(57)【要約】  上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーチロシンキナーゼ阻害剤であって、Ｃ７９７Ｓ突然変異を有するＥＧＦＲにおけるセリンＳ７９７残基またはＣ８０５Ｓ突然変異を有するＨＥＲ２におけるセリンＳ８０５残基に結合することができる官能基を含む、ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーチロシンキナーゼ阻害剤であって、Ｃ７９７Ｓ突然変異を有するＥＧＦＲにおけるセリンＳ７９７残基またはＣ８０５Ｓ突然変異を有するＨＥＲ２におけるセリンＳ８０５残基に結合することができる官能基を含む、ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含み、
【化１】
2021500350.tif 000071
式中、
Ａが、
【化２】
2021500350.tif 000072
であり、
Ｒ４が、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリールであるか、または共にシクロアルキルを形成し、
Ｒ５が、−ＮＨＲ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ｒ６が、水素、アルキル、シクロアルキル、ペルハロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ｒ７が、ＮＨＲ６、水素、アルキル、シクロアルキル、ペルハロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ｒ１１が、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルキル−ＣＯ２Ｒ１２から選択されるか、または共に（＝Ｏ）を形成することができ、Ｒ１２が、水素またはＣ１〜６アルキルから選択され、
Ｒ１が、１〜５個のＸで置換されたＣ６〜１０アリール、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つを有し、１〜５個のＸで置換された５〜１０員の複素環式基、またはフェニルで置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２が、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシ、またはＣ１〜６アルコキシもしくはＮ、ＯおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つを有する５員または６員複素環式基で置換されたＣ１〜６アルコキシであり、
Ｒ３が、水素、−ＣＯＯＨ、Ｃ１〜６アルキルオキシカルボニル、Ｎ−非置換アミド、またはＹでＮ−置換されたアミドであり、
ｎａおよびｎｂが、それぞれ０〜６の範囲の整数であるが、ｎａおよびｎｂが同時に０ではないことを条件とし、ｎａが０であるとき、前記
【化３】
2021500350.tif 000073
が、
【化４】
2021500350.tif 000074
であり、
かつｎｂが０であるとき、前記
【化５】
2021500350.tif 000075
が
【化６】
2021500350.tif 000076
であり、
式中、
Ｘが、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、（モノ−、ジ−、またはトリハロゲノ）メチル、メルカプト、Ｃ１〜６アルキルチオ、アクリルアミド、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜６ジアルキルアミノ、Ｚで置換されたＣ１〜６アルキル、またはＺで置換されたＣ１〜６アルコキシであり、
Ｙが、ヒドロキシ、またはＣ１〜６アルキルもしくはＺで置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｚが、ヒドロキシ、Ｃ１〜３アルコキシ、Ｃ１〜３アルキルチオ、Ｃ１〜３アルキルスルホニル、ジ−Ｃ１〜３アルキルアミン、Ｃ１〜６アルキル、アリール、または５員もしくは６員芳香族または非芳香族複素環基であり、前記複素環式基が、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、およびＳＯ２からなる群から選択される１〜４個の部分を含有し、前記アリールおよび複素環式基が、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６モノアルキルアミノ、およびＣ１〜６ジアルキルアミノからなる群から選択された置換基で置換されている、請求項１に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項３】
Ｒ６が、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキルである、請求項２に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項４】
Ｒ７が、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキルである、請求項２または請求項３に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項５】
Ｒ１が、３個のＸで置換されたＣ６−アリールである、請求項２〜４のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項６】
ｎａおよびｎｂが、両方とも２である、請求項２〜５のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項７】
Ｒ２が、メトキシである、請求項２〜６のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項８】
Ｒ３が、水素である、請求項２〜７のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項９】
Ａが、
【化７】
2021500350.tif 000077
であり、Ｒ４が、それぞれ個々にハロゲンである、請求項２〜８のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項１０】
Ｒ４が、フルオロである、請求項９に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項１１】
Ａが、
【化８】
2021500350.tif 000078
であり、Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７であり、Ｒ７が、ＮＨＲ６である、請求項２〜１０のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項１２】
Ａが、
【化９】
2021500350.tif 000079
であり、Ｒ４が、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールであるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成する、請求項２〜８のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項１３】
Ａが、
【化１０】
2021500350.tif 000080
であり、Ｒ４が、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールであるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成する、請求項２〜８のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項１４】
１）４−（４−（（４−（３，４−ジクロロ−２フルオロフェニル）アミノ）−７−メトキシキナゾリン−６−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）−Ｎ，３，３−トリメチル−２，４−ジオキソブタンアミド、
２）（２−（４−（（４−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）アミノ）−７−メトキシキナゾリン−６−）イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）−２−オキソエチル）ボロン酸、および
３）１−（４−（（４−（（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）アミノ）−７−メトキシキナゾリン−６−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）−２，２−ジフルオロブタン−１，３−ジオンからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項１５】
式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、もしくは溶媒和物を含み、
【化１１】
2021500350.tif 000081
式中、
Ａが、
【化１２】
2021500350.tif 000082
であり、
Ｅが、
【化１３】
2021500350.tif 000083
であり、
Ｊが、−ＣＯ２Ｒ１０、ハロ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１０を含み、
Ｒ８が、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリールから選択されるか、または共にシクロアルキルを形成し、
Ｒ１０が、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを含み、
Ｒ１１が、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルキル−ＣＯ２Ｒ１２から選択されるか、または共に（＝Ｏ）を形成することができ、Ｒ１２が、水素またはＣ１〜６アルキルから選択され、
ＣおよびＤが、それぞれ独立して、アルキル、−Ｎ（Ｒ８）２、−ＯＲ８、アルキル−Ｗから選択されるか、または共にシクロアルキルを含むことができ、
Ｗが、−Ｎ（Ｒ８）２または−ＯＲ８から選択され、
Ｌが、−ＣＯ２ＮＨ２、−ＣＯ２ＮＨＲ１０、アルキル、ペルフルオロアルキル、またはシクロアルキルから選択される、請求項１に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項１６】
ＣおよびＤのうちの一方または両方が、Ｃ１〜６アルキルであるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを含む、請求項１５に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項１７】
ＣおよびＤの一方または両方が、１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている、請求項１５または請求項１６に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項１８】
Ｒ８が、それぞれ独立して、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成する、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項１９】
Ｒ８の一方または両方が、１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２０】
Ｌが、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８ペルフルオロアルキル、またはＣ３〜７シクロアルキルであり、かつ非置換であるか、または１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２１】
Ｅが、
【化１４】
2021500350.tif 000084
である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２２】
Ｅが、
【化１５】
2021500350.tif 000085
である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２３】
Ｅが、
【化１６】
2021500350.tif 000086
である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２４】
Ｊが、−ＣＯ２Ｒ１０を含む、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２５】
Ｊが、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１０を含む、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２６】
Ｒ１０が、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキルを含む、請求項２４または２５のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２７】
Ｊが、クロロである、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２８】
