(57)【要約】  Ｔ細胞、特にＣＤ８  Ｔ細胞は、いくつかの癌における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在として、良好な予後と正の相関関係にあり、腫瘍根絶において不可欠なプレイヤーであることが知られている。腫瘍細胞を排除するために、ＣＤ８  Ｔ細胞は、腫瘍細胞の表面に存在するＭＨＣ  Ｉ関連ペプチドであり、正常細胞で発現しないか、または非常に低い発現である、腫瘍抗原を認識する。本明細書において、（ｉ）ゲノムのコード領域および非コード領域、（ｉｉ）非同義の一塩基変異または短い挿入／欠失、およびより複雑な再配列、ならびに（ｉｉｉ）試料の変異負荷または複雑性にかかわらず機能する内在性レトロエレメント、に由来する非寛容原性腫瘍特異的抗原を特定するために、癌および正常の一致するｍＴＥＣｈｉ試料に由来するＲＮＡ配列決定データを使用したプロテオゲノミクス法が記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞試料における腫瘍抗原候補を特定するための方法であって、
（ａ）腫瘍特異的プロテオームデータベースを、
（ｉ）腫瘍ＲＮＡ配列から、少なくとも３３塩基対を含むサブ配列（ｋ−ｍｅｒ）のセットを抽出することと、
（ｉｉ）（ｉ）の前記腫瘍サブ配列のセットを、正常細胞からのＲＮＡ配列から抽出された少なくとも３３塩基対を含む対応するコントロールサブ配列のセットと比較することと、
（ｉｉｉ）前記対応するコントロールサブ配列に存在しない前記腫瘍サブ配列を抽出し、それによって腫瘍特異的サブ配列を得ることと、
（ｉｖ）前記腫瘍特異的サブ配列をコンピュータによって翻訳し、それによって前記腫瘍特異的プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｂ）個別化腫瘍プロテオームデータベースを、
（ｉ）前記腫瘍ＲＮＡ配列を参照ゲノム配列と比較して、前記腫瘍ＲＮＡ配列における一塩基変異を特定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で特定された前記一塩基変異を前記参照ゲノム配列に挿入し、それによって個別化腫瘍ゲノム配列を作成することと、
（ｉｉｉ）前記個別化腫瘍ゲノム配列から、発現されるタンパク質コード転写物をコンピュータによって翻訳し、それによって前記個別化腫瘍プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｃ）前記腫瘍からの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）関連ペプチド（ＭＡＰ）の配列を、（ａ）の前記腫瘍特異的プロテオームデータベースおよび（ｂ）の前記個別化腫瘍プロテオームデータベースの配列と比較して、前記ＭＡＰを特定することと、
（ｄ）（ｃ）で特定された前記ＭＡＰの中で腫瘍抗原候補を特定することと、を含み、腫瘍抗原候補は、配列および／またはコード配列が、正常細胞と比較して腫瘍細胞中で過剰発現または過剰提示されるペプチドである、方法。
【請求項２】
前記方法は、（１）前記腫瘍細胞試料から主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）関連ペプチド（ＭＡＰ）を単離および配列決定すること、ならびに／または（２）前記腫瘍細胞試料で全トランスクリプトーム配列決定を実施して、前記腫瘍ＲＮＡ配列を得ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＡＰの単離は、（ｉ）前記ＭＡＰを前記細胞試料から弱酸処理によって放出することと、（ｉｉ）前記放出されたＭＡＰをクロマトグラフィーに供することと、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は、前記放出されたペプチドを前記クロマトグラフィーの前にサイズ排除カラムで濾過することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サブ配列は、３３〜５４塩基対を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
重複する腫瘍特異的サブ配列を、より長い腫瘍サブ配列（コンティグ）に組み立てることをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サイズ排除カラムは、約３０００Ｄａのカットオフを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＡＰの配列決定は、前記単離されたＭＡＰを質量分析（ＭＳ）配列決定分析に供することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、対応する正常細胞を使用して個別化正常プロテオームデータベースを生成することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ｄ）における特定は、前記ＭＡＰを、その配列が前記正常個別化プロテオームデータベース中で検出される場合に、除外することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、前記腫瘍ＲＮＡ配列および正常細胞からのＲＮＡ配列から２４または３９ヌクレオチドｋ−ｍｅｒデータベースを生成して腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースおよび正常ｋ−ｍｅｒデータベースを得ることと、前記腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースおよび正常ｋ−ｍｅｒデータベースを、前記ＭＡＰコード配列に由来する２４または３９ヌクレオチドｋ−ｍｅｒと比較することと、をさらに含み、前記正常ｋ−ｍｅｒデータベースと比較して前記腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースにおける前記ＭＡＰコード配列に由来する前記ｋ−ｍｅｒの過剰発現または過剰提示が、対応するＭＡＰが腫瘍抗原候補であることを示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＡＰコード配列に由来する前記ｋ−ｍｅｒは、前記正常ｋ−ｍｅｒデータベースと比較して、前記腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースにおいて少なくとも１０倍過剰発現または過剰提示される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＡＰコード配列に由来する前記ｋ−ｍｅｒは、前記正常ｋ−ｍｅｒデータベースには存在しない、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、
（ａ）腫瘍細胞試料におけるＭＡＰを単離および配列決定することと、
（ｂ）全トランスクリプトーム配列決定を前記腫瘍細胞試料で実施し、それによって腫瘍ＲＮＡ配列を得ることと、
（ｃ）腫瘍特異的プロテオームデータベースを、
（ｉ）前記腫瘍ＲＮＡ配列から少なくとも３３ヌクレオチドを含むサブ配列のセットを抽出することと、
（ｉｉ）（ｉ）の前記腫瘍サブ配列のセットを、正常細胞からのＲＮＡ配列から抽出された少なくとも３３ヌクレオチドを含む対応するコントロールサブ配列のセットと比較することと、
（ｉｉｉ）前記対応するコントロールサブ配列において、存在しないか、または少なくとも４倍下方発現されている前記腫瘍サブ配列を抽出し、それによって腫瘍特異的サブ配列を得ることと、
（ｉｖ）前記腫瘍特異的サブ配列をコンピュータによって翻訳し、それによって前記腫瘍特異的プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｄ）個別化腫瘍プロテオームデータベースを、
（ｉ）前記腫瘍ＲＮＡ配列を参照ゲノム配列と比較して、前記腫瘍ＲＮＡ配列における一塩基変異を特定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で特定された前記一塩基変異を前記参照ゲノム配列に挿入し、それによって個別化腫瘍ゲノム配列を作成することと、
（ｉｉｉ）前記個別化腫瘍ゲノム配列から、発現されるタンパク質コード転写物をコンピュータによって翻訳し、それによって前記個別化腫瘍プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｅ）個別化正常プロテオームデータベースを、
（ｉ）正常細胞からのＲＮＡ配列を参照ゲノム配列と比較して、前記正常ＲＮＡ配列における一塩基変異を特定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で特定された前記一塩基変異を前記参照ゲノム配列に挿入し、それによって個別化正常ゲノム配列を作成することと、
（ｉｉｉ）前記個別化正常ゲノム配列から、発現されるタンパク質コード転写物をコンピュータによって翻訳し、それによって前記個別化正常プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｆ）正常および腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースを、（ｉ）正常細胞からの前記ＲＮＡ配列および前記腫瘍ＲＮＡ配列から少なくとも２４ヌクレオチドを含むサブ配列のセットを抽出することによって生成することと、
（ｇ）（ａ）で得られた前記ＭＡＰの配列を、（ｃ）の前記腫瘍特異的プロテオームデータベースおよび（ｄ）の前記個別化腫瘍プロテオームデータベースの配列と比較して、前記ＭＡＰを特定することと、
（ｈ）（ｆ）で特定された前記ＭＡＰの中で腫瘍抗原候補を特定することと、を含み、腫瘍抗原候補は、（１）配列が前記個別化正常プロテオームデータベースに存在せず、かつ（２）（ｉ）配列が前記個別化腫瘍プロテオームデータベースに存在し、かつ／または（ｉｉ）コード配列が、前記正常ｋ−ｍｅｒデータベースと比較して前記腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースにおいて過剰発現もしくは過剰提示される、ＭＡＰに対応する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法は、８〜１１個のアミノ酸の長さを有するＭＡＰを選択することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記正常細胞は、胸腺細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記胸腺細胞は、髄質胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍抗原候補の前記コード配列を、正常組織からの配列と比較することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＭＡＰは、８〜１１個のアミノ酸の長さを有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍抗原候補のＭＨＣ分子との結合を評価することをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合は、ＭＨＣ結合予測アルゴリズムを使用して評価される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞集団における前記腫瘍抗原候補を認識するＴ細胞の頻度を評価することをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍抗原候補を認識するＴ細胞の前記頻度は、前記腫瘍抗原候補をそれらのペプチド結合溝に含む多量体ＭＨＣクラスＩ分子を使用して評価される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｔ細胞活性化を誘導する前記腫瘍抗原候補の能力を評価することをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｔ細胞活性化を誘導する前記腫瘍抗原候補の前記能力は、ＭＨＣクラスＩ分子にそれらの細胞表面で結合した前記腫瘍抗原候補を有する細胞と接触されたＴ細胞によるサイトカイン産生を測定することによって評価される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記サイトカイン産生は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）産生を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅を誘導し、かつ／または腫瘍成長を阻害する前記腫瘍抗原候補の前記能力を評価することをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項で定義される方法によって特定される、腫瘍抗原ペプチド。
【請求項２９】
配列番号１〜３９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、腫瘍抗原ペプチド。
【請求項３０】
配列番号１７〜３９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、請求項２９に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項３１】
前記腫瘍抗原ペプチドは、白血病腫瘍抗原ペプチドであり、配列番号１７〜２８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、請求項３０に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項３２】
前記白血病は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）である、請求項３１に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項３３】
前記腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号１７〜１９、２７、および２８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、請求項３１または３２に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項３４】
前記腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項３１または３２に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項３５】
前記腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号２１〜２３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、請求項３１または３２に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項３６】
前記腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ＊０８：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号２４または２５に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項３１または３２に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項３７】
前記腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項３１または３２に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項３８】
前記腫瘍抗原ペプチドは、肺腫瘍抗原ペプチドであり、配列番号２９〜３９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、請求項３０に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項３９】
前記肺腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項３８に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項４０】
前記腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号２９〜３５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、請求項３８または３９に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項４１】
前記腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項３８または３９に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項４２】
前記腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号３８または３９に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項３８または３９に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項４３】
前記腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項３８または３９に記載の腫瘍抗原ペプチド。
【請求項４４】
前記ゲノムの非タンパク質コード領域に由来する、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の腫瘍抗原。
【請求項４５】
前記ゲノムの前記非タンパク質コード領域は、遺伝子間領域、イントロン領域、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、または内在性レトロエレメント（ＥＲＥ）である、請求項４４に記載の腫瘍抗原。
【請求項４６】
請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドをコードする、核酸。
【請求項４７】
ｍＲＮＡまたはウイルスベクターである、請求項４６に記載の核酸。
【請求項４８】
請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、または請求項４６もしくは４７に記載の核酸を含む、リポソーム。
【請求項４９】
請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、請求項４６もしくは４７に記載の核酸、または請求項４８に記載のリポソームと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
【請求項５０】
請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、請求項４６もしくは４７に記載の核酸、請求項４８に記載のリポソーム、または請求項４９に記載の組成物と、アジュバントと、を含む、ワクチン。
【請求項５１】
請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドをそのペプチド結合溝に含む、単離された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子。
【請求項５２】
多量体の形態にある、請求項５１に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子。
【請求項５３】
前記多量体は、四量体である、請求項５２に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子。
【請求項５４】
請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドを含む、単離された細胞。
【請求項５５】
請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドをそれらのペプチド結合溝に含む主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を、その表面で発現する、単離された細胞。
【請求項５６】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
前記ＡＰＣは、樹状細胞である、請求項５６に記載の細胞。
【請求項５８】
請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子および／または請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞の表面で発現されるＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項５９】
請求項５８に記載のＴＣＲをその細胞表面で発現する、単離されたＣＤ８＋Ｔリンパ球。
【請求項６０】
請求項５９に定義されるＣＤ８＋Ｔリンパ球の少なくとも０．５％を含む、細胞集団。
【請求項６１】
対象において癌を治療する方法であって、前記対象に有効量の（ｉ）請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、（ｉｉ）請求項４６もしくは４７に記載の核酸、（ｉｉｉ）請求項４８に記載のリポソーム、（ｉｖ）請求項４９に記載の組成物、（ｖ）請求項５０に記載のワクチン、（ｖｉ）請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞、（ｖｉｉ）請求項５９に記載のＣＤ８＋Ｔリンパ球、または（ｖｉｉｉ）請求項６０に記載の細胞集団、を投与することを含む、方法。
【請求項６２】
前記癌は、白血病である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記白血病は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記癌は、肺癌である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記肺腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
少なくとも１つの追加の抗腫瘍剤または療法を前記対象に投与することをさらに含む、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記少なくとも１つの追加の抗腫瘍剤または療法は、化学療法剤、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法、または手術である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
対象において癌を治療するための、（ｉ）請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、（ｉｉ）請求項４６もしくは４７に記載の核酸、（ｉｉｉ）請求項４８に記載のリポソーム、（ｉｖ）請求項４９に記載の組成物、（ｖ）請求項５０に記載のワクチン、（ｖｉ）請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞、（ｖｉｉ）請求項５９に記載のＣＤ８＋Ｔリンパ球、または（ｖｉｉｉ）請求項６０に記載の細胞集団の、使用。
【請求項６９】
対象において癌を治療するための医薬品の製造のための、（ｉ）請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、（ｉｉ）請求項４６または４７に記載の核酸、（ｉｉｉ）請求項４８に記載のリポソーム、（ｉｖ）請求項４９に記載の組成物、（ｖ）請求項５０に記載のワクチン、（ｖｉ）請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞、（ｖｉｉ）請求項５９に記載のＣＤ８＋Ｔリンパ球、または（ｖｉｉｉ）請求項６０に記載の細胞集団の、使用。
【請求項７０】
前記癌は、白血病である、請求項６８または６９に記載の使用。
【請求項７１】
前記白血病は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）である、請求項７０に記載の使用。
【請求項７２】
前記癌は、肺癌である、請求項６８または６９に記載の使用。
【請求項７３】
前記肺腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
少なくとも１つの追加の抗腫瘍剤または療法の使用をさらに含む、請求項６８〜７３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７５】
前記少なくとも１つの追加の抗腫瘍剤または療法は、化学療法剤、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法、または手術である、請求項７４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７２４，７６０号の利益を主張し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、全般的には癌に関し、より具体的にはＴ細胞に基づく癌免疫療法に有用である腫瘍抗原の特定に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８  Ｔ細胞は、いくつかの癌における腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の存在として、良好な予後および免疫チェックポイント阻害剤への応答と正の相関関係にあり、腫瘍根絶において不可欠なプレイヤーであることが知られている１、２。腫瘍細胞を排除するために、ＣＤ８  Ｔ細胞は、腫瘍細胞によって提示される異常なＭＨＣ  Ｉ関連ペプチド（ＭＡＰ）である腫瘍抗原を認識する。ＣＤ８  Ｔ細胞がＭＨＣ  Ｉ関連ペプチド（ＭＡＰ）を認識するとき、最も重要な未解決の疑問は、ＣＤ８  ＴＩＬによって認識されるＭＡＰの性質である３。多数のＣＤ８  ＴＩＬは腫瘍の変異負荷と相関することが分かっており、支配的パラダイムは、ＣＤ８  ＴＩＬが一般にネオ抗原と呼ばれる変異した腫瘍特異的抗原（ｍＴＳＡ）を認識することを支持する２、４、５。ｍＴＳＡの高い免疫原性は、腫瘍でのそれらの選択的発現に起因し、免疫耐性のリスクを最小限にする６。それにもかかわらず、いくつかのＴＩＬは、異常に発現されたＴＳＡ（ａｅＴＳＡ）と称される癌限定化非変異ＭＡＰ７を認識することが示されている。ａｅＴＳＡは、内在性レトロエレメント（ＥＲＥ）などの正常細胞で発現されないゲノム配列の転写および翻訳につながる様々なシスまたはトランス作用遺伝子変化およびエピジェネティック変化に由来し得る８−１０。
【０００４】
治療用癌ワクチンに使用することができる実用可能なＴＳＡの発見にかなりの努力がささげられている。最も一般的な戦略は、逆免疫学（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で定まり、ｉ）エクソーム配列決定を腫瘍細胞に実施して変異を特定し、ｉｉ）ＭＨＣ結合予測ソフトウェアツールを使用して、どの変異型ＭＡＰが優れたＭＨＣ結合物質であり得るかを特定する１１、１２。逆免疫学は、ＴＳＡ候補を豊富化することができるが、利用可能なコンピュータ法はＭＨＣ結合を予測し得るが、ＭＡＰ処理に含まれる他のステップを予測することはできないため１４、１５、これらの候補の少なくとも９０％は偽陽性である５、１３。この制限を克服するために、いくつかの研究は、それらのＴＳＡ発見パイプラインに質量分析（ＭＳ）解析を含めており１６、それによっていくつかのＴＳＡの厳密な分子決定をもたらす１７、１８。しかしながら、これらのアプローチの収率は極めて不十分であり、最も変異した腫瘍型の１つである黒色腫において、個別の腫瘍あたり平均２つのＴＳＡがＭＳによって検証されているが１９、一方、他の癌型についてはわずかなＴＳＡしか認められていない１５。ＴＩＬまたは免疫チェックポイント阻害剤の注入は、腫瘍が免疫原性抗原を発現しなかった場合、腫瘍退縮を引き起こさないため、ＴＳＡの乏しさは難題である２０。エキソン変異に基づくアプローチは、それらが２つの重要な要素を考慮しなかったため、ＴＳＡを特定することに失敗していたことが推測された。第１に、基本的には、ａｅＴＳＡのハイスループット識別のための方法が現在はないため、これらのアプローチはｍＴＳＡにのみ焦点を当ててａｅＴＳＡを軽視する。これは大きな欠点を意味し、ｍＴＳＡは固有抗原であるが、ａｅＴＳＡは、複数の腫瘍によって共有することができ、ワクチン開発のための好ましい標的になり得るためである７、９。第２に、ＴＳＡの唯一の供給源としてエクソームに焦点を当てることは、非常に限定的である。エクソーム（すなわち、全てのタンパク質コード遺伝子）は、ヒトゲノムのわずか２％を表し、一方、ゲノムの最大７５％は、転写され、潜在的に翻訳され得る２２。
【０００５】
したがって、Ｔ細胞に基づく癌免疫療法に使用され得る腫瘍抗原を特定するための新規アプローチが必要とされている。
【０００６】
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は、骨髄、血液、および髄外部位におけるリンパ系前駆細胞の悪性形質転換および増殖である。ＡＬＬの８０％は子供に生じるが、それは成人に生じるときに壊滅的な疾患を表す。米国内では、ＡＬＬの発症率は、人口１０万人あたり１．６人と推定される。用量強化戦略は、小児患者の転帰の有意な改善につながっているが、高齢者の予後は非常に悪いままである。導入化学療法に対する高い割合の応答にもかかわらず、ＡＬＬを有する成人患者の３０〜４０％のみが長期寛解を達成する。
【０００７】
したがって、ＡＬＬの治療のための新規アプローチが必要とされている。
【０００８】
高い侵襲性で、素早く転移し、蔓延している癌である肺癌は、アメリカ合衆国（米国）において男性および女性の両方における最も致死的な癌である。肺癌の症例の約９０％は、喫煙およびタバコ製品の使用によって引き起こされる。しかしながら、ラドンガス、アスベスト、大気汚染曝露、および慢性感染症などの他の要因が、肺癌の発癌に関与し得る。加えて、肺癌に対する感受性の複数の遺伝的および後天的メカニズムが提唱されている。肺癌は、異なって成長および伝播する、２つの広範な組織学的クラスである、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に分けられる。肺癌の治療選択肢には、手術、放射線療法、化学療法、および標的療法が含まれる。過去２５年間になされた診断および治療における改善にもかかわらず、肺癌を有する患者の予後は依然として満足のいくものではない。現在の標準療法に対する応答は、最も局在化した癌を除いては乏しいものである。
【０００９】
したがって、肺癌の治療のための新規アプローチが必要とされている。
【００１０】
本説明は多くの文書に言及しており、その内容は参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【００１１】
本開示は、以下の項目１〜７５を提供する。
１．腫瘍細胞試料における腫瘍抗原候補を特定するための方法であって、
（ａ）腫瘍特異的プロテオームデータベースを、（ｉ）腫瘍ＲＮＡ配列から少なくとも３３塩基対を含むサブ配列（ｋ−ｍｅｒ）のセットを抽出することと、（ｉｉ）（ｉ）の腫瘍サブ配列のセットを、正常細胞からのＲＮＡ配列から抽出された少なくとも３３塩基対を含む対応するコントロールサブ配列のセットと比較することと、（ｉｉｉ）対応するコントロールサブ配列に存在しない腫瘍サブ配列を抽出し、それによって腫瘍特異的サブ配列を得ることと、（ｉｖ）腫瘍特異的サブ配列をコンピュータによって翻訳し、それによって腫瘍特異的プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｂ）個別化腫瘍プロテオームデータベースを、（ｉ）腫瘍ＲＮＡ配列を参照ゲノム配列と比較して、腫瘍ＲＮＡ配列における一塩基変異を特定することと、（ｉｉ）（ｉ）で特定された一塩基変異を参照ゲノム配列に挿入し、それによって個別化腫瘍ゲノム配列を作成することと、（ｉｉｉ）個別化腫瘍ゲノム配列から、発現されるタンパク質コード転写物をコンピュータによって翻訳し、それによって個別化腫瘍プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｃ）腫瘍からの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）関連ペプチド（ＭＡＰ）の配列を、（ａ）の腫瘍特異的プロテオームデータベースおよび（ｂ）の個別化腫瘍プロテオームデータベースの配列と比較して、ＭＡＰを特定することと、
（ｄ）（ｃ）で特定されたＭＡＰの中で腫瘍抗原候補を特定することと、を含み、腫瘍抗原候補は、その配列および／またはコード配列が、正常細胞と比較して腫瘍細胞中で過剰発現または過剰提示されるペプチドである、方法。
２．上記の方法は、（１）腫瘍細胞試料から主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）関連ペプチド（ＭＡＰ）を単離および配列決定すること、ならびに／または（２）腫瘍細胞試料で全トランスクリプトーム配列決定を実施して、腫瘍ＲＮＡ配列を得ること、をさらに含む、項目１に記載の方法。
