(57)【要約】【課題】核酸分子をシーケンシングするための方法及びシステムを提供する。【解決手段】  方法は、二本鎖核酸又は一本鎖核酸をシーケンシングする工程を含み得る。シーケンシングは、静電気的部分と連結したヌクレオチドの使用を含み得る。静電気的部分はセンサーアレイにより検出され得る。静電気的部分は、ヌクレオチドの取り込み後、核酸分子から切断される可逆性静電気的部分であり得る。静電気的部分は不可逆性静電気的部分であり得る。不可逆性静電気的部分を含むヌクレオチドは、核酸分子へ取り込まれ、センサーアレイにより検出され、検出不能なヌクレオチドと交換され得る。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）センサーアレイに隣接した複数の二本鎖核酸分子を提供する工程であって、前記複数の核酸分子のうちの所与の二本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され、前記所与の二本鎖核酸分子が、第１の一本鎖核酸分子及び前記第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有する第２の一本鎖核酸分子を含み、前記所与のセンサーが、前記所与の二本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的と連結している、工程；
（ｂ）前記第２の一本鎖核酸分子の少なくとも一部分を、前記第１の一本鎖核酸分子から遊離させて、前記第２の一本鎖核酸分子とハイブリダイズしていない前記第１の一本鎖核酸分子のセグメントを提供する工程；
（ｃ）前記セグメントを個々のヌクレオチドと接触させて、前記セグメントを、前記個々のヌクレオチドから第３の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供する工程であって、前記第３の一本鎖核酸分子が、前記第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有する、工程；並びに
（ｄ）前記核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、前記所与のセンサーを用いて、前記個々のヌクレオチドの前記第３の一本鎖核酸分子への取り込みを示すシグナルを検出し、それにより、前記セグメントの配列又は長さを決定する工程
を含む、核酸分子を検出するための方法。
【請求項２】
前記第２の一本鎖核酸分子の少なくとも一部分を遊離させることが、フラップを形成し、前記フラップが前記第２の一本鎖核酸分子から切断される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フラップが、前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルを検出した後に切断される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の一本鎖核酸分子が核酸サブユニットのライブラリーから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸サブユニットのライブラリーがランダム配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸サブユニットのライブラリーの所与の核酸サブユニットが少なくとも５個のヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸サブユニットのライブラリーがペプチド核酸又はロックド核酸を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の一本鎖核酸分子が１つ又は複数の検出可能な標識を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の一本鎖核酸分子又はその一部分の前記第１の一本鎖核酸分子からの遊離が、前記個々のヌクレオチドの前記第３の一本鎖核酸分子への取り込みを示す前記シグナルを生成する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の二本鎖核酸分子が複数のビーズと連結しており、前記所与の二本鎖核酸分子が前記複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、前記電荷二重層が前記所与のビーズの表面に隣接している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の二本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結しており、前記所与の二本鎖核酸分子が前記所与のセンサーの表面と連結しており、前記電荷二重層が前記表面に隣接している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｃ）が、前記セグメントに隣接したプライミング部位を提供する工程、及び前記プライミング部位からのプライマー伸長により前記第３の一本鎖核酸分子を生成する工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記所与のセンサーが少なくとも２つの電極を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記個々のヌクレオチドの少なくともサブセットが、追加のヌクレオチドが前記第１の一本鎖核酸分子と安定的にハイブリダイズすることを阻止する可逆性ターミネーターを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記可逆性ターミネーターが、前記個々のヌクレオチドの前記第３の一本鎖核酸分子への取り込み後で、且つ別の個々のヌクレオチドの前記第３の一本鎖核酸分子への取り込み前に除去される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記個々のヌクレオチドの少なくともサブセットが検出可能な標識を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出可能な標識が静電気的部分である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出可能な標識が、前記個々のヌクレオチドの前記少なくともサブセットの核酸塩基と連結している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが、単一の型の検出可能な標識と可逆的に連結している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが、異なる型の検出可能な標識と可逆的に連結している、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出可能な標識が、少なくとも２つの連結機構により、前記異なる型のヌクレオチドと可逆的に連結している、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出可能な標識が、単一の連結機構により、前記異なる型のヌクレオチドと可逆的に連結している、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルの検出後に前記検出可能な標識を除去する工程をさらに含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、前記セグメントを前記異なる型のヌクレオチドと逐次的に接触させる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸取り込み反応中の所与の時点において、前記セグメントを、第１の型の個々のヌクレオチドと接触させ、前記核酸取り込み反応中の次の時点において、前記セグメントを第２の型の個々のヌクレオチドと接触させ、前記第１の型が前記第２の型と異なる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、前記セグメントを前記異なる型のヌクレオチドと同時に接触させる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが定常状態シグナルである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが、個々のヌクレオチドの取り込み後に１回検出される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが、個々のヌクレオチドの取り込み後に少なくとも２回検出される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが一過性シグナルである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが、前記電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の二本鎖核酸分子が前記二本鎖核酸分子のクローン集団である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
（ｂ）〜（ｄ）が、前記第１の一本鎖核酸分子の前記配列又は長さが決定されるまで繰り返される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）センサーアレイに隣接した複数の一本鎖核酸分子を提供する工程であって、前記複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され、前記所与のセンサーが、前記第１の一本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結している、工程；
（ｂ）前記第１の一本鎖核酸分子を個々のヌクレオチドと接触させて、前記第１の一本鎖核酸分子を、前記個々のヌクレオチドから第２の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供する工程であって、前記第２の一本鎖核酸分子が前記第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有し、前記個々のヌクレオチドの少なくともサブセットが検出可能な標識を含む、工程；及び
（ｃ）前記核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、前記所与のセンサーを用いて、前記個々のヌクレオチドの前記第２の一本鎖核酸分子への取り込みを示す前記検出可能な標識からのシグナルを検出し、それにより、前記第１の一本鎖核酸分子の配列又は長さを決定する工程
を含む、核酸分子を検出するための方法。
【請求項３５】
前記複数の一本鎖核酸分子が複数のビーズと連結しており、前記第１の一本鎖核酸分子が前記複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、前記電荷二重層が前記所与のビーズの表面に隣接している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数の一本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結しており、前記第１の一本鎖核酸分子が前記所与のセンサーの表面と連結しており、前記電荷二重層が前記表面に隣接している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
（ｂ）が、前記第１の一本鎖核酸に隣接したプライミング部位を提供する工程、及び前記プライミング部位からのプライマー伸長により前記第２の一本鎖核酸分子を生成する工程をさらに含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記プライミング部位が自己プライミングループである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記所与のセンサーが少なくとも２つの電極を含む、請求項３４〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記個々のヌクレオチドの少なくとも別のサブセットが、追加のヌクレオチドが前記第１の一本鎖核酸分子と安定的にハイブリダイズすることを阻止する可逆性ターミネーターを含む、請求項３４〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記可逆性ターミネーターが、前記個々のヌクレオチドの前記第２の一本鎖核酸分子への取り込み後で、且つ別の個々のヌクレオチドの前記第２の一本鎖核酸分子への取り込み前に除去される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出可能な標識が静電気的部分である、請求項３４〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記検出可能な標識が、前記個々のヌクレオチドの前記少なくともサブセットの核酸塩基と連結している、請求項３４〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが、単一の型の検出可能な標識と可逆的に連結している、請求項３４〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが、異なる型の検出可能な標識と可逆的に連結している、請求項３４〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記検出可能な標識が、少なくとも２つの連結機構により、前記異なる型のヌクレオチドと可逆的に連結している、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記検出可能な標識が、単一の連結機構により、前記異なる型のヌクレオチドと可逆的に連結している、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記検出可能な標識が、前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルの検出後に除去される、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、前記第１の一本鎖核酸分子を前記異なる型のヌクレオチドと逐次的に接触させる、請求項３４〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸取り込み反応中の所与の時点において、前記第１の一本鎖核酸分子を、第１の型の個々のヌクレオチドと接触させ、前記核酸取り込み反応中の次の時点において、前記第１の一本鎖核酸分子を第２の型の個々のヌクレオチドと接触させ、前記第１の型が前記第２の型と異なる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、前記第１の一本鎖核酸分子を前記異なる型のヌクレオチドと同時に接触させる、請求項３４〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが定常状態シグナルである、請求項３４〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが、個々のヌクレオチドの取り込み後に１回検出される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが、個々のヌクレオチドの取り込み後に少なくとも２回検出される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが一過性シグナルである、請求項３４〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが、前記電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである、請求項３４〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記複数の一本鎖核酸分子が前記第１の一本鎖核酸分子のクローン集団である、請求項３４〜５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
（ｂ）〜（ｃ）が、前記第１の一本鎖核酸分子の前記配列又は前記長さが決定されるまで繰り返される、請求項３４〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
（ａ）センサーアレイに隣接した複数の一本鎖核酸分子を提供する工程であって、前記複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置されている、工程；
（ｂ）前記第１の一本鎖核酸分子を核酸取り込み反応に供して、前記第１の一本鎖核酸分子と相補的な成長する鎖として第２の一本鎖核酸分子を生成する工程であって、前記核酸取り込み反応が、（ｉ）検出可能な標識を含む第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込むこと、及び（ｉｉ）検出可能な標識を含まない第２の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込むことを、交互に且つ逐次的に含む、工程；並びに
（ｃ）前記核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、前記所与のセンサーを用いて、前記検出可能な標識を含む二重層からの電荷又は伝導率の変化を示すシグナルを検出し、それにより、前記第１の一本鎖核酸分子の配列又は長さを決定する工程
を含む、核酸分子を検出するための方法。
【請求項６０】
前記第１の複数のヌクレオチドが、追加のヌクレオチドが前記第１の一本鎖核酸分子と安定的にハイブリダイズすることを阻止するターミネーターを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１の複数のヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記第２の複数のヌクレオチドが、追加のヌクレオチドが前記第１の一本鎖核酸と安定的にハイブリダイズすることを阻止する可逆性ターミネーターを含む、請求項５９〜６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記第１の複数のヌクレオチドが前記第２の複数のヌクレオチドと交換される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドが取り込まれていない、前記第１の一本鎖核酸分子に沿った位置に、前記第２の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドを取り込むことにより、前記第２の複数のヌクレオチドの前記取り込みが位相誤差を修正する、請求項５９〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記第１の複数のヌクレオチド由来の前記個々のヌクレオチドを用いて、前記核酸取り込み反応を継続する工程をさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記可逆性ターミネーターが、前記第２の複数のヌクレオチドの前記個々のヌクレオチドを取り込んだ後に除去される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記検出可能な標識が、除去可能ではない静電気的部分である、請求項５９〜６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
前記第１の複数のヌクレオチドの前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが単一の型の検出可能な標識と連結している、請求項５９〜６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の複数のヌクレオチドの前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが異なる型の検出可能な標識と連結している、請求項５９〜６７のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記所与のセンサーが、前記第１の一本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結している、請求項５９〜６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記複数の一本鎖核酸分子が複数のビーズと連結しており、前記第１の一本鎖核酸分子が前記複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、前記電荷二重層が前記所与のビーズの表面に隣接している、請求項５９に記載の方法。
【請求項７２】
前記複数の一本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結しており、前記第１の一本鎖核酸分子が前記所与のセンサーの表面と連結しており、前記電荷二重層が前記表面に隣接している、請求項５９に記載の方法。
【請求項７３】
（ｂ）が、前記第１の一本鎖核酸に隣接したプライミング部位を提供する工程、及び前記プライミング部位からのプライマー伸長により前記第２の一本鎖核酸分子を生成する工程をさらに含む、請求項５９〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記プライミング部位が自己プライミングループである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記所与のセンサーが少なくとも２つの電極を含む、請求項５９〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、前記第１の一本鎖核酸分子を前記異なる型のヌクレオチドと逐次的に接触させる、請求項５９〜７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
前記核酸取り込み反応中の所与の時点において、前記第１の一本鎖核酸分子を、第１の型の個々のヌクレオチドと接触させ、前記核酸取り込み反応中の次の時点において、前記セグメントを第２の型の個々のヌクレオチドと接触させ、前記第１の型が前記第２の型と異なる、請求項５９に記載の方法。
【請求項７８】
前記個々のヌクレオチドが異なる型のヌクレオチドを含み、前記第１の一本鎖核酸分子を前記異なる型のヌクレオチドと同時に接触させる、請求項５９〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが定常状態シグナルである、請求項５９〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが、個々のヌクレオチドの取り込み後に１回検出される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが、個々のヌクレオチドの取り込み後に少なくとも２回検出される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが一過性シグナルである、請求項５９〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記シグナルが、前記電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである、請求項５９〜８２のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記複数の一本鎖核酸分子が前記第１の一本鎖核酸分子のクローン集団である、請求項５９〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
（ｂ）〜（ｃ）が、前記第１の一本鎖核酸分子の前記配列又は前記長さが決定されるまで繰り返される、請求項５９〜８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
前記第１の一本鎖核酸分子が、前記所与のセンサーに隣接した前記複数の一本鎖核酸分子の一部であり、前記第１の一本鎖核酸分子を含む前記複数の一本鎖核酸分子の個々の一本鎖核酸分子が鋳型一本鎖核酸分子と配列相同性を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項８７】
複数のセンサーを含むセンサーアレイであって、使用中、複数の二本鎖核酸分子のうちの所与の二本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され、前記所与の二本鎖核酸分子が第１の一本鎖核酸分子及び前記第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有する第２の一本鎖核酸分子を含み、前記所与のセンサーが、前記所与の二本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結している、センサーアレイ；並びに
前記センサーアレイと動作可能に連結した１つ又は複数のコンピュータプロセッサであって、（ｉ）前記第２の一本鎖核酸分子とハイブリダイズしていない前記第１の一本鎖核酸分子のセグメントを個々のヌクレオチドと接触させて、前記セグメントを、前記個々のヌクレオチドから前記第３の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供する工程であって、前記第３の一本鎖核酸分子が前記第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有する、工程、及び（ｉｉ）前記核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、前記所与のセンサーを用いて、前記個々のヌクレオチドの前記第３の一本鎖核酸分子への取り込みを示すシグナルを検出し、それにより、前記セグメントの配列又は長さを決定する工程を行うように個々に又はまとめてプログラムされている、コンピュータプロセッサ
を含む、核酸分子を検出するためのシステム。
【請求項８８】
使用中、前記複数の二本鎖核酸分子が複数のビーズと連結しており、前記所与の二本鎖核酸分子が前記複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、前記電荷二重層が前記所与のビーズの表面に隣接している、請求項８７に記載のシステム。
【請求項８９】
使用中、前記複数の二本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結しており、前記所与の二本鎖核酸分子が前記所与のセンサーの表面と連結しており、前記電荷二重層が前記表面に隣接している、請求項８７に記載のシステム。
【請求項９０】
前記所与のセンサーが少なくとも２つの電極を含む、請求項８７〜８９のいずれかに記載のシステム。
【請求項９１】
使用中、前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが定常状態シグナルである、請求項８７〜９０のいずれかに記載のシステム。
【請求項９２】
使用中、前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが一過性シグナルである、請求項８７〜９０のいずれかに記載のシステム。
【請求項９３】
使用中、前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが、前記電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである、請求項８７〜９２のいずれかに記載のシステム。
【請求項９４】
複数のセンサーを含むセンサーアレイであって、使用中、複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され、前記所与のセンサーが、前記第１の一本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結している、センサーアレイ；並びに
