(57)【要約】本発明は、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１〜３を含み、ＣＤＲ１配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜７４に示される配列の１つであるかまたはそれを含み、ＣＤＲ２配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５〜１５１に示される配列の１つであるかまたはそれを含み、ＣＤＲ３配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２〜２３２に示される配列の１つであるかまたはそれを含む、ＳＦＴＳＶに結合可能なポリペプチドに関する。本発明は、致死率が高いが、効果的なワクチン及び特異的抗ウイルス薬物がないＳＦＴＳに対して、ナノ抗体薬物の開発及び診断キットの研究開発を行い、ＧＮタンパク質を製造し、フタコブラクダを免疫し、ファージライブラリーを用いてナノボディをディスプレイするプラットフォーム技術等によって、ＧＮに特異的結合されるナノ抗体ＶＨＨをスクリーニングし、そのＣＤＲ配列を同定し、ヒト化抗体ＳＮＢを構築するとともに、ヒト化マウスモデルでＳＦＴＳＶ感染の治療におけるＳＮＢによる治療効果をインビボ評定する。本発明は、ＳＦＴＳの臨床治療にナノ抗体の潜在的かつ新しい薬を提供するとともに、ＳＦＴＳの診断に対応する検出キットを提供する。  【選択図】図２
2021534727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つの相補性決定領域ＣＤＲ１〜３を含み、ＣＤＲ１配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜７４に示される配列の１つであるかまたはそれを含み、ＣＤＲ２配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５〜１５１に示される配列の１つであるかまたはそれを含み、ＣＤＲ３配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２〜２３２に示される配列の１つであるかまたはそれを含む、ことを特徴とするＳＦＴＳＶに結合可能なポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、前記ＣＤＲ１〜３に順に交差配列される４つのフレーム領域ＦＲ１〜４をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、モノクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、ＶＨＨである、ことを特徴とする請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、ラクダ由来のＶＨＨまたはヒト化のＶＨＨである、ことを特徴とする請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドの、ＳＦＴＳＶ検出剤またはＳＦＴＳＶ治療薬物の製造における使用。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、ことを特徴とする核酸コード配列。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸コード配列の、ＳＦＴＳＶ治療薬物の製造における使用。
【請求項９】
検出抗体と、固体マトリックスと、前記固体マトリックスにコーティングされるコーティング抗体とを含み、前記検出抗体及び前記コーティング抗体は、それぞれ請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドのうちの１種である、ことを特徴とするＳＦＴＳＶ検出キット。
【請求項１０】
前記検出抗体のＣＤＲ配列は、以下のとおりであることを特徴とする請求項９に記載のキット。
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１であり、またはＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６であり、またはＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬分野に関する。さらに特に、ＳＦＴＳＶに結合可能なポリペプチド、前記ポリペプチドの、ＳＦＴＳＶ検出剤またはＳＦＴＳＶ治療薬物の製造における使用、及びＳＦＴＳＶ検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
重症熱性血小板減少症候群（Ｓｅｖｅｒｅ  ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＦＴＳ）は、重症熱性血小板減少症候群ウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ  ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ、ＳＦＴＳＶ）によって引き起こされる急性感染症であり、主に、ダニ咬傷又は急性患者の血液、粘膜接触により伝染し、臨床における主な症状は、発熱、血小板減少症、白血球減少症、及び胃腸管、肝臓、腎臓を含む複数の器官の機能異常である。２００９年に、ＳＦＴＳが湖北及び河南で最初に報告されて以外、中国では、１６個の省が症例報告を発行しており、２０１４年の時点までの確認された症例数は３５００を超え、かつ発病率が近年絶えずに増加しており、また、韓国、日本、アラブ及び米国において、いずれもＳＦＴＳ症例が報告されており、該病気の流行地域が拡大していることを示している。現在報告されているＳＦＴＳの死亡率は６．３％〜３０％であるが、韓国及び日本が２０１６年に公布した死亡率はそれぞれ３５．４％及び５０％に達した。しかしながら、今まで、臨床においてＳＦＴＳに対する特異的な治療薬物がなく、広域スペクトル抗ウイルス療法と対症療法しか実施できず、ＳＦＴＳの予防及び制御に大きな困難をもたらす。
