(57)【要約】本開示は、無細胞組成物、ならびにこれを作製および使用するための方法に関する。一局面において、上記組成物は、１またはこれより多くの生物に由来する抽出物；１もしくはこれより多くの目的のタンパク質；および１もしくはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーを含み、ここで上記１もしくはこれより多くのタンパク質は、上記抽出物に対して外因性の１もしくはこれより多くの核酸から、および／または上記１もしくはこれより多くの生物によって発現され、好ましくは、上記１もしくはこれより多くのタンパク質は、基質と反応して生成物を生成する。上記組成物は、酸素除去され得る。その組成物はまた、エネルギーリサイクルシステムを含み得る。
2021500027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞組成物であって、該組成物は、
１もしくはこれより多くの生物に由来する抽出物；
１もしくはこれより多くの目的のタンパク質であって、ここで該１もしくはこれより多くのタンパク質は、該抽出物に対して外因性の１もしくはこれより多くの核酸から、および／または該１もしくはこれより多くの生物によって発現され、好ましくは該１もしくはこれより多くのタンパク質は、基質と反応して、生成物を生成する、１もしくはこれより多くの目的のタンパク質；ならびに
１もしくはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャー、
を含む組成物。
【請求項２】
前記組成物は、前記１もしくはこれより多くの核酸をさらに含み、該１もしくはこれより多くの核酸からの前記１もしくはこれより多くのタンパク質のインビトロ転写および翻訳のためのものであり、好ましくは該１もしくはこれより多くの核酸は、極限環境生物または嫌気性生物に由来する遺伝子またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記１またはこれより多くの生物は、前記１またはこれより多くのタンパク質を発現するように遺伝子操作される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
インビトロ転写および翻訳のための組成物であって、該組成物は、
転写および／または翻訳に必要な、補因子、酵素、および他の試薬の第１のセット；
エネルギーリサイクルに必要な、補因子、酵素、および他の試薬の第２のセット；
１またはこれより多くの目的のタンパク質をコードする１またはこれより多くの核酸；ならびに
１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャー、
を含む組成物。
【請求項５】
タンパク質、酵素、および他の試薬の前記第１のセットは、１もしくはこれより多くの生物に由来する抽出物によって、および／または完全にもしくは部分的に精製された供給源から、全体的にまたは部分的に提供される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
タンパク質、酵素、および他の試薬の前記第２のセットは、１もしくはこれより多くの生物に由来する抽出物によって、および／または完全にもしくは部分的に精製された供給源から、全体的にまたは部分的に提供される、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、酸素除去されているかまたは嫌気性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記１またはこれより多くの生物は、細菌、古細菌、植物、および動物から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記１またはこれより多くの生物は、極限環境生物およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍから選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーは、Ｏ２、Ｏ−、もしくはＨ２Ｏ２に結合する、および／またはＯ２、Ｏ−、もしくはＨ２Ｏ２を別の分子に生化学的に変換する（例えば、還元するもしくは酸化する）、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーは、ヘム基を含み、好ましくは、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン、ミオグロビン、ポルフィリン、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ルビスコ、およびこれらのホモログまたは改変体からなる群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーは、前記ヘム基によって結合される遷移金属をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーは、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、プロトカテク酸  ３，４−ジオキシゲナーゼおよびカタラーゼからなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
外因性エネルギーリサイクルシステムをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記外因性エネルギーリサイクルシステムは、酸化還元電位を提供するための構成要素、ホスフェート電位を提供するための構成要素、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１またはこれより多くの構成要素を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
１またはこれより多くの添加剤、好ましくは、転写および／または翻訳に必要な、１またはこれより多くの補因子、酵素、および他の試薬から選択される１またはこれより多くの添加剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抽出物は、細胞全体の抽出物、核抽出物、細胞質抽出物、およびこれらの組み合わせのうちの１またはこれより多くを含み、好ましくは、該抽出物は、細胞全体の溶解物を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
タンパク質合成のための方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物を提供する工程；および
（ｂ）１もしくはこれより多くのタンパク質を該組成物から単離する工程、
を包含する方法。
【請求項１９】
前記１もしくはこれより多くのタンパク質を、前記組成物中で、前記１もしくはこれより多くの核酸からインビトロで発現させる工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
生成物のインビトロ調製のための方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物を提供する工程；
（ｂ）生成物を生成するために、１もしくはこれより多くのタンパク質を基質と反応させる工程；および
（ｃ）必要に応じて、該生成物を該組成物から単離する工程、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国仮出願第６２／５７４，５７０号（２０１７年１０月１９日出願）および同第６２／５７６，１５７号（２０１７年１０月２４日出願）に基づく優先権および利益を主張し、これら仮出願はともに、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【０００２】
政府のライセンス権
本発明は、米国陸軍研究事務所によって与えられたＷ９１１ＮＦ−１７Ｐ−００５９の下での政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
分野
本開示は、無細胞組成物およびその使用、特に、嫌気性環境におけるタンパク質および分子の生成におけるものに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
産業上のおよび治療上の用途のある多くのタンパク質は、酸素が乏しい環境中の生物から単離される。生物は、海底熱水噴出孔（ｄｅｅｐ  ｓｅａ  ｖｅｎｔｓ）、油井およびガス井、高塩分環境、および嫌気性環境において生活しているものを含み得る。努力および進歩にも拘わらず、単離を行う現行のアプローチはしばしば面倒で、コストがかかりかつ困難である。
【０００４】
無細胞システムは、これらのタンパク質を機能的に発現させ、さらにこれらを下流のシステムへと巧みに設計していくプロトタイピング環境を提供する。その鍵となる着想は、細胞溶解物が作業用の化学工場として作用することである。その構成要素は、必須の基質（例えば、アミノ酸、ヌクレオチドエネルギー基質、補因子、および塩）とともに提供される場合に活性化される触媒である。インキュベートすると、これらの小工場は、ユーザーが供給した組換えＤＮＡを利用して、所望のタンパク質を合成および折りたたみし、次いで、これは、挙動および興味深い代謝機能を実行し得る。細胞と同様にふるまう環境において遺伝子構築物の迅速なプロトタイピングを可能にするインビトロ転写−翻訳無細胞システムが開発された。インビトロで作業するという主要な目的のうちの１つは、高速で生成できることである−インビトロでは反応時間は８時間であり得、１日に数千の反応（細胞における類似の反応を上回る数倍の改善）へと拡大し得る（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４）。
【０００５】
現在、嫌気性生物からのタンパク質生成は、その生物からの単離または異種発現のいずれかを通じて起こる。嫌気性生物からのものは、その嫌気性生物の増殖条件の知識を要求し、その嫌気性生物のうちの多くは、培養できない。異種発現は、タンパク質が非天然の宿主において発現することを要求し、そのために、補因子／シャペロンまたは条件（例えば、温度、ｐＨ）が存在しないこともある、および／または機能的発現にとって正しくないこともある。多数のタンパク質を生成しようとすれば、天然の調節エレメント（例えば、プロモーター、リプレッサー、アクチベーター）を理解することがまた要求され、さらに困難が増大する。目的のタンパク質、酵素、および分子を生成するために、または経路もしくは遺伝子回路を実行するために嫌気性条件が要求される用途が存在する。嫌気性条件は、物理的方法（例えば、嫌気性条件において培養する、嫌気フードの中で反応を実行する）を使用して達成され得るが、これらの条件は、無細胞システム効率に干渉し得るか、または大規模に実施することは実現不可能もしくは非経済的であり得る。
従って、嫌気性条件を達成し得る改善された無細胞システム（例えば、本明細書で開示される無細胞システム）が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sun,  Z.Z.  et  al.,  2014.  Linear  DNA  for  Rapid  Prototyping  of  Synthetic  Biological  Circuits  in  an  Escherichia  coli  Based  TX-TL  Cell-Free  System.  ACS  Synth  Biol,  3(6),  pp.387-397.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
