(57)【要約】  ジスルフィド結合再酸化を使用する、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)などの高純度組み換えタンパク質の産生方法が提供される。特に、本発明は、部分分子を含む出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤(例えば、システイン)および少なくとも一つのチオール酸化剤(例えば、シスチン)を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、部分分子(例えば、抗体断片)を完全分子(例えば、完全抗体)に変換する方法を提供する。開示される方法は、例えば、タンパク質精製中の部分分子の形成の防止もしくは軽減または部分分子(例えば、部分的に分解医薬製品)を含む溶液の再加工もしくはレスキューに使用され得る。
2021534151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発溶液における部分分子を完全分子に変換する方法であって、部分分子を含む出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法。
【請求項２】
部分分子を含む出発溶液から完全分子を精製または単離する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法。
【請求項３】
出発溶液における部分分子の形成を防止または低減する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子の形成を防止または低減する、方法。
【請求項４】
部分分子を含む出発溶液を再加工する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤および少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法。
【請求項５】
出発溶液中、
(ｉ)遊離チオールの濃度の決定；
(ii)部分分子の濃度の決定；
(iii)完全分子の純度または濃度の決定；
(iv)ジスルフィド還元を引き起こす酵素の存在または活性の決定；または
(ｖ)これらの何れかの組み合わせ
をさらに含む、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
遊離チオール濃度が約１００μMより高いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
非還元条件(ＣＥ−ＮＲ)下、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)ベースのアッセイを使用して決定して、部分分子の濃度が約１０％より高いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
非還元条件(ＣＥ−ＮＲ)下、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)ベースのアッセイを使用して決定して、完全分子の純度または濃度が９０％未満であるならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ジスルフィド還元を引き起こす酵素が、チオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼおよび／またはグルタチオン／グルタチオンレダクターゼなどの細胞内成分である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
(ｉ)チオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼの濃度が所定の閾値を超える；
(ii)チオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼ活性が所定の閾値を超える；
(iii)グルタチオン／グルタチオンレダクターゼの濃度が所定の閾値を超える；
(iv)グルタチオン／グルタチオンレダクターゼ活性が所定の閾値を超える；または
(ｖ)これらの何れかの組み合わせ
であるならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
再酸化を溶液中で実施する、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
再酸化を基質上で実施する、請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
基質がクロマトグラフィー媒体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
クロマトグラフィー媒体がクロマトグラフィー樹脂である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
クロマトグラフィー樹脂が親和性樹脂である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
親和性樹脂がプロテインＡ親和性樹脂である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プロテインＡ親和性樹脂がMabSelect SuRe樹脂である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
基質がカチオン交換基質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
カチオン交換基質がカチオン交換クロマトグラフィー(ＣＥＸ)樹脂である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
基質が疎水性相互作用基質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
疎水性相互作用基質が疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)樹脂である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
部分分子の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％が、再酸化後完全分子に変換される、請求項１〜２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
完全分子および部分分子が組み換えタンパク質である、請求項１〜２２の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
組み換えタンパク質が哺乳動物細胞で発現される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ＨＥＫ２９３細胞、マウス骨髄腫(ＮＳ０)、ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ)、サル腎線維芽細胞(ＣＯＳ−７)、メイディン・ダービー・ウシ腎臓細胞(ＭＤＢＫ)またはこれらの何れかの組み合わせである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
完全分子が抗体または融合タンパク質である、請求項１〜２５の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
融合タンパク質抗体またはその一部を含むイムノコンジュゲートである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
モノクローナル抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
出発溶液が採集細胞培養液上清、ライセート、濾液または溶離液を含む、請求項１〜２９の何れかに記載の方法。
【請求項３１】
出発溶液が精製した物質を含む、請求項１〜２９の何れかに記載の方法。
【請求項３２】
精製した物質が医薬製品である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
出発溶液が抗体断片を含む、請求項１〜３２の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
抗体断片がＨＨＬ、ＨＨ、ＨＬ、Ｈ、Ｌまたはこれらの何れかの組み合わせを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
レドックスペアがクロマトグラフィー緩衝液に存在する、請求項１〜３４の何れかに記載の方法。
【請求項３６】
クロマトグラフィー緩衝液が洗浄緩衝液である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
レドックスペアが「システイン、シスチン、グルタチオン(ＧＳＨ)、酸化グルタチオン(ＧＳＳＧ)、システイン誘導体、グルタチオン誘導体またはこれらの何れかの組み合わせを含む、請求項１〜３６の何れかに記載の方法。
【請求項３８】
レドックスペアがシステインおよびシスチンを含む、請求項１〜３７の何れかに記載の方法。
【請求項３９】
レドックスペアが
(ｉ)０〜１０mMシステイン、
(ii)０〜０.５mMシスチン、
(iii)０〜１０mMグルタチオンまたは
(iv)これらの何れかの組み合わせ
を含み、ここで、シスチンの濃度または還元グルタチオンが少なくとも０.１mMである、請求項１〜３８の何れかに記載の方法。
【請求項４０】
チオール還元剤対チオール酸化剤の比が０：１〜１０：１である、請求項１〜３９の何れかに記載の方法。
【請求項４１】
レドックス緩衝液のｐＨが約５〜約１０である、請求項１〜４０の何れかに記載の方法。
【請求項４２】
ｐＨが約７〜約９である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ｐＨが約８である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
レドックス緩衝液が電導度＜１００mS／cm、＜９５mS／cm、＜９０mS／cm、＜８５mS／cm、＜８０mS／cm、＜７５mS／cm、＜７０mS／cm、＜６５mS／cm、＜６０mS／cm、＜５５mS／cm、＜５０mS／cm、＜４５mS／cm、＜４０mS／cm、＜３５mS／cm、＜３０mS／cm、＜２５mS／cm、＜２０mS／cm、＜１５mS／cmまたは＜１０mS／cmを有する、請求項１〜４３の何れかに記載の方法。
【請求項４５】
レドックス緩衝液が電導度＜５mS／cmを有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
方法が約４℃〜３４℃の範囲の温度で操作される、請求項１〜４５の何れかに記載の方法。
【請求項４７】
方法が室温で操作される、請求項１〜４６の何れかに記載の方法。
【請求項４８】
レドックス緩衝液が約０.５mMシステインおよび約０.３mMシスチンを含む、請求項１〜４７の何れかに記載の方法。
【請求項４９】
レドックス緩衝液が約１mMシステインおよび約０.３mMシスチンを含む、請求項１〜４８の何れかに記載の方法。
【請求項５０】
再酸化時間が約３０分〜約８時間である、請求項１〜４９の何れかに記載の方法。
【請求項５１】
レドックス緩衝液が、１mMシステイン、０.３mMシスチン、ｐＨ８、２０℃で電導度＜７.３mS／cmを含む、請求項１〜５０の何れかに記載の方法。
【請求項５２】
完全分子の濃度が、再酸化後少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または１００％増加する、請求項１〜５１の何れかに記載の方法。
【請求項５３】
方法１〜５２の何れかにより製造される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１８年８月１５日出願の米国仮出願６２／７６４６５２および２０１９年６月１９日出願の米国仮出願６２／８６３４６７の優先権の利益を主張し、これらは引用により全体として本明細書に包含させる。
【０００２】
発明の背景
分野
本発明は、チオール基再酸化を使用して、タンパク質精製中タンパク質断片から完全タンパク質(full proteins)を産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
組み換えモノクローナル抗体(ｍＡｂ)は、その高い特異性および長い半減期により、最も有力な生物学的治療剤である。ｍＡｂの製法開発において、高分子量凝集体(ＨＭＷ)および低分子量タンパク質断片(ＬＭＷ)は、付随する免疫原性のリスク増加および薬物有効性に対する影響の可能性のために、適切なレベルまで除去されなければならない。さらに、これらの産物変化体は、保存期間を短くし、生産物の保存中の安定性に対するリスクを引き起こし得る(Rosenberg, AAPS J. 2006 8(3):E501-E507; Fan et al., Breast Cancer Res. 2012 14(4) R116)。
【０００４】
商業的治療抗体製造は複雑であるが、かなり確立されたプロセスであり、一般に哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)でのタンパク質発現、遠心分離またはデプス濾過を使用する採集、不純物を除去するための一連のクロマトグラフィー工程、続いて医薬製品を産生するための物質を含む。近年、高力価哺乳動物細胞培養プロセスの開発と共に、小分子量種(例えば、完全抗体ではなく遊離抗体軽鎖または重鎖)の存在による顕著なサンプル汚染をもたらす、ジスルフィド結合の還元が細胞培養採集後にしばしば観察されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多くの低減戦略は、ＬＭＷタンパク質産物のレスキューではなく、ジスルフィド結合還元によるＨＭＷ凝集の防止またはＨＭＷ種の脱凝集に焦点が絞られている。従って、ＬＭＷ断片の出現を最小化しながら、単量体タンパク質(例えば、完全抗体)の収率を上げる新規戦略が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の簡単な説明
本発明は、出発溶液における部分分子を完全分子に変換する方法であって、部分分子を含む出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法を提供する。また提供されるのは、部分分子を含む出発溶液から完全分子を精製または単離する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法である。
【０００７】
本発明はまた、出発溶液における部分分子の形成を防止または低減する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子の形成を防止または低減する、方法も提供する。また提供されるのは、部分分子を含む出発溶液から完全分子を精製し単離する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤および少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法である。
【０００８】
ある態様において、ここに開示する方法は、さらに(ｉ)出発溶液中の遊離チオールの濃度の決定；(ii)出発溶液中の部分分子の濃度の決定；(iii)出発溶液中の完全分子の純度または濃度の決定(例えば、出発溶液中の完全抗体に対応する免疫グロブリンタンパク質含量の％)；(iv)出発溶液中のジスルフィド還元を引き起こす酵素の存在または活性の決定；または(ｖ)これらの何れかの組み合わせを含む。
【０００９】
ある態様において、遊離チオール濃度が約１００μMより高いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。ある態様において、非還元条件(ＣＥ−ＮＲ)下、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)ベースのアッセイを使用して決定して、部分分子の濃度が約１０％より高いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。ある態様において、非還元条件(ＣＥ−ＮＲ)下、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)ベースのアッセイを使用して決定して、完全分子の純度または濃度が９０％未満であるならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。
【００１０】
ある態様において、ジスルフィド還元を引き起こす酵素は、チオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼおよび／またはグルタチオン／グルタチオンレダクターゼなどの細胞内成分である。ある態様において、(ｉ)チオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼの濃度が所定の閾値を超える；(ii)チオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼ活性が所定の閾値を超える；(iii)グルタチオン／グルタチオンレダクターゼの濃度が所定の閾値を超える；(iv)グルタチオン／グルタチオンレダクターゼ活性が所定の閾値を超える；または(ｖ)これらの何れかの組み合わせであるならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。
【００１１】
ある態様において、再酸化を溶液中で実施する。ある態様において、再酸化を基質上で実施する。ある態様において、基質はクロマトグラフィー媒体である。ある態様において、クロマトグラフィー媒体はクロマトグラフィー樹脂である。ある態様において、クロマトグラフィー樹脂は親和性樹脂である。ある態様において、親和性樹脂はプロテインＡ親和性樹脂である。ある態様において、プロテインＡ親和性樹脂はMabSelect SuRe樹脂である。
【００１２】
ある態様において、基質はカチオン交換基質である。ある態様において、カチオン交換基質はカチオン交換クロマトグラフィー(ＣＥＸ)樹脂である。ある態様において、基質は疎水性相互作用基質である。ある態様において、疎水性相互作用基質は疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)樹脂である。ある態様において、部分分子の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％が、再酸化後完全分子に変換される。
【００１３】
ある態様において、完全分子および部分分子は組み換えタンパク質である。ある態様において、組み換えタンパク質は哺乳動物細胞で発現される。ある態様において、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ＨＥＫ２９３細胞、マウス骨髄腫(ＮＳ０)、ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ)、サル腎線維芽細胞(ＣＯＳ−７)、メイディン・ダービー・ウシ腎臓細胞(ＭＤＢＫ)またはこれらの何れかの組み合わせである。ある態様において、完全分子は、抗体または融合タンパク質(例えば、Ｆｃドメインなどの免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質)である。
