(57)【要約】本開示は、目的サイトカインの条件付きで活性な変異型である融合タンパク質を特徴とする。一態様では、本発明の完全長ポリペプチドは、それらが機能的サイトカインポリペプチドを含有していても、サイトカイン受容体活性化活性が低下しているか、または最小限である。例えば、遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチド等を、活性サイトカインに順次連結するリンカーの切断等による活性化時、サイトカインは、その受容体と結合し、シグナル伝達を実行することができる。典型的には、融合タンパク質はさらに、インビボ半減期延長要素を含み、これは、腫瘍微小環境においてサイトカインから切断され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）サイトカインポリペプチド［Ａ］、
ｂ）サイトカイン遮断部分［Ｄ］、及び
ｃ）プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカー［Ｌ］、のそれぞれのうちの少なくとも１つを含む融合ポリペプチドであって、
前記サイトカインポリペプチドと前記サイトカイン遮断部分とは、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーによって機能的に連結されており、前記融合ポリペプチドはサイトカイン受容体活性化活性が減弱されており、前記融合ポリペプチドの前記サイトカイン受容体活性化活性は、前記プロテアーゼ切断可能リンカーの切断により産生される前記サイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍低い、前記融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記サイトカインポリペプチドは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＧＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＴＧＦベータ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１及びその活性断片からなる群から選択される、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記サイトカインポリペプチドは、半減期が短いサイトカインポリペプチドである、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記プロテアーゼ切断可能リンカーポリペプチドは、独立して、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＧ、カテプシンＬ、エラスターゼ、ＰＲ−３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭ、ＦＡＰ、カテプシンＬ、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ、及び腫瘍細胞表面プロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによる切断を受けることができる配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記プロテアーゼ切断可能ポリペプチドは、独立して、同じプロテアーゼのための２つ以上の切断部位、もしくは異なるプロテアーゼによって切断される２つ以上の切断部位を含むか、または前記プロテアーゼ切断可能ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、２つ以上の異なるプロテアーゼの切断部位を含む、１〜４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記サイトカイン遮断部分は半減期延長要素でもある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記サイトカイン遮断部分は、前記サイトカインのアゴニスト活性を立体的に遮断する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記サイトカイン遮断部分は、ヒト血清アルブミン、抗原結合タンパク質、またはヒト血清アルブミンもしくはその断片と結合する抗原結合ポリペプチドである、請求項６または７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記サイトカインは、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーがプロテアーゼによって切断された後、前記サイトカイン遮断部分から自由に解離する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記サイトカイン遮断部分は、前記サイトカインポリペプチドがその同族受容体を活性化するのを阻害する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドは、前記プロテアーゼ切断可能リンカーによる切断の前に、前記サイトカインポリペプチドの前記同族受容体に結合する、請求項１〜１０のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
少なくとも１つの半減期延長要素をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記サイトカイン遮断部分は、前記リンカーのペプチド結合とは独立して、前記サイトカインポリペプチドと非共有結合で会合する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記非共有結合の会合は、ｐＨ依存性である、請求項１３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記半減期延長要素は、前記サイトカインポリペプチドのその同族受容体に対する活性化及び／または結合を立体的に阻害もしくは遮断する、請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記半減期延長要素は、ヒト血清アルブミン、ヒトＩｇＧ、ヒト化ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｄＡｂまたはその断片である、請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
前記サイトカイン遮断部分は、リガンド結合ドメイン、前記サイトカインポリペプチドと結合する単一ドメイン抗体もしくはｓｃＦｖ、または抗体もしくは抗体断片であって、単一ドメイン抗体、及び前記サイトカインポリペプチドの受容体と結合するｓｃＦｖから選択される前記抗体もしくは抗体断片、を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記サイトカイン受容体活性化活性は、標準的なインビトロ受容体活性化アッセイ、ならびにモルに基づく等量の前記サイトカインポリペプチド及び融合タンパク質を使用して決定される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
サイトカインは、前記プロテアーゼ切断可能配列がプロテアーゼによって切断された後、前記サイトカイン遮断部分及び／または半減期延長要素との接触を失う、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記融合ポリペプチドは、［Ａ］、［Ｄ］、及び［Ｌ］のそれぞれのうちの少なくとも１つを、以下の
ａ）［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、
ｂ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］、
ｃ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］、
ｄ）［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、
ｅ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、
ｆ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、
ｇ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、及び
ｈ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、のいずれかの配向で含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記融合ポリペプチドは、２つのサイトカインペプチドを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
式
［Ａ］−［Ｌ１］−［Ｄ］−［Ｌ２］−［Ａ］−［Ｌ２］−［Ｄ］
［式中、
Ａは、サイトカインポリペプチドであり、
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーであり、
Ｄは、任意選択で血清中半減期を延長することができるサイトカイン遮断部分である］を有し、
Ｌ１は、第１のプロテアーゼに対する基質であり、Ｌ２は、第２のプロテアーゼに対する基質である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
前記半減期延長要素は、１つの半減期延長要素、２つの半減期延長要素、または３つの半減期延長要素である、請求項１２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
１つのプロテアーゼ切断可能リンカー、２つのプロテアーゼ切断可能リンカー、３つのプロテアーゼ切断可能リンカー、４つのプロテアーゼ切断可能リンカー、５つのプロテアーゼ切断可能リンカー、６つのプロテアーゼ切断可能リンカー、または７つのプロテアーゼ切断可能リンカーを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
腫瘍特異抗原結合ペプチドをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記腫瘍特異抗原結合ペプチドは、切断不可能なリンカーによって前記サイトカインポリペプチドに機能的に連結される、請求項２５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
前記腫瘍特異抗原結合ペプチドは、切断可能なリンカーによって前記サイトカインポリペプチドに機能的に連結される、請求項２５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２８】
前記サイトカインポリペプチドは、対応する、天然に存在するサイトカインと同等の血清中半減期を有する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
前記融合タンパク質の切断により産生されるサイトカインポリペプチドを含有する前記ポリペプチド血清中半減期は、対応する、天然に存在するサイトカインと同等である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
前記サイトカインポリペプチドは、血清中半減期が短く、かつ、前記融合ポリペプチドの切断後に迅速に除去される変異タンパク質である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３１】
ａ）インターフェロンポリペプチド［Ａ］、
ｂ）インターフェロン遮断部分［Ｄ］、及び
ｃ）プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカー［Ｌ］、のそれぞれのうちの少なくとも１つを含む融合ポリペプチドであって、
前記インターフェロンポリペプチドと前記インターフェロン遮断部分は、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーによって機能的に連結され、前記融合ポリペプチドはインターフェロン受容体活性化活性が減弱されており、前記融合ポリペプチドの前記インターフェロン受容体活性化活性は、前記プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって産生される前記インターフェロンポリペプチドのインターフェロン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍低い、前記融合ポリペプチド。
【請求項３２】
式
［Ｄ］−［Ｌ１］−［Ａ］−［Ｌ２］−［Ｄ］
［式中、
Ａは、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）ポリペプチドであり、
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーであり、
Ｄは、インビボ半減期も延長するＩＦＮα遮断部分である］を有し、
前記インターフェロンアルファポリペプチドと前記インターフェロンアルファ遮断部分は、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーによって機能的に連結され、前記融合ポリペプチドはインターフェロンアルファ受容体活性化活性が減弱されており、前記融合ポリペプチドの前記インターフェロンアルファ受容体活性化活性は、前記プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって産生される前記インターフェロンアルファポリペプチドのインターフェロン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍低く、かつ、両方のリンカーの切断が起こると、前記インターフェロンアルファポリペプチドのインビボ半減期は、天然に存在するインターフェロンアルファのインビボ半減期と実質的に同様である、請求項３１記載の融合ポリペプチド。
【請求項３３】
式
［Ｄ］−［Ｌ１］−［Ａ］−［Ｌ２］−［Ｄ］−［Ｌ３］−［Ａ］−［Ｌ４］−［Ｄ］、
［式中、
Ａは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）ポリペプチドであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、それぞれ独立して、プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーであり、
Ｄは、血清中半減期を延長することができるＩＦＮγ遮断部分である］を有し、
前記インターフェロンガンマポリペプチドと前記インターフェロンガンマ遮断部分は、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーによって機能的に連結され、前記融合ポリペプチドはインターフェロンガンマ受容体活性化活性が減弱されており、前記融合ポリペプチドの前記インターフェロンガンマ受容体活性化活性は、前記プロテアーゼ切断可能リンカーの切断によって産生される前記インターフェロンガンマポリペプチドのインターフェロンガンマ受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍低く、かつ、両方のリンカーの切断が起こると、前記インターフェロンガンマポリペプチドのインビボ半減期は、天然に存在するインターフェロンガンマのインビボ半減期と実質的に同様である、請求項３１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３４】
前記プロテアーゼ切断可能リンカーポリペプチドは、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＧ、カテプシンＬ、エラスターゼ、ＰＲ−３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭ、ＦＡＰ、カテプシンＬ、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ、及び腫瘍細胞表面プロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによる切断を受けることができる配列を含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３５】
各プロテアーゼ切断可能ポリペプチドは、独立して、同じプロテアーゼのための２つ以上の切断部位、もしくは異なるプロテアーゼによって切断される２つ以上の切断部位を含むか、または前記プロテアーゼ切断可能ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、２つ以上の異なるプロテアーゼの切断部位を含む、請求項３４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３６】
前記インターフェロンは、インターフェロンアルファまたはインターフェロンガンマである、請求項３１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３７】
式
［Ａ］−［Ｌ１］−［Ｄ］−［Ｌ２］−［Ａ］−［Ｌ２］−［Ｄ］
［式中、
Ａは、インターフェロンポリペプチドであり、
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して、プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーであり、
Ｄは、任意選択で血清中半減期を延長することができるインターフェロン遮断部分である］を有し、
Ｌ１は、第１のプロテアーゼに対する基質であり、Ｌ２は、第２のプロテアーゼに対する基質である、請求項３１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３８】
前記インターフェロン遮断部分は半減期延長要素でもある、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３９】
前記インターフェロン遮断部分は、前記サイトカインのアゴニスト活性を立体的に遮断する、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４０】
前記インターフェロン遮断部分は、ヒト血清アルブミン、またはヒト血清アルブミンと結合する抗原結合ポリペプチドである、請求項３８または３９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
前記インターフェロンは、前記プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーがプロテアーゼによって切断された後、前記インターフェロン遮断部分から自由に解離する、請求項３１〜４０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４２】
前記インターフェロン遮断部分は、前記インターフェロンポリペプチドがその同族受容体を活性化するのを阻害する、請求項３１〜４１のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４３】
前記融合ポリペプチドは、前記プロテアーゼ切断可能リンカーによる切断の前に、前記インターフェロンポリペプチドの前記同族受容体に結合する、請求項３１〜４２のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４４】
少なくとも１つの半減期延長要素をさらに含む、請求項３１〜４３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４５】
前記インターフェロン遮断部分は、前記インターフェロンポリペプチドと非共有結合で会合する、請求項３１〜４４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４６】
前記非共有結合の会合はｐＨ依存性である、請求項３１〜４４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記半減期延長要素は、前記インターフェロンポリペプチドのその同族受容体に対する活性化及び／または結合を立体的に阻害もしくは遮断する、請求項４４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
前記半減期延長要素は、ヒト血清アルブミン、ヒトＩｇＧ、またはその断片である、請求項４４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４９】
前記半減期延長要素は前記インターフェロンポリペプチドと結合しない、請求項４４〜４８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５０】
前記インターフェロン遮断部分は、前記インターフェロンに対する同族受容体のリガンド結合ドメインもしくは断片、前記インターフェロンポリペプチドと結合する単一ドメイン抗体もしくはｓｃＦｖ、または前記インターフェロンの受容体と結合する抗体もしくは抗体断片（例えば、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ）を含む、請求項３１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５１】
前記同族インターフェロン受容体活性化活性は、標準的なインビトロ受容体活性化アッセイ、ならびにモルに基づく等量の前記融合ポリペプチド及びインターフェロンポリペプチドを使用して決定される、請求項３１〜５０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５２】
インターフェロンは、前記プロテアーゼ切断可能配列がプロテアーゼによって切断された後、前記インターフェロン遮断部分及び／または半減期延長要素から自由に解離する、請求項３１〜５１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５３】
前記融合ポリペプチドは、［Ａ］、［Ｂ］、及び［Ｌ］のそれぞれのうちの少なくとも１つを、以下の
ａ）［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、
ｂ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］、
ｃ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］、
ｄ）［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、
ｅ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、
ｆ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、
ｇ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、及び
ｈ）［Ｄ］−［Ｌ］−［Ａ］−［Ａ］−［Ｌ］−［Ｄ］、のいずれかの配向で含む、請求項３１〜５２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５４】
前記融合ポリペプチドは、２つのサイトカインペプチドを含む、請求項３１〜５３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５５】
前記２つのサイトカインポリペプチドは、２つの異なるサイトカインペプチドである、請求項５４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５６】
前記少なくとも１つの半減期延長要素は、１つの半減期延長要素または２つの半減期延長要素である、請求項４４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５７】
１つのプロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカーを含むことは、１つのプロテアーゼ切断可能リンカー、２つのプロテアーゼ切断可能リンカー、３つのプロテアーゼ切断可能リンカー、４つのプロテアーゼ切断可能リンカー、５つのプロテアーゼ切断可能リンカー、６つのプロテアーゼ切断可能リンカー、または７つのプロテアーゼ切断可能リンカーである、請求項３１〜５６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５８】
腫瘍特異抗原結合ペプチドをさらに含む、請求項３１〜５７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５９】
前記腫瘍特異抗原結合ペプチドは、切断不可能なリンカーによって前記インターフェロンポリペプチドに機能的に連結される、請求項５８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６０】
前記腫瘍特異抗原結合ペプチドは、切断可能なリンカーによって前記インターフェロンポリペプチドに機能的に連結される、請求項５８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６１】
請求項１〜６０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項６２】
請求項６１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６３】
請求項６２に記載のベクターまたは請求項６１に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項６４】
請求項６３に記載の宿主細胞を、所望のポリペプチドの発現及び採取に適切な条件下で培養することを含む、医薬組成物を製造する方法。
【請求項６５】
ｉ）請求項１〜６０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドと、ｉｉ）薬理学的に許容される添加物とを含む医薬組成物。
【請求項６６】
腫瘍を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項６７】
医薬品として使用するための、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６８】
腫瘍の治療における、それを必要とする対象での使用のための、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６９】
腫瘍を治療することを、それを必要とする対象において行うための医薬組成物であって、有効成分として、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含む、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年５月１４日に出願された米国仮出願第６２／６７１，２２５号、２０１８年１１月６日に出願された米国仮出願第６２／７５６，５０４号、２０１８年１１月６日に出願された米国仮出願第６２／７５６，５１５号、及び２０１８年１１月６日に出願された米国仮出願第６２／７５６，５０７号の利益を主張するものである。上記出願の教示全体は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年５月１４日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは１０５３６５−００２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、サイズは８６６，３８４バイトである。
【背景技術】
【０００３】
コミットメントの低い前駆体からの成熟免疫担当リンパ系細胞の発達、その後のそれらの抗原駆動免疫応答、及びこれらの望ましくない自己反応性応答の抑制は、共通γ鎖（γｃ）ファミリー（Ｒｏｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）ならびにＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及びＩＬ−２３等のファミリーメンバーの受容体を利用するサイトカイン（インターロイキン−２［ＩＬ−２］、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１等）に大きく依存し、調節される。ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇ細胞の胸腺での発生に不可欠であり、成熟した末梢Ｔｒｅｇ及び抗原により活性化された従来のＴ細胞のいくつかの重要な側面を決定的に調節する。ＩＬ−２は、そのインビトロでの強力なＴ細胞増殖因子活性のため、一部には、この活性が、例えば、がん及びＡＩＤＳ−ＨＩＶ等の患者で免疫を直接促進する強力な手段、または望ましくない応答、例えば、移植拒絶及び自己免疫疾患等に拮抗する標的を提供したという理由で広く研究されてきた。ＩＬ−２を用いるインビトロ研究では、これらの研究についての強い理論的根拠が得られたが、インビボでのＩＬ−２の機能はＩＬ−２欠損マウスで最初に例証されているように明らかに、よりはるかに複雑であり、免疫欠如ではなく、急速で致死的な自己免疫症候群が観察された（Ｓａｄｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，１９９５）。後に、ＩＬ−２Ｒα（Ｉｌ２ｒａ）及びＩＬ−２Ｒβ（Ｉｌ２ｒｂ）をコードする遺伝子を個々に除去した際に、同様の観察が行われた（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｗｉｌｌｅｒｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０００４】
本発明は、免疫のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションに依存するがん及び他の疾患の治療における使用のための、条件付きで活性である、及び／または標的化されたサイトカインを指す。例えば、いくつかのサイトカインの抗腫瘍活性は十分に知られ、また記載されており、いくつかのサイトカインはすでにヒトで治療的に使用されている。インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターフェロンα（ＩＦＮα）等のサイトカインでは、様々な種類の腫瘍、例えば、腎臓転移性癌腫、有毛細胞白血病、カポシ肉腫、黒色腫、多発性骨髄腫等の患者において陽性の抗腫瘍活性が示されている。ＩＦＮβ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦβ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＣＳＦのような他のサイトカインでは、いくつかの種類の腫瘍に対して特定の抗腫瘍活性が示されており、したがって、それらはさらなる研究課題である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、疾患または障害、例えば、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病等の治療のための、治療用タンパク質、かかるタンパク質をコードする核酸、ならびにかかるタンパク質及び核酸を使用する組成物及び方法が提供される。
【０００６】
本発明は、目的サイトカインの条件付きで活性な変異型である融合タンパク質を特徴とする。一態様では、本発明の完全長ポリペプチドは、それらが機能的サイトカインポリペプチドを含有していても、サイトカイン受容体活性化活性が低下しているか、または最小限である。例えば、遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチド等を、活性サイトカインに順次連結するリンカーの切断等による活性化時、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１または前述のうちのいずれかの機能的断片もしくは変異タンパク質等は、その受容体と結合して、シグナル伝達を実行することができる。所望される場合、完全長ポリペプチドは、追加の有利な特性も提供する遮断ポリペプチド部分を含むことができる。例えば、完全長ポリペプチドはまた、血清中半減期も延長させ、及び／または完全長ポリペプチドをサイトカイン活性の所望の部位に指向もさせる、遮断ポリペプチド部分を含有することもできる。別法として、完全長融合ポリペプチドは、遮断ポリペプチド部分とは別個の、血清中半減期延長要素及び／または標的指向性ドメインを含有することができる。好ましくは、融合タンパク質は、インビボでの循環血中半減期を延長することができる少なくとも１つの要素またはドメインを含有する。好ましくは、この要素は、身体の所望の部位で酵素により除去され（例えば、腫瘍微小環境におけるプロテアーゼによる切断）、天然に存在するペイロード分子と実質的に同様の薬物動態学的特性をペイロード分子（例えば、ＩＬ２またはＩＦＮａ）に回復をさせる。融合タンパク質を所望の細胞または組織に指向させてよい。本明細書に記載されるように、標的指向は、所望の標的にも結合する遮断ポリペプチド部分の作用を介して、または標的指向性ドメインを介して達成される。好ましい標的上の標的抗原（例えば、腫瘍特異的抗原）を認識するドメインは、切断可能または切断不可能なリンカーを介してサイトカインに結合され得る。切断不可能なリンカーで結合された場合、標的指向性ドメインは、腫瘍内にサイトカインを保持することにさらに役立つ場合があり、保持ドメインとみなされ得る。標的指向性ドメインは、必ずしもペイロード分子に直接連結される必要はなく、融合タンパク質の別の要素に直接連結されてよい。これは、標的指向性ドメインが切断可能なリンカーで結合されている場合に特に当てはまる。
【０００７】
一態様では、サイトカインポリペプチド、またはその機能的断片もしくは変異タンパク質、及び遮断部分、例えば、立体遮断ドメイン等を含む融合ポリペプチドが提供される。遮断部分は、直接またはリンカーを介してサイトカインポリペプチドに融合され、融合部位もしくはリンカーまたは遮断部分内あるいはそれらの近傍での融合ポリペプチドの切断（例えば、プロテアーゼの媒介による切断）によってサイトカインポリペプチドから分離させることができる。例えば、サイトカインポリペプチドが、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーを介して遮断部分に融合される場合、サイトカインポリペプチドは、プロテアーゼの媒介によるリンカーの切断時に遮断部分から遊離し、その受容体と結合することができる。リンカーは、所望のサイトカイン活性の部位、例えば、腫瘍微小環境内等にて切断され、オフターゲットのサイトカイン活性を回避し、サイトカイン療法の全体的な毒性を低減するよう設計される。
【０００８】
遮断部分は、血清中半減期延長要素としても機能することができる。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドはさらに、別々の血清中半減期延長要素を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドはさらに、標的指向性ドメインを含む。様々な実施形態では、血清中半減期延長要素は、任意選択で分岐もしくはマルチアーム型のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、完全長ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＦｃＲｎに対する結合性を維持する断片、Ｆｃ断片、あるいはＦｃＲｎに直接結合するかもしくはヒト血清アルブミンに結合するナノボディ等の水溶性ポリペプチドである。
【０００９】
血清中半減期延長要素に加えて、本明細書に記載する医薬組成物は、好ましくは、１つ以上の標的抗原または単一標的抗原上の１つ以上の領域に結合する、少なくとも１つ、もしくはそれ以上の標的指向性ドメインを含む。本明細書では、本発明のポリペプチド構成体は、例えば、対象の疾患特異的微小環境内または血液中でプロテアーゼ切断部位にて切断されること、及び標的指向性ドメイン（複数可）は標的細胞上の標的抗原に結合することが企図される。少なくとも１つの標的抗原が疾患、障害もしくは状態に関与し、及び／または関連している。例示的標的抗原には、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病または宿主対移植片病に関連するものが含まれる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、標的抗原は、タンパク質、脂質または多糖等の細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷した赤血球、動脈プラーク細胞、または線維性組織細胞上にある。
【００１１】
標的抗原は、場合によっては、罹患した細胞または組織、例えば、腫瘍またはがん細胞の表面に発現されている。腫瘍の標的抗原としては、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰａ）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ２）、フィブロネクチンＥＤＢ（ＥＤＢ−ＦＮ）、フィブロネクチンＥＩＩＩＢドメイン、ＣＧＳ−２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃ−Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、ＦＡＰ、及びＣＥＡが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される医薬組成物には、罹患した細胞または組織上で発現されることが知られている２つの異なる標的抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを含むタンパク質も含まれる。抗原結合ドメインの例示的な対としては、ＥＧＦＲ／ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ、及びＨＥＲ−２／ＨＥＲ−３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、独立して、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、または標的抗原に特異的に結合するリガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１のうちの少なくとも１つから選択される腫瘍抗原に特異的かつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、２つの異なる抗原に特異的かつ独立して結合し、抗原のうちの少なくとも１つは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１から選択される腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、保持ドメインとして機能し、切断不可能なリンカーを介してサイトカインに結合されている。
【００１３】
本明細書に記載されるように、サイトカイン遮断部分は、サイトカインに結合し、それによりサイトカインの同族受容体の活性化を遮断することができる。
【００１４】
本開示はまた、本明細書に記載される、条件付きで活性なタンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ等、ならびにそのような核酸を含有するベクター及び宿主細胞にも関する。
【００１５】
本開示はまた、条件付きで活性なタンパク質を含有する医薬組成物、条件付きで活性なタンパク質をコードする核酸、及びそのような核酸を含有するベクター及び宿主細胞にも関する。典型的には、医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体及び／または添加物を含有する。
【００１６】
本開示はまた、前述のうちのいずれかの、条件付きで活性なタンパク質、条件付きで活性なタンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含有するベクターまたは宿主細胞、及び医薬組成物を有効量にて、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法にも関する。典型的には、対象は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病もしくは宿主対移植片病を有するか、または発症するリスクがある。
【００１７】
本開示はまた、前述のうちのいずれかの、条件付きで活性なタンパク質、条件付きで活性なタンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含有するベクターまたは宿主細胞、及び医薬組成物の、それを必要とする対象を治療するための使用にも関する。典型的には、対象は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病もしくは宿主対移植片病を有するか、または発症するリスクがある。
【００１８】
本開示はまた、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病または宿主対移植片病等の疾患を治療するための医薬品の製造のための、条件付きで活性なタンパク質、条件付きで活性なタンパク質をコードする核酸、そのような核酸を含有するベクターもしくは宿主細胞の使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】プロテアーゼにより活性化される、遮断部分を含むサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。遮断部分は、任意選択で、血清中半減期延長ドメインとして機能し得る。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断して遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。
【図１−２】ＨＳＡ（遮断部分）が目的のサイトカインまたはケモカインに直接結合され、プロテアーゼ切断部位は、ＨＳＡと目的のサイトカインまたはケモカインとの間にある、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断して遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。
【図１−３】２つ以上のＨＳＡ（遮断部分）が目的分子に直接結合されている、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。所望される場合、ＨＳＡのうち１つ以上を、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカー等のリンカーを介してサイトカインまたはケモカインに結合させることができる。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断して遮断部分を遊離させ、サイトカインが受容体と結合するのを可能にすることを示す図である。サイトカインはここで天然サイトカインと比較して同様のｐＫ特性を有する（例えば、半減期が短い）。
