(57)【要約】  医療用植物性カンナビノイドの生産方法は、組織培養によって培養された大麻の植物細胞を成長させることによる、医療用植物性カンナビノイドの生産方法であって、培養用の大麻の葉組織を選択する工程と、選択された前記葉組織から得られた組織培養物を、光への露出を制御して組織培養物のカンナビノイド含有量を制御しつつ、液体ベースの培地において成長させる工程と、を含んでいる。光への露出を制御することにより、成長した組織培養物の植物性カンナビノイド含有量を意図した用途に合わせることができる。例えば、組織培養物のＴＨＣ含有量は、意図される用途に応じて最大化または最小化されるように制御することができる。組織培養物の使用は、遺伝的な一貫性を可能にし、植物性カンナビノイドを含む植物細胞を生産するために必要な資源を減らすため、先行技術の方法と比較して有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織培養によって培養された大麻の植物細胞を成長させることによる、医療用植物性カンナビノイドの生産方法であって、
培養用の前記大麻の葉組織を選択する工程と、
選択された前記葉組織から得られた組織培養物を、光への露出を制御して前記組織培養物のカンナビノイド含有量を制御しつつ、液体ベースの培地において成長させる工程と、を含んでいる医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項２】
前記組織培養物の成長中に前記組織培養物が常にＰＡＲにさらされるように前記光への露出が制御されている請求項１に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項３】
前記ＰＡＲが、１日あたり少なくとも０．２モルの光子を提供するように制御されている請求項２に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項４】
前記ＰＡＲが、１日あたり０．５モルの光子を提供するように制御されている請求項２に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項５】
前記組織培養物の成長中に前記組織培養物がＵＶ光に露出されるように前記光への露出が制御されている請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項６】
前記組織培養物の成長中に前記組織培養物がＵＶＡ光に露出されるように前記光への露出が制御されている請求項５に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項７】
前記組織培養物の成長中に前記組織培養物がＵＶＢ光に露出されるように前記光への露出が制御されている請求項５または請求項６に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項８】
前記組織培養物の成長中に、前記組織培養物が１２００ルーメン以上２０００ルーメン未満の強度の前記ＵＶ光に露出され、且つ前記ＵＶ光は露出と暗闇の周期を交互に繰り返し、前記露出の各期間は少なくとも３０分であり、前記暗闇の各期間は少なくとも３０分であるように、前記ＵＶ光が制御されている請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項９】
前記露出の各期間が１時間以下であり、前記暗闇の各期間が１時間以下である請求項８に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項１０】
前記ＵＶ光の強度が２０００ルーメン以下である請求項８または請求項９に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項１１】
前記組織培養物の成長中、前記組織培養物が１２００ルーメン以下の強度の前記ＵＶ光に常に露出されるように、前記ＵＶ光が制御されている請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項１２】
