(57)【要約】  本発明は標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸に関する。特に、本発明は、内因性デアミナーゼを利用することによって内因性転写産物を部位特異的に編集することができる人工核酸を提供する。さらに、本発明は、特に本明細書に記載の修飾パターンにしたがって化学的に修飾された標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸を提供する。本発明はまた、上記人工核酸をコードするベクター、および上記人工核酸を含む組成物を含む。また、本発明は、標的ＲＮＡの部位特異的編集またはインビトロ診断のための人工核酸、組成物またはベクターの使用を提供する。さらに、本明細書に記載の人工核酸、組成物またはベクターは、医薬品としての使用のために、または疾患もしくは障害の診断における使用のために提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸であって、
ａ）上記標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的な核酸配列を含む標的化配列と、
ｂ）デアミナーゼをリクルートするリクルート部分と、を含み、
上記標的化配列は、核酸塩基が化学的に修飾された少なくとも一つのヌクレオチドを含み、および／または
上記標的化配列は少なくとも一つの骨格修飾を含む、人工核酸。
【請求項２】
上記標的化配列は、２’位が化学的に修飾された、少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の人工核酸。
【請求項３】
上記化学的に修飾されたヌクレオチドは、２’位の炭素原子において置換基を含み、上記置換基は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれ、好ましくは２’−水素、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロより選ばれ；および／または
上記化学的に修飾されたヌクレオチドは、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチド、および（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチドからなる群より選ばれる、請求項２に記載の人工核酸。
【請求項４】
上記標的化配列は、少なくとも一つの骨格修飾を含み、ここで、ヌクレオチドは、好ましくは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ハイドロジェンホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホネート、アリ−ルホスホネート、およびホスホトリエステルからなる群より選ばれる修飾リン酸基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項５】
上記標的化配列のヌクレオチドの少なくとも４０％が、２’位において化学的に修飾されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項６】
上記標的化配列は、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチド、好ましくは編集対象のアデノシンヌクレオチドまたはシチジンヌクレオチド、に対応する位置に、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項７】
上記標的配列において編集対象のヌクレオチドに対応する５’位または３’位に位置する、二つのヌクレオチドまたはそれらのバリアントの少なくとも一方、好ましくは両方は、２’位の炭素原子において化学的に修飾されており、ここで、上記２’位の炭素原子は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−水素、および２’−フルオロからなる群より選ばれる置換基と結合しており、および／または
上記標的配列において編集対象のヌクレオチドに対応する５’位または３’位に位置する、二つのヌクレオチドまたはそれらのバリアントの少なくとも一方、好ましくは両方は、修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項８】
上記標的化配列は、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置に、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位を含み、
上記編集対象のヌクレオチドに対応する５’位に位置する上記ヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチド、好ましくはピリミジンリボヌクレオチドまたはピリミジンデオキシヌクレオチドであり、上記ピリミジンヌクレオチドは、２’位において好ましくは２’−水素、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−Ｏ−フルオロによって化学的に修飾された核酸塩基を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項９】
上記標的化配列は以下の核酸配列を含み、
３’  Ａ  ｃ  Ｃ  ５’、
ここで、
Ａはアデノシンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはアデノシンリボヌクレオチドまたはデオキシアデノシンヌクレオチドであり；
ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはシチジン、より好ましくはアデノシン、に対応する位置における、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位であり；
Ｃは、シチジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはシチジンリボヌクレオチド、修飾シチジンリボヌクレオチド、デオキシシチジンヌクレオチド、または修飾デオキシシチジンヌクレオチドであり、より好ましくはデオキシシチジンヌクレオチドまたは修飾デオキシシチジンヌクレオチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項１０】
上記標的化配列は以下の核酸配列を含み、
３’  Ａｓ＊  ｃ  Ｃ＊  ５’、
ここで、
Ａｓはアデノシンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはアデノシンリボヌクレオチドまたはデオキシアデノシンヌクレオチドであり、さらにホスホロチオエート基を含み；
ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはシチジン、より好ましくはアデノシン、に対応する位置における、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位であり；
Ｃは、シチジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり；
アスタリスク（＊）は、直前のヌクレオチドが２’位の炭素原子において、２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−フルオロによって化学的に修飾されていることを示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項１１】
上記標的化配列は以下の核酸配列を含み、
３’  Ｕｓ＊  ｃ  Ｃ＊  ５’、
ここで、
Ｕｓはウリジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはウリジンリボヌクレオチドまたはデオキシウリジンヌクレオチドであり、さらにホスホロチオエート基を含み；
ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはシチジン、より好ましくはアデノシン、に対応する位置における、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位であり；
Ｃは、シチジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり；
アスタリスク（＊）は、直前のヌクレオチドが２’位の炭素原子において、２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−フルオロによって化学的に修飾されていることを示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項１２】
上記標的化配列の３’末端における五つのヌクレオチドのうち少なくとも二つは、修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項１３】
上記標的化配列の３’末端における五つのヌクレオチドのうち少なくとも二つは、ＬＮＡヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド、または（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項１４】
上記標的化配列は、
修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエートヌクレオチドを含む少なくとも一つのヌクレオチド；
ＬＮＡヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド、および（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも一つのヌクレオチド、好ましくはＬＮＡヌクレオチド；および
ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−水素、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロより選ばれる置換基を２’位の炭素原子に含む少なくとも一つのヌクレオチド、を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項１５】
上記標的化配列は、下記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）のいずれか一つに表す修飾パターンによって特徴付けられ、
（Ｉａ）３’  Ｎａ  Ｃ  Ｎｂ  ５’
ここで、
Ｎはヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはリボヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシヌクレオチドもしくはそのバリアントであり、より好ましくは修飾リボヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドであり；
Ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチドであり、ここで、Ｃは、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位であり；
ａは１〜４０の範囲、好ましくは６〜１０の範囲の整数であり；
ｂは４〜４０の範囲の整数であり；
ここで、ａ＋ｂは１５〜８０の範囲であり；
（Ｉｂ）３’  Ｎｃ  Ｎｓｄ  Ｎａ  Ｃ  Ｎｂ  Ｎｓｅ  Ｎｆ  ５’
ここで、
Ｎはヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはリボヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシヌクレオチドもしくはそのバリアントであり、より好ましくは修飾リボヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドであり；
Ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチドであり、ここで、Ｃは、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位であり；
Ｎｓは修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含むヌクレオチドであり；
ｃは０〜４の範囲の整数であり；
ｄは１〜１０の範囲の整数であり；
ａは１〜２６の範囲の整数であり；
ｂは４〜４０の範囲の整数であり；
ｅは０〜４の範囲の整数であり；
ｆは０〜４の範囲の整数であり；
ここで、ａ＋ｄ＋ｃは１〜４０の範囲であり；
ここで、ｂ＋ｅ＋ｆは４〜４０の範囲であり；
ここで、ａ＋ｄ＋ｃ＋ｂ＋ｅ＋ｆは１５〜８０の範囲であり；
（Ｉｃ）３’  Ｎｃ  Ｎｌｇ  Ｎｈ  Ｎｌｉ  Ｎａ  Ｃ  Ｎｂ  Ｎｌｊ  Ｎｋ  Ｎｌｌ  Ｎｍ  ５’
ここで、
Ｎはヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはリボヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシヌクレオチドもしくはそのバリアントであり、より好ましくは修飾リボヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドであり；
Ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチドであり、ここで、Ｃは、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位であり；
ＮｌはＬＮＡヌクレオチドまたは修飾ＬＮＡヌクレオチドであり；
ｃは０〜４の範囲、好ましくは１〜３の範囲の整数であり；
ｇ、ｉは１〜５の範囲の整数であり；
ｈは１〜３０の範囲、好ましくは１〜５の範囲の整数であり；
ａは１〜１５の範囲の整数であり；
ｂは４〜３０の範囲の整数であり；
ｊは０〜５の範囲、好ましくは１〜３の範囲の整数であり；
ｋは４〜３０の範囲の整数であり；
ｌは０〜５の範囲、好ましくは１〜３の範囲の整数であり；
ｍは０〜３の範囲の整数であり；
ここで、ｃ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ａは１〜４０の範囲であり；
ここで、ｂ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍは４〜４０の範囲であり；
ここで、ｃ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ａ＋ｂ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍは１５〜８０の範囲である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項１６】
上記標的化配列は、下記式ＩＩ（ａ）〜ＩＩ（ｌ）のいずれか一つから選択される修飾パターンによって特徴付けられ、
（ａ）３’  Ｎｓ４  Ｎ６  Ｃ  Ｎ７−２９  ５’；
（ｂ）３’  Ｎｓ４  Ｎ６−１０  Ｃ  Ｎ９−１２  Ｎｓ２  ５’；
（ｃ）３’  Ｎｓ２  Ｎ１１−１５  Ｃ  Ｎ９−１２  Ｎｓ２  ５’；
（ｄ）３’  Ｎｌｓ２  Ｎｓ２  Ｎｌ  Ｎ６−１０  Ｃ  Ｎ５−９  Ｎｌ２  Ｎ  Ｎｓ２  ５’；
（ｅ）３’  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎ６−１０  Ｃ  Ｎ４−８  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｓ２  ５’；
（ｆ）３’  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎ６−１０  Ｃ  Ｎ３−７  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｌ  Ｎ２  Ｎｓ２  ５’；
（ｇ）３’  Ｎｓ２  Ｎ  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｌ  Ｎ６−１０  Ｃ  Ｎ４−８  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｓ２  ５’、
（ｈ）３’  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ２  Ｎｌ  Ｎ５  Ｃ  Ｎ５  Ｎｌ  Ｎ１−２３  ５’；
（ｉ）３’  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎ８  Ｃ  Ｎ６  Ｎｌ  Ｎ１−２３  ５’
（ｊ）３’  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ２  Ｎｌ  Ｎ５  Ｃ  Ｎ５  Ｎｌ  Ｎ２０  Ｎｌ２  ５’；
（ｋ）３’  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎ８  Ｃ  Ｎ６  Ｎｌ  Ｎ２０  Ｎｌ２  ５’；および
（ｌ）３’  Ｎｓ４  Ｎ６  Ｃ  Ｎ９  Ｎｓ２  ５’、
ここで、
Ｎはヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはリボヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシヌクレオチドもしくはそのバリアントであり、より好ましくは修飾リボヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドであり；
Ｎｓは修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含むヌクレオチドであり；
ＮｌはＬＮＡヌクレオチドまたは修飾ＬＮＡヌクレオチドであり；
ＮｌｓはＬＮＡヌクレオチドまたは修飾ＬＮＡヌクレオチドであり、さらに修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含み；
Ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチドであり、ここで、Ｃは、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンもしくはそのバリアント（好ましくはデオキシシチジンヌクレオチド）、または脱塩基部位である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項１７】
上記標的化配列は、核酸配列を含み、
上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置における、上記シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、上記デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または上記脱塩基部位を除き、
ＬＮＡヌクレオチドを除き、
任意に、上記標的配列において編集対象のヌクレオチドに対応する位置の上記ヌクレオチドに対して５’位または３’位に位置する、二つのヌクレオチドの少なくとも一つを除き、
すべてのヌクレオチドは、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−水素、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロより選ばれる置換基に結合している、２’位の炭素原子において化学的に修飾されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項１８】
上記標的化配列は、
５’  Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊  ＵｃＡ  Ｇ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ａｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号１）；
５’  Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊  ＵｃＡ  Ｇ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ａｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２）；
５’  Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊  ＡｃＵ  Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号３）；
５’  Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊  ＣｃＡ  Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａ＊  ３’（配列番号４）；
５’  Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ａ＊  ＵｃＵ  Ｕ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ａｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号５）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｃ＊  ＣｃＵ  Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号６）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊  ＣｃＵ  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号７）；
５’  Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号８）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊  ＣｃＵ  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｕｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号９）；
５’  Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号１０）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊  ＣｃＵ  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号１１）；
５’  Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号１２）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊  ＣｃＵ  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号１３）；
５’  Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊  ＧｃＡ  Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａ＊  ３’（配列番号１４）；
５’  Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊  ＣｃＧ  Ｕ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｇｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｇｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号１５）；
５’  Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊  ＣｃＵ  ＣｃＵ  Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号１６）；
５’  Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊  ＣｃＡ  Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａｓ＊Ｃｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号１７）；
５’  Ｇ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊  ＣｃＡ  Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｃｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ｕｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号１８）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊  ＣｃＡ  Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ａｓ＊Ｕｓ＊Ｕｓ＊Ｕｓ＊Ｇ＊  ３（配列番号１９）；
５’  Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇ＊  ＣｃＵ  Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号２０）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊  ＣｃＵ  Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号２１）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊  ＣｃＵ  Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号２２）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊  ＣｃＵ  Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号２３）；
５’  Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｃ＊  ＣｃＡ  Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２４）；
５’  Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｃ＊  ＣｃＧ  Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２５）；
５’  Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊  ＣｃＧ  Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａｓ＊Ｃｓ＊Ｇｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号２６）；
５’  Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊  ＵｃＧ  Ｕ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２７）；
５’  Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊  Ｕ＊ｃＧ  Ｕ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２８）；
５’  Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊  ＡｃＡ  Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２９）；
５’  Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊  ＧｃＡ  Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号３０）；
５’  Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊  ＧｃＡ  Ｕ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号３１）；
５’  Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｕｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号３２）；
５’  Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号３３）；
５’  Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊  ＧｃＡ  Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号３４）；
５’  Ｕ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号３５）；
５’  Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊  ＣｃＵ  Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号３６）；
５’  Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊  ＵｃＵ  Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号３７）、からなる群より選ばれる核酸配列、
またはそれらの核酸配列のいずれかの断片もしくはバリアント、を含み、
ここで、
Ａはアデノシンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはアデノシンリボヌクレオチド、アデノシンデオキシヌクレオチド、修飾アデノシンリボヌクレオチド、または修飾アデノシンデオキシヌクレオチドであり；
Ｃは、シチジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはシチジンリボヌクレオチド、シチジンデオキシヌクレオチド、修飾シチジンリボヌクレオチド、または修飾シチジンデオキシヌクレオチドであり；
Ｇはグアノシンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくは、グアノシンリボヌクレオチド、グアノシンデオキシヌクレオチド、修飾グアノシンリボヌクレオチド、または修飾グアノシンデオキシヌクレオチドであり；
Ｕはウリジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくは、ウリジンリボヌクレオチド、ウリジンデオキシヌクレオチド、修飾ウリジンリボヌクレオチド、または修飾ウリジンデオキシヌクレオチドであり；
Ａｓ、Ｃｓ、Ｇｓ、およびＵｓは、ヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくは上記において規定したリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであり、ホスホロチオエート基をさらに含み；
アスタリスク（＊）は、直前のヌクレオチドが２’位の炭素原子において、好ましくは２’−水素、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−フルオロによって化学的に修飾されていることを示し；
小文字のｃは、標的配列中の編集対象のヌクレオチドまたはそのバリアント、好ましくはアデノシンまたはシチジン、より好ましくはアデノシンに対応する位置を示し、ｃは、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位を表す、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項１９】
上記標的化配列は、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置に、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位を含み、
上記標的配列において編集対象のヌクレオチドに対応する５’位または３’位に位置する、二つのヌクレオチドまたはそれらのバリアントの少なくとも一方、好ましくは両方は、２’位の炭素原子において化学的に修飾されており、ここで、上記２’位の炭素原子は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−水素、および２’−フルオロからなる群より選ばれる置換基と結合しており、および／または
上記標的配列において編集対象のヌクレオチドに対応する５’位または３’位に位置する、二つのヌクレオチドまたはそれらのバリアントの少なくとも一方、好ましくは両方は、修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項２０】
上記標的化配列は、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置に、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位を含み、
上記編集対象のヌクレオチドに対応する５’位に位置する上記ヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチド、好ましくはピリミジンリボヌクレオチドまたはピリミジンデオキシヌクレオチドであり、上記ピリミジンヌクレオチドは、２’位において好ましくは２’−水素、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−Ｏ−フルオロによって化学的に修飾された核酸塩基を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項２１】
上記標的化配列は、請求項９〜１１のいずれか一項に規定の核酸配列を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項２２】
上記リクルート部分は、少なくとも一つのカップリング剤を含み、上記カップリング剤は当該カップリング剤に結合する部分を有するデアミナーゼをリクルート可能であり、上記カップリング剤は、好ましくは、上記標的化配列の５’末端または３’末端に共有結合し、あるいは、上記標的化配列内の内部ヌクレオチドに共有結合する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項２３】
上記カップリング剤は、Ｏ６−ベンジルグアニン、Ｏ２−ベンジルシトシン、クロロアルカン、１ｘＢＧ、２ｘＢＧ、４ｘＢＧ、およびこれらのいずれかのバリアントからなる群より選ばれる、請求項２２に記載の人工核酸。
【請求項２４】
上記カップリング剤に結合する上記部分は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ、ＣＬＩＰ−ｔａｇ、ＨａｌｏＴａｇ、およびこれらのいずれか一つの断片またはバリアントからなる群より選ばれる、請求項２２または２３に記載の人工核酸。
【請求項２５】
上記リクルート部分は、Ｏ６−ベンジルグアニン、１ｘＢＧ、２ｘＢＧ、４ｘＢＧ、またはこれらのいずれか一つのバリアントを含み、上記デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼは、ＳＮＡＰ−ｔａｇまたはその断片もしくはバリアントを含み；
上記リクルート部分はクロロアルカンを含み、上記デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼは、ＨａｌｏＴａｇまたはその断片もしくはバリアントを含み；または
上記リクルート部分は、Ｏ２−ベンジルシトシンまたはそのバリアントを含み、上記デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼは、Ｃｌｉｐ−ｔａｇまたはその断片もしくはバリアントを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項２６】
上記リクルート部分は、二つ以上のデアミナーゼ分子をリクルート可能なカップリング剤を含み、上記カップリング剤は好ましくは２ｘＢＧ、４ｘＢＧ、およびこれらのいずれか一つのバリアントから選ばれ；および／または
上記リクルート部分は、カップリング剤の少なくとも二つの部分を含み、上記少なくとも二つの部分とは、同じカップリング剤または異なるカップリング剤を表す、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項２７】
上記リクルート部分は、上記デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼに特異的に結合可能な核酸配列を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項２８】
上記リクルート部分は、上記デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼのｄｓＲＮＡ結合ドメインに特異的に結合可能な核酸配列を含む、請求項２７に記載の人工核酸。
【請求項２９】
上記リクルート部分は、分子内において塩基対を形成可能な、好ましくはステムループ構造を形成可能な核酸配列を含む、請求項１〜２１、２７、および２８のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項３０】
上記ステムループ構造は、少なくとも二つのミスマッチを含む二重らせんステムを含む、請求項２９に記載の人工核酸。
【請求項３１】
上記ステムループ構造は、３個〜８個、好ましくは４個〜６個、より好ましくは５個、のヌクレオチドからなるループを含み、上記ループは好ましくは核酸配列ＧＣＵＡＡまたはＧＣＵＣＡを含む、請求項２９または３０に記載の人工核酸。