【図１−４】同じ種類または異なる種類の２つ以上のサイトカインを含む、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図であり、その各々が、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して結合ドメインに結合されている。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断して遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。
【図２】少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能リンカーにより接続されている、サイトカインまたはケモカインポリペプチド、遮断部分、及び血清中半減期延長ドメインを含む、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。サイトカインはまた、血清中半減期を延長する別個の半減期延長要素にも結合されている。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼがリンカー上のプロテアーゼ切断部位で切断し、そのため、血清中半減期延長要素及び遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。サイトカインはここで天然サイトカインと比較して同様のｐＫ特性を有する（例えば、半減期が短い）。
【図３】少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能リンカーにより接続されている、サイトカインまたはケモカインポリペプチド、遮断部分、及び標的指向性ドメインを含む、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して遮断部分及び標的指向性ドメインに接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の微小環境では、プロテアーゼが、リンカー内のプロテアーゼ切断部位で切断して標的指向性ドメイン及び遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。
【図４−１】少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能リンカーにより接続されている、サイトカインまたはケモカインポリペプチド、遮断部分、標的指向性ドメイン、及び血清中半減期延長ドメインを含み、サイトカインポリペプチドと標的指向性ドメインとがプロテアーゼ切断可能リンカーにより接続されている、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。矢印の左側は、サイトカインポリペプチドが、プロテアーゼ切断可能リンカー（複数可）を介して標的指向性ドメイン、遮断部分、及び半減期延長要素に接続されており、そのため、サイトカインポリペプチドがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼが、リンカー（複数可）上のプロテアーゼ切断部位で切断して半減期延長要素、標的指向性ドメイン、及び遮断部分を遊離させ、サイトカインがその受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。サイトカインはここで天然サイトカインと比較して同様のｐＫ特性を有する（例えば、半減期が短い）。
【図４−２】少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能リンカーにより接続されている、サイトカインまたはケモカインポリペプチド、遮断部分、標的指向性ドメイン、及び血清中半減期延長ドメインを含む、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。矢印の左側は、サイトカインが、プロテアーゼ切断可能リンカー（複数可）を介して標的指向性ドメイン、遮断部分、及び半減期延長要素に接続されており、そのため、サイトカインがその受容体に結合する能力が遮断されていることを示す図である。矢印の右側は、炎症性または腫瘍の環境では、プロテアーゼが、リンカー（複数可）上のプロテアーゼ切断部位で切断して半減期延長要素及び遮断部分を遊離させ、サイトカインが受容体に結合するのを可能にすることを示す図である。標的指向性部分は結合されたまま残り、サイトカインを腫瘍微小環境内に維持する。サイトカインはここで天然サイトカインと比較して同様のｐＫ特性を有する（例えば、半減期が短い）。
【図５】免疫グロブリン分子の可変ドメインの構造を示す概略図である。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインは、３つの超可変ループ、または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。Ｖドメインの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）がベータバレルの一端でクラスターを形成する。ＣＤＲは、免疫グロブリンフォールドのベータ鎖Ｂ−Ｃ、Ｃ’−Ｃ”、及びＦ−Ｇをつなぐループであるが、免疫グロブリンフォールドのベータ鎖ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”−Ｄ及びＥ−Ｆをつなぐ下部ループ、ならびに免疫グロブリンフォールドのＤ−Ｅ鎖をつなぐ上部ループは非ＣＤＲループである。
【図６】サイトカインまたはケモカインポリペプチド、血清アルブミン結合ドメイン（例えば、ｄＡｂ）である遮断部分、及びプロテアーゼ切断可能リンカーを含む、プロテアーゼにより活性化されるサイトカインまたはケモカインを示す概略図である。図示の例では、血清アルブミン結合ドメイン（例えば、ｓｄＡｂ）内の非ＣＤＲループはサイトカインＩＬ−２に対する結合部位を形成することができる。この例では、血清アルブミンの結合部位は血清アルブミン結合ドメインのＣＤＲにより形成することができる。
【図７−１】図７ａ〜図７ｈは、ＩＬ−２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ−２における例示的ＩＬ−２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、発光量に基づく細胞生存性アッセイであるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量したＩＬ−２増殖アッセイの結果を示す。各増殖アッセイは、ＨＳＡ（図７ｂ、図７ｄ、図７ｆ、図７ｈ）を用いて、または用いずに（図７ａ、図７ｃ、図７ｅ、図７ｇ）実施された。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合体を含み、融合タンパク質の非切断型及びＭＭＰ９プロテアーゼによる切断型の両方を各アッセイで使用した。
【図７−２】図７ａ〜図７ｈは、ＩＬ−２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ−２における例示的ＩＬ−２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、発光量に基づく細胞生存性アッセイであるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量したＩＬ−２増殖アッセイの結果を示す。各増殖アッセイは、ＨＳＡ（図７ｂ、図７ｄ、図７ｆ、図７ｈ）を用いて、または用いずに（図７ａ、図７ｃ、図７ｅ、図７ｇ）実施された。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合体を含み、融合タンパク質の非切断型及びＭＭＰ９プロテアーゼによる切断型の両方を各アッセイで使用した。
【図８】図８ａ〜図８ｆは、ＩＬ−２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ−２における例示的ＩＬ−２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、発光量に基づく細胞生存性アッセイであるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量したＩＬ−２増殖アッセイの結果を示す。融合タンパク質の非切断型及びＭＭＰ９プロテアーゼによる切断型の両方を各アッセイで使用した。
【図９−１】図９ａ〜図９ｚは、ＩＬ−２依存性細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株ＣＴＬＬ−２における例示的ＩＬ−２融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各グラフは、発光量に基づく細胞生存性アッセイであるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量したＩＬ−２増殖アッセイの結果を示す。融合タンパク質の非切断型及びＭＭＰ９プロテアーゼによる切断型の両方を各アッセイで使用した。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【図９−４】同上。
【図９−５】同上。
【図９−６】同上。
【図１０】タンパク質切断アッセイの結果を示す。融合タンパク質ＡＣＰ１６を切断形態及び非切断形態の両方でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。ゲルに示されるように、切断は完了した。
【図１１】図１１ａ及び図１１ｂは、プロテアーゼによる切断の前後にヒトｐ４０／マウスｐ３５  ＩＬ１２融合タンパク質で実施したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−１２レポーターアッセイから得た結果を示すグラフである。試薬ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（登録商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。結果から、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質は活性であることが確認される。
【図１２−１】図１２ａ〜図１２ｆは、ＭＭＰ９による切断の前後の、４つのＩＬ−１２融合タンパク質のＨＥＫ−ｂｌｕｅアッセイの結果を示す一連のグラフを示す。試薬ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。データは、完全融合タンパク質よりも切断型ＩＬ１２において活性が大きいことを示す。被験構成体は、ＡＣＰ０６（図１２ａ）、ＡＣＰ０７（図１２ｃ）、ＡＣＰ０８（図１２ｂ）、ＡＣＰ０９（図１２ｄ）、ＡＣＰ１０（図１２ｅ）、ＡＣＰ１１（図１２ｆ）であった。
【図１２−２】図１２ａ〜図１２ｆは、ＭＭＰ９による切断の前後の、４つのＩＬ−１２融合タンパク質のＨＥＫ−ｂｌｕｅアッセイの結果を示す一連のグラフを示す。試薬ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。データは、完全融合タンパク質よりも切断型ＩＬ１２において活性が大きいことを示す。被験構成体は、ＡＣＰ０６（図１２ａ）、ＡＣＰ０７（図１２ｃ）、ＡＣＰ０８（図１２ｂ）、ＡＣＰ０９（図１２ｄ）、ＡＣＰ１０（図１２ｅ）、ＡＣＰ１１（図１２ｆ）であった。
【図１３】タンパク質切断アッセイの結果を示す。融合タンパク質ＡＣＰ１１を切断形態及び非切断形態の両方でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。ゲルに示されるように、切断は完了した。
【図１４】誘導性サイトカインタンパク質の非限定的な例を示す概略図であり、構成体は、サイトカインの２つのサブユニット間に結合されたリンカーのプロテアーゼによる切断時に活性化される。
【図１５】図１５ａ〜図１５ｄは、プロテアーゼによる切断の前後にヒトｐ４０／マウスｐ３５  ＩＬ１２融合タンパク質で実施したＨＥＫ−Ｂｌｕｅアッセイから得た結果を示すグラフである。アッセイを実施した。結果から、ＩＬ１２タンパク質融合タンパク質は活性であることが確認される。各増殖アッセイは、ＨＳＡを用いて、またはＨＳＡを用いずに実施された。
【図１６】図１６ａ〜図１６ｆは、ＷＥＨＩ２７９細胞生存アッセイを使用した、マウスＩＦＮγ対照の活性と比較した例示的ＩＦＮγ融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各アッセイは、ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）かまたはＨＳＡを含有しない（−ＨＳＡ）培地を用いて実施された。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合体を含み、融合タンパク質の非切断型及びＭＭＰ９プロテアーゼによる切断型の両方を各アッセイで使用した。
【図１７】図１７ａ〜図１７ｆは、Ｂ１６レポーターアッセイを使用した、マウスＩＦＮγ対照の活性と比較した例示的ＩＦＮγ融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。各アッセイは、ＨＳＡを含有する（＋ＨＳＡ）かまたはＨＳＡを含有しない（−ＨＳＡ）培地を用いて実施された。各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合体を含み、融合タンパク質の非切断型及びＭＭＰ９プロテアーゼによる切断型の両方を各アッセイで使用した。
【図１８】図１８ａ及び図１８ｂは、実施例２に記載のタンパク質切断アッセイの結果を示す。２つの構成体であるＡＣＰ３１（ＩＦＮ−ａ融合タンパク質；図１８ａ）及びＡＣＰ５５（ＩＦＮ−ｇ融合タンパク質；図１８ｂ）を、切断形態及び非切断形態の両方でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。ゲルに示されるように、切断は完了した。
【図１９】図１９ａ及び図１９ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを使用した、プロテアーゼによる切断前後の例示的ＩＦＮγ融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである（図１９ａ及び図１９ｂ）。各アッセイは、ＨＳＡを含有する培地を用いて実施され、各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合体を含む。融合タンパク質の非切断型及びＭＭＰ９プロテアーゼによる切断型の両方を各アッセイで使用した。
【図２０】図２０ａ及び図２０ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを使用した、切断前後の例示的ＩＦＮａ融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである（２０ａ及び２０ｂ）。各アッセイはＨＳＡを含有する培地を用いて実施され、各融合タンパク質は抗ＨＳＡ結合体を含む。融合タンパク質の非切断型及びＭＭＰ９プロテアーゼによる切断型の両方を各アッセイで使用した。
【図２１】図２１ａ〜図２１ｄは、ＭＣ３８細胞株を使用した腫瘍増殖試験の結果を示す一連のグラフである。図２１ａ〜図２１ｃは、ＩＦＮγ及びＩＦＮγ融合タンパク質を、異なる投与レベル及びスケジュールを使用して腹腔内に（ＩＰ）注射した場合の腫瘍増殖に対する効果を示す（ｕｇ＝マイクログラム、ＢＩＤ＝１日２回、ＢＩＷ＝週２回、ＱＷ＝週１回）。図２１ｄは、ＩＦＮγ及びＩＬ−２の腫瘍内（ＩＴ）注射の腫瘍増殖に対する効果を示す。
【図２２】図２２ａ及び図２２ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを使用した、ＭＭＰ９プロテアーゼにより切断された例示的ＩＦＮγ融合タンパク質（ＡＣＰ５１及びＡＣＰ５２）の活性と非切断型融合タンパク質の活性との比較を示す一連のグラフである。各融合タンパク質は、抗ＨＳＡ結合体及び腫瘍指向性ドメインを含む。
【図２３】図２３ａ及び図２３ｂは、Ｂ１６レポーターアッセイを使用した、ＭＭＰ９プロテアーゼにより切断された例示的ＩＦＮγ融合タンパク質（ＡＣＰ５３及びＡＣＰ５４）の活性と非切断型融合タンパク質の活性との比較を示す一連のグラフである。各融合タンパク質は、アルブミンに直接融合されたＩＦＮγを含む。
【図２４−１】図２４ａ〜図２４ｄは、ＩＬ−２融合タンパク質及び組換え型ヒトＩＬ２（Ｒｅｃ  ｈＩＬ−２）で実施したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−２レポーターアッセイから得られた結果を示すグラフである。試薬ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量に基づいて分析を実施した。
【図２４−２】同上。
【図２４−３】同上。
【図２４−４】同上。
【図２５−１】図２５ａ及び図２５ｂは、ＨＳＡ存在下でのＨＥＫＢｌｕｅ  ＩＬ−２レポーターアッセイにおけるＡＣＰ１６（図２５ａ）及びＡＣＰ１２４（図２５ｂ）の分析を示す２つのグラフである。円は未切断ポリペプチドの活性を示し、四角は切断ポリペプチドの活性を示す。図２５ｃは、ＣＴＬＬ−２増殖アッセイの結果を示すグラフである。ＣＴＬＬ２細胞（ＡＴＣＣ）を、４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培地中に５００，０００細胞／ウェルの濃度にて懸濁播種し、活性化可能なｈＩＬ２の希釈系列を用いて３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なＡＣＰ１６の活性を試験した。活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって作製した切断型の活性化可能なｈＩＬ２を、発光量に基づく細胞生存性アッセイＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞活性を評価した。円は無傷の融合タンパク質を示し、四角はプロテアーゼにより切断された融合タンパク質を示す。
【図２５−２】同上。
【図２６−１】ＨＥＫＢｌｕｅ  ＩＬ−１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図２６ａは、ＡＣＰ１１（ヒトｐ４０／マウスｐ３５  ＩＬ１２融合タンパク質）とＡＣＰ０４（陰性対照）との比較におけるＩＬ−１２／ＳＴＡＴ４の活性化を示す。
【図２６−２】ＨＥＫＢｌｕｅ  ＩＬ−１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図２６ｂは、ＡＣＰ９１（キメラＩＬ−１２融合タンパク質）の分析を示すグラフである。四角は未切断ＡＣＰ９１ポリペプチドの活性を示し、三角は切断ポリペプチド（ＡＣＰ９１＋ＭＭＰ９）の活性を示す。各々のＥＣ５０値を表に示す。
【図２６−３】ＨＥＫＢｌｕｅ  ＩＬ−１２レポーターアッセイにおける融合タンパク質の活性を示す一連のグラフである。図２６ｃは、ＡＣＰ１３６（キメラＩＬ−１２融合タンパク質）の分析を示すグラフである。四角は未切断ＡＣＰ１３６ポリペプチドの活性を示し、三角は切断ポリペプチド（ＡＣＰ１３６＋ＭＭＰ９）の活性を示す。各々のＥＣ５０値を挿入表に示す。
【図２７−１】図２７ａ〜図２７ｆは、ＨＥＫＢｌｕｅレポーターアッセイにおいて、切断されたＩＦＮα１ポリペプチドＡＣＰ３１（図２７ａ）、ＡＣＰ１２５（図２７ｂ）、ＡＣＰ１２６（図２７ｃ）は活性であることを示す一連のグラフである。各ＩＦＮα構成体のＥＣ５０値を各グラフ下の表に示す。
【図２７−２】同上。
【図２７−３】同上。
【図２８−１】図２８ａ〜図２８ｎは、Ｂ１６  ＩＦＮαレポーターアッセイにおける、ＡＰＣ５６（図２８ａ）、ＡＰＣ５７（図２８ｂ）ＡＰＣ５８（図２８ｃ）、ＡＰＣ５９（図２８ｄ）、ＡＰＣ６０（図２８ｅ）、ＡＰＣ６１＋ＨＳＡ（図２８ｆ）、ＡＣＰ３０＋ＨＳＡ（図２８ｇ）、ＡＣＰ７３（図２８ｈ）、ＡＣＰ７０＋ＨＳＡ（図２８ｉ）、ＡＣＰ７１（図２８ｊ）、ＡＣＯ７２（図２８ｋ）、ＡＣＰ７３（図２８ｌ）、ＡＣＰ７４（図２８ｍ）、及びＡＣＰ７５（図２８ｎ）の活性を示す一連のグラフである。各融合を、切断（四角）した場合と未切断（丸）の場合のその活性について試験した。マウスＩＦＮγの分析を比較対照として各グラフに含めた。
【図２８−２】同上。
【図２８−３】同上。
【図２８−４】同上。
【図２８−５】同上。
【図２８−６】同上。
【図２８−７】同上。
【図２８−８】同上。
【図２８−９】同上。
【図２８−１０】同上。
【図２８−１１】同上。
【図２８−１２】同上。
【図２９−１】腫瘍異種移植モデルにおけるＡＣＰ３１（マウスＩＦＮα１融合タンパク質）を分析した結果を示すグラフである。図２９ａは、３３μｇのＡＣＰ３１（丸）、１１０μｇのＡＣＰ３１（三角）、３３０μｇのＡＣＰ３１（菱形）、及び対照としての１μｇのマウス野生型ＩＦＮａ１（破線、四角）及び１０μｇのｍＩＦＮａ１（破線、小さい丸）で処置したマウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。ビヒクル単体は大きい白丸で示される。データは、ＡＣＰ３１で処置したマウスにおいて腫瘍体積が用量依存的に経時的に減少することを示す。
【図２９−２】腫瘍異種移植モデルにおけるＡＣＰ１１（ヒトｐ４０／マウスｐ３５  ＩＬ１２融合タンパク質）を分析した結果を示すグラフである。図２９ｂは、１７．５μｇのＡＣＰ１１（四角）、１７５μｇのＡＣＰ３１（三角）、５２５μｇのＡＣＰ３１（丸）、及び対照としての２μｇのＡＣＰ０４（破線、三角）及び１０μｇのＡＣＰ０４（破線、菱形）で処置したマウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。ビヒクル単体は大きい白丸で示される。データは、ＡＣＰ１１及びＡＣＰ０４（ヒトｐ４０／マウスｐ３５  ＩＬ１２融合タンパク質）で処置したいずれのマウスにおいても腫瘍体積が用量依存的に経時的に減少することを示す。
【図３０】図３０ａ〜図３０ｆは、ビヒクル単体（図３０ａ）、２μｇのＡＣＰ０４（図３０ｂ）、１０μｇのＡＣＰ０４（図３０ｃ）、１７．５μｇのＡＣＰ１１（図３０ｄ）、１７５μｇのＡＣＰ１１（図３０ｅ）、及び５２５μｇＡＣＰ１１（図３０ｆ）で処置した各マウスのマウス異種移植腫瘍モデルにおける経時的な腫瘍体積を示す一連のスパゲッティプロットである。各線は１匹のマウスを表す。
【図３１−１】腫瘍異種移植モデルにおいてＡＣＰ１６を分析した結果を示すグラフである。図３１ａは、４．４μｇのＡＣＰ１６（四角）、１７μｇのＡＣＰ１６（三角）、７０μｇのＡＣＰ１６（逆三角）、２３２μｇのＡＣＰ１６（黒丸）、ならびに比較対照としての１２μｇの野生型ＩＬ−２（破線、三角）及び３６μｇの野生型ＩＬ−２（破線、菱形）で処置したマウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。ビヒクル単体は大きい白丸で示される。データは、高濃度のＡＣＰ１６で処置したマウスにおいて腫瘍体積が用量依存的に経時的に減少することを示す。
【図３１−２】腫瘍異種移植モデルにおいてＡＣＰ１２４を分析した結果を示すグラフである。図３１ｂは、１７μｇのＡＣＰ１２４（四角）、７０μｇのＡＣＰ１２４（三角）、２３０μｇのＡＣＰ１２４（逆三角）、及び７００μｇのＡＣＰ１２４で処置したマウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。ビヒクル単体は大きい白丸で示される。
【図３１−３】腫瘍異種移植モデルにおいてＡＣＰ１６、ＡＣＰ１２４を分析した結果を示すグラフである。１７μｇのＡＣＰ１６（三角）、７０μｇのＡＣＰ１６（丸）、２３２μｇのＡＣＰ１６（黒丸）、ならびに比較対照としての１７μｇのＡＣＰ１２４（破線、三角）７０μｇのＡＣＰ１２４（破線、菱形）、２３０μｇのＡＣＰ１２４（破線、菱形）で処置したマウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。ビヒクル単体は逆黒三角で示される。データは、ＡＣＰ１６で処置したマウスでは腫瘍体積が用量依存的に経時的に減少するが、ＡＣＰ１２４ではそのような減少がないことを示す。
【図３２−１】図３２ａ〜図３２ｃは、図３１に示すデータに対応する、ＭＣ３８マウス異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のスパゲッティプロットである。プロットの各線は１匹のマウスである。
【図３２−２】同上。
【図３２−３】同上。
【図３３】対照マウス（白丸）及びＡＰ１６処置マウス（四角）における腫瘍増殖を示すマウス異種移植モデルでの経時的な腫瘍体積を示すグラフである。
【図３４−１】切断可能な融合タンパク質による処置後のマウスの経時的な生存を示す一連の生存プロットである。図３４ａは、ビヒクル単体（灰色の線）、１７μｇのＡＣＰ１６（暗線）、及び１μｇのＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示す。
【図３４−２】切断可能な融合タンパク質による処置後のマウスの経時的な生存を示す一連の生存プロットである。図３４ｂは、ビヒクル単体（灰色の線）、７０μｇのＡＣＰ１６（暗線）、及び７０μｇのＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示す。
【図３４−３】切断可能な融合タンパク質による処置後のマウスの経時的な生存を示す一連の生存プロットである。図３４ｃは、ビヒクル単体（灰色の線）、２３２μｇのＡＣＰ１６（暗線）、及び２３０μｇのＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示す。
【図３４−４】切断可能な融合タンパク質による処置後のマウスの経時的な生存を示す一連の生存プロットである。図３４ｄは、ビヒクル単体（灰色の線）、２３２μｇのＡＣＰ１６（暗線）、及び７００μｇのＡＣＰ１２４（破線）で処置したマウスのデータを示す。
【図３５】ＭＣ３８マウス異種移植モデルにおける融合タンパク質の活性を示す一連のスパゲッティプロットである。１週間／２回投与の後に致死的毒性が検出されたＡＰＣ１３２の３つの最高用量を除いては、マウス全群に合計４回の投与を行った。図には、ビヒクル単体（上段）、１７μｇ、５５μｇ、７０μｇ、及び２３０μｇのＡＣＰ１６（上段全列）、９μｇ、２８μｇ、３６μｇ、及び１１９μｇのＡＣＰ１３２（中段全列）、及び１３μｇ、４２μｇ、５４μｇ、及び１７７μｇのＡＣＰ２１（下段全列）が示されている。プロットの各線は個々の動物を表す。
【図３６】プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴＡＣポリペプチドの特性を示す。
【図３７】プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴＡＣポリペプチドの特性を示す。
【図３８】プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴＡＣポリペプチドの特性を示す。
【図３９】プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴＡＣポリペプチドの特性を示す。
【図４０】プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴＡＣポリペプチドの特性を示す。
【図４１】プロテアーゼで切断可能な融合タンパク質の例示として使用するＴｒｉＴＡＣポリペプチドの特性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書では、誘導性サイトカインを含む構成体を操作し使用するための方法及び組成物を開示する。サイトカインは強力な免疫アゴニストであり、そのため、サイトカインが腫瘍学の有望な治療剤とみなされるようになる。しかしながら、サイトカインは治療域が非常に狭いことが証明された。サイトカインは血清中半減期が短く、また極めて強力であると考えられている。結果として、サイトカインの治療的投与により望ましくない全身性の作用及び毒性が生じる。これらは、サイトカイン作用が意図される部位（例えば、腫瘍）で所望のサイトカインレベルを達成するために大量のサイトカインを投与する必要性により悪化した。残念なことに、サイトカインの生物学、及びそれらの活性を効果的に標的とし、制御できないために、サイトカインでは、腫瘍の治療において期待される臨床的利点は達成されなかった。
【００２１】
本明細書では、腫瘍学におけるサイトカインの臨床用途を厳しく制限していた毒性及び短い半減期という問題を克服する融合タンパク質を開示する。融合タンパク質は、受容体アゴニスト活性を有するサイトカインポリペプチドを含有する。しかし、融合タンパク質との関連においては、サイトカイン受容体アゴニスト活性は減弱され、循環血中半減期は延長される。融合タンパク質にはプロテアーゼ切断部位が含まれ、これらは、サイトカイン活性の所望の部位（例えば、腫瘍）に関連するプロテアーゼによって切断され、所望の活性の部位において典型的には濃縮されるかまたは選択的に存在する。したがって、融合タンパク質は、優先的（または選択的）かつ効率的に活性の所望の部位で切断して、サイトカイン活性を活性の所望の部位、例えば、腫瘍微小環境等に実質的に制限する。腫瘍微小環境内等、活性の所望の部位でのプロテアーゼによる切断により、融合タンパク質よりもサイトカイン受容体アゴニストとしてはるかに活性な（典型的には融合タンパク質よりも少なくとも約１００倍活性である）融合タンパク質から、ある形態のサイトカインを遊離させる。融合タンパク質の切断時に遊離するサイトカインの形態は典型的には半減期が短く、天然に存在するサイトカインの半減期と実質的に同様であることが多く、サイトカイン活性を腫瘍微小環境にさらに制限する。融合タンパク質の半減期は延長されるが、循環融合タンパク質は減弱されており、活性サイトカインが腫瘍微小環境に指向されるため、毒性は劇的に低減または排除される。本明細書に記載される融合タンパク質は、初めて、サイトカインの活性を実質的に腫瘍微小環境に制限し、サイトカインの望ましくない全身性の作用及び毒性を劇的に低減または排除する、腫瘍を治療する有効治療量のサイトカインの投与を可能にする。
【００２２】
特別に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語、表記法及び他の科学用語はいずれも、本発明が関連する当業者により共通して理解される意味を持つことが意図される。場合によっては、共通して理解される意味を持つ用語は、分かりやすくするため、及び／またはすぐに参照できるようにするために本明細書で定義され、そのような定義を本明細書に含めることは、必ずしも当該技術分野で一般に理解されるものとの相違を表すものではないと解釈されるべきである。本明細書で記載または参照される技術及び手順は、一般によく理解されており、当業者による従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．（２０１２）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている、広く利用されている分子クローニング方法論等を使用して一般的に使用される。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順は一般に、特に断りのない限り、製造者が定義するプロトコル及び条件に従って行われる。
【００２３】
「サイトカイン」は、特に免疫系の細胞によって分泌され、免疫系の調節因子である一群の免疫調節タンパク質（インターロイキンまたはインターフェロン等）のいずれかを指す周知の技術用語である。本明細書に開示される融合タンパク質で使用できるサイトカインポリペプチドとしては、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）等のトランスフォーミング増殖因子；インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−カッパ及びインターフェロン−オメガ等のインターフェロン；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１及びＩＬ−２５等のインターロイキン；腫瘍壊死因子アルファ及びリンホトキシン等の腫瘍壊死因子；ケモカイン（例えば、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ）、ならびにサイトカインの同族受容体を活性化するようなポリペプチドの断片（すなわち、前述のものの機能的断片）が挙げられるが、これらに限定されない。「ケモカイン」は、応答性細胞近傍へ向けられる走化性を誘導する能力のある小さなサイトカインのファミリーのいずれかを指す技術用語である。
【００２４】
サイトカインは血清中半減期が短く、わずか数分または数時間である場合が多いことが周知である。血清中半減期を延長することを意図した改変アミノ酸配列を有するが受容体アゴニスト活性は保持するサイトカインの形態でさえも、典型的には血清中半減期が短い。本明細書で使用する場合、「半減期が短いサイトカイン」とは、対象の血清中を循環する半減期が実質的に短時間である、例えば、血清中半減期が１０分未満、１５分未満、３０分未満、６０分未満、９０分未満、１２０分未満、２４０分未満、または４８０分未満であるサイトカインを指す。本明細書で使用する場合、半減期の短いサイトカインには、対象の体内で通常よりも長い半減期を達成するように、その配列が修飾されていないサイトカイン、及び血清中半減期を延長することを意図した改変アミノ酸配列を有するが、受容体アゴニスト活性は保持するポリペプチドが含まれる。この後者の場合、異種タンパク質ドメイン、例えば、真正な半減期延長要素、例えば、血清アルブミン等の付加を含めることを意図しない。
【００２５】
「ソルターゼ」は、標的とするタンパク質もしくはペプチドに包埋されているかまたはその末端に結合しているカルボキシル末端の局在化シグナルを認識して切断することによってタンパク質を修飾するペプチド転移酵素である。ソルターゼＡは、標的タンパク質上のＴｈｒ残基とＧｌｙ残基の間のＬＰＸＴＧモチーフ（Ｘは、任意の標準アミノ酸）の切断を触媒し、Ｔｈｒ残基が酵素上の活性部位であるＣｙｓ残基に一過性に結合し、酵素−チオアシル中間体を形成する。ペプチド転移を完了させ、ペプチド−単量体複合体を作るために、Ｎ末端求核基、典型的にはオリゴグリシンモチーフを有する生体分子は中間体を攻撃し、ソルターゼＡを置換して２つの分子を連結する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「立体遮断物質」とは、サイトカインポリペプチドに、例えば、キメラポリペプチド（融合タンパク質）等の形態で、リンカー等の他の部分を介して共有結合で直接または間接的に結合させることができるが、それ以外の場合にはそのサイトカインポリペプチドには共有結合で結合しないポリペプチドまたはポリペプチド部分を指す。立体遮断物質は、サイトカインポリペプチドに非共有結合的に、例えば、静電結合、疎水結合、イオン結合または水素結合を介して結合することができる。立体遮断物質は、典型的には、それがサイトカイン部分に近接していること及び同等のサイズであることによりサイトカイン部分の活性を阻害するかまたは遮断する。立体遮断物質はまた、大きなタンパク質結合パートナーを動員することによっても遮断する場合がある。この一例は、血清アルブミンに結合する抗体であり、抗体自体は、単独で活性化または結合を遮断するのに十分な大きさである場合とそうでない場合があるが、アルブミンの動員により十分な立体遮断が可能になる。
【００２７】
本明細書で使用及び記載される場合、「半減期延長要素」は、例えば、そのサイズ（例えば、腎臓ろ過カットオフ値を上回るよう）、形状、流体力学的半径、電荷を改変するか、または吸収、生体内分布、代謝、及び消失というパラメータを改変することによって、血清中半減期を延長させ、かつｐＫを改善するキメラポリペプチドの一部である。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「活性化可能な」、「活性化する」、「誘導する」、及び「誘導性」とは、タンパク質、すなわち、融合タンパク質の一部であるサイトカインが、融合タンパク質からの追加要素の切断時に自身の受容体と結合して活性を実現する能力を指す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「プラスミド」または「ウイルスベクター」は、開示の核酸を分解されない状態で細胞に輸送し、かつ、送達先の細胞に核酸分子及び／またはポリペプチドの発現をもたらすプロモーターを含む、物質である。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結される２つ以上のアミノ酸を意味するために広く使用される。タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドはまた、本明細書ではアミノ酸配列を指すために同じ意味で使用される。本明細書では、分子を構成するアミノ酸の特定のサイズまたは数を示唆するためにはポリペプチドという用語は使用されないこと、本発明のペプチドは最大で数個からそれ以上のアミノ酸残基を含有することができることを認識されるべきである。
【００３１】
全体を通して使用する場合、「対象」は、脊椎動物、より具体的には、哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット、及びモルモット）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び他の任意の動物であり得る。かかる用語は特定の年齢または性別を意味しない。したがって、雌雄を問わず、成体及び新生の対象が包含されることが意図される。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「患者」または「対象」は、同じ意味で使用されてよく、疾患または障害（例えば、がん）を有する対象を指し得る。患者または対象という用語には、ヒト対象及び獣医学の対象が含まれる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「治療」、「治療する」、または「治療すること」とは、疾患もしくは状態の影響またはその疾患もしくは状態の症状を低減する方法を指す。したがって、開示の方法では、治療は、確立された疾患もしくは状態またはその疾患もしくは状態の症状の重症度における、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または実質的に完全な低減を指し得る。例えば、疾患を治療するための方法は、対象の疾患の１つ以上の症状において、対照と比較して１０％の低減がある場合、治療とみなされる。したがって、低減は、天然または対照でのレベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％〜１００％の間の任意の低減率であり得る。治療は必ずしも疾患、状態、またはその疾患もしくは状態の症状の治癒または完全な除去を指すものではないと理解される。
【００３４】
本明細書で使用する場合、疾患または障害について「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、行為、例えば、対象がその疾患または障害の１つ以上の症状を示し始める前、またはそれとほぼ同時に行われる、キメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列の投与等であって、その疾患もしくは障害の１つ以上の症状の発症または増悪を阻害するかまたは遅らせる行為を指す。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「減少すること」、「低減すること」、または「阻害すること」への言及には、適切な対照のレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはそれより大きい変化が含まれる。そのような用語には、機能または特性、例えば、アゴニスト活性等の完全な消失が含まれ得るが、必ずしも含まれるわけではない。
【００３６】
「減弱されたサイトカイン受容体アゴニスト」は、そのサイトカイン受容体の天然に存在するアゴニストと比較して受容体アゴニスト活性が低下しているサイトカイン受容体アゴニストである。減弱されたサイトカインアゴニストは、その受容体の天然に存在するアゴニストと比較して、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍またはそれより低いアゴニスト活性を有してよい。本明細書に記載のサイトカインポリペプチドを含有する融合タンパク質が「減弱された」または「減弱された活性」を有すると記載されている場合、その融合タンパク質は、減弱されたサイトカイン受容体アゴニストであることを意味する。
【００３７】
「無傷の融合タンパク質」は、例えば、プロテアーゼによる切断等によって除去されているドメインがない融合タンパク質である。ドメインはプロテアーゼによる切断または他の酵素活性によって除去可能であり得るが、融合タンパク質が「無傷」の場合は、これは起こっていない。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「部分」とは、分子の一部分であって、その分子内部で別個の機能を有し、別の分子の状況においてその機能がその部分によって実行され得るものを指す。部分は、特定の機能を有する化学物質であるか、または特定の機能を有する生物学的分子の一部分であってよい。例えば、融合タンパク質内部の「遮断部分」は、融合ポリペプチドの一部またはすべての活性を遮断することができる、融合タンパク質の一部分である。これは、血清アルブミン等のタンパク質ドメインであってよい。遮断は、立体遮断物質または特定の遮断物質によって達成されてよい。立体遮断物質は、特定の結合に基づくのではなくサイズ及び位置によって遮断し、一例は血清アルブミンである。特異的遮断物質は、遮断される部分との特定の相互作用によって遮断する。特定の遮断物質は、特定のサイトカインまたは活性なドメインに合わせて調整する必要があり、立体遮断物質は、それが十分な大きさである限りペイロードに関係なく使用することができる。
【００３９】
一般に、サイトカインの治療的使用は、その全身毒性により強く制限される。例えば、ＴＮＦは当初、それが一部の腫瘍の出血性壊死を誘発する能力、及び様々な腫瘍株に対するインビトロでの細胞毒性作用について発見されたが、その後、強い炎症誘発性活性を有することが証明され、それが過剰産生状態になった場合、危険なほど人体に影響を及ぼす場合がある。全身毒性は、ヒトにおいて薬理学的に活性な量のサイトカインの使用に関連する根本的な問題であるため、このクラスの生物学的エフェクターの治療有効性を維持しつつ、その毒性作用を低減することを目的とした新規の誘導体及び治療的戦略が現在評価中である。
【００４０】
