(57)【要約】本発明は、Ｆｃγ受容体のシグナル伝達ドメインを組み込んだキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現をもたらす構築物を発現するガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に関する。好適には、本発明はまた、そのようなＣＡＲを提供するための構築物、ならびにそのようなＣＡＲを細胞内に導入し、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の受容体を含む細胞においてそのようなＣＡＲを発現させる方法に関する。【選択図】なし
2021500866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）膜貫通ドメインに結合した抗原結合ドメイン、
（ｉｉ）細胞内活性化シグナル伝達ドメイン
を含有する核酸構築物を含むγδＴ細胞またはナチュラルキラー細胞であって、
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインへの抗原の結合が前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインによるシグナル伝達を引き起こすように、前記細胞内シグナル伝達ドメインは１つ以上のＦｃγ受容体細胞内シグナル伝達ドメインを含む、γδＴ細胞またはナチュラルキラー細胞。
【請求項２】
前記Ｆｃγ受容体細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲ共通γ鎖、ＣＤ１６受容体もしくはＣＤ３２ａもしくはＣＤ３２ｃもしくはＣＤ６４、またはそれらの機能的変異体のうち少なくとも１つの前記シグナル伝達ドメインから選択される、請求項１に記載のγδＴ細胞またはナチュラルキラー細胞。
【請求項３】
請求項１または２に記載のγδＴ細胞であって、前記γδＴ細胞の前記γδＴ細胞受容体による、前記γδＴ細胞受容体が結合特異性を有する標的リガンドへの結合は、第１の細胞内シグナルを引き起こし、
前記ＣＡＲ抗原結合ドメインの、前記ＣＡＲが結合特異性を有する標的リガンドへの結合は、第２の細胞内シグナルを引き起こし、
前記第１の細胞内シグナルと前記第２の細胞内シグナルは、単独でまたは組み合わせて、前記γδＴ細胞の活性化を引き起こす、γδＴ細胞。
【請求項４】
請求項１または２に記載のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であって、前記ＮＫ細胞のＮＫ細胞受容体による、前記ＮＫ細胞受容体が結合特異性を有する標的リガンドへの結合は、第１の細胞内シグナルを引き起こし、
前記ＣＡＲ抗原結合ドメインの、前記ＣＡＲが結合特異性を有する標的リガンドへの結合は、第２の細胞内シグナルを引き起こし、
前記第１の細胞内シグナルと前記第２の細胞内シグナルは、単独でまたは組み合わせて、前記ＮＫ細胞の活性化を引き起こす、ナチュラルキラー細胞。
【請求項５】
請求項３に記載のγδＴ細胞または請求項４に記載のナチュラルキラー細胞であって、活性化により、前記γδＴ細胞またはナチュラルキラー細胞は、細胞傷害性、サイトカイン産生、抗原獲得、または抗原提示から選択される少なくとも１つのエフェクター機能が増加する、γδＴ細胞またはナチュラルキラー細胞。
【請求項６】
請求項３に記載のγδＴ細胞または請求項４に記載のナチュラルキラー細胞であって、標的細胞による前記γδＴ細胞またはナチュラルキラー細胞の活性化は、前記γδＴ細胞またはナチュラルキラー細胞の活性化を引き起こし、前記標的細胞の細胞死を促進する、γδＴ細胞またはナチュラルキラー細胞。
【請求項７】
ＣＡＲをコードする核酸構築物を含み、
前記核酸構築物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、またはそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項１〜６の何れかに記載のγδＴ細胞またはナチュラルキラー細胞。
【請求項８】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、またはそれらの組み合わせの少なくとも１つから選択されるＣＡＲをコードする核酸構築物を含む、請求項１〜６の何れかに記載のγδＴ細胞またはナチュラルキラー細胞。
【請求項９】
（ｉ）膜貫通ドメインに結合した抗原結合ドメイン、
（ｉｉ）細胞内活性化シグナル伝達ドメイン
を含む核酸構築物であって、
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインへの抗原の結合が前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインによるシグナル伝達を引き起こすように、前記細胞内細胞シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３２ａもしくはＣＤ３２ｃもしくはＣＤ６４の前記シグナル伝達ドメイン、またはそのようなシグナル伝達ドメインの機能的変異体から選択される１つ以上のＦｃγ受容体シグナル伝達ドメインを含む、核酸構築物。
【請求項１０】
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインへの抗原の結合が前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインによるシグナル伝達を引き起こすように、前記細胞内細胞シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３２ａもしくはＣＤ３２ｃもしくはＣＤ６４シグナル伝達ドメイン、またはそのようなシグナル伝達ドメインの機能的変異体のうち少なくとも１つの前記シグナル伝達ドメインから選択される１つ以上のＦｃγ細胞内シグナル伝達ドメインからなる、請求項９に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記ＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃの機能的変異体は、配列番号２または配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項９または１０に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
配列番号６または配列番号７の核酸配列を含む、請求項９または請求項１０に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
請求項９〜１２の何れかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項１４】
レンチウイルスベクターである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項９〜１２の何れかに記載の構築物または請求項１３もしくは１４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１６】
γδＴ細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１５に記載の細胞の作製方法であって、請求項９〜１２の何れかに記載の構築物または請求項１３もしくは１４に記載のベクターを細胞に導入するステップを備える、方法。
【請求項１９】
請求項１〜８の何れかに記載の細胞の作製方法であって、請求項９〜１２の何れかに記載の構築物または請求項１３もしくは１４に記載のベクターを、γδＴ細胞受容体またはＮＫ細胞受容体を含む細胞に導入するステップを備える、方法。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の方法であって、前記構築物が導入される前記細胞は、前記構築物を含む前記細胞が投与される対象から単離されたサンプルから得られる、方法。
【請求項２１】
請求項１８または１９に記載の方法であって、前記構築物が導入される前記細胞は第１の対象から単離されたサンプルから得られ、前記構築物を含む前記細胞は第２の異なる対象に投与される、方法。
【請求項２２】
請求項１〜８または請求項１５〜１７に記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜８または請求項１５〜１７に記載の細胞を対象に投与するステップを備える、疾患を治療および／または予防する方法。
【請求項２４】
以下のステップを備える、請求項２３に記載の方法：
（ｉ）請求項９〜１２の何れかに記載の核酸構築物または請求項１３もしくは１４に記載のベクターで、第１の対象から得られたγδＴ細胞および／またはＮＫ細胞を形質導入するか、または請求項９〜１２の何れかに記載の核酸構築物または請求項１３もしくは１４に記載のベクターを、第１の対象から得られたγδＴ細胞および／またはＮＫ細胞にトランスフェクトするステップ；および
（ｉｉ）前記ステップ（ｉ）からの前記γδＴ細胞および／またはＮＫ細胞を、前記対象に投与するステップ。
【請求項２５】
以下のステップを備える、請求項２３に記載の方法：
（ｉ）請求項９〜１２の何れかに記載の核酸構築物または請求項１３もしくは１４に記載のベクターで、第１の対象から得られたγδＴ細胞および／またはＮＫ細胞を形質導入するか、または請求項９〜１２の何れかに記載の核酸構築物または請求項１３もしくは１４に記載のベクターを、第１の対象から得られたγδＴ細胞および／またはＮＫ細胞にトランスフェクトするステップ；および
（ｉｉ）前記ステップ（ｉ）からの前記γδＴ細胞および／またはＮＫ細胞を、第２の異なる対象に投与するステップ。
【請求項２６】
前記疾患は癌である、請求項２３〜２５の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
疾患の治療および／または予防において使用するための、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
疾患を治療および／または予防するための医薬の製造における、請求項１〜８または１５〜１７の何れかに記載の細胞の使用。
【請求項２９】
疾患の治療および／または予防において使用するための請求項１〜８または請求項１５〜１７の何れかに記載の細胞であって、任意に、前記疾患は癌またはウイルス感染を含む感染から選択される、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に関し、当該ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、Ｆｃγ受容体のシグナル伝達ドメインを組み込んだキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現をもたらす構築物を発現する。好適には、本発明はまた、そのようなＣＡＲを与える構築物、ならびにそのようなＣＡＲを細胞に導入して、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の受容体を含む細胞においてそのようなＣＡＲを発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（Ｉｇ）に対する細胞受容体（Ｆｃ受容体）は、４０年前に同定され、免疫応答の開始および解消（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）において中心的な役割を果たす。これらの受容体は、Ｂ細胞の活性化の閾値を設定し、樹状細胞の成熟を調節し、抗体応答の特異性を、食作用や抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などの先天性エフェクター機能に結び付ける。これまでに研究されたすべての哺乳動物種で、ＩｇＧを認識する４つの異なるクラスのＦｃ受容体（ＦｃＲ）、即ち、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃＲγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃＲγＩＩＩ（ＣＤ１６）およびＦｃＲγＩＶが同定されている。それらは、機能に基づいて、活性化受容体および抑制性受容体の２つのクラスに分類することができ、それぞれ免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）または免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を介してシグナルを伝達する。ＦｃγＲＩＩＢは、免疫応答を調節するＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１を含む免疫抑制性受容体のファミリーに属する。活性化ＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶが含まれる。活性化Ｆｃγ受容体の関与（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、Ｂ細胞の増殖、マクロファージによる食作用、細胞溶解、脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、および炎症反応を開始するサイトカインをコードする遺伝子の転写活性化など、多くの生物学的機能を誘発する。活性化タイプのＦｃＲのほとんどは、ＩＴＡＭを含むＦｃ受容体の共通γ鎖（ＦｃＲγ）と会合する（ＦｃＲγ鎖（ＦｃＲ共通γ鎖）は、サイトカイン受容体によって用いられる共通γ鎖（ＣＤ１３２）とは異なる。）。一方、活性化受容体ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｃは、細胞内ＩＴＡＭ含有ドメインを有する。リガンド結合後のＦｃ受容体の凝集は、ＩＴＡＭのリン酸化と細胞の活性化をもたらす。
