(57)【要約】装置は、多波長照明ビームを生成し、ナノタグを含み得るマイクロ流体標的に指向するように構成される、照明源と、マイクロ流体標的から多波長検出ビームを受け取るように、かつ検出信号を生成するように構成される、検出器であって、多波長検出ビームは、多波長照明ビームとマイクロ流体標的内のナノタグとの間の相互作用によって、弾性的に側方散乱される光を備える、検出器と、検出信号を受信するように、かつ検出信号の複数の波長側方散乱強度特性を１つ以上のナノタグタイプの所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルと比較することによって、マイクロ流体標的内のナノタグの存在を決定するように構成される、プロセッサとを含む。検出された信号および異なるナノタグタイプのための所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルに基づいて、多波長検出ビームに応答して、異なるナノタグの存在を決定する方法もまた、開示される。
2021500558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
装置であって、
照明源であって、前記照明源は、多波長照明ビームを生成し、ナノタグを含み得るマイクロ流体標的に指向するように構成される、照明源と、
検出器であって、前記検出器は、前記マイクロ流体標的から多波長検出ビームを受け取るように、かつ検出信号を生成するように構成され、前記多波長検出ビームは、前記多波長照明ビームと前記マイクロ流体標的内の前記ナノタグとの間の相互作用によって、弾性的に側方散乱される光を備える、検出器と、
プロセッサであって、前記プロセッサは、前記検出信号を受信するように、かつ前記検出信号の複数の波長側方散乱強度特性を１つ以上のナノタグタイプの所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルと比較することによって、マイクロ流体標的内のナノタグの存在を決定するように構成される、プロセッサと
を備える、装置。
【請求項２】
前記マイクロ流体標的内の前記ナノタグの存在を決定することは、単一ナノタグの存在を決定することを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記プロセッサは、前記比較に基づいて、細胞外小胞（ＥＶ）に付着した前記ナノタグのうちの少なくとも１つを有するＥＶの存在を決定するように構成される、請求項１−２のいずれかに記載の装置。
【請求項４】
前記プロセッサは、前記検出信号から、前記マイクロ流体標的内に同時に存在する複数のナノタグタイプの存在を決定するように構成される、請求項１−３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記複数のナノタグタイプは、共通細胞外小胞（ＥＶ）に付着される、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記比較は、前記所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルを使用する前記検出信号のデコンボリューションを通して実施される、請求項１−５のいずれかに記載の装置。
【請求項７】
単一ナノ粒子は、球形特性または非球形特性を有し、前記球形特性と関連付けられる直径、または１００ｎｍ以下である前記非球形特性と関連付けられる特徴的寸法を有する、請求項１−６のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
前記弾性側方散乱強度プロファイルは、ピーク散乱に対応する、請求項１−７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
前記ナノタグタイプは、金から作製される１つ以上のナノタグタイプと、銀から作製される１つ以上のナノタグタイプとを含む、請求項１−８のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
前記１つ以上のナノタグタイプは、１０ｎｍ〜３０ｎｍの範囲内で選択される直径を含むナノタグタイプを含む、請求項１−９のいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
前記照明源は、
所定の波長スペクトルを有する広帯域照明ビームを発生させるように配置された広帯域照明源
を備え、
前記装置は、波長分離システムを備え、前記波長分離システムは、前記広帯域照明ビームに光学的に結合され、前記広帯域照明ビームを、前記所定の波長スペクトルの別個の波長サブバンドをそれぞれ伴う複数のサブビームに分離するように、かつ個別の波長サブバンドの色集束距離に基づいて、前記マイクロ流体標的において前記サブビームを集束させるように、異なる個別の光学経路に沿って前記サブビームを指向し、集束させるように配置される、請求項１−１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
前記広帯域照明源は、スーパーコンティニウムレーザを備える、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記波長分離システムは、共線または平行光学経路に沿って別個のサブビームを前記マイクロ流体標的に指向するように配置された複数の二色性光学要素を含む、請求項１１−１２のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
前記波長分離システムは、前記サブビームを前記マイクロ流体標的の共通場所に集束させるように個別のサブビームに光学的に結合される複数の集束システムを含む、請求項１１−１３のいずれかに記載の装置。
【請求項１５】
検出システムは、
集光光学系であって、前記集光光学系は、前記多波長検出ビームを形成するように、前記マイクロ流体標的によって弾性的に側方散乱される光を受け取るように配置される、集光光学系と、
プリズム光学系であって、前記プリズム光学系は、前記集光光学系から前記多波長検出ビームを受け取るように、かつ前記多波長検出ビームを、波長に基づいて空間的に分離される複数の検出サブビームに分離するように配置される、プリズム光学系と
を備える、請求項１１−１４のいずれかに記載の装置。
【請求項１６】
前記検出システムはさらに、
個別の検出サブビームを受け取り、集束させるように配置された別個のマイクロレンズを伴うマイクロレンズアレイ
を備え、
前記検出器は、前記個別の検出サブビームを受け取るように配置された複数の検出器チャネルを含む、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記検出器は、１つ以上のアバランシェフォトダイオード、単一光子検出アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、シリコン光電子増倍管、または３−Ｄ高解像度、高感度、高フレームレート光照射野色記録デバイス、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記照明源は、前記多波長照明ビームに対応するように、異なる波長において個別のレーザビームを発生させるように配置された複数の単色レーザ源を備える、請求項１−１７のいずれかに記載の装置。
【請求項１９】
前記照明源はさらに、前記レーザビームの波長の色集束特性に基づいて、前記マイクロ流体標的において各個別のレーザビームを集束させるように配置されたビーム集束光学系を備える、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記照明源はさらに、前記レーザビームが前記マイクロ流体標的における共通場所に集束されるように、共線光学経路に沿って前記レーザビームを指向するように配置された複数の二色性光学要素を備える、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記検出器は、前記多波長検出ビームを形成するように、前記マイクロ流体標的によって弾性的に側方散乱される前記異なる波長における光を受け取るように配置された集光光学系を備える検出システムの一部である、請求項１８−２０のいずれかに記載の装置。
【請求項２２】
前記集光光学系は、前記マイクロ流体標的によって受け取られる前記多波長照明ビームの光学経路に対して垂直に配列される第１の集光光学系と、前記第１の集光光学系に隣接して前記光学経路に対して垂直に配列される第２の集光光学系とを含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記第２の集光光学系は、前記第１の集光光学系から見て前記マイクロ流体標的の反対側にある、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記第２の集光光学系は、所与の波長において所定の量だけミー共鳴を偏移させる前記第１の集光光学系と異なる集光光学系パラメータを伴って構成される、請求項２２−２３のいずれかに記載の装置。
【請求項２５】
前記集光光学系パラメータは、集光光学系角度および検出開口幾何学形状の一方または両方を含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記検出器は、前記第１の集光光学系に結合される第１の検出器と、前記第２の集光光学系に結合される第２の検出器とを含み、前記第１および第２の検出器の感度は、異なるサイズの粒子に関する検出のダイナミックレンジを増加させるために異なるように選択される、請求項２２−２５のいずれかに記載の装置。
【請求項２７】
前記検出システムはさらに、
少なくとも１つの二色性光学要素であって、前記少なくとも１つの二色性光学要素は、前記多波長検出ビームを集中的に受け取るように、かつ前記多波長検出ビームを前記異なる波長のうちの１つにそれぞれ対応する複数の検出サブビームに分離するように配置される、少なくとも１つの二色性光学要素
を備え、
前記検出器は、複数の光学検出器を備え、前記複数の光学検出器は、前記少なくとも１つの二色性要素から前記個別の検出サブビームを受け取るように配置され、かつ前記集光光学系によって提供される集束距離および前記集光光学系の色収差プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の焦点の光学経路長差に基づく前記少なくとも１つの二色性要素に対する離間関係で配置される、請求項２１−２６のいずれかに記載の装置。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの二色性光学要素は、第１の二色性光学要素と、第２の二色性光学要素とを含み、前記第１の二色性光学要素は、前記異なる波長のうちの第１の波長を有する第１の検出サブビームを、個別の光学検出器に指向するように配置され、前記第２の二色性光学要素は、前記第１の波長よりも長い第２の波長を有する第２の検出サブビームを、個別の光学検出器に指向するように配置される、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
少なくとも１つの二色性光学要素を用いた前記検出サブビームの発生の順序は、前記集光光学系の色デルタ焦点プロファイルに基づく、請求項２７−２８のいずれかに記載の装置。
【請求項３０】
前記集光光学系は、１つ以上の色消しまたはアポクロマートレンズ要素を含む、請求項２７−２９のいずれかに記載の装置。
【請求項３１】
前記第１の集光光学系は、第１の波長を有する前記多波長検出ビームのうちの第１の検出サブビームを検出するように配置され、前記第２の集光光学系は、第２の波長を有する前記多波長検出ビームの第２の検出サブビームを検出するように配置される、請求項２２−３０のいずれかに記載の装置。
【請求項３２】
前記第２の集光光学系を用いた前記第２の検出サブビームの検出は、前記第１の集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記第１の集光光学系による前記第１の検出サブビームと第２の検出サブビームとの間の集束距離共通性および集束距離差の一方または両方、または前記第１の集光光学系と前記第１の検出サブビームを受け取るように配置された光学検出器との間の空間関係に基づいて、前記第１の集光光学系を用いた第１の検出サブビームの検出から空間的に分離される、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記検出システムはさらに、
光ファイバアセンブリであって、
複数の光ファイバであって、前記複数の光ファイバは、前記異なる波長のうちの１つを有する前記多波長検出ビームのうちの個別の検出サブビームを受け取るように配置された開口をそれぞれ含む個別の隣接する第１の端部を有し、前記開口は、前記集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の集束距離変動に基づいて、前記サブビームの共通伝搬方向に沿って相互に関連して離間される、複数の光ファイバと、
前記第１の端部の反対の前記光ファイバの個別の第２の端部に光学的に結合される複数の光学検出器と
を含む、光ファイバアセンブリ
を備える、請求項２１−３２のいずれかに記載の装置。
【請求項３４】
前記開口は、前記個別の検出サブビームの画像スポットと整合される、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記伝搬方向に沿って対応する開口を平行移動させるように、前記光ファイバの前記第１の端部のうちの少なくとも１つに結合される平行移動ステージをさらに備える、請求項３３−３４のいずれかに記載の装置。
【請求項３６】
前記開口は、スリット開口であり、各スリット開口は、スリット幅よりも長いスリット長を有し、前記スリット長は、前記マイクロ流体標的の流動方向と平行に延在する、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
前記平行移動ステージは、前記伝搬方向および前記流動方向と垂直である側方方向に沿って前記スリット開口を平行移動させるように配置される、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記光ファイバの第１の端部はそれぞれ、光学ブロックを含み、前記光学ブロックは、個別の開口を含み、前記第１の端部を形成するように前記光ファイバに光学的に結合または融合される、請求項３３−３７のいずれかに記載の装置。
【請求項３９】
前記開口に隣接する前記光学ブロックの面積は、前記光ファイバの第１の端部に近接する迷光を低減させるように選択される吸収率を有する、請求項３８に記載の装置。
【請求項４０】
各開口は、成形光ファイバコアまたはクラッディング幾何学形状および端面上に配置された反射率コーティング変動のうちの１つ以上のものに基づいて、前記光ファイバの個別の端面によって画定される、請求項３３−３９のいずれかに記載の装置。
【請求項４１】
前記開口は、ミー共鳴に関連して選択される幾何学形状を有する、請求項３３−４０のいずれかに記載の装置。
【請求項４２】
前記幾何学形状は、非円形および非長方形である、請求項４１に記載の装置。
【請求項４３】
方法であって、
照明源を用いて発生される多波長照明ビームをマイクロ流体標的に指向することと、
前記マイクロ流体標的を用いて、前記多波長照明ビームを弾性的に側方散乱させることと、
検出器を用いて、前記弾性的に側方散乱された多波長照明ビームを伴って形成される多波長検出ビームの複数の検出サブビームを検出し、検出信号を生成することと、
前記検出信号および異なるナノタグタイプのための所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルに基づいて、前記多波長検出ビームに応答して、異なるナノタグの存在を決定することと
を含む、方法。
【請求項４４】
決定することは、前記所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルを使用する前記検出信号のデコンボリューションを通して実施される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記多波長照明ビームを指向することは、
前記多波長照明ビームを、異なる波長サブバンドをそれぞれ有する複数の照明サブビームに分離することと、
前記照明サブビームが、前記異なる波長サブバンドの色集束距離変動に基づいて、前記マイクロ流体標的において集束されるように、異なる個別の光学経路に沿って前記マイクロ流体標的において前記照明サブビームを指向することと
を含む、請求項４３−４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記複数の検出サブビームを検出することは、
プリズム配列を用いて、前記多波長検出ビームを前記検出サブビームに分離することと、
個別のマイクロレンズを有するマイクロレンズアレイを用いて前記検出サブビームを受け取ることであって、前記個別のマイクロレンズは、それぞれ、前記検出サブビームを集束させるように配置される、ことと、
光学検出器の個別の検出器チャネルを用いて、前記集束検出サブビームを受け取ることと
を含む、請求項４３−４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記照明源は、異なる個別の波長を伴うレーザビームを放射するように配置された複数の単色レーザを備える、請求項４３−４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記多波長照明ビームを指向することは、前記レーザビームが前記マイクロ流体標的における共通場所に集束されるように、共線光学経路に前記レーザビームを指向することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
複数の検出サブビームを検出することは、
前記多波長検出ビームを前記異なる波長のうちの１つにそれぞれ対応する前記検出サブビームに分離するように、少なくとも１つの二色性光学要素を用いて、集光光学系から前記多波長検出ビームを集中的に受け取ることと、
前記集光光学系によって提供される集束距離、および前記集光光学系の色収差プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の焦点の光学経路長差に基づく前記少なくとも１つの二色性光学要素との空間関係で配置された個別の光学検出器を用いて、前記検出サブビームを受け取ることと、
を含む、請求項４７−４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
複数の検出サブビームを検出することは、
前記集光光学系の第１のセットを用いて、前記多波長検出ビームの第１の部分を受け取ることと、
第１の波長を有する前記第１の部分の検出サブビームを検出することと、
前記第１の集光光学系から見て前記マイクロ流体標的の反対に配置された前記集光光学系の第２のセットを用いて、前記多波長検出ビームの第２の部分を受け取ることと、
前記第１の集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記集光光学系の第１のセットによって、前記第１の波長を有する前記検出サブビームと前記第２の波長を有する前記検出サブビームとの間の集束距離共通性および集束距離差の一方または両方に基づいて、第２の波長を有する前記第２の部分の検出サブビームを別個に検出することと
を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
複数の検出サブビームを検出することは、
集光光学系を用いて、前記検出サブビームを、隣接する光ファイバの第１の端部における個別の開口に指向することを含み、スリット開口は、前記集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の集束距離変動に基づいて、前記サブビームの共通伝搬方向に沿って相互に関連して離間される、請求項４７−５０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、それぞれがその全体として参照することによって本明細書に組み込まれる、２０１６年１０月２１日に出願された、米国仮出願第６２／４１１，３２４号、および２０１７年１０月２３日に出願され、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎａｎｏｔａｇｓ」と題された、ＰＣＴ出願に関連する。
【０００２】
本願は、その全体として参照することによって本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月２３日に出願された、米国仮出願第６２／５７５，９８８号の利益を主張する。
【０００３】
当技術分野は、フローサイトメトリを含む、マイクロ流体装置および方法である。
【０００４】
（政府支援に対する謝辞）
本発明は、米国国立衛生研究所の国立癌研究所によるプロジェクト番号Ｚ０１ＢＣ０１１５０２の下で政府支援を受けて行われた。政府は、本発明にある権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
単一ナノ粒子検出、分解、および／または選別のための改良された方法およびデバイスが、臨床および研究目的の両方のために有利であろう。例えば、それらは、重要な生物学的機能および治療薬、標的、またはバイオマーカとして使用するための有意な生物医学的可能性を有する、細胞によって放出される細胞外小胞（ＥＶ）および他のナノスケール粒子を識別および分析するために有用であろう。概して、ＥＶの構成成分および生物学的機能は、それらを産生する細胞のタイプおよびそれらが産生される条件に基づいて変動することが認められている（Ｒａｐｏｓｏ  ａｎｄ  Ｓｔｏｏｒｖｏｇｅｌ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００（４）：３７３−３８３，  ２０１３）。しかしながら、細胞系および部分集合が定義された方法で、これらの粒子の部分集合を特性評価することは、以前は可能ではなかった。同様に、他のナノスケール粒子およびこれらのナノスケール粒子の個々の分子成分を検出、選別、および計数することは、以前は困難であった。本技術にとって重要な障害は、具体的属性に基づいて、個々のナノスケール粒子を分析、選別、および機能的に研究するための利用可能なツールおよび試薬の欠如となっている。
【０００６】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が、細胞の標識部分集合を識別および選別するために、１９７２年のＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇおよび同僚らによるその導入以来、使用されている（Ｊｕｌｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６９（７）：１９３４−１９３８，  １９７２、Ｂｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ  ４３：４０４−４０９，  １９７２）が、サブミクロン亜集団を選別することは、約５００ｎｍよりも小さい粒子のために実行可能と見なされていない。フローサイトメトリマイクロ流体工学における従来の知恵は、５００ｎｍよりも小さい粒子からの信号が、サンプル残渣および電子雑音からの信号内で失われ、したがって、検出不可能なままであろうと考える。さらに、ＥＶの表面上の単一受容体等の単一分子の検出を可能にするであろう、フローサイトメトリおよびフローサイトメトリ装置等の試薬、方法、および装置の向上の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