３．当該ＭＡＰの単離は、（ｉ）当該ＭＡＰを当該細胞試料から弱酸処理によって放出することと、（ｉｉ）放出されたＭＡＰをクロマトグラフィーに供することと、を含む、項目２に記載の方法。
４．当該方法は、放出されたペプチドを当該クロマトグラフィーの前にサイズ排除カラムで濾過することをさらに含む、項目３に記載の方法。
５．当該サブ配列は３３〜５４塩基対を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
６．重複する腫瘍特異的サブ配列を、より長い腫瘍サブ配列（コンティグ）に組み立てることをさらに含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
７．当該サイズ排除カラムは、約３０００Ｄａのカットオフを有する、項目６に記載の方法。
８．当該ＭＡＰの配列決定は、単離されたＭＡＰを質量分析（ＭＳ）配列決定分析に供することを含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
９．当該方法は、対応する正常細胞を使用して個別化正常プロテオームデータベースを生成することをさらに含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
１０．当該（ｄ）における特定は、当該ＭＡＰを、その配列が正常個別化プロテオームデータベース中で検出される場合に、除外することを含む、項目９に記載の方法。
１１．方法は、当該腫瘍ＲＮＡ配列および正常細胞からのＲＮＡ配列から２４または３９ヌクレオチドｋ−ｍｅｒデータベースを生成して腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースおよび正常ｋ−ｍｅｒデータベースを得ることと、腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースおよび正常ｋ−ｍｅｒデータベースを、ＭＡＰコード配列に由来する２４または３９ヌクレオチドｋ−ｍｅｒと比較することと、をさらに含み、当該正常ｋ−ｍｅｒデータベースと比較して当該腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースにおけるＭＡＰコード配列に由来するｋ−ｍｅｒの過剰発現または過剰提示が、対応するＭＡＰが腫瘍抗原候補であることを示す、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．ＭＡＰコード配列に由来するｋ−ｍｅｒは、当該正常ｋ−ｍｅｒデータベースと比較して、当該腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースにおいて少なくとも１０倍過剰発現または過剰提示される、項目１１に記載の方法。
１３．ＭＡＰコード配列に由来するｋ−ｍｅｒは、当該正常ｋ−ｍｅｒデータベースには存在しない、項目１１または１２に記載の方法。
１４．当該方法は、
（ａ）腫瘍細胞試料におけるＭＡＰを単離および配列決定することと、
（ｂ）全トランスクリプトーム配列決定を当該腫瘍細胞試料で実施し、それによって腫瘍ＲＮＡ配列を得ることと、
（ｃ）腫瘍特異的プロテオームデータベースを、（ｉ）当該腫瘍ＲＮＡ配列から少なくとも３３ヌクレオチドを含むサブ配列のセットを抽出することと、（ｉｉ）（ｉ）の腫瘍サブ配列のセットを、正常細胞からのＲＮＡ配列から抽出された少なくとも３３ヌクレオチドを含む対応するコントロールサブ配列のセットと比較することと、（ｉｉｉ）対応するコントロールサブ配列において、存在しないか、または少なくとも４倍下方発現される腫瘍サブ配列を抽出し、それによって腫瘍特異的サブ配列を得ることと、（ｉｖ）腫瘍特異的サブ配列をコンピュータによって翻訳し、それによって腫瘍特異的プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｄ）個別化腫瘍プロテオームデータベースを、（ｉ）腫瘍ＲＮＡ配列を参照ゲノム配列と比較して、当該腫瘍ＲＮＡ配列における一塩基変異を特定することと、（ｉｉ）（ｉ）で特定された一塩基変異を参照ゲノム配列に挿入し、それによって個別化腫瘍ゲノム配列を作成することと、（ｉｉｉ）個別化腫瘍ゲノム配列から、発現されるタンパク質コード転写物をコンピュータによって翻訳し、それによって個別化腫瘍プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｅ）個別化正常プロテオームデータベースを、（ｉ）正常細胞からのＲＮＡ配列を参照ゲノム配列と比較して、   当該正常ＲＮＡ配列における一塩基変異を特定することと、（ｉｉ）（ｉ）で特定された一塩基変異を参照ゲノム配列に挿入し、それによって個別化正常ゲノム配列を作成することと、（ｉｉｉ）個別化正常ゲノム配列から、発現されるタンパク質コード転写物をコンピュータによって翻訳し、それによって個別化正常プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｆ）正常および腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースを、（ｉ）正常細胞からの当該ＲＮＡ配列および当該腫瘍ＲＮＡ配列から少なくとも２４ヌクレオチドを含むサブ配列のセットを抽出することによって、生成することと、
（ｇ）（ａ）で得られたＭＡＰの配列を、（ｃ）の腫瘍特異的プロテオームデータベースおよび（ｄ）の個別化腫瘍プロテオームデータベースの配列と比較して、ＭＡＰを特定することと、
（ｈ）（ｆ）で特定されたＭＡＰの中で腫瘍抗原候補を特定することと、を含み、腫瘍抗原候補は、（１）配列が個別化正常プロテオームデータベースに存在せず、かつ（２）（ｉ）配列が個別化腫瘍プロテオームデータベースに存在し、かつ／または（ｉｉ）コード配列が、当該正常ｋ−ｍｅｒデータベースと比較して当該腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースにおいて過剰発現もしくは過剰提示される、ＭＡＰに対応する、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．当該方法は、８〜１１個のアミノ酸の長さを有するＭＡＰを選択することをさらに含む、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．当該正常細胞は、胸腺細胞である、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．当該胸腺細胞は、髄質胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣ）である、項目１６に記載の方法。
１８．当該腫瘍抗原候補のコード配列を、正常組織からの配列と比較することをさらに含む、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．当該ＭＡＰは、８〜１１個のアミノ酸の長さを有する、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．腫瘍抗原候補のＭＨＣ分子との結合を評価することをさらに含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．当該結合は、ＭＨＣ結合予測アルゴリズムを使用して評価される、項目２０に記載の方法。
２２．細胞集団における腫瘍抗原候補を認識するＴ細胞の頻度を評価することをさらに含む、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．腫瘍抗原候補を認識するＴ細胞の頻度は、当該腫瘍抗原候補をそれらのペプチド結合溝に含む多量体ＭＨＣクラスＩ分子を使用して評価される、項目２２に記載の方法。
２４．Ｔ細胞活性化を誘導する腫瘍抗原候補の能力を評価することをさらに含む、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
２５．Ｔ細胞活性化を誘導する腫瘍抗原候補の能力は、ＭＨＣクラスＩ分子にそれらの細胞表面で結合した当該腫瘍抗原候補を有する細胞と接触されたＴ細胞によるサイトカイン産生を測定することによって評価される、項目２４に記載の方法。
２６．当該サイトカイン産生は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）産生を含む、項目２５に記載の方法。
２７．Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅を誘導し、かつ／または腫瘍成長を阻害する腫瘍抗原候補の能力を評価することをさらに含む、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．項目１〜２７のいずれか一項で定義される方法によって特定される、腫瘍抗原ペプチド。
２９．配列番号１〜３９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、腫瘍抗原ペプチド。
３０．配列番号１７〜３９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、項目２９に記載の腫瘍抗原ペプチド。
３１．当該腫瘍抗原ペプチドは、白血病腫瘍抗原ペプチドであり、配列番号１７〜２８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、項目３０に記載の腫瘍抗原ペプチド。
３２．当該白血病は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）である、項目３１に記載の腫瘍抗原ペプチド。
３３．当該腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号１７〜１９、２７、および２８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、項目３１または３２に記載の腫瘍抗原ペプチド。
３４．当該腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、項目３１または３２に記載の腫瘍抗原ペプチド。
３５．当該腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号２１〜２３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、項目３１または３２に記載の腫瘍抗原ペプチド。
３６．当該腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ＊０８：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号２４または２５に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、項目３１または３２に記載の腫瘍抗原ペプチド。
３７．当該腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、項目３１または３２に記載の腫瘍抗原ペプチド。
３８．当該腫瘍抗原ペプチドは、肺腫瘍抗原ペプチドであり、配列番号２９〜３９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、項目３０に記載の腫瘍抗原ペプチド。
３９．当該肺腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、項目３８に記載の腫瘍抗原ペプチド。
４０．当該腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号２９〜３５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる、項目３８または３９に記載の腫瘍抗原ペプチド。
４１．当該腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、項目３８または３９に記載の腫瘍抗原ペプチド。
４２．当該腫瘍抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号３８または３９に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、項目３８または３９に記載の腫瘍抗原ペプチド。
４３．当該腫瘍抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０１対立遺伝子のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、項目３８または３９に記載の腫瘍抗原ペプチド。
４４．ゲノムの非タンパク質コード領域に由来する、項目２９〜４３のいずれか一項に記載の腫瘍抗原。
４５．ゲノムの当該非タンパク質コード領域は、遺伝子間領域、イントロン領域、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、または内在性レトロエレメント（ＥＲＥ）である、項目４４に記載の腫瘍抗原。
４６．項目２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドをコードする、核酸。
４７．ｍＲＮＡまたはウイルスベクターである、項目４６に記載の核酸。
４８．項目２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、または項目４６もしくは４７に記載の核酸を含む、リポソーム。
４９．項目２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、項目４６もしくは４７に記載の核酸、または項目４８に記載のリポソームと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
５０．項目２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、項目４６もしくは４７に記載の核酸、項目４８に記載のリポソーム、または項目４９に記載の組成物と、アジュバントと、を含む、ワクチン。
５１．項目２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドをそのペプチド結合溝に含む、単離された主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子。
５２．多量体の形態にある、項目５１に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子。
５３．当該多量体は、四量体である、項目５２に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子。
５４．項目２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドを含む、単離された細胞。
５５．項目２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチドをそれらのペプチド結合溝に含む主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を、その表面で発現する、単離された細胞。
５６．抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、項目５５に記載の細胞。
５７．当該ＡＰＣは、樹状細胞である、項目５６に記載の細胞。
５８．項目５１〜５３のいずれか一項に記載の単離されたＭＨＣクラスＩ分子および／または項目５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞の表面で発現されるＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
５９．項目５８に記載のＴＣＲをその細胞表面で発現する、単離されたＣＤ８＋Ｔリンパ球。
６０．項目５９に定義されるＣＤ８＋Ｔリンパ球の少なくとも０．５％を含む、細胞集団。
６１．対象において癌を治療する方法であって、対象に有効量の（ｉ）項目２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、（ｉｉ）項目４６もしくは４７に記載の核酸、（ｉｉｉ）項目４８に記載のリポソーム、（ｉｖ）項目４９に記載の組成物、（ｖ）項目５０に記載のワクチン、（ｖｉ）項目５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞、（ｖｉｉ）項目５９に記載のＣＤ８＋Ｔリンパ球、または（ｖｉｉｉ）項目６０に記載の細胞集団、を投与することを含む、方法。
６２．当該癌は、白血病である、項目６１に記載の方法。
６３．当該白血病は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）である、項目６２に記載の方法。
６４．当該癌は、肺癌である、項目６１に記載の方法。
６５．当該肺腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、項目６４に記載の方法。
６６．少なくとも１つの追加の抗腫瘍剤または療法を対象に投与することをさらに含む、項目６１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
６７．当該少なくとも１つの追加の抗腫瘍剤または療法は、化学療法剤、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法、または手術である、項目６６に記載の方法。
６８．対象において癌を治療するための、（ｉ）項目２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、（ｉｉ）項目４６もしくは４７に記載の核酸、（ｉｉｉ）項目４８に記載のリポソーム、（ｉｖ）項目４９に記載の組成物、（ｖ）項目５０に記載のワクチン、（ｖｉ）項目５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞、（ｖｉｉ）項目５９に記載のＣＤ８＋Ｔリンパ球、または（ｖｉｉｉ）項目６０に記載の細胞集団、の使用。
６９．対象において癌を治療するための医薬品の製造のための、（ｉ）項目２８〜４５のいずれか一項に記載の腫瘍抗原ペプチド、（ｉｉ）項目４６もしくは４７に記載の核酸、（ｉｉｉ）項目４８に記載のリポソーム、（ｉｖ）項目４９に記載の組成物、（ｖ）項目５０に記載のワクチン、（ｖｉ）項目５４〜５７のいずれか一項に記載の細胞、（ｖｉｉ）項目５９に記載のＣＤ８＋Ｔリンパ球、または（ｖｉｉｉ）項目６０に記載の細胞集団、の使用。
７０．当該癌は、白血病である、項目６８または６９に記載の使用。
７１．当該白血病は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）である、項目７０に記載の使用。
７２．当該癌は、肺癌である、項目６８または６９に記載の使用。
７３．当該肺腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、項目７２に記載の使用。
７４．少なくとも１つの追加の抗腫瘍剤または療法の使用をさらに含む、項目６８〜７３のいずれか一項に記載の使用。
７５．当該少なくとも１つの追加の抗腫瘍剤または療法は、化学療法剤、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法、または手術である、項目７４に記載の使用。
【００１２】
本発明の他の目的、利点、および特徴は、本発明の特定の実施形態の以下の非限定的な説明を読むことでさらに明らかになり、付属の図面との関連でのみ実施例の方法で示される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
添付図面。
【００１４】
【図１Ａ−Ｃ】腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）の特定のための標的化プロテオゲノミクスワークフローを示す。図１Ａ、Ｂ：標準的癌プロテオーム（図１Ａ）および癌特異的プロテオーム（図１Ｂ）が各々の分析された試料についてどのように構築されたかを詳細に示す概略図。図１Ｃ：次いで、包括的癌データベース（ｇｌｏｂａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｄａｔａｂａｓｅ）と称されるこれらの２つのプロテオームの組み合わせを使用して、２つの十分に特徴付けられたマウス細胞株、すなわち、ＣＴ２６およびＥＬ４、ならびに７つのヒト原発性試料、すなわち、４つのＢ−ＡＬＬおよび３つの肺腫瘍生検（試料あたりｎ＝２〜４）から、液体クロマトグラフィー−ＭＳ／ＭＳ（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって配列決定されたＭＡＰ、より具体的にはＴＳＡを特定した。包括的癌データベースの各部分に関する統計は、表４ａ〜ｂで認めることができ、ｋ−ｍｅｒプロファイリングによって癌特異的プロテオームを構築するための実施詳細（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔａｉｌｓ）は、図７に示される。ａａ：アミノ酸、ｎｔ：ヌクレオチド、ｔｈ：ｋ−ｍｅｒ発生時の試料特異的閾値（以下の実施例１のｋ−ｍｅｒフィルタリングおよび癌特異的プロテオームの生成を参照する）。
【図２Ａ−Ｄ】ほとんどのＴＳＡは非コード領域の翻訳に由来することを示す実験の結果を示す。図２Ａ：ＴＳＡ発見に関わる主要な検証ステップを示すフローチャート。各ステップに関する詳細は、図８に認めることができる。図２Ｂ：ほとんどのＴＳＡ候補は、異常に発現した配列に由来する。ＣＴ２６およびＥＬ４腫瘍モデルにおけるｍＴＳＡ（ｍ）およびａｅＴＳＡ候補（ａｅ）の数を示すバープロット。図２Ｃ：ＲＮＡ−Ｓｅｑデータが公開されて利用可能である２２個の組織／臓器におけるａｅＴＳＡ候補に関するＭＣＳの発現を示すヒートマップ（表５を参照）。以前に報告された過剰発現したＥＬ４  ＴＡＡ４０、４１におけるＭＣＳの発現をコントロールとして示す。発現値をｒｐｈｍ（配列決定した１億リードあたりのリード、詳細については実施例１のＭＣＳの末梢発現のセクションを参照）に基準化し、各組織について利用可能な全てのＲＮＡ−Ｓｅｑ実験にわたって平均した。太字の正方形は、関連するＭＣＳが＞０ｒｐｈｍで検出された組織を示す。脂肪組織（Ａｄｉｐ．ｔｉｓｓｕｅ）：脂肪組織、乳腺（ｍａｍ．ｇｌａｎｄ）：乳腺、および皮下脂肪組織（ｓ．ｃ．ａｄｉｐ．ｔｉｓｓｕｅ）：皮下脂肪組織。図２Ｄ：ほとんどのａｅ／ｍＴＳＡは、非コード領域に由来する。コード化エキソンのインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）翻訳（コード化−内）、コード化エキソンのアウトオブフレーム（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ）翻訳（コード化−外）、および非コード化とされる領域の翻訳（非コード化）に由来するＴＳＡの数を示すバープロット。バー内の数値は、ａｅＴＳＡ／ｍＴＳＡの数を表す。バー上のパーセントは、非定型的な翻訳事象に由来するＴＳＡ、すなわち、コード化−外および非コード化分類に属するＴＳＡの割合を示す。ＣＴ２６およびＥＬ４  ＴＳＡの特徴は、それぞれ、表１ａおよびｂに認めることができる。
【図３Ａ−Ｃ】個々のＴＳＡに対する免疫は、ＥＬ４細胞に対して異なる程度の保護を付与することを示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６雌
【数Ａ】
2021534830.tif 000002
マウスを、以下のように、個々のＴＳＡによってパルス化したＤＣで２回免疫化した。（図３Ａ）２つのａｅＴＳＡ、（図３Ｂ）２つのＥＲＥ  ＴＳＡ（１つのａｅＴＳＡまたは１つのｍＴＳＡ）、および（図３Ｃ）１つのｍＴＳＡ。マウスに、５×１０５個の生ＥＬ４細胞（黒色の三角形）を０日目に静脈内に注入し、生存した全てのマウスを１５０日目に再負荷した。コントロール群を非パルス化ＤＣで免疫化した（黒色線）。生存期間中央値を表す。免疫化した群対コントロール群の統計的有意性は、対数順位検定を使用して計算し、ｎｓは有意でないことを表す（ｐ＞０．０５）。ペプチド特異的免疫についての群あたり１０匹のマウス、コントロール群について１９匹のマウス。
【図４Ａ−Ｄ】ナイーブおよび免疫化マウスにおけるＴＳＡ特異的Ｔ細胞の頻度およびＴＳＡ特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示すグラフである。図４Ａ：ナイーブマウスにおける１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞あたりの四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数。各円は、１匹のマウス（ｎ＝５〜９匹のマウス）を表す。点線は、１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞あたり１個の四量体＋Ｔ細胞の頻度を表す。ｐ値は、両側マンホイットニー検定を使用して計算された（＊＊、ｐ＜０．０１および＊＊＊、ｐ＜０．００１）。図４Ｂ：免疫後の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の豊富化倍率は、関連（白色バー）または無関連（灰色バー）ペプチドで免疫化されたマウスにおける平均頻度を、ナイーブマウスにおける平均頻度で除することによって計算した。図４Ｃ、４Ｄ：免疫化したマウスから選別したＣＤ８＋Ｔ細胞を、放射線照射したペプチドパルス化脾臓細胞の存在下で４８時間インキュベートした。図４Ｃ：ＩＦＮ−γ分泌性抗原特異的細胞の頻度は、免疫化マウスにおけるスポット形成細胞の平均頻度（播種された１０６個のＣＤ８  Ｔ細胞あたりで報告されたＳＦＣ）からナイーブマウスにおけるものを減じたものとして表される。技術的反復を表す円を有する３つの独立した実験。ｐ値は独立両側スチューデント検定ｔを使用して計算し、全てｐ＜０．０５（範囲：０．００２５〜０．０１４３）である。図４Ｄ：ＳＦＣの頻度を最大値に対して基準化することによって、そして用量応答曲線を使用して各ペプチドについてＥＣ５０を計算することによって、抗原特異的Ｔ細胞の機能的結合活性を計算した。Ｈ７ａおよびＨ１３ａにおける機能的結合活性値は、既に公表され、比較目的のために使用した。３つの独立した実験。全ての関連パネルで、各条件の上の全ての水平線および数値は平均値を表す。コントロールとして使用されるウイルスペプチドは、灰色で強調される。
【図５Ａ−Ｄ】ＥＬ４由来ＴＳＡの高発現は抗白血病応答を誘導するのに重要であるが十分ではないことを示すグラフである。図５Ａ、Ｂ：ＲＮＡおよびペプチドレベルでのＴＳＡ発現の分析を、０日目または１５０日目にそれぞれ注入されたＥＬ４細胞で実施した。図５Ａ：ＥＬ４  ＲＮＡ−Ｓｅｑリードの数を表すバープロットは、５つのＥＬ４  ＴＳＡの各々をコードするＭＣＳと完全に重複している。図５Ｂ：５つのＥＬ４  ＴＳＡの１３Ｃ合成ペプチド類似体を使用してＰＲＭ  ＭＳによって評価される、細胞あたりのＴＳＡコピー数。ＴＳＡあたりＥＬ４細胞の３回複製。細胞あたりのＴＳＡコピー数の平均をグラフの左側に示す。Ｎ．Ｄ．：検出されない。図５Ｃ：ペプチドパルス化ＤＣによる前免疫を伴わない生ＥＬ４細胞による注入後のＴＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の豊富化倍率は、ＥＬ４注入マウスにおける平均頻度をナイーブマウスの平均頻度で除することによって計算した。ＥＬ４細胞によって提示されないウイルスペプチドを認識するＴ細胞の豊富化倍率は陰性コントロールとして示され、灰色で強調される。図５Ｄ：Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを、５９２ｄ（１０，０００ｃＧｙ）放射線照射ＥＬ４細胞（青色線）またはコントロールとして非パルス化ＤＣ（黒色線）で２回免疫化し、次いで５×１０５個の生ＥＬ４細胞を静脈内注入した。
【数Ｂ】
2021534830.tif 000003
は生存期間の中央値を表す。放射線照射されたＥＬ４細胞免疫について１０匹のマウス、コントロール群について１９匹のマウス。
【図６Ａ−Ｃ】ヒト原発性腫瘍で検出されるほとんどのＴＳＡは、非コード化領域の翻訳に由来することを示す。図６Ａ：ほとんどのヒトＴＳＡはａｅＴＳＡである。分析した各原発性試料におけるａｅＴＳＡ候補（ａｅ）およびｍＴＳＡ（ｍ）の数を示すバープロット。図６Ｂ：ヒトａｅＴＳＡ候補およびＴＡＡの末梢発現。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータが公開されて利用可能である２８個のヒト組織のパネルにわたって、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅデータベース４８から得られた、２７個のａｅＴＳＡおよび２４個の過剰発現したＴＡＡについてＭＣＳの発現を示すヒートマップ（表６を参照）。発現値をｒｐｈｍに基準化し（詳細については、以下の実施例１のＭＣＳの末梢発現のセクションを参照）、各組織について利用可能な全てのＲＮＡ−Ｓｅｑ実験にわたって平均化した。各抗原について、そのＭＣＳが＞１５ｒｐｈｍで発現される組織の数がヒートマップの左側に示される。皮下脂肪（ａｄｉｐ．ｓ．ｃ）：皮下脂肪図６Ｃ：ほとんどのヒトＴＳＡは、非コード領域に由来する。コード化エキソンのインフレーム翻訳（コード化−内）、コード化エキソンのアウトオブフレーム翻訳（コード化−外）、および非コード化とされる領域の翻訳（非コード化）に由来するヒトＴＳＡの数を示すバープロット。各試料において特定されたヒトＴＳＡの特徴は、表２ａ〜ｄおよび３ａ〜ｃに認めることができる。
【図７Ａ−Ｄ】ｋ−ｍｅｒプロファイリングワークフローに使用される規則の構成の概略図である。ＲＮＡ−ｓｅｑリードからｋ−ｍｅｒを生成し（図７Ａ）、ｋ−ｍｅｒをフィルターにかけ（図７Ｂ）、ｋ−ｍｅｒをコンティグに組み立て（図７Ｃ）、コンティグを翻訳する（図７Ｄ）ために使用される規則に関する詳細。
【図８Ａ−Ｃ】ＴＳＡ検証プロセスを示す。図８Ａ：ＭＡＰ／タンパク質の対の免疫原性状態の計算を詳細に示す概略図。ＦＣ：腫瘍／同系ｍＴＥＣｈｉ（マウス試料）またはＴＥＣ／ｍＴＥＣ（ヒト試料）。図８Ｂ：ＴＳＡ候補としてフラグ付けされたＭＡＰのＭＳ関連検証を実施するために使用される戦略。図８Ｃ：ＭＳ検証済みマウスＴＳＡ候補（ＣＴ２６およびＥＬ４）、ならびにＢ−ＡＬＬ標本および肺癌におけるＭＳ検証済みヒトＴＳＡ候補にゲノム位置を割り当てるために使用される戦略を要約する概略図。
【図９Ａ−Ｄ】ナイーブおよび前免疫されたマウスにおける抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出を示すグラフである。図９Ａ：ｐＭＨＣ四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のエクスビボ検出のためのゲーティング戦略。四量体豊富化を、各マウスの脾臓およびリンパ節から単離した単一細胞懸濁液で実施した。ダブレット排除後、Ｄｕｍｐ−ＣＤ３＋細胞をＣＤ８およびＣＤ４発現について分析し、ｐＭＨＣ  Ｉ四量体＋細胞をＣＤ８＋区画内で分析した。ナイーブマウスにおけるＶＴＰＶ／Ｈ−２Ｋｂ−ＰＥおよびＭ４５／Ｈ−２Ｄｂ−ＡＰＣ四量体豊富化後に得られた代表的な染色を示す。各特異性について検出された四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を示す。Ｄｕｍｐチャネルは、死細胞、ＣＤ４５ＲおよびＣＤ１９、Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃについて陽性であるプールされた事象に対応する。図９Ｂ、Ｃ：ナイーブ（上段）および前免疫化（下段）マウスにおける抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞でのＣＤ４４発現の代表的な分析。磁気豊富化前（図９Ｂ、左パネル）ならびに四量体＋ウイルス特異性（図９Ｂ）およびＴＳＡ特異性（図９Ｃ）におけるエクスビボ豊富化後のＣＤ８＋細胞のＣＤ４４状態を表す。ＣＤ４４陽性または陰性細胞の割合および数を示す。図９Ｄ：免疫化およびナイーブマウスにおけるＩＦＮ−γ分泌性ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の１つの代表的な実験。各条件において播種したＣＤ８＋Ｔ細胞の数の数に対するスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を各枠の下に示す。
【図１０Ａ−Ｄ】抗原特異的Ｔ細胞の頻度を示すグラフである。図１０Ａ：ナイーブまたは関連もしくは無関連のペプチドで免疫化されたマウスにおける抗原特異的Ｔ細胞の頻度。図１０Ｂ、Ｃ：１５０日目にＥＬ４細胞で再負荷されたＶＴＰＶＹＱＨＬもしくはＴＶＰＬＮＨＮＴＬに対して（図１０Ｂ）、またはＶＮＹＬＨＲＮＶもしくはＶＮＹＩＨＲＮＶに対して（図１０Ｃ）免疫化されたマウスにおける抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度。比較目的のために、図１０Ａに報告されるナイーブおよび免疫化マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞の頻度を再現する。図１０Ｄ：ＥＬ４細胞を注入した非免疫化マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞の頻度。四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の全ての計算された頻度は、１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞あたりの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数として表される。各記号は、１匹のマウス（ｎ＝１〜９匹のマウス）を表す。点線は、１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞あたり１個の四量体＋Ｔ細胞の最小検出レベルを表す。コントロールとして使用されるウイルスペプチドを灰色で強調する。ｐ値は、両側マンホイットニー検定（＊ｐ≦０．０５）を使用して計算した。
