(57)【要約】  チーズ製品の中のメイラード反応を減ら（し、そのことによって褐色化を減ら）すため、その製品をヘキソースオキシダーゼ（EC1.1.3.5）酵素および／またはセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素と接触させることを含む方法。
2021524241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チーズ製品の中のメイラード反応を減らす方法であって、
（a）：酸性化する前、または酸性化している間、または酸性化した後のミルクを、結合した／カプセル化したヘキソースオキシダーゼ（EC1.1.3.5）酵素および／またはセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素を含む粒子と接触させる工程と；
（b）：（i）の酸性化されたミルクを凝固させた後、このカードを乳清から分離する工程と；
（c）：（ii）のカードを、このカードの中に存在する前記オキシダーゼ酵素がこのカードの中に存在するガラクトースを酸化する条件下で保管する工程と；
（d）：最終的に減少した量のガラクトースを含むチーズ製品にするのに十分な工程をさらに実施することにより、メイラード反応が減った製品にする工程を含む方法。
【請求項２】
前記ヘキソースオキシダーゼ酵素が、
（i）：本明細書の配列ID番号2のポリペプチド配列の成熟／活性部分を含む酵素である；または
（ii）：（i）のバリアントであって、（i）のポリペプチド配列と比べて20個未満（好ましくは10個未満、より好ましくは5個未満）のアミノ酸変化（好ましくは置換、欠失、挿入のいずれか、より好ましくは置換）を含む酵素である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ヘキソースオキシダーゼ酵素が、
（i）：本明細書の配列ID番号2のポリペプチド配列の成熟／活性部分を含む酵素である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記セロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素が、
（i）：配列ID番号1の1位〜473位のポリペプチド配列、すなわち1位のGlyで始まり473位のLysで終わるポリペプチド配列を含む酵素である；または
（ii）：（i）のバリアントであって、（i）のポリペプチド配列と比べて20個未満（好ましくは10個未満、より好ましくは5個未満）のアミノ酸変化（好ましくは置換、欠失、挿入のいずれか、より好ましくは置換）を含む酵素である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記セロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素が、
（i）：配列ID番号1の1位〜473位のポリペプチド配列、すなわち1位のGlyで始まり473位のLysで終わるポリペプチド配列を含む酵素であり；
前記製品と接触させるセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素の量が0.001〜1.0 LOXU/gである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
工程（a）の結合した／カプセル化したオキシダーゼ酵素を含む前記粒子が、少なくとも0.1μmの粒子径（D（v, 0.1））分布かつ200μm未満の粒子径（D（v, 0.9））分布を持つ粒子である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
工程（a）の粒子が、セルロースとその誘導体、アガロース、デキストラン、ポリマー（例えばポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート）、コポリマー、CGMPオリゴマー粒子（この粒子の中のCGMPオリゴマーは、分子間共有イソペプチド結合を通じて架橋したカゼイングリコマクロペプチド（CGMP）オリゴマー（CGMPオリゴマー）であり、モノマーCGMPは、κ-カゼインのアミノ酸残基106〜169を含有するペプチドであり、CGMPオリゴマーのモノマーはモノマーCGMPである）からなるグループから選択された少なくとも1つのタイプの粒子である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記チーズ製品がパスタフィラータチーズであり、好ましくはこのパスタフィラータチーズがノッツァレラチーズである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記チーズ製品が、加熱工程を含む方法によって製造される製品であり、この製品を前記オキシダーゼ酵素と接触させることが、前記加熱工程の前に実施され、前記加熱工程が、40℃超の温度まで加熱する工程である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記チーズ製品が、（例えばピザを作るため）100℃超の温度まで加熱する工程を含む方法で用いられる製品であり；前記製品がパスタフィラータチーズであり、好ましくはこのパスタフィラータチーズがモッツァレラチーズである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記チーズ製品が、デンプン固化防止剤（例えばジャガイモおよび／またはトウモロコシのデンプン）を含むシュレッドチーズ製品であり、このシュレッドチーズ製品が、モッツァレラチーズ、チェダーチーズ、パルメザンチーズ、スイスチーズのいずれかである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
