(57)【要約】  ナノポアベースの配列決定チップ内のナノポアを交換するための技術が提供される。第１の電解質溶液は、配列決定チップの外部リザーバに追加され、リザーバと脂質二重層膜の反対側に位置するウェルチャンバーとの間に浸透性の不均衡をもたらす。浸透性の不均衡は、膜が形状変化すること、および膜内のナノポアが排出されることを引き起こす。次いで、第２の電解質溶液が、交換用ナノポアを提供し、膜形状を復元するために、外部リザーバに追加される。交換用ナノポアは、膜内へ挿入され得、膜の破壊を引き起こすことなく初期ポアを効果的に交換する。【選択図】図６−２
2021500034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列決定セルを更新する方法であって、
前記配列決定セルの第１の電解質リザーバを、前記配列決定セルの第２の電解質リザーバから隔てる膜を提供するステップであって、ここで、前記膜が初期ナノポアを含み、前記第１の電解質リザーバが第１の初期モル浸透圧濃度を有し、前記第２の電解質リザーバが第２の初期モル浸透圧濃度を有する、前記ステップ；
第１の電解質溶液を前記第１の電解質リザーバへ流すステップであって、ここで、前記第１の電解質溶液が前記第１の初期リザーバモル浸透圧濃度とは異なる第１の電解質溶液モル浸透圧濃度を有し、それにより、前記第１の電解質リザーバが前記第１の初期モル浸透圧濃度とは異なる新規モル浸透圧濃度を有するようになる、前記ステップ；
前記新規モル浸透圧濃度と前記第２の初期モル浸透圧濃度との差の結果として、前記膜から前記初期ナノポアを排出するステップ；
第２の電解質溶液を前記第１の電解質リザーバに追加するステップであって、ここで、前記第２の電解質溶液が複数の交換用ナノポアを含み、前記第２の電解質溶液が前記第１の電解質溶液モル浸透圧濃度よりも前記第２の初期モル浸透圧濃度に近い第２の電解質溶液モル浸透圧濃度を有する、前記ステップ；および、
前記複数の交換用ナノポアのうちの１つを前記膜内に挿入するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記挿入するステップが、好ましくは前記膜にわたる交流電圧である電圧を印加するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の電解質溶液モル浸透圧濃度の前記第１の初期モル浸透圧濃度に対する比が１．０５以上である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の電解質溶液モル浸透圧濃度の前記第２の電解質溶液モル浸透圧濃度に対する比が１．０５以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の電解質溶液モル浸透圧濃度の前記第１の初期モル浸透圧濃度に対する比が、０．８５〜１．１５の範囲内にある、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記膜が脂質二重層を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記膜がトリブロック共重合体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
初期ナノポア複合体が、前記初期ナノポア、初期テンプレート、および初期ポリメラーゼを含み、前記初期ナノポア複合体が前記初期ナノポアにより排出され、ここで、複数の交換用ナノポア複合体の各々が、前記複数の交換用ナノポアのうちの１つ、交換用テンプレート、および交換用ポリメラーゼを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記初期ナノポアが、外膜タンパク質Ｇ（ＯｍｐＧ）、細菌アミロイド分泌チャネルＣｓｇＧ、マイコバクテリウム・スメグマチス・ポーリンＡ（ＭｓｐＡ）、アルファ溶血素（ａ−ＨＬ）、ＯｍｐＧ、ＣｓｇＧ、ＭｓｐＡ、またはａ−ＨＬのうちの少なくとも１つに対して少なくとも７０％の同一性を有する任意のタンパク質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
配列決定セルを更新するためのシステムまたは機器であって、前記システムが、
前記配列決定セルの第１の電解質リザーバ、前記配列決定セルの第２の電解質リザーバ、および前記第１の電解質リザーバを前記第２の電解質リザーバから隔てる膜を含む流体チャンバーであって、ここで、前記膜が初期ナノポアを含み、前記第１の電解質リザーバが第１の初期モル浸透圧濃度を有し、前記第２の電解質リザーバが第２の初期モル浸透圧濃度を有する、前記流体チャンバー；
前記第１の電解質リザーバへの溶液の流入を制御するフローサブシステム；
複数の交換用ナノポア；
前記膜にわたって電圧を印加するように構成される電圧源であり、好ましくは交流電圧源；ならびに、
動作を実施するために前記電圧源および前記フローサブシステムと通信可能に結合された制御回路であって、
第１の電解質溶液を前記第１の電解質リザーバへ流すための手段であって、ここで、前記第１の電解質溶液が前記第１の初期リザーバモル浸透圧濃度とは異なる第１の電解質溶液モル浸透圧濃度を有し、それにより、前記初期ナノポアを前記膜から排出するように、前記第１の電解質リザーバが前記第１の初期モル浸透圧濃度とは異なる新規モル浸透圧濃度を有するようにする、前記手段；
第２の電解質溶液を前記第１の電解質リザーバに追加するための手段であって、ここで、前記第２の電解質溶液が前記複数の交換用ナノポアを含み、前記第２の電解質溶液が前記第１の電解質溶液モル浸透圧濃度よりも前記第２の初期モル浸透圧濃度に近い第２の電解質溶液モル浸透圧濃度を有する、前記手段；および、
前記複数の交換用ナノポアのうちの１つを前記膜内に挿入するように、電圧を前記膜にわたって印加するための手段；を含む、前記制御回路；
を備える、前記システムまたは機器。
【請求項１１】
モル浸透圧濃度の測定を記録するように構成される検出器をさらに備え、ここで、前記制御回路が好ましくは前記第１の電解質リザーバを出る廃水のモル浸透圧濃度の測定を記録するように構成される検出器に通信可能に接続される、請求項１０に記載のシステムまたは機器。
【請求項１２】
前記動作が、
前記測定を、前記第１の電解質リザーバ内への流入を制御するための事前選択されたモル浸透圧濃度と比較することをさらに含む、請求項１０または１１に記載のシステムまたは機器。
【請求項１３】
前記動作が、
前記測定が前記事前選択されたモル浸透圧濃度を超えるか、または等しい場合に、信号を生成すること；および、
前記信号に応答して前記第１の電解質溶液の流入を停止すること；
をさらに含む、請求項１２に記載のシステムまたは機器。
【請求項１４】
前記動作が、
前記事前選択されたモル浸透圧濃度が前記測定を超えるか、または等しい場合に、信号を生成すること；および、
前記信号に応答して前記第２の電解質溶液の流入を停止すること；
をさらに含む、請求項１２に記載のシステムまたは機器。
【請求項１５】
前記第１の電解質溶液の流入および前記第２の電解質溶液の追加を調節するように構成される１つまたは複数のバルブまたはポンプをさらに備え、ここで、前記制御回路が前記１つまたは複数のバルブまたはポンプの各々に通信可能に接続される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のシステムまたは機器。
【請求項１６】
初期ナノポア複合体が、前記初期ナノポア、初期テンプレート、および初期ポリメラーゼを含み、ここで、複数の交換用ナノポア複合体の各々が、前記複数の交換用ナノポアのうちの１つ、交換用テンプレート、および交換用ポリメラーゼを含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のシステムまたは機器。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]ナノポアベースの配列決定チップは、ＤＮＡ配列決定のために使用され得る分析ツールである。これらのデバイスは、アレイとして構成される大量のセンサセルを組み込むことができる。例えば、配列決定チップは、例えば、１０００行×１０００列のセルを有する、１００万セルのアレイを含むことができる。アレイの各セルは、膜、および内径が１ナノメートル程度のポアサイズを有するタンパク質ポアを含むことができる。そのようなナノポアは、迅速なヌクレオチド配列決定において効果的であることが示されている。
【０００２】
[0002]電圧電位が、導電性流体に浸漬されたナノポアを横断して印加されるとき、ナノポアにわたるイオン伝導に起因する小さなイオン電流が存在し得る。電流のサイズは、ポアサイズ、およびナノポア内に位置付けられた分子のタイプに対して感受性がある。分子は、特定のヌクレオチドに取り付けられた特定のタグであり得、それにより、核酸の特定の位置におけるヌクレオチドの検出を可能にする。ナノポアを含む回路内の電圧または他の信号は、分子の抵抗を測定するやり方で（例えば、積分コンデンサにおいて）測定され得、それによりナノポア内にある分子の検出を可能にする。
【０００３】
[0003]この配列決定が、配列決定チップナノポアの生化学的構成、およびそれらの複合テンプレート核酸に依存することから、チップ内のナノポア複合体の除去および交換は、追加の核酸分子の配列決定を可能にし得る。ポアを除去し、膜内に再挿入するための１つの方法は、パッチクランプ法と称される。しかしながら、パッチクランプ法の静浮力および起電力は、チップベースのセンサアレイ内に見られるポアおよび膜との互換性がない。他の標準技術もまた、脂質二重層膜内に挿入されたタンパク質ナノポアを、二重層の破損および再形成の必要性なしに、制御可能に除去するために使用することはできない。
【０００４】
[0004]したがって、改善されたポア除去および挿入技術が、膜破壊を引き起こさずに膜内のポアの交換を可能にするために望まれる。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]様々な実施形態は、ナノポアベースの配列決定チップ内のナノポアおよびナノポア複合体の除去および交換に関連した技術およびシステムを提供する。
【０００６】
[0006]１つの実施形態によると、第１の電解質溶液は、初期ナノポアを含む膜によって第２の電解質リザーバから隔てられる第１の電解質リザーバへ流される。第１のリザーバは、最初、第１の初期モル浸透圧濃度を有し、第２のリザーバは、第２の初期モル浸透圧濃度を有し、第１の電解質溶液は、第１の初期モル浸透圧濃度とは異なる第１の電解質溶液モル浸透圧濃度を有する。第１のリザーバへの第１の電解質溶液の流入は、第１の電解質リザーバモル浸透圧濃度を、第１の初期モル浸透圧濃度から、第２の初期モル浸透圧濃度とは異なる新規のモル浸透圧濃度へと変化させる。新規のモル浸透圧濃度と第２の初期モル浸透圧濃度との差は、膜が第２の電解質リザーバの方向にたわむこと、およびナノポアがこのたわみの結果として膜から排出されることを引き起こす。１つの例では、第１の電解質溶液モル浸透圧濃度の第１の初期モル浸透圧濃度に対する比は、１．０５〜１．５の範囲内にある。第２の電解質溶液は、第１の電解質リザーバへ連続的に流され、第２の電解質溶液が、複数の交換用ナノポアを含み、第２の電解質溶液が、第１の電解質溶液モル浸透圧濃度よりも第２の初期モル浸透圧濃度に近い第２の電解質溶液モル浸透圧濃度を有する。次いで、複数の交換用ナノポアのうちの１つが、膜内に挿入される。１つの実施形態において、この挿入は、膜にわたって電気穿孔電圧を印加することを含む。
【０００７】
[0007]他の実施形態は、本明細書に説明される方法と関連付けられたシステムおよびコンピュータ可読媒体に向けられる。例えば、いくつかの実施形態では、配列決定セルを更新するためのシステムは、配列決定セルの第１の電解質リザーバ、配列決定セルの第２の電解質リザーバ、および第１の電解質リザーバを第２の電解質リザーバから隔てる膜を含む流体チャンバーを含み、膜が、初期ナノポアを含み、第１の電解質リザーバが、第１の初期モル浸透圧濃度を有し、第２の電解質リザーバが、第２の初期モル浸透圧濃度を有する。本システムは、第１の電解質リザーバへの溶液の流入を制御するフローサブシステムと、複数の交換用ナノポアと、膜にわたって電圧を印加するように構成される電圧源と、電圧源およびフローサブシステムと通信可能に結合される制御回路とをさらに含む。制御回路は、第１の電解質溶液を第１の電解質リザーバに流すことであって、第１の電解質溶液が、第１の初期リザーバモル浸透圧濃度とは異なる第１の電解質溶液モル浸透圧濃度を有し、それにより、膜から初期ナノポアを排出するように、第１の電解質リザーバが、第１の初期モル浸透圧濃度とは異なる新規のモル浸透圧濃度を有するようにさせる、流すことと、第２の電解質溶液を第１の電解質リザーバに追加することであって、第２の電解質溶液が、複数の交換用ナノポアを含み、第２の電解質溶液が、第１の電解質溶液モル浸透圧濃度よりも第２の初期モル浸透圧濃度に近い第２の電解質溶液モル浸透圧濃度を有する、追加することと、複数の交換用ナノポアのうちの１つを膜内に挿入するように、膜にわたって電圧を印加することとを含む、動作を電圧源およびフローサブシステムに実施させる。いくつかの実施形態では、本システムは、モル浸透圧濃度の測定を記録するように構成される検出器をさらに含み、制御回路が、検出器に通信可能に接続される。いくつかの実施形態では、検出器は、第１の電解質リザーバを出る廃水のモル浸透圧濃度の測定を記録するように構成される。いくつかの実施形態では、動作は、測定を、第１の電解質リザーバ内への流入を制御するための事前選択されたモル浸透圧濃度と比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、動作は、測定が事前選択されたモル浸透圧濃度を超えるか、または等しい場合に、信号を生成することと、信号に応答して第１の電解質溶液の流入を停止することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、動作は、事前選択されたモル浸透圧濃度が測定を超えるか、または等しい場合に、信号を生成することと、信号に応答して第２の電解質溶液の流入を停止することとをさらに含む。いくつかの実施形態では、本システムは、第１の電解質溶液の流入および第２の電解質溶液の追加を調節するように構成される１つまたは複数のバルブまたはポンプをさらに含み、制御回路が、１つまたは複数のバルブまたはポンプの各々に通信可能に接続される。いくつかの実施形態では、初期ナノポア複合体は、初期ナノポア、初期テンプレート、および初期ポリメラーゼを含み、複数の交換用ナノポア複合体の各々が、複数の交換用ナノポアのうちの１つ、交換用テンプレート、および交換用ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、電圧源は交流電圧源である。
【０００８】
[0008]本発明の実施形態の性質および利点のより良い理解は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】[0009]ナノポアセルのアレイを備えるナノポアセンサチップの一実施形態の上面図である。
【図２】[0010]ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを特徴づけるために使用され得る、ナノポアセンサチップ内のナノポアセルの一実施形態である。
【図３】[0011]ナノポアベースの、合成による配列決定（ナノ−ＳＢＳ）技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するナノポアセルの一実施形態である。
【図４】[0012]ナノポアセル内の電気回路の一実施形態である。
【図５】[0013]ＡＣサイクルの明期間および暗期間中のナノポアセルから取得されたデータポイントの例である。
