(57)【要約】式（Ｉ）：2021524844.tif 000049（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は本明細書に記載の通り）の化合物またはその医薬上許容し得る塩を含む医薬製剤を開示する。また式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与する工程を含む膵臓腺がんを治療する方法、ならびに哺乳動物からの膵臓腺がん腫瘍サンプルにおけるＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化を検出する方法（哺乳動物は式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与されている）を提供する。【選択図】図４９Ａ
2021524844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む医薬製剤：
（ａ）式（Ｉ）：
2021524844.tif 000045
（式中、Ｒ１が、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキルアルキル、チオシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アルキルチオシクロアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルキルピペリジン−４−イル、アリールピペラジニルアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ２が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ３が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ４が、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ１およびＲ４は、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノスルホニル、ヒドロキシル、パーフルオロアルコキシ、アルキレンジオキシ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基でアリールおよび／またはアルキル部分で置換されてもよい）の化合物またはその医薬上許容し得る塩；ならびに
（ｂ）１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよびＰＥＧ−８カプリリック／カプリックグリセリドを含む医薬上許容し得る界面活性剤。
【請求項２】
さらにカプリル酸を含む請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
以下を含む医薬製剤：
（ａ）式（Ｉ）：
2021524844.tif 000046
（式中、Ｒ１が、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキルアルキル、チオシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アルキルチオシクロアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルキルピペリジン−４−イル、アリールピペラジニルアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ２が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ３が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ４が、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ１およびＲ４は、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノスルホニル、ヒドロキシル、パーフルオロアルコキシ、アルキレンジオキシ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基でアリールおよび／またはアルキル部分で置換されてもよい）の化合物またはその医薬上許容し得る塩；ならびに
（ｂ）１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む医薬上許容し得る界面活性剤。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物がメタレスチンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
哺乳動物の膵臓腺がんの治療に使用するための式（Ｉ）：
2021524844.tif 000047
（式中、Ｒ１が、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキルアルキル、チオシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アルキルチオシクロアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルキルピペリジン−４−イル、アリールピペラジニルアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ２が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ３が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ４が、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ１およびＲ４は、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノスルホニル、ヒドロキシル、パーフルオロアルコキシ、アルキレンジオキシ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基でアリールおよび／またはアルキル部分で置換されてもよい）の化合物またはその医薬上許容し得る塩。
【請求項６】
さらに請求項５の使用のための化学療法剤または放射線処置を含み、任意で化学療法剤がゲムシタビンである、請求項５の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項７】
使用が（Ｉ）−（Ｖ）のひとつ以上の結果になる、請求項５または６の使用のための式（Ｉ）の化合物：
（Ｉ）哺乳動物の細胞内の核周囲コンパートメントを破壊すること、
（ＩＩ）哺乳動物の細胞内の核周囲コンパートメントの有病率を低下させること、
（ＩＩＩ）哺乳動物の転移性がん細胞が産生するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）レベルを低下させること、
（ＩＶ）哺乳動物のがん細胞のコロニー形成を減少させること、および
（Ｖ）哺乳動物のがん細胞の遊走を減少させること。
【請求項８】
哺乳動物がステージＩ膵臓腺がん、ステージＩＩ膵臓腺がん、ステージＩＩＩ膵臓腺がん、ステージＩＶ膵臓腺がん、および／または転移性膵臓腺がんを有する、請求項５〜７のいずれか１項の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
化学療法剤が、式（Ｉ）の化合物と任意の順序で連続投与されるか、または式（Ｉ）の化合物と同時に投与される、請求項８の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項１０】
式（Ｉ）の化合物が、哺乳動物から１つ以上の膵臓腺がん腫瘍を摘出した後に投与される、請求項５〜９のいずれか１項の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項１１】
哺乳動物におけるＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化を検出する方法に使用するための式（Ｉ）：
2021524844.tif 000048
（式中、Ｒ１が、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキルアルキル、チオシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アルキルチオシクロアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルキルピペリジン−４−イル、アリールピペラジニルアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ２が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ３が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ４が、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ１およびＲ４は、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノスルホニル、ヒドロキシル、パーフルオロアルコキシ、アルキレンジオキシ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基でアリールおよび／またはアルキル部分で置換されてもよい）の化合物またはその医薬上許容し得る塩であって、
該方法は以下を含む：
（ａ）式（Ｉ）の化合物を受けた哺乳動物から第１の膵臓腺がん腫瘍サンプルを提供する工程、
（ｂ）腫瘍サンプルをアッセイして、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ１（ＦｏｘＡ１）およびフォークヘッドボックスタンパク質Ｏ６（ＦｏｘＯ６）の一方または両方の発現レベルを決定する工程、
（ｃ）哺乳動物から第２の膵臓腺がん腫瘍サンプルを提供する工程、
（ｄ）第２の腫瘍サンプルをアッセイして、ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルを決定する工程；および
（ｅ）（ｉ）ＦｏｘＡ１の第２の決定された発現レベルに対するＦｏｘＡ１の第１の決定された発現レベル、および（ｉｉ）ＦｏｘＯ６の第１の決定された発現レベルとＦｏｘＯ６の第２の決定された発現レベルとを比較、の一方または両方を比較して、ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化を検出する工程、
ここで哺乳動物から第２の腫瘍サンプルを摘出する前に、第１の腫瘍サンプルが哺乳動物から摘出される。
【請求項１２】
哺乳動物の膵臓腺がんの治療方法に使用するための式（Ｉ）の化合物であって、該方法は以下含む：
（ａ）ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化の決定を受ける工程であって、変化が、（ｉ）ＦｏｘＡ１発現の第２の決定されたレベルがＦｏｘＡ１発現の第１の決定されたレベルよりも低いこと、および（ｉｉ）ＦｏｘＯ６発現の第２の決定されたレベルがＦｏｘＯ６発現の第１の決定されたレベルよりも高いこと、のうちの一方または両方であり、ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化が、請求項１１に記載の使用によって決定される；
（ｂ）式（Ｉ）の化合物の投与に対する臨床応答を予測する工程；ならびに
（ｃ）変化が、（ｉ）ＦｏｘＡ１発現の第２の決定されたレベルがＦｏｘＡ１発現の第１の決定されたレベルよりも低いこと、および（ｉｉ）ＦｏｘＯ６発現の第２の決定されたレベルがＦｏｘＯ６発現の第１の決定されたレベルよりも高いこと、の一方または両方である場合に、式（Ｉ）の化合物を哺乳動物に投与する工程。
【請求項１３】
式（Ｉ）の化合物の用量が、約０．１から約８０ｍｇ／ｋｇである、請求項５〜１２のいずれか１項の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２０１８年５月１５日に提出された米国仮特許出願Ｎｏ．６２／６７１，９６４の利益を主張するものであり、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府が後援する研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所国立がん研究所のプロジェクト番号１ＺＩＡＢＣ０１１２６７−０８の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明について一定の権利を有している。
【０００３】
電子的に提出された資料の参照によるインコーポレイション
本明細書には、参照によりその全体が組み込まれており、同時に提出され、以下のように識別されるコンピュータ読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストが記載されている：２０１９年５月１３日付けで「７４３５０２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられた１つの１２，６１９バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【背景技術】
【０００４】
背景技術
転移とは、疾患が臓器から生体の別の隣接しない部分に広がるために用いられる細胞のメカニズムである。この過程は固形腫瘍の発生に関与している可能性があり、疾患に関連した死亡の大部分の原因である可能性がある。腫瘍性病変の治療は、転移前の段階で開始すると予後が良好になることがある。過去１０年間で、転移に関与する基礎的なメカニズムの理解は進んできたが、特に転移過程に影響を与える治療上のツールは非常に限られている。そのため、転移性疾患を患っている対象者を治療するための新しい製剤や方法が必要とされている。
【０００５】
発明の概要
本発明の一実施形態として、式（Ｉ）：
【０００６】
【化１】
2021524844.tif 000003
【０００７】
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は本明細書に記載の通り）の化合物またはその医薬上許容し得る塩、ならびに１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよびＰＥＧ−８カプリリック／カプリックグリセリドを含む医薬上許容し得る界面活性剤を含む医薬製剤を提供する。
【０００８】
本発明の別の実施形態として、式（Ｉ）：
【０００９】
【化２】
2021524844.tif 000004
【００１０】
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は本明細書に記載の通り）の化合物またはその医薬上許容し得る塩、ならびに１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む医薬上許容し得る界面活性剤、を含む医薬製剤を提供する。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態として、哺乳動物の膵臓腺がんを治療する方法であって、哺乳動物の膵臓腺がんを治療するのに有効な量の式（Ｉ）：
【００１２】
【化３】
2021524844.tif 000005
【００１３】
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は本明細書に記載の通り）の化合物またはその医薬上許容し得る塩をそれを必要とする哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の実施形態として、哺乳動物からの膵臓腺がん腫瘍サンプルにおいてＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化を検出する方法  であって、哺乳動物は、式（Ｉ）：
【００１５】
【化４】
2021524844.tif 000006
【００１６】
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は本明細書に記載の通り）の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与されており、該方法は、哺乳動物から第１の膵臓腺がん腫瘍サンプルを提供する工程、腫瘍サンプルをアッセイして、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ１（「ＦｏｘＡ１」）およびフォークヘッドボックスタンパク質Ｏ６（「ＦｏｘＯ６」）の一方または両方の発現レベルを決定する工程、哺乳動物から第２の膵臓腺がん腫瘍サンプルを提供する工程、第２の腫瘍サンプルをアッセイして、ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルを決定する工程、ならびに（ｉ）ＦｏｘＡ１の第２の決定された発現レベルに対するＦｏｘＡ１の第１の決定された発現レベル、および（ｉｉ）ＦｏｘＯ６の第１の決定された発現レベルとＦｏｘＯ６の第２の決定された発現レベルとを比較、の一方または両方を比較して、ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化を検出する工程、を含み、ここで哺乳動物から第２の腫瘍サンプルを摘出する前に、第１の腫瘍サンプルが哺乳動物から摘出される、方法を提供する。
【００１７】
がん、特に転移性がんを治療するためのアンメットニーズの解決策として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で悪性腫瘍と関連している可能性があり、核小体の周辺部に位置することを特徴とする核内体である核周囲コンパートメント（ｐｅｒｉｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ「ＰＮＣ」）の阻害剤を含む製剤が開示されている。式（Ｉ）の化合物は、ＰＮＣ阻害剤である。さらに、膵臓腺がん、特に転移性がんを治療するためのアンメットニーズの解決策として、式（Ｉ）の化合物を投与して膵臓腺がんを治療する方法が開示されている。さらに、膵臓腺がんの治療薬として式（Ｉ）の化合物の投与に陽性反応する可能性が高い哺乳動物を決定するというアンメットニーズの解決策として、膵臓腺がん腫瘍サンプル中のＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化を検出する方法が開示されている。
【００１８】
実施例に見られるように、予想外にも、式（Ｉ）の化合物であるメタレスチンは、高い腫瘍内曝露を有し、かつ感知できる毒性を有さずに、異なる前臨床がん組織学にわたる転移に対して選択的であった。メタレスチンは、部分的にｅＥＦ１Ａ２の機能を妨害することにより、Ｐｏｌ  Ｉの転写を阻害し、核小体の分離を誘導し、核小体の体積を減少させ、ＰＮＣを破壊する。さらに、膵臓腺がん腫瘍サンプルにおけるＦｏｘＡ１とＦｏｘ０６の発現レベルの変化を予想外に検出したことで、どの哺乳動物にメタレスチンの投与を継続すべきかについての貴重な知見が得られた。
【００１９】
図面の複数見解の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＰＣ３Ｍ（転移性前立腺がん細胞株）−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）−ＰＴＢ（ポリピリミジントラクト結合タンパク質）細胞におけるＰＮＣ有病率に対する濃度−反応曲線（四角、ＰＣ３Ｍは、治療を行わない場合、７５〜８５％のＰＮＣ有病率を有する）、および細胞ＡＴＰ（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ  ＧＬＯ（登録商標））によって測定される細胞毒性（丸）を示すグラフである。指示された濃度（矢印の先はＰＮＣを示す）（スケールバー＝５μｍ）での細胞に対する代表的なＰＴＢ−ＧＦＰ画像を、グラフの上の３つのパネルに示す。相対シグナル（％）はｙ軸に沿っており、メタレスチン［ｌｏｇ  Ｍ］はｘ軸に沿っている。パネルから分かるように、細胞のＰＮＣ内の蛍光量は減少し、左パネルが最も明るい蛍光であり、右パネルが最も弱い蛍光である。図１〜４は、メタレスチンがサブマイクロモル濃度でＰＮＣを減少させ、がん細胞の浸潤を抑制することを示している。
【図２】図２は、１μＭメタレスチンが、様々ながん細胞株におけるＰＮＣの減少に有効であったことを示す棒グラフである（全ての細胞株におけるＰＮＣの減少についてｐ＜０．０５；細胞のリストは下記の表１にあり、下記の実施例２も参照のこと）。ＤＭＳＯ対照を薄い灰色のバーで、メタレスチンを濃い灰色のバーで示した。ＰＮＣ有病率（％）は、ｙ軸上に、細胞株名はｘ軸上に沿っている。
【図３】図３は、メタレスチンが、処理の２４時間以内に、マイクロモル以下の濃度（０．６μＭ）でＭＡＴＲＩＧＥＬゼラチン状タンパク質混合物（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）浸潤を阻害することを示す棒グラフである（＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ［対照］と比較）。浸潤（％）はｙ軸上に、メタレスチン［ｍｉｃｒｏＭ］はｘ軸上にある。細胞株ＰＣ３Ｍを白色バーで、細胞株ＰＡＮＣ１（ヒト膵臓）を黒色バーで示す。
【図４】図４は、１μＭでのメタレスチンがＰＣ３Ｍにおいては細胞増殖に影響を与えるが、正常な線維芽細胞（ＧＭ０２１５３）においては影響を与えないことを示す折れ線グラフである（矢印は培地変化の時間を示す）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。コンフルエンス（％）はｙ軸上、時間（時間単位）はｘ軸上にある。一番上の線がＧＭ０２１５３−ＤＭＳＯ、上から２番目の線がＰＣ３Ｍ−ＤＭＳＯ、上から３番目の線がＧＭ０２１５３−メタレスチン、一番下の線がＰＣ３Ｍ−メタレスチンである。
【図５】図５は、膵臓原発性腫瘍または転移性病変のいずれかに由来する膵臓がん細胞株が、原発性腫瘍に由来する細胞よりも転移に由来する細胞の方が、より高いＰＮＣ有病率を示したことを表すグラフである（下記表１に細胞株説明、＊ｐ＜０．０５）。この図は、メタレスチン処理が、ＮＯＤ／ＩＬ２ガンマ（ｎｕｌｌ）ＰＡＮＣ１マウスにおいて、肺および肝臓への転移を減少させることを示している。ＰＮＣ有病率（％）はｙ軸上、腫瘍のタイプ（原発性または転移性）はｘ軸上にある。
