(57)【要約】ＣＤ６３に対する抗体、それらの部分、及び、融合タンパク質を提供する。それらをコードする核酸配列も提供する。例えば、治療を要する患者の治療のために、それらを含む組成物、及び、それらを使用する方法も提供する。
2021524231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントであって、前記抗体、または、その抗原結合フラグメントは、表に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含み、または、ヒトＣＤ６３に対する結合について、表１に示したＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むリファレンス抗体と競合する、前記抗体、または、その抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記リファレンス抗体が、配列番号２／１０、配列番号１８／２６、配列番号３４／４２、配列番号５０／５８、配列番号６６／７４、配列番号８２／９０、配列番号９８／１０６、配列番号１１４／１２２、配列番号１３０／１３８、配列番号１４６／１５４、配列番号１６２／１７０、配列番号１７８／１８６、配列番号１９４／２０２、配列番号２１０／２１８、配列番号２２６／２３４、配列番号２４２／２５０、配列番号２５８／２６６、配列番号２７４／２８２、配列番号２９０／２８２、配列番号２９８／２８２、配列番号３０６／２８２、配列番号３１４／２８２、配列番号３２２／２８２、及び、配列番号３３０／２８２に記載したものからなる群から選択するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、請求項１に記載の抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体、または、その抗原結合フラグメントが、表１に示したＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含むリファレンス抗体と同じヒトＣＤ６３でのエピトープに対して結合する、請求項１または請求項２に記載の抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体、または、その抗原結合フラグメントが、配列番号２／１０、配列番号１８／２６、配列番号３４／４２、配列番号５０／５８、配列番号６６／７４、配列番号８２／９０、配列番号９８／１０６、配列番号１１４／１２２、配列番号１３０／１３８、配列番号１４６／１５４、配列番号１６２／１７０、配列番号１７８／１８６、配列番号１９４／２０２、配列番号２１０／２１８、配列番号２２６／２３４、配列番号２４２／２５０、配列番号２５８／２６６、配列番号２７４／２８２、配列番号２９０／２８２、配列番号２９８／２８２、配列番号３０６／２８２、配列番号３１４／２８２、配列番号３２２／２８２、及び、配列番号３３０／２８２からなる群から選択するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含むリファレンス抗体と同じヒトＣＤ６３でのエピトープに対して結合する、請求項３に記載の抗体、または、その抗原結合フラグメント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離した抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントと、ヒトＣＤ６３に対する結合について競合する第１の抗原結合ドメインと、標的抗原に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
前記標的抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
前記第１の抗原結合ドメインが、ＣＤ６３を発現するが、標的抗原を発現しないヒト細胞に結合せず、例えば、ＣＤ６３及び標的抗原の両方を発現するヒト細胞だけに結合する、請求項５または請求項６に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
前記第１の抗原結合ドメイン、及び、前記第２の抗原結合ドメインのそれぞれが、完全にヒトである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
前記抗原結合分子が、細胞で発現するヒトＣＤ６３、及び、ヒト標的抗原の両方に対して結合し、かつ、その細胞でのヒト標的抗原のＣＤ６３内在化、及び／または、分解を誘導する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
前記抗体が、ヒトＣＤ６３を発現するが、ヒト標的抗原を発現しない細胞では内在化されない、請求項５〜９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
前記抗体が、完全にヒトである、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＣＤ６３だけを発現する細胞には結合しないが、ヒトＣＤ６３と前記標的抗原の両方を発現する細胞に対して結合する前記抗体の低い結合親和性で、ヒトＣＤ６３に結合する、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメント、及び、酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項１４】
前記酵素ドメインが、ＧＡＡ、または、その生物学的に活性な部分を含む、請求項１３に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項１５】
配列番号３６４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３または請求項１４に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメント、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、または、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質、をコードする配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド配列が、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質をコードするＡＡＶベクターである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３６５、及び、配列番号３６６に記載の配列をさらに含む、請求項１６または請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド配列が、肝臓特異的エンハンサー、及び／または、肝臓特異的プロモーターをさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記肝臓特異的エンハンサーが、配列番号３６７に記載の配列を含み、及び／または、前記肝臓特異的プロモーターが、配列番号３６８に記載の配列を含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメント、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、請求項１３〜１５に記載のいずれか１項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質、または、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、及び、医薬として許容する担体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメント、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合分子、請求項１３〜１５に記載のいずれか１項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質、または、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬での使用のための化合物。
【請求項２３】
ＣＤ６３関連障害の治療での使用のための請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
前記ＣＤ６３関連障害を、肥満細胞（ＭＣ−）依存性疾患、関節リウマチ、ＩｇＥ依存性アレルギー反応、及び、Ｆｃ−ＥＲ１媒介性アレルギー反応、喘息、がん、及び／または、転移からなる群から選択する、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
エクソソームの同定、及び／または、単離での使用のための請求項２２に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、一般的に、ヒトＣＤ６３に結合するヒト抗体、及び、ヒト抗体の抗原結合フラグメント、及び、例えば、治療を要する患者の障害を治療する方法でのそれらの使用方法に関する。また、本出願は、抗ＣＤ６３抗体の少なくとも抗原結合フラグメントを含む抗原結合分子に関するものであり、ＣＤ６３に対する抗原結合分子の複合体化は、抗原結合分子／ＣＤ６３複合体の内在化を媒介する。さらに、本出願は、抗ＣＤ６３抗体（または、抗ＣＤ６３抗体の抗原結合フラグメントを含む抗原結合分子）、及び、治療薬（例えば、補充酵素、細胞傷害性薬など）を含むコンジュケートに関するものであり、コンジュゲートは、疾患の治療に役立ち得る。
【背景技術】
【０００２】
ヒト抗原ＣＤ６３、別名、リソソーム関連糖タンパク質３（ＬＡＭＰ３）は、テトラスパニンスーパーファミリーのメンバーである。その細胞発現は遍在しており、主に、細胞内エンドソーム、または、リソソームコンパートメント内に認められるが、細胞表面に一部の発現が認められる。ＣＤ６３とは、標的を何らかの方法で、例えば、ペイロードにコンジュケートした抗原結合タンパク質、または、標的とＣＤ６３に結合する二重特異性抗原結合タンパク質を介して、ＣＤ６３に対して物理的に連結すると、エンドソーム／リソソームコンパートメントに向けた標的の内在化及び輸送を媒介することができる内在化タンパク質のことである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
ＣＤ６３に対して結合し、かつ、その内在化を招くことができる二重特異性結合タンパク質での使用のための新規の抗ヒトＣＤ６３抗体、及び、その一価抗原結合フラグメントが、当該技術分野で待望されている。
【０００４】
本発明は、ヒトＣＤ６３に結合する抗体、及び、その抗原結合フラグメントを提供する。本発明の本態様での抗体は、とりわけ、標的タンパク質、酵素（例えば、ＧＡＡ、または、ＧＬＡ）、薬物コンジュゲートなどの内在化、及び／または、リソソーム輸送を特異的に誘導する上で有用である。したがって、本発明の本態様は、二重特異性抗体、ヒトＣＤ６３に結合するその抗原結合フラグメント、抗体−タンパク質融合構築物（例えば、図１を参照されたい）、及び、抗体薬物コンジュケートも提供する。
【０００５】
本発明の例示的な抗ＣＤ６３抗体を、表１に記載している。表１は、例示的な抗ＣＤ６３抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、ならびに、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び、ＨＣＤＲ３）、及び、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び、ＬＣＤＲ３）のアミノ酸、及び、核酸配列識別子を示す。
【０００６】
本発明は、表１に示したＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む抗体、または、その抗原結合フラグメントを提供する。
【０００７】
本発明は、表１に示したＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む抗体、または、その抗原結合フラグメントも提供する。
【０００８】
本発明は、表１に示したＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかとペアにした、表１に示したＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む抗体、または、その抗原結合フラグメントも提供する。特定の実施形態では、本発明は、表１に示した例示的な抗ＣＤ６３抗体のいずれかに含まれているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む抗体、または、その抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアは、配列番号２／１０、配列番号１８／２６、配列番号３４／４２、配列番号５０／５８、配列番号６６／７４、配列番号８２／９０、配列番号９８／１０６、配列番号１１４／１２２、配列番号１３０／１３８、配列番号１４６／１５４、配列番号１６２／１７０、配列番号１７８／１８６、配列番号１９４／２０２、配列番号２１０／２１８、配列番号２２６／２３４、配列番号２４２／２５０、配列番号２５８／２６６、配列番号２７４／２８２、配列番号２９０／２８２、配列番号２９８／２８２、配列番号３０６／２８２、配列番号３１４／２８２、配列番号３２２／２８２、及び、配列番号３３０／２８２からなる群から選択する。
【０００９】
本発明は、表１に示したＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択するアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む抗体、または、その抗原結合フラグメントも提供する。
【００１０】
本発明は、表１に示したＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択するアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む抗体、または、その抗原結合フラグメントも提供する。
【００１１】
本発明は、表１に示したＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択するアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む抗体、または、その抗原結合フラグメントも提供する。
【００１２】
本発明は、表１に示したＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択するアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む抗体、または、その抗原結合フラグメントも提供する。
【００１３】
本発明は、表１に示したＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択するアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む抗体、または、その抗原結合フラグメントも提供する。
【００１４】
本発明は、表１に示したＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択するアミノ酸配列、または、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体、または、その抗原結合フラグメントも提供する。
【００１５】
本発明は、表１に示したＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかとペアにした、表１に示したＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む抗体、または、その抗原結合フラグメントも提供する。特定の実施形態では、本発明は、表１に示した例示的な抗ＣＤ６３抗体のいずれかに含まれているＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む抗体、または、その抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアは、配列番号８／１６、配列番号２４／３２、配列番号４０／４８、配列番号５６／６４、配列番号７２／８０、配列番号８８／９６、配列番号１０４／１１２、配列番号１２０／１２８、配列番号１３６／１４４、配列番号１５２／１６０、配列番号１６８／１７６、配列番号１８４／１９２、配列番号２００／２０８；配列番号２１６／２２４；配列番号２３２／２４０；配列番号２４８／２５６；配列番号２６４／２７２；配列番号２８０／２８８；配列番号２９６／２８８；配列番号３０４／２８８；配列番号３１２／２８８；配列番号３２０／２８８；配列番号３２８／２８８；配列番号３３６／２８８からなる群から選択する。
【００１６】
本発明は、表１に記載した例示的な抗ＣＤ６３抗体のいずれかが含んでいた、６つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む抗体、または、その抗原結合フラグメントも提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、配列番号２０、２２−２４−２６−２８−３０−３２、配列番号３６−３８−４０−４４−４６−４８、配列番号５２−５４−５６−６０−６２−６４；配列番号６８−７０−７２−７６−７８−８０；配列番号８４−８６−８８−９２−９４−９６；配列番号１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２；配列番号１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８；配列番号１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４；配列番号１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０；配列番号１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６；配列番号１８０−１８２−１８４−１８８−１９０−１９２；配列番号１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８；配列番号２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４；配列番号２２８−２３０−２３２−２３６−２３８−２４０；配列番号２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６；配列番号２６０−２６２−２６４−２６８−２７０−２７２；配列番号２７６−２７８−２８０−２８４−２８６−２８８；配列番号２９２−２９４−２９６−２８４−２８６−２８８；配列番号３００−３０２−３０４−２８４−２８６−２８８；配列番号３０８−３１０−３１２−２８４−２８６−２８８；配列番号３１６−３１８−３２０−２８４−２８６−２８８；配列番号３２４−３２６−３２８−２８４−２８６−２８８、及び、配列番号３３２−３３４−３３６−２８４−２８６−２８８からなる群から選択する。
【００１７】
関連する実施形態では、本発明は、表１に記載した例示的な抗ＣＤ６３抗体のいずれかで定義した、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアに含まれていた６つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む抗体、または、その抗原結合フラグメントも提供する。例えば、本発明は、配列番号２／１０、配列番号１８／２６、配列番号３４／４２、配列番号５０／５８、配列番号６６／７４、配列番号８２／９０、配列番号９８／１０６、配列番号１１４／１２２、配列番号１３０／１３８、配列番号１４６／１５４、配列番号１６２／１７０、配列番号１７８／１８６、配列番号１９４／２０２、配列番号２１０／２１８、配列番号２２６／２３４、配列番号２４２／２５０、配列番号２５８／２６６、配列番号２７４／２８２、配列番号２９０／２８２、配列番号２９８／２８２、配列番号３０６／２８２、配列番号３１４／２８２、配列番号３２２／２８２、及び、配列番号３３０／２８２からなる群から選択するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアが含んでいた、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定する方法及び技術は、当該技術分野で周知であり、また、本明細書で開示した特定のＨＣＶＲ及び／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を識別するために使用可能な例示的な規則として、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、及び、ＡｂＭ定義がある。一般的には、Ｋａｂａｔの定義は、配列の変動性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づいており、そして、ＡｂＭの定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの手順の間の妥協点である。例えば、Ｋａｂａｔ、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）；及び、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を同定するための公開データベースも利用可能である。
【００１８】
本発明は、抗ＣＤ６３抗体、または、その一部をコードする核酸分子も提供する。例えば、本発明は、表１に示したＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する；特定の実施形態では、核酸分子は、表１に示したＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択するポリヌクレオチド配列、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む。
【００１９】
本発明は、表１に示したＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；特定の実施形態では、核酸分子は、表１に示したＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択するポリヌクレオチド配列、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む。
【００２０】
本発明は、表１に示したＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；特定の実施形態では、核酸分子は、表１に示したＨＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択するポリヌクレオチド配列、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む。
【００２１】
本発明は、表１に示したＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；特定の実施形態では、核酸分子は、表１に示したＨＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択するポリヌクレオチド配列、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む。
【００２２】
本発明は、表１に示したＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；特定の実施形態では、核酸分子は、表１に示したＨＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択するポリヌクレオチド配列、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む。
【００２３】
本発明は、表１に示したＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；特定の実施形態では、核酸分子は、表１に示したＬＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択するポリヌクレオチド配列、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む。
【００２４】
本発明は、表１に示したＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；特定の実施形態では、核酸分子は、表１に示したＬＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択するポリヌクレオチド配列、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む。
【００２５】
本発明は、表１に示したＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；特定の実施形態では、核酸分子は、表１に示したＬＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択するポリヌクレオチド配列、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む。
【００２６】
本発明は、ＨＣＶＲをコードする核酸分子も提供しており、ＨＣＶＲは、３つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）のセットを含み、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に示した例示的な抗ＣＤ６３抗体のいずれかで定義した通りである。
【００２７】
本発明は、ＬＣＶＲをコードする核酸分子も提供しており、ＬＣＶＲは、３つのＣＤＲ（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含み、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に示した例示的な抗ＣＤ６３抗体のいずれかで定義した通りである。
【００２８】
本発明は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子も提供しており、ＨＣＶＲは、表１に示したＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、ＬＣＶＲは、表１に示したＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、核酸分子は、表１に示したＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択するポリヌクレオチド配列、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含み、及び、表１に示したＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択するポリヌクレオチド配列、または、それに対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似するその配列を含む。本発明のこの態様での特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードしており、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、両方とも、表１に示した同じ抗ＣＤ６３抗体に由来する。
【００２９】
本発明は、抗ＣＤ６３抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターも提供する。例えば、本発明は、上記した核酸分子のいずれか、すなわち、表１に示したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む。本発明の範囲は、そのようなベクターを導入した宿主細胞、ならびに、抗体または抗体フラグメントの生産を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、次いで、生産した抗体または抗体フラグメントを回収して、抗体、または、その一部を生産する方法も含む。
【００３０】
一部の態様では、本発明は、修飾したグリコシル化パターンを有する抗ＣＤ６３抗体などの抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む。一部の実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾が有用になり得る、または、細胞傷害を所望しておれば、フコース部分を欠いた抗体を、オリゴ糖鎖に存在させて、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を高める（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照されたい）。その他の用途では、ガラクトシル化の修飾を行って、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾することができる。
【００３１】
別の態様では、本発明は、ＣＤ６３に特異的に結合する組換えヒト抗体、または、そのフラグメントと、医薬として許容する担体とを含む医薬組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＣＤ６３抗体と、第２の治療薬との組み合わせである組成物を特徴とする。ある実施形態では、第２の治療薬は、抗ＣＤ６３抗体と有利に組み合わせるあらゆる作用物質である。本発明の抗ＣＤ６３抗体に関与するさらなる併用療法、及び、共製剤は、本明細書の別の箇所で開示している。
【００３２】
別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ６３抗体を使用して、ＣＤ６３を発現する腫瘍細胞を標的化する／死滅させる治療方法を提供しており、この治療方法は、本発明の抗ＣＤ６３抗体を含む治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に対して投与することを含む。一部の事例では、抗ＣＤ６３抗体（または、その抗原結合フラグメント）を、細胞傷害を促すように修飾し得るものであり、その方法として、ＡＤＣＣを促すための修飾Ｆｃドメイン（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３）、放射免疫療法、抗体薬物コンジュゲート、または、腫瘍切除の効率を高めるその他の方法があるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明は、ＣＤ６３発現細胞に関連する、または、起因する疾患または障害（例えば、がん）の治療のための薬剤の製造における、本発明の抗ＣＤ６３抗体の使用も含む。ある態様では、本発明は、抗ＣＤ６３抗体または抗原結合フラグメント、または、二重特異性抗ＴＡＡｘＣＤ６３抗体を含む、医薬での使用のための化合物に関する。ある態様では、本発明は、本明細書に開示した抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む、医薬での使用のための化合物に関する。
【００３４】
さらに別の態様では、本発明は、例えば、イメージング試薬などの診断用途のための単一特異性抗ＣＤ６３抗体を提供する。
【００３５】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ６３抗体、または、抗体の抗原結合部分を使用して、リソソームへのＣＤ６３内在化、及び／または、リソソームによる分解を促す治療方法を提供しており、この治療方法は、抗体を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む。
【００３６】
別の態様では、本発明は、表面プラズモン共鳴、または、同等のアッセイで測定した１００ｎＭを超えるＫＤでＣＤ６３発現細胞に結合する抗体、または、その抗原結合フラグメントを提供する。別の態様では、本発明は、ＦＡＣＳ分析で測定した１００ｎＭを超えるＥＣ５０でＣＤ６３発現細胞に結合する抗体、または、その結合フラグメントを提供する。別の態様では、本発明は、同じ細胞で発現するＣＤ６３にも抗体が結合する場合に、ＣＤ６３発現細胞のリソソームに結合し、そして、内在化する抗体、または、その結合フラグメントを提供する。
【００３７】
さらに、本発明は、表１に示したＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含むリファレンス抗体と、ヒトＣＤ６３に対する結合について競合する抗体、または、抗原結合フラグメントを提供する。別の態様では、本発明は、配列番号２／１０、配列番号１８／２６、配列番号３４／４２、配列番号５０／５８、配列番号６６／７４、配列番号８２／９０、配列番号９８／１０６、配列番号１１４／１２２、配列番号１３０／１３８、配列番号１４６／１５４、配列番号１６２／１７０、配列番号１７８／１８６、配列番号１９４／２０２、配列番号２１０／２１８、配列番号２２６／２３４、配列番号２４２／２５０、配列番号２５８／２６６、配列番号２７４／２８２、配列番号２９０／２８２、配列番号２９８／２８２、配列番号３０６／２８２、配列番号３１４／２８２、配列番号３２２／２８２、及び、配列番号３３０／２８２からなる群から選択するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含むリファレンス抗体と、ヒトＣＤ６３に対する結合について競合する抗体、または、抗原結合フラグメントを提供する。
【００３８】
さらに、本発明は、抗体または抗原結合フラグメントを提供しており、抗体、または、その結合フラグメントは、表２に示したＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含むリファレンス抗体と同じヒトＣＤ６３でのエピトープに結合する。別の態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、配列番号１８／２６、配列番号３４／４２、配列番号５０／５８、配列番号６６／７４、配列番号８２／９０、配列番号９８／１０６、配列番号１１４／１２２、配列番号１３０／１３８、配列番号１４６／１５４、配列番号１６２／１７０、配列番号１７８／１８６、配列番号１９４／２０２、配列番号２１０／２１８、配列番号２２６／２３４、配列番号２４２／２５０、配列番号２５８／２６６、配列番号２７４／２８２、配列番号２９０／２８２、配列番号２９８／２８２、配列番号３０６／２８２、配列番号３１４／２８２、配列番号３２２／２８２、及び、配列番号３３０／２８２からなる群から選択するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含むリファレンス抗体と同じヒトＣＤ６３でのエピトープに結合する。
【００３９】
