(57)【要約】  本発明は、好塩基性顆粒球を同定する方法、特にin vitroの方法に関し、方法は、「大腸癌変異」（MCC）遺伝子の哺乳類遺伝子領域の少なくとも1つのCpG位置の修飾、例えばメチル化状態の解析を含み、非好塩基性顆粒球、又は末梢血若しくは他の組織における任意の他の細胞の種類と比較して、該遺伝子領域の脱メチル化、又は修飾若しくはメチル化の欠如は好塩基性顆粒球の指標である。本発明による解析は、好塩基性顆粒球をエピジェネティックレベルで同定し、複雑なサンプル内の他の全ての細胞、例えば他の血液又は免疫細胞と区別することができる。本発明は更に、好塩基性顆粒球、特に複雑なサンプル中の好塩基性顆粒球を定量する改良された方法を提供する。方法は、好ましくは全血及び／又は非トリプシン処理組織において、細胞の精製及び／又は濃縮工程を伴い又は伴わずに行うことができる。最後に、本発明はバイサルファイト処理された核酸に基づくプライマー、プローブ、及びアンプリコンを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおいて好塩基性顆粒球を同定する方法であって、大腸癌変異（MCC）哺乳類遺伝子領域における少なくとも1つのCpG位置の修飾、例えばメチル化状態を解析することを含み、解析される前記遺伝子領域が好ましくは配列番号1による位置にあり、非好塩基性顆粒球と比較した前記遺伝子領域の脱メチル化、又は修飾、例えばメチル化の欠如が好塩基性顆粒球の指標である、方法。
【請求項２】
前記少なくとも1つのCpG位置が、解析される前記遺伝子領域の転写開始、プロモーター領域、5'又は3'非翻訳領域、エキソン、イントロン、エキソン／イントロン境界よりも上流の5'領域に存在する、及び／又は解析される前記遺伝子領域の転写停止よりも下流の3'領域に存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも1つのCpG位置が、配列番号1によるアンプリコンにおけるCpG位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、及び18から選択されるCpGから選択され、好ましくは配列番号2又は3によるバイサルファイト変換された配列によるアンプリコン番号2694におけるCpG位置57、69、76、80、119、136、142、162、186、198、233、281、292、303、307、339、351及び362から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
バイサルファイト変換可能性の解析が、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、CpGアイランドメチル化、MSP、HeavyMethyl、MethyLight、Ms-SNuPEから選択される解析、及び増幅DNAの検出に依存する他の方法を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
解析される前記領域中の前記メチル化の頻度の相対量とコントロール遺伝子、例えばGAPDHのメチル化頻度の相対量との比較に基づく好塩基性顆粒球の相対量の定量を更に含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、ヒト血液サンプルを含む哺乳類の体液、又は組織、器官、若しくは細胞型の血液サンプル、血液リンパ球のサンプル又はそれらの画分から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記好塩基性顆粒球と、濾胞性ヘルパーT細胞、B細胞、細胞傷害性T細胞、好中性顆粒球、単球、NK細胞、及びTヘルパー細胞から選択される細胞型の全て、又は少なくとも1つとの区別を更に含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
同定される細胞の精製及び／又は濃縮の工程を伴わずに、好ましくは全血及び／又は非トリプシン処理組織を使用して行われる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類の免疫状態を、同定された前記好塩基性顆粒球に基づき決定する工程を更に含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳類において好塩基性顆粒球のレベルをモニタリングする方法であって、請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法を行うことと、さらに、同定された細胞の相対量を、以前に、又は並行して同じ哺乳類から採取されたサンプル、及び／又はコントロールサンプルと比較することとを含む、方法。
【請求項１１】
