(57)【要約】  軟組織傷害の修復を支持し、かつ容易にするうえで使用するための、生体適合性足場および外科的移植可能なデバイスを調製するために、生体高分子と生体容認性高分子の組成物およびブレンドが、低負荷型溶媒系の使用とともに説明される。【選択図】図１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植可能な生体高分子足場を生成するための方法であって、
生体高分子、および任意選択的に生体容認性高分子を、約４０〜１００容量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と、エタノール、テトラヒドロフラン、および酢酸からなる群から選択される、約０〜６０容量％の溶媒と、を含む、ＤＭＳＯ溶媒系中に溶解して、生体高分子溶液を形成するステップと、
前記生体高分子溶液から生体高分子繊維を生成するステップと、
前記生体高分子繊維を収集して、生体高分子足場を形成するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記生体高分子繊維が、
約１０〜１００重量％のコラーゲンと、
任意選択的に、ＰＤＬＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択される、約０〜９０重量％の生体容認性高分子と、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コラーゲンが、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、組換えヒトコラーゲン、およびそれらの混合物からなるＩ型コラーゲンの群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体高分子繊維が、本質的にコラーゲンからなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生体高分子繊維が、電界紡糸および空気紡糸からなる群から選択される技法によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生体高分子繊維を含む少なくとも１つの生体高分子シートを含む、軟組織傷害の修復を支持するための移植可能な生体高分子足場であって、
前記生体高分子繊維が、
約１０〜１００重量％のコラーゲンと、
任意選択的に、ＰＤＬＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択される、約０〜９０重量％の生体容認性高分子と、を含み、
前記生体高分子足場が、以下の特徴：
（ｉ）水銀圧入法によって決定される場合、約５０〜１５０マイクロメートル、より好ましくは８０〜１２０マイクロメートル、そして最も好ましくは約１００マイクロメートルの平均気孔率、
（ｉｉ）試験管内で測定される場合に、約５分間に血液中でほぼ前記足場の重量の吸収、および約２０分間に血液中でその重量の約２倍の吸収、
（ｉｉｉ）約１５０〜４５００ｎｍ、好ましくは約３００〜３０００ｎｍ、より好ましくは約５００〜２０００ｎｍ、そして最も好ましくは約７００〜１２００ｎｍの範囲の平均繊維直径、
（ｉｖ）移植後約２週間以内に前記足場への実質的な生体内細胞浸潤、より好ましくは、前記移植された足場のほぼ全厚までの細胞浸潤、ならびに
（ｖ）細孔の平均構成が、楕円形またはランダムな細孔構成を含む他の構成と比較して、実質的にスリットの形状であること、のうちの１つ以上を有する、移植可能な生体高分子足場。
【請求項７】
前記生体高分子足場が、請求項１〜５のいずれか一項に記載の前記ＤＭＳＯ溶媒系から生成されている、請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項８】
前記コラーゲンが、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、組換えヒトコラーゲン、およびそれらの混合物からなるＩ型コラーゲンの群から選択される、請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項９】
前記生体高分子繊維が、本質的にコラーゲンからなる、請求項８に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項１０】
前記生体高分子繊維が、本質的に、約２０〜３５重量％のコラーゲンおよび約６５〜８０重量％の生体容認性高分子、または約２７．５〜３２．５重量％のコラーゲンおよび約６７．５〜７２．５重量％の生体容認性高分子からなる、請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項１１】
前記生体容認性高分子が、ＰＤＬＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項１２】
前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンであり、かつ前記生体容認性高分子が、高分子量ＰＤＬＬＡである、請求項１１に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項１３】
前記ＰＤＬＬＡが、約１．６〜２．４ｄｌ／ｇの固有粘度を有する、請求項１２に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項１４】
前記足場が、実質的に整列されている生体高分子繊維を有する内面と、実質的に整列されていない繊維を有する外面と、を有する、請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項１５】
前記足場が、真空乾燥されて、残留溶媒を除去する、請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項１６】
前記生体高分子繊維はアニールされた前記生体高分子繊維であり、前記生体高分子繊維が、熱アニーリング処理が設定される長さだけ前記足場を制御可能に機械的に引き、かつ収縮することを可能にする、部分的に制約されたアニーリングフレーム内に定置される際に、前記整列された繊維軸に垂直な縁で把持される、請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項１７】
前記足場が、単一の生体高分子シートを含む、請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項１８】
前記足場が、複数の生体高分子シートを含む、請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項１９】
前記足場が、細胞で播種される、請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項２０】
前記細胞が、腱細胞、筋芽細胞、筋細胞、衛星細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、ならびに血管細胞および幹細胞からなる群から選択される、請求項１９に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項２１】
前記傷害を受けた軟組織が、腱および靭帯からなる軟組織型の群から選択される、請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項２２】
前記傷害を受けた軟組織が、アキレス腱、回旋腱板腱、膝蓋腱、二頭筋腱、および四頭筋腱からなる群から選択される、腱である、請求項２１に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項２３】
前記傷害を受けた軟組織が、前距腓靭帯、内側側副靭帯、後十字靭帯、ならびに脊椎および顎関節の靭帯からなる群から選択される、靭帯である、請求項２１に記載の移植可能な生体高分子。
【請求項２４】
無菌容器内に包装された、請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場。
【請求項２５】
損傷した腱の修復を容易にするための方法であって、前記足場が修復領域に機械的支持を提供するように、傷害を受けた軟組織に請求項６に記載の移植可能な生体高分子足場を留め付けるステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国政府支援の陳述
本発明は、米国国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）契約ＨＲ００１１−１５−９−０００６の下で政府支援によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月２４日に出願された米国特許出願６２／７０７，１５９号、２０１８年８月３日に出願された米国特許出願６２／７１４，３６７号、および２０１８年８月１４日に出願された米国特許出願６２／７１８，６９４号の優先権を主張する。これらの出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、靭帯および腱などの軟組織傷害に対する傷害の管理、保護、および修復のための生体高分子足場および移植片に関する。移植片は、強化された生体適合性を含む物理化学的および生物学的特性が改善している。本発明はまた、低負荷型溶媒系を使用するそのような移植片の生成のための処理にも関する。
【背景技術】
【０００４】
外科的修復の数は、足および足首（例えば、アキレス腱）、肩（例えば、回旋腱板）、および膝（例えば、前十字靭帯）の靭帯および腱のために、米国だけでも年間およそ８００，０００に上るが、依然として、置換要素および支持要素の移植を伴う現在の治療基準は、概して開業医によって最適とは言えないと考えられている。
【０００５】
生体適合性の軟組織支持足場を提供することを意図した主要な靭帯および腱修復移植片製品は、場合によっては死体組織または侵襲的自家移植に依存する、しばしば、２０年前の技術を伴う。同種移植片は、供給が限られ、瘢痕形成を促進し、免疫反応を引き起こす場合があり、かつターンオーバー率が十分に画定されておらず、そのすべてが治癒を阻害する。自家移植はまた、手術時間および関連する精神的外傷を延長し、多くの場合、自己組織を回復するための２番目の費用のかかる手技を追加する。
【０００６】
例えば、ＧＲＡＦＴＪＡＣＫＥＴ（登録商標）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍａｔｒｉｘは、提供された同種ヒト真皮移植片から形成されたシート様の製品であり、無菌で処理され、細胞を除去し、その後凍結乾燥される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｒｉｇｈｔ．ｃｏｍ／ｆｏｏｔａｎｄａｎｋｌｅｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｒａｆｔｊａｃｋｅｔ）。ＡｒｔｈｒｏＦＬＥＸ（登録商標）Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ  Ｄｅｒｍａｌ  Ａｌｌｏｇｒａｆｔは、同様の無細胞皮膚細胞外マトリックスである（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒｔｈｒｅｘ．ｃｏｍ／ｏｒｔｈｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ／ａｒｔｈｒｏｆｌｅｘ）。
【０００７】
損傷した軟部組織（腱および靭帯など）の修復を容易にする、またはこれを支持もしくは置換するための足場として有用な、移植可能なデバイス用の合成または半合成構成成分を開発するために、さまざまな他の手法が採用されている。そのような製品は、数ある中でも、例えば、適合性、強度、柔軟性、生分解性など、複数の機能パラメーターに対処する必要がある、さまざまな困難な生体力学的環境で機能しなければならない。
【０００８】
そのような手法および製品の中に、例えば、Ｒａｔｃｌｉｆｆｅらによる、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｓｏｆｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｐａｉｒ」と題された、米国特許第９，５９７，４３０号（２０１７）、に開示されたものがある。この特許は、編んだメッシュおよび単層または多層の平面繊維状形態などの、さまざまな合成繊維構造を説明する。Ｒａｔｃｌｉｆｆｅによれば、これらの構造は、生体吸収性であろうとなかろうと、適切な機械的特性を提供できる任意の生体適合性高分子材料から作ることができる。コラーゲンおよびラクチドは、適切であると述べられている。Ｓｙｎｔｈａｓｏｍｅの「Ｘ−Ｒｅｐａｉｒ」医療デバイスは、この特許に関連しているようであり、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）からＦＤＡ５１０（ｋ）承認を受けている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｎｔｈａｓｏｍｅ．ｃｏｍ／ｘＲｅｐａｉｒ．ｐｈｐ）。
【０００９】
別の手法は、Ｑｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎｗｏｖｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ／Ｐｏｌｙ−ｄｌ−ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１５，６，６６７−６８６；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｊｆｂ６０３０６６７によって説明される。この文献は、ポリ−ｄ，ｌ−乳酸（ＰＤＬＬＡ）とＩ型コラーゲンとの電界紡糸ブレンドを説明する。さまざまなブレンドが、４０／６０、６０／４０、８０／２０の重量比（ＰＤＬＬＡ／コラーゲン）の高分子ブレンドで説明される。Ｑｉａｏは、共溶媒系を説明し、また化学的架橋が細胞培養におけるこの材料の長期安定性を確保するために不可欠であることを報告した。Ｑｉａｏによると、重量比６０：４０でＰＤＬＬＡ／コラーゲンの足場は、５週間の培養期間にわたって最大の安定性を提供する。
【００１０】
筋肉移植片のための構造体の使用は、Ｌｅｅらの、米国特許第９，４２１，３０５号（２０１６）、「Ａｌｉｇｎｅｄ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」によっても説明されている。この特許は、縦軸に沿って配向され、かつ架橋されて、足場を形成する電界紡糸繊維で作られた異方性筋移植片について考察している。細胞は、繊維上に播種され、筋管を形成する。繊維は、天然高分子および／または合成高分子から形成されてもよい。天然高分子は、例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、およびヒアルロナンを含む。合成高分子としては、例えば、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（Ｄ−Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、およびポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）（ＰＬＣＬ）が挙げられる。繊維はまた、ヒドロゲル、微粒子、リポソームまたは小胞を含んでもよい。ブレンドされる場合、天然高分子と合成高分子の比率は、重量比で２：１〜１：２である。
【００１１】
軟組織の代替品を生成するための電界紡糸された足場は、Ｓｅｎｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｕｎｄｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）−ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｂｌｅｎｄｓ  Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆａｓｃｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｈｉｌｌｅｓ  Ｔｅｎｄｏｎ”，Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ９（２０１７）０１５０２５，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８８／１７５８−５０９０／ａａ６２０４によって説明される。ＰＬＬＡおよびコラーゲンの２つの異なるブレンドは、純粋なコラーゲンの束と比較されている。
【００１２】
Ｙａｎｇらの米国公開特許出願２０１４／００１１４１６号（２０１４）、「Ｔｈｒｅｅ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｌｙ  ａｎｄ  Ｒａｎｄｏｍｌｙ  Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」は、電界紡糸を介してランダムに、かつ均一に配向された三次元繊維構造を生成するための方法を説明する。これは、コラーゲン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびその他のものなどの１つ以上の高分子、溶媒、ならびに界面活性剤を含むドープを電界紡糸することを説明する。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および両性イオン性界面活性剤を含む多様な群のうちの１つ以上とすることができる。紡糸ドープはまた、酢酸、クロロホルム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、メタノール、およびリン酸緩衝生理食塩水を含むさまざまな溶媒のうちの１つ以上も含む。