チーズ製品の中のメイラード反応を減らすことを目的としたヘキソースオキシダーゼ（EC1.1.3.5）酵素および／またはセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素の利用であって、前記製品をオキシダーゼ酵素と接触させることを含む請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法が関与する利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チーズ製品の中のメイラード反応を減ら（し、そのことによって褐色化を減ら）すため、その製品をヘキソースオキシダーゼ（EC1.1.3.5）酵素および／またはセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素と接触させることを含む方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えばピザを作るためストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus：ST）によってモッツァレラチーズを作るとき、チーズを加熱している間に比較的高濃度のガラクトースが生じて「褐色化する」可能性があることがしばしば記載されている。
【０００３】
褐色化現象は、ガラクトースが還元糖としてアミノ酸／ペプチドのアミノ基と反応するメイラード反応に起因すると考えられている。
【０００４】
ピザ用のチーズを作っている間のこの主要な問題以外に、過剰量の遊離ガラクトースも、酸性化後の問題と、他の乳製品（例えばソフトチーズ）のフローラの不均衡につながる可能性がある。
【０００５】
多くのピザ製造業者は、ピザを260℃超の温度で焼く。このような高温ではチーズが過度に茶色になる傾向があることが、モッツァレラ業界にとっての特別な懸念事項になっている。
【０００６】
WO 02/39828A2（Danisco社）には、チーズ（モッツァレラチーズなど）の中のメイラード反応を減ら（し、したがって褐色化を減ら）すことを目的としたヘキソースオキシダーゼ（HOX）（EC1.1.3.5）酵素の利用が記載されている。
【０００７】
ヘキソースオキシダーゼ（EC1.1.3.5）は、「銅カチオン」を活性な補因子として利用しており、セロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）はフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を補因子として利用している。そのこととそれ以外の理由で、これらは異なった酵素であり、したがって異なるEC分類番号を持つ。
【０００８】
市販されている製品Lactoyield（登録商標）（Chr. Hansen A/S社、デンマーク国）は、セロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）を含んでいる。この酵素を本明細書では代わりにラクトースオキシダーゼ（LOX）または炭水化物オキシダーゼと呼ぶことができる。
【０００９】
EP 1041890B1（Novozymes社）とFeng Xuらの論文（Eur. J. Biochem. 第268巻、1136〜1142ページ（2001年））には、Lactoyield（登録商標）の中に存在するセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）が記載されている。先行技術に関するこれら文献には、食品または餌製品（例えばモッツァレラチーズ）の中のメイラード反応を減ら（し、したがって褐色化を減ら）すことを目的としたセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）の利用は記載されていない。
【００１０】
Lactoyield（登録商標）の中に存在するセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）の成熟アミノ酸配列は、EP 1041890B1の配列ID番号2の23位〜495位であり、これは23位のGlyから始まって495位のLysで終わる。
【００１１】
EP 1041890B1の配列ID番号2の23位〜495位のポリペプチドを、本明細書では配列ID番号1の1位〜473位として提示する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明によって解決すべき問題は、食品または餌製品（好ましくは乳製品であり、例えばチーズ、より好ましくはモッツァレラチーズ）の中のメイラード反応を減ら（し、したがって褐色化を減ら）すための新規な方法を提供することである。
【００１３】
解決法は、Lactoyield（登録商標）の中に存在するセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素が上記の問題を解決するのに非常に適していることを発明者が突き止めたことに基づいている（例えば本明細書の実施例を参照されたい）。
【００１４】
上述のように、セロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）は、代わりにラクトースオキシダーゼ（LOX）または炭水化物オキシダーゼと呼ぶことができる。
