(57)【要約】  本開示は、非経口投与の後、特に、静脈内投与の後における、ＲＮＡの、標的組織への送達のためのＲＮＡリポプレックス粒子を調製するための方法と、このようなＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物とに関する。本開示はまた、産業的なＧＭＰに準拠する形で、ＲＮＡリポプレックス粒子を調製することを可能とする方法にも関する。さらに、本開示は、製品の品質の実質的な喪失を伴わずに、特に、ＲＮＡ活性の実質的な喪失を伴わずに、ＲＮＡリポプレックス粒子を保管するための方法および組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームコロイドを作製する方法であって、エタノール中の脂質溶液を、水性相へと注入して、リポソームコロイドを作製することを含み、脂質溶液中の脂質のうちの少なくとも１つの濃度が、エタノール中の少なくとも１つの脂質の平衡溶解度に対応するか、またはこれより高い、方法。
【請求項２】
脂質溶液が、２つまたはこれを超える、異なる脂質の混合物の溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脂質溶液中の１つの脂質の濃度が、室温における、エタノール中の脂質の平衡溶解度に対応するか、またはこれより高い、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
脂質溶液中の総脂質濃度が、約１８０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約６００ｍＭ、または約３３０ｍＭである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
脂質溶液が、少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質とを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
脂質溶液中のさらなる脂質の濃度が、エタノール中のさらなる脂質の平衡溶解度に対応するか、またはこれより高い、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのカチオン性脂質が、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、および／または１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのさらなる脂質が、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、および／または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのカチオン性脂質が、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質が、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、請求項５から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのカチオン性脂質の、少なくとも１つのさらなる脂質に対するモル比が、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１である、請求項５から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
脂質溶液が、ＤＯＴＭＡと、ＤＯＰＥとを、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１のモル比で含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
脂質溶液中のＤＯＰＥの濃度が、少なくとも約６０ｍＭ、または少なくとも約９０ｍＭである、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
脂質溶液が、約５０ｒｐｍ〜約１５０ｒｐｍの、水性相の攪拌速度で、水性相へと注入される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
水性相が、水である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
リポソームコロイドを攪拌することをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
リポソームコロイドが、約１５分間〜約６０分間、または約３０分間攪拌される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
リポソームコロイドを作製する方法であって、ＤＯＴＭＡと、ＤＯＰＥとを、エタノール中に、約２：１のモル比で含む脂質溶液を、約１５０ｒｐｍの攪拌速度で攪拌される水へと注入して、リポソームコロイドを作製することを含み、脂質溶液中のＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥの濃度が約３３０ｍＭである、方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法により得られるリポソームコロイド。
【請求項１９】
リポソームが、少なくとも約２５０ｎｍの平均直径を有する、請求項１８に記載のリポソームコロイド。
【請求項２０】
リポソームが、約２５０ｎｍ〜約８００ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項１８または１９に記載のリポソームコロイド。
【請求項２１】
リポソームが、カチオン性リポソームである、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のリポソームコロイド。
【請求項２２】
リポソームが、少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質とを含む、請求項１８から２１のいずれか一項に記載のリポソームコロイド。
【請求項２３】
少なくとも１つのカチオン性脂質が、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、および／または１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む、請求項２２に記載のリポソームコロイド。
【請求項２４】
少なくとも１つのさらなる脂質が、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、および／または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、請求項２２または２３に記載のリポソームコロイド。
【請求項２５】
少なくとも１つのカチオン性脂質が、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質が、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載のリポソームコロイド。
【請求項２６】
少なくとも１つのカチオン性脂質の、少なくとも１つのさらなる脂質に対するモル比が、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１である、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のリポソームコロイド。
【請求項２７】
リポソームが、ＤＯＴＭＡと、ＤＯＰＥとを、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１のモル比で含む、請求項１８から２６のいずれか一項に記載のリポソームコロイド。
【請求項２８】
ＲＮＡリポプレックス粒子を調製する方法であって、請求項１８から２７のいずれか一項に記載のリポソームコロイドを、ＲＮＡを含む溶液へと添加することを含む、方法。
【請求項２９】
ＲＮＡリポプレックス粒子の連続フロー製造のための方法であって、ＲＮＡを含む溶液と、カチオン性リポソームを含む溶液とを、ＲＮＡおよびカチオン性リポソームの制御された混合条件下で混合することを含む、方法。
【請求項３０】
カチオン性リポソームを含む溶液が、請求項１８から２７のいずれか一項に記載のリポソームコロイドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＮＡを含む溶液およびカチオン性リポソームを含む溶液が、水溶液である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＲＮＡを含む溶液と、カチオン性リポソームを含む溶液との混合を可能とする流速が使用される、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
流動が、３００を超えるか、または約５００〜約２１００のレイノルズ数により特徴づけられる、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
制御された混合条件が、ＲＮＡを含む溶液と、カチオン性リポソームを含む溶液との混合比を制御することを含む、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
制御された混合条件が、混合される、ＲＮＡを含む溶液と、カチオン性リポソームを含む溶液との相対体積を制御することを含む、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＲＮＡと、カチオン性リポソームとの混合比が、ＲＮＡを含む溶液およびカチオン性リポソームを含む溶液の、同一の混合体積（ｖ／ｖ）を使用し、それぞれの溶液中のＲＮＡおよびカチオン性リポソームの濃度を調整することにより制御される、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
制御された混合条件が、目詰まりを回避しながら、ＲＮＡリポプレックス粒子の特性を維持するように選択される、請求項２９から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
Ｙ字型混合要素またはＴ字型混合要素を使用することを含む、請求項２９から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
Ｙ字型混合要素またはＴ字型混合要素が、約１．２ｍｍ〜約５０ｍｍの直径を有する、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
１つがカチオン性リポソームを含む溶液を含み、１つがＲＮＡを含む溶液を含む、２つのシリンジが、同じポンプへと、並列に挿入されたシリンジポンプを使用することを含む、請求項２９から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
加圧容器、膜ポンプ、ギアポンプ、磁気浮揚ポンプ、または蠕動ポンプを、任意選択で、流速のオンライン制御およびリアルタイム調整のためのフィードバックループを伴う流速センサーと組み合わせて使用することを含む、請求項２９から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ＲＮＡを含む溶液と、リポソームを含む溶液との混合物が、約４５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むか、または約４５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムに対応するイオン強度を含む、請求項２９から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ＲＮＡを含む溶液と、リポソームを含む溶液との混合物が、少なくとも約５０ｍＭのイオン強度を有する、請求項２９から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
Ｘ線散乱パターンにおいて、ＲＮＡリポプレックスが、約１ｎｍ−１における単一のブラッグピークにより特徴づけられ、ここで、ピーク幅が、０．２ｎｍ−１より小さい、請求項２８から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ＲＮＡリポプレックス粒子が、約２００〜約８００ｎｍ、約２５０〜約７００ｎｍ、約４００〜約６００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項２８から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ＲＮＡリポプレックス粒子を含む凍結組成物を調製する方法であって、（ｉ）ＲＮＡリポプレックス粒子と、安定剤とを含む水性組成物を用意することと、（ｉｉ）組成物を凍結させることとを含む、方法。
【請求項４７】
凍結させることが、約−１５℃〜約−４０℃、または約−３０℃の温度である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
安定剤が、単糖、二糖類、三糖類、糖アルコール、オリゴ糖またはその対応する糖アルコール、および直鎖ポリアルコールから選択される炭水化物である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＲＮＡリポプレックス粒子と、安定剤とを含む水性組成物を用意することが、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物を用意することと、安定剤を、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物へと添加することとを含む、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
安定剤を、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物へと添加することが、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物のイオン強度を低減する、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ＲＮＡリポプレックス粒子と、安定剤とを含む水性組成物中の、安定剤の濃度が、生理的オスモル濃度に要求される値より高い、請求項４６から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物中の、安定剤の濃度が、ＲＮＡリポプレックス粒子の品質を維持し、特に、約−１５℃〜約−４０℃の温度で、少なくとも１カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも２４カ月間、または少なくとも３６カ月間にわたる、組成物の保管の後で、ＲＮＡ活性の実質的な喪失を回避するのに十分である、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物中のｐＨが、ＲＮＡを保管するための、通常のｐＨ最適値より低い、請求項４６から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物が、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むか、または約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムに対応するイオン強度を含む、請求項４６から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物が、約２０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムに対応するイオン強度を有する、請求項４６から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ＲＮＡリポプレックス粒子が、請求項２８から４４のいずれか一項に記載の方法により得られる、請求項４６から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
請求項２８から４５のいずれか一項に記載の方法により得られる、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物。
【請求項５８】
ＲＮＡリポプレックス粒子が、少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質とを含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
ＲＮＡが、少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードし、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比が、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０である、請求項５７または５８に記載の組成物。
【請求項６０】
少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡと、
少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質と
を含み、
ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比が、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０であり、
約１ｎｍ−１における単一のブラッグピークにより特徴づけられ、ここで、ピーク幅が、０．２ｎｍ−１より小さい、ＲＮＡリポプレックス粒子
を含む組成物。
【請求項６１】
約１０〜約３００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約８０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを、さらに含む、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
バッファーをさらに含む、請求項５７から６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
キレート剤をさらに含む、請求項５７から６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
請求項４６から５６のいずれか一項に記載の方法により得られるＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物。
【請求項６５】
ＲＮＡリポプレックス粒子が、少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質とを含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
ＲＮＡが、少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードし、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比が、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０である、請求項６４または６５に記載の組成物。
【請求項６７】
約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムをさらに含む、請求項６４から６６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡと、
少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質と、
を含み、
ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比が、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０である、ＲＮＡリポプレックス粒子と、
０ｍＭ〜約４０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムと、
安定剤と
を含む組成物。
【請求項６９】
バッファーをさらに含む、請求項６４から６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７０】
組成物中のＲＮＡの量が、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約０．５ｍｇ／ｍＬ、または約０．０５ｍｇ／ｍＬである、請求項６４から６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
塩化ナトリウムが、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度である、請求項６７から７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
塩化ナトリウムが、約２０ｍＭの濃度である、請求項６７から７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
塩化ナトリウムが、約３０ｍＭの濃度である、請求項６７から７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
組成物中の安定剤の濃度が、生理的オスモル濃度に要求される値より高い、請求項６４から７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
組成物中の安定剤の濃度が、約５〜約３５重量／体積パーセント（％ｗ／ｖ）、または約１２．５〜約２５重量／体積パーセント（％ｗ／ｖ）である、請求項６４から７４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
安定剤が、単糖、二糖類、三糖類、糖アルコール、オリゴ糖またはその対応する糖アルコール、および直鎖ポリアルコールから選択される炭水化物である、請求項６４から７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
安定剤が、約５〜約２５重量／体積パーセント（％ｗ／ｖ）の濃度のショ糖である、請求項６４から７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７８】
ショ糖が、約１５％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
ショ糖が、約２０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項７７に記載の組成物。
【請求項８０】
ショ糖が、約２２％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項７７に記載の組成物。
【請求項８１】
ショ糖が、約２０％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項７７に記載の組成物。
【請求項８２】
ＲＮＡを保管するための、通常のｐＨ最適値より低いｐＨを有する、請求項６４から８１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８３】
約５．７〜約６．７、または約６．２のｐＨを有する、請求項６４から８２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８４】
バッファーが、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である、請求項６８から８３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８５】
ＨＥＰＥＳが、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約７．５ｍＭの濃度である、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
キレート剤をさらに含む、請求項６４から８５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８７】
約０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度の、少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡと、
約２：１のモル比の、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥと
を含み、
ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比が、約１．３：２．０である、ＲＮＡリポプレックス粒子と、
約２０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムと、
約２２％（ｗ／ｖ）の濃度のショ糖と、
ｐＨが約６．２である、約７．５ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳと、
約２．５ｍＭの濃度のＥＤＴＡと
を含む組成物。
【請求項８８】
液体状態または凍結状態である、請求項６４から８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８９】
約−１５℃〜約−４０℃の温度で、少なくとも１カ月間安定である、請求項８８に記載の凍結組成物。
【請求項９０】
約−１５℃の温度で、少なくとも１カ月間安定である、請求項８８に記載の凍結組成物。
【請求項９１】
約−１５℃の温度で、少なくとも２カ月間安定である、請求項８８に記載の凍結組成物。
【請求項９２】
約−２０℃の温度で、少なくとも１カ月間安定である、請求項８８に記載の凍結組成物。
【請求項９３】
約−２０℃の温度で、少なくとも２カ月間安定である、請求項８８に記載の凍結組成物。
【請求項９４】
約−３０℃の温度で、少なくとも１カ月間安定である、請求項８８に記載の凍結組成物。
【請求項９５】
約−３０℃の温度で、少なくとも２カ月間安定である、請求項８８に記載の凍結組成物。
【請求項９６】
請求項８８から９５のいずれか一項に記載の凍結組成物を融解させ、任意選択で、水性液体を添加することにより、オスモル濃度およびイオン強度を調整することにより得られる、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物。
【請求項９７】
組成物のオスモル濃度が、約２００ミリオスモル〜約４５０ミリオスモルである、請求項９６に記載の組成物。
【請求項９８】
約８０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項９６または９７に記載の組成物。
【請求項９９】
ＲＮＡリポプレックス粒子が、請求項２８から４５のいずれか一項に記載の方法により得られる、請求項６４から９８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１００】
ＲＮＡリポプレックス粒子が、約１ｎｍ−１における単一のブラッグピークにより特徴づけられ、ここで、ピーク幅が、０．２ｎｍ−１より小さい、請求項６４から９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０１】
ＲＮＡリポプレックス粒子が、約２００〜約８００ｎｍ、約２５０〜約７００ｎｍ、約４００〜約６００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項５７から１００のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０２】
少なくとも１つのカチオン性脂質が、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、および／または１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む、請求項５８から６３、６５から８６、および８８から１０１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０３】
少なくとも１つのさらなる脂質が、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、および／または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、請求項５８から６３、６５から８６、および８８から１０２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０４】
少なくとも１つのカチオン性脂質が、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質が、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む、請求項５８から６３、６５から８６、および８８から１０３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０５】
少なくとも１つのカチオン性脂質の、少なくとも１つのさらなる脂質に対するモル比が、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１である、請求項５８から６３、６５から８６、および８８から１０４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０６】
ＲＮＡリポプレックス粒子が、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを、約１０：０〜１：９、約４：１〜１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１のモル比で含み、ＤＯＴＭＡ内の正の電荷の、ＲＮＡ内の負の電荷に対する電荷比が、約１：２〜１．９：２である、請求項５８から６３、６５から８６、および８８から１０５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０７】
キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項６３、８６、および８８から１０６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０８】
ＥＤＴＡが、約０．２５ｍＭ〜約５ｍＭ、または約２．５ｍＭの濃度である、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
アジュバントをさらに含む、請求項５７から１０８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１０】
全身投与のために製剤化される、請求項５７から１０９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１１】
全身投与が、静脈内投与による、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
治療的使用のための、請求項５７から１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１３】
ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物を調製する方法であって、請求項８８から１１２のいずれか一項に記載の凍結組成物を融解させることと、任意選択で、水性液体を添加することにより、オスモル濃度およびイオン強度を調整することとを含む、方法。
【請求項１１４】
水性液体を添加して、約２００ミリオスモル〜約４５０ミリオスモルのオスモル濃度の組成物を得る、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
水性液体を添加して、約８０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを得る、請求項１１３または１１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、非経口投与の後、特に、静脈内投与の後における、ＲＮＡの、標的組織への送達のためのＲＮＡリポプレックス粒子を調製するための方法と、このようなＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物とに関する。本開示はまた、産業的なＧＭＰに準拠する形で、ＲＮＡリポプレックス粒子を調製することを可能とする方法にも関する。さらに、本開示は、製品の品質の実質的な喪失を伴わずに、特に、ＲＮＡ活性の実質的な喪失を伴わずに、ＲＮＡリポプレックス粒子を保管するための方法および組成物に関する。本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子製剤は、液体の保管と比較して、製品の貯蔵寿命の延長を得ることを可能とする、凍結乾燥、噴霧乾燥、または関連する方法により凍結または脱水させることができる。一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、薬学的に活性のペプチドまたはタンパク質など、目的のペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを含む。ＲＮＡは、標的組織の細胞により取り込まれ、ＲＮＡは、その生理的活性を呈示しうる、コードされたペプチドまたはタンパク質へと翻訳される。目的のペプチドまたはタンパク質は、１つまたは複数のエピトープに対して方向付けられた免疫応答を誘導または増強するための、１つまたは複数のエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質でありうる。本明細書で記載される方法および組成物は、医薬品についての要件に準拠する、より具体的には、ＧＭＰに則った製造についての要件、および非経口適用のための、医薬品の品質についての要件に準拠する形での使用に適する。
【背景技術】
【０００２】