【００１３】
そして、Ｄｏｎｇらの米国特許８，３１８，９０３号（２０１２）、「Ｂｅｎｉｇｎ  Ｓｏｌｖｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」は、水、アルコール、および塩を含む低負荷型溶媒中にコラーゲンなどのタンパク質を溶解することによってさまざまなタンパク質構造物を形成するための方法を説明する。これはまた、従来の電界紡糸技法についても説明する。
【００１４】
Ｅｌａｍｐａｒｉｔｈｉらのインド公開特許出願ＩＮ６４０ＣＨＥ２０１３号（２０１３）、「Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ａ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ＣｏｌｌａｇｅＮ  Ｆｉｂｅｒ  Ｍａｔ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂｅｎｉｇｎ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」は、環境低負荷型溶媒系として、酢酸とＤＭＳＯの組み合わせで調製された３次元の電界紡糸コラーゲンマットを説明する。Ｅｌａｍｐａｒｉｔｈｉと同僚による別の文献は、電界紡糸されたゼラチンを形成する処理で溶剤系を使用する。例えば、“Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  Ｎａｎｏｆｉｂｒｏｕｓ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ６６（１）：２０−２７（２０１７）を参照されたい。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、腱および靭帯の損傷ならびに傷害などの、生物学的および機械的の両方の軟組織傷害の修復に寄与し、これを助長し、容易にし、かつ支持するように使用するための移植可能な生体高分子足場を生成するための方法に関する。
【００１６】
修復され得ることが意図される腱としては、アキレス腱、回旋腱板腱、膝蓋腱、二頭筋腱、および四頭筋腱が挙げられ得る。修復され得ることが意図される靭帯としては、前距腓靱帯、内側側副靭帯、後十字靭帯、脊椎、および顎関節の靭帯が挙げられ得る。
【００１７】
本発明による生体高分子足場は、生体高分子、および任意選択的に生体容認性高分子をＤＭＳＯ溶媒系中に溶解することによって生成されている。好ましい溶媒系は、約４０〜１００容量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と約０〜６０容量％のエタノール、テトラヒドロフラン、および酢酸からなる群から選択される、溶媒との混合物である。溶媒系中の生体高分子の溶液を調製した後、生体高分子が生成され、そして収集される。
【００１８】
方法の特定の実施形態および生体高分子足場の特定の実施形態では、生体高分子繊維は、全体的に、または約１０〜１００重量％の範囲のいずれかで、コラーゲンから形成される。生体高分子中の１００％のコラーゲンの使用が好ましい。これに応じて、１００％のコラーゲンが利用されない場合、約０〜９０重量％の生体容認性高分子もまた、繊維を生成するために使用される。意図される生体容認性高分子は、ＰＤＬＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＬＧＡ、およびそれらの混合物である。意図されるコラーゲンの型としては、Ｉ型コラーゲン、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、組換えヒトコラーゲン、およびそれらの混合物が挙げられる。そして、高分子量ＰＤＬＬＡも、好ましく、例えば、約１．６〜２．４ｄｌ／ｇの固有粘度を有するＰＤＬＬＡである。
【００１９】
本発明のさまざまな実施形態では、生体高分子繊維は、電界紡糸および空気紡糸を含む、さまざまな技法によって生成される。
【００２０】
本発明の他の態様は、軟組織傷害の修復を助長し、容易にし、かつ支持するように、そのような移植可能な生体高分子足場の使用を含む。そのような足場は、上述の生体高分子繊維の１枚のシートで、または複数のシートから形成され得る。繊維は、上記のような組成内で変動する。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態は、これらの化学構成成分、生体高分子繊維を生成するための技法、および、残留溶媒を除去するために真空乾燥することと、シートおよび足場の収縮を拘束しながら、またはそれらの整列の軸に沿って機械的に引きながら、シートおよび足場をアニーリングすることとを含む、足場のための後処理ステップを反映する。
【００２２】
したがって、開示されるように処理される足場の実施形態は、水銀圧入法によって測定される場合、約５０〜１５０マイクロメートル、および他の実施形態では約８０〜１２０マイクロメートルまたは１００マイクロメートルの平均気孔率を有する。これらの実施形態はまた、試験管内で測定される場合に、約５分間に血液中でほぼ足場の重量の吸収、および約２０分間に血液中でその重量のほぼ２倍の吸収を有してもよく、約１５０〜４，５００ｎｍ、好ましくは約３００〜３，０００ｎｍ、より好ましくは約５００〜２，０００ｎｍ、および最も好ましくは約７００〜１，２００ｎｍの範囲の平均繊維直径を有してもよく、対象への移植後約２週間以内に足場の中への実質的な生体内細胞浸潤を有してもよく、そしていくつかの実施形態において、移植された足場のほぼ全厚に達する細胞浸潤の量を有してもよく、ここで足場内の細孔および空隙の平均構成は、楕円形、円筒形またはランダムな細孔構成などの他の構成に対して、実質的にスリットの形状である。
【００２３】
移植可能な生体高分子足場の他の実施形態は、実質的に整列された生体高分子繊維で形成される内面と、実質的に整列されていない、またはランダムに配向された繊維を有する外面と、を有する。
【００２４】
本発明のさらに他の実施形態は、さまざまな型の細胞が播種される、移植可能な生体高分子足場である。意図される細胞としては、腱細胞、筋芽細胞、筋細胞、衛星細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、ならびに内皮細胞および幹細胞などの血管細胞が挙げられる。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、有用な寸法および構成での、ならびに無菌容器内に包装される生体高分子移植片の生成を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ−１Ｄ】シートの形状の生体高分子足場が移植され、外科的縫合修復後に部分的に裂けた腱の周りに巻き付けられ、その後足場自体が所定の場所に縫合されている、本発明の好ましい実施形態を示す。図１Ａは、部分的に裂けた腱を示す。図１Ｂは、縫合修復を示す。図１Ｃは、修復部に巻き付けられた移植片を示す。図１Ｄは、所定の場所に縫合された移植片を示す。
【図２】本明細書に説明される電界紡糸技法の一般的な図示を示す。
【図３Ａ−３Ｄ】特許請求される発明の空気紡糸デバイスの好ましい実施形態を示す。
【図４Ａ−４Ｂ】それぞれ、アルミフレームでアニールされる生体高分子足場と、同時に処理される複数の足場を示す。
【図５】アニーリング前後の足場の厚さおよび密度を示す。
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａは、低細胞浸潤で８週間後のヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＰ）から電界紡糸されたコラーゲン／生体高分子の皮下移植片のＨ＆Ｅ組織像を示し、図６Ｂは、２週間後のＤＭＳＯから電界紡糸されたコラーゲン／生体高分子の皮下移植片のＨ＆Ｅ組織像を示し、図６Ｃは、図６Ａおよび６Ｂをグラフで図示する。図６Ａおよび６Ｂの＊および破線は、１０倍の倍率で、電界紡糸された組織片を表し、かつ境界を示す。
【図７】電界紡糸コラーゲン：ＰＤＬＬＡ足場の７日間の培地安定性試験の結果を示す。図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、電界紡糸された足場の媒体中での収縮および電界紡糸された足場の媒体中での容量膨張を示す。ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ組成：１５０ｍｇ／ｍＬの３０：７０テロコラーゲン：ＰＤＬＬＡを６５：３５のＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ中に溶解した。ＤＭＳＯ：ＴＨＦ組成：１５０ｍｇ／ｍＬの３０：７０テロコラーゲン：ＰＤＬＬＡを７５：２５のＤＭＳＯ：ＴＨＦ中に溶解した。ＨＦＰ組成：１００ｍｇ／ｍＬの３０：７０のテロコラーゲン：ＰＤＬＬＡをＨＦＰ中に溶解した。足場領域および容量は、０日目（３７℃にて５％ＣＯ２を用いたＤＭＥＭでのインキュベーション前）、１日目、４日目、７日目に評価した。
【図８Ａ−８Ｄ】３０倍（図８Ａ）、５００倍（図８Ｂ）、３，０００倍（図８Ｃ）、および１０，０００倍（図８Ｄ）倍率での整列された空気紡糸コラーゲンの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を示す。
【図９Ａ−９Ｅ】図９Ａ〜９Ｃは、整列したコラーゲン繊維の比較を示す。走査型電子顕微鏡は、電界紡糸（図９Ｃ）を使用して生成された整列された電界紡糸コラーゲンと比較して、空気紡糸（図９Ａ、図９Ｂ）によって等方性および異方性コラーゲン繊維を生成する可能性を明らかにした。より広い範囲の繊維サイズは、空気紡糸によって生成されるが、空気紡糸および電界紡糸の両方が、平均直径２００ｎｍの繊維を生成した（図９Ｄ）。ＩｍａｇｅＪを使用して定量化された繊維整列は、空気紡糸繊維と比較して電界紡糸でより高度な整列を示した。
【図１０】空気紡糸および電界紡糸コラーゲンの材料特性を示す。電界紡糸法および空気紡糸法によって製造されたゲニピン架橋コラーゲンは、機械的に試験され、比較された（ｎ＝６）。空気紡糸コラーゲンは、驚くべきことに、電界紡糸群と比較して、有意により高い平均引張強度およびピーク負荷を有し（＊はｐ＜０．０５を表す）、２つの試験群間で弾性率または破断時のひずみに統計的差異は見出されなかった。
【図１１】経時的なＡＳＣ代謝活性を示す（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）。ゲニピン−架橋電界紡糸および空気紡糸足場上に５×１０４細胞／ｃｍ２で播種したＡＳＣを、３７℃の細胞培養培地で２週間インキュベートした。時間の経過とともに増加する代謝活性は、両方のマトリックスの細胞容認性を示す。
【図１２】アニールまたは拘束されていない生体高分子シートの収縮を示す。
【図１３】培養１４日後の、アニーリングされ、かつ紡糸されたままの（把持され、緩んだ）足場の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。
【図１４】生体高分子足場の０日目および１４日目のアニーリングを有する、もしくは有しない、または抑制を有する、もしくは有しない、繊維整列を示す。
【図１５】生体高分子足場の０日目および１４日目のアニーリングを有する、もしくは有しない、または抑制を有する、もしくは有しない、繊維径を示す。
【図１６】さまざまな時点での細胞浸潤を分析するために、さまざまな溶媒から出した電界紡糸された足場の皮下移植片の比較を示す。
【図１７】気孔率の高い移植片と低い移植片を比較する、２〜１６週間にわたる細胞浸潤に関するラット皮下移植片を示す。
【図１８Ａ−１８Ｃ】コラーゲンベースのマイクロ繊維に沿った腱細胞の細胞整列および細胞伸長を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、移植可能な生体高分子足場、および軟組織傷害の管理、保護、および修復におけるそれらの使用方法に関する。傷害は、好ましくは、傷害の結果として組織の実質的な損失を提示しない、靭帯および腱に関与する。移植片は、傷害の領域での治癒反応を助長し、かつ容易にする。これは、細胞浸潤および組織内部成長を通して移植片のリモデリング、コラーゲン繊維の堆積、ならびに治療対象による血管新生と移植片の吸収を含む。図１は、シート状の生体高分子足場が移植され、そして外科的縫合修復後に部分的に裂けた腱の周りに巻き付けられ、そしてその後足場自体が所定の場所に縫合される、本発明の好ましい実施形態を示す。
【００２８】
本発明はまた、すなわち生体高分子および生体容認性高分子から形成される構築物を意味する、生体高分子足場を生成する方法にも関する。そのような構造物は、好ましくは実質的に、層、マット、シート、および管へと形成される整列された繊維であり、靭帯および腱などの軟組織傷害に対する傷害の管理、保護、および修復のための移植片として使用されてもよい。
【００２９】
本発明の方法は、生体高分子および任意選択的に生体容認性高分子を、約４０〜１００容量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と、エタノールおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）からなる群から選択される、約０〜６０容量％の溶媒と、を含む、ＤＭＳＯ溶媒系中に溶解して、生体高分子溶液を形成し、生体高分子溶液から生体高分子繊維を生成し、そして生体高分子繊維を収集して、生体高分子足場を形成する。
【００３０】
生体高分子
生体高分子足場を生成するために本発明の方法で使用され得る生体高分子は、天然組織の生物学的構造および細胞外マトリックスの構成成分である、タンパク質である。意図される生体高分子は、天然に存在している、結合組織およびその他の軟組織内、ならびに細胞外マトリックス内に天然に見出されるタンパク質ベースの巨大分子（コラーゲン、エラスチン、細胞外基質タンパク質、フィブリン、フィブリノーゲン、ゼラチン、およびラミニン、ならびにそれらの組み合わせなど）である。また、前述のタンパク質ベースの巨大分子の組換え型および化学修飾型、ならびにクラゲ、ナマコ、およびイカなどの海洋起源のコラーゲンの使用も意図される。
【００３１】
好ましい生体高分子は、コラーゲンである。本発明による生物的容認可能な足場用に使用されるＩ型コラーゲンは、概して哺乳動物の組織、特にウシおよびブタの腱から抽出されるが、組換えコラーゲンも使用され得る。時として無細胞のヒト真皮がコラーゲンの供給源として使用される。
【００３２】
Ｉ型コラーゲンは、２つの一般的な形成で研究製品および臨床グレードの製品の両方で利用され、かつ商品化されている。ペプシンによる組織の酸および酵素消化で生成される、より一般的なコラーゲン変異体は、「アテロコラーゲン」と呼ばれるコラーゲンの形態であり、コラーゲンタンパク質の終止末端領域を欠いているので（「ＤＥＫＳＴＧＩＳＶＰ  ｖｓ．ｐＱＬＳＹＧＹＤＥＫＳＴＧＩＳＶＰ」の末端ペプチド配列）、これにより、テロペプチドが切断され、親組織からのコラーゲンの回復を助ける。あまり一般的ではないが、コラーゲンは、緩酸中で可溶化されて、溶液中のコラーゲンを収集し、「テロコラーゲン」として知られる、コラーゲンのモノマー中にテロペプチドを維持する。
【００３３】
酸可溶性（テロコラーゲン）およびペプシン可溶性（アテロコラーゲン）凍結乾燥コラーゲンは、本発明の方法で使用するための適切な出発物質である。ウシ真皮からの好ましいＧＭＰグレードのＩ型コラーゲンは、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓからその天然型で入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｌａｇｅｎｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｅｄｉｃａｌ−ｇｒａｄｅ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）。コラーゲンは、他の供給業者から、またさまざまな種からも入手可能である（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ／ｅｎｚｙｍｅ−ｅｘｐｌｏｒｅｒ／ｌｅａｒｎｉｎｇ−ｃｅｎｔｅｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ／ｃｏｌｌａｇｅｎ．ｈｔｍｌ）。
【００３４】
本発明による好ましい足場は、生体容認性高分子を含まない、１００％生体高分子から成る。他の好ましい実施形態は、生体高分子を１つ以上の生体容認性高分子と一緒にした混合物またはブレンドである、足場を生成する。
【００３５】
生体容認性高分子
生体高分子足場は、生体高分子と生体容認性高分子との混合物を使用して、本発明に従って生成され得る。生体容認性高分子を組み込むことは、強度、繊維サイズ、安定性、分解特性などの全体的な移植材料特性を調整する一方で、細胞容認性をほとんど失うことなく全体的な移植片コストを削減する手段を提示する。多種多様な生体容認性、例えば、生分解性および生物活性の高分子が、軟組織修復における単独または他の高分子とのブレンドでの使用について考慮され、また時として上記のタンパク質などの天然組織の構成成分を含む。有用かつ改善された生体力学的特性および生分解性特性は、そのようなタンパク質とさまざまな生体容認性高分子とのブレンドされる組み合わせから、例えば、コラーゲンとポリ乳酸を組み合わせることで、そのＬ−アイソフォームとＤ−アイソフォームの両方を含み、特に、ポリ−ＤＬ−ラクチドまたはＰＤＬＬＡと呼ばれるラセミ混合物で、生じる。