改善されたインビトロの嫌気性無細胞システムおよび環境ならびにその使用が、本明細書で開示される。
【０００８】
第１の局面において、インビトロ転写および翻訳のための組成物が提供される。この組成物は、以下を含む：１またはこれより多くの生物に由来する抽出物；目的の遺伝子または遺伝子の一部を含むテンプレート核酸；および１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャー。上記組成物は、酸素除去されているかまたは嫌気性であり得る。上記１またはこれより多くの生物は、細菌、古細菌、植物、および動物からなる群より選択され得る。上記１またはこれより多くの生物は、極限環境生物およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍからなる群より選択され得る。
【０００９】
上記１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーは、Ｏ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２に結合し得る。上記１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーは、Ｏ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２を別の分子へと生化学的に変換し得る。上記１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーは、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン、ミオグロビン、ポルフィリン、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ルビスコ、およびこれらのホモログまたは改変体からなる群より選択され得る。上記スカベンジャーは、遷移金属を含み得る。上記遷移金属は、ヘム基の中にあり得る。上記スカベンジャーは、グルコース、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、およびカタラーゼからなる群より選択され得る。上記スカベンジャーは、プロトカテク酸  ３，４−ジオキシゲナーゼおよびプロトカテク酸からなる群より選択され得る。
【００１０】
上記組成物は、エネルギーリサイクルシステムをさらに含み得る。上記エネルギーリサイクルシステムは、酸化還元電位を提供するための構成要素、ホスフェート電位を提供するための構成要素、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１またはこれより多くの構成要素を含み得る。
【００１１】
上記組成物は、１またはこれより多くの添加剤をさらに含み得、ここで上記１またはこれより多くの添加剤は、転写および／または翻訳に必要な、１またはこれより多くの補因子、酵素、および他の試薬を含み得る。
【００１２】
上記組成物において、上記テンプレート核酸は、極限環境生物または嫌気性生物に由来する遺伝子を含み得る。
【００１３】
上記組成物において、上記抽出物は、細胞全体の抽出物、核抽出物、細胞質抽出物、およびこれらの混合物のうちの１またはこれより多くを含み得る。上記抽出物は、細胞溶解物を含む。
【００１４】
第２の局面は、転写および翻訳システムにおいてインビトロでタンパク質を合成するための方法に関する。上記方法は、（ａ）（ｉ）１またはこれより多くの生物に由来する抽出物；（ｉｉ）目的の遺伝子または遺伝子の一部を含むテンプレート核酸；および（ｉｉｉ）１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーを含む反応混合物を提供する工程、ならびに（ｂ）上記反応混合物から上記タンパク質を発現させ、単離する工程を包含する。
【００１５】
上記方法における反応混合物は、酸素除去されているかまたは嫌気性であり得る。上記１もしくはこれより多くのＯ２、Ｏ−、もしくはＨ２Ｏ２スカベンジャーは、Ｏ２、Ｏ−、もしくはＨ２Ｏ２に結合し得るか、またはＯ２、Ｏ−、もしくはＨ２Ｏ２を異なる分子へと生化学的に変換し得る。上記１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーは、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン、ミオグロビン、ポルフィリン、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ルビスコ、およびこれらのホモログまたは改変体からなる群より選択され得る。上記方法における反応混合物は、エネルギーリサイクルシステムをさらに含み得る。
【００１６】
さらなる局面は、ａ．転写および／または翻訳に必要な、補因子、酵素、および他の試薬の第１のセット；  ｂ．エネルギーリサイクルに必要な、補因子、酵素、および他の試薬の第２のセット；  ｃ．目的の遺伝子または遺伝子の一部を含むテンプレート核酸；  ならびにｄ．１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーを含む、インビトロ転写および翻訳のための組成物に関する。上記組成物において、転写および／または翻訳に必要なタンパク質、酵素、および他の試薬の上記第１のセットは、１またはこれより多くの生物に由来する抽出物によって全体的にまたは部分的に提供され得る。転写および／または翻訳に必要なタンパク質、酵素、および他の試薬の上記第１のセットは、完全にまたは部分的に精製された供給源から、全体的にまたは部分的に提供され得る。エネルギーリサイクルに必要な、タンパク質、酵素、および他の試薬の第２のセットは、１またはこれより多くの生物に由来する抽出物によって全体的にまたは部分的に提供され得る。エネルギーリサイクルに必要な、タンパク質、酵素、および他の試薬の上記第２のセットは、完全にまたは部分的に精製された供給源から、全体的にまたは部分的に提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、無細胞発現の概観を提供する。無細胞発現において、宿主は溶解物に変換され、ＤＮＡからｍＲＮＡおよびタンパク質への変換を可能にする因子とともに供給される。
【００１８】
【図２】図２は、旧来の異種発現と無細胞発現との比較を提供する。
【００１９】
【図３】図３は、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびグルコースから構成される、サンプル脱酸素システムを示す。
【００２０】
【図４】図４は、脱酸素を追加したＥ．ｃｏｌｉベースの無細胞発現反応（左）と脱酸素なし（右）のものとを比較した視覚的差異を示す。色の変化（溶液中の遊離鉄の酸化状態を示す）は、無細胞発現反応における酸素の成功裡の還元を示す。その色の変化は、黒の矢印にある点でＩｍａｇｅＪソフトウェアによって測定される場合、強度単位（大きいほど鮮明である）によって示される。
【００２１】
【図５】図５は、脱酸素（ＯＳ）を追加またはなしのＥ．ｃｏｌｉベースの無細胞発現反応に関する８つの条件を示す。種々のＤＮＡ（蛍光ＧＦＰまたは非蛍光コード配列（ＣＤＳ）のいずれかを発現する）を、２００μＬ、２９℃において一晩実行する。種々のエネルギー再生システムを使用する：  ＣＰ／ＣＫ（これは酸素とは無関係である）またはグルタミン酸（これは酸素依存性である）のいずれか。その得られる反応を可視化し（上）、ここで色の変化（溶液中の遊離鉄の酸化状態を示す）は、無細胞発現反応における酸素の成功裡の還元を示す。黒の実線矢印、黒の矢印の点でＩｍａｇｅＪによって測定される場合の強度単位（ｕ．）（大きいほど鮮明である）。底、チューブの底。黒の破線矢印、底の液体と空気層（ａｉｒｓｐａｃｅ）との間の界面での強度単位。次いで、各反応のうちの１０μＬを、シグナルをＧＦＰ標準と相関させるために、４８５／５２８  励起／発光においてＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２プレートリーダーで可視化する。
【００２２】
【図６】図６は、無細胞発現反応のための酸素とは無関係の方法におけるマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）の活性な発現および検出を示す。ＭＢＰを発現するＤＮＡまたはＤＮＡなしのコントロールを、１％  ＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔＴＭ、ｇａｍＳ、脱酸素溶液、および他の添加物の存在下で、２００μＬ、２９℃において、０．２ｍＬチューブの中で一晩発現させる。各サンプル２μＬの４−１２％  ＭＥＳ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが示され、ＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔＴＭ強度に関して画像化される。ＭＢＰのバンドサイズが示される。
【００２３】
上記で特定した図面は、本開示の実施形態を示すが、他の実施形態がまた、考察の中で注記されるように、企図される。本開示は、限定ではなく代表によって例示的実施形態を示す。本開示の実施形態の原理の範囲および趣旨の中に入る多くの他の改変および実施形態は、当業者によって考案され得る。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
嫌気性の無細胞転写および翻訳システム（嫌気性のインビトロ転写および翻訳システムともいわれる）の組成物および製剤、ならびに使用法が本明細書で開示される。一実施形態において、本明細書で記載される嫌気性の無細胞転写および翻訳システムは、以下を含む：１またはこれより多くの生物に由来する抽出物；テンプレート核酸；および１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャー（本明細書でスカベンジャーともいわれる）。それらはまた、ホスフェート電位または酸化還元電位を提供するためのエネルギーリサイクルシステムを含み得る。一実施形態において、本明細書で記載される嫌気性の無細胞転写および翻訳システムは、以下を含む：転写および／または翻訳に必要な、補因子、酵素、および他の試薬の第１のセット；エネルギーリサイクルに必要な、補因子、酵素、および他の試薬の第２のセット；目的の遺伝子または遺伝子の一部を含むテンプレート核酸；ならびに１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャー。
【００２５】
このような嫌気性の無細胞システムは、環境的極限状態（例えば、温度、ｐＨ、塩分、酸化還元電位など）にあるバイオームにおいて、または中心代謝および末梢代謝の栄養バリエーション（例えば、無機栄養性、化学栄養性、従属栄養性、光合成性など）に関して選択した、特化して進化した生物または群集から作動する、古細菌、細菌または真核生物の供給源の嫌気性環境をまね得る。
【００２６】
区画、機構および存在様式は、広範な、例えば、温度、ｐＨ、および集中的な条件（例えば、現存する環境のニッチな化学的性質）の下で生命システムを駆動および保護し、利用可能な栄養素、酸化還元対などを利用するために進化した。これらの機構のうちの多くは、酸素以前の大気（＞３０億年）において生命システムを支配するか、または拡大する酸素大気中でこれらの機構を保護するように進化した。
