(57)【要約】  本発明は、医薬組成物の製造方法であって、以下の段階：  ほ乳類から収集され、血液の細胞成分を含む液体を準備する段階、内部表面を有する容器を準備する段階、前記液体を前記内部表面と接触させる段階、前記内部表面と接触させた前記液体を培養時間の間、培養する段階であって、ここで前記液体を攪拌手段によって、前記培養時間の間に少なくとも１回攪拌する前記段階、および前記培養時間が経過した後、（１）前記液体を収集すること、または（２）前記細胞成分の一部または全部を前記液体から除去し、残留物を収集することを含む段階によって、前記医薬組成物を得る段階を含む前記方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物の製造方法であって、以下の段階：
（ａ）  ほ乳類から収集され、血液の細胞成分を含む液体を準備する段階、
（ｂ）  内部表面を有する容器を準備する段階、
（ｃ）  前記液体を前記内部表面と接触させる段階、
（ｄ）  前記内部表面と接触させた前記液体を培養時間に亘って、培養する段階であって、ここで前記液体を攪拌手段によって、前記培養時間の間に少なくとも１回攪拌する段階、および
（ｅ）  前記培養時間が経過した後、（１）前記液体を収集すること、または（２）前記細胞成分の一部または全部を前記液体から除去し、残留物を収集することを含む段階によって、前記医薬組成物を得る段階
を含む前記方法。
【請求項２】
前記容器が、
・  前記液体と接触させるための、巨視的粒子、微視的粒子およびナノ粒子から選択される１種以上の粒子を含有する、
・  ガラス、プラスチック、コランダムおよび石英から選択される１種以上で作られた表面を含む内部表面を有する、または
・  １ｍｌ〜１０００ｍｌの容積を有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記液体が血液試料、好ましくは全血試料、または赤血球が枯渇された全血試料である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記液体を、
（１）  前記培養時間全体の間、攪拌する、
（２）  前記培養時間の間、２回以上攪拌する、
（３）  合計で少なくとも５分間攪拌する、
（４）  前記培養時間の開始後、１０分より後の時点で攪拌する、
（５）  培養時間の最初の１０分の間は攪拌しない、または
（６）  前記容器をその軸周りに回転させること、前記容器の軸を閉じた軌道に沿って動かすこと、前記容器をシフトさせること、前記容器を傾けること、前記容器を逆さにすること、前記容器を振とうさせること、前記液体を回転させること、前記液体をシフトさせること、および前記液体をかき混ぜることから選択される１つ以上によって攪拌する、
請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記攪拌手段が、
・  前記容器をその軸周りに回転させるためのホイール形またはプロペラ形の装置であって、好ましくは重力方向に対して垂直または９０度までの角度で傾けられた回転軸を有する前記装置、および
・  振とう装置、好ましくは円運動または並進運動を行うために適合された振とう装置
から選択される、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培養を、以下の条件：
・  １５分〜２４時間、１時間〜６時間、１時間〜５時間、１．５時間〜２４時間、２時間〜２４時間未満、２時間〜５時間、少なくとも３時間、３時間〜５時間、３時間〜２４時間未満、３時間〜２０時間、３時間〜１６時間、４時間〜１２時間、少なくとも５時間、５時間〜１０時間、５時間〜７時間、６時間まで、少なくとも６時間、または少なくとも７時間の培養時間の間、
・  ３０℃〜４０℃、好ましくは３７℃の温度で、または
・  添加された凝固防止剤の不在下、または存在下
の１つ以上の下で実施する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記医薬組成物において、
・  エクソソームの濃度が、他は同一の条件下で攪拌しない場合よりも高く、好ましくは少なくとも１．１倍高い、
・  ゲルゾリンの濃度が、他は同一の条件下で攪拌しない場合よりも高く、好ましくは少なくとも１．１倍高い、
・  レゾルビンの濃度が、他は同一の条件下で攪拌しない場合よりも高く、好ましくは少なくとも１．１倍高い、
・  ＩＬ−１Ｒａの濃度が、他は同一の条件下で攪拌しない場合よりも高く、好ましくは少なくとも１．１倍高い、
・  抗炎症性メディエーター（好ましくはＩＬ−１Ｒａ）および炎症性メディエーター（好ましくはＩＬ−１β）の濃度の少なくとも１つの比が、他は同一の条件下で攪拌しない場合よりも高く、好ましくは少なくとも１．１倍高い、または
・  炎症性メディエーター（好ましくはＩＬ−５またはＩＦＮ−γ）の少なくとも１つの濃度は前記培養前と本質的に同じである、
請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記血液の細胞成分が血小板を含み、且つ、段階（ｅ）が、前記培養時間が経過した後にカルシウムイオンおよび／またはトロンビンを添加することにより前記血小板を脱顆粒し、その後、前記液体を収集することにより前記医薬組成物を得る段階である、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法によって製造される医薬組成物。
【請求項１０】
エクソソームの製造方法であって、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法によって医薬組成物を製造すること、および前記医薬組成物中に含有されるエクソソームを収集することを含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法によって製造されるエクソソーム。
【請求項１２】
エクソソーム不含の調製物の製造方法であって、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法により医薬組成物を製造すること、および前記医薬組成物中に含有されるエクソソームを前記医薬組成物から除去して、前記エクソソーム不含の調製物を得ることを含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法によって製造されるエクソソーム不含の調製物。
【請求項１４】
好ましくは前記液体が収集されたものと同じほ乳類に投与することによる薬剤として使用するための、請求項９に記載の医薬組成物、請求項１１に記載のエクソソーム、または請求項１３に記載のエクソソーム不含の調製物。
【請求項１５】
整形外科的状態、関節の状態、腱の状態、痛み、変性脊椎疾患、椎間板の状態、神経整形外科的状態、神経根の状態、神経系の刺激、神経系の炎症、神経障害性の状態、免疫系の関与する疾患、自己免疫疾患、乾癬、慢性的な傷、筋肉疾患、食物不耐性、薬物不耐性、子宮内膜症、アポトーシスが役割を果たす状態、加齢および加齢に関連する疾患から選択される状態の治療において使用するための、老化防止剤として使用するための、または肌への注入による薬剤として使用するための、請求項９に記載の医薬組成物、請求項１１に記載のエクソソーム、または請求項１３のエクソソーム不含の調製物。
【請求項１６】
１種以上の他の有効な薬剤と組み合わせて使用する、請求項１４または１５に記載される使用をするための医薬組成物、請求項１４または１５に記載される使用をするためのエクソソーム、または請求項１４または１５に記載される使用をするためのエクソソーム不含の調製物。
【請求項１７】
請求項９に記載の医薬組成物、請求項１１に記載のエクソソーム、または請求項１３に記載のエクソソーム不含の調製物の、化粧品としての使用。
【請求項１８】
（ｉ）  請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法によって医薬組成物を製造すること、（ｉｉ）  請求項１０の方法によってエクソソームを製造すること、または（ｉｉｉ）  請求項１２の方法によってエクソソーム不含の調製物を製造すること、および前記医薬組成物、エクソソームおよびエクソソーム不含の調製物を、その保管手段、ほ乳類へのその投与手段、または賦形剤とそれぞれ組み合わせることを含む、組み合わせの製造方法。
【請求項１９】
請求項１８の方法によって製造される組み合わせ。
【請求項２０】
・  ほ乳類から収集され、血液の細胞成分を含む液体と接触する内部表面を有する容器、
・  前記液体を前記内部表面と接触させて培養する培養時間の間に、少なくとも１回前記液体を攪拌するための攪拌手段、および好ましくは
・  前記細胞成分の一部または全体を前記液体から除去して、前記培養時間後に残留物を収集することにより得られる医薬組成物の、ほ乳類への投与手段
