(57)【要約】本発明は、ＳＡＲＭ１活性の阻害剤として有用な組成物、その医薬組成物およびそれらを使用する方法を提供する。本発明は、神経変性のまたは神経学的の疾患または障害の治療に有用なドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子、その医薬組成物、およびそれらを使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＡＲＭ１分子を含む組成物であって、ＳＡＲＭ１が、損傷または傷害の後に軸索の断片化を予防する少なくとも１つのアミノ酸変化を有する、組成物。
【請求項２】
前記ＳＡＲＭ１分子が、アミノ酸１〜２５に対応する領域、アミノ酸２５〜５０に対応する領域、アミノ酸５０〜７５に対応する領域、アミノ酸７５〜１００に対応する領域、アミノ酸１００〜１２５に対応する領域、アミノ酸１２５〜１５０に対応する領域、アミノ酸１５０〜１７５に対応する領域、アミノ酸１７５〜２００に対応する領域、アミノ酸２００〜２２５に対応する領域、アミノ酸２２５〜２５０に対応する領域、アミノ酸２５０〜２７５に対応する領域、アミノ酸２７５〜３００に対応する領域、アミノ酸３００〜３２５に対応する領域中、アミノ酸３２５〜３５０に対応する領域中に、アミノ酸３５０〜３７５に対応する領域中、アミノ酸３７５〜４００対応する領域中、アミノ酸４００〜４２５に対応する領域中、アミノ酸４２５〜４５０に対応する領域中、アミノ酸４５０〜４７５に対応する領域中、アミノ酸４７５〜５００に対応する領域中、アミノ酸５００〜５２５に対応する領域中、アミノ酸５２５〜５５０に対応する領域中、アミノ酸５５０〜５７５に対応する領域中、アミノ酸５７５〜６００に対応する領域中、アミノ酸６００〜６２５に対応する領域中、アミノ酸６２５〜６５０に対応する領域中、アミノ酸６５０〜６７５に対応する領域中、アミノ酸６７５〜７００に対応する領域中、アミノ酸７００〜７２４に対応する領域中またはこれらの組み合わせからなる群において、少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＳＡＲＭ１分子が、アミノ酸１７５〜２００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＳＡＲＭ１分子が、アミノ酸６５０〜６７５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＳＡＲＭ１分子が、アミノ酸６７５〜７００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＳＡＲＭ１分子が、アミノ酸６７５〜７００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異をさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＳＡＲＭ１分子が、アミノ酸６５０〜６７５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＳＡＲＭ１分子が、１９３に対応する残基にアミノ酸置換を含む、請求項１、３、６または７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＳＡＲＭ１分子が、６８５に対応する残基にアミノ酸置換を含む、請求項１、５または７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＳＡＲＭ１分子が、１９３に対応する残基にアミノ酸置換を、および６８５に対応する残基にアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
５７５〜６００に対応する領域中の少なくとも１つの突然変異が５９７に対応する残基にある、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
５５０〜５７５に対応する領域中の少なくとも１つの突然変異が５７０に対応する残基にある、請求項２に記載の組成物。
【請求項１３】
１７５〜２００に対応する領域中の少なくとも１つの突然変異が１８９または１９０に対応する残基にある、請求項２に記載の組成物。
【請求項１４】
医薬組成物である、請求項１〜１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜７または１０〜１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＭ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノウイルスである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
アデノ随伴ウイルスである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載のウイルスベクターを含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜７または１０〜１３に記載のドミナントネガティブＳＡＲＭ１をコードするオープンリーディングフレームを含むゲノムを有する単離ウイルス粒子を含む医薬組成物。
【請求項２１】
単離ウイルス粒子がアデノ随伴ウイルスのビリオンである、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ドミナントネガティブＳＡＲＭ１をコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１が、配列番号１との配列アラインメントによって決定した場合に、位置１９３および位置６８５にアミノ酸置換を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
【請求項２３】
ヒトまたは非ヒトアデノ随伴ウイルスを使用して生成される、請求項２２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載のＡＡＶベクターおよび医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項２５】
内在的に発現しているＳＡＲＭ１の活性を阻害するおよび／またはそれを必要とする対象において神経変性もしくは神経性の疾患もしくは障害を治療する方法であって、有効量の、請求項１〜７、１０〜１３または１５〜２４のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２６】
神経変性または神経性の疾患または障害が、軸索変性、軸索傷害、軸索障害、脱髄性疾患、橋中心髄鞘崩壊症、神経損傷疾患または障害、代謝疾患、ミトコンドリア性疾患、代謝性軸索変性、白質脳症または白質ジストロフィーに起因する軸索傷害と関係がある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
神経変性または神経性の疾患または障害が、脊髄損傷、卒中、多発性硬化症、進行性多巣性白質脳症、先天性ミエリン形成不全、脳脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、橋中心ミエリン分解、浸透圧性低ナトリウム血症、低酸素脱髄、虚血性脱髄、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ニーマンピック病、ペリツェウスメルツバッヘル病、脳室周囲白質軟化症、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ワーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、テイ−サックス病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、外傷性脳損傷、放射線後損傷、化学療法の神経学的合併症（化学療法誘導性神経障害；ＣＩＰＮ）、神経障害、急性虚血性視神経症、ビタミンＢ１２欠乏症、単独ビタミンＥ欠乏症候群、バッセン−コーンツヴァイク症候群、緑内障、レーバー遺伝性視神経萎縮症、レーバー先天黒内障、視神経脊髄炎、異染性白質ジストロフィー、急性出血性白質脳炎、三叉神経痛、ベル麻痺、脳虚血、多系統萎縮症、外傷性緑内障、熱帯性痙性不全対麻痺ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）関連脊髄症、西ナイルウイルス脳症、ラクロスウイルス脳炎、ブニヤウイルス脳炎、小児ウイルス脳炎、本態性振戦、シャルコー−マリー−トゥース病、運動ニューロン疾患、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー（ＨＳＡＮ）、副腎脊髄神経障害、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、フリートライヒ運動失調症、遺伝性運動失調症、騒音性難聴、前頭側頭認知症、鋭角緑内障および先天性難聴からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
それを必要とする対象において軸索障害を治療する方法であって、有効量の、請求項１〜７、１０〜１３または１５〜２４のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２９】
ＳＡＲＭ１活性を阻害する方法であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子とＳＡＲＭ１を接触させることを含む方法。
【請求項３０】
治療期間中に組成物が対象に一回投与される、請求項２５または２７に記載の方法。
【請求項３１】
治療期間中に組成物が２回以上対象に投与される、請求項２５または２７に記載の方法。
【請求項３２】
対象がヒトである、請求項２５または２７に記載の方法。
【請求項３３】
対象が、げっ歯類、家畜動物、伴侶動物または動物園の動物からなる群から選択される、請求項２５または２７に記載の方法。
【請求項３４】
家畜動物が、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマおよびアルパカからなる群から選択される請求項３２に記載の方法。さらに別の実施形態では、対象は伴侶動物でもよい。
【請求項３５】
伴侶動物が、イヌ、ネコ、ウサギおよびトリからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月１８日に出願された米国特許仮出願第６２／５７３，９６７号、および２０１８年３月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／６４４，０９０号の利益を主張し、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた助成金番号ＮＳ０８７６３２およびＮＳ０９１４４８のもとで政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本開示は、一般に、ＳＡＲＭ１活性の阻害に、および／または神経変性もしくは神経性の疾患もしくは障害を治療するのに有用な、様々な組成物および方法に関する。特に、本開示は、遺伝子療法で使用するための、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【背景技術】
【０００４】
背景
軸索変性は、末梢神経障害、外傷性脳損傷および神経変性疾患を含めたいくつかの神経障害の顕著な特徴である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Gerdts et al. , SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD(+) destruction. Science 348 2016, pp. 453-457）。パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症では、例えば、軸索変性は、症状の発症および広範な神経細胞の消失に先立つ初期イベントである（Kurowska et al., 2017；Fischer et al., Axonal degeneration in motor neuron disease Neurodegener. Dis. 4 2007 pp. 431 -442；これらの両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、軸索変性プログラムの分子基礎を標的にする、神経変性障害のための新規な治療選択肢の開発が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
様々な態様の中で、本開示は、軸索変性または軸索障害をともなう多くの神経障害に対する治療介入として使用するためのドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本発明は、軸索変性、軸索障害および軸索変性をともなう神経性の疾患および障害を予防または改善するために、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子療法ベクター中に提供される。いくつかの実施形態では、本開示は、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＡＤ＋の低減または枯渇に起因する軸索変性を含めて、軸索変性を阻害するために、ＡＡＶベクターを含む組成物およびＡＡＶベクターの使用方法も提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、軸索分解と関係がある神経障害または軸索障害を治療する方法を提供する。いくつかのそのような実施形態では、軸索分解と関係がある神経障害または軸索障害は、遺伝性または先天性の神経障害または軸索障害から選択される。いくつかの実施形態では、軸索分解と関係がある神経障害または軸索障害は、末梢神経障害、緑内障、外傷性脳損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ヘルペス感染症、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、脱髄性疾患、虚血または卒中、化学的損傷、熱傷およびＡＩＤＳから選択されるかまたはこれらと関係がある。いくつかの実施形態では、軸索分解と関係がある神経障害または軸索障害は、パーキンソン病または非パーキンソン病およびアルツハイマー病から選択される。
【０００９】
本開示の組成物および本開示の組成物を含む医薬的に許容可能な組成物は、本発明のドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子との相互作用を介して、内在ＳＡＲＭ１活性の強力な阻害剤として有効であることが、今や見出されている。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子は、アミノ酸１７５〜２００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子は、アミノ酸６５０〜６７５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子は、アミノ酸６７５〜７００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子は、アミノ酸１７５〜２００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、およびアミノ酸６７５〜７００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子は、アミノ酸１７５〜２００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸６５０〜６７５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、およびアミノ酸６７５〜７００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子は、１９３に対応する残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子は、６８５に対応する残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子は、１９３に対応する残基にアミノ酸置換を、および６８５に対応する残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子は、軸索切断後３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間またはそれ以上で、約０．４以下の変性指数をもたらす。
【００１０】
複数の実施形態が開示されているが、本発明の例示的実施形態を示し、説明する以下の詳細な説明から、本発明のさらに他の実施形態が当業者に明らかとなるであろう。したがって、図および詳細な説明は、本質的に例示であり、限定的でないとみなされる。
【００１１】
図面の簡単な説明
出願ファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面をともなう本特許出願公開コピーは、要求し、必要な手数料を支払うことによって特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄおよび図１Ｅは、ＳＡＲＭ１ドミナントネガティブ導入遺伝子の同定を示す。図１ＡはヒトＳＡＲＭ１のドメイン構造の概略図である。個々の点突然変異を赤色で示す。ドットのセグメントは欠失領域を示す。省略形：デルタＴＩＲ−アミノ酸（ａａ）１〜２７および５６０〜７２４の欠失；ｍｔ−ミトコンドリア結合配列；ＡＲＭ−ＨＥＡＴ／アルマジロモチーフ；ＳＡＭ−ステライルアルファモチーフ；ＴＩＲ−Ｔｏｌｌ様インターロイキン受容体ドメイン。図１Ｂは、示されるコンストラクトを発現する野生型後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの軸索またはＥＧＦＰ−ベクターを発現するＳＡＲＭ１−ＫＯ  ＤＲＧニューロンの軸索を切断し、示された時点で、ハイスループット自動画像化を使用して画像化したことを示す。０（完全にインタクト）から１（完全に断片化）の範囲である変性指数（ＤＩ）を使用して、ＡｘＤを定量化した。３つの独立の実験の平均±標準誤差（ＳＥＭ）を示し、それぞれ、条件および実験あたり５ウェルの平均を示す。ウェルあたり１０〜１５画像のＤＩを平均した。二元配置ＡＮＯＶＡでデータを検定し、これは、群の有意な主効果Ｆ（６，１４）＝２５．５７；Ｐ＜０．０００１；時間：Ｆ（７，９８）＝１３８、Ｐ＜０．０００１；および相互作用Ｆ（４２，９８）＝８．８０９；Ｐ＜０．０００１を示す；事後ダネット多重比較検定＊＊＊＊Ｐ＝０．０００１；ベクター対デルタＴＩＲ：＊＊Ｐ＝０．００１３＊Ｐ＝０．０１２２；ベクター対Ｋ５９７Ｅ＊＊Ｐ＝０．００１５）。図１Ｃ上段：軸索切断から２４時間後に撮った、示されるコンストラクトを発現する野生型軸索またはＳＡＲＭ１−ＫＯ軸索の代表的な明視野顕微鏡写真。下段：上の段に示すものと同じ軸索において、赤色蛍光性テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）を用いてミトコンドリア電位をモニターした。ミトコンドリアの膜電位が失われると、赤色蛍光シグナルは見えなくなる。図１Ｄは、酵素的に活性な野生型（ＷＴ）ＳＡＲＭ１または示されるコンストラクトのいずれかを発現するＳＡＲＭ１−ＫＯニューロンの軸索を切断し、経時的にＡｘＤを測定したことを示す。データは平均±ＳＥＭとして示す。二元配置ＡＮＯＶＡは、群の有意な主効果Ｆ（５，１２）＝１２２．５、Ｐ＜０．０００１；時間（Ｆ４，４８）＝１２４、Ｐ＜０．００１および相互作用Ｆ（２０，４８）＝３８．９４、Ｐ＜０．０００１を示す；ダネット多重比較；＊＊＊＊Ｐ＝０．０００１；ｎ＝３つの独立の実験；実験あたり４ウェルを平均した。図１Ｅは、切断から７２時間後の、（Ｄ）に示されるコンストラクトを発現するＳＡＲＭ１−ＫＯ軸索の代表的な明視野画像である。（Ｃ、Ｅ）スケールバー５０μｍ。
【図１Ｂ】同上
【図１Ｃ】同上
【図１Ｄ】同上
【図１Ｅ】同上
【００１３】
【図２Ａ】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅおよび図２Ｆは、ＳＡＲＭ１−ＣＤＮが野生型ＳＡＲＭ１の機能を強力に阻害することを示す。図２Ａは、ＥＧＦＰ−ベクターまたはＳＡＲＭ１−複合ドミナントネガティブ（ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ）を発現する野生型ＤＲＧニューロンおよびＥＧＦＰ−ベクターを発現するＳＡＲＭ１  ＫＯニューロンの切断後の変性を示す。変性指数は０（完璧にインタクト）から１（完璧に断片化）の範囲である。データは平均±ＳＥＭとして示し、二元配置ＡＮＯＶＡで検定し、これは、群の有意な主効果Ｆ（２，９）＝２７１０、Ｐ＜０．０００１；時間（Ｆ８，７２）＝２９８．７、Ｐ＜０．０００１および相互作用Ｆ（１６，７２）＝１５４、Ｐ＜０．０００１を示す。ダネット多重比較検定、ベクター対ＳＡＲＭ１−ＣＤＮおよびＳＡＲＭ１−ＫＯ、＊＊＊＊Ｐ＝０．０００１。図２Ｂおよび図２Ｃは、軸索切断から９６時間後の、（図２Ａ）に示すコンストラクトを発現する軸索の代表的な明視野（図２Ｂ）およびＴＭＲＭ（図２Ｃ）画像を示す。（図２Ｄ）ＨＰＬＣを使用して、切断してから４時間の軸索抽出物から、ＥＧＦＰ−ベクターまたはＳＡＲＭ１−ＣＤＮを発現する野生型およびＳＡＲＭ１−ＫＯニューロンにおけるＮＡＤ＋レベルを測定し、ベースライン（＝切断直後）に対して正規化した。一元配置ＡＮＯＶＡは、有意な主効果Ｆ（２，６）＝２０．０１、Ｐ＝０．００２２を示す；事後チューキー多重比較検定は、ベクター対ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ＊＊Ｐ＝０．００３６、ベクター対ＳＡＲＭ１−ＫＯ＊＊Ｐ＝０．００３９、ＳＡＲＭ１−ＫＯ対ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ  Ｐ＝０．９９６９を示す。条件および実験あたり、４ウェルからの結果を含むｎ＝３の独立の実験を平均した。図２Ｅは、ＥＧＦＰ−ベクターまたはＳＡＲＭ１−ＣＤＮを発現する野生型ＤＲＧニューロンおよびＳＡＲＭ１−ＫＯニューロンを４０ｎＭビンクリスチンまたは媒体で処理し、変性指数を使用してＡｘＤを決定した。平均±ＳＥＭとしてデータを示す。二元配置ＡＮＯＶＡは群の有意な主効果Ｆ（３，８）＝２５９．６；Ｐ＜０．０００１；時間Ｆ（５，４０）＝８９．２８、Ｐ＜０．０００１；および相互作用Ｆ（１５，４０）＝３８．５９；Ｐ＜０．０００１を示す；事後ダネット多重比較検定は、野生型ベクタービンクリスチン対ＳＡＲＭ１−ＣＤＮビンクリスチン、ＳＡＲＭ１−ＫＯビンクリスチンおよびＳＡＲＭ１−ＫＯ媒体、＊＊＊＊Ｐ＝０．０００１を示す；各実験において条件あたり２〜４ウェルを含む、ｎ＝３の独立の実験。図２Ｆは、ビンクリスチン投与から９６時間後の、（図２Ｄ）に示されるコンストラクトの代表的な明視野（上段）およびＴＭＲＭ（下段）画像を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図２Ｂ】同上
【図２Ｃ】同上
【図２Ｄ】同上
【図２Ｅ】同上
【図２Ｆ】同上
【００１４】
