(57)【要約】ウイルスを介して送達することを使用せずに、ヌクレアーゼを介して初代細胞の遺伝子編集を行うための方法及び組成物が提供される。編集された初代細胞を用いた治療の方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変した細胞であって、前記改変した細胞は以下を含む：
外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドであって、前記外因性のヌクレオチド配列は以下を含む：
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列であって、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、並びに、
ここで、前記改変した細胞は実質的にウイルスを介した送達の成分を含まない。
【請求項２】
T細胞を含む改変した細胞物であって、前記T細胞は以下を含む：
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
c)  第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
d)  第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、内因性のTCR-アルファの座位の中に組み込まれている、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、各々のポリペプチド配列を1つのポリペプチドとして発現することができるように配向されている、ここで、第2リンカーのポリペプチド配列は、TCR-アルファのポリペプチド配列とTCR-ベータのポリペプチド配列との間に位置する、前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドは、TCR-アルファのポリペプチド配列及びTCR-ベータのポリペプチド配列がそれぞれ別個のポリペプチドを形成するように、T細胞中で切断され得る切断可能なリンカーのポリペプチドである、ここで、別個のポリペプチドは一緒に会合して機能的なTCRを形成することができる、ここで、前記改変した細胞は、実質的にウイルスを介した送達の成分を含まない、並びに、
ここで、内因性のTCR-ベータ遺伝子座位は破壊されている。
【請求項３】
請求項1に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む、ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含む、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれている、並びに前記組み込まれたヌクレオチド配列は、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている。
【請求項４】
請求項1〜3に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の規定したヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【請求項５】
T細胞を含む改変した細胞物であって、前記T細胞は以下を含む：
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
c)  第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
d)  第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、内因性のTCRの座位の中に組み込まれている、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、各々のポリペプチド配列を1つのポリペプチドとして発現することができるように配向されている、ここで、第2リンカーのポリペプチド配列は、TCR-アルファのポリペプチド配列とTCR-ベータのポリペプチド配列との間に位置する、並びに前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドは、TCR-アルファのポリペプチド配列及びTCR-ベータのポリペプチド配列がそれぞれ別個のポリペプチドを形成するように、T細胞中で切断され得る切断可能なリンカーのポリペプチドである、ここで、別個のポリペプチドは一緒に会合して機能的なTCRを形成することができる。
【請求項６】
請求項5に記載の改変した細胞、ここで前記改変した細胞は、外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記外因性のヌクレオチド配列は、以下を含む：: 
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、並びに第1リンカー及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、をコードするヌクレオチド配列；
b)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに内因性のTCR遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、内因性のTCR遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている。
【請求項７】
請求項5又は6に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、実質的にウイルスを介した送達の成分を含まない。
【請求項８】
請求項5〜7の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、内因性のTCR遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【請求項９】
請求項1〜8の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を更に含む。
【請求項１０】
請求項9に記載の改変した細胞、ここで、前記非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、以下からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域における変異を含む：翻訳されるタンパク質のフレームの変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及び1つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)。
【請求項１１】
請求項9に記載の改変した細胞、ここで、前記非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、以下からなる群より選択される遺伝子のノン‐コーディング領域における変異を含む：前記遺伝子によってコードされるmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子によってコードされるmRNA産物の安定性を変える変異。
【請求項１２】
請求項9〜11の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、前記改変した細胞内の第2の規定したヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【請求項１３】
請求項4又は請求項8〜12の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ又はその誘導体、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)又はその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)又はその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)又はその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。
【請求項１４】
請求項13に記載の改変した細胞、ここで、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。
【請求項１５】
請求項4又は請求項8〜14の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。
【請求項１６】
請求項4又は請求項8〜14の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、前記改変した細胞内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。
【請求項１７】
請求項4又は請求項8〜16の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を含む。
【請求項１８】
請求項17に記載の改変した細胞、ここで、前記crRNAはガイドRNA(gRNA)を含む、ここで、前記gRNAは規定されたヌクレオチド配列に対して相補的である。
【請求項１９】
請求項18に記載の改変した細胞、ここで、前記crRNA及び前記tracrRNAは、単一のポリヌクレオチド上にある。
【請求項２０】
請求項18に記載の改変した細胞、ここで、前記crRNA及び前記tracrRNAは、別個のポリヌクレオチド上にある。
【請求項２１】
請求項1〜20の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又はそのコードされたポリペプチド配列の発現が、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。
【請求項２２】
請求項1〜20の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又はそのコードされたポリペプチド配列の発現が、外因性プロモーターによって指示される。
【請求項２３】
請求項22に記載の改変した細胞、ここで、前記外因性プロモーターが、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターの融合、プロモーターの2つの部分の融合、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ‐アクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター系、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター系、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター系からなる群より選択される。
【請求項２４】
請求項1〜23の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又はTCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、100塩基長以上である。
【請求項２５】
請求項1〜23の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又はTCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【請求項２６】
請求項1〜25の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項２７】
請求項1〜26の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項２８】
請求項1〜25の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列、及び前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列が、それぞれ長さが600塩基以上である。
【請求項２９】
請求項4又は請求項8〜28の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記規定されたヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列の組み込み後に破壊される。
【請求項３０】
請求項1〜29の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位と動作可能的に関連する内因性遺伝子の発現が破壊される。
【請求項３１】
相同組換え率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項1〜30の何れか一項に記載の改変した細胞。
【請求項３２】
請求項31に記載の改変した細胞、ここで、前記相同組換え率を増加させることができる追加の試薬は、相同組換え修復経路の活性化因子、非相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)修復経路の阻害因子、又はそれらの組み合わせを含む。
【請求項３３】
改変した細胞の生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項1〜32の何れか一項に記載の改変した細胞。
【請求項３４】
請求項33に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞の生存率を増加させることができる追加の試薬が、核酸感知(nucleic acid sensing)経路の阻害因子を含む。
【請求項３５】
請求項34に記載の改変した細胞、ここで、前記核酸感知(nucleic acid sensing)経路は、以下から選択される群を含む：TLR9核酸感知(nucleic acid sensing)経路、AIM2核酸感知(nucleic acid sensing)経路、IFI16核酸感知(nucleic acid sensing)経路、cGAS核酸感知(nucleic acid sensing)経路、及び細胞質ゾル核酸感知(nucleic acid sensing)経路。
【請求項３６】
請求項34に記載の改変した細胞、ここで、前記核酸感知(nucleic acid sensing)経路の阻害因子は、オリゴヌクレオチド・アンタゴニストを含む。
【請求項３７】
請求項36に記載の改変した細胞、ここで、前記オリゴヌクレオチド・アンタゴニストは、配列TTAGGG又はそのタンデム・リピートを含む。
【請求項３８】
請求項1〜4の何れか一項又は請求項6〜33の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、プラスミド又はナノプラスミドを含む。
【請求項３９】
請求項38に記載の改変した細胞、ここで、前記プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、並びにここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記第1リンカー及び第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ではない、前記第1の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、及び前記第2の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、ヌクレオチド配列である。
【請求項４０】
請求項1〜4の何れか一項又は請求項6〜39の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【請求項４１】
請求項1〜40の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。
【請求項４２】
請求項1〜40の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位は、イントロンを含む。
【請求項４３】
請求項1〜42の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位は、T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む、。
【請求項４４】
請求項43に記載の改変した細胞、ここで、前記第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子は、破壊されたTCR-ベータ遺伝子である。
【請求項４５】
請求項1〜42の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位は、TCR-ベータ遺伝子座位を含む、。
【請求項４６】
請求項45に記載の改変した細胞、ここで、前記第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子は、破壊されたTCR-アルファ遺伝子である。
【請求項４７】
請求項1〜4の何れか一項又は請求項9〜42の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノム・ターゲットは、免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。
【請求項４８】
請求項47に記載の改変した細胞、ここで、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【請求項４９】
請求項1〜4の何れか一項又は請求項9〜48の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む。
【請求項５０】
請求項49に記載の改変した細胞、ここで、前記リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。
【請求項５１】
請求項50に記載の改変した細胞、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、フリン切断部位を含む。
【請求項５２】
請求項5〜51の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記リンカー配列の何れか1つは、以下からなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む：T2A、E2A、P2A、及びF2A。
【請求項５３】
請求項5〜52の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、Gly-Ser-Glyリンカーを含む、任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端にある、及び任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、N末端からC末端の方向で、フリン切断部位：Gly-Ser-Glyリンカー：2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)の並びの中にある。
【請求項５４】
請求項49に記載の改変した細胞、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項５５】
請求項49に記載の改変した細胞、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、外因性のプロモーターを含む。
【請求項５６】
請求項5〜55の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列がスプライス・アクセプター配列を含む。
【請求項５７】
請求項5〜56の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、シグナル・ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ここで、前記シグナル・ペプチドは、遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部によってコードされるポリペプチドに動作可能的に連結されている。
【請求項５８】
請求項57に記載の改変した細胞、ここで、前記シグナル・ペプチドは外因性のシグナル・ペプチドである、任意選択的に、ここで、前記外因性のシグナル・ペプチドはヒト成長ホルモンのシグナル・ペプチドである。
【請求項５９】
請求項5〜58の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。
【請求項６０】
請求項59に記載の改変した細胞、ここで、同じリンカーのポリペプチド配列をコードする、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、コドンが分岐している(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが分岐している(codon diverged)。
【請求項６１】
請求項1〜4の何れか一項又は請求項9〜56の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。
【請求項６２】
請求項61に記載の改変した細胞、ここで、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群より選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【請求項６３】
請求項1〜4の何れか一項又は請求項9〜56の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、ノンコーディング領域(non-coding region)をコードする。
【請求項６４】
請求項63に記載の改変した細胞、ここで、前記ノンコーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。
【請求項６５】
請求項1〜4の何れか一項又は請求項9〜56の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部はTCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【請求項６６】
請求項65に記載の改変した細胞、ここで、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む：
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及び
c)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項６７】
請求項5〜66の何れか一項に記載の改変細胞、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される：マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するために最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部。
【請求項６８】
請求項5〜67の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部によってコードされるポリペプチドは、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列とのより大きな関連性を示す、任意選択的に、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して互いにより大きな関連性を示す。
【請求項６９】
請求項5〜68の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端に、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、で並んでいる。
【請求項７０】
請求項5〜68の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端に、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、で並んでいる。
【請求項７１】
請求項1〜70の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コドンが分岐している(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記コドンが分岐している(codon diverged)ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドンが分岐している(codon diverged)。
【請求項７２】
請求項1〜71の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は免疫細胞を含む。
【請求項７３】
請求項72に記載の改変した細胞、ここで、前記免疫細胞はT細胞を含む。
【請求項７４】
請求項73に記載の改変した細胞、ここで前記T細胞は、以下からなる群より選択される：細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、初代T細胞、腫瘍浸潤T細胞、操作したT細胞、調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、アルファ-ベータT細胞、及びガンマ-デルタT細胞。
【請求項７５】
請求項72に記載の改変した細胞、ここで、前記免疫細胞は、ナチュラル・キラー細胞を含む。
【請求項７６】
請求項72に記載の改変した細胞、ここで、前記免疫細胞は、以下からなる群より選択される：B細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラーT細胞。
【請求項７７】
請求項1〜71の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は幹細胞を含む。
【請求項７８】
請求項78に記載の改変した細胞、ここで、前記幹細胞は造血幹細胞を含む。
【請求項７９】
請求項78に記載の改変した細胞、ここで、前記幹細胞は胚性幹細胞を含む。
【請求項８０】
請求項1〜79の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は初代細胞である。
【請求項８１】
請求項1〜81の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は単離した細胞である、ここで、前記単離した細胞は対象から単離する。
【請求項８２】
請求項81の改変した細胞、ここで、前記対象はがんを有していることが判明している、又は、そのような疑いがある。
【請求項８３】
請求項1〜82の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞はヒト細胞又はヒト由来細胞を含む。
【請求項８４】
請求項1〜83の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、ex vivo培養細胞である。
【請求項８５】
請求項84に記載の改変した細胞、ここで、前記ex vivo培養細胞は、刺激された細胞を含む。
【請求項８６】
請求項85に記載の改変した細胞、ここで、前記刺激された細胞はサイトカインで刺激されたT細胞を含み、任意選択的に、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞はCD3で刺激されたT細胞、CD28で刺激されたT細胞、又はCD3及びCD28で刺激されたT細胞、を含む。
【請求項８７】
請求項86に記載の改変した細胞、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL7、IL15、又はそれらの組合せの存在下で培養する。
【請求項８８】
請求項86又は87に記載の改変した細胞、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2の存在下で培養する。
【請求項８９】
請求項86又は87に記載の改変した細胞、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2を実質的に含まない培地中で培養する。
【請求項９０】
請求項1〜89の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は組み込まれたウイルスを含まない、ここで、前記組み込まれたウイルスは前記ウイルスを介した送達の成分と動作可能的に関連している。
【請求項９１】
請求項1〜89の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞の表面上のMHCクラスIは、ウイルスを介した送達の成分又は組み込まれたウイルスに由来するペプチドを含まない、ここで、前記組み込まれたウイルスはウイルスを介した送達の成分と動作可能的に関連している。
【請求項９２】
請求項1〜89の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、第2の外因性ヌクレオチド組成物を含む第2の環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記第2の外因性ヌクレオチド組成物は、以下を含む： 
a)  第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに、
前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の前記第1領域及び前記第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えが容易になるように配向されている。
【請求項９３】
請求項92に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は第2の組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む、ここで、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれていて、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている。
【請求項９４】
請求項3〜93の何れか一項に記載の改変した細胞を含む細胞の集団、ここで前記集団の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超は組み込まれたヌクレオチド配列を含む。
【請求項９５】
請求項94に記載の細胞の集団、ここで、前記改変した細胞は、前記組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、ソーティング、選択、又は単離されていない。
【請求項９６】
以下を含む細胞の集団：
組み込まれたヌクレオチド配列、
ここで、組み込まれたヌクレオチド配列は遺伝子の少なくとも一部を含み、前記組み込まれたヌクレオチド配列は内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で組み込まれ、そして前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている、
ここで、前記細胞の集団はウイルスを介した送達の成分を実質的に含まず、並びに
ここで、前記集団中のT細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超は組み込まれたヌクレオチド配列を含む。
【請求項９７】
請求項96に記載の細胞の集団、ここで、前記T細胞は、前記組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、ソーティング、選択、又は単離されていない。
【請求項９８】
請求項96又は97に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、内因性のTCR遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【請求項９９】
請求項96〜98の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記外因性のヌクレオチド配列は以下を含む： 
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  前記内因性遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列、及び
c)  前記内因性遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに
前記内因性遺伝子座位の前記第1領域及び前記第2領域と同一のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座位での相同組換えが容易になるように配向されている。
【請求項１００】
請求項96〜99の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、少なくとも1×106個のT細胞、少なくとも2×106個のT細胞、少なくとも5×106個のT細胞、少なくとも1×107個のT細胞、又は少なくとも5×107個のT細胞である。
【請求項１０１】
請求項96〜100の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を更に含む。
【請求項１０２】
請求項101に記載の細胞の集団、ここで、前記非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、以下からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む：翻訳されるタンパク質のフレームの変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及びあるアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)。
【請求項１０３】
請求項101に記載の細胞の集団、ここで、前記非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、以下からなる群より選択される遺伝子のノンコーディング領域(non-coding region)における変異を含む：前記遺伝子によってコードされるmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子によってコードされるmRNA産物の安定性を変える変異。
【請求項１０４】
請求項101〜103の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、前記細胞の集団内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2のヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【請求項１０５】
請求項98〜104の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)若しくはその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)若しくはその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)若しくはその誘導体、からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。
【請求項１０６】
請求項105に記載の細胞の集団、ここで、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。
【請求項１０７】
請求項98〜106の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。
【請求項１０８】
請求項98〜106の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、細胞の集団内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。
【請求項１０９】
請求項98〜108の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、規定されたヌクレオチド配列でヌクレアーゼ媒介切断を指示するガイドRNAを含む。
【請求項１１０】
請求項109に記載の細胞の集団、ここで、前記ガイドRNAは、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を含む。
【請求項１１１】
請求項110に記載の細胞の集団、ここで、前記crRNA及び前記tracrRNAは、単一のポリヌクレオチド上にある。
【請求項１１２】
請求項110に記載の細胞の集団、ここで、前記crRNA及び前記tracrRNAが、別々のポリヌクレオチド上にある。
【請求項１１３】
請求項96〜112の何れか一項にポリペプチドの細胞の集団、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。
【請求項１１４】
請求項96〜112の何れか一項にポリペプチドの細胞の集団、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指示される。
【請求項１１５】
請求項114に記載の細胞の集団、ここで、前記外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターの融合、プロモーターの2つの部分の融合、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ‐アクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター系、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター系、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター系からなる群より選択される。
【請求項１１６】
請求項96〜115の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、100塩基長以上である。
【請求項１１７】
請求項96〜115の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【請求項１１８】
請求項99〜117の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項１１９】
請求項99〜118の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項１２０】
請求項99〜119の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列及び前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、それぞれ長さが600塩基以上である。
【請求項１２１】
請求項98〜120の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記規定されたヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の組み込み後に破壊される。
【請求項１２２】
請求項96〜121の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位と動作可能的にに関連している内因性遺伝子の発現が破壊される。
【請求項１２３】
相同組換え率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項96〜122の何れか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１２４】
前記細胞の集団の生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項96〜123の何れか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１２５】
請求項99〜124の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、プラスミド又はナノプラスミドを含む。
【請求項１２６】
請求項125に記載の細胞の集団、ここで、前記プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、並びにここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記第1リンカー及び第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ではない、前記第1の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、及び前記第2の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、ヌクレオチド配列である。
【請求項１２７】
請求項99〜126の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【請求項１２８】
請求項96〜127の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。
【請求項１２９】
請求項96〜127の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、イントロンを含む。
【請求項１３０】
請求項96〜129の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む。
【請求項１３１】
請求項130に記載の細胞の集団、ここで、前記第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子は、破壊されたTCR-ベータ遺伝子である。
【請求項１３２】
請求項96〜129の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、TCR-ベータ遺伝子座位を含む。
【請求項１３３】
請求項132に記載の細胞の集団、ここで、前記第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子は、破壊されたTCR-アルファ遺伝子で。
【請求項１３４】
請求項96〜129の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノム・ターゲットが免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。
【請求項１３５】
請求項134に記載の細胞の集団、ここで、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【請求項１３６】
請求項96〜135の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む。
【請求項１３７】
請求項136に記載の細胞の集団、ここで、前記リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。
【請求項１３８】
請求項137に記載の細胞の集団、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは、以下からなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む：T2A、E2A、P2A、及びF2A。
【請求項１３９】
請求項137〜138の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは、フリン切断部位を含む。
【請求項１４０】
請求項137〜139の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは、Gly-Ser-Glyリンカーを含む、任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端にある、及び任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、N末端からC末端の方向で、フリン切断部位：Gly-Ser-Glyリンカー：2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)の並びの中にある。
【請求項１４１】
請求項136に記載の細胞の集団、ここで、前記リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項１４２】
請求項136に記載の細胞の集団、ここで、前記リンカー配列は、外因性のプロモーター配列を含む。
【請求項１４３】
請求項136〜142の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記リンカー配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【請求項１４４】
請求項96〜135の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、第1リンカーのポリペプチド配列及び第2リンカーのポリペプチド配列を含む。
【請求項１４５】
請求項144に記載の細胞の集団、ここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。
【請求項１４６】
請求項145に記載の細胞の集団、ここで、同じリンカーのポリペプチド配列をコードする、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、コドンが分岐している(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが分岐している(codon diverged)。
【請求項１４７】
請求項96〜146の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。
【請求項１４８】
請求項147に記載の細胞項集団、ここで、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群より選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【請求項１４９】
請求項96〜146の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部はノンコーディング領域(non-coding region)をコードする。
【請求項１５０】
請求項149に記載の細胞の集団、ここで、前記ノンコーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。
【請求項１５１】
請求項96〜146の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで前記遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【請求項１５２】
請求項151に記載の細胞の集団、ここで、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む： 
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及び
c)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１５３】
請求項151又は152に記載の細胞の集団、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される：マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するために最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部。
【請求項１５４】
請求項151〜153の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部によってコードされるポリペプチドは、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列とのより大きな関連性を示す、任意選択的に、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して互いにより大きな関連性を示す。
【請求項１５５】
請求項152〜154の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。
【請求項１５６】
請求項152〜154の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。
【請求項１５７】
請求項151〜156の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コドンが分岐している(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記コドンが分岐している(codon diverged)ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドンが分岐している(codon diverged)。
【請求項１５８】
請求項96〜157の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、ヒト細胞又はヒト由来細胞を含む。
【請求項１５９】
請求項96〜158の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、免疫細胞の集団を含む。
【請求項１６０】
請求項159に記載の細胞の集団、ここで、前記免疫細胞の集団は、T細胞の集団を含む。
【請求項１６１】
請求項160に記載の集団、ここで前記T細胞の集団は、以下からなる群より選択される：細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、初代T細胞、腫瘍浸潤T細胞、操作したT細胞、調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、アルファ-ベータT細胞、及びガンマ-デルタT細胞。
【請求項１６２】
請求項159に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、以下からなる群より選択される集団を含む：B細胞, 単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラーT細胞。
【請求項１６３】
請求項96〜158の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、幹細胞の集団を含む。
【請求項１６４】
請求項163に記載の細胞の集団、ここで、前記幹細胞の集団は、造血幹細胞の集団を含む。
【請求項１６５】
請求項163に記載の細胞の集団、ここで、前記幹細胞の集団は、胚性幹細胞の集団を含む。
【請求項１６６】
請求項96〜165の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、初代細胞である。
【請求項１６７】
請求項96〜166の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は単離した細胞の集団である、ここで、前記単離した細胞の集団は対象から単離する。
【請求項１６８】
請求項167に記載の細胞の集団、前記対象はがんを有していることが判明している、又は、そのような疑いがある。
【請求項１６９】
請求項96〜168の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団、ex vivo培養細胞である。
【請求項１７０】
請求項169に記載の細胞の集団、ここで、前記ex vivo培養細胞は、刺激された細胞を含む。
【請求項１７１】
請求項170に記載の細胞の集団、ここで、前記刺激された細胞はサイトカインで刺激されたT細胞を含み、任意選択的に、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞はCD3で刺激されたT細胞、CD28で刺激されたT細胞、又はCD3及びCD28で刺激されたT細胞、を含む。
【請求項１７２】
請求項171に記載の細胞の集団、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL7、IL15、又はそれらの組合せの存在下で培養する。
【請求項１７３】
請求項171又は172に記載の細胞の集団、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2の存在下で培養する。
【請求項１７４】
請求項171又は172に記載の細胞の集団、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2を実質的に含まない培地中で培養する。
【請求項１７５】
請求項96〜174の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は第2の組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む、ここで、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれていて、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている。
【請求項１７６】
請求項175に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、第2の外因性ヌクレオチド組成物を含む第2の環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記第2の外因性ヌクレオチド組成物は、以下を含む： 
a)  第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の前記第1領域及び前記第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えが容易になるように配向されている。
【請求項１７７】
治療を必要とする対象のためのその治療方法、ここで、前記治療は、治療有効量の請求項1〜176の何れか一項に記載の改変した細胞又は細胞の集団を投与することを含む。
【請求項１７８】
請求項177に記載の治療方法、ここで、前記改変した細胞又は細胞の集団は、前記対象に由来する。
【請求項１７９】
請求項177に記載の治療方法、ここで、前記改変した細胞又は細胞の集団は、前記対象に関して同種異系である。
【請求項１８０】
細胞を遺伝子改変するための方法であって、以下の工程を含む方法：
1)  単一ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を提供すること、前記単一ポリヌクレオチドは以下を含む：
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列であって、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている；並びに
2)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を提供すること；
3)  前記細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させること、
4)  前記細胞をウイルスで感染させること以外の手段によって、前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物を前記細胞に送達すること。
【請求項１８１】
前記細胞内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を提供することを更に含む、ここで、前記第2ヌクレアーゼ組成物は、前記接触させる工程において前記細胞と接触し、前記送達する工程において前記細胞中に送達される、請求項180に記載の方法。
【請求項１８２】
請求項181に記載の方法、ここで、前記切断により、前記第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異が起きる。
【請求項１８３】
請求項182に記載の方法、ここで、前記非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、翻訳されるタンパク質のフレームの変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及び1つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む。
【請求項１８４】
請求項182に記載の方法、ここで、前記非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、前記遺伝子によってコードされるmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子によってコードされるmRNA産物の安定性を変える変異、からなる群より選択される遺伝子のノンコーディング領域(non-coding region)における変異を含む。
【請求項１８５】
更に以下を含む、請求項181に記載の方法：
第2ヌクレオチド組成物を提供すること、前記第2ヌクレオチド組成物は以下を含む：
a)  第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記ヌクレオチド配列の全ては単一のポリヌクレオチド上にある、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えが容易になるように配向されている、
前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている、並びに、
前記第2ヌクレオチド組成物は、前記接触させる工程において前記細胞と接触し、前記送達する工程において前記細胞中に送達される。
【請求項１８６】
請求項180〜185の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)若しくはその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)若しくはその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)若しくはその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。
【請求項１８７】
請求項186に記載の方法、ここで、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。
【請求項１８８】
請求項180〜187の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。
【請求項１８９】
請求項180〜187の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、前記細胞内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。
【請求項１９０】
請求項180〜189の何れか一項に記載の方法、ここで、前記接触させる工程は、前記細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させる工程と前記送達する工程との間で、60分未満、45分未満、30分未満、20分未満、15分未満、10分未満、5分未満、又は1分未満である。
【請求項１９１】
請求項180〜190の何れか一項に記載の方法、ここで、前記送達する工程は、エレクトロポレーション、トランスフェクション、物理的な方法による細胞膜の変形、脂質ナノ粒子(LNP)、ウイルス様粒子(VLP)、及び超音波処理からなる群より選択される。
【請求項１９２】
請求項180〜190の何れか一項に記載の方法、ここで、前記送達する工程は、エレクトロポレーションを含む。
【請求項１９３】
請求項180〜192の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリペプチド配列の発現は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。
【請求項１９４】
請求項180〜192の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指示される。
【請求項１９５】
請求項194に記載の方法、ここで、前記外因性プロモーターが、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターの融合、2つの部分のプロモーターの融合、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、βアクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター系、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター系、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター系からなる群より選択される。
【請求項１９６】
請求項180〜195の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、100塩基長以上である。
【請求項１９７】
請求項180〜195の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【請求項１９８】
請求項180〜197の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域又は第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基、長さが100塩基、長さが200塩基、長さが400塩基、長さが600塩基、長さが800塩基、長さが1500塩基、長さが2000塩基、又は長さが4000塩基である。
【請求項１９９】
請求項180〜198の何れか一項に記載の方法、ここで、規定されたヌクレオチド配列は、組み込み後に破壊される。
【請求項２００】
請求項180〜199の何れか一項に記載の方法、ここで、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に動作可能的に関連する前記内因性遺伝子の発現は、破壊される。
【請求項２０１】
相同組換え率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項180〜200の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０２】
請求項180〜201の何れか一項に記載の方法、ここで、前記単一のポリヌクレオチドは、環状プラスミド、線状DNAフラグメント、ミニサークル、及びssDNAからなる群より選択される。
【請求項２０３】
請求項202に記載の方法、ここで、前記環状プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、ここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記第1の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列、又は前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列のどれでもない、ヌクレオチド配列を含む。
【請求項２０４】
請求項180〜203の何れか一項に記載の方法、ここで、前記単一のポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【請求項２０５】
請求項180〜204の何れか一項に記載の方法、ここで、前記単一のポリヌクレオチドは、混入物質を実質的に含まない。
【請求項２０６】
請求項180〜205の何れか一項に記載の方法、ここで、前記単一のポリヌクレオチドは、細胞生存率を低下させる成分を実質的に含まない。
【請求項２０７】
請求項180〜206の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。
【請求項２０８】
請求項180〜206の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、イントロンを含む、。
【請求項２０９】
請求項180〜208の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、前記細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位である。
【請求項２１０】
請求項180〜208の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、TCR-ベータ遺伝子座位である。
【請求項２１１】
請求項180〜208の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、免疫チェックポイント遺伝子座位である。
【請求項２１２】
請求項211に記載の方法、ここで、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【請求項２１３】
請求項180〜212の何れか一項に記載の方法。ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む、
【請求項２１４】
請求項213に記載の方法、こで、前記リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。
【請求項２１５】
請求項214に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。
【請求項２１６】
請求項214又は215に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む、。
【請求項２１７】
請求項213に記載の方法、ここで、前記リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項２１８】
請求項213に記載の方法、ここで、前記リンカー配列は、外因性のプロモーターを含む。
【請求項２１９】
請求項213〜218の何れか一項に記載の方法、ここで、前記リンカー配列は、スプライス・アクセプター配列を更に含む。
【請求項２２０】
請求項180〜219の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。
【請求項２２１】
請求項220に記載の方法、ここで、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群から選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【請求項２２２】
請求項180〜219の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、ノンコーディング領域(non-coding region)をコードする。
【請求項２２３】
請求項222に記載の方法、ここで、前記ノンコーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。
【請求項２２４】
請求項180〜219の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【請求項２２５】
請求項224に記載の方法、ここで、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するために最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部、からなる群より選択される。
【請求項２２６】
請求項224に記載の方法、ここで、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む： 
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)   TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及び
c)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２２７】
請求項226に記載の方法、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列は、マウス化TCR-アルファ、ヒト化TCR-アルファ、ドメイン・スワップをしたTCR-アルファ、点変異を入れたTCR-アルファ、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR-アルファ、コドンを最適化したTCR-アルファ（ヒトで発現するために最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-アルファ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、からなる群より選択される。
【請求項２２８】
請求項226又は227に記載の方法、ここで、前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、マウス化TCR-ベータ、ヒト化TCR-ベータ、ドメイン・スワップをしたTCR-ベータ、点変異を入れたTCR-ベータ、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR-ベータ、コドンを最適化したTCR-ベータ（ヒトで発現するために最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-ベータ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、からなる群より選択される。
【請求項２２９】
請求項226〜228の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、で並んでいる。
【請求項２３０】
請求項226〜228の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、で並んでいる。
。
【請求項２３１】
請求項226〜230の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含む。
【請求項２３２】
請求項231に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。
【請求項２３３】
請求項231又は232に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。
【請求項２３４】
請求項226〜230の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列が配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項２３５】
請求項226〜230の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列は、外因性のプロモーターを含む。
【請求項２３６】
請求項185〜235の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子からなる群より選択される。
【請求項２３７】
請求項185〜235の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2の遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【請求項２３８】
請求項180〜237の何れか一項に記載の方法によって産生される改変した細胞、ここで、前記細胞は組み込まれたヌクレオチド配列を含み、ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれ、及び前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される。
【請求項２３９】
請求項180〜237の何れか一項に記載の方法によって産生される細胞の集団、ここで、前記集団中の細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超は前記組み込まれたヌクレオチド配列を含み、ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記組み込まれたヌクレオチド配列が内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれ、及び前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される。
【請求項２４０】
請求項238又は239に記載の改変した細胞又は細胞の集団、ここで、前記細胞は、前記組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、ソーティング、選択、又は単離されていない。
【請求項２４１】
請求項238〜240の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、送達する工程後の細胞の集団の生存率は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも40%、少なくとも60%、又は少なくとも80%である。
【請求項２４２】
請求項241に記載の細胞の集団、ここで、前記生存率を、前記送達する工程の4日後に評価する。
【請求項２４３】
治療を必要とする対象のためのその治療方法、ここで、前記治療は、治療有効量の請求項238〜240の何れか一項に記載の細胞又は細胞の集団を投与することを含む。
【請求項２４４】
請求項243に記載の治療方法、ここで、前記細胞又は細胞の集団は、前記対象に由来する。
【請求項２４５】
請求項243に記載の治療方法、ここで、前記細胞又は細胞の集団は、前記対象に関して同種異系である。
【請求項２４６】
細胞を遺伝子改変するための方法であって、以下の工程を含む方法：
1)  以下を含むヌクレオチド組成物を提供すること：
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、
c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、長さが100塩基である、
前記ヌクレオチド配列の全ては単一のポリヌクレオチド上にある、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と第2領域と同一のヌクレオチド配列は前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている；並びに、
2)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるCRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物を提供すること；
3)  前記細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物と接触させること、並びに
4)  エレクトロポレーションによって、前記ヌクレオチド組成物及び前記CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物を前記細胞に送達すること。
【請求項２４７】
