(57)【要約】ナノフィブリルセルロースヒドロゲルが開示される。ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｌ１−Ｎ３で表され、式中ｎが１〜１０の範囲にあり；ｍが０または１であり；かつＬ１がリンカーであり；置換基がアジド修飾ナノフィブリルセルロースの１以上のグルコシル単位の炭素に結合し、したがって炭素に対するエーテル結合を形成する置換基を有するアジド修飾ナノフィブリルセルロースを含み得る。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノフィブリルセルロースヒドロゲルであって、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｌ１−Ｎ３で表され、式中ｎが１〜１０の範囲にあり；ｍが０または１であり；かつＬ１がリンカーである置換基を有するアジド修飾ナノフィブリルセルロースを含み、前記置換基がアジド修飾ナノフィブリルセルロースの１以上のグルコシル単位の炭素に結合し、したがって炭素へのエーテル結合を形成する、ナノフィブリルセルロースヒドロゲル。
【請求項２】
Ｌ１が−ＣＨ２−ＣＨ２（Ｒ１）−ＮＨ−Ｌ２−を表し、式中Ｒ１が存在しないかまたは−ＣＯＯＨであり、Ｌ２がリンカーである、請求項１に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲル。
【請求項３】
Ｌ２がＣ（Ｏ）−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−を表し、式中ｏが０以上である、請求項２に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲル。
【請求項４】
前記１以上のグルコシル単位の少なくとも１つ以上がβ１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位であり、前記置換基が結合している前記β１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位の１つ以上の炭素が炭素６である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲル。
【請求項５】
前記アジド修飾ナノフィブリルセルロースが、少なくとも約０．０００１、または少なくとも約０．０１の置換度を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲル。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲル、ならびに任意に反応緩衝液および／または使用のための指示を含む、キットまたは固体支持体。
【請求項７】
前記キットまたは固体支持体が、環状もしくは非環状アルキン基を有するリガンド、またはリガンドに結合可能であり、環状もしくは非環状アルキン基を有するリンカー化合物をさらに含む、請求項６に記載のキットまたは固体支持体。
【請求項８】
環状または非環状アルキン基を有するリガンドを調製するためのキットであって、前記キットがリガンドに結合可能なリンカー化合物を含み、環状または非環状アルキン基ならびに任意に反応緩衝液および／または使用のための指示を有するキット。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲルの調製方法であって、前記方法が、
ナノフィブリルセルロースの１つ以上のグルコシル単位の水酸基をアルケニル化剤でアルケニル化して、アルケニル化されたナノフィブリルセルロースを得るステップ、および
アジド含有化合物を前記アルケニル化されたナノフィブリルセルロースと結合させ、それによって前記アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含む前記ナノフィブリルセルロースヒドロゲルを得るステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
前記アルケニル化剤は式Ｘ−（ＣＨ２）ｎＣＨ＝ＣＨ２で表される構造を有し、式中ｎは１〜８の範囲であり、ＸはＢｒ、Ｃｌ、またはＩである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
チオール基含有化合物を前記アルケニル化されたナノフィブリルセルロースと反応させるステップを含み、前記チオール基含有化合物がアジド基をさらに有し、それによって前記アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含む前記ナノフィブリルセルロースヒドロゲルを得るステップを含み、または
前記チオール基含有化合物を前記アルケニル化されたナノフィブリルセルロースと反応させることを含み、前記チオール基含有化合物がアミノ基をさらに有し、それによってアミノ修飾ナノフィブリルセルロースを得るステップ、および前記アミノ基と反応可能な官能基を有する化合物を前記アミノ修飾ナノフィブリルセルロースと反応させるステップを含み、前記官能基を有する前記化合物がアジド基をさらに有し、それによって前記アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含む前記ナノフィブリルセルロースヒドロゲルを得るステップを含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記チオール基含有化合物が、システイン、システアミンまたはその組み合わせもしくは混合物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リガンド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルであって、前記リガンド修飾ナノフィブリルセルロースは、それに共有結合した１つ以上のリガンドを有し、前記１つ以上のリガンドは、タンパク質、ペプチド、グリカン、またはナノフィブリルセルロース分子のうちの少なくとも１つを含み；前記リガンド修飾ナノフィブリルセルロースは、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｌ１−Ｄによって表される置換基を有し、式中、ｎは、１〜１０の範囲であり、ｍは、０または１であり、Ｌ１は、存在しないか、またはリンカーであり；Ｄは、前記リンカーに共有結合したリガンドを表し、任意選択で、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲルの前記アジド修飾ナノフィブリルセルロースのアジド基と、前記リガンドの環状または非環状アルキン基との間の反応によって形成されるトリアゾール基を表し、前記置換基は、前記リガンド修飾ナノフィブリルセルロースの１つ以上のグルコシル単位の炭素に結合し、したがって前記炭素へのエーテル結合を形成する、ナノフィブリルセルロースヒドロゲル。
【請求項１４】
Ｄが、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲルの前記ナノフィブリルセルロースの前記アジド基と、前記リガンドの前記環状または非環状のアルキン基との反応により形成される前記リンカーおよび前記トリアゾール基に共有結合するリガンドを表し、したがって、前記リガンドが前記トリアゾール基を介して前記リンカーに共有結合する、請求項１３に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲル。
【請求項１５】
Ｌ１が−ＣＨ２−ＣＨ２（Ｒ１）−ＮＨ−Ｌ２−を表し、Ｒ１が存在しないかまたは−ＣＯＯＨであり、Ｌ２がリンカーである、請求項１３に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲル。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲルを調製する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲルを環状または非環状アルキン基を有するリガンドと接触させることを含む方法。
【請求項１７】
前記方法が、環状または非環状アルキン基を有するリンカー化合物を前記リガンドに結合させ、それによって前記環状または非環状アルキン基を有する前記リガンドを得るステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記環状アルキン基がＤＢＣＯ、ＯＣＴ、ＭＯＦＯ、ＤＩＦＯ、ＤＩＦＯ２、ＤＩＦＯ３、ＤＩＭＡＣ、ＤＩＢＯ、ＢＡＲＡＣ、ＢＣＮ、ソンドハイマージイン、ＴＭＤＩＢＯ、Ｓ−ＤＩＢＯ、ＣＯＭＢＯ、ＰＹＲＲＯＣ、またはそれらの修飾もしくは類似体である、請求項７もしくは８に記載のキットまたは固体支持体、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のナノフィブリルセルロースヒドロゲル、または請求項１６もしくは１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のアジド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルまたは請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のリガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルの、細胞または組織の維持、輸送、単離、培養、繁殖、継代培養、分化または移植のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、ヒドロゲルが３次元マトリックスを提供し、その中で細胞が成長することができ、それらが相互作用することができるので、３Ｄ細胞培養で使用される。ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、比較的特徴づけられた細胞培養基材であり、したがってナノフィブリルセルロース自体とは別に、通常、細胞の成長、分化またはそれへの付着に影響することを意図する成長因子または他の成分を含まない。
【０００３】
ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、典型的には、細胞培養に適した粘度および他のレオロジー特性を有するヒドロゲル分散体として送達される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ナノフィブリルセルロースヒドロゲルが開示される。ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含み得る。アジド修飾ナノフィブリルセルロースは、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｌ１−Ｎ３で表され、式中ｎが１〜１０の範囲にあり；ｍが０または１であり；かつＬ１がリンカーである置換基を有し得る。置換基は、アジド修飾ナノフィブリルセルロースの１以上のグルコシル単位の炭素に結合し、したがって炭素に対するエーテル結合を形成し得る。
【０００５】
実施形態のさらなる理解を提供するために含まれ、この明細書の一部を構成する添付の図面は、様々な実施形態を例示している。図面において：
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】アジド修飾およびリガンド修飾ナノフィブリルセルロースの生成の模式図である。
【図２】アジド修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析である。
【図３】修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）は高圧蒸気殺菌法後に官能性である。
【図４】アリル化されたＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）の１Ｈ−ＮＭＲ分光法。
【図５】培養の９日後の種々の３Ｄヒドロゲル中のｉＰＳ細胞。
【図６】種々の３Ｄヒドロゲル中のｉＰＳ細胞の細胞計数。
【図７】種々の３Ｄヒドロゲル中の細胞生存率。
【図８】細胞増殖アッセイ。
【図９】修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長したスフェロイドにおける抗Ｔｒａ−１−６０染色。
【図１０】ＥＣＡ−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長したスフェロイドにおける抗ＳＳＥＡ−４染色。
【図１１】ＥＣＡ−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長した「大きい」スフェロイド中のＡｌｅｘａ４８８−ファロイジン染色。
【図１２】グリカン１−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長したスフェロイド中のＡｌｅｘａ４８８−ファロイジン染色。
【図１３】修飾していないＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長したスフェロイド中のＡｌｅｘａ４８８−ファロイジン染色。
【図１４】修飾していないＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長したスフェロイド中のＡｌｅｘａ４８８−ファロイジン染色。
【図１５】応力−スイープ測定による、修飾していない試料（実線）および修飾した試料（点線）の０．５％ナノセルロース分散体の粘弾性特性。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルが開示される。アジド修飾ナノフィブリルセルロースは、それに共有結合したアジド（−Ｎ３）基を有する。
【０００８】
ここで、アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを用いて、リガンドをヒドロゲルのナノフィブリルセルロースと共有結合させ、すなわち結合させることが可能であることが見出された。例えば、成長因子または他の生体分子のようなリガンドを、ヒドロゲルに結合させることができる。適当なリガンドは、例えば、タンパク質、ペプチド、グリカンまたはナノフィブリルセルロース（架橋ナノフィブリルセルロース）を含み得る。このようなリガンドは、ヒドロゲルと接触して成長した細胞および／または組織の成長、分化および／または付着を改善または支持し得る。ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、細胞および／または組織、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹（ＰＳ）細胞の培養に適し得る。
【０００９】
ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、選択される１つ以上のリガンドおよび／または選択される量の１つ以上のリガンドを結合させる形態で提供することができる。結合は、ヒドロゲルの使用直前に、最終使用者が行うことができる。
【００１０】