開示される技術の側面によると、装置は、多波長照明ビームを生成し、ナノタグを含み得るマイクロ流体標的に指向するように構成される、照明源と、マイクロ流体標的から多波長検出ビームを受け取るように、かつ検出信号を生成するように構成される、検出器であって、多波長検出ビームは、多波長照明ビームとマイクロ流体標的内のナノタグとの間の相互作用によって、弾性的に側方散乱される光を備える、検出器と、検出信号を受信するように、かつ検出信号の複数の波長側方散乱強度特性を１つ以上のナノタグタイプの所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルと比較することによって、マイクロ流体標的内のナノタグの存在を決定するように構成される、プロセッサとを含む。
【０００８】
いくつかの実施例では、マイクロ流体標的内のナノタグの存在を決定するステップは、単一ナノタグの存在を決定するステップを含む。いくつかの実施例では、プロセッサは、比較に基づいて、ＥＶに付着したナノタグのうちの少なくとも１つを有する、細胞外小胞（ＥＶ）の存在を決定するように構成される。さらなる実施例では、プロセッサは、検出信号から、マイクロ流体標的内に同時に存在する複数のナノタグタイプの存在を決定するように構成される。いくつかの実施例では、複数のナノタグタイプは、共通細胞外小胞（ＥＶ）に付着される。さらなる実施例では、比較は、所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルを使用する、検出信号のデコンボリューションを通して実施される。いくつかの実施例では、単一ナノ粒子は、球形または非球形特性を有し、球形特性と関連付けられる直径、または１００ｎｍ以下である非球形特性と関連付けられる特徴的寸法を有する。さらなる実施例では、弾性側方散乱強度プロファイルは、ピーク散乱に対応する。いくつかの実施例では、ナノタグタイプは、金から作製される１つ以上のナノタグタイプと、銀から作製される１つ以上のナノタグタイプとを含む。さらなる実施例では、１つ以上のナノタグタイプは、１０ｎｍ〜３０ｎｍの範囲内で選択される直径を含む、ナノタグタイプを含む。いくつかの実施例によると、照明源は、所定の波長スペクトルを有する広帯域照明ビームを発生させるように配置された広帯域照明源を含み、本装置は、広帯域照明ビームに光学的に結合され、広帯域照明ビームを、所定の波長スペクトルの別個の波長サブバンドをそれぞれ伴う複数のサブビームに分離するように、かつ個別の波長サブバンドの色集束距離に基づいて、マイクロ流体標的においてサブビームを集束させるように、異なる個別の光学経路に沿ってサブビームを指向し、集束させるように配置された波長分離システムを含む。いくつかの実施例では、広帯域照明源は、スーパーコンティニウムレーザを備える。さらなる実施例では、波長分離システムは、共線または平行光学経路に沿って別個のサブビームをマイクロ流体標的に指向するように配置された複数の二色性光学要素を含む。いくつかの実施例では、波長分離システムは、サブビームをマイクロ流体標的の共通場所に集束させるように、個別のサブビームに光学的に結合される、複数の集束システムを含む。さらなる実施例では、検出システムは、多波長検出ビームを形成するように、マイクロ流体標的によって弾性的に側方散乱される光を受け取るように配置された集光光学系と、集光光学系から多波長検出ビームを受け取るように、かつ多波長検出ビームを、波長に基づいて空間的に分離される複数の検出サブビームに分離するように配置されたプリズム光学系とを含む。いくつかの例示的検出システムはさらに、個別の検出サブビームを受け取り、集束させるように配置された別個のマイクロレンズを伴うマイクロレンズアレイを含み、検出器は、個別の検出サブビームを受け取るように配置された複数の検出器チャネルを含む。いくつかの実施例では、検出器は、１つ以上のアバランシェフォトダイオード、単一光子検出アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、シリコン光電子増倍管、または３−Ｄ高解像度、高感度、高フレームレート光照射野色記録デバイス、またはそれらの組み合わせを含む。さらなる実施例では、照明源は、多波長照明ビームに対応するように、異なる波長において個別のレーザビームを発生させるように配置された複数の単色レーザ源を含む。いくつかの実施例では、照明源はさらに、レーザビームの波長の色集束特性に基づいて、マイクロ流体標的において各個別のレーザビームを集束させるように配置されたビーム集束光学系を備える。いくつかの実施形態では、照明源はさらに、レーザビームがマイクロ流体標的における共通場所に集束されるように、共線光学経路に沿ってレーザビームを指向するように配置された複数の二色性光学要素を備える。さらなる実施例によると、検出器は、多波長検出ビームを形成するように、マイクロ流体標的によって弾性的に側方散乱される、異なる波長における光を受け取るように配置された集光光学系を備える、検出システムの一部である。いくつかの実施例では、集光光学系は、マイクロ流体標的によって受け取られる多波長照明ビームの光学経路に対して垂直に配列される、第１の集光光学系と、第１の集光光学系に隣接して光学経路に対して垂直に配列される、第２の集光光学系とを含む。さらなる実施例では、第２の集光光学系は、第１の集光光学系から見てマイクロ流体標的の反対側にある。いくつかの実施例では、第２の集光光学系は、所与の波長において所定の量だけミー共鳴を偏移させる、第１の集光光学系と異なる集光光学系パラメータを伴って構成される。さらなる実施例では、集光光学系パラメータは、集光光学系角度および検出開口幾何学形状の一方または両方を含む。いくつかの実施例では、検出器は、第１の集光光学系に結合される第１の検出器と、第２の集光光学系に結合される第２の検出器とを含み、第１および第２の検出器の感度は、異なるサイズの粒子に関する検出のダイナミックレンジを増加させるために異なるように選択される。いくつかの例示的検出システムはさらに、多波長検出ビームを集中的に受け取るように、かつ多波長検出ビームを異なる波長のうちの１つにそれぞれ対応する複数の検出サブビームに分離するように配置された少なくとも１つの二色性光学要素を含み、検出器は、少なくとも１つの二色性要素から個別の検出サブビームを受け取るように配置され、かつ集光光学系によって提供される集束距離および集光光学系の色収差プロファイルと関連付けられる検出サブビームの間の焦点の光学経路長差に基づく、少なくとも１つの二色性要素に対する離間関係で配置された複数の光学検出器を備える。いくつかの実施例では、少なくとも１つの二色性光学要素は、第１の二色性光学要素と、第２の二色性光学要素とを含み、第１の二色性光学要素は、異なる波長のうちの第１の波長を有する第１の検出サブビームを、個別の光学検出器に指向するように配置され、第２の二色性光学要素は、第１の波長よりも長い第２の波長を有する第２の検出サブビームを、個別の光学検出器に指向するように配置される。いくつかの実施例では、少なくとも１つの二色性光学要素を用いた検出サブビームの発生の順序は、集光光学系の色デルタ焦点プロファイルに基づく。いくつかの実施形態では、集光光学系は、１つ以上の色消しまたはアポクロマートレンズ要素を含む。さらなる実施例では、第１の集光光学系は、第１の波長を有する多波長検出ビームのうちの第１の検出サブビームを検出するように配置され、第２の集光光学系は、第２の波長を有する多波長検出ビームの第２の検出サブビームを検出するように配置される。いくつかの実施例では、第２の集光光学系を用いた第２の検出サブビームの検出は、第１の集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる、第１の集光光学系による第１の検出サブビームと第２の検出サブビームとの間の集束距離共通性および集束距離差の一方または両方、または第１の集光光学系と第１の検出サブビームを受け取るように配置される光学検出器との間の空間関係に基づいて、第１の集光光学系を用いた第１の検出サブビームの検出から空間的に分離される。いくつかの検出システム実施例はさらに、異なる波長のうちの１つを有する、多波長検出ビームのうちの個別の検出サブビームを受け取るように配置される開口をそれぞれ含む、個別の隣接する第１の端部を有する、複数の光ファイバであって、開口は、集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる、検出サブビームの間の集束距離変動に基づいて、サブビームの共通伝搬方向に沿って相互に関連して離間される、光ファイバと、第１の端部の反対の光ファイバの個別の第２の端部に光学的に結合される、複数の光学検出器とを含む、光ファイバアセンブリを含む。いくつかの実施例では、開口は、個別の検出サブビームの画像スポットと整合される。いくつかの実施例はさらに、伝搬方向に沿って対応する開口を平行移動させるように、光ファイバの第１の端部のうちの少なくとも１つに結合される、平行移動ステージを含む。いくつかの実施形態では、開口は、スリット開口であり、各スリット開口は、スリット幅よりも長いスリット長を有し、スリット長は、マイクロ流体標的の流動方向と平行に延在する。いくつかの実施例では、平行移動ステージは、伝搬方向および流動方向と垂直である側方方向に沿ってスリット開口を平行移動させるように配置される。いくつかの実施形態では、光ファイバの第１の端部はそれぞれ、個別の開口を含み、第１の端部を形成するように光ファイバに光学的に結合または融合される、光学ブロックを含む。さらなる実施例では、開口に隣接する光学ブロックの面積は、光ファイバの第１の端部に近接する迷光を低減させるように選択される、吸収率を有する。いくつかの実施形態では、各開口は、成形光ファイバコアまたはクラッディング幾何学形状および端面上に配置された反射率コーティング変動のうちの１つ以上のものに基づいて、光ファイバの個別の端面によって画定される。さらなる実施例では、開口は、ミー共鳴に関連して選択される幾何学形状を有する。いくつかの実施形態では、幾何学形状は、非円形および非長方形である。
【０００９】
開示される技術の別の側面によると、方法は、照明源を用いて発生される多波長照明ビームをマイクロ流体標的に指向するステップと、マイクロ流体標的を用いて、多波長照明ビームを弾性的に側方散乱させるステップと、検出器を用いて、弾性的に側方散乱された多波長照明ビームを伴って形成される多波長検出ビームの複数の検出サブビームを検出し、検出信号を生成するステップと、検出信号および異なるナノタグタイプのための所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルに基づいて、多波長検出ビームに応答して、異なるナノタグの存在を決定するステップとを含む。
【００１０】
いくつかの実施例では、決定するステップは、所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルを使用する、検出信号のデコンボリューションを通して実施される。さらなる実施例では、多波長照明ビームを指向するステップは、多波長照明ビームを、異なる波長サブバンドをそれぞれ有する複数の照明サブビームに分離するステップと、照明サブビームが、異なる波長サブバンドの色集束距離変動に基づいて、マイクロ流体標的において集束されるように、異なる個別の光学経路に沿ってマイクロ流体標的において照明サブビームを指向するステップとを含む。いくつかの実施例では、複数の検出サブビームを検出するステップは、プリズム配列を用いて、多波長検出ビームを検出サブビームに分離するステップと、それぞれ、検出サブビームを集束させるように配置される個別のマイクロレンズを有する、マイクロレンズアレイを用いて、検出サブビームを受け取るステップと、光学検出器の個別の検出器チャネルを用いて、集束検出サブビームを受け取るステップとを含む。いくつかの実施例では、照明源は、異なる個別の波長を伴うレーザビームを放射するように配置された複数の単色レーザを備える。さらなる実施例では、多波長照明ビームを指向するステップは、レーザビームがマイクロ流体標的における共通場所に集束されるように、共線光学経路にレーザビームを指向するステップを含む。いくつかの実施例では、複数の検出サブビームを検出するステップは、多波長検出ビームを、異なる波長のうちの１つにそれぞれ対応する、検出サブビームに分離するように、少なくとも１つの二色性光学要素を用いて、集光光学系から多波長検出ビームを集中的に受け取るステップと、集光光学系によって提供される集束距離、および集光光学系の色収差プロファイルと関連付けられる検出サブビームの間の焦点の光学経路長差に基づく、少なくとも１つの二色性光学要素との空間関係で配置された個別の光学検出器を用いて、検出サブビームを受け取るステップとを含む。いくつかの実施例では、複数の検出サブビームを検出するステップは、集光光学系の第１のセットを用いて、多波長検出ビームの第１の部分を受け取るステップと、第１の波長を有する第１の部分の検出サブビームを検出するステップと、第１の集光光学系から見てマイクロ流体標的の反対に配置された集光光学系の第２のセットを用いて、多波長検出ビームの第２の部分を受け取るステップと、第１の集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる、集光光学系の第１のセットによって、第１の波長を有する検出サブビームと第２の波長を有する検出サブビームとの間の集束距離共通性および集束距離差の一方または両方に基づいて、第２の波長を有する第２の部分の検出サブビームを別個に検出するステップとを含む。さらなる実施例では、複数の検出サブビームを検出するステップは、集光光学系を用いて、検出サブビームを、隣接する光ファイバの第１の端部における個別の開口に指向するステップを含み、スリット開口は、集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる、検出サブビームの間の集束距離変動に基づいて、サブビームの共通伝搬方向に沿って相互に関連して離間される。
【００１１】
開示される技術の前述および他の特徴および利点は、付随する図面を参照して進められる、以下の詳細な説明から、より明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、例示的マイクロ流体フローサイトメータ装置の概略図である。
【図２】図２Ａは、例示的多波長照明源の概略図である。図２Ｂ−２Ｃは、図２Ａに示される多波長照明ビームのビーム断面である。
【図３】図３Ａは、多波長照明源の別の実施例の概略図である。図３Ｂ−３Ｃは、図３Ａに示される多波長照明ビームのビーム断面である。
【図４】図４Ａは、多波長照明源の別の実施例の概略図である。図４Ｂ−４Ｃは、図４Ａに示される多波長照明ビームのビーム断面である。
【図５】図５は、例示的多波長側方散乱検出システムの概略図である。
【図６】図６は、マイクロ流体検出システムの概略図である。
【図７】図７は、別のマイクロ流体検出システムの概略図である。
【図８Ａ】図８Ａは、光学画像フィルタ処理ユニットの斜視概略図である。
【図８Ｂ】図８Ｂ−８Ｄは異なる開口幾何学形状を示す。
【図８Ｃ】図８Ｂ−８Ｄは異なる開口幾何学形状を示す。
【図８Ｄ】図８Ｂ−８Ｄは異なる開口幾何学形状を示す。
【図９】図９−１３は、多波長マイクロ流体フローサイトメトリ方法のフローチャートである。
【図１０】図９−１３は、多波長マイクロ流体フローサイトメトリ方法のフローチャートである。
【図１１】図９−１３は、多波長マイクロ流体フローサイトメトリ方法のフローチャートである。
【図１２】図９−１３は、多波長マイクロ流体フローサイトメトリ方法のフローチャートである。
【図１３】図９−１３は、多波長マイクロ流体フローサイトメトリ方法のフローチャートである。
【図１４】図１４は、例示的マイクロ流体装置を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ−１５Ｄは、選択された直径における種々のナノスフェアに関するミー散乱材料のグラフを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａ−１５Ｄは、選択された直径における種々のナノスフェアに関するミー散乱材料のグラフを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ａ−１５Ｄは、選択された直径における種々のナノスフェアに関するミー散乱材料のグラフを示す。
【図１５Ｄ】図１５Ａ−１５Ｄは、選択された直径における種々のナノスフェアに関するミー散乱材料のグラフを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、６０ｎｍ金および銀球体に関する散乱断面対波長のグラフである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、異なる波長における６０ｎｍ金および銀ナノ粒子に関するモデル化された散乱特性のグラフである。
【図１７Ａ】図１７Ａ−１７Ｂは、それぞれ、４０ｎｍ球体および２０ｎｍ球体に関するＡｇ／Ａｕ散乱断面および他の散乱断面対波長のグラフである。Ａｇ／Ａｕ線は、Ａｇ対Ａｕ集光散乱能力の比を表す。黒い鎖線は、Ａｕ集光散乱能力を表す。一点鎖線は、Ａｇ集光散乱能力を表す。水平線は、１の金および銀散乱能力比を表す。点線は、１００ｎｍ金の集光散乱能力を表す。垂直線は、スペクトル散乱検出に使用され得る単色レーザダイオード源を表す。
【図１７Ｂ】図１７Ａ−１７Ｂは、それぞれ、４０ｎｍ球体および２０ｎｍ球体に関するＡｇ／Ａｕ散乱断面および他の散乱断面対波長のグラフである。Ａｇ／Ａｕ線は、Ａｇ対Ａｕ集光散乱能力の比を表す。黒い鎖線は、Ａｕ集光散乱能力を表す。一点鎖線は、Ａｇ集光散乱能力を表す。水平線は、１の金および銀散乱能力比を表す。点線は、１００ｎｍ金の集光散乱能力を表す。垂直線は、スペクトル散乱検出に使用され得る単色レーザダイオード源を表す。
【図１８Ａ】図１８Ａ−１８Ｂは、異なる集光角に関するＡｇ／Ａｕ散乱断面対波長のグラフである。４０ｎｍ金、銀、１００ｎｍポリスチレンのスペクトル散乱である。各材料は、２度増分で２０〜６０度にモデル化された。それぞれのスペクトル特性は、図１７Ａで見出され得る。
【図１８Ｂ】図１８Ａ−１８Ｂは、異なる集光角に関するＡｇ／Ａｕ散乱断面対波長のグラフである。４０ｎｍ金、銀、１００ｎｍポリスチレンのスペクトル散乱である。各材料は、２度増分で２０〜６０度にモデル化された。それぞれのスペクトル特性は、図１７Ａで見出され得る。
【図１９Ａ】図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｃは、ミー散乱モデルスクリプトの概略図である。
【図１９Ｂ】図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｃは、ミー散乱モデルスクリプトの概略図である。
【図１９Ｃ】図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｃは、ミー散乱モデルスクリプトの概略図である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、図２０Ｂ上で入手されるビーズデータの最接近適合集光半角を示す、変動係数対集光半角のグラフである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、チャネル数対粒子直径のグラフであり、図２０Ａから推定される集光角を使用するモデル化されたデータとともに、Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱフローサイトメータ上の既知の直径および屈折率（黒点）の入手された粒子の適合を図示する。
【図２１Ａ】図２１Ａ−２１Ｄは、異なる照明波長に関する散乱断面対粒子直径を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａ−２１Ｄは、異なる照明波長に関する散乱断面対粒子直径を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ａ−２１Ｄは、異なる照明波長に関する散乱断面対粒子直径を示す。
【図２１Ｄ】図２１Ａ−２１Ｄは、異なる照明波長に関する散乱断面対粒子直径を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａ−２２Ｄは、種々の波長における散乱検出に関する、および種々の粒子に関する、モデル化された性能および実際の性能を示す。図２２Ｂ、２２Ｄのデータはまた、計器較正のための基準ビーズとして、かつデコンボリューションアルゴリズムのための基準値を取得するために使用され得る、異なる分子ナノタグコア材料から成る代表的ビーズセットも示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａ−２２Ｄは、種々の波長における散乱検出に関する、および種々の粒子に関する、モデル化された性能および実際の性能を示す。図２２Ｂ、２２Ｄのデータはまた、計器較正のための基準ビーズとして、かつデコンボリューションアルゴリズムのための基準値を取得するために使用され得る、異なる分子ナノタグコア材料から成る代表的ビーズセットも示す。
【図２２Ｃ】図２２Ａ−２２Ｄは、種々の波長における散乱検出に関する、および種々の粒子に関する、モデル化された性能および実際の性能を示す。図２２Ｂ、２２Ｄのデータはまた、計器較正のための基準ビーズとして、かつデコンボリューションアルゴリズムのための基準値を取得するために使用され得る、異なる分子ナノタグコア材料から成る代表的ビーズセットも示す。
【図２２Ｄ】図２２Ａ−２２Ｄは、種々の波長における散乱検出に関する、および種々の粒子に関する、モデル化された性能および実際の性能を示す。図２２Ｂ、２２Ｄのデータはまた、計器較正のための基準ビーズとして、かつデコンボリューションアルゴリズムのための基準値を取得するために使用され得る、異なる分子ナノタグコア材料から成る代表的ビーズセットも示す。
【図２３】図２３は、ポリスチレン、金、ＣｄＳｅ、および銀の屈折率、および金、ＣｄＳｅ、および銀の吸光係数のグラフを示す。
【図２４】図２４は、金の光学定数および特性を示す。
【図２５】図２５は、金、銀、およびポリスチレンビーズに関するＦＡＣＳ  ＳｙｍｐｈｏｎｙとＡｓｔｒｉｏｓ  ＥＱフローサイトメトリデバイスとの間のＳＳＣ／ＦＳＣグラフ比較を示す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、５度増分で５〜９０度の半角を伴うＳＳＣ集光のための円形開口を使用する、モデル化された細胞外小胞の散乱・直径関係を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、５度増分で５〜９０度の半角を伴うＳＳＣ集光のための正方形開口を使用する、モデル化された細胞外小胞の散乱・直径関係を示す。
【図２７】図２７は、開放開口（９５０μｍ）、４５０μｍ、および２００μｍスリット開口を伴うＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ上で入手される、１００ｎｍ、３００ｎｍ、５００ｎｍ、および９００ｎｍビーズに関する、計算されたＳＳＣ分離指数を示す。分離指数は、それらの標準偏差の和にわたる平均強度差を使用して計算される。
【図２８Ａ】図２８Ａ−２８Ｆは、ナノ粒子の連続希釈および単一粒子検出を示す線形減少を示す。
【図２８Ｂ】図２８Ａ−２８Ｆは、ナノ粒子の連続希釈および単一粒子検出を示す線形減少を示す。
【図２８Ｃ】図２８Ａ−２８Ｆは、ナノ粒子の連続希釈および単一粒子検出を示す線形減少を示す。