【図６】図６は、移植後８週間後に採取したＮＯＤ／ＩＬ２ガンマ（ｎｕｌｌ）ＰＡＮＣ１マウスの原発性腫瘍組織（３５％［マウスグラィックの中央］）由来の転移組織［マウスグラフィックでは、肝臓、脾臓、および肺を示す矢印のついた丸で示されている］で増加したＰＮＣ有病率を示すマウスグラフィックおよび棒グラフを含んでいる。ＰＮＣ有病率を、ＳＨ５４抗体で染色した凍結組織切片上で決定した。ＰＮＣ有病率（％）はｙ軸上に、腫瘍の種類（すなわち、膵臓、脾臓、肝臓、および肺）はｘ軸上にある（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図７】図７は、処置の６週間後、肝臓および肺の臓器／腫瘍比によって測定される転移性沈着物が、メタレスチン２５ｍｇ／ｋｇを１日１回処置したマウスにおいて、ビヒクル処置した動物と比較して減少したことを示すグラフである（ｎ＝１０匹のマウスを各コホートに無作為に割り付けた）（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。腫瘍に対する臓器比はｙ軸上に、肝臓（左）および肺（右）組織についての処置（ビヒクル、５ｍｇ／ｋｇ、または２５ｍｇ／ｋｇ）はｘ軸上にある。
【図８】図８は、メタレスチン処置した動物の肝臓および肺は、ビヒクルで処置した動物と比較して転移性負担が減少していることを実証した病理検査の結果を示すグラフである（バー＝２５０μｍ；分析したグループあたりｎ＝４匹）（＊＊＊ｐ＜０．００１）。転移性沈着物はｙ軸上に、肝臓（左）および肺（右）組織についての処置（ビヒクルまたは２５ｍｇ／ｋｇ）はｘ軸上にある。
【図９】図９は、メタレスチン処置した動物の肝臓および肺が、ビヒクルで処置した動物と比較して転移負担が減少していることを実証した組織学的検査の一例を示す説明図である。矢印は転移性腫瘍を示す。
【図１０】図１０は、処置した動物の原発性腫瘍がメタレスチン処置後に変化しなかったことを示すグラフである。体重変化はｙ軸上にある。ビヒクル（三角）、５ｍｇ／ｋｇ（四角）、および２５ｍｇ／ｋｇ（丸）をグラフ上に示す。メタレスチン処置は良好な忍容性を示し、試験期間中、処置群間で有意な体重差は認められなかった。
【図１１】図１１は、メタレスチンがＮＳＧ  ＰＡＮＣ１マウスの原発性膵臓腫瘍および転移におけるＰＮＣを分解することを示す一組のパネルである。腫瘍内のＰＮＣを接種から１２週間後に免疫蛍光により可視化した（ＰＮＣは最も薄い色をしており、矢印でマークされている）。原発性腫瘍および肝転移からの画像を示す（スケールバー＝５μｍ）。ビヒクル処置した動物は、典型的で容易に検出可能なＰＮＣを示した。ＰＮＣの有病率は減少し、メタレスチン処置した動物（２５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ、６週間毎日投与；解析したグループあたりｎ＝４匹）では、残存するＰＮＣは小さくなっているようだった。
【図１２】図１２は、原発性膵臓腫瘍および転移部位におけるＰＮＣ有病率に対するメタレスチンの効果を示す。ＰＮＣ有病率（ｙ軸）は、原発性腫瘍（膵臓）および肺、肝臓、および脾臓の転移性腫瘍において、メタレスチン処置（２５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ、６週間毎日投与）により減少した（＊＊ｐ＜０．０１）。腫瘍の種類（膵臓、肺、肝臓、および脾臓）は、ｘ軸に沿っている。
【図１３】図１３は、メタレスチンまたはビヒクル処置後のマウスの生存率を示すグラフである。このグラフは、ＮＳＧ  ＰＡＮＣ１膵臓がん転移モデルにおいて、メタレスチン処置が生存期間を延長することを示す。メタレスチン処置は、動物が一般的に臓器表面に巨大転移を示さない３Ｄ  ＰＡＮＣ１腫瘍細胞接種後６週間後に開始された、薬剤を添加した飼料（ｃｈｏｗ）（１日１０ｍｇ／ｋｇを投与するように設計された７０ｐｐｍ）を介して提供された。メタレスチン処置は、処置の９０日を超える死亡を予防した。ｙ軸に生存率、ｘ軸上に処置後の日数を示す。メタレスチン処置は、生存率１００％での灰色の実線であり、下降する黒線はビヒクルである（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１４】図１４は、メタレスチンまたはビヒクル処置後のマウスの生存率を示すグラフである。このグラフは、ＮＳＧ  ＰＡＮＣ１膵臓がん転移モデルにおいて、メタレスチン処置が生存期間を延長することを示す。マウスが目に見える肝臓表面の沈着物を含む巨大転移を発症した後、メタレスチン処置は、薬剤を添加した飼料（ｃｈｏｗ）（１日１０ｍｇ／ｋｇを投与するように設計された７０ｐｐｍ）を介して提供された。メタレスチン処置は、ビヒクル処置したマウス（ＮＩＨ  ３１  Ｈａｓｌａｎ食）と比較して、マウスの生存時間を延長した。ｙ軸に生存率、ｘ軸上に治療後の日数を示す。メタレスチン処置は灰色の実線であり、黒線はビヒクルである（＊＊＊ｐ＝０．００７）。
【図１５】図１５は、死亡時のマウスの完全剖検後の例示的な組織を示す一連のパネルである。これらのパネルは、原発性腫瘍の大きさに検出可能な影響を与えることなく、メタレスチン処置した動物の肝臓における転移性疾患負担の減少を実証する。対照群の動物は、特に肝臓（＊右中隔膜が厚いことを示す）において、ほぼ完全または完全な腫瘍による臓器置換を示したが、肺においては劣っていた。膵臓腫瘍は、比較において、両群で同様であった。ビヒクル処置した動物からの組織は左の２列にあり、メタレスチン処置した動物からの組織は右の２列にある。肝臓組織を上段に、肺組織を中段に、膵臓組織を下段に示す。
【図１６】図１６は、図１４の研究から、ビヒクルおよびメタレスチン処置マウスにおける肝臓（転移性腫瘍を含む）および原発性膵臓腫瘍の平均サイズを示すグラフである（＊ｐ＜０．０５）。臓器の大きさ（ｍｍ×ｍｍ）はｙ軸上に、腫瘍の種類はｙ軸上（転移性肝臓および原発性膵臓）である。ビヒクルは黒いバーで、メタレスチンは灰色のバーで表している。
【図１７】図１７は、メタレスチンを毎日処置することにより、定量的ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（「ＩＶＩＳ」）（各群ｎ＝６）によって測定されるように肺転移が有意に減少したことを示すグラフである。発光（光子）はｙ軸上、処置（すなわち、ビヒクル、メタレスチン５ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ）はｙ軸上である（＊ｐ＜０．０５）。
【図１８】図１８は、腫瘍体積（ｙ軸、単位：ｍｍ３）によって測定されるように、メタレスチン処置が、ＳＣに接種されたＰＣ３Ｍ原発性腫瘍の増殖に対してわずかな効果を有していたことを示すグラフである。腫瘍移植後の日数は、ｘ軸に沿っている（＊ｐ＜０．０５）。
【図１９】図１９は、メタレスチン処置が、実験終了時の腫瘍体積（ｙ軸、単位ｍｍ３）および腫瘍重量によって測定されるように、患者の胸水（各群ｎ＝５）からの転移性細胞からなるＰＤＸの増殖を効果的に阻害したことを示している。処置開始後の日数は、ｙ軸に沿っている（＊＊ｐ＜０．０１）。
【図２０】図２０は、週ごとの体重評価が、処置群と対照群との間で有意差を示さなかったことを示すグラフである。処置した動物の体重は変化しなかった。メタレスチンで処置した動物は、ビヒクルで処置した動物とは対照的に、機敏でよく手入れされたままであった。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｃは、未処理またはＤＭＳＯで処理した細胞で見られるように、核小体がその典型的な３つの部分構造を失い（矢印は、ＤＦＣ、高密度繊維状部、ＦＣ、繊維状部、およびＧＣ、顆粒部を示す）、ＨｅＬａ細胞および腫瘍組織においてメタレスチンで処理した際に核小体キャッピング（拡大した挿入物）を発現することを示す一組のパネルである。代表的な電子顕微鏡写真は、７日間、ビヒクル（上）または１０ｍｇ／ｋｇメタレスチン（下）で処理したＮＳＧ  ＰＡＮＣ１マウスからのＨｅＬａ細胞（図２１Ａ；１μＭで２４時間処理）、原発性膵臓腫瘍（図２１Ｂ）、および肝臓転移（図２１Ｃ）について示す。マウスは、最後のメタレスチン投与の１時間後に採取された（挿入図は、核小体を示す）。スケールバー＝１μｍ。図２１Ａ〜２４は、メタレスチン処理が核小体構造の変化を誘導することを示す。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｃは、ＨｅＬａ細胞（図２２Ａ）、原発性膵臓腫瘍（図２２Ｂ）、および肝臓転移（図２２Ｃ）において、メタレスチン処理した細胞株および組織において、平均核小体面積がビヒクル対照（Ｐ＜０．０００１）と比較して減少したことを実証したＥＭ画像の定量的評価を示す３つのグラフである。１００個の核小体を無作為に選択して分析し、（（最大径＋最短径）／２）２×π）として核小体面積を計算した。平均核小体面積の比較は、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定、２−ｔａｉｌｅｄ、１群あたりｎ＝４匹を用いて行った。
【図２３】図２３は、ＰＮＣの損失に対応するキャップ状構造（キャッピング）（矢印）へのＰｏｌ  Ｉ転写因子ＵＢＦの再分布に反映されるメタレスチン処理によって誘導された核小体構造の変化を示す一連のパネルである（左上パネル）。Ｍｅｒｇｅのパネルに示されるように、図２１Ａ〜２１ＣのＥＭ画像に見られるように、ＵＢＦのキャッピングは、顆粒部から繊維状部の分離を反映している。スケールバー＝５μｍ。
【図２４】図２４は、メタレスチンがリボソーム生合成を妨害することを示すパネルである。誘導性ＲＰＬ２９−ＧＦＰ発現細胞株は、テトラサイクリンで処理するとＲＰＬ２９−ＧＦＰを合成する（２番目の列）。テトラサイクリン誘導前に細胞を１μＭメタレスチンで処理した場合、新たに合成されたタンパク質は、ＤＭＳＯ対照で処理した細胞（右から２番目のパネル）と比較して、核小体および核内に蓄積した（右端のパネル）。スケールバー＝５μｍ。
【図２５】図２５は、Ｃ２３／ヌクレオリン（左列）の核小体の標識の損失として示される核小体構造の変化に対応する、典型的な核小体標識から５分後のピンポイントへのＢｒＵ取り込みシグナルの再分布（左列から２番目）によって実証されるように、Ｐｏｌ  Ｉ転写パターンが変化していることを示す一組のパネルである。メタレスチンで処理されたすべての細胞は、ＤＭＳＯで処理された細胞（右パネル）のごく一部の細胞と比較して、核小体におけるＢｒＵ標識の変化を示した。図２５〜３４は、メタレスチン処理が、ｒＤＮＡクロマチン状態を変化させることなく、ｒＤＮＡにおけるプレＲＮＡ合成およびＰｏｌ  Ｉの占有を減少させることを示す。
【図２６】図２６は、メタレスチン処理細胞におけるプレｒＲＮＡの５’ＥＴＳの減少を示すＲＴ−ＰＣＲ（左パネル）およびｑＲＴ−ＰＣＲ（右パネル）の結果を示す。
【図２７】図２７は、メタレスチン処理細胞に存在する、ＲＰＡ１９４、Ｐｏｌ  ＩのラージサブユニットおよびＵＢＦのタンパク質発現に変化がないことを示すウエスタンブロットの結果を示す。
【図２８】図２８は、ソラレン−架橋実験の結果を示しており、メタレスチンに曝露しても不活性ｒＤＮＡクロマチンに対する活性ｒＤＮＡクロマチンの比率が変化しないことを示す。
【図２９】図２９は、ｒＤＮＡの構造を示す図である。
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｅは、メタレスチン処理が、プロモーターおよびコード領域を介してｒＤＮＡ上のＲＰＡ１９４の占有を減少させるが、ＵＢＦは減少させないことを示す定量的なＣｈＩＰ評価を示す一組のグラフである（図３０ＡはｒＤＮＡプロモーター、図３０Ｂは５’ＥＴＳ、図３０Ｃは５．８Ｓ、図３０Ｄは２８Ｓ、および図３０ＥはＵ１２である）。
【図３１】図３１は、ｓｉＲＮＡによるｐｏｌ  Ｉのノックダウンは、ウエスタンブロットによって測定されるようにＲＰＡ１９４の減少を示し、その量は、対照ｓｉＲＮＡ処理された細胞（１とした）との関係で定量化されたことを示す。
【図３２】図３２は、ｓｉＲＮＡによるＲＰＡ１９４のノックダウンが、ＰＮＣ有病率を低下させ、三日月形のＰＮＣ数を増加させたことを示す一組のパネルである（灰色部分）。
【図３３】図３３は、ＰＮＣ有病率を示すグラフである。ＰＮＣ有病率（％）はｙ軸上に、細胞の種類はｘ軸上にある（＊ｐ＜０．０５）。
【図３４】図３４は、ＲＰＡ１９４ノックダウン（上段、左列から２番目、白矢印）もまた、未処理および対照オリゴ処理細胞（下の２つのパネル）と比較して、核小体を破壊することを示す一組のパネルである。ＰＮＣ構造は、未処理および対照オリゴ処理細胞（下２列）と比較して、三日月形（上段、左列、矢印）に変化した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。すべての画像のスケールバー＝５μｍ。
【図３５】図３５は、メタレスチンが、アンカービオチン化メタレスチン−ｅＥＦ１Ａ複合体への結合から組換えｅＥＦ１Ａを効果的に打ち負かしたことを示すウエスタンブロットである。図３５〜４０Ｃは、メタレスチンがｅＥＦ１Ａ２を特異的に結合することを示す。ｅＥＦ１Ａ２の増加は、ＰＮＣおよび転移形成を促進する。
【図３６】図３６は、ＰＣ３Ｍ細胞溶解液を用いた熱安定性アッセイにおいて、メタレスチン処理がｅＥＦ１Ａを安定化させたことを示すゲルである。ＤＭＳＯが上のパネルであり、メタレスチンが下のパネルである。
【図３７】図３７は、メタレスチン１μＭで２４時間処理した際に、ｅＥＦ１Ａタンパク質の量に変化がなかったことを示すウエスタンブロット分析を示す。
【図３８】図３８は、グラフとパネル一式である。上は、ＨＡ−ｅＥＦ１Ａ２の過剰発現が、核あたりのＰＮＣの数を増加させたことを示している（スキャターＰＮＣ有病率：２個以上のＰＮＣを含む細胞の数）；ｎ＝３００細胞（バー＝２μｍ）。グラフは、全体のＰＮＣ有病率を有意に増加させなかったことを示している。スキャターは薄い灰色のバーで表され、スキャターなしは黒のバーで表される。ＰＮＣ有病率（％）はｙ軸上にあり、ｅＥＦ１Ａ２、ｅＥＦ１Ａ１および未処理はｘ軸に沿っている（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図３９】図３９は、ＰＣ３Ｍ細胞におけるｅＥＦ１Ａ２の過剰発現が、ＰＮＣ分解に対するメタレスチンのＩＣ５０を増加させたことを示すグラフである。ＰＮＣ有病率（％）はｙ軸上に、ｌｏｇ［Ｍ］メタレスチンはｙ軸上にある。ｅＥＦ１Ａ２は丸で示され、対照ベクターは四角で示されている。
【図４０】図４０Ａ〜４０Ｂは、空ベクター（対照）またはｅＥＦ１Ａ２（ｅＥＦ１Ａ２  Ｏ．Ｅ．）で形質導入した６×１０４のＰＡＮＣ１  ３ＤスフィアをＮＳＧマウスの膵臓の尾部に注入したときの結果を示す。両群からのマウスを、移植後６週間後に採取し、剖検にかけた。図４０Ａは、前（上パネル）および後（下パネル）の肝臓表面の巨視的画像が、空ベクター対照（左、採取した肝臓）よりもＰＡＮＣ  ｅＥＦ１Ａ２動物の方がより高い転移性負荷を示したことを示す。肝臓の組織病理学的画像（Ｈ＆Ｅ染色）（黒スケールバー＝２５０μｍ、白スケールバー＝１００μｍ）をマクロ画像の右に示す。挿入図は、代表的な転移性病変を示す。図４０Ｂは肝臓転移の定量化を示し、ＰＡＮＣ１  ｅＥＦ１Ａ２  Ｏ．Ｅ．動物（１群あたり分析した動物ｎ＝４）において、肝臓転移がより高い転移性負担を有していたことを示している（＊ｐ＜０．０５）。肝臓転移数（ｍｍ３）はｙ軸上に、対照およびｅＥＦ１Ａ２  Ｏ．Ｅはｘ軸上にある。
【図４１】図４１は、ＨｅＬａ細胞へのｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に、ｅＥＦ１Ａ１  ＲＮＡではなくｅＥＦ１Ａ２  ＲＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲによって測定されるように減少したことを示すゲルである。図４１〜４５Ｂは、ｅＥＦ１Ａ２の減少が、メタレスチンと同様の核小体およびＰＮＣの破壊を誘導することを示す。
【図４２】図４２は、ｑＲＴ−ＰＣＲがｓｉＲＮＡトランスフェクトされた細胞においてｅＥＦ１Ａ２  ＲＮＡの減少を示したことを示すグラフである。ｅＥＦ１Ａ２  ＲＮＡの相対的なレベルは、ｙ軸上にある（＊＊ｐ＜０．０１）。
【図４３】図４３は、ｅＥＦ１Ａ２  ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの７２時間後に、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたように、５’ＥＴＳ  ＲＮＡの量が減少したことを示すグラフである。
【図４４】図４４は、ｓｉＲＮＡトランスフェクトされた細胞において、免疫蛍光を用いて、核小体およびＰＮＣの破壊が検出されたことを示すパネルである。ｅＥＦ１Ａ２ノックダウン細胞におけるＰＮＣは、一般的に三日月形（矢印）、およびプレＲＮＡプロセッシング因子フィブリラリンを認識する抗体で免疫標識された分離した核小体（キャッピング、矢印）を示した；ｎ＝５００細胞。スケールバー＝５μｍ。
【図４５】図４５Ａ〜４５Ｂは、ＰＮＣ有病率が控えめに減少（図４５Ａ）および核小体破壊率が増加（図４５Ｂ）したことを示すグラフである（図４５Ｂ）。追加２４時間のｓｉＲＮＡ後のＨＡ−ｅＥＦ１Ａ２（黒いバー）のトランスフェクションは、ＰＮＣ有病率（図４５Ａ、黒いバー）および核小体破壊（図４５Ｂ、灰色のバー）を部分的に救済した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図４６】図４６は、単回投与、腹腔内注射として投与したときのメタレスチンの血漿薬物動態（「ＰＫ」）を示す。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）にメタレスチンを単回投与し、ＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウス（ｎ＝３）には時点ごと反復投与した。反復投与試験マウスには、４週間毎日腹腔内注射を行い、最後の投与から２４時間後に濃度を測定した。メタレスチンは、５％ＮＭＰ＋２０％ＰＥＧ４００＋７５％（水中１０％ＨＰ−β−ＣＤ）で製剤化した。
【図４７】図４７は、電子顕微鏡によって観察されるメタレスチン誘導核小体構造変化を示す一組のパネルである。核小体の構造は、未処理またはＤＭＳＯで処理した細胞に見られる典型的な３つの部分構造（ＤＦＣ、高密度繊維状部、ＦＣ、繊維状部、およびＧＣ、顆粒部は、矢印とラベルで特定されている）を失い、ＨｅＬａ細胞で２４時間メタレスチン１μＭで処理すると、高度に分離（メタレスチンパネル）になる。しかし、処理を停止すると、核小体の回復が可能になる（メタレスチン回復パネル）。スケールバー＝５００ｎｍ。
【図４８】図４８は、同様の変化がＰＡＮＣ１およびＰＣ３Ｍ細胞（左の２枚のパネル）で観察されるが、処理した正常な肝臓組織（右のパネル）では観察されないことを示す一組のパネルである。スケールバー＝１μｍである。
【図４９】図４９Ａ〜４９Ｃは、図４８のＥＭ画像の定量的評価を示すグラフである。図４９は、処理したがん細胞株（図４９Ａ〜４９Ｂ）では核小体体積が減少したが、処理した正常肝組織（図４９Ｃ）では減少しなかったことを実証した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図５０】図５０は、メタレスチン処理細胞における核小体構造の変化を示す一組のパネルである。核小体構造の変化（矢印の中のＵＢＦ標識）は、ＰＮＣの損失と密接に関連している。メタレスチン処理（１μＭ、１８時間）は、３つの細胞株、ＰＡＮＣ１、ＰＣ３Ｍ、およびＨｅＬａでテストした。メタレスチン処理細胞におけるＰｏｌ  Ｉ転写因子ＵＢＦのキャッピングは、マージした画像（矢印で示す）に示すように明らかである。スケールバー＝１０μｍ。
【図５１】図５１は、メタレスチン処理細胞におけるＰｏｌ  Ｉ転写因子のキャッピング構造を示す一組のパネルである。Ｐｏｌ  Ｉ転写因子であるＵＢＦ（左から２番目の列）、ＲＰＡ１９４（左の列）、およびプレリボソームＲＮＡプロセシング因子ＮＯＰＰ１４０（中央の列）は、メタレスチン処理細胞において同様のキャッピング構造を示した。スケールバー＝１０μｍ。
【図５２】図５２は、２つのプレリボソームＲＮＡプロセッシング因子、フィブリラリンおよびＮＯＰＰ１４０の免疫標識が、メタレスチン処理細胞においてキャップ様構造を実証したことを示す一組のパネルである（矢印）。スケールバー＝５μｍ。
【図５３】図５３は、同じプロトコル（１μＭ、１８時間）でメタレスチン処理した正常線維芽細胞株ＧＭ０２１５３において、Ｐｏｌ  Ｉ転写因子のキャッピングが明らかではなかったことを示す一組のパネルである。これらの細胞は、ＰＴＢ標識が核周囲エンリッチ標識を示さなかったので、ＰＮＣを有していない。これらの細胞において、ＵＢＦは５μＭで処理しても完全にキャップされた状態にはならなかった。スケールバー＝５μｍ。
【図５４】図５４は、メタレスチン処理した細胞において、核小体キャッピングで改変された核小体がＵＢＦの免疫標識によって検出され得ることを示す一組のパネルである。新たに合成されたＧＦＰ−ＲＰＬ２９は核内に入り、歪んだ核小体に局在したが、メタレスチン処理細胞では成熟リボソームに組み立てられず、細胞質に輸送されなかった。スケールバー＝１０μｍ。
【図５５】図５５は、メタレスチン（１μＭ、５時間）で処理した後、安定的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞をＧＦＰ−ＲＰＬ２９融合タンパク質を発現するように誘導したときに、ＧＦＰ−ＲＰＬ２９発現が有意に変化しなかったことを示すゲルである。図５４および５５は、メタレスチン処理細胞におけるＰｏｌ  ＩＩ転写、翻訳、または細胞質−核トラフィッキングにメタレスチン処理の影響がないことを併せて示している。
【図５６】図５６は、メタレスチン処理細胞において、ＤＮＡ損傷応答、細胞周期、またはＰｏｌ  ＩＩ転写に影響がないことを示すウエスタンブロットである。具体的には、ＤＮＡ損傷応答シグネチャーのリン酸化タンパク質またはｐ５３のウエスタンブロット分析である。
【図５７】図５７Ａ〜５７Ｃは、細胞を１μＭのメタレスチンで２４時間処理したときに有意な変化がなかったことを示すグラフである。図５７Ａはリン酸化されたｙＨ２ＡＸであり、図５７Ｂはｐ５３ＢＰ１であり、図５７Ｃはｐ−ｐ５３である。細胞株はｘ軸に沿っており、変化量はｙ軸上にある。ＤＭＳＯは黒いバーで表され、メタレスチンは灰色のバーで表される。
【図５８】図５８は、フローサイトメトリーによるＤＮＡ含有量の細胞周期分析を示すグラフである。この研究は、２つの異なる濃度でのメタレスチン処理の２４時間以内に有意な細胞周期ブロックが存在しないことを示している。細胞周期相（％）は、ｙ軸上にある。
【図５９】図５９は、メタレスチン処理細胞におけるＣＵＧＢＰおよびＳＣ３５の免疫標識が、α−アマニチンによるｐｏｌ  ＩＩ転写阻害中に見られるそれらの標識パターンのシグネチャー変化を示さなかったことを示す一組のパネルである。α−アマニチン処理は、タンパク質の細胞質再配置を誘導するが、ＰＮＣに局在するタンパク質には影響を与えない（右上パネル、矢印）のに対し、メタレスチン処理は、ＣＵＧＢＰの細胞質リロケーションを引き起こすことなくＰＮＣを分解した（中上パネル）。同様に、メタレスチン処理は、丸い凝集体を誘導するα−アマニチン（右下パネル、矢印）とは異なり、斑点状の分布パターンに有意な影響を与えなかった（中下パネル）。スケールバー＝５μｍ。
