(57)【要約】  本発明は、７β−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクル、特に、植物油を含む組成物、及び腫瘍性病態、例えば多形神経膠芽腫の処置におけるその使用に関する。この組成物は、経口経路によって投与され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの７β−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクルを含む組成物であって、前記脂質ビヒクルは、油又は油の混合物を含み、ここで、前記７β−ヒドロキシコレステロール誘導体は、式（Ｉ）：
【化１】
2021524490.tif 000010
［式中：
Ａは、以下を表し：
−Ｃ（Ｏ）Ｒ１基であって、Ｒ１は、５〜１４員を含みかつ１又は２のヘテロ原子を含む飽和複素環であって、該飽和複素環は、非置換であるか、又は少なくとも１つの直鎖状若しくは分枝鎖状Ｃ１−Ｃ６アルキル、又はＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されており、Ｒ及びＲ’は、独立して、水素、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル、又は非置換アリールを表し；又は
−（Ｒ２）ｎ−基であって、Ｒ２は、Ｃ−末端で結合したアミノ酸残基であり、及びｎは１〜３であり、Ｒ２のそれぞれは、同一であるか又は異なっており、前記アミノ酸のＮ末端は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３基で置換されていてもよく、Ｒ３は、単環式若しくは多環式のＣ６−Ｃ１４アリールアルキル基；同一であるか又は異なっていてもよい１つ以上のヘテロ原子を含み得る、単環式若しくは多環式のＣ５−Ｃ１４ヘテロアリールアルキル基；単環式若しくは多環式のＣ６−Ｃ１４アリールアルキルオキシ基、又は同一であるか又は異なっていてもよい１つ以上のヘテロ原子を含み得る、単環式若しくは多環式のＣ５−Ｃ１４ヘテロアリールアルキルオキシ基であり、
Ｂは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４基を表し、Ｒ４は、非置換であるか、又は上で規定されるとおりの、ＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されている、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル；又は、非置換であるか、又は上で規定されるとおりの、ＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されているアリール基であり；又は、Ｒ４はＯＲ５を表し、Ｒ５は直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキルである。］
に相当する、組成物。
【請求項２】
少なくとも１つの７β−ヒドロキシコレステロール誘導体と脂質ビヒクルとを含む組成物であって、前記脂質ビヒクルは、１つ以上の脂質層から形成される脂質小胞からなるか又は非リポソーム形態のリン脂質からなる脂質ビヒクルを除き、前記７β−ヒドロキシコレステロール誘導体は、式（Ｉ）：
【化２】
2021524490.tif 000011
［式中：
Ａは、以下を表し：
−Ｃ（Ｏ）Ｒ１基であって、Ｒ１は、５〜１４員を含みかつ１又は２のヘテロ原子を含む飽和複素環であって、該飽和複素環は、非置換であるか又は少なくとも１つの直鎖状若しくは分枝鎖状Ｃ１−Ｃ６アルキル、又はＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されており、Ｒ及びＲ’は、独立して、水素、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル、又は非置換アリールを表し；又は
−（Ｒ２）ｎ−基であって、Ｒ２は、Ｃ−末端で結合したアミノ酸残基であり、及びｎは１〜３であり、Ｒ２のそれぞれは、同一であるか又は異なっており、前記アミノ酸のＮ末端は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３基で置換されていてもよく、Ｒ３は、単環式若しくは多環式のＣ６−Ｃ１４アリールアルキル基；同一であるか又は異なっていてもよい１つ以上のヘテロ原子を含み得る、単環式若しくは多環式のＣ５−Ｃ１４ヘテロアリールアルキル基；単環式若しくは多環式のＣ６−Ｃ１４アリールアルキルオキシ基、又は同一であっても又は異なっていてもよい１つ以上のヘテロ原子を含み得る、単環式若しくは多環式のＣ５−Ｃ１４ヘテロアリールアルキルオキシ基であり、
Ｂは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４基を表し、Ｒ４は、非置換であるか、又は上で規定されるとおりの、ＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されている、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル；又は非置換であるか、又は上で規定されるようにＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されているアリール基であり；又は、Ｒ４はＯＲ５を表し、Ｒ５は直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキルである。］
に相当する、組成物。
【請求項３】
前記ビヒクルは、リン脂質以外の少なくとも１つの脂質を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記脂質ビヒクルは、油又は油の混合物を含む、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
経口経路による投与に好適な形態であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
式（Ｉ）の化合物は、前記脂質ビヒクル中で溶解している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記脂質ビヒクルは、植物油又は植物油の混合物を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記脂質ビヒクルは、アルガン油、アボカド油、亜麻仁油、ヒマワリ油、パーム油、キャベツパーム油、ココナツ油、グレープシード油、クロガラシ油、ケシ油、シアバター油、スイートアーモンド油、ダイズ油、落花生油、綿実油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油、ココア油、ヒマシ油、モリンガ油（又はベン油）、菜種油、アナットー油、小麦胚芽油、ベニバナ油、クルミ油、ヘーゼルナッツ油、カブ菜油又はそれらの混合物から選択される植物油を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記脂質ビヒクルが、アルガン油である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
式（Ｉ）において、Ａは−Ｃ（Ｏ）Ｒ１基を表し、Ｒ１は、５員を含みかつ２つの酸素原子を含む飽和複素環であって、該飽和複素環は、少なくとも１つの直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ６アルキルで置換されていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
式（Ｉ）において、Ｂは−Ｃ（Ｏ）Ｒ４基を表し、Ｒ４は、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか、又はＲ４はＯＲ５を表し、Ｒ５は直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
式（Ｉ）において、Ｂはアシル基を表し、ここで、アルキル基は、Ｃ１−Ｃ６であるか又はアルコキシカルボニル基を表し、ここで、アルキル基は、Ｃ１−Ｃ６である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
式（Ｉ）において、
Ａは、以下を表し：
−（Ｒ２）ｎ−基であって、Ｒ２がアミノ酸残基であり、及びｎが２であるか；又は
−（Ｒ２）ｎ−基であって、Ｒ２がアミノ酸残基であり、及びｎが２であり、かつ前記アミノ酸のＮ末端が、アリールアルコキシカルボニル基、特にベンジルオキシカルボニルによって置換されているか；又は
グリシニル基に結合したアラニル基であって、任意に、そのＮ末端において、アリールアルコキシカルボニル基、特にベンジルオキシカルボニルが置換しているか；又は
グリシニル基に結合したメチオニル基であって、任意に、そのＮ末端において、アリールアルコキシカルボニル基、特にベンジルオキシカルボニルが置換している、及び
Ｂは、請求項１〜３、５又は６のいずれか１項において規定されるとおりである
ことを特徴とする、請求項１〜９、１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記７β−ヒドロキシコレステロール誘導体が、式（Ｉ）の化合物から選択され、ここで：
Ａが３−ベンジルオキシカルボニル−グリシニル−アラニル基であり、及びＢがｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基であるか、又は
Ａが３−ベンジルオキシカルボニル−グリシニル−アラニル基であり、及びＢがアセチル基であるか、又は
Ａが−Ｃ（Ｏ）Ｒ１基であり、Ｒ１が２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン基であり、及びＢがｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基である、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記７β−ヒドロキシコレステロール誘導体が、式（Ｉ）の化合物であり、ここで、Ａが−Ｃ（Ｏ）Ｒ１基であり、Ｒ１が２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン基であり、及びＢがアセチル基であり、以下の式：