【００２７】
推定７０の構成要素が、Ｅ．ｃｏｌｉにおける転写および翻訳の機構に関与する。発エルゴン代謝経路は、ホスフェート電位（［ＡＴＰ］／［ＡＤＰ］  ＋  ［Ｐｉ］）、および酸化還元電位（［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ］／［ＮＡＤ（Ｐ＋）］）の形態で遺伝子発現の吸エルゴン反応を駆動するエネルギー通貨を供給する。発現システム構成要素の数、それが何であるか、特異性および機構は、系統にわたって変動し得、環境選択条件下での進化を反映し得る。
【００２８】
同様に、嫌気性生物または極限環境生物において進化した遺伝子は、それらの発現を調節する隠れた配列エレメントを有し得るか、またはエキソビボ条件に感受性のタンパク質をコードし得る。従って、理論によって拘束されることは望まないが、インビトロ遺伝子発現の忠実度および収量が、最適な発現について操作された遺伝子を有する系統学的に類似のＴＸＴＬシステム、またはその供給源生物（例えば、嫌気性）をまねるＴＸＴＬシステムの状況内で最適である、という仮説を立てた。
【００２９】
本明細書で開示される改善されたインビトロ転写／翻訳（ＴＸＴＬ）システムは、ＤＮＡから細胞機能への情報の流れを効率的に触媒し得る。そのシステムは、生物工学およびバイオディスカバリーに関するその有用性を拡げることによって、先行のシステムを改善する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるシステムおよび組成物は、嫌気性環境を助長することによって、嫌気性生物または極限環境生物に由来する遺伝物質の発現を促進するためにデザインされる。しかし、その組成の改変は、任意の生物に由来するインビトロシステムに関して実行され得る。バイオディスカバリーに使用される場合、本明細書で開示される組成物および方法は、異種宿主における従来の遺伝子発現に対する大部分は未解決の障壁を取り除いて、未だ培養されていない生物、マイクロバイオーム、隠れた遺伝子のライブラリーおよびクラスターからの遺伝子の発現を介して、探索のための遺伝子配列空間の広大な領域を開き得る。
【００３０】
定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の請求項において使用されるある種の用語は、ここにまとめられる。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３１】
冠詞「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の対象の１または１より多い（すなわち、少なくとも１）に言及するために本明細書で使用される。例示によれば、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つの要素または１より多くの要素を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、２０％以内、より好ましくは１０％以内、および最も好ましくは５％以内を意味する。用語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）とは、５０％より多い、好ましくは８０％より多い、および最も好ましくは９０％または９５％より多い、を意味する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「複数の（ａ  ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ）」とは、１より多い、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはこれより多い、例えば、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくはこれより多い、またはこれらの間の任意の整数を意味する。
【００３４】
用語「添加剤（ａｄｄｉｔｉｖｅ）」とは、性質が化学的であろうと生物学的であろうと、天然であろうと合成であろうと、システムに提供される添加物に言及する。例としては、酵素、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、糖、ベタイン、シクロデキストリン、溶媒、アルコール、タンパク質、酵素、および核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」、「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」および「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、交換可能に使用され得、１本鎖（ｓｓ）および２本鎖（ｄｓ）両方のＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含む。これらの用語は、種々の長さを有し得るヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドおよび／もしくはリボヌクレオチド、またはこれらのアナログもしくは改変を含む）のポリマー形態を含むがこれらに限定されないことが意図される。核酸分子は、全長ポリペプチドもしくはＲＮＡまたはこれらの任意の長さのフラグメントをコードしてもよいし、非コードであってもよい。
【００３６】
核酸は、ヌクレオチドの天然に存在するかまたは合成のポリマー形態であり得る。本開示の核酸分子は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子を形成する天然に存在するヌクレオチドから形成され得る。あるいは、その天然に存在するオリゴヌクレオチドは、それらの特性を質変化させ得る構造的改変（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックされた核酸（ＬＮＡ）におけるとおり）を含み得る。その用語は、等価物、ヌクレオチドアナログから作製されるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのアナログ、および記載されている実施形態に適用可能なように、１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。本開示において有用なヌクレオチドとしては、例えば、天然に存在するヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）、またはヌクレオチドの天然もしくは合成の改変、または人工塩基が挙げられる。改変はまた、増大した安定性のためにホスホロチオエート化した塩基を含み得る。
【００３７】
本明細書で使用される場合、別段述べられなければ、用語「転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）」とは、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡの合成をいう；用語「翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」とは、ｍＲＮＡテンプレートからのポリペプチドの合成をいう。翻訳は概して、そのｍＲＮＡ転写物の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列および構造によって調節される。１つの調節配列は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）であり、これは、ｍＲＮＡの効率的かつ正確な翻訳を促進する。原核生物ＲＢＳは、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（１６Ｓ  ｒＲＮＡ（３０Ｓの小さなリボソームサブユニット内に位置する）の３’末端のＵＣＣＵコア配列に相補的な５’−ＵＴＲのプリンリッチ配列）である。種々のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列が原核生物ｍＲＮＡにおいて見出されており、一般には、ＡＵＧ開始コドンから約１０ヌクレオチド上流にある。ＲＢＳの活性は、ＲＢＳとイニシエーターＡＵＧとを分離するスペーサーの長さおよびヌクレオチド組成によって影響を及ぼされ得る。真核生物では、Ｋｏｚａｋ配列が、短い５’非翻訳領域内にあり、ｍＲＮＡの翻訳を指向する。そのＫｏｚａｋコンセンサス配列を欠くｍＲＮＡはまた、安定な二次構造を欠く中程度に長い５’−ＵＴＲを有する場合には、インビトロシステムで効率的に翻訳され得る。Ｅ．ｃｏｌｉリボソームは、そのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を優先的に認識するが、真核生物リボソーム（例えば、網状赤血球溶解物（ｒｅｔｉｃ  ｌｙｓａｔｅ）中で見出されるもの）は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位またはＫｏｚａｋリボソーム結合部位のいずれかを効率的に使用し得る。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「宿主（ｈｏｓｔ）」または「宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」とは、任意の原核生物または真核生物の単一細胞（例えば、酵母、細菌、古細菌の細胞など）または生物に言及する。その宿主細胞は、複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは任意の異種核酸分子のレシピエントであり得る。宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の種）、または真核生物の単細胞生物（例えば、酵母）であり得る。その異種核酸分子は、目的の配列、転写調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど）および／または複製起点を含み得るが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「宿主」、「宿主細胞」、「組換え宿主（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｏｓｔ）」および「組換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」は、交換可能に使用され得る。このような宿主の例については、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ２０１２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（これは、それらの全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ）」または「レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）」とは、宿主細胞または生物における発現の際に、比較的容易に選択され得る、同定され得る、および／または測定され得るある種の特徴を付与し得る遺伝子、オペロン、またはタンパク質をいう。レポーター遺伝子はしばしば、ある種の遺伝子がその宿主細胞もしくは生物へと導入されているか、またはそこで発現されているかの兆候として使用される。一般に使用されるレポーターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗生物質耐性（「ａｂＲ」）遺伝子、蛍光タンパク質、栄養要求性選択モジュール、β−ガラクトシダーゼ（細菌遺伝子ｌａｃＺによってコードされる）、ルシフェラーゼ（ホタルに由来する）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ；細菌に由来する）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ；一般には植物において使用される）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；クラゲに由来する）、および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）。代表的には、その選択マーカーを発現する宿主細胞は、細胞増殖に対して毒性または阻害性である選択薬剤から保護される。