【図１１Ａ−Ｃ】ナイーブおよび前免疫化マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞頻度間の相関を示すグラフである。四量体染色（図１１Ａ）およびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（図１１Ｂ）によって計算したナイーブレパートリーおよび免疫化マウスにおける抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の相関。図１１Ｃ：四量体染色およびＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって計算された免疫化マウスにおける抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度における相関。平均頻度はデータのプロットに使用した。曲線のフィッティングは、決定係数（ｒ２）によって決定された。
【図１２Ａ−Ｂ】ヒトＴＥＣおよびｍＴＥＣトランスクリプトームランドスケープの概要を図示する。図１２Ａ：無関係ドナーから単離されたヒトＴＥＣ（０６２０１５および１０２０１５）およびｍＴＥＣ（Ｓ５〜Ｓ１１）は、類似のトランスクリプトームプロファイルを示す。ＲＮＡ−Ｓｅｑに続いて、ｋａｌｌｉｓｔｏによって推定されるように、ｔｐｍ＞１を有する少なくとも１つのドナーで発現された転写物を選択して、全ての１対１の散乱プロットを描いた。スピアマン順位相関係数（ρ）は、各グラフの左上隅に示され、黒色線は転写物の同一の発現を表す。図１２Ｂ：追加のヒトＴＥＣ／ｍＴＥＣ試料のＲＮＡ−Ｓｅｑは、情報の最小ゲインをもたらすべきである。発現した転写物のセット（少なくとも１つの試料中でｔｐｍ＞１）を使用して、追加の試料（ｎＳ、以下の実施例１のＴＥＣおよびｍＴＥＣ試料中で検出された転写物の累積数のセクションを参照）をコホートに添加することによって検出されるべき転写物の累積数（ｃＴ）を、以下の関数を使用して外挿し、
【数Ｃ】
2021534830.tif 000004
式中、ａ＝２３，８９２．７３、ｂ＝０．８２４３３８９、およびｃ＝７５，９７６．１１（灰色線）である。グラフ上には、ｎＳ＝６（本発明のコホート、黒点）またはｎＳ＝２０試料を分析することによって検出される転写物の累積数、ならびに
【数Ｄ】
2021534830.tif 000005
（漸近線値）に対応する検出されるべき転写物の総数が示される。
【図１３Ａ−Ｃ】ＦＡＣＳ選別によって単離された細胞におけるゲーティング戦略を示すグラフである。図１３Ａ：マウスｍＴＥＣｈｉの単離のためのゲーティング戦略。ｍＴＥＣｈｉ単離を、Ｃ５７ＢＬ／６またはＢａｌｂ／ｃマウスの胸腺から単離された単一細胞懸濁液で実施した。ダブレット排除後、ｍＴＥＣｈｉ細胞を、７−ＡＡＤ−、ＥｐＣＡＭ＋、ＣＤ４５−（Ｃ５７ＢＬ／６マウスではＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、またはＢａｌｂ／ｃマウスではＦＩＴＣ）、ＵＥＡ−１＋およびＩ−Ａｂ＋（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）、またはＩ−Ａ／Ｉ−Ｅ＋（Ｂａｌｂ／ｃマウス）として定義した。図１３Ｂ：ヒトＴＥＣおよびｍＴＥＣの単離のためのゲーティング戦略。細胞選別を、心臓血管矯正手術を受ける３ヶ月〜７歳の個体から得られた胸腺から単離された単一細胞懸濁液で実施した。ダブレット排除後、ＴＥＣを、ＣＤ４５−、７−ＡＡＤ−、ＥｐＣＡＭ＋、およびＨＬＡ−ＤＲ＋として定義した。ｍＴＥＣの選別のために、細胞をＣＤＲ２−としてさらに定義した。図１３Ｃ：ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ用のＣＤ８＋Ｔ細胞の単離のためのゲーティング戦略。ＣＤ８＋Ｔ細胞単離を、ナイーブまたは免疫化Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から単離された単一細胞懸濁液で実施した。ダブレット排除後、ＣＤ８ａマーカーを使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を豊富化した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書で使用される遺伝学、分子生物学、生化学、および核酸の用語および記号は、当該分野における標準的な論文およびテキスト、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０１２）、Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２０１８）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）などのものを使用する。全ての用語は、関連技術で確立されたそれらの一般的な意味で理解されるべきである。
【００１６】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語のうちの１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または複数の要素を意味する。本明細書全体を通して、文脈が別段必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言明されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を意味するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。
【００１７】
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に含まれる各々の別の値を個別に言及することの簡略法として機能することが単に意図されており、各々の別の値は、本明細書に個別に列挙されるかのようにそれらは本明細書に組み込まれる。範囲内の値の全てのサブセットも、本明細書に個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。
【００１８】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。
【００１９】
本明細書に提供される任意および全ての実施例、または例示的な言い回し（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く明らかにすることが単に意図されており、特に別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２０】
本明細書におけるいかなる言い回しも、任意の請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であると示すものとして解釈されるべきではない。
【００２１】
本明細書において、「約」という用語は、その通常の意味を有する。「約」という用語は、値が、その値を決定するために使用されるデバイスまたは方法における固有の誤差変動を含むか、または、列挙された値に近い値を包含することを示すために使用され、例えば、列挙された値（または値の範囲）の１０％もしくは５％以内である。
【００２２】
治療用癌ワクチンに使用することができる実用可能なＴＳＡの発見にかなりの努力がさげられている。最も一般的な戦略は、逆免疫学（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で定まり、ｉ）エクソーム配列決定を腫瘍細胞に実施して変異を特定し、ｉｉ）ＭＨＣ結合予測ソフトウェアツールを使用して、どの変異型ＭＡＰが優れたＭＨＣ結合物質であり得るかを特定する１１、１２。逆免疫学は、ＴＳＡ候補を豊富化することができるが、利用可能なコンピュータ法はＭＨＣ結合を予測し得るが、ＭＡＰ処理に含まれる他のステップを予測することはできないため１４、１５、これらの候補の少なくとも９０％は偽陽性である５、１３。この制限を克服するために、いくつかの研究は、それらのＴＳＡ発見パイプラインに質量分析（ＭＳ）解析を含めており１６、それによっていくつかのＴＳＡの厳密な分子決定をもたらす１７、１８。しかしながら、これらのアプローチの収率は極めて不十分であり、最も変異した腫瘍型の１つである黒色腫において、個々の腫瘍あたり平均２つのＴＳＡがＭＳによって検証されているが１９、一方、他の癌型についてはわずかなＴＳＡしか認められていない１５。ＴＩＬまたは免疫チェックポイント阻害剤の注入は、腫瘍が免疫原性抗原を発現しなかった場合、腫瘍退縮を引き起こさないため、ＴＳＡの乏しさは難題である２０。エキソン変異に基づくアプローチは、それらが２つの重要な要素を考慮しなかったため、ＴＳＡを特定することに失敗していたことが推測された。第１に、基本的には、ａｅＴＳＡのハイスループット識別のための方法が現在はないため、これらのアプローチはｍＴＳＡにのみ焦点を当ててａｅＴＳＡを軽視する。これは大きな欠点を意味し、ｍＴＳＡは固有抗原であるが、ａｅＴＳＡは複数の腫瘍によって共有することができ、ワクチン開発のための好ましい標的になり得るためである７、９。第２に、ＴＳＡの唯一の供給源としてエクソームに焦点を当てることは、非常に限定的である。エクソーム（すなわち、全てのタンパク質コード遺伝子）は、ヒトゲノムのわずか２％を表し、一方、ゲノムの最大７５％は、転写され、潜在的に翻訳され得る２２。
【００２３】
本明細書に記載される研究において、本発明者らは、それらがコード領域もしくは非コード領域、単純もしくは複雑な再配列、または単に癌制限型ＥＲＥに由来するかにかかわらず、非寛容原性ＴＳＡを特定することができるプロテオゲノミクスワークフローを開発している。非寛容原性配列を特定するために、全てのＲＮＡ配列決定リードをマッピングし、そこに存在する潜在的な変異を再構築しようとするよりもむしろ、正しく正常とマッチングするシグナル、すなわちｍＴＥＣｈｉのうちの１つを癌シグナルから省いて、得られた配列のコンピュータによる翻訳をＭＳにおけるデータベースとして使用した。他の技法と比較して、本明細書に記載のｋ−ｍｅｒプロファイリングワークフローは、いくつかの利点を有する。（ｉ）それは速い。増大した癌データベースのｋ−ｍｅｒ由来部分の生成に要するのは、典型的には半日未満である。（ｉｉ）それは偏りがない。これは、非コード領域に由来するＴＳＡ、ならびに約７，５００塩基対の欠失に由来する１つのＴＳＡの特定によって実証されるように、それらの性質に関係なく、全ての癌特異的配列を捉える。（ｉｉｉ）それはモジュール式である。非寛容原性配列を豊富化するために、癌データをｍＴＥＣｈｉでフィルタリングし、これは抗原の末梢発現のための優れた代行であることが示され、それ以外の場合、例えば、全てのＥＮＣＯＤＥデータを除去するか、またはｄｂＳＮＰを混合に加えることによって、データをフィルタリングし得る。関連付けられたｋ−ｍｅｒデータベースが生成され、フィルタリングされるべき正常試料の収集に加えられる。
【００２４】
一態様では、本開示は、腫瘍細胞試料中の腫瘍抗原候補を特定するための方法を提供し、本方法は、
（ａ）腫瘍特異的プロテオームデータベースを、
（ｉ）腫瘍ＲＮＡ配列（例えば、腫瘍細胞試料の全トランスクリプトーム配列決定によって得られるＲＮＡ配列）から少なくとも３３塩基対を含むサブ配列（ｋ−ｍｅｒ）のセットを抽出することと、
（ｉｉ）（ｉ）の腫瘍サブ配列のセットを、正常細胞からのＲＮＡ配列から抽出された少なくとも３３塩基対を含む対応するコントロールサブ配列のセットと比較することと、
（ｉｉｉ）対応するコントロールサブ配列において、存在しないか、または少なくとも４倍下方発現されている腫瘍サブ配列を抽出し、それによって腫瘍特異的サブ配列を得ることと、
（ｉｖ）腫瘍特異的サブ配列をコンピュータによって翻訳し、それによって腫瘍特異的プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｂ）個別化腫瘍プロテオームデータベースを、
（ｉ）腫瘍ＲＮＡ配列を参照ゲノム配列と比較して、当該腫瘍ＲＮＡ配列における一塩基変異を特定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で特定された一塩基変異を参照ゲノム配列に挿入し、それによって個別化ゲノム配列を作成することと、
（ｉｉｉ）当該個別化ゲノム配列から、発現されるタンパク質コード転写物をコンピュータによって翻訳し、それによって個別化プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｃ）当該腫瘍からの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）関連ペプチド（ＭＡＰ）の配列を、（ａ）の腫瘍特異的プロテオームデータベースおよび（ｂ）の個別化腫瘍プロテオームデータベースの配列と比較して、ＭＡＰを特定することと、
（ｄ）（ｃ）で特定されたＭＡＰの中で腫瘍抗原候補を特定することと、を含み、腫瘍抗原候補は、配列および／またはコード配列が、正常細胞と比較して腫瘍細胞中で過剰発現されるペプチドである。
【００２５】
一実施形態では、上記の方法は、腫瘍細胞試料から主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）関連ペプチド（ＭＡＰ）を単離および配列決定することをさらに含む。
【００２６】
一実施形態では、上記の方法は、腫瘍細胞試料で全トランスクリプトーム配列決定を実施し、それによって腫瘍ＲＮＡ配列を得ることをさらに含む。
【００２７】
本明細書で使用される「腫瘍抗原候補」という用語は、主要組織適合性分子（ＭＨＣ）に結合し、腫瘍細胞の表面にのみ存在するか、または腫瘍細胞の表面において、非腫瘍細胞と比較して有意に高いレベル／頻度（少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、５倍、または１０倍）で存在するペプチドを指す。そのような腫瘍抗原候補は、それらの表面で抗原を発現する腫瘍細胞に対するＴ細胞応答を誘導するように標的化され得る。
【００２８】
細胞試料からＭＨＣ関連ペプチド（ＭＡＰ）を単離するための方法は、当該技術分野で周知である。最も一般的に使用される技法は、Ｆｏｒｔｉｅｒら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５（３）：５９５−６１０，２００８）によって記載されている生細胞からのＭＨＣ関連ペプチドの弱酸溶出（ＭＡＥ）である。別の技法は、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体の免疫沈降またはアフィニティ精製、それに続くペプチド溶出である（例えば、Ｇｅｂｒｅｓｅｌａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；６７（１１）：８９４−９０６を参照する）。後者のアプローチに基づく２つのハイスループット戦略が使用されている。第１は、可溶性分泌型ＭＨＣをコードする発現ベクター（機能的膜貫通ドメインを欠く）による細胞株のトランスフェクション、および分泌型ＭＨＣに関連するペプチドの溶出に基づく（Ｂａｒｎｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｊａｎ，３２（１）：２１３−２２、およびＨｉｃｋｍａｎ  ＨＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４  Ｍａｒ  １；１７２（５）：２９４４−５２）。第２のアプローチは、化学的または代謝的標識で定まり、ＭＨＣ関連ペプチドの定量的プロファイルを提供する（Ｗｅｉｎｚｉｅｒｌ  ＡＯ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００７  Ｊａｎ；６（１）：１０２−１３．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｏｃｔ  ２９；Ｌｅｍｍｅｌ  Ｃｅｔａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４  Ａｐｒ；２２（４）：４５０−４．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｍａｒ  ７；Ｍｉｌｎｅ  Ｅ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００６  Ｆｅｂ；５（２）：３５７−６５．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｎｏｖ  ４）。
【００２９】
溶出したＭＡＰは、さらなる分析の前に、サイズ排除クロマトグラフィーまたは限外濾過（約５０００Ｄａ、例えば、約３０００Ｄａのカットオフを有するフィルターを使用）、逆相クロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー）、および／またはイオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー）を含む、任意の精製／豊富化ステップに供され得る。溶出したＭＡＰの配列は、質量分析（以下に記載されるタンデム質量分析またはＭＳ／ＭＳ）およびエドマン分解反応などの、ペプチド／タンパク質を配列決定するための当技術分野で知られている任意の方法を使用して決定され得る。
【００３０】
全トランスクリプトーム配列決定（「全ＲＮＡ配列決定」、「ＲＮＡ配列決定」、またはＲＮＡ−ｓｅｑとも称される）は、試料（腫瘍試料、正常細胞試料）中に存在する全てのＲＮＡの配列決定を指し、コード化ＲＮＡ、ならびにｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｔＲＮＡなどの非コード化ＲＮＡの複数の型が含まれる。全トランスクリプトーム配列決定を実施するための方法、例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ）法は、当該技術分野で周知である。市販されている（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）、ＨｉＳｅｑ（商標））、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（Ｉｏｎ  Ｔｏｔａｌ（商標）ＲＮＡ−Ｓｅｑキット）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＳＭＡＲＴｅｒ（商標））から）、または文献に言及されている複数のＮＧＳプラットフォームを、本明細書に記載の方法で使用することができ、例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１：Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３８（３），９５−１０９、またはＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９：Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｆｒｏｍ  ｂａｓｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５，６４１−６５８に詳細に記載されている。
【００３１】
好ましくは、ＲＮＡ調製物は、ＮＧＳの出発物質として機能する。そのような核酸は、生物学的材料などの試料から、例えば、新鮮な、急速冷凍もしくはホルマリン固定パラフィン包埋した腫瘍組織から、または新たに単離された細胞から、あるいは患者の末梢血中に存在する循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）から、容易に得ることができる。正常またはコントロールＲＮＡは、正常な体細胞組織または生殖細胞から抽出することができる。正常細胞からのＲＮＡ配列は、正常細胞の異なるタイプ、例えば、異なる組織からの正常細胞、からのＲＮＡ配列の収集に対応し得る。正常細胞からのＲＮＡ配列はまた、胸腺細胞、好ましくは、ＭＨＣ  ＩＩｈｉｇｈ髄質胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣｈｉ）などの髄質胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣ）から得ることができる。ｍＴＥＣｈｉ細胞は独自の乱雑遺伝子発現プロファイルを有利に有しており、体細胞のタンパク質コード配列の約７０〜９０％を発現し、それらのＭＡＰは中心免疫寛容を誘導することができる。
【００３２】
本明細書に記載される方法は、ｋ−ｍｅｒプロファイリングと呼ばれるアラインメントフリーＲＮＡ−ｓｅｑ分析ワークフローを使用して、腫瘍特異的プロテオームデータベースを生成することを含み、構造バリアント（大きな挿入もしくは欠失（ＩｎＤｅｌｓ）または融合を含む任意のタイプの変異）および非コード領域の翻訳に由来する配列を含む。腫瘍および正常ＲＮＡ配列（ＲＮＡ−ｓｅｑリード）は、ｋ−ｍｅｒ、すなわち、ｋ≧３３ヌクレオチドを有する長さｋのサブ配列に「切断」または「分割」される。ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＡＰ）に結合するペプチドは、一般に、１１個のアミノ酸長（したがって、３３個のヌクレオチド長配列によってコードされる）を超えないため、ＲＮＡ配列を少なくとも３３個のヌクレオチドのサブ配列に分割することは、潜在的なＭＡＰが欠落するリスクを最小限に抑える。当業者は、腫瘍特異的プロテオームデータベースのサイズを最小化するために、ＲＮＡ配列を３３ヌクレオチド（すなわち、ｋ＝３３ヌクレオチド）のサブ配列に分割することが、ＭＨＣクラスＩ制限腫瘍抗原を特定するために好ましいことを理解するであろう。当業者はまた、ＭＨＣクラスＩＩ制限腫瘍抗原を特定するために、最小ｋ−ｍｅｒ長を３３〜５４ヌクレオチド（ｋ≧５４ヌクレオチド）に、ＭＨＣ  ＩＩ関連ペプチドを一般に１３〜１８個のアミノ酸長の範囲に増加させるべきであることを理解するであろう。次いで、腫瘍サブ配列を対応するコントロールサブ配列（正常細胞のＲＮＡ配列から）のセットと比較して、対応するコントロールサブ配列において、存在しないか、または少なくとも４倍（好ましくは、少なくとも５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍）下方発現される腫瘍サブ配列を抽出する。一実施形態では、ｋ−ｍｅｒスペースに固有の冗長性を最小限にするために、本方法は、重複する腫瘍特異的サブ配列を、より長い腫瘍サブ配列（典型的にはコンティグと称される）に組み立てることをさらに含む。次いで、腫瘍特異的サブ配列またはコンティグは、コンピュータによって翻訳されて（例えば、サブ配列またはコンティグがコード鎖または非コード鎖に由来するかに応じて、３フレームまたは６フレーム翻訳される）、腫瘍特異的プロテオームデータベースを得る。一実施形態では、８個未満のアミノ酸（ＭＨＣクラスＩペプチドの最小長）または１３個のアミノ酸（ＭＨＣクラスＩＩペプチドの最小長）のタンパク質フラグメントは、腫瘍特異的プロテオームデータベースから除去される。
【００３３】
一実施形態では、本方法は、ＲＮＡ配列（正常細胞および腫瘍細胞）から、ｋ＝２４ヌクレオチド（ＭＨＣクラスＩペプチドについて）またはｋ＝３９（ＭＨＣクラスＩＩペプチドについて）を有するｋ−ｍｅｒデータベースを生成して、癌／腫瘍および正常の２４（または３９）ヌクレオチド長のｋ−ｍｅｒデータベースを得ることをさらに含む。これらのデータベースは、以下に記載されるように、ＭＡＰコード配列（ＭＣＳ）との比較のために使用されて、ＭＣＳが腫瘍細胞中で過剰発現または過剰提示されるかを決定し得る。
【００３４】
本方法はまた、個別化腫瘍プロテオームデータベースの生成を含む。そのために、腫瘍ＲＮＡ配列（腫瘍ＲＮＡ−ｓｅｑリード）を参照ゲノム配列と比較して、腫瘍ＲＮＡ配列における一塩基変異を特定する。次いで、これらの変異を参照ゲノムに挿入して、個別化腫瘍ゲノムを得、そこから、発現された全てのタンパク質コード転写物配列の標準的翻訳産物配列を含む対応する個別化腫瘍プロテオームデータベースを得ることが可能である。エクソームの標準的フレームによってコードされるＷＴ  ＭＡＰおよび変異ＴＳＡ（ネオ抗原）を特定することを可能にする、個別化腫瘍プロテオームデータベースの生成はまた、いくつかの偽陽性の特定をもたらすであろう腫瘍特異的配列にデータベースを過度にバイアスしないことによって、ＭＳ分析に使用されるデータベースの信頼性を改善する。
【００３５】
一実施形態では、本方法は、個別化正常プロテオームデータベースの生成も含む。そのために、正常細胞からのＲＮＡ配列（正常ＲＮＡ−ｓｅｑリード）を参照ゲノム配列と比較して、正常ＲＮＡ配列における一塩基変異を特定する。次いで、これらの変異を参照ゲノムに挿入して、個別化正常ゲノムを得、そこから、発現された全てのタンパク質コード転写物配列の標準的翻訳産物配列を含む対応する個別化正常プロテオームデータベースを得ることが可能である。この個別化正常プロテオームデータベースを使用して、正常（非腫瘍）細胞内で発現される、好適なＴＳＡ候補ではないＭＡＰをフィルタリングし得る。
【００３６】
本明細書で使用される「参照ゲノム」という用語は、文献に報告されているヒトゲノムアセンブリを指し、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｕｉｌｄ  ３８（ＧＲＣｈ３８，ＲｅｆＳｅｑ：受入番号ＧＣＦ＿０００００１４０５．３７）、Ｈｓ＿Ｃｅｌｅｒａ＿ＷＧＳＡ（Ｃｅｌｅｒａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｉｓｔｒａｉｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００４；１０１（７）：１９１６−２１）．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｆｅｂ  ９）、ＨｕＲｅｆおよびＨｕＲｅｆＰｒｉｍｅ（Ｊ．Ｃｒａｉｇ  Ｖｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌｅｖｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００７；５：２１１３−２１４４）、ＹＨ１およびＢＧＩＡＦ（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｌｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１０；２０：２６５−２７２）、ＨｓａｐＡＬＬＰＡＴＨＳ１（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）などが含まれる。参照ヒトゲノムアセンブリのリストは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の「アセンブリ」データベースに認められ得る。一実施形態では、参照ゲノムは、ＧＲＣｈ３８である。
【００３７】
次に、方法のステップ（ａ）で得られたＭＡＰの配列を、ＭＡＰの特定を可能にする腫瘍特異的プロテオームデータベースおよび個別化腫瘍プロテオームデータベースの配列と比較する（例えば、ＢＬＡＳＴ処理する）。
【００３８】
腫瘍抗原候補は、上記のＭＡＰの中で特定され得る。そのような腫瘍抗原候補は、配列および／またはコード配列が正常細胞と比較して腫瘍細胞中で過剰発現されるペプチドに対応する。
【００３９】
一実施形態では、本方法は、配列が正常個別化プロテオームデータベースで検出されるＭＡＰを排除または放棄することをさらに含む。
【００４０】
一実施形態では、本方法は、特定されたＭＡＰのコード配列、すなわちＭＡＰコード配列（ＭＣＳ）を回収することを含む。別の実施形態では、本方法は、ＭＣＳを２４個（ＭＨＣクラスＩペプチドの場合）または３９個（ＭＨＣクラスＩＩペプチドの場合）のヌクレオチドのｋ−ｍｅｒセットに変換することを含む。別の実施形態では、ＭＣＳに由来するこれらのｋ−ｍｅｒセットは、癌／腫瘍および正常２４−（または３９−）ヌクレオチドｋ−ｍｅｒデータベースと比較される。
【００４１】
一実施形態では、本方法は、
（ａ）腫瘍細胞試料中の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）関連ペプチド（ＭＡＰ）を単離および配列決定することと、
（ｂ）全トランスクリプトーム配列決定を当該腫瘍細胞試料で実施し、それによって腫瘍ＲＮＡ配列を得ることと、
（ｃ）腫瘍特異的プロテオームデータベースを、
（ｉ）当該腫瘍ＲＮＡ配列から少なくとも３３ヌクレオチドを含むサブ配列（ｋ−ｍｅｒ）のセットを抽出することと、
（ｉｉ）（ｉ）の腫瘍サブ配列のセットを、正常細胞からのＲＮＡ配列から抽出された少なくとも３３ヌクレオチドを含む対応するコントロールサブ配列のセットと比較することと、
（ｉｉｉ）対応するコントロールサブ配列において、存在しないか、または少なくとも４倍下方発現されている腫瘍サブ配列を抽出し、それによって腫瘍特異的サブ配列を得ることと、
（ｉｖ）腫瘍特異的サブ配列をコンピュータによって翻訳し、それによって腫瘍特異的プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｄ）個別化腫瘍プロテオームデータベースを、
（ｉ）腫瘍ＲＮＡ配列を参照ゲノム配列と比較して、当該腫瘍ＲＮＡ配列における一塩基変異を特定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で特定された一塩基変異を参照ゲノム配列に挿入し、それによって個別化腫瘍ゲノム配列を作成することと、
（ｉｉｉ）当該個別化腫瘍ゲノム配列から、発現されるタンパク質コード転写物をコンピュータによって翻訳し、それによって個別化腫瘍プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｅ）個別化正常プロテオームデータベースを、
（ｉ）正常細胞からのＲＮＡ配列を参照ゲノム配列と比較して、当該正常ＲＮＡ配列における一塩基変異を特定することと、
（ｉｉ）（ｉ）で特定された一塩基変異を参照ゲノム配列に挿入し、それによって個別化正常ゲノム配列を作成することと、
（ｉｉｉ）当該個別化正常ゲノム配列から、発現されるタンパク質コード転写物をコンピュータによって翻訳し、それによって個別化正常プロテオームデータベースを得ることと、によって生成することと、
（ｆ）（ｉ）正常細胞からの当該ＲＮＡ配列および当該腫瘍ＲＮＡ配列から少なくとも２４ヌクレオチドを含むサブ配列のセットを抽出することによって、正常および腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースを生成することと、
（ｇ）（ａ）で得られたＭＡＰの配列を、（ｃ）の腫瘍特異的プロテオームデータベースの配列および（ｄ）の個別化腫瘍プロテオームデータベースと比較して、ＭＡＰを特定することと、
（ｈ）（ｆ）で特定されたＭＡＰの中で腫瘍抗原候補を特定することと、を含み、腫瘍抗原候補は、（１）配列が個別化正常プロテオームデータベースに存在せず、かつ（２）（ｉ）配列が個別化腫瘍プロテオームデータベースに存在し、かつ／または（ｉ）コード配列は、当該正常ｋ−ｍｅｒデータベースと比較して当該腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースにおいて過剰発現もしくは過剰提示される、ＭＡＰに対応する。
【００４２】
一実施形態では、コード配列は、ＭＡＰ由来ｋ−ｍｅｒのセット（例えば、２４ｎｔ  ｋ−ｍｅｒ）に変換され、腫瘍および正常ｋ−ｍｅｒデータベースにおけるＭＡＰ由来ｋ−ｍｅｒの発現または提示が決定される。本明細書で使用される場合、過剰発現または過剰提示されるとは、配列が、腫瘍ｋ−ｍｅｒデータベースにおいて、正常ｋ−ｍｅｒデータベースと比較して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３、４、または５倍、より好ましくは少なくとも１０倍であるレベルで存在することを意味する。一実施形態では、コード配列またはＭＡＰ由来ｋ−ｍｅｒは、正常ｋ−ｍｅｒデータベースに存在しない。
【００４３】
一実施形態では、図７Ａを参照し、ＴＳＡ候補の特定および検証は、以下のように達成される。各ＭＡＰおよびその関連するＭＡＰコード配列（複数可）（ＭＣＳ）を、関連する癌および正常個別化プロテオーム、または癌および正常２４ヌクレオチド長ｋ−ｍｅｒデータベースに照会する。正常個別化プロテオームで検出されたＭＡＰは除外した。癌個別化プロテオームおよび／または癌ｋ−ｍｅｒデータベースにのみ存在するＭＡＰは、ＴＳＡ候補として特定／選択される。両方の個別化プロテオームに存在しないが両方のｋ−ｍｅｒデータベースに存在するＭＡＰについては、それらは、それらのＭＣＳが正常細胞と比較して癌細胞において過剰発現（例えば、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍）される場合に選択される。ＭＡＰがいくつかのＭＣＳによってコードされている場合、それは、それらのそれぞれのＭＣＳが一致していた場合、すなわち、それがＴＳＡ候補として一貫してフラグ付けされている場合、ＴＳＡ候補として特定／選択される。一実施形態では、それらはＭＳによって区別することが困難であるため、Ｉ／Ｌバリアントを有するＴＳＡ候補は、ＴＳＡ候補として除外される。