【化３】
2021524490.tif 000012
の化合物である、請求項１〜１２又は１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
式（Ｉ）の化合物の含量が、前記組成物の総容積の０．１〜３．５％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
式（Ｉ）の化合物の含量が、１〜３５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは３０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
脂質ビヒクルの含量が、前記組成物の総容積の９０〜９９％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
経口経路による投与に好適な形態であることを特徴とする、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
以下の工程：
請求項１、２又は１０〜１５のいずれか１項に規定される式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体、脂質ビヒクル及び共溶媒を含む、混合物を調製すること、
任意に、抗酸化剤を添加すること、及び
適用可能である場合、共溶媒を蒸散させること
を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物を調製するための方法。
【請求項２２】
前記脂質ビヒクルが、請求項３、４又は７〜９のいずれか１項に規定されるとおりである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍性病態又は悪性血液疾患の処置における使用のための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記腫瘍性病態が、多形神経膠芽腫である、請求項２３に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、７ベータ−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクルを含む組成物、その調製方法及び腫瘍性病態の処置におけるその使用、特に、多形神経膠芽腫の処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質ビヒクルは、油又は油の混合物、有利には、植物油又は植物油の混合物を、含んでもよい。
【０００３】
特に、本発明は、７ベータ−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクル（１つ以上の脂質層（単数又は複数）で形成される小胞、例えばリポソーム又はミセルタイプの小胞などからなる脂質ビヒクルを除く）を含む組成物に、関する。
【０００４】
有利には、この組成物は、液体形態であり、経口経路によって投与され得る。
【０００５】
特に、７ベータ−ヒドロキシコレステロール誘導体は、上記脂質ビヒクル中の溶液中にある。
【０００６】
本記載において、「７ベータ−ヒドロキシコレステロール」又は「７β−ヒドロキシコレステロール」は、等しく使用される。
【０００７】
多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、又は第ＩＶステージの星状細胞腫は、星状細胞を含むグリア細胞のがんへの形質転換によって本質的には性質決定される脳腫瘍である。
【０００８】
免疫療法及びナノテクノロジーの分野においてと同様に、腫瘍学における実質的な科学的及び処置的進歩にもかかわらず、ＧＢＭは、なお不治のがんである。せいぜい、研究者ら及び医師らは、患者生存中央値が、最大で１５ヶ月伸ばされ得るだけで満足である。
【０００９】
ＧＢＭの処置によって課される主要な問題は：（ａ）幹細胞によって起こる再燃。実際、既存の療法が腫瘍のすべて又は一部を根絶することに成功した際、幹細胞は、多くの場合、腫瘍再発の原因である；（ｂ）化学療法によって使用される分子は、容易に血液腫瘍関門（ＢＴＢ）を通らず、それによって低量の抗ＧＢＭ薬剤が腫瘍部位に到達する。ＢＴＢによって課される課題を回避するための、ＧＢＭ腫瘍内に埋め込まれたｍｉｎｉ−ｐｕｍｐｓ（Ａｌｚｅｔ（登録商標））、レザバ（Ｍａｍｉｙａ（登録商標））又は支持体（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））の使用は、化学療法の効果を有意に改善しない。ＢＴＢを可撓性にするための、化学療法の効能に対する脳の超音波照射の効果は、現在動物において研究中である。
【００１０】
化学療法において、主要な処置のひとつは、アバスチン（登録商標）（ＶＥＧＦのそのレセプターへの結合の阻害）及びイリノテカン（登録商標）（トポイソメラーゼＩのインヒビター）の投与からなる組み合わせ処置である。ＰＶＣタイプ（プロカルバジン、ＤＮＡアルキル化剤；ビンクリスチン、微小管重合の阻害；ＣＣＮＵ、非特異的アルキル化剤）の三重療法は、現在、非常に物議をかもしている。放射線療法と組み合わせたグアニンのアルキル化剤であるテモゾロミドは、高度メチル化ＤＮＡ（Ｓｔｕｐｐプロトコール）を有する患者について２〜３か月の生存中央値の増大を示した。Ｓｔｕｐｐプロトコールの補足として腫瘍処置分野（ＴＴＦ）を用いる臨床試験アプローチは、進行中である。シレンジタイド（いくつかのインテグリンレセプターの阻害）及びタランパネル（ＡＭＰＡタイプのグルタミン酸チャネルを遮断する）を試験する臨床試験（第ＩＩＩ相）が、進行中である。
【００１１】
また、ＧＢＭ以外のがんに対する効力を示す化学療法は、ＧＢＭを有する患者についての生存中央値を改善しない。例えばブレオマイシン（ホジキンリンパ腫に投与された）、アファチニブジマレエート及びシスプラチン（非小細胞肺がんに投与される）及びシクロホスファミド（乳がんのために投与される）が、言及され得る。
【００１２】
出願ＷＯ２０１３／１６８０９６は、ＧＢＭを含むヒトがん細胞に対するヒトがん細胞に対しインビトロで抗腫瘍効力を示す、特にリポソーム形態又はエタノール溶液の形態の、７β−ヒドロキシコレステロール誘導体のファミリーを記載する。特に、当該出願の実施例６において調製される化合物（本出願の実施例において「化合物ＢＩＭ２ｂ」と呼ばれる）は、ヒトＧＢＭ株であるＵ８７−ＭＧ株（Ｕ８７）上で、活性をインビトロで示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１６８０９６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、上記の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体、すなわち、処置的活性を有する分子が、血液腫瘍関門（ＢＴＢ）の障害を通って、特に、脳に位置する腫瘍に到達することを可能にする処方物であって、十分な量のこの処置的分子を含む処方物の需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
処方物はまた、容易な投与、好ましくは経口経路による投与を可能にすること、及び、患者の不安定な健康状態を考慮して、数週間又は数か月にすら及び得る処置期間にわたって、毒性の効果を起こさないことが求められる。
【００１６】
ステロイド性化合物、例えばステロイドホルモン、鉱質コルチコイド及び糖質コルチコイドは、コレステロールの一部及びオキシステロールファミリーの一部を形成する側鎖を欠く。また、特定のステロイド性化合物において、コレステロールや最も一般的なオキシステロールの場合にはない、アルコール官能基及び芳香族環と組み合わせた、ケトン官能基が存在する。
【００１７】
したがって、ステロイド性化合物は、通常、コレステロール及び７β−ヒドロキシコレステロール誘導体、特に、下記の式（Ｉ）の化合物よりも、以下の理由によって、油中により容易に溶解する：
−  ステロイド性化合物の立体障害は、上述のコレステロール及び７β−ヒドロキシコレステロール誘導体の立体障害よりも小さい、
−  ステロイド性化合物は、コレステロール及び７β−ヒドロキシコレステロール誘導体よりも、多くの化学基及び環（非局在化した電子を有する）を有する、及び
−  ステロイド性化合物に見出される極性の性質を有する化学基及び環状構造は、油中に存在する酸基、アルコール、二重結合及び特定の環（スピナステロール、ショッテノール）への結合を可能にし、したがって、コレステロール及び下記の式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体よりも、油中によりよく溶解する。
【００１８】
ここで、７β−ヒドロキシコレステロール誘導体と脂質ビヒクルとを組み合わせた処方物であって、前記脂質ビヒクルは、１つ以上の脂質層から形成される脂質小胞からなる脂質ビヒクルを除く、処方物は、このステロール誘導体がＢＴＢを通ることを可能にし、動物においてインビボで顕著な抗ＧＢＭ活性を得ることを可能にすることが、見いだされた。
【００１９】
好ましくは、この処方物は、７β−ヒドロキシコレステロール誘導体と１つ以上の脂質層から形成される脂質小胞からなるか、又は非リポソーム形態の少なくとも１つのリン脂質からなる脂質ビヒクルを除く脂質ビヒクルとを、合わせる。
【００２０】
有利には、この７β−ヒドロキシコレステロール誘導体は、本発明による脂質ビヒクル中で溶解している。
【００２１】
これらの特性、すなわち、ＢＴＢの通過、十分な量の活性生成物の投与、毒性の不存在及びインビボでの処置的効果の獲得の組み合わせを得ることは、腫瘍性病態の分野においてはますます、達成することが特に困難であり、ＢＴＢの通過だけでも、活性生成物の効率に対する主要な障害である。
【００２２】
本発明によると、脂質ビヒクルは、特に、薬学的に許容される脂質ビヒクルである。
【００２３】
特に、脂質ビヒクルは、飽和及び／又は単価不飽和及び／又は多価不飽和の脂肪酸、又はその混合物、特に、モノ−、ジ−又はトリグリセリドの形態、又はその混合物を、含む。
【００２４】