【図６−１】[0014]図６Ａは、一実施形態に従う方法の時間ｔ１において、初期ナノポアがナノポアベースの配列決定チップのセル内のウェル全体に及ぶ脂質二重層内へ挿入されることを例証する図である。[0015]図６Ｂは、時間ｔ２において、ウェル溶液のモル浸透圧濃度よりも低いモル浸透圧濃度を有する第１の電解質溶液が、ウェルの外側のリザーバ内へ流され、水がウェルから外部リザーバ内へ流れるようにすることを例証する図である。[0016]図６Ｃは、時間ｔ３において、脂質二重層の形状が、初期ナノポアを排出するのに十分な程度にまで変化したことを例証する図である。
【図６−２】[0017]図６Ｄは、時間ｔ４において、交換用ナノポア、および初期ウェル溶液のモル浸透圧濃度と同一または類似するモル浸透圧濃度を有する第２の電解質溶液が、ウェルの外側のリザーバ内へ流され、水が外部リザーバからウェル内へ流れるようにすることを例証する図である。[0018]図６Ｅは、時間ｔ５において、脂質二重層の形状が、その元の構成に実質的に復元されたことを例証する図である。[0019]図６Ｆは、時間ｔ６において、交換用ポアが脂質二重層内へ挿入されたことを例証する図である。
【図７】[0020]一実施形態に従って膜内のナノポアを交換するためのプロセスのフローチャートである。
【図８】[0021]本開示のある態様に従うフローシステムを示す図である。
【図９Ａ】[0022]ポア交換法の適用なしでの、ナノポアベースの配列決定チップのセルについての２つの独立したｋｆｃ値測定間の関係をプロットするグラフである。
【図９Ｂ】[0023]２つの測定間における一実施形態に従うポア交換法の適用ありでの、ナノポアベースの配列決定チップのセルについての２つの独立したｋｆｃ値測定間の関係をプロットするグラフである。
【図１０Ａ】[0024]ナノポアの排出および交換なしでの配列決定セルについての経時的なＡＤＣ数をプロットするグラフである。
【図１０Ｂ】[0025]一実施形態に従うナノポアの排出および交換ありでの配列決定セルについての経時的なＡＤＣ数をプロットするグラフである。
【図１１】[0026]本開示に従うある態様に従うコンピュータシステムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
用語
[0027]別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語は、当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものに類似するまたは等価の方法、デバイス、および材料が、開示された技術の実践において使用され得る。以下の用語は、頻繁に使用される特定の用語の理解を促進するために提供され、本開示の範囲を制限することは意味しない。本明細書で使用される略語は、化学および生物学分野内での慣習的な意味を有する。
【００１１】
[0028]「ナノポア」は、膜内に形成される、または別のやり方で提供される、ポア、チャネル、または通路を指す。膜は、脂質二重層などの有機膜、または高分子材料で形成される膜などの合成膜であり得る。ナノポアは、例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路など、検知回路、または検知回路に結合される電極に隣接または近接して配置され得る。いくつかの例では、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）程度から約１０００ｎｍの特徴的な幅または直径を有する。いくつかの実装形態において、ナノポアは、タンパク質であり得る。
【００１２】
[0029]「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本または二本鎖のいずれかの形態の、その重合体を指す。この用語は、合成、自然発生的、非自然発生的であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の挙動で代謝する、周知のヌクレオチドの類似物または修飾された主鎖の残基もしくは連鎖を含む核酸を包含する。そのような類似物の例は、それだけには限らないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイト、メチルホスホン酸塩、キラルメチルホスホン酸塩、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。別途示されない限り、特定の核酸配列はまた、暗示的に、保存的に修飾されたその変異体（例えば、変性コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示される配列を包含する。具体的には、変性コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１−９８  （１９９４））。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと交換可能に使用され得る。
【００１３】
[0030]用語「ヌクレオチド」は、自然発生リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマーを指すことに加えて、文脈が明確に別途示さない限り、ヌクレオチドが使用されている特定の文脈（例えば、相補的塩基へのハイブリッド形成）に関して機能的に等価である、派生物および類似物を含む、それらの関連した構造変異体を指すことが理解され得る。
【００１４】
[0031]用語「タグ」は、原子もしくは分子であり得る検出可能な部分、または原子もしくは分子の集まりを指す。タグは、光学、電気化学、磁気、または静電（例えば、誘導的、容量的）サインを提供することができ、このサインは、ナノポアの助けを借りて検出され得る。典型的には、ヌクレオチドがタグに取り付けられると、これは、「タグ付きヌクレオチド」と呼ばれる。タグは、リン酸塩部分を介してヌクレオチドに取り付けられ得る。
【００１５】
[0032]用語「鋳型」は、ＤＮＡ合成のためのＤＮＡヌクレオチドの相補的鎖へ複製される一本鎖核酸分子を示す。場合によっては、鋳型は、ｍＲＮＡの合成中に複製されるＤＮＡの配列を示し得る。
【００１６】
[0033]用語「プライマ」は、ＤＮＡ合成の開始点を提供する短い核酸配列を示す。ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ合成を触媒する酵素は、新たなヌクレオチドをＤＮＡ複製用プライマに加え得る。
【００１７】
[0034]「ポリメラーゼ」は、ポリヌクレオチドのテンプレート標的合成を実施する酵素を指す。この用語は、完全長ポリペプチド、およびポリメラーゼ活性を有するドメインの両方を包含する。ＤＮＡポリメラーゼは、当業者にはよく知られており、パイロコッカス・フリオサス、テルモコッカス・リトラリス、およびサーモトガ・マリティメ、またはそれらの修飾されたバージョンから単離または派生されるＤＮＡポリメラーゼを含むが、これに限定されない。それらは、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、および逆転写酵素などのＲＮＡ依存性ポリメラーゼの両方を含む。少なくとも５つのファミリーのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが知られているが、大半はファミリーＡ、Ｂ、およびＣに分類される。様々なファミリー間で配列類似性は、ほとんどあるいは全く存在しない。大半のファミリーＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性、および５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性などの複数の酵素機能を含むことができる単鎖タンパク質である。ファミリーＢポリメラーゼは、典型的には、ポリメラーゼおよび３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有する単一触媒ドメイン、ならびにアクセサリー因子を有する。ファミリーＣポリメラーゼは、典型的には、重合および３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有するマルチサブユニットタンパク質である。大腸菌においては、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ファミリーＡ）、ＩＩ（ファミリーＢ）、およびＩＩＩ（ファミリーＣ）という３つのタイプのＤＮＡポリメラーゼが発見されている。真核細胞においては、ＤＮＡポリメラーゼα、δ、およびεという３つの異なるファミリーＢポリメラーゼが核複製に関与し、ポリメラーゼγというファミリーＡポリメラーゼが、ミトコンドリアＤＮＡ複製に使用される。他のタイプのＤＮＡポリメラーゼとしては、ファージポリメラーゼが挙げられる。同様に、ＲＮＡポリメラーゼは、典型的には、真核性ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ、また、バクテリアＲＮＡポリメラーゼ、ならびにファージおよびウイルスポリメラーゼを含む。ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性およびＲＮＡ依存性であり得る。
【００１８】
[0035]用語「明期間」は、通常、タグ付けされたヌクレオチドのタグが、ＡＣ信号を通して印加される電界によってナノポア内に押し込まれる期間を指す。用語「暗期間」は、通常、タグ付けされたヌクレオチドのタグが、ＡＣ信号を通して印加される電界によってナノポア外に押し出される期間を指す。ＡＣサイクルは、明期間および暗期間を含み得る。異なる実施形態では、ナノポアセルを明期間（または暗期間）内に入れるためにナノポアセルに印加される電圧信号の極性は、異なり得る。
【００１９】
[0036]用語「信号値」は、配列決定セルから出力される配列決定信号の値を指す。特定の実施形態によると、配列決定信号は、１つまたは複数の配列決定セルの回路内のある地点から測定および／または出力される電気信号であり、例えば、信号値は、電圧または電流である（またはそれを表す）。信号値は、電圧および／もしくは電流の直接測定の結果を表すことができ、ならびに／または、間接測定を表し得、例えば、信号値は、電圧もしくは電流が指定の値に達するまでにかかる時間の測定された継続時間であってもよい。信号値は、ナノポアの抵抗性と相関する任意の測定可能な量を表し得、そこから、ナノポア（充填されたおよび／または充填されていない）の抵抗性および／またはコンダクタンスが導出され得る。別の例として、信号値は、例えば、ポリメラーゼを有する核酸に追加されているヌクレオチドに取り付けられたフルオロフォアからの光強度に対応し得る。
【００２０】
[0037]浸透圧濃度としても知られる、用語「モル浸透圧濃度」は、溶質濃度の尺度を指す。モル浸透圧濃度は、溶液の単位体積あたりの溶質粒子のオスモルの数を測定する。オスモルは、溶液の浸透圧に寄与する溶質のモルの数の尺度である。モル浸透圧濃度は、溶液の浸透圧の測定、および、溶媒が、異なる浸透圧濃度２つの溶液を分ける半透性膜（浸透性）にわたってどのように拡散するかの決定を可能にする。
【００２１】
[0038]用語「オスモライト」は、溶液内へ溶け出すと、溶液のモル浸透圧濃度を増大させる任意の可溶性化合物を指す。
【００２２】
[0039]特定の実施形態によると、本明細書に開示される技術およびシステムは、脂質二重層膜などの膜内のポアの除去および挿入に関する。ナノポアベースの配列決定チップを用いたＤＮＡ配列決定などの応用において、膜二重層を再形成する必要なしにポリメラーゼ−ポア複合体を除去し、交換する能力は、増大した分析物スループットを可能にし得る。しかしながら、主として静浮力または起電力を伴うものなどの標準的なポア除去法は、典型的には、膜の崩壊または破壊を引き起こす。そして、これらの膜の再形成は、いくつかの追加のステップを伴い、複雑性を増大させ、プロセスの効率を減少させる。
【００２３】
[0040]これらの問題に対処するため、本明細書に提供される方法は、膜（例えば、脂質二重層）の形状を、膜内に挿入されたポアがもはや安定せず、自然発生的に排出するところまで、非破壊的に変更するために使用され得る。このような膜の変形は、膜の片側の溶液を、元の溶液のモル浸透圧濃度とは異なるモル浸透圧濃度を有する新規の溶液と交換することによって達成される。ポアが排出された後、溶液の元の浸透圧条件は復元され得、膜の破損を引き起こすことなく膜をその元の形状に戻す。次いで、新規のポアが、除去されたポアと交換するために、膜内に挿入され得る。本方法の体積および濃度スケールが理由で、排出されたポアが、これが除去された同じ膜内に再挿入する可能性は、ほとんどないくらいに小さくなり得る。本明細書に開示されるポア取り換え技術は、一般的には単一分子センサアレイのスループット、具体的にはナノポアベースの配列決定チップのスループットを増大させるために使用され得る。
【００２４】
[0041]例となるナノポアシステム、回路、および配列決定動作が最初に説明され、その後に、ＤＮＡ配列決定セル内のナノポアを交換するための例となる技術が続く。本発明の実施形態は、コンピュータ可読記憶媒体ならびに／またはプロセッサ、例えば、プロセッサに結合されたメモリに格納されるおよび／もしくはこれによって提供される命令を実行するように構成されるプロセッサ、上に具現化された、プロセス、システム、およびコンピュータプログラム製品など、多数のやり方で実施され得る。
【００２５】
Ｉ．ナノポアベースの配列決定チップ
[0042]図１は、ナノポアセル１５０のアレイ１４０を備えるナノポアセンサチップ１００の一実施形態の上面図である。各ナノポアセル１５０は、ナノポアセンサチップ１００のシリコン基板上に集積化された制御回路を備える。いくつかの実施形態では、側壁１３６は、アレイ１４０に含まれ、ナノポアセル１５０のグループを分離し、その結果、各グループは、特徴づけのための異なるサンプルを受け取ることができる。各ナノポアセルは、核酸を配列決定するために用いられ得る。いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ１００は、カバープレート１３０を含む。いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ１００は、コンピュータプロセッサなどの他の回路とインタフェースするための複数のピン１１０も含む。
【００２６】
[0043]いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ１００は、例えばマルチチップモジュール（ＭＣＭ）またはシステムインパッケージ（ＳｉＰ）などのように同一のパッケージ内に複数チップを含む。チップは、例えば、メモリ、プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、データコンバータ、高速Ｉ／Ｏインタフェースなどを含み得る。
【００２７】
[0044]いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ１００は、本明細書で開示されるプロセスの多様な実施形態を実行する（例えば、自動的に実行する）ための多様な構成要素を含み得るナノチップワークステーション１２０に結合され（例えば、ドッキングされ）る。これらのプロセスは、例えば、脂質懸濁液もしくは他の膜構造化懸濁液、分析物溶液、および／または他の液体、懸濁液、もしくは固体を送達するためのピペットなどの分析物送達メカニズムを含み得る。ナノチップワークステーション構成要素は、ロボットアーム、１つもしくは複数のコンピュータプロセッサ、および／またはメモリをさらに含み得る。複数のポリヌクレオチドが、ナノポアセル１５０のアレイ１４０上で検出され得る。いくつかの実施形態では、各々のナノポアセル１５０は、個別にアドレス可能である。
【００２８】
ＩＩ．ナノポア配列決定セル