外来の遺伝情報の、標的細胞への送達のための、ＲＮＡの使用は、ＤＮＡに対する、魅力的な代替物を提供する。ＲＮＡを使用することの利点は、一過性発現および非形質転換的性格を含む。ＲＮＡは、発現させるために、核に侵入し、さらに、宿主ゲノムに組み込まれる必要がなく、これにより、発がん性の危険性がなくなる。
【０００３】
ＲＮＡは、ＲＮＡを、カチオン性脂質と、ヘルパー脂質との混合物から構成される、リポソームへと結合させて、注射用ナノ粒子製剤を形成する、いわゆるリポプレックス製剤により送達することができる。しかし、製剤を保管した後であってもなお、生物学的に活性のＲＮＡを、標的組織へと送達するための製剤を開発する必要は、満たされていない。加えて、貯蔵寿命が長い、ＧＭＰに準拠する注射用ＲＮＡリポプレックス粒子製剤を製造するための方法を開発する必要も、満たされていない。
【０００４】
したがって、生物学的に活性のＲＮＡを、標的組織へと送達するための製剤であって、送達されたＲＮＡが、それがコードするペプチドまたはタンパク質へと、効率的に翻訳される製剤を提供することが必要とされている。さらに、製品の品質の実質的な喪失を伴わずに、特に、ＲＮＡの生物活性の実質的な喪失を伴わずに常温保存可能な製剤を提供することが必要とされている。
【０００５】
本発明者らは、驚くべきことに、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子製剤が、上記で言及された要件を満たすことを見出した。
【発明の概要】
【０００６】
Ｉ．ＲＮＡリポプレックス粒子を調製するための方法、ＲＮＡリポプレックス粒子、およびＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物
第１の態様では、本開示は、生物活性が改善されたＲＮＡリポプレックス粒子を調製するための方法、本開示に従い調製されたＲＮＡリポプレックス粒子、およびこのようなＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物に関する。ＲＮＡリポプレックス粒子、およびＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、非経口投与の後、特に、静脈内投与の後における、ＲＮＡの、標的組織への送達に有用である。ＲＮＡリポプレックス粒子は、エタノール中の脂質の濃度が高濃度の溶液を、水または適切な水性相へと注入することにより得られるリポソームを使用して調製される。一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス製品は、約１ｎｍ−１における単一のブラッグピークが観察され、ピーク幅が０．２ｎｍ−１より小さい、ｘ線散乱における特異的パターンにより特徴づけられる。
【０００７】
一実施態様では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、および１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。脂質混合物中のＤＯＰＥの濃度は、エタノール単独中のＤＯＰＥの平衡溶解度より高い。室温では、ＤＯＰＥ単独は、約５０ｍＭの溶解度を有するが、ＤＯＴＭＡと併せると、１００ｍＭまたはこれを超える溶解度を有する。そこから高活性のリポプレックスを得る、リポソームを形成するための脂質溶液は、２７０ｍＭまたはこれを上回る総脂質濃度（例えば、９０ｍＭまたはこれを上回る濃度のＤＯＰＥ）を有しうる。温度を上昇させることにより、エタノール中の濃度がなおより高い溶液を得ることができる。ＤＯＰＥの濃度が、平衡溶解度を上回る脂質溶液から得られるリポソームは、ＤＯＰＥの濃度が、平衡溶解度以下である脂質溶液に由来するリポソームより、著明に大型である。リポソームサイズは、エタノール中の濃度と共に、単調に増大する。
【０００８】
本開示に従い調製されるリポソームは、リポソームを、ＲＮＡと混合することにより、ＲＮＡリポプレックス粒子を調製するために使用することができる。一実施態様では、ＲＮＡを、リポプレックスの活性を増大させるために要求される、ある特定のイオン強度を調整するために、混合の前に、ＮａＣｌと共にインキュベートする。これらの大型のリポソームから形成されるリポプレックスは、インビトロおよびインビボにおける実験により裏付けられる通り、著明に高度の生物活性を有する。これらの高活性のリポプレックスは、明らかに、ある特定の物理化学的パラメータ、例えば、（ｉ）ブラッグピークの低ピーク幅、および（ｉｉ）場流動分画のような、サイズ測定のための分散的解析法における、異なる分離プロファイルにより、低活性のリポプレックスから弁別することができる。低活性のリポプレックスは、平均して、小型である。加えて、低活性のリポプレックスはまた、分子コンフォメーション、形状、およびバルク相との相互作用のようなパラメータと、おそらく関連する、異なる溶出プロファイルも有する。
【０００９】
したがって、この態様では、本開示は、リポソームコロイドを作製する方法であって、エタノール中の脂質溶液を、水性相へと注入して、リポソームコロイドを作製することを含み、脂質溶液中の脂質のうちの少なくとも１つの濃度が、エタノール中の少なくとも１つの脂質の平衡溶解度に対応するか、またはこれより高い方法に関する。
【００１０】
一実施態様では、方法は、脂質溶液を加熱して、脂質溶液中の、脂質の濃度を上昇させることを含む。一実施態様では、脂質溶液を、少なくとも約４０℃、または少なくとも約６０℃の温度へと加熱する。
【００１１】
一実施態様では、脂質溶液は、２つまたはこれを超える、異なる脂質の混合物の溶液である。
【００１２】
一実施態様では、脂質溶液中の１つの脂質の濃度は、エタノール中の脂質の平衡溶解度に対応するか、またはこれより高い。
【００１３】
一実施態様では、脂質溶液中の総脂質濃度は、約１８０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約６００ｍＭ、または約３３０ｍＭである。
【００１４】
一実施態様では、脂質溶液は、少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質とを含む。
【００１５】
一実施態様では、脂質溶液中のさらなる脂質の濃度は、エタノール中のさらなる脂質の平衡溶解度に対応するか、またはこれより高い。
【００１６】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、および／または１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。
【００１７】
一実施態様では、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、および／または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。
【００１８】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
【００１９】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質の、少なくとも１つのさらなる脂質に対するモル比は、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１である。
【００２０】
一実施態様では、脂質溶液は、ＤＯＴＭＡと、ＤＯＰＥとを、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１のモル比で含む。
【００２１】
一実施態様では、脂質溶液中のＤＯＰＥの濃度は、少なくとも約６０ｍＭ、または少なくとも約９０ｍＭである。
【００２２】
一実施態様では、脂質溶液は、約５０ｒｐｍ〜約１５０ｒｐｍの、水性相の攪拌速度で、水性相へと注入される。
【００２３】
一実施態様では、水性相は、水である。
【００２４】
一実施態様では、水性相は、酸性のｐＨを有する。一実施態様では、水性相は、例えば、約５ｍＭの量の酢酸を含む。
【００２５】
一実施態様では、方法は、リポソームコロイドを攪拌することをさらに含む。
【００２６】
一実施態様では、リポソームコロイドは、約１５分間〜約６０分間、または約３０分間攪拌される。
【００２７】
本開示は、リポソームコロイドを作製する方法であって、ＤＯＴＭＡと、ＤＯＰＥとを、エタノール中に、約２：１のモル比で含む脂質溶液を、約１５０ｒｐｍの攪拌速度で攪拌される水へと注入して、リポソームコロイドを作製することを含み、脂質溶液中のＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥの濃度が、約３３０ｍＭである方法にさらに関する。
【００２８】
一実施態様では、リポソームを作製する方法は、リポソームを押し出す工程を含まない。
【００２９】
本開示は、リポソームを作製する方法により得られるリポソームコロイドにさらに関する。
【００３０】
一実施態様では、リポソームは、少なくとも約２５０ｎｍの平均直径を有する。
【００３１】
一実施態様では、リポソームは、約２５０ｎｍ〜約８００ｎｍの範囲の平均直径を有する。
【００３２】
一実施態様では、リポソームは、約０．５より小さいか、約０．４より小さいか、または約０．３より小さい多分散指数を有する。
【００３３】
一実施態様では、リポソームは、カチオン性リポソームである。
【００３４】
一実施態様では、リポソームは、少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質とを含む。
【００３５】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、および／または１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。
【００３６】
一実施態様では、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、および／または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。
【００３７】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
【００３８】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質の、少なくとも１つのさらなる脂質に対するモル比は、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１である。
【００３９】
一実施態様では、リポソームは、ＤＯＴＭＡと、ＤＯＰＥとを、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１のモル比で含む。
【００４０】
本開示は、ＲＮＡリポプレックス粒子を調製する方法であって、上記のリポソームコロイドを、ＲＮＡを含む溶液へと添加することを含む方法にさらに関する。
【００４１】
一実施態様では、Ｘ線散乱パターンにおいて、ＲＮＡリポプレックスは、約１ｎｍ−１における単一のブラッグピークにより特徴づけられ、ここで、ピーク幅は、０．２ｎｍ−１より小さい。
【００４２】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００〜約８００ｎｍ、約２５０〜約７００ｎｍ、約４００〜約６００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。
【００４３】
本開示は、上記で記載した通りに得られる、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物にさらに関する。
【００４４】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質とを含む。
【００４５】
一実施態様では、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードし、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比は、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０である。
【００４６】
本開示は、
少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡと、
少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質と
を含み、
ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比が、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０であり、
約１ｎｍ−１における単一のブラッグピークにより特徴づけられ、ここで、ピーク幅が、０．２ｎｍ−１より小さい、ＲＮＡリポプレックス粒子
を含む組成物にさらに関する。
【００４７】
一実施態様では、組成物は、約１０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約８０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを、さらに含む。
【００４８】
一実施態様では、組成物は、バッファーをさらに含む。
【００４９】
一実施態様では、組成物は、キレート剤をさらに含む。
【００５０】
一実施態様では、この態様のＩ．の下に記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００〜約８００ｎｍ、約２５０〜約７００ｎｍ、約４００〜約６００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。
【００５１】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約０．５より小さいか、約０．４より小さいか、または約０．３より小さい多分散指数を有する。
【００５２】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、および／または１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。
【００５３】
一実施態様では、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、および／または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。
【００５４】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
【００５５】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質の、少なくとも１つのさらなる脂質に対するモル比は、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１である。
【００５６】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子が、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを、約１０：０〜１：９、約４：１〜１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１のモル比で含み、ＤＯＴＭＡ内の正の電荷の、ＲＮＡ内の負の電荷に対する電荷比は、約１：２〜１．９：２である。
【００５７】
一実施態様では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【００５８】
一実施態様では、ＥＤＴＡは、約０．２５ｍＭ〜約５ｍＭ、または約２．５ｍＭの濃度である。
【００５９】
一実施態様では、組成物は、アジュバントをさらに含む。
【００６０】
一実施態様では、組成物は、全身投与のために製剤化される。
【００６１】
一実施態様では、全身投与は、静脈内投与による。
【００６２】
本開示は、治療的使用のために記載される組成物にさらに関する。
【００６３】
ＩＩ．産業的なＧＭＰに準拠する形で、ＲＮＡリポプレックス粒子を調製するための方法
第２の態様では、本開示は、産業的なＧＭＰに準拠する形で、ＲＮＡリポプレックス粒子を調製することを可能とする方法に関する。
【００６４】
本開示の一実施態様では、生成物の品質に重要な、ＲＮＡの、リポソームに対する混合比の正確な制御を可能とする流路システムを、医薬用ＲＮＡリポプレックス粒子生成物のＧＭＰに則った製造のために使用する。一実施態様では、流路は、リポソーム溶液と、ＲＮＡ溶液とを、１対１（体積／体積）の形で混合することを含み、この場合、成分の濃度は、目的の電荷比を正確に維持するために選択される。一実施態様では、ＲＮＡを、リポプレックスの活性に要求される、ある特定のイオン強度を調整するために、混合の前に、ＮａＣｌと共にインキュベートする。一実施態様では、単一の使用材料に完全に基づく、Ｙ字型混合の設定を実現する。粒子特性を維持し、目詰まりを回避するように、流体力学を最適化する。これに対し、市販のマイクロ流体デバイスを使用する場合、ある程度の時間の後に、目詰まりが生じ、ＧＭＰに向けた適用が不可能となる。
【００６５】
一実施態様では、リポプレックスは、ＲＮＡを、カチオン性リポソームと共にインキュベートすることにより製造され、この場合、混合比および混合条件は、１つがリポソームを含み、１つがＲＮＡを含む、２つのシリンジが、シリンジポンプ内の、同じポンプへと、優先的に、並列に挿入されるシリンジポンプ（灌流ポンプ）を使用することにより、正確に制御される。両方の（ｐｏｔｈ）ポンプのピストンは、同じ駆動器により、前方に動かされるので、混合される相対体積が、正確に制御される。選択される処理条件では、同一なシリンジを、両方の溶液に使用するので、正確な１対１（ｖ／ｖ）の混合条件が可能となる。次いで、混合の前に、２つの溶液の濃度を調整することにより、ＲＮＡと、リポソーム（カチオン性脂質）との比を、正確に制御する。
【００６６】
したがって、この態様では、本開示は、ＲＮＡリポプレックス粒子の連続フロー製造のための方法であって、ＲＮＡを含む溶液と、カチオン性リポソームを含む溶液とを、ＲＮＡおよびカチオン性リポソームの制御された混合条件下で混合することを含む方法に関する。
【００６７】
一実施態様では、カチオン性リポソームを含む溶液は、上記で記載したリポソームコロイドである。
【００６８】
一実施態様では、ＲＮＡを含む溶液およびカチオン性リポソームを含む溶液は、水溶液である。
【００６９】
一実施態様では、ＲＮＡを含む溶液と、カチオン性リポソームを含む溶液との混合を可能とする流速が使用される。
【００７０】
一実施態様では、流動は、３００を超えるか、または約５００〜約２１００のレイノルズ数により特徴づけられる。
【００７１】
一実施態様では、制御された混合条件は、ＲＮＡを含む溶液と、カチオン性リポソームを含む溶液との混合比を制御することを含む。
【００７２】
一実施態様では、制御された混合条件は、混合される、ＲＮＡを含む溶液と、カチオン性リポソームを含む溶液との相対体積を制御することを含む。
【００７３】
一実施態様では、ＲＮＡと、カチオン性リポソームとの混合比は、ＲＮＡを含む溶液およびカチオン性リポソームを含む溶液の同一の混合体積（ｖ／ｖ）を使用し、それぞれの溶液中のＲＮＡおよびカチオン性リポソームの濃度を調整することにより制御される。
【００７４】
一実施態様では、制御された混合条件は、目詰まりを回避しながら、ＲＮＡリポプレックス粒子の特性を維持するように選択される。
【００７５】
一実施態様では、方法は、Ｙ字型混合要素またはＴ字型混合要素を使用することを含む。
【００７６】
一実施態様では、Ｙ字型混合要素またはＴ字型混合要素は、約１．２ｍｍ〜約５０ｍｍの直径を有する。
【００７７】
一実施態様では、方法は、例えば、Ｙ字型混合要素またはＴ字型混合要素、２本のチューブまたはホースからの流体が合流し、例えば、分岐および再混合、互い違いのヘリングボーン型チャネル、ジグザグ型チャネル、もしくはツイスト型チャネル、または三次元蛇行路としての内的静態的混合要素は、存在しない混合要素を使用することを含む。混合要素は、１．２〜５０．０ｍｍの間の直径を有しうる。
【００７８】
一実施態様では、方法は、１つがカチオン性リポソームを含む溶液を含み、１つがＲＮＡを含む溶液を含む、２つのシリンジが、同じホルダーまたは２つのホルダーへと、並列に挿入され、デバイスのピストンが、１つまたは２つの精密アクチュエーターにより引き出されるデバイスを使用することを含む。一実施態様では、方法は、１つがカチオン性リポソームを含む溶液を含み、１つがＲＮＡを含む溶液を含む、２つのシリンジが、同じポンプへと、並列に挿入されたシリンジポンプを使用することを含む。
【００７９】
一実施態様では、方法は、加圧容器、膜ポンプ、ギアポンプ、磁気浮揚ポンプ、蠕動ポンプ、ＨＰＬＣ／ＦＰＬＣポンプ、または他の任意のピストンポンプを、任意選択で、流速のオンライン制御およびリアルタイム調整のためのフィードバックループを伴う流速センサーと、任意選択で組み合わせて使用することを含む。
【００８０】
一実施態様では、ＲＮＡを含む溶液と、リポソームを含む溶液との混合物は、約４５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むか、または約４５ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムに対応するイオン強度を含む。
【００８１】
一実施態様では、ＲＮＡ溶液は、約９０ｍＭ〜約６００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むか、または約９０ｍＭ〜約６００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムに対応するイオン強度を含む。
【００８２】
一実施態様では、ＲＮＡを含む溶液と、リポソームを含む溶液との混合物は、少なくとも約５０ｍＭのイオン強度を有する。
【００８３】
一実施態様では、Ｘ線散乱パターンにおいて、ＲＮＡリポプレックスは、約１ｎｍ−１における単一のブラッグピークにより特徴づけられ、ここで、ピーク幅は、０．２ｎｍ−１より小さい。
【００８４】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００〜約８００ｎｍ、約２５０〜約７００ｎｍ、約４００〜約６００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。
【００８５】
本開示は、上記で記載した通りに得られる、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物にさらに関する。
【００８６】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質とを含む。
【００８７】
一実施態様では、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードし、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比は、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０である。
【００８８】
本開示は、
少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡと、
少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質と
を含み、
ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比が、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０であり、
約１ｎｍ−１における単一のブラッグピークにより特徴づけられ、ここで、ピーク幅が、０．２ｎｍ−１より小さい、ＲＮＡリポプレックス粒子
を含む組成物にさらに関する。
【００８９】
一実施態様では、組成物は、約１０〜約３００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約８０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを、さらに含む。
【００９０】
一実施態様では、組成物は、バッファーをさらに含む。
【００９１】
一実施態様では、組成物は、キレート剤をさらに含む。
【００９２】
一実施態様では、この態様のＩＩ．の下に記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００〜約８００ｎｍ、約２５０〜約７００ｎｍ、約４００〜約６００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。
【００９３】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約０．５より小さいか、約０．４より小さいか、または約０．３より小さい多分散指数を有する。
【００９４】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、および／または１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。
【００９５】
一実施態様では、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、および／または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。
【００９６】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
【００９７】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質の、少なくとも１つのさらなる脂質に対するモル比は、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１である。
【００９８】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子が、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを、約１０：０〜１：９、約４：１〜１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１のモル比で含み、ＤＯＴＭＡ内の正の電荷の、ＲＮＡ内の負の電荷に対する電荷比は、約１：２〜１．９：２である。
【００９９】
一実施態様では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【０１００】
一実施態様では、ＥＤＴＡは、約０．２５ｍＭ〜約５ｍＭ、または約２．５ｍＭの濃度である。
【０１０１】
一実施態様では、組成物は、アジュバントをさらに含む。
【０１０２】
一実施態様では、組成物は、全身投与のために製剤化される。
【０１０３】
一実施態様では、全身投与は、静脈内投与による。
【０１０４】
本開示は、治療的使用のために記載される組成物にさらに関する。
【０１０５】
ＩＩＩ．ＲＮＡリポプレックス粒子を保管するための方法および組成物
第３の態様では、本開示は、製品の品質の実質的な喪失を伴わずに、特に、ＲＮＡ活性の実質的な喪失を伴わずに、ＲＮＡリポプレックス粒子を保管するための方法および組成物に関する。特に、本開示は、ＲＮＡリポプレックス粒子の品質の実質的な喪失を伴わずに、特に、ＲＮＡ活性の実質的な喪失を伴わずに、ＲＮＡリポプレックス粒子の凍結、凍結乾燥、または噴霧乾燥を可能とする製剤に関する。
【０１０６】
本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子製剤は、液体の保管と比較して、製品の貯蔵寿命の延長を得ることを可能とする、凍結乾燥、噴霧乾燥、または関連する方法により凍結または脱水させることができる。
【０１０７】
凍結を可能とするために、安定剤（低温保護剤）を添加する。一実施態様では、製造の後で、リポプレックスを、安定剤（低温保護剤）で希釈し、これにより、イオン強度を調整し、優先的には、イオン強度を低減することを可能とし、安定剤の適切な濃度を調整する。生成物を凍結させるためには、安定剤の濃度は、生理的オスモル濃度を得るための値より高い場合がある。この場合、投与のためには、所望のオスモル濃度およびイオン強度を調整するために、製品を、適切な水性相（例えば、注射用水、生理食塩水）で希釈する。安定剤として、グルコース、ショ糖、またはトレハロースのような糖類を使用しうるが、また、デキストランのような、他の化合物も使用しうる。
【０１０８】
驚くべきことに、本開示に従い、本明細書で記載される、安定剤を含むＲＮＡリポプレックス製剤はまた、凍結乾燥させることもできることが見出されている。凍結乾燥のために、要求される安定剤（凍結乾燥保護剤）の濃度は、凍結させるより低い可能性があり、許容されるＮａＣｌ濃度（イオン強度）も、凍結させるより高い可能性がある。大スケールにおける、費用節減的脱水が要求される場合、生成物はまた、噴霧乾燥させることもできる。
【０１０９】
ＲＮＡリポプレックス製剤のうちの一部のｐＨは、通例の生理的範囲およびバルク相におけるＲＮＡ保管のための、通常のｐＨの最適値より低い値に調整する。最適値のｐＨは、約６．２であり、適切な範囲は、約５．７〜約６．７の間である。他の製剤では、理想的なｐＨは、なお低い場合がある。ＲＮＡリポプレックス内部の局所ｐＨは、カチオン性脂質の正電荷に起因して、バルク相ｐＨより高いことが仮定される。
【０１１０】
ＲＮＡリポプレックス組成物を、保管のために凍結させる、本開示の実施態様では、組成物を、融解させることができ、任意選択で、水性液体を添加することにより、組成物の、オスモル濃度、イオン強度、および／またはｐＨを、調整することができる。結果として得られる組成物は、対象へと投与されうる。
【０１１１】
ＲＮＡリポプレックス組成物を、保管のために凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄまたはｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）させる、本開示の実施態様では、水性液体を添加することにより、組成物を、再構成することができ、任意選択で、水性液体を添加することにより、組成物の、オスモル濃度、イオン強度、および／またはｐＨを、調整することができる。結果として得られる組成物は、対象へと投与されうる。
【０１１２】
したがって、この態様では、本開示は、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む凍結組成物を調製する方法であって、（ｉ）ＲＮＡリポプレックス粒子と、安定剤とを含む水性組成物を用意することと、（ｉｉ）組成物を凍結させることとを含む方法に関する。
【０１１３】
一実施態様では、凍結させることは、約−１５℃〜約−４０℃、または約−３０℃の温度である。
【０１１４】
一実施態様では、組成物は、例えば、約−１５℃〜約−４０℃、または約−２０℃の保管温度で保管される。
【０１１５】
一実施態様では、安定剤は、単糖、二糖類、三糖類、糖アルコール、オリゴ糖またはその対応する糖アルコール、および直鎖ポリアルコールから選択される炭水化物である。
【０１１６】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子と、安定剤とを含む水性組成物を用意することは、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物を用意することと、安定剤を、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物へと添加することとを含む。したがって、凍結させるための組成物を調製する方法は、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物を用意することと、安定剤を、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物へと添加することとを含む。
【０１１７】
一実施態様では、安定剤を、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物へと添加することは、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物のイオン強度を低減する。
【０１１８】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子と、安定剤とを含む水性組成物中の、安定剤の濃度は、生理的オスモル濃度に要求される値より高い。
【０１１９】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物中の、安定剤の濃度は、ＲＮＡリポプレックス粒子の品質を維持し、特に、約−１５℃〜約−４０℃の温度で、少なくとも１カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも２４カ月間、または少なくとも３６カ月間、組成物の保管の後で、ＲＮＡ活性の実質的な喪失を回避するのに十分である。
【０１２０】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物中の、安定剤の濃度は、約５％〜約３５．０％（ｗ／ｖ）、約１０％〜約３０．０％（ｗ／ｖ）、約１２．５％〜約２５．０％（ｗ／ｖ）、または約２２．０％（ｗ／ｖ）である。
【０１２１】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物中のｐＨは、ＲＮＡを保管するための、通常のｐＨ最適値より低い。
【０１２２】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むか、または、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムに対応するイオン強度を含む。
【０１２３】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物は、約２０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムに対応するイオン強度を有する。