【００４０】
用語「操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）」、「操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、または「操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」とは、本明細書で使用される場合、生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質）の遺伝子操作（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）もしくは改変、または生物工学分野において一般に公知の類似技術に言及する。
【００４１】
本明細書で記載される場合、「遺伝子モジュール（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｕｌｅ）」および「遺伝的エレメント（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、交換可能に使用され得、任意のコードおよび／または非コード核酸配列に言及し得る。遺伝子モジュールは、オペロン、遺伝子、遺伝子フラグメント、プロモーター、エキソン、イントロン、調節配列、タグ、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子モジュールとは、コード配列、プロモーター、ターミネーター、非翻訳領域、リボソーム結合部位、ポリアデニル化テール、リーダー、シグナル配列、ベクターおよび前述の任意の組み合わせのうちのいずれか１またはこれより多くに言及する。ある種の実施形態において、遺伝子モジュールは、本明細書で定義されるとおり転写ユニットであり得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、遺伝子もしくはタンパク質の「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」、または「相同な（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」とは、別の種におけるその機能的等価物に言及する。ペプチドの状況における用語「実質的同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、ペプチドが、特定の比較ウインドウにわたって、参照配列と少なくとも７０％  配列同一性、例えば、参照配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。必要に応じて、最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３  （１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムを使用して行われる。２種のペプチドが実質的に同一であるという兆候は、一方のペプチドが第２のペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に反応性であることである。従って、ペプチドは、第２のペプチドと実質的に同一であり、例えば、ここでその２種のペプチドは、保存的置換によってのみ異なる。「実質的に類似である（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｓｉｍｉｌａｒ）」ペプチドは、同一でない残基位置が保存的アミノ酸変化によって異なり得るということを除いて、上記で注記したとおりの配列を共有する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、遺伝子または核酸配列の「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、その参照された遺伝子または核酸配列と少なくとも１０％  同一性を有する配列であり、その参照された配列に関して１またはこれより多くの塩基欠失、付加、または置換を含み得る。その配列における差異は、配列または構造における天然のまたはデザインによる変化の結果によるものであり得る。天然の変化は、特定の核酸配列の天然における通常の複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）または複製（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の過程の間で生じ得る。デザインされた変化は、具体的にデザインされ得、具体的目的のために配列に導入され得る。このような具体的な変化は、種々の変異誘発技術を使用してインビトロで作製され得る。このような具体的に生成される配列改変体は、元の配列の「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」といわれ得る。ペプチドまたはタンパク質の「改変体」は、その参照ペプチドまたはタンパク質に関して１またはこれより多くのアミノ酸位置で変動するペプチドまたはタンパク質の配列である。改変体は、天然に存在する改変体であり得るか、またはその改変体ペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸分子に対して自然発生的な、誘導された、もしくは遺伝子操作された変異の結果であり得る。改変体ペプチドはまた、化学的に合成された改変体であり得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「酸素除去された（ｏｘｙｇｅｎ−ｄｅｐｒｉｖｅｄ）」とは、酸素が実質的に除去されている環境をいう。単に例示によれば、その酸素濃度は、標準温度および圧力（ＳＴＰ）下で５ｐｐｍ未満であってもよいし、その酸素濃度は、２ｐｐｍ未満であってもよいし、その酸素濃度は、１ｐｐｍ未満であってもよいし、その酸素濃度は、０．０１ｐｐｍ未満であってもよいし、その酸素濃度は、０．００１ｐｐｍ未満であってもよい。嫌気性環境は、酸素除去された環境の例である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「嫌気性生物（ａｎａｅｒｏｂｅ）」とは、遊離酸素の存在によって増殖が阻害され得る任意の真核生物または原核生物の細胞を意味する（偏性嫌気性生物および微好気性生物として旧来から分類されている全ての細胞、ならびに純粋酸素によって阻害されるそれら偏性好気性生物および通性嫌気性生物が挙げられるが、これらに限定されない）。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「極限環境生物（ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅ）」とは、極限環境条件下で最適な増殖を示す生物をいう。極限環境生物としては、好酸性生物、好アルカリ性生物、好塩性生物、好熱性生物（８０℃を上回る温度を有する環境で代表的には見出される超好熱性生物（ｈｙｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）を含む）、金属耐性生物（ｍｅｔａｌｏｔｏｌｅｒａｎｔ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）、高濃性生物（ｏｓｍｏｐｈｉｌｅ）、および乾性生物（ｘｅｒｏｐｈｉｌｅ）が挙げられる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「酸素、酸素ラジカル、および／または過酸化水素（ｏｘｙｇｅｎ，  ｏｘｙｇｅｎ  ｒａｄｉｃａｌｓ，  ａｎｄ／ｏｒ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）」ならびに「Ｏ２、Ｏ−、および／またはＨ２Ｏ２（Ｏ２，  Ｏ−，  ａｎｄ／ｏｒ  Ｈ２Ｏ２）」は、本明細書で交換可能に使用される。
【００４８】
組換え核酸技術ならびに分子生物学および細胞生物学の分野において使用される他の用語は、本明細書で使用される場合、適用可能な分野の当業者によって一般に理解される。
【００４９】
インビトロ転写および翻訳システムの組成物
そのインビトロ転写および翻訳システムは、細胞の状況外で転写および翻訳を行い得るシステムである。いくつかの実施形態において、このシステムは、「無細胞システム（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」、「無細胞転写および翻訳（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」、「ＴＸ−ＴＬ」、「ＴＸＴＬ」、「ＴＸ／ＴＬ」、「抽出物システム（ｅｘｔｒａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ）」、「インビトロシステム（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｓｔｅｍ）、「ＩＴＴ」、または「人工細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｌｌ）」ともいわれる。例示的なインビトロ転写および翻訳システムとしては、宿主から作製された精製または部分的に精製されたタンパク質システム、宿主から作製されていない精製または部分的に精製されたタンパク質システム、および「抽出物（ｅｘｔｒａｃｔ）」として形成される宿主系統から作製されたタンパク質システムが挙げられる。一実施形態において、抽出物としては、細胞全体の抽出物、核抽出物、細胞質抽出物、これらの組み合わせなどが挙げられる。細胞全体の抽出物は、本明細書で溶解物ともいわれる。本明細書で記載される溶解物、および溶解物システムは、抽出物の非限定的な例であることが意図される；溶解物が本明細書で記載される場合、他の抽出物、または抽出物およびタンパク質の組み合わせが使用され得ることは、企図される。
【００５０】
一実施形態において、無細胞システムは、細胞に由来する細胞質および／または核の構成要素の組み合わせを含み得る。その構成要素は、抽出物、精製された構成要素、またはこれらの組み合わせを含み得る。その抽出物、精製された構成要素、またはこれらの組み合わせは、タンパク質合成、転写、翻訳、ＤＮＡ複製および／または当業者によって同定可能な細胞環境において起こるさらなる生物学的反応のための反応物を含む。
