(57)【要約】  ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２に結合する二重特異性抗体である。本発明は、ヒトＡＬＫ−１およびヒトＢＭＰＲ−２に結合する二重特異性抗体に関する。また、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達のアゴニストであるＢｓＡＢ、および骨形成シグナル伝達を誘発しないＢｓＡＢも提供する。更に、本発明は、特に肺高血圧の治療のための、ＢｓＡＢの医薬的使用に関する。また、例えば肺高血圧の治療における使用のためのＢｓＡＢをスクリーニングするための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの結合ドメインを含む二重特異性抗体（ＢｓＡＢ）であって、ここで、第１結合ドメインがＡＬＫ−１に特異的であり、そして、第２結合ドメインがＢＭＰＲ−２に特異的である、二重特異性抗体（ＢｓＡＢ）。
【請求項２】
ＡＬＫ−１がヒトＡＬＫ−１またはその断片であり、そして、ＢＭＰＲ−２がヒトＢＭＰＲ−２またはその断片である、請求項１記載のＢｓＡＢ。
【請求項３】
前記ＢｓＡＢが標的細胞におけるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有する、請求項１または２記載のＢｓＡＢ。
【請求項４】
前記標的細胞が内皮細胞である、請求項３記載のＢｓＡＢ。
【請求項５】
前記ＢｓＡＢがＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進する、請求項１〜４のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項６】
前記ＢｓＡＢが、ＢｓＡＢのＥＣ５０が、ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を検出するための適切なアッセイにおいて決定されうるように、ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進する、請求項１〜５のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項７】
前記ＢｓＡＢの有効量がＳＭＡＤ１および／またはＳＭＡＤ５のリン酸化を促進する、請求項１〜６のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項８】
前記ＢｓＡＢの有効量が内皮細胞において抗アポトーシス効果を有する、請求項１〜７のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項９】
前記ＢｓＡＢの有効量が、内皮細胞の飢餓時に観察される内皮細胞のアポトーシスを低減する、請求項１〜８のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項１０】
前記ＢｓＡＢの有効量が、ＴＮＦαおよび／またはシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の有効量で処理された内皮細胞のアポトーシスを低減する、請求項１〜９のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項１１】
前記ＢｓＡＢが、ウシ血清アルブミンに対するＢｓＡＢの結合アフィニティと同等以下のアフィニティでＡＬＫ−２または配列番号１１７の抗原に結合する、請求項１〜１０のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項１２】
前記ＢｓＡＢのＥＣ５０が、ｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０より低い骨形成活性を有する、請求項１〜１１のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項１３】
ｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０で処理されたＣ２Ｃ１２細胞が、同じ濃度のＢｓＡＢで処理されたＣ２Ｃ１２細胞より高いアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を有する、請求項１〜１２のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項１４】
前記ＢｓＡＢがＣ２Ｃ１２細胞において骨形成活性を有さない、請求項１〜１３のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項１５】
医薬としての使用のための、請求項１〜１４のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項１６】
肺高血圧の治療における使用のための、請求項１〜１５のいずれか１項記載のＢｓＡＢ。
【請求項１７】
治療における使用のためのＢｓＡＢの適合性を試験するための方法であって、該方法は、
（ｉ）ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進するＢｓＡＢの能力を分析し、そして
（ｉｉ）所望により、ＡＬＫ−２およびＢＳＡに対するＢｓＡＢの結合アフィニティを比較し、そして
（ｉｉｉ）適合するものとしてＢｓＡＢを選択する、ことを含み、
ここで、ＢｓＡＢは、工程（ｉ）に従い決定されるＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を少なくとも促進し、そして、所望により、工程（ｉｉ）に従い決定される、ＢＳＡに対するＢｓＡＢｓのアフィニティと同等以下のアフィニティでＡＬＫ−２に結合する、方法。
【請求項１８】
治療における使用のためのＢｓＡＢの適合性を試験するための方法であって、該方法は、
（ｉ）ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進するＢｓＡＢの能力を分析し、そして
（ｉｉ）所望により、ＡＬＫ−２およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進するＢｓＡＢの能力を分析し、そして
（ｉｉｉ）適合するものとしてＢｓＡＢを選択する、ことを含み、
ここで、ＢｓＡＢは、工程（ｉ）に従い決定されるＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を少なくとも促進し、そして、所望により、工程（ｉｉ）に従い決定されるＡＬＫ−２およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進しない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＡＬＫ−１およびヒトＢＭＰＲ−２に結合する二重特異性抗体に関する。また、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達のアゴニストであるＢｓＡＢ、および骨形成シグナル伝達を誘発しないＢｓＡＢも提供する。更に、本発明は、特に肺高血圧の治療のための、ＢｓＡＢの医薬的使用に関する。また、例えば肺高血圧の治療における使用のためのＢｓＡＢをスクリーニングするための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
血管疾患は内皮細胞の機能不全によって引き起こされる。種々の要因により、内皮細胞はサイトカインおよびケモカインの分泌を開始し、その表面上に接着分子を発現する。それにより、白血球（単球、顆粒球およびリンパ球）が動員され、これは血管壁に浸潤しうる。
【０００３】
平滑筋細胞層のサイトカイン刺激および白血球の動員は平滑筋細胞を増殖させ、血管の管腔へと移動させて、血管壁の肥厚およびプラーク形成を生じさせる。
【０００４】
プラークは血流を阻害し、標的器官における酸素および栄養素の量を減少させる。最終的に、プラークは、破裂すると、血餅形成および脳卒中をも引き起こしうる。
【０００５】
肺高血圧（ＰＨ）およびその下位範疇である肺動脈高血圧（ＰＡＨ）は、肺の血管に悪影響を及ぼす生命を脅かす疾患である。
【０００６】
ＰＨは多様な病因および病態形成の血行力学的異常であり、その診断および治療の両方が医師にとって難題である。ＰＨは、右心カテーテル法で測定された２５ｍｍＨｇ以上の安静時平均肺動脈圧によって臨床的に定義される。予後は不良であり、特別な治療を行わなければ、１年、３年および５年生存率は、それぞれ、６８、４８および３４％である。
【０００７】
ＰＨは、不可逆的なリモデリングに関連した、前毛細血管肺動脈の狭窄によって特徴づけられる。生じる肺動脈圧上昇は右心室肥大を引き起こし、最終的には右心不全による死を招く。
【０００８】
肺動脈内皮細胞および平滑筋細胞（ＳＭＣ）の過剰増殖は肺動脈高血圧（ＰＡＨ）における肺動脈内皮細胞機能不全の結果の１つである。前毛細血管肺動脈の狭窄の結果として、前毛細血管肺高血圧が生じ、肺血管抵抗の上昇（すなわち、２５ｍｍＨｇ以上の平均肺動脈圧）が生じる。また、ＰＡＨは、１５ｍｍＨｇ以下の正常肺動脈楔入圧および２４０ｄｙｎ×ｓ×ｃｍ−５を超える肺血管抵抗によって定義される。最初は、ＰＡＨは主に若い女性を冒す疾患であると考えられていた。しかし、ドイツにおいてＰＡＨと診断された患者の平均年齢は着実に増加しており、現在、平均年齢は６５歳である（Ｈｏｅｐｅｒ，ＭＭら，Ｄｔｓｃｈ  Ａｒｚｔｅｂｌ  Ｉｎｔ（２０１７）１１４：７３−８４）。ＰＡＨにおいては、肺動脈のリモデリングは血管抵抗の増加および肺血圧の増加につながる。肺動脈圧の増加は右心室肥大を引き起こし、最終的には右心不全による死亡を招く。
【０００９】
ＰＡＨの症状には、息切れ、失神、疲労、胸痛、脚の腫張および頻脈が含まれる。
【００１０】
治療はタイプに左右され、すなわち、ＰＨが動脈性、静脈性、低酸素性、血栓塞栓性またはその他のいずれであるかに左右される。ほとんどの治療は、利尿薬、ジゴキシン、血液希釈剤の適用による、または僧帽弁もしくは大動脈弁の修復／置換による左心室機能の最適化を目的としている。種々の治療アプローチは肺動脈の弛緩（Ｃａアンタゴニスト、ＥＴアンタゴニスト、ＰＤＥ  Ｖインヒビター、ｓＧＣ刺激物質など）による血圧の低下に基づいている。したがって、ほとんどの利用可能な治療法は対症療法であり、全体的な予後は依然として不良である。
【００１１】
結果として、抗リモデリング薬の提供が長年要望されている。更に、血行力学的に中性の抗リモデリング薬が、血圧降下に基づく治療アプローチと組合せて適用可能でありうる。
【００１２】
遺伝学的研究に基づいて、内皮細胞における骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体タイプＩＩ（ＢＭＰＲ−２）シグナル伝達の障害がＰＡＨの病理生物学において重要な役割を果たすことが示唆されている。ＢＭＰ経路における他のＰＡＨ変異も同様に記載されている。ＢＭＰＲ−２の変異が遺伝性ＰＡＨの７０％および特発性ＰＡＨの１０〜４０％で見られるが（Ｍａ＆Ｃｈｕｎｇ，２０１４，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、３００個を超える、ＢＭＰＲ−２の機能喪失変異がＰＡＨ患者において特定されている。ＢＭＰ経路における他の変異には、ＡＬＫ−１、ＳＭＡＤ９およびＥＮＧにおける変化が含まれる。最近、小児ＰＡＨ患者において新たなＢＭＰ−９変異が特定された（Ｗａｎｇら，２０１６，ＢＭＣ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）。
【００１３】
幾つかの動物モデル、例えば、遺伝的ＢＭＰＲ−２変異マウスモデル並びにＳｕｇｅｎ（スーゲン）／低酸素症（Ｈｙｐｏｘｉａ）ラットモデルにおいて、ＢＭＰ−９がＰＡＨを回復させることが示されている（Ｌｏｎｇら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｊｕｌ；２１（７）：７７７−８５）。例えば、右心室収縮期血圧（ＲＶＳＰ）および血管筋肉化が遺伝的マウスモデルにおいては上昇し、そして、７５ｎｇのＢＭＰ−９を４週間毎日腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することにより逆転することが判明した。ＢＭＰ−９は更に、内皮細胞アポトーシスを予防し、内皮透過性を低下させることが記載されている（Ｌｏｎｇら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｊｕｌ；２１（７）：７７７−８５）。外因性ＢＭＰ−９の投与は、幾つかのげっ歯類の疾患モデルにおいて、内皮ＢＭＰＲ−２シグナル伝達を増強し、ＰＡＨを逆転させることが示されている。
【００１４】
したがって、対応する好ましいリガンドであるＢＭＰ−９とのＢＭＰＲ−２／ＡＬＫ−１シグナル伝達複合体は、リモデリング薬を構築するための潜在的な治療標的であると仮定された。ＢＭＰＲ−２／ＡＬＫ−１ヘテロ四量体複合体のシグナル伝達を回復または増強するための１つの選択肢は、組換えＢＭＰ−９または組換えデザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）ＢＭＰ−９の適用である。
【００１５】
ＢＭＰ−９（ＧＤＦ−２、増殖分化因子２）はＴＧＦベータファミリーに属する。ＴＧＦベータスーパーファミリーは以下の３つの異なるサブファミリーを含む：アクチビン、ＴＧＦベータおよび骨形態形成／増殖分化因子タンパク質（ＢＭＰ／ＧＤＦ）。ＢＭＰ−９（ＧＤＦ２）に加えて、ＢＭＰの他のメンバーは、例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３（オステオゲニン）、ＢＭＰ−３ｂ（ＧＤＦ−１０）、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２ｂ）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−８ｂ、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１（ＧＤＦ１１）、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４およびＢＭＰ−１５を含む。
【００１６】
ＢＭＰの別名は、骨形成タンパク質（ＯＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）または軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）を含む。ＢＭＰは、最初は骨および軟骨組織の形成への関与に基づいて特定されたが、種々の細胞および発生過程を制御することが判明した（Ｖａｒｇａら，２００５；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４：５７１３−５７２１；Ｍｉｙａｚｏｎｏら，２０１０，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７：３５−５１）。これらの過程には、胚パターン形成および組織の特殊化、創傷治癒および組織修復過程が含まれる。このファミリーのメンバーは、胚組織と成体組織との両方における細胞の増殖および分化の調節因子である。げっ歯類の研究は、成体の肝臓における、およびコリン作動性中枢神経系ニューロンの分化におけるＢＭＰ−９の役割を示唆している。
【００１７】
ＢＭＰシグナル伝達の第１段階は、２つのＩ型および２つのＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体へのＢＭＰ二量体の結合である。ＩＩ型受容体はＩ型受容体の非存在下でリガンドに結合するが、シグナル伝達のためにはそれらのそれぞれのＩ型受容体を要する。これとは対照的に、Ｉ型受容体は、リガンドの結合のために、それらのそれぞれのＩＩ型受容体を要する。Ｉ型受容体は、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−２（ＡＣＶＲ１Ａ）、ＡＬＫ−３（ＢＭＰＲ１Ａ）およびＡＬＫ−６（ＢＭＰＲ１Ｂ）を含む。ＩＩ型受容体は、ＡｃｔＲｌｌａ、ＡｃｔＲｌｌｂおよびＢＭＰＲ−２（ＢＭＰＲ−ＩＩ）を含む。ＢＭＰの結合後、リン酸化カスケードが開始され、ここで、ＩＩ型受容体がＩ型受容体をリン酸化し、そして、Ｉ型受容体がＳＭＡＤファミリーメンバーをリン酸化する。ＳＭＡＤは転写因子のファミリーであり、活性化されると核に移行し、そこで、それぞれの標的遺伝子の発現を制御する。ＢＭＰ−９は、ＳＭＡＤ１およびＳＭＡＤ５のリン酸化を誘発すると記載されている。
【００１８】
ＢＭＰは、更に切断されて７つの保存されたシステイン残基を含む成熟タンパク質を放出する多塩基性タンパク質分解プロセシング部位により特徴づけられる。ＢＭＰ−９は、シグナルペプチドおよびプロドメインを伴って合成される。ＢＭＰ−９は、ホモ二量体化に際してコンバターゼによってその活性形態へと切断される。他のＢＭＰとは対照的に、プロ領域は、活性に影響を及ぼすことなく成熟タンパク質に堅く結合したままでありうる。ＢＭＰ−９は、その最も近い近縁体であるＢＭＰ−１０に対してアミノ酸レベルで６０％の同一性を有する。ＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０は共に、内皮細胞上のＢＭＰＲ−２受容体複合体に選択的に結合してそれを活性化する、血液中を循環するリガンドの代表例である。
【００１９】
ＢＭＰＲ−２およびＡＬＫ−１は主に内皮細胞上で発現され、それらのリガンドであるＢＭＰ−９に対する受容体複合体を形成する。ＢＭＰＲ−２変異またはＢＭＰＲ−２サイレンシングは、インビトロおよびインビボで内皮透過性を増加させることが判明している（Ｂｕｒｔｏｎら，２０１０，Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．）。同様に、ＴＮＦα誘導性アポトーシスおよびＬＰＳ誘導性透過性は、ＢＭＰＲ−２変異血液増殖内皮細胞（ＢＯＥＣ）において増加するが、ＢＭＰ−９治療によって低減されうる（Ｌｏｎｇら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｊｕｌ；２１（７）：７７７−８５）。
【００２０】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２複合体を活性化するための、天然リガンドＢＭＰ−９の未修飾変異体および修飾変異体が記載されている（ＷＯ２０１６／００５７５６およびＬｏｎｇら，２０１５  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３８７７）。しかし、ＢＭＰ−９またはその変異体（例えば、ＷＯ２０１６／００５７５６を参照されたい）の適用は、幾つかの欠点を有する。治療状況におけるＢＭＰ−９置換療法の欠点は、ｉ）短い半減期、ｉｉ）高い免疫原性リスク、ｉｉｉ）開発における低収率および難題、および、ｉｖ）骨形成活性による潜在的な副作用を含む。
【００２１】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形成、オステオカルシン誘導およびマトリックス石灰化を含む骨形成活性を促進することが公知である。天然ＢＭＰ−９およびＢＭＰ−９のほとんどの合成変異体は、インビボで投与されると骨形成シグナル伝達および骨形成を開始させうる。理論により束縛されるものではないが、ＡＬＫ−２を介したＢＭＰ−９シグナル伝達がこの骨形成活性に関与していると仮定されている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用したＡＬＫ−１およびＡＬＫ−２の配列のアラインメントは６０％未満の配列同一性を示す。
【発明の概要】
【００２２】
概要
第１の態様において、本発明は二重特異性抗体（ＢｓＡＢ）を提供し、ここで、前記抗体は２つの結合ドメインを含み、第１結合ドメインはヒトＡＬＫ−１に特異的であり、そして、第２結合ドメインはヒトＢＭＰＲ−２に特異的である。
【００２３】
本発明によるＢｓＡＢは、通常ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２複合体の天然リガンドであるＢＭＰ−９またはその変異体より長い半減期により特徴づけられる。更に、本発明によるＢｓＡＢは、高収率で製造されうる。アフィニティはＢＭＰ−９およびその変異体の場合より良好に得られ、なぜなら、ＢｓＡＢまたはその結合ドメインは容易に成熟可能であり、あるいは最適化結合能を有する結合体を検出するためにスクリーニング法が用いられうるからである。ＢｓＡＢの場合、各結合部位は個別に最適化されうる。最後に、例えば遺伝的欠損による機能的なＢＭＰ−９シグナル伝達の非存在下でさえも、抗体アプローチは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達カスケードを尚もレスキューしうるであろう。
【００２４】
第１の態様による好ましい実施形態においては、ＡＬＫ−１はヒトＡＬＫ−１もしくはその断片であり、および／またはＢＭＰＲ−２はヒトＢＭＰＲ−２もしくはその断片である。第１の態様による幾つかの好ましい実施形態においては、二重特異性抗体またはその少なくとも一部はモノクローナルである。特定の実施形態においては、抗体またはその少なくとも一部はキメラ体またはヒト化体または完全ヒト体である。
【００２５】
第２の態様においては、本発明は、標的細胞、例えば内皮細胞におけるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有する二重特異性抗体を含む。
【００２６】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有するＢｓＡＢは、血管透過性を低下させることにより、血管筋肉化を元に戻し、および肺内皮細胞のバリア機能を回復させる、より高い可能性を有する。
【００２７】
第２の態様による好ましい実施形態においては、ＢｓＡＢはＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進し、これは、例えば、Ｕ２ＯＳ  ＡＣＶＲＬ１／ＢＭＰＲ−２二量体化細胞系を使用するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ二量体化アッセイにおいて示されうる。
【００２８】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢのもう１つの好ましい実施形態においては、本発明による二重特異性抗体のＥＣ５０はＢＭＰ−９のＥＣ５０以上である。
【００２９】
第２の態様による好ましい実施形態においては、ＢｓＡＢの有効量はＳＭＡＤ１および／またはＳＭＡＤ５のリン酸化を促進する。
【００３０】
第２の態様による好ましい実施形態においては、前記抗体の有効量は内皮細胞のアポトーシス指数を低下させる。
【００３１】
本発明の第３の態様においては、第１の態様による抗体または第２の態様による抗体は、ｒｈＢＭＰ−９より低い骨形成活性を有する。
【００３２】
ｒｈＢＭＰ−９より低い骨形成活性を有するＢｓＡＢは、副作用として骨形成を誘導する、より低いリスクを有する。