【００４４】
一実施形態では、比較の前に、溶出されたＭＡＰをフィルタリングして８〜１１個のアミノ酸長ペプチドについて選択する。別の実施形態では、比較の前に、溶出されたＭＡＰをフィルタリングして、ＮｅｔＭＨＣソフトウェアバージョン４．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ−４．０）（Ａｎｄｒｅａｔｔａ  Ｍ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１６）Ｆｅｂ  １５；３２（４）：５１１−７；Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，（２００３）１２：１００７−１７）によって予測される関連ＭＨＣ  Ｉ分子で少なくとも１つについてパーセンタイルランク＜２％を有するものを選択する。
【００４５】
一実施形態では、本方法はさらに、腫瘍抗原候補のコード配列を正常な組織由来の配列と比較することを含む。実施形態では、少なくとも５、１０、１５、２０、または２５個の異なる組織の配列が使用される。正常組織からの配列は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｔｌａｓ（Ｐｅｔｒｙｓｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４４，Ｉｓｓｕｅ  Ｄ１，４  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１６，Ｐａｇｅｓ  Ｄ７４６−Ｄ７５２）、ｓｃＲＮＡＳｅｑＤＢ（Ｃａｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｇｅｎｅｓ８（１２），３６８）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ａｔｌａｓ（Ｋｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２８，Ｉｓｓｕｅ  ８，１５  Ａｐｒｉｌ  ２０１２，Ｐａｇｅｓ  １１８４−１１８５）、およびＥｎｃｏｄｅなどの公開データベースから入手され得、または正常組織にＲＮＡ−ｓｅｑを実施することによって生成され得る。一実施形態では、本方法は、（１）そのコード配列が評価された正常組織のいずれにおいても発現されない場合、またはそれがＭＨＣクラスＩ陰性組織においてのみ発現される場合、あるいは（２）そのコード配列が評価されたＭＨＣクラスＩ陽性組織の５０％未満、好ましくは４５％、４０％、３５％、もしくは３０％未満で発現される場合、腫瘍抗原候補を選択することをさらに含む。一実施形態では、腫瘍抗原候補は、そのコード配列が評価される正常組織の７個未満、好ましくは６、５、４、または３個未満で発現される場合に選択される。
【００４６】
一実施形態では、本方法は、ＴＳＡ候補のコード配列のゲノム位置を決定することと、（１）コード配列が、一致しているゲノムの位置とマッチングし、（２）コード配列が超可変領域（ＴＣＲ遺伝子のＨ２、Ｉｇなど）または複数の遺伝子とマッチングせず、かつ（３）同義変異と重複しない場合に、ＴＳＡ候補を選択することと、をさらに含む。そのような決定は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（Ｋｅｎｔ  ＷＪ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００２  Ａｐｒ；１２（４）：６５６−６４）および／またはＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）ツール（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ｊａｎ；２９（１）：２４−６）からのＢＬＡＴツールを使用して実施され得る。
【００４７】
一実施形態では、本方法は、特定された腫瘍抗原候補（ＴＳＡ候補）のＭＨＣクラスＩ分子との結合を決定または予測することをさらに含む。結合は、対立遺伝子産物に対するペプチドの予測される結合親和性（ＩＣ５０）であり得、ＮｅｔＭＨＣなどのツールを使用して得られ得る。様々な利用可能なＭＨＣクラスＩペプチド結合ツールの概要は、Ｐｅｔｅｒｓ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ２００６，２（６）：ｅ６５、Ｔｒｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００７，３（１）：５、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８，９：８）で示される。特定されたＴＳＡ候補のＭＨＣクラスＩ分子との結合は、他の既知の方法、例えば、Ｔ２ペプチド結合アッセイを使用して決定され得る。Ｔ２細胞株は、ＴＡＰを欠損しているが、依然として細胞表面上に低い量のＭＨＣクラスＩを発現する。Ｔ２結合アッセイは、Ｔ２細胞株の表面でＭＨＣクラスＩ複合体を安定化するペプチドの能力に基づいている。Ｔ２細胞を特異的ペプチド（例えば、ＴＳＡ候補）と共にインキュベートし、汎ＨＬＡクラスＩ抗体を使用して安定化ＭＨＣクラスＩ複合体を検出し、分析を（例えば、フローサイトメトリーによって）実行し、結合を非結合陰性コントロールと関連して評価する。安定化ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体の表面での存在は、ペプチド（例えば、候補ＴＳＡ）がＭＨＣクラスＩ分子に結合することを示す。
【００４８】
目的のペプチド（例えば、ＴＳＡ候補）のＭＨＣとの結合はまた、放射性標識プローブペプチドのＭＨＣ分子との結合を阻害するその能力に基づいて評価され得る。ＭＨＣ分子を、界面活性剤で溶解し、親和性クロマトグラフィーによって精製する。次いで、それらを、プロテアーゼ阻害剤のカクテルの存在下で、目的のペプチド（例えば、ＴＳＡ候補）および過剰な放射性標識プローブペプチドと共に室温で２日間インキュベートする。インキュベーション期間の最後に、ＭＨＣ−ペプチド複合体をサイズ排除ゲル濾過クロマトグラフィーによって、非結合放射性標識ペプチドから分離し、結合放射能パーセントを決定する。ＭＨＣ分子における特定のペプチドの結合親和性は、様々な用量の非標識競合ペプチドを、ＭＨＣ分子および標識プローブペプチドと共インキュベートすることによって決定され得る。標識ペプチドの結合を５０％阻害するのに必要とされる非標識ペプチドの濃度（ＩＣ５０）は、用量対阻害％をプロットすることによって決定することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１８．３．１〜１８．３．１９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照する）。
【００４９】
特定されたＴＳＡ候補のＭＨＣクラスＩ分子との結合はまた、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＲＥＶＥＡＬ（登録商標）＆ＰｒｏＶＥ（登録商標）Ｔ細胞エピトープ発見システムまたはＮｅｔＭＨＣツールなどのＴ細胞エピトープ発見システム／ツールを使用して決定され得る（例えば、Ｄｅｓａｉ  ａｎｄ  Ｋｕｌｋａｒｎｉ−Ｋａｌｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４；１１８４：３３３−６４を参照する）。
【００５０】
一実施形態では、本方法は、対象からの細胞集団、例えば、細胞試料（例えば、ＰＢＭＣ）における腫瘍抗原候補を認識するＴ細胞の数または頻度を評価することをさらに含む。所与の抗原を認識するＴ細胞の数または頻度は、当該技術分野で既知の様々な方法を使用して、例えば、細胞集団を、そのペプチド結合溝に当該腫瘍抗原候補を含む多量体ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ＭＨＣ四量体）と接触させ、多量体ＭＨＣクラスＩ分子で標識される細胞の数を決定することによって評価され得る。多量体ＭＨＣクラスＩ分子は、フルオロフォアで検出可能に標識され得るか（直接標識）、または標識されたリガンド（間接的または二次標識）によって認識される部分でタグ化され得る。あるいは、ＴＳＡ候補を認識するＴ細胞の数または頻度は、Ｔ細胞活性化に好適な条件下でＴＳＡ候補の存在において活性化されるＴ細胞の数／頻度を決定することによって評価され得る。活性化Ｔ細胞の数／頻度は、Ｔ細胞活性化によって誘導されるサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２を分泌する細胞を検出することによって評価され得る（例えば、ＥＬＩＳｐｏｔまたはフローサイトメトリーによる）。
【００５１】
一実施形態では、本方法は、Ｔ細胞活性化を誘導する腫瘍抗原候補の能力を、例えば、Ｔ細胞集団を、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する腫瘍抗原候補を有する細胞（例えば、樹状細胞などのＡＰＣ）とそれらの細胞表面で接触させ、増殖、サイトカイン／ケモカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２産生）、細胞傷害性死滅などのＴ細胞活性化の少なくとも１つのパラメータを測定することによって、評価することをさらに含む。
【００５２】
一実施形態では、本方法は、腫瘍抗原候補のＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅に対する能力および／または腫瘍増殖を阻害する能力を評価することをさらに含む。これは、腫瘍細胞を使用してインビトロで、または好適な動物モデルを使用してインビボで達成され得る。
【００５３】
一実施形態では、腫瘍抗原候補は、約７〜２０個のアミノ酸、より具体的には約８〜１８個のアミノ酸の長さ、好ましくは８〜１１個のアミノ酸（ＭＨＣクラスＩ腫瘍抗原について）または１３〜１８個のアミノ酸（ＭＨＣクラスＩＩ腫瘍抗原について）の長さを有する。
【００５４】
本明細書に記載の方法は、目的の腫瘍／癌細胞試料について全トランスクリプトーム配列決定を実施することによって、任意のタイプの癌の腫瘍抗原候補を特定するために有用であり得る。そのような癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病、より具体的には、骨癌、血液／リンパ系癌、例えば、白血病（ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ）、骨髄腫、リンパ腫、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が含まれる。したがって、実施形態では、本明細書に記載される方法のステップ（ａ）で使用される腫瘍細胞試料は、上記の癌のいずれかの細胞を含む試料である。
【００５５】
別の態様では、本開示は、本明細書で特定される腫瘍抗原ペプチド（または腫瘍特異的ペプチド）に関するものであり、すなわち、表１ａ、１ｂ、２ａ〜２ｄ、もしくは３ａ〜３ｃ（配列番号１〜３９）、好ましくは表２ａ〜２ｄ、もしくは３ａ〜３ｃ（配列番号１７〜３９）に開示されるアミノ酸配列のうちの１つ、または配列番号１〜３９の配列に対して１つ以上の変異を有するそのバリアントを含む。
【００５６】
一般に、ＨＬＡクラスＩの関連で提示される腫瘍抗原ペプチドなどのペプチドは、約７または８〜約１５、または好ましくは８〜１４個のアミノ酸残基の長さで変化する。本開示の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に定義される腫瘍抗原ペプチド配列を含む、より長いペプチドは抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの細胞に人工的に加えられ、細胞によって処理されて、腫瘍抗原ペプチドがＡＰＣの表面でＭＨＣクラスＩ分子によって提示される。この方法では、１５個のアミノ酸残基より長いペプチド／ポリペプチド（すなわち、腫瘍抗原前駆体ペプチド）をＡＰＣに加えることができ、ＡＰＣサイトゾル中のプロテアーゼによって処理されて、提示のために本明細書に定義される対応する腫瘍抗原ペプチドをもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に定義される腫瘍抗原ペプチドを生成するために使用される前駆体ペプチド／ポリペプチドは、例えば、１０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、もしくは１５個、またはそれ以下のアミノ酸である。したがって、本明細書に記載される腫瘍抗原ペプチドを使用する全ての方法およびプロセスは、細胞（ＡＰＣ）による処理後の「最終的な」８〜１４腫瘍抗原ペプチドの提示を誘導するために、より長いペプチドまたはポリペプチド（ネイティブタンパク質を含む）、すなわち、腫瘍抗原前駆体ペプチド／ポリペプチドの使用を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で言及される腫瘍抗原ペプチドは、約８〜１４、８〜１３、または８〜１２個のアミノ酸長（例えば、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸長）であり、ＨＬＡクラスＩ分子における直接的なフィッティングには十分に小さい。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸、より好ましくは１４個以下のアミノ酸を含む。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、少なくとも７個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８アミノ酸、より好ましくは少なくとも９個のアミノ酸を含む。
【００５７】
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、天然起源のアミノ酸のＬ−異性体およびＤ−異性体の両方、ならびに腫瘍抗原ペプチドの合成類似体を調製するペプチド化学で使用される他のアミノ酸（例えば、天然起源アミノ酸、非天然起源アミノ酸、核酸配列によってコードされないアミノ酸など）が含まれる。天然起源のアミノ酸の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンなどである。他のアミノ酸には、例えば、アミノ酸の非遺伝子コード形態、ならびにＬ−アミノ酸の保存的置換が含まれる。天然起源の非遺伝子コード化アミノ酸には、例えば、ベータ−アラニン、３−アミノ−プロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、アルファ−アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）、４−アミノ−ブチル酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン（例えば、Ｌ−オルニチン）、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン、２−ナプチルアラニン（２−ｎａｐｔｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、Ｌ−ホモギニン（Ｈｏａｒｇ）、Ｎ−アセチルリジン、２−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２，４，−ジアミノ酪酸（Ｄ−またはＬ−）、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン（ＨｏＳｅｒ）、システイン酸、イプシロン−アミノヘキサン酸、デルタ−アミノ吉草酸、または２，３−ジアミノ酪酸（Ｄ−またはＬ−）などが含まれる。これらのアミノ酸は、生化学／ペプチド化学の分野で周知である。実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、天然起源のアミノ酸のみを含む。
【００５８】
実施形態では、本明細書に記載の腫瘍抗原ペプチドは、本明細書で言及される配列と比較して、機能的に同等なアミノ酸残基の置換を含有する変化した配列を有するバリアントペプチドを含む。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する、同様な極性（同様な物理化学特性を有する）の別のアミノ酸によって置き換えられ得、サイレント変化をもたらす。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジン（ならびにホモアルギニンおよびオルニチン）が含まれる。非極性（疎水性）アミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンが含まれる。非荷電極性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。負荷電（酸性）アミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。アミノ酸グリシンは、非極性アミノ酸ファミリーまたは非荷電（中性）極性アミノ酸ファミリーのいずれかに含まれ得る。アミノ酸のファミリー内で行われる置換は、一般に、保存的置換であると理解される。本明細書で言及される腫瘍抗原ペプチドは、全てのＬ−アミノ酸、全てのＤ−アミノ酸、またはＬ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の混合物を含み得る。実施形態では、本明細書で言及される腫瘍抗原ペプチドは、全てのＬ−アミノ酸を含む。
【００５９】
一実施形態では、配列番号１〜３９に示される配列のうちの１つを含む腫瘍抗原ペプチドの配列において、Ｔ細胞受容体との相互作用に実質的に寄与しないアミノ酸残基は、組み込みがＴ細胞反応性に実質的に影響を与えず、関連するＭＨＣ分子への結合を排除しない他のアミノ酸と置換することによって改変され得る。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドバリアントは、ＭＨＣ結合を改善するように配列最適化され、すなわち、ＭＨＣ分子との結合を増強する１つ以上の変異（例えば、１、２、または３個の変異）、例えば、アミノ酸の置換を含む。腫瘍抗原ペプチドバリアントの結合親和性は、例えば、ＮｅｔＭＨＣ４．０、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ４．０、およびＭＨＣｆｌｕｒｒｙ１．２．０などのＭＨＣ結合予測ツールを使用して評価され得る。配列最適化された腫瘍抗原ペプチドバリアントは、例えば、特定のＨＬＡに対する予測結合親和性が、ネイティブ腫瘍抗原ペプチドと同等であるか、または好ましくは強い場合に考慮され得る。次いで、選択された配列最適化標的ペプチドは、当該技術分野で既知である方法を使用して、例えば、ＰｒｏｌｍｍｕｎｅのＲＥＶＥＡＬアッセイを使用して、特定のＨＬＡへのインビトロでの結合についてスクリーニングすることができる。
【００６０】
腫瘍抗原ペプチドはまた、Ｎ末端および／またはＣ末端をキャップ化もしくは修飾して、分解を防止し、安定性、親和性、および／もしくは取り込みを増加させ得、したがって、本開示は、式Ｚ１−Ｘ−Ｚ２を有する腫瘍抗原ペプチドのバリアントを提供し、式中、Ｘは、配列番号１〜３９、好ましくは１７〜３９に示される腫瘍抗原ペプチドの配列である。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドのアミノ末端残基（すなわち、Ｎ末端の遊離アミノ基）は、例えば部分／化学基（Ｚ１）の共有結合によって修飾される（例えば、分解に対する保護のため）。Ｚ１は、１〜８個の炭素の直鎖もしくは分岐アルキル基、またはアシル基（Ｒ−ＣＯ−）であり得、式中、Ｒは疎水性部分（例えば、アセチル、プロピオニル、ブタニル、イソプロピオニル、もしくはイソ−ブタニル）、またはアロイル基（Ａｒ−ＣＯ−）であり得、式中、Ａｒはアリール基である。一実施形態では、アシル基は、Ｃ１−Ｃ１６またはＣ３−Ｃ１６アシル基（直鎖または分枝、飽和または不飽和）であり、さらなる実施形態では、飽和Ｃ１−Ｃ６アシル基（直鎖または分枝）または不飽和Ｃ３−Ｃ６アシル基（直鎖または分枝）、例えば、アセチル基（ＣＨ３−ＣＯ−、Ａｃ）である。一実施形態では、Ｚ１は存在しない。腫瘍抗原ペプチドのカルボキシ末端残基（すなわち、腫瘍抗原ペプチドのＣ末端にある遊離カルボキシ基）は、例えば、部分／化学基（Ｚ２）の共有結合によって、例えば、アミド化（ＮＨ２基によるＯＨ基の置換）によって修飾され得、そのような例では、Ｚ２はＮＨ２基である。一実施形態では、Ｚ２は、ヒドロキサメート基、ニトリル基、アミド（一級、二級、または三級）基、メチルアミン、イソ−ブチルアミン、イソ−バレリルアミン、またはシクロヘキシルアミンなどの１〜１０個の炭素の脂肪族アミン、アニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シナミルアミン、またはフェニルエチルアミンなどの芳香族もしくはアリールアルキルアミン、アルコール、あるいはＣＨ２ＯＨであり得る。一実施形態では、Ｚ２は存在しない。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、配列番号１〜３９、好ましくは１７〜３９に開示の配列のうちの１つを含む。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、配列番号１〜３９、好ましくは１７〜３９に開示される配列のうちの１つからなり、すなわち、Ｚ１およびＺ２は存在しない。
【００６１】
一実施形態では、本開示は、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子、好ましくはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１対立遺伝子のＨＬＡ分子に結合する腫瘍抗原ペプチドを提供し、配列番号１７〜１９、２７、および２８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる。
【００６２】
一実施形態では、本開示は、ＨＬＡ−Ｂ４０対立遺伝子、好ましくはＨＬＡ−Ｂ＊４０：０１対立遺伝子のＨＬＡ分子に結合する腫瘍抗原ペプチドを提供し、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００６３】
一実施形態では、本開示は、ＨＬＡ−Ａ１１対立遺伝子好ましくはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１対立遺伝子のＨＬＡ分子に結合する腫瘍抗原ペプチドを提供し、配列番号２１〜２３および２９〜３５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる。
【００６４】
一実施形態では、本開示は、ＨＬＡ−Ｂ０８対立遺伝子、好ましくはＨＬＡ−Ｂ＊０８：０１対立遺伝子のＨＬＡ分子に結合する腫瘍抗原ペプチドを提供し、配列番号２４または２５に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００６５】
一実施形態では、本開示は、ＨＬＡ−Ｂ０７対立遺伝子、好ましくはＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２対立遺伝子のＨＬＡ分子に結合する腫瘍抗原ペプチドを提供し、配列番号２６または３６に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００６６】
一実施形態では、本開示は、ＨＬＡ−Ａ２４対立遺伝子、好ましくはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２対立遺伝子のＨＬＡ分子に結合する腫瘍抗原ペプチドを提供し、配列番号３８または３９に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００６７】
一実施形態では、本開示は、ＨＬＡ−Ｃ０７対立遺伝子、好ましくはＨＬＡ−Ｃ＊０７：０１対立遺伝子のＨＬＡ分子に結合する腫瘍抗原ペプチドを提供し、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００６８】
一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、白血病腫瘍抗原ペプチドであり、配列番号１７〜２８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる。
【００６９】
一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、肺腫瘍抗原ペプチドであり、配列番号２９〜３９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる。
【００７０】
一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、ゲノムの非コード領域に位置する配列によってコードされる。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、非翻訳転写領域（ＵＴＲ）、すなわち３’−ＵＴＲまたは５’−ＵＴＲ領域に位置する配列によってコードされる。別の実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、イントロンに位置する配列によってコードされる。別の実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、遺伝子間領域に位置する配列によってコードされる。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、内在性レトロエレメント（ＥＲＥ）に位置する配列によってコードされる。別の実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、エキソンに位置する配列によってコードされ、フレームシフトから生じる。
【００７１】
本開示の腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞における発現（組換え発現）によって、または化学合成（例えば、固相ペプチド合成）によって産生され得る。ペプチドは、当該技術分野で周知であるマニュアルおよび／または自動化固相手順によって容易に合成することができる。好適な合成は、例えば、「Ｔ−ｂｏｃ」または「Ｆｍｏｃ」手順を利用することによって実施され得る。固相合成のための技法および手順は、例えば、ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって発行されたＳｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｂｙ  Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄに記載されている。あるいは、腫瘍抗原ペプチドはセグメント縮合の方法によって調製され得、例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：９３３−９３６，１９９６、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１８８１−１８８７，１９９５、Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４５：２０９−２１６，１９９５、Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  ａｎｄ  Ｋｅｎｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：２２１−２２５，１９９２、Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４１４９−４１５３，１９９４、Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：６５８４−６５８８，１９９４、およびＹａｍａｓｈｉｒｏ  ａｎｄ  Ｌｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３１３２２−３３４，１９８８）に記載されている。腫瘍抗原ペプチドを合成するのに有用である他の方法は、Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７−７０９２，１９８５に記載されている。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、化学的に合成される（合成ペプチド）。本開示の別の実施形態は、非天然起源ペプチドに関するものであり、当該ペプチドは、本明細書に定義されるアミノ酸配列からなるか、または本質的になり、薬学的に許容される塩として合成的に産生されている（例えば、合成されている）。本開示による腫瘍抗原ペプチドの塩は、インビボで生成されるペプチドは塩ではないため、インビボでのそれらの状態（複数可）のペプチドとは実質的に異なる。ペプチドの非天然塩形態は、特に、ペプチドを含む医薬組成物、例えば、本明細書に開示されるペプチドワクチンの関連において、ペプチドの溶解性を調節し得る。好ましくは、塩は、ペプチドの薬学的に許容される塩である。
【００７２】
一実施形態では、本明細書で言及される腫瘍抗原ペプチドは、実質的に純粋である。化合物は、それが自然に付随する成分から分離されるとき、「実質的に純粋」である。典型的には、化合物は、それが試料中の全物質の、重量で、少なくとも６０％、より一般的には７５％、８０％、または８５％、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超である場合、実質的に純粋である。したがって、例えば、化学的に合成または組換え技術によって産生されるポリペプチドは、一般に、その天然に関連する成分、例えば、その供給源巨大分子の成分を実質的に含まないであろう。核酸分子は、核酸が由来する生物の天然起源のゲノムにおいて通常連続しているコード配列と、直接連続（すなわち、共有結合）していない場合、実質的に純粋である。実質的に純粋な化合物は、例えば、天然源から抽出によって、ペプチド化合物をコードする組換え核酸分子の発現によって、または化学合成によって、得ることができる。純度は、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣなどの任意の適切な方法を使用して測定することができる。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、溶液中にある。別の実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは固体形態にあり、例えば、凍結乾燥されている。
【００７３】
別の態様では、本開示は、本明細書で言及される腫瘍抗原ペプチドまたは腫瘍抗原前駆体−ペプチドをコードする、核酸（単離された）をさらに提供する。一実施形態では、核酸は、約２１個〜約４５個のヌクレオチド、約２４〜約４５個のヌクレオチド、例えば、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、または４５個のヌクレオチドを含む。本明細書で使用されるとき、「単離された」とは、分子の天然環境中に存在する他の成分または天然起源の巨大分子（例えば、他の核酸、タンパク質、脂質、糖などを含む）から分離されたペプチドまたは核酸分子を指す。本明細書で使用されるとき、「合成の」とは、その天然源から単離されない、例えば、組換え技術を通してまたは化学合成を使用して産生されるペプチドまたは核酸分子を指す。本開示の核酸は、本開示の腫瘍抗原ペプチドの組換え発現のために使用され得、宿主細胞にトランスフェクトされ得る、クローニングベクターまたは発現ベクターなどのベクターまたはプラスミドに含まれ得る。一実施形態では、本開示は、本開示の腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸配列を含むクローニングもしくは発現ベクターまたはプラスミドを提供する。あるいは、本開示の腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。いずれの場合でも、宿主細胞は、核酸によってコードされる腫瘍抗原ペプチドまたはタンパク質を発現する。本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指す。宿主細胞は、本明細書に記載の腫瘍抗原ペプチドを発現することができる任意の原核生物細胞（例えば、大腸菌）または真核生物細胞（例えば、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物細胞）であることができる。ベクターまたはプラスミドは、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有し、抵抗遺伝子、クローニング部位などの他の成分を含有し得る。当業者に周知の方法を使用して、ペプチドまたはポリペプチドをコードする配列、ならびにそれに操作可能に連結された適切な転写および翻訳の制御／調節要素を含有する発現ベクターを構築し得る。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。そのような技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。「操作可能に連結された」とは、成分、特にヌクレオチド配列が近接配置されており、それによって成分の正常な機能を実施することができることを指す。したがって、調節配列に操作可能に連結されるコード配列は、コード配列が調節配列の調節制御、すなわち、転写および／または翻訳の制御下で発現することができるヌクレオチド配列の構成を指す。本明細書で使用されるとき、「調節／制御領域」または「調節／制御配列」は、コード核酸の発現���調節に含まれる非コード化ヌクレオチド配列を指す。したがって、調節領域という用語は、プロモーター配列、調節タンパク質結合部位、上流活性化因子配列などを含む。実施形態では、本開示の腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、リポソームなどの小胞内に含まれるか、またはカプセル化される。