【００３６】
単独のＰＬＬＡアイソフォームは、比較的強いが、弾性的ではなく脆い。これは、生体内で約３６〜４８か月存在し続ける。傷害を受けた軟組織を支持するいくつかの用途用に好ましいＰＬＬＡは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍａｔｅｒｉａｌ−ｍａｔｔｅｒｓ／ｐｄｆ／ｒｅｓｏｍｅｒ−ｂｉｏｄｅｇｒａｄｅａｂｌｅ−ｐｏｌｙｍｅｒｓ．ｐｄｆ）。しかしながら、ＰＬＬＡはＤＭＳＯに不溶であるため、この生体容認性高分子およびベース溶剤の使用はケースバイケースで評価するべきであり、一般的にＤＭＳＯ以外の適切な溶剤が使用されるべきである。ＰＤＬＡアイソフォームは、より弾力性があり、それほど脆くなく、通常、生体内で１２〜１８か月間存続する。好ましいＰＤＬＡは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ＳＩＧＭＡ／６７１２２？ｌａｎｇ＝ｅｎ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＵＳ）。ＰＤＬＬＡは、強度と安定性の点では一般的にＰＬＬＡとＰＤＬＡの間にあり、生体内での寿命の点では、約１８〜３６か月の範囲内であり、これは一般的に、吸収されるためには十分な長さであり、かつカプセル化を回避するのに十分な短さである。ＰＤＬＬＡは、Ｌ−ラクチドとＤ−ラクチドのラセミ混合物の重合によって形成されるアモルファス高分子である。高分子の正確な組成は、その機械的特性および加水分解特性を決定する。
【００３７】
約０．５〜５ｄＬ／ｇの範囲の固有粘度を有するＰＤＬＬＡは、本発明による生体高分子足場を生成するために使用されてもよい。約１．５〜６ｄＬ／ｇの、比較的より高い平均固有粘度を有するＰＤＬＬＡは、好ましい生体容認性高分子であり、より好ましくは約４〜５ｄＬ／ｇ、５の平均固有粘度を有するが、より低い固有粘度、０．５〜１．３ｄＬ／ｇを有するＰＤＬＬＡは、より低いピーク応力が適切な場合に使用することができる。１．６〜２．４ｄＬ／ｇの固有粘度を有する好ましいＰＤＬＬＡは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｅｆａｕｌｔ／ｐｏｌｙｄｌ−ｌａｃｔｉｃ−ａｃｉｄ−ｉｖ−２０−２８ｄｌｇ、から入手可能である。より低い固有粘度のＰＤＬＬＡ（１．３〜１．７ｄＬ／ｇの固有粘度）は、Ｅｖｏｎｉｋ、ｈｔｔｐ：／／ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ．ｅｖｏｎｉｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｈｅａｌｔｈ−ｃａｒｅ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ／ｒｅｓｏｍｅｒ／ｐａｇｅｓ／ｍｅｄｉｃａｌ−ｄｅｖｉｃｅｓ．ａｓｐｘから入手可能である。０．５５〜０．７５ｄＬ／ｇの、さらにより低い平均固有粘度を有するＰＤＬＬＡは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ｐ１６９１？ｌａｎｇ＝ｅｎ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＵＳから入手可能であり、他の供給元からのＰＤＬＬＡも利用可能である。また、ＧＭＰレベルの純度を有する好ましいＰＤＬＬＡは、Ｃｏｒｂｉｏｎ（「ＰＵＲＡＳＯＲＢ  ＰＤＬ４５」）から入手可能であり、４．５ｄＬ／ｇの比較的高い固有粘度を有する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｓｔａｔｉｃ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｄａｔａｓｈｅｅｔｓ／３１ｄ／ＰＵＲＡＳＯＲＢ％２０ＰＤＬ％２０４５．ｐｄｆ）。
【００３８】
所与の製品もしくはデバイス用にも、または、例えば、コラーゲンと組み合わせた場合にも有用であり得る生体容認性高分子としては、ポリラクチド、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、およびポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）が挙げられる。他の有用な生体容認性高分子は、当業者に既知であり、例えば、ポリ（グリコール酸）、ポリエステル、トリメチレンカーボネート、ポリジオキサノン、カプロラクトン、アルキレンオキシド、オルトエステル、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、天然脂肪からの合成高分子および油、ならびにそれらの組み合わせである。
【００３９】
生体高分子と共に使用される生体容認性高分子は、生体高分子溶液から生体高分子／生体容認性高分子繊維を生成する際に架橋する生体容認性高分子を調製するために、１つ以上の官能化試薬で前処理され得る。例えば、ＰＤＬＬＡは、アミノ基を追加するようにアミノ分解を通して官能化することができる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１００２／ａｄｅｍ．２００９８００３１／ａｂｓｔｒａｃｔにおいて、Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ）ｆｏｒ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １２（４）：Ｂ１０１−Ｂ１１２（２０１０）を参照されたい。代替的に、ＰＤＬＬＡを、プラズマ処置によって官能化して、マトリックス内にカルボキシル基およびアミノ基を導入することができる。
【００４０】
一般的な手法として、例として、ＰＤＬＬＡを、電界紡糸の前にＯＨ基を用いて官能化することができる。ＰＤＬＬＡペレットは、ｍｉｌｌｉＱ（超精製）水中の１０〜２０％エタノール中に溶解された１０ｍＭ〜１Ｍ水酸化ナトリウムの混合溶液に浸漬される。ペレットを、室温または３７℃で１０〜６０分間浸漬する。インキュベーション後、ペレットは、ミリリットルの蒸留水またはより高度に精製された水ですすがれ、バイオセーフティーフード内で風乾される。その後、官能化されたＰＤＬＬＡチップは、以下に説明する、ＤＭＳＯ／エタノールなどの、ＤＭＳＯ溶媒系中で溶解できる。
【００４１】
生体高分子と生体容認性高分子の混合物が使用される場合、混合物は、約１０〜５０重量％の生体高分子、好ましくは約１５〜４０重量％の生体高分子、より好ましくは約２０〜３５重量％の生体高分子、より好ましくは約２７．５〜３２．５重量％の生体高分子、および最も好ましくは約３０重量％の生体高分子と、生体容認性高分子である残部とを含有してもよい。２つ以上の生体高分子および／または２つ以上の生体容認性高分子の混合物を、生体高分子および／または生体容認性高分子構成成分として使用されてもよい。
【００４２】
好ましい生体高分子の生体容認性高分子への混合物は、約１０〜５０重量％のコラーゲンと約５０〜９０重量％の生体容認性高分子と、好ましくは約２５〜３５重量％のコラーゲン、より好ましくは約２７．５〜３２．５重量％のコラーゲン、および最も好ましくは約３０重量％のコラーゲンと７０重量％の生体容認性高分子とを含有する。生体容認性高分子としては、Ｉ型コラーゲンが好ましく、ラクチド高分子、特にＰＤＬＬＡが好ましい。そのような混合物では、テロコラーゲンおよびアテロコラーゲンも好ましい。好ましい組成物は、生成後の処理中に化学的に架橋されていない、約３０％のＩ型ウシ皮膚コラーゲンおよび約７０％のＰＤＬＬＡである。そのような組成物は、所望の生体力学的性能および生体安定性パラメーターを提示する。
【００４３】
低負荷型溶媒系
本発明の方法は、生体高分子および任意選択的に生体容認性高分子を、溶媒系、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解して、生体高分子溶液を形成する。好ましいＤＭＳＯ溶媒系は、約１００容量％のＤＭＳＯを含有する。他の実施形態は、約４０〜１００容量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と、一価アルコール、環状エーテル、分岐鎖エーテル、ならびにそれらの塩素化物誘導体およびフッ素化誘導体、ならびにそれらのエステル、ならびにそれらの組み合わせなどの約０〜６０容量％の溶媒と、を含有する。意図される溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ペンタン−１−オール、ヘキサデカン−１−オール、および他の飽和直鎖、ならびに単一のヒドロキシル官能基を含有する分岐鎖炭化水素、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい環状エーテルとしては、シュウ酸塩（別名「テトラヒドロフラン」または「ＴＨＦ」として知られている）、オキセタン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。電界紡糸が生体高分子足場を生成するために使用される技法である場合、好ましい溶媒は、エタノールおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ならびにそれらの混合物である。ＤＭＳＯおよび酢酸、ならびにそれらの混合物は、空気紡糸が生体高分子足場の生成に使用される技法である場合に好ましい。
【００４４】
本発明の方法で使用されるＤＭＳＯ溶媒系は、「低負荷型」溶媒系である。それらは、生体高分子の足場を作製する生体高分子および生体容認性高分子を溶解することができる溶媒であり、かつ一般的に米国食品医薬品局によって安全であると認められているか、または別の方法で、例えば、１，１，１，３，３，３ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＰ）などの、関連する移植可能な足場を生成するために電界紡糸技法で使用される他の従来の溶媒と比較して、ヒト対象または他の哺乳類対象の健康へのリスクを最小限に抑える。
【００４５】
ＤＭＳＯは、タンパク質および核酸などのさまざまな生体分子を容易に溶解する、極性化学物質である。一般的に、ＤＭＳＯは、膜透過、膜輸送、抗炎症、血管拡張、およびさらに多数のもののような生物学的機能を強化する、多用途の化学物質であることが示されている。さらに、ＤＭＳＯは、エタノールおよびＴＨＦとの溶剤システムまたは溶剤ブレンドで使用することができる、溶剤である。これは比較的低い毒性を提示し、また、例えば、コラーゲンおよび他の高分子を電界紡糸するために使用される一般的な溶媒であるＨＦＰと比較して、より安全な選択肢であると考えられている。ＨＦＰは比較的毒性が強いため、電界紡糸された材料または移植片にＨＦＰが存在すると、移植後の生物的適合性に悪影響を及ぼす。当業者に知られているように、ＤＭＳＯは吸湿性であるため、水への曝露を最小限にすることは、重要である。ＤＭＳＯ溶液はまた、好ましい溶媒系のためには比較的低い含水量も有する。
【００４６】
本発明による生体高分子足場を生成するためのＤＭＳＯ溶媒系は、好ましくは約１００％のＤＭＳＯを含有する。ＤＭＳＯおよび溶媒を含有する他の好ましい実施形態は、約４０〜１００容量％、より好ましくは約５０〜９９容量％、５５〜９５容量％または約６０〜９０容量％、および最も好ましくは約７０〜８５容量％、７５〜８５容量％または約８０容量％のＤＭＳＯ、ならびにエタノールおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）から選択される、約０〜６０容量％、より好ましくは約１〜５０容量％、５〜４５容量％または約１０〜４０容量％、および最も好ましくは約１５〜３０容量％、１５〜２５容量％または約２０容量％の溶媒、を含有する。エタノールは吸湿性があり、典型的には水分を最小限に抑えるために密閉されている。ＴＨＦは、可燃性で揮発性が高い。空気（すなわち、酸素）への暴露は、過酸化物の蓄積の可能性を減らすために、避けるべきである。絶対エタノールは、エタノールの好ましい形成である。ＴＨＦを使用する場合、最も好ましいのは、２５％であり、エタノールを使用する場合、最も好ましいのは、３５％である。
【００４７】
本発明の方法で使用されるＤＭＳＯ溶媒系は、単純な混合または当技術分野で知られている他の手段によって調製されてもよい。例えば、適切な量のＤＭＳＯとＴＨＦまたはエタノールのいずれかを２０ｍＬシンチレーションガラスバイアル内で混ぜ合わせ、そして穏やかにかき混ぜるか、または混合溶液を上下にピペッティングして、溶媒がブレンドされるまで混合する。混合溶液は、気密バイアルに入れ、ドラフトまたは他の同様のデバイス内で保管するべきである。長期保存は、蒸発により溶液の濃度が変化する可能性があるので、推奨されない。当業者は、これらおよび他の低負荷型溶媒系を利用することができるであろう。
【００４８】
生体高分子溶液
本発明の方法において、生体高分子溶液は、生体高分子または生体高分子／生体容認性高分子混合物をＤＭＳＯ溶媒系、例えば３０重量％（ｗ／ｗ）（３００ｇ／ｍＬ）コラーゲンおよび７０重量％（ｗ／ｗ）（７００ｇ／ｍＬ）ＰＤＬＬＡ中に溶解することによって調製される。生体高分子または生体高分子／生体容認性高分子の混合物は、当技術分野で知られている手段を使用して、ＤＭＳＯ溶媒系中に溶解されてもよい。例えば、ＤＭＳＯとエタノールとの溶液、またはＤＭＳＯとＴＨＦとの溶液は、事前に混合され、ＤＭＳＯ溶媒系を作成してから、生体高分子および生体容認性高分子（存在する場合）を追加する。次に、コラーゲンなどの生体高分子は、任意の生体容認性高分子と同時に追加され、これは、室温でボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）するか、または室温で静置して、手動で反転させた後、例えば、電界紡糸により、生体高分子繊維を生成することができる。一般的に、生体容認性高分子は、溶解するためにボルテックスまたは攪拌が必要とされるが、コラーゲン単独では必要とされない。代替的に、コラーゲンなどの生体高分子および生体容認性高分子を、別々に溶解し、そして一緒にするか、または一緒にブレンドして一度に溶解することができる。
【００４９】
生体高分子繊維および生体高分子足場の生成
溶液から生成された後の生体高分子繊維は、その後収集されて生体高分子足場を形成する。生体高分子繊維および生体高分子足場は、単一の生体高分子、生体高分子の混合物、生体高分子と生体容認性高分子の混合物、または２つ以上の生体高分子と１つ以上の生体容認性高分子の混合物から構成され得る。生体高分子および生体容認性高分子は、それらの好ましい実施形態と共に、上記で考察されている。生体高分子繊維と足場はそれぞれ、本発明の別個の実施形態を表し、従来の溶媒技法で調製される足場と比較して、低減した、または同等の収縮量を提示するだけでなく、生成後にさまざまな液体、例えば、医療目的で対象に埋め込まれた後に足場が曝露される血液および他の生体液で湿潤したときに改善された膨潤特性を提示する。
【００５０】
本発明の生体高分子繊維および足場は、さまざまな技法によって生成され得る。電界紡糸および空気紡糸が好ましい。電界紡糸は、コラーゲンマイクロ繊維の直径、および二次元での繊維の順序を制御するための両方の比較的より多くの制御を提供する。しかしながら、電界紡糸は、コレクターの電気絶縁に起因して厚い三次元材料を生成する能力に制限があり、典型的には単一層で約１ミリメートル以下の生体高分子シートを生成する。この制限は、理論的に無制限の厚さを有する空気紡糸では存在しない。発明者らは、生体高分子混合物中の酢酸ナトリウムなどの塩を使用して電界紡糸してもよく、またＤＭＳＯのｐＨは、当業者によって決定され得るように、得られる足場の強度または架橋を調整または改善するために、ＤＭＳＯにＨＣｌまたは酢酸を追加するなど、さまざまな方法を通して下げることができる。
【００５１】
電界紡糸
電界紡糸は、生体高分子溶液から生体高分子繊維を生成するための好ましい処理技法である。図２は、本明細書に説明される電界紡糸装置の一般的な図を示す。ブレンドを溶媒系から分離する他の手法、例えば、空気紡糸、押出成形、冷間引き抜きまたはキャスティングは、当業者に知られているであろう。
【００５２】
電界紡糸は、高分子溶液または高分子溶融物の帯電した糸をさまざまな直径と長さの繊維へと引っ張る繊維生成技法である。電界紡糸は、電界スプレー、従来の溶液乾式紡糸および押出成形、または繊維の引き出し成形の両方の特徴を共有する。コラーゲンの電界紡糸は、天然組織構造を模倣する繊維性材料の形成のための一ステップ処理として広く説明される。シートの形状である生体高分子足場は、生体高分子繊維を高速ドラム（およそ１〜２０ｍ／ｓの表面速度になっている）上へと電界紡糸することにより生成されてもよい。後述するように、生体高分子足場は、残留溶媒を除去するために電界紡糸後に真空乾燥することができる。例えば、足場は、残留溶媒を除去するために約３０〜３７℃の温度で乾燥させることができる。電界紡糸装置は、従来のものであり、容易に入手可能である。概して、繊維シートは、大きなシートとしてドラムから容易に剥離または取り外され、その後、冷間引張または切断または折り畳みされて、さまざまな寸法の足場を生成することができる。
【００５３】
空気紡糸