【００３３】
特に好ましい実施形態においては、前記ＢｓＡＢはＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有し、そしてここで、前記ＢｓＡＢのＥＣ５０は、ｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０より低い骨形成活性を有し、または骨形成活性を有さない、前記態様のいずれかによるＢｓＡＢを提供する。
【００３４】
特に好ましい実施形態においては、前記ＢｓＡＢは２つの結合ドメインを含み、ここで、第１結合ドメインがＡＬＫ−１に特異的であり、第２結合ドメインがＢＭＰＲ−２に特異的であり、そしてここで、前記ＢｓＡＢがＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有し、そしてここで、前記ＢｓＡＢのＥＣ５０が、ｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０より低い骨形成活性を有し、または骨形成活性を有さない、ＢｓＡＢを提供する。
【００３５】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有するが、ｒｈＢＭＰ−９より低い骨形成活性を有する、および／または骨形成活性を有さないＢｓＡＢは、内皮機能障害を回復させ、右室収縮期血圧（ＲＶＳＰ）を低下させ、および／またはＰＡＨを回復させる可能性が高い。
【００３６】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は骨形成を促進することが知られている。ヒトＢＭＰ−９、ＢＭＰ−９変異体、およびデザイナーＢＭＰ−９、例えば変異ＢＭＰ−９型は、ＡＬＫ−２シグナル伝達を介して骨形成活性を誘発する可能性が高いのに対し、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２受容体複合体のみを特異的に標的化するＢｓＡＢでは、これとは異なる。本発明の抗体では、ＡＬＫ−１（およびＢＭＰＲ−２）に対するその真の特異性ゆえに、ＡＬＫ−２を介したシグナル伝達の誘導は起こりそうになく、更に特定のアッセイによって容易に排除されうる。
【００３７】
第３の態様による好ましい実施形態においては、第２の態様によるＢｓＡＢは、ＥＣ５０のｒｈＢＭＰ−９で処理されたＣ２Ｃ１２細胞が、同じ濃度のＢｓＡＢで処理された又はＥＣ５０のＢｓＡＢで処理されたＣ２Ｃ１２細胞より高いアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を有することにより特徴づけられる。
【００３８】
本発明は、更に医薬品としての使用のためのＢｓＡＢ、並びに血管疾患または肺高血圧の治療における使用のためのＢｓＡＢを提供する。幾つかの実施形態において、血管疾患または肺高血圧の治療における使用は、対象の少なくとも１つの標的細胞において、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達を増強またはレスキュー（救済）することを含む。幾つかの実施形態において、前記の少なくとも１つの標的細胞は、内皮細胞、例えば肺内皮細胞である。幾つかの実施形態において、対象はヒトまたは哺乳動物である。幾つかの実施形態において、ＰＨはＰＡＨである。
【００３９】
更に、本明細書に記載されているＢｓＡＢと薬学的に許容されるビヒクルとの両方を含む医薬組成物を提供する。
【００４０】
また、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に関してＢＭＰ−９に類似しているが、骨形成の誘導に関してはＢＭＰ−９とは異なるプロファイルを有するＢｓＡＢをスクリーニングするための方法も提供する。特に、治療、例えば肺高血圧の治療における使用のためのＢｓＡＢの適合性を試験するための方法を提供し、該方法は、（ｉ）ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性を評価する工程、および所望により、（ｉｉ）ＢｓＡＢの骨形成活性を評価する工程を含む。
【００４１】
詳細な説明
定義
特に定められていない限り、明細書、図面および特許請求の範囲において用いる全ての他の科学技術用語は、当業者によって一般に理解されているそれらの通常の意味を有する。本明細書中で挙げられている全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先される。参照により組み入れる２以上の文書が、互いに矛盾および／または相反する開示を含む場合、より遅い有効日を有する文書が優先されるものとする。材料、方法および例（実施例）は単なる例示にすぎず、限定的なものではない。
【００４２】
特に示されていない限り、明細書および特許請求の範囲を含む本文書において用いる以下の用語は、以下に示す定義を有する。
【００４３】
本明細書で用いる「約」なる語は、当業者によって決定される個々の値の許容誤差範囲内にある値を指し、これは、部分的には、該値がどのようにして測定または決定されるか、すなわち、測定系の限界に左右される。例えば、「約」は、当技術分野における慣例に従い、１以上の標準偏差を意味しうる。「約」なる語は、問題の量または値が示された値またはほぼ同じである何らかの他の値でありうることを示すためにも用いられる。この語は、類似した値が本明細書に記載されているのと同等の結果または効果を促進することを伝えることを意図している。この文脈においては、「約」は最大１０％上下の範囲を意味しうる。「約」なる語が特定のアッセイまたは実施形態に関して明記されている場合は常に、その定義がその個々の文脈で優先される。
【００４４】
「含む」、「包含する」、「含有する」、「有する」などの語は、限定的ではなく開放的または無制限（オープエンド）に解釈されるものとする。単数形は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数対象物を含む。したがって、例えば、「ＢｓＡＢ」に対する言及は、単一のＢｓＡＢだけでなく、同じまたは異なる複数のＢｓＡＢをも含む。同様に「細胞」に対する言及は、単一の細胞および複数の細胞を含む。
【００４５】
特に示されていない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」なる語は一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。「少なくとも１つ」および「の少なくとも１つ」なる語は、例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ以上の要素を含む。更に、示されている範囲の上下の僅かな変動が、該範囲内の値と実質的に同じ結果を達成するために用いられうると理解される。また、特に示されていない限り、範囲の開示は、最小値と最大値との間の全ての値を含む連続範囲と意図される。
【００４６】
「抗体」なる語は、限定的なものではないが免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）およびその抗原結合性フラグメントを含み、それは、免疫グロブリン様機能を有する任意のタンパク質性結合性分子をも含む。抗体フラグメントは一般に、抗原結合または可変領域を含有する。（組換え）抗体フラグメントの例としては、免疫グロブリンフラグメント、例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）またはドメイン抗体である（Ｈｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３），２１，１１，４８４−４９０）。免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合性分子の一例は、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテインである（ＷＯ  ０３／０２９４６２，Ｂｅｓｔｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６，１８９８−１９０３）。リポカリン、例えばビリン結合性タンパク質、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ヒトアポリポタンパク質Ｄまたはグリコデリンは、ハプテンとして公知の選択された小さなタンパク質領域に結合するように修飾されうる天然リガンド結合部位を有する。他のタンパク質性結合性分子の例としては、いわゆるグルボディ（例えば、国際特許出願ＷＯ  ９６／２３８７９またはＮａｐｏｌｉｔａｎｏ，Ｅ．Ｗ．ら，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）３，５，３５９−３６７）、アンキリン・スカフォールド（Ｍｏｓａｖｉ，Ｌ．Ｋ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）１３，６，１４３５−１４４８）または結晶スカフォールド（例えば、国際特許出願ＷＯ  ０１／０４１４４）、Ｓｋｅｒｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．（２０００）１３，１６７−１８７に記載されているタンパク質、アドネクチン、テトラネクチンおよびアビマーである。アビマーは、幾つかの細胞表面受容体における一連の複数ドメインとして生じる、いわゆるＡドメインを含有する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，１５５６−１５６１）。ヒトフィブロネクチンのドメインに由来するアドネクチンは、標的への免疫グロブリン様結合のために操作されうる３つのループを含有する（Ｇｉｌｌ，Ｄ．Ｓ．＆  Ｄａｍｌｅ，Ｎ．Ｋ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）１７，６５３−６５８）。それぞれのヒトホモ三量体タンパク質に由来するテトラネクチンは、同様に、所望の結合のために操作されうるＣ型レクチンドメインにおけるループ領域を含有する（同誌）。タンパク質リガンドとして機能しうるペプトイドは、アルファ炭素原子ではなくアミド窒素に側鎖が結合している点でペプチドとは異なるオリゴ（Ｎ−アルキル）グリシンである。ペプトイドは、典型的には、プロテアーゼおよび他の修飾酵素に対して抵抗性であり、ペプチドより遥かに高い細胞透過性を有しうる（例えば、Ｋｗｏｎ，Ｙ．−Ｕ．およびＫｏｄａｄｅｋ，Ｔ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）１２９，１５０８−１５０９）。
【００４７】
抗体または抗体フラグメントは、合成法または組換え法により製造されうる。抗体を製造するためには多数の技術が利用可能である。例えば、抗体を製造するためにファージ抗体技術が使用されうる（Ｋｎａｐｐｉｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，２０００）。抗体を得るためのもう１つのアプローチは、ＷＯ  ９１／１７２７１およびＷＯ  ９２／０１０４７に記載されているとおり、Ｂ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。これらの方法においては、メンバーがその外表面上に異なる抗体を提示するファージのライブラリーが製造される。抗体は通常、ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして提示される。ファージ提示抗体は、選択されたタンパク質への結合のためのアフィニティ濃縮により選択される。また、抗体はトリオーマ法を用いて製造されうる（例えば、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７，１９８３；米国特許第４，６３４，６６４号；米国特許第４，６３４，６６６号）。
【００４８】
抗体は、抗体をコードする発現構築物でトランスフェクトされた宿主細胞を含む、抗体を発現する任意の細胞からも精製されうる。宿主細胞は、抗体が発現される条件下で培養されうる。精製された抗体は、当技術分野でよく知られた方法を用いて、細胞内の抗体と結合しうる他の細胞成分、例えば、あるタンパク質、炭水化物または脂質から分離されうる。そのような方法には、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーおよび分取ゲル電気泳動が含まれるが、これらに限定されるものではない。調製物の純度は、当技術分野で公知の任意の手段、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価されうる。精製された抗体の調製物は複数の抗体型を含有しうる。
【００４９】
あるいは、本発明による抗体は、そのアミノ酸配列を合成するための化学法を用いて、例えば、固相技術を用いる直接ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４，１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２−２０４，１９９５）により製造されうる。タンパク質合成は、手動技術を用いてまたは自動化により行われうる。所望により、抗体のフラグメントを別々に合成し、化学法を用いて合体させて全長分子を得ることが可能である。
【００５０】
本明細書中で用いる「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」なる語は、定常領域の少なくとも一部を含有する抗体重鎖のＣ末端領域を意味する。この用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。例えば、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は重鎖のＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長しうる。
【００５１】
免疫グロブリンはモノクローナルまたはポリクローナルでありうる。「ポリクローナル」なる語は、例えば抗原またはその抗原機能的誘導体で免疫化された動物の血清に由来する、免疫グロブリン分子の不均一集団である免疫グロブリンを意味する。ポリクローナル免疫グロブリンの製造のためには、種々の宿主動物の１以上が抗原の注射により免疫化されうる。宿主種に応じて、免疫学的応答を増強するために種々のアジュバントが使用されうる。
【００５２】
「モノクローナル免疫グロブリン」は「モノクローナル抗体」とも称され、特定の抗原に対する免疫グロブリンの実質的に均一な集団である。それらは、培養内の連続細胞系による免疫グロブリン分子の産生をもたらす任意の技術により得られうる。モノクローナル免疫グロブリンは、当業者によく知られた方法により得られうる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，４９５−４９７および米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい）。特異的結合アフィニティを有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントは、原核生物または真核生物から、単離、富化（濃縮）または精製されうる。当業者に公知の通常の方法は、原核生物および真核生物の両方において、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントおよび免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合性分子の両方の製造を可能にする。
【００５３】
本発明による「二重特異性抗体」なる語は、少なくとも二重特異性である抗体構築物を意味し、すなわち、該構築物は、少なくとも、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインを含み、ここで、第１結合ドメインは１つの標的または抗原（ここではＡＬＫ−１）に結合し、そして、第２結合ドメインは別の抗原または標的（ここではＢＭＰＲ−２）に結合する。したがって、本発明による抗体構築物は、少なくとも２つの異なる抗原または標的に対する特異性を含む。本発明による二重特異性抗体構築物は、複数の結合ドメイン／結合部位を含む多重特異性抗体構築物、例えば、構築物が３つの結合ドメインを含む三重特異性抗体構築物をも含む。
【００５４】
二重特異性抗体形態には、ＩｇＧ様抗体および非ＩｇＧ様抗体が含まれる（Ｆａｎら（２０１５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．８：１３０）。ＩｇＧ様抗体は、２つのＦａｂアームと１つのＦｃ領域とのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）構造を有し、ここで、それらの２つのＦａｂ部位は、異なる抗原に結合する。最も一般的なＩｇＧ様抗体型は、２つのＦａｂ領域およびＦｃ領域を含む。それぞれの重鎖および軽鎖ペアは、特有のｍＡｂからのものでありうる。Ｆｃ領域は通常、２つの重鎖から構成される。これらのＢｓＡＢは、例えば、クアドローマもしくはハイブリッドハイブリドーマ法、または当技術分野で既知の別の方法で製造されうる。非ＩｇＧ様ＢｓＡＢはＦｃ領域を欠く。非ＩｇＧ様ＢｓＡＢには、Ｆａｂ領域のみを含む化学的に連結されたＦａｂ、および種々のタイプの２価および３価の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が含まれる。２つの抗体の可変ドメインを模倣した融合タンパク質も存在する。これらの形態は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）を含む。
【００５５】
本発明による二重特異性抗体には、多価一本鎖抗体、ジアボディおよびトリアボディ、並びに、１以上のリンカーまたはペプチドを介して別の抗原結合部位が連結されている全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。可能な更なる抗原結合部位は、例えば、一本鎖Ｆｖ、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、ＶＨＨナノボディ（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃら，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３（６４２８），４４６−４４８）、単一ドメイン抗体、ｓｃＦａｂまたはこれらのいずれかのフラグメントを含む。
【００５６】
本発明による二重特異性抗体には、１以上のリンカーまたはペプチドリンカー（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端）を介して更なる抗原結合部位が連結されたＦｃ融合体が含まれるが、これらに限定されるものではない。可能な更なる抗原結合部位は、例えば、一本鎖Ｆｖ、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、ＶＨＨナノボディ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦａｂまたはこれらのいずれかのフラグメントを含む。
【００５７】
Ｆｃ領域を含む抗体または二重特異性抗体は、Ｆｃドメインの第１サブユニットと第２サブユニットとの結合を促進する修飾を含んでいても含んでいなくてもよい。「Ｆｃドメインの第１サブユニットと第２サブユニットとの結合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一ポリペプチドとが結合してホモ二量体を形成することを低減または予防する、ペプチド骨格の操作またはＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書中で用いる結合促進性修飾は、特に、結合が望まれる２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１サブユニットおよび第２サブユニット）のそれぞれに対して行われる別々の修飾を含み、ここで、該修飾は、それらの２つのＦｃドメインサブユニットの結合を促進するように互いに相補的である。例えば、結合促進性修飾は、それらの結合を立体的または静電気的に有利にするようにＦｃドメインサブユニットの一方または両方の構造または電荷を変化させうる。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で生じ、これは、例えば、該サブユニットのそれぞれに融合している更なる成分（例えば、抗原結合部分）が同一ではない点で、それらは非同一でありうる。幾つかの実施形態において、結合促進性修飾は、Ｆｃドメインにおけるアミノ酸変異、特に、アミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、結合促進性修飾は、Ｆｃドメインの、２つのサブユニットのそれぞれにおいて、別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
【００５８】
本明細書中で用いる「リンカー」なる語は、ＢｓＡＢまたは抗体構築物の別々の部分の直接的なトポロジー（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ）連結を可能にする任意の分子を意味する。異なる抗体部分の間の共有結合を確立するリンカーの例には、ペプチドリンカーおよび非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールのコポリマー（これらに限定されるものではない）が含まれる。
【００５９】
本発明における「ペプチドリンカー」なる語は、抗体構築物の第１部分のアミノ酸配列を抗体構築物の第２部分に連結するアミノ酸配列を意味する。例えば、ペプチドリンカーは、抗体構築物の第１（可変および／または結合）ドメインを第２（可変および／または結合）ドメインに連結しうる。例えば、ペプチドリンカーはまた、抗体構築物の或る部分を抗体構築物の別の部分、例えば、抗原結合ドメインをＦｃドメインまたはそのフラグメントに連結しうる。適切なペプチドリンカーはＵＳ４７５１１８０、ＵＳ４９３５２３３、ＷＯ８８／０９３４４およびＨｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３に記載されている。好ましくは、ペプチドリンカーは、２つの物体を連結するのに適度な長さを有していて、それらがお互いに対するそれらのコンホメーションを維持し、所望の活性が妨げられないようになっている。特に、本発明による抗体構築物が１以上のリンカーを含む場合、そのような１以上のリンカーは、好ましくは結合ドメインの個々の結合特異性を損なわない長さおよび配列を有する。リンカーペプチドは、主に以下のアミノ酸残基を含む又は含まないことが可能である：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒ。
【００６０】