化学的及び／又は生物学的物質を前記哺乳類に与えるのに応じた、前記好塩基性顆粒球の量を、測定及び／又はモニタリングすることを更に含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類が、自己免疫疾患、移植拒絶、感染症、癌、及び／又はアレルギーを罹患している、又は罹患する可能性がある、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
MCC遺伝子領域中のCpG位置のバイサルファイト到達性の解析に基づき、哺乳類において好塩基性顆粒球を同定し、定量し、及び／又はモニタリングするためのキットであって、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法を行うための要素を含み、特にa)バイサルファイト試薬と、b)配列番号1による領域中のCpG位置から選択されるCpG位置のメチル化状態を解析するための材料、例えば配列番号4〜11による配列から選択されるオリゴマーとを含む、キット。
【請求項１４】
配列番号4〜11のいずれかによるオリゴマー、又は配列番号1、2、若しくは3によるアンプリコン。
【請求項１５】
哺乳類における好塩基性顆粒球の同定、定量、及び／又はモニタリングへの請求項13に記載のキット、又は請求項14に記載のオリゴマー若しくはアンプリコンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好塩基性顆粒球を同定する方法、特にin vitroの方法に関し、方法は、「大腸癌変異（mutated incolorectal cancer）」（MCC）遺伝子の哺乳類遺伝子領域における少なくとも1つのCpG位置の修飾、例えばメチル化状態の解析を含み、非好塩基性顆粒球、又は末梢血若しくは他の組織における任意の他の細胞の種類と比較して、該遺伝子領域の脱メチル化、又は修飾若しくはメチル化の欠如は好塩基性顆粒球の指標である。本発明による解析は、好塩基性顆粒球をエピジェネティックレベルで同定し、複雑なサンプル内の他の全ての細胞、例えば他の血液又は免疫細胞と区別することができる。本発明は更に、好塩基性顆粒球、特に複雑なサンプル中の好塩基性顆粒球を定量する改良された方法を提供する。方法は、好ましくは全血及び／又は非トリプシン処理組織において、細胞の精製及び／又は濃縮工程を伴い又は伴わずに行うことができる。
【０００２】
さらに、本発明は、上述の方法を行うためのキット、及びその個々の使用に関する。哺乳類の任意の固形臓器若しくは組織中の血液、又は任意の体液の好塩基性顆粒球を定量的に検出及び測定する、新規の、よりロバストな手段を提供することが、本発明のねらいの1つである。
【背景技術】
【０００３】
顆粒球は、白血球（leukocytes）とも呼ばれる全白血球細胞（white blood cells）の約60%を占める。顆粒球の主な作用は食作用、すなわち、細菌、ウイルス及び他の寄生生物等の外来細胞の分解である。顆粒球は、外来細胞の分解を助ける酵素で満たされた細胞内顆粒の存在により、単球及びリンパ球等の他の白血球と区別することができる。顆粒球は、通常は3葉に分葉する、その核の形状の変化から多形核白血球（PMN、PML、又はPMNL）とも呼ばれる。好中性顆粒球、好酸性顆粒球、及び好塩基性顆粒球と呼ばれる3種類の形態の顆粒球が存在する。これらの名称は、異なる色素により染色されるこれらの能力に由来する。例えば、好中球における顆粒は中性色素で染色することができ、一方好塩基球における顆粒は塩基性色素で染色することができる。
【０００４】
好塩基性顆粒球は顆粒球の中で最も少数であり、全循環白血球の約0.01%〜0.3%を占める。好塩基性顆粒球は、アレルギー症状を引き起こす炎症反応における過敏性に関与する。好塩基性顆粒球は刺激を受けると、炎症の誘発を助けるヒスタミン、及び血液の凝固を妨げるヘパリンを放出する。好塩基性顆粒球の細胞表面上のタンパク質受容体の存在により、IgEの結合が可能となり、環境物質、例えば花粉タンパク質への選択的な反応を促進する。
【０００５】
個体中のほぼ全ての細胞が全く同一の全数のDNAコードを含んでいるものの、高等生物は、様々な種類の組織において異なるパターンの遺伝子発現を定め、維持しなければならない。ほとんどの遺伝子調節は一過性であり、細胞の現在の状態及び外部刺激の変化に依存する。一方、持続的調節は、基本的なDNAの遺伝子コードを変更しない遺伝的調節パターンであるエピジェネティクスの主要な役割である。DNAメチル化はエピジェネティック調節の原型であり、細胞の安定した記憶として働き、様々な種類の細胞の長期にわたる同一性の維持において決定的な役割を果たす。近年、他の型のエピジェネティック調節が発見された。「第5の塩基」5-メチルシトシン（mC）に加えて、第6の塩基（5-ヒドロキシメチルシトシン、hmC）、第7の塩基（5-ホルミルシトシン、fC）及び第8の塩基（5-カルボキシシトシン、cC）が見られる（非特許文献1）。
【０００６】