[0045]ナノポアセンサチップ１００内のナノポアセル１５０は、多数の異なる方法で実施され得る。例えば、いくつかの実施形態では、異なるサイズおよび／または化学的構造のタグが、配列決定されるために、核酸分子内の異なるヌクレオチドに取り付けられる。いくつかの実施形態では、配列決定されることになる核酸分子の鋳型への相補鎖が、別の仕方で重合体がタグ付けされたヌクレオチドを鋳型とハイブリッド形成することによって、合成され得る。いくつかの実施態様では、核酸分子および取り付けられたタグは、両方ともナノポアを通り移動し、ナノポアを通過するイオン電流が、ヌクレオチドに取り付けられたタグの個々のサイズおよび／または構造によって、ナノポア内に存在するヌクレオチドを示し得る。いくつかの実施態様では、タグだけが、ナノポア内へ移動する。ナノポア内で異なるタグを検出するために、多数の異なる方法も存在し得る。
【００２９】
Ａ．ナノポア配列決定セル構造
[0046]図２は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを特徴づけるために使用され得る、図１のナノポアセンサチップ１００内のナノポアセル１５０のような、ナノポアセンサチップ内の一例のナノポアセル２００の一実施形態を示す。ナノポアセル２００は、誘電体層２０１および２０４から形成されたウェル２０５と、ウェル２０５を覆って形成された脂質二重層２１４と、脂質二重層２１４上の、脂質二重層２１４によってウェル２０５から分離された試料チャンバー２１５とを、含み得る。ウェル２０５は、ある体積の電解質２０６を収容し得て、試料チャンバー２１５は、例えば、可溶性タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）などのナノポア、および対象の分析物（例えば、配列決定されることになる核酸分子）を収容するバルク電解質２０８を保持し得る。
【００３０】
[0047]ナノポアセル２００は、ウェル２０５の底部に作用電極２０２と、試料チャンバー２１５内に配置された対電極２１０とを含み得る。信号源２２８は、電圧信号を作用電極２０２と対電極２１０との間に印加し得る。単一のナノポア（例えば、ＰＮＴＭＣ）が、電圧信号による電気穿孔法プロセスによって脂質二重層２１４内へと挿入され、それにより脂質二重層２１４内のナノポア２１６を形成し得る。アレイ内の個々の膜（例えば、脂質二重層２１４または他の膜構造）は、化学的にも電気的にも互いに接続されていないこともある。それゆえ、アレイ内の各ナノポアセルは、独立した配列決定機械であり、対象の分析物に対して作用し、そうでなければ不透過性の脂質二重層を介してイオン電流を調節するナノポアに関連付けられる、単一のポリマー分子に固有のデータを生成する。
【００３１】
[0048]図２に示すように、ナノポアセル２００は、シリコン基板などの基板２３０上に形成され得る。誘電体層２０１は、基板２３０上に形成され得る。誘電体層２０１を形成するために用いられる誘電体材料は、例えば、ガラス、酸化物、窒化物、その他を含み得る。電気的刺激を制御し、ナノポアセル２００から検出されるデータを処理する電気回路２２２は、基板２３０上および／または誘電体層２０１内部に形成され得る。例えば、複数のパタニングされた金属層（例えば、金属１〜金属６）が、誘電体層２０１内に形成され、複数の能動デバイス（例えば、トランジスタ）が、基板２３０上に製造され得る。いくつかの実施形態では、信号源２２８は、電気回路２２２の一部に含まれる。電気回路２２２は、例えば、増幅器、積算器、アナログデジタル変換器、ノイズフィルタ、フィードバック制御ロジック、および／または多様な他の構成要素を含み得る。電気回路２２２は、メモリ２２６に結合されたプロセッサ２２４にさらに結合され得て、ここでプロセッサ２２４は、アレイ内に配列されている重合体分子の配列を決定するために、配列決定データを分析することができる。
【００３２】
[0049]作用電極２０２は、誘電体層２０１上に形成され、ウェル２０５の底部の少なくとも一部を形成し得る。いくつかの実施形態では、作用電極２０２は、金属電極である。非ファラデー性伝導のために、作用電極２０２は、腐食および酸化に耐性を示す、例えば、白金、金、チタン窒化物、およびグラファイトなどの金属または他の材料で形成され得る。例えば、作用電極２０２は、電気めっきを用いた白金電極であってもよい。別の実施例では、作用電極２０２は、チタン窒化物（ＴｉＮ）作用電極であってもよい。作用電極２０２は、多孔質であってもよく、それによりその表面積および結果として生じる作用電極２０２に付随するキャパシタンスを増大させ得る。ナノポアセルの作用電極は、別のナノポアセルの作用電極から独立していることもあることから、作用電極は、本開示内でセル電極と呼ばれ得る。
【００３３】
[0050]誘電体層２０４は、誘電体層２０１上に形成され得る。誘電体層２０４は、ウェル２０５を囲む壁を形成する。誘電体層２０４を形成するために用いられる誘電体材料は、例えば、ガラス、酸化物、シリコン一窒化物（ＳｉＮ）、ポリイミド、または他の適切な疎水性の絶縁材料を含み得る。誘電体層２０４の上面は、シラン処理され得る。シラン処理は、誘電体層２０４の上面の上に疎水性層２２０を形成し得る。いくつかの実施形態では、撥水性層２２０は、約１．５ナノメートル（ｎｍ）の厚さを有する。
【００３４】
[0051]誘電体層壁２０４によって形成されるウェル２０５は、作用電極２０２の上の電解質２０６の体積を含む。電解質２０６の体積は、緩衝性を有し、以下の、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つまたは複数を含み得る。いくつかの実施形態では、電解質２０６の体積は、約３マイクロメートル（μｍ）の厚さを有する。
【００３５】
[0052]図２にも示すように、膜は、誘電体層２０４の上面に形成され得、ウェル２０５全体に及ぶ。いくつかの実施形態では、膜は、疎水性層２２０の上面に形成された脂質単一層２１８を含む。膜がウェル２０５の開口に達したとき、脂質単一層２０８は、ウェル２０５の開口全体に及ぶ脂質二重層２１４に遷移し得る。脂質二重層は、例えば、ジフィタノイル−ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ）、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイル−ホスファチジル−メチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−３５０］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−７５０］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−１０００］、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ラクトシル、ＧＭ１ガングリオシド、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）またはその任意の組合せから選択されるリン脂質などの、脂質を含み、またはそれらから構成され得る。例えば、ホスファチジン酸誘導体（例えば、ＤＭＰＡ、ＤＤＰＡ、ＤＳＰＡ）、ホスファチジルコリン誘導体（例えば、ＤＤＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＥＰＣ）、ホスファチジルグリセロール誘導体（例えば、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＰＯＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン誘導体（例えば、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ）、ホスファチジルセリン誘導体（例えば、ＤＯＰＳ）、ＰＥＧリン脂質誘導体（例えば、ｍＰＥＧ−リン脂質、ポリグリセリン−リン脂質、官能化リン脂質、末端活性リン脂質）、ジフィタノイルリン脂質（例えば、ＤＰｈＰＣ、ＤＯＰｈＰＣ、ＤＰｈＰＥ、およびＤＯＰｈＰＥ）などの、他のリン脂質誘導体もまた使用され得る。いくつかの実施形態では、二重層は、両親媒性ブロック共重合体（例えば、ポリ（ブタジエン）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）、ＰＥＧジブロック共重合体、ＰＥＧトリブロック共重合体、ＰＰＧトリブロック共重合体、およびポロクサマー）、および、非イオン性またはイオン性であり得る他の両親媒性共重合体など、非脂質ベースの材料を使用して形成され得る。いくつかの実施形態では、二重層は、脂質ベースの材料および非脂質ベースの材料の組合せから形成され得る。いくつかの実施形態では、二重層材料は、アルカン（例えば、デカン、トリデカン、ヘキサデカンなど）などの１つもしくは複数の有機溶媒、および／または１つもしくは複数のシリコーンオイル（例えば、ＡＲ−２０）を含む、溶媒相で送達され得る。
【００３６】
[0053]示したように脂質二重層２１４には、例えば、単一のＰＮＴＭＣによって形成された単一のナノポア２１６が埋め込まれる。上述のように、ナノポア２１６は、単一のＰＮＴＭＣを脂質二重層２１４内に電気穿孔法によって挿入することによって、形成され得る。ナノポア２１６は、対象の分析物および／または小さなイオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−）の少なくとも一部分を脂質二重層２１４の両側間を通過させるのに十分に大きくてもよい。
【００３７】
[0054]試料チャンバー２１５は、脂質二重層２１４を覆っており、特徴づける対象の分析物の溶液を保持し得る。溶液は、バルク電解質２０８を含み、最適なイオン濃度への緩衝性を有し、ナノポア２１６を開口状態に維持するために最適なｐＨに維持された水性溶液であり得る。ナノポア２１６は、脂質二重層２１４を横切り、バルク電解質２０８から作用電極２０２へのイオン流のための唯一の経路を提供する。ナノポア（例えば、ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物に加えて、バルク電解質２０８は、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つまたは複数をさらに含み得る。
【００３８】
[0055]対電極（ＣＥ）２１０は、電気化学的電位センサであり得る。いくつかの実施形態では、対電極２１０は、複数ナノポアセル間で共有され、それゆえ、共通電極とも称される。いくつかの場合では、共通の電位および共通電極は、全てのナノポアセルに対して、または少なくとも個々のグループ内の全てのナノポアセルに対して共通であり得る。共通電極は、共通の電位を、ナノポア２１６と接触するバルク電解質２０８に印加するように構成可能である。対電極２１０および作用電極２０２は、脂質二重層２１４を横断する電気的刺激（例えば、電圧バイアス）を供給するための信号源２２８に結合され、脂質二重層２１４の電気的特性（例えば、抵抗、電気容量、およびイオン電流）を検知のために用いられ得る。いくつかの実施形態では、ナノポアセル２００は、参照電極２１２も含み得る。
【００３９】
[0056]いくつかの実施形態では、多様なチェックが、較正の一部としてナノポアセルの作成中に実施される。ナノポアセルが作成された後、さらなる較正ステップが、例えば、所望されるように（例えば、セル中に１ナノポア）実行しているナノポアセルを識別するために、実行されてもよい。そのような較正チェックは、物理的チェック、電圧較正、開放流路較正、および単一のナノポアを有するセルの識別を含み得る。
【００４０】
Ｂ．ナノポア配列決定セルの信号検出
[0057]ナノポアセンサチップ１００内のナノポアセル１５０などのナノポアセンサチップ内のナノポアセルは、合成による単分子ナノポアベースの配列決定（ナノ−ＳＢＳ）技術を用いる並行配列決定を可能にし得る。
【００４１】
[0058]図３は、ナノ−ＳＢＳ技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するナノポアセル３００の一実施形態を示す。ナノ−ＳＢＳ技術では、配列決定されることになる鋳型３３２（例えば、ヌクレオチド酸分子または別の対象の分析物）およびプライマは、ナノポアセル３００の試料チャンバー内のバルク電解質３０８内に導入され得る。例として、鋳型３３２は、円形状または直線状であり得る。核酸プライマは、４つの別の仕方で重合体がタグ付けされたヌクレオチド３３８が付加され得る、鋳型３３２の一部にハイブリッド形成され得る。
【００４２】
[0059]いくつかの実施形態では、酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ３３４）が、鋳型３３２への相補鎖を合成するのに用いるナノポア３１６に関連付けられる。例えば、ポリメラーゼ３３４は、ナノポア３１６に共有結合していてもよい。ポリメラーゼ３３４は、ヌクレオチド３３８のプライマ上への、一本鎖核酸分子を鋳型として用いる取り込みを触媒する。ヌクレオチド３３８は、４つの異なるタイプＡ、Ｔ、ＧまたはＣのうちの１つであるヌクレオチドを伴うタグ種（「タグ」）を含み得る。タグ付けされたヌクレオチドが、ポリメラーゼ３３４と正しく複合体を形成するとき、タグは、電気的な力、例えば、脂質二重層３１４および／またはナノポア３１６を横断して印加される電圧により生成される電界の存在下で生成される力によってナノポア内に引き込まれ（例えば、装填され）得る。タグの尾部は、ナノポア３１６の筒内に位置決めされ得る。ナノポア３１６の筒内に保たれるタグは、タグの別個の化学的な構造および／またはサイズにより、固有のイオン遮断信号３４０を生成し、それにより、タグが取り付けられた付加された塩基を、電子的に同定する。
【００４３】
[0060]本明細書で用いられるとき、「装填された」または「充填された」タグは、認識可能な長さの時間、例えば、０．１ミリ秒（ｍｓ）から１００００ｍｓの間、ナノポア内に位置決めされる、および／または、ナノポア内または近くに留まるタグである。いくつかの場合では、タグは、ヌクレオチドから放出される前に、ナノポア内に装填される。いくつかの例では、装填されたタグが、ヌクレオチド組み込み事象の際に放出された後にナノポアを通過する（および／またはナノポアにより検出される）確率が適度に高く、例えば９０％から９９％である。
【００４４】
[0061]いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ３３４がナノポア３１６に接続される前に、ナノポア３１６のコンダクタンスは、例えば約３００ピコジーメンス（３００ｐＳ）のように高い。タグがナノポア内に装填されるとき、固有のコンダクタンス信号（例えば、信号３４０）は、タグの別個の化学構造および／またはサイズにより生成される。例えば、ナノポアのコンダクタンスは、約６０ｐＳ、８０ｐＳ、１００ｐＳまたは１２０ｐＳであり、それぞれは、タグ付けされたヌクレオチドの４つのタイプのうちの１つに対応する。ポリメラーゼは、次に異性化およびリン酸基転移反応を経て、ヌクレオチドを成長している核酸分子内に組み込み、タグ分子を放出する。
【００４５】
[0062]いくつかの場合では、タグ付けされたヌクレオチドのいくつかは、核酸分子（鋳型）の目下の位置（相補的塩基）と一致し得ない。核酸分子と塩基対合されていないタグ付けされたヌクレオチドも、ナノポアを通過し得る。これらの対合されていないヌクレオチドは、典型的には、正しく対合されたヌクレオチドがポリメラーゼと結合したままである時間スケールより短い時間スケール内で、ポリメラーゼによって拒絶される。対合されていないヌクレオチドに結合されたタグは、ナノポアを迅速に通過し、短期間（例えば、１０ｍｓ未満）の間検出され得て、一方、対合したヌクレオチドに結合されたタグは、ナノポア内に装填され、長期間（例えば、少なくとも１０ｍｓ）の間検出され得る。それゆえ、対合されていないヌクレオチドは、ヌクレオチドがナノポア内で検出される時間に少なくとも部分的に基づいて、下流のプロセッサによって識別され得る。
【００４６】