さらに、本発明は、ヒトＣＤ６３に結合する単離した抗体、または、その結合フラグメントを提供するものであり、抗体、または、抗原結合フラグメントは；表１に示したアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び、表１に示したアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む。別の態様では、単離した抗体、または、抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、配列番号１８／２６、配列番号３４／４２、配列番号５０／５８、配列番号６６／７４、配列番号８２／９０、配列番号９８／１０６、配列番号１１４／１２２、配列番号１３０／１３８、配列番号１４６／１５４、配列番号１６２／１７０、配列番号１７８／１８６、配列番号１９４／２０２、配列番号２１０／２１８、配列番号２２６／２３４、配列番号２４２／２５０、配列番号２５８／２６６、配列番号２７４／２８２、配列番号２９０／２８２、配列番号２９８／２８２、配列番号３０６／２８２、配列番号３１４／２８２、配列番号３２２／２８２、及び、配列番号３３０／２８２からなる群から選択するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む。さらに別の態様では、単離した抗体、または、抗原結合フラグメントは、それぞれ、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、配列番号２０−２２−２４−２６−２８−３０−３２、配列番号３６−３８−４０−４４−４６−４８、配列番号５２−５４−５６−６０−６２−６４；配列番号６８−７０−７２−７６−７８−８０；配列番号８４−８６−８８−９２−９４−９６；配列番号１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２；配列番号１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８；配列番号１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４；配列番号１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０；配列番号１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６；配列番号１８０−１８２−１８４−１８８−１９０−１９２；配列番号１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８；配列番号２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４；配列番号２２８−２３０−２３２−２３６−２３８−２４０；配列番号２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６；配列番号２６０−２６２−２６４−２６８−２７０−２７２；配列番号２７６−２７８−２８０−２８４−２８６−２８８；配列番号２９２−２９４−２９６−２８４−２８６−２８８；配列番号３００−３０２−３０４−２８４−２８６−２８８；配列番号３０８−３１０−３１２−２８４−２８６−２８８；配列番号３１６−３１８−３２０−２８４−２８６−２８８；配列番号３２４−３２６−３２８−２８４−２８６−２８８、及び、配列番号３３２−３３４−３３６−２８４−２８６−２８８からなる群から選択するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。別の態様では、本発明は、ヒトＣＤ６３に結合する単離した抗体、または、その結合フラグメントを提供するものであり、抗体、または、抗原結合フラグメントは：（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、２９８、３０６、３１４、３２２、及び、３３０からなる群から選択するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；及び、（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、及び、２８２からなる群から選択するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。さらなる態様では、単離した抗体、または、抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、配列番号１８／２６、配列番号３４／４２、配列番号５０／５８、配列番号６６／７４、配列番号８２／９０、配列番号９８／１０６、配列番号１１４／１２２、配列番号１３０／１３８、配列番号１４６／１５４、配列番号１６２／１７０、配列番号１７８／１８６、配列番号１９４／２０２、配列番号２１０／２１８、配列番号２２６／２３４、配列番号２４２／２５０、配列番号２５８／２６６、配列番号２７４／２８２、配列番号２９０／２８２、配列番号２９８／２８２、配列番号３０６／２８２、配列番号３１４／２８２、配列番号３２２／２８２、及び、配列番号３３０／２８２からなる群から選択するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
【００４０】
別の態様によれば、本発明は、本明細書に記載した抗ＣＤ６３抗体、その抗原結合フラグメント、または、その抗原結合フラグメントを含む多重特異性結合タンパク質、及び、治療薬（例えば、細胞傷害性薬）を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、（ａ）抗ＣＤ６３抗体、抗原結合フラグメント、及び／または、多重特異性結合タンパク質、及び（ｂ）細胞傷害性薬は、本明細書に記載したように、リンカーを介して共有結合する。様々な実施形態では、抗ＣＤ６３抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書に記載した抗ＣＤ６３抗体、または、フラグメントのいずれかとすることができる。
【００４１】
一部の実施形態では、細胞傷害性薬は、オーリスタチン、メイタンシノイド、ツブリシン、トマイマイシン、カリケアマイシン、または、ドラスタチン誘導体から選択する。一部の事例では、細胞傷害性薬は、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦから選択したオーリスタチン、または、ＤＭ１またはＤＭ４から選択したメイタンシノイドである。一部の実施形態では、細胞傷害性薬は、本明細書に記載した式の構造を有するメイタンシノイドである。
【００４２】
一部の実施形態では、細胞傷害性薬は、構造：
【化１】
2021524231.tif 000003
を有するメイタンシノイドである。
【００４３】
一部の実施形態では、細胞傷害性薬は、構造：
【化２】
2021524231.tif 000004
を有するメイタンシノイドである。
【００４４】
一部の実施形態では、抗体薬物コンジュゲートは、抗ＣＤ６３抗原結合タンパク質、または、その抗原結合部分を含む、多重特異性結合タンパク質などの抗原結合タンパク質、及び、
【化３】
2021524231.tif 000005
式中、
【化４】
2021524231.tif 000006
は、抗体、または、そのフラグメントに対する結合である、を含む。
【００４５】
一部の実施形態では、抗体薬物コンジュゲートは、抗ＣＤ６３抗原結合タンパク質、または、その抗原結合部分を含む、多重特異性結合タンパク質などの抗原結合タンパク質、及び、
【化５】
2021524231.tif 000007
式中、
【化６】
2021524231.tif 000008
は、抗体、または、そのフラグメントに対する結合である、を含む。
【００４６】
一部の実施形態では、抗体薬物コンジュゲートは、抗ＣＤ６３抗原結合タンパク質、または、その抗原結合部分を含む、多重特異性結合タンパク質などの抗原結合タンパク質、及び
【化７】
2021524231.tif 000009
それらの混合物であり、
式中、
【化８】
2021524231.tif 000010
は、抗体、または、そのフラグメントに対する結合である、を含む。
【００４７】
一部の実施形態では、結合は、システイン残基の硫黄成分を介して、抗体、または、そのフラグメントと接触する。
【００４８】
一部の実施形態では、結合は、リジン残基の窒素成分を介して、抗体、または、そのフラグメントと接触する。
【００４９】
上記した、または、本明細書に記載した抗体薬物コンジュゲートの様々な実施形態のいずれにおいても、抗体薬物コンジュゲートは、１〜１０個の細胞傷害性薬／抗原結合タンパク質を含むことができ、当該抗原結合タンパク質は、抗ＣＤ６３抗原結合タンパク質、または、その抗原結合部分を含む、多重特異性結合タンパク質などを含む。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、マルチドメイン治療用タンパク質を模式的に表す。パネルＡは、二重特異性抗体（ｉｉ）と補充酵素（ｉ）とを含むマルチドメイン治療用タンパク質を示す。パネルＢは、酵素−Ｆｃ融合ポリペプチド（ｉ）が、内在化エフェクター特異的半体（ｉｉ）と結合して、マルチドメイン治療タンパク質を形成する様子を示す。パネルＣは、抗内在化エフェクター抗体の重鎖のＣ末端に共有結合的に連結した補充酵素（六角形）を示す。パネルＤは、抗内在化エフェクター抗体の重鎖のＮ末端に共有結合的に連結した補充酵素（六角形）を示す。パネルＥは、抗内在化エフェクター抗体の軽鎖のＣ末端に共有結合的に連結した補充酵素（六角形）を示す。パネルＦは、抗内在化エフェクター抗体の軽鎖のＮ末端に共有結合的に連結した補充酵素（六角形）を示す。パネルＧは、ＶＨ領域（影付きのバー）とＶＬ領域（白抜きのバー）を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＣ末端に共有結合的に連結した補充酵素（六角形）を示す。パネルＨは、２つのｓｃＦｖドメインに共有結合的に連結した補充酵素（六角形）を示しており、第１のｓｃＦｖ（ｉ）は、第１の送達ドメインとして機能し、そして、第２のｓｃＦｖ（ｉｉ）は、第２の送達ドメインとして機能する。抗ＣＤ６３抗体、または、その結合部分を含むマルチドメイン治療用タンパク質を構築するために使用し得る例示的な抗ＣＤ６３ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列（及び、それらをコードするヌクレオチド配列）を、表１に示す。
【図２】図２は、パネルに示したマルチドメイン治療用タンパク質をコードするＡＡＶ遺伝子治療ベクターの例示的な図であり、これらに限定されるものではないが、ｓｃＦｖは、抗ヒトＣＤ６３  ｓｃＦｖであり、かつ、補充酵素は、ＧＡＡである（例えば、抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡ；例えば、抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖは、Ｈ４Ｈ１２４５０Ｎ抗体に由来する配列番号３６４に記載のアミノ酸配列を参照されたい。配列番号３６４のアミノ酸１〜１１７は、Ｈ４Ｈ１２４５０Ｎ抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列を提供する；配列番号３６４のアミノ酸１１８〜１３２は、Ｈ４Ｈ１２４５０Ｎの重鎖及び軽鎖可変ドメインの間のアミノ酸リンカー配列を提供する；配列番号３６４のアミノ酸１３３〜２４０は、Ｈ４Ｈ１２４５０Ｎ抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列を提供する；配列番号３６４のアミノ酸２４１〜２４５は、抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖとＧＡＡとの間のアミノ酸リンカー配列を提供する；及び、配列番号３６４のアミノ酸２４６〜１１２８は、補充酵素ＧＡＡのアミノ酸配列、または、その生物学的に活性な部分を提供する。例示的な５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列は、それぞれ、配列番号３６５及び配列番号３６６に記載している。例示的な肝臓特異的エンハンサー（セルピナ１）は、配列番号３６７に記載している。例示的な肝臓特異的プロモーター（ＴＴＲ）は、配列番号３６８に記載している。マルチドメイン治療用タンパク質を構築するために、例えば、治療を要する患者のポンペ病の治療のために使用し得る、抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合部分を含むさらなる例示的な抗ＣＤ６３  ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列（及び、それらをコードするヌクレオチド配列）を、表１に提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本明細書では、ＣＤ６３の内在化を媒介する上で有用である、新規の抗ヒトＣＤ６３抗体、及び、その一価の抗原結合フラグメントを提供する。抗ヒトＣＤ６３抗体、及び、その一価抗原結合フラグメントは、例えば、疾患の治療において、多重特異性抗原結合タンパク質、及び／または、マルチドメイン治療用タンパク質の一部として、及び／または、抗体薬物コンジュゲートとして有用となり得る。
【００５２】
本発明は、記載した特定の実施形態、組成物、方法、及び、実験条件に限定されることはなく、そのような実施形態、組成物、方法、及び、条件は変化し得る。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、また、本発明の範囲の限定を意図するものではなく、本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００５３】
本明細書に記載したものと類似する、または、同等である、あらゆる方法、及び、材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、一部の好ましい方法、及び、材料を、本明細書で説明する。本明細書で引用するすべての刊行物は、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する。特に断りの無い限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野での当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。
【００５４】
特に断りの無い限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野での当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。用語「約」は、特定の列挙した数値に関して使用する場合、その値が、列挙した値から１％以下しか変動し得ないことを意味する。例えば、表現「約１００」は、９９と１０１、ならびに、その間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。本明細書に記載したものと類似する、または、同等である、あらゆる方法、及び、材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法、及び、材料を本明細書で説明する。本明細書で引用するすべての特許、出願、及び、非特許文献は、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する。
【００５５】
「ＣＤ６３」は、ヒトにおいてＣＤ６３遺伝子によってコードされており、かつ、配列番号３３７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。ＣＤ６３は、細胞膜を４回貫通する細胞表面タンパク質のテトラスパニンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ６３は、実質的には、すべての組織で発現しており、そして、シグナル伝達複合体の形成と安定化に関与していると考えられている。ＣＤ６３は、細胞膜、リソソーム膜、及び、後期エンドソーム膜に局在する。ＣＤ６３は、インテグリンと結合することが知られており、そして、上皮間葉移行に関与し得る。Ｈ．Ｍａｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎｓ，”１１（６）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．４２８−４２、Ｍａｙ  １９９７；及び、Ｍ．Ｍｅｔｚｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“ＣＤ６３  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，  ｃｌｏｎｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，”２６６  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３２３９−３２４５，１９９１．を参照されたい。ＣＤ６３は、内在化エフェクターの生物学的活性を示す。タンパク質、ポリペプチド、及び、タンパク質フラグメントに関する本明細書でのすべての言及は、非ヒト種由来であると特に断りがされていない限りは、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、または、タンパク質フラグメントのヒト型を指す、ことを意図している。したがって、表現「ＣＤ６３」は、非ヒト種、例えば、「マウスＣＤ６３」、「サルＣＤ６３」などに由来するものとして特定されていない限り、ヒトＣＤ６３のことを意味する。
【００５６】
「内在化エフェクター」は、細胞に内在化することができる、さもなければ、逆行性膜輸送に関与するか、または、寄与するタンパク質を含む。一部の事例では、内在化エフェクターは、トランスサイトーシスを受けるタンパク質である；つまり、タンパク質は、細胞の一方の側に内在化され、そして、細胞の他方の側に（例えば、頂端から基底へ）輸送される。数多くの実施形態では、内在化エフェクタータンパク質は、細胞表面発現タンパク質、または、可溶性細胞外タンパク質である。しかしながら、本発明は、内在化エフェクタータンパク質が、エンドソーム、小胞体、ゴルジ、リソソームなどの細胞内区画内で発現する実施形態も企図している。例えば、逆行性膜輸送に関与するタンパク質（例えば、初期／リサイクルエンドソームからトランスゴルジネットワークに至る経路）は、本発明の様々な実施形態での内在化エフェクタータンパク質として機能し得る。いずれにしても、内在化エフェクタータンパク質に対する、マルチドメイン治療タンパク質、及び、それを含む多重特異性結合タンパク質など、抗体、または、その結合部分の結合は、マルチドメイン治療タンパク質、及び、それらを含む多重特異性結合など、抗体全体、または、その抗原結合部分、及び、それらに関連するあらゆる分子（例えば、酵素、標的分子、薬物コンジュゲート）をも細胞内に内在化させる。以下に説明するように、内在化エフェクタータンパク質として、細胞に直接的に内在化するタンパク質、ならびに、細胞に間接的に内在化するタンパク質がある。細胞に直接的に内在化する内在化エフェクタータンパク質として、少なくとも１つの細胞外ドメイン（例えば、膜貫通タンパク質、ＧＰＩアンカー型タンパク質など）を有する膜関連分子があり、このものは、細胞内在化を受けることとなり、そして、好ましくは、細胞内分解、及び／または、リサイクル経路を介して処理される。
【００５７】
語句「ＣＤ６３に結合する抗体」、または、「抗ＣＤ６３抗体」は、単一のＣＤ６３分子を特異的に認識する抗体、及び、その抗原結合フラグメントを含む。本発明の抗体、及び、抗原結合フラグメントは、可溶性ＣＤ６３、及び／または、細胞表面発現ＣＤ６３に対して結合し得る。可溶性ＣＤ６３として、天然ＣＤ６３タンパク質、ならびに、膜貫通ドメインを欠失している、または、細胞膜と会合していないＣＤ６３タンパク質変異体、例えば、組換えＣ末端Ｍｙｃ−Ｍｙｃ−ヘキサヒスチジン（ｈＣＤ６３  ＥＣループ２−ＭＭＨ；配列番号３３８）、または、Ｃ末端ヒトＦｃタグで発現した組換えヒトＣＤ６３細胞外ループ２（ｈＣＤ６３  ＥＣループ２−ｈＦｃ；配列番号３３９）があるが、これらに限定されない。
【００５８】
表現「細胞表面発現ＣＤ６３」は、インビトロまたはインビボで細胞の表面で発現する１つ以上のＣＤ６３タンパク質（複数可）を意味しており、ＣＤ６３タンパク質の少なくとも一部は、細胞膜の細胞外側に曝されており、そして、抗体の抗原結合部分に接近可能である。「細胞表面発現ＣＤ６３」として、細胞の膜内の機能的Ｔ細胞受容体に含まれるＣＤ６３タンパク質がある。「細胞表面発現ＣＤ６３」は、通常、ＣＤ６３タンパク質を発現する細胞の表面に発現するＣＤ６３タンパク質を含み、または、それらからなることができる。あるいは、「細胞表面発現ＣＤ６３」は、通常、その表面にヒトＣＤ６３を発現しないが、その表面にＣＤ６３を発現するように人工的に操作した細胞の表面で発現するＣＤ６３タンパク質を含むか、または、それからなることができる。
【００５９】
用語「抗原結合分子」は、抗体、及び、抗体の抗原結合フラグメント、例えば、二重特異性抗体を含む。
【００６０】
用語「親和性」とは、その所望の効果を達成するために、標的結合の閾値に到達する抗原結合分子の能力のことを指す。複数の標的抗原、及び、多重特異性抗原結合分子に関連する語句「親和性駆動結合」または「親和性駆動ペアリング」とは、多重特異性抗原結合分子が、少なくとも２つの一価の結合アームを提供する作用機序のことを指すものであり、かつ、第１の結合アーム（複数可）は、親和性が大きく、第１の標的抗原に結合する。第２の結合アーム（複数可）は、両方の抗原が、同じ細胞に存在するなど、互いに近接していない限りは、第２の結合アームが、第２の標的抗原にて結合しないような小さな親和性で、第２の標的抗原に結合する。したがって、第１の標的抗原に対する高親和性の結合は、第２の結合アームに対する低親和性アームの親和性を大きくし、かつ、第２の標的に対する結合を媒介する（Ｒｈｏｄｅｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｙ  ２０，２０１６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２９１，１１３３７−１１３４７、ｆｉｓｒｔ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎ  Ｍａｒｃｈ  ２８，２０１６  ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１６．７１４２８７；Ｊａｒａｎｔｏｗ、Ｓ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ９，２０１５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２９０（４１）：２４６８９−７０４．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１５．６５１６５３．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ａｕｇ  １０）。
【００６１】
用語「抗体」は、特定の抗原（例えば、ＣＤ６３）に特異的に結合する、または、それと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、あらゆる抗原結合分子、または、分子複合体のことを指す。本明細書で使用する用語「抗体」は、ジスルフィド結合で相互接続された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖、及び、２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびに、それらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）、及び、重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及び、ＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＬＣＶＲまたはＶＬと略記する）、及び、軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨ領域、及び、ＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称する良好に保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて配置された３つのＣＤＲと、４つのＦＲとからなる（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び、ＨＣＤＲ３と略記し得る；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び、ＬＣＤＲ３と略記し得る。用語「高親和性」抗体とは、それらの標的に対して、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、または、溶液親和性ＥＬＩＳＡで測定した、少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ；少なくとも１０−１１Ｍ；または、少なくとも１０−１２Ｍの結合親和性を有する抗体のことを指す。用語「抗体」は、例えば、モノクローナル、または、ポリクローナルなどのあらゆるタイプの抗体を含み得る。さらに、抗体は、例えば、哺乳動物、または、非哺乳動物などのあらゆる起源のものとし得る。ある実施形態では、抗体は、哺乳動物、または、鳥類とし得る。さらなる実施形態では、抗体は、ヒト由来のものとし得る、そして、さらに、ヒトモノクローナル抗体とし得る。
【００６２】
用語「抗体」は、完全抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語などは、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、または、遺伝子操作した抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチド、または、糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合フラグメントは、例えば、抗体可変ドメイン、及び、任意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現に関連するタンパク質消化技術、または、組換え遺伝子操作技術などのあらゆる適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から誘導し得る。このようなＤＮＡは公知であり、及び／または、例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリーなど）から容易に入手可能であり、または、合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメイン、及び／または、定常ドメインを、適切な配置変更を行って配置させ、または、コドンを導入し、システイン残基を生成し、アミノ酸を修飾、付加、または、欠失などするために、化学的に、または、分子生物学技術を用いて、配列決定、及び、操作し得る。
【００６３】
抗体結合フラグメントの例として：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び、（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離した相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または、環状ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位があるが、これらに限定されない。本明細書で使用する表現「抗原結合フラグメント」は、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、及び、サメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどのその他の遺伝子操作した分子も含む。
【００６４】
抗体の抗原結合フラグメントは、一般的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、あらゆるサイズ、または、アミノ酸組成物とし得るものであり、一般的に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、または、１つ以上のフレームワーク配列と共にインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗体結合フラグメントにおいて、ＶＨドメイン、及び、ＶＬドメインは、あらゆる適切な配置において、互いに対して配置し得る。例えば、可変領域を、二量体とし、そして、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、または、ＶＬ−ＶＬ二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含み得る。
【００６５】
特定の実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合的に連結した少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントで認め得る可変及び定常ドメインの例示的な構成として：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；及び、（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬがあるが、これらに限定されない。前掲の例示的な立体配置のいずれかを含む、可変ドメイン及び定常ドメインのあらゆる立体配置において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接に連結し得る、または、完全または部分的ヒンジ領域またはリンカー領域で連結し得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメイン、及び／または、定常ドメインとの間の可撓性または半可撓性の連結をもたらす少なくとも２つの（例えば、５つ、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個、または、それより多くの）アミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いに、及び／または、１つ以上の単量体ＶＨドメインまたはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合（複数可）による）非共有結合において、前掲の可変ドメイン立体配置、及び、定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または、その他の多量体）を含み得る。
【００６６】
完全抗体分子と同様に、抗体結合フラグメントは、単一特異性、または、多重特異性（例えば、二重特異性）とし得る。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、一般的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含んでおり、各可変ドメインは、別個の抗原、または、同じ抗原の異なるエピトープに対して特異的に結合することができる。本明細書で開示した例示的な二重特異性抗体フォーマットを含むあらゆる多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な通例の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合フラグメントとの関連で使用に適合し得る。
【００６７】
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、または、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して機能し得る。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）とは、補体の存在下での本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解のことを指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及び、マクロファージ）が標的細胞での結合抗体を認識し、それにより、標的細胞の溶解をもたらす、細胞媒介性反応のことを指す。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、当該技術分野で公知の利用可能なアッセイを用いて測定することができる。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号、及び、第５，８２１，３３７号、ならびに、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６を参照されたい）。抗体の定常領域は、補体を固定して細胞依存性細胞傷害性を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、その抗体が細胞傷害を媒介することが望ましいか否かに基づいて選択し得る。
【００６８】
本発明の特定の実施形態では、本発明の抗ＣＤ６３抗体は、ヒト抗体である。用語「ヒト抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域、及び、定常領域を有する抗体のことを指す。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発、または、インビボでの体細胞突然変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。
【００６９】
本発明の抗体は、一部の実施形態では、組換えヒト抗体とし得る。用語「組換えヒト抗体」は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体など、組換え手段によって調製、発現、作成、または、単離するすべてのヒト抗体（さらに後述する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体（さらに後述する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離した抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照されたい）、または、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を、その他のＤＮＡ配列へスプライシングすることを含む、あらゆるその他の手段によって調製、発現、生成、または、単離した抗体を含む、ことを意図している。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニック動物を使用する場合には、インビボ体細胞突然変異誘発）を受けており、したがって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来しており、そして、関連はしてはいるが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリーにおいて天然には存在し得ない配列である。
【００７０】
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在することができる。ある形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されている、約１５０〜１６０ｋＤａの安定な四本鎖構築物を含む。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、そして、共有結合した軽鎖と重鎖からなる約７５〜８０ｋＤａの分子が形成されている（半抗体）。これらの形態は、親和性精製の後でさえも分離することが極めて困難であった。
【００７１】
様々なインタクトのＩｇＧアイソタイプでの第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、これに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて一般的に観察されるレベルにまで、第２の形態の出現を有意に減少させることができる（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１つ以上の変異を有する抗体を含み、例えば、生産において、所望の抗体形態の収率を改善する上で望ましいものとなり得る。
【００７２】