を含むキット。
【請求項２１】
請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法における容器または攪拌手段の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
調整血清（ＣＳ）は、調整された末梢全血から製造される生物学的医薬品組成物である。自家調整血清（ＡＣＳ）は、血液のドナーであった同一人物に投与されるＣＳである。ＣＳは抗炎症特性およびおそらく軟骨保護特性を有する。ＣＳ（ＡＣＳ）を用いた治療は、サイトカイン、および血液の調整、つまり特定の要素の蓄積をもたらす表面との接触における培養に際して形成される他の要素に基づく。これは通常、ガラスビーズの存在下で行われる。ＡＣＳは１９９０年代から、元々は主に変形性関節症および他の整形外科疾患、例えば関節リウマチおよび（変性）脊椎障害において使用されており、そこで症状および疾患の進行について有益な作用を示した。通常、患者からの血液は、ガラスビーズを含有するパイロジェンフリーのシリンジに引き入れられ、細胞、特に白血球、例えば単球の活性化を開始する。培養後、血液を回収し、細胞を遠心分離によって取り出す。得られる血清は、抗炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３、並びに、インスリン様成長因子−１、血小板由来成長因子、およびトランスフォーミング成長因子−β１を含むいくつかの成長因子について富化されており、同一の患者に、例えば病変領域へと、例えば関節腔内注射法によって戻される。ＩＬ−１Ｒａは、サイトカインＩＬ−１の自然に生じる阻害因子である。ＩＬ−１は、炎症、痛み、および組織破壊の重要なメディエーターであると考えられている。
【０００２】
整形外科疾患の発症においては、生体力学的因子が役割を果たす。病因においては、さらにサイトカインカスケード全体の活性化が重要である。中心的なプロセスは、硝子軟骨の破壊に影響するサイトカインの局所放出である。これは、炎症誘発および破壊的因子のさらなる産生をもたらし、ひいてはさらなる硝子軟骨の破壊をもたらす。ＩＬ−１βは多くの炎症性疾患および変性疾患の主たるメディエーターなので、治療方針はその生物活性を打ち消すことに焦点を合わせている。ＩＬ−１βの活動を抑制する薬剤は高い治療可能性を有する。様々なアプローチは、例えばＩＬ−１Ｒａ、可溶性形態のＩＬ−１受容体、および抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３の投与であり、それはＩＬ−１の合成を抑制し、Ｌ−１Ｒａの合成を高めるか、またはその両方である。ＩＬ−１ＲａはＩＬ−１βを完全に抑制し、且つＩ型およびＩＩ型ＩＬ−１の受容体に対する親和性を有する。組み替え型ＩＬ−１Ｒａは米国ＦＤＡによって、関節リウマチの治療のために認可されている。局所的なＩＬ−１Ｒａ濃度は変性疾患において軟骨、筋肉、脊椎組織および他の関節構造の破壊を抑制するためには低すぎるという仮説が立てられている。
【０００３】
ＡＣＳは変形性関節症の発達の経過を変え得る薬剤（ＤＭＯＡＤ）であり、それにより外科的介入、例えば関節全置換術が必要になることをおそらく遅らせるか、またはさらには防ぐ。ＡＣＳは変形性関節症、例えば変形性膝関節症、変形性顎関節症、股関節変形性関節症および変形性股関節症、および前十字靭帯再建術後の骨孔拡大の減少において臨床的な利点を示している。患部組織へのＡＣＳの注入は、腰椎狭窄症、椎間板脱出および筋肉損傷の治療についての動物モデルおよび研究において、並びにヒトの臨床研究において、臨床的な有効性および安全性も示している。それは多くの炎症性の状態、例えば神経の炎症において可能性がある。従って、それは痛みを低減し、組織の分解を抑制し、且つ組織の修復を支えるための有用な非侵襲性技術である。
【０００４】
ＩＬ−１Ｒａだけでなく、さらなる因子もＣＳ（ＡＣＳ）の臨床的な有効性に関与し得る証拠が蓄積されている。少なくとも１０：１、好ましくは少なくとも１００：１であるべきＩＬ−１Ｒａ対ＩＬ−１の比は、調整血液についての品質管理パラメータとしても有用である。ＡＣＳの臨床効果および前臨床効果は、その中に存在する複数の因子の相乗作用に起因し得るという仮説が立てられている。効果は部分的には、血液細胞が異質の表面に暴露されることによる内因性の傷の治癒機構、例えば凝固カスケードおよび組織修復の機構を含む、活性化から生じ得る。変形性関節症における長期的な効果（例えば２年にわたる期間）は、健全な関節のホメオスタシスを再確立することによって暫定的に説明され得る。ＡＣＳの自家性ゆえに、リスク／利益の比は優れており、副作用を予期する必要はない。
【０００５】
全血、および調整全血はエクソソームを含有することが知られている。エクソソームは細胞がそれらの周囲に分泌する小さな小胞である。例えば、生物学的液体、例えば血清、尿、唾液、腹腔液、脳脊髄液、および滑液はエクソソームを含有する。ＣＳもエクソソームを含有する。大半の種類の調査されている細胞はエクソソームを分泌できる。分泌は、細胞の形質膜を通じた／細胞の形質膜からの放出により生じる。生成される細胞の種類に依存して、エクソソームはとりわけ、様々な組み合わせのタンパク質を含有する。エクソソームの調製および投与方法は、例えば国際公開第２００６／００７５２９号(WO2006/007529A2)に記載される。
【０００６】
まとめて、ＡＣＳ、ＡＣＳからのエクソソーム、および／またはＡＣＳから得られるエクソソーム不含の調製物は、以下の１つ以上において公知である：  老化の治療または老化防止剤としての使用において（国際公開第２０１８／０３３２２７号(WO2018/033227A1)）、老化に関連する疾患の治療において（国際公開第２０１７／０８０６６８号(WO2017/080668A1)）または肌への注入による使用について（国際公開第２０１８／０３３２２６号(WO2018/033226A1)）、筋肉疾患、腱疾患、食物不耐性、薬物不耐性、免疫系、乾癬、慢性的な傷、例えば糖尿病性潰瘍、神経皮膚炎、神経系の炎症および刺激、子宮内膜症、馬における慢性的な目の炎症を含む疾患から選択される１つ以上の治療において（国際公開第２００７／０９０５６９号(WO2007/090569A1)）、リウマチ、変形性関節症、関節の状態および疾患、背部の痛み（例えば神経学的原因に伴う）、神経整形外科的状態、神経根の状態、椎間板の状態、整形外科的状態（国際公開第２０００／４６２４９号(WO00/46249A1)）、腰椎根性痛、若年性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性スチル病およびアレルギー（国際公開第２００６／００７５２９号(WO2006/007529A2)）。ＡＣＳはウマの変形性関節症にも広く使用されており、そこでそれは臨床的跛行を著しく改善し、軟骨を分解から保護できる。
【０００７】
年齢と相関する一般的な特定の疾患は、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患、癌、聴覚障害、視覚障害、白内障、網膜変性、例えば黄斑変性、骨粗鬆症、２型糖尿病、高血圧、肝不全、悪液質、後彎症、歩行障害、振戦、運動失調、ジストニー、握力低下、筋肉消耗、および白髪化である。年齢は、神経変性および類似の疾患、例えば軽度認知障害、アルツハイマー病、脳血管性疾患、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症も促進する。
【０００８】
これまでに達成された成功にもかかわらず、上述および他の疾患の新たな薬物治療についての必要性が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００６／００７５２９号
【特許文献２】国際公開第２０１８／０３３２２７号
【特許文献３】国際公開第２０１７／０８０６６８号
【特許文献４】国際公開第２０１８／０３３２２６号
【特許文献５】国際公開第２００７／０９０５６９号
【特許文献６】国際公開第２０００／４６２４９号
【特許文献７】国際公開第２００６／００７５２９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、医薬品を製造するための新規の方法を提供することである。好ましくは、製造された医薬品は、先行技術の医薬品に対して、例えば作用物質のレベルまたは所望の因子の他の因子（例えば望ましくないもの）に対する比に関して改善されている。有利には、本発明によって製造できる医薬品は、製造が迅速であること、製造が容易であること、費用効率が良いこと、および身体適合性が高いことの１つ以上である。
【００１１】
上記の記載、および本願内で例示される実施態様の説明は、特定の実施態様または特徴の放棄を構成するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この課題は、医薬組成物の製造方法であって、以下の段階：