１）（２−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）アミノ）−５−（（４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）ボロン酸、および
２）Ｎ−（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）アミノ）−５−（（４−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）フェニル）−２，２−ジフルオロ−３−オキソブタンアミドからなる群から選択される、請求項１５に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項２９】
式（ＩＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、もしくは溶媒和物を含み、
【化１７】
2021500350.tif 000087
式中、
Ｇが、
【化１８】
2021500350.tif 000088
であり、
Ｒ９が、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリールから選択されるか、または共にシクロアルキルを形成し、
Ｍが、−ＣＯ２ＮＨ２、−ＣＯ２ＮＨＲ１０、アルキル、ペルフルオロアルキル、または任意に１個以上の炭素原子上にアルキル分岐鎖を含むシクロアルキルから選択され、
Ｒ１０が、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを含み、
Ｒ１１が、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルキル−ＣＯ２Ｒ１２から選択されるか、または共に（＝Ｏ）を形成することができ、Ｒ１２が、水素またはＣ１〜６アルキルから選択される、請求項１に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項３０】
Ｒ９が、それぞれ独立してＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成する、請求項２９に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項３１】
Ｒ９の一方または両方が、１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている、請求項２９または請求項３０に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項３２】
Ｍが、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８ペルフルオロアルキル、またはＣ３〜７シクロアルキルであり、かつ非置換であるか、または１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項３３】
Ｇが、
【化１９】
2021500350.tif 000089
である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項３４】
Ｇが、
【化２０】
2021500350.tif 000090
である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項３５】
Ｇが、
【化２１】
2021500350.tif 000091
である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項３６】
有効成分としての請求項２〜３５のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項３７】
ＥＧＦＲ  Ｃ７９７Ｓ突然変異を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、薬学的有効量の、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与することを含む、方法。
【請求項３８】
ＨＥＲ２  Ｃ８０５Ｓ突然変異を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、薬学的有効量の、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、変異体上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーチロシンキナーゼの阻害剤、その薬学的に許容される塩または溶媒和物、およびＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、その塩または溶媒和物を活性成分として含む薬学的組成物に関する。より具体的には、本開示は、ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼの過剰発現または活性化によって誘発された癌細胞の増殖を効果的に阻害する、ＥＧＦＲ中のＣ７９７Ｓ変異体および／またはＨＥＲ２中のＣ８０５Ｓ変異体に選択的なＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞中には、細胞の増殖、成長、転移、およびアポトーシスを制御するために、互いに機能的に結合された多くのシグナル伝達系がある。遺伝的および環境的要因による細胞内制御系の破壊は、腫瘍細胞生成をもたらすシグナル伝達系の異常な増幅または破壊を引き起こす。
【０００３】
タンパク質チロシンキナーゼは、このような細胞調節において重要な役割を果たしており、これらの異常な発現または突然変異は、癌細胞中で観察されている。タンパク質チロシンキナーゼは、ＡＴＰからのリン酸基のタンパク質基質上に位置するチロシンへの輸送を触媒する酵素である。チロシンキナーゼのような多くの成長因子受容体タンパク質は、細胞シグナルを輸送するように機能する。成長因子とそれらの受容体との間の相互作用は、通常、細胞の成長を制御することができるが、受容体のいずれかの突然変異または過剰発現によって引き起こされる異常なシグナル伝達は、腫瘍細胞および癌を誘発することが多い。
【０００４】
タンパク質チロシンキナーゼは、その成長因子の種類に従って多くのファミリーに分類されており、特に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に構造的に関連しているチロシンキナーゼが集中的に研究されてきた。ＥＧＦＲチロシンキナーゼは、受容体とチロシンキナーゼとから構成され、細胞膜を通して細胞核に細胞外シグナルを送達する。ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼファミリーには、ＥＧＦＲ（Ｅｒｂ−Ｂ１）、ＨＥＲ２（Ｅｒｂ−Ｂ２）、ＨＥＲ３（Ｅｒｂ−Ｂ３）、およびＥｒｂ−Ｂ４が含まれ、これらのそれぞれがホモ二量体またはヘテロ二量体シグナル送達複合体を形成することができる。また、悪性細胞では、２つ以上のこのようなヘテロ二量体の過剰発現が、観察されることが多い。加えて、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の両方が、ヘテロ二量体シグナル送達複合体の形成に大きく寄与していることが知られている。
【０００５】
例えば、ＥＧＦＲのキナーゼドメインにおける活性化突然変異が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の約１０〜２０％で観察されている。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）は、突然変異したＥＧＦＲを標的にするために開発された。ＥＧＦＲ−ＴＫＩは、ＥＧＦＲのＡＴＰ結合ポケットに可逆的または不可逆的に結合して、ＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、それにより、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性化を阻害する。
【０００６】
活性化変異体ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ（例えば、ｄ７４６〜７５０変異体、Ｌ８５８５Ｒ変異体、およびエクソン２０挿入変異体）を阻害するためのいくつかの小分子薬、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブなどが開発されている。ゲフィチニブまたはエルロチニブは、ＥＧＦＲを選択的かつ可逆的に阻害し、ラパチニブは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の両方を可逆的に阻害し、それにより、腫瘍の成長を阻止して、患者の寿命を大幅に延ばすか、または治療上の利点を提供する。
【０００７】
前述のＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤は、キナゾリン部分の共通の構造的特徴を有しており、キナゾリン部分を有するチロシンキナーゼ阻害剤は、国際公開第ＷＯ９９／００６３９６号、同第ＷＯ９９／００６３７８号、同第ＷＯ９７／０３８９８３号、同第Ｗ０２０００／０３１０４８号、同第ＷＯ９８／０５００３８号、同第ＷＯ９９／０２４０３７号、同第ＷＯ２０００／００６５５５号、同第ＷＯ２００１／０９８２７７号、同第ＷＯ２００３／０４５９３９号、同第ＷＯ２００３／０４９７４０号、および同第ＷＯ２００１／０１２２９０号；米国特許第７，０１９，０１２号および同第６，２２５，３１８号；ならびに欧州特許第０７８７７２２号、同第０３８７０６３号、および同第１２９２５９１号に開示されている。
【０００８】
ＥＧＦＲ標的に対する不可逆的な阻害剤が、従来の可逆的阻害剤と比較して、耐性発現の問題を克服する上でより有利であることが判明している。ＢＩＢＷ−２９９２（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ９８，８０，２００８）、ＨＫＩ−２７２（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４，３９５８，２００４）、およびＡＶ−４１２（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９８（１２），１９７７，２００７）などの不可逆的阻害剤が開発されている。前述の不可逆的な阻害剤の共通の特徴は、ＥＧＦＲのＡＴＰドメインまたはＨＥＲ２のシステイン８０５（Ｃｙｓ８０５）に位置するシステイン７９７（Ｃｙｓ７９７、以前はＣｙｓ７７３と呼ばれていた）と共有結合を形成し、それにより、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２の自己リン酸化を不可逆的にブロックして、癌細胞のシグナル伝達を効率的に阻害する、キナゾリンまたはシアノキナゾリン残基のＣ−６位にあるアクリルアミド官能基である。これらの不可逆的阻害剤は、従来の可逆的阻害剤と比較して、より高いインビトロおよびインビボの阻害活性を示す。
【０００９】
国際特許公開第ＷＯ２００８／０３２０３９号は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼに対して改善された阻害活性を示す、キナゾリンのＣ−６位に別のアクリルアミド置換基を有する新規抗癌化合物を開示している。
【００１０】
これらの薬剤は、化学療法単独と比較して、患者の約７０％が客観的奏効、改善された無増悪生存期間、および生活の質を経験し、優れた臨床的有効性を実証している。しかしながら、良好な初期治療反応を示したＮＳＣＬＣ患者において薬剤耐性が現れた。この獲得された薬剤耐性は、ゲートキーパー位置での二次体細胞突然変異（Ｔ７９０Ｍ）（例えば、Ｌ８５８５Ｒ／Ｔ７９０Ｍ、ｄ７４６−７５０／Ｔ７９０Ｍ変異体、エクソン２０挿入／Ｔ７９０Ｍ変異体）に起因する。ゲフィチニブまたはエルロチニブで治療された患者の約半分は、ゲフィチニブまたはエルロチニブに対する耐性を発現し、そのような薬物は、そのようなＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ多様体患者に実質的な臨床効果を提供しない。Ｔ７９０Ｍ突然変異は、ＥＧＦＲ阻害剤のＥＧＦＲのＡＴＰ結合部位への結合を阻害する。
【００１１】
アファチニブ、ダコミチニブ、ポジオチニブ、およびネラチニブなどの第２世代のＥＧＦＲ阻害剤は、後天的な薬剤耐性を克服するために開発されたが、野生型ＥＧＦＲの同時阻害によって、様々な重度の副作用を引き起こす。小分子阻害剤は、ＥＧＦＲ中の７９７位のシステイン残基（Ｃｙｓ７９７）またはＨＥＲ２のシステイン８０５と共有結合を形成し、それによりＥＧＦＲまたはＨＥＲ２の自己リン酸化を不可逆的にブロックし、癌細胞のシグナル伝達を効率的に阻害する。
【００１２】
いくつかの不可逆的な第２世代ＥＧＦＲ阻害剤は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８／１５０１１８号に記載されている。前述の不可逆的な阻害剤の共通の特徴は、アニリン−キナゾリンスキャフォールド上のアクリルアミド官能基であり、ここでは、スペーサ基が、アクリルアミド官能基とキナゾリン環との間に位置付けられる。アクリルアミド官能基は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のＡＴＰドメインに位置付けられたシステイン７９７（Ｃｙｓ７９７）とシステイン８０５（Ｃｙｓ８０５）のそれぞれとに共有結合を形成する。
【００１３】