ナノフィブリルセルロースヒドロゲルのレオロジー特性および／またはゲル化特性は、修飾（複数可）によって必ずしも有意な影響を受けない。この明細書に記載されている１つ以上の実施形態によるアジド修飾は、レオロジー特性またはゲル化特性に悪影響を及ぼし得るナノフィブリルセルロースの有意な望ましくない架橋を引き起こさないと見られる。
【００１１】
アジド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルを調製するための、およびリガンドをそれに結合するための反応は、水溶液中で行ってもよく、したがってヒドロゲルの特性は、ヒドロゲルの調製時に使用される反応条件に大きく影響されない可能性がある。反応には、たとえば苛性の溶媒は必要ない。さらに、使用する化学的性質から、ヒドロゲルに対する潜在的に毒性の成分は導入されない。したがって、反応後のヒドロゲルを精製するための手順は、比較的軽いものであってもよく、またはさらに排除され得る。
【００１２】
ナノフィブリルセルロースの修飾は、例えば、１つ以上のセルラーゼおよび／またはヘミセルラーゼを用いるナノフィブリルセルロースヒドロゲルの酵素分解を著しく妨害しない。リガンドはまた、例えばリガンドが溶液にあり、ナノフィブリルセルロースに共有結合しないように、リガンドをナノフィブリルセルロースヒドロゲルと単純に混合するのと比較して、ヒドロゲル内に比較的均一に分布し得る。
【００１３】
ナノフィブリルセルロースは、植物起源のセルロース原料から調製することができる。原料は、セルロースを含むあらゆる植物材料に基づき得る。原料はまた、ある種の細菌発酵プロセスから誘導され得る。一実施形態において、植物材料は木材である。木材は、トウヒ、マツ、モミ、カラマツ、ダグラスファーもしくはヘムロックなどの針葉樹から、またはカバノキ、アスペン、ポプラ、アルダー、ユーカリ、オーク、ブナもしくはアカシアなどの広葉樹から、または針葉樹および広葉樹の混合物からであり得る。一実施形態において、ナノフィブリルセルロースは、木材パルプから得られる。一実施形態において、ナノフィブリルセルロースは、広葉樹パルプから得られる。一例では、広葉樹はカバノキである。一実施形態において、ナノフィブリルセルロースは、針葉樹パルプから得られる。
【００１４】
ナノフィブリルセルロースは、植物材料から作られ得る。一例では、原線維は、非実質性植物材料から得られる。このような場合、原線維は、二次細胞壁から得られ得る。このようなセルロース原線維の１つの豊富な供給源は、木材繊維である。木材のような植物起源のセルロースパルプの最小のセルロース実体には、セルロース分子、基本原線維、およびミクロフィブリルが含まれる。ミクロフィブリル単位は、表面の自由エネルギーを減少させる機構として、物理的に条件づけられた合体によって引き起こされる基本原線維の束である。
【００１５】
ナノフィブリルセルロースは、化学パルプであってもよい木材由来の繊維状原料を均質化することによって製造される。セルロース繊維を崩壊させて、直径が２００ｎｍまで、または５０ｎｍまで、例えば１〜２００ｎｍまたは１〜１００ｎｍであり得るナノメートル範囲における直径を有するフィブリルを形成し、水中にフィブリルの分散体を生成し得る。原線維は、大部分の原線維の直径が２〜２０ｎｍの範囲であるサイズに減少し得る。二次細胞壁に由来する原線維は、本質的に結晶性であり得、結晶性の程度は、少なくとも５５％である。このような原線維は、一次細胞壁に由来する原線維とは異なる特性を有し得る。例えば、二次細胞壁に由来する原線維の脱水は、より困難であり得る。
【００１６】
本明細書の文脈において、用語「ナノフィブリルセルロース」は、セルロース系繊維原料から分離されたセルロース原線維または原線維束を指すことができる。これらの原線維は、高いアスペクト比（長さ／直径）を特徴とする：その長さは１μｍを超えることがあり、一方直径は、典型的には２００ｎｍより小さいままである。最も細いフィブリルは、いわゆる素原線維のスケールにあり、その直径は、典型的には２〜１２ｎｍの範囲にある。フィブリルの寸法およびサイズ分布は、精製方法および効率に依存し得る。ナノフィブリルセルロースは、粒子の長さの中央値（原線維またはフィブリル束）が、例えば１〜５０μｍの範囲では５０μｍ以下であり、例えば２〜５００ｎｍの範囲では粒子径が１μｍより小さいセルロース系材料として特徴づけられ得る。天然のナノフィブリルセルロースの場合、一実施形態では、フィブリルの平均直径は、例えば１０〜５０ｎｍの範囲で５〜１００ｎｍの範囲にある。未変化の、フィブリル化されていないミクロフィブリル単位は、ナノフィブリルセルロース中に存在し得る。本明細書の文脈において、「ナノフィブリルセルロース」という用語は、非フィブリル状、棒形状セルロースナノ結晶またはウィスカーを包含することを意味しない。
【００１７】
ナノフィブリルセルロースに関連する命名法は現在のところ一様ではなく、文献では用語が一貫せずに用いられている可能性がある。例えば、以下の用語は、ナノフィブリルセルロースの同義語として使用されている可能性がある：セルロースナノ繊維（ＣＮＦ）、ナノフィブリルセルロース、ナノフィブリル化セルロース（ＮＦＣ）、ナノセルロース、ナノスケールフィブリル化セルロース、ミクロフィブリルセルロース、セルロースミクロフィブリル、ミクロフィブリル化セルロース（ＭＦＣ）、およびフィブリルセルロース。
【００１８】
ナノフィブリルセルロースは、比表面積が大きく、水素結合を形成する能力が強いことを特徴とする。水分散において、ナノフィブリルセルロースは、典型的には、淡い、または濁ったゲル様物質のいずれかとして現れる。繊維原料に応じて、ナノフィブリルセルロースはまた、ヘミセルロースまたはリグニンなどの少量の他の木材成分を含有し得る。その量は、植物源に依存する。
【００１９】
ナノフィブリルセルロースの様々なグレードは、（ｉ）サイズ分布、長さおよび直径；（ｉｉ）化学組成；および（ｉｉｉ）レオロジー特性の３つの主な特性に基づいて分類することができる。グレードを十分に記述するために、その特性を並行して用いることができる。様々なグレードの例は、天然（または非修飾）ＮＦＣ、酸化ＮＦＣ（高粘度）、酸化ＮＦＣ（低粘度）、カルボキシメチル化ＮＦＣおよびカチオン化ＮＦＣを含み得る。これらの主要グレード内には、例えば、極めて良好な線維化対中程度の線維化、高度の置換対低、低粘度対高粘度などのサブグレードも存在し得る。線維化技術および化学的前修飾は、線維径分布に影響を及ぼす可能性がある。典型的には、非イオン性グレードは、より広い原線維直径（例えば、１０〜１００ｎｍの範囲、または１０〜５０ｎｍの範囲）を有し得、一方化学的に修飾されたグレードは、より厚い（例えば、２〜２０ｎｍの範囲）可能性がある。原線維の分布も、修正グレードについて狭い可能性がある。ある種の修飾、特にＴＥＭＰＯ酸化は、より短い原線維を生じる可能性がある。
【００２０】
原料源、例えば広葉樹（ＨＷ）対針葉樹（ＳＷ）パルプに依存して、種々の多糖組成が、最終ナノフィブリルセルロース生成物中に存在し得る。一般に、非イオン性グレードは、漂白カバパルプから調製され、これは、高いキシレン含有量（２５重量％）を生じ得る。修正グレードは、ＨＷまたはＳＷパルプのいずれかから調製してもよい。このような修正グレードでは、ヘミセルロースも、セルロースドメインと共に修飾され得る。修飾は、均質ではない場合がある。すなわち、ある部分は、他の部分よりも大きく修飾され得る。したがって、詳細な化学分析は、可能ではない場合がある。修飾された生成物は、典型的には、種々の多糖構造の複雑な混合物である。
【００２１】
水性環境では、セルロースナノ繊維の分散体は、粘弾性ヒドロゲル網目構造を形成し得る。ゲルは、例えば０．０５〜０．２％（ｗ／ｗ）の比較的低濃度で、分散し、水和した絡み合った線維で形成され得る。ＮＦＣヒドロゲルの粘弾性は、例えば、動的振動レオロジー測定によって特徴づけられ得る。ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、特徴的なレオロジー特性を示し得る。例えば、それらはせん断−薄化または偽可塑性材料であり、それは、その粘度が材料が変形する速度（または力）に依存することを意味する。回転レオメーターで粘度を測定する場合、せん断−薄化挙動は、せん断速度の増加に伴う粘度の低下として見られる。ヒドロゲルは、可塑的な挙動を示し、このことは、材料が容易に流れ始める前に、ある種のせん断応力（力）が必要であることを意味する。この臨界せん断応力は、しばしば降伏応力と呼ばれる。降伏応力は、応力制御レオメーターで測定した定常状態流動曲線から決定できる。粘度を適用されたせん断応力の関数としてプロットすると、臨界せん断応力を超えた後に粘度の劇的な減少が見られる。ゼロせん断粘度および降伏応力は、材料の懸濁力を記述するための最も重要なレオロジーパラメータであり得る。これら２つのパラメータは、種々のグレードを全く明確に区別し得、したがってグレードの分類を可能にし得る。
【００２２】
原線維または原線維束の寸法は、原料および崩壊法に依存し得る。セルロース原料の機械的崩壊は、リファイナー、グラインダー、分散機、ホモジナイザー、コロイダー、摩擦グラインダー、ピンミル、ローター−ローターディスパーゲーター、超音波処理装置、流動化装置、例えばマイクロ流動化装置、マクロ流動化装置または流動化装置型ホモジナイザーのような任意の適切な装置を用いて行うことができる。崩壊処理は、繊維間の結合の形成を防止するために水が十分に存在する条件で行うことができる。
【００２３】
一実施形態では、崩壊は、少なくとも１つの回転子、ブレード、または回転子−回転子ディスパーゲータのような類似の移動機械的部材を有する分散機を用いることによって行われる。回転子−回転子ディスパーゲータの一例は、Ａｔｒｅｘ装置である。
【００２４】
崩壊に適した装置の別の例は、マルチペリフェラル（ｍｕｌｔｉ−ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）ピンミルのようなピンミルである。このような装置の一例は、米国特許第６２０２９４６  Ｂ１号に記載されている。
【００２５】
一実施形態では、崩壊は、ホモジナイザーを用いることによって行われる。
【００２６】
この明細書の文脈において、「線維化」という用語は、一般的に、粒子に適用される仕事によって機械的に繊維材料を崩壊させ、それによって、繊維または繊維断片からセルロース原線維が剥離されることを指し得る。その仕事は、粉砕、破砕もしくはせん断、またはこれらの組み合わせ、または粒子径を減少させる他の対応する作用など、様々な効果に基づくことができる。精製仕事によって取られるエネルギーは、通常、処理された原料量あたりのエネルギー、例えばｋＷｈ／ｋｇ、ＭＷｈ／トン、またはこれらに比例する単位で表すことができる。「崩壊」または「崩壊処理」という表現は、「線維化」と互換的に使用され得る。線維化にさらされる線維材料分散は、本明細書中で「パルプ」とも呼ばれる線維材料および水（または水溶液）の混合物であってよい。繊維材料分散体は、一般に、繊維全体、それらから分離された部分（断片）、フィブリル束、または水と混合されたフィブリルを指し得、典型的には、水性繊維材料分散体は、そのような要素の混合物であり、成分間の比率は、処理の程度または処理段階、たとえば、繊維材料の同じバッチの処理を実行または「通過」する回数に依存する。
【００２７】
崩壊した繊維状セルロース原料は、修飾または非修飾の繊維状原料とすることができる。修飾繊維原料とは、繊維からセルロースナノフィブリルがより容易に離脱できるように、修飾処理により繊維が影響を受ける原料を意味する。修飾は、液体、例えば、パルプ中の懸濁液として存在する繊維状セルロース原料に対して行うことができる。
【００２８】
繊維に対する修飾処理は、化学的または物理的であり得る。化学的修飾では、セルロース分子の化学構造は、例えば、セルロース分子の長さは影響されないが、ポリマーのβ−Ｄ−グルコピラノース単位に官能基が付加されるように、化学反応（セルロースの「誘導体化」）によって変化する。セルロースの化学的修飾は、反応物の投与量および反応条件に依存する一定の変換度で起こり得、セルロースが原線維として固体形態で留まり、水に溶解しないように完全ではないことが多い。物理的修飾では、アニオン性、カチオン性、非イオン性物質またはこれらの任意の組合せが、セルロース表面に物理的に吸着され得る。修飾処理はまた、酵素的であってもよい。繊維中のセルロースは、セルロースのイオン電荷が繊維の内部結合を弱め、後にナノフィブリルセルロースへの崩壊を容易にし得るので、修飾後に特にイオン的に荷電され得る。イオン電荷は、セルロースの化学的または物理的修飾によって達成され得る。繊維は、出発原料と比較して修飾後のアニオン性電荷またはカチオン性電荷がより高い可能性がある。アニオン性電荷をつくるための一般的に用いられる化学的修飾法には、水酸基がアルデヒドおよびカルボキシル基に酸化される酸化、スルホン化およびカルボキシメチル化が含まれ得る。次に、第四級アンモニウム基のようなカチオン基をセルロースに結合させることによるカチオン化によって、カチオン性電荷を化学的につくることができる。
【００２９】
言い換えると、アジド修飾ナノフィブリルセルロースは、化学修飾などのさらなる修飾を含んでいてもよい。アジド修飾ナノフィブリルセルロースを調製するための原料として、化学的または物理的に修飾されたナノフィブリルセルロースを使用することができる。代わりに、アジド修飾ナノフィブリルセルロースは、さらなる化学的または物理的修飾、例えば、アジド含有化合物をアルケニル化ナノフィブリルセルロースと結合させ、続いてアジド修飾ナノフィブリルセルロースを化学的または物理的に修飾することによって、前に調製され得る。
【００３０】
ナノフィブリルセルロースヒドロゲルはまた、アジド修飾ナノフィブリルセルロースおよび１つ以上の他のナノフィブリルセルロースタイプまたはグレードの混合物であってもよい。
【００３１】
一実施形態では、ナノフィブリルセルロースは、アニオン修飾ナノフィブリルセルロースまたはカチオン修飾ナノフィブリルセルロースなどの化学修飾ナノフィブリルセルロースを含む。一実施形態では、ナノフィブリルセルロースは、アニオン修飾されたナノフィブリルセルロースである。一実施形態では、ナノフィブリルセルロースは、カチオン修飾されたナノフィブリルセルロースである。一実施形態では、アニオン的に修飾されたナノフィブリルセルロースは、酸化されたナノフィブリルセルロースである。一実施形態では、アニオン的に修飾されたナノフィブリルセルロースは、スルホン化されたナノフィブリルセルロースである。一実施形態では、アニオン的に修飾されたナノフィブリルセルロースは、カルボキシメチル化ナノフィブリルセルロースである。
【００３２】
セルロースは酸化され得る。セルロースの酸化において、セルロースの第一級水酸基は、一般に「ＴＥＭＰＯ」と呼ばれる複素環ニトロキシル化合物、例えば２，２，６，６−テトラメチルピペリジニル−１−オキシフリーラジカルによって触媒的に酸化され得る。セルロースβ−Ｄ−グルコピラノース単位の第一水酸基（Ｃ６−水酸基）の少なくともいくつかは、選択的にカルボキシル基に酸化され得る。いくつかのアルデヒド基はまた、第一級水酸基から生成し得る。セルロースは、０．６〜１．４ｍｍｏｌのＣＯＯＨ／ｇパルプの範囲の酸化されたセルロース中のカルボン酸含有量を有するレベルまで、または、０．８〜１．２ｍｍｏｌのＣＯＯＨ／ｇパルプ、例えば、コンダクトメトリー滴定によって測定される１．０〜１．２ｍｍｏｌのＣＯＯＨ／ｇパルプにまで酸化され得る。この方法で得られた酸化されたセルロースの繊維を水中で崩壊させると、個々のセルロースフィブリルの安定した透明な分散体が得られ、その幅は例えば３〜５ｎｍであろう。