上述のDNA修飾の主要な標的は、2ヌクレオチドの配列シトシン−グアニン（「CpGサイト」）であり、この文脈においてシトシン（C）は単純な化学修飾を受けてホルミル化、メチル化、ヒドロキシメチル化、又はカルボキシル化することができる。ヒトゲノムにおいて、CG配列は、「CpGアイランド」と呼ばれる或る特定の比較的密であるクラスターを除き、予想よりも大幅に低頻度である。CpGアイランドは遺伝子プロモーターと関連することが多く、ヒト遺伝子の半分を超えるものがCpGアイランドを有すると推定されている（非特許文献2）。
【０００７】
異常なDNAメチル化は、健康な細胞から癌細胞への形質転換に関連することが多い。観察される作用には、ゲノムワイド低メチル化、腫瘍抑制遺伝子のメチル化の増加、及び多くの癌遺伝子の低メチル化がある（例えば非特許文献3、非特許文献4及び非特許文献5で概説される）。メチル化プロファイルは腫瘍特異的であると認識されており（すなわち、特定の遺伝子又は更には個々のCpGのメチル化パターンの変化は、特定の種類の腫瘍の診断となる）、今日では膀胱癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、及び前立腺癌の幅広い診断マーカーのコレクションが存在する（例えば非特許文献5にまとめられる）。
【０００８】
近年説明されたシトシンの修飾の1つとして、5-ヒドロキシメチル化があり、酸化的バイサルファイトシークエンシングを用いたCpGアイランドにおける5hmCマッピング及び定量が示された（非特許文献1）。転写調節因子に関連するCpGアイランド、及び長鎖散在反復配列（long interspersed nuclear elements）において高レベルの5hmCが見られた。これらの領域が胚性幹細胞においてエピジェネティックリプログラミングを受けるかもしれないことが示唆される。
【０００９】
特許文献1は、細胞又は細胞の混合物を同定するため、及び血液中又は組織中の細胞の分布の変化を定量するため、及び疾患の状態、特に癌を診断し、予後判断し、治療するために、DNAメチル化アレイを使用する方法を説明する。該方法は、新鮮なサンプル及び保存されたサンプルを使用する。
【００１０】
特許文献2は、MCC遺伝子の発現を調節する核酸のメチル化の度合いを決定することで結腸直腸癌を診断する方法を開示する。MCC遺伝子自身のメチル化には言及していない。
【００１１】
非特許文献6は、結腸直腸発癌において、プロモーターCpGアイランドにおけるMCC遺伝子高メチル化が高頻度であり、初期の変化であることを開示する。プロモーターメチル化が、結腸直腸腫瘍抑制遺伝子MCCの遺伝子サイレンシングを引き起こし、疾患の進行を促進する。MCCプロモーター外のCpG位置のメチル化のエビデンスは説明されていない。
【００１２】
非特許文献7は、細胞系統特異的DNAメチル化パターンにより、正常ヒト白血球サブセットを区別し、これらのパターンを末梢血においてこれらのサブセットの検出及び定量に使用することができることを開示している。著者らは、DNAメチル化を複数の白血球サブセットの定量に使用し、同時にヒトT細胞、B細胞、NK細胞、単球、好酸球、好塩基球及び好中球を区別する細胞系統特異的DNAメチル化シグネチャーの特定に使用した。MCCについては言及していない。
【００１３】
非特許文献8は、MCC遺伝子の安定した先天的（刷り込み）メチル化パターンを説明する。
【００１４】
特許文献3は、結腸癌のマーカーとしてのMCCのメチル化を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第2012/162660号
【特許文献２】米国特許出願公開第2007/0243531号
【特許文献３】国際公開第2005/071404号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Michael J. Booth et al. QuantitativeSequencing of 5-Methylcytosineand 5-Hydroxymethylcytosine at Single-BaseResolution Science 18 May 2012, Vol.336 no. 6083 pp. 934-937
【非特許文献２】Antequera and Bird, Proc Natl Acad Sci USA 90: 11995-9, 1993
【非特許文献３】Jones and Laird, Nature Genetics 21:163-167,1999
【非特許文献４】Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002
【非特許文献５】Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003
【非特許文献６】Kohonen-Corish et al. (in: Kohonen-Corish et al.Promoter methylation of the mutated incolorectalcancer gene is a frequent early event in colorectal cancer)