【０００３】
特異的中和抗体は、抗ウイルス治療において非常に良好な臨床効果を有し、例えば、呼吸器合胞体ウイルスモノクローナル抗体Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ及び狂犬病ウイルス抗血清等である。研究によれば、ＳＦＴＳＶ表面糖タンパク質（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎ、ＧＮ）に対する中和抗体は患者の生存率に重要な作用を奏する。以前の研究の結果は、血清に抗ＧＮ抗体を有するＳＦＴＳ患者が全て良好に回復したが、血清にＧＮ抗体を有さないＳＦＴＳ患者の死亡率が６６．７％に達したことを示した。これらの研究は、ＧＮを標的とする中和抗体療法がＳＦＴＳＶに対抗する効果的な方法であることを示す。
【０００４】
１９９３年、ラクダ科に由来する新型の天然抗体が発見された。該抗体は、軽鎖を自然に欠き、重鎖のみで構成され、その重鎖は、２つの定常領域（ＣＨ２及びＣＨ３）、１つのヒンジ領域、及び１つの重鎖可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｏｍａｉｎ、ＶＨＨ、すなわち、抗原結合部位）を含み、該重鎖可変領域の相対分子量は約１３ＫＤａで、通常の抗体の１／１０のみであり、かつ分子の高さ及び直径がいずれもナノレベルであり、現在取得可能な最小の機能的抗体断片であり、それにより、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ、Ｎｂ）とも呼称される。ナノボディは、安定性が高く（９０℃の条件で分解しない）、親和力が高く、ヒト由来抗体との相同性が８０％を超え、毒性及び免疫原性がいずれも低い等の特徴を持つため、最近、免疫診断キットの研究開発、図像学の研究開発、及び、腫瘍、炎症、感染症、神経系疾患等の分野における抗体薬物の研究開発に幅広く用いられる。
【０００５】
現在、既知の抗ＧＮのＳＦＴＳ中和抗体は、２０１３年に、ファージディスプレイＳＦＴＳ患者抗体ライブラリースクリーニングによって得られたＭａｂ４−５であり、そのＩＣ５０は２μｇ／ｍｌ〜４４．２μｇ／ｍｌである。中和抗体のＩＣ５０は低いほど良好であり、抗体の使用量を大幅に節約して生産コストを節約できるとともに、抗体がインビボで有効な濃度を維持する時間を長くすることができる。以前にＳＦＴＳ患者の血清の抗体価を検出しており、ＧＮタンパク質に対する抗血清は約１００の希釈倍数に過ぎず、これは、抗体価の低いＳＦＴＳ患者の血清で抗体ライブラリーを構築すると高効率の中和抗体のスクリーニングを制限する可能性があることを示す。従って、新たな技術的手段により、より効果的で安定した、ＩＣ５０がより低いＳＦＴＳＶ特異的中和抗体を取得することが期待されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、抗原でラクダを免疫することによって、ラクダ由来のナノボディ及びそのＶＨＨを取得し、急性感染したＳＦＴＳ患者の診断及び治療に用いる。これらの研究に基づいて、本発明は、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１〜３を含み、ＣＤＲ１配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜７４に示される配列の１つであるかまたはそれを含み、ＣＤＲ２配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５〜１５１に示される配列の１つであるかまたはそれを含み、ＣＤＲ３配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２〜２３２に示される配列の１つであるかまたはそれを含む、ＳＦＴＳＶに結合可能なポリペプチドを提供する。
【０００７】
１つの特定の実施形態では、前記ポリペプチドは、前記ＣＤＲ１〜３に交差配列される４つのフレーム領域ＦＲ１〜４をさらに含む。たとえば、ＦＲ１〜４配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３５〜２３７に示されるように設計することができるが、本発明の範囲は、これに限られない。抗体の特異的識別及び結合能力が、主にＣＤＲ領域配列によって決定され、ＦＲ配列からの影響が大きくなく、種によって設計できることは、本分野での周知のものである。たとえば、ヒト由来、マウス由来またはラクダ由来のＦＲ領域配列を設計して上記ＣＤＲを接続でき、それにより、ＳＦＴＳＶに結合可能なポリペプチドまたはドメイン。
【０００８】
１つの好適な実施形態では、前記ポリペプチドは、モノクローナル抗体である。
【０００９】
１つの好適な実施形態では、前記ポリペプチドは、ＶＨＨである。
【００１０】
１つの好適な実施形態では、前記ポリペプチドは、ラクダ由来のＶＨＨまたはヒト化のＶＨＨである。
【００１１】
１つの特定の実施形態では、前記ポリペプチドのＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
Ｉ）ＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６であり、
