(57)【要約】      （修正有）【課題】成長因子の治療的使用、ならびに、特に血管内膜過形成および他の症状、とりわけ高血圧症の治療および予防するための有効薬剤を輸送する装置の提供。【解決手段】血管１４の周囲にシール１５を設けるのに適合した本体１２を含む、患者の血管への治療薬送達用装置であって、使用時に該治療薬が血管の外膜表面と接触するように該治療薬が装置内に保持されているかまたは装置と連結していることを特徴とする装置。【選択図】図４
2008155036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管の周囲にシールを設けるのに適合した本体を含む、患者の血管への治療薬送達用装置であって、使用時に該治療薬が血管の外膜表面と接触するように該治療薬が装置内に保持されているかまたは装置と連結していることを特徴とする装置。
【請求項２】
本体壁と血管外膜表面との間にリザーバーを画定しており、該リザーバーが、送達されるべき薬剤を含有してなる医薬製剤によって少なくとも部分充填されている請求項１記載の装置。
【請求項３】
製剤がリザーバー中に注入可能な液体もしくはゲルの形態またはペーストの形態である請求項２記載の装置。
【請求項４】
本体部の物質がセルフシール性である請求項３記載の装置。
【請求項５】
リザーバーが液体１０mlまで、好ましくは、少なくとも２−５mlを含有することができる請求項２〜４のいずれか１項記載の装置。
【請求項６】
本体物質の厚さがその長さに沿って概略一定であり、リザーバーが、使用時に、血管に対してシールする離間部間での第１本体部の膨張により形成される請求項２〜５のいずれか１項記載の装置。
【請求項７】
本体物質の厚さが血管に対してシールする離間シーリング部よりも中間部において薄く、薄くなった厚みがリザーバーを形成する、請求項２〜５のいずれか１項記載の装置。
【請求項８】
本体の内面が、薬剤を含有してなる医薬製剤を含浸する能力を有するスポンジ状物質を含む請求項１〜７のいずれか１項記載の装置。
【請求項９】
本体の内面が薬剤を含有してなる医薬製剤を含浸している請求項１〜７のいずれか１項記載の装置。
【請求項１０】
本体の物質が生分解性である請求項１〜９のいずれ１項記載の装置。
【請求項１１】
該物質がゼラチン、アルギナートまたはコラーゲンである請求項１０記載の装置。
【請求項１２】
本体が成形または押出される請求項１〜１１のいずれか１項記載の装置。
【請求項１３】
本体が拍動性血流により生じた血管の膨張を受け入れることができる可撓性シール部を含んでなる請求項１〜１２いずれか１項記載の装置。
【請求項１４】
本体が長さ８−１５mmの細長いシール部を含んでなる請求項１〜１３のいずれか１項記載の装置。
【請求項１５】
本体が略管状である請求項１〜１４のいずれか１項記載の装置。
【請求項１６】
本体が枝分かれして略Ｙ字形または略Ｔ字形の本体を形成する２つの略管状部を有する請求項１〜１４のいずれか１項記載の装置。
【請求項１７】
本体が少なくとも使用時に枝分かれして略Ｘ字形本体を形成する３つの略管状部を有する請求項１〜１４のいずれか１項記載の装置。
【請求項１８】
１つの本体部の、その縦方向に対する横断面が略弓形であり、これにより、血管が組織中に部分包埋されている場合に第１血管の露出部分をそれで取り巻くことができ、第１本体部の縦方向に伸びている縁部が使用時に第１血管の外膜壁または隣接組織にシールされるように配置される請求項１６または１７記載の装置。
【請求項１９】
本体が血管上へのその設置を容易にするために縦スリットを有する請求項１〜１８のいずれか１項記載の装置。
【請求項２０】
本体が捩り強さを増大させるために内層または螺旋状強化剤を含む請求項１〜１９のいずれか１項記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長因子の治療的使用、ならびに、特に血管内膜過形成および他の症状、とりわけ高血圧症の治療および予防に関する。本発明は、さらに、有効薬剤を送達する（輸送する）ために用いることができる装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
内膜過形成は、血管の内皮と内弾性膜との間、特に、そこに見られる内膜層におけるか、または、動脈における、細胞の数の増加である。内膜過形成は、しばしば、血管壁における平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖が原因である。
【０００３】
内膜過形成が生じると、内膜層または血管壁の新たな肥厚、すなわち、狭窄が生じる。かくして、該血管は、閉塞する。
【０００４】
また、血管の障害が取り除かれた場合、術後に生じる内膜過形成により、再び動脈が閉塞する。これは、再狭窄として知られている。
【０００５】
動脈平滑筋細胞の増殖は、一般に、血管、例えば、動脈が手術の間に変形させられるかまたは妨害された場合に生じる。例えば、内膜過形成は、静脈を動脈に吻合するバイパス移植後および一般に外科的吻合後に新たな狭窄を生じさせることがある。狭窄を生じることがある外科的方法の２つの例は、冠状動脈バイパス移植および膝上大腿膝窩動脈バイパス移植（above-knee femoro-popliteal arterial bypass graft）である。
【０００６】
同様に、再狭窄は、例えば、バルーン式血管形成術のような血管の障害を取り除くために用いられるバルーン式血管形成術後に生じることがある。
【０００７】
内膜過形成は、狭窄または再狭窄のいずれを生じさせるにしても、種々の手術の後に重大な課題を残す。
【０００８】
アテローム硬化性心臓血管疾患は、ヨーロッパおよび北アメリカにおける主な死亡原因であり、血流を妨害するかまたは減少させる動脈内腔の閉塞、可能な遠位塞栓形成を伴う斑上に生じた血栓症、動脈瘤拡大および最終的な破裂に導く動脈壁の脆弱化の結果として生ずる非常に重大な病的状態を誘発する。部位および疾患分布により、治療にはいくつかのオプションが存在し、動脈バイパス移植が最も一般的な外科的介入である。冠状動脈疾患については、これは、現在、アメリカ合衆国では最も一般的な手術となってきており、１９９０年以来毎年２００,０００件を超える手術が行われ、英国では毎年２０,０００件を超える手術が行われている。大動脈、腎血管、腸間膜血管および末梢血管では、外科的バイパス術の負担は増加しつづけており、アメリカ合衆国およびヨーロッパでは人口１００,０００人当たり３５−７０人の手術率である。合わせると、毎年行われている外科的バイパス術の件数は、ほぼ１００万件である。
【０００９】
術後の最初の２４か月では、非常に有意な数の動脈バイパス移植が失敗に終わる（閉塞する）。推定値は、２０％〜３０％の範囲である。これは、英国で毎年行われている心臓および末梢動脈バイパス術の総数（約２５,０００−３０,０００件）に対して６,０００〜７,０００件が２年以内に失敗すると予測されることを意味している。「再」手術についての失敗率は、もっと高い。失敗の財政上の費用は、アメリカ合衆国では、冠状動脈手術後の失敗率が３３％から２５％にわずかに低下した場合でさえ健康管理予算から７億５０００万ドルまで削減できると算出された。
【００１０】
手術から５年以内の移植失敗については、３つの主な原因がある。第一には、手術の３０日以内の初期に生じることが認められており（＜５％）、技術的なエラー（例えば、粗悪な吻合技術）を示す。後の２４ヶ月後の失敗は、一般に、本来のアテローム性動脈硬化症経過が進行した結果としてである。しかしながら、それは、失敗の大多数（＜７０％）を形成する１〜２４ヶ月の間に閉塞するこれらの移植片である。これらの場合、それは、最後には完全な閉塞を生じる、動脈内腔が進行的に狭くなること、すなわち狭窄を生じるＳＭＣ内膜過形成である。典型的には、ＳＭＣ内膜過形成は、遠位の動脈吻合および該吻合に対向する自然血管壁の周囲に位置する。かくして、それは、この部位での主要な病因であるが、血管形成術後に生じるような前の内膜過形成部位での再狭窄ではない。ＳＭＣ内膜過形成は、より近位の動脈吻合で移植片自体に沿って生じることもある。
血管形成術後の再狭窄は、血管形成術後の最初の６ヶ月間に２０％〜５０％のより高い失敗率を生じることがある。狭窄および再狭窄は、共に、依然として、術後の主な課題である。
【００１１】
現在までのところ、内膜過形成を治療または予防するための多くの方法が試験されてきたが、臨床的に満足のいくようなものは全くなかった。
【００１２】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、天然タンパク質である。ヒトにおいては、１２１、１６５、１８９および２０６アミノ酸の少なくとも４つの形態が存在する。ヒトＶＥＧＦの４つの形態のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、非特許文献１に記載されている。部分的なゲノム配列も記載されている。ヒトＶＥＧＦのｃＤＮＡ配列もまた、ウシＶＥＧＦ ｃＤＮＡ配列と一緒に、非特許文献２に記載されている。
【００１３】
これらの４つの形態は、本明細書ではＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９およびＶＥＧＦ−２０６と記載される。この番号付けは、各ケースで成熟タンパク質におけるアミノ酸の数を表す。該翻訳タンパク質は、また、細胞内プロセシングの間に自然に開裂される２６アミノ酸プレ配列を含む。
【００１４】
ＶＥＧＦは、血管内皮細胞（ＥＣ）の分割を刺激し、内皮透過性を増大させ、網膜血管中で内皮「生存因子」として作用するという脈管形成における役割を果たすことが知られている。例えば、組換えタンパク質の形態またはプラスミドから発現された場合のＶＥＧＦは、虚血性の脚に動脈内注射した場合、新しい血管の発生を誘発することができる。この特性により、該ＶＥＧＦは、手術の間に内皮が傷つけられた動脈を修復する際に用いられてきた。かくして、非特許文献３では、ラット頚動脈の内皮を露出させる血管形成術の後に該頚動脈の内部にカニューレを介してＶＥＧＦを送達した；ＶＥＧＦが、内膜過形成の抑制に寄与すると思われる動脈の再内皮形成を刺激することが見出された。
【００１５】
ＶＥＧＦタンパク質および遺伝子は、特許文献１に記載されており、血管上皮の外傷、糖尿病性潰瘍および血管創傷の治療のためのそれらの使用が提案されている。ＶＥＧＦフラグメントは、特許文献２に記載されており、例えば、潰瘍の治療における、血管形成および内部血管表面の再内皮形成におけるそれらの使用が提案されている。
【００１６】
特許文献３には、動静脈バイパス移植術用非拘束性多孔性外部ステントが記載されている。このステントは、内腔の大きさならびに中膜および内膜の肥厚に対して有益な効果を及ぼす。
【００１７】
特許文献４には、２つの構成要素の間に形成されたリザーバーを含む、薬剤の血管への局所デリバリー用装置が記載されている。その使用は、移植、すなわち、血管を切り開き、次いで、血管壁に装置を固定することを必要とする。該装置は、一部多孔性である。リザーバーは、内腔血流と直接接触する。これは、感染の危険性を伴う。
【００１８】
特許文献５には、薬物の血管外膜表面へのデリバリー用装置が記載されている。それは、液体形態の薬物のデリバリー用永久壁および経皮管を提供するものである。目的は、薬物が別の部位に移されることである。
【特許文献１】ＷＯ  ９０／１３６４９
【特許文献２】ＷＯ  ９１／０２０５８
【特許文献３】英国特許出願公開第２２９８５７７号
【特許文献４】ＷＯ  ９４／２３６６８
【特許文献５】米国特許第３７９７４８５号
【非特許文献１】Houck et al., Molecular Endocrinology (1991) vol 5, No. 12, pages 1806-1814
【非特許文献２】Leung et al., Science (1989) 246:1306-1309
【非特許文献３】Asahara et al., Circulation (1995) 91:2793
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の概要）
本発明は、内膜過形成により生じる上記症状の全てを治療および／または予防することを目的とする。驚くべきことに、ＶＥＧＦの特性が同定され、これは、種々の方法で内膜過形成に対して用いられうることを示す。
【００２０】
ウサギの動脈の外周にカラー（collar）を付けた。この方法は、通常、ウサギの動脈中で、バイパス術後にヒトの動脈中で起こりうる狭窄と類似する、動脈壁の肥厚を生じさせる内膜過形成を生じる。このカラーを用い、プラスミド／リポソームベクターを用いてＶＥＧＦをコードするＤＮＡを動脈壁に送達すると、ＶＥＧＦ遺伝子は、内皮層を含む動脈壁で過剰発現した。内膜過形成は、阻害された。外膜カラーが全ての試験された遺伝子デリバリーシステムを用いる動脈遺伝子導入に適することが見出された。
【００２１】
このことは、ＶＥＧＦが、内皮が損傷を受けた場合に再内皮形成を刺激することに加えて、内皮の全体または大部分が無傷である場合に内膜過形成が生じる状況で内膜過形成抑制能を有することを示している。したがって、血管形成術後の再狭窄を抑制することにおけるだけではなく、他の外科的状況下で新しい狭窄を予防または治療することにおいても潜在的に有用である。かくして、新しい知見と、ＶＥＧＦが内皮の再成長または治癒を刺激することが見出された従前の知見との間に差異がある。新しい知見は、ＶＥＧＦの作用の異なるメカニズムにより生じると思われる。
【００２２】
さらにまた、新しい知見は、有効な薬剤が血管の外部に送達されて、内膜過形成を治療することができるということを示す。このことは、いくつかの長所を有する。詳しくは、治療薬は、内腔内デリバリーの場合と同様に血流により過形成部位から洗浄されない。デリバリーリザーバーは、血管の周囲に維持でき、血管内皮に損傷を与える（自体、内膜過形成を誘発することがある）内腔内手技を必要としない。
【００２３】
さらに詳しくは、本発明は、ＳＭＣ内膜過形成に逆らう薬剤の動脈壁外膜表面（すなわち、外中膜においてこれらの細胞に最も近い）への直接適用を可能にする。内膜過形成性病変を発生させると思われる部位は、手術時に容易に露出されるので、用いられるいずれの薬剤もこれらの部位で特異的に適用することができる。
【００２４】
ＶＥＧＦは、単にＥＣおよび単球上で発現されるだけの特異的高結合性チロシンキナーゼ受容体ｆｌｋ−１／ＫＤＲおよびｆｌｔ−１を介してその既知の効果を媒介する。理論により制限されることなく、過形成の阻害におけるＶＥＧＦの効果もまた、同一受容体を介して媒介されると思われる。したがって、本発明は、また、内膜過形成を治療または予防するための、ＶＥＧＦが結合する受容体の他のアゴニスト、または、同一作用機序を有する他の物質の使用にも及ぶ。ＶＥＧＦ受容体の特異的な位置もまた、内膜肥厚の治療について示唆されている多くの他の成長因子およびサイトカインと比較してＶＥＧＦの優れた点を与える；単球の不在下、動脈壁における高結合性ＶＥＧＦ受容体は、単にＥＣ上で発現されるだけであるので、ＶＥＧＦの該効果は、ＥＣに対して、より特異的である。
例えば、一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害物質Ｌ−ＮＡＭＥの投与は、上記カラーモデルにおける内膜過形成に対するＶＥＧＦの効果を中和するので、内皮の全体または大部分が損傷受けていない状況下におけるＶＥＧＦの内膜過形成阻害メカニズムは、少なくとも部分的には、一酸化窒素（ＮＯ）経路を介するものであることが見出された。かくして、ＶＥＧＦは、ＮＯ産生を刺激する。
【００２５】
ＶＥＧＦは、内膜過形成の阻害に寄与する他の生物学的効果を及ぼすことも可能である。詳しくは、ＶＥＧＦ過剰発現が、プロスタサイクリンの産生、細胞質ホスホリパーゼＡ２の活性化およびＥＣによるフォン・ビルブラント因子分泌を刺激することが見出された。それは、ＶＥＧＦのＮＯ産生刺激およびそのプロスタサイクリン産生刺激が連携して内膜過形成を抑制するように作用する場合である。
【００２６】
ＶＥＧＦがＮＯおよびプロスタサイクリン産生を刺激するように作用するという知見は、さらに、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦを結合する受容体のアゴニストが他のＮＯ関連および／またはプロスタサイクリン関連症状の治療に有用であることを示唆する。詳しくは、Forte et al., Lancet (1997) 349:837-42には、高血圧症に罹患している個体ではＮＯレベルが低いことが示されている。したがって、ＶＥＧＦは、種々の形態の高血圧症の治療または予防に有用である。同様に、ＶＥＧＦは、アテローム性動脈硬化症の治療に有用である。
【００２７】
本発明の態様によると、ＶＥＧＦについて見出された所定の特徴のいずれかを有する薬剤が内膜過形成、例えば、狭窄の治療薬または予防薬の製造のために用いられる。該薬剤は、移植の形態で提供される。さらに詳しくは、該薬剤は、ＮＯまたはプロスタサイクリンの産生を刺激する；それは、ＶＥＧＦが結合する受容体のアゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ自体もしくはそのフラグメント、またはかかるアゴニストをコードする核酸である。
【００２８】
本発明の別の態様によると、患者における治療薬の血管へのデリバリー用装置は、血管の周囲でシールを与えるのに適合させた本体を含んでおり、該薬剤が使用時に血管外膜表面と接触するようになるように該薬剤が装置内に保持されているかまたは装置に装着されている。かかる装置は、生分解性であり得、永久的な経皮デリバリーチューブを必要としない。