ナザルチニブ、オシメルチニブ（米国特許第８，９５６，２３５号に記載されている）、ロシレチニブ、ＨＭ６１７１３、およびＷＺ４００２を含む第３世代のＥＧＦＲ阻害剤は、薬剤耐性Ｔ７９０Ｍ変異体に対して特徴的な特異性を示す。前述の不可逆的な阻害剤の共通の特徴は、ピリミジンスキャフォールド上のアクリルアミド官能基である。
【００１４】
ＥＧＦＲ変異体ＮＳＣＬＣ患者の約１０〜１２％は、ＥＧＦＲのエクソン２０内にインフレーム挿入を有し、一般的にＥＧＦＲ−ＴＫＩに耐性である。加えて、ＮＳＣＬＣにおけるＨＥＲ２突然変異の９０％は、エクソン２０突然変異である。利用可能なＨＥＲ２のチロシンキナーゼ阻害剤（アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ）は、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２エクソン２０変異体患者での活性を制限した。第３世代のＥＧＦＲ  ＴＫＩ（オシメルチニブおよびロシレチニブ）は、ＥＧＦＲエクソン２０に誘導されるＮＳＣＬＣの患者由来の異種移植片モデルで最小限の活性を有することが判明した。ＥＧＦＲと同様に、活性化ＨＥＲ２は、活性化ＨＥＲ２のチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性をもたらす、ゲートキーパー位置（Ｔ７９８Ｍ）での二次突然変異を裏付けることができる。
【００１５】
ＥＧＦＲにおける突然変異（Ｃ７９７Ｓ）およびＨＥＲ２における突然変異（Ｃ８０５Ｓ）の出現は、これらの不可逆的な阻害剤がＥＧＦＲのＣ７９７の側鎖またはＨＥＲ２のＣ８０５の側鎖と共有結合を形成することを防止することによって、既知の全ての第３世代ＥＧＲＦ−ＴＫＩに対する新しい薬剤耐性をもたらした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９９／００６３９６号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ９９／００６３７８号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ９７／０３８９８３号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ２０００／０３１０４８号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ９８／０５００３８号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ９９／０２４０３７号公報
【特許文献７】国際公開ＷＯ２０００／００６５５５号公報
【特許文献８】国際公開ＷＯ２００１／０９８２７７号公報
【特許文献９】国際公開ＷＯ２００３／０４５９３９号公報
【特許文献１０】同第ＷＯ２００３／０４９７４０号公報
【特許文献１１】同第ＷＯ２００１／０１２２９０号公報
【特許文献１２】米国特許第７，０１９，０１２号公報
【特許文献１３】米国特許第６，２２５，３１８号公報
【特許文献１４】欧州特許第０７８７７２２号公報
【特許文献１５】欧州特許第０３８７０６３号公報
【特許文献１６】欧州特許第１２９２５９１号公報
【特許文献１７】国際公開ＷＯ２００８／０３２０３９号公報
【特許文献１８】国際公開第ＷＯ２００８／１５０１１８号公報
【特許文献１９】米国特許第８，９５６，２３５号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ９８，８０，２００８
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４，３９５８，２００４
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９８（１２），１９７７，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本開示の一態様は、Ｃ７９７Ｓ突然変異を有するＥＧＦＲにおけるセリン残基Ｓ７９７、またはＣ８０５Ｓ突然変異を有するＨＥＲ２におけるセリン残基Ｓ８０５に結合することができる官能基を含む上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を提供する。不可逆的阻害剤で治療されたＴ７９０Ｍ、Ｔ７９８Ｍ、および／またはエクソン２０挿入変異体患者は、ＥＧＦＲにおけるＣ７９７Ｓ突然変異および／またはＨＥＲ２におけるＣ８０５Ｓ突然変異を獲得することによって耐性を発現し得る。本開示の阻害剤は、Ｔ７９０ＭまたはＴ７９８Ｍ突然変異によって妨害されず、Ｃ７９７Ｓ変異体および／またはＣ８０５Ｓ変異体のセリンに有利に結合し、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２の自己リン酸化をブロックし、癌細胞のシグナル伝達を阻害することができる。本明細書で使用される場合、かつ別途定めがない限り、「ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤」または「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤」は、ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ変異体（例えば、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のｄ７４６〜７５０変異体、Ｌ８５８５Ｒ変異体、および／またはエクソン２０挿入変異体）、およびその二次または三次変異体（例えば、Ｔ７９０Ｍ変異体、Ｔ７９８Ｍ変異体、Ｃ７９７Ｓ変異体、およびＣ８０５Ｓ変異体）を阻害する小分子化合物を指す。
【００２０】
本明細書で使用される場合、かつ別途定めがない限り、阻害剤が野生型ＥＧＦＲを同時に実質的に阻害しない場合、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は「選択的」である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、かつ別途定めがない限り、阻害剤がセリン残基と配位結合または共有結合を形成することができる場合、阻害剤はセリン残基に「結合する」ことができる。
【００２２】
本開示の別の態様は、セリン変異体Ｃ７９７Ｓ  ＥＧＦＲおよび／またはＣ８０５Ｓ変異体ＨＥＲ２に結合することができる官能基を含むＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を提供し、ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤が、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含み、
【化１】
2021500350.tif 000002
式中、
Ａは、
【化２】
2021500350.tif 000003
であり、
Ｒ４は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリールであるか、または共にシクロアルキルを形成し、
Ｒ５は、−ＮＨＲ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ｒ６は、水素、アルキル、シクロアルキル、ペルハロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、Ｒ７は、ＮＨＲ６、水素、アルキル、シクロアルキル、ペルハロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ｒ１１は、それぞれ独立して水素、アルキル、アルキル−ＣＯ２Ｒ１２から選択されるか、または共に（＝Ｏ）を形成することができ、Ｒ１２は、水素またはＣ１〜６アルキルから選択され、
Ｒ１は、１〜５個のＸで置換されたＣ６〜１０アリール、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つを有し、１〜５個のＸで置換された５〜１０員の複素環式基、またはフェニルで置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシ、またはＣ１〜６アルコキシもしくはＮ、ＯおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つを有する５員または６員複素環式基で置換されたＣ１〜６アルコキシであり、
Ｒ３は、水素、−ＣＯＯＨ、Ｃ１〜６アルキルオキシカルボニル、Ｎ−非置換のアミド、またはＹでＮ−置換されたアミドであり、
ｎａおよびｎｂは、それぞれ０〜６の範囲の整数であるが、ｎａおよびｎｂが同時に０ではないことを条件とし、ｎａが０であるとき、該
【化３】
2021500350.tif 000004
は
【化４】
2021500350.tif 000005
であり、
かつｎｂが０であるとき、該
【化５】
2021500350.tif 000006
は
【化６】
2021500350.tif 000007
であり、
式中、
Ｘは、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、（モノ−、ジ−、またはトリハロゲノ）メチル、メルカプト、Ｃ１〜６アルキルチオ、アクリルアミド、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜６ジアルキルアミノ、Ｚで置換されたＣ１〜６アルキル、またはＺで置換されたＣ１〜６アルコキシであり、
Ｙは、ヒドロキシまたはＣ１〜６アルキルもしくはＺで置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｚは、ヒドロキシ、Ｃ１〜３アルコキシ、Ｃ１〜３アルキルチオ、Ｃ１〜３アルキルスルホニル、ジ−Ｃ１〜３アルキルアミン、Ｃ１〜６アルキル、アリール、または５員もしくは６員芳香族または非芳香族複素環基であり、該複素環式基が、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、およびＳＯ２からなる群から選択される１〜４個の部分を含有し、該アリールおよび複素環式基が、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６モノアルキルアミノ、およびＣ１〜６ジアルキルアミノからなる群から選択された置換基で置換されている。
【００２３】
本開示の別の態様は、セリン変異体Ｃ７９７Ｓ  ＥＧＦＲまたはＣ８０５Ｓ  ＨＥＲ２に結合することができる官能基を含むＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を提供し、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含み、
【化７】
2021500350.tif 000008
式中、
Ａは、
【化８】
2021500350.tif 000009
であり、
Ｅは、
【化９】
2021500350.tif 000010
であり、
Ｊは、−ＣＯ２Ｒ１０、ハロ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１０を含み、
Ｒ８は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリールから選択されるか、または共にシクロアルキルを形成し、
Ｒ１０は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを含み、
Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルキル−ＣＯ２Ｒ１２から選択されるか、または共に（＝Ｏ）を形成することができ、Ｒ１２は、水素またはＣ１〜６アルキルから選択され、
ＣおよびＤは、それぞれ独立して、アルキル、−Ｎ（Ｒ８）２、−ＯＲ８、アルキル−Ｗから選択されるか、または共にシクロアルキルを含むことができ、
Ｗは、−Ｎ（Ｒ８）２または−ＯＲ８から選択され、
Ｌは、−ＣＯ２ＮＨ２、−ＣＯ２ＮＨＲ１０、アルキル、ペルフルオロアルキル、またはシクロアルキルから選択される。
【００２４】
本開示の別の態様は、セリン変異体Ｃ７９７Ｓ  ＥＧＦＲおよび／またはＣ８０５Ｓ  ＨＥＲ２に結合することができる官能基を含むＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を提供し、ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤が、式（ＩＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含み、
【化１０】
2021500350.tif 000011
式中、
Ｇは、
【化１１】
2021500350.tif 000012
であり、
Ｒ９は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリールから選択されるか、または共にシクロアルキルを形成し、
Ｍは、−ＣＯ２ＮＨ２、−ＣＯ２ＮＨＲ１０、アルキル、ペルフルオロアルキル、または任意に１個以上の炭素原子上にアルキル分岐鎖を含むシクロアルキルから選択され、
Ｒ１０は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを含み、
Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルキル−ＣＯ２Ｒ１２から選択されるか、または共に（＝Ｏ）を形成することができ、Ｒ１２は、水素またはＣ１〜６アルキルから選択される。
【００２５】