空気紡糸は、本発明による生体高分子および移植片を生成するのに有用な別の好ましい繊維および足場生成技法である。本発明のこの実施形態は、異方性空気および等方性足場を生成するために高速空気（空気紡糸）を使用する、または他のデバイス上のコラーゲンコーティングに有用な、コラーゲンマイクロ繊維の生成および組み立ての独自の方法を提供する。添付の図３Ａ〜３Ｄに示されるように、足場は、内部支柱繊維コレクター７０６がインジェクター７０２のノズル７０４の位置に対して回転するのに伴い、インジェクター７０２（エアブラシ）を通して生体高分子溶液を内部支柱ファイバーコレクター７０６に排出することにより、生成される。
【００５４】
Ａ．内部支柱繊維コレクター
本発明の１つの例示的な実施態様では、コレクター７０６は、コレクター壁７１６によってその周囲上で境界付けられた中空内部部分７０９を有する形状の実質的に開いたシリンダーである。本発明の他の実施例では、コレクターは、他の曲線平面を有することができ、かつ／またはインジェクターの反対側の端部で閉じることができる。
【００５５】
図３Ａ〜３Ｄに示されるように、繊維コレクター７０６は、内部スポーク７１０がコレクター７０６の内部部分７０９内に軸方向に位置付けられた形状の実質的に開いたシリンダーとすることができる。スポーク７１０は、コレクター７０６内の同じＸ−Ｙ平面において同軸にすることができ、または図３Ａおよび３Ｃに示すように、コレクター７０６の長さ全体にわたって互い違いにされた螺旋のアレイ状に配設することができ、ここで、スポークホルダー７０８は、コレクター７０６の長さ（Ｚ方向）に沿って異なるポイントに位置付けられる。スポーク７１０は、コレクター７０６に取り外し可能に取り付けることができる。本発明の１つの例示的な実装形態では、スポーク７１０は、スポークホルダー７０８を使用して、コレクター壁７１６の外側でコレクター７０６に取り付け／固定することができる。スポーク７１０は、収集処理の終わりに、生体高分子足場（複数可）にアクセスするためにコレクター７０６から取り外すことができる。他の例示的な実装形態では、スポーク７１０をコレクター壁７１６にコレクター７０６の内部部分７０９上で固定することができ、また収集処理の終わりに生体高分子足場（複数可）へのアクセスを容易にするために取り外すこともできる。スポーク７１０は、コレクター７０６の内径を横切って延在する。スポーク７１０は、長方形、円形、および楕円形を含む、多数の異なる断面形状を有することができ、またブレード付き断面を有することもできる。スポークの相対的なサイズ（例えば、直径、断面積など）は、使用する生体高分子、収集する足場または移植組織のサイズおよび形状、ならびにその他の考慮事項に基づいて選択することができる。
【００５６】
Ｂ．インジェクター
図３Ａに示すように、インジェクター７０２は、例えば、酢酸中のコラーゲンなどの生体高分子を受け入れる生体高分子ポート７０３を含む。インジェクター７０２は、圧縮ガス入力７０５を介してインジェクター７０２の中へと導入される調整される圧縮ガスを用いて生体高分子を駆動する。インジェクター７０２は、ノズル７０４を通して、生体高分子足場（複数可）を収集するために使用される回転繊維コレクター７０６の中へと生体高分子を駆動する。
【００５７】
Ｃ．回転構成成分
図３Ａ〜３Ｄでは、装置７００は、駆動モーター７１４、駆動ホイール７１２、第１のローラー軸７３４、第１のローラーホイール７２４、第２のローラー軸７３６、および第２のローラーホイール７２６を含む回転構成要素７２０を使用して、繊維コレクター７０６を回転させる。インジェクター７０２が生体高分子溶液をコレクター７０６に放出するのとともに、インジェクター７０２は、図３Ａおよび３Ｂに示されるように、コレクター７０６の断面Ａ−Ａに対して移動することができる。例えば、インジェクター７０２は、コレクターの円形断面に対してＸ方向に、コレクター７０６の円形断面に対してＹ方向に、およびコレクター７０６の円形断面に関してＺ方向に移動することができる。インジェクター７０２は、Ｘ、Ｙ、およびＺ方向の任意の組み合わせでも移動し得る。
【００５８】
回転構成成分７２０は、コレクター７０６をその（長手方向の）中心軸（Ｚ方向）の周りで回転させる。駆動モーター７１４は、駆動シャフト７１３に沿って同軸に位置させることができる駆動ホイール７１２を、回転および係合する。駆動モーター７１４は、本発明の特定の実施において必要に応じて、継続速度モーターとすることができ、または可変速度モーターとすることができる。駆動モーター７１４および駆動ホイール７１２が回転する（例えば、図３Ｄでは時計回り、ＣＷ）際、駆動ホイール７１２は、第１のローラー軸７３４に取り付けられた第１のローラーホイール７２４と係合し、これは次にコレクター７０６を回転させ、これは次に第２のローラーホイール７２６を回転させる。
【００５９】
第１のローラー軸７３４および第２のローラー軸７３６は、長手方向に延在し、かつコレクター７０６の長さ（Ｚ方向）に実質的に平行である。第１のローラー軸７３４および第２のローラー軸７３６は、それぞれの軸７３４、７３６の中心軸に沿って同軸に取り付けられた第１のローラーホイール７２４および第２のローラーホイール７２６をそれぞれ有する。第１のローラー軸７３４および第２のローラー軸７３６は、図に示すように、第１のローラーホイール７２４および第２のローラーホイール７２６がコレクター７０６を支持するように、互いに（Ｘ方向に）間隔を置いている。複数の第１のローラーホイール７２４および第２のローラーホイール７２６を使用されることができる。図３Ｃに示すように、第１のローラーホイール７２４および第２のローラーホイール７２６は、それらが、コレクター７０６の壁７１６を通して延在することができるスポークホルダー７０８の回転に当たったり、または回転を損なったりしないように、それらのそれぞれの軸７３４、７３６に沿って位置される。スポークホルダー７０８は、スポーク７１０をコレクター７０６上（および内部）の所定の位置に保持する。
【００６０】
Ｄ．構成要素の位置決め
図３Ａ〜３Ｄに示されるように、インジェクター７０２は、コレクター７０６の一端に位置される。インジェクター７０２がノズル７０４を通して生体高分子を駆動する際に、駆動モーター７１４は、駆動ホイール７１２、第１のローラー軸およびホイール（７３４および７２４）、ならびに最終的にはコレクター７０６を回転させる。コレクター７０６およびコレクター７０６内のスポーク７１０に対するＸ、Ｙ、およびＺ方向でのインジェクター７０２（およびノズル７０４）の位置は、インジェクター７０２を、コレクター７０６およびコレクター７０６内のスポーク７１０に対して、Ｘ、Ｙ、およびＺ方向に移動させる、プロッター位置コントローラー（別個には不図示）によって制御および変更することができる。同様に、生体高分子がインジェクター７０２のノズル７０４から排出されるコレクター入口７０７に関する角度（符号番号Θ）もまた、プロッター位置コントローラーによって制御および変更することができる。プロッター位置コントローラーは、生体高分子溶液がインジェクター７０２のノズル７０４を通してコレクター７０６に放出／排出される位置および角度を決定する。
【００６１】
コレクター７０６の回転速度は、駆動ホイール７１２、ローラー軸７３４、７３６、ローラーホイール７２４、７２６、およびコレクター７０６の相対直径、ならびに駆動モーター７１４自体の回転速度に基づいて、スピードコントローラー（個別には図示せず）を使用して、制御および変更することができる。この様式で、本発明の空気紡糸生体高分子足場製造装置７００は、インジェクター７０２から生体高分子繊維を受け取り、かつ収集するために空間内の最適点（複数可）にコレクター７０６のスポーク７１０を位置付けすることができる。
【００６２】
本発明による空気紡糸生体高分子足場製造装置７００を使用して、異方性または等方性繊維移植組織を、電界紡糸と比較してより高い出力、より低いコスト、およびより少ない複雑さで収集することができる。この様式でのコラーゲンマイクロ繊維の合成は、靭帯、腱、神経の修復などの医療デバイスの製造での用途だけでなく、マイクロ繊維コラーゲンベースのコーティングおよび他の生体高分子を他の材料に適用するための、多くの用途を有する。
【００６３】
空気紡糸の実施形態では、生体高分子溶液は、ＤＭＳＯ溶媒系中に溶解される、または酢酸中に溶解された生体高分子および／または生体容認性高分子であってもよい。欠陥のない生成速度は、酢酸に溶解された際、コラーゲンの電界紡糸を使用した場合の０．０６２５ｇ／時に対して約２ｇ／時であることが好ましく、この手法をより高効率の繊維収集デバイスエンジニアリングとともに使用すると、少なくとも８ｇ／時に増加する可能性を有する。したがって、空気紡糸は、生体高分子繊維生成への著しく拡大可能な手法である一方で、それほど特化した機器を必要とせず、かつより高価な機器を必要としない。
【００６４】
繊維および足場の処理
本発明の方法は、生体高分子足場の後処理のためのさまざまな任意選択的なステップを利用する。後処理の１つのステップは、生体高分子足場を乾燥して、少なくとも米国食品医薬品局の要件に一致するレベルまで残留溶媒を除去することである。乾燥は、例えば、風乾、真空乾燥、デシケーター内での乾燥、凍結乾燥、不活性ガス下での乾燥などの手法によって行われてもよい。好ましくは、ＤＭＳＯのレベルは、足場の約１．５重量％未満に減少されることになる。
【００６５】
生体高分子足場の後処理は、化学的、機械的、物理的、または熱的後処理も伴う場合がある。例えば、本発明の方法によって生成される生体高分子足場は、機械的引っ張りを有する、もしくは有しない熱アニーリングによって、またはアニーリング、引張、および緩和サイクルの混合によってなど、物理的に後処理することができる。そのような物理的後処理ステップは、繊維径、繊維整列、および結果として得られる生体高分子足場の空隙率または気孔率を変更することなどによって、結果として得られる生体高分子足場の材料特性を調整または別の方法で変更するために適用されることができる。例えば、図４Ａおよび４Ｂに示すように、生体高分子足場は、例えばアルミニウムで作製されたフレーム内でアニールされ、かつ任意選択的に張力下に維持されて、繊維整列および機械的安定性の向上を促進する。足場は、真空を用いて、また真空を用いずに、特に４５、５５、６５℃で最大２４時間、３種類のフレーム型でアニールされた。張力の量は、足場の収縮を回避または最小化するのに十分であるべきである。このようなアニーリングはまた、驚くべきことに、そして有利にも、足場の厚さを３倍または４倍も増加させ、これは、単層足場移植片の臨床使用を容易にする。
【００６６】
一実施形態では、電界紡糸された足場は、テロコラーゲン（３０ｍｇ／ｍｌ）およびＰＤＬ４５（７０ｍｇ／ｍｌ）の総濃度１００ｍｇ／ｍｌのブレンドを１００％ＤＭＳＯ中に溶解することによって調製される。足場は、最大２４時間（最小２〜最大２４時間）真空下に定置される。
【００６７】
その後、そのような足場を、約４５、５５、および６５℃の温度で、約１８〜２４時間、固定または非固定フレーム内でアニールしてもよい。結果として得られる足場の機械的安定性は、６５℃で１８時間アニールした場合、著しくより良好である。当業者は、経時的に、減少する、足場長さの変化、および増加する、足場厚さの変化を評価するであろう。好ましくは、約１〜４８時間のアニーリング時間が最適であり、より好ましくは約２〜２４時間であることになる。
【００６８】
図５は、アニーリング前後の足場の厚さおよび密度を示す。表面積が３６０ｃｍ２のコレクタードラムの上へと電界紡糸した２０ｍＬの溶液は、以下の厚さの足場を生じることになる。アニールされていない足場は、０．３±０．１ｍｍの平均厚さを有する。アニールされた足場は、５．６±１．２ｍｍの平均厚さを有する。アニーリングのセットアップ、初期の足場の厚さ（アニールされていない）、および所与の足場の使用のための好みに応じて、足場の厚さを実質的に増やすことができる。
【００６９】
本発明の生体高分子足場は、任意選択的に、化学的にも後処理され得る。例えば、上述のように、溶媒系の中に溶解される前にアミノ基を提供するように官能化される足場内の繊維は、一般にはアルデヒド、より具体的には小鎖アルデヒド、および好ましくはグリオキサール、または足場へのその抽出後に他の従来の架橋試薬で架橋され得る。例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ゲニピン、グリセルアルデヒド、グルタルアルデヒドなどの架橋剤が使用されてもよい。生体容認性高分子がカルボキシル基で官能化されている場合、その後ＥＤＣおよび他のカルボジイミドが架橋のために使用されてもよい。イソシアネートは、ＯＨ基およびアミンの両方と反応する。したがって、イソシアネートベースの架橋剤は、例えば、（ＯＨ基を別のＯＨ基にリンクする）官能化ＰＤＬＬＡ内でＯＨ基を相互に架橋して、媒体の安定性、強度を向上させるために使用されてもよい。イソシアネートはまた、コラーゲンからのＮＨ２基（すなわち、アミン基）を介して、官能化ＰＤＬＬＡのＯＨ基にコラーゲンを連結するために使用され得る。追加的に、光架橋剤を使用されることができる。
【００７０】
生体高分子繊維および生体高分子足場の物理的特徴
本発明によるＤＭＳＯ溶媒系から生成され、本明細書に説明されるように処理される場合、生体高分子繊維およびそれらが形成する生体高分子足場は、他の手段および方法によって調製された他の生体高分子繊維および足場では見られない、新規かつ予期しなかった特性および特徴を有する。
【００７１】
本発明によるＤＭＳＯ溶媒系から生成される生体高分子繊維は、直径が約１５０〜４５００ｎｍ、好ましくは約３００ｎｍ〜３０００ｎｍ、より好ましくは約５００ｎｍ〜２０００ｎｍ、および最も好ましくは約７００ｎｍ〜１２００ｎｍの範囲である。
【００７２】
本発明に従って生成される生体高分子足場は、溶媒系、生体容認性高分子の選択、および本明細書で考察されるようなさまざまな後処理ステップを含む、いくつかの要因に基づく有利な強度プロファイルを有する。例えば、溶媒系の選択を検討するとき、異なるＤＭＳＯ：ＴＨＦの比率は、大きく異なる機械強度プロファイルを生成し、７５：２５のＤＭＳＯ：ＴＨＦの比率では、他の比率よりも著しく強力になる。下記の実施例７中の表２を参照されたい。同様の結果は、ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨの比率を増やしても見られ、相対的なＤＭＳＯ濃度の増加は、強度の増加と相関し、ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨの比率が約８０：２０では、他の比率よりも著しく強力になる。下記の実施例７中の表３を参照されたい。追加的に、１００％ＤＭＳＯから紡糸された生体高分子足場は、ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨまたはＤＭＳＯ：ＴＨＦのブレンドした溶媒から紡糸されたいずれの足場よりも強力である。下記の実施例７中の表１および３を参照されたい。
【００７３】
本発明に従って生成される生体高分子足場は、約２．５〜１０ＭＰａのピーク応力強度を有する。生体高分子は、ヒトの腱、特にアキレス腱の弾性率と実質的に同様の弾性率を有し、これは約３５〜７５０ＭＰａである。その範囲内で、繊維については、約３５〜２００ＭＰａの弾性率が好ましい。また、水和状態で１ｍｍ／秒で試験したときの引張強度として、５０〜１００％（０．５〜１．０ｍｍ／ｍｍ）の破壊に至るひずみが好ましい。
【００７４】
移植可能な足場は、好ましくは、約５ＭＰａを超える引張強度、約６ＭＰａを超える弾性率、および０．６４Ｎを超える縫合引き抜き強度を有する。
【００７５】
説明されたアニーリングによる後処理は、有利なことに、生体高分子移植片内の繊維間の平均空隙容量を、ＨＦＰなどの従来の溶媒を用いた電界紡糸によって生成される移植片の、約５〜１０倍に増加させる。例えば、本発明によるＤＭＳＯ溶媒系を使用して生成されたアニールされた足場は、アニールされていない足場の約７マイクロメートルの平均細孔径と比較して、水銀圧入法によって決定される、最大約８０〜１２０マイクロメートル、より好ましくは約９０〜１１０マイクロメートル、およびより好ましくは約１００マイクロメートルの平均孔径を有する。当業者は、この測定技術が、水銀中に浸漬される試料に制御された圧力を加えることによって気孔率を測定することを理解するであろう。水銀を細孔の中へと押し込むのに必要な力の量は、細孔のサイズに反比例し、そのため、細孔が大きいほど、細孔の中へと浸透するのに必要な圧力は小さくなる。好ましい移植片の気孔率は、生体内での細胞浸潤を著しく改善し、医療機器用の電界紡糸製品の分野における長年の重要な課題を克服する。
【００７６】
追加的に、移植片は、自家細胞、同種細胞、または異種細胞を含む１つ以上複数の細胞型を播種されてもよい。意図される細胞型としては、脂肪、骨髄、または他の場所からの間葉系幹細胞などの幹細胞または前駆細胞、ならびに臍帯血細胞および羊膜細胞などの胎盤由来細胞、人工多能性幹細胞および胚幹細胞が挙げられる。腱細胞、筋芽細胞または筋細胞または衛星細胞などの筋骨格細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および内皮細胞などの血管細胞も、使用され得る。追加的に、他の細胞型は、皮膚、硬膜、脂肪、乳腺および他の組織特異的細胞型など、筋骨格組織以外の他の組織型の修復に適宜利用され得る。
【００７７】
繊維および足場の整列
移植片の好ましい実施形態では、生体高分子繊維の配向は、傷害を受けた組織に隣接する移植片の内面および移植片の外面で異なり、内面と外面の間に勾配または他の移行ゾーンを有する。例えば、生体高分子繊維は、移植片の内面に実質的に整列される場合があり、これは、足場内の基準から１５〜２０度以内にある繊維の少なくとも約半分が共通の軸に沿って配向されることを意味する。この移植片は、好ましくは、繊維がランダムに整列されるか、そうでなければ実質的に配置されない外面に向かって、移植片の厚さを通してあまり整列されていない繊維の勾配を有する。他の実施形態では、多層移植片の１つ以上の内向き層は、実質的に整列される繊維を含有し、移植片の１つ以上の外層は、ランダムに配向した、または実質的に整列していない繊維を含有する。