有用なリンカーには、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＧＳ）ｎＧを含むグリシン−セリンポリマーが含まれ、ここで、ｎは少なくとも１の整数である（好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）。有用なリンカーにはまた、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および他の柔軟なリンカーが含まれる。リンカー配列はＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の長さの任意の配列を含むことが可能であり、あるいはＣＬ／ＣＨ１ドメインの全残基を含むとは限らない。
【００６１】
リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えばＣκまたはＣλに由来しうる。リンカーは、例えばＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、ＣαおよびＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来する。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、他のタンパク質に由来する他の天然配列のような他のタンパク質に由来することが可能であり、あるいは荷電リンカーでありうる。
【００６２】
本発明に従いドメインを互いに連結するための方法は当技術分野でよく知られており、例えば遺伝子工学を含む。融合した及び機能的に連結された二重特異性一本鎖構築物を製造し、それらを哺乳類細胞または細菌において発現させる方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、ＷＯ９９／５４４４０またはＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）。
【００６３】
本発明における「価」なる語は、特定された数の結合部位が抗体分子に存在することを示す。したがって、２価、３価、４価なる語は、それぞれ、２つ、３つまたは４つの結合部位が抗体構築物に存在することを示す。本発明による二重特異性抗体は少なくとも２価であり、多価、例えば２価、３価、４価または６価でありうる。
【００６４】
本明細書中で用いる「結合ドメイン」なる語は、特定の標的または抗原に結合する二重特異性抗体の任意の部分を意味する。結合ドメインは抗原結合部位である。結合ドメインは、例えば、抗体もしくは免疫グロブリン自体または抗体フラグメントでありうる。そのような結合ドメインは、ＢｓＡＢの残部から独立した三次構造を有する又は有さないことが可能であり、その標的に個々の実体として結合する又は結合しないことが可能である。
【００６５】
二重特異性抗体、抗体、抗体フラグメントまたは抗原結合部位は、単一種からの全長でありうる。二重特異性抗体、抗体、抗体フラグメントまたは抗原結合部位は、キメラでありうる。二重特異性抗体、抗体、抗体フラグメントまたは抗原結合部位は、当技術分野で公知のとおりに完全に又は部分的にヒト化されうる。
【００６６】
本発明による抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメントまたは抗原結合部位がある形態である場合、これは、他の部分への天然または合成結合または融合（これらに限定されるものではない）を含む更なる修飾を除外するものではない。特に、抗体構築物またはＢｓＡＢは、ＰＥＧ化または（超）グリコシル化されうる。
【００６７】
「ＢＭＰ−９」なる語は、タンパク質増殖／分化因子２を意味する。ＢＭＰ−９タンパク質はＧＤＦ２遺伝子によりコードされる。ＢＭＰ−９タンパク質は、ヒト、マウス、更には哺乳類および非哺乳類ホモログを含む。ヒトＢＭＰ−９の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  Ｑ９ＵＫ０５（ＧＤＦ２＿ＨＵＭＡＮ）から入手可能である（例えば、ヒトアイソフォームＱ９ＵＫ０５−１）。マウスＢＭＰ−９の配列はＵｎｉＰｒｏｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  Ｑ９ＷＶ５６（ＧＤＦ２＿ＭＯＵＳＥ）から入手可能である。種によって異なるアイソフォームおよび変異体が存在し、それらは全て、ＢＭＰ−９なる語に含まれる。加えて、成熟の前および後の、すなわち、１以上のプロドメインの切断に無関係なＢＭＰ−９分子も含まれる。また、ＢＭＰ−９タンパク質の合成変異体が作製可能であり、ＢＭＰ−９なる語に含まれる。タンパク質ＢＭＰ−９は更に、種々の修飾、例えば、合成による修飾または天然で生じる修飾を受けうる。組換えヒトＢＭＰ−９（ｒｈＢＭＰ−９）は、商業的に入手可能であるか、または当技術分野で公知のとおりに製造されうる。
【００６８】
「ＡＬＫ−１」なる語は、タンパク質であるセリン／スレオニン−タンパク質キナーゼ受容体Ｒ３を意味する。別名は、ＳＫＲ３、アクチビン受容体様キナーゼ１、ＡＬＫ１、ＴＧＦ−Ｂスーパーファミリー受容体Ｉ型およびＴＳＲ−Ｉを含む。ＡＬＫ−１タンパク質は、ＡＣＶＲＬ１遺伝子によりコードされる。ＡＬＫ−１タンパク質は、ヒト、マウス、更には哺乳類ホモログを含む。ヒトＡＬＫ−１の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別番号（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）Ｐ３７０２３（ＡＣＶＬ１＿ＨＵＭＡＮ）から入手可能である（例えば、ヒトアイソフォームＰ３７０２３−１）。マウスＡＬＫ−１の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別番号Ｑ６１２８８（ＡＣＶＬ１＿ＭＯＵＳＥ）から入手可能である。種によって異なるアイソフォームおよび変異体が存在しうる。それらは全て、ＡＬＫ−１なる語に含まれる。加えて、ＡＬＫ−１タンパク質の合成変異体が、例えば、少なくとも１つの変異を導入することにより作製可能であり、ＡＬＫ−１なる語に含まれる。タンパク質ＡＬＫ−１は更に、種々の修飾、例えば、合成による修飾または天然に生じる修飾を受けうる。
【００６９】
「ＢＭＰＲ−２」なる語は、タンパク質である骨形成タンパク質受容体２型を意味する。別名は、ＢＭＰ２型受容体、骨形成タンパク質受容体ＩＩ型、ＢＭＰ  ＩＩ型受容体、ＢＭＲ２、ＰＰＨ１、ＢＭＰＲ３、ＢＲＫ−３、ＰＯＶＤ１、Ｔ−ＡＬＫ、ＢＭＰＲＩＩおよびＢＭＰＲ−ＩＩを含む。ＢＭＰＲ−２タンパク質は、ＢＭＰＲ２遺伝子によりコードされる。ＢＭＰＲ−２タンパク質は、ヒト、マウス、更には哺乳類ホモログを含む。ヒトＢＭＰＲ−２の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別番号Ｑ１３８７３（ＢＭＰＲ２＿ＨＵＭＡＮ）から入手可能である（例えば、ヒトアイソフォーム１（識別番号：Ｑ１３８７３−１）およびヒトアイソフォーム２（識別番号：Ｑ１３８７３−２））。マウスＢＭＰＲ−２の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別番号Ｏ３５６０７（ＢＭＰＲ２＿ＭＯＵＳＥ）から入手可能である。種によって異なるアイソフォームおよび変異体が存在しうる。それらは全て、ＢＭＰＲ−２なる語に含まれる。加えて、ＢＭＰＲ−２タンパク質の合成変異体が、例えば、少なくとも１つの変異を導入することにより作製可能であり、ＢＭＰＲ−２なる語に含まれる。ＢＭＰＲ−２タンパク質は更に、種々の修飾、例えば、合成による修飾または天然に生じる修飾を受けうる。
【００７０】
「ＡＬＫ−２」なる語は、タンパク質であるアクチビン受容体１型を意味する。ＡＬＫ−２タンパク質は、ＡＣＶＲ１遺伝子によりコードされる。ＡＬＫ−２タンパク質は、ヒトおよび更なるホモログを含む。ヒトＡＬＫ−２の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別番号Ｑ０４７７１（ＡＣＶＲ１＿ＨＵＭＡＮ）から入手可能である（例えば、ヒトアイソフォームＱ０４７７１−１）。種によって異なるアイソフォームおよび変異体が存在しうる。それらは全て、ＡＬＫ−２なる語に含まれる。加えて、ＡＬＫ−２タンパク質の合成変異体が作製可能であり、ＡＬＫ−２なる語に含まれる。ＡＬＫ−２タンパク質は更に、種々の修飾、例えば、合成による修飾または天然に生じる修飾を受けうる。
【００７１】
本明細書中で用いる「治療」および「治療する」なる語は、対象の生物における異常状態（病的症状を含む）を予防し、減速（低減）し、または少なくとも部分的に緩和もしくは抑制する、治療効果を有する予防的または防止的手段を意味する。治療を要する者には、障害を既に有する者、および障害を有する傾向にある者、または障害が予防されるべき者（予防方法）が含まれる。一般に、治療は、疾患または病的症状の存在および／または進行に関連した徴候の進行を低減し、安定化しまたは抑制する。本発明における目的は、医薬としての使用のための二重特異性抗体、および肺高血圧の治療における使用のためのＢｓＡＢを提供することである。
【００７２】
「治療効果」なる語は、異常状態を引き起こす又はそれに寄与する因子の抑制（阻害）または活性化を意味する。治療効果は異常状態または疾患の症状の１以上をある程度緩和する。「異常状態」なる語は、生物の細胞または組織における機能がその生物におけるそれらの正常機能から逸脱していることを意味する。異常状態は、とりわけ、細胞増殖、細胞分化、細胞透過性または細胞生存に関連しうる。ＰＨおよびＰＡＨの状況における治療効果の例としては、肺内皮細胞のバリア機能の改善、肺内皮細胞のアポトーシスの低減、右心室肥大の低減および右心室収縮期血圧（ＲＶＳＰ）の減少である。
【００７３】
本明細書中で用いる「医薬組成物」なる語は、対象、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。好ましい実施形態においては、医薬組成物は、非経口、経皮、管腔内、動脈内またはくも膜下腔内投与のための、あるいは組織内への直接注射による投与のための組成物を含む。特に、前記医薬組成物は、注入または注射により患者に投与されることが想定される。適切な組成物の投与は、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与のような種々の方法で行われうる。本発明による医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に含みうる。適切な薬学的に許容される担体の例は当技術分野でよく知られており、リン酸緩衝食塩水、水、乳濁液、湿潤剤、滅菌溶液などを包含する。適切な薬学的に許容される担体を含む組成物は、当技術分野でよく知られた通常の方法を用いて製剤化されうる。これらの医薬組成物は適切な用量で対象に投与されうる。投与計画（投与レジメン）は、関連する臨床的要因を考慮して担当医師により決定されうる。そのような投与計画に影響を及ぼしうる要因には、対象または患者のサイズ、体重、体表面積、年齢および性別、ならびに投与の時間および経路が含まれる。
【００７４】
本明細書中で用いる「薬学的に許容される」なる表現は、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴わない、ヒトおよび動物の組織との接触での使用に適した活性化合物、材料、組成物、担体および／または剤形をいう。
【００７５】
化合物またはＢｓＡＢの「有効量」は、適用される投与計画で所望の効果をもたらす、単回投与または一連の投与の一部としての量である。
【００７６】
化合物または抗体の「骨形成活性」は、例えばオステオカルシン誘導および／またはマトリックス石灰化によりモニタリングされる、細胞または組織における骨形成（骨の形成）を促進する化合物または抗体の能力である。例えば、骨形成活性を有する化合物または抗体は、有効量で、筋芽細胞性から骨芽細胞性へのマウス筋芽細胞系Ｃ２Ｃ１２（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１７７２）の分化を誘導しうる。
【００７７】
実施形態
第１の態様においては、本発明は二重特異性抗体（ＢｓＡＢ）を含み、ここで、前記抗体は２つの結合ドメインを含み、ここで、第１結合ドメインはＡＬＫ−１に特異的であり、そして、第２結合ドメインはＢＭＰＲ−２に特異的である。
【００７８】
幾つかの実施形態においては、ＢｓＡＢはＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２複合体を架橋し、あるいは、複合体を、下流シグナル伝達段階に適した構造構成にする。
【００７９】
本発明によるＢｓＡＢは、通常、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２複合体の天然リガンドであるＢＭＰ−９またはその変異体より長い半減期により特徴づけられる。更に、本発明によるＢｓＡＢは高収率で製造されうる。アフィニティはＢＭＰ−９およびその変異体の場合より良好に得られ、というのも、ＢｓＡＢまたはその結合ドメインは、容易に成熟可能であり、または最適化結合能を有する結合体を検出するためにスクリーニング法が用いられうるからである。ＢｓＡＢの場合、各結合部位は個別に最適化されうる。最後に、例えば遺伝的欠損による機能的なＢＭＰ−９シグナル伝達の非存在下でさえも、抗体アプローチはＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達カスケードを尚もレスキューしうるであろう。
【００８０】
本明細書に開示されている抗体は、ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２に特異的に結合し；すなわち、それらは、無関係な抗原（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン）に対するそれらの結合アフィニティより高い（例えば、少なくとも２倍高い）アフィニティで、それらの標的に結合する。
【００８１】
第１の態様による幾つかの実施形態において、ＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１の細胞外ドメインおよび／またはＢＭＰＲ−２の細胞外ドメインに特異的に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＬＫ−１は、ヒトＡＬＫ−１またはその断片であり、および／または、ＢＭＰＲ−２はヒトＢＭＰＲ−２またはその断片である。幾つかの実施形態において、ＢｓＡＢはヒトＡＬＫ−１の細胞外ドメインもしくはその断片および／またはヒトＢＭＰＲ−２の細胞外ドメインもしくはその断片に結合する。
【００８２】
幾つかの実施形態において、ＢｓＡＢは、最大約１０−４Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、１０−４Ｍ、１０−４．５Ｍ、１０−５Ｍ、１０−５．５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−６．５Ｍ、１０−７Ｍ、１０−７．５Ｍ、１０−８Ｍ、１０−８．５Ｍ、１０−９Ｍ、１０−９．５Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１０．５Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１１．５Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１２．５Ｍ、１０−１３ＭのＫｄでＡＬＫ−１に結合する。
【００８３】
幾つかの実施形態において、ＢｓＡＢは、最大約１０−４Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、１０−４Ｍ、１０−４．５Ｍ、１０−５Ｍ、１０−５．５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−６．５Ｍ、１０−７Ｍ、１０−７．５Ｍ、１０−８Ｍ、１０−８．５Ｍ、１０−９Ｍ、１０−９．５Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１０．５Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１１．５Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１２．５Ｍ、１０−１３ＭのＫｄでＢＭＰＲ−２に結合する。
【００８４】
幾つかの実施形態において、ＢｓＡＢは、最大約１０−４Ｍ〜約１０−１３Ｍ（例えば、１０−４Ｍ、１０−４．５Ｍ、１０−５Ｍ、１０−５．５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−６．５Ｍ、１０−７Ｍ、１０−７．５Ｍ、１０−８Ｍ、１０−８．５Ｍ、１０−９Ｍ、１０−９．５Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１０．５Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１１．５Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１２．５Ｍ、１０−１３ＭのＫｄでＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２に結合する。
【００８５】
幾つかの実施形態において、ＢｓＡＢは、約１０−４Ｍ、１０−４．５Ｍ、１０−５Ｍ、１０−５．５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−６．５Ｍまたは１０−７Ｍを超えたＫｄでＡＬＫ−２または配列番号１１７の抗原に結合する。幾つかの好ましい実施形態において、ＢｓＡＢは、ＢＳＡのような無関係な抗原に対する結合アフィニティより高い（例えば、少なくとも２倍高い）アフィニティではＡＬＫ−２に結合しない。
【００８６】
抗原に結合する抗体のＫｄは、例えばイムノアッセイ、例えば酵素結合免疫特異的アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、二分子相互作用分析（ＢＩＡ）（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ＆  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５，１９９１；Ｓｚａｂｏら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５，１９９５）、および抗原を発現する細胞への抗体結合の定量のための蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含む当技術分野で公知の任意の方法を用いてアッセイされうる。ＢＩＡは、相互作用物質のいずれをも標識することなく生体特異的相互作用をリアルタイムで分析するための技術である（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）。光学現象である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化は、生体分子間のリアルタイム反応の指標として用いられうる。
【００８７】
幾つかの実施形態において、本発明による抗体は、ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２に対する結合ドメインに加えて、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２受容体のリガンド、例えばＢＭＰ−９に対する、またはＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に関与する別の分子に対する結合ドメインを更に含む。
【００８８】
当業者にとって明らかな非適合性が存在する場合を除き、結合能を記載している実施形態のそれぞれは、抗体の形態を記載している実施形態のそれぞれと組合されうる。
【００８９】
幾つかの好ましい実施形態において、ＢｓＡＢまたはその少なくとも一部はモノクローナルである。幾つかの実施形態において、ＢｓＡＢはキメラである。幾つかの好ましい実施形態において、ＢｓＡＢは完全にまたは部分的にヒト化されている。
【００９０】
第１の態様による幾つかの実施形態において、ＢｓＡＢの形態はＩｇＧ様である。第１の態様による幾つかの実施形態においては、ＢｓＡＢの形態は非ＩｇＧ様である。第１の態様による幾つかの実施形態において、二重特異性抗体は、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ、ジアボディおよび前記形態のいずれかのオリゴマーからなる群から選択される形態である。好ましい実施形態において、第１の態様または任意の他の態様によるＢｓＡＢの形態は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｋｉｈ）である。
【００９１】
第１の態様による幾つかの実施形態において、二重特異性抗体は少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含み、これは、ｓｃＦｖリンカーにより互いに連結された可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含む。考察されているとおり、この形態においては、組換え技術により生成される通常のペプチド結合を含む、多数の適切なｓｃＦｖリンカーが利用可能である（Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）。
【００９２】
第１の態様による幾つかの実施形態において、二重特異性抗体は少なくとも１つのリンカーを含む。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのリンカーは少なくとも１つのペプチドリンカーを含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのペプチドリンカーは、１〜５０アミノ酸長、好ましくは１〜３０アミノ酸長、最も好ましくは４〜１６アミノ酸長である。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのペプチドリンカーは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６アミノ酸のサイズを有する。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのペプチドリンカーは、４、３、２または１アミノ酸のサイズを有する。好ましい実施形態において、少なくとも１つのペプチドリンカーはグリシンに富む。１つの実施形態においては、少なくとも１つのペプチドリンカーは単一グリシンからなる。好ましい実施形態において、１以上のリンカーは二次構造を促進しない。好ましい実施形態において、ＢｓＡＢは、ＧＧＧＧＳｎＧペプチドリンカーを含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される整数である。