【図２８Ｄ】図２８Ａ−２８Ｆは、ナノ粒子の連続希釈および単一粒子検出を示す線形減少を示す。
【図２８Ｅ】図２８Ａ−２８Ｆは、ナノ粒子の連続希釈および単一粒子検出を示す線形減少を示す。
【図２８Ｆ】図２８Ａ−２８Ｆは、ナノ粒子の連続希釈および単一粒子検出を示す線形減少を示す。
【図２９】図２９は、種々のＡｕ、Ａｇ、およびＰＳナノ粒子に関する波長に対するモデル化された散乱断面を示す。
【図３０Ａ】図３０Ａ−３０Ｂは、それぞれ、６０ｎｍＡｇ対６０ｎｍＡｕ粒子のモデル化され、実験的に入手された散乱断面を示す。
【図３０Ｂ】図３０Ａ−３０Ｂは、それぞれ、６０ｎｍＡｇ対６０ｎｍＡｕ粒子のモデル化され、実験的に入手された散乱断面を示す。
【図３１】図３１は、単一６０ｎｍＡｕおよびＡｇナノタグおよびＣＦＳＥ染色ＥＶの検出示す。
【図３２】図３２は、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、６３５ｎｍの照明波長における１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍの直径を伴うポリスチレン粒子の角度散乱分布を示す。
【図３３】図３３は、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、６３５ｎｍの照明波長を用いて３０度の集光半角においてモデル化される、ポリスチレン球体の散乱断面を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本願および請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別様に明確に決定付けない限り、複数形を含む。加えて、用語「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（〜を含む）」は、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（〜を備える）」を意味する。さらに、用語「ｃｏｕｐｌｅｄ（結合される）」（ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ（光学的に結合される）を含む）は、結合された項目の間の中間要素の存在を排除しない。
【００１４】
本明細書に説明されるシステム、装置、および方法は、いかようにも限定的として解釈されるべきではない。代わりに、本開示は、単独で、および相互との種々の組み合わせおよび副次的組み合わせで、種々の開示される実施形態の全ての新規かつ非明白な特徴および側面を対象とする。開示されるシステム、方法、および装置は、いずれの具体的側面または特徴またはそれらの組み合わせに限定されることもなく、開示されるシステム、方法、および装置は、いずれか１つ以上の具体的利点が存在すること、または問題が解決されることを要求することもない。任意の動作理論は、解説を促進するものであるが、開示されるシステム、方法、および装置は、そのような動作理論に限定されない。
【００１５】
開示される方法のうちのいくつかの動作は、便宜的な提示のために特定の連続順序で説明されるが、本説明の様式は、特定の順序付けが下記に記載される具体的用語によって要求されない限り、再配列を包含することを理解されたい。例えば、連続的に説明される動作は、ある場合には、再配列される、または同時に実施されてもよい。また、簡単にするために、添付された図は、開示されるシステム、方法、および装置が、他のシステム、方法、および装置と併せて使用され得る、種々の方法を示さない場合がある。加えて、説明は、時として、開示される方法を説明するために、「ｐｒｏｄｕｃｅ（〜を生成する）」および「ｐｒｏｖｉｄｅ（〜を提供する）」のような用語を使用する。これらの用語は、実施される実際の動作の高レベル抽象化である。これらの用語に対応する実際の動作は、特定の実装に応じて変動し、当業者によって容易に識別可能である。
【００１６】
いくつかの実施例では、値、手順、または装置は、「最低」、「最良」、「最小」、または同等物と称される。そのような説明は、多くの使用される機能代替物の中から選択が行われ得、そのような選択は、他の選択よりも良好であること、小さいこと、または別様に好ましいことは必要ないことを示すことを意図していると理解されたい。
【００１７】
本明細書で使用されるように、光学放射は、約１００ｎｍ〜１０μｍ、典型的には、約３００ｎｍ〜８００ｎｍの波長における電磁放射を指す。利用可能なレーザダイオード源および光ファイバに基づく実施例は、概して、約３５０ｎｍ〜１，０００ｎｍ超の波長と関連付けられる。いくつかの実施例では、伝搬光学放射は、ビーム波長およびビーム成形に使用される光学システムに依存し得る、直径、ビーム断面積、およびビーム発散を有する、１つ以上のビームと称される。便宜上、光学放射は、いくつかの実施例では、光と称され、典型的には、紫外線または可視波長にあるが、実施例は、紫外線または可視以外の波長を含むことができる。ビーム断面積、直径、または他のビーム寸法が、概して、ゼロ強度値、１／ｅ値、１／ｅ２値、半値全幅（ＦＷＨＭ）値、または他の好適なメトリックに対応する境界を使用して、説明されることができる。
【００１８】
光学ビームおよび光学要素は、いくつかの実施例では、１つ以上の軸に関して説明される。典型的には、軸は、それに沿って光学ビームが伝搬する、またはそれに沿って１つ以上の光学要素が配置された１つ以上の直線区画を含む。そのような軸は、軸が単一直線区画である必要がないように、反射または屈折面を伴って屈曲される、または折り畳まれることができる。凸・凸、平凸、凹・凹、平凹、円柱、フレネル、ゾーンプレート、ホログラフィック、球面、非球面、それらの組み合わせ等を含む、種々のレンズが、説明される、または使用されてもよい。円柱レンズは、クロスシリンダまたは交差円柱レンズまたはレンズアセンブリを提供するように相互と垂直に配列される、円柱表面を有することができる。
【００１９】
図１は、多波長照明ビーム１０４を生成し、多波長照明ビーム１０４をマイクロ流体フローサイトメトリ標的１０６に指向する、多波長照明源１０２を含む、マイクロ流体フローサイトメータ１００の実施例を示す。代表的実施例では、フローサイトメトリ標的１０６は、粒子状物質１１０に付着されるナノスケールタグ（「ナノタグ」）１１２ａ、１１２ｂによって弾性的に散乱される光に基づいて、単独で検出可能を含む、検出可能になり得る、細胞外小胞（ＥＶ）等の粒子状物質１１０を含む、流れが図１の平面に流入または流出するように断面で示される、流体１０８の流れを含む。流体１０８の流れは、いくつかの実施例では不動であり得ることを理解されたい。多波長照明ビーム１０４は、典型的には、流体１０８の流れの流動方向と垂直にフローサイトメトリ標的１０６に指向され、フローサイトメトリ標的１０６において合焦される。前方散乱（ＦＳＣ）検出システム１１４は、多波長照明ビーム１０４の同一の一般的方向に伝搬するフローサイトメトリ標的１０６から前方散乱検出ビーム１１６を受け取るように、フローサイトメトリ標的１０６上に入射するような多波長照明ビーム１０４から見てフローサイトメトリ標的１０６の反対に配置される。
【００２０】
分子ナノタグは、対応する固有の光散乱性質に基づいて、個別に検出される、または定量的に計測され得る、ナノサイズのサイトメトリ標識である。本明細書の光学装置実施例は、モジュール式であり得、広範囲の波長を横断して識別可能かつ独特の光散乱スペクトル性質をそれぞれ伴う、異なるナノ材料から成り得る、異なる分子ナノタグを識別するように、複数の波長光源からスペクトル散乱光データを収集することが可能である。いくつかの実施例では、光学強度または能力値が、検出されることができる。実施例は、複数の具体的波長における光散乱を測定し、金の光学性質に対応する波長における金ナノ材料と関連付けられる、向上された散乱信号が、観察される。代表的実施例では、プラズモン共鳴は、吸収に関することができ、散乱は、別個の現象に対応することができ、吸光係数に対応し、吸収を考慮する虚数部とともに、古典的屈折率を含む、複素屈折率が使用されるように、吸収および散乱の和が、検出される。
【００２１】
付加的実施例では、向上された光散乱能力のパターンは、屈折率および吸光係数を含む、光学性質にしたがって、材料の間で異なることが実証される。そのような差異は、レーザ光を区別するために、かつ明確に異なる標識をそれぞれ伴う、分子ナノタグ等の単一分子を検出する点まで検出の感度をさらに増加させるために、選択された波長におけるマルチスペクトル検出方法と併用されることができる。側方散乱（ＳＳＣ）検出システム１１８は、概して、フローサイトメトリ標的１０６の側面に伝搬する多波長検出ビーム１２０と、例えば、流体１０８の流れおよび多波長照明ビーム１０４の方向と垂直な多波長照明ビーム１０４とを受け取り、検出するように配置される。代表的実施例では、用語「側方散乱」は、典型的には、照明源からの粒子によって受け取られる光の伝搬の方向に対して５〜１８０度に及ぶ角度から集光される、流体１０８の流れ等の流れの中に懸濁される粒子によって散乱される光を指す。多波長検出ビーム１２０は、多波長照明ビーム１０４とフローサイトメトリ標的１０６の粒子状物質１１０およびナノタグ１１２ａ、１１２ｂとの間の弾性衝突によって生成される。代表的ＳＳＣ検出システム１１８は、１つ以上のアバランシェフォトダイオード、単一光子検出アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、シリコン光電子増倍管、または３−Ｄ高解像度、高感度、高フレームレート光照射野色記録デバイス、または組み合わせを含む、光学検出器を含む。代表的実施例では、異なる波長または波長の帯域に関するナノタグのミー散乱特性は、検出された散乱とフローサイトメトリ標的１０６内の１つ以上のナノタグの存在との間の対応が決定され得るように、数値的にモデル化されることができる。例えば、４０５ｎｍまたその近傍における検出された弾性散乱は、ＥＶに結合された銀ナノタグに対応することができ、５３２ｎｍまたその近傍における検出された弾性散乱は、ＥＶに結合された金ナノタグに対応することができる。したがって、フローサイトメトリ標的１０６は、異なる波長において異なる個別の散乱特性を生成する、異なるタイプのナノタグ、例えば、ナノタグ１１２ａ、１１２ｂが、側方散乱検出システム１１８を用いて検出され得るように、多波長照明ビーム１０４を用いて調査されることができる。いくつかの実施例では、ＳＳＣ検出システム１１８を用いたマルチスペクトル側方散乱検出は、非弾性散乱（ラマン）検出または蛍光検出と組み合わせられることができる。また、ＳＳＣ検出システム１１８の集光光学系（またはマイクロ流体フローサイトメータ１００の他の構成要素）は、相対散乱能力が具体的波長において粒子状物質直径とともに変動する（波長が変動されるにつれて転置または偏移する）、ミー共鳴特性を活用するように構成されることができる。所定のナノタグの存在を決定する、または所定のナノタグスペクトルプロファイルを伴う検出信号をデコンボリューションするプロセスはさらに、ミー共鳴特性を活用することによって向上されることができる。ミー共鳴の形状および／または位置を提供し、選択することによって、モデル化は、検出された粒子のサイズまたは屈折率をより正確に決定するように構成されることができる。例えば、集光光学系の単一のセットを備える、または集光パラメータ（例えば、具体的集光角）の単一のセットを定義する、検出システム１１８を用いると、（図３２に示されるような）波長に従ったミー共鳴の転置は、あるサイズの粒子の存在または非存在を示す、散乱断面の所定の変動を提供することができる。いくつかの実施例では、検出システム１１８は、集光パラメータの１つ以上の付加的セットを含むことができる、またはフローサイトメトリシステムは、集光パラメータの初期セットに対して選択された波長における（その結果として、他の波長に関する）ミー共鳴の所定の転置を提供し得る、集光パラメータの付加的セットを提供する、付加的検出システム（以下の付加的ＳＳＣ検出システム１４４等）を含むことができる。これは、多波長検出ビーム１２０の異なる散乱波長が、（図３２に示されるような）照明波長に起因するミー共鳴の移動を利用し、（図２６Ａ−２６Ｂに示されるような）低い集光角で見られる補正を可能にする、（図２０Ｂに示されるような）補完的散乱直径曲線を有することを可能にする。例えば、３０度の集光半角を有する検出システムは、４０５ｎｍの照明波長を用いて、直径２００〜３００ｎｍのポリスチレン粒子ではミー共鳴を受けるが、しかしながら、照明波長が６３５ｎｍである場合、本ミー共鳴は、３８０〜５００ｎｍまで見られない。２００〜３００ｎｍ粒子からの４０５ｎｍ信号にミー共鳴がある面積は、したがって、６３５ｎｍ照明波長の使用によって補正され得、３８０〜５００ｎｍにおける６３５ｎｍ信号にミー共鳴がある面積は、同様に、４０５ｎｍ信号を用いて補正され得る（図３３）。
【００２２】
ＳＳＣ検出システム１１８は、プロセッサ１２４を含む１つ以上のコンピューティングデバイスと、プロセッサ１２４に結合されるメモリ１２６とを含み得る、フローサイトメトリ制御環境１２２を含む、またはそれに結合されることができる。制御環境１２２は、ＳＳＣ検出システム１１８の１つ以上の光学検出器の選択された検出器チャネルのための散乱光の検出の信号閾値を調節するように配置された検出器閾値選択１２８と、検出器閾値選択１２８を用いて選択される１つまたは複数の信号閾値に基づいて、検出事象をトリガする、ＳＳＣ検出システム１１８の１つ以上の検出器チャネルを選択するように配置された検出器トリガチャネル選択１３０とを含むことができる。各検出事象のＦＳＣおよびＳＳＣデータは、粒子状物質１１０および／またはナノタグ１１２ａ、１１２ｂ等の選択された物体と関連付けられる所定のＳＳＣ／ＦＳＣ散乱プロファイルと比較されることができ、１つ以上の物体カウンタ１３２ａ、１３２ｂは、陽性決定に基づいて増分されることができる。
【００２３】
いくつかの実施例では、流体１０８の流れの追加を伴う（但し、いずれの粒子状物質１１０も伴わない）、少なくとも追加雑音を有する検出器チャネルが、トリガとして選択され、選択されたチャネルの検出器閾値は、流体１０８の流れと関連付けられる雑音レベルまたはその近傍にあるように選択される。多波長照明ビーム１０４を用いた、粒子状物質１１０およびナノタグ１１２ａ、１１２ｂを含有する流体１０８の流れの後続の調査後に、多波長検出ビーム１２０と関連付けられる事象は、背景雑音を最小限にするように構成される雑音設定を用いて検出されないであろう、フローサイトメトリ標的１０６内の物体の存在または非存在を決定するように、粒子状物質を含まない基準雑音と比較され得る、雑音サンプルを含むことができる。
【００２４】
代表的実施形態では、フローサイトメトリ制御環境１２２は、１つ以上の個別の光学検出器における多波長検出ビーム１２０またはフローサイトメトリ標的１０６における多波長照明ビーム１０４の異なる波長のための焦点位置を調節するように、ＳＳＣ検出システム１１８に結合されるＳＳＣ焦点制御１３８を含む。いくつかの実施例はさらに、多波長検出ビーム１２０の検出された特性が、ナノ粒子の存在を決定するように、多波長側方散乱プロファイル１４０と比較され得るように、１つ以上のナノ粒子に関する、特に、複数のナノ粒子に関する、波長依存性側方散乱特性（例えば、強度、能力）等のメモリ１２６内に記憶され得る多波長側方散乱プロファイル１４０を含む。付加的実施例では、１つ以上のデコンボリューションアルゴリズム１４２が、異なるナノ粒子に対応する光学信号を分離するために使用される。
【００２５】
異なる実施形態では、複数の単色レーザおよび広帯域またはスーパーコンティニウムレーザ源を含む、種々のタイプの多波長照明源１０２が、使用されることができる。いくつかの実施例では、照明ビーム制御１３６が、波長選択、検出器準備等に基づいて、多波長照明ビーム１０４のタイミングおよび／または発生を制御するために、使用されることができる。いくつかの実施例では、付加的ＳＳＣ検出システム１４４が、フローサイトメトリ標的１０６によって散乱される光を備える、別個の多波長検出ビーム１４０を受け取り、検出するように、例えば、フローサイトメトリ標的１０６の反対側を含む、多波長検出ビーム１２０およびＳＳＣ検出システム１１８に隣接してフローサイトメトリ標的１０６に結合されることができる。いくつかの例示的装置では、ＳＳＣ検出システム１１８、１４４のうちの１つ以上のものは、蛍光、ラマン、または他の光学波長および／または着目光学効果等の側方散乱波長以外の光を検出するように配置されることができる。いくつかの実施例では、付加的ＳＳＣ検出システム１４４は、粒子の直径と（図３２に示されるような）粒子の角度散乱分布内のミー共鳴に起因して集光される光散乱の量との間の関係に影響を及ぼす、異なる集光角、異なるスリット開口幾何学形状等を有する、異なる集光光学系等の異なる成分特性を伴って構成されることができる。図３２で見られるように、照明波長が増加すると、ミー共鳴の位置が移動する。図３２は、粒子レベルにおけるそのような効果を実証するが、図３３はさらに、３０度の比較的に低い集光角における集光で、ミー共鳴の偏移が、より小さい粒子からより大きい粒子まで見られる、システムレベルにおける効果を示す。いくつかの波長を利用し、したがって、複数または全てのこれらの曲線を使用することによって、粒子直径とともに散乱信号が一貫して増加し、したがって、サイズの正確な外挿を可能にする、領域が、見出されることができる。したがって、また、異なる特徴的なミー共鳴位置と関連付けられる別個の検出信号を取得することによって、サイズおよび屈折率の決定は、その領域が、その直径範囲内にミー共鳴を保有しない異なる波長において解釈されることに起因して、ミー共鳴が１つの波長において出現するであろう、領域内で取得されることができる。
【００２６】
フローサイトメトリ制御環境１２２は、デジタルコンピュータによって実施される、ソフトウェアまたはファームウェア命令を含むことができる。例えば、開示されるフローサイトメトリ検出技法のうちのいずれかは、フローサイトメータ制御システムの一部である、コンピュータまたは他のコンピューティングハードウェア（例えば、ＡＳＩＣ、ＦＰＧＡ、ＰＬＣ、ＣＰＬＤ、ＧＰＵ等のうちの１つ以上のもの）によって部分的に実施されることができる。フローサイトメトリ制御環境１２２は、多波長照明源１０２、ＦＳＣ検出システム１１４、ＳＳＣ検出システム１１８、および付加的ＳＳＣ検出システム１４４に接続され、または別様にそれと通信し、多波長照明ビーム１０４、ＦＳＣ、ＳＳＣ、および／または蛍光の検出を制御するように、かつ検出ビームデータを比較または選別し、フローサイトメトリ粒子状物質および／またはナノタグの存在または非存在を決定するようにプログラムまたは構成されることができる。コンピュータは、プロセッサ１２４（処理デバイス）のうちの１つ以上のものと、有形で非一過性のコンピュータ可読媒体（例えば、１つ以上の光学媒体ディスク、揮発性メモリデバイス（ＤＲＡＭまたはＳＲＡＭ等）、または不揮発性メモリまたは記憶デバイス（ハードドライブ、ＮＶＲＡＭ、およびソリッドステートドライブ（例えば、フラッシュドライブ）等）を含む、メモリ１２６とを備える、コンピュータシステムであり得る。１つ以上のプロセッサ１２４は、有形で非一過性のコンピュータ可読媒体のうちの１つ以上のものの上に記憶されたコンピュータ実行可能命令を実行し、それによって、開示される技法のうちのいずれかを実施することができる。例えば、開示される実施形態のうちのいずれかを実施するためのソフトウェアは、１つ以上のプロセッサによって実行されると、１つ以上のプロセッサに、開示される照明／検出技法のうちのいずれかを実施させる、コンピュータ実行可能命令として、１つ以上の揮発性で非一過性のコンピュータ可読媒体上に記憶されることができる。計算の結果およびフローサイトメトリ標的１０６の検出された光学特性は、１つ以上の有形で非一過性のコンピュータ可読記憶媒体内に（例えば、好適なデータ構造内に）記憶されることができ、および／または、例えば、グラフィカルユーザインターフェース等のディスプレイデバイス１３４上で、計数された物体の数、ＦＳＣ／ＳＳＣ強度または能力データ、コンボリューションまたはデコンボリューションされたＳＳＣデータ、チャネル選択、雑音／トリガレベル等を表示することによって、ユーザに出力されることもできる。
【００２７】
図２Ａは、多波長照明ビーム２０４を生成するように、かつフローサイトメトリ標的２０８において成形された多波長照明ビーム２０６を集束させるように配置された広帯域レーザデバイス２０２（例えば、スーパーコンティニウムレーザ、白色レーザ）を含む、多波長照明源２００の実施例を示す。多波長照明ビーム２０６は、典型的には、単色レーザ源よりも大きい、所定の放射またはフィルタ処理された波長範囲を有することができる。実施例は、典型的には、可視スペクトルに及び、約３５０ｎｍ〜１２００ｎｍ、３５０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲を含むことができるが、他の範囲も可能である。範囲は、フローサイトメトリ標的２０８の期待光学散乱特性に基づいて選択される。代表的実施形態では、レーザビームは、垂直軸を横断して非対称ビームプロファイルまたは異なるプロファイルを含む、ガウス、スーパーガウス、横断ガウストップハット、または他の集束幾何学形状を伴う、１つ以上の選択された横寸法に沿って、５〜１０μｍまたはそれよりも小さいウェストサイズに集束され、回折限界および焦点深度および距離に基づいて、照明波長への実用的制約を提供することができる。いくつかの例示的ビームスポットは、円形断面ではなく、ビーム整合を促進し得る、楕円形断面を有することができる。特定の楕円形ビーム実施例では、（流動の方向に対応する高さを伴って）フローサイトメトリ標的２０８に交差するビームウェストの高さは、５〜１０μｍの範囲内であり得、（流動を横断する方向に対応する）ビームウェストの幅は、５〜５０μｍに及び得る。
【００２８】
レンズ（例えば、平凸、凸・凸、球面、非球面、色消し、アポクロマート、円柱、交差円柱等）、ミラー、またはレンズおよびミラーの組み合わせ等のビーム成形光学系２１０が、広帯域レーザデバイス２０２から多波長照明ビーム２０４を受け取るように、かつ多波長照明ビーム２０４の伝搬の方向に対応する光学軸２１２と垂直な１つ以上の軸に沿った発散を低減させるように配置される。典型的実施例では、ビーム成形光学系２１０（および他の実施例におけるビーム成形光学系）は、光ファイバを用いて広帯域レーザデバイス２０２に光学的に結合されることができるが、空気、別の媒体、または付加的要素を通した自由空間結合も可能である。代表的実施例では、ビーム成形光学系２１０は、ビーム成形光学系２１０の色収差に起因して、光学軸２１２に沿った波長ベースの焦点誤差を伴って、フローサイトメトリ標的２０８において、関連付けられる所定の波長範囲を有する多波長照明ビーム２０４を集束させるように配置される。
【００２９】
複数の二色性光学要素２１４、２１６（例えば、低域通過、高域通過、帯域通過）が、フローサイトメトリ標的２０８に向かって集束されている多波長照明ビーム２０４を受け取るように、かつ多波長照明ビーム２０４を、二色性光学要素２１４、２１６の光学フィルタ処理特性と関連付けられる個別の波長サブバンドΔλ１、Δλ２、Δλ３を有する、複数の個別の照明サブビーム２１８、２２０、２２２に分離するように配置される。複数のビームディレクタ２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４が、図２Ｃの断面に示されるように重複するように、または図２Ｂの断面に示されるように、１つ以上の選択された方向に隣接する、かつ離間されるように、照明ビーム２１８、２２０、２２２を再結合する、複数の二色性光学要素２３６、２３８に照明サブビーム２１８、２２０、２２２を指向するように配置される。いくつかの実施例では、ビームディレクタ２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４および／または二色性光学要素２１４、２１６、２３６、２３８のうちの１つ以上のものは、隣接する構成で照明サブビーム２１８、２２０、２２２を位置付けるように、角度付けられる、または成形される。いくつかの実施形態では、成形された多波長照明ビーム２０６の照明サブビーム２１８、２２０、２２２は、異なる角度においてフローサイトメトリ標的２０８に入射する。