【図６０】図６０は、ＰＮＣの分解におけるビオチン−メタレスチンの効果を示す一組のパネルである。メタレスチンとビオチン−メタレスチンの効果を、２４時間１μＭで処理したＰＣ３Ｍ細胞または未処理のＰＣ３Ｍ細胞で比較した。矢印はＰＮＣを示す。スケールバー＝５μｍ。
【図６１】図６１は、トランスフェクトされた細胞におけるｅＥＦ１Ａ２−ＨＡの発現を示す。このタンパク質は細胞質において優勢である。ＳＨ５４を用いた免疫標識は、ＰＴＢの核質およびＰＮＣの分布を実証している。トランスフェクション効率は約７０％であった。（＊＊＊ｐ＜０．００１）。スケールバー＝２０μｍ。
【図６２】図６２は、メタレスチン処理細胞におけるＰｏｌ  ＩＩ転写、翻訳、または細胞質−核トラフィッキングにメタレスチン処理の影響がなかったことを示すグラフである。具体的には、安定的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、メタレスチン処理（１μＭ、５時間）後にＧＦＰ−ＲＰＬ２９融合タンパク質を発現するように誘導した。ＧＦＰ−ＲＰＬ２９の発現は有意に変化しなかった。
【図６３】図６３は、メタレスチン処理後のＰＡＮＣ１細胞の薬物応答を示すグラフである。相対的な細胞増殖は、７２時間後にＤＭＳＯ対照サンプル（１．０に設定）に正規化したＣＥＬＬＴＩＴＥＲＧＬＯ（登録商標）により測定した。平均細胞生存率の値は、３回繰り返して行った少なくとも２回の独立した実験からの平均の標準誤差（ＳＥＭ）でプロットされている。
【図６４】図６４は、ＰＡＮＣ１  ＮＳＧマウスにおける転移性がんの進行を示している。ＮＳＧマウスにスフェロイドとして増殖したＰＡＮＣ−ｌｕｃ細胞由来のルシフェラーゼ発現３Ｄ  ＰＡＮＣ１−ｌｕｃ細胞６万個を膵臓内に注入した後、約４週間で門脈周囲浸潤（白矢印）を伴う微小転移（黒矢印）が発生した（代表的なＨ＆Ｅ染色、−スケールバー＝２５０μｍ、白スケールバー＝１００μｍ）。表面に目に見える転移を伴う巨大転移（−で示す）は８週間後に発生した。＊は壊死を示す。タイムラインは上部に描かれている。
【図６５】図６５は、Ｎ−（６−（３−（（３−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）−４−イミノ−５，６−ジフェニル−３，４−ジヒドロ−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）メチル）フェニル）ヘキシ−５−イン−１−イル）−５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタナミド（ビオチン−メタレスチン）の合成を示す。具体的には、Roth and Eger(Synthesis of 2-amino-3-cyano-pyrroles (author’s transl), ArchPharm (Weinheim), 308: 179-85 (1975))の手順を用いて、修正されたＶｏｉｇｔ反応／Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ縮合配列を行った。こうして、ベンゾイン（５．２６ｇ，２４．８ｍｍｏｌ）、３−ブロモベンジルアミン（４．６１ｇ、２４．８ｍｍｏｌ）、およびトリフルオロ酢酸（０．１４ｇ、１．２４ｍｍｏｌ、０．０５  ｅｑｕｉｖ．）をディーン−スタークトラップに接続した還流下で１時間加熱し、混合物をオイルバスから取り出した。マロノニトリル（４．９１ｇ、７４．３ｍｍｏｌ、３．０  ｅｑｕｉｖ．）を混合物に添加し、反応を再びディーン−スタークトラップに接続した還流下で１時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、１９時間撹拌すると、暗赤色の固体として粗ピロールが得られた。生成物をエチルエーテルで析出させ、固体を濾液が無色になるまで追加のエチルエーテルで洗浄したところ、淡紫色のピロール生成物（６．８０ｇ、１５．８７ｍｍｏｌ、６４％収率）が得られ、これを精製せずに使用した。Rf = 0.53 (50%EtOAc/ヘキサン）; mp = 184-190℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.96 (s, 2 H), 6.80 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.03-7.28 (錯体, 12 H), 7.43 (d, J = 9.0 Hz, 1 H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6, APTパルス配列) δ d (CH, CH3): 125.6, 126.6, 128.3, 128.5, 128.9, 129.0, 129.6, 130.4, 131.1, 131.5; u: (C, CH2): 45.4, 118.4, 120.7, 122.0, 124.0, 131.3, 133.9, 140.4, 149.1; IR 2203, 1632 cm-1; C24H19BrN3 [M + H]+ 428.0757のために計算されたHRMS(ESI)m/zは、428.0749。
【図６６】図６６Ａ〜６６Ｂは、バイオマーカーＦｏｘＡ１（図６６Ａ）およびＦｏｘＯ６（図６６Ｂ）の相対発現を示すグラフである。相対発現はｙ軸上にあり、メタレスチンのＡＵＣ０−２４時間（ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬ）は両方のグラフにおいてｘ軸上にある（ＦｏｘＡ１についてはＲ２＝０．９９９９；ｐ＝０．００７６ならびにＦｏｘＯ６についてはＲ２＝０．９９５２；ｐ＝０．０４４０）。
【発明の概要】
【００２１】
発明の詳細な説明
製剤
発明の実施形態として、式（Ｉ）：
【００２２】
【化５】
2021524844.tif 000007
【００２３】
（式中、Ｒ１が、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキルアルキル、チオシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アルキルチオシクロアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルキルピペリジン−４−イル、アリールピペラジニルアルキルまたはヘテロアリールアルキル、
Ｒ２が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ３が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、および
Ｒ４が、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルであって、
Ｒ１およびＲ４は、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノスルホニル、ヒドロキシル、パーフルオロアルコキシ、アルキレンジオキシ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基でアリールおよび／またはアルキル部分で置換されてもよい）の化合物またはその医薬上許容し得る塩を含む製剤を提供する。
【００２４】
一つの実施形態において、Ｒ１は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群より選ばれる少なくともひとつのヘテロ原子を有する５もしくは６員ヘテロシクリル基；ヒドロキシＣ１−Ｃ７シクロアルキル基；ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル基；ヘテロアリールＣ１−Ｃ６アルキル基；ヘテロシクリルＣ１−Ｃ６アルキル基；フェニル環が１つ以上のＣ１−Ｃ６アルコキシ基で置換されたフェニルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｎ−ベンジルピペラジニル；Ｎ−フェニルピペラジニルアルキル；アルキルがヒドロキシ基で置換されたフェニルＣ１−Ｃ６アルキル基；または５もしくは６員ヘテロアリールアミノＣ１−Ｃ６アルキル基（式中、ヘテロアリール基はＯ、ＮおよびＳからなる群より選ばれる少なくともひとつのヘテロ原子を有する）である。
【００２５】
一つの実施形態において、Ｒ１は、下記から選ばれる：
【００２６】
【化６】
2021524844.tif 000008
【００２７】
一つの実施形態において、Ｒ２はフェニル、Ｒ３はフェニル、Ｒ４はベンジル、およびＲ１は下記構造のいずれであってもよい：
【００２８】
【化７】
2021524844.tif 000009
【００２９】
一つの実施形態において、Ｒ２はフェニル、Ｒ３はフェニル、Ｒ４はベンジル、およびＲ１は下記構造のいずれであってもよい：
【００３０】
【化８】
2021524844.tif 000010
【００３１】
一つの実施形態においてＲ４はメトキシベンジル、Ｒ２はフェニル、Ｒ３はフェニル、およびＲ１は下記構造のいずれであってもよい：
【００３２】
【化９】
2021524844.tif 000011
【００３３】
一つの実施形態において、Ｒ４はフェニルエチル、Ｒ２はフェニル、Ｒ３はフェニル、およびＲ１は下記構造のいずれであってもよい：
【００３４】
【化１０】
2021524844.tif 000012
【００３５】
一つの実施形態において、Ｒ４は、４−アミノスルホニルベンジル、４−トリフルオロメトキシベンジル、４−メトキシベンジルまたはシクロプロピルメチル、およびＲ１は下記構造のいずれであってもよい：
【００３６】
【化１１】
2021524844.tif 000013
【００３７】
一つの実施形態において、Ｒ４は、ヘテロアリールＣ１−Ｃ６アルキルである。
【００３８】
一つの実施形態において、Ｒ２はフェニル、Ｒ３はフェニル、Ｒ４は
【００３９】
【化１２】
2021524844.tif 000014
【００４０】
およびＲ１は下記から選ばれる：
【００４１】
【化１３】
2021524844.tif 000015
【００４２】
一つの実施形態において、Ｒ２はフェニル、Ｒ３はフェニル、Ｒ４はベンジル、およびＲ１は以下である：
【００４３】
【化１４】
2021524844.tif 000016
【００４４】
一つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、メタレスチンである（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．９，６６３，５２１を参照、その全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４５】
本発明の一つの実施形態として、１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよび１つ以上のＰＥＧ−８カプリリック／カプリックグリセリドを含む医薬上許容し得る界面活性剤を含む製剤を提供する。一つの実施形態において、製剤は、以下のいずれか一つの方法で投与される：経口、エアゾール、経鼻、肺、非経口（例えば、静脈内［“ＩＶ”］、皮下、皮内に、または筋肉内）、皮下、静脈、筋肉内、腹腔内、髄腔内、腫瘍内、局所、直腸、および経膣。好ましくは、製剤は経口投与に適する。
【００４６】
１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよび１つ以上のＰＥＧ−８  カプリリック／カプリックグリセリドの適切な供給源は、ＬＡＢＲＯＳＯＬ（登録商標）（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓe，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能）である。好ましくは、１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよび１つ以上のＰＥＧ−８  カプリリック／カプリックグリセリドの供給源は、ＬＡＢＲＯＳＯＬ（登録商標）ＡＬＦ（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓe）である。
【００４７】
一つの実施形態において、経口製剤は、ＬＡＢＲＯＳＯＬ（登録商標）（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓeから入手可能）を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、ＬＡＢＲＯＳＯＬ（登録商標）ＡＬＦ（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓe）を含む。
【００４８】
製剤は、約０．１から約９０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含有しうる。一つの実施形態において、製剤は、約１から約９０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、製剤は、約５０から約８５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、製剤は、約６５から約８５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、製剤は、約７５から約８５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、製剤は、約８０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。
【００４９】
経口製剤は、約０．１から約９０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含有しうる。一つの実施形態において、経口製剤は、約１から約９０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約５０から約８５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約６５から約８５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約７５から約８５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約８０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。
【００５０】
製剤は、約０．１から約７５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含有しうる。一つの実施形態において、製剤は、約１から約７０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、製剤は、約２５から約６５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、製剤は、約３０から約６０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、製剤は、約４０から約５０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、製剤は、約４５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。
【００５１】
経口製剤は、約０．１から約７５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含有しうる。一つの実施形態において、経口製剤は、約１から約７０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約２５から約６５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約３０から約６０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約４０から約５０ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約４５ｗｔ％の医薬上許容し得る界面活性剤を含む。
【００５２】
また、１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよび１つ以上のＰＥＧ−８  カプリリック／カプリックグリセリドを含む製剤は、カプリル酸を含有しうる。一つの実施形態において、製剤は、約０．１から約５０ｗｔ％のカプリル酸を含む。一つの実施形態において、製剤は、約１から約５０ｗｔ％のカプリル酸を含む。一つの実施形態において、製剤は、約３から約４０ｗｔ％のカプリル酸を含む。一つの実施形態において、製剤は、約５から約３０ｗｔ％のカプリル酸を含む。一つの実施形態において、製剤は、約５から約１５ｗｔ％のカプリル酸を含む。一つの実施形態において、製剤は、約１０ｗｔ％のカプリル酸を含む。
【００５３】
一つの実施形態において、１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよび１つ以上のＰＥＧ−８  カプリリック／カプリックグリセリドを含む製剤は、約１５から約２５ｗｔ％のカプリル酸も含む。一つの実施形態において、製剤は、約２０ｗｔ％のカプリル酸を含む。
【００５４】
１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよび１つ以上のＰＥＧ−８  カプリリック／カプリックグリセリドを含む経口製剤は、カプリル酸も含有する。一つの実施形態において、経口製剤は、約０．１から約５０ｗｔ％のカプリル酸を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約１から約５０ｗｔ％のカプリル酸を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約３から約４０ｗｔ％のカプリル酸を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約５から約３０ｗｔ％のカプリル酸を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約５から約１５ｗｔ％のカプリル酸を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約１０ｗｔ％のカプリル酸を含む。
【００５５】
一つの実施形態において、１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよび１つ以上のＰＥＧ−８  カプリリック／カプリックグリセリドを含む経口製剤は、約１５から約２５ｗｔ％のカプリル酸も含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約２０ｗｔ％のカプリル酸を含む。
【００５６】
１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよび１つ以上のＰＥＧ−８  カプリリック／カプリックグリセリドを含む製剤は、水も含有し得る。製剤は、約０．１から約９５ｗｔ％の水を含有しうる。一つの実施形態において、経口製剤は、約０．１から約９０ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、製剤は、約０．１から約８５ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、製剤は、約０．１から約８０ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、製剤は、約０．１から約７５ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、製剤は、約１から約７０ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、製剤は、約２５から約６５ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、製剤は、約３０から約６０ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、製剤は、約４０から約５０ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、製剤は約４５ｗｔ％の水を含む。
【００５７】
１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよび１つ以上のＰＥＧ−８  カプリリック／カプリックグリセリドを含む経口製剤は、水も含有し得る。経口製剤は、約０．１から約９５ｗｔ％の水を含有しうる。一つの実施形態において、経口製剤は、約０．１から約９０ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約０．１から約８５ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約０．１から約８０ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約０．１から約７５ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約１から約７０ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約２５から約６５ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約３０から約６０ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約４０から約５０ｗｔ％の水を含む。一つの実施形態において、経口製剤は、約４５ｗｔ％の水を含む。
【００５８】
