(57)【要約】  本発明は、複数の中空無機ナノ粒子を製造する方法に関し、方法は、（ａ）第１モノマー及び第２モノマーを溶媒において接触して、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、（ｂ）溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に無機化合物前駆体を加えて、溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、（ｃ）追加の量の第１及び第２モノマーを溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物に加えて、溶媒及び複数の複合ナノ粒子を含む組成物を製造し、並びに（ｄ）複数の複合ナノ粒子を加熱して、複数の中空無機ナノ粒子を製造し、工程（ａ）において、第１モノマー及び第２モノマーは、少なくとも３０℃の温度で溶媒に接触される。本発明は、また、複数の中空無機ナノ粒子及びその用途に関する。
2021509393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１モノマー及び第２モノマーを溶媒において接触して、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、
（ｂ）無機化合物前駆体を前記溶媒及び前記複数のポリマーナノ粒子を含む前記組成物に加えて、前記溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、
（ｃ）前記第１及び第２モノマーの追加量を前記溶媒及び前記複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む前記組成物に加えて、前記溶媒及び複数の複合ナノ粒子を含む組成物を製造し、並びに
（ｄ）前記複数の複合ナノ粒子を加熱して、前記複数の中空無機ナノ粒子を製造することを含む複数の中空無機ナノ粒子の製造方法であって、
前記工程（ａ）において、前記第１モノマー及び前記第２モノマーは、少なくとも３０℃の温度で溶媒において接触される、複数の中空無機ナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記第１モノマー及び前記第２モノマーが３０℃〜７０℃の温度、好ましくは４０℃〜５０℃の温度で溶媒において接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１モノマー及び前記第２モノマーが少なくとも３０℃の温度で、４時間以下、好ましくは１０分〜１８０分間、溶媒において接触される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記無機化合物がシリカであり、前記中空無機ナノ粒子が中空シリカナノ粒子である、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）が前記溶媒において前記第１モノマー及び前記第２モノマーを混合することを含み、溶媒が好ましくは、水、アルコール及びアンモニアを含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１モノマーが１つ以上のヒドロキシル基を含む化合物であり、前記第２モノマーが１つ以上のアルデヒド基を含む化合物であって、好ましくは前記第１モノマーがジオールであり、前記第２化合物がアルデヒドである、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１モノマーが式ＨＯ−Ａｒ−ＯＨの化合物であり、前記第２モノマーが式ＨＣ（Ｏ）−Ｒ１の化合物であり、Ａｒは置換又は非置換アリール基であり、Ｒ１はＨ又は置換若しくは非置換Ｃ１−６アルキルであって、好ましくは、前記第１モノマーがレゾルシノールであり、前記第２モノマーがホルムアルデヒドである、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１モノマーの濃度が１．０ｍＭ〜０．１Ｍであり、前記第２モノマーの濃度が１．０ｍＭ〜０．１Ｍであり、好ましくは、前記第１モノマーの濃度が０．０１Ｍ〜０．０３Ｍであり、前記第２モノマーの濃度が０．３〜０．０５Ｍである、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記無機化合物前駆体がシリカ前駆体である、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記シリカ前駆体が式Ｓｉ（Ｒ２）ｘ（ＯＲ３）ｙで表される化合物であり、
それぞれのＲ２及びそれぞれのＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、アリール及びＣ
２−６アルケニルから選択されるものであり、
ｘは、０、１又は２であり、並びに
ｙは２、３又は４である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記無機化合物前駆体がテトラエチルオルトケイ酸塩（ＴＥＯＳ）、テトラメチルオルトケイ酸塩、テトラプロピルオルトケイ酸塩又はテトラブチルオルトケイ酸塩であり、好ましくはテトラエチルオルトケイ酸塩である、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記無機化合物前駆体を前記溶媒及び前記複数のポリマーナノ粒子を含む前記組成物に加えた後、前記無機化合物前駆体の濃度が１．０ｍＭ〜０．１Ｍ、好ましくは、０．０１〜０．０５Ｍである、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）が３０℃以下の温度、好ましくは１０℃〜３０℃の温度で実施される、請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
方法は、工程（ａ）と工程（ｂ）との間で、前記溶媒及び前記複数のポリマーナノ粒子を含む前記組成物を冷却する工程をさらに含み、好ましくは、前記溶媒及び前記複数のポリマーナノ粒子を含む前記組成物が、１０分〜６０分の時間、０．５℃／分〜１．０℃／分の平均速度で冷却される、請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）において、追加の量の前記第１及び第２モノマーを前記溶媒及び前記複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む前記組成物に加えることは、工程（ｂ）の後に１〜３０分で実施され、シリカ前駆体化合物を前記溶媒及び前記複数のポリマーナノ粒子を含む前記組成物に加え、好ましくは、工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に、２〜１０分で実施される、請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
追加の量の前記第１及び前記第２モノマーを前記溶媒及び前記複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む前記組成物に追加した後に、前記溶媒及び前記複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子、並びに前記第１及び第２モノマーを含む前記組成物中、前記第１モノマーの濃度が２．０ｍＭ〜０．２Ｍであり、前記第２モノマーの濃度が２．０ｍＭ〜０．２Ｍである、請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記追加の量の第１及び第２モノマーを１．０〜４．０時間反応させる、請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｄ）が、前記複数の複合ナノ粒子を、複合ナノ粒子から前記ポリマーを取り除くのに適した温度、好ましくは、４００℃〜７００℃の温度で加熱することを含む、請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｄ）が、前記複数の複合ナノ粒子を、４．０時間未満、好ましくは１．０〜３．０時間加熱することを含む、請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数の中空無機ナノ粒子が複数のメソポーラス中空無機ナノ粒子である、請求項１〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記中空無機ナノ粒子のそれぞれが
無機化合物を含むシェル、
前記無機化合物を含まない前記シェル内部の容量、並びに
前記シェルの外部に配置される前記無機化合物を含む複数の突起を含む、請求項１〜
２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記中空無機ナノ粒子が１００ｎｍ〜６００ｎｍの粒径を有し、及び／又は
前記シェルの内部の容量が５０ｎｍ〜５００ｎｍの平均粒径を有し、及び／又は
前記無機化合物を含む前記シェルが１０ｎｍ〜２００ｎｍの平均厚さを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程が、（ｅ）複数の中空無機ナノ粒子を薬剤で処理して、前記薬剤を負荷された複数の中空無機ナノ粒子を製造することをさらに含む請求項１〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が殺虫剤、除草剤、治療薬、ワクチン、電荷改質剤、トランスフェクション試薬、核酸、タンパク質又は染料である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤が電荷改質剤であり、任意に、前記電荷改質剤がポリエチレンイミンである、請求項２３又は請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記電荷改質剤がポリペプチドであり、任意に前記ポリペプチドがポリヒスチジン、ポリアルギニン又はポリリジンである、請求項２３又は請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
方法が前記複数の中空無機ナノ粒子を薬剤で処理する前に、前記複数の中空無機ナノ粒子をホスホン酸塩リンカーで処理する工程を含む、請求項２３〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
方法が前記複数の中空無機ナノ粒子を前記薬剤で処理する前に、前記複数の中空無機ナノ粒子を酸性改質成分で処理する工程を含み、任意に、前記酸性改質成分がホスホン酸塩基、リン酸基、カルボキシレート基、又はα−ケトカルボン酸基を含む、請求項２３〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の中空無機ナノ粒子が６０分未満、好ましくは１５分未満、前記薬剤で処理される、請求項２３〜２８の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｅ）が
（ｅｌ）任意に、前記中空無機ナノ粒子をホスホン酸塩リンカーで処理し、好ましくは、前記ホスホン酸塩リンカーが１，３−（トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩であり、
（ｅ２）前記中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理し、任意に、前記電荷改質剤がポリエチレンイミンであり、及び、
（ｅ３）前記中空無機ナノ粒子を活性薬剤で処理し、任意に前記活性薬剤は核酸を含む、請求項２３〜２９の何れか１項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０の何れか１項に記載の方法によって得ることができる複数の中空無機ナノ粒子。
【請求項３２】
複数の中空無機ナノ粒子が
無機化合物を含むシェル、
前記無機化合物を含まない前記シェル内部の容量、並びに
前記シェルの外部に配置される前記無機化合物を含む複数の突起を含み、
前記複数の中空無機ナノ粒子の粒径が１００〜５００ｎｍである、複数の中空無機ナノ粒子。
【請求項３３】
中空無機ナノ粒子のそれぞれが
無機化合物を含むシェル、
前記無機化合物を含まない前記シェル内部の容量、並びに
前記シェルの外部に配置される前記無機化合物を含む複数の突起を含み、
前記中空無機ナノ粒子が前記無機化合物に結合される複数の酸性基をさらに含む、複数の中空無機ナノ粒子。
【請求項３４】
前記酸性基がホスホン酸塩基、リン酸塩基、カルボン酸基及びα−ケトカルボン酸基から選択され、好ましくは、前記酸性基がホスホン酸塩基である、請求項３３に記載の複数の中空無機ナノ粒子。
【請求項３５】
前記複数の中空無機ナノ粒子の粒径が１５０〜３５０ｎｍ、好ましくは１６０〜２５０ｎｍである、請求項３１〜３４の何れか１項に記載の複数の中空ナノ粒子。
【請求項３６】
前記複数の中空無機ナノ粒子の多分散指数が０．５以下、０．２以下、又は０．１以下、又は０．０５以下である、請求項３１〜３５の何れか１項に記載の複数の中空ナノ粒子。
【請求項３７】
前記ナノ粒子が少なくとも１２０ｃｍ２／ｇ、好ましくは少なくとも１５０ｃｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する、請求項３１〜３６の何れか１項に記載の複数の中空無機ナノ粒子。
【請求項３８】
前記中空無機ナノ粒子が中空シリカナノ粒子である、請求項３１〜３７の何れか１項に記載の複数の中空無機ナノ粒子。
【請求項３９】
ヒト又は動物の身体を治療法によって治療する方法において、アジュバントとして使用される請求項３１〜３７の何れか１項に記載の複数の中空無機ナノ粒子。
【請求項４０】
前記方法が前記治療薬を複数の前記複数の中空無機ナノ粒子と共投与することによって、治療薬の効果を増加することを含む、請求項３９に記載の使用のための複数の中空無機ナノ粒子。
【請求項４１】
ワクチンを使用して、疾患に対して、対象を免疫化することによって、対象の疾患の予防又は治療に使用し、前記複数の中空無機ナノ粒子が前記対象のワクチンに対して免疫応答を増加する、請求項３１〜３７の何れか１項に記載の複数の中空無機ナノ粒子。
【請求項４２】
請求項３１〜３７の何れか１項に記載の複数の中空無機ナノ粒子及び薬剤を含む組成物。
【請求項４３】
前記薬剤が前記中空無機ナノ粒子に結合される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記薬剤が疎水性活性薬剤である、請求項４２又は請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記薬剤が殺虫剤、除草剤、治療薬、ワクチン、電荷改質剤、トランスフェクション試薬、核酸、又は染料である、請求項４２〜４４の何れか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記薬剤がポリエチレンイミンである、請求項４２〜４５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記複数の中空無機ナノ粒子が、ホスホン酸塩リンカーで官能化される、請求項４２〜４６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記組成物が、電荷改質剤及び活性薬剤を含み、好ましくは、前記電荷改質剤がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり、前記活性薬剤が核酸、例えば、プラスミドＤＮＡである、請求項４２〜４７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
ヒト又は動物の身体を治療法による治療に使用される、請求項４２〜４８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記活性薬剤がワクチンであり、前記組成物が前記ワクチンを使用して疾患に対して対象を免疫化することによって、前記対象の前記疾患の予防又は治療に使用される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
方法が請求項４２〜４８の何れか１項に記載される組成物で細胞を処理することを含む、核酸を細胞にトランスフェクトする方法。
【請求項５２】
ヒト又は動物の身体を治療法によって治療する方法において使用され、前記中空無機ナノ粒子が前記薬剤について、アジュバントとして作用する、請求項４２〜４８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記方法が前記薬剤の前記効果を増加することを含む、請求項５２に記載の使用のための組成物。
【請求項５４】
核酸を細胞にトランスフェクトする方法に使用され、前記薬剤が核酸であり、前記方法が前記細胞を前記複数の中空無機ナノ粒子及び前記核酸を含む前記組成物で処理することを含み、それによって、前記細胞を前記核酸でトランスフェクトし、免疫応答を刺激する、請求項４２〜４８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
ある場所の害虫を制御する方法であって、前記場所を請求項４２〜４８の何れか１項に記載の組成物に暴露することを含む、ある場所の害虫を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の中空無機ナノ粒子の製造方法に関する。本発明は、また、複数の中空無機ナノ粒子、ナノ粒子を含む組成物及びこれらの組成物の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
無機材料を含む中空ナノ粒子が、幅広い適用を有することが分かっている。国際公開第２０１５／０８９５９０（Ａ１）号パンフレットは、シリカ小胞及び活性薬剤を送達するためのビヒクルとしてのそれらの使用を記載している。
【０００３】
粗メソポーラス中空シリカナノ粒子の製造方法が国際公開第２０１６／１６４９８７（Ａ１）号パンフレットに記載されている。この方法は、ポリマーナノ粒子の最初の形成によって進められ、続いてシリカで被覆され、その後さらにポリマーが導入される。国際公開第２０１６／１６４９８７（Ａ１）号パンフレットの方法は、焼成の後に冗長な方法を伴う。
【０００４】
中空無機ナノ粒子の製造についてより効率的な方法を提供することが望ましい。また、改善された形態及び／又は粒径分布を有するナノ粒子を製造する方法を提供することが望ましい。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の発明者は、驚くべきことに、ポリマーナノ粒子の最初の形成が実施される温度を上昇することによって、複数の中空無機ナノ粒子の製造方法の効率が著しく改善することができることが分かった。この変化は、中空無機ナノ粒子を製造するのに要する時間を劇的に減少することができ、ナノ粒子の形態に負に影響しないことが分かった。また、驚くべきことに、改善された方法によって改善された表面形態を有するナノ粒子の製造を導くことができることが分かった。中空無機ナノ粒子の単分散性の増加も観察することができる。本発明の中空無機ナノ粒子は、治療に使用される場合アジュバント効果を有することも分かっている。
【０００６】
本発明は、複数の中空無機ナノ粒子の製造方法を提供し、方法は、（ａ）第１モノマー及び第２モノマーを溶媒において接触して、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、（ｂ）無機化合物前駆体を溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に加えて、溶媒及び複数の無機化合物が被覆されたポリマーナノ粒子を製造し、（ｃ）追加の量の第１及び第２モノマーを、溶媒及び複数の複合ナノ粒子を含む無機化合物に被覆されたポリマーナノ粒子を加え、ならびに（ｄ）複数の複合ナノ粒子を加熱して、複数の中空無機ナノ粒子を製造し、工程（ａ）において、第１モノマー及び第２モノマーは、少なくとも３０℃の温度で溶媒において接触されることを含む。
【０００７】
本発明は、また、本発明に記載の方法によって得ることができる複数の中空無機ナノ粒子を提供する。
【０００８】
さらに、複数の中空無機ナノ粒子が本発明によって提供され、中空無機ナノ粒子のそれぞれは、無機化合物を含むシェル、無機化合物を含まないシェル内部の容量を含み、及びシェルの外部に配置され、無機化合物を含む複数の突起を含む。複数の中空無機ナノ粒子の粒径は、通常、１００〜５００ｎｍである。中空無機ナノ粒子は、さらに、無機化合物に結合される複数の酸性基を含み得る。
【０００９】
本発明は、さらに、本発明に記載の複数の中空無機ナノ粒子及び活性薬剤を含む組成物を提供する。
【００１０】
また、ヒト又は動物の身体を治療するときに使用される本発明に記載の組成物が本発明によって提供される。
【００１１】
また、ヒト又は動物の身体を治療するときにアジュバントとして使用される本発明に記載の中空無機ナノ粒子が本発明によって提供される。
【００１２】
本発明は、また、ある場所の害虫を制御する方法を提供し、方法は、その場所を本発明に記載の組成物に暴露することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】合成ＳｉＮＰ００１の間に製造されるＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。上の画像：被覆された粒子、下の画像：被覆されていない粒子。
【図２】合成ＳｉＮＰ００２の間に製造されるＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。上の画像：被覆された粒子、下の画像：被覆されていない粒子。
【図３】合成の間に一貫性を示す反応温度、ｐＨ及び攪拌機の速度のオンラインモニタリングである。
【図４】動的光散乱法を使用して測定されるＳｉＮＰ粒径の展開である。
【図５】合成ＳｉＮＰ００３の間に製造される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。
【図６】合成ＳｉＮＰ００４の間に製造される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。
【図７】合成ＳｉＮＰ００４の間に製造されるＳｉＮＰについての焼成工程のＴＧＡ分析である。
【図８】１４時間の焼成計画の合成ＳｉＮＰ００４の間に製造される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。
【図９】合成ＳｉＮＰ００５の間に調製されるＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。上の画像及び右下の画像：被覆されていない粒子、左下の画像：被覆された粒子。
【図１０】合成ＳｉＮＰ００５Ｖ２の間に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。
【図１１】合成ＳｉＮＰ００６の間に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。
【図１２】合成Ｓ１ＮＰ００６ＩＩの間に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。
【図１３】合成ＳｉＮＰ００６ＩＩＩの間に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。
【図１４】合成ＳｉＮＰ００６ＩＶの間に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。
【図１５】最初のモノマーの濃度が２５％に減少した合成ＳｉＮＰ００７の間に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。粒径は減少し、形態は保持されたことに留意されたい。
【図１６】最初のモノマーの濃度が２５％に減少し、冷却時間が３０分増加した合成ＳｉＮＰ００７ＩＩの間に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。粒径は増加したが、所望の形態は保持されたことに留意されたい。
【図１７】最初のモノマーの濃度が２５％に減少した合成ＳｉＮＰ００７Ｖの間に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。正確な粒径及び形態に留意されたい。
【図１８】ＳｉＮＰのＴＥＭ画像である。
【図１９】合成ＳｉＮＰ００８の間に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。粒子の単頂性分散分布、正確な粒径及び「先端の尖った」形態に留意されたい。