【非特許文献７】Accomando et al. (in: Accomando et al. Quantitativereconstructionof leukocyte subsets using DNAmethylation. Genome Biol. 2014 Mar 5;15(3))
【非特許文献８】Mozhui, K. et al. (Ancestry dependent DNA methylation and influenceof maternal nutrition. PLoSOne (2015) 10(3):e0118466, pages 1-17)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上述の観点から、本発明の目的は、好塩基性顆粒球をより簡便に、かつ確実に検出し、同定し、区別し、定量するための優れたツールとしてのDNAメチル化解析に基づく、改善された、特にロバストな方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、サンプルにおける好塩基性顆粒球を同定する方法を提供することで上記目的を解決し、方法は、大腸癌変異（MCC）哺乳類遺伝子領域における少なくとも1つのCpG位置の修飾、例えばメチル化状態の解析を含み、解析される該遺伝子領域は配列番号1による位置であることが好ましく、非好塩基性顆粒球と比較して、該遺伝子領域の脱メチル化、又はメチル化等の修飾の欠如は好塩基性顆粒球の指標である。「修飾」としては、「第5塩基」5-メチルシトシン（mC）に加えてエピジェネティック調節、すなわち5-ヒドロキシメチルシトシン（hmC）、5-ホルミルシトシン（fC）、及び5-カルボキシシトシン（cC）が挙げられる。
【００１９】
ヒトの大腸癌変異（MCC）遺伝子は、結腸直腸腫瘍抑制遺伝子の候補である。MCCタンパク質は、細胞周期の進行を負に調節し、Wnt/ベータカテニン経路を抑制することが知られている。MCCの下流の標的として、ホスホ-ERK、c-Myc、p27、サイクリンB1、Mcl-1、カスパーゼ8及び3が挙げられる。MCCは更に、RAC1、CDC42及びp21-活性化キナーゼ活性化と独立して、細胞遊走に関与する。ヒトMCCの遺伝子は、染色体5、113022099〜113488830リバース鎖、Ensembl-ID: ENSG00000171444に見られる。
【００２０】
顆粒球（GRC）は、好塩基球（bGRC）、好中球（nGRC）、及び好酸球（eGRC）を含む細胞の群である。
【００２１】
本発明の文脈において、「遺伝子」又は「遺伝子領域」は、MCCに関連する（例えば、調節する）、及びMCCをコードする全てのゲノム領域を含むものとする。したがって、MCCに属するエンハンサー領域、プロモーター領域（複数の場合もある）、イントロン、エキソン、及び非コーディング領域（5'-及び／又は3'-領域）が含まれる。したがって、少なくとも1つのCpG位置が、解析される遺伝子の転写開始、プロモーター領域、5'又は3'非翻訳領域、エキソン、イントロン、エキソン／イントロン境界よりも上流の5'領域に存在する、及び／又は解析される遺伝子の転写停止よりも下流の3'領域に存在する、本発明による方法が好ましい。
【００２２】
本発明は更に、本発明者らが驚くべきことにMCC遺伝子の領域を、好塩基性顆粒球の同定、及びMCC遺伝子の解析の臨床ルーチンへの適用を可能にする、特異的なエピジェネティックマーカーとして同定したことに基づく。
【００２３】
本発明の文脈において、特に配列番号1による、MCCのゲノム領域により、好塩基性顆粒球の同定が可能になる。驚くべきことに、バイサルファイト変換可能及びバイサルファイト変換不可能シトシンのパターン分離（discriminatory pattern）は、配列番号1によるアンプリコンを用いて、特に配列番号2及び／又は3によるバイサルファイト変換された配列に示されるように、特に、更には排他的に、好塩基性顆粒球の配列番号1によるゲノム領域に限定されている。
【００２４】
本発明者らは、好塩基性顆粒球において、開示されるCpGモチーフはほぼ完全に脱メチル化し（すなわち70%より多く、好ましくは80%、好ましくは90%より多く、最も好ましくは95%より多く）、一方他の全ての免疫細胞において同じモチーフは完全にメチル化されることを示すことができた。
【００２５】
上述の領域内のCpGモチーフの示差的メチル化は、好塩基性顆粒球を同定する有用なツールであり、例えば自己免疫疾患、移植拒絶、癌、アレルギー、一次及び二次免疫不全、例えばHIV感染及びAIDS、移植片対宿主（GvH）、血液悪性腫瘍、関節リウマチ、多発性硬化症、又は任意の想定され得る診断の状況における細胞傷害性T細胞に関連する免疫状態において上記細胞を同定及び定量するために不可欠、又は少なくとも幾らか価値のあるものとなるであろう。アッセイにより、精製又はいかなる染色工程も伴わずに好塩基性顆粒球の測定が可能となる。
【００２６】
