(57)【要約】  本発明は、第１の標的に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインと第２の標的に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインとを含む２つの融合ポリペプチドからなる新規の二重特異性抗体、及びこれらの分子を製造する方法、及びその使用方法に関する。【選択図】図１Ａ−Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの融合ポリペプチドからなり、第１の標的に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインと、第２の標的に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、
（ａ）第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分、スペーサードメイン、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分、及び第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分を含む第１の融合ポリペプチドであって、ここで、
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分が、スペーサードメインのＮ末端に、直接又は第１のペプチドリンカーを介して融合され、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分が、スペーサードメインのＣ末端に、直接又は第２のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
−  第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分が、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分のＮ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合される、
第１の融合ポリペプチド、及び
（ｂ）第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第１の部分、スペーサードメイン、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第２の部分、及び第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分を含む第２の融合ポリペプチドであって、ここで、
−  スペーサードメインがポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第１の部分が、スペーサードメインのＮ末端に、直接又は第１のペプチドリンカーを介して融合され、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第２の部分が、スペーサードメインのＣ末端に、直接又は第２のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
−  第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分が、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第１の部分のＮ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合される、
第２の融合ポリペプチド
を含み、
ここで、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分と第２の部分が、互いに結合して第２の標的に特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、ここで、第１の標的に特異的に結合することができる第１及び第２の抗原結合ドメインの第１の部分及び第２の部分が、互いに結合して環状融合ポリペプチドを形成し、かつ
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合し、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む、
二重特異性抗体。
【請求項２】
第１の融合ポリペプチドにおいて、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分が、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、ここで、第２の融合ポリペプチドにおいて、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分が、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分又は第２の部分を連結する第３のペプチドリンカーが、少なくとも１５個のアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
第１の融合ポリペプチドが、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの重鎖可変ドメインを含み、第２の融合ポリペプチドが、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの抗体軽鎖可変ドメインを含み、又はその逆である、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
第１の融合ポリペプチド及び第２の融合ポリペプチドの両方において、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分が抗体重鎖Ｆａｂ断片であり、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分が抗体軽鎖Ｆａｂ断片である、請求項１から４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
スペーサードメインが、抗体ヒンジ領域又はその断片、抗体ＣＨ２ドメイン、及び抗体ＣＨ３ドメイン又はその断片を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
スペーサードメインが、抗体ヒンジ領域又はその断片及びＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
ノブ・イントゥー・ホール法に従って、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメインがホールを含み、第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインがノブを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
ＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｅ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｆ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｇ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）
を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１６】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｅ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｆ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｇ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）
を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１７】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１８】
第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１９】
４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、請求項１から１３、又は１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２０】
４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、及び配列番号１４２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む、請求項１から１３、又は１８又は１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２１】
第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２２】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、請求項１から１３、又は２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２３】
ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び配列番号１５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、請求項１から１３、又は２１又は２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２４】
第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインであり、
（ｉ）配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、及び配列番号１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、並びに配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、及び配列番号１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）、又は
（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、及び配列番号１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、並びに配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、及び配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）
を含む、請求項１から１３、又は２１又は２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸を含むベクター又は宿主細胞。
【請求項２７】
二重特異性抗体の発現に適した条件下で、請求項２６に記載の宿主細胞を培養することを含む、二重特異性抗体を産生する方法。
【請求項２８】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体及び薬学的に許容される添加剤を含む薬学的組成物。
【請求項２９】
医薬としての使用のための、請求項１から２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
がん又は感染症の治療における使用のための、請求項１から２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激することにおける、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することにおける、
（ｉｉｉ）感染症の治療における、
（ｉｖ）がんの治療における、
（ｖ）がんの進行を遅延させることにおける、又は
（ｖｉ）がんに罹患する患者の生存期間を延長することにおける
使用のための医薬の製造における、請求項１から２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２８に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項３２】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項２８に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、がん又は感染症を有する個体を治療する方法。
【請求項３３】
追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、第１の標的に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインと第２の標的に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインとを含む２つの融合ポリペプチドからなる新規の二重特異性抗体（コントースボディ（ｃｏｎｔｏｒｓｂｏｄｙ））、及びこれらの分子を製造する方法、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９７４年にケーラーとミルシュタインが最初のモノクローナル抗体を開発して以来、多くの努力がヒトの治療に適した抗体の開発に捧げられてきた。利用できるようになった最初のモノクローナル抗体は、マウスとラットにおいて開発されていた。これらの抗体は、ヒトの治療のために使用されると、抗げっ歯類抗体に起因する望ましくない副作用を引き起こす。このような望ましくない副作用の低減又は排除に多くの努力が捧げられてきた。過去数年間、ますます多くのヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体が市場に届いている。
【０００３】
二重特異性抗体は、診断及び治療用途にますます関心が高まっている。天然の抗体は単一特異性であるが、二重特異性抗体は、同じ抗原又は異なる抗原上の２つの異なるエピトープを認識する。過去数年にわたって、多数の新しい抗体フォーマットが開発されてきた。洗練された分子設計と遺伝子工学の適用により、安定性、溶解性、及び薬物特性を付与し、かつ「開発性」という用語の下にまとめられるその他のパラメーターなど、二重特異性抗体の形成に関連する技術的な問題の多くが解決された。加えて、生成される二重特異性抗体の異なる所望の特徴（すなわち、標的生成物プロファイル）により、抗体フォーマットの多様なパネルにアクセスできるようにする必要がある。これらのフォーマットは、サイズ、それらの結合モジュールの配置、結合価、柔軟性並びにそれらの薬物動態特性において異なり得る（Brinkmann U. and Kontermann R.E., MABS 2017, 9(2), 182-212）。
【０００４】
しかしながら、すべてのニーズに対する１つの最適なフォーマットは存在せず、野生型４鎖Ｙ字型抗体フォーマットに由来する抗体フォーマットを最適化する可能性が依然としてあるようである。医薬品としての使用のために、二重特異性抗体が、再現性のある方法で、好ましくは高収率で大量に製造される必要がある。より複雑な構成（例えば、２鎖ＩｇＧとは対照的に３−４鎖）では、多くの場合、発現系のより広範な最適化を必要とする。さらに、所望されない副産物の有無は非常に重要であり得る。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要旨
本発明は、３つの抗原結合ドメインを含むが、特に２つの鎖からなる二重特異性抗体に関する。本発明の抗体は、抗原結合ドメインの空間的配向がＩｇＧフォーマットの古典的抗体とは異なる。
【０００６】
本発明は、２つの融合ポリペプチドからなり、第１の標的に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインと、第２の標的に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体を提供し、ここで、
（ａ）第１の融合ポリペプチドは、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分、スペーサードメイン、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分、及び第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分を含み、ここで、
−  スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分は、スペーサードメインのＮ末端に、直接又は第１のペプチドリンカーを介して融合され、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分は、スペーサードメインのＣ末端に、直接又は第２のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
−  第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分のＮ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
（ｂ）第２の融合ポリペプチドは、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第１の部分、スペーサードメイン、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第２の部分、及び第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分を含み、ここで、
−  スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第１の部分は、スペーサードメインのＮ末端に、直接又は第１のペプチドリンカーを介して融合され、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第２の部分は、スペーサードメインのＣ末端に、直接又は第２のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
−  第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第１の部分のＮ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
ここで、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分と第２の部分は、互いに結合して第２の標的に特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、ここで、第１の標的に特異的に結合することができる第１及び第２の抗原結合ドメインの第１の部分及び第２の部分は、互いに結合して環状融合ポリペプチドを形成し、かつ
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合し、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。
【０００７】
一態様では、本明細書で前に定義された二重特異性抗体が提供され、ここで、第１の融合ポリペプチドにおいて、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、ここで、第２の融合ポリペプチドにおいて、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合される。
【０００８】
別の態様では、本明細書で前に定義された二重特異性抗体が提供され、ここで、第１の融合ポリペプチドにおいて、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分のＮ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、ここで、第２の融合ポリペプチドにおいて、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分のＮ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合される。
【０００９】
一態様では、本明細書で前に定義された二重特異性抗体が提供され、ここで、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分又は第２の部分を連結する第３のペプチドリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸を含む。一態様では、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分を連結する第３のペプチドリンカー、及び第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分を連結する第３のペプチドリンカーは、同一である。一態様では、第３のペプチドリンカーは１５から２５個のアミノ酸を含む。一つの特定の態様では、第３のペプチドリンカーは配列番号８４のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
一態様では、本発明は、本明細書で前に定義された二重特異性抗体を提供し、ここで、第１の融合ポリペプチドは、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの重鎖可変ドメインを含み、第２の融合ポリペプチドは、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの抗体軽鎖可変ドメインを含み、又はその逆である。特定の一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分は抗体重鎖Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分は抗体軽鎖Ｆａｂ断片であり、又はその逆である。一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分と抗原結合ドメインの第２の部分は、ジスルフィド結合により互いに共有結合している。
【００１１】
したがって、一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分は抗体重鎖Ｆａｂ断片（ＶＨ−ＣＨ１）であり、抗原結合ドメインの第２の部分は抗体軽鎖Ｆａｂ断片（ＶＬ−Ｃｋａｐｐａ）である。別の一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分は抗体軽鎖Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分は抗体重鎖Ｆａｂ断片である。別の態様では、抗原結合ドメインの第１の部分はＶＨ−Ｃｋａｐｐａを含む抗体交差Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分はＶＬ−ＣＨ１を含む抗体交差Ｆａｂ断片である。さらなる態様では、抗原結合ドメインの第１の部分は、ＶＬ−ＣＨ１を含む抗体交差Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分は、ＶＨ−Ｃｋａｐｐａを含む抗体交差Ｆａｂ断片である。
【００１２】
上記のように、二重特異性抗体は、両方ともスペーサードメインを含む第１及び第２の融合ポリペプチドからなり、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合し、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。スペーサードメインは、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含む。
【００１３】
本発明の一態様では、スペーサードメインは、抗体ヒンジ領域又はその（Ｃ末端）断片及び抗体ＣＨ２ドメイン又はその（Ｎ末端）断片を含む。別の態様では、スペーサードメインは、抗体ヒンジ領域又はその断片、抗体ＣＨ２ドメイン、及び抗体ＣＨ３ドメイン又はその断片を含む。さらに、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。特定の態様では、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメインはホールを含み、第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインはノブを含む。さらなる態様では、本発明は二重特異性抗体を含み、ここでスペーサードメインは、抗体ヒンジ領域又はその断片及びＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。特に、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、特にＦｃγ受容体に対するＦｃ受容体への結合を減少させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。より具体的には、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【００１４】
いくつかの態様では、第２の標的に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、腫瘍関連抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。一態様では、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。
【００１５】
いくつかの態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【００１６】
より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【００１７】
いくつかの態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＴＮＦ受容体、特に共刺激ＴＮＦ受容体に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。具体的には、共刺激ＴＮＦ受容体はＯＸ４０である。一態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、本発明の二重特異性抗体は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインを含む。
【００１８】
いくつかの態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｅ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｆ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｇ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）
を含む。
【００１９】
特に、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含む。
【００２０】
いくつかの態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）
を含む。
【００２１】
一つの特定の態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含む。
【００２２】
特に、本発明は二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｃ）配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｅ）配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｇ）配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド
を含む。
【００２３】
さらに、本発明は二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号１１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｃ）配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｄ）配列番号１２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｅ）配列番号１２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｆ）配列番号１２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、配列番号１２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖、
（ｇ）配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｈ）配列番号１３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、又は
（ｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド
を含む。
【００２４】
いくつかの態様では、共刺激ＴＮＦ受容体が４−１ＢＢである二重特異性抗体が提供される。一態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、本発明の二重特異性抗体は、４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインを含む。
【００２５】
いくつかの態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。一態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、及び配列番号１４２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【００２６】
特に、本発明は二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１４３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号１４５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１４６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド
を含む。
【００２７】
いくつかの態様では、共刺激ＴＮＦ受容体がＣＤ４０である二重特異性抗体が提供される。一態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、本発明の二重特異性抗体は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインを含む。
【００２８】
いくつかの態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む。一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び配列番号１５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む。
【００２９】
別の態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインであり、
（ｉ）配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、及び配列番号１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、並びに配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、及び配列番号１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）、又は
（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、及び配列番号１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、並びに配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、及び配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）
を含む。
【００３０】
特に、本発明は二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号１５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｃ）配列番号１５９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１６０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｄ）配列番号１６１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、
（ｅ）配列番号１６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、又は
（ｆ）配列番号１６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、及び配列番号１６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド
を含む。
【００３１】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗体をコードする単離された核酸を提供する。本発明の核酸を含む発現ベクターも提供され、さらに、本発明の単離された核酸又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。二重特異性抗体の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む、二重特異性抗体を産生する方法も含まれる。この方法は、二重特異性抗体を単離する工程も含み得る。
【００３２】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗体及び少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００３３】
本発明はまた、医薬として使用のための、本発明の二重特異性抗体、又は本発明の薬学的組成物を提供する。より詳細には、がん又は感染症の治療における使用のための本発明の二重特異性抗体も提供される。特に、がんの治療における使用のための本発明の二重特異性抗体が提供される。
【００３４】
さらなる態様では、
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激することにおける、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を支持することにおける、
（ｉｉｉ）感染症の治療における、
（ｉｖ）がんの治療における、
（ｖ）がんの進行を遅延させることにおける、
（ｖｉ）がんに罹患する患者の生存期間を延長することにおける
使用のための医薬の製造における、本発明の二重特異性抗体又は本発明の薬学的組成物の使用が提供される。
【００３５】
本発明は、本発明の二重特異性抗体又は本発明の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、がん又は感染症を有する個体を治療する方法も提供する。
【００３６】
本発明はまた、細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御又は延長するための医薬の製造における、本発明の二重特異性抗体又は本発明の薬学的組成物の使用を提供する。本発明は、本発明の二重特異性抗体又は本発明の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、がんを有する個体において細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御又は延長する方法も提供される。本発明のさまざまな態様によるいくつかの実施態様では、個体は哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、本発明のコントースボディをどのように組み立てることができるかの例を示している。図１Ａでは、コントースボディは、第１の標的に特異的に結合することができるｆａｂの第１の半分（重鎖ｆａｂ）、これがペプチドリンカー（黒線）を介してスペーサードメインに連結され、これがペプチドリンカー（黒線）を介して、第１の標的に特異的に結合することができるｆａｂの第２の半分（軽鎖ｆａｂ）に連結され、これがさらに第２の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第１の半分（ＶＨ−Ｃｋａｐｐａ）に連結されたもの（ＮからＣ）を含む第１の融合ポリペプチド、及び第１の標的に特異的に結合することができるｆａｂの第１の半分（重鎖ｆａｂ）、これがペプチドリンカー（黒線）を介してスペーサードメインに連結され、これがペプチドリンカー（黒線）を介して第１の標的に特異的に結合することができるｆａｂの第２の半分（軽鎖ｆａｂ）に連結され、これがさらに第２の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第２の半分（ＶＬ−ＣＨ１）に連結されたもの（ＮからＣ）を含む第２の融合ポリペプチドからなる。２つのスペーサードメインは互いに異なり、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。この型のコントースボディの例はＣＤ１３４−００９３である（実施例２．１を参照）。図１Ｂでは、コントースボディは、第１の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第１の半分（ＶＨ−Ｃｋａｐｐａ）、これがペプチドリンカー（黒線）を介してスペーサードメインに連結され、これがペプチドリンカー（黒線）を介して第１の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第２の半分（ＶＬ−ＣＨ１）に連結され、これがさらに第２の標的に特異的に結合することができるｆａｂの第１の半分（軽鎖ｆａｂ）に連結されたもの（ＮからＣ）を含む第１の融合ポリペプチド、及び第１の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第１の半分（ＶＨ−Ｃｋａｐｐａ）、これがペプチドリンカー（黒線）を介してスペーサードメインに連結され、これがペプチドリンカー（黒線）を介して、第１の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第２の半分（ＶＬ−ＣＨ１）に連結され、これがさらに第２の標的に特異的に結合することができるｆａｂの第２の半分（重鎖ｆａｂ）に連結されたもの（ＮからＣ）を含む第２の融合ポリペプチドからなる。２つのスペーサードメインは互いに異なり、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。この型のコントースボディの例はＣＤ１３４−００９４である（実施例２．２を参照）。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、本発明のコントースボディをどのように組み立てることができるかの例を示している。図１Ｃでは、コントースボディは、第１の標的に特異的に結合することができるｆａｂの第１の半分（ＶＬ−Ｃｋａｐｐａ）、これがペプチドリンカー（黒線）を介してスペーサードメインに連結され、これがペプチドリンカー（黒線）を介して第１の標的に特異的に結合することができるｆａｂの第２の半分（ＶＨ−ＣＨ１）に連結され、これがさらに第２の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第１の半分（ＶＨ−Ｃｋａｐｐａ）に連結されたもの（ＮからＣ）を含む第１の融合ポリペプチド、及び第１の標的に特異的に結合することができるｆａｂの第１の半分（ＶＬ−Ｃｋａｐｐａ）、これがペプチドリンカー（黒線）を介してスペーサードメインに連結され、これがペプチドリンカー（黒線）を介して、第１の標的に特異的に結合することができるｆａｂの第２の半分（ＶＨ−ＣＨ１）に連結され、これがさらに第２の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第２の半分（ＶＬ−ＣＨ１）に連結されたもの（ＮからＣ）を含む第２の融合ポリペプチドからなる。２つのスペーサードメインは互いに異なり、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。この型のコントースボディの例はＰ１ＡＥ０８２１である（実施例２．７を参照）。図１Ｄでは、コントースボディは、第２の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第１の半分（ＶＨ−Ｃｋａｐｐａ）、これがペプチドリンカー（黒線）を介して第１の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第１の半分（ＶＨ−Ｃｋａｐｐａ）に連結され、これがさらにペプチドリンカー（黒線）を介してスペーサードメインに連結され、これがペプチドリンカー（黒線）を介して第１の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第２の半分（ＶＬ−ＣＨ１）に連結されたもの（ＮからＣ）を含む第１の融合ポリペプチド、及び第２の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第１の半分（ＶＬ−ＣＨ１）、これがペプチドリンカー（黒線）を介して、第１の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第１の半分（ＶＨ−Ｃｋａｐｐａ）に連結され、これがさらにペプチドリンカー（黒線）を介してスペーサードメインに連結され、これがペプチドリンカー（黒線）を介して第１の標的に特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ  ｆａｂの第２の半分（ＶＨ−ＣＨ１）に連結されたもの（ＮからＣ）を含む第２の融合ポリペプチドからなる。２つのスペーサードメインは互いに異なり、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。この型のコントースボディの例はＰ１ＡＥ２７３５である（実施例２．１４を参照）。
【図１Ｅ−Ｆ】図１Ｅは、コントースボディＣＤ１３４−００９３（実施例２．１）の組み立てられた構造の概略図である。図１Ｆでは、コントースボディＣＤ１３４−００９４（実施例２．２）の組み立てられた構造の概略図が示される。
【図１Ｇ−Ｈ】図１Ｇは、コントースボディＰ１ＡＥ００８５及びＰ１ＡＥ００８６（実施例２．３及び２．４）の組み立てられた構造の概略図である。第２の標的（ｃｒｏｓｓ  ｆａｂ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、分子の配置を変更する長いペプチドリンカーを介して連結される。図１Ｈは、コントースボディＰ１ＡＥ００８７（実施例２．５）及びコントースボディＰ１ＡＥ０８３９（実施例２．６）の組み立てられた構造の概略図である。この場合、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインはｆａｂであり、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは両方ともｃｒｏｓｓ  ｆａｂである。
【図１Ｉ−Ｊ】図１Ｉでは、コントースボディＰ１ＡＥ０８２１（コントースボディ１１、実施例２．７）の組み立てられた構造の概略図が示される。図１Ｊは、コントースボディＰ１ＡＥ１１２２（コントースボディ１、実施例２．８）の組み立てられた構造の概略図である。
【図１Ｋ−Ｌ】図１Ｋでは、コントースボディＰ１ＡＥ１８８７（コントースボディ３、実施例２．１０）の組み立てられた構造の概略図が示される。図１Ｌでは、コントースボディＰ１ＡＥ２２５４（コントースボディ５、実施例２．１２）の組み立てられた構造の概略図が示される。ＯＸ４０のＶＬ及びＶＨにそれぞれ融合したＣＨ及びＣｋａｐｐａでは、アミノ酸変異（いわゆる荷電残基）が、ベンスジョーンズタンパク質の生成を防ぎ、さらに正しいペアリングを促進するために導入された。
【図１Ｍ−Ｎ】図１Ｍは、コントースボディＰ１ＡＥ２３４０（コントースボディ６、実施例２．１３）の組み立てられた構造の概略図である。この場合、分子は２つの融合タンパク質と１つの軽鎖で構成される。図１Ｎは、コントースボディＰ１ＡＥ２７３５（コントースボディ８、実施例２．１４）の組み立てられた構造の概略図である。
【図１Ｏ−Ｐ】図１０は、ＯＸ４０に対する二価結合及びＦＡＰに対する一価結合を有する２＋１  ＯＸ４０×ＦＡＰ二重特異性抗体（陽性対照分子）の概略図である。ＦＡＰ結合ドメインがＤＰ４７生殖系列により置換された、同じ構造を有する陰性対照分子（２＋１  ＯＸ４０ｘＤＰ４７抗体）が作成された。図１Ｐは、ＯＸ４０に対する四価結合及びＦＡＰに対する一価結合を有する４＋１  ＯＸ４０×ＦＡＰ二重特異性抗体の概略図である。これらの対照分子は、実施例２．１８においてより詳細に記載される。
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び２Ｄにおいて、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（それぞれ図２Ａ及び２Ｃ）並びに休止ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（それぞれ図２Ｂ及び２Ｄ）へのＯＸ４０ｘＦＡＰ二重特異性抗体の結合が示される。四価４＋１  ＯＸ４０ｘＦＡＰ（４Ｂ９）二重特異性抗体は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞への最も強い結合を示した。２＋１フォーマットの２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）及び２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７は中間の結合を示した。コントースボディＣＤ１３４−００９３は２＋１フォーマットよりも強い結合を示したが、コントースボディＣＤ１３４−００９４はあまり強く結合しなかった。ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合よりもはるかに強かった。陰性対照ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡは、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合しなかった。分子は、休止ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合しなかった（図２Ｂ及び２Ｄ）。
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び２Ｄにおいて、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（それぞれ図２Ａ及び２Ｃ）並びに休止ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（それぞれ図２Ｂ及び２Ｄ）へのＯＸ４０ｘＦＡＰ二重特異性抗体の結合が示される。四価４＋１  ＯＸ４０ｘＦＡＰ（４Ｂ９）二重特異性抗体は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞への最も強い結合を示した。２＋１フォーマットの２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）及び２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７は中間の結合を示した。コントースボディＣＤ１３４−００９３は２＋１フォーマットよりも強い結合を示したが、コントースボディＣＤ１３４−００９４はあまり強く結合しなかった。ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合よりもはるかに強かった。陰性対照ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡは、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合しなかった。分子は、休止ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合しなかった（図２Ｂ及び２Ｄ）。
【図２Ｅ−Ｆ】図２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、及び２Ｈは、コントースボディＰ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６、及びＰ１ＡＥ００８７で得られた結果を示す。すべての２＋１フォーマットのＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）及びＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７は、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞に対して同様に良好な結合を示したが（それぞれ図２Ｅ及び２Ｇ）、一方ＯＸ４０への結合は、コントースボディ分子、特にコントースボディＰ１ＡＥ００８７では部分的に損なわれていた。ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡは、予想どおりＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合しなかった。試験した分子のいずれについても、休止ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞（それぞれ図２Ｆ及び２Ｈ）への結合は観察されなかった。