【００７８】
概して図１を参照すると、前述の繊維構成は、足場または移植片が対象に外科的に移植されている間に縫合を容易にし、また改善された縫合保持を付与する。この構成はまた、外面に癒着防止バリアを提供し、かつ軸外の移植片の機械的特性を改善し、これは、傷害を受けた組織の軸から外れ、組織自体の長手方向の繊維構成要素の配向の軸から外れることを意味する。
【００７９】
足場内の繊維の実質的な整列は、例えば、上述のようにドラム上に繊維を収集することによって生成される場合があり、一方で比較的遅い速度で回転していると、繊維のランダムな堆積が結果として生じる。実質的に整列して堆積した繊維を収集するために、回転速度を比較的徐々に、もしくは比較的急に、高速または完全な回転速度まで増加することができる。一実施形態では、ランダムに配向される繊維が約６時間の間収集され、その後ドラムの速度は、次の６時間にわたって、約１５ｍ／秒などのその最終的な最高速度まで増加される。繊維は、さらに１２時間収集され続けてもよい。堆積された繊維の配向におけるこの種の勾配は、縫合に対する優れた、かつ好ましい付着を提供する。ランダムから実質的に整列された繊維までの約２５〜３３％の勾配が好ましい。
【００８０】
移植のための生体適合性足場の機能的特徴
上述のように、本発明は、特に損傷した腱および靭帯の修復に有用な軟組織支持体として、組織工学のための合成繊維ならびに関連するシート様および束ねられた繊維製品を提供するための低負荷型溶媒系の使用に関する。例えば、本発明によれば、コラーゲンおよびＤＭＳＯ中に溶解された生分解性高分子で形成される、組織工学による靭帯および腱の足場は、損傷したアキレス腱の修復に使用され得る。
【００８１】
繊維から調製された足場に関して、足場の湿潤性は、５％ＣＯ２中での３７℃にて湿度１００％で７日間にわたるインキュベーションで、培地中で安定性を示す。概して、播種された細胞は、播種される細胞の半分以上が足場に付着し、好ましくは強い細胞付着を示す。
【００８２】
本発明による移植片はまた、例えば、従来の電界紡糸技法によって生成される移植片と比較して、比較的迅速に凝固血液および非凝固血液の両方を吸収する。吸収は、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｉｂｅｒｓ  ｆｏｒｍａｂｌｅ  ａｓ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  ｃｕｓｔｏｍ  ３Ｄ  ｐｒｉｎｔｅｄ  ｍｏｌｄ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｂｏｎｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ８（３）：０３５００７．ｄｏｉ：１０．１０８８／１７５８−５０９０／８／３／０３５００７（Ｊｕｌｙ  ２０１６）で開示されているように、当技術分野で既知の技法によって決定され得る。アニールされた足場は、血液吸収動態を評価するためにヒトの血液に沈降される。例えば、ヘパリン添加血液中に沈降された足場は、その重量の１３倍のＡＣＤ血液（凝固する血液）を吸収し、同等の足場は、その７倍の重量のヘパリン添加血液を約３０分間で吸収した。好ましい移植片は、試験管内で約５〜３０分で血液中のその重量の約１〜約４倍を吸収するであろう。
【００８３】
図６Ａ〜Ｃに示すように、本発明による低負荷型溶媒系および移植片の後処理により、従来の電界紡糸溶媒であるＨＦＰから電界紡糸された同様の移植組織と比較して実質的に改善された、細胞の内部成長を促進する足場の生成が可能になる。図１７に示されるように、本発明による足場の気孔率の向上は、移植された足場の細胞浸潤を著しく改善する。細胞整列および細胞伸長もまた、実質的に改善される（図１８Ａ〜１８Ｃ）。また、以下でさらに詳しく説明するように、成長因子の初期保持は、それらが移植片上に存在する場合、または移植片に埋め込まれている場合、ヒトの腱、特にアキレス腱などに天然に提示されているものと実質的により同様である。
【００８４】
臨床使用のための生体高分子移植片
生体高分子足場のシートは、任意選択的に、溶接または縫合または縫製を通して積層されてもよい。一般に、生体高分子足場のシートは、層状に共に積み重ねられる。それらを結合させるために、約３０〜１００℃の範囲内の熱の短時間の印加が局所的に適用されてもよい。移植片材料を補強して縫合保持を助けるために、溶接部に追加の材料が任意選択的に追加されてもよい。追加的に、癒着バリアが移植片に組み込まれてもよい。そのようなバリアは、外因性細胞の浸潤を防ぐために、（例えば、生体高分子足場が取り付けられるべき腱から離れる側に面する）純粋な高分子裏材から構成され得る。癒着バリア層は、電界紡糸、キャスト、発泡、押出成形、または他の従来の技法によって生成されてもよい。
【００８５】
好ましい実施形態として、本発明は、上述のように調製され、かつ単層または多層シート様足場の形態で対象（好ましくは哺乳動物、ならびにより好ましくはウマ、イヌ、ネコおよびヒト対象）への移植のために調製される、生体高分子足場に関する。一実施形態では、この足場は、整列された生体高分子足場のおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の層から構成される。本発明の単層足場は、およそ４ｃｍ×４ｃｍ、５ｃｍ×７ｃｍ、または約１０ｃｍ×１０ｃｍ×約１ｍｍの厚さであってもよい。移植片の全体の厚さは、約０．５ｍｍ〜約６．０ｍｍ、好ましくは約０．６ｍｍ〜約３ｍｍ、より好ましくは約０．７ｍｍ〜約１．０ｍｍ、および最も好ましくは約０．８ｍｍの範囲であることになる。代替の実施形態は、おおよそ同様の寸法の多層足場である。
【００８６】
上述のように、移植片は、その外向きの表面上にランダムに配向された繊維層を有して生成されてもよい。任意選択的に、移植片はまた、縫合保持のための追加の二軸支持を提供するために、縁の周りの横断面に置かれた繊維の小さなセクションを有する。また、任意選択的に、移植片の内面または外面は、矢印または他の認識可能な形状の印を付けて、内層と外層を区別することができる。
【００８７】
外科的使用のための移植片は、任意選択的に、高いバリアの二重ホイルポーチ内に乾燥状態で包装されてもよく、また移植前に解凍されるまで凍結されてもよい。
【実施例】
【００８８】
実施例１：ＤＭＳＯ／エタノール溶媒ならびにコラーゲンおよびＰＤＬＬＡの電界紡糸繊維の調製。
２０ｍＬのシンチレーションガラスバイアル中で、４５ｍｇ／ｍＬのテロコラーゲンおよび１０５ｍｇ／ｍＬのＰＤＬＬＡを、６ｍＬの６５：３５の比率のＤＭＳＯ：ＥｔＯＨ中で、シェーカー上で２０時間溶解した。（代替的に、これらの成分を一緒に混合する前に、別々の分割量で溶解してもよい。）コラーゲンは、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（米国カリフォルニア州、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）から入手し、ＰＤＬＬＡは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（米国ペンシルベニア州、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、カタログ番号２３９７６）から入手した。バイアルは、おおよそ２０時間後、試薬が溶解されるまで、レベル７でＶＷＲ  Ｈｅａｖｙ  Ｄｕｔｙ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒ（カタログ番号９７０４３−５６２）上に定置された。溶液は、その後、１１．６５ｍｍの直径を有するプラスチックルアーが付いている６ｍＬのプラスチックシリンジ、および３．９ｃｍ、２５ゲージのステンレス鋼針から、電気モーターを使用する、互いに５ｃｍ離れた６本のスポークを有するドラム（直径１０ｃｍ×幅１５．８ｃｍ）の上へと電界紡糸された。ドラムは、電界紡糸ボックスの床から３６ｃｍ上昇され、溶液針は、ボックスの床の上方１９．５ｃｍに上昇された。
【００８９】
針の先端からドラム面までの水平距離は、１６．０２ｃｍであった。針の先端からドラムの中線までの傾斜距離は、２３ｃｍであった。ファンからの方向性のある気流が、針の先端に沿って向けられ、ドラムの方向に角度付けされる。５ｍＬの溶液が、一度に紡糸された。第１のシリンジは、０．８ｍＬ／時の流量で紡糸され、針に＋１５ｋＶが印加され、ドラムに−３ｋＶが印加された。ドラム速度は、３５０ｒｐｍであった。第１のシリンジが空になった後、このシリンジは廃棄され、溶液で満たされた５ｍＬシリンジが、ルアーに取り付けられ、紡糸が再開された。第２の５ｍＬは、０．６ｍＬ／時の流量で紡糸され、針に＋８ｋＶが印加され、ドラムに−８ｋＶが印加され、ドラム速度３５０ｒｐｍであった。合計１０ｍＬが、紡糸された。ドラムは、繊維の乾燥を容易にするために、一晩回転しているままにされた。足場は、スポークから除去され、硫酸カルシウム乾燥剤を有するデシケーターの中へと配置された。
【００９０】
実施例２：ＤＭＳＯ／ＴＨＦ溶媒ならびにコラーゲン／ＰＤＬＬＡの電界紡糸繊維の調製。
２０ｍＬのシンチレーションバイアル中で、４５ｍｇ／ｍＬのテロコラーゲンおよび１０５ｍｇ／ｍＬのＰＤＬＬＡを、７５：２５の比率の５ｍＬＤＭＳＯ：ＴＨＦ中で、シェーカー上で１６時間溶解した。コラーゲンは、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）から入手し、ＰＤＬＬＡは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（米国ペンシルベニア州Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、カタログ番号２３９７６）から入手した。バイアルは、おおよそ１６時間後、試薬が溶解されるまで、レベル７でＶＷＲ  Ｈｅａｖｙ  Ｄｕｔｙ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒ（カタログ番号９７０４３−５６２）上に定置された。溶液は、その後、１１．６５ｍｍの直径を有するプラスチックルアーが付いている６ｍＬのプラスチックシリンジ、および３．９ｃｍ、２５ゲージのステンレス鋼針から、電気モーターを使用して、電気モーターで回転され、かつ互いに５ｃｍ離れた６本のスポークを有するドラム（直径１０ｃｍ×幅１５．８ｃｍ）の上へと電界紡糸された。
【００９１】
針の先端とドラムとの間の距離は、１６ｃｍであった。流量は、０．９ｍＬ／時であり、針に＋１８ｋＶが印加された。ドラムは、接地され、１０００ｒｐｍの速度で運転された。第１のシリンジが空になった後、このシリンジは廃棄され、５ｍＬの溶液を有する６ｍＬのシリンジがルアーに取り付けられ、そして紡糸が再開された。８時間の紡糸時間は、２３．５℃の温度と５１％の相対湿度で利用された。ドラムは、繊維の乾燥を容易にするために、一晩回転しているままにされた。足場は、ドラムから取り外され、真空オーブンに加熱せずに３時間定置され、そしてその後デシケーターの中へと定置された。
【００９２】
実施例３：足場の抽出後の処置。
抽出後、足場は、真空下に定置され、残留溶媒のさらなる乾燥および除去を援助した。その後、それらは、デシケーターの内部に保管された。概して、抽出後、足場は、最長２４時間、真空下に定置され、そしてその後ホイル内に包まれるか、または保管前にペトリ皿の内部に定置された。
【００９３】
実施例４：多層コラーゲン−高分子足場の調製。
それぞれ約０．２ｍｍの厚さの２枚のシートは、はんだごてを使用して１００℃で、またはインパルスシーラーからの短い熱パルスで溶接によって積層された。直角に配向される追加の繊維は、溶接部の中へと密封され、縫合保持のための補強が提供される。当業者は、追加のシート（例えば、３、４、５、および６枚のシート）が、同様の方法で溶接によってどのように積層され得るかを理解するであろう。
【００９４】
実施例５：電界紡糸繊維の足場上のヒト腱細胞の播種。
ヒト腱細胞（５×１０４細胞／ウェル）が、無血清培地内に懸濁され、その後上記の実施例３に従って調製された足場上に播種された。培養１５、３０、および６０分後、プレートは、穏やかに振とうされ、そして付着していない細胞は、除去された。各ウェル内に懸濁している付着していない細胞の数が数えられ、そして各足場ディスク上に付着している細胞の割合が播種した細胞の総数に基づいて決定された。より好ましい細胞付着は、従来のＨＦＰ溶媒系で調製された足場と比較して、見出される。
【００９５】
実施例６：生体適合性シートの収縮および安定性分析。
テロコラーゲン／ＰＤＬＬＡ電界紡糸シート（ＤＭＳＯ：ＴＨＦのさまざまな比率、１００：０〜７５：２５ｖ／ｖで溶解された）は、約５日後に３７℃での培地内の安定性のために試験された。結果は、試験されたすべての足場内で７０％〜８０％の総面積の収縮があったことを実証した（図７Ａ）。また、これらの足場が元のサイズの９９％から１４２％まで膨潤したことも示された（図７Ｂ）。これらの足場の機械的強度は、著しく低下した。下記の表１を参照されたい。
【００９６】
以下の実施例で使用される分析方法
実施例７〜１４のコラーゲン繊維足場を試験および特徴付けするために、以下の方法が使用された。
【００９７】
機械的試験：水和された電界紡糸および空気紡糸した（直径約１．５ｃｍＸ長さ４ｃｍ）足場の材料特性は、ＭＴＳ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ、Ｍｏｄｅｌ  ４２（米国ミネソタ州Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ）を使用した単軸引張試験を通して試験された。すべての機械的試験は、室温で実施された。足場の直径および厚さは、高精度デジタルキャリパーで測定され、断面積を計算するために記録された。試料は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ニューハンプシャー州Ｈａｍｐｔｏｎ）で１時間水和され、その後ＭＴＳマシンに装填されて、各群で６つの試料（ｎ＝６）が引き出された。
【００９８】
走査型電子顕微鏡：架橋されていない空気紡糸および電界紡糸足場の構造は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって分析された。ゲニピン架橋空気紡糸足場はまた、３７℃のＤＭＥＭ内で３０日後にも緩んだまま（張力がかかっていない）で評価された。繊維形成、寸法、およびマトリックス整列は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）、米国メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）のＯｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｊ機能を用いて評価された。ＳＥＭ撮像は、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｌａｂｓ（米国バージニア州Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｎｅｗｓ）において、ＪＥＯＬ  ＪＳＭ−６０６０  ＬＶ顕微鏡（日本電子（ＪＥＯＬ）株式会社、日本、東京）を２０ｋＶのビーム強度で使用して実施された。
【００９９】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動：コラーゲン供給原料（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、空気紡糸、および電界紡糸コラーゲン移植組織（非架橋、どちらも酢酸に溶解）を比較するために、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が使用された。Ｇｒａｄｉｅｎｔゲル（３〜８％）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）は、Ｘｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲル装置上で１５０ｋＶで行われた。ゲルは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ゲル染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色され、その後脱イオン水ですすがれた。ゲルは、その後、タンパク質の結合を見るために白色光の下で画像化された。
【０１００】
フーリエ変換赤外分光法：１２３５、１５６０、および１６５０ｃｍ−１波長での特徴的な３つの主要なアミド結合によって測定される際、Ｉ型コラーゲンの存在を評価するために、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＡＴＲ、Ｂｒｕｋｅｒ、米国マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）が使用された。電界紡糸および空気紡糸足場は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＦＴＩＲバイオインフォマティクスソフトウェア（Ｏｐｅｒａｎｔ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用してピーク変位および試料純度を評価することにより、出発物質と比較された。