前記センサーアレイと動作可能に連結した１つ又は複数のコンピュータプロセッサであって、（ｉ）前記第１の一本鎖核酸分子を個々のヌクレオチドと接触させて、前記第１の一本鎖核酸分子を、前記個々のヌクレオチドから第２の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供する工程であって、前記第２の一本鎖核酸分子が前記第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有し、前記個々のヌクレオチドの少なくともサブセットが検出可能な標識を含む、工程、及び（ｉｉ）前記核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、前記所与のセンサーを用いて、前記個々のヌクレオチドの前記第２の一本鎖核酸分子への取り込みを示す前記検出可能な標識からのシグナルを検出し、それにより、前記第１の一本鎖核酸分子の配列又は長さを決定する工程を行うように個々に又はまとめてプログラムされている、コンピュータプロセッサ
を含む、核酸分子を検出するためのシステム。
【請求項９５】
使用中、前記複数の一本鎖核酸分子が複数のビーズと連結しており、前記第１の一本鎖核酸分子が前記複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、前記電荷二重層が前記所与のビーズの表面に隣接している、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９６】
使用中、前記複数の一本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結しており、使用中、前記第１の一本鎖核酸分子が前記所与のセンサーの表面と連結しており、前記電荷二重層が前記表面に隣接している、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９７】
前記所与のセンサーが少なくとも２つの電極を含む、請求項９４〜９６のいずれかに記載のシステム。
【請求項９８】
使用中、前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが定常状態シグナルである、請求項９４〜９７のいずれかに記載のシステム。
【請求項９９】
使用中、前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが一過性シグナルである、請求項９４〜９７のいずれかに記載のシステム。
【請求項１００】
使用中、前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが、前記電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである、請求項９４〜９９のいずれかに記載のシステム。
【請求項１０１】
複数のセンサーを含むセンサーアレイであって、使用中、複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置されている、センサーアレイ；並びに
前記センサーアレイと動作可能に連結した１つ又は複数のコンピュータプロセッサであって、（ｉ）前記第１の一本鎖核酸分子を個々のヌクレオチドと接触させて、前記第１の一本鎖核酸分子を核酸取り込み反応に供して、第２の一本鎖核酸分子を生成する工程であって、前記核酸取り込み反応が、検出可能な標識を含む第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込むこと、及び検出可能な標識を含まない第２の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドと前記第１の複数のヌクレオチドの前記個々のヌクレオチドを交換することを交互に且つ逐次的に含む、工程、並びに（ｉｉ）前記核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、前記所与のセンサーを用いて、前記検出可能な標識を含む二重層からの電荷又は伝導率の変化を示すシグナルを検出し、それにより、前記第１の一本鎖核酸分子の配列又は長さを決定する工程を行うように個々に又はまとめてプログラムされている、コンピュータプロセッサ
を含む、核酸分子を検出するためのシステム。
【請求項１０２】
使用中、前記所与のセンサーが、前記第１の一本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結している、請求項１０１に記載のシステム。
【請求項１０３】
使用中、前記複数の一本鎖核酸分子が複数のビーズと連結しており、前記第１の一本鎖核酸分子が前記複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、前記電荷二重層が前記所与のビーズの表面に隣接している、請求項１０２に記載のシステム。
【請求項１０４】
使用中、前記複数の一本鎖核酸分子が、前記センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結しており、使用中、前記第１の一本鎖核酸分子が前記所与のセンサーの表面と連結しており、前記電荷二重層が前記表面に隣接している、請求項１０２に記載のシステム。
【請求項１０５】
前記所与のセンサーが少なくとも２つの電極を含む、請求項１０１〜１０４のいずれかに記載のシステム。
【請求項１０６】
使用中、前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが定常状態シグナルである、請求項１０１〜１０５のいずれかに記載のシステム。
【請求項１０７】
使用中、前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが一過性シグナルである、請求項１０１〜１０５のいずれかに記載のシステム。
【請求項１０８】
使用中、前記個々のヌクレオチドの取り込みを示す前記シグナルが、前記電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである、請求項１０１〜１０７のいずれかに記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  相互参照
この出願は、２０１７年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／５６１，３５８号、及び２０１８年４月９日に出願された米国仮特許出願第６２／６５５，０８３号の利益を主張し、それらのそれぞれは、参照により本明細書に全体として組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  全ヒトゲノムを解明するという目標は、スモールスケールとラージスケールのどちらの適用にとっても、迅速な核酸（例えば、DNA）シーケンシングについてのテクノロジーに関心を引き起こしている。重要なパラメータは、シーケンシング速度、単回のシーケンシング実行中に読み取ることができる配列の長さ、及びシーケンシング情報を生じさせるために必要とされる核酸鋳型の量である。ラージスケールのゲノムプロジェクトは、現在、現実的に多数の対象（例えば、患者）に対して行われるには費用がかかりすぎる。さらに、ヒト疾患についての遺伝的基礎の知識が増加するにつれて、臨床適用として手頃な価格である、正確でハイスループットのＤＮＡシーケンシングの需要がさらに増加するだろう。高速且つ長い読み取りの長さをもつ方法を含む、核酸の単一分子の塩基対配列を決定するための実際的な方法が測定能力を提供し得る。
【０００３】
[0003]  核酸シーケンシングは、核酸試料についての配列情報を提供するために用いられ得るプロセスである。そのような配列情報は、ある状態を有する対象を診断及び／又は処置するのに役立ち得る。例えば、対象の核酸配列は、遺伝的疾患を同定し、診断し、及び潜在的にはそれについての処置を開発するために用いられ得る。別の例として、病原体の研究によって、伝染性疾患についての処置がもたらされ得る。しかし、残念ながら、現状のままでの既存のシーケンシングテクノロジーは、費用がかかり、且つ、ある状態をもつ対象を診断及び／又は処置するのに十分であり得る時間内に及び／又は精度で、配列情報を提供することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[0004]  本開示は、核酸シーケンシングなどの試料分析又は同定のための方法及びシステムを提供する。本開示は、ビーズなどの粒子の使用なしに、試料調製及び同定（例えば、シーケンシング）を可能にし得る方法及びシステムを提供する。これにより、他のシステム及び方法と比較して実質的に低下した費用及び複雑さを以て試料を調製及び同定することが可能になり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0005]  一態様において、本開示は、センサーアレイに隣接した複数の二本鎖核酸分子を提供する工程であって、複数の核酸分子のうちの所与の二本鎖核酸分子が、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され、所与の二本鎖核酸分子が、第１の一本鎖核酸分子及び第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有する第２の一本鎖核酸分子を含み、所与のセンサーが、所与の二本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結している、工程；第２の一本鎖核酸分子の少なくとも一部分を、第１の一本鎖核酸分子から遊離させて、第２の一本鎖核酸分子とハイブリダイズしていない第１の一本鎖核酸分子のセグメントを提供する工程；セグメントを個々のヌクレオチドと接触させて、セグメントを、個々のヌクレオチドから第３の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供する工程であって、第３の一本鎖核酸分子が、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有する、工程；並びに核酸取り込み反応を行う間、所与のセンサーを用いて、個々のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への取り込みを示すシグナルを検出し、それにより、セグメントの配列及び／又は長さを決定する工程を含む、核酸分子を検出するための方法を提供する。
【０００６】
[0006]  いくつかの実施形態において、第２の一本鎖核酸分子の少なくとも一部分を遊離させることは、フラップを形成する。いくつかの実施形態において、フラップは、第２の一本鎖核酸分子から切断される。いくつかの実施形態において、フラップは、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルを検出した後に切断される。いくつかの実施形態において、フラップは、フラップエンドヌクレアーゼにより切断される。いくつかの実施形態において、フラップエンドヌクレアーゼは中温性である。
【０００７】
[0007]  いくつかの実施形態において、第２の一本鎖核酸分子は、核酸サブユニットのライブラリーから選択される。いくつかの実施形態において、核酸サブユニットのライブラリーは、ランダム配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸サブユニットのライブラリーの所与の核酸サブユニットは、少なくとも５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、核酸サブユニットのライブラリーの所与の核酸サブユニットは、少なくとも６個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、核酸サブユニットのライブラリーは、ペプチド核酸又はロックド核酸を含む。
【０００８】
[0008]  いくつかの実施形態において、第２の一本鎖核酸分子は、１つ又は複数の検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態において、第２の一本鎖核酸分子又はその一部分の第１の一本鎖核酸分子からの遊離が、検出可能なシグナルを生成する。
【０００９】
[0009]  いくつかの実施形態において、複数の二本鎖核酸分子は、複数のビーズと連結している。いくつかの実施形態において、所与の二本鎖核酸分子は、複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、電荷二重層が所与のビーズの表面に隣接している。いくつかの実施形態において、複数の二本鎖核酸分子は、センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結している。いくつかの実施形態において、所与の二本鎖核酸分子は、所与のセンサーの表面と連結しており、電荷二重層はその表面に隣接している。
【００１０】
[0010]  いくつかの実施形態において、方法は、セグメントに隣接したプライミング部位を提供する工程、及びプライミング部位からのプライマー伸長により第３の一本鎖核酸分子を生成する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、プライミング部位は、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有するプライマー配列である。いくつかの実施形態において、方法は、重合酵素を用いて、個々のヌクレオチドを取り込む工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、所与のセンサーは少なくとも２つの電極を含む。
【００１１】
[0011]  いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの少なくともサブセットは、追加のヌクレオチドが第１の一本鎖核酸分子と安定的にハイブリダイズすることを阻止する可逆性ターミネーターを含む。いくつかの実施形態において、可逆性ターミネーターは、個々のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への取り込み後で、且つ別の個々のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への取り込み前に除去される。
【００１２】
[0012]  いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの少なくともサブセットは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、静電気的部分である。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、個々のヌクレオチドの少なくともサブセットの核酸塩基と連結している。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが、単一の型の検出可能な標識と可逆的に連結している。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが、異なる型の検出可能な標識と可逆的に連結している。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、１つ又は複数の連結機構により、異なる型のヌクレオチドと可逆的に連結している。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、単一の連結機構により、異なる型のヌクレオチドと可逆的に連結している。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルの検出後に除去される。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、セグメントは、異なる型のヌクレオチドと逐次的に接触させる。
【００１３】
[0013]  いくつかの実施形態において、核酸取り込み反応中の所与の時点において、セグメントを、第１の型の個々のヌクレオチドと接触させ、核酸取り込み反応中の次の時点において、セグメントを、第２の型の個々のヌクレオチドと接触させ、第１の型は第２の型と異なる。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、セグメントは、異なる型のヌクレオチドと同時に接触させる。
【００１４】
[0014]  いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、定常状態シグナルである。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に１回検出される。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に少なくとも２回検出される。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、一過性シグナルである。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである。
【００１５】
[0015]  いくつかの実施形態において、複数の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子のクローン集団である。いくつかの実施形態において、方法は、第１の一本鎖核酸分子の配列が決定されるまで繰り返される。
【００１６】
[0016]  別の態様において、本開示は、センサーアレイに隣接した複数の一本鎖核酸分子を提供する工程であって、複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子が、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され、所与のセンサーが、第１の一本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結している、工程；第１の一本鎖核酸分子を個々のヌクレオチドと接触させて、第１の一本鎖核酸分子を、個々のヌクレオチドから第２の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供する工程であって、第２の一本鎖核酸分子が第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有し、個々のヌクレオチドの少なくともサブセットが検出可能な標識を含む、工程；及び核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、所与のセンサーを用いて、個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込みを示す検出可能な標識からのシグナルを検出し、それにより、第１の一本鎖核酸分子の配列及び／又は長さを決定する工程を含む、核酸分子を検出するための方法を提供する。
【００１７】
[0017]  いくつかの実施形態において、複数の一本鎖核酸分子は、複数のビーズと連結している。いくつかの実施形態において、第１の一本鎖核酸分子は、複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、電荷二重層は、所与のビーズの表面に隣接している。いくつかの実施形態において、複数の一本鎖核酸分子は、センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結している。いくつかの実施形態において、第１の一本鎖核酸分子は、所与のセンサーの表面と連結しており、電荷二重層は表面に隣接している。
【００１８】
[0018]  いくつかの実施形態において、方法は、第１の一本鎖核酸に隣接したプライミング部位を提供する工程、及びプライミング部位からのプライマー伸長により第２の一本鎖核酸分子を生成する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、プライミング部位は、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有するプライマー配列である。いくつかの実施形態において、プライミング部位は、自己プライミングループである。いくつかの実施形態において、方法は、重合酵素を用いて、個々のヌクレオチドを取り込む工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、所与のセンサーは少なくとも２つの電極を含む。
【００１９】
[0019]  いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの少なくとも別のサブセットは、追加のヌクレオチドが第１の一本鎖核酸分子と安定的にハイブリダイズすることを阻止する可逆性ターミネーターを含む。いくつかの実施形態において、可逆性ターミネーターは、個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込み後で、且つ別の個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込み前に除去される。
【００２０】
[0020]  いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、静電気的部分である。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、個々のヌクレオチドの少なくともサブセットの核酸塩基と連結している。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが、単一の型の検出可能な標識と可逆的に連結している。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが、異なる型の検出可能な標識と可逆的に連結している。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、１つ又は複数の連結機構により、異なる型のヌクレオチドと可逆的に連結している。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、単一の連結機構により、異なる型のヌクレオチドと可逆的に連結している。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルの検出後に除去される。
【００２１】
[0021]  いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、第１の一本鎖核酸分子は、異なる型のヌクレオチドと逐次的に接触させる。いくつかの実施形態において、核酸取り込み反応中の所与の時点において、第１の一本鎖核酸分子を、第１の型の個々のヌクレオチドと接触させ、核酸取り込み反応中の次の時点において、第１の一本鎖核酸分子を、第２の型の個々のヌクレオチドと接触させ、第１の型は第２の型と異なる。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、第１の一本鎖核酸分子は、異なる型のヌクレオチドと同時に接触させる。
【００２２】
[0022]  いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、定常状態シグナルである。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に１回検出される。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に少なくとも２回検出される。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、一過性シグナルである。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである。
【００２３】
[0023]  いくつかの実施形態において、複数の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子のクローン集団である。いくつかの実施形態において、第１の一本鎖核酸分子は、自己プライミングループを含む。いくつかの実施形態において、方法は、第１の一本鎖核酸分子の配列が決定されるまで繰り返される。
【００２４】
[0024]  別の態様において、本開示は、センサーアレイに隣接した複数の一本鎖核酸分子を提供する工程であって、複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子が、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置されている、工程；第１の一本鎖核酸分子を核酸取り込み反応に供して、第１の一本鎖核酸分子と相補的な成長する鎖として第２の一本鎖核酸分子を生成する工程であって、核酸取り込み反応が、（ｉ）検出可能な標識を含む第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込むこと、及び（ｉｉ）検出可能な標識を含まない第２の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込むことを、交互に且つ逐次的に含む、工程；並びに、核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、所与のセンサーを用いて、検出可能な標識を含む二重層からの電荷又は伝導率の変化を示すシグナルを検出し、それにより、第１の一本鎖核酸分子の配列及び／又は長さを決定する工程を含む、核酸分子を検出するための方法を提供する。
【００２５】
[0025]  いくつかの実施形態において、第１の複数のヌクレオチドは、追加のヌクレオチドが第１の一本鎖核酸分子と安定的にハイブリダイズすることを阻止するターミネーターを含む。いくつかの実施形態において、第１の複数のヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第２の複数のヌクレオチドは、追加のヌクレオチドが第１の一本鎖核酸分子と安定的にハイブリダイズすることを阻止する可逆性ターミネーターを含む。いくつかの実施形態において、可逆性ターミネーターは、第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを第２の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドと交換した後に除去される。
【００２６】
[0026]  いくつかの実施形態において、第１の複数のヌクレオチドは、第２の複数のヌクレオチドと交換される。いくつかの実施形態において、第２の複数のヌクレオチドの取り込みは、第１の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドが取り込まれていない、第１の一本鎖核酸分子に沿った位置に、第２の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドを取り込むことにより、位相誤差を修正する。いくつかの実施形態において、方法は、第１の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドを用いて、核酸取り込み反応を継続する工程をさらに含む。
【００２７】
[0027]  いくつかの実施形態において、検出可能な標識は除去可能ではない。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、静電気的部分である。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドの核酸塩基と連結している。いくつかの実施形態において、第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが、単一の型の検出可能な標識と連結している。いくつかの実施形態において、第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、異なる型のヌクレオチドのそれぞれが、異なる型の検出可能な標識と連結している。
【００２８】