【００３３】
ナノフィブリルセルロースはまた、平均直径（もしくは幅）によって、またはブルックフィールド粘度もしくはゼロせん断粘度のような粘度と共に平均直径によって特徴付けられ得る。一実施形態では、前記ナノフィブリルセルロースは、１〜１００ｎｍの範囲の原線維の数平均直径を有する。一実施形態では、前記ナノフィブリルセルロースは、１〜５０ｎｍの範囲の原線維の数平均直径を有する。一実施形態では、前記ナノフィブリルセルロースは、ＴＥＭＰＯ酸化ナノフィブリルセルロースのように、２〜１５ｎｍの範囲のフィブリルの数平均直径を有する。フィブリルの直径は、顕微鏡検査などのいくつかの手法を用いて決定することができる。線維の厚さおよび幅の分布は、電界放出走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）、低温透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）などの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、または原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）からの画像の画像解析によって測定することができる。一般に、ＡＦＭおよびＴＥＭは、狭いフィブリル直径分布のナノフィブリルセルロースグレードに良く適し得る。
【００３４】
ナノフィブリルセルロースの粘度は、レオメーターを用いて測定してもよい。一実施形態では、ナノフィブリルセルロース分散体のレオメーター粘度を、直径３０ｍｍを有する円筒試料カップ中の狭いギャップ羽根形状（直径２８ｍｍおよび長さ４２ｍｍを有する羽根）を搭載した応力制御回転レオメーター（ＡＲ−Ｇ２、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）で２２℃で測定する。試料をレオメーターに装填した後、測定を開始する前に５分間安静にさせる。徐々に増加するせん断応力（適用されるトルクに比例）で定常状態粘度を測定し、せん断速度（角速度に比例）を測定する。一定のせん断応力における報告された粘度（＝せん断応力／せん断速度）は、一定のせん断速度に達した後、または最大時間２分後に記録される。せん断速度１０００ｓ−１を超えると測定を停止する。この方法は、ゼロせん断粘度の測定に用いることができる。
【００３５】
一例において、ナノフィブリルセルロースは、水中に分散させた場合、１０００〜１０００００Ｐａ・ｓの範囲、例えば５０００〜５００００Ｐａ・ｓの範囲におけるゼロせん断粘度（小さなせん断応力での一定粘度の「プラトー」）、および水性媒体中の重さによる０．５％（ｗ／ｗ）のコンシステンシーで回転レオメーターによって決定される、１〜５０Ｐａの範囲、例えば３〜１５Ｐａの範囲における降伏応力（せん断薄化が始まるせん断応力）を提供する。
【００３６】
ナノフィブリルセルロースは、水中で０．５ｗ％の濃度に分散した場合、０．３〜５０Ｐａの範囲の貯蔵弾性率を有し得る。例えば、貯蔵係数は、水中で０．５ｗ％の濃度に分散させた場合、１〜２０Ｐａの範囲、または２〜１０Ｐａの範囲にあり得る。
【００３７】
濁度とは、一般に肉眼では見えない個々の粒子（総浮遊または溶存固体）によって引き起こされる液体の濁りまたは混濁である。濁度を測定する実用的な方法はいくつかあり、最も直接的な方法は、試料カラムの水を通過する際の光の減衰（すなわち、強度の低下）のいくつかの尺度である。代わりに用いられるジャクソンキャンドル方法（単位：ジャクソン濁度単位またはＪＴＵ）は、本質的には、それを通して見たロウソクの炎を完全に不明瞭にするのに必要な水のカラムの長さの逆測定である。
【００３８】
濁度は、光学的濁度測定機器を用いて定量的に測定してもよい。濁度を定量的に測定するために利用できる市販の濁度計がいくつかある。本場合、比濁法に基づく方法を用いる。検量線比濁計による濁度の単位は、比濁濁度単位（ＮＴＵ）と呼ばれる。測定装置（濁度計）は、標準的な校正試料で校正および制御し、その後、希釈ＮＦＣ試料の濁度を測定する。濁度測定法では、ナノフィブリルセルロース試料を水中で希釈して、前記ナノフィブリルセルロースのゲル点未満の濃度とし、希釈試料の濁度を測定してもよい。ナノフィブリルセルロース試料の濁度を測定する濃度は、０．１％であり得る。濁度測定には、５０ｍｌ測定容器付きのＨＡＣＨ  Ｐ２１００  Ｔｕｒｂｉｄｏｍｅｔｅｒを使用してもよい。ナノフィブリルセルロース試料の乾燥物を測定し、乾燥物として計算した０．５ｇの試料を測定容器に装填することができ、これを５００ｇまで水道水で満たし、約３０秒間振盪することによって激しく混合することができる。遅延なしに、水性混合物を５つの測定容器に分けてもよく、これを濁度計に挿入する。各容器について３回の測定を行うことができる。得られた結果から平均値および標準偏差を算出し、最終結果をＮＴＵ単位で示してもよい。
【００３９】
ナノフィブリルセルロースを特徴付ける一つの方法は、粘度および濁度の両方を明らかにすることである。低い濁度は、小さいフィブリルが光をあまり散乱しないため、小径などのフィブリルの小さいサイズと相関し得る。一般に線維化度が高くなると粘度は増加し、同時に濁度は低下する。しかし、ある時点までこのようなことが起こり得る。さらに細動が続くと、最終的にフィブリルが壊れ始め、それ以上強力なネットワークを形成できない。したがって、この時点を過ぎると、濁度および粘度がともに低下し始める可能性がある。
【００４０】
一例では、アニオン性ナノフィブリルセルロースの濁度は、水性媒体中の０．１％（ｗ／ｗ）のコンシステンシーで測定し、比濁法によって測定して、９０ＮＴＵよりも低く、例えば３〜９０ＮＴＵ、例えば５〜６０、例えば８〜４０である。一実施形態では、天然ナノフィブリルの濁度は、水性媒体中の０．１％（ｗ／ｗ）のコンシステンシーで測定し、比濁法によって測定して２００ＮＴＵ超、例えば１０〜２２０ＮＴＵ、例えば２０〜２００、例えば５０〜２００であり得る。ナノフィブリルセルロースを特徴づけるために、これらの範囲は、ナノフィブリルセルロースの粘度範囲と組み合わせることができる。
【００４１】
調製プロセスの出発材料は、上記の繊維状原料のいくつかの崩壊から直接得られるかまたは得ることができるナノフィブリルセルロースであり得、崩壊条件のために水中に均一に分布する比較的低濃度であり得る。出発物質は、０．２〜１０％の濃度の水性ゲルであり得る。
【００４２】
用語「アジド修飾ナノフィブリルセルロース」は、アジド（−Ｎ３）基が共有結合するように化学的に修飾されたナノフィブリルセルロースを指すものとして理解され得る。
【００４３】
ナノフィブリルセルロースヒドロゲルのアジド修飾ナノフィブリルセルロースは、グルコシル単位を含み、そのうちの１つ以上が置換され得る。ナノフィブリルセルロースヒドロゲルにおいて、アジド修飾ナノフィブリルセルロースは、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｌ１−Ｎ３によって表され、式中ｎが１〜１０の範囲にあり；ｍが０または１であり；およびＬ１がリンカーである置換基を有し得る。置換基は、アジド修飾ナノフィブリルセルロースの１つ以上のグルコシル単位の炭素に結合していてもよい。こうして置換基は、炭素に対するエーテル結合を形成する。
【００４４】
一実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一実施形態において、ｎは、１〜２の範囲、または１〜３の範囲、または１〜４の範囲、または１〜５の範囲、または１〜６の範囲、または１〜７の範囲、または１〜８の範囲にある。一実施形態では、ｎは３〜１０の範囲にある。
【００４５】
ナノフィブリルセルロースの各グルコシル単位は、分野での慣例に従って１〜６の番号を付けた６個の炭素原子を含む。修飾されていないナノフィブリルセルロースでは、炭素２、３および６は、それらに水酸基が結合している。これらの炭素の各々は、それらに１個の水酸基が結合していてもよい。この置換基は、したがって、水酸基の代わりにこれらの炭素のどれか一つに結合していてもよい。言い換えると、置換基は、炭素に結合している水酸基を置換すると考えてよい。
【００４６】
用語「１つ以上のグルコシル単位の炭素」は、１つ以上のグルコシル単位の１つ以上の炭素を指すものとして理解され得る。言い換えると、単一のグルコシル単位の１つ以上の炭素が、それに添付された本明細書に記載されている１つ以上の実施形態に従って置換基を有していてもよい。さらに、またはその代替として、複数のグルコシル単位の１つ以上の炭素が、本明細書に記載されている置換基の１つ以上の実施形態に従って置換されていてもよい。熟練者がよく知っているように、ナノフィブリルセルロースのセルロースフィブリル、またはセルロース原料に由来するフィブリル束は、数百または数千のグルコシル（典型的にはβ１，４−Ｄ−グルコピラノシル）単位の鎖を含むセルロース分子を含み得る。したがって、セルロース鎖の個々のグルコシル単位は、セルロース鎖の他のグルコシル単位とは独立に置換されていてもよい。
【００４７】
この文脈において、用語「置換基」は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｌ１−Ｎ３によって表され、式中ｎが１〜１０の範囲にあり；ｍが０または１であり；およびＬ１がリンカーである部分を指すものとして理解され得る。置換基は、さもなければグルコシル単位の炭素に結合しているであろう水酸基の代わりに炭素（すなわち、１つ以上の炭素）に結合してもよい。アジド修飾ナノフィブリルセルロースの１つ以上のグルコシル単位の炭素（すなわち、１つ以上の炭素）上の水酸基は、こうして置換基により置換され得る。ここで定義される式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｌ１−Ｎ３で表される置換基は、炭素に直接（共有）結合し：したがって、エーテル結合は、置換基の酸素原子を介して炭素と置換基との間に形成される。
【００４８】
１以上のグルコシル単位に加えて、ナノフィブリルセルロースの他の糖単位は、それに結合したこの明細書に記載されている１以上の実施形態に従って置換基を有する。例えば、原料によっては、ナノフィブリルセルロースは、ヘミセルロースおよび／またはリグニンなどの他の木材成分も含み得る。アジド修飾ナノフィブリルセルロースのヘミセルロースも置換され得る。したがって、アジド修飾ナノフィブリルセルロースのヘミセルロースはまた、アジド修飾ナノフィブリルセルロースと同様の方法で、ヘミセルロースの１つ以上の糖単位の炭素に結合した、本明細書に記載される１つ以上の実施形態による置換基を有してもよい。ヘミセルロースの１以上の糖単位は、キシロシル単位、グルクロノキシロシル単位、アラビノキシロシル単位、グルコマンノシル単位、キシログルコシル単位および／もしくはそれらの任意の組み合わせまたはポリマーであり得る。
【００４９】
また、アジド修飾ナノフィブリルセルロースにおいて、置換基は、本明細書に記載される１つ以上の実施形態に従って、置換基の混合物によって表され得ることが理解され得る。言い換えれば、アジド修飾ナノフィブリルセルロースの、またはアジド修飾ナノフィブリルセルロースのセルロースの単一の鎖の個々の置換基は、少なくともいくつかの実施形態において、本明細書に記載されている置換基の１つ以上の実施形態から独立して選択されてもよい。２つ以上の異なる置換基を、目的にアジド修飾ナノフィブリルセルロースに導入することができ、かつ／またはそれらを、例えば、アジド修飾ナノフィブリルセルロースの調製中に生じる種々の化学反応によって導入することができる。したがって、アジド修飾ナノフィブリルセルロースのすべての置換基は、必ずしも同じ式で表されるわけではない。
【００５０】
さらに、例えば、アジド修飾ナノフィブリルセルロースはまた、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣＨ＝ＣＨ２で表され、式中ｎが１〜８の範囲にあり、アルケニル（またはアリル）置換基がアジド修飾ナノフィブリルセルロースの１つ以上のグルコシル単位の炭素に結合し、従って炭素に対するエーテル結合を形成するアルケニル（またはアリル）置換基を有していてもよい。このような実施形態は、典型的には望ましくない一方、それは、アルケニル置換基がそれ以上反応しなかった場合には、副生成物として生じ得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、スルホキシド構造（基−Ｓ（Ｏ）−、すなわち−Ｓ（＝Ｏ）−）が、置換群中に存在してもよく、すなわち、ｍは１であってもよい。他の実施形態では、スルホキシド構造は存在せず、すなわち、ｍは０である。アジド修飾ナノフィブリルセルロースにおいて、置換基は混合物を表し得ることも理解され得る。したがって、アジド修飾ナノフィブリルセルロースの置換基のいくつか、またはアジド修飾ナノフィブリルセルロースのセルロースの単一の鎖において、ｍは０であり得、他においてｍは１であり得る。理論に束縛されるべきではないが、スルホキシド構造の存在は、例えば、アジド修飾ナノフィブリルセルロースの調製に使用される試薬および／または条件に依存し得る。例えば、ＵＶ触媒（活性化）反応では、スルホキシド構造は必ずしも形成されず、一方化学触媒（活性化）反応では、スルホキシド構造は、アジド修飾ナノフィブリルセルロース中に存在する置換基のかなりの割合で形成され得る。
【００５２】
一実施形態において、Ｌ１は、−ＣＨ２−ＣＨ２（Ｒ１）−ＮＨ−Ｌ２−を表し、式中、Ｒ１は存在しないかまたは−ＣＯＯＨであり、Ｌ２はリンカーである。
【００５３】
言い換えると、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルでは、アジド修飾ナノフィブリルセルロースは、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−ＣＨ２−ＣＨ２（Ｒ１）−ＮＨ−Ｌ２−Ｎ３で表される置換基を有することができ、式中、ｎ、ｍ、Ｒ１およびＬ２は、この明細書で定義されるとおりであり、置換基は、アジド修飾ナノフィブリルセルロースの１つ以上のグルコシル単位の炭素に結合している。こうして置換基が炭素に対するエーテル結合を形成することができる。
【００５４】
例示的な実施形態において、アジド修飾ナノフィブリルセルロースは、以下の式によって表され得る：
【化１】
2021524519.tif 000003
【００５５】
この式において、およびそれらを含む下の他の式において、Ｒ１およびＲ２は、グリコシル単位の炭素１および炭素４からのグリコシド結合によって一緒に結合されたナノフィブリルセルロース分子の隣り合ったグルコシル単位または鎖を表す。
【００５６】