【０００３】
γδＴ細胞やＮＫ細胞などの免疫細胞は、それらの機能の少なくとも一部をもたらすＦｃγ受容体を発現する。これらの細胞は自然免疫系の一部であり、癌および感染症に対する免疫に不可欠である。それらは、感染細胞および癌性細胞を、特定および死滅させるためにいくつかの受容体を利用する。γδＴ細胞やＮＫ細胞などの免疫細胞が、それらの細胞傷害活性をもたらす方法の１つは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によってＦｃγ受容体を介するものである。これは、免疫系のエフェクター細胞が標的細胞を能動的に溶解する免疫機構であり、該標的細胞上の膜表面抗原が特異的抗体によって結合される。γδＴ細胞およびＮＫ細胞は、ＡＤＣＣをもたらすＦｃγ受容体ＣＤ３２およびＣＤ１６を発現する。これらの細胞タイプはいずれも、様々な種類の癌（黒色腫、腎細胞癌など）に対する細胞療法として試験されており、安全性と治療の可能性が実証されている。おそらくは発現したＦｃＲによって開始される活性化シグナルのために、これらの細胞のエフェクター機能がモノクローナル抗体によって増強され得ることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって実証されている。このことは、これらの細胞療法がモノクローナル抗体療法、例えば、ＨＥＲ２受容体を標的とするトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）と組み合わされるべきであるという示唆につながった。この方法では、これらの細胞の活性は、抗体によって結合された細胞に集中するであろう（Ｔｏｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２０１１年，  Ｖγ９Ｖδ２  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇｓ−Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ａｎｄ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、およびＧｅｒｔｎｅｒ−Ｄａｒｄｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ，  ２００９年，  Ｂｒｏｍｏｈｙｄｒｉｎ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）。
【０００４】
（キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））
免疫系の活性を特定のターゲットに対してリダイレクトおよび標的化する非常に効果的な方法は、免疫系の細胞上でのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現によるものである。ＣＡＲは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性を免疫細胞のエフェクター機能に融合させるモジュールタンパク質である。ＣＡＲの通常の形態は、生存および活性化シグナルを伝達するシグナル伝達エンドドメイン（ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）に接続された抗原を認識するアミノ末端、スペーサー、および膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である。
【０００５】
ＣＡＲは、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合物（ｆｕｓｉｏｎ）であってもよい。もともと、標的抗原を発現する癌細胞に対してαβＴ細胞の免疫機能をリダイレクトするために、それらは開発された。これは、臨床試験で使用するための癌特異的αβＴ細胞クローンを、末梢血および生検中におけるそれらの希少性が原因で同定および増殖できないためであった。このようなＣＡＲで使用されるシグナル伝達ドメインの選択は、αβＴ細胞におけるＣＡＲの開発を反映している。ほとんどのＣＡＲは通常、Ｔ細胞受容体様（シグナル１）刺激を与えるＣＤ３ゼータ（ζ）鎖由来のシグナル伝達ドメインと、共刺激（シグナル２）を与えるＣＤ２８またはＣＤ１３７由来のドメインを含む。ＣＡＲによって標的抗原が認識されると、Ｔ細胞の活性化が続いて起こり、その結果、抗原を発現している細胞に対する直接的な細胞傷害性が生じる。ＣＡＲを発現するαβＴ細胞を用いた試験で印象的な（ｉｍｐｒｅｓｓｉｖｅ）反応が報告されているが、これらには常にサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、神経毒性、そして多くの場合死亡などの深刻な有害事象が伴っていた。これは、ＣＡＲによるＴ細胞の制御されていない活性化と、オンターゲット、オフ腫瘍毒性と呼ばれる、抗原を発現する健康細胞の標的化とが原因の１つとされている。さらに、抗原依存性または抗原非依存性のＣＡＲ活性化によるこれらのαβＴ細胞の持続的な活性化は、消耗と生物活性の低下につながり得る。
【発明の概要】
【０００６】
より優れた選択性を有し、かつオンターゲット、オフ腫瘍毒性が低減された代替のＣＡＲベースのアプローチに対する必要性が存在する。ＣＡＲのキャリアとしてγδＴ細胞やＮＫ細胞などの先天性細胞（ｉｎｎａｔｅ  ｃｅｌｌ）の使用が報告されている。しかしながら、これらの研究は、αβＴ  ＣＡＲと同様のシグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζおよびＣＤ２８またはＣＤ１３７、を有するＣＡＲを用いており、その結果、オンターゲット、オフ腫瘍細胞毒性などの同様の問題が生じる。
【０００７】
αβΤ細胞とは異なり、γδＴおよびＮＫ細胞のエフェクター機能は、ＦｃγＲなどの分子にリンクされている。本発明者らは、Ｆｃγ受容体共通鎖の刺激ドメインを含むＣＡＲを発現するγδＴ細胞またはＮＫ細胞が、細胞療法の開発において使用され得るエフェクター機能（例えば、細胞傷害性、サイトカイン産生、抗原の獲得および提示）の増加をもたらすことを決定した。したがって、本発明者らは、ＣＡＲの細胞外部分への抗原の結合時に、Ｆｃγ受容体に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを刺激し、これにより典型的にはＦｃγ受容体に関連するシグナル伝達経路の活性化を引き起こすＣＡＲ構築物を開発した。
【０００８】
γδＴ細胞またはＮＫ細胞またはγδＴ細胞もしくはＮＫ細胞に関連するＴ細胞受容体を発現する細胞であって、Ｆｃ受容体γ鎖のシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｃもしくはＣＤ６４、またはそれらの機能的変異体およびフラグメント、ならびにそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない１つ以上のＦｃγ受容体のシグナル伝達ドメインを組み込んだキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする構築物をさらに発現する細胞は、標的細胞に結合すると、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と同様の方法で標的細胞を認識し、細胞死を引き起こすことができる可能性がある。該構築物を発現するγδＴ細胞またはＮＫ細胞は、炎症性サイトカイン産生、抗原の獲得および提示、または適応免疫応答を活性化する能力などのエフェクター機能が増加している可能性がある。好適には、γδＴ細胞またはＮＫ細胞またはγδＴ細胞もしくはＮＫ細胞に関連するＴ細胞受容体を発現する細胞であって、Ｆｃ受容体γ鎖のシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｃまたはＣＤ６４、またはそれらの機能的変異体およびフラグメント、ならびにそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない１つ以上のＦｃγ受容体のシグナル伝達ドメインからなるまたは本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする構築物をさらに発現する細胞が提供され、該細胞は標的細胞に結合すると、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と同様の方法で標的細胞を認識し、細胞死を引き起こすことができる可能性がある。
【０００９】
したがって、本発明の第１の態様は、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、またはγδＴ細胞もしくはＮＫ天然細胞傷害性受容体を発現する細胞から選択される細胞であって、ＦｃγＲγ鎖またはＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃまたはＣＤ６４またはそれらの機能的変異体の１つ以上から選択される細胞内細胞シグナル伝達ドメインを含有するＣＡＲをさらに含む、細胞を提供する。
【００１０】
好適には、前記ＣＡＲは、
（ｉ）膜貫通ドメインに結合した抗原結合ドメイン、
（ｉｉ）細胞内活性化シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
を含み、前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインへの抗原の結合が前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインによるシグナル伝達を引き起こすように、前記細胞内活性化シグナル伝達ドメインは１つ以上のＦｃγ細胞内シグナル伝達ドメインを含み、好ましくは、前記Ｆｃγ受容体細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１６Ｆｃ受容体（ＦｃγＲγ鎖）またはＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃまたはＣＤ６４の少なくとも１つの前記シグナル伝達ドメイン、または前記シグナル伝達ドメインの組み合わせから選択される。
【００１１】
好適には、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、またはγδＴ細胞もしくはＮＫ天然細胞傷害性受容体を発現する細胞から選択される細胞における、ＣＤ１６Ｆｃ受容体（ＦｃγＲγ鎖）またはＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃまたはＣＤ６４またはシグナル伝達ドメインの組み合わせの少なくとも１つから選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲによるシグナル伝達は、例えば、ＡＤＣＣと同様の方法で、前記ＣＡＲによって結合された細胞の細胞死を促進することができる。
【００１２】
実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、スペーサーを介して膜貫通ドメインに結合させることができる。
【００１３】