【図３Ａ】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄおよび図３Ｅは、ＳＡＲＭ１−ＣＤＮがインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でＤＲＧを効率的に形質導入し、ＡｘＤから保護することを示す。図３Ａ上段：ニューロン特異的ヒトシナプシンプロモーターの制御化にあるＫ１９３およびＨ６８５で突然変異したヒトＳＡＲＭ１を発現するＡＡＶベクター（Ｓｙｎ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ−ＥＧＦＰ）の概略図。下段：対照実験に使用するＥＧＦＰ−ベクター（Ｓｙｎ−ＥＧＦＰ）の概略図。図３Ｂ：出生後日数１１または１２（Ｐ１１／１２）のマウスにＡＡＶ８−Ｓｙｎ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ−ＥＧＦＰまたはＥＧＦＰ−ベクター（ＡＡＶ８−Ｓｙｎ−ＥＧＦＰ）を髄腔内注射した（６×１０１１ｖｇ）。５週間後、右坐骨神経を切断し、５日後、解析用に組織を収集した。図３Ｃは、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で撮った、ＡＡＶ８−Ｓｙｎ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ−ＥＧＦＰの注射から５．５週間後の、（左から右に）脊髄（ＳＣ）に結合した後根神経節（アスタリスク）、その分岐（矢尻）を有する左（非損傷）坐骨神経（矢印）、および緑色蛍光タンパク質を発現する肋間神経（白色矢尻）の代表的な顕微鏡写真である。ｍ−筋肉、スケールバー：２ｍｍ。図３Ｄは、ＥＧＦＰ−ベクター（左カラム；Ｓｙｎ−ＥＧＦＰ）またはＳＡＲＭ１−ＣＤＮ（右カラム；Ｓｙｎ−ＳＡＲＭ１−ＤＮ−ＥＧＦＰ）を注射した後の後根神経節の６μｍ厚切片の代表的な共焦点画像を示す。ＰＧＰ９．５（赤；後根神経節ニューロン）および抗ＧＦＰ（緑；コンストラクト発現）で切片を染色し、これに、ＤＡＰＩ（青；核マーカー）を含むＶｅｃｔａｍｏｕｎｔを用いてカバーガラスをかけた。図３Ｅは、ＥＧＦＰ−ベクター（Ｓｙｎ−ＥＧＦＰ；左カラム）またはＳＡＲＭ１−ＣＤＮ（Ｓｙｎ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ−ＥＧＦＰ；右カラム）を注射したマウスにおいて切断してから５日後に撮った、右（切断した）坐骨神経の６μｍ厚切片の代表的な共焦点画像である。切片は、神経フィラメント２００およびペリフェリン（赤；軸索マーカー）ならびに緑色蛍光タンパク質（緑；コンストラクト発現）に対して抗体で染色し、ＤＡＰＩ（青；核マーカー）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いてマウントした。（図３Ｄ、図３Ｅ）スケールバー：５０μｍ。
【図３Ｂ】同上
【図３Ｃ】同上
【図３Ｄ】同上
【図３Ｅ】同上
【００１５】
【図４Ａ】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ、図４Ｆおよび図４Ｇは、ＳＡＲＭ１−ＣＤＮが、ＳＡＲＭ１−ＫＯと同様の効力で、インビボでＡｘＤから保護することを示す。（図４Ａ、図４Ｂ）ベクター（Ａ；ｎ＝４）またはＳＡＲＭ１−ＣＤＮ（ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ）（Ｂ；ｎ＝５）を注射したマウスの坐骨神経の切断から５日後の右腓腹神経のトルイジンブルー染色した半薄横断切片の代表的な顕微鏡写真。（Ａ’Ｂ’）（図４Ａ）および（図４Ｂ）において長方形で示した領域の拡大。矢印および矢尻は、それぞれ、脂質を帯びた組織球およびミエリンの残屑を示す。（図４Ｃ、図４Ｄ）ＥＧＦＰ−ベクターを注射したマウスの右腓腹神経の代表的な電子顕微鏡写真であり、内部神経構造が完全に消失している（図４Ｃ）が、ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ注射後に、無髄（アスタリスク）および有髄軸索は維持されていることを示す（図４Ｄ）。（Ｃ’、Ｄ’）（図４Ｃ）および（図４Ｄ）において長方形で示した領域の拡大。（図４Ｅ、図４Ｆ）切断してから５（図４Ｅ）および１０（図４Ｆ）日後に、ベクター（Ｅでｎ＝４；Ｆでｎ＝３）もしくはＳＡＲＭ１−ＣＤＮ（Ｅでｎ＝５、Ｆでｎ＝３）を注射した野生型マウスにおいて、またはＳＡＲＭ１−ＫＯマウス（ＥおよびＦでｎ＝５）において、全腓腹神経の横断切片中のすべての軸索を数え、これを、それぞれのインタクトな対側部の軸索数の％として表した。一元配置ＡＮＯＶＡは、（図４Ｅ）［Ｆ（２，１１）＝９７．１３、Ｐ＜０．０００１；事後チューキー多重比較検定は、ベクター対ＳＡＲＭ１−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ベクター対ＳＡＲＭ１−ＫＯ＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ対ＳＡＲＭ１−ＫＯ  Ｐ＝０．５９５３を示す］、および（図４Ｆ）［Ｆ（２，８）＝２０．７３；Ｐ＝０．０００７；チューキー多重比較検定は、ベクター対ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ＊＊Ｐ＝０．００７７；ベクター対ＳＡＲＭ１−ＫＯ＊＊＊Ｐ＝０．０００５；ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ対ＳＡＲＭ１−ＫＯ  Ｐ＝０．２５４３を示す］において、有意な主効果を示す。（図４Ｇ）切断から１０日後の、腓腹神経のトルイジンブルー染色切片の代表的な顕微鏡写真。下段は、上の画像中に示された領域の拡大を示す。スケールバー：（Ａ、Ｂ）５０μｍ、（Ａ’、Ｂ’）１０μｍ、（Ｃ、Ｄ）５μｍ、（Ｃ’、Ｄ’）１μｍ、（Ｇ、上部）５０μｍ、（Ｇ、下部）１０μｍ。
【図４Ｂ】同上
【図４Ｃ】同上
【図４Ｄ】同上
【図４Ｅ−Ｆ】同上
【図４Ｇ】同上
【００１６】
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂ。ＤＲＧニューロンの形質導入効率（図５Ａ）。ｖｅｎｕｓ（緑）でタグされたＳＡＲＭ１ドミナントネガティブ突然変異型を発現するレンチウイルスで形質導入し、ヘキスト３３３４２で対比染色して核（青）を標識したＤＲＧニューロンの代表的な顕微鏡写真。（図５Ｂ）ＳＡＲＭ１−ドミナントネガティブを発現するヘキスト陽性細胞の平均±ＳＥＭ。ウェルあたり１００細胞より多くを数え、各コンストラクトについて、少なくとも３つの独立の実験からのデータを平均した。ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ＝ＳＡＲＭ１複合ドミナントネガティブ。
【図５Ｂ】同上
【００１７】
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、ＳＡＲＭ１ドミナントネガティブ導入遺伝子の比較を示す。（図６Ａ、図６Ｂ）示されるコンストラクトを発現する野生型後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの軸索を切断し、示された時点で、ハイスループット自動画像化を使用して画像化した。０（完全にインタクト）から１（完全に断片化）の範囲である変性指数（ＤＩ）を使用して、ＡｘＤを定量化した。３つの独立の実験の平均±標準誤差（ＳＥＭ）を示し、それぞれ、条件および実験あたり４ウェルの平均を示す。ウェルあたり少なくとも６画像のＤＩを平均した。（図６Ａ）二元配置ＡＮＯＶＡでデータを検定し、これは、群の有意な主効果Ｆ（４，１３）＝２２．７７；Ｐ＜０．０００１；時間：Ｆ（５，６５）＝４８．５９、Ｐ＜０．０００１；および相互作用Ｆ（２０，６５）＝１５．３１；Ｐ＜０．０００１を示し；事後チューキー多重比較検定は、Ｈ６８５ＡとＨ６８５Ｙの間またはＫ１９３ＲとＫ１９３Ａの間で統計的差異を示さない。ベクター対すべてのコンストラクト１２〜４８時間：＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ベクター対Ｋ１９３ＲおよびＫ１９３Ａ  ７２時間：＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ベクター対Ｈ６８５Ａ  ７２時間：＊＊Ｐ＝０．００４０；ベクター対Ｈ６８５Ｙ  ７２時間：＊Ｐ＝０．０２２５。（図６Ｂ）二元配置ＮＡＯＶＡでデータを検定しこれは、群の有意な主効果Ｆ（２，６）＝２２８．８、Ｐ＜０．０００１、時間Ｆ（５，３０）＝１８９．９、Ｐ＜０．０００１および相互作用Ｆ（１０，３０）＝５４．５３、Ｐ＜０．０００１を示す。チューキー多重比較検定、ベクター対ＳＡＲＭ１−Ｋ１９３Ｒ／Ｈ６８５Ａおよび対ＳＡＲＭ１−Ｋ１９３Ｒ／Ｈ１９４Ａ／Ｈ６８５Ａ＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＳＡＲＭ１  Ｋ１９３Ｒ／Ｈ６８５Ａ対ＳＡＲＭ１−Ｋ１９３Ｒ／Ｈ１９４Ａ／Ｈ６８５Ａ−統計的有意差なし。
【図６Ｂ】同上
【００１８】
【図７Ａ】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅおよび図７Ｆは、ＡＡＶ−ベクターを注射した後の非損傷坐骨神経とＡＡＶ−ＳＡＲＭ１ドミナントネガティブを注射した後の非損傷坐骨神経の間に形態計測的差異を示さない。（図７Ａ〜図７Ｄ）：（図７Ａ、図７Ｃ）ＥＧＦＰベクター（ＡＡＶ−Ｓｙｎ−ＥＧＦＰ）または（図７Ｂ、図７Ｄ）ＡＡＶ−Ｓｙｎ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ−ＥＧＦＰ（ＡＡＶ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ−ＥＧＦＰ）を注射したマウスの非損傷坐骨神経のトルイジンブルー染色した半薄横断切片の代表的な顕微鏡写真。図７Ｃおよび図７Ｄは、それぞれＡおよびＢの拡大である。ＡＡＶ８−Ｓｙｎ−ＥＧＦＰを注射したマウスとＡＡＶ８−Ｓｙｎ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ−ＥＧＦＰを注射したマウスの神経は、軸索のサイズ分布（図７Ｅ）または軸索の髄鞘形成の尺度であるＧ比（図７Ｆ）において有意差を示さない。多重（図７Ｅ）または単純（図７Ｆ）ｔ検定（群あたりｎ＝３）にデータをかけた。スケールバー、ＡおよびＢで２０μｍ；ＣおよびＤで１０μｍ。ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ＝ＳＡＲＭ１複合ドミナントネガティブ。
【図７Ｂ】同上
【図７Ｃ】同上
【図７Ｄ】同上
【図７Ｅ】同上
【図７Ｆ】同上
【００１９】
【図８Ａ】図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、ＳＡＲＭ１点突然変異を組み合わせることによって、ＳＡＲＭ１  ＫＯと同程度に強力に損傷誘導性軸索変性を予防する強力なドミナントネガティブがもたらされることを示す。点突然変異を組み合わせることが損傷誘導性軸索変性からの保護を増大させるかどうかを研究するために、本発明者らは、２つまたは３つの点突然変異を有するＳＡＲＭ１コンストラクトを生成した。Ｋ１９３Ｒ／Ｅ６４２ＡおよびＨ６８５Ａ／Ｅ６４２Ａは、Ｋ１９３ＲまたはＨ６８５Ａ単独よりも大きく軸索変性を予防しないが、Ｋ１９３ＲおよびＨ６８５Ａに点突然変異を有するＳＡＲＭ１コンストラクトを発現させることにより、少なくとも１２０時間にわたって、かつＳＡＲＭ１  ＫＯと同じ程度まで、軸索切断誘導性軸索変性が予防される。図８Ｂおよび図８Ｃは、２４時間（図８Ｂ）および９６時間（図４Ｃ）で撮った、Ａに示されるコンストラクトを発現する軸索の明視野画像を示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊ｐ＜０．０１；エラーバーはＳＥＭを示す。
【図８Ｂ】同上
【図８Ｃ】同上
【００２０】
【図９Ａ】図９Ａおよび図９Ｂは、ＳＡＲＭ１の２重および３重突然変異型の発現が、化学療法剤ビンクリスチンに対し、軸索完全性を維持することを示す。図９Ａは、示されるコンストラクト（ベクター、Ｋ１９３Ｒ／Ｅ６４２Ａ、Ｈ６８５Ａ／Ｅ６４２Ａ、Ｋ１９３Ｒ／Ｈ１９４Ａ／Ｈ６８５Ａ、Ｋ１９３Ｒ／Ｅ６４２Ａ、Ｈ６８５Ｙ）を発現する野生型（ＷＴ）ＤＲＧニューロン、または空ベクターを発現するＳＡＲＭ１  ＫＯ  ＤＲＧを４０ｎＭビンクリスチンとともにインキュベートし、示された時点で軸索変性を評価したことを示す。空ベクターを発現するＷＴ  ＤＲＧでは、軸索は２４時間までに変性し、ビンクリスチン投与から４８時間で完璧に断片化した。これに対して、ＳＡＲＭ１の２重および３重点突然変異を発現するＷＴ  ＤＲＧの軸索ならびにＳＡＲＭ１  ＫＯニューロンの軸索は、少なくとも１２０時間にわたってビンクリスチン誘導性軸索変性から保護される。図９Ｂは、ビンクリスチン投与から１２０時間後に撮った、Ａで評価した示されるコンストラクトの明視野写真を示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；エラーバーは±ＳＥＭを示す。
【図９Ｂ】同上
【００２１】
【図１０】図１０は、Ｋ１９３における多くのアミノ酸置換が、強力なドミナントネガティブＳＡＲＭ１コンストラクトを生成することを示す。ＳＡＲＭ１導入遺伝子は、示されるアミノ酸置換（Ｋ１９３Ａ、Ｋ１９３Ｅ、Ｋ１９３Ｑ、Ｋ１９３Ｍおよび上記のＫ１９３Ｒ）を用いて生成された。野生型軸索で発現させた場合、すべての示される突然変異型は強力なドミナントネガティブであり、軸索切断後に長期持続性軸索保護をもたらす。したがって、多種多様のアミノ酸タイプへのＫ１９３の突然変異は、強力なドミナントネガティブＳＡＲＭ１導入遺伝子を生成する。Ｋ１９３Ａが特に強力であることに留意されたい。
【００２２】
【図１１Ａ】図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃは、ドミナントネガティブとして作用するための個々の点突然変異型の効力を示す。図１１Ａ、野生型Ｓａｒｍ１（ＷＴ）、Ｅ１８９Ｋ、Ｈ１９０ＡまたはＣ１９９Ｓ突然変異を保有するウイルスを野生型ＣＤ１  ＤＲＧニューロンに感染させた。５日後、軸索を切断し、軸索変性の重症度（ＡＤＩ）をモニターした。Ｅ１８９ＫおよびＨ１９０Ａは、ＷＴ感染と比較して有意な保護を示したが、Ｃ１９９Ｓ突然変異はいかなる保護も与えなかった。図１１Ｂ、野生型Ｓａｒｍ１（ＷＴ）、Ｒ５７０Ａ突然変異を保有するウイルスを野生型ＣＤ１  ＤＲＧニューロンに感染させた。５日後、軸索を切断し、軸索変性の重症度（ＡＤＩ）をモニターした。Ｒ５７０Ａは、ＷＴと比較して有意な保護を示した。図１１Ｃは、示されるＳＡＲＭ１コンストラクトを発現するニューロンの軸索変性阻害能力を図で示す。ＳＡＲＭ１  Ｅ５６９Ｋ、Ｄ６２７Ｋ、Ｋ６２８ＤまたはＣ６２９Ｓを発現する軸索は、野生型と同様の速さで２４時間で変性し、これによって、これらはドミナントネガティブとして作用しないことが示される。
【図１１Ｂ】同上
【図１１Ｃ】同上
【発明を実施するための形態】
【００２３】
様々な実施形態への言及は本発明の範囲を限定しない。本明細書に示す図は本発明による様々な実施形態に対する限定ではなく、本発明の例示的な実例のために提示される。
【００２４】
詳細な説明
本開示は、一般に、軸索変性に起因する疾患および障害を予防または改善する方法および組成物を提供する。特に、軸索変性または軸索障害をともなう多くの神経障害に対する治療介入として使用するためのドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子が本明細書で提供される。
【００２５】
軸索変性（ＡｘＤ）は、末梢神経障害、外傷性脳損傷、パーキンソン病および緑内障を含めた最も広く認められる神経性疾患のいくつかの、初期の潜在的な開始イベントである（Howell et al., 2007, 2013；Johnson et al., 2013；Cashman and Hoeke, 2015；Tagliaferro and Burke, 2016；Bellucci et al., 2017）。ＡｘＤは多くの神経障害にとって中心的なものであるが、現在、軸索破壊を効果的に標的にする治療が存在しない。
【００２６】
ＡｘＤの機構を解明するかなりの進展があった。ＡｘＤを有意に遅延させる自然突然変異を持つワーラー変性遅延マウスの発見（Lunn et al., 1989）によって、切断部に対して遠位の軸索は受動的にではなく、代わりに、遺伝的にコードされるＡｘＤプログラムの活性化により変性することが明らかになった。最近、１つは無脊椎動物、１つは哺乳動物における、２つのバイアスがない大規模フォワード遺伝子スクリーニングが、この内在性ＡｘＤプログラムの中心的遂行体（ｃｅｎｔｒａｌ  ｅｘｅｃｕｔｉｏｎｅｒ）として、ステライルアルファおよびＴＩＲモチーフ含有タンパク質１（ｓｔｅｒｉｌｅ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ＴＩＲ  ｍｏｔｉｆ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）（ＳＡＲＭ１）を独立に同定した（Osterloh et al., 2012；Gerdts et al., 2013）。ＳＡＲＭ１の遺伝子欠失は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ）の嗅球遠位軸索の完全性を、切断後５０日を超えて顕著に保存し、マウスの坐骨神経遠位セグメントを、切断後２週間を超えて顕著に保存する。ＳＡＲＭ１はＡｘＤに必要なだけでなく、十分でもある（Gerdts et al., 2015）。健常な軸索におけるＳＡＲＭ１の活性化は、損傷がない場合でさえ、ＡｘＤをもたらす。したがって、ＳＡＲＭ１はＡｘＤプログラムの基本的な遂行体である（Gerdts et al., 2016）。
【００２７】
ＳＡＲＭ１の遺伝子欠失は、切断後だけでなく、末梢神経障害（Geisler et al., 2016；Turkiew et al., 2017）および外傷性脳損傷（Henninger et al., 2016；Ziogas and Koliatsos, 2018）を含めたいくつかの神経性の疾患のモデルにおいても、変性から軸索を保護する。この軸索保護は大きく向上した機能的転帰と関係があり、これは、ＳＡＲＭ１の標的化が、初期のＡｘＤを特徴とする神経性疾患を治療するための、実行可能な戦略であることを示唆する。重要なことに、ＳＡＲＭ１は主にニューロンで発現しており、ＳＡＲＭ１ノックアウトマウスは正常な寿命を有し、明白な行動異常がなく、これは、ＳＡＲＭ１の標的化が良好な忍容性を示し得ることを示唆する。残念ながら、現在、ＳＡＲＭ１活性を阻害する既知の薬物はない。
【００２８】
ＳＡＲＭ１は、構成的ホモ多量体化を媒介する自己阻害性Ｎ末端、すなわち直列型ＳＡＭドメインと遂行体ＴＩＲ  ＮＡＤａｓｅドメインからなるマルチドメインタンパク質である（Gerdts et al., 2013, 2016；Essuman et al., 2017）。損傷の際に、Ｎ末端阻害が解放されることにより、固有のＮＡＤａｓｅ酵素が活性化され、それによって、必須の代謝補助因子ＮＡＤ＋を切断し、ＡｘＤを引き起こすＴＩＲ−ＴＩＲ相互作用が可能になる（Gerdts et al., 2016；Essuman et al., 2017）。ＳＡＲＭ１はホモ多量体として存在するので、突然変異型ＳＡＲＭ１を野生型ＳＡＲＭ１と同時発現させると、野生型ＳＡＲＭ１機能をブロックするドミナントネガティブとして作用し得る（Gerdts et al., 2013）。ＴＩＲドメインを欠くＳＡＲＭ１は、おそらく、酵素を活性化するＴＩＲ−ＴＩＲ相互作用を乱すことによって、野生型ＳＡＲＭ１の機能を阻害する。さらに、本発明者らは、以前に、Ｎ末端の自己阻害、したがって、ＳＡＲＭ１の損傷誘導性活性化の解放に必要とされる、ＴＩＲドメイン中に高度に保存された残基を同定した（Summers et al., 2016）。このＳＡＲＭ１突然変異型（ＳＡＲＭ１−Ｋ５９７Ｅ）の発現は、野生型ＳＡＲＭ１の機能を阻害することによって、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でＡｘＤを遅らせる。野生型ニューロンにおいてこれらのＳＡＲＭ１ドミナントネガティブ突然変異型を発現させることは、病的ＡｘＤを阻害するが、どちらも、ＳＡＲＭ１がない場合と同程度に効果的には軸索消失をブロックしない。
【００２９】
開示される組成物を調製するのに使用される成分および本明細書に開示される方法内で使用される組成物それ自体が開示される。これらおよび他の材料は本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されている場合、それぞれの様々な個々のおよび集団的な組み合わせ、ならびにこれらの化合物の順列の具体的な言及は、明確に開示されない可能性があるが、それぞれが、本明細書において、具体的に企図され、記載されることが理解されよう。例えば、特定の化合物が開示され、述べられ、化合物のいくつかの分子に対して行うことができるいくつかの修飾が述べられる場合、そうでないと特に指示がない限り、化合物および修飾のありとあらゆる可能な組み合わせおよび順列が、具体的に企図される。したがって、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスが開示され、ならびに分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスおよび組み合わせ分子の例、Ａ−Ｄが開示される場合、たとえそれぞれが個々に列挙されないとしても、それぞれが、個々におよび集団的に、組み合わせ、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示されるとみなされると意味することが企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループは、開示されるとみなされるであろう。この概念は、限定されないが、開示される組成物を製造および使用する方法における工程を含めた、本出願のすべての態様に適用される。したがって、実施することができる様々なさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程のそれぞれは、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを用いて実施することができることが理解されよう。
【００３０】
様々な本発明の態様を以下のセクションでさらに詳細に記載する。
【００３１】
（Ｉ）組成物
（ａ）ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子