「１つ以上の脂質層で形成される脂質小胞」は、１つ以上の脂質層を含むか又はこれによって構成される脂質小胞、例えば、リポソーム又はミセルタイプの小胞などを意味する。
【００２５】
有利には、本発明による脂質ビヒクルは、リン脂質ではない少なくとも１つの脂質を含み、このリン脂質はリポソーム形態又は非リポソーム形態である。
【００２６】
有利には、この処方物は、約１．５のｐＨ（ヒトにおける胃消化のｐＨ）、及び約８．５〜１０のｐＨ（ヒトにおけるファーター領域のレベルでの消化のｐＨ）にて安定であることも見出されており、これは、特に、経口経路による投与の文脈で、活性化合物が作用部位に到達することを可能にするために求められている。
【００２７】
したがって、本発明は、第１の局面により、少なくとも１つの７β−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクルを含む組成物であって、前記脂質ビヒクルは、１つ以上の脂質層から形成される脂質小胞からなる脂質ビヒクル、及び非リポソーム形態のリン脂質からなる脂質ビヒクルを除く、組成物に関し、ここで、前記７β−ヒドロキシコレステロール誘導体は、式（Ｉ）：
【化１】
2021524490.tif 000002
［式中：
Ａは、以下を表し：
−Ｃ（Ｏ）Ｒ１基であって、Ｒ１は、５〜１４員を含みかつ１又は２のヘテロ原子を含む飽和複素環であって、該飽和複素環は、非置換であるか、又は少なくとも１つの直鎖状若しくは分枝鎖状Ｃ１−Ｃ６アルキル、又はＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されており、Ｒ及びＲ’は、独立して、水素、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１アルキル、好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、又は非置換アリールを表し；又は
−（Ｒ２）ｎ−基であって、Ｒ２は、Ｃ−末端で結合したアミノ酸残基であり、及びｎは１〜３であり、Ｒ２のそれぞれは、同一であるか又は異なっており、前記アミノ酸のＮ末端は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３基で置換されていてもよく、Ｒ３は、単環式若しくは多環式のＣ６−Ｃ１４アリールアルキル基；同一であるか又は異なっていてもよい１つ以上のヘテロ原子を含み得る、単環式若しくは多環式のＣ５−Ｃ１４ヘテロアリールアルキル基；単環式若しくは多環式のＣ６−Ｃ１４アリールアルキルオキシ基、又は同一であっても又は異なっていてもよい１つ以上のヘテロ原子を含み得る、単環式若しくは多環式のＣ５−Ｃ１４ヘテロアリールアルキルオキシ基であり、
Ｂは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４基を表し、Ｒ４は、非置換であるか又は上で規定されるとおりの、ＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されている、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６、アルキル；又は、非置換であるか、又は上で規定されるとおりの、ＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されているアリール基であり；又は、Ｒ４はＯＲ５を表し、Ｒ５は、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキルである。］
に相当する。
【００２８】
アルキル基は、直鎖状又は分枝鎖状のＣ１−Ｃ１２基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｔｅｒｔ−ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル又はドデシル基を示し、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ６のアルキル基が、好ましい。
【００２９】
アリール基は、不飽和、単環式又は多環式の、炭素環式Ｃ６−Ｃ１４基をいい、例えば、フェニル、ナフチル、インデニル、アントラセニル基をいい、より特に、フェニル基である。
【００３０】
「ヘテロ原子」は、酸素原子、窒素原子又は硫黄原子を意味する。
【００３１】
有利なアミノ酸残基は、例えば、メチオニル、グリシニル又はアラニル単位である。
【００３２】
式（Ｉ）の化合物の調製は、出願ＥＰ２６６６３８２及びＷＯ２０１３／１６８０９６に記載される。
【００３３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本記載の意味の範囲内で、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「によって構成される（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｂｙ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を包含すると理解され得る。
【００３４】
「によって構成される（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｂｙ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、本記載の意味の範囲内で、この語に続く特徴の他の特徴の存在を除外する。
【００３５】
有利には、７β−ヒドロキシコレステロール誘導体は、上記脂質ビヒクル中で溶解している。
【００３６】
好ましくは、脂質ビヒクルは、油又は油の混合物、有利には、植物油又は植物油の混合物を、含む。
【００３７】
さらなる局面において、本発明は、少なくとも１つの７β−ヒドロキシコレステロール誘導体と脂質ビヒクルとを含む組成物に関し、ここで、この脂質ビヒクルは、油又は油の混合物を含み、ここで、７β−ヒドロキシコレステロール誘導体は、以下の式（Ｉ）：
【化２】
2021524490.tif 000003
［式中：
Ａは、以下を表し：
−Ｃ（Ｏ）Ｒ１基であって、Ｒ１は、５〜１４員を含みかつ１又は２のヘテロ原子を含む飽和複素環であって、該飽和複素環は、非置換であるか又は少なくとも１つの直鎖状若しくは分枝鎖状Ｃ１−Ｃ６アルキル、又はＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されており、Ｒ及びＲ’は、独立して、水素、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、又は非置換アリールを表し；又は
−（Ｒ２）ｎ−基であって、Ｒ２は、Ｃ−末端で結合したアミノ酸残基であり、及びｎは１〜３であり、Ｒ２のそれぞれは、同一であるか又は異なっており、前記アミノ酸のＮ末端は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３基で置換されていてもよく、Ｒ３は、単環式若しくは多環式のＣ６−Ｃ１４アリールアルキル基；同一であるか又は異なっていてもよい１つ以上のヘテロ原子を含み得る、単環式若しくは多環式のＣ５−Ｃ１４ヘテロアリールアルキル基；単環式若しくは多環式のＣ６−Ｃ１４アリールアルキルオキシ基、又は同一であっても又は異なっていてもよい１つ以上のヘテロ原子を含み得る、単環式若しくは多環式のＣ５−Ｃ１４ヘテロアリールアルキルオキシ基であり、
Ｂは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４基を表し、Ｒ４は、非置換であるか、又は上で規定されるとおりの、ＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されている、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル；又は非置換であるか、又は上で規定されるようにＯＲ、ＮＲＲ’、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基によって置換されているアリール基であり；又は、Ｒ４はＯＲ５を表し、Ｒ５は直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキルである。］
に相当する。
【００３８】
特に、この脂質ビヒクルは、油又は油の混合物、有利には、植物油又は植物油の混合物によって、構成される。
【００３９】
特に、７ベータ−ヒドロキシコレステロール誘導体は、油又は油の混合物、好ましくは植物油又は植物油の混合物中の溶液中にあり、有利には、油又は油の混合物、好ましくは植物油又は植物油の混合物中に、完全に溶解している。
【００４０】
「植物油」は、油質の植物、すなわち、植物の特定の部位、例えば脂質を含む種子、堅果又は果実から抽出された脂質物質、特に食用油を意味する。
【００４１】
植物油は、植物起源の飽和、単価不飽和及び／又は多価不飽和脂肪酸を含み、これは主に、グリセリドとも呼ばれるアシルグリセロール（グリセロールと脂肪酸とのエステル）の形態で存在している。このようなアシルグリセロールは、油の主要な構成要素であり、特に、植物油の量の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、又はなお少なくとも９５％である。このアシルグリセロールは、モノ−、ジ−又はトリ−グリセリド、又はこれらの混合物の形態であってもよい。
【００４２】
好ましくは、植物期限の脂肪酸は、４〜２４の炭素原子（Ｃ４〜Ｃ２４）を含み、特に、１０、１２、１４、１６、１８、２０又は２２の炭素原子を含む。この脂肪酸は、例えば、炭素鎖中に、１〜３の二重結合を含んでもよい。
【００４３】
植物油はまた、例えば、少量の、例えば、化合物の２０％未満、好ましくは１０％未満、又はなお５％未満の、アシルグリセロール以外の化合物、例えば、リン脂質、フィトステロール、トコフェロール、スフィンゴ脂質、カルテノイド類を、含んでもよい。
【００４４】