【０１２４】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、上記のＩ．およびＩＩ．の下に記載した方法により得られる。
【０１２５】
一実施態様では、凍結組成物を調製する方法は、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む凍結組成物を保管することをさらに含む。組成物は、凍結温度に対応するか、またはこれに本質的に対応する温度で保管することもでき、凍結温度より高温または低温で保管することもできる。一般に、組成物は、約−１５℃〜約−４０℃、例えば、約−２０℃の温度で保管される。
【０１２６】
本開示は、上記の凍結組成物を調製する方法により得られるＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物にさらに関する。本開示はまた、凍結させるための組成物を調製する、上記の方法により得られるＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物にも関する。
【０１２７】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質とを含む。
【０１２８】
一実施態様では、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードし、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比は、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０である。
【０１２９】
一実施態様では、組成物は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムをさらに含む。
【０１３０】
本開示は、
少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡと、
少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質と、
を含み、
ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比が、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０である、ＲＮＡリポプレックス粒子と、
０ｍＭ〜約４０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムと、
安定剤と
を含む組成物にさらに関する。
【０１３１】
一実施態様では、組成物は、バッファーをさらに含む。
【０１３２】
一実施態様では、組成物中のＲＮＡの量は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約０．５ｍｇ／ｍＬ、または約０．０５ｍｇ／ｍＬである。
【０１３３】
一実施態様では、塩化ナトリウムは、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度である。
【０１３４】
一実施態様では、塩化ナトリウムは、約２０ｍＭの濃度である。
【０１３５】
一実施態様では、塩化ナトリウムは、約３０ｍＭの濃度である。
【０１３６】
一実施態様では、組成物中の安定剤の濃度は、生理的オスモル濃度に要求される値より高い。
【０１３７】
一実施態様では、組成物中の安定剤の濃度は、約５〜約３５重量／体積パーセント（％ｗ／ｖ）、または約１２．５〜約２５重量／体積パーセント（％ｗ／ｖ）である。
【０１３８】
一実施態様では、安定剤は、単糖、二糖類、三糖類、糖アルコール、オリゴ糖またはその対応する糖アルコール、および直鎖ポリアルコールから選択される炭水化物である。
【０１３９】
一実施態様では、安定剤は、約５〜約２５重量／体積パーセント（％ｗ／ｖ）の濃度のショ糖である。
【０１４０】
一実施態様では、ショ糖は、約１５％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【０１４１】
一実施態様では、ショ糖は、約２０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【０１４２】
一実施態様では、ショ糖は、約２２％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【０１４３】
一実施態様では、ショ糖は、約２０％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【０１４４】
一実施態様では、組成物は、ＲＮＡを保管するための、通常のｐＨ最適値より低いｐＨを有する。
【０１４５】
一実施態様では、組成物は、約５．７〜約６．７、または約６．２のｐＨを有する。
【０１４６】
一実施態様では、バッファーは、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である。
【０１４７】
一実施態様では、ＨＥＰＥＳは、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約７．５ｍＭの濃度である。
【０１４８】
一実施態様では、組成物は、キレート剤をさらに含む。
【０１４９】
本開示は、
約０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度の、少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡと、
約２：１のモル比の、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥと
を含み、
ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比が、約１．３：２．０である、ＲＮＡリポプレックス粒子と、
約２０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムと、
約２２％（ｗ／ｖ）の濃度のショ糖と、
ｐＨが約６．２である、約７．５ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳと、
約２．５ｍＭの濃度のＥＤＴＡと
を含む組成物にさらに関する。
【０１５０】
一実施態様では、組成物は、液体状態または凍結状態である。
【０１５１】
一実施態様では、凍結組成物は、約−１５℃〜約−４０℃の温度で、少なくとも１カ月間安定、少なくとも６カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも２４カ月間、または少なくとも３６カ月間である。
【０１５２】
一実施態様では、凍結組成物は、約−１５℃の温度で、少なくとも１カ月間安定、少なくとも６カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも２４カ月間、または少なくとも３６カ月間である。
【０１５３】
一実施態様では、凍結組成物は、約−１５℃の温度で、少なくとも２カ月間安定である。
【０１５４】
一実施態様では、凍結組成物は、約−２０℃の温度で、少なくとも１カ月間安定、少なくとも６カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも２４カ月間、または少なくとも３６カ月間である。
【０１５５】
一実施態様では、凍結組成物は、約−２０℃の温度で、少なくとも２カ月間安定である。
【０１５６】
一実施態様では、凍結組成物は、約−３０℃の温度で、少なくとも１カ月間安定、少なくとも６カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも２４カ月間、または少なくとも３６カ月間である。
【０１５７】
一実施態様では、凍結組成物は、約−３０℃の温度で、少なくとも２カ月間安定である。
【０１５８】
本開示は、上記の凍結組成物を融解させ、任意選択で、水性液体を添加することにより、オスモル濃度およびイオン強度を調整することにより得られる、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物にさらに関する。
【０１５９】
一実施態様では、組成物のオスモル濃度は、約２００ミリオスモル〜約４５０ミリオスモルである。
【０１６０】
一実施態様では、組成物は、約８０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含む。
【０１６１】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、上記のＩ．およびＩＩ．の下に記載した方法により得られる。
【０１６２】
本開示は、脱水、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥させた、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物を調製する方法であって、（ｉ）ＲＮＡリポプレックス粒子と、安定剤とを含む水性組成物を用意することと、（ｉｉ）組成物を脱水すること、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥することとを含む方法にさらに関する。
【０１６３】
一実施態様では、安定剤は、単糖、二糖類、三糖類、糖アルコール、オリゴ糖またはその対応する糖アルコール、および直鎖ポリアルコールから選択される炭水化物である。
【０１６４】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子と、安定剤とを含む水性組成物を用意することは、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物を用意することと、安定剤を、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物へと添加することとを含む。したがって、脱水、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥のための組成物を調製する方法は、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物を用意することと、安定剤を、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物へと添加することとを含む。
【０１６５】
一実施態様では、安定剤を、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物へと添加することは、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物のイオン強度を低減する。
【０１６６】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子と、安定剤とを含む水性組成物中の、安定剤の濃度は、生理的オスモル濃度に要求される値より高い。
【０１６７】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物中の、安定剤の濃度は、ＲＮＡリポプレックス粒子の品質を維持し、特に、少なくとも１カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも２４カ月間、または少なくとも３６カ月間、組成物の保管の後で、ＲＮＡ活性の実質的な喪失を回避するのに十分である。
【０１６８】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物中の、安定剤の濃度は、約５％〜約３５．０％（ｗ／ｖ）、約１０％〜約３０．０％（ｗ／ｖ）、約１２．５％〜約２５．０％（ｗ／ｖ）、または約２２．０％（ｗ／ｖ）である。
【０１６９】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物中のｐＨは、ＲＮＡを保管するための、通常のｐＨ最適値より低い。
【０１７０】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物は、約１０ｍＭ〜約８０ｍＭもしくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むか、または約１０ｍＭ〜約８０ｍＭもしくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムに対応するイオン強度を含む。
【０１７１】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックスと、安定剤とを含む水性組成物は、約２０ｍＭ、約４０ｍＭ、約６０ｍＭ、または約８０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムに対応するイオン強度を有する。
【０１７２】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、上記のＩ．およびＩＩ．の下に記載した方法により得られる。
【０１７３】
一実施態様では、脱水組成物、例えば、凍結乾燥組成物または噴霧乾燥組成物を調製する方法は、凍結乾燥または噴霧乾燥させたＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物を保管することをさらに含む。一般に、組成物は、約−１５℃〜約−４０℃、例えば、約−２０℃の温度で保管される。ある特定の実施態様では、組成物は、０℃より高温で、例えば、約２５℃もしくは約４℃で、または、例えば、室温で保管される。
【０１７４】
本開示は、上記の脱水組成物、例えば、凍結乾燥組成物または噴霧乾燥組成物を調製する方法により得られる、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物にさらに関する。本開示はまた、脱水、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥のための組成物を調製する、上記の方法により得られる、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物にも関する。
【０１７５】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質とを含む。
【０１７６】
一実施態様では、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードし、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比は、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０である。
【０１７７】
一実施態様では、組成物は、約１０ｍＭ〜約８０ｍＭまたは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを、さらに含む。
【０１７８】
本開示は、
少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡと、
少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つのさらなる脂質と
を含み、
ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比が、約１：２〜約１．９：２、または約１．３：２．０である、ＲＮＡリポプレックス粒子と、
１０ｍＭ〜約８０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムと、
安定剤と
を含む組成物にさらに関する。
【０１７９】
一実施態様では、組成物は、バッファーをさらに含む。
【０１８０】
一実施態様では、組成物中のＲＮＡの量は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約０．５ｍｇ／ｍＬ、または約０．０５ｍｇ／ｍＬである。
【０１８１】
一実施態様では、塩化ナトリウムは、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度である。
【０１８２】
一実施態様では、塩化ナトリウムは、約２０ｍＭの濃度である。
【０１８３】
一実施態様では、塩化ナトリウムは、約３０ｍＭの濃度である。
【０１８４】
一実施態様では、組成物中の安定剤の濃度は、生理的オスモル濃度に要求される値より高い。
【０１８５】
一実施態様では、組成物中の安定剤の濃度は、約５〜約３５重量／体積パーセント（％ｗ／ｖ）、または約１０〜約２５重量／体積パーセント（％ｗ／ｖ）である。
【０１８６】
一実施態様では、安定剤は、単糖、二糖類、三糖類、糖アルコール、オリゴ糖またはその対応する糖アルコール、および直鎖ポリアルコールから選択される炭水化物である。
【０１８７】
一実施態様では、安定剤は、約５〜約３５重量／体積パーセント（％ｗ／ｖ）の濃度のトレハロースである。
【０１８８】
一実施態様では、トレハロースは、約５％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【０１８９】
一実施態様では、トレハロースは、約１０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【０１９０】
一実施態様では、トレハロースは、約１０％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【０１９１】
一実施態様では、トレハロースは、約１５％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【０１９２】
一実施態様では、組成物は、ＲＮＡを保管するための、通常のｐＨ最適値より低いｐＨを有する。
【０１９３】
一実施態様では、組成物は、約５．７〜約６．７、または約６．２のｐＨを有する。
【０１９４】
一実施態様では、バッファーは、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）である。
【０１９５】
一実施態様では、ＨＥＰＥＳは、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約７．５ｍＭの濃度である。
【０１９６】
一実施態様では、組成物は、キレート剤をさらに含む。
【０１９７】
本開示は、
約０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度の、少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡと、
約２：１のモル比の、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥと
を含み、
ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する比が、約１．３：２．０である、ＲＮＡリポプレックス粒子と、
約２０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムと、
約１０％（ｗ／ｖ）の濃度のトレハロースと、
ｐＨが約６．２である、約７．５ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳと、
約２．５ｍＭの濃度のＥＤＴＡと
を含む組成物にさらに関する。
【０１９８】
一実施態様では、組成物は、液体状態、または脱水状態、例えば、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄまたはｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）状態である。
【０１９９】
一実施態様では、脱水組成物、例えば、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄまたはｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）組成物は、少なくとも１カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも２４カ月間、または少なくとも３６カ月間安定である。一実施態様では、組成物は、０℃より高温で、例えば、約２５℃もしくは約４℃で、または、例えば、室温で保管される。
【０２００】
一実施態様では、脱水組成物、例えば、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄまたはｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）組成物は、少なくとも１カ月間安定である。
【０２０１】
一実施態様では、脱水組成物、例えば、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄまたはｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）組成物は、少なくとも２カ月間安定である。
【０２０２】
本開示は、上記の脱水組成物、例えば、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄまたはｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）組成物を再構成し、任意選択で、水性液体を添加することにより、オスモル濃度およびイオン強度を調整することにより得られる、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物にさらに関する。
【０２０３】
一実施態様では、組成物のオスモル濃度は、約１５０ミリオスモル〜約４５０ミリオスモルである。
【０２０４】
一実施態様では、組成物は、約８０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含む。
【０２０５】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、上記のＩ．およびＩＩ．の下に記載した方法により得られる。
【０２０６】
一実施態様では、この態様のＩＩＩ．の下で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、約１ｎｍ−１における単一のブラッグピークにより特徴づけられ、ここで、ピーク幅は、０．２ｎｍ−１より小さい。
【０２０７】
一実施態様では、この態様のＩＩＩ．の下で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００〜約８００ｎｍ、約２５０〜約７００ｎｍ、約４００〜約６００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。
【０２０８】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約０．５より小さいか、約０．４より小さいか、または約０．３より小さい多分散指数を有する。
【０２０９】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、および／または１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。
【０２１０】
一実施態様では、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、および／または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。
【０２１１】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
【０２１２】
一実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質の、少なくとも１つのさらなる脂質に対するモル比は、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１である。
【０２１３】
一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子が、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを、約１０：０〜１：９、約４：１〜１：２、約３：１〜約１：１、または約２：１のモル比で含み、ＤＯＴＭＡ内の正の電荷の、ＲＮＡ内の負の電荷に対する電荷比は、約１：２〜１．９：２である。
【０２１４】
一実施態様では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【０２１５】
一実施態様では、ＥＤＴＡは、約０．２５ｍＭ〜約５ｍＭ、または約２．５ｍＭの濃度である。
【０２１６】
一実施態様では、組成物は、アジュバントをさらに含む。
【０２１７】
一実施態様では、組成物は、全身投与のために製剤化される。
【０２１８】
一実施態様では、全身投与は、静脈内投与による。
【０２１９】
本開示は、治療的使用のために記載される組成物にさらに関する。
【０２２０】
本開示は、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む水性組成物を調製する方法であって、上記で記載した凍結組成物を融解させるか、または上記で記載した凍結乾燥組成物もしくは噴霧乾燥組成物を再構成することと、任意選択で、水性液体を添加することにより、オスモル濃度およびイオン強度を調整することとを含む方法にさらに関する。
【０２２１】
一実施態様では、水性液体を添加して、約２００ミリオスモル〜約４５０ミリオスモルのオスモル濃度の組成物を得る。
【０２２２】
一実施態様では、水性液体を添加して、約８０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを得る。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】脂質原液中の脂質濃度と、リポソームサイズとの相関を示す図である。リポソームは、水中の、エタノール注入（エタノール注入の後において、濾過法を実施しなかった）により調製した。リポソームのサイズは、エタノール中の脂質の濃度と共に増大する。例：％によるモル比を、６６：３３とする脂質混合物であるＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ。
【図２】異なる濃度の、異なる脂質溶液により調製された、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥリポソーム製剤中に存在する粒子の量を示す図である。
【図３】リポソーム前駆体（使用される、非濾過リポソームコロイド）サイズの、ＲＮＡリポプレックスサイズに対する影響を示す図である。小型のリポソームを、それらの形成のために使用したところ、小型のＲＮＡリポプレックスが得られた。全ての大型のリポソームにより調製されたＲＮＡリポプレックス内では、リポソームサイズと、ＲＮＡリポプレックスサイズとの明らかな相関が見出されなかった。
【図４】異なるリポソーム前駆体（非濾過リポソーム）により調製された、ＲＮＡリポプレックス製剤内に存在する粒子の量を示す図である。０．５μｍの粒子の量は、大型のリポソームにより調製されたＲＮＡリポプレックス製剤内で増大する。リポソームは、異なる脂質濃度で、異なる脂質原液を使用する、エタノール注入により調製した。
【図５】４／１の電荷比（上）、および１．３／２の電荷比で調製されたリポソームにより形成されたＲＮＡリポプレックスによるＳＡＸＳ測定から得られた回折曲線であって、リポプレックス形成のためのリポソームが、エタノール中に、４００ｍＭ、３００ｍＭ、および１００ｍＭの脂質原液により得られた場合の回折曲線を示す図である。
【図６】異なるリポソーム前駆体により調製された、異なるＲＮＡリポプレックスの、インビトロ（ヒト樹状細胞）における相関長、およびトランスフェクション効率を示す図である。生物活性（インビトロにおけるＲＮＡトランスフェクション）は、ＲＮＡリポプレックスの相関長と共に、単調に増大する。リポソームは、エタノール注入と、異なる脂質濃度で調製された、異なる脂質原液とにより調製した。
【図７】エタノール中に１５０ｍＭの原液、またはエタノール中に４００ｍＭの原液から製造された、２つの異なる種類のリポソームに由来するリポプレックスの、ＡＦ４測定を示す図である。
【図８】樹状細胞内の、異なるＲＮＡリポプレックスの、インビトロにおけるトランスフェクション効率を示す図である。ルシフェラーゼシグナルは、ＲＮＡリポプレックスの形成のために使用されるリポソームサイズと共に、単調に増大する。
【図９】樹状細胞内の、異なるＲＮＡリポプレックスの、インビトロにおけるトランスフェクション効率を示す図である。ルシフェラーゼシグナルは、リポソームサイズと共に、単調に増大する。
【図１０】適用の６時間後における、ＲＮＡリポプレックス製剤の、インビボにおけるトランスフェクション効率を示す図である。ＲＮＡリポプレックスは、小型および大型のリポソーム（非濾過リポソーム）により調製した。大型のリポソームにより調製されたＲＮＡリポプレックスは、高ルシフェラーゼ発現を結果としてもたらす。
【図１１】適用の６時間後における、ＲＮＡリポプレックスの、インビボイメージングを示す図である。ＲＮＡリポプレックスは、小型および大型のリポソームにより調製した。Ａ）生コロイドに由来する、小型のリポソームにより調製されたＲＮＡリポプレックスを示す図である。Ｂ）生コロイドに由来する、大型のリポソームにより調製されたＲＮＡリポプレックスを示す図である。Ｃ）濾過された、小型のリポソームにより調製されたＲＮＡリポプレックスを示す図である。Ｄ）濾過された、大型のリポソームにより調製されたＲＮＡリポプレックスを示す図である。大型のリポソームにより調製されたＲＮＡリポプレックスにより得られた、高生物発光シグナルである。
【図１２】ＲＮＡリポプレックスの、自動式バッチ製造のための一般的手順を示す図である。
【図１３】異なる流速で、内径を３．２ｍｍとする、Ｙ字型混合要素を使用して調製される、ＲＮＡリポプレックスのＺ平均および多分散性を示す図である。
【図１４】異なる流速で、内径を２．４ｍｍとする、Ｙ字型混合要素を使用して調製される、ＲＮＡリポプレックスのＺ平均および多分散性を示す図である。
【図１５】リポプレックス形成時における、粒子サイズと、ＲＮＡ濃度との相関を示す図である。ＰＣＳの測定は、凍結させる前に実施した。
【図１６】３凍結融解サイクル後の、リポプレックス形成時における、粒子特性と、ＲＮＡ濃度との相関を示す図である。
【図１７】粒子特性と、１．０：２．０〜２．１：２．０の範囲の電荷比（正：負）との相関を示す図である。
【図１８】粒子特性と、２．０：１．０〜５．０：１．０の範囲の電荷比（正：負）との相関を示す図である。
【図１９】リポプレックス形成時における、粒子特性と、ＮａＣｌ濃度との相関を示す図である。
【図２０】リポプレックス形成時における、生物活性と、ＮａＣｌ濃度との相関を示す図である。
【図２１】＋４０℃における加速保管の後における、いくつかのｐＨ値の、異なるバッファー物質（ＨＥＰＥＳ；酢酸Ｎａ；リン酸Ｎａ；炭酸Ｎａ）を使用する、低温保護剤を伴わずにＲＮＡ（ＬＩＰ）組成物中の、ＲＮＡの完全性の測定を示す図である。異なるバーは、左（３日間）から、右（２１日間）へと、保管期間の増大を指し示す。
【図２２】＋４０℃における加速保管の後における、いくつかのｐＨ値の、バッファー物質としてのＨＥＰＥＳを使用する、低温保護剤としてのショ糖を伴うＲＮＡリポプレックス製剤中の、ＲＮＡの完全性の測定を示す図である。異なるバーは、左（１日間）から、右（２１日間）へと、保管期間の増大を指し示す。
【図２３】４０℃で保管された、ＥＤＴＡの含有量が異なるリポプレックス中の、ＲＮＡの完全性を示す図である。
【図２４】ＮａＣｌおよび低温保護剤の濃度を、各工程において最適化したことを指し示す概略図である。
【図２５】量を増大させる、代替的低温保護剤の存在下で凍結させた、ＲＮＡリポプレックスの、Ｚ平均および多分散性を示す図である。
【図２６】量を増大させる、代替的低温保護剤の存在下で凍結させた、ＲＮＡリポプレックス製剤中の、≧１０μｍの、目視できない粒子の数を示す図である。
【図２７】−３０℃での凍結の前および後における、５〜２０％ｗ／ｖのショ糖（Ｘ軸）と、多様な低ＮａＣｌ濃度とを含有する、ＲＮＡリポプレックス製剤中の粒子サイズの測定を示す図である。
【図２８】−３０℃での凍結の前および後における、５〜２０％ｗ／ｖのトレハロース二水和物（ｘ軸）と、多様な低ＮａＣｌ濃度とを含有する、ＲＮＡリポプレックス製剤中の粒子サイズの測定を示す図である。
【図２９】複数の凍結融解サイクルの後における、５０ｍＭのＮａＣｌと、多様な量（％ｗ：ｖ）のトレハロース二水和物とを含有するＲＮＡリポプレックス製剤中の、粒子サイズの測定を示す図である。
【図３０】複数の凍結融解サイクルの後における、７０ｍＭのＮａＣｌと、多様な量（％ｗ／ｖ）のトレハロース二水和物とを含有するＲＮＡリポプレックス製剤中の、粒子サイズの測定を示す図である。
【図３１】複数の凍結融解サイクルの後における、９０ｍＭのＮａＣｌと、多様な量（％ｗ／ｖ）のトレハロース二水和物とを含有するＲＮＡリポプレックス製剤中の、粒子サイズの測定を示す図である。
【図３２】−１５℃で、８カ月間にわたる保管の後における、５〜２０％ｗ／ｖのショ糖と、多様な低ＮａＣｌ濃度とを含有する、ＲＮＡリポプレックス製剤中の粒子サイズの測定を示す図である。異なるバーは、左（０カ月間）から、右（８カ月間）へと、保管期間の増大を指し示す。８本未満のバーを伴う、ショ糖／ＮａＣｌの組合せでは、粒子サイズが、２つの後続の時点において、仕様を超えたので、解析を中止した。
【図３３】−３０℃で、８カ月間にわたる保管の後における、５〜２０％ｗ／ｖのショ糖と、多様な低ＮａＣｌ濃度とを含有する、ＲＮＡリポプレックス製剤中の粒子サイズの測定を示す図である。異なるバーは、左（０カ月間）から、右（８カ月間）へと、保管期間の増大を指し示す。８本未満のバーを伴う、ショ糖／ＮａＣｌの組合せでは、粒子サイズが、２つの後続の時点において、仕様を超えたので、解析を中止した。
【図３４】−１５℃で、８カ月間にわたる保管の後における、５〜２０％ｗ／ｖのトレハロース二水和物と、多様な低ＮａＣｌ濃度とを含有する、ＲＮＡリポプレックス製剤中の粒子サイズの測定を示す図である。異なるバーは、左（０カ月間）から、右（８カ月間）へと、保管期間の増大を指し示す。８本未満のバーを伴う、トレハロース／ＮａＣｌの組合せでは、粒子サイズが、２つの後続の時点において、仕様を超えたので、解析を中止した。