前記ＵＶ光が６００ルーメン以下の強度を有している請求項１０に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項１３】
成長中、前記組織培養物が２５℃から３０℃の間の温度に維持されている請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項１４】
成長中、前記組織培養物が２７℃の温度に維持されている請求項１３に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項１５】
前記組織培養物が１０〜２８日間成長されている請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項１６】
前記組織培養物が１４日間成長されている請求項１５に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項１７】
前記組織培養物が、前記組織培養物の成長中にかき混ぜられている請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項１８】
前記組織培養物が成長する環境のＣＯ2含有量が、組織成長を増進するように制御されている請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項１９】
成長後、前記組織培養物を収集して凍結乾燥するさらなる工程を含む請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【請求項２０】
培養用に選択された前記葉組織が、請求項１に記載の方法を用いて前もって成長された請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の医療用植物性カンナビノイドの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
植物性カンナビノイドは、大麻植物に存在する一連の化合物で、摂取すると人体と相互作用して身体的または心理的な効果をもたらす。最もよく知られている植物性カンナビノイドは、テトラハイドロカンナビノール（ＴＨＣ）である。植物性カンナビノイドは、医療用マリファナと総称されるもののもとでの治療においてますます一般的に使用されるようになってきている。総称されるものの中に、身体的または精神的状態を治療するための植物性カンナビノイドの使用は含まれている。医療用マリファナは活発で成長している分野であるため、信頼性が高く一貫した植物性カンナビノイドの供給源が必要である。
【０００２】
現在医療用マリファナとして使用される植物性カンナビノイドは、通常、従来の農業方法で栽培されている大麻植物（カンナビス・サティバ）から得られる。しかし、この方法での大麻植物（カンナビス・サティバ）の栽培は理想的とは言えない。植物間の生来の遺伝上の変動により、同じ条件で栽培されている場合でも、植物は常に植物性カンナビノイド含有量に変動を有するからである。さらに、植物の農業による生育中の天候および／または土壌条件の変動は、植物の植物性カンナビノイド含有量の変動をもたらし得る。
【０００３】
土地利用は、従来の農業などの代替用途のために利用されてきたので問題となる。大麻植物は、法的および非法的用途のために第三者にとって貴重であるため、土地の安全保障も問題になる可能性がある。農業用大麻栽培はまた大量の水を必要とし、比較的非効率的なプロセスである。
【０００４】
従来農業による栽培に代わるものとして、大麻植物は、多くの場合、屋内で水耕栽培されている。しかし、このような栽培は非常にエネルギー集約的であり、大量の水を必要とする。植物は屋内では人工照明を必要とするため、照明によって生じる過剰な熱を除去するために換気および温度制御を行うことも必要である。さらに、水耕栽培植物には遺伝上の変動の問題が残っている。
【０００５】
