。フレームワーク３（ＦＲ３）では、Ｋａｂａｔ残基Ｈ６９  ＶａｌおよびＨ７８  Ｖａｌが「Ｖｅｒｎｉｅｒ残基」として既知である。それらはＣＤＲに隣接し、ＣＤＲコンフォメーションおよび抗原認識の微調整に影響を与え得る。
軽鎖の設計
最も相同なラット生殖細胞系列ＩＧＬＶ４−Ｓ１＊０１とのアミノ酸の違い
ラット５Ａ１１  ＶＬのアミノ酸配列（ＣＤＲ領域が強調表示されている）
【化５】
2021501583.tif 000009
５Ａ１１ラットＶＬとラット生殖細胞系列免疫グロブリンλ可変ＩＧＬＶ４−Ｓ１＊０１との間の９７．９％（９４／９６）同一性（合計９６個のアミノ酸のうちの９４個の同一残基）。
【化６】
2021501583.tif 000010
【０２０４】
ヒトフレームワーク受容体ＶＬ領域の選択
５Ａ１１  ＶＬラットＣＤＲ領域が移植されるヒトフレームワーク受容体ＶＬ領域の選択は、ＩｇＢＬＡＳＴを使用し、ラットＶＬ領域のアミノ酸配列を入力として、ＩＭＧＴヒトＶＬ遺伝子データベースを検索することによって行った。ヒト生殖細胞系列に対する親抗体の配列アラインメントに基づいて、最も近似する一致エントリーを同定した。受容体としての最適なヒト生殖細胞系列の同定は、以下の順序付けられた基準：Ｋａｂａｔによって定義されたフレームワーク全体の配列同一性、ならびに鎖間インターフェース残基の同一性および／または適合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）、ならびに親ＣＤＲの規準的なコンフォメーションを有する支持ループ（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｌｏｏｐ）に基づいた。この分析から、ヒト生殖細胞系列ＩＧＬＶ３−２７＊０１は、ヒトフレームワーク受容体領域として最良の選択であると思われ、全体の同一性割合は６４．６％であった（合計９６個のうちの６２個の残基）。したがって、このヒト生殖細胞系列をヒト化形態の設計に使用した。
【０２０５】
ラット生殖細胞系列Ｊ１遺伝子（ＩＧＫＪ１＊０１）は、対応するラット５Ａ１１  ＶＬ  Ｊ遺伝子に最も相同な遺伝子セグメントとして同定された。ラットＪ１遺伝子セグメントをＣＤＲ３およびＦＲ４を上回るヒトＪセグメント遺伝子と比較し、ヒトＪセグメントＩＧＫＪ２（ＩＧＫＪ２＊０１）が最も高い全体的相同性を有することが見出された。
【０２０６】
フレームワーク受容体領域としてＩＧＬＶ３−２７＊０１ヒト生殖細胞系列を使用した設計
ヒト化形態
Ｋａｂａｔ番号付けによって定義されたラットＣＤＲをＩＧＬＶ３−２７＊０１に移植して、以下の詳細な配列を取得した。抗体の完全な活性を維持するために構造的に重要な多くのラットフレームワーク残基が保持されている。これにより、ＩＧＬＶ３−２７＊０１ヒト生殖細胞系列と８７．５％同一性（９６個のうちの８４個のアミノ酸残基）を有するヒト化形態が得られた。
【化７】
2021501583.tif 000011
【０２０７】
実施例７  パーフォリン／グランザイムアッセイ
抗ＣＲＴＡＭ抗体によって誘導された細胞傷害性能力を、刺激後のＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球によるパーフォリンおよびグランザイムＢ産生を測定することによって評価した。市販のキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞を健康なドナーＰＢＭＣからネガティブ単離した（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ）。単離されたＣＤ８細胞を、プレートに結合したＣＤ３（ＯＫＴ３、０．１μｇ／ｍｌ）および異なる用量の５Ａ１１で４日間刺激した。プレート上の刺激に続いて、ＣＤ８細胞をＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）、イオノマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、およびブレフェルジン（１０μｇ／ｍｌ）で４時間処理した。次いで細胞を洗浄し、４％ＰＦＡで１０分間固定し、０．５％サポニンを含むＰＢＳで希釈したフローサイトメトリー用のパーフォリンおよびグランザイムＢ抗体で１５分間染色した。染色後、細胞を０．５％サポニンを含むＰＢＳで２回、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で１回洗浄した。洗浄した細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）フローサイトメーターを使用して分析した。図７および図８に詳細を示されるように、５Ａ１１の用量を増加させて刺激することにより、ＣＤ８  Ｔ細胞の細胞傷害性能力が用量依存的に増加した。
【０２０８】
実施例８  Ｔ細胞傷害性アッセイ
抗ＣＲＴＡＭ抗体を使用したＭＣＦ−７乳癌細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を、Ｔ細胞およびＭＣＦ−７細胞のアンカーとしてＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体を使用して評価した。抗ＣＲＴＡＭ抗体を腫瘍細胞、ＰＢＭＣ、およびＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体を含むアッセイウェルに添加したときに、追加の細胞傷害性が観察された。抗ＣＲＴＡＭ抗体の作用に関連する細胞傷害性の割合を、抗ＣＲＴＡＭ抗体で処理していない細胞と比較したときの死滅率として計算した。