【００１４】
ある態様において、融合タンパク質抗体またはその一部を含むイムノコンジュゲート(例えば、ＦｃドメインまたはｓｃＦｖ)である。ある態様において、抗体はモノクローナル抗体である。ある態様において、モノクローナル抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。ある態様において、出発溶液は採集細胞培養液上清、ライセート、濾液または溶離液を含む。ある態様において、出発溶液は精製した物質を含む。ある態様において、精製した物質は医薬製品である。ある態様において、出発溶液は抗体断片を含む。ある態様において、抗体断片はＨＨＬ、ＨＨ、ＨＬ、Ｈ、Ｌまたはこれらの何れかの組み合わせを含む(図５参照)。
【００１５】
ある態様において、レドックスペアはクロマトグラフィー緩衝液に存在する。ある態様において、クロマトグラフィー緩衝液は洗浄緩衝液である。ある態様において、レドックスペアは「システイン、シスチン、グルタチオン(ＧＳＨ)、酸化グルタチオン(ＧＳＳＧ)、システイン誘導体、グルタチオン誘導体またはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある態様において、レドックスペアはシステインおよびシスチンを含む。ある態様において、レドックスペアは(ｉ)０〜１０mM  システイン、(ii)０〜０.５mM  シスチン、(iii)０〜１０mM  グルタチオンまたは(iv)これらの何れかの組み合わせを含み、ここで、シスチンおよび／または還元グルタチオンの濃度は少なくとも０.１mMである。
【００１６】
ある態様において、チオール還元剤対チオール酸化剤の比は０：１〜１０：１である。ある態様において、レドックス緩衝液のｐＨは約５〜約１０である。ある態様において、ｐＨは約７〜約９である。ある態様において、ｐＨは約８である。
【００１７】
ある態様において、レドックス緩衝液は電導度＜１００mS／cm、＜９５mS／cm、＜９０mS／cm、＜８５mS／cm、＜８０mS／cm、＜７５mS／cm、＜７０mS／cm、＜６５mS／cm、＜６０mS／cm、＜５５mS／cm、＜５０mS／cm、＜４５mS／cm、＜４０mS／cm、＜３５mS／cm、＜３０mS／cm、＜２５mS／cm、＜２０mS／cm、＜１５mS／cmまたは＜１０mS／cmを有する。ある態様において、レドックス緩衝液は電導度＜５mS／cmを有する。
【００１８】
ある態様において、方法は約４℃〜３４℃の範囲の温度で実施される。ある態様において、方法は室温で操作される。
【００１９】
ある態様において、レドックス緩衝液は約０.５mM  システインおよび約０.３mM  シスチンを含む。ある態様において、レドックス緩衝液は約１mM  システインおよび約０.３mM  シスチンを含む。ある態様において、再酸化時間は約３０分〜約８時間である。ある態様において、レドックス緩衝液は、１mM  システイン、０.３mM  シスチン、ｐＨ８、２０℃で電導度＜７.３mS／cmを含む。ある態様において、完全分子の濃度は、再酸化後少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または１００％増加する。本発明はまた、本発明方法の何れかにより産生された組成物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ここに開示する低分子量(ＬＭＷ)断片低減戦略の二つの主要な役割、すなわち一次的防止役割および二次的レスキュー役割を示すダイアグラムである。
【００２１】
【図２】図２は、防止相およびレスキュー相両者を含む、本明細書に開示するジスルフィド結合還元により引き起こされるＬＭＷ断片を減少させるための包括的戦略を要約する流れ図である。
【００２２】
【図３】図３は、抗体下流精製プロセスおよびインプロセスサンプル条件の略図である。
【００２３】
【図４】図４は、下流精製プロセス全体のインタクトｍＡｂ−ＴおよびｍＡｂ−Ｘ純度を示す。
【００２４】
【図５】図５は、断片からのインタクトＩｇＧ形成のための単純化反応経路を示すダイアグラムである。長い棒は抗体重鎖(Ｈ)を表し、短い棒は抗体軽鎖(Ｌ)を表す。
【００２５】
【図６】図６は、プロテインＡ樹脂含有および非含有炭酸ナトリウム(ｐＨ８)緩衝液中でのＩｇＧ再酸化を示す。点は実験データであり、線はシミュレーション結果を表す。
【００２６】
【図７Ａ】図７Ａは、種々の電導度(mS／cm)でのプロテインＡ樹脂非含有炭酸ナトリウム(ｐＨ８)緩衝液中のＩｇＧ再酸化を示す。点は実験データであり、線はシミュレーション結果を表す。
【００２７】
【図７Ｂ】図７Ｂは、種々の電導度(mS／cm)でのプロテインＡ樹脂含有炭酸ナトリウム(ｐＨ８)緩衝液中のＩｇＧ再酸化を示す。点は実験データであり、線はシミュレーション結果を表す。
【００２８】
【図８Ａ】図８Ａは、種々の温度でのプロテインＡ樹脂含有炭酸ナトリウム(ｐＨ８)緩衝液中、０.５  システインおよび０.３mM  シスチンによるＩｇＧ再酸化を示す。点は実験データであり、線はシミュレーション結果を表す。
【００２９】
【図８Ｂ】図８Ｂは、種々の温度でのプロテインＡ樹脂含有炭酸ナトリウム(ｐＨ８)緩衝液中、１mM  システインおよび０.３mM  シスチンによるＩｇＧ再酸化を示す。点は実験データであり、線はシミュレーション結果を表す。
【００３０】
【図９Ａ】図９Ａは、１mM  システイン、０.５mM  シスチン、ｐＨ８、２０℃で電導度７.３mS／cmでプロテインＡ樹脂を含む、最適条件でのＩｇＧの再酸化速度論を示す。点は実験データであり、線はコンピューターでの結果を表す。
【００３１】
【図９Ｂ】図９Ｂは、初期純度２９％の最適条件で種々の純度で出発したＩｇＧの再酸化速度論予測を示す。点は実験データであり、点線はコンピューターでの予測結果を表す。
【００３２】
【図９Ｃ】図９Ｃは、初期純度１４％の最適条件で種々の純度で出発したＩｇＧの再酸化速度論予測を示す。点は実験データであり、点線はコンピューターでの予測結果を表す。
【００３３】
【図１０】図１０は、レドックス洗浄を伴う提案されるプロテインＡクロマトグラフィー段階を示す。
【００３４】
【図１１】図１１は、種々の時点で種々の洗浄緩衝液を用いて、プロテインＡに対するインタクト単量体％がどのように溶出するかを示す。
【００３５】
【図１２】図１２は、代表的ｍＡｂ  Ｔサンプルの非還元キャピラリー電気泳動図を示す。
【００３６】
【図１３】図１３は、低純度(７５.５％)、高純度(９１.３％、システイン／シスチン処理後)および参照物質でのプロテインＡ溶離液のＳＥＣプロファイルを示す。
【００３７】
【図１４】図１４は、低純度(７５.５％)、高純度(９１.３％、システイン／シスチン処理後)および参照物質でのプロテインＡ溶離液の荷電バリアントプロファイルを示す。
【００３８】
【図１５】図１５は、種々のレドックス洗浄緩衝液を使用するｍＡｂ−Ｘの代表的な非還元キャピラリー電気泳動図を示す。
【００３９】
【図１６】図１６は、種々のレドックス洗浄緩衝液を使用するｍＡｂ−ＸについてのプロテインＡ溶離液の荷電バリアントプロファイルを示す。
【００４０】
【図１７】図１７は、最適化レドックス洗浄緩衝液を使用するプロテインＡによる再加工ｍＡｂ−Ｎの非還元カリパスを示す。
【００４１】
【図１８】図１８は、最適化レドックス洗浄緩衝液を使用するプロテインＡによる再加工ｍＡｂ−Ｎの荷電バリアントプロファイルを示す。
【００４２】
【図１９】図１９は、レドックス洗浄を用いる提案されるＣＥＸクロマトグラフィー段階を示す。
【００４３】
【図２０】図２０は、プロテインＡクロマトグラフィーでレドックス洗浄緩衝液を使用して再加工したレスキューされたインタクトｍＡｂを示す。
【００４４】
【図２１】図２１は、レスキューされたｍＡｂの詳細な非還元キャピラリー電気泳動図を示す。
【００４５】
【図２２】図２２は、レドックス洗浄緩衝液と親和性クロマトグラフィープラットフォームを統合した包括的評価のダイアグラムを示す。
【００４６】
【図２３】図２３は、インタクトｍＡｂ純度およびレスキューされたｍＡｂの凝集を示す。
【００４７】
【図２４】図２４は、レスキューされたｍＡｂのプロセス関連不純物(ＨＣＰおよびＤＮＡ)を示す。
【００４８】
【図２５】図２５は、レスキューされたｍＡｂのプロセス関連不純物(溶出性プロテインＡ)を示す。
【００４９】
【図２６】図２６は、示差走査熱量測定(ＤＳＣ)によるレスキューされたｍＡｂの熱変性プロファイルを示す。
【００５０】
【図２７】図２７は、円偏光二色性(ＣＤ)によるレスキューされたｍＡｂの高次構造プロファイルを示す。
【００５１】
【図２８】図２８は、レスキューされたｍＡｂ−ＮについてＬＣ−ＭＳにより分析した鎖間ジスルフィド結合完全性を示す。
【００５２】
【図２９】図２９は、レスキューされたｍＡｂ−ＮについてＳＥＣにより分析した熱安定性プロファイルを示す。
【００５３】
【図３０】図３０は、レスキューされたｍＡｂ−ＮについてＳＥＣにより分析した熱安定性プロファイルのプロットを示す。
【００５４】
【図３１】図３１は、レスキューされたｍＡｂ−ＮについてＣＥＸ−ＨＰＬＣにより分析した熱安定性プロファイルのプロットを示す。
【００５５】
【図３２】図３２は、レスキューされたｍＡｂ−Ｎの熱安定性荷電バリアントプロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
詳細な記載
組み換えタンパク質の産生および精製におけるタンパク質の還元は、チオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼなどの細胞内成分の放出による、高い還元力により生じる(Koterba et al., J. Biotechnol. 2012, 157(1), 261-7; Handlogten et al., Biotechnol. Bioeng. 2017, 114, 1469-77)。採取中および採取後の溶解酸素(ＤＯ)レベルの維持、採取細胞培養物の冷却、採取細胞培養物の保存期間の短縮または還元阻止剤の添加を含む、還元低減戦略開発のために相当な努力がなされて来た(Trexler-Schmidt et al., Biotechnol. Bioeng. 2010, 106(3), 452-61; Saccoccia et al., Curr. Protein Pept. Sci. 2014, 15(6), 621-46; Mun et al., Biotechnol. Bioeng. 2015, 112, 734-742; Zhang et al., Expert Opin. Ther. Pat. 2017, 27, 547-556; Du et al., mAb 2018, 0(0), 1-11)。しかしながら、厳しい細胞溶解のための異常に強い還元力などがある特異な状況下での阻止的低減は、ジスルフィド還元によるタンパク質断片の蓄積回避には十分ではない可能性がある。
【００５７】
ジスルフィド結合再酸化の速度論が１９７０代初めに研究されてから(White, Methods Enzymol. Academic Press 1972, 25B 387; Petersen and Dorrington, J. Biol. Chem. 1974, 249, 5633-41; Sears et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1975, 72(1), 353-7)、ジスルフィド結合再酸化の反応速度論および再酸化の有効性に影響する因子に対する理解はほとんど進んでいない。
【００５８】
低分子量(ＬＭＷ)断片の形成を制御する戦略としてのジスルフィド結合再酸化の利用の可能性は見過ごされている。さらに、抗体調製中または分解した抗体製品から得られた還元産物をレスキューする努力はほとんどなされていない。そこで、本発明では還元産物をレスキューするためにジスルフィド結合再酸化に基づくレスキュー戦略を開発した(例えば、図１、２および５参照)。
【００５９】
本発明は、抗体製剤の純度を増加させる別のアプローチ、すなわち、完全分子(例えば、完全抗体)を得るための、「部分分子」と称する還元抗体種、すなわち、遊離重鎖(Ｈ)、遊離軽鎖(Ｌ)および重鎖および／または軽鎖を含む低分子量複合体、例えば、ＨＨ、ＨＬまたはＨＨＬの再酸化を提示する。部分分子中の遊離チオールは再酸化され、ジスルフィド結合の再形成により、部分分子は、目的の完全分子、例えば、抗体を生じるように再結合し得る。
【００６０】
本方法は、本発明において、断片化の防止または軽減のために、出発溶液(例えば、細胞培養、ライセート、濾液もしくは溶離液からの上清または医薬製品)と、例えば、システイン、システイン、グルタチオンまたはこれらの何れかの組み合わせを含む、レドックスペアを含む緩衝液を混合するまたは合わせることを含む。開示される方法は、例えば、細胞培養から目的のタンパク質(例えば、抗体)を精製する間または低分子量断片を含む溶液から目的のタンパク質(例えば、抗体)を再加工または回収する間の１以上のクロマトグラフィー段階で実施され得る。
【００６１】
Ｉ. 用語
本発明がより容易に理解され得るように、特定の用語をまず定義する。本明細書で使用される限り、本明細書でこれと異なる定義が明示的に示されている場合を除き、次の用語の各々は、次に示す意味を有する。さらなる定義は、本明細書をとおして、示される。
【００６２】
本発明は、群の１個のメンバーのみが、ある産物またはプロセスに存在する、用いられるまたは他に関係する複数の態様を含む。本発明は、群の１個を超えるまたは全メンバーが、ある産物またはプロセスに存在する、用いられるまたは他に関係する複数の態様を含む態様を含む。
【００６３】
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が関係する分野における当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press;およびOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示で使用される用語の多くの一般的辞書を当業者に提供する。
【００６４】
単位、接頭辞および記号は、国際単位系(ＳＩ)が認めた形式で示す。数値範囲は、該範囲を規定する数を含む。ここに提供する表題は、本明細書を全体として引用して得られる本発明の種々の態様の限定ではない。従って、下記に定義する用語は、本明細書を全体として引用して、より完全に定義される。
【００６５】
冠詞：単数表現は、文脈に明らかに反しない限り、複数の対象を含む。用語「ａ」(または「ａｎ」)ならびに用語「１個以上の」および「少なくとも１個」は、ここでは相互交換可能に使用され得る。ある態様において、用語「ａ」または「ａｎ」は、「１個」を意味する。他の態様において、用語「ａ」または「ａｎ」は「２個以上」または「複数」を含む。それ故に、例えば、「抗体」に対する言及は、１個以上のこのようなタンパク質をいい、当業者に知られるその等価物などを含む。
【００６６】
約：値または組成に対してここで使用する用語「約」は、一部値または組成の測定または決定方法、すなわち、測定系の限界に依存する、当業者により決定される特定の値または組成物の許容される誤差範囲である。例えば、「約」は、当分野における実務に従い１または１を超える標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は２０％までの範囲を意味し得る。さらに、特に生物学的系またはプロセスに関して、本用語は、値の一桁までまたは５倍までを意味し得る。
【００６７】
特定の値または組成が本明細書および特許請求の範囲で提供されるとき、特に断らない限り、「約」の意味は、その特定の値または組成について許容される誤差範囲内であると推定されなければならない。用語「約」を数値範囲と組み合わせて使用するとき、示す数値の上および下に境界を伸ばすようにその範囲を修飾する。それ故に、「約１０〜２０」は「約１０〜約２０」を意味する。一般に、用語「約」は、数値を、例えば、上にまたは下に(高くまたは低く)、１０パーセントの偏差で、記載した値の上および下に修飾し得る。
【００６８】
親和性クロマトグラフィー：用語「親和性クロマトグラフィー」は、目的のタンパク質(例えば、抗体)が目的のタンパク質に特異的であるリガンドに特異的に結合する、タンパク質分離技術をいう。このようなリガンドは、一般に生物特異的リガンドと称される。ある態様において、生物特異的リガンド(例えば、プロテインＡまたはその機能的バリアント)はクロマトグラフィー媒体に共有結合され、溶液がクロマトグラフィー媒体と接触するため、溶液中で目的のタンパク質に接近可能である。
【００６９】
目的のタンパク質は、一般にクロマトグラフィー段階中生物特異性リガンドに対するその特異的結合親和性を保持し、一方混合物中の他の溶質および／またはタンパク質はリガンドに感知可能にまたは特異的に結合しない。固定化リガンドへの目的のタンパク質の結合は、目的のタンパク質を固相物質上の固定化リガンドに特異的に結合させたまま、夾雑タンパク質またはタンパク質不純物を、クロマトグラフィーマトリクスを通過させる。次いで、特異的に結合した目的のタンパク質を適当な条件(例えば、低ｐＨ、高ｐＨ、高塩、競合リガンドなど)下、固定化リガンドから活性形態で離脱させ、先にカラムを通過した夾雑タンパク質またはタンパク質不純物を含むことなく、溶出緩衝液を用いてクロマトグラフィーカラムを通過させる。
【００７０】
如何なる成分であっても、その各特異的結合タンパク質、例えば、抗体の精製のためのリガンドとして使用できる。しかしながら、本発明の種々の方法において、Ｆｃ領域含有標的タンパク質に対するリガンドとしてプロテインＡが使用される。標的タンパク質(例えば、Ｆｃ領域含有タンパク質)の生物特異的リガンド(例えば、プロテインＡ)から溶出させる条件は、当業者により容易に決定され得る。
【００７１】
ある態様において、プロテインＧまたはプロテインＬまたはその機能的バリアントが生物特異的リガンドとして使用され得る。ある態様において、５〜９のｐＨ範囲でプロテインＡなどの生物特異的リガンドを使用して、Ｆｃ領域含有タンパク質への結合、洗浄または生物特異的リガンド／標的タンパク質コンジュゲート再平衡化し、続いて少なくとも一つの塩を含むｐＨ約４以下の緩衝液で溶出する。
【００７２】
凝集：用語「凝集」は、他の分子(例えば同じポリペプチドの他の分子)と複合体を形成し、それにより、高分子量(ＨＭＷ)凝集体を形成するポリペプチド、例えば、抗体の特性をいう。凝集体の形成を測定する方法の例は、ここでの実施例に記載のとおり、分析的サイズ排除クロマトグラフィーを含む。凝集の相対量を、例えば、低減凝集を有するポリペプチドを同定するために、対照化合物に対して決定し得る。凝集の相対量はまた対照組成物に対しても決定され得る。
【００７３】
アミノ酸：アミノ酸は、ここでは、一般に知られる３文字記号またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される一文字記号により示す。特に断らない限り、アミノ酸配列は、左から右方向にアミノからカルボキシ方向で記載する。
【００７４】
および／または：ここで使用されるとき、「および／または」は、二つの特定された特性または要素の各々の、他方を伴うまたは伴わない具体的開示として解釈される。それ故に、ここで「Ａおよび／またはＢ」などの文脈で使用する用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」(単独)および「Ｂ」(単独)を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの文脈で使用する用語「および／または」は、次の態様の各々を含むことが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)。