【図２０】合成ＳｉＮＰ００８の間に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。粒子の単頂性分散分布、正確な粒径及び「先端の尖った」形態に留意されたい。
【図２１】異なるランプレートを使用して焼成されたＳｉＮＰ０００８に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。粒子の単頂性分散分布、正確な粒径に留意されたい。形態は、焼成及びいくらかの凝集作用の間に、標準的な２℃／分のランプレートを使用するよりも「先端が尖って」いないように見える。
【図２２】ＳｉＮＰ０００８ＩＩの合成の間に製造されるＳｉＮＰについての異なるランプで焼成工程の熱重量測定分析である。
【図２３】ＳｉＮＰ０００９に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。粒径および形態は、正確であるが、著しい凝集作用が観察されるように見える。
【図２４】ＳｉＮＰ０００９ＩＩに調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。粒子は、所望の「先端の尖った」形態を示すが、大きい粒径および凝集作用に留意されたい。
【図２５】ＳｉＮＰ０００９ＩＩＩに調製される被覆されていないレゾルシノールホルムアルデヒドのＳＥＭ画像である。大きい粒径及び凝集作用に留意されたい。
【図２６】ＳｉＮＰ０００９ＩＩＩに調製される被覆されていないレゾルシノールホルムアルデヒドのＳＥＭ画像である。大きい粒径及び凝集作用に留意されたい。
【図２７】ＳｉＮＰ００１０に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。いくつかの粒子の壁に穴が観察されることに留意されたい。
【図２８】ＳｉＮＰ００１１に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。粒子の単頂性分散分布、正確な粒径及び「先端の尖った」形態に留意されたい。
【図２９】ＳｉＮＰ００１１に調製される被覆されていないＳｉＮＰのＳＥＭ画像である。粒子の単頂性分散分布、正確な粒径及び「先端の尖った」形態に留意されたい。
【図３０】ＳｉＮＰのＴＥＭ画像である。
【図３１】ＳｉＮＰ００１２に調製される被覆されていないレゾルシノールホルムアルデヒドのＳＥＭ画像である。粒子分布を有する大きい粒径は単頂性であることに留意されたい。
【図３２】ＳｉＮＰ００１２ＩＩに調製される被覆されていないレゾルシノールホルムアルデヒドのＳＥＭ画像である。大きい粒径に留意されたい。
【図３３】ＳｉＮＰ００１２ＩＩＩに調製される被覆されていないレゾルシノールホルムアルデヒドのＳＥＭ画像である。大きい粒径に留意されたい。
【図３４】ＳｉＮＰ００１２ＩＶに調製される被覆されていないレゾルシノールホルムアルデヒドのＳＥＭ画像である。
【図３５】ｐＨの関数として被覆された及び被覆されていないＳＮＰ００８のゼータ電位の展開である。
【図３６】ｐＨの関数として異なる条件でＰＥＩが負荷されたＳＮＰ００８のゼータ電位の展開である。
【図３７】ｐＨの関数としてホスホン酸塩が結合されたＳＮＰ００８のゼータ電位の展開である。
【図３８】ホスホン酸塩の結合工程の間の炭素含有量の展開である。
【図３９】ｐＨの関数としてＰＥＩの負荷の間のＳＮＰ００８のゼータ電位の展開である。
【図４０】ＰＥＩの負荷の間、時間の関数としてＩＥＰの展開である。
【図４１】３０分のＰＥＩの負荷の後、ｐＨの関数としてＳＮＰ０１１のゼータ電位の展開である。
【図４２】５分のＰＥＩの負荷の後、ｐＨの関数としてＳＮＰ０１１＿ＩＩのゼータ電位の展開である。
【図４３】同様に処理された２つの異なる粒子について、ＰＥＩの負荷の間のＮ含有量の展開である。
【図４４】ＳｉＮＰ  ＮＵＭｅｄシリカナノ粒子のＳＥＭ画像である。
【図４５】ＳｉＮＰ  ＮＵＭｅｄシリカナノ粒子のＴＥＭ画像である。
【図４６】異なるビヒクルを使用して投与された場合の脾細胞の増殖に及ぼすオボアルブミン（ＯＶＡ）ＤＮＡの効果である。
【図４７】ルシフェラーゼをコードするｐＤＮＡを負荷されたＳｉＮＰのトランスフェクション効率である。
【図４８−１】（ａ）平滑な、キイチゴ及びランブータンの様な表面トポロジーを有するシリカナノ粒子の合成の模式図。
【図４８−２】（ｂ）Ｓ−ＳＮＰ、（ｃ）Ｒａｓ−ＳＮＰ及び（ｄ）Ｒａｍ−ＳＮＰ、のＴＥＭ画像。
【図４８−３】（ｅ）シリカナノ粒子の窒素収着等温線。
【図４８−４】（ｆ）シリカナノ粒子の対応する孔径分布。
【図４８−５】（ｇ）ＰＥＩ結合の前後のシリカナノ粒子のゼータ電位。
【図４９−１】シリカナノ粒子のＰＥＩ結合：３−ＧＰＳを使用した共有結合である。
【図４９−２】シリカナノ粒子のＴＨＰＭＰを使用した強力な静電引力である。
【図５０】異なる分子量のＰＥＩと共有結合的に修飾されたシリカナノ粒子のプラスミドＤＮＡ負荷能力である。
【図５１】異なる方法によって１０ｋのＰＥＩで修飾されたＲａｍ−ＳＮＰを使用してＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のｅＧＦＰ−ｐｃＤＮＡトランスフェクション効率の蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリー分析である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、複数の中空無機ナノ粒子を製造する方法を提供し、方法は、（ａ）第１モノマー及び第２モノマーを溶媒において接触して、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、（ｂ）無機化合物前駆体を溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に加えて、溶媒及び複数の無機化合物で被覆されるポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、（ｃ）溶媒及び複数の無機化合物で被覆されるポリマーナノ粒子を含む組成物に追加の量の第１及び第２モノマーを加え、並びに（ｄ）複数の複合ナノ粒子を加熱して、複数の中空無機ナノ粒子を製造し、工程（ａ）において、第１モノマー及び第２モノマーは、少なくとも３０℃の温度で溶媒に接触されることを含む。
【００１５】
第１モノマー及び第２モノマーを接触することは、通常、第１及び第２モノマーが反応することを含む。例えば、第１モノマー及び第２モノマーは、両方とも溶媒に溶解することができる。
【００１６】
本発明の方法は、室温より高い温度で複数のポリマーナノ粒子を形成することを伴う。工程（ａ）の全体は、通常、少なくとも３０℃の温度で実施される。第１モノマー及び第２モノマーは、通常、３０℃〜７０℃の温度で溶媒に接触される。好ましくは、第１及び第２モノマーは、通常、４０．０℃〜５０．０℃の温度で溶媒に接触され得る。例えば、温度は４２．０℃〜４８．０℃であってもよく、温度は約４５℃であってもよい。
【００１７】
第１及び第２モノマーは、通常、たった４時間以下（すなわち２４０分以下）、少なくとも３０℃の温度で接触され、その後、無機化合物前駆体を加える。通常、第１及び第２モノマーは、１０分〜１８０分、例えば、３０分〜１５０分間接触される。第１及び第２モノマーは、６０分〜１２０分、例えば、８０分〜１００分間接触される。第１及び第２モノマーが特定の時間、溶媒に接触される場合、通常、工程（ｂ）は特定の時間の後に開
始され、反応は、温度が特定の時間の後に低下され、又は反応は、（例えば、追加の量の溶媒を加えることによって）特定の時間の後停止される。
【００１８】
例えば、第１及び第２モノマーは、溶媒並びに第１及び第２モノマーを含む組成物を３０℃未満の温度に冷却する前に、４０．０℃〜５０．０℃の温度で、３０分〜１５０分間接触することができる。
【００１９】
中空無機ナノ粒子は、中空であり（すなわち、材料を含まない中心の容量の周りに材料を含むシェルを含む）、（無機材料とも呼ぶことができる）無機化合物を含むナノ粒子である。無機化合物は、任意の適切な無機化合物であってもよい。例えば、無機化合物は酸化物であってもよい。無機化合物は通常、シリカ（すなわちＳｉＯ２）、チタニア（ＴｉＯ２）又はアルミナ（Ａ１２Ｏ３）である。無機化合物は、好ましくはシリカであり、中空無機ナノ粒子は、好ましくは中空シリカナノ粒子である。「シリカ」という用語は、ケイ素の酸化物、通常は二酸化ケイ素を含むことが理解されるはずである。
【００２０】
中空無機ナノ粒子は、通常、中空無機ナノ粒子の総重量に対して、少なくとも７０重量％の無機化合物を含む。例えば、中空無機ナノ粒子は、少なくとも９０重量％の無機化合物又は少なくとも９５重量％の無機化合物を含み得る。複数の中空無機ナノ粒子は、無機化合物から成り得る、又は本質的に成り得る。これらの重量パーセントは、活性薬剤を有する複数の中空無機ナノ粒子を充填する前である。
【００２１】
特定の成分から本質的に成る組成物は、特定の成分の機能に物質的に影響しない量（例えば０．５重量％未満）で、特定の成分及び任意のその他の成分を含む。
【００２２】
工程（ａ）は、例えば、第１モノマー及び第２モノマーを溶媒に混合することによって、溶媒に第１及び第２モノマーを接触することを含む。溶媒は、任意の適切な溶媒であってもよく、例えば、Ｓｔｏｂｅｒ工程（Ｓｔｏｂｅｒ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６（１）：６２−６９；１９６８）を実施するのに適した溶媒であってもよい。溶媒は、極性溶媒を含んでもよい。極性溶媒は、水、アルコール若しくはカルボン酸等の極性プロトン性溶媒、又はケトン（例えば、アセトン）、ニトリル（例えば、アセトニトリル）、ハロアルカン（例えば、クロロメタン又はジクロロメタン）若しくはハロアレーン（例えばクロロベンゼン）等の極性非プロトン性溶媒であってもよい。通常、溶媒は、水及び／又はアルコールを含み、アルコールは、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール又はイソプロパノールであってもよい。通常、溶媒は、エタノール及び水を含む。エタノールと水の容量比は通常、６０：２０〜８０：５、例えば、約７０：１０である。
【００２３】
溶媒は、通常、塩基を含んでもよい（すなわち、溶媒は、溶媒として作用する不活液体及び触媒として作用する塩基を含む組成物であってもよい）。塩基は、通常、窒素、例えば、アンモニア、水酸化アンモニウム又はアルキルアミンを含む化合物である。溶媒は、通常、アンモニア又は水酸化アンモニウムを含む。溶媒は、２８〜３０容量％のアンモニア溶液の１．０〜１０．０容量％を含み得る。
【００２４】
溶媒は好ましくは、水、アルコール及びアンモニアを含む。溶媒のｐＨは通常、少なくとも９．０、例えば、１０．０〜１２．０である。
【００２５】
複数のポリマーナノ粒子を形成するための第１及び第２モノマーの反応は、通常、第１及び第２モノマー並びに溶媒を含む組成物を攪拌することを含む。組成物は、５０〜５００ｒｐｍ、例えば、２００〜４００ｒｐｍの速度で攪拌されてもよい。
【００２６】
第１及び第２モノマーは、複数のポリマーナノ粒子を形成するのに適した任意のモノマーであってもよい。第１モノマーは、通常、１つ以上のヒドロキシル基を含む化合物であり、第２モノマーは、通常、１つ以上のアルデヒド基を含む化合物である。より一般的には、第１モノマーはジオールであり、第２化合物はアルデヒドである。ジオールの例として、エタン−１，２−ジオール、プロパン−１，３−ジオール及びベンゼンジオールが挙げられる。例えば、第１モノマーは、式ＨＯ−Ａｒ−ＯＨの化合物であってもよく、第２モノマーは式ＨＣ（Ｏ）−Ｒ１の化合物であってもよく、Ａｒは置換又は非置換アリール基であり、Ｒ１はＨ又は置換若しくは非置換Ｃ１−６アルキルである。
【００２７】
置換基は、Ｃｉ−６アルキル、ヒドロキシル、オキソ、ハロ、アミノ、ニトロ又はカルボキシレートから選択される１つ以上の置換基を含んでもよい。
【００２８】
Ｃ１−６アルキル基は、１〜６個の炭素原子の直鎖又は分岐鎖を含む飽和炭化水素ラジカルである。Ｃ１−６アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオ−ペンチル及びヘキシルであってもよい。通常、Ｒ１はＨ又はメチルである。第１モノマーは、例えばホルムアルデヒド又はエタナールであってもよい。
【００２９】
Ａｒは、置換又は非置換フェニル基であってもよい。例えば、Ａｒはフェニル、メチルフェニル、ジメチルフェニル又はクロロフェニルであってもよい。第２モノマーは、ベンゼンジオール、例えば、レゾルシノール、カテコール又はヒドロキノンであってもよい。
【００３０】
好ましくは、第１モノマーはレゾルシノールであり、第２モノマーはホルムアルデヒドである。
【００３１】
第１モノマーは、あるいは、Ｃ１−６アルキルアミン、例えばメチルアミンであってもよい。
【００３２】
第１モノマーの濃度は、通常、１．０ｍＭ〜０．１Ｍであり、第２モノマーの濃度は、通常、１．０ｍＭ〜０．１Ｍである。例えば、第１モノマーの濃度は、０．０１Ｍ〜０．０３Ｍであってもよく、第２モノマーの濃度は、０．３〜０．０５Ｍであってもよい。
【００３３】
溶媒中の第１モノマーの濃度（例えば、レゾルシノール）は、例えば、１．０ｍｇ／ｍｌ〜３．０ｍｇ／ｍｌ、又は１．２ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌであってもよい。例えば、レゾルシノールの０．１〜０．４ｇをそれぞれ８０ｍｌの溶媒に加えることができる。
【００３４】
溶媒中の第２モノマーの濃度（例えばホルムアルデヒド）は、例えば、溶媒の２０〜５０重量％の第２モノマー／ｍｌを含む溶液の０．００１〜０．００５ｍｌであってもよい。例えば、ホルムアルデヒドの３７重量％の水溶液の０．１〜０．４ｍｌをそれぞれ８０ｍｌの溶媒に加えることができる。
【００３５】
（第１モノマー）：（第２モノマー）のモル比は、通常、３．０：１．０〜１．０：３．０、又は２．０：１．０〜１．０：２．０である。例えば、第１モノマー（例えば、レゾルシノール）のモル過剰があってもよく、（第１モノマー）：（第２モノマー）のモル比は、２．０：１．０〜１．１：１．０であってもよい。
【００３６】
第１モノマー及び第２モノマーを接触することは、複数のポリマーナノ粒子、すなわち、第１モノマー及び第２モノマーの反応から生じるポリマーを含む複数のナノ粒子を製造する。ポリマーは、通常、第１及び第２モノマーのコポリマーである。ポリマーは、通常
、濃縮ポリマーである。例えば、ポリマーはポリエーテル、ポリエステル又はポリアミドであってもよい。ポリマーは、通常、（例えば、直線ポリマーと対照的な）架橋ポリマーである。好ましくは、ポリマーは、レゾルシノール−ホルムアルデヒドコポリマーを含む。
【００３７】
複数のポリマーナノ粒子の平均粒径（例えば、平均粒径）は、通常、５０〜５００ｎｍ、例えば１００〜３００ｎｍである。
【００３８】
本明細書の粒径の参照は、通常、動的光散乱法を使用して決定される粒径分布から測定される平均粒径に対する参照である。動的光散乱法は、例えば、Ｈｏｒｉｂａ  ＳＺ−１００ナノ粒子アナライザーを使用して測定することができる。平均粒径は、Ｄｖ５０値又はＤｎ５０値であってもよい。粒径は、通常、流体力学的径である。
【００３９】
平均粒径は、あるいは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって測定することができる。例えば、平均粒径は、ＳＥＭ画像の画像分析を使用して測定することができる。
【００４０】
無機化合物前駆体は、例えば、溶媒に溶解される場合、無機化合物を形成するのに適した化合物である。無機化合物前駆体は、通常、シリカ前駆体、チタニア前駆体又はアルミナ前駆体である。無機化合物前駆体は、好ましくは、シリカ前駆体である。
【００４１】
シリカ前駆体は、通常、加水分解してシリカを生成する化合物である。シリカ前駆体は、例えば、式Ｓｉ（Ｒ２）ｘ（ＯＲ３）ｙの化合物であってもよく、それぞれのＲ２及びＲ３は、独立してＨ、Ｃ１−６アルキル、アリール及びＣ２−６アルケニルから選択され、ｘは０、１又は２であり、ｙは２、３又は４である。ｘ及びｙの和は通常４である。それぞれのＲ２及びＲ３は、通常、独立して、Ｃ１−６アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル及びｎ−ブチルから選択される。
【００４２】
アリール基は、本明細書で使用される場合、環部分に６〜１４個の炭素原子、通常６〜１０個の炭素原子を含む単環式、二環式又は多環式芳香族環を指す。例として、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、アントレセニル及びピレニル基が挙げられる。Ｃ２−６アルケニル基は、本明細書で使用される場合、１つ以上の炭素−炭素単結合が炭素−炭素二重結合に置き換えられるＣ２−６アルキル基を指す。例として、エネニル、プロペニル及びブテニルが挙げられる。
【００４３】
無機化合物前駆体は、通常、テトラエチルオルトケイ酸塩（ＴＥＯＳ）、テトラメチルオルトケイ酸塩、テトラプロピルオルトケイ酸塩又はテトラブチルオルトケイ酸塩である。好ましくは、無機前駆体化合物は、テトラエチルオルトケイ酸塩である。
【００４４】
工程（ｂ）において、無機化合物前駆体を溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に加えた後に、無機化合物前駆体の濃度は、通常１．０ｍＭ〜０．１Ｍである。例えば、無機化合物前駆体の濃度は、０．０１〜０．０５Ｍである。無機化合物前駆体がシリカ前駆体、例えばＴＥＯＳである場合、シリカ前駆体化合物の濃度は、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物の０．００２〜０．０１５ｍｌ／ｍｌであってもよい。
【００４５】
本発明に記載の方法において、以下の試薬が工程（ａ）：（ｉ）０．１〜２．０ｇのレゾルシノール、好ましくは０．２〜０．７ｇのレゾルシノール、及び（ｉｉ）水中０．１〜３．０ｍＬの３７重量％のホルムアルデヒド、好ましくは水中０．５〜１．０ｍＬの３７重量％のホルムアルデヒドにおける３９１ｍｌの溶媒あたりにつき使用することができる。工程（ｂ）において、３９１ｍｌの溶媒あたりの濃度は、１．０〜５．０ｍＬのテトラメチルオルトケイ酸塩、例えば、２．０〜４．０ｍＬのテトラメチルオルトケイ酸塩で
あってもよい。工程（ｃ）において、以下の試薬：（ｉ）０．２〜４．０ｇのレゾルシノール、好ましくは１．５〜２．０ｇのレゾルシノール、及び（ｉｉ）水中０．５〜６．０ｍＬの３７重量％のホルムアルデヒド、好ましくは２．０〜３．０ｍＬの３７重量％のホルムアルデヒドは、３９１ｍｌの溶媒あたりにつき使用することができる。
【００４６】
無機化合物前駆体を溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に加えることは、溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物を製造する。それぞれの無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子は、通常、無機化合物を含むポリマー及びシェルを含むコアを含む。複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子の平均粒径は、通常、１２０〜４００ｎｍである。
【００４７】
複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子（例えば、シリカで被覆されたポリマーナノ粒子）を製造する工程（ｂ）の条件は、Ｓｔｏｂｅｒ工程（Ｓｔｏｂｅｒ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６（１）：６２−６９；１９６８）に必要とされる条件と同じであってもよい。
【００４８】
工程（ａ）は少なくとも３０℃の温度で実施される。本発明の発明者は、この温度が無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子が製造される工程（ｂ）の温度を制御するのに有利でもあることが分かった。特に、反応混合物（すなわち溶媒及びポリマーナノ粒子）を工程（ａ）と工程（ｂ）との間で冷却することは利益であることが分かった。これにより粒径をより大きく制御することができる。工程（ｂ）において温度を制御することは、また、中空無機ナノ粒子の所望の「先端の尖った」表面形態を導く。
【００４９】
通常、工程（ｂ）は、３０℃以下、例えば、１０℃〜３０℃の温度で実施される。温度は、１８℃〜２８℃であってもよい。
【００５０】
工程は、通常、工程（ａ）と工程（ｂ）との間で、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物を冷却する工程をさらに含む。通常、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物は、０．５℃／分〜１．０℃／分の平均速度で冷却される。溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物は、通常、１０分〜６０分、例えば、２０〜５０分の時間、冷却される。例えば、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物は、４０℃〜５０℃の温度から１０℃〜３０℃の温度まで、２０〜５０分の時間で冷却されてもよい。
【００５１】
無機化合物前駆体を加えた後に、ポリマーナノ粒子を無機化合物で被覆することは、通常、１．０〜３０分の時間進めることができる。この時間の経過後、工程（ｃ）おいて、追加の量の第１及び第２モノマーの添加が開始される。追加の量の第１及び第２モノマーを添加した後、反応混合物は、第１及び第２モノマー並びに無機化合物前駆体を含む。結果として、ポリマー及び無機化合物は、無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子の上に同時に沈殿され、無機化合物のメソポーラス層の作製を導き、無機化合物のメソポアはポリマーで満たされる。「メソポーラス」という用語は、メソポア、すなわち、２ｎｍ〜５０ｎｍの幅（すなわち孔径）を有する孔を含む材料を指す。
【００５２】
工程（ｃ）において、追加の量の第１及び第２モノマーを溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物に加えることは、通常、シリカ前駆体化合物を溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に加える工程（ｂ）の後に１〜３０分で実施される。好ましくは、工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に２〜１０分間実施される。
【００５３】
工程（ｃ）は、通常、工程（ｂ）と同じ温度で実施される。例えば、工程（ｃ）において、溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物の温度は、通常、３０℃以下、例えば、１８℃〜２８℃である。
【００５４】
通常、追加の量の第１及び第２モノマーを溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物を追加した後に、溶媒、複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子並びに第１及び第２モノマーを含む組成物中の第１モノマーの濃度は、２．０ｍＭ〜０．２Ｍであり、第２モノマーの濃度は、２．０ｍＭ〜０．２Ｍである。加えられる第１モノマー（例えば、レゾルシノール）の質量は、例えば、全体として反応混合物の容量に対して、１．５ｍｇ／ｍｌ〜６．０ｍｇ／ｍｌ又は２．０ｍｇ／ｍｌ〜４．０ｍｇ／ｍｌであってもよい。加えられる第２モノマー（例えば、ホルムアルデヒド）の容量は、例えば、全体として反応混合物の第２モノマー／ｍｌの２０〜５０重量％を含む０．０２〜０．１ｍｌの溶液であってもよい。例えば、０．２〜０．６ｇのレゾルシノールは、溶媒のそれぞれの８０ｍｌに加えることができ、３７重量％のホルムアルデヒドの水溶液の０．２〜０．８ｍｌは、溶媒のそれぞれの８０ｍｌに加えてもよい。
【００５５】
通常、追加の量の第１及び第２モノマーは、１．０〜４．０時間反応することができる。これは、無機化合物の外側のメソポーラス層が形成される時間である。無機化合物のメソポーラス層は、ポリマーを完全に除去した後に、粗の又は先端の尖っているように記載することができる表面を形成する。
【００５６】
工程（ｃ）は複数の複合ナノ粒子の製造を導く。複合ナノ粒子は、通常、ポリマーを含むコア、無機化合物を含むシェル層、並びにポリマー及び無機化合物を含む外側層を含む。シェル層は、通常、ポリマーが除去されると、中空無機ナノ粒子の外側から内側に材料を移動することができるいくつかの孔を含む。
【００５７】