【０１０１】
円偏光二色性：空気紡糸足場のＣＤスペクトルを電界紡糸出発物質と比較するために、遠紫外線ＣＤ（Ｊ−８１５、ＪＡＳＣＯ）が使用された。ＣＤスペクトルは、０．１ｃｍのキュベット光路長を使用して取得された。試料は、分析のために、５０ｍＭの酢酸中に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解された。
【０１０２】
統計分析：群間の繊維整列の違いを評価するために、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続く事後的なＴｕｋｅｙの多重比較検定が使用された。群間および経時的な細胞生存率の違いを評価するために、双方向分散分析とそれに続く事後的なＴｕｋｅｙの多重比較検定が使用された。電界紡糸されたコラーゲン足場と空気紡糸されたコラーゲン足場との間の機械的強度の違いを評価するために、対応のないｔ検定が使用された。先験的に、ｐ値＜０．０５は、有意として画定された。すべての試験は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を使用して実施され、すべてのパラメーターは、平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表現される。
【０１０３】
実施例７：生体容認性高分子の固有粘度。
ＰＤＬＬＡの固有粘度（ＩＶ）は、開示された低負荷型溶媒系を使用して調製される場合、電界紡糸足場の全体的な強度と相関される。下記の表１で考察するように、比較的より高いＩＶのＰＤＬＬＡを選択すると、天然靭帯の特徴を維持しながら、構造のピーク応力および弾性率の増加につながる。
【表１】
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【０１０４】
ＤＭＳＯ：ＴＨＦの異なる比率で紡糸された足場は、著しく異なる機械的強度プロファイルを生成し、７５：２５のＤＭＳＯ：ＴＨＦの比率では、他の比率よりも著しく強力になる。表２を参照されたい。
【表２】
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【０１０５】
同様の結果は、ＤＭＳＯ：ＥｔＯＨの比率の増加でも見られ、これにより相対的なＤＭＳＯ濃度の増加は、強度の増加と相関し、約７５：２５の比率のＤＭＳＯ：ＥｔＯＨは、他の比率よりも著しく強く、１００％ＤＭＳＯは、最も強い足場を生じる。表３を参照されたい。
【表３】
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【０１０６】
実施例８：純粋なコラーゲン繊維の電界紡糸。
電界紡糸コラーゲン足場は、１０ｍ／秒の表面速度を有する高速ドラムを使用して収集され、整列された繊維が生成される。Ｉ型アテロコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）は、４０％の酢酸水溶液中に２５０ｍｇ／ｍｌで２〜４時間穏やかに揺り動かしながら溶解される。コラーゲン溶液は、シリンジポンプ（ＮＥ−４０００  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ニューヨーク州Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ）を使用して、長さ２インチの２０Ｇのブラントチップ針を通して、１時間あたり０．２〜０．５ｍＬで送液される。針の先端からコレクターまでの距離（「エアギャップ」電界紡糸のために接地ワイヤーが２５ｍｍ離間される）は、１０ｃｍであり、針は、＋１８ｋＶへと荷電される。
【０１０７】
実施例９：純粋なコラーゲン繊維の空気紡糸。
Ｉｗａｔａ重力送りエアブラシ（岩田、日本）は、空気紡糸コラーゲン繊維を生成するように改造された（図３Ａ）。６０ｐｓｉ（ポンド／平方インチ）の空気圧が使用され、粘性のあるコラーゲン溶液による詰まりを防ぐために、エアブラシの内針が溶液エミッターの端からおおよそ１ｍｍ引き出された。最大５００ｍｇ／ｍｌの臨床グレードＩ型アテロコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）は、２０〜５０体積％の４０％酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、セントルイス）水溶液中に振とうによって２〜４時間の間溶解された。溶液は、その後、空気紡糸によって繊維を形成する能力のために試験された。
【０１０８】
コラーゲン繊維は、静的グリッド（２．５ｃｍ角の一般的な５０ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管ラック）に収集するか、またはカスタム仕様の回転管の中へとスプレーして、整列された足場を収集した。カスタム設計された回転管設計では、垂直なロッドのいくつかの対が、気流が通過するファイバーを流れの方向に整列するのと同時に、通過するファイバーを捕らえるために管を通して挿入された（図３Ｃに示す）。回転コレクター管は、内径が２インチのＰＶＣ管の中心を通して配置された、２．５インチ離間した外径が２と１／１６インチの平行ステンレス鋼ロッドを有する。これらの平行なロッドは、３０度の増分で３０インチ管の長さにわたって螺旋状のパターンで配置される。ロッドは、繊維が管を通過するときに繊維を捕らえ、かつ繊維を流れの方向に整列するように作用する。平行なロッドは、管の側面から除去されることができるようにする薄いナイロン片で互いに接続されている。管は、単純なＤＣモーターおよびいくつかのアイドラーローラーを用いて毎秒１０〜２０度で回転される。エアブラシを管の入口に関しておおよそ４５℃に保ち、管を回転させると、繊維を均一に収集できる。繊維は、５分間の空気紡糸で収集され、確実に乾燥させるために、Ｂｅｌ−Ａｒｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅの再利用可能なカートリッジを含有するデシケーター内で保管した後、後続の実施例で使用される。
【０１０９】
２０〜２５重量％（例えば、４５０ｍｇ／ｍｌまたは５００ｍｇ／ｍｌのような）のＩ型アテロコラーゲンの酢酸溶液からの空気紡糸は、繊維をほとんど産しない。４５〜５０％コラーゲンの溶液は繊維を生成したが、溶液は溶解性が低く、非常に粘稠であり、空気紡糸中に不連続な繊維生成の結果をもたらした（表４）。４０％酢酸（水溶液）中の４０％コラーゲンは、コラーゲン繊維の連続スプレーを最適に生成し、５分間のスプレーによって繊維で密にコーティングされた、静的コレクター（図３Ｂ）でコラーゲンの堅牢なシートを生成することが見出され、それ故にこれらのパラメーターが実施例３〜５の後続のすべての実験に使用された。結果として得られた収集された足場は、出発物質（空気紡糸前に溶解したコラーゲンの総ミリグラム）の４５〜５０％の重量であった。空気紡糸された足場は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第６２／７０７，１５９号に説明されているように、酢酸からの電界紡糸（表５）と比較しておよそ３２倍増加した速度で収集される。空気紡糸繊維のより速い堆積速度は、より高い圧縮機圧力で達成可能であったが、収集効率は低下した。
【表４】
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【表５】
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【０１１０】
収集される繊維により高度な異方性を付与するように設計された回転管収集装置（図３Ｃ）で空気紡糸されたコラーゲン繊維（４０％酢酸（水溶液）、３００ｍｇ／ｍｌアテロコラーゲン）は、ＳＥＭ下で概して整列された繊維のアレイを示した（図８）。Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｊ（ＮＩＨシェアウェアのＩｍａｇｅＪプラグイン、米国メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）は、静的グリッド上で収集している空気紡糸コラーゲンと比較して、回転収集管での空気紡糸における繊維整列での全体的な有意な改善を定量化した（図９Ａおよび９Ｂ）。しかしながら、電界紡糸されたコラーゲン微小繊維足場は、空気紡糸された足場のものよりも著しく高い程度の整列（ｐ＜０．０５）を一貫して実証した（図９Ｃ）。酢酸から電界紡糸されたコラーゲンに関する空気紡糸の平均繊維径は、０．２２４±０．０５１μｍであったが、電界紡糸されたコラーゲンの平均繊維径は、０．２０１±０．０４７μｍであった（図９Ｄ）。繊維整列は、図９Ｅに示される。
【０１１１】
実施例１０：空気紡糸コラーゲンの安定性および機械的特性。
空気紡糸アテロコラーゲンは、水性媒体中に入れられた非架橋電界紡糸繊維の完全な溶解とは対照的に、架橋なしでは水性媒体中で安定せず、水和すると粘着性のあるゲル様のフィルムを形成する。他の方法では水和する（電界紡糸）、または水和するとゲルになる（空気紡糸）、電界紡糸および空気紡糸コラーゲンマトリックス（上記の実施例８および９）を水性媒体で使用するために安定させるために、ゲニピンが架橋剤として使用される。ゲニピンは、その確立された低毒性および臨床的に承認された医療デバイスにおける既存の使用のために選択される。
【０１１２】
Ｍｅｋｈａｉｌらによるプロトコルが、例えば、“Ｇｅｎｉｐｉｎ−ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｅｒｓ”，Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ．２０１１；２２（１７）：２２４１−５９．ｄｏｉ：１０．１１６３／０９２０５０６１０Ｘ５３８２０９に説明されるように、電界紡糸された、および空気紡糸された整列されたＩ型コラーゲンの両方の架橋に続いて行われる。９７％エタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の０．０３Ｍのゲニピン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液が、空気紡糸された足場および電界紡糸された足場を架橋するために使用された。空気紡糸された試料は、架橋のための繊維充填を改善するために、短い均等なねじれが与えられた。架橋中、試料は、３７℃にて、７日間およびインキュベーション期間中、繊維の張力を保持し、かつ収縮および折れ曲がるのを防ぐためにクランプされる。ゲニピン−エタノール浴は、移植組織が架橋溶液で覆われたままであることを確認するために毎日点検された。ゲニピン架橋された足場は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）で２０回洗浄して、残存する未反応のゲニピンを洗い流し、深い青色の足場を生成した。
【０１１３】
電界紡糸されたコラーゲン足場と比較して繊維の整列が少ないにもかかわらず（図９Ｅ）、酢酸溶媒から空気紡糸され、その後ゲニピンで架橋されたコラーゲン（ＤＭＥＭで１時間水和試験された）は、電界紡糸された足場と比較して、１．２３ＭＰａ±０．１１と著しくより強かった（図１０Ａ、Ｃ）。
【０１１４】
群間で弾性率またはひずみに有意な差はなかった（１．４５ＭＰａ±０．３４の空気紡糸コラーゲン）（図１０Ｂ、Ｄ）。ゲニピンと架橋する空気紡糸コラーゲン足場は、３７℃のＤＭＥＭ中に緩んだままで（拘束されずに）沈降されて少なくとも３０日間手付かずで保持されたものは、以前の繊維性移植組織から球状へと繊維の明らかな収縮および巻きを有して形態学的に変化した。
【０１１５】
実施例１１：電界紡糸および空気紡糸コラーゲンの化学的および構造的特徴。
コラーゲン供給原料（未処理、凍結乾燥）、電界紡糸コラーゲンおよび空気紡糸コラーゲン（上記の実施例１および２）の間のＦＴＩＲ分析は、Ｉ型コラーゲンに特徴的なカルボキシルおよび３つのアミド結合に変化はなく、一次的および二次的構造の整合性を表している。円偏光二色性分析は、空気紡糸コラーゲンが供給原料コラーゲンと比較して比較的小さい変化しか示さず、空気紡糸処理がタンパク質を変性させず、天然三重らせん構造を維持していることを示唆している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはさらに、未処理の空気紡糸および電界紡糸コラーゲン繊維内に存在するコラーゲンのアルファ、ベータおよびガンマ鎖の存在を確認した。
【０１１６】
実施例１２：電界紡糸および空気紡糸コラーゲン足場上で成長したＡＳＣの細胞生存率。
組織培養９６ウェルプレートは、細胞の細胞培養容器への付着を防止するために、２００μＬの７％ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングされた。ゲニピン架橋された空気紡糸および電界紡糸コラーゲン（上記の実施例７および８）からの直径６ミリメートルの足場ディスクは、組織生検パンチを使用して足場シートから切り出された。その後、７０％イソプロパノールに３０分間浸漬し、その後ＰＢＳ中で１０分間３回洗浄して、試料を消毒した。ウェル１つにつき１つの足場ディスクが使用された。ヒト脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）（ＺｅｎＢｉｏ、米国ノースカロライナ州Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ）は、ＤＭＥＭ中に混合され、かつ懸濁された。これらの細胞は、電界紡糸された足場と空気紡糸された足場の両方の上に５×１０４細胞／ウェルの密度で播種された。９６−ウェルプレートのコラーゲンコーティングウェル上の細胞生存率は、陽性対象として使用された。ウェルは、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（ＢｉｏＲａｄ、米国カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）生存率アッセイを使用して、１、４、および７日後に評価された。
【０１１７】
７日間の培養後、細胞播種された電界紡糸および空気紡糸の足場は、固定および染色されて、細胞形態および付着が評価された。１セットの試料（ｎ＝２）を４％パラホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ニューハンプシャー州Ｈａｍｐｔｏｎ）で固定し、そしてＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ファロイジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をそれぞれ使用して、核およびアクチンフィラメントを染色した。これらの染色した試料は、共焦点顕微鏡（ＺＥＩＳＳ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１倒立電動顕微鏡、ドイツＯｂｅｒｋｏｃｈｅｎ）を使用して画像化された。
【０１１８】
試料の第２のセット（ｎ＝２）は、２％グルタルアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ペンシルベニア州Ｈａｔｆｉｅｌｄ）で固定され、四酸化オスミウム（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ペンシルベニア州Ｈａｔｆｉｅｌｄ）で染色して、コラーゲン足場の細胞形態が画像化された。
【０１１９】
ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）アッセイが、経時的に増加する定量化された代謝活性を用いて（図１１）、酢酸を使用して空気紡糸された足場およびＤＭＳＯを使用して電界紡糸された足場で成長したＡＳＣの代謝活性を評価するために実施され、１４日間にわたる培養における細胞増殖および生存率を表した。ゲニピンで架橋された空気紡糸されたコラーゲンおよび電界紡糸されたコラーゲンで２週間成長したＡＳＣの共焦点撮像は、細胞がマトリックス全体に存在していたことを明らかにする。細胞の融合性層が、ＳＥＭによって両方の群の上部で見出され、空気紡糸コラーゲンに対する強い細胞付着および細胞適合性を集合的に表している。
【０１２０】
空気紡糸生体高分子は、培養状態において１か月の間安定していることが示されているが、それでも繊維形態および全体的な移植組織のトポグラフィーに凝縮した、またコイル状の外観への、明らかな変化を有している。これは、この明らかな繊維の収縮および巻きを駆動する架橋とともに、移植組織が張力下に保持されなかったので、経時的な材料の収縮に部分的に関連し得る。グリセルアルデヒドおよびグルタルアルデヒドなどの、他の架橋剤は、この形態の変化を提示せず、空気紡糸コラーゲンに対するゲニピン関連の影響が示唆される。材料に対する形態学的変化にもかかわらず、少なくとも２週間の培養を経ても、細胞の代謝活性および関連する細胞の生存率は、空気紡糸繊維で高かった。
【０１２１】
実施例１３：ＤＭＳＯからの空気紡糸コラーゲンおよびＰＤＬＬＡブレンド足場。