医薬上許容し得る界面活性剤に加えて、経口投与に適した製剤としては、（ａ）希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはジュース）中に溶解した治療有効量の化合物などの液体溶液、（ｂ）カプセル、サシェ、錠剤、ロゼンジ、およびトローチ、それぞれ固形または顆粒として有効成分を所定の量を含有する、（ｃ）粉末剤、（ｄ）適当な液体中の懸濁剤、および（ｅ）適当なエマルジョン、などが挙げられる。液体製剤は、希釈剤、例えば、エタノール、ベンジルアルコール、およびポリエチレンアルコールを医薬上許容し得る界面活性剤、懸濁剤、または乳化剤の添加の有無にかかわらず含むことができる。カプセルの形態は、例えば、追加の界面活性剤、滑沢剤、および不活性充填剤（ラクトース、スクロース、リン酸カルシウムおよびトウモロコシデンプンなど）を含む通常のハードまたはソフトシェルゼラチンタイプのものであり得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、アルギン酸、結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイダル二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存剤、香味料、および薬理学的に適合する賦形剤の１つ以上を含むことができる。ロゼンジ形態は、有効成分を香味剤（通常はスクロースおよびアカシアもしくはトラガント）中に含むことができ、同様に、パスティル（ｐａｓｔｉｌｌｅ）は有効成分を不活性基剤（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）中に含むことができる。エマルジョン、ゲルなどは、有効成分に加えて当技術分野で公知の賦形剤を含有する。
【００５９】
好ましくは、１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよび１つ以上のＰＥＧ−８  カプリリック／カプリックグリセリドを含む製剤は、経口製剤および懸濁剤である。
【００６０】
好ましくは、１つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよび１つ以上のＰＥＧ−８  カプリリック／カプリックグリセリドを含む製剤は、経口製剤およびピルである。ピルは、錠剤またはカプセル剤（ハード又はソフト）である。
【００６１】
本発明の一実施態様として、１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む医薬上許容し得る界面活性剤を含む製剤を提供する。一つの実施形態において、製剤は下記方法のいずれか一つによって投与される：経口、エアゾール、経鼻、肺、非経口（例えば、ＩＶ、皮下、皮内、または筋肉内）、皮下、静脈、筋肉内、腹腔内、髄腔内、腫瘍内、局所、直腸、および経膣。好ましくは、製剤は、静脈投与に適している。
【００６２】
１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルの適切な供給源はＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５である。
【００６３】
一つの実施形態において、製剤は、約１から約６０ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、製剤は、約５から約５５ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、製剤は、約１０から約５０ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、製剤は、約１５から約４５ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、製剤は、約２０から約４０ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、製剤は、約２５から約３５ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、製剤は、約３０ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。
【００６４】
一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約１から約６０ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約５から約５５ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約１０から約５０ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約１５から約４５ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約２０から約４０ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約２５から約３５ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約３０ｗｔ％の１つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む。
【００６５】
一つの実施形態において、製剤は、約１から約６０ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、製剤は、約５から約５５ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、製剤は、約１０から約５０ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、製剤は、約１５から約４５ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、製剤は、約２０から約４０ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、製剤は、約２５から約３５ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、製剤は、約３０ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。
【００６６】
一つの実施形態では、ＩＶ製剤は、約１から約６０ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約５から約５５ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約１０から約５０ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約１５から約４５ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約２０から約４０ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約２５から約３５ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。一つの実施形態において、ＩＶ製剤は、約３０ｗｔ％のＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を含む。
【００６７】
好ましくは、ＩＶ製剤は、水を含む。
【００６８】
好ましくは、ＩＶ製剤は、生理食塩水を含む。
【００６９】
治療方法
本発明の一実施形態としては、哺乳動物の膵臓腺がんを治療する方法を提供し、該方法はそれを必要とする哺乳動物に式（Ｉ）：
【００７０】
【化１５】
2021524844.tif 000017
【００７１】
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、本発明の態様によって本明細書に記載の通り）の化合物またはその医薬上許容し得る塩を、哺乳動物の膵臓腺がん治療に有効な量で投与する工程を含む。
【００７２】
一つの実施形態において、該方法は、式（Ｉ）の化合物を別の処置と一緒に投与する工程を含む。追加の処置は、放射線処置であってもよい。放射線処置は、膵臓腺がんの治療に使用される如何なる適切な放射線処置であってもよい。
【００７３】
追加の処置は化学療法剤であってもよい。化学療法剤は、如何なる適切な化学療法剤でもよく、例えば、化学療法剤は、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メソトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、およびビンクリスチンからなる群より選ばれてもよい。好ましくは、化学療法剤はゲムシタビンである。
【００７４】
化学療法剤は、式（Ｉ）の化合物を一緒に連続して投与することができる。化学療法剤は、式（Ｉ）の化合物の前に投与することができる。化学療法剤は、式（Ｉ）の化合物の後に投与することができる。
【００７５】
ゲムシタビンは、式（Ｉ）の化合物を一緒に連続して投与することができる。ゲムシタビンは、式（Ｉ）の化合物の前に投与することができる。ゲムシタビンは、式（Ｉ）の化合物の後に投与することができる。
【００７６】
化学療法剤は、式（Ｉ）の化合物と同時に投与することができる。
【００７７】
ゲムシタビンは、式（Ｉ）の化合物と同時に投与することができる。
【００７８】
投与すると、式（Ｉ）の化合物は、膵臓がんが転移する可能性を減少させる。腫瘍が既に転移している場合、式（Ｉ）の化合物を投与すると、転移性腫瘍の数または体積が減少する可能性がある。一つの実施形態では、哺乳動物は、ステージＩの膵臓腺がんを有する。一つの実施形態では、哺乳動物は、ステージＩＩの膵臓腺がんを有する。一つの実施形態では、哺乳動物はステージＩＩＩの膵臓腺がんである。一つの実施形態では、哺乳動物はステージＩＶの膵臓腺がんを有する。
【００７９】
一つの実施形態において、哺乳動物は転移性膵臓腺がんを有する。
【００８０】
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物の投与は、確立された転移巣のさらなる転移を減少させるか、または遅延させる。さらに、式（Ｉ）の化合物の投与は、転移の量または大きさを減少させるかもしれない（例えば、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％）。
【００８１】
式（Ｉ）の化合物は、１つ以上の膵臓腺がん腫瘍が哺乳動物から摘出される前に投与されてもよい。式（Ｉ）の化合物は、１つ以上の膵臓腺がん腫瘍が哺乳動物から摘出された後に投与されてもよい。腫瘍は、例えば、手術によって摘出されてもよい。
【００８２】
一つの実施形態では、治療方法は、哺乳動物の細胞内の核周囲コンパートメントの破壊をもたらす。
【００８３】
一つの実施形態において、治療方法は、哺乳動物の細胞内の核周囲コンパートメントの有病率の低下をもたらす。
【００８４】
一つの実施形態において、治療方法は、哺乳動物の転移性がん細胞が産生するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）レベルの低下をもたらす。
【００８５】
一つの実施形態において、治療方法は、哺乳動物のがん細胞のコロニー形成の減少をもたらす。
【００８６】
一つの実施形態において、治療方法は、哺乳動物のがん細胞の遊走の減少をもたらす。      
【００８７】
本明細書で使用される「治療する(treat)」という用語およびその語源となる言葉は、必ずしも１００％または完全な治療を意味するものではない。むしろ、潜在的な利益または治療効果を有すると当業者が認識する治療の程度は様々である。この点において、本発明の方法は、哺乳動物におけるがんの任意の量の任意のレベルの治療を提供することができる。さらに、本発明の方法によって提供される治療としては、治療または予防されるがんの１つ以上の状態または症状の治療が挙げられる。例えば、治療としては、腫瘍の退縮を促進することが挙げられる。
【００８８】
投薬
投与される化合物の治療有効量は、所望の効果および上述の要因に応じて変化し得る。一つの実施形態では、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから８０ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態では、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから７０ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから４０ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから９ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから８ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから７ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから６ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから４ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの間である。
【００８９】
一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．５ｍｇ／ｋｇから１．５ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の０．８ｍｇ／ｋｇから１．２ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は約１ｍｇ／ｋｇである。
【００９０】
一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の１．５ｍｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の１．８ｍｇ／ｋｇから２．２ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、約２ｍｇ／ｋｇである。
【００９１】
一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の４．５ｍｇ／ｋｇから５．５ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、対象者の体重の４．８ｍｇ／ｋｇから５．２ｍｇ／ｋｇの間である。一つの実施形態において、投与量は、約５ｍｇ／ｋｇである。
【００９２】
本明細書に開示される投与量は、毎日投与することができる。投与量は、１日に１回、または１日に１回以上投与することができる。投与量は、他の処置と同時にまたは連続的に投与することができる。
【００９３】
哺乳動物
本明細書の方法は、式（Ｉ）の化合物の有効量を、膵臓腺がんに罹患している動物に投与することを含む。好ましくは、動物は哺乳動物である。より好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００９４】
用語「哺乳動物」としては、マウスなどのＲｏｄｅｎｔｉａ目、ウサギなどのＬｏｇｏｍｏｒｐｈａ目などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。哺乳動物は、フェリヌス目（ネコ）、イヌ目（イヌ）などの肉食動物目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）に属するものであることがより好ましい。哺乳動物が、ウシ（牛）およびブタ（豚）などの偶蹄目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）、またはイコ（馬）を含むＰｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ目に属するものであることがより好ましい。哺乳類は、霊長目、セボイド目、シミオイド目（サル）、またはアントロポイド目（ヒトおよび類人猿）であることが最も好ましい。特に好ましい哺乳類は、ヒトである。さらに、対象は、前記宿主、特に哺乳類（例えば、ヒト）のいずれかの胎児でありえ、この場合、対象または対象の細胞の任意のスクリーニング、または対象または対象の細胞への化合物の投与は、胎内で行うことができる。
【００９５】
バイオマーカー
本発明の一つの実施形態は、哺乳動物からの膵臓腺がん腫瘍サンプル中のＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化を検出する方法を提供する。ここで、哺乳動物は式（Ｉ）の化合物を投与されている。該方法は、哺乳動物から第１の膵臓腺がん腫瘍サンプルを提供する工程、腫瘍サンプルをアッセイして、ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルを決定する工程、哺乳動物から第２の膵臓腺がん腫瘍サンプルを提供する工程、第２の腫瘍サンプルをアッセイして、ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルを決定する工程、および（ｉ）ＦｏｘＡ１の第２の決定された発現レベルに対するＦｏｘＡ１の第１の決定された発現レベルおよび（ｉｉ）ＦｏｘＯ６の第１の決定された発現レベルとＦｏｘＯ６の第２の決定された発現レベルとを比較、の一方または両方を比較して、ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化を検出する工程を含み、ここで哺乳動物から第２の腫瘍サンプルを摘出する前に、第１の腫瘍サンプルが哺乳動物から摘出される。
【００９６】
ＦｏｘＡ１は、肝細胞核内因子３−α（ＨＮＦ−３Ａ）とも呼ばれる。ＦｏｘＡ１は、ヒトにおける遺伝子ＦＯＸＡ１によってコードされている。ＦＯＸＡ１の配列は公開されている（例えば、ＮＣＢＩのデータベース、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３１６９を参照）。
【００９７】
ＦｏｘＯ６は、ヒトにおける遺伝子ＦＯＸＯ６によってコードされている。ＦＯＸＯ６の配列は公開されている（例えば、ＮＣＢＩのデータベース、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１００１３２０７４を参照）。
【００９８】
一つの実施形態では、該方法は、対象から第１のサンプルを得ることを含む。一つの実施形態では、第１のサンプルは、膵臓腺がん組織サンプルである。対象から第１のサンプルを得ることは、当技術分野で公知の任意の適切な方法で実施することができ、サンプルは、任意の適切な供給源、例えば、腫瘍切除材料または腫瘍生検（すなわち、グロス生検または細針生検）からのものであってもよい。
【００９９】
一つの実施形態では、該方法は、対象から第２のサンプルを得ることを含む。一つの実施形態では、第２のサンプルは、膵臓腺がん組織サンプルである。対象から第２のサンプルを得ることは、当技術分野で公知の任意の適切な方法で実施することができ、サンプルは、任意の適切な供給源、例えば、腫瘍切除材料または腫瘍生検（すなわち、グロス生検または細針生検）からのものであってもよい。
【０１００】
第１および第２のサンプルは、異なる方法で得られたものであってもよい。第１のおよび第２のサンプルは、腫瘍の異なる部位または臓器の異なる部位から得られたものであってもよい。
【０１０１】
一つの実施形態では、該方法は、第１および第２のサンプルをアッセイしてサンプル中のＦｏｘＡ１のレベルを検出する工程を含む。例えば、ＦｏｘＡ１タンパク質は、サンプルから精製し（部分的または実質的のいずれか）、１つ以上のＦｏｘＡ１タンパク質を認識する抗体を用いる免疫組織学的技術（例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法など）を介してアッセイすることができる。その際には、アッセイは、サンプルをＦｏｘＡ１タンパク質に特異的に結合する抗体に接触させ、それにより複合体を形成させその複合体を検出する工程を含んでもよい。一つの実施形態において、第１及び第２のサンプルは、精製され、同じまたは同様の技術を介してアッセイされる。
【０１０２】
一つの実施形態では、ＦｏｘＡ１タンパク質は、配列番号：１９のアミノ酸配列を含む。一つの実施形態において、ＦｏｘＡ１タンパク質は、配列番号：１９に対して、少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％、同一でありうる。
【０１０３】
一つの実施形態では、該方法は、第１および第２のサンプルをアッセイしてサンプル中のＦＯＸＯ６のレベルを検出する工程を含む。例えば、ＦｏｘＯ６タンパク質は、サンプルから精製し（部分的または実質的のいずれか）、１つ以上のＦｏｘＯ６タンパク質を認識する抗体を用いる免疫組織学的技術（例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法など）を介してアッセイすることができる。その際には、アッセイは、サンプルをＦｏｘＯ６タンパク質に特異的に結合する抗体に接触させ、それにより複合体を形成させその複合体を検出する工程を含んでもよい。一つの実施形態において、第１及び第２のサンプルは、精製され、同じまたは同様の技術を介してアッセイされる。
【０１０４】
一つの実施形態では、ＦｏｘＯ６タンパク質は、配列番号：２０のアミノ酸配列を含む。一つの実施形態において、ＦｏｘＯ６タンパク質は、配列番号：２０に対して、少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％、同一でありうる。
【０１０５】
第１及び第２のサンプルをアッセイすることにより、バイオマーカー発現のレベルの変化を決定することができる。一つの実施形態において、第１のサンプルは、式（Ｉ）の化合物を哺乳動物に投与する前に哺乳動物から採取する。一つの実施形態において、第２のサンプル中の一方または両方のバイオマーカーのレベルをそれぞれのバイオマーカーの哺乳動物の処置前レベルと比較する（第１のサンプルでアッセイすることにより公知）。
【０１０６】
一つの実施形態では、第１のサンプルは、式（Ｉ）の化合物の第１回の投与の１週間以内に哺乳動物から採取する。一つの実施形態において、第１のサンプルは、式（Ｉ）の化合物の第１回の投与の２週間以内に哺乳動物から採取する。
【０１０７】
一つの実施形態では、第１のサンプルは、第２のサンプルを哺乳動物から採取する少なくとも１週間前に哺乳動物から採取する。一つの実施形態において、第１のサンプルは、第２のサンプルを哺乳動物から採取する少なくとも２週間前に哺乳動物から採取する。
【０１０８】
一つの実施形態では、第１のサンプルは、第２のサンプルを哺乳動物から採取する少なくとも３週間前に哺乳動物から採取する。一つの実施形態では、第１のサンプルは、第２のサンプルを哺乳動物から採取する少なくとも４週間前に哺乳動物から採取する。一つの実施形態では、第１のサンプルは、第２のサンプルを哺乳動物から採取する少なくとも５週間前に哺乳動物から採取する。一つの実施形態では、第１のサンプルは、第２のサンプルを哺乳動物から採取する少なくとも６週間前に哺乳動物から採取する。一つの実施形態では、第１のサンプルは、第２のサンプルを哺乳動物から採取する少なくとも７週間前に哺乳動物から採取する。一つの実施形態では、第１のサンプルは、第２のサンプルを哺乳動物から採取する少なくとも８週間前に哺乳動物から採取する。