[0063]装填された（充填された）タグを含むナノポアのコンダクタンス（または等価的に抵抗）が、単一の値（例えば、ナノポアを通過する電圧または電流）を介して測定され得て、タグ種の識別、それによる目下の位置にあるヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、直流（ＤＣ）信号が、ナノポアセルに印加される（例えば、タグがナノポアを通って移動する方向が反転しないように）。しかし、直流を用いた長期間のナノポアセンサの運転は、電極の組成を変化させ得て、ナノポア全体のイオン濃度を不平衡にさせ、ナノポアセルの寿命に影響し得る他の望ましくない効果を有し得る。交流（ＡＣ）波形を印加することは、電界移動を低減し、これらの望ましくない効果を回避し、下記のある一定の利点を有し得る。タグ付けされたヌクレオチドを利用する本明細書で説明される核酸配列決定方法は、印加されるＡＣ電圧に完全に共存可能であり、それゆえＡＣ波形が、これらの利点を達成するために用いられ得る。
【００４７】
[0064]ＡＣ検出サイクルの間に電極を再充電する能力は、犠牲電極、電流通過反応で分子特性を変化させる電極（例えば、銀を含む電極）、または電流通過反応で分子特性を変化させる電極が使用されるとき、有益であり得る。電極は、直流信号が使用されるとき、検出サイクル中に消耗し得る。再充電は、電極が小さいとき（例えば、平方ミリメートル当たり少なくとも５００の電極を有する電極アレイに供給するために十分に小さいとき）問題になり得る、電極が完全に枯渇するなどの消耗限界に到達することを防止し得る。電極寿命は、場合によっては、電極幅と共に進み、少なくとも部分的に、それに依存する。
[0065]ナノポアを通過するイオン電流を測定する好適な状態は、当技術分野で知られており、例が本明細書で提供される。測定は、膜および細孔を横断して印加される電圧により実行され得る。いくつかの実施形態では、電圧は、−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶの範囲にある。用いられる電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶ、および０ｍＶから選択される下限と、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶ、および＋４００ｍＶから別々に選択される上限とを有する範囲にあることが好ましい。用いられる電圧は、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲にあることがさらに好ましく、１６０ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲にあることが最も好ましい。増大された印加電位を用いたナノポアによって異なるヌクレオチド間の識別能力を増大させることが可能である。ＡＣ波形およびタグ付けされたヌクレオチドを用いた核酸の配列決定は、その全体が引用することにより本明細書に組み込まれる、２０１３年１１月６日に提出された「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｇｓ（タグを用いた核酸配列決定）」という名称の米国特許公開第ＵＳ２０１４／０１３４６１６で説明されている。米国２０１４／０１３４６１６で説明されたタグ付けされたヌクレオチドに加えて、配列決定は、例えば、５つの一般的な核酸塩基、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、およびチミンの（Ｓ）−グリセロール・ヌクレオシド・三リン酸塩（ｇＮＴＰｓ）などの糖または非環式の部分を欠く、ヌクレオチド類似物を用いて実行され得る（Ｈｏｒｈｏｔａら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、８：５３４５−５３４７［２００６］）。
【００４８】
Ｃ．ナノポア配列決定セルの電気回路
[0066]図４は、ナノポアセル４００などのナノポアセル内の電気回路４００（図２の電気回路２２２の一部分を含み得る）の一実施形態を示す。上述のように、いくつかの実施形態では、電気回路４００は、ナノポアセンサチップ内の複数のナノポアセルまたは全てのナノポアセル間で共有され得、それゆえ、共通電極とも称され得る対電極４１０を含む。共通電極は、電圧源ＶＬＩＱ４２０に接続することによって、共通の電位を、ナノポアセル内の脂質二重層（例えば、脂質二重層２１４）と接触するバルク電解質（例えば、バルク電解質２０８）に印加するように構成されることが可能である。いくつかの実施形態では、ＡＣ非ファラデー性モードが、電圧ＶＬＩＱをＡＣ信号（例えば、方形波）で変調するために利用され、それをナノポアセル内で脂質二重層に接触するバルク電解質に印加する。いくつかの実施形態では、ＶＬＩＱは、±２００〜２５０ｍＶの大きさおよび例えば２５〜４００Ｈｚの周波数を有する方形波である。対電極４１０と脂質二重層（例えば、脂質二重層２１４）との間のバルク電解質は、例えば１００μＦ以上などの大きなコンデンサ（図示せず）によってモデル化され得る。
【００４９】
[0067]図４は、作用電極４０２（例えば、作用電極２０２）および脂質二重層（例えば、脂質二重層２１４）の電気特性を表す電気モデル４２２も示す。電気モデル４２２は、脂質二重層に関連付けられたキャパシタンスをモデル化するコンデンサ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ）と、ナノポア内の個々のタグの存在に基づいて変化し得る、ナノポアに関連付けられた可変抵抗をモデル化する抵抗器４２８（ＲＰＯＲＥ）とを含む。電気モデル４２２は、２重層キャパシタンス（ＣＤｏｕｂｌｅ  Ｌａｙｅｒ）を有し、作用電極４０２およびウェル２０５の電気特性を表すコンデンサ４２４も含む。作用電極４０２は、他のナノポアセル内の作用電極から独立した別個の電位を印加するように構成され得る。
【００５０】
[0068]パスデバイス４０６は、脂質二重層および作用電極を電気回路４００から接続または切断するために使用され得るスイッチである。パスデバイス４０６は、電圧刺激がナノポアセル内の脂質二重層を横断して印加されることを有効化または無効化するために、制御線４０７によって制御され得る。脂質が、脂質二重層を形成するために堆積される前では、２つの電極間のインピーダンスは、セルのウェルが封止されていないため、非常に低く、それゆえパスデバイス４０６は、短絡状態を回避するために開路に維持され得る。パスデバイス４０６は、脂質溶媒がナノポアセルに堆積されてナノポアセルのウェルを封止した後、閉じられ得る。
【００５１】
[0069]回路４００は、オンチップ積分コンデンサ４０８（ｎｃａｐ）をさらに含み得る。積分コンデンサ４０８は、リセット信号４０３を使用しスイッチ４０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ４０８が電圧源ＶＰＲＥ４０５に接続されることによって、事前充電され得る。いくつかの実施形態では、電圧源ＶＰＲＥ４０５は、例えば、９００ｍＶの大きさの固定の参照電圧を提供する。スイッチ４０１が閉じられているとき、積分コンデンサ４０８は、電圧源ＶＰＲＥ４０５の参照電圧レベルまで事前充電され得る。
【００５２】
[0070]積分コンデンサ４０８が事前充電された後、リセット信号４０３が使用されスイッチ４０１が開路され、その結果、積分コンデンサ４０８は、電圧源ＶＰＲＥ４０５から切断される。この時点では、電圧源ＶＬＩＱのレベルにより、対電極４１０の電位は、作用電極４０２（および積分コンデンサ４０８）の電位より高いレベルにあるか、その反対でもあり得る。例えば、電圧源ＶＬＩＱからの方形波の正位相の間（例えば、ＡＣ電圧源信号サイクルの明または暗期間）、対電極４１０の電位は、作用電極４０２の電位より高いレベルにある。電圧源ＶＬＩＱからの方形波の負位相の間（例えば、ＡＣ電圧源信号サイクルの暗または明期間）、対電極４１０の電位は、作用電極４０２の電位より低いレベルにある。したがって、いくつかの実施形態では、積分コンデンサ４０８は、対電極４１０と作用電極４０２との間の電位差により、明期間の間に電圧源ＶＰＲＥ４０５の事前充電された電圧レベルからさらに高いレベルまで充電され、暗期間中により低いレベルに放電され得る。他の実施形態では、充電および放電は、それぞれ暗期間および明期間に発生する。
【００５３】
[0071]積分コンデンサ４０８は、１ｋＨｚ、５ｋＨｚ、１０ｋＨｚ、１００ｋＨｚ、またはそれを超え得る、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）４３５のサンプリング速度による固定された期間に、充電または放電され得る。例えば、１ｋＨｚのサンプリング速度で、積分コンデンサ４０８は、約１ｍｓの期間中、充電／放電し、次に、電圧レベルがサンプリングされ、積分期間の終わりにＡＤＣ４３５によって変換され得る。個々の電圧レベルは、ナノポア内の個々のタグ種に対応し、それゆえ、鋳型上の目下の位置でのヌクレオチドに対応し得る。
【００５４】
[0072]ＡＤＣ４３５によるサンプリングされた後、積分コンデンサ４０８は、リセット信号４０３を使用しスイッチ４０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ４０８が電圧源ＶＰＲＥ４０５に再接続されることによって、再び事前充電され得る。積分コンデンサ４０８を事前充電するステップと、積分コンデンサ４０８が充電または放電する一定の期間待機するステップと、積分コンデンサの電圧レベルをＡＤＣ４３５によってサンプリングおよび変換するステップとが、配列決定プロセスの間中サイクルで繰り返され得る。
【００５５】
[0073]デジタルプロセッサ４３０は、例えば、正規化、データバッファリング、データフィルタリング、データ圧縮、データ削減、イベント抽出、またはナノポアセルアレイからのＡＤＣ出力データの多様なデータフレームへのアセンブリングなどのために、ＡＤＣ出力データを処理し得る。いくつかの実施形態では、デジタルプロセッサ４３０は、塩基判定などのさらに下流の処理を実行する。デジタルプロセッサ４３０は、ハードウェア（例えば、グラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）、ＦＰＧＡ、ＡＳＩＣなどの内部の）またはハードウェアとソフトウェアとの組合せとして実装され得る。
【００５６】
[0074]したがって、ナノポアを横断して印加される電圧信号は、ナノポアの個々の状態を検出するために用いられ得る。ナノポアの可能な状態の１つは、タグが取り付けられたポリホスフェートがナノポアの筒に存在しない場合、本明細書ではナノポアの非充填状態とも称される、開放チャネル状態である。ナノポアの別の４つの可能な状態は、タグが取り付けられたポリホスフェートヌクレオチドの４つの異なるタイプ（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）のうちの１つがナノポアの筒内に保持されるときの状態に各々対応する。ナノポアのさらに別の可能な状態は、脂質二重層が断裂するときである。
【００５７】
[0075]積分コンデンサ４０８での電圧レベルが、固定された期間後に測定されるとき、ナノポアの異なる状態は、異なる電圧レベルの測定値をもたらし得る。これは、積分コンデンサ４０８（すなわち、時間に対する積分コンデンサ４０８の電圧のグラフの傾きの程度）での電圧減衰率（放電による減少または充電による増大）が、ナノポアの抵抗（例えば、抵抗器ＲＰＯＲＥ４２８の抵抗）に依存するからである。より詳しくは、異なる状態のナノポアに関連付けられた抵抗が、分子（タグ）の別個の化学構造に起因して異なるので、異なる対応する電圧減衰率は、観察され得るようになり、ナノポアの異なる状態を識別するために用いられ得る。電圧減衰曲線は、ＲＣ時定数τ＝ＲＣを有する指数関数曲線であり得て、ここで、Ｒは、ナノポアに関連付けられた抵抗（すなわち、ＲＰＯＲＥ抵抗器４２８）であり、Ｃは、Ｒに並列の膜に関連付けられたキャパシタンス（すなわち、ＣＢｉｌａｙｅｒコンデンサ４２６）である。ナノポアセルの時定数は、例えば、約２００〜５００ｍｓであり得る。減衰曲線は、二重層の詳細な実施により、指数関数曲線に正確に一致し得ないが、減衰曲線は、指数関数曲線に類似し、単調であり得て、それゆえ、タグの検出を可能にする。
【００５８】
[0076]いくつかの実施形態では、開放チャネル状態にあるナノポアに関連付けられた抵抗は、１００ＭＯｈｍ〜２０ＧＯｈｍまでの範囲内にある。いくつかの実施形態では、タグが、ナノポアの筒内部に存在する状態にあるナノポアに関連付けられた抵抗は、２００ＭＯｈｍ〜４０ＧＯｈｍまでの範囲内にあり得る。他の実施形態では、積分コンデンサ４０８は、ＡＤＣ４３５へ導く電圧が、電気モデル４２２内の電圧減衰によりやはり変化することになるため、省略される。
【００５９】
[0077]積分コンデンサ４０８での電圧の減衰率は、異なる方法で決定され得る。上で説明したように、電圧減衰率は、一定の時間間隔の間の電圧減衰を測定することによって決定され得る。例えば、積分コンデンサ４０８での電圧は、最初に時間ｔ１でＡＤＣ４３５により測定され、次に、電圧は、時間ｔ２でＡＤＣ４３５により再び測定される。時間曲線に対する積分コンデンサ４０８での電圧の傾きがより急であるとき、電圧差はより大きく、電圧曲線の傾きがより緩やかなとき、電圧差はより小さい。このように、電圧差は、積分コンデンサ４０８での電圧の減衰率を、ゆえに、ナノポアセルの状態を決定するための測定基準として用いられ得る。
【００６０】
[0078]他の実施形態では、電圧減衰率は、選択された電圧減衰量のために必要な持続時間を測定することによって決定される。例えば、電圧が第１の電圧レベルＶ１から第２の電圧レベルＶ２に降下または増大するのに必要な時間が測定され得る。時間に対する電圧曲線の傾きがより急であるとき、必要な時間はより少なく、時間に対する電圧曲線の傾きがより緩やかなとき、必要な時間はより大きい。このように、必要な測定時間は、積分コンデンサｎｃａｐ４０８での電圧の減衰率を、ゆえに、ナノポアセルの状態を決定するための測定基準として用いられ得る。当業者には、例えば、電圧または電流測定などの信号値測定技術を含む、ナノポアの抵抗を測定するために必要とされ得る多様な回路を理解されよう。
【００６１】
[0079]いくつかの実施形態では、電気回路４００は、オンチップに、パスデバイス（例えば、パスデバイス４０６）および追加のコンデンサ（例えば、積分コンデンサ４０８（ｎｃａｐ））を含まず、それによりナノポアベースの配列決定チップのサイズの削減を支援する。膜（脂質二重層）の薄い性質のため、膜に関連付けられたキャパシタンス（例えば、コンデンサ４２６（ＣＤｉｌａｙｅｒ））のみで、追加のオンチップのキャパシタンスを必要とすることなく必要なＲＣ時定数を生み出すのに十分とすることができる。それゆえ、コンデンサ４２６は、積分コンデンサとして使用され得て、電圧信号ＶＰＲＥによって事前充電され、続いて、電圧信号ＶＬＩＱによって放電または充電され得る。そうでなければ電気回路内にオンチップで作製される追加のコンデンサおよびパスデバイスをなくすことにより、ナノポア配列決定チップ内の単一のナノポアセルのフットプリントを著しく減少させることができ、それにより、（例えば、ナノポア配列決定チップ内の数百万ものセルを有する）ますます多くのセルを含むためにナノポア配列決定チップを拡大することが容易になる。
【００６２】
Ｄ．ナノポアセル内でのデータサンプリング
[0080]核酸の配列決定を実行するために、積分コンデンサ（例えば、積分コンデンサ４０８（ｎｃａｐ））またはコンデンサ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ）の電圧レベルは、タグ付けされたヌクレオチドが核酸に加えられている間に、ＡＤＣ（例えば、ＡＤＣ４３５）によってサンプリングされ変換され得る。ヌクレオチドのタグは、例えば、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより低いような印加電圧のとき、対電極および作用電極を介して印加される、ナノポアを横断する電界によって、ナノポアの筒内へと押し入れられ得る。
【００６３】
１．充填
[0081]充填事象は、タグ付けされたヌクレオチドが、鋳型（例えば、核酸断片）に取り付けられ、タグがナノポアの筒の内外に移動するときにあたる。この移動は、充填事象の間に複数回発生し得る。タグが、ナノポアの筒内にあるとき、ナノポアの抵抗は、より高く、より低い電流がナノポアを通り流れ得る。