規定されたT細胞レセプターを有する改変したT細胞を生成する方法であって、以下の工程を含む方法：
1)  以下を含むヌクレオチド組成物を提供すること：
a)  TCR-アルファのポリぺポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリぺポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
c)  第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
d)  第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
e)  内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、
f)  前記内因性TCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記ヌクレオチド配列は単一のポリヌクレオチド上にある、
前記内因性TCR遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は内因性TCR遺伝子座位における相同組換えを促進するように配向されている、
前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、並びに第1リンカー及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、前記内因性のTCR遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記ポリペプチド配列のそれぞれが単一のポリペプチドとして発現することができるように配向されている、
前記第1リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部、前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部、及び第2リンカーのポリペプチド配列の前に位置する、
前記第2リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列と前記TCR-ベータのポリペプチド配列との間に位置する、並びに、
前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、それぞれ別個のポリペプチドを形成する、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に相互作用して機能的なTCRを形成することができる；
2)  前記内因性のTCR遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を提供すること；
3)  前記T細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させること、並びに
4)  前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物を前記T細胞に送達すること。
【請求項２４８】
前記T細胞内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を提供することを更に含む、請求項247に記載の方法、ここで、前記第2ヌクレアーゼ組成物を、前記接触させる工程において前記T細胞と接触させ、前記送達する工程において前記T細胞中に送達する。
【請求項２４９】
請求項248に記載の方法、ここで、前記切断により、前記第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異が生じる。
【請求項２５０】
請求項249に記載の方法、ここで、前記非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、翻訳されるタンパク質のフレームの変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及び1つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む。
【請求項２５１】
請求項249に記載の方法、ここで、前記非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、前記遺伝子によってコードされるmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子によってコードされるmRNA産物の安定性を変える変異、からなる群より選択される遺伝子のノンコーディング領域(non-coding region)における変異を含む。
【請求項２５２】
更に以下を含む、請求項249に記載の方法：
以下を含む第2ヌクレオチド組成物を提供すること：
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、
c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記ヌクレオチド配列の全ては単一のポリヌクレオチド上にある、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と第2領域と同一のヌクレオチド配列は前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている；並びに、
前記第2ヌクレオチド組成物を、前記接触させる工程において前記T細胞と接触させ、前記送達する工程において前記T細胞中に送達する。
【請求項２５３】
請求項247〜252の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)若しくはその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)若しくはその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)若しくはその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。
【請求項２５４】
請求項253に記載の方法、ここで、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。
【請求項２５５】
請求項247〜254の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。
【請求項２５６】
請求項247〜254の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、前記T細胞内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。
【請求項２５７】
請求項247〜256の何れか一項に記載の方法、ここで、前記接触させる工程は、前記T細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させる工程と前記送達する工程との間で、60分未満、45分未満、30分未満、20分未満、15分未満、10分未満、又は5分未満である。
【請求項２５８】
請求項247〜257の何れか一項に記載の方法、ここで、前記送達する工程は、エレクトロポレーション、トランスフェクション、物理的な方法による細胞膜の変形、脂質ナノ粒子(LNP)、ウイルス様粒子(VLP)、及び超音波処理からなる群より選択される。
【請求項２５９】
請求項247〜257の何れか一項に記載の方法、ここで、前記送達する工程は、エレクトロポレーションを含む。
【請求項２６０】
請求項247〜259の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。
【請求項２６１】
請求項247〜260の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指示される。
【請求項２６２】
請求項261に記載の方法、ここで、前記外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターの融合、2つの部分のプロモーターの融合、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、βアクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター系、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター系、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター系からなる群より選択される。
【請求項２６３】
請求項247〜262の何れか一項に記載の方法、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又はTCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが100塩基以上である。
【請求項２６４】
請求項247〜262の何れか一項に記載の方法、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又は前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【請求項２６５】
請求項247〜264の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域又は第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基、長さが100塩基、長さが200塩基、長さが400塩基、長さが600塩基、長さが800塩基、長さが1500塩基、長さが2000塩基、又は長さが4000塩基である。
【請求項２６６】
請求項247〜265の何れか一項に記載の方法、ここで、前記規定されたヌクレオチド配列は、組み込み後に破壊される。
【請求項２６７】
請求項247〜266の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位と機能的に関連する内因性遺伝子の発現は破壊される。
【請求項２６８】
相同組換え率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項247〜267の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６９】
請求項247〜268の何れか一項に記載の方法、ここで、前記単一のポリヌクレオチドは、環状プラスミド、線状DNAフラグメント、ミニサークル、及びssDNAからなる群より選択される。
【請求項２７０】
請求項269に記載の方法、ここで、前記環状プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、ここで、前記ベクター骨格は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列のどれでもない、ヌクレオチド配列である。
【請求項２７１】
請求項247〜270の何れか一項に記載の方法、ここで、前記単一のポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【請求項２７２】
請求項247〜271の何れか一項に記載の方法、ここで、前記単一のポリヌクレオチドは、実質的に混入物質を含まない。
【請求項２７３】
請求項247〜272の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。
【請求項２７４】
請求項247〜272の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位は、イントロンを含む。
【請求項２７５】
請求項247〜274の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位は、TCR-アルファ遺伝子座位を含む。
【請求項２７６】
請求項247〜274の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位は、TCR-ベータ遺伝子座位を含む。
【請求項２７７】
請求項247〜276の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第1リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含む、ここで、発現した後に、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部、TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部、及び第2リンカーのポリペプチド配列、をコードすることによってのみコードされるポリペプチド、が産生される。
【請求項２７８】
請求項277に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。
【請求項２７９】
請求項278又は279に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。
【請求項２８０】
請求項247〜276の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列は、IRESを含む。
【請求項２８１】
請求項247〜280の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第1リンカー配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【請求項２８２】
請求項247〜281の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含む、ここで、発現した後に、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、それぞれ別個のポリペプチドを形成する、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に相互作用して機能的なTCRを形成することができる。
【請求項２８３】
請求項277に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。
【請求項２８４】
請求項282又は283に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。
【請求項２８５】
請求項247〜281の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項２８６】
請求項247〜281の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列は、外因性のプロモーターを含む。
【請求項２８７】
請求項247-286の何れか一項に記載の方法、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列は、マウス化TCR-アルファ、ヒト化TCR-アルファ、ドメイン・スワップをしたTCR-アルファ、点変異を入れたTCR-アルファ、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR-アルファ、コドンを最適化したTCR-アルファ（ヒトで発現するために最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-アルファ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、からなる群より選択される。
【請求項２８８】
請求項247-287の何れか一項に記載の方法、ここで、前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、マウス化TCR-ベータ、ヒト化TCR-ベータ、ドメイン・スワップをしたTCR-ベータ、点変異を入れたTCR-ベータ、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR-ベータ、コドンを最適化したTCR-ベータ（ヒトで発現するために最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-ベータ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、からなる群より選択される。
【請求項２８９】
請求項247〜288の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、第1リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、で並んでいる。
【請求項２９０】
請求項247〜288の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、で並んでいる。
【請求項２９１】
請求項248〜290の何れか一項に記載の方法、ここで、前記規定されたヌクレオチド配列が内因性TCR-アルファ遺伝子座位内にある場合、前記第2の規定されたヌクレオチド配列は内因性TCR-ベータ遺伝子座位内にある。
【請求項２９２】
請求項248〜290の何れか一項に記載の方法、ここで、前記規定されたヌクレオチド配列が内因性TCR-ベータ遺伝子座位内にある場合、前記第2の規定されたヌクレオチド配列は内因性TCR-アルファ遺伝子座位内にある。
【請求項２９３】
請求項248〜290の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2の規定されたヌクレオチド配列は、免疫チェックポイント遺伝子座位内にある。
【請求項２９４】
請求項252〜293の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、shRNA、siRNA、miRNA、サイトカイン、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子からなる群より選択される。
【請求項２９５】
以下を含む環状ポリヌクレオチドを含む、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に相同組換えを指示する際に使用するためのヌクレオチド組成物：
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、
c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記ヌクレオチド配列の全ては単一のポリヌクレオチド上にある、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と第2領域と同一のヌクレオチド配列は前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている。
【請求項２９６】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが100塩基以上である。
【請求項２９７】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、長さが4000塩基以上である。
【請求項２９８】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項２９９】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項３００】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列及び前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、それぞれ、長さが600塩基以上である。
【請求項３０１】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、プラスミド又はナノプラスミドを含む。
【請求項３０２】
請求項301に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、並びにここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではない、及び前記第1の内因性の遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない。
【請求項３０３】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【請求項３０４】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。
【請求項３０５】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、イントロンを含む。
【請求項３０６】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む。
【請求項３０７】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記T細胞レセプター(TCR)-ベータ遺伝子座位を含む。
【請求項３０８】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノム・ターゲットは、免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。
【請求項３０９】
請求項308に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【請求項３１０】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む。
【請求項３１１】
請求項310に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。
【請求項３１２】
請求項311に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、フリン切断部位を含む。
【請求項３１３】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記リンカー配列の何れか1つが、以下からなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む：T2A、E2A、P2A、及びF2A。
【請求項３１４】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つが、Gly-Ser-Glyリンカーを含む、任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端にある、及び任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、N末端からC末端の方向で、フリン切断部位：Gly-Ser-Glyリンカー：2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)の並びの中にある。
【請求項３１５】
請求項310に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項３１６】
請求項310に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、外因性のプロモーターを含む。
【請求項３１７】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【請求項３１８】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部はシグナル・ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ここで、前記シグナル・ペプチドは前記遺伝子の少なくとも一部によってコードされるポリペプチド、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部によってコードされるポリペプチドに動作可能的に連結している。
【請求項３１９】
請求項318に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記シグナル・ペプチドは外因性のシグナル・ペプチドであり、任意選択的に、ここで、前記外因性のシグナル・ペプチドはヒト成長ホルモンのシグナル・ペプチドである。
【請求項３２０】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。
【請求項３２１】
請求項320に記載のヌクレオチド組成物、ここで、同じリンカーのポリペプチド配列をコードする、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、コドンが分岐している(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが分岐している(codon diverged)。
【請求項３２２】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。
【請求項３２３】
請求項322に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群より選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【請求項３２４】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、ノンコーディング領域(non-coding region)をコードする。
【請求項３２５】
請求項324に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記ノンコーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。
【請求項３２６】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【請求項３２７】
請求項326に記載のヌクレオチド組成物、ここで前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む： 
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及び
c)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項３２８】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下からなる群から選択される：マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するために最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部。
【請求項３２９】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部によってコードされるポリペプチドは、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列と、より強く相互作用するように操作される、任意選択的に、ここで。前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して、互いにより強く相互作用するように操作される。
【請求項３３０】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端に、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、で並んでいる。
【請求項３３１】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端に、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、で並んでいる。
【請求項３３２】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コドンが分岐している(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記コドンが分岐している(codon diverged)ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドンが分岐している(codon diverged)。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は2017年10月30日に出願された米国仮出願第62/579,113号、及び2017年10月30日に出願された米国仮出願第62/579,114号の利益を主張し、これらの各々は全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
即時申請書にはEFS-Web経由で提出されたSequence Listingが記載されており、ここではその全体を参照して盛り込まれている。月XX、20XXに作成されたASCIIコピーの名前はXXXXXUS_sequencelisting.txtで、サイズはX, XXX,XXXバイトである。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子ターゲティングとは、ゲノムを直接的に編集することができる方法であり、細胞産物を操作したり、遺伝病を引き起こす変異を修復したり、変異を作り出して遺伝子を検討したりするための道筋を提供する。遺伝子ターゲティングは目的の遺伝子座位をターゲティングする部位特異的ヌクレアーゼとともに、所望の改変配列を有する相同修理鋳型DNAのデリバリー後の相同組換えに依存する。
【０００４】
遺伝子標的化は新規特異性を有するT細胞を作製するために、一次ヒトT細胞において使用されてきた。これらの例において、AAVは、相同性修理鋳型DNAを送達するために使用されている。DNAには、新しいエピトープに特異的なキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)又はT-細胞レセプター(TCR)のコーディング配列が含まれている。これらの配列をTCRアルファ(一般的に)又はTCRβ遺伝子座位に標的化すると、研究者は内因性TCRのノックアウト(及び対応する特異性の除去)、及び新しいタンパク質のノックイン(及び対応する特異性)を同時に達成することができる。この方法は、治療的使用のためのCAR T細胞及びTCR T細胞を製造するためにスケールで使用される。しかしながら、AAVの製造には多大な時間がかかり、費用がかかり、困難であり、高度に規制されており、その用途が制限されている。
【０００５】
裸のプラスミドDNAによる遺伝子編集は以前に記載されているが、不死化細胞株との関連においてのみ、初代細胞における毒性の問題を引用している。これらの問題は細胞の生存性を更に低下させるDNAとともに、ある程度の毒性を示すヌクレアーゼを送達するためにmRNAを使用する研究者に由来する可能性がある。これらの問題はまた、DNAのデリバリー効率がDNAの大きさに依存し、ベクターが適切に最適化されていないことに起因し得る。更に、ほとんどの研究所によって使用されるキットベースのプラスミド調製物に共通するDNA不純物は細胞毒性に寄与することが知られており、これは、相同性修理テンプレートとしてのプラスミドDNAの使用における進歩を妨げているかもしれない。ごく最近になって、DNA精製及びデリバリー技術が改善された(例えば、プラスミドワクチンの出現、並びに最適化されたエレクトロポレーションプロトコル及び装置(例えば、ヌクレオフェクション))。
【０００６】
トランスポゾンはヒトの一次T細胞にDNAを挿入するのにも使われているが、非特異的な方法である(レトロウイルスのデリバリーに似ている)。この場合、ゲノムにランダムに挿入される裸のDNAは裸のプラスミドDNAとして送達される。しかしながら、高毒性及び低効率は、この方法の限界である。相同組換えを介する一次ヒトT細胞における遺伝子編集はまた、以前に記載されている(例えば、Schumannら、Proc Natl Acad Sci U S A.2015 Aug 18;112(33):10437-42)が非常に小さな編集又は修理(例えば、20ヌクレオチド以下)の文脈においてのみである。相同組換えを介するリボ核タンパク質(RNP)錯体のエレクトロポレーションによる遺伝子編集はまた、例えば、Kimら(Genome Res.2014 Jun;24(6):1012-9)及びインターナショナルパブリック(International Pub)に以前に記載されている。しかしながら、12ヌクレオチドの比較的小さい挿入(又はゲノム配列の置換)のみが、線状テンプレートを使用して、それぞれにおいて実証された(WO2016/123578)。より大きな編集のための組成物及び方法はまた、T細胞以外の初代細胞(例えば、造血幹細胞及びナチュラル・キラー(NK)細胞)について十分に記載されていない。この分野に欠けているのは、初代細胞に大きな編集を行う効率的な方法であり、それによって、遺伝子編集の治療的適用を潜在的に制限する。
【０００７】
したがって、ヒト初代細胞及びヒト一次T細胞などのin細胞で遺伝子編集を媒介するための改良された組成物及び方法が、この分野で大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
a)遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列;b)内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列を含み、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列が内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向され、改変した細胞が実質的に改変した細胞を含まない、外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを含むウイルスを介した送達の成分が本明細書に提供される。いくつかの実施形態に、本改変した細胞は、組み込まれたヌクレオチド配列が遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、組み込まれたヌクレオチド配列が内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれ、組み込まれたヌクレオチド配列が遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される、組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態に、本改変した細胞は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【０００９】
また、本明細書中に提供されるT細胞を含む改変細胞もまた、本明細書において提供される:a)TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;b)TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;b)TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; c)第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; d)第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;ここで、TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び第1及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列はポリペプチド配列の各々が単一のポリペプチドとして発現され得るように配向され、ここで、第2リンカーのポリペプチド配列はTCR-アルファポリペプチド配列とTCR-βポリペプチド配列との間に位置し、第1及び第2リンカーのポリペプチドは切断可能なリンカーのポリペプチドである。TCR-アルファポリペプチド配列及びTCR-βポリペプチド配列がそれぞれ別々のポリペプチドを形成し、別々のポリペプチドが一緒に会合して機能的TCRを形成することができるように、T細胞中で切断されることができ、改変された細胞はウイルス媒介送達の成分を実質的に含まず、内因性TCR-β遺伝子座位が破壊される。
【００１０】
また、本明細書中に提供されるT細胞を含む改変細胞もまた、本明細書において提供される:a)TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;b)TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;b)TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; c)第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; d)第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;ここで、TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び第1及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列はポリペプチド配列の各々が単一のポリペプチドとして発現され得るように配向され、ここで、第2リンカーのポリペプチド配列はTCR-アルファポリペプチド配列とTCR-βポリペプチド配列との間に位置し、第1及び第2リンカーのポリペプチドは切断可能なリンカーのポリペプチドであり得る。TCR-アルファのポリペプチド配列及びTCR-ベータのポリペプチド配列がそれぞれ別々のポリペプチドを形成し、別々のポリペプチドが一緒に会合して機能的TCRを形成することができるように、T細胞中で切断される。いくつかの実施形態に、この改変した細胞は外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み、この外因性のヌクレオチド配列はa)TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び第1及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む;b)内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列;並びに内因性のTCR遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は内因性のTCR遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向される。いくつかの実施形態に、改変した細胞は実質的にウイルスを介した送達の成分を含まない。いくつかの実施形態に、本改変した細胞は、内因性のTCR遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【００１１】
いくつかの実施形態に、この改変した細胞は、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を更に含む。いくつかの実施形態に、非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、翻訳されるタンパク質のフレームの変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及び1つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む。いくつかの実施形態に、非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、遺伝子によってコードされるmRNA産物の発現を変える変異、及び遺伝子によってコードされるmRNA産物の安定性を変える変異からなる群より選択される遺伝子のノンコーディング領域(non-coding region)における変異を含む。いくつかの実施形態に、改変した細胞は、改変した細胞内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【００１２】
いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ又はその誘導体、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)又はその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)又はその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)又はその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態に、CRISPRファミリーのヌクレアーゼはCas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、改変した細胞内でヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を含む。いくつかの実施形態に、crRNAはガイドRNA(gRNA)を含み、ここで、gRNAは、規定されたヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態に、crRNA及びtracrRNAは単一のポリヌクレオチド上にある。いくつかの実施形態に、crRNA及びtracrRNAは、別々のポリヌクレオチド上にある。
【００１３】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又はコードされるポリペプチド配列の発現は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指向される。いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又はコードされるポリペプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指向される。いくつかの実施形態に、外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、プロモーターの2つの部分の融合、プロモーターの2つの部分の融合、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、βアクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター系、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター系、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター系からなる群より選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又はTCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、100塩基長以上である。いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又はTCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【００１５】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【００１６】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【００１７】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列、及び内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、それぞれ長さが600塩基以上である。
【００１８】
いくつかの実施形態に、定義されたヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の組み込み後に破壊される。
【００１９】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位と機能的に関連する内因性遺伝子の発現は破壊される。
【００２０】
いくつかの実施形態に、本改変した細胞は、相同組換え速度を増加させることができる追加の試薬を更に含む。いくつかの実施形態に、相同組換え速度を増加させることができる追加の試薬は、相同組換え修復経路の活性化因子、非相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)修復経路の阻害因子、又はそれらの組み合わせを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は、改変した細胞の生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む。いくつかの実施形態に、改変した細胞の生存率を増加させることができる追加の試薬は、核酸感知(nucleic acid sensing)経路の阻害因子を含む。いくつかの実施形態に、核酸感知(nucleic acid sensing)経路は、TLR9核酸感知(nucleic acid sensing)経路、AIM2核酸感知(nucleic acid sensing)経路、IFI16核酸感知(nucleic acid sensing)経路、cGAS核酸感知(nucleic acid sensing)経路、及び細胞質ゾル核酸感知(nucleic acid sensing)経路から選択される群を含む。いくつかの実施形態に、核酸感知(nucleic acid sensing)経路の阻害因子は、オリゴヌクレオチド・アンタゴニストを含む。いくつかの実施形態に、オリゴヌクレオチド・アンタゴニストは、配列TTAGGG又はそのタンデム・リピートを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態に、環状ポリヌクレオチドはプラスミド又はナノプラスミドを含む。いくつかの実施形態に、プラスミドは500塩基未満のベクター骨格を有し、ベクター骨格は、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではなく、TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではなく、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列であって、第1及び第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ではなく、第1の内因性対象ゲノム遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではなく、第2の内因性対象ゲノム遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列である。
【００２３】
いくつかの実施形態に、環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではな
【００２４】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位はコーディング領域(coding region)を含む。いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位はイントロンを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位は、T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態に、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子は、破壊されたTCR-ベータ遺伝子である。
【００２６】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位はTCR-ベータ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態に、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子は、破壊されたTCR-アルファ遺伝子である。
【００２７】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノム・ターゲットは、免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態に、免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はリンカー配列を含む。いくつかの実施形態に、リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードし、ここで、式後、切断可能なリンカーのポリペプチドは、遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生されるように切断される。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、フリン切断部位を含む。いくつかの実施形態に、リンカー配列の何れか1つは、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、Gly-Ser-Glyリンカーを含み、任意選択で、Gly-Ser-Glyリンカーが2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端であり、任意選択で、Gly-Ser-GlyリンカーがN末端からC末端へのフューリン切断部位:Gly-Ser-Glyリンカー:2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)方位にある。
【００２９】
いくつかの実施形態に、リンカー配列、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態に、リンカー配列、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、外因性のプロモーターを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態に、リンカー配列、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部、TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列はシグナル・ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、シグナル・ペプチドは、遺伝子の少なくとも一部、TCR-アルファのポリペプチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部によってコードされるポリペプチドによってコードされるポリペプチドに動作可能的に連結される。いくつかの実施形態に、シグナル・ペプチドは外因性のシグナル・ペプチドであり、必要に応じて、外因性のシグナル・ペプチドは、ヒト成長ホルモンシグナル・ペプチドである。
【００３３】
いくつかの実施形態に、第1リンカーのポリペプチド配列及び第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態に、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び同じリンカーのポリペプチド配列をコードする第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列はコドンが異なるヌクレオチド配列を含み、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが異なる。
【００３４】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はコーディング領域(coding region)をコードする。いくつかの実施形態に、コーディング領域(coding region)は、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子からなる群より選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はノンコーディング領域(non-coding region)をコードする。いくつかの実施形態に、ノンコーディング領域(non-coding region)は、shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子からなる群より選択される。いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態に、TCR遺伝子の少なくとも一部は、a)TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;b)TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;及びc)第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、TCR-アルファのポリペプチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメインスワップTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するために最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、TCR遺伝子の可変領域配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCRからなる群より選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態に、TCR-アルファのポリペプチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部によってコードされるポリペプチドは内因性TCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列とのより大きな会合を実証するように操作され、場合により、TCR-アルファのポリペプチド配列及びTCR-ベータのポリペプチド配列は、内因性TCRポリペプチド配列と比較して互いにより大きな会合を実証するように操作される。
【００３８】
いくつかの実施形態に、コードされるポリペプチド配列は、N末端からC末端へのリンカー:TCR-アルファ:第2リンカー:TCR-ベータ方位にある。いくつかの実施形態に、コードされるポリペプチド配列は、N末端からC末端へのリンカー:TCR-ベータ:第2リンカー:TCR-アルファ方位にある。
【００３９】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部、TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列はコドン分岐ヌクレオチド配列を含み、コドン分岐ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドン分岐している。
【００４０】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は免疫細胞を含む。いくつかの実施形態に、免疫細胞はT細胞を含む。いくつかの実施形態に、T細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、一次T細胞、腫瘍浸潤T細胞、工学的T細胞、調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、アルファ-βT細胞、及びγ-δT細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態に、免疫細胞はナチュラル・キラー細胞を含む。いくつかの実施形態に、免疫細胞は、B細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラーT細胞からなる群より選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は幹細胞を含む。いくつかの実施形態に、幹細胞は造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態に、幹細胞は胚幹細胞を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は初代細胞である。
【００４３】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は単離された細胞であり、単離された細胞は対象から単離される。いくつかの実施形態に、対象は、がんを有することが知られているか、又は疑われる。
【００４４】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は、ヒト細胞又はヒト由来細胞を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態に、改変した細胞はex vivo培養細胞である。いくつかの実施形態に、ex vivo培養細胞は、刺激された細胞を含む。いくつかの実施形態に、刺激された細胞はサイトカイン刺激されたT細胞を含み、任意選択で、サイトカイン刺激されたT細胞は、CD3刺激されたT細胞、CD28刺激されたT細胞、又はCD3及びCD28刺激されたT細胞を含む。いくつかの実施形態に、サイトカインで刺激されたT細胞は、IL7、IL15、又はそれらの組合せの存在下で培養される。いくつかの実施形態に、サイトカインで刺激されたT細胞は、IL2の存在下で培養される。いくつかの実施形態に、サイトカインで刺激されたT細胞は、IL2を実質的に含まない培地中で培養される。
【００４６】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は組み込まれたウイルスを含まず、組み込まれたウイルスはウイルスを介した送達の成分と操作可能に結合している。いくつかの実施形態に、改変した細胞の表面上のMHCクラスIはウイルスを介した送達の成分又は組み込まれたウイルスに由来するペプチドを含まず、ここで、組み込まれたウイルスはウイルスを介した送達の成分と動作可能的に会合している。
【００４７】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は第2の外因性ヌクレオチド組成物を含む第2の環状ポリヌクレオチドを更に含み、第2の外因性ヌクレオチド組成物は、a)第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列; b)第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列;並びに第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列が第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向される。いくつかの実施形態に、この改変した細胞は第2の組み込まれたヌクレオチド配列を更に含み、ここで、第2の組み込まれたヌクレオチド配列は第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、第2の組み込まれたヌクレオチド配列は第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれ、そして第2の組み込まれたヌクレオチド配列は第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される。
【００４８】
集団の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超が組み込まれたヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載の改変した細胞の何れか1つを含む細胞の集団もまた、本明細書に提供される。いくつかの実施形態に、改変した細胞は組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、ソーティング、選択、又は単離されていない。
【００４９】
組み込まれたヌクレオチド配列が遺伝子の少なくとも一部を含み、組み込まれたヌクレオチド配列が内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で組み込まれ、遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように組み込まれたヌクレオチド配列が配向され、細胞の集団が実質的にウイルスを介した送達の成分を含まず、集団中のT細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超が細胞を含む、組み込まれたヌクレオチド配列を含む組み込まれたヌクレオチド配列の集団もまた、本明細書に提供される。いくつかの実施形態に、T細胞は組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、ソーティング、選択、又は単離されていない。
【００５０】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は、内因性のTCR遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【００５１】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み、外因性のヌクレオチド配列はa)遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列; b)内因性遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)内因性遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列を含み、内因性遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向される。
【００５２】
いくつかの実施形態に、細胞の装着は、少なくとも1x10 7 T細胞T細胞、少なくとも2x10 6T細胞、少なくとも5x10 6 T細胞、少なくとも1x10 7 T細胞、又は少なくとも5x10 である。
【００５３】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を更に含む。いくつかの実施形態に、非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、翻訳されるタンパク質のフレームの変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及び1つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む。いくつかの実施形態に、非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、遺伝子によってコードされるmRNA産物の発現を変える変異、及び遺伝子によってコードされるmRNA産物の安定性を変える変異からなる群より選択される遺伝子のノンコーディング領域(non-coding region)における変異を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)又はその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)又はその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)又はその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態に、CRISPRファミリーのヌクレアーゼはCas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、細胞の集団内でヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、定義されたヌクレオチド配列でヌクレアーゼ媒介切断を指示するガイドRNAを含む。いくつかの実施形態に、ガイドRNAは、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を含む。いくつかの実施形態に、crRNA及びtracrRNAは単一のポリヌクレオチド上にある。いくつかの実施形態に、crRNA及びtracrRNAは、別々のポリヌクレオチド上にある。
【００５５】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は、細胞の集団内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【００５６】
いくつかの実施形態に、コードされるポリペプチド配列の発現は、この内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指向される。いくつかの実施形態に、コードされたポリペプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指向される。いくつかの実施形態に、外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、プロモーターの2つの部分の融合、プロモーターの2つの部分の融合、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、βアクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター系、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター系、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター系からなる群より選択される。
【００５７】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、100塩基長以上である。いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【００５８】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【００５９】
いくつかの実施形態に、本内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【００６０】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列及び内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、それぞれ長さが600塩基以上である。
【００６１】
いくつかの実施形態に、定義されたヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の組み込み後に破壊される。
【００６２】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位と機能的に関連する内因性遺伝子の発現は破壊される。
【００６３】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は、相同組換え速度を増加させることができる追加の試薬を更に含む。
【００６４】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は、細胞の集団の生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む。
【００６５】
いくつかの実施形態に、環状ポリヌクレオチドはプラスミド又はナノプラスミドを含む。いくつかの実施形態に、プラスミドは500塩基未満のベクター骨格を有し、ベクター骨格は、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではなく、TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではなく、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列であって、第1及び第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ではなく、第1の内因性標的ゲノム遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではなく、第2の内因性標的ゲノム遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列である。
【００６６】
いくつかの実施形態に、環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【００６７】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位はコーディング領域(coding region)を含む。いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位はイントロンを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態に、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子は、破壊されたTCR-ベータ遺伝子である。
【００６９】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位はTCR-ベータ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態に、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子は、破壊されたTCR-アルファ遺伝子である。
【００７０】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノム・ターゲットは、免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態に、免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【００７１】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はリンカー配列を含む。いくつかの実施形態に、リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードし、ここで、式後、切断可能なリンカーのポリペプチドは、遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生されるように切断される。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチドは、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチドは、フリン切断部位を含む。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチドはGly-Ser-Glyリンカーを含み、任意選択で、Gly-Ser-Glyリンカーが2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端であり、任意選択で、Gly-Ser-GlyリンカーがN末端からC末端へのリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)方位でフリン切断部位:Gly-Ser-Glyリンカー:2Aにある。
【００７２】
いくつかの実施形態に、リンカー配列は配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態に、リンカー配列は、外因性のプロモーター配列を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態に、リンカー配列はスプライス・アクセプター配列を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部は、第1リンカーのポリペプチド配列及び第2リンカーのポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態に、第1リンカーのポリペプチド配列及び第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態に、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び同じリンカーのポリペプチド配列をコードする第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列はコドンが異なるヌクレオチド配列を含み、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが異なる。
【００７６】
Tinいくつかの実施形態では、遺伝子の少なくとも一部はコーディング領域(coding region)をコードする。いくつかの実施形態に、コーディング領域(coding region)は、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子からなる群より選択される。
【００７７】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はノンコーディング領域(non-coding region)をコードする。いくつかの実施形態に、ノンコーディング領域(non-coding region)は、shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子からなる群より選択される。
【００７８】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態に、TCR遺伝子の少なくとも一部は、a)TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;b)TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;及びc)第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、TCR-アルファのポリペプチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメインスワップTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するために最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、TCR遺伝子の可変領域配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCRからなる群より選択される。いくつかの実施形態に、TCR-アルファのポリペプチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部によってコードされるポリペプチドは内因性TCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列とのより大きな会合を実証するように操作され、場合により、TCR-アルファのポリペプチド配列及びTCR-ベータのポリペプチド配列は、内因性TCRポリペプチド配列と比較して互いにより大きな会合を実証するように操作される。いくつかの実施形態に、コードされたポリペプチド配列は、リンカー:TCR-アルファ:第2リンカー:TCR-ベータ方位にある。いくつかの実施形態に、コードされたポリペプチド配列は、リンカー:TCR-ベータ:第2リンカー:TCR-アルファ方位にある。いくつかの実施形態に、TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列はコドン分岐ヌクレオチド配列を含み、コドン分岐ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドン分岐している。