（ａ）  ほ乳類から収集され、血液の細胞成分を含む液体を準備する段階、
（ｂ）  内部表面を有する容器を準備する段階、
（ｃ）  前記液体を前記内部表面と接触させる段階、
（ｄ）  前記内部表面と接触させた前記液体を培養時間の間、培養する段階であって、ここで前記液体を攪拌手段によって、前記培養時間の間に少なくとも１回攪拌する段階、
（ｅ）  前記培養時間が経過した後、（１）前記液体を収集すること、または（２）前記細胞成分の一部または全部を前記液体から除去し、残留物を収集することを含む段階によって、前記医薬組成物を得る段階
を含む前記方法によって解決される。
【００１３】
以下において、この方法は「本発明の方法」とも称される。
【００１４】
好ましい「ほ乳類」は、家畜（例えば牛）、スポーツ動物（例えば馬またはラクダ）、ペット（例えば猫または犬）、または霊長類である。最も好ましいほ乳類はヒトである。
【００１５】
「血液の細胞成分」とは、大量または少量で存在するかにはかかわらず、全血の任意の細胞成分を意味する。好ましい血液の細胞成分は、白血球（特に好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞または単球）である。特に好ましい血液の細胞成分は単球である。
【００１６】
好ましくは、「液体」は血液試料である。特に好ましい実施態様において、液体は、（ｉ）全血試料または（ｉｉ）特定の細胞が（部分的に、本質的に完全に、または完全に）枯渇された全血試料である血液試料である。これに関し、枯渇される細胞は、好ましくは赤血球、白血球（特に好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞および／または単球）、および血小板から選択される。より好ましくは、枯渇される細胞は赤血球（核を欠き、ひいては遺伝子発現能力を欠く細胞）であり、この場合、液体は好ましくは血小板および白血球を含む。液体が、赤血球が枯渇された全血試料である場合、培養時間が経過した後に前記液体を収集することにより医薬組成物を得るための本発明の方法の段階（ｅ）において、選択肢（１）を選ぶことが好ましい。選択的に、前記血液の細胞成分が血小板を含み、段階（ｅ）が、前記培養時間が経過した後に、カルシウムイオンおよび／またはトロンビンを添加することにより前記血小板を脱顆粒し、その後、前記液体を収集することにより前記医薬組成物を得る段階である方法が好ましい。脱顆粒の代替として、血小板を溶解することができる。
【００１７】
容器の「内部表面」とは、容器自体の内部表面に関する。特に、容器内に含有され得る任意の粒子（巨視的粒子、微視的粒子、および／またはナノ粒子）の表面である。
【００１８】
外的な刺激物質または活性剤を添加する必要はなく、且つ添加しないことが好ましい。準備する段階の前に、本発明の方法はさらに、前記液体（好ましくは血液試料、より好ましくは全血試料）を前記ほ乳類から収集する段階を含む。
【００１９】
本発明の実施態様が特定の内容、例えば方法の段階、成分または他の特徴を「含有する」または「含む」として記載される場合、文脈がそうでないことを指示しない限り、好ましい実施態様は前記内容からなると理解される。
【００２０】
「治療」は予防も含むと理解される。
【００２１】
本願内で使用される際の「障害」は、通常の機能または外観における異常に関し、疾患、合併症および状態を含む。
【００２２】
表面との接触における培養（コンディショニング）の際、血液の細胞成分はサイトカイン、エクソソームおよび他の因子の形成および蓄積を担う。液体中で誘導されるそれらの因子およびそれらの組み合わせが薬学的効果を有する。従って、形成される組成物は医薬組成物である。この組成物を、薬物治療において使用できる。その前に、細胞を組成物から除去できるが、これは必須ではない。「エクソソーム」との用語は、好ましくはさらに、他の細胞外小胞（ＥＶ）を含む。コンディショングは上述のとおり、エクソソームのさらなる形成をもたらす。
【００２３】
意外なことに、今回、血液の細胞成分を含む、ほ乳類から収集された液体を容器の内部表面と接触させて培養することによって医薬組成物を製造する場合、培養の間の攪拌が、組成物の内容において静的培養（つまり攪拌しない）に比して異なる変化をもたらすことが判明した。例えば、多くの所望の因子が、望ましくないものよりも強力または迅速に誘導され、そのことにより、所望の因子の他の因子に対するより好ましい比をもたらすことができる。従って、攪拌の効果は特別な効果であり、それは予期されなかった知見である。有効成分（特に所望の因子）のレベルを上げることができる。
【００２４】
従って、医薬品を製造するための新規且つ代替的な方法が提供され、それは従来技術の薬剤とは異なる薬剤をもたらす。前記方法は、有効成分のレベル、所望の因子の他の因子（例えば望ましくないもの）に対する比、またはそれ以外に関し、従来技術に対して改善された医薬品を製造することを可能にする。従って、上記の障害または他の障害のために、新規の薬物治療が利用可能になる。所望の因子の他の因子に対する望ましくない比、または有効成分の低過ぎるレベルに起因する先行技術における潜在的な問題を回避することさえも可能である。
【００２５】
いくつかの実施態様においては、培養時間を短縮することが考えられ、なぜなら、所望の特性（例えば特定のレベルの有効成分）を有する医薬組成物をより迅速に形成できるからである。従って、本発明の方法の特定の実施態様は、医薬組成物が迅速に製造される点で有利であり得る。本発明の方法を行うために、容易且つ既製の装置および要素を選択することが可能である。その結果、医薬組成物を容易且つ／または費用効率の良い方式で製造することが可能である。ほ乳類から収集された材料を使用するので、身体適合性の高い医薬組成物を製造することが可能であり、なぜなら、身体にとって異物である成分を回避することが可能であるからである。
【００２６】
例えば、液体が全血試料である場合、本発明の方法から得られる医薬組成物は特定のタイプの調整全血である。例えば、細胞成分の全体が調整全血から除去される場合、その残りは特定のタイプの調整血清（好ましくは特定のタイプの自家調整血清）である。静的培養に比して、攪拌は組成物の内容の変化をもたらすので、それらの薬剤は先行技術の薬剤とは異なる。
【００２７】
本発明の好ましい方法においては、前記医薬組成物において、
・  エクソソームの濃度が、他は同一の条件下で攪拌しない場合よりも高く、好ましくは少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または特に少なくとも２倍高い、
・  ゲルゾリンの濃度が、他は同一の条件下で攪拌しない場合よりも高く、好ましくは少なくとも１．１倍、１．２倍、または特に少なくとも１．３倍高い、
・  レゾルビンの濃度は、他は同一の条件下で攪拌しない場合よりも高く、好ましくは少なくとも１．１倍高い、
・  ＩＬ−１Ｒａの濃度が、他は同一の条件下で攪拌しない場合よりも高く、好ましくは少なくとも１．１倍、１．２倍、または特に少なくとも１．３倍高い、
・  抗炎症性メディエーター（好ましくはＩＬ−１Ｒａ）および炎症性メディエーター（好ましくはＩＬ−１β）の濃度の少なくとも１つの比が、他は同一の条件下で攪拌しない場合よりも高く、好ましくは少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または特に少なくとも２倍高い、または
・  炎症性メディエーター（好ましくはＩＬ−５またはＩＦＮ−γ）の少なくとも１つの濃度が前記培養前と本質的に同じである。
【００２８】
他の態様において、本発明は、本発明の方法によって（特に本願内で記載される好ましい実施態様の１つにおいて）製造される医薬組成物に関する。以下で、この医薬組成物を「本発明の医薬組成物」とも称する。
【００２９】
血液の細胞成分がエクソソームを分泌するので、本発明の医薬組成物はエクソソームを含有する。上述のとおり、エクソソームは治療効果を有する。
【００３０】
エクソソームの平均直径は、透過型電子顕微鏡によって確認される場合、好ましくは３０〜２００ｎｍ、特に５０〜１９０ｎｍ、７０〜１８０ｎｍ、９０〜１６０ｎｍまたは１００〜１５０ｎｍである。このサイズのエクソソームが特に高い効果のための基本であり、より大きな小胞の大きさは損傷したエクソソームおよびアグリゲートを含有する凝塊を示していることがある。しかしながら、より大きなエクソソームが機能することもある。これは、２００〜５０００ｎｍ、または１００〜８００ｎｍの範囲の直径を有するエクソソームに該当する。それらのより大きなエクソソームは分画遠心分離によって得られる。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、エクソソームの製造方法であって、本発明の方法により（特に本願内に記載される好ましい実施態様の１つにおいて）医薬組成物を製造すること、および前記医薬組成物中に含有されるエクソソームを収集することを含む前記方法に関する。この方法は、「本発明のエクソソームの製造方法」とも称される。