【００９３】
ＢｓＡＢがリンカーを含む場合、リンカーを記載する各実施形態は、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、ＢｓＡＢの形態を記載する各実施形態および／または結合能を説明する各実施形態と組合されることが可能であり、具体的に示唆される。
【００９４】
好ましい実施形態において、ＢｓＡＢは少なくとも１つの（ＧＧＧＧＳ）３Ｇペプチドリンカーを含み、ここで、前記の少なくとも１つのリンカーの少なくとも１つはｓｃＦｖ領域とＦｃ領域とを連結する。好ましい実施形態において、ＢｓＡＢは、少なくとも１つの（ＧＧＧＧＳ）３ペプチドリンカーを含み、ここで、前記の少なくとも１つのリンカーの少なくとも１つは、ＶＨ鎖とＶＬ鎖とを連結する。
【００９５】
二重特異性抗体は通常は天然には存在せず、通常は人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体は、例えば、完全長抗体または抗体フラグメントとして製造されうる。種々の形態の二重特異性抗体およびそれらの製造方法が当技術分野でよく知られている。これらの方法には、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結が含まれるが、これらに限定されるものではない（Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０））。
【００９６】
二重特異性抗体または多重特異性抗体を製造するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組換え共発現（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ  ９３／０８８２９、ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、および２つの異なるモノクローナル抗体の化学的結合（Ｓｔａｅｒｚら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（６０１２）：６２８−３１を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されるものではない。多重特異性抗体はまた、２以上の抗体またはフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、二重特異性抗体を製造するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）、二重特異性抗体フラグメントを製造するために「ジアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）、および一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、並びにＴｕｔｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）記載されているとおりに三重特異性抗体を製造すること、および制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）（Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１３；１１０：５１４５−５０）によっても製造されうる。
【００９７】
第１の態様による幾つかの好ましい実施形態においては、二重特異性抗体は少なくとも１つのＦｃドメインを含む。ＢｓＡＢが少なくとも１つのＦｃ領域を含む好ましい実施形態においては、ＢｓＡＢは更に、Ｆｃドメインの第１サブユニットと第２サブユニットとの結合を促進する修飾、例えばノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）変異を含む。
【００９８】
好ましい実施形態において、結合促進性修飾は、「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」（ｋｉｈ）操作に基づく（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、Ｒｉｄｇｗａｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）；  Ａｔｗｅｌｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７  ２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号を参照されたい）。ノブズ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅ）技術は、１つのｍＡｂからの重鎖における大きなアミノ酸の変異と、他方のｍＡｂ重鎖における小さなアミノ酸の変異とを導入することに基づく。これは、標的重鎖（およびそれらの対応軽鎖）の、より良好なフィッティングを可能にし、ＢｓＡＢの製造の信頼性を高める。また、Ｍｅｒｃｈａｎｔら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているとおり、これらの「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」変異は、ジスルフィド結合と組合されて、ヘテロ二量体化への形成を促しうる。
【００９９】
本発明による幾つかの好ましい実施形態においては、ＢｓＡＢは、ヘテロ二量体ヒトＩｇＧ  Ｆｃに連結された２つの単一特異性抗体ｓｃＦｖフラグメントを組合せたｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｋｉｈ）構築物であり、ここで、第１のｓｃＦｖフラグメントはヒトＢＭＰＲ−２またはそのフラグメントに特異的に結合し、そしてここで、第２のｓｃＦｖフラグメントは、ヒトＡＬＫ−１またはそのフラグメントに特異的に結合する。ＩｇＧ  Ｆｃは、例えば、ＩｇＧ２または任意の他のタイプの免疫グロブリンでありうる。
【０１００】
幾つかの実施形態において、第１の態様によるＢｓＡＢの第１結合ドメインはＶＨＨ結合ドメインであり、および／または、ＢｓＡＢの第２結合ドメインはＶＨＨ結合ドメインである。これらの実施形態の幾つかにおいて、ＢｓＡＢはＦｃドメインを更に含み、ここで、Ｆｃドメインの第１サブユニットは１以上のノブ（ｋｎｏｂ）変異を含み、そして、Ｆｃドメインの第２サブユニットはノブズ・イントゥ・ホールズ（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）法による１以上のホール（ｈｏｌｅ）変異を含む。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、ＢｓＡＢの第１結合ドメインはＦａｂまたはそのフラグメントを含み、および／または、第２結合ドメインはＦａｂまたはそのフラグメントを含む。これらの実施形態の幾つかにおいて、ＢｓＡＢはＦｃドメインを更に含み、ここで、Ｆｃドメインの第１サブユニットは１以上のノブ（ｋｎｏｂ）変異を含み、そして、Ｆｃドメインの第２サブユニットはノブズ・イントゥ・ホールズ（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）法による１以上のホール（ｈｏｌｅ）変異を含む。
【０１０２】
幾つかの実施形態において、第１の態様によるＢｓＡＢは、（ｉ）配列番号２〜７、および／または、（ｉｉ）配列番号９〜１４、および／または、（ｉｉｉ）配列番号３０〜３５、および／または、（ｉｖ）配列番号３７〜４２、および／または（ｖ）配列番号３７〜４２を含む。
【０１０３】
第１の態様に関して記載されている各実施形態は、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第２の態様による各実施形態と組合されることが可能であり、そして具体的に示唆される。第１の態様に関して記載されている各実施形態は、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第２の態様による実施形態の各組合せと組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。第１の態様に関して記載されている実施形態の各組合せは、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第２の態様による各実施形態と組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。第１の態様に関して記載されている実施形態の各組合せは、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第２の態様による実施形態の各組合せと組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。
【０１０４】
第２の態様においては、本発明は、標的細胞におけるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有する、第１の態様によるＢｓＡＢを含む。
【０１０５】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有するＢｓＡＢは、血管透過性を低下させることにより、血管筋肉化を元に戻し、そして肺内皮細胞のバリア機能を回復させる、より高い可能性を有する。
【０１０６】
好ましい実施形態において、標的細胞は、天然にまたは操作後に、ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２を発現する。１つの実施形態において、標的細胞はＵ２ＯＳ  ＡＣＶＲＬ１／ＢＭＰＲ−２二量体化細胞系（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である。
【０１０７】
第２の態様による好ましい実施形態においては、抗体は標的細胞におけるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有し、ここで、該標的細胞は内皮細胞である。
【０１０８】
健常哺乳動物においては、ＢＭＰＲ−２およびＡＬＫ−１は主に内皮細胞上で発現される。幾つかの実施形態において、内皮細胞は、哺乳動物ドナー、例えばマウス、ラット、げっ歯類、ブタ、イヌおよびヒトに由来する。幾つかの好ましい実施形態において、内皮細胞は肺細胞である。幾つかの好ましい実施形態においては、内皮細胞はヒト肺細胞またはげっ歯類肺細胞である。幾つかの好ましい態様において、内皮細胞は、ＨＰＡＥＣ、ＨＡｏＥＣ、ＨＣＡＥＣおよびＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を含む群から選択される。
【０１０９】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性は、多数の方法および測定系で評価されうる。本発明において、ＢｓＡＢが以下のアッセイまたは方法の少なくとも１つにおいてアゴニスト活性を示す場合、ＢｓＡＢはＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であると言える。
【０１１０】
第１のクラスの方法は、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２を介したシグナル伝達の際に生じる構造変化の検出のための、十分に記載されている種々の生物物理学的方法を含む方法を含む。ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の最初の段階の発生を評価するための好ましい方法は、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ二量体化（Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）アッセイ（Ｕ２ＯＳ  ＡＣＶＲＬ１／ＢＭＰＲ−２  Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ，ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によるものである。このアッセイは、受容体−二量体ペアの、２つのサブユニットのリガンド誘発性二量体化を検出する。細胞は、酵素ドナー（ＥＤ）に融合した１つの受容体サブユニット、および酵素アクセプター（ＥＡ）に融合した第２の二量体パートナーを共発現するように操作されている。一方または両方の受容体サブユニットへの本発明のアゴニストの結合は二量体パートナーの相互作用を誘発して、それらの２つの酵素断片の相補を強いる。これは、基質を加水分解して化学発光シグナルを読出し情報として生成する機能的酵素の生成をもたらす。
【０１１１】
好ましい実施形態において、第２の態様によるＢｓＡＢはＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進する。ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を検出するための適切なアッセイとしては、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ二量体化（Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）アッセイ（Ｕ２ＯＳ  ＡＣＶＲＬ１／ＢＭＰＲ−２  Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ，ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、または本明細書に記載されているＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ二量体化アッセイの原理を用いる任意のアッセイである。
【０１１２】
本発明において、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｕ２ＯＳ  ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２二量体化アッセイを用いてＢｓＡＢのＥＣ５０が決定されうる場合、ＢｓＡＢはＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であると言える。しかし、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｕ２ＯＳ  ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２二量体化アッセイでＥＣ５０を決定できない場合であっても、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性をアッセイするための後記の別の方法がＢｓＡＢに関する有意なアゴニスト活性を示す場合には、本発明によるＢｓＡＢは尚もＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であると言える。例えば、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性をアッセイするための本明細書に記載されている他の方法には、ＳＭＡＤ１および／または５リン酸化アッセイ、ＡｐｏＯｎｅ／ＣＴＢアッセイ、ならびにインビトロまたは敗血症マウスモデル、ＭＣＴラットもしくはＳｕｇｅｎ／低酸素症誘発性肺高血圧ラットモデルにおける内皮バリア機能に関するアッセイが含まれる。
【０１１３】
５０％効果濃度（ＥＣ５０）は、特定された曝露時間の後、ベースラインと最大値との中間で応答を誘発する、薬物、抗体または毒物の濃度を意味する。適用抗体濃度と化学発光シグナルとの関係を示す用量反応曲線の数学的モデリング（例えば、非線形回帰）により変曲点が決定されうる場合、本発明の抗体のＥＣ５０が決定されうる。例えば、用量反応曲線がシグモイド曲線に従っている場合、ＥＣ５０が決定されうる。特に示されていない限り、本明細書に記載されているＥＣ５０は、例えばＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２二量体化アッセイから決定されるアゴニスト活性のＥＣ５０である（図８）。
【０１１４】
本発明による二重特異性抗体のアゴニスト活性の大きさを示すために、組換えＢＭＰ−９および抗体のそれぞれのＥＣ５０を、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｕ２ＯＳ  ＡＣＶＲＬ１／ＡＣＶＲ２二量体化細胞系に関する製造業者の説明に記載されているとおりに滴定により決定する。注目すべきことに、曝露時間は、好ましくは、抗体とＢＭＰ−９との両方で同等である。通常の条件下では、製造業者の説明に基づいて行うアッセイの場合、ＢＭＰ−９のＥＣ５０は約０．１ｎＭである。好ましい実施形態において、抗体およびＢＭＰ−９のＥＣ５０値は同程度の大きさである。もう１つの好ましい実施形態において、ＢｓＡＢのＥＣ５０値は、ＴＰＰ−１４６９６またはＴＰＰ−１４７１９のＥＣ５０より低いか、またはそれと同程度である（図８）。
【０１１５】
好ましい実施形態において、第２の態様によるＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進する。例えば、これは、Ｕ２ＯＳ  ＡＣＶＲＬ１／ＢＭＰＲ−２二量体化細胞系を使用するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ二量体化アッセイにおいて示されうる。好ましい実施形態において、第２の態様によるＢｓＡＢは、Ｕ２ＯＳ  ＡＣＶＲＬ１／ＢＭＰＲ−２二量体化細胞系を使用するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ二量体化アッセイにおいてＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進する。ＰａｔｈＢｕｎｔｅｒ  Ｕ２ＯＳ  ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２を使用してＢｓＡＢのＥＣ５０が決定されうる場合、ＢｓＡＢは、Ｕ２ＯＳ  ＡＣＶＲＬ１／ＢＭＰＲ−２二量体化細胞系を使用するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ二量体化アッセイにおいてＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進する。
【０１１６】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する幾つかの実施形態においては、該抗体に関する決定されたＥＣ５０と組換えＢＭＰ−９に関する決定されたＥＣ５０との比は、０．０００００１〜１００００００である。
【０１１７】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する幾つかの実施形態においては、該抗体に関する決定されたＥＣ５０と組換えＢＭＰ−９に関する決定されたＥＣ５０との比は、０．００００１〜１０００００である。
【０１１８】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する幾つかの更なる実施形態においては、該抗体に関する決定されたＥＣ５０と組換えＢＭＰ−９に関する決定されたＥＣ５０との比は、０．０００１〜１００００である。
【０１１９】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する幾つかの好ましい実施形態においては、該抗体に関する決定されたＥＣ５０と組換えＢＭＰ−９に関する決定されたＥＣ５０との比は、０．００１〜１０００である。
【０１２０】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する更に好ましい幾つかの実施形態においては、該抗体に関する決定されたＥＣ５０と組換えＢＭＰ−９に関する決定されたＥＣ５０との比は、０．０１〜１００である。
【０１２１】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する幾つかの好ましい実施形態においては、該抗体に関する決定されたＥＣ５０と組換えＢＭＰ−９に関する決定されたＥＣ５０との比は、０．１〜１０である。
【０１２２】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する好ましい実施形態においては、該抗体に関する決定されたＥＣ５０と組換えＢＭＰ−９に関する決定されたＥＣ５０との比は約ｎから約ｍの間であり、ここで、ｎは、０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９および１からなる第１群の要素であり、ｍは、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００からなる第２群の要素である。この特定の文脈においては、「約」なる語は＋／−１０％を意味する。
【０１２３】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢの好ましい実施形態においては、本発明による二重特異性抗体のＥＣ５０はＢＭＰ−９のＥＣ５０以上である。
【０１２４】
アゴニスト活性を評価するための別の方法には、例えば、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の、１以上の標的遺伝子産物の定量のための方法が含まれる。適切な方法は当技術分野でよく知られており、遺伝子アレイおよび定量的リアルタイムＰＣＲ分析、質量分析に基づくプロテオミクスおよびウエスタンブロット分析を含む。前記ＢｓＡＢの有効量の投与時に少なくとも１つの適切な標的遺伝子産物が標的細胞において有意にアップレギュレーションされる場合、ＢｓＡＢはＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であると言える。ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の適切な標的遺伝子の群は、血管新生関連遺伝子ＩＬ−８、ＥＴ−１、ＩＤ１、ＨＰＴＰηおよびＴＥＡＤ４のような種々の遺伝子が含まれる（Ｌｕｘら，ＢＭＣ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ２００６；６：１３）。Ｌｕｘらは、ＡＬＫ−１シグナル伝達の標的遺伝子の特定のためのモデルを記載しており、ここで、標的遺伝子発現の後続分析のために、ヒト微小血管内皮細胞系ＨＭＥＣ−１に構成的に活性な組換えＡＬＫ−１アデノウイルスを感染させた。
【０１２５】