【００２９】
（発明の説明）
上記で示唆し、実施例に示すとおり、一酸化窒素シンターゼおよびそれをコードする核酸を含む種々の薬剤は、本発明における使用に適している。該薬剤は、本明細書では、しばしば、ＶＥＧＦタンパク質または核酸と記載され、これらの言及およびＶＥＧＦ自体に対する言及が例として挙げられる。上記ＶＥＧＦのいずれの形態も本発明の目的のために用いられる。
【００３０】
本明細書では、これらのＶＥＧＦタンパク質配列に対する言及は、プレ配列を含む配列およびプレ配列を欠いている配列の両方に適用される。ＶＥＧＦタンパク質は、プレ配列を有していてもいなくても本発明の実施に適している。同様に、ＶＥＧＦ核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）配列に対する言及は、プレ配列をコードする配列およびプレ配列をコードしない配列の両方に適用される。
【００３１】
Houck et al.（上掲）には、１４１位（成熟タンパク質に相当する、Houck et al.の表示法では１１５位）でアミノ酸アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）を含むＶＥＧＦ−１６５の配列が記載されている。Houck et al.には、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１８９およびＶＥＧＦ−２０６においてこのアミノ酸はリジン（ＫまたはＬｙｓ）と記載されており、Houck et al.に引用された（ＶＥＧＦ−２０６の)ｃＤＮＡ配列は、これを支持している。したがって、本発明では、１４１位のアミノ酸は、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）であってもリジン（ＬｙｓまたはＫ）であってもよい。各アミノ酸は、本発明の核酸配列において適当なトリプレットコドンによりコードされている（ＤＮＡに関しては、これらのコドンは、リジンについてはＡＡＡであってもＡＡＧであってもよく、アスパラギンについてはＡＡＴであってもＡＡＣであってもよい）。これは、とりわけ、ＶＥＧＦ−１６５に適用される。
【００３２】
４つの形態は、同一遺伝子によりコードされるが、ＲＮＡレベルでの選択的スプライシングにより生じる。かくして、ヒトＶＥＧＦの全長形態および３つの公知のトランケート形態がある。ＶＥＧＦ−１２１およびＶＥＧＦ−１６５は、可溶性であり、分泌形態である。同様に、２６アミノ酸プレ配列は、疎水性であり、該タンパク質の溶解性を低下させると思われる。かくして、プレ配列を有していないＶＥＧＦの形態は、より高い溶解性を有すると思われるので好ましい。ＶＥＧＦの全ての形態が本発明の実施に適しているが、分泌形態が好ましい。本発明の実施に適するＶＥＧＦタンパク質は、他の種に源を発していてもよいが、ヒトＶＥＧＦが好ましい。例えば、マウス、ウサギおよびウシＶＥＧＦは、クローン化されており、それらの配列は、入手可能である。
【００３３】
参考のために、ＶＥＧＦ−１２１、１６５、１８９および２０６は、当該技術分野では、ＶＥＧＦ−１２０、１６４、１８８および２０５とも称される。
【００３４】
ＶＥＧＦタンパク質および核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、本発明の実施に適する薬剤である。
【００３５】
ＶＥＧＦタンパク質を用いる場合、配列番号２（ＶＥＧＦ−１２１）、４（ＶＥＧＦ−１６５）、６（ＶＥＧＦ−１８９）または８（ＶＥＧＦ−２０６）のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦタンパク質が好ましい。ＶＥＧＦの分泌形態が好ましく、従って、ＶＥＧＦ−１２１およびＶＥＧＦ−１６５がとりわけ好ましい。
【００３６】
本発明の実施において、例えば配列番号１、３、５または７の配列を有する、ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９またはＶＥＧＦ−２０６をコードするＶＥＧＦ ＤＮＡを用いるのが好ましい。ヒトＶＥＧＦの分泌形態をコードするＤＮＡ配列が好ましい。かくして、配列番号１および３のＤＮＡ配列がとりわけ好ましい。
【００３７】
しかしながら、本発明の実施に適するＶＥＧＦ ＤＮＡおよびタンパク質は、これらの特異的配列に限定されない。むしろ、本発明は、他の密接に関係するＤＮＡおよびタンパク質配列の使用を提供するものでもある。
【００３８】
本発明のＤＮＡ配列は、多くの点で配列番号１、３、５または７のものと関係していてもよい。例えば、本発明の実施に適するＤＮＡ配列は、同タンパク質、すなわち配列番号２、４、６または８のタンパク質をコードする縮重配列であってもよい。
【００３９】
別法としては、本発明のＤＮＡ配列は、配列番号１、３、５または７のものと実質的に相同であり、アミノ酸配列において配列番号２、４、６または８のものとは異なるタンパク質をコードするが、ＶＥＧＦ活性を有するタンパク質をコードする。典型的には、本発明で用いるためのＤＮＡ配列は、配列番号１、３、５または７の配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％の配列ホモロジーを有する。
【００４０】
同様に、本発明で用いるためのＶＥＧＦ ＤＮＡ配列は、ＶＥＧＦ活性を保有するＶＥＧＦのフラグメントをコードしていてもよい。このフラグメントは、少なくとも１５アミノ酸長、例えば、４０までまたはそれ以上のアミノ酸である。適当なフラグメントの例は、２０アミノ酸長であり、例えば、配列番号６として示される活性ＶＥＧＦタンパク質の配列１−２０、１１−３０、２１−４０、３１−５０、４１−６０、５１−７０、６１−８０、７１−９０、８１−１００、９１−１１０、１０１−１２０、１１１−１３０、１２１−１４０、１３１−１５０、１４１−１６０、１５１−１７０、１６１−１８０、１７１−１９０、１８１−２００、１９１−２１０および１９６−２１５である。
【００４１】
本発明で用いるためのＤＮＡ配列は、例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、または、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ間のハイブリッドであるか、または、それらは、合成または半合成であってもよい。それらは、いずれの種に源を発してもよいが、ヒトＶＥＧＦをコードするＤＮＡが好ましい。それらは、一本鎖または二本鎖であってもよい。配列番号２、４、６および８のタンパク質をコードするゲノムＤＮＡは、とりわけ好ましい。
【００４２】
本発明で用いるためのＤＮＡ配列は、１以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により、配列番号１、３、５または７に示される配列とは異なってもよい。ただし、それらは、ＶＥＧＦ活性を有するタンパク質をコードする。同様に、それらは、配列番号１、３、５または７に関してトランケートされるか、または、１以上のヌクレオチドにより伸長されていてもよい。ただし、それらは、ＶＥＧＦ活性を有するタンパク質をコードする。
【００４３】
ＲＮＡ配列もまた、本発明の実施に適している。詳しくは、本発明は、配列番号１、３、５または７のものに対応するＲＮＡ配列の使用を提供するものである；これらは、好ましいＲＮＡ配列である。本発明は、また、ＤＮＡ配列について上記したいずれかの点でこれらの配列と関係があるＲＮＡ配列の使用を提供するものである。本発明のＲＮＡ配列は、一本鎖または二本鎖であってもよい。本発明のＲＮＡは、いずれの起源のものであってもよい。例えば、それらは、いずれの種に源を発してもよいが、ヒトＶＥＧＦ、とりわけ、配列番号２、４、６または８に示される配列を有するヒトＶＥＧＦをコードするＲＮＡが好ましい。半合成ＲＮＡと同様に、合成ＤＮＡもまた用いられる。さらにまた、ＤＮＡ転写形態細菌プラスミドは、イン・ビボまたはイン・ビトロで用いられる。
【００４４】
本発明の実施に適するＲＮＡ配列において、Ｔ残基をＵにより置換することは、当業者により明白であろう。
【００４５】
本発明で用いるためのＶＥＧＦタンパク質は、上記定義の本発明のＤＮＡまたはＲＮＡ配列によりコードされる。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号２、４、６および８のタンパク質であるが、本発明は、また、配列番号２、４、６または８のものとは異なるがＶＥＧＦ活性を有する非常に密接に関係する配列を有する他のタンパク質の使用を提供するものでもある。
【００４６】
本発明によると、内膜過形成の治療または予防に関する限りにおいては、ＶＥＧＦ活性は、血管、とりわけ、動脈における内膜過形成を完全にまたは部分的に阻害または予防する能力である。上記の配列において天然ＶＥＧＦとわずかに異なるタンパク質は、この特性を保持しているが、必ずしもＶＥＧＦと同程度ではない。同様に、かかるタンパク質は、天然ＶＥＧＦよりも強いＶＥＧＦ活性を示すことができる。これは、ＶＥＧＦのアゴニスト、例えば、ペプチド、ペプトイドまたは他の小さい分子に適用される。
【００４７】
本発明がＶＥＧＦの他の特性に関する限りにおいては、ＶＥＧＦ活性は、ＶＥＧＦ以外の分子のこれらの特性を再現する能力である。例えば、本発明がＮＯ産生を刺激するためのＮＯ関連症状に対するＶＥＧＦの活性に関する限りにおいては、ＶＥＧＦ活性は、ＮＯ産生を刺激する能力を含む。本発明がプロスタサイクリン関連症状に対するＶＥＧＦの活性に関する限りにおいては、ＶＥＧＦ活性は、プロスタサイクリン産生を刺激する能力を含む。本発明の実施に適するＶＥＧＦタンパク質はまた、典型的には、インビトロおよび／またはインビボで動脈ＥＣの増殖を促進する能力、または、ＶＥＧＦが結合する受容体に結合して、まるでＶＥＧＦのようにそれらを活性化する能力など、当該技術分野ですでに知られているＶＥＧＦの生物学的特性の１つ以上を示す。
【００４８】
本発明の実施に適するＶＥＧＦタンパク質は、実質的には、配列番号２、４、６または８のＶＥＧＦと相同であり、典型的には、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％相同である。
【００４９】
本発明の実施に適するＶＥＧＦタンパク質は、１以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換により配列番号２、４、６または８に示される配列とは異なっていてもよい。ただし、それらは、ＶＥＧＦ活性を有する。同様に、それらは、配列番号２、４、６または８に関して１以上のアミノ酸によりトランケートされるか、または、１以上のアミノ酸により配列番号２、４、６または８に関して伸長されていてもよい。ただし、それらは、ＶＥＧＦ活性を有する。置換に関しては、保存的置換が好ましい。典型的には、保存的置換は、例えば、電荷および／または大きさおよび／または極性および／または疎水性に関して、置換アミノ酸が天然ＶＥＧＦ中に存在するものと類似の性質を有するものである置換である。同様に、保存的置換は、典型的には、該タンパク質のＶＥＧＦ活性に対してほとんど影響を及ぼさない。
【００５０】
配列において天然ＶＥＧＦと異なる本発明で用いるためのＶＥＧＦタンパク質は、活性において天然ＶＥＧＦと異なるように工学処理され得る。例えば、それらは、より強いＶＥＧＦ活性を有するように処理され得る。かかる操作は、典型的には、当該技術分野で知られている組換え技術を用いて核酸レベルで行われる。
【００５１】
上記ＶＥＧＦタンパク質を用いることに対する別法としては、ＶＥＧＦアゴニストを用いることが可能である。これは、本明細書に記載した全ての医薬用途に、特にアテローム性動脈硬化症の治療に適用される。
【００５２】
一般に、ＶＥＧＦアゴニストは、ＶＥＧＦが結合する受容体に結合する分子であり、実質的には、本明細書に記載のＶＥＧＦ活性を生じさせるという同一の効果を及ぼす。詳しくは、アゴニストは、ｆｌｋ−１／ＫＤＲまたはｆｌｔ−１受容体に結合する。かくして、本発明のアゴニストは、ＶＥＧＦのアゴニストおよびＶＥＧＦを結合する受容体のアゴニストと称される。
【００５３】
ＶＥＧＦアゴニストは、いずれかの化学構造を有する。例えば、ＶＥＧＦアゴニストは、例えば、１０まで、２０まで、５０まで、または、１００までのアミノ酸からなるペプチドまたはポリペプチドである。アゴニストは、同様に、修飾ペプチドまたはペプトイドであってもよい。グリコシル化、硫酸化、ＣＯＯＨ−アミド化およびアセチル化、例えば、Ｎ−末端アセチル化を含む適当な修飾がなされてもよい。さらに、または、別法としては、修飾アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸が存在してもよい。
【００５４】
いくつかの好ましいアゴニストは、ＶＥＧＦ活性を有する、所望により上記のとおり修飾されていてもよい、ＶＥＧＦのフラグメントである。ＶＥＧＦのとりわけ好ましいアゴニストフラグメントは、配列番号４のアミノ酸１〜２０（Ｍ...Ｈ）からなる；このペプチドは、Ahmed et al., Lab. Invest. (1997) 76:779により、ヒトトロホブラスト細胞におけるＦｌｔ−１受容体のアゴニストであると報告されている。
【００５５】
別の関連するアゴニストはまた、ＶＥＧＦのＮ末端領域から誘導されてもよい。例えば、配列番号４に関しては、ＶＥＧＦのペプチドアゴニストは、ＶＥＧＦのＮ末端（アミノ酸番号１）を含んでおり、２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０または５０〜１００の範囲のアミノ酸までのＶＥＧＦのアミノ酸配列を有する。同様に、好ましいアゴニストは、ＶＥＧＦのＮ末端領域から誘導され得るが、Ｎ末端のトランケートバージョンを含む。例えば、配列番号４におけるアミノ酸番号１で始まる代わりに、それらは、配列番号４のアミノ酸番号２、３、４、５、６、７、８、９または１０で始まっていてよく、２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０または５０〜１００の範囲のアミノ酸までのＶＥＧＦのアミノ酸配列を有する。
【００５６】
本発明のペプチドアゴニストはまた、ＶＥＧＦ配列の他の部分からも誘導され得る。例えば、さらなる好ましいペプチドアゴニストは、配列番号６のＶＥＧＦ−１８９配列のアミノ酸１４５〜１６９（Ｒ...Ｐ）からなるペプチドである。
【００５７】
別の関連するアゴニストもまた、ＶＥＧＦのこの領域から誘導されてもよい。例えば、配列番号６に関しては、ＶＥＧＦのペプチドアゴニストは、１３５〜１５５の範囲のアミノ酸から１６０〜１８０の範囲のアミノ酸までのＶＥＧＦのアミノ酸配列を有する。例えば、この領域から誘導されるペプチドアゴニストは、１３５〜１４０、１４０〜１４５または１４５〜１５０の範囲のアミノ酸から１６０〜１６５、１６５〜１７０または１７０〜１７５の範囲のアミノ酸までのＶＥＧＦの配列を有してもよい。
【００５８】
上記定義のＶＥＧＦのペプチドフラグメントは、好ましくは、１０〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜４０または４０〜５０アミノ酸の全長を有する。
【００５９】
他の好ましいアゴニストは、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質のフラグメントである。ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質は、ＶＥＧＦのアゴニスト作用によく似ており、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ受容体を介して作用する内皮細胞における脈管形成を刺激することができる；Albini et al., Oncogene (1996) 12:289-297およびNature Medicine (1996) 2(12):1321-1375を参照。かくして、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質のアミノ酸４６−６０のようなＨＩＶ−１ Ｔａｔ配列から誘導されるペプチドは、内皮細胞の増殖および移動を刺激することが示された；Albini et al., Oncogene (1996) 12:289-297を参照。ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質のアミノ酸４１〜６５からなるペプチドは、本発明の別の好ましいペプチドアゴニストである。
【００６０】
本発明のアゴニストはまた、それらのアゴニスト特性が保持される限りは、ＶＥＧＦタンパク質について上記したいずれかの点で天然ＶＥＧＦのものとは異なるアミノ酸配列を有していてもよい。
【００６１】
本発明のアゴニストがペプチドである場合、それらは、本発明に従って治療を達成するために、それらをコードする核酸配列からイン・ビボで得ることができる。かくして、アゴニストコード化核酸は、本明細書に記載するとおり、遺伝子治療により送達され得る。
【００６２】
別法としては、非ペプチドＶＥＧＦアゴニストを用いることができる。例えば、受容体と相互作用するＶＥＧＦの部分の形状とよく似ている小さい分子を用いてもよい。
【００６３】