ＩＩ）ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４でありかつＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２であり、又は
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２でありかつＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００である。
【００１２】
他の特定の実施形態では、前記ポリペプチドのＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
Ｉ）ＣＤＲ１の配列がＸＸＸＳＴＡＹＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３）であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、たとえばＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、２５、２６、６２、７３から選択され、
ＩＩ）ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８、８０、８４、９０、１０３から選択され、
ＩＩＩ）ＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５、１５７、１６１、１６９、１７２、１７９、１８０、１８１、２１０、２１８、２２９、２３０、２３１から選択される。
【００１３】
１つの特定の実施形態では、前記ポリペプチドのＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５７であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２９であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３０であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３１であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７である。
【００１４】
他の特定の実施形態では、前記ポリペプチドのＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
Ｉ）ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５であり、
ＩＩ）ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６であり、又は
ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７である。
【００１５】
他の特定の実施形態では、前記ポリペプチドのＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
Ｉ）ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１であり、
ＩＩ）ＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８、２１３または２２８である。
【００１６】
他の特定の実施形態では、前記ポリペプチドのＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
Ｉ）ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２であり、
ＩＩ）ＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８、１８９または２２５である。
【００１７】
他の特定の実施形態では、前記ポリペプチドのＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
Ｉ）ＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０であり、
ＩＩ）ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６であり、かつＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３であり、又は
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５であり、かつＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３であり、又は
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６であり、かつＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３であり、又は
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８であり、かつＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３である。
【００１８】
他の特定の実施形態では、前記ポリペプチドのＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３である。
【００１９】
他の特定の実施形態では、前記ポリペプチドのＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１６である。