[0028]  いくつかの実施形態において、所与のセンサーは、第１の一本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結している。いくつかの実施形態において、複数の一本鎖核酸分子は、複数のビーズと連結している。いくつかの実施形態において、第１の一本鎖核酸分子は、複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、電荷二重層は所与のビーズの表面に隣接している。いくつかの実施形態において、複数の一本鎖核酸分子は、センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結している。いくつかの実施形態において、第１の一本鎖核酸分子は、所与のセンサーの表面と連結しており、電荷二重層はその表面に隣接している。
【００２９】
[0029]  いくつかの実施形態において、方法は、第１の一本鎖核酸に隣接したプライミング部位を提供する工程、及びプライミング部位からのプライマー伸長により第２の一本鎖核酸分子を生成する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、プライミング部位は、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有するプライマー配列である。いくつかの実施形態において、プライミング部位は、自己プライミングループである。いくつかの実施形態において、方法は、重合酵素を用いて、個々のヌクレオチドを取り込む工程をさらに含む。
【００３０】
[0030]  いくつかの実施形態において、所与のセンサーは、少なくとも２つの電極を含む。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、第１の一本鎖核酸分子は、異なる型のヌクレオチドと逐次的に接触させる。いくつかの実施形態において、核酸取り込み反応中の所与の時点において、第１の一本鎖核酸分子を、第１の型の個々のヌクレオチドと接触させ、核酸取り込み反応中の次の時点において、セグメントを、第２の型の個々のヌクレオチドと接触させ、第１の型は第２の型と異なる。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み、第１の一本鎖核酸分子は、異なる型のヌクレオチドと同時に接触させる。
【００３１】
[0031]  いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、定常状態シグナルである。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に１回検出される。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に少なくとも２回検出される。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、一過性シグナルである。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである。
【００３２】
[0032]  いくつかの実施形態において、複数の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子のクローン集団である。いくつかの実施形態において、方法は、第１の一本鎖核酸分子の配列が決定されるまで繰り返される。いくつかの実施形態において、第１の一本鎖核酸分子は、所与のセンサーに隣接した、複数の一本鎖核酸分子の一部であり、第１の一本鎖核酸分子を含む複数の一本鎖核酸分子の個々の一本鎖核酸分子が、鋳型一本鎖核酸分子と配列相同性を有する。
【００３３】
[0033]  別の態様において、本開示は、複数のセンサーを含むセンサーアレイであって、使用中、複数の二本鎖核酸分子のうちの所与の二本鎖核酸分子が、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され、所与の二本鎖核酸分子が第１の一本鎖核酸分子及び第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有する第２の一本鎖核酸分子を含み、所与のセンサーが、所与の二本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結している、センサーアレイ；並びに、センサーアレイと動作可能に連結した１つ又は複数のコンピュータプロセッサであって、（ｉ）第２の一本鎖核酸分子とハイブリダイズしていない第１の一本鎖核酸分子のセグメントを個々のヌクレオチドと接触させて、セグメントを、個々のヌクレオチドから第３の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供する工程であって、第３の一本鎖核酸分子が第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有する、工程、及び（ｉｉ）核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、所与のセンサーを用いて、個々のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への取り込みを示すシグナルを検出し、それにより、セグメントの配列及び／又は長さを決定する工程を行うように個々に又はまとめてプログラムされている、コンピュータプロセッサを含む、核酸分子を検出するためのシステムを提供する。
【００３４】
[0034]  いくつかの実施形態において、使用中、複数の二本鎖核酸分子は、複数のビーズと連結している。いくつかの実施形態において、使用中、所与の二本鎖核酸分子は、複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、電荷二重層は、所与のビーズの表面に隣接している。いくつかの実施形態において、使用中、複数の二本鎖核酸分子は、センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結している。いくつかの実施形態において、使用中、所与の二本鎖核酸分子は、所与のセンサーの表面と連結しており、電荷二重層は表面に隣接している。いくつかの実施形態において、所与のセンサーは少なくとも２つの電極を含む。
【００３５】
[0035]  いくつかの実施形態において、使用中、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、定常状態シグナルである。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に１回検出される。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドは、検出可能な標識を組み込んでいる。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、静電気的部分である。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に少なくとも２回検出される。いくつかの実施形態において、使用中、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、一過性シグナルである。いくつかの実施形態において、使用中、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである。
【００３６】
[0036]  別の態様において、本開示は、複数のセンサーを含むセンサーアレイであって、使用中、複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子が、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され、所与のセンサーが、第１の一本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結している、センサーアレイ；並びに、センサーアレイと動作可能に連結した１つ又は複数のコンピュータプロセッサであって、（ｉ）第１の一本鎖核酸分子を個々のヌクレオチドと接触させて、第１の一本鎖核酸分子を、個々のヌクレオチドから第２の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供する工程であって、第２の一本鎖核酸分子が第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有し、個々のヌクレオチドの少なくともサブセットが検出可能な標識を含む、工程、及び（ｉｉ）核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、所与のセンサーを用いて、個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込みを示す検出可能な標識からのシグナルを検出し、それにより、第１の一本鎖核酸分子の配列及び／又は長さを決定する工程を行うように個々に又はまとめてプログラムされている、コンピュータプロセッサを含む、核酸分子を検出するためのシステムを提供する。
【００３７】
[0037]  いくつかの実施形態において、使用中、複数の一本鎖核酸分子は、複数のビーズと連結している。いくつかの実施形態において、使用中、第１の一本鎖核酸分子は、複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、電荷二重層は、所与のビーズの表面に隣接している。いくつかの実施形態において、使用中、複数の一本鎖核酸分子は、センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結している。いくつかの実施形態において、使用中、第１の一本鎖核酸分子は、所与のセンサーの表面と連結しており、電荷二重層は表面に隣接している。いくつかの実施形態において、所与のセンサーは少なくとも２つの電極を含む。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は静電気的部分である。
【００３８】
[0038]  いくつかの実施形態において、使用中、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、定常状態シグナルである。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に１回検出される。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に少なくとも２回検出される。いくつかの実施形態において、使用中、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、一過性シグナルである。いくつかの実施形態において、使用中、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである。
【００３９】
[0039]  別の態様において、本開示は、複数のセンサーを含むセンサーアレイであって、使用中、複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子が、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置されている、センサーアレイ；並びに、センサーアレイと動作可能に連結した１つ又は複数のコンピュータプロセッサであって、（ｉ）第１の一本鎖核酸分子を個々のヌクレオチドと接触させて、第１の一本鎖核酸分子を核酸取り込み反応に供して、第２の一本鎖核酸分子を生成する工程であって、核酸取り込み反応が、検出可能な標識を含む第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込むこと、及び検出可能な標識を含まない第２の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドと第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを交換することを交互に且つ逐次的に含む、工程、並びに（ｉｉ）核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、所与のセンサーを用いて、検出可能な標識を含む二重層からの電荷又は伝導率の変化を示すシグナルを検出し、それにより、第１の一本鎖核酸分子の配列及び／又は長さを決定する工程を行うように個々に又はまとめてプログラムされている、コンピュータプロセッサを含む、核酸分子を検出するためのシステムを提供する。
【００４０】
[0040]  いくつかの実施形態において、使用中、所与のセンサーは、第１の一本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結している。いくつかの実施形態において、使用中、複数の一本鎖核酸分子は、複数のビーズと連結している。いくつかの実施形態において、使用中、第１の一本鎖核酸分子は、複数のビーズのうちの所与のビーズと連結しており、電荷二重層は所与のビーズの表面に隣接している。いくつかの実施形態において、使用中、複数の一本鎖核酸分子は、センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結している。いくつかの実施形態において、使用中、第１の一本鎖核酸分子は、所与のセンサーの表面と連結しており、電荷二重層はその表面に隣接している。いくつかの実施形態において、所与のセンサーは、少なくとも２つの電極を含む。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は静電気的部分である。
【００４１】
[0041]  いくつかの実施形態において、使用中、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、定常状態シグナルである。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に１回検出される。いくつかの実施形態において、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、個々のヌクレオチドの取り込み後に少なくとも２回検出される。いくつかの実施形態において、使用中、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、一過性シグナルである。いくつかの実施形態において、使用中、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである。
【００４２】
[0042]  本開示の追加の態様及び利点は、当業者には以下の詳細な説明から容易に明らかになるだろうが、そこでは、本開示の例示的な実施形態のみが示され、記載されている。認識されているように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、それのいくつかの詳細は、様々な明白な点での改変が可能であり、それらは全て、本開示から逸脱することはない。したがって、図面及び説明は、本来、例示として見なされるべきであり、制限として見なされるべきではない。
【００４３】
[0043]  参照による組み込み
この明細書に言及された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、又は特許出願が具体的且つ個々に示されて、参照により組み込まれているのと同じ程度で参照により本明細書に組み込まれている。参照により組み込まれた刊行物及び特許又は特許出願が、本明細書に含有された開示と矛盾する限りにおいては、本明細書が、任意のそのような矛盾する材料に対して取って代わり及び／又は優先することを意図される。
【００４４】
[0044]  本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲において具体的に示されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用されている例示的な実施を示す以下の詳細な説明及び添付の図面（本明細書ではまた、「図（figure）」及び「図（FIG.）」）を参照することにより得られるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】[0045]ビーズと連結した非構造化鋳型核酸分子のモデル図である。
【図２】[0046]ビーズと連結した構造化鋳型核酸分子のモデル図である。
【図３】[0047]ほどけた鋳型シーケンシングについてのプロセスフローの例を示す図である。
【図４Ａ】[0048]標識及び非標識ヌクレオチドを用いた、二本鎖シーケンシング方法及びシーケンシング結果の例を示す図である。一本鎖シーケンシング結果と二本鎖シーケンシング結果の比較の例を示す。
【図４Ｂ】標識及び非標識ヌクレオチドを用いた、二本鎖シーケンシング方法及びシーケンシング結果の例を示す図である。ポリアニオン静電気的部分を用いた、二本鎖シーケンシングのシーケンシング結果の例を示す。
【図４Ｃ】標識及び非標識ヌクレオチドを用いた、二本鎖シーケンシング方法及びシーケンシング結果の例を示す図である。ポリカチオン静電気的部分を用いた、二本鎖シーケンシングのシーケンシング結果の例を示す。
【図４Ｄ】標識及び非標識ヌクレオチドを用いた、二本鎖シーケンシング方法及びシーケンシング結果の例を示す図である。ポリアニオン静電気的部分とポリカチオン静電気的部分の両方を用いた、二本鎖シーケンシングのシーケンシング結果の例を示す。
【図５】[0049]二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。
【図６】[0050]ランダムヘキサマーを用いた、二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。
【図７Ａ】[0051]可逆性ターミネーターを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。可逆性ターミネーター及びフラップエンドヌクレアーゼを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。
【図７Ｂ】可逆性ターミネーターを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。可逆性ターミネーター及び核酸サブユニットを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。
【図８】[0052]ヌクレオチドの型ごとに異なる型の静電気的部分を用いたシーケンシング方法の例を示す図である。
【図９】[0053]ヌクレオチドの各型に単一の型の静電気的部分を用いたシーケンシング方法の例を示す図である。
【図１０】[0054]静電気的部分及び可逆性ターミネーターを用いたシーケンシングのための方法の例を示す図である。
【図１１Ａ】[0055]第２の一本鎖核酸分子上の検出可能な標識を用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。フラップエンドヌクレアーゼによって切断される検出可能な標識を用いたシーケンシング方法の例を示す。
【図１１Ｂ】第２の一本鎖核酸分子上の検出可能な標識を用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。検出可能な標識及び可逆性ターミネーターを用いたシーケンシング方法の例を示す。
【図１２Ａ】[0056]検出可能な標識及びフラップエンドヌクレアーゼを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。検出可能な標識及び中温性フラップエンドヌクレアーゼを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。
【図１２Ｂ】検出可能な標識及びフラップエンドヌクレアーゼを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。検出可能な標識及び耐熱性フラップエンドヌクレアーゼを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。
【図１３Ａ】[0057]検出可能な標識、フラップエンドヌクレアーゼ、及び可逆性ターミネーターを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。検出可能な標識、中温性フラップエンドヌクレアーゼ、及び可逆性ターミネーターを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。
【図１３Ｂ】検出可能な標識、フラップエンドヌクレアーゼ、及び可逆性ターミネーターを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。検出可能な標識、耐熱性フラップエンドヌクレアーゼ、及び可逆性ターミネーターを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。
【図１４Ａ】[0058]検出可能な標識及び核酸サブユニットを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。
【図１４Ｂ】[0059]検出可能な標識、核酸サブユニット、及び可逆性ターミネーターを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す図である。
【図１５】[0060]加ピロリン酸分解媒介性ターミネーター交換シーケンシングのための方法の例を示す図である。
【図１６】[0061]本明細書に提供された方法を実行するようにプログラムされ又は別な方法で構成されているコンピュータシステムを示す図である。
【図１７】[0062]リンカーを介して核酸塩基に連結した検出可能な標識又はエフェクターを含む修飾ヌクレオチドの例を示す図である。
【図１８Ａ】[0063]検出可能な標識の例を示す図である。リジン残基を有するポリカチオン静電気的部分の例を示す。
【図１８Ｂ】検出可能な標識の例を示す図である。カルボン酸基を有するポリアニオン静電気的部分の例を示す。
【図１８Ｃ】検出可能な標識の例を示す図である。バッファーのｐＨに応答して中性状態と正の状態との間を切り替えることができるヒスチジンイミダゾール残基を含むスイッチ標識の例を示す。
【図１９】[0064]異なる塩濃度で、且つポリエチレングリコール（PEG）の存在下又は非存在下での重合酵素の活性を示す図である。
【図２０】[0065]シーケンシング反応中、位相誤差を修正するための方法を示す図である。
【図２１】[0066]位相誤差を修正するための方法の例を示す図である。
【図２２】[0067]位相誤差を修正するための方法の別の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
[0068]  本発明の様々な実施形態が本明細書で示され、且つ記載されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者に明らかであろう。本発明から逸脱することなく、多数のバリエーション、変化、及び置換が当業者の頭に浮かぶ可能性がある。本明細書に記載された本発明の実施形態の様々な代替物が用いられ得ることは理解されるべきである。
【００４７】
[0069]  本明細書で用いられる場合、用語「に隣接した」とは、一般的に、の隣に、の近くに、又は、の検知下に若しくは電子的に近接した（若しくは近くに）、を指す。例えば、第２の物体に隣接した第１の物体は、第２の物体と接触し得、又は第２の物体と接触していなくてもよいが、第２の物体の近くにあり得る。いくつかの例では、第２の物体に対する第１の物体は、第２の物体から約０マイクロメートル（「ミクロン」）、０．００１ミクロン、０．０１ミクロン、０．１ミクロン、０．２ミクロン、０．３ミクロン、０．４ミクロン、０．５ミクロン、１ミクロン、２ミクロン、３ミクロン、４ミクロン内、５ミクロン、１０ミクロン、又は１００ミクロン内である。
【００４８】
[0070]  本明細書で用いられる場合、用語「核酸」は、一般的に、１つ又は複数の核酸サブユニットを含む分子を指す。核酸は、アデノシン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、チミン（T）、及びウラシル（U）、又はそのバリアントから選択される１つ又は複数のサブユニットを含み得る。ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵ、又はそのバリアントを含み得る。ヌクレオチドは、成長する核酸鎖へ取り込まれ得る任意のサブユニットを含み得る。そのようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵであり得、或いは、より相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵのうちの１つに特異的であり、又はプリン（すなわち、A若しくはG、又はそのバリアント）若しくはピリミジン（すなわち、C、T、若しくはU、又はそのバリアント）に相補的である任意の他のサブユニットであり得る。いくつかの例では、核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、場合によっては、核酸分子は環状である。
【００４９】
[0071]  本明細書で用いられる場合、用語「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸断片」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」、及び「ポリヌクレオチド」は、一般的に、様々な長さをもち得るヌクレオチドの重合体の形、デオキシリボヌクレオチド（DNA）若しくはリボヌクレオチド（RNA）、又はその類似体のいずれかを指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には、４個のヌクレオチド塩基：アデニン（A）；シトシン（C）；グアニン（G）；及びチミン（T）（ポリヌクレオチドがRNAである場合、チミン（T）の代わりにウラシル（U））の特定の配列で構成される。したがって、用語「オリゴヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である；或いは、その用語は、ポリヌクレオチド分子自体に適用され得る。このアルファベット表示は、中央処理装置を有するコンピュータにおけるデータベースへ入力して、ゲノム機能解析及びホモロジー検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに用いることができる。オリゴヌクレオチドは、１個又は複数の非標準ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及び／又は修飾ヌクレオチドを含み得る。場合によっては、オリゴは、多くても３００塩基対（bp）、多くても２００ｂｐ、多くても１００ｂｐ、多くても９０ｂｐ、多くても８０ｂｐ、多くても７０ｂｐ、多くても６０ｂｐ、多くても５０ｂｐ、多くても４０ｂｐ、多くても３０ｂｐ、多くても２０ｂｐ、多くても１０ｂｐ、又はそれ未満である、短い一本鎖核酸配列を指し得る。場合によっては、オリゴは、コンジュゲーションに適した、その３’又は５’末端に−Ｃ６−ＮＨ２官能基を有し得る。
【００５０】