【００７９】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は、ヒト細胞又はヒト由来細胞を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は、免疫細胞の集団を含む。いくつかの実施形態に、免疫細胞の集団は、T細胞の集団を含む。いくつかの実施形態に、T細胞の集団は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、一次T細胞、腫瘍浸潤T細胞、工学的T細胞、調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、アルファ-βT細胞、及びγ-δT細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態に、免疫細胞の集団は、ナチュラル・キラー細胞の集団を含む。いくつかの実施形態に、細胞の集団は、B細胞, 単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラーT細胞からなる群より選択される集団を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は、幹細胞の集団を含む。いくつかの実施形態に、幹細胞の集団は、造血幹細胞の集団を含む。いくつかの実施形態に、幹細胞の集団は、胚幹細胞の集団を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は初代細胞である。
【００８３】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は細胞の単離された集団であり、細胞の単離された集団は、対象から単離される。いくつかの実施形態に、対象は、がんを有することが知られているか、又は疑われる。
【００８４】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は、ex vivo培養細胞を含む。いくつかの実施形態に、ex vivo培養細胞は、刺激された細胞を含む。いくつかの実施形態に、刺激された細胞はサイトカイン刺激されたT細胞を含み、任意選択で、サイトカイン刺激されたT細胞は、CD3刺激されたT細胞、CD28刺激されたT細胞、又はCD3及びCD28刺激されたT細胞を含む。いくつかの実施形態に、サイトカインで刺激されたT細胞は、IL7、IL15、又はそれらの組合せの存在下で培養される。いくつかの実施形態に、サイトカインで刺激されたT細胞は、IL2の存在下で培養される。いくつかの実施形態に、サイトカインで刺激されたT細胞は、IL2を実質的に含まない培地中で培養される。
【００８５】
いくつかの実施形態に、細胞の集団は第2の組み込まれたヌクレオチド配列を更に含み、ここで、第2の組み込まれたヌクレオチド配列は第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、第2の組み込まれたヌクレオチド配列は第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で組み込まれ、第2の組み込まれたヌクレオチド配列は第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される。いくつかの実施形態に、細胞の集団は第2の外因性ヌクレオチド組成物を含む第2の環状ポリヌクレオチドを更に含み、第2の外因性ヌクレオチド組成物はa)第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列; b)第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列を含み、第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向される。
【００８６】
また、本明細書では、治療が本明細書に記載される改変した細胞のいずれか又は細胞の集団のいずれかの治療有効量を投与することを含む、それを必要とする被験体のための方法治療も提供される。いくつかの実施形態に、細胞の改変した細胞又は集団は対象に由来する。いくつかの実施形態に、細胞の改変した細胞又は集団は、対象に関して同種異系である。
【００８７】
また、本明細書に提供されるのは、細胞を遺伝的に改変するための方法であって、1)単一のポリヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物であって、a)遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列; b)内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列を含み、内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列が内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向され、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が組成物の内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位への組み込み後に発現され得るように配向される、ヌクレオチド組成物を提供するステップと;2)内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位内の規定のヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を提供するステップと;3)細胞をヌクレオチド組成物及びヌクレアーゼ組成物と接触させるステップと、4)ヌクレオチド組成物及びヌクレアーゼを送達するステップとを含む、方法であって、単一のポリヌクレオチドを提供する。細胞にウイルスを感染させる以外の方法で細胞中に組成物を入れる。いくつかの実施形態に、本方法は細胞内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を提供することを更に含み、ここで、第2ヌクレアーゼ組成物は接触工程において細胞と接触し、送達工程において細胞中に送達される。いくつかの実施形態に、切断は、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を生じる。いくつかの実施形態に、非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、翻訳されるタンパク質のフレームの変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及び1つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む。いくつかの実施形態に、非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、遺伝子によってコードされるmRNA産物の発現を変える変異、及び遺伝子によってコードされるmRNA産物の安定性を変更させる変異からなる群より選択される遺伝子のノンコーディング領域(non-coding region)における変異を含む。いくつかの実施形態では、該方法がa)第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列; b)第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列であって、全てのヌクレオチド配列が単一のポリヌクレオチド上にあり、第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列が第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向され、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が組成物の第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位への組み込み後に発現され得るように配向され、第2のヌクレオチド組成物が接触工程において細胞と接触され、送達工程において細胞内に送達される、第2のヌクレオチド組成物を提供することを更に含む、第2のヌクレオチド組成物を提供することを更に含む。
【００８８】
いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)又はその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)又はその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)又はその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態に、CRISPRファミリーのヌクレアーゼはCas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、細胞内でヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。いくつかの実施形態に、接触工程は、細胞をヌクレオチド組成物及びヌクレアーゼ組成物と接触させる工程とデリバリー工程との間で、60分未満、45分未満、30分未満、20分未満、15分未満、10分未満、5分未満、又は1分未満である。
【００８９】
いくつかの実施形態に、送達工程は、エレクトロポレーション、物理的な方法によるトランスフェクション, 細胞膜変形、脂質ナノ粒子(LNP)、ウイルス様粒子(VLP)、及び超音波処理からなる群より選択される。いくつかの実施形態に、送達工程はエレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態に、コードされるポリペプチド配列の発現は、この内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指向される。いくつかの実施形態に、コードされたポリペプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指向される。いくつかの実施形態に、外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、プロモーターの2つの部分の融合、プロモーターの2つの部分の融合、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、βアクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター系、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター系、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター系からなる群より選択される。
【００９０】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部は、長さが100塩基以上である。いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【００９１】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域又は第2領域と同一のヌクレオチド配列は、50塩基長、100塩基長、200塩基長、400塩基長、600塩基長、800塩基長、1500塩基長、2000塩基長、又は4000塩基長である。
【００９２】
いくつかの実施形態に、定義されたヌクレオチド配列は、組込み後に破壊される。
【００９３】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に動作可能的に関連する内因性遺伝子の発現は破壊される。
【００９４】
いくつかの実施形態に、本方法は、相同組換え速度又は生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む。
【００９５】
いくつかの実施形態に、単一のポリヌクレオチドは、環状プラスミド、線状DNAフラグメント、ミニサークル、及びssDNAからなる群より選択される。いくつかの実施形態に、環状プラスミドは500塩基未満のベクター骨格を有し、ベクター骨格は、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列、第1の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列、又は第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態に、単一のポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。いくつかの実施形態に、単一のポリヌクレオチドは、実質的に混入物質を含まない。いくつかの実施形態に、単一のポリヌクレオチドは、細胞生存率を低下させる成分を実質的に含まない。
【００９６】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位はコーディング領域(coding region)を含む。いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位はイントロンを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位はT細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位である。いくつかの実施形態では、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位がTCR-ベータ遺伝子座位である。いくつかの実施形態, 内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は免疫チェックポイント遺伝子座位である。いくつかの実施形態に、免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【００９８】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はリンカー配列を含む。いくつかの実施形態に、リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードし、ここで、式後、切断可能なリンカーのポリペプチドは、遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生されるように切断される。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。いくつかの実施形態に、リンカー配列は配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。いくつかの実施形態に、リンカー配列は外因性のプロモーターを含む。いくつかの実施形態に、リンカー配列は、スプライス・アクセプター配列を更に含む。
【０１００】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はコーディング領域(coding region)をコードする。いくつかの実施形態に、コーディング領域(coding region)は、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子からなる群より選択される。
【０１０１】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はノンコーディング領域(non-coding region)をコードする。いくつかの実施形態に、ノンコーディング領域(non-coding region)は、shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子からなる群より選択される。
【０１０２】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、TCR遺伝子の少なくとも一部は、マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するために最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、TCR遺伝子の可変領域配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCRからなる群より選択される。いくつかの実施形態に、TCR遺伝子の少なくとも一部は、a)TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;b)TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;及びc)第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、TCR-アルファ、人間化TCR-アルファ、領域スワップTCR-アルファ、ポイント変化したTCR-アルファ、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを伴う技術化TCR-アルファ、ヒトでの表現に最適化されたコドン最適化TCR-アルファ、キメラ抗原レセプター(CAR)、及びコドン使用及びRNA不安定要素の除去のために最適化された順序TCR-アルファからなるグループから、TCR-アルファのポリペプチドシークエンスを選択する。いくつかの実施形態において、TCR-ベータのポリペプチド配列は、マウス化TCR-ベータ、ヒト化TCR-ベータ、ドメインスワップTCR-ベータ、点変異を入れたTCR-ベータ、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR-ベータ、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するために最適化した）-ベータ、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）-ベータからなる群より選択される。いくつかの実施形態に、コードされたポリペプチド配列は、リンカー:TCR-アルファ:第2リンカー:TCR-ベータ方位にある。いくつかの実施形態に、コードされたポリペプチド配列は、リンカー:TCR-ベータ:第2リンカー:TCR-アルファ方位にある。いくつかの実施形態に、第2リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。いくつかの実施形態に、第2リンカー配列は配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。いくつかの実施形態に、第2リンカー配列は、外因性のプロモーターを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部は、shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子からなる群より選択される。
【０１０４】
いくつかの実施形態に、第2の遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は免疫細胞を含む。いくつかの実施形態に、免疫細胞はT細胞を含む。いくつかの実施形態に、T細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、一次T細胞、腫瘍浸潤T細胞、工学的T細胞、調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、アルファ-βT細胞、及びγ-δT細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態に、免疫細胞はナチュラル・キラー細胞を含む。いくつかの実施形態に、免疫細胞は、B細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラーT細胞からなる群より選択される。
【０１０６】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は幹細胞を含む。いくつかの実施形態に、幹細胞は造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態に、幹細胞は胚幹細胞を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は初代細胞である。
【０１０８】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は単離された細胞であり、単離された細胞は対象から単離される。いくつかの実施形態に、対象は、がんを有することが知られているか、又は疑われる。
【０１０９】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は、ヒト細胞又はヒト由来細胞を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態に、改変した細胞はex vivo培養細胞である。いくつかの実施形態に、ex vivo培養細胞は、刺激された細胞を含む。いくつかの実施形態に、刺激された細胞はサイトカイン刺激されたT細胞を含み、任意選択で、サイトカイン刺激されたT細胞は、CD3刺激されたT細胞、CD28刺激されたT細胞、又はCD3及びCD28刺激されたT細胞を含む。いくつかの実施形態に、サイトカインで刺激されたT細胞は、IL7、IL15、又はそれらの組合せの存在下で培養される。いくつかの実施形態に、サイトカインで刺激されたT細胞は、IL2の存在下で培養される。いくつかの実施形態に、サイトカインで刺激されたT細胞は、IL2を実質的に含まない培地中で培養される。
【０１１１】
いくつかの実施形態に、改変した細胞は組み込まれたウイルスを含まず、組み込まれたウイルスはウイルスを介した送達の成分と操作可能に結合している。いくつかの実施形態に、改変した細胞の表面上のMHCクラスIはウイルスを介した送達の成分又は組み込まれたウイルスに由来するペプチドを含まず、ここで、組み込まれたウイルスはウイルスを介した送達の成分と動作可能的に会合している。
【０１１２】
改変した細胞が組み込まれたヌクレオチド配列を含み、組み込まれたヌクレオチド配列が遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、組み込まれたヌクレオチド配列が内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれ、組み込まれたヌクレオチド配列が遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される改変した細胞もまた、本明細書に提供される。
【０１１３】
集団中の細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超が組み込まれたヌクレオチド配列を含み、組み込まれたヌクレオチド配列が遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、組み込まれたヌクレオチド配列が内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれ、組み込まれたヌクレオチド配列が、遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される細胞の集団。
【０１１４】
いくつかの実施形態に、細胞は組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、ソーティング、選択、又は単離されていない。いくつかの実施形態に、デリバリー工程後の細胞の集団の生存率は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも40%、少なくとも60%、又は少なくとも80%である。いくつかの実施形態に、生存率は、デリバリー工程の4日後に評価される。いくつかの実施形態に、生存率は、AOPI汚染によって評価される。
【０１１５】
本明細書では、処理が本明細書に記載のいずれかの方法によって産生される細胞又は細胞の集団のいずれかの処理有効量を投与することを含む、それを必要とする対象のための方法処理も提供される。いくつかの実施形態に、細胞又は細胞の集団は対象に由来する。いくつかの実施形態に、細胞又は細胞の集団は、対象に関して同種異系である。
【０１１６】
また、本明細書において提供されるのはa)遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列; b)内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列(ここで、この遺伝子の少なくとも一部は100塩基長であり、このヌクレオチド配列のすべては単一のポリヌクレオチド上にあり、この内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位における相同組換えを容易にするように向けられ、この遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列はこの組成物の内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位への組み込み後に発現され得るように向けられる)を含む、ヌクレオチド組成物を提供する工程;及び2)内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断し得るCRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物を提供する工程を包含する、ヌクレオチド組成物であって、a)遺伝子組成物を遺伝的に改変するための方法であって、a)遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を提供する工程;を包含する、ヌクレオチド組成物;及びb)内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断し得るCRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物T細胞をヌクレオチド組成物及びCRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物と接触させ、4)ヌクレオチド組成物及びCRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物をエレクトロポレーションによってT細胞に送達する。
【０１１７】
また、本明細書に提供されるのは、定義されたT細胞受容体を有する修飾T細胞を作製する方法であって、a)TCR-アルファポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列;b)TCR-βポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列; c)第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; d)第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; e)内因性TCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びf)内因性TCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列であって、全てのヌクレオチド配列が単一のポリヌクレオチド上にあり、内因性TCR遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列が内因性TCR遺伝子座位における相同組換えを容易にするように配向され、TCR-アルファポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列であって、TCR-βの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド組成物を提供する工程を含む、方法でヌクレオチド組成物を提供する工程もまた、本明細書に提供される。ポリペプチド配列、及び第1及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が組成物を内因性TCR遺伝子座位に組み込んだ後に単一のポリペプチドとして発現されることができるように配向され、第1リンカーのポリペプチド配列がTCR-アルファポリペプチド配列、TCR-βポリペプチド配列の少なくとも一部、及び第2リンカーのポリペプチド配列の少なくとも一部の前に位置し、第2リンカーのポリペプチド配列がTCR-アルファポリペプチド配列とTCR-βポリペプチド配列との間に位置し、TCR-アルファポリペプチド配列及びTCR-βポリペプチド配列がそれぞれ別々のポリペプチドを形成し、別々のポリペプチドが一緒に会合して機能的TCRを形成することができる;2)内因性TCR遺伝子座位内で定義されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を提供すること;3)T細胞をヌクレオチド組成物及びヌクレアーゼ組成物と接触させること;及び4)ヌクレオチド組成物及びヌクレアーゼ組成物をT細胞に送達すること。
【０１１８】
いくつかの実施形態に、本方法はT細胞内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を提供することを更に含み、ここで、第2ヌクレアーゼ組成物は、接触工程においてT細胞と接触され、送達工程においてT細胞中に送達される。いくつかの実施形態に、切断は、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を生じる。いくつかの実施形態に、非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、翻訳されるタンパク質のフレームの変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及び1つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む。いくつかの実施形態に、非‐機能性の遺伝子を産生する変異は、遺伝子によってコードされるmRNA産物の発現を変更させる変異、及び遺伝子によってコードされるmRNA産物の安定性を変更させる変異からなる群より選択される遺伝子のノンコーディング領域(non-coding region)における変異を含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、該方法がa)遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列;b)内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列であって、全てのヌクレオチド配列が単一のポリヌクレオチド上にあり、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列が内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向され、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が組成物の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位への組み込み後に発現され得るように配向され、第2のヌクレオチド組成物が接触工程においてT細胞と接触され、送達工程においてT細胞に送達される、ヌクレオチド組成物を提供することを更に含む、第2のヌクレオチド組成物を提供することを更に含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)又はその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)又はその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)又はその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態に、CRISPRファミリーのヌクレアーゼはCas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。いくつかの実施形態に、ヌクレアーゼ組成物は、T細胞内でヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。いくつかの実施形態に、接触工程は、T細胞をヌクレオチド組成物及びヌクレアーゼ組成物と接触させる工程とデリバリー工程との間で、60分未満、45分未満、30分未満、20分未満、15分未満、10分未満、又は5分未満である。
【０１２１】
いくつかの実施形態に、送達工程は、エレクトロポレーション、物理的な方法によるトランスフェクション, 細胞膜変形、脂質ナノ粒子(LNP)、ウイルス様粒子(VLP)、及び超音波処理からなる群より選択される。いくつかの実施形態に、送達工程はエレクトロポレーションを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態に、コードされるポリペプチド配列の発現は、この内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指向される。いくつかの実施形態に、コードされたポリペプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指向される。いくつかの実施形態に、外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、プロモーターの2つの部分の融合、プロモーターの2つの部分の融合、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、βアクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター系、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター系、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター系からなる群より選択される。
【０１２３】
いくつかの実施形態に、TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又はTCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、100塩基長以上である。いくつかの実施形態に、TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又はTCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【０１２４】
いくつかの実施形態に、内因性のTCR遺伝子座位の第1領域又は第2領域と同一のヌクレオチド配列は、50塩基長、100塩基長、200塩基長、400塩基長、600塩基長、800塩基長、1500塩基長、2000塩基長、又は4000塩基長である。
【０１２５】
いくつかの実施形態に、定義されたヌクレオチド配列は、組込み後に破壊される。
【０１２６】
いくつかの実施形態に、内因性のTCR遺伝子座位に動作可能的に関連する内因性遺伝子の発現は破壊される。
【０１２７】
いくつかの実施形態に、本方法は、相同組換え速度又は生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態に、単一のポリヌクレオチドは、環状プラスミド、線状DNAフラグメント、ミニサークル、及びssDNAからなる群より選択される。いくつかの実施形態に、環状プラスミドは500塩基未満のベクター骨格を有し、ベクター骨格は、TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではなく、TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列でもなく、第1及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列でもないヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態に、単一のポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。いくつかの実施形態に、単一のポリヌクレオチドは、実質的に混入物質を含まない。
【０１２９】
いくつかの実施形態に、内因性のTCR遺伝子座位はコーディング領域(coding region)を含む。いくつかの実施形態に、内因性のTCR遺伝子座位はイントロンを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態に、内因性のTCR遺伝子座位はTCR-アルファ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態に、内因性のTCR遺伝子座位はTCR-ベータ遺伝子座位を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態に、第1リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含み、発現後、切断可能なリンカーのポリペプチドは、TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードすることによってのみコードされるポリペプチド、TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部、及び第2リンカーのポリペプチド配列が産生されるように切断される。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。いくつかの実施形態に、第1リンカーのポリペプチド配列はIRESを含む。いくつかの実施形態に、第1リンカー配列はスプライス・アクセプター配列を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態に、第2リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含み、ここで、式後、切断可能なリンカーのポリペプチドはTCR-アルファのポリペプチド配列及びTCR-ベータのポリペプチド配列がそれぞれ別個のポリペプチドを形成するように切断され、ここで、別個のポリペプチドは一緒に会合して機能的TCRを形成し得る。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態に、第2リンカー配列は配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。いくつかの実施形態に、第2リンカー配列は、外因性のプロモーターを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、TCR-アルファ、人間化TCR-アルファ、領域スワップTCR-アルファ、ポイント変化したTCR-アルファ、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを伴う技術化TCR-アルファ、ヒトでの表現に最適化されたコドン最適化TCR-アルファ、キメラ抗原レセプター(CAR)、及びコドン使用及びRNA不安定要素の除去のために最適化された順序TCR-アルファからなるグループから、TCR-アルファのポリペプチドシークエンスを選択する。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、TCR-ベータのポリペプチド配列は、マウス化TCR-ベータ、ヒト化TCR-ベータ、ドメインスワップTCR-ベータ、点変異を入れたTCR-ベータ、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR-ベータ、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するために最適化した）-ベータ、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）-ベータからなる群より選択される。
【０１３６】
いくつかの実施形態に、コードされたポリペプチド配列は、第1リンカー:TCR-アルファ:第2リンカー:TCR-ベータ方位にある。いくつかの実施形態に、コードされたポリペプチド配列は、リンカー:TCR-ベータ:第2リンカー:TCR-アルファ方位にある。
【０１３７】
いくつかの実施形態に、定義されたヌクレオチド配列が内因性TCR-アルファ座内にある場合、第2の規定されたヌクレオチド配列は内因性TCR-ベータ座内にある。
【０１３８】
いくつかの実施形態に、定義されたヌクレオチド配列が内因性TCR-ベータ座内にある場合、第2の規定されたヌクレオチド配列は内因性TCR-アルファ座内にある。いくつかの実施形態に、第2の規定されたヌクレオチド配列は、免疫チェックポイント遺伝子座位内にある。いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部は、shRNA、siRNA、miRNA、サイトカイン、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子からなる群より選択される。
【０１３９】
a)遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列;b)内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列であって、全てのヌクレオチド配列が単一のポリヌクレオチド上にあり、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列が内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向され、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が、組成物の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位への組み込み後に遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されるヌクレオチド配列を含む、環状ポリヌクレオチドを含む、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを指示する際に使用するためのヌクレオチド組成物もまた、本明細書に提供される。いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、100塩基長以上である。いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【０１４０】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【０１４１】
いくつかの実施形態に、本内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【０１４２】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列及び内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、それぞれ長さが600塩基以上である。
【０１４３】
いくつかの実施形態に、環状ポリヌクレオチドはプラスミド又はナノプラスミドを含む。いくつかの実施形態に、プラスミドは500塩基未満のベクター骨格を有し、ベクター骨格は、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではなく、第1の内因性標的ゲノム遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列である。
【０１４４】
いくつかの実施形態に、環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【０１４５】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位はコーディング領域(coding region)を含む。いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位はイントロンを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位は、T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態に、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位はTCR-ベータ遺伝子座位を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態に、内因性のゲノム・ターゲットは、免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態に、免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【０１４８】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はリンカー配列を含む。いくつかの実施形態に、リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードし、ここで、式後、切断可能なリンカーのポリペプチドは、遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生されるように切断される。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、フリン切断部位を含む。いくつかの実施形態に、リンカー配列の何れか1つは、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。いくつかの実施形態に、切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、Gly-Ser-Glyリンカーを含み、任意選択で、Gly-Ser-Glyリンカーが2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端であり、任意選択で、Gly-Ser-GlyリンカーがN末端からC末端へのフューリン切断部位:Gly-Ser-Glyリンカー:2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)方位にある。いくつかの実施形態に、リンカー配列、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。いくつかの実施形態に、リンカー配列、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、外因性のプロモーターを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態に、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はシグナル・ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、シグナル・ペプチドは、遺伝子の少なくとも一部、TCR-アルファのポリペプチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部によって符号化されるポリペプチドによって符号化されるポリペプチドに動作可能的に連結される。いくつかの実施形態に、シグナル・ペプチドは外因性のシグナル・ペプチドであり、必要に応じて、外因性のシグナル・ペプチドは、ヒト成長ホルモンシグナル・ペプチドである。
【０１５１】
いくつかの実施形態に、第1リンカーのポリペプチド配列及び第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態に、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び同じリンカーのポリペプチド配列をコードする第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列はコドンが異なるヌクレオチド配列を含み、第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが異なる。
【０１５２】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はコーディング領域(coding region)をコードする。いくつかの実施形態に、コーディング領域(coding region)は、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子からなる群より選択される。
【０１５３】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部はノンコーディング領域(non-coding region)をコードする。いくつかの実施形態に、ノンコーディング領域(non-coding region)は、shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子からなる群より選択される。
【０１５４】
Tinいくつかの実施形態では、遺伝子の少なくとも一部がTCR遺伝子の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態に、TCR遺伝子の少なくとも一部は、a)TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;b)TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;及びc)第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、TCR-アルファのポリペプチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメインスワップTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有するように遺伝子操作をしたTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するために最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)の除去のために最適化した）、TCR遺伝子の可変領域配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCRからなる群より選択される。
【０１５６】
いくつかの実施形態に、TCR-アルファのポリペプチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部によってコードされるポリペプチドは内因性TCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列とのより大きな会合を実証するように操作され、場合により、TCR-アルファのポリペプチド配列及びTCR-ベータのポリペプチド配列は、内因性TCRポリペプチド配列と比較して互いにより大きな会合を実証するように操作される。
【０１５７】
いくつかの実施形態に、コードされるポリペプチド配列は、N末端からC末端へのリンカー:TCR-アルファ:第2リンカー:TCR-ベータ方位にある。いくつかの実施形態に、コードされるポリペプチド配列は、N末端からC末端へのリンカー:TCR-ベータ:第2リンカー:TCR-アルファ方位にある。
【０１５８】
いくつかの実施形態に、遺伝子の少なくとも一部、TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又はTCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列はコドン分岐ヌクレオチド配列を含み、コドン分岐ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドン分岐している。
【発明を実施するための形態】
【０１５９】
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付の図面に関連してより良く理解されるのであろう:
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図1は、TRAC遺伝子座位へのZsGreenレポーター積分に使用される全般的な編集ストラテジを表す概略図を提示する。一般TCRアルファ遺伝子座位ターゲティングストラテジーは、1kbの左右相同アーム(「HR arms」)に挟まれ、P2A配列によって隔てられたプロモーターのないZsGreen及び切断されたLNGRFコーディング配列を含む相同修復テンプレート、並びに円形ナノプラスミドにコードされるTCRアルファ遺伝子座位配列からZsGreen及びLNGRFカセットを隔てる5'P2A配列を使用した。
【図２】図2は、ZsGreen統合のための一般的な編集タイムラインを示す。
【図３】図3は、TRAC遺伝子座位に組み込まれたZsGreenレポーターを用いたT細胞の編集効率を示す。
【図４】は、ネオ抗原特異的TCR構築物(neoTCR)をTCRアルファ遺伝子座位に組み込むために使用される一般的な標的化戦略を表す概略図を提示する。
【図５】は、TCRアルファ遺伝子座位にneo抗原特異的TCR構築物(neoTCR)を組み込むために使用されるneo抗原特異的TCR構築物設計を示す。図5Aは、標的TCRアルファ遺伝子座位(内因性TRAC、上部パネル)及びそのCRISPR Cas9標的部位(横縞、矢印で示される切断部位)、並びに組み込み前の左右のホモロジーアーム(それぞれ、「LHA」及び「RHA」)の間に位置するneoTCRをコードするポリヌクレオチドを有する環状プラスミドHRテンプレート(下部パネル)を示す。図5Bは、TCRアルファ遺伝子座位(上図)、転写されスプライシングされたneoTCR mRNA(中央図)、及び発現されたneoTCRの翻訳とプロセシング(下図)における組み込まれたneoTCRを示している。
【図６】は、neoTCRコンストラクトを挿入するT細胞に編集するための一般的な編集タイムラインを示す。
【図７】は、TCRアルファ遺伝子座位へのneoTCR構築物の正確なゲノム組み込みを確認するために使用される、インアウトPCR技術(一般ストラテジー、トップパネル)及びアガロースゲル上で可視化されたPCR増幅産物(ボトムパネル)を示す。
【図８】8は、フロー・サイトメトリーによるMART-1 neoTCRの発現を示す。図8Aは、MART-1特異的デキストラマー汚染を用いたMART-1 neoTCRの発現を示す。図8Bは、Day 10におけるMART-1特異的デキストラマー汚染を用いたMART-1 neoTCRの編集結果の要約を示す。
【図９】は、IFNγ(左側パネル)及びIL-2(右側パネル)についての抗原特異的サイトカイン産生アッセイにおける操作されたT細胞の評価を示す。
【図１０】は、抗原特異的増殖アッセイ(図10A)及び抗原特異的T細胞媒介殺傷アッセイ(図10B)における操作されたT細胞の評価を示す。
【図１１】はMART-1又はNY-ESO neoTCRのいずれかを表現するエンジニアド・T細胞を、レンバイラル変換処理法(図11、上部パネル)を用いて生成したか、又は小型又は大型フォーマットを用いた電解媒介HR編集を用いて生成したMART-1 neoTCRを表現するエンジニアド・T細胞を示している(図11、下部パネル)。
【図１２】は、抗原特異的T細胞媒介殺傷アッセイにおける操作されたT細胞の評価を示す。各群の上から下の列:同族ペプチドでパルスされない非同族MHC HLA-A01;10μM MART1でパルスされた非同族MHC HLA-A01;同族ペプチドでパルスされない同族MHC HLA-A02;10μM MART1でパルスされた同族MHC HLA-A01;MART-1同族抗原ペプチドを構成的に発現するHLA-A02ターゲット細胞。
【図１３】は、精製された環状プラスミドDNA及びHRテンプレートとしてのPCRによって生成された線状dsDNAを使用した、HR媒介編集効率を示す。図13Aは、標準PCR製品(上部)及び半保護PCR製品(下部)を示す。図13Bは、環状プラスミド、標準PCR産物、及びHRテンプレートのための半保護PCR産物を用いた編集効率を示す。
【図１４】は、細胞数(左側)又はAOPI汚染(右側)によって評価した、購入した(「pUC57」)又は社内精製した(「社内pUC57」)を用いたT細胞生存率を示す。
【図１５】は、Neo12特異的デキストラマー汚染によって検出されたNeo12 neoTCRの発現を示す。
【図１６】は、Neo12特異的デキストラマー汚染によって検出されたNeo12 neoTCRの発現を示す。
【図１７】は、特定のデクストラマーの汚れによって検出されたneoTCR MART-1、Neo12、及びNY-ESOの表現を示している。
【図１８】は、ドナー由来T細胞へのneoTCRの組み込みを示す。図18Aは、健全な供与者又は患者導出T細胞の特定のデクストラマー汚染によって検出されたneoTCR MART-1、Neo12、及びNY-ESOの編集効率(CD8+の%)を示す。図18Aは、健康なドナー由来T細胞におけるneoTCR neo12の編集効率(CD8+の%として)を示す。
【図１９】は、pan-TCR抗体に結合しないCD3錯体の検出によって評価された、CD4+及びCD8+細胞の編集効率を示す。
【図２０】は、組み込まれたneoTCR及び内因性TCRの表面発現レベルを示す。図20Aは、同じ抗体(CD3)を用いて染色された内因性TCR(左側ヒストグラム)及びNeo12 neoTCR TCR(右側ヒストグラム)についてのMFIのヒストグラムを示す。図20Aは、内生TCRと比較したNeoTCR MART-1、Neo12、NY-ESOの表面レベルの表現解析を示している。*1細胞あたりのTCR表現レベルは文献に基づいている。
【図２１】は、新たに単離され、プロディギープラットホームを用いて単離されたPBMCからのT細胞の大型編集を用いたNeo12特異的デキストラマー汚染によって評価されたNeo12 neoTCRの発現を示す。
【図２２】は、いずれかがペプチドでパルスされたターゲット細胞(HLA-A02発現K562細胞)を使用して、編集されたT細胞を評価するための全般的なストラテジーを示す。
【図２３】は、HLA複合体(pHLA)中で予め形成されたペプチドを発現するように操作されたターゲット細胞(HLA-A02発現K562細胞)を用いて編集T細胞を評価するための一般的なストラテジーを示す。
【図２４】は、抗原特異的T細胞媒介殺傷アッセイにおける操作されたT細胞の評価を示す。*パルスペプチドは標的新抗原を発現するインビボ腫瘍とは対照的に、インビトロでターゲット細胞上に簡単に表示されるだけである。
【図２５】は、抗原特異的増殖アッセイにおける操作されたT細胞の評価を示す。図25Aは、図25Bで計算された割り算細胞%での増殖を実証する典型的なヒストグラムプロットを示す。
【図２６】は、サイトカインIFNγ(図26A)、IL-2(図26B)、TNFアルファ(図26C)、及びIL-6(図26D)のための抗原特異的サイトカイン製造アッセイにおけるエンジド・T細胞の評価を示す。
【図２７】は、ドナー由来T細胞を用いた編集T細胞の評価を示す。図27Aは、健常ドナー及び患児ドナーに由来するT細胞の編集効率を示す。図27Bは、健常ドナー及び患児ドナーに由来するT細胞に対する抗原特異的T細胞媒介殺傷試験を示す。図27Cは、健康なドナー及びドナーに由来するT細胞についての抗原特異的増殖アッセイを示す。図27Dは、健常ドナー及び患児ドナーに由来するT細胞のための抗原特異的サイトカイン産生試験を示す。
【図２８】は、ドナー由来T細胞を用いた編集T細胞の評価を示す。図28Aは、Neo12 neoTCR又はMART-1 neoTCRのいずれかを発現するドナーT細胞の編集効率を示す。図28Bは、Neo12 neoTCR又はMART-1 neoTCRのいずれかを発現するドナーT細胞に対する抗原特異的T細胞媒介殺傷アッセイを示す。図28Cは、Neo12 neoTCR又はMART-1 neoTCRのいずれかを発現するドナーT細胞に対する抗原特異的増殖アッセイを示す。
【図２９】は、製造後14日(左側パネル)及び2ヶ月(右側パネル)でNeo12 neoTCR又はMART-1 neoTCRのいずれかを発現するドナーT細胞についての抗原特異的T細胞媒介殺傷アッセイを同等の有効性で示す。
【図３０】は、Neo12 neoTCR(図30A)又はMART-1 neoTCR(図30B)のいずれかを発現する編集されたT細胞についてのアイソプレキシ解析を示す。図30Cは、サイトカイン反応に対する操作されたT細胞の寄与(左側パネル)及びそれぞれのサイトカインを産生するT細胞の割合(右側パネル)を示す。
【図３１】は、使用されるHSC編集のための一般的なワークフローを示す。
【図３２】は、neo12 neoTCR構築物のHSCのTCRアルファ遺伝子座位への正確なゲノム組み込みを確認するために使用されるアガロースゲル上で可視化された増幅産物をPCRするインアウトPCR技術を示す。
【図３３】は、NK細胞のTCRアルファ遺伝子座位に組み込まれたZsGreenレポーターから11日目にZsGreen式を実証する典型的なプロットを示す。
【図３４】は、NK細胞のTCRアルファ遺伝子座位に組み込まれたZsGreenレポータの正確なゲノム組み込みを確認するために使用されるアガロースゲル上で可視化された増幅産物をPCRするインアウトPCR技術を示す。  発明の詳細な説明  定義
【０１６１】
本明細書中で使用される場合、「抗原」は、患者特異的ネオ抗原を含む任意の抗原を含む。抗原には、免疫反応を誘導することができる任意の物質が含まれる。
【０１６２】
本明細書中で使用される場合、「抗原特異的T細胞」は、それらの抗原特異性を与えるそれらのT細胞レセプター(TCR)によって互いに区別される細胞をいう。
【０１６３】
本明細書中で使用される場合、「抗原複合体」、「抗原-MHC」、「抗原-MHC複合体」、「組換え抗原-MHC複合体」、「ペプチドMHC」、「p/MHC」、及び「pHLA」は、抗原結合溝中のペプチドを有する組換え主要組織適合性遺伝子複合体を指すために互換的に使用される。本明細書中で使用される場合、用語MHCはヒト白血球抗原(HLA)と呼ばれるヒトMHCを含むが、これに限定されない。
【０１６４】
用語「有効量」又は「治療有効量」は疾患の症状を改善するのに有効な量、例えば、腫瘍の成長を阻害するのに有効な量を指す。
【０１６５】
「改善する」という用語は疾患状態、例えば癌性疾患状態の治療において治療上有益な結果を指し、予防、重症度又は進行の軽減、寛解、又は治癒を含む。
【０１６６】
「インサイチュ」という語は生きている生物から分離して成長する、例えば、組織培養で成長する生きている細胞で起こるプロセスを指す。
【０１６７】
「インビボ」という用語は、生体内で起こるプロセスを指す。
【０１６８】
本明細書で使用される「哺乳動物」という用語はヒト及び非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタを含むが、これらに限定されない。
【０１６９】
「アイデンティティ」という用語は2つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、以下に記載する配列比較アルゴリズム(例えば、BLASTP及びBLASTN又は当業者に利用可能な他のアルゴリズム)の1つを使用して、又は目視検査によって測定されるように、最大限の対応のために比較及び整列された場合に、同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基の指定されたパーセンテージを有する2つ以上の配列又はサブ配列を指し、用途に応じて、「アイデンティティ」パーセントは比較される配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在し得るか、又は代わりに、比較される2つの配列の全長にわたって存在し得る。
【０１７０】
配列比較のために、典型的には、1つの配列が試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、部分配列配位を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【０１７１】
比較のための配列の最適なアラインメントは例えば、Smith & Waterman、Advの局所相同性アルゴリズムによって行うことができる。Appl. 数学。2:482(1981)、Needleman & Wunsch、JMol.のホモロジーアラインメントアルゴリズムによる。Biol. 48:443(1970)Pearson & Lipman、Procの類似性方法の検索による。Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装(GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA in Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr、Madison、WI)、又は目視検査(一般的にAusubelらを参照のこと)。
【０１７２】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例はBLASTアルゴリズムであり、これはAltschulら、JMol.に記載されている。Biol. 215:403-410(1990). BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(<www.ncbi.nlm.nih.gov />)を通して公的に入手可能である。
【０１７３】
「保存的置換」又は「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸を化学的又は機能的に類似のアミノ酸で置換することを指す。類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知である。例えば、表1〜4に提供されるアミノ酸の群はいくつかの実施形態に、互いに保存的置換であると考えられる。
【０１７４】
[表1]
[表2]
[表3]
【０１７５】
更なる保存的置換は例えば、Creighton, タンパク質: Structures and Molecular Properties 2nd ed.(1993)WHFreeman & Co、New York、NYに見出され得る。親タンパク質中のアミノ酸残基の1つ以上の保存的置換を作製することによって生成されるタンパク質は、「保存的に改変された改変体」と呼ばれる
【０１７６】
用語「アミノ酸」は、20個の一般的な天然に存在するアミノ酸をいう。天然に存在するアミノ酸には、アラニン(Ala; A)、アルギニン(Arg; R)、アスパラギン(Asn; N)、アスパラギン酸(Asp; D)、システイン(Cys; C);グルタミン酸(Glu; E)、グルタミン(Gln; Q)、グリシン(Gly; G);ヒスチジン(His; H)、イソロイシン(Ile; I)、ロイシン(Leu; L)、リジン(Lys; K)、メチオニン(Met; M)、フェニルアラニン(Phe; F)、プロリン(Pro; P)、セリン(Ser; S)、トレオニン(Thr; T。
【０１７７】
特に明記しない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される用語「約」は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均値の2標準偏差内と理解される。約は、記載された値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、又は0.01%以内と理解することができる。
【０１７８】
「実質的に含まない」という用語は関連する全組成物中に存在する、統計的に有意な量未満の成分(例えば、混入物質又はウイルス成分)を意味すると理解され、関連する全組成物中に検出できないレベルである成分(すなわち、「含まない」)を含む。統計的に有意な量未満とは、0.1、0.05、又は0.01を超えるp値などの、成分が関連組成物中に存在するという統計的信頼性を有するとはみなされない検出レベルを指すことができる。組成物が10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、００００%又は0.００００%未満の質量/体積百分率濃度で成分を含有する場合、組成物は実質的に成分を含まないことができる。
【０１７９】
明細書及び特許請求範囲で使用されているように、単数形の「a」、「an」及び「the」は文脈が明瞭に他のことを指示しない限り、複数の引例を含んでいることに留意されたい。
改変した細胞
【０１８０】
例えば、ウイルスデリバリー・システムを使用せずに遺伝子元素を付加及び/又は除去するように改変された一次ヒト細胞を含む、改変した細胞が本明細書中に提供される。
【０１８１】
一態様では、本改変した細胞がa)遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と、 b)内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列と、 c)内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列とを含み、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列が内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向され、改変した細胞がウイルス媒介デリバリー成分を実質的に含まない、外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを含む。改変した細胞は組み込まれたヌクレオチド配列を更に含むことができ、ここで、組み込まれたヌクレオチド配列は遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、組み込まれたヌクレオチド配列は内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれ、組み込まれたヌクレオチド配列は遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される。
【０１８２】
別の局面において、改変細胞が提供され、改変細胞はa)TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; b)TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; b)TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; c)第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; d)第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; ここで、TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び第1及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列はポリペプチド配列の各々が単一のポリペプチドとして発現され得るように配向され、ここで、第2リンカーのポリペプチド配列はTCR-アルファポリペプチド配列とTCR-βポリペプチド配列との間に位置する。第2リンカーのポリペプチドがTCR-アルファポリペプチド配列及びTCR-βポリペプチド配列がそれぞれ別々のポリペプチドを形成するように、T細胞中で切断され得る切断可能なリンカーのポリペプチドであり、ここで、別々のポリペプチドは一緒に会合して機能的TCRを形成し得、ここで、改変された細胞はウイルス媒介送達の成分を実質的に含まず、そして内因性TCR-β遺伝子座位が破壊される。改変T細胞は外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み得、この外因性のヌクレオチド配列はa)TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び第1及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む;b)内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列;並びに内因性のTCR遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は内因性のTCR遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向される。
【０１８３】
別の局面において、改変されたT細胞が提供され、a)TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;b)TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; c)第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; d)第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;ここで、TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-アルファポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-βポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び第1及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、ポリペプチド配列の各々が単一のポリペプチドとして発現され得るように配向され、ここで、第2リンカーのポリペプチド配列はTCR-アルファポリペプチド配列とTCR-βポリペプチド配列との間に位置し、第1及び第2リンカーのポリペプチドは切断され得る切断可能なリンカーのポリペプチドである。TCR-アルファポリペプチド配列及びTCR-βポリペプチド配列がそれぞれ別々のポリペプチドを形成するようにT細胞を改変し、ここで別々のポリペプチドは一緒に会合して機能的TCRを形成することができる。改変T細胞は外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み得、この外因性のヌクレオチド配列はa)TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び第1及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む;b)内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列;並びに内因性のTCR遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は内因性のTCR遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向される。修飾T細胞は、ウイルス媒介デリバリー成分を実質的に含まなくてもよい。