【００７５】
アニオン交換媒体：用語「アニオン交換媒体」、例えば、「アニオン交換樹脂」または「アニオン交換膜」は、正に荷電した、故にそこに結合した１以上の正に荷電したリガンドを有する固相をいう。４級アミノ基などの、アニオン交換樹脂の形成に適する固相に結合したあらゆる正に荷電したリガンドが使用できる。市販のアニオン交換樹脂は、ＤＥＡＥセルロース、Applied BiosystemsからのPOROS(登録商標)PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50、SartoriusからのSARTOBIND(登録商標)Q、MonoQ、MiniQ、Source 15Qおよび30Q、Ｑ、DEAEおよびANX SEPHAROSE(登録商標)Fast Flow、Q SEPHAROSE(登録商標)High Performance、QAE SEPHADEX(登録商標)およびFAST Q SEPHAROSE(登録商標)(GE Healthcare)、J. T. BakerのWP PEI、WP DEAM、WP QUAT、Biochrom Labs Inc.のHydrocell DEAEおよびHydrocell QA、UNOsphere Q、MACRO-PREP(登録商標)、BioradのDEAEおよびMACRO-PREP(登録商標)High Q、Ceramic HyperD Q、ceramic HyperD DEAE、TRISACRYL(登録商標)MおよびLS DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA SPHEROSIL(登録商標)LS、QMA SPHEROSIL(登録商標)MおよびPall TechnologiesからのMUSTANG(登録商標)Q、DOWEX(登録商標)Fine Mesh Strong Base Type IおよびII型アニオン樹脂およびDOWEX(登録商標)MONOSPHER E 77、Dow Liquid Separationsからの弱塩基アニオン、INTERCEPT(登録商標)Q膜、MilliporeからのMatrex CELLUFINE(登録商標)A200、A500、Q500およびQ800、EMDからのFRACTOGEL(登録商標)EMD TMAE、FRACTOGEL(登録商標)EMD DEAEおよびFRACTOGEL(登録商標)EMD DMAE、AMBERLITE(登録商標)弱強アニオン交換体Ｉ型およびII型、ＤＯＷＥＸ(登録商標)弱および強アニオン交換体Ｉ型およびII型、DIAION(登録商標)弱および強アニオン交換体Ｉ型およびII型、Sigma-AldrichからのDUOLITE(登録商標)、TSKゲルQおよびDEAE 5PWおよび5PW-HR、TosohからのTOYOPEARL(登録商標)SuperQ-650S、650Mおよび650C、QAE-550Cおよび650S、DEAE-650Mおよび650C、QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、WhatmanからのExpress-Ion DまたはExpress-Ion QおよびSARTOBIND(登録商標)Q(Sartorius Corporation, New York, USA)を含む。
【００７６】
他のアニオン交換樹脂は、POROS HQ、Q SEPHAROSETM Fast Flow、DEAE SEPHAROSETM Fast Flow、SARTOBIND(登録商標)Q、ANX SEPHAROSETM 4 Fast Flow(high sub)、Q SEPHAROSETM XL、Q SEPHAROSETM big bease、DEAE Sephadex A-25、DEAE Sephadex A-50、QAE Sephadex A-25、QAE Sephadex A-50、Q SEPHAROSETM high performance、Q SEPHAROSETM XL、Sourse 15Q、Sourse 30Q、Resourse Q、Capto Q、Capto DEAE、Mono Q、Toyopearl Super Q、Toyopearl DEAE、Toyopearl QAE、Toyopearl Q、Toyopearl GigaCap Q、TS gel SuperQ、TS gel DEAE、Fractogel EMD TMAE、Fractogel EMD TMAE HiCap、Fractogel EMD DEAE、Fractogel EMD DMAE、Macroprep High Q、Macro-prep-DEAE、Unosphere Q、Nuvia Q、PORGS PI、DEAE Ceramic HyperDまたはQ Ceramic HyperDを含む。 
【００７７】
抗体：ここで使用する用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続した少なくとも２つの重(Ｈ)鎖および２つの軽(Ｌ)鎖を含むタンパク質をいう。各重鎖は、重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域(ここではＣＨと略す)からなる。ある抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体において、重鎖定常領域はヒンジおよび３ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。
【００７８】
ある抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体において、各軽鎖は軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１ドメイン(ここではＣＬと略す)からなる。ＶＨおよびＶＬ領域を、フレームワーク領域(ＦＲ)と名付けられるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と名付けられる超可変性の領域にさらに細分し得る。
【００７９】
各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端で次の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。重鎖はＣ末端リシンを含んでも含まなくてもよい。用語「抗体」は二特異的抗体または多特異的抗体を含み得る。
【００８０】
ここで使用する「ＩｇＧ抗体」、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体は、ある態様において、天然に存在するＩｇＧ抗体の構造を有し、すなわち、天然に存在する同じサブクラスのｇＧ抗体と同数の重鎖および軽鎖およびジスルフィド結合を有する。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体は、２個の重鎖(ＨＣ)および２個の軽鎖(ＬＣ)からなりえて、ここで、該２個のＨＣおよびＬＣは、それぞれ天然に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体で生じるのと同じ数および位置のジスルフィド架橋により結合される(抗体がジスルフィド架橋を修飾するように変異されていない限り)。
【００８１】
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない一般に知られるアイソタイプの何れかに由来し得る。ＩｇＧアイソタイプは、ある種ではサブクラスに分割される：ヒトにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４およびマウスにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１は数アロタイプで存在し、これは、最大で数アミノ酸互いに異なる。「抗体」は、例として、天然に存在するおよび天然に存在しない抗体両者；モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトおよび非ヒト抗体および完全合成抗体を含む。
【００８２】
ここで使用する抗体の「抗原結合部分」なる用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片をいう。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片により実施され得ることは示されている。抗体の「抗原結合部分」なる用語内に含まれる結合断片の例は、(ｉ)Ｆａｂ断片(パパイン開裂による断片)またはＶＬ、ＶＨ、ＬＣおよびＣＨ１ドメインからなる類似単価断片；(ii)Ｆ(ａｂ’)２断片(ペプシン開裂からの断片)またはヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２個のＦａｂ断片を含む類似二価断片；(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；(iv)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；(vi)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)および(vii)所望により合成リンカーにより結合されていてよい、２以上の単離ＣＤＲの組み合わせを含む。
【００８３】
さらに、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、組み換え方法を使用して、それらが、ＶＬおよびＶＨ領域が単価分子を形成するように対合する単一タンパク質鎖として製造されることを可能とする、合成リンカーにより結合させ得る(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる)；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片を、当業者に知られる慣用技術を使用して得て、断片をインタクト抗体であるのと同じ方法で有用性についてスクリーニングする。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術によりまたはインタクト免疫グロブリンの酵素もしくは化学開裂により製造され得る。
【００８４】
ここで使用する用語「組み換えヒト抗体」は、(ａ)ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物(例えば、マウス)またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、(ｂ)抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、(ｃ)組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および(ｄ)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む何れかの他の手段により調製、発現、製造または単離された抗体などの、組み換え手段により調製、発現、製造または単離された全ヒト抗体を含む。
【００８５】
おおよそ：ここで使用する用語「おおよそ」は、１以上の目的の値に付与される場合、記載する引用値に類似する値をいう。ある態様において、用語「おおよそ」は、特に断らない限りまたは文脈からそうでないことが明らかでない限り、記載する引用値の何れかの方向で(大きいまたは小さい)１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内に入る値の範囲をいう(このような数値が可能な値の１００％を超えるときを除く)。
【００８６】
緩衝液：ここで使用する用語「緩衝液」は、溶液中への存在により、ｐＨの単位変化をもたらすのに加えなければならない酸またはアルカリの量を増加させる、物質をいう。緩衝化された溶液は、その酸−塩基コンジュゲート成分の作用により、ｐＨの変化に抵抗性である。生物試薬と使用するための緩衝化された溶液は、一般に溶液のｐＨが生理学的範囲内であるように、一定濃度の水素イオンを維持できる。通常緩衝液成分は、有機および無機塩、酸および塩基を含むが、これらに限定されない。
【００８７】
カチオン交換媒体：「カチオン交換媒体」、例えば、「カチオン交換樹脂」または「カチオン交換膜」は、負に荷電し、固相を通過するまたは介する水溶液中のカチオンと交換するための遊離カチオンを有する、固相をいう。カチオン交換樹脂の形成に適する固相に結合したあらゆる負に荷電したリガンド、例えば、カルボキシレート、スルホネートおよび下記のもの、その他を使用できる。市販のカチオン交換樹脂には、例えば、スルホネートベースの基を有するもの(例えば、MonoS、MiniS、Source 15Sおよび30S、SP SEPHAROSE(登録商標)Fast Flow、GE HealthcareからのSP SEPHAROSE(登録商標)High Performance、TosohからのTOYOPEARL(登録商標)SP-650SおよびSP-650M、BioRadからのMACRO-PREP(登録商標)High S、Ceramic HyperD S、TRISACRYL(登録商標)MおよびLS SPおよびSpherodex LS SP from Pall Technologies)；スルホエチルベースの基を有するもの(例えば、EMDからのFRACTOGEL(登録商標)SE、Applied BiosystemsからのPOROS(登録商標)S-10およびS-20)；スルホプロピルベースの基を有するもの(例えば、TosohからのTSK Gel SP 5PWおよびSP-5PW-HR、Life TechnologiesからのPOROS(登録商標)HS-20、HS 50およびPOROS(登録商標)XS)；スルホイソブチルベースの基を有するもの(例えば、EMDからのFRACTOGEL(登録商標)EMD SO3-)；スルホキシエチルベースの基を有するもの(例えば、WhatmanからのSE52、SE53およびExpress-Ion S)、カルボキシメチルベースの基を有するもの(例えば、GE HealthcareからのCM SEPHAROSE(登録商標)Fast Flow、Biochrom Labs Inc.からのHydrocell CM、BioRadからのMACRO-PREP(登録商標)CM、Ceramic HyperD CM、TRISACRYL(登録商標)M CM、Pall TechnologiesからのTRISACRYL(登録商標)LS CM、MilliporeからのMatrx CELLUFINE(登録商標)C500およびC200、CM52、CM32、CM23およびWhatmanからのExpress-Ion C、TosohからのTOYOPEARL(登録商標)CM-650S、CM-650MおよびCM-650C)；スルホンおよびカルボン酸ベースの基を有するもの(例えば、J. T. BakerからのBAKERBOND(登録商標)Carboxy-Sulfon)；カルボン酸ベースの基を有するもの(例えば、J. T BakerからのWP CBX、Dow Liquid SeparationsからのDOWEX(登録商標). MAC-3、Sigma-AldrichからのAMBERLITE(登録商標)Weak Cation Exchanger、DOWEX(登録商標)Weak Cation ExchangerおよびDIAION(登録商標)Weak Cation ExchangerおよびEMDからのFRACTOGEL(登録商標)EMD COO--)；スルホン酸ベースの基を有するもの(例えば、Biochrom Labs Inc.からのHydrocell SP、Dow Liquid SeparationsからのDOWEX(登録商標)Fine Mesh Strong Acid Cation Resin、UNOsphere S、J. T. BakerからのWP Sulfonic、SartoriusからのSARTOBIND(登録商標)S膜、Sigma-AldrichからのAMBERLITE(登録商標)Strong Cation Exchanger、DOWEX(登録商標)Strong CationおよびDIAION(登録商標)Strong Cation Exchanger)；またはオルトホスフェートベースの基を有するもの(例えば、WhatmanからのP11)がある。
【００８８】
他のカチオン交換樹脂は、Poros HS、Poros XS、カルボキシ−メチル−セルロース、BAKERBOND ABXTM、アガロースに固定化されたスルホプロピルおよびアガロースに固定化されたスルホニル、MonoS、MiniS、Source 15S、30S、SP SEPHAROSETM、CM SEPHAROSETM、BAKERBOND Carboxy-Sulfon、WP CBX、WP Sulfonic、Hydrocell CM、Hydrocel SP、UNOsphere S、Macro-Prep High S、Macro-Prep CM、Ceramic HyperD S、Ceramic HyperD CM、Ceramic HyperD Z、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM、Trisacryl M SP、Trisacryl LS SP、Spherodex LS SP、DOWEX Fine Mesh Strong Acid Cation Resin、DOWEX MAC-3、Matrex Cellufine C500、Matrex Cellufine C200、Fractogel EMD SO3-、Fractogel EMD SE、Fractogel EMD COO-、Amberlite WeakおよびStrong Cation Exchanger、Diaion WeakおよびStrong Cation Exchanger、TSK Gel SP-5PW-HR、TSK Gel SP-5PW、Toyopearl CM (650S、650M、650C)、Toyopearl SP (650S、650M、650C)、CM (23、32、52)、SE(52、53)、P11、Express-Ion CまたはExpress-Ion Sを含む。
【００８９】
クロマトグラフィー：用語「クロマトグラフィー」は、混合物に存在する他の分子(例えば、夾雑物)から目的のタンパク質(例えば、抗体)を分離する、あらゆる種類の技術をいい、ここで、目的のタンパク質が、混合物の個々の分子が移動相の影響下、固定媒体を通って移動する速度または結合もしくは溶出プロセスの差異の結果として、他の分子(例えば、夾雑物)から分離される。
【００９０】
クロマトグラフィーリガンド：「クロマトグラフィーリガンド」は、クロマトグラフィー媒体に結合し、媒体の結合性質を決定する官能基をいう。「リガンド」の例は、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、チオフィリック相互作用基、金属親和性基、親和性基、生物親和性基および混合モード基(前記の組み合わせ)を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