植物油は、例えば、アルガン油、アボカド油、亜麻仁油、ヒマワリ油、パーム油、キャベツパーム油、ココナツ油、グレープシード油、クロガラシ油、ケシ油、シアバター油、スイートアーモンド油、ダイズ油、落花生油、綿実油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油、ココア油、ヒマシ油、モリンガ油（ｏｒベン油）、菜種油、アナットー油、小麦胚芽油、ベニバナ油、クルミ油、ヘーゼルナッツ油、カブ菜油又はそれらの混合物から選択されてもよい。
【００４５】
低ビタミンＥ含量の植物油、特にアルガン油が、好ましく使用される。
【００４６】
植物油はまた、合成によって、類似の化学組成を有する油を調製すること、例えばグリセリドを含む油を調製することによって、合成的に生成されてもよい。
【００４７】
油又は油の混合物、有利には植物油又は植物油の混合物の、組成物中の脂質ビヒクルとしての使用は、血液腫瘍関門（ＢＴＢ）の通過及び所望の処置的活性の両方を得るために、十分な量の式（Ｉ）の化合物を含み得る組成物を得ることを可能にする。
【００４８】
上記油、特に植物油は、好ましくは、薬学的に許容される形態で使用される。
【００４９】
さらに、このような脂質ビヒクルを含む本発明による処方物は、両極端のｐＨ、例えば、約１．５のｐＨ（ヒトにおける胃の消化のｐＨ）及び約８．５〜１０のｐＨ（ヒトにおけるファーター領域のレベルでの消化のｐＨ）において、非常に良好な安定性を有し、式（Ｉ）の化合物の活性を維持することを可能にする。このような特性は、１つ以上の脂質層から形成される脂質小胞、例えば、リポソーム又はミセルタイプの小胞の場合には示されない。
【００５０】
好ましい式（Ｉ）の化合物は、以下のものである：
−  Ａは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１基を表し、Ｒ１は、５〜１４員を含みかつ１又は２のヘテロ原子を含む飽和複素環であって、該飽和複素環は、非置換であるか又は少なくとも１つの直鎖状若しくは分枝鎖状Ｃ１−Ｃ６アルキルによって置換されている；
−  Ｂは、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４基を表し、Ｒ４は、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル；又は、Ｒ４はＯＲ５を表し、Ｒ５は直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキルである。
【００５１】
好ましい局面において、Ｒ１は、５員を含みかつ２つの酸素原子を含む、少なくとも１つの直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ６アルキル、特にメチル基で置換された、飽和複素環である。特に、Ｒ１は、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン基である。
【００５２】
好ましくは、Ｒ４は、直鎖状又は分枝鎖状Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、特にメチル基である。
【００５３】
好ましい局面において、Ｂは、アシル基を表し、ここで、アルキル基は、Ｃ１−Ｃ６、特にアセチルであり、又は、アルコキシカルボニル基を表し、ここで、アルキル基は、Ｃ１−Ｃ６であり、特に、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基である。
【００５４】
式（Ｉ）の他の好ましい化合物は、以下のものである：
−  Ａは、−（Ｒ２）ｎ−基を表し、Ｒ２がアミノ酸残基であり、及びｎが２であるか；又は
−  Ａは、−（Ｒ２）ｎ−基を表し、Ｒ２がアミノ酸残基であり、及びｎが２であり、かつ前記アミノ酸のＮ末端が、アリールアルコキシカルボニル基、特にベンジルオキシカルボニルで置換されているか；又は
−  Ａは、グリシニル基に結合したアラニル基を表し、任意に、そのＮ末端において、アリールアルコキシカルボニル基、特にベンジルオキシカルボニルが置換しているか；又は
−  Ａは、グリシニル基に結合するメチオニル基を表し、任意に、そのＮ末端において、任意選択的に、アリールアルコキシカルボニル基、特にベンジルオキシカルボニルが置換している、及び
−  Ｂは、上で規定されるように、その一般的又は好ましい既定のものである。
【００５５】
式（Ｉ）の好ましい化合物は、以下のとおりである：
−  ７−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２−（２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−アセトアミド）プロピオネートであり、単純化して、「３−ベンジルオキシカルボニル−グリシニル−アラニル−７−β−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−コレステロール」又は化合物ＢＩＭ１ａとも名付けられる；
−  ７−アセトキシ−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２−（２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−アセトアミド）プロピオネートであり、単純化して、「３−ベンジルオキシカルボニル−グリシニル−アラニル−７−β−Ｏ−アセチル−コレステロール」又は化合物ＢＩＭ１ｂとも名付けられる；
−  ７−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシレートであり、単純化して、「３−（Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシル−７−β−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−コレステロール」又は化合物ＢＩＭ２ａとも名付けられる；
−  ７−アセトキシ−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシレートであり、単純化して、「３−（Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシル−７−β−Ｏ−アセチル−コレステロール」又は「コレステ−５−エン−３，７−ジオール、７−アセテート３−［［（４Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル］カルボキシレート］、（３β，７β）」又は化合物ＢＩＭ２ｂとも名付けられる。
【００５６】
これらの式（Ｉ）の化合物は、それぞれ、出願ＷＯ２０１３／１６８０９６の実施例３、４、５及び６に記載される。
【００５７】
本発明の目的のために特に好ましい式（Ｉ）の化合物は、上述の「化合物ＢＩＭ２ｂ」であり、すなわち、Ａが−Ｃ（Ｏ）Ｒ１基であり、Ｒ１が２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン基であり、及びＢがアセチル基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００５８】
本化合物は以下の式に相当する：
【化３】
2021524490.tif 000004
【００５９】
化合物ＢＩＭ１ａは、Ａが３−ベンジルオキシカルボニル−グリシニル−アラニル基であり、及びＢがｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００６０】
化合物ＢＩＭ１ｂは、Ａが３−ベンジルオキシカルボニル−グリシニル−アラニル基であり、及びＢがアセチル基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００６１】
化合物ＢＩＭ２ａは、Ａが−Ｃ（Ｏ）Ｒ１基であり、Ｒ１が２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン基であり、及びＢがｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基である、式（Ｉ）の化合物である。
【００６２】
本記載において、他に明記されない限り、示された値の範囲は、包括的である。
【００６３】
本発明による組成物における式（Ｉ）の化合物の含量は、好ましくは、組成物の総容積の０．１〜３．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは３％である。好ましくは、この組成物は、式（Ｉ）の化合物を、１〜３５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは３０ｍｇ／ｍｌの割合で含む。
【００６４】
本発明による組成物中における脂質ビヒクル、特に植物油の含量は、好ましくは、組成物の総容積の９０〜９９％、特に、９５〜９９％（ｖ／ｖ）である。
【００６５】
本発明による組成物はまた、油性組成物の場合に、少なくとも１つの通常の賦形剤又は添加剤、例えば共溶媒、例えばアルコール、又は抗酸化剤などを含む。
【００６６】
例えばアルコールなどの共溶媒は、組成物中に、例えば、組成物の総容積の０〜５％、特に１〜５％（ｖ／ｖ）の割合で、存在してもよい。
【００６７】
アルコールとしては、好ましくは式Ｒ−ＯＨのアルコールが使用され、ここで、Ｒは、Ｃ２−Ｃ６炭化水素基であり、好ましくはエタノールを表す。
【００６８】
抗酸化剤は、この分野で通常のものである化合物から選択されてもよく、例えば：
−  ヒドロキシル化物質、例えばクエン酸及びその誘導体、特に、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム又はクエン酸カリウム；アスコルビン酸及びその誘導体、特に、イソアスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム又はアスコルビン酸カルシウム；
−  チオール誘導体、例えばシステイン、アセチルシステイン、ジチオトレイトールなど；
−  エチレン性不飽和物質、例えばソルビン酸など
である。
【００６９】
この抗酸化剤は、組成物中に、例えば、０．００５〜０．０２０％（ｗ／ｖ）、特に０．００５〜０．０１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１％の割合で存在してもよい。
【００７０】
好ましい抗酸化剤は、アスコルビン酸及びその誘導体から選択される。