【００６４】
[0082]配列決定の間、タグは、いくつかのＡＣサイクル状態でナノポア内に存在しないことがあり（開放チャネル状態と呼ぶ）、この場合電流は、ナノポアのより低い抵抗のために、最も高い。タグがナノポアの筒内へ引き込まれるとき、ナノポアは、明モードである。タグがナノポアの筒外へと押し出されるとき、ナノポアは、暗モードである。
【００６５】
２．明および暗期間
[0083]ＡＣサイクルの間、積分コンデンサでの電圧は、ＡＤＣによって複数回サンプリングされ得る。例えば、ある実施形態では、ＡＣ電圧信号が、システム全体に、例えば、約１００Ｈｚで印加され、ＡＤＣの取得速度は、セルあたり約２０００Ｈｚであり得る。このように、ＡＣサイクル（ＡＣ波形のサイクル）毎に取得される約２０のデータポイント（電圧測定値）が存在し得る。ＡＣ波形の１サイクルに対応するデータポイントは、１セットと呼ばれ得る。ＡＣサイクル毎のデータポイントの１セット内には、例えば、明モード（期間）に対応し得る、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより低いときキャプチャされるサブセットが存在し得て、このときタグは、ナノポアの筒内へと押し込まれる。別のサブセットは、暗モード（期間）に対応し得て、このときタグは、例えば、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより高いとき、印加される電界によってナノポアの筒外へと押し出される。
【００６６】
３．測定電圧
[0084]データポイント毎に、スイッチ４０１が開路のとき、積分コンデンサ（例えば、積分コンデンサ４０８（ｎｃａｐ）またはコンデンサ４２６（ＣＢｉｌａｙｅｒ））における電圧は、例えば、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより高いとき、ＶＰＲＥからＶＬＩＱに増大し、ＶＬＩＱがＶＰＲＥより低いとき、ＶＰＲＥからＶＬＩＱに減少するように、ＶＬＩＱによる充電／放電の結果として減衰する挙動で変化していく。最終的な電圧値は、ＶＬＩＱから作用電極の電荷だけずれる。積分コンデンサでの電圧レベルの変化率は、ナノポアを含み、結果としてナノポア内の分子（例えば、タグ付けされたヌクレオチドのタグ）を含み得る、二重層の抵抗の値によって支配され得る。電圧レベルは、スイッチ４０１が開路した後の所定時間に測定され得る。
【００６７】
[0085]スイッチ４０１は、データ収集速度で動作し得る。スイッチ４０１は、通常、ＡＤＣによる測定の直後の２回のデータ取得間の比較的短時間、閉路され得る。スイッチは、複数データポイントがＶＬＩＱの各ＡＣサイクルの各サブ期間（明または暗）の間に収集されることを可能にする。スイッチ４０１が開路のままのとき、積分コンデンサでの電圧レベルおよび、それゆえ、ＡＤＣの出力値は、完全に減衰し、そこに留まる。代わりにスイッチ４０１が閉路である場合、積分コンデンサは、再び事前充電され（ＶＰＲＥまで）、別の測定のための準備が整う。したがって、スイッチ４０１は、複数データポイントが、各ＡＣサイクルの各サブ期間（明または暗）の間に収集されることを可能にする。そのような複数の測定は、固定されたＡＤＣ（例えば、平均化され得る、より多数の測定による８ビットから１４ビット）を用いたより高い分解能を可能にさせ得る。複数の測定は、ナノポア内に充填される分子に関する動態情報をさらに提供し得る。時間の情報により、どれだけの長さで充填が発生するかの決定を可能にさせ得る。これは、核酸鎖に加えられる複数のヌクレオチドが配列決定されつつあるか否かを判定することを支援することにも用いられ得る。
【００６８】
[0086]図５は、ＡＣサイクルの明期間および暗期間中のナノポアセルから取得されたデータポイントの例を示す。図５では、データポイントでの変化は、図解目的用に強調されている。作用電極または積分コンデンサに印加される電圧（ＶＰＲＥ）は、例えば、９００ｍＶなどの一定のレベルにある。ナノポアセルの対電極に印加される電圧信号５１０（ＶＬＩＱ）は、方形波として示されるＡＣ信号であり、このときデューティサイクルは、５０％以下、例えば約４０％のような任意の好適な値であり得る。
【００６９】
[0087]明期間５２０の間、対電極に印加される電圧信号５１０（ＶＬＩＱ）は、作用電極に印加される電圧ＶＰＲＥより低く、その結果、タグは、作用電極および対電極に印加される、異なる電圧レベルに起因する電界によって、ナノポアの筒内に押し込まれ得る（例えば、タグ上の電荷および／またはイオンの流れにより）。スイッチ４０１が開路のとき、ＡＤＣの前のノードでの（例えば、積分コンデンサでの）電圧は、減少していく。電圧データポイントが取得された後（例えば、指定された期間の後）、スイッチ４０１は、閉路され得て、測定ノードでの電圧は、ＶＰＲＥへと再び戻るように増大していく。プロセスは、複数の電圧データポイントを測定するために繰り返され得る。このようにして、複数のデータポイントは、明期間の間に取得され得る。
【００７０】
[0088]図５に示すように、ＶＬＩＱ信号の符号の変化の後の明期間内の第１のデータポイント５２２（第１のポイントデルタ（ＦＰＤ）とも呼ばれる）は、後続のデータポイント５２４よりも低いことがあり得る。これは、ナノポア内にタグが存在しないからであり（開流路）、それゆえ、それは低抵抗および高放電率を有するためであり得る。いくつかの例では、第１のデータポイント５２２は、図５に示すようなＶＬＩＱレベルを超え得る。これは、信号をオンチップコンデンサに結合する二重層のキャパシタンスに起因し得る。データポイント５２４は、充填事象が発生した、すなわち、タグがナノポアの筒内に押し込まれた後取得され得て、この場合ナノポアの抵抗、およびそれゆえの積分コンデンサの放電速度は、ナノポアの筒内に押し込まれるタグの個々のタイプに依存する。データポイント５２４は、以下で説明するように、ＣＤｏｕｂｌｅ  Ｌａｙｅｒ４２４で生成される電荷により、測定毎にわずかに減少し得る。
【００７１】
[0089]暗期間５３０の間、対電極に印加される電圧信号５１０（ＶＬＩＱ）は、作用電極に印加される電圧ＶＰＲＥより高く、その結果、いずれのタグも、ナノポアの筒外に押し出され得る。スイッチ４０１が開路のとき、測定ノードでの電圧は、電圧信号５１０（ＶＬＩＱ）の電圧レベルがＶＰＲＥより高いので、増大する。電圧データポイントが取得された後（例えば、指定された期間の後）、スイッチ４０１は、閉路され得て、測定ノードでの電圧は、ＶＰＲＥへと再び戻るように減少していく。プロセスは、複数の電圧データポイントを測定するために繰り返され得る。このように、複数のデータポイントは、第１のポイントデルタ５３２および後続のデータポイント５３４を含む暗期間の間に取得され得る。上述のように、暗期間の間に、いずれのヌクレオチドタグもナノポアの外に押し出され、それゆえ、任意のヌクレオチドタグに関する最小限度の情報が取得され、さらに正規化に用いられる。
【００７２】
[0090]図５は、明期間５４０の間、対電極に印加される電圧信号５１０（ＶＬＩＱ）は、作用電極に印加される電圧ＶＰＲＥより低いにもかかわらず、充填事象が発生しない（開経路）ことも示す。したがって、ナノポアの抵抗は低く、積分コンデンサの放電速度は高い。結果的に、第１のデータポイント５４２および後続のデータポイント５４４を含む、取得されたデータポイントは、低電圧レベルを示す。
【００７３】
[0091]明または暗期間の間に測定される電圧は、ナノポアの一定の抵抗（例えば、１つのタグがナノポア内にある間に所与のＡＣサイクルの明モードの間に形成される）の測定毎にほぼ同一であると期待され得るが、このことは、電荷が２重層コンデンサ４２４（ＣＤｏｕｂｌｅ  Ｌａｙｅｒ）で生成する場合であり得ない。この電荷生成は、ナノポアセルの時定数をより長くさせる結果をもたらし得る。結果的に、電圧レベルは移動し、それにより測定値がサイクル内のデータポイント毎に減少するという結果をもたらし得る。このように、サイクル内で、データポイントは、図５に示すように、ある程度データポイントから別のデータポイントへ変化し得る。
【００７４】
[0092]測定に関するさらなる詳細は、例えば、「Ｎａｎｏｐｏｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｗｉｔｈ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｓｔｉｍｕｌｕｓ（電圧刺激を変化させるナノポアベースの配列決定）」という名称の米国特許公開第２０１６／０１７８５７７、「Ｎａｎｏｐｏｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｗｉｔｈ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｓｔｉｍｕｌｕｓ（電圧刺激を変化させるナノポアベースの配列決定）」という名称の米国特許公開第２０１６／０１７８５５４、「Ｎｏｎ−Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｔｏ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｓｔｉｍｕｌｕｓ（電気的刺激に応答した二重層の測定を用いた非破壊二重層モニタリング）」という名称の米国特許出願第１５／０８５，７００、および「Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ（二重層形成の電気的促進）」という名称の米国特許出願第１５／０８５，７１３の中で見つけることができ、これらの開示は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。
【００７５】
４．正規化および塩基分類
[0093]ナノポアセンサチップの有効なナノポアセル毎に、生成モードが、核酸を配列決定するために実行され得る。配列決定中に取得されるＡＤＣ出力データは、より高い精度を提供するために、正規化され得る。正規化は、サイクル形状、ゲインドリフト、電荷注入オフセット、およびベースラインシフトなどの偏位効果を引き起こし得る。いくつかの実施態様では、充填事象に対応する明期間サイクルの信号値は、単一の信号値がそのサイクルについて獲得されるように平らにされ得るか（例えば、平均）、または、サイクル内減衰（サイクル形状効果のタイプ）を低減するために、測定された信号に対して調節が行われ得る。ゲインドリフトは、信号全体を全体的にスケーリングし、１００〜１，０００秒程度変化する。例として、ゲインドリフトは、溶液における変化（ポア抵抗）または二重層キャパシタンスにおける変化によってトリガされ得る。ベースラインシフトは、約１００ｍｓの時間尺度で発生し、作用電極における電圧オフセットに関連する。ベースラインシフトは、明期間から暗期間まで配列決定セルにおける荷電平衡を維持する必要性の結果として、充填からの効果的な整流比における変化によって駆動され得る。
【００７６】
[0094]正規化の後、実施形態は、充填された経路の電圧のクラスタを決定し得て、ここで各クラスタは、異なるタグ種、およびそれゆえの異なるヌクレオチドに対応する。クラスタは、所与のヌクレオチドに対応する所与の電圧の確率を算出するために使用され得る。別の例として、クラスタは、異なるヌクレオチド（塩基）間での差別化のための分離電圧を決定するために用いられ得る。
【００７７】
ＩＩＩ．ナノポアを除去および交換すること
[0095]上に論じられるように、ナノポアの各複合体および関連テンプレートは、目的の特定の核酸分子の配列情報を提供するために使用され得る。同じセルアレイを有する追加の異なる分子を配列決定するために、配列決定チップのナノポア複合体は交換され得る。これを達成するための１つの方法は、膜内のナノポアが、チップから除去され得、新規の膜が形成され得、交換用ナノポア複合体が、新規の膜内に挿入され得るように、各セルの膜の破壊を伴う。これらのステップは、配列決定プロセスに複雑性を追加するが、デバイスおよび方法のスループットおよび効率に著しく影響を与える。
【００７８】
[0096]本明細書に説明される代替のプロセスは、配列決定チップ内での脂質二重層膜の非破壊操作を伴う。半透性脂質二重層膜の両側において相対的なモル浸透圧濃度を制御することによって、膜にわたる水の浸透圧流が生み出され得ることが分かっている。この水流、および膜に隣接するリザーバの体積に対する結果として生じる変化が、膜形状を実質的に平面の構造から、例えば、内向きにたわんだ構造へと変化させる。膜の二重層の性質は、膜が内向きにたわんで肥厚化すると失われ得、二重層のこのような損失は、膜内でのタンパク質ポアの位置決めに不安定性をもたらし得る。したがって、膜にわたって浸透性の不均衡をもたらし、膜の形状を変化させることによって、膜内のナノポアは、膜が構造統合性を失うことを引き起こすことなく、自然発生的な排出により膜から除去され得る。続いて浸透性の均衡を復元することによって、膜は、その元の実質的に平面の形状および二重層構成に戻ることができる。そして、この二重層構成は、再びタンパク質ポア安定性の助けになり、交換用ナノポアが、そこに受動的または能動的に挿入され得る。
【００７９】
Ａ．ナノポア交換の例証
[0097]図６Ａは、ナノポアベースの配列決定チップのセルのウェル６０２全体に及ぶ平面の脂質二重層膜６０１を例証する。初期ナノポア６０３は、脂質二重層内へ挿入される。二重層は、ウェルを外部リザーバ６０４から分ける。初期時間ｔ１において、ウェル内の塩／電解質溶液のモル浸透圧濃度［ＥＷ］は、外部リザーバのモル浸透圧濃度［ＥＲ］と実質的に同一である。他の実施態様では、２つのモル浸透圧濃度は異なり得るが、初期ナノポア６０３を排出するほどには十分に異なっていない。
【００８０】
[0098]図６Ｂは、第１の電解質溶液が外部リザーバ内へ流される、後の時間ｔ２におけるセルを例証する。第１の電解質溶液は、初期外部リザーバモル浸透圧濃度［ＥＲ］およびウェルモル浸透圧濃度［ＥＷ］よりも大きいモル浸透圧濃度［ＥＳ１］を有する。第１の電解質溶液の流入が外部リザーバのモル浸透圧濃度を増大させるため、浸透性の不均衡が、脂質二重層膜の両側の溶液間にもたらされる。この不均衡は、ウェルおよびリザーバのオスモライト濃度を平衡化するように水がウェルからリザーバへ膜にわたって拡散する、浸透への駆動力を提供する。
【００８１】
[0099]図６Ｃは、水の浸透拡散がウェル内の液体体積を減少させた、後の時間ｔ３におけるセルを例証する。体積のこのような変化は、脂質二重層膜６０１に対する緊張を生み出し、膜は、ウェルに向かって内向きにたわむことによりその形状を変化させる。内向きの動きは、ウェルに及ぶ少なくともいくつかの部分において膜がもはや脂質二重層ではなくなる程度まで、膜肥厚化をもたらし得る。今度はこれが、膜から初期ナノポア６０３が失われることを引き起こし得、図６Ｃに示されるようにポアが外部リザーバ内へ排出された状態にある。排出後、初期ナノポアは、より大きい容積の外部リザーバ内へ全体的に拡散し、その結果、初期ナノポアは、もはやセルに近接していない。
【００８２】
[0100]図６Ｄは、第２の電解質溶液が外部リザーバ内へ流される、後の時間ｔ４におけるセルを例証する。第２の電解質溶液は、複数の交換用ナノポア６０５を含有し得る。いくつかの実施態様では、交換用ナノポアを含有しないが、膜のたわみを減少させることができる中間溶液が流され得る。
【００８３】
[0101]第２の電解質溶液内の交換用ナノポアの濃度は、初期ナノポアがセルに近接しているよりも、交換用ナノポアがセルに近接している可能性のほうが著しく大きいほどに十分に高くなり得る。示されるように、第２の電解質溶液は、第１の電解質溶液モル浸透圧濃度［ＥＳ１］よりも小さいモル浸透圧濃度［ＥＳ２］を有する。第２の電解質溶液の流入が外部リザーバのモル浸透圧濃度を減少させるため、別の浸透性の不均衡が、膜の両側の溶液間にもたらされる。この第２の浸透性の不均衡は、ここでは水がウェルおよびリザーバ電解質濃度を平衡化するようにリザーバからウェル内へ膜にわたって反対方向に拡散する、浸透への別の駆動力を提供する。