ＩＬ−２は、免疫系において刺激性と調節性の両方の機能を発揮し、共通γ鎖（γｃ）サイトカインファミリーの他のメンバーとともに、免疫恒常性の中心である。ＩＬ−２は、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）に結合することによってその作用を媒介し、かかる受容体は、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）鎖、ＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）鎖、及びＩＬ−２Ｒγ（γｃ、ＣＤ１３２）鎖で構成される三量体の受容体または二量体のβγ  ＩＬ−２Ｒからなる（１、３）。いずれのＩＬ−２Ｒ変異型も、ＩＬ−２結合時にシグナルを伝達することができる。しかしながら、三量体のαβγ  ＩＬ−２Ｒは、ＩＬ−２に対する親和性が二量体のβγ  ＩＬ−２Ｒよりも約１０〜１００倍高く（３）、ＣＤ２５は、ＩＬ−２とその受容体との高親和性結合を付与するがシグナル伝達に不可欠というわけではないことが示唆される。三量体ＩＬ−２Ｒは、活性化Ｔ細胞、及びＣＤ４＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）にみられ、これらは、インビトロ及びインビボにおいてＩＬ−２に感受性である。逆に、抗原を経験した（メモリー）ＣＤ８＋、ＣＤ４４高度メモリー表現型（ＭＰ）ＣＤ８＋、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞には、高レベルの二量体βγ  ＩＬ−２Ｒが与えられており、これらの細胞もまた、インビトロ及びインビボでＩＬ−２に対して激しく応答する。
【００４１】
高親和性ＩＬ−２Ｒの発現は、インビボで一過性に利用可能な低濃度のＩＬ−２にＴ細胞が応答するようにするために重要である。ＩＬ−２Ｒαの発現は、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞には見られないが、抗原活性化後に誘導される。ＩＬ−２Ｒβは、ＮＫ、ＮＫＴ、及びメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞によって構成的に発現されるが、抗原活性化後にナイーブＴ細胞にも誘導される。γｃは、それほど厳密には調節されておらず、すべてのリンパ系細胞によって構成的に発現されている。一旦、抗原によって高親和性ＩＬ−２Ｒが誘導されると、ＩＬ−２Ｒシグナル伝達により、一部、Ｉｌ２ｒａ転写のＳｔａｔ５依存性調節を介してＩＬ−２Ｒαの発現が増加される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。この過程は、ＩＬ−２供給源が残っている状態のまま、高親和性ＩＬ−２Ｒの発現を維持してＩＬ−２シグナル伝達を持続させる機構を表す。
【００４２】
ＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒαによって、極性周辺に囲まれた大きな疎水結合表面を介して捕捉され、迅速なオンオフ結合動態を有する比較的弱い相互作用（Ｋｄ１０−８Ｍ）をもたらす。ただし、ＩＬ−２Ｒα−ＩＬ−２二元複合体はＩＬ−２に非常に小さい立体配座的変化をもたらし、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒβ間の別個の極性相互作用を介したＩＬ−２Ｒβとの会合を促進する。ＩＬ２／α／β三量体複合体の偽高親和性（すなわち、Ｋｄ約３００ｐＭ）は、Ｃｉａｒｄｅｌｌｉのデータで示されるように、三量体複合体は、ＩＬ２がα鎖単体（Ｋｄ＝１０ｎＭ）またはβ鎖単体（Ｋｄ＝４５０ｎＭ）に結合した場合よりも安定であることを明確に示している。いずれにしても、ＩＬ２／α／β三量体はその後、γ鎖を動員してシグナル伝達能のある四元複合体となるが、これは、ＩＬ２と結合したβ鎖上のγ鎖のための大きな複合結合部位によって促進される。
【００４３】
言い換えれば、ＩＬ−２Ｒα−ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ−２三元複合体はその後、ＩＬ−２との弱い相互作用及びＩＬ−２Ｒβとのより強い相互作用を介してγｃを動員し、安定な四元高親和性ＩＬ−２Ｒ（Ｋｄ１０−１１Ｍ、すなわち１０ｐＭ）を生成する。高親和性ＩＬ−２−ＩＬ−２Ｒ四元複合体の形成により、ＩＬ−２Ｒβ及びγｃにそれぞれ関連するチロシンキナーゼＪａｋ１及びＪａｋ３を介したシグナル伝達がもたらされる（Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｒｆｏｒｄ，１９９８）。ＩＬ−２−ＩＬ−２Ｒ四元複合体は迅速に内在化されて、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒβ、及びγｃは急速に分解されるが、ＩＬ−２Ｒαは細胞表面に再利用される（Ｈｅｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｙｕ  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ，２００１）。したがって、持続的なＩＬ−２Ｒシグナル伝達を必要とするそれらの機能活性には、ＩＬ−２Ｒαと会合してさらなるＩＬ−２−ＩＬ−２Ｒシグナル伝達複合体を形成するためにＩＬ−２の継続的供給源を必要とする。
【００４４】
サイトカインの４−アルファ−ヘリックスバンドルファミリーの別のメンバーであるインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）もまた、がん治療のための免疫調節薬として浮上している。ＩＬ−１５は、最初に、抗原提示樹状細胞、単球及びマクロファージ上に発現されるＩＬ−１５Ｒαを介して捕捉される。ＩＬ−１５は広い活性を示し、ＩＬ−１５／ＩＬ−２−Ｒ−β（ＣＤ１２２）及び共通γ鎖（ＣＤ１３２）を介したシグナル伝達によりＴ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の分化及び増殖を誘導する。また、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞溶解活性を増強し、抗原を経験した持続性のＣＤ８＋ＣＤ４４メモリーＴ細胞を誘導する。ＩＬ−１５はＢ細胞による分化及び免疫グロブリン合成を刺激し、樹状細胞の成熟を誘導する。免疫抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は刺激しない。したがって、腫瘍の微小環境においてＩＬ−１５活性を選択的に促進することで、自然免疫及び特異免疫を増強し腫瘍と戦うことができると考えられる（Ｗａｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＩＬ−１５は最初、それが、共通の受容体成分（ＩＬ−２Ｒ／１５Ｒβ−γｃ）を介したＩＬ−２様のＴ細胞増殖及びＪＡＫ１／ＪＡＫ３及びＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ５を介したシグナル伝達を刺激する能力について同定された。ＩＬ−２同様、ＩＬ−１５は、活性化されたＣＤ４−ＣＤ８−、ＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞の増殖を刺激すること、ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導、及びＮＫ細胞の発生、増殖及び活性化を促進することが示されている（Ｗａｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。しかしながら、ＩＬ−２が、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）を発現しているＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を維持することが必要であり、かつ、周辺におけるこれらの細胞の保持に必要とされるのとは異なり、ＩＬ−１５はＴｒｅｇにほとんど影響を与えない（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。これは、ＦＯＸＰ３を発現しているＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴｒｅｇはエフェクターＴ細胞を阻害し、それにより、腫瘍に対して向けられたものを含む免疫応答を阻害することから、重要なことである。ＩＬ−２にはまた、自己反応性Ｔ細胞の排除をもたらす過程である活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）の開始における重要な役割があるが、ＩＬ−１５はＴ細胞の抗アポトーシス因子である（Ｍａｒｋｓ−Ｋｏｎｃｚａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＨＩＶペプチドワクチンとともに共送達されたＩＬ−１５は、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の寿命を促進し、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスを遮断することによってＣＤ４＋Ｔ細胞欠損を克服することが示されている。（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。さらに、ＩＬ−１５は、ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉメモリーＴ細胞の長期維持を促進する（Ｋａｎｅｇａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００４５】
Ｔ細胞及びＮＫ細胞の発達に対するＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαの重要性は、ＩＬ−１５Ｒα−／−及びＩＬ−１５−／−マウスの表現型によってさらに強調される。ノックアウトマウスは総ＣＤ８＋  Ｔ細胞数の減少を示し、メモリー表現型のＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、及び腸上皮内リンパ球の一部のサブセットが欠損しており、これは、ＩＬ−１５が、細胞のこれらのサブセットに対し必須の正の恒常性機能を提供することを示している（Ｌｏｄｏｌｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ノックアウトマウスのこれらの２つの株の表現型における類似性は、生理学的に関連するＩＬ−１５シグナルの維持におけるＩＬ−１５Ｒαの重要性を示唆する。
【００４６】
ＩＬ−１５は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面に提示されるＩＬ−１５Ｒβγｃ複合体に対してＩＬ−１５受容体アルファ鎖によりトランスで提示される（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＩＬ−１５Ｒａ鎖はシャペロンタンパク質の役割を果たし、ＩＬ−１５活性を安定化させ、増加させる（Ｄｅｓｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。外因性ＩＬ−１５は、それが、がん患者で頻繁に減少されるＩＬ−１５Ｒａに依存しているため、がん患者に限定的な影響を与えることが示されている。したがって、リンカーを介してＩＬ−１５に結合されたＩＬ１５Ｒａのｓｕｓｈｉ＋ドメインで構成される融合タンパク質ＲＬＩはＩＬ１５療法の代替的方法として提案されている（Ｂｅｓｓａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。可溶性ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体の投与がインビボでのＩＬ−１５の血清中半減期及び生物学的利用能を大きく増強することがわかった（Ｓｔｏｋｌａｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００４７】
ＩＬ−１５には、Ｔ細胞及びＮＫ細胞に対する作用に加え、免疫系の他の成分に対するいくつかの作用もある。ＩＬ−１５は、好中球をアポトーシスから保護し、食作用を調節し、ＩＬ−８及びＩＬ−１Ｒアンタゴニストの分泌を刺激する。これは、ＪＡＫ２、ｐ３８及びＥＲＫ１／２ＭＡＰＫ、Ｓｙｋキナーゼ及びＮＦ−ｋＢ転写因子の活性化を介して機能する（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。マスト細胞では、ＩＬ−１５は増殖因子及びアポトーシス阻害因子として作用することができる。これらの細胞では、ＩＬ−１５はＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５経路を活性化し、γｃ結合の必要性はない（Ｔａｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＩＬ−１５はまた、Ｂリンパ球の増殖及び分化を誘導し、免疫グロブリンの分泌を増加させる（Ａｒｍｉｔａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。また、Ｆａｓ媒介性アポトーシスを防ぎ、抗体反応の誘導をＣＤ４ヘルプとは独立して部分的に可能にする（Ｄｅｍｅｒｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。単球、マクロファージ及び樹状細胞はＩＬ−１５を効果的に転写及び翻訳する。それらはＩＬ−１５刺激にも応答する。マクロファージは食作用を増加させ、ＩＬ−８、ＩＬ−１２及びＭＣＰ−１の発現を誘導し、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＴＮＦαを分泌することによって応答する（Ｂｕｄａｇｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＩＬ−１５とともにインキュベートした樹状細胞は、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ４０、及びＭＨＣクラスＩＩの発現の増加を伴う成熟を示し、アポトーシスにも耐性であり、インターフェロン−γの分泌増強を示す（Ａｎｇｕｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００４８】
ＩＬ−１５は、筋細胞、脂肪細胞、内皮細胞及び神経細胞等、非血液細胞に対して作用を及ぼすことも示されている。ＩＬ−１５には筋肉に対し同化作用を及ぼし、筋肉細胞の分化を支持する場合がある（Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。筋細胞及び筋線維を刺激して収縮タンパク質を蓄積し、がん関連悪液質のラットの筋肉の消耗を遅らせることができる（Ｆｉｇｕｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＩＬ−１５は、血管新生を刺激し（Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、ミクログリアの成長及び生存を誘導することも示されている（Ｈａｎｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００４９】
同じくＩＬ−２／ＩＬ−１５ファミリーであるインターロイキン−７（ＩＬ−７）は十分に特徴付けられている多面的サイトカインであり、間質細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞及びケラチノサイトにより発現され、活性化後、樹状細胞により発現される（Ａｌｐｄｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。もともとは前駆体のＢリンパ球の成長及び分化の因子として記載されたが、その後の研究では、ＩＬ−７は、Ｔリンパ球の発達及び分化に決定的に関与することが示されている。インターロイキン−７のシグナル伝達は、最適なＣＤ８  Ｔ細胞の機能、恒常性及び記憶の確立に不可欠であり（Ｓｃｈｌｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ほとんどのＴ細胞サブセットの生存に必要とされ、その発現は、Ｔ細胞数の調節に重要であることが提案されている。
【００５０】
ＩＬ−７は、ＩＬ−７Ｒα及びγｃ等二量体受容体に結合して、細胞外基質リモデリング、発達、ならびにＴ細胞及びＢ細胞の恒常性に基本的な役割を果たす三元複合体を形成する（Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｄｕｒｕｍ，２００７）。ＩＬ−７Ｒαはまた、交差反応して胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）及びその受容体（ＴＳＬＰＲ）と三元複合体を形成してＴＳＬＰ経路を活性化し、ヒトでのＴ細胞及び樹状細胞の増殖及びマウスでのＢ細胞のさらなる発達をもたらす（Ｌｅｏｎａｒｄ，２００２）。したがって、複合体によって活性化されたシグナル伝達カスケードの厳密な調節は、正常な細胞機能には不可欠である。ＩＬ−７Ｒα細胞外ドメインでの変異により生じたＩＬ−７経路の過少刺激は、Ｔ細胞及びＢ細胞の発達を阻害し、患者は重度複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）という形態になる（Ｇｉｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｐｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【００５１】
ＩＬ−７には、細胞傷害性化学療法後のがん患者の免疫再構築を強化する際に潜在的役割がある。ＩＬ−７療法は免疫再構築を強化し、たとえ数は少なくとも胸腺移出Ｔ細胞の末梢拡張を促進することによって、限られた胸腺機能であっても増強することができる。したがって、ＩＬ−７療法は、細胞傷害性化学療法によって免疫除去された患者の免疫系を修復できる可能性が高いと考えられる（Ｃａｐｉｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００５２】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、別々にコードされた２つのサブユニット（ｐ３５及びｐ４０）のジスルフィド結合ヘテロ二量体であり、それらは、共有結合で連結されていわゆる生物活性ヘテロ二量体の（ｐ７０）分子を生じさせる（Ｌｉｅｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｊａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ヘテロ二量体（ＩＬ−１２及びＩＬ−２３）の形成とは別に、ｐ４０サブユニットはまた、単量体（ｐ４０）として、及びホモ二量体（ｐ４０２）としても分泌される。ｐ３５をｐ４０サブユニットに接続するリンカーを用いた一本鎖としてのヘテロ二量体の合成により、ヘテロ二量体の完全な生物学的活性が保存されることは当該技術分野で公知である。ＩＬ−１２は、感染に対する初期炎症反応、及び細胞性免疫に有利なＴｈ１細胞の発生において重要な役割を果たす。ＩＬ−１２の過剰産生は、それが、いくつかの自己免疫性炎症性疾患（例えば、ＭＳ、関節炎、１型糖尿病）の病因に関与しているため、宿主にとって危険であり得ることがわかっている。
【００５３】
ＩＬ−１２受容体（ＩＬ−１２Ｒ）は、活性化Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞の表面に発現するＩＬ−１２Ｒβ１鎖及びＩＬ−１２Ｒβ２鎖からなるヘテロ二量体複合体である（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＩＬ−１２Ｒβ１鎖はＩＬ−１２ｐ４０サブユニットに結合するが、ＩＬ−１２Ｒβ２と会合したＩＬ−１２ｐ３５は、細胞内シグナル伝達能力を付与する（Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＩＬ−１２Ｒを介したシグナル伝達は、シグナル伝達物質及び転写（ＳＴＡＴ）１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、及びＳＴＡＴ５の活性化因子をリン酸化し、活性化する、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ２）及びチロシンキナーゼ（Ｔｙｋ２）のリン酸化を誘導する。ＩＬ−１２の細胞への特定の作用は主にＳＴＡＴ４の活性化によるものである。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１表現型へのＣＤ４＋  Ｔ細胞の分化等、ＩＬ−１２の炎症誘発性活性の多くを媒介するサイトカイン、特にインターフェロン（ＩＦＮ）γを産生するようナチュラルキラー及びＴ細胞を誘導する（Ｍｏｎｔｅｐａｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００５４】
制御性Ｔ細胞は、免疫系の活性化を能動的に抑制し、病理学的自己反応性疾患及びその結果としての自己免疫疾患を防ぐ。自己免疫疾患の治療のために制御性Ｔ細胞を選択的に活性化する薬物及び方法の開発は、精力的な研究の主題であり、活性なインターロイキンを炎症部位に選択的に送達することができる本発明の開発までは、大部分が不成功であった。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、他の免疫細胞の活性を抑制するＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞のクラスである。Ｔｒｅｇは免疫系恒常性の中心であり、自己抗原に対する寛容の維持及び異物抗原に対する免疫応答の調節において主要な役割を果たす。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等、複数の自己免疫及び炎症性疾患は、Ｔｒｅｇ細胞数またはＴｒｅｇ機能の欠損を有することが示されている。
【００５５】
結果として、Ｔｒｅｇ細胞の数及び／または機能を高める治療の開発に大きな関心が持たれている。検討されている自己免疫疾患の治療方法の１つは、自己のエキソビボ増殖Ｔｒｅｇ細胞の移植である（Ｔａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．，３：１−１５）。この方法は、疾患の動物モデルの治療及びいくつかの初期段階のヒト臨床試験において有望であることが示されているが、患者自身のＴ細胞を用いた個別化医療が必要であり、侵襲的である上、技術的に複雑である。別の方法は、低用量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いる治療である。Ｔｒｅｇ細胞は、サブユニットであるＩＬ２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ２Ｒβ（ＣＤ１２２）、及びＩＬ２Ｒγ（ＣＤ１３２）で構成される高親和性ＩＬ−２受容体ＩＬ２Ｒαβγを高い構成的レベルで特徴的に発現し、Ｔｒｅｇ細胞の増殖はＩＬ−２依存性であることが示されている（Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３３：１５３−６５）。
【００５６】
逆に、ＩＬ−２を使用して免疫活性化も達成されており、組換え型ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））が特定のがん治療に承認されている。高用量ＩＬ−２は、全生存に長期的影響を与える転移性黒色腫及び転移性腎細胞腫の患者の治療に使用される。
【００５７】
慢性ＧＶＨＤ（Ｋｏｒｅｔｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，３６５：２０５５−６６）及びＨＣＶ関連自己免疫性血管炎患者（Ｓａａｄｏｕｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，３６５：２０６７−７７）の低用量ＩＬ−２治療の臨床試験では、Ｔｒｅｇレベルの増加と臨床的有効性の徴候が実証されている。他の複数の自己免疫及び炎症性疾患におけるＩＬ−２の有効性を調査する新しい臨床試験が開始されている。いわゆる低用量ＩＬ−２を使用する理論的根拠は、Ｔｒｅｇに構成的に発現する三量体ＩＬ−２受容体の高ＩＬ−２親和性を利用することであるが、高親和性受容体を発現しない他のＴ細胞は不活性化状態のままにしておくことであった。これらの試験で使用されたＩＬ−２の組換え型であるアルデスロイキン（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡよりＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）として販売されている）は高い毒性と関連している。アルデスロイキンは、高用量で、転移性黒色腫及び転移性腎癌の治療用に承認されているが、その副作用は非常に重度であるため、その使用は、集中治療を受けられる病院に限り推奨される（ウェブアドレス：ｗｗｗ．ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ．ｃｏｍ／ａｓｓｅｔｓ／ｐｄｆ／ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ．ｐｄｆ）。
【００５８】
Ｔｒｅｇ細胞は、それがＩＬ２Ｒアルファを発現することにより、他の多くの免疫細胞型より低濃度のＩＬ−２に応答するため、自己免疫疾患におけるＩＬ−２の臨床試験では、Ｔｒｅｇ細胞を標的とするために、より低用量のＩＬ−２を使用した（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ  Ｄ，２０１５  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２８３−９４）。しかしながら、これらの低用量でさえ安全性及び忍容性の問題が生じ、使用された治療では、連日の皮下注射を慢性的または間欠的５日間治療コースのいずれかで採用した。したがって、Ｔｒｅｇ細胞の数と機能を強化し、ＩＬ−２よりも特異的にＴｒｅｇ細胞を標的とし、より安全で認容性が高く、投与頻度が少ない、自己免疫疾患治療法が必要とされている。
【００５９】
自己免疫疾患に対するＩＬ−２による治療法の治療指数を改善するために提案されている１つの方法は、他の免疫細胞と比較してＴｒｅｇ細胞に選択的なＩＬ−２の変異型を使用することである。ＩＬ−２受容体は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好酸球、及び単球等、多種多様な免疫細胞型で発現し、この広い発現パターンが、免疫系に及ぼすその多面的作用及び高い全身毒性に寄与する可能性がある。特に、活性化されたエフェクターＴ細胞は、肺上皮細胞と同様、ＩＬ２Ｒαβγを発現する。しかし、エフェクターＴ細胞の活性化は、免疫応答を抑制及び制御するという目標に真っ向から対立するものであり、肺上皮細胞の活性化は、肺水腫等、ＩＬ−２の既知の用量制限副作用をもたらす。事実、高用量ＩＬ−２免疫療法の主な副作用は、血管漏出症候群（ＶＬＳ）であり、これにより肺及び肝臓等の臓器に血管内液が蓄積され、その後の肺水腫及び肝細胞損傷を引き起こす。ＩＬ−２の中止以外にＶＬＳの治療法はない。ＶＬＳを回避するため、低用量のＩＬ−２レジメンが患者で試験されているが、その代償として治療結果は最適とは言えない。
【００６０】
文献によれば、ＶＬＳは、ＩＬ−２で活性化されたＮＫ細胞からの炎症性サイトカインの放出によって引き起こされると考えられている。しかしながら、肺水腫は、低〜中レベルの機能的αβγ  ＩＬ−２Ｒを発現する肺内皮細胞とＩＬ−２が直接結合することに起因するといういくつかの証拠がある。また、ＩＬ−２と肺内皮細胞との相互作用に関連する肺水腫は、ＣＤ２５欠損宿主マウスでは、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いてＣＤ２５への結合を遮断することによって、またはＣＤ１２２特異的ＩＬ−２／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ（ＩＬ−２／ｍＡｂ）複合体の使用によって抑制され、それによりＶＬＳを予防した。
【００６１】
ＩＬ−２以外のインターロイキンサイトカインでの治療はさらに制限されている。ＩＬ−１５は、ＩＬ−２と同様の免疫細胞刺激活性を示すが、同じ阻害効果はないため、免疫療法の有望な候補となる。転移性悪性黒色腫または腎細胞癌の治療のための組換え型ヒトＩＬ−１５の臨床試験では、免疫細胞分布、増殖、及び活性化における明らかな変化が示され、潜在的な抗腫瘍活性が示唆された（Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，２０１４）。ＩＬ−１５は現在、様々な形態のがんを治療する臨床試験が行われている。しかしながら、ＩＬ−１５治療は、特定の白血病、移植片対宿主病、低血圧、血小板減少症、及び肝損傷を悪化させる等の望ましくない毒性作用に関連することが知られている。（Ｍｉｓｈｒａ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅ  Ｃｅｌｌ，２０１２，２２（５）：６４５−５５、Ａｌｐｄｏｇａｎ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５（２）：８６６−７３、Ｃｏｎｌｏｎ  ＫＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２０１５，３３（１）：７４−８２）。
【００６２】
ＩＬ−７は、胸腺でのリンパ球の発達を促進し、末梢でのナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞の生存の恒常性を維持する。さらに、リンパ節（ＬＮ）の器官形成にとって、及び二次リンパ器官（ＳＬＯ）に動員された活性化Ｔ細胞の維持にとって重要である（Ｇａｏ  ｅｔ．ａｌ．，２０１５）。ＩＬ−７の臨床試験では、ＩＬ−７の投与を受けた患者は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方の増加を示し、ＦｏｘＰ３の発現によりモニターした制御性Ｔ細胞数に顕著な増加はなかった（Ｓｐｏｒｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。２００６年、２００８年及び２０１０年に報告された臨床試験では、転移性黒色腫または肉腫等の様々な種類のがんの患者に異なる用量のＩＬ−７を皮下注射した。一過性発熱と軽度の紅斑を除いては毒性はほとんど見られなかった。ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方の循環血中レベルは大幅に増加し、Ｔｒｅｇ数が減少した。ＴＣＲレパートリー多様性はＩＬ−７療法後増加した。しかしながら、ＩＬ−７の抗腫瘍活性は十分に評価されてはいなかった（Ｇａｏ  ｅｔ．ａｌ．，２０１５）。結果は、ＩＬ−７療法が免疫応答を増強及び拡大する可能性があることを示唆している。
【００６３】
ＩＬ−１２は多面的サイトカインであり、その作用により自然免疫と適応免疫の間の相互接続が形成される。ＩＬ−１２は最初、ＰＭＡで誘導されたＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株から分泌される因子として記載された。その作用に基づき、ＩＬ−１２は、細胞傷害性リンパ球成熟因子及びナチュラルキラー細胞刺激性因子であるとされている。自然免疫と適応免疫との橋渡しをすること、及び自然の抗がん防御機構を統合するサイトカインであるＩＦＮγの産生を強力に刺激することから、ＩＬ−１２はヒトでの腫瘍免疫療法の理想的候補と思われた。しかしながら、臨床研究におけるＩＬ−１２の全身投与に関連する重篤な副作用、及びこのサイトカインの治療指数が非常に狭いことにより、がん患者におけるこのサイトカインの使用に対する意気込みが著しく弱められた（Ｌａｓｅｋ  ｅｔ．ａｌ．，２０１４）。サイトカインの送達が腫瘍を標的とするＩＬ−１２療法に対する試みは、ＩＬ−１２療法に関するこれまでの問題のいくつかを軽減する可能性があり、現在、それらによるがんの臨床試験が行われている。
【００６４】
ＩＬ−２Ｒと結合して治療的に免疫応答を調節するアゴニストとしてのＩＬ−２の直接の使用は、十分に立証されているその治療上のリスク、例えば、その血清中半減期の短さ及び高い毒性等による問題があった。これらのリスクにより、治療法の発達及び他のサイトカインの使用もまた制限された。これらのリスクを低減する新しい形態のサイトカインが必要とされている。本明細書では、ＩＬ−２及びＩＬ−１５及び他のサイトカイン、サイトカインの機能的断片と変異タンパク質、ならびにこれらのリスクに対処し、必要とされる免疫調節治療法を提供するよう設計された条件付きで活性なサイトカインを含む組成物及び方法を開示する。
【００６５】
本発明は、直接的なＩＬ−２療法及び他のサイトカインを使用する療法の欠点に対処するよう設計されており、例えば、サイトカイン遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチド、血清中半減期延長ポリペプチド、標的指向性ポリペプチド、プロテアーゼ切断可能リンカー等の連結ポリペプチド、及びその組み合わせ等を使用する。サイトカインは、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１  ＩＬ−２３）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ及びＩＦＮガンマ等のＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ）を含め、患者に投与した場合に極めて強力である。本明細書で使用する場合、「ケモカイン」は、応答性細胞近傍へ向けられる走化性を誘導する能力のある小さなサイトカインのファミリーを意味する。サイトカインは、強力な治療法を提供できるが、臨床的に管理が困難な望ましくない作用を伴い、これによりサイトカインの臨床用途が制限されている。本開示は、望ましくない作用が低減または排除された、患者で使用することができる新しい形態のサイトカインに関する。特に、本開示は、キメラポリペプチド（融合タンパク質）が含まれる医薬組成物、融合タンパク質をコードする核酸、及び対応するサイトカインと比較してサイトカイン受容体活性化活性が低下しているサイトカインまたはサイトカインの活性断片もしくは変異タンパク質を含有する前述の医薬製剤に関する。ただし、選択された条件下または選択された生物学的環境では、キメラポリペプチドはそれらの同族受容体を活性化し、しばしば、対応する天然に存在するサイトカインと同じかまたはそれより高い効力を有する。本明細書に記載されるように、これは、典型的には、サイトカイン、その活性断片もしくは変異タンパク質の受容体活性化機能を遮断または阻害するサイトカイン遮断部分を、サイトカイン活性の所望の部位（例えば、炎症部位または腫瘍）に存在する条件等の選択された条件下ではなく一般的な条件下で使用して達成される。
【００６６】
キメラポリペプチド及びキメラポリペプチドをコードする核酸は、任意の適切な方法を使用して作製することができる。例えば、キメラポリペプチドをコードする核酸は、組換えＤＮＡ技術、合成化学、またはこれらの技術の組み合わせを使用して作製され得、そしてＣＨＯ細胞等の適切な発現系において発現され得る。キメラポリペプチドは同様に、例えば、合成または半合成の化学技術等を使用した、適切な核酸の発現によって作製することができる。いくつかの実施形態では、遮断部分は、ソルターゼ媒介性の結合を介してサイトカインポリペプチドに結合させることができる。「ソルターゼ」は、標的とするタンパク質もしくはペプチドに包埋されているかまたはその末端に結合しているカルボキシル末端の局在化シグナルを認識して切断することによってタンパク質を修飾するペプチド転移酵素である。ソルターゼＡは、標的タンパク質上のＴｈｒ残基とＧｌｙ残基の間のＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号１９３）（Ｘは、任意の標準アミノ酸）の切断を触媒し、Ｔｈｒ残基が酵素上の活性部位であるＣｙｓ残基に一過性に結合し、酵素−チオアシル中間体を形成する。ペプチド転移を完了させ、ペプチド−単量体複合体を作るために、Ｎ末端求核基、典型的にはオリゴグリシンモチーフを有する生体分子は中間体を攻撃し、ソルターゼＡを置換して２つの分子を連結する。
【００６７】
サイトカイン遮断部分融合タンパク質を形成するために、サイトカインポリペプチドは、最初に、Ｎ末端にてポリグリシン配列でタグ付けされるか、または別法として、Ｃ末端にてＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号１９３）でタグ付けされる。遮断部分または他の要素にはそれぞれにペプチドが結合され、タグ付きポリペプチド用のアクセプター部位として機能する。自身のＮ末端を介して結合しているＬＰＸＴＧ（配列番号１９３）アクセプターペプチドを保持するドメインへの結合の場合、ポリペプチドは、Ｎ末端のポリグリシンストレッチでタグ付けされる。自身のＣ末端を介して結合しているポリグリシンペプチドを保持するドメインへの結合の場合、ポリペプチドは、そのＣ末端にてＬＰＸＴＧ（配列番号１９３）ソルターゼ認識配列でタグ付けされる。ソルターゼは、ポリグリシン配列及びＬＰＸＴＧ（配列番号１９３）配列を認識すると、ポリマーのペプチドとタグ付きポリペプチドとの間にペプチド結合を形成する。ソルターゼの反応は、グリシン残基を中間体として切り離し、これは室温で起こる。
【００６８】
様々な機構を利用して、遮断部分により生じる阻害を除去または低減することができる。例えば、医薬組成物には、サイトカイン部分、ならびに遮断部分、例えば、立体遮断部分等とともに、サイトカインとサイトカイン遮断部分との間またはサイトカイン遮断部分内部に位置するプロテアーゼ切断部位を含むプロテアーゼ切断可能リンカーが含まれ得る。プロテアーゼ切断部位が切断されると、遮断部分はサイトカインから解離することができ、次いで、サイトカインが、サイトカイン受容体を活性化することができる。サイトカイン部分はまた、関連するサイトカインに見られるエピトープと結合する、抗体等の特定の遮断部分によっても遮断され得る。
【００６９】
任意の適切なリンカーを使用することができる。例えば、リンカーは、グリシン−グリシン、ソルターゼ認識モチーフ、またはソルターゼ認識モチーフとペプチド配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１９５）もしくは（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１９６）（ここで、ｎは、１、２、３、４または５）を含むことができる。典型的には、ソルターゼ認識モチーフは、ペプチド配列ＬＰＸＴＧ（配列番号１９３）を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＣ末端に結合している反応性リジン残基と、遮断物質または他のドメインのＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸との間にある。他の実施形態では、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸残基と、前記遮断物質または他のドメインのＣ末端に結合している反応性リジン残基との間にある。
【００７０】
したがって、本明細書に詳述されるように、使用したサイトカイン遮断部分は立体遮断物質であり得る。本明細書で使用する場合、「立体遮断物質」とは、サイトカインポリペプチドに、例えば、キメラポリペプチド（融合タンパク質）等の形態で、リンカー等の他の部分を介して共有結合で直接または間接的に結合させることができるが、それ以外の場合にはそのサイトカインポリペプチドには共有結合で結合しないポリペプチドまたはポリペプチド部分を指す。立体遮断物質は、サイトカインポリペプチドに非共有結合的に、例えば、静電結合、疎水結合、イオン結合または水素結合を介して結合することができる。立体遮断物質は、典型的には、それがサイトカイン部分に近接していること及び同等のサイズであることによりサイトカイン部分の活性を阻害するかまたは遮断する。サイトカイン部分の立体阻害は、立体遮断物質からサイトカイン部分を空間的に分離することによって、例えば、立体遮断物質とサイトカインポリペプチドとを含有する融合タンパク質を、立体遮断物質とサイトカインポリペプチドの間の部位で酵素により切断することによって取り除くことができる。
【００７１】
本明細書でさらに詳述されるように、遮断機能は、医薬組成物中の追加の機能的成分、例えば、標的指向性ドメイン、血清中半減期延長要素、及びプロテアーゼ切断可能連結ポリペプチド等との組み合わせであっても、またそれらが存在することによるものであってもよい。例えば、血清中半減期延長ポリペプチドは立体遮断物質でもあり得る。
【００７２】
本発明の全範囲について簡潔な開示を提示するために、本発明の態様は、サイトカインＩＬ−２を例示的サイトカインとして使用して詳述される。しかしながら、本発明及び本開示はＩＬ−２に限定されない。本開示が、開示の方法、ポリペプチド及び核酸を含めて、他のサイトカイン、断片及び変異タンパク質、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１  ＩＬ−２３、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１及び前述のうちのいずれかの機能的断片もしくは変異タンパク質等の使用を適切に記載し、かつ可能にすることは、当業者には明らかであろう。
【００７３】
様々な要素により、所望のＩＬ−２活性の部位に優先的にＩＬ−２の送達と活性を保証し、血清中半減期延長戦略に優先的に連結させた遮断及び／または標的指向戦略を介してインターロイキンへの全身曝露を厳しく制限する。この血清中半減期延長戦略では、遮断型のインターロイキンは、長時間（好ましくは１〜２週間またはそれ以上）循環するが、活性化型はインターロイキンの典型的な血清中半減期を有する。
【００７４】
血清中半減期延長型と比較すると、静脈内投与されたＩＬ−２の血清中半減期は、平均サイズの成人では約１５Ｌと大きい全身の細胞外間隙に分布するため、わずか約１０分である。その後、ＩＬ−２は、腎臓により代謝され、半減期は約２．５時間である。（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２４０（２００１））。他の測定値では、ＩＬ−２は、血漿中半減期は、静脈内投与では８５分、皮下投与では３．３時間と非常に短い（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，Ｇ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：５−１０）。本発明のいくつかの実施形態では、半減期延長要素は、リンカーを介してインターロイキンに連結され、作用部位で切断（例えば、炎症特異的または腫瘍特異的なプロテアーゼによって）されて、所望の部位でインターロイキンの完全な活性を遊離し、また、それを非切断型半減期延長から分離させる。そのような実施形態では、完全に活性な遊離インターロイキンは、非常に異なる薬物動態（ｐＫ）特性を有し、半減期は数週間ではなく数時間である。さらに、活性サイトカインへの曝露は、所望のサイトカイン活性の部位（例えば、炎症部位または腫瘍）に限定され、活性サイトカインへの全身曝露、ならびに関連する毒性及び副作用が低減される。
【００７５】
本発明で想定される他のサイトカインは、ＩＬ−２と同様の薬理学（例えば、Ｂｌｏｏｄ  ２０１１  １１７：４７８７−４７９５；ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１０−１０−３１１４５６で報告されたＩＬ−１５）を有し、したがって、本発明の設計は、これらの薬剤を直接使用することの欠点に対処し、より長い半減期を有すること、及び／または所望の活性の部位（例えば、炎症部位または腫瘍）に指向させることができるキメラポリペプチドを提供する。
【００７６】