【００３２】
従って、他の態様において、本発明は、本発明のエクソソームの製造方法によって（特に本願内で記載される好ましい実施態様の１つにおいて）製造されるエクソソームに関する。それらのエクソソームは、「本発明のエクソソーム」とも称される。
【００３３】
エクソソームを濃縮または単離することによって収集でき、例えば２，０００〜１，０００，０００ｇ、１０，０００〜８００，０００ｇ、２０，０００〜６００，０００ｇ、５０，０００〜４００，０００ｇ、８０，０００〜２００，０００ｇ、および特に１００，０００ｇでの遠心分離を通じて実現でき、なぜなら、そのような加速はエクソソームをそれらの大きさに応じて濃縮または単離するために特に適しているからである。そのような遠心分離が好ましくは少なくとも１０分、例えば少なくとも３０分、特に少なくとも６０分間行われる。その際、遠心分離によって形成されたペレットはエクソソームを含有する。好ましくは、濃縮または単離されたエクソソームを次に、流体（好ましくは緩衝溶液、例えばＰＢＳ、または選択的に例えば血漿または血清）に取り込む。任意に、それらを次に例えば０．２μｍのフィルターを通じてろ過する。
【００３４】
エクソソーム不含の調製物も治療効果を有する。従って、本発明のさらなる態様は、エクソソーム不含の調製物の製造方法であって、本発明の方法によって（特に本願内で記載される好ましい実施態様の１つにおいて）医薬組成物を製造すること、および前記医薬組成物中に含有されるエクソソームを前記医薬組成物から除去し、それによって前記エクソソーム不含の調製物を得ることを含む前記方法に関する。本願内で、この方法は「本発明のエクソソーム不含の調製物の製造方法」とも称される。
【００３５】
さらに他の態様において、本発明は、本発明のエクソソーム不含の調製物の製造方法によって（特に本願内で記載される好ましい実施態様の１つにおいて）製造されるエクソソーム不含の調製物に関する。この調製物は、「本発明のエクソソーム不含の調製物」とも称される。
【００３６】
本発明の組成物、本発明のエクソソームおよび／または本発明のエクソソーム不含の調製物は、好ましくはサイトカインおよび／または成長因子を含有する。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、（ｉ）  本発明の方法によって医薬組成物を製造すること、（ｉｉ）  本発明のエクソソームの製造方法によってエクソソームを製造すること、または（ｉｉｉ）  本発明のエクソソーム不含の調製物の製造方法によってエクソソーム不含の調製物を製造すること、および前記医薬組成物、エクソソームおよびエクソソーム不含の調製物を、それらの保管手段、ほ乳類へのそれらの投与手段、または賦形剤とそれぞれ組み合わせることを含む、組み合わせの製造方法に関する。この方法は、「本発明の組み合わせの製造方法」とも称される。
【００３８】
保管手段は上記の容器と同じではない。好ましい保管手段は、１つのバイアル、複数のバイアル、１つのアンプル、複数のアンプル、１つの瓶、複数の瓶、１つの医療用液体バッグ、および複数の医療用液体バッグから選択される。
【００３９】
ほ乳類への好ましい投与手段は、１つのシリンジおよび複数のシリンジから選択される。
【００４０】
賦形剤の例は、担体、希釈剤、ビヒクル、保存剤、安定剤、等張剤および溶剤である。好ましい賦形剤は、食塩水（好ましくは塩化ナトリウム溶液、特に０．９％の塩化ナトリウム溶液）および緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）から選択される。
【００４１】
他の態様は、本発明の組み合わせの製造方法によって（特に本願内で記載される好ましい実施態様の１つにおいて）製造される組み合わせに関する。この組み合わせは、「本発明の組み合わせ」とも称される。
【００４２】
さらに、本発明は、
・  ほ乳類から収集され、血液の細胞成分を含む液体と接触する内部表面を有する容器、
・  前記液体を前記内部表面と接触させて培養する培養時間の間に、少なくとも１回前記液体を攪拌するための攪拌手段、および好ましくは
・  前記細胞成分の一部または全体を前記液体から除去して、前記培養時間後に残留物を収集することにより得られる医薬組成物の、ほ乳類への投与手段
を含むキットに関する。
【００４３】
本願において、このキットを「本発明のキット」とも称する。
【００４４】
さらに本発明は、本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、本発明のエクソソーム不含の調製物、本発明の組み合わせ、または本発明のキットの、化粧品としての使用に関する。
【００４５】
本発明のさらに他の態様は、本発明の方法における（特に本願内で記載される好ましい実施態様の１つにおける）容器または攪拌手段の使用に関する。
【００４６】
本発明は、薬剤として使用するための、本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、本発明のエクソソーム不含の調製物、本発明の組み合わせ、または本発明のキットにも関する。この使用は、前記液体が収集されたものとは異なるほ乳類への投与によるものであってもよいが、好ましくは前記液体が収集されたものと同じほ乳類への投与によるものであり、つまり、治療は好ましくは（特に安全性の理由から）自家的である。好ましくは、前記使用は、１つ以上の他の有効な薬剤と組み合わせる。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、整形外科的状態、関節の状態、腱の状態、痛み、変性脊椎疾患（好ましくは椎間板ヘルニア）、椎間板の状態、神経整形外科的状態、神経根の状態、神経系の刺激、神経系の炎症、神経障害性の状態、免疫系の関与する疾患、自己免疫疾患、乾癬、慢性的な傷（好ましくは糖尿病性潰瘍）、筋肉疾患、食物不耐性、薬物不耐性、子宮内膜症、アポトーシスが役割を果たす状態、加齢および加齢に関連する疾患から選択される状態の治療において使用するための、老化防止剤として使用するための、または肌への注入による薬剤として使用するための、本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、本発明のエクソソーム不含の調製物、本発明の組み合わせ、または本発明のキットである。
【００４８】
本発明のこの態様を言い換えると以下のとおりである：
・  整形外科的状態、関節の状態、腱の状態、痛み、変性脊椎疾患（好ましくは椎間板ヘルニア）、椎間板の状態、神経整形外科的状態、神経根の状態、神経系の刺激、神経系の炎症、神経障害性の状態、免疫系の関与する疾患、自己免疫疾患、乾癬、慢性的な傷（好ましくは糖尿病性潰瘍）、筋肉疾患、食物不耐性、薬物不耐性、子宮内膜症、アポトーシスが役割を果たす状態、加齢および加齢に関連する疾患から選択される状態の治療のための薬剤の製造のための、老化防止剤として使用するための、または肌への注入による薬剤として使用するための、本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、本発明のエクソソーム不含の調製物、本発明の組み合わせ、または本発明のキットの使用、
・  整形外科的状態、関節の状態、腱の状態、痛み、変性脊椎疾患（好ましくは椎間板ヘルニア）、椎間板の状態、神経整形外科的状態、神経根の状態、神経系の刺激、神経系の炎症、神経障害性の状態、免疫系の関与する疾患、自己免疫疾患、乾癬、慢性的な傷（好ましくは糖尿病性潰瘍）、筋肉疾患、食物不耐性、薬物不耐性、子宮内膜症、アポトーシスが役割を果たす状態、加齢および加齢に関連する疾患から選択される状態の治療における、老化防止剤としての、または肌への注入による薬剤としての、本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、本発明のエクソソーム不含の調製物、本発明の組み合わせ、または本発明のキットの使用、
・  整形外科的状態、関節の状態、腱の状態、痛み、変性脊椎疾患（好ましくは椎間板ヘルニア）、椎間板の状態、神経整形外科的状態、神経根の状態、神経系の刺激、神経系の炎症、神経障害性の状態、免疫系の関与する疾患、自己免疫疾患、乾癬、慢性的な傷（好ましくは糖尿病性潰瘍）、筋肉疾患、食物不耐性、薬物不耐性、子宮内膜症、アポトーシスが役割を果たす状態、加齢および加齢に関連する疾患から選択される状態の治療が必要な患者、老化防止剤での治療が必要な患者、または肌への注入による治療が必要な患者を治療するための方法であって、前記患者に有効量の本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、本発明のエクソソーム不含の調製物、本発明の組み合わせ、または本発明のキットを投与し、それにより、前記患者における前記状態を治療すること、前記患者を老化防止剤で治療すること、または肌への注入によって前記患者を治療することを含む前記方法、または、