【００５１】
無細胞転写−翻訳は、図１に記載される。上、ＤＮＡを利用して、反応を触媒するタンパク質を生成する無細胞発現。下、無細胞生成のダイアグラムおよびＧＦＰ発現の３８４ウェルプレートフォーマットにおいて集めた代表的データ。細胞アプローチとは対照をなす無細胞アプローチは、図２に記載される。無細胞プラットフォームは、生細胞なしで多数の遺伝子からのタンパク質発現を可能にする。無細胞生成生物工学方法は、原核生物細胞から溶解物を生成し、その溶解物は、組換えＤＮＡを入力として利用し、連結された転写および翻訳を行って、酵素として活性なタンパク質を出力し得る。無細胞システムは、発現するのに８時間しかかからず、むしろ細胞においては数日から数週間かかる。なぜならクローニングおよび形質転換の必要性がないからである。それらはまた、細胞で行うより少なくとも１０倍安価であり、ハイスループットで実行され得る。なぜなら反応は、試薬の等価物であり、３８４ウェルプレートで使用されるからである。原核生物システムの代表的な収量は、７５０μｇ／ｍＬのＧＦＰ（３０μＭ）である。無細胞システムは、多数の生物で実行され得、発現は、１０μｌから１０ｍＬまでのスケールで行われ得る。
【００５２】
無細胞システムの抽出物構成要素、特に、Ｅ．ｃｏｌｉから溶解物をどのように作製するかの指示は、（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）に見出され得る；溶解物を生成するための他の方法は、当業者に公知である。この手順はＥ．ｃｏｌｉ無細胞システムに適合されるが、この手順は、他の生物および宿主（原核生物、真核生物、古細菌、真菌など）から他の無細胞システムを生成するために使用され得る。他の無細胞システムの生成の例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．（Ｋｅｌｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６）、およびＴｏｂａｃｃｏ  ＢＹ２（Ｂｕｎｔｒｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４）（これらは、全体において本明細書に参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。溶解物を生成するための例示的なプロセスは、対数増殖期中期までリッチな培地中で宿主を増殖させ、次いで、洗浄し、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓおよび／またはＢｅａｄ  Ｂｅａｔｉｎｇ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎおよび／または等価な方法によって溶解し、清澄化することを含む。このようにして処理された溶解物は、「溶解物（ｌｙｓａｔｅ）」または「処理された細胞溶解物（ｔｒｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）」といわれ得、「抽出物（ｅｘｔｒａｃｔ）」の非限定的な例である。一実施形態において、細胞は、嫌気性条件下で増殖され得る。一局面において、抽出物は、嫌気性条件下で調製され得る。
【００５３】
１またはこれより多くの添加剤は、遺伝子発現を維持するために抽出物と一緒に供給され得る。企図される添加剤としては、そのインビボ発現および／またはその溶解物の供給源生物の代謝環境を複製するように合わせられたものが挙げられる。例えば、レドックス緩衝化剤、ホスフェート電位緩衝化剤、特注のエネルギー再生システム、天然のリボソーム、シャペロン、種特異的ｔＲＮＡ、ｐＨ緩衝化剤、金属（例えば、マグネシウムおよびカリウム）、浸透圧調節剤、ガス濃度；［Ｏ２］、［ＣＯ２］、［Ｎ２］、糖、マルトース、デンプン、マルトデキストリン、グルコース、グルコース−６−ホスフェート、フルクトース−１，６−ビホスフェート、３−ホスホグリセレート、ホスホエノールピルベート、ピルベートキナーゼ、ピルベートデヒドロゲナーゼ、ピルベート、アセチルホスフェート、アセテートキナーゼ、クレアチンキナーゼ、クレアチンホスフェート、グルタメート、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、ＵＤＰ、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、フォリン酸、スペルミジン、プトレシン、ベタイン、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、ｂ−メルカプトエタノール、ＴＰＰ、ＦＡＤ、ＦＡＤＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ、シュウ酸、ＣｏＡ、グルタミン酸塩、酢酸塩、ｃＡＭＰ、天然のポリメラーゼ、合成ポリメラーゼ、ファージポリメラーゼ、温度調節条件。選択肢的な添加剤の総説は、（Ｃｈｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６）（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）に見出され得る。選択肢的な添加剤としてはまた、転写および翻訳を補助する構成要素（例えば、ファージポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）、ＳＰ６ファージポリメラーゼ、補因子、伸長因子、ナノディスク、小胞、および消泡剤が挙げられ得る。選択肢的な添加剤としてはまた、ＤＮＡを保護する添加剤（例えば、ｇａｍＳ、Ｋｕ、ｊｕｎｋ  ＤＮＡ、ＤＮＡ擬態タンパク質（ＤＮＡ  ｍｉｍｉｃｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、カイサイトＤＮＡ（ｃｈｉ  ｓｉｔｅ−ＤＮＡ）、または他のＤＮＡ保護剤が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられ得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、その反応は、０．１％（ｗ／ｖ）より多くのクラウディング剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含む得る。高分子クラウディングは、高分子を含まない溶液と比較した、溶液への高分子の添加の効果に言及する。このような高分子は、クラウディング剤といわれる。企図されるクラウディング剤は、単一の供給源に由来してもよいし、種々の供給源の混合物であってもよい。そのクラウディング剤は、種々のサイズのものであり得る。いくつかの実施形態において、そのクラウディング剤としては、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、ポリエチレンオキシドまたはポリオキシエチレンが挙げられる。
【００５５】
エネルギーリサイクルおよび／または再生システムは、ＡＴＰをシステムに供給することによって、およびＡＤＰをＡＴＰへとリサイクルすることによるシステムホメオスタシスを維持することによって、ｐＨを維持し、転写および翻訳のためのシステムを概して支持することによって、ｍＲＮＡおよびタンパク質の合成を駆動する。エネルギーリサイクルシステムの総説は、（Ｃｈｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６）（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）に見出され得る。使用され得るエネルギーリサイクルおよび／またはシステムの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：グリセレート  ３−ホスフェート（３−ＰＧＡ）（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）、クレアチニンホスフェート／クレアチニンキナーゼ（ＣＰ／ＣＫ）（Ｋｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）、ＰＡＮＯｘ（Ｋｉｍ  ＆  Ｓｗａｒｔｚ  ２００１）、およびグルタメート（Ｊｅｗｅｔｔ  ＆  Ｓｗａｒｔｚ  ２００４）。他のリサイクルおよび／またはシステムとしては、酸化還元電位（［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ］／［ＮＡＤ（Ｐ＋）］）を再生し得るものが挙げられる。酸化還元リサイクルの例は、（Ｏｐｇｅｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４）に記載される。リサイクルおよび／またはシステムは、その宿主に先天的な中心代謝経路（例えば、解糖、酸化的リン酸化）、外部から供給される代謝経路、または両方を利用し得る。
【００５６】
そのインビトロ転写および翻訳システムは、１またはこれより多くの核酸を含む。一実施形態において、その核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、その抽出物中の転写および翻訳機構ならびに／またはその抽出物への添加物を利用することによってタンパク質を生成し得るＤＮＡが供給され得る。このＤＮＡは、例えば、ＯＲ２−ＯＲ１−Ｐｒプロモーター（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）、Ｔ７プロモーターまたはＴ７−ｌａｃＯプロモーターの下で、ＲＢＳ領域（例えば、λファージに由来するＵＴＲ１）とともに、調節領域を有し得る。そのＤＮＡは、直線状であってもプラスミドであってもよい。いくつかの実施形態において、遺伝子配列は、その溶解物の供給源生物に由来するＴＸＴＬシステムにおける無細胞発現のために操作され得る（例えば、改善されたＴＸＴＬ連結のための５’側の希なコドン、改善されたＴＸＴＬ連結のための５’  ＡＴ／ＧＣ含有量、ＵＴＲ、ＲＢＳ、終結配列、改善されたＴＸＴＬ連結のための５’融合物、改善されたＴＸＴＬ連結のための遺伝子融合物、タンパク質安定性のための融合物、膜タンパク質の可溶性を促進する配列欠失、およびタンパク質タグ）。
【００５７】
他の実施形態において、その溶解物中の翻訳の構成要素および／または溶解物への添加物を利用して、タンパク質を生成するｍＲＮＡが、供給され得る。そのｍＲＮＡは、精製された天然の供給源に由来してもよいし、合成して生成された供給源に由来してもよいし、インビトロで、例えば、インビトロ転写キット（例えば、ＨｉＳｃｒｉｂｅＴＭ、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔＴＭ、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔＴＭ、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ＭＡＣＨＩＮＥＴＭ、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＴＭ）から生成され得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、非標準アミノ酸が、その組成物の中で利用され得る。非標準アミノ酸は、細胞が生成する生成物中に天然に見出されてもよいし、その生成物に人工的に付加されて、所望の特性（例えば、タグ化、可視化、分解への抵抗性、または標的化）を生成してもよい。非標準アミノ酸の実現が細胞において困難である一方で、無細胞システムでは、実現率は、その非標準アミノ酸を飽和させる能力に起因してより高い。非標準アミノ酸の例としては、オルニチン、ノルロイシン、ホモアルギニン、トリプトファンアナログ、ビフェニルアラニン、ヒドロキシリジン（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｎｅ）、ピロリジン、または（Ｂｌａｓｋｏｖｉｃｈ  ２０１６）（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載されるとおりのものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