【００２０】
本発明は、上記ポリペプチドの、ＳＦＴＳＶ検出剤またはＳＦＴＳＶ治療薬物の製造における使用をさらに提供する。
【００２１】
本発明は、上記ポリペプチドの核酸コード配列をさらに提供する。
【００２２】
１つの実施形態では、前記核酸コード配列は、ＤＮＡコード配列またはＲＮＡコード配列である。
【００２３】
１つの特定の実施形態では、前記核酸コード配列は、遺伝子発現カセットに存在する。
【００２４】
本発明は、上記核酸コード配列の発現カセットを含む発現ベクターをさらに提供する。
【００２５】
１つの好適な実施形態では、前記発現ベクターは、ウィルスベクターである。
【００２６】
１つの好適な実施形態では、前記発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）である。
【００２７】
本発明は、上記核酸コード配列及び発現ベクターの、ＳＦＴＳＶ治療薬物の製造における使用をさらに提供する。
【００２８】
本発明は、検出抗体と、固体マトリックスと、前記固体マトリックスにコーティングされるコーティング抗体とを含み、前記検出抗体及び前記コーティング抗体がそれぞれ、上記ポリペプチドのうちの１種であるＳＦＴＳＶ検出キットをさらに提供する。
【００２９】
１つの特定の実施形態では、前記検出抗体のＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６である。
【００３０】
１つの特定の実施形態では、前記コーティング抗体のＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８であり、または
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６である。
【００３１】
１つの好適な実施形態では、
Ｉ）前記検出抗体のＣＤＲ配列は、以下のとおりである。ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１であり、またはＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６であり、
ＩＩ）前記コーティング抗体のＣＤＲ配列は、以下のとおりである。ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１であり、またはＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６であり、またはＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８であり、またはＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６である。
【００３２】
１つの好適な実施形態では、
Ｉ）前記検出抗体ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１であり、
ＩＩ）前記コーティング抗体のＣＤＲ配列は、以下のとおりである。ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６であり、またはＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６である。
【００３３】
他の好適な実施形態では、
Ｉ）前記検出抗体ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６であり、
前記コーティング抗体のＣＤＲ配列は、以下のとおりである。
ＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１であり、またはＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６であり、またはＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８であり、またはＣＤＲ１の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＣＤＲ２の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９であり、かつＣＤＲ３の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６である。
【発明の効果】
【００３４】
本発明は、致死率が高いが、効果的なワクチン及び特異的抗ウイルス薬物がないＳＦＴＳに対して、ナノ抗体薬物の開発及び診断キットの研究開発を行い、ＧＮタンパク質を製造し、フタコブラクダを免疫し、ファージライブラリーを用いてナノボディをディスプレイするプラットフォーム技術等によって、ＧＮに特異的結合されるナノ抗体ＶＨＨをスクリーニングし、そのＣＤＲ配列を同定し、ヒト化のＶＨＨ−ｈｕＦｃ１（ＳＮＢ）を構築するとともに、ヒト化マウスモデルでＳＦＴＳＶ感染の治療におけるＳＮＢによる治療効果をインビボ評定する。本発明は、ＳＦＴＳの臨床治療にナノ抗体の潜在的かつ新しい薬を提供するとともに、ＳＦＴＳの診断に対応する検出キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ｓＧＮでラクダを３回目、４回目免疫した１週間後の抗血清力価の検出曲線である。
【図２】ラクダを４回目免疫した１週間後の異なる希釈度の抗血清がＶｅｒｏ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏのＳＦＴＳＶウイルス感染を阻害する曲線であり、免疫前の血清を対照として使用する。