所望される場合、ＩＬ−２Ｒ複合体に一般的に結合するか、または３つのＩＬ−２Ｒサブユニットのうちの１つに、対応する野生型ＩＬ−２の親和性とは異なる親和性で特異的に結合して、例えば、ＴｒｅｇもしくはＴｅｆｆを選択的に活性化するよう、ＩＬ−２を操作することができる。例えば、野生型ＩＬ−２と比較して、二量体のベータ／ガンマ形態のＩＬ−２受容体と比べると三量体形態のＩＬ−２受容体に対する親和性の方が高いと言われるＩＬ−２ポリペプチドは、配列番号１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ６０５６８−１を有するヒトＩＬ−２のアミノ酸２１〜１５３を含む成熟ＩＬ−２タンパク質）について、変異のセット、すなわち、（ａ）Ｋ６４Ｒ、Ｖ６９Ａ、及びＱ７４Ｐ、（ｂ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＴ１０１Ａ、（ｃ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ｔ、（ｄ）Ｎ３０Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＦ１０３Ｓ、（ｅ）Ｋ４９Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ、及びＫ７６Ｅ、（ｆ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｔ１０１Ａ、及びＴ１３３Ｎ、（ｇ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ａ、（ｈ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＳ９９Ｐ、（ｉ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ｔ、（ｊ）Ｋ９Ｔ、Ｑ１１Ｒ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、及びＱ７４Ｐ、（ｋ）Ａ１Ｔ、Ｍ４６Ｌ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ６１Ｄ、Ｖ６９Ａ、及びＨ７９Ｒ、（ｌ）Ｋ４８Ｅ、Ｅ６８Ｄ、Ｎ７１Ｔ、Ｎ９０Ｈ、Ｆ１０３Ｓ、及びＩ１１４Ｖ、（ｍ）Ｓ４Ｐ、Ｔ１０Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＴ１３３Ａ、（ｎ）Ｅ１５Ｋ、Ｎ３０Ｓ  Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ、（ｏ）Ｎ３０Ｓ、Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｋ７６Ｒ、及びＮ９０Ｈ、（ｐ）Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｃ、Ｔ３７Ａ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ、Ｑ７４Ｐ、Ｈ７９Ｒ、及びＩ１２８Ｔ、（ｑ）Ｎ２６Ｄ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ５４Ｒ、Ｅ６７Ｇ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ、（ｒ）Ｋ８Ｒ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ２６Ｄ、Ｎ３０Ｔ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ、ならびに（ｓ）Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＩ８９Ｖのうちの１つが含まれるアミノ酸配列を有することができる。この方法は、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ及びＩＦＮガンマ等のＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ）等、他のサイトカインの変異タンパク質を調製するためにも適用することができる。例えば、同族受容体に対する所望の結合親和性を有する変異タンパク質を調製することができる。
【００７７】
上記のように、本明細書に開示する変異ＩＬ−２ポリペプチドのいずれも、記載される配列を含めることができ、それらは記載配列に限定することも、別の場合には配列番号１と同一であることも可能である。さらに、本明細書に開示する変異ＩＬ−２ポリペプチドのいずれも、任意選択で、１２５位のシステイン残基の別の残基（例えば、セリン）での置換を含めることができ、及び／または、任意選択で、配列番号１の１位のアラニン残基の欠失を含めることができる。
【００７８】
ＩＬ−２による治療法の治療指数を改善する別の方法は、Ｔｒｅｇ細胞を最大限に活性化するよう分子の薬物動態を最適化することである。ＩＬ−２作用の初期の研究では、インビトロでのヒトＴ細胞増殖のＩＬ−２刺激には、有効濃度のＩＬ−２への最低５〜６時間の曝露が必要であることが実証された（Ｃａｎｔｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：１３１２−１３１６）。ヒト患者に投与した場合、ＩＬ−２は、血漿中半減期が静脈内投与では８５分、皮下投与では３．３時間と非常に短い（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，Ｇ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：５−１０）。その短い半減期のため、循環血中ＩＬ−２を、Ｔ細胞増殖を刺激するのに必要なレベル以上に必要な期間維持するには、Ｔｒｅｇ細胞のＥＣ５０を大幅に上回るＩＬ−２ピークレベルをもたらす高用量を必要とするか、または頻回投与が必要になる。これらの高いＩＬ−２ピークレベルはＩＬ２Ｒβγ受容体を活性化することができ、他の意図しないまたは有害な作用、例えば、上述のようなＶＬＳ等が生じ得る。ＩＬ−２アナログ、またはＦｃＲｎ受容体への結合を可能にするドメインにＩＬ−２が結合している、ＩＬ−２よりも循環血中半減期の長い多機能性タンパク質では、目的薬物濃度を指定された期間、ＩＬ−２よりも低用量かつ低いピークレベルで達成することができる。したがって、そのようなＩＬ−２アナログでは、Ｔｒｅｇ細胞を効果的に刺激するためにＩＬ−２よりも低い用量または少ない頻度の投与しか必要とされない。ＩＬ−２薬のより頻度の少ない皮下投与もまた患者にとって許容されやすい。これらの特徴を備えた治療法は、臨床的には、治療法に関する薬理学的有効性の改善、毒性の低減、及び患者のコンプライアンスの改善につながる。別法として、ＩＬ−２またはＩＬ−２の変異タンパク質（本明細書では、「ＩＬ−２＊」）は、意図される作用部位（例えば、炎症部位または腫瘍）に選択的に指向させることができる。この標的指向性は、切り離されるＩＬ−２（または変異タンパク質）の遮断物質を含む投与薬剤へのドメインの追加等、いくつかの戦略のうちの１つによって、またはドメインに標的指向させることによって、または２つの組み合わせによって達成することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２＊部分アゴニストは、所望の標的に応じて、より高いまたはより低い親和性で結合するよう調整することができ、例えば、ＩＬ−２＊は、受容体サブユニットのうちの１つに増強された親和性で結合し、他のサブユニットには結合しないよう操作することができる。これらのタイプの部分アゴニストは、完全アゴニストまたは完全アンタゴニストとは異なり、シグナル伝達特性を、望ましくない特性の閾値を満たさずに所望の機能特性を誘発する振幅に調整する能力を提供する。部分アゴニストの特異的な活性を考えると、ＩＬ−２変異型のレパートリーは、ほぼ完全〜部分的なアゴニスト作用から完全なアンタゴニスト作用に至るまで、さらに細かい程度の特徴的なシグナル伝達活性を示すよう操作することができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２＊は、ＩＬ−２Ｒαに対する親和性が改変している。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２＊は、ＩＬ−２Ｒαに対する親和性が野生型ＩＬ−２より高い。他の実施形態では、ＩＬ−２＊は、ＩＬ−２Ｒβに対する親和性が改変している。一実施形態では、ＩＬ−２＊は、ＩＬ−２Ｒβ、例えば、ＩＬ−２ＲβのＮ末端に対する結合親和性が増強されており、これにより、ＩＬ−２Ｒαに対する機能的要件が排除される。別の実施形態では、ＩＬ−２＊は、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性は増加しているが、ＩＬ−２Ｒγへの結合減少を示すよう作製されるため、ＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体化及びシグナル伝達に欠陥がある。
【００８１】
以下に詳述される遮断部分はまた、１つ以上の受容体への結合または活性化を促進するためにも使用することができる。一実施形態では、遮断部分は、ＩＬ−２Ｒβγの結合または活性化は遮断されるがＩＬ−２Ｒαの結合または活性化は変化させないよう付加される。別の実施形態では、遮断部分は、ＩＬ−２Ｒαの結合または活性化が減少されるよう付加される。別の実施形態では、遮断部分は、３つすべての受容体の結合及びまたは活性化が阻害されるよう付加される。この遮断は、特定の環境における遮断部分の除去によって、例えば、１つ以上の遮断部分をサイトカインに連結するリンカーのタンパク質分解性切断によって軽減され得る。
【００８２】
同様の方法は、他のサイトカインを、例えば、がん治療用等の、特に免疫刺激薬としての使用について改善するために適用することができる。例えば、この態様では、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１  ＩＬ−２３、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ及びＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３  ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、及びＣＣＬ２１等の薬物動態及び／または薬力学は、エフェクター細胞（例えば、エフェクトＴ細胞、ＮＫ細胞）及び／または細胞傷害性免疫応答促進細胞を、腫瘍内等所望の活性の部位にて、好ましくは全身性ではなく、最大限に活性化させる（例えば、樹状細胞の成熟を誘導する）よう調整することができる。
【００８３】
したがって、本明細書では、少なくとも１つのサイトカインポリペプチド、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３）、インターフェロン（ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ及びＩＦＮガンマ等のＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦアルファ、リンホトキシン）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３）、ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ）等、または前述のうちのいずれかの機能的断片もしくは変異タンパク質を含む、医薬組成物が提供される。ポリペプチドには、典型的には、少なくとも１つのリンカーアミノ酸配列も含まれ、アミノ酸配列は、特定の実施形態では、内在性プロテアーゼによる切断を受けることができる。一実施形態では、リンカーは、ＨＳＳＫＬＱ（配列番号２５）、ＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号１９７）、ＩＰＶＳＬＲＳＧ（配列番号１９８）、ＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１９９）、またはＳＧＥＳＰＡＹＹＴＡ（配列番号２００）を含むアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、キメラポリペプチドはさらに、インターロイキンポリペプチドの活性を遮断することができる遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチド部分等を含有する。遮断部分は、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメインまたは任意選択で分岐もしくはマルチアーム型のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。別法として、医薬組成物は、第１のサイトカインポリペプチドまたはその断片、及び遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチド部分を含み、遮断部分は、サイトカイン受容体上でサイトカインポリペプチドの活性を遮断し、特定の実施形態では、遮断部分はプロテアーゼ切断可能ドメインを含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン活性の遮断及び低減は、非常に短いリンカーを用いてインターロイキンドメインのＮ末端またはＣ末端に追加ドメインを結合させることにより簡単に達成される。そのような実施形態では、遮断は、遮断部分、または遮断物質をインターロイキンに繋ぎ止める短いリンカーが、プロテアーゼにより消化されることにより軽減されることが予測される。一旦ドメインが切り取られるかまたは遊離されると、サイトカイン活性の遮断を達成することはできなくなる。
【００８４】
医薬組成物、例えば、キメラポリペプチドは、２つ以上のサイトカインを含むことができ、それらは、同一サイトカインポリペプチドでも異なるサイトカインポリペプチドでもあり得る。例えば、２つ以上の異なる種類のサイトカインは補完的機能を有する。いくつかの例では、第１のサイトカインはＩＬ−２であり、第２のサイトカインはＩＬ−１２である。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なる種類のサイトカインポリペプチドの各々は、他のサイトカインポリペプチドの活性を調節する活性を有する。２つのサイトカインポリペプチドを含有するキメラポリペプチドのいくつかの例では、第１のサイトカインポリペプチドはＴ細胞活性化であり、第２のサイトカインポリペプチドは非Ｔ細胞活性化である。２つのサイトカインポリペプチドを含有するキメラポリペプチドのいくつかの例では、第１のサイトカインは化学誘引物質、例えば、ＣＸＣＬ１０であり、第２のサイトカインは免疫細胞活性化因子である。
【００８５】
好ましくは、本明細書に開示の融合タンパク質に含まれるサイトカインポリペチド（機能的断片を含む）は、受容体結合の親和性及び特異性または血清中半減期等、天然に存在するサイトカインの特性を改変するよう変異または操作されない。ただし、天然に存在する（野生型を含む）サイトカインからのアミノ酸配列の変化は、例えば、クローニングを容易にするため、及び所望の発現レベルを達成するために許容される。
【００８６】
遮断部分
遮断部分は、サイトカインがその受容体と結合及び／または活性化する能力を阻害する任意の部分であり得る。遮断部分は、サイトカインがその受容体と結合及び／または活性化する能力を、立体的に遮断することによって、及び／またはサイトカインに共有結合で結合することによって阻害することができる。適切な遮断部分の例には、サイトカインの同族受容体の、完全長またはサイトカイン結合断片または変異タンパク質が含まれる。サイトカインと結合する、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体  一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディ（ＶＨＨ）の可変ドメイン等）、ｄＡｂ等のような、抗体及びその断片を使用することもできる。サイトカインと結合する他の適切な抗原結合ドメインを使用することもでき、これには、抗体の結合及び／または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４といった足場等の他の操作された足場に基づく結合ドメイン等が含まれる。適切な遮断ポリペプチドのさらなる例には、サイトカインのその同族受容体への結合を立体的に阻害または遮断するポリペプチドが含まれる。有利なことに、そのような部分はまた、半減期延長要素としても機能する。例えば、ＰＥＧ等の水溶性ポリマーへの結合により修飾されているペプチドは、サイトカインのその受容体への結合を立体的に阻害または防止することができる。血清アルブミン（ヒト血清アルブミン）、免疫グロブリンＦｃ、トランスフェリン等、ならびにそのようなポリペプチドの断片及び変異タンパク質等、血清中半減期が長いポリペプチドまたはその断片を使用することもできる。例えば、ＨＳＡ、免疫グロブリンまたはトランスフェリン等の血清中半減期の長いタンパク質に結合するか、またはＦｃＲｎもしくはトランスフェリン受容体のような形質膜に再利用される受容体に結合する抗体及び抗原結合ドメインはまた、特にそれらの抗原に結合した場合に、サイトカインを阻害することができる。そのような抗原結合ポリペプチドの例には、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディ（ＶＨＨ）の可変ドメイン等）、ｄＡｂ等が含まれる。サイトカインと結合する他の適切な抗原結合ドメインを使用することもでき、これには、抗体の結合及び／または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４といった足場等の他の操作された足場に基づく結合ドメイン等が含まれる。
【００８７】
例示的な例では、ＩＬ−２がキメラポリペプチド内のサイトカインである場合、遮断部分は、ＩＬ−２受容体のアルファ鎖（ＩＬ−２Ｒα）またはＩＬ−２受容体のベータ（ＩＬ−２Ｒβ）鎖もしくはガンマ鎖（ＩＬ−２Ｒγ）の、完全長または断片または変異タンパク質、抗ＩＬ−２単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）もしくはｓｃＦｖ、Ｆａｂ、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、及び抗ＨＡＳ  ｄＡｂもしくはｓｃＦｖ等であり得る。
【００８８】
本発明のさらなる態様
１．非ＣＤＲループと切断可能なリンカーとを含む結合部分に、機能的に連結されているサイトカイン部分を含む融合タンパク質であって、前記結合部分は、前記サイトカインのその受容体への結合及び／または前記サイトカインによる前記受容体の活性化をマスキングすることができる、前記融合タンパク質。
【００８９】
２．前記結合部分は、天然ペプチド、合成ペプチド、操作された足場、または操作されたバルク血清タンパク質である、態様１に記載の融合タンパク質。
【００９０】
３．前記操作された足場は、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、免疫グロブリン様足場、ＤＡＲＰｉｎ、シスチンノットペプチド、リポカリン、３ヘリックスバンドル足場、プロテインＧ関連アルブミン結合モジュール、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマー足場を含む、態様１または２に記載の融合タンパク質。
【００９１】
４．前記結合部分は、バルク血清タンパク質に結合することができる、態様１〜２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【００９２】
５．前記非ＣＤＲループは、可変ドメイン、定常ドメイン、Ｃ１セットドメイン、Ｃ２セットドメイン、Ｉドメイン、またはその任意の組み合わせに由来する、態様１〜３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【００９３】
６．前記結合部分はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、態様１〜４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【００９４】
７．前記結合部分は、前記バルク血清タンパク質に結合することができる、態様５に記載の融合タンパク質。
【００９５】
８．前記バルク血清タンパク質は半減期延長タンパク質である、態様６に記載の融合タンパク質。
【００９６】
９．前記バルク血清タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、第ＸＩＩＩ因子、またはフィブリノゲンである、態様６または７に記載の融合タンパク質。
【００９７】
１０．前記ＣＤＲループは、前記バルク血清タンパク質または前記免疫グロブリン軽鎖、またはその任意の組み合わせに対して特異的な結合部位を提供する、態様５〜８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【００９８】
１１．前記切断可能なリンカーが切断部位を含む、態様１〜９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【００９９】
１２．前記切断部位はプロテアーゼによって認識される、態様１０に記載の融合タンパク質。
【０１００】
１３．前記結合部分は前記サイトカインに結合されている、態様１１に記載の融合タンパク質。
【０１０１】
１４．前記結合部分は、共有結合で前記サイトカインに連結されている、態様１１または１１に記載の融合タンパク質。
【０１０２】
１５．前記結合部分は、前記結合部分と前記サイトカインの間の特異的な分子間相互作用を介して、前記サイトカインのその標的への結合をマスキングすることができる、態様１１、１１、または１４に記載の融合タンパク質。
【０１０３】
１６．前記非ＣＤＲループは、前記部分の前記サイトカインへの結合に対して特異的な結合部位を提供する、態様１１〜１４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１０４】
１７．前記切断可能なリンカーの切断時、前記結合部分は、前記サイトカインから分離され、前記サイトカインがその標的に結合する、態様１１〜１５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１０５】
１８．前記サイトカインはサイトカイン受容体に結合する、態様１〜１６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１０６】
１９．前記サイトカイン受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体、Ｉ型ＩＬ受容体、ＩＩ型ＩＬ受容体、ケモカイン受容体、または腫瘍壊死受容体スーパーファミリー受容体を含む、態様１７に記載の融合タンパク質。
【０１０７】
２０．前記切断可能なリンカーは切断部位を含む、態様１〜１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１０８】
２１．前記切断部位はプロテアーゼによって認識される、態様２０に記載の融合タンパク質。
【０１０９】
２２．前記プロテアーゼ切断部位は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタルプロテアーゼ、ゼラチナーゼ、またはアスパラギンペプチドリアーゼによって認識される、態様２１に記載の融合タンパク質。
【０１１０】
２３．前記プロテアーゼ切断部位は、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメライシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ−３、Ｍｉｒ１−ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１２、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異標的（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン−１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ−α）、ジペプチジルペプチダーゼ、またはジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、プロテイナーゼ３、好中球セリンプロテアーゼ４、マスト細胞キマーゼ、マスト細胞トリプターゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）によって認識される、態様２１に記載の融合タンパク質。
【０１１１】
２４．非ＣＤＲループ、サイトカイン、及び切断可能なリンカー（Ｌ）を含む結合部分（Ｍ）を含む、条件付きで活性な結合タンパク質であって、前記非ＣＤＲループは、前記サイトカインに結合することができ、前記結合部分は、前記サイトカインのその受容体への結合を阻害すること、及び／または前記サイトカインによる前記受容体の活性化を阻害することができる、前記条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１１２】
２５．前記結合部分は、半減期延長タンパク質に結合することができる、態様２４に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１１３】
２６．前記結合部分は、天然ペプチド、合成ペプチド、操作された足場、または操作された血清バルクタンパク質である、態様２４または２５に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１１４】
２７．前記操作された足場は、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、免疫グロブリン様足場、ＤＡＲＰｉｎ、シスチンノットペプチド、リポカリン、３ヘリックスバンドル足場、プロテインＧ関連アルブミン結合モジュール、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマー足場を含む、態様２６に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１１５】
２８．前記非ＣＤＲループは、可変ドメイン、定常ドメイン、Ｃ１セットドメイン、Ｃ２セットドメイン、Ｉドメイン、またはその任意の組み合わせに由来する、態様２４〜２７のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１１６】
２９．前記結合部分はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、態様２４〜２８のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１１７】
３０．前記結合部分は、バルク血清タンパク質に対して特異的な結合部位を含む、態様２４〜２９のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１１８】
３１．前記バルク血清タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、第ＸＩＩＩ因子、またはフィブリノゲンである、態様３０に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１１９】
３２．前記ＣＤＲは、前記バルク血清タンパク質または前記免疫グロブリン軽鎖、またはその任意の組み合わせに対して特異的な結合部位を提供する、態様２９〜３１のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１２０】
３３．前記結合部分は、前記結合部分と前記サイトカインの間の特異的な分子間相互作用を介して、前記サイトカインのその標的への結合をマスキングすることができる、態様２９〜３２のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１２１】
３４．前記非ＣＤＲループは、前記結合部分の前記サイトカインへの結合に対して特異的な結合部位を提供する、態様２９〜３３のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１２２】
３５．前記サイトカインはサイトカイン受容体に結合する、態様２４〜３４のいずれか１つに記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１２３】
３６．前記サイトカイン受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体、Ｉ型ＩＬ受容体、ＩＩ型ＩＬ受容体、ケモカイン受容体、または腫瘍壊死受容体スーパーファミリー受容体を含む、態様３５に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１２４】
３７．前記切断可能なリンカーは切断部位を含む、態様２４〜３６に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１２５】
３８．前記切断部位はプロテアーゼによって認識される、態様３７に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１２６】
３９．前記プロテアーゼ切断部位は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタルプロテアーゼ、ゼラチナーゼ、またはアスパラギンペプチドリアーゼによって認識される、態様３８に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１２７】
４０．前記プロテアーゼ切断部位は、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメライシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ−３、Ｍｉｒ１−ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１２、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異標的（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン−１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ−α）、ジペプチジルペプチダーゼ、またはジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、プロテイナーゼ３、好中球セリンプロテアーゼ４、マスト細胞キマーゼ、マスト細胞トリプターゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）によって認識される、態様３８に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１２８】
４１．前記結合部分に結合した半減期延長ドメインをさらに含み、ここで、前記半減期延長ドメインは、前記結合タンパク質に安全スイッチを提供し、前記リンカーの切断時、前記サイトカインからの前記結合部分と前記半減期延長ドメインの分離によって前記結合タンパク質が活性化され、それにより、前記結合タンパク質が前記安全スイッチから分離される、態様２４に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１２９】
４２．前記リンカーの前記切断は腫瘍微小環境におけるものである、態様４１に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１３０】
４３．結合部分内部の非ＣＤＲループを介してサイトカインに結合する前記結合部分を含む条件付きで活性な結合タンパク質であって、前記結合部分がさらに半減期延長ドメインに連結され、かつ切断可能なリンカーを含み、前記結合タンパク質は、前記リンカーの切断によるその活性化より前の半減期が延長されており、活性化時、前記結合部分及び前記半減期延長ドメインは前記サイトカインから分離され、前記結合タンパク質は、その活性化状態では、半減期が延長されていない、前記条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１３１】
４４．前記リンカーの前記切断は腫瘍微小環境におけるものである、態様４３に記載の条件付きで活性な結合タンパク質。
【０１３２】
インビボ半減期延長要素
好ましくは、キメラポリペプチドは、インビボ半減期延長要素を含む。天然では半減期が短い治療用分子のインビボ半減期を増加させることにより、有効性を犠牲にすることなく、より許容できる管理可能な投与レジメンが可能になる。本明細書で使用する場合、「半減期延長要素」は、例えば、そのサイズ（例えば、腎臓ろ過カットオフ値を上回るよう）、形状、流体力学的半径、電荷を改変するか、または吸収、生体内分布、代謝、及び消失というパラメータを改変することによって、インビボ半減期を増加させ、ｐＫを改善するキメラポリペプチドの一部である。ポリペプチドのｐＫを改善する例示的方法は、内皮細胞上のＦｃＲｎ受容体及びトランスフェリン受容体等、リソソームで分解されるのではなく細胞の形質膜に再利用される受容体に結合するポリペプチド鎖の要素の発現によるものである。３種のタンパク質、例えば、ヒトＩｇＧ、ＨＳＡ（または断片）、及びトランスフェリン等は、ヒト血清中では、そのサイズだけから予測されるよりはるかに長く存続し、これは、リソソームで分解されるのではなく再利用される受容体に対するそれらの結合能の作用である。これらのタンパク質、またはＦｃＲｎ結合を保持するそれらの断片は、それらの血清中半減期を延長させるために他のポリペプチドに日常的に連結される。一実施形態では、半減期延長要素は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメインである。ＨＳＡ（配列番号２）はまた、医薬組成物に直接結合させても短いリンカーを介して結合させてもよい。ＨＳＡの断片を使用してもよい。ＨＳＡ及びその断片は、遮断部分としても半減期延長要素としても機能することができる。ヒトＩｇＧ及びＦｃ断片もまた同様の機能を実行することができる。
【０１３３】
血清中半減期延長要素はまた、血清アルブミン、トランスフェリン等の血清中半減期の長いタンパク質に結合する抗原結合ポリペプチドでもあり得る。そのようなポリペプチドの例には、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体  一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディ（ＶＨＨ）の可変ドメイン等）、ｄＡｂ等のような、抗体及びその断片が含まれる。他の適切な抗原結合ドメインには、抗体の結合及び／または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４といった足場等の他の操作された足場に基づく結合ドメイン等が含まれる。抗原結合ポリペプチドのさらなる例には、所望の受容体に対するリガンド、受容体のリガンド結合部分、レクチン、及び１つ以上の標的抗原に結合するかまたは会合するペプチドが含まれる。
【０１３４】
いくつかの好ましい血清中半減期延長要素は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び任意選択で非ＣＤＲループを含むポリペプチドである。有利なことに、そのような血清中半減期延長要素は、サイトカインの血清中半減期を延長させることができ、また、サイトカイン阻害物質として（例えば、立体遮断、非共有結合の相互作用またはそれらの組み合わせを介して）、及び／または標的指向性ドメインとしても機能する。場合によっては、血清中半減期延長要素は、免疫グロブリン分子（Ｉｇ分子）に由来するドメインであるか、あるいは抗体の構造及び／または結合活性を模倣する、操作されたタンパク質足場である。Ｉｇは、任意のクラスまたはサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等）のものであってよい。Ｉｇ分子のポリペプチド鎖は、折り畳まれてループで連結された一連の平行なベータ鎖になる。可変領域では、ループのうちの３つが「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を構成し、分子の抗原結合特異性を決定する。ＩｇＧ分子は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖、またはその抗原結合性断片を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分することができ、それらは、配列が超可変であり、及び／または抗原認識に関与し、及び／または通常構造的に定義されたループを形成し、より保存性の高いフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順序で並んでいる。本開示のいくつかの実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のアミノ酸配列の少なくとも一部またはすべては、本明細書に記載する結合部分の「非ＣＤＲループ」の一部である。図５に示すように、免疫グロブリン分子の可変ドメインは、２枚のシート状に並んだいくつかのベータ鎖を有する。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインは、３つの超可変ループ、または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。Ｖドメインの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）がベータバレルの一端でクラスターを形成する。ＣＤＲは、免疫グロブリンフォールドのベータ鎖Ｂ−Ｃ、Ｃ’−Ｃ”、及びＦ−Ｇをつなぐループであるが、免疫グロブリンフォールドのベータ鎖ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”−Ｄ及びＥ−Ｆをつなぐ下部ループ、ならびに免疫グロブリンフォールドのＤ−Ｅ鎖をつなぐ上部ループは非ＣＤＲループである。本開示のいくつかの実施形態では、定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３の少なくともいくつかのアミノ酸残基は、本明細書に記載する結合部分の「非ＣＤＲループ」の一部である。非ＣＤＲループは、いくつかの実施形態では、ＩｇまたはＩｇ様分子のＣ１セットドメインのＡＢ、ＣＤ、ＥＦ、及びＤＥループ；ＩｇまたはＩｇ様分子のＣ２セットドメインのＡＢ、ＣＣ’、ＥＦ、ＦＧ、ＢＣ、及びＥＣ’ループ；ＩｇまたはＩｇ様分子のＩ（中間体）セットドメインのＤＥ、ＢＤ、ＧＦ、Ａ（Ａ１Ａ２）Ｂ、及びＥＦループのうち１つ以上を含む。
【０１３５】
可変ドメイン内部では、ＣＤＲは抗原認識及び結合に関与すると考えられており、ＦＲ残基は、ＣＤＲの足場とみなされている。しかしながら、特定の場合には、ＦＲ残基のいくつかは抗原認識及び結合において重要な役割を果たす。Ａｇ結合に影響を与えるフレームワーク領域の残基は、２つのカテゴリーに分けられる。１つ目は、抗原と接触するＦＲ残基であり、そのため、それらは結合部位の一部であり、これらの残基のいくつかはＣＤＲに並んで近接する。他の残基は、ＣＤＲから離れて並んでいるが、分子の３−Ｄ構造においては近接しており、例えば、重鎖のループである。血清中半減期延長ドメイン（例えば、ＣＤＲを含むドメイン）は、少なくとも１つの非ＣＤＲループを含むことができる。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは、サイトカイン、バルク血清タンパク質または他の標的抗原に結合するための結合部位を提供する。
【０１３６】
血清中半減期延長要素は、ＣＤＲを含有することに加えて、または代替的に、非ＣＤＲループを含む。いくつかの実施形態では、非ＣＤＲループは、アルブミン等のバルク血清タンパク質等の所望の標的抗原に対して、またはサイトカイン部分もしくは他の標的とする抗原に対して特異的な抗原結合部位を生成するよう修飾される。非ＣＤＲループを修飾するために、様々な技術、例えば、部位特異的変異導入、ランダム変異誘発、非ＣＤＲループアミノ酸配列にとって外来性である少なくとも１つのアミノ酸の挿入、アミノ酸置換等を使用することができることが企図される。いくつかの例では、非ＣＤＲループに抗原ペプチドを挿入する。いくつかの例では、非ＣＤＲループを抗原ペプチドに置き換える。抗原結合部位を生成するための修飾は、場合によっては、１つの非ＣＤＲループにおいてのみである。他の場合には、２つ以上の非ＣＤＲループを修飾する。例えば、修飾は、図５に示される非ＣＤＲループ、すなわち、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、ＥＦ、及びＤ−Ｅのいずれか１つにおいてである。場合によっては、修飾は、ＤＥループ内である。他の場合では、修飾は、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”−Ｄ、Ｅ−Ｆの４つのループすべてにおいてである。
【０１３７】
いくつかの例では、血清中半減期延長要素は二重結合特異性を有し、血清アルブミン等のバルク血清タンパク質と特異的に結合するＣＤＲ、及びサイトカインドメインと特異的に結合して遮断する非ＣＤＲループを含有する。他の例では、血清中半減期延長要素は、サイトカインドメインまたは他の標的抗原等の標的抗原と特異的に結合するＣＤＲ、及び血清アルブミン等のバルク血清タンパク質と特異的に結合する非ＣＤＲループを含有する。好ましくは、血清中半減期延長要素は、サイトカインドメインの同族のサイトカイン受容体への結合を、例えば、立体閉塞を介して、特異的分子間相互作用を介して、または両方の組み合わせで阻害する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、血清中半減期延長要素は、非共有結合でサイトカインと直接結合し、その活性を阻害する。
【０１３９】
特定の例では、結合部分は、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、及びＥ−Ｆループのうちの１つ以上を介してサイトカインに結合し、ＢＣ、Ｃ’Ｃ”、及びＦＧループのうちの１つ以上を介してアルブミン等のバルク血清タンパク質に結合する。特定の例では、結合部分は、そのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、またはＥＦループを介して、アルブミン等のバルク血清タンパク質に結合し、そのＢＣ、Ｃ’Ｃ”、またはＦＧループを介してサイトカインに結合する。特定の例では、結合部分は、そのＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、及びＥＦループを介してアルブミン等のバルク血清タンパク質に結合し、そのＢＣ、Ｃ’Ｃ”、及びＦＧループを介してサイトカインに結合されている。特定の例では、結合部分は、ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、及びＥ−Ｆループのうち１つ以上を介してアルブミン等のバルク血清タンパク質に結合し、ＢＣ、Ｃ’Ｃ”、及びＦＧループのうち１つ以上を介してサイトカインに結合する。
【０１４０】