【図２Ｇ−Ｈ】図２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、及び２Ｈは、コントースボディＰ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６、及びＰ１ＡＥ００８７で得られた結果を示す。すべての２＋１フォーマットのＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）及びＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７は、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞に対して同様に良好な結合を示したが（それぞれ図２Ｅ及び２Ｇ）、一方ＯＸ４０への結合は、コントースボディ分子、特にコントースボディＰ１ＡＥ００８７では部分的に損なわれていた。ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡは、予想どおりＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合しなかった。試験した分子のいずれについても、休止ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞（それぞれ図２Ｆ及び２Ｈ）への結合は観察されなかった。
【図３Ａ−Ｂ】ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合を図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄに示す。第１の実験では、コントースボディＣＤ１３４−００９３及びＣＤ１３４−００９４が対照分子と比較された。ＷＭ２６６−４（ＦＡＰ＋陽性）及びＡ５４９ＮＬＲ（ＦＡＰ陰性）腫瘍細胞への結合が、それぞれ図３Ａ及び３Ｂに示される。すべてのＯＸ４０ｘＦＡＰ二重特異性抗体は、ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞に効率的に結合した。四価４＋１  ＯＸ４０ｘＦＡＰ（４Ｂ９、ＦＡＰへの高親和性）二重特異性抗体が、ＦＡＰ＋細胞に最も強く結合し、それに、コントースボディＣＤ１３４−００９３、コントースボディＣＤ１３３４−００９４、及び２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）二重特異性抗体が続いた。非標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、任意のＦＡＰ＋細胞に結合しなかった。
【図３Ｃ−Ｄ】ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合を図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄに示す。第１の実験では、コントースボディＣＤ１３４−００９３及びＣＤ１３４−００９４が対照分子と比較された。図３Ｃ及び３Ｄは、コントースボディＰ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６及びＰ１ＡＥ００８７のＮＩＨ／３Ｔ３ｈｕＦＡＰクローン１９（ＦＡＰ＋）（図３Ｃ）及びＡ５４９ＮＬＲ（ＦＡＰ−）腫瘍細胞（図３Ｄ）への結合を示す。すべてのＦＡＰ標的化抗ＯＸ４０抗体は、ヒトＦＡＰ発現標的細胞に効率的に結合した。コントースボディ分子の結合は、それぞれの対照と比較してわずかに損なわれた。再び、非標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、ＦＡＰ＋細胞への結合を示さなかった。
【図４Ａ−Ｃ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ、及び４Ｆでは、異なる型の架橋によるＮＦκＢの活性化が示される。ＦＡＰ発現細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰクローン１９）を架橋剤として使用すると、ＦＡＰ標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）構築物は最強のＮＦκＢ活性化を誘導し、次にコントースボディＣＤ１３４−００９３及びＣＤ１３４−００９４が続いたが、ＣＤ１３４−００９４は、ＣＤ１３４−００９３よりもわずかに強い活性化を示した。非標的化、したがって架橋されていない２つの非標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７は、弱いＮＦκＢ活性化を誘導した（図４Ａ）。二次、抗ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｆｃγ特異的抗体を架橋剤として使用する場合、２つの２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）及びＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７は同様の挙動を示した。コントースボディＣＤ１３４−００９３及びＣＤ１３４−００９４も同様に動作したが、２＋１構築物よりも低かった（図４Ｂ）。最小のＮＦκＢ活性化は、架橋剤を使用しないことによって得られた。２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）及びＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７は、中程度のＮＦκＢ活性化を示し、次にさらに効力の弱いコントースボディＣＤ１３４−００９３及びＣＤ１３４−００９４が続いた。ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡは、ＮＦκＢ活性化を誘導しなかった（図４Ｃ）。
【図４Ｄ−Ｆ】コントースボディＰ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６、及びＰ１ＡＥ００８７が、異なる型の架橋によりＮＦκＢ活性化を誘導する能力を図４Ｄから４Ｆに示す。架橋の非存在下で、最高の抗体濃度では弱いシグナルしか検出できなかった（図４Ｄ）。３つのコントースボディ分子は、ヒトＦＡＰ発現細胞によって架橋されると、ＦＡＰ標的化２＋１フォーマットのＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）及びＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）と非常に類似したＮＦκＢ活性化を誘導した（図４Ｅ）。二次抗体架橋の存在下で、３つすべてのコントースボディ分子が、２＋１対照分子よりわずかに低いＮＦκＢ活性化を示した（図４Ｆ）。ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡは、ＮＦκＢ活性化を誘導しなかった。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ及び５Ｆでは、準最適にＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣ及び細胞表面ＦＡＰによる過架橋のＯｘ４０媒介共刺激が示される。図５Ａ及び５Ｂは、ＦＡＣＳ分析により小さな角度で散乱された光の強度として測定された、準最適なＣＤ３刺激後の、それぞれＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のサイズである、ＦＳＣ−Ａ（前方散乱（ＦＳＣ）パルスの「面積」）をそれぞれ示す。ＦＡＰ標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）は、サイズの中程度の増加を示したが、一方コントースボディＣＤ１３４−００９３はより大きな増加を示した。非標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７、コントースボディＣＤ１３４−００９４、及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞のサイズを変更しなかった。図５Ｃ及び５Ｄは、表面マーカーＣＤ２５を使用したＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の活性化を示す。ＣＤ４  Ｔ細胞（図５Ｃ）については、コントースボディＣＤ１３４−００９３及びＣＤ１３４−００９４が最も高い活性化を示し、次にどういうわけか効力の弱い標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）が続いた。非標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７及び陰性対照は、ベースライン補正後に任意の活性化を示さなかった。ＣＤ８  Ｔ細胞（図５Ｄ）では、コントースボディＣＤ１３４−００９４は、２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）及びＣＤ１３４−００９３と比較して、より強い活性化を示した。図５Ｅ及び５Ｆは、活性化時に下方制御されたＩＬ−７Ｒα（ＣＤ１２７）を示す。コントースボディＣＤ１３４−００９３は、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞に対して最も強いＣＤ１２７下方制御を示し、次に標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）及びコントースボディＣＤ１３４−００９４が続いた。
【図５Ｄ−Ｆ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ及び５Ｆでは、準最適にＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣ及び細胞表面ＦＡＰによる過架橋のＯｘ４０媒介共刺激が示される。図５Ａ及び５Ｂは、ＦＡＣＳ分析により小さな角度で散乱された光の強度として測定された、準最適なＣＤ３刺激後の、それぞれＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のサイズである、ＦＳＣ−Ａ（前方散乱（ＦＳＣ）パルスの「面積」）をそれぞれ示す。ＦＡＰ標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）は、サイズの中程度の増加を示したが、一方コントースボディＣＤ１３４−００９３はより大きな増加を示した。非標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７、コントースボディＣＤ１３４−００９４、及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞のサイズを変更しなかった。図５Ｃ及び５Ｄは、表面マーカーＣＤ２５を使用したＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の活性化を示す。ＣＤ４  Ｔ細胞（図５Ｃ）については、コントースボディＣＤ１３４−００９３及びＣＤ１３４−００９４が最も高い活性化を示し、次にどういうわけか効力の弱い標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）が続いた。非標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７及び陰性対照は、ベースライン補正後に任意の活性化を示さなかった。ＣＤ８  Ｔ細胞（図５Ｄ）では、コントースボディＣＤ１３４−００９４は、２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）及びＣＤ１３４−００９３と比較して、より強い活性化を示した。図５Ｅ及び５Ｆは、活性化時に下方制御されたＩＬ−７Ｒα（ＣＤ１２７）を示す。コントースボディＣＤ１３４−００９３は、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞に対して最も強いＣＤ１２７下方制御を示し、次に標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）及びコントースボディＣＤ１３４−００９４が続いた。
【図６】図６は、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞におけるＦＳＣ−Ａ及びＣＤ２５の正規化曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す。塗りつぶされた記号はＣＤ４  Ｔ細胞、空の記号はＣＤ８  Ｔ細胞を表す。すべての値は、コントースボディＣＤ１３４−００９３の最大ＡＵＣ値（＝１００％）に正規化された。非標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７は、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞において最小限の活性化のみを示したが、一方、ＦＡＰ標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（２８Ｈ１）は、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞におけるＦＳＣ−Ａ及びＣＤ２５に関してより高い効力（６０から１００の間の正規化値）を示したが、ＣＤ１３４−００９３と比較して効力は弱かった。コントースボディＣＤ１３４−００９４については、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のＣＤ２５  ＭＦＩ  ＡＵＣ値のみが、ＣＤ１３４−００９３と比較して同様の活性化を示した。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、及び７Ｄに、準最適にＴＣＲトリガーされたＰＢＭＣ及び細胞表面ＦＡＰによる過架橋のＯｘ４０媒介共刺激に対するコントースボディＰ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６及びＰ１ＡＥ００８７の影響を示す。図７Ａ及び７Ｂは、準最適なＣＤ３刺激後の、それぞれＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のサイズである、ＦＳＣ−Ａをそれぞれ示す。図７Ｃ及び７Ｄは、表面マーカーＣＤ２５の発現を使用した、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の活性化をそれぞれ示す。すべてのＦＡＰ標的化分子（対照及び３つすべてのコントースボディ分子）は、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方で、前方散乱面積及びＣＤ２５発現の用量依存的増加を誘導した。非標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、ベースライン補正後に任意の活性化を示さなかった。
【図７Ｃ−Ｄ】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、及び７Ｄに、準最適にＴＣＲトリガーされたＰＢＭＣ及び細胞表面ＦＡＰによる過架橋のＯｘ４０媒介共刺激に対するコントースボディＰ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６及びＰ１ＡＥ００８７の影響を示す。図７Ａ及び７Ｂは、準最適なＣＤ３刺激後の、それぞれＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のサイズである、ＦＳＣ−Ａをそれぞれ示す。図７Ｃ及び７Ｄは、表面マーカーＣＤ２５の発現を使用した、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の活性化をそれぞれ示す。すべてのＦＡＰ標的化分子（対照及び３つすべてのコントースボディ分子）は、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方で、前方散乱面積及びＣＤ２５発現の用量依存的増加を誘導した。非標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、ベースライン補正後に任意の活性化を示さなかった。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ及び８Ｄでは、異なるＯＸ４０ｘＦＡＰコントースボディの活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合が示される。非標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７を陽性対照として、ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡを陰性対照として使用した。図８Ａは、コントースボディ１（Ｐ１ＡＥ１１２２）、コントースボディ２（Ｐ１ＡＥ１９４２）、及びコントースボディ３（Ｐ１ＡＥ１８８７）の結合を示し、図８Ｂは、コントースボディ４（Ｐ１ＡＥ１８８８）、コントースボディ５（Ｐ１ＡＥ２２５４）、及びコントースボディ６（Ｐ１ＡＥ２３４０）の結合を示す。コントースボディ７（Ｐ１ＡＥ００８６）及びコントースボディ８（Ｐ１ＡＥ２７３５）の結合を図８Ｃに示し、コントースボディ９（Ｐ１ＡＥ２７４３）及びコントースボディ１０（Ｐ１ＡＥ２７６２）の結合を図８Ｄに示す。
【図８Ｃ−Ｄ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ及び８Ｄでは、異なるＯＸ４０ｘＦＡＰコントースボディの活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合が示される。非標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７を陽性対照として、ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡを陰性対照として使用した。図８Ａは、コントースボディ１（Ｐ１ＡＥ１１２２）、コントースボディ２（Ｐ１ＡＥ１９４２）、及びコントースボディ３（Ｐ１ＡＥ１８８７）の結合を示し、図８Ｂは、コントースボディ４（Ｐ１ＡＥ１８８８）、コントースボディ５（Ｐ１ＡＥ２２５４）、及びコントースボディ６（Ｐ１ＡＥ２３４０）の結合を示す。コントースボディ７（Ｐ１ＡＥ００８６）及びコントースボディ８（Ｐ１ＡＥ２７３５）の結合を図８Ｃに示し、コントースボディ９（Ｐ１ＡＥ２７４３）及びコントースボディ１０（Ｐ１ＡＥ２７６２）の結合を図８Ｄに示す。
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、及び９Ｄでは、それぞれ、試験したコントースボディのいずれも休止ＣＤ４  Ｔ細胞に結合しないことが示される。
【図９Ｃ−Ｄ】図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、及び９Ｄでは、それぞれ、試験したコントースボディのいずれも休止ＣＤ４  Ｔ細胞に結合しないことが示される。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ及び１０Ｄでは、同じＯＸ４０ｘＦＡＰコントースボディの活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合が示される。非標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７を陽性対照として、ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡを陰性対照として使用した。
【図１０Ｃ−Ｄ】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ及び１０Ｄでは、同じＯＸ４０ｘＦＡＰコントースボディの活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合が示される。非標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７を陽性対照として、ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡを陰性対照として使用した。
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、及び１１Ｄでは、それぞれ、試験したコントースボディのいずれも休止ＣＤ８  Ｔ細胞に結合しないことが示される。
【図１１Ｃ−Ｄ】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、及び１１Ｄでは、それぞれ、試験したコントースボディのいずれも休止ＣＤ８  Ｔ細胞に結合しないことが示される。
【図１２Ａ−Ｂ】活性化又は休止ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合の曲線下面積値の概要が図１２Ａに示され、活性化又は休止ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合の曲線下面積値の概要が図１２Ｂに示される。
【図１３Ａ−Ｂ】コントースボディ１から１０のヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合が、それぞれ図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、及び１３Ｄと図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、及び１４Ｄに示される。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９（ＦＡＰ＋）腫瘍細胞（ＦＡＰ＋陽性）への結合が、それぞれ図１２Ａから１２Ｄに示される。図１３Ａは、コントースボディ１（Ｐ１ＡＥ１１２２）、コントースボディ２（Ｐ１ＡＥ１９４２）、及びコントースボディ３（Ｐ１ＡＥ１８８７）の結合を示し、図１３Ｂは、コントースボディ４（Ｐ１ＡＥ１８８８）、コントースボディ５（Ｐ１ＡＥ２２５４）、及びコントースボディ６（Ｐ１ＡＥ２３４０）の結合を示す。コントースボディ７（Ｐ１ＡＥ００８６）及びコントースボディ８（Ｐ１ＡＥ２７３５）の結合が図１３Ｃに示され、コントースボディ９（Ｐ１ＡＥ２７４３）及びコントースボディ１０（Ｐ１ＡＥ２７６２）の結合が図１３Ｄに示される。すべてのＯＸ４０ｘＦＡＰ二重特異性コントースボディは、ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞に効率的に結合した。コントースボディ８（図１２Ｃ）はＦＡＰ＋細胞に最も強く結合し、続いてコントースボディ１０（図１２Ｄ）及びコントースボディ６（図１２Ｂ）が、２＋１二重特異性抗体ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）よりもはるかに強く結合した。非標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、ＦＡＰ＋細胞に結合しなかった。コントースボディ１から１０のＡ５４９ＮＬＲ（ＦＡＰ陰性）腫瘍細胞への対応する結合が、図１４Ａから１４Ｄに示される。ＦＡＰ標的化分子（コントースボディ１から１０又は２＋１二重特異性抗体ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９））は、ＦＡＰ標的細胞に結合できなかった。
【図１３Ｃ−Ｄ】コントースボディ１から１０のヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合が、それぞれ図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、及び１３Ｄと図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、及び１４Ｄに示される。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９（ＦＡＰ＋）腫瘍細胞（ＦＡＰ＋陽性）への結合が、それぞれ図１２Ａから１２Ｄに示される。図１３Ａは、コントースボディ１（Ｐ１ＡＥ１１２２）、コントースボディ２（Ｐ１ＡＥ１９４２）、及びコントースボディ３（Ｐ１ＡＥ１８８７）の結合を示し、図１３Ｂは、コントースボディ４（Ｐ１ＡＥ１８８８）、コントースボディ５（Ｐ１ＡＥ２２５４）、及びコントースボディ６（Ｐ１ＡＥ２３４０）の結合を示す。コントースボディ７（Ｐ１ＡＥ００８６）及びコントースボディ８（Ｐ１ＡＥ２７３５）の結合が図１３Ｃに示され、コントースボディ９（Ｐ１ＡＥ２７４３）及びコントースボディ１０（Ｐ１ＡＥ２７６２）の結合が図１３Ｄに示される。すべてのＯＸ４０ｘＦＡＰ二重特異性コントースボディは、ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞に効率的に結合した。コントースボディ８（図１２Ｃ）はＦＡＰ＋細胞に最も強く結合し、続いてコントースボディ１０（図１２Ｄ）及びコントースボディ６（図１２Ｂ）が、２＋１二重特異性抗体ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）よりもはるかに強く結合した。非標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、ＦＡＰ＋細胞に結合しなかった。コントースボディ１から１０のＡ５４９ＮＬＲ（ＦＡＰ陰性）腫瘍細胞への対応する結合が、図１４Ａから１４Ｄに示される。ＦＡＰ標的化分子（コントースボディ１から１０又は２＋１二重特異性抗体ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９））は、ＦＡＰ標的細胞に結合できなかった。
【図１４Ａ−Ｂ】コントースボディ１から１０のヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合が、それぞれ図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、及び１３Ｄと図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、及び１４Ｄに示される。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９（ＦＡＰ＋）腫瘍細胞（ＦＡＰ＋陽性）への結合が、それぞれ図１２Ａから１２Ｄに示される。図１３Ａは、コントースボディ１（Ｐ１ＡＥ１１２２）、コントースボディ２（Ｐ１ＡＥ１９４２）、及びコントースボディ３（Ｐ１ＡＥ１８８７）の結合を示し、図１３Ｂは、コントースボディ４（Ｐ１ＡＥ１８８８）、コントースボディ５（Ｐ１ＡＥ２２５４）、及びコントースボディ６（Ｐ１ＡＥ２３４０）の結合を示す。コントースボディ７（Ｐ１ＡＥ００８６）及びコントースボディ８（Ｐ１ＡＥ２７３５）の結合が図１３Ｃに示され、コントースボディ９（Ｐ１ＡＥ２７４３）及びコントースボディ１０（Ｐ１ＡＥ２７６２）の結合が図１３Ｄに示される。すべてのＯＸ４０ｘＦＡＰ二重特異性コントースボディは、ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞に効率的に結合した。コントースボディ８（図１２Ｃ）はＦＡＰ＋細胞に最も強く結合し、続いてコントースボディ１０（図１２Ｄ）及びコントースボディ６（図１２Ｂ）が、２＋１二重特異性抗体ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）よりもはるかに強く結合した。非標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、ＦＡＰ＋細胞に結合しなかった。コントースボディ１から１０のＡ５４９ＮＬＲ（ＦＡＰ陰性）腫瘍細胞への対応する結合が、図１４Ａから１４Ｄに示される。ＦＡＰ標的化分子（コントースボディ１から１０又は２＋１二重特異性抗体ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９））は、ＦＡＰ標的細胞に結合できなかった。
【図１４Ｃ−Ｄ】コントースボディ１から１０のヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合が、それぞれ図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、及び１３Ｄと図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、及び１４Ｄに示される。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９（ＦＡＰ＋）腫瘍細胞（ＦＡＰ＋陽性）への結合が、それぞれ図１２Ａから１２Ｄに示される。図１３Ａは、コントースボディ１（Ｐ１ＡＥ１１２２）、コントースボディ２（Ｐ１ＡＥ１９４２）、及びコントースボディ３（Ｐ１ＡＥ１８８７）の結合を示し、図１３Ｂは、コントースボディ４（Ｐ１ＡＥ１８８８）、コントースボディ５（Ｐ１ＡＥ２２５４）、及びコントースボディ６（Ｐ１ＡＥ２３４０）の結合を示す。コントースボディ７（Ｐ１ＡＥ００８６）及びコントースボディ８（Ｐ１ＡＥ２７３５）の結合が図１３Ｃに示され、コントースボディ９（Ｐ１ＡＥ２７４３）及びコントースボディ１０（Ｐ１ＡＥ２７６２）の結合が図１３Ｄに示される。すべてのＯＸ４０ｘＦＡＰ二重特異性コントースボディは、ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞に効率的に結合した。コントースボディ８（図１２Ｃ）はＦＡＰ＋細胞に最も強く結合し、続いてコントースボディ１０（図１２Ｄ）及びコントースボディ６（図１２Ｂ）が、２＋１二重特異性抗体ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）よりもはるかに強く結合した。非標的化２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、ＦＡＰ＋細胞に結合しなかった。コントースボディ１から１０のＡ５４９ＮＬＲ（ＦＡＰ陰性）腫瘍細胞への対応する結合が、図１４Ａから１４Ｄに示される。ＦＡＰ標的化分子（コントースボディ１から１０又は２＋１二重特異性抗体ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９））は、ＦＡＰ標的細胞に結合できなかった。
【図１５Ａ−Ｂ】図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、及び１５Ｄでは、架橋によるコントースボディ１から１１のＮＦκＢ活性化が示される。ＦＡＰ発現細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰクローン１９）を架橋剤として使用すると、ＮＦκＢ活性化はすべてのコントースボディについて同等であり、コントースボディ１１（Ｐ１ＡＥ０８２１）が最も効力が弱かった。非標的化、したがって架橋されていない２つの非標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７抗体（７７１８）は弱いＮＦκＢ活性化を誘導し、一方二重特異性ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）抗体（７７１９）は最も高いＮＦκＢ活性化を引き起こした。ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（８１０５）は、ＮＦκＢ活性化を誘導しなかった。
【図１５Ｃ−Ｄ】図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、及び１５Ｄでは、架橋によるコントースボディ１から１１のＮＦκＢ活性化が示される。ＦＡＰ発現細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＦＡＰクローン１９）を架橋剤として使用すると、ＮＦκＢ活性化はすべてのコントースボディについて同等であり、コントースボディ１１（Ｐ１ＡＥ０８２１）が最も効力が弱かった。非標的化、したがって架橋されていない２つの非標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７抗体（７７１８）は弱いＮＦκＢ活性化を誘導し、一方二重特異性ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）抗体（７７１９）は最も高いＮＦκＢ活性化を引き起こした。ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（８１０５）は、ＮＦκＢ活性化を誘導しなかった。
【図１６Ａ−Ｂ】ＦＡＰによる架橋なしのＮＦκＢ活性化が、図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、及び１６Ｄに示される。架橋の非存在下で、より高い抗体濃度では弱いシグナルしか検出できなかった。非標的２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７抗体（７７１８）は、中程度のＮＦκＢ活性化を示し、次にコントースボディ７が続いた（図１６Ｃ）。他のコントースボディは、マイナー又はゼロレベルを誘導した。陰性対照（８１０５）は、ＮＦκＢの活性化を誘導しなかった。
【図１６Ｃ−Ｄ】ＦＡＰによる架橋なしのＮＦκＢ活性化が、図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、及び１６Ｄに示される。架橋の非存在下で、より高い抗体濃度では弱いシグナルしか検出できなかった。非標的２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７抗体（７７１８）は、中程度のＮＦκＢ活性化を示し、次にコントースボディ７が続いた（図１６Ｃ）。他のコントースボディは、マイナー又はゼロレベルを誘導した。陰性対照（８１０５）は、ＮＦκＢの活性化を誘導しなかった。
【図１７】ＦＡＰ＋細胞との架橋あり及び架橋なしでのＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化の正規化された曲線下面積値が、図１７にまとめられる。陰性対照（８１０５）は両方の場合においてＮＦκＢ活性化を誘導しなかったが、非標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７抗体（７７１８）は両方の場合において最小限の活性化のみを示した。二重特異性ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）抗体（７７１９）はより高いレベルの活性化を示し、次にコントースボディ８、９、及び１０が続いた。コントースボディ１１（Ｐ１ＡＥ０８２１）について、より低いレベルが観察された。
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、及び１８Ｄに、準最適にＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣ及びコントースボディ７、８、９、及び１０の細胞表面ＦＡＰによる過架橋のＯＸ４０媒介共刺激が示される。図１８Ａ及び１８Ｂは、ＣＤ４  Ｔ細胞の活性化を示し、図１８Ｃ及び１８Ｄは、準最適なＣＤ３刺激後の表面マーカーＣＤ２５を使用したＣＤ８  Ｔ細胞の活性化を示す。ＣＤ４  Ｔ細胞（図１８Ａ及び１８Ｂ）について、二重特異性ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）抗体（７７１９）が最も高い活性化を示し、次に最小限に効力が弱いコントースボディ８が続いた。非標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７抗体（７７１８）及び陰性対照（８１０５）は、ベースライン補正後に任意の活性化を示さなかった。ＣＤ８  Ｔ細胞（図１８Ｃ及び１８Ｄ）について、コントースボディ７、８及び９、及び二重特異性ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）抗体（７７１９）が、コントースボディ１０と比較してより強い活性化を示した。
【図１８Ｃ−Ｄ】図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、及び１８Ｄに、準最適にＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣ及びコントースボディ７、８、９、及び１０の細胞表面ＦＡＰによる過架橋のＯＸ４０媒介共刺激が示される。図１８Ａ及び１８Ｂは、ＣＤ４  Ｔ細胞の活性化を示し、図１８Ｃ及び１８Ｄは、準最適なＣＤ３刺激後の表面マーカーＣＤ２５を使用したＣＤ８  Ｔ細胞の活性化を示す。ＣＤ４  Ｔ細胞（図１８Ａ及び１８Ｂ）について、二重特異性ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）抗体（７７１９）が最も高い活性化を示し、次に最小限に効力が弱いコントースボディ８が続いた。非標的化２＋１  ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＤＰ４７抗体（７７１８）及び陰性対照（８１０５）は、ベースライン補正後に任意の活性化を示さなかった。ＣＤ８  Ｔ細胞（図１８Ｃ及び１８Ｄ）について、コントースボディ７、８及び９、及び二重特異性ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）抗体（７７１９）が、コントースボディ１０と比較してより強い活性化を示した。
【図１９Ａ−Ｂ】図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、及び１９Ｄは、それぞれ準最適なＣＤ３刺激後のＣＤ４（図１９Ａ及び１９Ｂ）及びＣＤ８  Ｔ細胞（図１９Ｃ及び１９Ｄ）のサイズであるＦＳＣ−Ａを示す。すべてのコントースボディは、同等の中程度の増加を示した。非標的化２＋１抗ＯＸ４０分子（７７１８）及び陰性対照（８１０５）を加えても、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のサイズは変化しなかった。
【図１９Ｃ−Ｄ】図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、及び１９Ｄは、それぞれ準最適なＣＤ３刺激後のＣＤ４（図１９Ａ及び１９Ｂ）及びＣＤ８  Ｔ細胞（図１９Ｃ及び１９Ｄ）のサイズであるＦＳＣ−Ａを示す。すべてのコントースボディは、同等の中程度の増加を示した。非標的化２＋１抗ＯＸ４０分子（７７１８）及び陰性対照（８１０５）を加えても、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のサイズは変化しなかった。
【図２０Ａ−Ｂ】図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、及び２０Ｄは、それぞれ準最適なＣＤ３刺激後のＣＤ４（図２０Ａ及び２０Ｂ）及びＣＤ８  Ｔ細胞（図２０Ｃ及び２０Ｄ）の増殖であるｅＦｌｕｏｒ  ６７０値を示す。ＣＤ４亜集団では、コントースボディ８及び１０はｅＦｌｕｏｒ  ６７０値のかなりの減少を示し、より強い増殖を示している。ＣＤ８亜集団では、コントースボディ７及び９はｅＦｌｕｏｒ  ６７０値のより大きな減少を示した。非標的化２＋１抗ＯＸ４０分子（７７１８）及び陰性対照（８１０５）は、すべての亜集団においてわずかな減少のみを示した。
【図２０Ｃ−Ｄ】図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、及び２０Ｄは、それぞれ準最適なＣＤ３刺激後のＣＤ４（図２０Ａ及び２０Ｂ）及びＣＤ８  Ｔ細胞（図２０Ｃ及び２０Ｄ）の増殖であるｅＦｌｕｏｒ  ６７０値を示す。ＣＤ４亜集団では、コントースボディ８及び１０はｅＦｌｕｏｒ  ６７０値のかなりの減少を示し、より強い増殖を示している。ＣＤ８亜集団では、コントースボディ７及び９はｅＦｌｕｏｒ  ６７０値のより大きな減少を示した。非標的化２＋１抗ＯＸ４０分子（７７１８）及び陰性対照（８１０５）は、すべての亜集団においてわずかな減少のみを示した。
【図２１Ａ−Ｂ】図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ及び２１Ｄは、活性化時に下方制御されたＩＬ−７Ｒα（ＣＤ１２７）を示す。二重特異性ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）抗体（７７１９）は、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞に対して最も強い下方制御を示し、次にコントースボディ１０が続いた。ＣＤ１２７細胞のより大きな下方制御は、ＣＤ８亜集団よりもＣＤ４細胞において観察された。
【図２１Ｃ−Ｄ】図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ及び２１Ｄは、活性化時に下方制御されたＩＬ−７Ｒα（ＣＤ１２７）を示す。二重特異性ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）抗体（７７１９）は、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞に対して最も強い下方制御を示し、次にコントースボディ１０が続いた。ＣＤ１２７細胞のより大きな下方制御は、ＣＤ８亜集団よりもＣＤ４細胞において観察された。
【図２２Ａ−Ｄ】ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ２５（図２２Ａ）、ＦＳＣ−Ａ（図２２Ｂ）、ｅＦｌｕｏｒ  ６７０（図２２Ｃ）、及びＣＤ１２７（図２２Ｄ）の曲線下の正規化された面積が、図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄにまとめられる。非標的化２＋１抗ＯＸ４０分子（７７１８）は、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞において最小限の活性化のみを示したが、一方、二重特異性ＯＸ４０（４９Ｂ４）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）抗体（７７１９）は、コントースボディと比較して、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞におけるｅＦｌｕｏｒ  ６７９及びＣＤ１２７に関してより高い効力を示した。ＣＤ２５及びＦＳＣ−Ａは、ＣＤ４とＣＤ８の両方の亜集団において、７７１９分子とコントースボディの両方において同様の活性化レベルを示した。
【図２３Ａ−Ｂ】図２３Ａ及び２３Ｂは、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２におけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現活性を示す。２＋１抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘ抗ＦＡＰ（４Ｂ９）コントースボディ対２＋１抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘ抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子対対照の機能性を試験するために、分子をインキュベートした。抗原結合分子又はその対照の濃度が、インキュベーションの６時間後に測定された放出光の単位（ＲＬＵ）に対してブロットされる。すべての値は、ブランク対照（例えば、抗体が加えられていない）のベースライン値を差し引くことによってベースライン補正される。図２３Ａでは、ＦＡＰ標的非依存性４−１ＢＢ活性化が示され、それにより４−１ＢＢ結合は、レポーター細胞株において、いかなるＦＡＰ媒介架橋もなしにＮＦκＢ制御ルシフェラーゼ発現を誘導する。図２３Ｂでは、高ＦＡＰ発現細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９（ヒトＦＡＰトランスジェニックマウス線維芽細胞株）が加えられた。ＦＡＰ発現腫瘍細胞は、二重特異性４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子の架橋をもたらし、４−１ＢＢ発現レポーター細胞株においてＮＦκＢ誘導／ルシフェラーゼ活性化を誘導するその可能性を大きく増加させた。二重特異性２＋１抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘ抗ＦＡＰ（４Ｂ９）抗原結合分子（黒塗りの星と線）は、コントースボディよりもわずかに良好な活性化（低いＥＣ５０値）を示した。しかし、コントースボディによって引き起こされる活性化は、非標的化４−１ＢＢ抗体によって示される活性化よりもはるかに高かった。
【図２４Ａ−Ｂ】図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、２４Ｄ、２４Ｅ、２４Ｆ、２４Ｇ、及び２４Ｈは、２日間のインキュベーション後、ＦＡＰコーティング（図２４Ａ、２４Ｃ、２４Ｅ及び２４Ｇ）又はコーティングなし（図２４Ｂ、２４Ｄ、２４Ｆ及び２４Ｈ）のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下における、二価ヒト抗ＣＤ４０ｘＦＡＰ  コントースボディによるヒトＢ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化を示す。架橋されたＳＧＮ４０により誘導されるＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲのＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰコーティングビーズの存在下においてＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されるこれらの活性化マーカーの上方制御はわずかに低かった。ＦＡＰ（コーティングされていないビーズ）の非存在下では、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０コントースボディでは、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はＨＬＡ−ＤＲ発現の増加は観察できなかったが、一方、架橋された陽性対照抗体ＳＧＮ４０は、これらの活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されるのは、滴定コントースボディ又は対照抗体との２日間のインキュベーション後の、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＨＬＡ−ＤＲ陽性の生Ｂ細胞の割合である。ＸＬは、Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的による架橋を意味する。ｘ軸は、コントースボディ又は対照抗体の濃度を示す。
【図２４Ｃ−Ｄ】図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、２４Ｄ、２４Ｅ、２４Ｆ、２４Ｇ、及び２４Ｈは、２日間のインキュベーション後、ＦＡＰコーティング（図２４Ａ、２４Ｃ、２４Ｅ及び２４Ｇ）又はコーティングなし（図２４Ｂ、２４Ｄ、２４Ｆ及び２４Ｈ）のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下における、二価ヒト抗ＣＤ４０ｘＦＡＰ  コントースボディによるヒトＢ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化を示す。架橋されたＳＧＮ４０により誘導されるＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲのＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰコーティングビーズの存在下においてＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されるこれらの活性化マーカーの上方制御はわずかに低かった。ＦＡＰ（コーティングされていないビーズ）の非存在下では、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０コントースボディでは、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はＨＬＡ−ＤＲ発現の増加は観察できなかったが、一方、架橋された陽性対照抗体ＳＧＮ４０は、これらの活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されるのは、滴定コントースボディ又は対照抗体との２日間のインキュベーション後の、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＨＬＡ−ＤＲ陽性の生Ｂ細胞の割合である。ＸＬは、Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的による架橋を意味する。ｘ軸は、コントースボディ又は対照抗体の濃度を示す。
【図２４Ｅ−Ｆ】図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、２４Ｄ、２４Ｅ、２４Ｆ、２４Ｇ、及び２４Ｈは、２日間のインキュベーション後、ＦＡＰコーティング（図２４Ａ、２４Ｃ、２４Ｅ及び２４Ｇ）又はコーティングなし（図２４Ｂ、２４Ｄ、２４Ｆ及び２４Ｈ）のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下における、二価ヒト抗ＣＤ４０ｘＦＡＰ  コントースボディによるヒトＢ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化を示す。架橋されたＳＧＮ４０により誘導されるＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲのＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰコーティングビーズの存在下においてＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されるこれらの活性化マーカーの上方制御はわずかに低かった。ＦＡＰ（コーティングされていないビーズ）の非存在下では、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０コントースボディでは、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はＨＬＡ−ＤＲ発現の増加は観察できなかったが、一方、架橋された陽性対照抗体ＳＧＮ４０は、これらの活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されるのは、滴定コントースボディ又は対照抗体との２日間のインキュベーション後の、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＨＬＡ−ＤＲ陽性の生Ｂ細胞の割合である。ＸＬは、Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的による架橋を意味する。ｘ軸は、コントースボディ又は対照抗体の濃度を示す。
【図２４Ｇ−Ｈ】図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、２４Ｄ、２４Ｅ、２４Ｆ、２４Ｇ、及び２４Ｈは、２日間のインキュベーション後、ＦＡＰコーティング（図２４Ａ、２４Ｃ、２４Ｅ及び２４Ｇ）又はコーティングなし（図２４Ｂ、２４Ｄ、２４Ｆ及び２４Ｈ）のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の存在下における、二価ヒト抗ＣＤ４０ｘＦＡＰ  コントースボディによるヒトＢ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化を示す。架橋されたＳＧＮ４０により誘導されるＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲのＦＡＰ非依存性上方制御と比較して、ＦＡＰコーティングビーズの存在下においてＦＡＰ依存性二重特異性抗原結合分子により誘導されるこれらの活性化マーカーの上方制御はわずかに低かった。ＦＡＰ（コーティングされていないビーズ）の非存在下では、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０コントースボディでは、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はＨＬＡ−ＤＲ発現の増加は観察できなかったが、一方、架橋された陽性対照抗体ＳＧＮ４０は、これらの活性化マーカーの上方制御を誘導した。示されるのは、滴定コントースボディ又は対照抗体との２日間のインキュベーション後の、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＨＬＡ−ＤＲ陽性の生Ｂ細胞の割合である。ＸＬは、Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的による架橋を意味する。ｘ軸は、コントースボディ又は対照抗体の濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な記載