[0072]  修飾ヌクレオチドの例には、ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケウオシン（galactosylqueosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケウオシン（mannosylqueosine）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｄ４６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケウオシン（queosine）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノプリンなどが挙げられるが、それらに限定されない。核酸分子はまた、塩基部分（例えば、相補ヌクレオチドと水素結合を形成するのに典型的に利用できる１つ若しくは複数の原子、及び／又は相補ヌクレオチドと水素結合を形成する能力が典型的にない１つ若しくは複数の原子において）、糖部分、又はリン酸骨格において修飾され得る。核酸分子はまた、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHS）などのアミン反応部分の共有結合性付着を可能にするために、アミノアリル−ｄＵＴＰ（aa-dUTP）及びアミノヘキシルアクリルアミド（aminohexhylacrylamide）−ｄＣＴＰ（aha-dCTP）などのアミン修飾基を含有し得る。本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準ＤＮＡ塩基対又はＲＮＡ塩基対の代替物は、立方ｍｍあたりのビットでのより高い密度、より高い安全性（天然毒素の偶発的又は意図的な合成に対する抵抗性）、光プログラム化ポリメラーゼにおけるより容易な識別、又はより低レベルの二次構造を提供することができる。新規及び／又は増幅合成のための天然及び変異体ポリメラーゼと適合性のそのような代替塩基対は、Ｂｅｔｚ  Ｋ、Ｍａｌｙｓｈｅｖ  Ｄ  Ａ、Ｌａｖｅｒｇｎｅ  Ｔ、Ｗｅｌｔｅ  Ｗ、Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ  Ｋ、Ｄｗｙｅｒ  Ｔ  Ｊ、Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ  Ｐ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ  Ｆ  Ｅ、Ｍａｒｘ  Ａ（２０１２）に記載されている。
【００５１】
[0073]  本明細書で用いられる場合、用語「ヌクレオチド」は、一般的に、デオキシリボ核酸（DNA）分子又はリボ核酸（RNA）分子などの核酸分子のモノマー又はサブユニットとして働く有機分子を指す。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドはまた、ペプチド核酸（PNA）ヌクレオチド、ロックド核酸（LNA）ヌクレオチド、又はジデオキシヌクレオチドであり得る。
【００５２】
[0074]  本明細書で用いられる場合、用語「プライマー」は、一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの核酸合成のための起始点として働く核酸の鎖を指す。一例では、ＤＮＡ試料の複製中、複製を触媒する酵素が、ＤＮＡ試料に付着したプライマーの３’末端において複製を開始し、逆鎖を複写する。
【００５３】
[0075]  本明細書で用いられる場合、用語「重合酵素」は、一般的に、重合反応を触媒する能力がある任意の酵素を指す。ポリメラーゼの例には、限定なしに、核酸ポリメラーゼが挙げられる。ポリメラーゼは、天然に存在し得、又は合成され得る。ポリメラーゼの例は、Φ２９ポリメラーゼ又はその誘導体である。ポリメラーゼは、重合酵素であり得る。場合によっては、転写酵素又はリガーゼが用いられる（すなわち、結合の形成を触媒する酵素）。ポリメラーゼの例には、ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、修飾ポリメラーゼ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９（phi29）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｗポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｃａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔポリメラーゼ、又はそのバリアント、修飾産物、及び誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、単一サブユニットのポリメラーゼである。ポリメラーゼは、高い処理能力、つまり、核酸鋳型において、核酸鋳型を遊離することなく、ヌクレオチドを継続的に取り込むポリメラーゼの能力を有し得る。
【００５４】
[0076]  本明細書で用いられる場合、用語「検出可能な標識」は、一般的に、検出されるべき分子と連結している任意の検出可能な部分を指す。検出可能な標識の非限定的例には、静電気的部分、蛍光部分、化学発光部分、放射性部分、比色部分、又はそれらの任意の組合せが挙げられ得る。検出可能な標識は、検出されるべき分子と可逆的に、又は不可逆的に連結し得る。そのような部分は標識であり得る。静電気的部分の例には、電荷標識が挙げられる。検出可能な標識は、核酸塩基とＣ５又はＣ７位において連結し得る。例えば、可逆性静電気的部分は、核酸分子へ取り込まれるヌクレオチドと連結し得る。
【００５５】
[0077]  検出可能な標識は、リンカーを介して核酸塩基と連結し得る。リンカーは、核酸塩基とＣ５又はＣ７位において連結し得る。リンカーは、非ヌクレオチド分子であり得る。リンカーは、酸不安定性、感光性であり得、又はジスルフィド結合を含有し得る。リンカーは、ヌクレオチドと酵素の間でのいかなる相互作用も干渉することがないように、ヌクレオチドから十分な距離を置いて、検出可能な標識を保持し得る。いくつかの例では、検出可能なリンカーは、ヌクレオチドから少なくとも約１ナノメートル（nm）、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、又はそれ以上の距離にある。図１７は、リンカーを介してヌクレオチドと連結した検出可能な標識を有する修飾ヌクレオチドの例を示す。この例において、検出可能な標識はまた、エフェクター分子と呼ばれる場合があり、その検出可能な標識が、そのヌクレオチドの周囲の電荷分布に影響し得るからである。
【００５６】
[0078]  本明細書で用いられる場合、用語「静電気的部分」は、一般的に、正味正電荷若しくは負電荷を含む検出可能な標識、又は化学的若しくは生物学的ユニットを検出可能にする、化学的若しくは生物学的ユニットに付着した部分を指す。例えば、静電気的部分は、荷電官能基、電荷を有する官能基の一部、電荷標識、又は検出可能な標識としての荷電分子を含み得る。静電気的部分は、一価（例えば、+1又は-1電荷を有する）又は多価（例えば、+2、+3、+4、+5、+6など、又は-1、-2、-3、-4、-5、-6などの電荷を有する）であり得る。静電気的部分は、正味正電荷又は負電荷を有し得る。静電気的部分は、１つ又は複数のアニオン性又はカチオン性荷電基を有し得る。一例では、静電気的部分は、アニオン性荷電基とカチオン性荷電基の両方を有し、正味正電荷又は負電荷を有する。別の例では、静電気的部分は双性イオンではない。静電気的部分は、一定の正味電荷を有する場合もあるし、電荷を変化させる場合もある。一例では、静電気的部分は、溶液条件（例えば、pH、温度など）の関数として電荷を切り替え、又は変化させる。
【００５７】
[0079]  本明細書で用いられる場合、用語「クローンの」は、一般的に、センサー区域の集団の少なくとも一部、実質的に全部、又は全部が同じ核酸配列であることを指す。「メイトペア（mate pairs）」、「ペアードエンド（paired ends）」、又は他の類似した方法論について用いられる場合のように、単一試料核酸断片に関連した２つの集団があり得る；その集団は、センサー区域においておおよそ類似した数で存在し得、センサー区域にわたってランダムに分布され得る。
【００５８】
[0080]  本明細書で用いられる場合、用語「位相誤差」は、一般的に、所与のポリヌクレオチド配列（例えば、第２又は第３の一本鎖核酸分子）と、その所与のポリヌクレオチド配列が由来する鋳型核酸分子との間での誤差又は違いを指す。所与のポリヌクレオチド配列は、クローン集団の一部であり得、所与のヌクレオチド配列は、クローン集団のコンセンサス状態（例えば、参照配列）より長い、又は短い配列を有し得る。位相誤差は、リーディング（leading）又はラギング（lagging）位相誤差であり得る。リーディング位相誤差は、コンセンサス（例えば、参照）配列に存在しない追加のヌクレオチド塩基を含み得る。ラギング位相誤差は、コンセンサス（例えば、参照）配列に対してより少ないヌクレオチド塩基を含み得る。位相誤差は、重合酵素によるヌクレオチド塩基の誤取り込み又は取り込みの欠損の産物であり得る。位相誤差は、シーケンシングシステムの読み取り長を制限し得る。
【００５９】
[0081]  本明細書で用いられる場合、用語「フラップ」は、一般的に、別の一本鎖核酸分子とハイブリダイズ又は会合していない一本鎖核酸分子の一部分を指し、同時に、その一本鎖核酸分子の一部分がその他方の一本鎖核酸分子とハイブリダイズ又は会合している。フラップは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０ヌクレオチド塩基長、又はそれ以上であり得る。
【００６０】
[0082]  用語「at least（少なくとも）」、「greater than（より大きい）」、又は「greater than or equal to（以上）」が、一連の２つ以上の数値において最初の数値の前に置かれる場合はいつでも、その用語「at least（少なくとも）」、「greater than（より大きい）」、又は「greater than or equal to（以上）」は、その一連の数値における数値のそれぞれに適用される。例えば、「greater than or equal to 1, 2, or 3（１、２、又は３以上）」は、「greater than or equal to 1, greater than or equal to 2, or greater than or equal to 3（１以上、２以上、又は３以上）」と等価である。
【００６１】
[0083]  用語「no more than（多くとも）」、「less than（未満）」、又は「less than or equal to（以下）」が、一連の２つ以上の数値において最初の数値の前に置かれる場合はいつでも、その用語「no more than（多くとも）」、「less than（未満）」、又は「less than or equal to（以下）」は、その一連の数値における数値のそれぞれに適用される。例えば、「less than or equal to 3, 2, or 1（３、２、又は１以下）」は、「less than or equal to 3, less than or equal to 2, or less than or equal to 1（３以下、２以下、又は１以下）」と等価である。
【００６２】
[0084]  核酸シーケンシングのための方法
一態様において、本開示は、核酸シーケンシングのための方法を提供する。方法は、センサーアレイに隣接した複数の二本鎖核酸分子を提供する工程を含み得る。所与の、又は個々の二本鎖核酸分子は、センサーアレイの所与の、又は個々のセンサーに隣接して配置され得る。二本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子を含み得る。第１及び第２の一本鎖核酸分子は、互いとの配列相補性を有し得る。センサーは、二本鎖核酸分子の（例えば、デバイ長内の）電荷二重層と電気的に連結し得る。第２の一本鎖核酸分子の一部分は、第１の一本鎖核酸分子から遊離されて、第２の一本鎖核酸分子とハイブリダイズしていない第１の一本鎖核酸分子のセグメントを提供し得る。そのセグメントは、個々のヌクレオチドと接触させ得る。個々のヌクレオチドは、第３の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供され得る。第３の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有し得る。核酸取り込み反応中、センサーは、個々のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への取り込みを示すシグナルを検出し、それにより、ハイブリダイズしていないセグメントの配列又は長さを決定するために用いられ得る。
【００６３】
[0085]  別の態様において、本開示は、核酸分子を検出するための方法を提供し得る。その方法は、センサーアレイに隣接した複数の一本鎖核酸分子を提供する工程、第１の一本鎖核酸分子を個々のヌクレオチドと接触させて、第１の一本鎖核酸分子を、個々のヌクレオチドから第２の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供する工程、並びに、核酸取り込み反応の間、又はその後に、所与のセンサーを用いて、個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込みを示す検出可能な標識からのシグナルを検出し、それにより、第１の一本鎖核酸分子の配列及び／又は長さを決定する工程を含み得る。複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子は、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され得る。所与のセンサーは、第１の一本鎖核酸分子の（例えば、デバイ長内の）電荷二重層と電気的に連結し得る。第２の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有し得る。個々のヌクレオチドの少なくともサブセットは、検出可能な標識を含み得る。
【００６４】
[0086]  別の態様において、本開示は、核酸シーケンシングのための方法を提供する。その方法は、センサーアレイに隣接した複数の一本鎖核酸分子を提供する工程、第１の一本鎖核酸分子を核酸取り込み反応に供して、第１の一本鎖核酸分子と相補的な成長する鎖としての第２の一本鎖核酸分子を生成する工程、及び、核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、所与のセンサーを用いて、第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込みを示す検出可能な標識からのシグナルを検出し、それにより、第１の一本鎖核酸分子の配列又は長さを決定する工程を含み得る。複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子は、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され得る。核酸取り込み反応は、（ｉ）検出可能な標識を含む第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込むこと、及び（ｉｉ）検出可能な標識を含まない第２の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込むことを、交互に且つ逐次的に含み得る。
【００６５】
[0087]  本明細書に記載されたシステム及び方法は、生物学的分子及び反応を検出するために用いられ得る。例えば、記載されたシステム及び方法は、結合事象、反応及び反応産物、並びに／又は生物学的分子の存在若しくは非存在を検出するために用いられ得る。一例では、システム及び方法は、核酸分子の配列を決定するために用いられ得る。別の例では、システム及び方法は、核酸分子の長さ（例えば、ヌクレオチドの数）を決定するために用いられ得る。一例では、システム及び方法は、標的核酸分子の配列と長さの両方を決定するために用いられ得る。システム及び方法は、核酸多型性、例えば、これらに限定されないが、誤取り込みされたヌクレオチド、断片サイズの変化、反復ヌクレオチド配列、及び／又は欠失したヌクレオチド配列を検出するために用いられ得る。核酸分子の長さを決定することは、診断学（例えば、がん検出）などのヘルスケアへ適用され得る。例えば、システム及び方法は、断片長の増加を検出することにより、マイクロサテライト不安定性を検出するために用いられ得る。
【００６６】
[0088]  核酸分子をシーケンシングし、又はその長さを決定することは、溶液中に遊離した、又は支持体に連結した核酸鋳型を利用し得る。支持体には、ビーズ、平面、ウェル、又は核酸分子と連結する能力がある任意の他の構造が挙げられ得る。支持体は、センサーアレイのセンサーの近くに位置し得る。代替として、又は加えて、支持体は、センサーアレイのセンサーの一部であり得る（例えば、電極、保護層、誘電体層など）。支持体と連結した核酸鋳型は、構造化されていない（例えば、支持体表面から直線的に伸びる）場合もあるし、構造化されている（例えば、ループ、ヘアピン、及び／又は他の二次構造を形成する）場合もある。図１は、ビーズと連結した非構造化核酸鋳型の例を示す。ビーズは、単一の核酸鋳型と連結し、又は複数の核酸鋳型と連結し得る。非構造化鋳型は、ビーズの表面の周りで互いに相互作用することができない。代替として、又は加えて、非構造化核酸鋳型は、ビーズの表面の周りで互いに相互作用し得る。相互作用しない核酸鋳型は、シーケンシング中、単調なシグナルを生成し得る（例えば、取り込まれた各ヌクレオチドは一定のシグナルを生成する）。図２は、ビーズと連結した構造化核酸鋳型の例を示す。核酸鋳型は、自分自身と相互作用して、ループ、ヘアピン、及び／又は他の二次構造を形成し得る。ビーズは、それと連結した、単一の核酸鋳型又は複数の核酸鋳型を有し得る。一例では、ビーズは、複数の核酸鋳型と連結し、核酸鋳型は互いに相互作用し得る。互いに相互作用する核酸鋳型は、シーケンシング中、非単調なシグナルを生成し得る（例えば、取り込まれた各ヌクレオチドは、異なる、非直線的シグナルを生成する）。
【００６７】
[0089]  構造化核酸鋳型は、シーケンシング前に非構造化され、又はほどかれて、単調なシグナルを生成し得る。鋳型構造は、ヌクレオチド取り込み（例えば、プライマー伸長反応）の前に、又は取り込み事象を読み取り、若しくは検出する前に、ほどかれ得る。図３は、ほどけた鋳型のシーケンシングのための方法の例を示す。構造化鋳型には、ランダムコイル、二次構造、及び／又はヘアピンが挙げられ得る。一例では、鋳型は、自己プライミングループを含む。自己プライミングループは、一本鎖核酸構造が別個のプライマー配列なしに伸長されるのを可能にするヘアピン構造であり得る。構造化状態において、自己プライミングループは、ループ媒介型増幅（LAMP）によるプライマー伸長反応を促進するように配置され得る。自己プライミングループは、核酸鋳型の３’末端へのヌクレオチドの取り込みを促進し得る。代替として、又は加えて、自己プライミングループは、核酸鋳型の５’末端へヌクレオチドを取り込み得る。ヌクレオチドの取り込み後、核酸鋳型の構造はほどかれ得る。鋳型構造は、これらに限定されないが、熱を加えること、ｐＨを変化させること、イオン強度を変化させること、及び／又は１つ若しくは複数の有機溶媒（例えば、ホルムアミド又は尿素）を溶液へ導入することを含む溶液条件を変化させることによりほどかれ得る。その後、ほどけた核酸鋳型は、ヌクレオチド取り込みを検出するために読み取られ得る。検出されたシグナルは、直線的又は単調なシグナルであり得る。
【００６８】
[0090]  シグナル直線性は、二本鎖シーケンシングを用いると増加し得る。二本鎖シーケンシングは、溶液中に遊離した、又は支持体と連結した二本鎖核酸鋳型を含み得る。二本鎖核酸鋳型は、二重らせん構造などの二次構造を有し得る。二重らせん構造は、同じ支持体と連結した二本鎖核酸鋳型間の相互作用を低下させ、又は阻止し得る。二本鎖核酸鋳型間の相互作用を低下させ、又は阻止することは、シーケンシング中に検出されるシグナルの直線性を増加し得る。追加として、二本鎖シーケンシングを、検出可能な標識を含むヌクレオチドと組み合わせることは、直線性を増加させ、且つシグナルノイズ比を増加させ得る。図４Ａ〜４Ｄは、二本鎖シーケンシング方法の例、並びに標識ヌクレオチド及び非標識ヌクレオチドを用いたシーケンシング結果の例を示す。図４Ａは、一本鎖４０１シーケンシング結果と二本鎖４０２シーケンシング結果の比較の例を示す。一本鎖シーケンシング４０１の例は、プロットの、ｙ軸に対して正と負の両方であり、且つ非単調に変動するシグナルを示す。二本鎖シーケンシング４０２の例は、プロットの、ｙ軸に対して正であり、且つ取り込まれたヌクレオチドの数と共に単調に変動するシグナルを示す。図４Ｂは、ポリアニオン静電気的部分を用いた二本鎖シーケンシングについてのシーケンシング結果の例を示す。ポリアニオン静電気的部分は、リン酸、ホスホン酸、硫酸、スルホン酸、ボロン酸、又はカルボン酸基の１つ又は複数を含み得る。この例において検出されたシグナルは、ｙ軸に対して正であり、且つ単調である。追加として、検出されたシグナルは、検出可能なシグナルノイズの外側にあり得る（例えば、高いシグナルノイズ比を有する）。図４Ｃは、ポリカチオン静電気的部分を用いた二本鎖シーケンシングのシーケンシング結果の例を示す。ポリカチオン静電気的部分は、ピリジニウム、イミダゾリウム、グアニジニウム、イミニウム、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、又は第四級アンモニウムの１つ又は複数を含み得る。ポリアニオン静電気的部分のように、ポリカチオン静電気的部分は、検出可能なシグナルノイズの外側にあるシグナルを生成し得る。しかしながら、ポリカチオン静電気的部分は、負、すなわち、ポリアニオン静電気的部分を用いて生成したシグナルと反対であるシグナルを生成し得る。図４Ｄは、ポリアニオン静電気的部分とポリカチオン静電気的部分の両方を用いた二本鎖シーケンシングのシーケンシング結果の例を示す。ポリアニオン及びポリカチオン静電気的部分は、検出可能なシグナルノイズの外側にあり、且つ正と負の両方である（例えば、互いに対して反対のシグナル方向）検出可能なシグナルを生成し得る。
【００６９】
[0091]  ポリカチオン静電気的部分は、シーケンシング中など、シグナルノイズ比を向上させるのに有用であり得る。ポリカチオン又はポリアニオン静電気的部分などの検出可能な標識は、単調なシグナル、すなわち、非修飾ヌクレオチドからのシグナルと比較した場合、直線的シグナルを生成することにおいて有用であり得る。直線化しているシグナルは、検出可能な標識により引き起こされた核酸分子の構造遷移のせいであり得る。構造遷移は、核酸分子の周りのイオン分布の変化をもたらし得、その結果、単一ヌクレオチド取り込みにより生成したシグナルと同じ大きさであるシグナルを生じる。
【００７０】
[0092]  ポリカチオン静電気的部分は、アミン、若しくはリジン、ヒスチジン、アルギニンなどのアミノ酸残基、又はそれらの任意の組合せを含み得る。ポリカチオン静電気的部分は、核酸分子の近傍からマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）などの他のポリカチオンを移動させ、又は遠ざけ得る。他のポリカチオンの移動は、結果として、より弱い伝導電流を生じ得、それは、センサーにより負のシグナルとして検出され得る。カルボン酸基などのポリアニオン静電気的部分は、核酸分子の周りのＭｇ２＋などのポリカチオンを引き付け、又は濃縮し得る。検出可能な標識は、荷電基を含み得る。検出可能な標識は、一価（例えば、単一の正又は負の電荷、例えば、+1又は-1などを有する）又は多価（例えば、複数の正又は負の電荷、例えば、+2又は-2などを有する）であり得る。ポリカチオン又はポリアニオンの検出可能な標識などの検出可能な標識は、約１個〜約５０個、又はそれより多い正又は負の電荷を有し得る。場合によっては、検出可能な標識は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０個以上、又はそれより多い荷電基を有し得る。検出可能な標識は、約１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜６個、１〜７個、１〜８個、１〜９個、１〜１０個、１〜１２個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個、１〜３０個、１〜４０個、又は１〜５０個の荷電基を含み得る。一例では、検出可能な標識は、３個のリジン残基、６個のリジン残基、又は６個より多いリジン残基を含むポリカチオン静電気的部分であり得る。別の例では、検出可能な標識は、３個のカルボン酸基、６個のカルボン酸基、又は６個より多いカルボン酸基を含むポリアニオン静電気的部分であり得る。ポリカチオン静電気的部分のより高い濃度は、結果として、より高い伝導電流を生じ得、それは、センサーにより正のシグナルとして検出され得る。検出可能な標識におけるポリカチオン又はポリアニオンの数は、センサーにより検出された場合のシグナルの強度と相関し得る。例えば、６個のリジン残基を有する検出可能な標識（例えば、K6標識）は、３個のリジン基を有する検出可能な標識（すなわち、K3標識）と比較してより強い負のシグナルを生じ得る。同様に、検出可能な標識において、６個のカルボン酸基は、３個のカルボン酸基と比較して、より強い正のシグナルを生じ得る。検出可能な標識のより大きい電荷状態は、ガラス製品などの表面とのより強い非特異的結合をもたらし得る。例えば、Ｋ６標識は、Ｋ３標識より高い電荷状態を有し得、したがって、Ｋ６標識は、Ｋ３標識と比較してより強い非特異的結合を有し得る。リジン残基を有するポリカチオン静電気的部分の例は、図１８Ａに示されている。カルボン酸基を有するポリアニオン静電気的部分の例は、図１８Ｂに示されている。
【００７１】
[0093]  検出可能な標識は、荷電状態と中性状態との間、又は一つの電荷状態と別の電荷状態との間（例えば、正電荷から負電荷へ、又は負電荷から正電荷へ）を切り替え可能であり得る。検出可能な標識は、溶液条件、例えば、バッファー条件、例えば、バッファーのｐＨ又はイオン強度などに応答して電荷状態を切り替え得る。切り替え可能な検出可能な標識は、核酸取り込み反応中（例えば、シグナル検出中）、荷電状態であり得、残りの時間は、中性状態であり得る。一例では、ヌクレオチド取り込みは、取り込み事象中、検出され、検出可能な標識は、取り込み中、荷電され得る。別の例では、ヌクレオチド取り込みは、ヌクレオチド取り込み後に検出され得、検出可能な標識は、取り込み中、荷電され得ないが、検出可能な標識が検出中荷電するように切り替えられ得る。別の例では、検出可能な標識は、取り込み中、一つの電荷（例えば、正、負、又は中性）を有し、検出中、別の電荷（例えば、負又は正）を有するように切り替えられる。スイッチ標識は、プロセスを通して荷電状態のままである検出可能な標識、例えばＫ６標識と比較して、非特異的結合を低下させることにおいて有用であり得る。ヒスチジンのスイッチ標識の例は図１８Ｃに示されている。図１８Ｃに示されているように、スイッチ標識は、バッファーのｐＨに応答して中性状態と正の状態との間を切り替えることができるヒスチジンイミダゾール残基を含み得る。スイッチ標識の例には、１個、２個、３個、４個、５個、６個、８個、１０個、１２個以上、又はそれより多いヒスチジン基を有する検出可能な標識が挙げられ得る。一例では、検出可能な標識は、３個のヒスチジン基（例えば、H3）、６個のヒスチジン基（例えば、H6）、又は６個より多いヒスチジン基を有する。スイッチ標識は、ｐＨが７以上である時、中性状態であり得る。スイッチ標識は、ｐＨが５以下である時、正の状態であり得る。スイッチ標識が中性状態である時、その標識は、表面と非特異的に結合する可能性はなく、正の状態での標識と比較して、より大きい移動性を有し得る。スイッチ標識は、センサーによるシグナル検出中、その標識を固定化するために、正の状態に保たれ得る。スイッチ標識は、ヌクレオチドが標的核酸分子の方へ向けられ、及び／又はそれから離れる方向へ向けられる時（例えば、ヌクレオチドがシステム内を移動できる時）、中性状態を維持され得る。
【００７２】
[0094]  検出可能な標識の非特異的結合は、反応条件を変化させることにより低下し得る。例えば、Ｋ６標識は、Ｋ３標識などの低親和性ペプチドの高濃度と共に用いられ得る。そのような状況において、Ｋ６標識は、その低親和性ペプチドからの表面を結合することにおける競合のせいで非特異的結合の低下を示し得る。場合によっては、非特異的結合は、高いイオン強度バッファーを用いることにより低下し得る。例えば、２００ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）を含むバッファーは、Ｋ６標識による非特異的結合を低下させ、次に、Ｋ６標識を動かして、Ｋ６標識を溶液中に維持し得る。
【００７３】