コラーゲンを生体高分子と組み合わせて、空気紡糸によってブレンドした生体材料を生成することが可能かどうかを評価するために、コラーゲンは、最適な繊維生成に対して経験的に決定されたように、３０：７０の比率でＰＤＬＬＡと共にＤＭＳＯベースの溶媒系中に溶解された。テロコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）は、ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ペンシルべニア州Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ）とともに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）またはＤＭＳＯおよび絶対エタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に１５０ｍｇ／ｍＬで溶解され、上記の実施例９に説明されているように、静的グリッド上で収集された。ＤＭＳＯからのコラーゲン単独の空気紡糸は、試験された濃度では達成されなかったが、ＰＤＬＬＡ単独およびコラーゲン：ＰＤＬＬＡブレンドは、ＤＭＳＯ単独から、およびＤＭＳＯ：エタノール共溶媒系から空気紡糸によって生成足場を形成することができた（表６）。本発明による空気紡糸繊維を調製するために、約１０：９０〜５０：５０の範囲のコラーゲン：ＰＤＬＡ比が、使用され得る。空気紡糸されたコラーゲン：ＰＤＬＬＡのＦＴＩＲ分析は、収集された足場内の両方の生体材料の存在を確認した。ここでコラーゲンをポリ−ｄ，ｌ−乳酸などの生体高分子とブレンドする能力は、本発明による空気紡糸方法のさらなる潜在的な用途を提示する。
【表６】
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【０１２２】
実施例１４：ｐＨ３バッファー中に溶解したテロコラーゲンを使用する空気紡糸繊維。
空気紡糸テレコラーゲン繊維は、以下の手順を使用して生成された。
【０１２３】
ｐＨ３バッファーの調製：
ｉ．１．２グラムの酢酸ナトリウム（最終的に２９２ｍＭ）を２２．５ｍｌの酢酸（４７％）および２７．５ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水中に溶解する。酢酸を使用してｐＨを３に調整する。
【０１２４】
エアブラッシングの２４時間前に、シンチレーションバイアル内のｐＨ３バッファー中で３００ｍｇ／ｍｌテロコラーゲン（細かく切ったもの）を１０ｍｌ調製した。室温にて１時間４００ｒｐｍで短時間ボルテックスした後、ロッカー（速度５；傾斜１０）上で一晩放置した。２４時間後、テロコラーゲン溶液は、粘稠になったが、テロコラーゲンは、完全に溶解した。
【０１２５】
空気紡糸の当日に、以下のセットアップが行われた。
ｉｉ．エアブラシは、使用前に水、酢酸、水、そしてその後エタノールを使用して洗浄された。
ｉｉｉ．エアブラシの針は、引き出され、そのためエアブラシの端に針の６ｃｍが曝露される。
ｉｖ．ドラムを中速に、かつ空気圧縮機を６０ｐｓｉに設定する。
ｖ．エアブラシは、ボックスの設置で、ドラムから２４インチ離して保持される。ボール紙の傾斜路は、液体が傾斜路上に定着するように、そしてそのために繊維が傾斜路を離れて回転ドラムに集まるように、設置された。
ｖｉ．繊維は、最初はドラムに収集されたが、その後ドラムを避けて周囲に形成され、大きな損失につながった。
ｖｉｉ．その後、圧力は、４０ｐｓｉに下げられ、ドラム速度は、より低速に変更された。
ｖｉｉｉ．繊維は、再びドラム上に形成され始めたが、ボックス内のドラムの周りに長い繊維がかなり蓄積された。
【０１２６】
およそ９ｍｌの溶液は、１．５時間でエアブラシされた。しかしながら、ボックス内の繊維を乾燥させる気流がかなりの量の繊維を吸い上げていたため、繊維の４０％以上（ドラム上の蓄積に基づく概算見積もり）は、失われた。
【０１２７】
ドラム上の繊維は、２４時間風乾され、続いて２４時間化学ドラフト内で乾燥された。
【０１２８】
繊維を画像化する際、それらは湿っているように見えたため、ドラム上にあるときに３時間真空乾燥した。
【０１２９】
実施例１５：細胞付着、増殖および浸潤。
整列された電界紡糸足場は、テロコラーゲンとＰＤＬ４５をそれぞれ３０：７０の比率でブレンドし、１００ｍｇ／ｍｌの最終濃度で１００％ＤＭＳＯ中に溶解することによって生成された。この高分子ブレンドは、垂直電界紡糸セットアップでワイヤーホイールコレクターの上へと電界紡糸された。
【０１３０】
１セットの足場は、アルミニウムフレーム内に拘束され、６５℃で１８時間アニールされて、繊維整列をさらに促進し、そして機械的安定性を向上させた。すべての足場は、細胞実験の前に、１０×３０ｍｍのストリップへと切断され、かつ電子ビーム（Ｅビーム）滅菌された。
【０１３１】
ヒト腱細胞付着を評価するために、紡糸されたまま、またはアニールされた足場の各１セット（ｎ＝３）が把持部に定置され、静的張力下で保持されて収縮が防止され、かつさらに繊維整列が促進された（これらの足場は、「把持された」足場と呼ばれる）。把持部内のこれらの足場の利用可能な細胞播種面積は、１０×１０ｍｍである。紡糸されたまま、またはアニールされた足場の各第２のセット（ｎ＝３）は、把持された足場の利用可能な播種領域に一致するように、１０×１０ｍｍの小片へと切断された。これらの試料は、張力のない超低細胞結合培養プレートに定置された（これらの足場は「緩んだ」足場と呼ばれる）。ヒト腱細胞は、無血清培地中に懸濁され、１×１０５細胞／足場の密度で播種され、３０および６０分間培養が維持された。コラーゲンでコーティングされたウェルへの細胞付着は、陽性対照として使用された。各時点で足場は、ウェルから除去され、別個に媒体含有しているウェル内に浸漬して４回洗浄され、付着していない細胞が除去された。各ウェル内に懸濁された非付着細胞の数が数えられ、そして各足場上の付着細胞の割合が、播種された細胞の総数に基づいて決定された。
【０１３２】
ヒト腱細胞の増殖を評価するために、紡糸されたまま、およびアニールされた把持された足場の各１セット（ｎ＝６）、ならびに紡糸された、およびアニールされた緩んだ足場の各１セット（ｎ＝３）は、２５×１０３細胞／足場で播種された。細胞増殖は、培養１、７および１４日後に評価された。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）代謝活性アッセイは、意図される細胞型とデバイスの互換性を試験するための標準的な方法である。健康でかつ代謝活性のある細胞は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅからのレサズリンを代謝する。レサズリン（青色）の代謝は、レゾルフィン（赤色）に還元され、細胞培地での代謝活性の経時的な蛍光モニタリングが可能になる。代謝物および副産物の両方は、無毒である。ａｌａｍａｒＢｌｕｅの蛍光レベルは、生細胞の代謝活性を測定するため、生存細胞の数に正比例する。
【０１３３】
細胞浸潤は、１４日間にわたる時間枠で評価された。紡糸されたまま、およびアニールされた把持された足場の各１セット（ｎ＝３）、ならびに紡糸されたまま、およびアニールされた緩んだ足場の各１セット（ｎ＝３）は、１×１０５細胞／足場で播種された。細胞浸潤は、培養１、７および１４日後に評価された。細胞は、ＤＡＰＩ核染色で染色され、細胞浸潤は共焦点顕微鏡によって測定された。各足場ごとに５つの視野が、調査された。各視野で、厚さ５μｍの複数のｚ走査スライスが、キャプチャされ、キャプチャされるセルを含有するスライスの数に基づいて、細胞浸潤の合計深度が計算された。合計深度は、５つの視野間で平均化された。
【０１３４】
統計：すべてのパラメーターは、平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）として表現された。細胞付着、増殖、および浸潤の違いを評価するために、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続く事後のＴｕｋｅｙの多重比較検定が使用された。先験的に、０．０５未満のｐ値は、有意として画定された。
【０１３５】
アニールされ、かつ紡糸されたままの足場（把持され、緩んだ）は、これらの足場が細胞付着を支持する能力を評価するために、ヒト腱細胞で播種された。培養３０および６０分後、すべての足場は、それぞれ５０％および９０％を超える細胞付着が示された。６０分後に試験されたすべての状態間で細胞付着に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。追加的に、ヒト腱細胞の増殖は、培養の１、７、および１４日後に、把持された、および緩んだ、アニールされた、および紡糸されたままの足場で評価された。試験されたすべての足場は、細胞生存率および増殖を裏付けた。培養７および１４日後、すべての足場上に著しくより多数の代謝活性細胞が存在することが示された（ｐ＜０．０５）。緩んだ足場内の細胞の数がより少ないのは、細胞播種中に足場から少量の細胞懸濁液がこぼれたこと、および主に足場の収縮の結果として利用可能な成長領域が減少したことに起因する。
【０１３６】
細胞浸潤の評価は、１４日間の期間にわたって有意な細胞浸潤を促進する足場はなかったことを決定した。しかしながら、培養７日後、紡糸されたままの把持された足場は、緩んだ紡糸されたままの足場と比較して著しくより深い細胞浸潤を示した（ｐ＜０．０５）。追加的に、培養１４日後、把持されたアニールされた足場は、緩んだ紡糸されままの足場よりも著しくより深い細胞浸潤を裏づけた（ｐ＜０．０５）。
【０１３７】
実施例１６：培養におけるテロコラーゲン−ＰＤＬ４５足場の物理的特性。
アニールされ、かつ紡糸されたままのテロコラーゲン−ＰＤＬ４５電界紡糸足場は、上述のように生成され、かつ把持される。図１２は、アニールまたは拘束されていない生体高分子シートの収縮を示す。培養１４日後、アニールされた、および紡糸されたままの（把持された、および緩んだ）足場は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を通して画像化された（図１３）。繊維整列および繊維直径は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／で入手可能）を使用して測定された。これらの測定値は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に３０分間浸漬した後、０日目に繊維整列および緩んだ足場の直径と比較された（図１４および１５）。繊維整列は、ＩｍａｇｅＪの「方向性」機能を使用して測定された。この関数は、繊維の方向をキャプチャし、繊維が特定の角度内に置かれた、発生回数を示すヒストグラムをプロットする。したがって、ヒストグラムがより狭く、かつより高くなるほど、特定の方向内の繊維がより多くなる。
【０１３８】
統計学：すべてのパラメーターは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表現される。繊維整列の頻度分布の違いを評価するために、対応のないノンパラメトリックなコルモゴロフ−スミルノフｔ検定が使用された。繊維径の違いを評価するために、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続く事後のＴｕｋｅｙの多重比較検定が使用された。先験的に、０．０５未満のｐ値は、有意として画定された。
【０１３９】
静的張力下でのアニーリングは、足場が収縮する傾向の結果として、さらなる繊維整列および繊維径の減少をもたらすことが示された。これらの物理的変化は、０日目のアニールされた足場と、紡糸されたままの足場との間の繊維整列および直径の有意差によって実証された（図１４および１５）。テロコラーゲン−ＰＤＬ４５足場は、３７℃にて培地中で収縮する。しかしながら、培養中の静的張力下でこれらの足場のアニーリングまたは把持を通して、足場の収縮および繊維整列の損失は、実質的に減少した。図１２に示されるように、培養１４日後、把持された足場は当初のサイズを保持するが、アニールされた緩んだ足場は、当初のサイズの約６０％のみを保持し、緩んだ紡糸されたままの足場は、それらの当初のサイズの２５％未満へと収縮することが明白である。追加的に、図１３に描画されたＳＥＭ画像は、アニールされた、および紡糸されたままの把持された足場の両方は高度に整列されたままであるが、一方でアニールされた、および紡糸されたままの緩んだ足場の両方が培養でその繊維整列を失うことを実証する。ＳＥＭ画像のＩｍａｇｅＪ繊維整列分析により、０日目のアニールされた足場が、試験された他のすべての足場よりも著しく高い繊維整列の程度を示すことが明らかになった（ｐ＜０．０５）。把持された足場が、その繊維の整列を保持し、一方で緩んだ足場内で繊維整列の損失があることが示された。紡糸されたままの緩んだ足場内の繊維整列の程度は、試験された他のすべての足場と比較して著しく減少した（ｐ＜０．０００１）。この繊維整列の損失は、緩んだ紡糸されたままの足場内で観察された収縮に起因することが明らかである。
【０１４０】
繊維径の分析は、０日目のアニールされた足場が、把持された紡糸されたままの１４日目の足場を除いて、試験された他のすべての足場よりも著しく小さい繊維径を呈したことを示唆する（ｐ＜０．０５）。この繊維径の低下は、拘束された足場が熱処理の下で収縮する傾向があることに起因する。把持された、および緩んだアニールされた足場の両方は、それらの繊維径の著しい増加によって示される繊維膨張を経験した（ｐ＜０．０００１）。紡糸されたままの０日目と比較して、把持された紡糸されたままの足場の繊維径における著しい低下は、培養中の拘束された紡糸されたままの足場がアニーリングと同じ物理的な効果を誘発し得ることを示唆している。培養１４日後では、緩んだ紡糸されたままの繊維の繊維径には著しい違いはなかった（図１５）。
【０１４１】
例１７：テロコラーゲン−ＰＤＬ４５電界紡糸された足場の細胞の形態および伸長。
アニールされた足場および紡糸されたままの足場を、上記に説明されるように調製した。把持された足場および緩んだ足場の両方に、足場あたり１×１０５個のヒト腱細胞を播種し、最長１４日間、培養を保持した。細胞形態および伸長を視覚化するために、ヒト腱細胞で培養したすべての足場を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そしてＤＡＰＩおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ファロイジンをそれぞれ使用して、核およびアクチンフィラメントを染色した。染色した試料を、共焦点顕微鏡を使用して画像化した。細胞伸長の割合を、２０個の細胞核の長さおよび幅を測定することによって、平均の計算された核アスペクト比に基づいて決定した。さらに、細胞整列の角度を、１８０°にわたる伸長の方向における２０個の細長い細胞の角度を測定することによって決定し、頻度分布を２°ごとに提示した。両方の測定を、４０倍の倍率で撮影された共焦点画像を使用して実施した。
【０１４２】
結果は、ヒト腱細胞が、緩んだ足場と比較して、把持された足場内でより高い割合の伸長を有したことを実証する。これは、把持された足場内では、その形状が保たれるので、繊維整列の程度がより高いが、一方で緩んだ足場は、収縮および膨張により繊維整列を失うためである。アクチンフィラメントの方向（赤）は、把持されたアニールされた足場および把持された紡糸されたままの足場での繊維の方向に沿った細胞伸長を実証している。緩んだ足場における細胞中のアクチンフィラメントのランダムな形態は、これらの足場内の繊維整列の損失を実証している。このランダムな形態は、図１３の例１６に示される繊維のＳＥＭ画像によって確認される。細胞の広がりおよび伸長割合を、細胞アスペクト比の測定によって評価した。アニールされた、および紡糸されたままの把持された足場の両方は、それらの緩んだ足場と比較した際、著しくより高い割合の細胞伸長を裏づけた（ｐ＜０．０００１およびｐ＜０．０１）。さらに、細胞の方向性の頻度分布は、把持された足場内の細胞の整列の程度がより高いことを明らかにした。
【０１４３】
例１８：熱処理されたテルロコラーゲン（Ｔｅｌｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ）−ＰＤＬ４５電界紡糸された足場の評価。
電界紡糸された繊維の安定性および構造を強化するための熱の適用は次のとおりである。
１．１００ｍｇ／ｍｌの１００％ＤＭＳＯ中にテロコラーゲン−ＰＤＬ４５（３０：７０）を溶解することによって、整列した電界紡糸された供給原料のシートを生成した。
２．足場を以下によって後処理した。
ａ．６５℃にて１８時間のアニーリング
ｂ．６５℃にて真空下で１８時間のアニーリング
ｃ．８５℃にて３０％のひずみまで引張
３．足場を以下について評価した。
ａ．電界紡糸された足場に対する温度および真空の影響
ｂ．ＸＲＤ、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、ＤＳＣ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＳＥＭ、および一軸引張試験を使用した熱処理の結果としての生化学的および機械的特性の変化。
【０１４４】
統計学：すべてのパラメーターは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表現される。対応のないノンパラメトリックコルモゴロフ−スミルノフｔ検定を使用して、繊維整列の頻度分布の違いを評価した。通常の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて事後のＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、ピーク応力、弾性率、破断時のひずみ％、およびピーク負荷の違いを評価した。先験的に、ｐ値＜０．０５を有意と定義した。
【０１４５】