【００３０】
ビームディレクタ２２４、２２６、２２８は、ビーム成形光学系２１０とフローサイトメトリ標的２０８との間の照明サブビーム２２０、２２２の光学経路長に関連して、照明サブビーム２１８の光学経路長を変動させるように配置され、ビームディレクタ２３０、２３２は、照明ビーム２１８、２２２の光学経路長に関連して、照明ビーム２２０の光学経路長を変動させるように配置される。照明ビーム２１８、２２０、２２２の光学経路長の変動は、フローサイトメトリ標的２０８における照明ビーム２１８、２２０、２２２の間の焦点誤差が低減される、または最小限にされるように、選択されることができる。光学経路長変動は、反射要素を伴って示されるが、プリズムを含む、他の要素および要素の数も、経路長を変動させるために使用され得ることを理解されたい。いくつかの実施例では、１つ以上の透過性光学要素（例えば、透明な材料の長方形ブロック）が、ビーム位置を軽く動かし、または変位させ、個別の照明サブビーム２１８、２２０、２２２に関して経路長を選択的に増加させるように、照明サブビーム２１８、２２０、２２２のうちの１つ以上のものの経路内に設置されることができる。いくつかの実施例では、二色性光学要素２１４、２１６、２３６、２３８またはビームディレクタ２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４のうちの１つ以上のものは、非平行対向透過性表面を有することができる。
【００３１】
図３は、多波長照明ビーム３０４（例えば、ファイバ結合ビームを含む）を生成するように、かつフローサイトメトリ標的３０８において成形された多波長照明ビーム３０６を集束させるように配置された広帯域レーザデバイス３０２を含み、いくつかの点に関して多波長照明源２００と類似する、または同一であり得る、多波長照明源３００の別の実施例を示す。ビーム成形光学系３１０が、広帯域レーザデバイス３０２から多波長照明ビーム３０４を受け取るように、かつ成形されたビーム３１４を形成するように、多波長照明ビーム３０４の伝搬の方向に対応する光学軸３１２と垂直な１つ以上の軸に沿った発散を低減させるように配置される。いくつかの実施例では、成形されたビーム３１４は、コリメートされたビームに対応し、他の実施例では、発散または収束ビームが、生成されることができる。複数の二色性光学要素３１６、３１８が、成形されたビーム３１４を受け取るように、かつ異なる個別の波長サブバンドΔλ１、Δλ２、Δλ３を有する、照明サブビーム３２０、３２２、３２４を形成するように配置される。ビームディレクタ３２５、３２７が、個別の照明サブビーム３２０、３２４を指向するように配置され、付加的な複数の二色性光学要素３２６、３２８が、例えば、図３Ｃに示されるように重複することによって、または図３Ｂに示されるように離間関係で、照明サブビーム３２０、３２２、３２４を再結合するように、かつフローサイトメトリ標的３０８において集束される、成形された多波長照明ビームを形成するように配置される。複数の集束光学系３３０、３３２、３３４が、標的３０８において個別の照明サブビーム３２０、３２２、３２４を集束させるように配置される。異なる照明サブビーム３２０、３２２、３２４に関する焦点距離は、色収差と関連付けられるフローサイトメトリ標的３０８における焦点誤差が、低減される、または最小限にされ得るように、個別のサブビーム軸３３６、３３８、３４０に沿って個別の集束光学系３３０、３３２、３３４を位置付けること、または焦点距離等の光学特性を変動させること（または両方）によって、調節されることができる。いくつかの実施例では、照明サブビーム３２０、３２２、３２４のうちの少なくとも１つに関する焦点距離は、ビーム成形光学系３１０によって、すなわち、集束光学系３３０、３３２、３３４のうちの１つを使用することなく、提供されることができる。
【００３２】
図４は、異なる個別の波長λ１、λ２、λ３において個別のレーザビーム４０４ａ、４０４ｂ、４０４ｃを放射するように配置された複数の単色レーザダイオード４０２ａ、４０２ｂ、４０２ｃを含む、多波長照明源４００の実施例を示す。概して、「単色」と称されるが、そのような源は、典型的には、スーパーコンティニウムまたは広帯域源に対して狭い波長帯域内のビームを放射する。いくつかの実施例では、単色レーザビームは、５０ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、５ｎｍ以下、１ｎｍ以下、またはより狭い半値全幅、１／ｅ２、または他の好適な波長帯域メトリックを有することができる。フローサイトメトリ用途では、単色レーザ源の波長特性は、着目フローサイトメトリ物体の弾性または非弾性側方または前散乱または蛍光特性に基づいて、選択されることができる。複数のビーム成形光学系４０６ａ、４０６ｂ、４０６ｃは、それぞれ、レーザビーム４０４ａ、４０４ｂ、４０４ｃを個別の反射要素４０８ａ、４０８ｂ、４０８ｃに指向するように、（例えば、自由空間、光ファイバ等を介して）レーザビーム４０４ａ、４０４ｂ、４０４ｃに結合される。いくつかの実施例では、反射要素４０８ａは、ビーム方向４１０に沿ってレーザビーム４０４ａを指向するように配置される反射体であり、反射要素４０８ｂ、４０８ｃは、フローサイトメトリ標的４１２において重複する（図４Ｃ）、または相互に関連して隣接して離間される（図４Ｂ）ように、ビーム方向４１０にレーザビーム４０４ａ、４０４ｂ、４０４ｃを組み合わせるように配置された二色性光学要素である。
【００３３】
代表的実施例では、レーザビーム４０４ａ、４０４ｂ、４０４ｃは、ビーム方向４１０に平行または共線である。いくつかの実施形態では、二色性フィルタ処理は、λ１＜λ２＜λ３であるように構成されるが、他の配列およびフィルタも、選択されることができる。（特に、同じ特性を有するときに）ビーム成形光学系４０６ａ、４０６ｂ、４０６ｃと関連付けられる色焦点誤差は、レーザビーム４０４ａ、４０４ｂ、４０４ｃがそれぞれ、種々の方法でフローサイトメトリ標的４１２において集束され得るように、補正されることができる。いくつかの実施例では、ビーム成形光学系４０６ａ、４０６ｂ、４０６ｃとフローサイトメトリ標的４１２との間のレーザビーム４０４ａ、４０４ｂ、４０４ｃに関する個別の光学経路長が、λ１＜λ２＜λ３である、単色レーザダイオード４０２ａ、４０２ｂ、４０２ｃを順序付けること等によって、焦点誤差を低減させるように調節される。色消しまたはアポクロマートレンズである、ビーム成形光学系４０６ａ、４０６ｂ、４０６ｃに関して、レーザダイオード４０２ａ、４０２ｂ、４０２ｃの位置は、並べ替えられることができ、光学経路長は、レンズの色補正プロファイルに従って調節されることができる。いくつかの実施例では、ビーム成形光学系４０６ａ、４０６ｂ、４０６ｃは、個別のレーザビーム４０４ａ、４０４ｂ、４０４ｃの光学軸に沿って異なる位置を有することができ、および／または異なる焦点距離を有することができる。いくつかの実施例では、ビーム成形光学系４０６ａ、４０６ｂ、４０６ｃは、個別のレーザビーム４０４ａ、４０４ｂ、４０４ｃをコリメートすることができ、付加的集束光学系が、典型的には、反射要素４０８ｃとフローサイトメトリ標的４１２との間に配置される。付加的実施例では、反射要素４０８ｂ、４０８ｃは、伝搬ビームを切り取ることなく、集束する、またはコリメートされたレーザビーム４０４ａ、４０４ｂを受け取るためにｙ方向に十分な遊隙を伴う反射体である。
【００３４】
図５は、フローサイトメトリ標的５０４によって弾性的に散乱される多波長検出ビーム５０２を検出するように配置された例示的側方散乱検出システム５００を示す。側方散乱検出システム５００は、フローサイトメトリ標的５０４にゲル結合される、または別の好適な浸漬材料と結合され得る、高開口数レンズ（例えば、１．２）等の集光光学系５０６を含む。いくつかの実施例では、集光光学系５０６は、色補正されることができる。複数のウェッジプリズム５０８ａ−５０８ｇが、多波長検出ビーム５０２を受け取り、増加（または減少）する波長の順序で複数の検出サブビーム５１０ａ−５１０ｅに空間的に分離するように配置される。マイクロレンズアレイ５１２は、個別の検出サブビーム５１０ａ−５１０ｅを、個別の光電子増倍管、アバランシェフォトダイオード、または他の好適な光学検出器の検出器バンク５１６に集束させるように配置された複数のマイクロレンズ５１４ａ−５１４ｅを含む。
【００３５】
図６は、図６の平面に流入または流出しているフローサイトメトリ標的６０４によって散乱される、多波長照明ビーム６０２からの光を検出するように配置された検出システム６００の実施例を示す。前方散乱検出システム６０６は、入射前方散乱ビーム６１０の中心部分を遮断するように配置されたオブスキュレーションバー６０８を含む。集光光学系６１２は、前方散乱ビーム６１０を集光し、光電子増倍管６１４または他の好適な光学検出器に指向するように配置される。側方散乱検出システム６１６は、多波長検出ビーム６２０を集光し、アバランシェフォトダイオード等の波長特有の光学検出器６２２ａ−６２２ｄへの標的面に指向し、集束させるように配置された色補正の有するかまたは有しない高開口数レンズ等の集光光学系６１８を含む。
【００３６】
複数の二色性光学要素６２４、６２６、６２８が、異なる波長に従って、多波長検出ビーム６２０を複数の検出サブビーム６３０ａ−６３０ｄに分離するように配置される。一実施例では、光学検出器６２２ａ−６２２ｄは、それぞれ、例えば、１０ｎｍ帯域通過フィルタを用いて、それぞれ、４４５ｎｍ、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、および５６１ｎｍに中心合わせされた波長を検出し、個別の光学検出器６２２ａ−６２２ｄによって受け取られる検出サブビーム６３０ａ−６３０ｄの光の波長範囲を狭くするように配置される。代表的実施例では、検出サブビーム６３０ａ−６３０ｄは、集光光学系６１８を用いて、標的面に選択的に集束され、二色性光学要素６２４、６２６、６２８および個別の光学検出器６２２ａ−６２２ｄは、検出サブビーム６３０ａ−６３０ｄが焦点において受け取られるように、検出サブビーム６３０ａ−６３０ｄの波長差と関連付けられる焦点誤差を補正する光学経路長差を提供するように選択的に離間される。示されるように、集光光学系６１８と光学検出器６２２ａ−６２２ｄとの間の光学経路長は、検出されるべき波長の増加とともに増加する。いくつかの実施例では、光学検出器６２２ａ−６２２ｄの異なる空間順序は、集光光学系６１８と関連付けられる色デルタ焦点プロファイルに基づいて選択されることができ、二色性光学要素、帯域通過フィルタ、および光学検出器の間の距離は、高開口数レンズのデルタ焦点に基づいて選択されることができる。いくつかの実施例では、１つ以上の光学画像フィルタ処理開口６３１ａ−６３１ｄは、個別の入射検出サブビーム６３０ａ−６３０ｄを画像フィルタ処理するように配置され、光学検出器６２２ａ−６２２ｄまたは二色性光学要素６２４、６２６、６２８に近接することを含む、種々の場所に位置付けられることができる。一実施例では、単一の開口が、集光光学系６１８と二色性光学要素６２４との間に位置付けられることができる。
【００３７】
さらなる実施例では、多波長検出ビーム６２０の選択された波長が、多波長検出ビーム６２０の反対に指向される別個の多波長検出ビーム６３４を受け取るように配置された別個の側方散乱検出システム６３２を用いて、検出されることができる。側方散乱検出システム６３２は、多波長検出ビーム６３４を集光し、アバランシェフォトダイオード等の１つ以上の光学検出器に指向するように配置された集光光学系６３６の別のセットを含む。構成に応じて、二色性光学要素の配列が、多波長検出ビーム６３４を、検出されるべき複数のサブビームに分離するために、使用されることができる。一実施例では、多波長検出ビーム６３４の（４０５ｎｍにおける）単一の波長が、アバランシェフォトダイオード等の対応する光学検出器６３８を用いて、検出される。いくつかの実施例では、光学画像フィルタ処理開口６３９が、多波長検出ビーム６３４を光学的に画像フィルタ処理するように、集光光学系６３６と光学検出器６３８との間に配置される。いくつかの実施例では、多波長検出ビーム６３４の選択されたサブビーム波長が、（集光光学系６１８と二色性光学要素６２４との間または隣接する検出器の間等に）光学検出器６２２ａ−６２２ｄに関連して付加的光学検出器および二色性光学要素対を位置付けることと関連付けられる空間制約、および／または選択されたサブビーム波長の関連付けられる色デルタ焦点に基づいて、側方散乱検出システム６２０ではなく、側方散乱検出システム６３２を用いて検出される。例えば、特定の波長（紫外線等）に関するデルタ焦点の大きな変動が、側方散乱検出システム６１６ではなく、側方散乱検出システム６３２を用いて検出されることができる。いくつかの実施例では、色消しまたはアポクロマートプロファイルを含む、集光光学系６１８の色デルタ焦点プロファイルは、波長が比較的に離間される、選択された波長に、比較的に近いデルタ焦点を持たせることができる。
【００３８】
図７では、図７の平面に流入または流出しているフローサイトメトリ標的７０４によって散乱される、多波長照明ビーム７０２からの光を検出するように配置された検出システム７００の実施例を示す。前方散乱検出システム７０６は、入射前方散乱ビーム７１０の中心部分を遮断するように配置されたオブスキュレーションバー７０８を含む。集光光学系７１２は、前方散乱ビーム７１０を集光し、光電子増倍管７１４または他の好適な光学検出器に指向するように配置される。側方散乱検出システム７１６は、多波長検出ビーム７２０を集光し、光学画像フィルタ処理ユニット７２２およびアバランシェフォトダイオード等の波長特有の光学検出器７２４に指向するように配置された高開口数レンズ等の集光光学系７１８を含む。いくつかの実施例では、高開口数レンズは、色補正されることができる。光学画像フィルタ処理ユニット７２２は、多波長検出ビーム７２０の隣接する入射散乱ビームを受け取り、フィルタ処理するための複数の光学フィルタを含むことができ、光学画像フィルタ処理ユニット７２２は、結合されたビームを個別の波長特有の光学検出器７２４に指向する光ファイバ７２６の中に、フィルタ処理された側方散乱ビームを光学的に結合することができる。
【００３９】
図８Ａは、色補正された多成分高開口数レンズ等の集光光学系８０４を用いてフローサイトメトリ標的８０２に光学的に結合される、光学画像フィルタ処理ユニット８００の実施例を示す。光学画像フィルタ処理ユニット７２２のいくつかの実施形態は、光学画像フィルタ処理ユニット８００を含むことができる。代表的実施例では、フローサイトメトリ標的８０２は、フローセル８０３内で伝搬し、集光光学系８０４は、光を受け取るようにフローセル８０３にゲル結合される。異なる個別の波長λ１、λ２、λ３を伴う複数のレーザビーム８０６ａ、８０６ｂ、８０６ｃが、多波長照明ビームを形成し、レーザビーム８０６ａ−８０６ｃの個別のビーム焦点が、フローサイトメトリ標的８０２またはその近傍に配置されるように、典型的には、平行に、フローサイトメトリ標的８０２において指向される。集光光学系８０４は、レーザビーム８０６ａ−８０６ｃの個別の波長における弾性側方散乱光を集光し、個別の検出ビーム８０８ａ、８０８ｂ、８０８ｃを形成し、複数の個別の光ファイバ８１０ａ、８１０ｂ、８１０ｃに指向する。光ファイバ８１０ａ−８１０ｃは、それぞれ、集束検出ビーム８０８ａ−８０８ｃを受け取るように配置された個別の開口８１４ａ、８１４ｂ、８１４ｃを含む、個別の第１の端部８１２ａ、８１２ｂ、８１２ｃを含む。光ファイバ８１０ａ−８１０ｃの個別の反対端は、アバランシェフォトダイオード等の個別の光学検出器に光学的に結合されることができる。いくつかの実施例では、光学画像フィルタ処理ユニット８００は、フローサイトメータのフローセル蛍光／散乱集光光学系と反対側の従来のフローサイトメータのためのモジュール式アドオンデバイスとして、使用されることができる。
【００４０】
付加的実施例では、光学画像フィルタ処理ユニット８００は、高解像度計器上のレーザあたりの具体的フルオロフォアの解像度を増加させるために使用されることができる。光学画像フィルタ処理ユニット８００は、具体的波長における検出のための信号対雑音比を増加させることができる。フルオロフォアの側方散乱およびピーク発光波長を含む、選択された波長とのフィルタ処理ユニット８００の整合は、選択された波長における信号対雑音比の増加を可能にすることができる。従来の蛍光サイトメータは、典型的には、蛍光のいくつかの色を検出し、したがって、選択された波長における集光角の低減が、検出器に到達する光の量を低減させるにつれて、選択された波長のための最適焦点にはない信号の低減した信号対雑音比を有するように、最適化される。加えて、従来のフローサイトメータは、前方散乱と側方散乱との間の典型的サイズ粒度比較が単一チャネル上で達成され得るため、複数のチャネル上で側方散乱を検出しない。
【００４１】
開口８１４ａ−８１４ｃは、いくつかの実施例では、円形であり得るが、スリットのより長い寸法がフローサイトメトリ標的８０２の移動方向と平行に延在する、スリットとして形成されることもできる。図８Ｂ−８Ｄは、開口８１５ａ、８１５ｂ、８１５ｃの付加的実施例を示す。垂直軸８１７ａ、８１７ｂ、８１７ｃは、フローサイトメトリ標的８０２の移動方向に対応することができる。いくつかの実施形態では、異なる選択された波長の間を含む、異なる開口幾何学形状が、異なる波長（および対応する散乱粒子）の特性シグネチャに基づいて、選択されることができる。いくつかの実施例では、幾何学形状は、他の粒子または散乱波長と関連付けられる、選択されたミー共鳴の低減に基づいて、選択される。開口幾何学形状選択は、ナノ粒子の存在またはナノ粒子のタイプを区別する際に、スペクトルデコンボリューションを支援する、または散乱直径関係を向上させることができる。いくつかの実施例では、選択された開口幾何学形状は、１つ以上の軸を横断して対称である必要はない。
【００４２】
異なる実施例では、スリットまたは円形開口幅（直径）は、５０μｍ以下、１００μｍ以下、２００μｍ以下、３００μｍ以下、または５００μｍ以下延在することができ、開口寸法は、集束レーザビーム８０６ａ−８０６ｃの画像サイズ、光ファイバ８１０ａ−８１０ｃの導波管寸法、および集光光学系８０４の開口数よりも小さくあり得る光ファイバ８１０ａ−８１０ｃの開口数に関連して画定されることができる。他の寸法も可能であるが、しかしながら、集束レーザビーム８０６ａ−８０６ｃの画像サイズに関連する、より狭いスリット寸法は、背景雑音と関連付けられる検出ビーム８０８ａ等の入射検出サブビームの波長における光を含む、光学雑音の改良されたフィルタ処理を提供することができる。背景雑音は、フローサイトメトリ標的８０２の周囲で、入射検出ビーム８０８ａおよびフローサイトメトリ標的８０２に入射するレーザビーム８０６ａ等の対応する照明ビームによって形成される平面内に延在する、回折のリングと関連付けられる光を含むことができる。
【００４３】
いくつかの実施例では、第１の端部８１２ａ−８１２ｃは、ステージ制御８１８に結合され、入射検出ビーム８０８ａ−８０８ｃの方向（例えば、図８Ａに示されるようなｚ軸）に沿うことを含み、１つ以上の方向に沿って、それぞれ、第１の端部８１２ａ−８１２ｃを平行移動させるように配置された個別の平行移動ステージ８１６ａ、８１６ｂ、８１６ｃに結合される。独立した平行移動は、個別の第１の端部８１２ａ−８１２ｃが、入射検出ビーム８０８ａ−８０８ｃの方向に沿って相互から離間されることを可能にし、集光光学系８０４の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる検出ビーム８０８ａ−８０８ｃの間の集束距離変動を補正し得る、わずかな調節を提供することができる。いくつかの実施例では、平行移動ステージ８１６ａ−８１６ｃは、それぞれ、入射検出ビーム８０８ａ−８０８ｃの伝搬方向およびフローサイトメトリ標的８０２の流動方向と略垂直である、側方方向（例えば、図８Ａに示されるようなｘ軸）に沿って、それぞれ、第１の端部８１２ａ−８１２ｃを平行移動させるように配置される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、開口８１４ａ−８１４ｃは、例えば、挿入を介して端面８２２ａ−８２２ｃを受容することによって、ともに光学的に融合されることによって、空気または別の媒体内で離間されることによって、または便宜的であるように他の方法で、光ファイバ８１０ａ−８１０ｃの端面８２２ａ、８２２ｂ、８２２ｃに光学的に結合される、個別の光学ブロック８２０ａ、８２０ｂ、８２０ｃ上に配置される。光学ブロック８２０ａ−８２０ｃのための例示的材料は、陽極酸化アルミニウム等の金属を含むことができる。いくつかの実施例では、開口８１４ａ−８１４ｃに隣接する光学ブロック８２０ａ−８２０ｃの面積は、別様に光ファイバ８１０ａ−８１０ｃのうちの１つ以上のものの中に光学的に結合され、信号品質を劣化させ得る、入射または反射迷光を低減させるように、（典型的には広義で）光学的に吸収性および非蛍光である。付加的実施形態では、開口８１４ａ−８１４ｃは、選択された開口形状に対応する、導波管幾何学形状（例えば、円形コアまたは長方形スリット形コア）または選択的反射率コーティング適用に基づいて、光ファイバの個別の端面８２２ａ−８２２ｃ上に画定される。
【００４５】
図９は、フローサイトメトリにおけるナノタグ検出の方法９００の実施例を示す。９０２では、多波長照明ビームが、照明源を用いて発生され、フローサイトメトリ標的に指向される。９０４では、多波長照明ビームが、フローサイトメトリ標的によって弾性的に側方散乱され、９０６では、弾性的に側方散乱された多波長照明ビームと形成される多波長検出ビームの複数の検出サブビームが、多波長照明ビームの異なる波長に応答する、異なるナノタグの存在を決定するように、検出される。
【００４６】
図１０は、フローサイトメトリ標的において指向されるべき多波長照明ビームを組み合わせる方法１０００の実施例を示す。１００２では、広帯域多波長照明ビームが、スーパーコンティニウムレーザ等の広帯域源を用いて生成される。１００４では、広帯域多波長照明ビームは、異なる波長サブバンドをそれぞれ有する、複数の照明サブビームに分離される。１００６では、照明サブビームは、照明サブビームが、異なる波長サブバンドの色集束距離変動に基づいてフローサイトメトリ標的において集束されるように、異なる個別の光学経路に沿ってフローサイトメトリ標的において指向される。いくつかの実施例では、広帯域多波長照明ビームおよび別個の照明サブビームは、多波長検出ビームを生成するフローサイトメトリ標的内で弾性散乱を生成することができる。多波長検出ビームは、プリズム配列を用いて、多波長検出ビームを、波長に従って分離される複数の検出サブビームに分離することによって、検出されることができる。検出サブビームは、それぞれ、検出サブビームを集束させるように配置された個別のマイクロレンズを有する、マイクロレンズアレイを用いて受け取られることができ、検出サブビームは、マイクロレンズを用いて、光学検出器の個別の検出器チャネルに集束されることができる。
【００４７】