上記課題を解決するために、安全であり、資源の必要性を減少させ、一貫した量の植物性カンナビノイドを提供することができる、新規な植物性カンナビノイドの生産方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、組織培養によって培養された大麻の植物細胞を成長させることによる、医療用植物性カンナビノイドの生産方法であって、培養用の前記大麻の葉組織を選択する工程と、選択された前記葉組織から得られた組織培養物を、光への露出を制御して前記組織培養物のカンナビノイド含有量を制御しつつ、液体ベースの培地において成長させる工程と、を含んでいる。
【０００７】
本発明の方法は、一貫性があり且つ制御可能な植物性カンナビノイド含有量を有する培地の生産を可能にするので有利である。特に、組織培養は、遺伝上の変異のない組織の生産を可能にし、光への露出の制御は、組織内の植物性カンナビノイド生成の制御を可能にする。培養される葉組織は、正確な植物性カンナビノイド組成を提供するように選択することができる。例えば、最大化または最小化されたレベルのＴＨＣおよび／または大麻油を提供する葉組織が選択されてもよい。
【０００８】
組織培養物を成長させた後、得られた細胞を直接薬剤として使用してもよいし、または、その細胞から植物性カンナビノイドを抽出してさらなる処理を行ってもよい。以前の方法とは対照的に、本発明の方法によって生産される組織培養物は、制御され得る一貫した植物性カンナビノイド含有量を有し、したがって、さらなる有意な処理なしに組織培養物の植物細胞を薬剤として使用することが可能である。例えば、組織培養物の植物細胞を凍結乾燥させ、さらなる処理なしに薬剤として使用してもよいし、またはその後凍結乾燥した細胞を水に溶解することにより薬剤として使用してもよい。
【０００９】
本発明の方法によって生産される植物性カンナビノイドは、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、蒸気吸入生成物または他の経口摂取剤形を含むがこれらに限定されない多くの剤形で使用することができる。
【００１０】
本発明の組織培養物を成長させるためには、組織培養物が光合成活性放射（ＰＡＲ）にさらされることが必要である。容易に理解されるように、ＰＡＲは、組織が光合成することを可能にする光である。一般的に、光合成用の光受容体は、光スペクトルの青色（４００〜５００ｎｍ）および赤色（６００〜７００ｎｍ）領域において最も効率的である。遠赤色（７００〜８００ｎｍ）は、多くの植物の開花にとって重要である。緑色の領域（５００〜６００ｎｍ）はあまり理解されておらず、この領域の光の多くが反射されても、カロテノイドおよびリコピン（色および光保護用）にとって有益であると考えられている。これに基づいて、ほとんどのＰＡＲは青色光と赤色光を含んでおり、また遠赤色光および／または緑色光を含んでいてもよい。植物の成長のためのＰＡＲを生成するように設計および意図され、本発明の方法での使用に適している多くの市販の照明システムがある。
【００１１】
本発明の実施形態では、組織培養物の成長中に組織培養物が常にＰＡＲにさらされるように、光への露出が制御されていてもよい。このことは、組織培養物の成長を最大化できるため、有益である。特に、本発明の方法は、植物全体ではなく組織培養物の成長を必要とするので、自然光のサイクルを再現するためにＰＡＲを周期的に行う必要はない。
【００１２】
組織培養物を十分に成長させるために、ＰＡＲは、１日あたり少なくとも０．２モルの光子、好ましくは１日あたり０．５モルの光子を提供するように制御されることが一般に好ましい。本発明の方法の任意の実施形態において提供されるＰＡＲの正確な量は、ＰＡＲにさらされる組織培養物の量に依存する。組織培養物の量が多いと、一般に、十分に成長するために大量のＰＡＲが必要になる。
【００１３】
組織培養物を成長させるにはＰＡＲが必要であるが、組織培養物における植物性カンナビノイドの制御は、組織培養物のＵＶ光への露出を制御することによって制御可能である。特に、ＴＨＣを含む植物性カンナビノイドは、各ＴＨＣ分子がＵＶ光から植物を保護するように作用するいくつかのリング構造を持っているため、ＵＶ光から植物を保護するために大麻植物内に形成されると考えられている。したがって、ＵＶ光への露出は、大麻植物におけるＴＨＣの生産を増加させると考えられており、同じメカニズムが大麻組織培養物内でも生じるであろう。