したがって、本発明による方法の別の好ましい態様は、解析される上記領域中の上記メチル化の頻度の相対量とコントロール遺伝子、例えばGAPDHのメチル化頻度の相対量との比較に基づく好塩基性顆粒球の相対量の定量を更に含む。したがって、上記定量は、本明細書で記載され、解析される（例えば配列番号1の）MCCの遺伝子領域におけるバイサルファイト変換可能なDNAと、バイサルファイト変換不可能なDNAとの比率に基づき達成される。好塩基性顆粒球の相対量の定量が、MCCの細胞特異的な領域のバイサルファイト変換可能なDNAの相対量、及び非細胞特異的な遺伝子（好ましくは指定の「コントロール遺伝子」又は「コントロール領域」、例えばGAPDHの遺伝子）のバイサルファイト変換可能なDNAの相対量の（好ましくは並行又は同時の）解析に基づくことが最も好ましい。
【００２７】
本発明による方法の更に好ましい実施の形態において、上記バイサルファイト変換可能性の解析は、配列番号1に基づき適切に設計され得る、適切なプライマー対の少なくとも1つのプライマー、好ましくは配列番号4〜11のいずれかによるオリゴマーによる増幅を含む。
【００２８】
FACS及びmRNAの測定とは対照的に、本発明による方法を使用すると、測定（複数の場合もある）及び解析は、精製、保存、及び幾分は組織の品質に関わらず行うことができる。
【００２９】
例えばMSP、HeavyMethyl、Scorpion、MS-SNUPE、MethylLight、バイサルファイトシークエンシング、メチル特異的制限アッセイ、及び／又はデジタルPCR（例えばKristensen and Hansen PCR-BasedMethods for Detecting Single-Locus DNA MethylationBiomarkers in CancerDiagnostics, Prognostics, andResponse to Treatment Clinical Chemistry 55:81471-1483 (2009)を参照されたい）の状況における増幅は、ポリメラーゼ酵素、PCR若しくは化学的増幅反応、又は下記の当業者に知られる他の増幅方法を含むことが好ましい。
【００３０】
増幅により、本発明による方法（複数の場合もある）を行うのに特に好ましい「ツール」であるMCC遺伝子領域のアンプリコンが生産される。結果として、配列番号4及び5のいずれかによるオリゴマー、又は本明細書に記載のように配列番号4及び5若しくは6及び7若しくは9及び10に基づくプライマー対により増幅されたアンプリコンが、本発明の好ましい実施の形態を構成する。したがって、配列番号1〜3の配列（及び、必要であればそれらの相補配列）が、増幅のためのプライマーの設計に使用される、すなわち関連配列の「ビーコン」として働くことができる。同様に、追加のプライマー及びプローブを、配列番号1によるアンプリコンに基づき設計することができる。増幅は、ゲノムDNA配列及び／又はバイサルファイト（すなわち「変換」）DNA配列のいずれにおいても行うことができる。
【００３１】
当業者は更に、解析すべきサイトの量を最小限とするようにCpG位置の特定のサブセットを選択することができる。例えば、CpG位置の少なくとも1つは配列番号1によるアンプリコンにおけるCpG位置から選択され、好ましくは配列番号1によるアンプリコン番号2694におけるCpG位置57、69、76、80、119、136、142、162、186、198、233、281、292、303、307、339、351及び362から選択される。位置は、生成され、解析されるアンプリコンの5'-末端から数値的に数えられ、図1に指定される。9、4又は5の全ての位置の組み合わせが好ましく（ボックスを参照されたい）、それらの解析は本発明の状況において有益となるのに十分なデータ及び／又は情報をもたらす。
【００３２】
当業者は更に、解析すべきサイトの量を最小限とするようにCpG位置の特定のサブセット、例えばMCC特異的バイサルファイト変換可能領域のアンプリコン番号2694（配列番号1）のCpG位置186及び／又は198の少なくとも1つ、又は配列番号1によるバイサルファイト変換可能領域に存在する全てのサイトを選択することができる。
【００３３】
CpG位置のバイサルファイト変換可能性を解析するために、DNAメチル化を解析する任意の既知の方法を使用することができる。本発明による方法の好ましい実施の形態において、メチル化状態の解析は、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、CpGアイランドメチル化、MSP、HeavyMethyl、MethyLight、Ms-SNuPEから選択される解析、又は増幅DNAの検出に依存する他の方法を含む。これらの方法は当業者によく知られており、個々の文献に見ることができる。
【００３４】
本発明による方法の好ましい実施の形態において、上記方法は日常的な適用、例えばDNAチップに適している。上述の情報及び個々の文献に基づき、当業者は上述のような方法をかかる状況に適合させることができるであろう。
【００３５】