【図３５】−３０℃で、８カ月間にわたる保管の後における、５〜２０％ｗ／ｖのトレハロース二水和物と、多様な低ＮａＣｌ濃度とを含有する、ＲＮＡリポプレックス製剤中の粒子サイズの測定を示す図である。異なるバーは、左（０カ月間）から、右（８カ月間）へと、保管期間の増大を指し示す。８本未満のバーを伴う、トレハロース／ＮａＣｌの組合せでは、粒子サイズが、２つの後続の時点において、仕様を超えたので、解析を中止した。
【図３６】−２０℃での保管の後における、２２％ｗ／ｖのショ糖と、多様な低ＮａＣｌ濃度とを含有する、ＲＮＡリポプレックス製剤中の粒子サイズの測定を示す図である。
【図３７】−２０℃での保管の後における、２２％ｗ／ｖのトレハロース二水和物と、多様な低ＮａＣｌ濃度とを含有する、ＲＮＡリポプレックス製剤中の粒子サイズの測定を示す図である。
【図３８】−２０℃での保管の後における、２２％ｗ／ｖのグルコースと、多様な低ＮａＣｌ濃度とを含有する、ＲＮＡリポプレックス製剤中の粒子サイズの測定を示す図である。
【図３９】−１５〜−４０℃で、凍結させ、保管される、２２％ｗ／ｖのグルコースと、２０ｍＭのＮａＣｌとを含有する、ＲＮＡリポプレックス製剤中の粒子サイズの測定を示す図である。
【図４０】表１０に列挙される低温保護剤の組合せを含有する組成物中で凍結させた、ＲＮＡリポプレックスの、−２０℃での保管の後における、粒子サイズの測定を示す図である。
【図４１】凍結融解の後、または凍結乾燥および再構成の後における、ＲＮＡリポプレックス製剤［ＲＮＡ（ｌｉｐ）］製剤中の、トレハロース濃度の効果を示す図である。
【図４２】２２％のトレハロース中で調製された、凍結乾燥ＲＮＡ（ｌｉｐ）製剤中の、０．９％のＮａＣｌ溶液またはＷＦＩ（注射用水）による再構成の後における、粒子サイズの変化を示す図である。
【図４３】２２％のトレハロース中、異なるＮａＣｌ濃度で調製された、凍結乾燥ＲＮＡリポプレックス製剤［ＲＮＡ（ｌｉｐ）］の、インビトロにおける、ｌｕｃ−ＲＮＡトランスフェクションを示す図である。凍結乾燥試料は、０．９％のＮａＣｌ溶液により再構成した（縞柄カラム：液体コントロール）。
【図４４】異なるトレハロース／ＮａＣｌ比で製剤化され、２〜８℃または２５℃で保管された、凍結乾燥ＲＮＡリポプレックス製剤［ＲＮＡ（ｌｉｐ）］の、０．９％のＮａＣｌ溶液による再構成の後における、Ｚ平均直径を示す図である。製剤は、凍結乾燥の後、元の体積で再構成した。
【図４５】異なるトレハロース／ＮａＣｌ比で製剤化され、２〜８℃または２５℃で保管された、凍結乾燥ＲＮＡ（ｌｉｐ）の、０．９％のＮａＣｌ溶液による再構成の後における、ＲＮＡの完全性（完全長ＲＮＡ％）を示す図である。製剤は、凍結乾燥の後、元の体積で再構成し、細胞培養実験のために、０．９％のＮａＣｌ溶液で、１：１に希釈した（０．０１ｍｇ／ｍＬのＲＮＡ）。
【発明を実施するための形態】
【０２２４】
本開示について、下記で詳細に記載するが、本開示は、それらは、変動しうるので、本明細書で記載される、特定の方法、プロトコール、および試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語法は、特定の実施態様について記載することだけを目的とするものであり、付属の特許請求の範囲だけにより限定される、本開示の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。別途規定がない限り、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【０２２５】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」、Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｂ．Ｎａｇｅｌ、およびＨ．Ｋｏｌｂｌ編、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（１９９５）において記載されている通りに規定される。
【０２２６】
本開示の実施では、別途指示がない限り、化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ法の従来の方法が援用され、これらについては、当技術分野の文献において説明されている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９を参照されたい）。
【０２２７】
以下では、本開示の要素について記載する。これらの要素を、具体的な実施態様と共に列挙するが、それらを、任意の形および任意の数で組み合わせて、さらなる実施態様を創出しうることを理解されたい。様々に記載される例および実施態様は、本開示を、明示的に記載された実施態様だけに限定するようには解釈されないものとする。この記載は、明示的に記載された実施態様を、任意の数の、開示された要素と組み合わせる実施態様を開示し、包摂するように理解されるものとする。さらに、記載される全ての要素の、任意の順列および組合せは、文脈により別途指示がない限り、この記載により開示されると考えられるものとする。
【０２２８】
「約」という用語は、「およそ」または「ほぼ」を意味し、本明細書で明示される数値または範囲の文脈における、一実施態様では、列挙されるかまたは主張される数値または範囲の±２０％、±１０％、±５％、または±３％を意味する。
【０２２９】
「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」および「その」という用語、ならびに本開示について記載する文脈で（とりわけ、特許請求の範囲の文脈で）使用される類似の言及は、本明細書で別途指示がないか、または文脈により明確に否定されない限り、単数および複数の両方を対象とするように解釈されるものとする。本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内に収まる各個別の値に、個々に言及することの縮約法として用いられることだけを意図するものである。本明細書で別途指示がない限り、各個別の値は、本明細書で個別に列挙された場合と同様に、本明細書へと組み込まれる。本明細書で別途指示がないか、または文脈により明確に否定されない限り、本明細書で記載される全ての方法は、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提示される、任意の例および全ての例、または例示のための表現（例えば、「など」）の使用は、本開示をよりよく例示することだけを意図するものであり、特許請求の範囲に、限定を施すものではない。本明細書におけるいかなる表現も、本開示の実施に不可欠な、任意の、特許請求されていない要素を指し示すとは解釈されないものとする。
【０２３０】
別途明示的な指示がない限り、「〜を含むこと」という用語は、本文献の文脈では、「〜を含むこと」により導入されるリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーも、任意選択で存在しうることを指し示すのに使用される。しかし、本開示の具体的実施態様として、「〜を含むこと」という用語が、さらなるメンバーが存在しない可能性も包摂することも想定される、すなわち、この実施態様の目的では、「〜を含むこと」とは、「〜からなること」の意味を有すると理解されるものとする。
【０２３１】
いくつかの文献は、本明細書の本文を通して引用される。本明細書で引用される文献の各々（全ての特許、特許出願、学術刊行物、製造元の仕様、指示書などを含む）は、上記の引用であれ、下記の引用であれ、参照によりそれらの全体において組み込まれる。本明細書におけるいかなる事柄も、本開示が、このような開示に先行する権利が与えられていないことの容認として解釈されないものとする。
【０２３２】
定義
以下では、本開示の全ての態様に当てはまる定義を提示する。別途指示がない限り、以下の用語は、以下の意味を有する。任意の、規定されていない用語は、当該技術分野で認知された、それらの意味を有する。
【０２３３】
本明細書で使用される「〜を低減する」または「〜を阻害する」などの用語は、例えば、約５％もしくはこれを超える、約１０％もしくはこれを超える、約２０％もしくはこれを超える、約５０％もしくはこれを超える、または約７５％もしくはこれを超えるレベルの全体的な低下を引き起こす能力を意味する。「〜を阻害する」という用語または同様の語句は、完全または本質的に完全な阻害、すなわち、ゼロまたは本質的にゼロへの低減を含む。
【０２３４】
一実施態様では、「〜を増大させる」または「〜を増強する」などの用語は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約１００％の増大または増強に関する。
【０２３５】
本明細書で使用される「生理的ｐＨ」とは、約７．５のｐＨを指す。
【０２３６】
本開示で使用される「％ｗ／ｖ」とは、ミリリットル（ｍＬ）単位の溶液の総体積に対するパーセントとして表される、グラム（ｇ）単位の溶質の量を測定する、濃度の単位である、重量／体積パーセントを指す。
【０２３７】
「イオン強度」という用語は、異なる種類のイオン性分子種の数の間の数学的関係、特に、溶液と、それらのそれぞれの電荷との数学的関係を指す。したがって、イオン強度Ｉは、式
2021500324.tif 000002
［式中、ｃは、特定のイオン性分子種のモル濃度であり、ｚは、その電荷の絶対値である。総和Σは、溶液中の、全ての異なる種類のイオン（ｉ）について取る］により、数学的に表される。
【０２３８】
一実施態様では、本開示に従う、「イオン強度」という用語は、一価イオンの存在に関する。一実施態様では、二価イオン、特に、二価カチオンの存在に関して、キレート剤の存在のために、それらの濃度または有効濃度（遊離イオンの存在）は、ＲＮＡの分解を防止するのに、十分に低い。一実施態様では、二価イオンの濃度または有効濃度は、ＲＮＡヌクレオチドの間の、ホスホジエステル結合の、加水分解のための触媒レベルを下回る。一実施態様では、遊離二価イオンの濃度は、２０μＭまたはこれ未満である。一実施態様では、遊離二価イオンが存在しないか、または本質的に存在しない。
【０２３９】
「オスモル濃度」とは、溶媒１キログラム当たりの溶質のオスモル数として表される、特定の溶質の濃度を指す。
【０２４０】
レイノルズ数とは、以下の形式：
2021500324.tif 000003
［式中、ρは、流体の密度であり、νは、流体量であり、ｌは、特性長（ここでは、混合要素の内径）であり、ηは、粘度である］を使用して計算されうる、無次元数である。
【０２４１】
「〜を凍結させること」という用語は、通例、熱の除去による、液体の固体化に関する。
【０２４２】
「〜を凍結乾燥すること」または「凍結乾燥」という用語は、物質を凍結させ、次いで、周囲の圧力を低減して、凍結させた物質中の媒体が、固体相から、気体相へと、直接昇華することを可能とすることによる、物質の凍結乾燥を指す。
【０２４３】
「噴霧乾燥」という用語は、（加熱された）気体を、容器（噴霧乾燥器）内で微粒子化された（噴霧された）流体と混合し、ここで、形成された液滴から、溶媒がエバポレートし、乾燥粉末をもたらすことにより噴霧乾燥された物質を指す。
【０２４４】
「低温保護剤」という用語は、凍結段階において、有効成分を保護するために、製剤へと添加される物質に関する。
【０２４５】
「凍結乾燥保護剤」という用語は、乾燥段階において、有効成分を保護するために、製剤へと添加される物質に関する。
【０２４６】
「〜を再構成する」という用語は、水などの溶媒を、乾燥生成物へと添加して、その元の液体状態など、液体状態へと戻すことに関する。
【０２４７】
本開示の文脈における、「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作られた」を意味する。一実施態様では、本開示の文脈における「組換え対象物」は、天然に存在しない。
【０２４８】
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、対象物を、天然で見出しうるという事実を指す。例えば、生物体（ウイルスを含む）に存在し、天然の供給源から単離することが可能であり、実験室内で、人為により、意図的に修飾されたペプチドまたは核酸は、天然に存在する。「天然で見出される」という用語は、「天然に存在する」を意味し、公知の対象物のほか、天然から発見および／または単離されていないが、将来において、天然の供給源から発見および／または単離されうる対象物を含む。
【０２４９】
「平衡溶解度」という用語は、溶質が溶解する速度と、溶質が溶液から沈着する速度とが同じである、溶質の濃度を指す。一実施態様では、用語は、室温における、それぞれの濃度に関する。
【０２５０】
本明細書で使用される「室温」という用語は、４℃を超える温度、好ましくは、約１５℃〜約４０℃、約１５℃〜約３０℃、約１５℃〜約２４℃、または約１６℃〜約２１℃の温度を指す。このような温度は、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、および２２℃を含むであろう。
【０２５１】
本開示の文脈では、「粒子」という用語は、分子または分子複合体により形成された構造化実体に関する。一実施態様では、「粒子」という用語は、ミクロンサイズまたはナノサイズの稠密構造など、ミクロンサイズまたはナノサイズの構造に関する。
【０２５２】
本開示の文脈では、「ＲＮＡリポプレックス粒子」という用語は、脂質、特に、カチオン性脂質、およびＲＮＡを含有する粒子に関する。正に帯電したリポソームと、負に帯電したＲＮＡとの静電相互作用は、複合体化およびＲＮＡリポプレックス粒子の自発的形成を結果としてもたらす。正に帯電したリポソームは、一般に、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質、およびＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成することができる。一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、ナノ粒子である。
【０２５３】
本開示で使用される「ナノ粒子」とは、ＲＮＡと、少なくとも１つのカチオン性脂質とを含み、静脈内投与に適する平均直径を有する粒子を指す。
【０２５４】
「平均直径」という用語は、長さの次元を伴う、いわゆるＺａｖｅｒａｇｅと、無次元である多分散指数（ＰＩ）とを結果として提示する、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用するデータ解析を伴う、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定される、粒子の平均値流体力学的直径（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、５７、１９７２、４８１４〜４８２０頁、ＩＳＯ  １３３２１）を指す。ここで、粒子の「平均直径」、「直径」、または「サイズ」は、Ｚａｖｅｒａｇｅによるこの値と同義に使用される。
【０２５５】
本明細書では、「多分散指数」という用語は、粒子、例えば、ナノ粒子の集合についての、サイズ分布の尺度として使用される。多分散指数は、いわゆるキュムラント解析により、動的光散乱測定に基づき計算される。
【０２５６】
本明細書で使用される「目視できない粒子」とは、１００マイクロメートル（μｍ）未満の平均直径を有する粒子を指す。目視できない粒子の数は、本開示におけるＲＮＡリポプレックス粒子の凝集の程度を指し示す、光掩蔽を使用して測定することができる。一部の実施態様では、１０μｍ以上の平均直径を有する、目視できない粒子の数を測定する。他の実施態様では、２５μｍ以上の平均直径を有する、目視できない粒子の数を測定する。
【０２５７】
「エタノール注入法」という用語は、注射針を介して、脂質を含むエタノール溶液を、水溶液へと、急速に注入する方法を指す。この方法は、脂質を、溶液全体に分散させ、脂質構造形成、例えば、リポソーム形成などの脂質ベシクル形成を促進する。一般に、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、ＲＮＡを、コロイド状リポソーム分散体へと添加することにより得られる。一実施態様では、エタノール注入法を使用して、このようなコロイド状リポソーム分散体を、以下の通りに：ＤＯＴＭＡのようなカチオン性脂質などの脂質を含むエタノール溶液と、さらなる脂質とを、攪拌下で、水溶液へと注入して形成する。一実施態様では、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、押出し工程を伴わずに得られる。
【０２５８】
「〜を押し出す」または「押出し」という用語は、一定の断面プロファイルを有する粒子の創出を指す。特に、「〜を押し出す」または「押出し」という用語は、粒子を、規定された小孔を伴うフィルターを通るように強いる、粒子の小型化を指す。
【０２５９】
ＲＮＡリポプレックス粒子の直径
本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、一実施態様では、約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約２５０〜約７００ｎｍ、約４００〜約６００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。具体的な実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、約８００ｎｍ、約８２５ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８７５ｎｍ、約９００ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９７５ｎｍ、または約１０００ｎｍの平均直径を有する。ある実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。別の実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。
【０２６０】
本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子、例えば、本明細書で記載される方法により作出されるＲＮＡリポプレックス粒子は、約０．５未満、約０．４未満、または約０．３未満の多分散指数を呈示する。例として、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約０．１〜約０．３の範囲内の多分散指数を呈示しうる。
【０２６１】
脂質
一実施態様では、脂質溶液、リポソームおよび本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質を含む。本明細書で使用される「カチオン性脂質」は、正味の正の電荷を有する脂質を指す。カチオン性脂質は、脂質マトリックスとの静電相互作用により、負に帯電したＲＮＡに結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖またはジアシル鎖、および正の電荷を保有することが典型的な、脂質のヘッド基などの親油性部分を有する。カチオン性脂質の例は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；１，２−ジアルキルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチル塩化アンモニウム（ＤＯＤＡＣ）、２，３−ジ（テトラデコキシ）プロピル−（２−ヒドロキシエチル）−ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、１（ｌ），２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物（ＤＯＲＩＥ）、および２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１（ｌ）−プロパナミウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）を含むがこれらに限定されない。ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＳＰＡが好ましい。具体的な実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＴＡＰである。
【０２６２】
さらなる脂質を組み込んで、全体的な正電荷の、負電荷に対する比と、物理的なＲＮＡリポプレックス粒子の安定性とを調整することができる。ある特定の実施態様では、さらなる脂質は、中性脂質である。本明細書で使用される「中性脂質」は、正味の電荷がゼロである脂質を指す。中性脂質の例は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、およびセレブロシドを含むがこれらに限定されない。具体的な実施態様では、第２の脂質は、ＤＯＰＥ、コレステロール、および／またはＤＯＰＣである。
【０２６３】
ある特定の実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。例示的実施態様では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質は、ＤＯＰＥである。理論に束縛されることを望まないが、少なくとも１つのさらなる脂質の量と比較した、少なくとも１つのカチオン性脂質の量は、電荷、粒子サイズ、安定性、組織選択性、およびＲＮＡの生物活性など、重要なＲＮＡリポプレックス粒子特性に影響を及ぼしうる。したがって、一部の実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質の、少なくとも１つのさらなる脂質に対するモル比は、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、または約３：１〜約１：１である。具体的な実施態様では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１でありうる。例示的実施態様では、少なくとも１つのカチオン性脂質の、少なくとも１つのさらなる脂質に対するモル比は、約２：１である。
【０２６４】
ＲＮＡ
本開示では、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施態様では、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基の全てまたは大部分を含有する。本明細書で使用される「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位において、ヒドロキシル基を伴うヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定せずに述べると、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡなど、部分精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え作製ＲＮＡのほか、１つまたは複数のヌクレオチドの、付加、欠失、置換、および／または変更により、天然に存在するＲＮＡと異なる、修飾ＲＮＡを包摂する。このような変更は、非ヌクレオチド素材の、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡの末端への付加を指す場合がある。本明細書ではまた、ＲＮＡ内のヌクレオチドが、化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなど、非標準ヌクレオチドでありうることも想定される。本開示のために、これらの変更されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡのアナログであると考えられる。
【０２６５】
本開示の、ある特定の実施態様では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関する、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当該技術分野で確立されている通り、ｍＲＮＡは、一般に、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、ペプチドコード化領域、および３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を含有する。一部の実施態様では、ＲＮＡを、インビトロ転写または化学合成により作製する。一実施態様では、ｍＲＮＡを、ＤＮＡが、デオキシリボヌクレオチドを含有する核酸を指す、ＤＮＡ鋳型を使用する、インビトロ転写により作製する。
【０２６６】
一実施態様では、ＲＮＡは、インビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により得ることができる。転写を制御するためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための、任意のプロモーターでありうる。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特に、ｃＤＮＡをクローニングし、これを、インビトロ転写に適切なベクターへと導入することにより得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得ることができる。
【０２６７】
本開示の、ある特定の実施態様では、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス組成物中のＲＮＡは、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、または約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度である。具体的な実施態様では、ＲＮＡは、約０．０５ｍｇ／ｍＬ、約０．０６ｍｇ／ｍＬ、約０．０７ｍｇ／ｍＬ、約０．０８ｍｇ／ｍＬ、約０．０９ｍｇ／ｍＬ、約０．１０ｍｇ／ｍＬ、約０．１１ｍｇ／ｍＬ、約０．１２ｍｇ／ｍＬ、約０．１３ｍｇ／ｍＬ、約０．１４ｍｇ／ｍＬ、約０．１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１６ｍｇ／ｍＬ、約０．１７ｍｇ／ｍＬ、約０．１８ｍｇ／ｍＬ、約０．１９ｍｇ／ｍＬ、約０．２０ｍｇ／ｍＬ、約０．２１ｍｇ／ｍＬ、約０．２２ｍｇ／ｍＬ、約０．２３ｍｇ／ｍＬ、約０．２４ｍｇ／ｍＬ、約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．２６ｍｇ／ｍＬ、約０．２７ｍｇ／ｍＬ、約０．２８ｍｇ／ｍＬ、約０．２９ｍｇ／ｍＬ、約０．３０ｍｇ／ｍＬ、約０．３１ｍｇ／ｍＬ、約０．３２ｍｇ／ｍＬ、約０．３３ｍｇ／ｍＬ、約０．３４ｍｇ／ｍＬ、約０．３５ｍｇ／ｍＬ、約０．３６ｍｇ／ｍＬ、約０．３７ｍｇ／ｍＬ、約０．３８ｍｇ／ｍＬ、約０．３９ｍｇ／ｍＬ、約０．４０ｍｇ／ｍＬ、約０．４１ｍｇ／ｍＬ、約０．４２ｍｇ／ｍＬ、約０．４３ｍｇ／ｍＬ、約０．４４ｍｇ／ｍＬ、約０．４５ｍｇ／ｍＬ、約０．４６ｍｇ／ｍＬ、約０．４７ｍｇ／ｍＬ、約０．４８ｍｇ／ｍＬ、約０．４９ｍｇ／ｍＬ、または約０．５０ｍｇ／ｍＬの濃度である。例示的実施態様では、ＲＮＡは、０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【０２６８】
一実施態様では、ＲＮＡは、修飾リボヌクレオチドを有しうる。修飾リボヌクレオチドの例は、限定せずに述べると、５−メチルシチジンおよびシュードウリジンを含む。
【０２６９】
一部の実施態様では、本開示に従うＲＮＡは、５’キャップを含む。一実施態様では、本開示のＲＮＡは、キャッピングされていない５’三リン酸を有さない。一実施態様では、ＲＮＡは、５’キャップアナログにより修飾することができる。「５’キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端において見出される構造を指し、一般に、５’から５’への三リン酸連結を介して、ＲＮＡへと接続されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施態様では、このグアノシンを、７位においてメチル化する。ＲＮＡに、５’キャップまたは５’キャップアナログを施すことは、インビトロ転写により達成することができ、この場合、５’キャップを、共転写により、ＲＮＡ鎖へと発現させることもでき、キャッピング酵素を使用して、転写後において、ＲＮＡへと接合させることもできる。
【０２７０】
一部の実施態様では、本開示に従うＲＮＡは、５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲを含む。「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、アミノ酸配列、またはｍＲＮＡ分子など、ＲＮＡ分子内の対応する領域へと、転写はされるが、翻訳はされない、ＤＮＡ分子内の領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンの読み枠の５’側（上流）（５’−ＵＴＲ）、および／またはオープンの読み枠の３’側（下流）（３’−ＵＴＲ）存在しうる。５‘−ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード化領域の開始コドンの上流である、５’末端に位置する。５’−ＵＴＲは、５’キャップ（存在する場合）の下流であり、例えば、５’キャップと直接隣接する。３‘−ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード化領域の終結コドンの下流である、３’末端に位置するが、「３’−ＵＴＲ」という用語は、好ましくは、ポリ（Ａ）テールを含まない。したがって、５’−ＵＴＲは、ポリ（Ａ）配列（存在する場合）の上流であり、例えば、ポリ（Ａ）配列と直接隣接する。
【０２７１】
一部の実施態様では、本開示に従うＲＮＡは、３’−ポリ（Ａ）配列を含む。「ポリ（Ａ）配列」という用語は、典型的に、ＲＮＡ分子の３’末端に位置する、アデニル（Ａ）残基の配列に関する。本開示に従い、一実施態様では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約８０、または少なくとも約１００のＡヌクレオチドを含み、最大で約５００、最大で約４００、最大で約３００、最大で約２００、または最大で約１５０のＡヌクレオチドを含み、特に、約１２０のＡヌクレオチドを含む。
【０２７２】
本開示の文脈では、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列内の遺伝子コードが、ＲＮＡへと転写される過程に関する。その後、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質へと翻訳されうる。
【０２７３】
ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖が、アミノ酸の配列のアセンブリーを、ペプチドまたはタンパク質をもたらすように方向付ける、細胞のリボソーム内の過程に関する。
【０２７４】
一実施態様では、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子を投与した後で、ＲＮＡのうちの、少なくとも一部は、標的細胞へと送達される。一実施態様では、ＲＮＡのうちの、少なくとも一部は、標的細胞のサイトゾルへと送達される。一実施態様では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡであり、ＲＮＡは、標的細胞により翻訳されて、ペプチドまたはタンパク質をもたらす。一実施態様では、標的細胞は、脾臓細胞である。一実施態様では、標的細胞は、脾臓内の、プロフェッショナルの抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。一実施態様では、標的細胞は、脾臓内の樹状細胞である。したがって、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、ＲＮＡを、このような標的細胞へと送達するために使用することができる。したがって、本開示はまた、ＲＮＡを、対象における標的細胞へと送達するための方法であって、を含む方法。本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子の、対象への投与にも関する。一実施態様では、ＲＮＡは、標的細胞のサイトゾルへと送達される。一実施態様では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡであり、ＲＮＡは、標的細胞により翻訳されて、ペプチドまたはタンパク質をもたらす。
【０２７５】
ある実施態様では、ＲＮＡは、薬学的に活性のペプチドまたはタンパク質をコードする。
【０２７６】
本開示に従う、「ＲＮＡは、〜をコードする」という用語は、ＲＮＡが、標的組織の細胞内など、適切な環境内に存在する場合、翻訳過程において、それがコードするペプチドまたはタンパク質を産生するように、アミノ酸のアセンブリーを方向付けうることを意味する。一実施態様では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質の翻訳を可能とする、細胞内翻訳機構と相互作用することが可能である。細胞は、コードされるペプチドまたはタンパク質を、細胞内において（例えば、細胞質中および／または核内において）産生する場合もあり、コードされるペプチドまたはタンパク質を、分泌する場合もあり、表面へと産生する場合もある。
【０２７７】
本開示に従う、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合を介して、互いへと連結された、約２つまたはこれを超え、約３つまたはこれを超え、約４つまたはこれを超え、約６つまたはこれを超え、約８つまたはこれを超え、約１０またはこれを超え、約１３またはこれを超え、約１６またはこれを超え、約２０またはこれを超え、かつ、最大で約５０、約１００、または約１５０の連続アミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大型のペプチド、特に、少なくとも約１５１アミノ酸を有するペプチドを指すが、本明細書では、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、通例、同義語として使用される。
【０２７８】