ＣＤ１６シグナル伝達ドメインはＦｃＲγ鎖であり、それはいくつかのＦｃ受容体によって共有されている。さらに、ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｃとそれらのシグナル伝達ドメインは、γδＴ細胞およびＮＫ細胞によって発現される。ＮＫ細胞およびγδＴ細胞によって発現されるこれらの受容体とそのシグナル伝達ドメインは、γδ細胞およびＮＫ細胞のエフェクター機能にとって重要であり、例えば、ＡＤＣＣ、サイトカイン産生、抗原の獲得および提示をもたらす。好適には、ＣＡＲを提供するための構築物は、ＮＫ細胞と共に利用され得る。好適には、実施形態において、ＣＡＲは、ＦｃγＲ共通鎖またはＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃまたはＣＤ６４から選択される細胞内シグナル伝達ドメインのみを含み得る。
【００１４】
実施形態において、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、またはγδＴ細胞もしくはＮＫ天然細胞傷害性受容体を発現する細胞から選択される細胞で発現されるＣＡＲのエンドドメインは、ＦｃＲγ鎖またはＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃの１つ以上を含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含み、当該ＦｃＲγ鎖またはＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃは、配列番号１もしくは配列番号２もしくは配列番号３の配列を有する細胞内ドメインまたはその機能的変異体もしくはフラグメントまたはこれらの組み合わせを含み得る。
【００１５】
［化１］
配列番号１−ＦｃＲγ鎖
ＭＩＰＡＶＶＬＬＬＬＬＬＶＥＱＡＡＡＬＧＥＰＱＬＣＹＩＬＤＡＩＬＦＬＹＧＩＶＬＴＬＬＹＣＲＬＫＩＱＶＲＫＡＡＩＴＳＹＥＫＳＤＧＶＹＴＧＬＳＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬＫＨＥＫＰＰＱ
［化２］
配列番号２−ＣＤ３２ａ（ＦＣＧＲ２Ａ）
ＭＴＭＥＴＱＭＳＱＮＶＣＰＲＮＬＷＬＬＱＰＬＴＶＬＬＬＬＡＳＡＤＳＱＡＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＰＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＱＧＡＲＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＭＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＱＫＦＳＨＬＤＰＴＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＦＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＶＰＳＭＧＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＩＡＴＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＮＳＴＤＰＶＫＡＡＱＦＥＰＰＧＲＱＭＩＡＩＲＫＲＱＬＥＥＴＮＮＤＹＥＴＡＤＧＧＹＭＴＬＮＰＲＡＰＴＤＤＤＫＮＩＹＬＴＬＰＰＮＤＨＶＮＳＮＮ
［化３］
配列番号３−ＣＤ３２ｃ（ＦＣＧＲ２Ｃ）
ＭＧＩＬＳＦＬＰＶＬＡＴＥＳＤＷＡＤＣＫＳＰＱＰＷＧＨＭＬＬＷＴＡＶＬＦＬＡＰＶＡＧＴＰＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＱＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＲＧＴＨＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＶＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＫＫＦＳＲＳＤＰＮＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＹＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＡＰＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＴＧＩＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＮＳＴＤＰＶＫＡＡＱＦＥＰＰＧＲＱＭＩＡＩＲＫＲＱＰＥＥＴＮＮＤＹＥＴＡＤＧＧＹＭＴＬＮＰＲＡＰＴＤＤＤＫＮＩＹＬＴＬＰＰＮＤＨＶＮＳＮＮ
【００１６】
理論に拘束されるつもりはないが、ＣＡＲによる抗原結合（ここで該ＣＡＲの細胞内細胞シグナル伝達ドメインは、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、またはγδＴＣＲもしくはＮＫ天然細胞傷害性受容体を発現する細胞から選択される細胞で発現されるＦｃＲγ鎖またはＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃの１つ以上を含む）は、Ｓｒｃキナーゼファミリーのメンバーによる細胞内シグナル伝達ドメインのＩＴＡＭリン酸化と、それに続くＳＨ−２含有キナーゼ、例えば、Ｓｙｋキナーゼファミリーのメンバーのリクルートにつながる。これらは最終的に、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）およびホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）のリクルートにつながり、それらはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化と持続的なカルシウム上昇を引き起こし、ＣＡＲを発現する細胞タイプに応じた機能的結果をもたらすが、γδＴ細胞の場合、その機能的結果はＡＤＣＣ、サイトカイン産生（例えば、ＴＮＦ）、ならびに潜在的に増加した抗原の獲得および提示である。
【００１７】
実施形態において、発現したＣＡＲのシグナル伝達ドメインの機能的変異体またはフラグメントは、配列番号１、配列番号２および配列番号３として与えられる「野生型」配列の１つ以上のアミノ酸変異、例えば、挿入／欠失／置換、好ましくは１つ以上のアミノ酸を挿入／欠失／置換するための挿入／欠失／置換から選択される最大２０個、最大１５個、最大１０個、最大５個の変異を含み得る。
【００１８】
実施形態では、ＣＡＲが発現される細胞は、γδＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択され得、好ましくはγδＴ細胞である。
【００１９】
本発明の第２の態様では、本発明の第１の態様による細胞の作製方法が提供され、前記方法はＣＡＲをコードする核酸構築物またはベクターを導入するステップを備え、前記ＣＡＲは、
（ｉ）膜貫通ドメインに結合した抗原結合ドメイン、
（ｉｉ）細胞内活性化シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
を含み、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、またはγδＴＣＲもしくはＮＫ天然細胞傷害性受容体を発現する細胞から選択される細胞であって、前記細胞内細胞シグナル伝達ドメインが１つ以上のＦｃＲγ鎖またはＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃまたはＣＤ６４を含む細胞において、前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインへの抗原の結合が前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインによるシグナル伝達を引き起こすように、前記細胞内活性化シグナル伝達ドメインは１つ以上のＦｃγＲ共通細胞内シグナル伝達ドメインを含み、好ましくは、前記ＦｃγＲ共通細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１６Ｆｃ受容体（ＦｃＲγ鎖）またはＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃまたはＣＤ６４またはそれらの機能的変異体の少なくとも１つの前記シグナル伝達ドメイン、または前記シグナル伝達ドメインの組み合わせから選択される。
【００２０】
実施形態では、構築物またはベクターが導入される細胞は、対象から単離されたサンプルの一部であるか、または対象から単離されたサンプルに由来し得る。
【００２１】
本発明の第２の態様の方法において使用される細胞は、患者、血縁もしくは非血縁造血移植ドナー、全く縁故のないドナーから単離されたサンプルに由来するか、臍帯血に由来するか、胚細胞株から分化されるか、誘導性前駆細胞株から分化されるか、または形質転換細胞株に由来し得る。
【００２２】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様による複数の細胞、またはは本発明の第２の態様の方法によってもたらされる複数の細胞を含む医薬組成物を提供する。前記組成物は、自家γδＴおよび／またはＮＫ細胞組成物であり得る。
【００２３】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様による複数の細胞、本発明の第２の態様の方法によってもたらされる複数の細胞、または本発明の第３の態様による医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを備える、疾患を治療および／または予防する方法を提供する。
【００２４】
前記方法は、以下のステップを備え得る：
（ｉ）任意に、対象からγδＴおよび／またはＮＫ細胞を含むサンプルを単離するステップ；
（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸構築物またはベクターでγδＴおよび／またはＮＫ細胞を形質導入するか、またはＣＡＲをコードする核酸構築物またはベクターをγδＴおよび／またはＮＫ細胞にトランスフェクトするステップであって、前記ＣＡＲは、
（ａ）膜貫通ドメインに結合した抗原結合ドメイン、
（ｂ）細胞内活性化シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
を含み、前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインへの抗原の結合が前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインによるシグナル伝達を引き起こし、前記ＣＡＲを発現する活性化γδＴ細胞またはＮＫ細胞を生成するように、前記細胞内シグナル伝達ドメインは１つ以上のＦｃγ共通鎖細胞内シグナル伝達ドメインを含み、好ましくは、前記Ｆｃγ共通鎖細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ鎖、ＣＤ１６Ｆｃ受容体もしくはＣＤ３２ａもしくはＣＤ３２ｃもしくはＣＤ６４、またはそれらの機能的変異体の少なくとも１つの前記シグナル伝達ドメイン、または前記シグナル伝達ドメインの組み合わせから選択される、ステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からのγδＴおよび／またはＮＫ細胞を対象に投与するステップ。
【００２５】
好適には、γδＴ細胞またはＮＫ細胞が投与される対象は、γδＴ細胞および／またはＮＫ細胞が単離された対象であり得る。あるいは、γδＴ細胞またはＮＫ細胞が投与される対象は、γδＴ細胞および／またはＮＫ細胞が単離された対象とは異なる対象であり得る。好適には、γδＴ細胞またはＮＫ細胞が投与される対象は、当該細胞が得られた対象とは血縁関係（ｎｏｔ  ｂｅ  ｒｅｌａｔｅｄ）がなくてもよい。
【００２６】
疾患の治療および／または予防において使用するための、本発明の第１の態様の細胞、または本発明の第２の態様によってもたらされる細胞、または本発明の第３の態様による医薬組成物も提供される。
【００２７】
疾患を治療および／または予防するための医薬の製造における、本発明の第１の態様の細胞、または本発明の第２の態様によってもたらされる細胞も提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））
ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインを細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続するキメラＩ型の膜貫通タンパク質である。抗原認識ドメインは、通常、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことができる。バインダー（ｂｉｎｄｅｒ）を膜から分離し、適切な配向を可能にするために、通常、スペーサードメインが必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃである。抗原によっては、よりコンパクトなスペーサー、例えば、ＣＤ８ａ由来のストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジのみでも十分である。Ｆｃ受容体への結合を低減するために、ＩｇＧドメインを改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）することができる。膜貫通ドメインはタンパク質を細胞膜中に固定し、抗原結合部位／スペーサーをエンドドメインに接続する。