・  整形外科的状態、関節の状態、腱の状態、痛み、変性脊椎疾患（好ましくは椎間板ヘルニア）、椎間板の状態、神経整形外科的状態、神経根の状態、神経系の刺激、神経系の炎症、神経障害性の状態、免疫系の関与する疾患、自己免疫疾患、乾癬、慢性的な傷（好ましくは糖尿病性潰瘍）、筋肉疾患、食物不耐性、薬物不耐性、子宮内膜症、アポトーシスが役割を果たす状態、加齢および加齢に関連する疾患から選択される状態を治療するための、老化防止剤として使用するための、または肌への注入による薬剤として使用するための薬物であって、本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、本発明のエクソソーム不含の調製物、本発明の組み合わせ、または本発明のキットを含む前記薬物。
【００４９】
以下の記述は本発明のこの態様の文言とは関わりなく適用される。
【００５０】
好ましい関節の状態は、変形性関節症、関節炎、関節の炎症、軟骨の炎症性喪失、およびリウマチから選択される。変形性関節症は、過度の歪みによって引き起こされることがあり、先天性または外傷性の原因を有するか、または他の疾患、例えば炎症の結果であり得る。変形性関節症は好ましくは活性変形性関節症または炎症性変形性関節症である。変形性関節症または関節炎は、任意の関節、例えば膝関節、股関節、足首関節、肩関節、椎骨関節、指関節、肘関節、つま先関節、顎関節、および手首関節に存在し得る。関節炎は感染によって引き起こされる関節炎、例えば細菌性関節炎、または感染によって引き起こされていない関節炎、例えば関節リウマチ、乾癬性関節炎または痛風性関節炎であってよい。好ましくは、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、および若年性スチル病である。特に好ましい関節の状態は変形性関節症および関節リウマチである。
【００５１】
好ましい痛みは、背部の痛み（好ましくは神経学的原因に伴う）、関節炎の痛み、および腰椎根性痛から選択される。
【００５２】
免疫系の関与する疾患は、好ましくは（特に馬における）慢性的な目の炎症またはアレルギーである。好ましい実施態様において、前記使用は炎症の消散にある。他の好ましい実施態様において、前記使用はＴＮＦ−α発現の抑制にある。
【００５３】
自己免疫疾患は、好ましくは関節の自己免疫疾患、例えば強直性脊椎炎、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスである。他の好ましい自己免疫疾患は、神経皮膚炎または円形脱毛症である。
【００５４】
本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、および本発明のエクソソーム不含の調製物を、静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、経皮的投与、皮下投与、鼻腔内投与、経口投与、神経周囲投与または鞘内投与によって、または局所注射または滴下によって、またはそれらの任意の組み合わせによって投与できる。それらは好ましくは局所投与のために意図されている。従って、好ましい実施態様においては、それらは注入、特に治療されるべき身体の領域への、特に患部関節への、患部神経根への、または患部椎間板への、またはそれらの局所環境への注入のために意図されている。従って、前記医薬組成物は特に、関節内注入および／または根周囲注入のために意図されている。選択的に、本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、および本発明のエクソソーム不含の調製物は、局所投与のために、特にクリームまたはゲルとして、または全身投与、特に錠剤、カプセルまたはトローチ剤の形態での経口投与のために配合され得る。投与の種類はとりわけ、治療されるべき疾患に依存する。局所的な変形性関節症または変性脊椎疾患においては局所投与が好ましい。本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、および本発明のエクソソーム不含の調製物は、当業者に公知の方式で様々な種類の投与のために適切に配合される。従って、注入のために適した医薬組成物は、好ましくは溶液または分散液の形態、またはさらには例えば注入前に適切な溶剤、例えば水中に溶解されるべき粉末または凍結乾燥物としての乾燥形態を有する。
【００５５】
上記の状態の治療における、老化防止剤としての、または肌への注入による薬剤としての使用の好ましい実施態様は、１つ以上のさらなる有効な薬剤との組み合わせの治療である。さらなる有効な薬剤は本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、本発明のエクソソーム不含の調製物、本発明の組み合わせおよび本発明のキット中に存在してもよいし、またはさらなる有効な薬剤は、同時または連続して投与され得る別の組成物中に存在してもよい。
【００５６】
攪拌は、液体を内部表面と接触させた後に行われる。前記接触が、容器に液体を充填することによる場合、これは、液体を容器中に充填した後に攪拌が行われることを意味する。
【００５７】
本発明の方法において、液体は好ましくは容器を攪拌することによって攪拌される。好ましくは液体の攪拌によって、それが混合される。
【００５８】
液体は好ましくは、
（１）  前記培養時間の全体の間、攪拌される、
（２）  前記培養時間の間、２回以上、攪拌される、
（３）  合計で少なくとも５分間（好ましくは合計で少なくとも１０、１５、３０または４５分間、または１、２、３、４、５または６時間）攪拌される、
（４）  前記培養時間の開始後、１０分より後（好ましくは１５分、３０分または１時間超）の時点で攪拌される、
（５）  培養時間の最初の１０分の間は攪拌されない、または
（６）  前記容器をその軸周りに回転させること、前記容器の軸を閉じた軌道に沿って動かすこと、前記容器をシフトさせること、前記容器を傾けること、前記容器を逆さにすること、前記容器を振とうさせること、前記液体を回転させること、前記液体をシフトさせること、および前記液体をかき混ぜることから選択される１つ以上によって攪拌され、その際、前記攪拌は好ましくは均一である。
【００５９】
好ましくは、上記選択肢（６）を、選択肢（１）〜（５）のいずれかと組み合わせる。
【００６０】
容器をその軸周りに回転させることと、容器の軸を閉じた軌道に沿って動かすこととを組み合わせることが好ましい。容器をその縦軸周りに（好ましくは１０〜２０ｒｐｍ、特に１５ｒｐｍで）回転させることと、容器の縦軸を閉じた（好ましくは連続的な、より好ましくは楕円形の、および最も好ましくは円形の）軌道に沿って同一の周波数で動かすこととを組み合わせることが特に好ましい。
【００６１】
容器をその軸周りに回転させる好ましい実施態様は、容器をその縦軸周りに回転させること、容器をその縦軸に対して垂直な軸周りに回転させること、またはその両方である。容器を好ましくはその軸周りに１〜３０ｒｐｍ、５〜２５ｒｐｍ、１０〜２０ｒｐｍ、特に１５ｒｐｍで回転させる。前記軸が縦軸である場合、通常、前記軸が縦軸に対して垂直な軸である場合よりも高い速度を選択できる。１０〜２０ｒｐｍ、特に１５ｒｐｍでの縦軸周りの回転が特に好ましい。
【００６２】
閉じた軌道に沿って動く容器の軸は、好ましくはその縦軸、またはその縦軸に対して垂直な軸である。好ましくは、閉じた軌道は連続的、より好ましくは楕円形、および最も好ましくは円形である。その動きは好ましくは１分あたり１０〜２００回の繰り返し（より好ましくは１分あたり２０〜１８０、４０〜１６０、６０〜１４０および８０〜１２０回の繰り返し）で行われる。前記軸が縦軸である場合、通常、前記軸が縦軸に対して垂直な軸である場合よりも高い速度を選択できる。選択的に、閉じた軌道に沿った容器の軸の動きを、容器をその軸周りに回転させることと組み合わせる場合、前者の周波数が後者の周波数と同一であるように選択できる。閉じた軌道の直径（または１つより多くの直径を有する場合はその最長の直径）は、好ましくは０．１〜２０ｃｍ、０．２〜１０ｃｍ、または０．３〜５ｃｍの長さである。
【００６３】
シフトは並進運動に関する。好ましくは１分あたり１０〜２００回の繰り返し（より好ましくは１分あたり２０〜１８０、４０〜１６０、６０〜１４０および８０〜１２０回の繰り返し）で繰り返される二方向のシフトが好ましい。並進の経路は、好ましくは０．１〜２０ｃｍ、０．２〜１０ｃｍ、または０．３〜５ｃｍの長さを有する。
【００６４】