「薬学的に活性のペプチドまたはタンパク質」は、対象へと、治療有効量で施される場合に、対象の状態または病状に対して、適正な効果または有利な効果を及ぼす。一実施態様では、薬学的に活性のペプチドまたはタンパク質は、治癒的特性または緩和的特性を有し、疾患または障害の、１つまたは複数の症候を、改善するか、軽減するか、和らげるか、抑制するか、これらの発症を遅延させるか、またはこれらの重症度を軽減するように投与される。薬学的に活性のペプチドまたはタンパク質は、予防的特性を有することが可能であり、疾患の発症を遅延させるか、またはこのような疾患もしくは病理学的状態の重症度を軽減するのに使用することができる。「薬学的に活性のペプチドまたはタンパク質」という用語は、全タンパク質または全ポリペプチドを含み、また、これらの薬学的に活性の断片も指す。「薬学的に活性のペプチドまたはタンパク質」という用語はまた、ペプチドまたはタンパク質の、薬学的に活性のアナログも含みうる。
【０２７９】
薬学的に活性のタンパク質の例は、免疫学的に活性の化合物（例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレッシン、セレチン、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、可溶型主要組織複合抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、またはウイルス抗原、アレルゲン、自己抗原、自己抗体など、免疫学的に活性の抗原）、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロフィン、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロフィン、レプチンなど）、成長ホルモン（例えば、ヒト成長（ｇｒｏｗｎ）ホルモン）、増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経成長因子、インスリン様成長因子など）、増殖因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成酵素またはコレステロール分解酵素、ステロイド産生酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、チトクローム、アデニル酸シクラーゼまたはグアニル酸シクラーゼ、ノイラミニダーゼなど）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合性タンパク質（成長ホルモンまたは増殖因子結合性タンパク質など）、転写因子および翻訳因子、腫瘍増殖抑制性タンパク質（例えば、血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（コラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン、およびミオシンなど）、血液タンパク質（トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、フォンウィレンブラント因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、または修飾第ＶＩＩＩ因子、抗凝固剤など、サイトカインおよび免疫系タンパク質を含むがこれらに限定されない。
【０２８０】
「免疫学的に活性の化合物」という用語は、例えば、免疫細胞の成熟を誘導および／もしくは抑制し、サイトカイン生合成を誘導および／もしくは抑制することにより、免疫応答を変更し、かつ／またはＢ細胞による抗体の産生を刺激することにより、体液性免疫を変更する、任意の化合物に関する。免疫学的に活性の化合物抗ウイルス活性および抗腫瘍活性を含むがこれらに限定されない、強力な免疫刺激活性を有し、免疫応答の他の側面もまた下方調節しうる、例えば、免疫応答を、広範なＴＨ２媒介性疾患を処置するために有用なＴＨ２免疫応答からシフトさせうる。免疫学的に活性の化合物は、ワクチンアジュバントとして有用でありうる。
【０２８１】
一実施態様では、薬学的に活性のペプチドまたはタンパク質は、１つもしくは複数の抗原、または１つもしくは複数のエピトープを含む、すなわち、ペプチドまたはタンパク質の、対象への投与は、対象における、１つもしくは複数の抗原、または１つもしくは複数のエピトープに対する免疫応答であって、治療的であるか、または部分的に、もしくは完全に防御的である免疫応答を誘発する。
【０２８２】
「抗原」という用語は、それに対する免疫応答を発生させうるエピトープを含む作用物質に関する。「抗原」という用語は、特に、タンパク質およびペプチドを含む。一実施態様では、抗原は、樹状細胞またはマクロファージのような抗原提示細胞など、免疫系の細胞により提示される。一実施態様では、抗原またはＴ細胞エピトープなど、このプロセシング産物には、Ｔ細胞受容体もしくはＢ細胞受容体、または抗体などの免疫グロブリン分子が結合する。したがって、抗原またはこのプロセシング産物は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と、特異的に反応しうる。一実施態様では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原などの疾患関連抗原であり、エピトープは、このような抗原に由来する。
【０２８３】
「疾患関連抗原」という用語は、疾患と関連する、任意の抗原を指すように、その最広義において使用される。疾患関連抗原は、疾患に対して、抗原特異的な、細胞性免疫応答および／または体液性抗体応答をもたらすように、宿主の免疫系を刺激するエピトープを含有する分子である。したがって、疾患関連抗原またはこのエピトープは、治療目的で使用することができる。疾患関連抗原は、微生物、典型的に、微生物性抗原による感染と関連する場合もあり、がん、典型的に、腫瘍と関連する場合もある。
【０２８４】
「腫瘍抗原」という用語は、細胞質、細胞表面、および細胞核に由来しうる、がん細胞の構成要素を指す。特に、「腫瘍抗原」は、細胞内で、または腫瘍細胞上の表面抗原として産生される抗原を指す。
【０２８５】
「ウイルス抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち、個体において、免疫応答を惹起することが可能な、任意のウイルス成分を指す。ウイルス抗原は、ウイルスリボ核タンパク質またはウイルスエンベロープタンパク質でありうる。
【０２８６】
「細菌抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち、個体において、免疫応答を惹起することが可能な、任意の細菌の構成要素を指す。細菌抗原は、細菌の細胞壁または細胞膜に由来しうる。
【０２８７】
「エピトープ」という用語は、免疫系により認識される抗原など、分子の部分または断片を指す。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または抗体により認識されうる。抗原のエピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含むことが可能であり、約５〜約１００アミノ酸の間の長さでありうる。一実施態様では、エピトープは、約１０〜約２５アミノ酸の間の長さである。「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞エピトープを含む。
【０２８８】
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＭＨＣ分子の文脈で提示される場合に、Ｔ細胞により認識される、タンパク質の部分または断片を指す。「主要組織適合性複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略号は、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全ての脊椎動物において存在する、遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ分子は、免疫反応における、リンパ球と、抗原提示細胞または罹患細胞とのシグナル伝達に重要であり、この場合、ＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ分子は、ペプチドエピトープに結合し、それらを、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のために提示する。ＭＨＣによりコードされるタンパク質は、細胞の表面上に発現し、自己抗原（細胞自体に由来するペプチド断片）および非自己抗原（例えば、侵入する微生物の断片）の両方を、Ｔ細胞へと提示する。クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合性ペプチドは、典型的に、約８〜約１０アミノ酸の長さであるが、これより長いペプチドまたは短いペプチドも、有効でありうる。クラスＩＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合性ペプチドは、典型的に、約１０〜約２５アミノ酸の長さであり、特に、約１３〜約１８アミノ酸の長さであるが、これより長いペプチドおよび短いペプチドも有効でありうる。
【０２８９】
本開示の、ある特定の実施態様では、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープをコードする。ある特定の実施態様では、エピトープは、腫瘍抗原に由来する。腫瘍抗原は、多様ながんにおいて発現することが一般に公知である、「標準的」抗原でありうる。腫瘍抗原はまた、個体の腫瘍に特異的であり、いまだ、免疫系により認識されていない、「ネオ抗原」でもありうる。ネオ抗原またはネオエピトープは、アミノ酸変化を結果としてもたらす、がん細胞のゲノム内の、１つまたは複数のがん特異的突然変異から生じうる。腫瘍抗原の例は、限定せずに述べると、ｐ５３、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、ベータ−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂＬＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＬＡＵＤＩΝ（ＣＬＡＵＤ  ΓΝ）−６、ＣＬＡＵＤＩＮ−１８．２、およびＣＬＡＵＤＩＮ−１２など、ｃｌａｕｄｉｎファミリーの細胞表面タンパク質、ｃ−ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（ｏｒｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ、好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、またはＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＦ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ｐｌ９０  ｍｉｎｏｒ  ＢＣＲ−ａｂＬ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、ＷＴ、およびＷＴ−１を含む。
【０２９０】
がん突然変異は、各個体と共に変動する。したがって、新規のエピトープ（ネオエピトープ）をコードするがん突然変異は、ワクチン組成物および免疫療法の開発において、魅力的な標的を表す。腫瘍免疫療法の有効性は、宿主内で、強力な免疫応答を誘導することが可能な、がん特異的な抗原およびエピトープの選択に依拠する。ＲＮＡを使用して、患者特異的腫瘍エピトープを、患者へと送達することができる。脾臓内にある樹状細胞（ＤＣ）は、腫瘍エピトープなど、免疫原性エピトープまたは抗原のＲＮＡを発現させるために、特に、目的となる抗原提示細胞を表す。複数のエピトープの使用は、腫瘍ワクチン組成物中で、治療有効性を促進することが示されている。腫瘍ミュータノームの迅速なシーケンシングは、本明細書で、例えば、単一のポリペプチドとして記載されるＲＮＡによりコードされうる、個別化ワクチンのための、複数のエピトープであって、任意選択で、リンカーにより隔てられたエピトープを提示しうる。本開示の、ある特定の実施態様では、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープ、少なくとも２つのエピトープ、少なくとも３つのエピトープ、少なくとも４つのエピトープ、少なくとも５つのエピトープ、少なくとも６つのエピトープ、少なくとも７つのエピトープ、少なくとも８つのエピトープ、少なくとも９つのエピトープ、または少なくとも１０のエピトープをコードする。例示的実施態様は、少なくとも５つのエピトープをコードするＲＮＡ（「ペンタトープ」と称する）と、少なくとも１０のエピトープをコードするＲＮＡ（「デカトープ」と称する）とを含む。
【０２９１】
電荷比
本開示のＲＮＡリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質内に存在する電荷と、ＲＮＡ内に存在する電荷との総和である。電荷比は、少なくとも１つのカチオン性脂質内に存在する正の電荷の、ＲＮＡ内に存在する負の電荷に対する比である。少なくとも１つのカチオン性脂質内に存在する正の電荷の、ＲＮＡ内に存在する負の電荷に対する電荷比は、以下の式：電荷比＝［（カチオン性脂質濃度（モル））×（カチオン性脂質内の、正の電荷の総数）］／［（ＲＮＡ濃度（モル））×（ＲＮＡ内の、負の電荷の総数）］により計算される。ＲＮＡの濃度、および少なくとも１つのカチオン性脂質量は、当業者が、常套的方法を使用して決定することができる。
【０２９２】
第１の実施態様では、生理的ｐＨでは、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する電荷比は、約１．９：２〜約１：２である。具体的な実施態様では、生理的ｐＨにおける、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する電荷比は、約１．９：２．０、約１．８：２．０、約１．７：２．０、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０、または約１：２．０である。一実施態様では、生理的ｐＨにおける、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する電荷比は、１．３：２．０である。別の実施態様では、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、生理的ｐＨで、等数の正の電荷と負の電荷とを有することから、正味の中性電荷比を伴うＲＮＡリポプレックス粒子をもたらしうる。
【０２９３】
第２の実施態様では、生理的ｐＨでは、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する電荷比は、約６：１〜約１．５：１である。具体的な実施態様では、生理的ｐＨにおける、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する電荷比は、約６．０：１．０、約５．９：１．０、約５．８：１．０、約５．７：１．０、約５．６：１．０、約５．５：１．０、約５．４：１．０、約５．３：１．０、約５．２：１．０、約５．１：１．０、約５．０：１．０、約４．９：１．０、約４．８：１．０、約４．７：１．０、約４．６：１．０、約４．５：１．０、約４．４：１．０、約４．３：１．０、約４．２：１．０、約４．１：１．０、約４．０：１．０、約３．９：１．０、約３．８：１．０、約３．７：１．０、約３．６：１．０、約３．５：１．０、約３．４：１．０、約３．３：１．０、約３．２：１．０、約３．１：１．０、約３．０：１．０、約２．９：１．０、約２．８：１．０、約２．７：１．０、約２．６：１．０、約２．５：１．０、約２．４：１．０、約２．３：１．０、約２．２：１．０、約２．１：１．０、約２．０：１．０、約１．９：１．０、約１．８：１．０、約１．７：１．０、約１．６：１．０、または約１．５：１．０である。
【０２９４】
ＲＮＡベースの免疫療法のために、脾臓など、正確な臓器のターゲティングは、他の臓器内の自己免疫応答および潜在的な毒性を回避するのに必要である。本開示に従い、ＲＮＡは、異なる細胞、組織、または臓器へとターゲティングすることができる。
【０２９５】
第１の実施態様に従う電荷比を有するＲＮＡリポプレックス粒子を使用して、抗原提示細胞、特に、樹状細胞など、脾臓組織または脾臓細胞を、優先的にターゲティングしうることが見出されている。したがって、一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与の後において、脾臓内のＲＮＡの蓄積および／またはＲＮＡの発現が生じる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓内で、ＲＮＡを発現させるために使用することができる。ある実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与の後において、肺内および／または肝臓内のＲＮＡの蓄積および／またはＲＮＡの発現が生じない。一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与の後において、脾臓内の、プロフェッショナルの抗原提示細胞内など、抗原提示細胞内のＲＮＡの蓄積および／またはＲＮＡの発現が生じる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、このような抗原提示細胞内で、ＲＮＡを発現させるために使用することができる。一実施態様では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。
【０２９６】
第２の実施態様に従う電荷比を有するＲＮＡリポプレックス粒子を使用して、肺組織または肺細胞を、優先的にターゲティングしうることが見出されている。したがって、一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与の後において、肺内のＲＮＡの蓄積および／またはＲＮＡの発現が生じる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、肺内で、ＲＮＡを発現させるために使用することができる。したがって、第１の実施態様に従う電荷比、例えば、約１：２〜約１．９：２の電荷比と関連する、本明細書で記載される実施態様において、脾臓以外の組織内のＲＮＡの発現が所望である場合は、第１の実施態様に従う電荷比の代わりに、第２の実施態様に従う電荷比、例えば、約６：１〜約１．５：１の電荷比を使用することができる。これらの実施態様および他の実施態様では、本明細書では、少なくとも１つのエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ以外のＲＮＡが記載される、例えば、本明細書で記載される、薬学的に活性のペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡを使用することができる。一実施態様では、薬学的に活性のペプチドまたはタンパク質が、サイトカインであり、かつ／または肺がんの処置が目的である。
【０２９７】
ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物
Ａ．塩強度およびイオン強度
本開示に従い、本明細書で記載される組成物は、塩化ナトリウムなどの塩を含みうる。理論に束縛されることを望まないが、塩化ナトリウムは、少なくとも１つのカチオン性脂質と混合する前に、ＲＮＡを前処理するためのイオン性オスモル濃度剤として機能する。ある特定の実施態様は、本開示における塩化ナトリウムに対する、代替的な有機塩または無機塩を想定する。代替的な塩は、限定せずに述べると、塩化カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一カリウム、酢酸カリウム、重炭酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化カルシウム、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩を含む。
【０２９８】
一般に、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、好ましくは、０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約４００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲の濃度の塩化ナトリウムを含む。一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、このような塩化ナトリウム濃度に対応するイオン強度を含む。
【０２９９】
一般に、ＲＮＡおよびリポソームから、ＲＮＡリポプレックス粒子を形成するための組成物、およびこれから得られる組成物であって、本明細書で記載される組成物などの組成物は、高塩化ナトリウム濃度を含むか、または、高イオン強度を含む。一実施態様では、塩化ナトリウムは、少なくとも４５ｍＭの濃度である。一実施態様では、塩化ナトリウムは、約４５ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度である。一実施態様では、組成物は、このような塩化ナトリウム濃度に対応するイオン強度を含む。
【０３００】
一般に、ＲＮＡリポプレックス粒子を凍結するための組成物など、ＲＮＡリポプレックス粒子を保管するための組成物であって、本明細書で記載される組成物などの組成物は、低塩化ナトリウム濃度を含むか、または、低イオン強度を含む。一実施態様では、塩化ナトリウムは、０ｍＭ〜約５０ｍＭ、０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度である。具体的な実施態様では、塩化ナトリウムは、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、約４０ｍＭ、約４１ｍＭ、約４２ｍＭ、約４３ｍＭ、約４４ｍＭ、約４５ｍＭ、約４６ｍＭ、約４７ｍＭ、約４８ｍＭ、約４９ｍＭ、または約５０ｍＭの濃度である。好ましい実施態様では、塩化ナトリウムは、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約４０ｍＭの濃度である。例示的な一実施態様では、塩化ナトリウムは、２０ｍＭの濃度である。別の例示的実施態様では、塩化ナトリウムは、３０ｍＭの濃度である。一実施態様では、組成物は、このような塩化ナトリウム濃度に対応するイオン強度を含む。
【０３０１】
一般に、凍結させた、ＲＮＡリポプレックス粒子組成物を融解させることと、任意選択で、水性液体を添加することにより、オスモル濃度およびイオン強度を調整することとから得られる組成物は、高塩化ナトリウム濃度を含むか、または、高イオン強度を含む。一実施態様では、塩化ナトリウムは、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約８０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度である。一実施態様では、組成物は、このような塩化ナトリウム濃度に対応するイオン強度を含む。
【０３０２】
Ｂ．安定剤
本明細書で記載される組成物は、凍結組成物、凍結乾燥組成物、または噴霧乾燥組成物の、凍結、凍結乾燥、または噴霧乾燥、および保管時における、製品の品質の実質的な喪失を回避し、特に、ＲＮＡ活性の実質的な喪失を回避するための安定剤を含みうる。本明細書では、このような組成物はまた、安定とも称する。典型的に、安定剤は、凍結工程、凍結乾燥工程、または噴霧乾燥工程の前に存在し、結果として得られる凍結調製物中、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄまたはｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）調製物中に存続する。本明細書で記載される組成物を使用して、凍結調製物、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄまたはｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）調製物の、凍結、凍結乾燥、または噴霧乾燥、および保管時に、ＲＮＡリポプレックス粒子を保護する、例えば、凝集、粒子崩壊、ＲＮＡ分解、および／または他の種類の損傷を低減または防止することができる。
【０３０３】
ある実施態様では、安定剤は、炭水化物である。本明細書で使用される「炭水化物」という用語は、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖、および多糖類を指し、これらを包摂する。
【０３０４】
ある実施態様では、安定剤は、単糖である。本明細書で使用される「単糖」という用語は、より単純な炭水化物単位へと、加水分解されえない、単一の炭水化物単位（例えば、単糖）を指す。例示的な、単糖による安定剤は、グルコース、果糖、ガラクトース、キシロース、リボースなどを含む。
【０３０５】
ある実施態様では、安定剤は、二糖類である。本明細書で使用される「二糖類」という用語は、グリコシド連結を介して、例えば、１−４連結または１−６連結を介して、一体に結合した、２つの単糖単位により形成される、化合物または化学的部分を指す。二糖類は、２つの単糖類へと加水分解することができる。例示的な、二糖類による安定剤は、ショ糖、トレハロース、ラクトース、マルトースなどを含む。
【０３０６】
「三糖類」という用語は、１つの分子を形成するように、一体に連結された、３つの糖類を意味する。三糖類の例は、ラフィノースおよびメレジトースを含む。
【０３０７】
ある実施態様では、安定剤は、オリゴ糖である。本明細書で使用される「オリゴ糖」という用語は、グリコシド連結を介して、例えば、１−４連結または１−６連結を介して、直鎖状構造、分枝状構造、または環状構造を形成するように、一体に結合した、３つ〜約１５、好ましくは、３つ〜約１０の単糖単位により形成される、化合物または化学的部分を指す。例示的な、オリゴ糖による安定剤は、シクロデキストリン、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、スタキオース、アカルボースなどを含む。オリゴ糖は、酸化することもでき、還元することもできる。
【０３０８】
ある実施態様では、安定剤は、環状オリゴ糖である。本明細書で使用される「環状オリゴ糖」という用語は、グリコシド連結を介して、例えば、１−４連結または１−６連結を介して、環状構造を形成するように、一体に結合した、３つ〜約１５、好ましくは、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の単糖単位により形成される、化合物または化学的部分を指す。例示的な、環状オリゴ糖による安定剤は、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、またはγシクロデキストリンなど、個別の化合物である、環状オリゴ糖を含む。
【０３０９】
他の例示的な、環状オリゴ糖による安定剤は、環状オリゴ糖部分を含有するポリマーなど、大型の分子構造内に、シクロデキストリン部分を含む化合物を含む。環状オリゴ糖は、酸化することもでき、還元することもでき、例えば、ジカルボニル形態へと酸化することができる。本明細書で使用される「シクロデキストリン部分」という用語は、ポリマーなど、大型の分子構造に組み込まれるか、またはこの部分である、シクロデキストリン（例えば、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、またはγシクロデキストリン）基を指す。シクロデキストリン部分は、１つまたは複数の他の部分へと、直接結合させることもでき、任意選択のリンカーを介して結合させることもできる。シクロデキストリン部分は、酸化することもでき、還元することもでき、例えば、ジカルボニル形態へと酸化することができる。
【０３１０】
炭水化物による安定剤、例えば、環状オリゴ糖による安定剤は、誘導体化炭水化物でありうる。例えば、ある実施態様では、安定剤は、誘導体化環状オリゴ糖、例えば、誘導体化シクロデキストリン、例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、例えば、部分エーテル化シクロデキストリン（例えば、部分エーテル化βシクロデキストリン）である。
【０３１１】
例示的安定剤は、多糖である。本明細書で使用される「多糖」という用語は、グリコシド連結を介して、例えば、１−４連結または１−６連結を介して、直鎖状構造、分枝状構造、または環状構造を形成するように、一体に結合した、少なくとも１６の単糖単位により形成される、化合物または化学的部分を指し、それらの骨格構造の部分として、多糖類を含むポリマーを含む。骨格内で、多糖は、直鎖状の場合もあり、環状の場合もある。例示的な、多糖による安定剤は、グリコーゲン、アミラーゼ、セルロース、デキストラン、マルトデキストリンなどを含む。
【０３１２】
ある実施態様では、安定剤は、糖アルコールである。本明細書で使用される「糖アルコール」という用語は、「糖類」の還元生成物を指し、単糖アルコール分子内の、全ての酸素原子が、ヒドロキシル基の形態で存在することを指し示す糖アルコールは、「ポリオール」である。この用語は、３つまたはこれを超えるヒドロキシル基を含有する化合物を指し、別の一般的な用語である、多価アルコールと同義である。糖アルコールの例は、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ラクチトール、エリトリトール、グリセリン、キシリトール、またはイノシトールを含むがこれらに限定されない。
【０３１３】
本開示に従い、ショ糖を、安定剤として含む薬学的組成物が提示される。理論に束縛されることを望まないが、ショ糖は、組成物の低温保護を促進するように機能し、これにより、ＲＮＡリポプレックス粒子の凝集を防止し、組成物の化学的安定性および物理的安定性を維持する。ある特定の実施態様は、本開示における、ショ糖に対する代替的安定剤を想定する。代替的安定剤は、限定せずに述べると、トレハロース、グルコース、果糖、アルギニン、グリセリン、マンニトール、プロリン、ソルビトール、グリシンベタイン、およびデキストランを含む。具体的な実施態様では、ショ糖に対する代替的安定剤は、トレハロースである。
【０３１４】
一実施態様では、安定剤は、約５％（ｗ／ｖ）〜約３５％（ｗ／ｖ）、または約１０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である。具体的な実施態様では、安定剤は、約１０％（ｗ／ｖ）、約１１％（ｗ／ｖ）、約１２％（ｗ／ｖ）、約１３％（ｗ／ｖ）、約１４％（ｗ／ｖ）、約１５％（ｗ／ｖ）、約１６％（ｗ／ｖ）、約１７％（ｗ／ｖ）、約１８％（ｗ／ｖ）、約１９％（ｗ／ｖ）、約２０％（ｗ／ｖ）、約２１％（ｗ／ｖ）、約２２％（ｗ／ｖ）、約２３％（ｗ／ｖ）、約２４％（ｗ／ｖ）、または約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である。好ましい一実施態様では、安定剤は、約１５％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である。別の好ましい実施態様では、安定剤は、約２０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である。例示的な一実施態様では、安定剤は、約２５％（ｗ／ｖ）の濃度である。別の例示的実施態様では、安定剤は、約２２％（ｗ／ｖ）の濃度である。本開示の、ある実施態様では、安定剤は、ショ糖またはトレハロースである。本開示の、ある実施態様では、安定剤は、ショ糖である。本開示の、ある実施態様では、安定剤は、トレハロースである。
【０３１５】
本開示に従い、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子組成物は、組成物の安定性に適する安定剤濃度、特に、ＲＮＡリポプレックス粒子の安定性に適し、ＲＮＡの安定性に適する安定剤濃度を有する。
【０３１６】
Ｃ．ｐＨおよびバッファー
本開示に従い、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子組成物は、ＲＮＡリポプレックス粒子の安定性に適し、特に、ＲＮＡの安定性に適するｐＨを有する。一実施態様では、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子組成物は、約５．７〜約６．７のｐＨを有する。具体的な実施態様では、組成物は、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、または約６．７のｐＨを有する。
【０３１７】
本開示に従い、バッファーを含む組成物が提示される。理論に束縛されることを望まないが、バッファーの使用は、組成物の製造時、保管時、および使用時において、組成物のｐＨを維持する。本開示の、ある特定の実施態様では、バッファーは、重炭酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸（ビシン）、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（トリス）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン（トリシン）、３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、ジメチルヒ酸（ａｒｓｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、２−モルホリン−４−イルエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でありうる。他の適切なバッファーは、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸でありうる。
【０３１８】
一部の実施態様では、バッファーは、約５．７〜約６．７のｐＨを有する。具体的な実施態様では、バッファーは、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、または約６．７のｐＨを有する。一実施態様では、バッファーは、ＨＥＰＥＳである。好ましい実施態様では、ＨＥＰＥＳは、約５．７〜約６．７のｐＨを有する。具体的な実施態様では、ＨＥＰＥＳは、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、または約６．７のｐＨを有する。例示的実施態様では、ＨＥＰＥＳは、約６．２のｐＨを有する。