【００８４】
[0102]図６Ｅは、水の浸透拡散がウェル内の液体体積を増大させた、後の時間ｔ５におけるセルを例証する。ウェルの体積におけるこのような変化は、膜に対する以前の緊張を和らげ、膜が、ウェルに及ぶその元の平面形状へ復元することを可能にする。この動きは、膜が、ウェル全体に及ぶ全てまたは大半の位置において再び脂質二重層になることをもたらし得、これにより、ナノポアが膜内へ再び挿入されるようになることを許す。
【００８５】
[0103]図６Ｆは、交換用ナノポアがウェルに及ぶ平面の脂質二重層膜内へ挿入された、後の時間ｔ６におけるセルを例証する。膜内へのナノポアの挿入は、受動的であり得るか、または能動的であり得る。能動的な例では、挿入は、膜にわたる電気穿孔電圧の印加を通じて誘発され得る。
【００８６】
Ｂ．ナノポア交換のためのプロセス
[0104]図７は、分子を分析するためにナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質二重層内に挿入されたナノポアを交換するためのプロセス７００の一実施形態を例証する。改善された技術は、平面の脂質二重層膜の上の第１の電解質流を応用し、電解質流は、平面の脂質二重層の下（すなわち、セルのウェル内）の電解質溶液のモル浸透圧濃度とは異なるモル浸透圧濃度を有する。第１の電解質流は、初期ナノポアまたはナノポア複合体の膜からの排出を促進する。本技術は、膜の上の第２の電解質流をさらに応用し、電解質流は、膜の下の電解質溶液のモル浸透圧濃度に類似するか、または同一であるモル浸透圧濃度を有する。第２の電解質流もまた、複数の交換用ナノポアを含有し得、第２の電解質溶液の流入が、平面の脂質二重層膜内への交換用ナノポアの挿入を促進し得る。
【００８７】
[0105]開示された技術は、配列決定されるべき分析物のスループットの増大を可能にすることを含め、多くの利点を有する。開示された技術は、水の膜透過流を許すが、イオンまたは他のオスモライトの流入に対する非透過性に限って有する他の半透性膜（例えば、脂質二重層以外）に応用され得るということも理解されたい。例えば、開示された方法およびシステムは、重合体である膜と共に使用され得る。いくつかの実施形態では、膜は、共重合体である。いくつかの実施形態では、膜は、トリブロック共重合体である。開示された技術は、ナノポアベースの配列決定チップの要素ではない膜に応用され得るということも理解されたい。
【００８８】
[0106]いくつかの実施形態では、膜は、ナノポアベースの配列決定チップの要素である。いくつかの実施形態では、図１に示されるようなナノポアベースの配列決定チップ１００が、図７のプロセスのために使用される。いくつかの実施形態では、図７のプロセスのために使用されるナノポアベースの配列決定チップは、図２の複数のセル２００を含む。
【００８９】
[0107]任意選択のステップ７０１において、核酸配列決定が行われる。配列決定は、データサンプリング法および上に説明される技術を用いて実施され得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定は、４つのタイプの、タグが取り付けられたポリホスフェートヌクレオチドの充填に対応するナノポア状態を検出するために使用される、図４にモデル化されるような電気システムを用いて実施される。
【００９０】
[0108]ステップ７０２において、第１の電解質溶液は、セルのウェルの外側のリザーバ（すなわち、第１の電解質リザーバ）へ流される。第１の電解質溶液の流入の前、外部リザーバは、典型的には、ウェルチャンバー（すなわち、第２の電解質リザーバ）内の溶液のモル浸透圧濃度（すなわち、第２の初期モル浸透圧濃度）と同一、または類似するモル浸透圧濃度（すなわち、第１の初期モル浸透圧濃度）を有する。第１の電解質溶液は、第１または第２の電解質リザーバとは異なる、電解質の濃度またはオスモライトを有する。１つの実施形態において、第１の電解質溶液は、流入前の第１の電解質リザーバのモル浸透圧濃度よりも大きいモル浸透圧濃度を有する。代替の実施形態では、第１の電解質溶液は、流入前の第１の電解質リザーバのモル浸透圧濃度よりも小さいモル浸透圧濃度を有するということを理解されたい。いずれの場合においても、第１の電解質溶液の流入は、外部リザーバのモル浸透圧濃度を、第１の初期モル浸透圧濃度から、初期モル浸透圧濃度とは異なる新規のモル浸透圧濃度へ変化させるように作用する。
【００９１】
[0109]第１の電解質リザーバ、第２の電解質リザーバ、および第１の電解質溶液の各々は、独立して、１つまたは複数のオスモライトを有し得る。第１および第２の電解質リザーバ、ならびに第１の電解質溶液のうちの２つ以上は、類似するか、または異なるオスモライトを含み得る。本発明での使用のためのオスモライトとしては、限定するものではないが、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣ１）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）などのイオン性塩；グリセロール、エリスリトール、アラビトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マンニシドマンニトール（ｍａｎｎｉｓｉｄｏｍａｎｎｉｔｏｌ）、グリコシルグリセロール、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース、およびイソフルオロシド（ｉｓｏｆｌｕｏｒｏｓｉｄｅ）などのポリオールおよび糖類；デキストラン、レバン、およびポリエチレングリコールなどの重合体；ならびに、グリシン、アラニン、アルファアラニン、アルギニン、プロリン、タウリン、ベタイン、オクトピン、グルタミン酸、サルコシン、ｙ−アミノ酪酸、およびトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）などのいくつかのアミノ酸およびその誘導体が挙げられる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｆｉｓｈｅｒらの米国特許出願公開第２０１１００５３７９５号も参照されたい）。１つの実施形態では、溶液は、イオン性塩であるオスモライトを含む。当業者は、本発明での使用のための好適なオスモライトである他の化合物を理解するものとする。別の態様では、本発明は、２つ以上の異なるオスモライトを含む溶液を提供する。
【００９２】
[0110]第１および第２の電解質リザーバの初期モル浸透圧濃度（すなわち、それぞれ第１および第２の初期モル浸透圧濃度）は、例えば、および限定するものではないが、１００ｍＭ〜１Ｍ、例えば、１００ｍＭ〜４００ｍＭ、１２５ｍＭ〜５００ｍＭ、１６０ｍＭ〜６２５ｍＭ、２００ｍＭ〜８００ｍＭ、または２５０ｍＭ〜１Ｍの範囲内にあり得る。第１および第２の電解質リザーバは、２００ｍＭ〜５００ｍＭ、例えば、２００ｍＭ〜３５０ｍＭ、２２０ｍＭ〜３８０ｍＭ、２４０ｍＭ〜４２０ｍＭ、２６０ｍＭ〜４６０ｍＭ、または２９０ｍＭ〜５００ｍＭの範囲内の初期モル浸透圧濃度を有し得る。下限に関しては、第１および第２の電解質リザーバは、１００ｍＭより大きい、１２５ｍＭより大きい、１６０ｍＭより大きい、２００ｍＭより大きい、２５０ｍＭより大きい、４００ｍＭより大きい、５００ｍＭより大きい、６２５ｍＭより大きい、または８００ｍＭより大きい初期モル浸透圧濃度を有し得る。上限に関しては、第１および第２の電解質リザーバの初期モル浸透圧濃度は、１Ｍ未満、８００ｍＭ未満、６２５ｍＭ未満、５００ｍＭ未満、４００ｍＭ未満、２５０ｍＭ未満、２００ｍＭ未満、１６０ｍＭ未満、または１２５ｍＭ未満であり得る。
【００９３】
[0111]１つの実施形態において、外部リザーバ内の溶液の濃度は、約１０ｎＭ〜３Ｍの間である。別の実施形態では、外部リザーバ内の溶液の濃度は、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２１０ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２３０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２６０ｍＭ、約２７０ｍＭ、約２８０ｍＭ、約２９０ｍＭ、約３００ｍＭ、３０５ｍＭ、約３１０ｍＭ、約３１５ｍＭ、約３２０ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３３０ｍＭ、約３３５ｍＭ、約３４０ｍＭ、約３４５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３５５ｍＭ、約３６０ｍＭ、約３６５ｍＭ、約３７０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約３８０ｍＭ、約３８５ｍＭ、約３９０ｍＭ、約３９５ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約６００ｍＭ、約６５０ｍＭ、約７００ｍＭ、約７５０ｍＭ、約８００ｍＭ、約８５０ｍＭ、約９００ｍＭ、約９５０ｍＭ、約１Ｍ、約１．２５Ｍ、約１．５Ｍ、約１．７５Ｍ、約２Ｍ、約２．２５Ｍ、約２．５Ｍ、約２．７５Ｍ、または約３Ｍである。別の実施形態では、ウェル内の溶液の濃度は、約３０５ｍＭ、約３１０ｍＭ、約３１５ｍＭ、約３２０ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３３０ｍＭ、約３３５ｍＭ、約３４０ｍＭ、約３４５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３５５ｍＭ、約３６０ｍＭ、約３６５ｍＭ、約３７０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約３８０ｍＭ、約３８５ｍＭ、約３９０ｍＭ、約３９５ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約６００ｍＭ、約６５０ｍＭ、約７００ｍＭ、約７５０ｍＭ、約８００ｍＭ、約８５０ｍＭ、約９００ｍＭ、約９５０ｍＭ、または約１Ｍである。１つの追加的な実施形態では、外部リザーバ内の溶液の濃度は、約３００ｍＭであり、ウェル内の溶液の濃度は、約３１０ｍＭ、約３２０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約３４０ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３６０ｍＭ、約３７０ｍＭ、約３８０ｍＭ、約３９０ｍＭ、または約４００ｍＭからなる群より選択される。他の実施形態では、溶液の濃度は、（ｉ）外部リザーバ内では３００ｍＭおよびウェル内では３１０ｍＭ、（ｉｉ）外部リザーバ内では３００ｍＭおよびウェル内では３２０ｍＭ、（ｉｉｉ）外部リザーバ内では３００ｍＭおよびウェル内では３３０ｍＭ、（ｉｖ）外部リザーバ内では３００ｍＭおよびウェル内では３４０ｍＭ、（ｖ）外部リザーバ内では３００ｍＭおよびウェル内では３５０ｍＭ、（ｖｉ）外部リザーバ内では３００ｍＭおよびウェル内では３６０ｍＭ、（ｖｉｉ）外部リザーバ内では３００ｍＭおよびウェル内では３７０ｍＭ、（ｖｉｉｉ）外部リザーバ内では３００ｍＭおよびウェル内では３８０ｍＭ、（ｉｘ）外部リザーバ内では３００ｍＭおよびウェル内では３９０ｍＭ、ならびに（ｘ）外部リザーバ内では３００ｍＭおよびウェル内では４００ｍＭからなる群より選択される。
【００９４】
[0112]第１の電解質溶液モル浸透圧濃度の外部リザーバモル浸透圧濃度に対する比は、例えば、および限定することなく、１．０５〜１．５、例えば、１．０５〜１．３、１．０８〜１．３５、１．１３〜１．４、１．１７〜１．４５、または１．２１〜１．５の範囲内にあり得る。第１の電解質溶液モル浸透圧濃度の外部リザーバモル浸透圧濃度に対する比は、１．１２〜１．４、例えば、１．１２〜１．２８、１．１５〜１．３１、１．１７〜１．３４、１．２〜１．３７、または１．２２〜１．４の範囲内にあり得る。下限に関しては、第１の電解質溶液モル浸透圧濃度の外部リザーバモル浸透圧濃度に対する比は、１．０５超、１．０８超、１．１７超、１．２１超、１．３超、１．３５超、１．４超、または１．４５超であり得る。上限に関しては、第１の電解質溶液モル浸透圧濃度の外部リザーバモル浸透圧濃度に対する比は、１．５未満、１．４５未満、１．４未満、１．３５未満、１．３未満、１．２１未満、１．１７未満、１．１３未満、または１．０８未満であり得る。
【００９５】
[0113]任意選択のステップ７０３において、第１の電解質溶液の流入が継続される、または繰り返されるべきかどうかが決定される。異なる基準が、このステップにおいて決定を行うために使用され得る。いくつかの実施形態では、ステップ７０２は、事前決定された回数だけ実施される予定であり、ステップ７０３は、ステップ７０２がすでに実施した回数を事前決定された数と比較する。いくつかの実施形態では、ステップ７０２は、事前決定された時間期間にわたって実施される予定であり、ステップ７０３は、ステップ７０２がすでに実施した累積時間を事前決定された時間期間と比較する。いくつかの実施形態では、測定は、外部リザーバ内の溶液のモル浸透圧濃度、または外部リザーバから出る流出物のモル浸透圧濃度について行われる。外部リザーバまたは流出物モル浸透圧濃度が事前決定された値に達していない場合、ステップ７０２は繰り返され得る。いくつかの実施形態では、ステップ７０２は、外部リザーバ内の溶液、または外部リザーバを出ていく溶液のモル浸透圧濃度が、外部リザーバに入る溶液（すなわち、第１の電解質溶液）のモル浸透圧濃度の事前決定されたパーセンテージ範囲内に入るまで繰り返される。
【００９６】
[0114]第１の電解質溶液内の電解質の濃度は、ステップ７０２の各反復について、同一である、類似する、または異なり得る。より低いまたはより高い濃度の電解質が、１つまたは複数の追加サイクルに適用され得る。例えば、そのステップ７０２が繰り返される度に、塩電解質溶液の濃度は、［ＥＳ１］／［ＥＷ］比が事前決定された目標比まで増大されるまで、初期電解質濃度または溶液モル浸透圧濃度（すなわち、ステップ７０２の第１の反復のための条件）から最終電解質濃度または溶液モル浸透圧濃度（すなわち、ステップ７０２の最後の反復のための条件）まで漸進的に増大され得る。この比は、システムを出る外部リザーバ流体のモル浸透圧濃度測定を使用することにより予測され得る。電解質溶液の流入（ステップ７０２における）が繰り返される場合、プロセス７００は、ステップ７０３からステップ７０２へと進み得、そうでない場合、プロセス７００は、ステップ７０４へ進み得る。
【００９７】
[0115]ステップ７０４において、第２の電解質溶液は、セルのウェルの外側のリザーバへ流される。第２の電解質溶液は、第１の電解質溶液内の電解質のものとは異なる、電解質の濃度またはオスモライトを有する。第２の電解質溶液モル浸透圧濃度はまた、第１の電解質溶液モル浸透圧濃度よりも第２の初期モル浸透圧濃度（すなわち、ウェルチャンバー内の電解質溶液の初期モル浸透圧濃度）に近い。言い換えると、第２の電解質溶液モル浸透圧濃度と第２の初期モル浸透圧濃度との差は、第１の電解質溶液モル浸透圧濃度と第２の初期モル浸透圧濃度との差よりも小さい。１つの実施形態では、第２の電解質溶液は、第１の電解質溶液のモル浸透圧濃度よりも小さいモル浸透圧濃度を有する。代替の実施形態では、第２の電解質溶液は、第１の電解質溶液のモル浸透圧濃度よりも大きいモル浸透圧濃度を有するということを理解されたい。いずれの場合においても、第２の電解質溶液の流入は、外部リザーバモル浸透圧濃度が初期ウェルリザーバモル浸透圧濃度により近くなるように、外部リザーバのモル浸透圧濃度を変化させるように作用する。第２の電解質溶液は、１つまたは複数のオスモライトを有し得、それらの各々が、独立して、上に説明されるオスモライトのうちのいずれかであり得る。
【００９８】