言い換えると、本実施態様では、アジド修飾ナノフィブリルセルロースのβ１，４−Ｄ−グルコース単位の炭素６に結合した置換基は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｌ１−Ｎ３で表され、式中ｎは３であり；ｍは１であり；Ｌ１は−ＣＨ２−ＣＨ２（Ｒ１）−ＮＨ−Ｌ２−を表し、式中Ｒ１は−ＣＯＯＨであり、Ｌ２はＣ（Ｏ）−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−を表し、式中ｏは４である。当該式のさらなる実施形態では、ｍは、０であってもよく、Ｒ１は、存在しなくてもよく、および／またはｏは、０、１またはそれ以上であってもよい。図に示すように、置換基は、置換基の酸素原子を介して炭素６に対するエーテル結合を形成する。
【００５７】
Ｌ１および／またはＬ２を含む、本明細書の文脈における「リンカー」は、１つ以上のリンカー基もしくは部分および／または１つ以上のスペーサー基を含むことができる。リンカー基は、原則として、本明細書に記載される１つ以上の実施形態に従ってアジド修飾ナノフィブリルセルロース中に組み込むことができる任意のリンカー基であってもよい。当該技術分野では多数の種々のリンカーが知られており、商業的に入手可能であり得る。それはまた、２つの官能基間の反応によって形成される１つ以上の基を含んでもよい。熟練者は、種々の異なる化学が利用され得、従って、種々の異なる官能基が反応して、Ｌ１および／またはＬ２によって構成される基または部分、例えばスルフヒドリル、アミノ、アルケニル、アルキニル、アジジル、アルデヒド、カルボキシル、マレイミジル、スクシンイミジルおよび／またはヒドロキシルアミノ基を形成し得ることを認識する。熟練者は、特定の条件で反応し得るように官能基を選択することができる。
【００５８】
リンカーは、親水性であってもよい。親水性リンカーは、それが水溶液中で比較的良好に水溶性であり得るという有用性を有し得る。例えば、リンカーは、ペプチドリンカー、例えば、長さが２〜５アミノ酸のペプチドリンカーであってもよい。リンカーの長さは特に制限されず、例えばリガンドの大きさに応じて選択され得る。リンカーおよびその長さは、立体障害を減少させ、アジド修飾またはリガンド修飾ナノフィブリルセルロースの水溶液中での溶解度を最適化し、かつ／またはナノフィブリルセルロースヒドロゲルの様々な特性を最適化するように選択され得る。
【００５９】
Ｌ１および／またはＬ２を含むリンカーは、例えば、以下のいずれかの基または部分を含むか、またはそれらであってもよい：
（ａ）ポリプロピレングリコールホモポリマーおよびエチレングリコールのプロピレングリコールとのコポリマーを含む、他のポリアルキレングリコールまたはその誘導体；
（ｂ）式−（ＡＡ）ｎ−で表され、式中ＡＡは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜約１００の整数であるペプチドまたはその誘導体を含む、ペプチドまたはその誘導体；
（ｃ）オリゴ糖またはポリオール；
（ｄ）デンプン、デキストリン、デキストランまたはデキストラン誘導体、デキストラン硫酸、架橋デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリンを含む；
（ｅ）ヘパリンまたはヘパリンの断片；
（ｆ）ポリビニルアルコールまたはポリビニルエチルエーテル；
（ｇ）ポリビニルピロリドン；
（ｈ）α，β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパラタミド；
（ｉ）ポリオキシエチル化ポリオール；あるいは
（ｊ）アルカン、置換アルカン、アルケン、置換アルケン、アルキン、置換アルキン、またはそれらの誘導体。
【００６０】
適切なリンカーまたはリンカー部分の例は、例えば、国際公開第２００４１００９９７号に記載されているスペーサー部分、例えば、本明細書中に記載されているポリ（エチレングリコール）部分である。
【００６１】
一実施形態では、Ｌ２は、Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−を表し、式中ｏは０以上である。一実施形態において、ｏは１以上であってもよい。一実施形態では、ｏは、０〜１００もしくは１〜１００の範囲、または０〜２０もしくは１〜２０の範囲であり得る。ｏは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。この種のリンカーは、比較的生体適合性、親水性かつフレキシブルであり得る。ｏ、すなわち、Ｌ２中の（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）単位の数は、例えばリガンドのサイズに応じて選択できる。
【００６２】
アジド修飾（置換基）なしで一級または二級水酸基に直接結合するナノフィブリルセルロースのグルコシル単位の炭素のいずれか１つは、置換基が一級または二級水酸基の代わりに炭素に結合するように修飾されてもよい。ナノフィブリルセルロースの１つ以上のβ１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位のうちの１つ以上の炭素２、３および６を、本明細書に記載されているように修飾してもよい。言い換えれば、ナノフィブリルセルロースの１つ以上のβ１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位の１つ以上の炭素２、３および６は、それに結合した本明細書に記載されている１以上の実施形態に従う置換基を有してもよい。
【００６３】
炭素６（Ｃ６）、すなわちセルロース中のＤ−グルコピラノシル残基の第一級水酸基への修飾を選択的に方向付けすることも可能であり得る。言い換えれば、１つ以上のグルコシル単位の少なくとも１つ以上は、β１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位であり得、置換基が結合している１つ以上のβ１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位の炭素は、炭素６であり得る。
【００６４】
アジド修飾ナノフィブリルセルロースは、少なくとも約０．０００１、少なくとも約０．００１、少なくとも約０．０１、または少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約０．３、少なくとも約０．４、少なくとも約０．５、少なくとも約０．６、少なくとも約０．７、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、または約１の置換度（ＤＳ）を有し得る。一実施形態では、ＤＳは、約０．０９である。一実施形態では、ＤＳは、約０．０６である。この文脈において、ＤＳは、本明細書の１以上の実施形態による置換基によるＤＳを具体的に指すことができる。用語「置換度」は、アジド修飾またはリガンド修飾ナノフィブリルセルロースのグルコシル単位当たりに結合した置換基の数または平均数を指すものとして理解され得る。乾燥ナノフィブリルセルロース１グラム当たりの利用可能なアジド基のモル量の計算のために、ナノフィブリルセルロースの構造単位は、グルコース残基、言い換えると無水グルコースの質量に対応する約１６２．１ｇ／ｍｏｌの質量を有すると理解することができる。このように、１ｍｏｌのナノフィブリルセルロースは、約１６２．１ｇの質量を有すると理解され、１ｇのナノフィブリルセルロースは、約６．１７ｍｍｏｌのモル量を有すると理解され得る。したがって、０．０１の置換度は、乾燥ナノフィブリルセルロース１６２．１ｇ当たりアジド基の１０ｍｍｏｌ、または０．０６ｍｍｏｌ／ｇに相当し得る。
【００６５】
ＤＳは、アジド基の含有量または数が、アジド修飾ナノフィブリルセルロースに結合したリガンド（複数可）の含有量または数を超えているようになっていてもよい。
【００６６】
この明細書に記載される１つ以上の実施形態に従ってナノフィブリルセルロースヒドロゲルを含むキットも、開示される。キットは、使用のための指示をさらに含むことができる。
【００６７】
本明細書に記載されている１つ以上の実施形態によるナノフィブリルセルロースヒドロゲルを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、または含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）固体支持体も、開示される。固体支持体は、例えば、マルチウェルプレート、容器、バイオリアクター、スキャフォールド、または３−Ｄマイクロ流体細胞培養チップ（ｏｒｇａｎ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）であってもよい。固体支持体は、細胞および／または組織の培養に適し得る。固体支持体は、ナノフィブリルセルロースヒドロゲル（アジド修飾および／またはリガンド修飾）を受容または含有するための陥凹を有していてもよい。
【００６８】
環状または非環状アルキン基を有するリガンドを調製するためのキットも開示され、当該キットは、リガンドに結合可能なリンカー化合物を含み、かつ環状アルキン基を有する。
【００６９】
キットは、さらに、本明細書に記載される１つ以上の実施形態に従って、アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを含み得る。
【００７０】
キットは、この明細書に記載された１つ以上の実施形態による固体支持体をさらに含むことができる。
【００７１】
キットまたは固体支持体は、さらに、例えば反応緩衝液および／または追加の試薬を含み得る。例えば、キットは、リガンドに結合可能であり、環状アルキン基を乾燥形態で有するリンカー化合物を含み得、したがって、キットは、乾燥リンカー化合物を再構成するための水溶液を含み得る。キットまたは固体支持体は、さらに細胞培養培地を含み得る。
【００７２】
キットは、必ずではないが、さらにリガンドを含み得る。リガンドは、別々に得ることができる。
【００７３】
キットはさらに、環状または非環状アルキン基を有するリガンドを含み得る。あるいは、またはさらに、キットは、リガンドに結合可能なリンカー化合物をさらに含み得、このリンカー化合物は、環状または非環状アルキン基を有し得る。リガンドと結合可能なリンカー化合物は、この明細書に記載される任意の適切なリンカー化合物であり得る。使用のための指示は、本明細書に記載される１つ以上の実施形態に従ってリガンド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを調製するための指示書を含むことができる。
【００７４】
本明細書の文脈において、用語「リガンド」は、生物学的目的に役立つ生体分子と複合体を形成し得る分子を指すものとして理解することができる。リガンドは、生体分子、例えばペプチド、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、グリカン、またはそれらの任意の混合物もしくは組み合わせであってよい。リガンドは、細胞、例えば、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルと接触して培養されるのに適し得る細胞の分子と複合体を形成することが可能であり得る。リガンドは、細胞の表面上で分子と複合体を形成することが可能であり得る。リガンドは、細胞のナノフィブリルセルロースヒドロゲルへの付着／接着および／または細胞の成長を促進することが可能であり得、例えば、成長因子、接着分子または接着分子に結合することができるリガンドである。リガンドのサイズは、特に制限されない。用語「リガンド」または「１つのリガンド」はまた、１つ以上のリガンド、例えばリガンドの混合物を包含してもよい。
【００７５】
リガンドは、例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、レクチン、Ｓ型レクチン、Ｃ型レクチン、Ｐ型レクチン、Ｉ型レクチン、ガレクチン、ガレクチン−１、ガレクチン−３、ガレクチンリガンド、脂質、糖脂質、グリコシド、ガラクトシド、プロテオグリカン、オリゴ糖、多糖類、グリコサミノグリカン、ヘパリン、ヘパラン硫酸塩、コンドロチン、コンドロイチン硫酸塩、ケラタン硫酸塩、ヒアルロナン、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インテグリン（例えば、αＶ、β１、β５α５、またはα６ネテグリン）、α６β１インテグリン、α３β１インテグリン、α１β１またはα２β１インテグリン、インテグリンリガンド、タリン、ビンクリン、キンドリン、カドヘリン、上皮（Ｅ）カドヘリン、神経（Ｎ）カドヘリン、血管内皮（ＶＥ）カドヘリン、カドヘリンリガンド、セレクチン、セレクチンリガンド、ラミニン、ラミニン−５１１、ラミニ−１１１、ラミニン−３３２、ラミニン−５２１、ラミニンリガンド、ニドゲン、フィブロネクチン、フィブロネクチンＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤ接着ペプチド（例えば、ＧＲＧＤＳＰＣ、配列番号１）、ビトロネクチン、ビトロネクチンオリゴペプチドＫＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ（配列番号２）、コラーゲン、コラーゲンタイプＩ、コラーゲンタイプＩＶ、またはドメイン、断片、またはその改変であり得るかまたはそれを含む。
【００７６】
用語「環状（または非環状）アルキン基を有するリガンド」は、環状（または非環状）アルキン基が直接的に、または１つ以上のリンカーおよび／もしくはスペーサーを介して共有結合される、この明細書に記載される任意のリガンドを指すものとして理解され得る。
【００７７】
環状または非環状アルキン基は、アジド修飾ナノフィブリルセルロースのアジド基と反応可能であり得る。非環状アルキン基は、例えば銅（Ｉ）触媒のように効率的に反応する触媒を必要とし得る。環状アルキン基は、双直交反応、すなわち、外因性金属（例えば、銅）触媒の非存在下での付加環化反応においてアジド基と反応し得る。したがって、環状アルキン基を用いると、外因性金属触媒の必要がなく、したがって、いかなる潜在的に細胞傷害性の金属イオンも、反応中の触媒として含まれなければならないことはないであろう。
【００７８】
環状アルキン基は、ＤＢＣＯ（ジベンジルシクロオクチン）、ＯＣＴ（シクロオクチン）、ＭＯＦＯ（一フッ素化シクロオクチン）、ＡＬＯ（無アリールオクチン）、ＤＩＦＯ（ジフルオロシクロオクチン）、ＤＩＦＯ２（ジフルオロシクロオクチン）、ＤＩＦＯ３（ジフルオロシクロオクチン）、ＤＩＭＡＣ（ジメトキシアザシクロオクチン）、ＤＩＢＯ（ジベンゾシクロオクチン）、ＤＩＢＡＣ（ジベンゾアザシクロオクチン）、ＢＡＲＡＣ（ビアリールアザシクロオクチノン）、ＢＣＮ（ビシクロノニン）、Ｓｏｎｄｈｅｉｍｅｒジイン、ＴＭＤＩＢＯ（２，３，６，７−テトラメトキシ−ＤＩＢＯ）、Ｓ−ＤＩＢＯ（スルホニル化ＤＩＢＯ）、ＣＯＭＢＯ（カルボキシメチルモノベンゾシクロオクチン）、ＰＹＲＲＯＣ（ピロロシクロオクチン）、またはそれらの修飾もしくはアナログであり得る。
【００７９】
環状アルキン基は、ＤＢＣＯ、ＯＣＴ、ＭＯＦＯ、ＡＬＯ、ＤＩＦＯ、ＤＩＦＯ２、ＤＩＦＯ３、ＤＩＭＡＣ、ＤＩＢＯ、ＤＩＢＡＣ、ＢＡＲＡＣ、ＢＣＮ、Ｓｏｎｄｈｅｉｍｅｒジイン、ＴＭＤＩＢＯ、Ｓ−ＤＩＢＯ、ＣＯＭＢＯ、ＰＹＲＲＯＣ、およびこれらの修飾またはアナログからなる群より選択され得る。
【００８０】