【図３】ｓＧＮ−ＶＨＨファージ抗体ライブラリーをテンプレートとして増幅されたＰＣＲ生成物の電気泳動図である。
【図４】ｓＧＮ−ＶＨＨファージ抗体ライブラリーのパニングアッセイであり、ここで、ＡはｓＧＮタンパク質に対してパニングされた後のファージライブラリーのＥＬＩＳＡ検出統計図であり、Ｂは２回目（２ｎｄ）及び３回目（３ｒｄ）パニングされた後のファージ抗体ライブラリーからそれぞれ９６個のクローンを選択してファージＥＬＩＳＡ検出を行った統計図である。
【図５】ＶＨＨ抗体の原核生物発現のＥＬＩＳＡ検出統計図であり、各ドットは１つのクローンを表し、縦座標はｓＧＮのＯＤ４５０／空白対照のＯＤ４５０であり、比が５．０より大きい場合陽性として定義される。
【図６】陽性ＶＨＨ抗体がＳＦＴＳＶウイルス感染を中和する実験の統計図であり、１つのドットは１つのクローンを表し、Ｙ軸は異なるウイルスに対する相対阻害率である。
【図７】異なる精製濃度のＳＮＢとｓＧＮタンパク質の結合のＥＬＩＳＡ検出を示し、異なる色は異なるクローン番号を表す。
【図８】異なる濃度の抗体が存在する環境でウイルス感染によって得られた蛍光染色の写真であり、蛍光ドットはＳＦＴＳＶウイルスを表し、ウイルス非感染の細胞を非感染対照（Ｎｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、抗体を加えないウイルス感染細胞を感染対照（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用する。
【図９】図７で統計された蛍光ドットに基づいて得られた抗体のＳＦＴＳＶウイルスに対する阻害率を示す図である。
【図１０】チャレンジ後の異なるマウスの相対阻害率の統計図であり、相対阻害率は１日目〜９日目のウイルス量／６日目のウイルス量であり、ヒト免疫グロブリン（Ｈｕ−ＩｇＧ）を対照として使用する。
【図１１】ＳＮＢ二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡで検出したｓＧＮタンパク質の統計図であり、ここで、それぞれＳＮＢ０１（Ａ）、ＳＮＢ０２（Ｂ）及びＳＮＢ３７（Ｃ）を検出抗体とし使用し、Ｄはコーティング抗体ＳＮＢ０１であり、検出抗体ＳＮＢ３７の二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡで検出した異なる濃度のｓＧＮのＯＤ４５０統計曲線を示す。
【図１２】コーティング抗体ＳＮＢ０１、検出抗体ＳＮＢ３７の二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡで検出した異なる濃度のＳＦＴＳＶウイルスのＯＤ４５０の統計曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
１．免疫原の調製
ＮＣＢＩウエブサイトにおけるＨＢ２９  ＳＦＴＳＶのＧＮタンパク質配列及び遺伝子配列情報に基づいて、ラクダによるＧＮタンパク質に対する特異的抗体の生成を効果的に誘導できるペプチドｓＧＮを分析して設計し、Ｈｉｓ−ｔａｇ（ｓＧＮ−ｈｉｓ）又はウサギＦｃ（ｓＧＮ−ｒＦｃ）をＣ末端に接続して後続の精製及び検出を行った。
【００３７】
２．ラクダ免疫と抗血清の取得
２５０μｇのｓＧＮ−ｒＦｃタンパク質と２５０μｌのフロイント完全アジュバントの乳化混合物でフタコブラクダを１回目免疫し、１４日目、２８日目、４２日目に、ｓＧＮ−ｒＦｃタンパク質と２５０μｌのフロイント不完全アジュバントで３回追加免疫し、２回目及び３回目の免疫の１週間後、採血して抗血清力価を検出し、４回目の免疫の１週間後、ファージ抗体ライブラリーの構築のために２００ｍｌの血液を採血した。
【００３８】
抗血清力価をＥＬＩＳＡで検出し、０．５μｇ／ｍｌ濃度のＧＮタンパク質を用いて検出プレートをコーティングし、勾配希釈された抗血清又は精製された抗体１００μｌを各ウェルに加え（免疫前のラクダの血清を対照として使用した）、３７℃で１．５ｈインキュベートし、２回洗浄し、１：１００００に希釈されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｌｌａｍｍａ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）二次抗体を各ウェルに加え、３７℃で１ｈインキュベートし、４〜６回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ基質を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ  ０．２ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止し、ＯＤ  ４５０ｎｍを測定した。ＥＬＩＳＡで検出された血清力価は、ＯＤ４５０が空白対照の２．１倍以上且つ０．２より大きい場合の最高の希釈倍数として規定された。
【００３９】
結果が図１に示され、３回目及び４回目の免疫の抗血清力価はそれぞれ２．１９×１０６及び４．６１×１０６であった。これで分かるように、該抗原は、ラクダによるＧＮタンパク質に対する特異的な高力価の抗血清の生成を誘導することができた。
【００４０】
該高力価のラクダ抗血清がＳＦＴＳＶウイルス感染を効果的に阻害できるかどうかをさらに検証するために、ウイルス感染の中和実験を行った。異なる希釈濃度の抗血清及び免疫前血清をそれぞれＳＦＴＳＶウイルスと６０ｍｉｎインキュベートし、その後Ｖｅｒｏ細胞に移し、４８ｈ後、ｓＧＮタンパク質の細胞免疫蛍光染色によってＳＦＴＳＶの感染を判断した。中和実験の結果は、ｓＧＮによって誘導された抗血清が９０％のＳＦＴＳＶ感染を阻害するＩＤ９０は、５４０倍希釈度以上であることを示した（図２）。以上より、ｓＧＮは高力価抗血清を誘導しており、且つ該抗血清はＳＦＴＳＶウイルス感染を効果的に阻害する能力を有した。