本開示の一態様は、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドおよびそれをコードする核酸を提供する。本明細書で使用する場合、用語「ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子」は、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドとドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドをコードする核酸の両方を包含するように使用される。例示的ドミナントネガティブポリペプチドおよびコード核酸は以下に記載される。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「ドミナントネガティブＳＡＲＭ１」は、野生型ＳＡＲＭ１ポリペプチドと相互作用することができ、野生型ＳＡＲＭ１ポリペプチドの機能を阻害することができる突然変異したＳＡＲＭ１ポリペプチドまたはそれをコードする核酸を指す。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子の投与は、内在性ＡｘＤプログラムの中心的遂行体として作用するという、内在ＳＡＲＭ１の機能を阻害する。特に、用語「突然変異型」、「突然変異した」または「突然変異」は、ＳＡＲＭ１を指す場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、付加または欠失を有することによって、その対応する野生型ポリペプチドと異なる、任意のポリペプチドまたはそれらの代表（例えば、トランケーションもしくは断片）を含むことが意図される。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例示的一実施形態では、アミノ酸置換はアルギニン置換である。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「ＳＡＲＭ１」は、「ＳＡＲＭ１タンパク質」および「ＳＡＲＭ１類似体」の両方を含む。別段指示がない限り、「タンパク質」は、タンパク質、タンパク質ドメイン、ポリペプチドまたはペプチドおよびそれらの任意の断片を含むものとする。ヒト野生型ＳＡＲＭ１タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。相同体は、例えば、手作業で、または一般に知られており、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎと称されるものなどの既知の相同性ベースの検索アルゴリズムを使用して、アミノ酸配列を比較することによって同定することができる。局所的配列アラインメントプログラム、例えばＢＬＡＳＴは、類似配列および配列ベースの類似性を測定するのに使用される概要期待値（ｓｕｍｍａｒｙ  Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）（Ｅ値）を見出すために、配列のデータベースを検索するのに使用することができる。特定の生物に対して最高のＥ値を有するタンパク質ヒットが必ずしもオルソログである、または唯一のオルソログであるとは限らないので、相互クエリ（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｑｕｅｒｙ）を本発明で使用して、オルソログの同定のために、有意なＥ値を有するヒット配列を選別する。相互クエリは、クエリタンパク質の配列と類似している基準生物からのアミノ酸配列のデータベースに対する有意なヒットの検索を必要とする。相互クエリの最高ヒットがクエリタンパク質それ自体であるか、または種分化後の重複遺伝子にコードされるタンパク質である場合、ヒットはオルソログである可能性がある。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、ヒトドミナントネガティブＳＡＲＭ１、マウスドミナントネガティブＳＡＲＭ１、ゼブラフィッシュドミナントネガティブＳＡＲＭ１、チンパンジードミナントネガティブＳＡＲＭ１、アカゲザルドミナントネガティブＳＡＲＭ１、イヌドミナントネガティブＳＡＲＭ１、ネコドミナントネガティブＳＡＲＭ１、ラットドミナントネガティブＳＡＲＭ１、ニワトリドミナントネガティブＳＡＲＭ１、ショウジョウバエドミナントネガティブＳＡＲＭ１、蚊ドミナントネガティブＳＡＲＭ１、線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）ドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはカエルドミナントネガティブＳＡＲＭ１である。
【００３４】
ある種の実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、アミノ酸１〜２５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸２５〜５０に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸５０〜７５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸７５〜１００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸１００〜１２５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸１２５〜１５０に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸１５０〜１７５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸１７５〜２００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸２００〜２２５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸２２５〜２５０に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸２５０〜２７５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸２７５〜３００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸３００〜３２５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸３２５〜３５０に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸３５０〜３７５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸３７５〜４００対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸４００〜４２５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸４２５〜４５０に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸４５０〜４７５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸４７５〜５００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸５００〜５２５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸５２５〜５５０に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸５５０〜５７５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸５７５〜６００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸６００〜６２５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸６２５〜６５０に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸６５０〜６７５に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸６７５〜７００に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、アミノ酸７００〜７２４に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１中の突然変異の位置は、配列番号１との配列アラインメントによって決定される。別の態様では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、アミノ酸６２５〜６５０に対応する領域中に少なくとも１つの突然変異を含み、６４２に対応するアミノ酸は突然変異していない。一態様では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、１９３に対応する残基にアミノ酸置換を含む。別の態様では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、６８５に対応する残基にアミノ酸置換を含む。さらに別の態様では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、１９３に対応する残基にアミノ酸置換を、および６８５に対応する残基にアミノ酸置換を含む。さらになお別の態様では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、１９３に対応する残基におけるアミノ酸置換および６８５に対応する残基におけるアミノ酸置換から本質的になる。別の態様では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、１９３に対応する残基におけるアミノ酸置換および６８５に対応する残基におけるアミノ酸置換からなる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、配列番号１、３、４、５、６、７、８、１０、１３または１４と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、配列番号１、３、４、５、６、７、８、１０、１３または１４と少なくとも約９５、９６、９７、９８または９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書で使用する場合、「相同な」アミノ酸配列は、１つもしくは複数の（例えば、１、２、３、４もしくは５つの）保存的アミノ酸置換、または１つもしくは複数の（例えば、１、２、３、４もしくは５つの）非保存的アミノ酸置換、欠失もしくは付加だけが参照アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を指す。相同なアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に同一であるかまたは実質的に同一のペプチド配列を含む。「実質的に同一のアミノ酸配列」は、参照のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９７％、最も好ましくは９９％同一であり、たとえあったとしても、好ましくは、保存的アミノ酸置換の大部分が参照の配列と異なる配列を意味する。
【００３６】
保存的アミノ酸置換は、典型的には、同じクラスのアミノ酸の間の置換を含む。これらのクラスとしては、例えば、（ａ）無電荷極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシン、（ｂ）塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン、（ｃ）酸性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（ｄ）非極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステインが挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「ＳＡＲＭ１活性を阻害する」は、内在ＳＡＲＭ１のある特定の活性の阻害、無効化または減退を指す。これらの特定の属性は、軸索分解の中心的制御因子としてのＳＡＲＭ１の活性を含む。ＳＡＲＭ１活性を阻害することは、提供されるドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１組成物の非存在下で内在ＳＡＲＭ１活性を含む均等な試料と比較した場合の、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１組成物を含む試料での内在ＳＡＲＭ１活性の測定可能な変化を意味する。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１組成物は、ＳＡＲＭ１媒介性軸索変性を阻害する、遅らせるまたは低減させることによって、ＳＡＲＭ１活性を「阻害する」。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＭ１阻害は、対照と比較した場合の、変性指数の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１組成物は、約０．５、約０．４５、約０．４、約０．３５、約０．３、約０．２５、約０．２、約０．１５、約０．１、約０．５または約０．０１で提供される変性指数をもたらす。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子は、軸索切断後３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間またはそれ以上で、約０．４以下の変性指数をもたらす。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１組成物は、対照と比較した場合に、少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、７５％またはそれ以上ＳＡＲＭ１活性を「阻害する」。
【００３８】
ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子の発現に起因する変性指数を決定する方法は以下のとおりである。ＳＡＲＭ１発現導入遺伝子を含むレンチウイルス粒子の生成のために、以下のプラスミドをＨＥＫ２９３ｔ細胞にトランスフェクトする：水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質を発現するｐｃＤＮＡ、ＰｓｐＡＸ２レンチウイルスパッケージングプラスミド、およびヒトユビキチンプロモーターの下流にＳＡＲＭ１オープンリーディングフレームを含むＦＵＧＷプラスミド。トランスフェクションから２日後に、レンチウイルス粒子を含む培地上清を収集し、一次ニューロン培養に用いるまで−８０℃で保存する。
【００３９】
ＳＡＲＭ１ドミナントネガティブ分子の機能分析のために、一次胚後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを胎生期１３．５日のマウスの胚から単離する。ＤＲＧニューロンは、有糸分裂細胞の死を誘導するために、Ｌ−グルタミン、２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｂ２７補充物、５０ｎｇ／ｍＬ  ＮＧＦおよび１μＭ５−フルオロ−２’デオキシウリジン＋１μＭウリジンを補充した神経基本培地中で維持する。ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンでプレコーティングされたプレート上にＤＲＧニューロンを播種する。インビトロでの日数（ＤＩＶ）１日目に、野生型ＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子をコードする発現導入遺伝子を含むレンチウイルスでＤＲＧを形質導入した。ＤＩＶ７日目に、軸索をカミソリの刃で切断し、軸索切断後の示された時点で、明視野顕微鏡下で遠位軸索を可視化する。
【００４０】
軸索変性を、断片化した軸索の面積対軸索の総面積の比を規定するＩｍａｇｅＪマクロ（Sasaki, 2009）を使用して明視野画像から定量化し、変性指数（ＤＩ）として表す。このメトリックは、０（完全にインタクト）から１（完璧に断片化）の範囲であり、０．５以上の値は大規模な軸索変性に相当する。技術的複製物としてウェルあたり１０画像を測定し、条件あたり４〜６ウェルを平均する。少なくとも３つの独立の実験を行う。
【００４１】
ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドは、細胞に対するドミナントネガティブ分子の有効性またはターゲティングを高めるようなさらなる機能ドメイン（例えば、細胞浸透性）、または少なくとも１つのタグを適宜含んでもよい。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブタンパク質は、少なくとも１つのさらなるドメインをさらに含む。一実施形態では、細胞浸透性ドメインは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質に由来する細胞浸透性ペプチド配列でもよい。非限定例では、少なくとも１つのタグは、ＳｔｒｅｐＴａｇ、ポリヒスチジンタグ、抗体エピトープ（例えば、ｍｙｃに由来する）など、またはそれらの組み合わせである。さらなるドメインまたは少なくとも１つのタグは、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端に、または内部位置に位置することができる。さらなるドメインまたはタグは、リンカードメインによってドミナントネガティブＳＡＲＭ１に結合していてもよく、リンカードメインは、細胞中への侵入の際にドミナントネガティブＳＡＲＭ１から細胞浸透性ドメインを放出するために、酵素切断部位を含んでもよい。好ましくは、切断酵素はニューロン中に豊富な酵素である。
【００４２】
本開示の別の態様は、上記のドミナントネガティブ分子のうちのいずれかをコードする核酸を提供する。核酸はＤＮＡでもよいし、ＲＮＡでもよい。一実施形態では、ＤＮＡはベクター中に存在していてもよい。本発明のドミナントネガティブ分子をコードする核酸配列は、発現制御配列に作動可能に連結され得る。「作動可能に連結される」は、そのように記載される成分が、それらがその意図された方法で機能することが可能になる関係にある並置を指す。コード配列に作動可能に連結される発現制御配列は、発現制御配列と適合する条件下で達成される。本明細書で使用する場合、発現制御配列は、それが作動可能に連結される核酸配列の発現を調節する核酸配列を指す。発現制御配列は、発現制御配列が核酸配列の転写および必要に応じて翻訳を制御および調節する場合、核酸配列に作動可能に連結されている。したがって、発現制御配列は、タンパク質をコードする遺伝子の前の適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのための、およびｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするようにその遺伝子の正しいリーディングフレームを維持するためのスプライシングシグナル、ならびに終止コドンを含むことができる。用語「制御配列」は、少なくとも、その存在が発現に影響し得る成分を含むことが意図され、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含むこともできる。発現制御配列はプロモーターを含むことができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、配列番号１５と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％の相同性を有する核酸配列を含む。一実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、配列番号１５と少なくとも約９５、９６、９７、９８または９９％の配列相同性を有する核酸配列を含む。
【００４４】
一態様では、本開示は、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。一態様では、本開示は、ヒトに安全に投与され、治療用導入遺伝子の持続的発現を提供するというアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの能力に、少なくとも部分的に基づいている。本発明は、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的になるか、または該核酸配列からなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。ＡＡＶベクターがドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドをコードする核酸配列から本質的になる場合、ＡＡＶベクターに実質的に影響を及ぼさないさらなる成分（例えば、インビトロでのベクターの操作を容易にする、ポリ（Ａ）配列または制限酵素部位などの遺伝子エレメント）を含むことができる。ＡＡＶベクターがドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドをコードする核酸配列からなる場合、ＡＡＶベクターはいかなるさらなる成分（すなわち、ＡＡＶにとって内在性でなく、核酸配列の発現をもたらし、それによってドミナントネガティブＳＡＲＭ１を提供するのに必要とされない成分）も含まない。
【００４５】
アデノ随伴ウイルスは、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーであり、約５，０００ヌクレオチド未満の直鎖状一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（すなわち、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス）との同時感染、またはヘルパー遺伝子の発現を必要とする。治療用核酸の投与に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、ＤＮＡ複製およびパッケージングのための認識シグナルを含む末端反復（ＩＴＲ）のみが残るように、およそ９６％の親ゲノムが除去される。これによって、ウイルス遺伝子の発現による免疫性または毒性の副作用が排除される。さらに、必要であれば、産生細胞への特定のＡＡＶタンパク質のデリバリーによって、細胞ゲノムの特定の領域中へのＡＡＶ  ＩＴＲを含むＡＡＶベクターの組み込みが可能になる（例えば、米国特許第６，３４２，３９０号および同第６，８２１，５１１号を参照されたい）。組み込まれたＡＡＶゲノムを含む宿主細胞は、細胞増殖または形態の変化を示さない（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号を参照されたい。）。
【００４６】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質および構造カプシド（Ｃａｐ）タンパク質［ビリオンタンパク質（ＶＰ）としても知られる］のためのユニークなコードヌクレオチド配列に隣接する。末端の１４５ヌクレオチドは自己相補的であり、丁字形のヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖が形成され得るように組織化される。これらのヘアピン構造は、細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして作用することによって、ウイルスのＤＮＡ複製のための開始点として機能する。Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８はｐ５プロモーターから転写され、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０はｐ１９プロモーターから転写される。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８タンパク質は、ＡＡＶ末端の分解を可能にするように、増殖性複製の間にヘリカーゼおよびニッカーゼ機能を果たす、多機能性ＤＮＡ結合タンパク質である［例えば、Im et al., Cell, 61 : 447-57 (1990)を参照されたい］。これらのタンパク質はまた、内在性ＡＡＶプロモーターおよびヘルパーウイルス中のプロモーターからの転写を調節する［例えば、Pereira et al., J. Virol., 71 : 1079-1088 (1997)を参照されたい］。他のＲｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の機能を修飾する。ｃａｐ遺伝子は、カプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから転写される。特定の実施形態では、ＡＡＶは、異種遺伝子に作動可能に連結された細胞特異的発現（例えば、ニューロン）を導くプロモーターを含む少なくとも１つのカセットに隣接する、１対の逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。この文脈における異種は、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）にとって天然ではない任意のヌクレオチド配列または遺伝子（例えば、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１）を指す。典型的には、ＡＡＶおよびＢ１９コード領域は除去されており、この結果、安全な非細胞毒性ベクターがもたらされる。ＡＡＶ  ＩＴＲまたはその改変体は、感染性および部位特異的組み込みを与えるが、細胞毒性は与えず、プロモーターは細胞特異的発現を導く。米国特許第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関する材料について、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「ＡＡＶベクター」は、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味する。非限定例では、ＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびこれらの突然変異型が挙げられる。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子の１つまたは複数、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の全体または一部が除去され得るが、機能的な隣接するＩＴＲ配列を保つ。高度な相同性にもかかわらず、異なる血清型は異なる組織に対して指向性を有する。