【００１５】
実施例1では、Lactoyield（登録商標）をシュレッドモッツァレラチーズの表面に添加したところ、14日間低温で保管した後にガラクトースの有意な減少が得られ、（100℃に70分間加熱した後の）褐色化が有意に減少した。
【００１６】
実施例2は、Lactoyield（登録商標）（LOX）が熱に対して安定であることを実証している。
【００１７】
実施例3は、酸性化する前のミルクにLactoyield（登録商標）（LOX）を直接添加することにより、有意に減少した量のガラクトースを含むチーズ製品を製造することが可能になったことを示している。
【００１８】
実施例3の結論に関して後述するように、LOXを粒子の表面に吸着させると酵素が乳清（ホエイ）に移動することが回避される。こうすることで、乳清の値が維持されるだけでなく、必要とされる酵素を1/10しか投与しないことが可能になる。チーズカード（凝乳）の中にLOXが存在しているとガラクトースを酸化してガラクトン酸にする触媒となり、このガラクトン酸によって焼いたときの褐色化が減少することになる。
【００１９】
上記のWO 02/39828A2（Danisco社）には、その中に記載されているヘキソースオキシダーゼ（HOX）酵素が粒子の表面に吸着される可能性に言及されてさえいない。
【００２０】
実施例4は、Lactoyield（登録商標）（LOX）が、固化防止剤の存在下でさえ褐色化をうまく減らすことを示している。
【００２１】
オキシダーゼ酵素の吸着に関して本明細書で議論されている実施例3の好ましい結果について、理論に囚われることがないと、すべての実施例でHOX酵素を製品（例えばモッツァレラチーズ）の表面に「スプレーして」添加することしか実質的に記載していない上記のWO 02/39828A2（Danisco社）に記載されている方法と比べ、粒子の表面へのHOXの吸着は改良された方法を提供することができないと考える明白な理由はない。
【００２２】
本明細書で議論する好ましい結果が、他の適切なヘキソースオキシダーゼ（EC1.1.3.5）および／またはセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）を使用することによって一般に得られるはずはないと考える明白な理由はない。
【００２３】
その1つの理由は、クラスが同じECの酵素は一般に多くの特徴を共通に持っていることにある。それが、それら酵素に同じクラスのECが割り当てられることの1つの技術的理由であると見なすことができる。
【００２４】
したがって本発明の第1の側面は、チーズ製品の中のメイラード反応を減らす方法に関するものであり、この方法は、
（a）：酸性化する前、または酸性化している間、または酸性化した後のミルクを、結合した／カプセル化したヘキソースオキシダーゼ（EC1.1.3.5）酵素および／またはセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素を含む粒子と接触させる工程と；
（b）：（i）の酸性化されたミルクを凝固させた後、このカードを乳清から分離する工程と；
（c）：（ii）のカードを、このカードの中に存在するオキシダーゼ酵素がこのカードの中に存在するガラクトースを酸化する条件下で保管する工程と；
（d）：最終的に減少した量のガラクトースを含むチーズ製品にするのに十分な工程をさらに実施することにより、メイラード反応が減った製品にする工程を含んでいる。
【００２５】
言い換えるならば、第1の側面と、本明細書の中のそれに関係する実施態様は、食品または餌製品（好ましくは乳製品）の中のメイラード反応を減らすことを目的としたヘキソースオキシダーゼ（EC1.1.3.5）酵素および／またはセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素の利用と規定することができ、この利用には、その製品をヘキソースオキシダーゼ（EC1.1.3.5）酵素および／またはセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素と接触させることを含む方法が関与する。
【００２６】
当業者であれば本明細書の文脈からわかるように、「メイラード反応の減少」という表現は、メイラード反応の程度が減少していること、および／またはメイラード反応が完了するのに必要な時間が長くなることに関係する。
【００２７】
本発明の実施態様を下に記述するが、単なる例示である。当業者であれば本明細書の文脈からわかるように、好ましい一実施態様と別の好ましい一実施態様の組み合わせは、より一層好ましい一実施態様であると見なすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図1：モッツァレラチーズの細片の褐色化試験。単一の細片をウエルに入れ、プレートを100℃に75分間加熱した。それぞれの列は、LOXを用いて異なる処理をしたチーズのレプリケートを示す。サンプル1〜3：Hannilase XPを用いて作ったモッツァレラチーズの細片をLOXで処理し、5℃で14日間保管した。1：LOXなしの対照、2：0.01 LOXU/g、3：0.02 LOXU/g。サンプル10〜12：CHY-MAX Mを用いて作ったモッツァレラチーズをLOXで処理し、5℃で14日間保管した。10：LOXなしの対照、11：0.01 LOXU/g、12：0.02 LOXU/g。
【００２９】
【図２】図2：サンプルを図1と同じように処理したが、カタラーゼCatazyme（チーズ1 gにつき0.1 U）を添加した。