結合部分は、任意の種類のポリペプチドである。例えば、場合によっては、結合部分は、天然ペプチド、合成ペプチド、またはフィブロネクチン足場、または操作されたバルク血清タンパク質である。バルク血清タンパク質は、例えば、アルブミン、フィブリノゲン、またはグロブリンを含む。いくつかの実施形態では、結合部分は操作された足場である。操作された足場は、例えば、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、免疫グロブリン様足場（Ｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  １２（７）：５６３−５７１で示唆されるように）、ＤＡＲＰｉｎ、シスチンノットペプチド、リポカリン、３ヘリックスバンドル足場、プロテインＧ関連アルブミン結合モジュール、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマー足場を含む。
【０１４１】
場合によっては、血清中半減期延長要素は、その非ＣＤＲループを介してサイトカインドメインに結合し、サイトカインドメインはさらに、本明細書に記載する標的指向性ドメインに接続される。場合によっては、血清中半減期延長要素は、バルク血清タンパク質に対する結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、バルク血清タンパク質に対する結合部位を提供する。バルク血清タンパク質は、いくつかの例では、グロブリン、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ３、ＩｇＡモノマー、第ＸＩＩＩ因子、フィブリノゲン、ＩｇＥ、または五量体ＩｇＭである。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、Ｉｇκ遊離軽鎖またはＩｇλ遊離軽鎖等に対する結合部位を形成する。
【０１４２】
例示的な条件付きで活性なタンパク質の１つを図６に示す。図示の例では、血清アルブミン結合ドメイン（例えば、ｄＡｂ）内の非ＣＤＲループは、サイトカインＩＬ−２に対する結合部位を形成することができる。この例では、血清アルブミンの結合部位は血清アルブミン結合ドメインのＣＤＲにより形成することができる。
【０１４３】
血清中半減期延長要素は、任意の種類の結合ドメインであり得、これには、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、結合部分は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）等である。他の実施形態では、結合部分は、非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、及びモノボディ等の抗体模倣物である。
【０１４４】
他の実施形態では、血清中半減期延長要素は、水溶性ポリマー、またはＰＥＧ等の水溶性ポリマーに結合されているペプチドであり得る。本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」及び「ポリ（エチレングリコール）」は同じ意味であり、任意の非ペプチド水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含する。用語「ＰＥＧ」はまた、大部分、すなわち、５０％超に−ＯＣＨ２ＣＨ２−反復サブユニットが含有されるポリマーを意味する。特定の形態に関して、ＰＥＧは、任意の数の様々な分子量、ならびに構造または幾何学、例えば、「分岐」、「直鎖」、「フォーク型」、「多官能性」等をとることができ、詳細は以下に記載する。ＰＥＧは、特定の構造に限定されず、直鎖（例えば、封止末端、例えば、アルコキシＰＥＧまたは二官能性ＰＥＧ）、分岐またはマルチアーム型（例えば、フォーク型ＰＥＧまたはポリオールコアに結合しているＰＥＧ）、樹状（または星状）構造であり得、それぞれ、１つ以上の分解性結合がある場合とない場合がある。さらに、ＰＥＧの内部構造は、任意の数の異なる反復パターンで組織化することができ、また、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、及びブロックトリポリマーからなる群から選択され得る。ＰＥＧは、ポリペプチド及びペプチドに任意の適切な方法により結合させることができる。典型的には、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミジル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｙｌ）エステルＰＥＧ等の反応性ＰＥＧ誘導体を、システイン、リジン、アスパラギン、グルタミン、テオニン（ｔｈｅｏｎｉｎｅ）、チロシン、セリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸等の、アミン、スルフヒドリル、カルボン酸またはヒドロキシル官能基を含有する側鎖を有するアミノ酸が含まれるペプチドまたはポリペプチドと反応させる。
【０１４５】
標的指向性ドメイン及び保持ドメイン
特定の用途では、構成体がその所望される体内の部位に存在する時間を最大化することが望ましい場合がある。これは、キメラポリペプチド（融合タンパク質）にさらに１つのドメインを含めて、体内でのその移動に影響を与えることにより実現することができる。例えば、キメラ核酸は、ポリペプチドを体内の部位、例えば、腫瘍細胞もしくは炎症部位等に向けるドメイン（このドメインは「標的指向性ドメイン」と呼ばれる）をコードする、及び／またはポリペプチドを体内の部位、例えば、腫瘍細胞もしくは炎症部位等に保持するドメイン（このドメインは「保持ドメイン」と呼ばれる）をコードすることができる。いくつかの実施形態では、ドメインは、標的指向性ドメインとしても保持ドメインとしても機能することができる。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、プロテアーゼに富む環境に特異的である。いくつかの実施形態では、コードされた標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対して特異的であり、例えば、ＣＣＲ４受容体またはＣＤ３９受容体を標的とする。他の適切な標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、炎症組織で過剰発現される同族リガンド、例えば、ＩＬ−１受容体、またはＩＬ−６受容体の同族リガンドを有するものを含む。他の実施形態では、適切な標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、腫瘍組織で過剰発現される同族リガンド、例えば、Ｅｐｃａｍ、ＣＥＡまたはメソテリンの同族リガンドを有するものを含む。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメインは、リンカーを介してインターロイキンに連結され、作用部位で切断（例えば、炎症またはがんに特異的なプロテアーゼによって）されて、所望の部位でインターロイキンの完全な活性を遊離する。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは、リンカーを介してインターロイキンに連結され、作用部位で切断（例えば、炎症またはがんに特異的なプロテアーゼによって）されずに、サイトカインを所望の部位に留まらせる。
【０１４６】
選択される抗原は、場合によっては、罹患した細胞または組織、例えば、腫瘍またはがん細胞の表面に発現されている。腫瘍への標的指向及び保持に有用な抗原としては、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃ−Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、及びＣＥＡが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される医薬組成物には、罹患した細胞または組織上で発現されることが知られている２つの異なる標的抗原に結合する２つの標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインを含むタンパク質も含まれる。抗原結合ドメインの例示的な対としては、ＥＧＦＲ／ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ、及びＨＥＲ−２／ＨＥＲ−３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
適切な標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインには、抗原結合ドメイン、例えば、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体  一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ型ナノボディ（ＶＨＨ）の可変ドメイン等）、ｄＡｂ等の、抗体及びその断片が含まれる。他の適切な抗原結合ドメインには、抗体の結合及び／または構造を模倣する非免疫グロブリンタンパク質、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ならびにＳｐＡ、ＧｒｏＥＬ、フィブロネクチン、リポカリン及びＣＴＬＡ４といった足場等の他の操作された足場に基づく結合ドメイン等が含まれる。抗原結合ポリペプチドのさらなる例には、所望の受容体に対するリガンド、受容体のリガンド結合部分、レクチン、及び１つ以上の標的抗原に結合するかまたは会合するペプチドが含まれる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメイン及び／または保持ドメインは腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰａ）、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ２）、フィブロネクチンＥＤＢ（ＥＤＢ−ＦＮ）、フィブロネクチンＥＩＩＩＢドメイン、ＣＧＳ−２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１のうちの少なくとも１つから選択される腫瘍抗原に特異的かつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、標的指向性ポリペプチドは、２つの異なる抗原に特異的かつ独立して結合し、抗原のうちの少なくとも１つは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１から選択される腫瘍抗原である。
【０１４９】
標的及び／または保持の抗原は、腫瘍細胞で発現される腫瘍抗原であり得る。腫瘍抗原は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃ−Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、及びＣＥＡ、５Ｔ４、ＡＦＰ、Ｂ７−Ｈ３、カドヘリン−６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０５、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＤＬＬ３、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＦＬＴ−３、ｇｐＮＭＢ、ＨＰＶ−１６Ｅ６、ＨＰＶ−１６Ｅ７、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＳＬＣ３９Ａ６、ＭＡＧＥ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮａＰｉ２ｂ、Ｎｅｃｔｉｎ−４、Ｐ−カドヘリン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ５、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＩＭ１、Ｔｒｏｐ２、ＷＴ１が含まれる。
【０１５０】
標的及び／または保持の抗原は、免疫チェックポイントタンパク質であり得る。免疫チェックポイントタンパク質の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ−１、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、またはＶＩＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
標的及び／または保持の抗原は、タンパク質、脂質または多糖等の細胞表面分子であり得る。いくつかの実施形態では、標的及び／または保持の抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷した赤血球、動脈プラーク細胞、炎症組織細胞または線維性組織細胞の上にある。標的及び／または保持の抗原は、免疫応答モジュレーターを含むことができる。免疫応答モジュレーターの例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３、またはＧＩＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
標的及び／または保持の抗原は、サイトカイン受容体であり得る。サイトカイン受容体の例としては、Ｉ型サイトカイン受容体、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、Ｉ型ＩＬ受容体、Ｅｐｏ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＴＰＯ受容体等；ＩＩ型サイトカイン受容体、例えば、ＩＦＮ−アルファ受容体（ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２）、ＩＦＢ−ベータ受容体、ＩＦＮ−ガンマ受容体（ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２）、ＩＩ型ＩＬ受容体等；ケモカイン受容体、例えば、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、ＸＣケモカイン受容体等；腫瘍壊死受容体スーパーファミリー受容体、例えば、ＴＮＦＲＳＦ５／ＣＤ４０、ＴＮＦＲＳＦ８／ＣＤ３０、ＴＮＦＲＳＦ７／ＣＤ２７、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＴＮＦＲ１／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ／ＴＮＦＲ２／ＣＤ１２０ｂ等；ＴＧＦ−ベータ受容体、例えば、ＴＧＦ−ベータ受容体１、ＴＧＦ−ベータ受容体２等；Ｉｇスーパーファミリー受容体、例えば、ＩＬ−１受容体、ＣＳＦ−１Ｒ、ＰＤＧＦＲ（ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ＳＣＦＲ等、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
リンカー
上述のように、医薬組成物は、１つ以上のリンカー配列を含む。リンカー配列は、ポリペプチド間に柔軟性を提供して、例えば、遮断部分がサイトカインポリペプチドの活性を阻害することができるようにするのに役立つ。リンカー配列は、サイトカインポリペプチド、血清中半減期延長要素、及び／または遮断部分のうちのいずれかまたは全ての間に位置させることができる。本明細書に記載するように、リンカーのうちの少なくとも１つはプロテアーゼで切断可能であり、（１つ以上の）所望のプロテアーゼのための（１つ以上の）切断部位を含有する。好ましくは、所望のプロテアーゼは、サイトカイン活性の所望の部位（例えば、腫瘍微小環境）において豊富にされるかまたは選択的に発現される。したがって、融合タンパク質は、所望のサイトカイン活性の部位で優先的または選択的に切断される。
【０１５４】
適切なリンカーは、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）〜２０アミノ酸、２アミノ酸〜１５アミノ酸、３アミノ酸〜１２アミノ酸等の異なる長さであり得、これには、４アミノ酸〜１０アミノ酸、アミノ酸〜９アミノ酸、６アミノ酸〜８アミノ酸、または７アミノ酸〜８アミノ酸が含まれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０のアミノ酸であってよい。
【０１５５】
医薬組成物の成分の配向は主に設計の選択の問題であり、複数の配向が可能であること、また、いずれも本開示により包含されることが意図されることが認識される。例えば、遮断部分は、サイトカインポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に位置させることができる。
【０１５６】
罹患した細胞または組織に関連することが知られているプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫｌ、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメライシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリ  シン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ−３、Ｍｉｒｌ−ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン−１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ−ａ）、ジペプチジルペプチダーゼ、メプリン、グランザイム及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供されるキメラ核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を切断することができるプロテアーゼは、例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、Ａディスインチグリン及びメタルプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、腫瘍細胞表面プロテアーゼ、及びエラスターゼからなる群から選択され得る。ＭＭＰは、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）またはマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ９）であり得る。
【０１５７】
本明細書に開示する方法において有用なプロテアーゼを表１に示し、例示的プロテアーゼとそれらの切断部位を表１ａに示す。
表１．炎症及びがんに関連するプロテアーゼ
【表１−１】
2021524756.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
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表１ａ：例示的プロテアーゼ及びプロテアーゼ認識配列
【表１ａ−１】
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【表１ａ−２】
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【０１５８】
本明細書では、ポリペプチド配列を含む医薬組成物が提供される。すべてのペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質（それらの断片を含む）の場合と同様、キメラポリペプチド（アミノ酸配列変異型）のアミノ酸配列において、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の性質または機能を改変しない追加の修飾が起こり得ることが理解される。そのような修飾には、保存的アミノ酸置換が含まれ、以下でさらに詳細に考察される。
【０１５９】
本明細書で提供する組成物は所望の機能を有する。組成物は、少なくともサイトカインポリペプチド、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＦＮａ、もしくはＩＦＮｇ、またはＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１といったケモカイン等、遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチド等、ならびに任意選択の血清中半減期延長要素、及び任意選択の標的指向性ポリペプチド、さらに組成物中の各ポリペプチドを接続する１つ以上のリンカーで構成される。第１のポリペプチド、例えば、ＩＬ−２変異タンパク質は、活性物質として提供される。遮断部分は、インターロイキンの活性を遮断するために提供される。リンカーポリペプチド、例えば、プロテアーゼで切断可能なポリペプチドは、活性物質の意図される標的で特異的に発現されるプロテアーゼで切断されるよう提供される。任意選択で、遮断部分は、インターロイキンポリペプチドと結合することによって第１のポリペプチドの活性を遮断する。いくつかの実施形態では、遮断部分、例えば、立体遮断ペプチドは、プロテアーゼ切断可能リンカーを介してインターロイキンに連結され、作用部位で切断（例えば、炎症特異的または腫瘍特異的なプロテアーゼによって）されて、所望の部位でサイトカイン完全活性を遊離する。
【０１６０】
プロテアーゼ切断部位は、天然に存在するプロテアーゼ切断部位であっても、または人工的に操作されたプロテアーゼ切断部位であってもよい。人工的に操作されたプロテアーゼ切断部位は、切断が起こる所望の環境、例えば、腫瘍等に特異的な２つ以上のプロテアーゼによって切断することができる。プロテアーゼ切断部位は、少なくとも１つのプロテアーゼ、少なくとも２つのプロテアーゼ、少なくとも３つのプロテアーゼ、または少なくとも４つプロテアーゼによって切断可能であり得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン−グリシン、ソルターゼ認識モチーフ、またはソルターゼ認識モチーフとペプチド配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１９５）もしくは（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１９６）（ここで、ｎは、１、２、３、４または５）を含む。一実施形態では、ソルターゼ認識モチーフは、ペプチド配列ＬＰＸＴＧ（配列番号１９３）を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。一実施形態では、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＣ末端に結合している反応性リジン残基と、遮断部分または他の部分のＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸との間にある。一実施形態では、共有結合は、サイトカインポリペプチドのＮ末端に結合している反応性アスパラギン酸残基と、遮断部分または他の部分のＣ末端に結合している反応性リジン残基との間にある。
【０１６２】
切断及び誘導性
本明細書に記載されるように、融合タンパク質においてはサイトカインポリペプチドの活性は減弱されており、腫瘍微小環境内等、活性の所望の部位でのプロテアーゼによる切断により、融合タンパク質よりもサイトカイン受容体アゴニストとしてはるかに活性な融合タンパク質から、ある形態のサイトカインを遊離させる。例えば、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体活性化（アゴニスト）活性は、別個の分子実体としてのサイトカインポリペプチドのサイトカイン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍小さくてよい。融合タンパク質の一部であるサイトカインポリペプチドが別個の分子実体として存在するのは、その分子実体が、サイトカインポリペプチドと実質的に同一なアミノ酸を含有し、追加のアミノ酸を実質的に含まず、他の分子と（共有結合または非共有結合によって）会合していない場合である。必要に応じて、別個の分子実体としてのサイトカインポリペプチドには、発現及び／または精製を助けるためのタグまたは短い配列等のいくつかの追加のアミノ酸配列が含まれてよい。
【０１６３】
他の例では、融合ポリペプチドのサイトカイン受容体活性化（アゴニスト）活性は、融合タンパク質中のプロテアーゼ切断可能リンカーの切断により産生されるサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または約１０００倍小さい。言い換えれば、融合タンパク質中のプロテアーゼ切断可能リンカーの切断により産生されるサイトカインポリペプチドを含有するポリペプチドのサイトカイン受容体活性化（アゴニスト）活性は、融合タンパク質のサイトカイン受容体活性化活性よりも少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍大きい。
【０１６４】
ポリペプチド置換
本明細書に記載するポリペプチドには、所望の機能が維持される限り、対応する天然に存在するタンパク質（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＨＳＡ）と同じアミノ酸配列を有する成分（例えば、サイトカイン、遮断部分）を含めること、または天然に存在するタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有することができる。開示されるタンパク質及びそれらをコードする核酸の任意の既知の修飾及び誘導体または発生し得るものを定義する１つの方法は、特定の既知の参照配列に対する同一性の点で配列変異型を定義することによるものであることが理解される。具体的には、本明細書で提供されるキメラポリペプチドに対して少なくとも、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するポリペプチド及び核酸を開示する。例えば、本明細書に記載の核酸またはポリペプチドのうちのいずれかの配列に対して少なくとも、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの同一性を有するポリペプチドまたは核酸を提供する。当業者は、２つのポリペプチドまたは２つの核酸の同一性を決定する方法を容易に理解する。例えば、同一性は、同一性がその最高レベルになるように２つの配列を整列させた後に計算することができる。
【０１６５】
同一性を計算する別の方法は、公開されているアルゴリズムによって実施することができる。比較用の配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的同一性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似検索方法によって、コンピュータ化されたこれらのアルゴリズムの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査確認によって行ってよい。
【０１６６】
同じ種類の同一性を核酸について、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２（１９８９）、Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０（１９８９）、Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６（１９８９）に開示されるアルゴリズムによって得ることができ、それらは、少なくとも核酸アラインメントに関連する材料については参照により本明細書に組み込まれる。いずれの方法も、典型的には、使用することができること、また、場合によっては、これらの様々な方法の結果が異なる場合があることが理解されるが、当業者は、これらの方法のうちの少なくとも１つで同一性が見出された場合に、その配列が、記述の同一性を有し、かつ本明細書に開示されると言われることを理解する。
【０１６７】
タンパク質の修飾には、アミノ酸配列の修飾が含まれる。アミノ酸配列での修飾は、アレル変異として（例えば、遺伝子多型による）自然に生じ得るか、環境の影響により（例えば、紫外光への曝露による）生じ得るか、または誘発された点変異体、欠失変異体、挿入変異体及び置換変異体等人の介入によって（例えば、クローン化ＤＮＡ配列の変異誘発による）作られ得る。これらの修飾により、アミノ酸配列の変化をもたらすこと、サイレント突然変異を提供すること、制限部位を修飾すること、または他の特定の変異を提供することができる。アミノ酸配列の修飾は、典型的には、置換修飾、挿入修飾または欠失修飾という３つの種類のうちの１つ以上に該当する。挿入には、アミノ末端及び／またはカルボキシル末端での融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は、通常、アミノ末端またはカルボキシル末端での融合の挿入よりも小さい、例えば、約１〜４個の残基の挿入である。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基除去を特徴とする。典型的には、タンパク質分子内の任意の一部位で約２〜６個以下の残基を欠失させる。アミノ酸置換は、典型的には、単一の残基の置換であるが、一度にいくつかの異なる位置で発生させることができ、挿入は、通常、約１〜１０個のアミノ酸残基上であり、欠失は、約１〜３０個の残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対で、すなわち、２個の残基の欠失または２個の残基の挿入で行われる。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを組み合わせて、最終構成体に到達してよい。変異は、読み枠の外に配列を配置してはならず、好ましくは、二次的ｍＲＮＡ構造を生成し得る相補領域を生じさせることがない。置換修飾は、少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている修飾である。そのような置換は一般に以下の表２に従って行われ、保存的置換と呼ばれる。
表２．例示的アミノ酸置換
【表２−１】
2021524756.tif 000007
【表２−２】
2021524756.tif 000008
【０１６８】
特定のアミノ酸置換を含め、修飾は、既知の方法によって行われる。例えば、修飾は、ポリペプチドをコードするＤＮＡのヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって行われ、それにより、修飾をコードするＤＮＡが生成され、その後、組換え細胞培養においてＤＮＡを発現させる。既知配列を有するＤＮＡの所定の部位における置換変異を行う技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異がある。
【０１６９】
修飾を選択して結合を最適化することができる。例えば、親和性成熟技術は、相補性決定領域（ＣＤＲ）内にランダム変異を導入することによってｓｃＦｖの結合を改変するために使用することができる。そのようなランダム変異は、放射線、化学的変異原、エラープローンＰＣＲ等、様々な技術を使用して導入することができる。複数ラウンドの変異及び選択を、例えば、ファージディスプレイ等を使用して実行することができる。
【０１７０】
本開示はまた、本明細書に記載のキメラポリペプチドをコードする核酸、ならびにそのような核酸の、キメラポリペプチドを製造するため、及び治療目的のための、使用に関する。例えば、本発明には、キメラポリペプチドをコードするＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ）、ならびにそのようなＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の治療的使用が含まれる。
【０１７１】
例示的組成物
本発明の例示的な融合タンパク質は、上記の要素を様々な指向で組み合わせる。この項で記載する指向は例としての指向を意味するものであり、限定的なものとみなされるべきではない。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、サイトカイン、遮断部分及び半減期延長要素を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインを、半減期延長要素と遮断部分の間に位置させる。いくつかの実施形態では、サイトカインは、遮断部分及び半減期延長要素に対するＮ末端である。そのようないくつかの実施形態では、サイトカインは遮断部分の近位にあり、そのようないくつかの実施形態では、サイトカインは半減期延長要素の近位にある。サイトカインが切断時に活性であり得るように、少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能リンカーがすべての実施形態に含まれていなければならない。いくつかの実施形態では、サイトカインは遮断部分及び半減期延長要素に対するＣ末端である。追加要素は、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカーによって、または直接融合によって互いに結合させてよい。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、使用される遮断ドメインは半減期を延長させることができ、そのような２つの遮断ドメイン間にサイトカインを位置させる。いくつかの実施形態では、サイトカインを、２つの遮断ドメイン間に位置させ、そのうちの一方は、半減期を延長させることができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、２つのサイトカインは同じ構成体に含まれる。いくつかの実施形態では、サイトカインにはそれぞれ２つの遮断ドメインが接続され（１分子内に合計３つ）、２つのサイトカインドメイン間に１つの遮断ドメインがある。いくつかの実施形態では、薬物動態学的特性を最適化するために１つ以上の追加の半減期延長ドメインを含めてよい。場合によっては、二量体化を促進するために同じサイトカインを２つ含めることが有益である。二量体として機能するサイトカインの一例はＩＦＮγである。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、３つのサイトカインは同じ構成体に含まれる。いくつかの実施形態では、第３のサイトカインは、２つのサイトカイン間の遮断ドメインの代わりに他の２つのサイトカインを遮断するように機能し得る。
【０１７６】
融合タンパク質で使用するための好ましい半減期延長要素は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、血清アルブミンと結合する抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦＶ、ｄＡｂ）、ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ、または前述のうちのいずれかの断片である。いくつかの好ましい実施形態では、遮断部分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または血清アルブミンに結合する抗体もしくは抗体断片、サイトカインと結合してサイトカイン受容体の結合の活性化もしくは活性化を防止する抗体、別のサイトカイン、または前述のうちのいずれかの断片である。追加の標的指向性ドメインを含む好ましい実施形態では、標的指向性ドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、及びフィブロネクチン等、がん細胞の表面で豊富になっている細胞表面タンパク質と結合する抗体である。
【０１７７】
治療方法及び医薬組成物
さらに、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、もしくは移植片対宿主病等の疾患もしくは障害を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法を提供する。典型的には医薬組成物として投与される、本明細書に開示する融合タンパク質を有効量にて投与することを、それを必要とする対象に行う方法。いくつかの実施形態では、方法はさらに、そのような疾患または障害を有するかまたは発症するリスクがある対象を選択することを含む。医薬組成物は、好ましくは、炎症部位または腫瘍で活性化される、遮断されたサイトカイン、その断片もしくは変異タンパク質を含む。一実施形態では、キメラポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、その断片または変異タンパク質及び血清中半減期延長要素を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、その断片または変異タンパク質及び遮断部分、例えば、立体遮断ポリペプチドを含み、かかる立体遮断ポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、その断片または変異タンパク質の活性を立体的に遮断することができる。別の実施形態では、キメラポリペプチドは、サイトカインポリペプチド、その断片または変異タンパク質、遮断部分、及び血清中半減期延長要素を含む。
【０１７８】
炎症は、病原体、損傷した細胞、刺激物質等の有害な刺激に対する体組織の複雑な生物学的応答の一部であり、免疫細胞、血管、分子メディエーターが関与する防御反応である。炎症の機能は、細胞傷害の最初の原因を排除し、元の傷害及び炎症過程により損傷を受けた壊死細胞及び壊死組織を取り除き、組織修復を開始することである。炎症は、感染により生じるか、症状として生じるか、または疾患、例えば、がん、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、ミオパシー、ＨＩＶ、肥満、もしくは自己免疫疾患として生じ得る。自己免疫疾患は、自己抗原に対する異常な免疫応答から生じる慢性病態である。本明細書に開示するポリペプチドで治療され得る自己免疫疾患としては、狼瘡、セリアック病、１型真性糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
医薬組成物は、１つ以上のプロテアーゼ切断可能リンカー配列を含むことができる。リンカー配列は、それぞれのポリペプチドが第１のポリペプチドの活性を阻害することができるよう、ポリペプチド間に柔軟性を提供するのに役立つ。リンカー配列は、サイトカインポリペプチド、その断片または変異タンパク質、遮断部分、及び血清中半減期延長要素のうちのいずれかまたは全ての間に位置させることができる。任意選択で、組成物は、２つ、３つ、４つ、または５つのリンカー配列を含む。リンカー配列、２つ、３つ、または４つのリンカー配列は同一または異なるリンカー配列であり得る。一実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２０１）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号２０２）、またはＧ（ＳＧＧＧ）２ＳＧＧＴ（配列番号２０３）を含む。別の実施形態では、リンカーは、ＨＳＳＫＬＱ（配列番号２５）、ＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号１９７）、ＩＰＶＳＬＲＳＧ（配列番号１９８）、ＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１９９、及びＳＧＥＳＰＡＹＹＴＡ（配列番号２００）からなる群から選択されるプロテアーゼ切断可能配列を含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、リンカーは、カリクレイン、トロンビン、キマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＧ、エラスターゼ、ＰＲ−３、グランザイムＭ、カルパイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、プラスミノーゲン活性化因子、カテプシン、カスパーゼ、トリプターゼ、または腫瘍細胞表面プロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断される。
【０１８１】
適切なリンカーは、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）〜２０アミノ酸、２アミノ酸〜１５アミノ酸、３アミノ酸〜１２アミノ酸等の異なる長さであり得、これには、４アミノ酸〜１０アミノ酸、アミノ酸〜９アミノ酸、６アミノ酸〜８アミノ酸、または７アミノ酸〜８アミノ酸が含まれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０のアミノ酸であってよい。
【０１８２】
さらに、がんを有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法を提供する。方法は、典型的には医薬組成物として投与される、本明細書に開示するキメラポリペプチド（融合タンパク質）を有効量にて投与することを、それを必要とする対象に行うことを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、がんを有するかまたは発症するリスクがある対象を選択することを含む。医薬組成物は、好ましくは、腫瘍部位で活性化される、遮断されたサイトカイン、その断片もしくは変異タンパク質を含む。好ましくは、腫瘍は固形腫瘍である。がんは、結腸癌、肺癌、黒色腫、肉腫、腎細胞腫、及び乳癌であり得るが、これに限定されない。
【０１８３】
方法ではさらに、がんを治療する１つ以上の追加の薬剤、例えば、化学療法薬（例えば、アドリアマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アルケラン、ベルバン、オンコビン、フルオロウラシル、チオテパ、メトトレキサート、ビサントレン、ノアントロン（Ｎｏａｎｔｒｏｎｅ）、チグアニン（Ｔｈｉｇｕａｎｉｎｅ）、シタリビン（Ｃｙｔａｒｉｂｉｎｅ）、プロカラビジン（Ｐｒｏｃａｒａｂｉｚｉｎｅ））、腫瘍免疫療法薬（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−１、抗ＣＤ４７、抗ＧＤ２）、細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ、Ｔ細胞療法）、腫瘍溶解性ウイルス等の投与を行うことを含む。
【０１８４】
本明細書では、キメラポリペプチド及び薬理学的に許容される担体を含有する医薬製剤または組成物が提供される。本明細書で提供される組成物は、インビトロまたはインビボでの投与に好適である。薬理学的に許容される担体とは、生物学的または他の点で望ましくないということがない材料を意味し、すなわち、かかる材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすか、またはそれが含有されている医薬製剤もしくは組成物の他の成分と有害な様態で相互作用することなく、対象に投与される。担体は、有効成分の分解を最小限にするよう、また、対象における有害な副作用を最小限にするよう選択される。
【０１８５】