いくつかの実施形態において、入力核酸は、極限環境生物または嫌気性生物に由来する。その組成物は、宿主細胞の活性を（例えば、嫌気性環境を生成するにあたって）まねることによって、これらの環境的配列を使用してその所望の生成物を生成し得、それによって、「人工細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｌｌ）」または代替の異種発現プラットフォームとして作用し得る。
【００６０】
酸素、酸素ラジカル、または過酸化水素スカベンジャー
無細胞システムにおける嫌気性環境を維持するために、Ｏ２、Ｏ−、もしくはＨ２Ｏ２スカベンジャーは、生体変換によって、または結合および／もしくは隔離からのいずれかで、その無細胞システムから酸素、酸素ラジカル、および／または過酸化水素を除去し得る。これは、宿主生物が嫌気性でなくても、または物理的条件が無酸素性でなくても、その無細胞システムが嫌気的にふるまうことを可能にする。一実施形態において、嫌気性のインビトロ転写および翻訳のための組成物は、１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーを含み得る。一局面において、その１またはこれより多くのＯ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーは、Ｏ２、Ｏ−、もしくはＨ２Ｏ２の１またはこれより多くの結合剤、Ｏ２、Ｏ−、もしくはＨ２Ｏ２を別の分子に生化学的に変換する１もしくはこれより多くの生化学的変換因子、またはこれらの組み合わせを含み得る。
【００６１】
酵素、タンパク質、またはタンパク質様模倣物スカベンジャー
いくつかの実施形態において、その１またはこれより多くのスカベンジャーは、Ｏ２、Ｏ−、もしくはＨ２Ｏ２を結合および／または隔離する酵素、タンパク質、またはタンパク質様模倣物を含み得る。一実施形態において、Ｏ２、Ｏ−、もしくはＨ２Ｏ２の結合および／または隔離は、可逆的であっても不可逆的であってもよい。Ｏ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２スカベンジャーである企図される酵素およびタンパク質の例としては、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン、ミオグロビン、ポルフィリン、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ルビスコ、およびこれらの模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素およびタンパク質は、天然に存在してもよいし（その環境から単離される）、操作された改変体であってもよいし、その天然に存在する改変体を模倣するように合成して生成されてもよい。いくつかの実施形態において、その酵素、タンパク質、またはタンパク質様模倣物は、酸素を結合する公知の実体のホモログまたは改変体である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、その酵素、タンパク質、またはタンパク質様模倣物は、１またはこれより多くの遷移金属を含み得る。一実施形態において、その遷移金属は、イオン形態にあり得る；その遷移金属は、２＋または３＋の電荷を有し得る。一局面において、その遷移金属は、鉄であり得る；さらなる局面において、その遷移金属は、アルミニウム、銅、コバルト、錫、鉛、バナジウム、クロム、および限定なしに他の遷移金属であり得る。その遷移金属は、他の分子との配位錯体内にあり得る（例えば、ポルフィリン）。その酵素、タンパク質、またはタンパク質様模倣物は、天然に存在し得る。その酵素、タンパク質、またはタンパク質様模倣物はまた、天然でない遷移金属を含むように操作され得る。
【００６３】
いくつかの実施形態において、その酵素、タンパク質、またはタンパク質様模倣物は、１またはこれより多くのヘム基を含み得る。ヘム内では、鉄イオンは、四座配位子として作用するポルフィリン、および１個または２個の軸配位子に配位される。これらの酵素、タンパク質、またはタンパク質様模倣物はまた、ヘムタンパク質として公知であり得る。多数のタイプのヘム基が存在する（例えば、ヘムＡ、ヘムＢ、ヘムＣ、ヘムＯ、ヘムＩ、ヘムｍ、ヘムＤ、ヘムＳ）。
【００６４】
酸素、酸素ラジカル、または過酸化水素の変換
いくつかの実施形態において、その１またはこれより多くのスカベンジャーは、Ｏ２、Ｏ−、またはＨ２Ｏ２を別の分子へと生化学的に変換し得る。一実施形態において、その変換は、不可逆的であり得る。例示的なスカベンジャーであるシトクロムオキシダーゼは、電子を分子酸素へと転移させて、２分子の水を生成する。別の例示的なスカベンジャーであるグルコースオキシダーゼは、グルコースを酸化して、Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンおよび過酸化水素を形成する。別の例示的なスカベンジャーであるモノオキシゲナーゼは、２分子の酸素を還元して、１個のヒドロキシル基および１分子の水を形成する。別の例示的なスカベンジャーであるカタラーゼは、２分子の過酸化水素の分解を触媒して、２分子の水および１分子の酸素を形成する。
【００６５】
一実施形態において、嫌気性のインビトロ転写および翻訳のための組成物はまた、そのスカベンジャーの機能を促進する１またはこれより多くの添加剤を含み得る。そのスカベンジャー添加剤は、さらなる補因子、補酵素、エネルギー源などであり得る。その補因子は、酵素触媒、酵素構造、または両方に影響を及ぼし得る。そのスカベンジャー添加剤は、酵素の活性を補助し得る。一実施形態において、そのスカベンジャー添加剤は、ＡＴＰ／ＡＤＰ、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ／ＦＡＤＨ等からなる群より選択され得る。一実施形態において、その添加剤は、スカベンジャー酵素の基質であり得る。例示的、非限定的な基質添加剤は、グルコースである。
【００６６】
いくつかの実施形態において、そのスカベンジャーシステム自体は、基質、中間体、または生成物を始めとして、その無細胞システムに対して毒性であり得る。いくつかの実施形態において、その毒性生成物は、より具体的には、過酸化水素であり得る。過酸化水素の場合、カタラーゼが、その生成物を水および酸素へと不可逆的に変換するために使用され得る。一実施形態において、そのスカベンジャーは、ペルオキシダーゼを含み得る。ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）はまた、過剰の過酸化水素を使用して、基質（例えば、ＡＭＰＬＥＸ（登録商標）レッドをレゾルフィンへと変換するために使用され得る。他の実施形態において、その毒性出発基質、中間体、または生成物は、許容可能なｐＨから許容できないｐＨへのｐＨのシフトを引き起こし得る。出発基質の例は、グルコースであり、これは、グルコン酸へと酸化する。ｐＨに対するグルコース酸化の効果を打ち消すために、さらなる緩衝化能力が、一般に使用される生体適合性緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ）を使用して、その抽出物へと組み込まれ得る。
【００６７】
いくつかの実施形態において、そのスカベンジャーシステムの構成要素は、図３に示されるように、グルコース、グルコースオキシダーゼ、およびカタラーゼを含み得る。この例示的な非限定的緩衝化システム内では、１単位のグルコースおよび１個の酸素が、比較的不活性の基質、１単位のＤ−グルコノ−１，５−ラクトンおよび１単位の過酸化水素へと変換される。その過酸化水素は毒性である；次いで、２単位の過酸化水素は、カタラーゼによってそのシステムから除去されて、２単位の水および１単位の酸素が生成される。２単位の酸素が消費されるごとに、１単位の酸素が生成される。その反応は不可逆的であるので、その得られるシステムは、Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンを蓄積させ、嫌気性になる。カルボン酸の蓄積に由来するｐＨ変化を打ち消すために、さらなる緩衝化能力が、その無細胞システムへと追加され得る。他の実施形態において、グルコースオキシダーゼは、ピラノースオキシダーゼ（Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンではなくデヒドロ−Ｄ−グルコースを生成する）の代わりに使用される。
【００６８】
一実施形態において、そのスカベンジャーシステムは、１ｎＭ〜５Ｍ；５０ｎＭ〜５００ｍＭ；または５０μＭ〜２００ｍＭの濃度のグルコースを含み得る。一実施形態において、そのスカベンジャーシステムは、０．１ｐＭ〜１Ｍ；０．１ｎＭ〜１ｍＭ；または１ｎＭ〜５００μＭの濃度のグルコースオキシダーゼを含み得る。一実施形態において、そのスカベンジャーシステムは、０．１ｐＭ〜１Ｍ；０．１ｎＭ〜１ｍＭ；または１ｎＭ〜５００μＭの濃度のカタラーゼを含み得る。一実施形態において、そのスカベンジャーシステムは、０．１ｐＭ〜１Ｍ；０．１ｎＭ〜１ｍＭ；または１ｎＭ〜５００μＭの濃度のピラノースオキシダーゼを含み得る。
【００６９】
他の例示的な非限定的実施形態において、そのスカベンジャーシステムの構成要素は、プロトカテク酸  ３，４−ジオキシゲナーゼおよびプロトカテク酸を含む。１単位のプロトカテク酸は、酸素と反応して、３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを生成する。その無細胞システムに影響を及ぼすカルボン酸の生成は、さらなる緩衝化能力によって制御され得る。
【００７０】
一実施形態において、そのスカベンジャーシステムは、０．１ｐＭ〜１Ｍ；０．１ｎＭ〜１ｍＭ；または１ｎＭ〜５００μＭの濃度のプロトカテク酸  ３，４−ジオキシゲナーゼを含み得る。一実施形態において、そのスカベンジャーシステムは、１ｎＭ〜５Ｍ；５０ｎＭ〜５００ｍＭ；または５０μＭ〜２００ｍＭの濃度のプロトカテク酸を含み得る。
【００７１】
酸素、酸素ラジカル、または過酸化水素の結合
いくつかの例示的な非限定的実施形態において、そのスカベンジャーシステムの構成要素は、酸素、酸素ラジカル、および／または過酸化水素に結合またはキレート化し、これらを、溶液中の他の構成要素と相互作用することから効果的に隔離する。一実施形態において、その結合は、可逆的であり得る。天然に酸素に結合する分子の例は、ヘモグロビンであり、これは、脊椎動物および無脊椎動物において酸素を運ぶために使用される。ヘモグロビン内には、ポルフィリン複素環式環の中に保持された鉄を含むヘム基が存在し、このヘム基は、配位結合（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｂｏｎｄ）において酸素に可逆的に結合し得る。一実施形態において、無細胞システムでは、ヘモグロビンは、その無細胞システムに過剰に添加されて、その無細胞システムにおける酸素濃度を低減し得る。いくつかの実施形態において、例示的なスカベンジャーは、酸素キャリアタンパク質であり得、ヘモグロビン、ヘムエリスリン、またはヘモシアニンとして公知である。他の実施形態において、そのスカベンジャーは、合成であってもよいし、操作されていてもよい。いくつかの実施形態において、そのスカベンジャーは、ヘム基を含み得る。