【０３１９】
さらに別の実施態様では、バッファーは、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度を有する。ＨＥＰＥＳがバッファーである、具体的な実施態様では、ＨＥＰＥＳの濃度は、約２．５ｍＭ、約２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、約３．２５ｍＭ、約３．５ｍＭ、約３．７５ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．２５ｍＭ、約４．５ｍＭ、約４．７５ｍＭ、約５．０ｍＭ、約５．２５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約５．７５ｍＭ、約６．０ｍＭ、約６．２５ｍＭ、約６．５ｍＭ、約６．７５ｍＭ、約７．０ｍＭ、約７．２５ｍＭ、約７．５ｍＭ、約７．７５ｍＭ、約８．０ｍＭ、約８．２５ｍＭ、約８．５ｍＭ、約８．７５ｍＭ、約９．０ｍＭ、約９．２５ｍＭ、約９．５ｍＭ、約９．７５ｍＭ、または約１０．０ｍＭである。好ましい実施態様では、ＨＥＰＥＳは、約７．５ｍＭの濃度である。
【０３２０】
Ｄ．キレート剤
本開示のある特定の実施態様は、キレート剤の使用を想定する。キレート剤とは、金属イオンとの、少なくとも２つの配位共有結合を形成し、これにより、安定的な、水溶性の複合体を発生させることが可能な化合物を指す。理論に束縛されることを望まないが、キレート剤は、そうしなければ、本開示における、加速ＲＮＡ分解を誘導しうる、遊離二価イオンの濃度を低減する。適切なキレート剤の例は、限定せずに述べると、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡの塩、デスフェリオキサミンＢ、デフェロキサミン、ジチオカルブナトリウム、ペニシラミン、ペントテト酸カルシウム、ペンテト酸のナトリウム塩、スクシマー、トリエンチン、ニトリロ三酢酸、ｔｒａｎｓ−ジアミノシクロヘキサンテトラ酢酸（ＤＣＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ビス（アミノエチル）グリコールエーテル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、イミノ二酢酸、クエン酸、酒石酸、フマル酸、またはこれらの塩を含む。ある特定の実施態様では、キレート剤は、ＥＤＴＡまたはＥＤＴＡの塩である。例示的実施態様では、キレート剤は、ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物である。
【０３２１】
一部の実施態様では、ＥＤＴＡは、約０．２５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度である。具体的な実施態様では、ＥＤＴＡは、約０．２５ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．１ｍＭ、約２．２ｍＭ、約２．３ｍＭ、約２．４ｍＭ、約２．５ｍＭ、約２．６ｍＭ、約２．７ｍＭ、約２．８ｍＭ、約２．９ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．１ｍＭ、約３．２ｍＭ、約３．３ｍＭ、約３．４ｍＭ、約３．５ｍＭ、約３．６ｍＭ、約３．７ｍＭ、約３．８ｍＭ、約３．９ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．１ｍＭ、約４．２ｍＭ、約４．３ｍＭ、約４．４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約４．６ｍＭ、約４．７ｍＭ、約４．８ｍＭ、約４．９ｍＭ、または約５．０ｍＭの濃度である。好ましい実施態様では、ＥＤＴＡは、約２．５ｍＭの濃度である。
【０３２２】
Ｅ．本開示の例示的組成物
例示的な一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子の組成物は、約２：１〜約１：１のモル比の、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥと、少なくとも１つのエピトープをコードする、約０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度のＲＮＡとを含み、この場合、生理的ｐＨにおいて、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する電荷比が、約１．３：２．０であり；約２０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムと；約２２％（ｗ／ｖ）の濃度のショ糖と；ｐＨが約６．２である、約７．５ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳと；約２．５ｍＭの濃度のＥＤＴＡとを含む。さらなる具体的実施態様では、ＲＮＡは、５つのエピトープまたは１０のエピトープをコードする。
【０３２３】
別の例示的実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子の組成物は、約２：１〜約１：１のモル比の、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥと、少なくとも１つのエピトープをコードする、約０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度のＲＮＡとを含み、この場合、生理的ｐＨにおいて、ＲＮＡリポプレックス粒子内の、正の電荷の、負の電荷に対する電荷比が、約１．３：２．０であり；約３０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムと；約２０％（ｗ／ｖ）の濃度のショ糖と；ｐＨが約６．２である、約７．５ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳと；約２．５ｍＭの濃度のＥＤＴＡとを含む。さらなる具体的実施態様では、ＲＮＡは、５つのエピトープまたは１０のエピトープをコードする。
【０３２４】
Ｆ．本開示の組成物の安定性
本明細書で使用される「安定な」とは、多様な生理化学的パラメータについての測定値が、規定された範囲内にある組成物を指す。一実施態様では、多様なパラメータに従い、安定性について評価するように、組成物を解析する。本開示に従い、安定性パラメータは、限定せずに述べると、ＲＮＡリポプレックス粒子の平均直径、多分散指数、ＲＮＡの完全性、ＲＮＡ含有量、ｐＨ、オスモル濃度、および目視できない粒子の数を含む。当業者は、常套的な実験室法および測定器を使用して、このようなパラメータを測定することが可能であろう。例えば、安定性パラメータは、動的光散乱（ＤＬＳ）、光掩蔽、分光光度法法、アガロースゲル電気泳動、バイオアナライザー、または他の任意の適切な技法を使用して評価することができる。一実施態様では、バイオアナライザーは、ＲＮＡの完全性およびＲＮＡの含有量の両方を測定することが可能な、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。一実施態様では、バイオアナライザーは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ製の、Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒである。
【０３２５】
理論に束縛されることを望まないが、ＤＬＳ測定は、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子と関連するパラメータを解析するために有用である。一実施態様では、ＤＬＳを使用して、Ｚ平均（平均粒子サイズについての尺度）との関係で表される、ＲＮＡリポプレックス粒子の平均直径を決定することができる。別の実施態様では、ＤＬＳを使用して、ＲＮＡリポプレックス粒子のサイズ分布および重量分布を指し示す、ＲＮＡリポプレックス粒子の多分散指数を決定することができる。
【０３２６】
ある特定の実施態様では、組成物は、安定性パラメータについての尺度が、規定された範囲内にある場合に安定である。安定な組成物についての、一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、保管の後で、例えば、約−１５℃〜約−４０℃の温度における保管の後で、元の平均直径（すなわち、凍結、凍結乾燥、または噴霧乾燥させ、融解または再構成させる前における平均直径）と、±２０％、±１０％、±５％、または±３％以下異なる平均直径を有する。安定な組成物についての一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、保管の後で、例えば、約−１５℃〜約−４０℃の温度における保管の後で、元の平均直径（すなわち、凍結、凍結乾燥、または噴霧乾燥させ、融解または再構成させる前における平均直径）と比較して、２０％、１０％、５％、または３％を超えない平均直径を有する。安定な組成物についての、別の実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、保管の後で、例えば、約−１５℃〜約−４０℃の温度における保管の後で、元の多分散指数（すなわち、凍結、凍結乾燥、または噴霧乾燥させ、融解または再構成させる前における多分散指数）と、±２０％、±１０％、±５％、または±３％以下異なる多分散指数を有する。一実施態様では、安定な組成物は、保管の後で、例えば、約−１５℃〜約−４０℃の温度における保管の後で、直径が１０μｍ以上である、６，０００以下の、目視できない粒子を有する。一実施態様では、安定な組成物は、保管の後で、例えば、約−１５℃〜約−４０℃の温度における保管の後で、直径が２５μｍ以上である、６００以下の、目視できない粒子を有する。
【０３２７】
安定な組成物についての一実施態様では、ＲＮＡの完全性は、保管の後で、例えば、約−１５℃〜約−４０℃の温度における保管の後で、少なくとも８０パーセントである。
【０３２８】
一実施態様では、組成物は、約−１５℃〜約−４０℃の保管温度で安定である。具体的な実施態様では、組成物は、約−１５℃、約−１６℃、約−１７℃、約−１８℃、約−１９℃、約−２０℃、約−２１℃、約−２２℃、約−２３℃、約−２４℃、約−２５℃、約−２６℃、約−２７℃、約−２８℃、約−２９℃、約−３０℃、約−３１℃、約−３２℃、約−３３℃、約−３４℃、約−３５℃、約−３６℃、約−３７℃、約−３８℃、約−３９℃、または約−４０℃の温度で安定である。好ましい実施態様では、組成物は、約−１５℃、約−２０℃、約−３０℃、または約−４０℃の温度で安定である。
【０３２９】
一実施態様では、薬学的組成物を、光から保護する場合に、組成物は、約−１５℃〜約−４０℃の温度で安定である。好ましい実施態様では、組成物を、光から保護する場合に、組成物は、約−１５℃〜約−２５℃の温度で安定である。
【０３３０】
一実施態様では、組成物は、約−１５℃〜約−４０℃の温度で、約２４カ月後までの、少なくとも１カ月間安定である。具体的な実施態様では、組成物は、約−１５℃〜約−４０℃の温度で、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも５カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも７カ月間、少なくとも８カ月間、少なくとも９カ月間、少なくとも１０カ月間、少なくとも１１カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも１３カ月間、少なくとも１４カ月間、少なくとも１５カ月間、少なくとも１６カ月間、少なくとも１７カ月間、少なくとも１８カ月間、少なくとも１９カ月間、少なくとも２０カ月間、少なくとも２１カ月間、少なくとも２２カ月間、少なくとも２３カ月間、少なくとも２４カ月間、少なくとも２５カ月間、少なくとも２６カ月間、少なくとも２７カ月間、少なくとも２８カ月間、少なくとも２９カ月間、少なくとも３０カ月間、少なくとも３１カ月間、少なくとも３２カ月間、少なくとも３３カ月間、少なくとも３４カ月間、少なくとも３５カ月間、または少なくとも３６カ月間安定である。
【０３３１】
好ましい実施態様では、組成物は、約−１５℃の温度で、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも５カ月間、または少なくとも６カ月間安定である。
【０３３２】
別の好ましい実施態様では、組成物は、約−２０℃の温度で、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも５カ月間、または少なくとも６カ月間安定である。
【０３３３】
さらに別の好ましい実施態様では、組成物は、約−３０℃の温度で、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも５カ月間、または少なくとも６カ月間安定である。
【０３３４】
一実施態様では、組成物は、約−１５℃〜約−４０℃の温度で凍結させ、約４℃〜約２５℃の温度（常温）へと融解させた後で、安定である。別の実施態様では、組成物は、複数の凍結融解サイクル内で、約−１５℃〜約−４０℃の温度で凍結させ、約４℃〜約２５℃の温度（常温）へと融解させた後で、安定である。
【０３３５】
Ｇ．本開示の組成物の物理的状態
ある実施態様では、本開示の組成物は、液体または固体である。非限定的な固体の例は、凍結形態または凍結乾燥形態を含む。好ましい実施態様では、組成物は、液体である。
【０３３６】
本開示の薬学的組成物
本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、治療処置または予防処置のための、薬学的組成物または医薬として有用であるか、またはこれらを調製するために有用である。
【０３３７】
本開示の粒子は、任意の適切な薬学的組成物の形態で投与されうる。
【０３３８】
「薬学的組成物」という用語は、治療的に有効な薬剤を、好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤と併せて含む製剤に関する。前記薬学的組成物は、前記薬学的組成物の、対象への投与により、疾患または障害を、処置、防止、またはこれらの重症度を軽減するために有用である。当該技術分野ではまた、薬学的組成物は、薬学的製剤としても公知である。本開示の文脈では、薬学的組成物は、本明細書で記載される、ＲＮＡリポプレックス粒子を含む。
【０３３９】
本開示の薬学的組成物は、好ましくは、１つもしくは複数のアジュバントを含むか、または、１つまたは複数のアジュバントと共に投与される。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長するか、増強するか、またはこれを加速化させる化合物に関する。アジュバントは、油性エマルジョン（例えば、フロイントのアジュバント）、鉱物性化合物（ミョウバンなど）、細菌生成物（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素など）、または免疫刺激性複合体など、異質な化合物群を含む。アジュバントの例は、限定せずに述べると、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、増殖因子、およびモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインなどのサイトカインを含む。ケモカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＮＦａ、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＴ−ａでありうる。さらなる公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントのアジュバント、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１などの油である。本開示における使用に適する、他のアジュバントは、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドを含む。
【０３４０】
本開示に従う薬学的組成物は、一般に、「薬学的に許容される調製物」中に、「薬学的有効量」で適用される。
【０３４１】
「薬学的に許容される」という用語は、薬学的組成物の活性成分と相互作用しない、材料の非毒性を指す。
【０３４２】
「薬学的有効量」という用語は、単独で、またはさらなる用量と併せて、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の処置の場合、所望の反応は、好ましくは、疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行の緩徐化、特に、疾患の進行の中断または抑制を含む。疾患の処置における所望の反応はまた、前記疾患もしくは前記状態の発症の遅延、またはこれらの発症の防止でもありうる。本明細書で記載される粒子または組成物の有効量は、処置される状態、疾患の重症度、年齢、生理的状態、身長および体重、処置の持続期間、併用治療（存在する場合）の種類、特異的投与経路および類似の因子を含む、患者の個別のパラメータに依存するであろう。したがって、本明細書で記載される粒子または組成物の、投与される用量は、このような諸パラメータに依存しうる。万一、初期用量では、患者における反応が不十分である場合、高用量（または異なる、より局所的な投与経路により達成される、有効な高用量）を使用することができる。
【０３４３】
本開示の薬学的組成物は、塩と、バッファーと、防腐剤と、任意選択で、他の治療剤とを含有しうる。一実施態様では、本開示の薬学的組成物は、１つまたは複数の、薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を含む。
【０３４４】
本開示の薬学的組成物における使用に適する防腐剤は、限定せずに述べると、ベンザルコニウムクロライド、クロロブタノール、パラベン、およびチメロサールを含む。
【０３４５】
本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の薬学的組成物中に存在しうるが、有効成分ではない物質を指す。賦形剤の例は、限定せずに述べると、担体、結合剤、希釈剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤を含む。
【０３４６】
「希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）」という用語は、希釈（ｄｉｌｕｔｉｎｇおよび／またはｔｈｉｎｎｉｎｇ）剤に関する。さらに、「希釈剤」という用語は、流体、液体、もしくは固体の懸濁液、および／または混合媒体のうちの、任意の１または複数を含む。適切な希釈剤の例は、エタノール、グリセロール、および水を含む。
【０３４７】
「担体」という用語は、薬学的組成物の投与を容易とするか、増強するか、またはこれを可能とするために、その中で活性成分を混合する、天然、合成、有機、無機でありうる成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適する、１つまたは複数の、適合性の、固体または液体の、充填剤、希釈剤、または封入物質でありうる。適切な担体は、限定せずに述べると、滅菌水、リンゲル液、乳酸化リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張性生理食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、および、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体を含む。一実施態様では、本開示の薬学的組成物は、等張性生理食塩水を含む。
【０３４８】
医薬技術分野では、治療使用のための、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤が周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）において記載されている。
【０３４９】
医薬用の、担体、賦形剤、または希釈剤は、目的の投与経路および標準的な薬学的実践に照らして選択することができる。
【０３５０】
本開示の薬学的組成物の投与経路
一実施態様では、本明細書で記載される薬学的組成物は、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、または筋肉内投与される。ある特定の実施態様では、薬学的組成物は、局所投与または全身投与のために製剤化される。全身投与は、消化管を介する吸収を伴う経腸投与、または非経口投与を含みうる。本明細書で使用される「非経口投与」は、静脈内注射など、消化管を介する投与以外の、任意の形の投与を指す。好ましい実施態様では、薬学的組成物は、全身投与のために製剤化される。別の好ましい実施態様では、全身投与は、静脈内投与による。
【０３５１】
製品
一態様では、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、薬学的組成物中に存在する。別の態様では、本明細書で記載される組成物は、薬学的組成物である。
【０３５２】
一態様では、本開示は、本明細書で記載される薬学的組成物を含有するバイアルに関する。別の態様では、本開示は、本明細書で記載される薬学的組成物を含有するシリンジに関する。
【０３５３】
本開示の薬学的組成物の使用
本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子は、多様な疾患、特に、ペプチドまたはタンパク質の、対象への提供が、治療効果または予防効果を結果としてもたらす疾患の、治療処置または予防処置において使用することができる。例えば、ウイルスに由来する抗原またはエピトープの提供は、前記ウイルスにより引き起こされるウイルス性疾患の処置において有用でありうる。腫瘍抗原またはエピトープの提供は、がん細胞が、前記腫瘍抗原を発現させるがん疾患の処置において有用でありうる。
【０３５４】
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす、異常な状態を指す。疾患は、特異的な症候および徴候と関連する医学的状態として解釈されることが多い。疾患感染性疾患など、元来、外部の疾患源に由来する因子により引き起こされる場合もあり、自己免疫疾患など、内的機能不全により引き起こされる場合もある。ヒトでは、「疾患」は、より広範に、罹患個体へと、疼痛、機能不全、苦痛、社会的問題、または死を引き起こすか、または罹患個体と接触する個体に、同様の問題を引き起こす、任意の状態を指すように使用されることが多い。このより広義において、「疾患」は、場合によって、傷害、身体機能障害、障害、症候群、感染、孤発性症候、逸脱性挙動、ならびに構造および機能の非典型的な変動を含むが、他の文脈において、他の目的では、「疾患」は、識別可能な類別であると考えられる。多くの疾患に罹患し、これらと共に生きることは、人生の見方を変更する場合があり、性格を変更しうるので、疾患は、通例、個体に、物理的影響を及ぼすだけでなく、また、情緒的影響も及ぼす。
【０３５５】
本文脈では、「処置」、「〜を処置すること」、または「治療介入」という用語は、疾患または障害などの状態に対抗することを目的とする、対象の管理およびケアに関する。用語は、対象が患う、所与の状態のための、全スペクトルにわたる処置であって、症候もしくは合併症を緩和し、疾患、障害、もしくは状態の進行を遅延させ、症候および合併症を緩和するか、もしくは和らげ、かつ／または疾患、障害、もしくは状態を治癒もしくは消失させるほか、状態を防止するのに、治療的に有効な化合物の投与などであり、防止が、疾患、状態、または障害に対抗することを目的とする、個体の管理およびケアであることが理解され、症候または合併症の発症を防止する、活性化合物の投与を含む処置を含むことを意図する。
【０３５６】
「治療処置」という用語は、個体の健康状態を改善し、かつ／または個体の寿命を延長する（増大させる）、任意の処置に関する。前記処置は、個体における疾患を消失させる場合もあり、個体における疾患の発生を停止もしくは緩徐化させる場合もあり、個体における疾患の発生を阻害するか、もしくは緩徐化させる場合もあり、個体における症候の頻度もしくは重症度を減殺する場合もあり、かつ／または現在のところ疾患を有するか、もしくはかつてこれを有したことがある個体における再発を減殺する場合もある。
【０３５７】
「予防処置」または「防止処置」という用語は、個体において疾患が生じることを防止することを意図する、任意の処置に関する。本明細書では、「予防処置」または「防止処置」という用語は、互換的に使用される。
【０３５８】
本明細書では、「個体」および「対象」という用語は、互換的に使用される。「個体」および「対象」という用語は、疾患または障害（例えば、がん）に罹患しうるか、またはこれらに対する感受性があるが、疾患または障害を有する場合もあり、これらを有さない場合もある、ヒトまたは別の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。多くの実施態様では、個体は、ヒトである。別途指定のない限り、「個体」および「対象」という用語は、特定の年齢を表示せず、したがって、成人、老齢者、小児、および新生児を包摂する。本開示の、ある実施態様では、「個体」または「対象」とは、「患者」である。
【０３５９】
「患者」という用語は、処置のための個体または対象、特に、罹患個体または罹患対象を意味する。
【０３６０】
本開示の一実施態様では、目的は、腫瘍抗原を発現させるがん細胞など、抗原を発現させる罹患細胞に対する免疫応答をもたらし、腫瘍抗原などの抗原を発現させる細胞に関与するがん疾患などの疾患を処置することである。
【０３６１】
１つもしくは複数の抗原、または１つもしくは複数のエピトープを含む、ＲＮＡをコードすることペプチドまたはタンパク質を含む、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子を含む薬学的組成物は、対象へと投与されて、対象における、１つもしくは複数の抗原、または１つもしくは複数のエピトープに対する免疫応答であって、治療的であるか、または部分的に、もしくは完全に防御的である免疫応答を誘発する。当業者には、免疫療法およびワクチン接種の原理が、対象を、処置される疾患に関して、免疫学的に関与性である、抗原またはエピトープで免疫化することにより、疾患に対する免疫防御反応がもたらされるという事実に基づくことが公知であろう。したがって、本明細書で記載される薬学的組成物は、免疫応答の誘導または増強に適用可能である。したがって、本明細書で記載される薬学的組成物は、抗原またはエピトープに関与する疾患の予防処置および／または治療処置において有用である。
【０３６２】
本明細書で使用される「免疫応答」は、抗原または抗原を発現させる細胞に対する、統合された身体応答を指し、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を指す。細胞性免疫応答は、限定せずに述べると、抗原を発現させる細胞へと方向付けられ、クラスＩ  ＭＨＣ分子またはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を伴う抗原の提示により特徴づけられている、細胞性応答を含む。細胞性応答は、免疫応答を調節することにより、中心的な役割を果たす、ヘルパーＴ細胞（また、ＣＤ４＋  Ｔ細胞とも称する）、または感染細胞もしくはがん細胞におけるアポトーシスを誘導する、キラー細胞（また、細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはＣＴＬとも称する）として分類されうる、Ｔリンパ球に関する。一実施態様では、本開示の薬学的組成物を投与することは、１つまたは複数の腫瘍抗原を発現させるがん細胞に対する、抗腫瘍ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の刺激を伴う。具体的な実施態様では、腫瘍抗原は、クラスＩ  ＭＨＣ分子により提示される。
【０３６３】
本開示は、防御的な場合もあり、防止的な場合もあり、予防的な場合もあり、かつ／または治療的な場合もある免疫応答を想定する。本明細書で使用される「免疫応答を誘導する［または免疫応答を誘導すること］」とは、誘導の前に、特定の抗原に対する免疫応答が存在しなかったことを指し示す場合もあり、誘導の前にも、特定の抗原に対する、基礎レベルの免疫応答が見られたが、誘導の後で増強されたことを指し示す場合もある。したがって、「免疫応答を誘導する［または免疫応答を誘導すること］」は、「免疫応答を増強する［または免疫応答を増強すること］」を含む。
【０３６４】
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導または増強することによる、疾患または状態の処置に関する。「免疫療法」という用語は、抗原による免疫化、または抗原によるワクチン接種を含む。
【０３６５】
「免疫化」または「ワクチン接種」という用語は、例えば、治療的理由または予防的理由で、免疫応答を誘導することを目的として、抗原を、個体へと投与する方法について記載する。
【０３６６】
一実施態様では、本開示は、脾臓組織をターゲティングする、本明細書で記載される、ＲＮＡリポプレックス粒子を投与する実施態様を想定する。ＲＮＡは、例えば、本明細書で記載される、抗原またはエピトープを含む、ペプチドまたはタンパク質をコードする。ＲＮＡは、樹状細胞など、脾臓内の抗原提示細胞により取り込まれて、ペプチドまたはタンパク質を発現させる。抗原提示細胞による、任意選択のプロセシングおよび提示の後、抗原またはエピトープに対する免疫応答が発生する結果として、抗原またはエピトープに関与する疾患の、予防処置および／または治療処置がもたらされうる。一実施態様では、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子により誘導される免疫応答は、樹状細胞および／またはマクロファージなどの抗原提示細胞による、抗原またはエピトープなど、この断片の提示と、この提示に起因する、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化とを含む。例えば、ＲＮＡまたはこのプロセッション（ｐｒｏｃｅｓｓｉｏｎ）産物によりコードされる、ペプチドまたはタンパク質は、抗原提示細胞上に発現する、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質により提示されうる。次いで、ＭＨＣペプチド複合体は、Ｔ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞により認識され、それらの活性化をもたらしうる。
【０３６７】
したがって、一実施態様では、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子内のＲＮＡは、投与の後、脾臓へと送達され、かつ／または脾臓内で発現する。一実施態様では、脾臓の抗原提示細胞を活性化させるために、ＲＮＡリポプレックス粒子を、脾臓へと送達する。したがって、一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子を投与した後で、抗原提示細胞内の、ＲＮＡの送達および／またはＲＮＡの発現が生じる。抗原提示細胞は、プロフェッショナルの抗原提示細胞の場合もあり、非プロフェッショナルの抗原提示細胞の場合もある。プロフェッショナルの抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージであることが可能であり、なおより好ましくは、脾臓樹状細胞および／または脾臓マクロファージでありうる。
【０３６８】
したがって、本開示は、免疫応答、好ましくは、がんに対する免疫応答を誘導または増強するための、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子、またはＲＮＡリポプレックス粒子を含む薬学的組成物に関する。
【０３６９】
さらなる実施態様では、本開示は、抗原、好ましくは、がん疾患に関与する疾患の、予防処置および／または治療処置における使用のための、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子、またはＲＮＡリポプレックス粒子を含む薬学的組成物に関する。
【０３７０】
さらなる実施態様では、本開示は、抗原もしくは抗原のエピトープを、脾臓内の、プロフェッショナルの抗原提示細胞などの抗原提示細胞へと送達するか、または脾臓内の、プロフェッショナルの抗原提示細胞などの抗原提示細胞内で、抗原もしくは抗原のエピトープを発現させるための方法であって、を含む方法。対象へと、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子、またはＲＮＡリポプレックス粒子を含む薬学的組成物を投与することに関する。一実施態様では、抗原は、腫瘍抗原である。この態様では、抗原または抗原のエピトープは、好ましくは、ＲＮＡリポプレックス粒子内のＲＮＡによりコードされる。
【０３７１】
一実施態様では、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子、またはＲＮＡリポプレックス粒子を含む薬学的組成物を全身投与することは、脾臓内であり、肺内および／または肝臓内ではない、ＲＮＡリポプレックス粒子またはＲＮＡのターゲティングおよび／または蓄積を結果としてもたらす。一実施態様では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓内にＲＮＡを放出し、かつ／または脾臓内の細胞に侵入する。一実施態様では、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子、またはＲＮＡリポプレックス粒子を含む薬学的組成物を全身投与することは、ＲＮＡを、脾臓内の抗原提示細胞へと送達する。具体的な実施態様では、脾臓内の抗原提示細胞は、樹状細胞またはマクロファージである。
【０３７２】
さらなる実施態様では、本開示は、対象における免疫応答を誘導または増強するための方法であって、対象へと、本明細書で記載されるＲＮＡリポプレックス粒子、またはＲＮＡリポプレックス粒子を含む薬学的組成物を投与することを含む方法に関する。例示的実施態様では、免疫応答は、がんに対する。