【００４８】
ＡＡＶベクターは、本明細書で開示される場合、当技術分野で既知の任意のＡＡＶ血清型を使用して生成することができる。いくつかのＡＡＶ血清型および１００を超えるＡＡＶ変異型が、アデノウイルスストックから、またはヒトもしくは非ヒト霊長類の組織から単離されている［例えば、Wu et al., Molecular Therapy, 14(3): 316-327 (2006)で概説される］。一般に、ＡＡＶ血清型は、核酸配列およびアミノ酸配列レベルで有意な相同性のゲノム配列を有し、その結果、異なる血清型は、同一の一連の遺伝的機能を有し、本質的に、物理的におよび機能的に均等なビリオンを生成し、事実上同一の機構によって、複製およびアセンブルする。ＡＡＶ血清型１〜６および７〜９は、すべての他の現存し、特徴づけられた血清型に対して特異的な中和血清と効率的に交差反応しないという点において、「真の」血清型と定義される。これに対して、ＡＡＶ血清型６、１０（Ｒｈ１０とも称される）および１１は、「真の」血清型の定義に準拠していないので、「変異型」血清型とみなされる。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）は、病原性でないこと、広範な感染性および長期の導入遺伝子発現を確立する能力が理由で、遺伝子療法適用に広く使用されている［例えば、Carter, B. J., Hum. Gene Ther., 16: 541 -550 (2005)；およびWu et al.、上記を参照されたい］。様々なＡＡＶ血清型のゲノム配列およびそれらの比較は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９７９０、Ｊ０１９０１、ＡＦ０４３３０３およびＡＦ０８５７１６；Chiorini et al., J. Virol., 71 : 6823-33 (1997)；Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-64 (1983)；Chiorini et al., J. Virol., 73: 1309-1319 (1999)；Rutledge et al., J. Virol., 72: 309-319 (1998)；およびWu et al., J. Virol., 74: 8635-47 (2000)に開示されている。
【００４９】
ＡＡＶのｒｅｐおよびＩＴＲ配列は、大抵のＡＡＶ血清型にわたって特に保存されている。例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６のＲｅｐ７８タンパク質は、報告によると、約８９〜９３％同一である［Bantel-Schaal et al., J. Virol., 73(2): 939-947 (1999)を参照されたい］。ＡＡＶ血清型２、３Ａ、３Ｂおよび６は、ゲノムレベルで約８２％の全ヌクレオチド配列同一性を有することが報告されている（Bantel-Schaal et al.、上記）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のｒｅｐ配列およびＩＴＲは、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の生成の間に、他の血清型由来の対応する配列を効率的に相互補完する（すなわち、機能的に置換する）ことが知られている。
【００５０】
一般に、ＡＡＶ粒子の細胞トロピシティー（ｔｒｏｐｉｃｉｔｙ）を決定するｃａｐタンパク質および関連したｃａｐタンパク質をコードする配列は、異なるＡＡＶ血清型の全体にわたって、Ｒｅｐ遺伝子と比べて有意に保存されていない。ＲｅｐおよびＩＴＲ配列が他の血清型の対応する配列を相互補完する能力を考慮すると、ＡＡＶベクターは血清型の混合物を含むことができ、それにより、「キメラの」または「シュードタイプ化された」ＡＡＶベクターでもよい。キメラのＡＡＶベクターは、典型的には、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つなど）の異なるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶカプシドタンパク質を含む。これに対して、シュードタイプ化されたＡＡＶベクターは、別のＡＡＶ血清型のカプシド中にパッケージングされている１つのＡＡＶ血清型の１つまたは複数のＩＴＲを含む。キメラのおよびシュードタイプ化されたＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第６，７２３，５５１号；Flotte, Mol. Ther., 13(1): 1-2 (2006)；Gao et al. , J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)；Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 11854-11859 (2002)；De et al. , Mol. Ther., 13: 67-76 (2006)；およびGao et al., Mol. Ther., 13: 77-87 (2006)にさらに記載されている。
【００５１】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ヒトに感染するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）を使用して生成される。あるいは、ＡＡＶベクターは、例えば、大型類人猿（例えば、チンパンジー）、旧世界ザル（例えば、マカク）および新世界ザル（例えば、マーモセット）などの非ヒト霊長類に感染するＡＡＶを使用して生成される。好ましくは、ＡＡＶベクターは、ヒトに感染するＡＡＶでシュードタイプ化された、非ヒト霊長類に感染するＡＡＶを使用して生成される。そのようなシュードタイプ化されたＡＡＶベクターの例は、例えば、Cearley et al., Molecular Therapy, 13: 528-537 (2006)に開示されている。一実施形態では、ＡＡＶ２逆位末端配列（ＩＴＲ）を用いてシュードタイプ化された、アカゲザルに感染するＡＡＶ由来のカプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターを生成することができる。特に好ましい実施形態では、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２  ＩＴＲを用いてシュードタイプ化された、アカゲザルに感染するＡＡＶ１０（「ＡＡＶｒｈ．１０」とも称される）由来のカプシドタンパク質を含む［例えば、Watanabe et al., Gene Ther., 17(8): 1042-1051 (2010)；およびMao et al., Hum. Gene Therapy, 22: 1525-1535 (2011)を参照されたい］。
【００５２】
ＡＡＶベクターは、本明細書で開示される場合、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。「核酸配列」は、一本鎖または二本鎖であり得、非天然または変化させられたヌクレオチドを含むことができる、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマー、すなわちポリヌクレオチドを包含することが意図される。本明細書で使用する場合、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は分子の一次構造を指し、したがって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。本用語は、均等物として、ヌクレオチド類似体でできているＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体、ならびに、限定されないが、メチル化および／またはキャップ化ポリヌクレオチドなどの修飾ポリヌクレオチドを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１をコードする核酸配列を含むベクターは、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ウイルスベクターまたはバクテリオファージであり得る。ベクターは、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１核酸の複製、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドの発現、または宿主細胞の染色体中へのドミナントネガティブＳＡＲＭ１核酸の組み込みをもたらすことができる。ベクターの選択は、所望の目的に依存する。ある種のクローニングベクターは、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１核酸のクローニング、突然変異および操作に有用である。他のベクターは、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドの発現に有用であり、精製目的でポリペプチドを大量に発現させること、またはニューロンのみにおけるドミナントネガティブＳＡＲＭ１の発現など、時間的または組織特異的な方法でドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドを発現させることができる。ベクターは、例えば、細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、魚細胞（例えば、ゼブラフィッシュ）および／または両生類細胞において発現を容易にするために、宿主細胞に基づいて選択することもできる。宿主細胞に適合するベクターの選択は当業者に明らかであり、宿主細胞のタイプは以下に述べられる。多くのベクターまたはベクターシステムが市販されており、例えば、ｐＥＴ細菌発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆ．）である。
【００５４】
本明細書に開示されるベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。例えば、開示されるベクターはウイルスベクターであり得る。特に、開示されるベクターはアデノウイルスベクターであり得る。インビトロまたはインビボのいずれかで細胞へ核酸をデリバリーするのに使用することができる、いくつかの組成物および方法がある。これらの方法および組成物は、２つのクラス、すなわち、ウイルスベースのデリバリーシステムおよび非ウイルスベースのデリバリーシステムに大きく分けることができる。例えば、核酸は、いくつかの直接デリバリーシステム、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドによって、または細胞もしくは担体、例えば陽イオン性リポソーム中への遺伝物質の移行を介して、デリバリーすることができる。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタントまたは物理機械的方法、例えば、エレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散を含めた、トランスフェクションの適切な手段は、例えば、Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990)；およびWolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991)によって記載されている。そのような方法は当技術分野で周知であり、本明細書に記載の組成物および方法を用いる使用に、容易に適合させることができる。ある場合には、方法は、巨大ＤＮＡ分子を用いて特に機能するように改変される。さらに、これらの方法は、担体のターゲティング特性を使用して、ある種の神経変性の疾患または障害および細胞集団を標的にするのに使用することができる。
【００５５】
ベクターは、限定されないが、複製開始点、１種または複数のマーカーまたは選択遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ｎｅｏ）、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化配列、リプレッサーまたはアクチベーターを含めた、様々な成分を含むことができる。そのようなエレメントは、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１をコードする核酸のコード領域に作動可能に連結され、それによって目的の宿主細胞において発現を促進するように、ベクター中に提供される。クローニングベクターおよび発現ベクターは、ベクターが宿主細胞中で複製することを可能にする複製開始点を含むことができる。ベクターは、例えば、薬物に対して抵抗性を与える、または増殖の不全を補完する（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）ために、選択マーカーを含むこともできる。薬物抵抗性マーカーの例としては、限定されないが、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシンまたはメトトレキサートが挙げられる。他のマーカー遺伝子の例は、蛍光性ファミリーのタンパク質のメンバーのうちの１つのような蛍光性ポリペプチド、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＲＦＰなどであり得る。これらのマーカーは、目的の遺伝子と同じベクター上に含まれてもよく、または別のベクター上にあり、目的の遺伝子を含むベクターと同時にトランスフェクトされてもよい。
【００５６】
ベクターは哺乳動物細胞におけるドミナントネガティブＳＡＲＭ１の発現に適したプロモーターを含むことができ、プロモーターは、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ペプチドの誘導性発現または構成的発現をもたらすように、作動可能に連結され得る。例示的誘導性プロモーターとしては、例えば、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーターまたはエクジソン応答性プロモーターが挙げられる。例示的構成的プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、トリ肉腫ウイルス由来のウイルス性プロモーター、ベータ−アクチンプロモーターおよび熱ショックプロモーターが挙げられる。プロモーターは、その組織特異性のために選択することができる。ある種のプロモーターはある種の組織内で発現するのみであり、選択された組織中でのみ目的のポリペプチドを発現させることが望ましい場合は、これらのプロモーターのうちの１つを使用することができる。例えば、神経細胞中のみで治療用タンパク質を発現させるために、シナプシン１遺伝子プロモーターが組換えアデノウイルスベクターシステムで使用された［Kugler et al., Mol Cell Neurosci. (2001) 17(1):78-96］。プロモーターの選択は、所望の宿主細胞システムに関して当業者に明らかである。
【００５７】
ドミナントネガティブＳＡＲＭ１をコードするベクターはウイルスベクターでもよい。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬｖ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびワクシニアウイルスが挙げられる。ウイルスベクターは、例えば、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１の生成のために、または療法における使用（例えば、ベクターからの発現によってドミナントネガティブＳＡＲＭ１を患者にデリバリーすることを目的とする）のために、標的細胞において発現を促進するために使用することができる。療法のために使用される場合は、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１をコードするベクター（例えば、ウイルスベクター）は、適切な経路を介して患者に直接的に投与することができ、または患者の細胞（自己）または同種異系細胞を使用するエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）戦略を使用して投与することができ、これらは、治療される患者への投与に適している。
【００５８】
本明細書で使用する場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、開示される核酸、例えば、開示されるペプチドの１つまたは複数をコードすることができる核酸配列を分解なしで細胞中に輸送し、それがデリバリーされる細胞中で遺伝子の発現をもたらすプロモーターを含む、薬剤である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列はウイルスまたはレトロウイルスのいずれかに由来する。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養性ウイルス、シンドビスおよび他のＲＮＡウイルスであり、ＨＩＶバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる。ベクターとしての使用に適したものにするこれらのウイルスの特質を有する任意のウイルスファミリーも好ましい。レトロウイルスとしては、マウスマロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、およびベクターとしてのＭＭＬＶの望ましい特質を発現するレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは他のウイルスベクターよりも大きな遺伝子ペイロード（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｙｌｏａｄ）、すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子を保持することができ、この理由で、一般に使用されるベクターである。しかし、これは、非増殖性細胞においてそれほど有用ではない。アデノウイルスベクターは比較的安定であり、取り扱いやすく、高い力価を有し、エアロゾル製剤中でデリバリーすることができ、非分裂細胞をトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは大きく、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、これは、熱安定性であり、室温で保存することができる。上記のものと同様に、ウイルスベクターは医薬組成物中に製剤化することができる。さらに、ウイルスベクターは、中枢神経系、血液／脳関門の外側、血液／脳関門の内側またはこれらの任意の組み合わせに直接デリバリーするために、製剤化することができる。ウイルスベクターは、髄腔内、静脈内または頭蓋内注射による投与のために、製剤化することができる。ウイルスベクターは、単離ウイルス粒子の形態であってもよい。
【００５９】
レトロウイルスベクターは、一般に、Verma, I. M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology, Amer. Soc. for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985)によって記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。遺伝子療法のためにレトロウイルスベクターを使用するための方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０６およびＷＯ８９／０７１３６；ならびにMulligan,［Science 260:926-932 (1993)］に記載されている。これらの教示は、遺伝子療法のためにレトロウイルスベクターを使用するための方法の教示について、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６０】
他の有用なシステムとしては、例えば、複製および宿主制限非複製ワクシニアウイルスベクターが挙げられる。さらに、非核酸ベースのシステムで、開示される核酸配列を標的細胞にデリバリーすることができる。例えば、エレクトロポレーションによって、またはリポフェクションによって、またはリン酸カルシウム沈殿によって、開示されるポリヌクレオチドをデリバリーすることができる。選択されるデリバリー機構は、標的にする細胞のタイプ、およびデリバリーが例えばインビボで行われるか、またはインビトロで行われるかどうかにある程度依存する。
【００６１】
したがって、組成物は、開示される発現ベクターに加えて、リポソーム、例えば陽イオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）または陰イオン性リポソームなどの脂質を含むことができる。リポソームは、必要であれば、特定の細胞を標的化しやすくするために、タンパク質をさらに含むことができる。ペプチドおよび陽イオン性リポソームを含む組成物の投与は、血液に、標的器官に投与することができ、または気道の細胞を標的化するために、気道に吸入することができる。例えば、本明細書に記載のペプチドまたは核酸配列および陽イオン性リポソームを含む組成物は、対象の肺細胞に投与することができる。リポソームに関して、例えば、Brigham et al. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1 :95-100 (1989)；Feigner et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417 (1987)；米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい。さらに、化合物は、特定の細胞型、例えばマクロファージを標的にすることができるマイクロカプセルの成分として投与することができ、または化合物は、マイクロカプセルからの化合物の拡散もしくは化合物のデリバリーが特定の速度もしくは投薬量について設計されている場合に、マイクロカプセルの成分として投与することができる。