ここで使用され得る一部リガンドは、スルホプロピル、スルホン酸などの強カチオン交換基；トリメチルアンモニウムクロライドなどの強アニオン交換基；カルボン酸などの弱カチオン交換基；Ｎ５ＮジエチルアミノまたはＤＥＡＥなどの弱アニオン交換基；フェニル、ブチル、プロピル、ヘキシルなどの疎水性相互作用基；およびプロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬなどの親和性基を含むが、これらに限定されない。
【００９２】
クロマトグラフィーカラム：ここで使用する用語「クロマトグラフィーカラム」またはクロマトグラフィーと関連する「カラム」は、クロマトグラフィー媒体または樹脂を充填された、しばしばシリンダーまたは中空柱形状の、容器をいう。クロマトグラフィー媒体または樹脂は、精製に用いられる物理的および／または化学的性質を提供する物質をいう。
【００９３】
クロマトグラフィー媒体：用語「クロマトグラフィー媒体」または「クロマトグラフィーマトリクス」は、ここでは相互交換可能に使用され、分離プロセスにおいて、目的のタンパク質(例えば、免疫グロブリンなどのＦｃ領域含有タンパク質)を混合物に存在する他の分子から分離させる、あらゆる種類の吸着剤、樹脂または固相をいう。非限定的例は、カラムまたはカートリッジに入れることができる粒子、モノリスまたは線維性樹脂および膜をいう。マトリクスを形成するための物質の例は、多糖(例えばアガロースおよびセルロース)；および他の機械的に安定なマトリクス、例えばシリカ(例えば制御孔ガラス)、ポリ(スチレンジビニル)ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子および上記の何れかの誘導体を含む。
【００９４】
クロマトグラフィー樹脂：用語クロマトグラフィー樹脂は、一般に共有結合した正にまたは負に荷電した基を含むように誘導体化される、例えばアガロース、アクリルアミドまたはセルロースからなる、三次元マトリクスまたはビーズを含むクロマトグラフィー媒体をいう。本発明の方法に適するクロマトグラフィー樹脂のタイプは、カチオン交換樹脂、親和性樹脂、アニオン交換樹脂または混合モード樹脂である。
【００９５】
含む：本明細書に態様が用語「含む」を用いて記載されるとき、「からなる」および／または「から本質的になる」の用語で記載されている以外、類似する態様も提供されることは理解される。
【００９６】
：ここで使用する用語「電導度」は、２電極間で電流を流す水溶液の能力をいう。溶液では、電流はイオン輸送により流れる。それ故に、水溶液に存在するイオンの量が増えると、溶液の電導度は高くなる。電導度の測定単位は、１センチメートルあたりミリジーメンス(mS／cm)であり、電導度計を使用して測定され得る。
【００９７】
ジスルフィド結合：ここで使用する用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子間で形成された共有結合をいう。アミノ酸システインは、第二チオール基とジスルフィド結合または架橋を形成できるチオール基を含む。大部分の天然に存在するＩｇＧ分子において、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合により結合され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用して２３９および２４２に対応する位置(位置２２６または２２９、ＥＵナンバリングシステム)の２個のジスルフィド結合により結合される。
【００９８】
発現：ここで使用する用語「発現」は、遺伝子が生化学物質、例えば、抗体などの目的のポリペプチドを生じるプロセスをいう。プロセスは、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)への遺伝子の転写およびこのようなＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を含むが、これらに限定されない。最終の所望の産物が生化学物質であるならば、発現は、その生化学物質および何れかの前駆体の製造を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」、例えば、抗体を生じる。ここに記載する遺伝子産物は、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク分解性開裂など、例えば翻訳語修飾されたポリペプチドを含む。
【００９９】
高分子量(ＨＭＷ)凝集体：ここで使用する用語高分子量「ＨＭＷ」凝集態は、一般に所望の目的のタンパク質、例えば、抗体より高い分子量を有する、混合物に存在するあらゆる１以上の望まないタンパク質をいう。高分子量タンパク質は、二量体、三量体、四量体または他の多量体を含み得る。これらのタンパク質は、共有または非共有的に結合され、例えば、疎水性アミノ酸残基が極性溶媒に露出され、凝集を引き起こし得るミスフォールド単量体からなり得る。例えば、本発明の状況において、所望の分子が、２個の重鎖(Ｈ)および２個の軽鎖(Ｌ)を含むＩｇＧ抗体であるならば、ＨＭＷ凝集体は、例えば、４個のＨ鎖および４個のＬ鎖を含む二量体分子または４個のＨ鎖を含む分子または６個のＨ鎖および４個のＬ鎖を含む分子であり得る。
【０１００】
イオン交換クロマトグラフィー：用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」は、目的の溶質が、イオン化可能な目的の溶質(例えば、混合物中の目的のタンパク質)が、固相イオン交換物質に結合した(例えば、共有結合により)逆の荷電のリガンドに、ｐＨおよび電導度の適切な条件下、荷電化合物と混合物中の溶質不純物または夾雑物より多かれ少なかれ非特異的に相互作用するように相互作用する、クロマトグラフィープロセスをいう。混合物中の夾雑溶質は、イオン交換物質のカラムから洗い流され得るかまたは目的の溶質より速くまたは遅く樹脂に結合するまたは除去される。
【０１０１】
「イオン交換クロマトグラフィー」は、具体的にカチオン交換(ＣＥＸ)、アニオン交換(ＡＥＸ)および混合モードクロマトグラフィーを含む。
【０１０２】
単離：ここで使用する用語「単離」は、それが会合していた成分の少なくとも一部から分離されている、物質または実体(例えば、ポリペプチド)をいう(天然であれまたは実験条件下であれ)。単離物質(例えば、タンパク質)は、会合していた物質に対して、種々のレベルの純度を有し得る。
【０１０３】
アイソタイプ：ここで使用する「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)をいう。
【０１０４】
低分子量(ＬＭＷ)断片：用語「ＬＭＷ」(低分子量(ＬＭＷ)断片)は、所望のタンパク質の分子より小さい分子量を有する混合物に存在するあらゆる１以上の望まないタンパク質をいう。低分子量タンパク質は、二量体(例えばモノクローナル抗体)であることが意図される化合物の切断断片または半分子を含み得る。例えば、本発明の状況において、抗体由来のＬＭＷ断片は、例えば、遊離重鎖(Ｈ)、遊離軽鎖(Ｌ)または１個のＨ鎖およびＬ鎖(ＨＬ)または２個のＨ鎖(ＨＨ)または２個のＨ鎖および１個のＬ鎖(ＨＨＬ)を含む分子である。例えば、図５参照。
【０１０５】
低減：ここで使用する用語「低減」は、溶液中の部分分子含量の低減をいう。例えば、低減は、防止により生じ得て、すなわち、ここに開示する方法は、溶液中のレドックス平衡を、部分分子の産生から完全分子の形成に向けてシフトさせることにより、部分分子の形成を防止できる。低減はまたレスキューを介しても生じ得て、すなわち、出発溶液に存在する既存の部分分子が完全分子に再酸化される。
【０１０６】
ポリペプチド：用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、あらゆる長さのアミノ酸ポリマーをいうために、ここで相互交換可能に使用される。ポリマーは、修飾アミノ酸を含み得る。本用語はまた、天然にまたは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化またはラベリング成分とのコンジュゲーションなどの何れかの他の操作または修飾により修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。本定義にさらに含まれるのは、例えば、１以上のアミノ酸アナログ(例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、Ｄ−アミノ酸およびクレアチンなどの非天然アミノ酸を含む)および当分野で知られる他の修飾を含む、ポリペプチドである。
【０１０７】
ここで使用する本用語は、あらゆるサイズ、構造または機能のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドをいう。ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片ならびに前記の他の等価物、バリアントおよびアナログを含む。ポリペプチドは、単一ポリペプチドでも、二量体、三量体または四量体などの多分子複合体でもよい。また一本鎖または多鎖ポリペプチドを含み得る。最も一般的ジスルフィド結合は多鎖ポリペプチドに見られる。用語ポリペプチドはまた、１以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学アナログである、アミノ酸ポリマーにも適用され得る。ある態様において、「ペプチド」は５０アミノ酸長以下、例えば、約５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸または５０アミノ酸長であり得る。
【０１０８】
純度：ここで相互交換可能に使用される用語「精製」、「分離」または「単離」およびその文法的変形は、目的のタンパク質および１以上の不純物を含む組成物またはサンプルから、目的のタンパク質、例えば、抗体の純度を上げることをいう。一般に、目的のタンパク質の純度は、組成物から少なくとも一つの不純物(例えば、凝集形態)を(完全にまたは一部)除去することにより増加される。
【０１０９】
範囲：ここで記載するあらゆる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、特に断らない限り、引用範囲内のあらゆる整数値、および、適切なとき、その分数(例えば整数の１／１０および１／１００)を含むと理解されるべきである。
【０１１０】
組み換え：「組み換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組み換えＤＮＡテクノロジーにより産生されたポリペプチドまたはタンパク質をいう。操作された宿主細胞(例えば、ＣＨＯ細胞)で発現される組み換えにより産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、何れかの適当な技術により分離、分割または部分的にまたは実質的に精製されている天然または組み換えポリペプチドであるため、本発明の目的で単離されているとみなされる。例えば、ここに開示する抗体は、当分野で知られる方法を使用して、組み換えにより産生される。ここに開示するタンパク質(例えば、抗体)および断片は化学合成もされ得る。
【０１１１】
レドックス成分：ここで使用する用語「レドックス成分」は、タンパク質の他のチオールまたはシステイン残基との可逆性チオール交換を促進する、あらゆるチオール反応性化学物質またはこのような化学物質を含む溶液をいう。このような化合物の例は、還元グルタチオン、酸化グルタチオン、システイン、シスチン、システアミン、シスタミン、ベータ−メルカプトエタノールおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
レドックスペア：ここで使用する用語「レドックスペア」は、異なる酸化数を有する２種の化学物質をいう。高酸化数を有する種の還元は低酸化数を有する種を生じる。あるいは、低酸化数を有する種の酸化は高酸化数を有する種を生じる。レドックスペアは、一般に２つのレドックス成分、すなわち、還元剤および酸化剤からなる。レドックスペアにおける特異的レドックス成分の例は、１以上の還元グルタチオン、酸化グルタチオン、システイン、シスチン、システアミン、シスタミンおよびベータ−メルカプトエタノールを含み得る。それ故に、本発明のレドックスペアは、例えば、還元グルタチオンおよび酸化グルタチオンを含み得る。本発明のレドックスペアの他の例はシステアミンおよびシスタミンである。本発明の他の態様において、レドックスペアはシステインおよびシスチンを含む。
【０１１３】
再加工／レスキュー：用語「再加工」および「レスキュー」は、本適用で相互交換可能に使用され、完全分子を産生するための溶液中の部分分子を再酸化するための、本発明の方法の適用をいう。例えば、抗体断片が高含量である濾液または溶離液を、再酸化により部分分子を完全分子に再結合させるために、下流精製プロセス中で、再加工またはレスキューされ得る。他の態様において、再加工またはレスキューは、断片化が保存中に生じている医薬製品の、再酸化により断片を完全分子(例えば、完全抗体)に再形成させるための本発明の方法の適用であり得る。
【０１１４】
ug、uM、uL：ここで使用する用語「ug」、「uM」および「uL」は、それぞれ「μg」、「μM」および「μL」と相互交換可能である。
【０１１５】
部分分子：ここで使用する用語「部分分子」は、大きな好ましい分子、例えば、ＩｇＧ抗体のポリペプチド成分をいう。従って、軽鎖(ＬＣ)、重鎖(ＨＣ)、２個のＨＣを含む複合体、１個のＨＣおよび１個のＬＣを含む複合体または２個のＨＣおよび１個のＬＣを含む複合体が部分分子と考えられる(例えば、図５参照)。本発明の状況において、部分分子はＬＭＷ断片と相互交換可能である。
【０１１６】
完全分子：ここで使用する用語「完全分子」は、例えば、部分分子(すなわち、ＬＭＷ断片)の結合によりもたらされる、完全な目的のタンパク質、例えば、抗体をいう。従って、ＨＨ、ＨＨＬ、ＨＬ、ＨまたはＬは部分分子(すなわち、ＬＭＷ断片)であるが、完全ＩｇＧ抗体(ＨＨＬＬ)は、それらの対応する完全分子と考えられる。
【０１１７】
II. 部分分子再酸化
本発明は、少なくとも一つの免疫グロブリン部分(例えば、Ｆｃドメイン)を含む抗体または融合タンパク質の精製中または抗体または融合タンパク質を含む組成物の製剤または保存中、部分分子(すなわち、ＨＨＬ、ＨＨまたはＨＬ断片などのＬＭＷ断片、ここで、ＨおよびＬはそれぞれ抗体の重鎖および軽鎖である)の形成を防止または軽減する方法であって、抗体または融合タンパク質を含む出発溶液とレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液は部分分子の形成を防止および／または部分分子を再酸化して、完全分子(すなわち、融合タンパク質の完全抗体)を産生する、方法提供する。従って、本発明は、例えば、出発溶液中の部分分子(例えば、抗体断片)の形成を防止または低減する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子の形成を防止または低減する、方法を提供する。
【０１１８】
また提供されるのは、再酸化プロセスによりジスルフィド結合還元(例えば、ＨＨＬ、ＨＨまたはＨＬ断片、ここで、ＨおよびＬはそれぞれ抗体の重鎖および軽鎖である)が原因の部分分子(例えば、抗体断片)を完全分子(例えば、２個の重鎖および２個の軽鎖を含む単量体抗体)に変換する方法であって、部分分子を含む出発溶液とレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法である。それ故に、本発明は、出発溶液中の部分分子(例えば、抗体断片)を完全分子(例えば、完全抗体)に変換する方法であって、部分分子を含む出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法を提供する。
【０１１９】
本発明はまた、部分分子(例えば、抗体断片)を含む出発溶液から完全分子(例えば、完全抗体)を精製または単離する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤と少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法も提供する。
【０１２０】
また提供されるのは、部分分子(例えば、抗体断片)を含む出発溶液(例えば、長期保存中に分解を受けている抗体を含む医薬製品)を再加工する方法であって、出発溶液と少なくとも一つのチオール還元剤および少なくとも一つのチオール酸化剤を含むレドックスペアを含むレドックス緩衝液を混合することを含み、ここで、レドックス緩衝液が部分分子を完全分子に再酸化する、方法である。
【０１２１】
ある態様において、ここに開示する方法は、さらに、本発明の方法の適用が適切であるか否かを決定する、１以上の診断的測定の実施を含む。従って、ある態様において、本発明の方法は、さらに、例えば、(ｉ)出発溶液中の遊離チオールの濃度の決定；(ii)出発溶液中の部分分子の濃度の決定；(iii)出発溶液中の完全分子の純度または濃度の決定；(iv)出発溶液中のジスルフィド還元を引き起こす酵素の存在または活性の決定；または(ｖ)これらの何れかの組み合わせを含む。
【０１２２】
１または１を超える診断的測定が実施されたら、得られた１以上の値を、低分子量断片の形成を軽減または防止するまたは出発溶液(例えば、部分分子を含む培養培地上清、ライセート、溶離液、濾液または医薬製品)を再加工またはレスキューするために、ここに開示する再酸化プロセスを適用するのが有利であるか否かを決定する、対照値または閾値と比較する。
【０１２３】
ある態様において、出発溶液における遊離チオール濃度がある閾値、例えば、約１００μMを超えると決定されたならば、本発明の方法が適用される。従って、ある態様において、遊離チオール濃度が約１００μMより高いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。ある態様において、遊離チオール濃度が約５０μM、約６０μM、約７０μM、約８０μM、約９０μM、約１００μM、約１１０μM、約１２０μM、約１３０μM、約１４０μM、約１５０μM、約１６０μM、約１７０μM、約１８０μM、約１９０μMまたは約２００μMより高いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。
【０１２４】
ある態様において、遊離チオール濃度を、不対システイン残基の遊離チオール基レベルを測定することによる、タンパク質におけるジスルフィド結合の完全性を評価する遊離チオールアッセイを使用して測定する。例えば、サンプルを、遊離チオールと結合し、着色チオラートイオンを放出する５,５０−ジチオビス−(２−ニトロ安息香酸(ＤＴＮＢ)と天然および変性条件下インキュベートさせる。次いで、着色チオラートイオンをＵＶ可視分光光度計で検出する。遊離チオールの濃度を標準曲線から内挿し、遊離チオール対抗体モル比が記録される。Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82:70-77 (1959); Hansen & Winther, Anal. Biochem. 394:147-158 (2009)参照。遊離チオール濃度を決定する別の方法は当分野で知られ、過度の実験なく開示される方法に適応され得る。
【０１２５】
ある態様において、出発溶液の純度がある閾値を超えるまたはそれより低いと決定されるならば、本発明の方法が適用される。例えば、ある態様において、部分分子(不純物)の濃度がある閾値に達しているならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。逆に、他の態様において、完全分子(例えば、完全抗体)の濃度がある閾値より低いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。