上記環状アルキン基の構造を、以下に表１に示す。当業者は、本明細書に記載される環状アルキン基のいずれかが、環状アルキン基の適当な原子または基、例えばＤＢＣＯのＮ原子またはＤＩＢＯのＯ原子を介してリガンドおよび／またはリンカーに結合し得ることを理解するであろう。
【００８１】
【表１（１）】
2021524519.tif 000004
【表１（２）】
2021524519.tif 000005
【表１（３）】
2021524519.tif 000006
【００８２】
これらの環状アルキンの種々の修飾およびアナログも考えられ、または開発され得る。
【００８３】
リガンドに結合可能なリンカー化合物は、１つ以上のリンカー基または部分を含み得る。それはまた、２つの官能基間の反応によって形成される１つ以上の基を含み得る。当業者は、化合物を調製する際に種々の異なる化学を利用することができ、したがって、種々の異なる官能基を反応させて、リガンドに結合可能なリンカー化合物によって含まれる基を形成することができることを理解する。さらに、リガンドに結合可能なリンカー化合物は、リガンドに結合可能な１つ以上の官能基を含み得る；官能基（複数可）は、例えばリガンドに応じて選択され得る。例えば、リガンドに結合可能なリンカー化合物は、スルフヒドリル、アミノ、アルケニル、アルキニル、アジジル、アルデヒド、カルボキシル、マレイミジル、スクシンイミジル、ヒドロキシルアミノ基の少なくとも１つを含み得る。リガンドに結合可能なリンカー化合物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）またはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル（スルホ−ＮＨＳ）エステルを含み得る。例えば、リガンドに結合可能なリンカー化合物は、ＮＨＳ−スルホ−ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）またはＮＨＳ−ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）を含むか、またはそれらであってよく、ＮＨＳおよびＤＢＣＯは、任意にリンカーまたはスペーサー基を介して結合され得る。本明細書において、「スクシンイミジル」は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）またはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル（スルホ−ＮＨＳ）を指すことができる。このような化合物は、リガンドの第一級アミノ基と反応し得る。種々の他のアミノ反応性官能基、例えばイミドエステルも考えられ得る。
【００８４】
本明細書に記載される１つ以上の実施形態に従ってアジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを調製する方法が開示される。この方法は、
ナノフィブリルセルロースの１つ以上のグルコシル単位をアルケニル化剤でアルケニル化して、アルケニル化されたナノフィブリルセルロースを得るステップ、および
アジド含有化合物をアルケニル化されたナノフィブリルセルロースと結合させ、それによってアジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを得るステップ
を含み得る。
【００８５】
この方法は、アルケニル化の前に、ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを提供することを含むことができる。
【００８６】
アルケニル化剤は、式Ｘ−（ＣＨ２）ｎＣＨ＝ＣＨ２で表され、式中ｎは１〜８の範囲であり、ＸはＢｒ、Ｃｌ、またはＩである構造を有してもよい。
【００８７】
一実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７または８である。一実施形態において、ｎは、１〜２の範囲、または１〜３の範囲、または１〜４の範囲、または１〜５の範囲、または１〜６の範囲、または１〜７の範囲である。
【００８８】
一実施形態では、アルケニル化剤は、臭化アリルである。臭化アリルをアルケニル化剤として用いる場合、アルケニル化された（すなわち、アリル化された）ナノフィブリルセルロースは、以下の式によって表され得る：
【化２】
2021524519.tif 000007
【００８９】
この式およびそれらを含む下の他の式において、Ｒ１およびＲ２は、グリコシル単位の炭素１および炭素４からのグリコシド結合によって一緒に結合されたナノフィブリルセルロース分子の隣り合ったグルコシル単位または鎖を表す。
【００９０】
また、アルケニル化を炭素６（Ｃ６）の水酸基、すなわち、セルロース中のＤ−グルコピラノシル残基の一級水酸基に選択的に導くことが可能であり得る。言い換えれば、１つ以上のグルコシル単位の少なくとも１つ以上がβ１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位であり、アルケニル化されているβ１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位の１つの炭素上の水酸基が、炭素６上の水酸基であろう。
【００９１】
アジド含有化合物をアルケニル化ナノフィブリルセルロースと結合させることは、１つ以上のステップで実施され得る。
【００９２】
この方法は、チオール基含有化合物をアルケニル化ナノフィブリルセルロースと反応させることを含むことができ、チオール基含有化合物は、アジド基をさらに有し、それによって、アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを得る。言い換えると、アジド含有化合物は、さらにアジド基を有するチオール基含有化合物であり得る。
【００９３】
本方法は、チオール基含有化合物をアルケニル化ナノフィブリルセルロースと反応させるステップを含み得、チオール基含有化合物は、さらにアミノ基を有し、それによりアミノ修飾ナノフィブリルセルロースを得、アミノ基と反応することが可能な官能基を有する化合物をアミノ修飾ナノフィブリルセルロースと反応させ、官能基を有する化合物はさらにアジド基を有し、それによりアジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを得る。
【００９４】
チオール基含有化合物は、システイン、システアミン、またはそれらの組み合わせもしくは混合物であり得る。臭化アリルをアルケニル化剤として、およびシステインをチオール基含有化合物として用いる場合、アミノ修飾ナノフィブリルセルロースは、以下の式で表され得る：
【化３】
2021524519.tif 000008
【００９５】
チオール基含有化合物は、ラジカル開始剤の存在下でアルケニル化ナノフィブリルセルロースと反応させることができる。ラジカル開始剤は、アルケニル化ナノフィブリルセルロースのアルケニル基（複数可）とチオール（スルフヒドリル）基との反応を触媒することができる。本明細書の文脈において、「ラジカル開始剤」とは、穏和な条件下でラジカル種を生成し、ラジカル反応を促進することができる剤を指すと理解することができる。「ラジカル開始剤」という用語は、ＵＶ（紫外線）光を指すこともできる。ＵＶ光照射は、例えば適切な光開始剤の存在下でラジカルを生成することができる。好適なラジカル開始剤としては、過硫酸アンモニウムまたは過硫酸カリウムなどの無機過酸化物、有機過酸化物、およびＵＶ光が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００９６】
臭化アリルをアルケニル化剤として、システインをチオール基含有化合物として、およびＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド（ＰＥＧ部分に４−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）単位を有するＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ−アジドリンカー）をアミノ基と反応できる官能基を有する化合物として用いる場合、アジド修飾ナノフィブリルセルロースは、次式で表され得る：
【化４】
2021524519.tif 000009
【００９７】
言い換えると、この実施形態では、置換基は、アジド修飾ナノフィブリルセルロースのβ１，４−Ｄ−グルコース単位の炭素６における炭素上の水酸基の代わりにあり、すなわち置き換える。置換基は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｌ１−Ｎ３によって表され、式中ｎは３であり、ｍは１であり、Ｌ１は−ＣＨ２−ＣＨ２（Ｒ１）−ＮＨ−Ｌ２−を表し、Ｒ１は−ＣＯＯＨであり、Ｌ２は、Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−を表し、式中ｏは４である。当該式のさらなる実施形態では、ｍは、０であってもよく、Ｒ１は、存在しなくてもよく、および／またはｏは、０、１もしくはそれ以上であってもよい。
【００９８】
その全てのステップを含む方法は、水溶液中で行うことができる。適当な水溶液は、例えば約６〜８のｐＨを有し得る水性緩衝液であり得る。
【００９９】
修飾されるナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、方法を実施するために所望のコンシステンシーに希釈され得る。続いて、アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含む、得られるナノフィブリルセルロースヒドロゲルを、さらなる使用のために所望のコンシステンシーに濃縮することができる。ヒドロゲルは、例えば、遠心分離により、または濾過により濃縮され得る。所望により、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルを、水または水溶液で希釈し、次いで濃縮することによって洗浄してもよい。
【０１００】
アジド含有化合物を、アルケニル化ナノフィブリルセルロースと直接反応させ、それによってアジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを得ることができる。そのような実施形態において、アジド含有化合物は、さらにチオール基を有していてもよい。アジド修飾ナノフィブリルセルロースを得るためのさらなる方法または経路も考えられる。
【０１０１】
リガンド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルが開示され、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースは、それに共有結合する１つ以上のリガンドを有する。１つ以上のリガンドは、タンパク質、ペプチド、グリカンまたはナノフィブリルセルロース分子の少なくとも１つを含み得る。
【０１０２】
リガンド修飾ナノフィブリルセルロースは、アジド基と環状アルキン基との反応によって形成される基を介して、それに共有結合する１つ以上のリガンドを有していてもよい。この基は、トリアゾール基、例えば１，２，３−トリアゾール基であってよい。生成したトリアゾール基の正確な構造は、環状アルキン基の構造に依存し得る。このように、１，２，３−トリアゾリルは、トリアゾール部分を含むクリック共役によって形成される基であり得る。クリック共役は、銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン付加環化反応（ＣｕＡＡＣ）のような１，５−二置換１，２，３−トリアゾールという共有結合生成物を生じるアジドとアルキンとの反応を指すものとして理解されるべきである。クリック共役は、アジドと環状アルキン基、例えばジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）との反応のような、銅を含まないクリック化学を指すこともある。このように「１，２，３−トリアゾリル」は、アジドおよびＤＢＣＯのような環状アルキン基との反応によって形成される基を指してもよく、基は、１，２，３−トリアゾール部分を含む。
【０１０３】
環状アルキン基は、この明細書に記載されたいずれの環状アルキン基でもよい。環状アルキン基は、ＤＢＣＯ、ＯＣＴ、ＭＯＦＯ、ＡＬＯ、ＤＩＦＯ、ＤＩＦＯ２、ＤＩＦＯ３、ＤＩＭＡＣ、ＤＩＢＯ、ＤＩＢＡＣ、ＢＡＲＡＣ、ＢＣＮ、Ｓｏｎｄｈｅｉｍｅｒジイン、ＴＭＤＩＢＯ、Ｓ−ＤＩＢＯ、ＣＯＭＢＯ、ＰＹＲＲＯＣ、またはそれらの修飾もしくはアナログであり得る。
【０１０４】
環状アルキン基は、ＤＢＣＯ、ＯＣＴ、ＭＯＦＯ、ＡＬＯ、ＤＩＦＯ、ＤＩＦＯ２、ＤＩＦＯ３、ＤＩＭＡＣ、ＤＩＢＯ、ＤＩＢＡＣ、ＢＡＲＡＣ、ＢＣＮ、Ｓｏｎｄｈｅｉｍｅｒジイン、ＴＭＤＩＢＯ、Ｓ−ＤＩＢＯ、ＣＯＭＢＯ、ＰＹＲＲＯＣ、およびこれらの修飾またはアナログからなる群より選択され得る。
【０１０５】
リガンド修飾ナノフィブリルセルロースは、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｌ１−Ｄで表され、式中ｎは、１〜１０の範囲であり、ｍは、０または１であり、Ｌ１は、リンカーであり、Ｄは、リンカーに共有結合したリガンドを表す置換基を有することができ、当該置換基は、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースの１つ以上のグルコシル単位の炭素に結合する。こうして置換基は、炭素に対するエーテル結合を形成する。一実施形態において、Ｄは、本明細書に記載される１つ以上の実施形態によるナノフィブリルセルロースヒドロゲルのナノフィブリルセルロースのアジド基とリガンドの環状または非環状アルキン基との反応によって形成されるリガンドおよびトリアゾール基を表す。
【０１０６】
一実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一実施形態において、ｎは、１〜２の範囲、または１〜３の範囲、または１〜４の範囲、または１〜５の範囲、または１〜６の範囲、または１〜７の範囲、または１〜８の範囲である。一実施形態では、ｎは、３〜１０の範囲にある。
【０１０７】
１つ以上のグルコシル単位の少なくとも１つ以上が、β１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位であってよく、それに結合した置換基を有するβ１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位の１つの炭素が炭素６であってよい。
【０１０８】
炭素は、いくつかの実施形態において、炭素６であってもよい。言い換えると、１つ以上のグルコシル単位の少なくとも１つ以上は、β１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位であり得、置換基が結合している１つ以上のβ１，４−Ｄ−グルコピラノシル単位の炭素は、炭素６であり得る。炭素６における置換基は、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルの酵素分解を著しく妨害しない可能性がある。
【０１０９】