細胞修飾及びゲノム編集
【０１８４】
概して、改変した細胞は、それらがゲノム編集されるか、又はゲノム編集され得るように改変される。例えば、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集システムを用いて、改変した細胞をゲノム編集して外因性遺伝子を発現させることができる。そのようなものとして、改変した細胞は、内因性のTCR遺伝子座位を含む内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断するヌクレアーゼ組成物を含むことができる。外因性ポリヌクレオチド(例えば、外因性遺伝子又はその一部)が本改変した細胞のゲノムに組み込まれている場合、細胞は修飾されていると考えることができる。細胞はヌクレアーゼ媒介遺伝子編集において一般的に使用される成分、すなわちゲノム編集を促進することができる成分(例えば、ヌクレアーゼ、ホモロジー修理テンプレート、CRISPRシステムヌクレオチドなど)の1つ以上を含む場合、修飾されているとみなすことができる。細胞は内因性標的遺伝子座位を破壊する1つ以上の非鋳型化変異(例えば、組み込まれた外因性ポリヌクレオチドとは別個の変異)、例えば1つ以上の非鋳型化変異を含む場合、修飾されているとみなすことができる。種々の変形は相互に排他的ではなく、すなわち、改変した細胞は組み込まれた外因性のポリヌクレオチド(例えば、外因性の遺伝子又はその一部)、並びに外因性のポリヌクレオチドの組み込みを促進する成分のような、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集において一般的に使用される成分の1つ以上を有し得る。
【０１８５】
例示的な実施例では、修飾T細胞が外因性のTCR配列をコードする組み込まれたポリヌクレオチド、内因性のTCR遺伝子座位を標的とするCRISPR/Cas9 RNP、及び外因性のTCR配列をコードするホモロジーリペアテンプレート(HRT)を有することができる。別の例示的な例では、改変した細胞が内因性のTCR遺伝子座位を標的とするCRISPR/Cas9 RNP及び外因性のTCR配列をコードする相同修理テンプレート(HRT)を有することができる。
【０１８６】
別の例示的な例において、改変した細胞は外因性の配列(例えば、遺伝子の少なくとも一部)をコードする組み込まれたポリヌクレオチド、内因性遺伝子座位を標的とするCRISPR/Cas9 RNP、及び外因性の配列をコードするホモロジーリペアテンプレート(HRT)を有することができる。別の例示的な例において、改変した細胞は、内因性遺伝子座位を標的とするCRISPR/Cas9 RNP、及び外因性配列をコードするホモロジーリペアテンプレート(HRT)を有することができる。
【０１８７】
別の例示的な実施例では、改変造血幹細胞(HSC)が外因性の配列(例えば、遺伝子の少なくとも一部)をコードする組み込まれたポリヌクレオチド、内因性遺伝子座位を標的とするCRISPR/Cas9 RNP、及び外因性の配列をコードするホモロジーリペアテンプレート(HRT)を有することができる。別の例示的な例において、改変HSCは、内因性遺伝子座位を標的とするCRISPR/Cas9 RNP、及び外因性配列をコードするホモロジーリペアテンプレート(HRT)を有することができる。
【０１８８】
別の例示的な例では、改変ナチュラル・キラー(NK)細胞が外因性の配列(例えば、遺伝子の少なくとも一部)をコードする組み込まれたポリヌクレオチド、内因性遺伝子座位を標的とするCRISPR/Cas9 RNP、及び外因性の配列をコードするホモロジーリペアテンプレート(HRT)を有することができる。別の例示的な例では、修飾NK細胞が内因性遺伝子座位を標的とするCRISPR/Cas9 RNP、及び外因性配列をコードするホモロジーリペアテンプレート(HRT)を有することができる。
内因性遺伝子の破壊
【０１８９】
改変した細胞は、非‐機能性の遺伝子が産生されるか、又は産生され得るように改変され得る。
【０１９０】
ヌクレアーゼ組成物によって産生される非機能的遺伝子をもたらす変異は鋳型ゲノム編集、例えば、相同組換えDNA修復機構の結果であり得る。ゲノム標的遺伝子座位において外因性ポリヌクレオチド(例えば、遺伝子)を発現するようにゲノム学的に編集された改変した細胞は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に動作可能的に関連する内因性遺伝子の発現をも破壊することができる。例えば、ゲノム標的遺伝子座位によってコードされる内因性遺伝子は機能的に欠失され得るか(例えば、内因性遺伝子又はその一部の、組み込まれた外因性遺伝子による除去/置換)、又は機能的に破壊され得る(例えば、内因性遺伝子の転写及び/又は翻訳が破壊されるような、内因性遺伝子又はその一部内への外因性遺伝子の組み込み)。例示的な例では、TCRをコードする外因性遺伝子を、内因性TCR遺伝子の発現が破壊されるように、エクソンをコードするTCRアルファ定常領域のような内因性のTCR遺伝子座位に組み込むことができる。式の破壊は無改変した細胞と比較して内因性遺伝子をコードするmRNAの式を減少させることができ、又は無改変した細胞と比較して内因性遺伝子の翻訳を減少させることができる。式の破壊は、無改変した細胞と比較して内因性遺伝子をコードするmRNAの検出可能な式の排除であり得るか、又は無改変した細胞と比較して内因性遺伝子の検出可能な翻訳の排除であり得る。
【０１９１】
改変した細胞は規定されたヌクレオチド配列(すなわち、ゲノム標的遺伝子座位)によってコードされる非機能的遺伝子を産生する非鋳型化変異(例えば、組み込まれた外因性ポリヌクレオチドとは別の変異)を含む修飾を有することができる。ヌクレアーゼ組成物によって産生される非機能的遺伝子をもたらす変異は非鋳型ゲノム削除、例えば、ゲノムの挿入又は削除をもたらすヌクレアーゼ切断誘導非相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)DNA修復機構(インデルとも呼ばれる)の結果であり得る。非機能的遺伝子を産生し得る変異には、遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異(例えば、翻訳されるタンパク質のフレームの変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、又は1つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation))又はノンコーディング領域(non-coding region)における変異(例えば、遺伝子によってコードされるmRNA産物の発現を変化させる変異、又は遺伝子によってコードされるmRNA産物の安定性を変化させる変異)が含まれる。修飾はin改変した細胞で非鋳型変異を生成することができるヌクレアーゼ組成物(例えば、定義されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物)を含むことができる。
複数の変更
【０１９２】
改変した細胞は2つ以上の修飾、例えば、改変した細胞中の2つ以上のゲノム遺伝子座位での修飾を有することができる。例えば、改変した細胞は2つ以上のゲノム遺伝子座位(例えば、第2の組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む改変した細胞)において、2つ以上の組み込まれた外因性ポリヌクレオチドを有し得、ここで、第2の組み込まれたヌクレオチド配列は第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、第2の組み込まれたヌクレオチド配列は第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位において組み込まれ、そして第2の組み込まれたヌクレオチド配列は第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される。改変した細胞は第2の外因性ヌクレオチド組成物を含む第2の環状ポリヌクレオチドなどの第2の外因性ポリヌクレオチドの組み込みを促進する成分を有することができ、第2の外因性ヌクレオチド組成物はa)第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、b)第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列、及びc)第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを容易にするように配向される、及び/又は改変した細胞内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を含む。概して、改変した細胞は、1つ又は2つの組み込まれたヌクレオチド配列のみに限定されず、1〜10、1〜2、1〜3、2〜3、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の組み込まれたヌクレオチド配列などの任意の個数の組み込まれたヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１９３】
同様に、改変した細胞は1〜10、1〜2、1〜3、2〜3、3、4、5、6、7、8、9、10以上の組み込まれたヌクレオチド配列を生じ得る成分(例えば、相同的修理テンプレート、ヌクレアーゼなど)を有し得る。例示的な実施例では、「多重化」CRISPR媒介遺伝子編集アプローチを使用して、複数のゲノム位置での切断を指示する複数のCRISPR RNP複合体と同時に複数の相同修復テンプレートを導入することによって、複数の遺伝子又はその部分を組み込むことができる。複数の配列はまた、連続的に統合され得る。
【０１９４】
改変した細胞は定義されたヌクレオチド配列(すなわち、ゲノム標的遺伝子座位)によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する複数の非鋳型化変異などの、複数の非鋳型化変異(例えば、組み込まれた外因性ポリヌクレオチドとは別個の変異)を含む修飾を有することができる。修飾は、in改変した細胞で多数の非鋳型変異を産生することができるヌクレアーゼ組成物を含むことができる。例えば、改変した細胞は、それぞれ2つ又は3つの非‐機能性の遺伝子を生じる、2つ又は3つの別々の非鋳型化変異を有することができる。概して、改変した細胞は任意の数の非鋳型変異、例えば、それぞれ、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の別個の非鋳型変異を有し得る。例示的な実施例では、「多重化」CRISPR媒介遺伝子編集アプローチを使用して、複数のゲノム位置での切断を指示する複数のCRISPR RNP錯体を同時に導入することによって複数の遺伝子を破壊し、複数の非鋳型変異をもたらすことができる。
【０１９５】
改変した細胞は、複数の非‐機能性の遺伝子をもたらす複数の変異を有することができる。例えば、改変した細胞は、それぞれ2つ又は3つの非‐機能性の遺伝子を生じる2つ又は3つの別個の変異を有することができる。概して、改変した細胞は任意の数の非‐機能性の遺伝子、例えば、4、5、6、7、8、9、10以上の別々の変異をもたらし、それぞれ、4、5、6、7、8、9、10以上の非‐機能性の遺伝子をもたらす任意の数の変異を有することができる。例示的な実施例では、「多重化」CRISPR媒介遺伝子編集アプローチを使用して、複数のゲノム位置での切断を指示する複数のCRISPR RNP錯体を同時に導入することによって複数の遺伝子を破壊し、複数の変異をもたらすことができる。複数の遺伝子はまた、連続的に破壊され得る。ヌクレアーゼ組成物によって産生される非機能的遺伝子をもたらす変異は鋳型ゲノム編集、例えば、相同組換えDNA修復機構の結果であり得る。ヌクレアーゼ組成物によって産生される非機能的遺伝子をもたらす変異は非鋳型ゲノム削除、例えば、ゲノムの挿入又は削除をもたらすヌクレアーゼ切断誘導非相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)DNA修復機構(インデルとも呼ばれる)の結果であり得る。
【０１９６】
多重修飾は、1つ以上の非鋳型変異と組み合わせた1つ以上の組み込まれたヌクレオチド配列のような、記載された修飾のいずれかの組み合わせを含むことができる。例示的な実施例では、「多重化」CRISPR媒介遺伝子編集アプローチを使用して、相同性指向修理(すなわち、複数のゲノム位置での切断を指令する複数のCRISPR RNP複合体と同時に複数の相同修理テンプレートを導入する)を通して1つ以上の遺伝子又はその部分を組み込み、同時に複数の遺伝子を破壊する(すなわち、複数のゲノム位置での切断を指令する複数のCRISPR RNP複合体を同時に導入して、複数のテンプレートでない変異、例えば、複数のインデルを生じる)ことの両方を行うことができる。積分及び破壊は、連続的に行うことができる。
【０１９７】
多重修飾を伴う改変した細胞の実例として、TCRアルファ遺伝子座位に組み込まれたTCR発現カセットを有する修飾T細胞及びTCRβ遺伝子座位が非‐機能性の遺伝子であるように破壊されたTCRβ遺伝子座位。別の例示的な例として、多重修飾を有する改変した細胞、TCRβ遺伝子座位に組み込まれたTCR発現カセットを有する修飾T細胞、及びTCRアルファ遺伝子座位が非‐機能性の遺伝子であるような破壊されたTCRアルファ遺伝子座位の例示的な例が挙げられる。
ターゲット・ローカス
【０１９８】
改変した細胞はゲノム的に編集されるか、又は内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位、すなわち、目的の特定の遺伝子又は目的の特定のヌクレオチド配列などの改変した細胞内の特定のゲノム位置においてゲノム的に編集されることが可能である。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、遺伝子のコーディング領域(coding region)であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、イントロンのような遺伝子のノンコーディング領域(non-coding region)であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、非コード機能性RNA、反復DNA元素、レトロウイルス元素、偽遺伝子などをコードする1つ又は複数の領域など、典型的な遺伝子に典型的に関連するゲノム領域以外の非コードゲノム領域であってもよい。
細胞の集団
【０１９９】
特定の態様では、細胞の集団(例えば、T細胞の集団)が提供される。細胞の集団は、本明細書に記載の改変した細胞のいずれかを含むことができる。改変した細胞は、細胞の異種集団及び/又は種々の細胞型の異種集団内であり得る。細胞の集団は、ゲノム編集された細胞の割合に関して不均一であり得る。細胞の集団は、集団の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、又は90%超が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことができる。特定の局面において、細胞の集団は組み込まれたヌクレオチド配列を含み、ここで、組み込まれたヌクレオチド配列は遺伝子の少なくとも一部を含み、組み込まれたヌクレオチド配列は内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で組み込まれ、そして組み込まれたヌクレオチド配列は遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向され、ここで、細胞の集団はウイルス媒介デリバリー成分を実質的に含まず、そしてここで、集団中の細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、又は90%超は組み込まれたヌクレオチド配列を含む。
【０２００】
細胞の集団は、集団の91%超、92%超、93%超、94%超、95%超、96%超、又は97%超、98%超、99%超、99.5%超、又は99.9%超を含むことができる組み込まれたヌクレオチド配列を含む。細胞の集団は、組み込まれたヌクレオチド配列を構成する集団の20%より多くを有することができる。細胞の集団は、組み込まれたヌクレオチド配列を含む集団の30%より多くを有することができる。細胞の集団は、組み込まれたヌクレオチド配列を含む集団の60%より多くを有することができる。細胞の集団は、組み込まれたヌクレオチド配列を含む集団の70%より多くを有することができる。
【０２０１】
細胞の集団は、集団の10%〜70%、20%〜70%、30%〜70%、40%〜70%、50%〜70%、60%〜70%、10%〜80%、10%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、10%〜30%、10%〜20%、20%〜80%、30%〜80%、40%〜80%、50%〜80%、60%〜80%、70%〜80%の組み込まれたヌクレオチド配列を含むことができる。細胞の集団は、集団の10%〜100%、20%〜100%、30%〜100%、40%〜100%、50%〜100%、60%〜100%、70%〜100%、80%〜100%、90%〜100%、95%〜100%、96%〜100%、97%〜100%、980%〜100%、99%〜100%、99.5%〜100%が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことができる。細胞の集団は、10%〜70%の間の組み込まれたヌクレオチド配列を含むことができる。細胞の集団は、20%〜70%の間の組み込まれたヌクレオチド配列を含むことができる。細胞の集団は、30%〜70%の間の組み込まれたヌクレオチド配列を含むことができる。細胞の集団は、10%〜80%の間の組み込まれたヌクレオチド配列を含むことができる。細胞の集団は、20%〜80%の間の組み込まれたヌクレオチド配列を含むことができる。細胞の集団は、組み込まれたヌクレオチド配列を構成する30%〜80%を有することができる。
【０２０２】
細胞の集団は、単一の修飾、例えば組み込まれたヌクレオチド配列を有する細胞の割合に関して不均一であり得る。細胞の集団は第1の修飾、第2の修飾、又は第1及び第2の修飾の両方のいずれかを有する細胞の割合に関して、例えば、例示的な例として、組み込まれたヌクレオチド配列、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異、又は組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異のいずれかを有する細胞の割合に関して不均一であり得る。
【０２０３】
細胞の集団は集団の10%を超える、20%を超える、30%を超える、40%を超える、50%を超える、60%を超える、70%を超える、80%を超える、又は90%を超えることができ、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含む。細胞の集団は、集団の91%遺伝子、92%遺伝子、93%遺伝子、94%遺伝子、95%遺伝子、96%遺伝子、97%遺伝子、98%遺伝子、99%遺伝子、99.5%遺伝子、又は99.9%遺伝子を有し得る。細胞の集団は集団の20%を超えることができ、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含む。細胞の集団は集団の30%を超えることができ、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含む。細胞の集団は集団の60%を超えることができ、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含む。細胞の集団は集団の70%を超えることができ、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含む。細胞の集団は、集団の10%〜70%、20%〜70%、30%〜70%、40%〜70%、50%〜70%、60%〜70%、10%〜80%、10%〜50%、10%〜40%、10%〜30%、10%〜20%、20%〜80%、30%〜80%、40%〜80%、50%〜80%、60%〜80%、70%〜80%が第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する組み込まれたヌクレオチド配列及び変異を含むことができる。細胞の集団は、10%〜100%、20%〜100%、30%〜100%、40%〜100%、50%〜100%、60%〜100%、70%〜100%、80%〜100%、90%〜100%、95%〜100%、96%〜100%、97%〜100%、980%〜100%、99%〜100%、99.5%〜100%の集団が第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する組み込まれたヌクレオチド配列及び変異を含み得る。細胞の集団は、10%から70%の間の組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含むことができる。細胞の集団は、20%〜70%の間の組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含むことができる。細胞の集団は、30%から70%の間の組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含むことができる。細胞の集団は、10%から80%の間の組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含むことができる。細胞の集団は、20%から80%の間の組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含むことができる。細胞の集団は、30%から80%の間の組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含むことができる。
【０２０４】
細胞の集団は集団の10%を超える、20%を超える、30%を超える、40%を超える、50%を超える、60%を超える、70%を超える、80%を超える、又は90%を超えることができ、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する組み込まれたヌクレオチド配列又は変異を含む。細胞の集団は、集団の10%〜70%、20%〜70%、30%〜70%、40%〜70%、50%〜70%、60%〜70%、10%〜80%、10%〜50%、10%〜40%、10%〜30%、10%〜20%、20%〜80%、30%〜80%、40%〜80%、50%〜80%、60%〜80%、70%〜80%が第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する組み込まれたヌクレオチド配列又は変異を含むことができる。細胞の集団は、集団の91%遺伝子、92%遺伝子、93%遺伝子、94%遺伝子、95%遺伝子、96%遺伝子、97%遺伝子、98%遺伝子、99%遺伝子、99.5%遺伝子、又は99.9%遺伝子を有し得る。細胞の集団は集団の20%を超えることができ、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する組み込まれたヌクレオチド配列又は変異を含む。細胞の集団は集団の30%を超えることができ、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する組み込まれたヌクレオチド配列又は変異を含む。細胞の集団は集団の60%を超えることができ、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する組み込まれたヌクレオチド配列又は変異を含む。細胞の集団は集団の70%を超えることができ、組み込まれたヌクレオチド配列又は第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含む。
【０２０５】
細胞の集団は、組み込まれたヌクレオチド配列を遺伝子改変した細胞の10%変異、20%変異、30%変異、40%変異、50%変異、60%変異、70%変異、80%変異、90%変異、95%変異、98%変異、又は99%変異を有し得る。細胞の集団は10%〜70%、20%〜70%、30%〜70%、40%〜70%、50%〜70%、60%〜70%、60%〜70%、10%〜80%、10%〜50%、10%〜40%、10%〜30%、10%〜20%、20%〜80%、30%〜80%、40%〜80%、50%〜80%、60%〜80%、70%〜80%、10%〜90%、20%〜90%、30%〜80%、10%〜90%、20%〜90%、30%〜90%、10%〜95%、20%〜95%を有することができる。また、組み込まれたヌクレオチド配列を含む改変細胞のうち、50%と95%との間、30%と95%との間、40%と95%との間、30%と95%との間、30%と95%との間、20%と95%との間、98%との間、30%と95%との間、40%と95%との間、30%と95%との間、20%と95%との間、99%との間、60%と95%との間、80%と95%との間、30%と95%との間、20%と95%との間、95%との間、80%と95%との間、80%と95%との間 -第二の定義されたヌクレオチド配列によってコードされる機能的遺伝子。
【０２０６】
細胞の集団は、第2の規定されたヌクレオチド配列によってコードされる非‐機能性の遺伝子を産生する変異を含む改変した細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、95%超、98%超、又は99%超を有することができる。細胞の集団は、10%〜70%、20%〜70%、30%〜70%、40%〜70%、50%〜70%、60%〜70%、60%〜70%、10%〜80%、10%〜50%、10%〜40%、10%〜30%、10%〜20%、20%〜80%、30%〜80%、40%〜80%、50%〜80%、60%〜80%、70%〜80%、10%〜90%、20%〜90%、30%〜80%、10%〜90%、20%〜90%、30%〜90%、10%〜95%、20%〜95%を有することができる。50%〜95%、40%〜95%、50%〜95%、20%〜95%、80%〜95%、80%〜95%、20%〜95%、20%〜98%、50%〜95%、98%、30%〜99%、40%〜99%、50%〜99%、60%〜99%、70%〜99%、70%〜99%、80%〜99%、90%〜99%、90%〜95%、95%〜99%、95%〜 第2の規定されたヌクレオチド配列はまた、組み込まれたヌクレオチド配列を遺伝子。
【０２０７】
改変した細胞は特異的修飾(例えば、外因性遺伝子の組み込み)を濃縮するために、修飾後(例えば、ゲノム編集後)の細胞の集団内で濃縮することができる。集団は蛍光活性化細胞選別(FACS)(例えば、外因性遺伝子が蛍光マーカを式又は同時式する、又は集団が外因性遺伝子の式又は内因性遺伝子の喪失のための抗体を使用して染色される)、薬剤選択(例えば、外因性遺伝子が薬剤選択遺伝子を式又は同時式する)、又は親和性精製(例えば、外因性遺伝子がアフィニティタグを式又は同時式する)を含むが、これらに限定されない方法を使用して濃縮することができる。
【０２０８】
特定の局面において、本明細書中に記載される均一な集団は改変した細胞のための濃縮なしで達成され得る(すなわち、濃縮工程はヌクレアーゼ媒介(例えば、CRISPR媒介)ゲノム編集後のような、細胞の改変後に実施されない)。
【０２０９】
細胞の集団、特に集団が濃縮されていない改変直後の細胞の集団は、少なくとも10細胞、少なくとも100細胞、少なくとも1000細胞、少なくとも10000細胞、1x106細胞、少なくとも2x106細胞、少なくとも5x106細胞、少なくとも1x107細胞、少なくとも5x107細胞、少なくとも1x108細胞、少なくとも5x108細胞、少なくとも1x109細胞、又は少なくとも5x109細胞であり得る。細胞の集団、特に集団が濃縮されていない改変直後の細胞の集団は、少なくとも1×107細胞であり得る。細胞、特に改変直後の細胞の集団で、少なくとも5×107細胞の人口が豊かでない人口。
遺伝子編集システム
【０２１０】
上記のように、概して、改変した細胞は、ヌクレアーゼ媒介編集を使用して、ゲノム編集されるか、又はゲノム編集され得るように改変される。
【０２１１】
概して、ヌクレアーゼは最初に特異的ヌクレオチド配列(すなわち、ヌクレアーゼによって切断された「定義されたヌクレオチド配列」)、例えばゲノム配列で切断を指示することによって編集を促進し、その後の編集は、非鋳型ベースのDNA修理、例えばヌクレアーゼ切断誘導非相同末端結合(non-homologous end joining)DNA修理機構から生じるか、又は鋳型ベースの修理、例えば相同組換えDNA修理機構から生じる。
【０２１２】
配列特異的切断を促進するように操作され得る種々のヌクレアーゼは当業者に公知であり、そしてクラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)若しくはその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)若しくはその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)若しくはその誘導体を含むが、これらに限定されない。特に、CRISPR/Cas9編集システムなどのCRISPR媒介遺伝子編集システムを使用することができる。ヌクレアーゼ媒介編集、特にCRISPR媒介編集はAdli M(The CRISPR tool kit for genome editing and bexthand.Nat Commun.2018 May 15;9(1):1911)においてより詳細に議論されており、これは、それが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる。
CRISPR媒介遺伝子編集
【０２１３】
一般に、CRISPR媒介遺伝子編集システムは、CRISPR関連(Cas)ヌクレアーゼ及び特定の標的配列への切断を指示するRNAを含む。例示的なCRISPR媒介遺伝子編集システムは、Cas9ヌクレアーゼ及びCRISPR RNA(crRNA)ドメイン及びトランス活性化CRISPR(tracrRNA)ドメインを有するRNAからなるCRISPR/Cas9システムである。crRNAは、典型的には2つのRNAドメインを有する:例えばゲノム配列のような標的配列(「特定のヌクレオチド配列」)への塩基対ハイブリダイゼーションを通して特異性を指示するガイドRNA配列(gRNA);及びtracrRNAにハイブリダイズするRNAドメイン。tracrRNAはヌクレアーゼ(例えば、Cas9)と相互作用し、それによってゲノム座へのヌクレアーゼの動員を促進することができる。crRNA及びtracrRNAポリヌクレオチドは、別々のポリヌクレオチドであり得る。crRNA及びtracrRNAポリヌクレオチドは、単一ガイドRNA(sgRNA)とも呼ばれる単一ポリヌクレオチドであり得る。ここではCas9システムを示しているが、Cpf1システムのような他のCRISPRシステムを使用することもできる。ヌクレアーゼはその誘導体、例えば、Cas9機能性変異体、例えば、一般に、Cas9酵素によって典型的に産生される完全な二本鎖切断とは対照的に、規定されたヌクレオチド配列の一本鎖のみの切断を媒介するCas9「ニカーゼ」変異体を含むことができる。
【０２１４】
一般に、CRISPR系の成分は互いに相互作用して、リボヌクレオタンパク質(RNP)錯体を形成し、配列特異的切断を媒介する。いくつかのCRISPRシステムでは、各成分を別々に産生し、RNP複合体を形成するために使用することができる。いくつかのCRISPRシステムにおいて、各成分はインビトロで別々に産生され得、そして互いにインビトロで接触(すなわち、「複合体化」)されて、RNP複合体を形成し得る。次いで、インビトロで産生されたRNPは細胞のサイトゾル及び/又は核(例えば、T細胞のサイトゾル及び/又は核)に導入され得る(すなわち、「送達され得る」)。インビトロで産生されたRNP複合体はエレクトロポレーション、物理的な手段による脂質媒介トランスフェクション, 細胞膜変形、脂質ナノ粒子(LNP)、ウイルス様粒子(VLP)、及び超音波処理を含むが、これらに限定されない種々の手段によって細胞に送達され得る。特定の例において、インビトロで産生されたRNP複合体は、Nucleofactor/Nucleofection(登録商標)エレクトロポレーションベースのデリバリー・システム(Lonza(登録商標))を使用して細胞に送達され得る。他のエレクトロポレーションシステムとしてはMaxCyteエレクトロポレーションシステム、Miltenyi CliniMACSエレクトロポレーションシステム、ネオンエレクトロポレーションシステム、及びBTXエレクトロポレーションシステムが挙げられるが、これらに限定されない。CRISPRヌクレアーゼ(例えば、Cas9)は当業者に公知の種々のタンパク質製造技術を使用して、インビトロで製造され得る(すなわち、合成及び精製され得る)。CRISPRシステムRNA(例えば、sgRNA)はインビトロ転写又は化学合成のような、当業者に公知の種々のRNA製造技術を使用して、インビトロで製造され得る(すなわち、合成及び精製され得る)。
【０２１５】
インビトロで産生されたRNP複合体は、ヌクレアーゼ対gRNAの異なる比で複合体化され得る。例えば、インビトロで産生されたRNP複合体は1:1〜1:9の間のCas9:sgRNAモル比(例えば、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、又は1:9のCas9:sgRNAモル比)でCas9タンパク質と複合体化されたsgRNAと形成され得る。インビトロで産生されたRNP複合体は、約1:1、約1:2、約1:3、約1:4、約1:5、約1:6、約1:7、約1:8、又は約1:9のCas9:sgRNAモル比でCas9タンパク質と複合体化されたsgRNAと形成され得る。
【０２１６】
インビトロで産生されたRNP複合体はまた、CRISPR媒介編集システムにおいて異なる量で使用され得る。例えば、編集したい細胞の数に応じて、多数(例えば、5×107)の細胞をリアクションで編集する際に追加されるRNP複合体の量を減らすなど、追加される合計RNP量を調整することができる。
【０２１７】
いくつかのCRISPRシステムにおいて、各構成要素(例えば、Cas9及びsgRNA)はポリヌクレオチドによって別々にコードされ得、そして各ポリヌクレオチドは細胞に導入され得る。いくつかのCRISPRシステムにおいて、各成分は単一のポリヌクレオチド(すなわち、多層プロモーター又は多層シストロンベクター、以下の例示的な多層シストロンシステムの説明を参照のこと)によってコードされ得、そして細胞に導入され得る。細胞内でのそれぞれのポリヌクレオチドコードCRISPR構成要素の発現(例えば、ヌクレアーゼの翻訳及びCRISPR RNAの転写)に続いて、RNP複合体が細胞内で形成され得、次いで部位特異的切断を指示し得る。
【０２１８】
いくつかのRNPは、核へのRNPのデリバリーを促進する部分を有するように操作され得る。例えば、Cas9ヌクレアーゼは核局在シグナル(NLS)ドメインを有し得、その結果、Cas9 RNP複合体が細胞の細胞質ゾルに送達される場合、又はCas9の翻訳及びその後のRNP形成の後に、NLSは、核へのCas9 RNPの更なる輸送を促進し得る。
【０２１９】
本明細書中に記載される改変した細胞は非ウイルス方法を使用して改変され得、例えば、本明細書中に記載されるヌクレアーゼ及びCRISPR媒介遺伝子編集システムは、非ウイルス方法を使用して細胞に送達され得る。ウイルス媒介デリバリー(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、及びレンチウイルスベースのデリバリー方法)はヌクレアーゼ及びCRISPR媒介遺伝子編集システムを送達するために使用されているが、ウイルス媒介システムは免疫原性をもたらす成分も導入するウイルスシステムに悩まされ得る。例えば、ウイルス媒介デリバリー成分は、ゲノムに組み込むことができるウイルス又はウイルス由来のヌクレオチド配列を含むことができる。したがって、本明細書に記載の改変した細胞は、実質的にウイルスを介した送達の成分を含まなくてもよい。「ウイルス媒介デリバリー成分を実質的に含まない」という語は関連する全組成物(例えば、細胞又は細胞の集団)中に存在する統計的に有意な量未満の1つ以上のウイルスを介した送達の成分を意味すると理解され、関連する全組成物中で検出不可能なレベルにあるウイルスを介した送達の成分を含む(すなわち、「本明細書に記載される改変した細胞はウイルス媒介デリバリー成分を含まないことができる」)。統計的に有意な量未満とは、0.1、0.05、又は0.01を超えるp値など、ウイルスを介した送達の成分が関連する組成物中に存在するという統計的信頼性を有するとはみなされない検知の水準を指すことができる。ウイルス媒介デリバリー成分はウイルス構造タンパク質(例えば、キャプシド、エンベロープ、及び/又は膜融合タンパク質)などのウイルスタンパク質を含むことができる。概して、組み込まれたウイルス配列又は導入されたウイルスタンパク質に由来する全てのペプチドは、細胞表層のMHC分子、特にMHCクラスI対立遺伝子によって提示され、その後、免疫原性を導くことができる。養子細胞療法などの治療的状況において、免疫原性は、治療効果に悪影響を及ぼし得る。したがって、非ウイルスデリバリー方法は、養子T細胞療法などの養子細胞療法で使用される細胞を修正及び編集する際に有益であり得る。従って、特定の局面において、改変した細胞の表面上のMHCクラスIはウイルスを介した送達の成分又は組み込まれたウイルスに由来するペプチドを含まなくてもよく、ここで、組み込まれたウイルスはウイルスを介した送達の成分と動作可能的に会合している。
【０２２０】
いくつかのCRISPRシステムにおいて、各々が2つ以上の規定されたヌクレオチド配列において同じ遺伝子又は一般的なゲノム遺伝子座位を別々に標的とするように、2つ以上のCRISPR組成物を提供することができる。例えば、2つの別個のCRISPR組成物を設けて、互いの一定の距離内で切断を向けることができる。例えば、10塩基対以下、20塩基対以下、30塩基対以下、40塩基対以下、50塩基対以下、100塩基対以下、200塩基対以下、300塩基対以下、400塩基対以下、500塩基対以下、1,000塩基対以下、2,000塩基対以下、5,000塩基対以下、1万塩基対以下等である。いくつかのCRISPRシステムにおいて、各々が同じ遺伝子又は一般的なゲノム遺伝子座位の反対鎖を別々に標的とするように、2つ以上のCRISPR組成物を提供することができる。例えば、2つの別々のCRISPR「ニッカーゼ」組成物を提供して、同じ遺伝子又は一般的なゲノム遺伝子座位での反対鎖での切断を指向させることができる。
遺伝子編集における相同性指向修理(HDR)
【０２２１】
理論に拘束されることは望まないが、概して、外因性遺伝子を導入するために使用されるヌクレアーゼ媒介遺伝子編集システムは細胞の天然DNA修復機構、特に相同組換え(HR)修復経路を利用する。手短に言えば、ゲノムDNAに対する傷害(典型的には二本鎖切断)後、細胞は、傷害を修復するためのDNA合成の間のテンプレートとして、その5'末端及び3'末端の両方に同一又は実質的に同一の配列を有する別のDNA供給源を使用することによって、傷害を解決し得る。自然の状況では、HDRが鋳型として細胞中に存在する他の染色体を使用することができる。遺伝子編集システムにおいて、外因性ポリヌクレオチドは、相同組換えテンプレート(HRT又はHRテンプレート)として使用される細胞に導入される。一般に、HRT内の5'及び3'相補末端(例えば、遺伝子又は遺伝子の一部)の間に含まれる、病変を有する染色体中に元来見出されないいかなる追加の外因性配列も、鋳型HDR中に所与のゲノム座に組み込む(すなわち、「組み込まれる」)ことができる。したがって、所与のゲノム遺伝子座位の典型的なHRテンプレートは内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、及び遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列(例えば、目的の外因性遺伝子)を有する。
【０２２２】
いくつかの例では、HRテンプレートは線形であり得る。線状HRテンプレートの例としては線状プラスミドベクター、ssDNA、合成DNA、及びPCR増幅DNAが挙げられるが、これらに限定されない
【０２２３】
特定の例において、HRテンプレートは、プラスミド又はナノプラスミドのような円形であり得る。理論に束縛されることを望むものではないが、円形HRテンプレートは安定性の増加、(例えば、PCR増幅の間の)合成誤差の減少、及び製造の容易さのような、類似の線状テンプレートを超える特定の利点を有し得る。本明細書で実証されるように、円形HRテンプレートは類似の線状テンプレート、例えば、類似のサイズの線状テンプレートと比較して、改善された編集効率を有することができる。円形テンプレートは、スーパーコイルテンプレートを含むことができる。
【０２２４】
理論に束縛されることを望むものではないが、一般に、使用されるHR鋳型が大きいほど、相同組換え(HR)修復経路は典型的には全体的に効率が低い。したがって、HRテンプレート、特に環状テンプレートから外来ヌクレオチド配列を除去することなどによって、HRテンプレートのサイズを制限することが有利であり得る。例えば、長さが500塩基未満であるベクター骨格(すなわち、遺伝子又はその部分以外のすべてのヌクレオチド配列)、例えば、抗生物質耐性マーカー及び複製起点を除くすべての外来配列が除去されたベクターを使用することができる。
【０２２５】
円形HRテンプレートの例示的な例では、ナノプラスミド(商標)(ネイチャーテクノロジー)が使用される。ナノプラスミド(商標)は、ネイチャーテクノロジー社の商標である。抗生物質を含まないRNA-OUT選択ベクター及び細胞株はそれぞれ、国際特許出願WO2008153733及び同等の米国特許、欧州特許及びオーストラリア特許: US 2010/0303859; EP2333091;及びAU 2008262478に更に詳細に記載されており、それらは、それらが教示するすべてについて、その全体が参考として本明細書に援用される。ナノプラスミド(商標)ベクター及び細胞株は更に、PCT/US 13/000259; PCT/US 13/00067;及びPCT/US 13/00068(これらが教示するすべてについて、その全体が本明細書中に参考として援用される)の、特許協力条約に基づく以下の世界特許に更に詳細に記載される。
【０２２６】
理論に束縛されることを望むものではないが、概して、HR鋳型中の不純物は改変した細胞の編集効率及び/又は改変した細胞の生存率の低下をもたらし得る。したがって、使用されるHRテンプレートは検出限界に基づいて、不純物(例えば、HRテンプレートのDNA以外の任意のコンポーネント)を実質的に含まないか、又は混入物質を含まないことができる。不純物としては精製プロセス関連不純物(例えば、バッファーからの塩又は溶媒など)、DNA及びHRテンプレート以外の他の核酸、並びにエンドトキシン、残留宿主細胞タンパク質、残留宿主細胞RNA、残留宿主細胞gDNA、及び残留宿主細胞脂質又は炭水化物などのHRテンプレートを生成するために使用される残留宿主細胞(例えば、大腸菌などの細菌細胞)からの残留混入物質が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０２２７】
HRテンプレートの均一性(例えば、DNAを含まないHRテンプレートの純度及びHRテンプレート以外の他の核酸)はアガロースゲル電気泳動によって評価することができ、典型的には、純度がアガロースゲル電気泳動によって評価されるように、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも98%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%純粋である場合、DNA及びHRテンプレート以外の他の核酸を実質的に含まないとみなすことができる。HRテンプレートは、アガロースゲル電気泳動によって評価した純度が少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、又は少なくとも99.9%純粋である場合、HRテンプレート以外のDNA及び他の核酸を実質的に含まないと考えることができる。
【０２２８】
HRテンプレートのエンドトキシン汚染はLimulous amoebocyte lysate(LAL)アッセイによって評価することができ、1000 EU/mg未満、900 EU/mg未満、800 EU/mg未満、700 EU/mg未満、又は600 EU/mg未満が検出される場合、典型的には、エンドトキシンを実質的に含まないと考えることができる。HR鋳型は、450 EU/mg未満、400 EU/mg未満、350 EU/mg未満、300 EU/mg未満、250 EU/mg未満、200 EU/mg未満、150 EU/mg未満、100 EU/mg未満、又は50 EU/mg未満が検出された場合、エンドトキシンを実質的に含まないと考えられる。HR鋳型は、500 EU/mg未満が検出される場合、実質的にエンドトキシンを含まないと考えられる。
【０２２９】
残留宿主細胞タンパク質は、マイクロBCAによって評価することができる。HR鋳型は、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1%未満、0.5%未満、又は0.1%未満が残留宿主細胞タンパク質を含む場合、残留宿主細胞タンパク質を実質的に含まないと考えられる。合成物の2%未満が残留宿主細胞タンパク質を含む場合、HR鋳型は、残留宿主細胞タンパク質を実質的に含まないと考えられる。
【０２３０】
残留宿主細胞RNAは、アガロースゲル電気泳動及びSYBRゴールドでの染色によって評価され得る。10%未満、7.5%未満、5%未満、2.5%未満、1%未満、0.5%未満、又は0.1%未満が残留宿主細胞RNAを含む場合、HR鋳型は、残留宿主細胞RNAを実質的に含まないと考えられる。HR鋳型は、構成物の5%未満が残留宿主細胞RNAを含む場合、残留宿主細胞RNAを実質的に含まないと考えられる。
【０２３１】
残留宿主細胞ゲノムDNAはqPCRで評価できる。10%未満、7.5%未満、5%未満、2.5%未満、1%未満、0.5%未満、又は0.1%未満が残留宿主細胞ゲノムDNAを含む場合、HR鋳型は、残留宿主細胞ゲノムDNAを実質的に含まないと考えられる。合成物の5%未満が残留宿主細胞ゲノムDNAを含む場合、HR鋳型は、残留宿主細胞ゲノムDNAを実質的に含まないと考えられる。
【０２３２】
処理関連不純物(例えば、バッファーからの塩又は溶媒など)は、当技術分野で公知の方法によって評価することができる。
【０２３３】
残留宿主細胞脂質又は炭水化物は、当該分野で公知の方法によって評価され得る。
【０２３４】
HRテンプレートは、分光測定によって評価することができる。A260/A280ratioが1.8、1.8+/-.001の場合、HRテンプレートは実質的に混入物質を含まないと考えられる。1.8+/-.01、又は1.8+/-.1を分光法で評価する。
【０２３５】
当技術分野で公知の他のアッセイを使用して、HRテンプレート純度を評価することができる。HRテンプレートは当該分野で公知のアッセイによって評価されるように、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%純粋であり得る。HRテンプレートは当該分野で公知のアッセイによって評価されるように、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、又は少なくとも99.9%純粋であり得る。HRテンプレートは当該分野で公知のアッセイによって評価されるように、95%〜100%、96%〜100%、97%〜100%、98%〜100%、99%〜100%、99.5%〜100%、又は99.9%〜100%、純粋であり得る。
【０２３６】
HRテンプレートはシリカカラムベースの精製、フェノールクロロホルム抽出、クロマトグラフィー精製(例えば、HPLC)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)精製、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、当業者に公知の方法によって精製され得る。
【０２３７】
HDR後、標的配列(「規定されたヌクレオチド配列」)は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位もはや切断され得ないように除去され得る。例えば、HRテンプレート上にコードされる外因性のヌクレオチド配列は、所定のヌクレアーゼが切断する標的配列を欠失し得る。
人事アーム
【０２３８】
導入される外因性配列に関して、HRテンプレートの5'及び3'末端に見出される同一又は実質的に同一の配列(すなわち、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列)は、一般にアーム(HRアーム)と呼ばれる。心拍数アームは内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と同一(すなわち、100%の同一)とすることができる。いくつかの例における人工心臓アームは内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と実質的に同一であり得る(例えば、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、又は少なくとも99.9%同一)。実質的に同一のHRアームを使用することができるが、100%未満のアイデンティティを有するHRアームによってHDR経路の効率が影響を受ける可能性があるので、HRアームが同一であることが有利であり得る。
【０２３９】
HRアームは一般に、任意の長さとすることができるが、HRアーム長及び全体のテンプレートサイズが全体の編集効率に及ぼす影響など、実際的な考慮事項も考慮に入れることができる。内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位(すなわち、5' HRアーム)の第1領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが400塩基以上、長さが500塩基以上、長さが600塩基以上、長さが700塩基以上、長さが800塩基以上、長さが900塩基以上、長さが1000塩基以上、長さが1100塩基以上、長さが1200塩基以上、長さが1300塩基以上、長さが1400塩基以上、長さが1500塩基以上、1600塩基以上であり得る。長さが1700塩基以上、長さが1800塩基以上、長さが1900塩基以上、長さが2000塩基以上。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域(すなわち、5' HRアーム)と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、長さが300塩基以上であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域(すなわち、5' HRアーム)と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、長さが600塩基以上であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域(すなわち、5' HRアーム)と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、長さが1000塩基以上であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域(すなわち、5' HRアーム)と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、長さが2000塩基以上であり得る。
【０２４０】
内因性のゲノム・ターゲット遺伝子座位(すなわち、3' HRアーム)の第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが400塩基以上、長さが500塩基以上、長さが600塩基以上、長さが700塩基以上、長さが800塩基以上、長さが900塩基以上、長さが1000塩基以上、長さが1100塩基以上、長さが1200塩基以上、長さが1300塩基以上、長さが1400塩基以上、長さが1500塩基以上、1600塩基以上であり得る。長さが1700塩基以上、長さが1800塩基以上、長さが1900塩基以上、長さが2000塩基以上。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域(すなわち、3' HRアーム)と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、長さが300塩基以上であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域(すなわち、3' HRアーム)と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、長さが600塩基以上であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域(すなわち、3' HRアーム)と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、長さが1000塩基以上であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域(すなわち、3' HRアーム)と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、長さが2000塩基以上であり得る。
【０２４１】
内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列の各々は、同じ大きさ又は異なった大きさであり得る。例えば、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列、及び内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、それぞれ、長さが600塩基以上であり得る。
【０２４２】
内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1又は第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は切断部位にすぐに隣接する内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域(すなわち、規定されたヌクレオチド配列)と同一又は実質的に同一であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列はそれぞれ、切断部位にすぐに隣接する内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域(すなわち、規定されたヌクレオチド配列)と同一又は実質的に同一であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1又は第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は1塩基対以下、2塩基対以下、3塩基対以下、4塩基対以下、5塩基対以下、6塩基対以下、7塩基対以下、8塩基対以下、9塩基対以下、10塩基対以下、15塩基対以下、20塩基対以下、50塩基対以下、又は100塩基対以下のような切断部位(すなわち、定義されたヌクレオチド配列)の特定の間隔内の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と同一又は実質的に同一であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1又は第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、切断部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20塩基対内の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と同一又は実質的に同一であり得る。
外因性配列
【０２４３】
遺伝子(例えば、目的の外因性遺伝子)の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、概して、任意の目的の外因性のヌクレオチド配列であり得る。例えば、目的の外因性のヌクレオチド配列は短い配列(例えば、3〜100ヌクレオチド長)であり得る。目的の外因性のヌクレオチド配列は、一塩基であり得る。更に、目的の外因性のヌクレオチド配列は長い配列(例えば、500〜3000ヌクレオチド長)であり得る。目的の外因性のヌクレオチド配列は、ポリぺポリペプチド配列をコードするか又はコードしないかであり得る。更に、目的の外因性のヌクレオチド配列はそれが挿入されるとキメラ遺伝子を形成するように、細胞に挿入され得る。例えば、外因性のレセプター部分は編集後に、内因性細胞内部分に動作可能的に連結された外因性のレセプター部分を含むキメラレセプターコーディング配列を産生するために、内因性レセプターコーディング配列中にインフレームで挿入され得る(例えば、シグナル伝達のために)。
【０２４４】
いくつかの例において、遺伝子又はその一部はタンパク質をコードするヌクレオチド配列(すなわち、ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列)であり得る。通常、任意のタンパク質コードヌクレオチドを使用することができる。いくつかの例では、ヌクレオチド配列をコードするタンパク質が自己細胞治療(例えば、自己T細胞治療)に有用なタンパク質をコードする。いくつかの例示において、タンパク質コードヌクレオチド配列は免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、又は免疫チェックポイント阻害因子を含むことができるが、これらに限定されない。タンパク質コードヌクレオチド配列、特に分泌タンパク質又は膜結合タンパク質は、シグナル・ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。シグナル・ペプチドは、タンパク質コードヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に対して内因性であり得る。シグナル・ペプチドは、ヒト成長ホルモンシグナル・ペプチドのような、タンパク質をコードするヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に対して外因性であり得る。
【０２４５】
いくつかの例において、遺伝子又はその一部は、非タンパク質コードヌクレオチド配列であり得る。通常、任意の非タンパク質コードヌクレオチドを使用することができる。場合によっては、非タンパク質コードヌクレオチド配列が自己細胞治療(例えば、自己T細胞治療)に有用なヌクレオチド配列とすることができる。いくつかの場合において、非タンパク質コードヌクレオチド配列はshRNA、siRNA、miRNA、及びlncRNAを含み得るが、これらに限定されない。
【０２４６】
遺伝子の少なくとも一部(例えば、目的の外因性遺伝子)をコードするヌクレオチド配列は一般に、任意のサイズであり得るが、全体的なテンプレートサイズ及びその後の全体的な編集効率に対する遺伝子サイズの衝撃のような実際的な考慮が考慮され得る。従って、特定の局面において、本明細書中に提供されるのは、特に非ウイルスデリバリー方法を使用する場合に、ゲノム的に編集されるか、又はゲノム的に編集されて、100塩基以上の長さの外因性遺伝子を、以前に記載されたもの(例えば、組み込まれたポリヌクレオチド配列を有する集団のより大きな割合)よりも高いHR有効率で発現し得る改変した細胞である。改善されたHR効率率は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが500塩基以上、長さが600塩基以上、長さが750塩基以上、長さが1000塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、長さが3000塩基以上、長さが4000塩基以上の外因性配列を導入するような、長さが100塩基以上の遺伝子に同様に適用される。遺伝子の少なくとも一部は、長さが800塩基以上であり得る。遺伝子の少なくとも一部は、長さが1600塩基以上であり得る。
【０２４７】
外因性配列は、長さ100〜200塩基、長さ100〜300塩基、長さ100〜400塩基、長さ100〜500塩基、長さ100〜600塩基、長さ100〜700塩基、長さ100〜800塩基、長さ100〜900塩基、又は長さ100〜1000塩基であり得る。外因性配列は、長さ100〜2000塩基、長さ100〜3000塩基、長さ100〜4000塩基、長さ100〜5000塩基、長さ100〜6000塩基、長さ100〜7000塩基、長さ100〜8000塩基、長さ100〜9000塩基、又は長さ100〜1万塩基であり得る。外因性配列は、長さが1000〜2000塩基、長さが1000〜3000塩基、長さが1000〜4000塩基、長さが1000〜5000塩基、長さが1000〜6000塩基、長さが1000〜7000塩基、長さが1000〜8000塩基、長さが1000〜9000塩基、又は長さが1000〜1万塩基であり得る。
【０２４８】
外因性配列は、長さが10塩基以上、長さが20塩基以上、長さが30塩基以上、長さが40塩基以上、長さが50塩基以上、長さが60塩基以上、長さが70塩基以上、長さが80塩基以上、長さが90塩基以上、又は長さが95塩基以上であり得る。外因性配列は、長さが1〜100塩基、長さが1〜90塩基、長さが1〜80塩基、長さが1〜70塩基、長さが1〜60塩基、長さが1〜50塩基、長さが1〜40塩基、又は長さが1〜30塩基であり得る。外因性配列は、長さが1〜20塩基、長さが2〜20塩基、長さが3〜20塩基、長さが5〜20塩基、長さが10〜20塩基、又は長さが15〜20塩基であり得る。外因性配列は、長さが1〜10塩基、長さが2〜10塩基、長さが3〜10塩基、長さが5〜10塩基、長さが1〜5塩基、又は長さが1〜15塩基であり得る。外因性配列は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96。外因性配列は、長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14塩基であり得る。
【０２４９】
複数の外因性の配列が導入される例では、複数の外因性の配列は異なるサイズであってもよく、例えば、第1の外因性の配列は100塩基以上であってもよく、第2の外因性の配列は100塩基以上であってもよく、又は第1の外因性の配列は100塩基以上であってもよく、第2の外因性の配列は100塩基未満(例えば、長さ1〜100塩基)であってもよい。
【０２５０】
遺伝子の少なくとも一部は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれた後に発現することができる。
【０２５１】
いくつかの例では、HRテンプレートはプロモーター配列をコードしない。遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の発現は内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指令することができ、すなわち、遺伝子の少なくとも一部は、内因性プロモーターが遺伝子の少なくとも一部に動作可能的に連結されるように内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれる。例示的な例では、TCRをコードする外因性配列を、内因性TCRアルファプロモーターがTCRに動作可能的に連結されるように、エクソンをコードするTCRアルファ定常領域のようなTCRゲノム座に組み込むことができる。
【０２５２】
いくつかの例では、HRテンプレートが遺伝子の少なくとも一部に機能的に連結される外因性プロモーター配列をコードする。外因性のプロモーターの例としては哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルス由来の長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)誘導プロモーター、プロモーターの2つの部分の融合、プロモーターの2つの部分の融合、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、βアクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター系、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター系、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター系が挙げられるが、これらに限定されない。外因性のプロモーターは構成的である。外因性のプロモーターは例えば、低分子(例えば、テトラサイクリン及び誘導体)によって誘導可能であり得る。外因性のプロモーターはゲノム再配置後に活性化するプロモーターのような条件付きであってもよい(例えば、Cre-LoxP及びFLP-Frtシステム)。外因性のプロモーターは細胞型依存的であり得る、すなわち、特定の細胞の集団における直接的な式のみであり得る。外因性のプロモーターは、ヒトを含む哺乳動物であり得る。外因性のプロモーターはウイルス性である。
【０２５３】
外因性配列は、リンカー配列を有し得る。例えば、外因性配列は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位への組み込み後に遺伝子の少なくとも一部を内因性配列に連結するリンカー配列を有し得る。リンカーは切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードし得、ここで、式後、切断可能なリンカーのポリペプチドはその遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが別個のポリペプチドとして産生されるように切断される。切断可能なペプチドの例としては、Furin切断部位及びTEV切断部位が挙げられる。いくつかの例において、切断可能なリンカーは切断を更に促進するポリペプチド配列(例えば、柔軟なリンカー(例えば、Gly-Ser-Gly配列))を含む。別の例において、リンカーは遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが翻訳の間に別個のポリペプチドとして産生されるように、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)(例えば、T2A、E2A、P2A、及びF2A)をコードし得る。別の例において、リンカーは、遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが翻訳の間に別個のポリペプチドとして産生されるように、配列内リボソーム進入部位(Internal Ribosome Entry Site)(IRES)をコードし得る。リンカーは、バイラル・スプライス・アクセプタのようなスプライス・アクセプタを記号化することができる。
【０２５４】
HRテンプレートは、内因性のヌクレオチド配列から分岐したコドンである外因性ポリヌクレオチドをコードすることができる。例えば、コドン分岐配列は、コードされたタンパク質の増加した式を促進するために最適化されたコドンであり得る。コドン分岐配列は組換えを促進する配列要素(例えば、組換えシグナル配列)のようなゲノム不安定性につながる可能性のある配列要素を除去するために分岐したコドンであり得る。
多シストロン性及び多重プロモーター系
【０２５５】
外因性配列はマルチシストロニックであり得、すなわち、2つ以上の別個のポリペプチドが、単一のmRNA転写物から産生され得る。外因性配列は種々のリンカーの使用を通して多シストロン性であり得、例えば、第1の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列(例えば、第1の遺伝子:リンカー:第2の遺伝子において、5'から3'の方位で)に連結され得る。例えば、リンカーは切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードし得、ここで、式後、切断可能なリンカーのポリペプチドは第1及び第2の遺伝子によってコードされる別々のポリペプチドが産生されるように切断される。切断可能なペプチドの例としては、Furin切断部位及びTEV切断部位が挙げられる。いくつかの例において、切断可能なリンカーは切断を更に促進するポリペプチド配列(例えば、柔軟なリンカー(例えば、Gly-Ser-Gly配列))を含む。別の例では、リンカーが第1及び第2の遺伝子によってコードされる別々のポリペプチドが翻訳中に産生されるように、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)(例えば、T2A、E2A、P2A、及びF2A)をコードし得る。別の実施形態では、リンカーが第1及び第2の遺伝子によってコードされる別個のポリペプチドが翻訳中に産生されるように、配列内リボソーム進入部位(Internal Ribosome Entry Site)(IRES)をコードすることができる。リンカーは、バイラル・スプライス・アクセプタのようなスプライス・アクセプタを記号化することができる。概して、多シストロンシステムは任意の数のリンカー(例えば、上記のもの)を使用して、任意の数の遺伝子又はその部分を発現し得る(例えば、外因性配列は、第1、第2、及び第3の遺伝子をコードし得、各々は第1、第2、及び第3の遺伝子によってコードされる別々のポリペプチドが産生されるように、リンカーによって分離される)。同じリンカーの倍数を使用するマルチシストロンシステムではリンカーは同じポリペプチド配列をコードし得るが、コドンが異なるヌクレオチド配列を有する。
【０２５６】
外因性の配列は複数のオープンリーディングフレーム(ORF)を有することができ、すなわち、外因性の配列から複数の別々のmRNA転写産物を産生することができる。外因性配列は複数のプロモーターの使用を通じて複数のORFを有することができ、例えば、第1のプロモーターは第1の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列に動作可能的に連結することができ、第2のプロモーターは、第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列に動作可能的に連結することができる。本明細書中で使用される「リンカー」は、上記の多シストロンリンカー、上記の追加のORFに動作可能的に連結される追加のプロモーター、又は第1のポリペプチド配列及び第2のポリペプチド配列を連結するポリペプチドのいずれかをいうことができる。
【０２５７】
第2の遺伝子は、本明細書中に記載される外因性の配列のいずれかであり得る(外因性の配列の節を参照のこと)。
追加試薬
【０２５８】
いくつかの例において、改変した細胞(又は改変されるべき細胞)はHDR修復を促進する(すなわち、相同性組換え速度及び/又は効率を増大させる)試薬(例えば、NHEJのような他のDNA修復経路と比較してHDR修復を促進することを含む)と接触され得る(例えば、培養され得る)。HDR修理を促進する試薬としては相同組換え修復経路の活性化因子、阻害因子非相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)修復経路、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５９】
概して、本明細書に記載される細胞修飾及び編集技術は改変した細胞に対して有毒であり得る(すなわち、その生存能力を低下させる)。したがって、場合によっては、総合的な編集効率、特に人事編集効率のために、改変した細胞の生存能力を増大させることができる試薬を提供することが好都合であり得る。生存率を増加させることができる試薬は、TLR9核酸感知(nucleic acid sensing)経路、AIM2核酸感知(nucleic acid sensing)経路、IFI16核酸感知(nucleic acid sensing)経路、cGAS核酸感知(nucleic acid sensing)経路、及び細胞質核酸感知(nucleic acid sensing)経路の阻害剤などの核酸感知(nucleic acid sensing)経路の阻害剤を含むことができる。理論に束縛されることを望むものではないが、核酸感知(nucleic acid sensing)経路のこれらの阻害因子は種々の導入された(すなわち、送達された)核酸(例えば、HRテンプレート及びsgRNA)に応答する細胞応答(例えば、自然免疫シグナル伝達経路)を減少させることができ、細胞応答の減少は生存率を改善することができる。例示的な例において、生存率を増加させることができる試薬は、タンデム・リピートTTAGGGを有するアンタゴニストA151などのオリゴヌクレオチド・アンタゴニストであり得る。生存率を増加させることができる試薬には生存率因子(例えば、細胞の生存を促進する因子)を発現するようにT細胞を改変することなど、細胞培養で提供されるもの以外の因子、例えば、Porttら(Biochim Biophys Acta.2011 Jan; 1813(1): 238-59)により詳細に記載されているものを含めることができ、それらはそれが教示するすべてについて参照により本明細書に組み込まれる。
修飾T細胞
【０２６０】
特定の態様では、改変した細胞は修飾T細胞である。概して、改変されたT細胞はそれらがゲノム学的に編集されるか、又はゲノム学的に編集され得るように、任意の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で改変され得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は内因性のTCR遺伝子座位となりうる。内因性のTCR遺伝子座位は、TCR-アルファ遺伝子座位又はTCR-ベータ遺伝子座位であり得る。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTA遺伝子座位などの免疫チェックポイント遺伝子座位とすることができる。
【０２６１】
概して、改変されたT細胞は、それらがゲノム学的に編集されるか、又はゲノム学的に編集され得るように改変されて、関心のある任意の外因性遺伝子を発現することができる。例えば、目的の外因性遺伝子(「遺伝子の少なくとも一部」)はTCR遺伝子の少なくとも一部(例えば、TCR-アルファ若しくはTCR-ベータ遺伝子、又はその一部)を含み得る。TCR遺伝子は、TCR-アルファ遺伝子とTCR-ベータ遺伝子の両方を含むことができる。TCR-アルファ遺伝子及びTCR-ベータ遺伝子は、リンカーによって連結され得る(多シストロンシステムにおいて上記に記載されるリンカーを参照のこと)。TCR遺伝子は、TCR-ガンマ又はTCR-デルタ遺伝子、又はその一部を含むことができる。TCR遺伝子は、TCR-γとTCR-δ遺伝子の両方を含むことができる。TCR遺伝子は限定されるものではないが、マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン入換TCR-ベータ(domain swapped TCR-beta)、点変異を入れたTCR-ベータ、ジスルフィド結合を形成できるように改変したシステインを有する改変TCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するために最適化した）-ベータ、RNA不安定性エレメント(RNA instability element)のコドンの利用度及び除去のために最適化された配列最適化TCR、TCR遺伝子の可変領域配列、キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)、又は単鎖TCRを含むことができる。TCR遺伝子は、マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン入換TCR-ベータ(domain swapped TCR-beta)、点変異を入れたTCR-ベータ、ヒトでの発現のために最適化された改変TCR、ヒトでの発現のために最適化されたコドン最適化TCR-ベータ、RNA不安定性エレメント(RNA instability element)のコドンの利用度及び除去のために最適化された配列最適化TCR、TCR遺伝子の可変領域配列、キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)、又は単鎖TCRの少なくとも一部を含むことができる。TCR遺伝子は、TCR-アルファのポリペプチド配列及び内因性TCRポリペプチド配列と比較して互いにより大きな関連を実証するように操作されたTCR-ベータのポリペプチド配列のような、内因性TCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列とより大きな関連を実証するように操作されたTCR遺伝子を含むことができる。