本発明の抗体を、単離した抗体とし得る。「単離した抗体」とは、同定した抗体、及び、その自然環境の少なくとも１つの成分から同定、分離、及び／または、回収した抗体のことを指す。例えば、生物の少なくとも１つの成分、または、抗体が天然に存在する、または、天然に生産される組織または細胞から分離または除去した抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離した抗体は、組換え細胞内の原位置での抗体も含む。単離した抗体は、少なくとも１つの精製または単離工程に供した抗体である。特定の実施形態によると、単離した抗体は、その他の細胞物質、及び／または、化学物質を実質的に含み得ない。
【００７３】
本発明は、ＣＤ６３に結合するワンアーム抗体も含む。用語「ワンアーム抗体」とは、単一の抗体重鎖、及び、単一の抗体軽鎖を含む抗原結合分子のことを指す。本発明のワンアーム抗体は、表１に示したＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ、または、ＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。
【００７４】
本明細書に開示する抗ＣＤ６３抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖可変ドメイン、及び、軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域、及び／または、ＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または、欠失を含み得る。このような変異は、本明細書に開示するアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することで、容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体、及び、その抗原結合フラグメントを含み、１つ以上のフレームワーク、及び／または、ＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）、または、別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）、または、対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換へ変異する（このような配列変化を、本明細書では「生殖系列変異」と総称する）。当業者であれば、本明細書に開示する重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異、または、これらの組み合わせを含む数多くの抗体、及び、抗体結合フラグメントを容易に生産することができる。特定の実施形態では、ＶＨ、及び／または、ＶＬドメイン内のフレームワーク、及び／または、ＣＤＲ残基はすべて、抗体が由来した元の生殖系列配列において認められる残基へと変異して戻される。その他の実施形態では、ある特定の残基のみが、元の生殖系列配列へと変異して戻され、例えば、変異した残基だけが、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、または、ＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められ、または、変異した残基だけが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、または、ＣＤＲ３内に認められる。その他の実施形態では、フレームワーク、及び／または、ＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へと変異する。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク、及び／または、ＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異のあらゆる組み合わせを含有してもよく、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へと変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なる特定のその他の残基は、維持され、または、異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異する。一旦取得してしまえば、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体、及び、抗体結合フラグメントは、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合によるが）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について、容易に試験することができる。本発明の範囲には、この一般的な方法で得られた抗体及び抗体結合フラグメントが含まれる。
【００７５】
本発明は、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＣＤ６３抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書の表１に示したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、または、４個以下などの保存的アミノ酸置換を有する、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＣＤ６３抗体を含む。
【００７６】
語句「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープを選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は、一般的に、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、異なるエピトープ  −２つの異なる分子（例えば、抗原）、または、同じ分子（例えば、同じ抗原）のどちらかの−  を特異的に結合する。二重特異性抗体が、２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ、及び、第２のエピトープ）を選択的に結合することができる場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は、一般的に、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性よりも少なくとも１桁〜２桁、または、３桁または４桁小さく、その逆もまた同様である。二重特異性抗体が認識するエピトープは、同じ標的にも、異なる標的にも（例えば、同じタンパク質でも、異なるタンパク質でも）あり得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせて作り出すことができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合することができ、そして、こうした配列は、イムノグロブリン軽鎖を発現する細胞内で発現することができる。一般的な二重特異性抗体は、各々が三つの重鎖ＣＤＲと、それに続く（Ｎ末端からＣ末端に向けて）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及び、ＣＨ３ドメインを有する２つの重鎖と、抗原結合特異性は付与しないが、各重鎖と会合可能であるか、または、各重鎖と会合でき、かつ、重鎖抗原結合領域により結合される１つ以上のエピトープを結合できる、または、各重鎖と会合でき、かつ、重鎖の一方または両方をエピトープの一方または両方に結合させることができるイムノグロブリン軽鎖とを有する。
【００７７】
語句「重鎖」または「イムノグロブリン重鎖」は、あらゆる生物に由来するイムノグロブリン重鎖定常領域配列を含み、そして、特に断りの無い限り、重鎖可変ドメインを含む。特に断りの無い限り、重鎖可変ドメインは、３つの重鎖ＣＤＲと、４つのＦＲ領域とを含む。重鎖の断片として、ＣＤＲ、ＣＤＲ、及び、ＦＲ、ならびに、それらの組み合わせがある。一般的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端に向けて）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及び、ＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片として、抗原を特異的に認識する（例えば、抗原を、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、または、ピコモル濃度の範囲のＫＤで認識する）ことが可能であり、かつ、細胞から発現及び分泌することも可能であり、しかも、少なくとも一つのＣＤＲを含む、断片がある。
【００７８】
語句「軽鎖」は、あらゆる生物に由来するイムノグロブリン軽鎖定常領域配列を含み、そして、特に断りの無い限り、ヒトカッパ軽鎖、及び、ヒトラムダ軽鎖を含む。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、特に断りの無い限り、一般的には、３つの軽鎖ＣＤＲと、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域とを含む。一般的に、完全長の軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端に向けて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含むＶＬドメインと、軽鎖定常ドメインとを含む。本発明で使用することができる軽鎖は、例えば、抗原結合タンパク質が選択的に結合する第１の抗原と第２の抗原のどちらにも選択的に結合しない軽鎖を含む。好適な軽鎖として、既存の抗体ライブラリー（ウェットライブラリー、または、インシリコ）で最も一般的に採用されている軽鎖をスクリーニングすることで同定できるものがあり、この軽鎖は、抗原結合タンパク質の抗原結合ドメインの親和性、及び／または、選択性に実質的に干渉しない。好適な軽鎖として、抗原結合タンパク質の抗原結合領域が結合するエピトープの一方または両方に結合できる軽鎖がある。
【００７９】
語句「可変ドメイン」は、以下のアミノ酸領域を、Ｎ末端からＣ末端に向かう配列に（特に断りの無い限り）含む（望み通りに修飾した）イムノグロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列を含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「可変ドメイン」は、２連のベータシート構造を有する標準ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）内に折り畳むことができるアミノ酸配列を含み、このベータシートは、第１のベータシートと第２のベータシートの残基間を、ジスルフィド結合で接続している。
【００８０】
語句「相補性決定領域」、または、用語「ＣＤＲ」は、生物のイムノグロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、この配列は、通常（すなわち、野生型動物では）、イムノグロブリン分子（例えば、抗体、または、Ｔ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域における２つのフレームワーク領域の間に認められる。ＣＤＲは、例えば、生殖系列配列、または、再構成または非再構成の配列がコードすることができ、例えば、ナイーブＢ細胞または成熟Ｂ細胞またはＴ細胞がコードすることができる。一部の状況（例えば、ＣＤＲ３について）では、ＣＤＲは、２つ以上の配列（例えば、生殖系列配列）がコードすることができ、それらの配列は、（例えば、再構成されていない核酸配列では）連続していないが、Ｂ細胞の核酸配列では、例えば、配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するＶ−Ｄ−Ｊ再構成）の結果として、連続している。
【００８１】
用語「抗体フラグメント」とは、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントのことを指す。用語「抗体フラグメント」に含まれる結合フラグメントの例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及び、ＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域で、ジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン、及び、ＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ２４１：５４４−５４６）、（ｖｉ）単離したＣＤＲ、及び、（ｖｉｉ）Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨからなり、合成リンカーで接続して単一タンパク質鎖を形成し、そこには、ＶＬ領域とＶＨ領域とがペアリングして一価分子を形成しているｓｃＦｖがある。ダイアボディなどの一本鎖抗体のその他の形態も、用語「抗体」は含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。
【００８２】
語句「Ｆｃ含有タンパク質」は、イムノグロブリンのＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも機能性部分を含む、抗体、二重特異性抗体、イムノアドヘシン、及び、その他の結合タンパク質を含む。「機能性部分」とは、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃｙＲ；または、ＦｃＲｎ、すなわち、胎児性Ｆｃ受容体）を結合できる、及び／または、補体の活性化に関与できるＣＨ２領域及びＣＨ３領域のことを指す。ＣＨ２領域及びＣＨ３領域が、あらゆるＦｃ受容体を結合不能にし、かつ、補体の活性化も不能にする欠失、置換、及び／または、挿入、または、その他の修飾を有する場合、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域は、機能的ではない。
【００８３】
Ｆｃ含有タンパク質は、イムノグロブリンドメインに修飾を含むことができ、そのような修飾として、結合タンパク質の１つ以上のエフェクター機能に影響を及ぼす修飾（例えば、ＦｃｙＲ結合、ＦｃＲｎ結合、及び、それ故に、半減期、及び／または、ＣＤＣ活性に影響を及ぼす修飾）がある。そのような修飾として、イムノグロブリン定常領域を、ＥＵ付番法で参照した次の：２３８、２３９、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１５、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８、及び、４３９での修飾、及び、それらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。
【００８４】
例えば、限定を意図するものではないが、結合タンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質であり、（記載された修飾（複数可）を含まない同じＦｃ含有タンパク質と比較して）血清半減期の改善を示し、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）；２５０位及び４２８位（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、及び２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾；または、４２８位及び／または４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／ＳＩ／Ｐ／ＱまたはＫ）、及び／または４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）での修飾；または、２５０位及び／または４２８位での修飾；または、３０７位または３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び、４３４位での修飾を有する。別の例では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９１（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び、３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）、及び、４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、及び、２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び、２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑ、及び、４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ、及び、Ｍ４２８Ｌ）；３０７及び／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含むことができる。
【００８５】
本明細書で使用する用語「抗原結合タンパク質」は、抗原、例えば、細胞特異的抗原、及び／または、本発明の標的抗原などのエピトープを特異的に認識するポリペプチド、または、タンパク質（機能単位で複合体化した１つ以上のポリペプチド）のことを指す。抗原結合タンパク質を、多重特異性とし得る。抗原結合タンパク質に関連する用語「多重特異性」は、そのタンパク質が、同じ抗原、または、異なる抗原のいずれかにおいて、異なるエピトープを認識することを意味する。本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、単一の多機能性ポリペプチドとすることができ、または、相互に共有結合、または、非共有結合で会合した２つ以上のポリペプチドの多量体複合体とすることができる。用語「抗原結合タンパク質」は、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質と連結または共発現し得る、本発明の抗体、または、そのフラグメントを含む。例えば、抗体、または、そのフラグメントは、１つ以上のその他の分子実体、例えば、タンパク質、または、そのフラグメントなどに、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合による会合、または、その他により）機能的に連結して、第２の結合特異性を有する二重特異性、または、多重特異性の抗原結合分子を生産することができる。
【００８６】
「マルチドメイン治療用タンパク質」は、（ｉ）２つ以上の機能ドメインを含有する単一のタンパク質、（ｉｉ）２つ以上のポリペプチド鎖を含有するタンパク質、及び、（ｉｉｉ）２つ以上のタンパク質、または、２つ以上のポリペプチドの混合物を含む。用語ポリペプチドは、一般的には、ペプチド結合を介して連結している一本鎖のアミノ酸のことを意味する、とされている。用語タンパク質は、用語ポリペプチドのみならず、さらに複雑な構造をも含む。すなわち、単一のポリペプチドとは、タンパク質であり、そして、タンパク質は、より高次の構造に会合した１つ以上のポリペプチドを含むことができる。例えば、ヘモグロビンは、四つのポリペプチド：２つのアルファグロビンポリペプチドと、２つのベータグロビンポリペプチドとを含むタンパク質である。ミオグロビンもタンパク質であるが、このものは、単一のミオグロビンポリペプチドだけを含む。
【００８７】
マルチドメイン治療用タンパク質は、１つ以上のポリペプチド（複数可）と、２つの機能を付与する少なくとも２つのドメインとを含む。これらのドメインの内の一方は、酵素欠損症に関連する欠陥タンパク質の活性の補充をもたらす「酵素ドメイン」である。これらのドメインの内の他方は、本明細書に開示した抗ＣＤ６３抗体、または、その結合フラグメントなどの内在化エフェクター、例えば、ＣＤ６３に対する結合を提供する「送達ドメイン」である。そのため、酵素置換活性と、内在化エフェクター（別名、内在化エフェクター結合タンパク質に結合する能力（送達ドメイン活性）とを付与する単一のポリペプチドは、マルチドメイン治療用タンパク質である。また、一方のタンパク質が酵素機能を付与し、かつ、別のタンパク質が内在化エフェクター結合活性を付与するタンパク質の混合物も、マルチドメイン治療用タンパク質である。
【００８８】
用語「タンパク質」は、アミド結合を介して共有結合的に連結した約２０個を超えるアミノ酸を有するあらゆるアミノ酸ポリマーのことを意味する。タンパク質は、一般的に当該技術分野で「ポリペプチド」として公知の１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。したがって、ポリペプチドは、タンパク質とし得るものであり、また、タンパク質は、複数のポリペプチドを含有して、単一機能性生体分子を形成し得る。ジスルフィド架橋（すなわち、シスチンを形成するシステイン残基間にある）が、一部のタンパク質に存在し得る。これらの共有結合的連結を、単一のポリペプチド鎖内、または、２つの個々のポリペプチド鎖間に設け得る。例えば、ジスルフィド架橋は、インスリン、イムノグロブリン類、及び、プロタミンなどの適切な構造及び機能に不可欠である。ジスルフィド結合形成の最近の総説として、Ｏｋａ  ａｎｄ  Ｂｕｌｌｅｉｄ，“Ｆｏｒｍｉｎｇ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，”  １８３３（１１）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２４２５−９  （２０１３）を参照されたい。
【００８９】
本明細書で使用する用語「タンパク質」は、生物学的治療用タンパク質、研究または治療法で使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質、及び、その他のＦｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメント、ナノボディ、組換え抗体キメラ、ｓｃＦｖ融合タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含む。タンパク質は、組換え細胞をベースとした生産系、例えば、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞、及び、ＣＨＯ−Ｋ１細胞などのＣＨＯ誘導物）を用いて生産し得る。生物学的治療用タンパク質と、その生産について論じている最近の総説として、Ｇｈａｄｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ      ｆｏｒ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，  ｉｍｐａｃｔ，  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”  ２８  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ    Ｒｅｖ．１４７−７５（２０１２）を参照されたい。
【００９０】
本明細書で使用する用語「エピトープ」は、多重特異性抗原結合ポリペプチドによって認識される抗原の一部のことを指す。単一抗原（抗原ポリペプチドなど）は、２つ以上のエピトープを有し得る。エピトープは、構造的または機能的に定義し得る。機能的エピトープは、一般的に、構造的エピトープのサブセットであり、そして、抗原結合ポリペプチドと抗原との間の相互作用の親和性に直接的に寄与する残基として定義される。また、エピトープは、高次構造的、すなわち、非直線状アミノ酸で構成し得る。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、または、スルホニル基などの分子の化学的活性表面基である決定基を含み得るものであり、また、特定の実施形態では、特定の３次元構造特性、及び／または、特定の荷電特性を有し得る。連続したアミノ酸から形成したエピトープは、一般的には、変性溶媒への露出に際して保持されるのに対して、三次折り畳みにより形成するエピトープは、一般的には、変性溶媒での処理に際して損なわれる。
【００９１】
用語「ドメイン」は、特定の機能または構造を有するタンパク質、または、ポリペプチドのあらゆる部分のことを指す。好ましくは、本発明のドメインは、細胞特異的抗原、または、標的抗原に結合する。細胞特異的抗原ドメイン、または、標的抗原結合ドメインなどは、本明細書での使用では、自然に存在する、酵素的に入手可能である、合成したものである、または、遺伝子操作されており、かつ、抗原に特異的に結合する、あらゆるポリペプチド、または、糖タンパク質を含む。
【００９２】
用語「半抗体（ｈａｌｆ−ｂｏｄｙ）」または「半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、互換的に使用しており、１つの重鎖と、１つの軽鎖とを本質的に含有している抗体の半分のことを指す。抗体重鎖は、二量体を形成することができ、それ故に、１つの半抗体の重鎖は、異なる分子（例えば、別の半抗体）、または、別のＦｃ含有ポリペプチドと会合している重鎖と会合することができる。僅かに異なる２つのＦｃドメインは、二重特異性抗体、または、その他のヘテロ二量体、−三量体、及び、−四量体などの形成など、「ヘテロ二量体化」し得る。Ｖｉｎｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｉ，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ，  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”  ７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．  １４４４−１４５０（２０９１２）；及び、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍａｔ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  ４（５）  ＭＡｂｓ  ５８６−９１（２０１２）を参照されたい。
【００９３】
ある実施形態では、半抗体可変ドメインは、内在化エフェクターを特異的に認識し、そして、半抗体のＦｃドメインは、補充酵素（例えば、ペプチボディ）を含むＦｃ融合タンパク質と二量体化する、同文献、５８６。
【００９４】
用語「単鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」は、イムノグロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、及び、イムノグロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む一本鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、１０〜２５個のアミノ酸のリンカー配列で接続する。ＳｃＦｖポリペプチドは、ＣＬ領域またはＣＨ１領域などのその他のアミノ酸配列も含み得る。ＳｃＦｖ分子は、ファージディスプレイによって製造することができ、または、ハイブリドーマまたはＢ細胞から重鎖及び軽鎖を直接的にサブクローニングして作り出すことができる。Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌｕｍｅ  ２０１２，    ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９８０２５は、ファージディスプレイ、及び、抗体ドメインクローニングによってｓｃＦｖフラグメントを作り出す方法に関して、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【００９５】
二重特異性抗原結合分子
本発明の抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療用タンパク質を含む）を、単一特異性、二重特異性、または、多重特異性とし得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または、２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含み得る。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒ    ｅｔ    ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ    Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４を参照されたい。本発明の抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療用タンパク質を含む）は、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結すること、または、それと同時発現させることができる。例えば、抗体またはそのフラグメントは、別の抗体または抗体フラグメントなどの１つ以上のその他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合性会合などにより）機能的に連結させて、第２の、または、さらなる結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を生成することができる。
【００９６】
本明細書での表現「抗ＣＤ６３抗体」の使用は、単一特異性の抗ＣＤ６３抗体、ならびに、ＣＤ６３結合アーム、及び、「標的」結合アームを含む二重特異性抗体の両方を含むことを意図している。したがって、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームが、ヒトＣＤ６３に対して結合し、そして、免疫グロブリンの他方のアームが、別の標的分子に特異的である二重特異性抗体を含む。ＣＤ６３結合アームは、本明細書の表１に示したＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ、または、ＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。
【００９７】
特定の実施形態では、ＣＤ６３結合アームは、ヒトＣＤ６３に対して結合し、そして、ＣＤ６３、及び、それに結合した抗体の内在化を誘導する。特定の実施形態では、ＣＤ６３結合アームは、ヒトＣＤ６３に弱く結合し、そして、ＣＤ６３、及び、それに結合した抗体の内在化を誘導する。その他の実施形態では、ＣＤ６３結合アームは、ヒトＣＤ６３に弱く結合し、そして、例えば、ＣＤ６３結合アーム、及び、「標的」結合アームを含み、当該「標的」結合アームが腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、二重特異性抗体または多重特異性抗体との関連で、腫瘍関連抗原発現細胞の死滅を誘導する。特定の腫瘍関連抗原の例として、例えば、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、β−カテニン、ｂｒｃ−ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、炭酸脱水酵素ＩＸ、カスパーゼ−８、ＣＤ４０、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ４、サイクリン−Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ−１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（例えば、ＧＡＧＥ−１、−２）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン−３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ−ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ−ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ−Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥタンパク質（例えば、ＭＡＧＥ−１、−２、−３、−４、−６、及び−１２）、ＭＡＲＴ−１、メソセリン、ＭＬ−ＩＡＰ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６（ＣＡ−１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ−ＢＲ１、ＮＹ−ＢＲ６２、ＮＹ−ＢＲ８５、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、Ｓｔｅａｐ−１、Ｓｔｅａｐ−２、スルビビン、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｎ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、及び、ウロプラキン−３があるが、これらに限定されない。その他の実施形態では、ＣＤ６３結合アームは、ヒト及びカニクイザル（サル）ＣＤ６３と弱く結合または会合するが、それでもなお、結合相互作用は、当該技術分野で公知のインビトロアッセイでは検出できない。
【００９８】
本発明の特定の例示的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体の各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）、及び、軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を含む。第１及び第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗体）に関して、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ａ１」を付けて示し、そして、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、接頭辞「Ａ２」を付けて示し得る。したがって、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書では、Ａ１−ＨＣＤＲ１、Ａ１−ＨＣＤＲ２、及び、Ａ１−ＨＣＤＲ３と称し得るものであり、また、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲを、本明細書では、Ａ２−ＨＣＤＲ１、Ａ２−ＨＣＤＲ２、及び、Ａ２−ＨＣＤＲ３と称し得る。
【００９９】
第１の抗原結合ドメイン、及び、第２の抗原結合ドメインは、互いに直接的または間接的に接続して、本発明の二重特異性抗原結合分子を形成し得る。あるいは、第１の抗原結合ドメイン、及び、第２の抗原結合ドメインは、それぞれ、別個の多量体化ドメインに接続し得る。ある多量体化ドメインと、別の多量体化ドメインとの会合は、２つの抗原結合ドメイン間の会合を促し、それにより、二重特異性抗原結合分子を形成する。「多量体化ドメイン」は、同じ、または、類似の構造または構成の第２の多量体化ドメインと会合する能力を有するあらゆる高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または、アミノ酸である。例えば、多量体化ドメインを、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドとし得る。多量体化成分の例として、免疫グロブリンのＦｃ部分（ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む）、例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び、ＩｇＧ４から選択するＩｇＧのＦｃドメイン、ならびに、各アイソタイプ群内のアロタイプがあるが、これらに限定されない。