【請求項３２】
上記リクルート部分は、少なくとも一つのヌクレオチドを含む核酸配列を含み、上記核酸塩基は化学的に修飾され、および／または
上記核酸配列は少なくとも一つの骨格修飾を含む、請求項１〜２１および２７〜３１のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項３３】
上記リクルート部分は、２’位において化学的に修飾された少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む核酸配列を含む、請求項３２に記載の人工核酸。
【請求項３４】
上記化学的に修飾されたヌクレオチドは、２’位の炭素原子において置換基を含み、上記置換基は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれ、好ましくは２’−水素、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロより選ばれ；および／または
上記化学的に修飾されたヌクレオチドは、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチド、または（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチドである、請求項３３に記載の人工核酸。
【請求項３５】
上記リクルート部分は少なくとも一つの骨格修飾を含む核酸配列を含み、二つの隣接するヌクレオチドの糖を連結する上記リン酸基は、修飾リン酸基であり、好ましくは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ハイドロジェンホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネート、およびホスホトリエステルからなる群より選ばれる、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項３６】
上記リクルート部分は核酸配列を含み、上記ヌクレオチドの少なくとも４０％が２’位において化学的に修飾されている、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項３７】
上記リクルート部分は核酸配列を含み、上記核酸配列の５’末端における五つのヌクレオチドのうち少なくとも二つがホスホロチオエート基を含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項３８】
上記リクルート部分は核酸配列を含み、上記核酸配列の５’末端における五つのヌクレオチドのうち少なくとも二つが、ＬＮＡヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド、または（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチドである、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項３９】
上記リクルート部分は、
修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含む少なくとも一つのヌクレオチド；
少なくとも一つのＬＮＡヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド、または（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチド；および
ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−水素、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロより選ばれる置換基を２’位の炭素原子に含む少なくとも一つのヌクレオチド、を含む核酸配列を含む、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項４０】
上記リクルート部分は、
（ａ）５’  ＧＧＵＧＵＣＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣＡＡＵＡＵ−ＧＣＵ  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵＧＵＵＧＵＵＣＵＣ−Ｎｄ−ＵＣＵ−Ｎｂ−ＣＵＣＧＡＣＡＣＣ  ３’（配列番号３８）；
（ｂ）５’  ＧｓＧｓＵＧＵＣＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣＡＡＵＡＵ−ＧＣＵ  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵＧＵＵＧＵＵＣＵＣ−Ｎｄ−ＵＣＵ−Ｎｂ−ＣＵＣＧＡＣＡＣＣ  ３’（配列番号３９）；および
（ｃ）５’  ＧｓｌＧｓｌＵＧＵＣＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣＡＡＵＡＵ−ＧＣＵ  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵＧＵＵＧＵＵＣＵＣ−Ｎｄ−ＵＣＵ−Ｎｂ−ＣＵＣＧＡＣＡＣＣ  ３’（配列番号４０）、からなる群より選ばれる核酸配列、
またはそれらの核酸配列のいずれかの断片もしくはバリアント、を含み、
ここで、
ＮａおよびＮｂはミスマッチを形成し、好ましくは、Ｎａはアデノシンであり、Ｎｂはシチジンであり；
ＮｃおよびＮｄはミスマッチを形成し、好ましくはＮｃおよびＮｄはグアノシンであり；
Ｇｓはホスホロチオエート基を含むグアノシンであり；
Ｇｓｌはホスホロチオエート基を含むＬＮＡグアノシンである、請求項１〜２１および２７〜３９のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項４１】
上記リクルート部分は、ＶＡ  ＲＮＡ  Ｉまたはその断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含む、請求項１〜２１および２７〜３９のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項４２】
上記リクルート部分は、核酸配列ＧＣＡＣＡＣＣＴＧＧＧＴＴＣＧＡＣＡＣＧＣＧＧＧＣＧＧＴＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＡＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＣＣＧＧＡＴＴＣＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＧＴＣＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＡＴＡＣＣＣＴＴＧＣ（配列番号４１）またはその断片もしくはバリアントを含む、請求項１〜２１、２７〜３９、および４１のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項４３】
上記リクルート部分は請求項４０〜４２に規定する核酸配列を含み、少なくとも一つのヌクレオチド、好ましくは少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％のヌクレオチドは、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−水素、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロより選ばれる置換基を２’位の炭素原子において含む、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項４４】
上記リクルート部分は、
（ａ）５’  Ｇ＊Ｇ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｃ＊ＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣ＊ＡＡＵ＊ＡＵ＊−ＧＣ＊Ｕ＊  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵ＊ＧＵ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊−Ｎｄ−Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊−Ｎｂ＊−Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊ＧＡＣ＊ＡＣ＊Ｃ＊  ３’（配列番号４２）；
（ｂ）５’  Ｇｓ＊Ｇｓ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｃ＊ＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣ＊ＡＡＵ＊ＡＵ＊−ＧＣ＊Ｕ＊  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵ＊ＧＵ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊−Ｎｄ−Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊−Ｎｂ＊−Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊ＧＡＣ＊ＡＣ＊Ｃ＊  ３’（配列番号４３）；および
（ｃ）５’  Ｇｓｌ＊Ｇｓｌ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｃ＊ＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣ＊ＡＡＵ＊ＡＵ＊−ＧＣ＊Ｕ＊  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵ＊ＧＵ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊−Ｎｄ−Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊−Ｎｂ＊−Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊ＧＡＣ＊ＡＣ＊Ｃ＊  ３’（配列番号４４）、からなる群より選ばれる核酸配列、
またはこれらの配列のいずれかの断片もしくはバリアント、を含み、
ここで、
ＮａおよびＮｂはミスマッチを形成し、好ましくは、Ｎａはアデノシンであり、Ｎｂはシチジンであり；
ＮｃおよびＮｄはミスマッチを形成し、好ましくはＮｃおよびＮｄはグアノシンであり；
Ｇｓはホスホロチオエート基を含むグアノシンであり；
Ｇｓｌはホスホロチオエート基を含むＬＮＡグアノシンであり；
アスタリスク（＊）は、ヌクレオチドが２’位の炭素原子において、好ましくは２’−水素、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−フルオロによって修飾されていることを示す、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項４５】
標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸であって、
ａ）上記標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的なまたは部分的に相補的な核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなる標的化配列と、
ｂ）デアミナーゼをリクルートするリクルート部分と、を含み、上記リクルート部分は、上記デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼに特異的に結合可能な核酸配列を含み、
上記リクルート部分は、請求項２７〜４４に規定する特徴のいずれか一つによって特徴付けられる、人工核酸。
【請求項４６】
上記人工核酸の細胞内取り込みを増強する部分をさらに含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項４７】
上記細胞内取り込みを増強する部分は、好ましくは上記人工核酸の３’末端または５’末端とコンジュゲートする、トリアンテナ型Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ３）である、請求項４６に記載の人工核酸。
【請求項４８】
請求項１〜４７において規定した上記リクルート部分および上記標的化配列を５’から３’への方向に含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項４９】
ＲＮＡである、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項５０】
上記デアミナーゼは、
好ましくは、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、およびそれらの断片またはバリアントからなる群より選ばれるアデノシンデアミナーゼまたはその断片もしくはバリアント、より好ましくはアデノシンデアミナーゼドメインを含むペプチドまたはタンパク質；または
シチジンデアミナーゼまたはその断片もしくはバリアント、好ましくはＡｐｏｂｅｃ１またはその断片もしくはバリアント、より好ましくはシチジンデアミナーゼドメインを含むペプチドまたはタンパク質である、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項５１】
上記デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ、好ましくは真核生物のアデノシンデアミナーゼ、より好ましくは脊椎動物のアデノシンデアミナーゼ、さらにより好ましくは哺乳類のアデノシンデアミナーゼ、最も好ましくはヒトのアデノシンデアミナーゼであり、または、シチジンデアミナーゼ、好ましくは真核生物のシチジンデアミナーゼ、より好ましくは脊椎動物のシチジンデアミナーゼ、さらにより好ましくは哺乳類のシチジンデアミナーゼ、さらにより好ましくはマウスまたはヒトのシチジンデアミナーゼ、最も好ましくはｍＡｐｏｂｅｃ１である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項５２】
上記部位特異的編集は、上記標的配列におけるアデノシンまたはシチジンの脱アミノ反応を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の人工核酸。
【請求項５３】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸をコ−ドするベクター。
【請求項５４】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸または請求項５３に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項５５】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸、請求項５３に記載のベクター、または請求項５４に記載の細胞、および追加の賦形剤、好ましくは薬学的に許容される賦形剤、を含む、組成物。
【請求項５６】
上記人工核酸または上記ベクターを、ナノ粒子、好ましくは脂質ナノ粒子またはリポソーム、の形態で含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
上記人工核酸または上記ベクターは、カチオン性化合物によって複合体化されている、請求項５５または５６に記載の組成物。
【請求項５８】
上記カチオン性化合物はカチオン性脂質である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸、請求項５３に記載のベクター、請求項５４に記載の細胞、または請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物、を含む、キット。
【請求項６０】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸、請求項５３に記載のベクター、請求項５４に記載の細胞、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５９に記載のキットの、標的ＲＮＡの部位特異的編集における使用。
【請求項６１】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸、請求項５３に記載のベクター、請求項５４に記載の細胞、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５９に記載のキットの、疾患または障害のインビトロ診断における使用。
【請求項６２】
標的ＲＮＡを請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸に接触させる工程を含む、標的ＲＮＡの部位特異的編集方法。
【請求項６３】
医薬品として使用するための、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸、請求項５３に記載のベクター、請求項５４に記載の細胞、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５９に記載のキット。
【請求項６４】
感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患または障害からなる群より選ばれる疾患または障害の治療または予防に使用するための、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸、請求項５３に記載のベクター、請求項５４に記載の細胞、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５９に記載のキット。
【請求項６５】
疾患または障害の治療または予防に使用するためのものであって、上記治療または予防は標的ＲＮＡの部位特異的編集工程を含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸、請求項５３に記載のベクター、請求項５４に記載の細胞、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５９に記載のキット。
【請求項６６】
好ましくは感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患または障害からなる群より選ばれる疾患または障害の診断に使用するための、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸、請求項５３に記載のベクター、請求項５４に記載の細胞、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項５９に記載のキット。
【請求項６７】
疾患または障害を有する被験体を治療する方法であって、上記方法は、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の人工核酸、請求項５３に記載のベクター、請求項５４に記載の細胞、または請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物を、上記被験体に有効量投与する工程を含む、方法。
【請求項６８】
上記疾患または上記障害は、感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患または障害からなる群より選ばれる、請求項６７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸に関する。特に、本発明は、内因性デアミナーゼを利用することによって内因性転写産物を部位特異的に編集することができる人工核酸を提供する。さらに、本発明は、特に本明細書に記載の修飾パターンにしたがって化学的に修飾された標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸を提供する。本発明はまた、上記人工核酸をコードするベクター、および上記人工核酸を含む組成物を含む。また、本発明は、標的ＲＮＡの部位特異的編集またはインビトロ診断のための人工核酸、組成物またはベクターの使用を提供する。さらに、本明細書に記載の人工核酸、組成物またはベクターは、医薬品としての使用のために、または疾患もしくは障害の診断における使用のために提供される。
【０００２】
〔背景技術〕
従来の遺伝子治療では、遺伝情報は典型的にはＤＮＡレベルで操作され、したがってゲノムを永久的に変化させる。用途に応じて、ゲノムの持続的な修飾は、有利であるか、または深刻なリスクを伴うかのいずれかであり得る。この点において、ＤＮＡの代わりにＲＮＡを標的化することは、魅力的な代替アプローチと言える。ＲＮＡレベルで被験体を治療する場合、遺伝子発現の変化は通常可逆的であり、調整可能であり、かつ、非常に多くの場合、より効率的でもある。一方では、効果の持続時間が限られることにより、有害な副作用に関連するリスクも制限される。また、効果を微調整できる場合、時間・用量依存的に治療法を継続的に調整し、有害作用を制御することが可能となる。さらに、例えば、遺伝子欠損が致死的であるか、または重複した処理によって容易に補償される場合、遺伝子発現の多くの操作はゲノムレベルでは実行不可能であるか、または効果がない。例えば、ＲＮＡレベルでシグナル伝達ネットワークを標的とすることは特に魅力的であると思われる。多くのシグナル伝達の合図は必須であるかまたは大幅に重複しているので、ノックアウトが明確な表現型をもたらさない場合がある一方、ノックダウンは明確な表現型をもたらす場合もある。
【０００３】
したがって、ＲＮＡ標的化ストラテジーの設計に対する関心が高まっている。そのようなストラテジーの一つはＲＮＡ編集である。アデノシン（Ａ）−イノシン（Ｉ）ＲＮＡ編集は、トランスクリプトームを多様化するための天然の酵素メカニズムである。イノシンは生物化学的にグアノシンと解釈されるので、ＡからＩへの編集は形式的に(formally)ＡからＧへの変異を導入し、とりわけ、アミノ酸コドン、開始コドンおよび終止コドンの再コード化、スプライシングの変化、およびｍｉＲＮＡ活性の変化がもたらされ得る。このような酵素活性を選択された転写産物の特定の部位に標的化することは、部位特異的ＲＮＡ編集と呼ばれるストラテジーであり、疾患の治療や、タンパク質やＲＮＡの機能の研究全般において大きな期待が寄せられている。改変デアミナーゼに基づくＲＮＡ編集ストラテジーが開発されている（例えば、Vogel, P., Schneider, M.F., Wettengel, J., Stafforst, T. Improving Site-Directed RNA Editing In Vitro and in Cell Culture by Chemical Modification of the GuideRNA. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 6267-6271 (2014)参照）。しかしながら、治療の場では、ＲＮＡに作用する広く発現した内因性デアミナーゼの利用が最も魅力的と思われる。それにより、任意の（改変された）タンパク質の異所性発現を必要とせずに、オリゴヌクレオチド薬物のみの投与によって、トランスクリプトームに特定の変異を導入することが可能になると考えられる。例えば、Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌら（Wettengel, J., Reautschnig, J., Geisler, S., Kahle, P. J., Stafforst, T. Harnessing human ADAR2 for RNA repair - Recoding a PINK1 mutation rescues mitophagy. Nucl. Acids Res. 45, 2797-2808 (2017)）は、人工タンパク質を必要とせずに、細胞ＡＤＡＲ２を使用するシステムを報告している。また、部位特異的ＲＮＡ編集のためのオリゴヌクレオチドコンストラクトが、国際特許出願ＷＯ２０１６／０９７２１２およびＷＯ２０１７／０１０５５６に記載されている。また、ドイツ特許ＤＥ１０  ２０１５  ０１２  ５２２  Ｂ３には、部位特異的ＲＮＡ編集のためのガイドＲＮＡ分子が記載されている。
【０００４】
しかしながら、当該技術分野で知られているストラテジーには同様の問題がある。つまり、一方では、十分なＲＮＡ編集を提供するために十分に効率的にデアミナーゼ、特に内因性デアミナーゼをリクルートすることが困難であることが判明した。他方、効率的な編集は典型的には低特異性、例えば、トランスクリプトーム全体にわたる多数の標的外編集を伴う。これは、本明細書でＥ／Ｑと呼ばれる既知の過剰活性変異体（Kuttan A, Bass BL: Mechanistic insights into editing-site specificity of ADARs. Proceedings of the National Academy of Sciences 2012, 109:E3295-E3304）が効率およびコドン範囲を改善するために適用された場合に特に当てはまる。
【０００５】
したがって、高い編集収率および高い特異性を可能にするＲＮＡ編集ストラテジーが緊急に必要とされている。特に、内因性デアミナーゼをリクルートするのに適し、標的外編集をもたらさない化合物が必要とされている。
【０００６】
本発明は、したがって、編集対象のＲＮＡ標的にデアミナーゼ、好ましくは内因性デアミナーゼ、例えばアデノシンデアミナーゼをリクルートすることができる化合物を提供することを目的とする。特に、本発明は、高効率、高特異性、特に、標的外編集の割合が低下した、ＲＮＡ標的の編集に適した化合物を提供することを目的とする。したがって、改善されたＲＮＡ編集アプローチが提供され、これにより、好ましくは他のゲノム部位での非特異的編集の減少の有無にかかわらず、標的ＲＮＡ中の特異的に標的化された部位での高収率なＲＮＡ編集が可能となる。本発明の別の特定の目的は、内因性デアミナーゼを利用する、好ましくは前述の利点を特徴とするＲＮＡ編集システムを提供することである。
【０００７】
上記課題の解決は、本明細書に記載され、特許請求の範囲によって定義される実施形態によって達成される。
【０００８】
〔本発明の詳細な説明〕
［部位特異的ＲＮＡ編集のための人工核酸］
第一の態様において、本発明は、標的ＲＮＡの部位特異的編集のための新規な人工核酸に関する。特に、本明細書における標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸は、
ａ）標的ＲＮＡ中の標的配列(target sequence)に相補的なまたは部分的に相補的な核酸配列を含む標的化配列(targeting sequence)と、
ｂ）デアミナーゼをリクルートするリクルート部分(recruiting moiety)と、を含む人工核酸であって、
上記標的化配列は、核酸塩基が化学的に修飾された少なくとも一つのヌクレオチドを含み、
および／または
上記標的化配列は少なくとも一つの骨格修飾を含む。
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載の人工核酸、特に本明細書に規定する化学的に修飾された標的化配列を含む人工核酸が、デアミナーゼ、特に内因性デアミナーゼをＲＮＡ標的にリクルートし、ヌクレオチド、好ましくはアデノシンヌクレオチドまたはシチジンヌクレオチドを当該ＲＮＡ中の標的部位で特異的に編集することができることを見出した。有利なことに、標的ＲＮＡが本明細書に記載の人工核酸によって高効率で編集され、したがって、編集された標的ＲＮＡが高収率に得られる。驚くべきことに、人工核酸を使用することによって、ＲＮＡ編集収率の増加が達成され、それにもかかわらず、望ましくない標的外編集を回避することができる。したがって、本明細書に記載の人工核酸は、高効率および高特異性を両立させた部位特異的ＲＮＡ編集を可能にする。本発明者らは、この人工核酸が幅広い種類の転写産物（例えば、ハウスキーピング遺伝子の内因性ｍＲＮＡ、ならびに疾患関連遺伝子の内因性転写産物（ＳＴＡＴ１またはＳＥＲＰＩＮＡ１など））を編集するのに適していることを見出した。有利なことに、本発明に係るシステムは、不死化細胞株および腫瘍細胞株からいくつかの初代ヒト細胞に及ぶ多種多様な細胞に適用可能であることが判明した。本発明者らはさらに、本発明に係る人工核酸が、例えば、血清中での劣化に対しても特に抵抗性を有することを観察した。いかなる仮説にも束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載の人工核酸の改良された安定性は、上記の有利な効果に寄与すると考えられる。
【００１０】
本明細書において使用される場合、「人工核酸（分子）」という表現は、典型的には天然には存在しない核酸を指す。言い換えれば、人工核酸分子は、非天然核酸分子であってもよい。このような人工核酸分子は、その個々の配列（自然には存在しない配列）のために、および／またはこれに関して自然には存在しないヌクレオチドの他の修飾、例えば、構造的な修飾のために、非天然であり得る。本明細書において使用される場合、人工核酸は、好ましくは少なくとも一つのヌクレオチドが、またはヌクレオチドの少なくとも一つの修飾によって、天然に存在する核酸とは異なる。人工核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含むハイブリッド分子であり得る。好ましい実施形態では、人工核酸はＲＮＡ分子であり、好ましくは一つ以上の２’−デオキシヌクレオチドを含む。特に、本明細書で使用される人工核酸は、（修飾されていないまたは修飾された）リボヌクレオチドおよび／または（修飾されていないまたは修飾された）デオキシヌクレオチドを含み得る。典型的には、人工核酸は、ヌクレオチドの所望の人工配列（非相同配列）に対応するように、または本明細書に記載の所望の人工修飾パターンを有する核酸配列に対応するように、遺伝子工学的方法によって設計および／または生成され得る。さらに、「人工核酸（分子）」という表現は、「単一分子」に限定されず、同一の分子の集合も指す場合がある。したがって、この表現は、例えば、サンプル中に含まれる複数の同一の分子を指し得る。
【００１１】
本発明との関係において、「ＲＮＡ編集」という表現は、標的ＲＮＡ中のヌクレオチド、好ましくはアデノシンヌクレオチドまたはシチジンヌクレオチドが脱アミノ化反応によって別のヌクレオチドに変換される反応を指す。変化したヌクレオチドは好ましくはコドンの変化をもたらし、例えばＲＮＡから翻訳されたポリペプチドへの別のアミノ酸の組み込みまたは終止コドンの生成もしくは欠失をもたらすので、その変化は典型的には異なる遺伝子産物をもたらす。特に、標的ＲＮＡ中のアデノシンヌクレオチドは、脱アミノ化によって、例えば本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼによってイノシンに変換される。別の実施形態において、標的ＲＮＡ中のシチジンヌクレオチドはウリジンヌクレオチドに変換される。本明細書で使用される「標的ＲＮＡ」という用語は、典型的には本明細書に記載の人工核酸によって支持される編集反応に供されるＲＮＡを指す。
【００１２】
本明細書に記載の人工核酸によって達成されるＲＮＡ編集はさらに「部位特異的」であり、これは標的ＲＮＡ中の標的部位における特定のヌクレオチドが好ましくは他のヌクレオチドを編集することなく、または本質的に編集することなく編集されることを意味する。典型的には標的部位のヌクレオチドが本明細書に記載の人工核酸の標的化配列によって標的化され、ここで、標的化配列は好ましくは生理学的条件下で、標的配列と特定の塩基対を形成することができる。したがって、本発明との関係において、「標的配列」という表現は、典型的には人工核酸の標的化配列に（少なくとも部分的に）相補的である核酸配列に関して使用される。標的配列は標的部位を含み、ここで、当該標的部位は、典型的には編集対象のヌクレオチド（好ましくはアデノシンヌクレオチドまたはシチジンヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、標的部位が編集対象の二つ以上のヌクレオチドを含んでもよく、ここで、これらのヌクレオチドは好ましくは少なくとも一つ、好ましくは二つの他のヌクレオチドだけ互いに離れている。本明細書で使用される場合、「相補的」または「部分的に相補的」という用語は、好ましくはそれらの相補的なヌクレオチドのために、好ましくは生理学的条件下で、特定の分子間塩基対形成、好ましくはワトソン−クリック塩基対形成が可能である核酸配列を指す。本明細書で使用される「相補的」という用語は、逆相補的配列を指すこともある。本明細書に記載の人工核酸はまた、人工核酸が典型的には標的ＲＮＡ中の核酸配列のアンチセンスを表す標的化配列中の核酸配列を含むので、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＡＳＯ」と本明細書中で称され得る。したがって、標的化配列は好ましくは配列特異的様式で、リクルート部分およびデアミナーゼを標的ＲＮＡ中の標的部位に導く。本発明との関係において、「ガイドＲＮＡ」という用語は、好ましくはデアミナーゼ機能を標的部位に導く人工核酸を指すために使用されてもよい。
【００１３】
本発明との関係において、「リクルート部分」という用語は、デアミナーゼをリクルートし、典型的には標的化配列に共有結合される、本明細書に記載の人工核酸の部分を指す。したがって、「リクルート部分」は、標的ＲＮＡ中の標的部位へデアミナーゼをリクルートし、ここで、標的ＲＮＡ（および標的部位）は、好ましくは標的化配列によって配列特異的な様式で認識され、そして結合される。特定の実施形態において、リクルート部分はデアミナーゼをリクルート可能な少なくとも一つのカップリング剤を含むかまたはそれからなり、ここで、そのデアミナーゼは当該カップリング剤に結合する部分を含む。デアミナーゼをリクルートするカップリング剤は、典型的には標的化配列に共有結合している。好ましくは、カップリング剤は標的化配列の５’末端または３’末端に連結される。あるいは、カップリング剤が標的化配列の内部ヌクレオチド（つまり、５’または３’末端ヌクレオチド以外）に、例えば、ヌクレオチドバリアントまたは修飾ヌクレオチド（好ましくはアミノチミジンなどの本明細書に記載のもの）への結合を介して連結されていてもよい。さらなる実施形態では、リクルート部分はデアミナーゼ、好ましくはデアミナーゼの二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ結合ドメインに特異的に結合することができる核酸配列を含む。リクルート部分の上記核酸配列は、典型的には標的化配列の５’末端または３’末端のいずれか、好ましくは標的化配列の５’末端に共有結合している。特定の実施形態において、本明細書に記載の人工核酸は、本明細書に記載の標的化配列および本明細書に記載の少なくとも二つのリクルート部分を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、人工核酸は、当該人工核酸の細胞内取り込みを増強する部分を含む。好ましくは、上記細胞内取り込みを増強する部分は、好ましくは人工核酸の３’末端または５’末端と接合するトリアンテナ型Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ３）である。
【００１５】
本発明に係る人工核酸はその長さが限定されるものではなく、例えば、オリゴヌクレオチドであってもよい。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は短い核酸分子（例えば、６量体または１０量体）ならびにより長いオリゴヌクレオチド（例えば、１００個または２００個ものヌクレオチドを含む核酸分子）を指し得るものであり、ここで、オリゴヌクレオチドは、（修飾されていないまたは修飾された）リボヌクレオチドおよび／または（修飾されていないまたは修飾された）デオキシヌクレオチドを含み得る。好ましい実施形態によれば、人工核酸は、少なくとも約１５個、好ましくは少なくとも約２０個、より好ましくは少なくとも約２５個、さらにより好ましくは少なくとも約３０個、さらにより好ましくは少なくとも約３５個、最も好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチドを含む。あるいは、人工核酸の長さは、約１０個〜約２００個のヌクレオチド、好ましくは約１５個〜約１００個のヌクレオチド、より好ましくは約１５個〜約７０個のヌクレオチド、最も好ましくは約２０個〜約７０個のヌクレオチドの範囲である。
【００１６】
本明細書に記載の人工核酸は、好ましくは一本鎖（ｓｓ）核酸分子である。好ましい実施形態では、人工核酸は生理学的条件下で二本鎖（ｄｓ）領域を含む一本鎖核酸である。好ましくは、人工核酸はリクルート部分内に二本鎖領域を含む一本鎖核酸である。
【００１７】
人工核酸の標的化配列は、典型的には標的ＲＮＡ中の核酸配列に対して、好ましくは標的部位におけるヌクレオチドの５’位に隣接する核酸配列および３’位に隣接する核酸配列に対して、相補的または少なくとも部分的に相補的な核酸配列を含む。好ましくは、標的化配列は標的ＲＮＡ中の核酸配列に相補的または少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％相補的な核酸配列を含み、ここで、標的ＲＮＡ中の相補的核酸配列は標的部位を含み、好ましくは少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２２個、少なくとも２５個または少なくとも３０個のヌクレオチドを含む。好ましくは、人工核酸の標的化配列は、特に生理学的条件下で、本質的に一本鎖の核酸として存在する。
【００１８】
本明細書に記載の人工核酸は、当該技術分野で知られている方法によって合成され得る。好ましくは、人工核酸は、好ましくは本明細書に記載のように、好適なベクターから化学的に、またはインビトロ転写によって合成される。特に明記しない限り、本明細書における核酸配列は、５’〜３’に印字される。言い換えれば、本明細書に印字された核酸配列中の最初のヌクレオチド残基は、特に明記しない限り、当該核酸配列の５’末端である。アミノ酸配列は、特に明記しない限り、Ｎ末端からＣ末端に印字されている。
【００１９】
［化学修飾］
本発明に係る人工核酸は、典型的には化学的に修飾されている。本明細書で使用される場合、「化学修飾」という用語は、好ましくは、脱塩基部位を含む、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾から選択される化学修飾を指す。本発明に関して、「化学的に修飾された核酸」は、少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む核酸を指し得る。
【００２０】