定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆もまた同様である。
【００３９】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
【００４０】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原決定基に特異的に結合する抗原結合分子の一部を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合ドメインは、抗原の一部又はすべてに特異的に結合し、相補的である抗体の領域又は断片を含む。加えて抗原結合ドメインは、本明細書でさらに定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計反復タンパク質又は設計反復ドメインに基づく結合ドメインが含まれる（例えば国際公開第２００２／０２０５６５号を参照）。特に、抗原結合ドメインは、第１の部分及び第２の部分で構成され、ここで、第１の部分は抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、第２の部分は抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、又はその逆である。
【００４１】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、さまざまな抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００４２】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる突然変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００４３】
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体とは、それぞれが同一の抗原の同一のエピトープに結合する１つ又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な少なくとも２つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。例えば、本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインと、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む。特定の一態様では、本発明の抗体は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインと、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む。別の特定の態様では、本発明の抗体は、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインと、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、本発明の抗体は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインと、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む。
【００４４】
本出願内で使用される用語「価」は、抗原結合分子における特定数の結合部位の存在を意味する。このように、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗原結合分子中、それぞれ２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在を意味する。抗原結合分子の原子価は、所定の抗原決定基の結合部位の数に関連して表される場合もある。例えば、本発明の二重特異性抗体は、第一の標的に関して二価であり、第二の標的に関して一価である。
【００４５】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然抗体」は、さまざまな構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの１つに割当てることができ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００４６】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられる。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照のこと）。抗体断片はさまざまな技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００４７】
インタクトな抗体のパパイン消化は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）をそれぞれ含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生産する。本明細書で使用される場合、したがって、用語「Ｆａｂ」とは、ＶＬ及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨ及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。本発明によれば、用語「Ｆａｂ断片」は、以下に定義される「ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」も含む。
【００４８】
「ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ断片を指す。ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる：一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。また一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含んでいる。このクロスオーバー分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００４９】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；ここで前記リンカーは、少なくとも３０のアミノ酸、好ましくは３２から５０の間のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。さらに、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさら安定化され得る。
【００５０】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；ここでＶＨ及びＶＬは、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、前記リンカーは少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。さらに、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化され得る。
【００５１】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０個から約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより連結された抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、かつ溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか、又はその逆に連結することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)に記載される。加えて、抗体断片は、ＶＨの特性、すなわちＶＬと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性、又はＶＬの特性、すなわちＶＨと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００５２】
「足場抗原結合タンパク質」は当該技術分野で公知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）が、抗原結合ドメインのための代替の足場として使用されている（例えばGebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeuticsを参照のこと）。Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) and Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）などのプロテインＡ由来分子、Ａ−ドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））；新規抗原受容体β−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ−クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ノッチンファミリー由来のタンパク質などのミクロボディ、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋  Ｔ細胞上に発現するＣＤ２８ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様のＩｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディー（Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）としても知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７（Ｂ１）号）。エビボディーは、抗体の単離された可変領域（例えば、ドメイン抗体）とほぼ同じサイズである。さらなる詳細については、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照のこと。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる円錐構造の開放端に多数のループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０−１８０アミノ酸のサイズであり、リポカリンに由来する。さらなる詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、米国特許第７２５０２９７（Ｂ１）号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照のこと。アフィボディは、抗原に結合するように操作することができる、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。そのドメインは、約５８個のアミノ酸の３つのヘリックスの束からなる。ライブラリーは表面残基の無作為化によって生成されている。さらなる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462及び欧州特許第１６４１８１８（Ａ１）号を参照のこと。アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）は、Ａ���メインスキャフォールドファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、定義されたジスルフィド結合構造をとる。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される自然変異をシャッフルすることによって生成される。さらなる詳細は、Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) 及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照のこと。トランスフェリンは単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容される表面ループにペプチド配列を挿入することによって、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリン足場の例にはトランスボディ（Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）が含まれる。さらなる詳細は、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照のこと。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリン（Ａｎｋｙｒｉｎ）に由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックスとβターンとからなる３３残基のモチーフである。それらは、各リピートの第１のαヘリックス及びβターンの残基を無作為化することによって、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。それらの結合面は、モジュールの数を増加させることによって増大させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細は、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８（Ａ１）号を参照のこと。単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科動物由来の抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ又はＶＨＨ断片）に由来した。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作することができる足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５個の反復単位の第１０ドメインの天然のアミノ酸配列の骨格からなる。ベータサンドイッチの一端にある３つのループを操作して、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識できるようにすることができる。さらなる詳細は、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８（Ｂ１）号を参照のこと。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入された拘束可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）から成るコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細は、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)を参照のこと。ミクロボディは、３〜４個のシステインブリッジを含有する、長さ２５〜５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質に由来する。微小タンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが含まれる。微小タンパク質は、その微小タンパク質の全体的な折り畳みに影響を与えることなく最大２５個のアミノ酸を含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインのさらなる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照のこと。
【００５３】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいて参照分子とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。
【００５４】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見いだすことができる。本明細書の抗原として有用なタンパク質は、他に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質、並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００５５】
用語「パラトープ」は、標的と結合部位との間の特異的結合に必要な所定の抗体分子の部分を指す。パラトープは連続的であり得、すなわち結合部位に存在する隣接アミノ酸残基により形成されるか、又は不連続であり得、すなわちアミノ酸残基の一次配列における異なる位置にあるアミノ酸残基により形成され、例えば、アミノ酸残基のＣＤＲのアミノ酸配列にあるが、結合部位が採用する三次元構造に近接しているアミノ酸残基により形成され得る。
【００５６】
「特異的結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置における解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００５７】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表される。この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と結合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比率である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比率が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当該技術分野で公知である一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００５８】
「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、１つ又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ又は複数の改変があり、そのような改変が抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす抗体を指す。
【００５９】
本明細書において使用される「腫瘍関連抗原」は、がん細胞、腫瘍間質の細胞又はＢ細胞などの腫瘍内の細胞である標的細胞の表面上に提示される抗原決定基を指す。特定の態様では、腫瘍関連抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【００６０】
用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合できる」とは、抗原結合分子がＦＡＰを標的とする診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＦＡＰに結合できる抗原結合分子を指す。抗原結合分子には、限定されないが、抗体、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、及びＶＨ及び足場抗原結合タンパク質が含まれる。一態様では、抗ＦＡＰ抗原結合分子の無関係の非ＦＡＰタンパク質への結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される場合、抗原結合分子のＦＡＰへの結合の約１０％未満である。特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施態様では、抗ＦＡＰ抗原結合分子は、異なる種に由来するＦＡＰに結合する。特に、抗ＦＡＰ抗原結合分子は、ヒト、カニクイザル及びマウスＦＡＰに結合する。
【００６１】
特に断りのない限り、プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ  ３．４．２１）としても知られている用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＦＡＰを指す。その用語は、「完全長」の未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。この用語は、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号９７）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０に及ぶ。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号９８）、又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１に及ぶ。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＦＡＰ結合分子は、国際特許出願番号ＷＯ２０１２／０２０００６Ａ２に記載されている。
【００６２】
用語  「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照のこと。単一のＶＨ又はＶＬは、抗原結合特異性を付与するのに十分である。
【００６３】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変である（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に定義されたループを形成する（「超可変ループ」）及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。本明細書において、例示的なＨＶＲは：
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。
【００６４】
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ（例えばＣＤＲ）残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
【００６５】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００６６】
本明細書において抗原結合分子（例えば抗体）の文脈で使用される用語「親和性成熟」は、参照抗原結合分子に由来し、例えば変異により、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し、抗原に対して、参照抗原結合分子より高い親和性を有する抗原結合分子を指す。親和性成熟は通常、抗原結合分子の１つ又は複数のＣＤＲにおいて１つ又は複数のアミノ酸残基の修飾を伴う。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【００６７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）において以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００６８】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００６９】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００７０】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００７１】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を生成するように定常領域が追加的に修飾されているもの又は元の抗体から変更されているものである。
【００７２】
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００７３】
用語「ＣＨ１ドメイン」は、おおよそＥＵ位置１１８からＥＵ位置２１５（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けシステム）まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一態様では、ＣＨ１ドメインは、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶ（配列番号９４）のアミノ酸配列を有する。通常、ＥＰＫＳＣのアミノ酸配列（配列番号９９）を有するセグメントが、ＣＨ１ドメインをヒンジ領域に連結するために続いている。
【００７４】
用語「ヒンジ領域」は、野生型抗体重鎖においてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインを結合する抗体重鎖ポリペプチドの部分、例えば、ＫａｂａｔのＥＵ番号システムによる約２１６から約２３０の位置、又はＫａｂａｔのＥＵ番号システムによる約２２６から約２３０の位置までを示す。他のＩｇＧサブクラスのヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基と整列させることにより決定できる。ヒンジ領域は通常、同一のアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は一般に２５個までのアミノ酸残基を含み、柔軟であり、結合した標的結合部位が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、上部、中間、下部の３つのドメインに細分化することができる（例えば、Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083を参照）。
【００７５】
一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号１００）を有し、ここでＸはＳ又はＰのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号１０１）を有し、ここでＸはＳ又はＰのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＣＰＸＣＰ（配列番号１０２）を有し、ここでＸはＳ又はＰのいずれかである。
【００７６】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異型Ｆｃ領域を含む。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃドメインは、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、又はＡｌａ２３１から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。ＩｇＧ  Ｆｃ領域はＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。
【００７７】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、ＥＵ位置約２３１のアミノ酸残基からＥＵ位置約３４０のアミノ酸残基にまで及ぶ（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けシステム）。一態様では、ＣＨ２ドメインは、ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ  ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＷＤＶＳＨＥＤＰ  ＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧ  ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ  ＲＥＥＱＥＳＴＹＲＷ  ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ  ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ  ＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥ  ＫＴＩＳＫＡＫのアミノ酸配列（配列番号９５）を有する。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接な対にならないという点でユニークである。むしろ、２つのＮ結合型分枝状糖鎖がインタクトな天然Ｆｃ領域の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入される。糖がドメイン−ドメインペアリングの代替を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化に役立つと推測することができる。Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206。一実施態様では、糖鎖はＣＨ２ドメインに結合される。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであり得る。
【００７８】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでの残基のストレッチを含み、おおよそＥＵ位置３４１からＥＵ位置４４６（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けシステム）まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一態様では、ＣＨ３ドメインは、ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ  ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＰＧ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する。本明細書のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインであり得る（例えば、１つの鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）を有するＣＨ３ドメイン及び他の鎖に導入された対応する「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン；参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５８２１３３３号を参照のこと）。そのような変異体ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載の２つの同一でない抗体重鎖のヘテロ二量化を促進するために使用され得る。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００７９】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、したがって二量体をさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。番号付けは、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991のＥＵインデックスによる。
【００８０】
「免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（抗体依存性細胞傷害など）を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない改変を有する変異体を含むように意図されている。例えば、１つ又は複数のアミノ酸を、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から、生物学的機能を実質的に失うことなく欠失させることができる。そのような変異体は、活性に対する影響が最小限であるように、当該技術分野で公知の一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)を参照のこと）。
【００８１】
用語「野生型Ｆｃドメイン」は、自然界に見られるＦｃドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を指す。野生型ヒトＦｃドメインには、天然のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然のヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然のヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域、天然のヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、及びその天然に存在する変異体が含まれる。野生型Ｆｃ領域は、配列番号１０２（ＩｇＧ１、白人アロタイプ）、配列番号１０３（ＩｇＧ１、アフリカ系アメリカ人アロタイプ）、配列番号１０４（ＩｇＧ２）、配列番号１０５（ＩｇＧ３）及び配列番号１０６（ＩｇＧ４）に示される。
【００８２】
用語「変異体（ヒト）Ｆｃドメイン」は、少なくとも１つの「アミノ酸変異」により「野生型」（ヒト）Ｆｃドメインのアミノ酸配列のものとは異なるアミノ酸配列を意味する。一態様では、変異体Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸変異、例えば、約１から約１０個のアミノ酸変異、一態様では、天然のＦｃ領域における約１から約５個のアミノ酸変異を有する。一態様では、（変異体）Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と少なくとも約９５％の相同性を有する。
【００８３】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００８４】
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞上の特殊な細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用によって媒介され得る。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介した免疫複合体の食作用による、抗体でコーティングされた病原体の除去と、対応する抗体でコーティングされた赤血球及び種々の他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えばVan de Winkel, J.G. anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524を参照のこと）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに関するそれらの特異性により定義される：ＩｇＧ抗体に関するＦｃ受容体は、ＦｃγＲと表される。Ｆｃ受容体結合は、例えば、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341；及びGessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248に記載されている。
【００８５】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する受容体（ＦｃγＲ）の架橋は、免疫複合体の除去及び抗体産生の制御のみならず、食作用、抗体依存性細胞傷害性、及び炎症メディエーターの放出を含む広範なエフェクター機能を誘発する。ヒトでは、ＦｃγＲの３つのクラスが特徴づけられており、
−ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は単量体ＩｇＧと高親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球上に発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３−Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つにおける、ＩｇＧのＦｃ領域における改変は、ＦｃγＲＩへの結合を減少させる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された位置２３３−２３６のＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を千分の一に減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624）。
−ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、中程度から低い親和性で、複合体化したＩｇＧに結合し、広く発現される。この受容体は、２つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、死滅に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）に見られ、死滅プロセスを活性化するようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球に見られる。Ｂ細胞では、さらなる免疫グロブリン産生、及び例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制するように機能するようである。マクロファージでは、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを介して媒介される食作用を阻害するように作用する。好酸球及び肥満細胞では、Ｂ型は、ＩｇＥがその別の受容体に結合することによってこれらの細胞の活性化を抑制するのに役立ち得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３−Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４の少なくとも１つに変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体について見いだされる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
−ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中程度から低い親和性でＩｇＧに結合し、２つのタイプとして存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びＴ細胞上に見いだされ、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上で高度に発現される。ＦｃγＲＩＩＡへの結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３−Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６の少なくとも１つに変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体について見いだされる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）。
【００８６】
Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＧ１上の結合部位のマッピング、上記変異部位、並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定するための方法は、Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604に記載される。
【００８７】
用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害」は、Ｆｃ受容体結合によって媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下における本明細書中に報告される抗体による標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣを媒介する初期段階を誘導する抗体の能力は、ＦｃγＲＩ及び／又はＦｃγＲＩＩＡを組換え発現する細胞又はＮＫ細胞（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）などの、Ｆｃγ受容体を発現する細胞に対するそれらの結合を測定することによって調べられる。特に、ＮＫ細胞上のＦｃγＲへの結合が測定される。
【００８８】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照）。
【００８９】
「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」又は「ＴＮＦ受容体スーパーファミリー」は、現在２７の受容体で構成されている。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーは、細胞外のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力によって特徴づけられるサイトカイン受容体のグループである。この偽反復は、受容体鎖内の高度に保存されたシステイン残基によって生成される鎖内ジスルフィドによって画定される。神経成長因子（ＮＧＦ）を除き、すべてのＴＮＦは原型のＴＮＦ−αと相同である。ＴＮＦの活性型では、ＴＮＦ受容体の大部分が原形質膜中で三量体複合体を形成する。したがって、ほとんどのＴＮＦ受容体は膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含む。これらの受容体のいくつかには、リガンド結合後にカスパーゼ相互作用タンパク質を動員して、カスパーゼ活性化の外因性経路を開始する細胞内デスドメイン（ＤＤ）も含まれる。デスドメインを欠いている他のＴＮＦスーパーファミリー受容体は、ＴＮＦ受容体関連因子に結合し、増殖又は分化を引き起こし得る細胞内シグナル伝達経路を活性化する。このような受容体はアポトーシスも開始することができるが、それは間接的なメカニズムを介して行われるものである。アポトーシスの調節に加えて、ＴＮＦスーパーファミリー受容体のいくつかは、Ｂ細胞の恒常性と活性化、ナチュラルキラー細胞の活性化、及びＴ細胞の共刺激等の免疫細胞機能の調節に関与している。いくつかの他のものは、毛包発達及び破骨細胞発達などの細胞型特異的応答を調節する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーには以下のものが含まれる：腫瘍壊死因子受容体１（１Ａ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＣＤ１２０ａ）、腫瘍壊死因子受容体２（１Ｂ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＣＤ１２０ｂ）、リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ、ＣＤ１８）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ１３４）、ＣＤ４０（Ｂｐ５０）、Ｆａｓ受容体（Ａｐｏ−１、ＣＤ９５、ＦＡＳ）、デコイ受容体３（ＴＲ６、Ｍ６８、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔｐ５５）、ＣＤ３０（Ｋｉ−１、ＴＮＦＲＳＦ８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１、Ａｐｏ−２、ＣＤ２６１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２、ＣＤ２６２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、デコイ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ３、ＣＤ２６３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、デコイ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ４、ＣＤ２６４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＲＡＮＫ（ＣＤ２６５、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ、ＴＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（Ｆｎ１４、ＣＤ２６６、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＴＡＣＩ（ＣＤ２６７、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＢＡＦＦ受容体（ＣＤ２６８、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ、ＴＲ２、ＣＤ２７０、ＴＮＦＲＳＦ１４）、神経成長因子受容体（ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ２７１、ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連（ＧＩＴＲ、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＲＯＹ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＤＲ６（ＣＤ３５８、ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＤＲ３（Ａｐｏ−３、ＴＲＡ���Ｐ、ＷＳ−１、ＴＮＦＲＳＦ２５）、及びエクトジスプラシンＡ２受容体（ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２Ｒ）。
【００９０】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのいくつかのメンバーは、Ｔ細胞応答を維持するために最初のＴ細胞活性化後に機能する。「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦファミリー受容体」という用語は、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができるＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのサブグループを指す。この用語は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＴＮＦファミリー受容体を指す。本発明の特定の実施態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＣＤ３０及びＧＩＴＲから成る群から選択され、これらはすべてＴ細胞への共刺激作用を与え得る。より詳細には、本発明の抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＯＸ４０に特異的に結合することができる部分を少なくとも含む。
【００９１】
ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーの、特定の配列におけるさらなる情報が、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）などの一般にアクセス可能なデータベースから取得できる。例えば、ヒト共刺激ＴＮＦ受容体は、以下のアミノ酸配列：ヒトＯＸ４０（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４３４８９、配列番号１０８）、ヒト４−１ＢＢ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１、配列番号１０９）、ヒトＣＤ２７（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２６８４２、配列番号１１０）、ヒトＨＶＥＭ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９２９５６、配列番号１１１）、ヒトＣＤ３０（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２８９０８、配列番号１１２）、ヒトＧＩＴＲ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５、配列番号１１３）及びヒトＣＤ４０（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２５９４２、配列番号１１５）を有する。
【００９２】
特に断らない限り、本明細書で使用される用語「ＯＸ４０」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む脊椎動物源由来の任意の天然ＯＸ４０を指す。その用語は、「完全長」で未処理のＯＸ４０、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＯＸ４０を含む。その用語はまた、ＯＸ４０の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。例示的なヒトＯＸ４０のアミノ酸配列は配列番号１０７（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４３４８９、バージョン１１２）に示され、例示的なマウスＯＸ４０のアミノ酸配列は配列番号１１３（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４７７４１、バージョン１０１）に示されている。
【００９３】