本開示の別の態様は、有効成分としての、ＥＧＦＲのセリン変異体（Ｃ７９７Ｓ）および／またはＨＥＲ２の（Ｃ８０５Ｓ）に結合することができる官能基を含むＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と、薬学的に許容される担体と、を含む薬学的組成物を提供する。
【００２６】
本開示の別の態様は、ＥＧＦＲ  Ｃ７９７Ｓ突然変異またはＨＥＲ２  Ｃ８０５Ｓ突然変異を有する対象を治療する方法であって、対象に、薬学的有効量の、本開示によるＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与することを含む、方法を提供する。
【００２７】
本明細書に記載される化合物および組成物については、任意の特徴は、本明細書に提供される様々な態様、実施形態、および実施例から選択されることが企図される。
【００２８】
さらなる態様および利点は、以下の発明を実施するための形態を査読することで、当業者には明らかであろう。化合物および組成物は、様々な形態の実施形態で可能であるが、以降の説明は、開示が例示的であり、本発明を本明細書に記載の特定の実施形態に限定することを意図するものではないという理解の下で、特定の実施形態を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、Ｃ７９７Ｓ突然変異を有するＥＧＦＲにおけるセリン残基Ｓ７９７および／またはＣ８０５Ｓ突然変異を有するＨＥＲ２におけるセリン残基Ｓ８０５に結合することができる官能基を含む上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を提供する。有利には、ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異体および／またはＨＥＲ２のＣ８０５Ｓ変異体のセリンに結合することができる官能基を含むＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤はまた、Ｃ７９７Ｓおよび／またはＣ８０５Ｓ突然変異が、それぞれＴ７９０Ｍ突然変異またはＴ７９８Ｍ突然変異と共存する限りにおいて、変異体Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ  ＥＧＦＲおよび／または変異体Ｔ７９８Ｍ／Ｃ８０５  ＨＥＲ２を選択的に阻害する。理論に拘束されることを望むものではないが、ＥＧＦＲの突然変異が、システイン７９７のセリンによる置き換えに関与し、ＨＥＲ２の突然変異が、システイン８０５のセリンによる置き換えに関与し、セリンの求核性ヒドロキシル基が、ボロン酸または電子不足カルボニルなどのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤上の電子不足官能基と結合することができると考えられている。電子不足カルボニルは、タンパク質の増殖シグナル伝達が結合形成を介して破壊されるように、セリントラップとして使用することができる。
【００３０】
本開示のＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異体および／またはＨＥＲ２のＣ８０５Ｓ変異体におけるセリンに結合することができる官能基を含むＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤は、式（Ｉ）の化合物または、その薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含むことができ、
【化１２】
2021500350.tif 000013
式中、
Ａは、
【化１３】
2021500350.tif 000014
であり、
Ｒ４は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリールであるか、または共にシクロアルキルを形成し、
Ｒ５は、−ＮＨＲ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ｒ６は、水素、アルキル、シクロアルキル、ペルハロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、Ｒ７は、ＮＨＲ６、水素、アルキル、シクロアルキル、ペルハロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルキル−ＣＯ２Ｒ１２から選択されるか、または共に（＝Ｏ）を形成することができ、Ｒ１２は、水素またはＣ１〜６アルキルから選択され、
Ｒ１は、１〜５個のＸで置換されたＣ６〜１０アリール、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される少なくとも１つを有し、１〜５個のＸで置換された５〜１０員の複素環式基、またはフェニルで置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２は、水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシ、またはＣ１〜６アルコキシもしくはＮ、ＯおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つを有する５員または６員複素環式基で置換されたＣ１〜６アルコキシであり、
Ｒ３は、水素、−ＣＯＯＨ、Ｃ１〜６アルキルオキシカルボニル、Ｎ−非置換アミド、またはＹでＮ−置換されたアミドであり、
ｎａおよびｎｂは、それぞれ０〜６の範囲の整数であるが、ｎａおよびｎｂが同時に０ではないことを条件とし、ｎａが０であるとき、該
【化１４】
2021500350.tif 000015
は
【化１５】
2021500350.tif 000016
であり、
かつｎｂが０であるとき、該
【化１６】
2021500350.tif 000017
は
【化１７】
2021500350.tif 000018
であり、
式中、
Ｘは、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、（モノ−、ジ−、またはトリハロゲノ）メチル、メルカプト、Ｃ１〜６アルキルチオ、アクリルアミド、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜６ジアルキルアミノ、Ｚで置換されたＣ１〜６アルキル、またはＺで置換されたＣ１〜６アルコキシであり、
Ｙは、ヒドロキシまたはＣ１〜６アルキルもしくはＺで置換されたＣ１〜６アルキルであり、
Ｚは、ヒドロキシ、Ｃ１〜３アルコキシ、Ｃ１〜３アルキルチオ、Ｃ１〜３アルキルスルホニル、ジ−Ｃ１〜３アルキルアミン、Ｃ１〜６アルキル、アリール、または５員もしくは６員芳香族または非芳香族複素環基であり、該複素環式基が、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、およびＳＯ２からなる群から選択される１〜４個の部分を含有し、該アリールおよび複素環式基が、非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６モノアルキルアミノ、およびＣ１〜６ジアルキルアミノからなる群から選択された置換基で置換されている。
【００３１】
「ハロゲン」という用語は、別途記載のない限り、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを指す。実施形態では、各ハロゲンは、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードからなる群から個々に選択することができる。実施形態では、少なくとも１つのハロゲンは、フルオロを含む。実施形態では、全てのハロゲンは、フルオロを含む。実施形態では、少なくとも１つのハロゲンは、クロロを含む。
【００３２】
「アルキル」という用語は、別途記載のない限り、直鎖、環状、または分枝状部分（すなわち、非置換または置換であり得る）を有する飽和一価炭化水素ラジカルを指す。実施形態では、各アルキルは、非置換アルキルおよびメチル、エチル、プロピル、またはこれらの組み合わせで置換されたアルキルからなる群から個々に選択することができる。
【００３３】
Ｘがアリールオキシである実施形態では、Ｘはフェニルオキシとすることができる。ＹがＣ１〜６アルキルまたはＺで置換されたＣ１〜６アルキルである実施形態では、Ｃ１〜６アルキルは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、およびＳＯ２からなる群から選択される１〜４個の部分を含むことができる。Ｚがアリールである実施形態では、Ｚはフェニルとすることができる。Ｚがアリールである実施形態では、該アリール基は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、およびＳＯ２からなる群から選択される１〜４個の部分を含有するＣ５〜１２の単環式または二環式芳香族もしくは非芳香族基とすることができる。
【００３４】
実施形態では、Ｒ６は、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキルである。実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキルである。実施形態では、Ｒ１は、３個のＸで置換されたＣ６アリールである。実施形態では、ｎａおよびｎｂは、両方とも２である。実施形態では、Ｒ２は、メトキシである。実施形態では、Ｒ３は、水素である。
【００３５】
実施形態では、Ａは、
【化１８】
2021500350.tif 000019
である。実施形態では、Ａは、
【化１９】
2021500350.tif 000020
であり、Ｒ４は、両方ともハロゲンである。実施形態では、Ａは、
【化２０】
2021500350.tif 000021
であり、Ｒ４は、両方ともフルオロである。
【００３６】
実施形態では、Ａは、
【化２１】
2021500350.tif 000022
であり、Ｒ５は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７であり、Ｒ７は、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキルであり、Ｒ１は、３個のＸで置換されたＣ６アリールであり、ｎａおよびｎｂは、両方とも２であり、Ｒ２は、メトキシであり、Ｒ３は、水素であり、Ｒ４は、それぞれ個々にハロゲンである。
【００３７】
実施形態では、Ａは、
【化２２】
2021500350.tif 000023
であり、Ｒ５は、Ｃ（Ｏ）Ｒ７を含み、Ｒ７は、ＮＨＲ６を含む。実施形態では、Ａは、
【化２３】
2021500350.tif 000024
であり、Ｒ５は、Ｃ（Ｏ）Ｒ７を含み、Ｒ７は、ＮＨＲ６を含み、Ｒ４は、それぞれ個々に、フルオロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にシクロアルキルを形成する。実施形態では、Ａは、
【化２４】
2021500350.tif 000025
であり、Ｒ５は、Ｃ（Ｏ）Ｒ７を含み、Ｒ７は、ＮＨＲ６を含み、Ｒ６は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、ペルハロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから選択される。
【００３８】
実施形態では、Ａは、
【化２５】
2021500350.tif 000026
であり、Ｒ５は、Ｃ（Ｏ）Ｒ７を含み、Ｒ７は、ＮＨＲ６、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキルを含み、Ｒ６は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、ペルハロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから選択され、Ｒ４は、それぞれ、フルオロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから個々に選択されるか、または共にシクロアルキルを形成し、Ｒ１は、３個のＸで置換されたＣ６アリールであり、ｎａおよびｎｂは、両方とも２であり、Ｒ２は、メトキシであり、Ｒ３は、水素である。
【００３９】
実施形態では、Ａは、
【化２６】
2021500350.tif 000027
である。実施形態では、Ａは、
【化２７】
2021500350.tif 000028
であり、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールであるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成する。実施形態では、Ａは、
【化２８】
2021500350.tif 000029
であり、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールであるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成し、Ｒ１は、３個のＸで置換されたＣ６アリールであり、ｎａおよびｎｂは、両方とも２であり、Ｒ２は、メトキシであり、Ｒ３は、水素である。
【００４０】
実施形態では、Ａは、
【化２９】
2021500350.tif 000030
である。実施形態では、
【化３０】
2021500350.tif 000031
Ａは、
【化３１】
2021500350.tif 000032
であり、式中、２つのＲ１１は、共に（＝Ｏ）を含み、かつ２つのＲ１１は、それぞれメチル−ＣＯ２Ｒ１２を含み、式中、Ｒ１２は、水素であり、そのため、Ａは、
【化３２】
2021500350.tif 000033
である。実施形態では、Ａは、
【化３３】