【０２６２】
特定の局面において、改変T細胞は、a)TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;b)TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; c)第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列; d)第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、コードされたポリペプチド配列がN末端からC末端へのリンカー:TCR-アルファ:第2リンカー:TCR-ベータ方位にある。一実施形態では、コードされたポリペプチド配列がN末端からC末端へのリンカー:TCR-ベータ:第2リンカー:TCR-アルファ方位にある。
【０２６３】
TCR遺伝子はMHC上に提示される疾病特異的エピトープを認識するTCR(例えば、連結されたTCR-アルファ及びTCR-ベータ構築物)であり得る。TCR遺伝子はMHC対立遺伝子上に提示されたがん特異的ネオエピトープ(ネオ抗原)を認識するTCRのような、MHC対立遺伝子上に提示されたがん特異的エピトープを認識するTCR(例えば、TCR-アルファ及びTCR-ベータ連鎖の両方)であり得る。TCR認識とは、一般に、TCR結合、又は複数のTCR結合の組合せ(すなわち、TCRクラスター化)が免疫反応を導き得るように十分な親和性を有する抗原-MHC複合体を結合するTCRを指す。ネオエピトープ、特に患者特異的ネオエピトープを認識するTCRを同定するための方法及び組成物はWO2018165475により詳細に記載されており、その全体が本明細書中に参考として援用される。更に、ネオ抗原特異的T細胞が患者サンプル中に存在するかどうかを同定するために有用な方法は例えば、米国公開第2017/0003288号及びPCT/US17/59598号(それらの全体が参考として本明細書中に援用される)に記載されるような、本明細書中に記載される方法と組合せて使用され得る。
【０２６４】
概して、修飾T細胞は、任意のT細胞であり得る。修飾されたT細胞は、ヒトT細胞であり得る。修飾T細胞は不死化T細胞又はex vivoで発生したT細胞(例えば、胸腺臓器培養物発生細胞)のようなヒト由来T細胞であり得る。修飾されたT細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、一次T細胞、腫瘍浸潤T細胞、又は操作されたT細胞であり得る。修飾されたT細胞は調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞(例えば、Th1細胞、Th2細胞、又はTh17細胞)、アルファ-βT細胞、又はγ-δT細胞であり得る。改変T細胞は、ナイーブT細胞、幹細胞メモリーT細胞、中心メモリーT細胞、移行メモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、又はエフェクターT細胞であり得る。改変されたT細胞は、一次T細胞であり得る。
【０２６５】
一次T細胞などの改変されたT細胞は、がんを有することが知られているか又は有することが疑われる被験体などの被験体から単離することができる。T細胞単離方法は当業者に公知であり、細胞表面マーカ式に基づく選別技術(例えば、FACS選別)、陽性単離技術(例えば、CD4及び/又はCD8 MACS(登録商標))、及び陰性単離(例えば、CD3 MACS(登録商標))、磁気単離、並びにこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。T細胞を単離するために使用される供給源としては血液、PBMC、アフェレーシスによって収集された血液(例えば、ロイコパック)、及び腫瘍組織が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６６】
修飾T細胞は、ex vivo培養T細胞などの培養T細胞であってもよい。修飾T細胞は、被験体から単離された一次T細胞などのex vivo培養一次T細胞であり得る。培養されたT細胞は、1つ以上のサイトカインとともに培養することができる。培養T細胞は、IL2、IL7、IL15、又はそれらの組み合わせと共に培養することができる。例えば、培養T細胞をIL2と共に培養することができる。別の実施形態では、培養T細胞をIL7及びIL15と共に培養することができる。別の実施形態では、培養T細胞をIL2、IL7、及びIL15と共に培養することができる。別の実施形態では、培養T細胞を、IL2の非存在下(実質的にIL2を含まない)でIL7及びIL15と共に培養することができる。別の例では、培養T細胞をIL21単独で、IL2、IL7、及び/又はIL15と組み合わせて(例えば、IL2と組み合わせて、IL7と組み合わせて、IL15と組み合わせて、又はIL7及びIL15と組み合わせて)培養することができ、培養T細胞を刺激することができ、例えば、1つ以上の刺激分子(例えば、レセプターアゴニスト)で培養することができる。刺激分子としてはCD3及びCD28が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、培養T細胞をCD3(CD3刺激T細胞)で刺激することができる。別の実施形態では、培養T細胞をCD28(CD28刺激T細胞)で刺激することができる。別の実施形態では、培養T細胞をCD3及びCD28(CD3及びCD28刺激T細胞)の両方で刺激することができる。刺激分子は、プレートの表面(プレート結合)又はビーズの表面(ビーズ結合)などの表面に固定化することができる。
【０２６７】
例示的な実施例では、改変T細胞が腫瘍抗原、ネオ抗原、腫瘍抗原、ウイルス抗原、ホスホ抗原、細菌抗原、微生物抗原、又はそれらの組み合わせなどの特異的エピトープ(すなわち、抗原)を認識するTCRを発現するようにゲノム編集された一次T細胞であり得る。
【０２６８】
例示的な例では、改変されたT細胞がMHC対立遺伝子上に提示されるがん特異的ネオエピトープ(ネオ抗原)を認識するTCRのような、がん特異的エピトープを認識するTCRを発現するようにゲノム学的に編集された一次T細胞であり得る。本明細書中で使用される場合、「ネオ抗原」という語は例えば、腫瘍細胞における変異又は腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾を介して、対応する野生型親抗原とは区別される少なくとも1つの変化を有する抗原である。ネオ抗原は、ポリペプチド配列又はヌクレオチド配列を含み得る。変異は、フレームシフト又は非フレームシフトインデル、ミスセンス又はナンセンス置換、スプライス部位変更、ゲノム再配列又は遺伝子融合、又はneoORFを生じる任意のゲノム又は発現変更を含むことができる。変異はまた、スプライス変異体を含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾には、異常なリン酸化が含まれる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾はまた、プロテアソーム生成スプライシング抗原を含み得る(Liepeら、HLAクラスI配位子の大部分はプロテアソーム生成スプライシングペプチドである: Science.2016 Oct 21 ;354(6310):354-358を参照のこと)ネオ抗原が被験体からの腫瘍、ウイルス、又はバクテリアシークエンシングデータを分析して、1つ以上の体細胞変異を同定することによって(例えば、インシリコ予測アルゴリズムを使用してシークエンシングデータを分析すること)選択され得る。予測アルゴリズムは、被験体の新抗原とMHC対立遺伝子との間の結合を予測するためのMHC結合アルゴリズムであり得る。
【０２６９】
別の例示的な例では、改変されたT細胞が被験体から単離され、ゲノム学的に編集されて、被験体のMHC対立遺伝子上に提示された癌特異的ネオエピトープ(ネオ抗原)を認識するTCRのような癌特異的エピトープを認識するTCRを発現することができるT細胞であり得る。
【０２７０】
別の例示的な例では、改変されたT細胞が対象から単離され、ゲノム一次編集されて、対象のMHC対立遺伝子上に存在すると予測される、癌特異的ネオエピトープ(ネオ抗原)を認識するTCRのような、癌特異的エピトープを認識するTCRを発現することができるT細胞であり得る。MHC表示予測方法は当業者に公知であり、そしてシークエンシングデータを質量分析及びMHC表示予測と組み合わせること(例えば、米国公開第2017/0199961号(これは本明細書中に参考として援用される)、及びシークエンシングデータをMHC結合親和性予測と組み合わせること(例えば、米国特許第9,115,402号(これはこれが教示する全てについて、本明細書中に参考として援用される))を介して、ネオ抗原を同定することを包含するが、これらに限定されない。
【０２７１】
別の例示的な例では、改変されたT細胞が被験体に関連して同種異系であり、ゲノム学的に編集されて、被験体のMHC対立遺伝子上に提示された癌特異的ネオエピトープ(ネオ抗原)を認識するTCRのような癌特異的エピトープを認識するTCRを発現する一次T細胞であり得る。同種T細胞は修飾T細胞の投与の結果としての免疫原性の低下が所望される例におけるように、HLA型決定され、被験体に適合され得る(HLA適合)。ヒト白血球抗原(HLA)タイピングは、患者の腫瘍又は血中サンプルから決定することができる。ヒト集団において一般に見出されるHLAはまた、ネオ抗原予測アルゴリズム(例えば、HLA-A*02、24、01; HLA-B*35、44、51;白人におけるDRB1*11、13、07;白人におけるHLA-A*02、30; HLA-B*35、15、44;アフロブラジリアンにおけるDRB1*13、11、03;及びアジア人におけるHLA-A*24、02、26; HLA-B*40、51、52; DRB1*04、15、09)に含まれ得る。HLA対立遺伝子の特異的対合も使用できる。ヒト集団に見出される一般的な対立遺伝子はBardiら(Rev Bras Hematol Hemoter.2012; 34(1): 25-30)に更に記載されており、これは、それが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる。HLA情報はFritsch et al、2014、Cancer Immunol Res、2:522-529により詳細に記載されているように、MHC結合の予測アルゴリズムにおいて同定された推定ネオ抗原ペプチド配列と一緒に利用することができ、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
修飾初代細胞
【０２７２】
特定の態様では、改変した細胞は修飾初代細胞である。概して、改変された初代細胞はそれらがゲノム学的に編集されるか、又はゲノム学的に編集され得るように、任意の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で改変され得る。概して、改変された初代細胞は、それらがゲノム学的に編集されるか、又はゲノム学的に編集され得るように改変されて、関心のある任意の外因性遺伝子を発現することができる。
【０２７３】
概して、修飾初代細胞は、任意の初代細胞であり得る。例示的な初代細胞としては幹細胞、ヒト幹細胞、胚性幹細胞、及び免疫細胞(例えば、造血細胞)が挙げられ、免疫細胞の例としてはB細胞、T細胞, 単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラー(NK)細胞が挙げられるが、これらに限定されない。免疫細胞はNK細胞となりうる。免疫細胞はNK-T細胞である。免疫細胞は、適応免疫系及び/又は自然免疫系の細胞を含むことができる。ヒト幹細胞を含む幹細胞は、造血幹細胞であり得る。
【０２７４】
修飾された初代細胞は、ヒト初代細胞であり得る。修飾された初代細胞は、腫瘍浸潤初代細胞又は遺伝子操作された初代細胞であり得る。改変された初代細胞は、一次T細胞であり得る。改良型初代細胞は造血幹細胞である。改変された初代細胞は、ナチュラル・キラー細胞であり得る。修飾された初代細胞は、あらゆる体細胞であり得る。
【０２７５】
修正された初代細胞は例えば、がんを抱えていることがわかっている、あるいは疑われている主体から切り離すことができる。初代細胞単離方法は当業者に公知であり、そして細胞表面マーカー発現に基づく選別技術(例えば、FACS選別、陽性単離技術、及び陰性単離、磁気単離、並びにこれらの組み合わせ)を含むが、これらに限定されない。
【０２７６】
修飾初代細胞は、ex vivo培養初代細胞などの培養初代細胞であってもよい。修飾初代細胞は、被験体から単離された初代細胞などのex vivo培養初代細胞であり得る。培養された初代細胞は、1つ以上のサイトカインと共に培養することができる。
相同性修理指向細胞編集方法
【０２７７】
1つの局面において、細胞を遺伝子改変するための方法が提供される。
【０２７８】
細胞を遺伝的に改変するための方法は本明細書中に記載される任意のHRテンプレートを提供すること、本明細書中に記載される任意のヌクレアーゼ組成物を提供すること、本明細書中に記載される任意の細胞(例えば、T細胞、初代細胞、HSC、又はNK細胞)をHRテンプレート及びヌクレアーゼ組成物と接触させること、及びHRテンプレート及びヌクレアーゼ組成物を細胞中に、特にウイルス媒介デリバリー以外のデリバリー的方法によって送達することを含み得る。接触工程は、細胞をHRテンプレート及びヌクレアーゼ組成物と接触させる工程とデリバリー工程との間で、60分未満、45分未満、30分未満、20分未満、15分未満、10分未満、又は5分未満、又は1分未満であり得る。デリバリーな方法は、本明細書に記載されるデリバリーCRISPR媒介システムについて記載される方法のいずれか、例えば本明細書に記載されるRNP複合体を送達するための方法を含むことができる。上記のように、複数のHRテンプレート及び/又はヌクレアーゼ組成物は、複数のHRテンプレート及び/又はヌクレアーゼ組成物を細胞に同時に送達するなど、細胞に送達することができる。
【０２７９】
理論に束縛されることを望むものではないが、概して(及びHRテンプレート純度の文脈において議論されるように)、編集処理中に導入される不純物及び混入物質は改変した細胞の編集効率及び/又は改変した細胞の生存率の低下をもたらし得る。例えば、培養細胞からの残留培地は、編集処理において不純物及び混入物質を導入し得る。従って、細胞を遺伝子改変するための方法は、残留培地を最小限にするか又は排除するためにとられる工程を含み得る。
【０２８０】
例示的な実施例では、ヒト一次T細胞(例えば、ヒト対象から単離されたT細胞)を遺伝的に改変するための方法は完全なTCR(TCR-アルファ及びTCR-ベータの両方)、TCR遺伝子座位(例えば、TCR-アルファ一定遺伝子座位)を標的とすることができるCRISPR RNP錯体をコードするHRテンプレートを提供すること、及びエレクトロポレーションを使用してHRテンプレート及びRNP錯体をT細胞に送達することを含むことができる。
【０２８１】
本明細書中に記載される細胞の改変集団のいずれかのような、改変した細胞の集団を産生し得る方法もまた提供される。
治療方法
【０２８２】
一態様では、治療のための方法も提供される。例えば、がん患者の治療方法が提供される。別の例では、非‐機能性の遺伝子を機能性遺伝子(例えば、ヘマグロビン症のためのHSC)で置換るなど、遺伝子を補正することができる(例えば、置換る、遺伝子治療又は遺伝子置換療法も知られている)。前記方法はゲノム編集細胞(例えば、ゲノム編集T細胞)などの治療有効量の改変した細胞を投与することを含む。改変した細胞は、医薬組成物中に製剤化することができる。これらの組成物は、1つ以上の改変した細胞に加えて、薬学的に許容される賦形剤, 担体,バッファー、安定剤、又は当業者に周知の他の物質を含み得る。このような物質は非毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨害すべきではない。担体又は他の物質の正確な性質は投与経路(例えば、静脈内)に依存し得る。
【０２８３】
改変した細胞は(自己由来の)処理を施されている被験体に由来し得る(例えば、単離され得る)。
【０２８４】
改変した細胞は、処理が施されている対象に関して同種であり得る。同種改変した細胞は上記のように、処置を投与される対象にHLA適合され得る。
【０２８５】
改変した細胞は、単独で、又は他の処置と組合せて、処置される状態に同時に又は連続してのいずれかで投与され得る。
ヌクレオチド組成物
【０２８６】
本発明に有用な遺伝子のポリペプチド及びヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、ベクター、外因性配列、発現構築物、HRテンプレートを本明細書に記載する。本発明に有用なポリペプチド及びヌクレオチド配列は、本明細書中に記載されるか、又はデータベース受託番号によって本明細書中で言及される配列と、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも99.5%同一である。本発明に有用なポリペプチド及びヌクレオチド配列は、本明細書中に記載される配列と100%同一であり得るか、又はデータベース受託番号によって本明細書中に言及され得る。
【０２８７】
「アイデンティティパーセント」という用語は2つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、以下に記載される配列比較アルゴリズム(例えば、BLASTP及びBLASTN又は当業者に利用可能な他のアルゴリズム)の1つを使用して、又は目視検査によって測定されるように、最大限の対応のために比較及び整列された場合に、同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する2つ以上の配列又はサブ配列を指し、適用に応じて、「アイデンティティパーセント」は比較される配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在し得るか、又は代わりに、比較される2つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較のために、典型的には、1つの配列が試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、部分配列配位を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。比較のための配列の最適なアラインメントは例えば、Smith & Waterman、Advの局所相同性アルゴリズムによって行うことができる。Appl. 数学。2:482(1981)、Needleman & Wunsch、JMol.のホモロジーアラインメントアルゴリズムによる。Biol. 48:443(1970)Pearson & Lipman、Procの類似性方法の検索による。Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装(GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA in Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr、Madison、WI)、又は目視検査(一般的にAusubelらを参照のこと)。配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例はBLASTアルゴリズムであり、これはAltschulら、JMol.に記載されている。Biol. 215:403-410(1990). BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(<www.ncbi.nlm.nih.gov />)を通して公的に入手可能である。
【０２８８】
1つの局面において、相同組換えを内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に向ける際に使用するためのヌクレオチド組成物(例えば、本明細書中に記載される任意のHRテンプレート)が提供される。
【０２８９】
一例では内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位(すなわち、HRテンプレート)において相同組換えを指示する際に使用するためのヌクレオチド組成物はa)遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列;b)内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列;及びc)内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列を含み、ここで、遺伝子の少なくとも一部は100塩基長であり、すべてのヌクレオチド配列は単一のポリヌクレオチド上にあり、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位における相同組換えを容易にするように配向され、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は組成物の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位への組み込み後に遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される。ヌクレオチド組成物は円形であり得る。
【実施例】
【０２９０】
下記は、本発明を実施するための具体的な実施形態の実施例である。実施例は説明のためにのみ提供されるのであって、決して本発明の範囲を限定するためのものではない。使用される数及び順序(例えば、量、温度など)に関して正確さを保証する努力がなされてきたが、もちろん、いくらかの実験誤差及び偏差が許容されるべきである。
【０２９１】
特に明記しない限り、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技術及び薬理学の通常の方法を当技術分野の範囲内で使用する。このような技術は特許文献で全て説明されている。例えば、T.ECreighton, タンパク質: Structures and Molecular Properties(W.HFreeman and Company,1993); A.L。
「実施例１」
CRISPRを使用したT細胞編集の方法と物質
【０２９２】
目的の遺伝子(すなわち、「遺伝子の一部」)を内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込み、そしてそれを分析するために使用される方法及び物質は、以下に記載される。
T細胞
【０２９３】
PBMCは標準フィコール単離方法に従って、血中から単離された(例えば、アフェレーシスによって収集されたロイコパック)。単離したPBMCを、標準的なプロトコールに従ってアリコート中で凍結した。標準プロトコルの一部として、凍結ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)を解凍し、標準遺伝子編集プロトコルの一部として培地(TexMACS、3%ヒトAB血清、サイトカインあり)で培養した。プロトコルのバリエーションにおいて、凍結PBMCを購入した(AllCells)。翌日、CD8及びCD4正T細胞を、標準的な遺伝子編集プロトコルの一部として製造業者のプロトコルに従い、磁気ビーズ(ミルテニー)を用いた正選択により濃縮した。プロトコルのバリエーションにおいて、以下に示すように、CD3ネガティブ選択又はCD62Lポジティブ選択を使用して、細胞を濃縮した。濃縮細胞を、エレクトロポレーション手順(以下を参照のこと)の前に48〜72時間、1:17.5の比率で製造業者の推奨で使用されるTransAct(CD3/CD28試薬、Miltenyi)で刺激し、そして培地(TexMACS、それぞれ12.5ng/mLのIL-7及びIL-15を含む3%ヒト血清)で培養し、そして標準的な遺伝子編集プロトコルの一部として培養した。
【０２９４】
患者/ドナーのPBMCの単離が適応となる場合は、患者アフェレーシスにより細胞のロイコパックを採取した。次いで、このロイコパックを凍結し、次いで、標準的な遺伝子編集プロトコルの一部として、又は示されるように2〜8℃(新鮮)に維持されたプロトコルのバリエーションにおいて、必要に応じて解凍した。翌日、CD8及びCD4陽性T細胞をプロディジープラットホーム(ミルテニー)を用いた正の選択により濃縮した。濃縮細胞を上記のように培養した。
相同組換え(人事)テンプレート
【０２９５】
ナノプラスミド(商標)(Nature Technology)を、記載のように使用した(「NTC」として示されるHRテンプレート)。ナノプラスミド(商標)は、ネイチャーテクノロジー社の商標である。抗生物質を含まないRNA-OUT選択ベクター及び細胞株はそれぞれ、世界特許出願WO2008153733、並びに同等の米国特許、欧州特許及びオーストラリア特許: US 2010/0303859; EP2333091;及びAU 2008262478に含まれ、これらはそれらが教示するすべてについて、その全体が本明細書中に参考として援用される。ナノプラスミド(商標)ベクター及び細胞株は更に、PCT/US 13/000259; PCT/US 13/00067;及びPCT/US 13/00068(これらが教示するすべてについて、その全体が本明細書中に参考として援用される)の特許協力条約に基づく以下の世界特許によって包含される。
【０２９６】
pUC57ベクターに由来するPBR322複製起点及びカナマイシン(Kan)抗生物質耐性マーカーを含有する標準プラスミドもまた、記載されるように使用した(「pUCu」として示されるHR鋳型)。抗生物質耐性マーカーと複製起点を除き、余分な配列を除去した。
【０２９７】
ここでは、製造業者のプロトコル(Maxiキット、Macherey Nagel)に従い、精製されたHRテンプレートを購入するか(Nature Technology)、又は標準的なDNA精製技術を用いて「社内」精製した。
【０２９８】
使用したHRテンプレートを表4に記載する。特に断りのない限り、提供される配列は、相同性アーム、遺伝子カセット、及びプラスミド骨格を有する完成HRテンプレートを含む。
[表4]
表4:相同修復テンプレートシーケンス
NTC9385R-TRAC(1k)_P2A.ZsGreen.f-P2A.LNGFRt.BGHpA   (配列番号(SEQ ID NO): 8)
CCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGGCTTGTTGTCCACAACCGTTAAACCTTAAAAGCTTTAAAAGCCTTATATATTCTTTTTTTTCTTATAAAACTTAAAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATTTATATTAATTTTATTGTTCAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGGGTTTAGTTCGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTACTATCAACAGGTTGAACTGCTGATCCACGTTGTGGTAGAATTGGTAAAGAGAGTCGTGTAAAATATCGAGTTCGCACATCTTGTTGTCTGATTATTGATTTTTGGCGAAACCATTTGATCATATGACAAGATGTGTATCTACCTTAACTTAATGATTTTGATAAAAATCATTAGGTACCACATTAAAAACACAAAATCCTACGGAAATACTGAAGAATGAGTCTCAGCACTAAGGAAAAGCCTCCAGCAGCTCCTGCTTTCTGAGGGTGAAGGATAGACGCTGTGGCTCTGCATGACTCACTAGCACTCTATCACGGCCATATTCTGGCAGGGTCAGTGGCTCCAACTAACATTTGTTTGGTACTTTACAGTTTATTAAATAGATGTTTATATGGAGAAGCTCTCATTTCTTTCTCAGAAGAGCCTGGCTAGGAAGGTGGATGAGGCACCATATTCATTTTGCAGGTGAAATTCCTGAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCGAATTCGGCTCCGGAGCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAGGCTGGCGATGTTGAAGAAAACCCCGGTCCTATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAGGACATCGTGGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGATACACCTGGGACCGCTCCTTCCTGTTCGAGGACGGCGCCGTGTGCATCTGCAACGCCGACATCACCGTCAGCGTGGAGGAGAACTGCATGTACCACGAGTCCAAGTTCTACGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTGATGAAGAAGATGACCGACAACTGGGAGCCCTCCTGCGAGAAGATCATCCCCGTGCCCAAGCAGGGCATCTTGAAGGGCGACGTCAGCATGTACCTGCTGCTGAAGGACGGTGGCCGCTTGCGCTGCCAGTTCGACACCGTGTACAAGGCCAAGTCCGTGCCCCGCAAGATGCCCGACTGGCACTTCATCCAGCACAAGCTGACCCGCGAGGACCGCAGCGACGCCAAGAACCAGAAGTGGCACCTGACCGAGCACGCCATCGCCTCCGGCTCCGCCTTGCCCCGGGCCAAGCGGGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCTATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCTATGGACGGGCCGCGCCTGCTGCTGTTGCTGCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGCTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAGATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCCCCAGAGGGCTCGGACAGCACAGCCCCCAGCACCCAGGAGCCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTCATAGCCAGCACGGTGGCAGGTGTGGTGACCACAGTGATGGGCAGCTCCCAGCCCGTGGTGACCCGAGGCACCACCGACAACCTCATCCCTGTCTATTGCTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGTCTTGTGGCCTACATAGCCTTCAAGAGGTAACTCGAGTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCGCGGCCGCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGGAGAAGAGCAGCAGGCATGAGTTGAATGAAGGAGGCAGGGCCGGGTCACAGGGCCTTCTAGGCCATGAGAGGGTAGACAGGCTAGC
NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA   (配列番号(SEQ ID NO): 9)
CCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGGCTTGTTGTCCACAACCGTTAAACCTTAAAAGCTTTAAAAGCCTTATATATTCTTTTTTTTCTTATAAAACTTAAAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATTTATATTAATTTTATTGTTCAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGGGTTTAGTTCGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTACTATCAACAGGTTGAACTGCTGATCCACGTTGTGGTAGAATTGGTAAAGAGAGTCGTGTAAAATATCGAGTTCGCACATCTTGTTGTCTGATTATTGATTTTTGGCGAAACCATTTGATCATATGACAAGATGTGTATCTACCTTAACTTAATGATTTTGATAAAAATCATTAGGTACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCCATGGACATTAAAAACACAAAATCCTACGGAAATACTGAAGAATGAGTCTCAGCACTAAGGAAAAGCCTCCAGCAGCTCCTGCTTTCTGAGGGTGAAGGATAGACGCTGTGGCTCTGCATGACTCACTAGCACTCTATCACGGCCATATTCTGGCAGGGTCAGTGGCTCCAACTAACATTTGTTTGGTACTTTACAGTTTATTAAATAGATGTTTATATGGAGAAGCTCTCATTTCTTTCTCAGAAGAGCCTGGCTAGGAAGGTGGATGAGGCACCATATTCATTTTGCAGGTGAAATTCCTGAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCGAATTCGGCTCCGGAGCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAGGCTGGCGATGTTGAAGAAAACCCCGGTCCTATGGCCACCGGCTCTAGAACAAGCCTGCTGCTCGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCATGTCTCCAAGAGGGATCTGCCGGCATTACACAGGCCCCTACATCTCAGATTCTGGCCGCTGGCAGACGGATGACACTGAGATGCACCCAGGACATGAGACACAACGCCATGTACTGGTATCGGCAGGACCTCGGCCTGGGACTGAGACTGATCCACTACTCTAATACCGCCGGCACCACCGGCAAAGGCGAAGTGCCTGATGGCTACTCCGTGTCCAGAGCCAATACCGACGACTTCCCACTGACACTGGCCTCTGCTGTGCCTAGCCAGACCTCCGTGTACTTCTGTGCCAGCAGCCTGTCCTTTGGCACCGAGGCCTTTTTCGGCCAAGGCACCAGACTGACCGTGGTGGAAGATCTGAACAAAGTGTTCCCTCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTGAGGCCGAGATCAGCCACACACAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCTACCGGCTTCTTCCCCGATCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTCAGCACAGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCCGCTCTGAACGACAGCCGCTACTGCCTGTCTAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAACCACTTCAGATGCCAGGTCCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGATGAGTGGACCCAGAAGAGAGCCAAGCCTGTGACACAGATCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGCAGAGCCGATTGTGGCTTTACCAGCGTGTCATACCAGCAGGGCGTGCTGTCTGCCACCATCCTGTATGAGATCCTGCTCGGCAAGGCCACACTGTACGCTGTGCTGGTGTCTGCTCTGGTGCTGATGGCTATGGTCAAGCGGAAGGACTTCCGGGCCAAGCGGGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCTATGGCCACAGGCAGCAGAACATCTCTGCTGCTGGCCTTCGGACTGCTGTGTCTGCCTTGGCTGCAAGAGGCTTCCGCCCAGCAGAAAGAGGTGGAACAGAATAGCGGCCCTCTGAGCGTTCCAGAAGGCGCTATCGCCAGCCTGAACTGCACCTACAGCGATAGAGGCAGCCAGAGCTTCTTCTGGTACAGACAGTACAGCGGCAAGAGCCCCGAGCTGATCATGTTCATCTACAGCAACGGCGACAAAGAGGACGGCCGGTTTACAGCCCAGCTGAACAAGGCCAGCCAATACGTGTCCCTGCTGATCAGAGATAGCCAGCCTAGCGACAGCGCCACCTATCTGTGCGCCGTGAATTTTGGCGGCGGAAAGCTGATCTTTGGCCAGGGCACAGAGCTGAGCGTGAAGCCCAACATTCAGAACCCCGATCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGACAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGATTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGTCCTGAGAGCAGCTGCGACGTGAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTGTCCGTGATCGGCTTCCGCATCCTGCTGCTGAAAGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGAGACTGTGGTCCAGCTGACTCGAGTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCGCGGCCGCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGGAGAAGAGCAGCAGGCATGAGTTGAATGAAGGAGGCAGGGCCGGGTCACAGGGCCTTCTAGGCCATGAGAGGGTAGACAGGGATCCGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGCTAGC
NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt   (配列番号(SEQ ID NO): 10)
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NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA   (配列番号(SEQ ID NO): 11)
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Linear_TRAC(1k)P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt   (配列番号(SEQ ID NO): 12)
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NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt   (配列番号(SEQ ID NO): 13)
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pUCu-Kan   TRAC(1k)_P2A.Neo12.TRBC2opt.f-P2A.TRA(Va)(配列番号(SEQ ID NO): 14)
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pUCu-Kan   TRAC(1k)_MNDZsGreen.f-P2A.LNGFRt.P2A(配列番号(SEQ ID NO): 15)
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TTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCCAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACAC
pUCu骨格のみ(配列番号(SEQ ID NO): 16)
GCTAGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCCAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGTACC
TRAC   5'相同アーム(配列番号(SEQ ID NO): 17)
ACATTAAAAACACAAAATCCTACGGAAATACTGAAGAATGAGTCTCAGCACTAAGGAAAAGCCTCCAGCAGCTCCTGCTTTCTGAGGGTGAAGGATAGACGCTGTGGCTCTGCATGACTCACTAGCACTCTATCACGGCCATATTCTGGCAGGGTCAGTGGCTCCAACTAACATTTGTTTGGTACTTTACAGTTTATTAAATAGATGTTTATATGGAGAAGCTCTCATTTCTTTCTCAGAAGAGCCTGGCTAGGAAGGTGGATGAGGCACCATATTCATTTTGCAGGTGAAATTCCTGAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTC
TRAC   3'相同アーム(配列番号(SEQ ID NO): 18)
ACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGGAGAAGAGCAGCAGGCATGAGTTGAATGAAGGAGGCAGGGCCGGGTCACAGGGCCTTCTAGGCCATGAGAGGGTAGACAG
リボ核タンパク質(RNP)錯体
【０２９９】
ヌクレアーゼとしてCRISPR spCas9(Aldevron、sNLS-SpCas9-sNLSヌクレアーゼ)を用いてRNP複合体を生成した。sgRNAを化学的に合成し(Synthego)、エレクトロポレーションバッファー中で600μMのストック濃度から120μMの作業濃度に希釈した。sgRNAをCas9タンパク質と1:6のCas9:sgRNAモル比で複合体化し、室温で少なくとも10分間インキュベートし、次いで使用するまで冷たく保った(4℃又は氷上)。
【０３００】
sgRNAは目的の標的部位(すなわち、内因性のゲノム・ターゲット内の定義されたヌクレオチド配列)に向けられたgRNA配列を、同じヌクレオチド上のcrRNA及びtracrRNA配列の両方を含むsgRNAヌクレオチド骨格に組み込むことによってデザインされた。本明細書で使用されるsgRNAは、ホスホロチオエート結合を示す「(ps)」及び2'O-メチル塩基を示す「m」と共に以下に提示される。
TRAC-1 sgRNA (配列番号(SEQ ID NO): 19):
[mG](ps)[mA](ps)[mG](ps)AAUCAAAAUCGGUGAAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC[mU](ps)[mU](ps)[mU](ps)U
TRBC-2 sgRNA (配列番号(SEQ ID NO): 20):
[mG](ps)[mG](ps)[mC](ps)UCUCGGAGAAUGACGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC[mU](ps)[mU](ps)[mU](ps)U
エレクトロポレーション/核フェクション
【０３０１】
T細胞の遺伝子編集に使用したエレクトロポレーション条件を記載する一般的なプロトコールを以下に概説する:
エクィップメント
Cas9   タンパク質
エレクトロポレーションのためのCRISPR sgRNA
相同修復テンプレート
ロンザP3初代細胞4D-ヌクレオフェクター登録商標 XキットS(32   RCT)付:
P3ヌクレオフェクター液
サプリメント(又はP3溶液と混合)
pmaxGFP対照ベクター
16ウェルNucleocuvette Strip
単離された一次ヒトT細胞
48ウェル組織培養プレート
T細胞培養培地(IL-7及びIL-15を含む3% HS TexMACS)
200 μLPCR帯試験管、滅菌済み
X単位のLonzaヌクレオフェクションシステム
細胞カウンター
注:20μLのキュベットの代わりに100μLのヌクレオフェクションキュベット(カタログ番号V4XP-3012又はV4XP-3024)を使用してもよく、そのケースでは、細胞の数、トランスフェクトされた試薬の量、及び平板培養体積をすべてスケールアップしなければならない。代替のエレクトロポレーション装置もまた使用され得る(それに応じて、バッファー及び体積を置換する)。
手順:
1mLのT細胞培養培地(TexMACS、それぞれ12.5ng/mLのIL-7及びIL-15を含む3%ヒト血清)を、48ウェルプレートの各ウェル(各サンプル及び制御[例えば、模擬及びGFP]に十分なウェル、1培地のみ+約10%余分)に添加することによって、サンプルプレートを調製する。注:プロトコルのバリエーションにおいて、以下に示すように、IL-7及びIL-15の代わりにIL-2を含む培地で細胞を培養した。
完全に混合したら、1mLの培地をウェルにアリコートする。プレートを37℃のインキュベーターに入れる。
ヌクレオフェクター液にヌクレオフェクターサプリメント(4.5:1)を加える。
記載されるように、200μLストリップチューブ中でRNP複合体を組み立てる。偽(ヌクレオフェクションバッファーのみ)及びヌクレオフェクション制御(例えば、0.5μgのGFPプラスミド)を含める。
適量のHR DNAを各チューブに添加する(典型的には0.2〜0.4μg/μL)。
計数のために少量の細胞(例えば、セロメーターについては20μL)を除去し、残りを適当な円錐バイアルに移し、細胞をスピンダウンする。
室温で10分間、90×gでペレット細胞する。
計数細胞。
ペレット化した細胞から上清を除去する。
20μLのヌクレオブベットがそれぞれ0.5〜100万細胞を有するように、細胞ペレットの体積(10 Mの細胞について約15μL)を考慮に入れて、細胞を十分なヌクレオフェクターバッファーに再懸濁する。
細胞を、サンプルを含む200μLの試験管に分配する。細胞を0〜45分、典型的には10分未満インキュベートする。
核分裂反応をヌクレオキュベットに移す。
カバーを適所にクリックする。
予め温めた培地を含むプレートをインキュベーターから取り出す。
EO-115 プログラムを使用するように4Dユニットをプログラムし、容器を適切な方位(カットアウトの大きい方のA1 上部)に4D-Xに配置して、スタートボタンを押す。
温めた細胞培地約100μLを、プレートのそれぞれのウェルからヌクレオキュベットのウェルにゆっくりと移す(100μLキュベットについては500)。
各ヌクレオキュベットから〜120μL全てをプレート上のそれぞれのウェルに移す。
細胞を5〜11日間インキュベートし(すなわち、7〜14日目に採取)、その後解析する(例えば、導入遺伝子発現、ゲノムターゲティング、又は機能アッセイ(例えば、T細胞死滅又はサイトカイン産生))(注意:典型的には24時間未満で見られるノックアウト表現型、典型的には24〜48時間で見られるノックアウト表現型であり、表現型は72時間後に安定化する)
フロー・サイトメトリー解析
【０３０２】
細胞は、フロー・サイトメトリーにより目的の遺伝子の発現について評価した。ZsGreen構築物について、ZsGreen構築物(GFP)の蛍光を評価した。TCR式のために、細胞をTCR特異的抗体(抗ヒトTCRアルファ/β抗体クローンIP26ブリリアントバイオレット510、バイオレジェンド)を用いて染色した。CD3式のために、細胞をCD3特異的抗体(クローン化SK7、Biolegend)を用いて染色した。NK細胞研究のために、CD5(クローン化UCHT2、Biolegend)及びCD56(クローン化5.1H11、Biolegend)を使用した。
【０３０３】
特に断らない限り、T細胞はFSC/SSC、一重項、生細胞(近赤外線染色)、次いで特異的ゲート(例えば、CD8、デキストラマーなど)によってゲートした。
上記のとおり、フッ素-MHCトリマー・デクストラン・コンビナート(デクストラマー)を用いて抗原固有のTCR認識を識別し、それらが教える全ての参考文献として、Bethune、et al.(BioTechniques 62:123-130 Mar.2017)及びBethune、et al.(eLife 5: 2016)に、より詳細に記載されている。デキストラマーは、蛍光標識ストレプトアビジン(Life Technologies、Carlsbad、CA)を用いて調製した。抗原特異的TCR認識に使用したペプチドは、ELAGIGILTV(Mart-1 F5、配列番号(SEQ ID NO): 5); YLTHRVDVI(Neo12、配列番号(SEQ ID NO): 6); SLLMWITQV(NY-ESO 1G4、配列番号(SEQ ID NO): 7)であった。
レンチウイルスの産生と伝達
【０３０４】
NY-ESO (1G4)及びMART-1(F5)TCR構築物を、TCRa-F2A-TCRb-P2A-Myc271のフォーマットでpCCLc-MNDベースのレンチウイルスベクター(Add遺伝子#81071)にサブクローニングした。Myc271は、細胞外cMycエピトープ標識に融合したCD271(LNGFR)の膜貫通及び切断細胞外ドメインを含むキメラ伝達マーカである。NY‐ESO(1G4)及びMART‐1をコードするレンチウイルスを、レンチウイルスベースのベクター及びそれらのパッケージングベクター(pMD2.G)の一過性トランスフェクションによりHEK‐293T細胞で産生した。トランスフェクションの48時間後、ウイルスを収集し、0.45μmのシリンジフィルターを通して濾過し、感染のために使用した。
【０３０５】
ヒトCD3+ T細胞を、健康な供与体のPBMCから単離し、24時間刺激し、次いで、上記のようにサイトカインの存在下で増殖させた。48時間後に、細胞をポリブレンを用いて、500μLの媒体(モック条件)又は固有バイラル上清(pCCLc-MND-F5TCR-Myc271又はpCCLc-MND-1G4TCR-Myc271)を加えた250μLの媒体の油井で2x10℃6細胞で播種した。CD3+ T細胞を、ウイルスの存在下、800g、90分、30℃で、緩慢な加速及び制動なしで遠心分離した。遠心分離後、500μLの培地を除去し、500μLの新しい培地又は500μLのウイルスを添加した。4日後、ヒトT細胞をTCR面式についてアッセイした。表面発現について試験するために、細胞をすすぎ、FACSバッファー中の蛍光抗体及びpHLA多量体で染色し、フロー・サイトメトリーによって分析した。
生存解析
【０３０６】
細胞数及び生存率を、Nucleocounter NC-200(ケモメティック(Chemometic))を用いて測定した。この器具はサンプル容量を吸引し、カセット内に固定化された蛍光色素アクリジンオレンジ(AO)及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)でサンプルを染色するために、ビルトインピペットを有するカセットVia-2を利用し、これらは、カセットの読み取りウィンドウの前に、流体チャネルを通って移動する際に、合計及び死んだ細胞の集団をそれぞれ染色する。いったんカセットが器具に装填されると、PBMCサンプルのために設計されたプロトコルを使用し、細胞/mL(AO汚染を取り込んだ細胞のカウントに由来する)での総細胞カウントを報告し、DAPIマーカ陽性である集団の分画から外挿される生存率から生きた細胞の集団(細胞/mL)を計算した。
【０３０７】
バイアビリティ・アッセイ・プロトコルの変形において、下記のようにアクリジンオレンジ/プロピジウムヨウ化(AOPI)及びセルロメーター(ネクスセロム)を用いてバイアビリティを評価した。
ゲノム標的解析
【０３０８】
インアウトPCR技術を用いて、2一対のプライマー:上流ジャンクションを標的とするプライマー一対、及び下流ジャンクションプライマー一対を介して、TCRアルファ遺伝子座位への目的遺伝子の正確なゲノム積分を確認した。工学的T細胞のインアウトPCRに続く正しい質量の2つの増幅配列の検出は、組み込まれたneoTCR配列カセットのTCRアルファゲノム座への正しい挿入を確認した。
【０３０９】
イン・アウト・PCR・技術に用いられるプライマーは、次のようなものであった
上流: TGCTAATCCTCCGGCAAACC(配列番号(SEQ ID NO): 1)
上流逆: TTCTTCAACATCGCCAGCCT(配列番号(SEQ ID NO): 2)
下流: CAGCCATCTGTTGTTTGCCC(配列番号(SEQ ID NO): 3)
下流逆: AGCTTTCTGGCGTCCTTAGAAT(配列番号(SEQ ID NO): 4)
【０３１０】
遺伝子操作されたT細胞からゲノムDNAを単離し、通常のPCR技術を用いて、目的のゲノム領域を増幅し、ゲル電気泳動によりPCR産物を分析した。
機能性解析のためのT細胞/ターゲット細胞共培養
【０３１１】
操作したT細胞(10万)を、種々の濃度の特異的ペプチド(0.01〜1000nMの10倍連続希釈)でパルスしたHLA-A2(エフェクター対標的比4:1)を発現するターゲット細胞(25,000)と共培養した。プロトコルのバリエーションにおいて、T細胞(5万)を、以下に示すように、標的に対するエフェクター比率2:1でHLA-A2を発現するターゲット細胞(25,000)と共培養した。凍結乾燥ペプチド(Bio-Synthesis Inc、GenScript)をDMSO中で10mMに再構成し、次いでDMSO中で更に希釈して1mM作業ストックとした。次に、ペプチドの10倍連続希釈を、0.01 nMに達するまで、1mM出発溶液(9μLのDMSO中の1μLの1mM作業ストック)を使用して行った。標的A2-K562細胞(1M総細胞/ペプチド濃度、1×106細胞/mL)を、15mLコニカルチューブ中の1μLのシリアルペプチド希釈物でパルスし、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、9mLの培地を各チューブに添加し、次いで1000rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを10mLの培地で1回洗浄し、次いで同時インキュベーション実験のために4mLの培地に再懸濁した。「ペプチドなし」又は「0ペプチド」条件にはペプチドを使用しなかった。
【０３１２】
マッチしたペプチド-HLA(pHLA)及びミスマッチしたペプチド-HLA(pHLA)を構成的に発現するターゲット細胞もまた、示されるように、特異性を評価するためのコントロールとして使用した。K562ターゲット細胞を、K562細胞への伝達マーカとしてZsGreenを有するNeo12、MART1、又はNYESO1ペプチドを含むHLAペプチド分子をコードするレンチウイルスベクターで伝達した。発現されたHLA(MHC)ペプチド分子はBethuneら(eLife 5: 2016)により詳細に記載されているように、抗原性ペプチド、β2-ミクログロブリン、及びHLA-A2ドメインの線状組成物を有する単一のポリペプチド鎖から、柔軟性GSリンカー及びジスルフィドトラップ修飾を介して組成物され、これらは、本明細書中に参考として援用される。
T細胞細胞毒性解析
【０３１３】
48時間の共培養後、T細胞及びターゲット細胞, 細胞を、Live/Dead細胞染色キット(Live/Dead Near IR viability stain for flow、cat# NC0584313、ThermoFisher)を用いて、暗所で4℃で20分間染色した。損なわれた膜と細胞して、色素は細胞内部及び細胞表面の両方において遊離アミンと反応し、強い蛍光染色を生じる。実行可能な細胞では、色素の反応性が細胞表面アミンに限定され、その結果、より弱い蛍光を生じる。強度の差異は、典型的には生きている細胞と死んでいる細胞との間で50倍より大きく、容易な識別を可能にする。インキュベーション細胞を洗浄後、eBioscience IC Fixationバッファー(ThermoFisher、cat# 00-8222-49)で固定し、フロー・サイトメトリーにより解析した。
増殖解析
【０３１４】
操作したT細胞を、共培養の前に、細胞増殖色素e450(ThermoFisher、カタログ番号65-0842-90)で予め標識した。この蛍光色素は第一級アミンを含む任意の細胞タンパク質に結合し、そして細胞が分裂することにつれて、色素は、色素の蛍光強度連続的な半減として測定され得る娘細胞の間に等しく分配される。共培養アッセイを、T細胞細胞毒性アッセイについて記載したように行った。72時間の共同培養T細胞とターゲット細胞, 細胞をeバイオサイエンスIC固定化バッファー(ThermoFisher、cat# 00-8222-49)で固定し、フロー・サイトメトリーにより解析した。
サイトカイン産生解析
【０３１５】
サイトカイン産生を、サイトカインビーズアッセイ(BD BioSciencesからのCBA, ビーズ-BASED IMMUNOASSAY)を使用して、共培養の上清において評価した。CBAは、解析対象物を効率的に捕捉するために抗体被覆ビーズを使用することによって多数のタンパク質の定量を同時に可能にする、フロー・サイトメトリー多重化ビーズベースのイムノアッセイ適用である。24時間の共培養後、T細胞及びターゲット細胞, 上清を回収し、IFNγ、IL-2及びTNFアルファ分泌について分析した。
「実施例２」
Reporter Integration in TCRアルファ Locus
【０３１６】
ZsGreenレポーター構築物をTCRアルファ遺伝子座位に組み込んだ。図1は、使用される一般的な編集戦略を表す模式図である。簡単に述べると、全般的なTCRアルファ遺伝子座位標的化方策は1kbの左右相同アーム(「HR arms」)に挟まれ、P2A配列によって隔てられたプロモーターのないZsGreen及び切断されたLNGRFコーディング配列を含む相同修復テンプレート、並びに円形ナノプラスミドにコードされるTCRアルファ遺伝子座位配列からZsGreen及びLNGRFカセットを隔てる5'P2A配列を用いた(配列番号(SEQ ID NO): 8参照)図2はZsGreen統合のための一般的な編集スケジュールを示している。簡単に述べると、PBMCを解凍し、一次ヒトT細胞をCD3ネガティブ選択を用いて単離し、上記のように抗‐CD3/抗‐CD28で刺激した。内因性TCRアルファ遺伝子座位(TRAC遺伝子座位とも呼ばれる)を標的とするsgRNAを用いたリボ核タンパク質(RNP)錯体を、上記のように形成した。ここで、sgRNAは、TRAC gRNA標的化配列GAGAATCAAAATCGGTGAAT(配列番号(SEQ ID NO): 21)を組み込んだ。上記のように、HR鋳型、RNP複合体、及びT細胞を混合し、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞をIL-2(20ng/mL)を含む培地で培養した。
【０３１７】
ZsGreenレポーターはプロモーターを有さないので、正確なインフレーム溶融のみが検出可能なシグナルを生成することはずである。加えて、TCRアルファ遺伝子座位の適切なターゲティングは、同時にTCRアルファのノックアウト及び表面発現TCR複合体の喪失をもたらすはずである。実際、図3に示すように、HRテンプレートとRNPの両方を含めた場合、ZsGreen-正/TCR-負の細胞の高い割合(22%以上)が検出された(図3右のパネル「KO-KI」)。特に、全てのZsGreen正もTCR陰性であり、ZsGreenレポーターがTCRアルファ遺伝子座位に適切に組み込まれていることを示唆した。対照として、RNPの非存在は、背景と考えられる量を上回るZsGreen陽性細胞又はTCR陰性細胞をもたらさなかった(図3左図)。試験した種々の条件下での編集効率を表5に定量化する。
[表５]
「実施例３」
TCRアルファ遺伝子座位戦略におけるネオアンチゲン特異的TCR積分
【０３１８】
ネオアンチゲン特異的TCR構築物(neoTCR)をTCRアルファ遺伝子座位に組み込んだ。図4は、使用される一般的なターゲティング戦略を表す概略図を提示する。簡単に述べると、一般TCRアルファ遺伝子座位標的化方策は、左右の1kbのHRアームに挟まれたneoTCRコーディング配列を含む相同修復テンプレートを用いた。更に、内因性TCRβ遺伝子座位は破壊され、neoTCR構築物によってコードされるTCR配列のみの発現につながる。ナノプラスミド又はpUCuプラスミドである円形HRテンプレートを用いて、一般方法を適用した。
【０３１９】
ネオ抗原特異的TCR構築物の設計を図5に示す。標的TCRアルファ遺伝子座位(「TRAC(Cアルファ)」)をプラスミドHRテンプレートとともに示し、得られた編集配列と下流mRNA/タンパク質産物を示す。標的TCRアルファ遺伝子座位(内因性TRAC)とそのCRISPR Cas9標的部位(横縞、矢印で示す切断部位)を示す(図5A、上図)左右の相同アームの間に位置するneoTCRをコードするポリヌクレオチドを有する環状プラスミドHRテンプレート(それぞれ「LHA」と「RHA」)を示す(図5A、下図)。コドン最適化されたHRテンプレートによって導入されたTRACの領域を示す(縦縞)。TCRβ定常ドメインはTRBC2に由来し、TRBC1と機能的に同等であることが示された。ネオTCRカセット中の他のエレメントは、2A = P2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element);F=上流TCRβタンパク質から2Aタグを除去する2Aの上流のフリン切断部位; HGH =ヒト成長ホルモンシグナル配列を含む。neoTCR発現遺伝子カセットのHRテンプレートは、CRISPR Cas9ヌクレアーゼRNPが標的とするTCRアルファゲノム座にTCRアルファガイドRNAを直接挿入するための2つのフランキングホモロジーアームを含む。これらの相同アーム(LHA及びRHA)は、neoTCR発現遺伝子カセットのneoE特異的TCR配列に隣接している。
【０３２０】
いったんゲノムに組み込まれると(図5B、上図)、neoTCR発現遺伝子カセットは、内因性TCRアルファプロモーターからの単一のメッセンジャーRNAとして転写される。内因性TCRアルファプロモーターがそれでもその個々のT細胞からの内因性TCRアルファポリペプチドの一部を含む(図5B、中央パネル。この単一のneoTCRメッセンジャーRNAのリボソームポリペプチド翻訳の間、PACT neoTCR配列は、豚テシオウイルス-1に由来するP2Aリボソーム省略配列での自己切断によって、内因性のCRISPR破壊TCRアルファポリペプチドから連結されない(図5B、下図)。コードされたneoTCRアルファ及びneoTCRβポリペプチドはまた、内因性セルラヒトフリンプロテアーゼによる切断、及びneoTCR発現遺伝子カセットに含まれる第2の自己切断P2A配列モチーフを介して互いに連鎖していない(図5B、下図)。neoTCRアルファ及びneoTCRβポリペプチドは、シグナルリーダー配列(ヒト成長ホルモン、HGHに由来する)によって小胞体に別々に標的化され、多量体の集合及びneoTCRタンパク質複合体のT細胞表層への輸送のためである。フリンプロテアーゼ切断部位の介在物はTCRβ機能に対する潜在的干渉を減少させるために、上流TCRβ鎖からの2A配列の除去を容易にする。各々の2A(示さず)の前にgly-ser-glyリンカーを含めることは、3つのポリペプチドの分離を更に増強する。
【０３２１】
更に、3つの反復タンパク質配列はゲノム安定性を促進するために、心拍数テンプレート内で分岐したコドンである。2つのP2Aは互いに比較して、並びに2つのHGHシグナル配列と同様に、TCR遺伝子カセット内で、互いに比較して、コドンが分岐し、ex vivoで操作されたT細胞のゲノム内に導入されたneoTCRカセット配列の安定性を促進する。同様に、TRACエクソン1の再導入された5'末端(縦縞)は、2つの直接反復の介在配列を取り除くことによって、カセッテ全体が経時的に失われる可能性を減少させる。
【０３２２】
図6は、neoTCRコンストラクトを挿入するT細胞に編集するための一般的な編集タイムラインを示す。簡潔には、一次ヒトT細胞(新鮮又は凍結のいずれか)を、上記のように、通常の編集手法に従って培養した。内因性TCRアルファ遺伝子座位(TRAC遺伝子座位とも呼ばれる)を標的とするsgRNAを用いて、TRAC gRNA標的配列GAGAATCAAAATCGGTGAAT(配列番号(SEQ ID NO): 21)を有するリボ核タンパク質(RNP)錯体を、上記のように形成した。更に、内因性TCRβ遺伝子座位(TRBC遺伝子座位とも呼ばれる)を標的とするsgRNAを用いて、TRBC gRNA標的配列GGCTCTCGGAGAATGACGAG(実施配列番号(SEQ ID NO): 22)とのRNP複合体を、上記のように形成した。上記のように、HR鋳型、RNP複合体、及びT細胞を混合し、エレクトロポレーションした。次いで、エレクトロポレーションしたT細胞(すなわち、改変した細胞)を、上記のように、サイトカインの存在下で培養した。
「実施例４」
NeoTCR積分(MART-1)
【０３２３】
MART‐1 neoTCRをTCRアルファ遺伝子座位に組み込んだ。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRAoptによってコードされるMART-1 neoTCR構築物を挿入した。BGHpA (配列番号(SEQ ID NO): 9)。
【０３２４】
2一対のプライマー:上流接合部を標的とするプライマー一対、及び下流接合部プライマー一対を介して、neoTCR構築物のTCRアルファ遺伝子座位への正確なゲノム組み込みを確認するために、インアウトPCR技術を使用した(図7の上図に示される模式図)。工学的T細胞のインアウトPCR後の正しい質量の2つのPCR増幅配列の検出を用いて、組み込まれたneoTCR配列カセットのTCRアルファゲノム座への正しい挿入を確認した。図7に示すように、プラスミドDNA HRテンプレート単独及びヌクレアーゼなし(「DNAのみ」)で処理した細胞については積分は観察されず、上流(図7左側パネル)及び下流(図7右側パネル)の両方についての増幅産物は、TCRアルファヌクレアーゼ単独(「KOKI」)又はTCRアルファ+TCRβヌクレアーゼ(「KOKI KO」)と一緒に操作された細胞について観察された。従って、結果は、neoTCR構築物が適切に統合され、内因性TCRβが適切な場合に破壊されたことを実証する。
【０３２５】
フロー・サイトメトリーによりMART‐1 neoTCRの発現について工学的T細胞を評価した。図8Aに示すように、MART-1 neoTCRの発現は、小さい(20μL、図8Aの左下のパネル)編集フォーマット及び大きい(100μL、図8Aの右下のパネル)編集フォーマットの両方において、MART-1特異的デキストラマー汚染によって検出された。RNPなしのHRテンプレートのみ(図8Aの左上パネル)又はHRテンプレートなしのRNPのみ(図8Aの右上パネル)を使用した場合には、信号のバックグラウンドレベルのみが検出された。同様の結果が、編集手順の後の様々な時点で見られた。編集手順後4日目の遺伝子編集の結果を以下の表6に定量する。編集手順後7日目の遺伝子編集の結果を以下の表7に定量する。編集手順後10日目の遺伝子編集の結果を図8Bに示し、HRテンプレート及びRNP複合体の両方が提供された場合、組み込まれたneoTCR(ストライプ)を伴う。このように、結果はHRテンプレート及びRNP複合体の両方が提供された場合に、neoTCR構築物がTCRアルファ遺伝子座位への組み込み後に適切に発現されたことを実証する。
［表６］
［表７]
【０３２６】
抗原特異的サイトカイン産生について、工学的T細胞を評価した。図9に示すように、MART-1 neoTCRを発現する操作T細胞はHLA-A02ターゲット細胞(K562)と同時インキュベートした場合(図9「K562 HLA-A02/MART1」)、又はMART-1 同族抗原ペプチド(E:T比率2:1)で構成的に発現するか(図9「K562 HLA-A02/MART1」)、MART-1 同族抗原ペプチドと同時インキュベートした場合(E:T比率2:1)、サイトカイン産生は同族ペプチドと同時インキュベートしないHLA-A02ターゲット細胞(図9「K562 HLA-A02」)、又は非同族MHC HLA-A01を発現するターゲット細胞と同時インキュベートした場合(図9「K562 HLA-A01(10μM MART1)」及び「K562 HLA-A01」)、有意水準で観察されなかった。このように、MART‐1 neoTCRを発現する遺伝子操作T細胞は、抗原特異的サイトカイン産生を示した。
【０３２７】
工学的T細胞を、抗原特異的増殖及び抗原特異的T細胞媒介殺傷について評価した。図10Aに示されるように、ペプチド特異的pHLAを発現する形質導入されたK562標的細胞は小型(図10A、「MART-1」)又は大型(図10A、「MART-1」)編集フォーマットのいずれかを用いて操作されたT細胞と共インキュベートされた場合、ほとんど又は全く増殖を示さなかった。対照的に、標的細胞は単独でインキュベートされた場合(図10A、「標的細胞」)、又は偽編集手順を受けたが、neoTCRを発現するように操作されなかった(すなわち、HRテンプレート又はRNPなしでエレクトロポレーションされた)(図10A、「mock」)図10Bに示されるように、標的細胞は小型(図10B、「MART-1」)又は大型(図10B)のいずれかを用いて操作されたMART-1 neoTCRを発現するT細胞と共インキュベートされた場合、死滅した。10B、"MART-1(large)"編集形式(e): 対照的に、標的細胞の最小死は単独でインキュベートした場合(図10B、「標的細胞単独」)、又は模擬編集手順を行ったがneoTCRを発現するように操作しなかったT細胞と共インキュベートした場合に観察された(図10B、「模擬」)。このように、MART-1 neoTCRを発現する遺伝子操作T細胞は、ターゲット細胞の抗原特異的殺傷を示した。
「実施例５」
エレクトロポレーション及び伝達による編集効率の比較
【０３２８】
T細胞は、標準的なエレクトロポレーション媒介HR編集手順又はレンチウイルス形質導入手順のいずれかに続いて、TCRアルファ遺伝子座位でネオTCRを発現するように操作された。円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRAoptによってコードされるMART-1 neoTCR構築物。BGHpA (配列番号(SEQ ID NO): 9)をエレクトロポレーション媒介編集に使用した。図11に示すように、MART-1又はNY-ESO neoTCRのいずれかを表現するエンジニアリングT細胞をレンバイラルトランスダクション手順(図11、上段)を用いて生成し、MART-1 neoTCRを表現するエンジニアリングT細胞を、小型又は大型のフォーマットを用いたパネル媒介型HR編集を用いて生成した(図11、下段)。従って、エレクトロポレーション媒介性HR編集はレンチウイルス形質導入に匹敵するか又はそれより大きい、操作されたT細胞の割合を生成した。
【０３２９】
工学的T細胞を、抗原特異的T細胞媒介殺傷について評価した。図12に示すように、HLA-A02ターゲット細胞は構成的に発現するか(図12、各群の下柱)、又は(図12、各群の下柱)a)同族抗原性MART-1ペプチドであるMART-1 TCR(F5)をパルスしたものが、HR媒介編集(図12、「MART1 TCR HR」)又はレンチウイルス形質導入(図12、「MART1 TCR lenti」)(E:T比2:1)のいずれかを用いて操作したMART-1 neoTCR(F5)を発現するT細胞と同時インキュベートした場合、同等に死滅した。一方、非同族NY-ESO TCR(図12、「NY-ESO TCR lenti」)を発現するT細胞と同時インキュベートした場合、又は模擬編集法を施したがneoTCRを発現するように操作しなかったT細胞と同時インキュベートした場合(図12、「mock」)、ターゲット細胞の死亡は最小限であった。更に、同族ペプチドでパルスされていないHLA-A02ターゲット細胞と同時インキュベートした場合(図12、各群の中央列)、又は非同族MHC HLA-A01を発現するターゲット細胞と同時インキュベートした場合(図12、各群の上から2番目に10μM MART1でパルスした)、死滅はバックグラウンドレベルを超えて観察されなかった。データの定量化を以下の表8に示す。このように、標準的なエレクトロポレーション媒介HR編集手順又はレンチウイルス形質導入手順のいずれかに従い、ネオTCRを発現するように操作されたT細胞は、同等の殺傷を実証した。
［表８］
「実施例６」
円形又は線状のHRテンプレートを用いた編集効率の比較
【０３３０】
精製された環状プラスミドDNA及びHRテンプレートとしてPCRによって生成された線状dsDNAを使用することによるHR媒介編集効率を試験した。標準的なPCR製品(図13Aの上部)並びにヌクレアーゼ保護された5'末端(5'末端ホスホロチオエート骨格結合)を有するプライマーを使用して生成されたPCR製品を使用して、標準的な線状dsDNA及び「半保護された」線状dsDNAを生成した(図13Aの下部)。Neo12 neoTCRをTCRアルファ遺伝子座位に組み込んだ。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるNeo12 neoTCR構築物を挿入した(配列番号(SEQ ID NO): 13)又はライナーHRテンプレートLinear_TRAC(1k)P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 12).編集効率は、Neo12特異的デキストラマー汚染によって決定されるneoTCR(Neo12)を発現するT細胞の割合によって評価した。プラスミドDNAの使用は、ある範囲の濃度(ここに示される等しい質量)にわたって試験された場合でさえ、ライナーHRテンプレート(それぞれ、14.3%及び14.4%、図13Bの中央列及び右列)と比較して、有意に高いレベルの編集(47.3%、図13Bの左列)を生じた。別の試験では、直鎖状の共有結合的に閉じたDNA(dbDNA、タッチライト)を試験し、直鎖状の開放末端PCR産物と同様のプロファイルを示した(データーは示さず)。以上より、直鎖状HR鋳型と同じHR標的配列を持つ環状プラスミドDNA HR鋳型は、直鎖状PCR生成DNAに比べて約3倍高い編集能を支持すると結論した。
「実施例７」
異なる供給源から生成された円形HRテンプレートの比較
【０３３１】
生存率を、異なる供給源から作製された円形HRテンプレートを使用して、標準的なエレクトロポレーション媒介編集手順において試験した。Neo12 neoTCRをTCRアルファ遺伝子座位に組み込んだ。T細胞は、円形HRテンプレートpUCu‐Kan TRAC(1k)_P2A.Neo12.TRBC2opt.f‐P2A.TRA(Va)によりコードされるNeo12 neoTCR構築物を挿入することにより編集した精製された形態(図14「pUC57」、ネイチャーテクノロジー)で購入されたか、又はDNA精製キット(図14「自社pUC57」、MaxiキットMacherey Nagel)を用いて自社で精製されたかのいずれかであった(実施配列番号(SEQ ID NO): 14)。図14に示されるように、T細胞は細胞計数によって生存可能であり(図14左パネル)、そして生存アッセイ(AOPI、図14右パネル)によって評価されるように、HRテンプレートは60%を超える生存率を達成し、そして購入されたHRテンプレートは、80%を超える生存率を達成した。