【００４１】
３．ＶＨＨファージライブラリーの構築及びパニング
免疫後の２００ｍｌのラクダの末梢血を収集し、リンパ球分離液（ＧＥ  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ）でラクダのＰＢＭＣを分離して取得し、ＴＲＩｚｏｌ操作マニュアルに基づいて、ＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）を利用してｃＤＮＡに戻し、プライマー増幅、及び分子クローニング等の技術により、ラクダのＶＨＨ遺伝子をｐｈａｇｅｍｉｄプラスミドにクローニングし、ＴＧ１細菌を形質転換し、ＶＨＨファージライブラリーを得た。ｓＧＮ−ＶＨＨファージライブラリーの構築が成功したがどうかをさらに確認するために、ｓＧＮで免疫したラクダのＶＨＨ標的遺伝子をＰＣＲ増幅した結果、標的バンドが５００ｂｐであり、大きさが予想に一致し（図３）、該ｓＧＮ−ＶＨＨファージ抗体ライブラリーにはＶＨＨ遺伝子が含まれていることを表した。５０個のクローンを選択してシークエンシングし、シークエンシングの結果は、シークエンシングされた配列には完全に同じの反復配列がないことを示し、比較の結果は、差分配列がほとんどＣＤＲ結合領域に位置することを示した。検出した結果、該構築されたｓＧＮ−ＶＨＨファージ抗体ライブラリーの容量が２．０×１０９であり、陽性率が１００％であり、配列多様性（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）が１００％であり、フレームレート（Ｉｎ  ｆｒａｍｅ  ｒａｔｅ）が９５％より大きかった。
【００４２】
Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージの助けを借りて、ＶＨＨ−ｐｈａｇｅｍｉｄ形質転換された細菌を用いて、ファージ抗体ライブラリーを復活し、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿した。５０μｇ／ｍｌのコーティングしたｓＧＮ−Ｈｉｓタンパク質でファージ抗体ライブラリーを３回濃縮した。濃縮されたファージを、溶離して、形質転換し、プレートコーティングし、モノクローナルを選択してファージとｓＧＮタンパク質ＥＬＩＳＡの結合アッセイを行い、結合値＞１．０のクローンをシークエンシングし、発現ベクターｐＶＡＸ１にクローニングし、２９３Ｆ細胞にトランスフェクトしてナノモノクローナル抗体を発現して生成した。
【００４３】
パニングされた後のライブラリーとＧＮタンパク質の結合検出を行った。ファージＥＬＩＳＡの結果は、濃縮前のｓＧＮ−ＶＨＨファージライブラリーとｓＧＮタンパク質の結合値が０．５７であり、１回目、２回目、３回目濃縮された後のファージライブラリー値がそれぞれ０．９８、２．２、３．０であることを示した（図４Ａ）。濃縮された後のライブラリーにおけるｓＧＮ−ＶＨＨタンパク質に結合した陽性ファージの割合を更に検証するために、２回目及び３回目の濃縮後のライブラリーからそれぞれ９６個のクローンを選択して単一のファージＥＬＩＳＡ検出を行った。結果は、２回目のライブラリーにおいて、２４．５％の単一のファージクローンが陽性であり、３回目のライブラリーにおいて、６７％のファージクローンが陽性であり、且つ結合の平均値が約３．０であり（図４Ｂ）、ｓＧＮタンパク質のパニングによって、高結合能力を有するｓＧＮ−ＶＨＨファージライブラリーの濃縮が成功したことを、示した。
【００４４】
４．ＶＨＨの原核生物発現ライブラリーの構築及びＶＨＨの発現
上記２回目及び３回目のパニング濃縮後の２ｎｄ−ｓＧＮ−ＶＨＨ及び３ｒｄ−ｓＧＮ−ＶＨＨファージ抗体ライブラリーをＰＣＲ増幅し、抗体ライブラリーにおけるすべてのＶＨＨの遺伝子断片を取得して精製し、ＶＨＨの遺伝子断片を原核生物発現ベクターにクローニングし、ＳＳ３２０株を形質転換して、ＶＨＨの原核生物発現抗体ライブラリーを構築し、原核生物発現抗体ライブラリーをプレートにコーティングし、一晩培養し、翌日、１０００個のモノクローナルコロニーをランダムに選択し、ＩＰＴＧを用いて誘導して抗体上清を発現し、抗体の上清とｓＧＮタンパク質のＥＬＩＳＡ結合検出を行った。
【００４５】
結果は、細菌の上清がｓＧＮタンパク質に結合したが、空白対照に結合せず、ｓＧＮ結合値／空白対照値は５．０より大きいことを示した（図５及び表１）。これらの配列をシークエンシングして比較し、反復配列を除去し、最終的に１４２個のＶＨＨ抗体配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１４２）を得た。さらなる実験により、この１４２個のＶＨＨ抗体及びＶＨＨ抗体から得られたＣＤＲは全てＳＦＴＳＶウイルスに特異的に結合できることを実証した。
【００４６】
表１  １４２個のＶＨＨ抗体とｓＧＮタンパク質の結合値及びその配列
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【００４７】
該配列がＳＦＴＳＶウイルス感染を良好に阻害できるか否かをさらに検証するために、１２２個のＶＨＨ抗体の細菌上清を処理後にＳＦＴＳＶウイルスとインキュベートし、抗体がＳＦＴＳＶウイルス感染を阻害できるか否かをテストした。中和実験の結果は、２３個の抗体が５０％以上の阻害効果を達成できることを示した（図６）。抗体番号は、それぞれＧ７７、Ｇ７８、Ｇ７９、Ｇ８７、Ｇ９５、Ｇ１０３、Ｇ１０９、Ｇ１１１、Ｇ１１２、Ｇ１１３、Ｇ１１４、Ｇ１１６、Ｇ１１７．１、Ｇ１２１、Ｇ１２４、Ｇ１２５、Ｇ１２６、Ｇ１３１、Ｇ１３３、Ｇ１４５、Ｇ１７０及びＧ１７１であった。