2021500350.tif 000034
、例えば
【化３４】
2021500350.tif 000035
であり、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールであるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成する。
実施形態では、Ａは、
【化３５】
2021500350.tif 000036
、例えば
【化３６】
2021500350.tif 000037
であり、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールであるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成し、Ｒ１は、３個のＸで置換されたＣ６アリールであり、ｎａおよびｎｂは、両方とも２であり、Ｒ２は、メトキシであり、Ｒ３は、水素である。
【００４１】
本開示による式（Ｉ）の化合物の例としては、
１）４−（４−（（４−（３，４−ジクロロ−２フルオロフェニル）アミノ）−７−メトキシキナゾリン−６−）イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）−Ｎ、３，３−トリメチル−２，４−ジオキソブタンアミド
２）（２−（４−（（４−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）アミノ）−７−メトキシキナゾリン−６−）イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）−２−オキソエチル）ボロン酸、および
３）１−（４−（（４−（（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）アミノ）−７−メトキシキナゾリン−６−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）−２，２−ジフルオロブタン−１，３−ジオンが挙げられる。
【００４２】
本開示の別の態様は、ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓにおけるセリンおよび／またＨＥＲ２のＣ８０５Ｓにおけるセリンに結合することができる官能基を含むＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を提供し、ＥＧＦＲファミリー阻害剤が、式（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含み、
【化３７】
2021500350.tif 000038
式中、
Ａは、
【化３８】
2021500350.tif 000039
であり、
Ｅは、
【化３９】
2021500350.tif 000040
であり、
Ｊは、−ＣＯ２Ｒ１０、ハロ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１０を含み、
Ｒ８は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリールから選択されるか、または共にシクロアルキルを形成し、
Ｒ１０は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを含み、
Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルキル−ＣＯ２Ｒ１２から選択されるか、または共に（＝Ｏ）を形成することができ、Ｒ１２は、水素またはＣ１〜６アルキルから選択され、
ＣおよびＤは、それぞれ独立して、アルキル、−Ｎ（Ｒ８）２、−ＯＲ８、アルキル−Ｗから選択されるか、または共にシクロアルキルを含むことができ、
Ｗは、−Ｎ（Ｒ８）２または−ＯＲ８から選択され、
Ｌは、−ＣＯ２ＮＨ２、−ＣＯ２ＮＨＲ１０、アルキル、ペルフルオロアルキル、またはシクロアルキルから選択される。
【００４３】
実施形態では、Ｊは、ハロを含む。実施形態では、Ｊは、クロロを含む。実施形態では、Ｊは、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１０を含み、かつＲ１０は、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキル、任意に置換されたＣ１〜６アルキルもしくはＣ３〜７シクロアルキルを含む。実施形態では、Ｊは、−ＣＯ２Ｒ１０を含み、かつＲ１０は、Ｃ１〜６アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキル、任意に置換されたＣ１〜６アルキルもしくはＣ３〜７シクロアルキルを含む。実施形態では、Ｊは、−ＣＯ２Ｒ１０を含み、かつＲ１０は、ｔｅｒｔ−ブチルまたはシクロヘキシルを含むか、あるいはＪは、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１０を含み、かつＲ１０は、イソプロピルを含む。
【００４４】
実施形態では、ＣおよびＤの一方または両方は、１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている。実施形態では、Ｌは、Ｃ１〜８アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキルであり、かつ非置換であるか、または１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている。実施形態では、Ｒ８は、それぞれ独立して、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成する。実施形態では、一方または両方のＲ８は、１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている。
【００４５】
実施形態では、Ｅは、
【化４０】
2021500350.tif 000041
である。実施形態では、Ｅは、
【化４１】
2021500350.tif 000042
であり、ＣおよびＤの一方または両方は、１つ以上の炭素原子でＣ１〜３アルキルで置換され、Ｒ８は、それぞれ独立してＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成する。
【００４６】
実施形態では、Ｅは、
【化４２】
2021500350.tif 000043
である。実施形態では、Ｅは、
【化４３】
2021500350.tif 000044
であり、ＣおよびＤの一方または両方は、１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されており、Ｌは、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８ペルフルオロアルキル、またはＣ３〜７シクロアルキルであり、かつ非置換であるか、または１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されており、Ｒ８は、それぞれ独立して、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成する。
【００４７】
実施形態では、Ｅは、
【化４４】
2021500350.tif 000045
である。実施形態では、Ｅは、
【化４５】
2021500350.tif 000046
であり、式中、２つのＲ１１は、共に（＝Ｏ）を含み、かつ２つのＲ１１は、メチル−ＣＯ２Ｒ１２を含み、式中、Ｒ１２は、水素であり、そのため、Ｅは、
【化４６】
2021500350.tif 000047
である。実施形態では、Ｅは、
【化４７】
2021500350.tif 000048
、例えば、
【化４８】
2021500350.tif 000049
であり、ＣおよびＤの一方または両方は、１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されており、Ｒ８は、それぞれ独立して、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成する。
【００４８】
本開示による式（ＩＩ）の化合物の例としては、
１）２−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）アミノ）−５−（（４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−１−３−イる）ピリミジン−２−イル）アミノ）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）ボロン酸、および
２）Ｎ−（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）アミノ）−５−（（４−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）フェニル）−２，２−ジフルオロ−３−オキソブタンアミドが挙げられる。
【００４９】
本開示の別の態様は、ＥＧＦＲのＣ７９７Ｓ変異体および／またＨＥＲ２のＣ８０５Ｓ変異体におけるセリン残基に結合することができる官能基を含むＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を提供し、ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤が、式（ＩＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含み、
【化４９】
2021500350.tif 000050
式中、
Ｇは、
【化５０】
2021500350.tif 000051
であり、
Ｒ９は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、ヘテロアリールから選択されるか、または共にシクロアルキルを形成し、
Ｍは、−ＣＯ２ＮＨ２、−ＣＯ２ＮＨＲ１０、アルキル、ペルフルオロアルキル、または任意に１個以上の炭素原子上にアルキル分岐鎖を含むシクロアルキルから選択され、
Ｒ１０は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アリール、またはヘテロアリールを含み、
および
Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルキル−ＣＯ２Ｒ１２から選択されるか、または共に（＝Ｏ）を形成することができ、Ｒ１２は、水素またはＣ１〜６アルキルから選択される。
【００５０】
実施形態では、Ｒ９は、それぞれ独立して、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成する。実施形態では、一方または両方のＲ９は、１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている。実施形態では、Ｍは、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８ペルフルオロアルキル、またはＣ３〜７シクロアルキルであり、Ｍは、非置換であるか、または１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている。
【００５１】
実施形態では、Ｒ９は、それぞれ独立して、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成し、各Ｒ９は、非置換であるか、または１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されており、Ｍは、Ｃ１〜８アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキルであり、かつＭは、非置換であるか、または１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている。
【００５２】
実施形態では、Ｇは、
【化５１】
2021500350.tif 000052
である。実施形態では、Ｇは、
【化５２】
2021500350.tif 000053
であり、Ｒ９は、それぞれ独立して水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成し、かつ各Ｒ９は、非置換であるか、または１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている。
【００５３】
実施形態では、Ｇは、
【化５３】
2021500350.tif 000054
である。実施形態では、Ｇは、
【化５４】
2021500350.tif 000055
であり、式中、２つのＲ１１は、共に（＝Ｏ）を含み、かつ２つのＲ１１は、メチル−ＣＯ２Ｒ１２を含み、式中、Ｒ１２は、水素であり、そのため、Ｇは、
【化５５】
2021500350.tif 000056
である。実施形態では、Ｇは、
【化５６】
2021500350.tif 000057
、例えば、
【化５７】
2021500350.tif 000058
であり、Ｒ９は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成し、かつ各Ｒ９は、非置換であるか、または１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている。
【００５４】
実施形態では、Ｇは、
【化５８】
2021500350.tif 000059
である。実施形態では、Ｇは、
【化５９】
2021500350.tif 000060