【００３０】
【図３】図3：Lactoyield（登録商標）（LOX）は固化防止剤の存在下でさえ機能することを実証するデータ。詳細に関しては本明細書の実施例3を参照されたい。黒色：0 LOXU/g、青色：0.01 LOXU/g、赤色：0.05 LOXU/g。VAT 4は、ガラクトースのレベルが高い（0.5％超）対照チーズサンプルであり、Gouda 45+は、残留ガラクトースがないか非常に少ない対照チーズサンプルである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
セロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素
【００３２】
セロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素は、
（i）：EP 1041890B1の配列ID番号2の23位〜495位のポリペプチド配列、すなわち23位のGlyで始まり495位のLysで終わるポリペプチド配列を含む酵素である；または
（ii）：（i）のバリアントであって、（i）のポリペプチド配列と比べて20個未満（好ましくは10個未満、より好ましくは5個未満）のアミノ酸変化（好ましくは置換、欠失、挿入のいずれか、より好ましくは置換）を含む酵素であることが好ましい。
【００３３】
EP 1041890B1の配列ID番号2の23位〜495位のポリペプチドを本明細書では配列ID番号1の1位〜473位として提示する。
【００３４】
したがってセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素は、
（i）：配列ID番号1の1位〜473位のポリペプチド配列、すなわち1位のGlyで始まり473位のLysで終わるポリペプチド配列を含む酵素であること；または
（ii）：（i）のバリアントであって、（i）のポリペプチド配列と比べて20個未満（好ましくは10個未満、より好ましくは5個未満）のアミノ酸変化（好ましくは置換、欠失、挿入のいずれか、より好ましくは置換）を含む酵素であることが好ましい。
【００３５】
対象の酵素（例えば上記の第（i）項のセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素）から出発し、（例えばいわゆる保存された変化を生じさせることによって、例えば1個のアミノ酸を似たアミノ酸に（例えば疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に）変えることによって）同じ／似たセロビオースオキシダーゼ活性を持つバリアントを作ることは当業者にとって定型的な作業である。
【００３６】
言い換えると、上記の第（ii）項のバリアントを作ることは当業者にとって定型的な作業である。したがってこれについて本明細書でさらに詳しく説明／議論する必要はないと考えられる。
【００３７】
ヘキソースオキシダーゼ（EC1.1.3.5）
【００３８】
WO 02/39828A2（Danisco社）で議論されているヘキソースオキシダーゼ（HOX）酵素の完全長ポリペプチド配列（プレ／シグナル配列、すなわち成熟ペプチドの上流を含む）を本明細書では配列ID番号2の位で示すポリペプチド配列として提示する。
【００３９】
この配列はCAS番号：9028-75-5とUniProt参照番号「UniProtKB - P93762（HOX_CHOCR）」（http://www.uniprot.org/uniprot/P93762）を持つ。
【００４０】
ヘキソースオキシダーゼ酵素は、
（i）：本明細書の配列ID番号2のポリペプチド配列の成熟／活性部分を含む酵素であること；または
（ii）：（i）のバリアントであって、（i）のポリペプチド配列と比べて20個未満（好ましくは10個未満、より好ましくは5個未満）のアミノ酸変化（好ましくは置換、欠失、挿入のいずれか、より好ましくは置換）を含む酵素であることが好ましい。
【００４１】
第（i）項にある本明細書の配列ID番号2のポリペプチド配列の成熟／活性部分の一例は、Danisco／DuPont社から製品Grindamyl Surebake 800として市販されているHOX酵素であり、これが本明細書の実施例で用いられている。
【００４２】
好ましいプロセスパラメータ
【００４３】
本明細書の技術的教示と、当業者に共通の一般的な知識に基づくと、食品または餌製品（好ましくは乳製品）の中のメイラード反応を減ら（し、したがって褐色化を減ら）すことを目的として関連するプロセスパラメータ（例えば温度、時間、使用する酵素の量など）を最適化することは当業者にとって定型的な作業である。したがって本明細書では、これについてさらに詳しく説明する必要はない。
【００４４】
酵素は、乾燥形態または粉末形態で添加することもできる。酵素が湿潤形態または乾燥形態であるときには、他の成分と組み合わせて食品と接触させることができる。例えば酵素が乾燥形態であるときには、固化防止剤と組み合わせることができる。
【００４５】
いくつかの側面では、本発明はさらに、食品または餌製品をカタラーゼと接触させる工程を含んでいる。
【００４６】
当業者は、本発明を実施する際に乳製品を十分な量の酵素と接触させてメイラード反応を阻止する、および／または減らすことを理解するであろう。そのような十分な量の酵素を同定することは当業者にとって定型的な作業である。
【００４７】
食品と接触させることのできる酵素の典型的な量は、0.05〜5 U/g（食品1グラム当たりの酵素の単位）、0.05〜3 U/g、0.05〜2 U/g、0.1〜2 U/g、0.1〜1.5 U/g、0.5〜1.5 U/gである。