適切な担体及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。典型的には、適切な量の薬理学的に許容される塩を製剤中に用いて製剤を等張性にするが、所望であれば、製剤は高張性または低張性であり得る。薬理学的に許容される担体の例としては、滅菌水、生理食塩水、リンゲル液のような緩衝液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは一般に、約５〜約８または約７〜７．５である。他の担体には、免疫原性ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス等の徐放性調製物が含まれる。マトリクスは、例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子等の成形物品の形態にある。特定の担体が、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、より好ましい場合がある。担体は、ヒトまたは他の対象に対するキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列の投与に適したものである。
【０１８６】
医薬製剤または組成物は、局所または全身的な治療が所望されるか否かに応じて、及び治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与される。組成物は、いくつかの投与経路のいずれかを介して投与され、これには、局所、経口、非経口、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮、肝内、頭蓋内、噴霧／吸入を含むか、または気管支鏡検査を介した設置によるものが含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、腫瘍内、関節内、髄腔内等、局所的に（非全身的に）投与される。
【０１８７】
非経口投与用調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油、例えば、オリブ油等、及び注入可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル等である。水性担体には、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれ、生理食塩水及び緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体及び栄養補充薬、電解質補充薬（リンゲルデキストロースに基づくもの等）等が含まれる。例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等のような保存剤及び他の添加剤が任意選択で存在する。
【０１８８】
局所投与用製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴薬、坐剤、スプレー剤、液剤及び粉末が含まれる。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤もしくは油性基剤、粘稠剤等が任意選択で必要であるかまたは望ましい。
【０１８９】
経口投与用組成物には、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水性媒体に溶解させた懸濁液もしくは溶液、カプセル、小袋またはテーブルズが含まれる。粘稠剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が任意選択で望ましい。
【０１９０】
任意選択で、キメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列は、ベクターによって投与される。インビトロまたはインビボで、例えば、発現ベクターを介して、核酸分子及び／またはポリペプチドを細胞に送達するために使用することができるいくつかの組成物及び方法がある。これらの方法及び組成物は、ウイルス系送達システム及び非ウイルス系送達システムの２つの種類に大別することができる。そのような方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書に記載する組成物及び方法とともに使用するために容易に適合可能である。そのような組成物及び方法は、インビトロまたはインビボで細胞をトランスフェクトまたは形質導入するため、例えば、コードされたキメラポリペプチドを発現し、好ましくは分泌する細胞株を製造するため、または核酸を対象に治療的に送達するために使用することができる。本明細書に開示するキメラ核酸の成分は、典型的には、融合タンパク質をコードするようインフレームで機能的に連結される。
【０１９１】
本明細書で使用する場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、開示の核酸を分解されない状態で細胞に輸送し、かつ、送達先の細胞に核酸分子及び／またはポリペプチドの発現をもたらすプロモーターを含む物質である。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビス、及び他のＲＮＡウイルス等であり、これらのウイルスでＨＩＶ骨格を有するものが含まれる。また、これらのウイルスの特性を共有し、ベクターとしての使用に適した任意のウイルスファミリーも好ましい。レトロウイルスベクターは、Ｃｏｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）により概説されており、ベクター及びその製造方法について参照により本明細書に組み込まれる。複製欠損アデノウイルスの構築が記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２１３−２０（１９８７）、Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−８３（１９８６）、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−７４（１９８６）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２２６−３９（１９８７）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−７２（１９９３））。これらのウイルスのベクターとしての利点と使用は、それらが最初の感染細胞内で複製できるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することができないため、他の細胞型に伝播することができる範囲が制限されることである。組換え型アデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、及び他の多くの組織部位への直接のインビボ送達後に高効率を達成することが示されている。他の有用な系には、例えば、複製ワクシニアウイルスベクター及び宿主限定非複製ワクシニアウイルスベクターが含まれる。
【０１９２】
提供されるポリペプチド及び／または核酸分子は、ウイルス様粒子を介して送達することができる。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスタンパク質（複数可）で構成されている。ウイルス様粒子を作製及び使用するための方法は、例えば、Ｇａｒｃｅａ  ａｎｄ  Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：５１３−７（２００４）に記載されている。
【０１９３】
提供されるポリペプチドは、サブウイルス密集体（ｓｕｂｖｉｒａｌ  ｄｅｎｓｅ  ｂｏｄｉｅｓ）（ＤＢ）によって送達することができる。ＤＢは、膜融合によってタンパク質を標的細胞に輸送する。ＤＢを作製及び使用するための方法は、例えば、Ｐｅｐｐｅｒｌ−Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：２７８−８４（２００３）に記載されている。
【０１９４】
提供されるポリペプチドは、外被凝集体によって送達することができる。外被凝集体を作製及び使用するための方法は、国際公開公報第ＷＯ２００６／１１０７２８号に記載されている。
【０１９５】
非ウイルス系送達方法には、核酸分子及びポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含めることができ、ここで、核酸は、発現制御配列に機能的に連結される。適切なベクター骨格には、例えば、プラスミド、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、またはＰＡＣ等の当該技術分野で日常的に使用されるものが含まれる。多数のベクター及び発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）等の企業から市販されている。ベクターは、典型的には、１つ以上の調節領域を含有する。調節領域には、限定することなく、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位、誘導性要素、タンパク質結合配列、５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、及びイントロンが含まれる。そのようなベクターはまた、ＣＨＯ細胞等の適切な宿主細胞での発現によってキメラポリペプチドを作製するために使用することもできる。
【０１９６】
哺乳類宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源から得てよく、例えば、ポリオーマウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）等のウイルスのゲノムから得るか、または異種哺乳類プロモーター、例えば、β−アクチンプロモーターもしくはＥＦ１αプロモーターから得るか、またはハイブリッドもしくキメラプロモーター（例えば、β−アクチンプロモーターに融合させたＣＭＶプロモーター）から得てよい。もちろん、宿主細胞または関連種からのプロモーターもまた本明細書では有用である。
【０１９７】
エンハンサーとは、一般に、機能する転写開始部位からの距離が一定ではなく、転写単位に対して５’でも３’でもあり得るＤＮＡ配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内部にあり得、またコード配列自体の内部にもあり得る。それらは、通常、長さが１０〜３００塩基対（ｂｐ）であり、シスで機能する。エンハンサーは通常、近傍のプロモーターからの転写を増加させるよう機能する。エンハンサーには、転写の調節を媒介する応答配列を含有させることもできる。哺乳類の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン、及びインスリン）から多くのエンハンサー配列が知られており、典型的には、一般的な発現には真核細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーである。
【０１９８】
プロモーター及び／またはエンハンサーは誘導性であり得る（例えば、化学的または物理的に調節される）。化学的に調節されるプロモーター及び／またはエンハンサーは、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、または金属の存在によって調節され得る。物理的に調節されるプロモーター及び／またはエンハンサーは、例えば、温度及び光等の環境要因によって調節され得る。任意選択で、プロモーター領域及び／またはエンハンサー領域は、構成的プロモーター及び／またはエンハンサーとして作用して、転写される転写単位の領域の発現を最大化することができる。特定のベクターでは、プロモーター領域及び／またはエンハンサー領域は、細胞型特異的な様態で活性であり得る。任意選択で、特定のベクターでは、プロモーター領域及び／またはエンハンサー領域は、細胞型に関係なく、すべての真核細胞において活性であり得る。この種の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β−アクチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、及びレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）である。
【０１９９】
ベクターにはまた、例えば、複製起点及び／またはマーカーも含めることができる。マーカー遺伝子は、細胞に対し、選択可能な表現型、例えば抗生物質耐性等を付与することができる。マーカー産物は、ベクターが細胞に送達されたかどうか、送達された後は、それが発現されているかどうかを決定するために使用される。哺乳類細胞の選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、及びブラストサイジンである。そのような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に首尾よく移されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に生き残ることができる。他のマーカーの例には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びルシフェラーゼが含まれる。さらに、発現ベクターには、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を容易にするよう設計されたタグ配列が含まれ得る。タグ配列、例えば、ＧＦＰ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、またはＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ；Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．）等の配列は、典型的には、コードされたポリペプチドとの融合体として発現される。そのようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含め、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。
【０２００】
本明細書で使用する場合、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質という用語は、ペプチド結合によって連結される２つ以上のアミノ酸を意味するために広く使用される。タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドはまた、本明細書ではアミノ酸配列を指すために同じ意味で使用される。本明細書では、分子を構成するアミノ酸の特定のサイズまたは数を示唆するためにはポリペプチドという用語は使用されないこと、本発明のペプチドは最大で数個からそれ以上のアミノ酸残基を含有することができることを認識されるべきである。全体を通して使用する場合、対象は脊椎動物であり得、より具体的には、哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット、及びモルモット）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び他の任意の動物であり得る。かかる用語は特定の年齢または性別を意味しない。したがって、雌雄を問わず、成体及び新生の対象が包含されることが意図される。本明細書で使用する場合、患者または対象は、同じ意味で使用されてよく、疾患または障害（例えば、がん）を有する対象を指し得る。患者または対象という用語には、ヒト対象及び獣医学の対象が含まれる。
【０２０１】
疾患もしくは障害を発症するリスクのある対象は、その疾患もしくは障害への遺伝的素因があり得、例えば、家族病歴を有するか、またはその疾患もしくは障害を引き起こす遺伝子変異があるか、またはその疾患もしくは障害の早期兆候もしくは症状を示す。現在疾患または障害を有する対象は、その疾患または障害の１つまたは１つ以上の症状を有しており、その疾患または障害と診断されている場合がある。
【０２０２】
本明細書に記載する方法及び薬剤は、予防的処置及び治療的処置の両方に有用である。予防的使用の場合、治療的有効量の、本明細書に記載するキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列を、発症前（例えば、がんまたは炎症の明らかな徴候の前）または早期発症中（例えば、がんまたは炎症の初期の徴候及び症状時）に対象に投与する。予防的投与は、がんまたは炎症の症状の発現前に数日から数年間行うことができる。予防的投与は、例えば、がんに対する遺伝的素因があると診断された対象の予防的治療において使用することができる。治療的治療では、がんまたは炎症（例えば、自己免疫疾患）の診断または発症後に、治療的有効量の、本明細書に記載のキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列を対象に投与することが行われる。予防的使用はまた、患者が、炎症が予測される治療、例えば、化学療法等を受けている場合にも適用され得る。
【０２０３】
本明細書に教示される方法に従って、対象は、有効量の薬剤（例えば、キメラポリペプチド）を投与される。有効量及び有効投与量という用語は、同じ意味で使用される。有効量という用語は、所望の生理学的応答を生じさせるために必要な任意の量として定義される。薬剤を投与するための有効量及びスケジュールは、経験的に決定されてよく、そのような決定を行うことは、当業者の技量の範囲内である。投与のための投与量範囲は、疾患または障害の１つ以上の症状が影響を受ける（例えば、低減または遅延する）、所望の効果をもたらすために十分に多いものである。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等のような実質的な有害副作用を引き起こすほど大量であってはならない。一般的、投与量は、年齢、状態、性別、疾患の種類、疾患もしくは障害の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれるか否かにより変動し、当業者により決定され得る。投与量は、禁忌があった場合には、個々の医師が調整することができる。投与量は変動し得るとともに、１回分以上の用量を連日、１日または数日間投与され得る。所与のクラスの医薬品に適切な投与量について、手引を文献に見出することができる。
【０２０４】
本明細書で使用する場合、治療、治療する、または治療することという用語は、疾患もしくは状態の影響またはその疾患もしくは状態の症状を低減させる方法を指す。したがって、開示の方法では、治療とは、確立された疾患もしくは状態またはその疾患もしくは状態の症状の重症度における、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低減を指し得る。例えば、疾患を治療するための方法は、対象の疾患の１つ以上の症状において、対照と比較して１０％の低減がある場合、治療とみなされる。したがって、低減は、天然または対照でのレベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％〜１００％の間の任意の低減率であり得る。治療は必ずしも疾患、状態、またはその疾患もしくは状態の症状の治癒または完全な除去を指すものではないと理解される。
【０２０５】
本明細書で使用する場合、疾患または障害を予防する、予防すること、及び予防という用語とは、行為、例えば、対象がその疾患または障害の１つ以上の症状を示し始める前、またはそれとほぼ同時に行われる、キメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸配列の投与等の行為であって、その疾患もしくは障害の１つ以上の症状の発症または増悪を阻害するかまたは遅らせる行為を指す。本明細書で使用する際、減少、低減、または阻害に関する言及は、対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の変化を含む。このような用語は、完全な排除を含み得るが、必ずしもそれを含むとは限らない。
【０２０６】
ＩＬ２Ｒβγと比べると、ＩＬ２Ｒαβγに対して選択的であるＩＬ−２変異型が開発された（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１１９７−２０２、Ｃａｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．，８：２１７１−８３）。これらの変異型は、ＩＬ２ＲＢに対するその親和性を低下させるアミノ酸置換を有する。ＩＬ−２は、ＩＬ２ＲＧに対して検出不可能な親和性を有するため、結果的にこれらの変異体はＩＬ２Ｒβγ受容体複合体に対する親和性が低く、ＩＬ２Ｒβγ発現細胞を活性化する能力が低いが、ＩＬ２ＲＡと結合する能力、及びＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体と結合して活性化する能力は保持する。
【０２０７】
これらの変異型の１つであるＩＬ２／Ｎ８８Ｒ（Ｂａｙ  ５０−４７９８）は、ＩＬ２Ｒβγを発現するＮＫ細胞が毒性の主な原因であるという仮説に基づいて、免疫系刺激因子としての低毒性型ＩＬ−２として臨床試験が行われた。Ｂａｙ  ５０−４７９８は、ＮＫ細胞と比較して活性化Ｔ細胞の増殖を選択的に刺激することが示され、がん患者（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，２００７，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３：３３１２−９）及びＨＩＶ患者（Ｄａｖｅｙ，Ｒ．Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，２８：８９−１００）を対象とした第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で評価が行われた。これらの臨床試験は、Ｂａｙ  ５０−４７９８がアルデスロイキンよりもかなり安全で忍容性が高いことを示し、また、Ｔｒｅｇ細胞が豊富な細胞集団であるＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞のレベルを上昇させることも示した。これらの試験に続き、この分野の研究で、Ｔｒｅｇ細胞の固有性がさらに十分に確立され、Ｔｒｅｇ細胞がＩＬ２Ｒαβγを選択的に発現することが実証された（Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３３：１５３−６５に概説されている）。
【０２０８】
さらに、天然Ｉｌ−２と比較してＣＤ２５鎖に対する親和性を選択的に改変させる変異体を作製することができる。
【０２０９】
ＩＬ−２を操作して、ＩＬ−２Ｒ複合体に一般的に結合するか、またはＩＬ−２Ｒαサブユニットに、対応する野生型ＩＬ−２もしくは現在利用可能な変異体（Ｃ１２５Ｓと呼ばれ、１２５位のシステイン残基がセリン残基に置き換えられている）とは異なる親和性で特異的に結合する、変異体を作製することができる。
【０２１０】
したがって、本発明は、野生型ＩＬ−２と少なくとも８０％同一（例えば、８５％、８７％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一）なアミノ酸配列が含まれており、かつ、ＷＴ  ＩＬ−２と比較して、二量体のＩＬ−２受容体よりもＩＬ−２三量体受容体に対して高度に結合する、変異インターロイキン−２（ＩＬ−２＊）ポリペプチドを特徴とする。典型的には、変異タンパク質はまた、野生型ＩＬ−２がＩＬ−２Ｒαと結合する親和性よりも高い親和性でＩＬ−２受容体αサブユニット（ＩＬ−２Ｒα）とも結合する。変異ＩＬ−２ポリペプチド内のアミノ酸配列は、保存的または非保存的置換とみなされ得る、１つ以上のアミノ酸置換を含有する（または含有するのみ）ことにより、配列番号１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ６０５６８）とは異なり得る。天然に存在しないアミノ酸も組み込むことができる。別法として、またはさらに、アミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸残基を含有すること、ならびに付加及び／または欠失することにより、配列番号１（「参照」配列とみなされ得る）とは異なり得る。より具体的には、アミノ酸配列は、配列番号１の１位、４位、８位、９位、１０位、１１位、１３位、１５位、２６位、２９位、３０位、３１位、３５位、３７位、４６位、４８位、４９位、５４位、６１位、６４位、６７位、６８位、６９位、７１位、７３位、７４位、７５位、７６位、７９位、８８位、８９位、９０位、９２位、９９位、１０１位、１０３位、１１４位、１２５位、１２８位、もしくは１３３位（またはその組み合わせ）のうちの少なくとも１つの位置での変異によって配列番号１のアミノ酸配列のものとは異なり得る。前述のように、これらの位置のうちわずか１つを改変してよく、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１またはそれ以上（最大すべてを含む）の位置を改変してよい。例えば、アミノ酸配列は、６９位及び７４位で配列番号１とは異なり得、さらに３０位、３５位、及び１２８位のうちの１つ以上で異なり得る。アミノ酸配列はまた、以下の位置セット（ａ）６４位、６９位、及び７４位；（ｂ）６９位、７４位、及び１０１位；（ｃ）６９位、７４位、及び１２８位；（ｄ）３０位、６９位、７４位、及び１０３位、（ｅ）４９位、６９位、７３位、及び７６位、（ｆ）６９位、７４位、１０１位、及び１３３位、（ｇ）３０位、６９位、７４位、及び１２８位、（ｈ）６９位、７４位、８８位、及び９９位、（ｉ）３０位、６９位、７４位、及び１２８位、（ｊ）９位、１１位、３５位、６９位、及び７４位；（ｋ）１位、４６位、４９位、６１位、６９位、及び７９位；（１）４８位、６８位、７１位、９０位、１０３位、及び１１４位；（ｍ）４位、１０位、１１位、６９位、７４位、８８位、及び１３３位；（ｎ）１５位、３０位  ３１位、３５位、４８位、６９位、７４位、及び９２位；（Ｏ）３０位、６８位、６９位、７１位、７４位、７５位、７６位、及び９０位；（ｐ）３０位、３１位、３７位、６９位、７３位、７４位、７９位、及び１２８位；（ｑ）２６位、２９位、３０位、５４位、６７位、６９位、７４位、及び９２位；（ｒ）８位、１３位、２６位、３０位、３５位、３７位、６９位、７４位、及び９２位；及び��ｓ）２９位、３１位、３５位、３７位、４８位、６９位、７１位、７４位、８８位、及び８９位のうちの１つのセットの位置において、配列番号２（参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７５６９２１５に開示されている）とは異なり得る。これらの位置での変異を除いては、変異ＩＬ−２ポリペプチドのアミノ酸配列は、他の点では配列番号１と同一であり得る。特定の置換に関して、アミノ酸配列は、以下の変異、Ａ１Ｔ、Ｓ４Ｐ、Ｋ８Ｒ、Ｋ９Ｔ、Ｔ１０Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｑ１３Ｒ、Ｅ１５Ｋ、Ｎ２６Ｄ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｄ、Ｎ３０Ｔ、Ｙ３１Ｈ、Ｙ３１Ｃ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｔ３７Ｒ、Ｍ４６Ｌ、Ｋ４８Ｅ、Ｋ４９Ｒ、Ｋ４９Ｅ、Ｋ５４Ｒ、Ｅ６１Ｄ、Ｋ６４Ｒ、Ｅ６７Ｇ、Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｔ、Ｎ７１Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ａ７３Ｖ、Ｑ７４Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｋ７６Ｅ、Ｋ７６Ｒ、Ｈ７９Ｒ、Ｎ８８Ｄ、Ｉ８９Ｖ、Ｎ９０Ｈ、Ｉ９２Ｔ、Ｓ９９Ｐ、Ｔ１０１Ａ、Ｆ１０３Ｓ、Ｉ１１４Ｖ、Ｉ１２８Ｔ、Ｉ１２８Ａ、Ｔ１３３Ａ、またはＴ１３３Ｎのうちの１つ以上を有することによって、配列番号１とは異なり得る。ここでの命名法は科学文献の命名法と一致しており、野生型または参照配列のアミノ酸の１文字表記の後に、配列内のその位置が続き、次にそれに置き換わるアミノ酸の１文字表記がある。したがって、Ａ１Ｔは、１位のアラニン残基のトレオニンによる置換を表す。本発明の範囲内の他の変異ポリペプチドには、Ｖ６９（例えば、Ａ）及びＱ７４（例えば、Ｐ）に置換を有する配列番号２の変異体が含まれているものが含まれる。例えば、アミノ酸配列には、配列番号２に対する以下の変異セット（ａ）Ｋ６４Ｒ、Ｖ６９Ａ、及びＱ７４Ｐ、（ｂ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＴ１０１Ａ、（ｃ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ｔ、（ｄ）Ｎ３０Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＦ１０３Ｓ、（ｅ）Ｋ４９Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ、及びＫ７６Ｅ、（ｆ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｔ１０１Ａ、及びＴ１３３Ｎ、（ｇ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ａ、（ｈ）Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＳ９９Ｐ、（ｉ）Ｎ３０Ｓ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ１２８Ｔ、（ｊ）Ｋ９Ｔ、Ｑ１１Ｒ、Ｋ３５Ｒ、Ｖ６９Ａ、及びＱ７４Ｐ、（ｋ）Ａ１Ｔ、Ｍ４６Ｌ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ６１Ｄ、Ｖ６９Ａ、及びＨ７９Ｒ、（ｌ）Ｋ４８Ｅ、Ｅ６８Ｄ、Ｎ７１Ｔ、Ｎ９０Ｈ、Ｆ１０３Ｓ、及びＩ１１４Ｖ、（ｍ）Ｓ４Ｐ、Ｔ１０Ａ、Ｑ１１Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＴ１３３Ａ、（ｎ）Ｅ１５Ｋ、Ｎ３０Ｓ  Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ、（ｏ）Ｎ３０Ｓ、Ｅ６８Ｄ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ａ、Ｑ７４Ｐ、Ｓ７５Ｐ、Ｋ７６Ｒ、及びＮ９０Ｈ、（ｐ）Ｎ３０Ｓ、Ｙ３１Ｃ、Ｔ３７Ａ、Ｖ６９Ａ、Ａ７３Ｖ、Ｑ７４Ｐ、Ｈ７９Ｒ、及びＩ１２８Ｔ、（ｑ）Ｎ２６Ｄ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ５４Ｒ、Ｅ６７Ｇ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ、（ｒ）Ｋ８Ｒ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ２６Ｄ、Ｎ３０Ｔ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ｒ、Ｖ６９Ａ、Ｑ７４Ｐ、及びＩ９２Ｔ、ならびに（ｓ）Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ、及びＩ８９Ｖのうちの１つが含まれ得る。配列番号２は、ＵＳ７５６９２１５に開示されており、本発明に使用できる例示的ＩＬ−２ポリペプチド配列として参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２１１】
上記のように、本明細書に開示する変異ＩＬ−２ポリペプチドのいずれも、記載される配列を含めることができ、それらは記載配列に限定することも、別の場合には配列番号１と同一であることも可能である。さらに、本明細書に記載の変異ＩＬ−２ポリペプチドのいずれも、任意選択で、１２５位のシステイン残基の別の残基（例えば、セリン）での置換を含むことができ、及び／または任意選択で、配列番号１の１位のアラニン残基の欠失を含むことができる。
【０２１２】
本明細書に開示する変異ＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒαサブユニットに約２８ｎＭ未満のＫｄ（例えば、約２５ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ、約５００ｐＭ未満、または約１００ｐＭ未満）で結合することができる。具体的には、変異ＩＬ−２ポリペプチドは、１．０ｎＭ未満（例えば、約０．８ｎＭ、０．６ｎＭ、０．４ｎＭ、または０．２ｎＭ）の親和性平衡定数を有し得る。親和性は、ＩＬ−２ＲαサブユニットまたはＩＬ−２受容体複合体（例えば、細胞の表面に発現されるかまたは別の場合には膜に結合している複合体）からの相対的な解離速度として表すこともできる。例えば、変異ＩＬ−２ポリペプチドは、野生型ポリペプチドまたはＩＬ−２を用いる治療薬、例えば、ＩＬ−２＊と比較して、低い速度で、例えば、ＩＬ−２Ｒα等から解離することができる。別法として、親和性は、ＩＬ−２＊ポリペプチドが、例えば、ＩＬ−２Ｒを発現する細胞の表面上に存続する時間、または平均時間として特徴付けることができる。例えば、ＩＬ−２＊ポリペプチドは、受容体上で少なくとも約２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または２５０倍（またはそれ以上）存続することができる。
【０２１３】
開示される方法及び組成物に、使用され得るか、それらと併用され得るか、それらの調製において使用され得るか、またはそれらの産物である、材料、組成物、及び成分が開示される。これら及び他の材料は、本明細書において開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物の様々な個々及び集約的組み合わせ及び順列のそれぞれに関する具体的な言及が明確に開示されない場合があるが、それぞれが具体的に企図され、本明細書に記載されることが理解される。例えば、ある方法が開示及び考察され、その方法を含む、いくつかの分子に対して行われ得るいくつかの修飾が考察される場合、その方法のあらゆる組み合わせ及び順列、ならびに可能な修飾は、明らかに他の意味が明示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意の部分集合または組み合わせもまた、具体的に企図され開示される。この概念は、本開示の全態様に適用され、これには、開示される組成物を使用する方法でのステップが含まれるが、これに限定されない。したがって、実施され得る多様な追加ステップある場合、これらの追加ステップの各々は、開示される方法の任意の具体的な方法のステップまたは方法のステップの組み合わせを用いて実施可能であること、及びそのような組み合わせまたは組み合わせの部分集合の各々が具体的に企図され、開示されるとみなされるべきであることが理解される。
【０２１４】
本明細書で引用した刊行物及びそれらを引用した理由となる材料は、参照によりそれら全体が具体的に本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２１５】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。本明細書で提供される概要を踏まえ、他の様々な実施形態を実施してよいことが理解される。
【０２１６】
実施例１：ＥＬＩＳＡによる融合タンパク質中のＩＬ−２、ＩＬ−２変異タンパク質、ＩＬ−２Ｒα及びＩＬ−２Ｒγの検出
市販の抗体、例えば、抗ＩＬ−２モノクローナル（ＪＥＳ６−１Ａ１２）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）を用いてＩＬ−２変異タンパク質を検出する。モノクローナル抗体がサイトカインまたは変異タンパク質を認識するかどうかを示すため陽性対照を使用する。ＩＬ−２Ｒα鎖及びＩＬ−２Ｒγ鎖に対する抗体も使用する。９６ウェルプレートのウェルを、抗体（２．５μｇ／ｍｌ）含有ＰＢＳでコーティングする。０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む５％無脂肪乳含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｍ−Ｔｗ）でウェルをブロッキングし、融合タンパク質を３７℃で１〜２時間加えた。洗浄後、抗ＩＬ−２ビオチン標識抗体、例えば、ＪＥＳ５Ｈ４（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加え、Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ  ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）を使用して結合を検出する。０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ４．５）及び０．０４％Ｈ２Ｏ２に溶解した５０μｌのＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えることによりＥＬＩＳＡプレートを作製し、５０μｌ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて停止し、４９０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０２１７】
実施例２：ＭＭＰ９プロテアーゼによる融合タンパク質のプロテアーゼ切断
当業者であれば、タンパク質切断アッセイを設定する方法に精通しているであろう。１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１００ｕｇのタンパク質を１ｕｇの活性ＭＭＰ９（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＳＡＥ００７８−５０またはＥｎｚｏカタログＢＭＬ−ＳＥ３６０）で切断し、室温で最大１６時間インキュベートした。消化されたタンパク質は、その後、機能解析で使用されるか、または試験前に−８０℃で保存される。当該技術分野において周知の方法を使用してＳＤＳ  ＰＡＧＥにより切断の程度をモニターした。図１０、図１３、図１８ａ、図１８ｂ、図２４ｂ、図２４ｃ、及び図２７ａに示すように、ＭＭＰ９プロテアーゼによる融合タンパク質の完全な切断が見られる。
【０２１８】
実施例３：ＣＴＬＬ−２アッセイ
ＣＴＬＬ２細胞（ＡＴＣＣ）を、４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培地中に５００，０００細胞／ウェルの濃度にて懸濁播種し、組換え型ｈＩＬ２または活性化可能なｈＩＬ２の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なｈＩＬ２の活性を試験した。活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって切断型の活性化可能なｈＩＬ２を作製した。発光量に基づく細胞生存性アッセイＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞活性を評価した。結果を図８、図９、及び図２５に示す。
【０２１９】
実施例４：ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα／ＩＬ−２Ｒγキメラポリペプチドのプロテアーゼ切断は抗体への接近可能性及び生物学的に活性なＩＬ−２変異タンパク質の増大をもたらす
プロテアーゼ、例えば、ＰＳＡを用いて、切断前後のＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質を生化学的に特徴付ける。イムノブロット分析は、融合タンパク質がＰＳＡによって切断され得ること、及びＰＳＡでの試料処理後、抗ＩＬ−２抗体と反応性である約２０ｋＤａの予測される低分子量切断産物の強度の増大があることを示す。切断の程度は、ＰＳＡの量及びインキュベーション時間に依存する。興味深いことに、ＥＬＩＳＡによってＰＳＡ処理の前後の融合タンパク質を分析すると、ＰＳＡ切断後、ＩＬ−２の見かけの量が増加することがわかった。この実験では、構成体に応じて、このサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して検出されたＩＬ−２の見かけの量に約２倍または４倍の増加があり、このことは、抗体結合が無傷の融合タンパク質で部分的に妨げられていることを示唆している。同一試料の分割試料も、増殖と生存にＩＬ−２を必要とするＣＴＬＬ−２細胞株を使用したＰＳＡ処理後に分析され、細胞の生存は、比色ＭＴＴアッセイを使用して確認することができる。このアッセイでは、上清がさらに希釈され得るほど、生物学的に活性なＩＬ−２が多く含まれ、ＰＳＡ切断後、生物学的に活性なＩＬ−２の量の増加がある。ＩＬ−２変異タンパク質の増加量は、ＰＳＡ切断後、抗ＩＬ−２抗体と反応性である約２０ｋＤａの予測される低分子量切断断片の増加、抗体の接近可能性の増大、さらに最も重要なことに、生物学的に活性なＩＬ−２変異タンパク質の量の増加があることを示唆する。
【０２２０】
実施例５．プロテアーゼ活性化融合タンパク質のインビボ送達は腫瘍増殖低下をもたらす
キメラポリペプチドを調べてインビボでの生物学的効果を有する可能性があるか否かを決定する。これらの実験では、腹腔内に注入された腫瘍細胞が迅速かつ優先的に、大網に見られる一連の組織化された免疫凝集体である乳斑に最初に結合して増殖する系を使用する（Ｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９：１７３９−５２（２００６））。この系では、融合タンパク質を腹腔内に複数回送達することができること、また、解離した大網細胞を調べることによって腫瘍増殖を分析できることから、腫瘍増殖に対する融合タンパク質治療の効果を調べる好都合な方法が提供される。これらの実験では、インビトロでＭＭＰ２及びＭＭＰ９の両方を発現する、急速に増殖する腫瘍細胞株であるＣｏｌｏｎ３８細胞株が使用され得る。大網組織は通常、比較的少量のＭＭＰ２及びＭＭＰ９を発現するが、Ｃｏｌｏｎ３８腫瘍が大網に存在する場合はＭＭＰレベルが増加する。この腫瘍モデルを使用して、腫瘍増殖に影響を与えるＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の能力を調べる。Ｃｏｌｏｎ３８細胞を腹腔内注射し、１日間結合及び増殖させた後、腹腔内により融合タンパク質で連日処置する。７日目、動物を屠殺し、フローサイトメトリー及びコロニー形成アッセイを使用して大綱を腫瘍増殖について調べる。
【０２２１】
実施例６：ＣＤ２０を標的とする例示的な活性化可能ＩＬ２タンパク質の構築
活性化可能なＩＬ２ドメインの生成
腫瘍または腫瘍細胞に存在するＣＤ２０ポリペプチドに結合することができるＩＬ−２ポリペプチドを、以下のように作製する。（１）ＩＦＮｇポリペプチド配列をコードする核酸配列と、（２）１つ以上のポリペプチドリンカーの核酸配列と、を含有するよう、核酸を生成する。活性化可能なインターロイキンプラスミド構成体は、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティータグを有することができ、ＨＥＫ２９３または他の適切なヒトもしくは哺乳類の細胞株に電気穿孔し、精製する。検証アッセイには、プロテアーゼ存在下でＩＦＮｇ刺激に応答性のＴ細胞を使用するＴ細胞活性化アッセイが含まれる。
【０２２２】
ｓｃＦｖ  ＣＤ２０結合ドメインの生成