人工核酸は、好ましくは少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む標的化配列を含む。より好ましくは、標的化配列は複数の化学的に修飾されたヌクレオチドを含み、好ましくは本明細書に記載の標的化配列の修飾パターンをもたらす。別の実施形態において、人工核酸はデアミナーゼに特異的に結合することができる核酸配列を含むリクルート部分を含み、ここで、当該リクルート部分は、少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、リクルート部分中の核酸配列は、複数の化学的に修飾されたヌクレオチドを含み、好ましくは、本明細書に記載のリクルート部分の核酸配列の修飾パターンをもたらす。特に好ましい実施形態によれば、人工核酸は、本明細書に記載の化学的に修飾された標的化配列と、本明細書に記載の化学的に修飾された核酸配列を含むリクルート部分とを含む。
【００２１】
一般に、本発明の人工核酸分子は、天然の（＝自然界に存在する）ヌクレオチドならびに化学的に修飾されたヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、一般に、（修飾されていないおよび修飾された）リボヌクレオチド、ならびに（修飾されていないおよび修飾された）デオキシヌクレオチドを含む。したがって、「ヌクレオチド」という用語は、好ましくはアデノシン、デオキシアデノシン、グアノシン、デオキシグアノシン、５−メトキシウリジン、チミジン、ウリジン、デオキシウリジン、シチジン、デオキシシチジンまたはそれらのバリアントを指す。また、本明細書において「ヌクレオチド」に言及する場合、それぞれのヌクレオシドも同様に含まれることが好ましい。
【００２２】
この点において、ヌクレオチドの「バリアント」は、典型的にはヌクレオチドの天然または人工バリアントである。したがって、バリアントは、好ましくは天然ヌクレオチドに対して付加または欠失し、またはヌクレオチドの天然に存在する官能基を置換する、非天然官能基を有する化学的に誘導体化されたヌクレオチドである。したがって、このようなヌクレオチドバリアントにおいて、天然ヌクレオチド（好ましくはリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチド）の各部分は修飾されてもよく、つまり、塩基部分、糖（リボース）部分および／または人工核酸の骨格を形成するリン酸部分は、好ましくは本明細書に記載の修飾によって修飾されてもよい。したがって、「（ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチドなどの）バリアント」という用語もまた、好ましくは本明細書に記載の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
【００２３】
本明細書において使用される場合、化学的に修飾されたヌクレオチドは、好ましくは、グアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、およびシトシンのバリアントであり、例えばアセチル化、メチル化、ヒドロキシル化などによって化学的に改変された天然のまたは非天然のいずれかのグアノシン、ウリジン、アデノシン、チミジン、またはシチジンが挙げられるがこれらに限定されず、１−メチル−アデノシン、１−メチル−グアノシン、１−メチル−イノシン、２，２−ジメチル−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン、２’−アミノ−２’−デオキシグアノシン、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド、２−アミノプリン−リボシド、２’−アラアデノシン、２’−アラシチジン、２’−アラウリジン、２’−アジド−２’−デオキシアデノシン、２’−アジド−２’−デオキシシチジン、２’−アジド−２’−デオキシグアノシン、２’−アジド−２’−デオキシウリジン、２−クロロアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、２’−フルオロ−２’−デオキシグアノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、２’−フルオロチミジン、２−メチル−アデノシン、２−メチル−グアノシン、２−メチル−チオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−２−アミノアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシシチジン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルイノシン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、２−チオシチジン、２−チオ−シチジン、３−メチル−シチジン、４−アセチル−シチジン、４−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−アミノアリルシチジン、５−アミノアリル−デオキシウリジン、５−ブロモウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−クロロ−アラ−シトシン、５−フルオロ−ウリジン、５−ヨードウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン、５−メトキシ−ウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン、６−アザシチジン、６−アザウリジン、６−クロロ−７−デアザ−グアノシン、６−クロロプリンリボシド、６−メルカプト−グアノシン、６−メチル−メルカプトプリン−リボシド、７−デアザ−２’−デオキシ−グアノシン、７−デアザアデノシン、７−メチル−グアノシン、８−アザアデノシン、８−ブロモ−アデノシン、８−ブロモ−グアノシン、８−メルカプト−グアノシン、８−オキソグアノシン、ベンズイミダゾール−リボシド、ベータ−Ｄ−マンノシル−クエオシン、ジヒドロ−ウリジン、イノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、Ｎ６−（［６−アミノヘキシル］カルバモイルメチル）−アデノシン、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン、Ｎ６−メチル−アデノシン、Ｎ７−メチル−キサントシン、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ピューロマイシン、クエオシン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトキソシン、キサントシン、およびキシロ−アデノシン、が挙げられる。そのようなバリアントの調製方法は当業者にとって公知であり、例えば、米国特許ＵＳ４，３７３，０７１、ＵＳ４，４０１，７９６、ＵＳ４，４１５，７３２、ＵＳ４，４５８，０６６、ＵＳ４，５００，７０７、ＵＳ４，６６８，７７７、ＵＳ４，９７３，６７９、ＵＳ５，０４７，５２４、ＵＳ５，１３２，４１８、ＵＳ５，１５３，３１９、ＵＳ５，２６２，５３０、または５，７００，６４２に記載されている。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の人工核酸は、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸、２−アミノプリン−リボシド−５’−三リン酸、２−アミノアデノシン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−三リン酸、２−チオシチジン−５’−三リン酸、２−チオウリジン−５’−三リン酸、２’−フルオロチミジン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチル−イノシン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン−５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン−５’−三リン酸、５−ブロモシチジン−５’−三リン酸、５−ブロモウリジン−５’−三リン酸、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、５−ヨードシチジン−５’−三リン酸、５−ヨード−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、５−ヨードウリジン−５’−三リン酸、５−ヨード−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、５−メチルシチジン−５’−三リン酸、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、５−プロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、５−プロピニル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、６−アザシチジン−５’−三リン酸、６−アザウリジン−５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸、７−デアザアデノシン−５’−三リン酸、７−デアザグアノシン−５’−三リン酸、８−アザアデノシン−５’−三リン酸、８−アジドアデノシン−５’−三リン酸、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−三リン酸、プソイドウリジン−５’−三リン酸、ピューロマイシン−５’−三リン酸、またはキサントシン−５’−三リン酸、から選ばれる少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の人工核酸は、ピリジン−４−一リボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、および４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、から選ばれる少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の人工核酸は、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、および４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジンより選ばれる少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
【００２７】
他の実施形態では、本明細書に記載の人工核酸は、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、および２−メトキシ−アデニンより選ばれる少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
【００２８】
他の実施形態では、本明細書に記載の人工核酸は、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンより選ばれる少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
【００２９】
特定の実施形態において、本明細書に記載の人工核酸は、６−アザ−シチジン、２−チオ−シチジン、アルファ−チオ−シチジン、プソイド−イソ−シチジン、５−アミノアリル−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、アルファ−チオ−ウリジン、４−チオ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン、デオキシ−チミジン、５−メチル−ウリジン、ピロロ−シチジン、イノシン、アルファ−チオ−グアノシン、６−メチル−グアノシン、５−メチル−シチジン、８−オキソ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、Ｎ１−メチル−アデノシン、２−アミノ−６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン、プソイド−イソ−シチジン、６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−アデノシン、アルファ−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシンより選ばれる少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。
【００３０】
好ましい実施形態によれば、人工核酸は、２’位が化学的に修飾された、少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。好ましくは、上記化学的に修飾されたヌクレオチドは、２’位の炭素原子において置換基を含み、上記置換基は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれ、好ましくは２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロから選ばれる。人工核酸に関して、特に、人工核酸がＲＮＡまたはリボヌクレオチドを含む分子である場合、デオキシシチジンまたはそのバリアントなどの２’−デオキシヌクレオチド（２’位の炭素原子において置換基として水素を含む）はまた、「化学的に修飾されたヌクレオチド」と呼ばれ得る。
【００３１】
本明細書に記載のヌクレオチドの２’位に関する別の化学修飾は、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチド、および（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチドである。これらの骨格修飾は、修飾ヌクレオチドの糖を好ましいノーザン立体配置(northern conformation)に固定する。人工核酸の標的化配列におけるこの種の修飾の存在によって、標的ＲＮＡへの標的化配列のより強力でより迅速な結合が可能になると考えられる。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、人工核酸は少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含み、ここで、人工核酸分子に組み込まれているリン酸骨格は修飾されている。骨格のリン酸基は、例えば、一つ以上の酸素原子を別の置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載のように、修飾されていないリン酸部分を修飾されたホスフェートで全置換することを含み得る。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ハイドロジェンホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネート、およびホスホトリエステルからなる群が挙げられるが、これらに限定されない。ホスフェートリンカーはまた、結合酸素を窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによっても修飾され得る。
【００３３】
さらに好ましい実施形態によれば、人工核酸は脱塩基部位を含む。本明細書で使用される場合、「脱塩基部位」は、有機塩基を欠くヌクレオチドである。好ましい実施形態において、脱塩基ヌクレオチドは、リボースの２’位に本明細書に記載の化学修飾をさらに含む。好ましくは、リボースの２’位のＣ原子は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロから選ばれる置換基で置換される。好ましい脱塩基部位ヌクレオチドは、以下の構造１Ａまたは１Ｂによって特徴付けられる：
【００３４】
【化１】
2021534732.tif 000002
【００３５】
したがって、本発明に関して、「化学的に修飾されたヌクレオチド」は、脱塩基部位でもあり得る。
【００３６】
他の実施形態によれば、人工核酸分子は、いわゆる「５’キャップ構造」を追加することによって修飾されてもよい。５’キャップは、概して成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップ」する構成要素、典型的には修飾ヌクレオチドの構成要素である。５’キャップは、典型的には、修飾ヌクレオチドによって形成されてもよく、特に、グアニンヌクレオチドの誘導体によって形成されてもよい。好ましくは、５’キャップは、人工核酸の５’末端に対して５’−５’−三リン酸結合を介して連結される。５’キャップは、メチル化されてもよく、例えばｍ７ＧｐｐｐＮであってもよい。ここで、Ｎは、５’キャップを保有する核酸の、５’末端のヌクレオチドであり、通常、ＲＮＡの５’末端である。５’キャップ構造のさらなる例には、以下が含まれる：グリセリル、逆位(inverted)デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環状ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’−セコヌクレオチド、非環状３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環状３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド部分、３’−３’−逆位脱塩基部分、３’−２’−逆位ヌクレオチド部分、３’−２’−逆位脱塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または架橋性もしくは非架橋性メチルホスホネート部分。特に好ましい修飾５’キャップ構造は、ＣＡＰ１（ｍ７Ｇに隣接するヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ２（ｍ７Ｇの下流の２番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ３（ｍ７Ｇの下流の３番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＣＡＰ４（ｍ７Ｇの下流の４番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＡＲＣＡ（アンチ−リバースＣＡＰアナログ）、修飾ＡＲＣＡ（例えば、ホスホチオエート修飾ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンである。
【００３７】
［標的化配列］
本発明に係る人工核酸は、標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的な核酸配列を含む標的化配列を含み、ここで、当該標的化配列は少なくとも一つのヌクレオチドを含み、ここで、核酸塩基は化学的に修飾され、および／または標的化配列は少なくとも一つの骨格修飾を含む。本節では、標的化配列をより詳細に説明する。しかしながら、本明細書の他の節における記載、特に人工核酸およびリクルート部分に関する記載も同様に標的化配列に適用される。特に、そこでの化学修飾の記載は、標的化配列にも関係する。
【００３８】
好ましい実施形態によれば、標的化配列は、２’位が化学的に修飾された、少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。好ましくは、上記化学的に修飾されたヌクレオチドは、２’位の炭素原子において置換基を含み、上記置換基は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれ、好ましくは２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロから選ばれ；および／または、上記化学的に修飾されたヌクレオチドは、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチド、および（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチドからなる群より選ばれる。
【００３９】
好ましくは、人工核酸の標的化配列は少なくとも一つの骨格修飾を含み、ここで、ヌクレオチドは修飾リン酸基を含む。当該修飾リン酸基は、好ましくは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ハイドロジェンホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネート、およびホスホトリエステルからなる群より選ばれ、最も好ましくはホスホロチオエートである。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、標的化配列のヌクレオチドの少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９５％が、好ましくは本明細書に記載の修飾によって２’位において化学的に修飾される。
【００４１】
標的ＲＮＡ中の標的部位（編集対象のヌクレオチド）に対応する位置において、標的化配列は、シチジンヌクレオチドまたはシチジンヌクレオチドのバリアント、好ましくはシチジンリボヌクレオチド、デオキシシチジンヌクレオチド、修飾シチジンリボヌクレオチド、修飾デオキシシチジンヌクレオチド、または脱塩基部位を含む。これに関して、「標的部位に対応する位置」または「編集対象のヌクレオチドに対応する位置」は、標的配列を好ましくは本明細書に記載の特定の塩基対形成によって標的ＲＮＡと並べた場合の、当該標的部位に対向する標的化配列中のヌクレオチドの位置を指す。好ましい実施形態において、標的化配列は、標的部位に対応する位置に、好ましくは本明細書に記載の、シチジンもしくはそのバリアント、デオキシシチジンもしくはそのバリアント、または脱塩基部位を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的部位は、編集対象の二つ以上のヌクレオチドを含み、ここで、これらのヌクレオチドは好ましくは少なくとも一つ、好ましくは二つの他のヌクレオチドだけ互いに離れている。これらの実施形態において、標的化配列は、上述のヌクレオチド、好ましくはシチジンもしくはそのバリアント、デオキシシチジンもしくはそのバリアント、または脱塩基部位を、好ましくは本明細書に記載のように（例えば、配列番号１６の核酸配列に例示するように）、編集対象のヌクレオチドに対応する各位置において含み得る。
【００４３】
好ましい実施形態において、標的部位に対応する５’位または３’位に、好ましくはシチジンヌクレオチドまたはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドまたはそのバリアント、または脱塩基部位の５’位または３’位に位置する二つのヌクレオチドの少なくとも一方、好ましくは両方は、２’位の炭素原子において化学的に修飾されており、ここで、上記２’位の炭素原子は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−水素（２’−デオキシ）、および２’−フルオロからなる群より選ばれる置換基と結合しており、および／または標的部位に対応する位置の、シチジンヌクレオチドまたはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドまたはそのバリアント、または脱塩基部位の５’位または３’位に位置する二つのヌクレオチドの少なくとも一方、好ましくは両方は、修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含む。
【００４４】
驚くべきことに、標的部位に対応するヌクレオチド（好ましくはシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位）を囲む二つのヌクレオチドの少なくとも一つ、好ましくは両方の化学修飾を減少させることによって、標的外編集が減少してＲＮＡ編集反応の特異性が有意に増加し、好ましくは、人工核酸の血清安定性も増加することがわかった。本発明より前は、本分野において、編集対象のヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチド、ならびに標的化配列中の当該ヌクレオチドに隣接する二つのヌクレオチドは、修飾すべきではないと一般に考えられていた。したがって、標的部位に対向するヌクレオチド・トリプレットが本明細書に記載の少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含む人工核酸を使用する場合に、本発明者らによって得られた優れた成果は、なおさら予想外のものであった。
【００４５】
これに関して、上記標的化配列は以下の核酸配列を含むことが特に好ましい。
【００４６】
３’  Ａｓ＊  ｃ  Ｃ＊  ５’
ここで、
Ａｓはアデノシンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはアデノシンリボヌクレオチドまたはデオキシアデノシンヌクレオチドであり、さらにホスホロチオエート基を含み；
ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはシチジン、より好ましくはアデノシン、に対応する位置における、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位であり；
Ｃは、シチジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり；
アスタリスク（＊）は、直前のヌクレオチドが２’位の炭素原子において、２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−フルオロによって化学的に修飾されていることを示す。
【００４７】
いくつかの実施形態では、上記標的化配列は以下の核酸配列を含むことが好ましい。
【００４８】
３’  Ａ  ｃ  Ｃ  ５’
Ａはアデノシンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはアデノシンリボヌクレオチドまたはデオキシアデノシンヌクレオチドであり；
ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはシチジン、より好ましくはアデノシン、に対応する位置における、デオキシシチジンヌクレオチドまたは修飾デオキシシチジンヌクレオチドであり；
Ｃは、シチジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはシチジンリボヌクレオチド、修飾シチジンリボヌクレオチド、デオキシシチジンヌクレオチド、または修飾デオキシシチジンヌクレオチドであり、より好ましくはデオキシシチジンヌクレオチドまたは修飾デオキシシチジンヌクレオチドである。
【００４９】
別の実施形態によれば、上記標的化配列は以下の核酸配列を含む。
【００５０】
３’  Ｕｓ＊  ｃ  Ｃ＊  ５’
ここで、
Ｕｓはウリジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはウリジンリボヌクレオチドまたはデオキシウリジンヌクレオチドであり、さらにホスホロチオエート基を含み；
ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはシチジン、より好ましくはアデノシン、に対応する位置における、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位であり；
Ｃは、シチジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり；
アスタリスク（＊）は、直前のヌクレオチドが２’位の炭素原子において、２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−フルオロによって化学的に修飾されていることを示す。
【００５１】
本明細書に記載の人工核酸の標的化配列の３’末端における五つのヌクレオチドのうち少なくとも二つが、修飾リン酸基、好ましくは本明細書に規定する修飾リン酸基、より好ましくはホスホロチオエート基を含むことがさらに好ましい。
【００５２】
特定の実施形態において、標的配列中の編集対象となるヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはシチジン、より好ましくはアデノシンに対応する位置のヌクレオチドは、脱塩基部位、好ましくは本明細書に記載の脱塩基部位である。このような実施形態は、デアミナーゼが天然（生理学的）標的（標的部位におけるアデノシンまたはシチジンヌクレオチドなど）に対してデアミナーゼの活性を低下させる変異を含む場合に、特に好ましい。このような変異デアミナーゼの例としては、ＡＤＡＲ２変異体、Ｅ４８８Ｙ、Ｅ４８８ＦまたはＥ４８８Ｗが挙げられる。
【００５３】
上述の修飾に代えて、または上述の修飾に加えて、標的化配列の３’末端の五つのヌクレオチドのうち少なくとも二つは、好ましくはＬＮＡヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチドまたは（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチド、より好ましくはＬＮＡヌクレオチドである。
【００５４】
好ましい実施形態において、人工核酸の標的化配列は以下を含む：
修飾リン酸基、好ましくは本明細書に規定の修飾リン酸基、より好ましくはホスホロチオエートヌクレオチドを含む少なくとも一つのヌクレオチド；
少なくとも一つのＬＮＡヌクレオチド；および
ハロゲン、アルコキシ基、水素（２’−デオキシ）、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−水素（２’−デオキシ）、および２’−フルオロより選ばれる置換基を２’位の炭素原子において含む少なくとも一つのヌクレオチド。
【００５５】
特定の実施形態において、人工核酸の標的化配列は、下記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）のいずれか一つに表す修飾パターンによって特徴付けられる：
（Ｉａ）３’  Ｎａ  Ｃ  Ｎｂ  ５’
ここで、
Ｎはヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはリボヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシヌクレオチドもしくはそのバリアントであり、より好ましくは修飾リボヌクレオチドまたは本明細書に記載の修飾デオキシヌクレオチドであり；
Ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチドであり、ここで、Ｃは、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位であり；
ａは１〜４０の範囲、好ましくは６〜１０の範囲の整数であり；
ｂは４〜４０の範囲の整数であり；
ここで、ａ＋ｂは１５〜８０の範囲であり；
（Ｉｂ）３’  Ｎｃ  Ｎｓｄ  Ｎａ  Ｃ  Ｎｂ  Ｎｓｅ  Ｎｆ  ５’
ここで、
Ｎはヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはリボヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシヌクレオチドもしくはそのバリアントであり、より好ましくは修飾リボヌクレオチドまたは本明細書に記載の修飾デオキシヌクレオチドであり；
Ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチドであり、ここで、Ｃは、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位であり；
Ｎｓは修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含むヌクレオチドであり；
ｃは０〜４の範囲の整数であり；
ｄは１〜１０の範囲の整数であり；
ａは１〜２６の範囲の整数であり；
ｂは４〜４０の範囲の整数であり；
ｅは０〜４の範囲の整数であり；
ｆは０〜４の範囲の整数であり；
ここで、ａ＋ｄ＋ｃは１〜４０の範囲であり；
ここで、ｂ＋ｅ＋ｆは４〜４０の範囲であり；
ここで、ａ＋ｄ＋ｃ＋ｂ＋ｅ＋ｆは１５〜８０の範囲であり；
（Ｉｃ）３’  Ｎｃ  Ｎｌｇ  Ｎｈ  Ｎｌｉ  Ｎａ  Ｃ  Ｎｂ  Ｎｌｊ  Ｎｋ  Ｎｌｌ  Ｎｍ  ５’
ここで、
Ｎはヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはリボヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシヌクレオチドもしくはそのバリアントであり、より好ましくは修飾リボヌクレオチドまたは本明細書に記載の修飾デオキシヌクレオチドであり；
Ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチドであり、ここで、Ｃは、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位であり；
ＮｌはＬＮＡヌクレオチドまたは修飾ＬＮＡヌクレオチドであり；
ｃは０〜４の範囲、好ましくは１〜３の範囲の整数であり；
ｇ、ｉは１〜５の範囲の整数であり；
ｈは１〜３０の範囲、好ましくは１〜５の範囲の整数であり；
ａは１〜１５の範囲の整数であり；
ｂは４〜３０の範囲の整数であり；
ｊは０〜５の範囲、好ましくは１〜３の範囲の整数であり；
ｋは４〜３０の範囲の整数であり；
ｌは０〜５の範囲、好ましくは１〜３の範囲の整数であり；
ｍは０〜３の範囲の整数であり；
ここで、ｃ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ａは１〜４０の範囲であり；
ここで、ｂ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍは４〜４０の範囲であり；
ここで、ｃ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ａ＋ｂ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍは１５〜８０の範囲である。
【００５６】
さらに好ましい実施形態によれば、上記標的化配列は、下記式ＩＩ（ａ）〜ＩＩ（ｌ）のいずれか一つから選択される修飾パターンによって特徴付けられる：
（ａ）３’  Ｎｓ４  Ｎ６  Ｃ  Ｎ７−２９  ５’；
（ｂ）３’  Ｎｓ４  Ｎ６−１０  Ｃ  Ｎ９−１２  Ｎｓ２  ５’；
（ｃ）３’  Ｎｓ２  Ｎ１１−１５  Ｃ  Ｎ９−１２  Ｎｓ２  ５’；
（ｄ）３’  Ｎｌｓ２  Ｎｓ２  Ｎｌ  Ｎ６−１０  Ｃ  Ｎ５−９  Ｎｌ２  Ｎ  Ｎｓ２  ５’；
（ｅ）３’  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎ６−１０  Ｃ  Ｎ４−８  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｓ２  ５’；
（ｆ）３’  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎ６−１０  Ｃ  Ｎ３−７  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｌ  Ｎ２  Ｎｓ２  ５’；
（ｇ）３’  Ｎｓ２  Ｎ  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｌ  Ｎ６−１０  Ｃ  Ｎ４−８  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｌ  Ｎ  Ｎｓ２  ５’、
（ｈ）３’  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ２  Ｎｌ  Ｎ５  Ｃ  Ｎ５  Ｎｌ  Ｎ１−２３  ５’；
（ｉ）３’  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎ８  Ｃ  Ｎ６  Ｎｌ  Ｎ１−２３  ５’
（ｊ）３’  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ２  Ｎｌ  Ｎ５  Ｃ  Ｎ５  Ｎｌ  Ｎ２０  Ｎｌ２  ５’；
（ｋ）３’  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎｌｓ  Ｎｓ  Ｎ８  Ｃ  Ｎ６  Ｎｌ  Ｎ２０  Ｎｌ２  ５’；
（ｌ）３’  Ｎｓ４  Ｎ６  Ｃ  Ｎ９  Ｎｓ２  ５’、
ここで、
Ｎはヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはリボヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシヌクレオチドもしくはそのバリアントであり、より好ましくは修飾リボヌクレオチドまたは本明細書に記載の修飾デオキシヌクレオチドであり；
Ｎｓは修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含むヌクレオチドであり；
ＮｌはＬＮＡヌクレオチドまたは修飾ＬＮＡヌクレオチドであり；
ＮｌｓはＬＮＡヌクレオチドまたは修飾ＬＮＡヌクレオチドであり、さらに修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含み；
Ｃは、上記標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチドであり、ここで、Ｃは、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位である。
【００５７】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、ならびに式ＩＩ（ａ）〜（ｌ）は、本明細書に記載の人工核酸の標的化配列の修飾パターンを表す。本明細書で使用される修飾パターンは、標的化配列中の特定の位置での式に示される特定の修飾の存在（または欠如、それぞれ）を指す。それぞれの位置は、上記式、特に標的ＲＮＡ中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置におけるヌクレオチド、好ましくはシチジンもしくはそのバリアント、デオキシシチジンもしくはそのバリアント、または脱塩基部位に対する上記修飾の相対位置から導き出すことができる。上記式は修飾パターンを定義し、これは、式中に定義されるヌクレオチドを含む種々の核酸配列に適用される。特定の標的ＲＮＡを編集するための人工核酸の標的化配列の個々の核酸配列は、常に、その特定の標的ＲＮＡおよび標的部位に依存する。それにもかかわらず、本明細書中で同定される修飾パターンは、特定の核酸配列から独立して適用可能であり、修飾の数および種類ならびにそれらの相対位置を規定する。