紡糸されたままの足場および熱処理した足場の機械的特性を評価して、繊維に対する温度および真空の影響を評価した。機械的試験は、すべての処理が紡糸されたままの対照群と比較して、足場のピーク応力を著しく増加させたことを表す（ｐ＜０．０５）。処理された群の中でも、８５℃で引っ張られた足場は、６５℃でアニールされた足場よりも著しくより高いピーク応力を示した（ｐ＜０．０５）。熱処理された群は、紡糸されたままの対照群よりも著しく高い弾性率を呈したが、しかしながら８５℃で引っ張られた足場は、両方のアニールされた群より低い弾性率を呈した（ｐ＜０．０１）。ピーク応力および弾性率は熱処理による影響を受けたが、それらのピーク負荷には有意な違いは観察されなかった。どちらのアニーリング条件も、破断時のひずみを有意に改善した（ｐ＜０．０５）。真空を用いずに６５℃でアニールされた足場は、最高の破断時のひずみ％を呈した（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、熱処理が繊維の構造に影響を与え、ピーク応力、弾性率、および破断時のひずみ％の増加を促進することを表す。これは、繊維および分子整列の程度の変化によるものである可能性がある。
【０１４６】
拘束されたまたは引っ張られた足場に対する熱処理の影響を決定するために、例１６に説明されるように、ＳＥＭ画像を撮影し、ＩｍａｇｅＪの「方向性」機能を使用して繊維整列を分析した。結果は、繊維整列が、８５℃で引っ張られた、または６５℃でアニールされた足場内で著しく改善したことを示している（ｐ＜０．０５）。８５℃で引っ張られた電界紡糸された足場は高い程度の繊維整列を呈するが、対応するＳＥＭ画像は、繊維の一部が破断したことを示しており、したがって、この方法は、組織再生のためには理想的ではない場合がある。
【０１４７】
さらに、ポリマーの結晶化度に対する後処理の影響を評価した。ＸＲＤを使用して、テロコラーゲンおよびＰＤＬ４５繊維の結晶化度を評価した。結果は、すべての群が同様の強度を有し、ピークが重複していることを表し、熱処理がポリマーの結晶化度に影響を与えなかったことを示している。真空下、６５℃で処理した足場は、ピーク強度がより低くなり、２θ軸の右側にわずかにシフトした。
【０１４８】
これらの足場に対する熱の効果もＦＴＩＲによって分析した。これらの結果は、アミドＩ（約１６５０ｃｍ−１）、アミドＩＩ（約１５６０ｃｍ−１）、アミドＡ（約３２８５ｃｍ−１）、およびアミドＢ（約２９１７ｃｍ−１）結合の存在によって、熱処理された群内のコラーゲンの存在を確認した。ＰＤＬ４５がこの区域内でコラーゲンと同じＦＴＩＲフィンガープリントを有するため、アミドＩＩＩ（約１２４５ｃｍ−１）結合を容易に区別することはできない。ピークが純粋なコラーゲンからわずかにシフトしているため、このピークがコラーゲンからのものか、またはＰＤＬ４５からのピークによるものかを完全に決定することはできない。コラーゲンからのアミドＩＩＩは存在するが、ピークがシフトしている場合、結合の状態が変化したことを表す。しかしながら、ＦＴＩＲは、アミドＩ、ＩＩ、Ａ、およびＢ結合の存在を示し、すべての熱処理された群内でコラーゲンの存在を確認する。
【０１４９】
アニールされた試料のコラーゲン変性を分析し、コラーゲン出発物質および紡糸されたままの対照群と比較した。ＤＳＣグラフは、コラーゲン出発物質の２つのピーク、約９０℃における幅広いピークと、約２００℃における鋭いピークと、を示している。グラフは、紡糸されたままの対照群およびアニールされた群が、コラーゲン出発物質と比較したときに、より低い温度にシフトしたことを示している。電界紡糸後にコラーゲンの熱変性温度は低下したが、ＤＳＣデータは、アニールされた試料に対するピークが約５８℃であり、一方で紡糸されたままの対照に対するピークは約５５℃であるため、アニーリングが変性温度を増加させることを示唆している。
【０１５０】
コラーゲン鎖に対する電界紡糸、熱アニーリング、および真空乾燥の影響を調査するために使用される別の方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。紡糸されたままの足場および熱処理された足場を、酢酸またはＤＭＳＯ中で溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで実行した。２３８および１１７ｋＤａで視認可能な別個のバンドは、それぞれ、電界紡糸された繊維内のアルファ鎖およびベータ鎖の存在を確認する。さらに、１１７ｋＤａを下回るスメアリングの欠如は、電界紡糸または任意の後加工処理によりコラーゲンが破断しなかったことを示している。
【０１５１】
例１９：皮下移植片細胞定量化。
異なる時点での細胞浸潤を分析するために、さまざまな溶媒から電界紡糸された足場の皮下移植片を比較した。結果は、移植後２週間および８週間の時点でのＨＦＰ足場と比較すると、ＤＭＳＯから電界紡糸された足場が著しくより大きい数の細胞を有することを表している（図１６）。
【０１５２】
例２０：残留ＤＭＳＯの決定。
ＧＣ／ＭＳを使用して、電界紡糸された足場中の残留ＤＭＳＯを決定した。２、４、６、および２４時間の間真空にされた移植組織を、真空にされなかった移植組織と比較した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ７８９０Ａ  ＧＣを使用して、試料のＧＣ／ＭＳ分析をＭａｓｓ  Ｓｐｅｃ  Ｌａｂ、米国カリフォルニア州によって実施し、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用してデータを分析した。
【０１５３】
ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）を抽出溶媒として使用して、足場からＤＭＳＯを回復した。簡潔に、約２０ｍｇの試験試料を、３ｍＬのＤＭＡＣ溶媒中に懸濁させた（抽出１）。これらを攪拌しながら６０℃で２４時間加熱した後、上澄みをＧＣ／ＭＳ分析に使用した。試料の各々に対して複製抽出物を調製（１および２とラベル付けされた複製、表７を参照）し、ならびに、複製ごとに２回の注入を行った（表７の注入１および注入２）。第２の抽出ステップ（抽出２）（同じ試料の残留物を使用）を行って、残留ＤＭＳＯの完全な回復を確認した。両方の抽出した上澄み（抽出１および抽出２）の実行時に、第１の抽出でＤＭＳＯの９５％より多くを抽出することができたことを観察した。ＤＭＡＣ中のＤＭＳＯの標準曲線を、ＤＭＳＯの最も強いイオンピークの積分面積をＤＭＳＯ濃度の関数として使用して生成した。次いで、この標準曲線を使用して、未知の試料中のＤＭＳＯの範囲を決定した。
【０１５４】
表７は、足場のＧＣ／ＭＳ研究から得た結果の概要を示す。表７のデータは、試料から抽出されたＤＭＳＯの量が、ＦＤＡのガイドラインによる５０ｍｇ／用量／日の許容可能範囲よりも著しく低い（＞１０００倍少ない）ことを明確に表している。
【表７】
2021500160.tif 000009
【０１５５】
参照文献
以下の文献を含む、本明細書において特定されるすべての書類は、それらの全体が参照により組み込まれる。
Ａｄｄａｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍａｒ  Ｄｒｕｇｓ．２０１１、９（６）：９６７−８３．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｄ９０６０９６７．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｊｕｎ  ７．
Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｒｏｍ  Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ  Ｒｈｏｐｉｌｅｍａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１７  Ｊａｎ  １９，１２（１）：ｅ０１６９７３１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１６９７３１．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１７．
Ｅｌａｍｐａｒｉｔｈｉ，Ａｎｕｒａｄｈａ，Ａｌａｎ  Ｍ．Ｐｕｎｎｏｏｓｅ，ａｎｄ  Ｓａｒａｈ  Ｋｕｒｕｖｉｌｌａ、“Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｎａｔｉｖｅ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｕｓｉｎｇ  ｂｅｎｉｇｎ  ｂｉｎａｒｙ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４４．５（２０１６）：１３１８−１３２５．
Ｈｕａｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ，”Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６３（１５）：２２２３−２２５３（２００３）．
Ｈｏｃｈｌｅｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｌｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｗｒｉｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８  Ａｐｒｉｌ  １４：ｅ１８０００５５．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍａｒｃ．２０１８０００５５．
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Ｈｒｙｎｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｍｅｌｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｗｒｉｔｔｅｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ，”Ｓｍａｌｌ．２０１８  Ａｐｒ  ３０：ｅ１８００２３２．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｍｌｌ．２０１８００２３２．
Ｊａｃｏｂ，Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｗ．，ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｈｅｒｓｃｈｌｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＤＭＳＯ，”Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ２３．１（１９８６）：１４−２７。
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Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  Ｂｅｔｔｅｒ  Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｌｏｗｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，”ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｌｏｓ．ｏｒｇ／ｐｌｏｓｏｎｅ／ａｒｔｉｃｌｅ？ｉｄ＝１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４２０７５．
Ｓｈｅｋｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ：Ａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｗｉｔｈ  Ｕｎｉｑｕｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｗｉｄｅ  Ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１１  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ３４８２６８．
Ｓｈｏｓｅｙｏｖらの“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｆｉｂｅｒｓ”と題する米国特許出願公開第２０１２／０２７３９９３号。
Ｓｉｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｓｍａｔｅｃｈｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂｏｕｔ／ｐｕｂｓ／Ｐｌａｓｍａ％２０Ｍｅｔｈｏｄｓ％２０ｆｏｒ％２０Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ％  ２０Ｒｅａｃｔｉｖｅ％２０Ｓｕｒｆａｃｅｓ％２０ｆｏｒ％２０Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ％２０Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．ｐｄｆ
Ｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ（ＰＬＡ）ｖｉａ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，”ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｅａｒｃｈｇａｔｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｆｉｌｅ／Ｚｕｒａｔｕｌ＿Ａｂｄｕｌ＿Ｈａｍｉｄ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／２７７３０６８３８＿Ｓｕｒ  ｆａｃｅ＿Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ＿ｏｆ＿Ｐｏｌｙ＿ｌａｃｔｉｃ＿ａｃｉｄ＿ＰＬＡ＿ｖｉａ＿Ａｌｋａｌｉｎｅ＿Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ＿Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ／ｌｉｎｋｓ／５５６  ６ａｆｄ４０８ａｅａｂ７７７２１ｃｂｆａ７／Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｏｆ−Ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｃ−ａｃｉｄ−ＰＬＡ−ｖｉａ−ＡｌｋａｌｉｎｅＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓ−Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ｐｄｆ
Ｚａｇｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｓ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，”Ｃｈａｐｔｅｒ  １  ｉｎ“Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ”ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈａｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＳＢＮ  ９７８−９５３−５１−２８２２−９，Ｐｒｉｎｔ  ＩＳＢＮ９７８−９５３−５１−２８２１−２，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ：Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２１，２０１６  ｕｎｄｅｒ  ＣＣ  ＢＹ  ３．０  ｌｉｃｅｎｓｅ．２６  Ｃｏｎｔｉｎｕａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ：１８２．０００１‐ＵＳ００
Ｚｈａｎｇ、Ｋｕｉｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｌｋ  ｆｉｂｒｏｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ  ９３．３（２０１０）：９７６−９８３．
Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂｏｄｙ  ｗａｌｌ  ｏｆ  ｓｅａ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｍｏｎｏｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ，”Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．２０１５  Ａｐｒ；８０（４）：Ｃ６７１−９．ｄｏｉ：１０．１１１１／１７５０−３８４１．１２８２６．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｍａｒ  ２１．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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