容器を振とうさせることは、好ましくは１分あたり１０〜２００回の繰り返し（より好ましくは１分あたり２０〜１８０、４０〜１６０、６０〜１４０および８０〜１２０回の繰り返し）で行われる。
【００６５】
前記攪拌手段は、好ましくは
・  容器をその縦軸周りに回転させる（且つ好ましくは同時に容器の軸を閉じた軌道、好ましくは連続的、より好ましくは楕円形および最も好ましくは円形の軌道に沿って動かす）ためのホイール型またはプロペラ型の装置であって、好ましくは重力の方向に対して垂直である、または９０度まで（特に８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５度まで）の角度で傾けられた回転軸を有する前記装置、および
・  振とう装置、好ましくは円運動または並進運動を（特にそれぞれ０．１〜２０ｃｍ、０．２〜１０ｃｍまたは０．３〜５ｃｍの並進の経路および直径で）行うために適合された振とう装置から選択される。
【００６６】
振とう装置が円運動を行うように適合されている場合、それは容器の軸を閉じた軌道に沿って動かすための装置でもある。振とう装置が並進運動を行うように適合されている場合、それは容器をシフトさせるための装置でもある。振とうの動きは好ましくは水平面で行われる。
【００６７】
攪拌手段は好ましくは上記の周波数で動かすように適合される。
【００６８】
液体（好ましくは血液試料、より好ましくは全血試料）の培養は、好ましくは１５分〜２４時間、１時間〜６時間、１時間〜５時間、１．５時間〜２４時間、２時間〜２４時間未満、２時間〜５時間、少なくとも３時間、３時間〜５時間、３時間〜２４時間未満、３時間〜２０時間、３時間〜１６時間、４時間〜１２時間、少なくとも５時間、５時間〜１０時間、５時間〜７時間、６時間まで、少なくとも６時間または少なくとも７時間の培養時間の間、行われる。選択的に、その後に特定のパラメータにおいて、培養前の値および／またはそのパラメータ（例えばサイトカインの濃度、サイトカインアンタゴニスト、特にＩＬ−１Ｒａの濃度、エクソソームの濃度、および／または成長因子の濃度）の通常の値に対して測定可能な変化が生じる培養時間の間、培養を行う。特定の実施態様において、より長い培養の持続、例えば２４時間超、例えば３０時間、３６時間以上が好ましいことがある。
【００６９】
培養を、好ましくは０℃〜４５℃の温度、特に１０℃〜４３℃、２０℃〜４１℃、３０℃〜４０℃、３５℃〜３９℃、３６℃〜３８℃または３７℃の温度で行う。それらの温度は最高の有効性を確実にする。
【００７０】
培養を、添加される凝固防止剤（好ましくはワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクーモン、フェニンジオン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、Ｘａ因子の合成阻害剤、およびトロンビン阻害剤から選択され、最も好ましくはヘパリン）の不在または存在下で行うことができる。好ましくは、添加されるヘパリンの不在下、より好ましくは添加される凝固防止剤の不在下で行う。
【００７１】
有効性は、前記培養時間と前記内部表面との間の関係が以下の式：ｔ＝ｆ×Ａに従う場合に特に有利であり、前記式中、ｔは培養時間を示し、Ａは内部表面積を示し、且つｆは０．５時間／ｃｍ2以下である。好ましくは、ｆは０．４５時間／ｃｍ2以下、０．４時間／ｃｍ2以下、０．３５時間／ｃｍ2以下、０．３時間／ｃｍ2以下、０．２５時間／ｃｍ2以下、０．２４時間／ｃｍ2以下、０．２３時間／ｃｍ2、および特に０．２２時間／ｃｍ2以下である。これは、本発明の医薬組成物、本発明のエクソソーム、本発明のエクソソーム不含の調製物、本発明の組み合わせ、および本発明のキットが、望ましくない炎症の可能性を有さないことを確実にするために有用である。ｆについて０．０４〜０．２５時間／ｃｍ2、０．０５〜０．２４時間／ｃｍ2、０．０６〜０．２３時間／ｃｍ2、および特に０．０７〜０．２２時間／ｃｍ2の範囲の値が特に好ましい一方で、いくつかの例においては０．１〜０．２２時間／ｃｍ2、０．１２〜０．２２時間／ｃｍ2、または０．１４〜０．２２時間／ｃｍ2の範囲も使用できる。
【００７２】
内部表面積について好ましい範囲は、１０〜３００ｃｍ2、１５〜２００ｃｍ2、２０〜１５０ｃｍ2、２５〜１４０ｃｍ2、３０〜１３０ｃｍ2、３５〜１２０ｃｍ2、および特に４０〜１１０ｃｍ2である。
【００７３】
本発明の方法における「容器」は、前記液体が収集されるものと同じであってもよいし、または異なったものであってもよい。
【００７４】
適した容器は例えば、皮下注射針、シリンジ、管、例えば真空管または試験管、マイクロタイタープレート、シリンジおよび輸液バッグである。容器は例えば直径０．４〜５ｃｍ、０．９〜４ｃｍ、または１．４〜３．５ｃｍ、および／または長さ３〜３０ｃｍ、５〜２０ｃｍ、７〜１５ｃｍ、または８〜１２ｃｍを有し得る。好ましくは、容器は円筒状である。好ましい容器は容積１ｍｌ〜１０００ｍｌ、３ｍｌ〜７５０ｍｌ、５ｍｌ〜５００ｍｌ、７ｍｌ〜３００ｍｌ、８ｍｌ〜２００ｍｌ、９ｍｌ〜１５０ｍｌ、１０ｍｌ〜１００ｍｌ、１１ｍｌ〜８０ｍｌ、および特に１２ｍｌ〜７０ｍｌを有するが、しかし容積１５ｍｌ〜６５ｍｌ、２０ｍｌ〜６０ｍｌ、２５ｍｌ〜５０ｍｌ、または３０〜４０ｍｌを有してもよい。好ましくは、内部表面積と容積との比は０．０１〜１０ｃｍ2／ｍｌである。液体（好ましくは血液試料）の好ましい容積は、０．５ｍｌ〜９００ｍｌ、１ｍｌ〜７００ｍｌ、２ｍｌ〜４００ｍｌ、３ｍｌ〜３００ｍｌ、６ｍｌ〜２００ｍｌ、７ｍｌ〜１５０ｍｌ、８ｍｌ〜１００ｍｌ、９ｍｌ〜８０ｍｌ、および特に１０ｍｌ〜６０ｍｌであるが、しかし容積１１ｍｌ〜５５ｍｌ、１２ｍｌ〜５０ｍｌ、１５ｍｌ〜４０ｍｌまたは２０〜３０ｍｌを有してもよい。好ましくは、液体の容積は容器の容積よりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２５％小さい。
【００７５】
容器は、好ましくはガラス、プラスチック、コランダムおよび石英から選択される１種以上で作られた表面を含む、（液体、好ましくは血液試料、より好ましくは全血試料と接触させるための）内部表面を有する。好ましくは、前記ガラスはホウケイ酸ガラスである。好ましいプラスチックは、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンおよびポリプロピレンからなる群から選択される。好ましくは、液体と接触させるための容器の内部表面は、完全に取り囲まれた空間を作り出す。好ましい容器は１つ以上の以下の特性：  面に対する対称性、軸に対する対称性および円筒形を有する。
【００７６】
好ましい実施態様によれば、容器は前記液体と接触させるための、巨視的粒子、微視的粒子およびナノ粒子から選択される１種以上である粒子を含有する。本願について、巨視的粒子は肉眼で見た場合に可視である粒子として定義され、微視的粒子は肉眼で見た場合には小さすぎて見えないが、顕微鏡で見た場合には可視である粒子として定義され、且つナノ粒子は顕微鏡で見た場合に小さすぎて見えない（且つ好ましくは１ｎｍよりも大きい）粒子として定義される。そのような粒子は液体（血液試料）と接触させるための表面積を（例えばさらに０．３〜９０ｃｍ2、２〜８０ｃｍ2、５〜７０ｃｍ2、１０〜６０ｃｍ2、２０〜５０ｃｍ2、または３０〜４０ｃｍ2だけ）大きくするために役立ち、且つビーズ、顆粒、粉末、ゲルまたはウールの形状を有し得る。好ましい材料はガラス（好ましくはホウケイ酸ガラス）、プラスチック、コランダム、石英、金および粘土鉱物（例えばカオリン）である。好ましくは直径０．５〜５ｍｍ、１．５〜４．５ｍｍ、２．５〜４ｍｍ、および特に３．５ｍｍを有するガラスビーズ（特にホウケイ酸ガラスビーズ）が特に好ましい。粒子の表面を、例えば腐食剤、例えば５０％ｖ／ｖのクロモ硫酸と共に培養し、引き続き洗浄を繰り返すことによって任意に改質できる。そのような粒子の表面は、上記の式に従って容器の「内部表面積」を計算する際には考慮されない。培養の間に液体（好ましくは血液試料、より好ましくは全血試料）がより大きな表面積で接触する場合、培養がより効率的になり得る。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、静的培養と低速回転での培養との２つの異なる条件下でのＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａの濃度の時間的推移を示す（ｘ軸：  培養時間［分］、ｙ軸：  ＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａの濃度［それぞれｐｇ／ｍｌ］）。
【図２】図２は、３つの異なる条件下でのＩＬ−１Ｒａ対ＩＬ−１βの濃度比の時間的推移を示す（ｘ軸：  培養時間［時間］、ｙ軸：  ＩＬ−１ＲａおよびＩＬ−１βの濃度の比［両者ともｐｇ／ｍｌ］）。