本発明の実施において、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦをコードする核酸またはＶＥＧＦアゴニストまたはＶＥＧＦアゴニストをコードする核酸は、適当な形態で、血管、好ましくは動脈に送達され得る。核酸は、ベクターと結合していない「裸の」形態で、または、遺伝子治療ベクターにより、送達され得る。適当な遺伝子治療ベクターによりそれらを送達することが好ましい。特に、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを用いてもよい。
【００６４】
適当なウイルスベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、偽型レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびバキュロウイルスが挙げられる。適当な非ウイルスベクターとしては、オリゴヌクレオチド、プラスミド、リポソーム、陽イオンリポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、リポソーム−タンパク質複合体、イムノリポソーム、リポソーム−タンパク質−ポリリジン誘導体、水−油型エマルジョン、ポリエチレンイミンおよびデンドリマー（dendrimer）が挙げられる。好ましいベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来レトロウイルス、偽型水疱性口内炎ウイルスタンパク質−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）含有レトロウイルス、アデノウイルス、プラスミドおよびプラスミド／リポソーム複合体が挙げられる。
【００６５】
適当な場合、２つ以上の型のベクターを一緒に用いることができる。例えば、プラスミドベクターをリポソームと共に用いてもよい。適当なリポソームとしては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、３β−[Ｎ−(Ｎ',Ｎ'−ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、または、正に荷電した脂質（Ｎ−[１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ））を含むものが挙げられる。
【００６６】
本発明のウイルスベクターは、好ましくは、無能力にされており、例えば、複製不全である。すなわち、それらは、それらの複製に必要な１つ以上の機能的遺伝子を欠いており、イン・ビボでそれらの非制御増殖を予防し、ウイルス感染の望ましくない副作用を回避する。好ましくは、ウイルスコートまたはキャプシドにＶＥＧＦ核酸を取込んでいるウイルスゲノムをパッケージするために必要な最小ゲノム要素を除いて、ウイルスゲノムの全てを除去する。例えば、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）およびパッケージングシグナル以外の全てのウイルスゲノムを欠失させるのが望ましい。アデノウイルスの場合、欠失は、典型的には、Ｅ１領域で行われ、所望により、Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４領域のうちの１つ以上で行われてもよい。
【００６７】
本発明のウイルスは、いずれか適当な技術により無能力にされてよい。例えば、ゲノム欠失は、複製のために必要とされる遺伝子の完全な除去または一部のみの除去を含む。完全な除去が好ましい。一般に、好ましい欠失は、ウイルス遺伝子の初期転写のために必要とされる遺伝子のものである。
【００６８】
複製応答能を有する自己制御性または自滅性ウイルスベクターを使用してもよい。
【００６９】
一般に、本発明に用いるためのＶＥＧＦ核酸は、好ましくは上記定義のベクターにより、それらが動脈に送達された後にイン・ビボでのそれらの発現を確実にする発現構築物内に含まれる。かかる構築物は、典型的には、ＶＥＧＦ核酸の発現を指向する能力を有するプロモーター（および、所望により、該プロモーターの調節因子）、翻訳開始コドンおよび該プロモーターに操作可能に連結されたＶＥＧＦ核酸を含む。好ましくは、これらの成分は、５'−３'方向に並べられる。
【００７０】
該構築物は、また、他の適当な成分を含有してもよい。例えば、該構築物は、シグナル配列をコードする核酸を含有していてもよく、従って、翻訳される場合に発現ＶＥＧＦタンパク質を所定の細胞タイプまたは細胞コンパートメントに指向させる能力を有するようなＶＥＧＦ核酸に対する位置にある。いずれのかかるシグナル配列も、典型的には、ＶＥＧＦ核酸に対して３'側または５'側に隣接した位置にあり、従って、シグナル配列およびＶＥＧＦタンパク質は、Ｃ−末端またはＮ−末端にシグナル配列をもつ単一融合タンパク質として翻訳される。
【００７１】
該構築物は、プロモーターによりもたらされる発現の程度を増強するエンハンサーを含有していてもよい。選択されたプロモーターによりもたらされる発現を増強するエンハンサーを用いてもよい。例えば、ＣＭＶ初期遺伝子プロモーターの場合、ＣＭＶ初期遺伝子エンハンサーを用いてもよい。
【００７２】
所望により、該構築物は、ＶＥＧＦ核酸に対して３'側に転写終結因子を含有していてもよい。いずれの適当な終結因子を用いてもよい。
【００７３】
所望により、該構築物は、ＶＥＧＦ核酸に対して３'側に操作可能に連結されたポリアデニル化シグナルを含有していてもよい。
【００７４】
所望により、該構築物は、培養物における形質転換細胞の選択を可能にするために、例えば抗生物質耐性を有する、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有していてもよい。例えば、細胞は、適切に、抗生物質耐性について選択されてもよい。
【００７５】
所望により、該構築物は、例えば、ＶＥＧＦ核酸に対して３'側または５'側に、１つ以上のイントロン、または、他の非コード化配列を含有していてもよい。
【００７６】
適当なプロモーターを用いて、本発明の核酸の発現を制御してもよい。一般に、ウイルスプロモーターまたは治療される対象体の種において機能するのに適合したプロモーターを用いるのが好ましい。かくして、ヒト対象体の場合、ウイルスプロモーター、とりわけ、ヒトに感染するウイルスから誘導されたプロモーター、または、ヒト遺伝子から誘導されたプロモーターを用いるのが好ましい。所望により、プロモーターは、いずれか適当なエンハンサーと組み合わせて用いられてもよい。
【００７７】
望ましくは、「強い」プロモーター、すなわち、本発明のＶＥＧＦタンパク質を高レベルで発現させるものが用いられる。ＶＥＧＦタンパク質の過剰発現を達成するプロモーターが望ましい。好ましいプロモーターとしては、所望によりサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーと組み合わせられていてもよいＣＭＶプロモーター；ヒトβアクチンプロモーター；サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期遺伝子プロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；およびレトロウイルスロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターが挙げられる。
【００７８】
プロモーターおよび他の構築成分は、ＶＥＧＦ核酸に操作可能に連結される。かくして、それらは、それらがＶＥＧＦ核酸の発現に対するそれらの効果を発揮できるように配置される。例えば、プロモーターの場合、プロモーターは、ＶＥＧＦ核酸の発現を指向しうるようにＶＥＧＦ核酸に対して配置される。望ましくは、構築成分は、発現に対するそれらの最大効果をそれらに発揮させるように配置される。
【００７９】
本発明において用いるための核酸または構築物は、当該技術分野で知られている適当な手段によりウイルスゲノムに取り込まれ得る。次いで、ウイルスゲノムは、適当な方法によりウイルスコートまたはキャプシドにパッケージされ得る。特に、適当なパッケージングセルラインを用いて本発明のウイルスベクターを得てもよい。典型的には本発明の複製不全ウイルスゲノムに取り込まれるこれらのパッケージングラインは、該複製不全ゲノムから欠失された遺伝子を含むので、これらのパッケージングラインは、本発明の複製不全ウイルスゲノムを補足する。かくして、パッケージングラインの使用により、培養物中で本発明のウイルスベクターが生じる。適当なパッケージングラインとしては、ＰＡ３１７細胞、Ψ−２細胞、ＣＲＥ細胞、ＣＲＩＰ細胞、Ｅ−８６−ＧＰ細胞、Ｆｌｙ細胞、ライン２９３細胞および２９３ＧＰ細胞の誘導体が挙げられる。
【００８０】
非ウイルスベクターの場合、核酸は、当該技術分野で公知の適当な手段によって非ウイルスベクターに取り込まれ得る。
【００８１】
所望により、ベクター、とりわけウイルスベクターは、核酸または構築物を治療されるべき対象体の細胞のゲノムへ組込むように、または、細胞質中で核酸または構築物を遊離状態にするように選択される。組込みベクターが好ましい。
【００８２】
上記の、好ましくはウイルスまたは非ウイルスベクターと結合した、本発明で用いるためのＶＥＧＦタンパク質またはＶＥＧＦ核酸は、過形成を治療するために、適当な方法で動脈に投与され得る。例えば、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦをコードする核酸は、血管の外壁、例えば、動脈の外壁に、または、例えば内腔を介して、血管内皮、例えば、動脈内皮に投与され得る。注入された化合物は血流により迅速に押し流されて血中半減期が短いので、局所遺伝子導入は、組換えＶＥＧＦタンパク質の投与よりも優れていると思われる。
【００８３】
いったん送達されると、本発明のＶＥＧＦ核酸は、発現してＶＥＧＦタンパク質を産生し、次いで、内膜過形成が治療または予防される。発現は、血管壁、例えば、動脈壁においていずれの細胞型でも生じ得る。
【００８４】
好ましくは、発現は、発現ＶＥＧＦが血管、例えば、動脈の内皮に到達できるような位置で生じる。例えば、発現は、平滑筋細胞中および／または内皮中で生じ得る。最も好ましくは、発現は、少なくとも、血管、例えば、動脈の内皮中で生じる。
【００８５】
例えば、ＶＥＧＦタンパク質または核酸は、治療または予防されるべき過形成部位の周囲への直接注入によるか、または、血管、例えば、動脈の内腔中への注入により、血管、例えば、動脈の外側に送達され得る。
【００８６】
さらに好ましくは、ＶＥＧＦタンパク質または核酸は、治療されるべき過形成部位に接近して、血管、例えば、動脈に外部から設置された移植片により送達される。かかる移植片は、ＶＥＧＦタンパク質もしくは核酸またはベクターを含有しており、薬剤のリザーバーを設けている。ＶＥＧＦタンパク質または核酸（好ましくは、ベクターと結合している）は、移植片が治療されるべき対象体に導入される前または後に該移植片に導入され得る。例えば、該移植片は、血管付近に設置され、次いで、ＶＥＧＦタンパク質または核酸が、例えば、注射により、移植片に導入され得る。
【００８７】
好ましくは、該移植片は、血管、例えば、動脈と直接接触して設置される。これは、血管の物理的歪みが平滑筋細胞増殖を誘発し得、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入の効率を増大させるので、レトロウイルスベクターを用いてＶＥＧＦ核酸を送達する場合にとりわけ好ましい。過形成自体により誘発される増殖のようなこの増殖は、ＶＥＧＦタンパク質または核酸の送達により解消されるか、または、少なくとも改善される。同様に、標的細胞が分割している場合に遺伝子導入の効率の増大を示す他のベクターを用いる場合には、移植片が動脈と接触しているのが好ましい。例えば、細胞増殖は、また、プラスミド／リポソーム複合体を用いて遺伝子導入効率を増強し得る。
【００８８】
かかる移植片は、適当な形態であってよい。好ましくは、該移植片は、治療または予防されるべき過形成部位またはその近くで、動脈を、部分的または完全に、好ましくは完全に取り巻くカラーの形態である。
【００８９】
血管外遺伝子送達は、内皮を損傷または露出させる可能性のあるバルーンカテーテル法または高圧液体法などの方法を回避する。トランスフェクトされた遺伝子は、好ましくは、シラスティックまたは生分解性移植片、好ましくは、血管の外側に隣接して、好ましくは血管の外周に設置されたカラーを介して適用される。内皮は、ほとんど損傷を受けない。これは、この形態の送達の主な利点である。
【００９０】
本発明によると、ベクターがカラーの内側の血管外膜表面上に直接適用される場合、外膜との密接な接触が維持される。ウサギ動脈において、カラー単独は、典型的には、術後７−１４日以内に新内膜の形成をもたらす。該カラーは、また、外膜表面でベクターを高濃度に維持する。
【００９１】
移植片、好ましくは、カラーは、いずれか適当な物質から作製される。シラスティック移植片、すなわち、シリコーンゴムを含む移植片は、一つの好ましい代替物である。最も好ましくは、生分解性移植片である。適当な生分解性物質を用いることができる。
【００９２】
移植片、例えば、カラー内では、ＶＥＧＦタンパク質または核酸は、いずれの方法でも含有され得る。好ましくは、移植片、例えばカラーの構造は、ＶＥＧＦタンパク質または核酸が血管壁と直接接触して保持されるようなものである。かくして、１つの実施態様では、移植片の構造は、血管壁と移植片の壁との間にスペースを残しておく。カラーの場合、該移植片は血管の周囲に中空容器を形成する。このスペース中にＶＥＧＦ核酸またはタンパク質を導入することができ、その結果、それらは、血管壁と接触することによる。好ましくは、移植片の末端は、血管壁と接触しており、かくして、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質の漏出を防止する。好ましくは、カラーの外壁は、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質に対して不透過性、または、実質的に不透過性であり、かくして、周辺組織中へのその漏出を防止するか、または、少なくとも制限し、血管へのその送達を確実にする。
【００９３】
所望により、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質を含有するスペースは、一層以上の、ＶＥＧＦまたは核酸に対して透過性または半透過性の物質により血管壁から隔てられていてもよい。これは、緩やかな送達が意図され、ＶＥＧＦタンパク質または核酸が血管壁に送達される速度の制限が望まれる場合に望ましい。
【００９４】
所望により、移植片、例えば、カラーは、浸透圧ポンプとして作用するように設計されてもよい。
【００９５】
所望により、ＶＥＧＦは、カラー内の媒体、例えば、固体またはゲル媒体内に含有されていてもよい。これは、ＶＥＧＦタンパク質または核酸が組織へ漏出することを防止するのに役立ち得る。この場合、カラーの外壁は、該移植片の末端の血管と接触している必要はない。
【００９６】
別法としては、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質は、使用時に血管と接触している移植片の表面に塗布されてもよい。別法としては、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質は、移植片の構造全体に分散させられていてもよい。
【００９７】
このような移植片、とりわけ、カラーの使用のいくつかの利点は、（ｉ）それらが、持続性送達を可能にする送達リザーバーを与えること；（ii）内腔内操作が必要ではなく、動脈内皮が無傷のままであること；および（iii）上記で説明したとおり、移植片により生じる歪み（例えば、カラーの場合には収縮）が遺伝子送達の効率を増強することである。
【００９８】
本発明の装置は、概して、少なくとも、使用時に第１血液運搬管（blood-carrying vessel）の縦方向に沿って伸長し、該管を少なくとも部分的に取り巻くように形成された実質的に不透過性の第１本体部を含む本体（ここで、第１本体部は、使用時に第１血液運搬管の外膜表面に対してシールするのに適した縦方向に空間を設けたシール部を含む）、および、使用時に少なくとも１つの薬剤を収容して該薬剤を第１血液運搬管の外膜表面へ送達するのに適したシール部間の中間部を含む。
【００９９】
本発明の装置の好ましい具体例を、添付図面を引用して、単に例示する：
図１は、血管の周囲の所定個所にある本発明の装置の略縦断面図であり；
図２は、図１に示されるＡ−Ａ線に沿った、同具体例の略冠状断面図であり；
図３は、端−端吻合の周囲にある装置の第２の具体例の略斜視図を示し；
図４は、図３の具体例の鉛直面での縦断面図であり；
図５は、シール部について別の構造を有する具体例の変形例を示す以外は、図４のものと同様の図であり；
図６は、端−側吻合の周囲にある装置の第３の具体例の略斜視図を示し；
図７は、図６の具体例の鉛直面での縦断面図であり；
図８は、側−側吻合の周囲にある装置の第４の具体例の略斜視図を示し；
図９は、図８の具体例の鉛直面での縦断面図であり；
図１０は、一部包埋血管を示す側−側吻合の周囲にある装置の第５の具体例の略斜視図を示し；
図１１は、図１０の具体例の鉛直面での縦断面図である。
【０１００】