【０１２６】
ある態様において、出発溶液濃度の純度(例えば、総免疫グロブリン含量または完全タンパク質含量に対する完全抗体の量)が約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％または約１０％より低いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。ある態様において、出発溶液の部分分子(例えば、総免疫グロブリン含量または完全タンパク質含量に対する抗体断片の量)の濃度が約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％より高いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。
【０１２７】
ある態様において、出発溶液中の部分分子の純度または濃度を、非還元条件下、LabChip GXII(Perkin Elmer)で実施されるSDS Microchipベースのキャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム(ＣＥ−ＳＤＳ)を使用して決定し得る。ヨードアセトアミド(ＩＡＭ)を、HT Protein Express Sample Buffer(Perkin Elmer)に、おおよそ５mMの最終ＩＡＭ濃度で加える。おおよそ１mg／mLの計５μL抗体サンプルを１００μLのＩＡＭ含有サンプル緩衝液と混合する。次いで、サンプルを７５℃で１０分間インキュベートする。変性タンパク質を「HT Protein Express 200」プログラムで分析し得る。本発明の出発溶液の純度を決定する別の方法は当分野で知られ、過度の実験なく開示される方法に適応され得る。
【０１２８】
ある具体的態様において、非還元条件(ＣＥ−ＮＲ)下、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)ベースのアッセイを使用して決定して、部分分子の濃度が約１０％より高いならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。
【０１２９】
他の具体的態様において、非還元条件(ＣＥ−ＮＲ)下、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)ベースのアッセイを使用して決定して、完全分子の純度または濃度が９０％未満であるならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。
【０１３０】
ある態様において、チオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼのレベルが上記閾値レベルを超える部分分子の蓄積を引き起こす所定のレベルを超えると決定されるならば、本発明の方法が適用される。ある態様において、グルタチオン／グルタチオンレダクターゼのレベルが上記閾値レベルを超える部分分子の蓄積を引き起こす所定のレベルを超えると決定されるならば、本発明の方法が適用される。
【０１３１】
チオレドキシンは、タンパク質のジチオール結合を破壊する。チオレドキシンレダクターゼはチオレドキシンの作用を触媒する。両者とも反応が起こるためおよびジチオール結合が破壊されるために必要である。チオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼのレベルを決定するためのアッセイは、チオレドキシン濃度を決定するとき過剰のチオレドキシンを有するとの原則に基づき作用し、逆もそうである。較正曲線を、既知濃度の一方の酵素に過剰の他方を加えることにより、チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼ両方について作成する。インスリンを、ジチオール結合を破壊する酵素の基質として加える。破壊されたジチオール結合数は酵素濃度に比例するが、これは限定的である。破壊されたジチオール結合数は、上記のとおりＤＴＮＢでの滴定により測定される。
【０１３２】
酵素濃度が未知であるサンプルについて、二つの並行アッセイが実施され、一方のアッセイは過剰のチオレドキシンを用い、他方は過剰のチオレドキシンレダクターゼを用いる。次いで、ＤＴＮＢ吸光度を較正曲線を使用して酵素濃度に変換する。例えば、Arner & Holmgren. Measurement of thioredoxin and thioredoxin reductase. Curr. Protoc. Toxicol., Chapter 7, Unit 74 (2001)参照。
【０１３３】
ここに開示する方法のある態様において、(ｉ)発現されるチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼ濃度(例えば、タンパク質またはＲＮＡレベル)が所定の閾値を超える；(ii)チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼ活性が所定の閾値を超える；(iii)発現されるグルタチオンおよび／またはグルタチオンレダクターゼ濃度(例えば、タンパク質またはＲＮＡレベル)が所定の閾値を超える；(iv)グルタチオンおよび／またはグルタチオンレダクターゼ活性が所定の閾値を超える；または(ｖ)これらの何れかの組み合わせであるならば、レドックス緩衝液を出発溶液と混合する。
【０１３４】
本発明の方法を、溶液中またはクロマトグラフィー媒体(例えば、クロマトグラフィー樹脂)への適用により、ここに開示するレドックス緩衝液での処理を受け得る対照タンパク質(例えば、ＩｇＧモノクローナル抗体または融合タンパク質などの完全分子)の部分分子(例えば、ＨＨＬ、ＨＨ、ＨＬ、ＨＣ、ＬＣ抗体断片またはこれらの何れかの組み合わせ)を含む何れかの出発溶液に適用し得る。
【０１３５】
ある態様において、出発溶液は細胞培養またはライセートの上清であり得る。他の態様において、出発溶液は濾液(例えば、細胞培養上清が、デブリを除去するために濾過された後)または溶離液(例えば、下流抗体精製中のクロマトグラフィーカラムからの溶離液)であり得る。さらに、出発溶液は、例えば、ＬＭＷ断片を含む先に精製された調製物またはＬＭＷ断片を含む市販のタンパク質調製物(例えば、市販の抗体調製など)であり得る。従って、ある態様において、出発溶液は、一定期間保存されている(例えば、凍結)タンパク質溶離液またはタンパク質濃縮物または一定期間保存されている液体医薬製品(例えば、抗体を含む)または例えば先に凍結乾燥されたタンパク質溶液の再懸濁による再構成溶液(例えば、再懸濁抗体調製物)であり得る。
【０１３６】
目的のタンパク質(すなわち、完全分子および／またはその部分分子)は、例えば、組み換えタンパク質(例えば、組み換えにより産生された抗体)、合成タンパク質または天然に存在するタンパク質であり得る。ある態様において、目的のタンパク質は、モノクローナル抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４モノクローナル抗体などのＩｇＧモノクローナル抗体である。他の態様において、目的のタンパク質は、融合タンパク質、例えば、免疫グロブリン部分(例えば、抗体重鎖または軽またはＦｃドメインなどのその断片)を含む融合タンパク質である。
【０１３７】
ある態様において、目的のタンパク質を、哺乳動物細胞発現系、例えば、培養培地で増殖させたＣＨＯ細胞で発現させる。本発明方法に使用され得る細胞型は、培養で増殖可能なあらゆる哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ(チャイニーズハムスター卵巣)(ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＧ４４およびＣＨＯ  ＤＵＸＢ１１を含む)、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ(ヒト子宮頸部癌腫)、ＣＶ１(サル腎線維芽細胞株)(ＣＯＳおよびＣＯＳ−７を含む)、マウス骨髄腫(ＮＳ０)、ＢＨＫ(ベビーハムスター腎臓)、メイディン・ダービー・ウシ腎臓細胞ＭＤＣＫ、Ｃ１２７、ＰＣ１２、ＨＥＫ−２９３(ＨＥＫ−２９３ＴおよびＨＥＫ−２９３Ｅを含む)、ＰＥＲ  Ｃ６、ＮＳ０、ＷＩ３８、Ｒ１６１０(チャイニーズハムスター線維芽細胞)、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３(マウス線維芽細胞)、ＨＡＫ(ハムスター腎臓株)、ＳＰ２／Ｏ(マウス骨髄腫)、Ｐ３×６３−Ａｇ３.６５３(マウス骨髄腫)、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ(ウシ内皮細胞)、ＲＡＪＩ(ヒトリンパ球)、２９３(ヒト腎臓)細胞およびこれらの何れかの組み合わせを含む。
【０１３８】
他の態様において、細胞培養は、例えば、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞を含み得る。
【０１３９】
本発明のある態様において、目的のタンパク質(すなわち、完全分子および／またはその部分分子)は採取細胞培養液に存在する。ある態様において、採取細胞培養液は、例えば、細胞および他のデブリが、例えば、濾過または遠心分離により除去された後の、細胞培養培地からの上清である。ある態様において、採取細胞培養液は、例えば、ライセートである。他の態様において、出発溶液は、精製した物質、例えば、目的のタンパク質(すなわち、完全分子および／またはその部分分子)を含む溶液(例えば、製剤)であり得る。
【０１４０】
ここに開示する方法のある態様において、部分分子の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％が、再酸化後完全分子に変換される。
【０１４１】
ある態様において、再酸化後の完全分子(例えば、単量体ＩｇＧモノクローナル抗体)の純度は少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％である。
【０１４２】
ある態様において、本発明の方法による部分分子の再酸化は、溶液中の部分分子の含量の、その再酸化前の含量に対する少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％減少をもたらす。
【０１４３】
ある態様において、完全分子の濃度は、再酸化後少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも１００％増加する。
【０１４４】
本発明のある特定の態様において、レドックスペアはシステイン(例えば、Ｌ−システイン)およびシスチンおよび／またはその誘導体および／またはグルタチオン(ＧＳＨ)および酸化グルタチオン(ＧＳＳＧ)および／またはその誘導体またはこれらの何れかの組み合わせを含む。ある態様において、本発明の方法は、システアミン、二酸化硫黄、硫化水素、チオグリコール酸、亜硫酸水素、アスコルビン酸、ソルビン酸、ＴＣＥＰ(トリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン)、フマル酸またはこれらの何れかの組み合わせなどの還元剤を含むレドックスペアで実施され得る。
【０１４５】
ここに開示する方法のある態様において、レドックスペアは(ｉ)０mM〜１０mM  システイン；(ii)０mM〜０.５mM  シスチン；(iii)０〜１０mM  グルタチオン；または(iv)これらの何れかの組み合わせを含み、ここで、シスチンおよび／またはグルタチオンの濃度は少なくとも０.１mMである。本発明の目的のために、シスチンまたはグルタチオンのみを含むレドックス緩衝液はなお「レドックスペア」とみなされる。
【０１４６】
ここに記載する方法によって、レドックスペアは遊離システインおよび遊離シスチンを含み得る。ある具体的態様において、システインの濃度は約０.５mMであり、シスチンの濃度は約０.３mMである。他の具体的態様において、システインの濃度は約１mMであり、シスチンの濃度は約０.３mMである。
【０１４７】
溶液中の遊離システイン濃度は、例えば、約０.１mM以上かつ約１０mM未満である。本発明のある態様において、遊離システインの濃度は０mMである。
【０１４８】
ある態様において、システインの濃度は、例えば、約０mM〜約１０mM、約０mM〜約９mM、約０mM〜約８mM、約０mM〜約７mM、約０mM〜約６mM、０mM〜約５mM、約０mM〜約４mM、約０mM〜約３mM、約０mM〜約２mMまたは約０mM〜約１mMであり得る。ある態様において、システインの濃度は、例えば、約０mM〜約０.５mMまたは約０.５mM〜約１mMまたは約１mM〜約１.５mMまたは約１.５mM〜約２mMまたは約２mM〜約２.５mMまたは約２.５mM〜約３mMまたは約３mM〜約３.５mMまたは約３.５mM〜約４mMまたは約４mM〜約４.５mMまたは約４.５mM〜約５mMまたは約５mM〜約５.５mMまたは約５.５mM〜約６mMまたは約６mM〜約６.５mMまたは約６.５mM〜約７mMまたは約７mM〜約７.５mMまたは約７.５mM〜約８mMまたは約８mM〜約８.５mMまたは約８.５mM〜約９mMまたは約９mM〜約９.５mMまたは約９.５mM〜約１０mMであり得る。ある態様において、システインの濃度は、例えば、約０.１mM〜約１mMまたは約０.２mM〜約０.９mMまたは約０.３mM〜約０.８mMまたは約０.４mM〜約０.７mMまたは約０.５mM〜約０.６mMであり得る。ある態様において、システインの濃度は、約０.１mMまたは約０.２mMまたは約０.３mMまたは約０.４mMまたは約０.５mMまたは約０.６mMまたは約０.７mMまたは約０.８mMまたは約０.９mMまたは約１mMまたは約１.１mMまたは約１.２mMまたは約１.３mMまたは約１.４mMまたは約１.５mMまたは約１.６mMまたは約１.７mMまたは約１.８mMまたは約１.９mMまたは約２mMまたは約２.１mMまたは約２.２mMまたは約２.３mMまたは約２.４mMまたは約２.５mMまたは約２.６mMまたは約２.７mMまたは約２.８mMまたは約２.９mMまたは約３mMまたは約３.１mMまたは約３.２mMまたは約３.３mMまたは約３.４mMまたは約３.５mMまたは約３.６mMまたは約３.７mMまたは約３.８mMまたは約３.９mMまたは約４mMまたは約４.１mMまたは約４.２mMまたは約４.３mMまたは約４.４mMまたは約４.５mMまたは約４.６mMまたは約４.７mMまたは約４.８mMまたは約４.９mMまたは約５mMまたは約５.１mMまたは約５.２mMまたは約５.３mMまたは約５.４mMまたは約５.５mMまたは約５.６mMまたは約５.７mMまたは約５.８mMまたは約５.９mMまたは約６mMまたは約６.１mMまたは約６.２mMまたは約６.３mMまたは約６.４mMまたは約６.５mMまたは約６.６mMまたは約６.７mMまたは約６.８mMまたは約６.９mMまたは約７mMまたは約７.１mMまたは約７.２mMまたは約７.３mMまたは約７.４mMまたは約７.５mMまたは約７.６mMまたは約７.７mMまたは約７.８mMまたは約７.９mMまたは約８mMまたは約８.１mMまたは約８.２mMまたは約８.３mMまたは約８.４mMまたは約８.５mMまたは約８.６mMまたは約８.７mMまたは約８.８mMまたは約８.９mMまたは約９mMまたは約９.１mMまたは約９.２mMまたは約９.３mMまたは約９.４mMまたは約９.５mMまたは約９.６mMまたは約９.７mMまたは約９.８mMまたは約９.９mMまたは約１０mMであり得る。
【０１４９】
ある態様において、システインの濃度は約１.０mM〜約９mM、約１.０mM〜約８mM、約１.０mM〜約７mM、約１.０mM〜約６mM、約１.０mM〜約５mM、約１.０mM〜約４mMまたは約１.０mM〜約３mMである。ある特定の態様において、濃度は約１.０mM  システインまたは約３.０mM  システインである。ある態様において、システインはＬ−システインである。
【０１５０】
溶液中の遊離シスチンの濃度は、例えば、約０mM以上および約１０mM未満であり得る。ある態様において、溶液中の遊離シスチンの濃度は、約０mMであり得る。
【０１５１】
ある態様において、シスチンの濃度は、例えば、約０.１mM〜約１０mM、約０.１mM〜約９mM、約０.１mM〜約８mM、約０.１mM〜約７mM、約０.１mM〜約６mM、０.１mM〜約５mM、０.１mM〜約４mM、０.１mM〜約３mM、約０.１mM〜約２mMまたは約０.１mM〜約１mMであり得る。ある態様において、シスチンの濃度は、例えば、約０.１mM〜約０.５mMまたは約０.５mM〜約１mMまたは約１mM〜約１.５mMまたは約１.５mM〜約２mMまたは約２mM〜約２.５mMまたは約２.５mM〜約３mMまたは約３mM〜約３.５mMまたは約３.５mM〜約４mMまたは約４mM〜約４.５mMまたは約４.５mM〜約５mMまたは約５mM〜約５.５mMまたは約５.５mM〜約６mMまたは約６mM〜約６.５mMまたは約６.５mM〜約７mMまたは約７mM〜約７.５mMまたは約７.５mM〜約８mMまたは約８mM〜約８.５mMまたは約８.５mM〜約９mMまたは約９mM〜約９.５mMまたは約９.５mM〜約１０mMであり得る。ある態様において、シスチンの濃度は、例えば、約０.１mM〜約１mMまたは約０.２mM〜約０.９mMまたは約０.３mM〜約０.８mMまたは約０.４mM〜約０.７mMまたは約０.５mM〜約０.６mMであり得る。ある態様において、シスチンの濃度は、約０.１mMまたは約０.２mMまたは約０.３mMまたは約０.４mMまたは約０.５mMまたは約０.６mMまたは約０.７mMまたは約０.８mMまたは約０.９mMまたは約１mMまたは約１.１mMまたは約１.２mMまたは約１.３mMまたは約１.４mMまたは約１.５mMまたは約１.６mMまたは約１.７mMまたは約１.８mMまたは約１.９mMまたは約２mMまたは約２.１mMまたは約２.２mMまたは約２.３mMまたは約２.４mMまたは約２.５mMまたは約２.６mMまたは約２.７mMまたは約２.８mMまたは約２.９mMまたは約３mMまたは約３.１mMまたは約３.２mMまたは約３.３mMまたは約３.４mMまたは約３.５mMまたは約３.６mMまたは約３.７mMまたは約３.８mMまたは約３.９mMまたは約４mMまたは約４.１mMまたは約４.２mMまたは約４.３mMまたは約４.４mMまたは約４.５mMまたは約４.６mMまたは約４.７mMまたは約４.８mMまたは約４.９mMまたは約５mMまたは約５.１mMまたは約５.２mMまたは約５.３mMまたは約５.４mMまたは約５.５mMまたは約５.６mMまたは約５.７mMまたは約５.８mMまたは約５.９mMまたは約６mMまたは約６.１mMまたは約６.２mMまたは約６.３mMまたは約６.４mMまたは約６.５mMまたは約６.６mMまたは約６.７mMまたは約６.８mMまたは約６.９mMまたは約７mMまたは約７.１mMまたは約７.２mMまたは約７.３mMまたは約７.４mMまたは約７.５mMまたは約７.６mMまたは約７.７mMまたは約７.８mMまたは約７.９mMまたは約８mMまたは約８.１mMまたは約８.２mMまたは約８.３mMまたは約８.４mMまたは約８.５mMまたは約８.６mMまたは約８.７mMまたは約８.８mMまたは約８.９mMまたは約９mMまたは約９.１mMまたは約９.２mMまたは約９.３mMまたは約９.４mMまたは約９.５mMまたは約９.６mMまたは約９.７mMまたは約９.８mMまたは約９.９mMまたは約１０mMであり得る。
【０１５２】