本発明による方法の更に別の好ましい実施の形態において、上記方法は、同定すべき上記細胞の精製及び／又は濃縮の工程を伴わずに、好ましくは全血及び／又は非トリプシン処理組織を使用して行われる。
【００３６】
本発明による方法の別の好ましい実施の形態において、同定は、上記好塩基性顆粒球と、主要な全ての末梢血細胞型及び／又は非血液細胞、限定されないが好ましくは濾胞性ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、顆粒球、好塩基性顆粒球、NK細胞、及びTヘルパー細胞、並びに血液以外の器官に由来する他の種類の細胞との区別を含む。
【００３７】
本発明による方法の更に別の好ましい実施の形態において、サンプルは、ヒトの血液サンプルを含む哺乳類の体液、又は組織、器官、若しくは白血球のサンプル、又はかかる組織、器官、若しくは白血球若しくは細胞型のサンプルの精製若しくは分離された画分から選択される。好ましくは、上記哺乳類は、マウス、ヤギ、イヌ、ブタ、ネコ、ウシ、ラット、サル又はヒトである。サンプルは必要であれば適切にプールすることができる。
【００３８】
したがって、本発明による方法の別の好ましい態様は、上記好塩基性顆粒球に基づき上記哺乳類の免疫状態を決定する工程を更に含む。好塩基性顆粒球は定量され、更に詳細なサブ集団を相対的に定量するベンチマークとして使用することができ、又は予測及び／又はスクリーニング及び／又は診断及び／又は予後判断及び／又は有害事象検出要素として使用することができ、又は最終的に好塩基性顆粒球の集団を検出することで全体的な免疫活性状態を決定するために使用することができる。
【００３９】
本発明による方法の更に別の好ましい実施の形態において、上記哺乳類は、自己免疫疾患、移植拒絶、感染症、癌、及び／又はアレルギー、例えば限定されるものではないが、クルーズトリパノソーマ感染症、マラリア及びHIV感染；血液悪性腫瘍、例えば限定されるものではないが慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、慢性リンパ性白血病、移植片対宿主病及び宿主対移植片病、菌状息肉腫、節外T細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、退形成性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫並びに他のT細胞、B細胞及びNK細胞新生物、T細胞不全、例えば限定されるものではないがリンパ球減少症、重症複合免疫不全（SCID）、オーメン症候群、軟骨毛髪低形成症、後天性免疫不全症候群（AIDS）、及び遺伝性状態、例えばディ・ジョージ症候群（DGS）、染色体切断症候群（CBS）、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性硬化症、皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、白斑、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、特発性拡張型心筋症、I型糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、IgA腎症、膜性腎症及び悪性貧血；並びにB細胞及びT細胞混合障害、例えば限定されるものではないが毛細血管拡張性運動失調症（AT）及びウィスコット・アルドリッチ症候群（WAS）；並びに癌腫、例えば限定されるものではないが乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、黒色腫、及び頭頸部癌に罹患しているか、又は罹患している可能性がある。
【００４０】
したがって、本発明による方法の別の好ましい態様は、化学的及び／又は生物学的物質を上記哺乳類に与えるのに応じた、すなわち上記患者への治療に応じた好塩基性顆粒球の量を、測定及び／又はモニタリングすることを更に含む、上述の方法に関する。上記方法は上述の工程と、同定された上記細胞の上記相対量を、以前に、又は並行して同じ哺乳類から採取されたサンプル、及び／又はコントロールサンプルと比較することとを含む。本発明の方法（複数の場合もある）がもたらす結果に基づき、担当医は患者の免疫状態を決定し、それに応じて基礎疾患の治療を調整することができるであろう。
【００４１】
上記方法は、細胞を精製及び／又は濃縮する工程を伴わず、好ましくは全血及び／又は非トリプシン処理組織、又は例えば患者に移植する細胞のサンプルとして他の任意の潜在的に上記好塩基性顆粒球を含む生物学的サンプルにおいて行うことが好ましい。
【００４２】
したがって、本発明による方法の別の好ましい態様は、同定された上記好塩基性顆粒球を、患者への移植のために製剤することを更に含む上述の方法に関する。これらの目的のための医薬調製物及びそれらの生産方法は、移植医療の技術分野で既知の方法で行われる。
【００４３】
本発明による方法の別の好ましい態様は、配列番号4〜11のいずれかによるオリゴマー、又は配列番号1〜3によるアンプリコンに関する。