[0095]  重合酵素は、スイッチ標識と共に、及び／又は検出可能な標識を含むヌクレオチドと共に用いられる反応条件変化において、動態学的に活性であり得る。場合によっては、重合酵素は、動態学的活性及び／又は検出可能な標識との適合性に基づいて選択され得る。例えば、より大きい結合ポケットを有するＢ型ポリメラーゼ、例えば、９°  Ｎ、ＲＢ６９、ＫＯＤポリメラーゼは、大きい検出可能な標識と共に用いられ得る。場合によっては、高いイオン強度バッファーに耐えることができる重合酵素、例えば、Ｂ型ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ、Ｂｓｔ  ３．０、Φ２９、Ｔａｑポリメラーゼは、高塩濃度バッファーと共に、及びＫ６標識などのポリカチオン静電気的部分と共に用いられ得る。重合酵素の耐性は、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、デキストラン、又は類似した化合物などの体積排除剤を加えることにより向上し得る。図１９に示されているように、重合酵素は、ＰＥＧの存在下で核酸取り込み反応中、耐塩性の向上を示し得る。鋳型はビーズと連結し得る。プライマーは、鋳型鎖の３’末端と相補的であり得る。プライマーは、６−ＦＡＭフルオロフォアで蛍光標識され、個々のヌクレオチドの取り込みにより伸長され得る。プライマー伸長反応はセンサーにより検出され得る。
【００７４】
[0096]  プライマー伸長反応は、例えば、耐熱性重合酵素などの重合酵素により促進され得る。伸長反応に用いられ得るポリメラーゼ酵素の例には、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８、変異体Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ；Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼ（AmpliTaq（登録商標）ＦＳ又はＴａｑ（G46D、F667Y）、Ｔａｑ（G46D、F667Y、E6811）、及びＴａｑ（G46D、F667Y、T664N、R660G）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＧＢ−Ｄポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（９°  N-7株）ポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼ（Bst）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Bca）、Ｔｓｐポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ（商標）ポリメラーゼ（Invitrogen）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ｚ０５ポリメラーゼ、ｄｅｌｔａ  Ｚ０５ポリメラーゼ（例えば、delta Z05 Gold DNAポリメラーゼ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、又はその変異体、バリアント、若しくは誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。プライマー伸長反応に用いられ得るポリメラーゼ酵素の追加の例は、非耐熱性ポリメラーゼであり、それには、これらに限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、変異体ＤＮＡポリメラーゼＩ、例えば、これらに限定されないが、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（３’→５’エキソヌクレアーゼ  マイナス）、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、変異体Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、変異体Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、並びに変異体ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００７５】
[0097]  いくつかの例では、プライマー伸長反応は、３つの塩濃度（約０ｍＭ、１００ｍＭ、及び２００ｍＭ）などの様々な塩濃度で、及びＰＥＧの存在下又は非存在下で、実施され得る。例えば、１セットの実験は、ＰＥＧ有りで行われ得、別のセットは、ＰＥＧ無しで行われ得る。図１９は、様々な塩及びＰＥＧ濃度において、異なる型の重合酵素を用いて行われたプライマー伸長反応の結果の例を示す。バッファーがＫＣｌを欠く（例えば、０ｍＭ  ＫＣｌを有する）場合、Ｂｓｔ  ２．０ポリメラーゼは、＋ＰＥＧと−ＰＥＧの両方におけるピークの存在により示されているように、ＰＥＧの存在（例えば、+PEG）、非存在（例えば、-PEG）に関わらず、ヌクレオチドを取り込み得る。バッファーがＫＣｌを欠く（例えば、０ｍＭ  ＫＣｌを有する）場合、ＴＩＸポリメラーゼは、＋ＰＥＧと−ＰＥＧの両方におけるピークの非存在により示されているように、ＰＥＧの存在、非存在に関わらず、ヌクレオチドを取り込むことができない。バッファーが１００ｍＭ  ＫＣｌを含む場合、どちらの重合酵素も、＋ＰＥＧと−ＰＥＧの両方におけるピークの存在により示されているように、ＰＥＧの存在、非存在に関わらず、ヌクレオチドを取り込み得る。バッファーが２００ｍＭ  ＫＣｌを含む場合、どちらの重合酵素も、＋ＰＥＧにおけるピークにより示されているように、ＰＥＧの存在下でヌクレオチドを取り込み得るが、ＰＥＧの非存在下ではヌクレオチドを取り込むことができない。
【００７６】
[0098]  場合によっては、シグナルノイズ比は、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋などのポリカチオンにより生じる伝導電流を向上させることができる分子を含むことにより向上し得る。そのような分子は、伝導電流の増加をもたらし得るポリカチオンと会合し得る。伝導電流を向上させ得る分子の非限定的例には、核酸分子のホスホジエステル骨格（例えば、dT3、dT6、dT12など）、カルボキシグルタミン酸（Gla）（例えば、γ−カルボキシグルタミン酸Gla3、Gla6、Gla12など）、特定のペプチド（例えば、配列DIETDIET、FDGDFDGD、及び／又はSTLPLPPを有するペプチド）、又は小分子（例えば、ピリジン、NTA、IDA、又はホスファン）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７７】
[0099]  標的核酸分子は、シーケンシングされ得、及び／又は標的核酸分子の長さが決定され得る。標的核酸分子は、断片化された核酸分子であり得、又は断片化されていない核酸分子であり得る。標的核酸分子は、検出前に増幅され得る。標的核酸分子は、溶液中で及び／又は支持体上で、増幅され得る。支持体上で増幅される標的核酸分子は、増幅前に支持体へ固定化され得る。標的核酸分子は、ブリッジ増幅、ワイルドファイア（wild fire）増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、等温増幅、又は任意の他の増幅技術を用いることにより増幅され得る。標的核酸分子のシーケンシング又はその長さを決定する工程は、センサーアレイに隣接した複数の二本鎖核酸分子を供給することを含み得る。所与の、又は個々の二本鎖核酸分子は、センサーアレイの所与の、又は個々のセンサーに隣接して配置され得る。二本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子を含み得る。第１及び第２の一本鎖核酸分子は、互いとの配列相補性を有し得る。センサーは、二本鎖核酸分子の（例えば、デバイ長以内の）電荷二重層と電気的に連結し得る。第２の一本鎖核酸分子の一部分は、第１の一本鎖核酸分子から遊離されて、第２の一本鎖核酸分子とハイブリダイズしていない第１の一本鎖核酸分子のセグメントを提供し得る。そのセグメントは、個々のヌクレオチドと接触させ得る。個々のヌクレオチドは、第３の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供され得る。第３の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有し得る。核酸取り込み反応中、センサーは、個々のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への取り込みを示すシグナルを検出し、それにより、ハイブリダイズしていないセグメントの配列を決定するために用いられ得る。
【００７８】
[00100]  二本鎖核酸分子は支持体と連結し得る。支持体は、ビーズ、又はセンサーアレイの１つ若しくは複数の表面であり得る。複数の二本鎖核酸分子は、複数のビーズ、又はセンサーアレイの表面上の複数の部位と連結し得る。複数のビーズの各ビーズは、所与のセンサーに隣接して配置され得る。電荷二重層（例えば、デバイ長）は、ビーズの表面に隣接し得る。代替として、又は加えて、複数の二本鎖核酸分子は、センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結し得る。所与の二本鎖核酸分子は、所与のセンサーの表面と連結し得る。電荷二重層（例えば、デバイ長）は、所与のセンサーの表面に隣接し得る。支持体と連結した二本鎖核酸分子は、支持体表面が二本鎖核酸分子のクローン集団と連結しているように、シーケンシング前にクローン的に増幅され得る。
【００７９】
[00101]  所与のセンサーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、若しくは少なくとも４つの電極、又はそれより多い電極を含み得る。一例では、所与のセンサーは、少なくとも２つの電極を含む。別の例では、所与のセンサーは、２つの電極を含む。電極は、プライマー伸長反応が起こる溶液に曝露され得る。代替として、又は加えて、電極は、センサーアレイ内に埋められてもよく、したがって、プライマー伸長反応が起こる溶液に曝露され得ない。所与のセンサーの電極は、個々のヌクレオチドの二本鎖核酸分子への取り込みを示すシグナルを検出し得る。取り込み事象を示すシグナルには、電子二重層におけるインピーダンス、伝導率、又は電荷の変化が挙げられ得る。一例では、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである。個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、定常状態シグナル、一過性シグナル、又は定常状態シグナルと一過性シグナルの組合せであり得る。シグナルは、一過性に、又は定常状態条件中に、検出され得る。一過性シグナル検出様式において、検出は、ヌクレオチド取り込み中、又はそのすぐ後に、起こる。定常状態検出において、センサーの読み取りは、取り込み事象の完了後、起こり得る。シグナルの定常状態変化は、センサーの周りの環境に変化が導入されるまで一定であり得る。
【００８０】
[00102]  図５は、二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。二本鎖核酸鋳型は、ヌクレオチド取り込みによる電荷の変化に対して、線形、実質的に線形、又は半線形応答を生じる均一構造を有し得る。二本鎖核酸は、第１の一本鎖核酸（例えば、シーケンシングされるべき核酸鋳型）の３’末端に隣接したプライミング部位を含み得る。プライマー５０３は、第１の一本鎖核酸分子の３’末端との相補性を有し得、第１の一本鎖核酸分子の３’末端とハイブリダイズし得る。代替として、又は加えて、第２の二本鎖核酸は、プライマー、及び置換され得る鎖（例えば、置換鎖）を提供するためにニックを入れられ得る。第２の一本鎖核酸は、ウラシルヌクレオチドを含み得る。第２の一本鎖核酸分子は、そのウラシルヌクレオチドにニックを入れられ得る。第２の一本鎖核酸分子は、ウラシルを切断する能力がある任意の酵素（例えば、ウラシルDNAグリコシラーゼ）によりニックを入れられ得る。重合酵素５０２は、二本鎖核酸と結合し、プライマー伸長反応を促進し得る。一例では、重合酵素５０２は、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼである。プライマー伸長反応は、第２の一本鎖核酸の末端を置換し、一本鎖フラップ５０５、及び第２の一本鎖核酸分子とハイブリダイズしていない第１の一本鎖核酸分子のセグメントを生じ得る。セグメントは、第２又は第３の一本鎖核酸分子とハイブリダイズしていない第１の一本鎖核酸分子の一部分であり得る。そのセグメントは、第１の一本鎖核酸分子全体を含み得ない。そのセグメントは、長さが単一のヌクレオチドであり得、又は長さが複数のヌクレオチドであり得る。フラップ５０５は、第２の一本鎖核酸分子と連結しているが、第１の一本鎖核酸分子とハイブリダイズしていないヌクレオチドであり得る。フラップ５０５は、重合酵素５０２を、シーケンシング中、スタッター（stutter）して、位相整合をもたらすように誘導し得る。フラップ５０５は、フラップエンドヌクレアーゼ（FEN）５０１により認識及び切断され得る。ＦＥＮ５０１は、耐熱性又は中温性であり得る。耐熱性ＦＥＮは、フラップ５０５の切断後、及びその後の核酸取り込み反応中、その核酸と会合したままであり得る。中温性ＦＥＮは、プライマー伸長反応中、不活性にされ得、各取り込み及び検出のサイクル後に、システムへ補充され得る。フラップは、ヌクレオチド５０４取り込みを示すシグナルを検出した後で、且つ次のヌクレオチドの取り込みの前に、切断され得る。ヌクレオチド５０４の取り込みは、二本鎖核酸分子の負電荷の増加を生じ得る。フラップ５０５を切断することは、二本鎖核酸分子の負電荷の減少を生じ得る。したがって、ヌクレオチドの取り込み、続いて、フラップの切断は、電荷の正味中性の変化を生じ得、その結果として、ほとんど又は全く検出可能なシグナルを生じ得ない。
【００８１】
[00103]  二本鎖核酸の第２の一本鎖核酸は、サブユニットを含み得る。図６は、核酸サブユニット６０１を用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。核酸サブユニット６０１は、核酸サブユニット６０１のライブラリーから選択され得る。核酸サブユニットのライブラリーは、ランダム配列を含み得る。核酸サブユニット６０１は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又はそれより多いヌクレオチドを含み得る。一例では、核酸サブユニット６０１は、少なくとも５個のヌクレオチドを含む。一例では、核酸サブユニット６０１は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。核酸サブユニット６０１は、全て同じ長さであり得、又は長さが様々であり得る。核酸サブユニットのライブラリーは、ＤＮＡサブユニット、ペプチド核酸（PNA）サブユニット、ＲＮＡサブユニット、又はロック核酸（LNA）サブユニットを含み得る。核酸サブユニット６０１と第１の一本鎖核酸（例えば、核酸鋳型分子）の間の会合は、二本鎖核酸分子を生じ、その核酸鋳型を直線化し得る。ヌクレオチド５０４取り込み（例えば、プライマー伸長反応による）は、そのサブユニットを置換し、ハイブリダイズしていない一本鎖核酸鋳型のセグメントを提供し得る。一例では、核酸サブユニットは、荷電されておらず、したがって、核酸サブユニット６０１の置換は、二本鎖核酸分子の電荷状態を変化させない。一例では、核酸サブユニットは、荷電されており、サブユニット６０１の置換は、二本鎖核酸分子の電荷状態を変化させる。核酸サブユニットの使用は、ＦＥＮの使用なしに、二本鎖シーケンシングを促進し得る。
【００８２】
[00104]  個々のヌクレオチドは可逆性ターミネーターを含み得る。可逆性ターミネーターは、次のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への付加を阻止し得る。代替として、又は加えて、可逆性ターミネーターは、追加のヌクレオチドが、第１の一本鎖核酸分子と安定的にハイブリダイズするのを阻止し得る。可逆性ターミネーターは、取り込みサイクル中、ホモポリマーの形成及び／又は１個より多いヌクレオチドの取り込みを低下させ得る。可逆性ターミネーターは、ヌクレオチド五炭糖の３’のヒドロキシル基の酸素原子と連結し得る（例えば、３’−Ｏ−ブロック化可逆性ターミネーター）。代替として、又は加えて、可逆性ターミネーターは、ヌクレオチドの核酸塩基と連結し得る（例えば、３’−非ブロック化可逆性ターミネーター）。可逆性ターミネーターは、検出可能な標識を含み得る。可逆性ターミネーターは、アリル、ヒドロキシルアミン、アセテート、安息香酸、リン酸、アジドメチル、又はアミド基を含み得る。可逆性ターミネーターは、還元剤、酸若しくは塩基、有機溶媒、イオン性界面活性剤、光子（光分解）、又はそれらの任意の組合せでの処理により除去され得る。３’−Ｏ−ブロック化可逆性ターミネーターの可逆性ターミネーターの除去は、ヌクレオチドの五炭糖へヒドロキシル基を戻し、次のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への取り込みを可能にし得る。
【００８３】
[00105]  図７Ａ及び７Ｂは、可逆性ターミネーター７０１を用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。図７Ａは、可逆性ターミネーター及びＦＥＮ５０１を用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。二本鎖核酸の第２の一本鎖核酸は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによりニックを入れられるウラシルヌクレオチドを含み得る。代替として、又は加えて、第２の一本鎖核酸分子は、置換鎖及びプライマーを含み得る。重合酵素５０２は、プライマー５０３と結合し得る。重合酵素は、高い効率及び忠実度での取り込みを可能にする酵素であり得る。重合酵素は、限定なしに、Ｂｓｔポリメラーゼ、逆転写酵素、Ａ型ポリメラーゼ、Ｂ型ポリメラーゼ、又はＣ型ポリメラーゼであり得る。重合酵素は、可逆性ターミネーター７０１を含む個々のヌクレオチドを取り込み得る。ヌクレオチド７０１の取り込みは、フラップを生じ得る。取り込まれたヌクレオチド７０１は、検出され得、検出後、フラップは、ＦＥＮ  ５０１により切断され得る。ＦＥＮ  ５０１は中温性であり得る。中温性ＦＥＮ  ５０１は、取り込まれたヌクレオチドの検出後、フラップと接触させ得、次の取り込みサイクル前に除去し得る。ＦＥＮ  ５０１は、ヌクレオチド取り込みサイクルごとに補充され得る。可逆性ターミネーターは、フラップの切断中又は後に、解除され（reversed）得る。可逆性ターミネーターは、還元剤を溶液へ導入することにより解除され得る。一例では、還元剤はジチオスレイトール（DTT）である。可逆性ターミネーターが解除された後、ヌクレオチド取り込み、検出、フラップの切断、及びターミネーターの解除のサイクルは、第１の一本鎖核酸の一部分又は全体がシーケンシングされるまで、繰り返される。
【００８４】
[00106]  図７Ｂは、可逆性ターミネーター及び核酸サブユニットを用いた二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。第２の一本鎖核酸分子は、ランダムな核酸サブユニットを含み得る。第２の一本鎖核酸分子は、プライマー５０３を追加として含み得る。重合酵素５０２は、プライマーと結合し、個々のヌクレオチド７０１を第３の一本鎖核酸分子へ取り込み得る。個々のヌクレオチドは、核酸サブユニットの一部分又は全体を置換し得る。取り込まれたヌクレオチドは、第３の一本鎖核酸分子への取り込み後、検出され得る。個々のヌクレオチドは可逆性ターミネーターを含み得る。可逆性ターミネーターは、取り込まれたヌクレオチドの検出後、解除され得る。可逆性ターミネーターは、還元剤を溶液へ導入することにより解除され得る。一例では、還元剤はＤＴＴである。可逆性ターミネーターが解除された後、ヌクレオチド取り込み、検出、及びターミネーターの解除のサイクルは、第１の一本鎖核酸の一部分又は全体がシーケンシングされるまで、繰り返され得る。
【００８５】
[00107]  二本鎖核酸分子は、検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は、静電気的部分、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、放射性標識、又はそれらの任意の組合せであり得る。検出可能な標識は、第２の一本鎖核酸分子、第３の一本鎖核酸へ取り込まれるヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せと連結し得る。検出可能な標識は、ヌクレオチドのリン酸、ヌクレオチドの核酸塩基、又はヌクレオチドと連結した可逆性ターミネーターと連結し得る。一例では、検出可能な標識は、ヌクレオチドの核酸塩基と連結している。検出可能な標識は、ヌクレオチドと可逆的に連結し、又は不可逆的に連結し得る。検出可能な標識は、第３の一本鎖核酸分子へのヌクレオチド取り込み、又はヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子からの切断を示すシグナルを生成し得る。検出可能な標識からのシグナルは、センサーアレイにより検出され得る。
【００８６】
[00108]  一例では、各異なる型のヌクレオチドは、異なる検出可能な標識と連結し得る。各型の検出可能な標識は、それが結合しているヌクレオチド塩基を示し得る。例えば、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、及びウラシルのそれぞれが、互いから分解できる異なる検出可能な標識を有し得る。図８は、それぞれが異なる静電気的部分及び可逆性ターミネーター８０１を有するヌクレオチドの例を示す。静電気的部分は、ポリアニオン又はポリカチオン静電気的部分であり得る。１つ又は複数の個々のヌクレオチドは、静電気的部分を有し得ない。１つ又は複数の個々のヌクレオチドはポリカチオン静電気的部分を有し得る。ポリカチオン静電気的部分は、様々な度数の電荷を有し得る。１つ又は複数の個々のヌクレオチドは、ポリアニオン静電気的部分を有し得る。ポリアニオン静電気的部分は、様々な度数の電荷を有し得る。二本鎖核酸分子上の過剰な電荷の存在は、重合酵素の効率を低下させ得る。重合酵素は、検出可能な標識を有するヌクレオチドの高い効率及び忠実度での取り込みを可能にする酵素であり得る。重合酵素は、限定なしに、Ｂｓｔポリメラーゼ、逆転写酵素、Ａ型ポリメラーゼ、Ｂ型ポリメラーゼ、又はＣ型ポリメラーゼであり得る。静電気的部分はヌクレオチドと可逆的に又は不可逆的に連結し得る。ヌクレオチド静電気的部分は、第２の一本鎖核酸分子と、又は第３の一本鎖核酸へ取り込まれる個々のヌクレオチドと連結し得る。一例では、静電気的部分は、第３の一本鎖核酸分子へ取り込まれる個々のヌクレオチドと連結している。個々のヌクレオチドは、二本鎖核酸と、個々に、且つ逐次的に接触するように方向付けられ得（例えば、Aと接触させ、続いてTと、続いてCと、続いてGと、など接触させる）、センサーは、各付加の間にヌクレオチド取り込みを検出し得る。代替として、又は加えて、ヌクレオチドは、二本鎖核酸分子と、同時に接触するように方向付けられ得（例えば、G、A、T、及びCの全部を含む溶液と一度に接触させる）、センサーは、ヌクレオチド取り込み後、電荷の変化を検出し得る。異なる型の個々のヌクレオチドと連結した異なる静電気的部分は、第３の一本鎖核酸分子へ取り込まれた各型の個々のヌクレオチドが、検出され、互いから識別されるのを可能にし得る。個々のヌクレオチドは、取り込みサイクルあたり単一の読み取りを用いて解明され得る。ヌクレオチド取り込みの検出後、検出可能な標識は、ヌクレオチドから切断され得る。切断反応には、還元反応、酸若しくは塩基切断、有機溶媒（例えば、ホルムアミド又は尿素）における切断、イオン性界面活性剤による切断、又はそれらの組合せが挙げられ得る。
【００８７】
[00109]  一例では、各異なる型のヌクレオチドは、同じ検出可能な標識を有し得る。図９は、それぞれが、同じ静電気的部分及び異なる可逆的連結機構を有するヌクレオチドの例を示す。連結機構は、還元反応、酸若しくは塩基切断、有機溶媒における切断、イオン性界面活性剤による切断、又はそれらの組合せにより脱連結又は切断され得る。追加として、静電気的部分が、個々のヌクレオチドと様々な連結機構により連結し得、その連結機構には、共有結合、会合解離相互作用、リガンドと結合ペアの相互作用（例えば、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用）、ハイブリダイゼーション相互作用、又はそれらの任意の組合せが挙げられるが、それらに限定されない。個々のヌクレオチドは、二本鎖核酸と、個々に、且つ逐次的に接触するように方向付けられ得（例えば、Aと接触させ、続いてTと、続いてCと、続いてTと、など接触させる）、センサーは、各付加の間にヌクレオチド取り込みを検出し得る。代替として、又は加えて、ヌクレオチドは、二本鎖核酸と、同時に接触するように方向付けられ得（例えば、A、T、C、及びGの全部の溶液と一度に接触させる）、センサーは、ヌクレオチド取り込み後、電荷の変化を検出し得る。電荷の変化は、核酸標的分子の長さを決定するために用いられ得る。一例では（図９参照）、ヌクレオチドＧ、Ａ、及びＴは全て、条件１により切断される同じポリアニオン静電気的部分を有する。ヌクレオチドＣは、静電気的部分を有し得ない。Ａについての静電気的部分は、条件２下で切断される第２の連結機構をさらに含み得る。Ｔについての静電気的部分は、最初、ヌクレオチド取り込み中には存在し得ないが、第３の連結機構（例えば、ストレプトアビジン−ビオチン）を用いてヌクレオチドと連結し得る。二本鎖核酸分子は、全ての４個のヌクレオチドと一度に接触させ得る。１つ又は複数のヌクレオチドは、センサーアレイに隣接した複数の第３の一本鎖核酸分子へ取り込まれ得る。取り込み反応後、ヌクレオチド取り込みは、読み取られ、又は検出され得る。この例において、ヌクレオチドＧ及びＡは、最初の読み取り（例えば、検出サイクル）中、ポリアニオン静電気的部分を有し得、ＧとＡの両方は、検出可能なシグナルを生成し得る。ヌクレオチドＴ及びＣは、最初、静電気的部分を含み得ないし、検出可能なシグナルも生成し得ない。Ａについての静電気的部分は、そのヌクレオチドを第２の切断条件と接触させることにより除去され得、Ｔは、第３の連結機構を含む静電気的部分（例えば、ストレプトアビジン基）の導入により静電気的部分を獲得し得る。２回目の読み取り（例えば、検出サイクル）が実施され得、ＧとＴの両方が、検出可能なシグナルを生成し得、Ａ及びＣは、検出可能なシグナルを生成し得ない。その後、取り込まれたヌクレオチドは、１回目及び２回目の読み取りからのシグナルを組み合わせ、そのシグナルを対応するヌクレオチドとマッチさせることにより互いから分解及び識別され得る。１回目及び２回目の読み取り後、静電気的部分は、切断条件１を用いて切断され得る。
【００８８】
[00110]  図１０は、静電気的部分及び可逆性ターミネーターを用いたシーケンシングのための方法の例を示す。シーケンシングされるべき核酸鋳型は、核酸取り込み反応（例えば、プライマー伸長反応）に供され得る。取り込まれるヌクレオチドは、切断可能な静電気的部分及び可逆性ターミネーターを有し得る。可逆性ターミネーターは、次のヌクレオチドが、伸長したプライマーへ取り込まれるのを阻止し得る。ヌクレオチドの取り込み後、取り込まれたヌクレオチドは、読み取られ、又は検出され得る。読み取り後、静電気的部分は切断され得、可逆性ターミネーターは除去され得る。静電気的部分は切断され得、ターミネーターは同じ化学作用を用いて除去され得る。化学作用の例には、ジチオスレイトール（DTT）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）などの還元剤での処理が挙げられる。代替として、又は加えて、静電気的部分は切断され得、ターミネーターは異なる切断及び除去化学作用を用いて除去され得る。
【００８９】