本発明の方法は、大規模に実施することができることが分かった。例えば、溶媒の合計容量は、少なくとも５００ｍＬ又は少なくとも５Ｌであってもよい。工程（ａ）〜（ｃ）は、少なくとも５００ｍＬ又は少なくとも５Ｌの許容量を有する反応容器で実施されてもよい。反応容器は、Ｒａｄｌｅｙ反応器であってもよい。
【００５８】
工程（ｄ）は、複数の複合ナノ粒子を加熱して、ポリマー成分を除去し、それによって、複数の中空無機ナノ粒子を製造することを含む。通常、工程（ｄ）は、ポリマーを複合ナノ粒子から取り除くのに適した温度で複数の複合ナノ粒子を加熱することを含む。
【００５９】
例えば、複数の複合ナノ粒子は、４００℃〜７００℃、又は５００℃〜６００℃の温度で加熱されてもよい。焼成工程の間のランプレート（すなわち工程（ｄ）の加熱）は通常１℃／分〜２０℃／分である。ランプレートは、中空無機ナノ粒子の表面形態に有害に影響することなく増加させることができることが分かった。ランプレートは、６℃／分〜１５℃／分であってもよい。
【００６０】
ナノ粒子を加熱する（例えば焼成する）のに必要とされる時間は、以前に予想されるよりも少ないことが分かった。工程（ｄ）は、通常、４．０時間未満の時間、複数の複合ナノ粒子を加熱することを含む。例えば、複数の複合ナノ粒子は、１．０〜３．０時間、又は９０〜１５０分間加熱することができる。
【００６１】
工程（ｄ）の前に、この方法は、通常、複数の複合ナノ粒子を分離することを含む。
【００６２】
これは、通常、溶媒及び複合ナノ粒子を含む組成物を、例えば、５〜２０℃の温度で、１〜２０分間、３０００〜５０００ｒｐｍ遠心分離にかけることを含む。遠心分離の間、上清は、通常除去され、追加の溶媒（例えばエタノール）が加えられる。複数の複合ナノ粒子が分離されると、例えば、１２〜４８時間、室温で空気乾燥されてもよい。
【００６３】
中空無機ナノ粒子の合計収率は、通常、工程（ａ）〜（ｃ）において使用される溶媒の１Ｌあたり１．０ｇ以上であり、例えば、１．５ｇ／Ｌ以上である。
【００６４】
複数の中空無機ナノ粒子は通常、複数のメソポーラス中空無機ナノ粒子である。中空無機ナノ粒子のそれぞれは、無機化合物を含むシェル、無機化合物を含まないシェル内部の容量を含み、及びシェルの外部に配置され、無機化合物を含む複数の突起を含む。
【００６５】
中空無機ナノ粒子は、通常、無機化合物を含む複数の突起を含む粗又は「先端の尖った」表面形態を有する。無機化合物の突起は、無機化合物を含むシェルから外側に伸長する無機化合物の容量である。突起は、通常、中空無機ナノ粒子の表面積を増加させる。シェルの表面の突起は、ナノ粒子のさらなる層を形成し、層は、無機化合物を含むメソポーラス層である。このメソポーラス層の厚み（すなわち、突起の長さ）は、通常、１０ｎｍ〜２００ｎｍ、例えば、５０ｎｍ〜１５０ｎｍである。無機化合物を含むメソポーラス層の多孔性は、通常、無機化合物を含むシェルに最も近いメソポーラス層の部分から、中空無機ナノ粒子の外面に最も近いメソポーラス層の部分までの移動を増加させる。
【００６６】
通常、中空無機ナノ粒子は、１００ｎｍ〜６００ｎｍ、例えば１２０ｎｍ〜４００ｎｍまたは１５０ｎｍ〜２５０ｎｍの平均粒径を有する。シェルの内部の容量は、５０ｎｍ〜５００ｎｍ、例えば１００〜３００ｎｍの平均直径を有する。無機化合物を含むシェルは、１０ｎｍ〜２００ｎｍの平均厚さを有する。
【００６７】
中空無機ナノ粒子は、１５０ｎｍ〜２５０ｎｍの平均粒径を有し、シェルの内部の容量は、５０ｎｍ〜１５０ｎｍの平均直径を有することができる。
【００６８】
中空無機ナノ粒子は、通常、活性薬剤を製剤化し、送達するのに有用である。方法は、適宜に、複数の中空無機ナノ粒子を薬剤で処理をして、薬剤を負荷した複数の中空無機ナノ粒子を製造する工程（ｅ）をさらに含む。薬剤は、任意の適切な薬剤であってもよく、通常、例えば、疎水性活性薬剤である。中空無機ナノ粒子は、活性薬剤を細胞又は生物の特定の場所に輸送することを高めることができる。例えば、中空無機ナノ粒子は、細胞を通って輸送している間、核酸を保護することによって、細胞の核に核酸を輸送することを高めることができる。
【００６９】
複数の中空無機ナノ粒子を活性薬剤で処理する前に、中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理することが望ましいことが多い。電荷改質剤は、通常、アミンポリマー、例えば、ポリアミンである。あるいは、電荷改質剤は、キトサンのアミノ基がトリアルキル化する、例えば、３つのＣ１−６アルキル基で、例えば、３つのメチル基（トリメチル化）でアルキル化されるキトサン又はその誘導体であってもよい。したがって、トリメチルキトサンを使用してもよい。キトサン及びその誘導体は、非ウイルス性遺伝子送達において以前から使用されている。
【００７０】
中空無機ナノ粒子の表面は、通常、負電荷されており、電荷改質剤は通常カチオン性ポリマーである。カチオン性ポリマーの使用は、中空ナノ粒子を核酸等の負電荷剤で負荷することができる。カチオン性ポリマーは、通常、ポリアミン、例えば、ポリエチルアミン（ＰＥＩ）、ポリエチレンイミン又はポリエチレンイミンである。カチオン性ポリマーは、ポリペプチド、例えば、ポリアルギニン、ポリリジン又はポリヒスチジンであってもよい。カチオン性ポリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）であってもよい。
【００７１】
通常、電荷改質剤は、ポリエチレンイミンである。ポリエチレンイミンは、通常、分岐鎖ポリエチレンイミンである。ポリエチレンイミンは、直鎖ポリエチレンイミンであってもよい。ポリエチレンイミンは、５，０００ＭＷ〜４０，０００ＭＷ、例えば、１０，０
００ＭＷ〜２５，０００ＭＷの分子量を有してもよい。ポリエチレンイミンは、通常、５，０００ＭＷ〜１５，０００ＭＷ、例えば、約１０，０００ＭＷの分子量を有し、分子量は、通常、重量平均分子量である。
【００７２】
活性薬剤は、殺虫剤、除草剤、治療薬、ワクチン、トランスフェクション試薬、核酸又は染料であってもよい。殺虫剤は、例えば、スピノサドであってもよい。
【００７３】
治療薬は、核酸、例えば、核酸ワクチンであってもよい。核酸は、通常ＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）である。そのため、核酸はＤＮＡワクチン又はＲＮＡワクチン（例えば、ｍＲＮＡワクチン又はｓｉＲＮＡワクチン）であってもよい。核酸は、例えば、オボアルブミンｐＤＮＡ、オボアルブミンｍＲＮＡ、ＨＰＶ  ｐＤＮＡ又はＨＰＶ  ｍＲＮＡであってもよい。核酸は、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。薬剤が核酸である場合、中空無機ナノ粒子を核酸で処理することは、通常、緩衝化生理食塩水溶液で行われる。中空無機ナノ粒子を核酸で処置する前に、得られる組成物は、２〜１０℃で、１〜１０時間冷却されてもよい。
【００７４】
治療薬は、小分子、例えば、抗増殖化合物、抗菌化合物又は免疫治療化合物であってもよい。
【００７５】
治療薬は、タンパク質であってもよく、例えば、タンパク質を含むワクチンであってもよい。
【００７６】
中空無機ナノ粒子は、治療薬の活性を高めることができ、したがって、中空無機ナノ粒子はアジュバント効果を有することが分かった。例えば、中空無機粒子は、ワクチンの送達後、免疫応答を高めることによってアジュバントとして作用することができ、それによって、必要とされるワクチンの量が減少する。
【００７７】
前述の方法のように、中空無機ナノ粒子の表面は、通常、負に帯電させる。ナノ粒子の表面に酸性基を加える（通常、脱プロトン化される）酸性改質成分でナノ粒子を処理することによって、中空無機ナノ粒子の表面の負電荷を増強させることが望ましい場合があり、それによって、中空無機ナノ粒子の表面の負電荷を増加させる。これは、ポリエチレンイミン等のカチオン性電荷改質剤をナノ粒子の表面に結合することを改善することができる。「結合」は、共有結合及び非共有結合、例えば、イオン結合を含む。通常、電荷改質剤は、イオン相互作用又はファンデルワールス相互作用によって中空無機ナノ粒子の酸性改質された表面に結合する。
【００７８】
方法は、したがって、複数の中空無機ナノ粒子を（酸性リンカーとも呼ぶことができる）酸性改質成分で処理し、その後、複数の中空無機ナノ粒子を薬剤（例えば、電荷改質剤）で処理する工程を含んでもよい。
【００７９】
酸性改質成分は、通常、シリカより小さいｐＫａ（例えば、４．５未満のｐＫａ）を有する酸性基を含む。酸性基は、プロトン化又は脱プロトン化されてもよい。好ましくは、酸性基は、中空ナノ粒子の表面で負電荷を増加するため、脱プロトン化される。通常、酸性改質成分は、３．５以下のｐＫａとして有する酸性基を含む。例えば、酸性改質成分は、ホスホン酸塩基、リン酸基、硫酸基、カルボキシレート基、又はαα−ケトカルボン酸基（−Ｃ（Ｏ）−ＣＯＯ−）を含んでもよい。酸性改質成分はピルビン酸を含み得る。
【００８０】
酸性改質成分は、式Ｓ−Ｒ−Ａの化合物であってもよく、Ｓがケイ素を含む基であり、Ｒが二価有機部分であり、Ａが酸性基である。Ｓは通常、式−Ｓｉ（ａｌｋ）ｎ（ＯＨ）
ｍで表される基であり、ａｌｋがＣ１−６アルキル基であり、ｎが０〜３であり、ＯＨが０〜３である。例えば、Ｓは−Ｓｉ（ＯＨ）３であってもよい。Ｒは通常、Ｃ１−６アルキレン基、例えば、−（ＣＨ２）Ｐ−であり、ｐが１〜６の整数である。Ａは通常、ホスホン酸塩基（例えば、−０−Ｐ（Ｒｐ）（＝０）０−であり、ＲｐはＨ又はＣ１−６アルキル基）、リン酸基、硫酸基、カルボキシレート基、α−ケトカルボン酸基（−Ｃ（Ｏ）−ＣＯＯ−）である。Ａは好ましくは、ホスホン酸塩基、例えば、メチルホスホン酸である。Ａは、酸性基の塩の形態、例えば、メチルホスホン酸一ナトリウム又はピルビン酸一ナトリウムであってもよい。例えば、Ｓが、トリヒドロキシシリルであってもよく、Ｒが−（ＣＨ２）３−であってもよく、Ａがホスホン酸塩基であってもよい。ケイ素含有基は、中空無機ナノ粒子の無機材料（例えば、シリカ）と反応することができ、酸性基を中空無機ナノ粒子に加えることができる。
【００８１】
中空無機ナノ粒子は、通常、０．００５ｇ／ｍＬ〜０．１ｇ／ｍＬの濃度で、酸性改質剤で処理される。酸性改質剤と中空無機ナノ粒子との反応における温度は、通常、２０〜５０℃であり、例えば、３５〜４５℃である。反応時間が、通常１〜５時間である。
【００８２】
方法は、複数の中空無機ナノ粒子を薬剤で処理する前に、複数の中空無機ナノ粒子をホスホン酸塩リンカーで処理する工程を含んでもよい。この場合、酸性改質成分は、ホスホン酸塩酸性改質剤である。多くは、例えば、方法は、複数の中空無機ナノ粒子を電荷改質剤（例えば、ポリエチレンイミン）で処理する前に、複数の中空無機ナノ粒子をホスホン酸塩リンカーで処理する工程を含む。ホスホン酸塩リンカーは、通常、１，３−（トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩（ＴＨＰＭＰ）である。
【００８３】
多くは、例えば、方法（すなわち、その工程（ｅ））は、（ｅｌ）中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理し、及び（ｅ２）中空無機ナノ粒子を活性薬剤で処理することを含む。方法、すなわち、その工程（ｅ）は、例えば、（ｅｌ）中空無機ナノ粒子を酸性改質成分で処理し、（ｅ２）中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理し、及び（ｅ３）中空無機ナノ粒子を活性薬剤で処理することを含んでもよい。方法、すなわちその工程（ｅ）は、例えば、（ｅｌ）中空無機ナノ粒子をホスホン酸塩リンカーで処理し、（ｅ２）中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理し、及び（ｅ３）中空無機ナノ粒子を活性薬剤で処理することを含んでもよい。中空無機ナノ粒子は、例えば、中空シリカナノ粒子であってもよい。ホスホン酸塩リンカーは、例えば、ＴＨＰＭＰであってもよい。電荷改質剤は、例えば、さらに前に規定されるように、例えば、ポリアミン、例えば、ＰＥＩ又はキトサン若しくはその誘導体であってもよい。活性薬剤は、また、さらに前に規定されるように、例えば、核酸、タンパク質又は小分子であってもよく、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）ワクチン、又はタンパク質若しくはペプチドワクチンであってもよい。
【００８４】
中空無機ナノ粒子は、薬剤、例えば、電荷改質剤を素早く負荷することができることが分かった。複数の中空無機ナノ粒子は、したがって、薬剤、例えば、電荷改質剤で、６０分未満又は１５分未満、例えば、３０分〜１５分で処理することができる。例えば、ホスホン酸塩が結合される中空無機ナノ粒子は、１〜１０分間、ポリエチレンイミンで処理されてもよい。多くは、しかしながら、少なくとも１時間、例えば、２〜１０時間、中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理することが好ましい。中空無機ナノ粒子は、電荷改質剤で２０〜３０℃の温度で処理することができる。
【００８５】
本発明は、また、本発明の記載の方法によって得られる複数の中空無機ナノ粒子を提供する。
【００８６】
本発明は、さらに、複数の中空無機ナノ粒子を提供し、中空無機ナノ粒子のそれぞれは、無機化合物を含むシェル、無機化合物を含まないシェル内部の容量を含み、及びシェル
の外部に配置され、無機化合物を含む複数の突起を含む。複数の中空無機ナノ粒子の粒径は、通常、１００〜５００ｎｍである。中空無機ナノ粒子は、前述の記載の通りであってもよい。中空無機ナノ粒子は、通常、中空シリカナノ粒子である。
【００８７】
本発明は、さらに、複数の中空無機ナノ粒子を提供し、中空無機ナノ粒子のそれぞれは、無機化合物を含むシェル、無機化合物を含まないシェル内部の容量を含み、及びシェルの外部に配置され、無機化合物を含む複数の突起を含み、中空無機ナノ粒子は、さらに、無機化合物に結合される複数の酸性基を含む。酸性基は通常、ホスホン酸塩基（例えば、（−０−Ｐ（Ｒｐ）（＝０）Ｏ−であり、ＲｐはＨ又はＣ１−６アルキル基）、リン酸基、硫酸基、カルボキシレート基、又はα−ケトカルボン酸基（−Ｃ（Ｏ）−ＣＯＯ−）である。酸性基は、例えば、メチルホスホン酸基であってもよい。表面に結合される酸性基を含む中空無機ナノ粒子は、前に規定される式Ｓ−Ｒ−Ａの化合物で中空無機ナノ粒子を処理することによって得ることができる。酸性基は、通常、負に帯電させる。例えば、酸性基は塩の形態であってもよく、対イオンは、通常、ナトリウム等のアルカリ金属カチオンである。
【００８８】
前に検討されたように、無機ナノ粒子の表面にホスホン酸塩等の酸性基が存在することは、中空無機ナノ粒子の表面の負電荷を有利に増加し、順に、ポリエチレンイミン等の電荷改質剤をナノ粒子に結合することを改善することができる。
【００８９】
複数の中空無機ナノ粒子の平均粒径は、通常、１５０〜３５０ｎｍ、例えば１６０〜２５０ｎｍである。複数の中空無機ナノ粒子の平均粒径は、１６０〜２００ｎｍであってもよい。粒径は、通常、前に検討されたように、動的光散乱法を使用して測定される。粒径は、ＳＥＭ画像の画像分析によって測定することができる。
【００９０】
本発明に記載の複数の中空無機ナノ粒子は、かなり単分散性であり得る。通常、複数の中空無機ナノ粒子の多分散指数（ＰＤＩ、分散指数としても知られる）は、０．３以下、０．１５以下、０．１以下、又は０．０５以下である。分散指数は、平方平均の比（すなわち、測定された直径の平方の平均値、ｄ）及び測定された直径の単純平均の平方として計算することができる。分散指数の計算は、ＩＳＯ規格文書１３３２１：１９９６Ｅ及びＩＳＯ２２４１２：２００８に規定され得る。
【００９１】
例えば、本発明に記載の又は本発明の方法によって製造される中空無機ナノ粒子は、約１５０〜２００ｎｍの平均粒径（例えば、ＳＥＭによって測定される場合）及び０．１５以下の多分散指数を有することができる。中空無機ナノ粒子は、１５０〜２５０ｎｍの平均粒径及び０．２５以下の多分散指数を有することができる。
【００９２】
中空無機ナノ粒子は通常、大きい表面積を有する。例えば、複数の中空無機ナノ粒子は、少なくとも１２０ｃｍ２／ｇ、例えば、少なくとも１５０ｃｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有することができる。無機ナノ粒子は、少なくとも１４０ｃｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有することができる。複数の中空無機ナノ粒子は、１６０〜２５０ｎｍの平均粒径及び少なくとも１２０ｃｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有することができる。
【００９３】
ＢＥＴ表面積は、例えば、ＩＳＯ９２７７規格を使用して測定することができる。ＢＥＴ表面積は、窒素の吸収及び脱離に基づいて測定することができる。
【００９４】
本発明は、また、本発明に記載の複数の中空無機ナノ粒子及び薬剤を含む組成物を提供する。薬剤は、本明細書に規定される通りであってもよい。薬剤は、通常、例えば、ホスホン酸塩リンカーによって、中空無機ナノ粒子に結合され、これは、特に、薬剤がポリエチレンイミン等の電荷改質剤を含む場合である。ホスホン酸塩リンカーは、１，３−（ト
リヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩（ＴＨＰＭＰ）であってもよい。
【００９５】
薬剤は、通常、疎水性活性薬剤である。例えば、薬剤は、殺虫剤、除草剤、治療薬、ワクチン、電荷改質剤、トランスフェクション試薬、ＤＮＡを含む薬剤又は染料であってもよい。
【００９６】
通常、薬剤は、ポリエチレンイミンである電荷改質剤である。ポリエチレンイミンは、通常、分岐鎖ポリエチレンイミンである。ポリエチレンイミンは、直鎖ポリエチレンイミンであってもよい。ポリエチレンイミンは、５，０００ＭＷ〜４０，０００ＭＷ、例えば、１０，０００ＭＷ〜２５，０００ＭＷの分子量を有してもよい。ポリエチレンイミンは、通常、５，０００ＭＷ〜１５，０００ＭＷ、例えば、約１０，０００ＭＷの分子量を有し、分子量は、通常、重量平均分子量である。
【００９７】
通常、複数の中空無機ナノ粒子は、少なくとも１．０重量％の電荷改質剤を含む。例えば、複数の中空無機ナノ粒子は、少なくとも２．０重量％又は少なくとも５．０重量％の電荷改質剤を含んでもよい。複数の中空無機ナノ粒子は、６．０〜１５重量％の電荷改質剤、例えば、ポリエチレンイミンを含み得る。
【００９８】
複数の中空無機ナノ粒子は、ホスホン酸塩リンカー、例えば、ＴＨＰＭＰで官能化されてもよい。
【００９９】
好ましくは、組成物は、電荷改質剤及び活性薬剤を含む。電荷改質剤は、通常、中空無機ナノ粒子に結合される。例えば、電荷改質剤は、ホスホン酸塩リンカー、例えば、ＴＨＰＭＰによって中空無機ナノ粒子に結合されてもよい。電荷改質剤は、さらに本明細書に記載することができ、通常、アミンポリマー、例えば、ポリアミンである。あるいは、電荷改質剤は、キトサンのアミノ基がトリアルキル化される、例えば、３つのＣ１−６アルキル基で、例えば、３つのメチル基（トリメチル化）でアルキル化されるキトサン又はその誘導体であってもよい。したがって、トリメチルキトサンを使用してもよい。
【０１００】
キトサン及びその誘導体は、以前から非ウイルス性遺伝子送達において使用されている。電荷改質剤は、ポリヒスチジン、ポリリジン又はポリアルギニン等のポリペプチドであってもよい。
【０１０１】
中空無機ナノ粒子の表面は、通常、負電荷されており、電荷改質剤は通常カチオン性ポリマーである。カチオン性ポリマーの使用は、中空ナノ粒子を核酸等の負電荷剤で負荷することができる。カチオン性ポリマーは、通常、ポリアミン、例えば、ポリエチルアミン（ＰＥＩ）、ポリエチレンイミン又はポリエチレンイミンである。通常、電荷改質剤は、ポリエチレンイミンである。ポリエチレンイミンは、通常、分岐鎖ポリエチレンイミンである。ポリエチレンイミンは、通常、５，０００ＭＷ〜１５，０００ＭＷ、例えば、約１０，０００ＭＷの分子量を有し、分子量は、通常、重量平均分子量である。活性薬剤は、殺虫剤、除草剤、治療薬、ワクチン、トランスフェクション試薬、核酸又は染料であってもよい。殺虫剤は、例えば、スピノサドであってもよい。活性薬剤は、通常、例えば、静電気的に電荷改質剤に結合される（この例として、カチオン性ポリアミン、例えば、ＰＥＩ、又はキトサン若しくはキトサンの誘導体に結合される負電荷された核酸）。したがって、治療薬は、核酸、例えば、核酸ワクチンであってもよい。核酸は、通常ＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）である。そのため、核酸はＤＮＡワクチン又はＲＮＡワクチン（例えば、ｍＲＮＡワクチン又はｓｉＲＮＡワクチン）であってもよい。治療薬は、小分子、例えば、抗増殖化合物、抗菌化合物又は免疫治療化合物であってもよい。治療薬は、タンパク質であってもよく、例
えば、タンパク質を含むワクチンであってもよい。
【０１０２】
中空無機ナノ粒子に対する活性薬剤（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の重量比は、通常、１：２〜１：１００（活性薬剤：ナノ粒子）、例えば、１：５〜１：５０、又は１：２０〜１：５０である。
【０１０３】
好ましくは、組成物は、電荷改質剤及び核酸を含む。核酸は、通常ＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）である。例えば、組成物は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及び核酸、例えば、ＰＥＩ及びプラスミドＤＮＡを含んでもよい。
【０１０４】
電荷改質剤、例えばＰＥＩは、通常、ホスホン酸塩リンカー、例えば、１，３−（トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩（ＴＨＰＭＰ）によって、中空無機ナノ粒子に結合される。ＴＨＰＭＰによって中空無機ナノ粒子の表面に加えられるＰＥＩとホスホン酸塩基との結合は、通常、イオン結合である。
【０１０５】
本発明の組成物は、１０μｇ／ｍＬ以上、又は４０μｇ／ｍＬ以上、又は６０μｇ／ｍＬ以上の濃度で、中空無機ナノ粒子を含んでもよい。
【０１０６】
本発明の組成物は、概して、医薬組成物である。好ましい医薬組成物は、無菌でパイロジェンを含まない。本発明の組成物は、したがって、薬学的に許容される担体又は希釈剤をさらに含むことが多い。例えば、注射又は注入のための溶液は、担体として、例えば、無菌水を含んでもよく、又は例えば、無菌、水性、等張性生理食塩水溶液であってもよい。固体剤形は、他方で、活性化合物と共に、希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、ショ糖、セルロース、コーンスターチ又はジャガイモデンプン；潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、マグネシウム又はステアリン酸カルシウム及び／又はポリエチレングリコール；結合剤；例えば、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン；脱凝集剤、例えば、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩又はデンプングリコール酸ナトリウム；泡立ち混合物；染料：甘味料：レシチン、ポリソルベート、ラウリルサルフェート等の湿潤剤；並びに概して、医薬製剤に使用される非毒性及び薬理学的に不活性物質を含んでもよい。このような医薬調製物は、知られている方法で、例えば、混合、顆粒化、錠剤化、糖コーティング又はフィルムコーティング工程の方法によって、製造することができる。経口投与のための液体分散液は、シロップ、乳化剤及び懸濁液であってもよい。シロップは、担体として、例えば、ショ糖、又はグリセリン及び／又はマンニトール及び／又はソルビトールを有するショ糖を含んでもよい。懸濁液及び乳化剤は、担体として、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルアルコールを含んでもよい。筋肉内注射のための懸濁液又は溶液は、活性化合物と共に、薬学的に許容される担体、例えば、無菌水、オリーブオイル、オレイン酸エチル、グリコール、例えば、プロピレングリコール、及び望まれる場合、適切な量のリドカイン塩酸塩を含んでもよい。
【０１０７】
本発明は、また、ヒト又は動物の身体を治療法による治療に使用のための本明細書に記載の組成物を提供する。本願の明細書に係る治療は、疾患の軽減及び予防を含む。活性薬剤は、例えば、ワクチンであってもよく、組成物は、ワクチンを使用して、疾患に対する患者を免疫化することによって、患者の疾患を予防するために使用してもよい。
【０１０８】