【００７４】
別の態様では、本開示は、腫瘍抗原ペプチドを含む（すなわち、提示するか、または結合する）ＭＨＣクラスＩ分子を提供する。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２分子であり、さらなる実施形態では、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ１１分子であり、さらなる実施形態では、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１分子である。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２４分子であり、さらなる実施形態では、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子である。別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ｂ０７分子であり、さらなる実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２分子である。別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ｂ０８分子であり、さらなる実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ＊０８：０１分子である。別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ｂ４０分子であり、さらなる実施形態ではは、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０１である。別の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ｃ０７分子であり、さらなる実施形態では、ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０１分子である。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子に非共有結合される（すなわち、腫瘍抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝／ポケットに負荷されるか、または非共有結合される）。別の実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子（アルファ鎖）に共有結合によって付着／結合される。そのような構築物において、腫瘍抗原ペプチドおよびＭＨＣクラスＩ分子（アルファ鎖）は、典型的には、短い（例えば、５〜２０個の残基、好ましくは、約８〜１２個、例えば、１０個）フレキシブルリンカーまたはスペーサー（例えば、ポリグリシンリンカー）を有する合成融合タンパク質として産生される。別の態様では、本開示は、ＭＨＣクラスＩ分子（アルファ鎖）に融合された本明細書に定義される腫瘍抗原ペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。一実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子（アルファ鎖）−ペプチド複合体は、多量体化される。したがって、別の態様では、本開示は、本明細書で言及される腫瘍抗原ペプチドが負荷された（共有結合的にまたは非共有的に）ＭＨＣクラスＩ分子の多量体を提供する。そのような多量体は、多量体の検出を可能にするタグ、例えば、蛍光タグに付着され得る。多くの戦略がＭＨＣ二量体、四量体、五量体、八量体などを含むＭＨＣ多量体の産生のために開発されている（Ｂａｋｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００５，１７：４２８−４３３でレビューされている）。ＭＨＣ多量体は、例えば、抗原特異的Ｔ細胞の検出および精製のために有用である。したがって、別の態様では、本開示は、本明細書に定義される腫瘍抗原ペプチドに特異的であるＣＤ８＋Ｔリンパ球を検出または精製する（単離、豊富化する）ための方法を提供し、本方法は、細胞集団を腫瘍抗原ペプチドが負荷されたＭＨＣクラスＩ分子の多量体と接触させることと、ＭＨＣクラスＩ多量体によって結合されたＣＤ８＋Ｔリンパ球を検出または単離することと、を含む。ＭＨＣクラスＩ多量体によって結合されるＣＤ８＋Ｔリンパ球は、既知の方法、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用して単離され得る。
【００７５】
さらに別の態様では、本開示は、本明細書で言及される本開示の腫瘍抗原ペプチド、核酸、ベクター、またはプラスミド、すなわち、１つ以上の腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸またはベクターを含む、細胞（例えば、宿主細胞）、一実施形態では、単離された細胞を提供する。別の態様では、本開示は、本開示による腫瘍抗原ペプチドと結合されるか、またはそれを提示する、ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、上記で開示される対立遺伝子の１つのＭＨＣクラスＩ分子）を表面で発現する細胞を提供する。一実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、細胞株、または不死化細胞などの真核生物細胞である。別の実施形態では、細胞は、樹状細胞（ＤＣ）または単球／マクロページなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。一実施形態では、宿主細胞は、一次細胞、細胞株、または不死化細胞である。核酸およびベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技法を介して細胞に導入することができる。「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、外来核酸を宿主細胞に導入するための技法を指し、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介トランスフェクションを含む。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための好適な方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）、および他の実験室マニュアルに認めることができる。核酸をインビボで哺乳動物細胞に導入するための方法も既知であり、遺伝子治療のために本開示のベクターまたはプラスミドを対象に送達するために使用され得る。
【００７６】
ＡＰＣなどの細胞は、当該技術分野で既知である様々な方法を使用して、１つ以上の腫瘍抗原ペプチドで負荷することができる。本明細書で使用される場合、腫瘍抗原ペプチドで「細胞を負荷する」とは、腫瘍抗原ペプチドをコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡ）もしくはＤＮＡ、または腫瘍抗原ペプチドが細胞にトランスフェクトされること、または代替的に、ＡＰＣが腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸で形質転換されることを意味する。細胞はまた、細胞表面（例えば、ペプチドパルス化細胞）に存在するＭＨＣクラスＩ分子に直接結合することができる外因性腫瘍抗原ペプチドと細胞を接触させることによって負荷することができる。腫瘍抗原ペプチドはまた、ＭＨＣクラスＩ分子によるその提示を容易にするドメインまたはモチーフ、例えば、小胞体（ＥＲ）回収シグナル、Ｃ末端Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ配列、に融合され得る（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４  Ｄｅｃ；３４（１２）：３５８２−９４を参照する）。
【００７７】
別の態様では、本開示は、本明細書で定義される腫瘍抗原ペプチド（または、当該ペプチド（複数可）をコードする核酸）のうちのいずれか１つ、もしくは任意の組み合わせを含む、組成物またはペプチドの組み合わせ／プールを提供する。一実施形態では、組成物は、本明細書で定義される腫瘍抗原ペプチドの任意の組み合わせ（２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の腫瘍抗原ペプチドの任意の組み合わせ）、または当該腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸の任意の組み合わせを含む。本明細書に定義される腫瘍抗原ペプチドの任意の組み合わせ／サブ組み合わせを含む組成物は、本開示によって包含される。一実施形態では、組成物またはペプチドの組み合わせ／プールは、配列番号１７〜２８に示される配列を含むか、またはそれらからなる腫瘍抗原ペプチドの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個を含む。一実施形態では、組成物またはペプチドの組み合わせ／プールは、配列番号２９〜３９に示される配列を含むか、またはそれらからなる腫瘍抗原ペプチドの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個を含む。別の実施形態では、組み合わせまたはプールは、１つ以上の既知の腫瘍抗原を含み得る。
【００７８】
したがって、別の態様では、本開示は、本明細書に定義される腫瘍抗原ペプチドのうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせと、ＭＨＣクラスＩ分子（例えば、上記に開示される対立遺伝子のうちの１つのＭＨＣクラスＩ分子）を発現する細胞と、を含む組成物を提供する。本開示で使用するためのＡＰＣは、特定のタイプの細胞に限定されず、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ／単球、およびＢ細胞などのプロフェッショナルＡＰＣを含み、これらは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球によって認識されるように、それらの細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている。例えば、ＡＰＣは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボのいずれかで、末梢血単球からＤＣを誘導し、次いで腫瘍抗原ペプチドと接触させる（刺激する）ことによって得ることができる。ＡＰＣはまた、腫瘍抗原ペプチドをインビボで提示するように活性化され得、本開示の腫瘍抗原ペプチドのうちの１つ以上が対象に投与され、腫瘍抗原ペプチドを提示するＡＰＣが対象の体内で誘導される。「ＡＰＣを誘導する」または「ＡＰＣを刺激する」という語句は、細胞を１つ以上の腫瘍抗原ペプチド、または腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸と接触させるか、またはそれらを負荷することを含み、それによって腫瘍抗原ペプチドはＭＨＣクラスＩ分子によってその表面に提示される。本明細書に記載されるように、本開示に従い、腫瘍抗原ペプチドは、間接的に、例えば、腫瘍抗原ペプチド（ネイティブタンパク質を含む）の配列を含む、より長いペプチド／ポリペプチドを使用して負荷され得、次いで、ＡＰＣ内で処理され（例えば、プロテアーゼによって）、腫瘍抗原ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体を細胞の表面で生成する。ＡＰＣに腫瘍抗原ペプチドを負荷して、ＡＰＣが腫瘍抗原ペプチドを提示することを可能にした後、ＡＰＣをワクチンとして対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は、（ａ）ＡＰＣを第１の対象から収集するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のＡＰＣを腫瘍抗原ペプチドと接触／負荷してＭＨＣクラスＩ／腫瘍抗原ペプチド複合体をＡＰＣの表面に形成するステップと、（ｃ）ペプチド負荷したＡＰＣを、治療を必要とする第２の対象に投与するステップと、を含むことができる。
【００７９】
第１の対象および第２の対象は、同じ対象（例えば、自己ワクチン）であり得、または異なる対象（例えば、同種ワクチン）であり得る。あるいは、本開示に従い、抗原提示細胞を誘導するための組成物（例えば、医薬組成物）を製造するための本明細書に記載の腫瘍抗原ペプチド（またはそれらの組み合わせ）の使用が提供される。加えて、本開示は、抗原提示細胞を誘導するための医薬組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、本方法またはプロセスは、腫瘍抗原ペプチド、またはそれらの組み合わせを薬学的に許容される担体と混合または製剤化するステップを含む。本明細書に定義される腫瘍抗原ペプチドのうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせで負荷されたＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ｂ０７、ＨＬＡ−Ｂ０８、ＨＬＡ−Ｂ４０、またはＨＬＡ−Ｃ０７分子）を発現するＡＰＣなどの細胞は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、例えば、自己ＣＤ８＋Ｔリンパ球を刺激／増殖するために使用され得る。したがって、別の態様では、本開示は、本明細書で定義される腫瘍抗原ペプチド（またはそれをコードする核酸もしくはベクター）、ＭＨＣクラスＩ分子を発現する細胞、およびＴリンパ球、より具体的にはＣＤ８＋Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を含む細胞集団）、のうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせを含む組成物を提供する。
【００８０】
一実施形態では、本組成物は、緩衝液、賦形剤、担体、希釈剤、および／または培地（例えば、培養培地）をさらに含む。さらなる実施形態では、緩衝液、賦形剤、担体、希釈剤、および／または培地は、薬学的に許容される緩衝液（複数可）、賦形剤（複数可）、担体（複数可）、希釈剤（複数可）および／または培地（複数可）である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される緩衝液、賦形剤、担体、希釈剤、および／または培地」は、生理学的に適合性であり、有効成分（複数可）の生物活性の有効性を妨げず、かつ対象に毒性でない、任意および全ての溶媒、緩衝液、結合剤、潤滑剤、充填剤、増粘剤、崩壊剤、可塑剤、コーティング、バリア層製剤、潤滑剤、安定化剤、放出遅延剤、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような培地および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である（Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２００３，４ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  ＵＫ）。任意の従来の培地または薬剤が活性化合物（ペプチド、細胞）と不適合でない限り、本開示の組成物におけるそれらの使用が企図される。一実施形態では、緩衝液、賦形剤、担体、および／または培地は、非天然起源の緩衝液、賦形剤、担体、および／または培地である。一実施形態では、本明細書に定義される腫瘍抗原ペプチドのうちの１つ以上、または当該１つ以上の腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、リポソーム、例えば、カチオン性リポソーム内に含まれるか、またはリポソームと複合体化される（例えば、Ｖｉｔｏｒ  ＭＴ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｆｏｒｍｕｌ．２０１３  Ａｕｇ；７（２）：９９−１１０を参照する）。
【００８１】
別の態様では、本開示は、本明細書で定義される腫瘍抗原ペプチド（または当該ペプチド（複数可）をコードする核酸）のいずれか１つ、またはいずれかの組み合わせのうちの１つ以上と、緩衝液、賦形剤、担体、希釈剤、および／または培地と、を含む組成物を提供する。細胞（例えば、ＡＰＣ、Ｔリンパ球）を含む組成物について、組成物は、生細胞の維持を可能にする好適な培地を含む。そのような培地の代表的な例には、生理食塩水、Ｅａｒｌ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））またはＰｌａｓｍａＬｙｔｅ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（登録商標））が含まれる。一実施形態では、組成物（例えば、医薬組成物）は、「免疫原性組成物」、「ワクチン組成物」、または「ワクチン」である。本明細書で使用される「免疫原性組成物」、「ワクチン組成物」、または「ワクチン」という用語は、１つ以上の腫瘍抗原ペプチドまたはワクチンベクターを含む組成物または製剤を指し、対象に投与されるときに、そこに存在する１つ以上の腫瘍抗原ペプチドに対する免疫応答を誘導することができる。哺乳動物における免疫応答を誘導するためのワクチン接種方法は、ワクチン分野で既知の任意の従来の経路によって、例えば、粘膜（例えば、眼、鼻腔内、肺、経口、胃、腸、直腸、膣、または尿路）表面を介して、非経口（例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または腹腔内）経路を介して、または局所投与（例えば、パッチなどの経皮送達系を介して）によって投与されるワクチンまたはワクチンベクターの使用を含む。一実施形態では、腫瘍抗原ペプチド（またはその組み合わせ）を担体タンパク質にコンジュゲートして（コンジュゲートワクチン）、腫瘍抗原ペプチド（複数可）の免疫原性を増加させる。したがって、本開示は、腫瘍抗原ペプチド（またはその組み合わせ）と、担体タンパク質と、を含む組成物（コンジュゲート）を提供する。例えば、腫瘍抗原ペプチド（複数可）は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド（例えば、Ｚｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，１１４：１７７−２０１を参照する）、またはポリマー／デンドリマー（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１３  Ａｕｇ  １２；１４（８）：２７９８−８０６を参照する）にコンジュゲートされ得る。一実施形態では、免疫原性組成物またはワクチンは、アジュバントをさらに含む。「アジュバント」とは、抗原（本開示による腫瘍抗原ペプチドおよび／または細胞）などの免疫原性薬剤に添加されるとき、混合物への曝露で宿主における薬剤に対する免疫応答を非特異的に高めるかまたは増強する物質を指す。ワクチンの分野において現在使用されているアジュバントの例には、（１）ミネラル塩（リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩、リン酸カルシウムゲル）、スクアレン、（２）油性エマルションおよび界面活性剤系製剤などの油系アジュバント、例えば、ＭＦ５９（マイクロ流動性界面活性剤安定化水中油エマルション）、ＱＳ２１（精製サポニン）、ＡＳ０２［ＳＢＡＳ２］（水中油エマルション＋ＭＰＬ＋ＱＳ−２１）、（３）微��子アジュバント、例えば、ビロソーム（インフルエンザのヘマグルチニンを組み込んだ単層リポソームビヒクル）、ＡＳ０４（［ＳＢＡＳ４］、ＭＰＬを有するアルミニウム塩）、ＩＳＣＯＭＳ（サポニンおよび脂質の構造複合体）、ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）、（４）微生物誘導体（天然および合成）、例えば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、Ｄｅｔｏｘ（ＭＰＬ＋Ｍ．Ｐｈｌｅｉ細胞壁骨格）、ＡＧＰ［ＲＣ−５２９］（合成アシル化単糖）、ＤＣ＿Ｃｈｏｌ（リポソームに自己組織化することができるリポイド免疫刺激物質）、ＯＭ−１７４（脂質Ａ誘導体）、ＣｐＧモチーフ（免疫刺激ＣｐＧモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチド）、改変ＬＴおよびＣＴ（非毒性アジュバント効果をもたらすように遺伝子改変された細菌毒素）、（５）内因性ヒト免疫調節物質、例えば、ｈＧＭ−ＣＳＦまたはｈＩＬ−１２（タンパク質またはコードされたプラスミドのいずれかとしてコードされるサイトカイン）、イムダプチン（Ｃ３ｄタンデムアレイ）、および／または（６）不活性ビヒクル、例えば金粒子などが含まれる。
【００８２】
一実施形態では、腫瘍抗原ペプチド（複数可）またはそれを含む組成物は、凍結乾燥形態にある。別の実施形態では、腫瘍抗原ペプチド（複数可）またはそれを含む組成物は、液体組成物中にある。さらなる実施形態では、腫瘍抗原ペプチド（複数可）は、組成物中に約０．０１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの濃度である。さらなる実施形態では、腫瘍抗原ペプチド（複数可）は、組成物中に、約０．２μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ〜約１０、２０、３０、４０、または５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、または約２μｇ／ｍＬの濃度である。
【００８３】
本明細書に記載されるように、本明細書に定義される腫瘍抗原ペプチドのうちのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせで負荷されるかまたはそれらと結合されたＭＨＣクラスＩ分子を発現するＡＰＣなどの細胞は、インビボまたはエクスビボでＣＤ８＋Ｔリンパ球を刺激／増殖するために使用され得る。したがって、別の態様では、本開示は、本明細書で言及されるＭＨＣクラスＩ分子／腫瘍抗原ペプチド複合体と相互作用または結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子、およびそのようなＴＣＲ分子をコードする核酸分子、ならびにそのような核酸分子を含むベクターを提供する。本開示によるＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩ分子に負荷されるか、またはＭＨＣクラスＩ分子によって提示される腫瘍抗原ペプチドと、好ましくはインビトロまたはインビボで生細胞の表面において、特異的に相互作用または結合することができる。本開示のＴＣＲ、特にＴＣＲをコードする核酸は、例えば、ＭＨＣクラスＩ／腫瘍抗原ペプチド複合体を特異的に認識する新しいＴリンパ球クローンを生成するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔリンパ球）または他のタイプのリンパ球を遺伝子的に形質転換／改変するために適用され得る。特定の実施形態では、患者から得られるＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔリンパ球）を形質転換して、腫瘍抗原ペプチドを認識する１つ以上のＴＣＲを発現させ、形質転換細胞を患者に投与する（自己細胞注入）。特定の実施形態では、ドナーから得られるＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔリンパ球）を形質転換して、腫瘍抗原ペプチドを認識する１つ以上のＴＣＲを発現させ、形質転換細胞をレシピエントに投与する（同種細胞注入）。別の実施形態では、本開示は、Ｔリンパ球、例えば、腫瘍抗原ペプチド特異的ＴＣＲをコードするベクターまたはプラスミドによって形質転換／トランスフェクトされたＣＤ８＋Ｔリンパ球を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、腫瘍抗原ペプチド特異的ＴＣＲで形質転換された自己または同種細胞によって患者を治療する方法を提供する。なおさらなる実施形態では、癌の治療のための自己細胞または同種細胞の製造における腫瘍抗原特異的ＴＣＲの使用が提供される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物（例えば、医薬組成物）で治療される患者は、同種幹細胞移植（ＡＳＣＬ）、同種リンパ球注入、または自己リンパ球注入による治療の前または後に治療される。本開示の組成物には、腫瘍抗原ペプチドに対してエクスビボで活性化された同種Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔリンパ球）、腫瘍抗原ペプチドを負荷された同種または自己ＡＰＣワクチン、腫瘍抗原ペプチドワクチン、ならびに腫瘍抗原特異的ＴＣＲで形質転換された同種もしくは自己Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔリンパ球）またはリンパ球が含まれる。本開示による腫瘍抗原ペプチドを認識することができるＴリンパ球クローンを提供する方法は、対象（例えば、移植片レシピエント）、例えばＡＳＣＴおよび／またはドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）レシピエントにおいて、腫瘍抗原ペプチドを発現する腫瘍細胞のために生成され得、特異的に標的化することができる。したがって、本開示は、腫瘍抗原ペプチド／ＭＨＣクラスＩ分子複合体を特異的に認識または結合することができるＴ細胞受容体をコードおよび発現するＣＤ８＋Ｔリンパ球を提供する。当該Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔリンパ球）は、組換え（操作された）または天然で選択されたＴリンパ球であり得る。したがって、本明細書は、本開示のＣＤ８＋Ｔリンパ球を産生するための少なくとも２つの方法を提供し、未分化リンパ球を、腫瘍抗原ペプチド／ＭＨＣクラスＩ分子複合体と（典型的には、ＡＰＣなどの細胞の表面で発現される）、Ｔ細胞の活性化および増殖を誘発することに資する条件下で接触させるステップを含み、インビトロまたはインビボ（すなわち、ＡＰＣが腫瘍抗原ペプチドで負荷されるＡＰＣワクチンが投与される患者において、または腫瘍抗原ペプチドワクチンで治療される患者において）で行われ得る。ＭＨＣクラスＩ分子に結合した腫瘍抗原ペプチドの組み合わせまたはプールを使用して、複数の腫瘍抗原ペプチドを認識することができる集団ＣＤ８＋Ｔリンパ球を生成することが可能である。あるいは、腫瘍抗原特異的または標的化Ｔリンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子／腫瘍抗原ペプチド複合体（すなわち、操作または組換えＣＤ８＋Ｔリンパ球）に特異的に結合するＴＣＲ（より具体的には、アルファおよびベータ鎖）をコードする１つ以上の核酸（遺伝子）をクローニングすることによって、インビトロまたはエクスビボで産生／生成され得る。本開示の腫瘍抗原ペプチド特異的ＴＣＲをコードする核酸は、当該技術分野で既知の方法を使用して、エクスビボで腫瘍抗原ペプチドに対して活性化されたＴリンパ球（例えば、腫瘍抗原ペプチドが負荷されたＡＰＣを有する）から、またはペプチド／ＭＨＣ分子複合体に対する免疫応答を示す個体から、得られ得る。本開示の腫瘍抗原ペプチド特異的ＴＣＲは、移植片レシピエントまたは移植片ドナーから得られる宿主細胞および／または宿主リンパ球において組換えによって発現され得、任意選択的にインビトロで分化されて、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をもたらし得る。ＴＣＲアルファおよびベータ鎖をコードする核酸（複数可）（導入遺伝子（複数可））は、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション）または形質導入（例えば、ウイルスベクターを使用）などの任意の好適な方法を使用して（例えば、治療される対象または別の個体から）Ｔ細胞に導入され得る。腫瘍抗原ペプチドに特異的であるＴＣＲを発現する操作されたＣＤ８＋Ｔリンパ球は、周知の培養方法を使用してインビトロで増殖され得る。
【００８５】
本開示は、腫瘍抗原ペプチド（すなわち、細胞表面で発現するＭＨＣクラスＩ分子に結合した腫瘍抗原ペプチド）、または腫瘍抗原ペプチドの組み合わせによって特異的に誘導、活性化、および／または増幅（増殖）される単離されたＣＤ８＋Ｔリンパ球を提供する。本開示はまた、本開示による腫瘍抗原ペプチド、またはそれらの組み合わせ（すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子に結合した１つ以上の腫瘍抗原ペプチド）を認識することができるＣＤ８＋Ｔリンパ球と、当該腫瘍抗原ペプチド（複数可）と、を含む組成物を提供する。別の態様では、本開示は、本明細書に記載の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子／腫瘍抗原ペプチド複合体（複数可）を特異的に認識する、ＣＤ８＋Ｔリンパ球で豊富化された細胞集団または細胞培養物（例えば、ＣＤ８＋Ｔリンパ球集団）を提供する。そのような豊富化集団は、本明細書に開示される腫瘍抗原ペプチドのうちの１つ以上が負荷された（例えば、提示する）ＭＨＣクラスＩ分子を発現するＡＰＣなどの細胞を使用して、特定のＴリンパ球のエクスビボ増殖を実施することによって得られ得る。本明細書で使用される「豊富化」とは、集団中の腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の割合が、細胞のネイティブ集団、すなわち、特定のＴリンパ球のエクスビボ増殖のステップに供されていない集団と比較して有意に高いことを意味する。さらなる実施形態では、細胞集団における腫瘍抗原ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の割合は、少なくとも約０．５％、例えば、少なくとも約１％、１．５％、２％、または３％である。いくつかの実施形態では、細胞集団における腫瘍抗原ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の割合は、約０．５〜約１０％、約０．５〜約８％、約０．５〜約５％、約０．５〜約４％、約０．５〜約３％、約１％〜約５％、約１％〜約４％、約１％〜約３％、約２％〜約５％、約２％〜約４％、約２％〜約３％、約３％〜約５％、または約３％〜約４％である。目的の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子／ペプチド（腫瘍抗原ペプチド）複合体（複数可）を特異的に認識するＣＤ８＋Ｔリンパ球で豊富化されそのような細胞集団または培養物（例えば、ＣＤ８＋Ｔリンパ球集団）は、以下に詳細に記載されるように、腫瘍抗原に基づく癌免疫療法において使用され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の集団はさらに豊富化され、例えば、本明細書に定義される腫瘍抗原ペプチド（複数可）で負荷された（共有結合的または非共有的に）ＭＨＣクラスＩ分子の多量体などの親和性に基づいた系を使用する。したがって、本開示は、腫瘍抗原ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の精製または単離された集団を提供し、例えば、腫瘍抗原ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の割合は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。
【００８６】
本開示は、医薬品としての、または医薬品の製造における、本開示による任意の腫瘍抗原ペプチド、核酸、発現ベクター、Ｔ細胞受容体、細胞（例えば、Ｔリンパ球、ＡＰＣ）の使用、および／または組成物、あるいはそれらの任意の組み合わせに関する。一実施形態では、医薬品は、癌の治療のためのもの、例えば、癌ワクチンである。本開示は、癌の治療における使用、例えば、癌ワクチン（例えば、治療用癌ワクチン）のための、本開示による任意の腫瘍抗原ペプチド、核酸、発現ベクター、Ｔ細胞受容体、細胞（例えば、Ｔリンパ球、ＡＰＣ）、および／または組成物（例えば、ワクチン組成物）、あるいはそれらの任意の組み合わせに関する。本明細書で特定される腫瘍抗原ペプチド配列は、ｉ）腫瘍患者に注入される腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のインビトロでのプライミングおよび増殖のために、かつ／またはｉｉ）癌患者における抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導もしくは増強するワクチンとして、好適である合成ペプチドの産生に使用され得る。