ある態様において、シスチンの濃度は約１.０mM〜約９mM、約１.０mM〜約８mM、約１.０mM〜約７mM、約１.０mM〜約６mM、約１.０mM〜約５mM、約１.０mM〜約４mMまたは約１.０mM〜約３mMである。ある特定の態様において、濃度は約１.０mM  シスチンまたは約３.０mM  シスチンである。ある態様において、システインはＬ−システインである。
【０１５３】
ここに記載する方法によって、レドックスペアはグルタチオン(酸化グルタチオンおよび還元グルタチオン両者)であり得る。
【０１５４】
溶液中のグルタチオンの濃度は、例えば、約０.１mM以上および約１０mM未満であり得る。ある態様において、グルタチオンの濃度は０mMである。
【０１５５】
ある態様において、グルタチオンの濃度は、例えば、約０.１mM〜約１０mM、約０.１mM〜約９mM、約０.１mM〜約８mM、約０.１mM〜約７mM、約０.１mM〜約６mM、０.１mM〜約５mM、０.１mM〜約４mM、０.１mM〜約３mM、約０.１mM〜約２mMまたは約０.１mM〜約１mMであり得る。ある態様において、グルタチオンの濃度は、例えば、約０.１mM〜約０.５mMまたは約０.５mM〜約１mMまたは約１mM〜約１.５mMまたは約１.５mM〜約２mMまたは約２mM〜約２.５mMまたは約２.５mM〜約３mMまたは約３mM〜約３.５mMまたは約３.５mM〜約４mMまたは約４mM〜約４.５mMまたは約４.５mM〜約５mMまたは約５mM〜約５.５mMまたは約５.５mM〜約６mMまたは約６mM〜約６.５mMまたは約６.５mM〜約７mMまたは約７mM〜約７.５mMまたは約７.５mM〜約８mMまたは約８mM〜約８.５mMまたは約８.５mM〜約９mMまたは約９mM〜約９.５mMまたは約９.５mM〜約１０mMであり得る。ある態様において、グルタチオンの濃度は、例えば、約０.１mM〜約１mMまたは約０.２mM〜約０.９mMまたは約０.３mM〜約０.８mMまたは約０.４mM〜約０.７mMまたは約０.５mM〜約０.６mMであり得る。ある態様において、グルタチオンの濃度は、約０.１mMまたは約０.２mMまたは約０.３mMまたは約０.４mMまたは約０.５mMまたは約０.６mMまたは約０.７mMまたは約０.８mMまたは約０.９mMまたは約１mMまたは約１.１mMまたは約１.２mMまたは約１.３mMまたは約１.４mMまたは約１.５mMまたは約１.６mMまたは約１.７mMまたは約１.８mMまたは約１.９mMまたは約２mMまたは約２.１mMまたは約２.２mMまたは約２.３mMまたは約２.４mMまたは約２.５mMまたは約２.６mMまたは約２.７mMまたは約２.８mMまたは約２.９mMまたは約３mMまたは約３.１mMまたは約３.２mMまたは約３.３mMまたは約３.４mMまたは約３.５mMまたは約３.６mMまたは約３.７mMまたは約３.８mMまたは約３.９mMまたは約４mMまたは約４.１mMまたは約４.２mMまたは約４.３mMまたは約４.４mMまたは約４.５mMまたは約４.６mMまたは約４.７mMまたは約４.８mMまたは約４.９mMまたは約５mMまたは約５.１mMまたは約５.２mMまたは約５.３mMまたは約５.４mMまたは約５.５mMまたは約５.６mMまたは約５.７mMまたは約５.８mMまたは約５.９mMまたは約６mMまたは約６.１mMまたは約６.２mMまたは約６.３mMまたは約６.４mMまたは約６.５mMまたは約６.６mMまたは約６.７mMまたは約６.８mMまたは約６.９mMまたは約７mMまたは約７.１mMまたは約７.２mMまたは約７.３mMまたは約７.４mMまたは約７.５mMまたは約７.６mMまたは約７.７mMまたは約７.８mMまたは約７.９mMまたは約８mMまたは約８.１mMまたは約８.２mMまたは約８.３mMまたは約８.４mMまたは約８.５mMまたは約８.６mMまたは約８.７mMまたは約８.８mMまたは約８.９mMまたは約９mMまたは約９.１mMまたは約９.２mMまたは約９.３mMまたは約９.４mMまたは約９.５mMまたは約９.６mMまたは約９.７mMまたは約９.８mMまたは約９.９mMまたは約１０mMであり得る。
【０１５６】
ある態様において、グルタチオンの濃度は約１.０mM〜約９mM、約１.０mM〜約８mM、約１.０mM〜約７mM、約１.０mM〜約６mM、約１.０mM〜約５mM、約１.０mM〜約４mMまたは約１.０mM〜約３mMである。ある特定の態様において、濃度は約１.０mM  グルタチオンである。ある態様において、グルタチオンはＬ−グルタチオンである。
【０１５７】
ある態様において、レドックス緩衝液は、チオール酸化剤(例えば、シスチン)のみを含み、チオール還元剤がない。ある態様において、レドックス緩衝液は単一チオール酸化剤および単一チオール還元剤を含む。他の態様において、レドックス緩衝液は１を超えるチオール酸化剤および／１を超えるチオール還元剤を含む。
【０１５８】
ある態様において、レドックス緩衝液はチオール還元剤およびチオール酸化剤を含み、ここで、チオール還元剤はモル過剰である。ある態様において、チオール還元剤対チオール酸化剤の比は０：１〜１０：１である。ある態様において、チオール還元剤対チオール酸化剤の比は１：１０〜１０：１、例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、２：１、２：２、２：３、２：４、２：５、２：６、２：７、２：８、２：９、２：１０、３：１、３：２、３：３、３：４、３：５、３：６、３：７、３：８、３：９、３：１０、４：１、４：２、４：３、４：４、４：５、４：６、４：７、４：８、４：９、４：１０、５：１、５：２、５：３、５：４、５：５、５：６、５：７、５：８、５：９、５：１０、６：１、６：２、６：３、６：４、６：５、６：６、６：７、６：８、６：９、６：１０、７：１、７：２、７：３、７：４、７：５、７：６、７：７、７：８、７：９、７：１０、８：１、８：２、８：３、８：４、８：５、８：６、８：７、８：８、８：９、８：１０、９：１、９：２、９：３、９：４、９：５、９：６、９：７、９：８、９：９、９：１０、１０：１、１０：２、１０：３、１０：４、１０：５、１０：６、１０：７、１０：８または１０：９である。
【０１５９】
ある態様において、レドックス緩衝液のｐＨは約５〜約１０である。ある態様において、ｐＨは約６〜約９である。ある態様において、ｐＨは約７〜約９である。ある具体的態様において、ｐＨは約８である。ある態様において、ｐＨは約５〜約６または約６〜約７または約７〜約８または約８〜約９または約９〜約１０である。ある態様において、ｐＨは約５、約５.５、約６、約６.５、約７、約７.５、約８、約８.５、約９、約９.５または約１０である。
【０１６０】
ある態様において、レドックス緩衝液は低電導度を有する。ある態様において、レドックス緩衝液は電導度＜５mS／cmを有する。ある態様において、レドックス緩衝液は約５mS／cmの電導度を有する。ある態様において、レドックス緩衝液は、約１００mS／cm未満、約９５mS／cm未満、約９０mS／cm未満、約８５mS／cm未満、約８０mS／cm未満、約７５mS／cm未満、約７０mS／cm未満、約６５mS／cm未満、約６０mS／cm未満、約５５mS／cm未満、約５０mS／cm未満、約４５mS／cm未満、約４０mS／cm未満、約３５mS／cm未満、約３０mS／cm未満、約２５mS／cm未満、約２０mS／cm未満、約１５mS／cm未満または約１０mS／cm未満の電導度を有する。
【０１６１】
ある態様において、レドックス緩衝液は約２mS／cm〜約６mS／cmまたは約２mS／cm〜約５mS／cmまたは約２mS／cm〜約４mS／cmまたは約２mS／cm〜約３mS／comの電導度を有する。ある態様において、レドックス緩衝液は約１mS／cm、約２mS／cm、約３mS／cm、約４mS／cm、約５mS／cm、約６mS／com、約７mS／com、約８mS／cm、約９mS／cmまたは約１０mS／cmの電導度を有する。ある態様において、レドックス緩衝液は約５mS／cm〜約１０mS／cmまたは約１０mS／cm〜約２０mS／cmまたは約２０mS／cm〜約３０mS／cmまたは約３０mS／cm〜約４０mS／cmまたは約４０mS／cm〜約５０mS／cmまたは約５０mS／cm〜約６０mS／cmまたは約６０mS／cm〜約７０mS／cmまたは約７０mS／cm〜約８０mS／cmまたは約８０mS／cm〜約９０mS／cmまたは約９０mS／cm〜約１００mS／cmの電導度を有する。
【０１６２】
ある態様において、ここに開示する方法は室温で操作される。他の態様において、ここに開示する方法は約４℃〜約３４℃の温度範囲で操作される。ある態様において、温度は約４℃〜約１０℃または約１０℃〜約１５℃または約１５℃〜約２０℃または約２０℃〜約２５℃または約２５℃〜約３０℃または約３０℃〜約３５℃である。ある態様において、温度は約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃または約３４℃である。
【０１６３】
本発明のある具体的態様において、レドックス緩衝液は、２０℃で、１mM  システイン、０.３mM  シスチン、ｐＨ８、電導度＜７.３mS／cmを含む。
【０１６４】
ある態様において、再酸化時間は約３０分〜約８時間である。例えば、レドックス緩衝液を洗浄緩衝液として、部分分子を含むサンプルを負荷したプロテインＡカラムに適用したとき、洗浄緩衝液接触時間(すなわち、その間に再酸化が起こるであろう時間)は４.５時間であり得る。他の態様において、再酸化時間は約３０分、約１時間、約１.５時間、約２時間、約２.５時間、約３時間、約３.５時間、約４時間、約４.５時間、約５時間、約５.５時間、約６時間、約６.５時間、約７時間、約７.５時間または約８時間である。ある態様において、再酸化時間は約３０分〜約１時間または約１時間〜約２時間または約２時間〜約３時間または約３時間〜約４時間または約４時間〜約５時間または約５時間〜約６時間または約６時間〜約７時間または約７時間〜約８時間または約１時間〜約３時間または２時間〜約４時間または約３時間〜約５時間または約４時間〜約６時間または約５時間〜約７時間または約６時間〜約８時間または約１時間〜約４時間または約２時間〜約５時間または約３時間〜約６時間または約４時間〜約７時間または約５時間〜約８時間である。
【０１６５】
ある態様において、再酸化を溶液中で実施する。例えば、溶液はリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)溶液であり得る。しかしながら、他の態様において、再酸化は基質上で実施され得る。ある態様において、基質はクロマトグラフィー媒体、例えば、クロマトグラフィー樹脂である。クロマトグラフィー媒体は当分野で知られるあらゆるクロマトグラフィー媒体であり得る。それ故に、ここに開示する方法のある態様において、レドックス緩衝液は、少なくとも一つのクロマトグラフィー精製段階中、例えば、親和性クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィー(例えば、カチオン交換クロマトグラフィー)で適用され得る。クロマトグラフィー媒体は、タンパク質サンプル中のタンパク質が結合できるもの、すなわち単なる流体通過モードで動作しないクロマトグラフィー媒体であり得る。タンパク質の結合は、例えば、タンパク質の動作を制限することにより、特定の利点をもたらし得る。従って、ある態様において、目的のタンパク質(例えば、抗体)および／またはそのＬＭＷ断片を含むタンパク質サンプルを、親和性クロマトグラフィー媒体(例えばMabSelect SuReなどのプロテインＡ親和性樹脂)に適用でき、レドックス緩衝液を、例えば、負荷緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液またはこれらの何れかの組み合わせに使用し得る。特定の態様において、レドックス緩衝液を洗浄緩衝液で使用する。
【０１６６】
プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに加えて、親和性クロマトグラフィー媒体は、例えばレクチンクロマトグラフィー媒体、ニッケルクロマトグラフィー媒体などの金属結合クロマトグラフィー媒体、ＧＳＴクロマトグラフィー媒体、プロテインＧクロマトグラフィー媒体または免疫親和性クロマトグラフィー媒体であり得る。ある態様において、クロマトグラフィー媒体は抗体Ｆｃ領域結合クロマトグラフィー媒体である。
【０１６７】
他の態様において、レドックス緩衝液は、カチオン交換(ＣＥＸ)クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)中に適用される。ある態様において、カチオン交換クロマトグラフィー(ＣＥＸ)媒体は樹脂である。ある態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)媒体は樹脂である。
【０１６８】
クロマトグラフィー媒体は、例えば、カラムの形態、バッチモードのクロマトグラフィー樹脂または９６ウェル形式などの他の形式の類似結合マトリクスであり得る。さらに、タンパク質サンプルは適切に修飾された膜に結合し得る。
【０１６９】
ある態様において、レドックス緩衝液は、一段階または複数段階(例えば、複数クロマトグラフィー段階または抗体精製中の他の段階)で適用され得る。レドックス緩衝液を、一定濃度でまたは濃度増加もしくは減少の連続的もしくはステップワイズ勾配で適用し得る。ある態様において、レドックスペアの両レドックス成分の濃度を変える。他の態様において、レドックスペアのレドックス成分の一方のみの濃度を変える。
【０１７０】
ある態様において、レドックス緩衝液とタンパク質サンプルの接触時間は、適切なカラム流速の選択により制御され得る。例えば、速い流速と短い接触時間が、高濃度のレドックス緩衝液を用いて、使用され得る。
【０１７１】
III. 完全分子(例えば、抗体)
ある態様において、本発明は、ここに開示する方法の何れかの適用により得られた完全分子(例えば、モノクローナル抗体または融合タンパク質)を提供する。それ故に、例えば、完全モノクローナル抗体または完全融合タンパク質を、ここに開示する方法の何れかを使用して、部分分子(例えば、抗体断片)を含むサンプルから得ることができる。ここに記載する方法により得られたタンパク質を、診断的アッセイ、免疫アッセイおよび／または医薬製品におけるその後の使用のために調製し得る。
【０１７２】
ある態様において、ここに記載する方法で得た完全分子、例えば抗体は、未処理対照と比較して、保存安定性が増加している。他の態様において、ここに記載する方法で得たタンパク質、例えば抗体は、未処理対照と比較して、凝集傾向が低減している。
【０１７３】
ある態様において、ここに記載する方法を使用して得た完全分子(例えば、抗体)を、「薬学的に許容される」形態に製剤し得る。「薬学的に許容される」は、合理的な医学的判断の範囲内で、過度の毒性または他の合併症なく、ヒトおよび動物の組織と接触させるのに適する、合理的利益／危険比を伴う、生物学的製剤をいう。
【実施例】
【０１７４】
実施例１
ジスルフィド結合再酸化を使用する高純度モノクローナル抗体(ｍＡｂ)の産生
ジスルフィド結合再酸化は、高純度ｍＡｂ産物を産生するために別のアプローチとして適用されている。再酸化は、遊離チオールを再接続して、ジスルフィド結合を形成する翻訳後修飾である(Thies et al., J. Mol. Biol. 2002, 319, 1267-1277)。まず、溶液中のジスルフィド結合再酸化に影響し得るプロセスパラメータを研究した。これらのパラメータは、プロテインＡ樹脂存在下および非存在下での、温度、ｐＨ、電導度、酸化剤である。次に、再酸化機構に基づく反応の動力学的特性(kinetic charateristics)を定量化するための動力学モデルを数学的に構築した。経験的モデルと比較して、動力学モデル化は、反応動力学に関係する基本的要素を反映する。最後に、溶液研究および動力学モデリング予測からの知見を、下流精製に適用した。
【０１７５】
溶液試験およびモデル予測からの最適条件を使用して、プロテインＡクロマトグラフィー段階およびカチオン交換クロマトグラフィー段階における洗浄段階を単純に実行することにより、試験を行った。種々のＩｇＧ分子を使用した多数の実験の中で、出発物質純度＜５％の最悪の場合のシナリオを使用した再酸化後、＞９０％インタクトｍＡｂ純度を達成した。さらに、再酸化ｍＡｂは、対照物質と同等の品質を示した。結果として、再酸化は、経済的に顕著な影響を有する、既存の防止戦略を補う有効なＬＭＷ制御ツールであり得る。
【０１７６】
２. 材料および方法
２.１. 細胞培養
細胞培養液(ＣＣＦ)を、ＣＨＯ細胞を使用して、使い捨てバッグバイオリアクター中、５００Ｌパイロットフェドバッチで、特製の基本および追加培地を使用して産生した。一次深部濾過、続いて浄化濾過および０.２μｍ  滅菌濾過を使用して採集を実施して、採集細胞培養液(ＨＣＣＦ)を得た。ＨＣＣＦを、使い捨て滅菌バッグに入れ、プロテインＡ精製まで２〜８℃に維持した。
【０１７７】
２.１.１. 溶液中の再酸化試験
１５mL試験管で、先に精製したｍＡｂ−ＴサンプルとプロテインＡ樹脂およびシステイン、シスチンおよびグルタチオンを含む緩衝液を混合することにより、試験を実施した。十分に混合した後、試験管を水浴に入れて、一定反応温度を維持した。時間の関数としてサンプルを集めた。プロテインＡ樹脂を使用したサンプルについて、混合物を１分間、１０００RCFで遠心分離して、上清を除き、産物を酢酸緩衝液(ｐＨ３.５)で溶出した。次いで、溶離液をｔｒｉｓ緩衝液でｐＨ５.５に中和した。最後に、全サンプルを、分析まで凍結保存した。
【０１７８】
２.１.２. プロテインＡカラム上での再酸化試験
MabSelect SuRe LX樹脂(GE Healthcare, Piscataway, NJ)が充填された１cm×２０cmカラムを備えるAKTA Avant 150系(GE Healthcare, Piscataway, NJ)で精製を実施した。標準プロテインＡクロマトグラフィー操作として、カラムに精製する物質を乗せ、連続洗浄段階が続いた。産物は低ｐＨ緩衝液で溶出し、続いてｐＨ５.５に中和した。サンプルを集め、分析まで凍結保存した。
【０１７９】
２.１.３. カチオン交換カラム上での再酸化試験
Poros XS樹脂(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)が充填された１cm×２０cmカラムを備えるAKTA Avant 150系(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を使用して、精製を実施した。標準カチオン交換クロマトグラフィー操作として、カラムに精製する物質を負荷し、次いで連続洗浄を実施た。産物を、高イオン強度の緩衝液を使用して、溶出した。サンプルを集め、分析まで凍結保存した。
【０１８０】
２.１.４. 断片分析
SDS Microchipベースのキャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム(ＣＥ−ＳＤＳ)を、非還元条件下、LabChip GXII(Perkin Elmer)で実施した。ヨードアセトアミド(ＩＡＭ)を、おおよそ５mMの最終ＩＡＭ濃度までHT Protein Express Sample Buffer(Perkin Elmer)に加えた。おおよそ１mg／mLの計５μL抗体サンプルを１００μLのＩＡＭ含有サンプル緩衝液と混合した。サンプルを７５℃で１０分間インキュベートした。変性タンパク質を「HT Protein Express 200」プログラムで分析した。
【０１８１】
２.１.５. サイズ排除ＨＰＬＣ(ＳＥＣ)
サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を、Waters ACQUITY UPLC系(Milford, MA)で２８０nmでモニターする等張勾配でWaters BEHカラム(４.６mm×１５０mm、２００Å、１.５μm)を使用して実施した。サンプルを、０.１Ｍリン酸ナトリウム、０.１５Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ６.８の移動相を使用する０.４mL／分の等張流速系に注入した。
【０１８２】
２.１.６. チャージバリアント分析
チャージバリアント分析を、Protein Simple iCE3装置(Bio-Techne)上でAlcott 720 NVオートサンプラー(San Jose, CA)を用いて実施したImaged Capillary Isoelectric Focusing(ｉＣＩＥＦ)によりアッセイした。サンプルを適切なｐＩマーカー、両性電解質および尿素と混合し、フッ化炭素被覆キャピラリーカートリッジに注入した。高電圧を適用し、チャージバリアントは、各ｐＩに移動した。ＵＶカメラは２８０nmで画像を取得した。主ピークが同定され、酸性範囲および塩基性範囲に移動したピークが合計され、定量され、相対的面積パーセントとして示された。
【０１８３】
２.１.７. 遊離チオール分析
遊離チオールアッセイは、不対システイン残基の遊離チオール基レベルの測定により、タンパク質におけるジスルフィド結合の完全性を評価する。サンプルを、遊離チオールと結合し、着色チオラートイオンを放出する５,５０−ジチオビス−(２−ニトロ安息香酸(ＤＴＮＢ)と天然および変性条件下インキュベートさせる。着色チオラートイオンをＵＶ可視分光光度計で検出する。遊離チオールの濃度を標準曲線から内挿し、遊離チオール対抗体モル比が示される。
【０１８４】
３. 結果および考察
３.１. 下流プロセス全体のインタクトｍＡｂ純度の増加
３種のモノクローナル抗体(ｍＡｂ−Ｔ、ｍＡｂ−ＸおよびｍＡｂ−Ｎ)のプラットフォームｍＡｂ精製プロセスを使用する大規模ラン中(図３)、ジスルフィド結合還元に起因する低インタクト単量体純度が観察された。ランのプロテインＡプールのインタクト単量体は、４.５％〜５１％の範囲であった。興味深いことに、インタクト単量体純度は、下流プロセスに進むに連れて徐々に増加し(図４)、最終的に９０％近くに達した。表１は、これら４ランの採集パラメータを要約する。
【表１】
2021534151.tif 000003
【０１８５】
これら４ラン中、採集後ＨＣＣＦハンドリングに不一致があり、これがＬＭＷ形成に寄与したと考えられる。しかしながら、能動的低減戦略は実行されたがＬＭＷはなお存在し、現在の低減戦略がジスルフィド結合還元に至る強還元力を凌駕するには不十分であることを示唆する。ジスルフィド結合還元の結果としての部分分子形成の状況下、産物を回収する方法は経済的に実行可能な選択肢となる。
【０１８６】
図４に示すｍＡｂ純度％結果に基づき、かつインプロセスサンプルマトリクス条件を考慮に入れて(図３)、(１)インタクト単量体は下流プロセス中のジスルフィド結合再酸化により再形成され得る；(２)さらに下流での純度％増加は、酸素またはより望ましい再酸化条件(ｐＨ、電導度)への長期暴露による可能性があり得ると考えられる。従って、別のＬＭＷ低減戦略を、破壊されたジスルフィド結合の再酸化により開発した。
【０１８７】
本試験において、系統的実験を、ジスルフィド結合再酸化に対する種々のプロセスパラメータを理解するために実施した。試験を単純化するため、５００ＬランからのｍＡｂ−ＴプロテインＡプールサンプル(ＰＡＶＩＮ)を使用した。試験は、まず、プロテインＡ樹脂存在下および非存在下の条件を比較するため、比較的アルカリ条件(ｐＨ８)下で実施した。次いで、ｐＨおよびシステイン／シスチン／グルタチオンを含む因子のスクリーニングのために、実験による設計(ＤｏＥ)アプローチを使用して、プロテインＡ樹脂存在下、試験した。ＤｏＥ試験からの最適条件下、電導度、システイン／シスチンペアおよび温度を含む因子を評価するために、動力学試験を実施した。最後に、数例試験を実施して、複数分子について親和性クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィーの最適再酸化条件を確認した。
【０１８８】
出発物質は部分的に還元されたＨＣＣＦおよび精製した物質を含んだ。クロマトグラフィーカラムでの洗浄としてのシステインおよびシスチンを含むレドックス系の使用は、高単量体純度タンパク質産物を達成する実行可能なアプローチであり得ることが示された。
【０１８９】
３.２. 再酸化に対する影響因子の基本的理解
３.２.１. ジスルフィド再酸化の基本的反応
種々のタイプの断片がＩｇＧ溶液に存在し得る。ＣＥ分析に基づき、初期溶液の主要成分は、軽鎖(Ｌ)、重鎖(Ｈ)、重−重断片(ＨＨ)、半量体(ＨＬ)、重−重−軽断片(ＨＨＬ)およびインタクト単量体(Ｍｏｎｏ)である。再酸化反応の機構は、断片の遊離チオールが再酸化されてジスルフィド結合を形成し、インタクトＩｇＧ分子に至ることである(White, Methods Enzymol. Academic Press 1972, 25B 387; Petersen and Dorrington, J. Biol. Chem. 1974, 249, 5633-41; Sears et al., 1975)。再酸化速度論は温度、ｐＨ、電導度などを含む複数因子によるが、単純化反応経路を図５のとおり説明し得る。それ故に、反応動力学は次のとおり、表し得る。
【数１】
2021534151.tif 000004
式中、ｒｉ(ｉ＝１,..６)は、各素反応の反応速度であり、ｋｉ(ｉ＝１,..６)は、対応する反応の速度定数である。
【０１９０】
式(１)〜(６)に基づき、各断片のモルバランスを次のとおり表し得る。
【数２】
2021534151.tif 000005
式中、ｔは反応時間である。
【０１９１】
３.２.２. 再酸化に対するプロテインＡ樹脂の影響
プロテインＡは、採集後ＩｇＧを捕捉するための樹脂として使用される、４２kDa表面タンパク質である(Pathak and Rathore, J. Chromatogr. A 2016, 1459, 78-88; Gagnon, J. Chromatogr. A 2012, 1221, 57-70; Low et al., J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2007, 848(1), 48-63)。重鎖のＦｃ領域への高結合親和性により、ＩｇＧ型抗体に対する高選択性を有する(Pathak and Rathore, J. Chromatogr. A 2016, 1459, 78-88; Gagnon, J. Chromatogr. A 2012, 1221, 57-70; Alabi et al., Mol. Immunol. 2017, 92, 161-168)。本試験において、精製ｍＡｂ−Ｔサンプルを、ｐＨ８の炭酸緩衝液で約５ｇ／Ｌの濃度に希釈した。
【０１９２】
次いで、希釈サンプルを、７時間の時間経過でMabSelect SuRe樹脂存在下および非存在下、維持した。図６に示されるとおり、ｍＡｂ−Ｔ分子はｐＨ８緩衝液でゆっくり再酸化された。プロテインＡ樹脂の存在は、全素反応の速度を上げることにより、再酸化プロセスを加速させた。可能性のある理由は、プロテインＡ樹脂が樹脂表面上で断片を捕捉および濃縮し、２個のスルフヒドロ基間を近づけ、再酸化のための反応活性化エネルギーを低減させることによる。
【０１９３】
３.２.３. ＤｏＥを使用する再酸化スクリーニング
システイン、シスチンおよびグルタチオン(ＧＳＨ)は、部分的に還元された断片を再酸化して単量体を回復させるために有効な組み合わせとして報告されている(Poole, Free Radic. Biol. Med. 2015, 80, 148-57; Suzuki et al., Mol. Bio. Cell 2017, 28(8), 1123-31)。シスチンは、再酸化反応のための酸化剤およびチオールドナーとして認識されているが、システインおよびＧＳＨの機構は不明のままである(Oliyai and Borchardt, Pharm. Res. 1993, 10(1), 95-102; Vlasak and Ionescu, mAbs 2011, 3(3), 253-63; Heimer et al., Anal. Chem. 2018, 90, 3321-7)。
【０１９４】
これらの２種の化学物質は、化学ポテンシャル変化により種々のｐＨで酸化剤および還元剤両者として作用し得る(Oliyai and Borchardt, Pharm. Res. 1993, 10(1), 95-102; Vlasak and Ionescu, mAbs 2011, 3(3), 253-63))。これらの因子の機能をさらに理解するために、実験による設計(ＤｏＥ)方法を使用した。実験を、２０℃で３０分間の生成物接触時間でプロテインＡ樹脂上で実施した。次いで、ソフトウェアＪＭＰ  １３を使用して、これら全因子の相関を統計的に分析した。
【０１９５】
表２に示すとおり、最終純度は、異なる条件で変化した。低い純度は、ｐＨ８および１０よりｐＨ７で観察され、おそらく種々のｐＨでの化学ポテンシャル変化により、再酸化プロセスにアルカリ条件が好ましいことを示した。この物質の初期純度は６４％であったが、上記化学物質の何れも伴わないプロテインＡカラムを単独で通すことにより、ｐＨ８および１０で純度が約８５％まで上昇した。これはまたプロテインＡ樹脂からの正の影響を示す。
【表２】
2021534151.tif 000006
【０１９６】
表２に示すこれら実験の中で、最高最終純度は≧９５％を達成した。３％の実験誤差を考慮して、最終純度≧９２％をもたらした９個の条件を‘高純度’条件と定義し、表２で‘レ’を付した。これら９個の条件のうち、７個はｐＨ８であり、２個はｐＨ１０であった；７個の条件はシスチンを含み、６個はシステインを含み、４個はＧＳＨを含んだ。ｐＨ８でのシステインとシスチンの組み合わせが再酸化処理に最適条件であり得ると結論付けるのが妥当と思われる。
【０１９７】
シスチン単独を含む系は、ｐＨ８および１０両者で純度を９２.５％に改善したが、システインまたはＧＳＨの単独の存在は、ｐＨ１０よりｐＨ８で良好に作用し、約９０％(ｐＨ８)および約７０％(ｐＨ１０)をもたらした。これは、シスチンが独立した酸化剤およびチオールドナーであるが、システインおよびＧＳＨの性能は、よりｐＨ依存性であるを示す。これは、シスチンが独立した因子(Ｐｒｏｂ＞[ｔ]、０.０２)であるが、システインおよびＧＳＨはあまり非依存的ではない因子(Ｐｒｏｂ＞[ｔ]、０.４)、ＪＭＰ  ＤｏＥ分析(示していない)と一致する。
【０１９８】
３.２.４. 再酸化に対する電導度の影響
電導度は、緩衝液の一つの重要な特徴である。それは単位操作において十分に制御される必要がある。本試験において塩化ナトリウムを、緩衝液の電導度調整に使用した。次いで、種々の電導度での速度論を測定して、影響を評価した。
【０１９９】
電導度は再酸化速度論に負の影響を有することが判明した(図７Ａおよび７Ｂ)。すなわち、高い再酸化速度は低い電導度で観察された。逆に、遅い再酸化速度は高い電導度で観察された。再酸化速度と溶液電導度間のこのような逆相関は、分子相互作用が塩濃度により負に影響されるとの事実によるものであり得る(Huguet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2010, 107, 15431-6; Roberts et al., Mol. Pharmaceutics 2015, 12(1), 179-93)。
【０２００】
さらに、塩濃度の増加は、酸素溶解度の減少をもたらし(U.S. Geological Survey TWRI Book 9, 4/98, 6.2.4., Correction factors for oxygen solubility and salinity. DO 27-38)、それ故に再酸化速度に影響した。表３は、プロテインＡ樹脂が、各無樹脂条件と比較して、種々の電導度で反応を加速することを示した。それ故に、高単量体純度を達成するために、電導度を制御することが望ましい。
【表３】
2021534151.tif 000007
【０２０１】
３.２.５. 再酸化に対する温度の影響
温度は、反応動力学上の重大な因子である。この試験を、３個の異なる温度レベル(４℃、２０℃および３４℃)および２個の異なるシステインレベル(０.５mMおよび１.０mM)で実施した。シスチンは、その限定的な溶解度のために、全条件で０.３mMの一定濃度に制御した(Carta, J. Chem. Eng. Data, 1996, 41, 414-417)。図８Ａおよび８Ｂに示すとおり、両０.５mMおよび１.０mMシステインレベルで、温度を下げると、反応速度の減少が観察された。
【０２０２】
３.２.６. 再酸化に対する分子タイプの影響
４個の主要タイプのＩｇＧがヒトで天然に存在する。異なるＩｇＧタイプは、通常異なるジスルフィド結合を含み、故に異なる再酸化速度論を有し得る(Wypych et al., J. Biol. Chem. 2008, 283(23), 16194-205; Liu and May, mAbs 2012, 4(1), 17-23)。本試験において、２個のモデル分子、ｍＡｂ−Ｔ(ＩｇＧ１)およびｍＡｂ−Ｘ(ＩｇＧ４)を使用した。ｍＡｂ−Ｘのｋ３およびｋ６値はｍＡｂ−Ｔより有意に大きく(表４)、ＩｇＧ４ジスルフィドがＩｇＧ１より迅速に回復され得ることを示唆する。
【表４】
2021534151.tif 000008
【０２０３】
ｍＡｂ−Ｔは、反応(３)および(６)で類似するＥａを示したが、ｍＡｂ−Ｘは、反応(６)より低いＥａを反応(３)で示した。これは、温度変化がＩｇＧ４について好ましい再酸化経路３または６をシフトさせ得るが、ＩｇＧ１はあまり影響を受けないことを示す。それ故に、最適再酸化条件は、高インタクト単量体純度を達成するために、各分子で評価される必要がある。
【０２０４】
３.２.７. 再酸化に対する出発純度の影響
上記に基づき、次の因子が再酸化反応に好ましいと結論づけられ得る：プロテインＡ樹脂の存在、低電導度、高ｐＨ(８〜１０)、システイン＆シスチンおよび高温度(２０〜３４℃)。製造におけるプロセス実行可能性を考慮して、最適化条件は、次のとおり提案された：１mMシステイン、０.３mMシスチン、ｐＨ８、２０℃で電導度＜７.３mS／cm、プロテインＡ樹脂存在。この条件下、ｍＡｂ−Ｔを使用する動力学を試験し、図９Ａに示すとおり模倣した。単量体純度は、１時間処理後５７％から９４％に改善した。
【０２０５】
図９Ａのパラメータを使用して、上記最適化条件下で、異なる純度の同じ分子の動力学を、研究室で試験するのではなく、予測できる。図９Ｂおよび９Ｃに示すとおり、２９％および１４％の低純度の２バッチの物質の再酸化速度論を、式(７)〜(１２)に基づき、計算した(点線)。予測結果を、実験で確認した(点)。１時間処理後、２サンプルの純度は、それぞれ８８％および８０％に達した。２時間処理後、両サンプルで９２％の純度が達成された。これらの結果は速度論モデリング機構を検証し、速度論性能予測のためのこのモデリング方法の使用の妥当性を確認した。
【０２０６】
３.３. プロテインＡクロマトグラフィーへの適用
ジスルフィド再酸化を、ｐＨ、電導度、温度およびプロテインＡ樹脂存在の条件について評価している。最適条件は、１mMシステイン、０.３mMシスチン、ｐＨ８、２０℃で電導度＜７.３mS／cm、プロテインＡ樹脂存在と提案された。再酸化性能を予測するために動力学モデルを構築した。しかしながら、最適化条件は、妥当性を確認するため、実際の操作上のシナリオを適用する必要がある。この目的のため、プロテインＡ樹脂充填１cm×２０cmプロテインＡカラム(MabSelect SuReまたはMabSelect SuRe LX、GE Healthcare)を使用し、部分的に還元されたタンパク質を負荷した。負荷後、カラムを、規定した接触時間レドックス洗浄緩衝液で洗浄し、続いてブリッジング洗浄および低ｐＨ溶出した。ブリッジング洗浄は、生成物溶出前にｐＨを下げ、レドックス成分を除去するために必要である。想起できるプロテインＡクロマトグラフィーワークフローを図１０に示す。
【０２０７】
３.３.１. ｍＡｂ−Ｔを使用する評価
カラム上のレドックス緩衝液系を使用する再酸化の有効性をさらに評価するため、時間経過試験を実施した。ｍＡｂ−Ｔ  ５００ＬランからのＨＣＣＦを２個の１Ｌ  Flexboyバッグに、各５００mLで入れた。バッグ１は無気条件に維持し、バッグ２は、シリンジおよび防止汚染のためのフィルターを使用して５０％空気で膨張させた。バッグ１およびバッグ２両者とも室温に維持し、それぞれ１cm×２０cm  MabSelect SuRe LXカラムを備えたAvant系に接続した。両サンプルを、０時間、４時間および１８時間の時間経過で同時にカラムに負荷した。負荷後、カラムを２種の緩衝液で洗浄した：対照としてのＰＢＳ洗浄ならびに１mMシステインおよび０.３mMシスチンを含む緩衝液。両緩衝液はｐＨ７.２を有した。プロテインＡ溶離液を集め、分析するまで凍結させた。
【０２０８】
図１１に示すとおり、９０％を超えるインタクト単量体純度から開始された。無気条件下、インタクト単量体パーセンテージは、４時間の室温維持内で８０％未満まで下がり、ジスルフィド結合還元を示した。このような激しい還元は、強還元環境を示す約７００μMの極度の高遊離チオール測定値に基づき、驚くに値しなかった。しかしながら、５０％空気での予め膨張させたサンプルについて、インタクト単量体純度は、それぞれ４時間および１８時間維持後、８７％および９１％であった。これは、空気(酸素)の存在がジスルフィド結合還元を減速できることを証明する[Mun et al., Biotechnol. Bioeng. 2015, 112, 734-742]。最も有効アプローチは、サンプルをシステイン／シスチンペアを含む緩衝液で洗浄することであり、サンプルの空気存在にかかわらず、最終インタクト単量体は９４％を超えた(図１２)。
【０２０９】
図１３および図１４に示すとおり、プロテインＡクロマトグラフィー段階でシステイン／シスチンペアを含む洗浄緩衝液を使用する精製サンプルの製品品質は、ＳＥＣおよび荷電バリアントプロファイルに基づき、対照物質と同等であった。インタクト単量体の回復と許容される製品品質の組み合わせは、洗浄緩衝液が部分的に還元されたタンパク質断片のインタクト単量体への変換に有効であったことを示した。さらに、このような戦略は、最終溶出前に洗浄緩衝液の一つにレドックス成分を単に加えることにより、プロテインＡクロマトグラフィー段階において容易に実行され得る(図１０)。それ故に、レドックス緩衝液系は、防止およびレスキュー両方の態様で有効なＬＭＷ制御戦略と考えられる。
【０２１０】
３.３.２. ｍＡｂ−Ｘを使用する評価
この試験を、５００ＬパイロットランからのＩｇＧ４分子ｍＡｂ−Ｘを使用して実施した。図１０に示すとおり、プロテインＡランを、３５ｇ／Ｌ樹脂充填で１cm×２０cm  MabSelect SuReカラムを使用して実施した。ＨＣＣＦを水浴を使用して、４℃に維持した。出発緩衝液として１×ＰＢＳを使用して、一連の洗浄緩衝液を、システイン、シスチンまたはグルタチオンの組み合わせを加え、ｐＨ７.２の最終ｐＨへの滴定により調製した。負荷および洗浄後、溶離液を非還元ＣＥ、ＳＥＣおよびｉＣＩＥＦ分析のために集めた。選択したサンプルを、ＲＰＬＣ−ＦＬＲ−ＭＳペプチドマッピングによる不対チオール分析に供した。
【０２１１】
表５に示すとおり、何れかのレドックス成分の付加は、種々の程度でインタクト単量体純度を改善できた(図１５)。
【表５】