【００４４】
したがって、本発明の更に別の好ましい態様は、MCC遺伝子領域中のCpG位置のバイサルファイト到達性の解析に基づき、哺乳類において好塩基性顆粒球を同定し、定量し、及び／又はモニタリングするためのキットに関する。該キットは、本明細書に記載の発明による方法を行うための要素を含み、特にa)バイサルファイト試薬と、b)配列番号1による領域中のCpG位置から選択されるCpG位置のメチル化状態を解析するための材料、例えば配列番号4〜11による配列から選択されるオリゴマーとを含む。
【００４５】
本発明は、本発明によるオリゴマー又はアンプリコン又はキットの、本明細書に記載のような哺乳類における好塩基性顆粒球を同定及び／又はモニタリングするための使用も包含する。
【００４６】
上述のように、近年3つの新規のシトシン修飾が発見された。それゆえ、将来の科学的発見により、過去に記載されたエピジェネティック修飾パターンが修正されることが期待される。これらの過去のシトシン修飾パターンは、バイサルファイト変換可能（非メチル化、非修飾）及びバイサルファイト変換不可能（メチル化、修飾）シトシンを包含する。説明したように、どちらの用語（termini）も修正が必要である。新規の科学的発見によると、(i)非バイサルファイト変換可能シトシンは、5-メチルシトシン（mC）及び5-ヒドロキシメチルシトシン（hmC）を包含し、(ii)バイサルファイト変換可能（すなわち、「バイサルファイト変換可能性」）シトシンは、5-ホルミルシトシン（fC）、5-カルボキシシトシン（cC）、及び非修飾シトシンを包含する。
【００４７】
加えて、以前の発明は、(i)クロマチン（細胞型に依存せず、100%バイサルファイト変換可能なDNA座）の全量に対するバイサルファイト変換可能シトシンの比率、又は(ii)非バイサルファイト変換可能シトシン（hmC及びmC）に対するバイサルファイト変換可能シトシン（fC、cC、非修飾シトシン）の比率に基づく。これらの比率は細胞型、細胞分化、細胞段階、及び病理学的細胞段階を特徴付ける。したがって、新たな技術により、新規の、より特異的な比率がもたらされ、現行の細胞特異的、細胞状態特異的、及び病理学的なエピジェネティック修飾パターンが補完され、それゆえ潜在的な新規のバイオマーカーが決定され得る。バイオマーカーとして発見されるべき新規の比率は以下のように定義することができる：
【化１】
2021501574.tif 000002
（式中、a及びbは、1〜4種類の修飾でそれぞれ異なる。新規のDNA修飾の発見によりこの列挙は拡張され得る）。
【００４８】
本願のための定義の目的で、DNA配列における「エピジェネティック修飾」は、(i)バイサルファイト変換可能シトシン（5-ホルミルシトシン（fC）及び／又は5-カルボキシシトシン（cC））及び(ii)非バイサルファイト変換可能シトシン（5-メチルシトシン（mC）、5-ヒドロキシメチルシトシン（hmC）を含む）の用語で称される。mC及びhmCの両方の種類のメチル化はバイサルファイト変換可能ではないため、これら2つを区別することができない。同様に、fC、cC及び非修飾シトシンはバイサルファイト変換可能であり、同様にそれぞれを区別することができない。「メチル化」DNAの用語は、mC及びhmCを包含する。「非メチル化」DNAの用語は、fC、cC、及び非修飾DNAを包含する。新規のDNA修飾の変形が将来発見されることが期待される。修飾の各型は、バイサルファイト変換可能であってもなくてもよい。しかしながら、本方法により2つの群を確実に区別しているため、これらの新規の修飾もマーカーとして使用可能であろう。
【００４９】
さらに、DNAの修飾とは別に、ヒストンも翻訳後修飾を受け、DNA及び核タンパク質との相互作用を変更する。修飾として、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、SUMO化、シトルリン化、及びADP-リボシル化が挙げられる。ヒストンH2A、H2B、及びH3のコアも修飾され得る。ヒストン修飾は様々な生物学的プロセス、例えば遺伝子調節、DNA修復、染色体凝縮（有糸分裂）、及び精子形成（減数分裂）で作用する。これらの修飾においても、特定の修飾パターンは、異なる細胞型、細胞段階、分化状態に特異的であり、かかるパターンをバイサルファイト変換可能性又は類似の方法で解析し、或る特定の細胞又は細胞段階を同定することができる。本発明はこれらの修飾の使用も包含する。
【００５０】
まとめると、MCC遺伝子領域、特に本明細書に記載のアンプリコンをマーカーとして使用することで、本発明者らは好塩基性顆粒球を非常に特異的に同定し、定量し、特にサンプル中の他の細胞型、例えば他の血液細胞との関連で区別した。
【００５１】