【００５８】
なお、これに関して、上記式中で使用される下付きの数字（および変数）は、標的化配列中に存在する特定の型のヌクレオチドの数を示す。例えば、「Ｎ１１−１３」は、標的化配列が（その位置に）に１１個〜１３個（つまり、１１個、１２個または１３個の）ヌクレオチドを含むことを式によって規定している。したがって、この例示的な修飾パターンは、１１個、１２個または１３個のその型のヌクレオチドをその位置に含む核酸配列に適用される。
【００５９】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の人工核酸の標的化配列は、修飾パターンによって特徴付けられ、ここで、
標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置における、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント（好ましくはデオキシシチジンヌクレオチド）、または脱塩基部位を除き、
ＬＮＡヌクレオチドを除き、
任意に、標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置のヌクレオチドに対して５’位または３’位に位置する、二つのヌクレオチドの少なくとも一つを除き、
すべてのヌクレオチドは、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロより選ばれる置換基に結合している、２’位の炭素原子において化学的に修飾される。
【００６０】
特定の実施形態において、人工核酸の標的化配列は、
５’  Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊  ＵｃＡ  Ｇ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ａｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号１）；
５’  Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊  ＵｃＡ  Ｇ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ａｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２）；
５’  Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊  ＡｃＵ  Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号３）；
５’  Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊  ＣｃＡ  Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａ＊  ３’（配列番号４）；
５’  Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ａ＊  ＵｃＵ  Ｕ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ａｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号５）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｃ＊  ＣｃＵ  Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号６）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊  ＣｃＵ  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号７）；
５’  Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号８）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊  ＣｃＵ  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｕｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号９）；
５’  Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号１０）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊  ＣｃＵ  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号１１）；
５’  Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号１２）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊  ＣｃＵ  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号１３）；
５’  Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ｃ＊  ＧｃＡ  Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａ＊  ３’（配列番号１４）；
５’  Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊  ＣｃＧ  Ｕ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｇｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｇｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号１５）；
５’  Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊  ＣｃＵ  ＣｃＵ  Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号１６）；
５’  Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊  ＣｃＡ  Ｇ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａｓ＊Ｃｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号１７）；
５’  Ｇ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊  ＣｃＡ  Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｃｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ｕｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号１８）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ａ＊  ＣｃＡ  Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ａｓ＊Ｕｓ＊Ｕｓ＊Ｕｓ＊Ｇ＊  ３（配列番号１９）；
５’  Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇ＊  ＣｃＵ  Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号２０）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊  ＣｃＵ  Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号２１）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊  ＣｃＵ  Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号２２）；
５’  Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊  ＣｃＵ  Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号２３）；
５’  Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｃ＊  ＣｃＡ  Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２４）；
５’  Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｃ＊  ＣｃＧ  Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２５）；
５’  Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊  ＣｃＧ  Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａｓ＊Ｃｓ＊Ｇｓ＊Ａｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号２６）；
５’  Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊  ＵｃＧ  Ｕ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２７）；
５’  Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊  Ｕ＊ｃＧ  Ｕ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２８）；
５’  Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊  ＡｃＡ  Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号２９）；
５’  Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊  ＧｃＡ  Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃｓ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ｃｓ＊Ｇ＊  ３’（配列番号３０）；
５’  Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊  ＧｃＡ  Ｕ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ｇｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号３１）；
５’  Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｕｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号３２）；
５’  Ｕ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号３３）；
５’  Ｃ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊  ＧｃＡ  Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕｓ＊Ｃｓ＊Ａｓ＊Ａｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号３４）；
５’  Ｕ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊  ＡｃＡ  Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｃｓ＊Ｃ＊  ３’（配列番号３５）；
５’  Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊  ＣｃＵ  Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号３６）；
５’  Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊  ＵｃＵ  Ｃ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａｓ＊Ｕｓ＊Ｇｓ＊Ｕｓ＊Ｕ＊  ３’（配列番号３７）、からなる群より選ばれる核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなり、
またはこれらの配列のいずれかの断片もしくはバリアントを含んでいるかまたはそれからなり、
ここで、
Ａはアデノシンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはアデノシンリボヌクレオチド、アデノシンデオキシヌクレオチド、修飾アデノシンリボヌクレオチド、または修飾アデノシンデオキシヌクレオチドであり；
Ｃは、シチジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくはシチジンリボヌクレオチド、シチジンデオキシヌクレオチド、修飾シチジンリボヌクレオチド、または修飾シチジンデオキシヌクレオチドであり；
Ｇはグアノシンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくは、グアノシンリボヌクレオチド、グアノシンデオキシヌクレオチド、修飾グアノシンリボヌクレオチド、または修飾グアノシンデオキシヌクレオチドであり；
Ｕはウリジンヌクレオチドまたはそのバリアントであり、好ましくは、ウリジンリボヌクレオチド、ウリジンデオキシヌクレオチド、修飾ウリジンリボヌクレオチド、または修飾ウリジンデオキシヌクレオチドであり；
Ａｓ、Ｃｓ、Ｇｓ、およびＵｓは、ヌクレオチドであり、好ましくは上記において規定したリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであり、ホスホロチオエート基をさらに含み；
アスタリスク（＊）は、直前のヌクレオチドが２’位の炭素原子において、好ましくは２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−フルオロによって化学的に修飾されていることを示し；
小文字のｃは、標的配列中の編集対象のヌクレオチド、好ましくはアデノシンまたはシチジン、より好ましくはアデノシンに対応する位置を示し、ｃは、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位を表す。
【００６１】
本発明との関係において、核酸配列またはアミノ酸配列の「バリアント」は、当該バリアントが由来する配列に対して、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、同一であることが好ましい。バリアントは、機能性バリアントであることが好ましい。
【００６２】
本明細書に使用されるとき、核酸配列またはアミノ酸配列の「断片」は、完全長配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の連続配列に相当する、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の連続配列からなり、これは、当該断片が由来する完全長配列の、少なくとも５％、１０％、２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、に相当する。本発明の意味において、このような断片は、機能性断片であることが好ましい。
【００６３】
いくつかの実施形態によれば、人工核酸の標的化配列は、標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置に、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、または脱塩基部位を含み、
編集対象のヌクレオチドに対応する５’位に位置する上記ヌクレオチドまたはそのバリアントは、ピリミジンヌクレオチド、好ましくはピリミジンリボヌクレオチドまたはピリミジンデオキシヌクレオチドであり、上記ピリミジンヌクレオチドは、２’位において好ましくは２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−フルオロによって化学的に修飾されている核酸塩基を含む。
【００６４】
別の実施形態において、人工核酸の標的化配列は、標的配列中の編集対象のヌクレオチドに対応する位置に、シチジンヌクレオチドもしくはそのバリアント、デオキシシチジンもしくはそのバリアント（好ましくはデオキシシチジンヌクレオチド）、または脱塩基部位を含み、
編集対象のヌクレオチドに対応する５’位または３’位に位置する、二つのヌクレオチドまたはそれらのバリアントの少なくとも一方、好ましくは両方は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−水素、および２’−フルオロからなる群より選ばれる置換基と結合している２’位の炭素原子において化学的に修飾されており、および／または
編集対象のヌクレオチドに対応する５’位または３’位に位置する、二つのヌクレオチドまたはそれらのバリアントの少なくとも一方、好ましくは両方は、修飾リン酸基、好ましくは本明細書に記載の修飾リン酸基、より好ましくはホスホロチオエート基を含む。
【００６５】
［カップリング剤を含むリクルート部分］
本発明のいくつかの実施形態によれば、人工核酸は本明細書に記載の標的化配列を含み、少なくとも一つのカップリング剤を含むリクルート部分をさらに含む。上記カップリング剤は、当該カップリング剤に結合する部分を含むデアミナーゼをリクルートすることができる。上述のように、リクルート部分はデアミナーゼをリクルートし、典型的には標的化配列に共有結合しているカップリング剤を含むか、または当該カップリング剤からなる。より好ましくは、リクルート部分は、標的化配列の５’末端または３’末端に、好ましくは共有結合で連結される、本明細書に記載のカップリング剤からなる。あるいは、カップリング剤は、標的化配列の内部ヌクレオチド（つまり、５’または３’末端ヌクレオチド以外）に、例えば、ヌクレオチドバリアントまたは修飾ヌクレオチド（好ましくはアミノチミジンなどの本明細書に記載のもの）への、好ましくは共有結合を介して連結されていてもよい。
【００６６】
デアミナーゼをリクルートするカップリング剤は、典型的には標的化配列に共有結合している。好ましくは、カップリング剤は標的化配列の５’末端または３’末端に連結される。あるいは、カップリング剤が標的化配列の内部ヌクレオチド（つまり、５’または３’末端ヌクレオチド以外）に、例えば、ヌクレオチドバリアントまたは修飾ヌクレオチド（好ましくはアミノチミジンなどの本明細書に記載のもの）への結合を介して連結されていてもよい。
【００６７】
好ましい実施形態において、カップリング剤は、Ｏ６−ベンジルグアニン、Ｏ２−ベンジルシトシン、クロロアルカン、１ｘＢＧ、２ｘＢＧ、４ｘＢＧ、およびこれらのいずれかのバリアントからなる群より選ばれる。特に好ましい実施形態によれば、カップリング剤は、２ｘＢＧまたは４ｘＢＧなどの分岐分子であり、その各々は好ましくはデアミナーゼ分子をリクルートすることができ、したがって、好ましくは、編集反応を増幅することができる。好適な分岐カップリング剤の例示的構造を以下に示す：
【００６８】
【化２】
2021534732.tif 000003
【００６９】
カップリング剤は、好ましくはデアミナーゼ中の部分に特異的に結合することができる。デアミナーゼ中の上記部分は好ましくはタグであり、これは本明細書に記載のデアミナーゼ、好ましくは本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼに連結される。より好ましくは、上記タグは、ＳＮＡＰ−ｔａｇ、ＣＬＩＰ−ｔａｇ、ＨａｌｏＴａｇ、およびこれらのいずれか一つの断片またはバリアントからなる群より選ばれる。したがって、これらの実施形態においてカップリング剤によって結合されるデアミナーゼは、好ましくは内因性デアミナーゼの人工物バージョン、好ましくは本明細書に記載のデアミナーゼの人工物バージョンである。好ましくは、デアミナーゼは、好ましくは本明細書に記載の、ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１−ＳＮＡＰ、ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１−ＳＮＡＰｆ、Ｈａｌｏ−ＡＤＡＲ１、Ｈａｌｏ−ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１−Ｈａｌｏ、Ｃｌｉｐ−ＡＤＡＲ１、Ｃｌｉｐ−ＡＤＡＲ２、Ｃｌｉｐｆ−ＡＤＡＲ１、Ｃｌｉｐｆ−ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１−ＣｌｉｐおよびＡｐｏｂｅｃ１−Ｃｌｉｐｆからなる群より選ばれ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントから選択され、ここで、デアミナーゼは好ましくはヒトまたはマウスに由来するものである。より好ましくは、デアミナーゼは、ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ２、ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ２、Ｈａｌｏ−ＡＤＡＲ１、Ｈａｌｏ−ＡＤＡＲ２、Ｃｌｉｐ−ＡＤＡＲ１、Ｃｌｉｐ−ＡＤＡＲ２、Ｃｌｉｐｆ−ＡＤＡＲ１およびＣｌｉｐｆ−ＡＤＡＲ２からなる群より選ばれ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントから選ばれ、ここで、デアミナーゼはヒトに由来するものである。別の実施形態によれば、デアミナーゼは、ｍＡｐｏｂｅｃ１−ＳＮＡＰ、ｍＡｐｏｂｅｃ１−ＳＮＡＰｆ、ｍＡｐｏｂｅｃ１−Ｈａｌｏ、ｍ  Ａｐｏｂｅｃ１−ＣｌｉｐおよびｍＡｐｏｂｅｃ１−Ｃｌｉｐｆからなる群より選ばれ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントから選ばれ、ここで、デアミナーゼはマウスに由来するものである。特に好ましい実施形態において、デアミナーゼは本明細書に記載のデアミナーゼのいずれかの過剰活性(hyperactive)変異体であり、好ましくは過剰活性Ｑ変異体であり、より好ましくはＡＤＡＲ１デアミナーゼ、ＡＤＡＲ２デアミナーゼの過剰活性Ｑ変異体（例えば、ヒトＡＤＡＲ１ｐ１５０、Ｅ１００８Ｑ；ヒトＡＤＡＲ１ｐ１１０、Ｅ７１３Ｑ；ヒトＡＤＡＲ２、Ｅ４８８Ｑ）であり、またはこれらのタグ付きバージョン（最も好ましくは本明細書に記載のもの）であり、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントである。
【００７０】
好ましくは本明細書に記載のタグ付きデアミナーゼ（例えば、ＳＮＡＰ−、ＳＮＡＰｆ−、Ｃｌｉｐ−、Ｃｌｉｐｆ−、Ｈａｌｏ−タグ付きデアミナーゼまたはそれらの断片もしくはバリアント）は、好ましくはＲＮＡ編集のために、例えば、上記タグ付きデアミナーゼをコードするベクターによる細胞の一過性トランスフェクションによって、または形質転換細胞、組織もしくは生体における安定な発現によって、過剰発現する。
【００７１】
好ましい実施形態によれば、リクルート部分は、Ｏ６−ベンジルグアニン、１ｘＢＧ、２ｘＢＧ、４ｘＢＧおよびこれらのいずれか一つのバリアントからなる群より選ばれるカップリング剤を含むか、または当該カップリング剤からなる。この実施形態では、人工核酸はデアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ、より好ましくは本明細書に記載のデアミナーゼ、の存在下で使用され、ここで、デアミナーゼはＳＮＡＰ−ｔａｇまたはそのバリアントを含む。別の実施形態において、リクルート部分はクロロアルカンを含むかまたはそれらからなり、デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ、より好ましくは本明細書に記載のデアミナーゼは、ＨａｌｏＴａｇまたはそのバリアントを含む。さらなる実施形態によれば、リクルート部分は、Ｏ２−ベンジルシトシンまたはそのバリアントを含み、デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ、より好ましくは本明細書に記載のデアミナーゼは、Ｃｌｉｐ−ｔａｇまたはそのバリアントを含む。
【００７２】
特定の実施形態において、本明細書に記載の人工核酸は、本明細書に記載の標的化配列および少なくとも二つ以上のリクルート部分を含み、ここで、各リクルート部分は、本明細書に記載のカップリング剤を含むかまたは当該カップリング剤からなり、各リクルート部分は好ましくはデアミナーゼ分子をリクルートし、したがって、好ましくは編集反応を増幅する。これらのリクルート部分のそれぞれは、好ましくは他のリクルート部分から独立して、Ｏ６−ベンジルグアニン、Ｏ２−ベンジルシトシン、クロロアルカン、１ｘＢＧ、２ｘＢＧ、４ｘＢＧ、およびこれらのいずれかのバリアントからなる群より選ばれるカップリング剤を含む。好ましくは、人工核酸は少なくとも二つのリクルート部分を含み、ここで、各リクルート部分は同じまたは異なるカップリング剤を含む。二つ以上のリクルート部分を含むおよび／または分岐カップリング剤を含む実施形態の概略構造を、本願の図１１に示す。
【００７３】
［核酸リクルートモチーフを含むリクルート部分］
本発明の好ましい実施形態では、人工核酸は本明細書に記載の標的化配列と、デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼに特異的に結合することができる核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなるリクルート部分と、を含む。好ましくは、デアミナーゼに特異的に結合することができる核酸配列は、好ましくは本明細書に記載の、デアミナーゼの二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ結合ドメインに特異的に結合する。有利なことに、デアミナーゼに特異的に結合することができる核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなるリクルート部分はまた、内因性デアミナーゼに結合する。これにより、本発明に係る人工核酸は、内因性（または異種発現）デアミナーゼを用いる部位特異的ＲＮＡ編集を促進する。
【００７４】
好ましくは、リクルート部分は、デアミナーゼに特異的に結合することができる核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなり、ここで、当該核酸配列は好ましくは標的化配列の５’末端または３’末端のいずれかに、より好ましくは標的化配列の５’末端に、共有結合している。特定の実施形態において、人工核酸は、本明細書に記載の標的化配列および本明細書に記載の少なくとも二つのリクルート部分を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、リクルート部分は分子内塩基対形成が可能な核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなる。リクルート部分は、好ましくはステムループ構造を形成することができる核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなる。特定の実施形態において、上記ステムループ構造は、少なくとも二つのミスマッチを含む二重らせんステムを含むかまたは当該二重らせんステムからなる。好ましい実施形態において、ステムループ構造は、３個〜８個、好ましくは４個〜６個、より好ましくは５個のヌクレオチドからなるループを含む。当該ループは、好ましくは核酸配列ＧＣＵＡＡまたはＧＣＵＣＡを含むかまたは当該核酸配列ＧＣＵＡＡまたはＧＣＵＣＡからなる。
【００７６】
好ましい実施形態によれば、人工核酸のリクルート部分は、本明細書に記載の少なくとも一つの化学修飾を含む核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなる。特に、人工核酸のリクルート部分は、好ましくは、少なくとも一つのヌクレオチドを含む核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなり、ここで、核酸塩基は化学的に修飾され、および／または核酸配列は、少なくとも一つの骨格修飾を含む。本明細書のそれぞれの節において記載の、さらに人工核酸全般および標的化配列に関する化学修飾は、リクルート部分にも適用可能である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドは、２’位において化学的に修飾されている。好ましくは、化学的に修飾された塩基は、２’位の炭素原子において置換基を含み、当該置換基は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれ、好ましくは２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロから選ばれる。別の実施形態によれば、化学的に修飾されたヌクレオチドは、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチド、または（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチドである。
【００７８】
好ましい実施形態では、人工核酸は、本明細書に記載の核酸配列を含むリクルート部分を含み、ここで、当該リクルート部分は少なくとも一つの化学的に修飾されたヌクレオチドを含み、ここで、当該化学的に修飾されたヌクレオチドは、２’位の炭素原子において置換基を含み、当該置換基は、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれ、好ましくは２’−水素、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロより選ばれ；および／または
上記化学的に修飾されたヌクレオチドは、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチド、または（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチドである。
【００７９】
好ましくは、人工核酸のリクルート部分は少なくとも一つの骨格修飾を含み、ここで、ヌクレオチドは修飾リン酸基を含む。当該修飾リン酸基は、好ましくは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ハイドロジェンホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネート、およびホスホトリエステルからなる群より選ばれ、最も好ましくはホスホロチオエートである。
【００８０】
いくつかの実施形態では、リクルート部分の核酸配列のヌクレオチドの少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９５％が、好ましくは本明細書に記載の修飾によって２’位において化学的に修飾される。
【００８１】
好ましくは、リクルート部分は核酸配列を含み、ここで、核酸配列の５’末端における五つのヌクレオチドのうち少なくとも二つがホスホロチオエート基を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態によれば、リクルート部分は核酸配列を含み、ここで、核酸配列の５’末端における五つのヌクレオチドのうち少なくとも二つが、ＬＮＡヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド、または（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチドである。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態において、リクルート部分は核酸配列を含み、ここで、
少なくとも一つのヌクレオチドは修飾リン酸基、好ましくはホスホロチオエート基を含み；
少なくとも一つのＬＮＡヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド、または（Ｓ）拘束エチルｃＥｔヌクレオチド；および
ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−フルオロより選ばれる置換基を２’位の炭素原子において含む少なくとも一つのヌクレオチド。
【００８４】
特に好ましい実施形態によれば、リクルート部分は、
（ａ）５’  ＧＧＵＧＵＣＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣＡＡＵＡＵ−ＧＣＵ  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵＧＵＵＧＵＵＣＵＣ−Ｎｄ−ＵＣＵ−Ｎｂ−ＣＵＣＧＡＣＡＣＣ  ３’（配列番号３８）；
（ｂ）５’  ＧｓＧｓＵＧＵＣＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣＡＡＵＡＵ−ＧＣＵ  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵＧＵＵＧＵＵＣＵＣ−Ｎｄ−ＵＣＵ−Ｎｂ−ＣＵＣＧＡＣＡＣＣ  ３’（配列番号３９）；および
（ｃ）５’  ＧｓｌＧｓｌＵＧＵＣＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣＡＡＵＡＵ−ＧＣＵ  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵＧＵＵＧＵＵＣＵＣ−Ｎｄ−ＵＣＵ−Ｎｂ−ＣＵＣＧＡＣＡＣＣ  ３’（配列番号４０）、からなる群より選ばれる核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなり、
またはそれらのいずれかの断片もしくはバリアントを含んでいるかまたはそれからなり、
ここで、
ＮａおよびＮｂはミスマッチを形成し、好ましくは、ＮａはアデノシンでありＮｂはシチジンであり；
ＮｃおよびＮｄはミスマッチを形成し、好ましくはＮｃおよびＮｄはグアノシンであり；
Ｇｓはホスホロチオエート基を含むグアノシンであり；
Ｇｓｌはホスホロチオエート基を含むＬＮＡグアノシンである。
【００８５】
別の実施形態によれば、リクルート部分は、ＶＡ（ウイルス関連）ＲＮＡ  Ｉ、またはその断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなる。ＶＡ  ＲＮＡ  Ｉはアデノウイルスに由来するＲＮＡであり、当業者に公知である。好ましい実施形態では、人工核酸のリクルート部分は以下の核酸配列：
ＧＣＡＣＡＣＣＴＧＧＧＴＴＣＧＡＣＡＣＧＣＧＧＧＣＧＧＴＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＡＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＣＣＧＧＡＴＴＣＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＧＴＣＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＡＴＡＣＣＣＴＴＧＣ  （配列番号４１）、またはその断片もしくはバリアントを含む。
【００８６】
好ましい実施形態において、リクルート部分は配列番号３８〜４１のいずれか一つに表す核酸配列、またはそれらの配列のいずれかの断片もしくはバリアントを含み、ここで、少なくとも一つのヌクレオチド、好ましくは少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％のヌクレオチドは、ハロゲン、アルコキシ基、水素、アリールオキシ基、アミノ基、およびアミノアルコキシ基からなる群より選ばれる置換基、好ましくは２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、および２’−フルオロより選ばれる置換基を２’位の炭素原子において含む。
【００８７】
特に好ましい実施形態によれば、リクルート部分は、
（ａ）５’  Ｇ＊Ｇ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｃ＊ＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣ＊ＡＡＵ＊ＡＵ＊−ＧＣ＊Ｕ＊  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵ＊ＧＵ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊−Ｎｄ−Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊−Ｎｂ＊−Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊ＧＡＣ＊ＡＣ＊Ｃ＊  ３’（配列番号４２）；
（ｂ）５’  Ｇｓ＊Ｇｓ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｃ＊ＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣ＊ＡＡＵ＊ＡＵ＊−ＧＣ＊Ｕ＊  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵ＊ＧＵ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊−Ｎｄ−Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊−Ｎｂ＊−Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊ＧＡＣ＊ＡＣ＊Ｃ＊  ３’（配列番号４３）；および