【００７１】
本発明による好ましい組成物は、３％（ｗ／ｖ）の式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体、特に、上述の好ましい式（Ｉ）の化合物の１つ、より好ましくは化合物ＢＩＭ２ｂ、０．０１％の無水クエン酸（ｗ／ｖ）１％のエタノール（ｖ／ｖ）を、アルガン油中に含む。この組成物はまた、エタノール非含有であってもよい。
【００７２】
本発明はまた、上述の組成物を含む医薬組成物に関する。
【００７３】
医薬組成物はまた、脂質媒体中に溶解する別の活性成分、例えば抗炎症剤、特にコルチコイド、又は抗てんかん薬剤などをも含んでもよい。
【００７４】
本発明による医薬組成物は、好ましくは、経口経路による投与に好適な形態であってもよく、特に、液体形態、例えば経口溶液、経口懸濁液、ドロップなど、又はカプセル封入形態、例えば、液体製剤をカプセル封入したカプセル、特に、ゼラチンベースの硬質又は軟質カプセルであってもよい。
【００７５】
本発明はまた、上述の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクルを含む組成物を調製する方法にも関し、以下の工程を含む：
−  上述の式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体、脂質ビヒクル及び共溶媒を含む、混合物を調製すること、
−  任意に、抗酸化剤を添加すること、及び
−  適用可能である場合、共溶媒を蒸散させること。
【００７６】
脂質ビヒクル、抗酸化剤及び共溶媒は、上で規定されるとおりである。上述の好ましい局面もまた、本発明による方法に適用される。
【００７７】
特に、油又は油の混合物、有利には植物油又は植物油の混合物からなる上記脂質ビヒクルは、特にアルガン油である。
【００７８】
上記油、特に植物油は、好ましくは、薬学的に許容される形態で使用される。
【００７９】
上記方法の好ましい条件は、以下のとおりである：
−  混合物は、およそ２２〜３５℃、好ましくは３３℃で調製される；
−  混合物中の式（Ｉ）の化合物の含量は、０．１〜３．５％（ｗ／ｖ）である；
−  共溶媒、好ましくはエタノールの、混合物中の初期含量は、およそ１〜５％、好ましくは２．５％（ｖ／ｖ）である；
−  抗酸化剤、好ましくはクエン酸及びその誘導体の、混合物中の含量は、０．００５〜０．０２０％（ｗ／ｖ）、特に０．００５〜０．１５％、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）である。
【００８０】
式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体、脂質ビヒクル及び共溶媒、並びに任意選択的に抗酸化剤を含む混合物は、例えば、回転蒸発装置を用いて攪拌しながら、式（Ｉ）の化合物が溶解するまで混合してもよい。
【００８１】
混合は、例えば、式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体と脂質ビヒクルとを混合し、次いで、共溶媒及び任意選択的に抗酸化剤を添加することによって、実施されてもよい。
【００８２】
蒸散後に得られた、共溶媒、特にアルコール（特にエタノール）の含量は、医薬形態の現行の規則（ＩＣＨＱ３Ｃ（Ｒ６）規則）に適合している。
【００８３】
本発明はまた、腫瘍性病態、特に多形神経膠芽腫の処置における使用のための、上で規定されるような、式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクルを含む組成物にも関する。
【００８４】
本発明はまた、悪性血液疾患（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈａｅｍｏｐａｔｈｙ）、特に骨髄タイプの悪性血液疾患の処置における使用のための、上で規定されるような、式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクルを含む組成物にも関する。
【００８５】
本発明はまた、腫瘍性病態、特に多形神経膠芽腫を処置するための、上で規定されるような、式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクルを含む有効な濃度の組成物を、上記処置を必要とする患者に投与することを含む、方法にも関する。
【００８６】
本発明はまた、悪性血液疾患、特に骨髄タイプの悪性血液疾患を処置するための、上で規定されるような、式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクルを含む有効な濃度の組成物を、上記処置を必要とする患者に投与することを含む、方法にも関する。
【００８７】
本発明はまた、腫瘍性病態、特に多形神経膠芽腫の処置における使用、又は悪性血液疾患、特に骨髄タイプの悪性血液疾患の処置における使用のための、上で規定されるような、式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクルを含む組成物を含む、医薬組成物にも関する。
【００８８】
上述の一般的かつ好ましい局面、特に、式（Ｉ）の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体及び脂質ビヒクルについての局面もまた、使用及び方法に適用される。
【００８９】
投与される用量は、例えば、例えば８４〜１０５日間に及ぶ期間に、例えば、１日に３〜５ｍｇ／ｋｇであってもよい。しかし、用量は、患者の状態及び疾患の段階に依存して、３０ｍｇ／ｋｇ／日まで増大してもよく、処置期間は、例えば２か月間まで延長してもよい。
【００９０】
本発明は、実施例１〜２（調製）及び実施例３〜８（結果）によって説明される。
【００９１】
ＢＩＭ２ｂの可溶化方法は、実施例１及び２に詳述されるように、ＢＩＭ２ｂを油中、特にアルガン油中に溶解させることができた。有利な局面において、油１〜５００ｍｌの範囲にわたり、ＢＩＭ２ｂ粉末を油に添加する条件、ＢＩＭ２ｂ／油系を混合する条件及び混合が行われる表面積／容積比は、ＢＩＭ２ｂ粉末の油中への完全な溶解をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、実施例２の油性処方物で処置した健康なマウスの脳からの脂質抽出物の、シリカカラムクロマトグラフィーを示す。
【図２】図２は、実施例２の油性処方物で処置した神経膠芽腫を有するイヌの脳からの脂質抽出物の、シリカカラムクロマトグラフィーを示す。
【図３】図３は、極度のｐＨに対する抵抗性の試験後の、実施例２の油性処方物の安定性のモニタリングを、ＨＰＴＬＣによって示す。
【図４】図４は、実施例２の油性処方物で処置した神経膠芽腫を有するイヌにおける腫瘍の全体的退縮を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
以下の略号が、使用される：
７β−アセチル−ＣＨ：７β−アセチル−コレステロール
７β−ＯＨＣＨ：７β−ヒドロキシコレステロール
ＡＰＣＩ：大気圧化学イオン化源
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＣＨ：コレステロール
ＣＨＣｌ３：クロロホルム
化合物ＢＩＭ２ｂ：化合物７−アセトキシ−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシレート。コレステ−５−エン−３，７−ジオール、７−アセテート３−［［（４Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル］カルボキシレート］、（３β，７β）とも呼ぶ
化合物ＢＩＭ２ｂ  ＰＯ：経口経路による投与のための、実施例２の油性処方物の形態の、化合物ＢＩＭ２ｂ
ＥｔＯＨ：エタノール
Ｆｏｌｃｈ：ＣＨＣｌ３：ＭｅｔＯＨ（２：１、ｖ：ｖ）
ＡＯ：アルガン油
ＨＣｌ：塩酸
ＧＢＭ：多形神経膠芽腫
ＨＰＴＬＣ：高速薄層クロマトグラフィー
ＫＣｌ：塩化カリウム
ＭｅｔＯＨ：メタノール
ＮａＯＨ：水酸化ナトリウム
ｐ：重量
ＭＷ：分子量
ＲＴ：周囲温度
ＵＰＬＣ  ＭＳ：超高速液体クロマトグラフィー質量分析
ｖ：容積
【００９４】
＜Ａ／使用した分子及びビヒクル及び分析＞
＜１）活性物質＞
コレステ−５−エン−３，７−ジオール、７−アセテート３−［［（４Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル］カルボキシレート］、（３β，７β）を、ＧＬＰ／ＧＭＰ等級にて、出願ＷＯ２０１３／１６８０９６に記載されるように合成した（実施例６で詳述するとおり、粉末の形態で得た）。
【００９５】
以下に示す式のこの分子は、実施例の節を通して、ＢＩＭ２ｂと呼ばれる。
【化４】
2021524490.tif 000005
【００９６】
＜２）活性物質の分解生成物及び主要な代謝物＞
ａ）  ７β−アセチル−コレステロールを、出願ＷＯ２０１３／１６８０９６に詳述されるように合成した（化合物１．４）。
【００９７】
以下に示す式のこの分子は、実施例の節を通して、７β−アセチル−ＣＨと呼ばれる。
【化５】
2021524490.tif 000006
【００９８】
ｂ）  ７β−ヒドロキシコレステロールは、ＳＩＧＭＡによって供給された（参照７０００３５Ｐ）。
【００９９】
以下に示す式のこの分子は、実施例の節を通して、７β−ＯＨＣＨと呼ばれる。
【化６】
2021524490.tif 000007
【０１００】
ｃ）  コレステロールは、ＳＩＧＭＡによって供給された（参照Ｃ８５０３）。
【０１０１】
以下に示す式のこの分子は、実施例の節を通して、ＣＨと呼ばれる。
【化７】
2021524490.tif 000008
【０１０２】
ｄ）  選択したビヒクルは、アルガン油（Ｏｌｓａｎａ、Ｆｒａｎｃｅ）であり、実施例の節を通して、ＡＯと呼ばれる。
【０１０３】
＜Ｂ）資材及び方法＞
＜Ｉ）資材＞
＜Ｉ．１）クロマトグラフィー＞
＜Ｉ．１．１）高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）及び従来のシリカカラム上の吸着クロマトグラフィー＞
−  クロマトグラフィー用マルチプレートタンク  ２０×２０ｃｍ（参照５５２−０３５９）