ヒト肺動脈内皮細胞の場合、ＳＭＡＤ１およびＳＭＡＤ５リン酸化のウエスタンブロット分析により示されるとおり、ｒｈＢＭＰ−９での処理は内皮細胞における標準（カノニカル）ＢＭＰシグナル伝達の鍵成分を活性化した。したがって、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を評価するためのもう１つのクラスの適切な方法は、シグナル伝達中に生じるリン酸化ＳＭＡＤまたは他の化学修飾の増加を検出することに基づく。このクラスによる適切な方法も同様に当技術分野において十分に記載されており、実施例５に記載されているとおり、質量分析に基づくホスホプロテオミクスおよびウエスタンブロット分析を含む（図２も参照されたい）。
【０１２６】
第２の態様による好ましい実施形態においては、ＢｓＡＢの有効量はＳＭＡＤ１および／またはＳＭＡＤ５のリン酸化を促進する。
【０１２７】
本発明においては、天然リガンドＢＭＰ−９に匹敵する内皮細胞におけるＳＭＡＤ１および／またはＳＭＡＤ５リン酸化の誘導をもたらすＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニストであるとみなされる。注目すべきことに、ＢｓＡＢとＢＭＰ−９との必要濃度（有効量）は、互いに大きく異なりうる。
【０１２８】
この特定の文脈において、ＢｓＡＢまたは化合物に関しては、ＳＭＡＤのリン酸化のための「有効量」は、ウエスタンブロットまたはホスホプロテオミクス分析によりシグナル（ここで、該シグナルは内皮細胞におけるそのＳＭＡＤのリン酸化を示す）が検出されうる、前記ＢｓＡＢまたは前記化合物の濃度または量である。
【０１２９】
前記抗体または化合物の有効量が標的細胞においてＳＭＡＤ１またはＳＭＡＤ５のリン酸化を誘導する場合、ＢｓＡＢまたは化合物は、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であると言える。例えば、特定の標的細胞の場合、ＳＭＡＤ５のリン酸化に対するｒｈＢＭＰ−９の有効量は、１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌである（図２を参照されたい）。注目すべきことに、この文脈においては、多数の有効量が存在しうる。
【０１３０】
第２の態様によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する１つの実施形態においては、ＳＭＡＤ１および／またはＳＭＡＤ５のリン酸化のための少なくとも１つの有効量は、０．０００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲内である。
【０１３１】
第２の態様によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する１つの実施形態においては、ＳＭＡＤ１および／またはＳＭＡＤ５のリン酸化のための少なくとも１つの有効量は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲内である。
【０１３２】
第２の態様によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する１つの実施形態においては、ＳＭＡＤ１および／またはＳＭＡＤ５のリン酸化のための少なくとも１つの有効量は、０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの範囲内である。
【０１３３】
第２の態様によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する１つの実施形態においては、ＳＭＡＤ１および／またはＳＭＡＤ５のリン酸化のための少なくとも１つの有効量は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌ範囲内である。
【０１３４】
第２の態様によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する１つの実施形態においては、ＳＭＡＤ１および／またはＳＭＡＤ５のリン酸化のための少なくとも１つの有効量は、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内である。
【０１３５】
組換えヒトＢＭＰ−９（ｒｈＢＭＰ−９）は、ヒト肺内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）のアポトーシスをインビトロで低減した。特に、２つの独立したアッセイであるＡｐｏＯｎｅ／ＣＴＢアッセイ、並びにＰＡＲＰに基づくウエスタンブロット分析で示されるとおり、５ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＢＭＰ−９での一晩の処置は、ヒトＰＡＥＣにおけるアポトーシスを低減した。したがって、ＢｓＡＢのＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を評価するためのもう１つの方法は、ＨＰＡＥＣ、ＨＡｏＥＣ、ＨＣＡＥＣまたはＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞のような初代内皮細胞を使用してＢｓＡＢの抗アポトーシス活性を分析することである。抗アポトーシス活性は、実施例６に記載されているＡｐｏＯｎｅ／ＣＴＢアッセイを含む種々のアッセイを用いて分析されうる。
【０１３６】
第２の態様による幾つかの好ましい実施形態においては、前記ＢｓＡＢの有効量は内皮細胞において抗アポトーシス効果をもたらす、すなわち、前記ＢｓＡＢの有効量は、アポトーシスの誘導時に観察される内皮細胞のアポトーシスまたはアポトーシス指数を低減する。
【０１３７】
これらの好ましい実施形態の幾つかにおいては、前記ＢｓＡＢの有効量は、ＴＮＦαおよび／またはシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の有効量で処理された内皮細胞のアポトーシスまたはアポトーシス指数を低減する。これらの幾つかの他の又は同じ好ましい実施形態において、前記ＢｓＡＢの有効量は、例えば実施例６に記載されているとおり、細胞の飢餓時に観察される内皮細胞のアポトーシスまたはアポトーシス指数を低減する。当技術分野で公知のとおり、アポトーシス指数（生細胞当たりのカスパーゼ３／７活性）はアポトーシスの指標である。前記の好ましい実施形態の幾つかにおいて、前記ＢｓＡＢの有効量は、ＴＮＦαおよび／またはシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の有効量で処理された内皮細胞のアポトーシスを低減する。前記の好ましい実施形態の幾つかにおいては、前記ＢｓＡＢの有効量は、細胞の飢餓時に観察される内皮細胞のアポトーシスを低減する。前記の好ましい実施形態の幾つかにおいては、前記ＢｓＡＢの有効量は、ＴＮＦαおよび／またはシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の有効量で処理された内皮細胞のアポトーシス指数を低減する。前記の好ましい実施形態の幾つかにおいては、前記ＢｓＡＢの有効量は、細胞の飢餓時に観察される内皮細胞のアポトーシス指数を低減する。
【０１３８】
幾つかの実施形態においては、内皮細胞は、ＨＰＡＥＣ、ＨＡｏＥＣ、ＨＣＡＥＣおよびＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を含む群から選択される。好ましい実施形態においては、ＴＮＦαおよびシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の有効量での処理は、実施例６および／または図３に記載されているとおりに行われる。好ましい実施形態においては、アポトーシス指数は、ＨＰＡＥＣ細胞に関しては、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦαおよび２０μｇ／ｍｌ  シクロヘキシミド（ＣＨＸ）での処理の４時間後に決定される。少なくとも１つの内皮細胞系におけるアポトーシス指数（生細胞当たりのカスパーゼ３／７活性）の低減を招くＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるとみなされる。
【０１３９】
少なくとも１つの内皮細胞系におけるアポトーシス指数（生細胞当たりのカスパーゼ３／７活性）の低減を招くＢｓＡＢは、低減が、ＢＭＰ−９での処置により誘発される低減に匹敵する場合、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニストであるとみなされる。
【０１４０】
第２の態様によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する１つの実施形態においては、ＢｓＡＢでの処置の後のアポトーシス指数は、ビヒクル対照のアポトーシス指数の１％未満〜９５％である。
【０１４１】
第２の態様によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する１つの実施形態においては、ＢｓＡＢでの処置の後のアポトーシス指数は、ビヒクル対照のアポトーシス指数の１％未満〜９０％である。
【０１４２】
第２の態様によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する１つの実施形態においては、ＢｓＡＢでの処置の後のアポトーシス指数は、ビヒクル対照のアポトーシス指数の１％未満〜８５％である。
【０１４３】
第２の態様によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する１つの実施形態においては、ＢｓＡＢでの処置の後のアポトーシス指数は、ビヒクル対照のアポトーシス指数の１％未満〜８０％である。
【０１４４】
第２の態様によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する１つの実施形態においては、ＢｓＡＢでの処置の後のアポトーシス指数は、ビヒクル対照のアポトーシス指数の６０％未満〜８０％である。
【０１４５】
第２の態様によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるＢｓＡＢに関する好ましい実施形態においては、ＢｓＡＢでの処置の後のアポトーシス指数は、約ｎ％と約ｍ％との間であり、ここで、ｎは、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９および７０からなる第１群の要素であり、ｍは、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９および８０からなる第２群の要素である。この特定の文脈においては、「約」なる語は＋／−０．５を意味する。
【０１４６】
ＢｓＡＢのＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を評価するためのもう１つの方法は、インビトロで内皮バリア機能の保存を分析するためのアッセイを使用することである。インビトロアッセイの一例は実施例７に記載されている（図４および５も参照されたい）。ＢＭＰ−９により誘発されるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性は、インビトロでの初代ヒト肺動脈内皮細胞における電気抵抗のＬＰＳ誘発性減少を抑制する。この設定においては、電気抵抗はＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達と内皮バリア機能との両方に関する適切な読出し指標である。
【０１４７】
そのようなインビトロアッセイのための適切な内皮細胞には、初代ヒト内皮細胞、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）、ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）およびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）が含まれる。媒体（ｖｅｈ）、ＢＭＰ−９またはＢｓＡＢの存在下でベースライン電気抵抗を１時間測定した後、内皮透過性を高める又は内皮細胞層のバリア機能を損なう１以上の物質を添加する。そのような物質の例としては、ＬＰＳおよびトロンビンである。内皮バリア機能に対するＢｓＡＢの効果をビヒクルおよびＢＭＰ−９と比較する。
【０１４８】
内皮単層の内皮電気抵抗を保存し、したがって内皮バリア機能をＢＭＰ９と同様に保存するＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニストであるとみなされる。
【０１４９】
内皮細胞における電気抵抗のトロンビン／ＬＰＳ誘発性の減少を有意に抑制するＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるとみなされる。
【０１５０】
第２の態様によるＢｓＡＢに関する好ましい実施形態においては、ＢｓＡＢの有効量とのプレインキュベーションは、少なくとも１つの内皮細胞系に関して、電気抵抗に対する有効量のトロンビンの効果を有意に低減する。幾つかの実施形態においては、トロンビンの有効量は０．５  Ｕ／ｍｌである。
【０１５１】
第２の態様によるＢｓＡＢに関する好ましい実施形態においては、ＢｓＡＢの有効量でのプレインキュベーションは、少なくとも１つの内皮細胞系に関して、電気抵抗に対する有効量のＬＰＳの効果を有意に低減する。幾つかの実施形態においては、ＬＰＳの有効量は４００ｎｇ／ｍｌである。
【０１５２】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性を評価するためのもう１つの方法は、インビボでの内皮バリア機能の保存を分析するためのアッセイを使用することである。適切なモデルは、実施例８に記載されている敗血症マウスモデルである。この方法においては、ＢＭＰ−９はマウス敗血症モデルにおける肺に浸潤する白血球の数を減少させる（気管支肺胞洗浄液における白血球数に対する効果に関しては、図６を参照されたい）。
【０１５３】
肺内への白血球の浸潤またはタンパク質の漏出をＢＭＰ９と同様に低減するＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニストであるとみなされる。
【０１５４】
ビヒクル対照と比較してＬＰＳ処置時に肺内への白血球（ＷＢＣ）の浸潤またはタンパク質の漏出を有意に低減するＢｓＡＢは、本発明によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性であるとみなされる。
【０１５５】
幾つかの実施形態においては、第２の態様によるＢｓＡＢの有効量での前処置は、ＬＰＳの有効量での処置時に敗血症マウスモデルの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）におけるＷＢＣの数を減少させる。幾つかの実施形態においては、ＬＰＳの有効量は５ｍｇ／ｋｇである。
【０１５６】
モノクロタリン（ＭＣＴ）で処置されたラットモデルは、肺動脈高血圧の広く使用されている動物モデルである。皮下注射後、ピロリジジンアルカロイドＭＣＴは肝臓によって活性化されて毒性ＭＣＴピロールになり、これは数日以内に肺血管系の内皮損傷を引き起こし、ついで小さな肺動脈が再形成（リモデリング）される（デノボ筋肉化および内側肥大）。実施例９に記載されているとおり、モノクロタリン（ＭＣＴ）で処置されたラットモデルは、本発明によるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性をインビボで評価するための代替的方法である。
【０１５７】
実施例９に記載されているとおりに得られる右心室質量と左心室質量と（右心室および左心室；後者は中隔を含む）の比が、ＢｓＡＢで処置されたモノクロタリン（ＭＣＴ）処置ラットモデルの動物においてビヒクル対照と比較して有意に小さい場合、ＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性である。
【０１５８】
別の方法においては、血漿プロＢＮＰレベルが、ＢｓＡＢで処置されたモノクロタリン（ＭＣＴ）処置ラットモデルの動物においてビヒクル対照と比較して同一条件下で有意に低い場合も、ＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性である。バイオマーカーｐｒｏＢＮＰの血漿レベルは当技術分野で公知のとおりに決定される。
【０１５９】
右心室圧および／または右心室肥大および／または血漿プロＢＮＰレベルをＢＭＰ９と同様に低減するＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニストであるとみなされる。
【０１６０】
Ｓｕｇｅｎ（ＳＵ５４１６）ラットモデルは、肺動脈高血圧について広く使用されている動物モデルである。ＶＥＧＦＲインヒビターＳＵ５４１６の皮下注射と低酸素雰囲気（１０％  Ｏ２）中での動物の収容との組合せは、進行性肺血管リモデリングを引き起こす。このアッセイは、第２の態様によるＢｓＡＢのアゴニスト活性を評価するためのもう１つの選択肢である。
【０１６１】
実施例１０に記載されているとおりに得られる右心室質量と左心室質量と（右心室および左心室；後者は中隔を含む）の比が、ビヒクル対照と比較してＢｓＡＢで処置されたＳｕｇｅｎラットモデルの動物において小さい場合、ＢｓＡＢはＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性である。
【０１６２】
別の方法においては、血漿プロＢＮＰレベルがＢｓＡＢで処置されたＳｕｇｅｎラットモデルの動物において、ビヒクル対照と比較して同一条件下で有意に低い場合も、ＢｓＡＢはＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対してアゴニスト性である。
【０１６３】
このモデルにおいて右心室圧および／または右心室肥大および／または血漿プロＢＮＰレベルをＢＭＰ９と同様に低減するＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニストであるとみなされる。
【０１６４】
本発明の第３の態様においては、第１の態様による抗体または第２の態様による抗体は、ｒｈＢＭＰ−９より低い骨形成活性を有する。
【０１６５】
ｒｈＢＭＰ−９より低い骨形成活性を有するＢｓＡＢは、副作用として骨形成を誘導する、より低いリスクを有する。第１の態様に関して記載されている各実施形態は、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第３の態様による各実施形態と組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。第１の態様に関して記載されている各実施形態は、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第３の態様による実施形態の各組合せと組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。第１の態様に関して記載されている実施形態の各組合せは、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第３の態様による各実施形態と組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。第１の態様に関して記載されている実施形態の各組合せは、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第３の態様による実施形態の各組合せと組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。
【０１６６】
第２の態様に関して記載されている各実施形態は、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第３の態様による各実施形態と組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。第２の態様に関して記載されている各実施形態は、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第３の態様による実施形態の各組合せと組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。第２の態様に関して記載されている実施形態の各組合せは、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第３の態様による各実施形態と組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。第２の態様に関して記載されている実施形態の各組合せは、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第３の態様による実施形態の各組合せと組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。
【０１６７】
第１の態様による少なくとも１つの実施形態と第２の態様による少なくとも１つの実施形態との組合せから得られる各実施形態は、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第３の態様による各実施形態と組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。
【０１６８】
第１の態様による少なくとも１つの実施形態と第２の態様による少なくとも１つの実施形態との組合せから得られる各実施形態は、組合せが明らかに不適合であると当業者がみなす場合を除き、第３の態様による少なくとも２つの実施形態の組合せにより得られる各実施形態と組合されることが可能であり、そして、具体的に示唆される。
【０１６９】
特に好ましい実施形態においては、本発明によるＢｓＡＢは、ＡＬＫ−２に結合しないか、あるいは１０−６Ｍを超えるＫＤでＡＬＫ−２または配列番号１１７の抗原に結合する。特に好ましい実施形態においては、第３の態様によるＢｓＡＢはＡＬＫ−２に結合しないか（例えば、図９を参照されたい）、あるいはＢＳＡのような無関係な抗原に対するアフィニティと同等以下のＡＬＫ−２に対する又は配列番号１１７の抗原に対するアフィニティを有する。非常に好ましい実施形態においては、第３の態様によるＢｓＡＢは、ＡＬＫ−２／ＢＭＰＲ−２の二量体化を誘導しない。骨形成活性はＡＬＫ−２シグナル伝達を介して生じると推定されており、したがって、ＡＬＫ−２結合および／または二量体化の省略は天然ＢＭＰ−９の骨形成活性を少なくとも部分的に回避すると推定されうる。ＡＬＫ−２／ＢＭＰＲ−２の二量体化をモニターするための適切なアッセイは、商業的に入手可能であり、本明細書に記載されているＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２アッセイと同じ原理に基づく。
【０１７０】