【００１４】
組織培養物におけるＴＨＣおよび他の植物性カンナビノイドの生成を増加させるために、本発明の実施形態では、組織培養物の成長中に組織培養物がＵＶ光にさらされるように、光への露出が制御されている。別の実施形態では、組織培養物におけるＴＨＣおよび他の植物性カンナビノイドの生成を最小限にするために、ＵＶ光への組織培養物の露出が最小限になるように制御されていてもよい。しかしながら、ＵＶ光の放射は、フェノール類、アントシアニン類（着色剤）、酸化防止剤、組織培養でのカビの成長を阻害するビタミン類の生成を誘発する上で重要である。したがって、組織培養物がこのような化学物質を生成できるようにするために、組織培養物を比較的少量のＵＶ光に露出することが必要な場合がある。例えば、ＵＶ光の放射が最小化される場合、組織培養物が１日あたり０．０５モル未満の光子に露出されるように制御されていてもよい。
【００１５】
慢性疼痛または他の同様の状態の治療に使用するＴＨＣを生成するために組織培養物が成長されている場合、ＴＨＣ含有量を最大化することが好ましい場合がある。パーキンソン病の治療に使用する大麻油を生産するために組織培養物が成長されている場合には、ＴＨＣ含有量を最小限に抑えることが好ましい場合がある。
【００１６】
波長３１５〜４００ｎｍの光で構成されるＵＶＡ光は、ＴＨＣ、他の植物性カンナビノイド、および組織の成長に不可欠な他の化学物質のレベルを上昇させる可能性がある。したがって、組織培養物の成長中に組織培養物がＵＶＡ光に露出されるように制御することが好ましい場合がある。
【００１７】
波長２８０〜３１５ｎｍの光で構成されるＵＶＢ光への露出は、ＴＨＣ、他の植物性カンナビノイド、および大麻植物内の組織の成長に不可欠な他の化学物質の生成を増加させる。したがって、組織培養物の成長中に組織培養物がＵＶＢ光に露出されるように制御することが好ましい場合がある。一般に、大麻内のＴＨＣのレベルを上げる上で、ＵＶＢ光はＵＶＡ光よりも効果的であると考えられている。したがって、高いＴＨＣレベルが望まれる本発明による方法ではＵＶＢ光のレベルが最大化され、低いＴＨＣレベルが望まれる本発明による方法ではＵＶＢ光のレベルが最小化されることが好ましい場合がある。
【００１８】
組織培養物におけるＴＨＣレベルを最大化するために、組織培養物が露出されるＵＶ光の強度を最大化することは、一般的に有益であり得る。ただし、ＵＶ光の強度が強すぎると、組織培養物に損傷を与える可能性がある。特に、１２００ルーメン以上の強度のＵＶ光への絶えざる露出は、組織培養物に損傷を与える可能性がある。一方、２０００ルーメンを超える強度のＵＶ光への断続的な露出も、組織培養物に損傷を与える可能性がある。したがって、本発明の実施形態では、組織培養物の成長中に、組織培養物が１２００ルーメン以上２０００ルーメン未満の強度のＵＶ光に露出され且つＵＶ光への露出が露出と暗闇の周期を交互に繰り返すように、ＵＶ光が制御されることが好ましい場合がある。ここで、ＵＶ光への露出の各期間は少なくとも３０分であり、暗闇の各期間は少なくとも３０分である。ＵＶ光への露出の各期間は１時間以下であってもよく、暗闇の各期間は１時間以下であってもよい。有利なことに、ＵＶ光への露出の各期間に続いて、その露出期間と持続時間が等しい暗闇の期間が続く。ＵＶ光への露出の各期間が等しい持続時間であることも有利であり得る。
【００１９】
組織培養物のＵＶ光への露出期間に関して、暗闇の期間は、組織培養物がＵＶ光に実質的に露出されない期間であるが、通常のＰＡＲまたは他の光に露出され得る期間であると理解されるべきである。すなわち、この文脈では、「暗闇」は、ＵＶ光が実質的に存在しないことを意味すると理解されるべきである。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、組織培養物が、１２００ルーメン以下または６００ルーメン以下の強度のＵＶ光に常にさらされるように、ＵＶ光が、組織培養物の成長中に制御されている。