【０１００】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、一般的には、２つの多量体化ドメイン、例えば、それぞれ別個の抗体重鎖の一部である２つのＦｃドメインを含む。第１及び第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４などの同じＩｇＧアイソタイプとし得る。あるいは、第１及び第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４などの異なるＩｇＧアイソタイプとし得る。
【０１０１】
特定の実施形態では、多量体化ドメインは、Ｆｃフラグメント、または、少なくとも１つのシステイン残基を含有する長さが１〜約２００アミノ酸のアミノ酸配列である。その他の実施形態では、多量体化ドメインは、システイン残基、または、短いシステイン含有ペプチドである。その他の多量体化ドメインは、ロイシンジッパー、ヘリックスループノチーフ、または、コイルドコイルモチーフを含み、または、それらからなるペプチドまたはポリペプチドを含む。
【０１０２】
あらゆる二重特異性抗体フォーマット、または、技術を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子を作り出し得る。例えば、第１の抗原結合特異性を有する抗体、または、そのフラグメントは、第２の抗原結合性を有するその他の抗体、または、抗体フラグメントなどの１つ以上のその他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合などで）機能的に連結して、二重特異性抗原結合分子を生成することができる。本発明に関して使用できる特定の例示的な二重特異性フォーマットとして、例えば、ｓｃＦｖをベースとしたフォーマット、または、ダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブズ−イントゥ−ホールズ、共通の軽鎖（例えば、ノブズ−イントゥ−ホールズを備えた共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、及び、Ｍａｂ２二重特異性フォーマットがあるが、これらに限定されない（前出のフォーマットの総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ    ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ  ４：６，１−１１、及び、そこで引用されている参考文献を参照されたい）。
【０１０３】
本発明の二重特異性抗原結合分子に関して、多量体化ドメイン、例えば、Ｆｃドメインは、天然に存在する野生型のＦｃドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失、または、置換）を含み得る。例えば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎとの間の修飾した結合相互作用（例えば、増強または減少）を有する修飾したＦｃドメインをもたらす、Ｆｃドメインでの１つ以上の修飾を含む二重特異性抗原結合分子を含む。ある実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、ＣＨ２またはＣＨ３領域に修飾を含み、この修飾は、酸性環境（例えば、ｐＨ範囲約５．５〜約６．０のエンドソーム内）において、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を高める。そのようなＦｃ修飾の例として、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）；２５０位、及び、４２８位（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、及び、２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾；または、４２８位、及び／または、４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、及び／または、４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）での修飾；あるいは、２５０位、及び／または、４２８位での修飾；あるいは、３０７位または３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び、４３４位での修飾があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）、及び、４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び、３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び、４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、及び、２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑ、及び、４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ、及び、Ｍ４２８Ｌ）；及び、３０７、及び／または、３０８の修飾（例えば、３０８Ｆ、または、３０８Ｐ）を含む。
【０１０４】
本発明は、第１のＣＨ３ドメイン、及び、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインを含む二重特異性抗原結合分子も含み、第１及び第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸で互いに相違しており、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違が無い二重特異性抗体と比較して、プロテインＡに対する二重特異性抗体の結合を抑制する。ある実施形態では、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、プロテインＡを結合し、そして、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン付番法による；ＥＵ付番法ではＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を、抑制または排除する変異を含む。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号を参照されたい。第２のＣＨ３内で認め得るさらなる修飾として；ＩｇＧ１抗体の事例では、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及び、Ｖ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及び、Ｖ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の事例では、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及び、Ｖ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及び、Ｖ４２２Ｉ）；及び、ＩｇＧ４抗体の事例では、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及び、Ｖ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及び、Ｖ４２２Ｉ）がある。
【０１０５】
特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプに由来するＦｃ配列を組み合わせたキメラとし得る。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、または、ヒトＩｇＧ４のＣＨ２領域に由来するＣＨ２配列の一部または全部、及び、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、または、ヒトＩｇＧ４に由来するＣＨ３配列の一部または全部を含むことができる。また、キメラＦｃドメインは、キメラヒンジ領域を含むことができる。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、または、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、または、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」配列を含み得る。本明細書に記載した抗原結合分子のいずれかが含むことができるキメラＦｃドメインの特定の例として、Ｎ末端からＣ末端に向けて；［ＩｇＧ４    ＣＨ１］−［ＩｇＧ４上方ヒンジ］−［ＩｇＧ２下方ヒンジ］−［ＩｇＧ４    ＣＨ２］−［ＩｇＧ４    ＣＨ３］がある。本明細書に記載した抗原結合分子のいずれかが含むことができるキメラＦｃドメインの別の例として、Ｎ末端からＣ末端に向けて；［ＩｇＧ１    ＣＨ１］−［ＩｇＧ１上方ヒンジ］−［ＩｇＧ２下方ヒンジ］−［ＩｇＧ４    ＣＨ２］−［ＩｇＧ１    ＣＨ３］がある。本発明の抗原結合分子のいずれかが含むことができるキメラＦｃドメインのこれら、及び、その他の例は、２０１４年８月２８日に公開された米国特許公開第２０１４／０２４３５０４号に記載されており、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する。これらの一般的な構造配置を有するキメラＦｃドメイン、及び、その変異体は、Ｆｃ受容体結合を改変することができ、そのことが、Ｆｃエフェクター機能に影響を与える。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明は、重鎖定常領域（ＣＨ）領域が、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、または、配列番号３５１のいずれか１つに対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％が同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖を提供する。一部の実施形態では、重鎖定常領域（ＣＨ）領域は、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、または、配列番号３５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
その他の実施形態では、本発明は、Ｆｃドメインが、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、または、配列番号３６３のいずれか１つに対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％が同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖を提供する。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、または、配列番号３６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
マルチドメイン治療用タンパク質
図１は、マルチドメイン治療用タンパク質の様々な例を図示している。一例（図１、パネルＡ）では、マルチドメイン治療用タンパク質は、酵素（六角形で表した）、及び、酵素（破線）と内在化エフェクター（実線）とを結合する二重特異性抗体（ＩＥ−ＢＰ）とを含む。ここで、二重特異性抗体の一方のアームは、酵素に非共有結合しており、そして、他方のアームは、内在化エフェクターに非共有結合しており、それにより、補充酵素を、細胞内または細胞内区画に内在化させることができる。別の例（パネルＢ）では、マルチドメイン治療用タンパク質は、２つのポリペプチドを含む単一のタンパク質を含み、その一方のポリペプチドは、酵素機能を有しており、そして、他方は、送達ドメイン機能を有する。ここで、酵素は、イムノグロブリンＦｃドメイン、または、重鎖定常領域に融合しており、このものが、酵素半抗体のＦｃドメインと会合して、二機能性マルチドメイン治療用タンパク質を形成する。パネルＢに図示した実施形態は、酵素が、半抗体のイムノグロブリン可変ドメインでの抗原抗体相互作用を介しておらず、半抗体の一方に共有結合で付加していることを除いて、パネルＡの実施形態と同様である。
【０１０９】
その他の例では、マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメインに（直接的に、または、リンカーを介して間接的に）共有結合的に連結させた酵素からなる。ある実施形態では、酵素は、イムノグロブリン分子（例えば、重鎖、または、代替的に軽鎖）のＣ末端に結合している。別の実施形態では、酵素は、イムノグロブリン分子（例えば、重鎖、または、代替的に軽鎖）のＮ末端に結合している。これらの例では、イムノグロブリン分子は、送達ドメインである。さらに別の実施形態では、酵素は、内在化エフェクターに結合するｓｃＦｖ分子のＣ末端に結合する。
【０１１０】
ある実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、２つの送達ドメインを含む。ある実施形態では、第１の送達ドメインは、リソソーム輸送分子、または、その他の内在化エフェクター（例えば、ＣＤ６３）と結合する。別の実施形態では、第２の送達ドメインは、トランスサイトーシスエフェクターと結合して、マルチドメイン治療用タンパク質の経細胞輸送を促す。ある実施形態では、トランスサイトーシスエフェクターは、特に、ＬＤＬ受容体、ＩｇＡ受容体、トランスフェリン受容体、または、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）である。特定の実施形態では、トランスサイトーシス送達ドメインは、トランスフェリン受容体に結合する分子、例えば、抗トランスフェリン受容体抗体、または、抗トランスフェリン受容体ｓｃＦｖ分子などを含む。Ｔｕｍａ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂａｒｄ、“Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ：Ｃｒｏｓｓｉｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂａｒｒｉｅｒｓ，”Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，８３（３）：８７１−９３５（１  Ｊｕｌｙ  ２００３）は、本発明の実施において有用なトランスサイトーシスを媒介する細胞表面受容体に関して、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０１１１】
「酵素ドメイン」または「酵素」は、酵素欠損症の病因、または、生理学的効果に関連するあらゆるタンパク質のことを意味する。酵素として、実在の酵素、輸送タンパク質、受容体があり、または、欠陥を有しており、かつ、疾患の原因となった分子的損傷があると考えられるその他のタンパク質がある。また、酵素として、疾患の分子病変を置換または回避する、同様の、または、十分な生化学的または生理学的活性を提供できるあらゆるタンパク質がある。例えば、「アイソザイム」は、酵素として使用し得る。
【０１１２】
一部の実施形態では、酵素は、ヒドロラーゼであり、エステラーゼ、グリコシラーゼ、エーテル結合に作用するヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、線状アミダーゼ、ジホスファターゼ、ケトンヒドロラーゼ、ハロゲナーゼ、ホスホアミダーゼ、スルホヒドロラーゼ、スルフィナーゼ、デスルフィナーゼなどがある。一部の実施形態では、酵素は、グリコシラーゼであり、グリコシダーゼ、及び、Ｎ−グリコシラーゼがある。一部の実施形態では、酵素は、グリコシダーゼであり、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、グルカン１，４−アルファ−グルコシダーゼ、セルロース、エンド−１，３（４）−ベータ−グルカナーゼ、イヌリナーゼ、エンド−１，４−ベータ−キシラナーゼ、エンド−１，４−ｂ−キシラナーゼ、デキストラナーゼ、キチナーゼ、ポリガラクツロニダーゼ、リソザイム、エクソ−アルファ−シアリダーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルファ−マンノシダーゼ、ベータ−マンノシダーゼ、ベータ−フルクトフラノシダーゼ、アルファ，アルファ−トレハロース、ベータ−グルクロニダーゼ、キシランエンド−１，３−ベータ−キシロシダーゼ、アミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、ヒアルロノグルクロニダーゼなどがある。
【０１１３】
分子の欠陥が、α−グルコシダーゼ活性の欠陥であるポンペ病の場合には、酵素として、ヒトアルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、及び、「アイソザイム」、例えば、その他のアルファ−グルコシダーゼ類、遺伝子操作した組換えアルファ−グルコシダーゼ、その他のグルコシダーゼ類、組換えグルコシダーゼ類、非還元末端１−４連結アルファ−グルコース残基を加水分解して、単一のアルファグルコース分子を放出するように遺伝子操作したあらゆるタンパク質、あらゆるＥＣ３．２．１．２０酵素、グリコーゲンまたはデンプンのための天然または組換えの低ｐＨ糖質加水分解酵素、及び、グルコシルヒドロラーゼ、例えば、スクラーゼ・イソマルターゼ、マルターゼ・グルコアミラーゼ、グルコシダーゼＩＩ、及び、中性アルファ−グルコシダーゼなどがある。例示的な遺伝子治療用ベクター
【０１１４】
生殖細胞変異
本明細書に開示する抗ＣＤ６３抗体は、抗体が由来する生殖系列配列と比較して、重鎖可変ドメインのフレームワーク領域、及び／または、ＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または、欠失を含み得る。
【０１１５】
また、本発明は、本明細書に開示したアミノ酸配列のいずれかに由来する本発明の抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）を含み、１つ以上のフレームワーク、及び／または、ＣＤＲ領域内での１つ以上のアミノ酸を、抗体が由来する生殖系列配列での対応する残基（複数可）、または、別のヒト生殖系列配列での対応する残基（複数可）、または、対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換へと変異させ（このような配列変化を、本明細書では「生殖系列変異」と総称する）、そして、ＣＤ６３抗原に対する検出可能な結合は、弱く、または、皆無である。ＣＤ６３を認識する幾つかのかような例示的抗体を、本明細書の表１に記載している。
【０１１６】
さらに、本発明の抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）は、フレームワーク、及び／または、ＣＤＲ領域内での２つ以上の生殖系列変異のあらゆる組み合わせを含み得るものであり、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対して、元の生殖系列配列とは異なるある特定のその他の残基は、維持され、または、異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異する。一旦取得してしまえば、１つ以上の生殖系列変異を含む抗体、及び、抗体結合フラグメントを、結合特異性の向上、結合または結合親和性の弱化または抑制、薬物動態学的特性の向上または増強、免疫原性の抑制などの１つ以上の所望の特性に関して試験することができる。本開示の指針を考慮して、この一般的な方法で得た抗体、及び、抗原結合フラグメントは、本発明の範囲内に属する。
【０１１７】
また、本発明は、本明細書に開示したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含み、１つ以上の保存的置換を有する抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）を含む。例えば、本発明は、本明細書の表１に記載したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、または、４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）を含む。本発明の抗体、その抗原結合フラグメント、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質は、個々の抗原結合ドメインが由来となる対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク、及び／または、ＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または、欠失を含むが、例えば、ＣＤ６３抗原に対する所望の弱い結合から検出不可能な結合を維持または改善する。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換したものである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない、すなわち、アミノ酸置換が、抗ＣＤ６３結合分子の事例では、所望の弱い結合から検出不可能な結合、または、結合親和性を維持または改善する。同様の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例として、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及び、イソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン、及び、トレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン、及び、グルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及び、トリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及び、ヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸、及び、グルタミン酸；及び（７）硫黄含有側鎖：システイン、及び、メチオニンがある。好ましい保存的アミノ酸置換基は；バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及び、アスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、Ｇｏｎｎｅｔ    ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５に開示されている、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有するあらゆる変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて、負以外の値を有するあらゆる変化である。
【０１１８】
また、本発明は、本明細書で開示したＨＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと実質的に同一であるＨＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）を含むが、ＣＤ６３抗原に対する所望の弱い親和性を維持または改善する。アミノ酸配列に関連する用語「実質的な同一性」または「実質的に同一の」は、２つのアミノ酸配列が、既定のギャップ重みを用いてプログラムＧＡＰ、または、ＢＥＳＴＦＩＴなどで最適に整列させた場合に、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％、または、９９％の配列同一性を共有する、ことを意味している。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換だけ互いに異なる事例では、配列同一性の割合、または、類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整し得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。
【０１１９】
ポリペプチドに対する配列類似性、別名、配列同一性は、一般的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定する。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、及び、その他の修飾に対して割り当てた類似の測定値を使用して、類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物に由来する相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチドの間、または、野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメーターと共に使用することができるＧａｐ、及び、Ｂｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムである、既定パラメーターまたは推奨パラメーターを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２、及び、ＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複の領域の整列とパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）前掲）。本発明の配列を、異なる生物に由来する数多くの配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメーターを用いるコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特に、ＢＬＡＳＴＰ、または、ＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ    ｅｔ    ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、及び、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照されたい。
【０１２０】
一旦取得してしまえば、１つ以上の生殖系列変異を含む抗原結合ドメインを、１つ以上のインビトロアッセイを利用して、結合親和性の抑制について試験した。特定の抗原を認識する抗体は、一般的には、抗原に対する高い（すなわち、強い）結合親和性について試験することで、それらの目的がスクリーニングされるが、本発明の抗体は、弱い結合、または、検出不可能な結合を示す。この一般的な方法で得た１つ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子もまた本発明の範囲に属しており、結合活性駆動腫瘍療法として有利であることを見出した。
【０１２１】
予想外の利益、例えば、改善した薬物動態特性、及び、患者に対する低毒性が、本明細書に記載の方法によって、本発明の抗体をさらに修飾することで実現し得る。
【０１２２】
抗体の結合特性
抗体、免疫グロブリン、抗体結合フラグメント、または、Ｆｃ含有タンパク質の、例えば、細胞表面タンパク質、または、そのフラグメントなどの所定の抗原に対する結合に関する用語「結合」とは、一般的には、抗体−抗原相互作用などの、最低でも２つの実体、または、分子構造間の相互作用または会合のことを指す。
【０１２３】
例えば、結合親和性は、リガンドとして抗原を使用し、そして、分析物（または、抗リガンド）として抗体、Ｉｇ、抗体結合フラグメント、または、Ｆｃ含有タンパク質を使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ    ３０００機器での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術で決定する場合、一般的には、約１０−７Ｍ以下、例えば、約１０−８Ｍ以下、例えば、約１０−９Ｍ以下のＫＤ値に対応する。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）結合アッセイなどの細胞をベースとした結合戦略もまた、日常的に使用されており、そして、細胞表面に発現するタンパク質に関する結合特性データを提供する。ＦＡＣＳデータは、放射性リガンド競合結合、及び、ＳＰＲなどのその他の方法とよく相関する（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，ＣＡ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７，２０１（２）：２２３−３１；Ｇｅｕｉｊｅｎ，ＣＡ，ｅｔ    ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５，３０２（１−２）：６８−７７）。
【０１２４】
したがって、抗ＣＤ６３抗体及びその抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）は、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合の親和性よりも少なくとも１０倍低いＫＤ値に対応する親和性を有する所定の抗原、または、細胞表面分子（受容体）に結合する。本発明によると、非特異的抗原よりも１０倍以下の低いＫＤ値に対応する抗体の親和性は、検出不可能な結合とみなすし得るが、そのような抗体は、本発明の二重特異性抗体を生産するための第２の抗原結合アームとペアを形成し得る。
【０１２５】
モル（Ｍ）における用語「ＫＤ」または「ＫＤ」とは、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数、または、抗原に結合する抗体または抗体結合フラグメントの解離平衡定数のことを指す。ＫＤと結合親和性との間には逆の関係があり、したがって、ＫＤ値が小さいほど、親和性は高い、すなわち、より強くなる。したがって、用語「より高い親和性」または「より強い親和性」は、相互作用を形成する能力が高い、つまり、より小さいＫＤ値に関するものであり、逆に、用語「より低い親和性」または「より弱い親和性」は、相互作用を形成する能力が低い、つまり、より大きなＫＤ値に関する。一部の状況では、別の相互作用パートナー分子（例えば、抗原Ｙ）に対する分子（例えば、抗体）の結合親和性と比較して、その相互作用パートナー分子（例えば、抗原Ｘ）に対する特定の分子（例えば、抗体）のより高い結合親和性（または、ＫＤ）は、より大きなＫＤ値（より低い、または、より弱い親和性）を、より小さなＫＤ（より高い、または、より強い親和性）で割って決定した結合率として表され、例えば、場合によっては、５倍または１０倍高い結合親和性として表される。
【０１２６】
一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子、または、そのコンジュゲートは、ＣＤ６３に対するその結合親和性の１０倍を超える結合親和性（ＫＤ値）で、標的分子に結合する。このように、二重特異性分子は、ＣＤ６３に対する結合親和性よりも、標的分子に対する結合親和性がはるかに強い。一部の事例では、結合親和性は、３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイ、または、同等のアッセイで測定する。
【０１２７】
用語「ｋｄ」（ｓｅｃ  −１、または、１／ｓ）は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数、または、抗体または抗体結合フラグメントの解離速度定数のことを指す。その値は、ｋｏｆｆ値とも称する。
【０１２８】
用語「ｋａ」（Ｍ−１×ｓｅｃ−１、または、１／Ｍ）は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数、または、抗体または抗体結合フラグメントの会合速度定数のことを指す。
【０１２９】
用語「ＫＡ」（Ｍ−１、または、１／Ｍ）は、特定の抗体−抗原相互作用の会合平衡定数、または、抗体または抗体結合フラグメントの会合平衡定数のことを指す。会合平衡定数は、ｋａをｋｄで割って得る。
【０１３０】
用語「ＥＣ５０」または「ＥＣ５０」は、最大半量の有効濃度のことを指し、特定の曝露時間の後に、ベースラインと最大値との間の中間で応答を誘導する抗体の濃度を含む。ＥＣ５０は、本質的に、その最大効果の５０％が認められる抗体の濃度を表す。特定の実施形態では、ＥＣ５０値は、例えば、ＦＡＣＳ結合アッセイによって決定するように、ＣＤ６３または腫瘍関連抗原を発現する細胞に対して最大半量の結合を与える本発明の抗体の濃度に等しい。したがって、低下した、または、弱い結合は、増加した、ＥＣ５０、または、最大半量の有効濃度値で認められる。
【０１３１】
ある実施形態では、結合の抑制は、最大半量の標的細胞に対する結合を可能にするＥＣ５０抗体濃度の増加として定義することができる。
【０１３２】
配列変異体
抗ＣＤ６３抗体及びその抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）は、個々の抗原結合ドメインが由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク、及び／または、ＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／または、欠失を含み得る。このような変異は、本明細書に開示した例示的アミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することで、容易に確認することができる。本発明の抗原結合分子は、本明細書に開示するアミノ酸配列のいずれかに由来する抗原結合フラグメントを含み、１つ以上のフレームワーク、及び／または、ＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）、または、別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）、または、対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換へ変異する（このような配列変化を、本明細書では「生殖系列変異」と総称する）。当業者であれば、本明細書に開示する重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異、または、これらの組み合わせを含む数多くの抗体、及び、抗体結合フラグメントを容易に生産することができる。特定の実施形態では、ＶＨ、及び／または、ＶＬドメイン内のフレームワーク、及び／または、ＣＤＲ残基はすべて、抗体が由来する元の生殖系列配列において認められる残基へと変異して戻される。その他の実施形態では、ある特定の残基だけが、元の生殖系列配列へと変異して戻され、例えば、変異した残基だけが、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、または、ＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められ、または、変異した残基だけが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、または、ＣＤＲ３内に認められる。その他の実施形態では、フレームワーク、及び／または、ＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元来由来している生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へと変異する。さらに、本発明の抗原結合ドメインは、フレームワーク、及び／または、ＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異のあらゆる組み合わせを含有し得るものであり、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へと変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なる特定のその他の残基は、維持され、または、異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異する。一旦取得してしまえば、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗原結合ドメインは、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合によるが）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について、容易に試験することができる。本発明の範囲には、この一般的な方法で得られた１つ以上の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子が含まれる。