図１１は、フローサイトメトリ標的の共通場所に空間的に隣接する、共線である、または集束される、複数の単色レーザビームを備える、多波長照明ビームと形成される、多波長検出ビームを検出する方法１１００の実施例を示す。代表的実施例では、集光光学系が、フローサイトメトリ標的に光学的に結合される。１１０２では、多波長検出ビームが、多波長検出ビームを、多波長検出ビームの異なる単色波長のうちの１つにそれぞれ対応する複数の検出サブビームに分離するように、少なくとも１つの二色性光学要素によって集光光学系から集中的に受け取られる。１１０４では、検出サブビームが、集光光学系によって提供される集束距離および集光光学系の色収差プロファイルと関連付けられる検出サブビームの間の焦点の光学経路長差に基づく、二色性要素との離間関係で配置された個別の光学検出器を用いて受け取られる。
【００４８】
図１２は、フローサイトメトリ標的の反対側で流動と垂直な多波長検出ビームを検出する方法１２００の実施例を示す。１２０２では、多波長検出ビームの第１の部分が、集光光学系の第１のセットを用いて受け取られる。１２０４では、第１の波長を有する第１の部分の検出サブビームが、光学検出器を用いて検出される。１２０６では、多波長検出ビームの第２の部分が、第１の集光光学系から見てフローサイトメトリ標的の反対に配置された集光光学系の第２のセットを用いて、受け取られる。１２０８では、第２の波長を有する第２の部分の検出サブビームが、第１の集光光学系の色差焦点プロファイルと関連付けられる、集光光学系の第１のセットによって、第１の波長を有する検出サブビームと第２の波長を有する検出サブビームとの間の集束距離共通性および集束距離差の一方または両方に基づいて、別個に検出される。
【００４９】
図１３は、光学画像フィルタ処理ユニットを用いて、フローサイトメトリ標的から受け取られる多波長検出ビームを検出する方法１３００の実施例を示す。１３０２では、複数の単色レーザビームが、フローサイトメトリ標的の隣接する場所において集束される。１３０４では、集光光学系が、弾性的に側方散乱された検出サブビームを、隣接する光ファイバの第１の端部において、円形開口またはスリット開口を含む個別の開口に指向する。代表的実施例では、開口は、集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる、検出サブビームの間の集束距離変動に基づいて、サブビームの共通伝搬方向に沿って相互に関連して離間される。
【００５０】
図１４は、波長の連続範囲を含む、複数の波長において、弾性散乱または準弾性散乱を検出するように配置されたマイクロ流体デバイス１４００の構成の実施例を示す。いくつかの実施例では、スーパーコンティニウム白色レーザ１４０２、または複数の単色レーザまたは広帯域源を含む、代替タイプの多波長照明が、サンプル１４０８が懸濁されるマイクロ流体または他の流体デバイスの調査チャンバ１４０６に光学的に結合される、ビーム成形光学系１４０４に光学的に結合される。照明されたサンプル１４０８からの準弾性粒子散乱は、ビデオ記録デバイス１４１２を用いて記録する前に、１つまたは一連の集光光学系１４１０と結合される。代表的実施例では、ビデオ記録デバイス１４１２は、３−Ｄ高解像度、高感度、高フレームレート光照射野色記録デバイスである。
【実施例】
【００５１】
（実施例１）
ナノタグ組成物のスペクトル性質
個別に定量化可能である、高弾性散乱能力コアまたは高非弾性散乱（蛍光またはラマン散乱）を伴う成分を含み、それによって、単一の着目エピトープへの結合に基づいて、ＥＶまたは他のナノ材料の検出および選別を可能にする、光学性質を伴う単一分子ナノタグ。部分集合の表現型を決定することは、一度に１つを上回るエピトープの標識化を要求する、強力なツールである。同時に１つを上回るエピトープを標識化するために、それらを相互に区別するための独特の光学性質を伴う第２の、またはさらなるナノタグの使用が、有益であろう。図２３に示されるように、異なる金属が、屈折率および吸光係数に対して紫外線・可視スペクトル内で独特の分散性質を有する。図２４に示されるもの等のこれらの光学性質は、ＲｅｆｒａｃｔｉｖｅＩｎｄｅｘ．ｉｎｆｏ等のオンラインデータベース内で見出されることができる。
【００５２】
分子ナノタグは、種々の組成物を伴うナノ粒子の特徴的な光学性質を使用し、蛍光検出信号ではなく、弾性側方散乱検出信号を用いた単一分子標的の表現型決定を可能にすることができる。異なるナノ粒子直径および組成物の散乱性質が、ミー理論に基づくレーザ散乱物理学モデル化を使用して調査され、予測散乱性質に基づくフローサイトメータを用いた検出のために好適であり得るナノタグ組成物が、選択された。ミー理論を使用して、球体の散乱断面を概算し、したがって、異なる波長においてそれらの散乱プロファイル内に独特のピークまたはトラフを有することに起因して、複数の粒子が同時に区別され得る方法を推定することが可能である。本方法は、異なる直径および組成物の粒子を検出する、Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱ、例えば、４０５ｎｍのＳＳＣ、４８８ｎｍのＳＳＣ、５６１ｎｍのＳＳＣ、６４０ｎｍのＳＳＣ等によって、異なるレーザ波長において、複数の側方散乱（ＳＳＣ）検出器を伴うフローサイトメータの能力を予測するために有用である。
【００５３】
本モデル化技法は、金、銀、ポリスチレン、白金、二酸化チタン、酸化鉄、および銅を含む、異なる材料に適用された（図１５Ａ−１５Ｄ）。図１５Ａ−１５Ｄに示されるように、より小さい粒子、すなわち、金および銀等の約２０〜６０ｎｍの球体が、独特のスペクトルピークおよびトラフをもたらした。加えて、金、銅、および銀等の金属は、（例えば、ポリスチレンと比較して）粒子検出を向上させると予測されることが分かり得る。例えば、２０ｎｍのＡｇ球体は、３８０ｎｍの照明波長において約１×１０−１６ｍ２ｓｒ−１の散乱断面を有し、４０ｎｍのＡｕ球体は、５３２ｎｍの照明波長において約１×１０−１６ｍ２ｓｒ−１の散乱断面を有する。
【００５４】
異なる組成物を伴う粒子のこれらの固有の散乱性質は、蛍光が使用されるにつれて、しかしながら、代わりに散乱を利用することによって、標識化へのスペクトルアプローチを可能にするであろう。例えば、図１５Ｂおよび図１６Ａでは、４０５ｎｍの照明波長において、６０ｎｍの銀粒子の集光された光散乱は、６０ｎｍの金粒子よりも約１００倍高い。しかしながら、５６１ｎｍの照明波長において、６０ｎｍの金粒子の集光された光散乱は、６０ｎｍの銀粒子よりも５〜１０倍高い。本モデル化されたデータは、Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱ計器上で４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、および６４０ｎｍの照明波長において６０ｎｍの銀および金球体を入手し、スペクトル散乱が利用され得る方法への初期洞察を与えることによって正当性を立証された（図１６Ｂ）。モデルが予測したように、６０ｎｍの銀粒子の集光された散乱（赤色または薄い灰色）は、６０ｎｍの金と比較して（青色または濃い灰色）、５６１ｎｍ散乱チャネル上でより少なく、６０ｎｍの銀粒子の集光された散乱は、４０５ｎｍ散乱チャネル上で６０ｎｍの金よりも多かった。
【００５５】
したがって、その計器上で入手可能である特定のＳＳＣに基づいて、本明細書に説明される分子ナノタグを作製する適切な材料を選択することができる。例えば、計器が４０５ｎｍＳＳＣ検出器を有する場合、銀ナノ粒子が使用されることができ、計器が５６１ｎｍまたは５３２ｎｍＳＳＣ検出器を有する場合、金ナノ粒子が、使用されることができる等である。特定の実施例が、下記の表１に示される。
【表１】
2021500558.tif 000003
【００５６】
図１７Ａ−１７Ｂは、金と銀ナノ粒子との間のスペクトルデコンボリューション分析の実装を決定するように、２０ｎｍおよび４０ｎｍの金および銀粒子からの集光された散乱の関係を示す。金および銀ナノ粒子の集光された散乱が、銀対金散乱の比とともにプロットされた。Ａｇ／Ａｕ線は、Ａｇ対Ａｕ集光散乱能力の比を表す。黒い鎖線は、Ａｕ集光散乱能力を表す。一点鎖線は、Ａｇ集光散乱能力を表す。水平線は、１の金および銀散乱能力比を表す。点線は、１００ｎｍ金の集光散乱能力を表す。銀対金の散乱の比は、銀粒子からの散乱光が金のものを上回り（Ａｇ／Ａｕ＝１水平線の上方、３５０ｎｍ〜５１０ｎｍ）、金粒子の集光された散乱が銀粒子のものを上回る（Ａｇ／Ａｕ＝１水平線の下方、５１０ｎｍ〜８００ｎｍ）であろう波長を決定するために、使用されることができる。単色レーザ照明波長が、スペクトル散乱検出に使用され得るスペクトル照明の一実装を示すように、垂直線としてグラフとオーバーレイされる。
【００５７】
集光光学系の集光角および幾何学形状は、（図２６Ａ−２６Ｂに示されるように）粒子散乱とそれらの直径および組成物との間の関係に影響を及ぼし得る。上記のモデルの第２の変形例（図１８Ａ）が、４０ｎｍのＡｕ、４０ｎｍのＡｇ、および１００ｎｍのポリスチレン（ＰＳ）に関して、２度増分で２０〜６０度の典型的フローサイトメータ集光半角によって、モデル化された粒子を満たすように作成された。特定のスペクトル特性が、図１７Ａで見られ得る。図１８Ａは、集光半角が光学検出器によって集光される散乱能力に影響を及ぼすことを示す。しかしながら、図１８Ｂは、集光半角の全てを横断する銀対金の比がオーバーレイされるときに、比が同一のままであることを示す。球体がレイリー範囲内であり、等方的に光を散乱しているため、単一デコンボリューション方法が、異なる集光半角を伴う計器を横断して球体を検出するように適用されることができる。図２１Ａ−２１Ｂは、０〜５００ｎｍに及ぶ直径を伴う３０度の集光半角においてモデル化される、金と銀との間の散乱関係への側方散乱集光光学系の集光角の影響を示す。
【００５８】
Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱ上で４０５、４８８、５６１、および６４０ｎｍ照明波長を使用する、金および銀スペクトルデコンボリューションの方法が、上記のモデルおよび所見に基づいて作成された。図２２Ａおよび２２Ｃは、照明波長によって層別化される、異なる直径の金および銀ナノ粒子のモデル化された集光散乱能力を示す。図２２Ｂおよび２２Ｄは、本明細書のスペクトルモデル化技法の正当性を立証するように、モデル化されたデータと比較して、金および銀ナノ粒子散乱の実際の性能を示す。本データは、再度、予測されたモデル化データおよび入手されたデータが極めて同等であることを示す。いくつかの実施例では、図２２Ｂおよび２２Ｄに示されるデータは、フローサイトメータ計器較正のための異なる分子ナノタグコア材料から成る代表的基準ビーズセットとして、かつデコンボリューションアルゴリズムのための基準値を取得するために、使用されることができる。デコンボリューションアルゴリズムは、入手された基準ビーズデータを使用し、計器を較正し、波長毎に粒子散乱モデル化（図２０Ａ−２０Ｂ）を可能にすることができる。較正後に入手された信号は、入手された信号のスペクトル散乱特性および計器の散乱モデル化に基づいて、デコンボリューションされることができる。例えば、入手された信号ｈは、フローサイトメトリ標的内の他の粒子からの散乱、計器特有の応答特性、および雑音を含む、散乱スペクトルプロファイルｆを覆うように動作する、種々の関数成分を有し得る、関数ｇを用いてコンボリューションされる（※）、散乱粒子スペクトルプロファイルｆに対応することができる。いくつかの実施例では、計器特有の応答特性は、検出感度がミー共鳴に合致される、または具体的に合致されないように、構成要素選択（例えば、広帯域またはスーパーコンティニウム照明源、フローサイトメトリ標的が流動しているキュベット幾何学形状、ＮＡ等の集光レンズ特性、スリット開口幾何学形状、検出器および／またはフィルタ選択を伴う検出器感度調節）によって調節されることができる。実施形態では、複数の検出ユニットが、検出中にミー共鳴を活用するように、異なる所定の集光角を伴う集光レンズをそれぞれ用いて、側方散乱を検出するように配置される。さらなる実施形態では、単一の検出ユニットは、検出中にミー共鳴を活用するように構成されることができる。代表的実施例では、フローサイトメトリ集光光学系は、実際の集光角に対応するように検証され得る、集光光学系の集光角の予測を提供するようにモデル化されることができる。代表的計器は、既知のサイズおよび屈折率のビーズを用いて較正されることができる。検出された粒子の直径または屈折率は、検出された散乱性質および集光角に基づいて推測されることができる。散乱性質および集光角はまた、異なるスペクトル散乱特性を有する複数の異なる粒子についての情報を含有する、検出された信号のデコンボリューションを支援するために使用されることもできる。異なる実施例では、異なるサイズのナノタグが、検出されることができる、または同一のサイズであるが異なるスペクトル特性のナノタグ、または付着したナノタグを含む、具体的ＥＶが、検出されることができる。
【００５９】
単一金および銀ナノ粒子を検出し、検出技法としてのその適用可能性を示す他の市販のフローサイトメータの能力もまた、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメータ上で種々の金および銀ナノ粒子を入手することによって示された（図２５）。
【００６０】
（実施例２）
ナノタグを検出するための例示的レーザ整合
複数の側方散乱波長における側方散乱検出に基づいて、エピトープ検出のためにナノタグを使用することは、異なる粒子組成物の弾性散乱に依拠することができる。したがって、代表的実施形態は、同時に使用および検出され得るナノタグ組成物の数を増加させるように、紫外線・可視スペクトルを横断する波長または波長範囲を有する、多波長照明入力を使用する。異なる実施例では、ナノタグを検出することが可能な光学デバイスは、ナノタグの広範なスペクトル照明を提供するように、一例として図１または図２Ａに示されるもの等のスーパーコンティニウム白色レーザ源を使用することができる。付加的実施例では、単色レーザが、使用されることができる。いくつかのフローサイトメトリシステムの実施例では、別個のビームが、共線的に整合された波長として、または他の構成で、空間的に分離された波長に配列されることができる。フローサイトメータ照明ビーム入力の実施例は、波長特有の焦点距離の差を考慮し、例えば、図２Ａ−４Ａに示されるように、レーザビームの最高強度部分がフローサイトメトリ標的のコア流上に集束されることを確実にすることができる。いくつかの実施例では、フィルタもまた、異なる波長のためのレーザビームを空間的に分離するために使用されてもよい。いくつかの実施例では、白色光スーパーコンティニウム光源を用いると、ビーム成形光学系が、フィルタの前、間、または後に含まれることができる。単色レーザ源の場合、ビーム成形光学系自体、またはビーム指向ミラーが、レーザビームを空間的に分離するように移動されることができる。
【００６１】
（実施例３）
ナノタグを検出するための白色光の使用
開示される分子ナノタグは、（例えば、単色レーザの代わりに）白色または広帯域光照明を使用して、検出されることができる。単一分子ナノタグスペクトル散乱分析は、波長に基づいて、プリズムアセンブリを通して白色光照明を有する検出ビームを別個の照明に指向することによって、かつマイクロレンズアレイを用いて別個のビームを集束させ、ＰＭＴ／ＡＰＤ検出器アレイ（３２チャネルＰＭＴ／ＡＰＤ検出器アレイ等）を用いて集束ビームを検出することによって、達成されることができる。本実施例では、フルスペクトル散乱フローサイトメトリが、全ての紫外線・可視波長において照明を提供する、スーパーコンティニウム白色レーザを使用することができる。白色光は、コア流懸濁粒子上に集束されることができる。粒子光散乱は、高開口数色補正レンズを使用して、照明光と垂直に集光されることができる。本光は、紫外線・可視スペクトル散乱検出を提供するマルチチャネル光検出器上に連続的に集束される、光の波長を分離するように、一連のプリズム上に集束される。帯域通過フィルタが、プリズムとマルチチャネル光検出器との間に配置されることができる。いくつかの実施例では、選択されたチャネルが、より大きい波長範囲を横断して散乱を検出し、検出感度を増加させることができる。ビーム成形光学系またはビーム成形システムが、多波長照明の焦点の変動を殆ど提供しないように、使用されることができる。例えば、白色光源からの多波長照明は、照明の帯域に分割され、複数のビーム成形光学系と共線的に整合されることができる。
【００６２】
（実施例４）
ナノ粒子散乱およびフローサイトメータモデル化
光の量をモデル化するために、フローサイトメータは、所定の直径および屈折率の所与の粒子から受け取り、図２０Ｂ等の散乱直径曲線を作成するように、ＨＡＤ（半角決定）モデル化スクリプトが、集光半角を決定するために使用される（図２０Ａ）。本モデル化方法は、本来、散乱直径関係曲線（図２６Ｂ）を作成し、既知の直径および屈折率の粒子を使用するフローサイトメトリ計器の集光半角（図２０Ａ）を決定するように設計された、Ｗｅｌｓｈ，  Ｊｏｓｈｕａ  （２０１６）  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｓａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｔｈｅｓｉｓ，  ２０９ｐｐ（その全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）による研究を基礎とした。光検出器に到達する光の限定的集光角を決定する本方法は、「予測曲線のみ」１０００方法または「波走査」２０００および「波走査」３０００方法等のフローサイトメータのさらなるモデル化を可能にする。
【００６３】
図１９Ａに示されるような「予測曲線のみ」１０００方法は、入手されたフローサイトメトリデータを予測粒子散乱データに適合／正規化する必要なく、異なる波長および集光角において種々の直径の粒子の散乱関係を予測するために使用される。ＡｕＲＩ  １１６およびＡｇＲＩ  １１７スクリプトが、金および銀の両方の光学性質をモデルの中に入力するために、「ＨＡＤ方法」からの以前に開発されたスクリプトのセット（１１４、１１５、２００、２０１、２０２、２０３、２２０、２２１、２２２、２２３、２２００、２２１０、２２２０）に追加された。
【００６４】
本方法は、異なる照明波長における異なる組成物を伴うナノタグの散乱能力の集光差を予測するために使用されることができる（図２１Ａ−Ｄ）。組成物あたりの集光粒子散乱を理解するための本アプローチは、最適な分離を伴って直径／組成物の識別を可能にし、入手されたデータの区別を可能にする。例えば、散乱集光光学系を伴う４０５ｎｍ照明レーザフローサイトメータ構成を有し、２つの４０ｎｍの球体が標識として使用された場合、それらの組成物は、４０ｎｍのポリスチレン球体および銀球体が最高分離を示す、図２１Ａを使用して決定され得る。
【００６５】
「予測曲線のみ」１０００方法の外挿は、既知の直径および組成物を伴う粒子のセットのための最適な照明波長を見出し、それによって、粒子ナノタグ組成物のための照明または集光光学系の設計を可能にするように設計される、「波走査」１０００および２０００方法（図２４Ｈ−２４Ｉ）である。これらの方法はまた、紫外線・可視スペクトル内の複数の波長を横断して（図１９Ｂ）、または複数の集光半角を横断する設定された分子ナノタグサイズを横断して（図１９Ｃ）、当該フローサイトメータに関して、所定の半角（既知であるか、または「ＨＡＤ」方法を使用して決定されるかのいずれかである）において異なる分子ナノタグ組成物のスペクトル散乱特性を分析することによって、スペクトルデコンボリューションを補助するために使用されることもできる。
【００６６】
スクリプト２０００、３０００は両方とも、共通サブスクリプトを使用するが、異なる出力を提供するように実装される。そのようなスクリプトに関する図および説明は、２０１７年１０月２３日に出願され、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎａｎｏｔａｇｓ」と題された、関連ＰＣＴ出願（参照することによって本明細書に組み込まれる）で見出されることができる。スクリプト２０００は、紫外線・可視スペクトル内の波長を横断して、所定の直径の種々の粒子組成物の散乱能力をモデル化する。スクリプト２０００は、特定の波長のための好適な散乱性質を伴う組成物を決定または選択するように、異なる粒子組成物のスペクトル散乱性質の推定値を提供することができる。また、モデル化方法２０００の出力は、スペクトル散乱検出に適用される一般的スペクトルデコンボリューションアルゴリズムの基礎を提供することができる。「波走査」３０００は、集光角別に、複数の波長を横断して粒子の散乱能力を層別化する。粒子散乱直径性質への集光角の影響が、したがって、調査され得る。「波走査」３０００方法を使用して、金および銀のナノタグ組成物の間の集光散乱能力の比（図１８Ａ−Ｂ）が、等方的に光を散乱させる粒子に起因して、集光角にかかわらず維持されることが示され得る。
【００６７】
さらに、金および銀等の異なるナノタグ組成物のスペクトル散乱特性を理解することによって、単色レーザダイオード源の場合、最適な照明入力を推定することが可能である（図１７Ａ−１７Ｂ）。図１７Ａには、４０ｎｍの金および銀球体、１００ｎｍのポリスチレン球体のスペクトル散乱特性、および各波長における銀対金の散乱の比が示される。フローサイトメータがスーパーコンティニウム白色レーザ等の広帯域照明源を使用しなかった場合、いくつかの単色レーザダイオード源の実装は、検出されているナノタグのスペクトル散乱特性への洞察を要求するであろう。図１７Ａのように、金および銀の場合、照明波長４０５ｎｍ、４４５ｎｍ、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、５６１ｎｍ（全て市販のレーザ源である）の探査が、金および銀の照明波長依存性散乱におけるピークおよびトラフから十分なデータを提供し、スペクトルデコンボリューションを可能にするであろう。これは、４０５、４８８、５６１、６４０ｎｍの波長における照明および散乱検出とともに市販のフローサイトメータ（Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱ）をすでに利用している初期的様式で実装されている（図１９Ａ−Ｂ）。
【００６８】
本明細書に議論される波長モデルはまた、ＨＡＤスクリプトを基礎とするが、しかしながら、いくつかの粒子組成物の入力を可能にするために、種々の材料の分散性質が、金、ＡｕＲＩ  １１６、銀、ＡｇＲＩ  １１７、ポリスチレン、ｐｏｌｙ  ＲＩ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  １１４、白金、ＰｔＲＩ  １１８、二酸化チタン、ＴｉＯＲＩ  ２０１０、酸化鉄、Ｆｅ３Ｏ４  ＲＩ  １１９、銅、ＣｕＲＩ  １２０、および鉛、ＰｂＲＩ  １２１を含む、スクリプトへの入力を可能にするように、データベースに入力された。
【００６９】
（実施例５）
検出された粒子散乱への光学開口の影響
スリット開口の使用は、分離指数（平均大型ビーズ散乱能力−平均小型ビーズ散乱能力）／（大型ビーズ散乱能力標準偏差＋小型ビーズ散乱能力標準偏差）を使用することによって、図２７に示される信号対雑音比を増加させ得ることが実証されている。より大きい分離指数は、より大きい信号対雑音比に対応する。１つの波長において信号対雑音比を増加させている間のスリット開口の適用は、典型的には、他の波長の信号対雑音比を損なわせる。これは、従来のフローサイトメトリ光学系内のその実装が、同一の励起波長を使用して、異なる波長において発光する、異なるフルオロフォアを検出することによって、従来のサイトメータが行うように、同時にいくつかの異なる波長の検出に役立たないことを意味する。さらに、固定された光学系ではなく光ファイバを利用する、フローサイトメータ上の集光光学系は、固定面内で集光し、したがって、１つの散乱波長のためのスリット開口の使用は、典型的には、他のレーザの散乱波長を損なわせるであろう。本明細書の光学画像フィルタ処理ユニット（ＯＩＦＵ）の議論される実装は、レーザあたり異なる集光波長に同調されることができる。さらに、これは、フローセルの反対側に実装され、したがって、蛍光感度を維持しながら高感度散乱検出を可能にすることができる。