いくつかの共刺激分子の中でも、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーメンバーのＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、エフェクター及びメモリーＴ細胞の生存と恒常性において重要な役割を果たす（Croft M. et al. (2009), Immunological Reviews 229, 173-191）。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は複数の細胞型において発現し、感染、腫瘍及び自己抗原に対する免疫応答を調節し、その発現はＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、好中球の表面で実証されていて（Baumann R. et al. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 2268-2275）、さまざまな刺激シグナルに応答して厳密に誘導可能であるか又は強く上方制御されることを示している。その分子の機能活性は、すべてのＯＸ４０発現細胞型で実証されており、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＯＸ４０媒介活性の複雑な調節を示唆している。Ｔ細胞受容体誘発と組み合わさった、ＯＸ４０のその天然リガンド又はアゴニスト抗体によるＴ細胞への関与は、ＰＩ３Ｋ及びＮＦκＢシグナル伝達経路の相乗的活性化をもたらす（Song J. et al. (2008) J. Immunology 180(11), 7240-7248）。ひいては、これにより増殖が促進され、サイトカイン受容体及びサイトカイン産生が増加し、活性化Ｔ細胞の生存が向上した。エフェクターＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＯＸ４０の共刺激活性に加えて、ＯＸ４０トリガーがＴ調節細胞の発達と免疫抑制機能を阻害することが最近示された。この作用は、少なくとも部分的に、抗腫瘍又は抗微生物免疫応答に対するＯＸ４０の活性を増強する役割を果たしている可能性がある。ＯＸ４０の関与がＴ細胞集団を拡大し、サイトカイン分泌を促進し、Ｔ細胞記憶を維持し得ることから、抗体及びＯＸ４０Ｌリガンドの可溶型を含むアゴニストがさまざまな前臨床腫瘍モデルにおいて成功裡に使用されている（Weinberg et al. (2000), J. Immunol. 164 (2160-2169)）。
【００９４】
用語「抗ＯＸ４０抗体」、「抗ＯＸ４０」、「ＯＸ４０抗体」及び「ＯＸ４０に特異的に結合する抗体」は、ＯＸ４０を標的とするうえで診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性でＯＸ４０に結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗ＯＸ４０抗体の、無関係な、非ＯＸ４０タンパク質への結合の程度は、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体のＯＸ４０への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＯＸ４０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍから１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００９５】
特に断らない限り、本明細書で使用される用語「４−１ＢＢ」又は「ＣＤ１３７」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然４−１ＢＢを指す。その用語は、「完全長」で非プロセス型の４−１ＢＢ、及び細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態の４−１ＢＢを含む。その用語はまた、４−１ＢＢの天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。例示的なヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列は、配列番号１０９（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１）に示される。
【００９６】
用語「抗４−１ＢＢ抗体」、「抗４−１ＢＢ」、「４−１ＢＢ抗体」及び「４−１ＢＢに特異的に結合する抗体」は、４−１ＢＢを標的とするうえで診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性で４−１ＢＢに結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗４−１ＢＢ抗体の、無関係な、非４−１ＢＢタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体の４−１ＢＢへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、４−１ＢＢに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍから１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。特に、抗４−１ＢＢ抗体は、米国特許第７２８８６３８号に開示されているように、クローン２０Ｈ４．９である。
【００９７】
特に断らない限り、本明細書で使用される用語「ＣＤ４０」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ４０を指す。その用語は、「完全長」で非プロセス型ＣＤ４０、及び細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ４０を含む。その用語はまた、ＣＤ４０の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。例示的なヒトＣＤ４０のアミノ酸配列は、配列番号１１５（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ２５９４２、バージョン２００）に示される。ＣＤ４０抗原は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）ファミリーに属する５０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質である。（Stamenkovic et al. (1989), EMBO J. 8: 1403-10）。ＣＤ４０は、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、胸腺上皮、内皮細胞、線維芽細胞、及び平滑筋細胞を含む、多くの正常及び腫瘍細胞型で発現される。ＣＤ４０は、すべてのＢリンパ腫及びすべての固形腫瘍の７０％において発現され、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦなどの成熟シグナルにより抗原提示細胞（ＡＰＣ）において上方制御される。ＣＤ４０の活性化は、単球の機能性樹状細胞（ＤＣ）への分化も誘導し、ＡＰＣ−ＣＤ４０誘導サイトカインを介してＮＫ細胞の細胞溶解活性を高める。したがって、ＣＤ４０は、ＡＰＣの成熟、ヘルパーサイトカインの分泌、共刺激分子の上方制御及びエフェクター機能の増強を誘導することによって、免疫応答の開始及び増強における重要な役割を果たしている。
【００９８】
本明細書で使用される用語「ＣＤ４０アゴニスト」は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を刺激する任意の部分を含む。この文脈で使用されるＣＤ４０は、好ましくはヒトＣＤ４０を指し、したがってＣＤ４０アゴニストは好ましくは、ヒトＣＤ４０のアゴニストである。典型的には、この部分はアゴニストＣＤ４０抗体又は抗体断片である。
【００９９】
用語「抗ＣＤ４０抗体」、「抗ＣＤ４０」、「ＣＤ４０抗体」及び「ＣＤ４０に特異的に結合する抗体」は、ＣＤ４０を標的とするうえで診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性でＣＤ４０に結合することができる抗体を指す。一態様では、抗ＣＤ４０抗体の、無関係な、非ＣＤ４０タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体のＣＤ４０への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＣＤ４０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍから１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１００】
用語「ペプチドリンカー」は、１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当該技術分野において公知であるか、又は本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎのペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は、一般に１から１０の数、典型的には１から４の間の数、特に２であり、すなわち、ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号７７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７８）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７９）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳ（配列番号８０），（Ｇ４Ｓ）３又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ又はＧ４（ＳＧ４）２（配列番号８２）、（Ｇ４Ｓ）４又は  ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８３）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号８５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号８６）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号８７）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号８８）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号８９）、ＧＧＳＧ（配列番号９０）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号９１）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号９２）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号９３）も含む。特に目的とするペプチドリンカーは、（（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７８）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）である。
【０１０１】
本発明による「スペーサードメイン」は、折り畳み後に構造ドメインを形成するポリペプチドである。したがって、スペーサードメインは１００アミノ酸残基よりも小さくすることができるが、結合モチーフを固定するために構造的に限定される必要がある。例示的なスペーサードメインは、五量体コイルコイル、抗体ヒンジ領域又は抗体Ｆｃ領域又はその断片である。スペーサードメインは二量体化ドメインであり、すなわち、スペーサードメインは二量体化機能を提供できるアミノ酸を含む。
【０１０２】
本出願の中で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【０１０３】
「融合された」又は「連結された」とは、構成要素（例えば、抗体の重鎖及びＦａｂ断片）が、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。
【０１０４】
本明細書で使用される「融合ポリペプチド」又は「単一融合ポリペプチド」は、直接又はペプチドリンカーを介してそれぞれに融合される、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインなどの、異なる構成要素から構成される単鎖ポリペプチドを指す。「融合された」又は「連結された」とは、構成要素（例えば、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及びエクトドメイン）が、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。
【０１０５】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ．  ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムで使用するためにコンパイルする必要がある。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡとＢとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【０１０６】
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれる。抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換が含まれる。最終構築物が所望の特性、例えば抗原結合を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを最終構築物に到達させることができる。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。表Ｂの「好ましい置換」という項目で保存的置換が示されており、その後にアミノ酸側鎖の分類（１）から（６）がさらに記載されている。アミノ酸置換を目的の分子に導入することができ、その生成物を、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
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【０１０７】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０１０８】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とするであろう。
【０１０９】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的変異体を含む。一般に、さらなる研究のために選択された得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載のものなどファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して簡便に生成することができる。簡潔には、１つ又は複数のＨＶＲ残基が変異され、変異体抗原結合分子がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、そのような改変が抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ又は複数のＨＶＲ内で生じてもよい。例えば、実質的に結合親和性を低減させない保存的改変（例えば本明細書において提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいてなされ得る。突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは又はさらに、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１１０】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する本発明の二重特異性抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体には、二重特異性抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
【０１１１】
特定の実施態様では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、１つ又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に得ることができる。二重特異性抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合した糖は改変され得る。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって通常結合される分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖には、さまざまな糖、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様では、特定の改善された特性を有する変異体を作製するために、抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾が行われ得る。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠く糖鎖構造を有する本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照のこと。別の態様では、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分されたオリゴ糖を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。そのような変異体は、フコシル化が低減されている可能性があり、かつ／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有してもよく、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１１２】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のシステイン操作変異体（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）、例えば分子の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換された「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の態様において、置換残基は、分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、その反応性チオール基を使用して抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分に結合させ、イムノコンジュゲートを作成することができる。特定の態様では、以下の残基のうちのいずれかの１つ又は複数がシステインで置換される：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗原結合分子は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１１３】
特定の態様では、本明細書に提供される抗原結合分子は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量のものであってよく、分枝鎖又は非分枝鎖であってよい。抗体に付着するポリマーの数は変化してよく、１つを超えるポリマーが付着する場合、それらは同じ分子でも又は異なる分子でもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が限定条件下での治療に使用されるかどうかなどを含むが、これらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線への曝露により選択的に加熱することのできる抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、限定しないが、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質部分の近位細胞を死滅させる温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含む。
【０１１４】
別の態様では、本明細書に提供される二重特異性抗体のイムノコンジュゲートを得ることができる。「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１つ又は複数の異種分子に結合した抗体である。
【０１１５】
用語「核酸」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１１６】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、通常そのポリヌクレオチド分子を含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は染色体外に、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖型及びマイナス鎖型、及び二重鎖型を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった調節エレメントであり得るか又はそれらを含み得る。
【０１１７】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチド配列がその参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに５個までの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がその参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除され又は別のヌクレオチドで置換されても良く、又は参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％までの複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はそれらの末端位置の間の任意の場所で、参照配列中の残基の間に個別に散在して、又は参照配列内部の１つ又は複数の連続する群において散在して生じ得る。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に判定することができる。
【０１１８】
用語「発現カセット」は、標的細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え的又は合成的に生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、数ある配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１１９】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１２０】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異型子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するのに使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞等の哺乳動物の培養細胞、又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれるだけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。
【０１２１】
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１２２】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、減少させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１２３】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１２４】
用語「薬学的組成物」は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である付加的成分を含まない調製物を指す。
【０１２５】
「薬学的に許容される添加剤」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される添加剤には、限定されないが、バッファー、安定剤又は保存剤が含まれる。
【０１２６】
用語「添付文書」は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１２７】
本明細書で用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１２８】
本明細書で使用する用語「がん」は、例えば、リンパ腫、カルシノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、Ｂ細胞がん（リンパ腫）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病などの増殖性疾患を意味し、上記がんの任意の難治性のもの、又は上記がんのうちの１つ又は複数の組み合わせを含む。
【０１２９】
本発明の二重特異性抗原結合分子
本発明は、生産可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、及び低い毒性などの特に有利な特性を有する新規の二重特異性抗原結合分子を提供する。新規二重特異性抗体は、第１の標的に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインと、第２の標的に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインとを含む２つの融合ポリペプチドからなる。驚くべきことに、これらの２つの融合ポリペプチドは、３つの抗原結合ドメインが正しく組み立てられ、二重特異性結合が完全に機能するように設計されている。
【０１３０】
臨床応用に向けて開発することを目的とする分子の場合、機能的に活性な分子の凝集体を避ける必要があり、抗原結合分子を形成する異なる融合ポリペプチドのアセンブリの純度と安定性が非常に重要であることを意味する。重要なことに、本発明の二重特異性抗体において、３つすべての抗原結合ドメインは、３つの抗原結合ドメインの正しいアセンブリを可能にする方法で融合される。また、３つすべての抗原結合ドメインは、すべての抗原結合ドメインがそれぞれの標的に結合できるように配置される。本発明の新しい二重特異性抗原結合分子はさらに、２つの融合ポリペプチドのみからなり、軽鎖を含まない。したがって、重鎖と軽鎖の正しいペアリングの問題を回避することができる。重要なことは、構築物が適度に良好な力価で発現可能であり、所望の産物の良好な比率を生み出すことである。二量体化のためのスペーサードメインを含む抗体様構造は、他のタンパク質と比較して安定している；それらの発現は、異なる細胞株を使用しても非常に堅牢である。
【０１３１】
本発明の新規二重特異性抗原結合分子は、２＋１  コントースボディと呼ばれる。
【０１３２】
したがって、２＋１  コントースボディは、２つの融合ポリペプチドからなり、第１の標的に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインと、第２の標的に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体であって、ここで、
（ａ）第１の融合ポリペプチドは、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分、スペーサードメイン、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分、及び第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分を含み、ここで、
−  スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分は、スペーサードメインのＮ末端に、直接又は第１のペプチドリンカーを介して融合され、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分は、スペーサードメインのＣ末端に、直接又は第２のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
−  第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分のＮ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
（ｂ）第２の融合ポリペプチドは、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第１の部分、スペーサードメイン、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第２の部分、及び第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分を含み、ここで、
−  スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第１の部分は、スペーサードメインのＮ末端に、直接又は第１のペプチドリンカーを介して融合され、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第２の部分は、スペーサードメインのＣ末端に、直接又は第２のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
−  第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第１の部分のＮ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、
ここで、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分と第２の部分は、互いに結合して第２の標的に特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、ここで、第１の標的に特異的に結合することができる第１及び第２の抗原結合ドメインの第１の部分及び第２の部分は、互いに結合して環状融合ポリペプチドを形成し、かつ
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合し、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。
【０１３３】
一態様では、本明細書で前に定義された二重特異性抗体が提供され、ここで、第１の融合ポリペプチドにおいて、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、ここで、第２の融合ポリペプチドにおいて、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合される。
【０１３４】
別の態様では、本明細書で前に定義された二重特異性抗体が提供され、ここで、第１の融合ポリペプチドにおいて、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分のＮ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、ここで、第２の融合ポリペプチドにおいて、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分のＮ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合される。
【０１３５】
したがって、本明細書で前に定義された二重特異性抗体において、元の抗体ドメインは柔軟なペプチドリンカーによって融合されている。これらのリンカーは、コントースボディ分子内の正しいドメイン会合、並びに抗体の適切な折り畳みを可能にする。この新しいチェーントポロジーは、従来のＩｇＧ１フォーマットとは異なるＦａｂアームとＦｃ部分の空間的配置をもたらす。コントースボディは、抗原結合部位が平行に配置されているため、アゴニストメカニズムに非常に適した抗体フォーマットである。
【０１３６】
一態様では、本明細書で前に定義された二重特異性抗体が提供され、ここで、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分又は第２の部分を連結する第３のペプチドリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸を含む。一態様では、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分を連結する第３のペプチドリンカー、及び第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分を連結する第３のペプチドリンカーは、同一である。一態様では、第３のペプチドリンカーは１５から２５個のアミノ酸を含む。一つの特定の態様では、第３のペプチドリンカーは、配列番号８３又は配列番号８４のアミノ酸配列を含む。より具体的には、第３のペプチドリンカーは配列番号８４のアミノ酸配列を含む。さらなる態様では、（両方の融合ポリペプチドにおける）第３のペプチドリンカーは、配列番号８３又は配列番号８４のアミノ酸配列を含み、第１及び第２のペプチドリンカーは、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。
【０１３７】
一態様では、本発明は、本明細書で前に定義された二重特異性抗体を提供し、ここで、第１の融合ポリペプチドは、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの重鎖可変ドメインを含み、第２の融合ポリペプチドは、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの抗体軽鎖可変ドメインを含み、又はその逆である。
【０１３８】
一態様では、本発明は、本明細書で前に定義された二重特異性抗体を提供し、ここで、第１の融合ポリペプチドは、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの重鎖可変ドメインを含み、第２の融合ポリペプチドは、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの抗体軽鎖可変ドメインを含み、又はその逆である。特定の一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分は抗体重鎖Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分は抗体軽鎖Ｆａｂ断片であり、又はその逆である。一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分と抗原結合ドメインの第２の部分は、ジスルフィド結合により互いに共有結合している。
【０１３９】
別の態様では、二重特異性抗体は、２つの融合ポリペプチドからなり、第１の標的に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインと、第２の標的に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインとを含み、ここで、
（ａ）第１の融合ポリペプチドは、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分、スペーサードメイン、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分、及び第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分を含み、ここで、
−  スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分は、スペーサードメインのＮ末端に、直接又は第１のペプチドリンカーを介して融合され、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分は、スペーサードメインのＣ末端に、直接又は第２のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
−  第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第２の部分のＣ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、又は、第１の標的に特異的に結合することができる第１の抗原結合ドメインの第１の部分のＮ末端に、直接又は第３のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
（ｂ）第２の融合ポリペプチドは、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第１の部分、スペーサードメイン、第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第２の部分、及び第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分を含み、ここで、
−  スペーサードメインはポリペプチドであり、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含み、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第１の部分は、スペーサードメインのＮ末端に、直接又は第１のペプチドリンカーを介して融合され、
−  第１の標的に特異的に結合することができる第２の抗原結合ドメインの第２の部分は、スペーサードメインのＣ末端に、直接又は第２のペプチドリンカーを介して融合され、かつ
（ｃ）軽鎖は、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分を含み、
ここで、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分と第２の部分は、互いに結合して第２の標的に特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し、ここで、第１の標的に特異的に結合することができる第１及び第２の抗原結合ドメインの第１の部分及び第２の部分は、互いに結合して環状融合ポリペプチドを形成し、かつ
ここで、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合し、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。
【０１４０】
いくつかの態様では、抗原結合ドメインの第１の部分は抗体重鎖Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分は抗体軽鎖Ｆａｂ断片であり、又はその逆である。一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分と抗原結合ドメインの第２の部分は、ジスルフィド結合により互いに共有結合している。
【０１４１】
一態様では、本明細書で前に定義された二重特異性抗体が提供され、ここで、第１の融合ポリペプチド及び第２の融合ポリペプチドの両方において、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第１の部分は抗体重鎖Ｆａｂ断片であり、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの第２の部分は抗体軽鎖Ｆａｂ断片である。
【０１４２】
抗原結合ドメインがＦａｂ断片である場合、Ｆａｂは従来のＦａｂ、ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ又はＤｕｔａＦａｂであり得る。
【０１４３】
従来のＦａｂの場合、抗原結合ドメインの第１の部分は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、（完全な）第１の抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）の少なくともＮ末端断片とを含み、かつ抗原結合ドメインのそれぞれの第２の部分は、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、（完全な）抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ又はＣｋａｐｐａ）の少なくともＮ末端断片とを含む。これらのドメインの順序は、それらの会合及び（機能的な）抗原結合ドメインの形成が可能である（すなわち、防止されない）限り、どのような順序でもよい。一態様では、抗原結合ドメインの一部は、ＮからＣ末端方向にＶＨ−ＣＨ１を含み、抗原結合ドメインの他の部分は、ＮからＣ末端方向にＶＬ−ＣＬ（Ｃｋａｐｐａ）を含む。
【０１４４】
ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂの場合、抗原結合ドメインの両方の部分は、それぞれ抗体可変ドメインと、（完全な）抗体定常ドメインの少なくともＮ末端断片とを含み、これにより、可変ドメインと定常ドメインのペアは互いに自然に結合せず、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとのドメイン交差／交換によって得られる。これは、ＶＨとＶＬ、又はＣＨ１とＣＬの交換であり得る。これらのドメインの順序は、それらの会合及び（機能的な）結合部位の形成が可能である（すなわち、防止されない）限り、どのような順序でもよい。一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分は、ＮからＣ末端方向にＶＬ−ＣＨ１を含み、抗原結合ドメインの第２の部分は、ＮからＣ末端方向にＶＨ−ＣＬ（Ｃｋａｐｐａ）を含む。別の態様では、抗原結合ドメインの第１の部分は、ＮからＣ末端方向にＶＨ−ＣＬを含み、抗原結合ドメインの第２の部分は、ＮからＣ末端方向にＶＬ−ＣＨ１を含む。
【０１４５】
ＤｕｔａＦａｂの場合、抗原結合ドメインの第１の部分は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、（完全な）第１の抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）の少なくともＮ末端断片とを含み、かつ、それぞれの第２の抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、（完全な）抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の少なくともＮ末端断片とを含み、ここで、前記抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の相補的ペアにおいて２つの非重複パラトープを含み、ここで、第１のパラトープはＶＬドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３、及びＶＨドメインのＣＤＲ２からの残基を含み、第２のパラトープはＶＨドメインのＣＤＲ１及びＣＤＲ３、及びＶＬドメインのＣＤＲ２からの残基を含む。
【０１４６】
したがって、一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分は抗体重鎖Ｆａｂ断片（ＶＨ−ＣＨ１）であり、抗原結合ドメインの第２の部分は抗体軽鎖Ｆａｂ断片（ＶＬ−Ｃｋａｐｐａ）である。別の一態様では、抗原結合ドメインの第１の部分は抗体軽鎖Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分は抗体重鎖Ｆａｂ断片である。別の態様では、抗原結合ドメインの第１の部分はＶＨ−Ｃｋａｐｐａを含む抗体交差Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分はＶＬ−ＣＨ１を含む抗体交差Ｆａｂ断片である。さらなる態様では、抗原結合ドメインの第１の部分は、ＶＬ−ＣＨ１を含む抗体交差Ｆａｂ断片であり、抗原結合ドメインの第２の部分は、ＶＨ−Ｃｋａｐｐａを含む抗体交差Ｆａｂ断片である。
【０１４７】
特定の態様では、本発明は二重特異性抗体を提供し、ここで、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインはｃｒｏｓｓ−Ｆａｂであり、第１の標的に特異的に結合することができる両方の抗原結合ドメインは従来のＦａｂである。
【０１４８】
別の態様では、本発明は、二重特異性抗体を提供し、ここで、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは従来のＦａｂであり、第１の標的に特異的に結合することができる両方の抗原結合ドメインはｃｒｏｓｓ−Ｆａｂである。
【０１４９】
上記のように、二重特異性抗体は、両方ともスペーサードメインを含む第１及び第２の融合ポリペプチドからなり、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、ジスルフィド結合により互いに共有結合し、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。スペーサードメインは、少なくとも２５個のアミノ酸残基を含む。
【０１５０】
本発明の一態様では、スペーサードメインは、抗体ヒンジ領域又はその（Ｃ末端）断片及び抗体ＣＨ２ドメイン又はその（Ｎ末端）断片を含む。別の態様では、スペーサードメインは、抗体ヒンジ領域又はその断片、抗体ＣＨ２ドメイン、及び抗体ＣＨ３ドメイン又はその断片を含む。一態様では、本明細書に記載される融合ポリペプチドのスペーサードメインは、抗体Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブクラス、より具体的にはＩｇＧ１サブクラスの抗体Ｆｃドメインである。
【０１５１】
一態様では、スペーサードメインは、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、及び配列番号１０７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＦｃドメイン、又はその９５％相同性の変異体を含む。
【０１５２】
さらに、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメイン及び第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインは、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。特定の態様では、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、第１の融合ポリペプチドのスペーサードメインはホールを含み、第２の融合ポリペプチドのスペーサードメインはノブを含む。さらなる態様では、本発明は二重特異性抗体を含み、ここでスペーサードメインは、抗体ヒンジ領域又はその断片及びＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。特に、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、特にＦｃγ受容体に対するＦｃ受容体への結合を減少させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。特定の態様では、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。別の態様では、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは変異Ｐ３２９Ｇを含む。より具体的には、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１５３】
別の態様では、本明細書で報告されるＦｃドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブクラスのものであり、変異ＰＶＡ２３６、ＧＬＰＳＳ３３１、及び／又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。さらなる態様では、本明細書で報告されるＦｃドメインは、ＩｇＧ４サブクラスのものであり、変異Ｌ２３５Ｅを含む。一態様では、Ｆｃドメインは変異Ｓ２２８Ｐをさらに含む。一態様では、ＩｇＧ４サブクラスのＦｃドメインは、変異Ｐ３２９Ｇを含む。別の態様では、本明細書で報告されるＦｃドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスのものであり、変異Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３２９Ｇ（すべてＫａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１５４】
いくつかの態様では、第２の標的に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、腫瘍関連抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。一態様では、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。
【０１５５】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、（ａ）本明細書で前に定義された第１の融合ポリペプチド及び本明細書で前に定義された第２の融合ポリペプチドを含むことができ、ここで、第１及び第２の融合ポリペプチドは、第１及び第２の融合ポリペプチドの会合を促進する修飾を含む。通常、これらの修飾はＦｃドメインに導入される。２つの構造的に異なる融合ポリペプチドの組換え共発現、及びその後の二量体化は、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせをもたらすであろう。したがって、組換え産生における二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。
【０１５６】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、前記修飾は特にＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０１５７】
特定の態様では、前記修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含む。したがって、特定の態様では、本発明は、ＩｇＧ分子を含む、本明細書で前に記載される二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、第１の重鎖のＦｃ部分は第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分はＩｇＧ分子の２つの重鎖のヘテロ二量体化を可能にする第２の二量体化モジュールを含み、ノブ・イントゥー・ホールに従って、第１の二量体化モジュールはノブを含み、第２の二量体化モジュールはホールを含む。