[0116]第２の電解質溶液は、複数の交換用ナノポアを含み得る。複数の交換用ナノポアの各々は、複数の交換用ナノポア複合体のうちの１つの部分であり得る。交換用ナノポア複合体は、例えば、ポリメラーゼおよびテンプレートを含み得る。各交換用ナノポア複合体のテンプレートは、交換される初期ナノポア複合体内に存在していたテンプレートとは異なり得る。初期および交換用ナノポア、または初期および交換用ナノポア複合体のナノポアは各々、独立して、例えば、および限定することなく、外膜タンパク質Ｇ（ＯｍｐＧ）；細菌アミロイド分泌チャネルＣｓｇＧ；マイコバクテリウム・スメグマチス・ポーリンＡ（ＭｓｐＡ）；アルファ溶血素（ａ−ＨＬ）；ＯｍｐＧ、ＣｓｇＧ、ＭｓｐＡ、もしくはａ−ＨＬのうちの少なくとも１つに少なくとも７０％の同一性を有する任意のタンパク質；またはそれらの任意の組合せであり得る。
【００９９】
[0117]第１の電解質溶液モル浸透圧濃度の第２の電解質溶液モル浸透圧濃度に対する比は、例えば、および限定することなく、１．０５〜１．５、例えば、１．０５〜１．３、１．０８〜１．３５、１．１３〜１．４、１．１７〜１．４５、または１．２１〜１．５の範囲内にあり得る。第１の電解質溶液モル浸透圧濃度の第２の電解質溶液モル浸透圧濃度に対する比は、１．１２〜１．４、例えば、１．１２〜１．２８、１．１５〜１．３１、１．１７〜１．３４、１．２〜１．３７、または１．２２〜１．４の範囲内にあり得る。下限に関しては、第１の電解質溶液モル浸透圧濃度の第２の電解質溶液モル浸透圧濃度に対する比は、１．０５超、１．０８超、１．１７超、１．２１超、１．３超、１．３５超、１．４超、または１．４５超であり得る。上限に関しては、第１の電解質溶液モル浸透圧濃度の第２の電解質溶液モル浸透圧濃度に対する比は、１．５未満、１．４５未満、１．４未満、１．３５未満、１．３未満、１．２１未満、１．１７未満、１．１３未満、または１．０８未満であり得る。
【０１００】
[0118]第２の電解質溶液モル浸透圧濃度の、ウェル溶液モル浸透圧濃度に対する、またはステップ７０２における第１の電解質溶液の流入前の外部リザーバのモル浸透圧濃度（すなわち、第１の初期モル浸透圧濃度）に対する比は、例えば、および限定することなく、０．８５〜１．１５、例えば、０．８５〜１．０３、０．８８〜１．０６、０．９１〜１．０９、０．９４〜１．１２、または０．９７〜１．１５の範囲内にあり得る。第２の電解質溶液モル浸透圧濃度の第１の初期モル浸透圧濃度に対する比は、０．９４〜１．０６、例えば、０．９４〜１．０２、０．９５〜１．０３、０．９６〜１．０４、０．９７〜１．０５、または０．９８〜１．０６の範囲内にあり得る。下限に関しては、第２の電解質溶液モル浸透圧濃度の第１の初期モル浸透圧濃度に対する比は、０．８５超、０．８８超、０．９１超、０．９４超、０．９７超、１超、１．０３超、１．０６超、１．０９超、または１．１２超であり得る。上限に関しては、第２の電解質溶液モル浸透圧濃度の第１の初期モル浸透圧濃度に対する比は、１．１５未満、１．１２未満、１．０９未満、１．０６未満、１．０３未満、１未満、０．９７未満、０．９４未満、０．９１未満、または０．８８未満であり得る。
【０１０１】
[0119]任意選択のステップ７０５において、第２の電解質溶液の流入が継続される、または繰り返されるべきかどうかが決定される。異なる基準が、このステップにおいて決定を行うために使用され得る。いくつかの実施形態では、ステップ７０４は、事前決定された回数だけ実施され、ステップ７０５は、ステップ７０４がすでに実施した回数を事前決定された数と比較する。いくつかの実施形態では、ステップ７０４は、事前決定された時間期間にわたって実施される予定であり、ステップ７０５は、ステップ７０４がすでに実施した累積時間を事前決定された時間期間と比較する。いくつかの実施形態では、測定は、外部リザーバ内の溶液のモル浸透圧濃度、または外部リザーバから出る流出物のモル浸透圧濃度について行われる。外部リザーバまたは流出物モル浸透圧濃度が事前決定された値に達していない場合、ステップ７０４は繰り返され得る。いくつかの実施形態では、ステップ７０４は、外部リザーバ内の溶液、または外部リザーバを出る溶液のモル浸透圧濃度が、外部リザーバに入る溶液（すなわち、第２の電解質溶液）のモル浸透圧濃度の事前決定されたパーセンテージ範囲内に入るまで繰り返される。いくつかの実施形態では、ステップ７０４は、外部リザーバ内の溶液、または外部リザーバを出る溶液のモル浸透圧濃度が、ウェルチャンバー内の溶液（すなわち、第２のリザーバ）のモル浸透圧濃度の事前決定されたパーセンテージ範囲内に入るまで繰り返される。
【０１０２】
[0120]第１の電解質溶液内の電解質の濃度は、ステップ７０４の各反復について、同一である、類似する、または異なり得る。より低いまたはより高い濃度の電解質が、１つまたは複数の追加サイクルに適用され得る。例えば、ステップ７０４が繰り返される度に、塩電解質溶液の濃度は、［ＥＳ２］／［ＥＷ］比が事前決定された目標比まで減少されるまで、初期電解質濃度または溶液モル浸透圧濃度（すなわち、ステップ７０４の第１の反復のための条件）から最終電解質濃度または溶液モル浸透圧濃度（すなわち、ステップ７０４の最後の反復のための条件）まで漸進的に減少され得る。この比は、システムを出る外部リザーバ流体のモル浸透圧濃度測定を使用することにより予測され得る。電解質溶液の流入（ステップ７０４における）が繰り返される場合、プロセス７００は、ステップ７０５からステップ７０４へと進み得、そうでない場合、プロセス７００は、ステップ７０６へ進み得る。
【０１０３】
[0121]プロセス７００の任意選択のステップ７０６において、第２の電解質溶液の複数の交換用ナノポアのうちの１つが、セルの膜内へ挿入される。異なる技術が、ナノポアベースの配列決定チップのセル内のナノポアを挿入するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ナノポアは、受動的に、すなわち、外的刺激の使用なしに、挿入する。いくつかの実施形態では、撹拌または電気的刺激（例えば、１００ｍＶ〜１．０Ｖの電圧を５０ミリ秒〜１秒間）が、脂質二重層膜にわたって印加されて、脂質二重層内に崩壊を引き起こし、脂質二重層内へのナノポアの挿入を開始する。いくつかの実施形態では、膜にわたって印加される電圧は、交流（ＡＣ）電圧である。いくつかの実施形態では、膜にわたって印加される電圧は、直流（ＤＣ）電圧である。セルの膜にわたって印加される電気穿孔電圧は、ナノポアベースの配列決定チップの全てのセルに全体的に印加され得るか、または電圧は、チップの１つまたは複数のセルを特に標的とし得る。
【０１０４】
[0122]プロセス７００の任意選択のステップ７０７において、核酸配列決定が行われる。配列決定は、データサンプリング法および上に説明される技術を用いて実施され得る。いくつかの実施形態では、ステップ７０６において挿入される交換用ナノポア複合体と関連したテンプレートは、ステップ７０４の第１の電解質溶液流の結果として排出される初期ナノポア複合体と関連したテンプレートとは異なる。この場合、ステップ７０７の配列決定動作は、ステップ７０１の配列決定動作で分析されたものとは異なる核酸配列を分析するために使用され得る。これが、配列決定チップの効率を増大させ得、チップの個々のセルが、配列決定ナノポアの交換に起因する複数の異なる核酸分子の配列決定において使用されることを可能にする。
【０１０５】
Ｃ．ナノポア交換のフローシステム
[0123]図７のプロセス７００は、異なるタイプの流体（例えば、液体または気体）がウェルの外側のリザーバを通って流されるステップ（例えば、ステップ７０１、７０２、７０４、および７０７）を含む。著しく異なる特性（例えば、モル浸透圧濃度、圧縮性、疎水性、および粘度）を有する複数の流体は、ナノポアベースの配列決定チップ（例えば、図１のチップ１００など）の表面上のセンサセル（例えば、図２のセル２００など）のアレイの上に流され得る。いくつかの実施形態では、プロセス７００を実施するシステムは、外部リザーバ内外への異なる流体の流入を指示および／または監視するフローシステムを含む。
【０１０６】
[0124]図８は、図７のプロセス７００と共に使用するためのフローシステム８００の一実施形態を例証する。フローシステムは、ウェル８０２のアレイの外側にある第１の電解質リザーバ８０１を含む。ウェルの各々について、内部ウェルチャンバー（すなわち、第２の電解質リザーバ）は、挿入された初期ナノポアまたはナノポア複合体を含む膜８０３によって、第１の電解質リザーバから隔てられ得る。プロセス７００のステップ７０１において、核酸配列決定は、フローシステム８００を使用して行われ得る。この核酸配列決定の部分として、１つまたは複数の流体は、第１の電解質リザーバ８０１内へ、またはそこを通って流され得る。これらの１つまたは複数の流体は、最初、第１の電解質リザーバの外側の１つまたは複数の貯蔵容器（例えば、図８の第１の貯蔵容器８０４）内に保持され得る。１つまたは複数の貯蔵容器の各々は、独立して、または一緒に、１つまたは複数のチャネル、管、またはパイプ（例えば、第１のチャネル８０５）を通じて、第１の電解質リザーバと流体接続状態にあり得る。第１の貯蔵容器８０４から、第１のチャネル８０５を通じた、および第１の電解質リザーバ８０１内への流体の輸送は、１つまたは複数のポンプ（例えば、ポンプ８０６）の行為によるものであり得る。各ポンプは、例えば、容積式ポンプまたは脈動ポンプであり得る。制御回路８１２は、例えば、第１の貯蔵容器８０４から、第１のチャネル８０５を通じた、および第１の電解質リザーバ８０１内への流体の輸送を制御するためのポンプ８０６に制御信号を送信するため、ポンプ８０６と通信可能に結合され得る。流体は、第１のリザーバ８０１の実質的に幅全体にわたって第１のリザーバ８０１に入ることができるか、または、第１の電解質リザーバ８０１内の流入を案内するチャネル（例えば、蛇行チャネル）を通じて第１のリザーバ８０１に入ることができる。
【０１０７】
[0125]フローシステム８００はまた、プロセス７００のステップ７０２の第１の電解質溶液を保持するために使用され得る第２の貯蔵容器８０７を含み得る。第２の貯蔵容器８０７は、チャネル、管、またはパイプ（例えば、第２のチャネル８０８）を通じて、第１の電解質リザーバと流体接続状態にあり得る。第２の貯蔵容器８０７から、第２のチャネル８０８を通じた、および第１の電解質リザーバ８０１内への流体の輸送は、１つまたは複数のポンプの行為によるものであり得る。ステップ７０２において第２の貯蔵容器８０７から流体を輸送するために使用される１つまたは複数のポンプのうちの１つまたは複数は、ステップ７０１において第１の貯蔵容器８０４から流体を輸送するために使用される１つまたは複数のポンプと同じであってもよい。例えば、および図８に示されるように、ポンプ８０６は、第１のチャネル８０５および第２のチャネル８０８の共通の共有部分を通じて流体をポンピングするために使用され得る。
【０１０８】
[0126]いくつかの実施形態では、１つまたは複数のバルブ（例えば、バルブ８０９および８１０）は、貯蔵容器のうちの１つまたは複数を出る流体流を制御するために使用される。例えば、プロセス７００がステップ７０１からステップ７０２へ進むと、核酸配列決定と関連した流体流が停止され、第１の電解質溶液の流入が開始されるように、第１のバルブ８０９は、完全に閉じられ得、第２のバルブ８０７は開かれ得る。別の例として、プロセス７００がステップ７０１から７０２へ進むと、第１の電解質リザーバ８０１に入る貯蔵容器８０４および８０７からの流体の比が調節されるように、第１のバルブ８０９の開口部は、狭小化され得、および／または第２のバルブ８０７の開口部は、拡張され得る。制御回路８１２は、例えば、第１の電解質リザーバ８０１に入る貯蔵容器８０４および８０７からの流体の比を調節するための第１のバルブ８０９および／または第２のバルブ８１０に制御信号を送信するため、第１のバルブ８０９および第２のバルブ８１０と通信可能に結合され得る。
【０１０９】
[0127]フローシステム８００はまた、第１の電解質リザーバ８０１を出る流体のモル浸透圧濃度を監視するために検出器８１１を含み得る。いくつかの実施形態では、検出器８１１は、流体モル浸透圧濃度を監視するため、および電解質溶液流を制御するために、制御回路に通信可能に接続される。いくつかの実施形態では、別の検出器（図示せず）が、第１の電解質リザーバ内の流体モル浸透圧濃度を測定するために第１の電解質リザーバ内に位置する。他の実施形態では、フローシステムは、モル浸透圧濃度検出器を有しない。
【０１１０】
[0128]プロセス７００のステップ７０３において、検出器８１１は、貯蔵容器８０７から第１の電解質リザーバ８０１内への第１の電解質溶液の流入が、継続される、または繰り返されるべきかどうかを決定するために使用され得る。例えば、検出器８１１は、モル浸透圧濃度測定を報告し得、この測定と事前選択されたモル浸透圧濃度値との比較は、プロセス７００がステップ７０３からステップ７０２へ進むか、またはステップ７０４へ進むかを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、プロセス７００がステップ７０２へ進む場合、第１のバルブ８０９および第２のバルブ８１０は、新規のステップ７０２反復において第１の電解質リザーバ８０１に入る流体の比を調節するように制御される。例えば、第２の貯蔵容器８０７内の第１の電解質溶液のモル浸透圧濃度が、第１の貯蔵容器８０４内の溶液のモル浸透圧濃度よりも大きい場合、ステップ７０２が繰り返される度に、第１のバルブ８０９の開口部は狭小化され得、および／または第２のバルブ８０７の開口部は拡張され得る。このやり方では、第１の電解質リザーバ８０１に入る塩電解質溶液の濃度は、［Ｅ８０１］／［Ｅ８０２］比が事前決定された目標比まで増大されるまで、初期電解質濃度または溶液モル浸透圧濃度（すなわち、ステップ７０２の第１の反復のための条件）から最終電解質濃度または溶液モル浸透圧濃度（すなわち、ステップ７０２の最後の反復のための条件）まで漸進的に増大され得る。
【０１１１】
[0129]いくつかの実施形態では、第１の電解質リザーバ８０１に入る貯蔵容器８０４および８０７からの流体の比は、バルブの代わりにポンプの使用により調節される。例えば、第１の電解質リザーバ８０１内のモル浸透圧濃度を漸進的に増大するように、貯蔵容器８０４から流体を輸送するポンプの流量は減少され得、および／または貯蔵容器８０７から第１の電解質溶液を輸送するポンプの流量は増大され得る。
【０１１２】
[0130]プロセス７００のステップ７０４において第１の電解質リザーバ８０１へ流される第２の電解質溶液もまた、フローシステム８００の１つまたは複数の貯蔵容器内に保持され得る。いくつかの実施形態では、第２の電解質溶液は、プロセス７００のステップ７０１の核酸配列決定の間に使用される１つまたは複数の流体と同一である。いくつかの実施形態では、第２の電解質溶液は、第１の貯蔵容器８０４内にある。いくつかの実施形態では、第２の電解質溶液は、第１の貯蔵容器８０４または第２の貯蔵容器８０７以外の貯蔵容器内にある。第２の電解質溶液の貯蔵容器は、上に説明されるタイプおよび構成のチャネル、管、パイプ、ポンプ、またはバルブのうちのいずれかの１つまたは複数を通じて第１のリザーバと流体接続状態にあり得る。いくつかの実施形態では、プロセス７００がステップ７０３からステップ７０４へ進むと、第１の電解質溶液の流入が停止され、第２の電解質溶液の流入が開始されるように、第１のバルブ８０９は完全に開かれ、第２のバルブ８１０は閉じられる。いくつかの実施形態では、プロセス７００がステップ７０３から７０４へ進むと、第１の電解質リザーバ８０１に入る貯蔵容器８０４および８０７からの流体の比が調節されるように、第１のバルブ８０９の開口部は拡張され、および／または第２のバルブ８０７の開口部は狭小化される。
【０１１３】