であり、Ｒ９は、それぞれ独立して、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキルから選択されるか、または共にＣ３〜７シクロアルキルを形成し、かつ各Ｒ９は、非置換であるか、または１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されており、Ｍは、Ｃ１〜８アルキルまたはＣ３〜７シクロアルキルであり、かつＭは、非置換であるか、または１つ以上の炭素原子上でＣ１〜３アルキルで置換されている。
【００５５】
本開示の式（Ｉ）の化合物は、例えば、反応スキーム（Ｉ）（［Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００１；１１：１９１１］および国際特許公開第ＷＯ２００３／０８２８３１号を参照されたい）に示される手順により調製することができ、
【化６０】
2021500350.tif 000061
式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ｎａおよびｎｂは、式（Ｉ）の化合物について上で定義されたものと同じ意味を有する。
【００５６】
反応スキーム（Ｉ）において、式（Ｘ）の化合物を高温（例えば、２１０℃）でホルムアミジン塩酸塩との縮合反応に供して、中間体式（ＩＸ）の化合物を形成し、続いて、有機酸（例えば、メタンスルホン酸）中のＬ−メチオニンとの反応によって、中間式（ＩＸ）の化合物のＣ−６位においてメチルの除去を誘導して、中間式（ＶＩＩＩ）の化合物を形成する。
【００５７】
続いて、中間式（ＶＩＩＩ）の化合物を、塩基（例えば、ピリジン）および無水酢酸中で保護反応に供して、中間式（ＶＩＩ）の化合物を形成し、続いて、触媒量のジメチルホルムアミドの存在下、還流条件下で無機酸（例えば、塩化チオニルまたはオキシ塩化リン）と反応させて、中間式（ＶＩ）の化合物を塩酸塩の形態で形成する。
【００５８】
中間式（ＶＩ）の化合物を、撹拌されたアンモニア含有アルコール溶液（例えば、７Ｎアンモニア含有メタノール溶液）に添加し、そこからアセチルの除去を誘導して、中間式（ＩＶ）の化合物を形成する。中間式（ＩＶ）の化合物を、式（Ｖ）の化合物との光延反応および有機溶媒（例えば、２−プロパノールまたはアセトニトリル）中でのＲ１ＮＨ２との置換反応に順次供して、それにＲ１を導入する。得られた化合物を、有機溶媒（例えば、塩化メチレン）中で、有機酸または無機酸（例えば、トリフルオロ酢酸または重塩酸）との反応に供し、ｔ−ブトキシカルボニルの除去を誘導して、中間式（ＩＩ）の化合物を形成する。光延反応においては、アゾジカルボン酸ジイソプロピル、アゾジカルボン酸ジエチル、アゾジカルボン酸ジ−ｔ−ブチル、またはトリフェニルホスフィンが使用されてもよい。
【００５９】
続いて、無機または有機塩基（例えば、重炭酸ナトリウム、ピリジンまたはトリエチルアミン）の存在下で、有機溶媒の混合物（例えば、テトラヒドロフランと水または塩化メチレン）中で、中間式（ＩＩ）の化合物を中間式（ＩＩＩ）の化合物、Ａ−Ｃｌとの縮合反応に供することによって、またはカップリング剤（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）または２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルユーロピウムヘキサフルオロホスフェートメタナミニウム（ＨＡＴＵ））の存在下で、有機溶媒（例えば、テトラヒドロフランまたは塩化メチレン）中で、中間式（ＩＩ）の化合物を、中間式体（ＩＩＩ）の化合物、Ａ−ＯＨとの縮合反応に供することによって、本開示の中間式（Ｉ）の化合物が調製される。
【００６０】
本開示の式（ＩＩ）の化合物は、例えば、反応スキーム（ＩＩＡおよびＩＩＢ）（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，５７（２０），ｐｐ８２４９−８２６７を参照されたい）に示される手順によって調製することができる。
【化６１】
2021500350.tif 000062
式中、Ｊ、Ｄ、およびＣは、式（ＩＩ）の化合物について上で定義されたものと同じ意味を有する。
【化６２】
2021500350.tif 000063
式中、Ｊ、Ｄ、およびＣは、式（ＩＩ）の化合物について上で定義されたものと同じ意味を有する。
【００６１】
反応スキーム（ＩＩＡ）と反応スキーム（ＩＩＢ）との間の違いは、工程（ｉ）におけるインドール（ＩＩＡ）またはピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン（ＩＩＢ）の添加である。反応スキーム（ＩＩ）において、基Ｊで置換された２，４−ジクロロピリミジンは、０℃のＴＨＦ中のＭｅＭｇＢｒ（１当量、２−メチルＴＨＦ中３．２Ｍ）および１当量のインドールまたはピラゾロ［１，５−ａ］ピリジンと反応させ、６０℃に加温した（ｉ）。１．０５当量の水酸化ナトリウムおよび１．０５当量のヨウ化メチルを反応スキーム（ＩＩＡ）において０℃で添加して、インドール窒素の水素をメチル基で置き換える（ｉｉ）。４−フルオロ−５−ニトロアニリン（１．０５当量）、トシル酸（１．１当量）、および２−ペンタノールを混合物に１２５℃で添加した（ｉｉｉ）。続いて、ＤＭＡ中の２．２当量のＮ（Ｄ）（Ｃ）部分を１４０℃で添加し（ｉｖ）、続いて、３当量の鉄、０．７当量の塩化アンモニウム、エタノール、水を１００℃で添加した（ｖ）。続いて、０℃のＤＩＰＥＡおよびＴＨＦ中のＥ−ＣｌまたはＥ−ＯＨ（１Ｍ、ＴＨＦ、１当量）を添加してセリンに結合できる官能基を組み込み、これにより式（ＩＩ）の化合物を形成した。
【００６２】
本開示の式（ＩＩＩ）の化合物は、例えば、反応スキーム（ＩＩＩ）（国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／１６２５１５Ａ２号を参照されたい）に示される手順によって調製することができる。
【化６３】
2021500350.tif 000064
式中、Ｇは、式（ＩＩＩ）の化合物について上で定義されたものと同じ意味を有する。
【００６３】
反応スキーム（ＩＩＩ）において、式１の化合物を、還流温度から２００℃の範囲の温度での、有機溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、またはＮ−メチルピロリドン）中で尿素との縮合反応；または室温から１００℃の範囲の温度での６％〜５０％の酢酸水溶液などの酸性条件下でシアン酸カリウムとの縮合反応に供して、式２の縮合化合物を得る。
【００６４】
このようにして得られた式３の化合物を、塩素化剤（例えば、オキシ塩化リンまたは塩化チオニル）の存在下で撹拌しながら還流させて、式４の塩素化化合物を得て、続いて、室温から１００℃までの温度で、無機塩基（例えば、炭酸セシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウム）の存在下で、有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、トルエンまたはベンゼン）中で反応させ、式４の化合物のＣ−４位での式５の化合物による置換を誘導して、式６の化合物を得る。
【００６５】
式６の化合物を、７０℃から還流温度の範囲の温度で、有機酸（例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））の存在下にて、アルコール溶液（例えば、２−プロパノールまたは２−ブタノール）中で式７の化合物と反応させて、式８の化合物を得る。
【００６６】
式８の化合物を、パラジウム／炭素触媒を用いた水素化、またはＦｅで仲介された還元反応に供して、式９のアニリン化合物を得る。その後、式９のアニリン化合物を、−１０℃〜１０℃の低温範囲で、無機塩基（例えば、重炭酸ナトリウム）または有機塩基（例えば、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミン）の存在下で、有機溶媒（例えば、塩化メチレンまたはテトラヒドロフラン）中、または５０％テトラヒドロフラン水溶液などの混合溶媒中での基Ｇの塩化物との反応に供するか；あるいは、カップリング剤（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）または２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウランヘキサフルオロリン酸メタンアミニウム（ＨＡＴＵ））を使用した、ピリジン中の基Ｇの酸との反応に供して、式（ＩＩＩ）のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤化合物に対応する式１０の化合物を得る。
【００６７】
本開示の式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物はまた、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびトルエンスルホン酸などの無機酸または有機酸と形成された薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の形態で使用することができる。
【００６８】
本開示の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、システインからセリンへの突然変異を有する活性化上皮成長因子ファミリーのチロシンキナーゼによって誘発される癌細胞の増殖を、選択的かつ効率的に阻害して、別の抗癌剤と組み合わせたときに増強された抗癌効果を提供する。すなわち、本開示の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、細胞シグナル伝達阻害剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的反応調節剤、抗ホルモン剤および抗アンドロゲンからなる群から選択される抗癌剤の効果を増強させるために有用である。
【００６９】
したがって、本開示は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、上記の薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、または有効成分としての上記の組み合わせのうちの１つ以上を含む、癌細胞増殖を阻害するための薬学的組成物、およびＥＧＦＲ  Ｃ７９７Ｓ突然変異および／またはＨＥＲ２  Ｃ８０５Ｓ突然変異を有する対象を治療する方法であって、対象に、薬学的有効量の本開示によるＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与することを含む、方法を提供する。
【００７０】
本開示の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、ヒトを含む哺乳動物の場合、単回投与または分割投与で、１日当たりの約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．２〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の有効量で、有効成分として経口または非経口投与され得る。有効成分の投与量は、治療される対象の状態、疾患の種類ならびに重篤性、投与速度、医師の意見などの、様々な関連する要因を考慮して調整され得る。ある特定の症例では、上記の投与量より少ない量が好適である場合がある。上記の投与量が有害な副作用を引き起こさない限り、上記の投与量を超える量が使用されてもよく、そのような量は、１日当たりの分割用量で投与することができる。
【００７１】
薬学的組成物は、経口投与用、または筋肉内、静脈内および皮下経路を含む非経口投与用に、錠剤、粒剤、粉剤、カプセル、シロップ、乳剤またはマイクロエマルジョンの形態で、従来の方法のいずれかに従って製剤化され得る。
【００７２】
経口投与用の薬学的組成物は、活性成分を、セルロース、ケイ酸カルシウム、コーンスターチ、ラクトース、デキストロース、リン酸カルシウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ゼラチン、タルク、界面活性剤、懸濁剤、乳化剤および希釈剤などの担体と混合することによって調製され得る。本開示の注射可能な組成物で使用される担体の例は、水、生理食塩水、グルコース溶液、グルコース様溶液、アルコール、グリコールエーテル（例えば、ポリエチレングリコール４００）、油、脂肪酸、脂肪酸エステル、グリセリド、界面活性剤、懸濁剤および乳化剤である。
【００７３】
以下の実施例は、本開示を、その範囲を限定することなく、さらに例証することを意図している。
【実施例】
【００７４】
実施例１：中間式ＩＩＩの化合物の調製
（１−１）６，７−ジメトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン
【００７５】
３６．９ｇの４，５−ジメトキシアントラニル酸を、２５．０ｇのホルムアミジン塩酸塩と混合し、この混合物を２１０℃で３０分間撹拌した。反応の完了後、このようにして得られた固体を室温まで冷却し、２００ｍｌ（０．３３Ｍ）の水酸化ナトリウム水溶液と共に撹拌し、減圧下で濾過した。このようにして得られた固体を水で洗浄し、空気乾燥させて、表題化合物（２４．６ｇ、６４％）を得た。
【００７６】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．９９（ｓ、１Ｈ）、７．４４（ｓ、１Ｈ）、７．１３（ｓ、１Ｈ）、３．９０（ｓ、３Ｈ）、３．８７（ｓ、３Ｈ）。
【００７７】
（１−２）６−ヒドロキシ−７−メトキシキナゾリン−４（３Ｈ）−オン
【００７８】