【００２１】
組織培養物の成長中に、組織の成長を促進するために組織培養物を最適温度に維持することが好ましい。例えば、組織培養物は、２５℃〜３０℃、例えば２７℃の温度に維持されていてもよい。
【００２２】
本発明の方法では、所望の量の組織培養物を成長させるために、組織培養物が任意の適切な期間成長されていてもよい。例えば、組織培養物は１０〜２８日間成長させることができる。本発明の実施形態において、組織培養物は、１４日間成長され得る。
【００２３】
組織培養物の成長を促進するために、例えば、成長中に組織培養物を攪拌機上に配置することにより、組織培養物がその成長中に攪拌されることが好ましい場合がある。
【００２４】
組織培養物が成長する環境のＣＯ2含有量が、組織の成長を増進させるように制御されることも好ましい場合がある。これは、当業者に明らかな任意の方法で行うことができる。
【００２５】
本発明の方法によって生成される組織培養物は、任意の適切な方法で使用され得る。例えば、この方法は、成長後に、組織培養物を収集および凍結乾燥する工程をさらに含んでいてもよい。次いで、凍結乾燥した組織培養物を、薬剤として、または薬剤の一部として使用してもよい。あるいは、所望の活性成分、例えば、ＴＨＣまたは任意の他の植物性カンナビノイドを、成長後に組織培養物から抽出してもよい。
【００２６】
本発明の方法において一貫性を提供するために、培養のために選択された葉組織培養物の一部またはすべてが、本発明の方法に従って以前に成長されたことが有利であり得る。すなわち、本発明の方法を最初に実行した後に、その後の組織培養のために同じ組織培養物を継続して使用することにより、遺伝的な一貫性を保証することができる。
【００２７】
組織培養物の成長中に、組織細胞に酸素を供給し続けるために、液体ベースの培地に空気を加えることが好ましい。例えば、液体ベースの培地の飽和酸素レベルを２０％以上、より好ましくは２５％以上に保つことが好ましい場合がある。
【００２８】
組織培養物を成長させるために、任意の適切な液体ベースの培地を使用してもよい。本発明の実施形態では、液体ベースの培地は、ムラシゲスクーグの溶液から形成されていてもよく、ｐＨレベルを調整するための潜在的なさらなる添加、および／またはスクロースまたは同等の物質の潜在的な添加、が可能である。
【００２９】
本発明の実施形態の一例を以下で説明する。これは単なる一例として提供されており、本出願の範囲を制限することを意図するものではないことを理解されたい。特に示さない限り、本発明のいずれの方法においても、本発明の方法の任意の特定の工程を用いることができる。
【実施例】
【００３０】
ｉ）液体培地
・出発培地
０．４４％のムラシゲスクーグの基礎粉末培地
１．０％のＮＡＡ（ナフタレン酢酸）０．００４％原液
３．０％のスクロース
蒸留水で１００％に
・器具
キャップ付きガラスびん
磁気攪拌機
無菌プラスチック植物培養皿
ガラスピペット
ｐＨメーター
高圧滅菌器
層流キャビネット
天秤
ネスコフィルム（登録商標）
フィタゲル
１モルの水酸化ナトリウム溶液
０．１モルの水酸化ナトリウム溶液
【００３１】
液体培地は、以下の方法で準備した。
ａ）開始培地は、３％のスクロースと（０．００４ｗ／ｖ％の濃縮原液から作成された）１％のナフタレン酢酸とを含む、ムラシゲスクーグ（ＭＳ）の培地である。
ｂ）その後、培地は、ｐＨ５．７５に調整され、０．２％フィタゲルを用いて凝固される。
ｃ）それから、培地は１２１℃で２０分間高圧滅菌処理され、滅菌プラスチック植物組織培養皿に注がれる。
【００３２】
ｉｉ）培養開始
・試剤
液体培地（上記の方法で調製）
大麻（カンナビス・サティバ）の葉組織
・器具
滅菌ガラスビーカー
滅菌蒸留水
滅菌メス
滅菌ピンセット
１０％の漂白剤
７０％のエタノール溶液
１モルの水酸化ナトリウム溶液
０．１モルの水酸化ナトリウム溶液
【００３３】
培養は、以下の方法で開始した。
ａ）大麻（カンナビス・サティバ）の葉組織を７０％のエタノール溶液に２分間浸漬して滅菌し、続いて１０％の漂白液に１０分間浸漬する。