【００８７】
別の態様では、本開示は、対象における癌を治療するためのワクチンとしての、本明細書に記載される腫瘍抗原ペプチド、またはそれらの組み合わせ（例えば、ペプチドプール）の使用を提供する。本開示はまた、対象における癌を治療するためのワクチンとしての使用のための、本明細書に記載の腫瘍抗原ペプチド、またはそれらの組み合わせ（例えば、ペプチドプール）を提供する。一実施形態では、対象は、腫瘍抗原ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球のレシピエントである。したがって、別の態様では、本開示は、癌を治療する方法（例えば、腫瘍細胞の数を減少させる、腫瘍細胞を死滅させる）を提供し、当該方法は、それを必要とする対象に、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子／腫瘍抗原ペプチド複合体（ＡＰＣなどの細胞の表面で発現される）を認識する（すなわち、結合するＴＣＲを発現する）有効量のＣＤ８＋Ｔリンパ細胞を投与する（注入する）ことを含む。一実施形態では、本方法は、当該ＣＤ８＋Ｔリンパ球の投与／注入後に、腫瘍抗原ペプチド、もしくはそれらの組み合わせ、および／または腫瘍抗原ペプチド（複数可）が負荷されたＭＨＣクラスＩ分子（複数可）を発現する細胞（例えば、樹状細胞などのＡＰＣ）の有効量を、当該対象に投与することをさらに含む。なおさらなる実施形態では、本方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の１つ以上の腫瘍抗原ペプチドが負荷された樹状細胞を投与することを含む。なおさらなる実施形態では、本方法は、それを必要とする患者に、治療有効量の、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示される腫瘍抗原ペプチドに結合する組換えＴＣＲを発現する同種または自己細胞を投与することを含む。
【００８８】
別の態様では、本開示は、対象における癌を治療する（例えば、腫瘍細胞の数を減少させ、腫瘍細胞を死滅させる）ために、腫瘍抗原ペプチド、またはそれらの組み合わせが負荷された（提示する）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子を認識するＣＤ８＋Ｔリンパ球の使用を提供する。別の態様では、本開示は、対象における癌を治療するための（例えば、腫瘍細胞の数を減少させ、腫瘍細胞を死滅させるための）医薬品の調製／製造のために、腫瘍抗原ペプチド、またはそれらの組み合わせが負荷された（提示する）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子を認識するＣＤ８＋Ｔリンパ球の使用を提供する。別の態様では、本開示は、対象における癌の治療における使用のために（例えば、腫瘍細胞の数を減少させ、腫瘍細胞を死滅させるために）、腫瘍抗原ペプチド、またはそれらの組み合わせが負荷された（提示する）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子を認識するＣＤ８＋Ｔリンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球）を提供する。さらなる実施形態では、使用は、当該腫瘍抗原ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の使用後に、有効量の腫瘍抗原ペプチド（またはそれらの組み合わせ）、および／または腫瘍抗原ペプチドが負荷された（提示する）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子（複数可）を発現する細胞（例えば、ＡＰＣ）の使用をさらに含む。
【００８９】
本開示はまた、対象において、本明細書に開示される腫瘍抗原ペプチドまたはそれらの組み合わせのうちのいずれかが負荷されたヒトクラスＩＭＨＣ分子を発現する腫瘍細胞に対して免疫応答を生じさせる方法を提供し、本方法は、腫瘍抗原ペプチドまたは腫瘍抗原ペプチドの組み合わせが負荷されたクラスＩＭＨＣ分子を特異的に認識する細胞傷害性Ｔリンパ球を投与することを含む。本開示はまた、本明細書に開示される腫瘍抗原ペプチドまたは腫瘍抗原ペプチドの組み合わせのいずれかが負荷されたクラスＩＭＨＣ分子を特異的に認識する細胞傷害性Ｔリンパ球の使用を提供し、腫瘍抗原ペプチドまたはそれらの組み合わせが負荷されたヒトクラスＩＭＨＣ分子を発現する腫瘍細胞に対して免疫応答を生じる。
【００９０】
一実施形態では、本明細書に記載の方法または使用は、治療／使用の前に患者によって発現されるＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を決定することと、患者によって発現されるＨＬＡクラスＩ対立遺伝子のうちの１つ以上に結合する腫瘍抗原ペプチドを投与または使用することと、をさらに含む。例えば、Ｂ−ＡＬＬに罹患している患者がＨＬＡ−Ａ２＊０１およびＨＬＡ−Ｂ＊０８：０１を発現することが決定される場合、（ｉ）配列番号１７〜１９、２７および／または２８（ＨＬＡ−Ａ２＊０１に結合する）、ならびに（ｉｉ）配列番号２４または２５（ＨＬＡ−Ｂ０８＊０１に結合する）の腫瘍抗原ペプチドの任意の組み合わせが患者において投与または使用され得る。
【００９１】
一実施形態では、治療される癌、例えば、白血病または肺癌の腫瘍細胞は、本明細書に開示される腫瘍抗原ペプチド（配列番号１７〜３９）のうちの１つ以上を発現する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法または使用は、患者からの腫瘍細胞が本明細書に開示される腫瘍抗原ペプチド（配列番号１７〜３９）のうちの１つ以上を発現するか決定することと、癌を治療するために患者からの腫瘍細胞によって発現される腫瘍抗原ペプチド（複数可）のうちの１つ以上を投与または使用することと、をさらに含む。
【００９２】
一実施形態では、癌は、血液または血液学的癌、例えば、白血病、リンパ腫、および骨髄腫である。一実施形態では、癌は、白血病であり、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞性白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大顆粒性リンパ球性白血病、または成人Ｔ細胞性白血病が含まれる。別の実施形態では、癌は、限定されないが、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫、前駆Ｔ細胞白血病／リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／リンパ腫、またはＭＡＬＴリンパ腫である。さらなる実施形態では、癌は、Ｂ−ＡＬＬなどのＢ細胞白血病である。
【００９３】
別の実施形態では、癌は、肺癌などの固形癌である。さらなる実施形態では、肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。一実施形態では、肺癌は扁平上皮肺癌（ＳＱＣＬＣ）、腺癌、または大型細胞未分化癌（ＬＣＡＣ）である。
【００９４】
一実施形態では、本明細書に開示される腫瘍抗原ペプチド、核酸、ベクター、組成物は、化学療法、免疫療法（例えば、ＣＡＲ  Ｔ／ＮＫ細胞に基づく療法、チェックポイント阻害剤に基づく療法、抗体に基づく療法）、放射線療法、または手術などの他の療法（例えば、抗腫瘍療法）と組み合わせて使用され得る。免疫チェックポイント阻害剤の例には、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＫＩＲ、ＣＤ４０、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３を阻害する薬剤、例えば、遮断抗体が含まれる。化学療法のための薬剤の例には、例えば、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、グラデリムプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル（タキソール）、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフル−ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはそれらの組み合わせが含まれる。あるいは、化学療法のための薬剤は生物学的製剤であり得、ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、またはＥＧＦ受容体に対するＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）、およびＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）などの抗体が含まれる。そのような追加の薬剤または治療は、本明細書に開示される腫瘍抗原ペプチド、核酸、ベクター、組成物の投与／使用の前、間、および／または後に投与／使用され得る。
【００９５】
ＡＬＬのための現在の治療は、典型的には、ビンクリスチン、デキサメタゾン、またはプレドニゾン、ならびにドキソルビシン（アドリアマイシン）またはダウノルビシンなどのアントラサイクリン薬剤を含む。同種幹細胞移植（アロ−ＳＣＴ）も、高リスク患者および再発性／難治性疾患を有する患者において実施される。Ｂ−ＡＬＬの治療のために臨床開発中の他の薬剤には、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２０、および抗ＣＤ１９抗体、ならびにプロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路阻害剤（ルキソリチニブ）、低メチル化剤（デシタビン）、およびＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤が含まれる（例えば、Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ａｂｄｕｌ−Ｈａｙ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．２０１７  Ｊｕｎ；７（６）：ｅ５７７を参照する）。
【００９６】
肺癌のための現在の治療は、典型的には、手術、放射線治療、低分子チロシンキナーゼ阻害剤（エルロチニブ、クリゾチニブ）による化学療法、ならびに抗ＰＤ１抗体（ペムブロリズマブ）などのチェックポイント阻害剤による免疫療法が含まれる（例えば、Ｄｈｏｌａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ，Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．２０１６；９：１３８を参照する）。
【００９７】
本発明を実行するための形態（複数可）
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に説明される。
【００９８】
実施例１：材料および方法
マウス。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得た。マウスを特定の病原体を含まない条件下で飼育した。
【００９９】
細胞株。ＥＬ４  Ｔリンパ芽球性リンパ腫細胞株、ＣＴ２６結腸直腸癌細胞株、およびＢ細胞ハイブリドーマＨＢ−１２４は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。ＥＬ４およびＣＴ２６細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０／ＨＥＰＥＳで培養した。細胞培養培地にはさらに、１％非必須アミノ酸および１％ピルビン酸ナトリウムを、またはＥＬ４細胞およびＣＴ２６細胞については１％ピルビン酸ナトリウムのみを、それぞれ補充した。抗ＣＤＲ２抗体を産生するために、ＨＢ−１２４細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清を補充したＩＭＤＭで培養した。特に明記しない限り、全ての試薬はＧｉｂｃｏ（登録商標）から購入した。
【０１００】
ヒト原発性試料。この研究で使用した原発性白血病試料（４個のＢ−ＡＬＬ標本：０７Ｈ１０３、１０Ｈ０８０、１０Ｈ１１８、および１２Ｈ０１８）は、Ｂａｎｑｕｅ  ｄｅ  Ｃｅｌｌｕｌｅｓ  Ｌｅｕｃｅｍｉｑｕｅｓ  ｄｕ  Ｑｕｅｂｅｃ（ＢＣＬＱ）ａｔ  Ｈｏｐｉｔａｌ  Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ−Ｒｏｓｅｍｏｎｔで収集されて凍結保存された。原発性白血病試料は、既に報告されている１ａように、ＮＳＧマウスにおける移植後にインビボで増殖させた。簡単に説明すると、１〜２×１０６個のＢ−ＡＬＬ細胞を解凍し、亜致死的に照射された（２５０ｃＧｙ、１３７Ｃｓ−γ線源）８〜１２週齢ＮＳＧマウスに静脈内注入を介して移植した。マウスを疾患の徴候で屠殺し、細胞懸濁液を、機械的に破壊された脾臓から、または０７Ｈ１０３について、脾細胞、骨髄、および腹水の混合物から調製した。そこから、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）勾配を使用して、ＭＡＰ単離前にＢ−ＡＬＬ細胞を豊富化した（ＭＡＰ単離のセクションを参照）。肺腫瘍生検（ｌｃ２、ｌｃ４、およびｌｃ６）をＴｉｓｓｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから購入し、ＭＡＰ単離前に均質化した（ＭＡＰ単離セクションを参照）。全ての試料について、ＨＬＡタイピングはＯｐｔｉｔｙｐｅバージョン１．０を使用して、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）データのためのデフォルトパラメータで実行して得た（ＲＮＡ抽出、ライブラリ調製、および配列決定のセクションを参照）。
【０１０１】
ペプチド。ネイティブおよび１３Ｃ標識バージョンのＴＳＡは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成された。純度は、製造業者によって決定されたとき、ネイティブおよび１３Ｃ標識ペプチドについてそれぞれ９５％および７５％を超えた。
【０１０２】
マウスｍＴＥＣｈｉ抽出。胸腺を５〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６またはＢａｌｂ／ｃマウスから単離し、機械的に破壊して胸腺細胞を抽出した。間質細胞の豊富化を既に報告されている２ａのように実施した。胸腺間質細胞を、ビオチン化Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  ｌｅｃｔｉｎ１（ＵＥＡ１；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート化ストレプトアビジン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および以下の抗体によって染色した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）７００抗ＣＤ４５、ＰＥ抗Ｉ−Ａｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、アロフィコシアニン−Ｃｙ７抗ＥｐＣＡＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。細胞生存率を、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して評価した。生きた成熟ｍＴＥＣ（ｍＴＥＣｈｉ）を７−ＡＡＤ−ＣＤ４５−ＥｐＣＡＭ＋ＵＥＡ１＋ＭＨＣ  ＩＩｈｉとしてゲーティングした。ｍＴＥＣｈｉを３レーザーＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩＩｕ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、図１３Ａ）で選別した。
【０１０３】
ヒトＴＥＣおよびｍＴＥＣ抽出。胸腺を、心臓血管矯正手術を受ける３ヶ月〜７歳の個体から得た（ＣＨＵ  Ｓａｉｎｔ  Ｊｕｓｔｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃ  Ｂｏａｒｄ、プロトコルおよびバイオバンク＃２１２６）。簡単に説明すると、胸腺を、それらの外科的切除後数時間以内に、培地を含有する５０ｍｌ円錐形チューブ中で４℃に保持し、２〜５ｍｍ立方体に切断した。長期保存のため、胸腺立方体を熱不活化ヒト血清／１０％ＤＭＳＯを含有する凍結保存用バイアル中で凍結させ、液体窒素中で最大３年間維持した。凍結保存された胸腺試料をドライアイス上に移し、Ｃ．Ｓｔｏｅｃｋｌｅら３ａから適応したプロトコルによってヒトＴＥＣおよびｍＴＥＣを単離するために使用した。胸腺組織を小断片に切断し、次いで、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中の２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ）および０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液を使用して３７℃で４０分間の３〜５回で消化した。２回目の消化後、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）の溶液を添加し、その活性を、インキュベーション終了の１５分前にＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することによって中和した。ＴＥＣおよびｍＴＥＣ選別について（図１３Ｂ）、細胞懸濁液を、パシフィックブルーコンジュゲート化抗ＣＤ４５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥコンジュゲート化抗ＨＬＡ−ＤＲ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣコンジュゲート化抗ＥｐＣＡＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ａｌｅｘａ  ４８８コンジュゲート化抗ＣＤＲ２（ＨＢ−１２４ハイブリドーマで産生され−細胞株のセクションを参照−、ｍＴＥＣ試料についてのみＡｂｃａｍからのＤｙｌｉｇｈｔ  ４８８  Ｆａｓｔコンジュゲーションキットによってコンジュゲート化される）によって染色し、細胞生存率を７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して評価した。
【０１０４】
ＲＮＡ抽出、ライブラリ調製、および配列決定。ＥＬ４およびＣＴ２６細胞について、５×１０６個の細胞の１回複製を使用して、ＲＮＡ配列決定を実施した。Ｃ５７ＢＬ／６およびＢａｌｂ／ｃのｍＴＥＣｈｉについて、２匹の雌および２匹の雄から抽出した最低３１，６８６個または１６，３３８個のＦＡＣＳ選別細胞に対して、ＲＮＡ配列決定を３回複製で実施した。原発性白血病細胞について、ＲＮＡ−Ｓｅｑを２．０〜４．０×１０６個の細胞の単回複製で実施した。ヒトＴＥＣおよびｍＴＥＣについて、ドナーあたり１回のＲＮＡ−Ｓｅｑ複製を、３３，０７６〜８４，１９８個のＦＡＣＳ選別したＴＥＣまたは５０，０５８〜１００，７１９個のｍＴＥＣで実施した。全ての場合において、全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単離し、ＲＮｅａｓｙキットまたはＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏキット（ＱＩＡＧＥＮ）を各製造業者によって推奨されるように使用してさらに精製した。各肺腫瘍生検について（合計３回）、全ＲＮＡを約３０ｍｇの組織から、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者によって推奨されるように使用して単離し、試料あたりＲＮＡ−Ｓｅｑの１回複製を実施するために使用した。各マウス試料（ＥＬ４、ＣＴ２６、およびマウスｍＴＥＣｈｉ）を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化し、ＲＮＡ品質を２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）で評価して、ＲＩＮ値（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ）≧９の試料を選択した。ヒト試料（Ｂ−ＡＬＬ、肺腫瘍生検、およびヒトＴＥＣ／ｍＴＥＣ）について、全ＲＮＡの定量化をＱｕＢｉｔ（ＡＢＩ）によって行い、全ＲＮＡの品質を２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）で評価してＲＩＮ値（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ）≧７の試料を選択した。ｃＤＮＡライブラリは、ＥＬ４およびＣＴ２６細胞について２〜４μｇ、マウスｍＴＥＣｈｉについて５０〜１００ｎｇ、Ｂ−ＡＬＬ標本について５００ｎｇ、肺腫瘍生検について４μｇ、ヒトＴＥＣについて８〜１３ｎｇ、または全ＲＮＡのヒトｍＴＥＣについて４１〜６８ｎｇから、ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐキット（ＥＬ４細胞）、ＫＡＰＡ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑキット（ＣＴ２６細胞、Ｃ５７ＢＬ／６のｍＴＥＣｈｉ、ヒトｍＴＥＣ、肺腫瘍、およびＢ−ＡＬＬ標本）、またはＫＡＰＡ  ＲＮＡ  ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキット（Ｂａｌｂ／ｃのｍＴＥＣｈｉ、ヒトＴＥＣ）を使用して調製した。これらのライブラリは、配列決定前にＰＣＲの９〜１６サイクルによってさらに増幅させた。ペアエンド（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ）ＲＮＡ配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）５００（Ｂａｌｂ／ｃのｍＴＥＣｈｉ、ヒトＴＥＣ、およびｍＴＥＣ）またはＨｉＳｅｑ（商標）２０００（任意の他の試料）で実施し、マウスおよびヒト試料あたりそれぞれ平均１７５および１９９×１０６リードを得た。
【０１０５】
標準的癌および正常プロテオームの生成。全ての試料について、ＲＮＡ−Ｓｅｑリードを、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃバージョン０．３５を使用して配列決定アダプタおよび低品質３’塩基のためにトリミングし、次いで、マウス試料ではＧＲＣｍ３８．８７およびヒト試料ではＧＲＣｈ３８．８８である参照ゲノムに対して、ＳＴＡＲバージョン２．５．１ｂ４ａを使用し、−−ａｌｉｇｎＳＪｏｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ、−−ａｌｉｇｎＭａｔｅｓＧａｐＭａｘ、−−ａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭａｘ、および−−ａｌｉｇｎＳＪｓｔｉｔｃｈＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘでは、パラメータはデフォルト値をそれぞれ１０、２００，０００、２００，０００、および５−１５５に置き換えた以外は、デフォルトパラメータで実行してアラインメントした。最小代替カウント設定が５である一塩基変異を、ｆｒｅｅＢａｙｅｓバージョン１．０．２−１６−ｇｄ４６６ｄｄｅ［ａｒＸｉｖ：１２０７．３９０７］を使用して特定し、ＶＣＦでエクスポートし、これをｐｙＧｅｎｏ５ａと互換性のある非依存ＳＮＰファイル形式に変換した（ＧｉｔＨｕｂ、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔａｒｉｑｄａｏｕｄａ／ｐｙＧｅｎｏで入手可能。最後に、転写発現を、Ｋａｌｌｉｓｔｏバージョン０．４３．１［Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｌ  Ｂｒａｙ，Ｈａｒｏｌｄ  Ｐｉｍｅｎｔｅｌ，Ｐａｌｌ  Ｍｅｌｓｔｅｄ  ａｎｄ  Ｌｉｏｒ  Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｎｅａｒ−Ｏｐｔｉｍａｌ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３４，５２５−５２７（２０１６）］を用いてデフォルトパラメータで実行し、百万あたりの転写物（ｔｐｍ）で定量化した。注意すべきこととして、Ｋａｌｌｉｓｔｏインデックスは、インデックス機能を使用し、Ｅｎｓｅｍｂｌからダウンロードされた適切な＊．ｃｄｎａ．ａｌｌ．ｆａ．ｇｚファイルを使用して構築した。各試料の標準的プロテオームを構築するために、ｐｙＧｅｎｏを使用して、（ｉ）高品質の試料特異的一塩基変異（ｆｒｅｅＢａｙｅｓ品質＞２０）を参照ゲノムに挿入し、それによって個別化エクソームを作成し、（ｉｉ）発現した転写物（ｔｐｍ＞０）によって生成された既知タンパク質の試料特異的配列（複数可）をエクスポートした。これらのタンパク質配列をｆａｓｔａファイルに書き込み、その後、質量分析（ＭＳ）データベース検索（癌標準的プロテオーム）および／またはＭＨＣ  Ｉ関連ペプチド（ＭＡＰ）分類（癌および正常標準的プロテオーム）に使用した。概略について図１Ｂを、統計について表４ａ〜ｂを参照する。
【０１０６】
癌および正常ｋ−ｍｅｒデータベースの生成。全ての癌および正常試料について、Ｒ１およびＲ２  ｆａｓｔｑファイルの両方を、独立してダウンロードし、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃバージョン０．３５を使用して、配列決定アダプタおよび低品質の３’塩基のためにトリミングした。全てのリードが転写物コード鎖上にあったことを確実にするために、Ｒ１リードを、ＦＡＳＴＸ−Ｔｏｏｌｋｉｔバージョン０．０．１４のｆａｓｔｘ＿ｒｅｖｅｒｓｅ＿ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ機能を用いて使用して逆補完した。ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ  ２．２．３６ａを使用して、ｋ−ｍｅｒプロファイリングおよびＭＡＰ分類にそれぞれ使用された３３個および２４個のヌクレオチド長のｋ−ｍｅｒデータベースを生成した（詳細については図７Ａを参照）。注目すべきこととして、複数の生物学的複製物（マウスｍＴＥＣｈｉ）または無関係ドナー（ヒトＴＥＣおよびｍＴＥＣ）からの複数の試料が利用可能である場合、ｆａｓｔｑファイルを連結して、条件（Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃまたはヒト）あたり単一の正常ｋ−ｍｅｒデータベースを生成した。
【０１０７】
ｋ−ｍｅｒフィルタリングおよび癌特異的プロテオームの生成。ＴＳＡを生じさせる可能性のある３３ヌクレオチド長のｋ−ｍｅｒを抽出するために、分析はＥＬ４またはＣＴ２６ｋ−ｍｅｒ細胞で少なくとも４回、肺腫瘍生検で７回、および原発性白血病試料で１０回認められるｋ−ｍｅｒに限定した。次いで、癌特異的ｋ−ｍｅｒは、関連するｍＴＥＣｈｉまたはヒトＴＥＣ／ｍＴＥＣのｋ−ｍｅｒデータベースにおいて発現されなかったものを選択することによって得た（図７Ｂを参照）。この癌特異的ｋ−ｍｅｒセットは、コンティグと呼ばれる、より長い線形配列にさらに組み立てた。簡単に説明すると、提示された３３ヌクレオチド長のｋ−ｍｅｒのうちの１つをランダムに選択して、次いで、同じ鎖上に３２ヌクレオチドで重複する連続するｋ−ｍｅｒで両端から伸長するシードとして使用する（−ｒオプションを無効にし、ｋ−ｍｅｒの鎖状セットとして使用した）。組み立てプロセスは、ｋ−ｍｅｒが組み立てられない、すなわち、３２ヌクレオチド重複ｋ−ｍｅｒが認められないとき、または複数のｋ−ｍｅｒが適合するときのいずれかに停止する（線形組み立て用の−ａ１オプション）。そのような場合、新しいシードが選択され、提示されたリストから全てのｋ−ｍｅｒが一度使用されるまで組み立てプロセスが再開される（図７Ｃを参照）。このステップは、ＮＥＫＴＡＲ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｔｂｕｃｋｅｔ．ｏｒｇ／ｅａｕｄｅｍａｒｄ／ｎｅｋｔａｒ）というインハウスの開発ソフトウェアのｋｍｅｒ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ機能によって行われる。タンパク質を得るために、少なくとも３４ヌクレオチド長であったコンティグの３フレーム翻訳を、インハウスのｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して実施した。次いで、癌特異的タンパク質を内部停止コドンで分割し、少なくとも８個のアミノ酸長の任意の得られたサブ配列に、関連するデータベースに含める前に独自のＩＤを与えた（図７Ｄを参照）。概略図については図１Ｂを、統計については表４ａ〜ｂを参照する。
【０１０８】
ＭＡＰ単離。ＥＬ４およびＣＴ２６細胞について、２５０×１０６個の指数的に増殖する細胞の３つの生物学的複製物を、指数的に増殖する細胞から調製した。全ての原発性白血病試料について、約４５０〜７００×１０６個の細胞の３つの生物学的複製物を、新たに採取した白血病細胞から調製した（ヒト原発性試料のセクションを参照）。ＭＡＰを、既に報告されている７ａ方法に軽微な変更を加えて得、弱酸溶出（ＭＡＥ）後、ペプチドを、Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢカートリッジ（３０ｍｇ、Ｗａｔｅｒｓ）で脱塩し、３ｋＤａの分子量カットオフ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過して、β２−ミコルグロブリン（β２−ｍｉｃｏｒｇｌｏｂｕｌｉｎ）（β２Ｍ）タンパク質を除去した。原発性白血病試料のうちの１つ（標本１０Ｈ０８０）について、１００×１０６個の細胞の４つの追加の複製物を調製し、ＭＡＰを、既に報告されている１ａように免疫沈降（ＩＰ）によって単離した。最後に、肺腫瘍生検（７７１〜１，８２５ｍｇの範囲の湿潤重量、ヒト原発性試料のセクションを参照）を小切片に切断し（約３ｍｍのサイズの立方体）、タンパク質阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を含有する氷冷ＰＢＳ５ｍｌを各組織試料に添加した。組織を、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５ホモジナイザー（２０，０００ｒｐｍで２０秒、ＩＫＡ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）を使用して最初に２回均質化し、次にＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ８ホモジナイザー（２５，０００ｒｐｍで２０秒、ＩＫＡ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）を使用して１回均質化した。次いで、５５０μｌの氷冷１０倍溶解緩衝液（１０％ｗ／ｖＣＨＡＰＳ）を各試料に加え、ＭＡＰを既に報告されている１ように、試料あたりプロテインＡ磁気ビーズと共有結合によって交差結合したＷ６／３２抗体の１ｍｇ（１ｍｌ）を使用して免疫沈降させた。ＭＡＰ分離技法にかかわらず、ＭＡＰ抽出物はＭＳ分析前に、全てＳｐｅｅｄ−Ｖａｃを使用して乾燥させ、凍結して維持した。
【０１０９】