【００７０】
ＯＩＦＵの使用は、選択的散乱波長の高感度を提供するが、スペクトル散乱波長検出を利用する構成と比較した、その使用は、デコンボリューションプロセスが適用されるときに限定される。選択的散乱波長検出のみを使用することによって、典型的には、使用され得る分子ナノタグの数を削減し、最終的に、粒子表現型決定においてより少ない能力をもたらす、限定された程度の利用可能であるデコンボリューションが存在する。
【００７１】
図２０Ｂに示されるようなフローサイトメトリ散乱モデルの開発と組み合わせられる、光学開口の実装は、さらなる理解がフローサイトメータ集光光学系の設計において獲得されることを可能にする。図２６Ａ−２６Ｂに示されるように、その集光角および開口タイプは、粒子の散乱直径関係に影響を及ぼし得る。円形開口が１０度の集光半角を伴う計器上で使用される場合、散乱直径関係曲線内のミー共鳴（トラフ）は、同一の集光半角を使用する正方形集光開口のものよりも深いことが分かり得る。したがって、開口特性（例えば、幾何学形状）を着目粒子の散乱分布に合わせ、検出またはデコンボリューションを補助するであろう一意の散乱直径関係を生成することが可能である。
【００７２】
（実施例６）
スペクトルプロファイル比較およびデコンボリューション
Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．“Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，”  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ２０１８，  １８，  ２４６１；  ｄｏｉ：  １０．３３９０／ｓ１８０８２４６１（参照することによって本明細書に組み込まれる）に説明されるように、本明細書に説明されるモデル化アプローチが、種々のフローサイトメトリ計器の感度を特性評価し、ナノタグ（または他の粒子）サイズ（典型的には直径）および屈折率に関する検出限定を決定するために、使用されることができる。いったん特性評価されると、いくつかの実施例では、側方散乱検出信号をデコンボリューションし、異なる組成物および／またはサイズの粒子に関して、データを特性スペクトルプロファイルと比較することによって、フローサイトメトリ標的内のナノタグおよび他の粒子の存在を決定するように、既存のフローサイトメトリ計器を改造することによるものを含む、本明細書に説明されるスペクトル分析アプローチが、使用されることができる。代表的実施例では、特徴的なスペクトルプロファイルが、選択されたスペクトル範囲を横断して波長の関数としての強度の変動によって定義されることができ、いくつかの実施例では、そのような比較およびデコンボリューションは、単一粒子検出を提供することができる。
【００７３】
Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．で解説されるように、細胞外小胞（ＥＶ）は、大部分は直径が＜１５０ｎｍである、小型（３０〜１，０００ｎｍ）の膜小胞である。それらの小さい表面積に起因して、細胞と比較すると、ＥＶ表面マーカの大部分のエピトープ発現は、フローサイトメトリ等の従来の高スループット、マルチパラメータ検出技法の検出可能範囲を下回る。
【００７４】
現在のフローサイトメータは、数千から数百個の蛍光分子を区別することが可能である。ＣＤ１４等の極めて豊富なリンパ球表面マーカの表面発現は、リンパ球あたり１００，０００個のコピーの領域内にある。本エピトープ密度が１００ｎｍのＥＶまで縮小された場合、小胞あたり＜３０個のＣＤ１４コピーに相当するであろう。したがって、ＥＶ分野で満たされていない要求は、理想的には、現在利用可能な検出機器およびフローサイトメータを利用して、単一ＥＶ上で単一エピトープ検出を可能にする、標識の開発である。
【００７５】
現在の蛍光ベースのフローサイトメトリは、蛍光共役抗体の形態である傾向がある、蛍光プローブを使用して、タンパク質の発現を定量化する。これらは、免疫学分野で細胞分析のための強力なツールであることが証明されているが、それらの現在の形態では、利用可能なフローサイトメータの大部分上のＥＶ表面タンパク質発現を定量化するためには不十分である。ＱＤｏｔｓ等のより新しい世代の蛍光標識が出現しているが、それらは、概して、低表面エピトープ定量化のためには不十分なままである。個々の標的の時限検出のための標識としてのＱＤｏｔｓの使用はまた、一般的に「ブリンキング」と称される、確率的光学変動によって複雑化される。
【００７６】
分析の目的が、サンプル内の具体的マーカに関して陽性であるＥＶの数を計測することであるとき、計測の方法は、１つ以上の具体的表面マーカを伴う各ＥＶを検出することが可能でなければならない。この場合、単一標識感度で単一標識を検出することが可能な標識および計器を使用することが重要である。他方では、目的が、個々のＥＶ上に存在する受容体の数を定量化または比較することであるとき、一定の標識対標的比が存在しなければならず、１価の標的結合部位を伴う標識が、ＥＶ上の単一分子検出および表面受容体定量化のために必要とされる。希釈制御、ＭＥＳＦビーズ、および／または散乱モデル化等の他の標準化ステップもまた、ＥＶを計測するときに考慮されるべきである。ＱＤｏｔｓを利用する、殆どの市販の技法は、多価形態でこれらの標識を使用するが、他のナノ粒子の共役に直接移入可能であり得る、１価のＱＤｏｔｓを作成しようとした、新しい手段が出現している。
【００７７】
本明細書に説明される、新規の部類のナノスケール分子タグ（ナノタグ）は、フローサイトメータを使用する、単一標識、したがって、単一分子検出を可能にすることができる。代表的実施例では、ナノタグは、高い屈折率および／または高い光吸収、および細胞外小胞等の小粒子の低エピトープ数計測およびスペクトル表現型決定の両方を可能にするであろう一意のスペクトル散乱性質を伴う材料から成ることができる。本明細書に説明されるように、ナノタグ組成物が、明白な光学検出のために選択され得、ナノタグ組成物が、粒子表現型決定を可能にするように同時に使用され、依然として、相互と区別され得ることが示される。分析は、ナノ粒子による波長依存性光散乱の数値モデル化およびフローサイトメトリデータとの比較に基づく。
【００７８】
最初に、増加した光散乱を補助するであろう有用な光学性質を伴う粒子を識別するために、屈折率および吸光係数が、照合される。波長３００〜８００ｎｍを横断する粒子屈折率および吸光係数が、以下の組成物、すなわち、金、銀、酸化鉄、二酸化チタン、銅、白金、鉛、およびジルコニウムに関して、文献から集計された。ポリスチレンおよび水の屈折率は、対応するセルマイヤー方程式を使用して、各波長において計算された。組成物選択は、ナノ粒子可用性および高い屈折率（例えば、二酸化チタン）または吸光係数（例えば、鉛）、または中程度の屈折率および吸光係数を有すること（例えば、金、銀、銅）に基づいて、さらに絞られた。
【００７９】
フローサイトメトリ測定が、ＭｏＦｌｏ  Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ，  ＵＳＡ））およびＦＡＣＳ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（ＢＤ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ  ，ＵＳＡ））フローサイトメータ上で実施された。Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱは、側方散乱集光（ＳＳＣ）検出が、４０５、４８８、５６１、および６４０ｎｍにおいて可能である、５つのレーザ（３５５、４０５、４８８、５６１、および６４０ｎｍ波長）を用いたジェットインエアシステムである。Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱ設定および検出閾値の詳細な説明が、文献で見出されることができる。ＦＡＣＳ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙは、ＳＳＣ検出がデフォルトデバイス構成を用いて４８８ｎｍのみにおいて可能である、５つのレーザ（３５５、４０５、４８８、５３２、および６４０ｎｍ）を用いた細胞分析器である。ＳＳＣを介した粒子計測のための機器パラメータは、２００のトリガ閾値、３５０の電圧、および低流体率に設定された。散乱パワー対直径の測定に関して、ＮＩＳＴ追跡可能ポリスチレンビーズ（１００、１２５、１４７、２０３、２９６、４００、６００、７９９、９９４ｎｍ直径）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌからの贈与（Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ））およびシリカビーズ（１８２、３１５、３５９、４０５、５４８、８００、１，０００ｎｍ）（Ｋｉｓｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌからの贈与（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））が、１ｍＬあたり０．１〜１×１０８個の粒子の濃度において分析され、以前に公開されたフローサイトメータ方法を使用して、予測された散乱対入手された散乱の適合を確認した。
【００８０】
高屈折率粒子入手モデル化比較に関して、直径２０、４０、６０、８０、および１００ｎｍのＡｇ粒子（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＯＮ，  Ｃａｎａｄａ））、直径２０、４０、６０、および８０ｎｍのＡｕ粒子（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、および１００ｎｍのポリスチレンＮＩＳＴ追跡可能ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および２００ｎｍの蛍光ポリスチレンビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、各計器上の入手の前に、１ｍＬあたり０．１〜１×１０７個の粒子の濃度に希釈された。図２８Ａ−２８Ｆに示されるように、４０、６０、８０ｎｍのＡｕ粒子の線形希釈が、単一粒子検出を維持した、機能するサイトメータ入手濃度を確認するように実施された。すなわち、４０ｎｍのＡｕナノ粒子の連続希釈が、図２８Ａ−２８Ｂに示され、６０ｎｍが、図２８Ｃ−２８Ｄに示され、８０ｎｍが、図２８Ｅ−２８Ｆに示される。Ａｕナノ粒子が、１ｅ７粒子ｍＬ−１における２００ｎｍの蛍光ポリスチレンビーズにおけるスパイクを伴って、１ｅ７、１ｅ６、および１ｅ５粒子ｍＬ−１まで希釈された。検出されたＡｕ対２００ｎｍのポリスチレンの比が、Ａｕの調製濃度に対してプロットされた。調製Ａｕ濃度と対比した希釈Ａｕ対スパイクビーズの比は、線形減少を取得することが分かり得る。これは、単一粒子検出を示す。さらに、単一粒子検出をさらに示す、種々の希釈における粒子散乱信号の感知できる差がない。粒子濃度が、製造業者割合の固体を使用して決定された。スパイクイン粒子濃度が、ナノ粒子追跡分析を使用して決定された。
【００８１】
データが、Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱ上の入手ソフトウェアＳｕｍｍｉｔ  ｖ６およびＦＡＣＳ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ用のＤｉｖａ  ｖ８を使用して、入手された。データ入手の完了に応じて、ファイルが、入手ソフトウェアからエクスポートされ、入手後分析のためにＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０（ＴｒｅｅＳｔａｒ）の中にインポートされた。フローサイトメトリファイルは、ｈｔｔｐｓ：／／ｆｌｏｗｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．ｏｒｇ／ｉｄ／ＦＲ−ＦＣＭ−ＺＹＬ７およびｈｔｔｐｓ：／／ｆｌｏｗｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．ｏｒｇ／ｉｄ／ＦＲ−ＦＣＭ−ＺＹＬ６において見出されることができる。
【００８２】
上記で試験されるいくつかの異なるフローサイトメトリ計器は、非常に高い蛍光分子検出感度を有するとされる。しかしながら、同等可溶性フルオロフォアの分子（ＭＥＳＦ）検出の概算である、ＭＥＳＦ値に関する検出の下限を測定した後、試験される計器のうちの最も敏感なものでさえも、＞２５個の蛍光分子を伴う物体を検出することのみ可能であることが見出される。そのような感度および蛍光ベースのアプローチは、小胞あたり１つまたは２つの分子と同程度の少ない数で存在し得る、細胞外小胞の成分の構成要素の検出のためには不十分である。本データは、金属等の標識から側方散乱光スペクトルを検出することの重要性へのさらなる支持を提供する。したがって、本明細書の開示される技術の代表的実施例は、蛍光および非蛍光光散乱の両方を分析することが可能であり得る。
【００８３】
ナノ粒子検出のためのスペクトルプロファイルを提供するために、フローサイトメータおよび粒子スペクトル散乱が、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）  ｖ９．３．０（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈ  Ｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．（Ｎａｔｉｃｋ，  ＭＡ，  ＵＳＡ））を用いて数値的にモデル化された。検出器に到達する、固定直径（２０、４０、６０、８０、１００ｎｍ）の球形粒子によって散乱される光の累積パワーは、ミー理論を使用して計算され、ミー散乱および吸収に関する関数を説明する、Ｍａｔｚｌｅｒからのものを基礎とするスクリプトを用いて、数値的に実装された。使用される計算は、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．およびＦａｔｔａｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．のものに類似する。本ソフトウェアは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｏｓｈｕａｗｅｌｓｈ．ｃｏ．ｕｋ／ｓｃａｔｔｅｒ−ｄｉａｍｅｔｅｒ−ｓｏｆｔｗａｒｅ／（参照することによって本明細書に組み込まれる）において入手可能である。粒子光散乱モデル化は、側方散乱、すなわち、照明の方向と垂直に集光される光に焦点を当てた。Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱフローサイトメータの側方散乱集光光学系は、２９°であるように概算される限定的半角を伴う円形集光開口を有する。粒子懸濁媒体は、水の光学性質を使用してモデル化された。散乱パワー（または同等に散乱断面）対粒子直径の曲線を生成するために、実験データにモデル化されたデータを適合させることが、シミュレートされた散乱断面と実験的に測定されたパワーレベルとの間で変換するように、単一倍率を使用して、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．の方法を使用して実行された。フローサイトメトリデータは、モデル化からの予測対入手された値の線形回帰を使用して、恣意的単位からｎｍ２単位の散乱断面に変換された。
【００８４】
金および銀粒子直径分布および濃度が、４０５ｎｍ  ＬＭ１２モジュールおよびＥＭＣＣＤカメラ（ＤＬ−６５８−ＯＥＭ−６３０，Ａｎｄｏｒ（Ｂｅｌｆａｓｔ，  ＵＫ））を具備した、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＬＭ１０計器（Ｍａｌｖｅｒｎ，  ＵＫ）を伴うＮＴＡを使用して測定された。ビデオ入手が、１４のカメラレベルを使用して、ＮＴＡソフトウェアｖ３．２を用いて実施された。３つの３０秒のビデオが、サンプルあたりで捕捉された。入手後ビデオ分析は、以下の設定、すなわち、最小追跡長＝５、検出閾値＝４、自動ぼやけサイズ＝２パス、最大ジャンプサイズ＝１２．０を使用した。
【００８５】
本明細書に説明されるフローサイトメータ粒子散乱モデル化の方法を使用して、（図２０Ｂに示されるような）散乱直径関係は、検出可能であり得る粒子直径および組成物を予測するように、文献からの基準屈折率および吸光係数と組み合わせられることができる。Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱサイトメータの側方散乱集光光学系は、図２９に示される（また、図１５Ａ−１５Ｄでも見られ得る）紫外線・可視スペクトルを横断してＡｕおよびＡｇナノ粒子の相対的な検出された散乱能力を決定するように、モデル化された。他の組成物（白金、二酸化チタン、酸化鉄、銅、鉛、ジルコニウム）もまた、図１５Ａ−１５Ｄで波長に関して（強度または能力と同様に）断面のスペクトルプロファイルを伴って示されるように、モデル化された。プロファイルのそれぞれにおける組成物とサイズとの間のスペクトル変動の差は、フローサイトメトリ標的内のナノタグおよび他の粒子を識別するために、デコンボリューション中に使用されることができる。一般に、複数の波長において検出することによって、スペクトル検出能力を増加させることは、多波長検出信号のデコンボリューション中に粒子識別の信頼レベルを改良することができる。
【００８６】
断面散乱基準として１００ｎｍのポリスチレン（ＰＳ）ビーズを使用し、それらが種々のフローサイトメトリプラットフォーム上で検出可能であることに起因して、図２９から、約４００ｎｍにおいて照明される２０ｎｍの銀ナノ粒子が、１００ｎｍのＰＳ粒子よりも高い散乱断面を有することが分かり得る。また、４０ｎｍのＡｕ粒子は、約５３２ｎｍの照明波長において１００ｎｍのＰＳ球体の散乱断面を超え、４０ｎｍのＡｇ粒子は、約３５０〜４５０ｎｍに及ぶ照明波長を伴って高い散乱断面を有する。さらに、セレン化カドミウム、酸化鉄、および二酸化チタンを除く全ての組成物の６０ｎｍ球体は、スペクトルの赤色面積（＞７００ｎｍ）内に落下する前に、紫外線・可視スペクトルの大部分を横断して１００ｎｍのＰＳ球体よりも高い散乱断面を有する。
【００８７】
図２５に示されるように、ＰＳ、Ａｕ、およびＡｇナノ粒子が、粒子が４８８ｎｍの従来の散乱集光波長を使用して検出可能であるかどうかを決定するように、Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱおよびＦＡＣＳ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ計器上で分析された。染色されていない１００ｎｍのＰＳビーズが、両方の計器上で分解可能であった。１００、８０、６０、および４０ｎｍのＡｇ粒子が、両方の計器上で背景から区別可能であり、４０ｎｍ集団は、Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱおよびＦＡＣＳ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ上で背景雑音から部分的にのみ分解された。２０ｎｍのＡｇまたはＡｕ粒子は、いずれの計器上でも分解されなかった。８０、６０、および４０ｎｍのＡｕ粒子が、両方の計器上で分解され、再度、４０ｎｍのＡｕは、各計器上で部分的にのみ分解された。
【００８８】
ＰＳ、Ａｕ、およびＡｇ粒子は、（図２２Ｃに示されるように）Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱの多波長モデル化を使用して調査され、それらは、（図２２Ｄに示されるように）４８８および５６１ｎｍＳＳＣチャネルからの入手されたデータと比較された。４０５、４８８、５６１、６４０ｎｍにおけるモデル化されたデータと入手されたデータとの間の比較もまた、実施された。計器背景雑音を基準として使用して、４０ｎｍのＡｇ粒子が、５６１ｎｍ、４８８ｎｍ、および４０５ｎｍＳＳＣチャネル上で部分的に分解され、６４０ｎｍＳＳＣチャネル上で分解されなかった。４０ｎｍのＡｕ粒子が、５６１ｎｍおよび４８８ｎｍＳＳＣチャネル上で完全に分解され、６４０ｎｍＳＳＣチャネル上で部分的に分解され、４０５ｎｍＳＳＣチャネル上で分解されなかった。１００ｎｍのＰＳ粒子が、４８８ｎｍおよび５６１ｎｍＳＳＣチャネル上で完全に分解され、４０５ｎｍＳＳＣチャネル上で部分的に分解され、６４０ｎｍＳＳＣチャネル上で分解されなかった。全ての他の粒子が、全てのＳＳＣチャネル上で計器背景雑音から分解可能であった。
【００８９】
全てのチャネル上のＡｕ、Ａｇ、およびＰＳ粒子散乱の間の関係は、図２２Ｃと図２２Ｄとの間の類似性で見られ得るように、モデルと入手されたデータとの間で良好に維持された。Ａｕ粒子は、４８８ｎｍＳＳＣチャネルと５６１ｎｍＳＳＣチャネルとの間で散乱の線形増加を示し、ＰＳ粒子もまた、線形に増加するが、Ａｕよりも増加した４８８ｎｍ散乱を伴うと考えられ、Ａｇは、６０〜８０ｎｍの４８８ｎｍ散乱チャネル上の散乱が漸減し始める前に、４８８ｎｍ散乱チャネルと５６１ｎｍ散乱チャネルとの間で線形に散乱するが、５６１ｎｍ散乱で増加し続けると考えられる。
【００９０】
フローサイトメトリにおいて即座にいくつかのナノタグの使用を実装するために、粒子が、デコンボリューションを通して信号抽出および識別の基礎を提供するように、区別可能なスペクトル散乱性質に基づいて選択される。明確に異なるスペクトル散乱性質を示す２つの材料の実施例は、図３０Ａに示されるように（図１８Ｂと同様に）６０ｎｍのＡｕおよびＡｇである。Ａｇ対Ａｕ散乱の比をプロットすることによって、殆どの分離が起こる可能性が高い波長が、決定されることができる。６０ｎｍのＡｇ粒子は、逆が５１０ｎｍ〜８００ｎｍで起こる前に、３５０〜５１０ｎｍの波長の間で６０ｎｍのＡｕ粒子よりも多く散乱するであろうことが分かり得る。本分離は、（相対パワーの正規化を伴わないが）図３０Ｂに示されるように、４０５、４８８、５６１、および６４０ｎｍにおいて散乱を集光する、Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱからの入手されたデータ内で確認される。しかしながら、入手された６０ｎｍのＡｇ粒子は、モデル化から予測されるように、５６１ｎｍおよび６４０ｎｍ波長上で反転する前に、４０５ｎｍおよび４８８ｎｍにおける６０ｎｍのＡｕよりも高い散乱強度を有することが分かり得る。したがって、付着したナノタグを有するＥＶを含有する、フローサイトメトリ標的のための側方散乱検出信号が、付着したナノタグを伴うＥＶの存在を決定するようにデコンボリューションされることができる。
【００９１】