【００４８】
本明細書の実施例で議論されているように、Lactoyield（登録商標）（LOX）の量は、一般に知られているいわゆるLOXU/g単位に従って求めることができる。
【００４９】
LOXU/g単位は、Lactoyield（登録商標）（Chr. Hansen A/S社、デンマーク国；バージョン：5 PI GLOB EN 02-24-2017）に関して公開されている製品情報シートから入手すること／知ること（によって当業者が決めること）ができる。Lactoyield（登録商標）の製品情報シートは、Chr. Hansen A/S社、デンマーク国に請求することによって、またはLactoyield（登録商標）製品を単に購入することによって取得することができる。
【００５０】
食品と接触させることのできるセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素の典型的な量は、0.0001〜10.0 LOXU/g、例えば0.001〜5.0 LOXU/g、より好ましくは0.001〜1.0 LOXU/g、より一層好ましくは0.005〜0.1 LOXU/gであることが好ましかろう。
【００５１】
上記の工程（a）に関し、酵素は適切な任意の形態でミルクと接触させること、例えば液体酵素をミルクと接触させることができる。
【００５２】
実施例3には、非常にうまく機能する（すなわち酵素が乳清に移ることを回避する）直径分布を持つ粒子が記載されている。
【００５３】
実施例3で用いられているのと比べて小さい／大きい直径分布を持つ粒子が納得できる程度には機能しないと考える理由はない。
【００５４】
したがって好ましい一実施態様では、工程（a）の結合した／カプセル化されたオキシダーゼ酵素を含む粒子は、少なくとも10 nmの粒子径（D（v, 0.1））分布かつ500μm未満の粒子径（D（v, 0.9））分布を持つ粒子、より好ましくは少なくとも0.1μmの粒子径（D（v, 0.1））分布かつ200μm未満の粒子径（D（v, 0.9））分布を持つ粒子、より一層好ましくは少なくとも0.5μmの粒子径（D（v, 0.1））分布かつ100μm未満の粒子径（D（v, 0.9））分布を持つ粒子である。
【００５５】
本分野では「D（V, 0.1）」という記号は、その値よりも小さな粒子径を持つ粒子が粒子分布の10％となる粒子径を表わし、「D（V, 0.9）」は、その値よりも小さな粒子径を持つ粒子が粒子分布の90％となる粒子径を表わす。
【００５６】
その帰結として、例えばD（V, 0.1）が2μmでD（V, 0.9）が200μmである場合には、直径が2μm超である粒子の比較的多く（90％超）、200μm未満の直径を持つ粒子が比較的多い（少なくとも90％）、すなわち粒子の大半が2μm〜200μmの範囲に入る。
【００５７】
本分野で知られているように、不規則な形の粒子に関しては、一般に「球相当径」の考え方が用いられる。この考え方では、粒子の何らかの物理的特性が、同じ特性（例えば同じ体積）を持つと考えられる球と関係している。したがって粒子の直径は、本明細書では「球相当径」に関する周知の考え方と関係している。
【００５８】
本分野では、「D（V, 0.1）」と「D（V, 0.9）」の中の「v」という記号は、体積、すなわち体積分布に関係する。
【００５９】
本明細書に関係する「D（V, 0.1）」と「D（V, 0.9）」の値を例えば適切なMalvern社の装置または適切な別の装置を用いて測定することは、当業者にとって定型作業である。
【００６０】
本明細書の実施例3では、工程（a）の粒子はアガロースで作られる。
【００６１】
当業者は、食品／餌製品の製造に関して許容できる／認められている適切な異なるタイプの多数の粒子を知っており、原則として、そのような適切なタイプの任意のものを工程（a）の適切なタイプの粒子として用いることができる。
【００６２】
工程（a）の粒子は、セルロースとその誘導体、アガロース、デキストラン、ポリマー（例えばポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート）、コポリマーからなるグループから選択された少なくとも1つのタイプの粒子である。
【００６３】
当業者には本明細書の文脈から明らかなように、「少なくとも1つの」という表現は、工程（a）の粒子がもちろん異なるタイプの粒子であってもよいこと（例えば50％が1つのタイプであり、50％が別のタイプであること）を意味する。
【００６４】
PCT出願番号がPCT/EP2018/050317である国際特許出願が2018年1月8日に出願された。
【００６５】
PCT/EP2018/050317には、いわゆるCGMPオリゴマー粒子という粒子が記載されている。この粒子の中のCGMPオリゴマーは、分子間共有イソペプチド結合を通じて架橋したカゼイングリコマクロペプチド（CGMP）オリゴマー（CGMPオリゴマー）であり、モノマーCGMPは、κ-カゼインのアミノ酸残基106〜169を含有するペプチドであり、CGMPオリゴマーのモノマーはモノマーCGMPである。
【００６６】
PCT/EP2018/050317の実施例6には、カプセル化したラクトースオキシダーゼ（LOX、Lactoyield（登録商標））を含むCGMPオリゴマー粒子が記載されている。
【００６７】
PCT/EP2018/050317には、本明細書で議論している食品または餌製品の中のメイラード反応を減らすための方法におけるLOXの利用が、直接的にも漠然とも開示されていない。例えば「褐色化」という用語は、PCT/EP2018/050317には言及さえされていない。