[00111]  検出可能な標識は、プライマー伸長反応中に取り込まれるヌクレオチドに連結し得、又は第２の一本鎖核酸分子のヌクレオチドと連結し得る。一例では、第２の一本鎖核酸（例えば、置換鎖）は、１つ又は複数の検出可能な標識を含み得る。図１１Ａ及び１１Ｂは、第２の一本鎖核酸分子と連結した検出可能な標識を用いた、二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。図１１Ａは、フラップエンドヌクレアーゼ５０１により切断される検出可能な標識を用いたシーケンシング方法の例を示す。二本鎖核酸分子の第２の一本鎖核酸分子は、検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は静電気的部分であり得る。第２の一本鎖核酸分子の各ヌクレオチドは、静電気的部分と連結し得る。第２の一本鎖核酸分子における各異なる型のヌクレオチドは、異なる静電気的部分と連結し、又は同じ静電気的部分と連結し得る。重合酵素５０２は、置換鎖の末端に隣接したプライマー５０３と結合し得る。重合酵素５０３は、ヌクレオチド５０４を第３の一本鎖核酸分子へ取り込み得る。取り込まれるヌクレオチドは静電気的部分を有してもいいし、有しなくてもいい。ヌクレオチドの取り込みは、フラップを生じ得る。フラップは、ＦＥＮ  ５０１により切断され得る。ＦＥＮ  ５０１は、耐熱性又は中温性ＦＥＮであり得る。ＦＥＮ  ５０１によるフラップの切断は、置換鎖から静電気的部分を除去し、それにより、二本鎖核酸分子の電荷状態を変化させ得る。電荷状態の変化は、センサーアレイにより検出されて、第１の一本鎖核酸分子の配列を作成し得る。ヌクレオチド取り込み、フラップの切断、及び電荷の変化の検出のサイクルは、第１の一本鎖核酸分子の配列が決定されるまで繰り返され得る。
【００９０】
[00112]  図１１Ｂは、第２の一本鎖核酸分子と連結した検出可能な標識と、可逆性ターミネーターの両方を用いた、二本鎖シーケンシング方法の例を示す。検出可能な標識は静電気的部分であり得る。第２の一本鎖核酸分子の各ヌクレオチドは、静電気的部分と連結し得る。第２の一本鎖核酸分子における各異なる型のヌクレオチドは、異なる静電気的部分と連結し、又は同じ静電気的部分と連結し得る。重合酵素５０２は、置換鎖の末端に隣接したプライマー５０３と結合し得る。重合酵素５０２は、ヌクレオチド７０１を第３の一本鎖核酸分子へ取り込み得る。取り込まれるヌクレオチドは静電気的部分及び可逆性ターミネーターを有してもいいし、有しなくてもいい。フラップは、ＦＥＮにより切断され得る。ＦＥＮは、耐熱性又は中温性であり得る。ＦＥＮによるフラップの切断は、置換鎖から静電気的部分を除去し、それにより、二本鎖核酸分子の電荷状態を変化させ得る。電荷状態の変化は、検出されて、第１の一本鎖核酸分子の配列を作成し得る。ヌクレオチド取り込みを検出した後、その新しく取り込まれたヌクレオチドは、切断反応を受けて、可逆性ターミネーターを除去し得る。可逆性ターミネーターの除去は、次のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への取り込みを可能にし得る。ヌクレオチド取り込み、生じたフラップの切断、電荷の変化の検出、及び可逆性ターミネーターの除去のサイクルは、第１の一本鎖核酸分子の配列が決定されるまで繰り返され得る。方法は、ヌクレオチド取り込み及び検出の１、２、３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００回以上の、又はそれより多いサイクルを実施する工程を含み得る。ヌクレオチド取り込み及び検出は、一定サイクル数、行われ得、又はプライマー伸長反応が完了するまで行われ得る。
【００９１】
[00113]  検出可能な標識は、第３の一本鎖核酸分子へ取り込まれる個々のヌクレオチドと連結し得る。図１２Ａは、静電気的部分と連結した個々のヌクレオチド１２０１及び中温性ＦＥＮ  ５０１を用いた、二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。重合酵素は、第２の一本鎖核酸分子のプライマーと結合して、個々のヌクレオチド１２０１の取り込みを促進し得る。個々のヌクレオチド１２０１は、そのヌクレオチドの核酸塩基と結合した静電気的部分を含み得る。個々のヌクレオチドの取り込みはフラップを生じ得る。フラップはＦＥＮにより切断され得る。ＦＥＮは、中温性ＦＥＮであり得、各取り込みサイクル後、再生され得る。フラップは、ヌクレオチド取り込み事象の検出後、切断され得る。静電気的部分はヌクレオチドと可逆的に連結し得る。静電気的部分は、フラップの切断と同時に、又はその後に切断され得る。ヌクレオチド取り込み、ヌクレオチド取り込みの検出、生じたフラップの切断、及び静電気的部分の切断のサイクルは、第１の一本鎖核酸分子の少なくとも一部分の配列が決定されるまで繰り返され得る。
【００９２】
[00114]  図１２Ｂは、静電気的部分及び耐熱性ＦＥＮを用いた、二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。重合酵素５０２は、第２の一本鎖核酸分子のプライマー５０３と結合して、個々のヌクレオチド１２０１の取り込みを促進し得る。個々のヌクレオチド１２０１は、そのヌクレオチドの核酸塩基と結合した静電気的部分を含み得る。個々のヌクレオチドの取り込みはフラップを生じ得る。フラップはＦＥＮ  ５０１により切断され得る。ＦＥＮ  ５０１は、耐熱性ＦＥＮであり得、フラップの切断後、二本鎖核酸分子と会合したままであり得る。耐熱性ＦＥＮは、各取り込みサイクル後、再生され得ない。フラップは、ヌクレオチド取り込み事象の検出前に、切断され得る。静電気的部分はヌクレオチドと可逆的に連結し得、ヌクレオチド取り込み事象の検出後、切断され得る。ヌクレオチド取り込み、生じたフラップの切断、ヌクレオチド取り込みの検出、及び静電気的部分の除去のサイクルは、第１の一本鎖核酸分子の少なくとも一部分の配列が決定されるまで繰り返され得る。
【００９３】
[00115]  個々のヌクレオチドは、検出可能な標識と可逆性ターミネーターの両方を含み得る。図１３Ａは、静電気的部分、可逆性ターミネーター、及び中温性ＦＥＮを用いた、二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。重合酵素５０２は、第２の一本鎖核酸分子のプライマー５０３と結合して、個々のヌクレオチド１３０１の取り込みを促進し得る。個々のヌクレオチド１３０１は、そのヌクレオチドの核酸塩基と結合した静電気的部分、及びその五炭糖の３’側と結合した可逆性ターミネーターを含み得る。可逆性ターミネーターは、サイクルあたりのホモポリマー形成及び／又は複数のヌクレオチドの取り込みを低下させ得る。個々のヌクレオチドの取り込みはフラップを生じ得る。フラップはＦＥＮ  ５０１により切断され得る。ＦＥＮ  ５０１は、中温性ＦＥＮであり得、各取り込みサイクル後、再生され得る。フラップは、ヌクレオチド取り込み事象の検出後、切断され得る。静電気的部分はヌクレオチドと可逆的に連結し得る。静電気的部分は、フラップの切断と同時に、又はその後に切断され得る。可逆性ターミネーターは、静電気的部分の切断の前、それと同時に、又はその後に、解除され得る。一例では、ＤＴＴ又はＴＣＥＰなどの還元剤により、静電気的部分は切断され、可逆性ターミネーターは解除される。ヌクレオチド取り込み、ヌクレオチド取り込みの検出、生じたフラップの切断、静電気的部分の切断、及び可逆性ターミネーターの解除のサイクルは、第１の一本鎖核酸分子の少なくとも一部分の配列が決定されるまで繰り返され得る。方法は、ヌクレオチド取り込み及び検出の１、２、３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００回以上の、又はそれより多いサイクルを実施する工程を含み得る。ヌクレオチド取り込み及び検出は、一定サイクル数、行われ得、又はプライマー伸長反応が完了するまで行われ得る。
【００９４】
[00116]  図１３Ｂは、静電気的部分、耐熱性ＦＥＮ、及び可逆性ターミネーターを用いた、二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。重合酵素５０２は、第２の一本鎖核酸分子のプライマー５０３と結合して、個々のヌクレオチド１３０１の取り込みを促進し得る。個々のヌクレオチド１３０１は、そのヌクレオチドの核酸塩基と結合した静電気的部分、及び３’側の可逆性ターミネーターを含み得る。可逆性ターミネーターは、サイクルあたりのホモポリマー形成及び／又は複数のヌクレオチドの取り込みを低下させ得る。個々のヌクレオチドの取り込みはフラップを生じ得る。フラップはＦＥＮ  ５０１により切断され得る。ＦＥＮ  ５０１は、耐熱性ＦＥＮであり得、フラップの切断後、二本鎖核酸分子と会合したままであり得る。耐熱性ＦＥＮは、各取り込みサイクル後、再生され得ない。フラップは、ヌクレオチド取り込み事象の検出前に切断され得る。静電気的部分は可逆的に連結し得、ヌクレオチド取り込み事象の検出後に切断され得る。可逆性ターミネーターは、静電気的部分の切断と同時に、又は静電気的部分の切断の後に、解除され得る。一例では、ＤＴＴ又はＴＣＥＰなどの還元剤により、静電気的部分は切断され、可逆性ターミネーターは解除される。ヌクレオチド取り込み、生じたフラップの切断、ヌクレオチド取り込みの検出、静電気的部分の切断、及び可逆性ターミネーターの除去のサイクルは、第１の一本鎖核酸分子の少なくとも一部分の配列が決定されるまで繰り返され得る。方法は、ヌクレオチド取り込み及び検出の１、２、３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００回以上の、又はそれより多いサイクルを実施する工程を含み得る。ヌクレオチド取り込み及び検出は、一定サイクル数、行われ得、又はプライマー伸長反応が完了するまで行われ得る。
【００９５】
[00117]  図１４Ａは、検出可能な標識及び核酸サブユニットを用いた、二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。検出可能な標識は静電気的部分であり得る。検出可能な標識は、個々のヌクレオチドと可逆的に連結し得る。第２の一本鎖核酸は、ランダムな核酸サブユニット及びプライマー５０３を含み得る。重合酵素５０２は、プライマー５０３と結合し得る。重合酵素５０２は、静電気的部分を有する個々のヌクレオチドを第３の一本鎖核酸分子へ取り込み得る。個々のヌクレオチド１２０１の取り込みは、ランダムな核酸サブユニットの一部分又は全体を置換し得る。センサーアレイは、個々のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への取り込み後、取り込み事象を示すシグナルを検出し得る。取り込み事象の検出後、可逆性静電気的部分は切断され得る。一例では、可逆性静電気的部分は、ＤＴＴ又はＴＣＥＰなどの還元剤で切断される。ヌクレオチド取り込み、核酸サブユニット置換、個々のヌクレオチド検出、及び静電気的部分の切断のサイクルは、第１の一本鎖核酸分子の少なくとも一部分の配列が決定されるまで繰り返され得る。方法は、ヌクレオチド取り込み及び検出の１、２、３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００回以上の、又はそれより多いサイクルを実施する工程を含み得る。ヌクレオチド取り込み及び検出は、一定サイクル数、行われ得、又はプライマー伸長反応が完了するまで行われ得る。
【００９６】
[00118]  図１４Ｂは、検出可能な標識、核酸サブユニット、及び可逆性ターミネーターを用いた、二本鎖シーケンシングのための方法の例を示す。検出可能な標識は静電気的部分であり得る。検出可能な標識は、個々のヌクレオチド１３０１と可逆的に連結し得る。個々のヌクレオチドは、３’側に可逆性ターミネーターを含み得る。第２の一本鎖核酸は、ランダムな核酸サブユニット及びプライマー５０３を含み得る。重合酵素５０２は、プライマー５０３と結合し得る。重合酵素５０２は、静電気的部分及び可逆性ターミネーターを有する個々のヌクレオチド１３０１を第３の一本鎖核酸分子へ取り込み得る。個々のヌクレオチドの取り込みは、ランダムな核酸サブユニットの一部分又は全体を置換し得る。センサーアレイは、個々のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への取り込み後、取り込み事象を示すシグナルを検出し得る。取り込み事象の検出後、可逆性静電気的部分は切断され得る。可逆性ターミネーターは、静電気的部分の切断と同時に、又はそれに続いて、除去され得る。一例では、ＤＴＴ又はＴＣＥＰなどの還元剤で、可逆性静電気的部分及び可逆性ターミネーターは同時に切断される。ヌクレオチド取り込み、核酸サブユニット置換、個々のヌクレオチド検出、静電気的部分の切断、及び可逆性ターミネーターの除去のサイクルは、第１の一本鎖核酸分子の少なくとも一部分の配列が決定されるまで繰り返され得る。方法は、ヌクレオチド取り込み及び検出の１、２、３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００回以上の、又はそれより多いサイクルを実施する工程を含み得る。ヌクレオチド取り込み及び検出は、一定サイクル数、行われ得、又はプライマー伸長反応が完了するまで行われ得る。
【００９７】
[00119]  標的核酸分子は、シーケンシングされ得、及び／又は標的核酸分子の長さが決定され得る。標的核酸分子は、断片化された核酸分子であり得、又は断片化されていない核酸分子であり得る。標的核酸分子は、検出前に増幅され得る。標的核酸分子は、溶液中及び／又は支持体上で増幅され得る。支持体上で増幅される標的核酸分子は、増幅前に支持体へ固定化され得る。標的核酸分子は、ブリッジ増幅、ワイルドファイア増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、等温増幅、又は任意の他の増幅技術を用いることにより増幅され得る。標的核酸分子のシーケンシング又はその長さを決定する工程は、センサーアレイに隣接した複数の一本鎖核酸分子を供給することを含み得る。複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子は、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され得る。所与のセンサーは、第１の一本鎖核酸分子を含有する（例えば、デバイ長以内の）電荷二重層と電気的に連結し得る。第１の一本鎖核酸分子を、個々のヌクレオチドと接触させて、第１の一本鎖核酸分子を核酸取り込み反応に供し得る。核酸取り込み反応（例えば、プライマー伸長反応）は、個々のヌクレオチドから第２の一本鎖核酸分子を生成し得る。第２の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有し得る。個々のヌクレオチドの少なくともサブセットは、検出可能な標識を含み得る。センサーアレイの所与のセンサーは、核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、個々のヌクレオチドの取り込みを示す検出可能な標識からのシグナルを検出するために用いられ得る。検出されたシグナルは、第１の一本鎖核酸分子の配列を決定するために用いられ得る。
【００９８】
[00120]  複数の一本鎖核酸分子は、複数の支持体と連結し得る。複数の支持体は、複数のビーズ、又はセンサーアレイ上の複数の表面であり得る。一例では、複数の一本鎖核酸分子は複数のビーズと連結し得、所与の一本鎖核酸分子は、所与のビーズと連結し得る。電荷二重層は、所与のビーズの表面に隣接し得る。一本鎖核酸分子は、ビーズの表面上で増幅され得る。増幅産物は、ビーズの表面と連結し得る。増幅産物は、ビーズの表面上に一本鎖核酸分子のクローンコロニーを形成し得る。一本鎖核酸分子のクローンコロニーはシーケンシングされ得る。
【００９９】
[00121]  一例では、複数の一本鎖核酸分子は、センサーアレイ上の複数の表面と連結し得、所与の一本鎖核酸分子は、所与のセンサーの表面と連結している。電荷二重層は、所与のセンサーの表面に隣接し得る。一本鎖核酸分子はセンサーの表面上で増幅され得る。増幅産物は、センサーの表面と連結し得る。増幅産物は、センサーの表面の一本鎖核酸分子のクローンコロニーを形成し得る。一本鎖核酸分子のクローンコロニーはシーケンシングされ得る。
【０１００】
[00122]  センサーアレイの所与のセンサーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又はそれより多い電極を含み得る。一例では、所与のセンサーは、少なくとも２つの電極を含む。別の例では、所与のセンサーは、２つの電極を含む。電極は、プライマー伸長反応が起こる溶液に曝露され得る。代替として、又は加えて、電極は、センサーアレイ内に埋められてもよく、したがって、プライマー伸長反応が起こる溶液に曝露され得ない。センサーは、ヌクレオチド取り込み事象を示すシグナルを検出し得る。センサーは、個々のヌクレオチドと連結した検出可能な標識を検出し得る。センサーは、検出可能な標識を一過性又は定常状態条件中に検出し得る。ヌクレオチド取り込みは、定常状態条件中、取り込みサイクルあたり、１回、２回、３回、４回、又は４回より多く検出され得る。一例では、ヌクレオチド取り込みは、定常状態条件中に取り込みサイクルあたり少なくとも２回検出され得る。センサーアレイは、電気的シグナルを一過性又は定常状態条件中に、検出し得る。電気的シグナルには、分子の電荷状態の変化、周囲の溶液の伝導率の変化、インピーダンスシグナル、又はインピーダンスシグナルの変化が挙げられ得るが、それらに限定されない。センサーは、電荷及び／若しくは伝導率の変化、又はインピーダンスの変化を検出し得る。センサーは、センサー、支持体、又は核酸分子（例えば、試料）の電荷二重層（例えば、デバイ長）内の電荷及び／若しくは伝導率又はインピーダンスの変化を検出し得る。個々のヌクレオチドと連結した検出可能な標識は、一本鎖核酸分子を囲む電気的環境を変化させ得、所与のセンサーは、その電気的変化を検出し得る。
【０１０１】
[00123]  第２の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子に隣接したプライミング部位を含み得る。プライミング部位は、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有するプライマーであり得る。第２の一本鎖核酸分子は、そのプライマーから始まるプライマー伸長反応により生成され得る。一例では、プライマーは自己プライミングループである。自己プライミングループは、プライマー伸長反応中、ループになった立体配置の構造をとり得る。個々のヌクレオチドの取り込みの後、自己プライミングループの構造は、ほどかれて、直鎖状核酸分子を形成し得る。個々のヌクレオチドの取り込みは、ほどけた非構造化状態中に検出され得る。自己プライミングループは、反応温度を上昇させること、溶液ｐＨを変化させること、溶液イオン強度を変化させること、ホルムアミドを溶液へ導入することにより、又は核酸構造を変性させる任意の他の方法により、ほどかれ得る。
【０１０２】
[00124]  異なる型の個々のヌクレオチドは、一本鎖核酸分子と逐次的に（例えば、１回に単一ヌクレオチド）接触させ得る。ヌクレオチド取り込みを示すシグナルは、各型の個々のヌクレオチドが一本鎖核酸分子と接触した後に検出され得る。一例では、一本鎖核酸分子を、Ａヌクレオチドと接触させ、続いて、ヌクレオチドの取り込みを示すシグナルを検出し得る。その後、一本鎖ヌクレオチドを、Ｔヌクレオチドと接触させ、続いて、シグナルを検出し得る。その後、一本鎖ヌクレオチドをＧヌクレオチドと接触させ、続いて、シグナルを検出し得る。一本鎖ヌクレオチドをＣヌクレオチドと接触させ、続いて、シグナルを検出し得る。このサイクルは、一本鎖核酸分子の配列の全体又は一部分が決定されるまで繰り返され得る。方法は、ヌクレオチド取り込み及び検出の１、２、３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００回以上の、又はそれより多いサイクルを実施することを含み得る。
【０１０３】
[00125]  一本鎖核酸分子は、異なる型のヌクレオチドと同時に接触させ得る。例えば、一本鎖核酸分子は、全てのＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧと一度に接触させ得る。代替として、又は加えて、一本鎖核酸分子は、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの任意の組合せと一度に接触させ得る。例えば、一本鎖核酸分子は、ＡとＴ、ＣとＧ、ＡとＣ、ＡとＧ、ＴとＣ、又はＴとＧと一度に接触させ得る。一例では、一本鎖核酸分子を、全てのＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧと同時に接触させ、続いて、その核酸分子の配列長又は配列を決定するためにシグナルを検出する。このサイクルは、一本鎖核酸分子の配列の全部又は一部分が決定されるまで繰り返され得る。
【０１０４】
[00126]  個々のヌクレオチドは検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は、個々のヌクレオチドと可逆的に又は不可逆的に連結し得る。検出可能な標識は、個々のヌクレオチドの核酸塩基と連結し得る。個々のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み得る。一例では、検出可能な標識は静電気的部分であり得る。各異なる型の個々のヌクレオチドは、同じ、すなわち、単一の型の検出可能な標識と連結し得る。各異なる型の個々のヌクレオチドは、同じ型の検出可能な標識と、異なる連結機構により連結し得る。検出可能な標識は、個々のヌクレオチドと、選択的に連結し、又はそれから切断され得る。例えば、個々のヌクレオチドは、一本鎖核酸分子と接触した時、検出可能な標識を含み得る。取り込み後、個々のヌクレオチドのシグナルは、検出され、正のシグナルを生成し得る（例えば、シグナルが検出される）。検出可能な標識は、所与の切断条件下で除去され得る。検出可能な標識の除去後、取り込まれたヌクレオチドは、ゼロのシグナルを生成し得る（例えば、シグナルが検出されない）。一例では、二重読み取りシーケンシングアプローチを用いて（図９参照）、個々のヌクレオチドは、正／ゼロのシグナル、正／正のシグナル、ゼロ／ゼロのシグナル、又はゼロ／正のシグナルを生じ得る。一例では、一本鎖核酸分子は、４つの異なる型のヌクレオチドと同時に接触させ得、重合酵素はヌクレオチド取り込みを促進し得る。ヌクレオチドのそれぞれは、同じ、又は異なる検出可能な標識を有し得る。一例では、各型のヌクレオチドは、異なる検出可能な標識を有し、核酸分子の配列が検出される。別の例では、各型のヌクレオチドは同じ検出可能な標識を有し、核酸分子の長さが検出される。ヌクレオチド取り込み後、ヌクレオチド取り込みを示すシグナルが測定され得る。取り込まれたヌクレオチドは、様々な正及びゼロのシグナルを生成し得る。一本鎖核酸分子は、切断及び／又は連結条件で処理され得る。切断及び／又は連結条件での処理後、ヌクレオチド取り込みを示すシグナルは、再び、測定され得る。取り込まれたヌクレオチドは、様々な正及びゼロのシグナルを生成し得る。正及びゼロのシグナルのパターンは、どの型のヌクレオチドが第２の一本鎖核酸分子へ取り込まれたかを決定するために用いられ得る。２回目の検出サイクル後、静電気的部分は、第２の切断条件を用いて除去され得る。
【０１０５】
[00127]  一例では、各異なる個々のヌクレオチドは、異なる検出可能な標識と連結し得る。検出可能な標識は、静電気的部分であり得る。静電気的部分には、ポリアニオン、ポリカチオン、又は中性静電気的部分が挙げられ得る。一本鎖核酸分子は、異なるヌクレオチドと逐次的に又は同時に接触させ得る。一例では、一本鎖核酸分子は、異なる個々のヌクレオチドと同時に接触させ得、その異なる個々のヌクレオチドの各個々のヌクレオチドは、異なる静電気的部分と連結し得る。重合酵素は、個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込みを促進し得る。個々のヌクレオチドの取り込み後、センサーアレイは、個々のヌクレオチド取り込みを示すシグナルを検出し得る。異なる個々のヌクレオチドは、それらが連結している静電気的部分に対する、異なる荷電基を表すシグナル及び電荷の異なる大きさを表すシグナルを生成し得る。検出可能な標識は、シグナル検出後、除去され得る。
【０１０６】
[00128]  個々のヌクレオチドは、可逆性ターミネーター、検出可能な標識、及び可逆性ターミネーターと検出可能な標識の両方を含み得る。可逆性ターミネーターは、個々のヌクレオチドの３’側に連結し得る。可逆性ターミネーターは、追加のヌクレオチドが、第１の一本鎖核酸分子と安定的にハイブリダイズするのを阻止し得る。可逆性ターミネーターは、ヌクレオチド取り込みを示すシグナルの検出後、除去され得る。可逆性ターミネーターの除去は、次のヌクレオチドの取り込みを可能にし得る。一例では、一本鎖核酸分子は、異なる検出可能な部分及び可逆性ターミネーターを含む異なる個々のヌクレオチドと、同時に接触させ得る。重合酵素は、単一の個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込みを促進し得る。センサーは、ヌクレオチド取り込みを示すシグナルを検出し得る。シグナル検出後、検出可能な標識及び可逆性ターミネーターは、同時又は逐次的に除去され得る。このサイクルは、第１の一本鎖核酸分子の全部又は一部の配列が決定されるまで繰り返され得る。
【０１０７】
[00129]  検出可能な標識の切断は、切断後、個々のヌクレオチド上に傷跡（scar）を残し得る。傷跡は、標識の切断中、完全には除去されない検出可能な標識の一部分を含み得る。一例では、傷跡は、重合酵素の効率を低下させ得る。一例では、傷跡は、重合酵素を阻害し得る。加ピロリン酸分解媒介性ターミネーター交換（PMTE）シーケンシングは、シーケンシング中、傷跡の集積の量を低下させ得る。
【０１０８】
[00130]  標的核酸分子はシーケンシングされ得、及び／又は標的核酸分子の長さが決定され得る。標的核酸分子は、断片化された核酸分子であり得、又は断片化されていない核酸分子であり得る。標的核酸分子は、検出前に増幅され得る。標的核酸分子は、溶液中及び／又は支持体上で増幅され得る。支持体上で増幅される標的核酸分子は、増幅前に支持体へ固定化され得る。標的核酸分子は、ブリッジ増幅、ワイルドファイア増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、等温増幅、又は任意の他の増幅技術を用いることにより増幅され得る。標的核酸分子のシーケンシング又はそれの長さを決定する工程は、センサーアレイに隣接した複数の一本鎖核酸分子を供給することを含み得る。複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子は、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され得る。第１の一本鎖核酸分子を、核酸取り込み反応に供して、第２の一本鎖核酸分子を生成させ得る。核酸取り込み反応は、検出可能な標識を含む第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込むこと、及び、その後、検出可能な標識を含まない第２の複数の個々のヌクレオチドを取り込むことを、交互に且つ逐次的に、含み得る。核酸取り込み反応は、検出可能な標識を含む第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込むこと、及び、検出可能な標識を含まない第２の複数の個々のヌクレオチドの個々のヌクレオチドと第１の複数の個々のヌクレオチドを交換すること（例えば、第１のヌクレオチドの除去）を、交互に且つ逐次的に、含み得る。第１の複数のヌクレオチドは、成長する核酸鎖へ共有結合性に取り込まれ得、又は成長する核酸鎖と一過性に結合（例えば、非共有結合性に結合）し得る。第２の複数の個々のヌクレオチドは、検出可能な標識を含み得ない。所与のセンサーは、核酸取り込み反応を行う間、又はその後に、検出可能な標識からのシグナルを検出し得る。検出されるシグナルは、検出可能な標識から生成し得、第１の複数の個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込みを示し得、それにより、第１の一本鎖核酸分子の配列を決定し得る。
【０１０９】
[00131]  複数の一本鎖核酸分子は、複数の支持体と連結し得る。複数の支持体は複数のビーズであり得る。一例では、複数の一本鎖核酸分子は複数のビーズと連結し得、所与の一本鎖核酸分子は所与のビーズと連結し得る。所与のセンサーは、第１の一本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結し得る。電荷二重層は、所与のビーズの表面に隣接し得る。一本鎖核酸分子は、ビーズの表面上で増幅され得る。増幅産物は、ビーズの表面と連結し得る。増幅産物は、ビーズの表面上に、一本鎖核酸分子のクローンコロニーを形成し得る。一本鎖核酸分子のクローンコロニーがシーケンシングされ得る。