３．０６ｇの（１−１）で得られた化合物を、２０ｍｌのメタンスルホン酸で希釈した。２．６６ｇのＬ−メチオニンを、得られた溶液に添加し、１００℃で２２時間撹拌した。反応混合物に氷を添加し、４０％の水酸化ナトリウム溶液で中和し、生成物の結晶化を誘発させた。固体を減圧下で濾過し、水で洗浄し、空気乾燥させて、表題化合物（２。６７ｇ、９４％）を得た。
【００７９】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．９４（ｓ、１Ｈ）、９．８１（ｓ、１Ｈ）、７．９２（ｓ、１Ｈ）、７．３９（ｓ、１Ｈ）、７．１１（ｓ、１Ｈ）、３．９１（ｓ、３Ｈ）。
【００８０】
（１−３）７−メトキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−６−イルアセテート
【００８１】
６．０８ｇの（１−２）で得られた化合物を、５５０ｍｌの酢酸と７ｍｌのピリジンとの混合物中に溶解し、得られた溶液を、１００℃で３時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、それに氷を添加して、生成物の結晶化を誘発させた。固体を減圧下で濾過し、水で洗浄し、空気乾燥させて、表題化合物（４．８７ｇ、６５％）を得た。
【００８２】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．２１（ｓ、１Ｈ）、８．０９（ｓ、１Ｈ）、７．７６（ｓ、１Ｈ）、７．２８（ｓ、１Ｈ）、３．９１（ｓ、３Ｈ）、２．３０（ｓ、３Ｈ）。
【００８３】
（１−４）４−クロロ−７−メトキシキナゾリン−６−イルアセテート塩酸塩
【００８４】
４．８７ｇの（１−３）で得られた化合物を、３３ｍｌの塩化チオニルと６ｍｌのオキシ塩化リンとの混合物に溶解した。２滴のジメチルホルムアミドを、得られた溶液に添加し、１２０℃で７時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、溶媒を減圧下でそれから除去し、残渣を得た。トルエンを残渣に添加し、得られた溶液を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、この手順をさらに２回繰り返した。このようにして得られた固体を減圧下乾燥させて、表題化合物（５．１６ｇ）を得た。
【００８５】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．０１（ｓ、１Ｈ）、８．０２（ｓ、１Ｈ）、７．６４（ｓ、１Ｈ）、４．０２（ｓ、３Ｈ）、２．３５（ｓ、３Ｈ）。
【００８６】
（１−５）４−クロロ−７−メトキシキナゾリン−６−オール
【００８７】
２ｇの（１−４）で得られた化合物を、２５ｍｌの７Ｎアンモニアメタノール溶液に添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、反応混合物中に形成された固体を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させて、表題化合物を得た（１．４３ｇ、９８％）。
【００８８】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．７８（ｓ、１Ｈ）、７．４１（ｓ、１Ｈ）、７．３７（ｓ、１Ｈ）、４．００（ｓ、３Ｈ）。
【００８９】
（１−６）Ｎ−（３、４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−メトキシキナゾリン−６−イルオキシ）ピペリジン−１−イル）プロ−２−ペン−１−オン
【００９０】
１．４３ｇの（１−５）で得られた化合物、１．９１ｇの（Ｒ）−（−）−Ｎ−Ｂｏｃ−４−ヒドロキシピペリジン、および１．９６ｇのトリフェニルホスフィンを、２０ｍｌの塩化メチレンに添加し、そこに２．０１ｍｌのジイソプロピルアゾジカルボキシレートを滴加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、減圧下で蒸留して、残渣をカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：塩化メチレン：メタノール＝２０２０：１）により簡単に精製した。次いで、部分的に精製した残渣を、６０ｍｌの２−プロパノール中に溶解し、１．１７ｇの３，４−ジクロロ−４−フルオロアニリンをそれに添加し、混合物を１００℃で３時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で蒸留して溶媒を除去し、残渣を６０ｍｌの塩化メチレン６０ｍｌ中に溶解した。６０ｍｌのトリフルオロ酢酸をそれに添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で蒸留して、溶媒を除去した。飽和重炭酸ナトリウム溶液を得られた残渣に添加して、それを塩基性にして、続いてクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸留した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール＝１：２）に供し、表題化合物を得た。
【００９１】
実施例２：１−（４−（（４−（（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）アミノ）−７−メトキシキナゾリン−６−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）−２，２−ジフルオロブタン−１，３−ジオンの調製
【化６４】
2021500350.tif 000065
（１−６）で得られた化合物の一部（１ｍｍｏｌ）を、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏｐ）（１．５当量）、トリエチルアミン（３．０当量）、ジクロロメタン（３０ｍｌ）、および２，２−ジフルオロ−３−オキソブタン酸（１．３当量）と、室温で、撹拌を続けながら１２時間混合する。
【００９２】
実施例３：４−（４−（（４−（（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）アミノ）−７−メトキシキナゾリン−６−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）−Ｎ，３，３−トリメチル−２，４−ジオキソブタンアミドの調製
【化６５】
2021500350.tif 000066
（１−６）で得られた化合物の一部（１ｍｍｏｌ）を、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏｐ）（１．５当量）、トリエチルアミン（３．０当量）、ジクロロメタン（３０ｍｌ）、および２，２−ジメチル−４−（メチルアミノ）−３，４−ジオキソブタン酸（１．３当量）と、室温で、撹拌を続けながら１２時間混合する。
【００９３】
実施例４：（２−（４−（（４−（（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）アミノ）−７−メトキシキナゾリン−６−イル）オキシ）ピペリジン−１−イル）−２−オキソエチル）ボロン酸の調製
【化６６】
2021500350.tif 000067
（１−６）で得られた化合物の一部（１ｍｍｏｌ）を、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏｐ）（１．５当量）、トリエチルアミン（３．０当量）、ジクロロメタン（３０ｍｌ）、および２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシボラニル）酢酸（１．３当量）と、室温で、撹拌を続けながら１２時間混合する。次いで、混合物を、濃ＨＣｌと混合する。
【００９４】
実施例５：Ｎ１−（２−ジメチルアミノ）エチル）−Ｎ１−メチル−Ｎ４−（４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル）ベンゼン−１，２，４−トリアミンの調製
【化６７】
2021500350.tif 000068
２，４−ジクロロピリミジンを、０℃のＴＨＦ中のＭｅＭｇＢｒ（１当量、２−メチルＴＨＦ中３．２Ｍ）および１当量のインドールと反応させ、６０℃に加温する。１．０５当量の水酸化ナトリウムおよび１．０５当量のヨウ化メチルを０℃で添加し、インドール窒素上の水素をメチル基で置き換える。４−フルオロ−５−ニトロアニリン（１．０５当量）、トシル酸（１．１当量）、および２−ペンタノールを１２５℃で混合物に添加する。続いて、ＤＭＡ中の２．２当量のＮ，Ｎ，Ｎ´−トリメチルエタン−１，２−ジアミンを１４０℃で添加し、続いて３当量の鉄、０．７当量の塩化アンモニウム、エタノール、および水を１００℃で添加して、実施例５の化合物を提供する。
【００９５】
実施例６：（２−（（２−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）（メチル）アミノ）−５−（（４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）ボロン酸の調製
【化６８】
2021500350.tif 000069
実施例５で得られた化合物の一部（１ｍｍｏｌ）を、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏｐ）（１．５当量）、トリエチルアミン（３．０当量）、および２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシボラニル）酢酸（１．３当量）と混合する。次いで、混合物を１２時間撹拌しながら濃ＨＣｌと反応させる。
【００９６】
実施例７：Ｎ−（２−（（２−ジメチルアミノ）エチル）（メチル）アミノ）−５−（（４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）フェニル）−２，２−ジフルオロ−３−オキソブタンアミドの調製
【化６９】
2021500350.tif 000070
実施例５で得られた化合物の一部（１ｍｍｏｌ）を、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏｐ）（１．５当量）、トリエチルアミン（３．０当量）、および２，２−ジフルオロ−３−オキソブタン酸（１．３当量）と室温で撹拌しながら１２時間混合する。
【００９７】
試験例１：ＥＧＦＲ酵素の阻害
１０μｌのＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ１型キナーゼ、ＵＰＳＴＡＴＥ、１０ｎｇ／μｌ）を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。ＥＧＦＲ阻害剤として、実施例２〜７で得られた化合物のそれぞれの連続希釈溶液１０μｌ、Ｉｒｅｓｓａ（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）およびラパチニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１０分間インキュベートする。１０μｌのポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１（Ｓｉｇｍａ、１０ｎｇ／ｍｌ）および１０μｌのＡＴＰ（５０μＭ）を添加してキナーゼ反応を開始させ、得られた混合物を室温で１時間インキュベートする。１０μｌの１００ｍＭのＥＤＴＡを各ウェルに添加し、５分間撹拌して、キナーゼ反応を停止させる。１０μｌの１０Ｘ抗ホスホチロシン抗体（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ）、１０μｌの１０Ｘ  ＰＴＫ（タンパク質チロシンキナーゼ）グリーントレーサ（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ）、および３０μｌのＦＰ（蛍光偏光）希釈緩衝液を反応混合物に添加し、続いて暗所で、室温にて３０分間インキュベートする。各ウェルのＦＰ値を、ＶＩＣＴＯＲＩＩＩ蛍光メータ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で４８８ｎｍ（励起フィルタ）および５３５ｎｍ（吸収フィルタ）を用いて判定し、５０％阻害が観察される濃度であるＩＣ５０を判定し、ここでは、最大（０％阻害）値は、ＥＧＦＲ阻害剤で未処理のウェルについて測定された偏光値で設定され、最小値は、１００％阻害に相当した。ＩＣ５０の計算および分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して実施する。
【００９８】
試験例２：ＥＧＦＲ変異体酵素（Ｃ７９７Ｓ）の阻害
１０μｌのＣ７９７Ｓ酵素（ＥＧＦＲ  Ｃ７９７Ｓキナーゼ、ＵＰＳＴＡＴＥ）を、１０μｌのＥＧＦＲの代わりに使用すること以外は、試験例１の手順を繰り返す。
【００９９】
試験例３：癌細胞の増殖阻害の試験
ＥＧＦＲ  Ｃ７９７Ｓ突然変異またはＨＥＲ２  Ｃ８０５Ｓ突然変異を有する肺癌細胞株および乳癌細胞株を用いて、培養培地の１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清を添加かつ補充した４．５ｇ／１のグルコースおよび１．５ｇ／１の重炭酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）を使用する癌細胞増殖の阻害における本発明の化合物の効力を試験する。
【０１００】