バックグランドによると、一般に、動脈バイパス移植片は、天然血管が、通常、アテロームにより、閉塞されるか、または、有意に狭窄された場合に組織への血流を修復または改良するために用いられる。自家静脈もしくは動脈、または、ダクロン（Ｄacron）もしくはＰＴＦＥなどの合成物質のいずれを用いる場合でも、移植片は、一般に、３つの方法（「端−端」（図４）；「端−側」（図７）；または「側−側」（図９））のうちの１つの方法で天然血管に吻合される。これらの技術のうち、端−側および側−側が端−端よりも非常に一般的である。血流の方向は、矢印で示される。
【０１０１】
図１および２は、血管壁２内の血液１、および、例えば生分解性物質の、壁４により定義された空間３を含む外膜カラーを示す。カラー５は、カラーの両端で血管壁に接している。この具体例は、他の具体例について以下に記載すると同様の方法で用いることができる。
【０１０２】
図３および４に示される具体例は、端−端吻合への適用を示す。該装置は、移植片１３の天然血管１４への端−端吻合により作製される血液運搬管の縦方向に沿って伸長し、該管を取り巻く略管状本体１２を含む。
【０１０３】
図４から最も明らかであるように、装置の本体１２は、その両端に設けられた、縦方向に空間を設けるシール部１５を有する。使用時に装置を端−端吻合部位１６上に位置させる場合、これらのシール部１５は、移植片１３および天然血管１４の外膜表面に対してシールする。本体１２の物質の半径厚さは、中間部１７におけるよりもシール部１５での方が厚い。その結果、シール部１５が移植片１３および血管１４の外膜表面に対してシールした場合、装置の本体１２の内部と移植片１３および血管１４の囲まれた端部の外膜表面との間に空間が形成される。この空間は、密封リザーバー１８を構成し、吻合１６と一緒に縦方向に並べられていることが示される。
【０１０４】
このリザーバーにより、１つ以上の薬剤を含有する医薬製剤が、吻合部位１６で移植片および血管１３、１４の外膜表面と接触して配置される。該製剤が流体またはゲルの形態である場合、それは、例えば、皮下注射針および注射器を用いて本体１２の壁を介して密封リザーバー１８へ注入され得る。該製剤に含有される薬剤は、有利には、抗増殖効果を有していて、吻合部位１６およびそれに隣接する領域での平滑筋細胞内膜過形成を抑制することができる。
【０１０５】
該医薬製剤は、流体またはゲル形態である必要はなく、例えば、練り歯磨きと同様のコンシステンシーを有するラニーペースト（runny paste）であってもよい。したがって、それは、それが暴露される拍動している（pulsing）外膜表面と接触したままであり、血管を収縮させる。
【０１０６】
吻合部位１６上に該装置を配置するために、円筒状本体１２を移植片１３および血管１４のいずれか一方の上で、それらを吻合する前に、軸方向にスライドさせ得る。次いで、外科医は、吻合部位１６で移植片１３および血管１４を一緒に接合することができ、次いで、本体１２を図４に示した位置を占めるように吻合部位１６上でスライドさせて、各外膜表面へのシール部１５のシールを可能にすることができる。
【０１０７】
別法としては、装置の本体１２は、図示されるように、その全長に沿って縦スリット１９を設けていてもよい。この場合、外科医は、患者の体へ装置１２を導入せずに、移植片１３および血管１４を吻合することができる。吻合が成功裏に完了した後、外科医は、適当な大きさの本体１２を選択し、スリット１９に沿って可撓性本体１２を開き、吻合した移植片および血管１３、１４上でそれをスリップさせ、次いで、例えば、ティスシール（Ｔisseal）の名称の下に販売されているトロンビン接着剤またはシアノメタクリレートをベースとする接着剤などの慣用的な「組織接着剤」を用いて、スリット１９で本体の縦方向の両端を一緒にシールすることにより、吻合した移植片および血管の周囲にそれを適用することができる。
【０１０８】
リザーバー１８内に収容された医薬製剤の効果を集中させるため、および、周辺組織へのその薬剤の漏出を回避するために、本体１２は、該製剤に対して実質的に不透過性である。該物質は、また、有利には、製剤中の有効薬剤が消耗されてしまうと思われる設定時間の間、例えば１〜５日間、生分解性である。該物質は、また、周辺組織からの反応をあまり激しく促進しないように選択される。本体に適する物質の例としては、ゼラチン、アルギナートまたはコラーゲンが挙げられる。これらの物質は、また、本体を可撓性にし、成形または押出による該装置の製造を可能にする。
【０１０９】
本体１２の壁材は、また、皮下注射針により穴をあけることが必要な場合に密封リザーバー１８の保全性を保つように、セルフシール性であるのが有利であり得る。別法としては、または、さらに、該針の除去後に現れる壁における漏出口は、「組織接着剤」などでシールしてもよい。
【０１１０】
様々な大きさの血管に適合するように様々な大きさの本体１２が提供され得る。下肢血管は、一般に、外径約６−８mmである。冠状血管は、外径約３−５mmである。したがって、直径約３−１０mmの本体サイズの範囲が外科医にとって無菌パケット中で利用可能であり得る。さらに、本体の大きさを変更して、リザーバー１８の容量に影響を及ぼしてもよい。リザーバー１８に適当な大きさは、１０mlまで、好ましくは、２−５mlである。
【０１１１】
拍動性血流により生じた血液運搬管１３、１４の膨張に順応させるために、少なくとも本体のシール部１５は、有利には、血管壁の膨張に順応させるように延伸する能力を有する。該装置による血管壁の収縮を回避し、同時にシールを無傷に維持することが非常に望ましい。
【０１１２】
図５は、別のシール部を示す。本体１２の物質の半径厚さは、本体の長さに沿って一定であり、中間部１７は、シール部１５での本体１２の内径に対して実質的に膨らんでいる。シール部１５は共に、例えば、各々、約８−１５mmの軸方向の長さ「Ｘ」上で移植片１３および血管１４の各外膜表面と接触するように、縦方向に伸びる尾部を持って形成される。シール部１５についてのこれらの長い尾部は、「フラップ弁」のように作用してリザーバー１８のシールを助けるように作製できるが、「フラップ弁」を通る流れが望まれないことは明らかである。別法としては、該尾部を内部へ折り畳んで（図示されない）、その末端で本体の厚さを２倍にし、図４で示されるものと類似の形態で中間部における本体厚さよりも厚い半径本体厚さのシール部を形成してもよい。
【０１１３】
液密シールを形成するかまたはその形成を助けるために、外科医は、例えば、「組織接着剤」のような上記タイプの接着剤を用いて、外膜表面にシール部１５を接着してもよい。しかしながら、これは、必須ではない。例えば、シール部１５での本体１２の大きさが血管１３、１４の胴回りに適合するように選択される場合、接着剤を用いる必要はない。代わりに、外科医は、シール部１５での本体１２の内径と外膜表面の直径との間の半径方向の障害に頼ってもよい。これは、特に、図５の長く尾を付けたシール部の具体例についてそうである。しかしながら、該シール部は、血管を収縮させるほど血管上で締め付けるべきではない。
【０１１４】
図６および７は、端−側吻合と共に用いられる装置の具体例を示す。これらの図は、第１本体部２１および９０°未満の角度でそれから分枝して略Ｙ字形本体を形成する第２本体部２２を有する本体２０を示す。第１および第２本体部２１、２２は、９０°までおよび９０°を含む他の分枝角度でお互いに分枝してもよく、後者の場合、本体は、略Ｔ字形である。外科医は、有利には、吻合した血管の配置および大きさに対して最も適当な装置を選択することができる一連の様々な大きさおよび様々な形状の本体が利用可能である。例えば、第１本体部２２は、長さ約１−１０cmであってよく；第２本体部２２は、長さ１−５cmであってもよい。
【０１１５】
第１本体部２１は、略管状であり、天然血管２３を取り囲むように示される。第２本体部２２もまた、略管状であり、吻合部位２９で端−側形態で天然血管２３に吻合された移植片２４を取り囲むように示される。図７からわかるように、第１本体部２１の両端は、シール部２５を設けており、第２本体部２２の終端は、シール部２６を設けている。上記具体例におけると同様に、これらのシール部２５、２６は、有利には、「組織接着剤」を用いて、各々、血管２３および移植片２４の外膜表面にシールされ得る。
【０１１６】
図７は、第１本体部２１の内部と血管２３の外膜表面との間に形成された密封リザーバー２７を示す。該リザーバー２７は、第２本体部２２の内部にまで及んでいる。かくして、この密封リザーバー２７は、吻合部位２９といっしょに並べられる。リザーバー２７には、有利には、皮下注射針および注射器を用いて、有効薬剤を含有する液状医薬製剤が注入され得る。
【０１１７】
装置の血管２３および移植片２４への設置を容易にするために、装置の本体２０は、図７に示した断面図の平面で分離しており、該平面について対照的である２つの対照的な二分した部分を含有する無菌パッケージにおいて外科医に提供され得る。このような場合、外科医は、移植片２４を血管２３に吻合した後、２つの、同一本体二分割部分を組み立てて、例えば上記のような接着剤を用いて、同一の二分した部分の対向する縁部を一緒にシールすることが必要である。
【０１１８】
別法としては、第１本体部２１のみが、図６に示すように、縦スリット２８を設けていてもよい。この場合、外科医は、移植片２４の端部上で第２本体部２２をスライドさせることができる。次いで、外科医は、移植片２４の自由端を血管２３に吻合し、次いで、第２本体部２２を移植片２４の下方にスライドさせ、吻合部位２９を覆い、スリット２８を用いて第１本体部２１の中心に血管２３を供給し、これにより取り囲むことができる。次いで、外科医は、スリット２８で第１本体部２１の対向する縦方向の縁部同士をシールして、そこに密封リザーバー２７を形成することができる。
【０１１９】
本体部２１および２２について他の形状を用いてもよいのは明らかである。例えば、第１および第２本体部２１および２２は、お互いに別々に提供され、患者においてin situの場合のみ密封リザーバー２７を形成するようにお互いに固定される。
【０１２０】
図８および９は、側−側吻合の状況下で用いるのに適する装置の具体例を示す。装置の本体３０は、第２および第３本体部３２、３３に枝分かれしている第１本体部３１を含むことを示す。この分枝は、図８に示すとおり、略Ｘ字形本体を形成する。
【０１２１】
３つの本体部３１、３２、３３は全て、形状が略管状である。該装置は、追加の第３本体部３３を除くと、概して、図６および７に示したものと同様である。
【０１２２】
第１本体部３１は、閉塞した天然血管３４を取り囲み、その外膜表面にシール部３５によりシールされる。第２および第３本体部３２、３３は、移植片３６を取り囲み、各シール部３７、３８で移植片の外膜表面にシールされる。図９において最も明確に示されるとおり、シール部３５、３７、３８の効果は、本体３０の内部と囲まれた血管の外膜表面との間に密封リザーバー３９を形成することであり、該リザーバー３９は、上記方法で医薬製剤を少なくとも部分充填することができる。
【０１２３】
図８および９に示す装置の設置を容易にするために、該装置は、有利には、少なくとも２つの部品で外科医に提供される。例えば、第１本体部３１は、第２および第３本体部３２、３３を含む第２要素とは分けて提供され得る。該本体部に縦スリット（図示されない）を設けることにより、該本体部は、血管３４および移植片３６を取り囲むように設置され、次いで、これらの縦スリットに沿ってシールされ、接触線に沿ってお互いにシールされて、吻合部位４０の周囲に密封リザーバー３９が設けられる。
【０１２４】
図１０および１１は、図８および９に示した装置の変形例を示す（共通部分については同一の照合数字を用いる）。本発明の装置についてとりわけ適している使用の１つは、冠状動脈バイパス移植手術においてである。かかる状況下で、第１血管３４は、図示されるとおり、心臓壁５０に部分包埋されている冠状動脈であり得る。図８および９に示される形態の装置は、第１本体部が部分包埋冠状動脈３４の周囲全体に広がることができないので、部分包埋冠状動脈３４に設置できなかった。したがって、図１０および１１の具体例では、本体３１の第１本体部５１は、その縦方向に対する横断面で見ると完全な円を描かない；代わりに、略弓形である。図示した具体例では、約１８０°の弧を描く。これは、第１本体部５１を部分包埋冠状動脈３４の露出部分のみに設置させて、それを部分的にのみ取り巻くことができる。この装置では、第１本体部５１の縦方向に伸びている縁部４１は、例えば、組織接着剤を用いて、冠状動脈３４の外膜壁または図示されるように心臓壁５０の表面のいずれかに外科医によりシールされる。
【０１２５】
図１０および１１の装置は、また、第１血液運搬管が動脈により供給される臓器の壁において部分包埋されている動脈である他の手術にも適用可能である。かかる臓器としては、脳、膀胱および子宮が挙げられる。
【０１２６】
図示された具体例は、吻合部位の血液運搬管およびそれに続く部位に薬剤を送達するための装置の使用に集中していたが、本発明は、かかる使用に限定されない。該装置は、例えば、さらに一般的には、非吻合血液運搬管の外膜に薬剤を送達するために用いられてもよい。例えば、バルーン血管形成術後、図３〜５に示される形態の装置をバルーン血管形成部位の領域で動脈の外周に設置して、該動脈の外膜表面を介してそれに１種類以上の薬剤を送達してもよい。
【０１２７】
上記具体例では、密封リザーバーは、血液運搬管の外膜表面と少なくとも第１本体部の内部との間でラジアル空間または隙間の形態を取ることが示されており、該空間には、医薬製剤が少なくとも部分充填されている。しかしながら、かかる空間は、必須ではない。例えば、別の具体例では、本体は、略不透過性可撓性外層、および、製剤を含浸させた、使用時に外膜表面と接触するように配置される可撓性内層を有してもよい。
【０１２８】
外層は、例えば、固体コラーゲンから作られてよく、内層は、それに架橋結合された海綿状コラーゲンから作られてよく、該海綿状層は、送達されるべき薬剤を含有する医薬組成物を含浸させ得る。かかる条件下で、該装置は、既に含浸されている製剤と一緒に設置するために外科医に提供され得るか、または、例えば、上記のとおり注入されることにより、設置後に該製剤で湿潤させられ得る。
【０１２９】
別法としては、薬剤を本体の内部表面に塗布していてもよく、使用時に該表面を血管と接触させる。別法としては、薬剤を本体の構造全体に分散させていてもよい。
【０１３０】
装置の本体は、捩り応力に耐えるのに充分な強度を有するのが望ましい。この目的のために、本体は、例えば、コラーゲンフィルムなどの内層、または、縦、横もしくは螺旋状のリブを設けて形成されてもよい。リブは、リザーバーをコンパートメントに細分割し、さらなる安定性を与えるために設けられる。
【０１３１】
当該タンパク質または核酸は、臨床環境により生じる内膜過形成の治療または予防のために用いられ得る。例えば、血管形成術、例えば、バルーン血管形成術；バイパス術、例えば、静脈を動脈に吻合する冠状バイパス術；他の吻合術、例えば、足における吻合術；および動脈内膜切除術、例えば、頚動脈内膜切除術を含むいずれのタイプの手術の後に生じる過形成も治療することが可能である。動脈損傷または高血圧症、例えば、肺動脈高血圧症に伴う内膜過形成を治療することも可能である。本発明は、いずれかのタイプの血管における、例えば、動脈または静脈、好ましくは動脈における、内膜過形成の治療を提供するものである。
【０１３２】
本発明によると、確立された内膜過形成を治療もしくは改善するか、または、内膜過形成が発生しないように予防することが可能である。同様に、内膜過形成が発生する可能性を減少させること、または、確立された内膜過形成もしくは発生すると思われる過形成の重篤度を低下させることが可能である。本発明による治療は、例えば、術後に生じる過形成の機会を減少させるために、手術の前、間または後に行われ得る。
【０１３３】
好ましくは、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質は、新しい狭窄を予防または治療するために投与される。しかしながら、それは、再狭窄を治療または予防するためにも用いることができる。
【０１３４】
本発明のタンパク質または核酸は、好ましくは、医薬上許容される担体を含む医薬製剤の形態で送達される。いずれの適当な医薬製剤も用いられ得る。
【０１３５】
例えば、適当な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質、および、予定されたレシピエントの血液と一緒に製剤を等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性無菌注射溶液；ならびに、懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁剤が挙げられる。該製剤は、単位投与または多投与容器、例えば、密封されたアンプルまたはバイアル中で提供され得、使用直前に無菌液体担体、例えば、注射用蒸留水の添加のみを必要とする冷凍または凍結乾燥条件下で保存され得る。
【０１３６】
当然のことながら、上記で詳述した成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤のタイプを考慮して当該技術分野で慣用的な他の薬剤を含んでもよい。可能な製剤のうち、無菌無パイロジェン水性および非水性溶液が好ましい。
【０１３７】
当該タンパク質、核酸およびベクターは、適当な用量で、適当な投与方針を用いて送達され得る。多くの因子に応じて投与量および投与方針を治療されるべき個々の症状の最適な治療を確実にするように適合させ得ることは、当業者に明らかである。かかる因子のいくつかは、治療されるべき対象体の年齢、性および臨床状態であり得る。