特に好ましい実施形態では、ＢｓＡＢが２つの結合ドメインを含み、ここで、第１結合ドメインがＡＬＫ−１に特異的であり、第２結合ドメインがＢＭＰＲ−２に特異的であり、そしてここで、前記ＢｓＡＢがＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有し、そしてここで、ＢｓＡＢがＡＬＫ−２／ＢＭＰＲ−２の二量体化を誘導しない、ＢｓＡＢを提供する。
【０１７１】
特に好ましい実施形態では、第１、第２または第３の態様によるＢｓＡＢは、ＢＳＡに対するＢｓＡＢの結合アフィニティと同等以下のアフィニティでＡＬＫ−２または配列番号１１７の抗原に結合する。
【０１７２】
特に好ましい実施形態では、ＢｓＡＢは２つの結合ドメインを含み、ここで、第１結合ドメインはＡＬＫ−１に特異的であり、第２結合ドメインはＢＭＰＲ−２に特異的であり、そしてここで、前記ＢｓＡＢはＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２の二量体化を促進し、そしてここで、ＢｓＡＢは、ＢＳＡに対するＢｓＡＢの結合アフィニティと同等以下のアフィニティでＡＬＫ−２または配列番号１１７の抗原に結合する。
【０１７３】
特に好ましい実施形態では、ＢｓＡＢが２つの結合ドメインを含み、ここで、第１結合ドメインがＡＬＫ−１に特異的であり、第２結合ドメインがＢＭＰＲ−２に特異的であり、そしてここで、前記ＢｓＡＢがＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２の二量体化を促進し、ここで、ＢｓＡＢがＡＬＫ−２／ＢＭＰＲ−２の二量体化を促進しない、ＢｓＡＢを提供する。
【０１７４】
特に好ましい実施形態では、ＢｓＡＢが２つの結合ドメインを含み、ここで、第１結合ドメインがＡＬＫ−１に特異的であり、第２結合ドメインがＢＭＰＲ−２に特異的であり、そしてここで、前記ＢｓＡＢがＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有し、そしてここで、有効量のＢｓＡＢが有効量のｒｈＢＭＰ−９より低い骨形成活性を有する又は骨形成活性を有さない、ＢｓＡＢを提供する。ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性の決定は、本明細書に特定されている任意の方法で行われうる。骨形成活性の決定は、本明細書に特定されている任意の方法で行われることが可能であり、好ましくは、Ｃ２Ｃ１２法を用いて行われる。
【０１７５】
ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有し、ｒｈＢＭＰ−９より低い骨形成活性を有するかまたは骨形成活性を有さないＢｓＡＢは、内皮機能障害を回復させ、右室収縮期血圧（ＲＶＳＰ）を低下させ、および／またはＰＡＨを回復させる可能性が高い。
【０１７６】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形成を促進することが公知である。ヒトＢＭＰ−９、ＢＭＰ−９変異体、およびデザイナーＢＭＰ−９、例えば変異ＢＭＰ−９変異体は、ＡＬＫ−２シグナル伝達を介して骨形成活性を誘発する可能性が高いのに対し、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２受容体複合体のみを特異的に標的化するＢｓＡＢでは、これとは異なる。本発明の抗体では、ＡＬＫ−１（およびＢＭＰＲ−２）に対するその真の特異性ゆえに、ＡＬＫ−２を介したシグナル伝達の誘導は起こりそうになく、更に特定のアッセイによって排除されうる（例えば、実施例１１、実施例１２）。
【０１７７】
ＢｓＡｂの潜在的骨形成活性は、野生型ＢＭＰの骨形成活性を評価するのに特異的な任意の方法を用いて評価されうる。ＢＭＰは多数の細胞型の成長（増殖）および分化を促進する。分化は、例えば、アルカリホスファターゼの発光レポーター、または熱量測定試薬、例えばアルシアンブルーもしくはＰＮＰＰを使用してモニターされうる（Ａｓａｈｉｎａら（１９９６）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２２２：３８−４７；Ｉｎａｄａら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｖｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２２：３１７−３２２；Ｊｏｒｔｉｋｋａら（１９９８）Ｌｉｆｅ  ＳｃＬ  ６２：２３５９−２３６８；Ｃｈｅｎｇら（２００３）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ９５Ａ：１５４４−１５５２）。
【０１７８】
マウス筋芽細胞系、例えばＣ２Ｃ１２（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１７７２）は、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を示すＢｓＡＢの骨形成活性を評価するための好ましい選択肢である。Ｃ２Ｃ１２細胞系は迅速に分化して、収縮性筋管を形成し、そして、特徴的な筋肉タンパク質を産生する。ＢＭＰでの処理は、筋芽細胞性から骨芽細胞性への、分化経路における変化（シフト）を引き起こす。Ｃ２Ｃ１２細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、骨芽細胞活性のマーカーとして使用されうる。実施例に記載されているとおり、アルカリホスファターゼアッセイキットはＡＬＰ活性の読出しに使用されうる。複数のアルカリホスファターゼアッセイキットが商業的に入手可能である。
【０１７９】
第３の態様による好ましい実施形態においては、第１の態様によるＢｓＡＢは、ｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０で処理されたＣ２Ｃ１２細胞が、同濃度のＢｓＡＢで処理されたＣ２Ｃ１２細胞より高いアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を有することにより特徴づけられる。特定の状況においては、ＥＣ５０は、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２二量体化アッセイから決定されるアゴニスト活性のＥＣ５０である（図８）。
【０１８０】
第３の態様による好ましい実施形態においては、第２の態様によるＢｓＡＢは、ｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０で処理されたＣ２Ｃ１２細胞が、同じ濃度のＢｓＡＢで処理されたＣ２Ｃ１２細胞より高いアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を有することにより特徴づけられる。
【０１８１】
第３の態様による好ましい実施形態においては、第１または第２の態様によるＢｓＡＢは、ｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０で処理されたＣ２Ｃ１２細胞が、ＢｓＡＢのＥＣ５０で処理されたＣ２Ｃ１２細胞より高いアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を有することにより特徴づけられる。
【０１８２】
ｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０で処理されたＣ２Ｃ１２細胞が同じ濃度のＢｓＡＢで処理されたＣ２Ｃ１２細胞より高いアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を有する場合、本発明によるＢｓＡＢは、ｒｈＢＭＰ−９より低い骨形成活性を有するとみなされる。ｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０（アゴニスト活性に関するもの）は、当技術分野で公知の滴定により決定される。
【０１８３】
ｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０で処理されたＣ２Ｃ１２細胞が、ＢｓＡＢのＥＣ５０で処理されたＣ２Ｃ１２細胞より高いアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を有する場合、本発明によるＢｓＡＢはｒｈＢＭＰ−９より低い骨形成活性を有するとみなされる。
【０１８４】
第３の態様による好ましい実施形態においては、第１の態様によるＢｓＡＢまたは第２の態様によるＢｓＡＢは、Ｃ２Ｃ１２細胞における骨形成活性を有さない。
【０１８５】
ＢｓＡＢ、例えばＢｓＡＢの有効量またはＥＣ５０でのＣ２Ｃ１２細胞の処理が、ビヒクル対照で処理されたＣ２Ｃ１２細胞より高いアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性をもたらさない場合、本発明によるＢｓＡＢはＣ２Ｃ１２細胞における骨形成活性を有さないとみなされる。
【０１８６】
インビトロまたはインビボで骨形成活性を評価するための更なる方法は当技術分野で公知である。しかし、明瞭化のために、ＢｓＡＢが、Ｃ２Ｃ１２アッセイに基づくｒｈＢＭＰ−９より低い骨形成活性を有するとみなされる場合は常に、この結果が優先される。
【０１８７】
初代細胞における活性をモニターするためにラット肢芽軟骨分化アッセイも用いられうる。別の実施形態においては、レポーター遺伝子またはキナーゼアッセイが使用されうる。ＢＭＰはＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達を活性化するため、ＳＴＡＴ応答性レポーター、例えばＧＦＰまたはルシフェラーゼを含有するＢＭＰ応答性細胞系が使用されうる（Ｋｕｓａｎａｇｉら（２０００）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１１：５５５−５６５）。例えば、腎細胞におけるＢＭＰ活性は、細胞に基づくアッセイを用いて決定されうる。例えば、ＷａｎｇおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２３２００−２３２０６を参照されたい。骨形成活性はラット異所性骨アッセイまたは哺乳類骨成長モデルによりインビボでも測定されうる。幾つかの実施形態においては、骨形成活性は非ヒト霊長類モデルにおいて測定される。これらのモデルはＩｓａａｃｓら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２４：１４６９−１４７７（２０１０）に記載されている。骨量および骨質を評価するための方法は当技術分野で公知であり、Ｘ線回折：ＤＸＡ：ＤＥＱＣＴ；ｐＱＣＴ、化学分析、密度分画、組織光度法、組織形態計測および組織化学分析（例えば、Ｌａｎｅら  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１８：２１０５−２１１５（２００３）に記載されているとおり）を包含する。皮質骨密度を決定するための１つのアッセイはマイクロ（Ｍｉｃｒｏ）ＣＴアッセイである。ｐＱＣＴ測定後、マイクロ（ｍｉｃｒｏ）ＣＴ評価は、例えば、大腿骨におけるＳｃａｎｃｏ  ｍＣＴ４０（Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ）を用いて行われうる。
【０１８８】
第４の態様においては、医薬としての使用のための第１、第２または第３の態様によるＢｓＡＢを提供する。
【０１８９】
幾つかの実施形態においては、医薬としての使用は、対象の、少なくとも１つの標的細胞におけるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達を増強またはレスキュー（救済）することを含む。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの標的細胞は、内皮細胞、例えば肺内皮細胞である。幾つかの実施形態においては、対象はヒトまたは哺乳動物である。幾つかの実施形態においては、医薬としての使用は、本発明によるＢｓＡＢの有効量をそれを要するヒト対象に投与することによる、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の調節を含む。幾つかの実施形態においては、医薬としての使用は、本発明によるＢｓＡＢの有効量をそれを要する対象に投与することによる、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の調節を含み、ここで、ＢｓＡＢは、骨形成活性を誘導しないか、および／または、ｒｈＢＭＰ−９の等用量もしくはＥＣ５０より低い骨形成活性を誘導する。幾つかの実施形態においては、医薬としての使用は、本発明によるＢｓＡＢの有効量を含む医薬組成物をそれを要する対象に投与することを含む。第４の態様による特定の実施形態においては、医薬としての使用は、併用療法（組合せ療法）を行うのに適した少なくとも１つの追加的な治療用物質、例えば、肺動脈の弛緩によって血圧を低下させるための物質、例えばＣａアンタゴニスト、ＥＴアンタゴニスト、ＰＤＥ  ＶインヒビターまたはｓＧＣ刺激物質を投与することを更に含む。
【０１９０】
第５の態様においては、血管疾患または肺高血圧の治療における使用のための、第１、第２または第３の態様によるＢｓＡＢを提供する。
【０１９１】
幾つかの実施形態においては、血管疾患または肺高血圧の治療における使用は、対象の少なくとも１つの標的細胞におけるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達を増強またはレスキューすることを含む。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの標的細胞は、内皮細胞、例えば肺内皮細胞である。幾つかの実施形態においては、対象は哺乳動物である。幾つかの好ましい実施形態においては、対象はヒト患者である。幾つかの実施形態においては、血管疾患または肺高血圧の治療における使用は、本発明によるＢｓＡＢの有効量を、それを要するヒト対象に投与することによる、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の調節を含む。幾つかの実施形態においては、血管疾患または肺高血圧の治療における使用は、本発明によるＢｓＡＢの有効量をそれを要する対象に投与することによる、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の調節を含み、ここで、ＢｓＡＢは骨形成活性を誘導せず、および／またはｒｈＢＭＰ−９の等用量より低い骨形成活性を誘導する。幾つかの実施形態においては、血管疾患または肺高血圧の治療における使用は、本発明によるＢｓＡＢの有効量を含む医薬組成物を、それを要する対象に投与することを含む。
【０１９２】
幾つかの実施形態においては、ＰＨは肺動脈高血圧（ＰＡＨ）である。幾つかの実施形態においては、ＰＡＨは１群ＰＡＨである。１群ＰＡＨは、例えば、特発性または原発性肺高血圧でありうるか、それらを含みうる。幾つかの実施形態においては、ＰＨは特発性肺動脈高血圧（ＩＰＡＨ）である。また、１群ＰＡＨは、幾つかの実施形態においては、家族性高血圧でありうるか、それを含みうる。幾つかの実施形態においては、１群ＰＡＨは、慢性低酸素症に続発する肺高血圧を含みうるか、それでありうる。幾つかの実施形態においては、１群ＰＡＨは、結合組織疾患、先天性心疾患（シャント）、肺線維症、門脈圧亢進症、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球症、薬物および／または毒素（例えば、拒食症、コカイン慢性肺閉塞性疾患、睡眠時無呼吸および住血吸虫症）（これらに限定されるものではない）に続発する肺高血圧を含みうるか、それらでありうる。幾つかの実施形態においては、１群ＰＡＨは、有意な静脈または毛細血管の関与（肺静脈閉塞性疾患、肺毛細血管腫症）に関連した肺高血圧を含みうるか、それでありうる。幾つかの実施形態においては、１群ＰＡＨは、左心室機能不全の程度に比例しない続発性肺高血圧に関連した肺高血圧を含みうるか、それでありうる。幾つかの実施形態においては、１群ＰＡＨは新生児における持続性肺高血圧を含みうるか、それでありうる。幾つかの実施形態においては、対象はヒトである。幾つかの実施形態においては、対象は哺乳動物である。
【０１９３】
第６の態様においては、治療、例えば肺高血圧の治療における使用のためのＢｓＡＢの適合性を試験するための方法であって、（ｉ）ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性を評価する工程を含む方法を提供する。
【０１９４】
第６の態様による幾つかの実施形態においては、前記方法は、治療、例えば肺高血圧の治療における使用のためのＢｓＡＢの適合性を試験するための方法であって、（ｉ）ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性を評価する工程、および／または（ｉｉ）ＢｓＡＢの骨形成活性を評価する工程を含む。
【０１９５】
第６の態様による幾つかの実施形態においては、治療は、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の機能不全により特徴づけられる疾患、例えば肺高血圧の治療である。
【０１９６】
第６の態様による幾つかの実施形態においては、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性の評価は、本明細書に記載されている適切な方法の１つにより行われる。
【０１９７】
第６の態様による幾つかの好ましい実施形態においては、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性の評価は、ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進するＢｓＡＢの能力を分析することにより行われる。第６の態様によるこれらの好ましい実施形態の幾つかにおいては、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性の評価は、Ｕ２ＯＳ  ＡＣＶＲＬ１／ＢＭＰＲ−２二量体化細胞系を使用することにより行われる。
【０１９８】
第６の態様による好ましい実施形態においては、（ｉ）ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進するＢｓＡＢの能力を分析し、（ｉｉ）所望により、ＡＬＫ−２およびＢＳＡに対するＢｓＡＢの結合アフィニティを比較し、そして、（ｉｉｉ）適合するものとしてＢｓＡＢを選択することを含む方法を提供し、ここで、ＢｓＡＢは、工程（ｉ）に従い決定される二量体化を少なくとも促進し、所望により、工程（ｉｉ）に従い決定される、ＢＳＡに対するＢｓＡＢｓのアフィニティと同等以下のアフィニティでＡＬＫ−２に結合する。
【０１９９】
第６の態様による好ましい実施形態においては、（ｉ）ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進するＢｓＡＢの能力を分析し、（ｉｉ）所望により、ＡＬＫ−２およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進するＢｓＡＢの能力を分析し、そして、（ｉｉｉ）適合するものとしてＢｓＡＢを選択することを含む方法を提供し、ここで、ＢｓＡＢは、工程（ｉ）に従い決定されるＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を少なくとも促進し、所望により、工程（ｉｉ）に従い決定されるＡＬＫ−２およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進しない。
【０２００】
第６の態様による好ましい実施形態においては、（ｉ）ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を促進するＢｓＡＢの能力を分析し、（ｉｉ）所望により、ＢｓＡＢの有効量の骨形成活性をＢＭＰ−９の有効量の骨形成活性と比較し、そして、（ｉｉｉ）適合するものとしてＢｓＡＢを選択することを含む方法を提供し、ここで、ＢｓＡＢは、工程（ｉ）に従い決定されるＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２の二量体化を少なくとも促進し、所望により、工程（ｉｉ）に従い決定される、ＢＭＰ−９の有効量より低い骨形成活性を示す。
【０２０１】
ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｕ２ＯＳ  ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２二量体化アッセイを使用してＢｓＡＢのＥＣ５０が決定されうる場合、ＢｓＡＢは、治療、例えば肺高血圧の治療における使用に適しているとみなされる。しかし、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｕ２ＯＳ  ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２二量体化アッセイによってＥＣ５０が決定できない場合でも、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性をアッセイするための本明細書に記載の代替方法がＢｓＡＢに対する有意なアゴニスト活性を示すのであれば、本発明によるＢｓＡＢは尚も適切でありうる。Ｕ２ＯＳ  ＡＣＶＲＬ１／ＢＭＰＲ−２二量体化アッセイにおいて、本発明による二重特異性抗体のＥＣ５０がＢＭＰ−９のＥＣ５０以上である場合、ＢｓＡＢは、治療、特に肺高血圧の治療における使用に特に適しているとみなされる。
【０２０２】
第６の態様によるもう１つの好ましい実施形態においては、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性の評価は、本発明の第２の態様に関して記載されているとおり、ＳＭＡＤ１／ＳＭＡＤ５リン酸化に関するアッセイにより行われる。
【０２０３】
ＢｓＡＢまたは化合物は、前記抗体または化合物の有効量がＳＭＡＤ１および／またはＳＭＡＤ５のリン酸化を誘導する場合、治療、例えば肺高血圧の治療における使用に適しているとみなされる。例えば、ＳＭＡＤ５のリン酸化に対するｒｈＢＭＰ−９の有効量は１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌである（図２を参照されたい）。
【０２０４】
ＢｓＡＢの有効量が内皮細胞系におけるＳＭＡＤ１の誘導および／またはＳＭＡＤ５リン酸化を招き、これが、ｒｈＢＭＰ−９の有効量での処置の際に生じる誘導に匹敵する場合、ＢｓＡＢまたは化合物は、治療、例えば肺高血圧における治療における使用に特に適しているとみなされる。注目すべきことに、ＢｓＡＢとＢＭＰ−９との必要濃度は互いに大きく異なりうる。
【０２０５】
第６の態様によるもう１つの好ましい実施形態においては、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性の評価は、初代内皮細胞、例えばＨＰＡＥＣ、ＨＡｏＥＣ、ＨＣＡＥＣまたはＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞（実施例６に記載されているとおり）を使用してＢｓＡＢの抗アポトーシス活性を分析することにより行われる。