【０３７３】
「マクロファージ」という用語は、単球の分化によりもたらされる、食作用性細胞の亜群を指す。炎症、免疫サイトカイン、または微生物生成物により活性化するマクロファージは、病原体の分解を結果としてもたらす、加水分解攻撃および酸化攻撃により、マクロファージ内の、外来の病原体を、非特異的に飲み込み、死滅させる。分解されたタンパク質に由来するペプチドは、マクロファージ細胞表面上に表示され、ここで、Ｔ細胞により認識され、Ｂ細胞表面上の抗体と、直接相互作用する結果として、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化、ならびに免疫応答のさらなる刺激をもたらすことができる。マクロファージは、抗原提示細胞のクラスに属する。一実施態様では、マクロファージは、脾臓マクロファージである。
【０３７４】
「樹状細胞」（ＤＣ）という用語は、抗原提示細胞のクラスに属する、食作用性細胞の、別の亜型を指す。一実施態様では、樹状細胞は、骨髄造血前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞はまず、未成熟樹状細胞へと形質転換する。これらの未成熟細胞は、高食作用活性および低Ｔ細胞活性化の潜在的可能性により特徴づけられる。未成熟樹状細胞は、周囲の環境を、ウイルスおよび細菌などの病原体について、恒常的にサンプリングする。未成熟樹状細胞は、提示しうる抗原と接触すると、成熟樹状細胞へと活性化するようになり、脾臓またはリンパ節へと遊走し始める。未成熟樹状細胞は、病原体を貪食し、それらのタンパク質を、小片へと分解し、成熟すると、ＭＨＣ分子を使用して、これらの断片を、それらの細胞表面へと提示する。同時に、ＤＣは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ４０など、Ｔ細胞の活性化において、共受容体として作用する、細胞表面受容体を上方調節し、Ｔ細胞を活性化させるそれらの能力を、大幅に増強する。ＤＣはまた、樹状細胞が、血流を介して、脾臓へと移動するか、またはリンパ系を介して、リンパ節へと移動するように誘導する走化性受容体である、ＣＣＲ７も上方調節する。ＤＣは、抗原提示細胞として作用し、それらに、非抗原特異的な共刺激シグナルと共に、抗原を提示することにより、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞のほか、Ｂ細胞も活性化させる。したがって、樹状細胞は、Ｔ細胞関連免疫応答またはＢ細胞関連免疫応答を、能動的に誘導しうる。一実施態様では、樹状細胞は、脾臓樹状細胞である。
【０３７５】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、少なくとも１つの抗原または抗原性断片を、その細胞表面上に（または、細胞表面において）表示し、取り込み、かつ／または提示することが可能な、様々な細胞のうちの１つの細胞である。抗原提示細胞は、プロフェッショナルの抗原提示細胞と、非プロフェッショナルの抗原提示細胞とに識別することができる。
【０３７６】
「プロフェッショナルの抗原提示細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞との相互作用に要求される、主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を、構成的に発現させる、抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が、抗原提示細胞の膜上の、ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用すると、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する、共刺激分子を産生する。プロフェッショナルの抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。
【０３７７】
「非プロフェッショナルの抗原提示細胞」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を、構成的には発現させないが、インターフェロンガンマなど、ある特定のサイトカインにより刺激されると、これを発現させる、抗原提示細胞に関する。例示的な、非プロフェッショナルの抗原提示細胞は、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞、または血管内皮細胞を含む。
【０３７８】
「抗原のプロセシング」とは、抗原の、前記抗原の断片である、プロセッション（ｐｒｏｃｅｓｓｉｏｎ）産物への分解（例えば、タンパク質の、ペプチドへの分解）と、抗原提示細胞などの細胞による、特異的Ｔ細胞への提示のための、これらの断片のうちの１つまたは複数の、ＭＨＣ分子との会合（例えば、結合を介する）とを指す。
【０３７９】
「疾患に関与する抗原」または「疾患に関与するエピトープ」という用語は、抗原またはエピトープに関与する任意の疾患、例えば、抗原またはエピトープの存在により特徴づけられる疾患を指す。抗原またはエピトープに関与する疾患は、感染性疾患の場合もあり、がん疾患の場合もあり、単に、がんの場合もある。上記で言及した通り、抗原は、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原など、疾患関連抗原であることが可能であり、エピトープは、このような抗原に由来しうる。
【０３８０】
「感染性疾患」という用語は、個体から個体へと伝染される場合もあり、生物体から生物体へと伝染される場合もあり、微生物性作用物質（例えば、一般的な風邪）により引き起こされる、任意の疾患を指す。当該技術分野では、感染性疾患が公知であり、例えば、ウイルス、細菌、および寄生虫のそれぞれにより引き起こされる、ウイルス疾患、細菌性疾患、または寄生虫病を含む。この点で、感染性疾患は、例えば、肝炎、性感染症（例えば、クラミジアまたは淋病）、結核、ＨＩＶ／後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ字型肝炎、コレラ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、トリインフルエンザ、およびインフルエンザでありうる。
【０３８１】
「がん疾患」または「がん」という用語は、典型的に、調節不能の細胞増殖により特徴づけられる、個体における生理的状態を指すか、またはこれについて記載する。がんの例は、癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むがこれらに限定されない。より特定すると、このようながんの例は、骨がん、血液がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、性生殖器の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌システムのがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、膀胱がん、腎がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、神経外胚葉がん、脊椎腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫を含む。本開示に従う「がん」という用語はまた、がん転移も含む。
【０３８２】
がん処置における組合せ戦略は、単剤療法の効果より、大幅に強力でありうる、結果として得られる相乗効果に起因して、所望でありうる。一実施態様では、薬学的組成物を、免疫療法剤と共に投与する。本明細書で使用される「免疫療法剤」は、特異的な免疫応答および／または免疫エフェクター機能の活性化に関与しうる、任意の薬剤に関する。本開示は、免疫療法剤としての抗体の使用を想定する。理論に束縛されることを望まないが、抗体は、アポトーシスを誘導するか、シグナル伝達経路の構成要素をブロックするか、または腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、多様な機構を介して、がん細胞に対して治療効果を達成することが可能である。ある特定の実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して、細胞死を誘導しうるか、または、補体タンパク質に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として公知の、直接的な細胞傷害性をもたらす。本開示と組み合わせて使用されうる、抗がん抗体および潜在的な抗体標的（カッコ内）の非限定的な例は、アバゴボマブ（ＣＡ−１２５）、アブシキシマブ（ＣＤ４１）、アデカツムマブ（ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（ＣＤ２０）、アラシズマブペゴル（ＶＥＧＦＲ２）、ペンテト酸アルツモマブ（ＣＥＡ）、アマツキシマブ（ＭＯＲＡｂ−００９）、アナツモマブマフェナトクス（ＴＡＧ−７２）、アポリズマブ（ＨＬＡ−ＤＲ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ）、アテゾリズマブ（ＰＤ−Ｌ１）、バビツキシマブ（ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（ＣＤ２２）、ベリムマブ（ＢＡＦＦ）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（ＣＤ４４ｖ６）、ブリナツモマブ（ＣＤ１９）、ブレンツキシマブベドチン（ＣＤ３０であるＴＮＦＲＳＦ８）、カンツズマブメルタンシン（ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラバタンシン（ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（前立腺癌細胞）、カルルマブ（ＣＮＴ０８８８）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、シタツズマブボガトクス（ＥｐＣＡＭ）、シクスツムマブ（ＩＧＦ−１受容体）、クラウジキシマブ（Ｃｌａｕｄｉｎ）、クリバツズマブテトラキセタン（ＭＵＣ１）、コナツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ダセツズマブ（ＣＤ４０）、ダロツズマブ（インスリン様成長因子Ｉ受容体）、デノスマブ（ＲＡＮＫＬ）、デツモマブ（Ｂ細胞リンパ腫細胞）、ドロジツマブ（ＤＲ５）、エクロメキシマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、エナバツズマブ（ＰＤＬ１９２）、エンシツキシマブ（ＮＰＣ−１Ｃ）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（インテグリンανβ３）、ファレツズマブ（葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（ＳＣＨ９００１０５）、フィギツムマブ（ＩＧＦ−１受容体）、フランボツマブ（糖タンパク質７５）、フレソリムマブ（ＴＧＦ−β）、ガリキシマブ（ＣＤ８０）、ガニツマブ（ＩＧＦ−Ｉ）、ゲムツズマブオゾガミシン（ＣＤ３３）、ゲボキズマブ（ＩＬ−Ιβ）、ギレンツキシマブ（炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ））、グレムバツムマブベドチン（ＧＰＮＭＢ）、イブリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０）、イクルクマブ（ＶＥＧＦＲ−１）、イゴボマブ（Ｉｇｏｂｏｍａ）（ＣＡ−１２５）、インダツキシマブラブタンシン（ＳＤＣ１）、インテツムマブ（ＣＤ５１）、イノツズマブオゾガマイシン（ＣＤ２２）、イピリムマブ（ＣＤ１５２）、イラツムマブ（ＣＤ３０）、ラベツズマブ（ＣＥＡ）、レキサツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、リビビルマブ（Ｂ型肝炎表面抗原）、リンツズマブ（ＣＤ３３）、ロルボツズマブメルタンシン（ＣＤ５６）、ルカツムマブ（ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３）、マパツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、マツズマブ（ＥＧＦＲ）、メポリズマブ（ＩＬ−５）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ミツモマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトクス（ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（５Ｔ４）、ナマツマブ（ＲＯＮ）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（ＩｇＧ４）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、オララツマブ（ＰＤＧＦ−Ｒａ）、オナルツズマブ（ヒト散乱因子受容体キナーゼ）、オポルツズマブモナトクス（ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ＣＡ−１２５）、オキセルマブ（ＯＸ−４０）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、パトリツマブ（ＨＥＲ３）、ペムツモマブ（ＭＵＣ１）、ペルツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピンツモマブ（腺癌抗原）、プリツムマブ（ビメンチン）、ラコツモマブ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（フィブロネクチン細胞外ドメインＢ）、ラフィビルマブ（狂犬病ウイルス糖タンパク質）、ラムシルマブ（ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（ＨＧＦ）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、ロバツムマブ（ＩＧＦ−１受容体）、サマリズマブ（ＣＤ２００）、シブロツズマブ（ＦＡＰ）、シリツキシマブ（ＩＬ−６）、タバルマブ（ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（アルファ−フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（ＣＤ１９）、テナツモマブ（テネイシンＣ）、テプロツムマブ（ＣＤ２２１）、チシリムマブ（ＣＴＬＡ−４）、チガツズマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＴＮＸ−６５０（ＩＬ−１３）、トシツモマブ（ＣＤ２０）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＴＲＢＳ０７（ＧＤ２）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４）、ツコツズマブセルモロイキン（ＥｐＣＡＭ）、ユビリツキシマブ（ＭＳ４Ａ１）、ウレルマブ（４−１ＢＢ）、ボロシキシマブ（インテグリンα５β１）、ボツムマブ（腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、ザルツムマブ（ＥＧＦＲ）、およびザノリムマブ（ＣＤ４）を含む。
【０３８３】
一実施態様では、免疫療法剤は、ＰＤ−１軸結合性アンタゴニストである。ＰＤ−１軸結合性アンタゴニストは、ＰＤ−１結合性アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１結合性アンタゴニスト、およびＰＤ−Ｌ２結合性アンタゴニストを含むがこれらに限定されない。「ＰＤ−１」の別称は、ＣＤ２７９およびＳＬＥＢ２を含む。「ＰＤ−Ｌ１」の別称は、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−４、ＣＤ２７４、およびＢ７−Ｈを含む。「ＰＤ−Ｌ２」の別称は、Ｂ７−ＤＣ、Ｂｔｄｃ、およびＣＤ２７３を含む。一部の実施態様では、ＰＤ−１結合性アンタゴニストは、ＰＤ−１の、そのリガンドの結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的態様では、ＰＤ−１リガンドの結合パートナーは、ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌｌ）、および／またはＰＤ−Ｌ２である。別の実施態様では、ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌｌ）結合性アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌｌ）の、その結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な実施態様では、ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌｌ）の結合パートナーは、ＰＤ−１および／またはＢ７−１である。別の実施態様では、ＰＤ−Ｌ２結合性アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ２の、その結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な実施態様では、ＰＤ−Ｌ２の結合パートナーは、ＰＤ−１である。ＰＤ−１結合性アンタゴニストは、抗体、この抗原結合性断片であるイムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドでありうる。一部の実施態様では、ＰＤ−１結合性アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。抗ＰＤ−１抗体の例は、限定せずに述べると、ＭＤＸ−１１０６（ニボルマブ、ＯＰＤＩＶＯ）、Ｍｅｒｃｋ３４７５（ＭＫ−３４７５、ペムブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＢＧＢ−１０８、およびＢＧＢ−Ａ３１７を含む。
【０３８４】
一実施態様では、ＰＤ−１結合性アンタゴニストは、定常領域へと融合させた、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の、細胞外部分またはＰＤ−１結合性部分を含む、イムノアドヘシンである。一実施態様では、ＰＤ−１結合性アンタゴニストは、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２において記載された、融合可溶型受容体である、ＡＭＰ−２２４（また、Ｂ７−ＤＣ  Ｉｇとしても公知であり、ＰＤ−Ｌ２−Ｆｃである）である。
【０３８５】
一実施態様では、ＰＤ−１結合性アンタゴニストは、限定せずに述べると、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、ＭＥＤＩ４７３６（ヅルバルマブ）、ＭＤＸ−１１０５、およびＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）を含む、抗ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌｌ）抗体である。
【０３８６】
一実施態様では、免疫療法剤は、ＰＤ−１結合性アンタゴニストである。別の実施態様では、ＰＤ−１結合性アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。例示的実施態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブである。
【０３８７】
本明細書で参照される文献および研究の引用は、前述のうちのいずれかが、関連の先行技術であることの容認としては意図されない。これらの文献の内容についての、全ての言明は、本出願者らに入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の内容の正確さについての、いかなる容認も構成しない。
【０３８８】
以下の記載は、当業者が、多様な実施態様を行い、使用することを可能とするように提示される。具体的なデバイス、技法、および適用についての記載は、例だけとして提示される。当業者には、本明細書で記載される例に対する、多様な改変が、容易に明らかとなり、本明細書で規定される、一般的原理は、多様な実施態様の精神および範囲から逸脱しない限り、他の例および適用へも適用することができる。したがって、多様な実施態様は、本明細書で記載され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と符合する範囲を与えられるものとする。
【実施例】
【０３８９】
実施例１
材料
本明細書の後出で記載される実験のために使用される、重要な材料は、
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であった。
【０３９０】
実施例２
脂質混合物の調製
ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ脂質混合物を、それぞれ、脂質モル比を２：１として、異なる、エタノール中の脂質の濃度で調製する。溶液を、以下の通りに調製する：
・ＤＯＰＥ脂質を秤量する。
・ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥの、％によるモル比を、２：１に保つ、ＤＯＴＭＡの量を計算する。
・ＤＯＴＭＡ脂質を秤量する。
・脂質を溶解させるのに必要な無水エタノールの量を計算する。
・無水エタノールを秤量する。
・３７℃の水浴（ｂａｄ）を用いて、脂質を、エタノール中に溶解させる。
【０３９１】
ＤＯＰＥおよびＤＯＰＥ／ＤＯＴＭＡの、エタノール中の溶解度は、エタノール中に３００ｍＭのＤＯＰＥ溶液、または３３０ｍＭのＤＯＰＥ／ＤＯＴＭＡ（６６：３３）溶液を調製することにより探索した。脂質は、脂質溶液を、３７℃で、２０分間インキュベートすることにより溶解させた。ＤＯＰＥ溶液を、１７０００Ｇで、１時間遠心分離し、ＤＯＰＥ濃度は、上清中で、ＨＰＬＣにより測定した。ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ溶液は、０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターを通して濾過し、脂質濃度は、濾液中で、ＨＰＬＣにより測定した。
【０３９２】
他の脂質を、出発物質として使用し、かつ／または他のモル比を計算することを条件として、本実施例で記載される基礎工程に従うことにより、さらなる脂質混合物もまた調製することができる。
【０３９３】
実施例３
リポソームの調製
リポソームは、以下の通りに、エタノール注入により調製した：０．９×４０ｍｍの注射針を装備した、１ｍＬのシリンジを用いて、エタノール中に０．２ｍＬのＤＯＴＭ／ＤＯＰＥ（または他の脂質溶液）を、１２０ｒｐｍの攪拌下で、９．８ｍＬの水へと注入した。リポソームコロイドを、３０分間攪拌した。リポソームは、０．４５もしくは１．２もしくは５μｍのＣＡシリンジフィルターを介するか、またはこれらを介さずに濾過した。リポソームコロイドは、４〜８℃で保管した。ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ脂質溶液は、５０ｍＭずつの中間段階を伴う、１００〜４００ｍＭにわたる、異なる総脂質濃度の、６６：３３の％によるモル比で調製した。
【０３９４】
実施例４
ＲＮＡリポプレックスの調製
ＲＮＡリポプレックス製剤は、以下の通り、まず、ＲＮＡ溶液（例えば、ｌｕｃ−ＲＮＡ溶液）を、ＮａＣｌ溶液と混合し、ｌｕｃ−ＲＮＡをあらかじめ濃縮することにより調製した。この後で、リポソームコロイドと、ｌｕｃ−ＲＮＡ−ＮａＣｌ溶液とを混合して、ＲＮＡリポプレックスを形成した。ＲＮＡリポプレックス製剤は、室温で、１０分間インキュベートし、４〜８℃で保管した。異なるＲＮＡリポプレックス製剤を、例えば、０．６５のＮ／Ｐ比で調製した。ＲＮＡの、これらの異なるＲＮＡリポプレックス製剤中の濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬであり、ＮａＣｌ濃度は、５０ｍＭであった。ＲＮＡリポプレックスを調製するために、異なるリポソーム前駆体（異なるサイズ）を使用した。
【０３９５】
実施例５
動的光散乱
リポソームサイズおよびＲＮＡリポプレックスサイズは、Ｎｉｃｏｍｐ測定器（ＰＳＳ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）を使用する、公知の動的光散乱（ＤＬＳ）法により測定した。リポソーム試料は、水により、１ｍＭの全脂質濃度へと希釈した。ＲＮＡリポプレックス試料は、０．９％のＮａＣｌ溶液により、１対５に希釈した。試料は、５×５０ｍｍの培養チューブ（Ｋｉｍｂｌｅ、ＵＳＡ）内で測定した。
【０３９６】
実施例６
光掩蔽：動的光散乱
０．５〜５μｍの間のサイズ範囲内の、異なるリポソーム製剤およびＲＮＡリポプレックス製剤についての、粒子の計数／測定は、Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ  Ａ７０００測定器（ＰＳＳ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）を使用して実施した。５ｍＬの体積（２．５μＬの試料／２０ｍＬの遊離粒子水）について、３回の測定を実施した。得られた結果は、３回の測定による粒子の量の平均値を表した。
【０３９７】
実施例７
小角度Ｘ線散乱
異なるリポソーム前駆体により調製される、異なるＲＮＡリポプレックス製剤の内部構造パラメータは、小角度Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）により測定した。ＳＡＸＳとは、材料を通過する場合の、Ｘ線の弾性散乱挙動を解析し、それらの小角度の散乱を記録することにより、試料中のナノスケールの密度差を定量しうる技法である。あらゆる被験ＲＮＡ製剤について、長さパラメータと、ｄ間隔パラメータとの相関を計算した。ＲＮＡリポプレックス製剤は、０．６５のＮ／Ｐ比、０．１ｍｇ／ｍＬのＲＮＡ、および１１２ｍＭのＮａＣｌにより調製した。
【０３９８】
実施例８
アガロースゲル電気泳動
遊離ＲＮＡの、異なるＲＮＡリポプレックス試料中の量は、ゲル電気泳動により測定した。次亜塩素酸ナトリウムを含有する、１％のアガロースゲルを使用して、測定を実施した。ＲＮＡリポプレックス試料は、ＤＮＡローディングダイにより、１：６に希釈した。１２μＬの、希釈ＲＮＡリポプレックス試料を、アガロースゲルへと、注意深くロードした。電気泳動を、８０Ｖ、４０分間の試行時間で実施した。
【０３９９】
実施例９
ＨＰＬＣ
異なるリポソーム製剤中の脂質濃度は、Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８  ２．５μｍ  ４．６×７５ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）と、２０５ｎｍの波長とを使用する、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）により測定した。移動相Ａは、７０％のメタノール／３０％のイソプロパノール／０．１％のＴＦＡの混合物であり、移動相Ｂは、５５％のメタノール／１５％のイソプロパノール／３０％の水／０．１％のＴＦＡの混合物であった。リポソーム試料は、水により、３ｍＭの全脂質濃度へと希釈するか、または希釈しないでおいた。
【０４００】
実施例１０
細胞培養物：インビトロにおける、樹状細胞内のＲＮＡトランスフェクション
ＲＮＡリポプレックス製剤は、異なるリポソーム前駆体およびｌｕｃ−ＲＮＡにより調製した。ＲＮＡリポプレックスは、細胞培養実験のために、０．９％のＮａＣｌ溶液により、０．０１ｍｇ／ｍＬのＲＮＡへと希釈した。異なるＲＮＡリポプレックス製剤の、ＲＮＡトランスフェクション効率は、培地中または全血中に播種された、ヒト樹状細胞内で探索した。
【０４０１】
実施例１１
動物モデル：脾臓のターゲティングおよび樹状細胞内のＲＮＡトランスフェクション
異なるＲＮＡリポプレックス製剤のトランスフェクション効率は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて探索した。２０μｇの製剤化ＲＮＡリポプレックスを、眼窩後注射し、樹状細胞（脾臓標的）内のルシフェラーゼ発現を、６時間後に測定した。ＲＮＡリポプレックスは、ｌｕｃ−ＲＮＡおよび異なるリポソーム前駆体、生コロイドから得られた、小型または大型のリポソーム、ならびに０．４５μｍの濾過の後における小型および大型のリポソーム、０．６５のＮ／Ｐ比、ならびに１１２ｍＭのＮａＣｌにより調製した。
【０４０２】
実施例１２
溶解度試験
高濃度（過飽和状態）のＤＯＰＥ含有溶液を調製し、リポソームを製造するためのエタノール注入（次節）に使用しうるのかどうかを調べた。この溶解度試験シリーズにおいて得られる結果を、表１および２に示す。
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2021500324.tif 000006
【０４０３】
これらの結果に従い、異なる供給元から購入されたＤＯＰＥは、約５０〜６０ｍＭ（室温）の、エタノール中の平衡溶解度を有する。しかし、カチオン性脂質であるＤＯＴＭＡとの共溶液を調製する場合、平衡溶解度は、著明に、例えば、モル比を６６：３３とするＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ共溶液を使用する場合、約９０〜１００ｍＭへと増大する。
【０４０４】
実施例１３
異なるサイズのリポソームの製造
リポソームは、実施例３で記載したプロトコールを使用する、エタノール注入により製造した。エタノール注入後に、濾過法は実施しなかった。他の全てのパラメータを固定したまま、エタノール中の脂質の濃度を変動させた。リポソームサイズおよびは、実施例５および６に記載した、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した。
【０４０５】
例として、％によるモル比を６６：３３とするＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ混合物から得られた、リポソームに関する結果を、表３（下記）ならびに図１および２に示す。
2021500324.tif 000007
【０４０６】
見られる通り、得られたリポソームのサイズ（Ｚ平均）は、エタノール注入に使用されるエタノール溶液中の脂質濃度と共に増大する。したがって、エタノール中の脂質の濃度は、リポソームのサイズを制御するために、効率的に使用することができる。興味深いことに、サイズの変化は、ＤＯＰＥ濃度が、エタノール単独中のＤＯＰＥの平衡溶解度を下回る場合、およびこれを上回る場合に最も顕著であった。ＤＯＰＥ濃度が、５０ｍＭ（１５０ｍＭの全脂質濃度）を上回った場合、得られるリポソームサイズは、＜５０ｎｍから、５００ｎｍを超えるサイズへと、大幅に増大した（図１）。しかし、溶解度限界を上回ってもまた、リポソームサイズは、脂質濃度の増大と共に、さらに単調に増大した。
【０４０７】
全てのリポソーム製剤中には、０．５μｍのリポソーム画分が存在し、このリポソーム画分は、３００ｍＭの脂質溶液により調製されたリポソーム内では増大し、低脂質濃度および高脂質濃度で調製されたリポソーム内では減少した。さらに、高脂質濃度で調製されたリポソーム製剤中では、０．６μｍおよび０．７μｍのリポソーム画分も測定された（図２）。高濃度の脂質溶液へのエタノール注入後には、大型のリポソームが形成された。形成されたリポソームの総量は、脂質溶液中の低脂質濃度で調製されたリポソーム製剤と比較して低量であった。得られた結果は、３回の測定による粒子の量の平均値を表した。
【０４０８】
実施例１４
異なるサイズのリポソームからの、ＲＮＡリポプレックスの製造
ＲＮＡリポプレックスは、他の全てのパラメータを固定したまま、それらの形成のためのリポソームのサイズを変動させる、異なるリポソーム前駆体を使用して、実施例４に記載される通りに製造した。リポソームサイズ（ｚ平均）および多分散指数（ＰＤＩ）は、実施例５および６に記載される、動的光散乱（ＤＬＳ）実験の経過において決定した。
【０４０９】
リポソーム調製物についての、脂質濃度の、ＲＮＡリポプレックスサイズ（Ｚ平均）に対する影響（および、したがって、リポソーム前駆体サイズに対する影響）に関する結果を、表４（下記）、ならびに対応する図３および４に示す。
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【０４１０】
この試験シリーズに従い、小型のリポソームから得られたＲＮＡリポプレックスは、大型のリポソームに由来するＲＮＡリポプレックスより小型であった。３００ｍＭおよびこれを上回る溶液により製造したリポソームから得られたＲＮＡリポプレックスは、１５０ｍＭの原液から得られたリポソームに由来するＲＮＡリポプレックスの約２倍であった。大型のリポソームにより調製された、全てのＲＮＡリポプレックス内で、リポソームサイズと、ＲＮＡリポプレックスサイズとの相関は見出されなかった（図３）。
【０４１１】
得られたＲＮＡリポプレックスの量は、それらの形成のために使用されるリポソームのサイズと共に増大した。大型のリポソームにより調製された製剤中では、高量の大型ＲＮＡリポプレックス粒子が測定されることから、動的光散乱測定から得られたデータが確認される（図４）。得られた結果は、３回の測定による粒子の量の平均値を表した。
【０４１２】
実施例１５
異なるリポプレックスによる小角度Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）
小角度のＸ線散乱実験は、異なる濃度の原液に由来するリポソームから得られたＲＮＡリポプレックスにより、記載される通りに実施した。例えば、ＲＮＡリポプレックスは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥを、２／１（モル／モル）とするリポソーム、および電荷比を１．３対２とするＲＮＡから形成した。リポソームは、エタノール中の脂質の濃度を、１００ｍＭ、３００ｍＭ、および４００ｍＭとして、記載される通りに、エタノール注入により製造した。