【００２９】
第一世代のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖の細胞内部分に由来するエンドドメインを含んでいた。これらの設計は主にαβＴ細胞に適用された。これらのドメインによって開始された活性化シグナルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてコグネイト標的細胞（ｃｏｇｎａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ）のＴ細胞殺傷を誘発するのに十分であったが、Ｔ細胞を完全に活性化して増殖および生存させることはできなかった。これらのドメインの使用がαβΤ細胞アネルギーをもたらすことがすぐに発見された。さらに、ＦｃεＲ１のγ鎖の使用は、αβＴ細胞の活性化に有効ではなく、すぐに放棄されたことも報告された。第２世代のＣＡＲ設計は、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分との融合物（ｆｕｓｉｏｎ）を含有するエンドドメインを含んでいた。これらは、抗原認識後に、活性化シグナルと共刺激シグナルを同時に伝達することができる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、最も強力な共刺激シグナル、即ちＴ細胞の増殖を引き起こす免疫学的シグナル２を与える。ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン、例えば、生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４−１ＢＢを含むいくつかの受容体も記載されている。臨床試験で使用される最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８または４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。
【００３０】
共刺激シグナル部分を含むさらなるＣＡＲ設計は、例えばＷＯ２０１６／１６６５４４によって記載されているとおりである。
【００３１】
ＣＡＲをコードする核酸は、例えばレトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞に移入され得る。レンチウイルスベクターが好適に使用され得る。
【００３２】
本発明では、実施形態において、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、γδＴＣＲまたはＮＫ天然細胞傷害性受容体を発現する細胞であって、細胞内細胞シグナル伝達ドメインが１つ以上のＦｃγ受容体シグナル伝達ドメインを含む細胞で発現されるＣＡＲは、以下によって提供され得る。
【００３３】
［化４］
配列番号４（ＣＤ１９ｓｃＦｖ−リンカー−ｍｙｃ−ＣＤ２８［ＥＸ］−ＦｃＲγ［ＴＭ−ＩＮ］）
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＡＡＳＧＧＧＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＬＣＹＩＬＤＡＩＬＦＬＹＧＩＶＬＴＬＬＹＣＲＬＫＩＱＶＲＫＡＡＩＴＳＹＥＫＳＤＧＶＹＴＧＬＳＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬＫＨＥＫＰＰＱＡＡＡ
［化５］
配列番号５（ＣＤ１９ｓｃＦｖ−リンカー−ｍｙｃ−ＣＤ２８［ＥＸ−ＴＭ］−ＦｃＲγ［ＩＮ］）
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＡＡＳＧＧＧＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＬＫＩＱＶＲＫＡＡＩＴＳＹＥＫＳＤＧＶＹＴＧＬＳＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬＫＨＥＫＰＰＱ
［化６］
配列番号６（ＣＤ１９ｓｃＦｖ−リンカー−ｍｙｃ−ＣＤ２８［ＥＸ−ＴＭ］−ＣＤ３２ａ［ＩＮ］）
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＡＡＳＧＧＧＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＣＲＫＫＲＩＳＡＮＳＴＤＰＶＫＡＡＱＦＥＰＰＧＲＱＭＩＡＩＲＫＲＱＬＥＥＴＮＮＤＹＥＴＡＤＧＧＹＭＴＬＮＰＲＡＰＴＤＤＤＫＮＩＹＬＴＬＰＰＮＤＨＶＮＳＮＮ
または
［化７］
配列番号７（ＣＤ１９ｓｃＦｖ−リンカー−ｍｙｃ−ＣＤ２８［ＥＸ−ＴＭ］−ＣＤ３２ｃ［ＩＮ］）
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＡＡＳＧＧＧＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＣＲＫＫＲＩＳＡＮＳＴＤＰＶＫＡＡＱＦＥＰＰＧＲＱＭＩＡＩＲＫＲＱＰＥＥＴＮＮＤＹＥＴＡＤＧＧＹＭＴＬＮＰＲＡＰＴＤＤＤＫＮＩＹＬＴＬＰＰＮＤＨＶＮＳＮＮ
【００３４】
ＥＸ＝細胞外ドメイン
ＴＭ＝膜貫通ドメイン
ＩＮ＝細胞内ドメイン
【００３５】
好適には、配列番号４、５、６または７として示される配列の機能的変異体が、該機能的変異体が記載された抗原に結合できるＣＡＲであって、γδＴ細胞受容体またはＮＫ受容体シグナル伝達と組み合わせたときにＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化可能な細胞内シグナル伝達ドメインを介してシグナルを与えるという条件で、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性で提供され得る。好適には、本発明のＣＡＲ構築物の実施形態は、配列番号４、５、６または７のいずれか１つによって提供され得る。配列アラインメントおよび配列同一性の決定の方法は、当該分野で周知であり、適切なアラインメントプログラムを使用して達成され得る。配列同一性％とは、２つの配列が最適にアラインメントされている場合に、該２つの配列で同一であるアミノ酸またはヌクレオチド残基の割合（％）を指す。ヌクレオチドおよびタンパク質配列の相同性または同一性は、標準的なアルゴリズム、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで公開されているデフォルトのパラメーターを用いたＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、アメリカ国立生物工学情報センター）を使用して決定することができる。配列同一性または相同性を決定するためのその他のアルゴリズムには、以下のものが含まれる：ＬＡＬＩＧＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｏｓａ／ｌａｌｉｇｎ／およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｌａｌｉｇｎ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌ）；ＡＭＡＳ（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｙ  Ａｌｉｇｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ａｍａｓ／ａｍａｓ．ｈｔｍｌ）；ＦＡＳＴＡ（ｆｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａ／）；Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）；ＳＩＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｖ．ｏｒｇ／ｓｉｍ／）；およびＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ  ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌ）。
【００３６】
細胞によって発現されたＣＡＲの所望の抗原への結合は、該ＣＡＲによって標的化された抗原およびヒトＩｇＧのＦｃ部分を含むキメラタンパク質を使用することによって試験することができる。ＣＡＲへのキメラタンパク質の結合は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、キメラタンパク質のＦｃ部分を検出する適切な二次抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの方法で検出することができる。
【００３７】
本発明の他の態様では、アネキシンＶ／ＰＩ細胞傷害性アッセイ、クロム放出アッセイ、ＣＤ１０７脱顆粒アッセイ、細胞内サイトカインアッセイ、Ｌｕｍｉｎｅｘを含むがこれらに限定されない当技術分野で既知の方法によって、ＣＡＲを発現するγδＴ細胞またはＮＫ細胞の機能性を、標的化された抗原を発現する癌細胞株または原発腫瘍細胞に対して試験することができる。標的抗原を発現しない非形質導入γδＴまたはＮＫ細胞および細胞株などの適切なコントロールを使用して、エフェクター機能の増加が特異的なＣＡＲ活性に起因することを実証することができる。
【００３８】
本発明の実施形態では、ＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃのシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲは、γδＴ細胞によって発現される。ＣＡＲがその標的に結合すると、該ＣＡＲを発現するγδＴ細胞による抗原の獲得および提示の増加をもたらし得るシグナル伝達が開始される。γδＴ細胞は抗原を獲得および提示して、適応免疫応答を開始および伝播させることができる（Ｂｒａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５年）。γδＴ細胞は、オプソニン化された標的細胞との相互作用により抗原を獲得することができ（Ｈｉｍｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ，ＪＩ，２０１２年）、プロフェッショナルな抗原提示細胞として機能することができる。理論に拘束されるつもりはないが、ＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｃまたはＦｃＲγ鎖共刺激ドメインを含むＣＡＲを発現するγδＴ細胞は、抗原の獲得および提示の能力が増強されていると考えられる。実施形態では、本発明のＣＡＲ発現細胞が抗原を獲得および提示する能力の増加は、限定されないが、標的抗原を発現する蛍光ビーズの食作用、またはモデル抗原とＨＬＡペプチド抗原を認識する抗体とを使用した抗原提示の検出を含む、当技術分野で既知のアッセイにより実証することができる。
【００３９】
＜抗原結合ドメイン＞
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの部分である。抗原結合ドメインには、細胞表面の疾患関連抗原、または主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）との複合体として発現される疾患関連抗原に由来するペプチドに結合する、抗体、抗体フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｃ、抗体の軽鎖および重鎖、またはそれらの任意の組み合わせの抗原結合部位が含まれ得る。実施形態において、抗原結合部分は、２つの異なる抗体を含む二重特異性構築物であり得、該２つの異なる抗体は、２つの異なる抗原、同一抗原の異なるエピトープ、または疾患関連抗原および共刺激もしくは共阻害分子またはホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）／マイグレーション（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）受容体に対するものである。本発明の他の実施形態では、抗原結合ドメインは、αβＴ細胞受容体またはγδＴ細胞受容体であり得る。抗原結合ドメインで使用する抗体は、ヒトＢ細胞、マウスＢ細胞、ラットＢ細胞、またはハイブリドーマ細胞株に由来し得る。ハイブリドーマ細胞株は、免疫化された野生型またはヒト化マウス、ラットＢ細胞、免疫化された野生型またはヒト化ラットから単離されたラットハイブリドーマ細胞、またはヒト、マウス、ラット、ラクダ、サメもしくはラマに由来する抗体ライブラリーに由来し得る。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、標的抗原の天然リガンド、標的に対して十分な親和性を有するペプチド、単一ドメイン抗体、またはＴ細胞受容体に由来する単鎖を含み得る。