【０２０９】
新たに単離されたＰＢＭＣを、１０００×ｇで５分間遠心分離することにより採取し、ＤＭＥＭ完全培地で１．５Ｅ６細胞／ｍｌに希釈した。ＰＢＭＣを等分し、試験抗体（５Ａ１１抗体）を２０ｕｇ／ｍｌまで添加した。細胞を氷上で１０〜２０分間インキュベートした。ＭＣＦ−７細胞を収集し、１．５Ｅ６細胞／ｍｌの密度まで希釈した。
【０２１０】
ＰＢＭＣおよびＭＣＦ−７の両方の５０ｕｌの得られた細胞懸濁液を、各ウェルが７５０００個のＰＢＭＣおよびＭＣＦ−７細胞を含むように各ウェルに添加した。Ｈｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体を完全ＤＭＥＭ培地で段階希釈し、１０ｕｌのこの希釈液を各ウェルに添加して、各アッセイウェルにおいて５ｕｇ／ｍｌの最終希釈液を作製した。
【０２１１】
５０ｕｌ／ウェルの培養培地を含む未処理のウェルが陰性対照を表すものとした。アッセイプレートを５％ＣＯ２とともに３７℃で９６時間インキュベートした。インキュベーション後、アッセイプレートを室温まで３０分間平衡化した。ＰＢＭＣを除去して廃棄し、ＭＣＦ−７細胞をアッセイウェル中に残存させた。プレートをＰＢＳで室温で３回洗浄し、１００ｕｌの室温のＰＢＳを各ウェルに添加した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（カタログ番号Ｇ７５７２、Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を製造元の説明書に従って調製し、１００ｕｌ／ウェルを分注した。試薬をアッセイウェルに数回ピペットで出し入れして混合し、細胞溶解を誘導した。アッセイプレートを暗所で１５分間インキュベートした。製造業者の推奨に従って、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して発光を記録した。
【０２１２】
生存細胞数は発光単位に比例し、アッセイされたウェル中の各濃度について平均を計算した。生存率を対照として試験抗体を含まないウェルを使用して計算し、抗体濃度に対してプロットした。
【０２１３】
図９から分かるように、抗体５Ａ１１の添加により、５Ａ１１抗体なしの対照と比較して細胞傷害性のレベルが有意に増加した。
【０２１４】
実施例９  腫瘍浸潤リンパ球を用いたＥＬＩＳＰＯＴ
ＮＳＣＬＣ（図１０）または乳癌（図１１）腫瘍からの原発腫瘍由来腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、示された濃度に希釈したＣＲ２４．１、５Ａ１１、またはペンブロリズマブ、および完全ＲＰＭＩ培地で１μｇ／ｍｌに希釈したＯＫＴ３で９６時間刺激した。刺激後、ＴＩＬを採取し、カウントし、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍａｂｔｅｃｈ）上に１００，０００細胞／ウェルでプレーティングした。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、続いて製造業者の説明書に従って展開した。スポットの数をＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ５  ＥＬＩＳＰＯＴアナライザーを使用して読み取り、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
【０２１５】
図１０は、抗体５Ａ１１がより多くのＮＳＣＬＣ由来ＴＩＬを活性化することを示しており、このことは、市販の抗体ＣＲ２４．１またはペンブロリズマブのいずれかよりも有意に高いＩＦＮγ産生を反映している。
【０２１６】
図１１は、抗体５Ａ１１およびペンブロリズマブが同様の数の乳癌由来ＴＩＬを活性化してＩＦＮγを産生することを示している。
【０２１７】
実施例１０  腫瘍浸潤リンパ球を用いた用量反応ＥＬＩＳＰＯＴ
ＮＳＣＬＣ腫瘍からの原発腫瘍由来腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、０．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、または１０μｇ／ｍｌの５Ａ１１、ペンブロリズマブ（１０μｇ／ｍｌ）、または完全ＲＰＭＩ培養培地で１μｇ／ｍｌに希釈したＯＫＴ３で９６時間刺激した。刺激後、ＴＩＬを採取し、カウントし、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍａｂｔｅｃｈ）上に１００，０００細胞／ウェルでプレーティングした。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、続いて製造業者の説明書に従って展開した。スポットの数をＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ５  ＥＬＩＳＰＯＴアナライザーを使用して読み取り、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
図１２は、すべての用量の５Ａ１１がＴＩＬを活性化して、ペンブロリズマブによって産生されたものに対してより高い量のＩＦＮγを産生したことを示している。
【０２１８】
実施例１１  Ｄｅｌｆｉａ（登録商標）キットによるＰＢＭＣ介在性細胞傷害性