【０４１３】
４／１の電荷比（上）、および１．３／２の電荷比で調製されたリポソームにより形成されたＲＮＡリポプレックスによる小角度Ｘ線散乱測定から得られた回折曲線であって、リポプレックス形成のためのリポソームが、エタノール中に、４００ｍＭ、３００ｍＭ、および１００ｍＭの脂質原液により得られた場合の回折曲線を、図５に示す。
【０４１４】
散乱パターンは、約１ｎｍ−１の、単一のブラッグピークを含む。これは、過剰量の（負に帯電した）ＲＮＡを、リポプレックス形成のために使用した、脾臓ターゲティングリポプレックスについての、典型的な回折パターンである。リポプレックスが、負に帯電していない場合、散乱プロファイルは、完全に異なる。例として、電荷比を±４／１とするＲＮＡリポプレックスを測定したところ、はるかに曖昧なピークが見出された。同様に、二次ピークも識別可能である（低強度であるが）。実際、リポプレックスのｘ線散乱プロファイルの一般的特徴は、相状態に応じて、等距離の場合もあり、他の間隔を有する場合もある、いくつかのピークが存在することである。ここでは、これに対して、単一のピークだけが決定される。さらに、ピーク幅も、元来、リポソームを製造するために使用された、原液の濃度に応じて変化する。エタノール中の濃度が高い場合、ピーク幅は、小さかった。ブラッグピークは、リポプレックスが、規則的に配置されており、ここで、反復距離（ｄ間隔）は、
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［式中、ｑは、ｎ次とし、ｑｍａｘを、それぞれのブラッグピークが最大となる位置とし、λを波長とし、θを角度とする、
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による運動量移行である］
としてのピーク位置から与えられることを指し示す。ブラッグピークに由来しうるｄ間隔は、６．５ｎｍのオーダーである。
【０４１５】
ピーク幅であるΔｑは、スタック内の反復単位の数の増大と共に減少する。液晶アレイについて、相関長は、
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として与えられうる。本明細書におけるリポプレックス生成物では、散乱パターンの、前述の、リポソームを製造するための、エタノール中の脂質の濃度、および生物活性との明らかな相関を導出することができる。ピーク位置は、不変であるが、ピーク幅は、適用されたエタノール中の脂質の濃度と共に、単調に変化する。エタノール中の脂質の濃度の増大（リポソームサイズの増大をもたらす）は、ピーク幅の減少に対応し、したがって、大きな相関長に対応する。同時に、生物活性も、相関長の増大と共に増大する。したがって、活性を改善した、記載されるリポプレックスであって、その製造のためにエタノール中に高濃度の脂質原液を使用し、使用したリポソームから製造されるリポプレックスは、明らかな構造的特徴により、区別することができる。加えて、非対称場流動分画（ＡＦ４）のような、他の方法によってもまた、活性を改善した、記載されるリポプレックスを、低活性のリポプレックスから区別することができる。
【０４１６】
実施例１６
ヒト樹状細胞内の、ＲＮＡリポプレックスのトランスフェクション効率
ｌｕｃ−ＲＮＡリポプレックスは、他の全てのパラメータを固定したまま、それらの形成のためのリポソームのサイズを変動させる（それらの形成のための出発脂質濃度を変動させることにより）、異なるリポソーム前駆体を使用して、記載される通りに製造した。その後、異なるＲＮＡリポプレックス製剤の、ＲＮＡトランスフェクション効率は、培地中または全血中に播種された、ヒト樹状細胞内で探索した。
【０４１７】
ルシフェラーゼの発現と、異なるリポソーム前駆体により調製される、異なるＲＮＡリポプレックスの、対応する生物活性とを測定することにより決定される、インビトロ（ヒト樹状細胞）におけるトランスフェクション効率を例示する結果を、図６に示す。
【０４１８】
生物活性（インビトロにおけるＲＮＡトランスフェクション）は、ＲＮＡリポプレックスの相関長と共に、単調に増大する。大きな相関長は、ＲＮＡリポプレックス内の脂質二重層の、より均一な集団を指し示す。
【０４１９】
実施例１７
異なるリポプレックスの、非対称流動場流動分画
懸濁液中の粒子を、分画および分離するための、今日の、一般的かつ最新の方法である、非対称流動場流動分画（ＡＦ４）を使用して、ＲＮＡリポプレックスの、さらなる差違を決定した。ＡＦ４理論に従えば、同様の特性および同等のサイズを伴う粒子は、同時に溶出するとされる。
【０４２０】
エタノール中に１５０ｍＭの原液、またはエタノール中に４００ｍＭの原液から製造された、２つの異なる種類のリポソームに由来するリポプレックスの、ＡＦ４測定に関する一部の結果を、図７に示す。
【０４２１】
まとめると、場流動分画の測定は、エタノール中に１５０ｍＭの脂質濃度によるリポソームに由来するリポプレックスが、４００ｍＭの脂質濃度によるリポプレックスと、定性的、かつ、定量的に異なることを裏付ける。１５０ｍＭに由来するリポプレックスは、小型であるが、直感に反し、後で溶出するので、２つの部分の間には、定性的差違（形状、培地との相互作用、電荷）が見られるはずである。１５０ｍＭのエタノールによるＲＮＡリポプレックスは、後で溶出するが、サイズは小さい。これは、エタノール中に１５０ｍＭの脂質溶液を使用したリポソームから製造された、リポソームに由来するＲＮＡリポプレックスは、平均で、エタノール中に４００ｍＭの脂質に由来するＲＮＡリポプレックスより小型であることを指し示す。同じサイズであってもなお、１５０ｍｍに由来するリポプレックスは、４００ｍＭに由来するリポプレックスと異なる物理化学的特性を有する。これらの、サイズおよび物理化学的特性の差違は、４００ｍＭに由来するＲＮＡリポプレックスの高生物活性と相関する。
【０４２２】
実施例１８
インビトロにおけるＲＮＡリポプレックスの生物活性
記載される通りに、リポソーム、異なる脂質原液、および／または異なる脂質濃度から調製された、異なるサイズの、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡリポプレックスの、細胞培養物へのトランスフェクション実験（樹状細胞）により決定される通り、ルシフェラーゼシグナルは、したがって、生物活性は、脂質の出発濃度と共に、単調に増大し、したがって、ＲＮＡリポプレックス形成のために使用されたリポソームサイズと共に、単調に増大する。対応する結果を、図６、８、および９に示す。
【０４２３】
まとめると、リポソーム製造のために、高脂質濃度から作出されたＲＮＡリポプレックスは、インビトロにおいて、著明な高活性を呈示する。
【０４２４】
実施例１９
インビボにおけるＲＮＡリポプレックスの生物活性
異なるサイズのリポソームから調製された、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡリポプレックスの、細胞培養物へのトランスフェクション実験（樹状細胞）により決定される通り、大型のリポソームにより調製されたＲＮＡリポプレックスは、著明な高ルシフェラーゼの発現と、対応する生物活性とを結果としてもたらす。
【０４２５】
この試験シリーズの非限定的な例を、図１０および１１に示す。３６０ｍＭの生コロイドに由来する、大型のリポソームにより調製されたＲＮＡリポプレックスは、２００ｍＭの生コロイドに由来する小型のＲＮＡリポプレックスより著明な、インビボにおける発現シグナルをもたらす。
【０４２６】
実施例２０
ＲＮＡリポプレックスの自動式製造
ＲＮＡリポプレックスの自動式バッチ製造のために、図１２に示される、一般に適用可能な手順を開発した。全ての工程は、材料の、安全な無菌操作を可能とする、あらかじめ滅菌した、単回使用の流路を使用して実施する。まず、ＲＮＡの濃度を、リポソーム濃度に照らして調整し、ＲＮＡを濃縮するために、ＮａＣｌを添加する。これにより、ＲＮＡ溶液を、ＲＮＡ濃度に照らして調整することから、同一体積のＲＮＡと、リポソームとの混合を可能とする。ＲＮＡおよびリポソーム溶液の両方を、大容量シリンジへと移し、両方のシリンジを、単一のシリンジポンプへと取り付け、シリンジの２つのピストンを、同時に駆動する。ＲＮＡリポプレックス形成の後、低温保護剤溶液を添加し、薬物生成物の最終濃度を調整する。薬物生成物を、ガラス製のボトルへと充填した後で、薬物生成物を、長期保管のための濃縮物として凍結させる。
【０４２７】
ＲＮＡリポプレックスの、極めて重要な品質属性は、ＲＮＡとリポソームとの混合比により調整される電荷比である。混合比の効率的な制御を可能とする、ＲＮＡリポプレックスのための、自動式でスケーリング可能な産業的製造法を開発した。小スケール（≦１０リットル）の製造のための方法では、ＲＮＡまたはリポソームを充填した、２つの大容量シリンジを、同時に駆動する、単一の灌流ポンプを使用することにより、リポソームおよびＲＮＡを含有する、同一な体積の、２つの水溶液の混合の制御を達成する。大容量（≧１０リットル）の、等積駆出のためには、加圧容器、膜ポンプ、ギアポンプ、磁気浮揚ポンプ、または蠕動ポンプとしてのポンピングシステムを、流速のオンライン制御およびリアルタイム調整のためのフィードバックループを伴う流速センサーと組み合わせて使用する。
【０４２８】
自動式のＲＮＡリポプレックス製造のためには、ＲＮＡおよびリポソームを含有する水溶液の効率的な混合を確保する、静的混合要素が要求される。混合を増強するための、蛇行路および埋込み構造を含有する、市販のマイクロ流体型混合要素のほか、同等なアーキテクチャーを伴う試作の混合要素は、製造時に閉塞することが見出された。したがって、これらの混合要素は、ＲＮＡリポプレックスの自動式製造に適さない。直径を１．２〜５０．０ｍｍの間とする、Ｙ字型混合要素およびＴ字型混合要素は、ＲＮＡリポプレックスの自動式製造に適することが見出された。
【０４２９】
方法：ＲＮＡリポプレックスは、異なる混合要素（表１）を使用することにより調製した。リポプレックスの製造時に、作業者が、混合要素を観察し、材料の沈着または目詰まりを記録した。
【０４３０】
結果：市販のマイクロ流体チップ（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）では、３ｍＬのＲＮＡリポプレックスを調製した後で目詰まりが観察された。さらなる、試作のマイクロ流体混合要素（表５）についての試験時にも、同様の観察がなされた。市販の混合要素と同等なアーキテクチャーを含む、全ての（マイクロ）流体型混合要素について、沈着、特に、要素の閉塞を観察しえたのに対し、Ｙ字型混合要素またはＴ字型混合要素を使用する場合には、観察がなされなかった。直径を２．４ｍｍとする、記載されるｙ字型混合要素のほか、大直径の混合要素についても調べた。Ｙ字型混合要素の直径には、制限が見出されなかったので、記載される方法は、ｙ字型混合要素の、最大で５０ｍｍの直径で、ＲＮＡリポプレックスの調製に適すると考えられる。
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【０４３１】
Ｙ字型混合要素またはＴ字型混合要素を使用する場合、十分な混合を達成するために、最小限の流速が要求される。ＲＮＡリポプレックスの調製は、内径を１．６〜５０ｍｍとする、Ｙ字型混合要素またはＴ字型混合要素を使用することから、ＲＮＡおよびリポソームを含有する、２つの水溶液を混合することにより実施することができる。効率的な混合を確保するために、混合のための流速から得られるレイノルズ数は、約３００より低値とするべきではない。効率的な混合を確保するために、流速の、混合要素の直径に対する比は、約１５０より低値とするべきではない。約２１００までのレイノルズ数について実験し、自動式製造に適することを見出した。データは、高流速もまた実施可能であることを裏付ける。これは、レイノルズ数を２１００とするとき、条件は、既に、乱流モードであり、したがって、高流速であってもなお、同様の混合条件であることが予測される事実に由来する。
【０４３２】
方法：ＲＮＡリポプレックスは、単一の灌流ポンプを使用して、ＲＮＡ溶液およびリポソーム溶液を駆出することにより調製した。ＲＮＡリポプレックスの形成は、２．４および３．２ｍｍの内径を含む、代表的なＹ字型混合要素により実施した。ＲＮＡリポプレックスの粒子サイズおよび多分散性は、光子相関分光（ＰＣＳ）測定により解析した。流速と混合要素の直径との組合せの探索から得られるレイノルズ数は、式を使用して、理論的に計算した（図１３）。流速の、混合要素の直径に対する比は、流速（ｃｍ３／分）を、混合要素の直径（ｃｍ）で除することにより計算した。因数は、無次元数として与えられる。
【０４３３】
結果：約３００を下回るレイノルズ数の理論計算値を結果としてもたらす、流速と混合要素との組合せにより、ＲＮＡリポプレックスを製造する場合に、粒子サイズおよび多分散性を増大させたＲＮＡリポプレックスが形成される（図１３および表６）。理論的に、所望の粒子特性を伴うＲＮＡリポプレックスの、再現可能な形成を確保するためには、レイノルズ数は、約３００の最小値（図１３および１４および表６）であるべきであり、流速の、混合要素の直径に対する比は、約１５０の最小値であるべきである。２．４ｍｍの混合要素が、広範な流速（６０〜２４０ｍＬ／分）において、ＲＮＡおよびリポソームの、効率的、かつ、再現可能な混合を可能とすることが見出された。これらの研究では、上限が見出されなかったので、レイノルズ数または流速の、混合要素の直径に対する比の上限は予測されない。
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【０４３４】
実施例２１
ＲＮＡ濃度の影響
ＲＮＡリポプレックスは、代表的な寸法（２．４ｍｍ）を伴う、ｙ字型混合要素により調製した。現行の設定で、ＲＮＡリポプレックスを調製しうる濃度範囲を同定するために、ＲＮＡ濃度を、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍｇ／ｍＬにおいて、体系的に変動させた。形成されたリポプレックスの安定性を探索するために、最終的な製剤を、０．０５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡ、２２％のショ糖、および２０ｍＭのＮａＣｌへと調整し、製剤を、３回にわたり凍結させた。
【０４３５】
ＲＮＡリポプレックス形成時におけるＲＮＡ濃度を、０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬの間とする、ＲＮＡリポプレックスの形成は、同等な粒子特性（図１５）を結果としてもたらす。このような粒子の粒子特性はまた、３時間にわたる凍結時にも保存されたことから、ＲＮＡ濃度の変動に関して、極めて頑健な製造法が指し示される（図１６）。ＲＮＡリポプレックスの調製時におけるＲＮＡ濃度の限界については、示唆がなされていないので、記載される設定は、ＲＮＡ濃度を、最大で５ｍｇ／ｍＬとするときの、ＲＮＡリポプレックスの調製に適すると考えられる。
【０４３６】
ＲＮＡリポプレックスの自動式製造のための、記載される方法は、異なる電荷比を伴う、安定的なＲＮＡリポプレックスの、再現可能な調製を可能とする。
【０４３７】
方法：ＲＮＡリポプレックスの半自動式調製の、電荷比（ｒａｔｉｏｎ）に関する頑健性を実証するために、このパラメータを、１．０：２．０〜２．１：２．０および２．０：１．０〜５．０：１：０において、体系的に変動させた。ＲＮＡリポプレックスの粒子サイズおよび多分散性は、光子相関分光（ＰＣＳ）測定により解析した。
【０４３８】
結果：１．０：２．０〜２．１：２．０の間の電荷比では、電荷比の変動の、ＲＮＡリポプレックスのサイズおよび多分散性に対する影響は、見出されなかった（図１７）。したがって、１．０：２．０〜２．１：２．０の間の範囲は、品質が同等な、ＲＮＡリポプレックス調製物を結果としてもたらすと考えられる。加えて、サイズおよび多分散性が規定された、安定的な粒子は、３．０：１．０〜５．０：１．０の間の電荷比でも形成された（図１８）。
【０４３９】
実施例２２
ＲＮＡリポプレックス形成時における塩濃度
高生物活性を含むＲＮＡリポプレックスの自動式製造のためには、ＲＮＡリポプレックス形成時における、イオン条件の制御が要求される。生物活性を確保するために、ＲＮＡリポプレックスの形成は、４５〜３００ｍＭのＮａＣｌの存在下で実施しなければならない。他のイオン性化合物、例えば、ＥＤＴＡ、ＨＥＰＥＳなどは、イオン強度に寄与し、要求される、ＮａＣｌの最小濃度を低減しうる。
【０４４０】
方法：ＲＮＡリポプレックスは、ＲＮＡリポプレックス形成時の、異なるＮａＣｌ濃度で、自動調製した。ＲＮＡリポプレックスの粒子サイズおよび多分散性は、光子相関分光（ＰＣＳ）測定により解析した。加えて、リポプレックスの生物活性は、インビトロにおいて、ルシフェラーゼシグナルを測定することにより探索した。
【０４４１】
結果：粒子特性は、イオン強度を調整することにより制御することができた。製造時における塩濃度の上昇は、粒子サイズのわずかな増大を誘導した（図１９）。塩濃度は、生物活性に対して影響を及ぼすことが見出された。製造時における塩濃度の上昇は、生物活性の増大を誘導した（図２０）。したがって、ＲＮＡリポプレックス形成時におけるＮａＣｌ濃度は、４５ｍＭのＮａＣｌより低くすべきではない。
【０４４２】
実施例２３
ＲＮＡリポプレックスの安定化
低温保護剤の存在下および非存在下の両方における、ＲＮＡリポプレックス内のＲＮＡを安定化させるために、リポプレックス内のＲＮＡを、ｐＨ５．５〜６．７のｐＨ範囲内に安定化させるための、ＨＥＰＥＳ、酢酸／酢酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウムとしてのバッファーシステムを使用することができる。炭酸ナトリウムシステムは、同等な安定化の有効性を結果としてもたらさないことが見出された。
【０４４３】
方法：最適のｐＨ範囲について探索し、異なるｐＨ範囲（ＨＥＰＥＳ：ｐＨ６．８〜８．２、酢酸／酢酸ナトリウム：ｐＨ３．７〜５．６、リン酸ナトリウム：ｐＨ５．８〜８．０、および炭酸ナトリウム：ｐＨ６．２〜８．６）を対象とする、異なるバッファリング薬剤について調べるため、まず、ＲＮＡリポプレックスを、低温保護剤の非存在下の、ストレス条件（４０℃）下でインキュベートする。ＲＮＡの完全性は、２１日間、キャピラリー電気泳動により解析した。例示的低温保護剤の存在下で、最適のｐＨ範囲を探索するために、ＲＮＡリポプレックスを、ＨＥＰＥＳおよびショ糖の存在下、４０℃でインキュベートし、ＲＮＡの完全性を、２１日間解析した。
【０４４４】
結果：バッファリングシステムである、ＨＥＰＥＳ、酢酸／酢酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウムについては、同等な結果が得られたのに対し、炭酸塩システムは、ＲＮＡの同等な安定化を結果としてもたらさなかった（図２１）。ＲＮＡの完全性は、製剤のｐＨ値に依存する。最適のｐＨ範囲は、ｐＨ５．５〜７．４の間の範囲にあることが同定された。例示的な低温保護剤であるショ糖の存在下で、ＲＮＡの、最良の安定化を結果としてもたらす、ｐＨ５．５〜８．０のｐＨ範囲が同定された（図２２）。
【０４４５】
ＲＮＡ合成法から、二価の金属イオンが生じる場合があり、製剤の賦形剤またはガラス製容器および缶は、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼしうる。ＥＤＴＡ二ナトリウム塩は、アルカリ土類金属および重金属イオンと共に、安定的な水溶性の複合体を形成する。ＥＤＴＡ二ナトリウム塩は、ＲＮＡリポプレックス形成時に存在する、イオンの濃度に寄与し、これにより、生物活性のＲＮＡリポプレックスを調製するために要求される、ＮａＣｌの濃度を低減する。ＥＤＴＡ（０〜２０ｍＭ）の存在下における、ＲＮＡリポプレックスの形成は、記載される方法により可能である。
【０４４６】
方法：ＲＮＡリポプレックスを、漸増濃度のＥＤＴＡ（最大で１８ｍＭ）存在下で形成し、希釈したら、４０℃で、ＥＤＴＡ含有量を低減して（０．１ｍＭ〜５．４ｍＭ）インキュベートした。ＲＮＡの完全性を、２１日間、鍵となる物理化学的パラメータとして解析した。
【０４４７】
結果：高濃度のＥＤＴＡ（最大で１８ｍＭ）の存在下における、ＲＮＡリポプレックスの形成は、低濃度のＥＤＴＡの存在下における調製物と同等な粒子特性を結果としてもたらすことが見出された。保管時における、０．０１％（ｗ：ｖ）（０．１ｍＭ）〜０．２％（ｗ：ｖ）（５．４ｍＭ）の間のＥＤＴＡを含有する、異なる群の間では、有意差が見出されなかった（図２３）。ＥＤＴＡ二ナトリウム塩は、ＲＮＡリポプレックス形成時に存在するイオン濃度に寄与し、ＲＮＡの完全性を減殺する可能性がある、二価金属イオンのスカベンジャーとして作用しうるので、ＲＮＡリポプレックス形成時における、最大で２０ｍＭのＥＤＴＡ濃度の存在は、有利であると考えられる。
【０４４８】
実施例２４
ＮａＣｌおよび低温保護剤の含有量の最適化
調整されるイオン条件は、ＲＮＡリポプレックスの製造時、長期にわたる保管時、および患者への適用時に調整する必要がある（図２４）。ＮａＣｌの濃度は、ＲＮＡリポプレックスの形成時に、４５〜３００ｍＭであることが可能であり；凍結状態にあるＲＮＡリポプレックスの、長期にわたる保管時に、１０〜５０ｍＭであることが可能であり；融解および生理食塩水による希釈の後において、８０〜１５０ｍＭでありうる。
【０４４９】
複数回の凍結時における、粒子特性の安定化を確保するために、≦７０ｍＭの、各ＮａＣｌ濃度について、これを下回るべきではない、それぞれの含有量の低温保護剤を見出した。低温保護剤として、１２．５〜３５．０％（ｗ：ｖ）の間の濃度の、グルコース、ショ糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、グリセリンとしてのトリオール、およびこれらの混合物など、単分子または二分子の糖類を使用することができる。ソルビトールの安定化有効性は、直前の化合物と比較して低度であり、アルギニンは、凍結時において、ＲＮＡリポプレックスを、効率的に安定化させない。
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【０４５０】
方法：適切な低温保護剤を同定するために、単糖類（グルコースおよびソルビトール）、二糖類（ショ糖およびトレハロース）、アミノ酸（アルギニン、プロリン）、トリオール（グリセリン）に代表的な、異なる化合物、ならびに異なる糖類（マンニトールおよびショ糖）の混合物を含有する低温保護システムを探索した（図２５および２６）。したがって、ＲＮＡリポプレックスを、濃度を増大させた、これらの化合物の存在下で凍結させた。ＮａＣｌを、ある特定の濃度とするときの、低温保護剤の最小の含有量を同定するために、ＲＮＡリポプレックスを、量を増大させる、代表的な低温保護剤としての、ショ糖またはトレハロースの存在下で凍結させた（表７）。探索される低温保護剤の濃度範囲を、詳細に決定するために、まず、試料を、単回凍結させた。第３の実験において、低温保護剤であるトレハロースの存在下で、ＲＮＡリポプレックスを、最大で１０回にわたり凍結させることにより、粒子サイズの安定化の有効性を吟味した（表８）。
【０４５１】
結果：アルギニンが、明らかに、ＲＮＡリポプレックスを不安定化させるのに対し、他の低温保護剤は、一般に、凍結時における、ＲＮＡリポプレックスの安定化に適用可能である（図２５および２６）。グリセリン、マンニトール、およびショ糖（１：１、ｗ：ｗ）、プロリン、ならびにソルビトールは、ＲＮＡリポプレックスのための低温保護剤として使用することができる。アルギニンに加え、全てのさらなる被験安定剤は適すると考えられることから、広範にわたるアミノ酸、糖類、およびこのような化合物の混合物が、凍結時における、ＲＮＡリポプレックスの安定化に適することが指し示される。ソルビトールの安定化有効性は、直前の化合物と比較した場合、低度である。
【０４５２】
各濃度のＮａＣｌで要求される低温保護剤の量を、詳細に探索したところ（表８）、単回の凍結工程の後で、ＮａＣｌ濃度と、要求される低温保護剤の濃度との、直接的な相関が見出された（図２７および２８）。０〜６０ｍＭのＮａＣｌ、２０％（ｗ：ｖ）のショ糖またはトレハロース二水和物について、単回の凍結工程の後で、粒子サイズの、許容可能な保存が見出されたのに対し、低百分率の低温保護剤（例えば、６０ｍＭのＮａＣｌについて、≦１５％；４０ｍＭのＮａＣｌについて、≦１０％；２０ｍＭのＮａＣｌについて、≦５％）では、不十分な安定化が見出された。探索された範囲内の、ショ糖と、トレハロースとの間のでは、差違が見出されなかった。
【０４５３】
表９．３．２に示される、ＮａＣｌと、トレハロースとの組合せの存在下、１、２、３、５、および１０回にわたる凍結の後において、ＲＮＡリポプレックスの粒子サイズを解析したところ、以下の結果が得られた。５０ｍＭのＮａＣｌの濃度では、≧１２．５％のトレハロースが、１０時間にわたる凍結の後であってもなお、ＲＮＡリポプレックス粒子の特性の安定化に十分であったのに対し（図２９）、７０ｍＭのＮａＣｌでは、≧１２．５％が、最小限の安定化に要求され、≧２２．５％が、粒子サイズの正確な保存に要求された（図３０）。９０ｍＭのＮａＣｌでは、≧１５．０％のトレハロースが、最小限の安定化に要求され、粒子サイズの正確な保存は、≧２７．５％の最高探索濃度によってもなお、達成することができなかった（図３１）。
【０４５４】
実施例２５
長期の保管のための、塩と低温保護剤との組合せ
所与の温度における、長期にわたる保管のためには、表９に列挙された、ＮａＣｌと、低温保護剤との組合せを使用すべきである。
【０４５５】
方法：−１５〜−３０℃、ある特定の濃度のＮａＣｌで、長期にわたる保管のための、低温保護剤の最小の含有量を探索するために、ＲＮＡリポプレックスを、ＮａＣｌと、ショ糖またはトレハロースとの組合せの存在下で凍結させた。試料を、−３０℃で凍結させ、次いで、長期にわたる保管のために、それぞれの温度へと移行させた（−１５または−３０℃）。規定された保管期間の後に、試料を解析し、ＰＣＳを使用して、粒子サイズを測定することにより、コロイドの安定性の保存について解析した。
【０４５６】
結果：これらの実験では、最大で７０ｍＭのＮａＣｌの存在下における凍結時に、ＲＮＡリポプレックスの粒子特性を保存しうる一方で、コロイドの安定性の不安定化に寄与するさらなる影響も観察することができた。また、例えば、６０ｍＭのＮａＣｌと、２０％のショ糖との組合せについて、凍結の後における、粒子特性の許容可能な安定化も確認したところ、−１５℃の保管温度では、これらの製剤の粒子サイズは、時間経過にわたり、有意に増大した（図３２および３３）。この影響は、−３０℃における保管時に低減された（図３４および３５）。
【０４５７】
所与のＮａＣｌ含有量では、ＲＮＡリポプレックスの安定性は、低温保護剤の量に依存する。必要とされる低温保護剤の量は、塩の、保管溶液中含有量の増大と共に増大する。この効果は、低温保護剤として使用される糖の種類に依存しない。−１５または−３０℃の凍結状態における、長期にわたる保管のための、ＲＮＡリポプレックスの組成物は、表９に列挙された含有量の低温保護剤を含有すべきである。
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【０４５８】
実施例２６
異なる低温保護剤による、長期にわたる保管
２２％（ｗ：ｖ）の、単分子または二分子の糖類の存在下における、９カ月間にわたる安定化は、１０〜４０ｍＭのＮａＣｌにより可能である。これらの製剤は、−１５〜−４０℃で凍結させ、長期にわたる保管のために、それぞれの温度に保つことができる。１２．６〜１６．８％（ｗ：ｖ）のデキストランの存在下では、１０〜３０ｍＭのＮａＣｌが使用可能である。
【０４５９】
方法：−２０℃における、長期にわたる保管に要求される、ショ糖、トレハロース、グルコース、およびデキストランを含む混合物としての、最小含有量の、代表的な低温保護剤を探索するために、ＲＮＡリポプレックスを、変動させるＮａＣｌ濃度を、一定の低温保護剤含有量と組み合わせて凍結させた。グルコース、ショ糖、およびトレハロースとしての、モノマー分子またはダイマー分子の低温保護剤について、濃度を２２％（ｗ：ｖ）に調整した。これらの製剤を凍結させ、−１５〜−４０℃で保管し、規定された保管時間の後、ＰＣＳを使用して、粒子サイズを測定することにより、長期にわたる安定性を探索した。
【０４６０】
表９．５．１に列挙された、ポリマーであるデキストラン組成物の混合物を含有する製剤を調整した。試料を凍結させ、−２０℃で保管した。規定された保管時間の後、試料を解析し、粒子サイズを測定することにより、コロイド安定性の保存を解析した。
【０４６１】
結果：凍結状態における、長期にわたるＲＮＡリポプレックスの安定化を確保するために、全ての、探索される、モノマー分子またはダイマー分子の低温保護剤について、これを超えるべきではない、最大のＮａＣｌ濃度を見出した。６０および８０ｍＭのＮａＣｌが、リポプレックスの、急速な不安定化を結果としてもたらしたのに対し、ＮａＣｌ濃度を、≦４０ｍＭとしたところ、−２０℃で保管した場合、コロイド特性を、最短で９カ月間保存することができた（表１０および図３６〜３８）。ショ糖、トレハロース、およびグルコースについて、安定化有効性の差違を見出すことはできなかった。２０ｍＭのＮａＣｌを含む製剤について、試料を凍結させ、−１５〜−４０℃で保管したところ、長期にわたる安定性の差違を見出すことはできなかった（図３９）。
【０４６２】
低温保護剤の含有量が低量である（１２．６〜１６．８％（ｗ：ｖ））、デキストランを含有する製剤について探索したところ、安定化の有効性は、単分子または二分子の糖類と比較する場合に、同等なまたは良好である（図４０）。
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【０４６３】
実施例２７
凍結乾燥
ａ）凍結融解
最も有効な低温／凍結乾燥保護剤濃度を決定するために、凍結融解研究を実施した。ＲＮＡリポプレックス製剤を、１０％、１５％、２０％、２５％、および３０％のトレハロースを添加した、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、８０ｍＭのＮａＣｌ、２．６ｍＭのＥＤＴＡ中で凍結融解させた。粒子サイズは、−２０℃での保管の前および後において決定した。トレハロースの非存在下で凍結させた製剤中では、粒子の凝集が観察されたので、それらの粒子サイズを決定しなかった。図４１に従い、低温／凍結乾燥保護剤と共に凍結させた製剤は、濃度依存性の低温保護を示し、粒子サイズは、低凍結乾燥／低温保護剤濃度で増大した。２２％ｗ／ｖのトレハロースでは、Ｓｆ／Ｓｉを１．０４とし、１．３未満であるので、なおも許容可能であると考えられる（Ｓｆ＝最終サイズ、Ｓｉ＝初期サイズ）、粒子サイズの、最小限の増大だけが観察された。低トレハロース濃度では、Ｓｆ／Ｓｉ比が増大した。凍結融解研究から得られたＳｆ／Ｓｉ比は、凍結乾燥および再構成の後で、同じ製剤から得られたＳｆ／Ｓｉ比と相関する。
【０４６４】
ｂ）再構成および粒子の安定性
５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．６ｍＭのＥＤＴＡ、０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭのＮａＣｌ、ならびに５％、１０％、１５％、および２２％のトレハロース中で調製された、ＲＮＡリポプレックス製剤を凍結乾燥させた。全ての凍結乾燥試料は、良好なケーキ様外観を呈した。試料は、０．９％のＮａＣｌ溶液により、元の体積で再構成した。全ての凍結乾燥ＲＮＡリポプレックス製剤は、０．９％のＮａＣｌ溶液またはＷＦＩによる再構成時に、速やかに溶解させた。０．９％のＮａＣｌ溶液または水による再構成の後における、２２％のトレハロース中で調製された、凍結乾燥ＲＮＡリポプレックス製剤中の、粒子サイズの変化を決定した。
【０４６５】
図４２に従い、凍結乾燥および再構成の後で、粒子サイズは、トレハロースを含有する、全ての凍結乾燥ＲＮＡリポプレックス製剤中で、安定を維持した。凍結乾燥試料を、０．９％のＮａＣｌで再構成した場合、水で再構成された凍結乾燥試料と比較して、ＲＮＡリポプレックスのサイズの、わずかな減少が観察された。ＮａＣｌの、トレハロースに対する比と、粒子の安定性との相関が観察された。低濃度のトレハロースおよび高ＮａＣｌ濃度で調製された製剤中では、ＲＮＡリポプレックス粒子のサイズが増大した。
【０４６６】
ｃ）凍結乾燥ＲＮＡリポプレックス製剤による細胞培養実験
２２％のトレハロース中、異なるＮａＣｌ濃度で調製された、凍結乾燥させた、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡリポプレックス製剤についての、インビトロにおけるトランスフェクション実験を実施した。凍結乾燥試料は、０．９％のＮａＣｌ溶液により再構成した。
【０４６７】
図４３に従い、２２％のトレハロースおよび異なるＮａＣｌ濃度で調製された、凍結乾燥ＲＮＡリポプレックス製剤は、樹状細胞内で、同様のｌｕｃ−ＲＮＡトランスフェクションレベルを示した。ＲＮＡリポプレックス製剤中に存在するＮａＣｌ濃度と、インビトロにおけるＲＮＡトランスフェクションとの相関は、見出されなかった。凍結乾燥試料は、トランスフェクションされていないＲＮＡリポプレックスコントロールと比較して、同様であるか、なおまたは良好な、ｌｕｃ−ＲＮＡトランスフェクションを示した。
【０４６８】
ｄ）安定性研究
１０％のトレハロース、２２％のトレハロース、ならびに０ｍＭ、２０ｍＭ，４０ｍＭ、６０ｍＭ、および８０ｍＭのＮａＣｌを含有する、凍結乾燥ＲＮＡリポプレックス製剤を、安定性研究のために、４℃、２５℃、および４０℃で（１カ月間および６カ月間）探索した。０．９％のＮａＣｌ溶液による、元の体積における再構成の後、粒子サイズおよびＲＮＡの完全性（完全長ＲＮＡ％）について、試料の特徴を明らかにした。
【０４６９】
図４４および４５に従い、異なるＲＮＡリポプレックスのサイズは、時間経過にわたり、製剤または保管温度から独立に、有意には変化しなかった。興味深いことに、低量の低温保護剤（例えば、１０％）が、凍結乾燥製剤中の粒子安定性を維持するのに十分であるのに対し、高量（例えば、２２％）は、凍結製剤の場合に要求される。４℃で、６カ月間にわたる保管の後における、凍結乾燥試料中のＲＮＡの完全性（完全長ＲＮＡ％）は、９４％〜１００％の間で変動し、２５℃で保管されたＲＮＡ（ｌｉｐ）製剤では、８５％〜９４％の間で変動した。しかし、トレハロースの、ＮａＣｌ濃度に対する比、または保管時間との相関は同定されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【国際調査報告】
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