【０２０６】
ＢｓＡＢの有効量が内皮細胞のアポトーシス指数を低減する場合、ＢｓＡＢまたは化合物は、治療、例えば肺高血圧の治療における使用に適しているとみなされる。幾つかの実施形態においては、内皮細胞は、ＨＰＡＥＣ、ＨＡｏＥＣ、ＨＣＡＥＣおよびＨＭＶＥＣ−Ｌ細胞を含む群から選択される。
【０２０７】
少なくとも１つの内皮細胞系においてアポトーシス指数（生細胞当たりのカスパーゼ３／７活性）の低減を招くＢｓＡＢは、肺高血圧の治療における使用に適しているとみなされる。
【０２０８】
少なくとも１つの内皮細胞系においてアポトーシス指数（生細胞当たりのカスパーゼ３／７活性）の低減を招く本発明のＢｓＡＢは、該低減が、ＢＭＰ−９での処置により誘導される低減に匹敵する場合、肺高血圧の治療における使用に適しているとみなされる。
【０２０９】
第６の態様によるもう１つの好ましい実施形態においては、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性の評価は、インビトロまたはインビボでの内皮バリア機能の保存を分析するためのアッセイを使用することにより行われる。
【０２１０】
幾つかの実施形態においては、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性の評価は、実施例７に記載されているアッセイにより行われる。幾つかの実施形態においては、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性の評価は、実施例８に記載されている敗血症マウスモデルにおける内皮バリアの評価により行われる。幾つかの実施形態においては、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性の評価は、実施例９に記載されているモノクロタリン誘発性肺高血圧ラットモデルを使用して行われる。幾つかの実施形態においては、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢのアゴニスト活性の評価は、実施例１０に記載されているｓｕｇｅｎ／低酸素症誘発肺高血圧ラットモデルを使用して行われる。
【０２１１】
ＢｓＡＢが、前記アッセイのいずれかに基づいて、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するアゴニスト活性を有するとみなされる場合、ＢｓＡＢは肺高血圧の治療における使用に適しているとみなされる。
【０２１２】
第６の態様による好ましい実施形態においては、ＢｓＡＢの骨形成活性の評価は、本明細書に記載されている方法のいずれか１つにより行われる。
【０２１３】
第６の態様による好ましい実施形態においては、ＢｓＡＢの骨形成活性の評価は、Ｃ２Ｃ１２アッセイを使用することにより行われる。
【０２１４】
所定濃度のＢｓＡＢで処理されたＣ２Ｃ１２細胞が、同じ濃度のｒｈＢＭＰ−９で処理されたＣ２Ｃ１２細胞より高いアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を有し、ここで、前記所定濃度がｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０である場合、ＢｓＡＢは、治療における、例えば肺高血圧の治療における使用に適していないとみなされる。
【０２１５】
ｒｈＢＭＰ−９のＥＣ５０で処理されたＣ２Ｃ１２細胞が、同じ濃度のＢｓＡＢで処理されたＣ２Ｃ１２細胞より高いアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を有することにより特徴づけられる場合、ＢｓＡＢは、治療、例えば肺高血圧の治療における使用に適しているとみなされる。
【０２１６】
第７の態様においては、態様１、２、３、４または５のいずれか１つによるＢｓＡＢと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、予防用成分を包含する１以上の更なる治療用成分をも含有しうる。担体は、製剤のその他の成分に適合し、その被投与者に有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。第７の態様による１つの実施形態においては、予防用成分を包含する前記の１以上の更なる治療用成分は、肺動脈の弛緩によって血圧を低下させる少なくとも１つの物質である。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】図１は、内皮細胞における内皮ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２を選択的に活性化する抗体の概要図である。ＡＬＫ−２／ＢＭＰＲ−２を発現する他の細胞型においては、ＡＬＫ−２シグナル伝達は活性化されない。
【図２】図２は、培養ヒト肺内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）においてインビトロで組換えヒトＢＭＰ−９（ｒｈＢＭＰ−９）がＳＭＡＤ１および／または５リン酸化（それぞれｐＳｍａｄ１およびｐＳｍａｄ５）を誘導したことを示す。示されている濃度のＢＭＰ−９を細胞培養培地に加え、２時間後に細胞溶解を行い、ついでウエスタンブロット分析を行った。ベータアクチン染色をローディング対照として用いた。
【図３】図３は組換えヒトＢＭＰ−９（ｒｈＢＭＰ−９）での処置の後のヒト肺内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）におけるインビトロでのアポトーシスの低減を示す。ＨＰＡＥＣを５ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＢＭＰ−９と共に１６時間インキュベートした。１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦαおよび２０μｇ／ｍｌ  シクロヘキシミド（ＣＨＸ）を加え、４時間後、ＡｐｏＯｎｅ／ＣＴＢアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従い使用して細胞アポトーシスを測定した。
【図４】図４は、ＬＰＳにさらされたＨＰＡＥＣ単層の電気抵抗に対するヒトＢＭＰ−９の効果を示す。４００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳはＢＭＰ−９の非存在下で電気抵抗を低下させ、したがって内皮バリア機能を低下させるが、２０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−９と１時間プレインキュベートした場合には、ＨＰＡＥＣに影響を及ぼさない。
【図５】図５は、トロンビンにさらされたＨＰＡＥＣ単層の電気抵抗に対するヒトＢＭＰ−９（ＢＭＰ−９）の効果を示す。２０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−９は、電気抵抗に対する、したがってＨＰＡＥＣ単層の内皮バリア機能に対する０．５Ｕ／ｍｌ  トロンビンの効果を有意に低減した。
【図６】図６は敗血症のマウスモデルの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）における白血球（ＷＢＣ）数に対するＢＭＰ−９の効果を示す。５ｍｇ／ｋｇ  ＬＰＳの単回腹腔内注射の４８時間後に気管支肺胞洗浄を行った。毎日の１００ｎｇ／動物のＢＭＰ−９での処置をＬＰＳ注射の１時間前に開始した（ＬＰＳ  ＋  ＢＭＰ−９）。ＬＰＳの投与を受けたがＢＭＰ−９（ＬＰＳ）での処置を受けなかった動物には、ＬＰＳ投与の１時間前からビヒクル（ＰＢＳ）を毎日腹腔内注射した。対照動物（対照）はＬＰＳの投与もＢＭＰ−９の投与もビヒクルの投与も受けなかった。＊：ｐ＜０．０５；対ＬＰＳ（一元配置分散分析、フィッシャーのＬＳＤ検定）；平均±ＳＥＭ、ｎ＝６〜７。ＢＭＰ−９は肺内皮細胞におけるバリア機能を回復させ、ＢＭＰ−９は、インビボマウス敗血症モデルにおいて、肺内への白血球のＬＰＳ誘発性移行を低減する（１００ｎｇ  ＢＭＰ−９、１時間後に５ｍｇ  ＬＰＳ／ｋｇ  ｉｐ、ＬＰＳの４８時間後にＢＡＬ）。
【図７】図７は、ヘテロ二量体ヒトＩｇＧ  Ｆｃに連結された２つの単一特異性抗体ｓｃＦｖフラグメントが組合されたｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｋｉｈ）構築物の概要図である。白：ＢＭＰＲ−２に特異的なｓｃＦｖ、灰色：ＡＬＫ−１に特異的なｓｃＦｖ、黒：陰影付き円により表されるノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）変異を有するヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン。
【図８】図８は、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号９３−０９６２Ｃ３）から入手したＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｕ２ＯＳ  ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２二量体化細胞アッセイにおけるアゴニスト性ＢｓＡｂｓ  ＴＰＰ−１４６６９およびＴＰＰ−１４７１９の結果を示す。
【図９】図９は、ＡＬＫ−２／ＢＭＰＲ−２受容体と比較したＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２受容体複合体の選択性データを示し、ここで、アゴニスト抗体の特異性はＥＬＩＳＡにより評価されている。抗原ヒトＡＬＫ−１−ＦｃおよびヒトＡＬＫ−２−Ｆｃを２μｇ／ｍｌでコーティングし、ＴＰＰ−１４６９６およびＴＰＰ−１４７１９の結合を抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｉ９５１３）により検出し、ついで抗マウスＩｇＧ（全分子）−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａ９０４４、１：４００００）により検出した。
【表１】
2021501759.tif 000002
2021501759.tif 000003
2021501759.tif 000004
【０２１８】
実施例
実施例１  ＢＭＰＲ−２およびＡＬＫ１に対する結合体の特定：
ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ抗体ライブラリーからの抗体作製
完全ヒト抗体ファージ提示ライブラリー（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ  ｎ−ＣｏＤｅＲ  ＦａｂラムダおよびｓｃＦｖラムダライブラリー）を使用して、可溶性ビオチン化抗原に対する選択により、本発明のヒトモノクローナル抗体を単離した。以下のプロトコルを両方のライブラリに適用した。ストレプトアビジン結合ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）をビオチン化抗原（１チューブ）およびビオチン化オフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）（３チューブ）でそれぞれ室温（ＲＴ）で１時間コーティングした。ダイナビーズを洗浄し、ついで、転倒回転（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）させながら室温で１時間ブロッキングした。オフターゲット結合体の枯渇のために、ブロッキングされたファージライブラリを、ブロッキングされたオフターゲットがローディングされたダイナビーズに添加し、転倒回転させながら室温で１０分間インキュベートした。この枯渇工程を２回繰り返した。枯渇したファージライブラリーを、ブロッキングされたターゲットがローディングされたダイナビーズに加え、転倒回転させながら室温で６０分間インキュベートした。ストリンジェントな洗浄［ブロッキングバッファー中で３回およびＰＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ＝７．４〜７．６に調整）（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０の存在下）中で９回］の後、コーティングされた標的に特異的に結合するＦａｂファージを含有するダイナビーズを直接使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１に感染させた。ついで、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して、大腸菌株ＨＢ１０１においてファージを増幅した。次の選択ラウンドにおいて、標的濃度を減少させて、高アフィニティ結合体のための選択圧を増加させた。最初の定性評価においては、各クローンプールに関して、ランダムに選択された８８個のＦａｂファージクローンのモノクローナル培養および発現を行い、ついで、パンニングに予め使用されたそれぞれの標的への結合を試験した。特定の例においては、「結合体」は、少なくとも非結合性対照Ｆａｂ−ファージ分子の平均シグナル強度に標準偏差の１０倍を加えたシグナル強度をＥＬＩＳＡアッセイにおいて示すＦａｂ−ファージ分子である（非標的結合性Ｆａｂファージの、平均  ＋  １０×標準偏差）。次の工程において、ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２パンニングクローンプールに由来する３９７４４および３８２７２クローンのＶＨおよびＶＬをそれぞれ配列した。望ましくない配列の特徴および停止コドンを有するクローンを除去した。異なるアミノ酸配列を有する４４８３および１０５９  ＶＨ／ＶＬの組合せが、それぞれ、ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２パンニングプール由来のクローンに関して見出された。それぞれのＶＨ／ＶＬの異なる配列の組合せに関して、最大４つの代表的クローンを選択し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で検査した。ＡＬＫ−１パンニングクローンプールに由来するクローンの場合、標的であるヒトＡＬＫ−１およびマウスＡＬＫ−１、ならびにオフターゲット（標的外）であるヒトＲＯＲ１−Ｆｃ（配列番号１１３）への結合を測定した。ＢＭＰＲ−２パンニングクローンプールに由来するクローンの場合、標的であるヒトＢＭＰＲ−２、およびオフターゲットであるヒトＲＯＲ１−Ｆｃへの結合を測定した。その目的のために、ストレプトアビジンでコーティングされた３８４ウェルプレートを、まず、それぞれのタンパク質でコーティングした。ついで、プレートを洗浄し、そして、スクリーニングされる抗体フラグメントを発現するように形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物からの可溶性ｓｃＦｖ、可溶性Ｆａｂまたはファージ上Ｆａｂ（Ｆａｂ−ｏｎ−Ｐｈａｇｅ）を含む上清と共にインキュベートした。ついで、結合していない抗体フラグメントは洗浄により除去した。次に、検出用の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して、プレートに結合した抗体フラグメントを検出した。異なるＶＨ／ＶＬアミノ酸配列の組合せを有し、ヒトおよびマウスのＡＬＫ−１に特異的に結合する２００個のクローンを特定した。異なるＶＨ／ＶＬアミノ酸配列の組合せを有し、ヒトＢＭＰＲ−２に特異的に結合する３８８個のクローンを特定した。
【０２１９】
実施例２  受容体結合活性／抗体の生化学的特性の評価
受容体結合活性は、野生型ＢＭＰの活性を評価するのに適した任意の方法を用いて評価されうる。１以上のＢＭＰ受容体に対するＢｓＡｂのアフィニティは受容体結合アッセイにより決定されうる。例えば、ＡＬＫ−２、ＡＬＫ−３、ＡＬＫ−６、ＡｃｔＲｌｌ、ＡｃｔＲｌｌｂまたはＢＭＰＲｌｌに対するアフィニティが決定されうる。適切な結合アッセイには、ＥＬＩＳＡ、蛍光異方性および強度、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｐｅａｒｃｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：８１−８９（１９９９））、ＤＥＬＦＩＡアッセイ、ならびにＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｂｏｓｓｅ  Ｒ．，Ｉｌｌｙ  ＣおよびＣｈｅｌｓｋｙ  Ｄ（２００２））が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２２０】
例えば、Ｂｉａｃｏｒｅまたは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを用いる（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｇｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：５７２−５７７（２００１））。受容体またはＢｓＡｂを蛍光色素で標識することにより、蛍光アッセイが容易に開発されうる。加えて、受容体結合アフィニティを決定するために、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）が用いられうる。
【０２２１】
シリーズＳセンサーチップ（Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐｓ）ＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を備えたＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．）を使用して、定量的結合分析のためのＳＰＲ実験を行った。アッセイバッファーＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を使用して、２５℃で結合アッセイを行った。抗原を、アミンカップリング化学法によりチップ表面に共有結合で固定化した。パンニングおよびスクリーニング中に本発明の抗体を単離するために既に使用したのと同じタンパク質［マウスＡＬＫ−１−Ｆｃ配列番号１１４、ヒトＡＬＫ−１−Ｆｃ配列番号１１６およびＢＭＰＲ−２−Ｆｃ配列番号１１５（ヒト体とマウス体との細胞外部分は同一）］を、ＫＤ値を決定するためのアナライトとしてここで使用した。アミンカップリング用試薬（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、エタノールアミン−ＨＣｌ  ｐＨ８．５）は、アミンカップリングキット（Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、製品コードＢＲ−１０００−５０）からのものを使用した。センサーチップ表面は、０．２Ｍ  ＥＤＣおよび０．０５Ｍ  ＮＨＳの新たに調製した溶液をセンサーチップ表面上に１０μｌ／分の流量で４２０秒間通過させて活性化し、ついで抗原（固定化バッファー、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中、０．５μｇ／ｍｌに溶解）を５０ＲＵの目標値で注入した。１モル濃度溶液のエタノールアミンを１０μｌ／分の流量で４２０秒間注入することにより、過剰な活性化基をブロッキングした。
【０２２２】
速度論およびアフィニティを決定するために、１．５６ｎＭ〜２００ｎＭの一連の濃度の抗体を固定化抗原上に３０μｌ／分の流速で１８０秒間注入し、解離を１０分間モニターした。１回のアナライトの注入からなる各アッセイサイクルの後、再生溶液（グリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．５）でセンサー表面を２０秒間再生させた。
【０２２３】
得られたセンサーグラムを二重参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（参照セル補正およびそれに続くバッファーサンプル減算）した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアパッケージ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）において実装された１次１：１ラングミュア結合モデルを使用する大域（ｇｌｏｂａｌｌｙ）フィッティングセンサーグラムにより得られた解離（ｋｄ）速度定数および結合（ｋａ）速度定数の比に基づいて、ＫＤ値を計算した。
【０２２４】
２つのＢＭＰＲ２ならびに２つのマウスおよびヒトＡｌｋ１  ｘ反応性結合体を表１に例示として示す。
【表２】
2021501759.tif 000005
【０２２５】
実施例３：ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｋｉｈ）形態でのＢｓＡｂの構築および発現
最初の工程において、標的ＢＭＰＲ−２およびＡＬＫ−１に対するＢｉｏＩｎｖｅｎｔ  ｎ−ＣｏＤｅＲ  ＦａｂラムダおよびｓｃＦｖラムダライブラリーから得た全ての結合体を、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ｄ  Ｅｄ．１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．Ｖｏｌｓ．１−３）を用いて、１つの適合ｓｃＦｖ形態に変換した。ＶＨ配列を、１５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）３リンカーにより、それぞれの結合性結合体のＶＬ配列に連結した。ついで、ＡＬＫ−１に対する、生じた全てのｓｃＦｖ結合ドメインを、ノブ（ｋｎｏｂ）変異を含有するヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインに融合させ、一方、全てのＢＭＰＲ−２  ｓｃＦｖ結合ドメインを、ホール（ｈｏｌｅ）変異を含有するヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメインに融合させた。ｓｃＦｖ結合ドメインを、配列ＧＧ  ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ  ＧＧＳＧを介して、それぞれのＦｃヘテロ二量体化ドメインに連結する（図７）。ＡＬＫ−１  ｓｃＦｖ−リンカー−Ｆｃ（ノブ）およびｓｃＦｖ−リンカー−Ｆｃ（ホール）結合性構築物の両方を、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞内での発現のためにベクターｐＴＴ５内にクローニングした。それぞれのＡＬＫ−１特異的ノブ構築物をそれぞれのＢＭＰＲ−２特異的ホール構築物と組合せることにより、ＡＬＫ−１およびＢＭＰＲ−２に結合するＢｓＡｂの組合せセットを作製し、ついで、これを潜在的アゴニストペアに関してスクリーニングした。