【０３３２】
特に、これらの結果は、エレクトロポレーション媒介編集における環状プラスミドHRテンプレートの使用を、線状製品と比較した場合にT細胞生存率の低下をもたらすと記載した、最近公表された報告(Rothら[Nature,2018 Jul;559(7714):405-409])と一致しない。
「実施例８」
NeoTCR積分(Neo12)
【０３３３】
Neo12 neoTCRをTCRアルファ遺伝子座位に組み込んだ。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるNeo12 neoTCR構築物を挿入した(配列番号(SEQ ID NO): 13).操作されたT細胞を、フロー・サイトメトリーによってNeo12 neoTCRの発現について評価した。Neo12 neoTCRの発現を、Neo12特異的デキストラマー汚染によって検出した。注目すべきことに、使用したNeo12構築物は、それがpan-TCR抗体によって結合されないように修飾した。図15に示すように、36.5%のT細胞がNeo12 neoTCRを発現し、内因性TCRを発現しなかった(図15右パネル。更に、内因性TCRの発現は、大多数のT細胞(96%)で破壊された。模擬編集法をT細胞した場合、neoTCR発現シグナルの背景レベルのみが検出された(図15左側)。
【０３３４】
円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるNeo12 neoTCR構築物を挿入して、更なる編集実験も行った(配列番号(SEQ ID NO): 13).工学的T細胞を上記のように評価した。図16に示すように、74.5%のT細胞がNeo12 neoTCRを発現し、内因性TCRを発現しなかった(図16右パネル。更に、内因性TCRの発現は、T細胞の大多数(98.6%)で破壊された。T細胞を模擬処理した場合、neoTCR発現シグナルのバックグランドレベルのみが検出された(図16左側)。
「実施例９」
種々NeoTCRのためのNeoTCR積分
【０３３５】
種々のneoTCRをTCRアルファ遺伝子座位に組み込んだ。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるMART-1 neoTCR(F5)構築物のいずれかを挿入した(配列番号(SEQ ID NO): 10)HRテンプレート、NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるNeo12 neoTCR(Neo12)構築物(配列番号(SEQ ID NO): 13)、又は円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAoptによってコードされるNY-ESO neoTCR(1G4)構築物。BGHpA (配列番号(SEQ ID NO): 11)工学的T細胞を、新TCR固有デクストラマー汚染によるフロー・サイトメトリーにより、それぞれの新TCRの表現について評価した。ここで使用したneoTCR構築物は、pan-TCR抗体によって結合されないように修飾した。図17に示すように、T細胞の39.6%、36.5%、28.5%がそれぞれneoTCR MART-1(F5)、Neo12、NY-ESO(1G4)を発現しており、内因性TCRを発現していなかった(それぞれ図17左、中央、右のパネル)更に、内因性TCRの発現は大多数のT細胞で破壊されていた(それぞれ97.9%、96%、86.6%)。したがって、異なるneoTCRを使用するT細胞工学は一般に、編集効率が、本明細書に記載のT細胞編集方法を使用して、異なるTCR発現構築物にわたって再現可能であるという結論を支持する同様の編集効率を生成した。
「実施例１０」
NeoTCRの積分(Patient Derived T細胞)
【０３３６】
種々neoTCRを、健常又は患者由来T細胞(メラノーマ、大腸がん、及びBio-options及びConversant Bioから典型的に使用される肺がん)のいずれかのTCRアルファ遺伝子座位に統合した。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるMART-1 neoTCR構築物のいずれかを挿入した(配列番号(SEQ ID NO): 10)HRテンプレート、NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるNeo12 neoTCR構築物(配列番号(SEQ ID NO): 13)、又は円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAoptによってコードされるNY-ESO neoTCR構築物。BGHpA (配列番号(SEQ ID NO): 11)工学的T細胞を、新TCR固有デクストラマー汚染によるフロー・サイトメトリーにより、それぞれの新TCRの表現について評価した。
【０３３７】
図18Aに示すように、健康なサンプル又は患者サンプルからのT細胞を、Neo12及びMART-1構築物について同様の効率で編集した。更に、編集効率は試験した種々のneoTCR構築物にわたって同様であり、そしてサンプル間の再現性のある編集効率を実証した。図18Bに示すように、健康なサンプルからのT細胞を編集し、75%に近い効率でNeo12 neoTCRを挿入した。
【０３３８】
Neo12 neoTCRを更に試験し、編集効率の結果を表9に示す。特に、同様の編集効率が患者1由来のT細胞の二重サンプルについて観察され(レプリカ#1について36.2%、及びレプリカ#2について36.4%)、更に、本明細書に記載されるT細胞編集方法の再現性を実証する。従って、結果は、本明細書に記載されるT細胞編集方法が種々の発現構築物に広く適用可能であり、そして臨床環境内で再現可能であることの両方を実証する。
［表９］
「実施例１１」
CD4及びCD8 T細胞におけるNeoTCRの組込み
【０３３９】
CD4及びCD8 T細胞の編集効率を評価した。Neo12 neoTCRをTCRアルファ遺伝子座位に組み込んだ。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるNeo12 neoTCR構築物を挿入した(配列番号(SEQ ID NO):13).注目すべきことに、ここで使用したNeo12構築物は、それがpan-TCR抗体によって結合されないように修飾した。CD8 T細胞の編集は、Neo12 neoTCR(Neo12特異的デキストラマー汚染)の式により評価した。デキストラマー汚染は、MHCクラスI分子上に提示されているペプチドによると思われるCD4 T細胞上のneoTCR分子を検出するほど感度が低く、CD8はMHC-I/TCR相互作用を安定化するために存在しない。したがって、CD4 T細胞の編集は、汎TCR抗体に結合しないCD3錯体の検出によって評価した。図19に示すように、CD8及びCD4 T細胞の両方を同様の効率で編集した。したがって、結果は、本明細書に記載されるT細胞編集方法が様々なT細胞の集団に広く適用可能であることを実証する。
「実施例１２」
NeoTCR発現レベル
【０３４０】
種々のneoTCRの表面発現レベルを、TCRアルファ遺伝子座位への組み込み後に試験した。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるMART-1 neoTCR構築物のいずれかを挿入した(配列番号(SEQ ID NO): 10)HRテンプレート、NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるNeo12 neoTCR構築物(配列番号(SEQ ID NO): 13)、又は円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAoptによってコードされるNY-ESO neoTCR構築物。BGHpA (配列番号(SEQ ID NO): 11)種々のneoTCR及び内因性TCRの表面発現を、抗‐CD3での汚染によるフロー・サイトメトリーによって評価した。
【０３４１】
図20に示すように、組み込まれたneoTCRの表面発現は、内因性TCR表面発現レベルに匹敵した。平均蛍光強度(MFI)フローサイトメトリープロットは、同じ抗体(CD3)を用いて染色した内因性TCR(図20A、左側ヒストグラム)及びNeo12 neoTCR TCR(図20A、右側ヒストグラム)について大きく重複した。試験した3つのneoTCRすべてについてのMFI算出を図20Bで定量化し、それぞれは内因性TCRレベルに匹敵する表面発現を示している。従って、結果は、本明細書に記載されるT細胞編集方法が挿入された発現カセットを内因性に匹敵するレベルでコードする完全なTCR(すなわち、TCRアルファ及びTCRβの両方)の表面発現を生じることを実証する。
「実施例１３」
例13: 大型非凍結T細胞へのNeoTCRの組み込み
【０３４２】
新鮮に単離されたPBMC(すなわち、凍結されていない)を、プロディギープラットホームを使用して、ロイコパック及びT細胞中に収集した。T細胞は、円形HRテンプレートpUCu‐Kan TRAC(1k)_P2A.Neo12.TRBC2opt.f‐P2A.TRA(Va)によりコードされるNeo12 neoTCR構築物を挿入することにより編集した(配列番号(SEQ ID NO):14).Neo12 neoTCRの発現を、Neo12特異的デキストラマー汚染によって検出した。
【０３４３】
図21に示すように、41.6%のCD8正T細胞がNeo12構築物を発現した。したがって、結果は、本明細書に記載されるT細胞編集方法が診療環境に適用可能であることを実証する。
例14: 編集されたT細胞は機能的である
【０３４４】
T細胞の機能性について編集T細胞を評価した。より具体的には、ターゲット細胞(K562細胞を表現するHLA-A02)を用いたサイトカインの製造/秘密、T細胞拡散、及び抗原固有のターゲット細胞殺菌に関して、ペプチドで操作するか(図22に例示されている)、又はHLA錯体でプリフォームするペプチドを表現するようにエンジニアリングしたか(図23に例示されている)のいずれかを用いて、T細胞を評価した。
【０３４５】
T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるMART-1 neoTCR構築物のいずれかを挿入した(配列番号(SEQ ID NO): 10)HRテンプレート、NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるNeo12 neoTCR構築物(配列番号(SEQ ID NO): 13)、又は円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAoptによってコードされるNY-ESO neoTCR構築物。BGHpA (配列番号(SEQ ID NO): 11)。
【０３４６】
記載のように、抗原特異的T細胞媒介殺傷について、工学的T細胞を評価した。図24に示すように、ターゲット細胞は、ターゲット細胞をペプチド濃度依存的な様式でそれらのそれぞれの同族ペプチドにパルスした場合(図24、0〜1000ng/ml)、又はペプチド/HLA複合体を発現するように操作した場合(図24、pHLA)(E:T比4:1)、T細胞と同時インキュベートした場合に死滅した。特に、ペプチド/HLA複合体を発現するように操作されたターゲット細胞はおそらく、HLAによって表示されるパルスペプチドの一過性の性質に起因して、ペプチドパルス細胞とは対照的に、ほとんど完成殺傷を実証し、より生理学的に関連する状況(例えば、抗原ペプチドの非一過性表示)が、高水準の殺傷をもたらし得ることを示唆した。更に、T細胞の抗原特異的殺傷はまた、Neo12発現T細胞と同時インキュベートされたペプチド/HLA複合体を発現する操作されたターゲット細胞を使用して、アネキシンV細胞死滅アッセイを使用して実証された(E:T比4:1、データーは示さず)。従って、操作されたT細胞は、ターゲット細胞の抗原特異的殺傷を示した。
【０３４７】
操作されたT細胞を、記載されるように、抗原特異的T細胞増殖について評価した。図25に示すように、Neo12発現T細胞は、Neo12同族ペプチドでパルスしたターゲット細胞とペプチド濃度依存的に共インキュベートした場合(図25A及び25B、0〜1000ng/ml)、又はペプチド/HLA複合体を発現するように操作した場合(図25B、pHLA)(E:T比率2:1)に増殖した。図25Aは、図25Bで計算された割り算細胞%での増殖を実証する典型的なヒストグラムプロットを示す。従って、操作されたT細胞は、ターゲット細胞提示同族ペプチドと同時インキュベートした場合、抗原特異的増殖を示した。
【０３４８】
抗原特異的サイトカイン産生について、工学的T細胞を評価した。図26に示すように、Neo12発現T細胞は、Neo12同族ペプチドとペプチド濃度依存的にパルスしたターゲット細胞(図26A〜D、0〜1000ng/ml)と共インキュベートした場合、又はペプチド/HLA複合体を発現するように操作した場合(図26A〜D、pHLA)(E:T比4:1)、サイトカインを産生した。特に、サイトカインプロファイルはTh1プロ炎症性サイトカインIFNγ、IL-2、TNFアルファ、及び少量のIL-6(それぞれ図26A-Dに提示した)の産生を示したが、Th2サイトカインIL-4又はIL-10の産生は示さなかった(データは示していない)。したがって、操作されたT細胞は、ターゲット細胞と共インキュベートした場合、抗原特異的炎症誘発性Th1サイトカインプロファイルを示した。
「実施例１５」
編集ドナー由来T細胞は機能的である
【０３４９】
ドナー由来のT細胞を、編集後のT細胞の機能性について評価した。Neo12 neoTCRをTCRアルファ遺伝子座位に組み込んだ。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるNeo12 neoTCR構築物を挿入した(配列番号(SEQ ID NO): 13).工学的T細胞を、neoTCR特異的デキストラマー汚染によるフロー・サイトメトリーによって編集効率について評価した。図27Aに示すように、健常ドナーと患児ドナーに由来するT細胞を同様の効率で編集した。
【０３５０】
記載のように、抗原特異的T細胞媒介殺傷について、工学的T細胞を評価した。図27Bに示されるように、ターゲット細胞はターゲット細胞がペプチド濃度依存的様式でそれらのそれぞれの同族ペプチドをパルスした場合(図27B、0〜1000ng/ml)、又はペプチド/HLA複合体を発現するように操作された場合(図27B、「Neo12 HLA」)(E:T比4:1)、健康なドナー及びドナーに由来する編集Neo12発現T細胞と共インキュベートされた場合に死滅した。特に、非同族ペプチド/HLA複合体を発現するように操作されたターゲット細胞は、有意な死滅を示さなかった(図27B、「MART1 HLA」)。また、模擬編集を行ったT細胞を用いた場合には、殺傷は観察されなかった。したがって、遺伝子操作された健康なドナー由来及び患者由来のT細胞は、臨床環境内での適用可能性を実証するターゲット細胞の抗原特異的殺傷を実証した
【０３５１】
遺伝子操作された健常及び患者ドナー由来のT細胞を、記載されているように、抗原特異的T細胞増殖について評価した。図27Cに示すように、Neo12発現ドナーT細胞はNeo12同族ペプチドとペプチド濃度依存的にパルスしたターゲット細胞と共インキュベートした場合(図27B、0〜1000ng/ml)、又はペプチド/HLA複合体を発現するように操作した場合(図27C、「Neo12 HLA」)(E:T比4:1)に増殖した。特に、非同族ペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞は、T細胞増殖を示さなかった(図27C、「MART1 HLA」)。更に、T細胞を模擬処理した場合、T細胞増殖は観察されなかった。したがって、操作された健常及びドナー由来T細胞は、ターゲット細胞提示同族ペプチドと同時インキュベートした場合、抗原特異的増殖を示した。
【０３５２】
工学的に作製した健常及び患児ドナー由来T細胞について、抗原特異的サイトカイン産生を評価した。図27Dに示すように、Neo12発現T細胞は、100nMのNeo12同族ペプチド(E:T比4:1)をパルスしたターゲット細胞と共インキュベートした場合にサイトカインを産生した。特に、サイトカインプロファイルは、Th1プロ炎症性サイトカインIFNγ、IL-2、TNFアルファの産生、及びほとんどIL-6の産生を実証した。このように、遺伝子操作された健常及び患者ドナー由来のT細胞は、ターゲット細胞と共インキュベートした場合、抗原特異的炎症誘発性Th1サイトカインプロファイルを示した。
【０３５３】
特に、操作されたドナー由来のT細胞は、操作されたドナー由来のT細胞が更なる富化工程なしで機能的であることを実証する、実施されたアッセイの前に分類されなかった。
「実施例１６」
種々のneoTCRを発現するドナー由来T細胞は機能的である
【０３５４】
編集後、T細胞の機能性についてT細胞を評価した。Neo12 neoTCRとMART‐1 neoTCRの両方がTCRアルファ遺伝子座位に組み込まれた。同じ供血者からのT細胞を、標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるMART-1 neoTCR構築物のいずれかを挿入した(配列番号(SEQ ID NO): 10)NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるHR鋳型又はNeo12 neoTCR構築物(配列番号(SEQ ID NO): 13).工学的T細胞を、neoTCR特異的デキストラマー汚染によるフロー・サイトメトリーによって編集効率について評価した。図28Aに示すように、同じ供与体に由来するT細胞を、Neo12及びMART-1(「F5」)TCR構築物の両方について同様の効率で編集した。
【０３５５】
次いで、これらの操作されたT細胞を、記載されているように、抗原特異的T細胞媒介殺傷について評価した(4:1 E:T比率)。図28Bに示すように、標的細胞を編集したNeo12発現T細胞(白四角)又はMART-1発現MART-1発現T細胞(黒四角)と同時インキュベートした場合、ペプチド/HLA複合体(「Neo12 HLA」及び「MART-1 HLA」)を発現するように操作した場合、標的細胞は死滅した。特に、非同族ペプチド/HLA複合体を発現するように操作した標的細胞はMART1 HLA発現細胞を死滅させず、MART-1 T細胞(「F5」)はNeo12 HLA細胞を死滅させなかった。操作したドナー由来T細胞は図に示すように、抗原特異的T細胞増殖について評価した。ペプチド中のそれぞれの同族ペプチドでパルスした標的細胞と共インキュベートした場合に増殖したドナーT細胞を発現する28C、Neo12(白四角)又はMART-1(黒四角)濃度依存的様式(0〜1000ng/ml)又はペプチド/HLA複合体(「Neo12 HLA」及び「MART-1 HLA」)(e:T比4:1)を発現するように操作された、特に、非同族ペプチド/HLA複合体を発現するように操作された標的細胞はT細胞増殖を示さなかった、すなわち、Neo12 T細胞はMART1 HLA発現細胞と同時インキュベートされた場合に増殖せず、MART-1 T細胞(「F5」)はNeo12 HLA細胞と同時インキュベートされた場合に増殖しなかった。したがって、操作されたドナー由来T細胞はターゲット細胞提示同族ペプチドと同時インキュベートされた場合、抗原特異的増殖を実証し、複数TCR構築物についての臨床環境内での適用性を実証した。
【０３５６】
特に、操作されたドナー由来のT細胞は、操作されたドナー由来のT細胞が更なる富化工程なしで機能的であることを実証する、実施されたアッセイの前に分類されなかった。
「実施例１７」
編集されたT細胞の機能的活性の維持
【０３５７】
延長された培養のためにそれらの機能性を維持する操作されたT細胞の性能を評価した。Neo12 neoTCRとMART‐1 neoTCRの両方をTCRアルファ遺伝子座位に組み込んだ。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるMART-1 neoTCR構築物のいずれかを挿入した(配列番号(SEQ ID NO): 10)NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるHR鋳型又はNeo12 neoTCR構築物(配列番号(SEQ ID NO):13).
【０３５８】
図29に示すように、Neo12及びMART-1操作T細胞は、抗原特異的な様式で、製造後14日(図29左側パネル)及び2ヶ月(図29右側パネル)でターゲット細胞を同等の有効性で殺すことができた。ターゲット細胞をペプチド濃度依存的様式(0〜1000ng/ml)でパルスした場合、又はペプチド/HLA複合体(「Neo12 HLA」及び「MART-1 HLA」)(E:T比率4:1)を発現するように操作した場合、同じ供与体由来の編集T細胞と同時インキュベートし、Neo12(白丸)又はMART-1(円)のいずれかを発現させた場合、ターゲット細胞を死滅させた。特に、非同族ペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞は有意な死滅を示さず、すなわち、Neo12 T細胞は細胞を発現するMART1 HLAを死滅させず、MART-1 T細胞(「F5」)はNeo12 HLA細胞を死滅させなかった。細胞は、IL7及びIL-15(抗原なし)を含む培地中に保持され、培養物中で健康であった。このように、編集T細胞は長期間にわたってTCR式と抗原特異的活性を維持し、クリニカルセッティング内での適用可能性を示した。
【０３５９】
特に、操作されたT細胞は、操作されたT細胞が更なる富化工程なしで機能的であることを実証する、実施されたアッセイの前に分類されなかった。
「実施例１８」
編集済みT細胞の特性評価
【０３６０】
設計されたドナー由来(健康なドナー)T細胞を、編集後のT細胞の機能性について評価した。Neo12 neoTCRとMART‐1 neoTCRの両方がTCRアルファ遺伝子座位に組み込まれた。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるMART-1 neoTCR構築物のいずれかを挿入した(配列番号(SEQ ID NO): 10)NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるHR鋳型又はNeo12 neoTCR構築物(配列番号(SEQ ID NO):13).
【０３６１】
工学的に作製したT細胞を発現させたneoTCRについて、細胞ごとに単一細胞セクレトーム解析(Isoplexis)を行った。Isoplexisプラットホームは抗原特異的刺激に対するT細胞の反応を描写するために、単一細胞32-plexサイトカインアッセイマイクロデバイス(単一細胞バーコードチップ)を利用した。CD4+及びCD8+T細胞サブセットを、抗CD4又は抗CD8マイクロビーズ(Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)を用いて分離した。CD4及びCD8細胞を、特異的ペプチド/ターゲット細胞(10又は100nMの特異的ペプチドでパルスしたターゲット細胞、又は特異的ペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞と共培養)又は対照で、37℃、5% CO2で1:2の比率で19〜21時間、別々に刺激した。CD4+又はCD8+ T細胞の存在はAlexa Fluor 647(Thermo Fisher細胞Therapy Systems、Waltham、MA)結合抗CD4又は抗CD8抗体を用いて室温で10分間染色し、リン酸緩衝生理食塩水で1回リンスし、1×106細胞/mLの密度で培地に再懸濁することによって確認した。約30μLの細胞懸濁液を、単一細胞分泌学的評価のために単一細胞バーコードマイクロチップに装填した。それぞれのサンプルについて、32プレックスアッセイは、〜2000T細胞からの分泌タンパク質を測定した。単一細胞バーコードチップ上に負荷した細胞サンプルの原料顕微鏡及びマイクロアレイスキャンとタンパク質分泌データを、イソプレキシスソフトウエアを用いて分析し、各々の個々の細胞によってどのような組合せのタンパク質が分泌されたかを決定した。
【０３６２】
図30に示すように、アイソプレキシス解析は、CD4及びCD8 T細胞の両方に対する多機能プロファイルを示した。Neo12 neoTCR発現操作T細胞(図30A)及びMART-1 neoTCR発現操作T細胞(図30B)のCD4(左パネル)及びCD8(右パネル)のプロフィールを示す。CD8OBT細胞は用量依存性の多機能プロフィール(この実験でTCR編集された細胞の%を表す)を示したため、Neo12 neoTCR(図30A、右パネル)及びMART-1(図30B、右パネル)T細胞の両方について2つ以上のサイトカインを産生した。CD4応答はおそらくMHC-I/TCR相互作用を安定化するCD8の不在のために、全体的に弱かった。特に、CD4+ MART-1 neoTCR(「F5」)T細胞はいずれかのペプチドでパルスした標的細胞での抗原刺激後に多機能プロフィールを示した(図)左パネル「10nM」及び「100nM」 MART-1ペプチド/HLA複合体の発現(図30B、左パネル「MART1 HLA」)対照的に、CD4+Neo12 T細胞はNeo12ペプチド/HLA複合体を発現するように操作した標的細胞で刺激した場合、検出可能な多機能プロファイルを示したが(図30A、左パネル「Neo12 HLA」)、ペプチドでパルスした標的細胞(図30A、左パネル「10nM」及び「100nM」)とインキュベートした場合、検出可能なサイトカイン産生を示さなかったが、これもまた、おそらくMHC-I/TCR相互作用を安定化するCD8が存在しなかったためである。
【０３６３】
更に、図30Cに示すように、工学的T細胞の最大の寄与はIFNγの全量に対するものであるが(図30C、左図)、本研究のneo12 neoTCR及びMART-1 neoTCR(F5)遺伝子編集効率は約45%であったため(データは示さず)、IFNγを産生するT細胞の割合は編集細胞の数よりも少ない(図30C、右パネル)。対照的に、TNFアルファを産生するT細胞の割合は編集効率とより良く相関し、すなわち、TNFの量(〜45%)は遺伝子編集の量(〜45%)と相関した。(図30C、右パネル及びデータは示されていない)。このように、Isoplexisの成績は、操作されたT細胞によるTNFアルファ分泌がIFNγ分泌と比較して、それらのインビトロ殺傷活性のより良い予測因子である可能性があることを実証した。
【０３６４】
このように、イソプレキシス解析は、細胞の集団を発現する工学的ネオTCRが重要なことに、低抗原刺激の存在下でさえ、多機能活性を有することを実証した(インビボ効力に対する重要な考察)。
「実施例１９」
エレクトロポレーションタイミング効果効率
【０３６５】
エレクトロポレーション前の細胞とのRNP複合体のインキュベーション工程の時期を評価した。活性化T細胞採取後、遠心分離し、エレクトロポレーションバッファー, 細胞に再懸濁した後、RNP複合体と混合し、エレクトロポレーション及びその後の培養の前に、室温で様々な期間(5、10、15、20、30、45、60分及び1分未満)放置した。細胞を、neoE特異的デキストラマー汚染による編集されたT細胞のパーセントについてのフロー・サイトメトリーによって、及び細胞カウンターを使用する生存率%によって分析した。生存率はインキュベーション期間45分以下で〜20〜〜100%の範囲であったが、60分でのインキュベーションはほぼ0%であった(データは示さず)。適切に編集されたT細胞(デトラマー+/内因性TCR-)の割合は、試験したすべての時点で20%を超えていた(データ示さず)。
「実施例２０」
HSC編集
【０３６６】
ヒトHSC(HSPCとも呼ばれる)を編集してneoTCRを挿入した。HSC編集のための一般的なワークフローを図31に示す。単離されたHSC(CD34+細胞)CD34+細胞を、プレスチム媒体中で48時間培養した(X-VIVO +50ng/ml SCF、TPO、FL-3L及び20ng/mlのIL-3)。核エフェクト化は、以下の表10に記載された条件を用いて実施された。エレクトロポレーションした細胞(すなわち、改変初代細胞)を、BBMM媒体(IMDM、20% FBS、35% BSA、IL3 5ng/ml、IL6 10ng/ml、SCF:25ng/ml)中にプレーティングし;媒体を定期的に交換し、核形成16日後に細胞を収集した。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるNeo12 neoTCR構築物を挿入した(配列番号(SEQ ID NO):13).
［表１０］
【０３６７】
編集を評価するために、gDNAを抽出し、そしてイン及びアウトPCRを行った。図32に示すように、群5、6、7、及び10は、適正積分を示す1Kb増幅PCR帯域を示した。このように、HSCはTCRアルファ遺伝子座位で適切に編集された。
【０３６８】
HSCにおける編集を更に評価するために、編集手法を、1kbの左右のホモロジーアーム(「HRアーム」)に隣接し、環状プラスミド(pUCu-Kan TRAC(1k)_MNDZsGreen.f-P2A.LNGFRt)にコードされたP2A配列によって分離された、MNDプロモーター駆動ZsGreen及び切断LNGRFコーディング配列を含む4μgのHRテンプレートを使用して、上記のように行った。P2A;配列番号(SEQ ID NO):15).HSC(0.4×106))を、1.13pmolのRNP(Cas9/sgRNA)を使用して、20μL中のプログラムEK100を使用してエレクトロポレーションした。明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡によって評価したところ、14日目のメチルセルロースコロニーはZsGreenを発現した(データは示さず)。
「実施例２１」
HRアーム長編集
【０３６９】
MART‐1 neoTCRをTCRアルファ遺伝子座位に組み込んだ。T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRAoptによってコードされるMART-1 neoTCR構築物を挿入した。300塩基対、600塩基対、1000塩基対(標準)、又は2000塩基対を含むHRアーム長を有するBGHpA。
【０３７０】
工学的T細胞は、MART‐1ネオTCRの発現(MART‐1特異的デキストラマー汚染)及びフロー・サイトメトリーによる内因性TCR発現の消失について評価した。表11に要約されるように、適切に編集されたT細胞(デキストラマー+/内因性TCR-)を生成するための編集効率は試験された全てのアーム長について17.6%以上であり、試験された600塩基対以上の全てのアーム長について20%以上であった。
［表１１］
「実施例２２」
A151阻害因子は生存率を改善する
【０３７１】
T細胞は標準的なエレクトロポレーション媒介編集法に従って編集し、円形HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)optによってコードされるNeo12 neoTCR構築物を挿入した(配列番号(SEQ ID NO): 13).操作されたT細胞を、フロー・サイトメトリーによってNeo12 neoTCRの発現について評価した。Neo12 neoTCRの発現を、Neo12特異的デキストラマー汚染によって検出した。注目すべきことに、ここで使用したNeo12構築物は、それがpan-TCR抗体によって結合されないように修飾した。
【０３７２】
T細胞は、種々の濃度のA151添加プレインキュベーションで編集した。表12にまとめたように、適切に編集されたT細胞(デキストラマー+/内因性TCR-)を生成するための編集効率はA151の場合、有意に変化しなかったが、細胞生存率(細胞の数により評価)は0.1μM又は10μMのA151の追加で改善した。
【０３７３】
T細胞は、0.1μM A151を編集工程の異なる段階で添加して編集した。表13に要約されるように、適切に編集されたT細胞(デキストラマー+/内因性TCR-)を生成するための編集効率は試験された異なる段階でA151が有意に変化しなかったが、編集された細胞の細胞生存率(編集された細胞の数によって評価される)はRNP及び細胞のプレインキュベーションの間のA151の添加、並びにプレインキュベーション及びポストエレクトロポレーションの両方の間のA151の添加によって改善された。
［表１２］
［表１３］
「実施例２３」
腫瘍モデルにおける工学的T細胞効果
【０３７４】
特異的新抗原を発現するヒト腫瘍細胞及び特異的新抗原を構成的に発現するように形質導入されたK562及び特異的新抗原を構成的に発現するHLA又は特異的新抗原を内因的に発現し適合したHLAを初代ヒト腫瘍細胞などのHLA分子に対して、TCRで操作されたヒトT細胞のインビボでの有効性を評価する。腫瘍細胞(1×106又は3×106)を、8週齢のNSGマウス(ジャクソンラボラトリー)の脇腹に皮下接種する。腫瘍増殖を、1週間に2〜3回(ノギスを使用して)腫瘍寸法を測定することによってモニターする。(Length x Width 2)/2 の計算式により、Tumor sizeを算出する。腫瘍の大きさが〜100mmの3に達したら、マウスに1×106又は5×106のTCR操作ヒトT細胞(処置群)又はPBS又は模擬T細胞(RNP又はHR鋳型なしでエレクトロポレーションした)対照群を投与する。腫瘍増殖を経時的にモニターし、腫瘍の大きさが2000mm 3に達したときにマウスを安楽死させる。各群のマウスのコホートを初期の時点(T細胞投与後4〜7日)で屠殺する。血液、脾臓及び腫瘍を採取する。血中の編集されたヒトT細胞の存在は、qPCR及びフロー・サイトメトリーにより評価される。腫ようにおける編集ヒトT細胞の存在/浸潤をqPCR、フロー・サイトメトリー及び免疫組織化学により評価した。
【０３７５】
結果は、TCR操作されたヒトT細胞のインビボ効力がヒト腫瘍細胞に対して評価されることを実証する。
「実施例２４」
NK編集
【０３７６】
ヒトナチュラル・キラー細胞(NK細胞)を、TCRアルファ遺伝子座位にZsGreenレポーター構築物を組み込んで編集した。NK細胞は、まずCD4/CD8の正の選択孤立(Miltenyi、CliniMACS)からフロースルーを採取することにより分離された。単核細胞をフィコール(標準法)を用いて単離し、次いでNK細胞をNK細胞単離キット(ミルテンイ)を用いて特異的に単離した。単離したNK細胞(1×106)を、NK MACS完全培地(Miltenyi)、5% hABS(Valley Biomedical)、200ng/mL IL-2(Miltenyi)、12.5ng/mL IL-15(Miltenyi)、及びMiltenyi NK活性化ビーズ(製造業者の説明書に従って5 uLビーズ/106細胞)を含む培養物中で活性化した。活性化後3日目に、活性化NK細胞(3x106)を下表14のパラメータ輪郭に従って100μL体積で電解した。環状プラスミド(pUCu-Kan TRAC(1k)_MNDZsGreen.f-P2A.LNGFRt)にコードされる、1kbの左右のホモロジーアーム(「HRアーム」)に隣接し、P2A配列によって分離された、MNDプロモーター駆動ZsGreen及び切断LNGRFコーディング配列を含む相同修理テンプレート。P2A;配列番号(SEQ ID NO):15).
【０３７７】
群を、4、7及び11日目にフローサイトメトリーによってGFP発現について評価した。表14に要約されるように、ZsGreen式は、4日目(群12及び13)と同じくらい早く見られた。11日目までに、20%を超える細胞が、プログラムEN-138及びEK-100(群11、12、14、及び15)を使用してZsGreenであった。11日目(グループ12)のZsGreen式を示す代表的なプロットを図33に示す。
【０３７８】
インアウトPCR技術を用いた組込みのための分子解析を行い、発現構築物のTCRアルファ遺伝子座位への正確なゲノム組込みを確認した。PCRは以前のTCR積分解析(配列番号(SEQ ID NO): 1)で使用された上流順方向プライマーを使用し、一方、MND挿入に特異的な上流逆方向プライマーは、編集されたT細胞からのgRNA及びそのそれぞれの逆方向プライマー(配列番号(SEQ ID NO): 2)を使用したポジティブ・コントロールを除いて、逆方向プライマー(AGGGTCATTTCAGGTCCTT、配列番号(SEQ ID NO): 23)として使用された。表14に要約し、図34に示すように、基11〜18は、適正積分を示す1Kb増幅PCR帯域を示した。したがって、NK細胞はTCRアルファ遺伝子座位で適切に編集された。特に、PCRバンドの強さはZsGreenを発現する細胞の割合と相関し、すなわち、ZsGreenが最も高い割合を有するサンプルは最も明るいPCRバンドを生成した。
［表１４］
「実施例２５」
初代細胞編集
【０３７９】
以上の手順で初代細胞の編集を行う。エレクトロポレーション条件及び試薬の変更を含むが、これらに限定されない方法は編集すべき厳密な初代細胞に応じて調整される。初代細胞には、幹細胞、ヒト幹細胞、胚性幹細胞、及び免疫細胞が含まれる。免疫細胞の例としてはB細胞、T細胞, 単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラー細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
追加の実施形態及び参考文献の組み込み
【０３８０】
本発明を、好ましい実施形態及び様々な代替実施形態を参照して特に示し、説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更を行うことができることが、当業者には理解されよう。
【０３８１】
本明細書の本体内で引用された全ての参考文献、発行済み特許及び特許出願は全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021501581.tif 000003
【図２】
2021501581.tif 000004
【図３】
2021501581.tif 000005
【図４】
2021501581.tif 000006
【図５Ａ】
2021501581.tif 000007
【図５Ｂ】
2021501581.tif 000008
【図６】
2021501581.tif 000009
【図７】
2021501581.tif 000010
【図８Ａ】
2021501581.tif 000011
【図８Ｂ】
2021501581.tif 000012
【図９】
2021501581.tif 000013
【図１０Ａ】
2021501581.tif 000014
【図１０Ｂ】
2021501581.tif 000015
【図１１】
2021501581.tif 000016
【図１２】
2021501581.tif 000017
【図１３Ａ】
2021501581.tif 000018
【図１３Ｂ】
2021501581.tif 000019
【図１４】
2021501581.tif 000020
【図１５】
2021501581.tif 000021
【図１６】
2021501581.tif 000022
【図１７】
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【図１８Ａ】
2021501581.tif 000024
【図１８Ｂ】
2021501581.tif 000025
【図１９】
2021501581.tif 000026
【図２０Ａ】
2021501581.tif 000027
【図２０Ｂ】
2021501581.tif 000028
【図２１】
2021501581.tif 000029
【図２２】
2021501581.tif 000030
【図２３】
2021501581.tif 000031
【図２４】
2021501581.tif 000032
【図２５Ａ】
2021501581.tif 000033
【図２５Ｂ】
2021501581.tif 000034
【図２６Ａ】
2021501581.tif 000035
【図２６Ｂ】
2021501581.tif 000036
【図２６Ｃ】
2021501581.tif 000037
【図２６Ｄ】
2021501581.tif 000038
【図２７Ａ】
2021501581.tif 000039
【図２７Ｂ】
2021501581.tif 000040
【図２７Ｃ】
2021501581.tif 000041
【図２７Ｄ】
2021501581.tif 000042
【図２８Ａ】
2021501581.tif 000043
【図２８Ｂ−２８Ｃ】
2021501581.tif 000044
【図２９】
2021501581.tif 000045
【図３０Ａ】
2021501581.tif 000046
【図３０Ｂ】
2021501581.tif 000047
【図３０Ｃ】
2021501581.tif 000048
【図３１】
2021501581.tif 000049
【図３２】
2021501581.tif 000050
【図３３】
2021501581.tif 000051
【図３４】
2021501581.tif 000052
【誤訳訂正書】
【提出日】令和2年11月18日(2020.11.18)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は2017年10月30日に出願された米国仮出願第62/579,113号、及び2017年10月30日に出願された米国仮出願第62/579,114号の利益を主張し、これらの各々は全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願にはEFS-Web経由で提出された配列表が含まれており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。20XX年、XX月、に作成されたASCIIコピーの名前はXXXXXUS_sequencelisting.txtで、サイズはX, XXX,XXXバイトである。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子ターゲティングとは、ゲノムを直接的に編集することができる方法であり、細胞産物を操作したり、遺伝病を引き起こす変異を修復したり、変異を作り出して遺伝子を研究したりするための道筋を提供する。遺伝子ターゲティングは、目的の遺伝子座位をターゲティングする部位特異的ヌクレアーゼとともに、所望の改変配列を有する相同組換え修復テンプレートDNA(homology repair template DNA)を送達した後に、相同組換えを起こすことに依るものである。
【０００４】
遺伝子ターゲティングを、初代ヒトT細胞において使用して、新規な特異性を有するT細胞が作製されてきた。これらの例において、AAVを使用して、相同組換え修復テンプレートDNAが送達されてきた。前記DNAには、新しいエピトープに特異的なキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)又はT-細胞レセプター(TCR)のコーディング配列が含まれる。これらの配列をTCRアルファ(一般的に)又はTCRβ遺伝子座位にターゲティングすると、研究者は内因性TCRのノックアウト(及び対応する特異性を無くすこ)、及び新しいタンパク質(及び対応する特異性)のノックインを同時に行うことができる。この方法は、治療的使用を目的とするCAR T細胞及びTCR T細胞を製造するスケールで使用される。しかしながら、AAVを製造するには、多大な時間がかかり、費用がかかり、困難であり、厳しく規制されており、その用途が制限されている。
【０００５】
裸のプラスミドDNAを使った遺伝子編集はこれまでに報告されているが、不死化細胞株との関連においてのみであって、初代細胞においては毒性の問題が言及されている。これらの問題は、mRNAを使用して、ヌクレアーゼ（これは、いくらかの毒性を示す）を、細胞の生存性を更に低下させるDNAとともに、送達することに由来している可能性がある。これらの問題はまた、DNAの送達効率がDNAの大きさに依存し、ベクターが適切に最適化されていないことに起因している可能性もある。更に、多くの研究所が使用するキットによって調製したプラスミドに共通して存在するDNA不純物は、細胞毒性に寄与することが知られており、このことによって、相同組換え修復テンプレートとしてプラスミドDNAを使用することが妨げられてきた可能性がある。ごく最近になって、DNA精製及び送達の技術が改良されてきている(例えば、プラスミド・ワクチンの登場、並びに最適化されたエレクトロポレーション・プロトコル及び装置(例えば、ヌクレオフェクション(Nucleofection)))。
【０００６】
トランスポゾンは、ヒトの初代T細胞にDNAを挿入するのにも使われているが、非特異的な方法である(レトロウイルスによる送達に似ている)。この場合、ゲノムにランダムに挿入される裸のDNAは、裸のプラスミドDNAとして送達される。しかしながら、高い毒性及び低い効率が、この方法の限界となっている。相同組換えを介した、初代ヒトT細胞における遺伝子編集も、これまでに報告されているが(例えば、Schumann et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Aug 18;112(33):10437-42)、非常に小さな編集又は修復(例えば、20ヌクレオチド以下)の場合に限られる。リボ核タンパク質(RNP)複合体をエレクトロポレーションして、相同組換えを介した、遺伝子編集も、これまでに報告されている（例えば、Kimら(Genome Res.2014 Jun;24(6):1012-9)及び国際公開WO2016/123578）。しかしながら、12ヌクレオチドの比較的小さい挿入(又はゲノム配列の置換)を、それぞれ線状テンプレートを使用して、実証した場合に限られている。より大きな編集をするための組成物及び方法は、T細胞以外の初代細胞(例えば、造血幹細胞及びナチュラル・キラー(NK)細胞)について、十分に報告されていない。この分野に欠けているのは、初代細胞において大きな編集を行う効率的な方法である（それによって、遺伝子編集の治療的応用が潜在的に制限されている）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、ヒト初代細胞及びヒト初代T細胞などの細胞における遺伝子編集を行うための改良した組成物及び方法が、この分野で大いに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［概要］
本出願は、以下を含む改変した細胞を提供する： 外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドであって、前記外因性のヌクレオチド配列は以下を含む：a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及びc)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、並びに、ここで、前記改変した細胞は実質的にウイルスを介した送達の構成成分を含まない。ある実施形態では、前記改変した細胞は組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む、ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含む、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれている、並びに前記組み込まれたヌクレオチド配列は、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている。ある実施形態では、前記改変した細胞は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の規定したヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【０００９】
又、本出願は、T細胞を含む改変した細胞を提供し、前記T細胞は以下を含む：a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；c)  第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；d)  第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、内因性のTCR-アルファの遺伝子座位の中に組み込まれている、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、各々のポリペプチド配列をシングル・ポリペプチド(single polypeptide)として発現することができるように配向されている、ここで、第2リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列と前記TCR-ベータのポリペプチド配列との間に位置する、前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドは、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列がそれぞれ別個のポリペプチドを形成するように、前記T細胞中で切断され得る切断可能なリンカーのポリペプチドである、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に会合して機能的なTCRを形成することができる、ここで、前記改変した細胞は、実質的にウイルスを介した送達の構成成分を含まない、並びに、ここで、内因性のTCR-ベータ遺伝子座位は破壊されている。
【００１０】
又、本出願は、T細胞を含む改変した細胞を提供し、前記T細胞は以下を含む：a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；c)  第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；d)  第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、内因性のTCRの遺伝子座位の中に組み込まれている、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、各々のポリペプチド配列をシングル・ポリペプチド(single polypeptide)として発現することができるように配向されている、ここで、前記第2リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列と前記TCR-ベータのポリペプチド配列との間に位置する、並びに前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドは、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列がそれぞれ別個のポリペプチドを形成するように、前記T細胞中で切断され得る切断可能なリンカーのポリペプチドである、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に会合して機能的なTCRを形成することができる。ある実施形態では、前記改変した細胞は、外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記外因性のヌクレオチド配列は、以下を含む：a)  前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、並びに前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、をコードするヌクレオチド配列；b)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及びc)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のTCR遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている。ある実施形態では、前記改変した細胞は、実質的にウイルスを介した送達の構成成分を含まない。ある実施形態では、前記改変した細胞は、前記内因性のTCR遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【００１１】
ある実施形態では、前記改変した細胞は、第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を更に含む。ある実施形態では、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、以下からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域における変異を含む：翻訳されるタンパク質のフレームに変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及びあるアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)。ある実施形態では、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、以下からなる群より選択される前記遺伝子のノン-コーディング領域における変異を含む：前記遺伝子がコードするmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子がコードするmRNA産物の安定性を変える変異。ある実施形態では、前記改変した細胞は、前記改変した細胞内の第2の規定したヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ又はその誘導体、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)又はその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)又はその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)又はその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、前記改変した細胞内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を含む。いくつかの実施形態では、前記crRNAはガイドRNA(gRNA)を含む、ここで、前記gRNAは前記規定されたヌクレオチド配列に対して相補的である。いくつかの実施形態では、前記crRNA及び前記tracrRNAは、シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある。いくつかの実施形態では、前記crRNA及び前記tracrRNAは、別個のポリヌクレオチド上にある。
【００１３】
いくつかの実施形態では、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又はそのコードされたポリぺプチド配列の発現は、、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。いくつかの実施形態では、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又はそのコードされたポリぺプチド配列の発現は、、外因性プロモーターによって指示される。いくつかの実施形態では、前記外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターが融合したもの、プロモーターの2つの部分が融合したもの、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター・システム、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター・システム、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター・システム、からなる群より選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、長さが100塩基以上である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列、及び前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、それぞれ長さが600塩基以上である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、前記規定されたヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列の組み込み後に破壊される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位と動作可能的に関連している内因性の遺伝子の発現は、破壊される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は、相同組換え率を増加させることができる追加の試薬を更に含む。いくつかの実施形態では、前記相同組換え率を増加させることができる追加の試薬は、相同組換え修復経路の活性化因子、非-相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)修復経路の阻害因子、又はそれらの組み合わせを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は、前記改変した細胞の生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む。いくつかの実施形態では、前記改変した細胞の生存率を増加させることができる追加の試薬が、核酸感知(nucleic acid sensing)経路の阻害因子を含む。いくつかの実施形態では、前記核酸感知(nucleic acid sensing)経路は、以下から選択される群を含む：TLR9核酸感知(nucleic acid sensing)経路、AIM2核酸感知(nucleic acid sensing)経路、IFI16核酸感知(nucleic acid sensing)経路、cGAS核酸感知(nucleic acid sensing)経路、及び細胞質ゾル核酸感知(nucleic acid sensing)経路。いくつかの実施形態では、前記核酸感知(nucleic acid sensing)経路の阻害因子は、オリゴヌクレオチド・アンタゴニストを含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチド・アンタゴニストは、配列TTAGGG又はそのタンデム・リピートを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドは、プラスミド又はナノプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、前記プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、並びにここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ではない、第1の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、及び第2の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、ヌクレオチド配列である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【００２４】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、イントロンを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態では、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子は、破壊されたTCR-ベータ遺伝子である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記TCR-ベータ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態では、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子は、破壊されたTCR-アルファ遺伝子である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノム・ターゲットは、免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、フリン切断部位を含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列の何れか1つは、以下からなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む：T2A、E2A、P2A、及びF2A。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、Gly-Ser-Glyリンカーを含む、任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端にある、及び任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、N末端からC末端の方向で、フリン切断部位：Gly-Ser-Glyリンカー：2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)、の並びの中にある。
【００２９】
いくつかの実施形態では、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、外因性のプロモーターを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、シグナル・ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ここで、前記シグナル・ペプチドは、遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチド、に動作可能的に連結している。いくつかの実施形態では、前記シグナル・ペプチドは外因性のシグナル・ペプチドである、任意選択的に、ここで、前記外因性のシグナル・ペプチドはヒト成長ホルモンのシグナル・ペプチドである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、前記第1リンカーのポリペプチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、同じリンカーのポリペプチド配列をコードする、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが異なる(codon diverged)。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。いくつかの実施形態では、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群より選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【００３５】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、ノン-コーディング領域(non-coding region)をコードする。いくつかの実施形態では、前記ノン-コーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部はTCR遺伝子の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む：a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及びc)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。
【００３６】
いくつかの実施形態では、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される：マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するのに最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部。
【００３７】
いくつかの実施形態では、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチドは、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列と、より強く相互作用する、任意選択的に、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して互いにより強く相互作用する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端の方向で、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端の方向で、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。
【００３９】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドンが異なる(codon diverged)。
【００４０】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞はT細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記T細胞は、以下からなる群より選択される：細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、初代T細胞、腫瘍浸潤T細胞、操作したT細胞、調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、アルファ-ベータT細胞、及びガンマ-デルタT細胞。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、ナチュラル・キラー細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、以下からなる群より選択される：B細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラーT細胞。
【００４１】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は胚性幹細胞を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は初代細胞である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は単離した細胞である、ここで、前記単離した細胞は対象から単離する。いくつかの実施形態では、前記対象はがんを有していることが判明している、又は、そのような疑いがある。
【００４４】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞はヒト細胞又はヒト由来細胞を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は、ex vivoで培養した細胞である。いくつかの実施形態では、前記ex vivoで培養した細胞は、刺激された細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記刺激された細胞はサイトカインで刺激されたT細胞を含み、任意選択的に、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞はCD3で刺激されたT細胞、CD28で刺激されたT細胞、又はCD3及びCD28で刺激されたT細胞、を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL7、IL15、又はそれらの組合せの存在下で培養する。いくつかの実施形態では、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2を実質的に含まない培地中で培養する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は組み込まれたウイルスを含まない、ここで、前記組み込まれたウイルスは前記ウイルスを介した送達の構成成分と動作可能的に関連している。いくつかの実施形態では、前記改変した細胞の表面上のMHCクラスIは、ウイルスを介した送達の構成成分又は組み込まれたウイルスに由来するペプチドを含まない、ここで、前記組み込まれたウイルスは前記ウイルスを介した送達の構成成分と動作可能的に関連している。
【００４７】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は、第2の外因性ヌクレオチド組成物を含む第2の環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記第2の外因性ヌクレオチド組成物は、以下を含む： a)  第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及びc)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の前記第1領域及び前記第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている。いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は第2の組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む、ここで、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれている、及び前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている。
【００４８】
又、本出願は、本明細書に記載の改変した細胞の何れか一種を含む細胞の集団を提供し、ここで前記集団の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超は組み込まれたヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は、前記組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、選別、選択、又は単離されていない。
【００４９】
又、本出願は、以下を含む細胞の集団を提供する：組み込まれたヌクレオチド配列、ここで、組み込まれたヌクレオチド配列は遺伝子の少なくとも一部を含み、前記組み込まれたヌクレオチド配列は内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で組み込まれている、及び前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている、ここで、前記細胞の集団はウイルスを介した送達の構成成分を実質的に含まない、並びにここで、前記集団中のT細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超は組み込まれたヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記T細胞は、前記組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、選別、選択、又は単離されていない。
【００５０】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、前記内因性のTCR遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記外因性のヌクレオチド配列は以下を含む： a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  前記内因性の遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列、及びc)  前記内因性の遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに前記内因性の遺伝子座位の前記第1領域及び前記第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性の遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている。
【００５２】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、少なくとも1×106個のT細胞、少なくとも2×106 個のT細胞、少なくとも5×106 個のT細胞、少なくとも1×107個のT細胞、又は少なくとも5×107 個のT細胞である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を更に含む。いくつかの実施形態では、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、以下からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む：翻訳されるタンパク質のフレームに変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及びあるアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)。いくつかの実施形態では、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、以下からなる群より選択される前記遺伝子のノン-コーディング領域(non-coding region)における変異を含む：前記遺伝子がコードするmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子がコードするmRNA産物の安定性を変える変異。
【００５４】
いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)若しくはその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)若しくはその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)若しくはその誘導体、からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。
いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、前記細胞の集団内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、規定されたヌクレオチド配列でヌクレアーゼを介した切断を指示するガイドRNAを含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドRNAは、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を含む。いくつかの実施形態では、前記crRNA及び前記tracrRNAは、シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある。いくつかの実施形態では、前記crRNA及び前記tracrRNAは、別個のポリヌクレオチド上にある。