ここで、本発明は、以下の実施例に基づき、添付の図面及び配列リストを参照して更に説明されるが、それらに限定されない。本発明の目的で、本明細書に引用される全ての参照文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明によるアンプリコン番号2694（配列番号1）のCpGサイトの解析を示す図である。表中の水平のボックスは、解析されるアンプリコン内のCpG位置（例えばCpG1〜4、及びCpG6〜10）と示される位置（例えばAMP2694の位置57のCpG1に対応するAMP2694:57）とに対応し、列は解析される細胞の種類に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
配列番号1は、本発明によるアンプリコンAMP2694のゲノム配列を示す。
【００５４】
配列番号2及び3は、本発明の好ましいqPCRアッセイシステムのバイサルファイト変換された標的領域の配列を示す。
【００５５】
配列番号4〜11は、本発明による特異的オリゴマー（プライマー及びプローブ）の配列を示す。
【実施例】
【００５６】
実施例1
好塩基性顆粒球を同定するため、以下の配列（AMP2694、配列番号1）による、ヒトゲノム領域由来のバイサルファイト変換サンプルでqPCRを行った。関連するCpGを太字で示す：
【表Ａ】
2021501574.tif 000003
【００５７】
作成された好ましいqPCRアッセイシステムのバイサルファイト変換された標的領域は以下の通りであった：
【００５８】
TpG特異的（配列番号2、太字及び下線は関連する位置)：
【表Ｂ】
2021501574.tif 000004
【００５９】
CpG特異的（配列番号3、太字及び下線は関連する位置)：
【表Ｃ】
2021501574.tif 000005
【００６０】
以下のプライマー及びプローブが増幅に使用された：
【００６１】
【表１】
2021501574.tif 000006
Forward amplification primer  フォワード増幅プライマー
SEQ ID No.  配列番号
Reverse amplification primer  リバース増幅プライマー
Forward primerTpG-specific  フォワードプライマーTpG特異的
Reverse primerTpG-specific  リバースプライマーTpG特異的
ProbeTpG-specific  プローブTpG特異的
Forward primerCpG-specific  フォワードプライマーCpG特異的
Reverse primerCpG-specific  リバースプライマーCpG特異的
ProbeCpG-specific  プローブCpG特異的
【００６２】
本実施例に明示的に開示されていなくても、他のバイサルファイト鎖及びそれらによるプライマーも同等に好ましい。
【００６３】
TpG特異的PCRシステムの特異性を、以下の表に示すように試験テンプレート（プラスミドDNA）を使用して示した。表は、2つの代替的な「コントロールシステム」と比較した、MCCのTpG特異的アッセイを使用した精製細胞の種類、例えば好塩基性顆粒球の測定を表す。表中の細胞の種類は以下のように略される：MOC29  精製されたCD14単球；CTL11  細胞傷害性T細胞；Grc32  全てのCD15顆粒球；NKC  CD56ナチュラルキラー細胞；THC13  Tヘルパー細胞；eGRC  好酸性顆粒球（eosinophil basophils）；BLC28  B細胞；nGRC03  好中球；NKT  ナチュラルキラーT細胞、及びbGRC  好塩基性顆粒球。上パネルにおいて、コントロール増幅システムは実際にCpG特異的システムである。この点において、比較的細胞数が少なく、解析される位置においてゲノム修飾されていない（脱メチル化）細胞数が多く、メチル修飾された位置を有する細胞数が多いものであるべきであるため、このシステムはより良いコントロールシステムである。最後の解析システムはしかしながら、全ての細胞が同等に計測され、特定の細胞のみが所与のエピジェネティック修飾された位置の増幅を示すシステムに依存する。
【００６４】
【表２】
2021501574.tif 000007
TpG specificPCR-System  TpG特異的PCRシステム
CP Value  Cp値
Plasmid Units  プラスミド単位
CpG specificPCR-System  CpG特異的PCRシステム
GAPDH specificPCR-System  GAPDH特異的PCRシステム
【符号の説明】
【００６５】
図面訳
図1
B cells  B細胞
Cytotixic T cells  細胞傷害性（正：Cytotoxic）T細胞
Granulocytes  顆粒球
Monocytes  単球
Natural killercells  ナチュラルキラー細胞
Basophils  好塩基球
Eosinophils  好酸球
Neutrophils  好中球
【図１】
2021501574.tif 000008
【配列表】
2021501574000001.app
【国際調査報告】
2021501574.tif 000009
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