（ｃ）５’  Ｇｓｌ＊Ｇｓｌ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｃ＊ＧＡＧ−Ｎａ−ＡＧＡ−Ｎｃ−ＧＡＧＡＡＣ＊ＡＡＵ＊ＡＵ＊−ＧＣ＊Ｕ＊  Ａ／Ｃ  Ａ−ＡＵ＊ＧＵ＊Ｕ＊ＧＵ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊−Ｎｄ−Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊−Ｎｂ＊−Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊ＧＡＣ＊ＡＣ＊Ｃ＊  ３’（配列番号４４）、からなる群より選ばれる核酸配列、
またはこれらの配列のいずれかの断片もしくはバリアント、を含み、
ここで、
ＮａおよびＮｂはミスマッチを形成し、好ましくは、ＮａはアデノシンでありＮｂはシチジンであり；
ＮｃおよびＮｄはミスマッチを形成し、好ましくはＮｃおよびＮｄはグアノシンであり；
Ｇｓはホスホロチオエート基を含むグアノシンであり；
Ｇｓｌはホスホロチオエート基を含むＬＮＡグアノシンであり；
アスタリスク（＊）は、ヌクレオチドが２’位の炭素原子において、好ましくは２’−水素（２’−デオキシ）、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、または２’−フルオロによって修飾されていることを示す。
【００８８】
特定の実施形態において、本明細書に記載の人工核酸は、本明細書に記載のリクルート部分および本明細書に記載の標的化配列を、５’から３’への方向に含むことが好ましい。
【００８９】
本発明のさらなる態様は、標的ＲＮＡの部位特異的編集を行うための人工核酸に関係し、当該人工核酸は、
ａ）標的ＲＮＡ中の標的配列に相補的なまたは部分的に相補的な核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなる標的化配列と、
ｂ）デアミナーゼをリクルートするリクルート部分と、を含み、ここで、当該リクルート部分は、デアミナーゼ、好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼに特異的に結合可能な核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなる。
【００９０】
その態様によれば、リクルート部分は、好ましくは「核酸リクルートモチーフを含むリクルート部分」の節において本明細書に規定した通りである。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、標的化配列は、好ましくは本明細書に記載のように、化学的に修飾される。この態様の特定の実施形態において、標的化配列は化学的に修飾されない。特に好ましい実施形態では、人工核酸が細胞、好ましくは本明細書に記載の細胞において、より好ましくはベクターからの転写によって、好ましくは本明細書に記載のベクターからの転写によって合成される。本発明のこの態様の特に好ましい実施形態によれば、人工核酸は、配列番号３８〜４１のいずれか一つに表す核酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含んでいるかまたはそれからなるリクルート部分を含む。
【００９１】
［デアミナーゼ］
人工核酸はデアミナーゼによるＲＮＡの部位特異的編集に適しており、ここで、デアミナーゼは好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはその断片もしくはバリアント、好ましくはＡＤＡＲ（ｄｓＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）酵素またはその断片もしくはバリアントであり、より好ましくはＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびその断片もしくはバリアントからなる群より選ばれ、さらにより好ましくはアデノシンデアミナーゼドメインを含むペプチドもしくはタンパク質であり；あるいはシチジンデアミナーゼまたはその断片もしくはバリアント、好ましくはＡｐｏｂｅｃ１またはその断片もしくはバリアント、より好ましくはシチジンデアミナーゼドメインを含むペプチドまたはタンパク質である。
【００９２】
本明細書で使用される「デアミナーゼ」という用語は、標的ＲＮＡ中のヌクレオチドまたはそのバリアントの脱アミノ化、特にアデノシンまたはシチジンの脱アミノ化を触媒することができる任意のペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメインを指す。したがって、この用語は、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２またはＡｐｏｂｅｃ１などの完全長および野生型デアミナーゼを指すだけでなく、デアミナーゼの断片またはバリアント、好ましくは機能性断片または機能性バリアント、も指す。特に、当該用語は、好ましくは本明細書に記載の、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２またはＡｐｏｂｅｃ１の変異体などのデアミナーゼの変異体およびバリアントも指す。さらに、本明細書で使用される「デアミナーゼ」という用語は、任意のデアミナーゼ融合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９およびＣａｓ１３に基づく）も含む。本発明に関して、「デアミナーゼ」という用語はまた、好ましくは本明細書に記載の、ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１−ＳＮＡＰ、ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１−ＳＮＡＰｆ、Ｈａｌｏ−ＡＤＡＲ１、Ｈａｌｏ−ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１−Ｈａｌｏ、Ｃｌｉｐ−ＡＤＡＲ１、Ｃｌｉｐ−ＡＤＡＲ２、Ｃｌｉｐｆ−ＡＤＡＲ１、Ｃｌｉｐｆ−ＡＤＡＲ２、Ａｐｏｂｅｃ１−ＣｌｉｐおよびＡｐｏｂｅｃ１−Ｃｌｉｐｆからなる群より選ばれ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントから選択されるデアミナーゼなどのデアミナーゼのタグ付きバリアントも指し、ここで、デアミナーゼは好ましくはヒトまたはマウスに由来するものである。
【００９３】
好ましい実施形態において、デアミナーゼはアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１、好ましくはＡＤＡＲ１ｐ１５０またはＡＤＡＲ１ｐ１１０、またはＡＤＡＲ２など）、好ましくは真核生物のアデノシンデアミナーゼ、より好ましくは脊椎動物のアデノシンデアミナーゼ、さらにより好ましくは哺乳類のアデノシンデアミナーゼ、最も好ましくはｈＡＤＡＲ１またはｈＡＤＡＲ２などのヒトのアデノシンデアミナーゼ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントである。特に好ましい実施形態において、デアミナーゼは、好ましくは本明細書に記載のタグ付きアデノシンデアミナーゼ、またはその断片もしくはバリアントである。より好ましくは、本明細書で使用されるデアミナーゼは、ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ２、ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ２、Ｈａｌｏ−ＡＤＡＲ１、Ｈａｌｏ−ＡＤＡＲ２、Ｃｌｉｐ−ＡＤＡＲ１、Ｃｌｉｐ−ＡＤＡＲ２、Ｃｌｉｐｆ−ＡＤＡＲ１およびＣｌｉｐｆ−ＡＤＡＲ２、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントからなる群より選ばれ、ここで、デアミナーゼはヒトに由来するものである。
【００９４】
別の実施形態によれば、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ（Ａｐｏｂｅｃ１、好ましくはヒトＡｐｏｂｅｃ１またはマウスＡｐｏｂｅｃ１（ｍＡｐｏｂｅｃ１）など）、好ましくは真核生物のシチジンデアミナーゼ、より好ましくは脊椎動物のシチジンデアミナーゼ、さらにより好ましくは哺乳類のシチジンデアミナーゼ、最も好ましくはマウスもしくはヒトのシチジンデアミナーゼ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントである。特に好ましい実施形態において、デアミナーゼは、好ましくは本明細書に記載のタグ付きシチジンデアミナーゼ、またはその断片もしくはバリアントである。好ましい実施形態によれば、デアミナーゼは、ｍＡｐｏｂｅｃ１−ＳＮＡＰ、ｍＡｐｏｂｅｃ１−ＳＮＡＰｆ、ｍＡｐｏｂｅｃ１−Ｈａｌｏ、ｍＡｐｏｂｅｃ１−ＣｌｉｐおよびｍＡｐｏｂｅｃ１−Ｃｌｉｐｆ、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントからなる群より選ばれ、ここでデアミナーゼはマウスに由来するものである。
【００９５】
好ましい実施形態において、デアミナーゼは、好ましくは本明細書に記載の、内因性デアミナーゼ、またはその断片もしくはバリアントである。核酸リクルートモチーフ（本明細書中のそれぞれの節を参照のこと）を有するリクルート部分を含む人工核酸は、好ましくは内因性デアミナーゼ、またはその断片もしくはバリアントと関連して使用される。
【００９６】
特に好ましい実施形態において、デアミナーゼは本明細書に記載のデアミナーゼのいずれかの過剰活性変異体であり、好ましくは過剰活性Ｑ変異体であり、より好ましくはＡＤＡＲ１デアミナーゼ、ＡＤＡＲ２デアミナーゼの過剰活性Ｑ変異体（例えば、ヒトＡＤＡＲ１ｐ１５０、Ｅ１００８Ｑ；ヒトＡＤＡＲ１ｐ１１０、Ｅ７１３Ｑ；ヒトＡＤＡＲ２、Ｅ４８８Ｑ）であり、またはこれらのタグ付きバージョン（最も好ましくは本明細書に記載のもの）であり、またはこれらのいずれかの断片もしくはバリアントである。
【００９７】
タグ付きデアミナーゼは、好ましくは本明細書に記載のように、好ましくは本発明に係る人工核酸に関連して使用され、ここで、リクルート部分はそのカップリング剤に結合する部分を含むデアミナーゼをリクルートすることができる少なくとも一つのカップリング剤を含む（「カップリング剤を含むリクルート部分」の節も参照のこと）。
【００９８】
以下に、本明細書において使用されるデアミナーゼの特に好ましい例を記載する。
【００９９】
ｈＡＤＡＲ１ｐ１５０：
核酸配列：
ATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGCCCTGAATTTGGCTAAAAATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGAAAGGCAGGGGGATGTCTATAGACAAGGGACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGAGAGAGGATGCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTCCTGAAACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGACCAAAAGAAACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCCTCAAATAACATGGTAACCACAGAAAAAGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGAGGCCAGACCAGAACCAGCAAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGAAAATGGCCAGTGGGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGTTTCGAGCCATCATGGAGATGCCCTCCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAACTGACAGAGTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAGCGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAACCTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATGCAGCTATGAAAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTATTCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTTCTGGGAAGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTGGCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCAGCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTCGTGAGATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTGGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGCACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCAGAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACACTCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTGAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGTCAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTGTGGAATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAAATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCACATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGATGGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTCAAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTATAG（配列番号４５）
アミノ酸配列：
MAEIKEKICDYLFNVSDSSALNLAKNIGLTKARDINAVLIDMERQGDVYRQGTTPPIWHLTDKKRERMQIKRNTNSVPETAPAAIPETKRNAEFLTCNIPTSNASNNMVTTEKVENGQEPVIKLENRQEARPEPARLKPPVHYNGPSKAGYVDFENGQWATDDIPDDLNSIRAAPGEFRAIMEMPSFYSHGLPRCSPYKKLTECQLKNPISGLLEYAQFASQTCEFNMIEQSGPPHEPRFKFQVVINGREFPPAEAGSKKVAKQDAAMKAMTILLEEAKAKDSGKSEESSHYSTEKESEKTAESQTPTPSATSFFSGKSPVTTLLECMHKLGNSCEFRLLSKEGPAHEPKFQYCVAVGAQTFPSVSAPSKKVAKQMAAEEAMKALHGEATNSMASDNQPEGMISESLDNLESMMPNKVRKIGELVRYLNTNPVGGLLEYARSHGFAAEFKLVDQSGPPHEPKFVYQAKVGGRWFPAVCAHSKKQGKQEAADAALRVLIGENEKAERMGFTEVTPVTGASLRRTMLLLSRSPEAQPKTLPLTGSTFHDQIAMLSHRCFNTLTNSFQPSLLGRKILAAIIMKKDSEDMGVVVSLGTGNRCVKGDSLSLKGETVNDCHAEIISRRGFIRFLYSELMKYNSQTAKDSIFEPAKGGEKLQIKKTVSFHLYISTAPCGDGALFDKSCSDRAMESTESRHYPVFENPKQGKLRTKVENGEGTIPVESSDIVPTWDGIRLGERLRTMSCSDKILRWNVLGLQGALLTHFLQPIYLKSVTLGYLFSQGHLTRAICCRVTRDGSAFEDGLRHPFIVNHPKVGRVSIYDSKRQSGKTKETSVNWCLADGYDLEILDGTRGTVDGPRNELSRVSKKNIFLLFKKLCSFRYRRDLLRLSYGEAKKAARDYETAKNYFKKGLKDMGYGNWISKPQEEKNFYLCPV（配列番号４６）
好ましい実施形態によれば、アミノ酸残基Ｅ１００８はｈＡＤＡＲ１ｐ１５０において変異している。特に好ましくは、過剰活性変異体である変異Ｅ１００８Ｑである。さらに好ましい変異体としては、Ｅ１００８Ｙ、Ｅ１００８Ｆ、Ｅ１００８Ｗ、Ｅ１００８Ｈ、Ｅ１００８Ｌ、Ｅ１００８Ｍ、Ｅ１００８ＩおよびＥ１００８Ｖが挙げられ、これらは、活性が抑えられ、好ましくは編集対象のヌクレオチドに対応する位置の標的化配列中に脱塩基部位を有する人工核酸に関連して用いられる。
【０１００】
ｈＡＤＡＲ１ｐ１１０：
核酸配列：
ATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGCCCTGAATTTGGCTAAAAATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGAAAGGCAGGGGGATGTCTATAGACAAGGGACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGAGAGAGGATGCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTCCTGAAACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGACCAAAAGAAACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCCTCAAATAACATGGTAACCACAGAAAAAGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGAGGCCAGACCAGAACCAGCAAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGAAAATGGCCAGTGGGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGTTTCGAGCCATCATGGAGATGCCCTCCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAACTGACAGAGTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAGCGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAACCTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATGCAGCTATGAAAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTATTCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTTCTGGGAAGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTGGCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCAGCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTCGTGAGATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTGGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGCACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCAGAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACACTCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTGAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGTCAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTGTGGAATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAAATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCACATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGATGGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTCAAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTATAG（配列番号４７）
アミノ酸配列：
MAEIKEKICDYLFNVSDSSALNLAKNIGLTKARDINAVLIDMERQGDVYRQGTTPPIWHLTDKKRERMQIKRNTNSVPETAPAAIPETKRNAEFLTCNIPTSNASNNMVTTEKVENGQEPVIKLENRQEARPEPARLKPPVHYNGPSKAGYVDFENGQWATDDIPDDLNSIRAAPGEFRAIMEMPSFYSHGLPRCSPYKKLTECQLKNPISGLLEYAQFASQTCEFNMIEQSGPPHEPRFKFQVVINGREFPPAEAGSKKVAKQDAAMKAMTILLEEAKAKDSGKSEESSHYSTEKESEKTAESQTPTPSATSFFSGKSPVTTLLECMHKLGNSCEFRLLSKEGPAHEPKFQYCVAVGAQTFPSVSAPSKKVAKQMAAEEAMKALHGEATNSMASDNQPEGMISESLDNLESMMPNKVRKIGELVRYLNTNPVGGLLEYARSHGFAAEFKLVDQSGPPHEPKFVYQAKVGGRWFPAVCAHSKKQGKQEAADAALRVLIGENEKAERMGFTEVTPVTGASLRRTMLLLSRSPEAQPKTLPLTGSTFHDQIAMLSHRCFNTLTNSFQPSLLGRKILAAIIMKKDSEDMGVVVSLGTGNRCVKGDSLSLKGETVNDCHAEIISRRGFIRFLYSELMKYNSQTAKDSIFEPAKGGEKLQIKKTVSFHLYISTAPCGDGALFDKSCSDRAMESTESRHYPVFENPKQGKLRTKVENGEGTIPVESSDIVPTWDGIRLGERLRTMSCSDKILRWNVLGLQGALLTHFLQPIYLKSVTLGYLFSQGHLTRAICCRVTRDGSAFEDGLRHPFIVNHPKVGRVSIYDSKRQSGKTKETSVNWCLADGYDLEILDGTRGTVDGPRNELSRVSKKNIFLLFKKLCSFRYRRDLLRLSYGEAKKAARDYETAKNYFKKGLKDMGYGNWISKPQEEKNFYLCPV（配列番号４８）
好ましい実施形態によれば、アミノ酸残基Ｅ７１３はｈＡＤＡＲ１ｐ１１０において変異している。特に好ましくは、過剰活性変異体である変異Ｅ７１３Ｑである。さらに好ましい変異体としては、Ｅ７１３Ｙ、Ｅ７１３Ｆ、Ｅ７１３Ｗ、Ｅ７１３Ｈ、Ｅ７１３Ｌ、Ｅ７１３Ｍ、Ｅ７１３ＩおよびＥ７１３Ｖが挙げられ、これらは、活性が抑えられ、好ましくは編集対象のヌクレオチドに対応する位置の標的化配列中に脱塩基部位を有する人工核酸に関連して用いられる。
【０１０１】
ｈＡＤＡＲ２：
核酸配列：
ATGGATATAGAAGATGAAGAAAACATGAGTTCCAGCAGCACTGATGTGAAGGAAAACCGCAATCTGGACAACGTGTCCCCCAAGGATGGCAGCACACCTGGGCCTGGCGAGGGCTCTCAGCTCTCCAATGGGGGTGGTGGTGGCCCCGGCAGAAAGCGGCCCCTGGAGGAGGGCAGCAATGGCCACTCCAAGTACCGCCTGAAGAAAAGGAGGAAAACACCAGGGCCCGTCCTCCCCAAGAACGCCCTGATGCAGCTGAATGAGATCAAGCCTGGTTTGCAGTACACACTCCTGTCCCAGACTGGGCCCGTGCACGCGCCTTTGTTTGTCATGTCTGTGGAGGTGAATGGCCAGGTTTTTGAGGGCTCTGGTCCCACAAAGAAAAAGGCAAAACTCCATGCTGCTGAGAAGGCCTTGAGGTCTTTCGTTCAGTTTCCTAATGCCTCTGAGGCCCACCTGGCCATGGGGAGGACCCTGTCTGTCAACACGGACTTCACATCTGACCAGGCCGACTTCCCTGACACGCTCTTCAATGGTTTTGAAACTCCTGACAAGGCGGAGCCTCCCTTTTACGTGGGCTCCAATGGGGATGACTCCTTCAGTTCCAGCGGGGACCTCAGCTTGTCTGCTTCCCCGGTGCCTGCCAGCCTAGCCCAGCCTCCTCTCCCTGCCTTACCACCATTCCCACCCCCGAGTGGGAAGAATCCCGTGATGATCTTGAACGAACTGCGCCCAGGACTCAAGTATGACTTCCTCTCCGAGAGCGGGGAGAGCCATGCCAAGAGCTTCGTCATGTCTGTGGTCGTGGATGGTCAGTTCTTTGAAGGCTCGGGGAGAAACAAGAAGCTTGCCAAGGCCCGGGCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGCCATTTTTAACTTGCACTTGGATCAGACGCCATCTCGCCAGCCTATTCCCAGTGAGGGTCTTCAGCTGCATTTACCGCAGGTTTTAGCTGACGCTGTCTCACGCCTGGTCCTGGGTAAGTTTGGTGACCTGACCGACAACTTCTCCTCCCCTCACGCTCGCAGAAAAGTGCTGGCTGGAGTCGTCATGACAACAGGCACAGATGTTAAAGATGCCAAGGTGATAAGTGTTTCTACAGGAACAAAATGTATTAATGGTGAATACATGAGTGATCGTGGCCTTGCATTAAATGACTGCCATGCAGAAATAATATCTCGGAGATCCTTGCTCAGATTTCTTTATACACAACTTGAGCTTTACTTAAATAACAAAGATGATCAAAAAAGATCCATCTTTCAGAAATCAGAGCGAGGGGGGTTTAGGCTGAAGGAGAATGTCCAGTTTCATCTGTACATCAGCACCTCTCCCTGTGGAGATGCCAGAATCTTCTCACCACATGAGCCAATCCTGGAAGAACCAGCAGATAGACACCCAAATCGTAAAGCAAGAGGACAGCTACGGACCAAAATAGAGTCTGGTGAGGGGACGATTCCAGTGCGCTCCAATGCGAGCATCCAAACGTGGGACGGGGTGCTGCAAGGGGAGCGGCTGCTCACCATGTCCTGCAGTGACAAGATTGCACGCTGGAACGTGGTGGGCATCCAGGGTTCCCTGCTCAGCATTTTCGTGGAGCCCATTTACTTCTCGAGCATCATCCTGGGCAGCCTTTACCACGGGGACCACCTTTCCAGGGCCATGTACCAGCGGATCTCCAACATAGAGGACCTGCCACCTCTCTACACCCTCAACAAGCCTTTGCTCAGTGGCATCAGCAATGCAGAAGCACGGCAGCCAGGGAAGGCCCCCAACTTCAGTGTCAACTGGACGGTAGGCGACTCCGCTATTGAGGTCATCAACGCCACGACTGGGAAGGATGAGCTGGGCCGCGCGTCCCGCCTGTGTAAGCACGCGTTGTACTGTCGCTGGATGCGTGTGCACGGCAAGGTTCCCTCCCACTTACTACGCTCCAAGATTACCAAACCCAACGTGTACCATGAGTCCAAGCTGGCGGCAAAGGAGTACCAGGCCGCCAAGGCGCGTCTGTTCACAGCCTTCATCAAGGCGGGGCTGGGGGCCTGGGTGGAGAAGCCCACCGAGCAGGACCAGTTCTCACTCACG（配列番号４９）
アミノ酸配列：
MDIEDEENMSSSSTDVKENRNLDNVSPKDGSTPGPGEGSQLSNGGGGGPGRKRPLEEGSNGHSKYRLKKRRKTPGPVLPKNALMQLNEIKPGLQYTLLSQTGPVHAPLFVMSVEVNGQVFEGSGPTKKKAKLHAAEKALRSFVQFPNASEAHLAMGRTLSVNTDFTSDQADFPDTLFNGFETPDKAEPPFYVGSNGDDSFSSSGDLSLSASPVPASLAQPPLPALPPFPPPSGKNPVMILNELRPGLKYDFLSESGESHAKSFVMSVVVDGQFFEGSGRNKKLAKARAAQSALAAIFNLHLDQTPSRQPIPSEGLQLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLT（配列番号５０）
好ましい実施形態によれば、アミノ酸残基Ｅ４８８はｈＡＤＡＲ２において変異している。特に好ましくは、過剰活性変異体である変異Ｅ４８８Ｑである。さらに好ましい変異体としては、Ｅ４８８Ｙ、Ｅ４８８Ｆ、Ｅ４８８Ｗ、Ｅ４８８Ｈ、Ｅ４８８Ｌ、Ｅ４８８Ｍ、Ｅ４８８ＩおよびＥ４８８Ｖが挙げられ、これらは、活性が抑えられ、好ましくは編集対象のヌクレオチドに対応する位置の標的化配列中に脱塩基部位を有する人工核酸に関連して用いられる。ｈＡＤＡＲ２において変異し得るさらに好ましい部位としては、Ｉ４５６またはＴ４９０が含まれ、さらに、Ｒ３４８、Ｒ４７０、Ｈ４７１、Ｒ４７４、Ｓ４９５、Ｒ５１０、Ｋ５９４、Ｒ４７７、またはＲ４８１も含まれる。
【０１０２】
ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ１：
核酸配列：
ATGGACAAAGACTGCGAAATGAAGCGCACCACCCTGGATAGCCCTCTGGGCAAGCTGGAACTGTCTGGGTGCGAACAGGGCCTGCACCGTATCATCTTCCTGGGCAAAGGAACATCTGCCGCCGACGCCGTGGAAGTGCCTGCCCCAGCCGCCGTGCTGGGCGGACCAGAGCCACTGATGCAGGCCACCGCCTGGCTCAACGCCTACTTTCACCAGCCTGAGGCCATCGAGGAGTTCCCTGTGCCAGCCCTGCACCACCCAGTGTTCCAGCAGGAGAGCTTTACCCGCCAGGTGCTGTGGAAACTGCTGAAAGTGGTGAAGTTCGGAGAGGTCATCAGCTACAGCCACCTGGCCGCCCTGGCCGGCAATCCCGCCGCCACCGCCGCCGTGAAAACCGCCCTGAGCGGAAATCCCGTGCCCATTCTGATCCCCTGCCACCGGGTGGTGCAGGGCGACCTGGACGTGGGGGGCTACGAGGGCGGGCTCGCCGTGAAAGAGTGGCTGCTGGCCCACGAGGGCCACAGACTGGGCAAGCCTGGGCTGGGTCCTGCAGGCGGAGGCGCGCCAGGGTCTGGCGGCGGCAGTAAGGCAGAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACACTCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGTCAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTGTGGAATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAAATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCACATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGATGGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTCAAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTA（配列番号５１）
アミノ酸配列：
MDKDCEMKRTTLDSPLGKLELSGCEQGLHRIIFLGKGTSAADAVEVPAPAAVLGGPEPLMQATAWLNAYFHQPEAIEEFPVPALHHPVFQQESFTRQVLWKLLKVVKFGEVISYSHLAALAGNPAATAAVKTALSGNPVPILIPCHRVVQGDLDVGGYEGGLAVKEWLLAHEGHRLGKPGLGPAGGGAPGSGGGSKAERMGFTEVTPVTGASLRRTMLLLSRSPEAQPKTLPLTGSTFHDQIAMLSHRCFNTLTNSFQPSLLGRKILAAIIMKKDSEDMGVVVSLGTGNRCVKGDSLSLKGETVNDCHAEIISRRGFIRFLYSELMKYNSQTAKDSIFEPAKGGEKLQIKKTVSFHLYISTAPCGDGALFDKSCSDRAMESTESRHYPVFENPKQGKLRTKVENGEGTIPVESSDIVPTWDGIRLGERLRTMSCSDKILRWNVLGLQGALLTHFLQPIYLKSVTLGYLFSQGHLTRAICCRVTRDGSAFEDGLRHPFIVNHPKVGRVSIYDSKRQSGKTKETSVNWCLADGYDLEILDGTRGTVDGPRNELSRVSKKNIFLLFKKLCSFRYRRDLLRLSYGEAKKAARDYETAKNYFKKGLKDMGYGNWISKPQEEKNFYLCPV（配列番号５２）
好ましい実施形態によれば、アミノ酸残基Ｅ４０６はＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ１において変異している。特に好ましくは、過剰活性変異体である変異Ｅ４０６Ｑである。さらに好ましい変異体としては、Ｅ４０６Ｙ、Ｅ４０６Ｆ、Ｅ４０６Ｗ、Ｅ４０６Ｈ、Ｅ４０６Ｌ、Ｅ４０６Ｍ、Ｅ４０６ＩおよびＥ４０６Ｖが挙げられ、これらは、活性が抑えられ、好ましくは編集対象のヌクレオチドに対応する位置の標的化配列中に脱塩基部位を有する人工核酸に関連して用いられる。
【０１０３】
ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ２：
核酸配列：
ATGGACAAAGACTGCGAAATGAAGCGCACCACCCTGGATAGCCCTCTGGGCAAGCTGGAACTGTCTGGGTGCGAACAGGGCCTGCACCGTATCATCTTCCTGGGCAAAGGAACATCTGCCGCCGACGCCGTGGAAGTGCCTGCCCCAGCCGCCGTGCTGGGCGGACCAGAGCCACTGATGCAGGCCACCGCCTGGCTCAACGCCTACTTTCACCAGCCTGAGGCCATCGAGGAGTTCCCTGTGCCAGCCCTGCACCACCCAGTGTTCCAGCAGGAGAGCTTTACCCGCCAGGTGCTGTGGAAACTGCTGAAAGTGGTGAAGTTCGGAGAGGTCATCAGCTACAGCCACCTGGCCGCCCTGGCCGGCAATCCCGCCGCCACCGCCGCCGTGAAAACCGCCCTGAGCGGAAATCCCGTGCCCATTCTGATCCCCTGCCACCGGGTGGTGCAGGGCGACCTGGACGTGGGGGGCTACGAGGGCGGGCTCGCCGTGAAAGAGTGGCTGCTGGCCCACGAGGGCCACAGACTGGGCAAGCCTGGGCTGGGTCCTGCAGGCGGAGGCGCGCCAGGGTCTGGCGGCGGCAGTAAGAAGCTTGCCAAGGCCCGGGCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGCCATTTTTAACTTGCACTTGGATCAGACGCCATCTCGCCAGCCTATTCCCAGTGAGGGTCTTCAGCTGCATTTACCGCAGGTTTTAGCTGACGCTGTCTCACGCCTGGTCCTGGGTAAGTTTGGTGACCTGACCGACAACTTCTCCTCCCCTCACGCTCGCAGAAAAGTGCTGGCTGGAGTCGTCATGACAACAGGCACAGATGTTAAAGATGCCAAGGTGATAAGTGTTTCTACAGGAACAAAATGTATTAATGGTGAATACATGAGTGATCGTGGCCTTGCATTAAATGACTGCCATGCAGAAATAATATCTCGGAGATCCTTGCTCAGATTTCTTTATACACAACTTGAGCTTTACTTAAATAACAAAGATGATCAAAAAAGATCCATCTTTCAGAAATCAGAGCGAGGGGGGTTTAGGCTGAAGGAGAATGTCCAGTTTCATCTGTACATCAGCACCTCTCCCTGTGGAGATGCCAGAATCTTCTCACCACATGAGCCAATCCTGGAAGAACCAGCAGATAGACACCCAAATCGTAAAGCAAGAGGACAGCTACGGACCAAAATAGAGTCTGGTGAGGGGACGATTCCAGTGCGCTCCAATGCGAGCATCCAAACGTGGGACGGGGTGCTGCAAGGGGAGCGGCTGCTCACCATGTCCTGCAGTGACAAGATTGCACGCTGGAACGTGGTGGGCATCCAGGGATCCCTGCTCAGCATTTTCGTGGAGCCCATTTACTTCTCGAGCATCATCCTGGGCAGCCTTTACCACGGGGACCACCTTTCCAGGGCCATGTACCAGCGGATCTCCAACATAGAGGACCTGCCACCTCTCTACACCCTCAACAAGCCTTTGCTCAGTGGCATCAGCAATGCAGAAGCACGGCAGCCAGGGAAGGCCCCCAACTTCAGTGTCAACTGGACGGTAGGCGACTCCGCTATTGAGGTCATCAACGCCACGACTGGGAAGGATGAGCTGGGCCGCGCGTCCCGCCTGTGTAAGCACGCGTTGTACTGTCGCTGGATGCGTGTGCACGGCAAGGTTCCCTCCCACTTACTACGCTCCAAGATTACCAAGCCCAACGTGTACCATGAGTCCAAGCTGGCGGCAAAGGAGTACCAGGCCGCCAAGGCGCGTCTGTTCACAGCCTTCATCAAGGCGGGGCTGGGGGCCTGGGTGGAGAAGCCCACCGAGCAGGACCAGTTCTCACTCACGCCC（配列番号５３）