ＣＦＳＥ染色ＥＶの散乱性質が、図３１に示されるように、標識としてのそれらの使用が、エピトープ染色の区別を可能にするであろう方法を示すように、６０ｎｍのＡｕおよび６０ｎｍのＡｇ粒子のものと比較された。ＣＦＳＥ染色ＥＶがＡｇナノタグによって積極的に染色された場合、それらの４８８ｎｍおよび５６１ｎｍＳＳＣチャネル強度が増加するであろうことが分かり得る。ＣＦＳＥ染色ＥＶがＡｕナノタグによって積極的に染色された場合、主に、それらの５６１ｎｍＳＳＣチャネル強度が増加するであろう。ＡｕおよびＡｇナノタグを用いて見られる特性チャネル強度は、相互と明確に異なり、これらの差異は、２つの異なるエピトープを標識化する、または１つの検定で２つの異なるＥＶ関連分子を検出するための手段を提供する。これらの結果は、図２９および図２２Ｄで見られるＡｕおよびＡｇの散乱性質に基づいて期待される。
【００９２】
開示される技術によると、ＡｇまたはＡｕから成る、４０、６０、および８０ｎｍの直径を伴う粒子が、Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱおよびＦＡＣＳ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメータを使用して、部分的または完全に分解されることができる。しかしながら、そのようなサイトメータは、より複雑な「高級」機器と見なされ得、全ての従来のフローサイトメータが、（参照標準として使用される）１００ｎｍのポリスチレン球体を検出することが可能であるわけではない。複数の散乱検出波長において４０ｎｍの粒子を検出する能力が、本明細書の計器を用いて示されるが、同時に、複数の（＞３）スペクトル散乱標識の検出および分析を含む、粒子検出の改良（より小さいサイズ、単一の個々の粒子、複数の粒子タイプ）が、取得されることができる。そのような改良を取得するために、スーパーコンティニウム白色レーザおよび複数の散乱検出チャネルを用いるような本明細書に開示されるような例示的計器は、広範囲の照明波長を使用することができる。しかしながら、１つまたは２つだけの標識を使用することは、散乱集光フィルタを伴う既存のフローサイトメータ構成を使用して、実行可能であり得る。
【００９３】
限定された表面積、したがって、ＥＶ上の表面タンパク質に起因して、立体障害が、直径約１５ｎｍである現在の免疫グロブリン標識にとって問題であり得る。これは、特に、現在の計器上で検出不可能である、いくつかのフルオロフォアで標識化される免疫グロブリンにとって、問題であるが、１つだけのナノタグが、それが検出可能であるためにＥＶ表面エピトープに結合する必要がある。１００ｎｍのＥＶは、約２０個の緩く充塞された１５ｎｍの球形粒子を結合する容量を有することができる。ＥＶに対するナノタグの濃度は、したがって、はるかに低く、ＥＶ表面を飽和させず、それによって、異なるタンパク質に標識化される複数のナノタグが結合することを可能にする。標識としてのナノ粒子の使用を考慮するときの別の重要な要因は、それらの共役である。Ｑｄｏｔｓ等の多くの既存のナノ粒子標識は、多価標識をもたらす。ＥＶへの単一ナノタグ結合を確実にするために、１価標識の開発が有用であろう。Ｑｄｏｔｓの１価標識化は、ＤＮＡでナノ粒子を包被することによって以前に実証された。本方法は、抗体、アプタマー等に結合するために使用され得る、単一官能化末端基を残す。
【００９４】
本明細書の実施例によると、単一ナノタグは、ＥＶ等の標的粒子に結合されることなく検出されることが可能であるため、標識ＥＶおよび非標識ＥＶを区別する方法が有用であろう。いくつかの実施例では、全てのＥＶは、挿入膜色素またはＣＦＳＥ等の非特異的染色を用いて蛍光標識化される。ナノタグの蛍光の偏移が、次いで、ＥＶを標識化したかどうかを決定するように、標識ＥＶに結合されたときに識別されることができる。他の実施例では、具体的タイプのＥＶが着目され、例えば、ホスファチジルセリン陽性であった場合、ナノタグを着目集団に対して特異的にし、ＥＶ部分集合、例えば、ＣＤ９陽性において標的化される、第２のナノタグを使用することが可能であろう。一意の散乱分布が、次いで、それらに結合された、明確に異なる散乱性質をそれぞれ伴う２つのナノタグを有した、ＥＶに関して起こるであろう。
【００９５】
したがって、代表的実施例では、単一の４０、６０、および８０ｎｍのＡｕおよびＡｇ粒子は、既存のフローサイトメトリ計器を使用して検出可能であるだけではなく、それらのスペクトル散乱性質を使用することによって、相互および蛍光標識ＥＶと一意に区別可能である。いくつかの実施例では、そのような直径および組成物の粒子は、単一エピトープ検出のための手段として、現在利用可能な標識化方法を使用して、多価またはさらに１価検出標識として使用され、単一エピトープ検出タグとして実装され得る。分子ナノタグを標識として使用することは、高屈折率または高プラズモンナノ材料の光散乱性質を活用し、それによって、現在利用可能な流動方法を使用して、単一分子の検出のために十分に高い信号を提供し、したがって、ＥＶ等の低発現、低散乱標的のための標識として有用であり得る。
【００９６】
したがって、開示される実施例によると、分子ナノタグが、利用可能な検出方法における既存の間隙を充填するために使用されることができる。例えば、それによって、臨床研究室が血液サンプルを採取し、血液の単位体積あたりの具体的腫瘍マーカに関して陽性であるＥＶの数を決定することができる、現在利用可能な方法が存在しない。むしろ、現在の方法は、ＥＶをマルチミクロンサイズのビーズに結合し、検出抗体を使用し、より大型のビーズに結合されたＥＶを検出することのみ可能である。個々の分子ナノタグが、個別に分解され得る標識であるため、わずか１つの分子ナノタグ標識受容体を用いたＥＶの検出が実行可能である。また、標識が１価であることを確実にする様式での分子ナノタグの組立は、標識分子の数の計測を可能にすることができる。そのような分子計測は、現在のフローサイトメトリ標識および計器の計測能力を超える有意な前進である。
【００９７】
図示される実施形態を参照して、開示される技術の原理を説明および図示したが、図示される実施形態は、そのような原理から逸脱することなく配列および詳細を修正され得ることを認識されたい。例えば、ソフトウェアで示される図示される実施形態の要素は、ハードウェアで実装されてもよく、その逆も同様である。また、任意の実施例からの技術は、他の実施例のうちのいずれか１つ以上のものに説明される技術と組み合わせられることができる。図示される実施例を参照して説明されるもの等の手順および機能は、単一ハードウェアまたはソフトウェアモジュールで実装され得る、または別個のモジュールが提供される得ることを理解されたい。上記の特定の配列は、便宜的例証のために提供され、他の配列も使用されることができる。
【００９８】
開示される技術の原理が適用され得る、多くの可能性として考えられる実施形態に照らして、図示される実施形態は、代表的実施例にすぎず、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことを認識されたい。これらの節で具体的に対処される代替物は、単に例示的にすぎず、本明細書に説明される実施形態の全ての可能性として考えられる代替物を構成するわけではない。例えば、本明細書に説明されるシステムの種々のコンポーネントは、機能および用途が組み合わせられてもよい。我々は、したがって、添付の請求項の範囲内に入る全てを請求する。
【図１】
2021500558.tif 000004
【図２Ａ】
2021500558.tif 000005
【図２Ｂ−２Ｃ】
2021500558.tif 000006
【図３Ａ】
2021500558.tif 000007
【図３Ｂ−３Ｃ】
2021500558.tif 000008
【図４Ａ】
2021500558.tif 000009
【図４Ｂ】
2021500558.tif 000010
【図４Ｃ】
2021500558.tif 000011
【図５】
2021500558.tif 000012
【図６】
2021500558.tif 000013
【図７】
2021500558.tif 000014
【図８Ａ】
2021500558.tif 000015
【図８Ｂ】
2021500558.tif 000016
【図８Ｃ】
2021500558.tif 000017
【図８Ｄ】
2021500558.tif 000018
【図９】
2021500558.tif 000019
【図１０】
2021500558.tif 000020
【図１１】
2021500558.tif 000021
【図１２】
2021500558.tif 000022
【図１３】
2021500558.tif 000023
【図１４】
2021500558.tif 000024
【図１５Ａ】
2021500558.tif 000025
【図１５Ｂ】
2021500558.tif 000026
【図１５Ｃ】
2021500558.tif 000027
【図１５Ｄ】
2021500558.tif 000028
【図１６Ａ】
2021500558.tif 000029
【図１６Ｂ】
2021500558.tif 000030
【図１７Ａ】
2021500558.tif 000031
【図１７Ｂ】
2021500558.tif 000032
【図１８Ａ】
2021500558.tif 000033
【図１８Ｂ】
2021500558.tif 000034
【図１９Ａ】
2021500558.tif 000035
【図１９Ｂ】
2021500558.tif 000036
【図１９Ｃ】
2021500558.tif 000037
【図２０Ａ】
2021500558.tif 000038
【図２０Ｂ】
2021500558.tif 000039
【図２１Ａ】
2021500558.tif 000040
【図２１Ｂ】
2021500558.tif 000041
【図２１Ｃ】
2021500558.tif 000042
【図２１Ｄ】
2021500558.tif 000043
【図２２Ａ】
2021500558.tif 000044
【図２２Ｂ】
2021500558.tif 000045
【図２２Ｃ】
2021500558.tif 000046
【図２２Ｄ】
2021500558.tif 000047
【図２３】
2021500558.tif 000048
【図２４】
2021500558.tif 000049
【図２５】
2021500558.tif 000050
【図２６Ａ】
2021500558.tif 000051
【図２６Ｂ】
2021500558.tif 000052
【図２７】
2021500558.tif 000053
【図２８Ａ】
2021500558.tif 000054
【図２８Ｂ】
2021500558.tif 000055
【図２８Ｃ】
2021500558.tif 000056
【図２８Ｄ】
2021500558.tif 000057
【図２８Ｅ】
2021500558.tif 000058
【図２８Ｆ】
2021500558.tif 000059
【図２９】
2021500558.tif 000060
【図３０Ａ】
2021500558.tif 000061
【図３０Ｂ】
2021500558.tif 000062
【図３１】
2021500558.tif 000063
【図３２】
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【図３３】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月19日(2020.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
装置であって、
照明源であって、前記照明源は、多波長照明ビームを生成し、ナノタグを含み得るマイクロ流体標的に指向するように構成される、照明源と、
検出器であって、前記検出器は、前記マイクロ流体標的から多波長検出ビームを受け取るように、かつ検出信号を生成するように構成され、前記多波長検出ビームは、前記多波長照明ビームと前記マイクロ流体標的内の前記ナノタグとの間の相互作用によって、弾性的に側方散乱される光を備える、検出器と、
プロセッサであって、前記プロセッサは、前記検出信号を受信するように、かつ前記検出信号の複数の波長側方散乱強度特性を１つ以上のナノタグタイプの所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルと比較することによって、マイクロ流体標的内のナノタグの存在を決定するように構成される、プロセッサと
を備える、装置。
【請求項２】
前記マイクロ流体標的内の前記ナノタグの存在を決定することは、単一ナノタグの存在を決定することを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記プロセッサは、前記比較に基づいて、細胞外小胞（ＥＶ）に付着した前記ナノタグのうちの少なくとも１つを有するＥＶの存在を決定するように構成される、請求項１−２のいずれかに記載の装置。
【請求項４】
前記プロセッサは、前記検出信号から、前記マイクロ流体標的内に同時に存在する複数のナノタグタイプの存在を決定するように構成される、請求項１−３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
前記複数のナノタグタイプは、共通細胞外小胞（ＥＶ）に付着される、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記比較は、前記所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルを使用する前記検出信号のデコンボリューションを通して実施される、請求項１−５のいずれかに記載の装置。
【請求項７】
前記ナノタグは、球形特性または非球形特性を有し、前記球形特性と関連付けられる直径、または１００ｎｍ以下である前記非球形特性と関連付けられる特徴的寸法を有する、請求項１−６のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
前記弾性側方散乱強度プロファイルは、ピーク散乱に対応する、請求項１−７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
前記ナノタグタイプは、金から作製される１つ以上のナノタグタイプと、銀から作製される１つ以上のナノタグタイプとを含む、請求項１−８のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
前記１つ以上のナノタグタイプは、１０ｎｍ〜３０ｎｍの範囲内で選択される直径を含むナノタグタイプを含む、請求項１−９のいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
前記照明源は、
所定の波長スペクトルを有する広帯域照明ビームを発生させるように配置された広帯域照明源
を備え、
前記装置は、波長分離システムを備え、前記波長分離システムは、前記広帯域照明ビームに光学的に結合され、前記広帯域照明ビームを、前記所定の波長スペクトルの別個の波長サブバンドをそれぞれ伴う複数のサブビームに分離するように、かつ個別の波長サブバンドの色集束距離に基づいて、前記マイクロ流体標的において前記サブビームを集束させるように、異なる個別の光学経路に沿って前記サブビームを指向し、集束させるように配置される、請求項１−１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
前記広帯域照明源は、スーパーコンティニウムレーザを備える、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記波長分離システムは、共線または平行光学経路に沿って別個のサブビームを前記マイクロ流体標的に指向するように配置された複数の二色性光学要素を含む、請求項１１−１２のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
前記波長分離システムは、前記サブビームを前記マイクロ流体標的の共通場所に集束させるように個別のサブビームに光学的に結合される複数の集束システムを含む、請求項１１−１３のいずれかに記載の装置。
【請求項１５】
前記検出器は、検出システムの一部であり、
集光光学系であって、前記集光光学系は、前記多波長検出ビームを形成するように、前記マイクロ流体標的によって弾性的に側方散乱される光を受け取るように配置される、集光光学系と、
プリズム光学系であって、前記プリズム光学系は、前記集光光学系から前記多波長検出ビームを受け取るように、かつ前記多波長検出ビームを、波長に基づいて空間的に分離される複数の検出サブビームに分離するように配置される、プリズム光学系と
をさらに備える、請求項１１−１４のいずれかに記載の装置。
【請求項１６】
前記検出システムはさらに、
個別の検出サブビームを受け取り、集束させるように配置された別個のマイクロレンズを伴うマイクロレンズアレイ
を備え、
前記検出器は、前記個別の検出サブビームを受け取るように配置された複数の検出器チャネルを含む、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記検出器は、１つ以上のアバランシェフォトダイオード、単一光子検出アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、シリコン光電子増倍管、または３−Ｄ高解像度、高感度、高フレームレート光照射野色記録デバイス、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記照明源は、前記多波長照明ビームに対応するように、異なる波長において個別のレーザビームを発生させるように配置された複数の単色レーザ源を備える、請求項１−１７のいずれかに記載の装置。
【請求項１９】
前記照明源はさらに、前記レーザビームの波長の色集束特性に基づいて、前記マイクロ流体標的において各個別のレーザビームを集束させるように配置されたビーム集束光学系を備える、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記照明源はさらに、前記レーザビームが前記マイクロ流体標的における共通場所に集束されるように、共線光学経路に沿って前記レーザビームを指向するように配置された複数の二色性光学要素を備える、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記検出器は、前記多波長検出ビームを形成するように、前記マイクロ流体標的によって弾性的に側方散乱される前記異なる波長における光を受け取るように配置された集光光学系を備える検出システムの一部である、請求項１８−２０のいずれかに記載の装置。
【請求項２２】
前記集光光学系は、前記マイクロ流体標的によって受け取られる前記多波長照明ビームの光学経路に対して垂直に配列される第１の集光光学系と、前記第１の集光光学系に隣接して前記光学経路に対して垂直に配列される第２の集光光学系とを含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記第２の集光光学系は、前記第１の集光光学系から見て前記マイクロ流体標的の反対側にある、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記第２の集光光学系は、所与の波長において所定の量だけミー共鳴を偏移させる前記第１の集光光学系と異なる集光光学系パラメータを伴って構成される、請求項２２−２３のいずれかに記載の装置。
【請求項２５】
前記集光光学系パラメータは、集光光学系角度および検出開口幾何学形状の一方または両方を含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記検出器は、前記第１の集光光学系に結合される第１の検出器と、前記第２の集光光学系に結合される第２の検出器とを含み、前記第１および第２の検出器の感度は、異なるサイズの粒子に関する検出のダイナミックレンジを増加させるために異なるように選択される、請求項２２−２５のいずれかに記載の装置。
【請求項２７】
前記検出システムはさらに、
少なくとも１つの二色性光学要素であって、前記少なくとも１つの二色性光学要素は、前記多波長検出ビームを集中的に受け取るように、かつ前記多波長検出ビームを前記異なる波長のうちの１つにそれぞれ対応する複数の検出サブビームに分離するように配置される、少なくとも１つの二色性光学要素
を備え、
前記検出器は、複数の光学検出器を備え、前記複数の光学検出器は、前記少なくとも１つの二色性要素から前記個別の検出サブビームを受け取るように配置され、かつ前記集光光学系によって提供される集束距離および前記集光光学系の色収差プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の焦点の光学経路長差に基づく前記少なくとも１つの二色性要素に対する離間関係で配置される、請求項２１−２６のいずれかに記載の装置。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの二色性光学要素は、第１の二色性光学要素と、第２の二色性光学要素とを含み、前記第１の二色性光学要素は、前記異なる波長のうちの第１の波長を有する第１の検出サブビームを、個別の光学検出器に指向するように配置され、前記第２の二色性光学要素は、前記第１の波長よりも長い第２の波長を有する第２の検出サブビームを、個別の光学検出器に指向するように配置される、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
少なくとも１つの二色性光学要素を用いた前記検出サブビームの発生の順序は、前記集光光学系の色デルタ焦点プロファイルに基づく、請求項２７−２８のいずれかに記載の装置。
【請求項３０】
前記集光光学系は、１つ以上の色消しまたはアポクロマートレンズ要素を含む、請求項２７−２９のいずれかに記載の装置。
【請求項３１】
前記第１の集光光学系は、第１の波長を有する前記多波長検出ビームのうちの第１の検出サブビームを検出するように配置され、前記第２の集光光学系は、第２の波長を有する前記多波長検出ビームの第２の検出サブビームを検出するように配置される、請求項２２−３０のいずれかに記載の装置。
【請求項３２】
前記第２の集光光学系を用いた前記第２の検出サブビームの検出は、前記第１の集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記第１の集光光学系による前記第１の検出サブビームと第２の検出サブビームとの間の集束距離共通性および集束距離差の一方または両方、または前記第１の集光光学系と前記第１の検出サブビームを受け取るように配置された光学検出器との間の空間関係に基づいて、前記第１の集光光学系を用いた第１の検出サブビームの検出から空間的に分離される、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記検出システムはさらに、
光ファイバアセンブリであって、
複数の光ファイバであって、前記複数の光ファイバは、前記異なる波長のうちの１つを有する前記多波長検出ビームのうちの個別の検出サブビームを受け取るように配置された開口をそれぞれ含む個別の隣接する第１の端部を有し、前記開口は、前記集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の集束距離変動に基づいて、前記サブビームの共通伝搬方向に沿って相互に関連して離間される、複数の光ファイバと、
前記第１の端部の反対の前記光ファイバの個別の第２の端部に光学的に結合される複数の光学検出器と
を含む、光ファイバアセンブリ
を備える、請求項２１−３２のいずれかに記載の装置。
【請求項３４】
前記開口は、前記個別の検出サブビームの画像スポットと整合される、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記伝搬方向に沿って対応する開口を平行移動させるように、前記光ファイバの前記第１の端部のうちの少なくとも１つに結合される平行移動ステージをさらに備える、請求項３３−３４のいずれかに記載の装置。