【００４０】
好適には、細胞外抗原結合ドメインは、腫瘍／疾患細胞上にのみ存在し他の細胞上には存在しない腫瘍特異的抗原または疾患関連抗原、および／または一部の疾患細胞上に存在しかつ一部の正常細胞上にも存在する疾患関連抗原を認識して結合することができる。このような疾患関連抗原には、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＲＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＧＭ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＡＲＴ１、ＡＦＰ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、変異Ｒａｓ、ｐ５３、Ｂ−Ｒａｆ、ｃ−ｍｅｔ、ＶＥＧＦ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＷＴ１、癌胎児性抗原、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−３、上皮性腫瘍抗原、およびＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ１２、ＭＡＧＥＣ２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＸＡＧＥ１Ｂ、ＣＴＡＧ２、ＣＴＡＧ１、ＳＳＸ２またはＬＡＧＥ１を含むＭＡＧＥタイプの抗原またはウイルス抗原またはそれらの組み合わせまたは翻訳後修飾タンパク質（カルバミル化およびシトルニル化タンパク質を含み得るがこれらに限定されない）が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４１】
実施形態において、抗原結合ドメインは、細胞感染、細菌感染、真菌感染、原生動物感染もしくはウイルス感染に見られる抗原、またはウイルス由来の活性もしくは不活化ウイルスフラグメント、ペプチド、タンパク質、抗原性セグメントなどに結合することができる。
【００４２】
実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、免疫チェックポイントリガンド、例えばＰＤ−Ｌ１を認識し得る。
【００４３】
実施形態において、抗原結合ドメインは、細胞表面受容体の細胞外部分であり得、それは、次いで上述のような膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインに融合される。
【００４４】
＜スペーサードメイン＞
ＣＡＲは通常、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに接続するスペーサー配列を含む。スペーサードメインは、抗原結合ドメインをエンドドメインから分離し、フレキシブルなスペーサーは、抗原結合ドメインが異なる方向に配向することを可能にし、結合を促進することができる。
【００４５】
ＣＡＲのスペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、またはヒトＣＤ８ストークもしくはマウスＣＤ８ストークを含み得る。あるいは、スペーサーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと同様の長さおよび／またはドメインスペーシング特性（ｄｏｍａｉｎ  ｓｐａｃｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有する代替リンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するために変更され得る。
【００４６】
これらのスペーサーのアミノ酸配列の例を以下に示す。
【００４７】
［化８］
配列番号８（ヒトｌｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２ＣＨ３）
ＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＷＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＷＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤ
［化９］
配列番号９（ヒトＣＤ８ストーク）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩ
［化１０］
配列番号１０（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）
ＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＫＤＰＫ
［化１１］
配列番号１１（ＣＤ２エクトドメイン）
ＫＥＩＴＮＡＬＥＴＷＧＡＬＧＱＤＩＮＬＤＩＰＳＦＱＭＳＤＤＩＤＤＩＫＷＥＫＴＳＤＫＫＫＩＡＱＦＲＫＥＫＥＴＦＫＥＫＤＴＹＫＬＦＫＮＧＴＬＫＩＫＨＬＫＴＤＤＱＤＩＹＫＶＳＩＹＤＴＫＧＫＮＶＬＥＫＩＦＤＬＫＩＱＥＲＶＳＫＰＫＩＳＷＴＣＩＮＴＴＬＴＣＥＶＭＮＧＴＤＰＥＬＮＬＹＱＤＧＫＨＬＫＬＳＱＲＶＩＴＨＫＷＴＴＳＬＳＡＫＦＫＣＴＡＧＮＫＶＳＫＥＳＳＶＥＰＶＳＣＰＥＫＧＬＤ
［化１２］
配列番号１２（ＣＤ３４エクトドメイン）
ＳＬＤＮＮＧＴＡＴＰＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＹＱＥＴＴＴＰＳＴＬＧＳＴＳＬＨＰＶＳＱＨＧＮＥＡＴＴＮＩＴＥＴＴＶＫＦＴＳＴＳＶＩＴＳＶＹＧＮＴＮＳＳＶＱＳＱＴＳＶＩＳＴＶＦＴＴＰＡＮＶＳＴＰＥＴＴＬＫＰＳＬＳＰＧＮＶＳＤＬＳＴＴＳＴＳＬＡＴＳＰＴＫＰＹＴＳＳＳＰＩＬＳＤＩＫＡＥＩＫＣＳＧＩＲＥＶＫＬＴＱＧＩＣＬＥＱＮＫＴＳＳＣＡＥＦＫＫＤＲＧＥＧＬＡＲＶＬＣＧＥＥＱＡＤＡＤＡＧＡＱＶＣＳＬＬＬＡＱＳＥＶＲＰＱＣＬＬＬＶＬＡＮＲＴＥＩＳＳＫＬＱＬＭＫＫＨＱＳＤＬＫＫＬＧＩＬＤＦＴＥＱＤＶＡＳＨＱＳＹＳＱＫＴ
［化１３］
配列番号１３（ヒトＣＤ２８ストーク）
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ
［化１４］
配列番号１４（ＳＧＧＧＳリンカー）
ＳＧＧＧＧＳ
［化１５］
配列番号１５（ｍｙｃタグ）
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ
【００４８】
＜膜貫通ドメイン＞
膜貫通ドメインは、膜にまたがるＣＡＲの配列である。
【００４９】
膜貫通ドメインは、膜中で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。
【００５０】
膜貫通ドメインは、良好な受容体安定性を与えるＣＤ２８に由来していてもよい。あるいは、膜貫通領域は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｃγＲγ鎖、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）、ＣＤ３２ｃ（ＦｃγＲＩＩＣ）またはＣＤ６４（ＦｃγＲＩＡ）に由来していてもよい。
【００５１】
＜シグナル伝達ドメイン＞
ＣＡＲの活性化エンドドメインは、Ｆｃγ受容体のシグナル伝達ドメインを含むか、Ｆｃγ受容体のシグナル伝達ドメインから実質的になるか、またはＦｃγ受容体のシグナル伝達ドメインからなることができる。これらの受容体の例は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２ｃ）、またはＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）である。実施形態において、ＣＡＲは、ＦｃＲγ鎖、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２ｃ）、またはこれらの組み合わせ由来の活性化ドメインを含むことができる。本発明の実施形態において、Ｆｃγ受容体の活性化エンドドメインを、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＪＡＭＡＬ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＣＤ４６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、Ｄｙｎａｘ活性化タンパク質（Ｄｙｎａｘ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＡＰ）−１０、ＤＡＰ−１２、ＩＬ−２共通γ鎖、ＩＬ−１２受容体、ＣＤ２４４を含むがこれらに限定されない他の活性化ドメインと組み合わせることができる。
【００５２】
好適には、細胞内シグナル伝達配列は、ＦｃＲγ鎖（配列番号１）、ＣＤ３２ａ（配列番号２）またはＣＤ３２ｃ（配列番号３）の「野生型」細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。
【００５３】
好適には、提案された「野生型」細胞内シグナル伝達配列の変異体を提供することができ、Ｆｃγ受容体活性化ドメインの変異体配列は、該配列が有効な細胞内細胞シグナル伝達ドメインを与えるという条件で、配列番号１または配列番号２または配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
【００５４】
好適には、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインの活性は、当技術分野で知られている方法によって試験することができる。これらには、ＳＹＫ、ＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫなどのＣＡＲに組み込まれたドメインによって開始されるシグナル伝達カスケードの下流にあるリン酸化型のシグナル伝達分子に対する細胞内フローサイトメトリー染色、または細胞内カルシウム変化の測定が含まれ得る。組換えタンパク質またはキメラタンパク質を使用したＣＡＲの選択的結合（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を用いて、ＣＡＲ結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を開始し、シグナル伝達を刺激することができる。好適には、シグナル伝達ドメインの活性は、ＣＡＲ結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）によって開始される下流のエフェクター機能を決定する機能アッセイを使用して評価することができる。これには、アネキシンＶ／ＰＩ細胞傷害性アッセイ、クロム放出アッセイ、ＣＤ１０７脱顆粒アッセイ、細胞内サイトカインアッセイ、またはＬｕｍｉｎｅｘが含まれるが、これらに限定されない。標的抗原を発現しない非形質導入γδＴまたはＮＫ細胞および細胞株などの適切なコントロールを使用して、エフェクター機能の増加が特異的なＣＡＲ活性に起因することを実証することができる。
【００５５】
本発明の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、タンパク質を細胞膜に導くリーダー配列（例えば、ＧＭＣＳＦ−Ｒ分泌シグナルまたはＣＤ８）を含み得る。
【００５６】
（細胞）
第１の態様のＣＡＲを含む細胞は、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞であり得る。
【００５７】