アミノ酸配列：
MDKDCEMKRTTLDSPLGKLELSGCEQGLHRIIFLGKGTSAADAVEVPAPAAVLGGPEPLMQATAWLNAYFHQPEAIEEFPVPALHHPVFQQESFTRQVLWKLLKVVKFGEVISYSHLAALAGNPAATAAVKTALSGNPVPILIPCHRVVQGDLDVGGYEGGLAVKEWLLAHEGHRLGKPGLGPAGGGAPGSGGGSKKLAKARAAQSALAAIFNLHLDQTPSRQPIPSEGLQLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTP（配列番号５４）
好ましい実施形態によれば、アミノ酸残基Ｅ４０３はｈＡＤＡＲ２において変異している。特に好ましくは、過剰活性変異体である変異Ｅ４０３Ｑである。さらに好ましい変異体としては、Ｅ４０３Ｙ、Ｅ４０３Ｆ、Ｅ４０３Ｗ、Ｅ４０３Ｈ、Ｅ４０３Ｌ、Ｅ４０３Ｍ、Ｅ４０３ＩおよびＥ４０３Ｖが挙げられ、これらは、活性が抑えられ、好ましくは編集対象のヌクレオチドに対応する位置の標的化配列中に脱塩基部位を有する人工核酸に関連して用いられる。ｈＡＤＡＲ２において変異し得るさらに好ましい部位としては、Ｉ３７１またはＴ４０５が含まれ、さらに、Ｒ２６３、Ｒ３８５、Ｈ３８６、Ｒ３８９、Ｓ４１０、Ｒ４２５、Ｋ５０９、Ｒ３９２、またはＲ４８４も含まれる。
【０１０４】
ｍＡＰＯＢＥＣ１−ＳＮＡＰ（ｍＡ１−ＳＮＡＰ）、Ｃ−ｔｏ−Ｕデアミナーゼ：
核酸配列：
ATGAGTTCCGAGACAGGCCCTGTAGCTGTTGATCCCACTCTGAGGAGAAGAATTGAGCCCCACGAGTTTGAAGTCTTCTTTGACCCCCGGGAGCTTCGGAAAGAGACCTGTCTGCTGTATGAGATCAACTGGGGTGGAAGGCACAGTGTCTGGCGACACACGAGCCAAAACACCAGCAACCACGTTGAAGTCAACTTCTTAGAAAAATTTACTACAGAAAGATACTTTCGTCCGAACACCAGATGCTCCATTACCTGGTTCCTGTCCTGGAGTCCCTGCGGGGAGTGCTCCAGGGCCATTACAGAGTTTCTGAGCCGACACCCCTATGTAACTCTGTTTATTTACATAGCACGGCTTTATCACCACACGGATCAGCGAAACCGCCAAGGACTCAGGGACCTTATTAGCAGCGGTGTGACTATCCAGATCATGACAGAGCAAGAGTATTGTTACTGCTGGAGGAATTTCGTCAACTACCCCCCTTCAAACGAAGCATATTGGCCAAGGTACCCCCATCTGTGGGTGAAACTGTATGTACTGGAGCTCTACTGCATCATTTTAGGACTTCCACCCTGTTTAAAAATTTTAAGAAGAAAGCAACCTCAACTCACGTTTTTCACAATTACTCTTCAAACCTGCCATTACCAAAGGATACCACCCCATCTCCTTTGGGCTACAGGGTTGAAAGGAGCGGCCGCGACTGGCGCGCCAGGGGGATCCATGGACAAAGACTGCGAAATGAAGCGCACCACCCTGGATAGCCCTCTGGGCAAGCTGGAACTGTCTGGGTGCGAACAGGGCCTGCACCGTATCATCTTCCTGGGCAAAGGAACATCTGCCGCCGACGCCGTGGAAGTGCCTGCCCCAGCCGCCGTGCTGGGCGGACCAGAGCCACTGATGCAGGCCACCGCCTGGCTCAACGCCTACTTTCACCAGCCTGAGGCCATCGAGGAGTTCCCTGTGCCAGCCCTGCACCACCCAGTGTTCCAGCAGGAGAGCTTTACCCGCCAGGTGCTGTGGAAACTGCTGAAAGTGGTGAAGTTCGGAGAGGTCATCAGCTACAGCCACCTGGCCGCCCTGGCCGGCAATCCCGCCGCCACCGCCGCCGTGAAAACCGCCCTGAGCGGAAATCCCGTGCCCATTCTGATCCCCTGCCACCGGGTGGTGCAGGGCGACCTGGACGTGGGGGGCTACGAGGGCGGGCTCGCCGTGAAAGAGTGGCTGCTGGCCCACGAGGGCCACAGACTGGGCAAGCCTGGGCTGGGT（配列番号５５）
アミノ酸配列：
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSVWRHTSQNTSNHVEVNFLEKFTTERYFRPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRHPYVTLFIYIARLYHHTDQRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQEYCYCWRNFVNYPPSNEAYWPRYPHLWVKLYVLELYCIILGLPPCLKILRRKQPQLTFFTITLQTCHYQRIPPHLLWATGLKGAAATGAPGGSMDKDCEMKRTTLDSPLGKLELSGCEQGLHRIIFLGKGTSAADAVEVPAPAAVLGGPEPLMQATAWLNAYFHQPEAIEEFPVPALHHPVFQQESFTRQVLWKLLKVVKFGEVISYSHLAALAGNPAATAAVKTALSGNPVPILIPCHRVVQGDLDVGGYEGGLAVKEWLLAHEGHRLGKPGLG（配列番号５６）
Ｈａｌｏ−ＡＤＡＲ１Ｑ：
核酸配列：
ATGGCAGAAATCGGTACTGGCTTTCCATTCGACCCCCATTATGTGGAAGTCCTGGGCGAGCGCATGCACTACGTCGATGTTGGTCCGCGCGATGGCACCCCTGTGCTGTTCCTGCACGGTAACCCGACCTCCTCCTACGTGTGGCGCAACATCATCCCGCATGTTGCACCGACCCATCGCTGCATTGCTCCAGACCTGATCGGTATGGGCAAATCCGACAAACCAGACCTGGGTTATTTCTTCGACGACCACGTCCGCTTCATGGATGCCTTCATCGAAGCCCTGGGTCTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATTCACGACTGGGGCTCCGCTCTGGGTTTCCACTGGGCCAAGCGCAATCCAGAGCGCGTCAAAGGTATTGCATTTATGGAGTTCATCCGCCCTATCCCGACCTGGGACGAATGGCCAGAATTTGCCCGCGAGACCTTCCAGGCCTTCCGCACCACCGACGTCGGCCGCAAGCTGATCATCGATCAGAACGTTTTTATCGAGGGTACGCTGCCGATGGGTGTCGTCCGCCCGCTGACTGAAGTCGAGATGGACCATTACCGCGAGCCGTTCCTGAATCCTGTTGACCGCGAGCCACTGTGGCGCTTCCCAAACGAGCTGCCAATCGCCGGTGAGCCAGCGAACATCGTCGCGCTGGTCGAAGAATACATGGACTGGCTGCACCAGTCCCCTGTCCCGAAGCTGCTGTTCTGGGGCACCCCAGGCGTTCTGATCCCACCGGCCGAAGCCGCTCGCCTGGCCAAAAGCCTGCCTAACTGCAAGGCTGTGGACATCGGCCCGGGTCTGAATCTGCTGCAAGAAGACAACCCGGACCTGATCGGCAGCGAGATCGCGCGCTGGCTGTCGACGCTCGAGAAGCCAACCCCTGCAGGCGGAGGCGCGCCAGGGTCTGGCGGCGGCAGTAAGGCAGAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACACTCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGTCAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGACAAGGCACAATCCCTGTGGAATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAAATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCACATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGATGGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTCAAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTA（配列番号５７）
アミノ酸配列：
MAEIGTGFPFDPHYVEVLGERMHYVDVGPRDGTPVLFLHGNPTSSYVWRNIIPHVAPTHRCIAPDLIGMGKSDKPDLGYFFDDHVRFMDAFIEALGLEEVVLVIHDWGSALGFHWAKRNPERVKGIAFMEFIRPIPTWDEWPEFARETFQAFRTTDVGRKLIIDQNVFIEGTLPMGVVRPLTEVEMDHYREPFLNPVDREPLWRFPNELPIAGEPANIVALVEEYMDWLHQSPVPKLLFWGTPGVLIPPAEAARLAKSLPNCKAVDIGPGLNLLQEDNPDLIGSEIARWLSTLEKPTPAGGGAPGSGGGSKAERMGFTEVTPVTGASLRRTMLLLSRSPEAQPKTLPLTGSTFHDQIAMLSHRCFNTLTNSFQPSLLGRKILAAIIMKKDSEDMGVVVSLGTGNRCVKGDSLSLKGETVNDCHAEIISRRGFIRFLYSELMKYNSQTAKDSIFEPAKGGEKLQIKKTVSFHLYISTAPCGDGALFDKSCSDRAMESTESRHYPVFENPKQGKLRTKVENGQGTIPVESSDIVPTWDGIRLGERLRTMSCSDKILRWNVLGLQGALLTHFLQPIYLKSVTLGYLFSQGHLTRAICCRVTRDGSAFEDGLRHPFIVNHPKVGRVSIYDSKRQSGKTKETSVNWCLADGYDLEILDGTRGTVDGPRNELSRVSKKNIFLLFKKLCSFRYRRDLLRLSYGEAKKAARDYETAKNYFKKGLKDMGYGNWISKPQEEKNFYLCPV（配列番号５８）
好ましい実施形態によれば、野生型アミノ酸残基Ｅ５２１がＱに変異し、その結果、過剰活性デアミナーゼ変異体となる。さらに好ましい変異体としては、Ｅ５２１Ｙ、Ｅ５２１Ｆ、Ｅ５２１Ｗ、Ｅ５２１Ｈ、Ｅ５２１Ｌ、Ｅ５２１ＭおよびＥ５２１Ｖが挙げられ、これらは、活性が抑えられ、好ましくは編集対象のヌクレオチドに対応する位置の標的化配列中に脱塩基部位を有する人工核酸に関連して用いられる。
【０１０５】
Ｃｌｉｐｆ−ＡＤＡＲ１Ｑ：
核酸配列：
ATGGACAAAGACTGCGAAATGAAGCGCACCACCCTGGATAGCCCTCTGGGCAAGCTGGAACTGTCTGGGTGCGAACAGGGCCTGCACCGTATCATCTTCCTGGGCAAAGGAACATCTGCCGCCGACGCCGTGGAAGTGCCTGCCCCAGCCGCCGTGCTGGGCGGACCAGAGCCACTGATCCAGGCCACCGCCTGGCTCAACGCCTACTTTCACCAGCCTGAGGCCATCGAGGAGTTCCCTGTGCCAGCCCTGCACCACCCAGTGTTCCAGCAGGAGAGCTTTACCCGCCAGGTGCTGTGGAAACTGCTGAAAGTGGTGAAGTTCGGAGAGGTCATCAGCGAGAGCCACCTGGCCGCCCTGGTGGGCAATCCCGCCGCCACCGCCGCCGTGAACACCGCCCTGGACGGAAATCCCGTGCCCATTCTGATCCCCTGCCACCGGGTGGTGCAGGGCGACAGCGACGTGGGGCCCTACCTGGGCGGGCTCGCCGTGAAAGAGTGGCTGCTGGCCCACGAGGGCCACAGACTGGGCAAGCCTGGGCTGGGTCCTGCAGGCGGAGGCGCGCCAGGGTCTGGCGGCGGCAGTAAGGCAGAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACACTCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGTCAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGACAAGGCACAATCCCTGTGGAATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAAATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCACATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGATGGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTCAAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTA（配列番号５９）
アミノ酸配列：
MDKDCEMKRTTLDSPLGKLELSGCEQGLHRIIFLGKGTSAADAVEVPAPAAVLGGPEPLIQATAWLNAYFHQPEAIEEFPVPALHHPVFQQESFTRQVLWKLLKVVKFGEVISESHLAALVGNPAATAAVNTALDGNPVPILIPCHRVVQGDSDVGPYLGGLAVKEWLLAHEGHRLGKPGLGPAGGGAPGSGGGSKAERMGFTEVTPVTGASLRRTMLLLSRSPEAQPKTLPLTGSTFHDQIAMLSHRCFNTLTNSFQPSLLGRKILAAIIMKKDSEDMGVVVSLGTGNRCVKGDSLSLKGETVNDCHAEIISRRGFIRFLYSELMKYNSQTAKDSIFEPAKGGEKLQIKKTVSFHLYISTAPCGDGALFDKSCSDRAMESTESRHYPVFENPKQGKLRTKVENGQGTIPVESSDIVPTWDGIRLGERLRTMSCSDKILRWNVLGLQGALLTHFLQPIYLKSVTLGYLFSQGHLTRAICCRVTRDGSAFEDGLRHPFIVNHPKVGRVSIYDSKRQSGKTKETSVNWCLADGYDLEILDGTRGTVDGPRNELSRVSKKNIFLLFKKLCSFRYRRDLLRLSYGEAKKAARDYETAKNYFKKGLKDMGYGNWISKPQEEKNFYLCPV（配列番号６０）
好ましい実施形態によれば、野生型アミノ酸残基Ｅ４０６がＣｌｉｐｆ−ＡＤＡＲ１においてＱに変異し、その結果、過剰活性デアミナーゼ変異体となる。さらに好ましい変異体としては、Ｅ４０６Ｙ、Ｅ４０６Ｆ、Ｅ４０６Ｗ、Ｅ４０６Ｈ、Ｅ４０６Ｌ、Ｅ４０６ＭおよびＥ４０６Ｖが挙げられ、これらは、活性が抑えられ、好ましくは編集対象のヌクレオチドに対応する位置の標的化配列中に脱塩基部位を有する人工核酸に関連して用いられる。
【０１０６】
好ましい実施形態によれば、核酸リクルートモチーフ（本明細書中のそれぞれの節を参照のこと）を有するリクルート部分を含む、本明細書に記載の人工核酸は、（好ましくは上記において規定した配列によって定義される）ｈＡＤＡＲ１ｐ１１０、ｈＡＤＡＲ１ｐ１５０、ｈＡＤＡＲ２およびＡｐｏｂｅｃ１からなる群より選ばれる内因性デアミナーゼ、またはこれらのデアミナーゼのいずれかの断片もしくはバリアント、の存在下でＲＮＡの部位特異的編集のために使用されることが好ましい。
【０１０７】
別の実施形態によれば、カップリング剤（本明細書中のそれぞれの節を参照のこと）を有するリクルート部分を含む、本明細書に記載の人工核酸は、（好ましくは上記において規定した配列によって定義される）ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ１、ＳＮＡＰｆ−ＡＤＡＲ２、ｍＡＰＯＢＥＣ−ＳＮＡＰ、Ｈａｌｏ−ＡＤＡＲおよびＣｌｉｐｆ−ＡＤＡＲからなる群より選ばれるタグ付きデアミナーゼ、またはこれらのデアミナーゼのいずれかの断片もしくはバリアント、の存在下でＲＮＡの部位特異的編集のために使用されることが好ましい。
【０１０８】
［人工核酸を含むベクター］
一態様において、本発明は、本明細書に記載の人工核酸を含むベクターを提供する。
【０１０９】
本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、典型的には核酸分子を指し、好ましくは人工核酸分子を指す。本発明に関して、ベクターは、所望の核酸配列（人工核酸の核酸配列またはその断片など）を組み込むかまたは宿すのに好適である。このようなベクターとしては、ストレージベクター(storage vectors)、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクターなどが挙げられる。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクターまたはバクテリオファージベクターであり得る。トランスファーベクターは、核酸分子を細胞または生物に導入するのに好適なベクターであり得、例えば、ウイルスベクターである。好ましくは、本願の意味におけるベクターは、クローニング部位、抗生物質耐性因子などの選択マーカー、および複製起点などのベクターの増殖に好適な配列、を含む。
【０１１０】
ベクターは、ＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターであり得る。好ましくは、ベクターはＤＮＡベクターである。ベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターなどの、当業者に公知の任意のベクターであり得る。好ましくは、ベクターはプラスミドベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドベクターである。特定の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよびハイブリッドベクターからなる群より選ばれる。
【０１１１】
好ましくは、本発明に係るベクターは、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの製造に好適である。したがって、好ましくは、ベクターは転写に必要な要素（プロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）など）を含む。好ましくは、ベクターは、真核生物、原核生物、ウイルスまたはファージの転写系を用いる転写、例えば真核細胞、原核細胞、または真核生物、原核生物、ウイルスもしくはファージのインビトロ転写系を用いる転写、に適している。したがって、例えば、ベクターは、ポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼなど）によって、例えば真核生物、原核生物、ウイルス、またはファージのＲＮＡポリメラーゼによって、認識されるプロモーター配列を含み得る。好ましい実施形態において、ベクターは、ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７、好ましくはＴ７プロモーターなど）を含む。好ましくは、ベクターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに基づくインビトロ転写系などのファージに基づくインビトロ転写系を用いるインビトロ転写に適している。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、ベクターは、真核細胞へのトランスフェクションの際の、好ましくは哺乳類細胞へのトランスフェクションの際の、または被験体への投与の際の、好ましくは本明細書に記載のような、人工核酸の転写用に設計される。好ましい実施形態において、ベクターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ、より好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる人工核酸の転写用に設計される。特定の実施形態において、ベクターは、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターまたはＨ１プロモーター、および任意に、選択マーカー、例えば、レポーター遺伝子（ＧＦＰなど）または耐性遺伝子（ピューロマイシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子など）を含み得る。
【０１１３】
［人工核酸またはベクターを含む細胞］
本発明の一態様によれば、本明細書に記載の人工核酸またはベクターを含む細胞が提供される。細胞は、細菌細胞または真核細胞などの任意の細胞、好ましくは昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞またはマウス細胞）などの脊椎動物細胞であってもよい。細胞は、例えば、細菌細胞において、例えば本発明のベクターの複製のために使用され得る。さらに、細胞、好ましくは真核細胞は、本発明に係る人工核酸分子の合成のために使用され得る。
【０１１４】
本発明に係る細胞は、例えば、標準的なトランスフェクション法、形質導入法、または形質転換法などの標準的な核酸導入法によって得られる。本明細書において使用される場合、「トランスフェクション」という用語は一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）分子などの核酸分子の細胞への、好ましくは真核細胞への導入を指す。本発明に関しては、「トランスフェクション」という用語は、核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞（例えば哺乳類細胞）に導入するための当業者に既知のあらゆる方法を包含する。このような方法は、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法（例えば、カチオン性脂質および／またはリポソームに基づくリポフェクション法）、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、またはカチオン性のポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミンなど）に基づくトランスフェクションを包含する。これに関して、本明細書に記載の人工核酸またはベクターは、過渡的アプローチで、または細胞中（例えば、安定な細胞株中）で人工核酸またはベクターを安定に維持するために、細胞中に導入され得る。
【０１１５】
好ましくは、細胞は、哺乳類細胞（ヒト被験体の細胞、家畜の細胞、実験動物の細胞（マウス細胞またはラット細胞）など）である。好ましくは、細胞はヒト細胞である。細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３Ｔ、ＣＯＳ−７、ＨＥＬＡ、ＨＥＫ、ジャーカット細胞株などの確立された細胞株の細胞であってもよく、あるいは、細胞は、ヒト皮膚線維芽（ＨＤＦ）細胞などの初代細胞であってもよく、好ましくは生体から単離された細胞であってもよい。好ましい実施形態において、細胞は、哺乳類被験体、好ましくはヒト被験体の単離細胞である。
【０１１６】
［人工核酸を含む組成物］
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の人工核酸、ベクターまたは細胞、および任意に、追加の賦形剤、好ましくは薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に関する。本明細書に記載の組成物は、好ましくは薬学的組成物である。本明細書に記載の組成物は、遺伝子治療アプローチにおけるような、対象の治療または予防において使用され得る。あるいは、組成物はまた、診断目的のために、または実験用の使用（例えば、インビトロ実験）のために使用され得る。
【０１１７】
好ましくは、組成物は一つ以上のビヒクル、希釈剤、および／または賦形剤をさらに含み、それらは薬学的に許容されるものであることが好ましい。本発明との関係において、薬学的に許容されるビヒクルは、典型的に、本明細書に記載の組成物用の液体基剤または非液体基剤を含む。一つの実施形態において、組成物は液体形態で提供される。これに関して、ビヒクルは、好ましくは発熱物質を含まない水、等張性塩水、緩衝化（水性）溶液などの水に基づくものであり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩などの緩衝化溶液である。緩衝液は、特定の基準媒質を基準として高張性、等張性または低張性であってもよく、つまり、緩衝液は、特定の基準媒質を基準にしてより高い、同一の、またはより低い塩分を有してもよく、好ましくは、浸透性または他の濃縮効果による哺乳類細胞のダメージをもたらさない、そのような濃度の上述の塩が使用されてもよい。基準媒質は、例えば、インビボ方法で生じる液体（血液、リンパ液、細胞質液、または他の体液など）であり、または、例えば、インビトロ方法において基準媒質として使用され得る液体（一般的な緩衝液または液体など）である。このような一般的な緩衝液または液体は、当業者に既知である。液体基剤としては、乳酸リンゲル液が特に好ましい。
【０１１８】
被験体への投与に好適な、適合性の固体または液体の充填剤または希釈剤またはカプセル化化合物の一つ以上が、本発明の薬学的組成物に同様に使用され得る。本明細書において使用される場合、用語「適合性」は好ましくは、（薬学的）組成物のこれらの成分が、組成物の薬学的有効性を典型的な使用条件のもとで実質的に低下させるような相互作用を生じない様式において、本明細書に規定する人工核酸、ベクター、または細胞と混合可能であることを意味する。
【０１１９】
本発明に係る組成物は、任意に、一つ以上の追加の薬学的に活性な成分をさらに含んでもよい。これに関して、薬学的に活性な成分は、特定の徴候または疾患を治癒、改善または予防するための治療的効果を示す化合物である。このような化合物としては、ペプチドまたはタンパク質、核酸、（治療的に活性な）低分子量の有機化合物または無機化合物（分子量５０００未満、好ましくは１０００未満）、糖、抗原または抗体、または従来技術において既に知られている他の治療剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
さらに、組成物は、人工核酸分子用またはベクター用の担体を含み得る。このような担体は、生理学的に許容される液体への溶解、薬学的に活性な人工核酸分子またはベクターの輸送および細胞内取り込みを媒介するのに適し得る。したがって、このような担体は、本明細書に記載の人工核酸分子またはベクターのデポー(depot)および送達に適した成分であり得る。このような成分は例えば、トランスフェクション剤または複合体形成剤として機能し得るカチオン性またはポリカチオン性の担体または化合物であり得る。これに関して、特に好ましいトランスフェクション剤または複合体形成剤は、カチオン性またはポリカチオン性の化合物である。
【０１２１】
「カチオン性化合物」という用語は、典型的には、１〜９のｐＨ値、好ましくは９以下（例えば、５〜９）、または８以下（例えば、５〜８）、または７以下（例えば、５〜７）のｐＨ値、最も好ましくは生理的ｐＨ（例えば７．３〜７．４）で正に帯電した（カチオン）荷電分子を指す。したがって、カチオン性化合物は、任意の正に帯電した化合物またはポリマー、好ましくは、生理的条件下で、特にインビボでの生理学的条件下で、正に帯電したカチオン性のペプチドもしくはタンパク質、またはカチオン性脂質から選択され得る。「カチオン性のペプチドまたはタンパク質」は、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、またはＯｒｎから選択される、少なくとも一つの正に帯電したアミノ酸、または二つ以上の正に帯電したアミノ酸、を含有し得る。したがって、「ポリカチオン性化合物」は、所定の条件下で二つ以上の陽電荷を示す範囲にも含まれる。
【０１２２】
本明細書に記載の組成物は、好ましくはネイキッド(naked)形態または複合形態の人工核酸またはベクターを含む。好ましい実施形態において、組成物は、ナノ粒子、好ましくは脂質ナノ粒子またはリポソーム、の形態の人工核酸またはベクターを含む。
【０１２３】
［キット］
さらなる態様において、本発明は、本発明の人工核酸分子、ベクター、細胞および／または（薬学的）組成物を含むキットまたはパーツのキットに関する。
【０１２４】
好ましくは、キットは、取扱説明書、トランスフェクション用の細胞、組成物を投与するための手段、（薬学的に許容される）担体またはビヒクル、および／または人工核酸分子、ベクター、細胞または組成物を溶解または希釈するための（薬学的に許容される）溶液をさらに含む。好ましい実施形態では、キットは、液体形態または固体形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかの、本明細書に記載の人工核酸またはベクター、および投与用の（薬学的に許容される）ビヒクルを含む。例えば、キットは、人工核酸またはベクターおよびビヒクル（例えば、水、ＰＢＳ、乳酸リンゲルまたは他の好適な緩衝液）を含んでもよく、これらは、被験体への投与前に混合される。
【０１２５】
［人工核酸、ベクター、組成物または細胞の使用］
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、組成物または細胞の使用に関する。
【０１２６】
特に、本発明は、標的ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸、ベクター、組成物または細胞の使用を含む。そこで、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、組成物または細胞は、好ましくは、標的化配列を介して標的ＲＮＡに特異的に結合することによって、および本明細書に記載のデアミナーゼを標的部位にリクルートすることによって、標的ＲＮＡの部位特異的編集を促進するために使用されることが好ましい。この反応は、インビトロまたはインビボで起こり得る。
【０１２７】
好ましい実施形態において、人工核酸、ベクターまたは組成物は、編集対象の標的ＲＮＡを含む細胞に投与または導入される。標的ＲＮＡを含む当該細胞は、好ましくは本明細書に記載のデアミナーゼをさらに含むことが好ましい。当該デアミナーゼは、好ましくは、内因性デアミナーゼ、より好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ、または組み換えデアミナーゼ（好ましくは本明細書に記載の、タグ付きデアミナーゼまたは変異デアミナーゼなど）であり、これは、好ましくは人工核酸、ベクターまたは組成物に先行してまたは同時に、上記細胞中で安定に発現されるか、または上記細胞中に導入される。あるいは、本明細書に記載の人工核酸またはベクターを含む細胞は、好ましくは本明細書に記載のように、例えばトランスフェクションによって、細胞と標的ＲＮＡとを接触させることによって、または細胞に標的ＲＮＡを導入することによって、標的ＲＮＡの部位特異的編集のために使用される。
【０１２８】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、標的ＲＮＡを部位特異的編集するための方法であって、標的ＲＮＡを人工核酸と接触させることを含み、ＲＮＡの部位特異的編集のための人工核酸、ベクター、組成物または細胞の使用に関する本明細書に記載の工程を本質的に含む、方法を提供する。
【０１２９】
編集反応は、好ましくは標的ＲＮＡの配列分析によってモニターまたは制御される。
【０１３０】
本明細書に記載の使用および方法は、さらに、疾患または障害のインビトロ診断においても採用され得る。ここで、当該疾患または障害は、好ましくは、感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患または障害からなる群より選ばれる。
【０１３１】
［人工核酸、ベクター、組成物または細胞の医学的使用］
さらなる態様において、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、組成物、細胞またはキットは、例えば、遺伝子治療における医薬品としての使用のために提供される。好ましくは、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、組成物、細胞、またはキットは、疾患または障害の治療または予防に使用するために提供され、ここで、当該疾患または障害は、感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患または障害からなる群より選ばれる。好ましい実施形態によれば、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、組成物、細胞またはキットは、医薬品としての使用のために、または（好ましくは本明細書に規定する）疾患もしくは障害の治療または予防における使用のために提供され、ここで、医薬品としての使用または治療もしくは予防は、標的ＲＮＡの部位特異的編集工程を含む。
【０１３２】
一態様において、本発明は、疾患または障害を有する被験体を治療する方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、組成物、または細胞を被験体に有効量投与する工程を含み、ここで、当該疾患または障害は、好ましくは、感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患または障害からなる群より選ばれる。
【０１３３】
本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は、経口的に、非経口的に、吸入噴霧によって、局所的に、直腸に、経鼻的に、頬側に、経腟的に、埋め込みリザーバを介して、またはジェット注射を介して、投与され得る。本明細書で用いられる用語「非経口」としては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、心臓内、動脈内、および舌下注射または注入の技術が挙げられる。好ましい実施形態において、本明細書に記載の人工核酸分子、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は、無針注射（例えばジェット注射）によって投与される。
【０１３４】
好ましくは、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は、非経口的に投与され、例えば、注射剤によって投与され、より好ましくは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、心臓内、動脈内、舌下注射または注入の技術によって投与される。特に、皮内注射および筋肉内注射が好ましい。本発明の薬学的組成物の注入可能な無菌の形態は、水性懸濁液または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤ならびに懸濁剤を用いて、当該技術分野で知られている技術にしたがって調合され得る。
【０１３５】
本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物はまた、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含むが、これらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与されてもよい。
【０１３６】
本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は、特に、治療の標的が例えば、皮膚または任意の他の到達可能な上皮組織の疾患を含む、局所施用によって容易に到達可能な領域または器官を含む場合に、局所的に投与することもできる。適切な局所製剤は、これらの領域または器官のそれぞれに対して容易に調製される。局所施用のために、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は、一つ以上の担体に懸濁または溶解された適切な軟膏中に製剤化され得る。
【０１３７】
一実施形態では、医薬品としての使用は、哺乳類細胞のトランスフェクション工程、好ましくは哺乳類細胞のインビトロまたはエクスビボトランスフェクション工程、より好ましくは医薬品によって治療される被験体の単離細胞のインビトロトランスフェクション工程、を含む。使用が単離細胞のインビトロトランスフェクションを含む場合、医薬品としての使用は、トランスフェクションされた細胞の患者への再投与をさらに含み得る。人工核酸またはベクターの医薬品としての使用は、首尾よくトランスフェクションされた単離細胞の選択工程をさらに含み得る。したがって、ベクターは、選択マーカーをさらに含む場合に有益であり得る。
【０１３８】
本発明の他の態様によれば、本明細書に記載の人工核酸、ベクター、細胞、または（薬学的）組成物は疾患または障害の診断に使用するために提供され、ここで、当該疾患または障害は、好ましくは感染症、腫瘍性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および神経性疾患または障害からなる群より選ばれる。
【０１３９】
〔図面の簡単な説明〕
以下に示す図面は単に例示的なものであり、本発明をさらに説明する。これらの図面は、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１４０】
図１：改変されたＡＤＡＲ発現細胞株（２９３Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ）における編集。
【０１４１】
Ａ）いくつかのＡＳＯ設計の配列および化学修飾パターン。Ｂ）ルシフェラーゼレポーターの編集による、プラスミドコードされたガイドＲＮＡによる最初の配列スクリーニング。Ｃ）化学修飾ＡＳＯを、それぞれ、図示したＡＤＡＲ発現細胞系へトランスフェクションすることによる、二つの内因性転写産物（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ）の比較編集。単一のＡＳＯ（ＧＡＰＤＨまたはＡＣＴＢに対して）または二つのＡＳＯ（ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢに対して）のいずれかをトランスフェクションした。Ｂ）のデータは、平均値±ＳＤ、Ｎ＝２の独立した実験として示す。Ｃ）のデータは、平均値±ＳＤ、Ｎ＝３の独立した実験として示す。Ａ１ｐ１１０＝ＡＤＡＲ１ｐ１１０；Ａ１ｐ１５０＝ＡＤＡＲ１ｐ１５０。