液体窒素タンクに保存した癌細胞株を、３７℃で迅速に解凍し、遠心分離して培地を除去する。得られた細胞ペレットを培養培地と混合し、培養フラスコ内で３７℃にて、５％のＣＯ２下で２〜３日間インキュベートし、培地を除去する。残っている細胞を、ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを使用してフラスコから分離する。分離した細胞を、培養培地で１００，０００細胞／ｍｌの濃度に希釈する。１００μｌの希釈した細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃にて、５％のＣＯ２下で１日間インキュベートする。
【０１０１】
実施例２〜７で得られた化合物、ならびに従来のＥＧＦＲ阻害剤、陽性対照としてのイレッサおよびラパチニブ、ならびに陰性対照としてのアファチニブ、ポジオチニブ、およびオシメルチニブを、それぞれが９９．５％のＤＭＳＯに溶解して２５ｍＭの濃度にする。試験化合物がＤＭＳＯに溶解しない場合、少量の１％のＨＣｌをそれに添加し、完全に溶解するまで４０℃の水浴中で３０分間処理する。試験化合物溶液を培養培地で１００μＭの最終濃度に希釈し、次いで１０〜６μＭまで連続的に１０倍に希釈する（ＤＭＳＯの最終濃度は１％未満である）。培地を９６ウェルプレートの各ウェルから除去する。
【０１０２】
１００μｌの試験化合物溶液を、培養された細胞を保持する各ウェルに添加し、３７℃にて、５％のＣＯ２下で７２時間インキュベートする。プレートから培地を取り除いた後、５０μｌの１０％のトリクロロ酢酸を各ウェルに添加し、プレートを４℃で１時間保持して、細胞をプレートの底に固定させる。添加したトリクロロ酢酸を各ウェルから取り除き、プレートを乾燥させて、１００μｌのＳＲＢ（スルホローダミン−Ｂ）染料溶液をそれに添加し、得られた混合物を１０分間反応させる。ＳＲＢ染料溶液は、ＳＲＢを１％の酢酸に溶解して０．４％の濃度にすることによって調製される。染料溶液を除去した後、プレートを水で洗浄し、乾燥させる。染料溶液が水で効果的に除去されないときは、１％の酢酸を使用する。１５０μｌの１０ｍＭのｔｒｉｓｍａ塩基を各ウェルに添加し、５４０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダで判定する。
【０１０３】
５０％の阻害が生じる濃度であるＩＣ５０は、試験細胞の最終濃度と、１００％とみなされる試験化合物で処理されていないウェルにおいてインキュベートされた細胞の初期濃度との間の差に基づいて評価される。ＩＣ５０の計算を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して実施する。
【０１０４】
試験例４：長期化試験
ＥＧＦＲ  Ｃ７９７Ｓ突然変異を有する肺癌細胞株を用いて、ＥＧＦＲのリン酸化の阻害における本開示の化合物の効力およびそれを阻害する能力の長期化を試験するために使用される。
【０１０５】
細胞株を、ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、および１％のＰＳを含有する培養培地を使用して、９５％の空気および５％のＣＯ２下で、３７℃にて培養フラスコ中でインキュベートする。培養フラスコの全容量の９０％以上が細胞で満たされたとき、培養された細胞懸濁液を、二次培養に供し、５００，０００細胞／ウェルの程度まで６ウェルプレートの各ウェルに注ぐ。２４時間後、細胞を溶液から分離し、ＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ、０．１％のＦＢＳ、１％のＰＳを含有する培養培地で１６時間インキュベートする。実施例２〜７で得られた化合物、およびＥＧＦＲリン酸化阻害剤としてのＴａｒｃｅｖａを、それぞれを細胞含有ウェルに添加して、１μＭの濃度にする。４時間後に、細胞を溶液から分離し、０、２、４、および８時間後ごとにＰＢＳで４回洗浄し、ＤＭＥＭ、０．１％のＦＢＳ、１％のＰＳを含有する培養培地でインキュベートする。洗浄後０、８、２４、および４８時間が経過したとき、培地をそれらから除去して反応を停止させる。反応が完了する直前に、培養細胞溶液を１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ９９６４４）で５分間処理して、ＥＧＦＲの活性化を誘発させる。反応終了後、培養細胞を保持しているウェルプレートを−７０℃で保存する。対照群では、ＥＧＦＲリン酸化阻害剤を添加する代わりに、培地の交換を実行し、ここで、ＥＧＦを使用したＥＧＦＲ活性化の誘発は、陽性対照群でのみ行われ、陰性対照群では行われない。
【０１０６】
ウエスタンブロットおよび酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法については、−７０℃で保存したウェルプレートを室温まで融解させ、次いで、タンパク質抽出緩衝液を使用してウェルプレート内の細胞からタンパク質を抽出する。タンパク質の抽出は、以下のように実行する：プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む２５０μｌのタンパク質抽出緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈｏｓａｆｅ抽出試薬、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号７１２９６−３）を各細胞含有ウェルに添加し、室温で５分間撹拌する。細胞を、細胞スクレーパを使用して採取し、１．５ｍｌのチューブに入れ、１６，０００×ｇの速度で５分間遠心分離する。このようにして得られた上層を分離し、そのタンパク質含有量を、タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−ｒａｄ、カタログ番号５００−０１１６）によって判定した。抽出したタンパク質を、ＰＢＳで０．８ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。
【０１０７】
ヒトＥＧＦＲ（ｐｙ１１７３）イムノアッセイキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カタログ番号ＫＨＲ９０７１）を、酵素免疫測定法  で使用する。キットの標準希釈緩衝液で４倍に希釈された試料１００μｌをストリップウェルに添加し、４℃の冷蔵庫で一晩インキュベートする。培養細胞を分離し、２００μｌの洗浄緩衝液で４回洗浄する。１００μｌの一次抗体（ウサギ抗ヒトＥＧＦＲ［ｐＹ１１７３］）を各ストリップウェルに入れ、３７℃で１時間インキュベートし、２００μｌの洗浄緩衝液で４回洗浄する。二次抗体（抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ）を、キットのＨＲＰ希釈緩衝液で１００倍に希釈する。１００μｌの希釈液を各ストリップウェルに入れ、３７℃で３０分間インキュベートし、２００μｌの洗浄緩衝液で４回洗浄する。１００μｌのキットのＨＲＰ基質を各ストリップウェルに入れ、暗室で１０〜３０分間インキュベートする。１００μｌの反応停止液をそれに添加して反応を停止させ、次いで、４５０ｎｍで吸光度を観測した。
【０１０８】
電気泳動およびウエスタンブロット法は、以下の従来の方法に基づいて実施する：ＬＤＳ緩衝液を各試料に添加し、７０℃で１０分間沸騰させる。得られた溶液１０μｌを１２ウェルゲル（Ｎｕｐａｇｅ  ４〜１２％のＢｉｓ−ｔｒｉｓゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に装填し、続いて、緩衝液（ＭＯＰＳ電気泳動緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００６−１）で１２０ボルト電気泳動を２時間行う。電気泳動後、得られたタンパク質バンドを、移送緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００１）中のニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ、カタログ番号１６２−０２５１）に３０ボルトで２時間移動させる。移動されたニトロセルロース膜を３％のＢＳＡブロッキング溶液と室温で１〜２時間反応させ、非特異的な抗原抗体反応を阻害する。ブロッキング溶液で希釈した一次抗体（抗ＥＧＦＲ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ、カタログ番号ＣＳＡ３３０、１：１００希釈））、抗ｐＥＧＦＲ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、カタログ番号ＳＣ  １２３５１−Ｒ、１：５００希釈）および抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ１９７８、４μｇ／ｍｌ希釈）を、４℃で一晩互いに反応させ、これを洗浄緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ）で１０分間ごとに４回洗浄する。ブロッキング溶液で希釈した二次抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ１２４Ｐ、１：５０００希釈））および抗ウサギＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＡＰ１３２Ｐ、１：５０００希釈）を、室温で１時間互いに反応させ、洗浄緩衝液で１０分間ごとに５回洗浄し、続いて、ＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＲＰＮ２２０９）を使用して着色し、暗室でＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＲＰＮ２１０３Ｋ）へ暴露させる。フィルムの現像によりタンパク質バンドが観察される。
【０１０９】
本開示の化合物は、従来の不可逆的なＥＧＦＲ阻害剤、すなわち、ポジオチニブ、オシメルチニブ、およびアファチニブと比較して、ＥＧＦＲ  Ｃ７９７Ｓ変異体キナーゼの活性、および突然変異を有する細胞株の増殖を効果的に阻害することによって、優れた抗癌活性を示す。本開示の化合物は、ＥＧＦＲ  Ｃ７９７Ｓ突然変異またはＨＥＲ２  Ｃ８０５Ｓ突然変異を有する細胞株に対して非常に改善された阻害活性を示すが、一方本開示の化合物のいずれも、Ｃ７９７ＳまたはＣ８０５Ｓ突然変異を有しない細胞株の酵素の成長は阻害しない。このような結果は、セリンと反応しない従来の不可逆的ＥＧＦＲ阻害剤と比較した、本開示の化合物のセリン残基との反応の効果である。従来の可逆的な阻害剤は、突然変異を有する酵素および細胞株を阻害するが、本開示の化合物と比較して有効性ははるかに低い。
【０１１０】
試験例５：ＨＥＲ２酵素の阻害
１０μｌのＨＥＲ２（ＨＥＲ２キナーゼ、ＡＣＲＯ、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１０ｎｇ／μｌ）を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。ＨＥＲ２阻害剤として、実施例２〜７で得られた化合物のそれぞれの連続希釈溶液１０μｌ、Ｉｒｅｓｓａ（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）およびラパチニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１０分間インキュベートする。１０μｌのポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１（Ｓｉｇｍａ、１０ｎｇ／ｍｌ）および１０μｌのＡＴＰ（５０μＭ）を添加してキナーゼ反応を開始させ、得られた混合物を室温で１時間インキュベートする。１０μｌの１００ｍＭのＥＤＴＡを各ウェルに添加し、５分間撹拌して、キナーゼ反応を停止させる。１０μｌの１０Ｘ抗ホスホチロシン抗体（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ）、１０μｌの１０Ｘ  ＰＴＫ（タンパク質チロシンキナーゼ）グリーントレーサ（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ）、および３０μｌのＦＰ（蛍光偏光）希釈緩衝液を反応混合物に添加し、続いて暗所で、室温にて３０分間インキュベートする。各ウェルのＦＰ値を、ＶＩＣＴＯＲＩＩＩ蛍光メータ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で４８８ｎｍ（励起フィルタ）および５３５ｎｍ（吸収フィルタ）を用いて判定し、５０％阻害が観察される濃度であるＩＣ５０を判定し、ここでは、最大（０％阻害）値は、ＨＥＲ２阻害剤で未処理のウェルについて測定された偏光値で設定され、最小値は１００％阻害に相当した。ＩＣ５０の計算および分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して実施する。
【０１１１】
試験例６：ＨＥＲ２変異体酵素（Ｃ８０５Ｓ）の阻害
１０μｌのＣ８０５Ｓ酵素（ＨＥＲ２  Ｃ８０５Ｓキナーゼ）を、１０μｌのＨＥＲ２の代わりに使用すること以外は、試験例５の手順を繰り返す。
【０１１２】
本発明の範囲内の変更が当業者に明らかであり得るため、前述の説明は、理解を明確にするためだけに供与されるものであり、それから不必要な限定を理解されるべきではない。
【０１１３】
本明細書に引用される全ての特許、刊行物および参考文献は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。本開示と組み込まれた特許、刊行物、および参考文献との間に矛盾が生じた場合、本開示が優先するべきである。
【国際調査報告】
2021500350.tif 000092
2021500350.tif 000093
2021500350.tif 000094