Ｄｅｌｆｉａ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）キットに記載されるようにして、Ｋ５６２細胞を染色した。染色されたＫ５６２細胞を、１０μｇ／ｍｌに希釈した５Ａ１１、ＣＲ２４．１、またはペンブロリズマブの存在下、１：２０の標的とエフェクターとの比で健康なドナーＰＢＭＣ（ＩＬ−２とともに７２時間事前培養した）と混合した。５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２をアッセイの陽性対照として使用した。すべての条件を３回繰り返した。共培養物を３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、２０μｌの共培養上清を収集し、製造元の説明書（Ｄｅｌｆｉａ（登録商標）Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってアッセイした。３２０ｎｍ励起、６１５発光、１００マイクロ秒の遅延、１００マイクロ秒の積分での時間分解蛍光測定（ＴＲＦ）についてＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５プレートリーダーを使用して、結果を読み取った。具体的な溶解度の計算を可能にするための製造元が推奨するすべての対照がアッセイに含まれており、キットの取扱説明書に詳述されているようにして計算を行った。
【０２１９】
図１３は、抗体５Ａ１１が市販の抗体ＣＲ２４．１またはペンブロリズマブのいずれよりも有意に多くの細胞溶解を誘発したことを示している。
【０２２０】
実施例１２  ＨＣＣ８２７ヒトＮＳＣＬＣ  Ｍｉｘｅｎｏ  ＮＣＧマウスモデルにおける５Ａ１１抗体の抗腫瘍有効性のインビボ評価
アイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ；ＢＩＷ×３）および５Ａ１１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ；ＢＩＷ×３）をインビボモデルで試験した。各コホートは１０匹のマウスを含んでいた。各コホートを半分に分け、５匹のマウスに２人の健康なヒトドナーのうちの１人から単離および調製したＰＢＭＣを腹腔内注射した。３日後、マウスにＨＣＣ８２７腫瘍細胞を皮下接種した。１日後、上記の投与スケジュールで試験抗体による処置を開始した。体重（ＢＷ）をモニタリングし、腫瘍を毎週３回測定した。マウスを健康および有害な副作用について頻繁に検査した。移植片対宿主疾患の証拠により、マウスを安楽死させた。処置の結果を、示された研究日に測定した際の対照群の平均腫瘍体積に対する処置群の平均腫瘍体積の差の尺度である、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）によって決定した。
【０２２１】
図１４は、１５日後に、５Ａ１１抗体で処置したマウスにおける腫瘍は、アイソタイプ対照抗体で処置された動物における腫瘍よりも有意に小さかったことを示している。
【０２２２】
実施例１３  ヒト化５Ａ１１抗体の結合親和性
ヒト化５Ａ１１抗体の結合親和性を、抗ｈＩｇＧ捕捉バイオセンサー（カタログ＃１８−５０６０）を使用したＯｃｔｅｔ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）によって決定した。
抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）ＦｏｒｔｅＢｉｏバイオセンサーに、１μｇ／ｍＬの濃度の試験抗体を３００秒にわたって充填した。
【０２２３】
充填されたバイオセンサーを、２００ｎＭで開始し、１：３に段階希釈した５種類の濃度のヒト組換えｈＣＲＴＡＭ／Ｆｃキメラととともにインキュベートした。参照ウェルは、速度論的緩衝液のみを含んだ（ドリフト（ｄｒｉｆｔ）について補正するため）。
【０２２４】
すべての濃度のデータを、各試料についてグローバル１：１曲線フィット（ｃｕｒｖｅ  ｆｉｔ）を使用してフィッティングした。可能な場合には、速度論的結合および解離速度ならびにＫＤ値を決定した。
【０２２５】
分析により、ヒト化抗体５Ａ１１が以下の表２に示される特徴を有することが示された。
【表３】
2021501583.tif 000012
【表４−１】
2021501583.tif 000013
【表４−２】
2021501583.tif 000014
【図１ａ】
2021501583.tif 000015
【図１ｂ】
2021501583.tif 000016
【図２ａ】
2021501583.tif 000017
【図２ｂ】
2021501583.tif 000018
【図３】
2021501583.tif 000019
【図４】
2021501583.tif 000020
【図５】
2021501583.tif 000021
【図６ａ】
2021501583.tif 000022
【図６ｂ】
2021501583.tif 000023
【図７】
2021501583.tif 000024
【図８】
2021501583.tif 000025
【図９】
2021501583.tif 000026
【図１０】
2021501583.tif 000027
【図１１】
2021501583.tif 000028
【図１２】
2021501583.tif 000029
【図１３】
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【図１４】
2021501583.tif 000031
【配列表】
2021501583000001.app
【国際調査報告】
2021501583.tif 000032
2021501583.tif 000033
2021501583.tif 000034
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