【０１４２】
図２：種々のＡＳＯを用いたトランスフェクションによる種々の細胞および細胞株における内因性ＡＤＡＲのリクルートによる内因性転写産物（ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、３’−ＵＴＲ内の各５’−ＵＡＧトリプレット）の編集。図に示すように、ＩＦＮ−αの存在下または非存在下で実験を行った。
【０１４３】
Ａ）ＨｅＬａ細胞における内因性ＡＤＡＲのリクルートについての、三つの異なるＡＳＯの比較。単一のガイドＲＮＡ（ＧＡＰＤＨまたはＡＣＴＢに対して）または両方のガイドＲＮＡ（ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢに対して）のいずれかをトランスフェクションした。「Ｒ／Ｇ無し」は、ＡＤＡＲリクルートドメインを欠くＡＳＯを意味する。Ｂ）ＧＡＰＤＨに対するガイドＲＮＡ  ｖ９．４およびｖ９．５の比較編集。Ｃ）ＨｅＬａ細胞におけるＧＡＤＰＨ編集収率に対するアイソフォーム特異的ＡＤＡＲノックダウンの効果。Ｄ）ノックダウンの効果は、ウェスタンブロット法によって検証した。Ｅ）ＨｅＬａ細胞におけるＧＡＰＤＨを９６ウェルフォーマットで編集するためのＡＳＯ  ｖ９．５の有効量（ＥＤ５０）の決定。ＥＤ５０＝０．２ｐｍｏｌ／ウェル（ＩＦＮ−α有り）および０．４ｐｍｏｌ／ウェル（ＩＦＮ−α無し）。Ｆ）ＩＦＮ−α有りの場合および無しの場合の、ＨｅＬａ細胞におけるＧＡＰＤＨ編集収率の時間推移。Ｇ）種々の標準（癌）細胞株において５ｐｍｏｌ／９６ウェル（ＳＨ−ＳＹ５Ｙについて２５ｐｍｏｌ／２４ウェル）のＡＳＯ  ｖ９．５を用いた場合の、ＧＡＰＤＨ編集収率。Ｈ）種々の初代ヒト細胞においてＡＳＯ  ｖ９．５（別に示さない限り、２５ｐｍｏｌ／２４ウェル）を用いた場合の、ＧＡＰＤＨ編集収率。ＨＵＶＥＣ＝ヒト臍帯静脈内皮細胞；ＨＡＥＣ＝ヒト大動脈内皮細胞；ＮＨＡ＝正常ヒト星状細胞；ＲＰＥ＝ヒト網膜色素上皮；ＮＨＢＥ＝正常ヒト気管支上皮。Ａ〜Ｈ）データは、Ｎ＝３の独立した実験の平均値±ＳＤとして示し、肝細胞を用いた実験は、各ドナーの単回測定値または図示のドナーの平均値（平均値±ＳＤ）である。Ａ１ｐ１５０＝ＡＤＡＲ１ｐ１５０。
【０１４４】
図３：初代細胞におけるＯＲＦ編集および適用。
【０１４５】
Ａ）ＡＳＯ  ｖ９．４を適用したそれぞれのＡＤＡＲアイソフォームを発現する２９３−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞における内因性ＧＡＰＤＨの３’−ＵＴＲに対するＯＲＦ（部位＃２）における５’−ＵＡＧコドンの編集。Ｂ）ＯＲＦ編集用の、ＡＳＯ設計ｖ２５。Ｃ）ＨｅＬａおよび初代細胞におけるＡＳＯ  ｖ２５を用いたＧＡＰＤＨ  ＯＲＦ中の５’−ＵＡＧ部位（＃１）の編集。Ｄ）ＨｅＬａおよび初代細胞におけるＳＴＡＴ１のＴｙｒ７０１部位（５’−ＵＡＵコドン）の編集。Ｅ）ＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現する２９３細胞およびＨｅＬａ細胞におけるＰｉＺＺ変異（ＳＥＲＰＩＮＡ１におけるＥ３４２Ｋ、５’−ＣＡＡコドン）の編集。ＳＥＲＰＩＮＡ１  Ｅ３４２Ｋ  ｃＤＮＡを、ＨｅＬａ細胞に、共トランスフェクションし、または遺伝子的に組み込んだ。Ａ１ＡＴ分泌を、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１をトランスフェクションした場合の分泌に対して正規化した。Ａ、Ｃ、Ｄ：データは、Ｎ＝３の独立した実験の平均値±ＳＤとして示し；肝細胞を用いた実験は、各ドナーの単回測定値であり；ｎ．ｄ．は、編集が検出できなかったことを示す。
【０１４６】
図４：化学的に修飾されたＡＤＡＲリクルートドメインに対する、化学的に修飾されていないＡＤＡＲリクルートドメインを含むＡＳＯ  ｖ２５を用いたＨｅＬａ細胞中のＧＡＰＤＨのＯＲＦ中の５’−ＵＡＧコドンの編集収率。
【０１４７】
化学的に修飾されていないＡＤＡＲリクルートドメイン（未修飾Ｒ／Ｇ）を有するＡＳＯ  ｖ２５を、追加の化学修飾を有する同じ配列のＡＳＯ（ＡＤＡＲリクルートドメイン中のすべてのピリミジンヌクレオチドは骨格２’−Ｏ−メチル化されている）と比較した。ＡＳＯをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。データは、Ｎ＝３の独立した実験の、平均値±ＳＤとして示す。
【０１４８】
図５：本発明に係るＡＳＯの好ましい実施形態。
【０１４９】
Ａ）標的化配列およびリクルート部分の一般的な構成。リクルート部分の異なる配列変化形および標的化配列の異なる構成を示す。Ｂ）標的化配列およびリクルート部分のそれぞれの例示的な修飾パターン。
【０１５０】
図６：修飾されていないＡＳＯおよび修飾されたＡＳＯの血清安定性。
【０１５１】
Ａ）コドン５’−ＡＡＡを標的とするガイドＲＮＡの血清安定性。アンチコドンの５’位に修飾された（２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ）ヌクレオチドを有するガイドＲＮＡを、それぞれの修飾されていないガイドＲＮＡと比較した。図２Ａは、５分〜１２時間ガイドＲＮＡをインキュベートした後の、尿素ＰＡＧＥゲルを示す（実施例５参照）。Ｂ）血清安定性に対する標的コドンの影響。Ｃ）標的化アンチコドン（３’−ＡＣＣ）の修飾パターンが血清安定性に及ぼす影響。
【０１５２】
図７：化学的に修飾された短いガイドＲＮＡによって駆動されるＳＮＡＰタグ付きＡＤＡＲによる部位特異的ＲＮＡ編集。
【０１５３】
ａ）ｈＡＤＡＲの二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）が、ＳＮＡＰ−ｔａｇで置換されている。後者は、ベンジルグアニン（ＢＧ）によって修飾されたガイドＲＮＡと共有結合を形成することができる。ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲに結合すると、ガイドＲＮＡは付着したＳＮＡＰ−ＡＤＡＲタンパク質を標的ＲＮＡに向かわせ、デアミナーゼドメインによって触媒されるＡ−ｔｏ−Ｉ編集に必要な二次構造を形成する。ｂ）５’−ＣＣＡアンチコドンを有するＵＡＧ部位を標的とする典型的なＢＧガイドＲＮＡ。ガイドＲＮＡは２２ｎｔ長であり、２’−メトキシ化および末端ホスホロチオエート結合によって高密度に化学的に安定化されている。最初の三つの５’末端ヌクレオチドは、標的ＲＮＡと塩基対を形成しないが、リンカーとして機能する。この配列は、好ましくは、標的部位に面し、効率的な脱アミノ化のために標的アデノシンに対向する中央ミスマッチシトシンを含む、修飾されていないか、または部分的に修飾されたリボヌクレオチドギャップ（５’−ＣＣＡ）を含む。Ｃ６−アミノリンカーは、ガイドＲＮＡの５’末端に位置し、これにより完全長オリゴヌクレオチドにＢＧ修飾を導入する。ｃ）実験の設定。安定に組み込まれたＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ（ＳＡ）を有する細胞を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）を含有する培地を有する２４ウェルプレートに播種し、ＳＡ発現を誘導する。２４時間後、細胞をガイドＲＮＡでリバーストランスフェクションした。２４時間後、細胞をＲＮＡ単離のために溶解し、ＲＮＡ編集を分析した。
【０１５４】
図８：四つのＳＮＡＰ−ＡＤＡＲの編集性能。ａ）それぞれのＳＡ酵素を発現する改変された２９３細胞株に、図示した内因性転写産物中の５’−ＵＡＧトリプレットに対する一つのｇＲＮＡまたは四つのｇＲＮＡのいずれかをトランスフェクションした。ｂ）、ｃ）ＧＡＰＤＨ転写産物における編集の時間依存性および用量依存性。ｄ）様々な転写産物における５’−ＵＡＧ部位の編集（５’−ＵＴＲ対ＯＲＦおよび３’−ＵＴＲ）。ｅ）内因性ＧＡＰＤＨ転写産物のＯＲＦにおける１６個のトリプレット（５’−ＮＡＮ）すべての比較編集。ａ）〜ｅ）データは、Ｎ＝３の独立した実験の平均値±ＳＤとして示し、黒い点は個々のデータポイントを表す。
【０１５５】
図９：ＳＡＱ細胞の標的外編集の制御。ａ）標的部位における隣接アデノシンの意図しない編集を回避するために、ガイドＲＮＡ中の対向塩基は、２’−メトキシ化（Ｍ）または２’−フッ素化（Ｆ）によって修飾され得る。トリプレットＣＡＡを例としてこれを示す。ｂ）特にＳＡ２Ｑ細胞を用いた場合、トリプレットＣＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＣおよびＵＡＡにおいて、隣接アデノシンの標的外編集が検出された。しかしながら、本ストラテジーを適用した場合、標的外編集は著しく減少した。データは、Ｎ＝３の独立した実験の平均値±ＳＤとして示し、黒い点は個々のデータポイントを表す。
【０１５６】
図１０：編集収率および血清安定性に対する化学修飾の効果。
【０１５７】
標的化配列中の３’−ＡＣＣアンチコドン（Ａ）および３’−ＵＣＣアンチコドン（Ｂ）をそれぞれ安定化する化学修飾の例、例えば、２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシおよびホスホロチオエート修飾。
【０１５８】
図１１：ガイドＲＮＡに対する分岐および多重複製したカップリング剤のコンジュゲーション。１ｘＢＧ、２ｘＢＧ、または４ｘＢＧをＡＳＯの一つの末端または二つの部位に結合するスキームを示す。これらの構成は、いくつかのデアミナーゼを標的にリクルートし、例えば有効性に関してそれらの編集性能を明らかに改善することができる（図１２参照）。
【０１５９】
図１２：分岐した／複数のカップリング剤を適用した結果を示す。
【０１６０】
ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ１Ｑを発現する２９３−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞において、内因性ＳＴＡＴ１転写産物中のＴｙｒ７０１コドンの編集について、図１１に示すような構成を有する種々のガイドＲＮＡを試験した。具体的には、５’−アミノリンカーまたは５’−および３’−アミノリンカーの両方を含有するガイドＲＮＡを適用し、それらを一つ（単一）または二つ（二重）のカップリング剤（１ｘＢＧ、２ｘＢＧ、または４ｘＢＧ）のそれぞれに連結させた。
【０１６１】
〔実施例〕
以下に示す実施例は単に例示的なものであり、本発明をさらに説明している。これらの実施例は、それらに本発明が限定されると解釈されるべきではない。
【０１６２】
実施例１：
修飾されていないＲＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いて、３７℃で一晩、直鎖合成ＤＮＡ鋳型（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツから購入）からインビトロ転写によって生成した。得られたＲＮＡをエタノール中で沈殿させ、尿素（７Ｍ）ポリアクリルアミド（１５％）ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製し、水中に抽出し、エタノールで沈殿させ、再懸濁し、ヌクレアーゼを含まない水中に保存した。すべての化学的に修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ（ドイツ）、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）またはＤｈａｒｍａｃｏｎ（米国）から購入した。長い配列を、ライゲーションによって二つの断片から組み立てた。
【０１６３】
最初の工程として、適当なガイドＲＮＡ配列をスクリーニングするためにプラスミドを介したアプローチを適用した。レポーター編集アッセイ（図１Ｂ）によって、ＡＤＡＲリクルートドメインにおけるＲＮＡらせんの５’−部位に追加の５ｂｐを有する配列バリアント９．４を同定した。
【０１６４】
レポーター編集アッセイにおいて、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶプラスミドからのＣＭＶプロモーターの制御下で、ホタルルシフェラーゼを発現させた。Ｗ４１７Ｘアンバー変異を、オーバーラップＰＣＲによって導入した。クローン生成物の配列を、サンガーシーケンス解析によって決定した。Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌら（Wettengel, J., Reautschnig, J., Geisler, S., Kahle, P. J., Stafforst, T. Harnessing human ADAR2 for RNA repair - Recoding a PINK1 mutation rescues mitophagy. Nucl. Acids Res. 45, 2797‐2808 (2017)）に記載されているものと同様の修飾ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ骨格から、Ｒ／Ｇ−ガイドＲＮＡをＵ６プロモーターの制御下で発現させた。クローン生成物の配列を、サンガーシーケンス解析によって決定した。適用したＲ／Ｇ−ガイドＲＮＡの配列を表１に示す。
【０１６５】
【表１】
2021534732.tif 000004
【０１６６】
2021534732.tif 000005
【０１６７】
2021534732.tif 000006
【０１６８】
ＷｅｔｔｅｎｇｅｌらおよびＨｅｅｐら（Heep, M., Mach, P., Reautschnig, P., Wettengel, J., Stafforst, T. Applying Human ADAR1p110 and ADAR1p150 for Site‐Directed RNA Editing ‐ G/C Substitution Stabilizes GuideRNAs Against Editing. Genes 8, 34 (2017)）に記載されているように、それぞれのゲノム的に組み込んだＡＤＡＲバージョンを含むＦｌｐ−Ｉｎ  ２９３  Ｔ−ＲＥｘ細胞（Ｒ７８００７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を生成した。細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ＋１５μｇ／ｍｌブラスチシジンＳ中で培養した。編集のために、２．５×１０５細胞／ウェル（ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０）または３×１０５細胞／ウェル（ＡＤＡＲ２）を、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍｌドキシサイクリン中の、ポリ−Ｄ−リシンでコーティングした２４ウェルプレートに播種した。２４時間後、ルシフェラーゼレポータープラスミド（３００ｎｇ）およびＲ／Ｇ−ガイドＲＮＡ（１３００ｎｇ）を用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００対プラスミド比３：１を用いてトランスフェクションを行った。培地は、採取まで２４時間ごとに交換した。ＲＮＡを単離し、トランスフェクションの７２時間後、上述のように配列決定した。
【０１６９】
ＡＤＡＲ２のリクルートにあまり効果がない（編集収率が３５％低下）にもかかわらず、配列バリアント９．４はＡＤＡＲ１ｐ１１０を用いた編集収率をほぼ二倍に改善することが分かった。
【０１７０】
次の工程において、ガイドＲＮＡのプラスミドを介した発現を、化学的に安定化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の投与に置き換えた。まず、三つの化学的に安定化されたＡＳＯ設計（ｖ１、ｖ９、ｖ９．４）を、ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢの３’−ＵＴＲにおけるそれぞれの５’−ＵＡＧ部位の編集について試験した。ＡＤＡＲリクルートドメインが天然リボヌクレオチドからなる一方、ＡＳＯの１７ｎｔアンチセンス部分は、Ｖｏｇｅｌら（Vogel, P., Schneider, M.F., Wettengel, J., Stafforst, T. Improving Site‐Directed RNA Editing In Vitro and in Cell Culture by Chemical Modification of the GuideRNA. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 6267‐6271 (2014)）の記載と同様に、編集部位に対向する三つの天然リボヌクレオシドのギャップを有するＡｎｔａｇｏｍｉｒ様修飾ギャップマー１０（全体的な２’−Ｏメチル化、３’末端ホスホロチオエート結合、図１Ａ）としてＳＮＡＰ−ＡＤＡＲアプローチ用に設計した。ハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨの３’−ＵＴＲのいずれかにおける特定の５’−ＵＡＧ部位を標的とするＡＳＯを構築した。
【０１７１】
そのようなＡＳＯの個々のＡＤＡＲ選好性を評価するために、ＣＭＶ  ｔｅｔ−ｏｎプロモーターの制御下で特定のＡＤＡＲアイソフォーム（ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ１ｐ１１０またはＡＤＡＲ１ｐ１５０）１１を発現する改変された２９３  Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ細胞に当該ＡＳＯをリポフェクトした。ＡＳＯトランスフェクションの４８時間前に、１０ｎｇ／ｍＬドキシサイクリンを含むＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の２４ウェルプレートに、一ウェルあたり２×１０５のそれぞれのＡＤＡＲ−Ｆｌｐ−Ｉｎ  ２９３  Ｔ−ＲＥｘ細胞を播種し、ＡＤＡＲ遺伝子発現を誘発した。４８時間後、細胞を分離し、９６ウェルプレート中でリバーストランスフェクションした。そこで、ＡＳＯ（特に明記しない限り、５ｐｍｏｌ／ウェル）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（０．７５μＬ／ウェル）を、それぞれ、別々のチューブ内で１０μＬの量までＯｐｔｉＭＥＭで希釈した。５分後、両方の溶液を混合し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬドキシサイクリン中の１００μＬの細胞懸濁液（５×１０４細胞）を９６ウェル内のトランスフェクション混合物に添加した。２４時間後、細胞を、上述のように、ＲＮＡ単離および配列決定のために採取した。
【０１７２】
ここで、ＡＤＡＲ１ｐ１５０発現細胞中の両方の標的について、特に高い編集収率（７５％〜８５％）が検出された（図１Ｃ）。ＡＤＡＲ１−アイソフォームｐ１１０については、編集収率は１２％〜５０％の範囲で低かったが、データによれば、最初のバージョン１と比較して、新規なガイドＲＮＡ配列９．４での編集収率がかなり（２〜３倍）向上したことは明らかである。ＡＤＡＲ２を用いた編集は、ＡＤＡＲ１ｐ１１０と同等の範囲にとどまり（１５〜５０％）、また、古いバージョン１と比較して、新規な設計９．４では効果が低かった。最後に、両方のＡＳＯの共トランスフェクションによる両方の転写産物の同時編集を試験した（図１Ｃ、右側）。編集収率は、実質的に不変のままであり、部位特異的ＲＮＡ編集が同時にいくつかの部位または転写産物において実行され得る可能性が実証された。
【０１７３】
実施例２：
さらなる一連の実験において、ＨｅＬａ細胞における二つのハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢの３’−ＵＴＲにおける５’−ＵＡＧコドンの編集のために、内因的に発現したＡＤＡＲをそれぞれのＡＳＯの単純なリポフェクションに利用した。
【０１７４】
そこで、ＨｅＬａ細胞（カタログ番号：ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ（１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）中で培養した。９６ウェルフォーマット中の各ウェルにおいて、１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（＋６００ユニットのＩＦＮ−α、Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号：ＩＦ００７、ロット番号：２９３７８５８）中の５×１０４個の細胞を、０．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００および５ｐｍｏｌのガイドＲＮＡのトランスフェクション混合物に添加した。二つの異なるＡＳＯによる同時編集のために、２．５ｐｍｏｌの各ＡＳＯを共トランスフェクションした。２４時間後、ＲＮＡ単離および配列決定のために細胞を採取した。
【０１７５】
特異性ドメインのみを含みＡＤＡＲリクルートドメインを含まない対照ＡＳＯは、編集を誘発しなかった（図１Ａ、２Ａ）。初期配列ｖ１および設計ｖ４を用いた場合、いくらかの編集が観察された（図２Ａ）。しかしながら、新規な配列ｖ９．４は、両方の転写産物において明らかに高い編集をもたらし、収率は約４０％であった。ＡＳＯ設計ｖ９．４がＡＤＡＲｐ１５０と特によく機能したという事実に鑑み、ＡＤＡＲ１ｐ１５０の発現を誘導することが知られているＩＦＮ−αで前処理したＨｅＬａ細胞を用いて実験を繰り返した。実際、ＩＦＮ−αによる処理によって、すべてのＡＳＯ設計（ｖ１、ｖ４、ｖ９．４）および両方の転写産物について編集収率がほぼ二倍になり、７０％もの編集収率が得られた。この結果から、内因的に発現したＡＤＡＲを利用する上で配列ｖ９．４が優れていることが確認された。
【０１７６】
また、この一連の実験では、二つのガイドＲＮＡの共トランスフェクション後に、両方の転写産物の編集をさらに分析した。また、この設定において、編集収率は高レベルのまま変化しなかった（図２Ａ、右側）。化学修飾の影響を評価するために、Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞における過剰発現ＡＤＡＲのリクルートも、同じ配列の修飾されていないインビトロ転写ガイドＲＮＡを用いて試験し、化学的に安定化されたＡＳＯと比較して明らかに劣っていることがわかった。
【０１７７】
次の工程では、化学修飾をＡＤＡＲリクルートドメインにまで拡張した。具体的には、５’末端を２’−Ｏ−メチル化およびホスホロチオエート結合によって安定化させ、すべてのピリミジンをそれらの２’−Ｏ−メチル化アナログで置換した。重度に修飾されたとしても、このＡＳＯ設計ｖ９．５は、ＨｅＬａ細胞における内因性ＡＤＡＲのリクルートにおいて同等か、またはより良好であり（図２Ｂ）、ＡＤＡＲのｄｓＲＮＡ結合ドメインが広範な化学修飾を許容することが実証された。
【０１７８】
ＨｅＬａ細胞において、どのＡＤＡＲアイソフォームがＡＳＯ  ｖ９．５によってリクルートされるかを評価するために、ＡＤＡＲの発現をウェスタンブロット実験で判定した。
【０１７９】
ウェスタンブロット法では、ｓｉＲＮＡのリバーストランスフェクションの７２時間後に、細胞を採取し、尿素溶解緩衝液（８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８，０）中で溶解した。剪断力を２３ゲージ注射器を用いて印加し、３０．０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離することにより、細胞残屑を除去した。次いで、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて総タンパク質量を正規化し、１倍Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中の適正量のタンパク質溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％スタッキング、１２％分離ゲル）に充填した。タンパク質を、タンクブロッティングシステムを用いて、３０Ｖで一晩、ＰＶＤＦ膜上に移した。膜を５％脱脂粉乳ＴＢＳＴ＋５０μｇ／ｍｌアビジン中で室温で２時間ブロックし、その後、一次抗体（５％脱脂粉乳ＴＢＳＴ＋１：１０００α−ＡＤＡＲ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−７３４０８またはα−ＡＤＡＲ２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−７３４０９＋１：４０．０００α−ベータ−アクチン、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ５４４１）と共に４℃で一晩インキュベートした。二次抗体（５％脱脂粉乳ＴＢＳＴ＋１：１０．０００α−マウス−ＨＲＰ＋１：５０．０００  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＰｒｏｔｅｉｎＴＭ  ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１０３８１）を室温で１．５時間インキュベートした。各抗体のインキュベーションの後、膜をＴＢＳＴで５分間×３回洗浄した。１ｍｌのＣｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏｒａｄ）およびＦｕｓｉｏｎ  ＳＬ  Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ（Ｖｉｌｂｅｒ）を用いて検出を行った。
【０１８０】
ウェスタンブロットでは、ＡＤＡＲ１ｐ１１０のみがよく発現していることがわかった一方、ＡＤＡＲ１ｐ１５０はかすかに見えるだけであったが、ＩＦＮ−αによって明らかに誘導可能であった（図２Ｄ）。ＡＤＡＲ２は検出できなかった（データは示さず）。特定のＡＤＡＲアイソフォームをノックダウンするためにＲＮＡ干渉を適用した。そこで、ＨｅＬａ細胞を、ＡＤＡＲ１（両方のアイソフォーム、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＡＤＡＲ（１０３）ｓｉＲＮＡ、Ｌ−００８６３０−００−０００５）、ＡＤＡＲ１ｐ１５０（Ａｍｂｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、センス鎖：５’−ＧＣＣＵＣＧＣＧＧＧＣＧＣＡＡＵＧＡＡｔｔ（配列番号９０）；アンチセンス鎖：５’−ＵＵＣＡＵＵＧＣＧＣＣＣＧＣＧＡＧＧＣａｔ（配列番号９１））、ＡＤＡＲ２（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＡＤＡＲＢ１（１０４）ｓｉＲＮＡ、Ｌ−００９２６３−０１−０００５）またはモック（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ｓｉＧＥＮＯＭＥ  Ｎｏｎ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ  Ｐｏｏｌ  ＃２、Ｄ−００１２０６−１４−０５）に対して２．５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡで１２ウェルフォーマットにおいてリバーストランスフェクションした。２．５μｌのそれぞれのｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）および３μｌのＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）およびＯｐｔｉＭＥＭを含む２００μｌのトランスフェクション混合物を各ウェルに均等に分配し、続いて、１．２×１０５個のＨｅＬａ細胞を含む８００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを添加した。培地は２４時間毎に交換した。ＲＮＡ編集実験のために、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４８時間後に細胞を分離し、上述のようにそれぞれのＡＳＯでリバーストランスフェクションした。
【０１８１】
ＡＤＡＲ２またはモックのそれぞれに対してｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合、編集収率は、ＩＦＮ−αにそれぞれ依存して、３５％および７０％のまま影響を受けなかった（図２Ｃ）。しかしながら、長いアイソフォームＡＤＡＲ１ｐ１５０の特定のノックダウンによって、１０％および２０％までの編集収率が低下した。両方のＡＤＡＲ１アイソフォームの同時ノックダウンは、検出できないほど編集を無効にさせた。これは、両方のＡＤＡＲ１アイソフォームが編集に寄与するが、ＡＤＡＲ１の非常に弱く発現したｐ１５０アイソフォームが、得られた編集収率に最も寄与したことを示唆している。これは、ＩＦＮ−α処理で観察されたポジティブな効果とよく一致しているが（図２）、ＡＤＡＲ１ｐ１５０発現２９３  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞ではＡＳＯの性能が良好であることともよく一致している（図１Ｃ）。
【０１８２】
ＡＳＯ  ｖ９．５の量を２０ｐｍｏｌ〜４０ｆｍｏｌ／９６ウェルの間で変化させた場合（図２Ｅ）、編集収率のシグモイド依存性が観察され、０．２ｐｍｏｌ  ＡＳＯ／９６ウェル（ＩＦＮ−αを含む）および０．４ｐｍｏｌ／ウェル（ＩＦＮを含まない）の投与で最大収率の半分に達した。最大編集収率は、２ｐｍｏｌ／９６ウェル以上で得られた。ＨｅＬａ細胞における効力は、ＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ二重鎖のトランスフェクションについての効力と同様の範囲であると考えられる。
【０１８３】
５ｐｍｏｌ／ウェルを速やかに分裂するＨｅＬａ細胞（１０％  ＦＢＳ）にトランスフェクションした後、編集収率の時間プロファイルを五日間にわたってさらに評価した。この目的のために、ＨｅＬａ細胞を上述のようにトランスフェクションした。トランスフェクションの前に、細胞をＩＦＮ−αで２４時間処理した（そのように示した場合）。示したそれぞれの時点でＲＮＡ単離のために細胞を採取した。トランスフェクション後２４時間より後の時点については、細胞の過剰増殖を避けるために、２４時間後に細胞を分離し、２４ウェルプレートに移した。培地（ＩＦＮ−αを含む（そう示す場合））は、２４時間毎に交換した。最大編集収率は、典型的にはトランスフェクション後１２〜４８時間の時間窓(time window)で観察され、ゆっくりと低下した（図２Ｆ）。
【０１８４】
内因性ＡＤＡＲのリクルートが効率的に作用する細胞株の範囲を評価するために、ＡＳＯ  ｖ９．５を１０個の不死化ヒト標準（癌）細胞株の群に適用した（図２Ｇ）。すべての細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ中で培養した。５×１０４細胞／９６ウェルのそれぞれの細胞株［ＨｅＬａ細胞（カタログ番号：ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）、Ｕ２ＯＳ−Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ（Ｅｌｍａｒ  Ｓｃｈｉｅｂｅｌ教授からの親切な寄付）、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）（カタログ番号：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２７１）、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）（カタログ番号：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２７１）、Ｕ８７ＭＧ（カタログ番号：ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）、Ｈｕｈ７（ＣＬＳ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、カタログ番号：３００１５６）、ＨｅｐＧ２（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ、カタログ番号：ＡＣＣ１８０）、ＡＫＮ−１（Ｎｕｓｓｌｅｒ  ｌａｂからの親切な寄付）、空のＨＥＫ−Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ（Ｒ７８００７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、空のｐｃＤＮＡ５ベクターで安定にトランスフェクションした）、およびＡ５４９（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）８６０１２８０４）］を、さらなる最適化なしに、ＨｅＬａ細胞について上述したように、それぞれのＡＳＯでリバーストランスフェクションした。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（カタログ番号：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６６）細胞のみを、２４ウェルフォーマットで個別にリバーストランスフェクションした。その際、５００μＬの培地（＋３０００Ｕ  ＩＦＮ−α）中の５×１０５細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（２．５μＬ）およびＯｐｔｉＭＥＭ中のＡＳＯ（２５ｐｍｏｌ）からなる１００μＬのトランスフェクション混合物に添加した。例えばＡ５４９およびＨｕｈ７などのいくつかの細胞株では、編集収率はＨｅＬａ細胞と同等であったが、他のものの編集収率はより低かった。「空の」２９３  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞株（空のｐｃＤＮＡ５を組み込んだ）を用いた場合に編集レベルが最も低くなり、すべての条件下で１１％未満の収率であった。ＩＦＮ−α処理の前に、４％〜３４％（平均１８．５％）の編集収率が達成された。先の記載と同様に、ＩＦＮ−α処理後の収率は２〜３倍高くなり、１１％〜７３％（平均４６．８％）の範囲であった。
【０１８５】
ＡＤＡＲをリクルートするＡＳＯの潜在的な治療範囲を良好に評価するために、線維芽細胞（パーキンソン患者由来）、および市販の、星状細胞、肝細胞（数人のドナー）、網膜および気管支由来の上皮細胞、ならびに動脈血管および静脈血管由来の内皮細胞を含む、異なる組織由来の七つの初代細胞の群を試験した（図２Ｈ）。すべての初代細胞は、Ｖａｌｅｎｔｅ  ｌａｂからの親切な寄贈物であった初代線維芽細胞を除いて、Ｌｏｎｚａから購入した。初代線維芽細胞をＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ中で培養した。他の細胞株は、下記に示す通り、それぞれの市販培地中で培養した。Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＣＣ−２５１７）およびＨｕｍａｎ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（ＨＡＥＣ、Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＣＣ−２５３５）は、Ｌｏｗ  Ｓｅｒｕｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＬＳＧＳ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｓ００３１０）を含む培地２００ＰＲＦ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｍ２００ＰＲＦ５００）で培養し、Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ（ＮＨＡ、Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＣＣ−２５６５）は、ＡＧＭ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ  Ｋｉｔ  Ｓｕｐｐｌ．  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＣＣ−４１２３）を含むＡＢＭ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＣＣ−３１８７）で培養し、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｈ−ＲＰＥ、Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：１９４９８７）は、Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｓ００９５）を含むＥｐｉＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：ＭＥＰＩ５００ＣＡ）で培養し、Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（ＮＨＢＥ、Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＣＣ−２５４０）は、Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｋｉｔ（ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、カタログ番号：ＡＴＣＣ−ＰＣＳ−３００−０４０）を含むＡｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、カタログ番号：ＡＴＣＣ−ＰＣＳ−３００−０３０）で培養し、Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ（ＰＨＨ、Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＨＵＣＰＩ）はＣｒｙｏ  ＨＨ  ｔｈａｗｉｎｇ  ｍｅｄｉａ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＭＣＨＴ５０）で解凍し、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｐｌａｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗ／Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＭＰ１００）に播種し、播種の６時間後、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｍｅｄｉａ  ｗ／  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＭＭ２５０）で培養した。３．５×１０４個のＨＵＶＥＣおよびＨＡＥＣ、１×１０５個のＮＨＡ、Ｈ−ＲＰＥおよび��ＨＢＥならびに４．５×１０５個のＰＨＨを播種した２４時間後、２４ウェルフォーマットでＡＳＯトランスフェクションを行った。ＰＨＨには、ラットコラーゲンＩコーティング２４ウェルプレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏＯｎｅ）を使用した。トランスフェクションの直前に、培地を交換した（５００μＬ培地／ウェル中に３０００Ｕ  ＩＦＮ−αを加えた（そう示す場合））。各ウェルについて、１．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および２５ｐｍｏｌのＡＳＯを、それぞれ、総容量５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭで別々に希釈した。５分間のインキュベーション後、二つの溶液を合わせ、さらに２０分間のインキュベーション後、１００μＬのトランスフェクション混合物を一つのウェルに均等に分配した。２４時間後、ＲＮＡ単離および配列決定のために細胞を採取した。予想外に、不死化細胞と比較して、より高い編集レベルが初代細胞において検出され、１０％〜６３％（平均３１．５％）の編集レベルを得た。特に、初代肝細胞試料および患者の線維芽細胞の両方において、編集レベルがＨｅＬａ細胞よりも高かった。ここでも、ＩＦＮ−α処理後にすべての細胞で編集収率が増加し、３５％〜７７％（平均６２．６％）の範囲となった。一連のＡＳＯ希釈液（２５〜０．２ｐｍｏｌ  ＡＳＯ  ｖ９．５／２４ウェル、ＩＦＮ処理なし）をドナー＃１および＃２の肝細胞にトランスフェクションしたところ、明らかな用量依存性を示した（図２Ｈ）。