【００５５】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、前記細胞の集団内の前記第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指示される。いくつかの実施形態では、前記外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターが融合したもの、プロモーターの2つの部分が融合したもの、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター・システム、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター・システム、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター・システム、からなる群より選択される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが100塩基以上である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列及び前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、それぞれ長さが600塩基以上である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、前記規定されたヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の組み込み後に破壊される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位と動作可能的に関連している内因性の遺伝子の発現は、破壊される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、相同組換え率を増加させることができる追加の試薬を更に含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、前記細胞の集団の生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドは、プラスミド又はナノプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、前記プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、並びにここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ではない、前記第1の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、及び前記第2の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、ヌクレオチド配列である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【００６７】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、イントロンを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、前記T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態では、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子は、破壊されたTCR-ベータ遺伝子である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、前記TCR-ベータ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態では、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子は、破壊されたTCR-アルファ遺伝子である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノム・ターゲットが免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは、以下からなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む：T2A、E2A、P2A、及びF2A。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは、フリン切断部位を含む。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは、Gly-Ser-Glyリンカーを含む、任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端にある、及び任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、N末端からC末端の方向で、フリン切断部位：Gly-Ser-Glyリンカー：2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)、の並びの中にある。
【００７２】
いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、外因性のプロモーター配列を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、第1リンカーのポリペプチド配列及び第2リンカーのポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第1リンカーのポリペプチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、同じリンカーのポリペプチド配列をコードする、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが異なる(codon diverged)。
【００７６】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。いくつかの実施形態では、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群より選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【００７７】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部はノン-コーディング領域(non-coding region)をコードする。いくつかの実施形態では、前記ノン-コーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。
【００７８】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む： a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及びc)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。いくつかの実施形態では、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される：マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するのに最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部。いくつかの実施形態では、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチドは、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列と、より強く相互作用する、任意選択的に、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して互いにより強く相互作用する。いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。いくつかの実施形態では、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。いくつかの実施形態では、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドンが異なる(codon diverged)。
【００７９】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、ヒト細胞又はヒト由来細胞を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、免疫細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞の集団は、T細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、前記T細胞の集団は、以下からなる群より選択される：細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、初代T細胞、腫瘍浸潤T細胞、操作したT細胞、調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、アルファ-ベータT細胞、及びガンマ-デルタT細胞。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞の集団はナチュラル・キラー細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、以下からなる群より選択される集団を含む：B細胞, 単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラーT細胞。
【００８１】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、幹細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、前記幹細胞の集団は、造血幹細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、前記幹細胞の集団は、胚性幹細胞の集団を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、初代細胞である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は単離した細胞の集団である、ここで、前記単離した細胞の集団は対象から単離する。いくつかの実施形態では、前記対象はがんを有していることが判明している、又は、そのような疑いがある。
【００８４】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、ex vivoで培養した細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記ex vivoで培養した細胞は、刺激された細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記刺激された細胞はサイトカインで刺激されたT細胞を含み、任意選択的に、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞はCD3で刺激されたT細胞、CD28で刺激されたT細胞、又はCD3及びCD28で刺激されたT細胞、を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL7、IL15、又はそれらの組合せの存在下で培養する。いくつかの実施形態では、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2を実質的に含まない培地中で培養する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は第2の組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む、ここで、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれている、及び前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている。いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、第2の外因性ヌクレオチド組成物を含む第2の環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記第2の外因性ヌクレオチド組成物は、以下を含む：a)  前記第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及びc)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、ここで、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の前記第1領域及び前記第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺子座位での相同組換えを促進するように配向されている。
【００８６】
また、本願は、治療を必要とする対象のためのその治療方法、が提供され、ここで、前記治療は、本明細書に記載の治療有効量の何れかの改変した細胞又は細胞の集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記改変した細胞又は細胞の集団は、前記対象に由来する。いくつかの実施形態では、前記改変した細胞又は細胞の集団は、前記対象に関して同種異系である。
【００８７】
また、本願は、細胞を遺伝子改変するための方法、が提供され、前記方法は以下の工程を含む：1)  シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)を含むヌクレオチド組成物を提供すること、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は以下を含む：a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及びc)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている；並びに2)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を提供すること；3)  前記細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させること、4)  前記細胞をウイルスで感染させること以外の手段によって、前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物を前記細胞中に送達すること。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記細胞内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を提供することを更に含む、ここで、前記第2ヌクレアーゼ組成物を、前記接触させる工程において前記細胞と接触させる、及び前記送達する工程において前記細胞中に送達する。いくつかの実施形態では、前記切断により、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異が起きる。いくつかの実施形態では、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、翻訳されるタンパク質のフレームに変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及びあるアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)、からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む。いくつかの実施形態では、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、前記遺伝子がコードするmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子がコードするmRNA産物の安定性を変える変異、からなる群より選択される前記遺伝子のノン-コーディング領域(non-coding region)における変異を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は更に以下を含む：第2ヌクレオチド組成物を提供すること、その第2組成物は以下を含む：a)  第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及びc)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列の全てはシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記第2の内因性のゲノムのターゲ���ト遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている、並びに、前記第2ヌクレオチド組成物を、前記接触させる工程において前記細胞と接触させる、及び前記送達する工程において前記細胞中に送達する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)若しくはその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)若しくはその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)若しくはその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、前記細胞内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記接触させる工程は、前記細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させる工程と前記送達する工程との間が、60分未満、45分未満、30分未満、20分未満、15分未満、10分未満、5分未満、又は1分未満である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、前記送達する工程は、エレクトロポレーション、トランスフェクション、物理的な方法による細胞膜の変形、脂質ナノ粒子(LNP)、ウイルス様粒子(VLP)、及び超音波処理、からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記送達する工程は、エレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態では、前記コードされたポリペプチド配列の発現は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指示される。いくつかの実施形態では、前記外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターが融合したもの、プロモーターの2つの部分が融合したもの、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター・システム、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター・システム、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター・システム、からなる群より選択される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、長さが100塩基以上である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域又は第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基、長さが100塩基、長さが200塩基、長さが400塩基、長さが600塩基、長さが800塩基、長さが1500塩基、長さが2000塩基、又は長さが4000塩基である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、前記規定されたヌクレオチド配列は、組み込み後に破壊される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に動作可能的に関連している前記内因性の遺伝子の発現は、破壊される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、前記方法は、相同組換え率又は生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、環状プラスミド、線状DNAフラグメント、ミニサークル、及びssDNAからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記環状プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、ここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記第1の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列、又は前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列のどれでもない、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。いくつかの実施形態では、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、混入物質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、細胞生存率を低下させる構成成分を実質的に含まない。
【００９６】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、イントロンを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、前記細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位である。いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、TCR-ベータ遺伝子座位である。いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、免疫チェックポイント遺伝子座位である。いくつかの実施形態では、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む、いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、外因性のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、スプライス・アクセプター配列を更に含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。いくつかの実施形態では、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群より選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、ノン-コーディング領域(non-coding region)をコードする。いくつかの実施形態では、前記ノン-コーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するのに最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部、からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む：a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；b)   TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及びc)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。いくつかの実施形態では、前記TCR-アルファのポリペプチド配列は、マウス化TCR-アルファ、ヒト化TCR-アルファ、ドメイン・スワップをしたTCR-アルファ、点変異を入れたTCR-アルファ、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR-アルファ、コドンを最適化したTCR-アルファ（ヒトで発現するのに最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-アルファ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、マウス化TCR-ベータ、ヒト化TCR-ベータ、ドメイン・スワップをしたTCR-ベータ、点変異を入れたTCR-ベータ、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR-ベータ、コドンを最適化したTCR-ベータ（ヒトで発現するのに最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-ベータ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。いくつかの実施形態では、前記第2リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第2リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。いくつかの実施形態では、前記第2リンカー配列は、外因性のプロモーターを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子、からなる群より選択される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、前記第2の遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞はT細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記T細胞は、以下からなる群より選択される：細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、初代T細胞、腫瘍浸潤T細胞、操作したT細胞、調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、アルファ-ベータT細胞、及びガンマ-デルタT細胞。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、ナチュラル・キラー細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、以下からなる群より選択される：B細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラーT細胞。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は胚性幹細胞を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は初代細胞である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は単離した細胞である、ここで、前記単離した細胞は対象から単離する。いくつかの実施形態では、前記対象はがんを有していることが判明している、又は、そのような疑いがある。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞はヒト細胞又はヒト由来細胞を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は、ex vivoで培養した細胞である。いくつかの実施形態では、前記ex vivoで培養した細胞は、刺激された細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記刺激された細胞はサイトカインで刺激されたT細胞を含み、任意選択的に、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞はCD3で刺激されたT細胞、CD28で刺激されたT細胞、又はCD3及びCD28で刺激されたT細胞、を含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL7、IL15、又はそれらの組合せの存在下で培養する。いくつかの実施形態では、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2を実質的に含まない培地中で培養する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、前記改変した細胞は組み込まれたウイルスを含まない、ここで、前記組み込まれたウイルスは前記ウイルスを介した送達の構成成分と動作可能的に関連している。いくつかの実施形態では、前記改変した細胞の表面上のMHCクラスIは、ウイルスを介した送達の構成成分又は組み込まれたウイルスに由来するペプチドを含まない、ここで、前記組み込まれたウイルスは前記ウイルスを介した送達の構成成分と動作可能的に関連している。
【０１１２】
又、本願は、本明細書に記載される何れかの方法によって産生される改変した細胞、を提供し、ここで、前記細胞は組み込まれたヌクレオチド配列を含む、ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれ、及び前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される。
【０１１３】
本明細書に記載される何れかの方法によって産生される細胞の集団、ここで、前記集団中の細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超は前記組み込まれたヌクレオチド配列を含む、ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記組み込まれたヌクレオチド配列は内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれ、及び前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、選別、選択、又は単離されていない。いくつかの実施形態では、送達する工程後の細胞の集団の生存率は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも40%、少なくとも60%、又は少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、前記生存率を、前記送達する工程の4日後に評価する。いくつかの実施形態では、前記生存率を、AOPI染色によって評価する。
【０１１５】
又、本願は、治療を必要とする対象のためのその治療方法、を提供し、ここで、前記治療は、本明細書に記載の何れかの方法によって産生された、治療有効量の何れかの細胞又は細胞の集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記細胞又は細胞の集団は、前記対象に由来する。何れかの実施形態では、前記細胞又は細胞の集団は、前記対象に関して同種異系である。
【０１１６】
又、本願は、細胞を遺伝子改変するための方法、を提供し、前記方法は、以下の工程を含む：1)  以下を含むヌクレオチド組成物を提供すること：a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、長さが100塩基である、前記ヌクレオチド配列の全てはシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている；並びに、2)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるCRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物を提供すること；3)  前記細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物と接触させること、並びに4)  エレクトロポレーションによって、前記ヌクレオチド組成物及び前記CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物を前記細胞中に送達すること。
【０１１７】
又、本願は、規定されたT細胞レセプターを有する改変したT細胞を生成する方法、を提供し、前記方法は、以下の工程を含む：1)  以下を含むヌクレオチド組成物を提供すること：a)  TCR-アルファのポリぺプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  TCR-ベータのポリぺプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；c)  第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；d)  第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；e)  内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、f)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列はシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある、前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のTCR遺伝子座位における相同組換えを促進するように配向されている、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、並びに第1リンカー及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、前記内因性のTCR遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記ポリペプチド配列のそれぞれがシングル・ポリペプチド(single polypeptide)として発現することができるように配向されている、前記第1リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部、前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部、及び第2リンカーのポリペプチド配列の前に位置する、前記第2リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列と前記TCR-ベータのポリペプチド配列との間に位置する、並びに、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、それぞれ別個のポリペプチドを形成する、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に相互作用して機能的なTCRを形成することができる；2)  前記内因性のTCR遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を提供すること；3)  前記T細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させること、並びに4)  前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物を前記T細胞中に送達すること。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、前記方法は、前記T細胞内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を提供することを更に含む、ここで、前記第2ヌクレアーゼ組成物を、前記接触させる工程において前記T細胞と接触させる、及び前記送達する工程において前記T細胞中に送達する。いくつかの実施形態では、前記切断により、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異が生じる。いくつかの実施形態では、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、翻訳されるタンパク質のフレームに変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及びあるアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)、からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む。いくつかの実施形態では、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、前記遺伝子がコードするmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子がコードするmRNA産物の安定性を変える変異、からなる群より選択される前記遺伝子のノン-コーディング領域(non-coding region)における変異を含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、前記方法は、更に以下を含む：第2ヌクレオチド組成物を提供すること、その第2組成物は以下を含む：a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列の全てはシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている；並びに、前記第2ヌクレオチド組成物を、前記接触させる工程において前記T細胞と接触させる、及び前記送達する工程において前記T細胞中に送達する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)若しくはその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)若しくはその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)若しくはその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼ組成物は、前記T細胞内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。いくつかの実施形態では、前記接触させる工程は、前記T細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させる工程と前記送達する工程との間が、60分未満、45分未満、30分未満、20分未満、15分未満、10分未満、又は5分未満である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、前記送達する工程は、エレクトロポレーション、トランスフェクション、物理的な方法による細胞膜の変形、脂質ナノ粒子(LNP)、ウイルス様粒子(VLP)、及び超音波処理、からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記送達する工程は、エレクトロポレーションを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指示される。いくつかの実施形態では、前記外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターが融合したもの、プロモーターの2つの部分が融合したもの、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター・システム、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター・システム、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター・システム、からなる群より選択される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又は前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが100塩基以上である。いくつかの実施形態では、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又は前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域又は第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基、長さが100塩基、長さが200塩基、長さが400塩基、長さが600塩基、長さが800塩基、長さが1500塩基、長さが2000塩基、又は長さが4000塩基である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、前記規定されたヌクレオチド配列は、組み込み後に破壊される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、前記内因性のTCR遺伝子座位と機能的に関連している内因性の遺伝子の発現は、破壊される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、前記方法は、相同組換え率又は生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、環状プラスミド、線状DNAフラグメント、ミニサークル、及びssDNAからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記環状プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、ここで、前記ベクター骨格は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列のどれでもない、ヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。いくつかの実施形態では、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、実質的に混入物質を含まない。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、前記内因性のTCR遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性のTCR遺伝子座位は、イントロンを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記TCR-アルファ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記TCR-ベータ遺伝子座位を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、前記第1リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含む、ここで、発現した後に、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部、前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部、及び前記第2リンカーのポリペプチド配列、をコードすることによってのみコードされるポリペプチド、が産生される。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第1リンカーのポリペプチド配列は、IRESを含む。いくつかの実施形態では、前記第1リンカー配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、前記第2リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含む、ここで、発現した後に、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、それぞれ別個のポリペプチドを形成する、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に相互作用して機能的なTCRを形成することができる。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。
いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、前記第2リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。いくつかの実施形態では、前記第2リンカー配列は、外因性のプロモーターを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、前記TCR-アルファのポリペプチド配列は、マウス化TCR-アルファ、ヒト化TCR-アルファ、ドメイン・スワップをしたTCR-アルファ、点変異を入れたTCR-アルファ、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR-アルファ、コドンを最適化したTCR-アルファ（ヒトで発現するのに最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-アルファ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、からなる群より選択される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、マウス化TCR-ベータ、ヒト化TCR-ベータ、ドメイン・スワップをしたTCR-ベータ、点変異を入れたTCR-ベータ、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR-ベータ、コドンを最適化したTCR-ベータ（ヒトで発現するのに最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-ベータ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、からなる群より選択される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列は、第1リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、前記規定されたヌクレオチド配列が内因性TCR-アルファ遺伝子座位内にある場合、前記第2の規定されたヌクレオチド配列は内因性TCR-ベータ遺伝子座位内にある。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、前記規定されたヌクレオチド配列が内因性TCR-ベータ遺伝子座位内にある場合、前記第2の規定されたヌクレオチド配列は内因性TCR-アルファ遺伝子座位内にある。いくつかの実施形態では、前記第2の規定されたヌクレオチド配列は、免疫チェックポイント遺伝子座位内にある。いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、shRNA、siRNA、miRNA、サイトカイン、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子、からなる群より選択される。
【０１３９】
又、本願は、以下を含む環状ポリヌクレオチドを含む、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを指示する際に使用するためのヌクレオチド組成物、を提供する：a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列の全てはシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている。いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが100塩基以上である。いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、長さが4000塩基以上である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列及び前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、それぞれ、長さが600塩基以上である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドは、プラスミド又はナノプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、前記プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、並びにここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではない、及び前記第1の内因性の遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、前記環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、イントロンを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記T細胞レセプター(TCR)-ベータ遺伝子座位を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、前記内因性のゲノム・ターゲットは、免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、フリン切断部位を含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列の何れか1つが、以下からなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む：T2A、E2A、P2A、及びF2A。いくつかの実施形態では、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つが、Gly-Ser-Glyリンカーを含む、任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端にある、及び任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、N末端からC末端の方向で、フリン切断部位：Gly-Ser-Glyリンカー：2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)、の並びの中にある。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、外因性のプロモーターを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部はシグナル・ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ここで、前記シグナル・ペプチドは、前記遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチド、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチドに動作可能的に連結している。いくつかの実施形態では、前記シグナル・ペプチドは外因性のシグナル・ペプチドであり、任意選択的に、ここで、前記外因性のシグナル・ペプチドはヒト成長ホルモンのシグナル・ペプチドである。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、前記第1リンカーのポリペプチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、同じリンカーのポリペプチド配列をコードする、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが異なる(codon diverged)。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。いくつかの実施形態では、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群より選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、ノン-コーディング領域(non-coding region)をコードする。いくつかの実施形態では、前記ノン-コーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む：a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及びc)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下からなる群より選択される：マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するのに最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチドは、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列と、より強く相互作用するように操作されている、任意選択的に、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して、互いにより強く相互作用するように操作されている。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端の方向で、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。いくつかの実施形態では、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端の方向で、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、前記遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドンが異なる(codon diverged)。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付の図面を参照することでより良く理解されるのであろう:
【０１６０】
【図１】図１は、TRAC遺伝子座位にZsGreenレポーターを組み込ませるのに使用する、一般的な編集戦略を表す概略図を提示する。TCRα遺伝子座位への一般的なターゲティング戦略では、1 kbの左側と右側のホモロジー・アーム(homology arm「HRアーム」)に挟まれ、及びP2A配列によって隔てられた、プロモーターのないZsGreen及び一部を欠いたLNGRFコーディング配列、並びにそのZsGreen及びLNGRFのカセットをTCRα遺伝子座位配列からを隔てる5'P2A配列、を含む相同組換え修復テンプレート、を、環状ナノプラスミドの中にコードして、使用する。
【図２】図２は、ZsGreenを組み込ませるための、一般的な編集タイムラインを示す。
【図３】図３は、T細胞の編集効率を、TRAC遺伝子座位に組み込ませたZsGreenレポーターを用いて示す。
【図４】図４は、ネオ抗原-特異的なTCR構築物(neoTCR)をTCRα遺伝子座位に組み込ませるために使用する、一般的なターゲティング戦略を表す概略図を提示する。
【図５】図５は、ネオ抗原-特異的なTCR構築物(neoTCR)をTCRα遺伝子座位に組み込ませるために使用する、ネオ抗原-特異的なTCR構築物の設計を示す。図５Ａは、ターゲットのTCRα遺伝子座位(内因性TRAC、上パネル)及びそのCRISPR Cas9ターゲット部位(横縞、切断部位は矢印で示す)、並びに組み込まれる前の、左側及び右側のホモロジー・アーム(それぞれ、「LHA」及び「RHA」)の間に、neoTCRをコードするポリヌクレオチドが位置するようにした、環状プラスミドHRテンプレート(下パネル)を示す。図５Ｂは、TCRα遺伝子座位に組み込まれたneoTCR(上パネル)、転写され且つスプライシングを受けたneoTCR mRNA(中央パネル)、並びに翻訳及びその発現したneoTCRのプロセシング(下パネル)、を示している。
【図６】図６は、neoTCRコンストラクトを挿入して、T細胞を編集するための一般的な編集タイムラインを示す。
【図７】図７は、TCRα遺伝子座位の中に、neoTCR構築物が正確にゲノム組み込みが行われたことを確認するために使用した、イン‐アウトPCR技術(一般的な戦略、上パネル)及びアガロース・ゲルにて可視化したPCR増幅産物(下パネル)を示す。
【図８】図８は、MART-1 neoTCRの発現を、フロー・サイトメトリーにより示す。図８Ａは、MART-1 neoTCRの発現を、MART-1特異的なデキストラマー染色を用いて示す。図８Ｂは、10日目における、MART-1特異的なデキストラマー染色を用いた、MART-1 neoTCRの編集の結果をまとめたものを示す。
【図９】図９は、IFNγ(左側パネル)及びIL-2(右側パネル)に関して、抗原-特異的なサイトカイン産生アッセイによる、操作したT細胞の評価を示す。
【図１０】図１０は、抗原特異的な増殖アッセイ(図１０Ａ)及び抗原特異的なT細胞を介した傷害のアッセイ(図１０Ｂ)による、操作したT細胞の評価を示す。
【図１１】図１１は、レンチウィルスによる形質導入方法を使用して作成した、MART-1又はNY-ESO neoTCRのどちらかを発現する、操作したT細胞(図１１、上パネル)、又は小さい又は大きいフォーマットを用いたエレクトロポレーションを介したHR編集を使用して作成した、MART-1 neoTCRを発現する操作したT細胞(図１１、下パネル)、を示す。
【図１２】図１２は、抗原特異的なT細胞を介した傷害のアッセイによる、操作したT細胞の評価を示す。各群の上の棒から下の棒に向かって：コグネイト・ペプチド(cognate peptide)でパルスしていない非コグネイトMHC HLA-A01；10μM MART1でパルスした非コグネイトMHC HLA-A01；コグネイト・ペプチドでパルスしていない、コグネイトMHC HLA-A02；10μM MART1でパルスしたコグネイトMHC HLA-A01；MART-1コグネイト抗原ペプチドを構成的に発現するHLA-A02ターゲット細胞。
【図１３】図１３は、HRテンプレートとして、精製した環状プラスミドDNA及びPCRによって生成した線状dsDNAを使用した場合の、HRを介した編集の相対的な効率を示す。図１３Ａは、標準的なPCR産物(上)及びセミ-プロテクトPCR産物(semi-protect PCR product)(下)を示す。図１３Ｂは、HRテンプレートとして、環状プラスミド、標準的なPCR産物、及びセミ-プロテクトPCR産物を用いた場合の編集効率を示す。
【図１４】図１４は、細胞数(左側)又はAOPI染色(右側)によって評価した、購入した(「pUC57」)又はイン-ハウス(in-house)で精製した(「イン-ハウス(in-house)pUC57」)を用いた場合のT細胞の生存率を示す。
【図１５】図１５は、Neo12に特異的なデキストラマー染色によって検出した場合のNeo12 neoTCRの発現を示す。
【図１６】図１６は、Neo12に特異的なデキストラマー染色によって検出した場合のNeo12 neoTCRの発現を示す。
【図１７】図１７は、特異的なデキストラマー染色によって検出した場合のneoTCRs MART-1、Neo12、及びNY-ESOの発現を示す。
【図１８】図１８は、ドナー由来のT細胞へのneoTCRの組み込みを示す。図１８Ａは、健常者ドナー由来又は患者由来のT細胞における、特異的なデキストラマー染色によって検出した場合のneoTCRs MART-1、Neo12、及びNY-ESOの編集効率(CD8+の%として)を示す。図１８Ｂは、健常者ドナー由来のT細胞における、neoTCR neo12の編集効率(CD8+の%として)を示す。
【図１９】図１９は、pan-TCR抗体が結合しないCD3複合体を検出することによって評価した場合の、CD4+細胞及びCD8+細胞の編集効率を示す。
【図２０】図２０は、組み込まれたneoTCR及び内因性TCRの表面発現レベルを示す。図２０Ａは、同じ抗体(CD3)を用いて染色した、内因性TCR(左側ヒストグラム)及びNeo12 neoTCR TCR(右側ヒストグラム)のMFIのヒストグラムを示す。図２０Ｂは、内因生TCRと比較した、neoTCR MART-1、Neo12、NY-ESOの表面発現レベルを解析したものを示している。*1細胞あたりのTCR発現レベルは文献に基づいている。
【図２１】図２１は、新たに単離したPBMCに由来し、及びプロディジー・プラットホーム(Prodigy platform)を用いて単離したT細胞を、大きいフォーマットで編集し、Neo12特異的なデキストラマー染色によって評価した場合の、Neo12 neoTCRの発現を示す。
【図２２】図２２は、ペプチドでパルスしたターゲット細胞(HLA-A02発現K562細胞)を使用して、編集したT細胞を評価するための、一般的な戦略を示す。
【図２３】図２３は、HLA複合体(pHLA)として予め形成されたペプチドを発現するように操作したターゲット細胞(HLA-A02発現K562細胞)を用いて、編集したT細胞を評価するための、一般的な戦略を示す。
【図２４】図２４は、抗原特異的なT細胞を介した傷害のアッセイによる、操作したT細胞の評価を示す。*パルスしたペプチドは、ターゲット・ネオ抗原を発現するin vivo の腫瘍とは対照的に、in vitro のターゲット細胞上に、極短い時間だけ提示される。
【図２５】図２５は、抗原特異的増殖のアッセイにおける操作したT細胞の評価を示す。図２５Ａは、図２５Ｂで計算された分裂細胞%で増殖していることを示す、典型的なヒストグラム・プロットを表す。
【図２６】図２６は、サイトカインIFNγ(図２６Ａ)、IL-2(図２６Ｂ)、TNFα(図２６Ｃ)、及びIL-6(図２６Ｄ)に関する、抗原特異的なサイトカイン産生のアッセイによる、操作したT細胞の評価を示す。
【図２７】図２７は、ドナー由来T細胞を用いた場合の、編集したT細胞の評価を示す。図２７Ａは、健常者ドナー由来及び患者ドナー由来のT細胞の編集効率を示す。図２７Ｂは、健常者ドナー及び患者ドナー由来のT細胞に対する、抗原特異的なT細胞を介した傷害のアッセイを示す。図２７Ｃは、健常者ドナー由来及び患者ドナー由来のT細胞についての抗原特異的な増殖のアッセイを示す。図２７Ｄは、健常者ドナー由来及び患者ドナー由来のT細胞に関する抗原特異的なサイトカイン産生アッセイを示す。
【図２８】図２８は、ドナー由来T細胞を用いた場合の、編集したT細胞の評価を示す。図２８Ａは、Neo12 neoTCR又はMART-1 neoTCRの何れかを発現するドナーT細胞の編集効率を示す。図２８Ｂは、Neo12 neoTCR又はMART-1 neoTCRの何れかを発現するドナーT細胞に関する、抗原特異的なT細胞を介した傷害のアッセイを示す。図２８Ｃは、Neo12 neoTCR又はMART-1 neoTCRの何れかを発現するドナーT細胞に関する、抗原特異的な増殖のアッセイを示す。
【図２９】図２９は、同等の効率で作成して14日後(左側パネル)及び2ヶ月後(右側パネル)での、Neo12 neoTCR又はMART-1 neoTCRの何れかを発現するドナーT細胞についての抗原特異的なT細胞を介した傷害のアッセイを示す。
【図３０】図３０は、Neo12 neoTCR(図３０Ａ)又はMART-1 neoTCR(図３０Ｂ)の何れかを発現する編集したT細胞に関するアイソプレキシ解析(Isoplexis analysis)を示す。図３０Ｃは、サイトカイン応答性に対する操作したT細胞の寄与(左側パネル)及びそれぞれのサイトカインを産生するT細胞の割合(右側パネル)を示す。
【図３１】図３１は、HSCを編集するために使用した一般的なワークフローを示す。
【図３２】図３２は、イン-アウトPCR技術によるPCR増幅産物をアガロース・ゲル上で可視化することを利用して、HSCのTCRα遺伝子座位に、neo12 neoTCR構築物が正確にゲノム組み込みが行われたことを確認したことを、示す。
【図３３】図３３は、NK細胞のTCRα遺伝子座位に組み込まれたZsGreenレポーターから、11日目にZsGreenが発現していることを実際に示す、典型的なプロットを示す。
【図３４】図３４は、イン-アウトPCR技術によるPCR増幅産物をアガロース・ゲル上で可視化することを利用して、NK細胞のTCRα遺伝子座位に、ZsGreenレポーターが正確にゲノム組み込みが行われたことを確認したことを、示す。
【発明を実施するための形態】
【０１６１】
［発明の詳細な説明］
［定義］
本明細書中で使用する場合、「抗原」には、患者特異的ネオ抗原を含む任意の抗原が含まれる。抗原には、免疫反応を誘導することができる任意の物質が含まれる。
【０１６２】
本明細書中で使用する場合、「抗原特異的なT細胞」は、細胞のT細胞レセプター(TCR)によって互いに区別される細胞をいい、T細胞レセプター(TCR)は細胞にそれらの抗原特異性を付与する。
【０１６３】
本明細書中で使用する場合、「抗原複合体」、「抗原-MHC」、「抗原-MHC複合体」、「組換え抗原-MHC複合体」、「ペプチドMHC」、「p/MHC」、及び「pHLA」は、抗原結合溝の中のペプチドと複合体を形成した組換え主要組織適合性遺伝子複合体を指すために互換的に使用される。本明細書中で使用する場合、用語MHCには、限定されるものではないが、ヒト白血球抗原(HLA)と呼ばれるヒトMHCが含まれる。
【０１６４】
用語「有効量」又は「治療有効量」は、疾患の症状を改善するのに有効な量、例えば、腫瘍の成長を阻害するのに有効な量を指す。
【０１６５】
用語「改善する」は、疾患状態（例えばがん性疾患の状態）の治療における、任意の治療上の有益な結果を指し、予防、重症度又は進行度の軽減、寛解、又は治癒を含む。
【０１６６】
用語「in situ」は、生きている生物体から分離して成長する（例えば、組織培養中で成長する）生きている細胞で起こるプロセスをいう。
【０１６７】
「in vivo」という用語は、生物体内で起こるプロセスを指す。
【０１６８】
本明細書で使用される用語「哺乳動物」は、ヒト及び非ヒトの両方を含み、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタが含まれる。
【０１６９】
用語パーセント「同一性」は、2つ以上の核酸又はポリペプチドの配列において、以下に記載する配列比較のアルゴリズム(例えば、BLASTP及びBLASTN、又は当業者に利用可能な他のアルゴリズム)のうちの1つを使用して測定した場合に、又は目視検査によって測定した場合に、最も良く一致するように比較及びアライメントしたときの、2つ以上の配列又は部分配列に関する、同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージ、を指す。その使い方によっては、「同一性」パーセントは、比較対象の配列の領域にわたって（例えば、機能的ドメインにわたって）存在することがある、又は代わりに、比較対象の2つの配列の全長にわたって存在することがある。
【０１７０】
配列を比較するためには、典型的には、1つの配列が、試験配列と比較する参照配列としての役割をする。配列比較のアルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、部分配列の位置を指定し、及び配列アルゴリズム・プログラム・パラメータを指定する。次いで、配列比較のアルゴリズムによって、指定したプログラム・パラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが計算される。
【０１７１】
比較する配列を最適にアラインメントすることを、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所ホモロジーのアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジー・アライメントのアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性を検索する方法によって、これらのアルゴリズムをコンピューターで実行することによって(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中のGAP, BESTFIT, FASTA,及びTFASTA)、又は目視検査によって(一般的に、Ausubelらを参照のこと)、行うことがある。
【０１７２】
配列の同一性パーセント及び配列の類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムのある例はBLASTアルゴリズムであり、これは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)(<www.ncbi.nlm.nih.gov />)を通して公開入手可能である。
【０１７３】
「保存的置換」又は「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸を化学的又は機能的に類似したアミノ酸で置換することを指す。類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野で周知である。例えば、表１〜３に提供されるアミノ酸の群は、いくつかの実施形態では、互いに保存的置換であると考えられる。
【０１７４】
【表１】
2021501581.tif 000053
【０１７５】
【表２】
2021501581.tif 000054
【０１７６】
【表３】
2021501581.tif 000055
【０１７７】
更なる保存的置換は、例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties 2nd ed. (1993) W. H. Freeman & Co., New York, NYに記載されている。親タンパク質中のアミノ酸残基の1つ以上を保存的置換することによって生成されたタンパク質を、「保存的に改変した改変体」と呼ぶ。
【０１７８】
用語「アミノ酸」は、20種類の一般的な天然に存在するアミノ酸をいう。天然に存在するアミノ酸には、アラニン(Ala; A)、アルギニン(Arg; R)、アスパラギン(Asn; N)、アスパラギン酸(Asp; D)、システイン(Cys; C);グルタミン酸(Glu; E)、グルタミン(Gln; Q)、グリシン(Gly; G);ヒスチジン(His; H)、イソロイシン(Ile; I)、ロイシン(Leu; L)、リジン(Lys; K)、メチオニン(Met; M)、フェニルアラニン(Phe; F)、プロリン(Pro; P)、セリン(Ser; S)、スレオニン(Thr; T)、トリプトファン (Trp; W)、チロシン (Tyr; Y)、及びバリン(Val; V)が含まれる。
【０１７９】
特に明記しない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する用語「約」は、当該技術分野における通常の許容範囲内（例えば、平均値の2標準偏差内）と理解される。約は、記載された値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、又は0.01%以内と理解されることがある。
【０１８０】
用語「実質的に含まない(substantially free of)」は、関連する全組成物中に、構成成分(例えば、混入物質又はウイルス構成成分)が統計的に有意な量未満存在する、ことを意味すると理解され、関連する全組成物中に、構成成分が検出できないレベルである（即ち、無い(free of)）こと等が含まれる。統計的に有意な量未満とは、関連する組成物中に構成成分が存在することを、統計的信頼性をもって評価することができない検出レベルにあることを指す（例えば、p値が、0.1, 0.05 又は 0.01等である）。組成物が、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0001%又は0.0001%未満の質量／体積パーセンテージ濃度で構成成分を含有する場合、前記組成物は実質的に前記構成成分を含まないことがある。
【０１８１】
明細書及び添付した特許請求の範囲で使用しているように、単数形の「a」、「an」及び「the」は、文脈が明瞭に他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含んでいることに留意されたい。
【０１８２】
改変した細胞
本出願は、改変した細胞（例えば、ウイルス送達システムを使用せずに遺伝子の要素を付加及び／又は除去されているように改変した初代ヒト細胞等が含まれる）を提供する。
【０１８３】
ある態様では、前記改変した細胞は以下を含む：外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドであって、前記外因性のヌクレオチド配列は以下を含む：a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及びc)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、並びに、ここで、前記改変した細胞は実質的にウイルスを介した送達の構成成分を含まない。前記改変した細胞は組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む、ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含む、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれている、並びに前記組み込まれたヌクレオチド配列は、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている。
【０１８４】
別の態様では、改変した細胞を提供し、前記改変した細胞は以下を含む：T細胞、前記T細胞は以下を含む：a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；c)  第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；d)  第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、内因性のTCR-アルファの遺伝子座位の中に組み込まれている、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、各々のポリペプチド配列をシングル・ポリペプチド(single polypeptide)として発現することができるように配向されている、ここで、前記第2リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列と前記TCR-ベータのポリペプチド配列との間に位置する、前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドは、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列がそれぞれ別個のポリペプチドを形成するように、前記T細胞中で切断され得る切断可能なリンカーのポリペプチドである、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に会合して機能的なTCRを形成することができる、ここで、前記改変した細胞は、実質的にウイルスを介した送達の構成成分を含まない、並びに、ここで、内因性のTCR-ベータ遺伝子座位は破壊されている。前記改変したT細胞は、外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記外因性のヌクレオチド配列は、以下を含む：a)  前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、並びに前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、をコードするヌクレオチド配列；b)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及びc)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のTCR遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている。