質量分析解析。乾燥したＭＡＰ抽出物を全て０．２％ギ酸中に再懸濁した。ＥＬ４およびＣＴ２６について、ＭＡＰ抽出物を、自家製Ｃ１８プレカラム（Ｃ１８Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘで充填した５ｍｍ×内径３６０μｍ）に加え、自家製Ｃ１８分析カラム（Ｃ１８Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘで充填した１５ｃｍ×内径１５０μｍ）で、ｎＥａｓｙ−ＬＣ  ＩＩシステムによって、０〜４０％アセトニトリル（０．２％ギ酸）の５６分間の勾配、および６００ｎｌ・分−１の流量によって分離した。全てのヒト試料について、ＭＡＰ抽出物を、自家製Ｃ１８分析カラム（Ｃ１８Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘで充填した１５ｃｍ×内径１５０μｍ）で、ｎＥａｓｙ−ＬＣ  ＩＩシステムによって、０〜４０％アセトニトリル（０．２％ギ酸、０７Ｈ１０３、１０Ｈ０８０−ＭＡＥ、１０Ｈ１１８、および１２Ｈ０１８）の５６分間の勾配、または５〜２８％アセトニトリル（０．２％ギ酸、肺腫瘍生検および１０Ｈ０８０−ＩＰ）の１００分間の勾配、および６００ｎｌ・分−１の流量で加えた。試料をＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ（ＥＬ４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＨＦ（全ての他の試料、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓでは、７０，０００分解能で取得された各フルＭＳスペクトルに１２ＭＳ／ＭＳスペクトルが続き、最も豊富な多荷電イオンは、１７，５００の分解能、１ｅ６の自動ゲイン制御標的、５０ｍｓの注入時間、および２５％の衝突エネルギーで、ＭＳ／ＭＳ配列決定のために選択された。Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦでは、６０，０００分解能で取得した各フルＭＳスペクトルに続いて、２０ＭＳ／ＭＳスペクトルを得、最も豊富な多荷電イオンは、１５，０００（ＣＴ２６、０７Ｈ１０３、１０Ｈ０８０−ＭＡＥ、１０Ｈ１１８、１２Ｈ０１８）または３０，０００（肺腫瘍生検、１０Ｈ０８０−ＩＰ）の分解能、５×１０４の自動ゲイン制御標的、１００ｍｓの注入時間、および２５％の衝突エネルギーで、ＭＳ／ＭＳ配列決定のために選択された。ペプチドはピーク８．５（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．）を使用して特定し、ペプチド配列は関連する包括的癌データベースに対して検索し、標準的癌プロテオームと癌特異的プロテオームを連結することによって得た（標準的癌プロテオームおよび正常プロテオームの生成、ならびに、ならびに癌特異的プロテオームのｋ−ｍｅｒフィルタリングおよび生成のセクションを参照）。ペプチド特定のために、プレカーサーイオンおよびフラグメントイオンについて許容誤差をそれぞれ１０ｐｐｍおよび０．０１Ｄａに設定した。酸化（Ｍ）および脱アミド化（ＮＱ）の発生を翻訳後修飾として考慮した。
【０１１０】
ＭＡＰの特定。ＭＡＰについて選択するために、Ｐｅａｋｓから得られた独自の識別のリストをフィルタリングして、関連するＭＨＣ  Ｉ分子の少なくとも１つについてＮｅｔＭＨＣ  ４．０８ａによって予測されるように、≦２％のパーセンタイルランクを有する８〜１１個のアミノ酸長ペプチドを含んだ。さらに、所与のＰｅａｋｓスコア閾値を上回る標的識別の数で除したデコイ識別の数として定義される局所５％の偽発見率（ＦＤＲ）を適用して、最終ＭＡＰリスト内の偽陽性識別の数を制限した。
【０１１１】
ＴＳＡ候補の特定および検証。全ての特定されたＭＡＰの中でＴＳＡ候補を特定するために、免疫原性ステータスをＭＡＰ／タンパク質の各対に割り当てた。そのために、各ＭＡＰおよびその関連するＭＡＰコード配列（複数可）（ＭＣＳ）を、それぞれ関連する癌および正常個別化プロテオームまたは癌および正常２４ヌクレオチド長ｋ−ｍｅｒデータベースに照会した。正常の標準的プロテオームで検出されたＭＡＰは、それらが寛容原性である可能性があるため、それらのＭＣＳ検出ステータスに関係なく除外した。正当に癌特異的であったＭＡＰ、すなわち、正常標準的プロテオームまたは正常ｋ−ｍｅｒでは検出されなかったＭＡＰを、ＴＳＡ候補としてフラグ付けした。両方の標準的プロテオームには存在しないが、両方のｋ−ｍｅｒデータベースに存在するＭＡＰは、正常細胞に対して癌細胞で少なくとも１０倍過剰発現されるそれらのＭＣＳを有することが必要とされ、そのようにフラグ付けされる（図８Ａを参照）。最後に、いくつかのＭＣＳ（異なるタンパク質から）によってコードされるＭＡＰは、それらのそれぞれのＭＣＳが一致している場合、すなわち、このＭＡＰがＴＳＡ候補として一貫してフラグ付けされている場合にのみ、ＴＳＡ候補としてフラグ付けされ得る。全てのＴＳＡ候補のＭＳ／ＭＳスペクトルをマニュアルで精査して、いかなる偽の特定も除去した。加えて、複数のゲノムによって可能性があるＩ／Ｌバリアントを提示する配列をさらに精査して、両方のバリアントは、それらがＭＳによって区別可能であったときには両方のバリアントを、またはそれらが区別可能でなかったときには最も発現されたバリアントのみを報告した（図８Ｂを参照）。最後に、ゲノム位置は、ＢＬＡＴ（ＵＣＳＣゲノムブラウザからのツール）を使用して、ＭＣＳ含有リードを参照ゲノム（ＧＲＣｍ３８．８７またはＧＲＣｈ３８．８８）にマッピングすることによって、これらのＭＳ検証されたＴＳＡ候補全てに割り当てた。リードが一致するゲノムの位置にマッチングしなかったか、または超可変領域（ＭＨＣ、Ｉｇ、またはＴＣＲ遺伝子など）もしくは複数の遺伝子とマッチングしなかったＴＳＡ候補を除外した。一致したゲノム位置を有するものについて、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）９ａを使用して、それらの関連する正常な対応物に関してＭＣＳ重複同義変異を有するＴＳＡ候補、またはヒトＴＳＡ候補については、既知の生殖系多型と重複するもの（すなわち、ｄｂＳＮＰ  ｖ．１４９に列挙される、図８Ｃ）を除外した。残りのペプチドは、それらのＭＣＳが癌特異的変異と重複するか否かに応じて、ｍＴＳＡまたはａｅＴＳＡ候補として分類した。
【０１１２】
ＭＣＳの末梢発現。ＴＡＡおよびａｅＴＳＡ候補のＭＣＳの末梢発現を評価するために、（１）ＲＮＡがＥＮＣＯＤＥコンソーシアム１０ａ、１１ａによって配列決定されている２２個のマウス組織（表５）、または（２）ＧＴＥｘコンソーシアムによって配列決定されており、２０１８年４月１６日にＧＴＥｘ  Ｐｏｒｔａｌからダウンロードされた２８個の末梢ヒト組織（組織あたり約５０ドナー）（ｐｈｓ０００４２４．ｖ７．ｐ２、表６）、からのＲＮＡ−Ｓｅｑデータを使用した。簡単に説明すると、各組織からのＲＮＡ配列決定データを、Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ  ２．２．３（−Ｃオプションを使用）によって２４ヌクレオチド長ｋ−ｍｅｒデータベースに変換し、各ＭＣＳの２４ヌクレオチド長ｋ−ｍｅｒセットを照会するために使用した。各ＲＮＡ−Ｓｅｑ実験について、所与のＭＣＳと完全に重複するリードの数（ｒｏｖｅｒｌａｐ）を、ｋ−ｍｅｒセットの最小出現数（ｋｍｉｎ）を使用して推定した。実際、ｋｍｉｎ〜ｒｏｖｅｒｌａｐという仮説を立てたのは、同じｋ−ｍｅｒを複数回生成し得る低複雑性ＲＮＡ−Ｓｅｑリードを除いて、１つのｋ−ｍｅｒは常に単一のＲＮＡ−Ｓｅｑリードから生じるためである。したがって、全ての組織にわたるＭＣＳ発現レベルを比較するために、このｒｏｖｅｒｌａｐ値は、以下の式を使用して、配列決定された１０８リードあたり検出されたリードの数（ｒｐｈｍ）に変換し、
【数１】
2021534830.tif 000006
、式中、ｒｔｏｔは所与のＲＮＡ−Ｓｅｑ実験で配列決定したリードの総数を表す。次いで、そのような値を対数変換し（ｌｏｇ１０（ｒｐｈｍ＋１））、所与の組織の全てのＲＮＡ−Ｓｅｑ実験にわたって平均化した。マウス候補およびヒト候補について、それぞれ、１０個以下の組織（ｒｐｈｍ＞０）または肝臓以外の５個未満の組織（ｒｐｈｍ＞１５）において末梢発現を示すａｅＴＳＡ候補を、真のａｅＴＳＡとして考えた。これらのａｅＴＳＡ、ならびにｍＴＳＡの特徴は、表１ａ〜ｂ、２ａ〜ｄ、および３ａ〜ｃに報告される。
【０１１３】
ＴＳＡ候補のＭＳ検証。ＣＴ２６  ＴＳＡ候補および２つのＥＬ４  ＴＳＡ候補（ＡＴＱＱＦＱＱＬ−配列番号１１およびＳＳＰＲＧＳＳＴＬ−配列番号１３）について、既に取得しているＭＳ／ＭＳスペクトルを関連する１２Ｃ類似体と比較した。インビボで試験した他の５つのＥＬ４  ＴＳＡ候補（ＩＩＬＥＦＨＳＬ−配列番号１２、ＴＶＰＬＮＨＮＴＬ−配列番号１４、ＶＮＹＩＨＲＮＶ−配列番号１５、ＶＮＹＬＨＲＮＶ−配列番号１５、ＶＴＰＶＹＱＨＬ−配列番号１６）について、６つの追加のＥＬ４複製物（複製あたり約４５０〜１，４００×１０６個の細胞）からＭＡＰを溶出し、全て、前述のように処理した（ＭＡＰ単離および質量分析のセクションを参照）。絶対定量化のために、６つのＥＬ４複製物のうちの３つに、各１３Ｃ標識ＴＳＡの５００ｆｍｏｌを添加した。配列検証のために、１２Ｃ  ＴＳＡ候補のＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＰＲＭ  ＭＳによる試料分析の前に取得した。簡単に説明すると、計画通りに５つのペプチドをモニタリングしたＰＲＭ取得（各ペプチドは、その溶出時間を中心とした１０分間の幅でのみモニタリングされる）は、１つのＭＳ１スキャン、続いてＨＣＤモードでの標的ＭＳ／ＭＳスキャンから構成された。サーベイスキャンおよびタンデムマスペクトルの自動ゲイン制御および注入時間は、それぞれ、３ｅ６−５０ｍｓおよび２ｅ５−１００ｍｓだった。全ての場合において、Ｓｋｙｌｉｎｅ１２ａを使用して、各ＴＳＡ候補の内因性ＭＳ／ＭＳスペクトルを抽出し、それを関連する１２ＣＭＳ／ＭＳスペクトル（配列検証）と比較するか、または内因性および関連する合成１３Ｃ標識ペプチドの強度を抽出した（絶対定量化）。以下の式を使用し、これらの強度をさらに使用して、各複製について細胞あたりのＴＳＡコピー数を計算し、（ｎ合成×Ｉ内因性×ＮＡ／Ｉ合成）×（１／Ｎ細胞）、式中、ｎ合成は考慮される合成１３Ｃ標識ＴＳＡに添加されてされる初期モル数、Ｉ内因性およびＩ合成はそれぞれ関連する内因性および１３Ｃ標識ＴＳＡの強度、ＮＡはアボガドロ数、Ｎ細胞は弱酸溶出に使用される初期の細胞数である。
【０１１４】
ヒトＴＥＣおよびｍＴＥＣ試料において検出された転写物の累積数。分析を、６つの試料（２個のＴＥＣおよび６個のｍＴＥＣ）のうちの少なくとも１つにおいてｔｐｍ＞１で発現された転写物に限定し、スピアマンのランク相関係数を１対１のＴＥＣ／ｍＴＥＣ比較ごとに計算した。次いで、発現された転写物のこれらの同じセットを使用して、検出された転写物の累積数（ｃＴ）を、各追加試料を分析する際に計算した。分析において試料が導入される順序がｃＴ値に影響を及ぼす可能性があるため、全ての試料交換にわたるｃＴ値を平均化し、これらの平均データ点を使用して、以下の予測曲線にフィッティングさせ（Ｒの「ｎｌｓ」関数を用いる）、
【数２】
2021534830.tif 000007
、式中、ｃＴは転写物の累積数であり、ｎＳは分析した試料の数である。次いで、この方程式を使用して、最大２０個の試料を研究することによって検出され、単に
【数３】
2021534830.tif 000008
を計算することによって推定することができる転写物の数を外挿した。
【０１１５】
骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）、マウス免疫化、およびＥＬ４細胞注入の生成。骨髄由来ＤＣを、既に報告されている１３ａ、１４ａように生成した。マウス免疫化のために、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＤＣを、２μＭの選択されたペプチドで３時間パルスし、次いで洗浄した。８〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、放射線照射されたＥＬ４細胞（１０，０００ｃＧｙ）添加の１４日前、７日前、または同時に１０６個の、個別にペプチドパルス化ＤＣを静脈内注入した。陰性コントロールとして、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを非パルス化ＤＣで免疫化した。０日目および１５０日目に、マウスに５×１０５個のＥＬ４細胞を静脈内注入し、体重減少、麻痺、または腫瘍成長についてモニタリングした。
【０１１６】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイおよび結合活性アッセイ。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイおよび結合活性アッセイを、既に報告されている１４ａように実施した。簡単に説明すると、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＰＶＤＦプレートを３５％エタノールで透過させ、洗浄し、マウスＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！試薬セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して一昼夜コーティングした。マウス免疫化後０日目に、免疫化したマウスまたはナイーブマウスから脾細胞を採取した。３０×１０６個／ｍＬの脾細胞を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ＣＤ８α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって４℃で３０分間染色し、洗浄し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩｕまたはＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩｕ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、図１３Ｃ）を使用して選別した。選別したＣＤ８＋Ｔ細胞を播種し、関連するペプチド（ＥＬＩＳｐｏｔアッセイについて４μＭ、結合活性アッセイについて１０−４〜１０−１４Ｍ）でパルスした同系マウスからの放射線照射された脾細胞（４，０００ｃＧｙ）の存在下、３７℃で４８時間インキュベートした。陰性コントロールとして、ナイーブマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞をペプチドパルス化脾細胞と共にインキュベートした。スポットは試薬セット製造業者プロトコルを使用して明らかにし、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｓ５  ＵＶ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ）を使用して計数した。ＩＦＮ−γ産生を１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞あたりのスポット形成単位の数として表し、ＥＣ５０は用量応答曲線を使用して計算した。
【０１１７】
リンパ組織からの細胞単離および四量体ベースの豊富化プロトコル。脾臓および鼠径部、腋窩、上腕、頸部、および腸間膜リンパ節をＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。単一細胞懸濁液を、Ｆｃブロックおよび１０ｎＭのＰＥ−またはＡＰＣ−標識ｐＭＨＣ  Ｉ四量体（ＮＩＨ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）によって４℃で３０分間染色した。氷冷選別緩衝液（２％ＦＢＳ添加ＰＢＳ）で洗浄した後、細胞を２００μＬの選別緩衝液ならびに５０μＬの抗ＰＥおよび／または抗ＡＰＣ抗体コンジュゲート化磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再懸濁し、そして４℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、既に報告されている１５ａ、１６ａように四量体＋細胞を磁気によって豊富化した。得られた四量体＋豊富化画分は、ＡＰＣ  Ｆｉｒｅ  ７５０コンジュゲート化抗Ｂ２２０、Ｆ４／８０、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰコンジュゲート化抗ＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＶ４２１コンジュゲート化抗ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＢ５１５コンジュゲート化抗ＣＤ８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＶ５１０コンジュゲート化抗ＣＤ４４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体、およびＺｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって染色した。抗ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃは、これらのマーカーがいくつかの活性化されたＴ細胞によって発現され得るため１７ａ、１８ａ、免疫化後レパートリーの分析について省略した。次いで、染色した試料全体をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、蛍光計数ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して結果を基準化した。陰性コントロールとして、３つのウイルス由来抗原であるリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）タンパク質ｇｐ−３３からのｇｐ−３３（ＫＡＶＹＮＦＡＴＣ−配列番号４０、Ｈ−２Ｄｂ）、マウスサイトメガロウイルスタンパク質Ｍ４５からのＭ４５（ＨＧＩＲＮＡＳＦＩ−配列番号４１、Ｈ−２Ｄｂ）、およびワクシニアウイルスタンパク質Ｂ８ＲからのＢ８Ｒ（ＴＳＹＫＦＥＳＶ−配列番号４２、Ｈ−２Ｋｂ）を標的とする抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞レパートリーを豊富化した。
【０１１８】
データ。この研究で使用した全ての試料に関する情報を表７に列挙する。図１で使用される配列決定および発現データは、ＮＣＢＩ’ｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅａｄ  ＡｒｃｈｉｖｅおよびＧＥＯに預託されており、両方ともＳｕｐｅｒＳｅｒｉｅｓ受入コードＧＳＥ１１３９９２の下でＧＥＯからアクセスすることができ、マウスまたはヒトの配列決定および発現データについてそれぞれＧＳＥ１１１０９２およびＧＳＥ１１３９７２受入コードを含む。ＳｕｐｅｒＳｅｒｉｅｓレコードは、枠内にトークンｃｎｕｔｓｃａｃｊｂｋｚｔｅｂを入力することによってｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ１１３９９２からアクセスすることができる。図１で使用されるＭＳ生データおよび関連データベースは、ＰＲＩＤＥ１９ａパートナーレポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅコンソーシアムに預託され、以下のデータセット識別子を有する。ＰＸＤ００９０６５および１０．６０１９／ＰＸＤ００９０６５（ＣＴ２６細胞株）、ＰＸＤ００９０６４および１０．６０１９／ＰＸＤ００９０６４（ＥＬ４細胞株）、ＰＸＤ００９７４９および１０．６０１９／ＰＸＤ００９７４９（０７Ｈ１０３）、ＰＸＤ００９７５３および１０．６０１９／ＰＸＤ００９７５３（１０Ｈ０８０、弱酸溶出）、ＰＸＤ００７９３５−アッセイ＃８１７５６および１０．６０１９／ＰＸＤ００７９３５（１０Ｈ０８０、免疫沈降）１ａ、ＰＸＤ００９７５０および１０．６０１９／ＰＸＤ００９７５０（１０Ｈ１１８）、ＰＸＤ００９７５１および１０．６０１９／ＰＸＤ００９７５１（１２Ｈ０１８）、ＰＸＤ００９７５２および１０．６０１９／ＰＸＤ００９７５２（ｌｃ２）、ＰＸＤ００９７５４および１０．６０１９／ＰＸＤ００９７５４（ｌｃ４）、ならびにＰＸＤ００９７５５および１０．６０１９／ＰＸＤ００９７５５（ｌｃ６）。
【０１１９】
実施例２：ＴＳＡ発見のためのプロテオゲノミクスク法の根拠および設計。
様々なアルゴリズムを使用してＴＳＡをコンピュータによって予測する試みは、極めて高い誤発見率を伴う２７。したがって、ＭＡＰレパートリーのシステムレベルの分子定義は、ハイスループットＭＳ試験によってのみ達成することができる３。現在のアプローチは、Ｐｅａｋｓ２８などのＭＳ／ＭＳソフトウェアツールを使用し、取得した各ＭＳ／ＭＳスペクトルをペプチド配列に一致させるためにユーザ定義されたタンパク質データベースに依存する。参照プロテオームはＴＳＡを含まないため、ＭＳベースのＴＳＡ発見ワークフローは、プロテオゲノミクス戦略を使用して、腫瘍ＲＮＡ−配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）データに由来するカスタマイズされたデータベースを構築しなければならず２９、考えられる腫瘍試料で発現される、注釈さえない、全てのタンパク質を理想的には含むべきである。現在のＭＳ／ＭＳソフトウェアツールは、全てのＲＮＡ−Ｓｅｑリードを翻訳するオールフレームによって作成される大きな検索スペースに対処することができないため３０、３１、癌特異的配列を豊富にするプロテオゲノミクス戦略が考案され、全てのゲノム領域によってコードされるＴＳＡのランドスケープを包括的に特徴付けする。得られるデータベースは、包括的癌データベースと称される２つのカスタマイズ可能な部分からなる。第１の部分は、標準的癌プロテオーム（図１Ａ）と称され、発現されたタンパク質コード転写物をそれらの標準的フレーム内でコンピュータによって翻訳することで得られ、したがって、それは、正常であるか、または一塩基変異を含有するエキソン配列によってコードされるタンパク質を含有する。第２の部分は、癌特異的プロテオーム（図１Ｂ）と称され、現在のマッパーおよびバリアントコーラーが構造バリアントを十分に特定しないため、ｋ−ｍｅｒプロファイリングと呼ばれるアラインメントフリーのＲＮＡ−Ｓｅｑワークフローを使用して生成された。この第２のデータセットは、いずれかのゲノム起源の任意のリーディングフレーム（構造バリアントを含む）によってコードされるペプチドの検出を、それらが癌特異的である限り（すなわち、正常細胞には存在しない）可能にした。ここでは、ｍＴＥＣｈｉを「正常コントロール」として使用することが選択され、それらは最も知られた遺伝子を発現し、それらの広大なトランスクリプトーム３２によってコードされるＭＡＰに対する中枢性寛容を誘導するためである。したがって、癌特異的であったＲＮＡ配列を特定するために、癌ＲＮＡ−Ｓｅｑリードを、ｋ−ｍｅｒと呼ばれる３３ヌクレオチド長配列に切断し３３、ｋ−ｍｅｒを同系ｍＴＥＣｈｉから除去した（図７Ａ〜Ｂ）。ｋ−ｍｅｒスペースに固有の冗長性は、重複する癌特異的ｋ−ｍｅｒを、コンティグと呼ばれる長い配列に組み立てることによって除去し、さらにコンピュータによって３フレーム翻訳した（図１Ｂおよび図７Ｃ〜Ｄ）。次いで、標準的な癌プロテオームおよび癌特異的プロテオームを連結して、各分析された試料について１つの包括的癌データベースを作成した。そのような最適化データベースを使用して、２つの十分に特徴付けられたマウス腫瘍細胞株、すなわち、Ｂａｌｂ／ｃマウスからの結腸直腸癌であるＣＴ２６、およびＣ５７ＢＬ／６マウスからのＴリンパ芽球性リンパ腫であるＥＬ４から溶出されたＭＡＰが、ＭＳによって配列決定されて特定された（図１Ｃ）。
【０１２０】
実施例３：非コード領域はＴＳＡの主な供給源である。
５％の偽発見率で、ＣＴ２６細胞について１，８７５個のＭＡＰおよびＥＬ４細胞で７８３個のＭＡＰを特定した。これらの中で、ｍＴＥＣｈｉプロテオームに存在しないＭＡＰは、（ｉ）完全癌制限型３３ヌクレオチド長ｋ−ｍｅｒに由来するそれらの３３ヌクレオチド長ＭＡＰコード配列（ＭＣＳ）がｍＴＥＣｈｉトランスクリプトームに存在しない場合、または（ｉｉ）癌制限型３３ヌクレオチド長ｋ−ｍｅｒに由来するそれらの２４〜３０ヌクレオチド長ＭＣＳが、ｍＴＥＣｈｉ細胞に対して癌のトランスクリプトームにおいて少なくとも１０倍過剰発現された場合に、ＴＳＡ候補として考えた（図８Ａ）。ＭＳ関連の検証ステップおよびゲノム位置の割り当て（図８Ｂ〜Ｃ）に続いて、合計６個のｍＴＳＡおよび１５個のａｅＴＳＡ候補を得、１４個はＣＴ２６細胞によって提示され、７個はＥＬ４細胞によって提示された（図２Ａ〜Ｂ）。変異および異常発現の両方であったＭＡＰをｍＴＳＡカテゴリに含めた。これらのＭＡＰは全て新規であると考えられ、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ３６には存在しないが、１つだけ、ＡＨ１ペプチド（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ）は逆免疫学を使用してＣＴ２６細胞上で先に特定された１５０個のａｅＴＳＡ９、３７の１つであるため除外される。
【０１２１】
癌ｋ−ｍｅｒからのｍＴＥＣｈｉｋ−ｍｅｒの除去に基づくデータベース構築戦略の厳密性を評価するために、２２個の組織のパネルにわたるａｅＴＳＡをコードするＭＣＳの末梢発現を評価した３８、３９（表５）。１５個のａｅＴＳＡ候補のうちの４個は、それらのＭＣＳがほとんどまたは全ての組織で発現されたため、過去に報告された「過剰発現した」腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）４０、４１と同様の発現プロファイルを有した（図２Ｃ）。したがって、これら４つのペプチドをＴＳＡリストから除外した。対照的に、１１個のＭＡＰは、それらのＭＣＳが、いくつかの組織において全く存在しないか、または微量で存在したため、真のａｅＴＳＡと考えられた（図２Ｃ）。実際、低い転写物レベルの検出は、ＭＡＰが非常に豊富な転写物に優先的に由来するため４２、４３、重要ではない。この概念は、肝臓、胸腺、および膀胱におけるＭＣＳの発現が弱いにもかかわらず、有害効果を伴わない強い抗腫瘍応答を誘発するＡＨ１  ＴＳＡによって例証される９、３７（図２Ｃ）。これらの結果は、ｍＴＥＣｈｉに認められるｍＲＮＡ配列を減算することが、癌制限型ＭＣＳを強力に豊富化することを示す。マウスＴＳＡデータセット全体（６個のｍＴＳＡおよび１１個のａｅＴＳＡ）を考慮すると、最も顕著な発見は、それらのほとんどが、非定型的な翻訳事象であるコード化エキソンのアウトオブフレーム翻訳または非コード領域の翻訳に由来するということである（図２Ｄ）。さらに、特定された全てのＴＳＡは２個を除き、それらのソース配列（ｓｏｕｒｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）がタンパク質コード化として注釈付けされないため、古典的なエクソームに基づくアプローチによって見逃されていたであろう。興味深いことに、非コード領域の任意のタイプである、遺伝子間およびイントロン配列、非コード化エキソン、ＵＴＲ／エキソン接合部、ならびにＥＲＥは、ＴＳＡを生成することができることも注目され（表１）、ＴＳＡの特に豊富な供給源であるように思われる（８個のａｅＴＳＡおよび１個のｍＴＳＡ）。最後に、本明細書に記載のアプローチは構造バリアントを効率的に捕捉し、ＥＬ４細胞における非常に大きな遺伝子間欠失（約７，５００ｂｐ）に由来する抗原であるＶＴＰＶＹＱＨＬが特定された（表１ｂ）。総じて、これらの結果は、非コード領域がＴＳＡの主な供給源であり、それらが腫瘍のＴＳＡランドスケープをかなり拡大する可能性を有することを確証する。
【０１２２】
さらなる試験を、最も魅力的と思われるＴＳＡ、すなわち、ＥＬ４細胞によって提示され、ＭＣＳがいかなる正常組織によっても発現されないＴＳＡのいくつかについて実施した（図２Ｃおよび表１ｂ）。それらの免疫原性を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、生ＥＬ４細胞を負荷する前に、非パルス化（コントロール群）またはＴＳＡパルス化ＤＣのいずれかで２回免疫化した。ＩＩＬＥＦＨＳＬまたはＴＶＰＬＮＨＮＴＬに対するプライミングは、マウスの１０％で生存率を延長し、ＴＶＰＬＮＨＮＴＬ免疫化マウスのみが１５０日まで生存した（図３Ａ）。他の３つのＴＳＡは、２０％（ＶＮＹＩＨＲＮＶ）、３０％（ＶＴＰＶＹＱＨＬ）、および１００％（ＶＮＹＬＨＲＮＶ）の１５０日生存率を示した（図３Ｂ、Ｃ）。ＴＳＡワクチン接種の長期有効性を評価するために、生存しているマウスを１５０日目に生ＥＬ４細胞で再負荷し、疾患の徴候をモニタリングした。２匹のＶＮＹＩＨＲＮＶ免疫化生存マウスは５０日以内に白血病で死亡したが、他の全て（ＴＶＰＬＮＨＮＴＬ、ＶＴＰＶＹＱＨＬ、またはＶＮＹＬＨＲＮＶに対して免疫化）は再負荷で生存した（図３）。したがって、個別のＴＳＡに対する免疫は、ＥＬ４細胞に対して異なる程度の保護を付与し、ほとんどの場合、この保護は長期継続することが結論付けられ得る。
【０１２３】
実施例４：ナイーブおよび免疫化マウスにおけるＴＳＡ特異的Ｔ細胞の頻度。
様々なモデルにおいて、インビボでの免疫応答の強度は、抗原反応性Ｔ細胞の数によって調節される４４、４５。したがって、ナイーブおよび免疫化マウスにおけるＴＳＡ特異的Ｔ細胞の頻度を、四量体ベースの豊富化プロトコル４６、４７を使用して評価し、ゲーティング戦略および１つの代表的な実験を図９Ａ〜Ｃに認めることができる。陽性コントロールとして、３つのウイルスエピトープ（ｇｐ−３３、Ｍ４５、およびＢ８Ｒ）に特異的な非常に多量なＣＤ８  Ｔ細胞を使用し、それらの頻度が過去の研究４５で観察されたものの範囲内であることを確証した（図４Ａ）。ナイーブマウスでは、ＴＶＰＬＮＨＮＴＬ、ＶＴＰＶＹＱＨＬ、およびＩＩＬＥＦＨＳＬに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞は稀だった（１０６個のＣＤ８  Ｔ細胞あたり１個未満の四量体＋細胞）が、ＥＲＥ  ＴＳＡ（ＶＮＹＩＨＲＮＶおよびＶＮＹＬＨＲＮＶ）に特異的なＣＤ８  Ｔ細胞は、ウイルスコントロールのものと同様の頻度を示した（図４Ａおよび図１０Ａ）。したがって、ＴＳＡパルス化ＤＣで免疫化されたマウスにおいて、四量体染色またはＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価される２つのＥＲＥ  ＴＳＡに対するＴ細胞頻度（図９Ｃ〜Ｄおよび１０Ａ）は、ＴＶＰＬＮＨＮＴＬ、ＶＴＰＶＹＱＨＬ、およびＩＩＬＥＦＨＳＬよりも有意に高いことが認められた（図４Ｂ〜Ｃ）。さらに、ナイーブおよび免疫化マウスの両方において、抗原特異的Ｔ細胞の頻度は高い相関にあることが認められた（図１１Ａ〜Ｃ）。最後に、ＶＮＹＩＨＲＮＶおよびＶＮＹＬＨＲＮＶに特異的なＴ細胞の機能的結合活性は、２つの高度に免疫原性の非自己抗原である微小組織適合性抗原Ｈ７ａおよびＨ１３ａに特異的なＴ細胞と同様であったと評価された（図４Ｄ）。したがって、これらのＴＳＡは、非コード化とされる領域に由来するが、高い機能的な結合活性を有する非常に多量なＴ細胞によって認識された。これは、未変異生殖系配列を有するため、ＶＮＹＩＨＲＮＶ  ａｅＴＳＡについて特に注目すべきである。
【０１２４】
総合すると、これらの結果は、ＴＳＡ特異的Ｔ細胞の頻度は概してＴＳＡ免疫原性の重要なパラメータであることを示す。しかしながら、ＶＴＰＶＹＱＨＬは、その同族Ｔ細胞が非常に低い頻度で存在したにもかかわらず、ＥＬ４負荷に対する第２から最善までの保護を提供した（図３および４Ａ〜Ｃ）。白血病保護におけるＴ細胞増殖の重要性をより良く評価するために、１５０日目のＥＬ４細胞による再負荷後の長期生存マウスにおける四量体＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を評価した（図３）。これらの分析は、２１０日目に、または死亡の時点（ＶＮＹＩＨＲＮＶ−プライム化マウスの場合）に実施した。ＶＴＰＶＹＱＨＬ免疫化マウスを含む全ての長期生存マウスは、ＴＳＡ特異的（四量体＋）ＣＤ８  Ｔ細胞の顕著な集団を示した（図１０Ｂ〜Ｃ）。ＶＮＹＩＨＲＮＶは、四量体＋細胞の大集団によって認識されたが、これは、本明細書で使用される実験条件における再負荷でのマウスを保護するのに十分ではなかった。
【０１２５】
実施例５：ＥＬ４細胞に対する保護のための抗原発現の重要性。
次に、免疫原性に対する抗原発現の影響を、０日目に注入したＥＬ４細胞集団におけるＴＳＡの量をＲＮＡレベルで査定することによって評価した（図３）。ＥＬ４細胞に対する最良の保護を付与するＴＳＡをコードする配列（ＶＮＹＬＨＲＮＶ）は、他のＴＳＡよりもはるかに高いレベルで発現されたことが認められた（図５Ａ）。これは、ＶＮＹＬＨＲＮＶが「クローン」（全てのＥＬ４細胞によって発現される）である可能性があり、高度に発現されるが、一方、他のＴＳＡはサブクローンであり、かつ／または低レベルで発現されることを示唆する。次に、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）ＭＳを使用して、再負荷に使用されるＥＬ４細胞集団における細胞あたりのＴＳＡコピー数を分析した（１５０日目、図５Ｂ）。ＲＮＡにおけるＴＳＡ存在量とペプチドレベルとの間には直線関係はなかった４０（図５Ａ〜Ｂ）。特に、最良のＴＳＡであるＶＮＹＬＨＲＮＶは、２つの最も多量なＴＳＡの１つだった（細胞あたり＞５００コピー）が、本明細書で使用される実験条件下で再負荷時に有意な保護をもたらさなかったＶＮＹＩＨＲＮＶ（図３Ｂ）は、ＥＬ４細胞でもはや検出されなかった。この結果は、ＶＮＹＩＨＲＮＶがサブクローナルＴＳＡであり、抗原損失が再負荷での有意な保護の欠如の最も可能性のある説明であることを示唆する。最後に、ＴＳＡは、ＤＣによって提示されたときには免疫原性であったが、ＥＬ４細胞によって提示されたときには免疫原性ではなかったことが注目され、ｉ）前免疫を伴わない生ＥＬ４細胞の注入は、ＴＳＡ特異的Ｔ細胞の有意な増殖を誘導せず、ｉｉ）放射線照射されたＥＬ４細胞による免疫は、生ＥＬ４細胞に対する有意な保護を与えなかった（図５Ｃ〜Ｄおよび図１０Ｄ）。これは、免疫が存在しないとき、高免疫原性ＴＳＡ（ＶＮＹＬＨＲＮＶなど）は、それがＤＣによって効率的に交差提示されなかったため無視され、癌免疫療法における効率的なＴ細胞プライミングの重要性を強調していることを示唆する。
【０１２６】
実施例６：非コード領域は、ヒト原発性腫瘍のＴＳＡランドスケープを拡大する。