【請求項３６】
前記開口は、スリット開口であり、各スリット開口は、スリット幅よりも長いスリット長を有し、前記スリット長は、前記マイクロ流体標的の流動方向と平行に延在する、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
前記平行移動ステージは、前記伝搬方向および前記流動方向と垂直である側方方向に沿って前記スリット開口を平行移動させるように配置される、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記光ファイバの第１の端部はそれぞれ、光学ブロックを含み、前記光学ブロックは、個別の開口を含み、前記第１の端部を形成するように前記光ファイバに光学的に結合または融合される、請求項３３−３７のいずれかに記載の装置。
【請求項３９】
前記開口に隣接する前記光学ブロックの面積は、前記光ファイバの第１の端部に近接する迷光を低減させるように選択される吸収率を有する、請求項３８に記載の装置。
【請求項４０】
各開口は、成形光ファイバコアまたはクラッディング幾何学形状および端面上に配置された反射率コーティング変動のうちの１つ以上のものに基づいて、前記光ファイバの個別の端面によって画定される、請求項３３−３９のいずれかに記載の装置。
【請求項４１】
前記開口は、ミー共鳴に関連して選択される幾何学形状を有する、請求項３３−４０のいずれかに記載の装置。
【請求項４２】
前記幾何学形状は、非円形および非長方形である、請求項４１に記載の装置。
【請求項４３】
方法であって、
照明源を用いて発生される多波長照明ビームをマイクロ流体標的に指向することと、
前記マイクロ流体標的を用いて、前記多波長照明ビームを弾性的に側方散乱させることと、
検出器を用いて、前記弾性的に側方散乱された多波長照明ビームを伴って形成される多波長検出ビームの複数の検出サブビームを検出し、検出信号を生成することと、
前記検出信号および異なるナノタグタイプのための所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルに基づいて、前記多波長検出ビームに応答して、異なるナノタグの存在を決定することと
を含む、方法。
【請求項４４】
決定することは、前記所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルを使用する前記検出信号のデコンボリューションを通して実施される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記多波長照明ビームを指向することは、
前記多波長照明ビームを、異なる波長サブバンドをそれぞれ有する複数の照明サブビームに分離することと、
前記照明サブビームが、前記異なる波長サブバンドの色集束距離変動に基づいて、前記マイクロ流体標的において集束されるように、異なる個別の光学経路に沿って前記マイクロ流体標的において前記照明サブビームを指向することと
を含む、請求項４３−４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記複数の検出サブビームを検出することは、
プリズム配列を用いて、前記多波長検出ビームを前記検出サブビームに分離することと、
個別のマイクロレンズを有するマイクロレンズアレイを用いて前記検出サブビームを受け取ることであって、前記個別のマイクロレンズは、それぞれ、前記検出サブビームを集束させるように配置される、ことと、
光学検出器の個別の検出器チャネルを用いて、前記集束検出サブビームを受け取ることと
を含む、請求項４３−４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記照明源は、異なる個別の波長を伴うレーザビームを放射するように配置された複数の単色レーザを備える、請求項４３−４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記多波長照明ビームを指向することは、前記レーザビームが前記マイクロ流体標的における共通場所に集束されるように、共線光学経路に前記レーザビームを指向することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
複数の検出サブビームを検出することは、
前記多波長検出ビームを前記異なる波長のうちの１つにそれぞれ対応する前記検出サブビームに分離するように、少なくとも１つの二色性光学要素を用いて、集光光学系から前記多波長検出ビームを集中的に受け取ることと、
前記集光光学系によって提供される集束距離、および前記集光光学系の色収差プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の焦点の光学経路長差に基づく前記少なくとも１つの二色性光学要素との空間関係で配置された個別の光学検出器を用いて、前記検出サブビームを受け取ることと、
を含む、請求項４７−４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
複数の検出サブビームを検出することは、
前記集光光学系の第１のセットを用いて、前記多波長検出ビームの第１の部分を受け取ることと、
第１の波長を有する前記第１の部分の検出サブビームを検出することと、
前記第１の集光光学系から見て前記マイクロ流体標的の反対に配置された前記集光光学系の第２のセットを用いて、前記多波長検出ビームの第２の部分を受け取ることと、
前記第１の集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記集光光学系の第１のセットによって、前記第１の波長を有する前記検出サブビームと前記第２の波長を有する前記検出サブビームとの間の集束距離共通性および集束距離差の一方または両方に基づいて、第２の波長を有する前記第２の部分の検出サブビームを別個に検出することと
を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
複数の検出サブビームを検出することは、
集光光学系を用いて、前記検出サブビームを、隣接する光ファイバの第１の端部における個別のスリット開口に指向することを含み、スリット開口は、前記集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の集束距離変動に基づいて、前記サブビームの共通伝搬方向に沿って相互に関連して離間される、請求項４７−５０のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
開示される技術の前述および他の特徴および利点は、付随する図面を参照して進められる、以下の詳細な説明から、より明白になるであろう。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
装置であって、
照明源であって、前記照明源は、多波長照明ビームを生成し、ナノタグを含み得るマイクロ流体標的に指向するように構成される、照明源と、
検出器であって、前記検出器は、前記マイクロ流体標的から多波長検出ビームを受け取るように、かつ検出信号を生成するように構成され、前記多波長検出ビームは、前記多波長照明ビームと前記マイクロ流体標的内の前記ナノタグとの間の相互作用によって、弾性的に側方散乱される光を備える、検出器と、
プロセッサであって、前記プロセッサは、前記検出信号を受信するように、かつ前記検出信号の複数の波長側方散乱強度特性を１つ以上のナノタグタイプの所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルと比較することによって、マイクロ流体標的内のナノタグの存在を決定するように構成される、プロセッサと
を備える、装置。
（項目２）
前記マイクロ流体標的内の前記ナノタグの存在を決定することは、単一ナノタグの存在を決定することを含む、項目１に記載の装置。
（項目３）
前記プロセッサは、前記比較に基づいて、細胞外小胞（ＥＶ）に付着した前記ナノタグのうちの少なくとも１つを有するＥＶの存在を決定するように構成される、項目１−２のいずれかに記載の装置。
（項目４）
前記プロセッサは、前記検出信号から、前記マイクロ流体標的内に同時に存在する複数のナノタグタイプの存在を決定するように構成される、項目１−３のいずれかに記載の装置。
（項目５）
前記複数のナノタグタイプは、共通細胞外小胞（ＥＶ）に付着される、項目４に記載の装置。
（項目６）
前記比較は、前記所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルを使用する前記検出信号のデコンボリューションを通して実施される、項目１−５のいずれかに記載の装置。
（項目７）
単一ナノ粒子は、球形特性または非球形特性を有し、前記球形特性と関連付けられる直径、または１００ｎｍ以下である前記非球形特性と関連付けられる特徴的寸法を有する、項目１−６のいずれかに記載の装置。
（項目８）
前記弾性側方散乱強度プロファイルは、ピーク散乱に対応する、項目１−７のいずれかに記載の装置。
（項目９）
前記ナノタグタイプは、金から作製される１つ以上のナノタグタイプと、銀から作製される１つ以上のナノタグタイプとを含む、項目１−８のいずれかに記載の装置。
（項目１０）
前記１つ以上のナノタグタイプは、１０ｎｍ〜３０ｎｍの範囲内で選択される直径を含むナノタグタイプを含む、項目１−９のいずれかに記載の装置。
（項目１１）
前記照明源は、
所定の波長スペクトルを有する広帯域照明ビームを発生させるように配置された広帯域照明源
を備え、
前記装置は、波長分離システムを備え、前記波長分離システムは、前記広帯域照明ビームに光学的に結合され、前記広帯域照明ビームを、前記所定の波長スペクトルの別個の波長サブバンドをそれぞれ伴う複数のサブビームに分離するように、かつ個別の波長サブバンドの色集束距離に基づいて、前記マイクロ流体標的において前記サブビームを集束させるように、異なる個別の光学経路に沿って前記サブビームを指向し、集束させるように配置される、項目１−１０のいずれかに記載の装置。
（項目１２）
前記広帯域照明源は、スーパーコンティニウムレーザを備える、項目１１に記載の装置。
（項目１３）
前記波長分離システムは、共線または平行光学経路に沿って別個のサブビームを前記マイクロ流体標的に指向するように配置された複数の二色性光学要素を含む、項目１１−１２のいずれかに記載の装置。
（項目１４）
前記波長分離システムは、前記サブビームを前記マイクロ流体標的の共通場所に集束させるように個別のサブビームに光学的に結合される複数の集束システムを含む、項目１１−１３のいずれかに記載の装置。
（項目１５）
検出システムは、
集光光学系であって、前記集光光学系は、前記多波長検出ビームを形成するように、前記マイクロ流体標的によって弾性的に側方散乱される光を受け取るように配置される、集光光学系と、
プリズム光学系であって、前記プリズム光学系は、前記集光光学系から前記多波長検出ビームを受け取るように、かつ前記多波長検出ビームを、波長に基づいて空間的に分離される複数の検出サブビームに分離するように配置される、プリズム光学系と
を備える、項目１１−１４のいずれかに記載の装置。
（項目１６）
前記検出システムはさらに、
個別の検出サブビームを受け取り、集束させるように配置された別個のマイクロレンズを伴うマイクロレンズアレイ
を備え、
前記検出器は、前記個別の検出サブビームを受け取るように配置された複数の検出器チャネルを含む、項目１５に記載の装置。
（項目１７）
前記検出器は、１つ以上のアバランシェフォトダイオード、単一光子検出アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、シリコン光電子増倍管、または３−Ｄ高解像度、高感度、高フレームレート光照射野色記録デバイス、またはそれらの組み合わせを含む、項目１６に記載の装置。
（項目１８）
前記照明源は、前記多波長照明ビームに対応するように、異なる波長において個別のレーザビームを発生させるように配置された複数の単色レーザ源を備える、項目１−１７のいずれかに記載の装置。
（項目１９）
前記照明源はさらに、前記レーザビームの波長の色集束特性に基づいて、前記マイクロ流体標的において各個別のレーザビームを集束させるように配置されたビーム集束光学系を備える、項目１８に記載の装置。
（項目２０）
前記照明源はさらに、前記レーザビームが前記マイクロ流体標的における共通場所に集束されるように、共線光学経路に沿って前記レーザビームを指向するように配置された複数の二色性光学要素を備える、項目１９に記載の装置。
（項目２１）
前記検出器は、前記多波長検出ビームを形成するように、前記マイクロ流体標的によって弾性的に側方散乱される前記異なる波長における光を受け取るように配置された集光光学系を備える検出システムの一部である、項目１８−２０のいずれかに記載の装置。
（項目２２）
前記集光光学系は、前記マイクロ流体標的によって受け取られる前記多波長照明ビームの光学経路に対して垂直に配列される第１の集光光学系と、前記第１の集光光学系に隣接して前記光学経路に対して垂直に配列される第２の集光光学系とを含む、項目２１に記載の装置。
（項目２３）
前記第２の集光光学系は、前記第１の集光光学系から見て前記マイクロ流体標的の反対側にある、項目２２に記載の装置。
（項目２４）
前記第２の集光光学系は、所与の波長において所定の量だけミー共鳴を偏移させる前記第１の集光光学系と異なる集光光学系パラメータを伴って構成される、項目２２−２３のいずれかに記載の装置。
（項目２５）
前記集光光学系パラメータは、集光光学系角度および検出開口幾何学形状の一方または両方を含む、項目２４に記載の装置。
（項目２６）
前記検出器は、前記第１の集光光学系に結合される第１の検出器と、前記第２の集光光学系に結合される第２の検出器とを含み、前記第１および第２の検出器の感度は、異なるサイズの粒子に関する検出のダイナミックレンジを増加させるために異なるように選択される、項目２２−２５のいずれかに記載の装置。
（項目２７）
前記検出システムはさらに、
少なくとも１つの二色性光学要素であって、前記少なくとも１つの二色性光学要素は、前記多波長検出ビームを集中的に受け取るように、かつ前記多波長検出ビームを前記異なる波長のうちの１つにそれぞれ対応する複数の検出サブビームに分離するように配置される、少なくとも１つの二色性光学要素
を備え、
前記検出器は、複数の光学検出器を備え、前記複数の光学検出器は、前記少なくとも１つの二色性要素から前記個別の検出サブビームを受け取るように配置され、かつ前記集光光学系によって提供される集束距離および前記集光光学系の色収差プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の焦点の光学経路長差に基づく前記少なくとも１つの二色性要素に対する離間関係で配置される、項目２１−２６のいずれかに記載の装置。
（項目２８）
前記少なくとも１つの二色性光学要素は、第１の二色性光学要素と、第２の二色性光学要素とを含み、前記第１の二色性光学要素は、前記異なる波長のうちの第１の波長を有する第１の検出サブビームを、個別の光学検出器に指向するように配置され、前記第２の二色性光学要素は、前記第１の波長よりも長い第２の波長を有する第２の検出サブビームを、個別の光学検出器に指向するように配置される、項目２７に記載の装置。
（項目２９）
少なくとも１つの二色性光学要素を用いた前記検出サブビームの発生の順序は、前記集光光学系の色デルタ焦点プロファイルに基づく、項目２７−２８のいずれかに記載の装置。
（項目３０）
前記集光光学系は、１つ以上の色消しまたはアポクロマートレンズ要素を含む、項目２７−２９のいずれかに記載の装置。
（項目３１）
前記第１の集光光学系は、第１の波長を有する前記多波長検出ビームのうちの第１の検出サブビームを検出するように配置され、前記第２の集光光学系は、第２の波長を有する前記多波長検出ビームの第２の検出サブビームを検出するように配置される、項目２２−３０のいずれかに記載の装置。
（項目３２）
前記第２の集光光学系を用いた前記第２の検出サブビームの検出は、前記第１の集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記第１の集光光学系による前記第１の検出サブビームと第２の検出サブビームとの間の集束距離共通性および集束距離差の一方または両方、または前記第１の集光光学系と前記第１の検出サブビームを受け取るように配置された光学検出器との間の空間関係に基づいて、前記第１の集光光学系を用いた第１の検出サブビームの検出から空間的に分離される、項目３１に記載の装置。
（項目３３）
前記検出システムはさらに、
光ファイバアセンブリであって、
複数の光ファイバであって、前記複数の光ファイバは、前記異なる波長のうちの１つを有する前記多波長検出ビームのうちの個別の検出サブビームを受け取るように配置された開口をそれぞれ含む個別の隣接する第１の端部を有し、前記開口は、前記集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の集束距離変動に基づいて、前記サブビームの共通伝搬方向に沿って相互に関連して離間される、複数の光ファイバと、
前記第１の端部の反対の前記光ファイバの個別の第２の端部に光学的に結合される複数の光学検出器と
を含む、光ファイバアセンブリ
を備える、項目２１−３２のいずれかに記載の装置。
（項目３４）
前記開口は、前記個別の検出サブビームの画像スポットと整合される、項目３３に記載の装置。
（項目３５）
前記伝搬方向に沿って対応する開口を平行移動させるように、前記光ファイバの前記第１の端部のうちの少なくとも１つに結合される平行移動ステージをさらに備える、項目３３−３４のいずれかに記載の装置。
（項目３６）
前記開口は、スリット開口であり、各スリット開口は、スリット幅よりも長いスリット長を有し、前記スリット長は、前記マイクロ流体標的の流動方向と平行に延在する、項目３５に記載の装置。
（項目３７）
前記平行移動ステージは、前記伝搬方向および前記流動方向と垂直である側方方向に沿って前記スリット開口を平行移動させるように配置される、項目３６に記載の装置。
（項目３８）
前記光ファイバの第１の端部はそれぞれ、光学ブロックを含み、前記光学ブロックは、個別の開口を含み、前記第１の端部を形成するように前記光ファイバに光学的に結合または融合される、項目３３−３７のいずれかに記載の装置。
（項目３９）
前記開口に隣接する前記光学ブロックの面積は、前記光ファイバの第１の端部に近接する迷光を低減させるように選択される吸収率を有する、項目３８に記載の装置。
（項目４０）
各開口は、成形光ファイバコアまたはクラッディング幾何学形状および端面上に配置された反射率コーティング変動のうちの１つ以上のものに基づいて、前記光ファイバの個別の端面によって画定される、項目３３−３９のいずれかに記載の装置。
（項目４１）
前記開口は、ミー共鳴に関連して選択される幾何学形状を有する、項目３３−４０のいずれかに記載の装置。
（項目４２）
前記幾何学形状は、非円形および非長方形である、項目４１に記載の装置。
（項目４３）
方法であって、
照明源を用いて発生される多波長照明ビームをマイクロ流体標的に指向することと、
前記マイクロ流体標的を用いて、前記多波長照明ビームを弾性的に側方散乱させることと、
検出器を用いて、前記弾性的に側方散乱された多波長照明ビームを伴って形成される多波長検出ビームの複数の検出サブビームを検出し、検出信号を生成することと、
前記検出信号および異なるナノタグタイプのための所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルに基づいて、前記多波長検出ビームに応答して、異なるナノタグの存在を決定することと
を含む、方法。
（項目４４）
決定することは、前記所定の多波長弾性側方散乱強度プロファイルを使用する前記検出信号のデコンボリューションを通して実施される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記多波長照明ビームを指向することは、
前記多波長照明ビームを、異なる波長サブバンドをそれぞれ有する複数の照明サブビームに分離することと、
前記照明サブビームが、前記異なる波長サブバンドの色集束距離変動に基づいて、前記マイクロ流体標的において集束されるように、異なる個別の光学経路に沿って前記マイクロ流体標的において前記照明サブビームを指向することと
を含む、項目４３−４４のいずれかに記載の方法。
（項目４６）
前記複数の検出サブビームを検出することは、
プリズム配列を用いて、前記多波長検出ビームを前記検出サブビームに分離することと、
個別のマイクロレンズを有するマイクロレンズアレイを用いて前記検出サブビームを受け取ることであって、前記個別のマイクロレンズは、それぞれ、前記検出サブビームを集束させるように配置される、ことと、
光学検出器の個別の検出器チャネルを用いて、前記集束検出サブビームを受け取ることと
を含む、項目４３−４５のいずれかに記載の方法。
（項目４７）
前記照明源は、異なる個別の波長を伴うレーザビームを放射するように配置された複数の単色レーザを備える、項目４３−４６のいずれかに記載の方法。
（項目４８）
前記多波長照明ビームを指向することは、前記レーザビームが前記マイクロ流体標的における共通場所に集束されるように、共線光学経路に前記レーザビームを指向することを含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
複数の検出サブビームを検出することは、
前記多波長検出ビームを前記異なる波長のうちの１つにそれぞれ対応する前記検出サブビームに分離するように、少なくとも１つの二色性光学要素を用いて、集光光学系から前記多波長検出ビームを集中的に受け取ることと、
前記集光光学系によって提供される集束距離、および前記集光光学系の色収差プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の焦点の光学経路長差に基づく前記少なくとも１つの二色性光学要素との空間関係で配置された個別の光学検出器を用いて、前記検出サブビームを受け取ることと、
を含む、項目４７−４８のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
複数の検出サブビームを検出することは、
前記集光光学系の第１のセットを用いて、前記多波長検出ビームの第１の部分を受け取ることと、
第１の波長を有する前記第１の部分の検出サブビームを検出することと、
前記第１の集光光学系から見て前記マイクロ流体標的の反対に配置された前記集光光学系の第２のセットを用いて、前記多波長検出ビームの第２の部分を受け取ることと、
前記第１の集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記集光光学系の第１のセットによって、前記第１の波長を有する前記検出サブビームと前記第２の波長を有する前記検出サブビームとの間の集束距離共通性および集束距離差の一方または両方に基づいて、第２の波長を有する前記第２の部分の検出サブビームを別個に検出することと
を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
複数の検出サブビームを検出することは、
集光光学系を用いて、前記検出サブビームを、隣接する光ファイバの第１の端部における個別の開口に指向することを含み、スリット開口は、前記集光光学系の色デルタ焦点プロファイルと関連付けられる前記検出サブビーム間の集束距離変動に基づいて、前記サブビームの共通伝搬方向に沿って相互に関連して離間される、項目４７−５０のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2021500558.tif 000066
2021500558.tif 000067