2021534151.tif 000009
ａ. ＣＥ−ＮＲにより分析。
ｂ. ＳＥ−ＵＰＬＣにより分析。
ｃ. 生成物接触時間は、生成物が洗浄緩衝液と接触していた時間として示す。
【０２１２】
具体的に、インタクト単量体純度は、システインのみまたはＧＳＨのみを含む洗浄緩衝液を使用して、洗浄緩衝液と１時間生成物接触時間で、５０％増加した。生成物接触を２時間に増加したとき、インタクト単量体純度は８５％に改善した。評価した緩衝液中、３mMシステインおよび０.３mMシスチンを含む緩衝液が最高条件であるように見え、２時間生成物接触時間で９２％のインタクト単量体純度が達成された。
【０２１３】
結果はオフカラム結果に一致した。ＨＭＷ％は、これらの精製サンプル中、インタクト単量体レベルが異なるにも関わらず未変化のままであった。精製ｍＡｂ−Ｘの荷電バリアントプロファイルを図１６に提示した。何らレドックス成分と接触させていない対照サンプルは、異常荷電プロファイルを示した。興味深いことに、他の全サンプルの荷電プロファイルは、レドックス成分を適用したとき正常に回復されたが、インタクト単量体純度は低いままであった。
【０２１４】
３.３.３. ｍＡｂ−Ｎを使用する評価
この試験を、５００Ｌパイロットランからの精製ｍＡｂ−Ｎ(ＩｇＧ１)を使用して、実施した。単量体純度は、非還元ＣＥ−ＳＤＳ方法で４.５％であると試験された。プロテインＡランを、４０ｇ／Ｌ樹脂充填で１cm×２０cm  MabSelect SuRe LXカラムを使用して実施した(図１０)。負荷は、中和プロテインＡ溶出、ｐＨ７.２であった。洗浄２緩衝液は、２０mM  ｔｒｉｓ、１mMシステインおよび０.３mMシスチンをｐＨ８.０で含んだ。出発物質の極めて低い単量体純度を考慮して、洗浄２の露出時間を２時間および４時間で評価した。負荷および洗浄後、溶離液を非還元ＣＥ−ＳＤＳ、ＳＥＣおよびｉＣＩＥＦ、遊離チオールおよび結合分析のために集めた。
【０２１５】
オフカラム試験を、レドックスペアの存在下および非存在下に出発物質を維持しながら、並行して実施した。物質をｐＨ８.０に滴定し、室温に１５時間、４日間、７日間および１４日間維持した。サンプルを非還元ＣＥ−ＳＤＳ、ＳＥＣおよびｉＣＩＥＦ分析に付した。
【０２１６】
表６に示すとおり、Ｃａｌｉｐｅｒ−ＮＲにより決定した単量体純度は、４.５％から９６％に有意に改善され(図１７)、プロテインＡカラム上の再酸化に対するレドックス緩衝液の有効性を確認した。顕著なことに、この実験からの単量体純度は先のモデル予測と十分一致したが(データは示していない)、このモデルは異なる分子を使用して構築された。
【表６】
2021534151.tif 000010
ａ. Ｃａｌｉｐｅｒ−ＮＲにより分析。
ｂ. ＳＥ−ＵＰＬＣにより分析。
ｃ. 生成物接触時間は、生成物が洗浄緩衝液と接触していた時間として示す。
ｄ. オフカラム試験は、システインおよびシスチンを出発物質に転嫁し、ｐＨを８に調節することにより実施した。添加したサンプルを室温で１５時間維持した。
【０２１７】
結果は、レドックス条件が同一であるならば、予測モデルが類似分子に適用できることを示す。ｍＡｂ−ＴおよびｍＡｂ−Ｘで同じ観察であり、ｍＡｂ−Ｎの凝集レベルは未変化のままであり、チャージバリアントプロファイルは対照物質と同等まで回復された(図１８)。エルマン試薬を使用して決定した総遊離チオールは、対照物質と同等であった。このような結果は、インタクト単量体純度の有意な改善および再酸化が２個の遊離スルフヒドリル基間で起こるとの事実を考慮して、驚くことではない。
【０２１８】
オフカラム結果と比較して、プロテインＡは再酸化を促進するように見え、先の試験からの観察を再確認する。この研究は、プロテインＡカラム上のレドックス緩衝液を使用する部分的に還元された物質の再加工は、高純度生成物を得るための下流における実際的解決であることを示した。しかしながら、再酸化生成物の生物物理学的および生物学的性質は、対照物質に対するその比較性を証明するために、さらに評価される必要がある。
【０２１９】
３.３.４. パイロット規模での評価
MabSelect SuRe LX樹脂を充填した３０cm×２０cmプロテインＡカラムを、再酸化戦略の実行可能性を評価するためのパイロットプラントで使用した。同じｍＡｂ−Ｎ  ＰＡＶＩＢを負荷物として使用し、洗浄２は２０mM  ｔｒｉｓ、１mMシステインおよび０.３mMシスチンをｐＨ８.０で含んだ。出発物質の極めて低い単量体純度および続きのプロセシングにより産生される物質の潜在的有用性を考慮して、洗浄２の接触時間を４.５時間に設定した。並行して、縮小ランを、同じバッチの緩衝液を使用して、１cm×２０cmプロテインＡカラムで実施した。大型および小規模で溶離したプロテインＡを集め、ＣＥ−ＮＲ、ＳＥＣ、ｉＣＥおよび効力について分析した。再加工物質を、拡張生物物理学的特徴づけに付す
【０２２０】
表７に示すとおり、インタクト単量体純度は、大規模および小規模両方で９７％を超えるまで有意に改善され、プロセス堅牢性が示された。
【表７】
2021534151.tif 000011
ａ. Ｃａｌｉｐｅｒ−ＮＲにより分析。
ｂ. ＳＥ−ＵＰＬＣにより分析。
ｃ. 生成物接触時間は、生成物が洗浄緩衝液と接触していた時間として示す。
【０２２１】
３.４. 異なる負荷物質を使用する評価
プロテインＡクロマトグラフィーカラム上でのインビトロ再酸化の妥当性をさらに示すため、種々のレベルのＬＭＷを含む３個のｍＡｂ薬物物質を１cmｘ２０cmプロテインＡカラムに負荷し、続いて洗浄緩衝液(対照としてＰＢＳおよびレドックス洗浄緩衝液)、ブリッジング緩衝液および溶出緩衝液が続いた。再加工プロテインＡ溶離液を非還元カリパスにより分析し、結果を図２０に示した。図２１は、全３個のｍＡｂについて負荷、対照としてのＰＢＳ洗浄およびレドックス洗浄の詳細な電気泳動図を示す。結果は、レドックス洗浄が還元ｍＡｂの完全分子への変換に有効であったことを示す。
【０２２２】
３.５ プロテインＡカラム上の再酸化と高ｐＨ不純物洗浄の統合
下流プロセスが進歩し、プラットフォームが実行されるにつれて、プロテインＡクロマトグラフィー段階は、生成物負荷、プロセス不純物除去のための洗浄１、ブリッジングとしての洗浄２および生成物の最終低ｐＨ溶出を含むよう単純化されてきている。近年、洗浄１における高ｐＨ緩衝液がＨＣＰおよびＤＮＡを効率的に除去することが示され、故に高純度プロテインＡ溶出プールが得られ、その後の仕上げクロマトグラフィー段階におけるプロセス負担が軽減される。レドックス緩衝液がｍＡｂジスルフィド結合のインビトロ再酸化として既にプロテインＡカラムにおいて使用されているため、レドックス成分を現在の高ｐＨ洗浄レジメに統合し、それにより高単量体純度のプロテインＡプールを形成し、高プロセス関連不純物除去能を維持することが可能である。
【０２２３】
現在のプロテインＡプラットフォームにおけるレドックス系の妥当性および実現可能性を示すことを考えた。この試験は、次の１)レドックス系による鎖間ジスルフィド結合再形成の有効性の証明；２)全体的分子完全性および不純物除去に対するレドックス系の影響の証明；および３)ｍＡｂと樹脂の相互作用などの不純物挙動に対する鎖間ジスルフィド結合還元の影響の理解の目標を達成するために実施した。試験でジスルフィド結合還元によるＬＭＷ形成が高いことが示された３個のｍＡｂ  ＨＣＣＦ(ｍＡｂ−Ｘ、ｍＡｂ−ＴおよびｍＡｂ−Ｎ)を、レドックス成分のための再酸化および不純物除去のための高ｐＨ洗浄の統合の実行可能性を評価するために選択した。各ｍＡｂ  ＨＣＣＦを２つの部分に分け、「Ｇｏｏｄ  ＣＢ」および「Ｂａｄ  ＣＢ」と名付けた。「Ｇｏｏｄ  ＣＢ」を３０分間空気を通し、全試験中４℃に維持した。「Ｂａｄ  ＣＢ」を３０分間窒素を通し、室温に一夜維持した。「Ｇｏｏｄ  ＣＢ」および「Ｂａｄ  ＣＢ」両者とも、図２２に示す３種の洗浄レジメ(すなわちレジメ１、２および３)に付した。溶出プールを、生成物純度、凝集、ＨＣＰ、ＤＮＡ、残存プロテインＡについて分析した。プロセス収率も評価した。
【０２２４】
３.５.１. インタクト単量体純度およびレドックス系での凝集
異なる洗浄レジメを使用した３個のｍＡｂからのプロテインＡプールの純度および凝集を図２３に示した。全３個のｍＡｂについてＧｏｏｄ  ＣＢは何れの洗浄レジメを使用しても高純度を維持し、空気通気および冷蔵保存温度が鎖間ジスルフィド結合還元を防止できたことを示した。その後のレドックス洗浄(レジメ２)または同時のレドックス洗浄(レジメ３)は、分子完全性に負の影響はなかった。しかしながら、対照洗浄条件(レジメ１：レドックス系がない高ｐＨ)を使用したＮ２通気ＣＢは、全３個のｍＡｂで低単量体純度(＜５０％)を示した。レドックス洗浄(レジメ２または３)を使用して高純度単量体生成物が産生され、親和性カラム上での鎖間ジスルフィド結合再形成の有効性が証明された。さらに、種々の洗浄レジメ間の同等なＨＭＷレベルは、レドックス洗浄がタンパク質安定性に負の影響を有しなかったことを示した。
【０２２５】
３.５.２. レドックス系でのプロセス関連不純物除去
プロセス関連不純物(ＨＣＰ、ＤＮＡおよび残存プロテインＡ)のレベルを、レドックス系が不純物除去に何らかの影響を有するか否かを評価するために、「Ｇｏｏｄ  ＣＢ」および「Ｂａｄ  ＣＢ」でモニターした。図２４(ＡおよびＢ)および２５は、３個の洗浄レジメを使用する、空気通気(酸化条件)およびＮ２通気(還元条件)下の全３個のｍＡｂのＨＣＰ、ＤＮＡおよび残存プロテインＡ(ｒＰｒＡ)を示した。３個の洗浄レジメは全３個の分子をとおしてＨＣＰ除去に何ら区別可能な差異をもたらさなかった。しかしながら、「Ｂａｄ  ＣＢ」から産生されたＰＡＥで低ＨＣＰが観察されたのは注目すべきである。低ＨＣＰを引き起こす正確な理由は不明である。対照的に、レドックス洗浄の統合は、「Ｇｏｏｄ  ＣＢ」および「Ｂａｄ  ＣＢ」でＰＡＥにおける残存ＤＮＡおよびｒＰｒＡレベルを減少させ、鎖間ジスルフィド再形成に加えて、その優れたＤＮＡおよびｒＰｒＡ除去能が示唆された。
【０２２６】
３.６ 他のクロマトグラフィーカラムを使用する評価
レドックス洗浄緩衝液を使用するプロテインＡクロマトグラフィーは、再酸化により部分的に還元されたタンパク質を完全分子に効率的に変換することが示されている。採集物質の浄化またはすでに還元された物質の再加工に使用され得る。再加工目的で、疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)およびカチオン交換クロマトグラフィー(ＣＥＸ)は、同じ結果を達成できる(図１９)。しかしながら、プロテインＡクロマトグラフィーと比較して、ＨＩＣまたはＣＥＸクロマトグラフィー上でのレドックス洗浄緩衝液の使用は、ＣＥＸまたはＨＩＣクロマトグラフィーで一般に望ましくないアルカリおよび低電導度条件下で、再酸化がより容易に起こるため、より困難である。表８の予備的結果は、ＣＥＸクロマトグラフィーまたはＨＩＣクロマトグラフィーが鎖間ジスルフィド結合再形成にプロテインＡクロマトグラフィーほど有効ではないことを示す。
【表８】
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【０２２７】
３.７. 製品品質評価
ジスルフィド結合は、タンパク質の天然構造を安定化するための重要な因子である。不適切なジスルフィド結合形成およびジスルフィド結合還元は、プロセス性能およびタンパク質安定性および機能性に影響し得る(Liu and May, mAbs 2012, 4(1), 17-23; Trivedi et al., Curr. Protein Pept. Sci. 2009, 10(6), 614-25; Wang et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 2015, 102, 519-28; Chung et al., Biotechnol. Bioeng. 2017, 114, 1264)。全体的ＬＭＷ制御戦略に加えて、還元ジスルフィド結合の再酸化は、現在の防止戦略に別の方法を提供する。見かけ上損傷した分子の還元タンパク質から完全分子への変換によるレスキューのための現実的アプローチを提供することが示されている。インビトロ再酸化が有効な戦略であり得ることを証明するために、再酸化薬物生成物と対照物質の比較性を示すために、拡張された特徴づけを実施する必要がある。この目的のため、ＰＡＶＩＢにおける還元ｍＡｂ−Ｎタンパク質断片をプロテインＡカラムに再負荷し、続いてレドックス洗浄し、さらに、残りの下流プロセス(ＡＥＸ−ＨＩＣ−ＵＦ／ＤＦ−製剤)を実施して、「レスキューされたｍＡｂ−Ｎ  ＤＳ」を産生し、これは、次のアッセイ：ＳＥＣ、ｉＣＩＥＦ、ＣＥ−ＳＤＳ、円偏光二色性(ＣＤ)、ＤＳＣ、トリプシンペプチドマッピング(ＴＭＰ)、非還元インタクト質量、ＬＣ−ＭＳによるジスルフィド完全性を使用して、「ｍＡｂ−Ｎ対照」に対して特徴づけされた。
【０２２８】
３.７.１        純度、サイズ、荷電プロファイルおよび生物学的効力
レスキューされたＤＳおよび通常バッチＤＳの結果を表９に示す。対照物質と比較して、レスキューされたＤＳは同等な単量体純度、凝集プロファイル、荷電プロファイルおよび結合効力を示す。
【表９】
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【０２２９】
３.７.２. 高次構造、熱変性プロファイルおよびジスルフィドスクランブリング
レスキューされたＤＳおよび通常バッチＤＳ(対照物質)を、熱変性プロファイルついて示差走査熱量測定(ＤＳＣ)および円偏光二色性(ＣＤ)スペクトロスコピーで分析して、遠ＵＶでの二次構造および近ＵＶで三次構造を比較した。図２６に示すとおり、レスキューされたＤＳおよび対照物質は、同一の熱変性プロファイルを有した。レスキューされたＤＳおよび対照物質は、それぞれ遠ＵＶ  ＣＤおよび近ＵＶ  ＣＤで測定して、同等な二次および三次構造も示した(図２７)。
【０２３０】
特にアルカリｐＨまたは遊離システイン残基存在下、ジスルフィドスクランブリングが起こり得ることが報告されている(Zhang, et al., Anal. Biochem. 2002, 311, 1-9; Wang, et al., Anal Chem. 2011, 83(8) 3133-3140)。不正確なジスルフィド結合形成およびジスルフィド結合交換は、交差架橋および抗体凝集に至り得る。システイン／シスチン系存在下、アルカリｐＨ下で鎖間ジスルフィド結合を形成することが証明されている、レスキューされたＤＳのジスルフィド完全性の特徴づけは注目すべきである。図２８に示すとおり、レスキューされたＤＳは対照物質と同等なマッピングプロファイルを有し、ジスルフィド結合スクランブリングがないことを示す。
【０２３１】
３.７.３. ＴＰＭによる脱アミド化／酸化
レスキューされたＤＳおよび通常バッチＤＳ(対照物質)を、トリプシン消化ペプチドマッピング方法を使用して特徴づけした。表１０に示すとおり、全体的低酸化レベルおよび一貫した脱アミド化レベルが、レスキューされたＤＳと対照物質で示された。
【表１０】
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【０２３２】
３.７.４. 熱安定性
鎖間ジスルフィド結合再形成を介してレスキューされた物質が特徴づけされ、対照物質と同等であることが示されている。レスキュー戦略がＤＳ製造のために実行可能な選択肢であり得るかを示すために、レスキューされた物質を熱安定性について評価した。レスキューされた物質を、還元またはレドックス洗浄処理を受けていないＤＳ物質と共に試験した。試験方法は、ＳＥＣ、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ、ＣＥ−ＳＤＳ、トリプシン性ペプチドマッピングおよび遊離チオールを含む。全物質を、０、４週間および８週間の時点まで４０℃に維持した。熱安定性試験計画を表１１に示した。特徴づけ結果を表１２〜１４および図２９〜３２に示す。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【０２３３】
３.７.４. レスキューされたＤＳ対通常のＤＳの概要
レスキューされたｍＡｂ−Ｎ  ＤＳは、十分に特徴づけされている。レスキューされた物質が、次の態様においてジスルフィド結合還元を受けていないＤＳと同等であることが示された：
Ｉ. 高次構造、二次および三次構造に差異なし；
II. 熱変性およびＴｍ値；
III. 生成物関連バリアント(酸化、脱アミド化、末端バリアント、イソ−Ａｓｐ)；
IV. レベルの不対システインチオール；
Ｖ. 熱安定性プロファイル；
VI. ＥＬＩＳＡ効力による生物学的性質。
全体として、レスキューされたＤＳは、通常のＤＳと比較して、同等な生物物理学的および生物学的性質を示している。
【０２３４】
４. 結論
還元タンパク質の再酸化を、溶液中およびクロマトグラフィーカラム上で、酸化的環境にさらすことにより実施した。アルカリでシステインおよびシスチンを含むレドックスペアおよび低電導度条件は、還元ジスルフィド結合の酸化に有効であり、高インタクト単量体純度を有する完全分子をもたらした。さらに、親和性プロテインＡ樹脂存在下で再酸化が加速されることが判明し、これは、この方法の幅広い適用をもたらす。プロテインＡ洗浄段階においてレドックス成分を含む洗浄を実施することにより、還元タンパク質を、純度＜５％から約＞９０％にしてインタクト単量体変換することができた。レドックス洗浄は、有効な不純物除去およびジスルフィド結合再形成の可能性を伴い、親和性プラットフォームと統合され得る。
【０２３５】
再酸化タンパク質は、対照物質と同等な生物物理学的および生物学的性質を示した。さらに、レスキューされた物質は、ジスルフィド結合還元を受けていないＤＳと同等な熱安定性プロファイルを示した。この方法は、採集した細胞培養およびあらゆる下流物質の再加工に適用可能である、還元タンパク質から完全分子への変換のためのレスキュー戦略として適当であることが示された。
【０２３６】
概要および要約部分ではなく、詳細な記載の部分は、特許請求の範囲の解釈に利用されることが意図されることが認識される。概要および要約部分は、発明者らにより意図される本発明の例示的態様の１以上を示すかもしれないが、全てではなく、それ故に、本発明および添付する特許請求の範囲をいかなる方法でも限定することを意図しない。
【０２３７】
本発明は、特定した機能の実行を説明する機能的構成要素およびそれらの相関の助けを借りて、上に記載されている。これらの機能的構成要素の境界はここでは、記載の簡便さのために任意に規定されている。特定された機能およびそれらの相関が適切に実行される限り、別の境界を規定し得る。
【０２３８】
具体的態様の上の記載は、他者が、本発明の一般的概念から逸脱することなく、当分野の範囲内の知識を応用することにより、このような具体的態様の種々の応用を、過度の実験をすることなく、容易に修飾および／または適用でき得るように、本発明の一般的性質を十分に明らかにしている。それ故に、このような適用および修飾は、ここに示す教示および指針に基づき、開示された態様の意味の範囲内および均等物の範囲内であることが意図される。ここでの表現または用語は、本明細書の用語または表現が当業者に教示および指針に鑑みて解釈されるように、限定ではなく、説明の目的である。
【０２３９】
本発明の幅および範囲は、上記例示的態様によって限定されるべきではなく、添付する特許請求の範囲およびその均等物によってのみ定義されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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