【００６２】
本明細書に開示されるドミナントネガティブＳＡＲＭ１ペプチドの発現をもたらすように改変された宿主細胞も企図される。そのような宿主細胞は、エピソームまたはゲノムに組み込まれた核酸のいずれかからドミナントネガティブＳＡＲＭ１ペプチドを発現するように改変することができる。そのような宿主細胞は、任意の適切な方法、例えば、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ペプチドをコードするベクターを用いて、エレクトロポレーション、トランスフェクションまたは形質転換によって、生成することができる。宿主細胞は、所望の用途（例えば、哺乳動物細胞発現）に従って選択することができ、当技術分野で周知の方法に従って、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１の発現をもたらすように改変することができる。宿主細胞中にベクターを導入し、引き続いて、宿主細胞を培養するための技法は当技術分野で周知である。
【００６３】
ドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含むベクターの複製および発現に適した宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）が提供され、該細胞は、安定してもしくは一過的にトランスフェクトされてもよく、および／またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１を安定してまたは一過的に発現してもよい。そのようなドミナントネガティブＳＡＲＭ１発現哺乳動物細胞は、例えば、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドの生成に使用される。哺乳動物細胞におけるドミナントネガティブＳＡＲＭ１の生成は、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１の翻訳後修飾および／または融合する可能性がある異種アミノ酸［例えば、グリコシル化、シグナルペプチドの切断（存在する場合）］をもたらし得る。さらに、目的のドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１をコードする核酸を含む高力価のウイルス粒子の複製、パッケージング、および生成で使用するために、哺乳動物細胞系を選択することができる。そのようなドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含むウイルスは、次いで、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１をコードする核酸およびドミナントネガティブＳＡＲＭ１ペプチドを、それらを必要とする対象にデリバリーするのに使用することができる。
【００６４】
例示的宿主細胞としては、細菌、酵母、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞または細胞系）、昆虫細胞などが挙げられる。細菌性宿主細胞の例としては、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１核酸のクローニング、操作および生成、またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１ポリペプチドの生成に使用され得る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌が挙げられる。哺乳動物細胞の例としては、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ヒト子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）およびサル腎臓細胞（ＣＶ１）が挙げられる。
【００６５】
（ｂ）ドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物
本開示は医薬組成物も提供する。医薬組成物は、活性成分としてのドミナントネガティブＳＡＲＭ１、および少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記のＡＡＶベクターおよび医薬的に許容可能な（例えば、生理学的に許容可能な）担体を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物を提供する。組成物が本発明のＡＡＶベクターおよび医薬的に許容可能な担体から本質的になる場合、組成物に実質的に影響を及ぼさないさらなる成分（例えば、補助剤、緩衝剤、安定化剤、抗炎症剤、可溶化剤、防腐剤など）を含むことができる。組成物が本発明のＡＡＶベクターおよび医薬的に許容可能な担体からなる場合、組成物はいかなるさらなる成分も含まない。本発明の文脈において任意の適切な担体を使用することができ、そのような担体は当技術分野で周知である。担体の選択は、組成物が投与され得る特定の部位および組成物を投与するのに使用される特定の方法によって、ある程度決定される。組成物は、本明細書に記載のＡＡＶベクターを除いて、適宜滅菌されてもよい。組成物は、保存のために凍結または凍結乾燥することができ、使用前に適切な滅菌担体中で復元することができる。組成物は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. (2001)に記載されている従来の技法に従って生成することができる。
【００６６】
組成物のための適切な製剤としては、水性および非水性の溶液剤、等張滅菌溶液剤（これらは、抗酸化剤、緩衝剤および静菌薬を含むことができる）ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および防腐剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁剤が挙げられる。製剤は単位用量または多回用量の密閉容器、例えば、アンプルおよびバイアル中で提供することができ、使用直前に滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時溶液剤および懸濁剤は、前述の種類の滅菌粉末剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。好ましくは、担体は緩衝生理食塩水溶液である。より好ましくは、ＡＡＶベクターは、投与より前にＡＡＶベクターを破損から保護するように製剤化された組成物中で投与される。例えば、組成物は、ＡＡＶベクターを調製する、保存するまたは投与するために使用される装置、例えば、ガラス器具、シリンジまたは針においてＡＡＶベクターの消失を低減させるように製剤化することができる。組成物は、ＡＡＶベクターの光感受性および／または温度感受性を低減させるように製剤化することができる。この目的のために、組成物は、医薬的に許容可能な液体担体、例えば、上記のもの、ならびにポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロースおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される安定化剤を好ましくは含む。そのような組成物の使用は、ＡＡＶベクターの保存寿命を延ばし、投与を容易にし、本発明の方法の効率を高めるであろう。ＡＡＶベクター含有組成物のための製剤は、例えば、Wright et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 6(2): 174-178 (2003)およびWright et al., Molecular Therapy, 12: 171-178 (2005)にさらに記載されている。
【００６７】
組成物は、形質導入効率を高めるように製剤化することもできる。さらに、当業者は、ＡＡＶベクターは、他の治療的または生物学的活性薬剤とともに組成物中に存在することができることを認識するであろう。例えば、炎症を制御する因子、例えば、イブプロフェンまたはステロイドは、ＡＡＶベクターのインビボ投与と関係がある腫脹および炎症を低減させるために、組成物の一部であってもよい。したがって、本明細書に記載の療法に加えて、疾患、障害または状態の治療に効果的であると知られている他の療法を対象に提供することもできる。いくつかの実施形態では、さらなる薬物または治療剤は、小分子、ポリペプチド、核酸、細胞またはこれらの一部および抗体などでもよい。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１の投与は、さらなる薬物または治療剤の投与の前に、該投与と同時に、または該投与の後に、投与することができる。
【００６８】
医薬的に許容可能な賦形剤は、希釈剤、結合剤、フィラー、緩衝剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、分散剤、防腐剤、潤滑剤、矯味剤（ｔａｓｔｅ−ｍａｓｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、着香剤または着色剤でもよい。医薬組成物を形成ために利用する賦形剤の量およびタイプは、薬学の既知の原理に従って選択することができる。
【００６９】
（ｉ）希釈剤
一実施形態では、賦形剤は希釈剤でもよい。希釈剤は、圧縮性（すなわち、可塑的に変形可能）でもよく、または摩耗脆性（ａｂｒａｓｉｖｅｌｙ  ｂｒｉｔｔｌｅ）でもよい。適切な圧縮性希釈剤の非限定例としては、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル（すなわち、アセテートとブチレートの混合エステル）、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、トウモロコシデンプン、リン酸化トウモロコシデンプン、アルファ化トウモロコシデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、デンプン−ラクトース、デンプン−炭酸カルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、グルコース、フルクトース、ラクトース、ラクトース一水和物、ショ糖、キシロース、ラクチトール、マンニトール、マルチトール（ｍａｌｉｔｏｌ）、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリンおよびトレハロースが挙げられる。適切な摩耗脆性希釈剤の非限定例としては、第２リン酸カルシウム（無水または二水和物）、第３リン酸カルシウム、炭酸カルシウムおよび炭酸マグネシウムが挙げられる。
【００７０】
（ｉｉ）結合剤
別の実施形態では、賦形剤は結合剤でもよい。適切な結合剤としては、限定されないが、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカリド、オリゴ糖、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００７１】
（ｉｉｉ）フィラー
別の実施形態では、賦形剤はフィラーでもよい。適切なフィラーとしては、限定されないが、炭水化物、無機化合物およびポリビニルピロリドンが挙げられる。非限定例として、フィラーは、二塩基性および三塩基性の両方の硫酸カルシウム、デンプン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶セルロース、第２リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、加工デンプン、ラクトース、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールでもよい。
【００７２】
（ｉｖ）緩衝剤
さらに別の実施形態では、賦形剤は緩衝剤でもよい。適切な緩衝剤の代表的な例としては、限定されないが、ホスフェート、カルボネート、シトレート、トリス緩衝剤および緩衝生理食塩水塩（例えば、トリス緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）が挙げられる。
【００７３】
（ｖ）ｐＨ調整剤
様々な実施形態では、賦形剤はｐＨ調整剤でもよい。非限定例として、ｐＨ調整剤は炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸またはリン酸でもよい。
【００７４】
（ｖｉ）崩壊剤
さらなる実施形態では、賦形剤は崩壊剤でもよい。崩壊剤は非発泡性でもよく、または発泡性でもよい。非発泡性崩壊剤の適切な例としては、限定されないが、デンプン、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、これらのアルファ化および加工デンプン、甘味剤、粘土、例えばベントナイト、微結晶セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、ガム、例えば、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン（ｐｅｃｉｔｉｎ）およびトラガントが挙げられる。適切な発泡性崩壊剤の非限定例としては、クエン酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムおよび酒石酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムが挙げられる。
【００７５】
（ｖｉｉ）分散剤
さらに別の実施形態では、賦形剤は、分散剤でもよく、または分散増強剤でもよい。適切な分散剤としては、限定されないが、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製した木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファスシリケート（ｉｓｏａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａｔｅ）および微結晶セルロースを挙げることができる。
【００７６】
（ｖｉｉｉ）賦形剤
別の代替実施形態では、賦形剤は防腐剤でもよい。適切な防腐剤の非限定例としては、抗酸化剤、例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥまたはパルミチン酸レチニル、クエン酸、クエン酸ナトリウム；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ；および抗菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノールまたはフェノールが挙げられる。
【００７７】
（ｉｘ）潤滑剤
さらなる実施形態では、賦形剤は潤滑剤でもよい。適切な潤滑剤の非限定例としては、ミネラル、例えば、タルクまたはシリカ；および脂肪、例えば、植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸が挙げられる。
【００７８】
（ｘ）矯味剤
さらに別の実施形態では、賦形剤は矯味剤でもよい。矯味材料としては、セルロースエーテル；ポリエチレングリコール；ポリビニルアルコール；ポリビニルアルコールとポリエチレングリコールのコポリマー；モノグリセリドまたはトリグリセリド；アクリルポリマー；アクリルポリマーとセルロースエーテルの混合物；酢酸フタル酸セルロース；およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００７９】
（ｘｉ）着香剤
代替実施形態では、賦形剤は着香剤でもよい。着香剤は、合成香料油および着香芳香族化合物ならびに／または植物、葉、花、果実およびこれらの組み合わせから抽出された天然油から選択することができる。
【００８０】
（ｘｉｉ）着色剤
なおさらなる実施形態では、賦形剤は着色剤でもよい。適切な着色添加剤としては、限定されないが、食品、薬物および化粧品着色料（ＦＤ＆Ｃ）、薬物および化粧品着色料（Ｄ＆Ｃ）または外用薬物および化粧品着色料（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が挙げられる。
【００８１】
組成物中の賦形剤または賦形剤の組み合わせの重量分率は、組成物の総重量の約９９％以下、約９７％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％または約１％以下でもよい。
【００８２】
本明細書に記載の薬剤および組成物は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるRemington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)に記載されているような１種または複数の医薬的に許容可能な担体または賦形剤を使用して、任意の従来の方法によって、製剤化することができる。そのような製剤は、対象への適切な投与のための形態を提供するために、適切な量の担体とともに、精製形態で存在し得る本明細書に記載の治療有効量の生理活性物質を含むであろう。
【００８３】
用語「製剤」は、対象、例えばヒトへの投与に適した形態で薬物を調製することを指す。したがって、「製剤」は、希釈剤または担体を含めて、医薬的に許容可能な賦形剤含むことができる。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「医薬的に許容可能な」は、薬理学的活性の許容できない消失または許容できない有害な副作用を引き起こさない物質または成分を説明し得る。医薬的に許容可能な成分の例は、United States Pharmacopeia (USP 29) and National Formulary (NF 24), United States Pharmacopeial Convention, Inc, Rockville, Maryland, 2005（「ＵＳＰ／ＮＦ」）またはより最近の版にモノグラフを有するもの、およびＦＤＡの継続的にアップデートされる不活性成分検索オンラインデータベース（Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  ｏｎｌｉｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ）に列挙される成分であり得る。ＵＳＰ／ＮＦなどに記載されていない他の有用な成分も使用してもよい。
【００８５】
本明細書で使用する場合、用語「医薬的に許容可能な賦形剤」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤または吸収遅延剤を含むことができる。医薬的活性物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は当技術分野で周知である［一般に、Remington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)を参照されたい］。任意の従来の媒質または薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が企図される。補充活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【００８６】
「安定な」製剤または組成物は、商業的に合理的な期間、例えば、少なくとも約１日、少なくとも約１週、少なくとも約１か月、少なくとも約３か月、少なくとも約６か月、少なくとも約１年または少なくとも約２年にわたって、好都合な温度、例えば約０℃〜約６０℃の間で保存を可能にするのに十分な安定性を有する組成物を指すことができる。
【００８７】
製剤は投与様式に適さなければならない。本開示とともに有用である薬剤は、いくつかの経路を使用して対象に投与するための既知の方法によって製剤化することができ、経路としては、限定されないが、非経口、肺、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、眼部、頬側および直腸が挙げられる。個々の薬剤は、１種もしくは複数のさらなる薬剤と組み合わせて、または他の生物学的に活性なもしくは生物学的に不活性な薬剤とともに投与することもできる。そのような生物学的に活性または不活性な薬剤は、流体的もしくは機械的に薬剤連通していてもよく、またはイオン性、共有結合性、ファンデルワールス、疎水性、親水性もしくは他の物理的な力によって薬剤と結合していてもよい。
【００８８】
薬剤の活性を伸ばし、投与頻度を低減するために、制御放出（または持続性放出）調製物を製剤化することができる。制御放出調製物は、作用の開始時間または他の特性、例えば薬剤の血中レベルをもたらし、その結果、副作用の出現に影響を及ぼすように使用することもできる。制御放出調製物は、所望の治療効果をもたらす量の薬剤を最初に放出し、長期間にわたって治療効果のレベルを維持するために、他の量の薬剤を徐々にかつ絶えず放出するように設計することができる。体内でほぼ一定レベルの薬剤を維持するために、体から代謝または排出された薬剤の量を置換するであろう速度で、剤形から薬剤を放出することができる。薬剤の制御放出は、様々な誘導因子、例えば、ｐＨの変化、温度の変化、酵素、水または他の生理的条件もしくは分子によって刺激され得る。組成物は、スポンジ、生体適合性網目構造体、機械的リザーバーまたは機械的埋植体などの制御放出または持続性放出を可能にする装置中または該装置上で投与することができる。埋植体（例えば、米国特許第５，４４３，５０５号を参照されたい）、装置（例えば、米国特許第４，８６３，４５７号を参照されたい）、例えば、埋込式装置、例えば、機械的リザーバーまたはポリマー組成物から構成される埋植体もしくは装置は、ＡＡＶベクターの投与に特に有用である。組成物は、例えば、ゲルフォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポリリン酸エステル、例えば、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）および／またはポリ乳酸グリコール酸を含む持続性放出製剤（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号を参照されたい）の形態で投与することもできる。
【００８９】
（ｃ）投与
（ｉ）剤形
組成物は、様々な剤形に製剤化することができ、治療有効量の活性成分をデリバリーするであろういくつかの異なる手段によって投与することができる。そのような組成物は、所望により、従来の無毒の医薬的に許容可能な担体、補助剤および媒体を含む投薬単位製剤において、経口的（例えば、吸入）、非経口的または局所的に投与することができる。局所投与は、経皮投与、例えば、経皮パッチまたはイオントフォレーシス装置の使用も含み得る。本明細書で使用する場合、非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内または胸骨内の注射または注入技法を含む。薬物の製剤は、例えば、Gennaro, A. R., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (18th ed, 1995)、およびLiberman, H. A. and Lachman, L, Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y. (1980)で論じられている。特定の実施形態では、組成物は栄養補助食品でもよく、または組成物は化粧品でもよい。