γδＴ細胞は、感染症および癌に対する効果的な免疫に不可欠な先天的な特性（ｉｎｎａｔｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有する免疫細胞である。アルファベータ（αβ）Ｔ細胞とは異なり、γδＴ細胞はＴＣＲのγおよびδ鎖を発現し、より限られたクローン多様性を有すると考えられている。γδＴ細胞は、非ＭＨＣ制限された方法（ａ  ｎｏｎ−ＭＨＣ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｍａｎｎｅｒ）で非ペプチド抗原を認識する。血中では、γδＴ細胞はヒトにおけるマイナーなサブセット（１０％未満）を表す。γδＴ細胞の大部分はＶγ９Ｖδ２（ガンマ９デルタ２）Ｔ細胞受容体を発現し、当該Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞受容体は、メバロン酸経路の調節異常の結果として癌細胞で特異的に過剰産生される内因性イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を認識する。このことは、γδＴ細胞が形質転換細胞から健康な細胞を識別することを可能にする。さらに、γδＴ細胞は、細胞傷害性機能をもたらすＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ８０およびＮＫｐ４６などの多数のＮＫ細胞受容体を発現する。γδＴリンパ球がＩＦＮ−γおよびＴＮＦのような豊富な炎症性サイトカインを産生する能力、それらの強力な細胞傷害性効果機能、および抗原のＭＨＣ非依存性認識は、それらを癌免疫療法のための重要なツールにする。γδＴ細胞は、白血病、神経芽細胞腫、および様々な癌腫などを含む多くの様々な種類の腫瘍細胞株をｉｎ  ｖｉｔｒｏで死滅させ得ることが示されている。さらに、γδＴ細胞は、自発的に、またはゾレドロネートを含む様々なビスホスホネートによる処理後に、多くの様々な分化腫瘍細胞を認識し、かつ死滅させ得ることが示されている。ビスホスホネート処理は、γδＴ細胞の活性化を促進する内因性ＩＰＰの蓄積をもたらす。
【００５８】
ＮＫ細胞は、微生物感染および腫瘍に対する宿主防御を可能にする強力な細胞溶解機能を備えた自然免疫系の一部である。ＮＫ細胞は、表現型的にヒトのＣＤ３−ＣＤ５６＋リンパ球として特徴付けられ、それらの機能を調節する多くの天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）を発現する。活性化されると、ＮＫ細胞は直接的な細胞傷害性を示し、ＩＦＮγやＴＮＦなどの炎症性サイトカインを発現する。
【００５９】
αβＴ細胞とは異なり、γδＴ細胞およびＮＫ細胞はＦｃγ受容体を通してそれらの機能をもたらし、Ｆｃγ受容体を通してＡＤＣＣをもたらす。いずれの細胞タイプもＦｃγ受容体を発現し、ＡＤＣＣは主にＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）受容体によってもたらされると理解されている。さらに、γδＴ細胞は、抗体でコーティングされた標的細胞との物理的相互作用の後に抗原を獲得することが理解されている。この相互作用は、γδＴ細胞上に発現するＦｃγ受容体、好ましくはＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）およびＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２ｃ）によって促進される。Ｆｃγ受容体由来の活性化ドメインを含むＣＡＲの発現は、抗体によるこれらの受容体の自然の結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を模倣し、γδＴ細胞またはＮＫ細胞などの自然免疫細胞において生物学的効果を生成すると、本発明者によって考えられている。αβＴ細胞はＦｃγ受容体を通してその機能をもたらさないため、αβＴ細胞はＦｃγ共通細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ構築物の適切なホストではない。上述したＣＡＲを発現するγδＴ細胞は、細胞傷害性ポテンシャル、エフェクターサイトカインの産生、ならびに疾患関連抗原を獲得および提示する能力が増加するであろう。後者の効果は、適応αβ免疫応答を誘導するそれらの能力を高めることができる。
【００６０】
ＣＡＲ発現細胞は、患者自身の末梢血から（第一者）、またはドナーの末梢血由来の造血幹細胞の移植を介して（第二者）、または縁故のないドナー由来の末梢血から（第三者）、ｅｘ  ｖｉｖｏで作製され得る。
【００６１】
本発明はまた、本発明によるＣＡＲ発現γδＴ細胞および／またはＮＫ細胞などのＣＡＲ発現細胞を含む細胞組成物を提供する。該細胞組成物は、本発明による核酸構築物を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで血液サンプルを形質導入することによって作製され得る。
【００６２】
あるいは、ＣＡＲ発現細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の、γδＴ細胞などの関連細胞タイプへのｅｘ  ｖｉｖｏ分化に由来してもよい。あるいは、その溶解機能を保持し、治療剤として作用し得るγδＴ細胞株などの不死化細胞株を使用してもよい。
【００６３】
これらのすべての実施形態において、ＣＡＲ細胞は、ウイルスベクターを用いた形質導入、またはＤＮＡもしくはＲＮＡを用いたトランスフェクションを含む多くの手段の１つによって、ＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成され得る。
【００６４】
本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、対象由来のｅｘ  ｖｉｖｏのγδＴ細胞であり得る。好適には、本発明における使用のためのγδＴ細胞は、癌または感染組織由来の血液単核細胞（ＢＭＣ）または生検（ｂｉｏｐｓｉｅｓ）から生成され得る。好適には、ＢＭＣは、全血、白血球アフェレーシス物質または臍帯血（ＵＣＢ）のいずれかから、当業者に知られている任意の密度遠心分離法によって得ることができる。密度遠心分離法には、フィコール勾配またはリンホプレップが含まれ得るが、これらに限定されない。さらに、細胞分離は、磁気活性化細胞選別（ｍａｇｎｅｔｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）によって実施することができる。
【００６５】
好適には、実施形態において、γδＴ細胞は、化学的に画定された培地中で、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）、または組織由来の細胞から増殖され得、当該化学的に画定された培地には、ＡＬｙｓｓ５０５、ＲＰＭＩ、ＴｅｘＭＡＣＳ、ＩＭＤＭ、ＣＴＳ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０またはＡＩＭ−Ｖ培地が含まれ得るが、これらに限定されない。細胞培養培地には、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ヒトＡＢ血清、自家血漿、ヒト血小板溶解物、またはＣＴＳ免疫血清代替品などの化学的に画定された血清代替品を追加することができる。さらに、血清／血漿／血清代替品は、０．１〜２０％（ｖ／ｖ）の量で培養液に添加される。
【００６６】
好適には、実施形態において、Ｖγ９サブタイプのγδＴ細胞は、ＩＬ−２、血清／血漿／血清代替品、およびゾレドロン酸などのアミノビスホスホネートの供給による活性化などを含む化学的に画定された培地中で、ＰＢＭＣまたはＣＢＭＣまたは組織由来の細胞から選択的に増殖され得る。複数のγδＴＣＲアイソタイプが、Ｖγ１−９およびＶδ１−８からの任意のγδＴＣＲのペアリングから使用され得る。培養条件、具体的にはＴＣＲ活性化の方法が、増殖されるアイソタイプを画定することが、当業者には理解されよう。例として、δ２Ｔ細胞はアミノビスホスホネートなどによって活性化および増殖される一方で、δ１Ｔ細胞はＭＩＣＡまたはＭＩＣＢなどのＮＫＧ２Ｄリガンド、または抗ＴＣＲ抗体を使用して優先的に増殖され得る。単離したＰＢＭＣ／ＣＢＭＣはフレッシュに単離されるか、培地中での増殖前に凍結保存され得る。
【００６７】
ビスホスホネートはピロリン酸の類似体であり、ピロリン酸骨格Ｐ−Ｏ−ＰのＯ（酸素原子）がＣ（炭素原子）で置換された化合物（Ｐ−Ｃ−Ｐ）である。ビスホスホネートは、骨粗しょう症の治療薬として一般的に使用されている。アミノビスホスホネートは、ビスホスホネートのうちＮ（窒素原子）を有する化合物を指す。例えば、本発明で使用されるアミノビスホスホネートは特に限定されない；その例には、パミドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物、アレンドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物、ならびにゾレドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物が含まれる。アミノビスホスホネートの濃度は、好ましくは、パミドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物について１〜３０μＭ、アレンドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物について１〜３０μＭ、そしてゾレドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物について０．１〜１０μＭである。本明細書では、一例として５μＭのゾレドロン酸が添加される。
【００６８】
好適には、アミノビスホスホネートを介した抗原供給は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、ホスホスチム／ブロモヒドリンピロリン酸（ＢｒＨＰＰ）、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）またはＤＭＡＰＰなどの合成抗原で置換され得る。抗原刺激はまた、放射線照射された抗原提示細胞および／または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と共培養することによってもたらされてもよい。このような成分の添加は、培養サンプル中の総細胞数の典型的には７０％〜１００％のγδＴ細胞のポジティブセレクションを可能にする培養環境をもたらす。
【００６９】
γδＴ細胞の増殖はまた、ＣＤ３、γδＴＣＲ、ＣＤ２８およびＣＤ１３７に対する１つ以上の抗体を用いて刺激することもできる。これらの抗体は、溶解性、プレート結合性、またはダイナビーズやＭＡＣＳｉｂｅａｄｓなどの適切なビーズにコンジュゲートされたものであり得る。
【００７０】
γδＴ細胞は、以前に開示された方法論のいずれかを使用して増加および増殖させ得る。任意のアイソタイプのγδＴ細胞は、少なくとも７日間、より好ましくは１４日間の時間枠で選択的に増殖させ得る。好適には、培養期間は、多数の実質的に精製されたＣＡＲ発現γδＴ細胞の集団を達成するために、約９日間以上実施され得る。γδＴ細胞は、ＴＣＲ抗原またはＭＩＣＡやＭＩＣＢなどのＮＫＧ２Ｄリガンドを使用して増殖させ得る。増殖させたγδＴ細胞を凍結保存し、培地中でのさらなる増殖のために後日蘇生させることができる。
【００７１】
好適には、サイトカインＩＬ−２も５０ＩＵ／ｍｌ〜２０００ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは４００ＩＵ／ｍＬ〜１０００ＩＵ／ｍＬで含まれ得る。好適には、培地に、５０ＩＵ／ｍｌ〜２０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−９またはＩＬ−２１などの１つ以上のサイトカインを追加することもできる。
【００７２】
組織培養フラスコ、Ｇ−ＲＥＸ、バッグ、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｐｒｏｄｉｇｙなどの自動細胞培養システムを含むがこれらに限定されない適切な培養装置中で、細胞を培養することができる。
【００７３】
本発明のＣＡＲ発現細胞は、ＮＫ細胞であり得る。好適には、本発明のＮＫ細胞は、癌または感染組織由来の血液単核細胞（ＢＭＣ）または生検（ｂｉｏｐｓｉｅｓ）から生成され得る。好適には、ＢＭＣは、全血、白血球アフェレーシス物質または臍帯血（ＵＣＢ）のいずれかから、当業者に知られている任意の密度遠心分離法によって得ることができる。密度遠心分離法には、フィコール勾配またはリンホプレップが含まれ得るが、これらに限定されない。さらに、細胞分離は、磁気活性化細胞選別（ｍａｇｎｅｔｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）によって実施することができる。
【００７４】
好適には、本発明の態様では、ＮＫ細胞の増殖のための出発材料は、ＭＡＣＳなどの当業者に知られている方法を使用して、ＣＤ３を発現する細胞が枯渇していてもよい。
【００７５】