【０１０９】
第２のサンプル中の哺乳動物のＦｏｘＡ１発現のレベルが、第１のサンプル中の哺乳動物のＦｏｘＡ２発現のレベルを下回る場合、哺乳動物は、式（Ｉ）の化合物を投与されない場合と比較して、式（Ｉ）の化合物に対する好ましい応答（転移性腫瘍がより少ないか、またはより小さい）を有することが予測される。第２のサンプル中の哺乳動物のＦｏｘＯ６発現のレベルが第１のサンプル中のＦｏｘＯ６発現のレベルを上回る場合、哺乳動物は、式（Ｉ）の化合物を投与されない場合と比較して、式（Ｉ）の化合物に対する好ましい応答（転移性腫瘍が少ないか、またはより小さい）を有することが予測される。
【０１１０】
一つの実施形態では、膵臓腺がんの治療方法は、第１のサンプルと比較して第２のサンプルにおいて、より低いレベルのＦｏｘＡ１および／またはより高いレベルのＦｏｘＯ６の発現を有するとの哺乳動物の決定を受けること（より低いレベルのＦｏｘＡ１またはより高いレベルのＦｏｘＯ６発現は、本発明の一実施形態に従った方法によって決定される）、式（Ｉ）の化合物の投与に対する臨床応答を予測すること、および哺乳動物が、第１のサンプルと比較して第２のサンプルにおいて、より低いレベルのＦｏｘＡ１および／またはより高いレベルのＦｏｘＯ６の発現を有する場合に、哺乳動物に式（Ｉ）の化合物を投与することにより、哺乳動物の膵臓腺がんを治療することを含む。
【０１１１】
本明細書で使用されるように、「臨床応答を予測する」という表現は、式（Ｉ）の化合物の投与後に、転移性腫瘍の数または大きさまたは体積が対象において減少する可能性が高いかどうかを決定することを指す。
【０１１２】
本明細書で請求される場合、用語「バイオマーカー」は、ＦｏｘＡ１またはＦｏｘＯ６を指す。
【０１１３】
式（Ｉ）の化合物
今般、本明細書で一般的に使用される専門用語を参照すると、用語「アルキル」は、例えば、約１から約６個の炭素原子、好ましくは約１から約４個の炭素原子、より好ましくは約１から約２個の炭素原子を含む直鎖または分枝状のアルキル置換基を意味する。かかる置換基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル等が挙げられる。
【０１１４】
本明細書で使用される用語「アルケニル」は、少なくとも一つの炭素−炭素二重結合、および、例えば、約２から約６個の炭素原子（分枝状アルケニルは約３〜約６個の炭素原子）、好ましくは約２から約５個の炭素原子（分枝状アルケニルは、好ましくは約３から約５個の炭素原子）、より好ましくは約３から約４個の炭素原子を含有する直鎖状アルケニル置換基を意味する。かかる置換基としては、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、イソブテニル、ｔｅｒｔ−ブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル等が挙げられる。
【０１１５】
本明細書で使用される用語「アルキニル」は、少なくとも一つの炭素−炭素三重結合、および、例えば、２から約６個の炭素原子（分枝状アルキニルは約３〜約６個の炭素原子）、好ましくは２から約５個の炭素原子（分枝状アルキニルは好ましく約３から約５個の炭素原子）、より好ましくは約３から約４個の炭素原子を含有する直鎖状アルキニル置換基を意味する。かかる置換基としては、エチニル、プロピニル、イソプロピニル、ｎ−ブチニル、ｓｅｃ−ブチニル、イソブチニル、ｔｅｒｔ−ブチニル、ペンチニル、イソペンチニル、ヘキシニル等が挙げられる。
【０１１６】
本明細書で使用される用語「シクロアルキル」は、例えば、約３から約８個の炭素原子、好ましくは約４から約７個の炭素原子、より好ましくは約４から約６個の炭素原子を含有する環状アルキル置換基を指す。かかる置換基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。環状アルキル基は、未置換またはさらにメチル基、エチル基などのアルキル基で置換されていてもよい。本明細書で使用される用語「シクロアルキルアルキル」は、シクロアルキル基に連結されたアルキル基、およびアルキル基を介して分子にさらに連結されたアルキル基を意味する。
【０１１７】
本明細書で使用される用語「ヘテロシクリル」は、Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびそれらの組み合わせからなる群より選ばれる１つ以上のヘテロ原子を含有する単環式または二環式５員もしくは６員環系を意味する。ヘテロシクリル基は、任意の適当なヘテロシクリル基でありえ、脂肪族ヘテロシクリル基、芳香族ヘテロシクリル基、もしくはその組み合わせであり得る。ヘテロシクリル基は、単環式ヘテロシクリル基または二環式ヘテロシクリル基であり得る。好適な二環式ヘテロシクリル基としては、Ｃ６−Ｃ１０アリール環に縮合した単環式ヘテロシクリル環が挙げられる。ヘテロシクリル基が二環式ヘテロシクリル基である場合、両方の環系は、脂肪族または芳香族であってもよく、一方の環系は、芳香族でありえ、他方の環系は例えばジヒドロベンゾフランのように脂肪族であってもよい。非限定的な好適な芳香族ヘテロシクリル基としては、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ピペリジニル、およびモルホリニルが挙げられる。非限定的な好適な芳香族ヘテロシクリル基としては、フラニル；チオフェニル；ピロリル；ピラゾリル；イミダゾリル；１，２，３−トリアゾリル；１，２，４−トリアゾリル；イソキサゾリル；オキサゾリル；イソチアゾリル；チアゾリル；１，３，４−オキサジアゾール−２−イル；１，２，４−オキサジアゾール−２−イル；５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール；３−メチル−１，２，４−オキサジアゾール；ピリジニル；ピリミジニル；ピラジニル；トリアジニル；ベンゾフラニル；ベンゾチオフェニル；インドリル；キノリニル；イソキノリニル；ベンズイミダゾリル；ベンゾオキサゾリニル；ベンゾチアゾリニル；およびキナゾリニルが挙げられる。ヘテロシクリル基は、本明細書で説明するような、メチル基、エチル基などのアルキル基、またはフェニル基、ナフチル基などのアリール基など１、２、３、４または５個の置換基で置換されてもよい（アリール基は、さらに例えば、ハロ、ジハロアルキル、トリハロアルキル、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、置換されたアミノ、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アリールオキシカルボニル、チオ，アルキルチオ、アリールチオ等で置換されてもよく、任意の置換基は、ヘテロシクリル基上の任意の開放位置に存在してもよい）。
【０１１８】
本明細書で使用される用語「ヘテロシクリルアルキル」は、ヘテロシクリル基に連結されたアルキル基、およびアルキル基を介して分子にさらに連結されたヘテロシクリル基を指す。
【０１１９】
本明細書で使用される用語「アリールアルキル」は、Ｃ６−Ｃ１０アリール環に連結されたアルキル基、およびアルキル基を介して分子にさらに連結されたアルキル基を指す。本明細書で使用される用語「アルキルアリール」は、アルキル基に連結されたＣ６−Ｃ１０アリール環、およびアリール基を介して分子にさらに連結されたＣ６−Ｃ１０アリール環を指す。
【０１２０】
本明細書で使用される用語「アルキルカルボニル」は、カルボニル基に連結されたアルキル基、およびアルキル−Ｃ（＝Ｏ）−などのカルボニル基を介して分子にさらに連結されたアルキル基を意味する。本明細書で使用される用語「アルコキシカルボニル」は、カルボニル基に連結されたアルコキシ基、およびアルキル−Ｃ（＝Ｏ）−などのカルボニル基を介して分子にさらに連結されたアルコキシ基を意味する。
【０１２１】
構造中の原子数の範囲（例えば、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ８、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ４、またはＣ２−Ｃ１２、Ｃ２−Ｃ８、Ｃ２−Ｃ６、Ｃ２−Ｃ４アルキル、アルケニル、アルキニルなど）が示されるときはいつでも、示された範囲内に収まる炭素原子の任意のサブ範囲または個々の数も使用することができることが具体的に企図されている。したがって、本明細書で言及する、例えば、任意の化学基（例えば、アルキル、アルキルアミノなど）に関して使用される、１−８個の炭素原子（例えばＣ１−Ｃ８）、１−６個の炭素原子（例えばＣ１−Ｃ６）、１−４個の炭素原子（例えばＣ１−Ｃ４）、１−３個の炭素原子（例えばＣ１−Ｃ３）または２−８個の炭素原子（例えばＣ２−Ｃ８）の範囲の説明は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の炭素原子およびそれらの組み合わせを適宜、ならびに如何なるそのサブ範囲（例えば１−２個の炭素原子、１−３個の炭素原子、１−４個の炭素原子、１−５個の炭素原子、１−６個の炭素原子、１−７個の炭素原子、１−８個の炭素原子、１−９個の炭素原子、１−１０個の炭素原子、１−１１個の炭素原子、１−１２個の炭素原子、２−３個の炭素原子、２−４個の炭素原子、２−５個の炭素原子、２−６個の炭素原子、２−７個の炭素原子、２−８個の炭素原子、２−９個の炭素原子、２−１０個の炭素原子、２−１１個の炭素原子、２−１２個の炭素原子、３−４個の炭素原子、３−５個の炭素原子、３−６個の炭素原子、３−７個の炭素原子、３−８個の炭素原子、３−９個の炭素原子、３−１０個の炭素原子、３−１１個の炭素原子、３−１２個の炭素原子、４−５個の炭素原子、４−６個の炭素原子、４−７個の炭素原子、４−８個の炭素原子、４−９個の炭素原子、４−１０個の炭素原子、４−１１個の炭素原子、および／または４−１２個の炭素原子等、適宜）を包含及び具体的に記載する。同様に、本明細書で言及する任意の化学基（例えば、アリール）に関して使用される、６−１０個の炭素原子（例えばＣ６−Ｃ１０）の範囲の説明は、６、７、８、９、および／または１０個の炭素原子を適宜、ならびに如何なるそのサブ範囲（例えば、６−１０個の炭素原子、６−９個の炭素原子、６−８個の炭素原子、６−７個の炭素原子、７−１０個の炭素原子、７−９個の炭素原子、７−８個の炭素原子、８−１０個の炭素原子、および／または８−９個の炭素原子等、適宜）を包含及び具体的に記載する。
【０１２２】
本明細書で使用する用語「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素、臭素、塩素、およびヨウ素などのグループＶＩＩＡから選ばれる置換基を意味する。
【０１２３】
用語「アリール」は、当技術分野で一般的に理解されているように、未置換または置換された芳香族炭素環置換基を指し、用語「Ｃ６−Ｃ１０アリール」にはフェニルおよびナフチルが含まれる。用語「アリール」は、平面状であり、ヒュッケルの規則に従って４ｎ＋２π電子を含む環状置換基に適用されることが理解される。
【０１２４】
「医薬上許容し得る塩」というフレーズは、従来の化学的方法によって塩基性または酸性の部位を含有する親化合物から合成された非毒性の塩を含むことを意図している。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基の形態を、水または有機溶媒中、またはそれらの混合物中で、化学量論的量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストは、Remington’ Pharmaceutical Sciences, 22nd ed., Pharmaceutical Press, (2012)に記載されている。
【０１２５】
好適な塩基としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどの金属カチオンを含有するアルカリ金属塩基およびアルカリ土類金属塩基などの無機塩基が挙げられる。非限定的な好適な塩基の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどが挙げられる。好適な酸としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、およびｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、マレイン酸、酒石酸、脂肪酸、長鎖脂肪酸などの有機酸が挙げられる。酸性部位を有する化合物の好ましい医薬上許容し得る塩としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられる。塩基性部位（例えば、ジメチルアミノアルキル基）を有する化合物の好ましい医薬上許容し得る塩としては、塩酸塩および臭化水素酸塩が挙げられる。酸性または塩基性部位を有する化合物は、遊離塩基もしくは酸の形態で、またはその医薬上許容し得る塩の形態で有用である。
【０１２６】
本発明の任意の塩の一部を形成する特定の対イオンは、塩全体が薬理学的に許容し得る、かつ対イオンが塩全体に望ましくない資質を寄与しない限り、通常、臨界的な性質ではないことが認識されるべきである。
【０１２７】
上記の化合物および塩は、溶媒和物を形成してもよく、または無水形態のような実質的に非複合の形態で存在してもよいことがさらに理解される。本明細書で使用されるように、用語「溶媒和物」は、結晶化溶媒などの溶媒分子が結晶格子に組み込まれた分子複合体を指す。溶媒和物に組み込まれた溶媒が水である場合、分子複合体は水和物と呼ばれる。医薬上許容し得る溶媒和物としては、水和物、メタノラートおよびエタノラート、アセトニトリレートなどのアルコラートなどが挙げられる。また、これらの化合物は、多形の形態で存在してもよい。
【０１２８】
上記の実施形態のいずれかにおいて、式（Ｉ）の化合物または塩は、少なくとも１つの不斉炭素原子を有することができる。化合物または塩が少なくとも１つの不斉炭素原子を有する場合、化合物または塩は、ラセミ形態で、その純粋な光学異性体の形態で、または一方の異性体が他方の異性体と相対的に濃縮される混合物の形態で存在することができる。特に、本発明に従って、化合物が単一の不斉炭素原子を有する場合、化合物は、ラセミ体の形態、すなわち、等量の光学異性体の混合物の形態、すなわち、等量の２つのエナンチオマーの形態、または単一のエナンチオマーの形態で存在してもよい。本明細書で使用されるように、「単一エナンチオマー」は、５０％を超える単一エナンチオマー（すなわち、１００％の純粋なエナンチオマーまでのエナンチオマー過剰）を含む化合物を包含することが意図される。
【０１２９】
したがって、化合物または塩が２つ以上の不斉中心を有する場合、化合物または塩は、ジアステレオマーの混合物として、または単一のジアステレオマーの形態で存在し得る。本明細書で使用されるように、「単一のジアステレオマー」は、５０％を超える単一ジアステレオマー（すなわち、１００％の純粋なジアステレオマーに対するジアステレオマー過剰）を含む化合物を意味することが意図されている。
【０１３０】
本明細書に記載された本主題の実施形態は、単独で、または１つ以上の他の実施形態と組み合わせて有益であり得る。前記の説明を限定することなく、本開示の番号１−４４の特定の非限定的な実施形態が以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかになるであろうが、個別に番号が付けられた実施形態の各々は、先行または後続の個別に番号が付けられた実施形態のいずれかと一緒に使用されるか、または組み合わせることができる。これは、かかるすべての実施形態の組み合わせの支持を提供することを意図しており、以下に明示的に提供される実施形態の組み合わせに限定されるものではない。
（１）      以下を含む医薬製剤：
（ａ）      式（Ｉ）：
【０１３１】
【化１６】
2021524844.tif 000018
【０１３２】
（式中、Ｒ１が、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキルアルキル、チオシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アルキルチオシクロアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルキルピペリジン−４−イル、アリールピペラジニルアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ２が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル
Ｒ３が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ４が、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ１およびＲ４は、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノスルホニル、ヒドロキシル、パーフルオロアルコキシ、アルキレンジオキシ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基でアリールおよび／またはアルキル部分で置換されてもよい）の化合物またはその医薬上許容し得る塩；および
（ｂ）      １つ以上のカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドおよびＰＥＧ−８カプリリック／カプリックグリセリドを含む医薬上許容し得る界面活性剤。
【０１３３】
（２）さらにカプリル酸を含む実施形態（１）の製剤。
【０１３４】
（３）製剤が懸濁製剤である、実施形態（１）または（２）の製剤。
【０１３５】
（４）製剤がピルである、実施形態（１）または（２）の製剤。
【０１３６】
（５）以下を含む医薬製剤：
（ａ）式（Ｉ）：
【０１３７】
【化１７】
2021524844.tif 000019
【０１３８】
（式中、Ｒ１が、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキルアルキル、チオシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アルキルチオシクロアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルキルピペリジン−４−イル、アリールピペラジニルアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ２が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ３が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ４が、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ１およびＲ４は、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノスルホニル、ヒドロキシル、パーフルオロアルコキシ、アルキレンジオキシ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基でアリールおよび／またはアルキル部分で置換されてもよい）の化合物またはその医薬上許容し得る塩；および
（ｂ）      １つ以上の１２−ヒドロキシステアリン酸のポリオキシエチレンエステルを含む医薬上許容し得る界面活性剤。
【０１３９】
（６）製剤が水を含む、実施形態（１）−（３）および（５）のいずれかの製剤。
【０１４０】
（７）製剤が生理食塩水を含む、実施形態（５）の製剤。
【０１４１】
（８）Ｒ１が、Ｏ、ＮおよびＳからなる群より選ばれる少なくともひとつのヘテロ原子を有する５もしくは６員ヘテロシクリル基；ヒドロキシＣ１−Ｃ７シクロアルキル基；ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル基；ヘテロアリールＣ１−Ｃ６アルキル基；ヘテロシクリルＣ１−Ｃ６アルキル基；フェニル環が１つ以上のＣ１−Ｃ６アルコキシ基で置換されたフェニルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｎ−ベンジルピペラジニル；Ｎ−フェニルピペラジニルアルキル；アルキルがヒドロキシ基で置換されたフェニルＣ１−Ｃ６アルキル基；または５もしくは６員ヘテロアリールアミノＣ１−Ｃ６アルキル基（式中、ヘテロアリール基はＯ、ＮおよびＳからなる群より選ばれる少なくともひとつのヘテロ原子を有する）である、実施形態（１）−（７）のいずれかの製剤。
【０１４２】
（９）Ｒ１が、下記：
【０１４３】
【化１８】
2021524844.tif 000020
【０１４４】
からなる群より選ばれる、実施形態（１）−（８）のいずれかの製剤。
【０１４５】
（１０）Ｒ２が、フェニル、Ｒ３がフェニル、Ｒ４がベンジル、およびＲ１が下記：
【０１４６】
【化１９】
2021524844.tif 000021
【０１４７】
からなる群より選ばれる、実施形態（９）の製剤。
【０１４８】
（１１）Ｒ４が４−メトキシベンジル、Ｒ２がフェニル、Ｒ３がフェニル、およびＲ１が下記：
【０１４９】
【化２０】
2021524844.tif 000022
【０１５０】
からなる群より選ばれる、実施形態（１）〜（１０）の製剤。
【０１５１】
（１２）Ｒ４がフェニルエチル、Ｒ２がフェニル、Ｒ３がフェニル、およびＲ１が下記：
【０１５２】
【化２１】
2021524844.tif 000023
【０１５３】
からなる群より選ばれる、実施形態（１）−（１０）のいずれかの製剤。
【０１５４】
（１３）Ｒ４が４−アミノスルホニルベンジル、４−トリフルオロメトキシベンジル、４−メトキシベンジル、およびシクロプロピルメチルから選ばれ、かつＲ１が下記：
【０１５５】
【化２２】
2021524844.tif 000024
【０１５６】
から選ばれる、実施形態（１）−（１１）のいずれかの製剤。
【０１５７】
（１４）Ｒ４がヘテロアリールＣ１−Ｃ６アルキルである、実施形態（１）−（１１）のいずれかの製剤。
【０１５８】
（１５）Ｒ２がフェニル、Ｒ３がフェニル、Ｒ４が
【０１５９】
【化２３】
2021524844.tif 000025
【０１６０】
ならびにＲ１が下記：
【０１６１】
【化２４】
2021524844.tif 000026
【０１６２】
からなる群より選ばれる、実施形態（１４）の製剤。
【０１６３】
（１６）哺乳動物の膵臓腺がんを治療する方法であって、それを必要とする哺乳動物に哺乳動物の膵臓腺がんの治療に有効な量の式（Ｉ）：
【０１６４】
【化２５】
2021524844.tif 000027
【０１６５】