【００６８】
工程（a）の粒子は、CGMPオリゴマー粒子からなるグループから選択された少なくとも1つのタイプの粒子である。ただしこの粒子の中のCGMPオリゴマーは、分子間共有イソペプチド結合を通じて架橋したカゼイングリコマクロペプチド（CGMP）オリゴマー（CGMPオリゴマー）であり、モノマーCGMPは、κ-カゼインのアミノ酸残基106〜169を含有するペプチドであり、CGMPオリゴマーのモノマーはモノマーCGMPである。
【００６９】
食品または餌製品
【００７０】
食品／餌製品の有用な出発材料に含まれるのは、関係する任意の材料、例えば従来は乳酸細菌発酵工程を経る材料（ミルク（例えば豆乳、牛乳、好ましくは牛乳）、植物材料、肉製品、果汁、マスト、パン生地、バッター）である。
【００７１】
製品は乳製品であることが好ましく、発酵した乳製品であることが好ましい。
【００７２】
本発明の方法によって得られる発酵製品に含まれるのは、乳製品（発酵乳、ヨーグルト、チーズ、（フレッシュチーズ製品、ソフトチーズ製品、チェダー、モッツァレラ、バターミルク）が含まれる）である。
【００７３】
好ましい一実施態様では、乳製品は、ソフトチーズ、チェダーチーズ、パスタフィラータチーズ、モッツァレラチーズのいずれかであり、より好ましくは、乳製品は、パスタフィラータチーズ、チェダーチーズ、モッツァレラチーズのいずれかであり、最も好ましくは、乳製品は、（好ましくはピザを作るのに用いられる）モッツァレラチーズまたはチェダーチーズである。
【００７４】
本明細書の実施例2 は、Lactoyield（登録商標）（LOX）が上記のWO 02/39828A2（Danisco社）に記載されているヘキソースオキシダーゼ（HOX）よりも熱に対して安定であることを実証している。
【００７５】
これが、HOXと比べた LOXの大きな利点である。なざなら例えば多数の食品／餌製品（例えば乳製品）が加熱工程を含む方法で作られるからである。
【００７６】
その例は、加熱工程を含む方法で作られるモッツァレラチーズである。
【００７７】
本分野で知られているように、モッツァレラは、いわゆるパスタフィラータ法によって作られる（すなわちモッツァレラはいわゆるパスタフィラータチーズの一例である）。
【００７８】
パスタフィラータ技術で作られたチーズは、新鮮なカードを熱水の中で可塑化した後、こねる処理（すなわち温度が50〜95℃になる可能性がある加熱工程）を受ける可能性がある。
【００７９】
したがって好ましい一実施態様では、食品または餌製品は、加熱工程を含んでいて、この加熱工程の前に製品をセロビオースオキシダーゼ（EC1.1.99.18）酵素と接触させる方法によって作られる製品である。
【００８０】
この実施態様に関連して、好ましい1つの製品として、パスタフィラータチーズ（モッツァレラチーズなど）が可能である。
【００８１】
加熱工程として、例えば40℃超（50℃超、または70℃超など）の温度にする加熱工程が可能である。
【００８２】
上述のように、多くのピザ製造業者はピザを260℃超の温度で焼くため、褐色化という大きな問題が生じる可能性がある。
【００８３】
したがって好ましい一実施態様では、食品または餌製品は、（例えばピザを作るため）40℃超（約80℃超、または約100℃超、または約150℃超など）の温度に加熱する工程を含む方法で用いられる製品である。
【００８４】
この実施態様に関連して、好ましい1つの製品としてパスタフィラータチーズ（例えばモッツァレラチーズ）が可能である。これは、ピザを作るのに、言い換えるならばピザ用チーズを作るのに用いることができる。
【００８５】
消費者が市場で入手できるシュレッドチーズ（モッツァレラチーズなど）は、通常、固化防止剤を含んでいる。固化防止剤の役割は、チーズの細片が互いにくっついてチーズの塊を形成し、例えばピザの上に容易に広げることができなくなるのを阻止することである。
【００８６】
固化防止剤は、通常は、例えばジャガイモとトウモロコシからのデンプンで構成されている。デンプンは、還元糖基を多く含む天然の多糖であるため、デンプンがメイラード褐色化に顕著に寄与することが予測される。したがってガラクトースの減少だけを制御する解決法は、固化防止剤（デンプンなど）を含むシュレッド製品にとって有用でない可能性がある。
【００８７】
実施例4は、Lactoyield（登録商標）（LOX）が、デンプン固化防止剤の存在下でさえ、より具体的には、デンプン固化防止剤を含むシュレッドモッツァレラチーズ製品を作る際に、うまく機能することを示している。
【００８８】
したがって好ましい一実施態様では、食品または餌製品（好ましくは食品、好ましくはシュレッドチーズ製品（例えばモッツァレラチーズ））は、デンプン固化防止剤（例えばジャガイモおよび／またはトウモロコシのデンプン）を含む製品である。
【００８９】
本分野で知られているように、「シュレッドチーズ」という用語は、チーズの細片を作り出すためにシュレッダを通過させたチーズに関係する。シュレッドチーズは、一般に1つの成分として使用される。シュレッドチーズは、他の諸成分と混合されるか、サラダ、サンドイッチ、スープ、ピザ、ラザーニャなどの食品や、他の多くの風味ある料理のトッピングとして使用される。シュレッドチーズは、多彩なもの（モッツァレラ、チェダー、パルメザン、スイス）を利用できる。
【００９０】
したがってシュレッドチーズは、シュレッドモッツァレラチーズ、シュレッドチェダーチーズ、シュレッドパルメザンチーズ、シュレッドスイスチーズのいずれかであることが好ましい。