本発明は、また、治療を必要とする対象に、本明細書に記載の組成物を治療有効量で投与することを含む、疾患の治療方法を提供する。対象は、哺乳動物であってもよく、通常、ヒト対象である。再び、本明細書の「治療」という用語は、疾患を軽減し予防すること
を含む。組成物の活性薬剤は、例えば、ワクチンであってもよい。治療は、例えば、ワクチンを使用して疾患に対して対象を免疫化することによって、対象の疾患を予防することを含んでもよい。本発明の治療有効量の組成物は、対象に投与され、この量は、組成物に使用される特定の薬剤の活性、治療を受ける対象の年齢、体重及び病態、疾患の種類及び重症度並びに投与回数及び経路に従って、当業者によって容易に決定することができる。
【０１０９】
ナノ粒子によって治療を行うことができる疾患として、癌、細菌感染、ウイルス感染及び免疫障害が挙げられる。治療は、例えば、免疫療法、例えば、免疫療法による癌の治療であってもよい。
【０１１０】
本発明は、また、治療法によって、ヒト又は動物の身体を治療するときに、アジュバントとして使用される本発明に記載の複数の中空無機ナノ粒子を提供する。したがって、複数の中空無機ナノ粒子は、治療薬の効果を増加する方法に使用することができる。例えば、本発明は、治療薬を複数の中空無機ナノ粒子と共投与することによって、治療薬の効果を増加する方法を提供することができる。
【０１１１】
治療薬は、通常、ワクチン、核酸又は化学療法薬である。複数の中空無機ナノ粒子は、したがって、ワクチンアジュバントとして作用することができる。複数の中空無機ナノ粒子は、ワクチンに対する免疫応答を増加させる方法に使用することができる。本発明は、アジュバント及びワクチン等の治療薬として、複数の中空無機ナノ粒子を含む組成物を提供することができる。複数の中空無機ナノ粒子は、活性薬剤がない場合に投与される場合、免疫応答を引き起こし得る。本発明は、したがって、免疫応答を引き起こす方法に使用ための複数の中空無機ナノ粒子を提供する。
【０１１２】
複数の中空無機ナノ粒子は、癌、例えば、免疫療法による癌治療にアジュバントとして、使用することができる。複数の中空無機ナノ粒子は、化学療法薬を複数の中空無機ナノ粒子と共に共投与することによって、癌を治療する方法に使用することができる。
【０１１３】
本発明は、また、核酸を細胞にトランスフェクトする方法を提供し、方法は、細胞を本発明に記載の組成物で処理することを含む。組成物は、複数の中空無機ナノ粒子及び核酸を含んでもよい。細胞は、ヒト又は非ヒト細胞であってもよい。細胞は、ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６またはＨＥＫ２９３細胞株からの細胞であってもよい。核酸を細胞にトランスフェクトする方法は、例えば、記載の細胞株に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに実施することができる。本発明に記載の組成物は、あるいは、核酸をヒト又は動物の身体の細胞にトランスフェクトするために使用することができる。
【０１１４】
本発明の中空無機ナノ粒子は、非常に成功して細胞をトランスフェクトするだけでなく、同時に、免疫系を「起こして」（すなわちアジュバントして作用する）、有利な免疫応答を刺激することが予想外に分かった。したがって、本発明は、また、核酸を細胞にトランスフェクトする方法を提供し、方法は、本発明に記載の組成物で細胞を処理することを含み、組成物は、複数の中空無機ナノ粒子及び核酸を含み、それによって、細胞を核酸でトランスフェクトし、免疫応答を刺激する。有利なこととして、これにより、活性薬剤を負荷されたＳｉＮＰを活性薬剤が送達するビヒクル（例えば、ワクチン）とアジュバントの両方として作用することができる。これは、アジュバントを含む単純化されたワクチン組成物になる。
【０１１５】
本発明は、また、ある場所の害虫を制御する方法を提供し、方法は、ある場所を本明細書に記載の組成物に暴露することを含む。その場所は、通常、穀物又は植物である。害虫は、例えば、昆虫である。
【０１１６】
本発明は、以下の実施例によってより詳細に記載される。
【実施例】
【０１１７】
実施例１−中空シリカナノ粒子（ＳｉＮＰ）の合成
材料
【０１１８】
シリカナノ粒子の合成に使用される材料を、表１に示す。
【０１１９】
【表１】
2021509393.tif 000003
【０１２０】
方法
プロトコル：シリカナノ粒子の合成、１００ｍＬのスケール
以下のプロトコルは、以下に設定される実験の基本として使用された。このプロトコルでは、２つのモノマーが周囲温度で接触されることに留意されるべきである。
【０１２１】
５００ｍＬのＤｕｒａｎボトルは、エタノール（７０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）及び水酸化アンモニウム（３ｍＬ）で処理され、スターラーホットプレートに約３５０ｒｐｍで１５分間、（蓋をして）攪拌された。レゾルシノール（０．２ｇ）及びホルムアルデヒド（０．２８ｍＬ）が加えられ、溶液は、周囲温度で、約３５０ｒｐｍで６時間、（蓋をして）攪拌された。テトラメチルオルトケイ酸塩（０．６ｍＬ）が加えられ、混合物は（蓋をして）６分間攪拌された。追加のレゾルシノール（０．４ｇ）及びホルムアルデヒド（０．５６ｍＬ）が加えられ、溶液は（蓋をして）さらに２時間攪拌された。
【０１２２】
反応混合物は、２つの遠心分離管に移動し、４７００ＲＰＭで、１０℃で５分間、遠心分離が行われた。上清は除去され、新鮮なエタノールがそれぞれの管に加えられ、遠心分離が２ｘ４０ｍＬのエタノールを使用して繰り返された。上清は、除去され、粗の試料はセラミック皿に移動した。エタノール（５ｍＬ）は、移動を補助するために使用された。粗の試料は、周囲温度で３６時間乾燥された。最後に、試料は以下のように焼成された。開始温度：３３℃、ランプ温度：２℃／分、目標温度：５５０℃、保持時間：２時間。最終的なシリカナノ粒子が白色又は灰白色の固体の形で得られた。
【０１２３】
シリカナノ粒子の合成、５００ｍＬ及び５Ｌのスケール
角度のある４つの刃の付いたプロペラを備えた５００ｍＬ又は５ＬのいずれかのＲａｄｌｅｙ反応器で反応が実施され、温度、ｐＨ及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。使用される手順は、「プロトコル：シリカナノ粒子の合成、１００ｍＬスケール」に記載され、試薬の量及び反応条件は、表２及び３に記載されるように計測され、変化された。
【０１２４】
シリカナノ粒子の合成、１０Ｌのスケール
角度のある４つの刃の付いたプロペラを備えた２０ＬのＲａｄｌｅｙ反応器で反応は実施され、温度、ｐＨ、伝導率、スターラーの速度及びトルクについての能力のデータはログされた。使用される手順は、「プロトコル：シリカナノ粒子の合成、１００ｍＬスケール」に記載され、したがって、試薬の量及び反応条件は、表２及び３に記載されるように計測され、変化された。１０Ｌのスケールについて、反応付加安全基準は以下に記載の方法に適用された。
【０１２５】
可視吸収分光法を使用した溶液の濁度の分析
試料は定期的に採取され、１ｃｍのパス長のセルのＡｖａｎｔｅｓ可視吸収分光測定計を使用して、２００〜７００ｎｍで溶液の濁度について、希釈をせずに分析された。分析後、試料は、反応容器に戻された。
【０１２６】
動的光散乱法を使用した粒径の分析
方法では、粒子の成長を観察するために、試料を定期的に採取し、希釈せずに分析した。粒径は、Ｈｏｒｉｂａ  ＳＺ−１００ナノ粒子アナライザーを備える動的光散乱法を使用して測定された。分析後、試料は、反応容器に戻された。
【０１２７】
走査型電子顕微鏡
走査型電子顕微鏡、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＳＵ８２３０を使用して、全てのバッチを画像化した。走査型電子顕微鏡を使用する場合、画像化する前に、粒子は最初に２０ｎｍのクロム層で被覆された。しかしながら、帯電を防ぐために低電圧で実行されて被覆されていない粒子の後の分析は、表面モルフォロジーのより代表的な指標を提供した。
【０１２８】
熱重量測定分析を使用したシリカナノ粒子の調製の分析
熱重量測定分析を使用して、シリカナノ粒子の例示的なバッチから質量損失を研究した。周囲温度から５５０℃（空気中）まで２℃／分のランプレートを使用し、次に５５０℃で５時間保持した。焼成工程の変化例も以下に記載されるように研究された。
【０１２９】
【表２−１】
2021509393.tif 000004
【表２−２】
2021509393.tif 000005
＊より多くの量のレゾルシノールが賦形剤に加えられた。
Ｅエタノール（４０ｍＬ）を使用して、反応器に移すことを補助した。
【０１３０】
【表３】
2021509393.tif 000006
【０１３１】
結果及び検討
ＳｉＮＰ００１及びＳｉＮＰ００２（参照例）
２つの調製を１００ｍＬのスケールで実施し、３３０ｎｍのＳｉＮＰ粒径を目標にした。両方の反応をモニタリングし、工程の全体にわたって画像化した。合成ＳｉＮＰ００ｌの間に、可視吸収分光測定計を使用して濁度の測定も実施し、濁度の増加は視覚的観察と良好に相関した。
【０１３２】
走査型電子顕微鏡を使用して、クロム被覆された粒子とクロム被覆されていない粒子の両方を画像化した。被覆されていない粒子の画像化は、荷電を防ぐために低電圧で、表面モルフォロジーのより良好な代表例を提供する。クロム層の適用は、表面構造のマスキングを導く可能性があり、粒径の誤った増加が多くの場合、粒子の凝集作用を導く。ＳｉＮＰ００ｌ及びＳｉＮＰ００２調製で生成された粒子の画像を、それぞれ図１及び図２に示す。
【０１３３】
調製ＳｉＮＰ００ｌ及びＳｉＮＰ００２で生成される粒子は、それぞれ、２４２ｎｍ及び３００ｎｍの平均粒径を有する。表面モルフォロジーは、両方の場合、先端が尖っている。
【０１３４】
調製ＳｉＮＰ００２における先行技術の合成の複製が成功した後に、Ｒａｄｌｅｙ反応器を使用して反応が５００ｍＬまでスケールアップされた。スケールの他に、Ｒａｄｌｅｙのセットアップは、スターラーホットプレートの準備を上回るいくつかの利点を提供し、温度及び攪拌速度の正確な制御、並びに工程条件（攪拌速度、温度及びｐＨ）をモニタリングする能力を含む。いくつかの合成は、現在まで実施され、以下に要約される。それぞれの合成の結果は、以下の節に詳細に検討される。
【０１３５】
ＳＩＮＰ００３−１８０ｎｍの目標粒径、終始２５℃、３５０ｒｐｍの攪拌速度（参照例）
現在の作業のプログラムの目標粒径は１８０ｎｍであり、したがって、第１のスケールアップされた調製は、この面積の粒径を目標とした。反応のモニタリングは、反応温度、ｐＨ及び攪拌速度の一貫性を図３に示した。
【０１３６】
反応混合物の試料の合成過程の間、反応混合物の粒径の分析は、動的光散乱法を使用して行われた。図４は、約４時間後に、定常の約２００ｎｍの粒径の展開を示し、続いてシリカシェルを加えたときに、粒径は急速に増加したことを示す。しかしながら、最終の焼成されたＳｉＮＰのＳＥＭ画像は、技術の間で粒径の差を示す。この差は、シリカシェルを加えると、粒子の屈折率の変化に起因し得、ＤＬＳを使用して、粒径の異常に高い値を導く。被覆された及び被覆されていない粒子の画像を、図５に示す。粒子のいくらかの凝集作用が観察され、表面トポロジーを決定するのは困難である。調製ＳｉＮＰ００３は、レゾルシノールホルムアルデヒドコアの合成の間に、レゾルシノールの用量より僅かに低くなり、このことは、望まれる１８０ｎｍに対して得られる予想される平均粒径（１６８ｎｍ）よりも僅かに小さいことを説明し得る。このレゾルシノールの目標重量からの小さな偏差は、この小規模なスケールでより明白になる可能性のある粒径に影響を有し、スケールが増加するにつれて、それほど重要ではなくなる。粒径及び観察される凝集作用にも影響を有する可能性のあるその他の要因は、攪拌速度及び種類である。プロペラ刃を使用する攪拌は、概して、磁気スターラーよりもかなり良好な混合をもたらし、したがって、より少ない試薬及び粒子の衝突を生じるよりゆっくりとした攪拌速度によって、より小さい粒径が好まれ得る。
【０１３７】
ＳＩＮＰ００４−１８０ｎｍの目標粒径、終始３５℃、３５０ｒｐｍの攪拌速度（参照例）
１８０ｎｍのＳｉＮＰの合成に必要とされる時間を短縮するために、ＳｉＮＰの合成の温度を２５から３５℃に増加した。レゾルシノールは、ＲＦ（レゾルシノール−ホルムアルデヒド）コアの形成の間、僅かに過量であった。反応温度を増加した結果は２倍である。最初に得られた粒子は、かなり大きく（平均粒径３６７ｎｍ）であり、粒子のコアとシェルの両方の形成において、より速い反応速度論から生じる可能性がある。粒子の分布は、また二峰性であり、より小さい粒子は、シリカをＲＦコアに望ましく加えることの他に、シリカの自己縮合に起因して、図６における先端の尖った構造を生成する可能性がある。しかしながら、粒子の表面モルフォロジーは、以前の調製よりも「先端が尖っている」ように見え、このことはコアについてより高い温度の使用を示唆するが、シェルを形成する見込みがない。
【０１３８】
さらに、ＴＧＡを使用した焼成の工程が観察された。図７において、５５０℃で保持したときに有意な質量損失は観察されなかった。さらに、粒子の焼成が、１４時間実施され、短縮された焼成レジームと比較された（５５０℃までランプして２時間保持する）。表面モルフォロジーに明らかな差は観察されず、したがって、焼成レジームの持続時間は、粒子の形態に有害に影響することなく、短縮することができた（図８）。
【０１３９】
ＳｉＮＰ００５−１８０ｎｍの目標粒径、３５℃のＲＦコアの重合、２５℃のシェル形成、３５０ｒｐｍの攪拌速度
ＳｉＮＰ００４に観察される二峰性粒径分布は、中空の先端の尖ったナノ粒子の他に、固体のシリカナノ球体の形成から生じると考えられる。望ましくないシリカ粒子の形成を回避するために、３５℃の重合温度を使用して調製が実施されて、粒子コアを形成し、その後、低温（２５℃）で、先端の尖ったシリカシェルを形成した。レゾルシノールは、ＲＦコアの形成の間、僅かに過量であった。
【０１４０】
結果として得られる焼成された粒子のＳＥＭ画像を図９に示す。シェルの形成の間に温度を低下することによって、３３６ｎｍの平均粒径を有する単頂性粒径分布が生じる。この結果は、コアの形成の間に重合温度を増加することが、粒径分布又は表面モルフォロジーに有害に影響しないことを確認している。しかしながら、ＴＥＯＳを加える前に２５℃に冷却することは、特に固体のシリカ粒子の形成といった副反応を排除することを補助する。予想される粒径よりも大きいことは、コアの形成の間、より速い重合動力学に起因し得る。この工程の間に重合時間を短縮することは、粒径を減少させるはずである。レゾルシノールの僅かな過量が粒径の増加にさらに起因する可能性もある。
【０１４１】
ＳｉＮＰ００５Ｖ２−１８０ｎｍの目標粒径、３５℃のＲＦコアの重合、２５℃のシェル形成、３５０ｒｐｍの攪拌速度
ＳｉＮＰ００５合成の繰り返しがより少ない量のレゾルシノールを使用して実施されて、コア重合温度からの試薬濃度の効果を分離した。図１０において、焼成された粒子のＳＥＭ画像は、調製ＳｉＮＰ００５の間に生成される粒子に比べて、約８０ｎｍの平均粒径の減少を示し（３３６から２５８ｎｍに減少する）、これはＳｉＮＰ粒径が合成の間、試薬濃度に感受性であることを示唆する。粒径は、所望の１８０ｎｍよりも依然として大きい。しかしながら、コアにおけるより速い重合動力学に起因する可能性があり、コア重合時間の短縮によって、調整されることが予想される。
【０１４２】
ＳｉＮＰ００６−１８０ｎｍの目標粒径、４５℃のＲＦコアの重合、２５℃のシェル形成、３５０ｒｐｍの攪拌速度
さらに重合時間を短縮するために、レゾルシノールホルムアルデヒドのコアの重合が４５℃で実施され、次に、ＴＥＯＳを加える前に、反応温度を２５℃まで低下させた。類似の３５／２５℃の調製（ＳｉＮＰ０００５ＩＩ）に比べて、溶液の濁度のより早期の開始によって証明されるように、重合はより速い速度で生じた。図１１において、得られる焼
成粒子のＳＥＭ画像は、電導性被覆材がない状態で、２５７ｎｍの平均粒径を示す。粒子の表面構造が以前の実験よりも「先端が尖っている」ように見え、重合温度が増加し得る。予想される粒径よりも大きいことは、反応温度の増加によって説明することができ、コアの形成の間の反応時間を短縮することは、粒径の減少をもたらし得る。
【０１４３】
ＳｉＮＰ００６ＩＩ−１８０ｎｍの目標粒径、４５℃のＲＦコア重合、２５℃のシェルの形成、３５０ｒｐｍの攪拌速度、短縮されるコア重合時間
反応時間の粒径に対する効果を発見するために、ＳｉＮＰ００６調製の繰り返しが実施され、４５℃の重合時間は約９０分に減少された。ＳｉＮＰ００６と一致して、反応温度は、その後、ＴＥＯＳを加える前に、２５℃に低下した。焼成粒子のＳＥＭ画像は、電導性被覆材がない状態で、２６０ｎｍの平均粒径を示し、ＳｉＮＰ００６において調製された粒子と一致した。図１２において、表面構造もＳｉＮＰ００６で調製された粒子と一致し、以前の実験よりも「先端がとがっている」。
【０１４４】
ＳｉＮＰ００６ＩＩＩ−１８０ｎｍの目標粒径、４５℃のＲＦコア重合、２５℃のシェル形成、２５０ｒｐｍの攪拌速度、短縮されるコア重合時間
ＳｉＮＰ００６のさらなる繰り返しが実施され、攪拌速度が３５０ｒｐｍから２５０ｒｐｍに減少した。被覆されていない粒子のＳＥＭ画像、平均粒径２４８ｎｍを、図１３に示す。粒径と表面モルフォロジーの両方は、以前のＳｉＮＰ００６の合成と一致し、減少した攪拌速度は、有意差を生じない。
【０１４５】
ＳｉＮＰ００６ＩＶ−１８０ｎｍの目標粒径、４５℃のＲＦコア重合、２５℃のシェル形成、３５０ｒｐｍの攪拌速度、さらに短縮されるコア重合時間
コアの重合のための反応時間を９０分から６０分に短縮する効果を示す画像は、図１４に示される。平均粒径は、２４８ｎｍであると決定され、ＳｉＮＰ００６ＩＩＩについて得られた平均粒径と同一であった。粒子は、目標の１８０ｎｍより大きい。続く実験は、そのため、全体的な粒径及び形態への効果を評価するために、ポリマーコアの形成の間のモノマーの濃度を減少することに焦点を置いた。
【０１４６】
ＳｉＮＰ０００７−１８０ｎｍの目標粒径４５℃のＲＦコアの重合、２５℃のシェル形成、３５０ｒｐｍの攪拌速度、減少した試薬の濃度
この実験において、ポリマーコアの調製に使用されるレゾルシノール及びホルムアルデヒドモノマーの濃度は、２５％に減少した。図１５に示されるように、平均粒径は、１８８ｎｍに減少した。また、この平均粒径は、粒子の表面モルフォロジーに有害に影響することなく達成された。画像を注意深く検証すると、また、この段階において、これが測定の人工産物であるかどうか分からないが、少量の粒子凝集作用を示した。粒子が緩衝水性溶液に分散されるさらなる作業は、粒子が真に凝集されるかどうかを確立するための情報となり得る。
【０１４７】
ＳｉＮＰ０００７ＩＩ−１８０ｎｍの目標粒径４５℃のＲＦコアの重合、２５℃のシェル形成、３５０ｒｐｍの攪拌速度、減少した試薬の濃度、冷却の間の延長時間
粒径及び形態に及ぼす冷却の効果を探るために、冷却時間が３０分間延長されたＳｉＮＰ０００７の繰り返しを実施した。図１６において、被覆されていない粒子のＳＥＭ画像は、２０５ｎｍの平均粒径を示す。予想されるように、粒径は、反応時間がより長くなることにより増加される。しかしながら、所望の「先端の尖った」表面モルフォロジーは、延長された冷却時間がこの工程に組み込まれる場合、依然として達成することができる。
【０１４８】
ＳｉＮＰ０００７Ｖ−１８０ｎｍの目標粒径４５℃のＲＦコアの重合、２５℃のシェル形成、３５０ｒｐｍの攪拌速度、減少した試薬の濃度
図１７において、ＳｉＮＰ０００７の最終調製が実施され、１８９ｎｍの平均粒径、及
び正確な表面モルフォロジーとなった。正確な大きさ及び形態の粒子は、５００ｍＬのスケールで調製することができ、次の節に示されるように、また、ＤＮＡ負荷及びトランスフェクションの優れた能力を提供する。スケーリングにおいて、試薬の濃度の変化例によって存在する任意の変化例は、課題をかなり少なくすることが予想され、５Ｌのスケールでは、工程は再現することができ、粒子はかなり一貫している。
【０１４９】
ナノ粒子の特徴化
一連の粒子について、走査型電子顕微鏡、ＴＥＭによって試験を行った。粒径及び表面モルフォロジーは、図１８において、実施されるＳＥＭ分析と一致している。粒子は、また、所望の中空構造を示す。
【０１５０】
特徴化のデータに基づいて、本発明の方法によって調製される１８０ｎｍのシリカナノ粒子が正確なサイズ及び形態であり、目的に適合し、この方法を５Ｌのスケールアップに進めるべきである。
【０１５１】
５Ｌのスケールにおける方法の展開
正確な表面モルフォロジー及びトランスフェクションの有効性で、１８０ｎｍの粒子の合成を成功に実証した後、方法は、Ｒａｄｌｅｙ反応器を使用して５Ｌにスケールされた。いくつかの合成が現在まで実施されており、表２及び３に要約される。それぞれの合成の結果は、以下の節に詳細に検討される。
【０１５２】
ＳｉＮＰ０００８−１８０ｎｍの目標粒径４５℃のＲＦコアの重合、２５℃のシェル形成、２５０ｒｐｍの攪拌速度
この実験において、反応条件は、表２において、したがって、試薬のスケールの量と共に実験ＳｉＮＰ０００７について保持された。容量の増加によって、攪拌速度は３５０〜２５０ｒｐｍに減少され、ＳｉＮＰ００６ＩＩＩの結果に基づいて、攪拌速度の減少は、粒径又は形態に有害に影響しないことを示した。
【０１５３】
被覆されていない粒子のＳＥＭ画像を、図１９に示す。粒子は、かなり単分散性（ＰＤＩ０．１１）に見え、平均粒径は１８３ｎｍであり、表面モルフォロジーは、まさに必要とされる通りであり、スケールアップの成功を示す。
【０１５４】
ＳｉＮＰ０００８ＩＩ−１８０ｎｍの目標粒径４５℃のＲＦコアの重合、２５℃のシェル形成、２５０ｒｐｍの攪拌速度
再現性を確認するために、同一条件下で実験ＳｉＮＰ０００８が繰り返された。被覆されていない粒子のＳＥＭ画像化は、図２０において、１８４ｎｍの平均粒径、単頂性粒子分布（ＰＤＩ０．１０）、及び所望の表面モルフォロジーを示し、この方法が５Ｌのスケールで非常に再現可能であることを示す。
【０１５５】
形態に及ぼす焼成ランプレートの効果
この実験の目的は、焼成工程に必要とされる時間を潜在的に短縮するために、表面モルフォロジーに対する焼成工程の異なるランプレートの効果を調査するためであった。この実験において、ＳＮＰ０００８ＩＩ粗産物が使用された。被覆されていない粒子のＳＥＭ画像化は、図２１において、それぞれ５℃／分では１８３ｎｍ、１０℃／分では１８６ｎｍの平均粒径を示す。シリカ粒子は「先端が尖っている」ように見え、しかしながらＳｉＮＰ０００８ＩＩと比較すると、「先端が尖っている」様子はそれほど規定されず、いくらかの凝集作用が観察された。同一条件下の熱重量測定分析は、図２２において、ＳｉＮＰ０００８ＩＩについて得られる重量の損失が同様であり、ランプレートを変化させることによって影響を受けない。
【０１５６】
１８０ｎｍに近い粒子を目標とする方法の開発
１８０ｎｍの粒子の合成の成功の後、同様のシリカナノ粒子を目標とするために、方法に対する僅かな修正が試行された。いくつかの合成が実施され、以下の節にその結果を詳述する。
【０１５７】
ＳｉＮＰ００９−１３０ｎｍの目標粒径４５℃のＲＦコアの重合、２５℃のシェル形成、３５０ｒｐｍの攪拌速度
実験の目的は、１３０ｎｍのシリカナノ粒子を合成することであった。この実験では、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は、５２％まで減少され、その他の全ての反応条件は実験ＳｉＮＰ０００７について保持された。図２３は、１３５ｎｍの平均粒径の負荷されていないＳｉＮＰを図示した。凝集作用が観察されるが、先端の尖った表面モルフォロジーは維持される。
【０１５８】
さらに、ポリマーコアの形成に必要とされる時間は８５から１７５分に増加した。この時間の増加は、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの濃度の減少、及びしたがって粒子の衝突、重合反応の速度の減少に起因する。
【０１５９】
ＳｉＮＰ００９ＩＩ−１３０ｎｍの目標粒径４５℃のＲＦコア重合、２５℃のシェルの形成、３５０ｒｐｍの攪拌速度、短縮される重合成長時間
この実験の目的は、ポリマーの成長時間の減少が１３０ｎｍの粒子の合成の利益になるかどうかを検証することであった。図２４において、被覆されていない粒子のＳＥＭ画像は、所望の「先端の尖った」表面モルフォロジーを有する１６２ｎｍの平均粒径を示す。粒径は、二峰性分布を示し、粒子の凝集作用が観察される。
【０１６０】
ＳｉＮＰ０００９ＩＩＩ−さらなるポリマーの成長時間の減少によるＳＮＰ０００９の繰り返し（ＲＦコアの形成のみ）
この実験では、ポリマー成長時間は、４５℃で２００分（ＳｉＮＰ０００９ＩＩ）から１２０分に減少され、ＴＥＯＳの添加の前に停止した。重合は、約１２０分で生じた。得られる被覆されていない粒子のＳＥＭ画像を図２５に示す。レゾルシノールホルムアルデヒド粒子は、９５ｎｍの平均サイズを有する。
【０１６１】
ＳｉＮＰ０００９ＩＶ−５００ｍＬのＲａｄｌｅｙ反応器（１５０ｎｍの粒子のレシピ、４５℃のＲＦコア重合のみ、Ｒ＆Ｆにおける１６％までの減少）