【００４８】
５．ＶＨＨ−ｈｕＦｃ（ＳＮＢ）の真核生物発現
分子クローニング技術により、上記２３個のナノモノクローナル抗体ＶＨＨ遺伝子をヒトＦｃ遺伝子と融合させて、ｐＶＡＸ１真核生物発現ベクターに挿入し、Ｎｂ−ｈｕＦｃ−ｐＶＡＸ１発現プラスミドを構築して形成した。構築されたＮｂ−ｈｕＦｃ−ｐＶＡＸ１を、２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、Ｎｂ−ｈｕＦｃ（ＳＮＢ）を発現して生成し、且つＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇを利用して精製した。精製されたＶＨＨ−ｈｕＦｃ１（ＳＮＢ）抗体を収集してＥＬＩＳＡ測定を行って、一部の抗体が非常に良好な結合能力を有することを示した（図７）。構築されたヒト化抗体の対応する配列番号が表２に示された。
【００４９】
表２  ヒト化抗体ＳＮＢの対応する元の抗体の番号及びＣＤＲ配列
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【００５０】
ＢＩＡｃｏｒｅ  ｘ１００装置を介して、アミノカップリングキットの手引書に基づいて、４０００  ＲＵのｓＧＮタンパク質をＣＭ５チップにカップリングし、カップリングされたチップをエタノールアミンで密封した。抗体を各濃度に勾配希釈した。Ｂｉｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０ソフトウェアで検出プログラムを設定した。抗体の濃度を低濃度から高濃度へ検出し、各濃度ごとに２回繰り返し検出し、結合時間を１８０秒間、流速を３０μｌ／ｍｉｎに設定し、解離時間を１８０秒間、流速を３０μｌ／ｍｉｎに設定し、ｐＨ２．５  １０ｍＭのグリシンの場合、流速を３０μｌ／ｍｉｎに設定し、時間が３０秒間であり、チップの表面を活性化して、再生し、ＰＢＳで５秒間バランスを取り、流速が３０μｌ／ｍｉｎであった。実験のデータを分析して、結合、解離及び親和定数を取得した。結果が表３に示され、ほとんどの抗体の親和力が１０−９（Ｎａｎｏ  ｍｏｌｅレベル）に達することができ、そのうち、２つの抗体ＳＮＢ０２とＳＮＢ０７が１０−１０（Ｐｉｃｏ  ｍｏｌｅレベル）に達することができた。これで分かるように、親和力の高いＶＨＨ−ｈｕＦｃ１（ＳＮＢ）抗体を取得した。
【００５１】
表３  ＳＮＢ親和力の概要
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注：ｋａは結合定数であり、ｋｄは解離定数であり、ＫＤは親和力である。
【００５２】
６．Ｖｅｒｏ細胞のＳＦＴＳＶ感染におけるＳＮＢの中和
ＶＨＨ−ｈｕＦｃ１におけるＳＮＢ０２とＳＮＢ１６を選択してｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和実験を行った。抗体を異なる濃度に勾配希釈して、ＳＦＴＳＶウイルスとともに、５％のＣＯ２で３７℃において１時間インキュベートし、１．５×１０４個のＶｅｒｏ細胞を加え、５％のＣＯ２で３７℃において、インキュベーターで４８時間培養した後、細胞の上清を除去し、４％のパラホルムアルデヒドを加えて１５ｍｉｎ固定し、洗浄して密封し、抗ＧＮのウサギポリクローナル血清（１：１０００に希釈される）を加え、４℃で一晩放置し、ＰＢＳＴで洗浄した後、５０μｌの抗ウサギ二次抗体（Alexa Fluor 488 Anti-Rabbit IgG (H+L), Code: 111-545-144,Jackson ImmunoResearch Laboratories，１：１０００に希釈される）を加え、室温で４０ｍｉｎインキュベートしてから、１０ｍｉｎＤＡＰＩ染色し、洗浄して、蛍光顕微鏡で写真を撮って観察し、緑色のスポットと蛍光強度を統計して中和阻害率と中和力価を計算し、阻害率＝［１−（サンプル群の蛍光強度の平均値−細胞対照群ＣＣの蛍光強度の平均値）／（対照処理群の蛍光強度の平均値−細胞対照群ＣＣの蛍光強度の平均値）］×１００％であった。中和力価（ＩＤ５０又はＮＤ５０）は、阻害率が５０％である場合の希釈度の倍数として表された。
【００５３】
結果は図８及び９に示され、ＳＮＢ０２は、非常に良好な中和活性を有し、抗体濃度が９μｇ／ｍｌである場合、阻害率が８３．５％に達することができた。ヒト化マウスモデルでＳＮＢ０２の効果を評定した。
【００５４】
７．ＳＮＢによるＳＦＴＳインビボ感染の治療
ＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ  （ＮＣＧ）マウスは南京大学モデル動物所から購入され、ＮＳＧマウスに類似し、該マウスはＳＣＩＤマウスの上でＩＬ２受容体遺伝子がないため、インビボでマウスＴ細胞、Ｂ細胞及び非常に少数のＮＫ細胞がない。１．０〜１５×１０７個のＰＢＭＣを４〜６週齢のＮＣＧマウスに腹腔内注射し、３週間後、採血して、ヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋を染色して、ヒトＴ細胞を検出した。ヒトＣＤ４５陽性細胞の割合が５％以上に達し、マウスのヒト化に成功したと判定した。２×１０７個のＴＣＩＤ５０のＳＦＴＳＶウイルスを接種し、感染後の３日目、６日目に、それぞれ一回抗体治療を行い、すなわち、４００μｇのＳＮＢ０２抗体／マウス（抗体の量が約２０ｍｇ／ｋｇマウスである）を腹腔内注射した。毎回抗体治療の前及び９日目に採血し、マウスの血液におけるウイルス量を検出し、それにより、マウスがＳＦＴＳウイルスに正常に感染しているかどうか及びＳＮＢ抗体がマウスへのＳＦＴＳＶ感染を制御できるかどうかを判断し、ヒトＩｇＧを対照として使用した。結果は図１１に示され、治療を完了した３日後（９日目）、マウスのインビボのウイルス量を検出し、ＳＮＢ０２治療を受けた９匹のマウスのうち、７匹のマウスのインビボのウイルス量がいずれも非常に良好に阻害され、Ｈｕ−ＩｇＧ治療を受けた対照群のマウスでは、インビボのＳＦＴＳウイルスが大量に増殖し、２つの群のウイルス阻害率の比較分析によれば、ＳＮＢ０２がＳＦＴＳウイルス感染を有意に制御できることを示した（図１０）。