【０１３３】
また、本発明は、一方または両方の抗原結合ドメインが、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗原結合分子を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、または、４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合分子を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換したものである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。同様の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例として、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及び、イソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン、及び、トレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン、及び、グルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及び、トリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及び、ヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸、及び、グルタミン酸；及び（７）硫黄含有側鎖：システイン、及び、メチオニンがある。好ましい保存的アミノ酸置換基は；バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及び、アスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、本明細書の一部を構成するものとして援用する、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ    ２５６：１４４３−１４４５に開示されている、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有するあらゆる変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて、負以外の値を有するあらゆる変化である。
【０１３４】
また、本発明は、本明細書で開示したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと実質的に同一であるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／または、ＣＤＲアミノ酸配列を有する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を含む。アミノ酸配列に関連する用語「実質的な同一性」または「実質的に同一の」は、２つのアミノ酸配列が、既定のギャップ重みを用いてプログラムＧＡＰ、または、ＢＥＳＴＦＩＴなどで最適に整列させた場合に、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％、または、９９％の配列同一性を共有する、ことを意味している。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換だけ互いに異なる事例では、配列同一性の割合、または、類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整し得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、本明細書の一部を構成するものとして援用する、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。
【０１３５】
ポリペプチドに対する配列類似性、別名、配列同一性は、一般的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定する。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、及び、その他の修飾に対して割り当てた類似の測定値を使用して、類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物に由来する相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチドの間、または、野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメーターと共に使用することができるＧａｐ、及び、Ｂｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムである、既定パラメーターまたは推奨パラメーターを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２、及び、ＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複の領域の整列とパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）前掲）。本発明の配列を、異なる生物に由来する数多くの配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメーターを用いるコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特に、ＢＬＡＳＴＰ、または、ＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それぞれの内容を援用する、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、及び、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照されたい。
【０１３６】
ｐＨ依存性結合
本発明は、ｐＨ依存的な結合特性を有する、抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）を含む。例えば、本発明の抗ＣＤ６３抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＣＤ６３に対する結合の低下を示し得る。あるいは、本発明の抗ＣＤ６３抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＣＤ６３に対する結合の増強を示し得る。表現「酸性ｐＨ」とは、約６．２未満、例えば、約６．０、５．９５、５、９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０以下のｐＨ値を含む。表現「中性ｐＨ」は、約７．０〜約７．４のｐＨを意味する。表現「中性ｐＨ」は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、及び、７．４のｐＨ値を含む。
【０１３７】
特定の事例では、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨで．．．結合の低下」とは、中性ｐＨでその抗原に結合する抗体のＫＤ値に対する、酸性ｐＨでその抗原に結合する抗体のＫＤ値の比（または、その逆）を表す。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントが、約３．０以上の酸性／中性ＫＤ比を示す場合、本発明の目的のために、抗体またはその抗原結合フラグメントは「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨではＣＤ６３に対する結合の低下」を示す、とみなし得る。特定の例示的実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの酸性／中性ＫＤ比を、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０以上とし得る。
【０１３８】
ｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨで特定の抗原に対する結合の低下（または、増強）について、抗体の集団をスクリーニングすることで取得し得る。加えて、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの修飾は、ｐＨ依存的特徴を有する抗体を生産し得る。例えば、抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ内）の１つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換すると、中性ｐＨに対して酸性ｐＨで抗原結合が低下した抗体を取得し得る。
【０１３９】
Ｆｃ変異体を含む抗体
本発明の特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較した酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体に結合する抗体を増強または低下させる１つ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）を提供する。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗体を含み、変異（複数可）は、酸性環境において（例えば、ｐＨが、約５．５〜約６．０の範囲のエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を高める。そのような突然変異は、動物に投与したときに、抗体の血清半減期の延長をもたらし得る。そのようなＦｃ修飾の例として、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）；２５０位及び４２８位（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、及び、２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾；または、４２８位、及び／または、４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、及び／または、４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）での修飾；あるいは、２５０位及び／または４２８位の修飾；あるいは、３０７位または３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び、４３４位での修飾があるが、これらに限定されない。ある実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）、及び、４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び、３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び、４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、及び、２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑ及び４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；及び、３０７及び／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。
【０１４０】
例えば、本発明は、２５０Ｑ、及び、２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０Ｑ、及び、Ｍ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び、２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及び、Ｔ２５６Ｅ）；４２８Ｌ、及び、４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ、及び、Ｎ４３４Ｓ）；及び、４３３Ｋ、及び、４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３Ｋ、及び、Ｎ４３４Ｆ）からなる群から選択される１つ以上のペアまたは群の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）を含む。前出のＦｃドメイン変異、及び、本明細書で開示した抗体可変ドメイン内のその他の変異のすべての可能な組み合わせを、本発明の範囲内で企図している。
【０１４１】
抗体及び二重特異性抗原結合分子の生物学的特性
本発明は、治療状況、及び、所望の特定の標的化特性に応じて、高い、中位の、または、低い親和性でヒトＣＤ６３に結合する、抗体、及び、その抗原結合フラグメントを含む。例えば、一方のアームが、ＣＤ６３に対して結合し、かつ、他方のアームが、標的抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に結合する二重特異性抗原結合分子に関しては、標的抗原結合アームが、標的抗原には高い親和性で結合する一方で、抗ＣＤ６３アームが、中位または低いの親和性でしかＣＤ６３に対して結合しない、ことが望ましい。このようにして、標的抗原を発現する細胞に対する抗原結合分子の優先的標的化は、一般的／非標的化ＣＤ６３結合、及び、それに関連する結果として生じる有害な副作用を回避しながら達成し得る。
【０１４２】
本発明は、ヒトＣＤ６３に対して弱く（すなわち、低位の）結合をし、または、検出可能な親和性さえも示さずに結合する抗体、抗原結合フラグメント、及び、それらの二重特異性抗体を含む。特定の実施形態によれば、本発明は、表面プラズモン共鳴で測定した、約１００ｎＭを超えるＫＤで、ヒトＣＤ６３に対して（例えば、３７℃で）結合する、抗体、及び、抗体の抗原結合フラグメントを含む。特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴（例えば、ｍＡｂ捕捉、または、抗原捕捉フォーマット）、または、実質的に同様のアッセイで測定した、約１１０ｎＭを超える、少なくとも１２０ｎＭ、約１３０ｎＭを超える、約１４０ｎＭを超える、約１５０ｎＭを超える、少なくとも１６０ｎＭ、約１７０ｎＭを超える、約１８０ｎＭを超える、約１９０ｎＭを超える、約２００ｎＭを超える、約２５０ｎＭを超える、約３００ｎＭを超える、約４００ｎＭを超える、約５００ｎＭを超える、約６００ｎＭを超える、約７００ｎＭを超える、約８００ｎＭを超える、約９００ｎＭを超える、または、約１μＭを超えるＫＤでＣＤ６３に対して結合し、または、検出可能な親和性を示さない。
【０１４３】
本発明は、サル（すなわち、カニクイザル）ＣＤ６３に、弱い（すなわち、低位の）または、検出不可能な親和性ですら結合する、抗体、抗原結合フラグメント、及び、それらの二重特異性抗体を含む。
【０１４４】
エピトープマッピング及び関連技術
本発明の抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）が結合するＣＤ６３のエピトープは、３つ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または、それより多数）のＣＤ６３タンパク質のアミノ酸の単一連続配列からなり得る。あるいは、エピトープは、ＣＤ６３の複数の非連続アミノ酸（または、アミノ酸配列）からなり得る。用語「エピトープ」とは、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基のことを指す。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原での異なる領域に結合し得るものであり、かつ、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座、または、線状のいずれにでもし得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置したアミノ酸によって生産される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖での隣接するアミノ酸残基によって生産される。特定の状況では、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、または、スルホニル基の部分を含み得る。
【０１４５】
当業者に公知の様々な技術を使用して、抗体の抗原結合ドメインが、ポリペプチドまたはタンパク質内にある「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」か否かを判定することができる。例示的な技術として、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載されている通常のクロスブロッキングアッセイ、アラニンスキャニング突然変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−４６３）、及び、ペプチド切断分析がある。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、及び、抗原の化学修飾などの方法を、使用することができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）。抗体の抗原結合ドメインが相互作用するポリペプチドでのアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析で検出される水素／重水素交換である。一般的に、水素／重水素交換法は、関心を寄せているタンパク質を重水素標識した後に、抗体を、重水素標識タンパク質に対して結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を、水に移して、抗体が保護している（重水素標識したままの）残基以外のすべての残基で、水素−重水素交換を生じさせる。抗体を解離した後に、標的タンパク質を、プロテアーゼ切断、及び、質量分析に供し、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７（２）：２５２−２５９、Ｅｎｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａを参照されたい。また、抗原／抗体複合体のＸ線結晶解析も、エピトープマッピングの目的に使用し得る。
【０１４６】
さらに、本発明は、本明細書に記載した特定の例示的な抗体（例えば、本明細書の表１に記載したアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと、同じエピトープに結合する抗ＣＤ６３抗体を含む。同様に、本発明は、ＣＤ６３に対する結合に関して、本明細書に記載した特定の例示的な抗体（例えば、本明細書の表１に記載したアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと競合する抗ＣＤ６３抗体も含む。
【０１４７】
特定の抗原結合分子（例えば、抗体）、または、その抗原結合ドメインが、本発明のリファレンス抗原結合分子と同じエピトープに結合するか否か、または、結合するために本発明のリファレンス抗原結合分子と競合するか否かは、当該技術分野で公知の常法を用いて容易に判定できる。例えば、試験抗体が、本発明のリファレンス二重特異性抗原結合分子と同じＣＤ６３でのエピトープに結合するか否かを決定するために、リファレンス二重特異性分子を、まず、ＣＤ６３タンパク質に結合させる。次に、ＣＤ６３分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、リファレンス二重特異性抗原結合分子と飽和結合した後にＣＤ６３に結合できれば、試験抗体は、リファレンス二重特異性抗原とは異なるＣＤ６３のエピトープに結合する、と結論付けることができる。その一方で、試験抗体が、リファレンス二重特異性抗原結合分子に飽和結合した後にＣＤ６３分子に結合できなければ、試験抗体は、本発明のリファレンス二重特異性抗原結合分子が結合したエピトープと同じＣＤ６３のエピトープへ結合し得る。次に、試験抗体で認められた結合の欠失が、実際に、リファレンス二重特異性抗原結合分子と同じエピトープに対する結合によるものであるか、それとも立体遮断（または、別の現象）が、認められた結合の欠失に起因するものであるか否かを確認するために、さらなる通例の実験（例えば、ペプチド変異、及び、結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または、当該技術分野で利用可能なあらゆるその他の定量的または定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。本発明の特定の実施形態によると、例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または、１００倍過剰量の一方の抗原結合タンパク質が、競合結合アッセイによる測定で、少なくとも５０％、しかし、好ましくは７５％、９０％、または、さらに９９％の他方の結合を阻害する場合、２つの抗原結合タンパク質は、同一（または、重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照されたい）。あるいは、一方の抗原結合タンパク質の結合を抑制または排除する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合を抑制または排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は、同じエピトープと結合するものとみなす。一方の抗原結合タンパク質の結合を抑制または排除するアミノ酸変異のサブセットだけが、他方の結合を抑制または排除する場合、２つの抗原結合タンパク質は「重複エピトープ」を有するものとみなす。
【０１４８】
抗体、または、その抗原結合ドメインが、結合に関して、リファレンス抗原結合分子と競合するか否かを決定するために、上記した結合方法を、２つの方向性で実施する：第１の方向性では、リファレンス抗原結合分子を、飽和条件下で、ＣＤ６３タンパク質に対して結合させた後に、ＣＤ６３分子に対する試験抗体の結合を評価する。第２の方向性では、試験抗体を、飽和条件下で、ＣＤ６３分子に対して結合させた後に、リファレンス抗原結合分子のＣＤ６３分子に対する結合を評価する。両方向では、第１の（飽和）抗原結合分子だけが、ＣＤ６３分子に対して結合することができる場合に、試験抗体及びリファレンス抗原結合分子は、ＣＤ６３に対する結合について、競合するものと結論する。当業者であれば、リファレンス抗原結合分子との結合について競合する抗体は、必ずしもリファレンス抗体と同一のエピトープに対して結合するわけではなく、重複または隣接しているエピトープに結合することで、リファレンス抗体の結合を立体的に遮断し得ると認識する。
【０１４９】
抗原結合ドメインの調製と二重特異性分子の構築
特定の抗原に特異的な抗原結合ドメインは、当該技術分野で公知のあらゆる抗体生産技術で調製することができる。一旦取得してしまえば、２つの異なる抗原（例えば、ＣＤ６３、及び、標的抗原）に特異的な２つの異なる抗原結合ドメインを、互いに適切に配置して、常法を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子を生産することができる。（本発明の二重特異性抗原結合分子を構築するために使用できる例示的な二重特異性抗体フォーマットの考察を、本明細書の別の箇所に提供している）。特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子の１つ以上の個々の構成要素（例えば、重鎖、及び、軽鎖）は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または、完全ヒト型抗体に由来する。そのような抗体を作り出すための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子の１つ以上の重鎖、及び／または、軽鎖は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を使用して調製することができる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（または、あらゆるその他のヒト抗体産生技術）を使用して、まず、特定の抗原（例えば、ＣＤ６３）に対する高親和性のキメラ抗体が、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有した状態で単離される。抗体を、親和性、選択性、エピトープなどの望ましい特徴について特徴決定して選択する。マウス定常領域を、所望のヒト定常領域と置換して、本発明の二重特異性抗原結合分子に組み込むことができる完全ヒト重鎖、及び／または、軽鎖を生産する。
【０１５０】
遺伝子操作した動物は、ヒト二重特異性抗原結合分子を作り出すために使用し得る。例えば、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変配列を再編成及び発現することができない遺伝子改変マウスを使うことができ、マウスは、内在性マウスカッパ遺伝子座のマウスカッパ定常遺伝子に作動可能に連結されているヒト免疫グロブリン配列によってコードされる１つまたは２つのヒト軽鎖可変ドメインだけを発現する。そのような遺伝子改変マウスを使用して、重鎖及び軽鎖可変領域を単離して、完全ヒト二重特異性抗原結合分子を生産することできる。このように、完全ヒト二重特異性抗原結合分子は、同じ軽鎖と会合する２つの異なる重鎖を含む。（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４を参照されたい）。完全ヒト型とは、抗体、または、その抗原結合フラグメント、または、その免疫グロブリンドメインの各ポリペプチドの全長に及ぶヒト配列に由来するＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を含む、抗体、または、その抗原結合フラグメント、または、その免疫グロブリンドメインのことを指す。一部の事例では、完全ヒト型配列は、ヒトに対して内因性のタンパク質に由来する。その他の例では、完全ヒトタンパク質、または、タンパク質配列は、各成分配列がヒト配列に由来しているキメラ配列を含む。いかなる理論にも拘束されるものではないが、キメラタンパク質、または、キメラ配列は、一般的に、例えば、あらゆる野生型ヒト免疫グロブリン領域、または、ドメインと比較して、成分配列の接合部における免疫原性エピトープの生成を最小にするようにデザインする。
【０１５１】
二重特異性抗原結合分子は、プロテインＡに対する自らの結合を喪失する修飾Ｆｃドメインを有する１つの重鎖で構築することができ、したがって、ヘテロ二量体タンパク質を生成する精製方法を可能にする。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号を参照されたい。したがって、二重特異性抗原結合分子は、第１のＣＨ３ドメイン、及び、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインを含み、第１及び第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸が互いに異なり、また、アミノ酸の相違を持たない二重特異性抗体と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の相違が、プロテインＡに対する二重特異性抗体の結合を抑制する。ある実施形態では、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対して結合し、そして、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン付番法による；ＥＵ付番法ではＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を抑制または排除する突然変異／修飾を含む。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。
【０１５２】
生物学的等価物
本発明は、本明細書に開示した例示的な分子のものとは異なるが、ＣＤ６３に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有する抗原結合分子を含む。このような変異体分子は、親配列と比較してアミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または、置換を含むが、説明した二重特異性抗原結合分子の生物学的活性とは本質的に等価である生物学的活性を呈する。
【０１５３】
本発明は、本明細書に記載した例示的な抗原結合分子のいずれかと生物学的に等価な抗原結合分子を含む。２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、それらが、類似の実験条件下で、単回用量または複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与した場合に、吸収速度、及び、吸収の程度に有意差が認められない医薬的等価物または医薬的代替物であれば、生物学的等価物とみなす。これらの吸収の程度は等価であるが、吸収速度は等価ではなく、吸収速度におけるこのような差異が意図的であり、かつ、標識に反映されているので生物学的に等価とみなし得る場合には、一部の抗原結合タンパク質を、等価物または医薬代替物とみなしており、例えば、長期使用に及ぼす有効な身体薬剤濃度の達成に必須のものではなく、また、試験した特定の薬剤にとって医学的に有意でないものとみなす。
【０１５４】
ある実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、及び、効力において臨床的に有意性のある差異がない場合、生物学的に等価である。
【０１５５】
ある実施形態では、免疫原性の臨床的に有意な変化、または、有効性の低下を含む有害作用のリスクにおいて予想される上昇を伴わずに、リファレンス産物と生物産物との間で患者が１回以上の切り替えができる場合に、２つの抗原結合タンパク質は、そのような切り替え無しで継続する療法と比較して、生物学的に等価である。
【０１５６】
ある実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらが両方ともに、条件または使用条件についての共通の機序または作用機序によって、そのような機序が公知である程度にまで作用する場合、生物学的に等価である。
【０１５７】
生物学的等価性は、インビボ及びインビトロの方法で実証し得る。生物学的等価性の測定法として、例えば、（ａ）抗体、または、その代謝産物の濃度を、血液、血漿、血清、または、その他の生物学的流体での時間の関数として測定する、ヒトまたはその他の哺乳動物におけるインビボでの試験；（ｂ）ヒト生物学的利用能データと相関した、このデータを合理的に予測しているインビトロ試験；（ｃ）抗体（または、その標的）の適切な急性薬理学的効果を時間の関数として測定する、ヒトまたはその他の哺乳動物におけるインビボ試験；及び（ｄ）抗原結合タンパク質の安全性、効能、または、生物学的利用能、または、生物学的等価性を確立する十分に管理した臨床試験がある。
【０１５８】
本明細書に記載した例示的な二重特異性抗原結合分子の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基または配列に種々の置換を招くこと、または、生物活性に必要とされない末端または内部の残基または配列を欠失することで構築し得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際に不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失するか、または、その他のアミノ酸で置換することができる。その他に関して、生物学的に等価な抗原結合タンパク質は、分子のグリコシル化特性を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を含む、本明細書に記載した例示的な二重特異性抗原結合分子の変異体を含み得る。
【０１５９】
種の選択性と種の交差反応性
本発明の特定の実施形態によると、ヒトＣＤ６３に結合するが、その他の種に由来するＣＤ６３には結合しない抗原結合分子を提供する。また、本発明は、ヒトＣＤ６３、及び、１つ以上の非ヒト種に由来するＣＤ６３に結合する抗原結合分子を含む。
【０１６０】
本発明の特定の例示的な実施形態によると、抗原結合分子を提供しており、同抗原結合分子は、ヒトＣＤ６３に対して結合し、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、または、チンパンジーＣＤ６３の１つ以上に対して結合し得る、または、結合し得ない。
【０１６１】
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本発明は、細胞傷害性薬、化学療法剤、免疫抑制剤、または、放射性同位元素などの治療用部分にコンジュゲートした抗ＣＤ６３抗体、及び、その抗原結合フラグメント（抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗原結合分子、及び、マルチドメイン治療タンパク質を含む）を含む抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を提供する。治療部分にコンジュケートした抗ＣＤ６３抗体、または、その結合フラグメントも提供する。一般的に、ＡＤＣは：Ａ−［Ｌ−Ｐ］ｙを含み、式中、Ａは、抗原結合分子、例えば、抗ＣＤ６３抗体、または、そのフラグメント（例えば、表１に示したＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択する、少なくとも１つのＨＣＤＲ３を含むフラグメント）であり、Ｌは、リンカーであり、Ｐは、ペイロード、または、治療部分（例えば、細胞傷害性薬）であり、ｙは、１〜３０の整数である。
【０１６２】