【０１５８】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの界面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの界面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０１５９】
本明細書において報告される第１及び第２の融合ポリペプチドにおけるＣＨ３ドメインは、「ノブ・イントゥー・ホール」技術により改変することができ、これは、例えば国際公開第９６／０２７０１１号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及びMerchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681のいくつかの例で詳細に説明される。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面が改変され、これら２つのＣＨ３ドメインを含む両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれが「ノブ」になることができ、もう一方が「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入により、ヘテロ二量体がさらに安定化され（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収率を向上させる。
【０１６０】
したがって、特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内において、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
【０１６１】
特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ鎖」）のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。より具体的には、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール鎖」）においてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。より具体的には、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成される。ジスルフィド架橋は二量体をさらに安定する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０１６２】
しかし、ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されている他のノブ・イン・ホール技術も、代替的又は追加的に使用することができる。一実施態様では、本明細書において報告される多環式融合ポリペプチドは、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ変異、並びに「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ変異を含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６３】
さらなる態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を含み、又は、本明細書において報告される二重特異性抗原結合分子は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を含み、さらに、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅ変異、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋ変異（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１６４】
別の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの結合を促す修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にて、荷電したアミノ酸残基による１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
【０１６５】
「ノブ・イントゥー・ホール技術」とは別に、ヘテロ二量体化を実施するために重鎖のＣＨ３ドメインを修飾する他の技術が当該技術分野で公知である。これらの技術、特に、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号及び国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されるものは、本明細書に記載される二重特異性抗原結合分子と組み合わせた「ノブ・イントゥー・ホール」の代替物として本明細書で企図される。
【０１６６】
一態様では、所望のポリペプチドの会合をさらに促進するために、第１及び第２の重鎖間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸が導入される。したがって、この態様は、本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、抗体の三次構造において、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、それぞれの抗体のＣＨ３ドメインの間に位置する界面が形成され、ここで、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖のＣＨ３ドメインのそれぞれのアミノ酸配列はそれぞれ、環状融合ポリペプチドの三次構造において前記界面内に位置するアミノ酸のセットを含み、ここで、１つの重鎖のＣＨ３ドメインの界面に位置するアミノ酸のセットから、第１のアミノ酸が正に荷電したアミノ酸で置換され、かつ、他の重鎖のＣＨ３ドメインの界面に位置するアミノ酸のセットから、第２のアミノ酸が負に荷電したアミノ酸で置換される。この態様による二重特異性抗原結合分子は、本明細書では「ＣＨ３（＋／−）操作ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子」とも呼ばれる（ここで、略語「＋／−」は、それぞれのＣＨ３ドメインに導入された反対に荷電したアミノ酸を表す）。本明細書において報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作二重特異性抗原結合分子の一態様では、正に荷電したアミノ酸はＫ、Ｒ及びＨから選択され、負に荷電したアミノ酸はＥ又はＤから選択される。別の態様では、本明細書において報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作二重特異性抗原分子は、正に荷電したアミノ酸はＫ及びＲから選択され、負に荷電したアミノ酸はＥ又はＤから選択される。さらなる態様では、本明細書において報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作二重特異性抗原において、正に荷電したアミノ酸はＫであり、負に荷電したアミノ酸はＥである。一態様では、本明細書において報告される前記ＣＨ３（＋／−）操作二重特異性抗原結合分子において、１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、位置４０９のアミノ酸ＲはＤに置換され、位置のアミノ酸ＫはＥに置換され、他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、３９９位のアミノ酸ＤはＫに置換され、３５７位のアミノ酸ＥはＫに置換される（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１６７】
本発明のさらなる態様では、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、特にＦｃγ受容体に対するＦｃ受容体への結合を減少させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
【０１６８】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメインの修飾
本発明の二重特異性抗体は、スペーサードメインとして免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含み得る。例えば、免疫グロブリン  Ｇ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。Ｆｃ領域は、本発明の二重特異性抗体に、好ましい薬物動態特性、例えば標的組織内への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び好ましい組織−血液分布比などを付与する。しかしながら、同時に、好ましい抗原保有細胞よりはむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対しての、本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を導く可能性がある。したがって、特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ  Ｆｃ領域、特にＩｇＧ１  Ｆｃ領域又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域と比較して、Ｆｃ受容体に対する低減した結合親和性及び／又は低減したエフェクター機能を示す。より具体的には、Ｆｃ領域はＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。
【０１６９】
１つのそのような態様では、Ｆｃ領域（又は前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満を示し、かつ／又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、エフェクター機能の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満を示す。一態様では、Ｆｃ領域（又は前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、かつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃ受容体は抑制性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は抑制性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。一態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌のうちの１つ又は複数である。特定の態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃ領域ドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域と比較して実質的に同様の、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃ領域（又は前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の結合親和性の約７０％超、具体的には約８０％超、より具体的には約９０％超を示すときに達成される。
【０１７０】
特定の態様では、Ｆｃ領域は、非操作型Ｆｃドメインと比較して、低減した、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を有するように操作される。特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃ領域の２つのサブユニットのそれぞれに同じ１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する。一態様では、アミノ酸変異はＦｃ領域のＦｃ受容体に対する結合親和性を低減させる。別の態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低減させる。一態様では、操作型Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、非操作型Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗体と比較して、２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を示す。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。他の態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は抑制性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減される。いくつかの態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減される。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減されない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃ領域（又は前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、Ｆｃ領域の非操作型形態（又はＦｃドメインの前記非操作型形態を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の約７０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するときに達成される。Ｆｃ領域、又は前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％、及び場合によっては約９０％を上回る親和性を呈し得る。特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃ領域は、非操作型Ｆｃ領域と比較してエフェクター機能が低減するように操作される。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１つ又は複数を含むことができる。
【０１７１】
特定の態様では、本発明は、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有する二重特異性抗体が提供され、これらの機能は、その二重特異性抗体を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は重要であっても、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）は不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣの活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、環状融合ポリペプチドがＦｃγＲ結合を欠くが（したがって、恐らくはＡＤＣＣ活性が欠くが）、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確認することができる。
【０１７２】
したがって、特定の態様では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示す。一態様では、Ｆｃは、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、かつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１つ又は複数を含むことができる。
【０１７３】
特定の態様では、本明細書に提供される二重特異性抗原結合分子のＦｃ領域に１つ又は複数のアミノ酸修飾が導入され、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１７４】
特定の態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、スペーサードメインは、特にＦｃγ受容体に対するＦｃ受容体への結合を低減する１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。
【０１７５】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より具体的には、ＩｇＧ重鎖においてアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む本発明による二重特異性抗原結合分子が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組み合わせは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させるもので、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載があり、同文献には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定するための方法も記載されている。「ＥＵ番号付け」は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載のＥＵインデックスに従った番号付けを指す。
【０１７６】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を伴うものも含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含めた、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１７７】
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低下を呈する。さらに詳細な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異及びそのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
【０１７８】
変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の削除、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０１７９】
Ｆｃ受容体への結合は、例えばＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な機器を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、及び組換え発現によって得ることができるＦｃ受容体を使用して、容易に決定することができる。適切なそのような結合アッセイが本明細書に記載される。あるいは、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価してもよい。
【０１８０】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で公知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) 及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号； Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０１８１】
いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを判定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイが実施され得る。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。
【０１８２】
特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるすべての位置を含み、
ｉ）任意で変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は
ｉｉ）任意で変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は
ｉｉｉ）任意で変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａを有する、又は任意で変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、又は
ｉｖ）
ａ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、又は
ｂ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＳ３５４Ｃを含み、又は
ｃ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＹ３４９Ｃを含む
ヘテロ二量体Ｆｃ領域、
又は
ｖ）Ｆｃ領域ポリペプチドの両方が変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含み、かつ
ａ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、又は
ｂ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＳ３５４Ｃを含み、又は
ｃ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＹ３４９Ｃを含む
ヒトＩｇＧ１サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域、
又は
ｖｉ）Ｆｃ領域ポリペプチドの両方が変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを含み、かつ
ａ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、又は
ｂ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＳ３５４Ｃを含み、又は
ｃ）１つのＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＹ３４９Ｃを含む
ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域、
又は
ｖｉｉ）ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）のいずれかとｖｉ）、ｖ）、及びｖｉ）のいずれかとの組み合わせ
を含む。
【０１８３】
本明細書において報告される二重特異性抗体に含まれる融合ポリペプチドのＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。Ｃ末端は、Ｃ−末端アミノ酸残基の１つ又は２つが除去された短縮されたＣ末端であり得る。好ましい一実施態様では、Ｃ末端はアミノ酸残基ＰＧで終わる短縮されたＣ末端である。
【０１８４】
いくつかの態様では、第２の標的に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、腫瘍関連抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。一態様では、第２の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。
【０１８５】
ＴＮＦ受容体及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体  
いくつかの態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【０１８６】
より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【０１８７】
特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。一態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）からなる。
【０１８８】
別の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。一態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）からなる。
【０１８９】
一態様では、本明細書に提供される二重特異性抗体は、ＦＡＰに対して一価で結合する。
【０１９０】
ＯＸ４０及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体
いくつかの態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＴＮＦ受容体、特に共刺激ＴＮＦ受容体に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。具体的には、共刺激ＴＮＦ受容体はＯＸ４０である。一態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、本発明の二重特異性抗体は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインを含む。
【０１９１】
いくつかの態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｅ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｆ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｇ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び（ｉｖ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含む。
【０１９２】
特に、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含む。
【０１９３】
いくつかの態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）、又は
（ａ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）
を含む。
【０１９４】
特定の態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）、及び配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含む。
【０１９５】
一つの特定の態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含む。一態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）からなる。
【０１９６】
一態様では、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＯＸ４０）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＯＸ４０）を含むＯＸ４０に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体が提供される。
【０１９７】
より具体的には、本発明は二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｃ）配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｅ）配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、又は
（ｇ）配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド
を含む。
【０１９８】
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｃ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｅ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号６３のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号６５のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、又は
（ｇ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド
を含む。
【０１９９】
さらに、本発明は二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号１１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｃ）配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｄ）配列番号１２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｅ）配列番号１２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｆ）配列番号１２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、配列番号１２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、及び配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖、
（ｇ）配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド
（ｈ）配列番号１３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、又は
（ｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド
を含む。
【０２００】
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｃ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１２１のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｄ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１２３のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｅ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｆ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、及び配列番号１２８のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｇ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１３０のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｈ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、又は
（ｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１３４のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド
を含む。
【０２０１】
４−１ＢＢ及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体
いくつかの態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＴＮＦ受容体に特異的に結合することができる抗原結合ドメインであり、共刺激ＴＮＦ受容体が４−１ＢＢである二重特異性抗体が提供される。一態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、本発明の二重特異性抗体は、４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインを含む。
【０２０２】
いくつかの態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、並びに（ｉｖ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。一態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）、及び配列番号１４２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。
【０２０３】
一つの特定の態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）を含む。一態様では、４−１ＢＢに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ４−１ＢＢ）及び配列番号１４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ４−１ＢＢ）からなる。
【０２０４】
特に、本発明は二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１４３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号１４５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１４６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド
を含む。
【０２０５】
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１４３のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１４４のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１４６のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド
を含む。
【０２０６】
ＣＤ４０及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体  
いくつかの態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＴＮＦ受容体に特異的に結合することができる抗原結合ドメインであり、共刺激ＴＮＦ受容体がＣＤ４０である二重特異性抗体が提供される。一態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである二重特異性抗体が提供される。特に、本発明の二重特異性抗体は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つの抗原結合ドメインを含む。
【０２０７】
いくつかの態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、並びに（ｉｖ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む。一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び配列番号１５４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む。
【０２０８】
別の態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインであり、
（ｉ）配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、及び配列番号１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、並びに配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、及び配列番号１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）、又は
（ｉｉ）配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、及び配列番号１８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、並びに配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、及び配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）
を含む。
【０２０９】
一態様では、第１の標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインであり、
（ａ）配列番号１５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び配列番号１５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）、又は
（ｂ）配列番号１６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）
を含む。
【０２１０】
特に、本発明は二重特異性抗体を提供し、ここで二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号１５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｃ）配列番号１５９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１６０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｄ）配列番号１６１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｅ）配列番号１６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、又は
（ｆ）配列番号１６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド
を含む。
【０２１１】
一態様では、二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１５５のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１５６のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｂ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１５８のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｃ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１６０のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｄ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１６２のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、
（ｅ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド、又は
（ｆ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含む第１の融合ポリペプチド、及び配列番号１６６のアミノ酸配列を含む第２の融合ポリペプチド
を含む。
【０２１２】
Ｆａｂドメインにおける修飾
一態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、及び（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる１つのＦａｂ断片を含む二重特異性抗体であって、ここで、Ｆａｂ断片の（ａ）及び（ｂ）の１つにおいて、可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬのいずれかが交換されている二重特異性抗体に関する。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
【０２１３】
１つの結合アームにおけるドメイン置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ  ＶＨ−ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂ  ＣＨ−ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及び Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191に詳細に記載されている。それらは、第１の抗原に対する軽鎖の第２の抗原に対する誤った重鎖とのミスマッチによって引き起こされる副産物を（このようなドメイン交換のないアプローチと比較して）明らかに減少させる。
【０２１４】
一態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片、及び（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片を含む二重特異性抗体であって、ここで、定常ドメインＣＬ（Ｃｋａｐｐａ）及びＣＨ１は、ＣＨ１ドメインがＶＬドメインに融合され、ＣＬドメインがＶＨドメインに融合されるように、互いに置換されている二重特異性抗体に関する。
【０２１５】
別の態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片であって、ＶＨドメインがＣＬ（Ｃｋａｐｐａ）ドメインに融合され、かつＶＬドメインがＣＨ１ドメインに融合される、２つのｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片、及び（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片を含む二重特異性抗体に関する。
【０２１６】
別の態様では、正しいペアリングをさらに改善するために、二重特異性抗体は異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。このような修飾は、交差（ｃｒｏｓｓｅｄ）又は非交差（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓｅｄ）ＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は二重特異性抗体に関し、ここで、ＣＬドメインの１つにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）（正電荷）で置換されており、かつ、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（負電荷）で置換されている。
【０２１７】
より具体的には、本発明はＦａｂを含む二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、ＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、ＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【０２１８】
したがって、いくつかの実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子の１つ又は複数のＦａｂ断片（例えば、ＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片）は、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてアルギニン（Ｒ）を、及び１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてリジン（Ｋ）を含むＣＬドメイン、並びに１４７位及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてグルタミン酸（Ｅ）を含むＣＨ１ドメインを含む。
【０２１９】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載の本発明の二重特異性抗体又はその断片をコードする単離された核酸を提供する。
【０２２０】
本発明の二重特異性抗体をコードする単離された核酸は、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。同時発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して結合して、機能的抗原結合分子を形成し得る。共発現されると、融合ポリペプチドは結合して、第２の標的（例えば、ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインを形成するであろう。第１の標的（例えば、ＯＸ４０）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、１つのポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、融合ポリペプチドは結合して二重特異性抗体を形成するであろう。
【０２２１】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であり得る。
【０２２２】
本発明の別の態様によれば、本明細書で前に記載される融合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターと、本発明の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞とを提供する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【０２２３】
別の態様では、本明細書の二重特異性抗体を産生するための方法であって、（ｉ）本発明の宿主細胞を前記抗体の発現に適した条件下で培養する工程、及び（ｉｉ）前記二重特異性抗体を単離する工程を含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって製造された二重特異性抗体を包含する。
【０２２４】
組換え法
本発明の二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固体相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上述したように、抗体又はそのポリペプチド断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つ又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載される技術を参照のこと。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターには、二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片（すなわちコード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットが含まれる。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド若しくはそのポリペプチド断片又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか、又は融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、１つ又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモ��ターのような）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるであろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０２２５】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連結した最初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写調節領域には、脊椎動物遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギαグロビンに由来するもの、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写調節領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンを誘導可能なプロモーター）が含まれる。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、内部リボソーム侵入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２２６】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合させることができる。例えば、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、成長中のタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る排出輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、それが翻訳されたポリペプチドから切断されて分泌又は「成熟」型のポリペプチドを産生することを知っている。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド（例えば免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖シグナルペプチド）、又はその配列と作動可能に結合している、ポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２２７】
（例えばヒスチジンタグなど）後の精製を容易にするため又は融合タンパク質の標識化の補助のために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片の中又は両末端に含まれ得る。
【０２２８】