【０１３８】
ＶＥＧＦをコードする裸の核酸またはかかる核酸を含む構築物の送達について、典型的な用量は、用量当たり０.１−５０００μg、例えば、５０−２０００μg、例えば、５０−１００μg、１００−５００μgまたは５００−２０００μgなどである。ＶＥＧＦタンパク質の送達については、適当な用量としては、１〜１０００μg、例えば、１〜１０μg、１０〜１００μg、１００〜５００μgまたは５００〜１０００μgの用量が挙げられる。
【０１３９】
ウイルスまたは非ウイルスベクターによるＶＥＧＦ核酸の送達のために用いられる用量は、ベクターがＶＥＧＦ核酸を細胞に送達する効率、およびＶＥＧＦ核酸が細胞中で発現される効率を含む多くの因子に左右される。
【０１４０】
例えば、ウイルスベクターは、１０４〜１０１４cfuまたはpfu／ml、例えば、１０４〜１０６、１０６〜１０８、１０８〜１０１０、１０１０〜１０１２または１０１２〜１０１４cfuまたはpfu／mlの用量で送達される。１０５〜１０９cfuまたはcfu／mlの範囲の用量が好ましい。pfu（プラーク形成単位）なる用語は、アデノウイルスを含むある種のウイルスに適用され、ウイルス溶液の感染力に相当し、適当な細胞培養物の感染および一般に４８時間後の感染細胞のプラークの数の測定により決定される。cfu（コロニー形成単位）なる用語は、レトロウイルスを含むその他のウイルスに適用され、一般に選択可能なマーカーと一緒に１４日間インキュベートした後に当該技術分野で知られている手段により決定される。ウイルス溶液のcfuまたはpfu値を決定するための技術は、当該技術分野でよく知られている。
【０１４１】
レトロウイルスについては、１０５〜１０６cfu／mlの範囲の用量が特に好ましい。偽型レトロウイルスについては、１０７cfu／mlの範囲の用量が特に好ましい。アデノウイルスについては、１０９pfu／mlの範囲の用量が特に好ましい。
【０１４２】
同様に、かかる用量が緩やかな送達のための本発明の移植片内に含まれてもよい。
【０１４３】
非ウイルスベクターと結合したＶＥＧＦ核酸もまた、上記したいずれの投与手段によっても、または、移植片から緩やかに、いずれかの適当な用量で送達されてもよい。適当な用量は、典型的には、核酸０.１〜１０００μg、例えば、１〜１００μg、１００〜５００μgまたは５００〜１０００μg、１０００〜２０００μg、２０００〜３０００μgまたは３０００〜５０００μgである。好ましい用量は、５〜５０μg、例えば、１０〜２０μgの範囲である。
【０１４４】
投与方針は、例えば、投与経路、レシピエントの種およびレシピエントの健康状態によっても変化するであろう。しかしながら、単回投与、および、数日間、数週間または数ヶ月間に及ぶ多回投与が考えられる。また、上記で説明したとおり、ＶＥＧＦタンパク質および核酸の送達は、血管、好ましくは動脈の周囲に設置するのに適する移植片により行われる；好ましくは、移植片は、カラーの形態である。かかる移植片は、緩やかな送達を行う。例えば、送達は、数時間、数日間、数週間または数ヶ月間にわたって生じる。
【０１４５】
本発明のタンパク質および核酸は、例えば、局所投与、皮膚投与、非経口投与、筋肉内投与、皮下投与または経皮投与などのいずれの投与形態によっても、または、血流中への直接注射または動脈壁中もしくはその周囲への直接注射によるか、または粘膜組織への直接塗布によって投与されてもよい。好ましくは、投与は、上記したとおり、移植による。
【０１４６】
本発明のタンパク質、核酸およびベクターは、いずれの哺乳動物においても内膜過形成を治療するために用いられ得る。ヒト患者の治療が好ましい。
【０１４７】
本発明は、内膜過形成治療用または予防用キットを提供するものでもある。これらのキットは、（ｉ）薬剤として、上記で定義したとおり、好ましくは、ベクターと結合した、ＶＥＧＦタンパク質または核酸；および（ii）ＶＥＧＦタンパク質または核酸が導入され得るカラーの形態の本発明の移植片を有してなる。好ましくは、ＶＥＧＦ核酸またはタンパク質は、上記で定義した医薬上許容される担体を含む医薬製剤の形態で提供される。成分（ｉ）および（ii）は、いずれの適当な方法でもパッケージされ得る。例えば標準試薬および／または溶液および／または装備品などの当該技術分野で知られている他の成分もまた含有されてもよい。
【０１４８】
本発明は、また、内膜過形成の治療または予防方法であって、本発明のＶＥＧＦタンパク質、核酸またはアゴニストの有効な非毒性量を該処置を必要とする患者に投与することを含む方法を提供するものでもある。
【０１４９】
本発明の移植片、とりわけ、上記で定義したようなカラーの形態の移植片は、ＶＥＧＦ以外の薬剤の、血管、例えば、動脈への送達のために用いることもできる。いずれの適当な薬剤もこの方法で送達されて、いずれの所望の治療目的をも達成することができる。
【０１５０】
プラスミド／リポソーム複合体、ＭＭＬＶレトロウイルス、ＶＳＶ−Ｇレトロウイルスおよびアデノウイルスがカラーを付けた動脈中で発現を引き起こすことが観察された。遺伝子導入効率は、アデノウイルスについて最高であり、偽型ＶＳＶ−Ｇレトロウイルスもまた比較的高いトランスフェクション効率を生じた。複製不全ＶＳＶ−Ｇレトロウイルスの動脈遺伝子導入における利用性は、従来、示されていなかった。アデノウイルストランスフェクトされた動脈のいくつかの内皮細胞において発現が見られた。外膜から内膜への浸透が生じたので、これらの結果は、ＶＥＧＦ以外の遺伝子を用いる内腔外遺伝子導入によりヒト疾患において内皮機能を変化させる一般的な可能性を高める。これは、また、他の場合には動脈壁において作用する拡散可能なまたは分泌された遺伝子産物の外膜および外中膜における発現のために有用でもあり得る。好ましくは、かかる送達は、上記で定義したとおり、内膜過形成の治療をもたらすが、それは、さらなるまたは別の治療目的ももたらし得る。
【０１５１】
このような送達のための好ましい治療薬としては、動脈壁において一酸化窒素（ＮＯ）産生を刺激するＶＥＧＦ以外のタンパク質が挙げられる。内膜過形成の治療または予防をもたらすためのＮＯシンターゼ、特に、誘発性ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）の送達が特に好ましい。
【０１５２】
他の好ましい治療薬としては、内皮ＶＥＧＦ受容体を活性化するアゴニストが挙げられる（上記参照）。これらのアゴニストは、典型的には、小さい合成分子である。ＶＥＧＦタンパク質のペプチドフラグメントを含むペプチドを用いてもよい。この場合、治療は、ＶＥＧＦについて上記したとおり、ペプチド自体またはそれをコードする核酸の送達により行われ得る。これらは、好ましくは、同経路により、すなわち、本明細書で定義した移植片を介して送達されるが、それらは、全身的に送達され得る。
【０１５３】
好ましくは、治療薬は、医薬上有効なポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸の形態である。さらに好ましくは、この核酸は、上記で定義したとおり、構築物内に含まれる。さらに好ましくは、核酸または構築物は、上記定義のベクター、例えば、上記定義のウイルスまたは非ウイルスベクターにより動脈に送達される。
【０１５４】
かくして、動脈外遺伝子導入は、血管、好ましくは動脈の壁への遺伝子物質の送達のために用いることができる。実施例により、内側ＳＭＣの変化および内皮変化が外膜側から達成できることを見ることができ、血管、例えば、動脈の疾患の新しい治療方法の開発を可能にする。
【０１５５】
したがって、本発明は、血管内膜過形成治療薬または予防薬の製造における、ＮＯＳ（所望により、ｉＮＯＳ）またはＮＯＳ（好ましくは、ｉＮＯＳ）をコードする核酸の使用を提供するものである；ここで、ＮＯＳタンパク質または核酸は、ＶＥＧＦについて上記で定義した、移植片、好ましくはカラー中で提供される。
【０１５６】
本発明は、また、（ｉ）ＮＯＳ（所望によりｉＮＯＳ）タンパク質または核酸；および（ii）本発明の移植片を含むキットを提供するものでもある。これらのキットは、ＶＥＧＦについて上記したとおりである。これらは、血管内膜過形成の治療または予防に適している。
【０１５７】
本発明は、また、治療または予防されるべき過形成付近でＮＯＳタンパク質または核酸を含む本発明の移植片を移植し、これにより、ＮＯＳタンパク質または核酸のデリバリーを行うことを含む血管内膜過形成の治療方法を提供するものでもある。
【０１５８】
ＮＯＳ核酸は、好ましくは、ＶＥＧＦについて上記したとおり、ベクターと結合している。治療は、ＶＥＧＦについて上記したと同様に行われ、用量および医薬製剤もまた、ＶＥＧＦについて上記したと同様である。
【０１５９】
本発明は、また、ＮＯＳ（所望により、ｉＮＯＳ）、タンパク質または核酸を含む本発明の移植片を提供するものでもある。
【０１６０】
ＶＥＧＦが動脈壁中でＮＯおよびプロスタサイクリン産生を刺激するという知見は、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体のアゴニストが他のＮＯ関連および／またはプロスタサイクリン関連症状の治療において有用であろうということを示唆している。
【０１６１】
とりわけ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦが結合する受容体のアゴニストは、高血圧症（hypertensionまたはhigh blood pressure）を治療するために用いられ得る。Forte et al., Lancet (1997) 349:837-42は、低いＮＯレベルが本態性（すなわち、全身性）高血圧症に罹患している個体の特徴であることを見出した。ＮＯは、血管壁を弛緩することが知られている；Forte et al.は、ＮＯ産生障害がこの弛緩を低下させ、血管を収縮させ、血圧を上昇させることを示唆している。さらに、本態性高血圧症に罹患している個体では、プロスタサイクリンのレベルが抑制される。
【０１６２】
ＶＥＧＦがＮＯおよびプロスタサイクリン産生を刺激するので、それは、高血圧と戦うのに有用である。さらに詳しくは、本発明の薬剤は、特に関心のある３のつ疾患の治療において有用であり得る。
【０１６３】
第１は、本態性高血圧症、すなわち、任意の位置または体の至る所での全身性高血圧である。全身性症状である本態性高血圧症の治療については、それは、本発明のＶＥＧＦタンパク質またはアゴニストが、遺伝子治療により、全身的に、例えば、ＶＥＧＦタンパク質またはアゴニストをコードするＶＥＧＦ核酸の全身性送達により送達されるのが好ましい。
【０１６４】
第２は、肺性心、すなわち、肺動脈の高血圧により引き起こされる右心不全である。これは、本明細書に記載したＶＥＧＦ核酸、タンパク質およびアゴニストを投与することにより、とりわけ、その後のＤＮＡの発現を伴って動脈カラー（上記を参照）を介してＶＥＧＦ ＤＮＡを動脈に送達して動脈壁でタンパク質を得ることにより、治療可能であり得る。
【０１６５】
第３は、原発性肺高血圧症、すなわち、肺での高血圧である。これは、通常、最後には心不全および死に至らしめ、現在、連続プロスタサイクリン輸液または肺移植によって治療可能なだけである。本明細書では、好ましい治療技術は、ＶＥＧＦまたはそのアゴニストをコードする核酸を用いて肺組織を核酸で形質転換するかまたは肺組織に核酸をトランスフェクトし、これにより、イン・ビボでＶＥＧＦを生じさせ、ＮＯおよび／またはプロスタサイクリン産生を刺激することである。
【０１６６】
したがって、本発明は、イン・ビボでの一酸化窒素（ＮＯ）またはプロスタサイクリン産生刺激薬の製造における、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦをコードする核酸、ＶＥＧＦのアゴニスト、およびＶＥＧＦを結合する受容体のアゴニストをコードする核酸分子から選択される薬剤の使用を提供するものである。
【０１６７】
ＶＥＧＦタンパク質または核酸またはＶＥＧＦを結合する受容体のアゴニスト、またはかかるアゴニストをコードする核酸を含む本発明のキットもまた、高血圧症の治療に適している。
【０１６８】
本発明はまた、本発明のＶＥＧＦタンパク質、核酸またはアゴニストの有効な非毒性量を患者に投与することを含む高血圧症の治療または予防方法を提供するものでもある。かかる治療は、本明細書に記載したとおり行われる。原発性肺高血圧症については、好ましい方法は、本明細書で定義した、ＶＥＧＦをコードする核酸またはＶＥＧＦが結合する受容体のアゴニストをコードする核酸を用いる肺組織の形質転換である。
【０１６９】
本発明により治療することができる別の症状は、ＮＯ関連および／またはプロスタサイクリン関連症状であり得るアテローム性動脈硬化症である。アテローム性動脈硬化症の治療に関する場合、本明細書で定義したＶＥＧＦアゴニストを用いるのが好ましい。
【０１７０】
かくして、本発明は、イン・ビボでのＮＯおよび／またはプロスタサイクリン産生の刺激によるアテローム性動脈硬化症治療薬の製造における、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦをコードする核酸、ＶＥＧＦのアゴニスト、およびＶＥＧＦが結合する受容体のアゴニストをコードする核酸分子から選択される薬剤の使用を提供するものである。
【０１７１】
本発明はまた、本発明のＶＥＧＦタンパク質、核酸またはアゴニストの有効な非毒性量を患者に投与することを含むアテローム性動脈硬化症の治療方法または予防方法を提供するものである。かかる治療は、本明細書に記載したとおり行われる。
【０１７２】
アテローム性動脈硬化症治療については、デリバリーの好ましい形態の１つは、本発明のＶＥＧＦタンパク質の、または、好ましくは、本発明のＶＥＧＦアゴニストの、例えば、錠剤形態での、経口送達である。
【０１７３】
以下の実施例により本発明を説明する。以下の略語を用いる：
【表１】
2008155036.tif 000003
【０１７４】
実施例１
内膜平滑筋細胞増殖を生じる作用因子として、および、遺伝子およびベクターのためのリザーバーとして作用する頚動脈の周囲に挿入されたシリコーンカラーを用いて、内膜の肥厚に対する内皮細胞（ＥＣ）−特異的ＶＥＧＦ遺伝子導入の効果を研究した。該モデルは、ＥＣ完全性を保存し、いずれの血管内操作も用いずに、直接血管外遺伝子導入を可能にした。
【０１７５】
実施例１．１
遺伝子導入：全身麻酔下、ニュージーランド白ウサギ３２匹の頚動脈において、該動脈の周囲に不活性シリコーンカラーを挿入することにより内膜肥厚を誘発した（Booth et al., Atherosclerosis (1989) 76:257-268）。該カラーの設置から５日後、麻酔下で該カラーを静かに開き、該カラーの中にプラスミド／リポソーム複合体５００μlを注入することにより（すなわち、動脈の外膜表面上で）遺伝子導入を行った。該研究のいずれの工程においても、全く血管内操作を含まなかった。
【０１７６】
プラスミド／リポソーム複合体：ｐＣＭＶ５−ＶＥＧＦ−１６４プラスミド（マウスＶＥＧＦ ｃＤＮＡ（Breier et al., Development (1992) 114:521-32；ヌクレオチド１−５８３）を含有する）２５μgをリポフェクチン（ＢＲＬ）２５μlと複合体形成させ、リンゲル溶液で５００μlに希釈した。複合体を、遺伝子導入前に少なくとも１５分間室温で維持した。この研究で用いた濃度では、プラスミド／リポフェクチン複合体がイン・ビトロでウサギ大動脈ＥＣに対して有毒ではなかったことが予め判定された。対照動脈に、イー・コリ（E. coli）ｌａｃＺ ｃＤＮＡ（Kalnins et al.、上掲）（ヌクレオチド１−３１００）発現プラスミドを含有する同様のプラスミド／リポソーム複合体をトランスフェクトした。この研究に用いたプラスミドは、キアジェン・メガ（Ｑiagen Ｍega）カラムを用いてイー・コリ培養物（ＤＨ５α）から単離し、フェノール／クロロホルム抽出を３回およびエタノール沈殿法を１回行って精製し（Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons (1991) 4.2.3-4.2.4）、１μg／μlに調節し、微生物または内毒素汚染を含まないことを分析した（リムルス（Limulus）アッセイ、検出限界０.２ng）。動物を、遺伝子導入手術の３日後（ｎ＝８）、７日後（ｎ＝１２）および１４日後（ｎ＝１２）に屠殺した；動脈を注意深く取り出し、３等分した；近位の３分の１は、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で１５分間浸漬固定し、ＯＣＴ化合物（マイルズ・サイエンティフィック（Miles Scientific）（Yla-Herttuala et al., J. Clin. Invest. (1995) 95:2692-2698）中に包埋した。中間の３分の１は、上記と同様に４時間固定し、１５％スクロース中で４８時間洗浄し、パラフィン中に包埋した。遠位の３分の１は、ＯＣＴ化合物中に直接包埋し、液体窒素中で冷凍した。４つの動脈において、ｍＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ（下記を参照）のために遠位の３分の１を用いた。試料の起源の情報を持っていない２人の独立した観察者による内膜／中膜厚さ比の測定（Yla-Herttuala et al., Arteriosclerosis (1986) 6; 230-236）のために中間位置からランダムに選択した１０個の切片を用いた。２つの独立した測定値の平均値を用いて、結果（平均±ＳＤ）を算出した。グループ間の内膜／中膜厚さ比の差異を、ＡＮＯＶＡ、次いで、変形ｔ−検定（＊ｐ＜０.０５）により分析した。