一実施形態では、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースは、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ（Ｏ）ｍ−Ｌ１−Ｄによって表され、式中、ｎは、１〜１０の範囲であり、ｍは、０または１であり、Ｌ１は、存在しないかまたはリンカーであり、Ｄは、リガンドを表す置換基を有し；当該置換基は、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースの１つ以上のグルコシル単位の炭素に結合する。この実施形態は、例えば、チオール基を有するリガンド、例えば、チオール基を有するペプチドまたはタンパク質リガンドを、アルケニル化されたナノフィブリルセルロースと直接反応させることによって調製することができる。炭素は、いくつかの実施形態において、炭素６であってもよい。
【０１１０】
一実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一実施形態において、ｎは、１〜２の範囲、または１〜３の範囲、または１〜４の範囲、または１〜５の範囲、または１〜６の範囲、または１〜７の範囲、または１〜８の範囲である。一実施形態では、ｎは、３〜１０の範囲にある。
【０１１１】
一実施形態において、Ｌ１は、−ＣＨ２−ＣＨ２（Ｒ１）−ＮＨ−Ｌ２−を表し、式中、Ｒ１は存在しないかまたは−ＣＯＯＨであり、Ｌ２はリンカーである。
【０１１２】
一実施形態では、Ｌ２は、Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−を表し、式中ｏは０以上である。一実施形態において、ｏは、１以上であってもよい。一実施形態において、ｏは、０〜１００もしくは１〜１００の範囲、または０〜２０もしくは１〜２０の範囲であり得る。
【０１１３】
リガンド修飾ナノフィブリルセルロースは、少なくとも約０．０００１、少なくとも約０．００１、少なくとも約０．０１、または少なくとも約０．０５、または少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約０．３、少なくとも約０．４、少なくとも約０．５、少なくとも約０．６、少なくとも約０．７、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、または約１の置換度（ＤＳ）を有し得る。一実施形態では、ＤＳは、約０．０９である。一実施形態では、ＤＳは、約０．０６である。この文脈において、ＤＳは、リガンド（または１以上のリガンド）を含む本明細書の１以上の実施形態による置換基によるＤＳを特異的に指すことができる。
【０１１４】
１つの実施形態において、１つ以上のリガンドは、タンパク質、ペプチド、またはグリカンの少なくとも１つを含む。
【０１１５】
１つ以上のリガンドは、ナノフィブリルセルロース分子を含み得る。言い換えると、第２のナノフィブリルセルロース分子は、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースまたはリガンド修飾ナノフィブリルセルロース分子に共有結合され得る。従って、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースは架橋され得る。このような架橋したリガンド修飾ナノフィブリルセルロースは、より安定であり、かつ／または、例えば粘度もしくは剛性などの望ましい特性を有し得る。架橋したナノフィブリルセルロースは、例えば、活性医薬品成分の制御された放出のために、または３Ｄ印刷のために適し得る。
【０１１６】
タンパク質、ペプチド、グリカン、ナノフィブリルセルロース分子、またはそれらの任意の混合物もしくは組合せから選択される２つ以上のリガンドが、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースに共有結合され得る。さらに、他のリガンドは、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースに付加的に共有結合され得る。様々なタイプのリガンド、例えば、本明細書に記載される任意のリガンドが、考えられる。
【０１１７】
本明細書に記載されている１つ以上の実施形態によるリガンド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを調製するための方法が、開示される。この方法は、本明細書に記載の１つ以上の実施形態によるアジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを、環状または非環状アルキン基を有するリガンドと接触させるステップを含み得る。
【０１１８】
この方法は、アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルを、環状または非環状アルキン基を有するリガンドと接触させる前に提供するステップを含み得る。
【０１１９】
リガンドは、それ自体環状または非環状アルキン基を有し得る、例えば、環状または非環状アルキン基を有するように調製された合成リガンドを有し得る。リガンドが既に環状または非環状アルキン基を有していない場合には、一つを共有結合、すなわちそれに結合させてもよい。これは、リガンドの活性化と呼ばれ得る。したがって、本方法は、環状または非環状アルキン基を有するリンカー化合物をリガンドに結合させ、それによって環状アルキン基を有するリガンドを得、アジド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルを環状または非環状アルキン基を有するリガンドと接触させることを含み得る。１つ以上のリンカー化合物を、環状または非環状アルキン基が１つ以上のリンカーまたはリンカー基を介してリガンドに共有結合されるようにリガンドに結合させてもよい。
【０１２０】
環状または非環状アルキン基を有する１つ以上のリガンド、例えばリガンドの混合物は、アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルと接触され得る。
【０１２１】
その全てのステップを含む方法は、水溶液中で行うことができる。適当な水溶液は、例えば、約６〜８のｐＨを有し得る水性緩衝液であり得る。
【０１２２】
調製されるナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、本方法を実施するための所望のコンシステンシーに希釈され得る。その後、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースを含む、得られるナノフィブリルセルロースヒドロゲルを、さらなる使用のために所望のコンシステンシーに濃縮することができる。ヒドロゲルは、例えば、遠心分離により、または濾過により濃縮され得る。所望により、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルを、水または水溶液で希釈し、次いで濃縮することによって洗浄してもよい。
【０１２３】
アジド基の数もしくは含有量、またはＤＳは、リガンド（複数可）の量に関して過剰であってもよく、さもなければ、種々の数または量のリガンドが、アジド修飾ナノフィブリルセルロースに結合していてもよいようになっている。これによって、例えば、リガンドの濃度系列、すなわち、リガンドの種々の数または量を有するリガンド修飾ナノフィブリルセルロースを含むＮＦＣヒドロゲルを調製することが可能になり得る。
【０１２４】
細胞、組織、オルガノイドまたは器官の維持、輸送、単離、培養、増殖、継代、分化または移植のための、本明細書に記載されている１つ以上の実施形態によるアジド修飾もしくはリガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルの使用、または本明細書に記載されている１つ以上の実施形態による固体支持体の使用が、開示されている。
【０１２５】
３Ｄ印刷のための本明細書に記載されている１つ以上の実施形態によるアジド修飾またはリガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルの使用が、開示される。
【０１２６】
細胞、組織、オルガノイドまたは器官の接着、維持、輸送、単離、培養、増殖、継代、分化または移植を改善するため、本明細書に記載されている１つ以上の実施形態によるアジド修飾もしくはリガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルの使用、または本明細書に記載されている１つ以上の実施形態による固体支持体の使用も、開示されている。
【０１２７】
細胞、組織、オルガノイドまたは器官の維持、輸送、単離、培養、増殖、継代、分化または移植のための方法が開示される。この方法は、細胞、組織、オルガノイドまたは器官を、本明細書に記載されている１つ以上の実施形態によるアジド修飾もしくはリガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルと、または本明細書に記載されている１つ以上の実施形態による固体支持体と接触させることを含むことができる。
【０１２８】
細胞または組織の維持、輸送、単離、培養、増殖、継代、分化または移植のための使用または方法の文脈において、細胞は、例えばｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞など、本明細書に記載されている任意の細胞であってもよい。リガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲル中のリガンドの量は、細胞または組織が維持、輸送、単離、培養、増殖、継代、分化または移植される成長培地の容量によって、少なくとも約０．００１μｇ／ｍｌであってもよい。成長培地は、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルおよび任意に第２の培地、例えば栄養素を含有する培地を含み得る。適当な第２の培地は、例えば、細胞および／または組織培養のための様々な液体培地を含み得る。例えば、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲル中のリガンドの量は、少なくとも約０．０１μｇ／ｍｌ、または少なくとも約０．１μｇ／ｍｌであってよい。リガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲル中のリガンドの量は、約５００μｇ／ｍｌまで、または約１ｍｇ／ｍｌまで、または約１０ｍｇ／ｍｌまでであり得る。例えば、リガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲル中のリガンドの十分に適切な量は、成長培地の容量によって１〜５００μｇ／ｍｌ、または５〜１００μｇ／ｍｌであってもよい。
【０１２９】
使用または方法の実施形態において、アジド修飾またはリガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルまたは固体支持体は、３Ｄ培養マトリックスとして使用される。
【０１３０】
使用または方法の実施形態において、アジド修飾またはリガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルまたは固体支持体は、器官またはオルガノイドの成長のために使用される。例えば、３Ｄマイクロ流体細胞培養チップである固体支持体は、器官またはオルガノイドの成長のために使用され得る。
【０１３１】
例えば、腸スフェロイドの生存、拡大、およびＨＩＯへの上皮分化を支持することによる、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）スフェロイドからのヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成には、３Ｄ培養マトリックス中のＲＧＤ接着ペプチド（ＧＲＧＤＳＰＣ、配列番号１）の存在が必要であろう。
【０１３２】
椎間板（ＩＶＤ）の髄核（ＮＰ）領域における細胞のラミニンとの相互作用は、細胞付着および生合成を促進し得る。ラミニンタイプ１１１（ＬＭ１１１）の３Ｄ細胞培養マトリックスへの取り込みは、ＮＰ細胞の生存および表現型の促進に有益であり得る。
【０１３３】
肝細胞ニッチの２つの重要な要素は、ラミニン５２１およびラミニン１１１である。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の組織化、機能、および肝細胞への分化は、ラミニン５２１およびラミニン１１１の存在下で有意に改善し得る。
【実施例】
【０１３４】
ここでは、様々な実施形態について詳細に言及し、その例を、添付の図面に図示する。
【０１３５】
以下の記述は、当業者が開示に基づいて実施形態を利用することができる程度に詳細にいくつかの実施形態を開示する。ステップまたは特徴の多くが本明細書に基づいて当業者にとって明らかであろうことから、実施形態の全てのステップまたは特徴が詳細に考察されているわけではない。
【０１３６】
実施例１−アジド修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルの生成
以下の実施例において、用語「ＧｒｏｗＤｅｘ」または「ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）」は、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルを指す。これらの実施例で使用されるＧｒｏｗＤｅｘは、天然のナノフィブリルセルロースヒドロゲルである。
【０１３７】
図１は、アジド修飾およびリガンド修飾ナノフィブリルセルロースの生成を模式的に示す。
【化５】
2021524519.tif 000010
スキーム１
【０１３８】
修飾反応
最初の生成物であるアジド修飾ＧｒｏｗＤｅｘへの合成経路を、スキーム１に示す。０．７５％（ｗ／ｖ）のＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）ヒドロゲルを０．６２％（ｖ／ｖ）の臭化アリルと、０．２５Ｍ水酸化ナトリウム中で６０℃で３時間反応させることによって、アリル化を行った。酢酸で中和し、３０００ｒｃｆで１分間遠心して脱イオン水で洗浄し、上清を除去することにより、反応を停止した。洗浄を、５回繰り返した。次に、０．７５％（ｗ／ｖ）のＬ−システインを、２０ｍＭ過硫酸アンモニウム溶液中の１％（ｗ／ｖ）のＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）ヒドロゲルに添加した。５０℃で３時間後、上記のように脱イオン水で５回洗浄することにより反応を停止させた。最後に、０．７５％（ｗ／ｖ）のＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド試薬を、３０ｍＭのＮａ２ＣＯ３緩衝液ｐＨ９．３溶液中の１％（ｗ／ｖ）のＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）ヒドロゲルに加えた。室温で３時間後、上記のように脱イオン水で５回洗浄することによって反応を停止させた。１．５％までの濃縮は、３０００ｒｃｆでより長時間遠心分離し、上清を除去して行った。