本発明のさらなる態様では、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当該技術分野で周知である。このような細胞は、特定の発現ベクターを適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、臨床応用に十分な量の抗原結合分子を得るために大規模発酵槽に播種するために大量のベクター含有細胞を増殖させることができる。適切な宿主細胞には、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は種々の真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞、昆虫細胞等が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でない場合、細菌で産生され得る。発現後、可溶性画分中の細菌細胞ペーストからポリペプチドを単離し、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌などの真核微生物は、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生を結果として生じる菌類及び酵母菌株を含む、ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004),及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。
【０２２９】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁状態で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれ、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術は当該技術分野で周知である。抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現産物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する抗原結合ドメインであるように、免疫グロブリン鎖のもう一方も発現するように操作することができる。
【０２３０】
別の態様では、提供されるのは、本発明の二重特異性抗体を製造するための方法であって、（ｉ）前記二重特異性抗体の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程と、（ｉｉ）前記二重特異性抗体を宿主細胞又は宿主細胞培養培地から単離する工程とを含む方法である。
【０２３１】
二重特異性抗体の構成要素は、通常互いに融合している。二重特異性抗原結合分子は、その構成要素が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。二重特異性抗原結合分子のさまざまな構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書に提供されている配列に見出される。必要に応じて、融合体の個々の構成要素を切り離すための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
【０２３２】
特定の態様では、抗体の一部を形成するＦＡＰ（例えば、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、少なくとも、ＦＡＰに結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。同様に、特定の態様では、二重特異性抗体の一部を形成する、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分（例えばＦａｂ断片又はｓｃＦｖ）は、少なくとも、ＯＸ４０に結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然又は非天然の抗体及びその断片の一部を形成することができ、かつ、そのような抗体及び断片から得られる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。非天然抗体は、固体相−ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え的に産生することも、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙへの米国特許第５９６９１０８号を参照）。
【０２３３】
特定の態様では、本発明の抗原結合分子に含まれる、関連標的に特異的に結合することができる抗原結合ドメイン（例えばＦａｂ断片又はｓｃＦｖ）は、例えば国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従って、増強された結合親和性を有するように操作される。本発明の抗原結合分子が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）のいずれかによって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定するために使用され得る。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための例示的な方法の詳細が、Morris (1996)“Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原は、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗原結合分子はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化抗原が、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies:  A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０２３４】
本明細書で記載のように調製される本発明の二重特異性抗体は、当該技術分野で公知の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスが使用され得る。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを、本質的に実施例に記載されるように抗原結合分子を単離するために使用することができる。二重特異性抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む任意のさまざまな周知の分析方法によって決定され得る。例えば、実施例に記載されるように発現された二重特異性抗原結合分子は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されるようにインタクトであり、正しく組み立てられていることが示された。
【０２３５】
本発明はまた、本発明の方法によって製造される二重特異性抗体を包含する。
【０２３６】
アッセイ  
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子は、当該技術分野で公知のさまざまなアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物活性について同定、スクリーニング又は特徴づけすることができる。
【０２３７】
１．親和性アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のＯＸ４０又はＦＡＰに対する親和性は、実施例に記載の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、実施例３に記載される。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００装置（ＧＥヘルスケア）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２３８】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の、その対応するＯＸ４０及び／又はＦＡＰ発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することができる。一態様では、ＯＸ４０を発現する新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が結合アッセイで使用される。これらの細胞は、単離直後（ナイーブＰＭＢＣ）又は刺激後（活性化ＰＭＢＣ）に使用される。ＯＸ４０への結合を測定するための具体的な例示であって例示的な実施態様は、実施例４．１に記載される。
【０２３９】
さらなる態様では、ＦＡＰを発現するがん細胞株を使用して、ＦＡＰへの二重特異性抗体の結合を実証した（実施例４．２を参照）。
【０２４０】
別の態様では、競合アッセイを使用して、特異的抗体又は抗原結合分子とＦＡＰ又はＯＸ４０のそれぞれへの結合について競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合抗体は、特異的抗ＦＡＰ抗体又は特異的抗ＯＸ４０抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための代表的な方法が、Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)に掲載のMorris (1996) “Epitope Mapping Protocols,”に詳細に示されている。
【０２４１】
３．活性のアッセイ
一態様では、ＦＡＰ及びＯＸ４０に結合する、生物活性を有する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、ＯＸ４０を発現する細胞におけるＯＸ４０を介したアゴニストシグナル伝達が含まれ得る。これらのアッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのような生物活性を有すると認められた二重特異性抗原結合分子も提供される。特に、ヒトＯＸ４０を発現し、ＦＡＰ発現腫瘍細胞と共培養されたＨｅｌａ細胞におけるＮＦκＢ活性化を検出するレポーター細胞アッセイが提供される（例えば、実施例５．１を参照）。
【０２４２】
別の態様では、ＦＡＰ及び４−１ＢＢに結合する、生物活性を有する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。特に、ヒト４−１ＢＢにおけるＮＦ−κＢ活性化及びＮＦＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２を検出するレポーター細胞アッセイが提供される（例えば、実施例７．２を参照）。
【０２４３】
別の態様では、ＦＡＰ及びＣＤ４０に結合する、生物活性を有する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。特に、抗原の供給源としてＦＡＰ被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用して、ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒトＢ細胞の活性化を測定する方法が提供される（例えば、実施例１０．１を参照）。
【０２４４】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような生物活性について試験される。本発明の該分子の生物活性を検出するためのアッセイは、実施例５に記載されているものである。さらに、細胞溶解を検出するためのアッセイ（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）、誘導性アポトーシスキネティクスを検出するためのアッセイ（例えば、カスパーゼ３／７活性の測定による）又はアポトーシスを検出するためのアッセイ（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを使用する）は、当該技術分野において周知である。加えて、そのような複合体の生物学的活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はγδＴ細胞などのさまざまなリンパ球サブセットの生存、増殖及びリンホカイン分泌に対するそれらの効果を評価することによって、又は樹状細胞、単球／マクロファージ若しくはＢ細胞などの抗原提示細胞の表現型、及び機能を調節するそれらの能力を評価することによって評価することができる。
【０２４５】
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される二重特異性抗体のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、本明細書で提供される二重特異性抗体のいずれかと、少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とを含む薬学的組成物を提供する。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される二重特異性抗体のいずれかと、例えば後述するような少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
【０２４６】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加剤中に溶解又は分散された１つ又は複数の二重特異性抗体の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という句は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも１つの二重特異性抗体と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990（参照により本明細書に包含される）によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される添加剤」には、当業者に既知であるように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【０２４７】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の二重特異性抗体は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーなどの生理的に適合性のバッファー中において製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。あるいは、融合タンパク質は、使用前に適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水で構成するための粉末形態であってもよい。滅菌注射溶液は、本発明の融合タンパク質を、必要に応じて、以下に列挙するさまざまな他の成分と共に適切な溶媒中に必要量で組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば、無菌濾過膜による濾過により、容易に達成することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又は乳濁液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過されたその液体媒質から、活性成分に加えて任意の追加の所望の成分の粉末を得る真空乾燥又は凍結乾燥技術である。場合によっては、液体媒質を適切に緩衝し、注射前にまず、その液体希釈剤を十分な生理食塩水又はグルコースで等張にする必要がある。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染は、安全なレベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれるべきであることが理解されよう。薬学的に許容される適切な添加剤には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン等の懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ  ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２４８】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル、ポリ−（メチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなど）を組成物に使用することによって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【０２４９】
本明細書における例示的な薬学的に許容される添加剤には、介在性薬物分散剤、例えば水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２５０】
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝剤を含む。
【０２５１】
上記の組成物に加えて、融合タンパク質はデポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性又は疎水性材料を用いて（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤化することができる。
【０２５２】
本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、１つ又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、添加剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる従来の方式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０２５３】
二重特異性抗体は、遊離酸又は遊離塩基の、中性又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基の形態よりも水性溶媒及び他のプロトン性溶媒に溶解しやすい傾向がある。
【０２５４】
本明細書中の組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な１つを超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含み得る。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２５５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。
【０２５６】
治療方法及び組成物
本明細書に提供される二重特異性抗体のいずれも、治療方法において使用され得る。治療方法において使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子は、医療実施基準に一致した様式で製剤化、調薬及び投与され得る。この観点において考慮すべき要素には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者が知るその他の要素が含まれる。
【０２５７】
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、医薬としての使用のために提供される。さらなる態様では、二重特異性抗原結合分子は、疾患の治療における使用のため、特にがんの治療における使用のために提供される。特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、治療法における使用のために提供される。一実施態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体であって、それを必要とする個体の疾患の治療における使用のための二重特異性抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を疾患を有する個体に投与することを含む、該個体を治療する方法における使用のための二重特異性抗体を提供する。特定の実施態様では、治療される疾患は、がんである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害、特にがんである。がんの例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんが含まれる。本発明の二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性障害には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、（中枢及び末梢）神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんから成る群より選択される。治療を必要とする対象、患者又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【０２５８】
細胞傷害性Ｔ細胞活性の上方制御又は延長における使用のための、本発明の二重特異性抗体又は本発明の薬学的組成物も、本発明に包含される。
【０２５９】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患を有する個体に対し、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用のためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害、特にがんである。がんの例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんが含まれる。本発明の二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性障害には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、（中枢及び末梢）神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんから成る群より選択される。当業者は、二重特異性抗原結合分子は多くの場合、治癒をもたらすわけではないが部分的恩恵をもたらし得ることを容易に認識する。いくつかの実施態様では、何らかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの実施態様では、生理的変化をもたらす二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。上記実施態様のいずれにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【０２６０】
さらなる態様では、本発明は、感染症の治療、特にウイルス感染症の治療、又は自己免疫疾患、例えばループス病の治療のための、医薬の製造又は調製における、本明細書に記載の二重特異性抗体の使用に関する。
【０２６１】
さらなる態様では、本発明は、本発明の二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物が前記個体に投与される。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害である。特定の実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、方法は、個体に治療的有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合には抗がん剤を投与することをさらに含む。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【０２６２】
疾患の予防又は治療のために、本発明の二重特異性抗体の（単独で使用されるか、あるいは１つ又は複数の他の追加の治療剤との組み合わせで使用されるときの）適切な用量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重症度及び経過、融合タンパク質が予防目的又は治療目的のために投与されるのかどうか、以前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴、及び融合タンパク質に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。いずれの場合にも、投与の責任を負う施術者は、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象のための適切な用量を決定するであろう。限定されないが、単回又はさまざまな時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むさまざまな投与スケジュールが本明細書において考慮される。
【０２６３】
本発明の二重特異性抗体は、単回又は一連の治療にわたって患者へ適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の該抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な１日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで一般に持続されるであろう。融合タンパク質の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の例では、用量は、投与１回につき、体重１ｋｇあたり約１μｇから、体重１ｋｇあたり約５μｇから、体重１ｋｇあたり約１０μｇから、体重１ｋｇあたり約５０μｇから、体重１ｋｇあたり約１００μｇから、体重１ｋｇあたり約２００μｇから、体重１ｋｇあたり約３５０μｇから、体重１ｋｇあたり約５００μｇから、体重１ｋｇあたり約１ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約２００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約３５０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇまで、又はそれ以上の範囲、及びそこから導き出せる範囲を含む。本明細書に挙げた数字から導き出せる範囲の例では、上記の数字に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇから体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇから体重１ｋｇあたり約５００ｍｇ等の範囲が投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１つ又は複数の用量を患者に投与することができる。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２〜約２０用量、又は例えば約６用量の二重特異性抗原結合分子を受けるように）投与され得る。初回の高負荷用量の後、１つ又は複数の低用量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２６４】
本発明の二重特異性抗体は、一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるであろう。疾患の状態を治療又は予防するための使用のために、本発明の二重特異性抗原結合分子又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２６５】
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。その後、細胞培養で決定したＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて用量を定式化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。初期投与量は、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を使用して推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づくヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。投与の量及び間隔は、二重特異性抗原結合分子の、治療効果を維持するのに十分な血漿レベルを提供するために個別に調整され得る。注射による投与のための患者への通常の投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数回投与を行うことにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０２６６】
局所投与又は選択的取り込みの場合、二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０２６７】
本明細書に記載される二重特異性抗体の治療的に有効な用量は一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療的効果を提供するであろう。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物試験を用いて、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。大きな治療指数を示す二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを用いて、ヒトにおける使用に適した投与量の範囲を定式化することができる。投与量は、好ましくは、毒性がほどんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1を参照のこと。この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２６８】
本発明の二重特異性抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合、治療をより高いレベルに調整する（毒性は予め排除）ことも知っているであろう。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。状態の重篤度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価され得る。さらに、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答に応じて変動するであろう。
【０２６９】
その他の薬剤及び治療
本発明の二重特異性抗体は、治療において１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与され得る。用語「治療剤」は、このような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与され得る任意の薬剤を包含する。そのような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。特定の実施態様では、追加の治療剤は別の抗がん剤である。
【０２７０】
このような他の薬剤は、意図される目的に対して効果的な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の要因に依存する。二重特異性抗体は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載された用量の１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路によって使用される。
【０２７１】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明の二重特異性抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起き得る分離投与を包含する。
【０２７２】
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上又は容器に付属するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどのさまざまな材料から形成され得る。容器は、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載される二重特異性抗体である。
【０２７３】
ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態を治療するために使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）本発明の二重特異性抗体を含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。
【０２７４】
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液）を収容する第２（又は第３）の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
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【０２７５】
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、上で定義されたＫａｂａｔによるＥＵ番号付けシステム（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）に従って番号が付けられ、参照される。
＊＊＊
【実施例】
【０２７６】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他のさまざまな実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２７７】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられている。
【０２７８】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０２７９】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチドからＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での化学合成によって調製された。合成された遺伝子断片を、増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。あるいは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、又はＰＣＲを介して、短い合成ＤＮＡ断片を組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドはｍｅｔａｂｉｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ−Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製された。
【０２８０】
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Incに記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
【０２８１】
試薬
特に明記しない限り、すべての市販の化学薬品、抗体、及びキットは、製造者のプロトコルに従って提供されたとおりに使用された。
【０２８２】
実施例１
二重特異性コントースボディの生成
１．１二重特異性コントースボディのための発現プラスミドの構築
本明細書で報告される二重特異性コントースボディの発現のために、以下の機能的要素を含む転写ユニットが使用された：
−イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−それぞれの環状融合ポリペプチドをコードする核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ  ｐＡ）。
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットの他に、基本的な／標準の哺乳動物発現プラスミドは、
−大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、及び
−大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子
を含む。
【０２８３】
１．２  二重特異性コントースボディの発現
二重特異性抗原結合分子の一過性発現は、トランスフェクション試薬２９３フリー（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、懸濁液に適合したＨＥＫ２９３Ｆ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞で行われた。
【０２８４】
細胞は、１２５ｍｌの振とうフラスコ（３７℃、７％のＣＯ２、８５％湿度、１３５ｒｐｍでインキュベート／振とう）中で解凍した後、希釈により少なくとも４回（容量３０ｍｌ）継代した。細胞を２５０ｍｌの容量中に３×１０５細胞／ｍｌまで増殖させた。３日後、細胞を分割し、１リットルの振とうフラスコに２５０ｍｌの容量中に７×１０５細胞／ｍｌの密度で新たに播種した。トランスフェクションは、２４時間後に約１．４ー２．０ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度になるであろう。
【０２８５】
トランスフェクション前に、２５０μｇのプラスミドＤＮＡを予熱した（水浴；３７℃）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で最終容量１０ｍｌに希釈した。溶液を穏やかに混合し、室温で５分を超えない間インキュベートした。次いで、２９３−フリートランスフェクション試薬３３３．３μｌをＤＮＡ−ＯｐｔｉＭＥＭ溶液に加えた。その後、溶液を穏やかに混合し、室温で１５ー２０分間インキュベートした。混合物の全量を、２５０ｍｌのＨＥＫ細胞培養容量を含む１Ｌの振とうフラスコに加えた。
【０２８６】
３７℃、７％のＣＯ２、８５％湿度、１３５ｒｐｍで６又は７日間インキュベート／振とうする。
【０２８７】
２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の最初の遠心分離工程により上清を回収した。次いで、上清を新しい遠心フラスコに移し、２回目の遠心分離を４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間行った。その後、無細胞上清を０．２２μｍのボトルトップフィルターを介してろ過し、冷凍庫（−２０℃）で保存した。
【０２８８】
１．３  二重特異性コントースボディの精製
抗原結合分子を含む培養上清をろ過し、２つのクロマトグラフィー工程により精製した。抗体は、ＰＢＳ（１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ）、ｐＨ７．４により平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって捕捉した。未結合のタンパク質を平衡化バッファーにより洗浄することにより除去し、抗原結合分子を５０ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ２．８により回収し、溶出直後に１ＭのＴｒｉｓ−ｂａｓｅ、ｐＨ９．０によりｐＨ６．０に中和した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーを第２の精製工程として使用した。サイズ排除クロマトグラフィーは、２０ｍＭヒスチジンバッファー、０．１４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０において行った。二重特異性抗原結合分子を含む溶液を、Ｂｉｏｍａｘ−ＳＫメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を備えたＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ遠心フィルターユニットを用いて濃縮し、−８０℃で保存した。
【０２８９】
１．４  二重特異性コントースボディの質量分析
ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨから入手した（１４．３Ｕ／μｌ；リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ及びグリセロール溶液）。ＩｇＧ抗体のヒンジ領域を特異的に切断するプロテアーゼは、消化前に凍結乾燥物から新たに再構成された。
【０２９０】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる酵素的脱グリコシル化
５０μｇの抗原結合分子を１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．１により最終濃度０．６ｍｇ／ｍｌに希釈し、１μｌのＰＮＧａｓｅ  Ｆにより３７℃で１６時間脱グリコシル化した。
【０２９１】
酵素的切断  
脱グリコシル化した試料を２００ｍＭのＴｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０により最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、続いてＩｇＧ特異的プロテアーゼを用いて３７℃で１時間消化した。
【０２９２】
ＥＳＩ−ＱＴＯＦ質量分析
試料は、２％ギ酸（ｖ／ｖ）を含む４０％アセトニトリルを使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（Ｋｒｏｎｌａｂ、５ｘ２５０ｍｍ、ＴＡＣ０５／２５０Ｇ０−ＳＲ）上でのＨＰＬＣにより脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）上でＥＳＩ−ＭＳによって総質量を決定した。キャリブレーションはヨウ化ナトリウムを用いて実行された（Ｗａｔｅｒｓ  ＴｏＦ  Ｇ２−Ｓａｍｐｌｅ  Ｋｉｔ  ２  Ｐａｒｔ：７００００８８９２−１）。消化された抗原結合分子の場合、データ収集は１０００ー４０００ｍ／ｚで行われた（ＩＳＣＩＤ：３０ｅＶ）。生の質量スペクトルが評価され、個々の相対モル質量に変換された。結果を視覚化するために、プロプライエタリ・ソフトウェアを使用して、デコンボリューションされた質量スペクトルを生成した。
【０２９３】
実施例２
ＯＸ４０に結合する２つの抗原結合ドメインとＦＡＰに結合する１つの抗原結合ドメインとを有する二重特異性抗体の調製（ＦＡＰ−ＯＸ４０コントースボディ）
【０２９４】
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０２０００６（Ａ２）号に記載されている。ＯＸ４０バインダーは、国際公開第２０１７／０５５３９８（Ａ２）号に記載されている。
【０２９５】
２．１  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＣＤ１３４−００９３の調製
図１Ａに示すように、２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０２９６】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０２９７】
表１は、二重特異性抗体ＣＤ１３４−００９３のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000016
2021500898.tif 000017
【０２９８】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｅに示す。
【０２９９】
２．２  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＣＤ１３４−００９４の調製
図１Ｂに示すように、２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０３００】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３０１】
表２は、二重特異性抗体ＣＤ１３４−００９４のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000018
2021500898.tif 000019
【０３０２】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｆに示す。
【０３０３】
２．３  ＦＡＰ（２８Ｈ１）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ００８５の調製
図１Ａに示すように、２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０３０４】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３０５】
表３は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ００８５のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000020
2021500898.tif 000021
【０３０６】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｇに示す。
【０３０７】
２．４  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ００８６の調製
図１Ａに示すように、２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０３０８】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３０９】
表４は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ００８６のアミノ酸配列を示す（コントースボディ７）。
2021500898.tif 000022
2021500898.tif 000023
【０３１０】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｇに示す。
【０３１１】
２．５  ＦＡＰ（２８Ｈ１）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ００８７の調製
図１Ｂに示すように、２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０３１２】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３１３】
表５は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ００８７のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000024
2021500898.tif 000025
【０３１４】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｈに示す。
【０３１５】
２．６  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ０８３９の調製
図１Ｂに示すように、２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０３１６】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３１７】
表６は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ０８３９のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000026
2021500898.tif 000027
【０３１８】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｈに示す。
【０３１９】
２．７  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ０８２１の調製
図１Ｃに示すように、２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０３２０】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３２１】
表７は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ０８２１（コントースボディ１１）のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000028
2021500898.tif 000029
【０３２２】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｉに示す。
【０３２３】
２．８  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ１１２２（コントースボディ１）の調製
図１Ｄに示すように、２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
【０３２４】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３２５】
表８は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ１１２２のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000030
2021500898.tif 000031
【０３２６】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｊに示す。
【０３２７】
２．９  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ１９４２（コントースボディ２）の調製
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
【０３２８】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３２９】
表９は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ１９４２のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000032
2021500898.tif 000033
【０３３０】
２．１０  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ１８８７（コントースボディ３）の調製
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０３３１】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３３２】
表１０は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ１８８７のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000034
2021500898.tif 000035
【０３３３】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｋに示す。