【００７２】
いくつかの実施形態において、酸素結合のレベルは、さらなる添加剤によって滴定され得る。ヘモグロビンを例として使用すると、ヘモグロビンに結合した酸素の量は、酸素ヘモグロビン解離曲線によって説明され得、種々の変数（例えば、ｐＨ、温度、２，３−ＤＰＧ）は、酸素に対するヘモグロビンの親和性をシフトさせ得る。従って、より低い温度、より高いｐＨ、または減少させた２，３−ＤＰＧ濃度は、酸素結合を促進し得る。
【００７３】
他のインビトロ環境における酸素、酸素ラジカル、または過酸化水素スカベンジャーの使用
さらなる実施形態は、無細胞の酸素除去された酵素システムに関する。その無細胞の酸素除去された酵素システムは、本明細書で記載される１またはこれより多くのスカベンジャーを含む。
【００７４】
当業者によって理解されるように、その本明細書で記載されるスカベンジャーは、無細胞の転写および翻訳反応にとって有用であるだけでなく、任意のインビトロ酵素反応にとっても有用である。そのスカベンジャーは、任意の水性溶液中の酸素、酸素ラジカル、および過酸化水素濃度を低減する生化学的方法を提供する。従って、その基材、入力、出力、または中間体が、その水性溶液中の反応と適合性である限りにおいて、そのスカベンジャーは、利益を提供し得る。
【００７５】
いくつかの実施形態において、その無細胞の酸素除去された酵素システムは、精製された酵素を含み、ここで酵素は、一緒に合わされて、外因的に供給された入力から、またはその酵素自体から、のいずれかから生成物を生成する。これらのインビトロ組成物は、生成物を生成するために、転写および／または翻訳を行う必要はない。例示的な例は、限定なしに、（Ｏｐｇｅｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４）（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される。文献中の例としては、グルコースおよび／または他の糖から、バイオプラスチック、テルペノイド様分子（イソプレン、リモネン）へ、水素へ、タガトースへ、およびアルロース（ａｌｌｕｏｓｅ）へと変換されることが挙げられるが、これらに限定されない。エネルギーおよび／または酸化還元電位再生システムと一緒に添加された、精製された酵素は、高濃度（ｍｇ／ｍＬ）において入力を出力へと変換し得る。これらの反応のうちの多くについて、その関与する酵素またはその基質は、適切に機能するには嫌気性条件を要求し得るか、またはその生成物自体は、嫌気性生物に由来し、作動するのに類似の嫌気性条件を要求する。しかし、嫌気性条件を達成する物理的方法は、非経済的かつ実現不可能である。代わりに、本明細書で提唱されるスカベンジャーは、生化学的代替を代わりに提供するために使用され得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、その無細胞の酸素除去された酵素システムは、一緒に混合されて、外因的に供給された入力からまたはその溶解物自体の構成要素からのいずれかから生成物を生成する１またはこれより多くの天然のまたは操作された生物に由来する溶解物の組み合わせを含む。各溶解物内では、必要な酵素または経路は、遺伝子操作法によって過剰生成され得る。例は、限定なしに、「無細胞代謝操作」として（Ｏｐｇｅｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；  Ｋａｒｉｍ  ＆  Ｊｅｗｅｔｔ  ２０１６）（これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される）に記載される。さらに、いくつかの実施形態において、そのインビトロ組成物は、溶解物および精製された酵素両方の組み合わせである。
【実施例】
【００７７】
実施例１：嫌気性生物に由来する遺伝子の発現または原型の酸素除去インビトロシステムにおける環境
インビボでは、嫌気性生物におけるＴＸＴＬは、その細胞が低酸化還元電位において、すなわち、低酸化条件において維持する細胞質において作動する。嫌気性生物は、非呼吸代謝の作動を維持するために進化したＯ２感受性酵素活性（例えば、ヒドロゲナーゼ）、ラジカル支援酵素触媒、窒素固定（ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｙ）などを有する。
【００７８】
例示的なインビトロＴＸＴＬシステム組成物：
・  嫌気性細菌宿主（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）から調製した処理された溶解物（厳密に嫌気性条件下で培養したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｎ２雰囲気下の密閉フード中で標準的技術を使用して調製された溶解物、Ｎ２雰囲気下の３８４ウェルマイクロタイタープレートへと２５ｍＬ  アリコートでアドレス指定された溶解物）または好気性条件もしくは嫌気性条件下で標準的細菌宿主から調製した溶解物。
・  転写および翻訳のための標準的添加物。
・  発現のための還元、低Ｏ２環境を維持するための添加物：  比＞１００：１において低酸化還元電位溶解物を維持するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）＋バランスシステム（ｐｏｉｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）、酸化還元リサイクルのためのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生トランスヒドロゲナーゼ、Ｏ２スカベンジャー：  ヘモグロビン、オキシダーゼまたはオキシゲナーゼ酵素、反応性酸素スカベンジャー：  カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、宿主生物代謝経路に特異的なＡＴＰ再生の基質。
【００７９】
実施例２．酸素除去された条件は、無細胞システムにおいて模倣され得る
嫌気性条件をシミュレートするために、酵素成熟および脱酸素に寄与する種々の添加剤を、その反応に添加した。１つのサンプルシステムは、図３に示される、グルコース、グルコースオキシダーゼ、およびカタラーゼから構成される脱酸素システムであり、ここで２モルの酸素が消費されるごとに１モルの酸素が生成され、カタラーゼは、毒性の中間体である過酸化水素をリサイクルし得る。Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンの生成は、無細胞システムに対して比較的不活性である。各反応は不可逆的であるので、その反応は、酸素除去に向かってシフトする。その添加およびこのサンプルシステムにおけるその後のグルコースフラックスは、得られる反応においてｐＨ変化を引き起こし得、これは、その無細胞システムにおいて緩衝化能力を提供するために重要になる。
【００８０】
１つの反応では、以下の脱酸素ストックを以下のようにして使用した：  グルコースオキシダーゼの１００×ストック溶液を１０μＭに、カタラーゼの１００×ストック溶液を１５０μＭに、およびグルコースの１０×ストック溶液を５００ｍＭに。２つの２００μＬ  無細胞発現を設定して、遊離鉄酸化条件に対する脱酸素の効果を試験した。図４では、脱酸素ストックを添加した結果を、２つの異なる反応において比較する：一方は、１×作業濃度（０．１μＭ  グルコースオキシダーゼ、１．５μＭ  カタラーゼ、５０ｍＭ  グルコース）での脱酸素、および一方は、脱酸素なし。各反応は、他の点で類似であり、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＸＴＬ  ｅＡＣ２８および以下の改変を加えて（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）に記載される方法によって生成した緩衝液を利用した：  ９０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（対  ＨＥＰＥＳ）を使用するｐＨ緩衝化、ならびに２ｍＭ  ピリドキサールリン酸、２ｍＭ  Ｌ−システイン、１ｍＭ  Ｆｅ２＋、１ｍＭ  ジチオスレイトール、および１ｍＭ  硫化ナトリウムの添加。２９℃での数時間のインキュベーションの後、色の差異（脱酸素サンプルにおける薄い色（左）  対  非脱酸素サンプルにおける濃い色（右）を示す）は、反応における遊離鉄の酸化状態に基づく、利用可能な酸素の減少を示した。定量的計量を決定するために、矢印によって示される点を、ＩｍａｇｅＪの「測定」特徴を使用する任意単位の強度に関して測定した。ここで数字が大きいほど鮮明な領域を示す。その脱酸素サンプルは、１０２単位を測定したのに対して、非脱酸素サンプルは、３７単位を測定した。これは、生化学的脱酸素添加剤が、無細胞システムから酸素を除去し得ることを示した。別段注記されなければ、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ＩｍａｇｅＪソフトウェアは、ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／において利用可能である。
【００８１】
実施例３．酸素除去条件を伴う無細胞システムは、機能的タンパク質を作り出す
無細胞システムは、脱酸素溶液を使用して酸素除去されたが、そのシステムはまた、転写および翻訳の活性を通じて機能的タンパク質を生成する能力がなければならない。これは、その無細胞システムの特性を調整することを要求し得る。例えば、種々のエネルギー再生溶液が、その嫌気性反応条件を補完する無細胞システムにおいて使用され得る。グルタメートシステムを利用するエネルギー再生は、酸化的リン酸化を使用し、これは、酸素依存性である。しかし、クレアチニンリン酸／クレアチニンキナーゼ（ＣＰ／ＣＫ）を利用するエネルギー再生は、基質レベルのリン酸化を使用し、これは、酸素非依存性である。
【００８２】