【０１７７】
ＲＴ−ＰＣＲ：ｍＲＮＡ単離（マイクロ−ファーストトラック（Micro-FastTrack）、インビトロジェン（Ｉnvitrogen））のために遺伝子導入の７日後に回収したＶＥＧＦ（ｎ＝２）およびｌａｃＺ（ｎ＝２）トランスフェクト動脈の遠位部分を用い、従前の記載（Hiltunen et al., Circulation (1995) 92: 3297-3303）に従って、ランダムヘキサマープライマー（ｃＤＮＡサイクルキット、インビトロジェン）を用いてＡＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（反応あたり５Ｕ、ベーリンガー（Ｂoehringer））を用いて第１鎖ｃＤＮＡに逆転写させた。Ｔａｑポリメラーゼ（ベーリンガー）およびトランスフェクトｐＣＭＶ５−ＶＥＧＦ−１６４構築物に対して特異的なプライマーを用いて３５サイクルＰＣＲを行った（５'−プライマー：配列番号９；３'−プライマー：配列番号１０；ＰＣＲサイクルパラメーター：９０℃で1分、６０℃で１分、７２℃で１分、最後のサイクルが５分であることを除く）。ＶＥＧＦトランスフェクト動脈中で予想される長さ（５４７ｎｔ）を有する増幅フラグメントが見られた。ゲルの両側にＤＮＡサイズマーカー（１ｋｂラダー、ＢＲＬ）が示される。
【０１７８】
ＶＥＧＦまたはｌａｃＺ遺伝子導入の７日後にウサギ頚動脈の特徴を示す顕微鏡写真を撮影した。トランスフェクトされた動脈の免疫染色法は、以下のことを示した：ｌａｃＺ−プラスミド／リポソーム（ＳＭＣ特異的ＭＡｂ ＨＨＦ−３５、１：５００希釈、エンゾ・ダイアグノスティクス（Ｅnzo Ｄiagnostics））をトランスフェクトされた対照動脈は、典型的な内膜肥厚を示した；ＶＥＧＦプラスミド／リポソーム（ＳＭＣ特異的ＭＡｂ ＨＨＦ−３５）でトランスフェクトされた動脈は、限定された内膜肥厚のみを示した；内皮は、研究した全ての血管切片に存在した（Ａ，ＥＣ特異的ＭＡｂ ＣＤ３１に対する連続切片、希釈１：５０、ＤＡＫＯ）；ＶＥＧＦ−およびｌａｃＺ−トランスフェクト動脈において炎症は全く検出されなかった（マクロファージ特異的ＭＡｂ ＲＡＭ−１１、希釈１：５００、ＤＫＯ）；遺伝子導入の１４日後に、ＶＥＧＦトランスフェクト動脈の外膜に血管新生が見られた（ヘマトキシリン−エオシン染色法）。
【０１７９】
免疫染色法（Yla-Herttuala et al., PNAS (1990) 87: 6959-6963）のためにアビジン−ビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼ系（ベクター・エリート（Vector Elite）、ベクター・ラブズ（Ｖector Ｌabs））を用いた。免疫染色法のための対照は、無関連クラス−および種−適合イムノグロブリンを用いるインキュベーションおよび一次抗体が省略されたインキュベーションを含んだ。従前の記載（Yla-Herttuala et al., (1990)、上掲）に従ってpBluescript ＳＫプラスミド（ストラータジーン（Ｓtratagene））から合成したアンチセンスＶＥＧＦリポプローブ（５８３ｎｔ）を用いてin situハイブリダイゼーションを行った。すなわち、パラフィン包埋切片をプロテアーゼＫで前処理し、アセチル化し、３５−Ｓ−ＵＴＰ（デュポン（ＤuＰont）、ＮＥＮ）標識リボプローブ（６×１０６cpm／ml）を用いて５２℃で１６時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、最後に、６０℃で３０分間、０.１×ＳＳＣで洗浄した。シグナル検出のためにオートラジオグラフィーを用いた（イーストマン−コダック（Ｅastman-Ｋodak）ＮＡＢ−２）。非ハイブリダイズセンスリボプローブ（Yla-Herttuala et al., (1990)、上掲）を用いた対照ハイブリダイゼーションにより、マイナスの結果が得られた。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【０１８０】
実施例１．２
実施例１．１の記載に従って、遺伝子導入を行った。ＶＥＧＦ（ｎ＝５）またはｌａｃＺ（ｎ＝５）遺伝子導入の１日前から、ウサギに飲料水中でＬ−ＮＡＭＥ（７０mg／kg／d）を供給し始めた。遺伝子導入の７日後に動物を屠殺し、上記に従って内膜／中膜厚さ比および組織構造について分析した（Yla-Herttuala et al., Arteriosclerosis (1986) 6:230-236；Yla-Herttuala et al., (1990)、上掲）。内膜肥厚の差異はなくなった。
【０１８１】
実施例１．３
ＨＵＶＥＣの集密培養物を無血清培地で２回洗浄し、所定濃度の組換えヒトＶＥＧＦの存在下で１５分間、または１０ng／ml ＶＥＧＦの存在下で所定の時間、この培地と一緒にインキュベートした。いくつかの実験では、細胞を１００μＭ Ｌ−ＮＡＭＥで１時間前処理し、次いで、１０ng／ml ＶＥＧＦを用いるかまたは用いずに１０分間処理した。培地を取り出し、１０mＭ トリス／ＨＣl（ｐＨ７.６）、５mＭ ＥＤＴＡ、５０mＭ ＮaＣl、３０mＭピロリン酸ナトリウム、５０mＭ ＮaＦ、０.１mＭ Ｎa３ＶＯ４、１mＭ ＰＭＳＦおよび１％トリトンＸ−１００（溶解緩衝液）の添加により、４℃で細胞を迅速に溶解させた。溶解物を１５０００×ｇで１０分間遠心分離にかけることにより浄化し、浄化した溶解物をＰＹ２０抗ホスホチロシンｍＡｂと一緒に４０℃で２時間インキュベートすることにより免疫沈澱法を行った。溶解物をタンパク質Ａ−アガロースと一緒にさらに１時間インキュベートすることにより免疫沈澱物を回収した。免疫沈澱物を溶解緩衝液で３回洗浄し、次いで、タンパク質を２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で抽出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、免疫沈澱したタンパク質を膜に移動させ、次いで、ＰＹ２０ ｍＡｂでイムノブロッティングを行った。これは、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体に対応する主要な２０５ｋＤタンパク質のリン酸化を誘発することを示す（１００、１２５、１４５、１９０および２０５での主要なチロシンリン酸化タンパク質）。Ｌ−ＮＡＭＥは、ＶＥＧＦへの応答をなくす。
【０１８２】
組換えＶＥＧＦを、２５ng／mlの濃度で２時間まで（亜硝酸産生は、約１６μＭの外膜レベルから増加し、１.８−２μＭで維持された）、または、０、２.５、２５ng／mlの所定濃度で１０分間、添加した。２５ng／ml ＶＥＧＦを１０分間添加した後、ＶＥＧＦ応答に対するＬ−ＮＡＭＥ（１００μＭ）前処理（１時間）の効果を測定した。キャピラリー検出法を用いて亜硝酸産生を測定した（Leone et al., in Methods in Nitric Oxide Research, Feelisch and Stanler, eds. John Wiley & Sons, New York (1996) 499-508）。レベルは、ＶＥＧＦの存在下、約１９および約２.１μＭに上昇した；Ｌ−ＮＡＭＥの添加により対照レベル（約１７μＭ）に減少した。
【０１８３】
結果：ｌａｃＺ形質導入動脈と比較して、ＶＥＧＦ遺伝子導入は、術後１週間目に内膜肥厚を有意に減少させることが見出された（内膜／中膜比０.３対１.１、＜０.０５、各々）。この効果は、２週間後に低下した。これは、おそらく、プラスミド／リポソーム媒介遺伝子導入が、典型的には、遺伝子導入後２-３日の間に最高のタンパク質発現を有するトランスフェクト遺伝子の一時的発現を誘発するに過ぎないという事実によるものである（Nabel et al, Ann. Rev. Physiol. (1994) 56: 741-761）。
【０１８４】
動脈の免疫組織化学解析は、内膜肥厚がほぼ例外なくＳＭＣからなっていることを示した。内皮層は研究した切片の全てに存在した。トランスフェクト動脈において副作用または炎症は、全く検出されなかった。
【０１８５】
トランスフェクトＶＥＧＦの発現は、導入遺伝子に対して特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより、および、in situハイブリダイゼーションにより確認された。ＶＥＧＦおよびｌａｃＺ発現のほとんどは、線維芽細胞およびＳＭＣにおける外膜および外中膜で生じた。遺伝子導入の１４日後にＶＥＧＦトランスフェクト動脈のうち３つにおいて外膜血管新生が見られた。ｌａｃＺトランスフェクト動脈においては、血管新生は検出されなかった。
【０１８６】
カラーモデルを用いるｌａｃＺ−プラスミド／リポソーム遺伝子導入が動脈細胞の０.０５％において局所遺伝子導入を生じることは、従来、示されていた。低い遺伝子導入効率にもかかわらず、カラーの内側で産生された分泌形態のＶＥＧＦは、遺伝子導入の１４日後に３つのＶＥＧＦトランスフェクト動脈における血管新生の存在により示されるように、局所的な動脈微小環境中で生物学的効果を生じる。急性低酸素症における場合、分泌されたＶＥＧＦは、拡散によりＥＣに達し、ＥＣ上のＶＥＧＦ受容体に結合すると思われる。
【０１８７】
内膜肥厚に対するＶＥＧＦの阻害効果は、直接または間接ＶＥＧＦ誘発ＥＣ由来因子または次にＳＭＣ増殖を阻害する活性のいずれかによると仮定された。詳しくは、内膜肥厚に対するＶＥＧＦの効果は、ＮＯ経路を介して媒介されると仮定された。この仮説は、遺伝子導入実験の間、動物にＮＯシンターゼ阻害物質Ｌ−ＮＡＭＥを投与することにより、ニュージーランド白ウサギ（ｎ＝８）のサブセットにおいて試験された。Ｌ−ＮＡＭＥがＶＥＧＦ−およびｌａｃＺ−トランスフェクト動脈間の内膜肥厚の差異をなくしたことが見出された。動脈壁におけるＶＥＧＦに対する主要な標的細胞は、ＥＣである。ＶＥＧＦ受容体を有する他の細胞型は、単球であるが、特異的抗体を用いて免疫組織化学により判定すると、単球は、これらの条件下でカラーを取り付けた頚動脈からなくなっている。
【０１８８】
これらの結果（内膜肥厚の差異能）は、ＮＯ産生の刺激を介する内膜肥厚のＶＥＧＦ誘発阻害と矛盾しなかった。したがって、ＶＥＧＦがＥＣの培養物中でＮＯ産生を直接刺激するかを試験した。ＶＥＧＦは、１−２５ng／mlの濃度範囲内でＶＥＧＦ受容体に相当する主要な２０５ｋＤａタンパク質のチロシンリン酸化を誘発した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）へのＶＥＧＦの添加は、亜硝酸レベルの測定によりモニターされるとおり、ＮＯ産生の時間−および濃度−依存性増加を生じた。ＮＯ産生に対するＶＥＧＦの効果は、早くもＶＥＧＦの添加の３０秒後には見られ、５分後に最高に達し、２時間まで保持された。ＶＥＧＦの最大効果の半分が５ng／mlで得られた。ＶＥＧＦ誘発リン酸化およびＮＯ産生は、１００μＭ Ｌ−ＮＡＭＥの存在下で完全になくなった。かくして、ＶＥＧＦ遺伝子導入は、トランスフェクト動脈のＥＣにおけるＮＯ産生を刺激し、少なくとも部分的にＮＯ媒介メカニズムを介してＳＭＣ増殖を制限すると思われる。該知見は、内皮ＮＯシンターゼｃＤＮＡによる動脈のトランスフェクションが内膜肥厚を減少させるという従前の観察結果（Von der Leyon et al., PNAS (1995) 92: 1137-1141）と矛盾しない。
【０１８９】
Callow et al.（上掲）およびAsahara et al.（上掲）は、ＶＥＧＦタンパク質の投与が露出した動脈におけるＥＣ増殖を刺激するという結論を下したが、内膜肥厚の阻害に関する実際のメカニズムは、研究されなかった。カラーを取り付けた頚動脈では、内膜肥厚は、解剖学的に無傷の内皮の存在下で刺激される。したがって、ここで報告された内膜肥厚に対する動脈ＶＥＧＦ遺伝子導入の阻害効果は、ＶＥＧＦ刺激性再内皮形成によるものであるとは考えられない。これらの結果によると、ＶＥＧＦは、ＨＵＶＥＣにおけるＮＯ産生を直接誘発することができ、この結果、これは、ＶＥＧＦが内膜肥厚を阻害することができる１つのメカニズムである。ＶＥＧＦはまた、ＴＧＦ−βまたはプロスタサイクリンを含むＳＭＣ増殖を負に調節することができる他の因子の産生も刺激する。
【０１９０】
実施例２
遺伝子デリバリーのためにプラスミド／リポソーム複合体を用い、モロニーマウス白血病ウイルス由来（ＭＭＬＶ）レトロウイルス、偽型水疱性口内炎ウイルスタンパク質−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）含有レトロウイルスおよびアデノウイルスを外膜に適用したシラスティックカラーを用いてウサギ頚動脈に送達した。該カラーは、１）遺伝子送達リザーバーを提供するため；２）内腔内操作を行わず、内皮を全体的に解剖学的に無傷のままにしておくため；および３）カラーの設置が動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖を誘発し、標的細胞増殖が必要とされる場合にレトロウイルス遺伝子導入効率を増強するために用いられる。
【０１９１】
遺伝子導入：ニュージーランド白ウサギ（１.８−２.５kg）を用いた。麻酔薬は、フェンタニル−フルアニゾン（０.３mg／kg）／ミダゾラム（１mg／kg）（Yla-Herttuala et al., J. Clin Invest. (1995) 95:2692-2698）であった。正中頚切開により左頚動脈を露出させた。生物学的に不活性な２cmのシラスティックカラー（フィンランド、クオピオのメディジーン・オサケ・ユキチュア（ＭediＧene Ｏy））を、いずれかの端部でわずかに外膜に触れるように頚動脈の周囲に設置した（Booth et al.上掲）。カラー設置手術の４−５日後、遺伝子導入を行った。遺伝子導入のために、動物を再度麻酔した。外科的に再露出されたカラーを静かに開き、遺伝子導入溶液（下記参照）５００μlを充填した。切開部を閉じ、後に動脈を遺伝子導入効率について分析した。
【０１９２】
組織学的分析：カラーを設置した動脈を注意深く取り出し、３等分した：近位の３分の１を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中で１５分間浸漬固定し、次いで、ＯＣＴ化合物（アメリカ合衆国のマイルス・サイエンティフィック）中に包埋させた。中間の３分の１を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中で４時間浸漬固定し、１５％スクロース（ｐＨ７.４）で４８時間洗浄し、次いで、パラフィン中に包埋させた。遠位の３分の１をＯＣＴ化合物中に包埋させ、冷凍切片のために処理した。ランダムに選択した１０個の切片をβ−ガラクトシダーゼ活性のためのＸ−ｇａｌで１２時間染色し、遺伝子導入効率の測定のために用いた（Nabel et al., Science (1990) 249: 1285-1288；Yla-Herttuala et al., (1995)上掲）。遺伝子導入効率は、ランダムに選択した２０個の１００Ｘフィールド中で核酸の総数の割合としてのβ−ガラクトシダーゼ含有細胞のパーセンテージとして算出した。免疫細胞化学および細胞型および／または内膜／中膜厚さ比の分析のために、カラーを設置した動脈の各３分の１部分からランダムに選択された切片を用いた（Booth et al.上掲）。
【０１９３】
以下の抗体を用いて細胞型を同定した：ＳＭＣ：ＨＨＦ−３５ ｍＡｂ（１：５００希釈、アメリカ合衆国のエンゾ・ダイアグノスティクス）、α−アクチンｍＡｂ（１：１０００希釈；シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓigma Ｃhemical Ｃo.））；マクロファージ：ＲＡＭ−１１ ｍＡＢ（１：１０００希釈；アメリカ合衆国のダコ（Ｄako））、抗−ＣＤ６８ ｍＡｂ（１：２５０希釈、ダコ）；内皮細胞：抗ＣＤ３１ ｍＡｂ（１：５０希釈；ダコ）；多形核白血球：抗ＣＤ４５ ｍＡｂ（１：１００希釈；ダコ）；および抗ウサギＴ−細胞：ＭＣＡ ８０５ ｍＡｂ（１：１０００希釈；ダコ）。シグナル検出のためにアビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ系を用いた（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖector laboratories））（Yla-Herttuala et al., (1995)上掲）。免疫染色後、組織切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【０１９４】
増殖指数の決定：５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識化（Soma et al., Arterioscler. Thromb. (1993) 13:571-578）を用いて、カラーを設置した動脈における増殖指数を決定した。すなわち、ニュージーランド白ウサギ（ｎ＝１２）に、屠殺の３時間前にＢｒｄＵ（体重１kg当たり４０mg）を注射した。７０％エタノール中で頚動脈を一夜固定し、パラフィン中に包埋した。核のヨウ化プロピジウム染色法に従って、連続切片（動物あたり２０切片）を染色して、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（ダコ）を用いてＢｒｄＵを検出した。標識指数をＢｒｄＵ陽性核のパーセンテージとして計算した。対側頚動脈を偽手術し、対照として用いた。