【０１８６】
実施例３：
３’−ＵＴＲにおける５’−ＵＡＧトリプレットの編集のためのＡＳＯ設計９．４の特徴付けに続いて、ＡＤＡＲ発現２９３細胞株におけるＧＡＰＤＨのＯＲＦにおける５’−ＵＡＧトリプレットの編集を、ｖ９．４に基づくＡＳＯを用いて試験した（実施例１も参照のこと）。三つのＡＤＡＲで得られた編集収率を比較したところ、ＯＲＦにおける編集収率は、全体的に低めの編集収率（１１％〜５５％、図３Ａ参照）ではあるものの、前の３’−ＵＴＲと同じ傾向であった（ＡＤＡＲ１ｐ１５０＞ＡＤＡＲ１ｐ１１０≒ＡＤＡＲ２）。
【０１８７】
標的上の結合動態を改善するために、特異性ドメインの長さを増加させることによって、およびＬＮＡ修飾を含めることによって、ＡＳＯ構成をさらに最適化した。改変されていないＡＤＡＲリクルートドメインを含むが、２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオエート結合によって部分的に修飾され、三つのＬＮＡ修飾を含む４０ｎｔ特異性ドメインを含むＡＳＯ設計ｖ２５を同定した（図３Ｂ）。ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション後、ＡＳＯ  ｖ２５はＩＦＮ−無しで２６±３％、ＩＦＮ−有りで４２．７±１．５％の編集収率を達成した。特に、ＡＤＡＲリクルートドメインの化学修飾が重要であった。化学修飾無しでは、ｖ２５は、ＩＦＮ−が無い場合は編集をもたらさず、ＩＦＮ−有りでは中度の編集しかもたらさなかった（１３．７±３．５％、図４）。ＧＡＰＤＨのＯＲＦにおける５’−ＵＡＧ部位の編集のために、新規な設計ｖ２５をいくつかの初代細胞でも試験した。ＩＦＮ−処理の前は、得られた編集レベルは１２．７±２．１％（線維芽細胞）、９．３±０．６％（ＲＰＥ）、および３８％（肝細胞、一人のドナー）であった。上記と同様に、ＩＦＮ−処理を行うことによって、編集レベルが２２．７±０．６％（線維芽細胞）、３２．３±４．５％（ＲＰＥ）、および４５％（肝細胞、一人のドナー）に改善した。
【０１８８】
実施例４：
このようなＡＳＯの治療的可能性を評価するために、二つの治療的に関連する脱アミノ化部位の編集を試験した。まず、脱アミノ化することにより転写因子としてのタンパク質の機能を切り替える、内因性ＳＴＡＴ１のリン酸化部位（Ｔｙｒ７０１）を標的とした。編集後、それぞれの５’−ＵＩＵコドンは、リン酸化されたＴｙｒを模倣することができないアミノ酸であるＣｙｓをコードする。これらの実験では、上述のｖ２５設計に基づくＡＳＯを使用した。ＩＦＮ−α処理前では、初代線維芽細胞において２１．０±６．２％の編集収率が達成され、ＲＰＥ細胞において最大７％であった（図３Ｄ）。ＩＦＮ−α存在下では、収率は、３２±７％（線維芽細胞）および１９．７±２．５％（ＲＰＥ）に増加した。ＨｅＬａ細胞でも同様の値が得られた。全体として、内因性ＡＤＡＲをリクルートすることによる内因性ＳＴＡＴ１転写産物の編集は、初代細胞株において中度の収率で可能であった。
【０１８９】
第二の部位として、α１−アンチトリプシン欠損（Ａ１ＡＤ）の最も一般的な原因であるＳＥＲＰＩＮＡ１転写産物中のＰｉＺＺ変異（Ｅ３４２Ｋ）の編集を試験した。好中球エラスターゼ活性を調節するアンチトリプシンの喪失は、肺に重度の損傷を引き起こす。さらに、変異したアンチトリプシンは肝臓に蓄積し、重篤な肝障害を引き起こす。まず、ｖ９．４設計に基づくＡＳＯを適用したＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現する２９３細胞における変異ＳＥＲＰＩＮＡ１  ｃＤＮＡの過剰発現について、Ｅ３４２Ｋ変異（５’−ＣＡＡトリプレット）の編集を試験した。クローニング用のＳＥＲＰＩＮＡ１  ｃＤＮＡを得るために、ＨｅｐＧ２細胞から全ＲＮＡを単離し、逆転写した。Ｅ３４２Ｋ変異をＰＣＲによってｃＤＮＡに挿入し、ＳＥＲＰＩＮＡ１野生型およびＥ３４２Ｋ変異体の両方を、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩ制限を用いてＣＭＶプロモーターの制御下でｐｃＤＮＡ３．１ベクター上にクローニングした。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系を用いたＳＥＲＰＩＮＡ１のゲノム組み込みのために、野生型および変異体ｃＤＮＡを、上記と同じ制限部位を用いてＰＢ−ＣＡベクター上にクローニングした。１×１０６個のＨｅＬａ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に６ウェルプレートに播種した。１μｇのｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースベクター（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）および２．５μｇのＳＥＲＰＩＮＡ１  ＰＢ−ＣＡベクターを、製造者のプロトコルにしたがって１０．５μＬのＦｕＧＥＮＥ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて共トランスフェクションした。２４時間後、細胞を、１０μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有するＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中で２週間選択した。編集のために、安定してトランスフェクションされたか、またはプラスミドトランスフェクションされた（Ｈｅｌａについては３００ｎｇのプラスミド／０．９μＬのＦｕＧＥＮＥ６、およびＦｌｐ−ＡＤＡＲ１ｐ１５０細胞については１００ｎｇのプラスミド／０．３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）細胞を、上述のようにそれぞれのＡＳＯでリバーストランスフェクションした。２４時間後、細胞培養上清をＡ１ＡＴ−ＥＬＩＳＡのために回収し、細胞をＲＮＡ単離および配列決定のために採取した。Ａ１ＡＴ−ＥＬＩＳＡは、製造者のプロトコルにしたがって市販のキット（カタログ番号：ａｂ１０８７９９、Ａｂｃａｍ）を用いて行った。三つの生物学的複製に由来する試料を、技術的反復で測定した。Ａ１ＡＴタンパク質の量は、直線回帰を用いて標準曲線から計算した。
【０１９０】
ＡＳＯの存在下でのみ、２９±２％の編集収率が標的部位において測定された（図３Ｅ）。α１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）の分泌をＥＬＩＳＡアッセイで測定し、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ  ｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞の分泌に対して正規化した。分泌レベルは、修復前の１４±１．８％から修復後２７±４．３％に上昇した。５’−ＵＡＧトリプレット以外にも、５’−ＣＡＡトリプレットは標的Ａに最も近接した編集可能なアデノシンを含んでいる。実際、近接部位でいくらかの小さな編集が検出されたが、これは標的ヌクレオチドの周りのＡＳＯのさらなる化学修飾によって解決され得る問題である。内因性ＡＤＡＲを用いたＡ１ＡＤ原因変異の修復を試験するために、ｐｉｇｇｙＢａｃ系を用いて、またはＳＥＲＰＩＮＡ１  ｃＤＮＡのプラスミドを介した過剰発現によって、変異したＳＥＲＰＩＮＡ１を安定的に発現するＨｅＬａ細胞株を作製した。ｖ２５設計に基づくＡＳＯを適用することにより、１９±２％（ｃＤＮＡを組み込んだ、ＩＦＮ−α有り）および２１±４％（ｃＤＮＡの一過性発現、ＩＦＮ−α有り）の編集レベルが内因性ＡＤＡＲのリクルートによって得られた。
【０１９１】
実施例５：
ガイドＲＮＡの安定性を試験するために、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ緩衝液中でガイドＲＮＡを規定の時間（０分、５分、１０分、１時間、３時間、６時間、１２時間、または２４時間）インキュベートした。インキュベーション後、ガイドＲＮＡを１５％尿素（７Ｍ）−ＰＡＧＥ上で分離し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色し、写真撮影し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ生体分子イメージャーで定量した。修飾されていない３ｎｔアンチコドンを有するガイドＲＮＡは、典型的には血清中で非常に短い半減期（分）を有した。５’−ＡＡＡコドンを標的とする３’−ＵＣＵアンチコドンを有するガイドＲＮＡ（例えば、図６Ａ）は、分解によって、最初のインキュベーション時点（５分）では本質的に検出できなかった。しかしながら、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチルによる元々単一の骨格修飾によって、安定性が改善された（図６ＡおよびＢ）。アンチコドン３’−ＡＣＣについては、例えば、半減期はアンチコドン中のすべてのヌクレオチドをそれぞれ修飾するいくつかの修飾パターンによって、５分未満から約２４時間まで大幅に改善された（約３００倍の改善）。さらに、３ｎｔアンチコドンにおいて修飾されていないガイドＲＮＡ（ＢＧ−８５）と比較して、これらの修飾によって編集収率も増加した（例えば、ＢＧ−１５０／ＢＧ−１５１、図６Ｃ参照）。
【０１９２】
実施例６：
並列アプローチ(parallel approach)では、タグ付きＡＤＡＲを用いて内因性転写産物を編集するために、カップリング剤とコンジュゲートした(conjugated)ガイドＲＮＡを使用した。例えば、ＢＧコンジュゲートガイドＲＮＡをＳＮＡＰタグ付きＡＤＡＲと組み合わせて使用した（図７参照）。Ｈａｎｓｗｉｌｌｅｍｅｎｋｅら（J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 15875-15881）に記載されているように、５’−アミノ−Ｃ６リンカー（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ、ドイツ）を含む市販のオリゴヌクレオチドからＢＧコンジュゲートｇＲＮＡを合成し、ＰＡＧＥ精製に供した。すべてのガイドＲＮＡの配列および化学修飾を表２に示す。
【０１９３】
【表２】
2021534732.tif 000007
【０１９４】
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【０１９５】
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【０１９６】
この研究のために、５’−Ｃ６アミノリンカーを有するＨＰＬＣ精製ｓｓＲＮＡとしてすべてのＮＨ２−ガイドＲＮＡをＢｉｏｓｐｒｉｎｇ（ドイツ）から購入した。市販のＢＧ誘導体の代わりに、我々のプロトコルを用いてＢＧ部分を導入することができる。カルボン酸リンカー２，３（１２μｌ、ＤＭＳＯ中６０ｍＭ）に結合したベンジルグアニンを、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１２μｌ、ＤＭＳＯ中１７．４ｍｇ／ｍｌ）およびＮＨＳ（１２μｌ、ＤＭＳＯ中１７．８ｍｇ／ｍｌ）と３０℃で１時間インキュベートすることにより、ＯＳｕ−エステルとしてインサイチューで活性化させた。次いで、ＮＨ２−ガイドＲＮＡ（２５μｌ、６μｇ／μｌ）およびＤＩＰＥＡ（１２μｌ、ＤＭＳＯ中１：２０）を事前活性化混合物に添加し、インキュベートした（９０分、３０℃）。２０  １９粗ＢＧ−ガイドＲＮＡを、２０％尿素ＰＡＧＥによって未反応ＮＨ２−ガイドＲＮＡから精製し、次いでＨ２Ｏ（７００μｌ、４℃で一晩）で抽出した。ＲＮＡ沈殿は、酢酸ナトリウム（０．１体積(volumes)、３．０Ｍ）およびエタノール（３体積、１００％、−８０℃で一晩）を用いて行った。ＢＧ−ガイドＲＮＡをエタノール（７５％）で洗浄し、水（６０μｌ）に溶解した。
【０１９７】
ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ１（ＳＡ１）、ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ２（ＳＡ２）２およびそれらの過剰活性Ｅ・Ｑ変異体１０  ＳＡ１ＱおよびＳＡ２Ｑを安定して発現する細胞株を生成した。それぞれの酵素（ＳＡ１（ｗｔおよびＱ）およびＳＡ２（ｗｔおよびＱ））を、先に記載されたように、２９３  Ｆｌｉｐ−Ｉｎ細胞（Ｒ７８００７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のゲノム中に、ｄｏｘ誘導性ＣＭＶプロモーターの制御下で、ＦＲＴ部位においてシングルコピーとして組み込んだ（Wettengel, J., Reautschnig, J., Geisler, S., Kahle, P. J., Stafforst, T. Harnessing human ADAR2 for RNA repair - Recoding a PINK1 mutation rescues mitophagy. Nucl. Acids Res. 45, 2797-2808 (2017)；またはCox, D.B.T., Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Franklin, B., Kellner, M.J., Joung, J., Zhang, F. RNA editing with CRISPR-Cas13, Science, 10.1126/science.aaq0180 (2017)参照）。四つすべての酵素の酵素発現は、ドキシサイクリン（１０ｎｇ／ｍｌ）によって、ウェスタンブロット法および蛍光顕微鏡法によって確認されるように、おおよそ同等のレベルまで誘導可能であった（データは示さず）。また、ＲＮＡレベルでは、ＳＡ１（ｗｔおよびＱ）およびＳＡ２（ｗｔおよびＱ）の発現レベルはＳＡ１（Ｑ）およびＳＡ２（Ｑ）について平均ＦＰＫＭ値がそれぞれ６７９および８１４とほぼ同等であった。Ｅ・Ｑ変異はタンパク質局在化を変化させなかった。ＳＡ１（Ｑ）は細胞質および核質に局在し、ＳＡ２（Ｑ）は主に細胞質に局在する。異なるＳＮＡＰ−ＡＤＡＲタンパク質の位置を決定するために、１×１０５個の細胞を、２４ウェルフォーマットのポリ−Ｄ−リジンコーティングしたカバースリップ上のドキシクリン（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むかまたは含まない、５００μｌの選択培地に播種した。一日後、ＳＮＡＰ−ｔａｇのＢＧ−ＦＩＴＣラべリングおよび核染色を行った。ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲタンパク質の量を確認するために、ウェスタンブロット分析を用いた。このために、３×１０５個の細胞を、２４ウェルフォーマットでドキシクリン（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むかまたは含まない５００μｌの選択培地に、一日間播種した。次に、細胞を尿素緩衝液（１０ｍＭのトリス中８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）で溶解した。タンパク質溶解物（５μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＳＮＡＰ−ｔａｇ（１：１０００、Ｐ９３１０Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）およびβアクチン（１：４００００、Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）に対する一次抗体による免疫ブロット法のためにＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）上に移した。その後、ブロットを、ウサギ（１：１００００、１１１−０３５−００３、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）およびマウス（１：１００００、１１５−０３５−００３、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）に対するＨＲＰコンジュゲート二次抗体とインキュベートし、強化した化学発光によって可視化した。
【０１９８】
化学的に安定化させた短いＢＧガイドＲＮＡのトランスフェクションによって編集を開始し、四つの標的内因性ｍＲＮＡ（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、およびＳＡ１／２）の３’−ＵＴＲにおける特定の５’−ＵＡＧトリプレットでのｃＤＮＡにおける形式的(formal)Ａ−Ｇ変換について分析した。両方の野生型酵素（ＳＡ１／２）について、標的に応じて４０〜８０％の編集収率が達成された（図８ａ）。過剰活性変異体（ＳＡ１Ｑ／ＳＡ２Ｑ）を適用すると、収率は６５〜９０％に上昇した。トランスフェクションのほぼ３時間後に最大編集収率（８０〜９０％）が得られ（図１ｂ）、３日間一定のままであり、その後、おそらく細胞分裂によるガイドＲＮＡ−酵素コンジュゲートの減少のためにゆっくりと低下した。活性化酵素（ＳＡ１Ｑ＆ＳＡ２Ｑ）は野生型酵素（ＳＡ１＆ＳＡ２）と比較して１２倍まで強力であり、１〜２ｐｍｏｌ／ウェルと比較して０．１５ｐｍｏｌ／ウェルで既に最大編集収率の半分を達成した（図１ｃ）。四つの転写産物すべての同時編集を、四つのガイドＲＮＡの共トランスフェクションにより試験した。特に、収率は変化しないままであった（図１ａ）。編集収率は、ＯＲＦおよび５’−ＵＴＲと比較して、３’−ＵＴＲでより高く（図１ｄ）、これはおそらく翻訳による干渉に起因するものである。より速い酵素（ＳＡ１ＱおよびＳＡ２Ｑ）は５’−ＵＴＲにおける収率を２５〜５０％から６０〜７５％に、ＯＲＦにおける収率を１５〜６０％から５０〜８５％に上昇させた（図１ｄ）。さらに、ピューロマイシンによる翻訳阻害によって、ＳＡ１／２細胞におけるＯＲＦ編集が３’−ＵＴＲ編集のレベルまで増加した（データ示さず）。コドン範囲を評価するために、内因性ＧＡＰＤＨのＯＲＦ中の１６個の考えられる５’−ＮＡＮトリプレットすべてをＳＡ１ＱおよびＳＡ２Ｑについて試験した。ＡＤＡＲの既知の選好性を反映して、非常にわずかからほぼ定量的な範囲の収率が得られた（図１ｅ）。一般に５’−ＧＡＮトリプレット（＜３０％）では編集は困難であったが、１０／１６のトリプレットでは有意な収率（＞５０％）が達成された。７／１６のトリプレットについては、少なくとも一つの酵素について優れた編集収率（＞７０％）が得られた。
【０１９９】
実施例７：
ＲＮＡ編集における主要な目的は、オフサイト(off-site)編集の抑制である（図９ａ参照）。したがって、本明細書に記載のガイドＲＮＡの化学修飾バージョンを使用することによってオフサイト編集を回避できるかどうかを試験した。アデノシンに富むトリプレット（ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＵＡＡ、ＣＡＡ）についてのみ、主にＳＡ２Ｑ（５〜７５％）で、主にＣＡＡトリプレット（図９ｂ、右図、「ｒ」）について、いくらかの標的外編集が検出された。標的アデノシンに対向するガイドＲＮＡに三つの天然ヌクレオチドが存在する場合（図９ｂ、特に右図、「ｒ」）、標的外編集はより多かった。さらなる化学修飾（２’−メトキシ、２’−フルオロ）を慎重に含ませることによって、ＣＡＡトリプレットにおける標的外編集を２０％まで抑え、標的上の編集を減少させることなく、他のすべての部位における標的外編集を１０％未満に制限した（図９ｂ、「Ｍ」、「Ｆ」）。特に、少なくともＡＡＡについて、追加の修飾によって標的上の収率が４０％から５０％にも上昇した。
【０２００】
実施例８：
分岐リンカーおよびＢＧ由来リクルート部分の複数のコピーを、ＲＮＡ編集に対するそれらの効果に関して試験した。そこで、ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ１Ｑを発現する２９３−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞における内因性ＳＴＡＴ１転写産物中のＴｙｒ７０１コドンに対して、種々のガイドＲＮＡを並行して試験した（ガイドＲＮＡトランスフェクションの前に１０ｎｇ／ｍｌドキシサイクリンで２４時間誘導し、ガイドＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に編集分析を行った）。具体的には、５’−アミノリンカーまたは５’−および３’−アミノリンカーの両方を含有し、それぞれリクルート部分の一つまたは二つに結合したガイドＲＮＡを適用した。図１１に示すように、得られたガイドＲＮＡは、場合によって１個〜８個のＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ１Ｑデアミナーゼをリクルートすることができる。飽和量のガイドＲＮＡ（１ｐｍｏｌ／ウェル以上）が存在する場合、ほとんどすべてのガイドＲＮＡが同じ編集収率（７０〜８０％）を達成した。単一の１ｘＢＧガイドＲＮＡのみが最大収率を達成しなかったが、約６０％の収率で停止した。二つ以上のＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ１Ｑをリクルートすることを可能にするガイドＲＮＡは改善された効力を示し、ガイドＲＮＡの量が減少した場合、それらが高い編集収率を維持したことが示された。例えば、単一の１ｘＢＧの場合、ガイドＲＮＡの量を０．１ｐｍｏｌ／ウェルおよび０．０１ｐｍｏｌ／ウェルに減少させると、編集収率は２２％および検出未満に低下した。対照的に、二重２ｘＢＧおよび二重４ｘＢＧガイドＲＮＡについては、０．１ｐｍｏｌ／ウェルでそれぞれ編集収率が５８％および６５％のままであり、０．０１ｐｍｏｌ／ウェルで１７％および１０％に低下したのみであり、したがって、ガイドＲＮＡの効力は明らかに改善した。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】改変されたＡＤＡＲ発現細胞株（２９３Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ）における編集。
【０２０２】
Ａ）いくつかのＡＳＯ設計の配列および化学修飾パターン。Ｂ）ルシフェラーゼレポーターの編集による、プラスミドコードされたガイドＲＮＡによる最初の配列スクリーニング。Ｃ）化学修飾ＡＳＯを、それぞれ、図示したＡＤＡＲ発現細胞系へトランスフェクションすることによる、二つの内因性転写産物（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ）の比較編集。単一のＡＳＯ（ＧＡＰＤＨまたはＡＣＴＢに対して）または二つのＡＳＯ（ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢに対して）のいずれかをトランスフェクションした。Ｂ）のデータは、平均値±ＳＤ、Ｎ＝２の独立した実験として示す。Ｃ）のデータは、平均値±ＳＤ、Ｎ＝３の独立した実験として示す。Ａ１ｐ１１０＝ＡＤＡＲ１ｐ１１０；Ａ１ｐ１５０＝ＡＤＡＲ１ｐ１５０。
【図２】種々のＡＳＯを用いたトランスフェクションによる種々の細胞および細胞株における内因性ＡＤＡＲのリクルートによる内因性転写産物（ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、３’−ＵＴＲ内の各５’−ＵＡＧトリプレット）の編集。図に示すように、ＩＦＮ−αの存在下または非存在下で実験を行った。
【０２０３】
Ａ）ＨｅＬａ細胞における内因性ＡＤＡＲのリクルートについての、三つの異なるＡＳＯの比較。単一のガイドＲＮＡ（ＧＡＰＤＨまたはＡＣＴＢに対して）または両方のガイドＲＮＡ（ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢに対して）のいずれかをトランスフェクションした。「Ｒ／Ｇ無し」は、ＡＤＡＲリクルートドメインを欠くＡＳＯを意味する。Ｂ）ＧＡＰＤＨに対するガイドＲＮＡ  ｖ９．４およびｖ９．５の比較編集。Ｃ）ＨｅＬａ細胞におけるＧＡＤＰＨ編集収率に対するアイソフォーム特異的ＡＤＡＲノックダウンの効果。Ｄ）ノックダウンの効果は、ウェスタンブロット法によって検証した。Ｅ）ＨｅＬａ細胞におけるＧＡＰＤＨを９６ウェルフォーマットで編集するためのＡＳＯ  ｖ９．５の有効量（ＥＤ５０）の決定。ＥＤ５０＝０．２ｐｍｏｌ／ウェル（ＩＦＮ−α有り）および０．４ｐｍｏｌ／ウェル（ＩＦＮ−α無し）。Ｆ）ＩＦＮ−α有りの場合および無しの場合の、ＨｅＬａ細胞におけるＧＡＰＤＨ編集収率の時間推移。Ｇ）種々の標準（癌）細胞株において５ｐｍｏｌ／９６ウェル（ＳＨ−ＳＹ５Ｙについて２５ｐｍｏｌ／２４ウェル）のＡＳＯ  ｖ９．５を用いた場合の、ＧＡＰＤＨ編集収率。Ｈ）種々の初代ヒト細胞においてＡＳＯ  ｖ９．５（別に示さない限り、２５ｐｍｏｌ／２４ウェル）を用いた場合の、ＧＡＰＤＨ編集収率。ＨＵＶＥＣ＝ヒト臍帯静脈内皮細胞；ＨＡＥＣ＝ヒト大動脈内皮細胞；ＮＨＡ＝正常ヒト星状細胞；ＲＰＥ＝ヒト網膜色素上皮；ＮＨＢＥ＝正常ヒト気管支上皮。Ａ〜Ｈ）データは、Ｎ＝３の独立した実験の平均値±ＳＤとして示し、肝細胞を用いた実験は、各ドナーの単回測定値または図示のドナーの平均値（平均値±ＳＤ）である。Ａ１ｐ１５０＝ＡＤＡＲ１ｐ１５０。
【図３】初代細胞におけるＯＲＦ編集および適用。
【０２０４】
Ａ）ＡＳＯ  ｖ９．４を適用したそれぞれのＡＤＡＲアイソフォームを発現する２９３−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞における内因性ＧＡＰＤＨの３’−ＵＴＲに対するＯＲＦ（部位＃２）における５’−ＵＡＧコドンの編集。Ｂ）ＯＲＦ編集用の、ＡＳＯ設計ｖ２５。Ｃ）ＨｅＬａおよび初代細胞におけるＡＳＯ  ｖ２５を用いたＧＡＰＤＨ  ＯＲＦ中の５’−ＵＡＧ部位（＃１）の編集。Ｄ）ＨｅＬａおよび初代細胞におけるＳＴＡＴ１のＴｙｒ７０１部位（５’−ＵＡＵコドン）の編集。Ｅ）ＡＤＡＲ１ｐ１５０を発現する２９３細胞およびＨｅＬａ細胞におけるＰｉＺＺ変異（ＳＥＲＰＩＮＡ１におけるＥ３４２Ｋ、５’−ＣＡＡコドン）の編集。ＳＥＲＰＩＮＡ１  Ｅ３４２Ｋ  ｃＤＮＡを、ＨｅＬａ細胞に、共トランスフェクションし、または遺伝子的に組み込んだ。Ａ１ＡＴ分泌を、野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１をトランスフェクションした場合の分泌に対して正規化した。Ａ、Ｃ、Ｄ：データは、Ｎ＝３の独立した実験の平均値±ＳＤとして示し；肝細胞を用いた実験は、各ドナーの単回測定値であり；ｎ．ｄ．は、編集が検出できなかったことを示す。
【図４】化学的に修飾されたＡＤＡＲリクルートドメインに対する、化学的に修飾されていないＡＤＡＲリクルートドメインを含むＡＳＯ  ｖ２５を用いたＨｅＬａ細胞中のＧＡＰＤＨのＯＲＦ中の５’−ＵＡＧコドンの編集収率。
【０２０５】
化学的に修飾されていないＡＤＡＲリクルートドメイン（未修飾Ｒ／Ｇ）を有するＡＳＯ  ｖ２５を、追加の化学修飾を有する同じ配列のＡＳＯ（ＡＤＡＲリクルートドメイン中のすべてのピリミジンヌクレオチドは骨格２’−Ｏ−メチル化されている）と比較した。ＡＳＯをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。データは、Ｎ＝３の独立した実験の、平均値±ＳＤとして示す。
【図５】本発明に係るＡＳＯの好ましい実施形態。
【０２０６】
Ａ）標的化配列およびリクルート部分の一般的な構成。リクルート部分の異なる配列変化形および標的化配列の異なる構成を示す。Ｂ）標的化配列およびリクルート部分のそれぞれの例示的な修飾パターン。
【図６】修飾されていないＡＳＯおよび修飾されたＡＳＯの血清安定性。
【０２０７】
Ａ）コドン５’−ＡＡＡを標的とするガイドＲＮＡの血清安定性。アンチコドンの５’位に修飾された（２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ）ヌクレオチドを有するガイドＲＮＡを、それぞれの修飾されていないガイドＲＮＡと比較した。図２Ａは、５分〜１２時間ガイドＲＮＡをインキュベートした後の、尿素ＰＡＧＥゲルを示す（実施例５参照）。Ｂ）血清安定性に対する標的コドンの影響。Ｃ）標的化アンチコドン（３’−ＡＣＣ）の修飾パターンが血清安定性に及ぼす影響。
【図７】化学的に修飾された短いガイドＲＮＡによって駆動されるＳＮＡＰタグ付きＡＤＡＲによる部位特異的ＲＮＡ編集。
【０２０８】
ａ）ｈＡＤＡＲの二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）が、ＳＮＡＰ−ｔａｇで置換されている。後者は、ベンジルグアニン（ＢＧ）によって修飾されたガイドＲＮＡと共有結合を形成することができる。ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲに結合すると、ガイドＲＮＡは付着したＳＮＡＰ−ＡＤＡＲタンパク質を標的ＲＮＡに向かわせ、デアミナーゼドメインによって触媒されるＡ−ｔｏ−Ｉ編集に必要な二次構造を形成する。ｂ）５’−ＣＣＡアンチコドンを有するＵＡＧ部位を標的とする典型的なＢＧガイドＲＮＡ。ガイドＲＮＡは２２ｎｔ長であり、２’−メトキシ化および末端ホスホロチオエート結合によって高密度に化学的に安定化されている。最初の三つの５’末端ヌクレオチドは、標的ＲＮＡと塩基対を形成しないが、リンカーとして機能する。この配列は、好ましくは、標的部位に面し、効率的な脱アミノ化のために標的アデノシンに対向する中央ミスマッチシトシンを含む、修飾されていないか、または部分的に修飾されたリボヌクレオチドギャップ（５’−ＣＣＡ）を含む。Ｃ６−アミノリンカーは、ガイドＲＮＡの５’末端に位置し、これにより完全長オリゴヌクレオチドにＢＧ修飾を導入する。ｃ）実験の設定。安定に組み込まれたＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ（ＳＡ）を有する細胞を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）を含有する培地を有する２４ウェルプレートに播種し、ＳＡ発現を誘導する。２４時間後、細胞をガイドＲＮＡでリバーストランスフェクションした。２４時間後、細胞をＲＮＡ単離のために溶解し、ＲＮＡ編集を分析した。
【図８】四つのＳＮＡＰ−ＡＤＡＲの編集性能。ａ）それぞれのＳＡ酵素を発現する改変された２９３細胞株に、図示した内因性転写産物中の５’−ＵＡＧトリプレットに対する一つのｇＲＮＡまたは四つのｇＲＮＡのいずれかをトランスフェクションした。ｂ）、ｃ）ＧＡＰＤＨ転写産物における編集の時間依存性および用量依存性。ｄ）様々な転写産物における５’−ＵＡＧ部位の編集（５’−ＵＴＲ対ＯＲＦおよび３’−ＵＴＲ）。ｅ）内因性ＧＡＰＤＨ転写産物のＯＲＦにおける１６個のトリプレット（５’−ＮＡＮ）すべての比較編集。ａ）〜ｅ）データは、Ｎ＝３の独立した実験の平均値±ＳＤとして示し、黒い点は個々のデータポイントを表す。
【図９】ＳＡＱ細胞の標的外編集の制御。ａ）標的部位における隣接アデノシンの意図しない編集を回避するために、ガイドＲＮＡ中の対向塩基は、２’−メトキシ化（Ｍ）または２’−フッ素化（Ｆ）によって修飾され得る。トリプレットＣＡＡを例としてこれを示す。ｂ）特にＳＡ２Ｑ細胞を用いた場合、トリプレットＣＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＣおよびＵＡＡにおいて、隣接アデノシンの標的外編集が検出された。しかしながら、本ストラテジーを適用した場合、標的外編集は著しく減少した。データは、Ｎ＝３の独立した実験の平均値±ＳＤとして示し、黒い点は個々のデータポイントを表す。
【図１０】編集収率および血清安定性に対する化学修飾の効果。
【０２０９】
標的化配列中の３’−ＡＣＣアンチコドン（Ａ）および３’−ＵＣＣアンチコドン（Ｂ）をそれぞれ安定化する化学修飾の例、例えば、２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシおよびホスホロチオエート修飾。
【図１１】ガイドＲＮＡに対する分岐および多重複製したカップリング剤のコンジュゲーション。１ｘＢＧ、２ｘＢＧ、または４ｘＢＧをＡＳＯの一つの末端または二つの部位に結合するスキームを示す。これらの構成は、いくつかのデアミナーゼを標的にリクルートし、例えば有効性に関してそれらの編集性能を明らかに改善することができる（図１２参照）。
【図１２】分岐した／複数のカップリング剤を適用した結果を示す。
【０２１０】
ＳＮＡＰ−ＡＤＡＲ１Ｑを発現する２９３−Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞において、内因性ＳＴＡＴ１転写産物中のＴｙｒ７０１コドンの編集について、図１１に示すような構成を有する種々のガイドＲＮＡを試験した。具体的には、５’−アミノリンカーまたは５’−および３’−アミノリンカーの両方を含有するガイドＲＮＡを適用し、それらを一つ（単一）または二つ（二重）のカップリング剤（１ｘＢＧ、２ｘＢＧ、または４ｘＢＧ）のそれぞれに連結させた。
【図１（１−３）】
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【図１（２−３）】
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【図１（３−３）】
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【図２（１−６）】
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【図２（２−６）】
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【図２（３−６）】
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【図２（４−６）】
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【図２（５−６）】
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【図２（６−６）】
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【図３（１−３）】
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【図３（２−３）】
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【図３（３−３）】
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【図４】
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【図５（１−２）】
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【図５（２−２）】
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【図６（１−３）】
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【図６（２−３）】
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【図６（３−３）】
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【図７（１−２）】
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【図７（２−２）】
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【図８（１−４）】
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【図８（２−４）】
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【図８（３−４）】
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【図８（４−４）】
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【図９】
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【図１０（１−２）】
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【図１０（２−２）】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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