実験の目的は、１５０ｎｍのナノ粒子を合成することであった。レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は、ＳｉＮＰ０００７に比べて１６％減少し、重合反応は、４５℃で１０５分間実施された。重合及び次の沈殿は、約１２５分で生じた。得られる被覆されていないＲＦ粒子のＳＥＭ画像を図２６に示す。ＲＦ粒子は１７０ｎｍの平均サイズを有する。
【０１６２】
ＳｉＮＰ００１０−１８０ｎｍの目標粒径４５℃のＲＦコアの重合、２５℃のシェル形成、３５０ｒｐｍの攪拌速度
この実験の目的は、この工程における水酸化アンモニウムの役割を調査することであった。重合化工程において、水酸化アンモニウムは使用されなかった（上昇した温度でアンモニアの損失に関係する）。この実験からの重要な観察は、４５℃及び３５０ｒｐｍでの１９５分の反応実行時間の後に重合化が発生しなかったことであった。追加の水酸化アンモニウム（１４ｍＬ）沈殿は、９５分後に正常に発生した。
【０１６３】
反応温度は、また、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの第２の追加後に、２０分で２５℃から４５℃に増加された。得られる被覆されていない粒子のＳＥＭ画像を図２７に示す。シリカ粒子は、３０５ｎｍの平均サイズを有し、二峰性分布を示す。さらにいくつ
かの粒子において孔が観察される。増加した粒径は、第２の重合化工程における上昇した温度の結果であり得る。さらに、この上昇した温度は、粒子構造を弱め、焼成工程の間に粒子を破壊する可能性がある。
【０１６４】
１０Ｌのスケールにおける方法の展開
正確な表面モルフォロジーで、１８０ｎｍの粒子の合成の成功を実証した後、方法は、Ｒａｄｌｅｙ反応器を使用して１０Ｌにスケールされた。いくつかの合成が現在まで実施されており、表２及び３に要約される。それぞれの合成の結果は、以下の節に詳細に検討される。さらに、追加の安全基準が工程に適用された。
【０１６５】
１０Ｌのスケールアップに導入される安全基準
１０Ｌのスケールで、安全動作エンベロープを達成するために、いくつかの安全基準がこの工程に適用された。
１．窒素パージシステム−反応における酸素を排除して、いかなる発火の機会も最小にする。
２．静電気放電プラグ−いかなる発火の機会も最小にする。
３．反応器ジャケットの静電気放電添加剤−いかなる発火の機会も最小にする。
４．Ｄｒａｇｅｒホルムアルデヒド検知−ホルムアルデヒドの暴露の任意の徴候を試験する。
【０１６６】
ＳｉＮＰ００１ｌ−１８０ｎｍの目標粒径４５℃のＲＦの重合、２５℃のシェル形成、１６０ｒｐｍの攪拌速度
この実験において、反応条件は、表２において、したがって、試薬のスケールの量と共に実験ＳｉＮＰ０００７について保持された。容量の増加によって、攪拌速度は３５０〜１６０ｒｐｍに減少され、ＳｉＮＰ００６ＩＩＩの結果に基づいて、攪拌速度の減少は、粒径又は形態に有害に影響しないことを示した。
【０１６７】
被覆されていない粒子のＳＥＭ画像を、図２８に示す。粒子は、かなり単分散性（ＰＤＩ０．１１）に見え、平均粒径は１８３ｎｍであり、さらなる表面モルフォロジーは、まさに必要とされる通りであり、スケールアップの成功を示す。
【０１６８】
ＳｉＮＰ００ｌｌＩＩ−ＳｉＮＰ０１１の繰り返し
再現性を確認するために、同一条件下で実験ＳｉＮＰ００１１が繰り返された。被覆されていない粒子のＳＥＭ画像化は、図２９において、１８１ｎｍの平均粒径、単頂性粒子分布（ＰＤＩ０．１３）及び所望の表面モルフォロジーを示し、この方法が１０Ｌのスケールで再現可能であることを示す。少ない確率の孔を有する粒子が観察され、これは、焼成工程のランプレートの予期しない変化に起因するが、変化は２９８℃で固定された。
【０１６９】
ＴＥＭによる粒子構造及び形態の分析
５Ｌ及び１０Ｌの両方のスケールアップバッチに調製される粒子の試料は、ＴＥＭを使用して分析されて、中空構造及び表面モルフォロジーも確認した。画像を図３０に示す。全ての場合において、粒子は中空であり、所望の先端の尖った表面モルフォロジーを有し、約１８０ｎｍの大きさであり、粒子合成のスケールアップの成功を確認する。
【０１７０】
工程の収率の増加
１８０ｎｍの粒子の合成の成功の後、溶媒の容量あたりのシリカナノ粒子の量を増加させるために、方法に対する僅かな修正が試行された。いくつかの合成が実施され、以下の節にその結果を詳述する。
【０１７１】
ＳｉＮＰ００１２−５００ｍＬのＲａｄｌｅｙ反応器（１８０ｎｍの目的の粒径、４５
℃で９０分、ＴＥＯＳの添加前に停止、５倍の濃度のＲ＆Ｆ）
この実験の目的は、溶液中の高濃度の試薬で１８０ｎｍのシリカナノ粒子を合成することであった。この実験では、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は、実験ＳｉＮＰ０００７よりも５倍に増加された。反応は、４５℃で９０分間実施され、実験を停止する前に、２５℃に冷却された。図３１は、８９０ｎｍの平均粒径の負荷されていないＳｉＮＰを図示した。実験の間、約２３分で重合化が生じた。増加した割合の重合化及び粒径の増加は、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの濃度の増加に起因していると予想された。より多くの数の粒子というより、より大きい粒子の形成は、試薬の濃度が過飽和であることを示唆する。
【０１７２】
ＳｉＮＰ００１２ＩＩ−５００ｍＬのＲａｄｌｅｙ反応器（１８０ｎｍの目的の粒径、１０℃、ＴＥＯＳの添加前に停止、５倍の濃度のＲ＆Ｆ）（参照例）
この実験では、反応条件はＳｉＮＰ００１２と同様であって、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は変化しないままであり、ＴＥＯＳの添加前に反応は停止したが、反応は１０℃で実施された。図３２は、６４４ｎｍの平均粒径の負荷されていないＳｉＮＰを図示した。１０℃で、開始から１２０分後に重合反応は発生しなく、温度は２５℃（１１分）に上昇され、４５分後に重合が生じた。
【０１７３】
ＳｉＮＰ００１２ＩＩＩ−減少した重合時間によるＳｉＮＰ００１２の繰り返し
反応は、４５℃で７分間実施され、反応を停止する前に、２５℃に冷却された。重合は２３分で生じ、冷却段階に進んだ。図３３は、４１２ｎｍの平均粒径の負荷されていないＲＦ粒子を図示した。ＳｉＮＰ００１２に比べて、重合時間の減少は、まさに粒径の減少を生じ、しかしながら、より高い冷却力がない状態で１８０ｎｍの平均粒径を達成することはできない。
【０１７４】
ＳｉＮＰ００１２ＩＶ−５００ｍＬのＲａｄｌｅｙ反応器、（１８０ｎｍの標的粒径、ＴＥＯＳの添加の前に停止、Ｒ＆Ｆの約２４％の減少）
知られている合成手順についてＲＦコアのサイズを確認するために、ＳｉＮＰ０００７バッチを繰り返したが、ＴＥＯＳを添加する前に反応は停止した。図３４は、１８０ｎｍのコア／シェル先端の尖った粒子について観察されたコアサイズと一致する１２８ｎｍの平均粒径を有する被覆されていないＲＦ粒子を示す。
【０１７５】
調製されるＳｉＮＰについての粒径の比較
表４は、ＣＰＩで実施されたシリカナノ粒子の調製のそれぞれについて得られた粒径を示す。初期、試料の多くは、２５０ｎｍの領域の平均粒径を示し、ポリマーコアのサイズの発達において、反応時間は定常領域に落ち着くことを示すと思われる。モノマー濃度の減少は、ＳｉＮＰ０００７（５００ｍＬのスケール）、ＳｉＮＰ０００８（５Ｌのスケール）及びＳｉＮＰ０ｌ１（１０Ｌのスケール）に示されるように、コアのサイズの対応する減少を導く。
【０１７６】
【表４】
2021509393.tif 000007
【０１７７】
結論
約３００ｎｍの平均サイズを有する粒子は、１００ｍＬのスケールで製造された。その
後、スケーリング（５００ｍＬ、５Ｌ及び１０Ｌ）、及びプロセスパラメータを正確に制御するために、Ｒａｄｌｅｙ反応器を使用して、１８０ｎｍのＳｉＮＰの合成の工程の改善に焦点を置いた。レゾルシノールホルムアルデヒドコアの形成のための加工時間を減少する場合に、著しい進歩がなされた。さらに、重合温度は、粒子の表面構造に有害な影響を与えることなく、コアの形成の間に、重合温度を上昇させることができ、実際のところ、これは概して有益であることが理解される。シリカシェルの形成は、好ましくは、２５℃で実施されて、二峰性粒子分布の形成を回避し、所望の中空の先端の尖った粒子の他に、固体のシリカナノ球体を含みそうである。
【０１７８】
工程は、５００ｍＬ、５Ｌ及び続いて１０Ｌに成功にスケールされ、ＳＥＭ及びＴＥＭによって証明されるように、低い多分散性、正確な表面モルフォロジー及び多孔性を有する１８０ｎｍの粒子が生じた。粒径の制御は、工程がスケールされるにつれて、著しく改善する。反応溶媒の１リットルにつき得られる粒子の濃度の増加も観察され、１０Ｌのスケールで最大１．７ｇ／Ｌに増加した。特徴化のデータに基づいて、１０Ｌのスケールで調製される１８０ｎｍのシリカナノ粒子が正確なサイズ及び形態であり、目的に適合する。ポリエチレンイミンによって修正された合成工程を使用して製造されたＳｉＮＰの負荷は、実施例２に考察される。
【０１７９】
実施例２−ＰＥＩによるＳｉＮＰの負荷
材料及び方法
材料
シリカナノ粒子の改質に使用される材料を、表５に示す。
【表５】
2021509393.tif 000008
【０１８０】
方法
実施例１で生成されたシリカナノ粒子のＰＥＩ負荷が実施された。これは、２つの工程を含み、最初に、シリカナノ粒子（ＳＮＰ）を有するホスホン酸塩リンカー、３−（トリードロキシシリル）ホスホン酸プロピルメチル一ナトリウム塩溶液（ＴＨＰＭＰ）から成るリン酸塩結合を４０℃で２時間実施する。２番目の工程は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の負荷であり、ホスホン酸塩結合されたシリカナノ粒子をＰＥＩと混合し、シリカに比べて５倍過剰に存在する。この工程は、室温で４時間超行われる。
【０１８１】
前述のように、この工程は、完了するまでに４時間超との過剰な時間がかかったため、一連の実験は、各工程の混合時間を減少し、また、温度の上昇、次に各工程について異なる時間における反応の効果を検証しようとすることによって、工程を改善するために実施された。変化は、ゼータ電位及び炭素水素窒素（ＣＨＮ）分析の２つの異なる方法で分析された。
【０１８２】
ＰＥＩの負荷−ラボスケール
ＰＥＩの負荷は、実施例１において製造されたナノ粒子バッチＳＮＰ００８、ＳＮＰ００８−ＩＩ、ＳＮＰ００７、ＳＮＰ００７−ＶＩ、ＳＮＰ０１１、及びＳＮＰ０１１−ＩＩで実施された。ＣＨＮ分析を実施するために得られた少量の産物によって、この工程のスケールアップは、代わりに２００〜３００ｍｇのシリカを使用して行われた。成分間の比は全て同じレベルで維持された。
【０１８３】
ＰＥＩの負荷−２５０ｍｌのスケール及び１００ｍｇのＳＮＰ００８
角度のある４つの刃の付いたプロペラを備えた２５０ｍｌのＲａｄｌｅｙ反応器で反応は実施され、温度、ｐＨ及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。導入されるＳＮＰの量は、３０ｍｇから１００ｍｇに増加された。その他の反応物の量は、反応物の同比を保持するように増加された。使用される溶媒の容量は、反応器に適合するように調整され、すなわち、１００ｍＬのＨ２Ｏを使用して、ＴＨＰＭＰ及びＳＮＰを溶解及び分散した。さらに、１００ｍＬ及び５０ｍＬの炭酸塩バッファ（ｐＨ９．８）を使用して、それぞれ、ＰＥＩ及びホスホン酸塩結合ＳＮＰを懸濁した。５０％（５３ｍｇ）の収率が得られた。使用される材料を、以下の表６に示す。
【０１８４】
【表６】
2021509393.tif 000009
【０１８５】
ホスホン酸塩結合の研究−５００ｍｌのスケール、５００ｍｇのＳＮＰ００８
角度のある４つの刃の付いたプロペラを備えた５００ｍｌのＲａｄｌｅｙ反応器で反応は実施され、温度、ｐＨ及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。ホスホン酸塩結合工程の反応時間の最適化に焦点が置かれた。ＳＮＰ及びＴＨＰＭＰを混合した後に、粒子は、最初に、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけられ、その後、上清が除去され、粒子は、Ｈ２Ｏに再懸濁され、同条件を使用して、再び遠心分離にかけられた。最後に、上清は再び除去され、粒子は、室温で２日間乾燥された。
【０１８６】
この吸収試験の間、４０ｍＬの試料は３０分毎に採取された。実験は、３つの異なる温度（４０℃、５０℃、６０℃）で実施されて、反応速度に対する温度の影響を探った。
【０１８７】
ＳＮＰの量は、３０ｍｇから５００ｍｇに増加したが、反応物間の比は同じままであった。これは、充分な量の産物が確実に各試料で得られるようになされた。使用される溶媒の容量は、反応器に適合するように調整され、すなわち、２２０ｍＬのＨ２Ｏを使用して、ＳＮＰを分散し、ＴＨＰＭＰを溶解した。使用される材料を、以下の表７に示す。
【０１８８】
【表７】
2021509393.tif 000010
【０１８９】
ＰＥＩの負荷の研究−５００ｍＬのスケール、５００ｍｇのＳＮＰ００８
角度のある４つの刃の付いたプロペラを備えた５００ｍｌのＲａｄｌｅｙ反応器で反応は実施され、温度、ｐＨ及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。ＰＥＩ負荷工程の間の反応時間の最適化に焦点が置かれた。ホスホン酸塩結合粒子の溶液を最初に調製することが決定された。結果として、異なる実験について、次にＰＥＩが同調製溶液から負荷された。
【０１９０】
この溶液の条件は以下であった。
【０１９１】
【表８】
2021509393.tif 000011
【０１９２】
４０℃で２時間混合し、攪拌し、次に遠心分離及び洗浄を行った後に、粒子は、４８０ｍＬの炭酸塩バッファ溶液に再懸濁された。この溶液の３番目（１６０ｍＬ）は、その後、異なる実験に使用された。この工程と並行して、２．５ｇのＰＥＩ−１０Ｋが３２０ｍＬの炭酸塩バッファ溶液に懸濁された。
【０１９３】
本研究では、実験が３０℃及び５０℃という異なる温度下で実施された。試料は、それぞれの温度について、４５分、１時間４５分、２時間４５分、及び４時間後に取られた。３０℃で回収された試料の容量は、５０℃で、４０ｍＬ及び８０ｍＬであった。３０℃の実験の後に得られる少量の産物（約１５ｍｇ）のために、回収される容量を２倍にする決定がなされた。
【０１９４】
最後のスケールアップ改質工程
いくつかの実験を完了した後に、窒素含有量によって示されるように良好な吸収を与える最後のスケールアップ改質工程が採用された。全ての量は、１０倍された。角度のある４つの刃の付いたプロペラを備えた２５０ｍｌのＲａｄｌｅｙ反応器で、ホスホン酸塩結合反応は４０℃で２時間実施され、温度、ｐＨ及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。ＰＥＩの負荷は、室温で、ホットプレートスターラー上のガラス製瓶の内部で実施された。
【０１９５】
使用される条件は、以下の通りである。
【０１９６】
【表９】
2021509393.tif 000012
【０１９７】
動的光散乱法ゼータ電位を使用した表面電荷の分析
動的光散乱法を使用して、粒子の表面電荷及び特に等電点（ＩＥＰ）を特徴付けた。ｐＨの関数として、ゼータ電位は、Ｈｏｒｉｂａ  ＳＺ−１００ナノ粒子アナライザーを使用して測定された。この技術を使用することは、粒子の表面電荷についての情報を提供する。ゼータ電位が０ｍＶに達するときにＩＥＰが達成される。未修正及びＰＥＩ飽和粒子のＩＥＰを知ることによって、ＰＥＩ負荷の展開を追跡することができる。裸の粒子の表面において吸収が開始されると、ＩＥＰは完全飽和表面に移動する。さらに、ｐＨ＜２及びｐＨ＞１２について、この技術がかなり不正確であることに留意されるべきである。
【０１９８】
試料は、固体粒子を酸性又は塩基性溶液に分散することによって調製された。この溶液は、１００ｍＬの１０−３ＭのＫＣＬ溶液にＨＣｌ又はＮａＯＨ（１０−２Ｍ）を滴下することによって、調製された。粒子は、高いＩＥＰが予想され、逆になった場合に、酸性培地に分散された。その後、酸及び塩基の液滴が加えられて、溶液のｐＨを変化し、粒子の表面電荷の展開をモニタリングする。
【０１９９】
Ｃ：Ｈ：Ｎ分析を使用したＰＥＩ濃度の分析
Ｃ：Ｈ：Ｎ分析は、ＰＥＩが粒子に負荷され、吸着される量を定量することが成功したかどうかを確認することができる。この技術は、粒子表面の炭素、窒素及び水素の割合を測定する。この研究のために、窒素含有量及びＰＥＩの主要成分に分析の焦点を置いた。異なる時間及び異なる温度で異なる試料を分析することによって、反応及びその速度の理解に関する情報を提供した。これは、ゼータ電位分関と相補的な技術であり、両方の組の結果の相関を可能にする。単一の分析を実施するために最小３０ｍｇの試料が必要である。
【０２００】
走査型電子顕微鏡
走査型電子顕微鏡を使用して、ホスホン酸塩結合又はＰＥＩの負荷が、粒子の形態に任意の変化を誘導したかどうかが確認された。
【０２０１】
結果及び検討
ＳＮＰ００８へのＰＥＩ負荷
未変性及び変性されたシリカナノ粒子に、ゼータ電位分析が行われた。図３５は、ＤＬＳを使用したゼータ電位分析の結果を示す。ＩＥＰにおいて大きな差が観察される。被覆
されていないＳＮＰ００８のＩＥＰは約ｐＨ３であり、ＰＥＩが負荷されると、ＩＥＰはｐＨ１０に増加する。これは、シリカ表面が、被覆のない場合には負電荷され、ＰＥＩが負荷されると正電荷される。被覆のない粒子はその表面にヒドロキシ基を含有し、ＰＥＩが負荷された粒子は、ジメチルアミン基を含有し、約１０．５のｐＫａを有するために、これらの結果が予想される。
【０２０２】
ＳＮＰ００８−２５０ｍＬのスケール−１００ｍｇのＳＮＰ
第１のスケールアップは、２５０ｍｌのＲａｄｌｅｙ反応器において粒子の量を１００ｍｇ（対３０ｍｇ）に増加することによって、実施された。図３６は、スケールアップ粒子のゼータ電位分析からの結果を示す。ＩＥＰの小さな差は、観察されるが、装置の精度によって、この差は有意ではない。しかしながら、より低いｐＨについては、定常が達成される場合、我々は、２つの試料の間で、約２０ｍＶの強度の差があることを認めた。概して、電荷の強度が高いほど、粒子はより安定する。
【０２０３】
ホスホン酸塩が結合されたＳＮＰ００８
改質工程がより早く停止することが可能であるかどうかを確立するために、ホスホン酸塩結合工程の最適化に関係する一連の実験が実施された。図３７は、前述のように、得られたＳＮＰについてｐＨの関数として、ゼータ電位の展開を記載する。
【０２０４】
未変性ＳＮＰについて観察されるように、約ｐＨ３のＩＥＰを有する表面は負に帯電させるが、処理後に、ＩＥＰがｐＨ２未満に僅かに減少することが観察される。ｐＨ２以下の結果は、不正確であるが、これらの粒子のＩＥＰが、約１．５の亜リン酸のｐＫａになる傾向がある。この結果は、粒子がＰＥＩ負荷の間に、より負に帯電させることを確認する。異なる時間に試料を回収することによってホスホン酸塩結合をモニタリングして、工程を最適化することは、ＩＥＰが機械のｐＨ限界値以下である場合、ゼータ電位を使用することは不可能である。
【０２０５】
この工程を最適化する試みは、後に実施され、得られる粒子は、Ｃ：Ｈ：Ｎ分析を使用して分析された。ホスホン酸塩リンカー源は、プロピル及びメチル基を含み、表面の炭素含有量は、この工程をモニタリングするための良い試料になり得ると考えられた。しかしながら、得られた結果は、バッチ間で極めてランダムであり、環境からの汚染が存在する可能性あることを示す（低いＣ及び高いＮ含有量の両方を有するいくつかの試料が観察された）。
【０２０６】
しかしながら、同バッチの内部において、炭素含有量は、図３８に示されるように、時間と共に極めて一定である。この結果によって、我々は、３０分のみの混合（第１ポイントの測定）の後にのみ、定常に達するため、この工程の間の混合時間を劇的に減少させることができると考えている。
【０２０７】
ＰＥＩ負荷工程の最適化−ＳＮＰ００８−５００ｍＬスケール、５００ｍｇのＳＮＰ、３０℃
前述のグラフは、前述のように、得られたＳＮＰについてｐＨの関数として、ゼータ電位の展開を記載する。図３９は、また、異なる反応時間におけるｐＨを関数としてゼータ電位の展開を記載する。これらの実験は、ＰＥＩ負荷混合工程の最初の４時間を減少させるために実施される。試料の多くは、１００ｍＬの酸性溶液に２ｍｇの粒子を溶解することによって、調製された。これを行うことによって、約２（ホスホン酸塩結合粒子）から１０（完全に被覆された粒子）にＩＥＰを移行するだけでなく、おそらく全ての表面がＰＥＩによって飽和されたことを意味する定常に到達することが予想された。しかしながら、図３８に示されるように、反応を開始してからわずか４５分（すなわち、第１の測定ポイント）後に、定常に到達した。これらの結果に基づいて、粒子の最大ＰＥＩ負荷能力が
４５分の反応の後に到達し、したがって、４時間の反応を実施する必要がないという仮説が立てられる。このことは、ＰＥＩがシリカ粒子よりも５倍過剰に導入されるという事実によって説明することができる。これを考えると、さらなる実験が実施されて、導入されるＰＥＩの量を減少させて、そのためコストを削減することができる。
【０２０８】
第２の観察は、分析中の粒子の分散に関連して行われた。図３９の上部の２つのチャートは、粒子が酸性及び塩基性培地に分散れた場合の結果を示す。完全には理解されないが、曲線は、ｐＨ１０の被覆された表面について、高い正電荷から予想通りに開始し、培地がより酸性になるにつれて、ＰＥＩの不安定化を示し得る。
【０２０９】
ＰＥＩ負荷速度の評価
図４０に示されるように、ＩＥＰは第１ポイントの測定（４５分）で定常に到達する。これらの結果に基づいて、完全負荷能力が４５分の反応の後に到達し、４時間の反応を実施する必要がないという仮説が立てられる。また、最適化を実施する必要がないが、過剰に加えられるため、ＰＥＩの量が減少すると考えられる。
【０２１０】
以下の組の実験は、導入されるＰＥＩの量が減少し、また、粒子表面に対する負荷速度を検証することもできるかどうかを決定するために実施された。これを行うために、ＳＮＰ０１１及びＳＮＰ０１１−２に対する実験が、通常より２．５倍少ない量のＰＥＩを使用して実施された。条件は、表１０に示された。
【０２１１】
【表１０】
2021509393.tif 000013
【０２１２】
最初に、ＩＥＰの２〜１０の実際の移行を見ることができるかどうかを確認するために、３０分の反応語にゼータ電位分析が実施された。結果を図４１に以下に示す。
【０２１３】
図４１において、ＩＥＰは約ｐＨ１０．５である。この場合では、ＰＥＩは２倍過剰に導入され（比較として、以前は５倍である）、吸収反応はたったの３０分しか実施されなかったが、この値は、以前に見つけられたＩＥＰと極めて類似している。負荷速度のより良い評価を得るために、図４２において、１つ以上の分析がＰＥＩ負荷のたった５分後に実施された（過剰に２倍）。
【０２１４】
反応から５分後に、ＩＥＰは以前と極めて類似する。しかしながら、図４１では約４０ｍＶであり、ここでは約２０ｍＶになると、定常の大きさが劇的に減少する。
【０２１５】
ＰＥＩは粒子の表面を極めて素早く被覆し、そういった理由で粒子の表面が反応からたったの５分後に、正電荷にされることが予想される。それにもかかわらず、図４１及び図４２の間で、ｐＨ＜９の全体的なゼータ電位について大きな差が観察される。この差は、反応から５分後に負荷されるＰＥＩの量がより低いことに起因するが、それぞれの実験について異なる試料の種類を使用することからも生じる可能性もある。さらに、図４１に示される結果について（通常より２．５倍少ない量のＰＥＩ及びたったの３０分の反応）、電荷の大きさのレベル及びＩＥＰが通常の条件で変性される粒子（ＰＥＩ、過剰に５倍−４時間）と同じであることに留意されたい。これらの観察を確認するために、Ｃ：Ｈ：Ｎ分析が表１０に挙げられる実験の組で実施された。結果を、以下の図４３に示す。
【０２１６】
図４３は、２つの異なるバッチの粒子（１０Ｌのバッチ）及び２つの異なる時間スケールにおけるＰＥＩ負荷の間の窒素含有量の展開を示す。平均窒素含有量は、両方のグラフに記載される。
【０２１７】
図４３に示される結果は、過剰に２倍のＰＥＩを使用して得られ（対５倍のＵＱの工程）、通常６０％より少ないポリマーを意味する。最初に全体の窒素含有量は、経時的に両方のバッチについて一定であり、通常の工程を使用して観察される平均含有量よりも高い約２％である。このより高い値は、ここでは、ホスホン酸塩結合が、より良い温度の制御を有するＲａｄｌｅｙ反応器でなされるという事実によって、次の節で説明される。第２に、混合からちょうど５分後に、窒素の値が２％に到達し、その後、同レベルにい続けることが観察された。これは、興味深い結果であり、（ｉ）ＰＥＩの量が劇的に減少することができ、及び（ｉｉ）最初の４時間の混合を５分に減少することができる。しかしながら、この例では、混合の終わりと次の遠心分離工程との間の移行が特に制御されず、そのため、混合が終了した後に拡散によって負荷工程を連続することができた。追加の実験は、負荷レベルを確認するために、遠心分離への移行は、混合が実施された直後に実施された。同範囲（１．８２％）の窒素含有量が得られ、これは、５分間の混合がＰＥＩ負荷を生じるのに充分であることを示している。