【０３３４】
２．１１  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ１８８８（コントースボディ４）の調製
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０３３５】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３３６】
表１１は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ１８８８のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000036
2021500898.tif 000037
【０３３７】
２．１２  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ２２５４（コントースボディ５）の調製
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１＿ＥＥ（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ＿ＲＫ（Ｅ１２３Ｒ、Ｑ１２４Ｋ）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１＿ＥＥ（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ＿ＲＫ（Ｅ１２３Ｒ、Ｑ１２４Ｋ）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０３３８】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。さらに、ＯＸ４０のＶＬとＶＨにそれぞれ融合したＣＨとＣｋａｐｐａにおいて、ベンスジョーンズタンパク質の生成を防ぎ、正しいペアリングをさらに促進するために、アミノ酸変異（いわゆる荷電残基）、つまりＣＨ１ドメインにおける負電荷（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）と抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４のＣＬドメインにおける正電荷（Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）が導入された。
【０３３９】
表１２は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ２２５４のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000038
2021500898.tif 000039
【０３４０】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｌに示す。
【０３４１】
２．１３  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ２３４０（コントースボディ６）の調製
２つの融合ポリペプチドと軽鎖を含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１＿ＥＥ（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ＿ＲＫ（Ｅ１２３Ｒ、Ｑ１２４Ｋ）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１＿ＥＥ（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ＿ＲＫ（Ｅ１２３Ｒ、Ｑ１２４Ｋ）。
−軽鎖：ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０３４２】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。さらに、ＯＸ４０のＶＬとＶＨにそれぞれ融合したＣＨとＣｋａｐｐａにおいて、ベンスジョーンズタンパク質の生成を防ぎ、正しいペアリングをさらに促進するために、アミノ酸変異（いわゆる荷電残基）、つまりＣＨ１ドメインにおける負電荷（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）と抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４のＣＬドメインにおける正電荷（Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）が導入された。
【０３４３】
表１３は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ２３４０のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000040
2021500898.tif 000041
【０３４４】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｍに示す。
【０３４５】
２．１４  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ２７３５（コントースボディ８）の調製
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ。
【０３４６】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３４７】
表１４は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ２７３５のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000042
2021500898.tif 000043
【０３４８】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｎに示す。
【０３４９】
２．１５  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ２７４３（コントースボディ９）の調製
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−ＣＨ１。
【０３５０】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３５１】
表１５は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ２７４３のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000044
2021500898.tif 000045
【０３５２】
２．１６  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＯＸ４０（４９Ｂ４）コントースボディＰ１ＡＥ２７６２（コントースボディ１０）の調製
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−ＣＨ１。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＯＸ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＯＸ４０）−ＣＨ１。
【０３５３】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３５４】
表１６は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ２７６２のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000046
2021500898.tif 000047
【０３５５】
２．１７  精製後の分子の生化学分析
表１７は、ＦＡＰ  ＯＸ４０コントースボディの収率と最終的な単量体含有量をまとめている。
2021500898.tif 000048
【０３５６】
２．１８  対照分子としての二重特異性ＯＸ４０抗体の調製  
対照として、以下の二重特異性抗ＯＸ４０抗体を調製した：
ａ）ＯＸ４０に対する二価結合及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性抗体は、国際公開第２０１７／０５５３９８（Ａ２）号の実施例４．４（２＋１フォーマット）と同様に調製された。この分子において、第１の重鎖（ＨＣ１）は、抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の１つのＦａｂユニット（ＶＨＣＨ１）、それに続いて、（Ｇ４Ｓ）リンカーによって抗ＦＡＰバインダー２８Ｈ１又は４Ｂ９のＶＨドメインに融合されたＦｃノブ鎖で構成された。構築物の第２の重鎖（ＨＣ２）は、抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の１つのＦａｂユニット（ＶＨＣＨ１）と、それに続く（Ｇ４Ｓ）リンカーによって抗ＦＡＰバインダー２８Ｈ１又は４Ｂ９のＶＬドメインに融合されたＦｃホール鎖で構成された。分子の概略図を図１０に示す。
ｂ）抗ＦＡＰバインダーのＶＨ及びＶＬドメインが、抗原に結合していないＤＰ４７と呼ばれる生殖系列コントロールによって置換された、上記のようなＯＸ４０に対する２価結合を有する抗体。この分子は、負の「非標的」対照として使用される。
ｃ）ＯＸ４０に対する二価結合及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性抗体は、国際公開第２０１７／０６０１４４（Ａ１）号の実施例４．４（４＋１フォーマット）と同様に調製された。この分子において、第１の重鎖（ＨＣ１）は、抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の２つのＦａｂユニット（ＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１）、それに続いて、（Ｇ４Ｓ）リンカーによって抗ＦＡＰバインダー４Ｂ９のＶＨドメインに融合されたＦｃノブ鎖で構成された。構築物の第２の重鎖（ＨＣ２）は、抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４の２つのＦａｂユニット（ＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１）、それに続いて、（Ｇ４Ｓ）リンカーによって抗ＦＡＰバインダー４Ｂ９のＶＬドメインに融合されたＦｃホール鎖で構成された。分子の概略図を図１Ｐに示す。
【０３５７】
Ｏｘ４０に対する４価の結合とＦＡＰに対する１価の結合とを有する二重特異性アゴニストＯｘ４０抗体は、２つの異なる重鎖の組み立てを可能にするノブ・イントゥー・ホール技術を適用することによって調製された。国際公開第２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。
2021500898.tif 000049
【０３５８】
実施例３
ＦＡＰ  ＯＸ抗体の特徴づけ
３．１  ヒトＯＸ４０への結合（速度論的親和性）
二重特異性ＦＡＰ−ＯＸ４０抗体のヒトＯＸ４０への結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴によって調査した。捕捉システムの約８０００共鳴ユニット（ＲＵ）（２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）；注文コード：ＢＲ１００８３９；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、スウェーデン）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、ｐＨ５．０でＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００５−３０）上に結合させた。ランニングバッファーは、ＰＢＳ−Ｐ  ｐＨ７．４（２０ｍＭリン酸バッファー、２．７ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）であった。フローセルを２５℃に、試料ブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回刺激した。二重特異性抗体は、２μｇ／ｍｌの溶液を５μｌ／分の流速で６０秒間注入することによって捕捉された。結合は、１：３希釈において６００ｎＭから開始し、３０μｌ／分の流速で１２０秒間ヒトＯＸ４０を注入することによって測定された。解離フェーズは最大７２０秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面を、３ＭのＭｇＣｌ２により１０μｌ／分の流速で６０秒間洗浄することにより、再生した。バルク屈折率の差は、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた（＝ダブルリファレンス）。ＫＤ及び速度論的パラメーターの計算のために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルを使用した。
2021500898.tif 000050
【０３５９】
両方のコントースボディは、４価の抗ＯＸ４０抗体の「４＋１」ＩｇＧ様フォーマットと比較して同様のＫＤ値を有する。親和性は分子間で同等であり、Ｒｍａｘは試験されたさまざまな分子の価数を示す。
【０３６０】
さらなるＦＡＰ−ＯＸ４０コントースボディが試験され、以下の表２０に列挙されるようなＫＤ値を示した。
2021500898.tif 000051
【０３６１】
３．２  ヒトＦＡＰへの結合（速度論的親和性）
二重特異性ＦＡＰ−ＯＸ４０抗体のヒトＦＡＰへの結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴によって調査した。捕捉システムの約１２０００共鳴ユニット（ＲＵ）（１５μｇ／ｍｌの抗ヒスチジン抗体；注文コード：２８９９５０５６；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、スウェーデン）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、ｐＨ４．５でＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００５−３０）上に結合させた。固定用のランニングバッファーはＨＢＳ−Ｎ  ｐＨ７．４であった（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。以下の速度論的特徴づけのためのランニングバッファーは、ＰＢＳ−Ｐ  ｐＨ７．４（２０ｍＭリン酸バッファー、２．７ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）であった。フローセルを２５℃に、試料ブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回刺激した。組換えヒトＦＡＰは、２５μｇ／ｍｌの溶液を５μｌ／分の流速で６０秒間注入することにより捕捉された。結合は、１：２希釈において３００ｎＭから開始し、３０μｌ／分の流速で１２０秒間ヒトＯＸ４０を注入することによって測定された。解離フェーズは最大７２０秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面を、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５により３０μｌ／分の流速で６０秒間洗浄することにより、再生した。バルク屈折率の差は、抗ヒスチジン表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた（＝ダブルリファレンス）。 ＫＤ及び速度論的パラメーターの計算のために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルを使用した。
2021500898.tif 000052
【０３６２】
両方の分子は同様のＫＤ値を有する。ＦＡＰ  ＥＣＤへの結合は、標準の対照分子と比較して、コントースボディフォーマットにおいて最適ではなかった。しかしながら、対照分子では、２つの４ｘＧ４Ｓペプチドリンカーは、抗ＦＡＰ部分をＣ末端のＦｃ部分に連結させるために使用されたが、コントースボディでは、２つの２ｘＧ４Ｓペプチドリンカーは、抗ＦＡＰ部分をコントースボディに連結させるために使用された。さらなるＦＡＰ−ＯＸ４０コントースボディが試験され、以下の表２２に列挙されるようなＫＤ値を示した。
2021500898.tif 000053
【０３６３】
３．３  ヒトＯＸ４０とヒトＦＡＰへの同時結合（速度論的親和性）
ヒトＯＸ４０とヒトＦＡＰを同時に結合する能力も、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価された。捕捉システムの約８０００共鳴ユニット（ＲＵ）（２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）；注文コード：ＢＲ１００８３９；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、スウェーデン）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、ｐＨ５．０でＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００５−３０）上に結合させた。ランニングバッファーは、ＰＢＳ−Ｐ  ｐＨ７．４（２０ｍＭリン酸バッファー、２．７ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）であった。フローセルを２５℃に、試料ブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回刺激した。二重特異性抗体は、２μｇ／ｍｌの溶液を５μｌ／分の流速で６０秒間注入することによって捕捉された。結合は、第１の被分析物（それぞれヒトＯＸ４０又はヒトＦＡＰ）を３０μｌ／分の流速で１２０秒間、注入することによって測定された。次に、第２の被分析物（それぞれヒトＦＡＰ又はヒトＯＸ４０）を、３０μｌ／分の流速で１２０秒間注入された。解離フェーズは最大７２０秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面を、３ＭのＭｇＣｌ２により１０μｌ／分の流速で６０秒間洗浄することにより、再生した。バルク屈折率の差は、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた（＝ダブルリファレンス）。ＫＤ及び速度論的パラメーターの計算のために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルを使用した。すべてのＦＡＰ−ＯＸ４０コントースボディは、両方の抗原に同時にかつ独立して結合することができた。
【０３６４】
実施例４
細胞への結合
４．１  ナイーブ対活性化ヒトＰＢＭＣへの結合
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手した。ヒトＰＢＭＣは、フィコール密度勾配遠心分離により単離された。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離するために、バフィーコートは同体積のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０３２６）により希釈された。５０ｍＬのポリプロピレン製遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に、１５ｍＬのヒストパック１０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）が供給され、バフィーコート溶液がヒストパック１０７７の上に層にされた。管を４００ｘｇ、室温で３０分間、低加速で中断なしで遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から収集し、ＤＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号１６０００−０４４、ロット９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、及び５６℃で３５分間の熱不活性化）を供給されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号４２４０１−０４２）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｉｂｃｏ、カタログ番号３５０５０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭのβメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。ＰＢＭＣは、１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含むＦＢＳ中で凍結された。
【０３６５】
凍結されたＰＢＭＣはＴ細胞培地中で解凍され、ＰＢＭＣは分離後に直接使用され（休止ヒトＰＢＭＣへの結合）、又はＴ細胞の細胞表面上で強力なヒトＯＸ４０発現を受けるように刺激された（活性化ヒトＰＢＭＣへの結合）。したがって、ナイーブＰＢＭＣは、２００Ｕ／ｍＬのプロロイキン及び２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌが供給されたＴ細胞培地中で２日間、６ウェル組織培養プレート中で培養され、次いで、Ｔ細胞培地中のプレコート６ウェル組織培養プレート［４μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び２μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）］上で１日培養された。
【０３６６】
ＯＸ４０ナイーブヒトＰＢＭＣ及び活性化ヒトＰＢＭＣの検出のために混合した。ナイーブと活性化ヒトＰＢＭＣの区別を可能にするために、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を使用した結合アッセイの前に、ナイーブ細胞を標識した。次いで、１×１０５個のナイーブｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと非標識活性化ヒトＰＢＭＣの１対１混合物を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに加え、結合アッセイを行った。
【０３６７】
細胞は、滴定された抗Ｏｘ４０抗体構築物を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳバッファー中で、４℃で暗所で１２０分間染色された。過剰なＦＡＣＳバッファーにより３回洗浄した後、細胞を、蛍光標識された抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰＡ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０９６−０９８）の混合物を含む、２５μＬ／ウェルの４℃の冷ＦＡＣＳバッファー中で、暗所で４℃で４５分間染色した。最後に、プレートを、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、５−レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア付き）を使用して同日に取得した。
【０３６８】
図２Ｂ及び２Ｄに示されるように、ＯＸ４０に特異的な抗原結合分子は、休止ヒトＣＤ４  Ｔ細胞又はＣＤ８  Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、すべての抗原結合分子（ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１二重特異性抗体、コントースボディＣＤ１３４−００９３及びＣＤ１３４−００９４）は、活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合した（図２Ａ及び２Ｃ）。ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合よりもはるかに強かった。２＋１設計のすべてのフォーマットは、第２の特異性の結合部分とは無関係に、ＯＸ４０発現（陽性）細胞に同様の強度で結合した。さらに、４＋１構築物は、最も強い結合を示した。コントースボディＣＤ１３４−００９３は、２＋１フォーマットと４＋１フォーマットとの間の中間的な結合を示し、第２のコントースボディＣＤ１３４−００９４は、２＋１フォーマットよりもＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞に強く結合しなかった。陰性対照ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１抗体（Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、活性化又は休止Ｔ細胞に結合しなかった。ＯＸ４０は、休止ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞では上方制御されないため、試験分子は休止細胞に結合しなかった。さらに、すべての構築物（陰性対照を除く）の結合は、ＣＤ４  Ｔ細胞上でより強かったが、これは、ＯＸ４０の発現が、これらの細胞上ではＣＤ８  Ｔ細胞上よりも高いためである。
【０３６９】
第２の実験の結果が図２Ｅから２Ｈに示される。これらの図に示すように、試験した分子（ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１二重特異性抗体、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体、コントースボディＰ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６及びＰ１ＡＥ００８７）はいずれも、ＯＸ４０が休止細胞上では発現されないため、予想どおりに休止ＣＤ４＋  Ｔ細胞又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合なかった（図２Ｆ及び２Ｈ）。対照的に、すべての抗原結合分子は、活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合を示した（図２Ｅ及び２Ｇ）。シグナル振幅は、ＣＤ４  Ｔ細胞上よりもＣＤ８＋  Ｔ細胞上で低く、これはＯＸ４０発現レベル（ＣＤ４＋  Ｔ細胞上で高い）と相関した。しかしながら、試験された各分子の結合パターンは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞の間で同等であった。３つのコントースボディ分子はすべてＯＸ４０発現細胞に結合したが、ＦＡＰ結合クローンに関係なく、２＋１対照分子と比較してＯＸ４０への結合能力の低下を示した。特に、コントースボディＰ１ＡＥ００８７の結合は、コントースボディＰ１ＡＥ００８５の結合よりもわずかに損なわれていた。
【０３７０】
活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞へのさらなるコントースボディ（コントースボディ１から１１）の結合は図８Ａから８Ｄに示され、活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合は図１０Ａから１０Ｄに示される。図９Ａから９Ｄ及び図１１Ａから１１Ｄのそれぞれにおいて、予想されるように、コントースボディ１から１１のいずれも、休止ヒトＣＤ４  Ｔ細胞又はＣＤ８  Ｔ細胞に結合しなかったことが示されている。対照的に、すべての抗原結合分子は、活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞に結合した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合よりもはるかに強かった。２＋１設計のすべてのフォーマットは、第２の特異性の結合部分とは無関係に、ＯＸ４０陽性細胞に同様の強度で結合した。陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ）は、活性化又は休止Ｔ細胞に結合しなかった。ＯＸ４０は、休止ＣＤ４又はＣＤ８  Ｔ細胞では上方制御されないため、試験分子は休止細胞に結合しなかった。さらに、すべての構築物（陰性対照を除く）の結合は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞上でより強かったが、これは、ＯＸ４０の発現が、これらの細胞上ではＣＤ８＋  Ｔ細胞上よりも高いためである。
【０３７１】
４．２    ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞への結合
細胞表面ＦＡＰへの結合は、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）発現ＷＭ２６６−４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６７６）を使用して試験された。ＯＸ４０陰性ＦＡＰ陰性腫瘍細胞への結合の欠如は、非標識ヒトＦＡＰ陽性ＷＭ２６６−４細胞からの分離を可能にするために、核に限定されたＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ蛍光タンパク質を発現するＡ５４９  ＮｕｃＬｉｇｈｔＴＭＲｅｄ  Ｃｅｌｌｓ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４４９１）を使用して試験された。 親Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）は、標準のエッセンプロトコルに従って、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下でＭＯＩが３（ＴＵ／細胞）で、Ｅｓｓｅｎ  ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄレンチウイルス（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号４４７６；ＥＦ１α、ピューロマイシン）により形質導入された。これにより、≧７０％の形質導入効率が得られた。
【０３７２】
ＦＡＣＳバッファー中の５ｘ１０４の非標識ＷＭ２６６−４細胞と非標識Ａ５４９  ＮｕｃＬｉｇｈｔＴＭ赤血球の混合物を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに加え、結合アッセイを行った。プレートを４℃で４００ｘｇで４分間遠心分離し、上澄みを払い落とした。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを短く穏やかなボルテックスにより再懸濁した。すべての試料を、示されている濃度の範囲で（滴定された）二重特異性抗原結合分子（一次抗体）を含む４℃の冷ＦＡＣＳバッファーの５０μＬ／ウェルに再懸濁し、４℃で１２０分間インキュベートした。その後、細胞を４℃のＦＡＣＳバッファー２００μＬで４回洗浄し、短時間のボルテックスにより再懸濁した。細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０９６−０９８）を含む２５μＬ／ウェルの４℃の低温二次抗体溶液でさらに染色し、暗所で４℃で６０分間インキュベートした。最後に、プレートを、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む９０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、５−レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア付き）を使用して同日に取得した。
【０３７３】
図３Ａ及び３Ｂに示すように、ＦＡＰ標的化抗ＯＸ４０二重特異性抗体は、ヒトＦＡＰ発現標的細胞に効率的に結合した。したがって、ＦＡＰ標的化抗ＯＸ４０抗原結合分子のみが、直接的な腫瘍標的特性を示す。ＦＡＰ  ４Ｂ９はヒトＦＡＰに高い親和性を有するが、２８Ｈ１はヒトＦＡＰに低い親和性を有する。ＦＡＰ標的化（ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１二重特異性抗体は、ＦＡＰ＋細胞への最も強い結合を示し、その次に２＋１コントースボディＣＤ１３４−００９３、コントースボディＣＤ１３４−００９４、次にＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体が続いた。ＦＡＰ  ４Ｂ９は、２８Ｈ１と比較してヒトＦＡＰに対するより高い親和性を有することに留意するべきである。両方のコントースボディのＦＡＰ＋細胞への結合は、ＶＨＶＬを含む標的化２＋１抗体構築物と比較してわずかに改善された。非標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  抗体（Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ））は、任意のＦＡＰ＋細胞に結合しなかった。活性化ヒトＣＤ４  Ｔ細胞及びＦＡＰ陽性腫瘍細胞への結合のＥＣ５０値が表２３にまとめられる。
表２３：異なるフォーマットのＦＡＰ標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）二重特異性抗体の細胞表面ヒトＦＡＰ及びヒトＯＸ４０（ＣＤ４＋  Ｔ細胞上）への結合のＥＣ５０値
2021500898.tif 000054
【０３７４】
さらなる実験において、コントースボディＰ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６、及びＰ１ＡＥ００８７が、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１二重特異性抗体及びＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体（陰性対照）と比較して試験された。結果を図３Ｃ及び３Ｄに示す。すべてのＦＡＰ標的化抗ＯＸ４０抗原結合分子は、ヒトＦＡＰ発現細胞に結合した。ＦＡＰ  ４Ｂ９クローンは、２８Ｈ１のようにヒトＦＡＰへのより高い親和性を有する。その結果、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１二重特異性抗体で最良の結合特性が観察され、予想されるように、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体は結合の減少を示した。ＦＡＰ＋細胞への結合は、両方のＦＡＰクローン（４Ｂ９及び２８Ｈ１）についてＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ  ２＋１二重特異性抗体と比較してわずかに損なわれていたが、３つすべてのコントースボディはＦＡＰへの結合を示した。コントースボディＰ１ＡＥ００８５とＰ１ＡＥ００８７は非常に類似した結合特性を示したため、リンカーの長さはｈｕＦＡＰへの結合に影響を与えるように見えなかった。非標的化２ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体及び陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１抗体（Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ））は、任意のＦＡＰ＋細胞に結合しなかった。さらに、いずれの分子もＦＡＰ−Ａ５４９ＮＬＲ細胞への結合を示さなかった。これは、結合がヒトＦＡＰに特異的であることを示している。活性化ヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞及びＦＡＰ陽性細胞への結合のＥＣ５０値が表２４にまとめられる。
表２４：異なるフォーマットのＦＡＰ標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）二重特異性抗体の細胞表面ヒトＦＡＰ及びヒトＯｘ４０（ＣＤ４＋  Ｔ細胞上）への結合のＥＣ５０値
2021500898.tif 000055
ｎ．ｃ．カーブフィットなし。ＥＣ５０の計算はできない
ｎ．ａ．適用されない
【０３７５】
コントースボディ１から１０のＦＡＰ＋細胞への結合の結果は、図１３Ａから１３Ｄに示される。すべてのＦＡＰ標的化抗ＯＸ４０抗原結合分子が、ヒトＦＡＰ発現細胞に結合した。図１４Ａから１４Ｄに示されるように、ＦＡＰ標的化抗ＯＸ４０抗原結合分子のいずれも、Ａ５４９ＮＬＲ（ＦＡＰ陰性）腫瘍細胞に結合することができなかった。コントースボディ８はＦＡＰ＋細胞に最も強く結合し、その次にコントースボディ１０及びコントースボディ６が続いた。両方のコントースボディのＦＡＰ＋細胞への結合は、ＶＨＶＬを含む標的化２＋１抗体構築物と比較してわずかに改善された。非標的化２＋１抗ＯＸ４０構築物（７７１８）及び陰性対照（８１０５）は、任意のＦＡＰ＋細胞に結合しなかった。活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びＦＡＰ陽性腫瘍細胞への結合のＥＣ５０値が表２５にまとめられる。
表２５：異なるフォーマットのＦＡＰ標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）二重特異性抗体の細胞表面ヒトＦＡＰ及びヒトＯｘ４０（ＣＤ４＋  Ｔ細胞上）への結合のＥＣ５０値
2021500898.tif 000056
ｎ．ｃ．カーブフィットなし。ＥＣ５０の計算はできない
ｎ．ａ．適用されない
【０３７６】
実施例５
二重特異性抗ヒトＯＸ４０結合分子の機能特性
５．１    ヒトＯＸ４０及びレポーター遺伝子ＮＦκＢルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞
ＯＸ４０のそのリガンドに対するアゴニスト結合は、核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化を介して下流のシグナル伝達を誘導する（A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972）。組換えレポーター細胞株ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１は、その表面にヒトＯｘ４０を発現させるために生成された。さらに、それはＮＦκＢ感受性エンハンサーセグメントの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポータープラスミドを保有している。Ｏｘ４０トリガーはＮＦκＢの用量依存的活性化を誘導し、その後ＮＦκＢは核に移行し、そこでレポータープラスミドのＮＦκＢ感受性エンハンサーに結合してルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させる。ルシフェラーゼは、ルシフェリン酸化を触媒し、オキシルシフェリンを生成し、それが発光する。これは、ルミノメーターによって定量化可能である。
【０３７７】
したがって、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞においてＮＦκＢ活性化を誘導するさまざまな抗ＯＸ４０分子の能力を、生物活性の指標として分析した。
【０３７８】
二価ＦＡＰ標的化ＶＨＶＬ又はコントースボディフォーマット単独で、二次抗体又はＦＡＰ＋腫瘍細胞株による構築物の超架橋を有する、選択された二重特異性ＯＸ４０（４９Ｂ４）抗体のＮＦκＢ活性化能力を試験した。細胞表面ＦＡＰによるＦＡＰ結合抗体の架橋は、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９を発現するヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を使用して試験された。この細胞株は、マウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）に１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン選択下でｈｕＦＡＰを発現する発現ベクターｐＥＴＲ４９２１をトランスフェクションすることによって生成された。
【０３７９】
接着性ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞を、ウェルあたり０．２＊１０５細胞の細胞密度で一晩培養し、滴定された二重特異性抗ＯＸ４０（４９Ｂ４）抗体（ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体、コントースボディＣＤ１３４−００９３及びＣＤ１３４−００９４）を含むアッセイ培地により５時間刺激した。二次抗体による超架橋の効果を試験するために、二次抗体抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９８）を含有する２５μＬ／ウェルの培地が、１：２の比率（一次抗体と二次抗体）で加えられた。細胞表面のＦＡＰ結合による超架橋の効果を試験するために、ＦＡＰ＋腫瘍細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９）を含む培地２５μＬ／ウェルを４：１の比率（ウェルあたりレポーター細胞の４倍のＦＡＰ＋腫瘍細胞）で共培養した。
【０３８０】
インキュベーション後、アッセイ上清を吸引し、プレートをＤＰＢＳで２回洗浄した。ルシフェラーゼ１００アッセイシステムとレポーター溶解バッファー（双方ともＰｒｏｍｅｇａ製、カタログ番号Ｅ４５５０及びＥ３９７１）を製造元の指示書に従って使用して発光の定量化を行った。簡潔にいうと、細胞を、ー２０℃で１０分間、ウェルあたり３０μＬの１ｘ溶解バッファーを加えることによって溶解した。細胞を３７℃で２０分間解凍した後、ウェルあたり９０μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を加えた。発光は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダーを使用して、すべての波長を収集するためにフィルターを使用せずに、５００ｍｓの積分時間を用いて直ちに定量化された。放出された相対光単位（ＵＲＬ）は、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１細胞の基底発光によって補正され、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して対数の一次抗体濃度に対してブロットされた。組み込みのシグモイド用量反応を使用して、曲線をフィッティングさせた。
【０３８１】
図４Ａから４Ｃに示すように、すべての抗ＯＸ４０構築物の存在は、ＮＦκＢ活性化を誘導した。二次抗ｈｕＩｇＧＦｃγ特異的抗体を介した超架橋は、ＦＡＰ非依存的様式ですべてのバインダーのＮＦκＢ活性化を増加させた。２つの二重特異性抗体、２＋１構築物ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）及びＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７は、ＦＡＰ標的化がＮＦκＢ誘導に影響を与えないように思われたため、同様に実行された。コントースボディＣＤ１３４−００９３とＣＤ１３４−００９４は同等に機能したが、架橋下でのＮＦκＢの活性化はそれほど強くないことを示した（それらの効果は本質的であり、架橋に依存しないようである）。ＦＡＰ発現腫瘍細胞は、ＦＡＰ標的化分子（黒三角、半黒丸、黒丸）が使用された場合、濃度依存的様式でＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化の誘導を強く増加させた。ＦＡＰ＋腫瘍細胞によって構築物をさらに超架橋することができなかったため、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体（白丸）ではそのような効果は見られなかった。さらに、ＦＡＰ標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体は、コントースボディＣＤ１３４−００９３及びコントースボディＤ１３４−００９４より強いＮＦκＢ活性化を誘導し、一方ＣＤ１３４−００９４はＣＤ１３４−００９３より強い活性化を示した（図４Ａ）。まとめると、コントースボディ構築物はＯＸ４０を介したＮＦκＢ活性化を誘導できたが、二次抗体又は細胞表面発現ＦＡＰのいずれかで架橋された、ＦＡＰ標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体よりも活性が低かった。しかしながら、二次オリゴマー化なしで加えられた場合、活性も低下した。
【０３８２】
第２の実験の結果が図４Ｄから４Ｆに示される。これらの図に示されているように、試験されたすべての抗ＯＸ４０分子（ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１二重特異性抗体、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体、コントースボディＰ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６及びＰ１ＡＥ００８７）の存在は、架橋の非存在下で非常に最小限のＮＦκＢ活性化を誘導した（図４Ｄ）。３つすべての２＋１対照分子（ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１二重特異性抗体及びＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体）は、超架橋が二次抗体によって提供された場合、非常に類似したＮＦκＢ活性化を示した（図４Ｆ）。３つのコントースボディ分子は、対照と比較して、わずかに低下した活性を示した。試験されたコントースボディと対照分子の間のＮＦκＢ活性化のこの違いは、ＦＡＰ発現細胞の存在下では観察されなかった。コントースボディ分子とそれぞれのＦＡＰ標的化対照分子に対応する曲線をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで１つのグローバルカーブフィットを共有するものとして分析し、これは、効力に有意差がないことを示していた。試験された２つのクローン（４Ｂ９と２８Ｈ１）間でＦＡＰに対する結合親和性は異なるが、このアッセイでは効力における顕著な違いにならなかった。ＤＰ４７標的化２＋１対照分子はＦＡＰ結合部分を有しないため、最小限の活性しか示さなかった。陰性対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１抗体（Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ））は、架橋に関係なく、活性を示さなかった。
【０３８３】
さらに、コントースボディ１から１１のＮＦκＢ活性化能力を、単独で、及びＦＡＰ＋腫瘍細胞株による二重特異性抗体構築物の超架橋を有するもので試験した。図１５Ａから１５Ｄにおいて、ＦＡＰ発現腫瘍細胞の存在下でのＮＦκＢ活性化が示されている。ＦＡＰによる架橋なしのＮＦκＢ活性化は、図１６Ａから１６Ｄにおいて見ることができる。ＦＡＰ＋細胞との架橋あり及び架橋なしでのＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化の曲線下面積のまとめが、図１７に示される。すべての抗ＯＸ４０構築物の存在は、ＮＦκＢ活性化を誘導した。ＦＡＰ＋腫瘍細胞を介した超架橋は、試験されたすべての二重特異性抗体のＮＦκＢ活性化を増加させた。ＦＡＰ発現腫瘍細胞は、ＦＡＰ標的化分子を使用した場合、濃度依存的にＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化の誘導を強く増加させた。２＋１フォーマットにおいてＦＡＰ結合部分を非結合性ＤＰ４７ユニット（白三角）により置換した場合、そのような効果は見られなかった。すべてのコントースボディは、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）２＋１二重特異性抗体と同等に機能した。
【０３８４】
５．２    準最適にＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣ及び細胞表面ＦＡＰによる過架橋のＯＸ４０媒介共刺激
５．１節において、ＦＡＰ＋腫瘍細胞の追加は、ＯＸ４０受容体の強力なオリゴマー化を提供することにより、ヒトＯＸ４０陽性レポーター細胞株におけるＦＡＰ標的化二価抗ＯＸ４０抗体によって誘導されるＮＦκＢ活性を強く増加させることができることが示された。同様に、我々は、休止ヒトＰＢＭＣ細胞の準最適なＴＣＲ刺激を救済する能力について、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞の存在下で、ＦＡＰ標的化二価抗ＯＸ４０抗体を試験した。
【０３８５】
ヒトＰＢＭＣ調製物には、（１）休止、ＯＸ４０陰性ＣＤ４＋  及びＣＤ８＋  Ｔ細胞、並びに（２）細胞表面に種々なＦｃγ受容体分子を有する抗原提示細胞（例えばＢ細胞及び単球）が含まれている。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ヒトＣＤ３抗体は、そのＦｃ部分により、存在するＦｃγ受容体分子に結合し、休止ＯＸ４０陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞上での長期ＴＣＲ活性化を媒介することができる。これらの細胞は、数時間以内にＯＸ４０を発現し始める。ＯＸ４０に対する機能的アゴニスト化合物は、活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞に存在するＯＸ４０受容体を介してシグナルを伝達し、ＴＣＲ媒介刺激をサポートすることができる。
【０３８６】
休止ヒトＰＢＭＣを、照射されたＦＡＰ＋  ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞及び滴定された抗ＯＸ４０構築物の存在下で、準最適濃度の抗ＣＤ３抗体により５日間刺激した。Ｔ細胞の生存と増殖に対する影響は、総細胞数のモニタリングとフローサイトメトリーによるＴ細胞活性化に対する蛍光標識抗体と成熟マーカー（ＣＤ２５／ＣＤ１２７）との共染色によって分析された。
【０３８７】
マウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を、細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を使用して３７℃で１０分間回収した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）内で３７℃及び５％ＣＯ２で、滅菌９６ウェル丸底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）に入れたＴ細胞培地中１ウェルあたり０．２ｘ１０５細胞の密度で一晩培養した。翌日、それらは、腫瘍細胞株によるヒトＰＢＭＣの後の異常増殖を防ぐために、４５００ＲＡＤの線量を使用してｘ線照射装置で照射された。
【０３８８】
ヒトＰＢＭＣは、フィコール遠心分離により単離された。細胞を各ウェルに０．６ｘ１０１０５細胞／ウェルの密度で加えた。［１０ｎＭ］の最終濃度の抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＶ９、ヒトＩｇＧ１）、及びＦＡＰ標的化二価抗ＯＸ４０抗原結合分子とコントースボディを指定の濃度で加えた。細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）内で３７℃、５％ＣＯ２で４日間活性化させた。