ＮＫ細胞は、化学的に画定された培地中で、ＰＢＭＣ、ＣＢＭＣ、組織由来の細胞から、またはＣＤ３＋細胞が枯渇した材料から増殖され得、当該化学的に画定された培地には、ＡＬｙｓｓ５０５、ＲＰＭＩ、ＴｅｘＭＡＣＳ、ＩＭＤＭ、ＣＴＳ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０またはＡＩＭ−Ｖ培地が含まれるが、これらに限定されない。細胞培養培地には、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ヒトＡＢ血清、自家血漿、ヒト血小板溶解物、またはＣＴＳ免疫血清代替品などの化学的に画定された血清代替品を追加することができる。さらに、血清／血漿／血清代替品は、０．１〜２０％（ｖ／ｖ）の量で培養液に添加される。
【００７６】
ＮＫ細胞の増殖のために、サイトカインＩＬ−２も５０ＩＵ／ｍｌ〜２０００ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは４００ＩＵ／ｍＬ〜１０００ＩＵ／ｍｌで含まれ得る。好適には、培地に、５０ＩＵ／ｍｌ〜２０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−１５、ＩＬ−１８またはＩＬ−２１などの１つ以上のサイトカインを追加することもできる。
【００７７】
好適には、ＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲによって認識される組換えタンパク質、例えば、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲの場合には、組換えＣＤ１９−Ｆｃキメラまたは組換えＣＤ１９を使用して選択的に増殖させることができる。該組換えタンパク質は、プレート結合性、可溶性、またはダイナビーズやＭＡＣＳｉｂｅａｄｓなどの適切なビーズ上のものであり得る。あるいは、ＣＡＲによって認識される抗原を発現するａＡＰＣを、ＣＡＲ発現細胞の選択的増殖に使用することができる（例えば、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲの場合、ＣＤ１９を発現するように遺伝子改変されたＫ５６２細胞）。
【００７８】
本発明のＣＡＲをコードする核酸を組み込むためにγδＴ細胞またはＮＫ細胞を遺伝子改変する方法は、当業者に公知の任意の技術を含み得る。
【００７９】
好適な方法論には、ウイルス（例えば、レンチウイルス／レトロウイルス／アデノウイルス）を用いたウイルス形質導入、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、脂質ベースのトランスフェクション試薬、ナノ粒子、塩化カルシウムベースのトランスフェクション法または細菌由来のトランスポゾンによる核酸の細胞トランスフェクション、ＤＮＡトランスポゾンまたはレトロトランスポゾン、ＴＡＬＥＮＳまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーが含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
好適には、核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ、プラスミド、線形、エピソーム、ミニサークル）、ＲＮＡ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写された（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ、ＩＶＴ）ＲＮＡの形態をとり得る。ＣＡＲ配列をコードする核酸に加えて、核酸はまた、遺伝情報の宿主ゲノムへの組み込みを助けるために必要なタンパク質／酵素／配列をコードしていてもよい。
【００８１】
レンチウイルス／レトロウイルス／アデノウイルスが形質導入のために使用される場合、当業者によってこのプロセスを増強することが理解される化学試薬を含めることができる。これらの化学試薬には、例えば、臭化ヘキサジメトリン（ポリブレン）、フィブロネクチン、組換えヒトフィブロネクチン（例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ−Ｔａｋａｒａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＤＥＡＥデキストランおよびＴｒａｎｓＰｌｕｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＡＬＳＴＥＭ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ）、Ｌｅｎｔｉｂｏｏｓｔ（Ｓｉｒｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、硫酸プロタミンが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
好適には、ＣＡＲをコードする核酸の組み込みは、培養期間中の任意の時点で、γδＴまたはＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）、または組織由来の増殖γδＴもしくはＮＫ細胞に導入され得る。
【００８３】
本発明のＣＡＲ発現細胞は、以下のステップによって作製され得る：
（ｉ）対象または上記のその他の供給源からγδＴ細胞またはＮＫ細胞を含むサンプルを単離するステップ；および
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２ｃ）、およびＣＤ６４から選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸構築物でγδＴ細胞またはＮＫ細胞を形質導入するか、またはＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２ｃ）、およびＣＤ６４から選択される細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸構築物をγδＴ細胞またはＮＫ細胞にトランスフェクトするステップ。次いで、例えばＣＡＲの発現に基づいてセレクションするなどして、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を精製してもよい。
【００８４】
（ベクター）
本明細書で定義されるＣＡＲをコードする核酸構築物を含むベクターは、それがＣＡＲを発現するように、核酸配列を宿主細胞に導入するために使用され得る。
【００８５】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【００８６】
ベクターバックボーンは、細菌宿主におけるプラスミドＤＮＡの十分な増殖を可能にするために、例えば、ｐＢＲ３２２などの細菌の複製起点、および抗生物質への耐性を付与する選択可能なマーカー、例えば、限定されないが抗生物質アンピシリンへの耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含み得る。任意に、ベクターは、細菌のバックボーンを欠いたミニサークルの生成するために、ｐｈｉＣ３１などのインテグラーゼの細菌およびファージアタッチメント部位（ａｔｔＢおよびａｔｔＰ）を、Ｉ−ＳｃｅＩなどのエンドヌクレアーゼの認識部位と組み合わせて含み得る。ベクターはまた、目的の標的細胞、最も好ましくはγδＴ細胞またはＮＫ細胞での発現に適したプロモーター配列に連結されたＣＡＲ発現をコードする配列を含む。任意に、ベクターは、哺乳動物細胞におけるポジティブセレクションのための抗生物質耐性遺伝子を含み得、また発現の同定のためのレポーター遺伝子、例えば特に限定されないが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含み得る。追加のレポーターおよび／またはセレクション遺伝子の発現は、個々のプロモーター、双方向プロモーターから駆動されるか、またはＩＲＥＳもしくは自己切断Ｔ２Ａ配列の使用により達成される。
【００８７】
ベクターをγδＴ細胞またはＮＫ細胞にトランスフェクトするか、またはベクターでγδＴ細胞またはＮＫ細胞を形質導入することができる場合がある。
【００８８】
（医薬組成物）
本発明はまた、本発明のγδＴ細胞またはＮＫ細胞などの複数のＣＡＲ発現細胞を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。医薬組成物は、任意に、１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。
【００８９】
（治療方法）
本発明の細胞は、癌細胞などの標的細胞を死滅させ得る。本発明の細胞は、ウイルス感染などの感染症の治療に使用し得る。
【００９０】
本発明の細胞はまた、例えば自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片対宿主拒絶における病原性免疫応答の制御のために使用され得る。本発明の細胞は、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌などの癌性疾患の治療のために使用され得る。
【００９１】
本発明の細胞は、良好な選択的単一標的の利用可能性が制限されている固形腫瘍の治療に特に適している。
【００９２】
本発明の細胞は、以下を治療するために使用され得る：舌、口および咽頭の癌を含む口腔および咽頭の癌；食道癌、胃癌および結腸直腸癌を含む消化器系の癌；肝細胞癌および胆管癌を含む肝臓および胆道系の癌；気管支癌および喉頭癌を含む呼吸器系の癌；骨肉腫を含む骨および関節の癌；黒色腫を含む皮膚の癌；乳癌；女性の子宮癌、卵巣癌および子宮頸癌、男性の前立腺癌および精巣癌を含む生殖管の癌；腎細胞癌および尿管または膀胱の移行上皮癌を含む腎管の癌；神経膠腫、多形性神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳癌；甲状腺癌、副腎癌および複数の内分泌腫瘍症候群に関連する癌を含む内分泌系の癌；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；多発性骨髄腫および形質細胞腫;骨髄性またはリンパ性の急性白血病および慢性白血病；ならびに神経芽細胞腫を含む他のおよび特定されていない部位の癌。
【００９３】
本発明のさらなる態様によれば、治療薬と共に本発明の細胞を含む組成物が提供される。
【００９４】
好適には、治療薬は、放射性ヌクレオチド、ホウ素、ガドリニウムもしくはウラン原子、免疫調節物質、免疫複合体、サイトカイン、ホルモン、ホルモンアゴニスト、酵素、酵素阻害剤、光活性治療薬、細胞毒性薬、毒素、血管新生阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、治療用抗体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００９５】
治療薬は、細胞毒性薬を含有する免疫複合体／ＡＤＣを含み得る。好適には、細胞毒性薬は、薬剤、プロドラッグ、酵素または毒素であり得る。
【００９６】
実施形態において、対象、好ましくは哺乳動物、特にはヒトの癌を治療する方法は、治療有効量の本発明の細胞で該対象を治療するステップを備えることができる。実施形態において、細胞は、１回の投与あたり１×１０４細胞（対象の体重１ｋｇあたり）〜５×１０８細胞（対象の体重１ｋｇあたり）を超える用量で、治療上有効な細胞製剤として提供され得る。
【００９７】
実施形態において、前記方法は、治療上有効な細胞製剤を繰り返し投与するステップを備えることができる。
【００９８】
好適には、腫瘍反応は、例えば腫瘍負荷（ｔｕｍｏｕｒ  ｂｕｒｄｅｎ）、腫瘍サイズなどに関連して、またはＭＲＩスキャン、Ｘ線スキャン、ＣＴスキャン、骨画像化または生検サンプリングを使用して、腫瘍形態の変化について評価することができる。本明細書において、単離された核酸分子は、少なくとも１つの汚染核酸分子から識別および分離された核酸分子であり得、該汚染核酸分子によってそれは核酸の天然源と通常関連している。
【００９９】
実施形態において、本発明の細胞は、ウイルス感染を治療するために使用され、ここで、前記ウイルスは、ＨＩＶ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ヘルペスバリアント、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス、水痘、パピローマウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、または天然痘である。
【０１００】
実施形態において、インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡ（インフルエンザＡ型）ウイルスであリ得る。実施形態において、インフルエンザウイルスは、鳥またはブタを起源とするパンデミックインフルエンザウイルス、例えば、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９およびＨ９Ｎ２（鳥の亜型）、またはＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ３（ブタの亜型）であリ得る。