−  ガラスフリットを有するクロマトグラフィーカラム（有効長さ：３００ｍｍ；内径＝１１ｍｍ；キー操作ＰＴＦＥストップコック  １．５ｍｍ）（Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｌａｂ、参照ＬＥ−ＡＴ１８１１）
−  粉末シリカゲル６０（０．０６３〜０．２００ｍｍ）（参照１．０７７３４．１０００）
−  ＨＰＴＬＣプレート：アルミ箔（ＶＷＲ、参照１０５５８３０００１）上の濃縮領域（２．５ｃｍ）を有するシリカゲル６０  Ｆ２５４
−  ネブライザー及び三角フラスコ１００ｍｌ（Ｗｉｔｅｇ、参照２１４７１００、ＮＳ１４．５／２３）
−  ホットプレート（Ｓｔｕａｒｔ  ＳＢ１６２）
−  ホウケイ酸ガラス管
−  スキャナー（Ｅｐｓｏｎ  Ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ  Ｖ３７０  Ｐｈｏｔｏ）
−  マイクロキャピラリードラモンド  １０μｌ（Ｓｉｇｍａ、参照Ｐ１９２４）
【０１０４】
＜Ｉ．１．２）吸着カートリッジ又は逆相上のクロマトグラフィー＞
−  ＳＥＰ  ＰＡＫ  Ｃｌａｓｓｉｃ  Ｓｉｌｉｃａ（Ｗａｔｅｒｓ、参照ＷＡＴ０５１９００）
−  ＳＥＰ  ＰＡＫ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ、参照ＷＡＴ０２３６３５）
【０１０５】
＜Ｉ．１．３）超高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ）＞
調査する分子（ＢＩＭ２ｂ及びその代謝物）の定量を、Ｋｉｎｅｔｅｘ  ＥＶＯ  Ｃ１８カラム（粒子サイズ：１．９μｍ；カラム寸法：１００×２．１ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備えたＮｅｘｅｒａ  Ｘ２  ＵＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて行った。ＡＰＣＩ検出を、四重で実施した（ＬＣＭＳ  ８０５０、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）。
【０１０６】
＜Ｉ．２）  経口経路による投与のためのＢＩＭ２ｂの処方物（ＢＩＭ２ｂ  ＰＯ）＞
−  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｑｕｉｎｔｉｘ精密秤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、参照ＱＵＩＮＴＩＸ  １２４−１Ｓ）
−  ５ｍｌ  ホウケイ酸ガラス管１２×７５ｍｍ（Ｋｉｍｂｌｅ、参照７３５００−１２７５）
−  ２５ｍｌ  ホウケイ酸ガラス管Ｐｙｒｅｘ  １８×１８０ｍｍ（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、参照０９０４８２）
−  ５ｍｌ  ビーカー
−  擦りガラスストッパーつき１リットル反応フラスコ（メス、２９／３２ＮＳ）（ＶＷＲ、参照２０１−１３５９）
−  Ｒ−２１５  Ｂｕｃｈｉ回転蒸発装置
−  位相差倒立顕微鏡Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ−１００Ｆ三眼鏡Ｎｉｋｏｎ（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、参照：０９４５０１）、Ｃマウントデジタルカメラ（ＮＩＫＯＮ、ＤＣＭＣ５１０）との組み合わせ
【０１０７】
＜Ｉ．３）調査下にある分子の定量（ＢＩＭ２ｂ及びその代謝物）：野生型マウスの脳及びＧＢＭを有するイヌの脳の剖検後に得た腫瘍の、ホモジナイゼーション＞
−  ホモジナイザー（Ｉｋａ  ｅｕｒｏｓｔａｒ  ２０  ｄｉｇｉｔａｌ）
−  Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ組織粉砕機（容量：４ｍｌ；長さ：１２０ｍｍ；外径：１１ｍｍ）（ＶＷＲ、参照４３２−０２００）
−  球形分液漏斗、２５０ｍｌ、ＰＴＦＥストップコックつき（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、参照４７９０３６）
−  分液漏斗、５０ｍｌ、ＰＴＦＥストップコックつき（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、参照０８４１１８）
【０１０８】
＜Ｉ．４）有機溶媒及び他の消耗品＞
−  カラムクロマトグラフィー用シリカ、シリカゲル６０（０．０６３〜０．２００ｍｍ）（Ｍｅｒｃｋ、参照１．０７７３４．１０００）
−  ＣＨＣｌ３、ＨＰＬＣ等級（Ｓｉｇｍａ、参照５２８７３０）
−  無水ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ、参照ＳＩ−３２２２１）
−  ＭｅｔＯＨ  ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ  ＨＰＬＣ用≧９９．９％（ＳＩＧＭＡ、参照３４８６０）
−  Ｎ−ヘキサン  ＨＰＬＣ用（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、参照１０７０３６１）
−  酸化ジエチル、ＨＰＬＣ用に安定化（Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｌａｂ、参照ＦＩ−１０２５４９１４）
−  アセトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、参照３２２２０１）
−  オルトリン酸９９％（Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｌａｂ、参照Ｕ１Ｂ２０３１０２Ｈ）
−  酢酸銅９８％（Ｓｉｇｍａ、参照３２６７５５／
−  ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ；Ｓｉｇｍａ、Ｗ２１８４０５、参照Ｗ２１８４０５）
−塩  酸  最低３７％（ＨＣｌ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、参照Ｍ０６４３Ｈ）
−  ナトリウム（ＮａＯＨ／Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、参照０４８１５）
−  炭酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ、参照２０７８６１）
−  塩化カリウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、参照Ｗ２７５２）
−  ホルマリン又はホルムアルデヒド溶液（３６．５〜３８％、水中）（Ｓｉｇｍａ、参照Ｆ８７７５）
−酢酸アンモニウム（Ｍｅｒｃｋ、参照Ｃ１３８３１５）
【０１０９】
＜ＩＩ）方法＞
＜ＩＩ．１）ＨＰＴＬＣクロマトグラフィー＞
医薬（ＢＩＭ２ｂＰＯ）、野生型マウスの脳及びＧＢＭ腫瘍を有するイヌ由来のＧＢＭ腫瘍における、ＢＩＭ２ｂ、その分解生成物及びその主要な代謝産物を定量するために、分析アプローチを使用した。実験的に決定したＢＩＭ２ｂ及びその分解生成物（７β−アセチル−ＣＨ及び７β−ＯＨＣＨ）の検出の閾値は、０．５μｇである。
【０１１０】
本方法を、ＵＰＬＣ−ＭＳによって評価した。
【０１１１】
−  ＨＰＴＬＣプレートの処理
マルチプレートクロマトグラフィータンクを、溶出系：ＣＨＣｌ３：ＭｅｔＯＨ混合物（１：１；ｖ：ｖ）で、１時間にわたって飽和させる。ＨＰＴＬＣプレートを、タンク内に入れる；溶出を、溶出フロントがプレートの上端から１．５〜２ｃｍに達したときに停止する。次いで、これを周囲温度で１時間にわたり乾燥させる。次に、これらのプレートを、１１０℃で１５分間にわたって活性化する。いったん冷めた後、これらをアルミニウム箔で包み、光と湿度とを避けて保存する。
【０１１２】
−  ＨＰＴＬＣプレート上のサンプルの堆積及びクロマトグラフィー条件
全てのサンプルを、アセトン中で可溶化し、ドラモンドキャピラリー（１０μｌ）でＨＰＴＬＣプレート上の濃縮領域上に堆積させる。ＢＩＭ２ｂ、７β−アセチル−ＣＨ及び７β−ＯＨＣＨの標準範囲を使用する際、各参照分子につき０．１ｍｇ／ｍｌのエタノールストック溶液から、これらを調製する。
【０１１３】
クロマトグラフィー分離を、２工程で行う：濃縮領域のための溶出系としてＣＨＣｌ３：ＭｅｔＯＨ混合物（２：１、ｖ／ｖ）を用いる溶出前工程（３回）、その後、分離領域について、ヘキサン：エーテル混合物（３：７、ｖ／ｖ）を溶出系として用いて分離工程を実施し（３回）、ステロールを同定及び定量する。
【０１１４】
クロマトグラフィー前に、濃縮及び分離のために、タンクをそれぞれの溶出系で飽和させる。
【０１１５】
各溶出の間で、ヘアドライヤーからの冷空気流を用いて、プレートを乾燥させる。
【０１１６】
＜オキシステロールの可視化及び定量＞
オキシステロールを、Ｍａｃａｌａ方法（１）にしたがって可視化する。Ｍａｃａｌａ試薬は、８％（ｗ／ｖ）のオルトリン酸及び３％（ｗ／ｖ）の酢酸銅の水溶液からなる。クロマトグラフィー後、ＨＰＴＬＣプレートを乾燥させ、Ｍａｃａｌａ試薬を噴霧し、そしてホットプレート上で１４０℃まで加熱する。オキシステロールは、プルシャンブル―になり、コレステロールは、モーブ色になる。染色された点をスキャンし、次いで、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５０ｇ）で定量する。
【０１１７】
オキシステロール及びコレステロールの、ＨＰＴＬＣ方法による定量を、ＵＰＬＣ−ＭＳによって評価した。
【０１１８】
＜ＩＩ．２）ＵＰＬＣ−ＭＳ＞
溶出及び検出の実験条件：
−  ＢＩＭ２ｂ及び７β−ＯＨＣＨの定量：
定組成溶離を、５ｍＭの酢酸アンモニウムを含むＭｅｔＯＨからなる移動相で実施する。
【０１１９】
−  ７β−アセチル−ＣＨの定量：
溶出を、線形二成分勾配を用いて実施する。溶出液Ａは、０．１％（ｖ：ｖ）のギ酸であり、溶出液Ｂは、０．１％のギ酸を含むＭｅｔＯＨであった。溶出を、２０％のＡと８０％のＢ（ｖ：ｖ）との混合物で開始し、溶出液Ｂ１００％で停止する；勾配の間隔は、３分間である。
【０１２０】
注入の容積は、１０μｌであり、検出を、ポジティブモードのＡＰＣＩによって実施する。