様々な実施形態では、ＡＤＣは、表１に記載の配列番号（例えば、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、２９８、３０６、３１４、３２２、３３０、１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、及び、２８２）のアミノ酸配列、または、特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲペア（例えば、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２８２、２９８／２８２、３０６／２８２、３１４／２８２、３２２／２８２、及び、３３０／２８２）を有するＨＣＶＲ、及び、ＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメント（例えば、抗標的（ＴＡＡ）ｘ抗ＣＤ６３抗体）を含む。一部の事例では、抗ＣＤ６３抗体、または、その抗原結合フラグメントは、表１に記載の配列番号（例えば、配列番号４−６−８−１２−１４−１６、２０−２２−２４−２６−２８−３０−３２、３６−３８−４０−４４−４６−４８、５２−５４−５６−６０−６２−６４；６８−７０−７２−７６−７８−８０  ８４−８６−８８−９２−９４−９６；１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２、１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８；１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４；１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０；１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６；１８０−１８２−１８４−１８８−１９０−１９２；１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８；２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４；２２８−２３０−２３２−２３６−２３８−２４０；２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６；２６０−２６２−２６４−２６８−２７０−２７２；２７６−２７８−２８０−２８４−２８６−２８８；２９２−２９４−２９６−２８４−２８６−２８８；３００−３０２−３０４−２８４−２８６−２８８；３０８−３１０−３１２−２８４−２８６−２８８；３１６−３１８−３２０−２８４−２８６−２８８；３２４−３２６−３２８−２８４−２８６−２８８、及び、３３２−３３４−３３６−２８４−２８６−２８８）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。一部の事例では、抗ＣＤ６３抗体またはフラグメントは、表１に記載の配列番号（例えば、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、２９８、３０６、３１４、３２２、３３０、１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、及び、２８２）のアミノ酸配列、または、特定のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲペア（例えば、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０���９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２８２、２９８／２８２、３０６／２８２、３１４／２８２、３２２／２８２、及び、３３０／２８２）のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む。
【０１６３】
細胞傷害性薬として、細胞の成長、生存率、または、増殖に有害なあらゆる作用物質があり、チューブリン相互作用性薬剤、及び、ＤＮＡ損傷剤があるが、これらに限定されない。本開示のこの態様にしたがって、抗ＣＤ６３抗体にコンジュゲートすることができる適切な細胞傷害性薬、及び、化学療法剤の例として、例えば；１−（２−クロロエチル）−１，２−ジメタンスルホニルジヒドラジド、１，８−ジヒドロキシ−ビシクロ［７．３．１］トリデカ−４，９−ジエン−２，６−ジイン−１３−オン、１−デヒドロテストステロン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、９−アミノカンプトテシン、アクチノマイシンＤ、アマニチン、アミノプテリン、アングイジン、アンスラサイクリン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アウリスタチン、ブレオマイシン、ブスルファン、酪酸、カリケアマイシン（例えば、カリケアマイシンγ１）、カンプトセシン、カルミノマイシン、カルムスチン、セマドチン、シスプラチン、コルチシン、コンブレタスタチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デカルバジン、ジアセトキシペンチルドキソルビシン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、ジソラゾール、ドラスタチン（例えば、ドラスタチン１０）、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、エキノマイシン、エリューテロビン、エメチン、エポチロン、エスペラミシン、エストラムスチン、臭化エチジウム、エトポシド、フルオロウラシル、ゲルダナマイシン、グラミシジンＤ、グルココルチコイド、イリノテカン、キネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ）阻害剤、レプトマイシン、ロイロシン、リドカイン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メイタンシノイド、メクロレタミン、メルファラン、メルカトプリン、メトプテリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、ポドフィロトキシン、プロカイン、プロプラノロール、プテリジン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、リゾキシン、ストレプトゾトシン、タルリソマイシン、タキソール、テノポシド、テトラカイン、チオエパクロラムブシル、トマイマイシン、トポテカン、ツブリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及び、前出のいずれかの誘導体がある。
【０１６４】
特定の実施形態によると、抗ＣＤ６３抗体にコンジュゲートする細胞傷害性薬は、ＤＭ１またはＤＭ４などのメイタンシノイド、トマイマイシン誘導体、または、ドラスタチン誘導体である。特定の実施形態によると、抗ＣＤ６３抗体にコンジュゲートする細胞傷害性薬は、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦなどのアウリスタチン、または、それらの誘導体である。当該技術分野で公知のその他の細胞傷害性薬を、本開示の範囲内で企図しており、例えば、リシン、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、リシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ブリオジン、サポリン、ヤマゴボウ毒素（すなわち、フィトラカトキシン、及び、フィトラカゲニン）などのタンパク質毒素、及び、その他に、Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１３，１３８：４５２−４６９に記載されたものがある。
【０１６５】
特定の実施形態では、細胞傷害性薬は、メイタンシノイド、例えば、メイタンシンの誘導体である。好適なメイタンシノイドとして、ＤＭ１、ＤＭ４、または、それらの誘導体、立体異性体、または、同位体置換体がある。好適なメイタンシノイドとして、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する、ＷＯ２０１４／１４５０９０Ａ１、ＷＯ２０１５／０３１３９６Ａ１、ＵＳ２０１６／０３７５１４７Ａ１、及び、ＵＳ２０１７／０２０９５９１Ａ１に開示されているものがあるが、これらに限定されない。
【０１６６】
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下の構造：
【化９】
2021524231.tif 000011
を有しており、式中、Ａは、任意に置換したアリーレン、または、ヘテロアリールエンである。
【０１６７】
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下の構造：
【化１０】
2021524231.tif 000012
を有しており、式中、Ａは、任意に置換したアリーレン、または、ヘテロアリールエンである。
【０１６８】
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下の構造：
【化１１】
2021524231.tif 000013
を有しており、式中、ｎは１〜１２の整数であり、そして、Ｒ１は、アルキルである。
【０１６９】
一部の実施形態では、メイタンシノイドは：
【化１２】
2021524231.tif 000014
【化１３】
2021524231.tif 000015
【化１４】
2021524231.tif 000016
【化１５】
2021524231.tif 000017
である。
【０１７０】
一部の実施形態では、メイタンシノイドは：
【化１６】
2021524231.tif 000018
である。
【０１７１】
一部の実施形態では、メイタンシノイドは：
【化１７】
2021524231.tif 000019
である。
【０１７２】
１つ以上の放射性核種にコンジュゲートした抗ＣＤ６３抗体を含む抗体−放射性核種コンジュゲート（ＡＲＣ）も本明細書で提供する。本開示のこの態様の関連で使用することができる例示的な放射性核種として、例えば、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２２７Ｔｈ、２２２Ｒｎ、２２３Ｒａ、２２４Ｒａ、及び、９０Ｙがあるが、これらに限定されない。
【０１７３】
本明細書で提供する特定の実施形態では、ＡＤＣは、例えば、リンカー分子を介して、細胞傷害性薬（例えば、上記で開示した細胞傷害性薬のいずれか）に対してコンジュケートした抗ＴＡＡ  ｘ  抗ＣＤ６３二重特異性抗原結合タンパク質を含むものを提供する。リンカーは、治療部分、例えば、細胞傷害性薬を、本明細書に記載した抗体または抗原結合タンパク質と、連結、接続、または、結合するあらゆる基または部分である。好適なリンカーは、例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それぞれの全内容を援用する、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｌ．，Ｅｄ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０１３；Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｄｕｃｒｙ，Ｌ．，Ｅｄ．；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０１３；Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ．−Ｃ．，及び、Ｚａｒｏ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１５で認められ得る。一般的に、本明細書に記載した抗体コンジュケートに適したバインダーリンカーは、抗体の循環半減期の利用において十分に安定であり、同時に、抗原媒介によるコンジュケートの内在化をした後に、そのペイロードを放出することができるものである。リンカーは、切断可能、または、切断不可能とし得る。切断可能なリンカーは、内在化に続く細胞内代謝、例えば、加水分解、還元、または、酵素反応による切断によって切断されるリンカーである。切断不可能なリンカーは、内在化の後に抗体のリソソーム分解を介して結合ペイロードを放出するリンカーである。好適なリンカーとしては、酸不安定リンカー、加水分解不安定リンカー、酵素的に切断可能なリンカー、還元不安定的リンカー、自壊型的リンカー、及び、非切断可能リンカーがあるが、これらに限定されない。適切なリンカーとして、ペプチド、グルクロニド、スクシンイミド−チオエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位、ヒドラゾン、ｍａｌ−カプロイル単位、ジペプチド単位、バリン−シトルリン単位、及び、パラ−アミノベンジル（ＰＡＢ）単位であるか、または、それらを含むものもあるが、それらに限定されない。
【０１７４】
当該技術分野で公知のあらゆるリンカー分子、または、リンカー技術を使用して、本開示のＡＤＣを生成または構築することができる。特定の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。その他の実施形態によれば、リンカーは、切断不可能なリンカーである。本発明の関連で使用することができる例示的なリンカーとして、例えば、ＭＣ（６−マレイミドカプロイル）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ−ｃｉｔ（バリン−シトルリン）、ｖａｌ−ａｌａ（バリン−アラニン）、ｖａｌ−ｇｌｙ（バリン−グリシン）、プロテアーゼ切断可能なリンカーのジペプチド部位、ａｌａ−ｐｈｅ（アラニン−フェニルアラニン）、プロテアーゼ切断可能なリンカーのジペプチド部位、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル  ４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート）、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１  カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート）、ならびに、それらの変異体、及び、組み合わせを含む、または、それらからなるリンカーがある。本発明の関連において使用できるリンカーのさらなる例は、例えば、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、米国特許第７，７５４，６８１号、及び、Ｄｕｃｒｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０１０，２１：５−１３、及び、それらで引用された参考文献に開示されている。
【０１７５】
特定の実施形態では、リンカーは、生理学的条件において安定である。特定の実施形態では、リンカーは、切断可能であり、例えば、酵素の存在下で、または、特定のｐＨ範囲または値で、少なくともペイロード部分を放出することができる。一部の実施形態では、リンカーは、酵素切断可能な部分を含む。例示的な酵素切断可能部分として、ペプチド結合、エステル結合、ヒドラゾン、及び、ジスルフィド結合があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、リンカーは、カテプシン切断可能なリンカーを含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、リンカーは、切断不可能な部分を含む。
【０１７７】
好適なリンカーとして、単一のバインダー、例えば、抗体の２つのシステイン残基に化学的に結合しているリンカーがあるが、これらに限定されない。このようなリンカーは、コンジュケーションプロセスの結果として攪乱を受ける抗体のジスルフィド結合を模倣する上で役立つ。
【０１７８】
一部の実施形態では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。好適なアミノ酸として、天然、非天然、標準、非標準、タンパク新生、非タンパク新生、及び、Ｌ−またはＤ−α−アミノ酸がある。一部の実施形態では、リンカーは、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、または、シトルリン、それらの誘導体、または、それらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、アミノ酸の１つ以上の側鎖は、後述する側鎖基に連結する。一部の実施形態では、リンカーは、バリン、及び、シトルリンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、リジン、バリン、及び、シトルリンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、リジン、バリン、及び、アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、バリン、及びアラニンを含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、リンカーは、自壊型基を含む。自壊型基は、当業者に周知のあらゆる基とすることができる。特定の実施形態では、自壊型基は、ｐ−アミノベンジル（ＰＡＢ）、または、その誘導体である。有用な誘導体として、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）がある。当業者であれば、自壊型基が、ペイロード由来のリンカーの残存原子を放出する化学反応を実行することができる、ことを認識する。
【０１８０】
一部の実施形態では、リンカーは：
【化１８】
2021524231.tif 000020
であり、式中、
【化１９】
2021524231.tif 000021
は、抗体、または、抗原結合タンパク質に対する（例えば、リジン残基を介した）結合であり、及び、
【化２０】
2021524231.tif 000022
は、細胞傷害性薬（例えば、ＤＭ１）に対する結合である。一部の実施形態では、リンカーは：
【化２１】
2021524231.tif 000023
であり、式中、
【化２２】
2021524231.tif 000024
は、抗体、または、抗原結合タンパク質に対する（例えば、リジン残基を介した）結合であり、及び、
【化２３】
2021524231.tif 000025
は、細胞傷害性薬（例えば、ＤＭ１）に対する結合である。特定の実施形態では、リンカーは：
【化２４】
2021524231.tif 000026
である。
【０１８１】
特定の実施形態では、リンカーは：
【化２５】
2021524231.tif 000027
である。
【０１８２】
一部の実施形態では、リンカーは、マレイミジルメチル−４−トランス−シクロヘキサンカルボキシコハク酸塩に由来する：
【化２６】
2021524231.tif 000028
【０１８３】
一部の実施形態では、リンカーは：
【化２７】
2021524231.tif 000029
であり、式中、
【化２８】
2021524231.tif 000030
は、抗体、または、抗原結合タンパク質に対する（例えば、リジン残基を介した）結合であり、及び、
【化２９】
2021524231.tif 000031
は、細胞傷害性薬（例えば、以下の式：
【化３０】
2021524231.tif 000032
を有する化合物）に対する結合である。
【０１８４】
本開示は、リンカーが、抗体または抗原結合分子における特定のアミノ酸での付着を介して、抗ＴＡＡ  ｘ  抗ＣＤ６３二重特異性抗原結合タンパク質を薬物または細胞毒素に接続するＡＤＣを含む。例示的なアミノ酸付着、例えば、リジン（例えば、ＵＳ５，２０８，０２０；ＵＳ２０１０／０１２９３１４；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ２００８，  １９：３５８−３６１；ＷＯ  ２００５／０８９８０８；ＵＳ５，７１４，５８６；及び、ＵＳ  ２０１３／０１０１５４６を参照されたい）、システイン（例えば、ＵＳ２００７／０２５８９８７；ＷＯ２０１３／０５５９９３；ＷＯ２０１３／０５５９９０；ＷＯ２０１３／０５３８７３；ＷＯ２０１３／０５３８７２；ＷＯ２０１１／１３０５９８；ＵＳ２０１３／０１０１５４６；及び、ＵＳ７，７５０，１１６を参照されたい）、セレノシステイン（例えば、ＷＯ２００８／１２２０３９；及び、Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ２００８，  １０５：１２４５１−１２４５６を参照されたい）、ホルミルグリシン（例えば、Ｃａｒｒｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００７，  ３：３２１−３２２；Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ２０１３，  １１０：４６−５１，及び、Ｒａｂｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ２０１２，  １０：１０５２−１０６７を参照されたい）、非天然アミノ酸（例えば、ＷＯ２０１３／０６８８７４、及びＷＯ２０１２／１６６５５９を参照されたい）、及び、酸性アミノ酸（例えば、ＷＯ２０１２／０５９８２を参照されたい）は、この態様の関連で使用することができる。リンカーは、炭水化物（例えば、ＵＳ２００８／０３０５４９７，ＷＯ  ２０１４／０６５６６１，及び、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｏｏｄ  ＆  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００１，  １３：１２７−１３０を参照されたい）、及び、ジスルフィドリンカー（ＷＯ２０１３／０８５９２５，ＷＯ２０１０／０１０３２４，ＷＯ２０１１／０１８６１１，及び、Ｓｈａｕｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００６，  ２：３１２−３１３）に対する付着を介して、抗原結合タンパク質にコンジュゲートすることもできる。部位特異的コンジュゲーション技術を使用して、抗体または抗原結合タンパク質の特定の残基に直接にコンジュゲートすることもできる（例えば、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２０１６）  ３６（Ｓｕｐｐｌ  １）：  １００を参照されたい）。部位特異的コンジュゲーション技術として、トランスグルタミナーゼを介したグルタミンコンジュゲーションがあるが、これに限定されない（例えば、Ｓｃｈｉｂｌｉ，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒ  Ｅｄ．  ２０１０，  ４９  ，９９９５を参照されたい）。
【０１８５】
特定の実施形態によれば、本開示は、ＡＤＣを提供しており、本明細書に記載した抗ＴＡＡ  ｘ  抗ＣＤ６３二重特異性抗原結合タンパク質は、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、国際特許公開ＷＯ２０１４／１４５０９０に記載されたリンカー薬物組成物にコンジュゲートする（例えば、本明細書では「Ｍ００２６」とも称している以下の化合物「７」）：
【化３１】
2021524231.tif 000033
【０１８６】
本明細書では、抗ＴＡＡ  ｘ  抗ＣＤ６３二重特異性抗原結合タンパク質を含む抗体薬物コンジュゲートも提供しており、当該抗ＴＡＡ  ｘ  抗ＣＤ６３二重特異性抗原結合タンパク質は、細胞傷害性薬にコンジュケートする。特定の実施形態では、細胞傷害性薬は、メイタンシノイドである。特定の実施形態では、メイタンシノイドは、以下の式：
【化３２】
2021524231.tif 000034
を有する化合物であり、式中、ｎは、１〜１２の整数であり、かつ、Ｒ１は、アルキルである。特定の実施形態では、メイタンシノイドは、
【化３３】
2021524231.tif 000035
である。特定の実施形態では、細胞傷害性薬は、メイタンシノイドであり、そして、メイタンシノイドは、切断不可能なリンカーを介して抗体に対して共有結合する。特定の実施形態では、細胞傷害性薬は、メイタンシノイドであり、そして、メイタンシノイドは、切断可能なリンカーを介して抗体に対して共有結合する。
【０１８７】
ある実施形態では、抗体は：
【化３４】
2021524231.tif 000036
にコンジュゲートし、式中、
【化３５】
2021524231.tif 000037
は、抗体に対する結合である。
【０１８８】
ある実施形態では、抗体は：
【化３６】
2021524231.tif 000038
にコンジュゲートし、式中、
【化３７】
2021524231.tif 000039
は、抗体に対する結合である。
【０１８９】
ある実施形態では、抗体は：
【化３８】
2021524231.tif 000040
にコンジュゲートし、式中、
【化３９】
2021524231.tif 000041
は、抗体に対する結合である。
【０１９０】
ある実施形態では、抗体は：
【化４０】
2021524231.tif 000042
にコンジュゲートし、式中、
【化４１】
2021524231.tif 000043
は、抗体に対する結合である。
【０１９１】
一部の実施形態では、コンジュゲートは以下の構造：
Ａｂ−［Ｌ−Ｐａｙ］ｎ
を有しており、式中：
Ａｂは、本明細書に記載した抗ＴＡＡ  ｘ  抗ＣＤ６３二重特異性抗原結合タンパク質である；
Ｌは、リンカーである；
Ｐａｙは、細胞傷害性薬である；及び
ｎは、１〜１０までの整数である。
【０１９２】
一部の実施形態では、Ａｂは、表１に記載した抗体または抗原結合タンパク質のいずれかである。
【０１９３】
一部の実施形態では、ペイロードは、メイタンシノイドである。
【０１９４】
一部の実施形態では、Ｐａｙは：
【化４２】
2021524231.tif 000044
であり、式中、Ｒ１は、アルキルである。
【０１９５】
一部の実施形態では、Ｐａｙは：
【化４３】
2021524231.tif 000045
である。
【０１９６】
一部の実施形態では、Ｐａｙは：
【化４４】
2021524231.tif 000046
である。
【０１９７】
一部の実施形態では、ｎは、２〜５の整数である。
【０１９８】
一部の実施形態では、−Ｌ−Ｐａｙは：
【化４５】
2021524231.tif 000047
であり、式中、
【化４６】
2021524231.tif 000048
は、抗体に対する結合である。
【０１９９】
一部の実施形態では、−Ｌ−Ｐａｙは：
【化４７】
2021524231.tif 000049
であり、式中、
【化４８】
2021524231.tif 000050
は、抗体に対する結合である。
【０２００】
一部の実施形態では、−Ｌ−Ｐａｙは：
【化４９】
2021524231.tif 000051
であり、式中、
【化５０】
2021524231.tif 000052
は、抗体に対する結合である。
【０２０１】
一部の実施形態では、−Ｌ−Ｐａｙは：
【化５１】
2021524231.tif 000053
であり、式中、
【化５２】
2021524231.tif 000054
は、抗体に対する結合である。
【０２０２】
一部の実施形態では、−Ｌ−Ｐａｙは：
【化５３】
2021524231.tif 000055
であり、式中、
【化５４】
2021524231.tif 000056
は、抗体に対する結合である。
【０２０３】
本明細書に記載した抗体薬物コンジュゲートは、当業者に公知のコンジュゲーション条件を使用して、調製することができる（例えば、本明細書の一部を構成するものとして、その全内容を援用する、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００３，２１，７，７７８を参照されたい）。一部の実施形態では、抗ＴＡＡ  ｘ  抗ＣＤ６３二重特異性抗原結合タンパク質薬物コンジュゲートを、本明細書に記載した抗ＴＡＡ  ｘ  抗ＣＤ６３二重特異性抗原結合タンパク質を、所望のリンカーと細胞傷害性薬とを含む化合物と接触させることで調製しており、当該リンカーは、抗体または抗原結合タンパク質と反応する部分、例えば、抗体または抗原結合タンパク質の所望の残基、を有する。
【０２０４】
一部の実施形態では、本明細書に記載した抗ＴＡＡ  ｘ  抗ＣＤ６３二重特異性抗原結合タンパク質を、以下の式Ａ１：
【化５５】
2021524231.tif 000057
を有する化合物、それに、水性希釈剤と接触させることを含む、抗体薬物コンジュゲートを調製するためのプロセスを、本明細書で提供している。
【０２０５】
一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、化学量論的に過剰に存在する。一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、５〜６倍の化学量論的過剰で存在する。一部の実施形態では、水性希釈剤は、ＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態では、水性希釈剤は、ＤＭＡを含む。
【０２０６】
一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、式Ａ２またはＡ３：
【化５６】
2021524231.tif 000058
の化合物である。
【０２０７】
一部の実施形態では、式Ａ２の化合物は、立体的に純粋なＡ３である。一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、式Ａ１またはＡ２の化合物を含み、Ａ１またはＡ２の化合物は、５０％超のジアステレオマー過剰で存在する。特定の実施形態では、ジアステレオマーの過剰分は７０％超である。特定の実施形態では、ジアステレオマーの過剰分は、９０％超である。特定の実施形態では、ジアステレオマーの過剰分は９５％超である。構造Ａ１、Ａ２、及び、Ａ３は、個別に、または、まとめて、ＳＭＣＣ−ＤＭ１として知られている。
【０２０８】
用語「ジアステレオマー過剰」とは、組成物に残存するジアステレオマーと比較した、所望の単一のジアステレオマーのモル分率との間の差異のことを指す。ジアステレオマーの過剰分は、次のように計算する：（単一のジアステレオマーの量）−（その他のジアステレオマーの量）／１。例えば、９０％の１と、１０％の２、３、４、または、それらの混合物とを含む組成物は、８０％のジアステレオマー過剰である［（９０−１０）／１］。９５％の１と、５％の２、３、４、または、それらの混合物とを含む組成物は、９０％のジアステレオマー過剰である［（９５−５）／１］。９９％の１と、１％の２、３、４、または、それらの混合物とを含む組成物は、９８％のジアステレオマー過剰である［（９９−１）／１］である。ジアステレオマーの過剰分は、１、２、３、または、４のいずれかについても、同様に計算することができる。
【０２０９】
一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、式（ａ）の化合物：
【化５７】
2021524231.tif 000059
を、シリカゲル、及び、希釈剤の存在下で、式（ｂ）の化合物：
【化５８】
2021524231.tif 000060
と、接触させて調製する。一部の実施形態では、希釈剤は、有機溶媒、及び、水を含む。
【０２１０】
本明細書では：  
（ｉ）式（ａ）の化合物：
【化５９】
2021524231.tif 000061
を、シリカゲル、及び、希釈剤の存在下で、式（ｂ）の化合物：
【化６０】
2021524231.tif 000062
と、接触させて中間体を合成する；及び
（ｉｉ）抗ＴＡＡ  ｘ  抗ＣＤ６３二重特異性抗原結合タンパク質を、中間体、及び、水性希釈剤と接触させる、プロセスで調製した産物も提供する。
【０２１１】
一部の実施形態では、本明細書では、本明細書に記載した抗ＴＡＡ  ｘ  抗ＣＤ６３二重特異性抗原結合タンパク質を、以下の式Ｂ：
【化６１】
2021524231.tif 000063
式中、ＬＧが、脱離基、及び、水性希釈剤である化合物と接触させることを含む、抗体薬物コンジュゲートを調製するためのプロセスを提供する。
【０２１２】
一部の実施形態では、式Ｂの化合物は、化学量論的に過剰に存在する。一部の実施形態では、式Ｂの化合物は、５〜６倍の化学量論的過剰で存在する。一部の実施形態では、水性希釈剤は、ＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態では、水性希釈剤は、ＤＭＡを含む。一部の実施形態では、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧは、エステル、例えば、ＮＨＳ、または、ペンタフルオロフェニルエステルである。
【０２１３】
一部の実施形態では、式Ｂの化合物は、化合物Ｉとして公知の式Ｂ１：
【化６２】
2021524231.tif 000064
の化合物である。
【０２１４】
一部の実施形態では、式Ｃの化合物は、化合物ＩＩとして公知の式Ｃ：
【化６３】
2021524231.tif 000065
の化合物である。
【０２１５】
薬物対抗体比（ＤＡＲ）とは、抗体または抗原結合フラグメントに対してコンジュゲートした薬物の平均数のことであり、ＡＤＣの有効性、効力、及び、薬物動態に重要な影響を及ぼす。様々な実施形態では、ＤＡＲは、１つの抗体に対して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または、８つの薬物分子がある。一部の実施形態では、ＤＡＲは、１〜４である。特定の実施形態では、ＤＡＲは、２〜４である。一部の事例では、ＤＡＲは、２〜３である。特定の事例では、ＤＡＲは、３〜４である。一部の実施形態では、ＤＡＲは、１〜１０、１〜２０、または、１〜３０（すなわち、抗体、または、その抗原結合フラグメントあたり１つ〜３０個の薬物分子）である。
【０２１６】
治療用製剤及び投与
本発明は、本発明の抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な担体、賦形剤、及び、改善した移動、送達、耐性などをもたらすその他の薬剤と共に製剤する。数多くの適切な製剤は、すべての薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに認めることができる。これらの製剤として、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡなど）を含有する脂質（カチオン性、または、アニオン性）、ＤＮＡコンジュケート、無水吸収ペースト、水中油エマルション、及び、油中水エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及び、カーボワックスを含有する半固体混合物がある。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照されたい。
【０２１７】
患者に投与する抗原結合分子の用量は、患者の年齢、及び、身体の大きさ、標的疾患、病態、投与経路などに応じて変わり得る。好ましい用量は、一般的には、体重または体表面積に従って計算される。本発明の二重特異性抗原結合分子を、成人患者の治療目的に使用する場合、本発明の二重特異性抗原結合分子を、通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／体重ｋｇの単回投与で、より好ましくは、約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または、約０．０５〜約３ｍｇ／体重ｋｇの単回投与で静脈内投与することが有利となり得る。病態の重症度に応じて、治療の頻度、及び、期間を調整することができる。二重特異性抗原結合分子を投与するための有効投与量、及び、スケジュールは経験的に決定されており、例えば、患者の経過を定期的な評価によってモニターし、それに応じて用量を調整することができる。さらに、投与量の種間スケーリングは、当該技術分野において周知の方法を用いて実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
【０２１８】
様々な送達系が公知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルにおける封入、変異ウイルスを発現することのできる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスがある（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）。導入方法として、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び、経口経路があるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入またはボーラス注射による、上皮または粘膜皮膚内（例えば、口腔粘膜、直腸、及び、腸の粘膜など）を通じた吸収など、あらゆる簡便な経路によって投与し得るものであり、その他の生物学的に活性のある薬剤と共に投与し得る。投与は、全身的または局所的とし得る。