非コード領域が２つのマウス細胞株におけるＴＳＡの主な供給源であることが確立され、本明細書に記載のプロテオゲノミクスアプローチを、７つのヒト原発性腫瘍試料である４つのＢ系統ＡＬＬおよび３つの肺癌に適用した。そうするために、マウス同系ｍＴＥＣｈｉからのＲＮＡ−Ｓｅｑデータを使用するよりも、心臓血管矯正手術を受ける６例の無関係ドナー由来の全ＴＥＣ（ｎ＝２）および精製ｍＴＥＣ（ｎ＝４）のトランスクリプトームを配列決定した。注目すべきこととして、最小限の個体間差が認められ、このコホートサイズは、ｍＴＥＣトランスクリプトームランドスケープのほぼ全幅を網羅するのに十分であることが示された（図１２Ａ〜Ｂ）。これらのＲＮＡ−Ｓｅｑデータを図１に記載されるワークフローのための正常ｋ−ｍｅｒのレパートリーとして使用して、３個のｍＴＳＡおよび２７個のａｅＴＳＡ候補を特定した（図６Ａ）。広範に検証されることに加えて、ｍＴＳＡが既知の生殖系多型と重ならないことも確実にされた。ａｅＴＳＡ候補のステータスをさらに検証するために、２８個の組織からのＲＮＡ−ＳｅｑデータにおけるａｅＴＳＡ  ＭＣＳの発現（組織あたり６〜５０個、図６Ｂおよび表６）を、マウスａｅＴＳＡに行われたものと同様に分析した（図２Ｃ）。これらのデータに基づき、６個のａｅＴＳＡ候補を除外し、ｉ）３個は広く発現され、最も以前に報告された過剰発現したＴＡＡ４８と同様であり、ｉｉ）３個は単一の臓器、肝臓において有意なレベルで発現された（図６Ｂ）。したがって、合計３個のｍＴＳＡおよび２０個の非冗長ａｅＴＳＡ候補が特定された（図６Ｃならびに表２ａ〜ｄおよび３ａ〜ｃ）。注目すべきこととして、ＳＬＴＡＬＶＦＨＶ  ａｅＴＳＡは、２つのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−陽性ＡＬＬによって共有された（表２ａおよび２ｄ）。このａｅＴＳＡは、リンパ系悪性腫瘍に関与する遺伝子であるＴＣＬ１Ａの３’ＵＴＲに由来する。総じて、結果は、本明細書に記載されるプロテオゲノミクスアプローチが、個別腫瘍におけるｍＴＳＡおよびａｅＴＳＡのレパートリーを約２週間で特徴付けることができることを示す。
【０１２７】
表
【０１２８】
【表１ａ】
2021534830.tif 000009
【０１２９】
【表１ｂ】
2021534830.tif 000010
【０１３０】
【表２ａ】
2021534830.tif 000011
【０１３１】
【表２ｂ】
2021534830.tif 000012
【０１３２】
【表２ｃ】
2021534830.tif 000013
【０１３３】
【表２ｄ】
2021534830.tif 000014
【０１３４】
【表３ａ】
2021534830.tif 000015
【０１３５】
【表３ｂ】
2021534830.tif 000016
【０１３６】
【表３ｃ】
2021534830.tif 000017
【０１３７】
【表４ａ】
2021534830.tif 000018
【０１３８】
【表４ｂ−１】
2021534830.tif 000019
【０１３９】
【表４ｂ−２】
2021534830.tif 000020
【０１４０】
【表４ｂ−３】
2021534830.tif 000021
【０１４１】
【表４ｂ−４】
2021534830.tif 000022
【０１４２】
【表５】
2021534830.tif 000023
【０１４３】
【表６−１】
2021534830.tif 000024
【０１４４】
【表６−２】
2021534830.tif 000025
【０１４５】
【表６−３】
2021534830.tif 000026
【０１４６】
【表６−４】
2021534830.tif 000027
【０１４７】
【表６−５】
2021534830.tif 000028
【０１４８】
【表６−６】
2021534830.tif 000029
【０１４９】
【表７ａ−１】
2021534830.tif 000030
【０１５０】
【表７ａ−２】
2021534830.tif 000031
【０１５１】
【表７ａ−３】
2021534830.tif 000032
【０１５２】
【表７ｂ−１】
2021534830.tif 000033
【０１５３】
【表７ｂ−２】
2021534830.tif 000034
【０１５４】
【表７ｂ−３】
2021534830.tif 000035
【０１５５】
本発明は、上記にその特定の実施形態によって説明されているが、添付の特許請求で定義されるように、本発明の精神および性質から逸脱することなく変更することができる。特許請求において、単語「含む」は、「含むがこれらに限定されない」という語句と実質的に同等の、制限のない用語として使用される。単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明示しない限り、対応する複数の参照物を含む。
【０１５６】
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３４．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｖｉｅｗｅｒ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，２４−２６（２０１１）．
３５．Ｂｅｒｅｍａｎ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ｔｏ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  １５，４７６３−４７６９（２０１６）．
３６．Ｙｕｅ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１５，３５５−３６４（２０１４）．
３７．Ｂａｒｂｏｓａ−Ｍｏｒａｉｓ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８，１５８７−１５９３（２０１２）．
３８．Ｐａｔｅｎａｕｄｅ，Ｊ．＆  Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ，Ｃ．Ｔｈｙｍｉｃ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｈａｖｅ  ａ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  Ｐｒｏｆｉｌｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９６，４７６０−４７７０（２０１６）．
３９．Ｓｔ−Ｐｉｅｒｒｅ，Ｃ．，Ｔｒｏｆｉｍｏｖ，Ａ．，Ｂｒｏｃｈｕ，Ｓ．，Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｓ．＆  Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ，Ｃ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ＡＩＲＥ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｄ  ＡＩＲＥ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｙｍｉｃ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９５，４９８−５０６（２０１５）．
４０．Ｄｕｍｏｎｔ−Ｌａｇａｃｅ，Ｍ．，Ｓｔ−Ｐｉｅｒｒｅ，Ｃ．＆  Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ，Ｃ．Ｓｅｘ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ｈａｖｅ  ｐｅｒｖａｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｙｍｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５，１２８９５（２０１５）．
４１．Ｄｕｍｏｎｔ−Ｌａｇａｃｅ，Ｍ．，Ｂｒｏｃｈｕ，Ｓ．，Ｓｔ−Ｐｉｅｒｒｅ，Ｃ．＆  Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ，Ｃ．Ａｄｕｌｔ  ｔｈｙｍｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｎｏｎｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９２，２２１９−２２２６（２０１４）．
４２．ｄｅ  Ｖｅｒｔｅｕｉｌ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ  ｓｈａｐｅ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９３，１１２１−１１３２（２０１４）．
４３．ｄｅ  Ｖｅｒｔｅｕｉｌ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｍｐｒｉｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎｄ  ｈａｓ  ａ  ｂｒｏａｄ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ９，２０３４−２０４７（２０１０）．
４４．Ｍｏｏｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｉｖｅ  ＣＤ４（＋）Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｖａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７，２０３−２１３（２００７）．
４５．Ｌｅｇｏｕｘ，Ｆ．Ｐ．＆  Ｍｏｏｎ，Ｊ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＭＨＣ  ｔｅｔｒａｍｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ（２０１２）．
４６．ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｈ．Ｉ．，Ｎａｈｉｌｌ，Ｓ．Ｒ．，Ｍａｃｉａｓｚｅｋ，Ｊ．Ｗ．＆  Ｗｅｌｓｈ，Ｒ．Ｍ．ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）：ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ＣＤ８＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４９，１３２６−１３３３（１９９２）．
４７．Ｃｈａｄｂｕｒｎ，Ａ．，Ｉｎｇｈｉｒａｍｉ，Ｇ．＆  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｄ．Ｍ．Ｈａｉｒｙ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＬｅｕＭ５（ＣＤ１１ｃ）ｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｂｅｎｉｇｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １３６，２９−３７（１９９０）．
４８．Ｎｅｓｖｉｚｈｓｋｉｉ，Ａ．Ｉ．Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｃｏｎｃｅｐｔｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，１１１４−１１２５（２０１４）．
４９．Ｎｏｂｌｅ，Ｗ．Ｓ．Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｓｔｓ  ｓｈｏｕｌｄ  ｓｅａｒｃｈ  ｏｎｌｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈｅｙ  ｃａｒｅ  ａｂｏｕｔ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，６０５−６０８（２０１５）．
５０．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．ＭＨＣ−Ｉ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｅａｒｃｈｅｓ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｄａｔａ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  １６，１８０６−１８１６（２０１７）．
５１．Ｇｒａｎａｄｏｓ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５，３６００（２０１４）．
５２．Ｂａｓｓａｎｉ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｐｌｅｔｓｃｈｅｒ−Ｆｒａｎｋｉｌｄ，Ｓ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｊ．＆  Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｔｒｏｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １４，６５８−６７３（２０１５）．
５３．Ｆｏｒｔｉｅｒ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｓ  ｍｏｌｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０５，５９５−６１０（２００８）．
５４．Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｋ．＆  Ｍｏｏｎ，Ｊ．Ｊ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｄｉｃｔａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８８，４１３５−４１４０（２０１２）．
５５．Ｏｂａｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｋｈａｎｎａ，Ｋ．Ｍ．＆  Ｌｅｆｒａｎｃｏｉｓ，Ｌ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｎａｉｖｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８，８５９−８６９（２００８）．
５６．Ｌａ  Ｇｒｕｔａ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ  ＣＴＬ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０，１８８５−１８９４（２０１０）．
５７．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｎ．，Ｇｅｂｈａｒｄｔ，Ｔ．，Ｃａｒｂｏｎｅ，Ｆ．Ｒ．＆  Ｈｅａｔｈ，Ｗ．Ｒ．Ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ，ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１，１３７−１６１（２０１３）．
５８．Ｂａａｔｅｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｔｉｎｏｃｏ，Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｔ．＆  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｌ．Ｍ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ：Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｑｕｉｎｔｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｍａｒｋｅｒ  ＣＤ４４．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３，２３（２０１２）．
５９．Ｌａｕｇｅｌ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ  ａｎｄ  ＣＤ８  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｇｏｖｅｒｎ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２，２３７９９−２３８１０（２００７）．
６０．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｄ．Ｍ．，Ｋｙｅｗｓｋｉ，Ｂ．＆  Ｆｅｕｅｒｅｒ，Ｍ．Ｒｅ−ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７，１１４−１２５（２０１６）．
６１．ＭｃＧｒａｎａｈａｎ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎａｌ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｅｌｉｃｉｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１，１４６３−１４６９（２０１６）．
６２．Ａｓｓａｒｓｓｏｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８，７８９０−７９０１（２００７）．
６３．Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｗ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｉｎ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｙ  Ｌｉｍｉｔ  ｔｈｅ  Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １１，ｅ０１５５１８９（２０１６）．
６４．Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．，Ｐｒｅｓｔｏｎ−Ｈｕｒｌｂｕｒｔ，Ｐ．，Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｃ．，Ｂａｒｌｏｗ，Ａ．＆  Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５３，６２２−６２７（１９９１）．
６５．Ｍｅｙｄａｎ，Ｃ．，Ｏｔｕ，Ｈ．Ｈ．＆  Ｓｅｚｅｒｍａｎ，Ｏ．Ｕ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  ａｌｌｅｌｅｓ  ｂｙ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｍｏｔｉｆ  ｍｉｎｉｎｇ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ１３（２０１３）．
６６．Ｓｚｐａｋｏｗｓｋｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｐｒｉｍａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｇｅｎｅ  ４４８，１５１−１６７（２００９）．
６７．Ｃａｐｉｅｔｔｏ，Ａ．Ｈ．，Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ，Ｓ．＆  Ｄｅｌａｍａｒｒｅ，Ｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｏｒ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４６，５８−６５（２０１７）．
６８．Ｈｅｌｆｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．ＧＭ−ＣＳＦ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｅ  ａ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１１ｃ（＋）ＭＨＣＩＩ（＋）Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４２，１１９７−１２１１（２０１５）．
６９．Ｗｉｍｍｅｒｓ，Ｆ．，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｌｔ，Ｇ．，Ｓｋｏｌｄ，Ａ．Ｅ．，Ｆｉｇｄｏｒ，Ｃ．Ｇ．＆  Ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｉ．Ｊ．Ｐａｒａｄｉｇｍ  Ｓｈｉｆｔ  ｉｎ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｆｒｏｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  ＤＣｓ  ｔｏ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＣ  Ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５，１６５（２０１４）．
７０．Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．＆  Ｍａｌｉｓｓｅｎ，Ｂ．Ａ  Ｄｅａｔｈ  Ｎｏｔｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ−Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＧＭ−ＣＳＦ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ？  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４２，９８８−９９０（２０１５）．
７１．Ｍｅｌｉｅｆ，Ｃ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｈａｌｌ，Ｔ．，Ａｒｅｎｓ，Ｒ．，Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ，Ｆ．＆  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ，Ｓ．Ｈ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２５，３４０１−３４１２（２０１５）．
７２．Ｇｕｏ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ．Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１９，４２１−４７５（２０１３）．
７３．Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １１，５０９−５２４（２０１４）．
７４．Ｂａｒｕｃｈ，Ｅ．Ｎ．，Ｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．，Ｂｅｓｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｊ．＆  Ｍａｒｋｅｌ，Ｇ．Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｏｂｓｔａｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  １２３，２１５４−２１６２（２０１７）．
７５．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．＆  Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｓ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，６２−６８（２０１５）．
７６．Ｓｔｏｅｃｋｌｅ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｍｕｓ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ，ｅ５０９５１（２０１３）．
７７．Ｍａｒｃａｉｓ，Ｇ．＆  Ｋｉｎｇｓｆｏｒｄ，Ｃ．Ａ  ｆａｓｔ，ｌｏｃｋ−ｆｒｅｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｋ−ｍｅｒｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，７６４−７７０（２０１１）．
１ａ．Ｌａｎｏｉｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＨＣ  Ｉ  ｉｍｍｕｎｏｐｅｐｔｉｄｏｍｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，ｅ１７００２５１（２０１８）．
２ａ．Ｋｉｍ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｈａｄｒａｃｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｗａｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．＆  Ｓｅｒｗｏｌｄ，Ｔ．Ｙｏｕｎｇ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｔｈｙｍｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｇｒａｆｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ｔｈｙｍｕｓｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９４，４７８４−４７９５（２０１５）．
３ａ．Ｓｔｏｅｃｋｌｅ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｍｕｓ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ，ｅ５０９５１（２０１３）．
４ａ．Ｄｏｂｉｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．ＳＴＡＲ：Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ａｌｉｇｎｅｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２９，１５−２１（２０１３）．
５ａ．Ｄａｏｕｄａ，Ｔ．，Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ，Ｃ．＆  Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｓ．ｐｙＧｅｎｏ：Ａ  ｐｙｔｈｏｎ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｆ１０００Ｒｅｓ  ５，３８１（２０１６）．
６ａ．Ｍａｒｃａｉｓ，Ｇ．＆  Ｋｉｎｇｓｆｏｒｄ，Ｃ．Ａ  ｆａｓｔ，ｌｏｃｋ−ｆｒｅｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｋ−ｍｅｒｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，７６４−７７０（２０１１）．
７ａ．Ｃａｒｏｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＭＨＣ  Ｉ  ｉｍｍｕｎｏｐｅｐｔｉｄｏｍｅ  ｃｏｎｖｅｙｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ７，５３３（２０１１）．
８ａ．Ａｎｄｒｅａｔｔａ，Ｍ．＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｇａｐｐｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３２，５１１−５１７（２０１６）．
９ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｖｉｅｗｅｒ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，２４−２６（２０１１）．
１０ａ．Ｙｕｅ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１５，３５５−３６４（２０１４）．
１１ａ．Ｓｌｏａｎ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．ＥＮＣＯＤＥ  ｄａｔａ  ａｔ  ｔｈｅ  ＥＮＣＯＤＥ  ｐｏｒｔａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４，Ｄ７２６−７３２（２０１６）．
１２ａ．Ｂｅｒｅｍａｎ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  １５，４７６３−４７６９（２０１６）．
１３ａ．ｄｅ  Ｖｅｒｔｅｕｉｌ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｍｐｒｉｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎｄ  ｈａｓ  ａ  ｂｒｏａｄ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ９，２０３４−２０４７（２０１０）．
１４ａ．Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｖｉｄｉｔｙ．Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０，３７−４５（２０１４）．
１５ａ．Ｍｏｏｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｉｖｅ  ＣＤ４（＋）Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｖａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７，２０３−２１３（２００７）．
１６ａ．Ｌｅｇｏｕｘ，Ｆ．Ｐ．＆  Ｍｏｏｎ，Ｊ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＭＨＣ  ｔｅｔｒａｍｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ  ６８，４４２０（２０１２）．
１７ａ．ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｈ．Ｉ．，Ｎａｈｉｌｌ，Ｓ．Ｒ．，Ｍａｃｉａｓｚｅｋ，Ｊ．Ｗ．＆  Ｗｅｌｓｈ，Ｒ．Ｍ．ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）：Ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ＣＤ８＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４９，１３２６−１３３３（１９９２）．
１８ａ．Ｃｈａｄｂｕｒｎ，Ａ．，Ｉｎｇｈｉｒａｍｉ，Ｇ．＆  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｄ．Ｍ．Ｈａｉｒｙ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＬｅｕＭ５（ＣＤ１１ｃ）ｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｂｅｎｉｇｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １３６，２９−３７（１９９０）
１９ａ．Ｖｉｚｃａｉｎｏ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２０１６  ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＲＩＤＥ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏｏｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４，１１０３３（２０１６）．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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