【０１１０】
[00132]  一例では、複数の一本鎖核酸分子は、センサーアレイ上の複数の表面と連結し得、所与の一本鎖核酸分子は、所与のセンサーの表面と連結している。所与のセンサーは、第１の一本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結し得る。電荷二重層は、所与のセンサーの表面に隣接し得る。一本鎖核酸分子は、センサーの表面上で増幅され得る。増幅産物は、センサーの表面と連結し得る。増幅産物は、センサーの表面上に、一本鎖核酸分子のクローンコロニーを形成し得る。一本鎖核酸分子のクローンコロニーはシーケンシングされ得、及び／又は一本鎖核酸の長さが決定され得る。
【０１１１】
[00133]  センサーアレイの所与のセンサーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又はそれより多い電極を含み得る。一例では、所与のセンサーは、少なくとも２つの電極を含む。別の例では、所与のセンサーは、２つの電極を含む。電極は、プライマー伸長反応が起こる溶液に曝露され得る。代替として、又は加えて、電極は、センサーアレイ内に埋められてもよく、したがって、プライマー伸長反応が起こる溶液に曝露され得ない。センサーは、ヌクレオチド取り込み事象を示すシグナルを検出し得る。センサーは、個々のヌクレオチドと連結した検出可能な標識を検出し得る。センサーは、検出可能な標識を一過性又は定常状態条件中に検出し得る。ヌクレオチド取り込みは、定常状態条件中、取り込みサイクルあたり、１回、２回、３回、４回、又は４回より多く検出され得る。一例では、ヌクレオチド取り込みは、定常状態条件中に取り込みサイクルあたり少なくとも２回検出され得る。センサーアレイは、電気的シグナルを一過性又は定常状態条件中に、検出し得る。電気的シグナルには、分子の電荷状態の変化、周囲の溶液の伝導率の変化、インピーダンスシグナル、又はインピーダンスシグナルの変化が挙げられ得るが、それらに限定されない。センサーは、電荷及び／若しくは伝導率の変化、又はインピーダンスの変化を検出し得る。センサーは、センサー、支持体、又は核酸分子（例えば、試料）の電荷二重層（例えば、デバイ長）内の電荷及び／若しくは伝導率又はインピーダンスの変化を検出し得る。個々のヌクレオチドと連結した検出可能な標識は、一本鎖核酸分子を囲む電気的環境を変化させ得、所与のセンサーは、その電気的変化を検出し得る。
【０１１２】
[00134]  第２の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子に隣接したプライミング部位を含み得る。プライミング部位は、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有するプライマーであり得る。第２の一本鎖核酸分子は、そのプライマーから始まるプライマー伸長反応により生成され得る。一例では、プライマーは自己プライミングループである。自己プライミングループは、プライマー伸長反応中、ループになった立体配置の構造をとり得る。個々のヌクレオチドの取り込みの後、自己プライミングループの構造は、ほどかれて、直鎖状核酸分子を形成し得る。個々のヌクレオチドの取り込みは、ほどけた非構造化状態中に検出され得る。自己プライミングループは、反応温度を上昇させること、溶液ｐＨを変化させること、溶液イオン強度を変化させること、ホルムアミドを溶液へ導入することにより、又は核酸構造を変性させる任意の他の方法により、ほどかれ得る。
【０１１３】
[00135]  第１の複数のヌクレオチドは、追加のヌクレオチドが第１の一本鎖核酸分子と安定的にハイブリダイズすることを阻止するターミネーターを含み得る。ターミネーターは、可逆性ターミネーター又は不可逆性ターミネーターであり得る。一例では、ターミネーターは不可逆性ターミネーターである。ターミネーターは、取り込みサイクルあたりのホモポリマーの発生及び／又は複数の個々のヌクレオチドの取り込みを低下させ得る。第１の複数の個々のヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）又は３−フルオロデオキシヌクレオチドを含み得る。ｄｄＮＴＰは、鎖延長阻害剤であり得る。第１の複数のヌクレオチドは、検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は、ヌクレオチド取り込みの検出後、除去されなくてもよい。検出可能な標識は、静電気的部分、蛍光標識、化学発光標識、比色標識、放射性標識、又は任意の他の検出可能な標識であり得る。一例では、検出可能な標識は静電気的部分であり得る。検出可能な標識は、第１の複数のヌクレオチドの核酸塩基と連結し得る。
【０１１４】
[00136]  第１の複数のヌクレオチドは、異なる型のヌクレオチドを含み得る。一例では、異なる型のヌクレオチドは、異なる型の検出可能な標識と連結し得る。各個々の型のヌクレオチドは、個々の型の検出可能な標識と連結し得る。第１の一本鎖核酸分子は、全ての異なる型のヌクレオチドと同時に接触させ得る。その後、センサーアレイは、異なる個々のヌクレオチドと連結した異なる検出可能な静電気的部分を検出し得る。代替として、又は加えて、各型のヌクレオチドは、同じ検出可能な標識を有し得、センサーは、異なるヌクレオチドを分解することなく、ヌクレオチドの付加を検出し得る（例えば、配列長を決定する）。この例では、取り込みサイクルあたり、単一の読み取りが用いられ得る。一例では、各型の個々のヌクレオチドは、同じ検出可能な標識と連結し得る。第１の一本鎖核酸分子を、各型のヌクレオチドと逐次的に接触させ得る（例えば、１つの型のヌクレオチドと接触させ、続いて、別の型のヌクレオチドと接触させる）。１つの型のヌクレオチドの取り込み後、センサーアレイは、ヌクレオチド取り込みを示すシグナルを検出し得る。その後、第１の一本鎖核酸分子は、異なる型のヌクレオチドと接触させ得る。検出可能な標識は、第１の複数のヌクレオチドから切断され得ない（例えば、検出可能な標識は不可逆性であり得る）。
【０１１５】
[00137]  第１の複数の個々のヌクレオチドは、第２の複数の個々のヌクレオチドと交換され得る。交換反応は、過剰のピロリン酸塩、三リン酸塩、又は四リン酸塩を用いて、重合反応を逆に駆動させることにより達成され得る。第２の複数の個々のヌクレオチドは、検出可能な標識を含まなくてよい。第１の複数の個々のヌクレオチドを第２の複数の個々のヌクレオチドと交換することは、傷跡の形成を低下させ得る。第２の複数の個々のヌクレオチドは、可逆性ターミネーターを含み得る。可逆性ターミネーターは、還元剤との接触により、溶液ｐＨを変化させることにより、溶液イオン強度を変化させることにより、イオン性界面活性剤との接触により、又は任意の他のターミネーター除去方法により、解除され得る。
【０１１６】
[00138]  図１５は、ＰＭＴＥシーケンシング方法の例を示す。第１の一本鎖核酸分子は、ビーズと連結し得る。第１の一本鎖核酸分子は、プライミング部位を有し得る。プライミング部位は、第１の一本鎖核酸分子の一部分と相補的であり得る。第１の一本鎖核酸分子は、第１の複数の個々のヌクレオチド１５０１と接触させ得る。第１の複数の個々のヌクレオチド１５０１は、単一の型のヌクレオチドを含み得る。第１の複数の個々のヌクレオチド１５０１は、不可逆性ターミネーター及び不可逆性検出可能な静電気的部分を含み得る。不可逆性検出可能な静電気的部分は、各異なる型のヌクレオチドについて同じであり得る。重合酵素５０２は、第１の個々のヌクレオチド１５０１の第２の一本鎖核酸分子への取り込みを促進し得る。所与のセンサーは、検出可能な標識の存在又は非存在によりヌクレオチド取り込みの存在又は非存在を検出し得る。その後、第１の複数の個々のヌクレオチド１５０１は、第２の複数の個々のヌクレオチド７０１と交換され得る。第２の複数の個々のヌクレオチド７０１は、第１の複数の１５０１と同じ型のヌクレオチドであり得る。第２の複数の個々のヌクレオチド７０１は、検出可能な標識を有し得ず、可逆性ターミネーターを有し得る。第２の複数の個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込み後、可逆性ターミネーターは除去又は解除され得る。ターミネーターは、還元剤により解除され得る。このサイクルは、第１の一本鎖核酸分子の全部又は一部の配列が決定されるまで繰り返され得る。方法は、ヌクレオチド取り込み及び検出の１、２、３、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００回以上の、又はそれより多いサイクルを実施する工程を含み得る。
【０１１７】
[00139]  一例では（図１５参照）、第１の一本鎖核酸分子はビーズと連結し得る。第１の一本鎖核酸分子は、プライマー５０２と連結したプライミング部位を有し得る。プライミング部位は、第１の一本鎖核酸分子の一部分と相補的であり得る。第１の一本鎖核酸分子は、第１の複数の個々のヌクレオチドと接触させ得る。第１の複数の個々のヌクレオチド１５０１は、複数の異なる型のヌクレオチドを含み得る。第１の複数の個々のヌクレオチド１５０１は、不可逆性ターミネーター及び不可逆性の検出可能な静電気的部分を含み得る。不可逆性の検出可能な静電気的部分は、個々のヌクレオチドの型ごとに異なり得る。重合酵素５０２は、第１の個々のヌクレオチド１５０１の第２の一本鎖核酸分子への取り込みを促進し得る。所与のセンサーは、第２の一本鎖核酸分子へ取り込まれたヌクレオチドの型を、センサーに存在する検出可能な標識の型によって検出し得る。その後、第１の複数の個々のヌクレオチド１５０１は、第２の複数の個々のヌクレオチド７０１と交換され得る。第２の複数の個々のヌクレオチド７０１は、第１の複数と同じ型のヌクレオチドを含み得る。第２の複数の個々のヌクレオチド７０１は、検出可能な標識を有さず、可逆性ターミネーターを有し得る。第２の複数の個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込み後、可逆性ターミネーターは除去又は解除され得る。ターミネーターは、還元剤により解除され得る。このサイクルは、第１の一本鎖核酸分子の全部又は一部の配列が決定されるまで繰り返され得る。
【０１１８】
[00140]  上記のＰＭＴＥシーケンシングアプローチは、二本鎖シーケンシング方法と組み合わせて用いられ得る。例えば、第１及び第２の一本鎖核酸分子を含む二本鎖核酸分子は、重合酵素と接触させ得る。重合酵素は、不可逆性ターミネーター及び検出可能な標識を含む個々のヌクレオチドを第３の一本鎖核酸分子へ取り込ませ得る。個々のヌクレオチドの取り込みは、フラップを生じ得る。フラップは、個々のヌクレオチド取り込みの検出の前又は後に切断され得る。二本鎖核酸分子は、異なる型の個々のヌクレオチドと、同時に又は逐次的に接触させ得る。異なる型の個々のヌクレオチドは、同じ又は異なる検出可能な標識を含み得る。個々のヌクレオチドの取り込み後、取り込み事象がセンサーアレイにより検出され得る。検出後、検出可能な標識及び不可逆性ターミネーターを含む個々のヌクレオチドは、可逆性ターミネーターを含む個々のヌクレオチドと交換され得る。その後、可逆性ターミネーターは、次の個々のヌクレオチドの取り込みを可能にするために解除され得る。
【０１１９】
[00141]  方法は、位相誤差をモニターし、及び／又は修正する工程をさらに含み得る。位相誤差を有する核酸分子は、その核酸分子がメンバーであるクローン集団のコンセンサス状態（例えば、参照配列）、又はその核酸分子がコピー若しくは代表的な配列である鋳型核酸分子より長く又は短く伸長し得る。不正確に取り込まれた塩基（例えば、成長する鎖に付加された余分な塩基又は間違った塩基）を含む断片について、この位相誤差は、リーディングであると見なされ得る。コンセンサス配列と比較して塩基が成長する鎖へ取り込まれていない場合の他の核酸分子について、そのポリヌクレオチドはラギングであると見なすことができる。ポリメラーゼが不完全である可能性があるため、ある位相誤差は、コロニーに基づいたシーケンシングプロセスの一部として長い伸長反応を生じるコロニー内に起こり得る。位相誤差は、市販のクローンシーケンシングシステムの読み取り長を制限し得る。
【０１２０】
[00142]  位相誤差は、リーディングシーケンシング取り込みエラーをもたらし得る。リーディングシーケンシングエラーは、ヌクレオチドの間違った又は過剰な（例えば、ホモポリマー）付加による、優勢な配列より長い配列を指し得る。間違った又は過剰な付加は、特に高濃度のｄＮＴＰが非競合的反応に用いられる場合、ポリメラーゼエラーに起因する可能性がある。代替として、又は加えて、リーディングシーケンシング取り込みエラーは、ｄＮＴＰの不十分な洗浄又は非特異的結合に起因する可能性があり、そのｄＮＴＰが、その後、遊離し、取り込まれ得る。リーディングシーケンシング取り込みエラーは、有効な３’ターミネーターなしでのヌクレオチドの取り込みに起因する可能性があり、それにより、取り込み事象を１サイクル先に進行させる。例えば、リーディングシーケンシング取り込みエラーは、核酸取り込み事象中、微量の非保護化又は非ブロック化３’−ＯＨヌクレオチドの存在により引き起こされ得る。非保護化３’−ＯＨヌクレオチドは、製造プロセス中、又は場合により、貯蔵及び試薬取り扱いプロセス中に、生成され得る。
【０１２１】
[00143]  位相誤差は、ラギングシーケンシングエラーをもたらし得る。ラギングシーケンシング取り込みエラーは、正しいヌクレオチドの付加の欠損による、優勢な配列より短い配列を指し得る。ラギングシーケンシングエラーは、最適ではない反応条件、立体障害、二次構造、又はポリメラーゼ阻害の他の原因によって起こり得る。ラギングシーケンシングエラーを引き起こし得るプロセスの非限定的例には、可逆性ターミネーター、検出可能な標識、第２の一本鎖核酸分子由来のフラップ、修飾ヌクレオチド、及び／又はリンカーの不完全な除去が挙げられる。より長いサイクル時間は、ポリメラーゼが誤ったヌクレオチドを取り込むことのより多い機会を与え得る。同様に、より接近しにくい核酸分子（例えば、DNA）は、結果として、正しいヌクレオチドを取り込む機会の不足を生じ得る。取り込みエラーを最小限にするために、温度、工程時間、ポリメラーゼ選択、ヌクレオチド濃度、塩濃度、及びバッファー選択が最適化され得ることは認識されている。
【０１２２】
[00144]  例えば、核酸（例えば、DNA）試料は、プライマーに相補的である領域の後の第１の領域内にＴＧＴＴＣの配列を有し得る。流体サイクルは、第１にデオキシシチジン三リン酸（dCTP）、続いて第２にデオキシチミジン三リン酸（dTTP）、続いて第３にデオキシアデノシン三リン酸（dATP）、続いて第４にデオキシグアノシン三リン酸（dGTP）を、間に洗浄工程を組み入れて、導入し得る。流体サイクルの第１の部分において、第１のサイクルの一部として流入するｄＣＴＰ分子は、核酸鋳型から厳密に徹底して洗い流されなくてもよい。流体サイクルの第２の部分において、第２のサイクルの一部として流入するｄＴＴＰ分子は、ウェル構造から厳密に洗い流されなくてもよい。第１の流体サイクルの第１及び第２の部分の間、ｄＮＴＰは取り込まれ得ない。流体サイクルの第３の部分の間、ｄＡＴＰは試料の最初の塩基であるＴと相補的であるため、ｄＡＴＰは導入され、取り込まれ得る。非特異的に結合することを停止している任意の非特異的結合型ｄＣＴＰ分子もまた、流体サイクルのこの第３の部分の間、取り込まれ得る。これらの結合していないｄＣＴＰ分子は、ｄＡＴＰ分子の取り込みの後、取り込まれ得る。ｄＣＴＰ分子の取り込み後、さらに２個のｄＡＴＰ分子が取り込まれ得、そのことは、結果として、リーディングシーケンシング位相誤差を有する単クローンのビーズの分子の一部を生じ得る。このように、単クローンのビーズのいくつかの分子が位相の不一致になり得る。
【０１２３】
[00145]  位相誤差は、クローン集団由来の複数の二本鎖若しくは一本鎖の分子の配列を比較することにより、及び／又は参照配列と比較することにより、検出され得る。例えば、配列は、置換型又はインデル型のミスコールなどのミスコールについて分析され得る。ミスコールは、相補性一本鎖分子を生成するための鋳型として一本鎖分子を用いる核酸取り込み反応中にシグナル強度を測定することにより検出され得る。二本鎖又は一本鎖分子は、クローン集団を構成し得る。一例では、クローン集団の一部分は、クローン集団の残りの部分と比較して、閾値未満などの実質的に低い検出可能なシグナル強度を有し得る。これは、利用可能な位置の全部より少ない位置にヌクレオチドが取り込まれ得、インデル型ミスコールを生じている可能性があることを示し得る。インデル型ミスコールは、一本鎖分子の不完全な伸長により引き起こされ得、ラギングシーケンシングエラーをもたらし得る。別の例では、クローン集団の一部分が、参照配列と比較して、置換された塩基を有し得る。置換型ミスコールは、核酸取り込み反応における追加のヌクレオチドの取り込みによるリーディングシーケンシングエラーにより引き起こされ得る。追加のヌクレオチドは、参照配列におけるヌクレオチドとは異なり得る。
【０１２４】
[00146]  位相誤差は、核酸取り込み反応を競合条件で行うことにより低下し得る。例えば、リーディングシーケンシングエラーを軽減するためにヌクレオチドの濃度が減少され得る。別の例では、リーディングシーケンシングエラーを引き起こす、ヌクレオチドの誤った取り込みを避けるために、各読み取りについて、サイクル時間及び／又はサイクルの数が減少され得る。場合によっては、位相誤差は、そのヌクレオチドに基づいた重合酵素を用いることにより低下し得る。例えば、非修飾ヌクレオチドを取り込む場合、位相誤差を低下させるために、ＢｓｔポリメラーゼなどのＡ型ポリメラーゼが用いられ得る。修飾ヌクレオチドを取り込む場合、位相誤差を低下させるために、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ（商標）（NEB）などのＢ型ポリメラーゼが用いられ得る。
【０１２５】
[00147]  一態様では、位相誤差は、核酸取り込み反応において非修飾ヌクレオチドを修飾ヌクレオチドの後に又はそれと同時に取り込むことにより低下し得る。
【０１２６】
[00148]  核酸シーケンシングのための方法は、センサーアレイに隣接した複数の二本鎖又は一本鎖核酸分子を提供する工程を含み得る。複数の一本鎖核酸分子の第１の二本鎖又は一本鎖核酸分子は、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され得る。
【０１２７】
[00149]  第１の一本鎖核酸分子を核酸取り込み反応に供して、第１の一本鎖核酸分子と相補的な成長する鎖として第２の一本鎖核酸分子を生成させ得る。核酸取り込み反応は、（ｉ）検出可能な標識を含む第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込む工程、及び（ｉｉ）検出可能な標識を含まない第２の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込む工程を、交互に且つ逐次的に含み得る。所与のセンサーは、第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込みを示し得る、検出可能な標識からのシグナルを検出し、それにより、第１の一本鎖核酸分子の配列を決定するために用いられ得る。第１の複数のヌクレオチドは、第２の複数のヌクレオチドと交換され得る。第２の複数のヌクレオチドの取り込みは、位相誤差を修正し得る。第２の複数のヌクレオチドの取り込みは、第１の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドが取り込まれていない、第１の一本鎖核酸分子に沿った位置に、第２の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドを取り込むことにより、位相誤差を修正し得る。核酸取り込み反応は、第１の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドを用いることにより継続され得る。第１の一本鎖核酸分子は、鋳型一本鎖核酸分子と配列相同性を有し得る。
【０１２８】
[00150]  位相誤差を修正するための核酸シーケンシングのための方法の例は図２０に図示されている。複数の一本鎖核酸分子は、ビーズと連結し得る。複数の一本鎖核酸分子は、所与の一本鎖核酸分子のクローン集団を含み得る。第１の一本鎖核酸分子は、個々のプライマーと連結したプライミング部位を有し得る。プライミング部位は、第１の一本鎖分子の一部分と相補的であり得る。第１の一本鎖分子は、第１の複数の個々のヌクレオチドと接触させ得る。第１の複数の個々のヌクレオチドは、複数の異なる型のヌクレオチドを含み得る。第１の複数の個々のヌクレオチドは、単一の型のヌクレオチドを含み得る。第１の複数の個々のヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり得る。第１の複数の個々のヌクレオチドは、不可逆性ターミネーター及び不可逆性の検出可能な静電気的部分を含み得る。不可逆性の検出可能な静電気的部分は、個々のヌクレオチドの型ごとに異なり得る。重合酵素は、第１の個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込みを促進し得る。所与のセンサーは、第２の一本鎖核酸分子へ取り込まれたヌクレオチドの型を、センサーに存在する検出可能な標識の型によって検出し得る。その後、第１の複数の個々のヌクレオチドは、第２の複数の個々のヌクレオチドと交換され得る。第２の複数の個々のヌクレオチドは、第１の複数と同じ型のヌクレオチドを含み得る。第２の複数の個々のヌクレオチドは、検出可能な標識を有さなくてもよく、可逆性ターミネーターを有し得る。第２の複数のヌクレオチドの付加は、第１の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドが取り込まれていない、第１の一本鎖核酸分子に沿った位置に、第２の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドを取り込むことにより、位相誤差を修正し得る。
【０１２９】
[00151]  図２０に示されているように、位相誤差は、読み取り１においてリーディング第２の一本鎖核酸分子内の余分なヌクレオチドの付加（ｎ＋１）により示されているようなリーディングシーケンシングエラーであり得る。第２の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドは、ラギング第２の一本鎖核酸分子へ取り込まれ得、その結果、ラギング分子は、読み取り２の前の次のサイクルにおいて、「ｎ＋１」により示されているように、リーディング分子と同期し得る。第２の複数の個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込み後、可逆性ターミネーターは除去又は解除され得る。ターミネーターは還元剤により解除され得る。（ｎ＋１）である同じ数の取り込まれたヌクレオチドを有する両方の分子がいったん同期したならば、核酸取り込み反応は、第１の複数のヌクレオチド由来の個々のヌクレオチドを用いて継続され得る。次のサイクル、読み取り２において、第１の複数のヌクレオチドにおける検出可能な標識は、センサーによる検出のために切断され得る。検出可能な標識は、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（THPP）などのリン酸試薬を用いることにより切断され得る。検出可能な標識の切断は、切断後、個々のヌクレオチド上に傷跡を残し得る。傷跡は、標識の切断中に完全には除去されない、検出可能な標識の部分を含み得る。第１の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子の全部又は一部の配列が決定されるまで、第１の複数の個々のヌクレオチドと第２の複数の個々のヌクレオチドを交互に供給されて、第２の一本鎖核酸分子を生成し得る。
【０１３０】
[00152]  図２１及び２２は、核酸シーケンシング中の位相誤差を低下させるための方法を用いた結果の例を示す。第１の一本鎖分子は、第２の一本鎖分子を生成するために、３個のリジンアミノ酸残基などの検出可能な標識を有する第１の複数のヌクレオチドと接触させ得る。第１の複数のヌクレオチドは、第２の複数のヌクレオチドと交換され得る。第１の複数のヌクレオチドの取り込みは、読み取り１において、第２の一本鎖分子内のリーディング位相誤差（ｎ＋１）を引き起こし得る。位相誤差は、第２の複数のヌクレオチドをラギング分子へ取り込むことにより修正され得、その結果、ラギング分子はリーディング分子と同期し得る。図２１に示されているように、Ｘ軸は、取り込まれたヌクレオチドの数に対応するフロー数を示し、Ｙ軸は、検出可能な標識の切断に由来したシグナルを示す。読み取り１において、検出可能な標識は、第１の複数のヌクレオチドと連結し得、その結果、Ｙ軸上の負のシグナルを生じ得る。負のシグナルは、検出可能な標識のリジン残基によるＭｇ２＋などのカチオンの置換のせいであり得る。読み取り２において、検出可能な標識は、第１の複数のヌクレオチドから切断され得、その結果、傷跡の付いたヌクレオチドに由来した、Ｙ軸上の正のシグナルを生じ得る。正のシグナルは、リジン残基を含む検出可能な標識の除去により、Ｍｇ２＋などのカチオンの濃度に由来し得る。読み取り１と読み取り２の両方において、第２の複数の個々のヌクレオチドは、検出可能な標識をもたなくてもよく、その結果、Ｙ軸上にゼロに近いシグナルを生じ得る。シーケンシングプロセス中のシグナルの変化は、図２２に示されている。第１の複数のヌクレオチドにおける検出可能な標識、３個のリジン残基の存在は、読み取り１におけるΔＫ３により示されているように、Ｙ軸上に正味負のシグナルを生じ得る。非修飾ヌクレオチドの付加は、結果として、読み取り２におけるΔチェイスにより示されているように、Ｙ軸上にゼロに近い中性シグナルを生じ得る。ＴＨＰＰによる検出可能な標識の切断は、結果として、読み取り３におけるΔＴＨＰＰにより示されているように、正味正のシグナルのサージを生じ得る。検出可能な標識の切断により、非修飾ヌクレオチドによる中性シグナルは、Δチェイス中の矢印により示されているように、正のシグナルへシフトし得る。正のシグナルは、そのヌクレオチドにおける負のリン酸基のせいであり得、そのリン酸基が、次に、正味正のシグナルを生じ得るＭｇ２＋カチオンを濃縮し得る。
【０１３１】
[00153]  核酸シーケンシングのためのシステム
本開示は、様々な構成要素を含み得る核酸シーケンシングのためのシステムを提供する。システムは、生きている対象由来の核酸試料をシーケンシングするなどの様々な適用に用いられ得る。例えば、ビーズによって占有された部位、又はクローン集団を含む複数の核酸鋳型によって直接的に占有された部位を有するセンサーアレイを、クローンの核酸とハイブリダイズするプライマーを含む流体と接触させ得る。その後、センサーアレイは、洗浄され、適切なバッファー中に１つ若しくは複数の型のヌクレオチド、重合酵素、及び／又は任意の補助因子を含む流体と接触させ得る。その後、アレイは洗浄され得、取り込まれたヌクレオチドが検出され得る。取り込み、洗浄、検出のサイクルは、ビーズと結合した、又はセンサーの表面と結合した試料核酸が配列決定されるまで繰り返され得る。
【０１３２】
[00154]  センサーアレイは、統合シーケンシングプラットフォームへ組み込まれ得る。統合シーケンシングプラットフォームは、核酸（例えば、DNA）抽出モジュール、ライブラリー構築モジュール、増幅モジュール、抽出モジュール、及びシーケンシングモジュールのうちの１つ又は複数を含み得る。いくつかの実施形態において、システムは、別々で、及び／又はモジュール型式であり得る。いくつかの実施形態において、統合シーケンシングプラットフォームは、これらのシステムのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ全部を含み得る。場合によっては、モジュールは、単一のユニット（例えば、マイクロ流体デバイス）、単一のアレイ（例えば、再利用可能であり得るセンサーアレイ）、又はさらに単一のデバイス内に統合することができる。統合シーケンシングプラットフォームの例は、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５４７６９号、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３９８８０号、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６７６４５号、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７５４４号、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９６２４号、及びＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２０１３０号に見出すことができ、それらのそれぞれは、参照により本明細書に全体として組み込まれている。