【０２１９】
本発明の医薬組成物は、標準的な針、及び、注射器を使用して、皮下または静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達装置は、本発明の医薬組成物の送達に際して適用が容易である。このようなペン送達装置は、再利用、または、使い捨てが可能である。再利用可能なペン送達装置は、一般的に、医薬組成物を収めた交換可能なカートリッジを使用する。一旦、カートリッジ内の医薬組成物がすべて投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、医薬組成物を収めた新たなカートリッジと容易に交換することができる。また、ペン送達装置は、再利用することができる。使い捨てのペン送達装置において、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン送達装置では、この装置内の貯蔵器に収めた医薬組成物は、事前に充填されたものである。一旦、貯蔵器に収めた医薬組成物が無くなると、装置全体を廃棄する。
【０２２０】
数多くの再利用可能なペン送達装置、及び、自動注射送達装置を、本発明の医薬組成物の皮下送達において応用する。例として、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ｐｅｎ（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ｐｅｎ、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ｐｅｎ、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ｐｅｎ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ，ＩＩ、及び、ＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ｐｅｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及び、ＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）があるが、ほんの数種類だけをここに示しており、これらに限定されない。本発明の医薬組成物の皮下送達での用途を有する使い捨てペン送達装置の例として、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ｐｅｎ（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及び、ＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ    Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、及び、ＨＵＭＩＲＡ（商標）Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ    Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）があるが、ほんの数種類だけをここに示しており、これらに限定されない。
【０２２１】
特定の状況では、医薬組成物を、徐放系で送達することができる。ある実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，前掲；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ    Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態では、制御徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、それにより、全身用量のほんの一部しか必要とされない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，前掲，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照されたい。その他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３の総説で論じられている。
【０２２２】
注射可能な調製物には、静脈内、皮下、皮内、及び、筋肉内注射、点滴注入などのための剤形を含み得る。これらの注射可能な調製物は、公的に公知の方法で調製し得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来から使用されている滅菌水性媒体または油性媒体に、上記した抗体またはその塩を、溶解、懸濁、または、乳化させて調製し得る。注射用水性媒体として、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、及び、その他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用し得る。油性媒体として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用されており、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用し得る。このように調製した注射は、好ましくは、適切なアンプルに充填する。
【０２２３】
有利なことに、上記の経口または非経口での使用のための医薬組成物は、有効成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形に調製する。このような単位用量の剤形として、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射（アンプル）、坐薬などがある。含有される前述した抗体の量は、一般的に、単位用量の剤形あたり約５〜約５００ｍｇであり、特に、注射の形態では、前述の抗体は、約５〜約１００ｍｇで、その他の剤形については、約１０〜約２５０ｍｇで含有させることが好ましい。
【０２２４】
その治療的、及び、診断的使用
本明細書では、抗ＣＤ６３抗体、または、その結合フラグメント（それを含む多重特異性結合分子、または、マルチドメイン治療タンパク質を含む）、または、抗ＣＤ６３抗体を含む抗体薬物コンジュゲート（例えば、本明細書の表１に示したＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ、または、ＣＤＲ配列のいずれかを含む抗ＣＤ６３抗体またはＡＤＣ）を含む治療用組成物を、それを必要とする対象に対して投与する、ことを含む方法も開示している。治療用組成物は、抗ＣＤ６３抗体、その抗原結合フラグメント、または、本明細書に開示すＡＤＣのいずれかと、医薬として許容可能な担体または希釈剤とを含むことができる。
【０２２５】
抗体、その抗原結合フラグメント（それを含む多重特異性結合分子、または、マルチドメイン治療用タンパク質を含む）、または、本発明の抗ＣＤ６３抗体を含む抗体薬物コンジュゲートは、とりわけ、ＣＤ６３が関連する、または、媒介する、あらゆる疾患または障害の治療、予防、及び／または、改善について有用である。例えば、本発明の抗体、及び、ＡＤＣは、ＣＤ６３を発現する腫瘍、及び、一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体が標的化し得るＴＡＡの治療に有用である。抗体、その抗原結合フラグメント（それを含む多重特異性結合分子、または、マルチドメイン治療用タンパク質を含む）、または、本発明の抗ＣＤ６３抗体を含む抗体薬物コンジュゲートは、肥満細胞（ＭＣ−）依存性疾患、関節リウマチ、ＩｇＥ依存性アレルギー反応、及び、Ｆｃ−ＥＲ１媒介性アレルギー反応、喘息、がん、及び／または、転移の治療について有用である。例えば、Ｋｒａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＪＥＭ  ２０１：３８５；Ｖａｌａｄｉ（２００７）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：６５４を参照されたい。
【０２２６】
本発明の抗ＣＤ６３抗体は、様々な有用性を有する。ある実施形態では、抗ＣＤ６３抗体は、エクソソームのアフィニティー精製に有用であり、例えば、本明細書に開示した抗ＣＤ６３抗体は、当該技術分野で周知の方法を使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂、または、濾紙などの好適な支持体に固定し、次いで、精製するＣＤ６３を含む所望のエクソソームを含む試料と接触させ、その後、支持体を、好適な溶媒で洗浄して、固定した抗体に対して結合しているエクソソーム以外の試料に含まれる実質的にすべての材料を除去する。最後に、支持体を、抗体からエクソソームを放出する別の好適な溶媒で洗浄することができる。別の実施形態では、抗ＣＤ６３抗体を、例えば、特定の細胞、組織、または、血清において、その発現を検出する、例えば、エクソソームを同定／標識するための試薬として、ＣＤ６３の診断アッセイにおいて使用し得る。例えば、Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ：９（６）：６５４−９を参照されたい。異種または同種相のいずれかで実施する競合的結合アッセイ、直接または間接サンドイッチアッセイ、及び、免疫沈降アッセイなど、当該技術分野で公知の様々な診断及び予後アッセイ技術を使用することができる（Ｚｏｌａ（１９８７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．１４７−１５８１）。アッセイで使用する抗体は、検出可能な部分で標識することができる。検出可能な部分は、直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生成することができる。抗体を検出可能な部分にコンジュケートさせるための当該技術分野で公知のあらゆる方法を使用し得る。
【０２２７】
別の実施形態では、がんなどの疾患の治療の方法を提供する。本発明の方法は、好ましくは、上記したように、抗体またはそのＣＤ６３抗原結合フラグメントを、当該治療を必要とする対象に提供するステップを含む。
【０２２８】
抗体または抗体フラグメントを使用して、癌細胞を免疫標的化する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号は、Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法での抗ＣＤ２２抗体の使用を記載しており、また、米国特許第６，３２９，５０３号は、蛇行性膜貫通抗原を発現する細胞の免疫標的化を記載している。本明細書に記載した抗体（ヒト化またはヒトモノクローナル抗体、または、それのフラグメント、または、その他の修飾を含み、任意に、細胞傷害性薬またはその他の作用物質にコンジュケートする）は、抗体が癌細胞に結合し、そして、細胞及び腫瘍の破壊を媒介し、及び／または細胞または腫瘍の増殖を阻害するように、患者に対して導入することができる。
【０２２９】
開示の制限は意図しておらず、そのような抗体が治療効果を発揮できるメカニズムとして、例えば、腫瘍抗原の生理学的機能を調節する、結合またはシグナル伝達経路を阻害する、腫瘍細胞分化を調節する、腫瘍血管新生因子プロファイルを改変する、免疫刺激または腫瘍抑制サイトカイン及び成長因子の分泌を調節する、細胞接着を調節する、及び／または、アポトーシスを誘導する、補体媒介性細胞傷害、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）１がある。
【実施例】
【０２３０】
実施例１
例示的なＣＤ６３抗体
抗ヒトＣＤ６３抗体の生成
抗ヒトＣＤ６３抗体は、マウス（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖、及び、ヒトカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作したマウス）を、ヒトＣＤ６３で免疫処置して得た。
【０２３１】
免疫処置の後に、脾細胞を各マウスから採取し、そして、（１）マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、かつ、ハイブリドーマ細胞を形成し、そして、ヒトＣＤ６３特異性についてスクリーニングした、あるいは、（２）（ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に説明されているようにして）反応性抗体（抗原陽性Ｂ細胞）に対して結合し、そして、同定をする選別試薬として、いずれかのヒトＣＤ６３フラグメントを使用して、Ｂ細胞を選別した。
【０２３２】
まず、例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それらの各々を援用する、米国特許第７，１０５，３４８号；米国特許第８，６４２，８３５号；及び、米国特許第９，６２２，４５９号に記載されているＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ技術を使用して、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する、ヒトＣＤ６３に対するキメラ抗体を単離した。
【０２３３】
一部の抗体では、試験目的で、マウス定常領域を、所望のヒト定常領域、例えば、野生型ヒトＣＨ、または、修飾ヒトＣＨ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、または、ＩｇＧ４アイソタイプ）、及び、軽鎖定常領域（ＣＬ）と置換して、抗ｈＣＤ６３抗体、または、その結合部分を含む完全ヒト二重特異性抗体を含む完全ヒト抗ｈＣＤ６３を生成した。選択する定常領域は、特定の用途に応じて変化し得るが、高親和性の抗原結合、及び、標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。
【０２３４】
この実施例の方法に従って生成した抗ヒトＣＤ６３結合アームを含む例示的な二重特異性抗体の特定の生物学的特性は、後出の実施例に詳細に記載している。
【０２３５】
抗ＣＤ６３抗体の重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸及び核酸配列
表１は、本明細書に開示したマルチドメイン治療用抗ＣＤ６３タンパク質を生成するために使用した、選択した抗ＣＤ６３抗体の重鎖または軽鎖可変領域（それぞれ、ＨＣＶＲまたはＬＣＶＲ）、または、重鎖または軽鎖ＣＤＲ（それぞれ、ＨＣＤＲ及びＬＣＤＲ）をコードする核酸（ＮＡ）配列、及び、括弧内にはアミノ酸（ＡＡ）配列の配列識別子を示す。
表１：抗ＣＤ６３配列識別子
【表１−１】
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【表１−２】
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【０２３６】
親の抗ヒトＣＤ６３抗体による結合
ヒトＣＤ６３発現細胞に対する抗ＣＤ６３抗体の相対的な細胞表面結合を、ヒトＣＤ６３を内因的に発現するＣＤ６３ポジティブＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１５７３）、及び、ＣＤ６３ネガティブＨＥＫ２９３／ＣＤ６３ノックアウト細胞を使用したフローサイトメトリーを介してアクセスした。アッセイでは、２％ＦＢＳ（Ｓａｒａｄｉｇｍ  カタログ番号１５００−５００）（染色緩衝剤）を含有し、カルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳ（ＶＷＲ、カタログ番号４５０００−４４６）が入った９６ウェルＶ底プレート（Ａｘｙｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｐ−９６−４５０−Ｖ−Ｃ−Ｓ）に細胞を播いた。次に、細胞を、１００ｎＭ〜１．７ｐＭの範囲の濃度の抗ＣＤ６３抗体またはアイソタイプコントロール抗体と共に、氷上で、３０分間、インキュベートした。抗体を含まないウェルを、コントロールとして使用した。ＨＥＫ２９３／ＣＤ６３ＫＯ細胞を、最高濃度（１００ｎＭ）の抗体だけで染色した。次に、細胞を、染色緩衝剤で１回洗浄し、そして、ＰＥコンジュケート抗マウスＦｃ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−１１５−１６４）と共に、１００ｎＭで、４℃で、３０分間、インキュベートした。次いで、細胞を、洗浄し、そして、ＰＢＳで希釈したＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４６５５）の５０％溶液を使用して固定した。試料を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ  Ｈｙｐｅｒｃｙｔフローサイトメーターに適用し、結果を、ＦｏｒｅＣｙｔソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ）で分析して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、１２ポイント応答曲線での４つのパラメーターのロジスティック方程式を使用して測定値を分析し、そして、得られたＥＣ５０値を報告する（表１２）。シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）は、抗体不含のウェルに対する抗ＣＤ６３抗体またはコントロール抗体ＭＦＩの比を計算して決定した（表１２）。
【０２３７】
表２に示したように、本発明の抗ＣＤ６３抗体の内の３つは、２１．０〜３１．６の範囲のＳ／Ｎ値、及び、０．５ｎＭ〜１．９ｎＭの範囲のＥＣ５０値を示すＨＥＫ２９３細胞に結合することが実証された。非結合コントロールは、ＨＥＫ２９３細胞に対する結合を実証しなかった（Ｓ／Ｎ≦１．５）。抗ＣＤ６３抗体、及び、アイソタイプコントロール抗体はどちらも、ＨＥＫ２９３／ＣＤ６３ＫＯ細胞に対する結合が弱く、あるいは、皆無であることが実証された（Ｓ／Ｎ≦４．４）。
表２：フローサイトメトリーで測定したＨＥＫ２９３、及び、ＨＥＫ２９３／ＣＤ６３ＫＯ細胞に対する抗ＣＤ６３抗体の結合
【表２】
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【０２３８】
本発明の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体が、ヒトＣＤ６３発現細胞に結合する能力も、電気化学発光（ＥＣＬ）をベースとした検出アッセイを使用して決定した。
【０２３９】
過剰発現細胞を生成するために、マウス胎児線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１６５８）をトランスフェクトして、ヒトＣＤ６３（ｈＣＤ６３；受託番号ＮＰ＿００１７７１のアミノ酸Ｍ１−Ｍ２３８；配列番号３３７）を安定して発現する細胞株「ＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ６３」を形成した。内因的に発現する細胞、ヒトアンドロゲン感受性前立腺腺癌細胞株、ＬＮＣＡＰ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１７４０）、及び、ヒト原発性神経膠芽細胞腫細胞株、Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−１４）でのヒトＣＤ６３の発現レベルを、製造業者の指示に従って、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ＭＥＳＦ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号６４７Ｂ）、及び、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）抗マウスＩｇＧ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ、カタログ番号８１５）で分析した。ＬＮＣＡＰ細胞は、Ｕ８７ＭＧ細胞よりもヒトＣＤ６３コピー数が少ないと判断した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）でヒトＣＤ６３の検出可能な発現を示さず、トランスフェクトもされていないＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ネガティブコントロールとして含めた。
【０２４０】
簡単に説明すると、細胞株を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含のＰＢＳ緩衝剤で１度洗浄し、そして、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｆｒｅｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号Ｓ−００４−Ｃ）と共に、３７℃で、１０分間、インキュベートして、細胞を分離した。次に、細胞を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋含有ＰＢＳで１度洗浄し、そして、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（商標）Ａｕｔｏ  Ｔ４細胞計数器（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＬＬＣ）で計数した。約２．０×１０４個のＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ６３、ＬＮＣＡＰ、Ｕ８７ＭＧ、または、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、９６ウェルカーボン電極プレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｌ１５ＸＢ−６）に個別に播種し、そして、３７℃で、１時間、インキュベートした。非特異的結合部位を、２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含むＣａ２＋／Ｍｇ２＋含有ＰＢＳで、室温（ＲＴ）で、１時間、ブロックした。次に、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含むＣａ２＋／Ｍｇ２＋含有ＰＢＳに、ある範囲の濃度（１．７ｐＭ〜１００ｎＭ）で、抗ＣＤ６３抗体またはアイソタイプコントロール抗体を含む溶液、ならびに、コントロール緩衝剤だけを、プレートに結合したＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ６３、ＬＮＣＡＰ、Ｕ８７ＭＧ、または、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して、二組に加え、そして、ＲＴで、１時間、インキュベートした。続いて、細胞洗浄ヘッドを備えたＡｑｕａＭａｘ２０００プレート洗浄機（ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、プレートを洗浄して、未結合の抗体を除去した。Ｆｃγフラグメントに特異的なＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）−コンジュケートヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００５−０９８）、または、Ｆｃγフラグメントに特異的なＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）−コンジュケートヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−００５−１６４）のいずれかの１μｇ／ｍＬで、プレート結合抗体を、１時間、ＲＴで検出した。プレートを洗浄した後に、製造業者の指示に従って、Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ９２ＴＤ−２）と共に、インキュベートした。発光シグナルは、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ（ＭＳＤ）を使用して測定した。相対光単位（ＲＬＵ）で測定した発光強度を記録して、試験した濃度範囲での各抗体の結合強度を示した。ヒトＣＤ６３発現細胞に対して３．７ｎＭで結合する抗体を検出し、ネガティブ細胞に結合する同じ濃度の抗体と比較して得たシグナルの比率を、ＣＤ６３結合の特異性の指標として報告した。結合率が３を超える抗体を、特異的バインダーとして分類し、また、結合率が３以下の抗体を非バインダーとして分類し、かつ、表１３ではＮＢと記載した。加えて、直接結合シグナル（ＲＬＵ）を、抗体濃度の関数として分析し、そして、データを、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して、シグモイド（４パラメーターロジスティック）用量反応モデルに適合させた。最大結合シグナルの５０％を検出する抗体の濃度として定義する、ヒトＣＤ６３発現細胞に対する結合のＥＣ５０値を、各抗体の効力を示すために決定し、そして、特異的バインダーだけを表３に報告した。異なる抗体を試験している２つの別々の実験のデータを、表３Ａ及び３Ｂに報告する。
【０２４１】
表３Ａに示したように、本実施例で説明したようにして生成した４つの抗ＣＤ６３抗体、及び、コンパレーターＡｂ（コンパレータ１）は、遺伝子操作したＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ６３細胞で発現したヒトＣＤ６３、ならびに、ＬＮＣＡＰ及びＵ８７ＭＧ細胞株で内因的に発現したヒトＣＤ６３に対して特異的に結合した。本実施例で説明している４つの抗ＣＤ６３抗体は、ＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ６３細胞に結合しており、ＥＣ５０値は、２８０ｐＭ〜９７０ｐＭの範囲であり、かつ、結合率は、ネガティブ細胞株の９１〜２８１倍の範囲であった。本発明の４つの抗ＣＤ６３抗体は、Ｕ８７ＭＧ細胞に結合しており、ＥＣ５０値は、５００ｐＭ〜１．４ｎＭの範囲であり、かつ、結合率は、ネガティブ細胞株の５２〜２７２倍の範囲であった。本実施例で説明するようにして生成した４つの抗ＣＤ６３抗体は、ＬＮＣＡＰ細胞に結合しており、ＥＣ５０値は、２１０ｐＭ〜１．７ｎＭの範囲であり、かつ、結合率は、ネガティブ細胞株の７〜２０倍の範囲であった。ＬＮＣＡＰ細胞の結合率の低さは、Ｕ８７ＭＧ細胞と比較して、これらの細胞のＣＤ６３コピー数が小さいことと一致している。アイソタイプコントロール抗体は、予想した通り、非バインダーであり、細胞結合率は、３以下であった。
表３Ａ．電気化学発光をベースとした検出で測定した、ヒトＣＤ６３発現細胞に結合する抗ＣＤ６３抗体
【表３Ａ】
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【０２４２】
表３Ｂに示したように、試験した２０個の抗ＣＤ６３抗体の１９個、ならびに、コンパレーターＡｂ（コンパレーター１）は、遺伝子操作したＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ６３細胞、及び、内因的に発現するＵ８７ＭＧ及びＬＮＣＡＰ細胞株で発現したヒトＣＤ６３に対して特異的に結合した。１つの抗ＣＤ６３抗体、Ｈ４Ｈ１１９９８Ｐ２は、ＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ６３、及び、Ｕ８７ＭＧに対して特異的に結合したが、ＬＮＣＡＰには結合しなかった。試験した２０個の抗ＣＤ６３抗体が、ＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ６３細胞に結合しており、ＥＣ５０値は、０．３２０ｎＭ〜７．４ｎＭの範囲であり、結合率は、ネガティブ細胞株の１４〜６０８倍であり、また、それらは、Ｕ８７ＭＧ細胞に結合しており、ＥＣ５０値は、０．２９ｎＭ〜１７ｎＭの範囲であり、結合率は、ネガティブ細胞株の５〜４０５倍であった。１９個の抗ＣＤ６３抗体が、ＬＮＣＡＰ細胞に結合しており、ＥＣ５０値は、０．１５ｐＭ〜５５ｎＭの範囲であり、結合率は、ネガティブ細胞株の４〜５１倍であった。１つの抗ＣＤ６３抗体、Ｈ４Ｈ１１９９８Ｐ２は、ＬＮＣＡＰ細胞に対して非バインダーであり、細胞結合率は１であった。ＬＮＣＡＰ細胞の結合率の低さは、Ｕ８７ＭＧ細胞と比較して、これらの細胞のＣＤ６３コピー数が小さいことと一致している。アイソタイプコントロール抗体は、予想した通り、非バインダーであり、細胞結合率は３以下であり、そして、試験したヒトＣＤ６３細胞株に対する結合シグナルは１００ＲＬＵ未満であった。
表３Ｂ．電気化学発光をベースとした検出で測定した、ヒトＣＤ６３発現細胞に結合する抗ＣＤ６３抗体
【表３Ｂ−１】
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【表３Ｂ−２】
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【０２４３】
親の抗ヒトＣＤ６３抗体が媒介する内在化／細胞傷害性
本明細書に開示した抗ＣＤ６３抗体が、ＣＤ６３発現細胞に結合して内在化する能力を評価した。アッセイでは、１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２０２０）、ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）、１００μＭピルビン酸ナトリウム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＴＭ５−００５−Ｃ）、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１５６３００８０）、１０μｇ／ｍＬ  インスリンウシ（Ｇｅｍｉｎｉ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号７００−９１２Ｐ）（増殖培地）を含有するＲＰＭＩ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９１６０）を入れた、９６ウェルのコラーゲンコーティングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５９５６）に、Ｔ４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−１３３）を播種し、そして、５％ＣＯ２にて、３７℃で、一晩インキュベートした。染色するために、細胞の４枚組プレートを、２％ＦＢＳを含み、カルシウムとマグネシウムが含まないＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｇ、カタログ番号９２４０）（染色緩衝剤）で希釈した１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ６３抗体と共に、４℃で、３０分間、インキュベートした。細胞を、染色緩衝剤で２回洗浄した後に、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ  ４８８コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−５４７−００３、または、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−５４７−００３）の１０μｇ／ｍＬと共に、４℃で、３０分間、インキュベートを行い、続いて、染色緩衝液で、さらに２回洗浄した。２枚のプレートを直ちに固定し、そして、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２８９０８）＋５ｕＭ  ＤＲＡＱ５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号６２２５１）を含むＰＢＳで、２０分間、染色した（非内在化プレート）。残りの２枚のプレートを、増殖培地と共に、３７℃で、２時間、インキュベートした後に固定を行い、そして、ＰＢＳで希釈した４％ＰＦＡ＋５μＭ  ＤＲＡＱ５の溶液を使用して、２０分間、染色した（内在化プレート）。固定した後に、すべてのプレートを、ＰＢＳで１回洗浄した。１枚の非内在化プレートと１枚の内在化プレートを、５０μｇ／ｍＬの抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）を含むＰＢＳと共に、４℃で、一晩、インキュベートして、表面のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光を反応停止させた。残りのプレートは、ＰＢＳだけでインキュベートした。共焦点画像を、Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にて、４０倍の倍率で得た。ハーモニー分析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ＤＲＡＱ５で標識した細胞を同定し、そして、総Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８相対蛍光単位（ＲＦＵ）／細胞を決定した。４℃での総結合（反応停止させていない４℃のウェルでのＲＦＵ値）、３７℃での総結合（反応停止させていない３７℃のウェルのＲＦＵ値）、総内在化ＲＦＵ、及び、％内在化を、表１に示したように、各抗体について決定した。すべての計算について、第２のＡｂだけのコント���ールウェルでのバックグラウンド蛍光を、それぞれのウェルから控除した。総内部化ＲＦＵは、次のようにして計算した：反応停止させていない３７℃の試料での総ＲＦＵ−３７℃での表面ＲＦＵ。表面ＲＦＵとは、反応停止していない３７℃でのＲＦＵ−反応停止させた３７℃でのＲＦＵ）／ＱＥとして定義する。ＱＥ（反応停止効率）は：１−（反応停止した４℃での試料の総ＲＦＵ／反応停止していない４℃での試料の総ＲＦＵ）として定義する。％内在化は、次の式：（３７℃での総内在化ＲＦＵ／３７℃での総ＲＦＵ）＊１００で決定した。
【０２４４】
表４に示したように、本発明の４つすべての抗ＣＤ６３抗体は、６０．９％〜７３．７％内在化の範囲のＴ４７Ｄ細胞での内在化を実証した。アイソタイプコントロールは、測定可能な内在化を示さなかった。
表４：Ｔ４７Ｄ細胞での抗ＣＤ６３抗体の内在化と表面結合
【表４】
2021524231.tif 000072
【０２４５】