【０２１８】
ＳＮＰ０７／０７＿ＶＩ／０８／０８＿１１／０１１／０１１＿１１へのＰＥＩの負荷
【０２１９】
【表１１】
2021509393.tif 000014
【０２２０】
ＰＥＩが以前に合成された粒子に正しく負荷されたことを確認するために、Ｃ：Ｈ：Ｎ分析が実施された。結果を、以下の前述の表１１に示す。ＰＥＩ負荷は第１工程によって実施された。いくつかの試料について、Ｃ：Ｈ：Ｎ分析を実施するために回収された少量の産物によって、ＰＥＩ負荷が、その後、第１工程（第２工程）における量の増加変化例を使用して実施された。反応は、ホットプレートスターラーを使用して、ガラス製瓶で行われた。これらのＰＥＩ負荷された粒子の全体の窒素含有量は、クイーンズランド大学によって観察された予測レベルの２．５〜３．４％よりも低い。さらに、粒子間の僅かな差が観察される。この差の起源を理解するために、ＢＥＴ表面分析が異なる負荷されていない粒子に実施された。表７の結果は、０８＿ＩＩ及び０１１＿ＩＩが、より高い表面積及びＰＥＩ含有量を有することを示す。さらに、前述のように、２５０ｍｌのガラス製瓶及びホットプレートスターラーが、いくつかの試料の改質に使用された（第２工程）。溶液の内部の加熱が良好に分布されず、第２工程について、ＳＮＰ０１１＿２に観察される１．２３％の窒素含有量等の異常及び全体的な低い窒素含有量も説明することが想定される。
【０２２１】
ＰＥＩ負荷レベルの増加
Ｃ：Ｈ：Ｎ分析の結果を以下の表１１に示し、ＰＥＩ負荷レベルを増加させるいくつかの試行が実施された。粒子によって組み込まれる窒素の割合は、以下に２．５〜３．５％と予想された。この値に到達するために、粒子に結合されるホスホン酸塩の量を増加させることに焦点を置いた。最初に、リン酸塩の結合工程が、ホットプレートスターラーのガラス製瓶の代わりにＲａｄｌｅｙ反応器で実施されて、我々はより良い温度の制御を有した。ホスホン酸塩の結合工程は、その後、反応温度を４０℃から６０℃と９０℃に増加させることによって実施される。
【０２２２】
追加の実験において、炭酸塩バッファのｐＨは、ｐＨ９．８から１０．９６に増加され、より負電荷されたリンカーがポリマーの負荷を増加することができ、導入されるＰＥＩの量は通常量の２倍であった。高い割合の窒素が表１２に示されるように組み込まれたため、これらの実験をＳＮＰ００８−２に実施する決定がなされた。
【０２２３】
以下の表に、使用された条件の要約を示す。
【０２２４】
【表１２】
2021509393.tif 000015
【０２２５】
この組の実験のＣ：Ｈ：Ｎ分析の結果を以下の表１３に示す。
【０２２６】
【表１３】
2021509393.tif 000016
【０２２７】
概して、窒素含有量が、表１１に示される結果に比べて増加した。ＰＥＩ負荷は、熱が溶液の内部により良く分布されるため、Ｒａｄｌｅｙ反応器でより良いことが確認される。しかしながら、前述の表が示すように、温度上昇、ＰＥＩ量または炭酸塩のｐＨの増加のいずれもＰＥＩ含有量をさらに増加させなかった。実際に、温度が上昇する場合、窒素含有量は減少するように見える。これは、合間のｐＨが減少し、反応が温度よりもｐＨに感受性があるように見えるという事実によって説明される。
【０２２８】
結論
プロセスパラメータを正確に制御するためにＲａｄｌｅｙ反応器を使用した工程の改善に焦点が当てられた。処理時間及びＰＥＩ負荷に使用される材料の量の減少において、著しい展開がなされた。ＰＥＩ量は、少なくとも６０％に減少することができ、必要とされる負荷工程は、たった５分間しか継続する必要がないことが示された。ホスホン酸塩結合工程が減少し得るが、この発見を確認するためにさらなる実験が必要とされることも決定された。工程が実施される温度に関連する１つのその他の重要な観察は、温度の上昇が工程の有効性を減少し、結果として、より低いポリマー含有量になることである。ＰＥＩ負荷をより低い値に設定する必要がある場合、生物適合性の課題が関心事である場合、このパラメータは有用な制御パラメータになることができる。
【０２２９】
実施例３−ＳｉＮＰの製造及び核酸の負荷
方法
負荷されていないシリカナノ粒子の合成及び分析
負荷されていないシリカナノ粒子の合成−１０Ｌのスケール
角度のある４つの刃の付いたプロペラを備えた２０ＬのＲａｄｌｅｙ反応器で反応は実施され、温度、ｐＨ、伝導率、スターラーの速度及びトルクについての能力のデータはログされた。
【０２３０】
Ｒａｄｌｅｙ  Ｐｉｌｏｔ反応器（２０Ｌ）は、約−０．７５ｂａｒまで真空にされ、窒素で３回パージされた。一定の窒素ガスが０．１ｍＬ／分で容器に供給された。容器は、エタノール（８２００ｍＬ）、水（１１７８ｍＬ）及び水酸化アンモニウム（３５０ｍＬ）を充填され、１６０ｒｐｍで（蓋をして）攪拌された。反応培地は、その後、４５℃
まで加熱された。レゾルシノール（１２．８７０２ｇ）は、エタノール（１３０ｍＬ）に溶解された。レゾルシノール及びホルムアルデヒド（１８ｍＬ）が加えられ、溶液は、（蓋をして）４５℃で９０分間攪拌された。温度は、３５分間で、４５℃から２５℃に低下した。テトラメチルオルトケイ酸塩（７０ｍＬ）が加えられ、混合物は（蓋をして）６分間攪拌された。追加のレゾルシノール（４７．２８２９ｇ）が秤量され、エタノール（１００ｍＬ）に溶解された。レゾルシノール及びホルムアルデヒド（６６ｍＬ）が加えられ、反応液は（蓋をして）さらに２時間攪拌された。
【０２３１】
反応混合物は１５Ｌのカーボイに移された。４つの遠心分離瓶（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎａｌｇｅｎｅ、１Ｌ）に反応混合物が充填され、４７００ｒｐｍで、１０℃で５分間、遠心分離が実施された。上清は取り除かれ、遠心分離の瓶により多くの反応混合物が充填され、同条件下で遠心分離が実施された。遠心分離の工程は、全ての反応混合物が遠心分離工程に供されるまで繰り返された。新鮮なエタノール（１００ｍＬ）が各瓶に加えられ、同条件下で遠心分離が実施された。上清は取り除かれ、粗試料が周囲温度で約１７時間、空気中で乾燥された。
【０２３２】
乾燥された粗試料は、セラミック皿に移され、炉に置かれた。試料は、周囲温度から最大５５０℃まで、１分あたり２℃で加熱され、温度は、５時間保持され、その後、自然に冷却した。
【０２３３】
【表１４】
2021509393.tif 000017
【０２３４】
【表１５】
2021509393.tif 000018
【０２３５】
負荷されていないシリカナノ粒子のＳＥＭ分析
ＳＥＭ試料の調製：試料は、バイアルから抽出され、スパチュラの平坦な端を使用して、接着性カーボンタブでＳＥＭスタッド上に圧縮された。ＳＥＭ分析：走査型電子顕微鏡、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＳＵ８２３０装置を使用して、ＳｉＮＰの全てのバッチを画像化した。
【０２３６】
負荷されていないシリカナノ粒子のＴＥＭ分析
以下のプロトコルを使用してＴＥＭ分析が完了した：１０μｌの溶液をカーボンコートされた４００メッシュの銅グリッドに滴下した。余剰な溶液を一片のろ紙で取り除き、グリッドは乾燥された。試料は、１００ｋＶのＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ  １００  ＴＥＭで観察された。画像は、ＡＭＴ４０バージョン５．４２のイメージキャプチャーエンジンを有するＣＣＤカメラオプトロニクス１８２４ｘ１８２４ピクセルを使用してキャプチャーされた。
【０２３７】
銅グリッドは、Ｇｉｌｄｅｒグリッドによって供給され、Ｑｕｏｒｕｍ  Ｑ  １５０Ｔ
ＥＳコーティングユニットを使用してカーボンコーティングされた。
【０２３８】
負荷されていないシリカナノ粒子のＢＥＴ分析
ＴｒｉＳｔａｒ  ＩＩ  Ｐｌｕｓソフトウェアについて、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ
ＴｒｉＳｔａｒ  ＩＩ  Ｐｌｕｓ及びＭｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  ＶａｃＰｒｅｐ  ０６１  Ｓａｍｐｌｅ  Ｄｅｇａｓ  Ｓｙｓｔｅｍで分析が行われた。
【０２３９】
チューブは空のときに秤量され、バルブが半分以上になるまで、金属製の漏斗を使用して、試料がチューブに加えられた。チューブは、充填後に秤量された。チューブは、真空下に８０℃で少なくとも１２時間置かれた。チューブは、脱ガスされると秤量され、分析のためにセットアップされた。
【０２４０】
ＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子の合成及び分析
シリカナノ粒子のＰＥＩ負荷−３０ｍｇスケール
シリカナノ粒子（質量については表１６を参照）は、脱イオン水（１０ｍＬ）に懸濁され、１０分間超音波処理された。３−（トリヒドロキシシリルプロピルホスホン酸塩）（ＴＨＰＭＰ）（０．２１ｍＬ）が脱イオン水（１０ｍＬ）に溶解された。溶液は合わされ、磁気スターラーで２００ｒｐｍ、４０℃で２時間攪拌された。得られた濁った白色溶液
は、１０，０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は脱イオン水（１０ｍＬ）で懸濁された。得られた溶液は、１０，０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は、炭酸塩バッファ溶液（脱イオン水（１０００ｍＬ）中、５ｍＬ、炭酸ナトリウム（１．５９２６ｇ）及び炭酸水素ナトリウム（２．９３３３ｇ））で懸濁された。
【０２４１】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（質量については表１６参照）は、強く振盪することによって、炭酸塩バッファ（１０ｍＬ）に溶解された。溶液は合わされ、磁気スターラーで２００ｒｐｍ、２５℃で４時間攪拌された。得られた濁った白色溶液は、１０，０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は脱イオン水（１０ｍＬ）で懸濁された。得られた溶液は、１０，０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心分離にかけられた。上清は除去され、粒子は、室温で乾燥されて、固体の白色産物を得た。
【０２４２】
【表１６】
2021509393.tif 000019
【０２４３】
シリカナノ粒子のＰＥＩ負荷−５ｇスケール
シリカナノ粒子（質量については表１７を参照）は、脱イオン水（３００ｍＬ）に懸濁され、１５分間超音波処理された。３−（トリヒドロキシシリルプロピルホスホン酸塩）（ＴＨＰＭＰ）（１２．８ｍＬ）が脱イオン水（３００ｍＬ）に溶解された。溶液は合わされ、磁気スターラーで５００ｒｐｍ、４０℃で２時間攪拌された。得られた濁った白色溶液は（目に見える粒子を有して）、１０，０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は脱イオン水（チューブにつき約１５ｍＬ）で懸濁された。得られた溶液は、１０，０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心分離にかけられた。上清は除去され、粒子は、室温で乾燥されて、固体の白色産物を得た。
【０２４４】
ホスホン酸塩が負荷されたシリカナノ粒子の試料が取られ、残りの粒子は、炭酸塩バッファ溶液（２００ｍＬ）で懸濁された。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（質量については表１７参照）は、強く振盪することによって、炭酸塩バッファ（３００ｍＬ）に溶解された。溶液は合わされ、磁気スターラーで５００ｒｐｍ、２５℃で４時間攪拌された。目に見える粒子を有する濁った白色溶液は、１０，０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は脱イオン水（チューブにつき約１５ｍＬ）で懸濁された。得られた溶液は、１０，０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心分離にかけられた。上清は除去され、粒子は、室温で乾燥されて、固体の白色産物を得た。
【０２４５】
【表１７】
2021509393.tif 000020
【０２４６】
ＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のＤＬＳゼータ電位分析
Ｈｏｒｉｂａ  ＳＺ−１００ソフトウェアを使用して、Ｈｏｒｉｂａ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃａ、Ｎａｎｏ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＳＺ−１００で分析を行った。水において２５℃で、２回測定が行われた。
【０２４７】
シリカナノ粒子試料（２ｍｇ）は、脱イオン水（１ｍＬ）に脱イオン化されて、透明な水溶液の白色固体粒子を得た。目に見える固体白色粒子のない濁った白色溶液があるまで、試料は超音波処理された。６ピペットの試料の液滴がＫＣ１溶液（１０−３Ｍ、１００ｍＬ）に加えられた。シリンジ（２ｍＬ）を使用して、電極セルに得られた溶液を充填し、セルに目に見える泡がないことを確認し、ゼータ電位が記録された。
【０２４８】
ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子の合成及び分析
ＤＮＡ定量化のためのＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のＤＮＡ負荷
ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１０００μＬ）のＰＥＩ−ＳｉＮＰ粒子のストック溶液（５００μｇ）は、５分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに５分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割された（１０μＬ）。ＤＮＡは１μＬに分割することができるストック溶液に作製された。ＤＮＡ（１μｇ）がＤＮＡストック溶液から加えられ、３回再ピペットされて混合された。溶液は冷蔵庫に５℃で、４時間安定した。溶液は、その後、２５℃で、１０，９００ｒｐｍ、１３分間微量遠心機にかけられた。上清はピペットアウトされて、ＤＮＡ定量化に使用された。
【０２４９】
ポジティブコントロール：ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１０μＬ）のＤＮＡ（１μｇ）が３回再ピペットされて、混合された。溶液は冷蔵庫に５℃で、４時間安定した。溶液は、２５℃で、１０，９００ｒｐｍ、１３分間微量遠心機にかけられた。上清はピペットアウトされて、ＤＮＡ定量化に使用された。
【０２５０】
ネガティブコントロール：ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１０μＬ）。
【０２５１】
ＤＮＡ定量化のためのＤＮＡ及びＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子の可視吸収分析
上清のＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ８０００分光光度計及び２μｌの試料を使用して決定された。
【０２５２】
ＤＮＡ及びＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のＤＬＳゼータ電位分析
Ｈｏｒｉｂａ  ＳＺ−１００ソフトウェアを使用して、Ｈｏｒｉｂａ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃａ、Ｎａｎｏ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＳＺ−１００で分析を行った。測定は、１０ｍＭのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液において、２５℃で２回実施された。
【０２５３】
ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（２００μＬ）のＰＥＩ−ＳｉＮＰ粒子の溶液（１００μｇ）は、５分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに５分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。ＤＮＡは１μＬに分割することができるストック溶液に作製された。ＤＮＡ（１０μｇ）がＤＮＡストック溶液から加えられ、３回再ピペットされて混合された。溶液は冷蔵庫に５℃で、４時間安定した。溶液は、２５℃で、１０，９００ｒｐｍ、１３分間微量遠心機にかけられた。得られた産物は、１０ｍＭのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液（５ｍＬ）に再懸濁された。シリンジ（２ｍＬ）を使用して、電極セルに得られた溶液を充填し、セルに目に見える泡がないことを確認し、ゼータ電位が記録された。
【０２５４】
全てのＤＮＡ及びＲＮＡゼータ電位分析について、全ての装置がヌクレアーゼのないことを保証することはできないが、しかしながら、できるだけヌクレアーゼのない実験を実施しようと方法が採られることに留意されるべきである。
【０２５５】
ＲＮＡ定量化のためのＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のＲＮＡ負荷
ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１０００μＬ）のＰＥＩ−ＳｉＮＰ粒子のストック溶液（５００μｇ）は、５分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに５分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割され（１０μＬ）、ＲＮＡ（１μｇ）が、原材料から直接的に加えられ、３回再ピペットされて、混合された。溶液は、冷蔵庫に５℃で、４時間安定した。溶液は、２５℃で、１０，９００ｒｐｍ、３分間微量遠心機にかけられた。上清はピペットアウトされて、ＲＮＡ定量化に使用された。
【０２５６】
ポジティブコントロール：ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１０μＬ）のＲＮＡ（１μｇ）が３回再ピペットされて、混合された。溶液は冷蔵庫に５℃で、４時間安定した。溶液は、２５℃で、１０，９００ｒｐｍ、３分間微量遠心機にかけられた。上清はピペットアウトされて、ＲＮＡ定量化に使用された。
【０２５７】
ネガティブコントロール：ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１０μＬ）。
【０２５８】
ＲＮＡ定量化のためのＲＮＡ及びＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子の蛍光分析
上清のＲＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ３．０蛍光光度計及びＱｕｂｉｔ  ＲＮＡ  ＢＲキットを使用して決定された。試料及びキットＲＮＡ標準はＱｕｂｉｔ染料と混合され、Ｑｕｂｉｔ３．０蛍光光度計のＲＮＡ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ  Ａｓｓａｙプログラムを使用して分析された。
【０２５９】
ＲＮＡ及びＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のＤＬＳゼータ電位分析
Ｈｏｒｉｂａ  ＳＺ−１００ソフトウェアを使用して、Ｈｏｒｉｂａ，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃａ、Ｎａｎｏ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＳＺ−１００で分析を行った。測定は、１０ｍＭのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液において、２５℃で２回実施された。
【０２６０】
ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（２００μＬ）のＰＥＩ−ＳｉＮＰ粒子の溶液（１００μｇ）は、５分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに５分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。ＲＮＡ（１０μｇ）が、原材料から直接的に加えられ、３回再ピペットされて、混合された。溶液は冷蔵庫に５℃で、４時間安定した。得られた産物は、１０ｍＭのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液（４．８ｍＬ）に再懸濁された。シリンジ（２ｍＬ）を使用して、電極セルに得られた溶液
を充填し、セルに目に見える泡がないことを確認し、ゼータ電位が記録された。
【０２６１】
安定性試験のためのＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏのＤＮＡ負荷
ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１２５０μＬ）のＰＥＩ−ＳｉＮＰ粒子のストック溶液（５００μｇ）は、５分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに５分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割された（１００μＬ）。ＤＮＡは１μＬに分割することができるストック溶液に作製された。ＤＮＡ（４μｇ）がＤＮＡストック溶液から加えられ、３回再ピペットされて混合された。溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、５５０ｒｐｍで、４℃で６時間攪拌された。混合物は、ＤＮＡ定量化のために、０、２及び６時間のタイムポイントで採取された。６時間で、溶液は、２５℃で、１０，９００ｒｐｍ、１３分間微量遠心機にかけられた。上清はＤＮＡ定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のための６時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
【０２６２】
ポジティブコントロール：ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１００μＬ）のＤＮＡ（４μｇ）が３回再ピペットされて、混合された。この処理は、２回実施され、１つの試料は、ＤＮＡ定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のために直ちにスナップフリーズされた。その他の溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、５５０ｒｐｍで、４℃で６時間攪拌された。混合物は、ＤＮＡ定量化のために、０、２及び６時間のタイムポイントで採取された。６時間で、溶液は、２５℃で、１０，９００ｒｐｍ、１３分間微量遠心機にかけられた。上清はＤＮＡ定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のための６時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
【０２６３】
ネガティブコントロール：ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１００μＬ）。
【０２６４】
安定性試験のためのＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏのＲＮＡ負荷
ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１２５０μＬ）のＰＥＩ−ＳｉＮＰ粒子のストック溶液（５００μｇ）は、５分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに５分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割され（１００μＬ）、ＲＮＡ（４μｇ）が、原材料から直接的に加えられ、３回再ピペットされて、混合された。溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、５５０ｒｐｍで、４℃で６時間攪拌された。混合物はＤＮＡ定量化のために０、２及び６時間のタイムポイントで採取され、キャピラリー電気泳動のための６時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
【０２６５】
ポジティブコントロール：ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１００μＬ）のＲＮＡ（４μｇ）が３回再ピペットされて、混合された。この処理は、２回実施され、１つの試料は、ＲＮＡ定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のために直ちにスナップフリーズされた。その他の溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、５５０ｒｐｍで、４℃で６時間攪拌された。混合物はＲＮＡ定量化のために０、２及び６時間のタイムポイントで採取され、キャピラリー電気泳動のための６時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
【０２６６】
ネガティブコントロール：ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１００μＬ）。
【０２６７】
安定性試験のためのＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏのＤＮＡ負荷
ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１００μＬ）の０．２２μｍのろ過された０．５％（ｗ／ｖ）のヒドロキシメチルセルロース中のＰＥＩ−Ｓ
ｉＮＰ粒子の溶液（５００μｇ）は、プレートシェーカーに５００ｒｐｍで１分間攪拌された。溶液は、その後、１０分間超音波処理され、再ピペットされ、さらに１０分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに１０分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。ＤＮＡは１μＬに分割することができるストック溶液に作製された。ＤＮＡ（５０μｇ）がＤＮＡストック溶液から加えられ、３回再ピペットされて混合された。溶液は、氷浴中、プレートシェーカーに５５０ｒｐｍ、４℃で６時間、攪拌された。混合物は、ＤＮＡのために、０、２及び６時間のタイムポイントで採取された。６時間で、溶液は、２５℃で、１０，９００ｒｐｍ、１３分間微量遠心機にかけられた。上清はＤＮＡ定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のための６時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
【０２６８】
ポジティブコントロール：ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１００μＬ）の０．２２μｍのろ過された０．５％（ｗ／ｖ）のヒドロキシメチルセルロース中のＤＮＡ（５０μｇ）が３回再ピペットされて、混合された。この処理は、２回実施され、１つの試料は、ＤＮＡ定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のために直ちにスナップフリーズされた。その他の溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、５５０ｒｐｍで、４℃で６時間攪拌された。混合物は、ＤＮＡのために、０、２及び６時間のタイムポイントで採取された。６時間で、溶液は、２５℃で、１０，９００ｒｐｍ、１３分間微量遠心機にかけられた。上清はＤＮＡ定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のための６時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
【０２６９】
ネガティブコントロール：０．２２μｍのろ過された０．５％（ｗ／ｖ）のヒドロキシメチルセルロースのヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１００μＬ）。
【０２７０】
安定性試験のためのＰＥＴ負荷されたシリカナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏのＲＮＡ負荷
ヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１００μＬ）の０．２２μｍのろ過された０．５％（ｗ／ｖ）のヒドロキシメチルセルロース中のＰＥＩ−ＳｉＮＰ粒子の溶液（５００μｇ）は、プレートシェーカーに５００ｒｐｍで１分間攪拌された。溶液は、その後、１０分間超音波処理され、再ピペットされ、さらに１０分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに１０分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。ＲＮＡ（５０μｇ）が、原材料から直接的に加えられ、３回再ピペットされて、混合された。溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、５５０ｒｐｍで、４℃で６時間攪拌された。混合物はＲＮＡ定量化のために０、２及び６時間のタイムポイントで採取され、キャピラリー電気泳動のための６時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
【０２７１】
ポジティブコントロール：０．２２μｍのろ過された０．５％（ｗ／ｖ）のヒドロキシメチルセルロースのヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１００μＬ）中のＲＮＡ（５０μｇ）は、３回再ピペットされて、混合された。この処理は、２回実施され、１つの試料は、ＤＮＡ定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のために直ちにスナップフリーズされた。その他の溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、５５０ｒｐｍで、４℃で６時間攪拌された。混合物はＲＮＡ定量化のために０、２及び６時間のタイムポイントで採取され、キャピラリー電気泳動のための６時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
【０２７２】
ネガティブコントロール：０．２２μｍのろ過された０．５％（ｗ／ｖ）のヒドロキシメチルセルロースのヌクレアーゼのない１０ｍＭのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液（１００μＬ）。
【０２７３】
ＤＮＡ分析のためのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）
ＣＥ分析の前に、上清のプラスミドＤＮＡ試料（オボアルブミン（ＯＶＡ）ｐＤＮＡ及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ｐＤＮＡ）は、ＢａｍＨＩ酵素で消化され、Ｍｏｎａｒｃｈ  ＰＣＲ＆ＤＮＡクリーナップキットを使用して精製された。前処理されたプラスミドＤＮＡ試料は、その後、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ＧＸｉｉシステムで実行された。試料は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＤＮＡ５Ｋ試薬キットを使用して分析された。低分子量及び高分子量のマーカー（キットマーカーバッファに存在する）は、それぞれの試料で実行された。分子量マーカー（ＤＮＡ５Ｋ試薬キットからのＤＮＡラダー）は、試料と共に実行された。
【０２７４】
ＲＮＡ分析のためのキャピラリー電気泳動
上清のｍＲＮＡ試料（ＯＶＡ  ｍＲＮＡ）は、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ＧＸｉｉシステムで実行された。試料は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＲＮＡピコアッセイ試薬キットを使用して分析された。ｍＲＮＡ試料は、ＲＮＡピコアッセイ試薬キットの試料バッファで前処理され、７０℃で２分間加熱された。低分子量のマーカー（キット試料バッファに存在する）は、それぞれの試料と供に実行された。分子量マーカー（ＲＮＡピコアッセイ試薬キットからのＲＮＡラダー）は、試料と共に実行された。
【０２７５】
結果及び検討
ナノ粒子の合成、特徴化及び負荷
１０Ｌバッチのシリカナノ粒子の合成
１０Ｌバッチのシリカナノ粒子は調製され、ＳｉＮＰ  ＮＵＭｅｄ（バッチ１１（ＩＶ））と呼ばれる。得られたブランクのシリカナノ粒子は、粒径及び外観についてＳＥＭによって特徴付けられた。
【０２７６】
図４４は、ＳｉＮＰ  ＮＵＭｅｄについてのＳＥＭ画像を示す。粒子分析はＳＥＭ画像上で実施され、計算された結果は、粒子は２０３±２５ｎｍの平均粒径（カウント１６１、標準偏差２４．６ｎｍ、モード２０４ｎｍ）を有することを示す。均一な粒子（ＰＤＩ０．１２）がＳＥＭ画像に観察され、粒子は、所望の先端の尖った表面モルフォロジーを有するように見える。
【０２７７】
図４５は、ＳｉＮＰ  ＮＵＭｅｄについてのＴＥＭ画像を示す。１９５ｎｍの平均粒径は、ＴＥＭ画像の分析から計算された。平均コア径は、９６ｎｍとして計算され、シェルの平均厚は、５１．３５ｎｍとして計算された。
【０２７８】
粒子の表面積は、ＰＥＩ及び続く核酸の負荷にとって重要であり、Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）窒素収着によって決定される。１７２ｍ２／ｇの表面積は、ＳｉＮＰ  ＮＵＭｅｄナノ粒子について決定された。
【０２７９】
３０ｍｇスケールのシリカナノ粒子のＰＥＩ負荷
ＰＥＩ  ＳｉＮＰ  ＮＵＭｅｄのゼータ電位は１、２、３回実行され、それぞれ３．９、７．９及び２２．２ｍＶであることが分かった。これは、ＰＥＩの負荷を示す。
【０２８０】
５ｇスケールのシリカナノ粒子のＰＥＩ負荷
ＰＥＩ  ＳｉＮＰ００１１ＩＩのゼータ電位は１及び２回実行され、それぞれ１８．１及び１５．８ｍＶであることが分かった。これは、ＰＥＩの負荷を示す。
【０２８１】
ＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のＤＮＡ負荷
ＰＥＩ負荷されたＳｉＮＰナノ粒子のバッチは、３回ｅＧＦＰ  ｐＤＮＡで負荷された。表１８は、粒子がｅＧＦＰ  ＤＮＡの負荷に成功したことを示す。
【０２８２】
【表１８】
2021509393.tif 000021
【０２８３】
ＯＶＡ及びＨＰＶ核酸（ｐＤＮＡ及びｍＲＮＡ）の負荷及び定量化
ＯＶＡ  ｐＤＮＡ、ＨＰＶ  ｐＤＮＡ及びＯＶＡ  ｍＲＮＡの負荷は、溶液中のＤＮＡ／ＲＮＡ濃度を分析することによって試験が行われて、粒子表面対ポジティブコントロールにおいて、濃度を逆算した。ゼータ電位分析も使用して、ポジティブ（ＰＥＩ）からネガティブ（核酸）までの粒子の表面電荷の変化を確認した。
【０２８４】
ＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のＯＶＡ  ｐＤＮＡ負荷
ＰＥＩ負荷されたＳｉＮＰは、ＯＶＡ  ＤＮＡを３回負荷された。０及び４時間のタイムポイントでの１００〜１４０ｎｇ／μｇの標的範囲対ポジティブコントロールにおける負荷は、表１９に示されるように達成された。
【０２８５】
【表１９】
2021509393.tif 000022
【０２８６】
ＯＶＡ  ＤＮＡを負荷された粒子のゼータ電位分析は、核酸の負荷を示す予想された負表面電荷（−８．８ｍＶ）を示す。
【０２８７】
ＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のＨＰＶ  ｐＤＮＡ負荷
ＰＥＩ負荷されたＳｉＮＰナノ粒子へのＨＰＶ  ｐＤＮＡの負荷の成功が観察された。ｐＤＮＡ負荷の結果を表２０に示す。
【０２８８】
【表２０】
2021509393.tif 000023
【０２８９】
ＨＰＶ  ＤＮＡを負荷された粒子の対応するゼータ電位分析は、核酸の負荷を示す予想される負表面電荷（−７．８ｍＶ）を示す。
【０２９０】
ＰＥＩ負荷されたシリカナノ粒子のＯＶＡ  ｍＲＮＡ負荷
ＯＶＡ  ｍＲＮＡを使用して負荷実験が繰り返され、Ｑｕｂｉｔ蛍光アッセイを使用して分析が実施された。周囲温度での遠心分離の間のｍＲＮＡの安定性についての関心によって、ＤＮＡについて使用された時間（１３分）よりも短い時間（３分）遠心分離が実施された。
【０２９１】
ＯＶＡ  ｍＲＮＡは、ＰＥＩ−負荷ＳｉＮＰへの負荷が成功したことが分かった。負荷の結果を表２１に示す。
【０２９２】
【表２１】
2021509393.tif 000024
【０２９３】
ＯＶＡ  ｍＲＮＡについてのゼータ電位分析は、ＯＶＡ及びＨＰＶ  ｐＤＮＡからの結果と同様であり、粒子の表面がｍＲＮＡによって改変されたことを示す負表面電荷（−６．７ｍＶ）を示す。
【０２９４】
ＰＥＩ−ＳｉＮＰに負荷されるｐＤＮＡ及びｍＲＮＡの安定性
ＰＥＩ−ＳｉＮＰに負荷されるｐＤＮＡ及びｍＲＮＡの安定性は、ＤＮＡ定量化及びキャピラリー電気泳動によって負荷してから６時間後に評価された。ＯＶＡ  ｐＤＮＡ、ＯＶＡ  ｍＲＮＡ及びＨＰＶ  ｐＤＮＡの全てが６時間後にＳｉＮＰに上手く負荷され続け、ｐＤＮＡ又はｍＲＮＡについて、分解は観察されなかった。
【０２９５】
実施例４−脾細胞の増殖に対するＯＶＡ  ｐＤＮＡを負荷されたＳｉＮＰの効果
免疫応答の発生における異なる量のＯＶＡ  ｐＤＮＡ（Ｒａｍ−ＤＮＡ）を負荷されたＳｉＮＰ中空ナノ粒子の効果がマウス脾細胞増殖において評価され、コントロール（ＰＢＳ）、ＯＶＡ（オボアルブミンタンパク質）、ＯＶＡ−ＣＦＡ（オボアルブミンタンパク質／完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント）、ｐＤＮＡ（オボアルブミンＤＮＡ単独）、ＪＥＴ−ＤＮＡ（オボアルブミンＤＮＡ／ＪＥＴ  ＰＥＩトランスフェクション剤）及び負荷されていないＳｉＮＰ（Ｒａｍ−７５ｍｇ／ｋｇ）と比較された。マウスは０、７及び１４日目に免疫化され、脾細胞の単離のために脾臓が２８日目に回収された。脾細胞はＯＶＡ刺激のある場合とない場合で、４８時間９６ウェルプレートに播種された。ＭＴＴ分析が実施されて、１群につき６匹のマウスの脾細胞の相対数を３回分析した。
【０２９６】
結果を、図４６に示す。ＳｉＮＰ中空ナノ粒子が脾細胞の増殖の刺激の増加を導くことを知ることができる。
【０２９７】
実施例５−ＳｉＮＰを使用した癌細胞株のトランスフェクション
中空ＳｉＮＰにｐＧＬ４．１３［ｌｕｃ２／ＳＶ４０］プラスミドＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手）を負荷した。ｐＧＬ４．１３［ｌｕｃ２／ＳＶ４０］ｐＤＮＡは、ルシフェラーゼをコードし、発光によってトランスフェクションの成功を検出するために使用することができる。
【０２９８】
トランスフェクションから４８時間後のトランスフェクションの有効性が３つの細胞株：ＣＴ２６、ＨＣＴ１１６及びＨＥＫ２９３で評価された。ＣＴ２６は、癌モデルとして使用されることの多いマウス結腸癌細胞株である。ＣＴ２６は、アグレッシブ、未分化、難治性ヒト結腸癌細胞と分子特徴を共有する。ＨＣＴ１１６は、治療的調査及び薬剤スクリーニングに使用されるヒト結腸癌細胞株である。ＨＥＫ２９３は、１次胚ヒト腎細胞から確立される永久細胞株である。ＨＥＫ２９３は、組み換えＤＮＡ又は遺伝子産物の産生及び細胞試料についてのウイルスの産生に使用される。
【０２９９】
３つの細胞株のトランスフェクションの結果を、図４７に示す。ｐＤＮＡを負荷されたＳｉＮＰによるトランスフェクションは、裸ｐＤＮＡ及びｐＤＮＡのないＳｉＮＰと比較された。ＳｉＮＰは、ルシフェラーゼ遺伝子を３つの異なる細胞種に上手くトランスフェクションすることを可能にすることが分かり、その２つは、癌治療のモデルであり、その１つは細胞治療ベクターの産生に一般的に使用される。
【０３００】
実施例６−ＳｉＮＰの表面の改質
約３３０ｎｍの直径を有するＲａｍ−ＳＮＰの合成
レゾルシノール（０．２ｇ）及びホルムアルデヒド（３７重量％、０．２８ｍＬ）が、アンモニア水性溶液（２８重量％、３．０ｍＬ）、脱イオン水（１０ｍＬ）及びエタノール（７０ｍＬ）から成る溶液に加えられた。混合物は、室温で６時間強く攪拌され、その後、０．６ｍＬのテトラエチルオルトケイ酸塩（ＴＥＯＳ）が溶液に加えられ、８分間攪拌され、その後、レゾルシノール（０．４ｇ）及びホルムアルデヒド（３７重量％、０．５６ｍＬ）が第２に加えられた。混合物は室温で２時間攪拌され、その後、１５０℃で２４時間の水熱処理のためにオートクレーブに移された。ＲＦシリカ粒子は、その後、遠心分離によって回収され、エタノールで洗浄され、５０℃で乾燥された。最後に、空気中、
５５０℃で５時間焼成された後に、Ｒａｍ−ＳＮＰは回収された（「Ｒａｍ」はランブータン様構造を指す）。
【０３０１】
スムースシリカナノ粒子（Ｓ−ＳＮＰ）、ラズベリーシリカナノ粒子（Ｒａｓ−ＳＮＰ）及び花様シリカナノ粒子（Ｆｌｗ−ＳＮＰ）の合成
Ｓ−ＳＮＰの合成のために、レゾルシノール（０．２ｇ）及びホルムアルデヒド（３７重量％、０．２８ｍＬ）が、アンモニア水性溶液（２８重量％、３．０ｍＬ）、脱イオン水（１０ｍＬ）及びエタノール（７０ｍＬ）から成る溶液に加えられた。混合物は、室温で６時間強く攪拌され、その後、１．４ｍＬのＴＥＯＳが溶液に加えられ、遠心分離を行う前に２時間攪拌されて、固体産物を回収した。Ｒａｓ−ＳＮＰの合成のために、レゾルシノール（０．２ｇ）及びホルムアルデヒド（３７重量％、０．２８ｍＬ）が、アンモニア水性溶液（２８重量％、３．０ｍＬ）、脱イオン水（１０ｍＬ）及びエタノール（７０ｍＬ）から成る溶液に加えられた。混合物は、室温で１８時間強く攪拌され、その後、０．６ｍＬのＴＥＯＳが溶液に加えられ、遠心分離を行う前に２時間攪拌されて、固体産物を回収した。Ｆｌｗ−ＳＮＰの合成のために、プロトコルは、我々の以前の刊行物に基づく。９ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水、０．３ｇのＴＥＡ及び１ｍＬのＣＴＡＣ溶液が６０℃で１時間混合され、次に、混合物に、９．５ｍＬのクロロベンゼン及び２５μＬのＡＰＴＥＳが加えられた。反応溶液は、６０℃で１時間攪拌されて保持された。その後、０．５ｍＬのＴＥＯＳが反応溶液に加えられ、２４時間攪拌された。固体試料は、２０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収され、その後、エタノールで洗浄された。全ての試料は、さらに５５０℃で５時間、空気中に焼成されて、テンプレート又は界面活性薬剤を取り除いた。
【０３０２】
特徴化
シリカナノ粒子の形態は、１００ｋＶで動作されるＪＥＯＬ１０１０顕微鏡を使用して走査型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって特徴付けられた。窒素収着分析は、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  Ｔｒｉｓｔａｒ３０２０を使用して実施された。測定する前に、全ての試料は、真空下で、８０℃で少なくとも１２時間脱ガスされた。孔径分布は、吸着枝から生じるＢａｒｒｅｔ−  Ｊｏｙｎｅｒ−Ｈａｌｅｎｄａ（ＢＪＨ）方法に従って計算された。シリカナノ粒子のゼータ電位は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳを使用してＰＢＳにおいて測定された。ＰＥ１結合ナノ粒子の窒素含有量は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｌａｓｈ  ＥＡ１１１２Ｓｅｒｉｅｓを使用して、ＣＨＮＳ−Ｏ  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒによって決定された。
【０３０３】
結果
Ｓ−ＳＮＰ、Ｒａｓ−ＳＮＰ及びＲａｍ−ＳＮＰは、合成パラメータを変化することによって、ＲＦシリカ合成システムを使用して得ることができ、ＴＥＭ画像（図４８ｂ−ｄ）は、それらの表面トポロジーを明白に示す。これらの３つの種類のＳＮＰの粒径は、ＴＥＭから計算されるように、３１０〜３５０ｎｍであった。窒素収着分析の結果は図４８ｅ−ｆに示され、Ｒａｍ−ＳＮＰは、１４２ｍ２／ｇの表面積、０．６４ｃｍ３／ｇの孔容積及び２０ｎｍ超の孔径を示した。裸シリカナノ粒子の表面電荷は図４８ｇに示されるように、負であった。これらのシリカナノ粒子のゼータ電位は、ＰＥＩ結合後に約−２０〜３０ｍＶから＋１０ｍＶまで変化した。
【０３０４】
表面機能性の方法の選択
トランスフェクションは、細胞膜のバリアを横切る粒子が正電荷される場合、より効果的である。これは、正電荷された粒子が細胞膜の負電荷された表面と共に有するという有利な相互関係に起因する。表面改質の方法は、したがって、裸のシリカの生来負電荷の表面に正電荷する異なる方法に焦点を置いた。この薬剤の正電荷された表面を作製する能力について良く知られているため、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の改質の種類を変えるこ
とが発見された。
【０３０５】
方法
シリカナノ粒子のＰＥＩ改質−エポキシ基によるＰＥＩの共有結合
この基において、ＰＥＩ分子がシリカの表面に付着されるエポキシ基と共有結合することによって、様々なサイズのＰＥＩ分子がシリカ粒子の表面に付着された。１００ｍｇのシリカナノ粒子は、３０ｍＬのトルエンに浸漬され、その後、攪拌及び窒素ガスブラケット保護下で、７０℃で１５分間還流された。その後、１．５ｍＬの（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（３−ＧＰＳ）は、溶液に加えられて、エポキシ基で集合されたシリカ表面を生成し、さらに２４時間還流された。固体産物は、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離によって回収され、最初にトルエン、その後メタノールで２回洗浄された。エポキシ基を有する粒子は、その後、空気中、室温で乾燥された。５０ｍｇのエポキシ基修飾シリカナノ粒子は、２５０ｍｇのＰＥＩ分子（異なる分子量：１．８ｋ、１０ｋ及び２５ｋ）と、１００ｍＬの５０ｍＭ（ｐＨ９．５）の炭酸塩バッファ溶液に混合された。混合物は、２４時間攪拌され、その後、固体産物は、遠心分離及び水による洗浄によって回収された。固体産物は、その後、２０ｍＬの１ｇ／Ｌ（ｐＨ９）のエタノールアミン溶液に再懸濁され、室温で６時間攪拌された。最終的なＰＥＩ改質粒子は、遠心分離によって回収され、水／エタノールによる洗浄によって精製され、室温で乾燥された。
【０３０６】
シリカナノ粒子のＰＥＩ改質−ホスホン酸塩基による強い静電引力
ＰＥＩとの強い静電引力を使用して、シリカにＰＥＩを付着させる代替の方法が発見された。これは、ＰＥＩ分子に静電気的に結合するシリカ表面に結合されホスホン酸塩基を使用した。ホスホン酸塩表面基に付着するために、３０ｍｇのシリカナノ粒子が１０ｍＬの水に分散され、水酸化アンモニウムを使用して、ｐＨが１０に調節された。その後、１０ｍＬの粒子溶液が、４０℃で２時間攪拌することによって、表面ホスホン酸塩修飾について、１０ｍＬの５６ｍＭの３−（トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩（ＴＨＰＭＰ）溶液と混合された。固体産物は、遠心分離によって回収され、水で全体的に洗浄された。固体産物は、その後、１５０ｍｇのＰＥＩ分子を含有する１５ｍＬの水又はエタノールに再懸濁された。室温で４時間攪拌された後、ＰＥＩ改質ナノ粒子は、遠心分離、水による洗浄及び室温での乾燥によって得られた。
【０３０７】
結果
裸のシリカナノ粒子は、予想される負電荷表面電荷を有し、負電荷されたｐｃＤＮＡの吸着について同一ではない。シリカナノ粒子とｐｃＤＮＡとの強い結合を達成するために、ＰＥＩがシリカナノ粒子の表面に結合されて、正の表面電荷を生じた。しかしながら、共有結合及び強い静電引力を含むＰＥＩをシリカナノ粒子上で結合する様々な方法がある。シリカナノ粒子は、これらの２つのＰＥＩ結合モードに従って、比較のために修飾された。図４９に示されるように、シリカナノ粒子は、最初に３−ＧＰＳによって修飾され、エポキシ基を粒子の表面に結合し、さらに、ＰＥＩ分子のアミノ基との共有結合をさらに形成することができる。あるいは、シリカナノ粒子の表面は、ＴＨＰＭＰで改質され、多くのホスホン酸塩基をシリカ表面に付着し、さらに、シリカナノ粒子の負の表面電荷を増加し、正電荷されたＰＥＩ分子との強い静電引力を可能にする。