【０１９５】
プラスミド／リポソーム：以下のとおり、ｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）発現プラスミド（プロメガ（Ｐromega））をリポフェクチン試薬（ＢＲＬ）と複合体形成させた：プラスミド２５μgをリポフェクチン試薬２５μlとゆっくりと混合し、リンゲル溶液で５００μlに希釈した。プラスミド／リポフェクチン溶液中で沈殿物は見られなかった。該混合物を室温で少なくとも１５分間放置し、２時間以内に遺伝子導入のために用いた。プラスミド調製物を、リポ多糖汚染がないことについてチェックした（リムルス・アッセイ、シグマ・ケミカル・カンパニー）。
【０１９６】
レトロウイルス：該研究のために、ｌａｃＺ含有ｐＬＺＲＮＬ ＭＭＬＶレトロウイルス（Yla-Herttuala et al., (1995)上掲；Miyanohara et al., PNAS (1988) 85:6538-6542）またはＬａｃＺ ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルス（Yee et al., PNAS (1994) 91:9564-9568）を用いた。共に、５'ＬＴＲにより、ｌａｃＺの発現が駆動される。複製不全ＬＺＲＮＬ両栄養性レトロウイルスをＰＡ３１７細胞中にパッケージングし、従前の記載（Yla-Herttuala et al., (1995)上掲）に従って、力価５×１０５cfu／mlで用いた。複製不全ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスは、一過性トランスフェクションを用いて（Yee et al.上掲）２９３ ＧＰ細胞中で産生された。偽型レトロウイルスを、超遠心分離を用いて濃縮し、力価１×１０７cfu／mlで用いた。使用前、レトロウイルス調製物を、細菌学的汚染またはヘルパーウイルスがないことについてチェックした（Yee et al.上掲）。
【０１９７】
アデノウイルスベクター：該研究のために、複製不全Ｅｌ欠失アデノウイルスを用いた（Gosh-Choudhury et al., Gene (1986) 50: 161-171；Simari et al., J. Clin. Invest. (1996) 98: 225-235）。相同的組換え（Gosh-Choudhury et al., 上掲；Simari et al., 上掲）を用いて、β−アクチン−プロモーターおよびＣＭＶエンハンサー下の核標的β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡをアデノウイルスゲノムのＥｌ欠失領域にクローン化させた。複製不全アデノウイルスを２９３細胞中に産生させ、超遠心分離により濃縮した。遺伝子導入実験のために力価１×１０９pfu／mlを用いた。アデノウイルス調製物を、ヘルパーウイルスまたは細菌学的汚染がないことについて分析した（Gosh-Choudhury et al., 上掲）。
【０１９８】
結果：外膜カラーにより、手術の７−１４日後に新内膜過形成が生じた。内皮は該研究の全体にわたって解剖学的に無傷のままであった。ＢｒｄＵ標識は、手術の３日後に２３％のピーク増殖指数を示した。新内膜は、ＳＭＣのみから構成された。プラスミド／リポソーム複合体は、０.０１％未満の効率で外膜および外中膜中への検出可能な遺伝子導入を生じさせた。未トランスフェクトまたはリポソーム処理のカラーを取り付けた動脈は、β−ガラクトシダーゼ活性についての染色を示さなかった。
【０１９９】
おそらく、レトロウイルス遺伝子導入は増殖細胞中で生じるだけなので、外膜レトロウイルス遺伝子導入は、カラーなしではあまり効果的ではなかった。複製不全ＭＭＬＶレトロウイルスを用いた遺伝子導入効率は、低かった（０.０１％未満）。ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスを用いた遺伝子導入効率は、０.１％であった。ＭＭＬＶおよびＶＳＶ−Ｇレトロウイルスを用いると、β−ガラクトシダーゼ染色が外膜および外中膜中で見られた。
【０２００】
複製不全アデノウイルスは、効果的な遺伝子導入をもたらし、β−ガラクトシダーゼ染色が外膜および外中膜中で検出された。興味深いことには、染色は、いくつかの内皮細胞およびいくつかの内膜細胞中でも見られた。ｌａｃＺアデノウイルス構築物は、β−ガラクトシダーゼに対する核局在化シグナルを含有するので、強いＸ−ｇａｌ染色は、トランスフェクト細胞の核中にあった。遺伝子導入効率は、分析切片において染色された核の総数から概算すると、約１０％であった。ＶＳＶ−Ｇレトロウイルスおよびアデノウイルストランスフェクト動脈では、いくつかの炎症細胞が見られた。プラスミド／リポソームトランスフェクト動脈では、炎症細胞は全く見られなかった。
【０２０１】
この実施例では、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子の外膜および外中膜への導入は、全ての遺伝子導入系を用いて生じた。アデノウイルスもまた、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をいくつかの内皮細胞中に導入した。５日後、アデノウイルスベクターにより、細胞の１０％までがβ−ガラクトシダーゼ活性を示すという最高の遺伝子導入効率が得られた。偽型ＶＳＶ−Ｇレトロウイルスもまた、外膜および外中膜中で細胞の０.１％において遺伝子導入を成し遂げるのに効果的であった。プラスミド／リポソーム複合体およびＭＭＬＶレトロウイルスは、細胞の＜０.０１％を感染させた。いずれの遺伝子導入系を用いても有害な組織反応は見られなかった。
【０２０２】
かくして、複製不全アデノウイルス、ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスおよびプラスミド／リポソーム複合体は、カラー法を用いて動脈壁への遺伝子導入のために用いることができる。中膜ＳＭＣおよび内皮に対する効果は、外膜側から達成することができる。
【０２０３】
実施例３
この実施例では、ＶＥＧＦによるＰＧＩ２の刺激を試験した。
【０２０４】
細胞培養：ＨＵＶＥＣをクロネティクス（Ｃlonetics）から入手し、２％ＦＢＳで補足した製造者自身の培地中で培養させるか、または、コラゲナーゼ消化により新鮮な臍帯から増殖させ、２０％ＦＣＳおよび内皮細胞増殖サプリメントで補足した培地１９９において１％ゼラチン被覆プレート上で培養した（Wheeler-Jones et al., Biochem. J. (1996) 315:407-416）。実験目的のために、ＨＵＶＥＣの一次培養物を３７℃で５分間の０.０５％トリプシン／０.０２％ＥＤＴＡによる処理により分散させ、次いで、９０mm、６０mmまたは３５mmのプラスチック皿中、または、２４ウエルプレート上で再度平板培養した。培養物を３７℃で５％ＣＯ２および９０％空気を含有する加湿雰囲気中に維持し、６-８日後、または細胞が集密単層を形成した時に用いた。
【０２０５】
ＰＧＩ２アッセイ：２４ウエルプレート中のＨＵＶＥＣの集密培養物を無血清Ｍ１９９（ｐＨ７.４）中で２回洗浄し、ＶＥＧＦを含有する培地に暴露した。従前の記載（Wheeler-Jones et al., 上掲）に従って、ＰＧＩ２の安定な分解物である６−ケト−ＰＧＦ１ａのラジオイムノアッセイにより細胞上清のＰＧＩ２含量を定量化した。
【０２０６】
アラキドン酸放出：実質的に従前の記載（Domin and Rozengurt, J. Biol. Chem. (1993) 268:8927-8934）に従ってアラキドン酸放出を測定した。集密ＨＵＶＥＣ培養物を[５,６,８,９,１１,１２,１４,１５−３Ｈ]アラキドン酸（１mＣi／ml、２１１Ｃi／ミリモル）と一緒に２４時間インキュベートした。次いで、該細胞を培地１９９で２回洗浄し、０.３％ＢＳＡ（実質的に脂肪酸を含まない）およびＶＥＧＦまたはトロンビンで補足したこの培地１ml中でインキュベートした。処理後、培地を取り出し、１６,０００×ｇで５分間微量遠心器で遠心分離し、上清の放射能をシンチレーションカウンター中でカウントすることにより測定した。
【０２０７】
ウェスタンブロット法：上記ならびに結果および図面の説明の記載に従って、細胞の静止状態培養物の因子による処理、および、細胞溶解を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質をイモビロン（Immobilon）膜（ミリポア・インコーポレイテッド（Ｍillipore Inc.））に移した。ＭＡＰキナーゼアッセイのために、ＰＢＳ（ｐＨ７.２）中５％脱脂粉乳を用いて膜をブロックし、所定の一次抗体（１mg／ml）を含有するＰＢＳ／０.０５％トゥイーン−２０中で３−５時間インキュベートした。ｃＰＬＡ２に対する抗体を用いるイムノブロットのために、膜を０.２％（ｗ／ｖ）Ｉ−ブロック（トロピックス（Ｔropix））を含有するＴＢＳＴ５０mＭトリス／ＨＣl、１５０mＭ ＮaＣl、０.０２％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０（ｐＨ７.４）（ＴＢＳＴ）中で３時間ブロックし、次いで、ＴＢＳＴ中、一次抗血清と一緒にインキュベートした。次いで、膜をＴＢＳＴ中で６回洗浄し（各々１０分間洗浄）、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を含有するＴＢＳＴ中で１時間インキュベートした。製造者の使用説明書に従って、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧおよびＥＣＬＴＭ試薬を用いるケミルミネッセンスにより、免疫反応性バンドを視覚化した。
【０２０８】
ＭＡＰキナーゼアッセイ：所定の因子で細胞を処理し、氷冷ＰＢＳで２回迅速に洗浄し、すぐに、沸騰している２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液１００mlの添加により抽出した。細胞抽出物を掻取ることにより回収し、９５℃に１０分間加熱し、１２.５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で移動させた。イモビロン膜への移動後、Ｔｙｒ２０４（Payne et al., EMBO J. (1991) 10: 885-892）でのリン酸化により活性化されたｐ４２およびｐ４４ ＭＡＰキナーゼ（Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２）を特異的に認識する抗体でタンパク質をイムノブロットした。
【０２０９】
ｃＰＬＡ２移動度シフトアッセイ：６０mm皿中の集密静止状態ＨＵＶＥＣを無血清培地１９９（ｐＨ７.４）中で２回洗浄し、次いで、図面の説明で詳述した因子を含有する培地に所定の時間暴露させた。従前の記載（Wheeler-Jones et al., 上掲）に従って、細胞溶解物を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）によりタンパク質を分離し、膜への移動後、ｃＰＬＡ２に対するポリクローナル抗血清（BorschHaubold et al., J. Biol. Chem. (1995) 270: 25885-25892；および、Kramer et al.,J. Biol. Chem. (1996) 271:27723-27729）を用いてイムノブロットした。
【０２１０】
ｖＷＦ分泌のアッセイ：所定の因子で処理したＨＵＶＥＣの集密培養物から得られた培地の試料中でＥＬＩＳＡ（Wheeler-Jones et al., 上掲）によりｃＷＦ分泌を測定した。プレートは、抗ｖＷＦ ｍＡｂ ＣＬＢＲＡｇ３５で被覆されており、アッセイの検出下限は、約１.０mＵ／mlであった。
【０２１１】
材料：組換えＶＥＧＦは、ユービーアイ（ＵＢＩ）またはアール・アンド・ディ・システムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓystems）から入手した。組換えＰｌＧＦは、ワーナー・リゾー（Ｗerner Ｒisau）教授の寄贈物であり、また、アール・アンド・ディ・システムズからも入手された。ポリクローナルｃＰＬＡ２抗血清は、ラス・クラマー（Ｒuth Ｋramer）博士（インディアナポリスのイーライ・リリー（Ｅli Ｌilly））から快く提供された。抗ｖＷＦ ｍＡｂ ＣＬＢＲＡｇ３５は、ジェイ・エイ・ヴァン・モウリク（Ｊ. Ａ. Ｖan Ｍourik）博士（オランダ、アムステルダムのセントラル・ブラッド・ラボラトリー（Ｃentral Ｂlood Ｌaboratory））からの寄贈物であった。ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼの活性化リン酸化形態に対する抗体は、ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド（Ｎew Ｅngland Biolabs Inc.）から購入した。[５,６,８,９,１１,１２,１４,１５−３Ｈ]アラキドン酸、ＥＣＬＴＭ試薬およびＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧは、アマシャム（Ａmersham）（イギリス）から入手された。ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲートＩｇＧは、ピアス・インコーポレイテッド（Ｐierce Ｉnc.）から入手された。用いられる全ての他の試薬は、入手可能な最高純度のグレードのものであった。
【０２１２】
結果：ＨＵＶＥＣの集密培養物をＶＥＧＦで２時間までの様々な時間処理し、これらの時点で培地を取り出し、ＰＧＩ２の安定な代謝性分解物である６−ケトＰＧＦ１ａの存在についてアッセイした。ＶＥＧＦは、ＰＧＩ２の産生の時間依存性増加を生じ、これは、因子添加後の１５分ほどで検出可能であり、６０分間まで増加し続け、その後、２時間まで持続した。対照細胞は、試験された時間経過の間、ＰＧＩ２産生の非常にわずかな増加を示しただけであった。ＰＧＩ２産生のＶＥＧＦ刺激は、また、濃度依存性であった。６０分間インキュベートした後、ＰＧＩ２合成の増加は、５ng／mlで検出可能であり、１０ng／mlで最大値の半分であり、１５ng／mlで最大に達した。一貫して、ＶＥＧＦ誘発ＰＧＩ２合成が２５ng／mlでわずかに低下することに注目した。
【０２１３】
さらに、Ｆｌｔ−１ ＶＥＧＦ受容体に対して特異的なリガンドであるＶＥＧＦ関連因子ＰｌＧＦがＨＵＶＥＣ中でＰＧＩ２合成を誘発することができるかを試験した。５つの独立した試験において、ＰｌＧＦは、ＶＥＧＦよりも有意に弱くＰＧＩ２合成を刺激した。さらに、ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦの両方の応答を、内皮細胞および血小板におけるプロスタノイド合成の有効なインデューサーであるトロンビンの応答と比較した。ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦおよびトロンビンの効果を平行培養物中で直接比較したいくつかの独立した試験において、２５ng／ml ＶＥＧＦ、６０ng／ml ＰｌＧＦおよび１Ｕ／mlトロンビンと一緒に６０分間インキュベートすることにより産生された６−ケトＰＧＦ１ａの平均増加倍数は、各々、平均対照非刺激レベルの２.０倍、１.３倍および４.４倍であった。
【０２１４】
ＰＧＩ２合成のＶＥＧＦ刺激がＰＬＡ２のイソ形態の活性化により媒介された場合、ＶＥＧＦは、細胞からのアラキドン酸の迅速な動員を生じると予測される。これを試験するために、ＨＵＶＥＣを放射性標識アラキドン酸と一緒に２４時間プレインキュベートし、次いで、ＶＥＧＦで様々な時間で抗原投与した。ＶＥＧＦは、プレ標識細胞の培地中に放出された標識の増加を生じ、これは、因子添加後、１０分で明らかになり、３０分で最大に達した。平行培養物中で測定した場合、ＶＥＧＦ刺激性アラキドン酸放出のための時間経過は、トロンビンについてのものと非常に類似していた。ＶＥＧＦ刺激性アラキドン酸放出についての濃度依存性は、ＰＧＩ２産生について得られたものと非常に類似しており、２.５−５ng／mlで最大効果の半分であり、１０−２０ng／mlで最大であった。トロンビンおよびＶＥＧＦのＰＧＩ２産生を刺激する相対的な能力と同様に、一貫して、最大ＶＥＧＦ誘発アラキドン酸放出は、トロンビンについて得られたものよりも低かった。４つの独立した試験において、ＶＥＧＦおよびトロンビンは、各々、基本的な非刺激レベルの１.６倍および３.４倍の標識アラキドン酸の放出の平均増加を生じた。ＰｌＧＦは、プレ標識ＨＵＶＥＣからのアラキドン酸放出の検出可能な有意な増加を生じなかった。
【０２１５】