【００５５】
８．ＡＡＶウイルスベクターに搭載されたＳＮＢ０２によるインビボ実験
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）は、非病原性の野生型アデノ随伴ウイルスに由来し、安全性が高く、宿主細胞の範囲が広く（分裂細胞と非分裂細胞）、免疫原性が低く、インビボで外来遺伝子を発現する時間が長い等の特徴を有するため、最も将来性のある遺伝子導入ベクターの１つと見され、世界中で、遺伝子治療及びワクチン研究において幅広く応用されている。
【００５６】
ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅウイルスパッケージングシステムは、Cell Biolabs, San Diego USAから購入された。分子クローニング技術により、上記ＳＮＢ０２のＤＮＡコード配列をｐＡＡＶ−ＭＣＳプラスミドに挿入し、シークエンシングにより構築が成功したと証明した後、構築されたプラスミドｐＡＡＶ−ＡｂをｐＨｅｌｐｅｒ及びｐＡＡＶ−ＤＪプラスミドと、１：１：１の質量比で、ＰＥＩトランスフェクション試薬を用いてＡＡＶ−２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。トランスフェクトした後、それぞれ４８、７２、９６及び１２０時間に上清を収集し、５ｘＰＥＧ８０００（ｓｉｇｍａ）で濃縮し、最終的に、１．３７ｇ／ｍｌの塩化セシウムで精製した。精製されたＡＡＶをＰＢＳに溶解し、アッセイして分注し、−８０℃で保存した。
【００５７】
上記ヒト化マウスに２×１０７個のＴＣＩＤ５０のＳＦＴＳＶウイルスを接種し、感染後の３日目に採血して、ＡＡＶ−ＳＮＢ０２（１×１０１１ｇｃ／１００μｌ）を筋肉内注射し、６日目、９日目及び１２日目に採血し、ウイルス量を検出し、ＡＡＶ−ＧＦＰを対照群として使用した。結果は、ＡＡＶ−ＳＮＢ０２を注射したマウスのインビボのＳＦＴＳＶウイルス量がいずれも非常に低く、対照群のマウスのインビボのＳＦＴＳＶウイルスが大量に増殖していることを示した。
【００５８】
９．二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ
各濃度のＳＮＢ抗体を用いて検出プレートをコーティングし、各ウェル１００μｌであり、３７℃で２ｈインキュベートし、２〜４回洗浄し、１０％ウシ血清で密封し、各ウェル２００μｌであり、３７℃で１ｈインキュベートし、２〜４回洗浄し、勾配希釈されたタンパク質を各ウェルに加え、ウイルス又はサンプル１００μｌを、３７℃で１．５ｈインキュベートし、２回洗浄し、１：２００〜１：１００００に希釈されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識ＳＮＢ抗体１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で１ｈインキュベートし、４〜６回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ基質を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ  ０．２ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止し、ＯＤ４５０ｎｍを測定した。ＥＬＩＳＡで検出された陽性サンプルは、ＯＤ４５０が空白対照（すなわち非コーティング被検出物であり、図においてＮｅｇでマークされている）の２．１倍以上であり且つその光密度値が０．２より大きい場合の最高の希釈倍数として規定された。
【００５９】
結果は、コーティング抗体がＳＮＢ０２又はＳＮＢ０７であり、検出抗体がＳＮＢ０１である場合に、該組み合わせはｓＧＮタンパク質と陰性対照タンパク質を識別でき（図１１Ａ）、検出抗体がＳＮＢ０２である場合に、ＥＬＩＳＡアッセイバックグラウンドが非常に高く（図１１Ｂ）、検出抗体がＳＮＢ３７であり、コーティング抗体がＳＮＢ０１、ＳＮＢ０２及びＳＮＢ０７である場合に、ＥＬＩＳＡはｓＧＮタンパク質と陰性対照タンパク質を識別できる（図１１Ｃ）ことを示した。ＳＮＢ抗体は、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ検出ｓＧＮキットの開発に適用でき、ＳＮＢ０１とＳＮＢ３７の二重抗体の組み合わせの検出感度は３．９ｎｇ／ｍｌであった（図１１Ｄ）。測定した結果、ＳＦＴＳＶ真正ウイルスを検出する該組み合わせの感度が３．７５×１０６ｇｃ／ｍｌであり（図１２）、該キットがＳＦＴＳＶの真正ウイルスを検出できるだけでなく、コピー数が１０＾６のＳＦＴＳＶの真正ウイルスも検出できた。これで分かるように、該ナノ抗体二重抗体サンドイッチ検出キットは、ＳＦＴＳＶウイルス感染の検出に適用できた。
【００６０】
以上は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を制限するためのものではなく、本発明の精神及び原則から逸脱することなく、行われるいかなる補正、等価置換、改良などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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