ｂ）その後、葉組織を、滅菌（高圧滅菌処理）した蒸留水で３回洗浄する。
ｃ）洗浄された滅菌葉組織が、無菌的に無菌層流キャビネット内で円盤状に切断される。
ｄ）葉組織の断片は、カルス誘発培地を含む準備されたプレート上に置かれ、プレートはネスコフィルム（登録商標）で密封される。
ｅ）プレートは２７℃の暗所に置かれ、約１ヶ月後にカルスの形成が始まる。
【００３４】
ｉｉｉ）培養のための培地の準備
・試剤
３％のスクロース
０．４４％のムラシゲスクーグの基礎粉末培地
１．０％のＮＡＡ（ナフタレン酢酸）０．００４％原液
０．０１％のビタミン溶液（０．０５％ピリドキサール塩酸塩，０．１％二塩化チアミンおよび０．０５％ｇニコチン酸）
１モルの水酸化ナトリウム溶液
０．１モルの水酸化ナトリウム溶液
蒸留水で１００％に
・器具
１Ｌのガラス瓶
磁気攪拌機
２５０ｍｌの円錐２０個
約２０ｃｍ角のホイル２０枚
ガラスピペット
ｐＨメーター
高圧滅菌器
層流キャビネット
天秤
【００３５】
培地は、以下の方法で準備された。
ａ）３％のスクロース，０．４４％のムラシゲスクーグの基礎粉末培地，濃縮原液から作成された１％のナフタレン酢酸および０．０１％ビタミン溶液を混合して、蒸留水で１００％にする。
ｂ）磁気攪拌機を用いて、すべての乾燥成分が溶解するまで混合し、１モルと０．１モルの水酸化ナトリウム溶液でｐＨを調整してｐＨ を５．７５にする。
ｃ）２５０ｍｌの三角フラスコを２０個取り、それぞれ５０ｍｌの培地を加え、フラスコの首をホイルで密封する。１２１℃、１０３ｋＰａで２５分間高圧滅菌処理する。
ｄ）滅菌後すぐに、フラスコを層流キャビネット内に置き、周囲温度になるまで冷ます。
【００３６】
ｉｖ）確立された培養の接種および継代培養
・試剤
脆いカルス
７０％のエタノール
・器具
層流キャビネット
ブンゼンバーナー
準備された培地
約２０ｃｍ角の滅菌シート２０枚
ピンセットまたは小さな鉗子のいくつかのペア
穴のある広いへら
広域スペクトルＰＡＲ照明
ＵＶＡおよびＵＶＢ照明
【００３７】
確立された培養の接種および継代培養は、以下の方法で行われた。
ａ）層流キャビネット内を７０％のエタノールで滅菌する。
ｂ）すべてのピンセットとへらを７０％のエタノールに浸して滅菌後、真っ赤になるまで炎上させる。そして層流キャビネット内で冷却する。
ｃ）準備した培地フラスコからホイルを取り除く。
ｄ）滅菌したピンセットを取り、植物組織から脆いカルスの親指の爪サイズの破片を除去する。細かく分散した細胞に分解し、フラスコに追加する。約５ｇの組織を５０ｍｌの培地に（１０％  ｗ／ｖ）追加することを目的とする。
ｅ）フラスコの首を焼いて、ホイルの滅菌シートで覆う。
ｆ）２７℃に加熱された暗室内でフラスコを１２０ｒｐｍの攪拌機上に置き、厚い分散した細胞懸濁培養物が観察されるまで約２週間放置する。
ｇ）そして、準備された培地フラスコからホイルを取り除く。
ｈ）（ｆで接種することにより生成された）細胞懸濁培養液が分散しているフラスコからホイルを取り除く。
ｉ）穴の開いたへらを取り、滅菌し、冷まして、細胞をすくい取る。これらの細胞を新しい培地に追加する。約５ｇの組織を５０ｍｌの培地に追加することを目的とする。
ｊ）フラスコの首を焼いて、ホイルの滅菌シートで覆う。
ｋ）フラスコを１２０ｒｐｍの攪拌機上に置き、以下に示す２つの照明方式の１つに従い、２７℃で１４日間加熱する。そして
ｌ）１４日後、細胞の懸濁培養物をさらに継代培養または細胞の収穫物に用いる。
【００３８】
・照明方式１
１日あたり０．５モルの光子の割合のＰＡＲへの絶えざる露出。そして
約５００ルーメンの強度でのＵＶＢおよびＵＶＡ光への絶えざる露出。
・照明方式２
１日あたり０．５モルの光子の割合のＰＡＲへの絶えざる露出。そして
約１５００ルーメンの強度でのＵＶＢおよびＵＶＡ光への断続的な露出。断続的な露出は、１時間の露出と、ＵＶＢおよびＵＶＡへの露出がない１つの周期が交互に繰り返される構成である。
【国際調査報告】
2021500084.tif 000002
2021500084.tif 000003
2021500084.tif 000004