【０１３９】
高圧蒸気殺菌法
アジド修飾材料は、外観においていかなる視認可能な変化もなしに約１．５％溶液として高圧蒸気殺菌した。
【０１４０】
特性評価
スキーム１の各反応ステップの後、ヒドロゲルのアリコートを、セルラーゼ（ＵＰＭ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で消化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、予想される反応生成物：６−Ｏ−アリル、チオール−エンおよびアジド−ＰＥＧ４−アミド化セロビオースおよびセロトリオースを同定した（図２）。図２は、アジド修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を示す。セルラーゼ消化後に反応生成物を分析した。予想された修飾二糖および三糖反応生成物を観察した。
【０１４１】
アジド官能基が高圧蒸気殺菌法を生き延びたことを検証するために、それらの反応性を、蛍光標識を結合させて検証した（図３）。図３は、修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）が高圧蒸気殺菌法後に官能性であることを示している。アルキン官能化蛍光標識（ＤＢＣＯ−Ａｌｅｘａ）を、高圧蒸気殺菌したアジド修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）と反応させ、その後、遊離の未反応標識を洗浄除去した。標識は、遠心中にマトリックスと共に沈殿し、それが共有結合していることを示した。
【０１４２】
アリル化生成物を、アリル基の定量を可能にするために、セルラーゼ消化後の１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した（図４）。図４は、アリル化ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）の１Ｈ−ＮＭＲ分光法を示す。１ＭのＮａＯＨ中での反応で生成されたセルラーゼ消化アリル化Ｇｒｏｗｄｅｘ（登録商標）；データは、０．２５ＭのＮａＯＨ溶液について示されていない（最終最適化反応条件）。積分の定量は、試料中のグルコース単位とアリル基との間の１１：１の関係を示した。図４の参照符号１、２、３、４、５および６は、それらに対応する特定の水素原子およびＮＭＲスペクトルのピークを示している。
【０１４３】
実施例２−タンパク質修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルの生成
【化６】
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スキーム２。タンパク質およびグリカン修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）への合成経路。アクセス可能なアミン基を含む任意の水溶性分子は、ＮＨＳ−ＤＢＣＯ試薬で活性化し、クリック化学（銅を含まないアジド−アルキン環化付加反応）によりアジド修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）と結合させることができる。反応は、本質的に定量的である。
【０１４４】
リガンド修飾生成物、タンパク質およびグリカン修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）への合成経路を、スキーム２に示す。本プロジェクトのタンパク質リガンドは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）表面に結合し、標準的な２Ｄ細胞培養（Ｍｉｋｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２２：７０７−１６）において、成長表面への接着および効率的な培養を促進する植物Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ（ＥＣＡ）からのレクチンであった。ＥＣＡ（Ｓｉｇｍａ）を、ＥＣＡタンパク質モノマーに４：１ｍｏｌ：ｍｏｌのＮＨＳ−ＤＢＣＯ試薬を加え、２時間ＲＴで反応させることにより、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、アルキン修飾した。ＤＢＣＯのＥＣＡへの共有結合を、濾過による遊離標識の除去後３０９ｎｍでのＤＢＣＯ由来吸光度シグナルを示す分光光度分析により検証した（データは示さず）。ＤＢＣＯ−ＥＣＡ生成物は滅菌ろ過され、１００μｇ／ｍｌを０．５％アジド修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）と合わせた。ＲＴにおける２時間の反応後、ＥＣＡ修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）を洗浄し、上記と同様に遠心分離によりｉＰＳ培養培地に移した。ＥＣＡのセルロースマトリックスへの共有結合は、ＥＣＡ修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）のセルラーゼ消化、続いてタンパク質の単離およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって検証した。セルロース断片−リンカー付加に対応する予想される追加の質量を有するＥＣＡタンパク質が、観察された（データは示さず）。
【０１４５】
実施例３−グリカン修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲルの生成
本プロジェクトにおけるグリカンリガンドは、四糖類ＬＮＴ（ラクト−Ｎ−テトラオース）およびＬＮｎＴ（ラクト−Ｎ−ネオテトラオース）であり、それは、ＰＳＣ表面複合糖質の成分であり、ＥＣＡと同様に、成長表面および２Ｄ細胞培養への幹細胞接着を促進する（Ｍｉｋｋｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．、未発表観察）。ＤＢＣＯ−ＬＮＴおよびＤＢＣＯ−ＬＮｎＴ結合体をＧｌｙｋｏｓ  Ｆｉｎｌａｎｄ  Ｏｙで合成し、逆相ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析および１Ｈ−ＮＭＲ分光法により特性評価した（データは示していない）。ＤＢＣＯ−グリカン生成物を滅菌濾過し、上記のように０．５％アジド修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）と合わせた。
【０１４６】
実施例４−修飾ナノフィブリルセルロースを含むナノフィブリルセルロースヒドロゲル中の細胞培養
細胞培養
ｉＰＳ細胞を、０．５％のヒドロゲル中に、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２二塩酸塩、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補足したＮｕｔｒｉｓｔｅｍ培地（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）中の１．０ｘ１０５細胞／１００μｌヒドロゲルの密度に播種した。細胞を加えたヒドロゲルを、９６ウェルプレートに分割し、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を加えた１００μｌのＮｕｔｒｉｓｔｅｍ培地を、上に加えた。細胞は、毎日の培地更新で７〜１４日間培養した。
【０１４７】
細胞計数アッセイ
細胞を、ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）および修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）ヒドロゲル中で８日間培養し、その後、ヒドロゲルを＋３７℃で一晩６００μｇセルラーゼ／ｍｇセルロースで分解した。細胞を、９６ウェルプレートから試験管に採取し、ＰＢＳで１回洗浄した。スフェロイドを、＋３７℃で２分間０．５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、ピペットで５〜１０回粉末にすることにより解離した。細胞を培地で１回洗浄し、計数した。各ヒドロゲル条件からの３つの細胞試料を分析した。
【０１４８】
ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生存率試薬による細胞増殖アッセイ
細胞生存率は、０時点（ヒドロゲル中で細胞を播種した直後）および７時点（培養７日後）の３回の試料から、レサズリンベースのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）試薬で測定した。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１：１００希釈で細胞培養プレートに直接添加し、混合した。細胞を、＋３７℃で３．５時間インキュベートし、吸光度を５７０および６００ｎｍで測定した。結果は、製造者の指示に従って計算した。簡単に、Ａ６００をＡ５７０から差し引き、培地＋ヒドロゲルのみの対照ウェルを平均した。対照の平均を全試料ェルから差し引いた後、３回の試料の平均値を算出した。
【０１４９】
［２−１４Ｃ］チミジンによる細胞増殖アッセイ
細胞増殖は、［２−１４Ｃ］チミジンの細胞ＤＮＡおよびＲＮＡへの取り込みを測定することにより分析した。ｉＰＳ細胞を３Ｄヒドロゲル中で５日間培養し、その後、細胞を１．０μＣｉ／ｍＬの［２−１４Ｃ］チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の存在下で６、２４および４８時間培養した。次に、細胞を、低温リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して、遊離の［２−１４Ｃ］チミジンを除去した。細胞を可溶化するために、Ｓｏｌｖａｂｌｅを試料に加え、＋６０℃で一晩インキュベートした。計数に先立ち、試料にシンチレーション流体を添加し、取り込まれた［２−１４Ｃ］チミジンの量を液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で測定した。
【０１５０】
免疫蛍光染色
ｉＰＳ細胞を、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ培地でＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）および修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）ヒドロゲル中で１０日間培養した。ヒドロゲルの上の培養培地を除去し（ａ１００μｌ）、細胞を、１００μｌの８％パラホルムアルデヒドを添加し、室温（ＲＴ）で９０分間インキュベートすることによって固定した。その後、細胞を２回洗浄し、ヒドロゲルの上にＰＢＳを加え、５分間インキュベートし、２００ｘｇで１分間遠心した。細胞の透過を、ＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で＋４℃で一晩（ファロイジン試料）またはＲＴで２時間（ＴＲＡ−１−６０およびＳＳＥＡ−４−試料）行った。
【０１５１】
細胞を、２０μｇ／ｍｌで抗ＴＲＡ−１−６０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、およびで１５μｇ／ｍｌ濃度で抗ＳＳＥＡ−４（Ａｂｃａｍ）で、＋４℃一晩染色し、前と同様にＰＢＳで２回洗浄した。二次抗体（ＤｙＬｉｇｈｔ４８８抗マウスＩｇＭまたはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗マウスＩｇＧ）を、最終濃度２μｇ／ｍｌに加え、ＲＴで６０分間インキュベートした。ＤＡＰＩ核染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、二次抗体と同時に、最終濃度２．５μｇ／ｍｌに加えた。
【０１５２】
細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ファロイジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１：４００希釈で６０分間ＲＴで染色した。ＤＡＰＩ核染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ファロイジンと同時に加え、最終濃度２．５μｇ／ｍｌとした。細胞を、前と同様にＰＢＳで２回洗浄し、最後に共焦点画像形成のために黒色９６ウェルプレートに移し、蛍光顕微鏡画像形成のために顕微鏡スライドに移した。
【０１５３】
共焦点顕微鏡において、スフェロイドを、回転２０ｘ／０．４  ＬＤ  Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ  Ｐｈ２  Ｃｏｒｒ  ＷＤ＝７．９  Ｍ２７対物、紫色（固体状態４０５ｎｍ／１００ｍＷ）および青色（固体状態４８８ｎｍ／５０ｍＷ）レーザーおよびＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１倒立顕微鏡を装備した３Ｉ  Ｍａｒｉａｎａｓ（３Ｉ  ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）蛍光顕微鏡で撮影した。
【０１５４】
あるいは、スフェロイドを観察し、適切なフィルターセットを用いてＰｒｏｇＲｅｓ  Ｃ５  ＣＣＤカメラ（ＪＥＮＯＰＴＩＫ）および１０ｘまたは２０ｘ対物（Ｎ−ＡＣＨＲＯＰＬＡＮ  １０ｘ／０．２５  Ｐｈ１、Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ  ２０ｘ／０．５０  Ｐｈ２）を装備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ  Ａ１で撮影した。
【０１５５】
成長特性
ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）および修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）ヒドロゲル中で９日間の培養後、ｉＰＳ細胞は、小さいスフェロイドを形成した（図５）。図５は、培養の９日後の種々の３Ｄヒドロゲル中のｉＰＳ細胞を図示したものである。Ａ）ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）、Ｂ）ＥＣＡ−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）、Ｃ）ＬＮＴ−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）およびＤ）ＬＮｎＴ−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）。スフェロイドサイズは、試料間で有意差はなかった。３Ｄヒドロゲル培養物における細胞増殖を、３種類の異なる方法で測定した。最初に、培養の８日後の細胞の計数、ヒドロゲルの分解およびスフェロイドの解離により、粗細胞数アッセイを行った。細胞数を比較したところ、ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）と修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）ヒドロゲルとの間に差は認められなかった（図６）。図６は、種々の３ＤヒドロゲルにおけるｉＰＳ細胞の細胞計数を示す。８日後の３Ｄヒドロゲル培養物における細胞の総数を、３回の試料から平均した。