【０１２１】
＜ＩＩ．３）ＢＩＭ２ｂ及びその分解生成物の抽出及び精製＞
製剤化されたＢＩＭ２ｂ（ＢＩＭ２ｂ  ＰＯ）におけるＢＩＭ２ｂに対する安定性試験の間のＢＩＭ２ｂ、７β−アセチル−ＣＨ及び７β−ＯＨＣＨの定量（ＢＩＭ２ｂ  ＰＯのサンプルがＨＰＴＬＣプレート上に直接施用される）を除き、オキシステロールの抽出及び精製は、両極端のｐＨの条件にさらしたＢＩＭ２ｂ  ＰＯ、ＢＩＭ２  ＰＯを経管栄養で経口投与した野生型マウスの脳、並びに自然に生じたＧＢＭを有し、経口経路によりＢＩＭ２ｂで処置して８ケ月生存したイヌ（ＧＢＭイヌ対象）（化学療法処置を行ってもＧＢＭを有するイヌの平均生存は２〜３ヶ月である）の剖検から得たＧＢＭ腫瘍における、これらの分子の定量のために、必須である。
【０１２２】
オキシステロールを、Ｆｏｌｃｈらによって推奨される方法（２）によって、抽出する。抽出を、分液漏斗内で行う。簡潔には、抽出を、ＣＨＣｌ３：ＭｅｔＯＨ混合物（２：１、ｖ：ｖ；Ｆｏｌｃｈ）によって行う；この方法のための、Ｆｏｌｃｈの容積対水性サンプルの容積の比は、１９である。ＫＣｌを０．７４％で含む水溶液の０．２容量の有機相により、相をすすぎそして破壊する。
【０１２３】
ＢＩＭ２ｂ  ＰＯで経口経路により処置した健康なマウスの脳又はＢＩＭ２ｂ  ＰＯで経口経路により処置したイヌのＧＢＭ腫瘍からのオキシステロールの抽出の場合、０．７４％  ＫＣｌですすいだ有機相を、０．４容量のＣＨＣｌ３：ＭｅｔＯＨ：Ｈ２Ｏ混合物（３：４８：４７；ｖ：ｖ：ｖ；Ｆｏｌｃｈの上相）で再びすすぐ。次いで、乾燥した残渣を、抽出工程後の実験方法のために、好適な溶媒中で溶解する。
【０１２４】
＜ＩＩ．４）  オキシステロールの分離及び定量の前に抽出を必要とするサンプル＞
−  極端な酸性ｐＨ及びその後の塩基性ｐＨでのインキュベーションに対するＢＩＭ２ｂ  ＰＯの抵抗性の試験
これらの試験のために、ＢＩＭ２ｂ  ＰＯを、まずｐＨ１．５の酸性浴中でインキュベートし、次いで、ｐＨ８．５の塩基性浴中でインキュベートする。これらの２値は、それぞれ、ヒトの胃消化及びファーター膨大部のレベルにおける消化の生理学的ｐＨに対応する。
【０１２５】
酸性水溶液浴は、１Ｍ及び０．１Ｍ  ＨＣｌのストック溶液から調製する。塩基性浴は、２５ｍＭの炭酸アンモニウムである。
【０１２６】
実験を開始する前に、４ｍｌの酸浴（ｐＨ１．５）を含む第１ビーカーを、３７℃まで加熱する；次いで、２ｍｌのＢＩＭ２ｂ  ＰＯを、浴の表面上に静かに置く。反応混合物を、磁気棒で１０時間撹拌する。撹拌をやめ、反応混合物を２時間そのままにし、油上相を正しく再形成させる。反応混合物を置いておく２時間の間に、塩基性浴（ｐＨ８．５）を、第２ビーカー内で調製し、３７℃まで加熱する。１ｍｌサンプルを、酸性浴の脂質相から取り出し、塩基性浴の水性表面に静かに置く。インキュベーション１０時間にわたり、撹拌を開始する。撹拌を止めてから、混合物全体（ＢＩＭ２ｂ  ＰＯ及び塩基性浴）を、有機相をＦｏｌｃｈ上相で再度洗浄することなく、Ｆｏｌｃｈ抽出に供する。
【０１２７】
−  ＢＩＭ２ｂ  ＰＯ（経口経路）で処置した健康なマウスの脳由来のオキシステロール及びその代謝物の抽出及び定量
乾燥させ、そして１８０℃にて液体窒素中でクライオチューブ内に個別に保存したマウス脳を、周囲温度に戻す。各脳を計量し、Ｐｏｔｔｅｒに入れる；４ｍｌの０．７４％の冷ＫＣｌを加え、残りの手順を氷床上で行う。各脳を、１０００ｒｅｖ／分で６回、各回とも５分間のグラインドと５分間の休憩を行うことによって、つぶす。オキシステロールを、上で説明したとおり（ＩＩ．３．）、Ｆｏｌｃｈ手順にしたがって、抽出する。次いで、脂質残渣を、シリカカラム上の吸着クロマトグラフィーにかける。
【０１２８】
シリカ（８ｇ）を、４０ｍｌのヘキサン：エーテル混合物（ジエチルオキシド（３：７、ｖ／ｖ）中に調製し、次いで、適切なカラムに注ぐ。シリカ床の高さは、１８ｃｍであり、容量は１５ｍｌである。
【０１２９】
好適な量のマウス脳抽出物を、１ｍｌの第１溶出系中に溶解し、シリカ床上に置く。溶出を４工程で行い、オキシステロールを含む画分を濃縮して、マウス脳に夾雑する脂質、特にコレステロールを、可能な限り取り除く。
【０１３０】
溶出を以下の通り進める：
第１溶出：ヘキサン：エーテル（３：７、ｖ：ｖ）
第２溶出：アセトン：ＥｔＯＨ（９５：５、ｖ：ｖ）
第３溶出：アセトン：ＥｔＯＨ（９３：７、ｖ：ｖ）
第４溶出：ＥｔＯＨ
【０１３１】
溶出手順を、図１に説明する。
【０１３２】
画分の群を、乾燥するまで蒸散させ、アセトンに溶解し、適切な量をＨＰＴＬＣクロマトグラフィーに供する。
【０１３３】
−  ＢＩＭ２ｂ  ＰＯ（経口経路）で処置したイヌにおけるＧＢＭ腫瘍からのＢＩＭ２ｂ及びその代謝物の抽出及び定量
ＧＢＭ腫瘍を、ＢＩＭ２ｂ  ＰＯにより経口経路で処置した、神経膠芽腫を有するイヌ（８ヶ月の間良好なクオリティオブライフで生きた）の剖検から得た。剖検を、ＢＩＭ２ｂ  ＰＯによる処置を停止した後２１日目に行った。腫瘍を、主に組織病理学分析のためにホルマリン中に固定し、残った断片を、ＢＩＭ２ｂの定量のために分析した。
【０１３４】
ＧＢＭを有さないイヌの脳の断片及び腫瘍断片の一部において、全ての確認を行って、ホルマリンによる固定が、オキシステロールの質又はそのＦｏｌｃｈ技術による抽出物中の収量を変更させないことを実証した。
【０１３５】
ホルマリンの浴中のクライオチューブ内に、＋４℃で個別に保存したイヌ脳の断片を、ソパリン紙上で乾燥させ、その後、これらの重量を量り、Ｐｏｔｔｅｒに入れる。マウス脳の抽出物と同様に、４ｍｌの０．７４％  冷ＫＣｌを添加した後、各断片を抽出した。ホモジナイゼーション及び抽出の手順は、方法の節でマウス脳について記載したものと同じである。
【０１３６】
こうして、イヌＧＢＭ腫瘍断片の乾燥脂質抽出物を得、ＳＥＰ  ＰＡＫ  Ｃｌａｓｓｉｃシリカカートリッジ上に順次クロマトグラフィーした；次いで、ＳＥＰ  ＰＡＫ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８（溶出液  Ａ＝５ｍＭの酢酸アンモニウム／超純水、及びＢ＝５ｍＭの酢酸アンモニウム／ＭｅｔＯＨ）上でクロマトグラフした。ＳＥＰ  ＰＡＫカラム上のクロマトグラフィープロセスを、図２に示す。
【実施例】
【０１３７】
＜Ｃ．調製の実施例及び結果＞
＜実施例１：脂質ビヒクルにおける試験＞
試験する油は、アルガン油、アボカド油、オリーブ油、落花生油及びグレープシード油である。試験を、試験管規模で行った。
【０１３８】
種々の量のＢＩＭ２ｂ（１〜３５ｍｇの範囲に及ぶ）を、１ｍｌの選択した油に数回加え、決められた量に到達した。試験管を、ＢＩＭ２ｂの各添加の間、静かに撹拌する。
【０１３９】
試験管を、３７℃で２４時間にわたり、インキュベーターに入れる。インキュベーションの最初の５時間の間、管を、毎時間インキュベーターから出して静かに混ぜ、インキュベーターに戻して一晩置いた。翌日、油とＢＩＭ２ｂとの混合物の外観を視認して、粉末の油中への溶解度を決定した。ＢＩＭ２ｂが裸眼で油中に完全に溶けたように見える場合、顕微鏡による試験を行い、粉末又は結晶の形態にあるＢＩＭ２ｂの存在又は不存在を確認する。
【０１４０】
結果は、ＢＩＭ２ｂが、アボカド油、オリーブ油、落花生油、及びグレープシード油中に、３ｍｇのＢＩＭ２ｂ／ｍｌ油の濃度で完全に溶解することを示す。
【０１４１】
アルガン油（ＡＯ）中で、ＢＩＭ２ｂは、３０ｍｇ（５２μｍｏｌ）のＢＩＭ２ｂ／ｍｌ  ＡＯの濃度まで溶解する。
【０１４２】
＜実施例２：ＢＩＭ２ｂ  ＰＯの調製＞
２８５ｍｌのアルガン油（Ｏｌｓａｎａ、Ｆｒａｎｃｅ）を、１Ｌフラスコ中に入れ、生産用容器として使用した。フラスコの位置を傾け、その軸の周りを手動で回し、フラスコの壁に、面積／容積比：１．６ｃｍ−１（計算結果：４６０ｃｍ２／２８５ｃｍ３）で油を均等に行きわたらせる。この位置を維持し、９ｇのＢＩＭ２ｂ粉末を、壁全体にわたって取り込ませ、フラスコの表面全体を覆う。次に、３０ｍｇのクエン酸を含む３ｍＬのエタノールを添加する（１０ｍｇのクエン酸／ｍｌのエタノールのストック液から）；次いで、１２ｍｌのエタノール（すなわち、５％のエタノール）。フラスコを、３０℃の水浴中のＢｕｃｈｉ（登録商標）Ｒ−２１５  斜軸式回転蒸発装置に、１５ｒｐｍの速度で、２時間にわたって載せた。エタノールを蒸散させるために、次いで、３０℃の水浴中で一晩蒸散させた。
【０１４３】
こうして、ＢＩＭ２ｂをアルガン油中に３０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、３００ｍｌの組成物を得た。
【０１４４】
こうして得られたＢＩＭ２ｂ  ＰＯ処方物は、３％（ｗ／ｖ）のＢＩＭ２ｂ、０．０１％（ｗ／ｖ）の無水クエン酸及び１％のＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）（蒸散後）をアルガン油中に含み、これを以下の実施例で使用する。
【０１４５】
本バッチの生成の直後における、ＢＩＭ２ｂ  ＰＯ中のＢＩＭ２ｂ及びその分解生成物の定量は、何ら分解生成物のない、ＰＯの３０ｍｇのＢＩＭ２ｂ／ｍｌＢＩＭ２ｂ  ＰＯの濃度を示す。
【０１４６】
本方法によって生成されたＢＩＭ２ｂ  ＰＯバッチの安定性の研究は、実験条件下で、６ヶ月にわたる保存の後の１％の分解生成物（ｗ／ｖ）の存在、及び同じバッチの１２か月にわたる保存の後では、２％（ｗ／ｖ）以下だったことを示す。
【０１４７】
＜実施例３：ＢＩＭ２ｂ  ＰＯの酸性ｐＨ及びその後の塩基性ｐＨでのインキュベーションに対する耐性試験＞
試験手順は、上の第ＩＩ節）方法において記載される。
【０１４８】
ＢＩＭ２ｂ  ＰＯの連続的な酸性（ｐＨ１．５）及び塩基性（ｐＨ８．５）浴のインキュベーション後、乾燥脂質抽出物を、アセトン中に溶解した。スペースが不足していたため（理論上１５、３０、４０及び６０μｇの、４通りの追跡）、標準範囲は堆積しなかった。
【０１４９】
図３で示されるＨＰＴＬＣからの分析結果は、堆積量に関係なく、ＢＩＭ２ｂの一本のバンドの検出を、０．５〜０．６４の保持係数（Ｒｆ）と共に示す。実験的に決定した分解生成物７β−アセチル−ＣＨ及び７β−ＯＨＣＨ（視認できない）のＲｆ値は、それぞれ０．３７及び０．２４である。これらの結果は、ＢＩＭ２ｂ  ＰＯが、分解することなく、極端なｐＨの条件を耐えることを示す。