【図３】図３は、３つの異なる条件下でのＩＬ−１Ｒａの濃度の時間的推移を示す（ｘ軸：  培養時間［時間］、ｙ軸：  ＩＬ−１Ｒａの濃度［ｐｇ／ｍｌ］）。
【図４】図４は、３つの異なる条件下でのＩＬ−１βの濃度の時間的推移を示す（ｘ軸：  培養時間［時間］、ｙ軸：  ＩＬ−１βの濃度［ｐｇ／ｍｌ］）。
【図５】図５は、３つの異なる条件下でのレゾルビンＤ１の濃度の時間的推移を示す（ｘ軸：  培養時間［時間］、ｙ軸：  レゾルビンＤ１の濃度［ｐｇ／ｍｌ］）。
【図６】図６は、３つの異なる条件下でのエクソソームの濃度の時間的推移を示す（ｘ軸：  培養時間［時間］、ここでＴ０は培養がないことを示す、ｙ軸：  エクソソームの濃度［ｍｌあたりのエクソソームのカウント数で表現］）。
【図７】図７は、３つの異なる条件下でのゲルゾリンの濃度の時間的推移を示す（ｘ軸：  培養時間［時間］、ここでＴ０は培養がないことを示す、ｙ軸：  ゲルゾリンの濃度［ｎｇ／ｍｌ］）。
【図８】図８は、３つの異なる条件下でのＩＬ−１Ｒａ対ＩＬ−１βの濃度比の時間的推移を示す（ｘ軸：  培養時間［時間］、ｙ軸：  ＩＬ−１ＲａおよびＩＬ−１βの濃度の比［両者ともｐｇ／ｍｌ］）。
【図９】図９は、３つの異なる条件下でのＩＬ−１Ｒａの濃度の時間的推移を示す（ｘ軸：  培養時間［時間］、ｙ軸：  ＩＬ−１Ｒａの濃度［ｐｇ／ｍｌ］）。
【図１０】図１０は、３つの異なる条件下でのＩＬ−１βの濃度の時間的推移を示す（ｘ軸：  培養時間［時間］、ｙ軸：  ＩＬ−１βの濃度［ｐｇ／ｍｌ］）。
【実施例】
【００７８】
以下の実施例は、本発明によって先行技術に比して様々な点で優れた医薬品を製造できることを示す。
【００７９】
例１：  培養の間の攪拌に起因するＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａの異なる産生、１被験者
医薬品を以下のとおり、本発明の方法によって製造した：
抹消全血を１人の健康なヒトの男性から収集した。血液をパイロジェンフリーの１０ｍｌのプラスチックシリンジ（内部長：  約８４．５ｍｍ、内部直径：  約１４．３ｍｍ、内部表面積：  約４１００ｍｍ2、内部容積：  約１３５００ｍｍ3）に引き入れ、前記シリンジはそれらが浄化され研磨された直径３．５ｍｍを有するホウケイ酸ガラスビーズを含有する以外には処理されていなかった（ＥＯＴＩＩシリンジ、Ｏｒｔｈｏｇｅｎ  ＡＧ、デュッセルドルフ、ドイツ）。
【００８０】
試料を含有するシリンジを、様々な培養時間の間、３７℃で、Ｓａｎｙｏ  ＭＣＯ−２０ＡＩＣ培養器（日本）内でＣＯ2を添加せずに培養した。
【００８１】
試料の一部は攪拌せずに培養した（静的培養）。
【００８２】
試料の他の部分を培養の間攪拌した。容器をその軸周りに回転させ且つ同時に容器の軸を円形の軌道に沿って動かすためのプロペラ型の装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔｕｂｅ  Ｒｅｖｏｌｖｅｒ、カタログ番号８８８８１００１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）によって攪拌を実現し、それは１５ｒｐｍに設定された。前記装置は重力方向に対して垂直に配列された回転軸を有する。従って、容器はその縦軸周りに１５ｒｐｍで回転し、同じ周波数での円形の軌道に沿った容器の縦軸の動きと組み合わせられる。本願において、この動きは「低速回転」とも称される。
【００８３】
培養後、不溶性の成分を遠心分離によって除去した。得られる調整血清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１ＲａおよびＩＬ−１β濃度について調べた。
【００８４】
結果を図１に示す。表１に説明されるような４つの曲線が描かれる。
【００８５】
【表１】
2021534219.tif 000002
表１：  図１に示される曲線。
【００８６】
培養が静的であった場合と培養が低速回転で行われた場合との両方で、ＩＬ−１βの濃度が無視できるままであったことがわかる。しかしながら、低速回転は静的培養に比して経時的にＩＬ−１Ｒａ濃度における顕著な上昇をもたらす。従って攪拌、特に低速回転は、所望の因子ＩＬ−１Ｒａのレベルを、望ましくない因子ＩＬ−１βのレベルに影響することなく改善する。
【００８７】
例２：  培養の間の攪拌に起因するＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａの異なる産生、４被験者
上述のとおり、ＩＬ−１（例えばＩＬ−１β）は炎症、痛みおよび組織破壊のメディエーターである。ＩＬ−１Ｒａは自然に生じるその阻害物質であり、重要な抗炎症性サイトカインである。
【００８８】
医薬品を以下のとおり、本発明の方法によって製造した：
抹消全血を４人の健康なヒトから収集した。血液を例１に記載されたガラスビーズ含有シリンジに引き入れた。
【００８９】
試料を含有するシリンジを、様々な時間の間、３７℃で、Ｓａｎｙｏ  ＭＣＯ−２０ＡＩＣ培養器（日本）内でＣＯ2を添加せずに培養した。
【００９０】
試料の一部は攪拌せずに培養した（静的培養）。
【００９１】
試料の他の部分を培養の間、振とう装置（ＩＫＡ  ＭＴＳ  ４振とう機、ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ、シュタウフェン、ドイツ）で、１００ｒｐｍで直径３ｍｍの円運動を行って攪拌した。振とう機に取り付けられたプラスチックプレートにシリンジを水平位置で固定した。振とうを水平面で行った。従って、その縦軸に対して垂直な容器の軸を円形の軌道に沿って１分あたり１００回の繰り返しで動かした。従って、閉じた円形の軌道の直径（それぞれの円の直径）は０．３ｃｍであった。本願において、この動きは「高速振とう」とも称される。
【００９２】
試料のさらに他の部分を、培養の間、例１に定義された低速回転によって攪拌した。
【００９３】
培養後、不溶性の成分を遠心分離によって除去した。得られる調整血清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１ＲａおよびＩＬ−１β濃度について調べた。
【００９４】
図２はＩＬ−１Ｒａ対ＩＬ−１βの平均の比、図３はＩＬ−１Ｒａの平均濃度、および図４はＩＬ−１βの平均濃度を示す。曲線は、静的培養（三角の記号、点線）、高速振とうでの培養（四角の記号、破線）、低速回転での培養（菱形の記号、実線）である。
【００９５】
攪拌が、ＩＬ−１Ｒａの濃度における上昇をもたらすことがわかる。対照的に、ＩＬ−１βの濃度は攪拌をしてもしなくてもほぼ同じであるか、または低速回転の場合にはさらに低かった。従って、攪拌はＩＬ−１Ｒａ対ＩＬ−１βの比における増加をもたすことができ、それは低速回転の場合に特に顕著である。ＩＬ−１βのレベルが非常に低い場合、計算される比はより誤差が生じやすいことに留意する必要があり、なぜなら、そのような濃度は低い精度で測定され得るからである。
【００９６】
表２は測定されたＩＬ−１Ｒａ対ＩＬ−１βの比を示し、表３はＩＬ−１Ｒａの測定された濃度を示し、且つ表４はＩＬ−１βの測定された濃度を示す。培養を、上記に定義されたとおり、静的攪拌として、高速振とうで、または低速回転で実施した。
【００９７】
【表２】
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表２：  示された培養時間後に測定されたＩＬ−１Ｒａ濃度対ＩＬ−１β濃度の比（図２参照）。
【００９８】
【表３】
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表３：  示された培養時間後に測定されたＩＬ−１Ｒａ濃度［ｐｇ／ｍｌ］（図３参照）。
【００９９】
【表４】
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表４：  示された培養時間後に測定されたＩＬ−１β濃度［ｐｇ／ｍｌ］（図４参照）。
【０１００】
まとめると、攪拌は所望の因子ＩＬ−１Ｒａのレベルを、望ましくない因子ＩＬ−１βのレベルに悪影響することなく、または有利に影響して改善することが確認された。ＩＬ−１Ｒａ対ＩＬ−１βの濃度比から特に明らかなとおり、本発明によれば、製造され得る医薬品は抗炎症剤として、先行技術による静的培養を使用して製造されたものよりもさらにより価値がある。
【０１０１】
例３：  様々な方式の攪拌に起因するレゾルビンＤ１の産生の増加