[0131]フローシステム８００の検出器８１１はまた、第１の電解質リザーバ８０１内への第２の電解質溶液の流入が継続される、または繰り返されるべきかどうかを決定するために、プロセス７００のステップ７０５において使用され得る。例えば、検出器８１１は、モル浸透圧濃度測定を報告し得、この測定と事前選択されたモル浸透圧濃度値との比較は、プロセス７００がステップ７０５からステップ７０４へ進むか、またはステップ７０６へ進むかを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、プロセス７００がステップ７０４へ進む場合、第１のバルブ８０９および第２のバルブ８１０は、新規のステップ７０４反復において第１の電解質リザーバ８０１に入る流体の比を調節するように制御される。例えば、第２の貯蔵容器８０７内の第１の電解質溶液のモル浸透圧濃度が、第１の貯蔵容器８０４内の第２の電解質溶液のモル浸透圧濃度よりも大きい場合、ステップ７０４が繰り返される度に、第１のバルブ８０９の開口部は拡張され得、および／または第２のバルブ８０７の開口部は狭小化され得る。
【０１１４】
[0132]このやり方では、第１の電解質リザーバ８０１に入る塩電解質溶液の濃度は、［Ｅ８０１］／［Ｅ８０２］比が事前決定された目標比まで減少されるまで、初期電解質濃度または溶液モル浸透圧濃度（すなわち、ステップ７０４の第１の反復のための条件）から最終電解質濃度または溶液モル浸透圧濃度（すなわち、ステップ７０４の最後の反復のための条件）まで漸進的に減少され得る。いくつかの実施形態では、第１の電解質リザーバ８０１に入る貯蔵容器８０４および８０７からの流体の比は、バルブの代わりにポンプの使用により調節される。例えば、第１の電解質リザーバ８０１内のモル浸透圧濃度を漸進的に減少させるように、貯蔵容器８０４から第２の電解質溶液を輸送するポンプの流量は増大され得、および／または貯蔵容器８０７から第１の電解質溶液を輸送するポンプの流量は減少され得る。
【０１１５】
Ｄ．ナノポア交換の例
[0133]本発明の実施形態は、以下の非限定的な例に照らしてより良く理解されるものとする。
【０１１６】
[0134]初期アルファ溶血素ナノポアを、各々が３８０ｍＭグルタミン酸カリウム（ＫＧｌｕ）緩衝液を含有する外部リザーバおよびウェルリザーバを有する配列決定チップのセルの膜内へ電気穿孔した。次いで、ストレプトアビジン結合オリゴ（ｄＴ）４０タグを、３００ｍＭ  ＫＧｌｕ緩衝液中、外部リザーバ内へ流し入れた。能動制御として、チップ内の単一ポアセル毎に自由捕捉率（ｋｆｃ）について２つの独立した測定を行った。自由捕捉率は、所与のポアについて単位時間あたりに発生するタグ挿入事象の回数を指す。２つの測定は、ポアの排出または新規挿入なしで、同じセルについて異なる時間において行われる。
【０１１７】
[0135]図９Ａは、これらの測定からの結果をプロットするグラフ９００を示す。図９Ａグラフのｘ軸およびｙ軸は、ｋｆｃ測定値を示し、各データポイントは、個々のセルおよびナノポアについての２つの測定間の関係を表す。ポアが測定間で変化しないことから、理想の結果は、破線のｙ＝ｘ線上に全て位置するポイントを産出することである。この理想の線からのデータポイント位置の小さい偏差は、例えば、データ獲得ノイズなど、標準的な実験誤差を示すものである。示されるように、測定値は、概して線に従っており、これは、以下に説明されるような、本発明の実施形態を使用したポア取り換えを経るセルの測定とは対照的である。
【０１１８】
[0136]次いで、３８０ｍＭ  ＫＧｌｕの第１の電解質溶液を、配列決定チップの外部リザーバ内へ流し入れ、その後に３００ｍＭ  ＫＧｌｕの第２の電解質溶液が続いた。第２の電解質溶液は、交換用アルファ溶血素ナノポア、および交換用ストレプトアビジン結合オリゴ（ｄＴ）４０タグを含有していた。交換用ナノポアを、チップのセル膜内へ受動的に挿入させ、交換用ナノポア複合体を形成するために交換用タグと複合させた。チップ内のセル毎にｋｆｃについて別の測定を行い、これらの新規の測定を、電解質溶液の流入前に行った測定と比較した。
【０１１９】
[0137]図９Ｂは、これらの測定からの結果をプロットするグラフ９０１を示す。ｘ軸およびｙ軸は、ここでもｋｆｃ測定値を示し、図９Ｂの各データポイントは、個々のセルについて電解質溶液流の前後に行われた測定間の関係を表す。グラフから、理想のｙ＝ｘ線からのデータポイント位置の平均偏差は、図９Ａプロットのものよりも図９Ｂプロットのもののほうが著しく大きいということが分かる。これは、セルが電解質溶液の流入後に異なる特性を有すること、およびこれらの異なる特性が、実験または測定誤差またはノイズによって引き起こされるのではなく、代わりに、初期ナノポアおよびナノポア複合体の交換用ナノポアおよびナノポア複合体との交換によって引き起こされることを示す。このように、図９Ａおよび図９Ｂは、本発明の実施形態を使用して、ポアが排出され、新規のポアが挿入されたことを示す。
【０１２０】
[0138]ポア取り換え事象の不在および存在はまた、図１０Ａおよび図１０Ｂのものなど、ＡＤＣ出力のデータ追跡において実証され得る。
【０１２１】
[0139]図１０Ａは、ポア取り換えが誘発されなかった配列決定セルを用いて測定された時間（ｙ軸にプロットされる）を経てのＡＤＣ数（ｘ軸にプロットされる）のグラフ１００１を示す。グラフにおいて見られるのは、明開チャネル出力１００２および暗開チャネル出力１００３の電圧測定を示す厚い帯域である。時間１００４において、第１の電解質溶液が、配列決定セルの外部リザーバ内へ流されており、第１の電解質溶液は、外部リザーバの初期モル浸透圧濃度とは異なるモル浸透圧濃度を有していたが、モル浸透圧濃度差は、配列決定セルのナノポアの排出を促すほどは大きくなかった。
【０１２２】
[0140]時間１００４の直後の時間では、外部リザーバの新規のモル浸透圧濃度と配列決定セルのウェルリザーバとの間の小さい浸透性の不均衡が、配列決定セルの膜の構成においてわずかな変化を引き起こした。このわずかな変化は、明開チャネル出力１００２と暗開チャネル出力１００３との間の分離１００５に増加をもたらした。時間１００６において、第２の電解質溶液が外部リザーバ内へ流され、第２の電解質溶液は、第１の電解質溶液モル浸透圧濃度よりも配列決定セルのウェルリザーバの初期モル浸透圧濃度に近いモル浸透圧濃度を有していた。この第２の電解質溶液流の結果として、明開チャネル出力１００２と暗開チャネル出力１００３との間の分離１００５は、時間１００４前に観察されたものに類似する量へと復元された。
【０１２３】
[0141]図１０Ｂは、ポア取り換えが誘発された配列決定セルを用いて測定された、時間を経てのＡＤＣ数のグラフ１０１１を示す。時間１０１４において、第１の電解質溶液が、配列決定セルの外部リザーバ内へ流されており、第１の電解質溶液は、外部リザーバの初期モル浸透圧濃度とは異なるモル浸透圧濃度を有しており、モル浸透圧濃度差は、配列決定セルのナノポアの排出を促すほど大きかった。時間１０１４の直後の時間では、ナノポア排出が、明開チャネル１０１２と暗開チャネル１０１３との間の分離１０１５の崩壊をもたらしており、分離の欠如は、挿入されたナノポアの欠如を示すものであった。
【０１２４】
[0142]時間１０１６において、第２の電解質溶液が外部リザーバ内へ流され、第２の電解質溶液は、第１の電解質溶液よりも配列決定セルのウェルリザーバの初期モル浸透圧濃度に近いモル浸透圧濃度を有していた。この第２の電解質溶液流の結果として、配列決定セルの膜の構成は、その元の構成へと復元されており、再度、ポア挿入の助けとなった。時間１０１７において、交換用ポアが、膜内へ挿入され、明開チャネル出力１０１２と暗開チャネル出力１０１３との間の分離１０１５が再びもたらされており、この分離は、挿入されたナノポアの存在を示すものであった。したがって、図１０Ｂもまた、本発明の実施形態を使用して、ポアが排出され、新規のポアが挿入されたことを図１０Ａとは対照的に示す。
【０１２５】
ＩＶ．コンピュータシステム
[0143]本明細書で説明したコンピュータシステムの任意のものは、任意の適切な数のサブシステムを利用し得る。そのようなサブシステムの例は、図１１のコンピュータシステム１１１０内で示した。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、ここでサブシステムは、コンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施形態では、コンピュータシステムは、各々がサブシステムであり、内部に構成要素を有する、複数のコンピュータ装置を含む。コンピュータシステムは、デスクトップおよびラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、ならびに他の携帯機器を含み得る。
【０１２６】
[0144]図１１で示したサブシステムは、システムバス１１８０を介して相互接続されている。プリンタ１１７４、キーボード１１７８、記憶デバイス１１７９、ディスプレイアダプタ１１８２に結合されているモニタ１１７６、およびその他などの付加的なサブシステムを示す。Ｉ／Ｏ制御装置１１７１に結合された外付けおよび入出力（Ｉ／Ｏ）デバイスは、Ｉ／Ｏポート１１７７（例えば、ＵＳＢ、Ｆｉｒｅ  Ｗｉｒｅ（登録商標））などの当技術分野で知られている任意の数の手段によって、コンピュータシステムに接続され得る。例えば、Ｉ／Ｏポート１１７７または外部インタフェース１１８１（例えば、イーサネット、Ｗｉ−Ｆｉ、など）は、コンピュータシステム１１１０をインターネットなどの広域ネットワーク、マウス入力装置、またはスキャナに接続するために用いられ得る。システムバス１１８０を介した相互接続により、サブシステム間での情報交換を可能にするだけでなく、セントラルプロセッサ１１７３が、各サブシステムと通信すること、システムメモリ１１７２または記憶デバイス１１７９（例えば、ハードドライブまたは光ディスクなどの固定ディスク）からの複数の命令実行を制御することを可能にする。システムメモリ１１７２および／または記憶デバイス１１７９は、コンピュータ可読媒体を含み得る。別のサブシステムは、カメラ、マイクロフォン、加速度計、その他などのデータ収集デバイス１１７５である。本明細書で説明したデータの任意のものは、ある構成要素から別の構成要素へ出力され得て、ユーザに出力され得る。
【０１２７】
[0145]コンピュータシステムは、例えば、外部インタフェース１１８１によって、内部インタフェースによって、または１つの構成要素から別の構成要素へ接続され得るおよび取り外され得るリムーバル記憶デバイスを介して、共に接続される、複数の同一の構成要素またはサブシステムを含み得る。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム、サブシステム、または装置は、ネットワークを通して通信する。そのような事例では、あるコンピュータは、クライアント、別のコンピュータは、サーバと考えることができ、ここで各々は、同一のコンピュータシステムの一部であり得る。クライアントおよびサーバは、各々複数のシステム、サブシステム、または構成要素を含み得る。
【０１２８】
[0146]実施形態の態様は、ハードウェア回路（例えば、ＡＰＳＩＣまたはＦＰＧＡ）を用いて、および／またはモジュラーまたは統合された様式の一般にプログラム可能なプロセッサを伴う、コンピュータソフトウェアを用いて、制御ロジックの形態で実施され得る。本明細書で使用されるとき、プロセッサは、シングルコアプロセッサ、同一の集積チップ上のマルチコアプロセッサ、または単一の回路基板上の、もしくはネットワーク化された、マルチプロセシングユニット、ならびに専用ハードウェアを含み得る。本開示および本明細書で提供された教示に基づいて、ハードウェアならびにハードウェアおよびソフトウェアの組合せを用いて、本発明の実施形態を実施するための他の方法および／または方法が、当業者には、知られ、かつ理解されよう。
【０１２９】
[0147]本出願で説明されるソフトウェアの構成要素または機能の任意のものは、例えばＪａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｓｗｉｆｔなどの任意の好適なコンピュータ言語、または例えば、従来のまたはオブジェクト指向の技術を用いたＰｅｒｌもしくはＰｙｔｈｏｎなどのスクリプト言語を用いてプロセッサによって実行されるソフトウェアコードとして実装され得る。ソフトウェアコードは、一連の命令または指令として、保存および／または伝送用の、コンピュータ可読媒体上に格納され得る。好適な非一時的コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブ、フロッピーディスクなどの磁気媒体、コンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）などの光学的媒体、またはフラッシュメモリ、などを含み得る。コンピュータ可読媒体は、そのような記憶または伝送デバイスの任意の組合せであり得る。
【０１３０】
[0148]そのようなプログラムは、さらにエンコードされ、インターネットを含む、多様なプロトコルに従う有線、光学、および／または無線ネットワークを介した伝送に適応された、搬送波信号を用いて伝送され得る。そのように、コンピュータ可読媒体は、そのようなプログラムを用いてエンコードされたデータ信号を使用して作成され得る。プログラムコードを用いてエンコードされたコンピュータ可読媒体は、互換性のあるデバイスを用いて包装され得て、または別個に他のデバイスから供給され得る（例えば、インターネットでのダウンロード）。任意のそのようなコンピュータ可読媒体は、個々のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、または完全なコンピュータシステム）上にまたは内部に備えられ得て、また、システムまたはネットワーク内部の異なるコンピュータ製品上にまたは内部に存在し得る。コンピュータシステムは、本明細書で説明した成果の任意のものをユーザに提供するための、モニタ、プリンタ、または他の好適なディスプレイを含み得る。
【０１３１】
[0149]本明細書で説明した方法の任意のものは、ステップを実行するように構成され得る１つまたは複数のプロセッサを含むコンピュータシステムを用いて、全体的にまたは部分的に実行され得る。したがって、各ステップまたはステップの各グループを実行する異なる構成要素を潜在的に有する、本明細書で説明した方法の任意のもののステップを、実行するように構成されたコンピュータシステムに、実施形態は、向けられ得る。番号を付されたステップが提示されたが、本明細書の方法のステップは、同時に、または異なる時に、または異なる順序で実行され得る。さらに、これらのステップの部分は、他の方法からの他のステップの部分と共に用いられ得る。また、ステップの全てまたは部分は、任意選択的であり得る。さらに、任意の方法の任意のステップは、モジュール、ユニット、回路、またはこれらのステップを実行するためのシステムの他の手段を用いて、実行され得る。
【０１３２】
[0150]個々の実施形態の個別の詳細が、本発明の実施形態の技術概念および範囲から逸脱することのなく、任意の好適な方法で組み合わされ得る。しかし、本発明の他の実施形態は、各々の個別の態様に関する特定の実施形態に、またはこれらの個別の態様の特定の組合せに、向けられ得る。
【０１３３】
[0151]列挙の「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、具体的にそうでないことが示されない限り、「１つまたは複数」を意味することを意図する。「ｏｒ」のを使用法は、具体的にそうでないことが示されない限り、「排他的論理和」でなく、「包含的論理和」を意味することを意図する。「第１の」構成要素への言及は、第２の構成要素がもたらされることを必ずしも必要としない。さらに、「第１の」または「第２の」構成要素への言及は、構成要素を単に区別するにすぎず、明確に規定されない限り、言及された構成要素を特定の位置または順序に限定しない。用語「基づく」は、「少なくとも部分的に基づく」を意味することが意図する。
【０１３４】
[0152]本明細書で述べられる全ての特許、特許出願、刊行物、および説明は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。いずれも先行技術であると認められない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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