【０１５０】
＜実施例４：ＢＩＭ２ｂ  ＰＯの健康なマウスにおける毒性の調査＞
実施例２からの組成物を、野生型マウスに動物あたり１．５ｍｇ（５０μｌのＢＩＭ２  ＰＯ）、１日２回、７日中５日、最大処置期間２１日間で、（管により）経口投与する。並行して、野生型マウスの対照群は、何ら処置を受けなかった。
【０１５１】
処置群において、２匹のマウスを１８日後に屠殺し、３匹のマウスを２１日後後に屠殺した。対照群において、３匹のマウスを２１日後に屠殺した。
【０１５２】
内部器官（胃、消化管、肝臓、腎臓、肺、心臓）のサンプルを、４％ホルムアルデヒド中に７２時間にわたって浸漬し、４℃で保存して、パラフィン内に包埋した。サンプルは、切片化の前及び後に顕微鏡分析を経た。
【０１５３】
ホルムアルデヒドで固定した内部器官の組織学的実験及び毒性学的定量を、学名命名法（３）に適合した４レベル評価システムにしたがって、ヘマトキシリン−エオシン−サフランで染色した切片において実施した。
【０１５４】
全ての切片を、細胞変化、分解、壊死、炎症、繊維症などの、可能性のある兆候について試験した。結論を以下に示す（各器官について）。
−  胃：どの処置マウスにおいても病変なし
−  小腸：バックグラウンドノイズの一部を形成すると解釈される、リンパ形質細胞性の性質の最小の炎症。有意な病変なし。
−  大腸：どのマウスにも病変なし
−  肝臓：細胞質保存の低下及び肝細胞肥大の傾向が、対照マウスと比して、処置マウスにおいて観察された。この変化は、非常に拡散的なままであり、処置に対する確実性に寄与することはできなかった。
−  腎臓：どのマウスにおいても有意な病変は検出されなかった。
−  肺：最小の組織球増殖症及びわずかな肺胞炎症が、処置マウスの１匹にあったが、おそらくは強制経口給餌によって起きたのだろう。
−  心臓：どのマウスにも病変なし
【０１５５】
結論として、結果は、分子ＢＩＭ２ｂが、何ら毒性を有さないことを示した。指定した薬量、１日２回、週５日間、週末に処置の休止でのＢＩＭ２ｂの投与は、望まぬ臨床効果を起こさなかった。同様に、調査した生物学的パラメータは、肝臓毒性又は腎臓毒性を示さなかった。ステロイドの投与で予測される糖尿病及び高コレステロール血症は、観察されなかった。
【０１５６】
＜実施例５：変更なイヌにおけるＢＩＭ２ｂ  ＰＯの耐性研究＞
実施例２からの組成物を、平均体重１１ｋｇの３頭のビーグル犬に、１５ｍｇ（０．５ｍｌ）の割合で、１日２回（朝は食餌の後に、午後は絶食中に）、７日間のうちの５日間、２１日間の処置期間で、経口投与した。
【０１５７】
投与した用量の計算は、投与に特異的な値に基づいており、１日に３ｍｇ／ｋｇである。
【０１５８】
動物の完全な臨床試験を、Ｄ０〜Ｄ２１に、平日に毎日実施した：体重測定、直腸検温、一般状態、食欲。週末には（投与なしの休息期）、動物は、単純な観察のみを行い、一般状態及び行動が正常であるかを確認した。
【０１５９】
全血球数（ＦＢＣ）及び生化学アッセイのための血液サンプルを、開始時及び処置の最後（Ｄ０及びＤ２１）に採取した。全てのイヌが、全ての処置を受けた。イヌを試験した際、副作用は観察されなかった。
【０１６０】
研究の結果は、以下のとおりである：
【０１６１】
ステロイドの使用は体重増加を引き起こすので、イヌを、毎処置日に体重計量した。予測に反して、全てのイヌについて約４．５％の体重減少が観察された。
【０１６２】
コレステロール及びトリグリセリドのレベルの上昇は、検出されなかった。対照的に、これらの分子の量の低下が測定された：コレステロールについて平均で−２．３％、トリグリセリドについて平均で−３０％。
【０１６３】
ステロイドの使用はまた、糖尿病の発症の源でもあり得る。Ｄ２１において、糖血症の増大は観察されなかった。対照的に、平均１２．９％のグルコースの低下が、観察された。
【０１６４】
行った腎臓バランス（尿素及びクレアチニン）に基づいて、３頭のイヌにおいて、腎臓毒性は、観察されなかった。
【０１６５】
３頭のイヌの肝臓バランス（アルブミン、タンパク質、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）（ＡＳＴ／ＡＬＴ比）、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン）は、処置後、正常であった。その上、血液学的及び生化学的パラメータの有意な変化も観察されなかった。
【０１６６】
結果として、ＢＩＭ２ｂ  ＰＯ組成物形態で投与した化合物ＢＩＭ２ｂは、何ら毒性をもたらさなかった。３０ｍｇ／ｍｌの化合物ＢＩＭ２ｂの薬量、１日２回、週に５日、２１日間でのこの組成物の投与は、望まぬ臨床結果を生じなかった。同様に、研究したパラメータは、肝臓毒性及び腎臓毒性を実証しなかった。
【０１６７】
＜実施例６：自然発生した神経膠腫を有するイヌ（「ＧＢＭイヌ対象」と呼ぶ）に経口経路で投与されたＢＩＭ２ｂ  ＰＯの抗ＧＢＭ効力の研究＞
本研究の目的は、本発明による組成物で投与された化合物ＢＩＭ２ｂの、イヌ神経膠腫の処置における効力を、評価することであった。
【０１６８】
自然発生した神経膠腫を有すると画像診断された９頭のイヌを、本研究に組み込んだ。イヌを、５ｋｇあたり日用量の３ｍｇ／ｋｇの化合物ＢＩＭ２ｂ（実施例２からの組成物１ｍｌ）で経口により処置した。
【０１６９】
本研究は、２１日間の５サイクル（１０５日間）の処置、及びその後の３ヶ月の２サイクルの観察を含む。状態及び腫瘍容積は、ＭＲＩによって評価される。
【０１７０】
Ｄ０日目（第１回投与）に、ＧＢＭイヌ対象を、臨床試験し、血液サンプルを、生化学的パラメータの分析のために収集する。Ｄ１５に、心電図を記録し、血液サンプルを採取する。Ｄ２１日目から開始して、用量を見直し、腫瘍応答及び／又は毒性に依存して、上げた（元の用量の＋２５％）か又は下げた（元の用量の−２５％）。
【０１７１】
心電図、血液サンプル及びＭＲＩを、Ｄ４２、Ｄ６３、Ｄ８４及びＤ１０５に、次いで、処置の停止後３ヶ月後及び６ヶ月後に実施する。
【０１７２】
腫瘍応答を、ＲＥＣＩＳＴ基準（固形腫瘍における応答評価基準）に基づき、ＭＲＩによって評価する。これらの基準は、以下のような腫瘍応答を規定する。
−  進行は、以前のＭＲＩと比較して２０％を超える、腫瘍の最大軸の大きさの増大によって規定される。
−  退縮は、以前のＭＲＩと比較して３０％を超える、腫瘍の最大軸の大きさの減少によって規定される。
−  安定は、３０％未満の減少と２０％未満の増大との間の、腫瘍の大きさの変化によって規定される。
【０１７３】
＜結果＞
本研究は、２２ヶ月続いた。組み込んだ９頭のイヌのうちの３頭は、Ｄ４２に到達しなかったため、分析しなかった（特に、組み込むには疾患のステージが進みすぎていたことに起因する死）。残りの６頭のイヌの中で、２頭のイヌ（Ｎ及びＧ）は、Ｄ１６５（５．５ヶ月）及びＤ１２６（４．２ヶ月）に、それぞれ死亡した。ＧＢＭイヌ対象Ｎ由来の腫瘍を、ＢＩＭ２ｂ及びその代謝物を定量するために使用した（実施例８）。
【０１７４】
残りの４頭のＧＢＭイヌ対象について、経口経路による処置には、十分に耐えていたことが見出された。臨床兆候の改善が、４頭全てのイヌについて留意された。２頭は安定なままであり、他の２頭の場合には、非常に明確な退縮が観察され、そのうちの１頭（Ｄ）においては病変がほぼ消滅した。図４は、イヌＤのＤ４２における腫瘍の消失を示す。
【０１７５】
＜実施例７：ＢＩＭ２ｂ  ＰＯにより経口で処置されたマウスの脳におけるＢＩＭ２ｂの分析＞
健康なマウスのＢＩＭ２ｂ  ＰＯによる経口での処置及び脳の起源を、実施例４に記載する。
【０１７６】
方法の節で記載したように、脳における化合物ＢＩＭ２ｂ及びその代謝物を、ＨＰＴＬＣによって分離し、検出し、そして定量する。結果を下の表１に示す。
【表１】
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【０１７７】
結果は、化合物ＢＩＭ２ｂが、本発明による組成物中のＢＩＭ２ｂ  ＰＯによって経口経路で処置されたマウスの脳において見出されることを示す。これは、化合物ＢＩＭ２ｂが、処置された健康なマウスの血液脳関門（ＢＢＢ）を通ることを示す。Ｄ２２には、マウス脳におけるＢＩＭ２ｂの含量の顕著な低下（９１．５％）とＤ２０に処置を停止したこととの間に、明確な相関性が観察された。代謝物は、痕跡量としてのみしか見出されない。
【０１７８】
腫瘍性病態の場合、ＢＢＢよりもむしろ、ＢＴＢ（血液腫瘍関門）に対して言及がなされる。ＢＴＢは、腫瘍の存在によって、そしてその生理学によって、弱体化する。研究は、分子がＢＢＢをよりも容易にＢＴＢを通ることを示す。
【０１７９】
ＢＢＢの通過は、したがって、ＢＴＢを通る予測としてみなされていてもよい。
【０１８０】
脳内で見出されるＢＩＭ２ｂの百分率は、マウスが摂取した全量と比較して、Ｄ１８に、０．０１３％である。
【０１８１】
＜実施例８：ＢＩＭ２ｂ  ＰＯにより経口経路で処置されたＧＢＭイヌ対象の腫瘍におけるＢＩＭ２ｂの分析＞
ＧＢＭ腫瘍は、実施例６におけるイヌＮに由来する。
【０１８２】
腫瘍における化合物ＢＩＭ２ｂ及びその代謝物を、節ＩＩ）方法において記載されるように、ＨＰＴＬＣによって分離し、検出し、そして定量する。
【０１８３】
結果は、分析した２１２．７ｍｇの分析した腫瘍断片中に、３．７μｇのＢＩＭ２が存在することを示す。腫瘍全体に見出されるＢＩＭ２ｂの重量百分率は、イヌが摂取したＢＩＭ２ｂの全量に比較して、０．３９％である；すなわち、健康なマウスの脳において見出される重量百分率より、３０倍高い（実施例７）。
【０１８４】
腫瘍の剖検を、処置をやめてから２１日目に行った事実、及びＢＩＭ２ｂは腫瘍内でなお見出される事実は、ＢＩＭ２ｂ  ＰＯに含まれる化合物ＢＩＭ２ｂが、ＢＴＢを通って、ＧＢＭ腫瘍内に優先的に見出されることを示す。
【０１８５】
参考文献
１．  Ｍａｃａｌａ，ＬＪ，Ｙｕ  ＲＫ  ａｎｄ  Ａｎｄｏ，Ｓ．Ｊ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．（１９８３），２４：１２４３−１２５０．
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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