【００９１】
さらに別の実施態様では、基礎材料は、動物の餌のための出発材料（サイレージ（例えば草）、穀物、豆類、アルファルファ、テンサイの葉）であり、細菌培養物の接種が、保存するためサイロに貯蔵される餌用穀物の中に、またはやはり動物に供給するため保存することを目的としてタンパク質が豊富な動物の廃棄物（屠殺した家畜の臓物や魚の臓物）の中になされる。
【実施例】
【００９２】
実施例1：LactoYield（LOX）の実験データ
【００９３】
酵素の用量を今後はチーズ1 g当たりのLOXUで示す。
【００９４】
LOXUは、Lactoyield（登録商標）（Chr. Hansen A/S社、デンマーク国；バージョン：5 PI GLOB EN 02-24-2017）に関して公開されている製品情報シートに従って求めた。
【００９５】
以下に議論するように、この実施例では、約0.01〜0.02 LOXU/gを使用した。
【００９６】
この実験では、Lactoyield（登録商標）をシュレッドモッツァレラチーズの表面に添加した。Hannilase XP（ケカビ属のペプシンXL-typw）またはCHY-MAX M（ラクダのキモシン）および同じ培養物を用いて作ったモッツァレラチーズを細片化して-18℃で保管した。5.0 gの量のチーズの細片を15 mlの試験管に移し、0.05 Mの酢酸ナトリウム（pH 5.2）の中で希釈した0.5 mlのLactoyield（登録商標）酵素を添加した。酵素の用量は、チーズ1 g当たり0、0.01、0.02 LOXUのいずれかであった。試験管を気密な蓋で閉じ、20分間反転させ、5℃で保管した。14日間保管した後、サンプルを、褐色化する能力とガラクトースに関して分析した。
【００９７】
褐色化を、チーズの個々の細片を96ウエルプレートの1つのウエルに入れて調べた。プレートを100℃に70分間加熱した。図1と図2に示した結果から、シュレッドモッツァレラチーズを0.01〜0.02 LOXU/gで処理すると、チーズが褐色化する能力が低下することがわかる。カタラーゼ（Catazyme）を添加するとLactoyield（登録商標）酵素の効果が増大するように見え、褐色化がはるかに少なくなった。
【００９８】
4 gのチーズを25 mlの水に分散させて均一にし、試験管を30分間反転させることにより、サンプルをガラクトースに関して分析した。サンプルを80℃の水浴の中に25分間浸すことにより、この懸濁液の中のLOX酵素を不活化した。遠心分離の後に水相を回収し、-18℃に維持した後に分析した。ガラクトースをHPLCによって定量した。表1から、チーズのサンプルをLOXで処理すると、ガラクトースの濃度が200 mg/100 g未満のレベルへと低下することがわかる。LOXの添加によるガラクトースの減少は、観察された褐色化の減少とよく一致している。
【００９９】
【表１】
2021524241.tif 000003
【０１００】
実施例2：LactoYield（LOX）はHOXよりも熱に対して安定である
【０１０１】
パスタフィラータチーズの製造における1つの固有の工程は、カードの熱延伸である。ここでは、できたばかりのカードの塊を、このカードを可塑化するのに役立つ延伸プロセスにおいて熱水に浸す。いわゆるオーブンの中で、例えば80〜85℃に達する温度の熱水の中で延伸したカードを2〜3分間保持する。この処理によってカードの温度が65〜70℃になる。チーズミルクに添加されてカードの中に保持されている酵素の活性は、チーズの製造プロセス全体を通じて保持されねばならない。LOXを熱処理することの潜在的な効果を評価するため、酵素の緩衝化溶液を50〜80℃の範囲の温度まで加熱し、5〜30分間のさまざまな時間にわたって保持した。使用したバッファは、pHが5.2の50 mM酢酸ナトリウムであり、このpHは、モッツァレラカードの熱延伸を開始する標的pHである。加熱後、酵素を氷の上に置き、活性を測定した。酵素HOX（上記のWO 02/39828A2に記載されていてDanisco／DuPont社から市販されている製品Grindamyl Surebake 800）とGOX（Sigma社から製品G6125として市販されているグルコースオキシダーゼ）を参照基準として含めた。同じアッセイを利用して3種類の酵素の酵素活性をすべて測定した。活性測定は、Eur. J. Biochem. 第268巻、1136〜1142ページ、2001年に従い、発色剤として4-アミノアンチピリン（4AA）とN-エチル-N-スルホプロピル-m-トルイジン（Tops）を用いた結合ペルオキシダーゼアッセイにおいて実施した。活性を、同じ希釈度の各酵素の未処理対照サンプルの活性に規格化することにより、相対活性に変換した。活性を保持時間の関数としてプロットすると、単一の指数関数的減少が得られ、そこから速度定数を計算した。速度定数と温度の関係を記述するアーレニウスの式から、速度定数を50〜72℃で計算し、1次反応に関する半減期に変換した。
【０１０２】
表から、LOXは65〜72℃で安定であるのに対し、GOXとHOXは2〜5分以内に活性をかなり失ったことがわかる。
【０１０３】
【表２】
2021524241.tif 000004
【０１０４】
実施例3：チーズミルクへのLactoYield（LOX）の添加 - 粒子が最良である
【０１０５】
以下に、「粒子に結合した」酵素を取り扱う。粒子は、粒子径（D（v, 0.1））分布が少なくとも2μmかつ粒子径（D（v, 0.9））分布が200μm未満であった。
【０１０６】
粒子はアガロース（Workbeads WB40S）で作製した。（D（v, 0.5））は40μm。