【００９０】
経口投与用の固形剤形としては、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、丸剤、粉末剤、ペレット剤および顆粒剤が挙げられる。そのような固形剤形では、活性成分は、通常、１種または複数の医薬的に許容可能な賦形剤と組み合わされており、賦形剤の例は上で詳述されている。経口調製物は、水性懸濁剤、エリキシル剤またはシロップ剤として投与することもできる。これらについては、活性成分は、様々な甘味または着香剤、着色剤、必要であれば、乳化および／または懸濁化剤、ならびに希釈剤、例えば、水、エタノール、グリセリンおよびこれらの組み合わせと組み合わされ得る。吸入による投与については、化合物は、適切な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアゾール噴霧剤の形態でデリバリーされる。
【００９１】
非経口投与（皮下、眼内、皮内、静脈内、筋肉内、関節内および腹腔内を含める）については、調製物は、水性または油性の溶液剤でもよい。水性溶液剤は、滅菌希釈剤、例えば、水、生理食塩水、医薬的に許容可能なポリオール、例えば、グリセロール、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒；抗菌剤および／もしくは抗真菌剤、例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、チメロサールなど；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｅｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）；緩衝剤、例えば、アセテート、シトレートもしくはホスフェート；ならびに／または浸透圧調整用薬剤、例えば、塩化ナトリウム、デキストロースもしくはポリアルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトールを含むことができる。水溶液剤のｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調整することができる。油性溶液剤または懸濁剤は、ゴマ油、ピーナッツ油、オリーブ油またはミネラルオイルをさらに含むことができる。組成物は、単位用量または多回用量の容器、例えば、密閉したアンプルおよびバイアル中で提供することができ、使用直前に、運ばれた滅菌液体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時注射用溶液剤および懸濁剤は、滅菌粉末剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
【００９２】
局所（例えば、経皮的または経粘膜的）投与については、浸透させられる関門に適切な浸透剤が、調製物中に一般に含まれる。局所投与に適している医薬組成物は、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤、ローション剤、粉末剤、溶液剤、ペースト剤、ゲル剤、噴霧剤、エアロゾル剤または油として製剤化することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は局所軟膏剤またはクリーム剤として塗布される。軟膏剤中に製剤化される場合、活性成分はパラフィン系または水混和性軟膏基剤のいずれかとともに用いることができる。あるいは、活性成分は、水中油型クリーム基剤または油中水型基剤とともにクリーム剤中に製剤化することができる。眼への局所投与に適している医薬組成物としては、適切な担体、特に水性溶媒中に溶解または懸濁している点眼剤が挙げられる。口内の局所投与に適している医薬組成物としては、ロゼンジ剤、香錠および口腔洗浄薬が挙げられる。経粘膜的投与は鼻噴霧剤、エアゾール噴霧剤、錠剤または坐剤を使用して達成することができ、経皮的投与は、一般に当技術分野で既知の軟膏剤、膏薬、ゲル剤、パッチ剤またはクリーム剤を介してもよい。
【００９３】
ある種の実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物は、標的細胞への化合物のデリバリーを支援するため、組成物の安定性を高めるため、または組成物の潜在的毒性を最小限にするために、適切な媒体にカプセル化される。当業者が認識するように、様々な媒体が、本発明の組成物をデリバリーするのに適している。適切な構造化した流体デリバリーシステムの非限定例としては、ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、デンドリマーおよび他のリン脂質含有システムを挙げることができる。デリバリー媒体に組成物を組み込む方法は当技術分野で既知である。
【００９４】
一般に、安全かつ有効な量のドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物は、例えば、対象において所望の治療効果を引き起こすが、望まれない副作用を最小限にするであろう量である。様々な実施形態では、本明細書に記載の有効量のドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物は、実質的に内在ＳＡＲＭ１活性を阻害することができ、関連疾患を治療することができる。いくつかの実施形態では、有効量は、ＳＡＲＭ１媒介性軸索変性を阻害する、遅らせるまたは低減させることができる量である。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１組成物は、約０．５、約０．４５、約０．４、約０．３５、約０．３、約０．２５、約０．２、約０．１５、約０．１、約０．５または約０．０１の変性指数をもたらす。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子を含む組成物は、軸索切断後３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間またはそれ以上で、約０．４以下の変性指数をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、適切な投与レジメンで対象に投与される場合に、対象において、内在ＳＡＲＭ１活性を測定可能な程度に阻害する、ならびに／または軸索変性と関係がある疾患もしくは障害を治療する、ならびに／または軸索変性と関係がある疾患もしくは障害に関連する感染性、罹患率および死亡率を低下させるのに有効な量のドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含むおよび／またはデリバリーする。
【００９５】
単一剤形を生成するために医薬的に許容可能な担体と組み合わせることができる本明細書に記載の組成物の量は、治療される受容者および特定の投与様式によって変動する。必要な治療有効量はいくつかの個々の用量の投与によって達せられ得るので、各剤形の個々の用量に含まれる薬剤の単位含量は、それ自体で治療有効量を構成する必要はないことが当業者に理解されるであろう。
【００９６】
本明細書に記載の組成物の毒性および治療効力は、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らせる用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための細胞培養または実験動物の標準の医薬的手順によって決定することができる。有毒効果と治療効果の間の用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表すことができる治療指数であり、より大きな治療指数が最適であると当技術分野で一般に理解される。
【００９７】
任意の特定の対象に対する特定の治療有効量レベルは、治療を受ける障害および障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；対象の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事；投与時間；投与経路；用いられる組成物の排出速度；治療の継続期間；用いられる特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学分野で周知のような因子を含めた様々な因子に依存する（例えば、Koda-Kimble et al. (2004) Applied Therapeutics：The Clinical Use of Drugs, Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781748453；Winter (2003) Basic Clinical Pharmacokinetics, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781741475；Sharqel (2004) Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, McGraw-Hill/Appleton & Lange, ISBN 0071375503を参照されたい）。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるものよりも低いレベルで組成物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増大させることは、十分当技術分野の範囲内である。必要であれば、投与のために、有効な１日量を複数回用量に分けることができる。したがって、単回用量組成物は、１日用量を構成するために、そのような量またはそれらの約数を含むことができる。しかし、本開示の化合物および組成物の総１日使用量は適切な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されるであろうことを理解されたい。
【００９８】
また、本明細書に記載の状況、疾患、障害および状態のそれぞれ、ならびに他のものは、本明細書に記載の組成物および方法から利益を得ることができる。一般に、状況、疾患、障害または状態を治療することは、状況、疾患、障害または状態に苦しんでいるまたはなりやすい可能性があるが、それらの臨床的または亜臨床的症状をまだ経験していないまたは示していない哺乳動物において、臨床症状の出現を予防するまたは遅らせることを含む。治療することは、状況、疾患、障害または状態を阻害すること、例えば、疾患またはその少なくとも１つの臨床的または亜臨床的症状の発生を抑止するまたは低減させることを含むこともできる。さらに、治療することは、疾患を緩和すること、例えば、状況、疾患、障害もしくは状態またはその臨床的もしくは亜臨床的症状の少なくとも１つを退縮させることを含むことができる。治療される対象への利益は、統計学的に有意であるか、または対象もしくは医師に少なくとも認知されるかのいずれかであり得る。
【００９９】
ドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物の投与は、単一イベントとして、または治療のタイムコースにわたって生じ得る。例えば、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物は、毎日、毎週、隔週または毎月投与することができる。急性状態の治療については、治療のタイムコースは通常少なくとも数日である。ある種の状態は、数日から数週間に治療を延ばすことができる。例えば、１週、２週または３週を超えて治療を延ばすことができる。より慢性の状態については、数週間から数か月またはさらに１年以上に治療を延ばすことができる。
【０１００】
（ＩＩ）方法
本開示は、内在的に発現しているＳＡＲＭ１ポリペプチドの活性を測定可能な程度に阻害する方法を包含する。本開示は、インビトロ、インビボ、インサイチュまたはエキソビボでＳＡＲＭ１活性使用を阻害する方法を提供する。一般に、方法は、内在的に発現しているＳＡＲＭ１ポリペプチドの活性をダウンレギュレートするために、有効量のドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物の投与を含む。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物は、生物試料に投与される。本明細書で使用する場合、用語「生物試料」には、限定されないが、組織、細胞、細胞培養物またはそれらの抽出物；対象から得られる生検材料またはそれらの抽出物；および血液、唾液、尿、糞便、精液、涙または他の体液またはそれらの抽出物が含まれる。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物は、それらを必要とする対象に投与される。適切なドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物は、本明細書に開示される、例えば、セクションＩに記載されているものである。
【０１０１】
本開示の一態様では、内在的に発現しているＳＡＲＭ１活性を阻害し、それによって、それらを必要とする対象において神経変性または神経性の疾患を治療する方法を提供する。一般に、方法は、治療有効量のドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１をコードする核酸配列を含むＡＡＶを含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む。本明細書に記載のドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子は、軸索変性媒介性の様々な疾患および障害と関係がある感染性、罹患率および／または死亡率を低下させるのに有用である。本明細書で使用する場合、用語「治療」、「治療する」および「治療すること」は、本明細書に記載のように、疾患もしくは障害またはそれらの１つもしくは複数の症状を好転させる、疾患もしくは障害またはそれらの１つもしくは複数の症状を軽減する、疾患もしくは障害またはそれらの１つもしくは複数の症状の発症を遅らせる、または疾患もしくは障害またはそれらの１つもしくは複数の症状の進行を阻害することを指す。いくつかの実施形態では、治療は、１つまたは複数の症状が発生した後に施すことができる。他の実施形態では、治療は、症状の非存在下で施すことができる。例えば、治療は、症状の発症より前に（例えば、症状の病歴を考慮して、および／または遺伝的因子もしくは他の感受性因子を考慮して）高感受性個体に施すことができる。治療は、例えば、再発を予防するまたは遅らせるために、症状が回復した後に継続することもできる。
【０１０２】
神経変性または神経性の疾患になりやすい素質に対して、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１は、予防的に投与することができる。神経変性または神経性の疾患の進行を予防するまたは遅くするであろう、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１の有効量は、「予防有効量」として知られる。予防有効量は、体重、年齢、投与経路および素質の重大さの因子に依存する。用量は、診断された神経変性または神経性の疾患を治療するのに使用される有効量より低くてもよく、または該用量と同じでもよい。
【０１０３】
一態様では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物の投与は、それらを必要とする対象において軸索変性を一過的に予防する。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物は、軸索の損傷または傷害の１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１か月、６週、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月またはそれ以上前または後に投与される。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１またはドミナントネガティブＳＡＲＭ１を含む組成物の投与は、約５０％の正常繊維含量、約６０％の正常繊維含量、約７０％の正常繊維含量、約８０％の正常繊維含量、約９０％の正常繊維含量または約９５％以上の正常繊維含量をもたらす。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、神経変性または神経性の疾患または障害は、軸索変性、軸索傷害、軸索障害、脱髄性疾患、橋中心髄鞘崩壊症、神経損傷疾患または障害、代謝疾患、ミトコンドリア性疾患、代謝性軸索変性、白質脳症または白質ジストロフィーに起因する軸索傷害と関係がある。いくつかの実施形態では、神経変性または神経性の疾患または障害は、糖尿病性末梢神経障害、遺伝性神経障害、鋭角緑内障（ａｃｕｔｅ  ａｎｇｌｅ  ｇｌａｕｃｏｍａ）、脊髄損傷、卒中、多発性硬化症、進行性多巣性白質脳症、先天性ミエリン形成不全、脳脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、橋中心ミエリン分解（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｎｔｉｎｅ  ｍｙｅｌｏｌｙｓｉｓ）、浸透圧性低ナトリウム血症、低酸素脱髄、虚血性脱髄、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ニーマンピック病、ペリツェウスメルツバッヘル病、脳室周囲白質軟化症、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ワーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、テイ−サックス病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、外傷性脳損傷、放射線後損傷、化学療法の神経学的合併症（化学療法誘導性神経障害；ＣＩＰＮ）、神経障害、急性虚血性視神経症、ビタミンＢ１２欠乏症、単独ビタミンＥ欠乏症候群（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、バッセン−コーンツヴァイク症候群、緑内障、レーバー遺伝性視神経萎縮症、レーバー先天黒内障、視神経脊髄炎、異染性白質ジストロフィー、急性出血性白質脳炎、三叉神経痛、ベル麻痺、脳虚血、多系統萎縮症、外傷性緑内障、熱帯性痙性不全対麻痺ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）関連脊髄症、西ナイルウイルス脳症、ラクロスウイルス脳炎、ブニヤウイルス脳炎、小児ウイルス脳炎、本態性振戦、シャルコー−マリー−トゥース病、運動ニューロン疾患、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー（ＨＳＡＮ）、副腎脊髄神経障害、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、フリートライヒ運動失調症（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ’ｓ  ａｔａｘｉａ）、遺伝性運動失調症、騒音性難聴および先天性難聴からなる群から選択される。
【０１０５】
別の実施形態によれば、本発明は、ドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子および医薬的に許容可能な担体、補助剤または媒体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の治療用組成物によって提供されるドミナントネガティブＳＡＲＭ１の量は、生物試料または対象において、内在ＳＡＲＭ１活性を測定可能な程度に阻害するおよび／または神経変性もしくは神経性の疾患を治療するのに有効である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、生物試料において測定可能な程度にＳＡＲＭ１活性を阻害するのに有効な量のドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子を含む組成物を含むおよび／またはデリバリーする。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、適切な投与レジメンで対象に投与される場合に、対象において、そのようなＳＡＲＭ１活性を測定可能な程度に阻害する、ならびに／または神経変性もしくは神経性の疾患を治療する、ならびに／または神経変性もしくは神経性の疾患もしくは障害と関係がある軸索分解、罹患率および死亡率を低下させるのに有効な量のドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子を含むおよび／またはデリバリーする。ある種の実施形態では、本発明の組成物は、そのような組成物を必要としている対象に投与するために製剤化される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、対象への注射剤投与のために製剤化される。
【０１０６】
本明細書に記載の方法は、一般に、それらを必要とする対象に対して行われる。対象は、げっ歯類、ヒト、家畜動物、伴侶動物または動物園の動物でもよい。一実施形態では、対象は、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、モルモットなどでもよい。別の実施形態では、対象は家畜動物でもよい。適切な家畜動物の非限定例としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマおよびアルパカを挙げることができる。さらに別の実施形態では、対象は伴侶動物でもよい。伴侶動物の非限定例としては、ペット、例えば、イヌ、ネコ、ウサギおよびトリを挙げることができる。さらに別の実施形態では、対象は動物園の動物でもよい。本明細書で使用する場合、「動物園の動物」は、動物園で見出すことができる動物を指す。そのような動物としては、非ヒト霊長類、大型のネコ科動物、オオカミおよびクマを挙げることができる。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【０１０７】
（ＩＩＩ）キット
キットも提供される。そのようなキットは、本明細書に記載の薬剤または組成物を含むことができ、ある種の実施形態では、投与のための説明書を含むことができる。そのようなキットは、本明細書に記載の方法の実施を容易にし得る。キットとして供給される場合は、組成物の異なる成分を別の容器中に包装することができ、使用直前に混合することができる。成分としては、限定されないが、本明細書に記載のドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子を含む組成物および医薬製剤が挙げられる。成分のそのような包装は、必要であれば、別々に、組成物を含む１つまたは複数の単位剤形を含むことができるパックまたはディスペンサー装置中に提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックのように金属またはプラスチック箔を含むことができる。成分のそのような包装はまた、場合によっては、成分の活性が消失することなく、別々に長期保存を可能にし得る。
【０１０８】