（式中、Ｒ１が、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキルアルキル、チオシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アルキルチオシクロアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルキルピペリジン−４−イル、アリールピペラジニルアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ２が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ３が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ４が、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ１およびＲ４は、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノスルホニル、ヒドロキシル、パーフルオロアルコキシ、アルキレンジオキシ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基でアリールおよび／またはアルキル部分で置換されてもよい）の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与する工程を含む方法。
【０１６６】
（１７）Ｒ１が、Ｏ、ＮおよびＳからなる群より選ばれる少なくともひとつのヘテロ原子を有する５もしくは６員ヘテロシクリル基；ヒドロキシＣ１−Ｃ７シクロアルキル基；ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル基；ヘテロアリールＣ１−Ｃ６アルキル基；ヘテロシクリルＣ１−Ｃ６アルキル基；フェニル環が１つ以上のＣ１−Ｃ６アルコキシ基で置換されたフェニルＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｎ−ベンジルピペラジニル；Ｎ−フェニルピペラジニルアルキル；アルキルがヒドロキシ基で置換されたフェニルＣ１−Ｃ６アルキル基；または５もしくは６員ヘテロアリールアミノＣ１−Ｃ６アルキル基（式中、ヘテロアリール基はＯ、ＮおよびＳからなる群より選ばれる少なくともひとつのヘテロ原子を有する）である、実施形態（１６）の方法。
【０１６７】
（１８）Ｒ１が、下記：
【０１６８】
【化２６】
2021524844.tif 000028
【０１６９】
からなる群より選ばれる、実施形態（１６）の方法。
【０１７０】
（１９）Ｒ２が、フェニル、Ｒ３がフェニル、Ｒ４がベンジル、およびＲ１が下記：
【０１７１】
【化２７】
2021524844.tif 000029
【０１７２】
からなる群より選ばれる、実施形態（１６）の方法。
【０１７３】
（２０）Ｒ４が４−メトキシベンジル、Ｒ２がフェニル、Ｒ３がフェニル、およびＲ１が下記：
【０１７４】
【化２８】
2021524844.tif 000030
【０１７５】
からなる群より選ばれる、実施形態（１６）の方法。
【０１７６】
（２１）Ｒ４がフェニルエチル、Ｒ２がフェニル、Ｒ３がフェニル、およびＲ１が下記：
【０１７７】
【化２９】
2021524844.tif 000031
【０１７８】
からなる群より選ばれる、実施形態（１６）の方法。
【０１７９】
（２２）Ｒ４が４−アミノスルホニルベンジル、４−トリフルオロメトキシベンジル、４−メトキシベンジル、およびシクロプロピルメチルから選ばれ、かつＲ１が下記：
【０１８０】
【化３０】
2021524844.tif 000032
【０１８１】
から選ばれる、実施形態（１６）の方法。
【０１８２】
（２３）Ｒ４がヘテロアリールＣ１−Ｃ６アルキルである、実施形態（１６）の方法。
【０１８３】
（２４）Ｒ２がフェニル、Ｒ３がフェニル、Ｒ４が
【０１８４】
【化３１】
2021524844.tif 000033
【０１８５】
ならびにＲ１が下記：
【０１８６】
【化３２】
2021524844.tif 000034
【０１８７】
からなる群より選ばれる、実施形態（２３）の方法。
【０１８８】
（２５）さらに哺乳動物に化学療法剤を投与する、または哺乳動物を放射線処置にかける工程を含む、実施形態（１６）−（２４）のいずれかの方法。
【０１８９】
（２６）治療が（Ｉ）−（Ｖ）のひとつ以上の結果になる、実施形態（１６）−（２５）のいずれかの方法：
（Ｉ）哺乳動物の細胞内の核周囲コンパートメントを破壊すること、
（ＩＩ）哺乳動物の細胞内の核周囲コンパートメントの有病率を低下させること、
（ＩＩＩ）哺乳動物の転移性がん細胞が産生するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）レベルを低下させること、
（ＩＶ）哺乳動物のがん細胞のコロニー形成を減少させること、および
（Ｖ）哺乳動物のがん細胞の遊走を減少させること。
【０１９０】
（２７）哺乳動物がステージＩの膵臓腺がんを有する、実施形態（１６）−（２６）のいずれかの方法。
【０１９１】
（２８）哺乳動物がステージＩＩの膵臓腺がんを有する、実施形態（１６）−（２６）のいずれかの方法。
【０１９２】
（２９）哺乳動物がステージＩＩＩの膵臓腺がんを有する、実施形態（１６）−（２６）のいずれかの方法。
【０１９３】
（３０）哺乳動物がステージＩＶの膵臓腺がんを有する、実施形態（１６）−（２６）のいずれかの方法。
【０１９４】
（３１）哺乳動物が転移性膵臓腺がんを有する、実施形態（１６）−（２６）のいずれかの方法。
【０１９５】
（３２）哺乳動物に化学療法剤を投与する工程を含む、実施形態（２５）の方法。
【０１９６】
（３３）化学療法剤が、ゲムシタビンである、実施形態（３２）の方法。
【０１９７】
（３４）化学療法剤が、式（Ｉ）の化合物と一緒に任意の順序で連続投与される、実施形態（３２）または（３３）の方法。
【０１９８】
（３５）化学療法剤を式（Ｉ）の化合物と一緒に同時に投与する、実施形態（３２）または（３３）の方法。
【０１９９】
（３６）式（Ｉ）の化合物が、確立された転移巣のさらなる転移を減少させるか、または遅延させる、実施形態（１６）−（２６）および（２９）−（３５）のいずれかの方法。
【０２００】
（３７）式（Ｉ）の化合物が、哺乳動物から１つ以上の膵臓腺腫瘍を除去した後に投与される、実施形態（１６）−（３６）のいずれかの方法。
【０２０１】
（３８）１つ以上の膵臓腺腫瘍を手術により哺乳動物から除去する、実施形態（３７）の方法。
【０２０２】
（３９）式（Ｉ）の化合物の投与が転移巣の量や大きさを減少させる、実施形態（３８）の方法。
【０２０３】
（４０）式（Ｉ）の化合物の投与が、転移巣の成長を減少させるか、または遅らせる、実施形態（１６）〜（２６）および（２９）〜（３９）のいずれかの方法。
【０２０４】
（４１）哺乳動物におけるＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化を検出する方法であって、哺乳動物は、式（Ｉ）：
【０２０５】
【化３３】
2021524844.tif 000035
【０２０６】
（式中、Ｒ１が、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオアルキル、シクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、ヒドロキシシクロアルキルアルキル、チオシクロアルキル、アルコキシシクロアルキル、アルキルチオシクロアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルキルピペリジン−４−イル、アリールピペラジニルアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ２が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ３が、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよいフェニル、
Ｒ４が、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ、
Ｒ１およびＲ４は、ハロ、アルキル、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アルコキシ、アルキルチオアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルチオカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノスルホニル、ヒドロキシル、パーフルオロアルコキシ、アルキレンジオキシ、およびアルキルカルボニルからなる群より選ばれる１つ以上の置換基でアリールおよび／またはアルキル部分で置換されてもよい）の化合物またはその医薬上許容し得る塩を投与されており、以下の工程を含む方法：
（ａ）哺乳動物から第１の膵臓腺がん腫瘍サンプルを提供する工程、
（ｂ）腫瘍サンプルをアッセイして、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ１（ＦｏｘＡ１）およびフォークヘッドボックスタンパク質Ｏ６（ＦｏｘＯ６）の一方または両方の発現レベルを決定する工程、
（ｃ）哺乳動物から第２の膵臓腺がん腫瘍サンプルを提供する工程、
（ｄ）第２の腫瘍サンプルをアッセイして、ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルを決定する工程；および
（ｅ）（ｉ）第２の決定された発現レベルに対するＦｏｘＡ１の第１の決定された発現レベル、および（ｉｉ）ＦｏｘＯ６の第１の決定された発現レベルとＦｏｘＯ６の第２の決定された発現レベルとを比較、の一方または両方を比較して、ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化を検出する工程、
ここで哺乳動物から第２の腫瘍サンプルを摘出する前に、第１の腫瘍サンプルが哺乳動物から摘出される。
【０２０７】
４２．哺乳動物の膵臓線がんを治療する方法であって、該方法は以下を含む：
ａ）ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化の決定を受ける工程であって、変化が、（ｉ）ＦｏｘＡ１発現の第２の決定されたレベルがＦｏｘＡ１発現の第１の決定されたレベルよりも低いこと、および（ｉｉ）ＦｏｘＯ６発現の第２の決定されたレベルがＦｏｘＯ６発現の第１の決定されたレベルよりも高いこと、のうちの一方または両方であり、ＦｏｘＡ１およびＦｏｘＯ６の一方または両方の発現レベルの変化が、実施形態４１に記載の方法によって決定される；
ｂ）式（Ｉ）の化合物の投与に対する臨床応答を予測する工程；ならびに
ｃ）変化が、（ｉ）ＦｏｘＡ１発現の第２の決定されたレベルがＦｏｘＡ１発現の第１の決定されたレベルよりも低い、および（ｉｉ）ＦｏｘＯ６発現の第２の決定されたレベルがＦｏｘＯ６発現の第１の決定されたレベルよりも高い、のいずれか一方または両方である場合に、式（Ｉ）の化合物を哺乳動物に投与することにより哺乳動物の膵臓線がんを治療する工程。
【０２０８】
（４３）約０．１から約８０ｍｇ／ｋｇの式（Ｉ）の化合物を哺乳動物に投与する、実施形態（１６）−（４２）のいずれかの方法。
【０２０９】
（４４）哺乳動物がヒトである、実施形態（１６）−（４３）のいずれかの方法。
【０２１０】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、もちろん、いかなる方法でもその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない
【実施例】
【０２１１】
実施例１
本実施例では、式（Ｉ）の化合物を、転移性挙動の表現型マーカーおよびサロゲートとしてＰＮＣを用いて同定した方法を説明する。
【０２１２】
ＰＮＣを効果的に分解する低分子をスクリーニングするために、転移性前立腺がん細胞株ＰＣ３Ｍを開発した(Pettaway, et al.“Selection of highly metastatic variants of different human prostatic carcinomas using orthotopic implantation in nude mice,” Clin. Cancer Res., (2): 1627-36 (1996)を参照、その全体が本明細書に組み込まれる）。ＰＣ３Ｍは、ＰＮＣ(Huang, et al. “The perinucleolar compartment and transcription,” Journal of Cell Biology, (143): 35-47 (1998) を参照、その全体が本明細書に組み込まれる）の必須成分であるＧＦＰ−ＰＴＢ（ポリピリミジントラック結合タンパク質）を安定的に発現させるために、７５〜８５％のＰＮＣ有病率を有する（図１、上段）。ＰＮＣ有病率を５０％低減できる化合物を二次アッセイでフィルターし、アポトーシス、ＤＮＡ損傷、一般的な細胞毒性または細胞周期阻害を誘導する化合物を除去した(Norton, et al., “Automated high-content screening for compounds that disassemble the perinucleolar compartment,” J Biomol Screen, (14): 1045-53 (2009) and Frankowski, et al., “Discovery and Development of Small Molecules That Reduce PNC Prevalence, in Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program, Bethesda (MD).(2010)を参照、その全体が本明細書に組み込まれる）。残りのヒットは、ＭＡＴＲＩＧＥＬゼラチン状タンパク質混合物を介した浸潤阻害および軟寒天アッセイを用いたアンカーに依存しない増殖阻害について評価した。
【０２１３】
２４ウェルトランズウェルパーミアブルＭＡＴＲＩＧＥＬゼラチン状タンパク質混合物浸潤アッセイ：ＰＡＮＣ１およびＰＣ３Ｍ細胞の浸潤活性に対するメタレスチンの効果を、８μｍの細孔を有する２４ウェルトランズウェルパーミアブルＭＡＴＲＩＧＥＬゼラチン性タンパク質混合物浸潤チャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３５４４８０）を用いて測定した。膜は、チャンバー内およびウェル内の両方で無血清ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ＃１１９６５０８４）の５００μＬで再水和し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。細胞を剥離し、洗浄し、無血清ＤＭＥＭに再懸濁し、計数し、６つの別々の１５ｍＬのコニカルチューブ内の１×１０５細胞／ｍＬの最終濃度に希釈した。図３に示すように、メタレスチンまたはビヒクルを減少濃度で各チューブに添加し、メタレスチンまたはビヒクルを含む培地中に再懸濁された細胞の５００μＬをトリプリケイトで上部チャンバーに配置した。化学吸着剤として作用するＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの７５０μＬを基礎ウェルに配置した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。浸潤細胞の数をカウントするために、上部のインサートから培地を除去し、綿棒を使用してインサート上の膜の上側から非浸潤細胞を拭き取った。インサート上の膜の下側の浸潤細胞を固定し、３段階のＤＩＦＦ  ＱＵＩＫ  Ｒａｐｉｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｓｅｔ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を用いて染色した後、３回の水洗と空気乾燥を行った。各化合物処理のための細胞浸潤をトリプリケイトで行った。各インサートの代表的な写真を撮影した。
【０２１４】
ＰＮＣ阻害剤としての効力、軟寒天増殖阻害剤としての効力、浸潤をブロックする能力、および細胞毒性の欠如に基づいて、ＭＬＳ０００５５６９１５と名付けられた化合物が、さらなる研究のために選択された。
【０２１５】
スクリーニング結果に基づいて、その後、追加の薬理化学的研究が、式（Ｉ）の化合物であるメタレスチン（以下の構造）を設計するために使用された。
【０２１６】
【化３４】
2021524844.tif 000036
【０２１７】
実施例および図を通して、データは平均値＋／−ＳＤとして示されている。スチューデントのｔ検定は、示されている場所を除いて、すべての実験について実施した。平均核小体面積は、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定、２−ｔａｉｌｅｄを用いて分析した。
【０２１８】
実施例２
本実施例は、式（Ｉ）の化合物であるメタレスチンが、がん細胞型におけるＰＮＣを破壊することを示している。
【０２１９】
要約すると、いくつかの細胞型（表１の以下のリスト参照）を、メタレスチンの１μＭ（ＰＣ３Ｍ細胞についてはＩＣ１００）で２４時間処理した。具体的には、ＰＣ−３Ｍ細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地で維持した。ＨｅＬａ、Ｐａｎｃ１、ＰＡＣＡＤＤ１５９、ＰＡＣＡＤＤ１８３、ＰＡ−ＴＵ−８９８８Ｔ、ＫＰ−３、ＰＫ−８、ＮＯＲ−Ｐ１、Ｌ３．６ｓｌ、Ｃｏｌｏ３５７、Ｓｕｉｔ−２、ＨＰＡＣなどの他の細胞株を、１０％ＦＢＳ（ＧＥＭＩＮＩＴＭ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）および１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシンと一緒にＤＭＥＭ中に維持した。細胞は、一般に、メタレスチン１μＭで５時間または２４時間処理する前に約２４時間プレーティングした。
【０２２０】
【表１】
2021524844.tif 000037
【０２２１】
驚くべきことに、メタレスチンは、異なるヒトがん細胞株においてＰＮＣ有病率を減少させることがわかった（図２）。例えば、ＰＣ３Ｍ−ＧＦＰ−ＰＴＢ細胞では、メタレスチンは急性細胞毒性（図１、下のグラフ、丸）を伴わず、ＩＣ５０が０．３９μＭ（図１、下のグラフ、四角）でＰＮＣを破壊した。さらに、ＭＡＴＲＩＧＥＬゼラチン状タンパク質混合浸潤アッセイの分析から、メタレスチンは、ＰＣ３Ｍ細胞およびＰＡＮＣ１細胞の浸潤を、２４時間後のＰＣ３Ｍ細胞およびＰＡＮＣ１細胞の増殖に影響を与えない濃度（０．６Ｍ）で２４時間以内に効果的に遮断した（ＰＣ３Ｍ細胞については図４、ＰＡＮＣ１細胞については図４６）ことが示された。ＰＣ３Ｍ細胞と正常ヒト線維芽細胞（ＧＭ０２１５３）をＩＮＣＵＣＹＴＥＴＭ（登録商標）システムを用いて１μＭの濃度で長時間処理したところ、メタレスチンはＰＣ３Ｍがん細胞の細胞増殖を優先的に阻害した（図４）。
【０２２２】
実施例３
本実施例は、式（Ｉ）の化合物であるメタレスチンが、ヒト膵臓がん異種移植のマウスモデルにおいて転移を抑制し、生存期間を延長することを示す。
【０２２３】
膵臓がん患者は転移による死亡率が特に高いため、膵臓がんの同所性転移モデルにおける転移に対するメタレスチンのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を評価した。ＮＯＤ／インターロイキン２受容体共通ガンマ鎖（Ｉｌ２ｒγ）ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）ＰＡＮＣ−１マウス（Suemizu et al., “Identification of a key molecular regulator of liver metastasis in human pancreatic carcinoma using a novel quantitative model of metastasis in NOD/SCID/gammacnull (NOG) mice,” Int. J. Oncol., (31): 741-51 (2007)を参照、その全体が本明細書に組み込まれる）に展開した３Ｄ  ＰＡＮＣ１細胞スフィアモデルは、胃出口閉塞や総胆管のインピンジメントなどの局所浸潤の合併症による早期死亡の制限を受けずに、ヒトがんの進行および疾患の転移性表現型を再現している。６万個の３Ｄルシフェラーゼ発現ＰＡＮＣ１−ｌｕｃ細胞スフィアをＮＳＧマウスの膵臓に直交的に注入した。病理組織学的検査の結果、時折生じる門脈周囲浸潤と微小転移性の沈着の形で測定可能な転移が、肝臓では移植後約４週目には実質性浸潤の形で発生していたことが判明した。８週目までには、肝臓表面に巨大転移が認められた。マウスの寿命は１０〜１４週であった（図６３参照）。
【０２２４】
使用した前臨床モデルが臨床検体で以前に観察されたＰＮＣの特徴を保持しているかどうかを決定するために、ＮＳＧ  ＰＡＮＣ１マウスの様々な臓器からの原発性腫瘍および転移性病変に由来する膵臓がん細胞株のパネルでＰＮＣの有病率を測定した。その結果、転移性起源のヒトがん系統および転移性病変では、原発性腫瘍由来のものと比較して、ＰＮＣがより多く存在することが示された（図５、細胞株の説明、下記表２参照）。凍結保存された組織切片を調べると、ＰＮＣを標識し、マウス組織よりもヒト異種移植組織を特異的に同定することを可能にするモノクローナル抗ヒト特異的ＰＴＢ抗体ＳＨ５４を用いた免疫標識により、ＰＮＣは検出された。ＰＮＣ有病率は、移植後８週間後に採取した原発性腫瘍よりも転移性病変の方が高かった（図６）。
【０２２５】
【表２】
2021524844.tif 000038
【０２２６】
実施例４
実施例は、式（Ｉ）の化合物、メタレスチンが、好ましいＰＫプロファイルを有し、メタレスチンの投与が、メタレスチンで処置したマウスの転移−関連死をうまく抑制していることを示している。
【０２２７】
この研究（およびそれに続く研究）は、無作為化、非盲検化、およびNIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って実施した。動物は、所定の時点で、または動物の苦痛の兆候（動かない、または１５％以上の体重減少）があったときに屠殺した。動物データは、最初に登録されたマウスの１０％未満に影響を与えた、特定できない死亡または所定のエンドポイントの前に屠殺した場合には、外れ値として除外した。
【０２２８】