【０３８９】
蛍光色素結合抗体である、抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、ＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）、ＣＤ２５（クローンＭ−Ａ２５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５６１１２）及びＣＤ１２７（クローンＡ０１９Ｄ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５１３２４）を用い、４℃で２０分間表面染色した。細胞ペレットをＦＡＣＳバッファーで１回洗浄した。最後に、プレートを、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含む８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、５−レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア付き）を使用して同日に取得した。
【０３９０】
図５Ａから５Ｆに示すように、非標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体（白三角）による共刺激は、準最適にＴＣＲ刺激されたＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞を救出しなかった。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞の存在によるＦＡＰ標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体（黒三角）と、２＋１  コントースボディＣＤ１３４−００９３及びＣＤ１３４−００９４の過架橋は、生存を促進し、ヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の増強された活性化表現型を誘導した。さらに、特にコントースボディＣＤ１３４−００９３（黒丸）は、活性化に関して、標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体と比較して最も類似した特性を示すようである。さらに、コントースボディＣＤ１３４−００９４（半分黒丸）は、ＣＤ４  Ｔ細胞よりもＣＤ８  Ｔ細胞に対してより強い活性化を示したが（図５Ｄ）、一方それは、ＣＤ４  Ｔ細胞上におけるコントースボディＣＤ１３４−００９３及びＦＡＰ標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体と同等の活性化を示した。まとめると、生物活性及びＴ細胞活性化の結果は正規化され、図６にまとめられる。ここでは各構築物のアゴニスト能力は、分析されたマーカーについて曲線下面積として定量化され、互いにプロットされた。図６に示すように、コントースボディＣＤ１３４−００９３は、ＦＳＣ−Ａ及びＣＤ２５に関してＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方の最も強力な活性化を示した。この分子は、ＦＡＰ標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体（これはＣＤ１３４−００９３の約７５％の強さである）よりも強力であるように見える。コントースボディＣＤ１３４−００９４は、ＣＤ２５のみが上方制御されたため、少し効力が弱いように見えたが、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のサイズ（ＦＳＣ−Ａ）は増加しなかった。さらに、非標的化２＋１分子及び陰性対照は活性化を示さなかった（非常に低い正規化されたＡＵＣ値）。
【０３９１】
さらなる実験において、非標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体による共刺激は、準最適にＴＣＲ刺激されたＣＤ４及びＣＤ８  ＋Ｔ細胞を救出しなかった。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞の存在による、ＦＡＰ標的化二価抗ＯＸ４０抗体である、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体及びＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）二重特異性抗体、及び３つのコントースボディ分子（Ｐ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６及びＰ１ＡＥ００８７）の過架橋は、初代ヒトＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の増強された活性化を強く促進した。Ｐ１ＡＥ００８６は、対応する２＋１  ４Ｂ９対照抗体ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）二重特異性抗体よりも、Ｔ細胞の非常に類似した活性化をトリガーした。それらは、ヒトＦＡＰに対してより低い親和性を有することが知られている２８Ｈ１  ＦＡＰバインダーを有する分子よりもより活性化された表現型をもたらした。コントースボディＰ１ＡＥ００８５及びＰ１ＡＥ００８７は、２＋１対照分子ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体と比較して、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞上において同様のＣＤ２５発現及びわずかに高いＦＳＣ−Ａ  ＭＦＩを示した。初代ＰＢＭＣを用いたこのアッセイは、高親和性バインダー（４Ｂ９）を含むＦＡＰ標的化分子の効力が、低親和性ＦＡＰバインダー（２８Ｈ１）を含む分子の効力よりも高いことを示した。生物活性及びＴ細胞活性化の結果が、図７Ａから７Ｄに示される。
【０３９２】
コントースボディ７、８、９、及び１０の、準最適なＴＣＲ刺激ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞を救出する能力も試験された。図１８Ａ及び１８Ｂは、準最適なＣＤ３刺激後の表面マーカーＣＤ２５によって示されるＣＤ４  Ｔ細胞の活性化を示す。図１８Ｃ及び１８Ｄでは、表面マーカーＣＤ２５によって示されるＣＤ８  Ｔ細胞の活性化が示されている。図１９Ａ及び１９ＢはＣＤ４  Ｔ細胞のＦＳＣ−Ａ  ＭＦＩを示し、図１９Ｃ及び１９ＤはＣＤ８  Ｔ細胞のＦＳＣ−Ａ  ＭＦＩを示す。ｅＦｌｕｏｒ  ６７０は、細胞分裂を測定するための増殖色素である。ｅＦｌｕｏｒ  ６７０値は、それぞれ、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を図２０Ａ及び２０Ｂに示し、ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を図２０Ｃ及び２０Ｄに示す。ＩＬ−７Ｒａ（ＣＤ１２７）の下方制御は、ＣＤ４  Ｔ細胞について図２１Ａ及び２１Ｂに、ＣＤ８  Ｔ細胞について図２１Ｃ及び２１Ｄ示される。すべての結果は、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９細胞の存在下において、コントースボディとＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）二重特異性抗体（黒三角）の超架橋は、生存を強く促進し、ヒトＣＤ４では増強された活性化表現型を誘導し、ＣＤ８  Ｔ細胞ではより少ない程度で誘導した。図２２Ａから２２Ｄでは、さまざまな生物活性アッセイの結果が曲線下面積としてまとめられる。
【０３９３】
５．３  結果のまとめ
まとめると、２＋１  コントースボディＣＤ１３４−００９３は、２＋１コントースボディＣＤ１３４−００９４よりも良好に機能した。活性化ＣＤ４  Ｔ細胞へのＣＤ１３４−００９３の結合は、ＦＡＰ標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体及びＣＤ１３４−００９４のいずれよりも強く、どちらも同様の結合特性を示した（図２Ａ）。両方のコントースボディは、ＷＭ２６６−４細胞上のヒト表面ＦＡＰへの良好な結合を示し（図３Ａ）、結合強度は、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１二重特異性抗体（高親和性バインダー４Ｂ９を含む）とＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体（低親和性バインダー２８Ｈ１を含む）の間のものであった。実施例２．９において説明されるように、コントースボディのフォーマットがＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体と異なる場合でも、結合特性は同じかそれ以上に良好であるようである。それにもかかわらず、それらはＯＸ４０（４９Ｂ４）ＦＡＰ（４Ｂ９）４＋１二重特異性抗体（実施例２．９）のＭＦＩに達しない。ＮＩＨ  ３Ｔ３  ｈｕＦＡＰ細胞を架橋することによるＮＦκＢ活性化を見ると、コントースボディは、（４９Ｂ４）ＦＡＰ（２８Ｈ１）２＋１二重特異性抗体と比較して、ＮＦκＢの中間の活性化を示したが、非標的化ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＤＰ４７  ２＋１二重特異性抗体よりも依然として強かった（図４Ａ）。両方のコントースボディ上のＦＡＰドメインは、架橋剤として機能し、ＯＸ４０シグナル伝達を活性化できるようである。二次Ｆｃγ特異的抗体を架橋剤として使用すると、両方のコントースボディは同様のＮＦκＢ活性化を示したが、標的化対照分子よりもあまり良好に機能しなかった（図４Ｂ）。コントースボディの生物活性試験により、ＣＤ１３４−００９３は、ＣＤ１３４−００９４よりもＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞上でより顕著な活性化表現型を誘導するようであることを明らかにした（図５Ａ−Ｄ）。コントースボディＣＤ１３４−００９３は、２価の２＋１形式よりもＴ細胞のより強い活性化を示した（図６）。
【０３９４】
コントースボディＰ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６及びＰ１ＡＥ  ００８７は、二価の抗ＯＸ４０対照分子と比較して、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の表面上に発現するＯＸ４０に結合する能力のわずかな低下を示した（図２Ｅ−２Ｈ）。Ｐ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６、及びＰ１ＡＥ００８７は、ＮＩＨ−３Ｔ３  ｈｕＦＡＰクローン１９細胞（図３Ｃ及び３Ｄ）の表面上に発現したヒトＦＡＰへの結合が部分的に損なわれていることも示した（図３Ｃ及び３Ｄ）。高親和性ＦＡＰバインダー４Ｂ９を含む分子は、低親和性２８Ｈ１バインダーの分子よりもヒトＦＡＰへの優れた結合能力を示した。ＮＦκＢ活性化アッセイにより、３つのコントースボディ分子Ｐ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６、及びＰ１ＡＥ  ００８７は、ＮＩＨ−３Ｔ３  ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を介して架橋された場合、対照ＦＡＰ標的化分子よりもＮＦκＢの同様の活性化を誘導することを明らかにした（図４Ｆ）。ＨｅＬａＮＦκＢレポーターアッセイにおいて、低親和性と高親和性のＦＡＰ標的化抗ＯＸ４０分子の効力に区別はなかった。コントースボディ分子の生物活性はまた、５日間の活性化アッセイにおいて、初代ヒトＰＢＭＣ及びＮＩＨ−３Ｔ３  ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を架橋細胞として使用して試験された。４Ｂ９  ＦＡＰバインダーを含む分子は、２８Ｈ１バインダーと比較して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞においてより活性化された表現型を誘導した。コントースボディ分子は、それらのそれぞれの対照分子として同様に機能した。まとめると、これらのデータは、ＯＸ４０及びｈｕＦＡＰへの結合能力がわずかに低下しているにもかかわらず、コントースボディ分子Ｐ１ＡＥ００８５、Ｐ１ＡＥ００８６、及びＰ１ＡＥ００８７が対照分子と同様の効力を有することを示している。
【０３９５】
全体として、異なるフォーマットにもかかわらず、コントースボディ（特にＣＤ１３４−００９３）は、実施例２．１８に記載されているＦＡＰ標的化２＋１抗ＯＸ４０抗体よりも、結合及びＴ細胞活性化に関して、良好ではないにしても同等の特性を有するようである。
【０３９６】
実施例６
４−１ＢＢに結合する２つの抗原結合ドメインとＦＡＰに結合する１つの抗原結合ドメインとを有する二重特異性抗体の調製（ＦＡＰ−４−１ＢＢコントースボディ）
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０２０００６（Ａ２）号に記載されている。４−１ＢＢバインダーについては、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許第７２８８６３８（Ｂ２）号又は米国特許第７６５９３８４（Ｂ２）号に従って得られた。
【０３９７】
６．１  ＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）コントースボディＰ１ＡＥ１８９９の調製
図１Ａに示すように、２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（４−１ＢＢ）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（４−１ＢＢ）−Ｃｋａｐｐａ、（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（４−１ＢＢ）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（４−１ＢＢ）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０３９８】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０３９９】
表２６は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ１８９９のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000057
2021500898.tif 000058
【０４００】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｅに示す（ＯＸ４０は４−１ＢＢにより置換される）。
【０４０１】
６．２  ＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）コントースボディＰ１ＡＥ２０５１の調製  
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（４−１ＢＢ）−ＣＨ１＿ＥＥ（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（４−１ＢＢ）−Ｃｋａｐｐａ＿ＲＫ（Ｅ１２３Ｒ、Ｑ１２４Ｋ）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（４−１ＢＢ）−ＣＨ１＿ＥＥ（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（４−１ＢＢ）−Ｃｋａｐｐａ＿ＲＫ（Ｅ１２３Ｒ、Ｑ１２４Ｋ）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０４０２】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。さらに、ＯＸ４０のＶＬとＶＨにそれぞれ融合したＣＨとＣｋａｐｐａにおいて、ベンスジョーンズタンパク質の生成を防ぎ、正しいペアリングをさらに促進するために、アミノ酸変異（いわゆる荷電残基）、つまりＣＨ１ドメインにおける負電荷（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）と抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４のＣＬドメインにおける正電荷（Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）が導入された。
【０４０３】
表２７は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ２０５１のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000059
2021500898.tif 000060
【０４０４】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｌに示す（ＯＸ４０は４−１ＢＢにより置換される）。
【０４０５】
６．３  精製後の分子の生化学分析
表２８は、ＦＡＰ−４−１ＢＢコントースボディの収率と最終的な単量体含有量をまとめている。
2021500898.tif 000061
【０４０６】
実施例７
ＦＡＰ−４−ＢＢコントースボディの特徴づけ
７．１  ヒトＦＡＰへの結合（速度論的親和性）
二重特異性ＦＡＰ−４−１ＢＢ抗体のヒトＦＡＰへの結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴によって実施例３．２に記載されるように調査した。ＫＤ及び速度論的パラメーターの計算のために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルを使用した。
2021500898.tif 000062
【０４０７】
両方の分子は同様のＫＤ値を有する。
【０４０８】
７．２  ヒト４−１ＢＢ及びＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２におけるＮＦ−κＢ活性化
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）受容体とそのリガンド（４−１ＢＢＬ）のアゴニスト結合は、核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）の活性化を介して４−１ＢＢ−下流シグナル伝達を誘導し、ＣＤ８  Ｔ細胞の生存及び活性を促進する（Lee HW, Park SJ, Choi BK, Kim HH, Nam KO, Kwon BS. 4-1BB promotes the survival of CD8 (+) T lymphocytes by increasing expression of Bcl-x(L) and Bfl-1. J Immunol 2002; 169:4882-4888）。２＋１  Ｈ２Ｈ抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡ二重特異性抗体によって媒介されるこのＮＦκＢ活性化を監視するために、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株をＰｒｏｍｅｇａ（ドイツ）から購入した。細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＧＩＢＣＯ、カタログ番号１６０００−０４４、ロット９４１２７３、ガンマ線照射マイコプラズマフリー、熱不活性化）、２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチド（Ｇｌｕｔｑａ−ＭＡＸ−Ｉ、ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０−０３８）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ−非必須アミノ酸溶液１００ｘ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ７１４５）、６００μｇ／ｍｌのＧ−４１８（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４７２７８９４００１）、４００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：１０８４３５５５００１）及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｉｅｎｃｅ、カタログ番号：Ｈ０８８７−１００ｍＬを供給されたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４０１−０４２）中で浮遊細胞として培養された。アッセイのために、細胞を回収し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉが供給されたアッセイ培地ＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁した。２ｘ１０３のＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞を含む１０μｌを、蓋付きの無菌白色３８４ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３８２６）の各ウェルに移した。滴定濃度のコントースボディ、２＋１二重特異性アゴニスト抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘ抗ＦＡＰ（４Ｂ９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体、抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体、抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｈｕＩｇＧ４及びアイソタイプ対照（ＤＰ４７  ｈｕ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体）を含むアッセイ培地１０μＬが加えられた。最後に、アッセイ培地のみ又は１ｘ１０４細胞のＦＡＰ発現細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９（上記のとおり）を含むアッセイ培地１０μＬが供給され、プレートを細胞インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。６μｌの新たに解凍したＯｎｅ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ検出溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｅ６１１０）を各ウェルに加え、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーを使用して、ルミネセンス発光を即座に測定した（５００ｍｓの積分時間、フィルターなしですべての波長を収集する）。
【０４０９】
図２３Ａに示すように、ＦＡＰ発現細胞の非存在下では、どの分子もＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株で強力なヒト４−１ＢＢ受容体活性化を誘導できず、ＮＦｋＢ活性化につながり、したがってルシフェラーゼ発現をもたらした。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン１９（ヒトＦＡＰトランスジェニックマウス線維芽細胞株）のようなＦＡＰ発現細胞の存在下（図２３Ｂを参照）では、二重特異性２＋１  ＦＡＰ  ４−１ＢＢコントースボディと２＋１二重特異性アゴニスト抗４−１ＢＢ（２０Ｈ４．９）ｘ抗ＦＡＰ（４Ｂ９）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体（黒塗りの星）の架橋は、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株においてＮＦｋＢ活性化ルシフェラーゼ活性の強力な増加をもたらし、これは、非標的化対照４−１ＢＢ抗体によって媒介される活性化を上回っていた。活性化曲線のＥＣ５０値と曲線下面積（ＡＵＣ）が表３０と表３１に列挙される。
2021500898.tif 000063
2021500898.tif 000064
【０４１０】
実施例８
ＣＤ４０に結合する２つの抗原結合ドメインとＦＡＰに結合する１つの抗原結合ドメインとを有する二重特異性抗体の調製（ＦＡＰ−ＣＤ４０コントースボディ）
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０２０００６（Ａ２）号に記載されている。ＣＤ４０バインダーについては、クローン２０Ｈ４．９のＶＨ及びＶＬ配列は、国際公開第２００６／１２８１０３号の配列番号１０及び配列番号１６に従って得られた。
【０４１１】
８．１  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＣＤ４０コントースボディＰ１ＡＥ１７９９の調製
図１Ａに示すように、２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体をクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０４１２】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０４１３】
表３２は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ１７９９のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000065
2021500898.tif 000066
【０４１４】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｅに示す（ＯＸ４０はＣＤ４０により置換される）。
【０４１５】
８．２  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＣＤ４０コントースボディＰ１ＡＥ１９０２の調製
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
【０４１６】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０４１７】
表３３は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ１９０２のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000067
2021500898.tif 000068
【０４１８】
８．３  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＣＤ４０コントースボディＰ１ＡＥ１８００の調製
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０４１９】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０４２０】
表３４は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ１８００のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000069
2021500898.tif 000070
【０４２１】
８．４  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＣＤ４０コントースボディＰ１ＡＥ２０５２の調製  
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０４２２】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０４２３】
表３５は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ２０５２のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000071
2021500898.tif 000072
【０４２４】
８．５  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＣＤ４０コントースボディＰ１ＡＥ１９０１の調製
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
【０４２５】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０４２６】
表３６は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ１９０１のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000073
2021500898.tif 000074
【０４２７】
８．６  ＦＡＰ（４Ｂ９）−ＣＤ４０コントースボディＰ１ＡＥ２２５５の調製
２つの融合ポリペプチドを含む二重特異性抗体を以下のようにクローニングした：
−  第１の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１＿ＥＥ（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ＿ＲＫ（Ｅ１２３Ｒ、Ｑ１２４Ｋ）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＨ（ＦＡＰ）−Ｃｋａｐｐａ。
−  第２の融合ポリペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで）：ＶＨ（ＣＤ４０）−ＣＨ１＿ＥＥ（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ）、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＩｇＧ１ヒンジ、Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクタ、ＶＬ（ＣＤ４０）−Ｃｋａｐｐａ＿ＲＫ（Ｅ１２３Ｒ、Ｑ１２４Ｋ）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）コネクタ、ＶＬ（ＦＡＰ）−ＣＨ１。
【０４２８】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異が導入された。ノブ・イントゥー・ホールヘテロ二量体化技術は、ノブ鎖のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異と、ホール鎖のＣＨ３ドメインにおける対応するＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異により使用された（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。さらに、ＯＸ４０のＶＬとＶＨにそれぞれ融合したＣＨとＣｋａｐｐａにおいて、ベンスジョーンズタンパク質の生成を防ぎ、正しいペアリングをさらに促進するために、アミノ酸変異（いわゆる荷電残基）、つまりＣＨ１ドメインにおける負電荷（Ｋ１４７Ｅ、Ｋ２１３Ｅ、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）と抗ＯＸ４０バインダー４９Ｂ４のＣＬドメインにおける正電荷（Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）が導入された。
【０４２９】
表３７は、二重特異性抗体Ｐ１ＡＥ２２５５のアミノ酸配列を示す。
2021500898.tif 000075
2021500898.tif 000076
【０４３０】
組み立てられた構造の概略図を図１Ｌに示す（ＯＸ４０はＣＤ４０により置換される）。
【０４３１】
８．７  精製後の分子の生化学分析
表３８は、ＦＡＰ−４−１ＢＢコントースボディの収率と最終的な単量体含有量をまとめている。
2021500898.tif 000077
【０４３２】
実施例９
ＦＡＰ  ＣＤ４０抗体の特徴づけ
９．１  ヒトＣＤ４０への結合
二重特異性構築物がヒトＣＤ４０に結合する能力が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価された。すべてのＳＰＲ実験は、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、２５℃でＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ）上で行われた。結合は、１：３希釈中で３００ｎＭから始めて、３０μｌ／分の流速で３００秒間、溶液中にさまざまな濃度のヒトＣＤ４０細胞外ドメインを注入することによって測定された。解離フェーズは最大１２００秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面は、３０μｌ／分の流速でＧｌｙｃｉｎｅ  ｐＨ２．１溶液により６０秒間洗浄することにより再生された。バルク屈折率の差は、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた（＝ダブルリファレンス）。みかけのＫＤ及び速度論的パラメーターの計算のために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルを使用した。見かけのＫｄは、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ  Ｂ４０００評価ソフトウェア（バージョン１．１）を使用して計算された。
2021500898.tif 000078
【０４３３】
９．２  ヒトＦＡＰへの結合（速度論的親和性）
二重特異性ＦＡＰ−ＯＸ４０抗体のヒトＦＡＰへの結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴によって調査した。捕捉システムの約１２０００共鳴ユニット（ＲＵ）（１５μｇ／ｍｌの抗ヒスチジン抗体；注文コード：２８９９５０５６；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、スウェーデン）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、ｐＨ４．５でＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００５−３０）上に結合させた。固定用のランニングバッファーはＨＢＳ−Ｎ  ｐＨ７．４であった（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。以下の速度論的特徴づけのためのランニングバッファーは、ＰＢＳ−Ｐ  ｐＨ７．４（２０ｍＭリン酸バッファー、２．７ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）であった。フローセルを２５℃に、試料ブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回刺激した。組換えヒトＦＡＰは、２５μｇ／ｍｌの溶液を５μｌ／分の流速で６０秒間注入することにより捕捉された。結合は、１：２希釈において３００ｎＭから開始し、３０μｌ／分の流速で１２０秒間ヒトＯＸ４０を注入することによって測定された。解離フェーズは最大７２０秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面を、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５により３０μｌ／分の流速で６０秒間洗浄することにより、再生した。バルク屈折率の差は、抗ヒスチジン表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた（＝ダブルリファレンス）。ＫＤ及び速度論的パラメーターの計算のために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルを使用した。
2021500898.tif 000079
【０４３４】
９．３  ヒトＣＤ４０とヒトＦＡＰへの同時結合（速度論的親和性）
ヒトＣＤ４０とヒトＦＡＰを同時に結合する能力も、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価された。捕捉システムの約８０００共鳴ユニット（ＲＵ）（２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）；注文コード：ＢＲ１００８３９；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、スウェーデン）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、ｐＨ５．０でＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００５−３０）上に結合させた。ランニングバッファーは、ＰＢＳ−Ｐ  ｐＨ７．４（２０ｍＭリン酸バッファー、２．７ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）であった。フローセルを２５℃に、試料ブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回刺激した。二重特異性抗体は、２μｇ／ｍｌの溶液を５μｌ／分の流速で６０秒間注入することによって捕捉された。結合は、第１の被分析物（それぞれヒトＣＤ４０又はヒトＦＡＰ）を３０μｌ／分の流速で１２０秒間、注入することによって測定された。次に、第２の被分析物（それぞれヒトＦＡＰ又はヒトＣＤ４０）を、３０μｌ／分の流速で１２０秒間注入された。解離フェーズは最大７２０秒間監視され、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることによってトリガーされた。表面を、３ＭのＭｇＣｌ２により１０μｌ／分の流速で６０秒間洗浄することにより、再生した。バルク屈折率の差は、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）表面から得られた応答を差し引くことにより補正された。ブランク注入も差し引かれた（＝ダブルリファレンス）。ＫＤ及び速度論的パラメーターの計算のために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１モデルを使用した。すべてのＦＡＰ−ＣＤ４０コントースボディは、両方の抗原に同時にかつ独立して結合することができた。
【０４３５】
実施例１０
ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子の機能特性
１０．１  抗原の供給源としてＦＡＰコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用した、ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒトＢ細胞の活性化
Ｂ細胞は、ＳｔｉｆｔｕｎｇＺuｒｃｈｅｒＢｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ  ＳＲＫから入手したバフィーコートから単離された。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離するために、５０ｍＬのバフィーコートを同量のＰＢＳ（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００１００２３）で希釈した。５０ｍＬポリプロピレン製遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７８５１）が供給され、管あたり２５ｍＬのバフィーコート溶液がＬｙｍｐｈｏｒｅｐＴＭの上に注意深く層にされた。管を室温で２４分間、２０００ｒｐｍで、低加速で中断なしで遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から収集し、ＰＢＳで３回洗浄し、１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒセルカウンターＡｃ・ＴＴＭ５ｄｉｆｆ  ＯＶ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号６６０５５８０）により細胞の種類と数を分析した。ＰＢＭＣからのＢ細胞分離の前に、ＣＤ１４陽性画分を、ＣＤ１４マイクロビーズによるＣＤ１４陽性細胞の磁気標識（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０５０−２０１）、それに続くａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９２−５４５）による分離によって除去した。ＣＤ１４陰性画分は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂ細胞分離キットＩＩ（カタログ番号１３０−０９１−１５１）を用いたその後のＢ細胞分離とａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）分離のために使用された。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１６１４０、ロット番号１７９７３０６Ａ）を供給された、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地１６４０（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１８７０−０２５）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）、１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミン（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５０３０−０２４）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３６０−０３９）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１４０−０３５）及び５０μＭのβ−メルカプトエタノール（ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１３５０−０１０）からなるＲ１０培地１００μｌ中の１ｘ１０５のＢ細胞を、９６ウェル平底プレートのウェルごとに加えた。製造者のプロトコルに従って、ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１１２０５Ｄ）をビオチン化ヒトＦＡＰ（自社製、６．５ｘ１０４ビーズの結合能：０．０１μｇのタンパク質）によりコーティングし、５０μｌのＲ１０培地中で、ビーズ対細胞の比率が２：１でＢ細胞に加えた。対照として、コーティングされていないビーズをＢ細胞に加えた。
【０４３６】
ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０コントースボディを、５０μｌのＲ１０培地中で６．７から０．００３ｎＭの範囲の濃度（３ｘ希釈系列）でＢ細胞に加えた。ＦＡＰ非依存性陽性対照として、アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体ＳＧＮ４０（ＩｇＧ１、ＩＮＮ：ダセツズマブ）を使用した。ＳＧＮ４０抗体は生物学的活性のためにＦｃ受容体架橋を必要とすることが文献に記載されているため（C. Law et al., Cancer Res 2005, 65, 8331-8338）、抗体を架橋ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片と３０分間インキュベートした後、Ｂ細胞に加えた。４８時間後、細胞を９６ウェルの丸底プレートに移し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中３μｇ／ｍＬのＦｃ受容体ブロッキングマウスＩｇＧアイソタイプ対照（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０４００Ｃ）５０μｌとともにインキュベートした。４℃で１５分のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の蛍光標識抗体の混合物５０μｌを細胞に加えた。以下の蛍光標識抗体を使用した：抗ヒトＣＤ８０  ＢＶ６０５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＬ３０７．４、カタログ番号５６３３１５）、抗ヒトＣＤ６９  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＦＮ５０、カタログ番号３１０９１６）、抗ヒトＣＤ１４  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨＣＤ１４、カタログ番号３２５６２２）、抗ヒトＣＤ３  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＵＣＨＴ１、カタログ番号３００４３０）、抗ヒトＣＤ８６  ＰＥ−ＣＦ５９４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＦＵＮ−１、カタログ番号５６２３９０）、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＢＵＶ３９５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＧ４６−６、カタログ番号５６４０４０）及び抗ヒトＣＤ１９  ＡＰＣ−Ｈ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＳＪ２５Ｃ１、カタログ番号５６０１７７）。生細胞と死細胞を区別するために、生存率色素Ｚｏｍｂｉｅ  ＡｑｕａＴＭ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）を抗体混合物に加えた。４℃で３０分のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞を、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェア付き）を使用して、同日に分析した。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）を使用して実行された。ＣＤ１４及びＣＤ３について陰性、ＣＤ１９について陽性である生（アクアネガティブ）細胞を、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ発現について分析した。
【０４３７】
アゴニスト抗ＣＤ４０コントースボディ又は架橋されたＳＧＮ４０抗体との２日間のインキュベーション後に分析されたＢ細胞は、試験されたすべての構築物に対してＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ発現の増加を示した（図２４Ａから２４Ｈを参照）。これらの発現マーカーの上方制御は、異なるＦＡＰ標的化コントースボディの場合、ＦＡＰに依存し、これらのＦＡＰ依存抗体によって誘導される発現の増加は、架橋されたＳＧＮ４０抗体によって誘導される増加と同等又はわずかに低かった。
【図１Ａ−Ｂ】
2021500898.tif 000080
【図１Ｃ−Ｄ】
2021500898.tif 000081
【図１Ｅ−Ｆ】
2021500898.tif 000082
【図１Ｇ−Ｈ】
2021500898.tif 000083
【図１Ｉ−Ｊ】
2021500898.tif 000084
【図１Ｋ−Ｌ】
2021500898.tif 000085
【図１Ｍ−Ｎ】
2021500898.tif 000086
【図１Ｏ−Ｐ】
2021500898.tif 000087
【図２Ａ−Ｂ】
2021500898.tif 000088
【図２Ｃ−Ｄ】
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【図２Ｅ−Ｆ】
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【図２Ｇ−Ｈ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ−Ｆ】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図５Ｄ−Ｆ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【図９Ａ−Ｂ】
2021500898.tif 000103
【図９Ｃ−Ｄ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１４Ｃ−Ｄ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ−Ｄ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１６Ｃ−Ｄ】
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【図１７】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ−Ｄ】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【図１９Ｃ−Ｄ】
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【図２０Ａ−Ｂ】
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【図２０Ｃ−Ｄ】
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【図２１Ａ−Ｂ】
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【図２１Ｃ−Ｄ】
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【図２２Ａ−Ｄ】
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【図２３Ａ−Ｂ】
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【図２４Ａ−Ｂ】
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【図２４Ｃ−Ｄ】
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【図２４Ｅ−Ｆ】
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【図２４Ｇ−Ｈ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021500898.tif 000134
2021500898.tif 000135
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