キットは、例えば別々に包装された凍結乾燥活性成分に加えられる滅菌水または生理食塩水などの試薬を別の容器中に含むこともできる。例えば、密閉されたガラスアンプルが凍結乾燥成分を含んでもよく、別のアンプル中に、滅菌水、滅菌生理食塩水または滅菌物を含んでもよく、これらのそれぞれは、中性の非反応性ガス、例えば窒素化で包装されている。アンプルは、任意の適切な材料、例えば、ガラス、有機ポリマー、例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、セラミック、金属または典型的には試薬を保持するために用いられる任意の他の材料からなってもよい。適切な容器の他の例としては、アンプルと同様の物質から作られるボトルおよびアルミニウムまたは合金などの箔で裏打ちされた内部からなり得るエンベロープが挙げられる。他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどが挙げられる。容器は、皮下注射針によって穴をあけることができるストッパーを有するボトルのように、滅菌アクセスポートを有してもよい。他の容器は、除去されると成分を混合することが可能になる容易に除去可能な膜によって分離した、２つの区画を有してもよい。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどでもよい。
【０１０９】
ある種の実施形態では、キットは、説明資料とともに供給され得る。説明書は、紙もしくは他の基材に印刷されていてもよく、および／または電子的な読み取り可能なメディア、例えば、フロッピーディスク、ミニＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどとして供給されてもよい。詳細な説明書はキットに物理的に付随していなくてもよく、代わりに、使用者をキットの製造業者または販売業者によって指定されたインターネットウェブサイトに誘導することができる。
【０１１０】
分子生物学のプロトコールを利用する本明細書に記載の組成物および方法は、当技術分野で既知の様々な標準的な技法に従うことができる［例えば、Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717；Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929；Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773；Elhai, J. and Wolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754；Studier (2005) Protein Expr Purif. 41 (1), 207-234；Gellissen, ed. (2005) Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10: 3527310363；Baneyx (2004) Protein Expression Technologies, Taylor & Francis, ISBN-10: 0954523253を参照されたい］。
【０１１１】
定義
すべての本明細書で使用される術語は特定の実施形態のみを説明することを目的とし、任意の方法または範囲に限定することを意図したものではないことを理解されたい。例えば、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が特に明示しない限り、複数の指示物を含むことができる。さらに、すべての単位、接頭辞および記号は、そのＳＩで許容される形式で示され得る。
【０１１２】
本明細書内に記載される数値範囲は範囲を決定する数を含み、定義された範囲内の各整数を含む。本開示全体を通して、本発明の様々な態様が範囲方式で提供される。範囲方式の説明は、単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する確固とした限定として解釈されるべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内のすべての可能な部分範囲、分数および個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、ならびに範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５および６ならびに小数および分数、例えば、１．２、３．８、１と１／２、および４と３／４を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、例えば、限定されないが、質量、用量、時間、距離、波長、周波数、電圧、電流および電磁場を含めた任意の数量化可能な変数に関して、典型的な測定用の技法および機器を介して起こり得る、数量の変動を指す。さらに、現実の世界で使用される所与の固体および液体の取扱い手順を考えると、組成物を作製するかまたは方法を実施するなどのために使用される成分の製造、供給源または純度の差異による可能性がある、ある種の不注意による誤差および変動が存在する。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例は、様々な本開示の実施形態を示すために含まれる。次に続く実施例に開示されている技法は、本発明の実施において十分に機能するように本発明者らが見出した技法を示し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成するとみなされ得ることを当業者は理解されたい。しかし、当業者は、本開示を考慮して、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、依然として同様または類似の結果を得ることができることを認識するべきである。
【０１１５】
本明細書で、本発明者らは、ＳＡＲＭ１の機能を強力に阻害するＳＡＲＭ１ドミナントネガティブを特定することを目的として、ヒトＳＡＲＭ１に点突然変異を導入し、このコンストラクトを野生型ニューロンで発現させた。本発明者らは、インビトロでＡｘＤを強く阻害するいくつかのＳＡＲＭ１単一突然変異型を予想外に見出した。驚いたことに、これらのうちの最もよい２つを組み合わせることによって、ＳＡＲＭ１の酵素機能を強力に阻害し、軸索切断および神経障害の細胞モデルの軸索をＳＡＲＭ１ノックアウトニューロンと同程度にロバストに保護するドミナントネガティブが得られる。成体野生型マウスにおけるこの最適化したコンストラクトのアデノ随伴ウイルス媒介性発現および最も重度のＡｘＤのモデルとしての坐骨神経の切断を使用して、本発明者らは、ＳＡＲＭ１ノックアウトマウスにおいて観察されたものと類似した軸索の保存性を示す。したがって、インビボでＳＡＲＭ１の機能を効果的および永続的に阻害する新規な戦略が提供される。ＳＡＲＭ１−ドミナントネガティブのＡＡＶ媒介性発現は、病的ＡｘＤをブロックする、ならびに神経障害および急性および慢性の軸索変性を特徴とするあり得る他の疾患の機能的転帰を向上させるための治療選択肢に相当する。単一の遺伝性障害を治療しようとする従来の遺伝子療法と異なって、ＳＡＲＭ１を標的化する遺伝子療法は、共通の病理過程、すなわち軸索消失を特徴とする幅広い疾患を治療する可能性がある。
【０１１６】
実施例１−軸索変性を阻害するＳＡＲＭ１ドミナントネガティブ突然変異型の特定
強力なＳＡＲＭ１ドミナントネガティブを開発するために、個々の点突然変異をＮ末端およびＴＩＲドメインの高度に保存された領域に導入し（図１Ａ）、これらのコンストラクトのレンチウイルス媒介性発現がＡｘＤを減少させるかどうかを試験した。すべてのコンストラクトは培養した後根神経節ニューロンで十分に発現した（図５）。軸索を切断し、損傷部位への軸索の再成長を回避するために、細胞体を除去した。ハイスループット自動画像化および自動ＡｘＤ指数（Sasaki et al., 2009）を用いて、遠位軸索の断片化を経時的に評価した。軸索の断片化は切断から６時間に始まり、２４時間までに完了する（図１Ｂ、図１Ｃ）。野生型ＤＲＧニューロンにおける、以前に発見されたドミナントネガティブＳＡＲＭ１−Ｋ５９７Ｅ（Summers et al., 2016）およびＳＡＲＭ１−デルタＴＩＲ（Gerdts et al., 2013）の発現は、軸索切断から３６時間後までＡｘＤを遅らせる（図１Ｂ、図１Ｃ）。本発明者らは、ＴＩＲ  ＮＡＤａｓｅの活性部位内の重要な触媒残基として、グルタミン酸Ｅ６４２を最近特定した（Essuman et al., 2017）。酵素機能をブロックすることが強力なドミナントネガティブをもたらすかどうかを評価するために、野生型ニューロンでＳＡＲＭ１−Ｅ６４２Ａを発現させた。ＳＡＲＭ１−Ｅ６４２Ａは、ＳＡＲＭ１−ＫＯニューロンで発現させる場合機能的でないが（Essuman et al., 2017）、野生型ニューロンでＳＡＲＭ１−Ｅ６４２Ａを発現させる場合、ＥＧＦＰ−ベクターを発現する野生型軸索におけるものと同じキネティクスで軸索の断片化が進行する（図１Ｂ）。驚いたことに、ＳＡＲＭ１−Ｅ６４２Ａ突然変異型は機能的でないが、ドミナントネガティブとして作用せず、これによって、この突然変異型が、野生型ＴＩＲ  ＮＡＤａｓｅの活性化を可能にするＴＩＲ−ＴＩＲ相互作用を乱すことができないことが示唆される。これに対して、ＴＩＲドメイン中の別の高度に保存された位置Ｈ６８５の残基に点突然変異を導入すると（図１Ａ）、軸索切断から７２時間にわたって強力に軸索を保護するドミナントネガティブが生じる（図１Ｂ、図１Ｃ）。Ｈ６８５をＹまたはＡのいずれかへ突然変異させると、ドミナントネガティブ効力が識別不能なコンストラクトがもたらされ、これによって、ドミナントネガティブ効果を生じさせるのは、任意の特定のアミノ酸への変換ではなく、Ｈの消失であることが示唆される（図６）。したがって、このヒスチジンは、ＳＡＲＭ１活性に関与するＴＩＲ−ＴＩＲ相互作用に必要である可能性がある。最も強いドミナントネガティブ効果は、Ｎ末端の１９３のリジンが突然変異した場合に観察された（図１Ａ）。このリジンは、ＳＡＲＭ１の損傷誘導性活性化に必要であり得ると本発明者らが仮定した、Ｎ末端の高度に保存された領域内に存在する。野生型ＤＲＧにおけるＳＡＲＭ１−Ｋ１９３Ｒの発現は、軸索切断から７２時間にわたって軸索を強力に保護する（図１Ｂ、図１Ｃ）。Ｈ６８５と同様に、Ｋ１９３をＲまたはＡのいずれかへ突然変異させると、ドミナントネガティブ活性が識別不能なコンストラクトが生成され、これによって、ＳＡＲＭ１の損傷誘導性活性化をブロックするのはリジンの消失であることが示唆される（図６）。
【０１１７】
ニューロンの健常性の第２の指標として、蛍光性ミトコンドリア膜指示薬ＴＭＲＭを使用して、切断した軸索におけるミトコンドリア電位を調べた。ＳＡＲＭ１の活性化は、ミトコンドリアの膜電位の低下を引き起こし（Summers et al., 2016）、これは、赤色蛍光の消失によって示される。ＥＧＦＰ−ベクターまたはＳＡＲＭ１−Ｅ６４２Ａを発現する野生型ＤＲＧニューロンでは、軸索切断から２４時間後にＴＭＲＭ蛍光はもはや観察されない（図１Ｃ）。これに対して、ＴＭＲＭ陽性のミトコンドリアは、ＳＡＲＭ１ドミナントネガティブ突然変異を発現する野生型ＤＲＧにおいて、およびＳＡＲＭ１−ＫＯ  ＤＲＧにおいて保存されており（図１Ｃ）、これによって、形態的にインタクトな切断した軸索は代謝的に活性なままであることが示される。
【０１１８】
これらのＳＡＲＭ１突然変異型がそれ自体で変性促進機能を有するかどうかを評価するために、本発明者らは、培養したＳＡＲＭ１−ＫＯ  ＤＲＧニューロン中で野生型ＳＡＲＭ１またはＳＡＲＭ１突然変異型のいずれか（図１Ａ）を発現させ、軸索切断後のＡｘＤを評価した。ＳＡＲＭ１−ＫＯニューロンの軸索は、軸索切断後少なくとも７２時間にわたって完璧にインタクトであるが（図１Ｄ、図１Ｅ）、酵素的に活性な野生型ＳＡＲＭ１の再導入によって、切断後に急速なＡｘＤが促進される（図１Ｄ、図１Ｅ）。これに対して、ＳＡＲＭ１−ＫＯ  ＤＲＧにおけるドミナントネガティブ突然変異型およびＳＡＲＭ１−Ｅ６４２Ａの発現は、切断後少なくとも７２時間にわたってＡｘＤを誘導せず（図１Ｄ、図１Ｅ）、これによって、評価したＳＡＲＭ１突然変異型が変性促進能力を持たないことが示される。
【０１１９】
実施例２−ＳＡＲＭ１−Ｋ１９３Ｒ突然変異とＳＡＲＭ１−Ｈ６８５Ａ突然変異の組み合わせは、軸索切断および神経障害の細胞モデルにおいて、野生型ＳＡＲＭ１の酵素活性をブロックし、軸索変性から強力に保護する。
ＳＡＲＭ１−Ｋ１９３Ｒ（図１Ｂ、図１Ｃ）およびＳＡＲＭ１−Ｈ６８５Ａ（図６Ａ）の発現は、軸索切断後のＡｘＤを強く遅らせるが、保護はＳＡＲＭ１の欠失ほどロバストではない（図１Ｂ、図１Ｃ）。したがって、本発明者らは、Ｋ１９３とＨ６８５の両方に突然変異を有するＳＡＲＭ１分子がさらにいっそう強力なドミナントネガティブ活性をもたらすかどうかを評価した。本発明者らは、両方の突然変異および第３の突然変異Ｈ１９４Ａを有するコンストラクトを生成し、このコンストラクトをＳＡＲＭ１−複合ドミナントネガティブ（ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ）と名付ける。その後の解析によって、Ｈ１９４Ａを加えてもＳＡＲＭ１−ＣＤＮの効力に影響しないことが示されたが（図６Ｂ）、これは、最初に生成され、かつそのような強いドミナントネガティブ効果を与えたので、残りの解析はＳＡＲＭ１−ＣＤＮを用いる。ＳＡＲＭ１−ＣＤＮの発現はＡｘＤを完璧に予防し（図２Ａ、図２Ｂ）、軸索切断後少なくとも９６時間にわたってＴＭＲＭ陽性のミトコンドリアを保存する（図２Ｃ）。活性化の際に、野生型ＳＡＲＭ１はＮＡＤ＋を急速に分解し（Gerdts et al., 2015；Sasaki et al., 2016；Essuman et al., 2017）、これは、局部的代謝不全（Gerdts et al., 2015；Yang et al., 2015）およびその後のＡｘＤをもたらす。ＳＡＲＭ１−ＣＤＮがＳＡＲＭ１のこの分子活性もブロックするかどうかを評価するために、健常な軸索および損傷した軸索における軸索ＮＡＤ＋レベルを測定した。予想通り、切断してから４時間に、対照ベクターを発現する野生型ニューロンにおいてＮＡＤ＋はほとんど枯渇している（図２Ｄ）。これに対して、ＡＲＭ１−ＣＤＮを発現する野生型ニューロンにおいて、およびＳＡＲＭ１−ＫＯニューロンにおいて、ＮＡＤ＋は維持される（図２Ｄ）。したがって、野生型ニューロンにおけるＳＡＲＭ１−ＣＤＮの発現は、ＳＡＲＭ１の酵素機能およびその変性促進活性を強力にブロックする。
【０１２０】
ＳＡＲＭ１の消失は、外傷性脳損傷（Henninger et al., 2016；Ziogas and Koliatsos, 2018）および化学療法誘導性末梢神経障害（Geisler et al., 2016；Turkiew et al., 2017）を含めた疾患のモデルにおいて、ＡｘＤを阻害する。化学療法誘導性末梢神経障害におけるＳＡＲＭ１−ＣＤＮの効果を調べるために、ビンクリスチンをともなう野生型ＤＲＧを処理し、薬物投与から４８時間後に軸索の完全な断片化が観察された（図２Ｅ）。これに対して、ＳＡＲＭ１−ＫＯニューロンとＳＡＲＭ１ドミナントネガティブ突然変異型を発現する野生型ニューロンとの両方の軸索は形態的にインタクトであり、ビンクリスチンの投与から少なくとも９６時間にわたってＴＭＲＭ陽性のミトコンドリアを保つ（図２Ｅ、図２Ｆ）。まとめると、これらのデータは、野生型ニューロンにおいてＳＡＲＭ１−ＣＤＮを発現させると、インビトロにおいて、多様な傷害に対し、ＳＡＲＭ１の機能を強力に阻害することを示す。
【０１２１】
実施例３−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮは、ＡＡＶ媒介性遺伝子移入の際に後根神経節ニューロンおよび末梢神経で強く発現する
次に、インビボにおけるＳＡＲＭ１−ＣＤＮの任意の軸索保護特質を解析した。効力の最もロバストな試験であると考えるので、概念実証として、重度の病的ＡｘＤのモデルとしての坐骨神経切断を利用した。ＥＧＦＰに融合したＳＡＲＭ１−ＣＤＮ（図３Ａ）またはＥＧＦＰ単独をＡＡＶ８ベクターにクローニングし、これをニューロン特異的シナプシン（Ｓｙｎ）プロモーターの下で発現させた（図３Ａ）。ＡＡＶ８−Ｓｙｎ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ−ＥＧＦＰ（ＡＡＶ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ）または対照ＥＧＦＰウイルスの髄腔内投与から５週後に（図３Ｂ）、ＤＲＧならびに坐骨神経（図３Ｃ、図３Ｄ）および肋間神経（図３Ｃ）を含めた末梢神経のロバストなＥＧＦＰ標識が観察された。ＤＲＧは、ニューロンマーカーＰＧＰ９．５での染色による判定では、効率的に形質導入されている（図３Ｄ）。
【０１２２】
損傷誘導性軸索変性のブロックにおけるＳＡＲＭ１−ＣＤＮの役割を評価する前に、ＡＡＶ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮの発現が、損傷がない場合に軸索の形態変化を誘導するかどうかを最初に評価した。ドミナントネガティブを注射したマウスまたは対照ＥＧＦＰウイルスを注射したマウスの非損傷坐骨神経のトルイジンブルー染色した半薄横断切片を解析した。ＡＡＶ−ＳＡＲＭ１  ＣＤＮを注射したマウスおよびＡＡＶ−ＥＧＦＰを注射したマウスの坐骨神経の軸索は、形態的にインタクトであると思われた（図７Ａ〜Ｄ）。２つの処理群間で軸索のサイズ分布（図７Ｅ）およびＧ比（図７Ｆ）の差異はなかった。したがって、ＳＡＲＭ１−ＣＤＮの発現は、損傷がない場合に検出可能な影響を軸索に与えない。
【０１２３】
実施例４−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮはインビボで軸索変性から強力に保護する
坐骨神経切断から５日後、ＥＧＦＰ蛍光がないことならびに神経フィラメントおよびペリフェリン染色の消失によって証明されるように、対照ウイルスを注射したマウスの遠位神経セグメントに軸索はほとんど存在しない（図３Ｅ）。これに対して、ＡＡＶ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮを注射したマウスの神経において、ＥＧＦＰ蛍光および神経フィラメントおよびペリフェリン染色が容易に観察され（図３Ｅ）、これによって、ドミナントネガティブを発現する軸索が変性から保護されることが示される。
【０１２４】
神経切断後の軸索消失の重症度およびドミナントネガティブによって与えられる保護の程度は、プラスチック包埋した薄切片を使用するとさらに良好に認識される。切断から５日後、ミエリンの残屑を有するシュワン細胞、脂質を帯びた組織球および暗い細胞質を有する軸索残存物（図４Ａ、Ａ’、Ｃ、Ｃ’）を含めた広範なワーラー変性の徴候が、腓腹神経、切断部に対して遠位の坐骨神経の感覚枝の横断切片において明らかである。これに対して、ＡＡＶ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮを注射したマウスでは、有髄軸索は非常に良く維持されており、正常な形状、ミエリンの厚さおよび内部構造を有する（図４Ｂ、Ｂ’、Ｄ、Ｄ’）。電子顕微鏡を用いると、この保護が無髄軸索にも及ぶことが明らかなる（図４Ｄ、Ｄ’）。損傷側と非損傷側の有髄軸索の数を比較した場合、ＥＧＦＰ−ベクターを注射したマウスは、約９９％の低減を示すが（同側５±０．９軸索／神経；対側４４６±５７軸索／神経；ｎ＝４マウス；図４Ｅ）、ＳＡＲＭ１−ＣＤＮを発現するマウス（切断部位：３８９±１３軸索／神経；対側３９６±２８軸索、ｎ＝５マウス、図４Ｅ）またはＳＡＲＭ１−ＫＯマウス（図４Ｅ）において、有意な軸索消失はない。切断から１０日後でさえ、遠位軸索はＳＡＲＭ１−ＣＤＮを注射したマウスに存在する（図４Ｇ）。その時点のベクター処理群の腓腹神経の軸索は検出されなかったが（０．３±０．３軸索；ｎ＝３マウス、図４Ｆ、図４Ｇ）、ＡＡＶ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ群において腓腹神経あたり１６０±４０の軸索（ｎ＝３マウス）が確認され、これは、非損傷神経中に存在する軸索の数の約５９±１５％である（図４Ｆ）。この保存性はＳＡＲＭ１−ＫＯマウスに匹敵し（図４Ｆ、図４Ｇ）、軸索の７９±９％が損傷部位に対して遠位のままである（図４Ｆ、図４Ｇ）。
【０１２５】
上記の実施例は、インビボでＡｘＤを強力に阻害するための強力なツールとして、ＳＡＲＭ１−ドミナントネガティブのＡＡＶ媒介性ニューロン特異的発現を確立する。これらの発見は、ＳＡＲＭ１がニューロン自律的に作用することを示し、成体野生型マウスにおいてこれを効果的に標的化することができることを示す。これらの発見は、軸索変性の分子メカニズムの定義づけにおける最近の劇的な進歩を神経障害における病的ＡｘＤをブロックするための新規な治療戦略に転換する。
【０１２６】
ＳＡＲＭ１は多量体であり、突然変異型ＳＡＲＭ１は野生型ＳＡＲＭ１とともにアセンブルする（Gerdts et al., 2013）。したがって、発現および／または局在性の差異も寄与し得るが、異なるＳＡＲＭ１突然変異型の相対的ドミナントネガティブ効力は、ＳＡＲＭ１の機能に対する機構的な手がかりを与え得る。ＳＡＲＭ１の残基Ｋ１９３およびＨ６８５の突然変異により、非常に強力なドミナントネガティブ導入遺伝子が生成され、このことにより、Ｎ末端のＫ１９３およびＴＩＲドメインのＨ６８５はＳＡＲＭ１の活性化に必須である可能性があることが示される。興味深いことに、ＴＩＲドメインの活性部位の突然変異（Ｅ６４２Ａ）は、ＳＡＲＭ１ヌルニューロンにおいて再発現させた場合、ＳＡＲＭ１の機能を完璧に抑制するが、野生型ニューロンで発現させた場合ドミナントネガティブ効果を有さない。これは、複合体中の各酵素活性部位が独立に機能することを示唆する。しかし、本発明者らのデータ（Gerdts et al., 2013）および他のＴＩＲドメインタンパク質に関する大量の文献（Narayanan and Park, 2015）は、ＴＩＲ二量体の相互作用がＴＩＲドメインの活性化に必要であることを示す。本発明者らは、Ｅ６４２残基はＴＩＲドメインの固有の酵素活性に必要であるが、Ｈ６８５残基は近傍の相互作用するＴＩＲドメインにおける酵素活性の活性化に必要であり、それゆえ、突然変異した場合、ドミナントネガティブとして作用し得ることを示唆する。さらに、Ｋ１９３などのＮ末端残基は、ＴＩＲドメインとの自己阻害性相互作用の解放を介するＳＡＲＭ１の損傷誘導性活性化に必要とされるように思われる。Ｈ６８５ＡおよびＫ１９３Ｒ突然変異の効果は相加的であるので、それらの阻害機構は異なる可能性がある。
【０１２７】
多くの一般的な神経変性疾患は初期のＡｘＤを特徴とする(Burke and O’Malley, 2013；Johnson et al., 2013；Howell et al., 2013；Yin et al., 2016)。末梢神経障害は、米国単独で２０００万人より多くに影響を及ぼす最も一般的な神経変性疾患である。多くの神経障害は長軸索の変性により引き起こされ、まだ、この変性をブロックするための特定の療法は存在しない。さらに、中枢神経系の最も広く認められる疾患のいくつか、例えば、パーキンソン病、外傷性脳損傷および緑内障では、ＡｘＤはニューロンの変性に先行する（Tagliaferro and Burke, 2016；Caminiti et al., 2017；Fazio et al., 2018；O’Keeffe and Sullivan, 2018）。ＡｘＤを有意に遅延させる自然突然変異を持つワーラー変性遅延（ｗｌｄｓ）マウス（Lunn et al., 1989）およびＳＡＲＭ１−ＫＯマウスを使用する研究は、軸索破壊プログラムの阻害が大きく向上した機能的転帰につながることを示す（Wang et al., 2001 , 2002；Sajadi et al., 2004；Meyer zu Horste et al., 2011；Geisler et al., 2016；Henninger et al., 2016；Fernandes et al., 2018）。ＷＬＤｓ融合タンパク質の活性成分はＮＭＮＡＴ１であり（Araki et al., 2004）、これは、ＳＡＲＭ１を阻害する（Gilley et al., 2015；Sasaki et al., 2016）。しかし、ＷＬＤｓの発現は、高齢マウスの軸索の保護において、およびシナプスの維持において、ＳＡＲＭ１の遺伝子欠失ほど有効ではなく（Conforti et al., 2014；Gilley et al., 2017）、これによって、ＳＡＲＭ１の直接標的化が病的ＡｘＤのより優れた阻害を提供するであろうことが示唆される。本明細書で、本発明者らは、ＳＡＲＭ１−Ｋ１９３Ｒ／Ｈ６８５Ａのウイルス性デリバリーが、ＡｘＤの最も急速かつ攻撃的な誘発因子である坐骨神経切断後に長期持続性軸索保護を誘導することを示し、慢性神経変性疾患における緩徐な軸索消失の遺伝子療法治療に対して鋳型を提供する。