【０３０８】
改質の間に付着されたＰＥＩの量は、結合の後に粒子の元素分析によって分析された。裸のシリカナノ粒子又は３−ＧＰＳ／ＴＨＰＭＰ修飾粒子に窒素原子が含まれないため、窒素含有量だけが、粒子に付着されるＰＥＩから与えられる。表２２に示されるように、試験対象の４種類の粒子についての窒素含有量は、Ｒａｍ−ＳＮＰ＞Ｒａｓ−ＳＮＰ＞Ｓ−ＳＮＰの傾向を示し、表面積の差に起因し得る。２種類のＰＥＩ結合を比較すると、ホスホン酸塩修飾後のナノ粒子が表面のＰＥＩにより結合する。これらの２種類のＰＥＩ結合の他に、シリカナノ粒子の表面のＰＥＩの物理的吸着も試験することができ、粒子にお
いて３．１％の窒素含有量を示した。しかしながら、物理的に吸着されたＰＥＩは、３−ＧＰＳ及びＴＨＰＭＰによって付着されるＰＥＩほど強く結合しないことが予想される。
【０３０９】
【表２２】
2021509393.tif 000025
【０３１０】
ＰＥＩ結合モードとは別に、ＰＥＩの分子量もｐｃＤＮＡ結合及びトランスフェクション効率に影響する。ここで、１．８ｋ、１０ｋ及び２５ｋの分子量を有するＰＥＩは、さらなる比較するために、シリカナノ粒子に共有結合された。
【０３１１】
ｐｃＤＮＡ負荷及びゲル電気泳動
方法
ｐｃＤＮＡ負荷
１μｇのｐｃＤＮＡは、１０μＬのＰＢＳ溶液において、５μｇのＰＥＩと共有結合的に修飾されたシリカナノ粒子と４℃で４時間、混合された。その後、混合物は、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけられ、上清は、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって、ｐｃＤＮＡ残存量の定量化のために使用された。
【０３１２】
ゲル電気泳動
０．５μｇのｐｃＤＮＡは、０〜５、１０、２０、４０及び６０μｇの範囲のシリカ用量でシリカナノ粒子と混合された。混合物は、４℃で４時間インキュベートされ、その後、２ｍＬの核酸試料バッファが混合物に加えられ、１０μＬの合計溶液量を形成した。アガロースゲルを調製するために、２．５ｇの高純度のアガロースが２５０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に加えられ、その後、マイクロ波照射の下、ボイルされて、アガロースを完全に溶解した。アガロース溶液が冷却した後、２５μＬのＳＹＢＲ−Ｓａｆｅゲル染色（１０，０００倍）が溶液に加えられた。溶液は、最終的に、ゲル容器に注がれ、２０分間冷却されて、ゲルを形成した。ゲルを有するゲル容器は、タンクに移され、ＴＥＡバッファを充填して、ゲルを浸漬した。その後、１０μＬのｐｃＤＮＡ溶液は、ゲルの孔に１つずつ注入され、電気泳動のために電圧は８０Ｖで５０分間設定された。電気泳動の後のゲルは、１つずつ記録された。
【０３１３】
結果
６．１ｋＤの分子量のｐｃＤＮＡを発現するＧＦＰがこの研究で使用された。シリカナノ粒子のｐｃＤＮＡの負荷能力は、ＰＥＩと共有結合され、観察された。図５０に示されるように、異なる分子量のＰＥＩで修飾されたＲａｍ−ＳＮＰは、約１００μｇ／μｇの最も高いＤＮＡ負荷能力を示した。しかしながら、Ｓ−ＳＮＰ及びＲａｓ−ＳＮＰは、５０μｇ／μｇ未満の負荷を達成することができるのみである。これは、表面積及びｐｃＤＮＡを収容する孔容積の差から生じ得る。Ｒａｍ−ＳＮＰのランブータン様構造は、表面
スパイクのロープ様ｐｃＤＮＡのもつれを支持し得、溶液においてｐｃＤＮＡと容易でしっかりとした結合を可能にする。
【０３１４】
ＰＥＩ修飾シリカナノ粒子とｐｃＤＮＡとの間の結合親和性の差をさらに実証するために、ゲル電気泳動が比較のために使用された。全ての群において、ｐｃＤＮＡに対するシリカナノ粒子の比を増加することは（ｐｃＤＮＡ負荷を減少する）、放出されるｐｃＤＮＡの量を減少した。このことは、低い負荷レベルのｐｃＤＮＡが、粒子の表面に密接に結合され、したがって強く結合されるという直観的な観点から分かる。負荷されるｐｃＤＮＡの外層は、根底にあるｐｃＤＮＡ層に徐々に結合され、ｐｃＤＮＡに強く接着するように設計される改質されたシリカ表面には結合しないため、より多くのｐｃＤＮＡが粒子に負荷されるほど、負荷されるｐｃＤＮＡの追加の層がそれほど強く結合しないことが予想される。この発見は、ｐｃＤＮＡがシリカナノ粒子にきつく結合されすぎて、シリカ粒子に結合できず、粒子は細胞に入ると、放出することができない場合、有効なトランスフェクションが妨げられる可能性があるという意味を有し得る。トランスフェクション効率は、したがって、シリカ粒子に負荷するｐｃＤＮＡを増加することによって、促進することができる。
【０３１５】
シリカナノ粒子の表面に結合されるＰＥＩの分子量が多いほど、測定される多くの粒子についてより強い結合親和性を達成することができる。４つの種類のシリカ粒子を比較して、製剤からのｐｃＤＮＡバンドの放出は、全ての負荷レベルで、いつも識別することができる。Ｒａｓ−ＳＮＰは、Ｓ−ＳＮＰに対する僅かに改善された結合親和性のみを示し、ｐｃＤＮＡとＳ−ＳＮＰ表面との間の弱い結合を示した。１０ｋのＰＥＩで修飾されたＲａｍ−ＳＮＰは、１／１０のｐｃＤＮＡ／ＳｉＣｆｉ重量比で、ｐｃＤＮＡの放出がない状態で最も強い結合を示した。
【０３１６】
ＨＥＫ−２９３細胞のトランスフェクション効率について粒子ライブラリのスクリーニング
良く知られているＨＥＫ−２９３細胞株を使用して、前述のシリカ／ｐｃＤＮＡ変異体及びリポフェクタミン２０００市販薬とのｉｎ  ｖｉｔｒｏのトランスフェクション効率を比較した。
【０３１７】
方法
共有結合によってＰＥＩに結合されるシリカナノ粒子が、この試験の組に使用された。一般的なトランスフェクション工程について、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞が、１ウェルにつき２ｘ１０５細胞の密度で、６ウェルプレートに２４時間インキュベートされ、７０〜９０％のコンフルエンシーを達成した。８０μｇのＰＥＩ修飾ＵＱシリカ粒子は、５０μＬのＰＢＳにおいて、４℃で４時間、２．５μｇのｅＧＦＰ−ｐｃＤＮＡ（３１μｇのｐｃＤＮＡ／ｍｇのシリカの負荷）と混合された。これは、比較的低いｐｃＤＮＡ負荷レベル（前述のＲａｍ−ＳＮＰ粒子について測定された１００μｇ／μｇのレベルよりかなり低い）であるが、同負荷が異なる粒子の種類に使用されて、そのいくつかが、図５０に示されるように、より高い負荷になることができないように選択されたことに留意されたい。混合物は、その後、１０％のＦＢＳ及び１％のＰＳを含有する２ｍＬのＤＭＥＭ培地に移された。プレートの培地は、その後、粒子を含む培地に置き換えられ、その後、さらに４８時間培養された。続いて、細胞は、ＰＢＳで洗浄され、その後、５００μＬの４％のＰＦＡで固定された。細胞は、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  Ｚｅｉｓｓ７１０）を使用して見られ、又はフローサイトメトリー分析（ａｃｃｕｒｉ  Ｍ６）を使用して見られた。
【０３１８】
結果
前述に示されるように、ＰＥＩに共有結合されるシリカナノ粒子は、高いｐｃＤＮＡ負荷能力及び強い結合親和性を示した。ここでは、トランスフェクション効率は、さらにＨ
ＥＫ−２９３Ｔ細胞株に観察される。共焦点顕微鏡の画像は、異なる種類のシリカナノ粒子を使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のＧＦＰ発現を明白に示した。１．８ｋのＰＥＩで修飾されたシリカナノ粒子と比較して、より大きい分子量のＰＥＩで修飾されたベクターは、より明るい緑色の蛍光で改善されたｐｃＤＮＡの送達効率を示した。しかしながら、２５ｋのＰＥＩが重度の細胞毒性を示すことが明確に記載されている。したがって、１Ｏ０ｋのＰＥＩを使用した修飾が最適であると考えられる。３種類のシリカナノ粒子を比較して、Ｒａｍ−ＳＮＰは、明白な強い緑色の蛍光で、非常に増強されたｐｃＤＮＡ送達効率を示した。この結果は、Ｒａｍ−ＳＮＰのユニークな構造が、Ｒａｍ−ＳＮＰのユニークな先端の尖った表面を有しない同様のシリカ粒子と比較して優れたトランスフェクション効率を提供することを明白に実証する。この比較の重要性は、前者について観察されたより強いｐｃＤＮＡ結合親和性によって、その他のＳＮＰに対して有利ではなく、細胞の細胞質におけるｐｃＤＮＡの不完全な放出を導く可能性があるという事実によって強調される。
【０３１９】
ｐｃＤＮＡトランスフェクション効率は、さらに、フローサイトメトリーを使用して定量的に分析された。表２３に要約するように、裸のｐｃＤＮＡのトランスフェクション効率は０．８％で無視することができ、１０ｋのＰＥＩで修飾されたＲａｍ−ＳＮＰは、２７％超の最も高いトランスフェクション効率を示し、これは、同じ先端の尖ったシリカ表面を有しないその他のシリカ粒子よりも高く、Ｓ−ＳＮＰについては４．４％、Ｒａｓ−ＳＮＰについては９．６％の効率性を示した。１．８ｋ、１０ｋ及び２５ｋの分子量のＰＥＩを使用してＰＥＩ修飾された表面を有するＲａｍ−ＳＮＰのトランスフェクション効率の比較は、１０ｋのＰＥＩ変異体が最も高いトランスフェクション効率を有し、１．８ｋの変異体については１９．７％、２５ｋの変異体については２２．８％、効率性が減少することを示す。
【０３２０】
市販品のリポフェクタミン２０００は、最適化されていないＲａｍ−ＳＮＰよりも９８．８％の非常に高いトランスフェクション効率を予想した通り示した。リポフェクタミン製剤は、製造者によって推奨される最適なｐｃＤＮＡ負荷を使用した。
【０３２１】
【表２３】
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【０３２２】
共有結合されるＰＥＩ表面の改質に依存する前述のＲａｍ−ＳＮＰのトランスフェクション効率をさらに改善するために、Ｒａｍ−ＳＮＰについて別のモードのＰＥＩ結合が調査された。ここでは、Ｒａｍ−ＳＮＰは、シリカ表面に結合してＰＥＩとリンカーとして作用するホスホン酸塩基を使用して、１０ｋのＰＥＩで修飾され、ＰＥＩと強い静電引力を可能にする。物理的に吸着されるＰＥＩを有するＲａｍ−ＳＮＰも観察された。これらのナノ粒子は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクションについて、同用量のｐｃＤＮＡ（３１μｇ／μｇ）を負荷された。蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率を分析した。図５１に示されるように、リポフェクタミン２０００は、８０％超の細胞がトランスフェクションに成功した強い緑色の蛍光を示した。エポキシ−ＰＥＩと物理的ＰＥＩ吸着の両方のトランスフェクション効率は、かなり限定され、４０％未満の細胞がトランスフェクトされた。ホスホン酸塩−ＰＥＩ修飾は、蛍光顕微鏡で実証されるように、非常に改善されたトランスフェクション効率を示し、５１％超の細胞がトランスフェクションに成功したことを示した。したがって、ホスホン酸塩−ＰＥＩ修飾は、最適なＰＥＩ修飾モードとされる。
【０３２３】
ホスホン酸塩−ｌ０ｋＰＥＩで修飾されたＲａｍ−ＳＮＰの用量（シリカ用量）依存性トランスフェクションの振る舞いも研究された。シリカ用量を４０μｇ（シリカ）／ｍＬから６０μｇ／ｍＬ及び８０μｇ／ｍＬに増加することによって、トランスフェクション効率が５３％から６０μｇ／ｍＬでは７７％、８０μｇ／ｍＬでは８９％増加した。これらの実験で使用されるｐｃＤＮＡの質量は、８０μｇ／ｍＬの製剤は、粒子の数の２倍を有し、４０μｇ／ｍＬの製剤については、（μｇ／ｍｇで）ｐｃＤＮＡ負荷の半分を有するように一定であり続けた。８０μｇ／ｍＬの用量では、Ｒａｍ−ＳＮＰのトランスフェクション効率は、市販品のリポフェクタミン２０００と同様である（９０％）。しかしながら、留意することとして、８０μｇ／ｍＬの用量のＲａｍ−ＳＮＰの細胞毒性は、かなり高く、実際の製剤に使用できるシリカ粒子の最大用量のいくらかの指標を与える。市販の製剤を開発するうえで、トランスフェクション効率と細胞毒性との間で妥協が達成されなければならない。Ｒａｍ−ＳＮＰ粒子のｐｃＤＮＡの負荷を増加することは、このトレ
ードオフを回避する魅力的な手段を提供することができるが、より高いｐｃＤＮＡの負荷を使用することは、本質的により少ないシリカを使用する必要があることを意味するため、より少ない細胞毒性になると思われる。
【０３２４】
トランスフェクションの実験の間、ｐｃＤＮＡは最初にＰＥＩ修飾されたＲａｍ−ＳＮＰに負荷され、通常、ｐｃＤＮＡの負荷に４時間かかる。負荷工程を調査して、９０％超のｐｃＤＮＡが最初の５分以内にＰＥＩ修飾されたＲａｍ−ＳＮＰに負荷されることが分かった。この結果は、ｐｃＤＮＡとＲａｍ−ＳＮＰとの間の強い結合親和性の以前の観察と一致する。ｐｃＤＮＡ及びＰＥＩ修飾されたＲａｍ−ＳＮＰを４時間５分混合した後に、フローサイトメトリーによってそれらのトランスフェクション効率も研究された。５分間だけｐｃＤＮＡ及び粒子を混合することによって、４時間の負荷工程後に測定された５３．４％の効率よりも低い４３．６％のトランスフェクション効率になる。
【０３２５】
核酸の保護
目的：Ｒａｍ−ＳＮＰのｐｃＤＮＡを酵素分解から保護する能力を測定し、市販のリポフェクタミン２０００製品と性能を比較する。
【０３２６】
方法
０．５μｇのｐｃＤＮＡを１５μｇのＰＥＩ修飾Ｒａｍ−ＳＮＰ（ホスホン酸塩基）と混合し、その後、４℃で２時間インキュベートして、強いｐｃＤＮＡ及び粒子の結合を達成した。同量のｐｃＤＮＡは、１μＬのリポフェクタミン２０００で、室温で５分間インキュベートされた。粒子又はリポフェクタミン中のｐｃＤＮＡのＤＮａｓｅ  Ｉの消化について、１μＬの２Ｕ／μＬのＤＮａｓｅ  Ｉが混合物に加えられ、３７℃で３０分間インキュベートされた。分解を中断するために、１μＬの５００ｍＭのＥＤＴＡが混合物に加えられ、６５℃で１０分間インキュベートされた。ＤＮａｓｅ  Ｉの処理の後のｐｃＤＮＡの残余をさらに識別するために、１μＬの４０ｍｇ／ｍＬのヘパリンＰＢＳ溶液が混合物に加えられ、３７℃で１時間インキュベートされた。ｐｃＤＮＡ−トランスフェクション剤の複合体は、ゲル電気泳動によって分析された。ｐｃＤＮＡの残余を識別するために、ＤＮａｓｅ  Ｉの処理の後のｐｃＤＮＡ−トランスフェクション剤の製剤は、トランスフェクション効率の測定のために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に移された。
【０３２７】
結果
ＤＮａｓｅ  Ｉに対するＲａｍ−ＳＮＰのｐｃＤＮＡ保護能力を実証するために、ｅＧＦＰ−ｐｃＤＮＡがＰＥＩ修飾Ｒａｍ−ＳＮＰに負荷され、その後、ＤＮａｓｅ  Ｉ溶液で３０分間インキュベートされた。電気泳動の結果は、裸のｐｃＤＮＡがＤＮａｓｅ  Ｉの処理の後に容易に分解されることを示した。Ｒａｍ−ＳＮＰに負荷されるｐｃＤＮＡは、任意の遊離ｐｃＤＮＡが放出されない状態で、粒子に強く結合される。ＤＮａｓｅ  Ｉの処理の後、ｐｃＤＮＡ分解バンドは識別することができない。ｐｃＤＮＡの置換のためにヘパリン処理をした後、ゲルにｐｃＤＮＡバンドの放出は識別することができなかったが、ウェルに明らかなバンドシグナルが現れ、これは、ｐｃＤＮＡとＲａｍ−ＳＮＰとの強い結合親和性から生じ得る。ｐｃＤＮＡ断片の不在によって、これらのデータは、Ｒａｍ−ＳＮＰ粒子は、ヌクレアーゼ分解からｐｃＤＮＡを良好に保護することを示唆するが、Ｒａｍ−ＳＮＰとｐｃＤＮＡとの強い結合は、無傷のｐｃＤＮＡの直接的な視覚化を妨げる。
【０３２８】
市販のトランスフェクション製品のリポフェクタミン２０００について、ｐｃＤＮＡは、製剤から容易に放出されることを発見し、ｐｃＤＮＡとリポフェクタミンとの弱い結合親和性を示した。ＤＮａｓｅ  Ｉの処理の後、弱く結合されたｐｃＤＮＡは、酵素によって容易に分解され、この弱く結合されたｐｃＤＮＡの生存は見られなかった。ヘパリンの置換の後、少量の保護されたｐｃＤＮＡは、リポフェクタミンから放出されることが示さ
れた。
【０３２９】
ＤＮａｓｅ  Ｉの処理の後、活性なｐｃＤＮＡがＲａｍ−ＳＮＰに依然として存在することをさらに実証するために、ＤＮａｓｅ  Ｉの処理の前及び後のｐｃＤＮＡ／Ｒａｍ−ＳＮＰ粒子及びｐｃＤＮＡ−リポフェクタミン製剤は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏのトランスフェクションの比較に使用された。蛍光顕微鏡の画像は、ｐｃＤＮＡの厳しい分解によって、リポフェクタミン２０００のトランスフェクション効率が、ＤＮａｓｅ  Ｉの処理の後に劇的に減少したことを示した。しかしながら、Ｒａｍ−ＳＮＰのトランスフェクション効率は、相対的にＤＮａｓｅ  Ｉの処理の前及び後で変化しないままであり、Ｒａｍ−ＳＮＰの酵素分解に対してｐｃＤＮＡを保護することの成功をさらに実証する。この結果は、Ｒａｍ−ＳＮＰが、分解性酵素の存在下で、リポフェクタミンによってなされる性能の著しい減少によって、リポフェクタミンを上回るトランスフェクション効率の利点を提供すると思われる。
【０３３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのトランスフェクション効率
目的：異なる粒径を有するＲａｍ−ＳＮＰのトランスフェクション効率を、市販のリポフェクタミン及びｉｎ  ｖｉｖｏのＪＥＴ産物のトランスフェクション効率と比較し、細胞摂取の機構を解明することである。
【０３３１】
異なる粒径を有するＲａｍ−ＳＮＰ、遊離ｐｃＤＮＡ、リポフェクタミン及びｉｎ  ｖｉｖｏのＪＥＴのトランスフェクション効率
方法−異なる粒径を有するＲａｍ−ＳＮＰの合成
通常のＲＦ−シリカ合成において、最初のレゾルシノール及びホルムアルデヒドの量を０．２ｇ／０．２８ｍＬから０．１ｇ／０．１４ｍＬ又は０．３ｇ／０．４  ２ｍＬまで変化することによって、ポリマーのコアサイズはそれに従い変化し、最終的に、より小さい又はより大きいＲａｍ−ＳＮＰ粒径になる。留意することとして、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量を減少することによって、８時間のより長い重合時間がＴＥＯＳの添加の前に必要とされる。レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量を増加することによって、ＴＥＯＳの添加の前の時間は５時間に短縮することができる。ＲＦコアの重合の後に、ＴＥＯＳ及び第２のＲＦが添加され、通常の合成工程が行われる。最終的にシリカナノ粒子は回収され、ホスホン酸塩基で修飾され、さらなるトランスフェクションの研究のために１０ｋのＰＥＩと結合された。
【０３３２】
結果
前述の研究で使用されたＲａｍ−ＳＮＰは、約３３０ｎｍの粒径を有したが、粒径は、ｐｃＤＮＡのトランスフェクション効率にも影響し得る。ここでは、ＲＦ−シリカ合成においてポリマーコアサイズを変化することによって、より小さい直径（約１８０ｎｍ）及びより大きい直径（約５００ｎｍ）を有するＲａｍ−ＳＮＰが作製された。これらの３つのＲａｍ−ＳＮＰ変異体のＴＥＭ画像は、全て、先端の尖った表面トポロジーを示す。
【０３３３】
異なる粒径を有するＰＥＩ修飾されたＲａｍ−ＳＮＰは、４０μｇ／ｍＬのシリカ用量でＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のｅＧＦＰ  −ｐｃＤＮＡトランスフェクションのために使用された。比較において、市販されるトランスフェクション剤、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のリポフェクタミン２０００及びＰｏｌｙｐｌｕｓ社のＩｎ−ｖｉｖｏ  ＪＥＴが製造者の推奨するプロトコルに従って使用され、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーを使用して、トランスフェクション効率を分析した。リポフェクタミン及び特にＩｎ−ｖｉｖｏ  ＪＥＴは、９０％超の細胞がトランスフェクションに成功した強い緑色の蛍光を示した。Ｒａｍ−ＳＮＰは、４０μｇ／ｍＬの低用量のシリカについて予想されるように、より低い蛍光強度を示した。最も重要なこととして、Ｒａｍ−ＳＮＰによって提供されるトランスフェクション効率の４３％から６３％の増加において、粒径が５００ｎｍから１８０ｎｍに
減少される明白な傾向が示される。
【０３３４】
細胞摂取及び特定のエンドサイトーシス経路の阻害剤を使用した細胞内輸送の発見
方法
１８０ｎｍの粒径を有するＲａｍ−ＳＮＰがここで使用された。ＰＥＩ修飾の後、２ｍｇ／ｍＬのＲＩＴＣエタノール溶液にＰＥＩ修飾粒子を４時間攪拌することによって、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）がさらに粒子に結合された。ＲＩＴＣ標識された粒子は、上清に赤色が識別されなくなるまで、エタノールによって完全に洗浄された。ＲＩＴＣ標識された粒子は、その後、さらなる摂取分析のために、ｐｃＤＮＡを負荷された。粒子を加える前に、様々な内部移行−阻害条件が、培地において、３７℃の１時間のインキュベーションによって達成された。１００μＬの１μｇ／ｍＬのショ糖が２ｍＬの培地（５％ｗ／ｖ）に加えられて、クラスリン媒介エンドサイトーシスを阻害した。Ｄｙｎａｓｏｒｅが培地に加えられ、８０μＭの最終濃度を達成し、ダイナミン依存性エンドサイトーシスを阻害した。細胞の低温処理（４℃）が、一般的なエンドサイトーシス経路分析のために使用された。ｐｃＤＮＡ−ナノ粒子製剤は、その後、８０〜９０％のコンフルエンシーでＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に加えられ、必要な場合、４℃又は３７℃で４時間インキュベートされた。細胞は、４時間のインキュベーションの後に回収され、フローサイトメトリーによって分析された。実験の各群は、３回実施された。
【０３３５】
結果
Ｒａｍ−ＳＮＰの特定のエンドサイトーシスをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に識別するために、異なる種類の阻害剤が、粒子を添加する前に、細胞処理のために使用された。Ｒａｍ−ＳＮＰは、赤色蛍光を示すＲＩＴＣで染色され、フローサイトメトリーを使用して、阻害剤の処理のある場合とない場合で、粒子の摂取を分析した。ショ糖を阻害剤として加えた後に著しい摂取阻害はなく、これはエンドサイトーシス経路がクラスリン媒介されないことを示す。しかしながら、低温処置及びＤｙｎａｓｏｒｅの添加によるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、粒子の摂取の著しい減少を示し、Ｒａｍ−ＳＮＰが通常のダイナミン依存性エンドサイトーシス経路によって取り入れられることを示す。
【０３３６】
ｐｃＤＮＡ及びＲａｍ−ＳＮＰ結合親和性
方法
１５μｇのＰＥＩ修飾されたＲａｍ−ＳＮＰ（１８０ｎｍ）は、０．５μｇのｐｃＤＮＡで２時間インキュベートされ、その後、混合物は、０．５〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲の最終濃度で、３７℃で２時間、ヘパリンでさらにインキュベートされた。その後、混合物は、さらに、ゲル電気泳動によって分析されて、ｐｃＤＮＡ及びＲａｍ−ＳＮＰ粒子の結合親和性を識別した。
【０３３７】
結果
ｐｃＤＮＡ及びＲａｍ−ＳＮＰの結合親和性をさらに識別するために、ヘパリン競合アッセイが用量依存的に研究された。ｐｃＤＮＡは、高濃度のヘパリンで、ｐｃＤＮＡ−Ｒａｍ−ＳＮＰ粒子から置き換えることができることが観察された。留意することとして、０．５ｍｇ／ｍＬのヘパリン濃度では、放出されるｐｃＤＮＡ結合強度は、より高いヘパリン濃度で処理されたものよりもかなり低い。これは、ｐｃＤＮＡとＲａｍ−ＳＮＰ粒子との間に、強い結合親和性が存在することを示す。
【図１】
2021509393.tif 000027
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４８−３】
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【図４８−４】
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【図４８−５】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図５０】
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【図５１】
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【国際調査報告】
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