【０１０７】
チーズの製造を模倣したプロセスを利用し、小型化したチーズモデルを96ウエルのプレートの中に作った。スキムミルクには、CaCl2を0.5 g/lまで添加し、化学的酸性化のためグルコノデルタ-ラクトングルコン（GDL）を0.9 g/lまで添加し、ラクトースを加水分解してグルコースとガラクトースにするためHa-ラクターゼを5 NLU/mlまで添加した。GDLが溶解した直後、ミルクを深い96ウエルのプレートの各ウエルに1.25 ml移した。酵素LactoYield（LOX）を、液体酵素として、または上記の粒子径を持つ粒子に結合した状態で、異なるレベルで添加した。カタラーゼを液体酵素として異なるレベルで添加した。LOXの添加が実験の開始の合図であった（t＝0）。プレートを30℃まで加熱し、震盪することによって混合した。t＝10分の時点で凝固剤を各ウエルに添加し（0.4 IMCU/ml）、プレートを震盪し、5分後に停止した。凝固剤の添加によってミルクが凝固してレンネットカードになった。t＝35分の時点でピペットの先端を前後に数回移動させてカードを切断した後、温度を40℃まで上昇させ、プレートの震盪を開始した。t＝60分の時点で乳清の一部を水とともに取り出して移動させ、震盪を継続した。乳清のサンプルを維持してLOX活性を分析した。最後にt＝70分の時点でプレートを遠心分離器の中で3000 ppmにて20分間回転させた後、プレートを反転させて乳清を除去した。プレートにはレンネットカードの小片が残った。カードを5℃で保管し、サンプルを採取して0日後、4日後、8日後、12日後に分析した。カードを1.0 mlの0.5 Mクエン酸三ナトリウムに溶かし、塩酸を用いてpHを4.5に下げることによって溶けたレンネットカードから糖を抽出し、遠心分離の後に上清のサンプルを採取した。Megazyme社からの酵素アッセイキット（K-LACGAR）を用いてガラクトースを分析した。乳清の中のLOXの活性は、電子受容体としての2,6-ジクロロインドフェノールを用いた比色アッセイを利用して測定した。
【０１０８】
酵素を液体製剤として添加するとLOX活性のかなりの部分が乳清に移ることを結果は実証していた。LOX酵素が40μmの粒子に結合すると、酵素を乳清の中で検出することはできなかった。これは、酵素が、ミクロンサイズの粒子と会合すると選択的にカードに分配されることを示唆している。
【０１０９】
5℃で保管している間のカードの中でのガラクトースの変化に関する結果から、LOXを添加していない対照は、13日間の保管期間を通じてガラクトースの含量が同じであることがわかった。LOXを用いて作ったカードでは、保管中にガラクトースが減少する。保管の終了時、ガラクトースは200 mg/100 kg未満（0.2％未満）に減少していた。これは、保管中にチーズカードの中でガラクトースがラクトースオキシダーゼによって酸化されてガラクトン酸になったことを示している。ガラクトースの還元によってチーズカードの褐色化がより少なくなることが非常に確実である。
【０１１０】
結論として、粒子の表面へのLOXの吸着は、酵素が乳清に移動するのを阻止する。こうすることで、乳清の値が維持されるだけでなく、必要とされる酵素を1/10しか投与しないことが可能になる。チーズカードの中にLOXが存在しているとガラクトースを酸化してガラクトン酸にする触媒となり、このガラクトン酸によって焼いたときの褐色化が減少することになる。
【０１１１】
実施例 4：LactoYield（LOX）は、固化防止剤の存在下でさえ機能する
【０１１２】
実施例1で報告した実験は、目的上、細片化したチーズに基づいていた。消費者のために市販されているシュレッドチーズは必ず固化防止剤を含んでいる。固化防止剤の役割は、チーズの細片が互いにくっついてチーズの塊を形成し、例えばピザの上に容易に広げることができなくなるのを阻止することである。固化防止剤は、例えばジャガイモとトウモロコシのデンプンで構成されている。デンプンは、還元糖基を多く含む天然の多糖であるため、デンプンがメイラード褐色化に顕著に寄与することが予測される。したがってガラクトースの減少だけを制御する解決法は、固化防止剤（デンプンなど）を含むシュレッド製品にとって有用でない可能性がある。
【０１１３】
LOXは、その機能的類似体であるHOXおよびGOXとは異なりポリマー炭水化物を酸化することができる（Eur. J. Biochem. 第268巻、1136〜1142ページ、2001年）。デンプンに対するLOXの活性が、固化防止剤を含むモッツァレラチーズの褐色化を制御するのに十分であるかどうかを調べるため、ジャガイモのデンプンが成分リストに表示されているシュレッドチーズをスーパーマーケットから購入して実施例1の実験を繰り返した。
【０１１４】
LOXをシュレッドチーズに添加し、蓋をきつく締めた試験管の中に保管した。4℃で2週間保管した後、褐色化を調べた。本明細書の図3に示されている結果から、ジャガイモのデンプンを含むシュレッドモッツァレラチーズをLOXで処理すると、100℃で100分間加熱した後のチーズの色に強く影響していて、LOXを添加すると褐色化が有意に少ないことがわかった。
【０１１５】
参考文献
2021524241.tif 000005
【図１】
2021524241.tif 000006
【図２】
2021524241.tif 000007
【図３】
2021524241.tif 000008
【配列表】
2021524241000001.app
【国際調査報告】
2021524241.tif 000009
2021524241.tif 000010