エイコサペンタエン酸（２０：５（ｎ−３）、「ＥＰＡ」とも称される）、ドコサペンタエン酸（２２：５（ｎ−３））、および特にドコサヘキサエン酸（２２：６（ｎ−３）、「ＤＨＡ」とも称される）に由来し、且つ（ニューロ）プロテクチン、レゾルビンおよびマレシンと称される特定の代謝産物（オキシリピン類）は、ナノモルおよびピコモル範囲の濃度で有効な抗炎症作用および免疫調整作用を有する。炎症の自己治癒消散のメディエーターであるレゾルビンＤ１を、そのような生物学的に活性な多価不飽和脂肪酸代謝産物の例として評価した。それはＴＮＦ−α発現の抑制をもたらす。レゾルビンは関節炎の痛みおよび神経性の痛みのために有効な鎮痛剤でもある。
【０１０２】
医薬品を以下のとおり、本発明の方法によって製造した：
抹消全血を４人の健康なヒトから収集した。血液を例１に記載されたガラスビーズ含有シリンジに引き入れた。
【０１０３】
試料を含有するシリンジを、３７℃で、Ｓａｎｙｏ  ＭＣＯ−２０ＡＩＣ培養器（日本）内でＣＯ2を添加せずに培養した。
【０１０４】
試料の一部は攪拌せずに培養した（静的培養）。
【０１０５】
試料の他の部分を、培養の間、例２に定義された高速振とうによって攪拌した。
【０１０６】
試料のさらに他の部分を、培養の間、例１に定義された低速回転によって攪拌した。
【０１０７】
培養後、不溶性の成分を遠心分離によって除去した。得られる調整血清を収集し、レゾルビンＤ１を含む様々な因子の濃度についてＥＬＩＳＡによって調べた。
【０１０８】
図５はレゾルビンＤ１の経時的な平均濃度を示す。以下の曲線が描かれる：  静的培養（三角の記号、点線）、高速振とうでの培養（四角の記号、破線）、低速回転での培養（菱形の記号、実線）。
【０１０９】
培養が、時間に依存する濃度上昇をもたらしたことがわかる。培養の間の攪拌は、静的培養よりも顕著な上昇をもたらす。その効果は、試料が高速振とうによって攪拌された場合よりも、低速回転でさらに強かった。
【０１１０】
表５は測定された濃度を示す。培養を、上記に定義されたとおり、静的攪拌として、高速振とうで、または低速回転で実施した。
【０１１１】
【表５】
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表５：  示された培養時間後に測定されたレゾルビンＤ１濃度［ｐｇ／ｍｌ］。培養がないことを０時間として示す。
【０１１２】
ＩＬ−５およびＩＦＮ−γの濃度は検出限界未満であった。
【０１１３】
その結果、攪拌は、炎症の消散、ＴＮＦ−α発現の抑制および鎮痛においてより効果的であり得る医薬品をもたらすことができる。
【０１１４】
例４：  様々な方式の攪拌に起因するエクソソームの産生の増加
上述のとおり、エクソソームは様々な状態の治療において知られている。従って、エクソソームを含有する医薬品の治療的な価値は、エクソソームの濃度に依存することが予測され得る。
【０１１５】
例３に記載されたものと同じ実験において、エクソソームの濃度もＥＬＩＳＡによって調べた。
【０１１６】
図６はエクソソームの経時的な平均濃度を示す。以下の曲線が描かれる：  静的培養（三角の記号、点線）、高速振とうでの培養（四角の記号、破線）、低速回転での培養（菱形の記号、実線）。
【０１１７】
培養が、時間に依存するエクソソームの濃度上昇をもたらしたことが明らかである。攪拌はエクソソームの濃度をさらに上昇させることができる。
【０１１８】
表６は測定された濃度を示す。培養を、上記に定義されたとおり、静的攪拌として、高速振とうで、または低速回転で実施した。
【０１１９】
【表６】
2021534219.tif 000007
表６：  示された培養時間後に測定されたエクソソーム濃度［エクソソーム数／ｍｌ］。培養がないことを０時間として示す（図６におけるＴ０）。
【０１２０】
これは、本発明によれば、上述の状態の治療において価値が高められた医薬組成物を製造できることを意味する。
【０１２１】
例５：  様々な方式の攪拌に起因するゲルゾリンの産生の増加
ゲルゾリンはミトコンドリアを安定化することによりアポトーシスを阻害できる。より具体的には、それはシトクロムＣの放出を阻害するので、アポトーシスをもたらすシグナル増幅カスケードを妨げる。さらに、それはアクチンの重合も補助するアクチン結合（キャッピング）タンパク質である。
【０１２２】
例３に記載されたものと同じ実験において、ゲルゾリンの濃度もＥＬＩＳＡによって調べた。
【０１２３】
図７はゲルゾリンの経時的な平均濃度を示す。以下の曲線が描かれる：  静的培養（三角の記号、点線）、高速振とうでの培養（四角の記号、破線）、低速回転での培養（菱形の記号、実線）。
【０１２４】
培養がゲルゾリン濃度の時間に依存する上昇をもたらしたことが判明した。攪拌はゲルゾリンの濃度をさらに上昇させることができる。
【０１２５】
表７は測定された濃度を示す。培養を、上記に定義されたとおり、静的攪拌として、高速振とうで、または低速回転で実施した。
【０１２６】
【表７】
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表７：  示された培養時間後に測定されたゲルゾリン濃度［ｎｇ／ｍｌ］。培養がないことを０時間として示す（図７におけるＴ０）。
【０１２７】
その結果、本発明はアポトーシスの阻害における有効性が高められた医薬品の製造を可能にする。これは、アポトーシスが役割を果たす状態に影響を有する。
【０１２８】
例６：  培養の間の攪拌に起因するＩＬ−１Ｒａの異なる産生、３被験者
医薬品を以下のとおり、本発明の方法によって製造した：
抹消全血を４人の健康なヒトから収集した。血液をパイロジェンフリーの１０ｍｌのプラスチックシリンジ（内部長：  約８４．５ｍｍ、内部直径：  約１４．３ｍｍ、内部表面：  約４１００ｍｍ2、内部容積：  約１３５００ｍｍ3）に引き入れ、前記シリンジは液体と接触させるためのガラスビーズもいかなる他の粒子も含有しなかった。
【０１２９】
試料を含有するシリンジを、様々な培養時間の間、３７℃で、Ｓａｎｙｏ  ＭＣＯ−２０ＡＩＣ培養器（日本）内でＣＯ2を添加せずに培養した。
【０１３０】
試料の一部は攪拌せずに培養した（静的培養）。
【０１３１】
試料の他の部分を、培養の間、例２に定義された高速振とうによって攪拌した。
【０１３２】
試料のさらに他の部分を、培養の間、例１に定義された低速回転によって攪拌した。
【０１３３】
培養後、不溶性の成分を遠心分離によって除去した。得られる調整血清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１Ｒａの濃度について調べた。
【０１３４】
図８はＩＬ−１Ｒａ対ＩＬ−１βの平均の比、図９はＩＬ−１Ｒａの平均濃度、および図１０はＩＬ−１βの平均濃度を示す。曲線は、静的培養（三角の記号、点線）、高速振とうでの培養（四角の記号、破線）、低速回転での培養（菱形の記号、実線）である。
【０１３５】
液体と接触させるための粒子の不在下でも、攪拌はＩＬ−１Ｒａの濃度における上昇をもたらすことがわかる。
【０１３６】
対照的に、ＩＬ−１βの濃度は攪拌をしてもしなくてもほぼ同じであるか、または低速回転の場合にはさらに低かった。従って、粒子の不在下でも、且つ潜在的に培養時間に依存して、攪拌はＩＬ−１Ｒａ対ＩＬ−１βの比における増加をもたらすことができ、それは低速回転の場合に特に顕著であり得る。ＩＬ−１βのレベルが非常に低い場合、計算される比はより誤差が生じやすいことに留意する必要があり、なぜなら、そのような濃度は低い精度で測定され得るからである。
【０１３７】
表８は測定されたＩＬ−１Ｒａ対ＩＬ−１βの比を示し、表９はＩＬ−１Ｒａの測定された濃度を示し、且つ表１０はＩＬ−１βの測定された濃度を示す。培養を、上記に定義されたとおり、静的攪拌として、高速振とうで、または低速回転で実施した。
【０１３８】
【表８】
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表８：  示された培養時間後に測定されたＩＬ−１Ｒａ濃度対ＩＬ−１β濃度の比（図８参照）。
【０１３９】
【表９】
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表９：  示された培養時間後に測定されたＩＬ−１Ｒａ濃度［ｐｇ／ｍｌ］（図９参照）。
【０１４０】
【表１０】
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表１０：  示された培養時間後に測定されたＩＬ−１β濃度［ｐｇ／ｍｌ］（図１０参照）。
【０１４１】
攪拌は、ガラスビーズまたは他の粒子の不在下であっても所望の因子ＩＬ−１Ｒａのレベルを改善する。それらが存在する場合と比較して、ＩＬ−１Ｒａのレベルは幾分低く、そのような粒子が液体を接触するための表面積を高め、且つ誘導を改善するという説明と一致する。ＩＬ−１Ｒａ対ＩＬ−１βの優れた比およびＩＬ−１βの低いレベルも、粒子の不在下で実現できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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