【０２２６】
実施例４  アゴニスト活性の評価：
ＡＬＫ  １およびＢＭＰＲ−２を発現する組換え細胞におけるＢｓＡＢのアゴニスト活性
本発明の分子を潜在的アゴニスト活性に関して試験するために、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手したＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｕ２ＯＳ  ＡＬＫ  １／ＢＭＰＲ−２二量体化細胞（カタログ番号９３−０９６２Ｃ３）を使用した。細胞播種、細胞培養、細胞培養培地刺激培地に必要な全ての製品は、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。細胞の取り扱いおよび潜在的アゴニスト活性に関する分子の試験は、製造業者の説明に従い行った。シグナル強度の増加（例えば、天然リガンドＢＭＰ−９に匹敵するもの）をもたらす分子は、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２の二量体化を強く促進する。シグナル強度の増加（例えば、天然リガンドＢＭＰ−９に匹敵するもの）をもたらす分子は、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニスト効果を有するＢｓＡＢとみなされる。スクリーニングした１２４０個の二重特異性物質のうちの３６個の分子がシグナル強度の増加をもたらし、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニスト効果を有するＢｓＡＢとみなされた。図８に、アゴニスト性ＢｓＡＢであるＴＰＰ−１４６６９およびＴＰＰ−１４７１９の結果を表２における分子組成の概要と共に示す。
【表３】
2021501759.tif 000006
【０２２７】
実施例５  アゴニスト活性の評価：
初代内皮細胞を使用したＢｓＡＢｓアゴニスト活性の測定
ＢｓＡｂのアゴニスト活性を試験するために使用される初代ヒト内皮細胞は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨまたはＬｏｎｚａ（ロンザ）（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から入手される。ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ：ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２４１）；ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２０３）；ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２７１）；ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２２１）；Ｌｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）：ヒト肺動脈内皮細胞（カタログ番号ＨＰＡＥＣ）（ＣＣ−２５３０）；ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）（カタログ番号ＣＣ−２５２７）。
【０２２８】
ＢＭＰ−９はＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の天然活性化因子であるので、全ての試験は、組換えヒトＢＭＰ−９を参照体として使用して行われる。その方法の以下の説明に従い、ＢＭＰ−９は、肺動脈高血圧の病因に関与する内皮細胞型であるＨＰＡＥＣにおいて、Ｓｍａｄ１／５のリン酸化を示した（図２）。
【０２２９】
製造業者の説明に従い細胞を培養する。全ての培地および試薬はＰｒｏｍｏｃｅｌｌまたはＬｏｎｚａから入手される。ＢｓＡＢのアゴニスト活性を分析するために、細胞を６ウェルマイクロタイタープレート内に播種する。１日間の増殖の後、培地を０．１％のウシ胎児血清を含有する飢餓培地と交換し、細胞を更に２４時間培養する。この後、細胞を、種々の濃度のＢＭＰ−９および種々の濃度のＢｓＡＢと共に２〜４時間インキュベートする。タンパク質ライセートの調製のために、１×停止プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターカクテル（１００×停止プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターカクテル、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７８４４０）を含有する１×ＲＩＰＡバッファー（１０×ＲＩＰＡバッファー、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１５６０３４）中で細胞を細胞溶解させる。粗タンパク質抽出物の調製は、製造業者のプロトコルに従い行う。タンパク質サンプルをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）により分離し、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜上に転写（トランスファー）し、ＢＭＰ−９依存性シグナル伝達分子ＳＭＡＤ−１およびＳＭＡＤ−５のリン酸化状態を、特異的抗ホスホＳＭＡＤ−１および抗ホスホＳＭＡＤ−５抗体（ＮＥＢ、Ｓｍａｄ  １／５／９抗体サンプラーキット、カタログ番号１２６５６Ｔ）を使用して分析する。天然リガンドＢＭＰ−９に匹敵する、内皮細胞におけるＳＭＡＤ１またはＳＭＡＤ５リン酸化の誘導をもたらす分子は、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニスト効果を有するＢｓＡＢとみなされる。
【０２３０】
実施例６  アゴニスト活性の評価：
初代内皮細胞を使用したＢｓＡＢｓ抗アポトーシス活性の測定
ＢｓＡｂのアゴニスト活性を試験するために使用される初代ヒト内皮細胞はＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨまたはＬｏｎｚａ（ロンザ）（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から入手される。ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ：ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２４１）；ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２０３）；ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２７１）；ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２２１）；Ｌｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）：ヒト肺動脈内皮細胞（カタログ番号ＨＰＡＥＣ）（ＣＣ−２５３０）；ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）（カタログ番号ＣＣ−２５２７）。
【０２３１】
ＢＭＰ−９はＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の天然活性化因子であるので、一般に、全ての試験は、ＢＭＰ−９を参照体として使用して行われる。その方法の以下の説明に従い、ＢＭＰ−９はＨＰＡＥＣにおけるアポトーシス指数を減少させた（図３）。
【０２３２】
製造業者の説明に従い細胞を培養する。全ての培地および試薬はＰｒｏｍｏＣｅｌｌまたはＬｏｎｚａから入手される。ＢｓＡＢのアゴニスト活性を分析するために、１日間の増殖の後、培地を０．１％のウシ胎児血清を含有する飢餓培地と交換し、細胞を更に２４時間培養する。この後、細胞を種々の濃度のＢＭＰ−９および種々の濃度のＢｓＡＢと共に一晩インキュベートする。最後に、ＡｐｏＯｎｅ／ＣＴＢアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明に従い使用して、内皮細胞のアポトーシス指数を決定する。天然リガンドＢＭＰ−９に匹敵する、内皮細胞におけるアポトーシス指数（生細胞当たりのカスパーゼ３／７活性）の低下をもたらす分子は、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニスト効果を有するＢｓＡＢとみなされる。例えば、アポトーシスを誘導し、そして該効果がＢｓＡＢの有効量の添加によりレスキューされうるかどうかを判定するために、細胞をＴＮＦαおよびシクロヘキシミド（ＣＨＸ）と共に４時間インキュベートすることが可能である。
【０２３３】
実施例７  アゴニスト活性の評価：
インビトロでの内皮バリア機能の保存の測定
ＢｓＡｂのアゴニスト活性を試験するために使用される初代ヒト内皮細胞はＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨまたはＬｏｎｚａ（ロンザ）（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から入手される。ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ：ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２４１）；ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２０３）；ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２７１）；ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）（カタログ番号Ｃ−１２２２１）；Ｌｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）：ヒト肺動脈内皮細胞（カタログ番号ＨＰＡＥＣ）（ＣＣ−２５３０）；ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）（カタログ番号ＣＣ−２５２７）。
【０２３４】
ＢＭＰ−９はＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の天然活性化因子であるので、前記のとおり、全ての試験は、ＢＭＰ−９を参照体として使用して行われる。その示された方法の以下の説明に従い、ＬＰＳ（リポ多糖）（図４）またはトロンビン（図５）はいずれもＨＰＡＥＣ（Ｌｏｎｚａ）の電気抵抗（内皮バリア機能を測定するものである）を低下させたが、ＢＭＰ−９は内皮バリア機能を保存した。
【０２３５】
製造業者の説明に従い細胞を培養する。全ての培地および試薬はＰｒｏｍｏｃｅｌｌまたはＬｏｎｚａから入手される。内皮細胞を、金微小電極（例えば、ＥＣＩＳ  ８Ｗ１０Ｅ＋）を含有する１％  ゼラチンコート化バイオチップ上に播く。播種後の第２日に、ビヒクル、ＢＭＰ−９またはＢｓＡＢの存在下、細胞を１時間血清飢餓状態にする。ついで電気セル−基板インピーダンスセンシングシステム（ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（例えば、ＥＣＩＳ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｔｒｏｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して、４０００Ｈｚの周波数で電気抵抗を測定する。ビヒクル（ｖｅｈ）、ＢＭＰ−９またはＢｓＡＢの存在下でベースライン電気抵抗を１時間測定した後、それぞれ内皮細胞層のバリア機能を損なうＬＰＳ、トロンビンまたは内皮透過性を高める他の物質を細胞培地に加える。内皮バリア機能に対するＢｓＡＢの効果を、ビヒクルおよびＢＭＰ−９と比較する。内皮単層の内皮電気抵抗、したがって内皮バリア機能をＢＭＰ９様で保存するＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニスト効果を有するＢｓＡＢとみなされる。
【０２３６】
実施例８  アゴニスト活性の評価：
敗血症マウスモデルにおける内皮バリア機能の測定
ＢＭＰ−９はＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達の天然活性化因子であるので、前記のとおり、全ての試験は、ＢＭＰ−９を参照体として使用して行われる。その方法の以下の説明に従い、ＢＭＰ  ９は、マウス敗血症モデルにおける肺に浸潤する白血球の数を減少させた。（図６）。
【０２３７】
６〜８週齢、体重１８〜２２ｇの雄ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をイソフルラン（５％  ｖ／ｖ）でチャンバー内で麻酔する。全身性炎症（敗血症）を誘発するための５ｍｇ／ｋｇ  ＬＰＳの腹腔内注射の１時間前に、動物に、ＢｓＡＢ、１００ｎｇ／動物のＢＭＰ  ９またはビヒクルの腹腔内注射を行う。対照動物は未処置のままである。ＢＭＰ  ９の公知半減期に基づいて、ＢＭＰ  ９で処置された動物は、最初の投与の２４時間後および４８時間後に更に１００ｎｇ／動物の投与を受ける。ビヒクルの投与を受けた動物は毎日のビヒクルの注射も受ける。ＢｓＡＢの薬物動態プロファイルに応じて、動物は最初の注射の２４時間後および／または４８時間後にＢｓＡＢの注射を、更に受けるまたは受けない。ＢｓＡＢの最初の注射が該試験全体にわたって効率的なレベルをもたらす場合、動物は代わりにビヒクルの投与を受ける。ＬＰＳの適用から４８時間後、ＢＭＰ  ９、ビークルまたはＢｓＡＢ／ビヒクルの最後の注射からそれぞれ１時間後、マウスを、ケタミン／ロンプン（２００ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ）による深麻酔および最終的な放血により犠死させる。気管にカニューレを挿入し、動物の肺を、３回（毎回、０．５ｍｌの氷冷０．９％生理食塩水で）洗浄する（気管支肺胞洗浄液、ＢＡＬＦ）。ＢＡＬＦにおける白血球数を細胞計数器またはＦＡＣＳ装置で自動的に計数する。ＢＡＬＦの総タンパク質含有量を、測光標準プロトコルを用いて決定する。肺内への白血球の浸潤またはタンパク質の漏出をＢＭＰ  ９と同様に低減するＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニスト効果を有するＢｓＡＢとみなされる。
【０２３８】
実施例９  インビボでのアゴニスト活性の評価：
ラットにおけるモノクロタリン誘発性肺高血圧におけるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢｓ活性の測定
体重２５０〜２８０ｇの成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入する。ラットはイソフルラン麻酔（２％  ｖ／ｖ）下で６０ｍｇ／ｋｇ  ＭＣＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１回の皮下注射を受ける。したがって、ＭＣＴを１Ｍ  ＨＣｌ水溶液に溶解し、生理食塩水で希釈し、１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．４に中和して、ラット当たり最終注射量を０．５ｍｌにする。ＭＣＴ注射の１４日後、動物を、第２８日の最終血行動態分析の日までＢｓＡＢまたはＢＭＰ−９またはビヒクルのいずれかで１４日間処置されるように無作為化する。対照動物は未処置のままにする。ＢＭＰ  ９の公知半減期に基づいて、動物は７５０ｎｇ／動物の毎日の腹腔内注射を受ける。ビヒクルの投与を受けた動物は毎日のビヒクルの注射も受ける。ＢｓＡＢで処置された動物は、その薬物動態プロファイルに応じて注射を受ける（前記を参照されたい）。ＢｓＡＢの注射の必要頻度が毎日より低い場合、注射の回数が各処置群において同一になることが保証されるように、動物は代わりにビヒクルの投与を受ける。ＭＣＴの注射後の第２８日に、ラットをペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ）で麻酔する。気管切開後、人工換気の条件下、イソフルラン（１．８％  ｖ／ｖ）の吸入により麻酔を維持する。ＦｉＯ２を０．５に、呼吸量を６０ストローク／分で１０ｍｌ／ｋｇに、吸気と呼気との比を１：１に、そして、呼気終末陽圧を１．０ｃｍ  Ｈ２Ｏに設定する。制御された加熱パッドを使用して、中心体温を３７℃に維持する。ミラー（Ｍｉｌｌａｒ）マイクロチップカテーテルを左頸動脈に挿入して、心拍数および全身動脈圧を測定する。右心室圧を測定するために、流体で満たされたポリエチレンカテーテルを右頸静脈を介して右心室内に挿入する。全ての血行力学的測定を、チャート（Ｃｈａｒｔ）５．０ソフトウェアを使用するＰｏｗｅｒＬａｂシステムで行った。血漿ｐｒｏＢＮＰの測定のために、ＥＤＴＡ血漿サンプルを採取した。動物の最終放血後、右心室および左心室（後者は中隔を含む）を秤量して、右心室と左心室との質量比を計算して、右心室肥大を判定する。右心室圧、右心室肥大および／または血漿ｐｒｏＢＮＰレベルをそれぞれＢＭＰ−９と同様に低減するＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対する強力なアゴニスト効果を有するＢｓＡＢとみなされる。
【０２３９】
実施例１０  インビボでのアゴニスト活性の評価：
ラットにおけるＳｕｇｅｎ／低酸素症誘発性肺高血圧におけるＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２シグナル伝達に対するＢｓＡＢｓ活性の測定
体重１６０〜１８０ｇの成体雄Ｄａｈｌ／ＳＳラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入する。ラットはイソフルラン麻酔（２％  ｖ／ｖ）下で２０ｍｇ／ｋｇのＶＥＧＦＲインヒビターＳＵ５４１６の１回の皮下注射を受ける。注射直後、動物を低酸素条件（１０％  Ｏ２）下で次の４週間および正常酸素条件下で更に２週間飼育する。ＳＵ５４１６注射の１４日後、動物を、第４２日の最終血行動態分析の日までＢｓＡＢまたはＢＭＰ−９またはビヒクルのいずれかで２８日間処置されるように無作為化する。対照動物は未処置のままにする。ＢＭＰ−９の公知半減期に基づいて、動物は７５０ｎｇ／動物の毎日の腹腔内注射を受ける。ビヒクルの投与を受けた動物は毎日のビヒクルの注射も受ける。ＢｓＡＢで処置された動物は、その薬物動態プロファイルに応じて注射を受ける（前記を参照されたい）。ＢｓＡＢの注射の必要頻度が毎日より低い場合、注射の回数が各処置群において同一になることが保証されるように、動物は代わりにビヒクルの投与を受ける。第４２日に、ラットをペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ）で麻酔する。気管切開後、人工換気の条件下、イソフルラン（１．８％  ｖ／ｖ）の吸入により麻酔を維持する。ＦｉＯ２を０．５に、呼吸量を６０ストローク／分で１０ｍｌ／ｋｇに、吸気と呼気との比を１：１に、そして、呼気終末陽圧を１．０ｃｍ  Ｈ２Ｏに設定する。制御された加熱パッドを使用して、中心体温を３７℃に維持する。ミラー（Ｍｉｌｌａｒ）マイクロチップカテーテルを左頸動脈に挿入して、心拍数および全身動脈圧を測定する。右心室圧を測定するために、流体で満たされたポリエチレンカテーテルを右頸静脈を介して右心室内に挿入する。全ての血行力学的測定を、チャート（Ｃｈａｒｔ）５．０ソフトウェアを使用するＰｏｗｅｒＬａｂシステムで行う。血漿ｐｒｏＢＮＰの測定のために、ＥＤＴＡ血漿サンプルを採取した。動物の最終放血後、右心室および左心室（後者は中隔を含む）を秤量して、右心室と左心室との質量比を計算して、右心室肥大を判定する。右心室圧および／または右心室肥大および／または血漿ｐｒｏＢＮＰレベルをＢＭＰ−９と同様に低減するＢｓＡＢは強力なＢｓＡＢとみなされる。
【０２４０】
実施例１１  ＢｓＡｂのＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２特異性の評価
ＡＬＫ−２／ＢＭＰＲ−２受容体と比較したＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２受容体複合体に対する選択性を決定するために、アゴニスト性抗体の特異性をＥＬＩＳＡにより評価した（図９）。抗原ヒトＡＬＫ−１−ＦｃおよびヒトＡＬＫ−２−Ｆｃを２μｇ／ｍｌでコーティングし、ＴＰＰ−１４６９６およびＴＰＰ−１４７１９の結合を抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｉ９５１３）により、ついで抗マウスＩｇＧ（全分子）−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａ９０４４、１：４００００）により検出した。
【０２４１】
実施例１２  ＢｓＡｂの骨形成活性の評価
アゴニスト性分子の潜在的な骨形成活性を試験するために、マウス筋芽細胞系Ｃ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１７７２）を使用する。このために、細胞を製造業者の説明に従い培養する。
【０２４２】
骨形成活性の測定のために、細胞を５０００細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレート内に播く。２４時間後、０．２５％のＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１００８２−１４７）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１９６５−０５９）内で細胞を更に２０時間飢餓状態にする。この飢餓時間の後、細胞を種々の濃度のＢＭＰ−９およびＢｓＡＢでそれぞれ７２時間処理する。前記のとおりに処理されたＣ２Ｃ１２細胞におけるＢＭＰ−９およびＢｓＡＢ誘発性アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の測定には、アルカリホスファターゼアッセイキット（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ８３３６９）を使用する。これにより、サンプルの調製およびＡＬＰ活性の測定を製造業者の説明に従い行う。ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ細胞および初代内皮細胞においてはアゴニスト活性を示すが、Ｃ２Ｃ１２細胞系においては何らの活性も示さないＢｓＡＢは、ＡＬＫ−１／ＢＭＰＲ−２に対して選択的な強力なアゴニスト活性を有するＢｓＡＢとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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