一例では、ＧＦＰまたは別のコード配列のいずれかを発現する８種の異なるＥ．ｃｏｌｉ無細胞反応を、図５において設定した。全ての反応は、２００μＬであり、以下を共有する：  （Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）において記載される方法によって生成される３０％  ｅＡＣ２８  Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物、２ｍＭ  ピリドキサールリン酸、２ｍＭ  Ｌ−システイン、１ｍＭ  Ｆｅ２＋、および１ｍＭ  ジチオスレイトール。脱酸素（ＯＳ）を伴う反応はまた、０．１μＭ  グルコースオキシダーゼ、１．５μＭ  カタラーゼ、５０ｍＭ  グルコースを含んだ。ＧＦＰ  ＤＮＡでの反応は、８ｎＭのｓｉｇｍａ７０−ＧＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃４００１９）を含んだ一方で、ＣＤＳ  ＤＮＡでの反応は、コントロールとして８ｎＭのｓｉｇｍａ７０−非蛍光タンパク質全ＤＮＡを含んだ。そのＣＰ／ＣＫエネルギーシステムでの反応は、（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）に記載されるが、３−ＰＧＡの代わりに３０ｍＭ  クレアチニンリン酸および０．２ｍｇ／ｍｌ  クレアチニンキナーゼを、ならびにＨＥＰＥＳの代わりに９０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝化を伴う、３５％  エネルギー溶液緩衝液を利用した。グルタメートエネルギーシステムを含む反応は、（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）に記載されるが、ＨＥＰＥＳの代わりに９０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝化を伴う３５％  エネルギー溶液緩衝液を利用した。各反応を、０．６５ｍＬ  遠心分離チューブの中に維持し、２９℃で一晩貯蔵し、翌日に画像化した（図５、上）。次いで、各サンプルのうち、１０μＬを取り出してＮｕｎｃ  ３８４ウェルプレートの中に入れ、４８５／励起  ５２８／発光フィルタを使用してＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２で画像化した。得られた数字を、精製ＧＦＰの絶対標準に変換した。この実験は、脱酸素を追加した場合に、遊離鉄の酸化状態における変化から、明確な色の変化がなお存在することを示した。定量的計量を決定するために、矢印によって示される点を、ＩｍａｇｅＪの「測定」特徴を使用する任意単位の強度に関して測定した。ここで数字が大きいほど鮮明な領域を示す。その酸素除去（ｏｘｙｇｅｎ  ｓｃｒｕｂｂｉｎｇ）に供したサンプルは、４４、３９、４３、および３４単位を測定したが、酸素除去なしのサンプルは、６４、６４、６６、および６４単位を測定した。破線の黒の矢印、酸素除去された無細胞システムと空気層との界面では、遊離鉄の色がより濃く（５４単位  対  酸素除去した領域では６４単位を測定）、これは、その界面では、十分に嫌気性ではない状態を示すことに注意のこと。その実験はまた、脱酸素が、タンパク質生成の効率（毒性、低エネルギー再生、またはフルオロフォアを成熟させるごく微量の酸素に起因する）を減少させ得るが、機能的タンパク質（ＧＦＰ蛍光によって測定される場合）はなお、特に、酸素を要求しないエネルギー再生システムとともに生成されることが示された。従って、脱酸素システムは、活性な転写および翻訳を通じて、機能的タンパク質生成をなお可能にする。別の方法で注記されなければ、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【００８３】
別の実験では、タンパク質生成を、非酸素に依存する方法を使用して生成を直接検出することによって測定した。具体的には、本発明者らは、脱酸素条件内で、ＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔＴＭ（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識してリジンで荷電したｔＲＮＡ）を使用して、ｓｉｇｍａ７０−ＭＢＰ（配列番号１）の発現を測定した。０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブにおいて２つの６５μＬ反応を行った。各反応は、３０％  ｅＥＣ４  Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物および３５％  ｂＡＣ１０緩衝液（（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）に記載される方法によって生成）、１％  ＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔＴＭ、２０μｇ／ｍｌ  ｇａｍＳ、２ｍＭ  ピリドキサールリン酸、２ｍＭ  Ｌ−システイン、１ｍＭ  Ｆｅ２＋、および１ｍＭ  ジチオスレイトールを含んだ。反応はまた、脱酸素（ＯＳ）溶液、０．１μＭ  グルコースオキシダーゼ、１．５μＭ  カタラーゼ、５０ｍＭ  グルコースを含んだ。ＭＢＰ  ＤＮＡを伴う一方の反応は、１３．５ｎＭのｓｉｇｍａ７０−ＭＢＰ直線状ＤＮＡを含んだが、他方の反応は、コントロールとしてＤＮＡを含まなかった。その反応は、酸素除去および鉄における酸化状態の変化から１５分以内に色を変化させた。２９℃で一晩のインキュベーションの後、２μＬ  サンプルを、４−１２％  ＭＥＳ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、ＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔＴＭ検出のために画像化した。図６では、ＭＢＰは、脱酸素システムにおいて明らかに検出された一方で、ＤＮＡなしのコントロールは、ＭＢＰを欠いた。従って、脱酸素システムは、活性な転写および翻訳を通じて、非酸素に依存する出力に対して測定した場合にも、機能的タンパク質生成を可能にした。別段注記されなければ、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【００８４】
均等物
本開示は、とりわけ、無細胞システムおよびその使用を提供する。本開示の具体的実施形態が考察されてきたが、上記の明細書は、例証であって限定ではない。本開示の多くのバリエーションは、本明細書を検討すれば、当業者に明らかになる。本開示の全範囲は、請求項を参照することによって、それらの均等物の全範囲とともに、および本明細書によって、このようなバリエーションとともに決定されるべきである。
【００８５】
援用の表示
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および配列データベースエントリーは、各個々の刊行物または特許が、参考として援用されることを具体的かつ個々に示されるかのように、それらの全体において参考として援用される。
【００８６】
参考文献
Blaskovich,  M.A.T.,  2016.  Unusual  Amino  Acids  in  Medicinal  Chemistry.  Journal  of  medicinal  chemistry,  59(24),  pp.10807-10836.
Buntru,  M.  et  al.,  2014.  Tobacco  BY-2  cell-free  lysate:  an  alternative  and  highly-productive  plant-based  in  vitro  translation  system.  BMC  biotechnology,  14(1),  p.37.
Chiao,  A.C.,  Murray,  R.M.  &  Sun,  Z.Z.,  2016.  Development  of  prokaryotic  cell-free  systems  for  synthetic  biology.  bioRxiv,  p.048710.
Jewett,  M.C.  &  Swartz,  J.R.,  2004.  Mimicking  the  Escherichia  coli  cytoplasmic  environment  activates  long-lived  and  efficient  cell-free  protein  synthesis.  Biotechnol  Bioeng,  86(1),  pp.19-26.
Karim,  A.S.  &  Jewett,  M.C.,  2016.  A  cell-free  framework  for  rapid  biosynthetic  pathway  prototyping  and  enzyme  discovery.  Metab  Eng,  36,  pp.116-126.
Kelwick,  R.  et  al.,  2016.  Development  of  a  Bacillus  subtilis  cell-free  transcription-translation  system  for  prototyping  regulatory  elements.  Metab  Eng,  38,  pp.370-381.
Kigawa,  T.  et  al.,  1999.  Cell-free  production  and  stable-isotope  labeling  of  milligram  quantities  of  proteins  -  Kigawa  -  1999  -  FEBS  Letters  -  Wiley  Online  Library.  FEBS  ….
Kim,  D.-M.  &  Swartz,  J.R.,  2001.  Regeneration  of  adenosine  triphosphate  from  glycolytic  intermediates  for  cell‐free  protein  synthesis.  Biotechnol  Bioeng,  74(4),  pp.309-316.
Opgenorth,  P.H.,  Korman,  T.P.  &  Bowie,  J.U.,  2014.  A  synthetic  biochemistry  molecular  purge  valve  module  that  maintains  redox  balance.  Nature  Communications,  5,  p.998.
Sun,  Z.Z.  et  al.,  2014.  Linear  DNA  for  Rapid  Prototyping  of  Synthetic  Biological  Circuits  in  an  Escherichia  coliBased  TX-TL  Cell-Free  System.  ACS  Synth  Biol,  3(6),  pp.387-397.
Sun,  Z.Z.  et  al.,  2013.  Protocols  for  Implementing  an  Escherichia  Coli  Based  TX-TL  Cell-Free  Expression  System  for  Synthetic  Biology.  Journal  of  Visualized  Experiments,  e50762(79),  pp.e50762-e50762.
Thompson,  J.,  Rae,  S.  &  Cundliffe,  E.,  1984.  Coupled  transcription  -  translation  in  extracts  of  Streptomyces  lividans.  Molecular  and  General  Genetics  MGG,  195(1-2),  pp.39-43.
【化１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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