迅速なＶＥＧＦ刺激性アラキドン酸放出についての妥当と思われる１つのメカニズムは、サイトゾル形態のＰＬＡ２により触媒化されるアラキドン酸の直接酵素的放出である。ｃＰＬＡ２は、ＭＡＰキナーゼ依存性リン酸化により活性化させることができ、ＭＡＰキナーゼを含む他の酵素のリン酸化および活性化と同様に、ｃＰＬＡ２のその活性化形態への転換は、高速移動形態から低速移動形態へのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるその移動度のシフトによりモニターリングすることができる。したがって、ＶＥＧＦに対する応答におけるｃＰＬＡ２の活性化は、ｃＰＬＡ２に対する特異的抗体（BorschHaubold et al., 上掲、および、Kramer et al., 上掲）を用いてＨＵＶＥＣ抽出物のウェスタンブロット分析法により測定された。対照の非刺激ＨＵＶＥＣの抽出物において、ｃＰＬＡ２に対する抗体は、ほぼ等しい強度の、ほぼＭｒ ９７,０００について移動する２つの明瞭なバンドを認識した。ｃＰＬＡ２は、８５ｋＤａの予測分子量を有するが、このタンパク質は、９７ｋＤａバンドとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて移動することが従前に報告されていた（BorschHaubold et al., 上掲、および、Kramer et al., 上掲）。
【０２１６】
２５ng／mlのＶＥＧＦは、低速移動形態のｃＰＬＡ２の免疫反応性の著しい増加、および、付随的なより高速の移動形態の相対的な減少を生じ、これは、ＶＥＧＦ添加の２分後に検出可能であり、１５分後に最大に達し、６０分後まで持続した。５つの独立した試験において、一貫して、ＶＥＧＦは、より低速の移動形態のｃＰＬＡ２の免疫反応性の著しい増加を生じた。ｃＰＬＡ２の電気泳動移動度のＶＥＧＦ誘発性低下もまた、濃度依存性であり、２.５ng／mlで低速移動形態が著しく増加し、試験された最高濃度５−１０ng／mlで最大に増加した。ＶＥＧＦは、より高速の移動形態のｃＰＬＡ２のレベルの見掛の低下を生じたが、この種は、試験された全てのＶＥＧＦ濃度および処理時間で明らかであった。トロンビンはまた、より高速の移動形態からより低速の移動形態へのｃＰＬＡ２の移動の著しいシフトを生じた。どちらも正確に、ＶＥＧＦ処理ＨＵＶＥＣの抽出物中で検出されたものと共に移動した。同実験におけるＶＥＧＦおよびトロンビンの効果の直接比較は、ＰＧＩ２合成およびアラキドン酸放出について得られた結果と同様に、トロンビンは、より高速の移動形態の該酵素の実質的に完全な消失を伴って、ｃＰＬＡ２のゲル遅延のさらに著しい増加を生じた。ＰｌＧＦは、免疫反応性ｃＰＬＡ２のより高速の移動形態からより低速の移動形態への移動度において検出可能なシフトを生じなかった。
【０２１７】
さらに、ＶＥＧＦがまた、ＨＵＶＥＣによるｖＷＦ分泌を誘発したかを試験した。ＶＥＧＦは、ｖＷＦの時間および濃度依存性産生を刺激した。ｖＷＦは、早ければ２５ng／ml ＶＥＧＦの細胞への添加の３０分後にはＨＵＶＥＣ培地中で検出可能であり、試験された時間経過の間、増加し続け、３時間後、対照細胞におけるよりも２.５倍高いレベルに到達した。ＶＥＧＦの効果についての濃度依存性は、ＰＧＩ２産生について得られたものと同様であり、約１０ng／mlで最大応答の半分であり、試験された最高濃度である２５mg／mlで最大効果であった。ＰＧＩ２合成について得られた結果と同様に、ＶＥＧＦの効果は、トロンビンのものよりも一貫して弱いが、それに匹敵した（図１２Ａ）。ＶＥＧＦとは対照的に、ＰｌＧＦは、ＨＵＶＥＣにおけるｖＷＦ分泌の検出の可能な刺激を生じなかった。走化性チャンバーにおけるＨＵＶＥＣの移動に対するＶＥＧＦおよびＰｌＧＦの効果の比較により、ＶＥＧＦは、走化性の濃度依存性増加を刺激したが、ＰｌＧＦは、５−６０ng／mlの濃度範囲で検出可能な増加を生じなかったことが判明した。
【０２１８】
ＶＥＧＦは、ＨＵＶＥＣにおいてｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼを活性化する。ＭＡＰキナーゼが他の因子によるｃＰＬＡ２活性化に関与したことを考慮すると、これは、ＭＡＰキナーゼカスケードがＶＥＧＦ誘発性ＰＧＩ２合成およびｃＰＬＡ２活性化を媒介する可能性を生じた。集密的ＨＵＶＥＣにおけるｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼ活性のＶＥＧＦ刺激性活性化についての濃度依存性を試験した。細胞のＶＥＧＦへの１５分間暴露により、０.５nｇ／mlの低い濃度で活性の検出可能な増加を生じ、１〜５ng／mlで最大の半分の増加を生じ、１０ng／mlで最大効果を生じ、５０ng／mlまで持続した。ＶＥＧＦの著しい効果とは対照的に、１−６０ng／mlの濃度範囲のＰｌＧＦは、如何なる場合も、ＨＵＶＥＣにおけるＭＡＰキナーゼ活性の検出可能な増加をあまり生じなかった。ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼのＶＥＧＦ刺激は、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼを特異的にリン酸化および活性化する二重特異性トレオニンおよびチロシンキナーゼであるＭＡＰキナーゼキナーゼの選択阻害物質であるＰＤ９８０５９（Dudley et al., PNAS USA (1995) 92:7686-7689）での３０分間の前処理より完全に阻害された。該阻害物質の効果は、５mＭで５０％よりも大きい阻害、および、１０−２０mＭの対照非刺激レベルへのＭＡＰキナーゼ活性の低下を伴う濃度依存性である。
【０２１９】
ＶＥＧＦ誘発アラキドン酸動員経路におけるＭＡＰキナーゼカスケードの役割は、最初に、ＰＧＩ２合成に対するＰＤ９８０５９の効果を試験することにより研究された。ＨＵＶＥＣの３０mＭ ＰＤ９８０５９での３０分間の前処理は、２５ng／ml ＶＥＧＦまたは１Ｕ／mlトロンビンと一緒の次なる６０分間インキュベーションにより誘発されるＰＧＩ２産生を完全に阻害した。ＶＥＧＦ誘発性ＰＧＩ２合成に対するＰＤ９８０５９の効果は、約５mＭで最大の半分の効果、および、１０mＭで刺激されたＰＧＩ２産生に対する最大阻害効果を伴う濃度依存性であった。ＰＤ９８０５９が、ＶＥＧＦ処理細胞におけるＰＧＩ２産生を対照細胞において測定された値よりも減少させたことを示したが、この効果は、１０mＭよりも高い阻害物質濃度で明らかなだけであった。
【０２２０】
次に、ＰＤ９８０５９が、ｃＰＬＡ２の電気泳動移動度のＶＥＧＦ誘発性減少に対して効果を及ぼすかを試験した。２５mＭのＰＤ９８０５９での前処理は、低速移動形態のｃＰＬＡ２のＶＥＧＦ刺激性増加を完全にブロックした。ＰＧＩ２合成に対するＰＤ９８０５９の効果と同様に、該阻害物質は、ｃＰＬＡ２ゲル移動度のＶＥＧＦ依存性低下を逆転させるだけではなく、より低速の移動形成の免疫反応性を対照レベル以下に低下させ、より高速の移動形態の免疫反応性を対照レベル以上に上昇させた。
【０２２１】
ＶＥＧＦ誘発ｃＰＬＡ２活性化およびＰＧＩ２合成に対するＰＤ９８０５９の効果の選択性は、ＶＥＧＦ刺激性ｖＷＦ産生がＰＤ９８０５９による阻害の影響を受け易いかを試験することにより研究された。ｃＰＬＡ２活性化およびＰＧＩ２合成に対するＰＤ９８０５９の効果とは対照的に、ＨＵＶＥＣの２５mＭのＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害物質による前処理は、次のＶＥＧＦの添加により生じたｖＷＦの分泌を防止したり有意に低下させたりしなかった。ＰＤ９８０５９は、また、基底またはトロンビン刺激性ｖＷＦ分泌に対して効果を全く及ぼさなかった。
【０２２２】
結論：ＶＥＧＦは、１５分以内で検出可能であり、１０ng／mlで最大の半分であり、６０分後に１５ng／mlで最大であったＰＧＩ２合成の時間および濃度依存性増加を刺激した。１０個の独立した試験において、平均最大ＶＥＧＦ刺激性ＰＧＩ２合成は、６０分後、２５ng／mlで基底の２倍以上のレベルであった。ＶＥＧＦ関連因子である胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）は、非常に弱い１.３倍増加を誘発し、トロンビン（１Ｕ／ml、６０分）は、対照レベルよりも４.４倍高い平均最大増加を誘発した。ＶＥＧＦは、より迅速な速度（最大の半分のアラキドン酸動員が１０分後に起こり、３０分後に最大であった）を伴う以外はＰＧＩ２合成について得られたものと同様の濃度依存性を伴ってＨＵＶＥＣからのアラキドン酸の放出を刺激した。活性化のマーカーとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度シフトを用いるサイトゾルホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）活性化の測定は、ＶＥＧＦが時間および濃度依存的にｃＰＬＡ２活性を刺激したことを示した：低速移動および活性化形態のｃＰＬＡ２の増加が早くも２分で生じ、２.５ng／mlの低さで検出可能であり、１５分後に５ng／mlで最大に到達した。ＰＧＩ２合成を誘発する他の薬剤と同様に、ＶＥＧＦはまた、３０分以内で検出可能であり、１０ng／mlで最大の半分であり、２５ng／mlでの３時間処理後に対照レベルよりも２.５倍高いレベルに到達したＨＵＶＥＣにおけるフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）の分泌の著しい時間および濃度依存性増加を生じた。ＶＥＧＦは、１ng／mlの低さで検出可能であり、５−１０ng／mlで最大値に到達したｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼの迅速かつ一過性の活性化を誘発した。対照的に、ＰｌＧＦは、ＭＡＰキナーゼ活性に対してあまり効果を及ぼさなかった。ＭＡＰキナーゼキナーゼの選択的阻害物質であるＰＤ９８０５９は、ＶＥＧＦ刺激性ＭＡＰキナーゼ活性、ＰＧＩ２合成およびｃＰＬＡ２ゲル遅延の完全な阻害を生じたが、ＶＥＧＦ誘発性ｖＷＦ分泌に対して効果を及ぼさなかった。これらの知見は、ＶＥＧＦがｃＰＬＡ２媒介アラキドン酸放出を介するＰＧＩ２合成を刺激することができるという最初の証拠を提供する。これらの知見は、また、この生合成経路のＶＥＧＦ刺激が、少なくとも一部分、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼの活性化を介して生じ得ることを示す。
【０２２３】
ここで示された結果は、ＶＥＧＦがＨＵＶＥＣにおけるＰＧＩ２産生の著しい時間および濃度依存性増加を刺激することを示す。ＶＥＧＦの効果は、トロンビンのものよりも弱いが、２つの因子に対する応答は、平均して２.５のファクターだけ変化した。ＶＥＧＦは、ヒト内皮細胞からのアラキドン酸の迅速な動員およびゲル遅延アッセイにより判断されるようなｃＰＬＡ２の迅速な活性化を刺激する。アラキドン酸動員に対するＶＥＧＦの効果を測定するために用いられる方法は、３Ｈ−アラキドン酸で前標識した細胞からの３Ｈ−標識の放出に基づく。アラキドン酸放出の研究は、培地中に存在するＢＳＡを用いて行われるので、ＨＵＶＥＣから放出された主要産生物は、３Ｈ−アラキドン酸である可能性が高い。ＶＥＧＦ誘発ＰＧＩ２産生、アラキドン酸放出およびｃＰＬＡ２活性化についての濃度依存性は、お互いに類似していた（全て、５−１０ng／mlの範囲内）。これらの結果は、アラキドン酸放出およびＰＧＩ２合成のＶＥＧＦ刺激がＨＵＶＥＣにおけるこの因子に対する高親和性受容体を介して媒介されることを示す。
【０２２４】
アラキドン酸放出およびｃＰＬＡ２移動度シフトは、共に、ＰＧＩ２合成よりも迅速に生じ、ＰＧＩ２の増加した産生が、少なくとも一部分、増加したｃＰＬＡ２活性の直接的結果および構成酵素ＣＯＸ−１に対する基質である細胞内アラキドン酸の利用性の次なる増加である可能性が非常に高いという見解と一致する。ＶＥＧＦは、ホスホリパーゼＣ−ｇチロシンリン酸化およびホスホイノシチド代謝を刺激することが知られているので、ホスホリパーゼＣ−ｇ（および／または、ホスホリパーゼＤ）およびジアシル−およびモノアシルグリセロールリパーゼの続発性作用を含む他のメカニズムは、ＰＧＩ２合成のＶＥＧＦ誘発アラキドン酸動員に寄与し得ることは全く妥当であると思われる。
【０２２５】
ＶＥＧＦ関連因子、ＰｌＧＦ、Ｆｌｔ−１に対して特異的なリガンドがＰＧＩ２の発生を刺激するかを研究した。結果は、ＰｌＧＦがＰＧＩ２合成を誘発することができるが、ＶＥＧＦよりも弱いことを示唆する。アラキドン酸放出またはｃＰＬＡ２移動度シフトに対するＰｌＧＦの有意な効果は、全く検出されなかった。ＰｌＧＦは、Ｆｌｔ−１ ＶＥＧＦ受容体にのみ高親和性をもって結合するので、これらの結果は、ＨＵＶＥＣ中でのＶＥＧＦによるＰＧＩ２産生の刺激が主にＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体により媒介されるが、Ｆｌｔ−１もまたこの経路の刺激に対して寄与し得るという結論とほとんど一致する。しかしながら、Ｆｌｔ−１媒介ＰＧＩ２合成は、ｃＰＬＡ２リン酸化以外のメカニズムを含むことは明らかである。少なくとも２つの説明は、ＰｌＧＦに対する比較的低い応答を説明することができる。Ｆｌｔ−１は、弱い応答を誘発し、および／または、Ｆｌｔ−１は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１よりも低いレベルで存在する。
【０２２６】
ここで示した結果は、ＶＥＧＦが時間および濃度依存的にｖＷＦの分泌を誘発したことを示す。ｖＷＦ分泌に対するＶＥＧＦの効果についての濃度依存性は、ＰＧＩ２合成およびアラキドン酸動員についてのものと厳密に一致する。ＰＧＩ２合成に対するＰｌＧＦの比較的弱い効果とは対照的に、ＰｌＧＦは、ＨＵＶＥＣによるｖＷＦ放出の検出可能な増加を刺激しなかった。
【０２２７】
ＶＥＧＦがｃＰＬＡ２の電気泳動移動度の迅速なシフトを生じるという知見は、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼの増加したリン酸化および結果としての活性化と一致する。これは、血小板中でｃＰＬＡ２リン酸化および活性化を刺激することが知られているトロンビンがＨＵＶＥＣ中でのｃＰＬＡ２移動度の同様のシフトを生じたというここで示された知見により支持される。ここで示された結果は、ＶＥＧＦがｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰキナーゼを活性化し、ＭＡＰキナーゼキナーゼの選択的阻害物質であるＰＤ９８０５９によるこの経路の阻害がＰＧＩ２産生およびＶＥＧＦにより誘発されたｃＰＬＡ２の増加したゲル遅延をブロックすることも示す。ＰＤ９８０５９の効果は、ＶＥＧＦＤまたはトロンビンのいずれかにより刺激されるｖＷＦ分泌に対して効果を及ぼさなかったので、少なくとも部分的に、選択的であった。ＶＥＧＦの著しい効果と対照的に、ＰｌＧＦは、ＭＡＰキナーゼ活性を有意には増加させなかった。ＰｌＧＦのＭＡＰキナーゼ活性を刺激する能力が明らかにないことは、概して、ＶＥＧＦと比較してＰＧＩ２産生に対するこの因子の非常に弱い効果およびこの因子のｃＰＬＡ２ゲル遅延を促進する能力が明らかにないことと一致する。
【０２２８】
ＨＵＶＥＣにおけるＰＧＩ２産生のアッセイは、合成の有意な基底レベルの存在を示した。おもしろいことには、ＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害物質はまた、刺激を受けていない細胞である対照におけるＰＧＩ２産生をなくした。ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化を介するＰＧＩ２発生の媒介と一致して、ＰＤ９８０５９はまた、低速移動性リン酸化形態のｃＰＬＡ２のレベルを対照レベル以下に低下させ、高速移動性のあまりリン酸化されていない形態のレベルを対照レベル以上に増加させた。ＭＡＰキナーゼ活性のアッセイは、ＰＤ９８０５９により阻害可能であった有意なレベルの基底活性を示唆した。これらの知見は、ＭＡＰキナーゼ活性化がＶＥＧＦおよびトロンビン依存性ｃＰＬＡ２活性化に関与し得るだけではなく、基底ＭＡＰキナーゼ活性が構成的ｃＰＬＡ２活性およびＰＧＩ２産生の維持のために必要とされ得ることを示唆する。
【０２２９】
他のシグナル発生メカニズムが、細胞内[Ｃa２＋]の上昇を含むＰＧＩ２合成およびアラキドン酸放出のＶＥＧＦ刺激に寄与し得ることが妥当であると思われる。
【０２３０】
ＶＥＧＦは、現在まで、主に、内皮細胞成長および移動を促進する血管形成因子であると考えられてきた。ここで示した知見は、さらなる活性を明らかし、したがって、内皮機能の調節およびＶＥＧＦの機能の理解の両方に、ならびに狭窄、再狭窄、アテローム性動脈硬化症および高血圧症などの血管障害の治療および予防に重要な意味をもつ。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】血管の周囲の所定個所にある本発明の装置の略縦断面図である。
【図２】図１に示されるＡ−Ａ線に沿った、同具体例の略冠状断面図である。
【図３】端−端吻合の周囲にある装置の第２の具体例の略斜視図を示す。
【図４】図３の具体例の鉛直面での縦断面図である。
【図５】シール部について別の構造を有する具体例の変形例を示す以外は、図４のものと同様の図である。
【図６】端−側吻合の周囲にある装置の第３の具体例の略斜視図を示す。
【図７】図６の具体例の鉛直面での縦断面図である。
【図８】側−側吻合の周囲にある装置の第４の具体例の略斜視図を示す。
【図９】図８の具体例の鉛直面での縦断面図である。
【図１０】一部包埋血管を示す側−側吻合の周囲にある装置の第５の具体例の略斜視図を示す。
【図１１】図１０の具体例の鉛直面での縦断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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