【０１５６】
計数は、死細胞も含む総細胞数である（細胞生存率は測定されなかった）。
【０１５７】
また、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）細胞生存率アッセイを用いて、細胞の生存率および増殖を測定した。生存率は、細胞をヒドロゲル中に播種した後に直接測定し、培養の７日後に再度測定した。０日目および７日目の結果を比較したところ、培養中に生存率が低下した（図７）。図７は、時点０（０日）および７（７日）における種々の３Ｄヒドロゲル中のｉＰＳ細胞の細胞生存率を示す。ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）と修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）ヒドロゲルとの間の生存率の差は観察されなかった。［２−１４Ｃ］チミジンの細胞核酸への組み込みを用いて、ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）および修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）ヒドロゲルにおけるｉＰＳ細胞の増殖速度を比較した。５日間の培養後、細胞を、［２−１４Ｃ］チミジンと共に６、２４および４８時間インキュベートし、その後、細胞核酸中の放射能を、シンチレーションカウンターで測定した。修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）ヒドロゲル試料中で成長したｉＰＳ細胞は、ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）と比較して、いずれの時点においてもより多量の［２−１４Ｃ］チミジンを組み込んでおらず（図８）、これは、他の増殖アッセイからの結果と適合する。図８は、細胞増殖アッセイの結果を示す。ｉＰＳ細胞増殖を、［１４Ｃ］チミジン取込でアッセイした。修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）ヒドロゲル中の細胞増殖は、元のＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）より高くなかった。各時点でｎ＝２。
【０１５８】
幹細胞の特徴−抗ＴＲＡ−１−６０染色
一部の小さいスフェロイドは、全体的にＴｒａ−１−６０染色を示したが、大部分、染色は、スフェロイド内の細胞のサブセットに限局していた（図９）。図９は、修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長したスフェロイドにおける抗Ｔｒａ−１−６０染色を示す。Ａ）分散されたＴｒａ−１−６０陽性細胞（緑色）は上方スフェロイド中に見られ、これに対してＥＣＡ−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長した下方スフェロイド（スフェロイド直径約１００μｍ）にはＴｒａ−１−６０陽性細胞は見られないか、または非常に低いレベルで見られる。Ｂ）スフェロイドの共焦点画像は、多くのＴｒａ−１−６０陽性細胞（ＬＮｎＴ−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）、スフェロイド長さ約７０μｍ）を示す。青色ＤＡＰＩ染色は、核を示す。元の倍率２０倍。
【０１５９】
無作為のスフェロイド（１０倍の倍率で）およびそれらのＴｒａ−１−６０染色を計数することにより、約５９％、５２％、６４％、および６４％の修飾していないＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）、ＥＣＡ、ＬＮＴおよびＬＮｎＴ修飾ゲルは、それぞれ、Ｔｒａ−１−６０染色を示した（２０〜３０の無作為に選択されたスフェロイドの）。典型的に、最も大きいスフェロイドは、Ｔｒａ−１−６０陽性細胞を示さず、おそらく分化の開始を示した。
【０１６０】
幹細胞の特徴−抗ＳＳＥＡ−４染色
一般に、ＳＳＥＡ−４染色は、ほとんどが小型のスフェロイドに限局しており、通常、スフェロイドの全細胞またはほぼ全細胞に染色が出現していた（図１０）。図１０は、ＥＣＡ−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長したスフェロイドにおける抗ＳＳＥＡ−４染色を示す。Ａ）下方スフェロイドは多くのＳＳＥＡ−４陽性細胞を示し、一方上部スフェロイドではＳＳＥＡ−４陽性細胞は見られないかまたは非常に低いレベルで見られた。Ｂ）核は、青色に染色される（ＤＡＰＩ）。元の倍率２０倍、スフェロイド直径約８０および５０μｍ。
【０１６１】
いくつかのスフェロイドでは、細胞のサブセットが、ＳＳＥＡ−４染色を示した。無作為スフェロイド（１０ｘ倍率で）およびそのＳＳＥＡ−４染色を計数することにより、無処理ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）、ＥＣＡ、ＬＮＴ、ＬＮＴ修飾ゲルの約３０％、４５％、７０％、および５０％は、それぞれＳＳＥＡ−４染色（２０〜３０の無作為に選択されたスフェロイドのうち）を示した。一般に、抗ＳＳＥＡ−４染色の強度は、抗Ｔｒａ−１−６０染色のそれと比較して弱かった。
【０１６２】
一般的な特徴
ファロイジン−Ａｌｅｘａ４８８染色を用いて、全体的な細胞形態を描いた（ファロイジンはアクチンに結合する）。未修飾または修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で培養したスフェロイド間に肉眼的変化は検出されなかった。スフェロイドの大部分は、小〜中程度の範囲であったが、すべてのゲルも、「大」サイズのスフェロイドを含み、その数はほぼ同じであった（９６ウェル中で計数した場合、それぞれ未修飾、ＥＣＡ、ＬＮＴおよびＬＮｎＴ−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中の２０、９、１６および１０の大スフェロイド）。
【０１６３】
図１１〜１４は、スフェロイドのＡｌｅｘａ４８８−ファロイジン染色を示している。図１１は、共焦点画像であるＥＣＡ−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長した「大きい」スフェロイド中のＡｌｅｘａ４８８−ファロイジン染色を示す。Ａ）スフェロイドの複合画像、緑色はＡ４８８−ファロイジンを示し、青色は核を示す。Ｂ）Ａ４８８−ファロイジン染色を示す緑色チャネル。Ｃ）ＤＡＰＩ染色を示す青色チャネル。スフェロイドの長さは、約２２０μｍである（元の倍率２０倍）。図１２は、共焦点画像であるグリカン１−ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長したスフェロイドにおけるＡｌｅｘａ４８８−ファロイジン染色を例示する。Ａ）スフェロイドの複合画像、緑色はＡ４８８−ファロイジンを示し、青色は核を示す。Ｂ）Ａ４８８−ファロイジン染色を示す緑色チャネル。Ｃ）ＤＡＰＩ染色を示す青色チャネル。スフェロイドの外側に単一のＤＡＰＩ陽性断片が見られるが、これらはＡ４８８−ファロイジン染色を示さない。スフェロイドの直径は、約７０μｍ（元の倍率２０倍）。図１３は、修飾していないＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長したスフェロイド中のＡｌｅｘａ４８８−ファロイジン染色を示す。Ａ）スフェロイドの複合画像、緑色はＡ４８８−ファロイジンを示し、青色は核を示す。Ｂ）Ａ４８８−ファロイジン染色を示す緑色チャネル。Ｃ）ＤＡＰＩ染色を示す青色チャネル。単一のＤＡＰＩ陽性断片または断片クラスターが、スフェロイドの外側に見られ、これらはＡ４８８−ファロイジン染色を示さない。元の倍率２０倍。図１４は、修飾していないＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）中で成長したスフェロイド中のＡｌｅｘａ４８８−ファロイジン染色を示す。Ａ）スフェロイドの複合画像、緑色はＡ４８８−ファロイジンを示し、青色は核を示す。Ｂ）Ａ４８８−ファロイジン染色を示す緑色チャネル。Ｃ）ＤＡＰＩ染色を示す青色チャネル。ＤＡＰＩ陽性断片クラスターが、スフェロイド中に見られる。元の倍率２０倍。
【０１６４】
Ｔｒａ−１−６０、ＳＳＥＡ−４またはファロイジン染色を示す全てのゲル全体に多くの単一細胞が出現した。しかし、ＤＡＰＩ染色構造の大部分は、死細胞またはアポトーシスを起こしている細胞の断片化された核である可能性が最も高かった（ＤＡＰＩ陽性染色では証明されたが、Ａ４８８−ファロイジン染色では証明されていないように）。
【０１６５】
スフェロイドの中には、正常な細胞プロセス、またはスフェロイドには最適でない成長条件（アポトーシス）のいずれかの結果、断片化された核（周囲のファロイジン染色を伴わない）を含むものもあった。断片化された核は、すべてのゲルのスフェロイドで見られ、スフェロイド内またはスフェロイド外の断片化核の割合を定量するための努力はとられなかった。細胞アッセイにおいて、単一細胞をまた計数する。
【０１６６】
実施例４−ナノフィブリルセルロースヒドロゲルのレオロジー測定
３つの試料を、粘度測定分析のために調製した：
１．水中の０．５％ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）、２ｍｌ
２．水中の０．５％アジド修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）、２ｍｌ
３．水中の０．５％ＥＣＡ修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）、２ｍｌ
【０１６７】
各試料中のＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）濃度を、グルコースモノマー濃度と相関する比色レゾルシノールアッセイにより分析した。０．５％（ｗ／ｖ）のＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）調製物と比較することにより、すべての試料を０．５％（ｗ／ｖ）濃度に希釈した。
【０１６８】
修飾の成功を検証するために、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルの形態での試料のレオロジー測定を、２０ｍｍプレート幾何学を装備した応力制御回転レオメーター（ＡＲＧ２、ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）で行った。非修飾および修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルの応力掃引測定を、０．５ｗｔ％で実施して、ゲル強度が修飾により変化しないことを検証した。応力掃引は、０．０１〜１００Ｐａのせん断応力範囲で、周波数０．１Ｈｚ、２２℃で測定した。
【０１６９】
図１５は、応力掃引測定による未修飾試料（実線）および修飾試料（点線）の０．５％ナノセルロース分散体の粘弾性特性を図示したものである。Ｇ’（貯蔵弾性率、△）およびＧ’（損失弾性率、□）の応力依存性を、提示する。
【０１７０】
試料１．および２．（ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）およびアジド修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標））は、粘度が同レベルであり、アジド修飾が粘度に影響を及ぼさなかったことを実証した。試料３．（ＥＣＡ修飾ＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標））は、粘度が若干低かったが、ゲルの形態であった。
【０１７１】
実施例５−リガンド修飾ナノフィブリルセルロースヒドロゲルを調製するためのキット
リガンド結合キットの内容物：
−  ＤＢＣＯ：０．５ｍｇのＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルを試験管の底部まで乾燥
−  ＰＢＳ：滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍｌ
−  アミコン：１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心フィルター
−  ナノフィブリルセルロース−アジド：２．５ｍｌアジド修飾ナノフィブリルセルロースマトリックス、水中１．５％滅菌ゲル
【０１７２】
キットの使用のための指示：
１．タンパク質／リガンドの計算された量を緩衝液に溶解する。
２．リガンド溶液にＤＢＣＯ溶液の計算された量を加え、混合する。
３．室温でインキュベートする。
４．ＤＢＣＯ−リガンド溶液を遠心フィルター管に移して、遠心および緩衝液の添加を繰り返すことにより、過剰の未反応ＤＢＣＯを除去する。
５．ナノフィブリルセルロース−アジドマトリックスにＤＢＣＯ−リガンド試薬を加え、十分に混合して、リガンドをマトリックス中に均等に分布させる。
６．室温でインキュベートする。
７．リガンド修飾ナノフィブリルセルロース−アジドマトリックスを適切な培養培地に変更する。
【０１７３】
技術の進歩に伴い、基本的な考え方が様々な方法で実施され得ることは、当業者に明らかである。したがって、実施形態は、上述の実施例に限定されず、代わりに、それらは、特許請求の範囲内で変化し得る。
【０１７４】
上述の実施形態は、互いに任意の組み合わせで使用され得る。実施形態のいくつかを、一緒に組み合わせて、さらなる実施形態を形成することができる。本明細書に開示されている方法、生成物、系、または使用は、先に記載されている実施形態の少なくとも１つを含むことができる。上述の利益および利点は、１つの実施形態に関するものであり得るか、またはいくつかの実施形態に関し得ることが理解されるであろう。実施形態は、述べられた問題のいずれかもしくは全てを解決するもの、または述べられた利益および利点のいずれかもしくは全てを有するものに限定されるものではない。「１つの」項目への言及は、それらの項目の一つ以上を指すことがさらに理解されるであろう。「含む」という用語は、本明細書において、１つ以上の追加の特徴または作用の存在を除外することなく、その後に続く特徴（複数可）または作用（複数可）を含むことを意味するために使用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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