【０１２８】
ＡＡＶ媒介性遺伝子デリバリーは、臨床試験の患者において安全に使用されており、神経性の疾患、例えば脊髄性筋萎縮症において有望な結果を示した（Mendell et al., 2017；Deverman et al., 2018；Sumner and Crawford, 2018）。ＡＡＶはニューロンを効果的に形質導入し、病原性がなく、単回デリバリー後に長期持続性発現を支援する（Mittermeyer et al., 2012；Hwu et al., 2012）。したがって、ＡＡＶ媒介性ＳＡＲＭ１−ＣＤＮの発現は、ヒトで安全性が証明されれば、慢性神経変性疾患、例えば遺伝性および特発性の神経障害ならびにパーキンソン病、ならびに後天性神経障害、例えば化学療法誘導性神経障害の治療に有用であり得る。化学療法誘導性神経障害の治療において、ＡＡＶ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮの単回の注射が、化学療法治療の継続期間にわたって軸索保護をもたらすのに十分であり得ると推測することは魅力的である。
【０１２９】
実施例５−様々なＳＡＲＭ１突然変異の効力
点突然変異を組み合わせることが損傷誘導性軸索変性からの保護を増大させるかどうかを研究するために、２つまたは３つの点突然変異を有するＳＡＲＭ１コンストラクトを生成した。Ｋ１９３Ｒ／Ｅ６４２ＡおよびＨ６８５Ａ／Ｅ６４２ＡはＫ１９３ＲまたはＨ６８５Ａ単独よりも大きく軸索変性を予防しないが、Ｋ１９３ＲおよびＨ６８５Ａに点突然変異を有するＳＡＲＭ１コンストラクトを発現させることにより、少なくとも１２０時間にわたって、かつＳＡＲＭ１  ＫＯと同じ程度まで、軸索切断誘導性軸索変性が予防される。ＳＡＲＭ１点突然変異を組み合わせることによって、ＳＡＲＭ１  ＫＯと同程度に強力に損傷誘導性軸索変性を予防する強力なドミナントネガティブがもたらされる（図８Ａ）。化学療法剤に対する軸索完全性の保護におけるドミナントネガティブＳＡＲＭ１分子の効力を研究するために、示されるコンストラクト（ベクター、Ｋ１９３Ｒ／Ｅ６４２Ａ、Ｈ６８５Ａ／Ｅ６４２Ａ、Ｋ１９３Ｒ／Ｈ１９４Ａ／Ｈ６８５Ａ、Ｋ１９３Ｒ／Ｅ６４２Ａ、Ｈ６８５Ａ）を発現する野生型（ＷＴ）ＤＲＧニューロン、または空ベクターを発現するＳＡＲＭ１  ＫＯ  ＤＲＧを４０ｎＭビンクリスチンとともにインキュベートし、示された時点で軸索変性を評価した（図９Ａ）。空ベクターを発現するＷＴ  ＤＲＧでは、軸索は２４時間までに変性し、ビンクリスチン投与から４８時間で完璧に断片化する。これに対して、ＳＡＲＭ１の２重および３重点突然変異を発現するＷＴの軸索およびＳＡＲＭ１  ＫＯニューロンの軸索は、少なくとも１２０時間にわたってビンクリスチン誘導性軸索変性から保護される。ＳＡＲＭ１の２重および３重突然変異型の発現は、化学療法剤ビンクリスチンに対し、軸索完全性を維持する。さらに、Ｋ１９３における多くのアミノ酸置換は、強力なドミナントネガティブＳＡＲＭ１コンストラクトを生成する。ＳＡＲＭ１導入遺伝子は、示されるアミノ酸置換（Ｋ１９３Ａ、Ｋ１９３Ｅ、Ｋ１９３Ｑ、Ｋ１９３Ｍおよび上記のＫ１９３Ｒ）を用いて生成された。野生型軸索で発現させた場合、すべての示される突然変異型は強力なドミナントネガティブであり、軸索切断後に長期持続性軸索保護をもたらす。したがって、多種多様のアミノ酸タイプへのＫ１９３の突然変異が、強力なドミナントネガティブＳＡＲＭ１導入遺伝子を生成する。Ｋ１９３Ａが特に強力であることに留意されたい（図１０）。
【０１３０】
１９３近くの突然変異も試験した。野生型Ｓａｒｍ１（ＷＴ）、Ｅ１８９Ｋ、Ｈ１９０ＡまたはＣ１９９Ｓ突然変異を保有するウイルスを、野生型ＣＤ１  ＤＲＧニューロンに感染させた（図１１Ａ）。５日後、軸索を切断し、軸索変性の重症度（ＡＤＩ）をモニターした。Ｅ１８９ＫおよびＨ１９０Ａは、ＷＴ感染と比較して有意な保護を示したが、Ｃ１９９Ｓ突然変異はいかなる保護も与えなかった。野生型Ｓａｒｍ１（ＷＴ）、Ｒ５７０Ａ突然変異を保有するウイルスを野生型ＣＤ１  ＤＲＧニューロンに感染させた（図１１Ｂ）。５日後、軸索を切断し、軸索変性の重症度（ＡＤＩ）をモニターした。Ｒ５７０Ａは、ＷＴと比較して有意な保護を示した。最後に、ＳＡＲＭ１  Ｅ５６９Ｋ、Ｄ６２７Ｋ、Ｋ６２８ＤまたはＣ６２９Ｓコンストラクトを発現するニューロンを、軸索変性阻害能力について試験した。ＳＡＲＭ１  Ｅ５６９Ｋ、Ｄ６２７Ｋ、Ｋ６２８ＤまたはＣ６２９Ｓを発現する軸索は、２４時間で野生型と同様の速さで変性し、これによって、これらはドミナントネガティブとして作用しないことが示される（図１１Ｃ）。
【０１３１】
実施例に関する材料および方法
すべての手順は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針において義務付けられ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌの動物実験委員会（プロトコール＃２０１７００３０および２０１５００４３）によって認められた指針に従って行った。この原稿はＡＲＲＩＶＥ指針に準拠して作成した。妊娠中のＣ５７ＢＩ／６ＮＴａｃマウスはＴａｃｏｎｉｃ（Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ、ＮＹ）から購入し、妊娠中のＣＤ１マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。ＳＡＲＭ１ノックアウトマウスはＭａｒｃｏ  Ｃｏｌｏｎｎａ（Szretter et al., 2009）からの寄贈物であり、本発明者らのコロニーで繁殖させた。すべての実験に雄と雌のマウスを使用した。別段指示がない限り、化学薬品はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
【０１３２】
後根神経節の培養
ダルベッコ改変イーグル培地中で、後根神経節（ＤＲＧ）を胎生期１３．５（Ｅ１３．５）またはＥ１４．５のＣＤ−１（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）から、またはＥ１３．５  ＳＡＲＭ１ノックアウトマウスの胚から切り離した。ＤＲＧニューロンを３７℃の０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ中で切り離し、２％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｎｇ／ｍＬの神経成長因子（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１μΜの５−フルオロ−２−デオキシウリジンおよび１μΜのウリジンを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンでコーティングされた４８ウェルプレート中にプレーティングした。翌日（ＤＩＶ１日目）、濃縮したレンチウイルスを５０倍の最終希釈で加えた。直接比較をともなうすべての実験は、変動性を最小限にするために同じプレート上で行った。
【０１３３】
レンチウイルスのコンストラクトおよび感染
哺乳類発現コンストラクトは、ユビキチンプロモーターおよびＶｅｎｕｓマーカーを含むＦＣＩＶレンチウイルスベクター（Araki et al., 2004）に由来した。ＶｅｎｕｓがタグされたＳＡＲＭ１融合タンパク質は、ＳＡＲＭ１のＣ末端とＶｅｎｕｓの間にＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒリンカーを用いて、ＶｅｎｕｓとインフレームにＳＡＲＭ１  ｃＤＮＡを挿入することによって作出した。ＳＡＲＭ１突然変異型コンストラクトは、メガプライムＰＣＲ方法によって生成した。ＩｎＦｕｓｉｏｎシステムを使用して、残基２〜２７および５６１〜７２４を欠くＳＡＲＭ１欠失突然変異型（デルタＴＩＲ）をＦＣＩＶにサブクローニングした。対照ベクターは、ｖｅｎｕｓまたはユビキチンプロモーターの制御化にある高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）（ＥＧＦＰベクター）を含んでいた。シークエンシングによってクローンの挿入が成功していることを確認した。以前に記載されているように（Araki et al., 2004）、レンチウイルス発現ベクターＦＣＩＶとレンチウイルスパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質のＨＥＫ２９３Ｔ細胞への同時トランスフェクションによってレンチウイルス粒子を生成した。トランスフェクション後４８時間目にレンチウイルス粒子を収集し、これを、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ濃縮器（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて１〜１０×１０７感染粒子／ｍｌの終濃度に濃縮した。コンストラクトのレンチウイルス発現は、細胞体中の陽性蛍光シグナルによって確認し、９２．２±７．６％（ＳＡＲＭ１−デルタＴＩＲ）から９８．８±０．７％（ＳＡＲＭ１−Ｅ６４２Ａ；図６）の感染ＤＲＧの範囲であった。
【０１３４】
軸索切断およびビンクリスチン
ＤＲＧニューロンを４８ウェルマイクロタイタープレート中で培養し、自動化顕微鏡による軸索の画像化を可能にするように細胞体を隔離した。ＤＩＶ８日目に、ＤＲＧの軸索を、顕微鏡のガイダンスの下で３ｍｍ幅の平たい刃を用いてソマエ（ｓｏｍａｅ）の近くで手作業により切断した。軸索再生を防ぐために細胞体を除去した。ビンクリスチン（ＤＭＳＯ中４０ｎＭ）または媒体（ＤＭＳＯ）をＤＩＶ８日目に加え、実験の終わりまでウェル中に残した。
【０１３５】
軸索変性の画像化および定量化
生軸索についてウェルあたり１５〜２０個の明視野画像を、２０×対物レンズを有するＯｐｅｒｅｔｔａハイコンテンツ画像化システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して示された時点で取得した。ＩｍａｇｅＪベースのスクリプト（Sasaki et al., 2009）を使用して、軸索変性を軸索形態に基づいて定量化し「変性指数」（ＤＩ）として報告し、ＤＩは０（完全にインタクト）から１（完全に断片化）の範囲である。０．５を超える値は大規模な軸索変性を示す。すべての画像を詳しく調べ、軸索がないフィールドかまたは不適切な画像化を除外した。ウェルあたり１０〜１５個の画像を技術的複製物として測定した。すべての実験は少なくとも３回行い、各実験について、条件あたり３〜５ウェルを平均した。ミトコンドリア電位を評価するために、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、３０分後に、倒立Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１顕微鏡およびＮｉｋｏｎ  ＤＳ−ＱｉＩＭＣカメラを用いて、軸索を画像化した。コンストラクト間で露出時間を一定に保った。同じ顕微鏡およびカメラを使用して、位相差で明視野画像を得た。
【０１３６】
ＮＡＤ＋のＨＰＬＣによる定量化
ＣＤ１  Ｅ１３．５  ＤＲＧおよびＳＡＲＭ１  ＫＯ  Ｅ１３．５  ＤＲＧを、ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンでコーティングされた２４ウェルプレート中にスポット培養としてプレーティングした。ＤＩＶ１日目に、ユビキチン（Ｕｂｑｕｉｔｉｎ）−ＥＧＦＰまたはユビキチン−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ−Ｖｅｎｕｓを発現する濃縮したウイルスをニューロンに形質導入した。ＤＩＶ６日目に、記載のように、軸索を切断し、細胞体を除去した。即時（＝０時間時点）または軸索切断後４時間で、軸索を０．９％冷食塩水で洗浄し、０．５Ｍ過塩素酸の添加により溶解した。抽出物を遠心分離し、上清を収集し、３ＭのＫ２ＣＯ３で中和し、リン酸カリウム緩衝液中に希釈した。ＬＣ−１８Ｔ  ＨＰＬＣカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）による１ｍｌ／分の流速のＨＰＬによって、ＮＡＤ＋をアッセイした。溶出ピークをＮＡＤ＋標準と一致させた。条件あたり４ウェルを平均し、３つの独立の実験を行った。
【０１３７】
ＡＡＶコンストラクトおよびウイルス注射
ヒトシナプシンプロモーターの制御化にあるＥＧＦＰを発現するＡＡＶベクターはＡｄｄｇｅｎｅ（Ｂｒｙａｎ  Ｒｏｔｈからの寄贈物；Ａｄｄｇｅｎｅ＃５０４６５）から得て、ＥＧＦＰ−ベクター対照（Ａｄｄｇｅｎｅウイルス調製（ｐｒｅｐ）＃５０４６５−ＡＡＶ８）として使用した。ｐＡＡＶ−ｈＳｙｎ−ＥＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃５０４６５）をＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで切断し、ｉｎＦｕｓｉｏｎ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）システムを使用して、ＳＡＲＭ１−Ｋ１９３Ｒ／Ｈ１９４Ａ／Ｈ６８５Ａ（ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ）をシナプシンプロモーターとＥＧＦＰ配列の間に挿入した。ＡＡＶ８−ｈＳＹＮ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ−ＥＧＦＰは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓのｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｏｐｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓによって生成された。イオジキサノール勾配超遠心分離法によってウイルス粒を精製し、ドットブロットによってウイルス力価を測定した。アバチンによる軽い麻酔の下で、出生後日数１１または１２の雄（ｎ＝７）および雌（ｎ＝１０）のＣ５７ＢＩ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）中に６×１０１１ウイルスゲノム（ｖｇ）をＬ６／Ｓ１で髄腔内注射した。ＥＧＦＰ−ベクターを注射した２匹の雌マウスはその後死亡したが、ＳＡＲＭ１ドミナントネガティブコンストラクトを注射したマウスはどれも死亡しなかった。
【０１３８】
坐骨神経切断および組織収集
ウイルス注射から５週間後に、マウス（ｎ＝９）の１つの群をイソフルランで麻酔し、右坐骨神経を切断し、再接続を予防するために神経末端を曲げて互いに離した。神経切断から５日後、マウスにアバチンで麻酔し、坐骨神経および腓腹神経を切離摘出した後、４％パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝食塩水で経心的に灌流した。脊髄および後根神経節を切離摘出し、３０％ショ糖中で一晩凍結保護し、ドライアイスで冷却した液状２−メチルブタン中のＯ．Ｃ．Ｔ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃ）中で凍結した。ウイルス注射から８週間後にマウス（ｎ＝６）の第２群の坐骨神経を切断し、上記のように、１０日後に組織を収集した。比較のために、年齢が一致する（１１週）ＳＡＲＭ１ノックアウトマウス（ｎ＝１０；５匹の雄／５匹の雌）に坐骨神経切断を加え、切断したから５日後（ｎ＝５匹のマウス；２匹の雌／３匹の雄）または１０日後（ｎ＝５匹のマウス、３匹の雌／２匹の雄）に坐骨神経および腓腹神経を切離摘出した。
【０１３９】
トルイジンブルー染色および軸索の定量化
腓腹神経および坐骨神経を、新しく調製した３％グルタルアルデヒドの０．１Ｍ  ＰＢＳ中に浸漬することによって一晩固定し、最近記載されたように（Geisler et al., 2016）処理した。Ｌｅｉｃａ  ＥＭ  ＵＣ７ウルトラミクロトームを使用して横断切片（４００ｎｍ厚）を切断し、これを１％トルイジンブルー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ  ７０００−Ｔカメラを備えたＬｅｉｃａ  ＤＭＩ  ４０００Ｂ顕微鏡の６３×油浸対物レンズを用いて、腓腹神経の切片を画像化した。Ｌｅｉｃａのソフトウェアを使用して顕微鏡写真をステッチし、横断切片あたりのすべての軸索をＩｍａｇｅＪで数えた。軸索のサイズ分布および坐骨神経のＧ比を決定するために、横断切片あたり４つの重複していない領域をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐの１００×油対物レンズを用いて画像化し、Ｈｉｔａｃｈｉのカメラで撮影した。カスタマイズされた半自動二値画像化解析方法（Hunter et al., 2007）を用いて写真を解析した。処理群あたり３つの神経を解析し、神経あたり４領域の結果を平均した。すべての解析は盲検観察者によって行われた。
【０１４０】
電子顕微鏡
腓腹神経の選択されたブロックを使用して、９０ｎｍ厚の超薄切片を切断し、これを酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、ＪＥＯＬ  ＪＥＭ  １４００  ＴＥＭで見て調べた。
【０１４１】
免疫組織化学
後根神経節および坐骨神経の６μｍ厚の切片をクリオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１８６０）で切断し、スライドにマウントし、最近記載されたように（Geisler et al., 2016）処理した。群間の直接比較をともなう実験は、変動性を最小限にするために並行して行った。一次抗体は、ウサギ抗タンパク質遺伝子産物９．５（１：１０００、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＡＢ１７６１−１−Ｉ）、ウサギ抗ペリフェリン（１：２５０、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＡＢ１５３０）、ウサギ抗神経フィラメント２００（１：１０００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｎ４１４２）およびａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートしたマウス抗緑色蛍光タンパク質（１：２５０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃Ａ−２１３１１）を含んでいた。二次抗体は、１：５００希釈のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４コンジュゲート化ヤギ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて切片にカバーガラスをかけて、核の可視化を可能にした。坐骨神経およびＤＲＧを、それぞれ４０×および２０×の浸漬油対物レンズを使用して、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ  ４０００Ｂの共焦点モードで画像化した。Ｉｍａｇｅ  Ｊにおいて、全ＤＲＧの１つのステッチされた共焦点スライス中のＰＧＰ９．５陽性およびＧＦＰ陽性のＤＲＧニューロンを数えた。動物あたり２つの異なるＤＲＧのそれぞれ１切片を数え、値を平均した。ＡＡＶ８−Ｓｙｎ−ＳＡＲＭ１−ＣＤＮ−ＥＧＦＰの注射後に、ＰＧＰ９．５陽性ＤＲＧニューロンの８５±０．４％でＧＦＰが発現していた。
【０１４２】
統計解析
別段の記載がない限り、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）としてデータを報告する。群間比較は、必要に応じて一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡで行った。全体を通して両側有意性検定を使用し、Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であるとみなした。すべての統計値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算した。
【０１４３】
参考文献
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【図１Ａ】
2021500347.tif 000002
【図１Ｂ】
2021500347.tif 000003
【図１Ｃ】
2021500347.tif 000004
【図１Ｄ】
2021500347.tif 000005
【図１Ｅ】
2021500347.tif 000006
【図２Ａ】
2021500347.tif 000007
【図２Ｂ】
2021500347.tif 000008
【図２Ｃ】
2021500347.tif 000009
【図２Ｄ】
2021500347.tif 000010
【図２Ｅ】
2021500347.tif 000011
【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
2021500347.tif 000013
【図３Ｂ】
2021500347.tif 000014
【図３Ｃ】
2021500347.tif 000015
【図３Ｄ】
2021500347.tif 000016
【図３Ｅ】
2021500347.tif 000017
【図４Ａ】
2021500347.tif 000018
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
2021500347.tif 000020
【図４Ｄ】
2021500347.tif 000021
【図４Ｅ−Ｆ】
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【図４Ｇ】
2021500347.tif 000023
【図５Ａ】
2021500347.tif 000024
【図５Ｂ】
2021500347.tif 000025
【図６Ａ】
2021500347.tif 000026
【図６Ｂ】
2021500347.tif 000027
【図７Ａ】
2021500347.tif 000028
【図７Ｂ】
2021500347.tif 000029
【図７Ｃ】
2021500347.tif 000030
【図７Ｄ】
2021500347.tif 000031
【図７Ｅ】
2021500347.tif 000032
【図７Ｆ】
2021500347.tif 000033
【図８Ａ】
2021500347.tif 000034
【図８Ｂ】
2021500347.tif 000035
【図８Ｃ】
2021500347.tif 000036
【図９Ａ】
2021500347.tif 000037
【図９Ｂ】
2021500347.tif 000038
【図１０】
2021500347.tif 000039
【図１１Ａ】
2021500347.tif 000040
【図１１Ｂ】
2021500347.tif 000041
【図１１Ｃ】
2021500347.tif 000042
【配列表】
2021500347000001.app
【国際調査報告】
2021500347.tif 000043
2021500347.tif 000044
2021500347.tif 000045
2021500347.tif 000046