本明細書に記載した抗ＣＤ６３抗体が、ＣＤ６３発現細胞に内在化する能力を評価するために、インビトロ間接細胞傷害性アッセイを実施した。１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２０２０）、ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）、５０ｕＭベータ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ７５２２）（増殖培地）、ピルビン酸ナトリウム１００ｍＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＴＭＳ−００５−Ｃ）、ＨＥＰＥＳ  １Ｍ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９３１９）、及び、インスリンウシ１０ｕｇ／ｍＬ（Ｇｅｍｉｎｉ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号７００−９１２Ｐ）を含有するＲＰＭＩ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９１６０）に、６，０００個の細胞／ウェルで、あるいは、ＤＭＥ高グルコース（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９０３３）、１０％ウシ子牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７２．０３）、及び、ペンシルリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）に、２，０００個の細胞／ウェルで、ヒトＣＤ６３ポジティブＴ４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−１３３）、及び、ヒトＣＤ６３ネガティブＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１６５８）を、それぞれ、ＰＤＬでコーティングした９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ、カタログ番号３５６４６１）に播種を行い、そして、５％ＣＯ２にて、３７℃で、一晩、増殖させた。細胞生存率曲線については、細胞を、３．０ｐＭ〜２．２ｎＭの範囲の濃度の、段階希釈した抗ＣＤ６３抗体（Ｈ２Ｍ１２４５０Ｎ）、または、非結合アイソタイプコントロール抗体と共に、３７℃で、５分間、インキュベートした。次いで、細胞傷害性ペイロードＭＭＡＦにコンジュケートしたＦａｂ抗ｍＦｃ二次抗体（Ｍｏｒａｄｅｃ、カタログ番号ＡＭ−２０１ＡＦ−５０）を、各ウェルに、２０ｎＭで加えた。培地だけのものを、ネガティブコントロールとして機能させ、そして、３３μＭのジギトニン（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ９４４１）を使用して、最大細胞傷害性を決定した。７２時間のインキュベートの後に、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、カタログ番号ＣＫ０４）を使用して、製造業者のプロトコールに従って、１〜３時間のインキュベート時間範囲で、細胞生存率を測定した。４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ４５０）を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定した。ジギトニンで処理した細胞でのバックグラウンドＯＤ４５０レベルを、すべてのウェルから控除し、そして、未処理コントロールのパーセンテージ（％生存率）として生存率を表した。ＩＣ５０値は、８ポイントの応答曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）での４パラメーターロジスティック方程式から決定した。すべてのＩＣ５０値を、ｎＭ濃度で表し、そして、処理した後に残存している生細胞の最小％を報告する。
【０２４６】
表５にまとめたように、抗ＣＤ６３抗体、Ｈ２Ｍ１２４５０Ｎは、Ｔ４７Ｄの生存率を、２１％にまで低下させ、ＩＣ５０値は、０．２４ｎＭであったが、アイソタイプコントロールは、生存率を６４％に低下させたに過ぎなかった。抗体は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株の生存率に対して、ほとんど、または、全く影響を与えなかった。
表５．Ｔ４７Ｄ及びＮＩＨ３Ｔ３細胞での間接細胞傷害性アッセイで測定した抗ＣＤ６３抗体の内在化
【表５】
2021524231.tif 000073
【０２４７】
２５℃及び３７℃で測定した、ＣＤ６３（ＥＣ２）ループ試薬に結合する抗ＣＤ６３モノクローナル抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合反応速度論
精製した抗ＣＤ６３モノクローナル抗体に結合する異なるＣＤ６３（ＥＣ２）ループ試薬の平衡解離定数（ＫＤ）を、リアルタイム表面プラズモン共鳴をベースとしたＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００バイオセンサー、または、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００バイオセンサーを使用して決定した。すべての結合研究を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ−ＥＴ）ランニング緩衝剤にて、２５℃と３７℃で実施した。ＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサーチップ表面を、まずは、ウサギ抗マウスＦｃ特異的ポリクローナル抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３８）、または、抗ヒトＦａｂキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８９５８３２５）のいずれかとのアミンカップリングで誘導体化して、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体を捕捉した。Ｃ末端Ｍｙｃ−Ｍｙｃ−ヘキサヒスチジン（ｈＣＤ６３  ＥＣループ２−ＭＭＨ；配列番号３３８）で発現した組換えヒトＣＤ６３細胞外ループ２、または、Ｃ末端ヒトＦｃタグ（ｈＣＤ６３  ＥＣループ２−ｈＦｃ；配列番号３３９）で発現した組換えヒトＣＤ６３細胞外ループ２のいずれかに関して、結合研究を行った。異なる濃度のｈＣＤ６３  ＥＣループ２−ＭＭＨ、または、ｈＣＤ６３  ＥＣループ２−ｈＦｃ（４倍希釈で５０ｎＭ〜１２．５ｎＭ、または、３倍段階希釈で９０ｎＭ〜０．３７ｎＭのいずれかで試験した）を、まず、ＨＢＳ−ＥＴランニング緩衝剤で調製し、そして、それらを、捕捉した抗ＣＤ６３モノクローナル抗体表面に、３５μＬ／分、または、５０μＬ／分の流速で、４分間かけて注入し、一方で、モノクローナル抗体に対して結合したＣＤ６３試薬の解離を、ＨＢＳ−ＥＴランニング緩衝剤にて、８分間または１０分間モニターした。結合率（ｋａ）と解離率（ｋｄ）は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、物質移動制限のある１：１結合モデルに適合させて決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）、及び、解離半減期（ｔ１／２）は、反応速度から、次のように計算した：
【数１】
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【０２４８】
２５℃と３７℃での本発明の異なる抗ＣＤ６３モノクローナル抗体に結合するヒトＣＤ６３  ＥＣループ２タンパク質の結合動態パラメーターを、表６〜９に示す。
【０２４９】
表６に示したように、２５℃で、本発明の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体の２３個の内の２０個は、６７６ｐＭ〜１１．７ｕＭの範囲のＫＤ値で、ヒトＣＤ６３  ＥＣループ２−ＭＭＨに対して結合した。表７に示したように、３７℃で、本発明の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体の２３個の内の２１個は、１．１５ｎＭ〜１２．３μＭの範囲のＫＤ値で、ヒトＣＤ６３  ＥＣループ２−ＭＭＨに対して結合した。表８に示したように、２５℃で、本発明の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体の２３個の内の２２個が、１２９ｐＭ〜１０．１ｎＭの範囲のＫＤ値で、ヒトＣＤ６３  ＥＣループ２−Ｆｃに対して結合した。表９に示したように、３７℃で、本発明の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体の２３個の内の２２個が、４５．０ｐＭ〜１４．５ｎＭの範囲のＫＤ値で、ヒトＣＤ６３  ＥＣループ２−Ｆｃに対して結合した。
表６：２５℃で、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体に対して結合するヒトＣＤ６３  ＥＣループ２−ＭＭＨの結合動態パラメーター
【表６】
2021524231.tif 000075
表７：３７℃で、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体に対して結合するヒトＣＤ６３  ＥＣループ２−ＭＭＨの結合速度パラメーター
【表７−１】
2021524231.tif 000076
【表７−２】
2021524231.tif 000077
表８：２５℃で、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体に対して結合するヒトＣＤ６３  ＥＣループ２−ｈＦＣの結合動態パラメーター
【表８】
2021524231.tif 000078
表９：３７℃で、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体に対して結合するヒトＣＤ６３  ＥＣリープ２−ｈＦＣの結合動態パラメーター
【表９】
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【０２５０】
異なる抗ＣＤ６３モノクローナル抗体間のオクテット相互競合
抗ＣＤ６３モノクローナル抗体のパネルの間での結合競合を、Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．）でのリアルタイムの無標識バイオレイヤー干渉測定アッセイを使用して決定した。実験全体を、２５℃で、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４（ＨＢＳ−ＥＢＴ）緩衝剤にて、１０００ｒｐｍの速度でプレートを震盪しながら実施した。２つの抗体が、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグ（ｈＣＤ６３  ＥＣループ２−ＭＭＨ；配列番号ｘｘ）で発現した組換えヒトＣＤ６３  ＥＣループ２でのそれぞれのエピトープに対する結合について、互いに競合できるか否かを評価するために、約０．６１ｎｍのｈＣＤ６３  ＥＣループ２−ＭＭＨを、まず、ｈＣＤ６３  ＥＣループ２−ＭＭＨの２０μｇ／ｍＬ溶液を含むウェルに、バイオセンサーチップを３分間沈めて、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体でコーティングしたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ（ＦｏｒｔｅｂｉｏＩｎｃ、＃１８−５１２２）に捕捉させた。次に、抗原で捕捉したバイオセンサーチップを、第１の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（以下、ｍＡｂ−１と称する）を、ｍＡｂ−１の５０μｇ／ｍＬ溶液を含むウェルに、２１０秒間浸漬させたて飽和させた。次いで、バイオセンサーチップを、第２の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（以下、ｍＡｂ−２と称する）の５０μｇ／ｍＬ溶液を含むウェルに、１２０秒間浸漬させた。バイオセンサーチップは、実験のそれぞれのステップの間に、ＨＢＳ−ＥＢＴ緩衝剤で洗浄した。実験の全過程でリアルタイムの結合応答をモニターし、そして、それぞれのステップの終わりに結合応答を記録した。ｍＡｂ−１と事前に複合体化したｈＣＤ６３  ＥＣループ２−ＭＭＨに対するｍＡｂ−２結合の応答を比較し、そして、表１０に示したように、異なる抗ＣＤ６３モノクローナル抗体の競合／非競合挙動を決定した。
表１０．抗ＣＤ６３モノクローナル抗体間の相互競合
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【０２５１】
抗ＣＤ６３結合アームを有する二重特異性複合体の内在化を決定するための二重特異性抗体の生成
本実施例で説明したようにして生成した抗ＣＤ６３抗体が、二重特異性抗原結合分子の一部として内在化する能力を評価するために、抗体を、二重特異性フォーマットに再構築し、そして、一方の結合アームを、抗ＣＤ６３抗体ＶＨ／ＶＬペア（表１の親抗体を参照されたい）とし、また、他方を、無関係な結合アームとした。二重特異性抗体を作り出す標準的な方法を使用しており、例示的な方法として、例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それぞれの内容を援用する、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号、及び、米国特許第ＵＳ５７３１１６８号に記載されたものがある。二重特異性抗体を、ヒトＣＤ６３発現細胞を使用して、内在化する能力について試験した。アッセイでは、１０％ＦＢＳ、及び、ペニシリン−ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８０１６）を含有するＤＭＥＭを入れた、透明底の黒色ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５９４６）に、１０，０００細胞／ウェルの密度で、ヒトＣＤ６３を内因的に発現するＨＥＫ２９３細胞を播種した。２日後に、培地を、抗ＣＤ６３二重特異性抗体と、１０μｇ／ｍＬから始まって、０．１５７μｇ／ｍＬに至る２倍希釈系列のネガティブコントロール抗体とを含む新たな培地との交換を行い、併せて、培地だけのコントロールも交換した。次に、細胞を、３７℃で、３時間インキュベートして、抗体の内在化を可能にした。インキュベートの後に、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２８９０８）で、室温で、２０分間固定し、続いて、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号ＴＲ１３５）で、５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号ＰＣＮ５０００）にて、室温で、２０分間、透過処理した。次いで、細胞を、２ｕｇ／ｍＬのロバ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７  Ｆａｂ（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ、カタログ番号１１５−６０６−００６）、または、２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７  Ｆａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−６０６−００６）のいずれかと、５％ＮＧＳにて、室温で、１時間、インキュベートした。二次抗体溶液を除去した後に、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、続いて、２滴／ｍＬのＮｕｃＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ３７６０５）を含む新たなＰＢＳを添加して、生細胞の核を染色した。抗体の内在化と核を、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて、４０倍の倍率で、画像化を行い、そして、抗体の内在化を、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｔｒａｎｓｆｌｕｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して定量した。抗体内在化を、ピット積分強度／細胞±標準偏差（ＳＤ）として報告する。
【０２５２】
表１１に示したように、ヒトＣＤ６３に対して結合する単一アーム（Ｈ１Ｍ１２４５１、Ｈ２Ｍ１２４５０、または、Ｈ２Ｍ１２３９５のいずれかから誘導した）と、無関係の非結合アームとを組み込んだすべての二重特異性抗体は、ＨＥＫ２９３細胞への効率的な内在化を実証した。ｍＡｂ１２４５０の１つの結合アームを組み込んだ二重特異性抗体は、試験したその他の二重特異性抗体よりも大量の内在化を実証した。
表１１：ＨＥＫ２９３細胞による抗ＣＤ６３二重特異性抗体の内在化
【表１１】
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【０２５３】
実施例２
抗ｈＣＤ６３  ＳｃＦｖ：：ＧＡＡポリヌクレオチド、及び、遺伝子療法ベクターの構築
ヒトＧＡＡ（ｈＧＡＡ；配列番号３６９）、または、ヒトＧＡＡに対して、そのＣ末端で融合した抗ヒトＣＤ６３一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）（抗ｈＣＤ６３  ＳｃＦｖ−ｈＧＡＡ）の発現をコードするＡＡＶ２／８ウイルスを、標準的な三重トランスフェクションプロトコールを使用して生成する（Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１；“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ”，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９），  ｐｐ．４．１７．１−４．１７．２５，  Ｖｏｌ  １も参照されたい）。生産のために、１×１０７個のＨＥＫ２９３細胞を、１５ｃｍプレートに播く。翌日に、（Ａ）肝臓特異的セルピナ１エンハンサー（配列番号３６７）を含み、ＴＴＲプロモーター（配列番号３６８）駆動性ヒトＧＡＡをコードするコントロールｐＡＡＶベクター、または、肝臓特異的セルピナ１のエンハンサー（配列番号３６７）を含み、ＴＴＲプロモーター（配列番号３６８）駆動性ｈＣＤ６３  ＳｃＦｖ−ｈＧＡＡ（図２を参照されたい）をコードする試験ｐＡＡＶのいずれかの８μｇ、及び、（Ｂ）ｐＡＡＶ  ＲＣ２／８−由来ベクター（Ｇａｏ、２００２）、及び、１６μｇのｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号２４００７４）を、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，カタログ番号１１５−１００）媒介性トランスフェクションを、１：１の比（１ｕｌ  ＰＥＩｐｒｏ：１μｇ  ＤＮＡ）で用いて、トランスフェクションする。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を回収し、そして、標準的な凍結融解法を用いて、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌからなる緩衝剤に溶解する。次に、ベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ１０１４−２５ＫＵ）を、最終濃度０．５Ｕ／μＬで試料に添加し、次いで、これを、３７℃で、６０分間、インキュベートする。続いて、ウイルスを、（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９９；６：９７３−９８５）に記載されているようにして、イオジキサノール勾配超遠心分離を用いて精製し、続いて、ｑＰＣＲで滴定する。
【０２５４】
ＡＡＶ試料を、ＤＮａｓｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＥＮ０５２５）を用いて、３７℃で、１時間処理し、そして、ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｌｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４４０３３１９）を使用して溶解する。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＡＡＶ２  ＩＴＲに関するプライマーを使用して、キャプシド形成したウイルスゲノムを定量する。ＡＡＶ２  ＩＴＲのプライマーの配列は、５’−ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ−３’（ｆｗｄ  ＩＴＲ；配列番号３７０）、及び、５’−ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ−３’（ｒｅｖ  ＩＴＲ；配列番号３７１）（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）であり、それぞれ、ＡＡＶの左側内部逆反復（ＩＴＲ）配列（配列番号３６５）、及び、ＡＡＶの右内部逆反復（ＩＴＲ）配列（配列番号３６６）に由来する。ＡＡＶ２  ＩＴＲのプローブの配列は、５’−６−ＦＡＭ−ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号：３７２）（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ  Ｃ．，Ｈａａｓｅ  Ｍ．，Ｍｕｅｎｅｒ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３、１８−２８）である。９５℃の活性化ステップで１０分間の後に、２ステップＰＣＲサイクルを、９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間にて、４０サイクル行う。ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３０４４３７）を、ｑＰＣＲで使用する。ＤＮＡプラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号２４００７４）を標準として使用して、絶対力価を決定する。
【０２５５】
抗ヒトＣＤ６３抗体、及び、それらの融合物は、表１に示している抗ＣＤ６３可変ドメインを使用する。抗体のＳｃＦｖバージョンは、重−軽の順序で可変ドメインを用いて、グリシン−セリンリンカーを間に配して（５’−ＶＨ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＶＬ−３’）、クローニングする。
【０２５６】
配列番号３６４（図２）に記載のアミノ酸配列を有する抗ｈＣＤ６３  ｓｃＦｖ：：ＧＡＡマルチドメイン治療薬をコードするＡＡＶが生成され、そして、酵素置換治療を提供する際の有効性を試験した。
【０２５７】
実施例３
ＡＡＶ後のマウスポンペモデルのグリコーゲン含量
関連のグリコーゲン蓄積インビボモデルにおける、ＡＡＶが送達した抗ｈＣＤ６３  ＳｃＦｖ−ＧＡＡ融合体（配列番号３６４）と、ＡＡＶが送達したＧＡＡとの効果を決定するために、両方の療法をポンペ病マウスモデルに対して送達することとし、同マウスは、マウスＧＡＡ遺伝子の欠失についてホモ接合性であり、そして、マウスＣＤ６３の代わりに、ヒトＣＤ６３の発現についてホモ接合性であり、系統の背景は、７５％のＣ５７ＢＬ／６；２５％の１２９ＳｖＪである。本明細書では、これらのマウスを、ＣＤ６３  ＨｕｍＩｎ  ＧＡＡ  ＫＯマウス、または、ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕ；ＧＡＡ−／−マウスとも称する。
【０２５８】
実験では、ＴＴＲ肝臓特異的プロモーター駆動性のヒトＧＡＡ（ＡＡＶ−ｈＧＡＡ；実施例２に記載したもの）、または、ＴＴＲ肝臓特異的プロモーター駆動性のＣ末端でヒトＧＡＡに融合された抗ヒトＣＤ６３  ＳｃＦｖ（ＡＡＶ−抗ｈＣＤ６３  ＳｃＦｖ−ｈＧＡＡ；実施例２に記載したもの）のいずれかをゲノムに含有するＡＡＶ２／８ウイルスのいずれかを、尾静脈注射を介して、２ヶ月齢のＣＤ６３  ＨｕｍＩｎ  ＧＡＡ  ＫＯマウスに投与する。両方のＡＡＶ２／８ウイルスを、１ｅ１０ｖｇ／マウス、または、１ｅ１１ｖｇ／マウスの二つの用量のいずれか一方で送達する。コントロールとして、未処置のＣＤ６３  ＨｕｍＩｎ  ＧＡＡ  ＫＯマウスと、マウスＧＡＡ遺伝子がインタクトである未処置ＣＤ６３  ＨｕｍＩｎとを、アッセイに含める。マウスを、処置後３ヵ月間収容し、そして、この期間内に、ＧＡＡレベル、及び、抗ＧＡＡ抗体の血清測定のため少しずつ（毎月）採血をする。３ヶ月後に、すべてのマウスを屠殺し、そして、個々の組織を、グリコーゲン測定、ＰＡＳ−Ｈ染色、中心核の定量、リソソーム増殖の測定、及び、ＬＣ３ｂ発現の測定のために回収する。マウスの群についての実験用量および処理プロトコールを、表１２に示す。
表１２：マウスの群に対する実験用量および治療プロトコール
【表１２−１】
2021524231.tif 000092
【表１２−２】
2021524231.tif 000093
【０２５９】
実施例４
ＧＡＡに対する免疫応答
抗ヒトＧＡＡ抗体の血清レベルを測定するために、製造業者の仕様書に従って、血清分離チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３６５９６７）を使用して、すべての処置群から末期採血の間に回収した血液から血清を分離する。これとは別に、９６ウェル高タンパク質結合プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１５０４１）を、ＰＢＳで希釈した２０μｇのｈＧＡＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８３２９−ＧＨ−０２５）で、一晩、コーティングする。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）で、３回洗浄する。プレートを、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔでブロッキングし、そして、マウス血清の１：３００〜１：５．１ｅ７の範囲の希釈系列を、一晩、プレートに加える。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−０３５−１６４）、及び、ＢＤ  Ｏｐｔ  ＥＩＡ基質キットを使用して、総抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）を測定する。１Ｎリン酸を使用して、比色反応を停止する。次いで、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｉ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍでの吸光度を読み取る。希釈曲線を、シグモイド曲線に適合させ、そして、この曲線から力価を計算する。
【０２６０】
同様に実施した実験では、ＡＡＶ投与後の高レベルのＧＡＡ、または、抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ（配列番号３６４）は、低い抗ＧＡＡ力価と相関していた（データ示さず）。高力価または低力価のＡＡＶ−抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ（配列番号３６４）、または、ＡＡＶ−ＧＡＡで処理したＧＡＡヌルマウスの血清を、注射後の３ヶ月の間に、抗ＧＡＡ抗体について評価した。抗体力価とＧＡＡに対する血清曝露との間には負の相関が認められ、また、構築物の用量と抗ＧＡＡ抗体の力価との間には逆相関が認められた（データ示さず）。
【０２６１】
実施例５
血清ＧＡＡ
実験の過程でヒトＧＡＡ血清レベルを測定するために、尾部出血を介して、試料を、毎月回収する。製造業者の仕様書に従って、血清セパレーターチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３６５９６７）を使用して、血液から血清を分離する。次いで、１μＬの単離した血清を、４％〜２０％のＮｏｖｅｘ  ｗｅｄｇｅｗｅｌｌプレキャストゲルにロードし、２２０Ｖで、４５分間泳動させ、標準手順書を使用して、２００ｍＡで、１時間、ニトロセルロース膜に移送する。次いで、ニトロセルロース膜を、１：２０００希釈で使用する抗ＧＡＡ一次抗体（Ａｂｃａｍ、番号ａｂ１３７０６８）、及び、１：１０００希釈で使用する抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｃａｍ、番号ＡＢ９４８４）の１２ｍＬを使用してプロービングし、そして、４℃で、一晩、インキュベートする。一次抗体によるインキュベートの後に、膜を、１×ＴＢＳＴ／洗浄で、５分間、３回洗浄する。次いで、抗ウサギＩｇＧ（ＬｉＣｏｒ、９２６−３２２１１）、及び、抗マウスＩｇＧ（ＬｉＣｏｒ、９２５−６８０７０）（Ｌｉｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）二次抗体の１：１５０００希釈物の１２ｍＬを、膜に添加し、そして、室温で、１時間、インキュベートする。二次抗体によるインキュベートの後に、膜を、１×ＴＢＳＴ／洗浄で、５分間、２回、そして、１×ＴＢＳで、５分間、１回洗浄する。次いで、ＬｉＣｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ機器（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、膜を画像化して定量する。
【０２６２】
上記したものと同様の実験では、ＣＤ６３  ＨｕｍＩｎ  ＧＡＡ  ＫＯマウスを、高用量（１０１１ｖｇ／マウス）のＡＡＶ−抗−ｈＣＤ６３  ＳｃＦｖ−ｈＧＡＡ（配列番号３６４）、または、ＡＡＶ−ｈＧＡＡで処理し、実験の過程で、血清中に持続レベルのＧＡＡを実証した（データ示さず）。
【０２６３】
注射の３か月後に、肝臓、心臓、及び、四頭筋での発現のリアルタイムＰＣＲ定量を行った。肝臓での発現は、すべてのＡＡＶ構築物の注射について検出がされており、そして、血清ＧＡＡレベルとＧＡＡのＲＮＡ発現レベルとの比較も行った。そのデータ（示さず）は、配列番号３６４に記載の融合タンパク質をコードする（及び、発現が肝臓特異的プロモーターによって駆動される）ＡＡＶが、ＧＡＡの分泌プロファイルの改善を達成することを示唆した。
【０２６４】
実施例６
グリコーゲンの組織測定、及び、筋肉組織の組織学的特徴決定
グリコーゲンの組織測定：個々の組織のグリコーゲン含量を測定するために、心臓、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、ヒラメ筋、及び、ＥＤＬの組織を、ＣＯ２で窒息させた直後のすべての群由来のマウスから摘出し、次いで、液体窒素にて急速凍結し、及び、−８０℃で保存する。グリコーゲン測定のために、各組織の約５０ｍｇを、蒸留水中で、１ｍｇ対２５μＬの水の比率のステンレス鋼ビーズを用いて、ベンチトップ用ホモジナイザーで溶解する。グリコーゲン分析溶解物を、１０５°で、１５分間加熱し、そして、２１０００×ｇで遠心分離して破片を除去する。グリコーゲン測定は、蛍光アッセイに関する製造業者の指示書に従って、グリコーゲンアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、番号ＭＡＫ０１６）を使用して実施する。各試料の蛍光を、５３５ｎｍの励起、及び、５８７ｎｍの発光で、蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｉ３）にて測定する。グリコーゲンの計算量は、製造業者が提供した以下の式を使用して計算する。
【０２６５】
組織病理学、及び、定量のための四頭筋の回収：低用量（１ｅ１０ｖｇ／マウス）処置群以外の各群のマウスから得た四頭筋組織試料を、ＬＣ３ｂ発現の定量のために摘出した直後に液体窒素で急速凍結し、そして、−８０℃に保存するか、あるいは、Ｏ．Ｃ．Ｔ培地（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、番号４５８３）を含有するブロックに配置する。
【０２６６】
Ｏ．Ｃ．Ｔ培地に含まれる組織試料を、切片作製と、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色をして多糖類を検出するために、Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ，Ｉｎｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）に送る。中心核、及び、リソソーム増殖の染色のための切片をさらに調製して返却する。
【０２６７】
ＰＡＳ染色：ＰＡＳ染色切片を、倍率を２０倍としたＬｅｉｃａスライドスキャナーを使用して画像化する。
【０２６８】
中心核、及び、リソソーム増殖の定量：Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖから得た未染色切片を冷凍庫から取り出し、次いで、染色チャンバー内で、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを用いて、１５分間固定する。次いで、固定したスライドを、２回、ＰＢＳにて５分間洗浄し、続いて、ブロッキング緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、００−４９５３−５４）と共に、室温で、１時間、インキュベートする。次いで、スライドを、加湿染色チャンバー内で、ブロッキング緩衝液での１：５０希釈のラット抗Ｌａｍｐ−１抗体（Ａｂｃａｍ、番号ＡＢ２５２４５）、ブロッキング緩衝液での１：１０００希釈のウサギ抗ラミニン抗体（Ｓｉｇｍａ、番号Ｌ９３９３）のいずれか、または、抗体無添加のブロッキング緩衝液で染色し、次いで、４℃に移して、一晩、インキュベートする。翌日、次いで、スライドを２回、ＰＢＳにて５分間洗浄し、続いて、染色チャンバー内で、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  Ｔｈｅｒｍｏ、番号Ａ２７０４０）をコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）スーパークローナル二次抗体、または、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  Ｔｈｅｒｍｏ、番号Ａ２１４３４）をコンジュゲートしたヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を交差吸着させた二次抗体のいずれかを使用して染色し、次いで、室温で、１時間、インキュベートする。次いで、染色したスライドを、２回、ＰＢＳにて５分間洗浄した後に、ＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  Ｔｈｅｒｍｏ、番号００−４９５９−５２）を用いて装着し、そして、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０機器（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ    Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｇｍｂｈ）で画像化する。中央に位置する核の数を、Ｈａｌｏソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ  Ｌａｂｓ、ＮＭ）を使用して定量する。
【０２６９】
ＬＣ３ｂ発現の定量：ＬＣ３ｂ発現の定量のために、急速凍結試料を解凍し、均質化し、そして、４５秒間かけてビーズ固着（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）させたものを、１ｍｇの組織：２５μＬ  ＲＩＰＡ緩衝剤（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒ０２７８）の比率で、ＲＩＰＡ緩衝剤に溶解させる。２１，０００×ｇの遠心分離によって、溶解物から不溶性物質を除去し、次いで、ＲＩＰＡ緩衝剤での溶解物３００μｇを、４％〜２０％のＮｏｖｅｘ  ｗｅｄｇｅｗｅｌｌプレキャストゲルにロードし、ニトロセルロース膜に移送し、そして、ＧＡＡに対する一次抗体の代わりに、マウスＬＣ３ｂ−Ｉ、及び、ＬＣ３ｂ−ＩＩ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｌ７５４３）を認識する一次抗体を使用して、血清ＧＡＡレベルの分析について先に説明したものと同様のプロトコールに従って、ウエスタンブロットで分析を行う。次に、ＬｉＣｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ機器（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、膜の画像化と定量を行った。ＬＣ３ｂ−Ｉ、及び、ＬＣ３ｂ−ＩＩレベルは、任意の単位の（平均＋／−標準偏差）として表した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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