ＣＤ２０は、Ｂリンパ球に存在する細胞表面タンパク質の１つである。ＣＤ２０抗原は、Ｂ細胞の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上に見られるものを含め、正常及び悪性のプレＢリンパ球と成熟Ｂリンパ球に見られる。抗原は、造血幹細胞、活性化Ｂリンパ球（形質細胞）及び正常組織では見られない。そのため、主にマウス由来であるいくつかの抗体、すなわち、１Ｆ５、２Ｂ８／Ｃ２Ｂ８、２Ｈ７、及び１Ｈ４が記載されている。
【０２２３】
したがって、ヒト抗ＣＤ２０抗体またはヒト化抗ＣＤ２０抗体を使用して、活性化可能なインターロイキンタンパク質のＣＤ２０結合ドメインのｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化のＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を取得し、構成体のコドンを、任意選択で、ホモサピエンスの細胞での発現用に最適化する。ｓｃＦｖにおけるＶＬドメインとＶＨドメインの出現順序を変更し（すなわち、ＶＬ−ＶＨ、またはＶＨ−ＶＬの配向）、サブユニット「Ｇ４Ｓ」（配列番号２０１）または「Ｇ４Ｓ」（配列番号２０１）の３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２０４）が可変ドメイン同士をつないで、ｓｃＦｖドメインを作製する。抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖプラスミド構成体は、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティータグを有することができ、ＨＥＫ２９３または他の適切なヒトまたは哺乳類の細胞株に電気穿孔し、精製する。検証アッセイには、ＦＡＣＳによる結合分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する動態解析、及びＣＤ２０発現細胞の染色が含まれる。
【０２２４】
活性化可能なＩＬ２タンパク質をコードするＤＮＡ発現構成体のクローニング
プロテアーゼ切断部位ドメインを有する活性化可能なＩＬ２構成体を使用して、活性化可能なインターロイキンタンパク質を、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖドメイン及び血清中半減期延長要素（例えば、ＨＳＡ結合ペプチドまたはＶＨドメイン）と組み合わせて構築する。ＣＨＯ細胞での活性化可能なインターロイキンタンパク質の発現用に、すべてのタンパク質ドメインのコード配列を哺乳類発現ベクター系にクローニングする。簡単に言えば、活性化可能なインターロイキンドメイン、血清半減期延長要素、及びＣＤ２０結合ドメインをコードする遺伝子配列を、ペプチドリンカーＬ１及びＬ２とともに別々に合成し、サブクローニングする。次いで、得られる構成体を、ＣＤ２０結合ドメイン−Ｌ１−ＩＬ２サブユニット１−Ｌ２−プロテアーゼ切断ドメイン−Ｌ３−ＩＬ２サブユニット２−Ｌ４−抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ−Ｌ５−血清中半減期延長要素の順序で互いに連結して最終構成体を得る。すべての発現構成体は、タンパク質の分泌及び精製を促進するため、それぞれ、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグ（配列番号２０５）のコード配列を含むように設計される。
【０２２５】
安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における活性化可能なＩＬ２タンパク質の発現
ＣＨＯ細胞発現系（Ｆｌｐ−Ｉｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１）由来細胞（Ｋａｏ  ａｎｄ  Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９６８；６０（４）：１２７５−８１）を使用する。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが提供する標準細胞培養プロトコルに従って接着細胞を継代培養する。
【０２２６】
懸濁液中での増殖に適応させるために、細胞を組織培養フラスコから剥離させ、無血清培地に入れる。懸濁液に適応した細胞を、１０％ＤＭＳＯを含む培地で凍結保存する。
【０２２７】
分泌された活性化可能なインターロイキンタンパク質を安定して発現する組換え型ＣＨＯ細胞株は、懸濁液適応細胞のトランスフェクションによって生成される。抗生物質ハイグロマイシンＢによる選択時、生存細胞密度を週２回測定し、細胞を遠心分離にかけ、最大密度０．１×１０６生存細胞／ｍＬで新鮮な選択培地に再懸濁する。選択の２〜３週間後、活性化可能なインターロイキンタンパク質を安定して発現する細胞プールを回収し、その時点で、細胞を振とうフラスコ内の標準培地に移す。タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実行して、組換え型分泌タンパク質の発現を確認する。安定した細胞プールをＤＭＳＯ含有培地中で凍結保存する。
【０２２８】
活性化可能なＩＬ２タンパク質は、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日間流加培養で、細胞培養上清への分泌により産生される。１０日後、典型的には、培養生存率７５％超で細胞培養上清を回収する。産生培養物から試料を１日おきに採取し、細胞密度と生存率を評価する。回収日に、細胞培養上清を遠心分離によって除去し、以降の使用前に真空ろ過する。
【０２２９】
細胞培養上清中のタンパク質発現量と産物の完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
【０２３０】
活性化可能なＩＬ２タンパク質の精製
活性化可能なＩＬ２タンパク質を、ＣＨＯ細胞培養上清から２段階の手順で精製する。第１のステップで、構築物をアフィニティークロマトグラフィーに供し、その後、第２のステップでＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００での分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。試料は緩衝液交換され、限外ろ過によって典型的濃度の１ｍｇ／ｍＬ超まで濃縮される。最終試料の純度と均一性（通常９０％超）を、還元条件下及び非還元条件下でのＳＤＳ  ＰＡＧＥ、それに続く抗ＨＳＡまたは抗イディオタイプ抗体を使用するイムノブロッティング、ならびに分析ＳＥＣによってそれぞれ評価する。精製されたタンパク質を、使用時まで等量分割にて−８０℃で保存する。
【０２３１】
実施例７：フローサイトメトリーによる抗原親和性の決定
実施例６の活性化可能なインターロイキンタンパク質を、ヒトＣＤ２０＋細胞及びカニクイザルＣＤ２０＋細胞に対するそれらの結合親和性について試験する。
【０２３２】
実施例６の活性化可能なインターロイキンタンパク質の１００μＬの系列希釈及び少なくとも１つのプロテアーゼとともにＣＤ２０＋細胞をインキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を、同じ緩衝液中で０．１ｍＬの１０μｇ／ｍＬマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体とともに氷上で４５分間インキュベートする。２回目の洗浄サイクルの後、前回と同じ条件下、細胞を０．１ｍＬの１５μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートする。対照として、細胞を、活性化可能なＩＬ２タンパク質を用いずに抗Ｈｉｓ  ＩｇＧとともにインキュベートし、その後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートする。次に、細胞を再度洗浄し、死細胞を排除するために、２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。１×１０４の生細胞の蛍光を、ＭＸＰソフトウェアを使用するＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００  ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェアを使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定する。ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞試料の平均蛍光強度を計算する。二次試薬及び三次試薬単独で染色した細胞の蛍光強度値を減算後、次に、その値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用バージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）の１部位結合（双曲線）を求める方程式を用いたＫＤ値の計算に使用する。
【０２３３】
ＣＤ２０の結合性及び交差反応性をヒトＣＤ２０＋腫瘍細胞株で評価する。交差反応性のＫＤ比を、組換え型ヒト抗原または組換え型カニクイザル抗原を発現するＣＨＯ細胞株について決定されたＫＤ値を使用して計算する。
【０２３４】
実施例８：細胞毒性アッセイ
実施例６の活性化可能なインターロイキンタンパク質を、そのＣＤ２０＋標的細胞に対する免疫応答の媒介についてインビトロで評価する。
【０２３５】
蛍光標識ＣＤ２０＋  ＲＥＣ−１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−３００４）を、実施例６の活性化可能なＩＬ２タンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼ存在下で、ランダムドナーの単離されたＰＢＭＣまたはエフェクター細胞としてのＣＢ１５  Ｔ細胞（標準化Ｔ細胞株）とともにインキュベートする。加湿インキュベーター内で３７℃にて４時間インキュベートした後、標的細胞から上清への蛍光色素の放出を分光蛍光光度計で測定する。実施例６の活性化可能なＩＬ２タンパク質を用いずにインキュベートされた標的細胞及びインキュベーション終了時にサポニン添加によって完全に溶解された標的細胞をそれぞれ、陰性対照及び陽性対照として使用する。
【０２３６】
測定した残存する生きている標的細胞に基づいて、特定の細胞溶解のパーセンテージを次式に従って計算する：［１−（生きている標的（試料）の数／生きている標的（自然発生的））の数］×１００％。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して非線形回帰／４−パラメータロジスティックフィットによりシグモイド型用量反応曲線及びＥＣ５０値を計算する。所与の抗体濃度について得られた溶解値を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用した４パラメータロジスティックフィット分析によりシグモイド用量反応曲線を計算する。
【０２３７】
実施例９：活性化可能なインターロイキンタンパク質の薬物動態
実施例６の活性化可能なインターロイキンタンパク質を半減時間消失について動物試験で評価する。
【０２３８】
活性化可能なＩＬ２タンパク質を、伏在静脈への０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注射としてカニクイザルに投与する。別のカニクイザル群は、サイズは同等であるが血清中半減期延長要素を欠くＩＬ２構成体の投与を受ける。第３及び第４の群はそれぞれ、血清半減期延長要素を有するＩＬ２構成体、及びＣＤ２０と血清半減期延長要素とを有するサイトカインの投与を受け、いずれも活性化可能なインターロイキンタンパク質とサイズが同等である。各試験群は５匹のサルで構成される。示されている時点で血清試料を採取して段階希釈し、ＣＤ２０に対する結合ＥＬＩＳＡを使用してタンパク質の濃度を決定する。
【０２３９】
被験物質血漿濃度を使用して薬物動態解析を実施する。各被験物質の群平均血漿データは、投与後時間に対してプロットされた場合、多指数プロファイルに従っている。データは、分布相及び消失相について、ボーラス投与量及び一次速度定数を用いて標準の２コンパートメントモデルにより適合される。静脈内投与のデータの最良適合を求める一般方程式は、ｃ（ｔ）＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔであり、式中、ｃ（ｔ）は、時間ｔにおける血漿濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸上の切片であり、α及びβはそれぞれ、分布相及び消失相の見かけの一次速度定数である。α相はクリアランスの初期相であり、動物のすべての細胞外液へのタンパク質の分布を反映し、減衰曲線の第２またはβ相の部分は真の血漿クリアランスを表す。そのような方程式を適合させるための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α−ｋ２１）／（α−β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β−ｋ２１）／（α−β）であり、α及びβ（α＞βの場合）は二次方程式ｒ２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根であり、Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝消失速度、ｋ１２＝コンパートメント１からコンパートメント２への移動速度、ｋ２１＝コンパートメント２からコンパートメント１への移動速度、及びＤ＝投与した用量、という推定パラメータを使用する。
【０２４０】
データ分析：濃度対時間プロファイルのグラフを、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）Ｖ．３．０９  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９８６−１９９７．Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を使用して作成する。測定感度未満（ＬＴＲ）として報告された値はＰＫ分析に含めず、グラフに表わさない。薬物動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｖ．３．１  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９９８−１９９９．Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）を使用してコンパートメント分析によって決定する。薬物動態パラメータを、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ  Ｗ  Ａ  ａｎｄ  Ｋｅａｒｎｓ  Ｇ  Ｌ，１９９９，ＩＮ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に記載のように算出する。
【０２４１】
実施例６の活性化可能なインターロイキンタンパク質は、血清半減期延長要素を欠くタンパク質と比較して、消失半減時間の増加等、改善された薬物動態パラメータを有すると予想される。
【０２４２】
例１０：異種移植腫瘍モデル
実施例６の活性化可能なＩＬ２タンパク質を異種移植モデルで評価する。
【０２４３】
雌の免疫欠損ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに致死量以下で照射し（２Ｇｙ）、４×１０６のＲａｍｏｓ  ＲＡ１細胞を右背側腹に皮下接種する。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３に達したら、動物を３つの処置群に割り付ける。群２及び群３（動物８匹ずつ）に１．５×１０７の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注射する。３日後、群３の動物は引き続き、５０μｇの実施例６の活性化可能なインターロイキンタンパク質により合計９回の静脈内投与（１日１回×９日）で処置される。群１及び群２はビヒクルのみで処置する。体重及び腫瘍体積を３０日間測定する。
【０２４４】
実施例６の活性化可能なインターロイキンタンパク質で処置された動物は、それぞれのビヒクル処置対照群と比較して、腫瘍増殖において統計的に有意な遅延を有することが予想される。
【０２４５】
本明細書において本発明の好ましい実施形態を示し、また記載してきたが、そのような実施形態が例として提供されているだけであることは当業者には明らかであろう。ここで、当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び代用を想定するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替案が本発明の実施において採用され得ることを理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、ならびにこれらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの均等物が、それにより包含されることが意図される。
【０２４６】
実施例１１：マウスＩＦＮｇ  ＷＥＨＩ細胞生存アッセイ
ＷＥＨＩ２７９細胞（ＡＴＣＣ）を、２５，０００細胞／ウェルの濃度で、１．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培地に懸濁播種し、組換え型ｍＩＦＮｇまたは誘導性ｍＩＦＮｇの希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間刺激した。非切断型及び切断型の誘導性ｍＩＦＮｇの活性を試験した。切断型誘導性ｍＩＦＮｇを活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）発光量に基づく細胞生存性アッセイを使用して細胞生存を評価した。切断型誘導性ｍＩＦＮｇ分子のＥＣ５０値は、非切断型誘導性ｍＩＦＮｇ分子よりも少なくとも１００倍強力であった。図１６に示すように、培地にヒト血清アルブミンが含有されたアッセイでは、より高い誘導性が見られた。
【０２４７】
実施例１２：マウスＩＦＮｇ  Ｂ１６レポーター細胞アッセイ
Ｂ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＦＮｇ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、７５，０００細胞／ウェルの濃度で、１．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培地に播種し、組換え型ｍＩＦＮｇまたは誘導性ｍＩＦＮｇの希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間刺激した。非切断型及び切断型の誘導性ｍＩＦＮｇの活性を試験した。切断型誘導性ｍＩＦＮｇを活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成した。上清を回収し、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を加えて３７℃で２時間インキュベートし、６２０ｎｍでの吸光度を測定することによりＳＥＡＰ活性化を評価した。結果を図１７、図１９、図２２、図２３、及び図２８に示す。Ｂ１６−Ｂｌｕｅ  ＩＦＮａ／Ｂ細胞を使用してＩＦＮａ融合タンパク質に対して同実験を繰り返した。切断型誘導性ｍＩＦＮａ分子のＥＣ５０値は、非切断型誘導性ｍＩＦＮａ分子よりも少なくとも１００倍強力であった。
【０２４８】
実施例１３．プロテアーゼ活性化融合タンパク質のインビボ送達は腫瘍増殖低下をもたらす
キメラポリペプチドを調べてインビボでの生物学的効果を有する可能性があるか否かを決定する。これらの実験では、腹腔内に注入された腫瘍細胞が迅速かつ優先的に、大網に見られる一連の組織化された免疫凝集体である乳斑に最初に結合して増殖する系を使用する（Ｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９：１７３９−５２（２００６））。この系では、融合タンパク質を腹腔内に複数回送達することができること、また、解離した大網細胞を調べることによって腫瘍増殖を分析できることから、腫瘍増殖に対する融合タンパク質治療の効果を調べる好都合な方法が提供される。これらの実験では、インビトロでＭＭＰ２及びＭＭＰ９の両方を発現する、急速に増殖する腫瘍細胞株であるＣｏｌｏｎ３８細胞株が使用され得る。大網組織は通常、比較的少量のＭＭＰ２及びＭＭＰ９を発現するが、Ｃｏｌｏｎ３８腫瘍が大網に存在する場合はＭＭＰレベルが増加する。この腫瘍モデルを使用して、ＩＦＮ融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べる。Ｃｏｌｏｎ３８細胞を腹腔内注射し、１日間結合及び増殖させた後、腹腔内により融合タンパク質で連日処置する。７日目、動物を屠殺し、フローサイトメトリー及びコロニー形成アッセイを使用して大綱を腫瘍増殖について調べる。
【０２４９】
実施例１３ｂ：キメラポリペプチドを調べてインビボでのその生物学的効果を決定した。
インビトロでＭＭＰ９を発現する、急速に増殖する結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、ＩＦＮγ融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。ＭＣ３８細胞を皮下注射して１０〜１４日間増殖させ、その後、図２１に示されるレベルで融合タンパク質を用いて腹腔内に週２回、合計４回処置した。比較対照として、野生型ｍＩＦＮγを、示されている用量レベルにて１日２回、５日投与／２日休薬のスケジュールで（合計１０回の投与）２週間投与した。腫瘍増殖及び体重を週に約２回、２週間モニターした。
【０２５０】
実施例１４：ＣＤ２０を標的とする例示的ＩＦＮｇタンパク質の構築
活性化可能なサイトカインドメインの生成
腫瘍内または腫瘍細胞上に存在するＣＤ２０ポリペプチドに結合することができるＩＦＮｇポリペプチドを以下のとおり作製する。（１）ＩＦＮｇポリペプチド配列をコードする核酸配列と、（２）１つ以上のポリペプチドリンカーの核酸配列と、を含有するよう、核酸を生成する。活性化可能なＩＦＮｇプラスミド構成体は任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓまたは他のアフィニティータグを有することができ、ＨＥＫ２９３または他の適切なヒトまたは哺乳類細胞株に電気穿孔され、精製される。検証アッセイには、プロテアーゼ存在下でＩＦＮｇ刺激に応答性のＴ細胞を使用するＴ細胞活性化アッセイが含まれる。
【０２５１】
ｓｃＦｖ  ＣＤ２０結合ドメインの生成
ＣＤ２０は、Ｂリンパ球に存在する細胞表面タンパク質の１つである。ＣＤ２０抗原は、Ｂ細胞の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上に見られるものを含め、正常及び悪性のプレＢリンパ球と成熟Ｂリンパ球に見られる。抗原は、造血幹細胞、活性化Ｂリンパ球（形質細胞）及び正常組織では見られない。そのため、主にマウス由来であるいくつかの抗体、すなわち、１Ｆ５、２Ｂ８／Ｃ２Ｂ８、２Ｈ７、及び１Ｈ４が記載されている。
【０２５２】
しがたって、ヒト抗ＣＤ２０抗体またはヒト化の抗ＣＤ２０抗体を使用して、活性化可能なＩＦＮｇタンパク質のＣＤ２０結合ドメインのｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化のＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を取得し、構成体のコドンを、任意選択で、ホモサピエンスの細胞での発現用に最適化する。ｓｃＦｖにおけるＶＬドメインとＶＨドメインの出現順序を変更し（すなわち、ＶＬ−ＶＨ、またはＶＨ−ＶＬの配向）、サブユニット「Ｇ４Ｓ」（配列番号２０１）または「Ｇ４Ｓ」（配列番号２０１）の３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２０４）が可変ドメイン同士をつないで、ｓｃＦｖドメインを作製する。抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖプラスミド構成体は、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティータグを有することができ、ＨＥＫ２９３または他の適切なヒトまたは哺乳類の細胞株に電気穿孔し、精製する。検証アッセイには、ＦＡＣＳによる結合分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する動態解析、及びＣＤ２０発現細胞の染色が含まれる。
【０２５３】
活性化可能なＩＦＮｇタンパク質をコードするＤＮＡ発現構成体のクローニング
プロテアーゼ切断部位ドメインを有する活性化可能なＩＦＮｇ構成体を使用して、活性化可能なＩＦＮｇタンパク質を、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖドメイン及び血清中半減期延長要素（例えば、ＨＳＡ結合ペプチドまたはＶＨドメイン）と組み合わせて構築し、図１４に示すようにドメインを組織化する。ＣＨＯ細胞での活性化可能なＩＦＮｇタンパク質の発現用に、全タンパク質ドメインのコード配列を哺乳類の発現ベクター系にクローニングする。簡単に言えば、活性化可能なＩＦＮｇドメイン、血清中半減期延長要素、及びＣＤ２０結合ドメインをコードする遺伝子配列を、ペプチドリンカーＬ１及びＬ２とともに別々に合成し、サブクローニングする。次いで、得られる構成体を、ＣＤ２０結合ドメイン−Ｌ１−ＩＦＮｇサブユニット１−Ｌ２−プロテアーゼ切断ドメイン−Ｌ３−ＩＦＮｇサブユニット２−Ｌ４−抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ−Ｌ５−血清中半減期延長要素の順序で互いに連結して最終構成体を得る。すべての発現構成体は、タンパク質の分泌及び精製を促進するため、それぞれ、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグ（配列番号２０５）のコード配列を含むように設計される。
安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における活性化可能なＩＦＮｇタンパク質の発現
【０２５４】
ＣＨＯ細胞発現系（Ｆｌｐ−Ｉｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１）由来細胞（Ｋａｏ  ａｎｄ  Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９６８；６０（４）：１２７５−８１）を使用する。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが提供する標準細胞培養プロトコルに従って接着細胞を継代培養する。
【０２５５】
懸濁液中での増殖に適応させるために、細胞を組織培養フラスコから剥離させ、無血清培地に入れる。懸濁液に適応した細胞を、１０％ＤＭＳＯを含む培地で凍結保存する。
【０２５６】
分泌された活性化可能なＩＦＮｇタンパク質を安定して発現する組換え型ＣＨＯ細胞株は、懸濁液適応細胞のトランスフェクションによって生成される。抗生物質ハイグロマイシンＢによる選択時、生存細胞密度を週２回測定し、細胞を遠心分離にかけ、最大密度０．１×１０６生存細胞／ｍＬで新鮮な選択培地に再懸濁する。選択の２〜３週間後、活性化可能なＩＦＮｇタンパク質を安定して発現する細胞プールを回収し、その時点で、細胞を振とうフラスコ内の標準培地に移す。タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実行して、組換え型分泌タンパク質の発現を確認する。安定した細胞プールをＤＭＳＯ含有培地中で凍結保存する。
【０２５７】
活性化可能なＩＦＮｇタンパク質は、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日間流加培養で、細胞培養上清への分泌により産生される。１０日後、典型的には、培養生存率７５％超で細胞培養上清を回収する。産生培養物から試料を１日おきに採取し、細胞密度と生存率を評価する。回収日に、細胞培養上清を遠心分離によって除去し、以降の使用前に真空ろ過する。
【０２５８】
細胞培養上清中のタンパク質発現量と産物の完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
【０２５９】
活性化可能なＩＦＮｇタンパク質の精製
活性化可能なＩＦＮｇタンパク質を、ＣＨＯ細胞培養上清から２段階の手順で精製する。第１のステップで、構築物をアフィニティークロマトグラフィーに供し、その後、第２のステップでＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００での分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。試料は緩衝液交換され、限外ろ過によって典型的濃度の１ｍｇ／ｍＬ超まで濃縮される。最終試料の純度と均一性（通常９０％超）を、還元条件下及び非還元条件下でのＳＤＳ  ＰＡＧＥ、それに続く抗ＨＳＡまたは抗イディオタイプ抗体を使用するイムノブロッティング、ならびに分析ＳＥＣによってそれぞれ評価する。精製されたタンパク質を、使用時まで等量分割にて−８０℃で保存する。
【０２６０】
実施例１５：フローサイトメトリーによる抗原親和性の決定
実施例１４の活性化可能なＩＦＮｇタンパク質を、ヒトＣＤ２０＋細胞及びカニクイザルＣＤ２０＋細胞に対するそれらの結合親和性について試験する。
【０２６１】
実施例１４の活性化可能なＩＦＮｇタンパク質の１００μＬの系列希釈及び少なくとも１つのプロテアーゼとともにＣＤ２０＋細胞をインキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を、同じ緩衝液中で０．１ｍＬの１０μｇ／ｍＬマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体とともに氷上で４５分間インキュベートする。２回目の洗浄サイクルの後、前回と同じ条件下、細胞を０．１ｍＬの１５μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートする。対照として、細胞を、活性化可能なＩＦＮｇタンパク質を用いずに抗Ｈｉｓ  ＩｇＧとともにインキュベートし、その後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートする。次に、細胞を再度洗浄し、死細胞を排除するために、２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。１×１０４の生細胞の蛍光を、ＭＸＰソフトウェアを使用するＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００  ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェアを使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定する。ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞試料の平均蛍光強度を計算する。二次試薬及び三次試薬単独で染色した細胞の蛍光強度値を減算後、次に、その値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用バージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）の１部位結合（双曲線）を求める方程式を用いたＫＤ値の計算に使用する。
【０２６２】
ＣＤ２０の結合性及び交差反応性をヒトＣＤ２０＋腫瘍細胞株で評価する。交差反応性のＫＤ比を、組換え型ヒト抗原または組換え型カニクイザル抗原を発現するＣＨＯ細胞株について決定されたＫＤ値を使用して計算する。
【０２６３】
実施例１６：細胞毒性アッセイ
実施例１４の活性化可能なＩＦＮｇタンパク質を、そのＣＤ２０＋標的細胞に対する免疫応答の媒介についてインビトロで評価する。
【０２６４】
蛍光標識したＣＤ２０＋ＲＥＣ−１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−３００４）を、実施例１４の活性化可能なＩＦＮｇタンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で、ランダムドナーから単離されたＰＢＭＣまたはエフェクター細胞としてのＣＢ１５  Ｔ細胞（標準化Ｔ細胞株）とともにインキュベートする。加湿インキュベーター内で３７℃にて４時間インキュベートした後、標的細胞から上清への蛍光色素の放出を分光蛍光光度計で測定する。実施例１４の活性化可能なＩＦＮｇタンパク質を用いずにインキュベートされた標的細胞及びインキュベーション終了時にサポニン添加によって完全に溶解された標的細胞をそれぞれ、陰性対照及び陽性対照として使用する。
【０２６５】
測定した残存する生きている標的細胞に基づいて、特定の細胞溶解のパーセンテージを次式に従って計算する：［１−（生きている標的（試料）の数／生きている標的（自然発生的））の数］×１００％。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して非線形回帰／４−パラメータロジスティックフィットによりシグモイド型用量反応曲線及びＥＣ５０値を計算する。所与の抗体濃度について得られた溶解値を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用した４パラメータロジスティックフィット分析によりシグモイド用量反応曲線を計算する。
【０２６６】
実施例１７：活性化可能なＩＦＮｇタンパク質の薬物動態  
実施例１４の活性化可能なＩＦＮｇタンパク質を半減時間消失について動物試験で評価する。
【０２６７】
活性化可能なＩＦＮｇタンパク質を、伏在静脈への０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注射としてカニクイザルに投与する。別のカニクイザル群は、サイズは同等であるが血清中半減期延長要素を欠くサイトカインの投与を受ける。第３及び第４の群はそれぞれ、血清半減期延長要素を有するサイトカイン、及びＣＤ２０と血清半減期延長要素とを有するサイトカインの投与を受け、いずれも活性化可能なＩＦＮｇタンパク質とサイズが同等である。各試験群は５匹のサルで構成される。示されている時点で血清試料を採取して段階希釈し、ＣＤ２０に対する結合ＥＬＩＳＡを使用してタンパク質の濃度を決定する。
【０２６８】
被験物質血漿濃度を使用して薬物動態解析を実施する。各被験物質の群平均血漿データは、投与後時間に対してプロットされた場合、多指数プロファイルに従っている。データは、分布相及び消失相について、ボーラス投与量及び一次速度定数を用いて標準の２コンパートメントモデルにより適合される。静脈内投与のデータの最良適合を求める一般方程式は、ｃ（ｔ）＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔであり、式中、ｃ（ｔ）は、時間ｔにおける血漿濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸上の切片であり、α及びβはそれぞれ、分布相及び消失相の見かけの一次速度定数である。α相はクリアランスの初期相であり、動物のすべての細胞外液へのタンパク質の分布を反映し、減衰曲線の第２またはβ相の部分は真の血漿クリアランスを表す。そのような方程式を適合させるための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α−ｋ２１）／（α−β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β−ｋ２１）／（α−β）であり、α及びβ（α＞βの場合）は二次方程式ｒ２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根であり、Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝消失速度、ｋ１２＝コンパートメント１からコンパートメント２への移動速度、ｋ２１＝コンパートメント２からコンパートメント１への移動速度、及びＤ＝投与した用量、という推定パラメータを使用する。
【０２６９】
データ分析：濃度対時間プロファイルのグラフを、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）Ｖ．３．０９  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９８６−１９９７．Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を使用して作成する。測定感度未満（ＬＴＲ）として報告された値はＰＫ分析に含めず、グラフに表わさない。薬物動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｖ．３．１  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９９８−１９９９．Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）を使用してコンパートメント分析によって決定する。薬物動態パラメータを、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ  Ｗ  Ａ  ａｎｄ  Ｋｅａｒｎｓ  Ｇ  Ｌ，１９９９，ＩＮ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に記載のように算出する。
【０２７０】
実施例１４の活性化可能なＩＦＮｇタンパク質は、血清半減期延長要素を欠くタンパク質と比較して、消失半減時間の増加等、改善された薬物動態パラメータを有すると予想される。
【０２７１】
実施例１８：異種移植腫瘍モデル
実施例１４の活性化可能なＩＦＮｇタンパク質を異種移植モデルで評価する。
【０２７２】
雌の免疫欠損ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに致死量以下で照射し（２Ｇｙ）、４×１０６のＲａｍｏｓ  ＲＡ１細胞を右背側腹に皮下接種する。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３に達したら、動物を３つの処置群に割り付ける。群２及び群３（動物８匹ずつ）に１．５×１０７の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注射する。３日後、群３の動物は引き続き、５０μｇの実施例１４の活性化可能なＩＦＮｇタンパク質により合計９回の静脈内投与（１日１回×９日）で処置される。群１及び群２はビヒクルのみで処置する。体重及び腫瘍体積を３０日間測定する。
【０２７３】
実施例１４の活性化可能なＩＦＮｇタンパク質で処置された動物は、それぞれのビヒクル処置対照群と比較して、腫瘍増殖において統計的に有意な遅延を有することが予想される。
【０２７４】
本明細書において本発明の好ましい実施形態を示し、また記載してきたが、そのような実施形態が例として提供されているだけであることは当業者には明らかであろう。ここで、当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び代用を想定するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替案が本発明の実施において採用され得ることを理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、ならびにこれらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの均等物が、それにより包含されることが意図される。
【０２７５】
実施例１９：ＨＥＫ  Ｂｌｕｅアッセイ
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ１２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培地中に２５０，０００細胞／ウェルの濃度にて懸濁播種し、組換え型ｈＩＬ１２、キメラＩＬ１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）または活性化可能なｈＩＬ１２の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なｈＩＬ１２の活性を試験した。切断型誘導性ｈＩＬ１２を活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成した。ＩＬ１２活性を、比色に基づくアッセイである試薬ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量により評価した。結果を図１１、図１２、図１５、及び図２６に示す。
【０２７６】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、１５〜４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培地中に５０，０００細胞／ウェルの濃度にて懸濁播種し、組換え型ｈＩＬ２または活性化可能なｈＩＬ２の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間刺激した。非切断型及び切断型の活性化可能なｈＩＬ２の活性を試験した。切断型誘導性ｈＩＬ２を活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成した。ＩＬ１２活性を、比色に基づくアッセイである試薬ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用して、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の定量により評価した。結果を図２４ａ〜図２４ｄに示す。
【０２７７】
実施例２０：脾細胞Ｔ−Ｂｌａｓｔアッセイ
Ｔ−Ｂｌａｓｔを、ＰＨＡとの６日間インキュベーション及び組換え型ｈＩＬ１２との２４時間インキュベーションでマウス脾細胞から誘導した。その後、Ｔｂｌａｓｔを、２００，０００細胞／ウェルの濃度で、４０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むかまたは含まない培地に懸濁播種し、組換え型ｈＩＬ１２またはキメラＩＬ１２（マウスｐ３５／ヒトｐ４０）またはマウスＩＬ１２の希釈系列を用いて、３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間刺激した。非切断型及び切断型のＩＬ１２の活性を試験した。切断型誘導性ｈＩＬ１２を活性ＭＭＰ９とのインキュベーションによって生成した。ＩＬ１２活性を、ｍＩＦＮγ  ａｌｐｈａＬＩＳＡを使用したＩＦＮγ産生の下流定量によって評価した。
【０２７８】
実施例２１：プロテアーゼ活性化融合タンパク質のインビボ送達は腫瘍増殖の低下をもたらす