【０１０１】
実施形態において、癌または感染症を有する対象の治療のためのγδＴ細胞が提供され、ここで、前記治療はアロジェネイック（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）である。
【０１０２】
本発明の細胞を用いた治療は、標準的なアプローチでしばしば生じる腫瘍細胞のエスケープ（ｅｓｃａｐｅ）またはリリース（ｒｅｌｅａｓｅ）を防止するのに役立ち得る。
【０１０３】
本発明のさらなる態様によれば、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２ｃ）、およびＣＤ６４またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ構築物が提供される。
【０１０４】
ここで、本発明を実施例および図面によってさらに説明するが、実施例および図面は、当業者が本発明を実施するのを助けるのに役立つことを意図しており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】Ｆｃγ受容体の活性化ドメインを含むＣＡＲ構築物の提案された構造を示す図である。
【図２】Ｆｃγ受容体の活性化ドメインを含むＣＡＲを発現するγδＴ細胞の作用機序を示す図であり、Ｖγ９／Ｖδ２  ＴＣＲを発現するγδＴ細胞は、癌細胞に特異的に蓄積されたリン酸化抗原によって活性化され、抗原結合後に同時に発生するＣＡＲシグナル伝達によりＩＴＡＭのリン酸化が起こり、最終的にはＰＫＣ経路が活性化され、細胞傷害性の増加、サイトカイン産生の増加、およびＣＡＲ発現γδＴ細胞による潜在的な抗原提示の増加がもたらされる。
【図３】Ａ）γδＴ細胞を形質導入して、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ストックおよび膜貫通領域、ならびにＦｃγシグナル伝達エンドドメインからなるＣＡＲを発現させた。γδＴ細胞を増殖させ、ＣＡＲの発現をフローサイトメトリーで調べた。Ｂ）ＣＡＲで形質導入された細胞および形質導入されていない細胞をバーキットリンパ腫細胞株と１０：１の比率で共培養し、それらの細胞傷害性能力をアネキシンＶに基づくフローサイトメトリーおよびＰＩ染色で評価した。ＣＡＲで形質導入されたγδＴ細胞は、形質導入されていない（コントロール）γδＴ細胞と比較して、ほぼ２倍の細胞傷害性能力を示した。
【図４】ＣＡＲ構築物の略図である。Ａ）ＦｃεＲＩ−γエンドドメインを有するＣＤ１９を標的とするＣＡＲ構築物。Ｂ）Ｆｃγエンドドメインを有するＣＤ３３を標的とするＣＡＲ構築物。Ｃ）ＣＤ３ｚエンドドメインを有するＣＤ３３を標的とするＣＡＲ構築物。Ｄ）４１ＢＢ共刺激エンドドメインを有するＣＤ３３を標的とするＣＡＲ構築物。
【図５】図４に示すような抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ストークおよび膜貫通領域、ならびにＦｃεＲＩ−γシグナル伝達エンドドメインを含むＣＡＲを発現するように形質導入されたγδＴ細胞を示す図である。該細胞をＣＤ１９＋ラモス（Ｒａｍｏｓ）およびダウディ（Ｄａｕｄｉ）癌細胞、ＣＤ１９−Ｋ５６２癌細胞、ならびにＣＤ１９＋健康Ｂ細胞と１０：１の比率で共培養し、それらの細胞傷害性能力をアネキシンＶに基づくフローサイトメトリーおよびＰＩ染色で評価した。ＣＡＲで形質導入されたγδＴ細胞は、形質導入されていない（コントロール）γδＴ細胞と比較して、ＣＤ１９＋細胞に対して有意な追加の細胞傷害性を示したが、ＣＤ１９−Ｋ５６２細胞に対してはそれを示さなかった。
【図６】図４に示すような抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ストックおよび膜貫通領域、ならびにＦｃεＲＩ−γシグナル伝達エンドドメインからなるＣＡＲを発現するように形質導入されたγδＴ細胞を示す図である。該細胞をＣＤ１９＋ラモス（Ｒａｍｏｓ）およびダウディ（Ｄａｕｄｉ）癌細胞、ＣＤ１９−Ｋ５６２癌細胞、ならびにＣＤ１９＋健康Ｂ細胞と１：１の比率で共培養した。ＣＤ１０７ａの発現を、ＣＡＲ＋（Ａ）およびＣＡＲ−（Ｂ）γδＴ細胞における脱顆粒（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）のマーカーとしてフローサイトメトリーで測定した。ＣＤ１９＋癌細胞またはＢ細胞と共培養した場合、脱顆粒がＣＡＲ＋γδＴ細胞において有意に増加したが、ＣＤ１９−癌細胞と共培養した場合、脱顆粒はＣＡＲ＋γδＴ細胞において有意に増加しなかった。
【図７】図４に示すような抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１  Ｆｃヒンジ、ＣＤ２８膜貫通領域、およびＦｃεＲＩ−γまたはＣＤ３ｚシグナル伝達エンドドメインのいずれかからなるＣＡＲを発現するように形質導入されたγδＴ細胞を示す図である。該細胞をＣＤ３３  ＨＬ−６０癌細胞またはＣＤ３３＋健康単球（ＣＤ３３  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ）と１０：１の比率で共培養し、それらの細胞傷害性能力をアネキシンＶに基づくフローサイトメトリーおよびＰＩ染色で評価した。ＣＤ３３＋癌細胞または単球に対して、ＦｃεＲＩ−γおよびＣＤ３ｚエンドドメインを含有するＣＡＲは同等の細胞傷害性を有する。
【図８】図４に示すような抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１  Ｆｃヒンジ、ＣＤ２８膜貫通領域、およびＦｃεＲＩ−γまたは４１ＢＢシグナル伝達エンドドメインのいずれかからなるＣＡＲを発現するように形質導入されたγδＴ細胞を示す図である。次に、ＴＣＲまたは可溶性ＣＤ３３に対する抗体でコーティングされたＭＡＣＳｉＢｅａｄｓで該細胞を刺激し、ＣＡＲまたは両方の組み合わせを刺激した。脱顆粒はフローサイトメトリーによる表面ＣＤ１０７ａの検出によって測定され、ＣＡＲ＋または−（ＣＡＲ  ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｒ  ｎｅｇａｔｉｖｉｔｙ）と相関した。ＦｃεＲＩ−γエンドドメインを含有するＣＡＲのみによる刺激は脱顆粒を引き起こすが、４１ＢＢエンドドメインを含有するＣＡＲのみによる刺激は脱顆粒を引き起こさない。
【実施例】
【０１０６】
（実施例１）
＜γδＴ細胞およびＮＫ細胞のトランスフェクションを可能にするベクターの生成＞
ＧＭＣＳＦ受容体分泌シグナル、ＦＭＣ６３由来ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３２ｃ活性化ドメインをコードするＣＤ１９を標的とするＣＡＲをコードするＤＮＡは、ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２組換え部位の間のｐＤＯＮＲ２２１バックボーンで生成された。
【０１０７】
（実施例２）
＜レンチウイルスを使用したγδＴ細胞の形質導入＞
ＰＢＭＣを、白血球アフェレーシス物質から密度遠心分離（リンホプレップ）によって分離し、凍結保存した。ＰＢＭＣを蘇生させ、ゾレドロン酸（５μＭ）で刺激したＰＢＭＣをＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍＬ）および５％ヒトＡＢ血清の存在下、増殖培地中で培養した。培養（３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気）２４時間後、（図１Ｃのように）ＣＤ３２ｃの活性化ドメインを組み込んだＣＤ１９を標的とするＣＡＲを有するレンチウイルスで細胞を形質導入した。Ｇ−ＲＥＸ１００培養フラスコ中で細胞を形質導入後１０日間培養し、ＣＡＲの細胞外部分に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによってＣＡＲの発現を評価した。
【０１０８】
（実施例３）
＜レンチウイルスを使用したＮＫの形質導入＞
ＰＢＭＣを、白血球アフェレーシス物質から密度遠心分離（リンホプレップ）によって分離した。ＭＡＣＳを使用してＣＤ３＋細胞を枯渇させた。ＣＤ３枯渇ＰＢＭＣを、ＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）および５％ヒトＡＢ血清の存在下、細胞培養培地中で培養した。培養（３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気）２４時間〜７２時間後、（図１Ｃのように）ＣＤ３２ｃの活性化ドメインを組み込んだＣＤ１９を標的とするＣＡＲを有するレンチウイルスで細胞を形質導入した。Ｇ−ＲＥＸ１００培養フラスコ中で細胞を形質導入後１０日間培養し、ＣＡＲの細胞外部分に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによってＣＡＲの発現を評価した。
【０１０９】
（実施例４）
＜γδＴ細胞のトランスフェクションのためのトランスポゾンベースのシステムの使用＞
実施例１のＣＡＲ構築物をＰＢ５１ｘベクター（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にクローニングした。ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ、Ｌｏｎｚａ）またはＮｅｏｎエレクトロポレーションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）のいずれかにより、ＰＢ５１ｘベクターおよび「Ｓｕｐｅｒ」ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をＴ細胞に同時トランスフェクションした。
【０１１０】
（実施例５）
＜ＣＡＲ発現γδＴ細胞の細胞傷害性ポテンシャルの増加の実証＞
γδＴ細胞を形質導入して、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ストックおよび膜貫通領域、、ならびにＦｃγシグナル伝達エンドドメインからなるＣＡＲを発現させた。γδＴ細胞を増殖させ、ＣＡＲの発現をフローサイトメトリーで調べた。
【０１１１】
ＣＡＲで形質導入された細胞および形質導入されていない細胞をバーキットリンパ腫細胞株と１０：１の比率で共培養し、それらの細胞傷害性能力をアネキシンＶに基づくフローサイトメトリーおよびＰＩ染色で評価した。結果は図３に示され、ＣＡＲで形質導入されたγδＴ細胞は、形質導入されていない（コントロール）γδＴ細胞と比較して、ほぼ２倍の細胞傷害性能力を示すことを表わしている。
【０１１２】
さらに、図４に示すように、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ストークおよび膜貫通領域、ならびにＦｃεＲＩ−γシグナル伝達エンドドメインからなるＣＡＲを発現するように形質導入されたγδＴ細胞と、ＣＤ１９＋ラモス（Ｒａｍｏｓ）およびダウディ（Ｄａｕｄｉ）癌細胞、ＣＤ１９−Ｋ５６２癌細胞、ならびにＣＤ１９＋健康Ｂ細胞との１０：１の比率での共培養は、ＣＡＲで形質導入されたγδＴ細胞がＣＤ１９＋細胞に対して有意な追加の細胞傷害性を示すが、ＣＤ１９−Ｋ５６２細胞に対してはそれを示さないことを明らかにした。
【０１１３】
図５を考慮すると、非形質導入（コントロール）γδＴ細胞と比較して、ＣＡＲ誘導形質導入γδＴ細胞（ＣＡＲ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｇａｍｍａ  ｄｅｌｔａ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）（γδＴ細胞は、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ストークおよび膜貫通領域ならびにＦｃεＲＩ−γシグナル伝達エンドドメインからなるＣＡＲを発現するように形質導入される）は、ＣＤ１９＋細胞に対して有意な追加の細胞傷害性を示したが、ＣＤ１９−Ｋ５６２細胞に対してはそれを示さなかったことは明らかである。
【０１１４】
本発明の記載された方法およびシステムの様々な修正および変形は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、分子生物学、細胞生物学、免疫学または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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