ＢＡＬＢ／ｃマウス、１７−１９ｇ、雌、ｎ＝６６を購入し、餌と水への自由なアクセスを与えた。それらを、５％ＮＭＰ［ＮＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃａｔ＃２７０４５８）、２０％ＰＥＧ４００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃａｔ＃２０２３９８）、および７５％１０％ＨＰＢＣＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃａｔ＃Ｈ１０７）］中の５または２５ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｌ／ｋｇ）のメタレスチンを、左下腹部四分位（ｑｕａｄｒａｎｔ）注射（ｎ＝３３、各用量）を介して投与した。動物をイソフルランで麻酔し、指定された時点で、手動で拘束した。約１２０μＬの血液を、後眼窩穿刺を介するＫ２ＥＤＴＡチューブで動物から採取した。血液サンプルを氷上に置き、遠心分離（２０００ｇ、４℃、５分）して、１５分以内に血漿サンプルを得た。血漿サンプルの２０μＬのアリコートを、５０ｎｇ／ｍＬのＩＳ（デキサメタゾン）を含む２００μＬのアセトニトリルでタンパク質沈降させた。混合物を２分間ボルテックスし、５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清の３０μＬのアリコートを７０μＬ  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ）で希釈した後、２分間ボルテックスした。上清の２μＬのアリコートをＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入した。サンプルの分析は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ−０２（ＡＰＩ４０００）、Ｗａｔｅｒｓ−ＢＥＨ−Ｃ１８（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ）カラム、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ−０．０２５％ＦＡ−１ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ）および溶媒Ｂ（ＭｅＯＨ−０．０２５％ＦＡ−１ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ）からなる移動相を用いて行った。０．３０、０．６０、１．２０、１．２１、１．８０（停止）分で１０、９０、９０、１０％Ｂのグラジエントを行った。メタレスチンおよびデキサメタゾンの保持時間は、それぞれ１．０９および１．０８分であった。検量線は、分析前に既知のメタレスチンを連続的に希釈した濃度で設定した。ＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスを購入し、上記のように４週間、２４時間間隔で１日１回、５および２５ｍｇ／ｋｇのメタレスチンを投与した。最終投与から２４時間後、血漿中のメタレスチン濃度を分析した。
【０２２９】
マウスにおけるメタレスチンの５及び２５ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与による単回及び複数回の１日投与を用いたＰＫ研究（図４６）は、半減期が４．６〜５．５時間であり、蓄積の中等度のリスクが予測され、ｉｎ  ｖｉｖｏでの良好な曝露性、分布性及び忍容性を示した（図４６、表３及び４）。メタレスチンは高いバイオアベイラビリティを示し、血漿中の濃度は、長時間にわたってＰ３ＣＭ細胞においてそのＰＮＣ分解ＩＣ５０である０．３９Ｍを超え（図１および図４６）、原発性腫瘍においてはＩＣ９０である０．７５Ｍ（図１）の１０倍を超える濃度であり、腫瘍を有するＮＳＧ  ＰＡＮＣ１動物の転移性沈着物においては、ＰＯ経口投与により１０ｍｇ／ｋｇのメタレスチン７日間投与を中止した１時間後にさらに高い濃度であった（以下の表５を参照）。
【０２３０】
【表３】
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【０２３１】
【表４】
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【０２３２】
【表５】
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【０２３３】
接種４週間後、マウスを１日１回、メタレスチン（５ｍｇ／ｋｇもしくは２５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルをＩＰ注射で投与し、６週間継続した。最初の接種から１０週目の終わりに、２５ｍｇ／ｋｇメタレスチン毎日投与に曝露されたコホートは、Ｘｅｎｏｇｅｎ光子臓器／腫瘍比（図７）および標準病理組織学的検査（図８および９、ｐ＜０．００１）によって測定されるように、ビヒクル処置されたコントロールと比較して、肝臓（ｐ＜０．０１）および肺（ｐ＜０．０５）の両方の転移負担の減少を示した。原発性腫瘍重量は、コホート間で有意な変化はなかった（図１０）。処置は忍容性がよく、動物は体重を維持した（図１１）。自己同胞性ＫＰＣマウスに１０ｍｇ／ｋｇのメタレスチンを添加した飼料（７０ｐｐｍ）（下記表６参照、『Ｕ』は未決定）を慢性的に中断することなく３ヶ月間投与した後、または２５ｍｇ／ｋｇのメタレスチンを２週間経口強制投与した後、１２の臓器系および標準的な臨床化学物質の獣医病理組織学的レビューを行ったが、対照マウスと比較して、処置した動物の病理組織学的または実験室的異常を識別することができなかった。
【０２３４】
【表６−１】
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【０２３５】
【表６−２】
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【０２３６】
【表６−３】
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【０２３７】
処置動物のＰＮＣがメタレスチンの影響を受けているかどうかを判断するために、対照動物およびメタレスチン処置動物（２５ｍｇ／ｋｇ）からの原発性腫瘍および転移性病変におけるＰＮＣ有病率を腫瘍接種から１２週間後に調べた。その結果、転移性および原発性腫瘍組織におけるＰＮＣ有病率の有意な減少（図２、１２および３３、ｐ＜０．０１）が実証され、ＰＮＣ抑制が本化合物の抗転移活性と関連していることが示唆された。非処置動物におけるＰＮＣ有病率は、これらの腫瘍および転移性病変群において、より早い時期に採取された腫瘍（図６）または培養されたＰＡＮＣ１細胞（図２）よりも高かったが、末期がんはより高いＰＮＣ有病率を有するという以前の知見と一致した。
【０２３８】
メタレスチン処置が転移の進行を防ぐことで生存に有利になるかどうかを評価するために、上記の実験を繰り返したが、マウスは死亡するまで、または動物が試験の終点に達するまで追跡した。ＮＳＧマウスに６０，０００個の３Ｄ  ＰＡＮＣ１細胞を注入し（アッセイの詳細は後述）、腫瘍細胞を移植してから６週間後の病理組織学的検査で転移が微小転移に限定された時点で、メタレスチンを添加した飼料（１０ｍｇ／ｋｇ；７０ｐｐｍ、ＮＩＨ  ３１  Ｈａｓｌａｎゲッ歯動物食に添加した微細化粒子）による毎日処置を開始した（図６３）。通常の飼料を投与された対照群の動物は、処置開始から２５日後に死亡し始めたのに対し、メタレスチン処置群は処置開始から９０日を超えても死亡はなかった（図１３）。
【０２３９】
メタレスチン投与が、さらに進行した転移を有するマウスの生存に影響を与えるかどうかを評価するために、ＮＳＧマウスに６０，０００個の３Ｄ  ＰＡＮＣ１細胞を注入した。肝臓表面に巨大転移が確認された後、動物をメタレスチンを添加した飼料（１０ｍｇ／ｋｇ；７０ｐｐｍ）またはビヒクル飼料に無作為に割り付けた。ビヒクル飼料を投与したマウスは、処置コースの最初の１週間以内に死亡し始めた（図１４）。メタレスチン処置により、全生存期間の中央値は対照群の２倍以上に延長された。試験終了時点での完全剖検では、ビヒクル投与群で転移性病変の負担が有意に大きいことが明らかになった（ｐ＜０．０５）（図１５および１６）。対照群のほとんどの動物では、特に肝臓とそれ以下の程度ではあるが肺において、完全に近いまたは完全に臓器が腫瘍に置換されていることを示したのに対し、メタレスチン摂食マウスでは臓器が温存されていた（図１５）。膵臓の原発性腫瘍の増殖には、治療した動物とそうでない動物の間に有意な差はなかった（図１６）。これらの結果から、メタレスチン処置マウスでは転移関連死が抑制され、生存率が向上していることが示唆された。
【０２４０】
メタレスチンの抗転移活性（ＮＳＧ  ＰＡＮＣ１マウスおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏパンがん（ｐａｎｃａｎｃｅｒ）ＰＮＣ抑制で観察された）が、追加のがんモデルにおいて抗転移活性に変換するかどうかを決定するために、ＰＣ３Ｍ異種移植マウスを用いてメタレスチンを試験した。ＰＣ３Ｍ細胞の皮下移植の２週間後に、マウスに５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇのメタレスチンまたはビヒクルを毎日ＩＰ注射で投与を開始し、さらに４週間投与した。腫瘍の進行は、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（「ＩＶＩＳ」）分光法および腫瘍体積の両方によって追跡した。肺への転移は、ＩＶＩＳ分光法により、および実験の終点での病理組織学により、ｅｘ  ｖｉｖｏで評価した。２５ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．０５）でのメタレスチン処置は、ビヒクル処置したマウスと比較して肺転移の発生を減少させ（図１７）、原発性腫瘍異種移植片の成長を適度に減少させた（図１８）。処置した動物の体重および行動は、対照動物と有意な差はなかった（図１９）。ｉｎ  ｖｉｖｏ条件に最も近いと考えられる悪性異種移植片に対するメタレスチンの効果を評価するために、患者由来の乳がん異種移植モデル（ＰＤＸ）を使用した。ＩＶ期の乳管乳がん患者の胸水から採取した転移性乳がん細胞をマウスに接種し、第三世代マウスパセージした腫瘍をＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃマウスの乳腺脂肪パッドに移植した。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ３に達した後、メタレスチンによる処置を開始した。メタレスチン（２５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを毎日ＩＰ注射で４週間、５日間のオンと２日間のオフのスケジュールで投与した。腫瘍サイズと総体重は週２回測定し、腫瘍重量は実験終点で測定した。
【０２４１】
結果は、メタレスチンが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養を経ることなく、患者からの転移細胞から完全に形成されたＰＤＸの増殖を効果的に阻害したことを示している（図２０）。また、この処置は、動物の体重および行動に明らかな影響を与えることなく、忍容性が良好であった（図４Ｅ）。
【０２４２】
膵臓がんモデル：Ｎｏｄ／ＩＬ２ｇａｍｍａ（ｎｕｌｌ）マウスの膵臓に６０，０００ルシフェラーゼ標識ＰＡＮＣ１スフィアを注入した（ＮＣＩ  Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤから入手；ＡＣＵＣ承認動物プロトコルＳＢ−２１１−２において）。接種後４週目に、マウスをメタレスチン（５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルで１日１回、ＩＰ注射で処置し、さらに６週間延長した。マウスは、ＣＯ２安楽死によって屠殺される５分前にルシフェリンを注入した。臓器は、その後、個々に解剖し、定量的な異種遺伝子イメージングを受け、４％非緩衝ホルムアルデヒドで固定した。転移性負荷の影響を計算し、肝臓重量（ｇ）に正規化した肝臓の５分間の光子数に基づいて肝臓と肺／原発性腫瘍の比率としてグラフ化し、同じ動物の原発性膵臓腫瘍の重量（ｇ）あたりの平均光子数と比較した。この計算は、ルシフェリン注入、マウス心拍数、および灌流の変動を補正する。ｅＥＦ１Ａ２の過剰発現については、ｅＥＦ１Ａ２（ｅＥＦ１Ａ２  ＯＥ）でトランスフェクトされた６×１０^４  ＰＡＮＣ１  ３ＤスフィアをＮＳＧマウスの膵臓の尾部に注入した。両群のマウスを移植後６週目に採取し、剖検した。肝転移／ｍｍ２は、個々の転移の体積の合計として計算した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、（Ｌ×Ｗ２）として計算した（Ｌ＝長さ（ｍｍ）およびＷ＝幅（ｍｍ））。動物の生存率は、処置の初日から死亡するまで測定した。コントロールおよびメタレスチン治療コホートの動物は、所定の試験終点（１５％の体重減少、病的状態の認識可能な徴候、反射神経の全般的欠如、異常な姿勢、歩行能力の喪失、呼吸困難、飲用または給餌不能）に達するまで、連続的処置条件下で進行させ、動物の苦痛を防止するために、動物を、現地の動物飼育ガイドラインに従って安楽死させた。ＰＫ分析には、「温かい」剖検標本（血液、原発性腫瘍、肝臓および肺）のみを使用した。動物のケアと使用のためのすべての適用される機関のガイドラインに従った。
【０２４３】
乳がんモデル：乳がん患者（モデル番号３７３３４２）からの０．２リットルの胸水に由来するモデル。これらのがん細胞は、乳房で検出された最初の腫瘍から肺胸膜に転移していた。胸水を５０００  ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上清を除去し、細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬゼラチン状タンパク質混合物と一緒にマウス乳腺脂肪パッドに接種した。腫瘍の大きさが１ｃｍに達した後、２×２ｍｍの乳腺脂肪パッドの断片を別のマウスの乳腺脂肪パッドに再移植した。この実験で使用した腫瘍は、４回のパッセージを経た。ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ系マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を実験に使用した。動物を腫瘍接種の７日前まで順化した。２×２ｍｍの腫瘍を乳腺脂肪パッドに接種した。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ３に達した後、試験を開始した。５％ＮＭＰ、２０％ＰＥＧ４００、および１０％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）（７５％の水溶液）中のメタレスチン２５ｍｇ／ｋｇの用量を、週５日、４週間にわたってＩＰ注射した。腫瘍の大きさと総体重を週２回測定した。
【０２４４】
前立腺がんモデル：マウスを３×１０６個のヒトＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６膵臓腫瘍細胞（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を脇腹に移植し、１０匹のマウスを４群に分けた。５または２５ｍｇ／ｋｇの薬剤またはビヒクル単独（ネガティブコントロール）の投与を２週間後に開始し、移植後６週間後の実験終点まで継続した。原発性腫瘍の大きさ（キャリパーで測定）、生きた腫瘍細胞含有量（バイオフォトニックイメージング（ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ）で測定）、および総体重を毎週決定した。終点では、動物を安楽死させ、転移性臓器を除去し、臓器のバイオフォトニックイメージングにより転移を定量化した。
【０２４５】
実施例５
この実施例は、メタレスチン処理が、核小体構造を破壊し、Ｐｏｌ  Ｉ転写を阻害することを示す。
【０２４６】
メタレスチンが転移を抑制するメカニズムを調べるために、メタレスチン処理後の細胞変化を観察した。一次抗体：ＳＨ５４（抗ＰＴＢ抗体）のための１：３００希釈；Ｎｏｐｐ１４０（抗ヒトＮｏｐｐ１４０ウサギポリクローナル血清ＲＳ８）のための１：３００；ＵＢＦ（Ｆ−９）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のための１：５０；ＲＰＡ１９４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のための１：１００；ＣＵＧ−ＢＰ１（３Ｂ１）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のための１：１００；フィブリラリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ  ＃：  ＡＮＡ−Ｎ）のための１：１０；ＳＣ３５のための１：１０００；パキシリン（ａｂ３２０８４）のための１：３００；ビンクーリン（Ｓｉｇｍａ  Ｖ９１３１）のための１：６００。フルオレセイン結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：２００の希釈で使用した。サンプルは、ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ  ３．２ソフトウェア（ニコン）を用いて、Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ−Ｅ倒立蛍光顕微鏡上で可視化した。
【０２４７】
１μＭの濃度で、メタレスチンは、典型的に統合された３つの部分構造（図４７の矢印）：繊維状中心部（ＦＣ）、高密度繊維状部（ＤＦＣ）、および顆粒部（ＧＣ）から核の崩壊を誘導し、電子顕微鏡（ＥＭ）（図２１Ａ−２１Ｃ、下パネル）によって観察されるように、核内の顆粒部から繊維の分離をもたらした（図２１Ａ−２１Ｃ、電子顕微鏡）（図２１Ａ−２１Ｃ、下パネル）。核小体の破壊は、メタレスチンの処理を中止すると４８時間以内に可逆的であった（図４７）。同様の破壊は、ＰＡＮＣ１およびＰＣ３Ｍ細胞（図４８）、原発性腫瘍、およびＰＡＮＣ１異種移植モデルにおける肝転移組織などの他の処理された細胞株で観察された（図２１、右パネル）。ＥＭ画像の定量的評価は、処理した細胞株およびがん組織（図２２および図４９Ａ〜４９Ｃ）では核小体体積が有意に減少した（ｐ＜０．０００１）が、処理した正常マウス肝細胞では変化しなかったことを示した（図４９Ａ〜４９Ｃ）。ＥＭによって観察された核小体区画の分離は、核小体タンパク質の免疫蛍光によって検出された核小体キャッピング構造に対応すると考えられる（図２１Ａ〜２１Ｃ、図２３、図５０）。核小体分離とＰＮＣ欠損との結合は、核小体Ｐｏｌ  Ｉ転写開始因子、ＵＢＦ（上流結合転写因子）（図２３および５０）、またはＰｏｌ  Ｉポリメラーゼ、ＲＰＡ１９４（図５１）に対する抗体で免疫標識することによって、いくつかの細胞株にわたって確認された。リボソーム成熟に関与する因子、例えばフィブリラリンやＮＯＰＰ１４０（図５１、５２）も同様に再編成されていた。一方、正常ヒト線維芽細胞ＧＭ０２１５３細胞株を同濃度のメタレスチンで処理した場合、ＵＢＦ分布は変化しなかった（図５３）。
【０２４８】
核小体構造の破壊がリボソーム合成に影響を与えるかどうかを調べるために、誘導性ＧＦＰ−ＲＰＬ２９（リボソームサブユニット）を発現する細胞株を用いた。テトラサイクリンの添加により誘導されたＧＦＰ−ＲＰＬ２９（図２４）は、内因性リボソームサブユニットと同様の細胞内分布を示し、リボソームがアセンブルして細胞質へと移動する際に、核小体と細胞質に局在していた（図２４）。メタレスチンに５時間曝露した後（ＰＮＣを分解し、核小体構造を変化させた後）、ＧＦＰ−ＲＰＬ２９の発現を誘導したところ、核小体構造の変化にもかかわらず、ＧＦＰ−ＲＰＬ２９の産生（図５５および６２）およびその核小体局在は変化していなかった（図２４、右パネル）。しかし、新たに合成されたＧＦＰ−ＲＰＬ２９は、処理した細胞の細胞質ではほとんど検出されなかった（図２４、右図、図５４、下図）。これは、新たに合成されたリボソームタンパク質がリボソーム粒子に取り込まれず、細胞質に運び出されないことを示しており、それはひとつのリボソーム合成欠損の表現型である。これらの結果から、メタレスチンはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでリボソームサブユニットの細胞内分布を変化させながら核小体の超構造破壊を誘導することが明らかになり、本化合物の作用機序にリボソーム合成調節が関与していることが示唆された。
【０２４９】
実施例６
この実施例は、メタレスチン処理がｒＤＮＡプロモーターにおけるプレＲＮＡ合成およびＰｏｌ  Ｉ占有を減少させることを実証する。
【０２５０】
メタレスチンによって破壊されるのがリボソーム生合成のどのステップかを決定するために、新たに合成されたＲＮＡの局在パターンを検出するｉｎ  ｓｉｔｕランオンアッセイであるＢｒＵ取り込みアッセイを用いて、ｒＤＮＡ転写を評価した。細胞をグリセロール緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５％グリセロール、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ）で一度洗浄し、Ｂｒ−Ｕ取り込みアッセイプロトコールに従った。細胞は、１：１００希釈でのＣ２３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と１：５０希釈でのＢｒ−Ｕを認識する抗ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ）を用いて共免疫標識した。
【０２５１】
ＢｒＵを含む転写カクテル（図２５）で半透膜化細胞を５分間インキュベートすると、新たに合成されたｒＲＮＡ（転写部位を反映する）の組織がタイトな小さなクラスターに変化し、核小体機能の多くの側面に関与するタンパク質であるＣ２３／ヌクレオリンが核小体から分散することに代表されるように、核小体構造が破壊されていることが示された（図２５）。メタレスチン処理細胞におけるｒＤＮＡ転写への影響を評価するために、５’ＥＴＳ  ＲＮＡの量を定量した。５’ＥＴＳの量は、発生期のプレｒＲＮＡ転写物中の５’ＥＴＳが急速に除去されるため、ｒＤＮＡ転写量と相関している。メタレスチン処理細胞およびＤＭＳＯ処理対照細胞における５’ＥＴＳの定量的ＲＴ−ＰＣＲは、メタレスチン処理細胞では５’ＥＴＳ  ＲＮＡの大幅な減少を示した（図２６）。
【０２５２】
ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ：２−５×１０７細胞を、以前に記載されたプロトコルに従って各ＣｈＩＰアッセイに使用した。簡潔に言うと、メタレスチン処理の有無にかかわらず、ＨｅＬａ細胞を１％ホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間回転させながら架橋し、次いでグリシンの添加によって架橋を停止させた。固定したクロマチンをＣｏｖａｒｉｓで超音波処理し、指示された抗体を用いた免疫沈降に使用した。単離されたＤＮＡを、ＣＦＸコネクトリアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）上のＳＹＢＲグリーンを用いたｑＰＣＲにより分析した。比較サイクル閾値法を適用して、入力レベルに対するレプリケートＰＣＲ反応からの占有率を評価した。使用したプライマーセットは以下が挙げられる：ｒＤＮＡプロモーター(F: 5’-GCT GCG ATG GTG GCG TTT TTG GGG (配列番号: 1) およびR: 5’-ATA TAA CCC GGC GGC CCA AAA TTG CC) (配列番号: 2)、5’ETS (F: 5’-CGTGCCTGAGGTTTCTCC (配列番号: 3)およびR: 5’-CCACCAACGGACGTGAAG (配列番号: 4))、5.8S (F: 5’- GCA GGA CAC ATT GAT CAT CGA CAC (配列番号: 5) およびR: 5’- GCG CGG CGG CAA GAG GAG (配列番号: 6))、28S (F: 5’ GGAGGAAAAGAAACTAACCAGGAT (配列番号: 7) およびR: 5’ GCCTCGATCAGAAGGACTTG (配列番号: 8))、およびU12 (F: 5’GATCTGCCCGACCTTATTCA (配列番号: 9) およびR 5’AAACGCATTCACCACCTACC (配列番号: 10))。
【０２５３】
ＲＴ−ＰＣＲ：製造元の指示に従い、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細胞から総ＲＮＡを単離した。Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒ（ＩＤＴ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または遺伝子特異的プライマーと共にＭ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  ２８０２５−０１３）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＤＮＡは、遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。5’ETS-F: CCTCCAGTGGTTGTCGACTT (配列番号: 11);5’ETS-R: GAACGACACACCACCGTTC (配列番号: 12);eEF1A1-F:  AACATTGTCGTCATTGGACA (配列番号: 13;eEF1A1-R: TTGATCTTTCCCTTTCTGGT (配列番号: 14);eEF1A2-F: 5’CCATGTGTGTGGAGAGCTTCTC (配列番号: 15);eEF1A2-R: 5’ TCTCCACGTTCTTGATGACGCC (配列番号: 16;GAPDH-F: 5’ACCACAGTCCATGCCATCAC (配列番号: 17);GAPDH-R: 5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA (配列番号: 18)。ＰＣＲ産物を１−２％アガロースゲル上で分離した。リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ装置とＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ＃  ４３６７６５９）を用いて、ノースウェスタン大学コアファシリティで行った。
【０２５４】
メタレスチンがＰｏｌ  Ｉ転写を破壊するメカニズムを調べるために、処理した細胞における転写機構の全体的な状態とｒＤＮＡクロマチン構造を評価した。
【０２５５】
ウエスタンブロットは、製造元のプロトコル（Ｌｉ−ＣＯＲ）に従って行った。トランスファーメンブレンはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社（ｃａｔ．  ｎｏ．  ＩＰＦＬ０００１０）のものを使用した。使用した一次抗体は、ｐｈｏｓｐｈｏ−γＨ２ＡＸ（Ｕｐｓｔａｔｅ  ０７−１６４、ウサギ、１：１０００）；ｐ５３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｃ−６２４３  ウサギ  １：５００）；ＵＢＦ（Ｆ−９）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マウス、１：５００）；ＲＰＡ１９４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４８３８５、マウス、１：５００）；ｐ５３ＢＰ１（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢ１００−３０４、ウサギ  １：１０，０００）；ＥＦ１ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０５−２３５、マウス、１：１０００）、ＨＡ−タグ（Ｃ２９Ｆ４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ウサギ  １：１０００）  およびローディング対照としてアクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａ５０６０、ウサギ、１：３０００、Ａ４７００、マウス、１：１０００）である。ＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲＤｙ二次抗体（１：１０，０００）、ヤギ−抗マウス−６８０ＲＤ（９２６−６８０７０）、ヤギ−抗マウス−８００ＣＷ（９２６−３２２１０）、ヤギ−抗ウサギ−６８０ＲＤ（９２６−６８０７１）、ヤギ−抗ウサギ−８００ＣＷ（９２６−３２２１１）を用いて可視化した。タンパク質バンドは、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。
【０２５６】
ウエスタンブロットにより、ＰＡＮＣ１、ＰＣ３ＭおよびＨｅＬａの３つの細胞株において、１μＭの濃度でメタレスチンを２４時間処理しても、Ｐｏｌ  ＩラージサブユニットＲＰＡ１９４およびＵＢＦの量は有意に変化しないことが示された（図２７）。ｒＤＮＡクラスターのクロマチン状態の変化がｒＲＮＡの減少に関与しているかどうかを調べるために、ソラレン架橋実験を行い、メタレスチン処理細胞とＤＭＳＯ処理細胞の活性／不活性ｒＤＮＡクロマチン比を決定した。ソラレンは、ヌクレオソームや転写因子を移動させたり、クロマチンの状態を変化させたりすることなく、活性なアクセス可能なＤＮＡを紫外線下で架橋させる。ソラレン−架橋ＤＮＡはアガロースゲル上での移動が遅く、サザンブロットにより非架橋ＤＮＡと区別することができた。その結果、ｒＤＮＡクロマチンが大きく変化していないことが示唆され、活性／不活性のｒＤＮＡクロマチンの比率は、処理した細胞と未処理の細胞でほぼ同じであることが示された（図２８）。Ｐｏｌ  Ｉ転写因子とｒＤＮＡとの間の相互作用を調べるために、ｒＤＮＡのプロモーターおよびコーディング領域にまたがるプライマーセットを用いて定量的なＣｈＩＰ実験を行った（図２９〜３０Ｅ）。メタレスチン処理は、ＵＢＦ結合に有意な影響を与えることなく、ｒＤＮＡのプロモーターおよびコーディング領域上のＲＰＡ１９４占有を有意に減少させた（図３０Ａ〜３０Ｅ、ｐ＜０．０１）。対照として、小伸長複合体の構成要素であるＩＣＥ１は、ｒＤＮＡ配列との有意な関連を示さず、またはＰｏｌ  ＩＩによって転写された標的遺伝子Ｕ１２との変化した関連を示さなかった。これらの観察は、メタレスチンがＰｏｌ  Ｉ−ｒＤＮＡ相互作用を損なうことを示している。
【０２５７】
アクチノマイシンＤのようなＤＮＡに挿入したり、アルキル化したりする遺伝毒性物質は、メタレスチン処理で観察されたものと同様の核小体分離を誘導する。メタレスチンが遺伝毒性効果を介して核小体の変化を誘導するのか、一般的な細胞毒性を介して核小体の変化を誘導するのかを決定するために、ＰＡＮＣ１、ＰＣ３ＭおよびＨｅＬａの３つの細胞株におけるＤＮＡ損傷修復、細胞周期、および一般的なＰｏｌ  ＩＩ転写状態に対するメタレスチンの影響を評価した。フローサイトメトリー、免疫標識またはウェスタンブロット分析のために細胞を固定する前に、１μＭのメタレスチンまたはＤＭＳＯで２４時間処理した。処理した細胞におけるＤＮＡ損傷応答シグネチャー因子の評価（図５６）は、リン酸化されたγＨ２ＡＸまたはｐ５３ＢＰ１、およびリン酸化されたｐ５３（ＨｅＬａおよびＰＣ３Ｍはほとんどｐ５３を持たない）のいずれも、メタレスチン処理時にこれらの細胞株において変化しなかったことを実証した（図５７Ａ〜５７Ｃ）。フローサイトメトリーによるＤＮＡ含有量の細胞周期解析は、２４時間以内に２つの異なる濃度でメタレスチン処理を行っても、細胞周期パターンの有意な変化を示さなかった（図５８）。アポトーシス指数の評価は、メタレスチン処理に応答してアポトーシスを受ける細胞が１％未満であることを示した。
【０２５８】
メタレスチンがＰｏｌ  ＩＩ転写全般を妨害するかどうかをさらに決定するために、ＣＵＧＢＰを免疫標識した。ＰＮＣに豊富に存在する多機能性ｈｎＲＮＰタンパク質であるＣＵＧＢＰの定常状態の核内分布は、Ｐｏｌ  ＩＩ転写に依存していることが明らかになった。α−アマニチンによるＰｏｌ  ＩＩの選択的阻害は、ＰＮＣに局在するＣＵＧＢＰを除いて細胞質への局在シフトを誘導する（図５９、右上パネル）。もしメタレスチン処理がＰｏｌ  ＩＩ転写に有意な影響を与えるとすれば、α−アマニチン処理細胞において示されるように、ＣＵＧＢＰの細胞質内再分布が優位になると予想されたが、そうではなかった（図５９、上中央パネル）。また、必須のプレｍＲＮＡスプライシング因子であるＳＣ３５は、通常、核内で相互に連結したスペックル分布パターンを有していたが（図５９、左下パネル）、α−アマニチン処理細胞では孤立した大きなドットに変化していた（図５９、右下パネル）。一方、メタレスチン処理細胞では、ＳＣ３５のパターンは有意に変化しなかった（図５９、下中央パネル）。メタレスチン処理（図２４）がＧＦＰ−ＲＰＬ２９発現の誘導（図５４）およびその核小体局在（図２４、図５４）に影響を与えないという観察と合わせて、これらの知見は、メタレスチンが有効濃度範囲内でＰｏｌ  ＩＩ  転写、一般的なタンパク質合成、または核細胞質トラフィッキングを全体的に阻害しないが、Ｐｏｌ  Ｉ  転写およびリボソーム合成に選択的な効果を有することを示唆している。
【０２５９】
実施例７
本実施例は、ＲＰＡ１９４の減少がメタレスチンによる核小体とＰＮＣの破壊を部分的にフェノコピーすることを示す。
【０２６０】
ＲＮＡ干渉：７５  ｎＭ  Ｐｏｌ  Ｉ１  Ｓｔｅａｌｔｈ  ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃：  １０６２０３１８）またはＳｔｅａｌｔｈネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃：  １２９３５−３００）を、製造元の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞にトランスフェクションした。実験は７２時間トランスフェクション後に行った。ｅＥＦ１Ａ２ノックダウンについては、５０ｎＭ  ｅＥＦ１Ａ２  ＤｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ  Ｄｕｐｌｅｘ  ｐｏｏｌ  ＨＳＣ．ＲＮＡＩ．Ｎ００１９５８．１２／ＨＳＣ．ＲＮＡＩ．Ｎ００１９５８．１２．２）またはＤＳスクランブルネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＩＤＴ）を上記のようにリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸで３日間トランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３．１−ＨＡ−ｅＥＦ１Ａ２プラスミドをリポフェクタミン２０００で１日間のＤｓｉＲＮＡ  ＲＮＡｉ後、トランスフェクトした。その後、細胞を固定して免疫蛍光標識を行った。
【０２６１】
次に、メタレスチンがＰｏｌ  Ｉ機能を阻害し、核小体を破壊することによってＰＮＣを分解するかどうかを決定した。Ｐｏｌ  ＩのラージサブユニットであるＲＰＡ１９４は、細胞株ＰＡＮＣ１、ＨｅＬａおよびＰＣ３ＭにおけるｓｉＲＮＡオリゴでのトランスフェクションの７２時間後のタンパク質の減少によって明らかになった（図３１）ように、特定のｓｉＲＮＡによってノックダウンされた。ＲＰＡ１９４の減少は、誘導性ＧＦＰ−ＲＰＬ２９を発現するＨｅＬａ細胞で示されるように、単一細胞レベルでのリボソーム合成を阻害するのに十分であり、ＲＰＡ１９４のノックダウンは、細胞質ＧＦＰ−ＲＰＬ２９を検出不可能に近い状態にした（図３２、右のパネル）。ＲＰＡ１９４の減少は、メタレスチン処理した細胞（図２）と同じ程度ではなかったが、ＰＮＣの有病率を減少させた（図３３）。また、いくつかのＰＮＣは構造変化を示し（図３３）、ＲＰＡ１９４を減少させた細胞では、歪んだ核小体の周りに三日月形になり（図３４、上のパネル、矢印）、ＰＮＣを完全に除去しない濃度ではメタレスチンで処理した細胞と同様であった（図１、上段、中央パネル）。ＲＰＡ１９４に対するｓｉＲＮＡもまた、残留ＲＰＡ１９４に対する抗ＲＰＡ１９４での標識によって示されるように、核小体の構造をキャッピング構造へと破壊した（図３４、上段第２パネルの白矢印）。ＲＰＡ１９４をサイレンス化した細胞におけるＰＮＣおよび核小体の変化は、メタレスチン処理で観察されたものと同様であった（図２３および５１）。これらのデータは、Ｐｏｌ  Ｉ活性をダウンレギュレートすることで、メタレスチン処理によって誘導された核小体構造およびＰＮＣ構造の破壊が部分的に再現されていることを示しており、メタレスチンがＰｏｌ  Ｉ機能の阻害を介して、少なくとも部分的にＰＮＣを破壊するという考えを支持している。
【０２６２】
実施例８
本実施例は、メタレスチンが翻訳伸長因子ｅＥＦＩＡを結合することを示している。
【０２６３】
メタレスチンの分子標的ならびにリボソームおよびＰｏｌ  Ｉ機能に関与する上流因子を同定するために、ビオチンと共役したメタレスチンを用いたアフィニティー精製によりメタレスチンを結合するタンパク質を同定し（構造および合成については、図６５を参照）、ここで培養細胞におけるＰＮＣ分解に対する効力は維持されている（図６０）。タグ付けされていないメタレスチンを用いた競合研究とプロテオミクス解析により、メタレスチン結合タンパク質として真核生物の翻訳伸長因子（ｅＥＦ１Ａ）が同定された（図３５）。ｅＥＦ１Ａは、ｅＥＦ１Ａ１とｅＥＦ１Ａ２の２つのアイソフォームを持っており、ｅＥＦ１Ａ１がすべての組織でユビキタスに発現しているのに対し、ｅＥＦ１Ａ２は脳、心臓および骨格筋でのみ発現している。ｅＥＦ１Ａは２つのアイソフォーム、ｅＥＦ１Ａ１およびｅＥＦ１Ａ２を有し、ｅＥＦ１Ａ１がすべての組織でユビキタスに発現しているのに対し、ｅＥＦ１Ａ２は脳、心臓および骨格筋でのみ発現しているが、病期特異的な方法での発現などその過剰発現または再発現は、膵臓がんなど多くのがんにおいて記されている。ｅＥＦ１Ａへのメタレスチンの結合は、細胞サーマルシフトアッセイ（ＣＥＴＳＡ）を用いて細胞内でさらに確認され、メタレスチン処理時にｅＥＦ１Ａの凝集温度が上昇することが示された（図３６）。しかし、結合してもタンパク質の量に大きな変化はなく、ウエスタンブロット分析では、１μＭのメタレスチンを２４時間処理してもｅＥＦ１Ａタンパク質の総量は変わらないことが示された（図３７）。
【０２６４】
ｅＥＦ１Ａは多機能タンパク質であり、翻訳伸長、アクチン結束、核輸送、ｔＲＮＡ輸出などに関与している。ｅＥＦ１Ａがメタレスチンのがん細胞への作用を媒介しているかどうかを評価するために、ｅＥＦ１Ａを過剰発現させたり、ｓｉＲＮＡサイレンシングにより減少させたりした。ＨＡ−ｅＥＦ１Ａ１またはＨＡ−ＥＦＦ１Ａ２の過剰発現は、総ＰＮＣ有病率を有意に増加させなかったのに対し（図３８）、ＨＡ−ｅＥＦ１Ａ１よりもＨＡ−ｅＥＦ１Ａ２の過剰発現は、ＰＮＣ含有細胞内の既存のＰＮＣのスキャターパターン（細胞あたりのＰＮＣの数）を増加させた（図３８）。このように、ｅＥＦ１Ａ２はＰＮＣ構造を増強するが、単独ではＰＮＣ陰性細胞におけるＰＮＣの有意な形成を誘導するのに十分ではない。メタレスチン誘導ＰＮＣの分解とｅＥＦ１Ａ２の表現型との間の機能的なリンクを評価するために、野生型とｅＥＦ１Ａ２過剰発現がん細胞におけるＰＮＣの分解を分析した。ｅＥＦ１Ａ２−ＨＡの過剰発現のある細胞とない細胞（約７０％の効率でトランスフェクション後４８時間、図６１および６４）を１０濃度のメタレスチンで処理し、ＰＮＣ有病率を６３倍の倍率で評価した。その結果、ｅＥＦ１Ａ２の発現が増加すると、ＰＮＣ分解に対するメタレスチンの阻害濃度５０（ＩＣ５０）が増加することがわかった（図３９）。ｅＥＦ１Ａ２が本当に転移表現型を調節しているかどうかを評価するために、ｅＥＦ１Ａ２の過剰発現を有する（ＰＡＮＣ１  ｅＥＦ１Ａ２  Ｏ．Ｅ．）または有していない（ＰＡＮＣ１コントロール）ＰＡＮＣ１細胞をＮＳＧマウスへ同所的に注入した。移植後６週間後に、臓器を組織病理学的評価に供した。ＮＳＧ  ＰＡＮＣ１  ｅＥＦ１Ａ２  Ｏ．Ｅ．マウスは、ＰＡＮＣ１対照動物と比較して有意に増加した転移性疾患負荷を示した（図４０Ａ〜４０Ｂ、Ｐ＜０．０５）、メタレスチンが転移性表現型を支配する標的に関与していることを示唆している。
【０２６５】
ｅＥＦ１Ａ２の減少がメタレスチンのＰＮＣおよび核小体構造への影響を表現するかどうかを決定するために、ｓｉＲＮＡオリゴを用いてｅＥＦ１Ａ２の発現を減少させた。トランスフェクションの７２時間後、ｑＲＴ−ＰＣＲはｅＥＦ１Ａ２の選択的な減少を示した（図４１および４２）。ｅＥＦ１Ａ２の減少がＰｏｌ  Ｉ転写に影響を与えるかどうかを評価するために、ｅＥＦ１Ａ２ノックダウンのある細胞とない細胞で５’ＥＴＳ  ＲＮＡ発現を比較し、その結果、ｒＤＮＡ転写の有意な減少（図４３、Ｐ  ＜０．０１）を示した。これに対応して、抗フィブリラリン抗体による核小体およびＳＨ５４によるＰＮＣの免疫蛍光検出は、ｅＥＦ１Ａ２の減少が、メタレスチンと比較して低い有効性を有する（１μＭで１００％に近いＰＮＣの分解および核小体の歪み、図１、図２３）が、メタレスチン処理した細胞（図１）またはＰｏｌ  Ｉノックダウン細胞（図３４）と同様に、核小体（核小体分離）およびＰＮＣの構造（喪失または細長い三日月形になる、図４４および４５Ａ−４５Ｂの矢印）を破壊していることを示した。破壊は、部分的にＨＡ−ｅＥＦ１Ａ２の過剰発現によって救済することができた（図４５、灰色のバー）。以上のことから、これらの知見は、ｅＥＦ１Ａ２が膵臓がんの転移進行に関与しているという考えを支持し、その発現を妨害することで、メタレスチンによって誘導される核小体やＰＮＣの構造変化やＰｏｌ  Ｉの阻害が大きくフェノコピーされ、ｅＥＦ１Ａ２が少なくとも部分的に、メタレスチン処理によって誘導される核小体やＰＮＣの変化を媒介しているという考えを支持するものであった。
【０２６６】
上記の実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植モデルを介して、メタレスチンが、膵臓がんモデルにおけるＰＮＣ、がん細胞増殖、細胞浸潤、腫瘍増殖および転移を効果的に阻害することを実証している。
【０２６７】
本明細書で引用された出版物、特許出願、特許を含むすべての参考文献は、それぞれの参考文献が個別に参照により組み込まれることが明示されており、その全体が本明細書に記載されている場合と同様の範囲で参照により組み込まれる。
【０２６８】
本発明を説明する文脈での用語「ａ」および「ａｎ」、「ｔｈｅ」および類似の参照語の使用（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）は、本明細書に別段の記載がない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈される。用語「構成する」、「有する」、「含む」、および「含む」は、別段の記載がない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「含むが、これに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書に記載された値の範囲の列挙は、別段の記載がない限り、範囲内に該当する各個別の値を個別に参照するための略記法として機能することを単に意図しており、各個別の値は、それが個別に本明細書に列挙されたものであるかのように本明細書に組み込まれている。本明細書に記載されたすべての方法は、本明細書に別段の記載がない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供される任意のおよびすべての例示的な、または例示的な言語（例えば、「のような」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図したものであり、別段の主張がない限り、本発明の範囲に制限を与えるものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠なものとして、いかなる非請求項の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０２６９】
本発明の好ましい実施形態が、本発明を実施するために本発明者らに知られている最良の態様を含めて本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態のバリエーションは、前記の説明を読むと、当技術分野の通常の熟練者に明らかになるかもしれない。本発明者らは、当業者がそのような変形を適宜採用することを期待しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本発明を実施することを意図している。したがって、本発明は、適用法により許容し得るように、添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変および同等物を含む。さらに、本明細書に別段の記載がない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、上述した要素のあらゆる可能なバリエーションの組み合わせが本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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