【０１３３】
[00155]  別の態様において、本開示は、核酸シーケンシングのためのシステムを提供する。システムは、複数の個々のセンサーを含むセンサーアレイを含み得る。使用中、複数の二本鎖核酸分子のうちの所与の二本鎖核酸分子は、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され得る。所与の二本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子及び第２の一本鎖核酸分子を含み得る。所与のセンサーは、所与の二本鎖核酸分子の（例えば、デバイ長内の）電荷二重層と電気的に連結し得る。システムは、センサーアレイと動作可能に連結している１つ又は複数のコンピュータプロセッサをさらに含み得る。１つ又は複数のコンピュータプロセッサは、第１の一本鎖核酸分子のハイブリダイズしていないセグメントを個々のヌクレオチドと接触させて、ハイブリダイズしていないセグメントを、個々のヌクレオチドについての第３の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供するようにプログラムされ得る。第３の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有し得る。核酸取り込み反応中又はその後に、所与のセンサーは、個々のヌクレオチドの第３の一本鎖核酸分子への取り込みを示すシグナルを検出し、それにより、ハイブリダイズしていないセグメントの配列を決定し得る。
【０１３４】
[00156]  二本鎖核酸分子は支持体と連結し得る。支持体は、ビーズ、又はセンサーアレイの表面であり得る。複数の二本鎖核酸分子は、複数のビーズ、又はセンサーアレイの表面上の複数の部位と連結し得る。複数のビーズの各ビーズは、所与のセンサーに隣接して配置され得る。複数のビーズは磁気又は非磁気ビーズであり得る。ビーズは、二本鎖核酸分子のビーズへの連結を促進する表面コーティングを有し得る。電荷二重層（例えば、デバイ長）は、ビーズの表面に隣接し得る。代替として、又は加えて、複数の二本鎖核酸分子は、センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結し得る。所与の二本鎖核酸分子は、所与のセンサーの表面と連結し得る。電荷二重層（例えば、デバイ長）は、所与のセンサーの表面に隣接し得る。ビーズ又はセンサーアレイの表面と連結した二本鎖核酸分子は、シーケンシング前にクローン的に増幅され得、その結果、各ビーズが二本鎖核酸分子のクローン集団と連結し、又は所与のセンサーの各表面が二本鎖核酸分子のクローン集団と連結する。
【０１３５】
[00157]  所与のセンサーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの電極を含み得る。一例では、所与のセンサーは、少なくとも２つの電極を含む。所与のセンサーの電極は、個々のヌクレオチドの二本鎖核酸分子への取り込みを示すシグナルを検出し得る。取り込み事象を示すシグナルには、電子二重層におけるインピーダンス、伝導率、又は電荷の変化が挙げられ得る。一例では、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである。個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、定常状態シグナル、一過性シグナル、又は定常状態シグナルと一過性シグナルの組合せであり得る。シグナルは、一過性に、又は定常状態条件中に、検出され得る。一過性シグナル検出様式において、検出は、ヌクレオチド取り込み中、又はそのすぐ後に、起こる。定常状態検出において、センサーの読み取りは、取り込み事象の「完了」後に起こり得る。シグナルの定常状態変化は、センサーの周りの環境に変化が導入されるまで一定であり得る。
【０１３６】
[00158]  １つ又は複数のコンピュータプロセッサは、センサーアレイにわたって流体フローを方向付けるようにプログラムされ得る。二本鎖核酸分子は、流体フロー状態中、１つ又は複数の表面と安定的に連結し得る。二本鎖核酸分子は、複数のビーズと安定的に連結し得る。ビーズは、センサーアレイに隣接して安定的に配置され得る。ビーズは、磁場又は電場によりセンサーアレイに隣接した状態を保たれ得る。流体フローは、ビーズを乱したり移動させたりし得ない。センサーアレイにわたって方向付けられる流体は、ヌクレオチド取り込み反応（例えば、プライマー伸長反応）に用いられる核酸分子、プライマー、重合酵素、個々のヌクレオチド、補助因子、及び／又はバッファーを含み得る。流体は、バッファーを含む洗浄流体である場合がある。一例では、流体は、センサーアレイへ方向付けられ、センサーアレイとインキュベートされ得る。流体は、ヌクレオチド取り込み反応の単一サイクルの持続時間の間、センサーアレイとインキュベートされ得る。インキュベーションのサイクルとサイクルの間、センサーアレイは、洗浄流体で洗浄され得る。
【０１３７】
[00159]  別の態様において、本開示は、核酸シーケンシングのためのシステムを提供する。システムは、複数のセンサーを含むセンサーアレイを含み得る。使用中、複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子が、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され得る。所与のセンサーは、第１の一本鎖核酸分子の（例えば、デバイ長内の）電荷二重層と電気的に連結し得る。システムは、センサーアレイと連結した１つ又は複数のコンピュータプロセッサを含み得る。１つ又は複数のコンピュータプロセッサは、第１の一本鎖核酸分子を個々のヌクレオチドと接触させて、第１の一本鎖核酸分子を、個々のヌクレオチドから第２の一本鎖核酸分子を生成する核酸取り込み反応に供するようにプログラムされ得る。第２の一本鎖核酸分子は、第１の一本鎖核酸分子との配列相補性を有し得る。個々のヌクレオチドの少なくともサブセットは、検出可能な標識を含み得る。所与のセンサーは、核酸取り込み反応中、又はその後に、検出可能な標識からのシグナルを検出し得る。シグナルは、個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込みを示し得る。シグナルは、第１の一本鎖核酸分子の配列を決定するために用いられ得る。
【０１３８】
[00160]  一本鎖核酸分子は支持体と連結し得る。支持体は、ビーズ、又はセンサーアレイの表面であり得る。複数の一本鎖核酸分子は、複数のビーズ、又はセンサーアレイの表面上の複数の部位と連結し得る。複数のビーズの各ビーズは、所与のセンサーに隣接して配置され得る。複数のビーズは磁気又は非磁気ビーズであり得る。ビーズは、一本鎖核酸分子のビーズへの連結を促進する表面コーティングを有し得る。電荷二重層（例えば、デバイ長）は、ビーズの表面に隣接し得る。代替として、又は加えて、複数の二本鎖核酸分子は、センサーアレイの１つ又は複数の表面と連結し得る。所与の一本鎖核酸分子は、所与のセンサーの表面と連結し得る。電荷二重層（例えば、デバイ長）は、所与のセンサーの表面に隣接し得る。ビーズ又はセンサーアレイの表面と連結した一本鎖核酸分子は、シーケンシング前にクローン的に増幅され得、その結果、各ビーズが一本鎖核酸分子のクローン集団と連結し、又は所与のセンサーの各表面が一本鎖核酸分子のクローン集団と連結する。
【０１３９】
[00161]  所与のセンサーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの電極を含み得る。一例では、所与のセンサーは、少なくとも２つの電極を含む。別の例では、所与のセンサーは２つの電極を含む。電極は、プライマー伸長反応が起こる溶液に曝露され得る。代替として、又は加えて、電極は、センサーアレイ内に埋められてもよく、したがって、プライマー伸長反応が起こる溶液に曝露され得ない。所与のセンサーの電極は、個々のヌクレオチドの一本鎖核酸分子への取り込みを示すシグナルを検出し得る。取り込み事象を示すシグナルには、電子二重層におけるインピーダンス、伝導率、又は電荷の変化が挙げられ得る。一例では、個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、電荷二重層におけるインピーダンス又はインピーダンス変化により生成した電気的シグナルである。個々のヌクレオチドの取り込みを示すシグナルは、定常状態シグナル、一過性シグナル、又は定常状態シグナルと一過性シグナルの組合せであり得る。シグナルは、一過性に、又は定常状態条件中に、検出され得る。一過性シグナル検出様式において、検出は、ヌクレオチド取り込み中、又はそのすぐ後に、起こる。定常状態検出において、センサーの読み取りは、取り込み事象の完了後、起こり得る。シグナルの定常状態変化は、センサーの周りの環境に変化が導入されるまで一定であり得る。センサーは、取り込み事象を検出する（例えば、取り込み事象を数える）ことができ、又は取り込まれたヌクレオチドを個々に分解する（例えば、どのヌクレオチドが取り込まれたかを決定する）ことができる。
【０１４０】
[00162]  １つ又は複数のコンピュータプロセッサは、センサーアレイにわたって流体フローを方向付けるようにプログラムされ得る。一本鎖核酸分子は、流体フロー状態中、１つ又は複数の表面と安定的に連結し得る。一本鎖核酸分子は、複数のビーズと安定的に連結し得る。ビーズは、センサーアレイに隣接して安定的に配置され得る。ビーズは、磁場又は電場によりセンサーアレイに隣接した状態を保たれ得る。流体フローは、ビーズを乱したり移動させたりし得ない。センサーアレイにわたって方向付けられる流体は、ヌクレオチド取り込み反応（例えば、プライマー伸長反応）に用いられる核酸分子、プライマー、重合酵素、個々のヌクレオチド、補助因子、及び／又はバッファーを含み得る。流体は、バッファーを含む洗浄流体である場合がある。一例では、流体は、センサーアレイへ方向付けられ、センサーアレイとインキュベートされ得る。流体は、ヌクレオチド取り込み反応の単一サイクルの持続時間の間、センサーアレイとインキュベートされ得る。インキュベーションのサイクルとサイクルの間、センサーアレイは、洗浄流体で洗浄され得る。
【０１４１】
[00163]  別の態様において、本開示は、核酸シーケンシングのためのシステムを提供する。システムは、複数のセンサーを含むセンサーアレイを含み得る。使用中、複数の一本鎖核酸分子のうちの第１の一本鎖核酸分子が、センサーアレイの所与のセンサーに隣接して配置され得る。システムは、センサーアレイと動作可能に連結した１つ又は複数のコンピュータプロセッサを含み得る。１つ又は複数のコンピュータプロセッサは、第１の一本鎖核酸分子を、検出可能な標識を含む第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを取り込むこと、及び検出可能な標識を含まない第２の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドと第１の複数のヌクレオチドの個々のヌクレオチドを交換することを、交互に且つ逐次的に含む核酸取り込み反応に供するようにプログラムされ得る。所与のセンサーは、核酸取り込み反応中、又はその後に、検出可能な標識からのシグナルを検出し得る。シグナルは、個々のヌクレオチドの第２の一本鎖核酸分子への取り込みを示し得る。シグナルは、第１の一本鎖核酸分子の配列を決定するために用いられ得る。
【０１４２】
[00164]  複数の一本鎖核酸分子は、複数の支持体と連結し得る。複数の支持体は、複数のビーズ、又はセンサーアレイ上の複数の表面であり得る。一例では、複数の一本鎖核酸分子は複数のビーズと連結し得、所与の一本鎖核酸分子は所与のビーズと連結し得る。所与のセンサーは、第１の一本鎖核酸分子を含む電荷二重層と電気的に連結し得る。電荷二重層は、所与のビーズの表面に隣接し、又は所与のセンサーの表面上にあり得る。一本鎖核酸分子は、支持体の表面上で増幅され得る。増幅産物は、支持体の表面と連結し得る。増幅産物は、支持体の表面上に一本鎖核酸分子のクローンコロニーを形成し得る。一本鎖核酸分子のクローンコロニーがシーケンシングされ得る。
【０１４３】
[00165]  センサーアレイの所与のセンサーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又はそれより多い電極を含み得る。一例では、所与のセンサーは、少なくとも２つの電極を含む。別の例では、所与のセンサーは、２つの電極を含む。電極は、プライマー伸長反応が起こる溶液に曝露され得る。代替として、又は加えて、電極は、センサーアレイ内に埋められてもよく、したがって、プライマー伸長反応が起こる溶液に曝露され得ない。センサーは、ヌクレオチド取り込み事象を示すシグナルを検出し得る。センサーは、個々のヌクレオチドと連結した検出可能な標識を検出し得る。センサーは、検出可能な標識を一過性又は定常状態条件中に検出し得る。ヌクレオチド取り込みは、定常状態条件中、取り込みサイクルあたり、１回、２回、３回、４回、又は４回より多く検出され得る。一例では、ヌクレオチド取り込みは、定常状態条件中に取り込みサイクルあたり少なくとも２回検出され得る。センサーアレイは、電気的シグナルを一過性又は定常状態条件中に、検出し得る。電気的シグナルには、分子の電荷状態の変化、周囲の溶液の伝導率の変化、インピーダンスシグナル、又はインピーダンスシグナルの変化が挙げられ得るが、それらに限定されない。センサーは、電荷及び／若しくは伝導率の変化、又はインピーダンスの変化を検出し得る。センサーは、センサー、支持体、又は核酸分子（例えば、試料）の電荷二重層（例えば、デバイ長）内の電荷及び／若しくは伝導率又はインピーダンスの変化を検出し得る。個々のヌクレオチドと連結した検出可能な標識は、一本鎖核酸分子を囲む電気的環境を変化させ得、所与のセンサーは、その電気的変化を検出し得る。センサーは、取り込み事象を検出する（例えば、取り込み事象を数える）ことができ、又は取り込まれたヌクレオチドを個々に分解する（例えば、どのヌクレオチドが取り込まれたかを決定する）ことができる。
【０１４４】
[00166]  １つ又は複数のコンピュータプロセッサは、センサーアレイにわたって流体フローを方向付けるようにプログラムされ得る。一本鎖核酸分子は、流体フロー状態中、１つ又は複数の表面と安定的に連結し得る。一本鎖核酸分子は、複数のビーズと安定的に連結し得る。ビーズは、センサーアレイに隣接して安定的に配置され得る。ビーズは、磁場又は電場によりセンサーアレイに隣接した状態を保たれ得る。流体フローは、ビーズを乱したり移動させたりし得ない。センサーアレイにわたって方向付けられる流体は、ヌクレオチド取り込み反応（例えば、プライマー伸長反応）に用いられる核酸分子、プライマー、重合酵素、個々のヌクレオチド、補助因子、及び／又はバッファーを含み得る。流体は、バッファーを含む洗浄流体である場合がある。一例では、流体は、センサーアレイへ方向付けられ、センサーアレイとインキュベートされ得る。流体は、ヌクレオチド取り込み反応の単一サイクルの持続時間の間、センサーアレイとインキュベートされ得る。インキュベーションのサイクルとサイクルの間、センサーアレイは、洗浄流体で洗浄され得る。
【０１４５】
[00167]  コンピュータシステム
本開示は、本開示の方法を実行するようにプログラムされるコンピュータシステムを提供する。図１６は、核酸分子をシーケンシングするように、プログラムされ、又は別な方法で構成されるコンピュータシステム１６０１を示す。コンピュータシステム１６０１は、本開示のシーケンシングシステムの様々な態様、例えば、核酸鋳型のフローをセンサーアレイへコントロールすること、個々のヌクレオチドのフローをセンサーアレイへコントロールすること、及び取り込み反応条件をコントロールすることを制御することができる。コンピュータシステム１６０１は、ユーザーの電子デバイス、又は電子デバイスに対して遠隔設置されているコンピュータシステムであり得る。電子デバイスは携帯型電子デバイスであり得る。
【０１４６】
[00168]  コンピュータシステム１６０１は、シングルコア若しくはマルチコアのプロセッサ、又は並列処理のための複数のプロセッサであり得る、中央処理装置（CPU、本明細書では「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」とも呼ばれる）１６０５を含む。コンピュータシステム１６０１はまた、メモリ又はメモリ場所１６１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１６１５（例えば、ハードディスク）、１つ又は複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース１６２０（例えば、ネットワークアダプター）、及び周辺機器１６２５、例えば、キャッシュ、他のメモリ、データストレージ、及び／又は電子ディスプレイアダプターを含む。メモリ１６１０、記憶装置１６１５、インターフェース１６２０、及び周辺機器１６２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を通してＣＰＵ１６０５と通信する。記憶装置１６１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（又はデータ保存場所）であり得る。コンピュータシステム１６０１は、通信インターフェース１６２０の助けを借りて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１６３０と動作可能に連結することができる。ネットワーク１６３０は、インターネット（Internet）、インターネット（internet）及び／若しくはエクストラネット、又はイントラネット及び／若しくはインターネット（Internet）と通信するエクストラネットであり得る。ネットワーク１６３０は、場合によっては、遠隔通信及び／又はデータネットワークである。ネットワーク１６３０は、クラウドコンピューティングなどの分散型コンピューティングを可能にすることができる１つ又は複数のコンピュータサーバーを含むことができる。ネットワーク１６３０は、場合によっては、コンピュータシステム１６０１の助けを借りて、コンピュータシステム１６０１と連結したデバイスをクライアント又はサーバーとして働くことを可能にし得るピアツーピアネットワークを実装することができる。
【０１４７】
[00169]  ＣＰＵ  １６０５は、プログラム又はソフトウェアにおいて具体化することができる一連の機械可読命令を実行することができる。その命令は、メモリ１６１０などのメモリ場所に記憶され得る。命令は、ＣＰＵ  １６０５へ向けられ、その後、本開示の方法を実行するようにＣＰＵ  １６０５をプログラムし、又は別な方法で構成することができる。ＣＰＵ  １６０５により実施されるオペレーションの例には、フェッチ、デコード、実行、及びライトバックを挙げることができる。
【０１４８】
[00170]  ＣＰＵ  １６０５は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム１６０１の１つ又は複数の他の構成要素は、回路に含まれ得る。場合によっては、回路は、特定用途向け集積回路（ASIC）である。
【０１４９】
[00171]  記憶装置１６１５は、ドライバー、ライブラリー、及び保存されたプログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶装置１６１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザーの嗜好及びユーザーのプログラムを記憶することができる。コンピュータシステム１６０１は、場合によっては、イントラネット又はインターネット（Internet）を通してコンピュータシステム１６０１と通信する遠隔サーバー上に位置するなどの、コンピュータシステム１６０１の外部にある１つ又は複数の追加のデータ記憶装置を含むことができる。
【０１５０】
[00172]  コンピュータシステム１６０１は、ネットワーク１６３０を通して１つ又は複数の遠隔コンピュータシステムと通信できる。例えば、コンピュータシステム１６０１は、ユーザーの遠隔コンピュータシステム（例えば、ユーザーのラップトップ又は携帯電話）と通信できる。遠隔コンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、携帯型PC）、スレート若しくはタブレットＰＣ（例えば、Apple（登録商標）iPad、Samsung（登録商標）Galaxy Tab）、電話、スマートフォン（例えば、Apple（登録商標）iPhone、Android使用可能デバイス、Blackberry（登録商標））、又はパーソナルデジタルアシスタントが挙げられる。ユーザーは、ネットワーク１６３０を介してコンピュータシステム１６０１にアクセスすることができる。
【０１５１】
[00173]  本明細書に記載されているような方法は、コンピュータシステム１６０１の電子記憶場所、例えば、メモリ１６１０又は電子記憶装置１６１５に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行コードによって実行することができる。機械実行又は機械可読コードは、ソフトウェアの形で提供され得る。使用中、コードは、プロセッサ１６０５により実行され得る。場合によっては、コードは、記憶装置１６１５から取り出され、プロセッサ１６０５による即座のアクセスのためにメモリ１６１０上に記憶され得る。状況によっては、電子記憶装置１６１５を除外することができ、機械実行命令はメモリ１６１０に記憶される。
【０１５２】
[00174]  コードは、コードを実行するように適応したプロセッサを有する機械での使用のために事前にコンパイルされ、構成され得、又は実行時の間、コンパイルされ得る。コードは、コードが、事前コンパイルされた様式、又はコンパイルされながらの様式で実行されることを可能にするように選択され得るプログラミング言語で供給され得る。
【０１５３】
[00175]  コンピュータシステム１６０１など、本明細書に提供されたシステム及び方法の態様は、プログラミングにおいて具体化することができる。テクノロジーの様々な態様は、典型にはある種の機械可読媒体に搭載され、又は具体化される機械（又はプロセッサ）実行コード及び／又は関連データの形の「生産物」又は「製造品」と考えられ得る。機械実行コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）又はハードディスクなどの電子記憶装置に記憶され得る。「記憶」型媒体には、コンピュータ、プロセッサなど、又はその関連モジュールの有形メモリ、例えば、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのいずれか又は全部を挙げることができ、それらは、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一過性記憶を提供し得る。ソフトウェアの全部又は部分は、時には、インターネット（Internet）又は様々な他の遠隔通信ネットワークを通して通信され得る。そのような通信は、例えば、１つのコンピュータ又はプロセッサから別のものへ、例えば、管理サーバー又はホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にし得る。したがって、ソフトウェアエレメントを有し得る別の型の媒体には、有線の光学地上通信線を通して、及び様々なエアリンクによって、ローカルデバイス間の物理インターフェースを越えて用いられるものなどの、光波、電波、及び電磁波が挙げられる。有線又は無線リンク、光学的リンクなどの、そのような波を運ぶ物理的エレメントもまた、ソフトウェアを有する媒体として見なされ得る。本明細書で用いられる場合、非一過性の有形「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータ又は機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を与えることに関与する任意の媒体を指す。
【０１５４】
[00176]  したがって、コンピュータ実行コードなどの機械可読媒体は、多くの形をとり得、それには、有形記憶媒体、搬送波媒体、又は物理的伝送媒体が挙げられるが、それらに限定されない。非揮発性記憶媒体には、例えば、図面に示された、データベースなどを実行するために用いられ得るような、任意のコンピュータなどにおける記憶装置のいずれかなどの光学又は磁気ディスクが挙げられる。揮発性記憶媒体には、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが挙げられる。有形伝送媒体には、コンピュータシステム内にバスを含む線を含む、同軸ケーブル、銅線、及び光ファイバーが挙げられる。搬送波伝送媒体は、ラジオ周波数（RF）及び赤外線（IR）データ通信中に生成するものなど、電気的若しくは電磁的シグナル、又は音波若しくは光波の形をとり得る。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形には、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ又はＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ若しくはカートリッジ、搬送波輸送データ若しくは命令、そのような搬送波を輸送するケーブル若しくはリンク、又はコンピュータがプログラミングコード及び／又はデータを読み取り得る、任意の他の媒体が挙げられる。これらの形のコンピュータ可読媒体の多くは、１つ又は複数の命令の１つ又は複数の列を実行のためにプロセッサへ運ぶことに関与し得る。
【０１５５】
[00177]  コンピュータシステム１６０１は、例えば、システムの現在の動作状態又はシーケンシング結果を提供するためのユーザーインターフェース（UI）１６４０を含む電子ディスプレイ１６３５を含み、又はそれと通信することができる。ＵＩの例には、限定なしに、グラフィカルユーザーインターフェース（GUI）及びウェブ上のユーザーインターフェースが挙げられる。
【０１５６】
[00178]  本開示の方法及びシステムは、１つ又は複数のアルゴリズムによって実行することができる。アルゴリズムは、ソフトウェアを中央処理装置１６０５によって実行することにより、遂行され得る。アルゴリズムは、例えば、核酸配列へのヌクレオチド取り込みを示すシグナルを変換することができる。
【０１５７】
[00179]  本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され、且つ記載されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者に明白であろう。本発明が本明細書内で提供された特定の例によって限定されることは意図されない。本発明は、前述の明細書を参照して記載されているが、本明細書における実施形態の記載及び図示は、限定された意味で解釈されることを意図するものではない。本発明から逸脱することなく、多数のバリエーション、変化、及び置換が、今、当業者の頭に浮かぶだろう。さらに、本発明の全ての態様が、様々な条件及び変数に依存する、本明細書に示された特定の描写、形状、又は相対的割合に限定されないことは理解されるべきである。本明細書に記載された本発明の実施形態の様々な代替物が、本発明を実施することに用いられ得ることは理解されるべきである。したがって、本発明が、任意のそのような代替物、改変、バリエーション、又は等価物も網羅するはずであることは考えられる。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義すること、及びこれらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの等価物がそれにより網羅されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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