キメラポリペプチドを調べてインビボでの生物学的効果を有する可能性があるか否かを決定する。これらの実験では、腹腔内に注入された腫瘍細胞が迅速かつ優先的に、大網に見られる一連の組織化された免疫凝集体である乳斑に最初に結合して増殖する系を使用する（Ｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９：１７３９−５２（２００６））。この系では、融合タンパク質を腹腔内に複数回送達することができること、また、解離した大網細胞を調べることによって腫瘍増殖を分析できることから、腫瘍増殖に対する融合タンパク質治療の効果を調べる好都合な方法が提供される。これらの実験では、インビトロでＭＭＰ２及びＭＭＰ９の両方を発現する、急速に増殖する腫瘍細胞株であるＣｏｌｏｎ３８細胞株が使用され得る。大網組織は通常、比較的少量のＭＭＰ２及びＭＭＰ９を発現するが、Ｃｏｌｏｎ３８腫瘍が大網に存在する場合はＭＭＰレベルが増加する。この腫瘍モデルを使用して、腫瘍増殖に影響を与えるＩＬ−２変異タンパク質融合タンパク質の能力を調べる。Ｃｏｌｏｎ３８細胞を腹腔内注射し、１日間結合及び増殖させた後、腹腔内により融合タンパク質で連日処置する。７日目、動物を屠殺し、フローサイトメトリー及びコロニー形成アッセイを使用して大綱を腫瘍増殖について調べる。
【０２７９】
実施例２２：ＣＤ２０を標的とする例示的な活性化可能なインターロイキンタンパク質の構築
活性化可能なインターロイキンドメインの生成
ヒトＩＬ−１２ｐ３５鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９４５９である。ヒトＩＬ−１２ｐ４０鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９４６０である。ＩＬ−１２ｐ３５及びＩＬ−１２ｐ４０を発現構成体にクローニングする。プロテアーゼ切断部位をＩＬ−１２ｐ３５ドメインとＩＬ−１２ｐ４０ドメインの間に誘導する。腫瘍内または腫瘍細胞上に存在するＣＤ２０ポリペプチドに結合することができるＩＬ−１２ポリペプチドを以下のとおり作製する。（１）ＩＦＮｇポリペプチド配列をコードする核酸配列と、（２）１つ以上のポリペプチドリンカーの核酸配列と、を含有するよう、核酸を生成する。活性化可能なインターロイキンプラスミド構成体は、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティータグを有することができ、ＨＥＫ２９３または他の適切なヒトもしくは哺乳類の細胞株に電気穿孔し、精製する。検証アッセイには、プロテアーゼ存在下でＩＬ−１２刺激に対して応答性であるＴ細胞を使用するＴ細胞活性化アッセイが含まれる。
【０２８０】
ｓｃＦｖ  ＣＤ２０結合ドメインの生成
ＣＤ２０は、Ｂリンパ球に存在する細胞表面タンパク質の１つである。ＣＤ２０抗原は、Ｂ細胞の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上に見られるものを含め、正常及び悪性のプレＢリンパ球と成熟Ｂリンパ球に見られる。抗原は、造血幹細胞、活性化Ｂリンパ球（形質細胞）及び正常組織では見られない。そのため、主にマウス由来であるいくつかの抗体、すなわち、１Ｆ５、２Ｂ８／Ｃ２Ｂ８、２Ｈ７、及び１Ｈ４が記載されている。
【０２８１】
したがって、ヒト抗ＣＤ２０抗体またはヒト化抗ＣＤ２０抗体を使用して、活性化可能なインターロイキンタンパク質のＣＤ２０結合ドメインのｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化のＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を取得し、構成体のコドンを、任意選択で、ホモサピエンスの細胞での発現用に最適化する。ｓｃＦｖにおけるＶＬドメインとＶＨドメインの出現順序を変更し（すなわち、ＶＬ−ＶＨ、またはＶＨ−ＶＬの配向）、サブユニット「Ｇ４Ｓ」（配列番号２０１）または「Ｇ４Ｓ」（配列番号２０１）の３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２０４）が可変ドメイン同士をつないで、ｓｃＦｖドメインを作製する。抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖプラスミド構成体は、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他のアフィニティータグを有することができ、ＨＥＫ２９３または他の適切なヒトまたは哺乳類の細胞株に電気穿孔し、精製する。検証アッセイには、ＦＡＣＳによる結合分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する動態解析、及びＣＤ２０発現細胞の染色が含まれる。
【０２８２】
活性化可能なインターロイキンタンパク質をコードするＤＮＡ発現構成体のクローニング
プロテアーゼ切断部位ドメインを有する活性化可能なインターロイキン構成体を使用して、活性化可能なインターロイキンタンパク質を、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖドメイン及び血清中半減期延長要素（例えば、ＨＳＡ結合ペプチドまたはＶＨドメイン）と組み合わせて構築する。ＣＨＯ細胞での活性化可能なインターロイキンタンパク質の発現用に、すべてのタンパク質ドメインのコード配列を哺乳類発現ベクター系にクローニングする。簡単に言えば、活性化可能なインターロイキンドメイン、血清半減期延長要素、及びＣＤ２０結合ドメインをコードする遺伝子配列を、ペプチドリンカーＬ１及びＬ２とともに別々に合成し、サブクローニングする。次いで、得られる構成体を、ＣＤ２０結合ドメイン−Ｌ１−ＩＬ−１２ｐ３５−Ｌ２−プロテアーゼ切断ドメイン−Ｌ３−ＩＬ−１２ｐ４０−Ｌ４−抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ−Ｌ５−血清中半減期延長要素の順序で互いに連結して最終構成体を得る。すべての発現構成体は、タンパク質の分泌及び精製を促進するため、それぞれ、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグ（配列番号２０５）のコード配列を含むように設計される。
【０２８３】
安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における活性化可能なインターロイキンタンパク質の発現
ＣＨＯ細胞発現系（Ｆｌｐ−Ｉｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１）由来細胞（Ｋａｏ  ａｎｄ  Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９６８；６０（４）：１２７５−８１）を使用する。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが提供する標準細胞培養プロトコルに従って接着細胞を継代培養する。
【０２８４】
懸濁液中での増殖に適応させるために、細胞を組織培養フラスコから剥離させ、無血清培地に入れる。懸濁液に適応した細胞を、１０％ＤＭＳＯを含む培地で凍結保存する。
【０２８５】
分泌された活性化可能なインターロイキンタンパク質を安定して発現する組換え型ＣＨＯ細胞株は、懸濁液適応細胞のトランスフェクションによって生成される。抗生物質ハイグロマイシンＢによる選択時、生存細胞密度を週２回測定し、細胞を遠心分離にかけ、最大密度０．１×１０６生存細胞／ｍＬで新鮮な選択培地に再懸濁する。選択の２〜３週間後、活性化可能なインターロイキンタンパク質を安定して発現する細胞プールを回収し、その時点で、細胞を振とうフラスコ内の標準培地に移す。タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを実行して、組換え型分泌タンパク質の発現を確認する。安定した細胞プールをＤＭＳＯ含有培地中で凍結保存する。
【０２８６】
活性化可能なインターロイキンタンパク質は、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日間流加培養で、細胞培養上清への分泌により産生される。１０日後、典型的には、培養生存率７５％超で細胞培養上清を回収する。産生培養物から試料を１日おきに採取し、細胞密度と生存率を評価する。回収日に、細胞培養上清を遠心分離によって除去し、以降の使用前に真空ろ過する。
【０２８７】
細胞培養上清中のタンパク質発現量と産物の完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
【０２８８】
活性化可能なインターロイキンタンパク質の精製
活性化可能なインターロイキンタンパク質を、ＣＨＯ細胞培養上清から２段階の手順で精製する。第１のステップで、構築物をアフィニティークロマトグラフィーに供し、その後、第２のステップでＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００での分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。試料は緩衝液交換され、限外ろ過によって典型的濃度の１ｍｇ／ｍＬ超まで濃縮される。最終試料の純度と均一性（通常９０％超）を、還元条件下及び非還元条件下でのＳＤＳ  ＰＡＧＥ、それに続く抗ＨＳＡまたは抗イディオタイプ抗体を使用するイムノブロッティング、ならびに分析ＳＥＣによってそれぞれ評価する。精製されたタンパク質を、使用時まで等量分割にて−８０℃で保存する。
【０２８９】
実施例２３：フローサイトメトリーによる抗原親和性の決定
実施例２２の活性化可能なインターロイキンタンパク質を、ヒトＣＤ２０＋細胞及びカニクイザルＣＤ２０＋細胞に対するそれらの結合親和性について試験する。
【０２９０】
実施例２２の活性化可能なインターロイキンタンパク質の１００μＬの系列希釈及び少なくとも１つのプロテアーゼとともにＣＤ２０＋細胞をインキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、細胞を、同じ緩衝液中で０．１ｍＬの１０μｇ／ｍＬマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体とともに氷上で４５分間インキュベートする。２回目の洗浄サイクルの後、前回と同じ条件下、細胞を０．１ｍＬの１５μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートする。対照として、細胞を、活性化可能なインターロイキンタンパク質を用いずに抗Ｈｉｓ  ＩｇＧとともにインキュベートし、その後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートする。次に、細胞を再度洗浄し、死細胞を排除するために、２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。１×１０４の生細胞の蛍光を、ＭＸＰソフトウェアを使用するＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００  ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェアを使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定する。ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞試料の平均蛍光強度を計算する。二次試薬及び三次試薬単独で染色した細胞の蛍光強度値を減算後、次に、その値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用バージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）の１部位結合（双曲線）を求める方程式を用いたＫＤ値の計算に使用する。
【０２９１】
ＣＤ２０の結合性及び交差反応性をヒトＣＤ２０＋腫瘍細胞株で評価する。交差反応性のＫＤ比を、組換え型ヒト抗原または組換え型カニクイザル抗原を発現するＣＨＯ細胞株について決定されたＫＤ値を使用して計算する。
【０２９２】
実施例２４：細胞毒性アッセイ
実施例２２の活性化可能なインターロイキンタンパク質を、そのＣＤ２０＋標的細胞に対する免疫応答の媒介についてインビトロで評価する。
【０２９３】
蛍光標識したＣＤ２０＋ＲＥＣ−１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−３００４）を、実施例２２の活性化可能なインターロイキンタンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で、ランダムドナーから単離されたＰＢＭＣまたはエフェクター細胞としてのＣＢ１５  Ｔ細胞（標準化Ｔ細胞株）とともにインキュベートする。加湿インキュベーター内で３７℃にて４時間インキュベートした後、標的細胞から上清への蛍光色素の放出を分光蛍光光度計で測定する。実施例２２の活性化可能なインターロイキンタンパク質を用いずにインキュベートされた標的細胞及びインキュベーション終了時にサポニン添加によって完全に溶解された標的細胞をそれぞれ、陰性対照及び陽性対照として使用する。
【０２９４】
測定した残存する生きている標的細胞に基づいて、特定の細胞溶解のパーセンテージを次式に従って計算する：［１−（生きている標的（試料）の数／生きている標的（自然発生的））の数］×１００％。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して非線形回帰／４−パラメータロジスティックフィットによりシグモイド型用量反応曲線及びＥＣ５０値を計算する。所与の抗体濃度について得られた溶解値を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用した４パラメータロジスティックフィット分析によりシグモイド用量反応曲線を計算する。
【０２９５】
実施例２５：活性化可能なインターロイキンタンパク質の薬物動態
実施例２２の活性化可能なインターロイキンタンパク質を半減時間消失について動物試験で評価する。
【０２９６】
活性化可能なインターロイキンタンパク質を、伏在静脈への０．５ｍｇ／ｋｇのボーラス注射としてカニクイザルに投与する。別のカニクイザル群は、サイズは同等であるが血清中半減期延長要素を欠くサイトカインの投与を受ける。第３及び第４の群はそれぞれ、血清半減期延長要素を有するサイトカイン、及びＣＤ２０と血清半減期延長要素とを有するサイトカインの投与を受け、いずれも活性化可能なインターロイキンタンパク質とサイズが同等である。各試験群は５匹のサルで構成される。示されている時点で血清試料を採取して段階希釈し、ＣＤ２０に対する結合ＥＬＩＳＡを使用してタンパク質の濃度を決定する。
【０２９７】
被験物質血漿濃度を使用して薬物動態解析を実施する。各被験物質の群平均血漿データは、投与後時間に対してプロットされた場合、多指数プロファイルに従っている。データは、分布相及び消失相について、ボーラス投与量及び一次速度定数を用いて標準の２コンパートメントモデルにより適合される。静脈内投与のデータの最良適合を求める一般方程式は、ｃ（ｔ）＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔであり、式中、ｃ（ｔ）は、時間ｔにおける血漿濃度であり、Ａ及びＢはＹ軸上の切片であり、α及びβはそれぞれ、分布相及び消失相の見かけの一次速度定数である。α相はクリアランスの初期相であり、動物のすべての細胞外液へのタンパク質の分布を反映し、減衰曲線の第２またはβ相の部分は真の血漿クリアランスを表す。そのような方程式を適合させるための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ａ＝Ｄ／Ｖ（α−ｋ２１）／（α−β）、Ｂ＝Ｄ／Ｖ（β−ｋ２１）／（α−β）であり、α及びβ（α＞βの場合）は二次方程式ｒ２＋（ｋ１２＋ｋ２１＋ｋ１０）ｒ＋ｋ２１ｋ１０＝０の根であり、Ｖ＝分布容積、ｋ１０＝消失速度、ｋ１２＝コンパートメント１からコンパートメント２への移動速度、ｋ２１＝コンパートメント２からコンパートメント１への移動速度、及びＤ＝投与した用量、という推定パラメータを使用する。
【０２９８】
データ分析：濃度対時間プロファイルのグラフを、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）Ｖ．３．０９  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９８６−１９９７．Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｐａ．）を使用して作成する。測定感度未満（ＬＴＲ）として報告された値はＰＫ分析に含めず、グラフに表わさない。薬物動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｖ．３．１  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９９８−１９９９．Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）を使用してコンパートメント分析によって決定する。薬物動態パラメータを、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ  Ｗ  Ａ  ａｎｄ  Ｋｅａｒｎｓ  Ｇ  Ｌ，１９９９，ＩＮ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に記載のように算出する。
【０２９９】
実施例２２の活性化可能なインターロイキンタンパク質は、血清半減期延長要素を欠くタンパク質と比較して、消失半減時間の増加等、改善された薬物動態パラメータを有すると予想される。
【０３００】
実施例２６：異種移植腫瘍モデル
実施例２２の活性化可能なインターロイキンタンパク質を異種移植モデルで評価する。
【０３０１】
雌の免疫欠損ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに致死量以下で照射し（２Ｇｙ）、４×１０６のＲａｍｏｓ  ＲＡ１細胞を右背側腹に皮下接種する。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３に達したら、動物を３つの処置群に割り付ける。群２及び群３（動物８匹ずつ）に１．５×１０７の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注射する。３日後、群３の動物は引き続き、５０μｇの実施例２２の活性化可能なインターロイキンタンパク質により合計９回の静脈内投与（１日１回×９日）で処置される。群１及び群２はビヒクルのみで処置する。体重及び腫瘍体積を３０日間測定する。
【０３０２】
実施例２２の活性化可能なインターロイキンタンパク質で処置された動物は、それぞれのビヒクル処置対照群と比較して、腫瘍増殖において統計的に有意な遅延を有することが予想される。
【０３０３】
本明細書において本発明の好ましい実施形態を示し、また記載してきたが、そのような実施形態が例として提供されているだけであることは当業者には明らかであろう。ここで、当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び代用を想定するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替案が本発明の実施において採用され得ることを理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、ならびにこれらの特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにそれらの均等物が、それにより包含されることが意図される。
実施例２７：ＭＣ３８実験
インビトロでＭＭＰ９を発現する、急速に増殖する結腸腺癌細胞株であるＭＣ３８細胞株を使用した。この腫瘍モデルを使用して、融合タンパク質が腫瘍増殖に影響を与える能力を調べた。
実施例２７ａ：ＭＣ３８  ＩＬ−２ＰＯＣ
薬剤及び処置：
【表４−１】
2021524756.tif 000009
【表４−２】
2021524756.tif 000010
実施例２７ｂ：ＭＣ３８  ＩＬ−２
薬剤及び処置：
【表５−１】
2021524756.tif 000011
【表５−２】
2021524756.tif 000012
結果を図３１ａ〜図３１ｃ及び図３２ａ〜図３２ｃに示す。生存曲線を図３４ａ〜図３４ｄに示す。
実施例２７ｃ：ＭＣ３８  ＩＦＮａ及びＩＬ−１２
薬剤及び処置：
【表６−１】
2021524756.tif 000013
【表６−２】
2021524756.tif 000014
実施例２７ｅ：ＭＣ３８再チャレンジ
実施例２７ｂからの治癒したマウス（ＡＣＰ１６処置）を腫瘍移植で再チャレンジして、抗腫瘍記憶が最初の処置から確立されたかどうかを決定した。
薬剤及び処置：
【表７−１】
2021524756.tif 000015
【表７−２】
2021524756.tif 000016
【０３０４】
実施例２８．血清アルブミン結合ドメインである遮断部分を含有する、条件付きで活性な融合タンパク質
この実施例では、誘導性活性を有する、すなわち、典型的には遮断部分と活性部分の間のリンカーの切断時に活性部分からの遮断部分の分離によって、誘導されるまでは不活性である、融合タンパク質、好ましくはサイトカインの作製及び活性を記載する。融合タンパク質は、ＣＤＲループを介して血清アルブミンと結合する単一抗体可変ドメイン（ｄＡｂ）を含有し、１つ以上の非ＣＤＲループ（例えば、Ｃループ）を介して活性部分（ここでは抗ＣＤ３  ｓｃＦＶ）に結合する。血清アルブミン結合性遮断部分は、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して活性部分に機能的に連結され、活性部分は、プロテアーゼで切断可能ではないリンカーを介して標的指向性ドメイン（ここでは抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ｄＡｂまたは抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ｄＡｂ）に機能的に連結される。これらの融合タンパク質は、プロテアーゼ切断可能リンカーの切断、それに続く抑制性アルブミン結合ドメインの遊離時に活性化される不活性タンパク質として投与することができる。融合タンパク質中の抗ＣＤ３  ｓｃＦＶは、本開示に記載の融合タンパク質において所望されるサイトカインの代替である。所望のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、インターフェロン）またはその機能的断片もしくは変異タンパク質、標的指向性ドメイン、及びサイトカインまたはその機能的断片もしくは変異タンパク質と結合及び阻害もするアルブミン結合ｄＡｂを含有する、同様の融合タンパク質は、本明細書に記載及び例示される方法を使用して調製することができる。所望のサイトカインまたはその機能的断片もしくは変異タンパク質と結合しその活性を阻害する抗血清アルブミンｄＡｂにより、サイトカインの立体的マスキング（結合している血清アルブミンに対するサイトカインの近接による）及びサイトカインの特異的マスキング（サイトカインへの非ＣＤＲループ（例えば、Ｃループ）を介した結合による）の両方が提供され得る。所望のサイトカインまたはその機能的断片もしくは変異タンパク質と結合しその活性を阻害する抗血清アルブミンｄＡｂは、適切な方法を使用して、例えば、抗血清アルブミン結合ｄＡｂの非ＣＤＲループ（例えば、Ｃループ）にアミノ酸配列多様性を導入し、所望のサイトカインへの結合についてスクリーニングすること等によって得ることができる。選択には、ファージディスプレイ等、任意の適切な方法を使用することができる。例えば、使用され得る例示的な抗血清アルブミンｄａｂは以下の配列を有しており、Ｃループ（太字下線部）内のアミノ酸配列を多様化（例えば、ランダム化）して、得られるｄＡｂを、ＣＤＲ相互作用を介した血清アルブミンへの結合、及び非ＣＤＲループ相互作用を介したサイトカインへの結合についてスクリーニングを行うことができる。所望される場合、既知のサイトカイン結合ペプチドのアミノ酸配列をＣループに導入することができる。
【化１】
2021524756.tif 000017
【０３０５】
Ａ．ＰｒｏＴｒｉＴＡＣのプロテアーゼ活性化はインビトロでの活性の大幅な増強をもたらす
精製ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（プロドラッグ）、切断不可能ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ［プロドラッグ（切断不可能）］、及びプロテアーゼ活性化ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（活性薬物）を模倣する組換え型活性薬物断片を、ＥＬＩＳＡアッセイにおける組換え型ヒトＣＤ３への結合、フローサイトメトリーアッセイにおける精製したヒト初代Ｔ細胞への結合、及びＴ細胞依存性細胞傷害アッセイにおける機能的効力について試験した。
【０３０６】
ＥＬＩＳＡでは、適応濃度の可溶性ＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質を、固定化した組換え型ヒトＣＤ３ｅ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに、１５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを添加したＰＢＳ中で室温にて１時間インキュベートした。ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してプレートをブロッキングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳを使用して洗浄し、非競合的抗ＣＤ３イディオタイプモノクローナル抗体１１Ｄ３を使用し、その後、ペルオキシダーゼ標識二次抗体及びＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して検出した。
【０３０７】
フローサイトメトリーでは、示された濃度の可溶性ＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質を、２％ウシ胎児血清含有ＰＢＳと１５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンとの存在下、精製したヒト初代Ｔ細胞とともに４℃で１時間インキュベートした。プレートを２％ウシ胎児血清含有ＰＢＳで洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７標識非競合的抗ＣＤ３イディオタイプモノクローナル抗体１１Ｄ３を使用して検出し、ＦｌｏｗＪｏ  １０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用してデータを分析した。
【０３０８】
Ｔ細胞依存性細胞傷害アッセイにおける機能的効力の場合、示された濃度の可溶性ＰｒｏＴｒｉＴＡＣタンパク質を、精製した休止ヒトＴ細胞（エフェクター細胞）及びＨＣＴ１１６がん細胞（標的細胞）とともにインキュベートし、その際、エフェクター：標的細胞の比を１０：１にして３７℃で４８時間インキュベートした。ＨＣＴ１１６標的細胞株はルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクトされており、ＯＮＥ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により特定のＴ細胞媒介性細胞殺滅を測定することができた。
【０３０９】
Ｂ．ＰｒｏＴｒｉＴＡＣはげっ歯類腫瘍異種移植モデルにおいて強力なプロテアーゼ依存性の抗腫瘍活性を示す
免疫不全状態ＮＣＧマウスにおける、増殖したヒトＴ細胞と混合したＨＣＴ１１６皮下異種移植腫瘍において、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣを、そのインビボでの抗腫瘍活性について評価した。具体的には、第０日目、マウス１匹につき、５×１０６のＨＣＴ１１６細胞を２．５×１０６の増殖したＴ細胞と混合した。ＰｒｏＴｒｉＴＡＣの投与を翌日から開始し、１日１回×１０のスケジュールで腹腔内注入により実施した。示されている時間において、腫瘍体積測定値をキャリパー測定を使用して求め、式Ｖ＝（長さ×幅×幅）／２を使用して計算した。
【０３１０】
Ｃ．例示的ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ三重特異性分子の発現、精製及び安定性
タンパク質産生
誘導性融合タンパク質分子をコードする配列を、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ  ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に、リーダー配列の後、６×ヒスチジンタグの前にクローニングした（配列番号２０５）。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＡ１４５２７）をＥｘｐｉ  ２９３培地中０．２〜８×１ｅ６細胞／ｍｌでＯｐｔｉｍｕｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆｌａｓｋｓ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）内に浮遊状態で維持した。Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１４６３５）プロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞に精製プラスミドＤＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション後４〜６日間維持した。別の方法では、融合タンパク質分子をコードする配列を哺乳類発現ベクターｐＤＥＦ３８（ＣＭＣ  ＩＣＯＳ）にクローニングしてＣＨＯ−ＤＧ４４ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトし、安定なプールを生成し、精製前に最大１２日間、産生培地で培養した。条件培地中の例示的融合タンパク質の量は、標準曲線用の対照融合タンパク質を使用して、プロテインＡチップ付きＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｐａｌｌ）を使用して定量した。いずれかの宿主細胞からの条件培地をろ過し、アフィニティークロマトグラフィー及び脱塩クロマトグラフィーによって部分的に精製した。続いて、融合タンパク質は、イオン交換によってポリッシュされ、画分プールと同時に添加物含有中性緩衝液中に製剤化される。最終純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＡｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  ＳＥＣ  ２００  １．７ｕ  ４．６×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用する分析ＳＥＣを使用して評価し、１２９０  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍで中性ｐＨの添加物を用いて水性／有機移動相に分割し、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ  ＣＤＳソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）でピークを積分した。ＣＨＯ宿主細胞から精製された融合タンパク質は以下に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥに示す。
【０３１１】
安定性評価
２つの製剤にして精製された融合タンパク質を滅菌チューブにさらに等量分割し、１回が−８０℃及び室温で１時間超で構成される凍結融解サイクルを５回、または３７℃で１週間のインキュベーションによってストレスを与えた。ストレスを受けた試料は、ＵＶ透過９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６３５）をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２及びＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）とともに使用したＵＶ分光測定法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびに分析ＳＥＣによって濃度及び濁度について評価し、ストレスを受けていない対照試料についての同じ分析と比較した。２９３宿主細胞から精製された単一の例示的ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ分子についての対照及びストレスを受けた試料の分析ＳＥＣによるクロマトグラムのオーバーレイを以下に示す。
【０３１２】
結果は、ＰｒｏＴｒｉＴＡＣがＣＨＯ安定プールからの通常のＴｒｉＴＡＣと同等の収率で生成されたこと、また、タンパク質が、凍結融解の繰り返し後及び３７℃で１週間の後も安定であったことを示している。
【０３１３】
Ｄ．３週間のカニクイザル薬物動態試験におけるインビボでのＰｒｏＴｒｉＴＡＣの機能的マスキング及び安定性の実証
ＰＳＭＡ指向性ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（配列番号Ｃ１８７２）、切断不可能ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（配列番号１８７）、マスキングなし／切断不可能ＴｒｉＴＡＣ（配列番号１９０）、及び活性薬物を模倣するプロテアーゼ活性化ＰｒｏＴｒｉＴＡＣ（配列番号１８８）の１回量をカニクイザルに０．１ｍｇ／ｋｇで静脈内注射により投与した。示されている時点で血漿試料を採取した。ＰｒｏＴｒｉＴＡＣの濃度を、ビオチン化組換え型ヒトＰＳＭＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたリガンド結合アッセイ、及びスルホタグ付き抗ＣＤ３イディオタイプ抗体クローニング１１Ｄ３をＭＳＤアッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，  ＬＬＣ）で使用して決定した。薬物動態パラメータを、静脈内ボーラス投与経路と一致する非コンパートメント方法を使用したＰｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ薬物動態ソフトウェアを使用して推定した。
【０３１４】
インビボでのプロドラッグ変換速度を計算するため、循環血中活性薬物の濃度を、以下の連立微分方程式［Ｐはプロドラッグの濃度であり、Ａは活性薬物の濃度であり、ｋａは循環血中プロドラッグ活性化の速度であり、ｋｃ，Ｐはプロドラッグのクリアランス速度であり、ｋｃ，Ａは活性薬物のクリアランス速度である］を解くことにより推定した。
【数１】
2021524756.tif 000018
【０３１５】
プロドラッグ、活性薬物、及び切断不可能なプロドラッグ対照（ｋｃ，ＮＣＬＶ）のクリアランス速度をカニクイザルにおいて経験的に決定した。循環血中プロドラッグ活性化の速度を推定するため、切断可能なプロドラッグと切断不可能なプロドラッグの間のクリアランス速度の差は、循環血中の非特異的な活性化のみから生じると仮定した。したがって、循環血中でプロドラッグが変換されて活性薬物になる速度は、切断不可能なプロドラッグのクリアランス速度から切断可能なプロドラッグのクリアランス速度を減算することによって推定した。
【数２】
2021524756.tif 000019
【０３１６】
循環血中プロドラッグの初期濃度を経験的に決定し、活性薬物の初期濃度をゼロと仮定した。
【０３１７】
結果及び考察
実施例２８の結果は、サイトカインまたはその機能的断片もしくは変異タンパク質あるいは抗ＣＤ３  ｓｃＦＶ等、所望の治療活性を有するポリペプチドを含有する融合タンパク質は、治療活性が、血清アルブミンと活性ポリペプチドの両方に結合するマスキングドメインによってマスキングされるよう調製することができることを示す。マスキングドメインは、プロテアーゼ切断可能リンカーを介して活性ドメインに機能的に連結されている。結果は、この型の融合タンパク質が、腫瘍等、治療活性の所望の位置でのプロテアーゼ切断時に活性化される、不活性タンパク質として投与可能であることを示している。
【０３１８】
実施例２８で使用される融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１８３〜１９０として示す。
【０３１９】
例としての融合タンパク質構成体を表３に詳細に示す。表３において、「Ｌ」は「リンカー」の略語であり、「ｃｌｅａｖ．ｌｉｎｋ．」は「切断可能なリンカー」の略語である。他の略語で「ｍＩＦＮｇ」はマウスインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）を示し、「ｈＡｌｂｕｍｉｎ」はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を示し、「ｍＡｌｂｕｍｉｎ」はマウス血清アルブミンを示す。
表３：構成体順列表
【表３−１】
2021524756.tif 000020
【表３−２】
2021524756.tif 000021
【表３−３】
2021524756.tif 000022
【表３−４】
2021524756.tif 000023
【表３−５】
2021524756.tif 000024
【表３−６】
2021524756.tif 000025
【表３−７】
2021524756.tif 000026
【表３−８】
2021524756.tif 000027
配列表
【表８−１】
2021524756.tif 000028
【表８−２】
2021524756.tif 000029
【表８−３】
2021524756.tif 000030
【表８−４】
2021524756.tif 000031
【表８−５】
2021524756.tif 000032
【表８−６】
2021524756.tif 000033
【表８−７】
2021524756.tif 000034
【表８−８】
2021524756.tif 000035
【表８−９】
2021524756.tif 000036
【表８−１０】
2021524756.tif 000037
【表８−１１】
2021524756.tif 000038
【表８−１２】
2021524756.tif 000039
【表８−１３】
2021524756.tif 000040
【表８−１４】
2021524756.tif 000041
【表８−１５】
2021524756.tif 000042
【表８−１６】
2021524756.tif 000043
【表８−１７】
2021524756.tif 000044
【表８−１８】
2021524756.tif 000045
【表８−１９】
2021524756.tif 000046
【表８−２０】
2021524756.tif 000047
【表８−２１】
2021524756.tif 000048
【表８−２２】
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【表８−２３】
2021524756.tif 000050
【表８−２４】
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【表８−２５】
2021524756.tif 000052
【表８−２６】
2021524756.tif 000053
【表８−２７】
2021524756.tif 000054
【表８−２８】
2021524756.tif 000055
【表８−２９】
2021524756.tif 000056
【表８−３０】
2021524756.tif 000057
【表８−３１】
2021524756.tif 000058
【表８−３２】
2021524756.tif 000059
【表８−３３】
2021524756.tif 000060
【表８−３４】
2021524756.tif 000061
【表８−３５】
2021524756.tif 000062
【表８−３６】
2021524756.tif 000063
【０３２０】
参照による組み込み
本明細書で引用したすべての特許及び非特許刊行物の開示全体は、それぞれ、あらゆる目的のために参照することによりその全体が組み込まれる。
【０３２１】
他の実施形態
上記の開示は、独立した有用性を有する複数の別個の発明を包含し得る。これらの発明の各々を、その好ましい形態（複数可）で開示してきたが、多数の変形が可能であるため、本明細書に開示及び例示されるその具体的な実施形態は限定的な意味で考慮されるべきではない。本開示の主題は、本明細書で開示される様々な要素、特徴、機能、及び／または特性の、すべての新規かつ非自明の組み合わせと組み合わせ構成要素が含まれる。以下の特許請求の範囲は、特に、新規かつ非自明であるとみなされる特定の組み合わせ及び組み合わせ構成要素を指摘する。特徴、機能、要素、及び／または特性の他の組み合わせ及び組み合わせ構成要素で具体化された発明は、本出願、本出願からの優先権を主張する出願、または関連出願において特許請求され得る。そのような特許請求の範囲もまた、異なる発明を対象とするのか、または同じ発明を対象とするのか、また、元の特許請求の範囲と比較して範囲が広いか、狭いか、等しいか、もしくは異なるかということにかかわらず、本開示の発明の主題に含まれるとみなされる。
【図１−１】
2021524756.tif 000064
【図１−２】
2021524756.tif 000065
【図１−３】
2021524756.tif 000066
【図１−４】
2021524756.tif 000067
【図２】
2021524756.tif 000068
【図３】
2021524756.tif 000069
【図４−１】
2021524756.tif 000070
【図４−２】
2021524756.tif 000071
【図５】
2021524756.tif 000072
【図６】
2021524756.tif 000073
【図７−１】
2021524756.tif 000074
【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２８−４】
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【図２８−５】
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【図２８−６】
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【図２８−７】
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【図２８−８】
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【図２８−９】
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【図２８−１０】
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【図２８−１１】
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【図２８−１２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３４−４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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