【０１８５】
別の態様では、改変したT細胞を提供し、前記T細胞は以下を含む：a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；c)  第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；d)  第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、内因性のTCRの遺伝子座位の中に組み込まれている、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、各々のポリペプチド配列をシングル・ポリペプチド(single polypeptide)として発現することができるように配向されている、ここで、前記第2リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列と前記TCR-ベータのポリペプチド配列との間に位置する、並びに前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドは、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列がそれぞれ別個のポリペプチドを形成するように、前記改変したT細胞中で切断され得る切断可能なリンカーのポリペプチドである、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に会合して機能的なTCRを形成することができる。前記改変した細胞は、外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記外因性のヌクレオチド配列は、以下を含むことがある：a)  前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、並びに前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、をコードするヌクレオチド配列；b)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及びc)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のTCR遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている。前記改変したT細胞は、実質的にウイルスを介した送達の構成成分を含まないことがある。
【０１８６】
細胞改変及びゲノム編集
一般的に、改変した細胞は、それらがゲノム編集されているか、又はゲノム編集され得るように改変されている。例えば、ヌクレアーゼを介した遺伝子編集システムを用いて、改変した細胞をゲノム編集して外因性の遺伝子を発現させることができる。そのようなものとして、前記改変した細胞は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位（内因性のTCR遺伝子座位等を含む）内の、規定されたヌクレオチド配列を切断するヌクレアーゼ組成物を含むことがある。外因性のポリヌクレオチド(例えば、外因性の遺伝子又はその一部)が、本改変した細胞のゲノムに組み込まれている場合、細胞は改変されていると考えることができる。細胞は、ヌクレアーゼを介した遺伝子編集において一般的に使用される構成成分、即ちゲノム編集を促進することができる構成成分(例えば、ヌクレアーゼ、相同組換え修復テンプレート、CRISPRシステム・ヌクレオチド等)、を1種以上を含む場合、改変されているとみなすことができる。細胞は、内因性のターゲット遺伝子座位を破壊する1種以上のテンプレートに依らない変異等の、1種以上のテンプレートに依らない変異（例えば、組み込まれた外因性のポリヌクレオチドとは別個の変異）を含む場合、改変されている、とみなすことができる。様々な改変は相互に排他的ではない、即ち、改変した細胞は、組み込まれた外因性のポリヌクレオチド(例えば、外因性の遺伝子又はその一部)、及びヌクレアーゼを介した遺伝子編集において一般的に使用される1種類以上の構成成分（例えば、外因性のポリヌクレオチドの組み込みを促進する構成成分）、両方を有することがある。
【０１８７】
ある例示的な実施例では、改変したT細胞は、外因性のTCR配列、内因性のTCR遺伝子座位をターゲットとするCRISPR/Cas9 RNP、及び外因性のTCR配列をコードする相同組換え修復テンプレート(HRT)をコードするポリヌクレオチドが組み込まれている。別の例示的な実施例では、改変した細胞は、内因性のTCR遺伝子座位をターゲットとするCRISPR/Cas9 RNP及び外因性のTCR配列をコードする相同組換え修復テンプレート(HRT)を有することがある。
【０１８８】
別の例示的な実施例では、改変した細胞は、外因性の配列（例えば、遺伝子の少なくとも一部）、内因性の遺伝子座位をターゲットとするCRISPR/Cas9 RNP、及び外因性の配列をコードする相同組換え修復テンプレート(HRT)をコードするポリヌクレオチドが組み込まれている。別の例示的な実施例では、改変した細胞は、内因性の遺伝子座位をターゲットとするCRISPR/Cas9 RNP及び外因性の配列をコードする相同組換え修復テンプレート(HRT)を有することがある。
【０１８９】
別の例示的な実施例では、改変した造血幹細胞(HSC)は、外因性の配列（例えば、遺伝子の少なくとも一部）、内因性の遺伝子座位をターゲットとするCRISPR/Cas9 RNP、及び外因性の配列をコードする相同組換え修復テンプレート(HRT)をコードするポリヌクレオチドが組み込まれている。別の例示的な実施例では、改変したHSCは、内因性の遺伝子座位をターゲットとするCRISPR/Cas9 RNP及び外因性の配列をコードする相同組換え修復テンプレート(HRT)を有することがある。
【０１９０】
別の例示的な実施例では、改変したナチュラル・キラー(NK)細胞は、外因性の配列（例えば、遺伝子の少なくとも一部）、内因性の遺伝子座位をターゲットとするCRISPR/Cas9 RNP、及び外因性の配列をコードする相同組換え修復テンプレート(HRT)をコードするポリヌクレオチドが組み込まれている。別の例示的な実施例では、改変したNK細胞は、内因性の遺伝子座位をターゲットとするCRISPR/Cas9 RNP及び外因性の配列をコードする相同組換え修復テンプレート(HRT)を有することがある。
【０１９１】
内因性の遺伝子の破壊
改変した細胞は、非-機能的な遺伝子を産生するか、又は産生し得るように改変していることがある。
【０１９２】
ヌクレアーゼ組成物によって産生される非-機能的な遺伝子をもたらす変異は、テンプレートに依るゲノム編集（例えば、相同組換えDNA修復機構）の結果であることがある。ゲノムのターゲット遺伝子座位において外因性のポリヌクレオチド(例えば、遺伝子)を発現するようにゲノム編集された改変した細胞は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に動作可能的に関連している内因性の遺伝子の発現を破壊することもできる。例えば、ゲノムのターゲット遺伝子座位がコードする内因性の遺伝子は、機能的に欠失を受けることがあり (例えば、外因性の遺伝子が組み込まれることによって、内因性の遺伝子又はその一部が除去される／置換される)、又は機能的に破壊を受けることがある(例えば、内因性の遺伝子の転写及び／又は翻訳が破壊を受けるように、内因性の遺伝子又はその一部内に、外因性の遺伝子が組み込まれる)。ある例示的な実施例では、TCRをコードする外因性の遺伝子を、内因性のTCR遺伝子の発現が破壊されるように、TCRアルファ定常領域をコードするエクソンのような内因性のTCR遺伝子座位に組み込むことができる。発現が破壊されるとは、改変していない細胞と比較して、内因性の遺伝子をコードするmRNAの発現が減少していることがある、又は、改変していない細胞と比較して、内因性の遺伝子の翻訳が減少していることがある。発現が破壊されるとは、改変していない細胞と比較して、内因性の遺伝子をコードするmRNAの発現が検出できないほどになることがある、又は、改変していない細胞と比較して、内因性の遺伝子の翻訳が検出できないほどになることがある。
【０１９３】
改変した細胞は、規定されたヌクレオチド配列(即ち、ゲノムのターゲット遺伝子座位)がコードする非-機能的な遺伝子を産生する、テンプレートに依らない変異(例えば、組み込まれた外因性のポリヌクレオチドとは別の変異)を含む改変を有することがある。ヌクレアーゼ組成物によって生じる、非-機能的な遺伝子をもたらす変異は、テンプレートに依らないゲノムの削除（例えば、ヌクレアーゼによる切断によって誘導される、非-相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)DNA修復機構によってもたらされる、ゲノムの挿入又は削除(インデル(indel)とも呼ばれる)）によってもたらされることがある。非-機能的な遺伝子を生じることがある変異には、前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異(例えば、翻訳されるタンパク質のフレームに変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、若しくは、あるアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation))、又はノン-コーディング領域(non-coding region)における変異(例えば、その遺伝子がコードするmRNA産物の発現を変化させる変異、又はその遺伝子がコードするmRNA産物の安定性を変化させる変異)が含まれる。改変には、改変した細胞で、テンプレートに依らない変異を生成することができるヌクレアーゼ組成物(例えば、規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物)を含むことがある。
【０１９４】
複数の改変
改変した細胞は、2つ以上の改変（例えば、改変した細胞中で、2つ以上のゲノム遺伝子座位での改変）を有することがある。例えば、改変した細胞は、2つ以上のゲノム遺伝子座位で、2つ以上の外因性のポリヌクレオチドが組み込まれていることがあり、例えば、前記改変した細胞は、第2の組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む、ここで、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれている、及び前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている。前記改変した細胞は、第2の外因性のポリヌクレオチド（例えば、第2の外因性ヌクレオチド組成物を含む第2の環状ポリヌクレオチド等）が組み込まれることを促進する構成成分を有することがあり、前記第2の外因性ヌクレオチド組成物は、以下を含む： a)  第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)  第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及びc)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の前記第1領域及び前記第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、並びに／又は、前記細胞内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を有することがある。一般的に、改変した細胞は、1つだけ又は2つだけの組み込まれたヌクレオチド配列に限定されず、任意の数の組み込まれたヌクレオチド配列（例えば、1〜10、1〜2、1〜3、2〜3、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の組み込まれたヌクレオチド配列）を含むことがある。
【０１９５】
同様に、改変した細胞は、1〜10、1〜2、1〜3、2〜3、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の組み込まれたヌクレオチド配列を生じ得る構成成分(例えば、相同組換え修復テンプレート、ヌクレアーゼなど)を有することがある。ある例示的な実施例では、「多重化した(multiplexed)」CRISPRを介する遺伝子編集アプローチを使用して、複数のゲノム位置を切断することを指示する複数のCRISPR RNP複合体と同時に複数の相同組換え修復テンプレートを導入することによって、複数の遺伝子又はその部分を組み込ませることができる。複数の配列をまた、順番に組み込ませることもある。
【０１９６】
改変した細胞は、規定したヌクレオチド配列(即ち、ゲノムのターゲット遺伝子座位)がコードする非-機能的な遺伝子を産生する複数のテンプレートに依らない変異などの、複数のテンプレートに依らない変異(例えば、組み込まれた外因性のポリヌクレオチドとは別個の変異)を含む改変を受けていることがある。改変は、改変した細胞で複数のテンプレートに依らない変異を産生することができるヌクレアーゼ組成物を含むことがある。例えば、改変した細胞は、それぞれ2つ又は3つの非-機能的な遺伝子を生じる、2つ又は3つの別個のテンプレートに依らない変異を有することがある。一般的に、改変した細胞は、任意の数のテンプレートに依らない変異（例えば、それぞれ、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の別個のテンプレートに依らない変異）を有することがある。例示的な実施例では、「多重化した(multiplexed)」CRISPRを介する遺伝子編集アプローチを使用して、複数のゲノム位置を切断することを指示する複数のCRISPR RNP複合体を同時に導入することによって複数の遺伝子を破壊し、複数のテンプレートに依らない変異をもたらすことがある。
【０１９７】
改変した細胞は、複数の非-機能的な遺伝子をもたらす複数の変異を有することがある。例えば、改変した細胞は、それぞれ2つ又は3つの非-機能的な遺伝子をもたらす2つ又は3つの別個の変異を有することがある。一般的に、改変した細胞は任意の数の非-機能的な遺伝子をもたらす任意の数の変異（例えば、それぞれ、4、5、6、7、8、9、10以上の非-機能的な遺伝子をもたらす4、5、6、7、8、9、10以上の別個の変異）を有することがある。ある例示的な実施例では、「多重化した(multiplexed)」CRISPRを介する遺伝子編集アプローチを使用して、複数のゲノム位置を切断することを指示する複数のCRISPR RNP複合体を同時に導入することによって複数の遺伝子を破壊し、複数の変異をもたらすことがある。複数の遺伝子を、順番に破壊することもある。ヌクレアーゼ組成物によって生成される非-機能的な遺伝子をもたらす変異は、テンプレートに依るゲノム編集（例えば、相同組換えDNA修復機構）の結果であることがある。ヌクレアーゼ組成物によって生成される非-機能的な遺伝子をもたらす変異は、テンプレートに依らないゲノムの削除（例えば、ヌクレアーゼによる切断によって誘導される、非-相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)DNA修復機構によってもたらされる、ゲノムの挿入又は削除(インデル(indel)とも呼ばれる)）によってもたらされることがある。
【０１９８】
複数の改変は、1つ以上のテンプレートに依らない変異と組み合わせた1つ以上の組み込まれたヌクレオチド配列のような、記載された改変の何れかの組み合わせを含むことがある。ある例示的な実施例では、「多重化した(multiplexed)」CRISPRを介する遺伝子編集アプローチを使用して、相同性による修復(homology directed repair)を通して1つ以上の遺伝子又はその部分を組み込み(即ち、複数のゲノム位置を切断することを指示する複数のCRISPR RNP複合体と同時に複数の相同組換え修復テンプレートを導入する)、同時に複数の遺伝子を破壊する(即ち、複数のゲノム位置を切断することを指示する複数のCRISPR RNP複合体を同時に導入して、複数のテンプレートに依らない変異（例えば、複数のインデル）をもたらす)ことの両方を行うことがある。組み込むこと及び破壊することを、順番に行うことがある。
【０１９９】
複数の改変を有する改変した細胞の例示的な実施例として、TCRα遺伝子座位に組み込まれたTCR発現カセットを有する、及びTCRβ遺伝子座位が非-機能的な遺伝子であるように破壊されたTCRβ遺伝子座位を有する改変したT細胞。別の例示的な実施例（複数の改変を有する改変した細胞の例示的な実施例）として、TCRβ遺伝子座位に組み込まれたTCR発現カセットを有する、及びTCRα遺伝子座位が非-機能的な遺伝子であるような破壊されたTCRα遺伝子座位を有する改変したT細胞。
【０２００】
ターゲット遺伝子座位
前記改変した細胞は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位において（即ち、目的の特定の遺伝子又は目的の特定のヌクレオチド配列等の、改変した細胞内の特定のゲノム位置において）、ゲノム編集されている、又はゲノム編集されうる。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、遺伝子のコーディング領域(coding region)であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、イントロンのような遺伝子のノン-コーディング領域(non-coding region)であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、典型的な遺伝子に典型的に関連するゲノム領域以外のノン-コーディング・ゲノム領域（例えば、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、ノン-コーディング機能性RNA、反復DNA要素、レトロウイルス要素、偽遺伝子などをコードする複数の領域など）であることがある。
【０２０１】
細胞の集団
ある特定の態様では、細胞の集団(例えば、T細胞の集団)が提供される。前記細胞の集団は、本明細書に記載の改変した細胞の何れかを含むことがある。前記改変した細胞は、細胞のヘテロな集団及び／又は種々の細胞型のヘテロな集団の中にあることがある。前記細胞の集団は、ゲノム編集された細胞の割合に関して、ヘテロであることがある。細胞の集団では、前記集団の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、又は90%超が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。特定の態様において、細胞の集団は組み込まれたヌクレオチド配列を含む、ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は遺伝子の少なくとも一部を含む、前記組み込まれたヌクレオチド配列は内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で組み込まれている、及び前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている、ここで、前記細胞の集団はウイルスを介した送達の構成成分を実質的に含まない、並びに、ここで、前記集団中の細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、又は90%超は組み込まれたヌクレオチド配列を含む。
【０２０２】
細胞の集団では、前記集団の91%超、92%超、93%超、94%超、95%超、96%超、若しくは97%超、98%超、99%超、99.5%超、又は99.9%超が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の20%超が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の30%超が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の60%超が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の70%超が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。
【０２０３】
細胞の集団では、前記集団の10%〜70%、20%〜70%、30%〜70%、40%〜70%、50%〜70%、60%〜70%、10%〜80%、10%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、10%〜30%、10%〜20%、20%〜80%、30%〜80%、40%〜80%、50%〜80%、60%〜80%、70%〜80% が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の10%〜100%、20%〜100%、30%〜100%、40%〜100%、50%〜100%、60%〜100%、70%〜100%、80%〜100%、90%〜100%、95%〜100%、96%〜100%、97%〜100%、98%〜100%、99%〜100%、99.5%〜100%が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。細胞の集団では、10%〜70%が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。細胞の集団では、20%〜70%が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。細胞の集団では、30%〜70%が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。細胞の集団では、10%〜80%が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。細胞の集団では、20%〜80%が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。細胞の集団では、30%〜80%が組み込まれたヌクレオチド配列を含むことがある。
【０２０４】
細胞の集団では、単一の改変（例えば、組み込まれたヌクレオチド配列）を有する細胞のパーセンテージに関して、ヘテロであることがある。第1の改変、第2の改変、又は第1の改変及び第2の改変の両方、の何れかを有する細胞のパーセンテージに関して、ヘテロであることがある（例えば、例示的な実施例として、組み込まれたヌクレオチド配列、第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異、又は組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異の両方、の何れかを有する細胞のパーセンテージに関して、ヘテロであることがある。
【０２０５】
細胞の集団では、前記集団の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、又は90%超が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の91%超、92%超、93%超、94%超、95%超、96%超、若しくは97%超、98%超、99%超、99.5%超、又は99.9%超が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の20%超が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の30%超が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の60%超が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の70%超が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の10%〜70%、20%〜70%、30%〜70%、40%〜70%、50%〜70%、60%〜70%、10%〜80%、10%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、10%〜30%、10%〜20%、20%〜80%、30%〜80%、40%〜80%、50%〜80%、60%〜80%、70%〜80% が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の10%〜100%、20%〜100%、30%〜100%、40%〜100%、50%〜100%、60%〜100%、70%〜100%、80%〜100%、90%〜100%、95%〜100%、96%〜100%、97%〜100%、98%〜100%、99%〜100%、99.5%〜100% が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の10%〜70%が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の20%〜70%が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の30%〜70%が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の10%〜80%が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の20%〜80%が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の30%〜80%が、組み込まれたヌクレオチド配列及び第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。
【０２０６】
細胞の集団では、前記集団の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、又は90%超が、組み込まれたヌクレオチド配列又は第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の10%〜70%、20%〜70%、30%〜70%、40%〜70%、50%〜70%、60%〜70%、10%〜80%、10%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、10%〜30%、10%〜20%、20%〜80%、30%〜80%、40%〜80%、50%〜80%、60%〜80%、70%〜80% が、組み込まれたヌクレオチド配列又は第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の91%超、92%超、93%超、94%超、95%超、96%超、若しくは97%超、98%超、99%超、99.5%超、又は99.9%超が、組み込まれたヌクレオチド配列又は第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の20%超が、組み込まれたヌクレオチド配列又は第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の30%超が、組み込まれたヌクレオチド配列又は第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の60%超が、組み込まれたヌクレオチド配列又は第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。細胞の集団では、前記集団の70%超が、組み込まれたヌクレオチド配列又は第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むことがある。
【０２０７】
細胞の集団では、組み込まれたヌクレオチド配列を含む改変した細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、95%超、98%超、又は99%超が、第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むこともある。細胞の集団では、組み込まれたヌクレオチド配列を含む改変した細胞の10%〜70%、20%〜70%、30%〜70%、40%〜70%、50%〜70%、60%〜70%、10%〜80%、10%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、10%〜30%、10%〜20%、20%〜80%、30%〜80%、40%〜80%、50%〜80%、60%〜80%、70%〜80%, 10%〜90%、20%〜90%、30%〜90%、40%〜90%、50%〜90%、60%〜90%、70%〜90%、80%〜90%、10%〜95%、20%〜95%、30%〜95%、40%〜95%、50%〜95%、60%〜95%、70%〜95%、80%〜95%、10%〜98%、20%〜98%、30%〜98%、40%〜98%、50%〜98%、60%〜98%、70%〜98%、80%〜98%、10%〜99%、20%〜99%、30%〜99%、40%〜99%、50%〜99%、60%〜99%、70%〜99%、80%〜99%、90%〜99%、95%〜99%、90%〜95%、及び95%〜98%が、第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含むこともある。
【０２０８】
細胞の集団では、第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含む改変した細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、95%超、98%超、又は99%超が、組み込まれたヌクレオチド配列を含むこともある。細胞の集団では、第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を含む改変した細胞の10%〜70%、20%〜70%、30%〜70%、40%〜70%、50%〜70%、60%〜70%、10%〜80%、10%〜60%、10%〜50%、10%〜40%、10%〜30%、10%〜20%、20%〜80%、30%〜80%、40%〜80%、50%〜80%、60%〜80%、70%〜80%, 10%〜90%、20%〜90%、30%〜90%、40%〜90%、50%〜90%、60%〜90%、70%〜90%、80%〜90%、10%〜95%、20%〜95%、30%〜95%、40%〜95%、50%〜95%、60%〜95%、70%〜95%、80%〜95%、10%〜98%、20%〜98%、30%〜98%、40%〜98%、50%〜98%、60%〜98%、70%〜98%、80%〜98%、10%〜99%、20%〜99%、30%〜99%、40%〜99%、50%〜99%、60%〜99%、70%〜99%、80%〜99%、90%〜99%、95%〜99%、90%〜95%、及び95%〜98% が、組み込まれたヌクレオチド配列を含むこともある。
【０２０９】
改変した細胞を、改変の後（例えば、ゲノム編集の後）の細胞の集団の中で富化させて、特定の改変（例えば、外因性の遺伝子の組み込み）を富化させることがある。前記集団を、限定されるものではないが、蛍光活性化細胞選別(FACS)(例えば、外因性の遺伝子から蛍光マーカが発現若しくは共-発現する、又は前記集団を、外因性の遺伝子の発現若しくは内因性の遺伝子の喪失を見るために、抗体を使用して染色する)、薬剤選択(例えば、外因性の遺伝子から薬剤選択遺伝子が発現又は共-発現する)、又はアフィニティ精製(例えば、外因性の遺伝子からアフィニティ・タグが発現又は共-発現する)等を含む方法を使用して、富化することがある。
【０２１０】
特定の態様において、本明細書中に記載されるホモな集団を、改変した細胞を富化すること無く（例えば、細胞を改変した後（例えば、ヌクレアーゼを介した（例えば、CRISPRを介した）ゲノム編集の後）、富化する工程を行うことなく）、得ることがある。
【０２１１】
細胞の集団（特に、前記集団を富化していない、改変直後の細胞の集団）は、少なくとも10個の細胞、少なくとも100個の細胞、少なくとも1000個の細胞、少なくとも10000個の細胞、1x106個の細胞、少なくとも2x106個の細胞、少なくとも5x106個の細胞、少なくとも1x107個の細胞、少なくとも5x107個の細胞、少なくとも1x108個の細胞、少なくとも5x108個の細胞、少なくとも1x109個の細胞、又は少なくとも5x109個の細胞、であることがある。前記細胞の集団（特に、前記集団を富化していない、改変直後の細胞の集団）は、少なくとも1×107個の細胞、であることがある。前記細胞の集団（特に、前記集団を富化していない、改変直後の細胞の集団）は、少なくとも5×107個の細胞、であることがある。
【０２１２】
遺伝子編集システム
上記のように、一般的に、改変した細胞は、ヌクレアーゼを介した編集を使用して、ゲノム編集されている、又はゲノム編集されうるように、改変している。
【０２１３】
一般的に、ヌクレアーゼは、まず特異的な核酸配列(即ち、ヌクレアーゼが切断する「規定されたヌクレオチド配列」)（例えば、ゲノム配列）を切断することを指示することによって編集を促進し、その後の編集は、テンプレートに依らないことをベースとしたDNA修復（例えば、ヌクレアーゼによる切断によって誘導される、非-相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)DNA修復機構）から生じる、又はテンプレートをベースとした修復（例えば、相同組換えDNA修復機構）から生じる。
【０２１４】
配列特異的な切断を促進するように操作することがある種々のヌクレアーゼは、当業者に公知であり、及び、限定されるものではないが、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)若しくはその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)若しくはその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)若しくはその誘導体、が含まれる。特に、CRISPR/Cas9編集システム等のCRISPRを介した遺伝子編集システムを使用することがある。ヌクレアーゼを介した編集（特に、CRISPRを介した編集）は、Adli M (The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat Commun. 2018 May 15;9(1):1911)においてより詳細に議論されており、それが教示する全てについては、参照により本明細書に取り込まれる。
【０２１５】
CRISPRを介した遺伝子編集
一般的に、CRISPRを介した遺伝子編集システムは、CRISPR関連(Cas)ヌクレアーゼ及び特定のターゲット配列への切断を指示するRNAを含む。例示的なCRISPRを介した遺伝子編集システムは、Cas9ヌクレアーゼ並びにCRISPR RNA(crRNA)ドメイン及びトランス活性化CRISPR(tracrRNA)ドメインを有するRNAからなるCRISPR/Cas9システムである。前記crRNAは、典型的には、2つのRNAドメインを有する：例えばゲノム配列のようなターゲット配列(「規定されたヌクレオチド配列」)への塩基対ハイブリダイゼーションによって、特異性を指示するガイドRNA配列(gRNA)；及びtracrRNAにハイブリダイズするRNAドメイン。tracrRNAは、ヌクレアーゼ(例えば、Cas9)と相互作用し、それによってゲノムの遺伝子座位に、ヌクレアーゼを動員することを促進することがある。前記crRNA及びtracrRNAポリヌクレオチドは、別個のポリヌクレオチドであることがある。前記crRNA及びtracrRNAポリヌクレオチドは、シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)であることがあり、シングル・ガイドRNA(sgRNA)とも呼ばれる。ここでは、Cas9システムを示すが、Cpf1システムのような他のCRISPRシステムを使用することもある。ヌクレアーゼはその誘導体、例えば、Cas9の機能的な変異体、例えば、Cas9酵素が典型的には二本鎖を完全に切断することとは対極的に、規定されたヌクレオチド配列の一本鎖のみを切断することに一般的に介在するCas9「ニッカーゼ(nickase)」変異体、を含むことがある。
【０２１６】
一般的に、CRISPRシステムの構成成分は、互いに相互作用して、リボ核タンパク質(RNP)複合体を形成し、配列特異的な切断に介在する。いくつかのCRISPRシステムでは、各構成成分を別々に生成し、及び使用し、その結果、RNP複合体を形成させることがある。いくつかのCRISPRシステムでは、各構成成分をin vitroで別々に生成することがあり、そして互いにin vitroで接触させ(即ち、「複合体化」)、RNP複合体を形成させることがある。そして、in vitroで生成したRNPを、細胞の細胞質及び／又は核(例えば、T細胞の細胞質及び／又は核)の中に導入することがある(即ち、「送達することがある」)。前記in vitroで生成したRNP複合体を、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション, 物理的な手段によって細胞膜を変形させること、脂質ナノ粒子(LNP)、ウイルス様粒子(VLP)、及び超音波処理等を含む種々の方法によって、細胞中に送達することがある。特定の実施例では、in vitroで生成したRNP複合体を、ヌクレオファクター／ヌクレオフェクション(登録商標) (Nucleofactor/Nucleofection(登録商標))エレクトロポレーションをベースにした送達システム(Lonza(登録商標))を使用して、細胞中に送達することがある。他のエレクトロポレーション・システムとしては、限定されるものではないが、MaxCyteエレクトロポレーション・システム、Miltenyi CliniMACSエレクトロポレーション・システム、Neonエレクトロポレーション・システム、及びBTXエレクトロポレーション・システムが含まれる。CRISPRヌクレアーゼ(例えば、Cas9)を、当業者に公知の種々のタンパク質生成技術を使用して、in vitroで生成することがある(即ち、合成及び精製することがある)。CRISPRシステムのRNA(例えば、sgRNA)を、in vitro転写又は化学合成のような、当業者に公知の種々のRNA生成技術を使用して、in vitroで生成することがある(即ち、合成及び精製することがある)。
【０２１７】
in vitroで生成したRNP複合体は、種々の比のヌクレアーゼ対gRNAで複合体化していることがある。例えば、in vitroで生成したRNP複合体は、1:1〜1:9の間のCas9:sgRNAモル比(例えば、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、又は1:9のCas9:sgRNAモル比)でCas9タンパク質と複合体化しているsgRNAによって、形成され得る。in vitroで生成したRNP複合体は、約1:1、約1:2、約1:3、約1:4、約1:5、約1:6、約1:7、約1:8、又は約1:9のCas9:sgRNAモル比でCas9タンパク質と複合体化しているsgRNAによって、形成され得る。
【０２１８】
in vitroで生成したRNP複合体をまた、CRISPRを介した編集システムにおいて、種々の量で使用することもある。例えば、編集したい細胞の数に応じて、添加する合計RNP量を調整することがある（例えば、1回の反応で、多数(例えば、5×107個)の細胞を編集する際に添加するRNP複合体の量を減らす等）。
【０２１９】
いくつかのCRISPRシステムでは、各構成成分(例えば、Cas9及びsgRNA)はポリヌクレオチドによって別々にコードされることがあり、そして各ポリヌクレオチドを同じ細胞に導入することがある。いくつかのCRISPRシステムでは、各構成成分はシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)によってコードされることがあり（即ち、複数のプロモーター又はマルチシストロニックな（multicistronic）ベクター、以下の例示的なマルチシストロニックな（multicistronic）システムの説明を参照のこと)、そして細胞に導入することがある。それぞれのポリヌクレオチドがコードするCRISPR構成成分が細胞内で発現すると(例えば、ヌクレアーゼの翻訳及びCRISPR RNAの転写)、RNP複合体が細胞内で形成され、次いで部位特異的な切断が指示されることがある。
【０２２０】
いくつかのRNPを操作し、核の中にRNPを送達することを促進する部分を有するようにすることがある。例えば、Cas9ヌクレアーゼは、核局在シグナル(NLS)ドメインを有することがあり、その結果、Cas9 RNP複合体が細胞の細胞質ゾルに送達されると、又はCas9が翻訳され及びその後にRNPが形成された後に、前記NLSによって、核の中へのCas9 RNPの輸送が更に促進されることがある。
【０２２１】
本明細書中に記載される改変した細胞は、非ウイルス的な方法を使用して改変していることがある（例えば、本明細書中に記載されるヌクレアーゼ及びCRISPRを介した遺伝子編集システムを、非ウイルス的な方法を使用して細胞に送達することがある）。ウイルスを介した送達(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、及びレンチウイルスをベースとした送達方法)は、ヌクレアーゼ及びCRISPRを介した遺伝子編集システムを送達するために使用されてきているが、ウイルスを介したシステムには、そのウイルスのシステムが免疫原性をもたらす構成成分も導入してしまうという問題がある。例えば、ウイルスを介した送達の構成成分は、ゲノムの中に組み込まれ得るウイルス又はウイルス由来のヌクレオチド配列を含むことがある。従って、本明細書に記載の改変した細胞は、ウイルスを介した送達の構成成分を実質的に含まないことがある。「ウイルスを介した送達の構成成分を実質的に含まない」という用語は、関連する全組成物(例えば、細胞又は細胞の集団)中に存在する1種以上のウイルスを介した送達の構成成分が、統計的に有意な量未満であることを意味すると理解され、関連する全組成物中で、ウイルスを介した送達の構成成分が検出不可能なレベルにあること等を含む(即ち、「本明細書に記載される改変した細胞は、ウイルスを介した送達の構成成分を含まないことがある」)。統計的に有意な量未満とは、0.1、0.05、又は0.01を超えるp値など、ウイルスを介した送達の構成成分が関連する組成物中に存在するということに対して、統計的信頼性が有ると見なさない検出レベルを指すことがある。ウイルスを介した送達の構成成分には、ウイルス構造タンパク質(例えば、キャプシド、エンベロープ、及び／又は膜融合タンパク質)等のウイルス・タンパク質が含まれることがある。一般的に、組み込まれたウイルス配列又は導入されたウイルス・タンパク質に由来する全てのペプチドは、細胞表層のMHC分子、特にMHCクラスI対立遺伝子によって提示され、その後、免疫原性を引き起こすことがある。養子細胞療法等の治療的状況においては、免疫原性は、治療有効性に悪影響を及ぼすことがある。従って、非-ウイルス的な送達方法は、養子T細胞療法等の養子細胞療法で使用する細胞を改変及び編集する際に有益であることがある。従って、特定の態様において、改変した細胞の表面上のMHCクラスIには、ウイルスを介した送達の構成成分又は組み込まれたウイルス（ここで、前記組み込まれたウイルスは前記ウイルスを介した送達の構成成分と動作可能的に関連している）に由来するペプチドが無いことがある。
【０２２２】
いくつかのCRISPRシステムにおいて、2つ以上のCRISPR組成物が提供され、各々が、別々に、同じ遺伝子又は一般的なゲノムの遺伝子座位を、2つ以上の規定されたヌクレオチド配列で、ターゲットとすることがある。例えば、2つの別個のCRISPR組成物が与えられ、互いにある一定の距離内（例えば、互いに、10塩基対以下、20塩基対以下、30塩基対以下、40塩基対以下、50塩基対以下、100塩基対以下、200塩基対以下、300塩基対以下、400塩基対以下、500塩基対以下、1,000塩基対以下、2,000塩基対以下、5,000塩基対以下、又は10,000塩基対以下）にある2つの異なる規定されたヌクレオチド配列を切断するよう指示することがある。いくつかのCRISPRシステムにおいて、2つ以上のCRISPR組成物が提供され、各々が、別々に、同じ遺伝子又は一般的なゲノム遺伝子座位の反対鎖をターゲットとすることがある。例えば、2つの別個のCRISPR「ニッカーゼ(nickase)」組成物が提供され、同じ遺伝子又は一般的なゲノム遺伝子座位の反対鎖を切断することを指示することがある。
【０２２３】
遺伝子編集における相同性による修復(homology directed repair (HDR))
理論に拘束されることは望まないが、一般的に、外因性の遺伝子を導入するために使用するヌクレアーゼを介した遺伝子編集システムは、細胞の天然のDNA修復機構、特に相同組換え(HR)修復経路、を利用する。簡単に述べると、ゲノムDNAに対して傷害(典型的には二本鎖切断)があった後、細胞は、前記傷害を修復するためにDNAを合成する過程で、その5'末端及び3'末端の両方が同一又は実質的に同一の配列である別のDNA源を、テンプレートとして使用することによって、前記傷害を解消することがある。自然の状況では、HDRは、同じ細胞の中に存在する他の染色体をテンプレートとして使用することがある。遺伝子編集システムにおいては、外因性のポリヌクレオチドを前記細胞の中に導入して、相同組換えテンプレート(HRT又はHRテンプレート)として使用する。一般的に、前記HRT内に、5'及び3'相補性末端の間に傷害がある染色体には元々見られない、如何なる外因性の配列が付加されていたとしても(例えば、遺伝子又は遺伝子の一部)、その配列は、テンプレートに依るHDRの過程で、所与のゲノムの遺伝子座位の中に取り込まれる（即ち、組み込まれる）ことがある。従って、所与のゲノムの遺伝子座位に対する典型的なHRテンプレートは、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、及び遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列(例えば、目的の外因性の遺伝子)を有する。
【０２２４】
いくつかの実施例では、HRテンプレートは線状であることがある。線状HRテンプレートの実施例としては、限定されるものではないが、線状プラスミド・ベクター、ssDNA、合成DNA、及びPCRで増幅したDNAが挙げられる。
【０２２５】
特定の実施例において、HRテンプレートは、プラスミド又はナノプラスミドのような環状であることがある。理論に束縛されることは望まないが、環状HRテンプレートは、安定性の増加、(例えば、PCR増幅の過程での)合成エラーの減少、及び製造の容易さのような、類似の線状テンプレートを超える特定の利点を有することがある。本明細書で実証するように、環状HRテンプレートは、類似の線状テンプレート（例えば、類似のサイズの線状テンプレート）と比較して、編集効率を改善することがある。環状テンプレートには、スーパーコイルになったテンプレートが含まれることがある。
【０２２６】
理論に束縛されることは望まないが、一般的に、使用するHRテンプレートが大きければ大きいほど、典型的には、相同組換え(HR)修復経路は全体として効率がより低くなる。従って、HRテンプレートから（特に、環状テンプレートから）外来ヌクレオチド配列を除去することなどによって、HRテンプレートのサイズを制限することは有利であることがある。例えば、ベクター骨格(即ち、遺伝子又はその部分以外の全てのヌクレオチド配列)として、長さが500塩基未満であるベクター骨格（例えば、抗生物質耐性マーカー及び複製起点以外の全ての外来配列を除去したベクター）を使用することがある。
【０２２７】
環状HRテンプレートに関する例示的な実施例では、ナノプラスミド(商標)(NanoplasmidTM)(Nature Technology)を使用する。ナノプラスミド(商標)は、Nature Technology社の商標である。抗生物質のいらないRNA-OUT選択ベクター及び細胞株は、それぞれ、国際特許出願WO2008153733、並びに相当する米国特許、欧州特許及びオーストラリア特許：US 2010/0303859；EP2333091；及びAU 2008262478に、より詳細に記載されており、それらは、それらが教示する全てについて、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。ナノプラスミド(商標)ベクター及び細胞株は更に、特許協力条約に基づく以下の国際特許に、より詳細に記載されている：PCT/US 13/000259；PCT/US 13/00067；及びPCT/US 13/00068(これらが教示する全てについて、その全体が参照により本明細書に取り込まれる)。
【０２２８】
理論に束縛されることは望まないが、一般的に、前記HRテンプレート中の不純物は、改変した細胞の編集効率及び／又は改変した細胞の生存率の低下をもたらすことがある。従って、使用するHRテンプレートは、検出限界に基づいて、不純物(例えば、HRテンプレートのDNA以外の任意の構成成分)を実質的に含まないか、又は混入物質を含まないようにすることがある。不純物としては、限定されるものではないが、精製プロセスに関連した不純物(例えば、バッファー由来の塩又は溶媒等)、前記HRテンプレート以外のDNA及び他の核酸、並びにHRテンプレートを生成するために使用した宿主細胞(例えば、大腸菌等のバクテリア細胞)の残留に由来する残留混入物質（例えば、エンドトキシン、残留宿主細胞のタンパク質、残留宿主細胞のRNA、残留宿主細胞のgDNA、及び残留宿主細胞の脂質又は炭水化物等）を挙げることができる。
【０２２９】
HRテンプレートの均一性(例えば、HRテンプレート以外のDNA及び他の核酸を含まない、そのHRテンプレートの純度)を、アガロース・ゲル電気泳動によって評価することができ、典型的には、純度が、アガロース・ゲル電気泳動によって評価した場合に、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも98%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の純度である場合、前記HRテンプレート以外のDNA及び他の核酸を実質的に含まないとみなすことがある。HRテンプレートは、アガロース・ゲル電気泳動によって評価した場合に、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、又は少なくとも99.9%の純度である場合、前記HRテンプレート以外のDNA及び他の核酸を実質的に含まないとみなすことがある。
【０２３０】
HRテンプレートにエンドトキシンがコンタミネーションしていることはリムルス変形細胞溶解物(Limulous amoebocyte lysate(LAL))アッセイによって評価することができ、1000 EU/mg未満、900 EU/mg未満、800 EU/mg未満、700 EU/mg未満、又は600 EU/mg未満が検出される場合、典型的には、エンドトキシンを実質的に含まないと考えることができる。HRテンプレートは、450 EU/mg未満、400 EU/mg未満、350 EU/mg未満、300 EU/mg未満、250 EU/mg未満、200 EU/mg未満、150 EU/mg未満、100 EU/mg未満、又は50 EU/mg未満が検出される場合、エンドトキシンを実質的に含まないと考えられる。HRテンプレートは、500 EU/mg未満が検出される場合、エンドトキシンを実質的に含まないと考えられる。
【０２３１】
残留宿主細胞のタンパク質は、マイクロBCAによって評価することができる。HRテンプレートは、前記組成物の5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1%未満、0.5%未満、又は0.1%未満で残留宿主細胞のタンパク質が含まれる場合、残留宿主細胞のタンパク質を実質的に含まないと考えられる。HRテンプレートは、前記組成物の2%未満で残留宿主細胞のタンパク質が含まれる場合、残留宿主細胞のタンパク質を実質的に含まないと考えられる。
【０２３２】
残留宿主細胞のRNAは、アガロース・ゲル電気泳動及びSYBRゴールドを使った染色によって評価することができる。HRテンプレートは、前記組成物の10%未満、7.5%未満、5%未満、2.5%未満、1%未満、0.5%未満、又は0.1%未満で残留宿主細胞のRNAが含まれる場合、残留宿主細胞のRNAを実質的に含まないと考えられる。HRテンプレートは、前記組成物の5%未満で残留宿主細胞のRNAが含まれる場合、残留宿主細胞のRNAを実質的に含まないと考えられる。
【０２３３】
残留宿主細胞のゲノムDNAは、qPCRで評価できる。HRテンプレートは、前記組成物の10%未満、7.5%未満、5%未満、2.5%未満、1%未満、0.5%未満、又は0.1%未満で残留宿主細胞のゲノムDNAが含まれる場合、残留宿主細胞のゲノムDNAを実質的に含まないと考えられる。HRテンプレートは、前記組成物の5%未満で残留宿主細胞のゲノムDNAが含まれる場合、残留宿主細胞のゲノムDNAを実質的に含まないと考えられる。
【０２３４】
プロセスに関連した不純物(例えば、バッファー由来の塩又は溶媒など)を、当該技術分野における公知の方法によって評価することができる。
【０２３５】
残留宿主細胞の脂質又は炭水化物は、当該技術分野における公知の方法によって評価することができる。
【０２３６】
HRテンプレートは、分光測定によって評価することができる。HRテンプレートは、分光測定によって、A260/A280比が1.8、1.8+/-.001、1.8+/-.01、又は1.8+/-.1と評価された場合、混入物質を実質的に含まないと考えられる。
【０２３７】
当該技術分野における公知の他のアッセイを使用して、HRテンプレートの純度を評価することができる。HRテンプレートは、当該技術分野における公知のアッセイによって評価した場合に、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の純度であることがある。HRテンプレートは、当該技術分野における公知のアッセイによって評価した場合に、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、又は少なくとも99.9%の純度であることがある。HRテンプレートは、当該技術分野における公知のアッセイによって評価した場合に、95%〜100%、96%〜100%、97%〜100%、98%〜100%、99%〜100%、99.5%〜100%、又は99.9%〜100%の純度であることがある。
【０２３８】
HRテンプレートは、限定されるものではないが、シリカ・カラムをベースにした精製、フェノール・クロロホルム抽出、クロマトグラフィー精製(例えば、HPLC)、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動(PAGE)精製、及びそれらの組み合わせ等を含む、当業者に公知の方法によって精製することができる。
【０２３９】
HDRの後に、ターゲット配列(「規定されたヌクレオチド配列」)を除去して、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位がもはや切断され得ないようにすることがある。例えば、HRテンプレート上にコードされる外因性のヌクレオチド配列は、所与のヌクレアーゼが切断するターゲット配列を欠失していることがある。
【０２４０】
HRアーム
導入する外因性の配列に関して、前記HRテンプレートの5'及び3'末端に見出される同一又は実質的に同一の配列(即ち、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列)は、一般にアーム(HRアーム)と呼ばれる。HRアームは、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と同一(即ち、100%同一)であることがある。いくつかの実施例におけるHRアームは、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と実質的に同一であることがある(例えば、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、又は少なくとも99.9%同一)。実質的に同一なHRアームを使用することができるが、100%未満の同一性を有するHRアームによって、前記HDR経路の効率が影響を受ける可能性があるので、HRアームが同一であることは、有利であることがある。
【０２４１】
HRアームは、一般的に、任意の長さとすることができるが、実務的な考慮事項（例えば、HRアームの長さ及び全体のテンプレート・サイズが全体的な編集効率に及ぼす影響等）も計算に入れることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列(即ち、5' HRアーム)は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが400塩基以上、長さが500塩基以上、長さが600塩基以上、長さが700塩基以上、長さが800塩基以上、長さが900塩基以上、長さが1000塩基以上、長さが1100塩基以上、長さが1200塩基以上、長さが1300塩基以上、長さが1400塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが1600塩基以上、長さが1700塩基以上、長さが1800塩基以上、長さが1900塩基以上、長さが2000塩基以上、であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列(即ち、5' HRアーム)は、長さが300塩基以上、であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列(即ち、5' HRアーム)は、長さが600塩基以上、であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列(即ち、5' HRアーム)は、長さが1000塩基以上、であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列(即ち、5' HRアーム)は、長さが2000塩基以上、であることがある。
【０２４２】
内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列(即ち、3’ HRアーム)は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが400塩基以上、長さが500塩基以上、長さが600塩基以上、長さが700塩基以上、長さが800塩基以上、長さが900塩基以上、長さが1000塩基以上、長さが1100塩基以上、長さが1200塩基以上、長さが1300塩基以上、長さが1400塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが1600塩基以上、長さが1700塩基以上、長さが1800塩基以上、長さが1900塩基以上、長さが2000塩基以上、であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列(即ち、3’ HRアーム)は、長さが300塩基以上、であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列(即ち、3’ HRアーム)は、長さが600塩基以上、であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列(即ち、3’ HRアーム)は、長さが1000塩基以上、であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列(即ち、3’ HRアーム)は、長さが2000塩基以上、であることがある。
【０２４３】
内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列の各々は、同じ大きさ又は異なった大きさであることがある。例えば、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列、及び内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、それぞれ、長さが600塩基以上、であることがある。
【０２４４】
内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域又は第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、切断部位(即ち、規定されたヌクレオチド配列)にすぐに隣接する内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と同一又は実質的に同一であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、それぞれ、切断部位(即ち、規定されたヌクレオチド配列)にすぐに隣接する内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と同一又は実質的に同一であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域又は第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、切断部位(即ち、定義されたヌクレオチド配列)から特定の間隔（例えば、それぞれから、1塩基対、2塩基対以下、3塩基対以下、4塩基対以下、5塩基対以下、6塩基対以下、7塩基対以下、8塩基対以下、9塩基対以下、10塩基対以下、15塩基対以下、20塩基対以下、50塩基対以下、又は100塩基対以下等）内の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と同一又は実質的に同一であることがある。内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域又は第2領域と同一又は実質的に同一のヌクレオチド配列は、切断部位から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20塩基対内の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の領域と同一又は実質的に同一であることがある。
【０２４５】
外因性の配列
遺伝子(例えば、目的の外因性の遺伝子)の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、一般的に、目的の任意の外因性のヌクレオチド配列であることがある。例えば、目的の外因性のヌクレオチド配列は、短い配列(例えば、長さが3〜100ヌクレオチド)であることがある。目的の外因性のヌクレオチド配列は、一塩基であることがある。更に、目的の外因性のヌクレオチド配列は、長い配列(例えば、長さが500〜3000ヌクレオチド)であることがある。目的の外因性のヌクレオチド配列は、ポリぺプチド配列をコードする又はノン-コードであることがある。更に、目的の外因性のヌクレオチド配列は、それが挿入されるとキメラ遺伝子を形成するように、細胞に挿入されることがある。例えば、外因性のレセプター部分は、編集後に、内因性の細胞内部分と動作可能的に連結した(例えば、シグナル伝達のために)外因性のレセプター部分を含むキメラ・レセプター・コーディング配列を生成するように、内因性レセプターのコーディング配列中にフレームが合うように挿入されることがある。
【０２４６】
いくつかの実施例において、遺伝子又はその一部は、タンパク質コーディング・ヌクレオチド配列(即ち、ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列)であることがある。一般的に、任意のタンパク質コーディング・ヌクレオチドを使用することができる。いくつかの実施例では、タンパク質コーディング・ヌクレオチド配列は、自己細胞治療(例えば、自己T細胞治療)に有用なタンパク質をコードする。いくつかの実施例において、タンパク質コーディング・ヌクレオチド配列は、限定されるものではないが、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、又は免疫チェックポイント阻害因子を含むことがある。タンパク質コーディング・ヌクレオチド配列、特に分泌タンパク質又は膜結合タンパク質は、シグナル・ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことがある。前記シグナル・ペプチドは、タンパク質コーディング・ヌクレオチド配列がコードするタンパク質に対して内因性であることがある。前記シグナル・ペプチドは、ヒト成長ホルモンシグナル・ペプチドのような、タンパク質コーディング・ヌクレオチド配列がコードするタンパク質に対して外因性であることがある。
【０２４７】
いくつかの実施例において、遺伝子又はその一部は、非-タンパク質コーディング・ヌクレオチド配列であることがある。一般的に、任意の非-タンパク質コーディング・ヌクレオチドを使用することができる。ある場合には、非-タンパク質コーディング・ヌクレオチド配列は、自己細胞治療(例えば、自己T細胞治療)に有用なヌクレオチド配列であることがある。ある場合には、非-タンパク質コーディング・ヌクレオチド配列は、限定されるものではないが、shRNA、siRNA、miRNA、及びlncRNA、を含むことがある。
【０２４８】
遺伝子の少なくとも一部(例えば、目的の外因性の遺伝子)をコードするヌクレオチド配列は、一般的に、任意のサイズであって良いが、実務的な考慮事項（全体的なテンプレートサイズ及び遺伝子サイズがその後の全体的な編集効率に及ぼす影響等）を計算に入れることがある。従って、ある特定の態様において、本願は、長さが100塩基以上の外因性の遺伝子を発現するように、特に非ウイルス的な送達方法を使用する場合、既に報告されているHR効率比よりも高いHR効率比（例えば、より高いパーセンテージの集団がポリヌクレオチド配列を組み込んでいる）で、ゲノム編集されている、又はゲノム編集されうる改変した細胞を提供する。改善されたHR効率比は、長さが100塩基以上の遺伝子に同様に当てはまる（例えば、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが500塩基以上、長さが600塩基以上、長さが750塩基以上、長さが1000塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、長さが3000塩基以上、又は長さが4000塩基以上の外因性の配列を導入する等）。遺伝子の少なくとも一部は、長さが1600塩基以上、であることがある。
【０２４９】
外因性の配列は、長さが100〜200塩基、長さが100〜300塩基、長さが100〜400塩基、長さが100〜500塩基、長さが100〜600塩基、長さが100〜700塩基、長さが100〜800塩基、長さが100〜900塩基、又は長さが100〜1000塩基であることがある。外因性の配列は、長さが100〜2000塩基、長さが100〜3000塩基、長さが100〜4000塩基、長さが100〜5000塩基、長さが100〜6000塩基、長さが100〜7000塩基、長さが100〜8000塩基、長さが100〜9000塩基、又は長さが100〜10,000塩基であることがある。外因性の配列は、長さが1000〜2000塩基、長さが1000〜3000塩基、長さが1000〜4000塩基、長さが1000〜5000塩基、長さが1000〜6000塩基、長さが1000〜7000塩基、長さが1000〜8000塩基、長さが1000〜9000塩基、又は長さが1000〜10,000塩基であることがある。
【０２５０】
外因性の配列は、長さが10塩基以上、長さが20塩基以上、長さが30塩基以上、長さが40塩基以上、長さが50塩基以上、長さが60塩基以上、長さが70塩基以上、長さが80塩基以上、長さが90塩基以上、又は長さが95塩基以上であることがある。外因性の配列は、長さが1〜100塩基、長さが1〜90塩基、長さが1〜80塩基、長さが1〜70塩基、長さが1〜60塩基、長さが1〜50塩基、長さが1〜40塩基、又は長さが1〜30塩基であることがある。外因性の配列は、長さが1〜20塩基、長さが2〜20塩基、長さが3〜20塩基、長さが5〜20塩基、長さが10〜20塩基、又は長さが15〜20塩基であることがある。外因性の配列は、長さが1〜10塩基、長さが2〜10塩基、長さが3〜10塩基、長さが5〜10塩基、長さが1〜5塩基、又は長さが1〜15塩基であることがある。外因性の配列は、長さが15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、115、120、125、150、175、200、225、又は250塩基、であることがある。外因性の配列は、長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14塩基であることがある。
【０２５１】
複数の外因性の配列を導入する実施例では、前記複数の外因性の配列は異なるサイズであってもよく、例えば、第1の外因性の配列は100塩基以上であってもよく、及び第2の外因性の配列は100塩基以上であってもよく、又は第1の外因性の配列は100塩基以上であってもよく、及び第2の外因性の配列は100塩基未満(例えば、長さが1〜100塩基の間)であってもよい。
【０２５２】
遺伝子の少なくとも一部は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれた後に発現することがある。
【０２５３】
いくつかの実施例では、前記HRテンプレートは、プロモーター配列をコードしない。
内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターが、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の発現を指示することがある、即ち、遺伝子の少なくとも一部は、内因性プロモーターが前記遺伝子の少なくとも一部に動作可能的に連結するように、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれる。例示的な実施例では、TCRをコードする外因性の配列は、内因性のTCRアルファのプロモーターがTCRに動作可能的に連結するように、TCRのゲノムの遺伝子座位(例えば、エクソンをコードするTCRアルファ定常領域)に、組み込まれていることがある。
【０２５４】
いくつかの実施例では、前記HRテンプレートは、遺伝子の少なくとも一部に動作可能的に連結した外因性プロモーター配列をコードする。外因性のプロモーターの実施例としては、限定されるものではないが、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルス由来の長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)由来プロモーター、2つのプロモーターが融合したもの、プロモーターの2つの部分が融合したもの、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTR プロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター・システム、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター・システム、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター・システムが挙げられる。外因性のプロモーターは構成的であることがある。外因性のプロモーターは、低分子(例えば、テトラサイクリン及び誘導体）によって、誘導可能であることがある。外因性のプロモーターは、ゲノム再構成(例えば、Cre-LoxP及びFLP-Frtシステム)後に活性化するプロモーター等、コンディショナルであることがある。外因性のプロモーターは、細胞型依存的であることがある（即ち、特定の細胞の集団において、発現を指示すること、のみ）。外因性のプロモーターは、ヒト等を含む哺乳動物であることがある。外因性のプロモーターはウイルス性であることがある。
【０２５５】
外因性の配列は、リンカー配列を有することがある。例えば、外因性の配列は、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の中に組み込まれた後に、遺伝子の少なくとも一部を内因性の配列に連結するリンカー配列を有することがある。リンカーは、切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードすることがあり、ここで、発現した後、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは、前記遺伝子の少なくとも一部のみがコードするポリペプチドが別個のポリペプチドとして産生されるように、切断される。切断可能なペプチドの例としては、フリン切断部位及びTEV切断部位、が挙げられる。いくつかの実施例において、切断可能なリンカーには、切断を更に促進するポリペプチド配列(例えば、フレキシブルなリンカー(例えば、Gly-Ser-Gly配列))が含まれる。別の実施例において、リンカーは、前記遺伝子の少なくとも一部だけがコードするポリペプチドが、翻訳の中で、別個のポリペプチドとして生成されるように、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)(例えば、T2A、E2A、P2A、及びF2A)をコードすることがある。別の実施例において、リンカーは、前記遺伝子の少なくとも一部だけがコードするポリペプチドが、翻訳の中で、別個のポリペプチドとして生成されるように、配列内リボソーム進入部位(Internal Ribosome Entry Site)(IRES)をコードすることがある。リンカーは、スプライス・アクセプター（例えば、ウィルスのスプライス・アクセプター等）をコードすることがある。
【０２５６】
前記HRテンプレートは、内因性のヌクレオチド配列とは異なるコドンである外因性のポリヌクレオチドをコードすることがある。例えば、コドンが異なる(codon diverged)配列は、コードされたタンパク質の発現が増加することを促進するために最適化されたコドンであることがある。コドンが異なる(codon diverged)配列は、組換えを促進する配列要素(例えば、組換えシグナル配列)のようなゲノム不安定性につながる可能性のある配列要素を除去するために、異なるものとしたコドンであることがある。
【０２５７】
複数シストロン性及び複数プロモーター・システム
外因性の配列は、複数シストロン性であることがある、即ち、2つ以上の別個のポリペプチドが、単一のmRNA転写物から産生されることがある。外因性の配列は、種々のリンカーを使用することを通して、複数シストロン性であることがあり、例えば、第1の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列に連結していることがある(例えば、5'から3'の方位で、第1の遺伝子:リンカー:第2の遺伝子)。例えば、リンカーは、切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードすることがある、ここで、発現した後、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは、第1の遺伝子及び第2の遺伝子がコードするポリペプチドが別々に生成されるように、切断される。切断可能なペプチドの例としては、フリン切断部位及びTEV切断部位が挙げられる。いくつかの実施例において、切断可能なリンカーには、切断を更に促進するポリペプチド配列(例えば、フレキシブルなリンカー(例えば、Gly-Ser-Gly配列))が含まれる。別の実施例では、リンカーは、第1の遺伝子及び第2の遺伝子がコードするポリペプチドが、翻訳の中で、別々に生成されるように、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)(例えば、T2A、E2A、P2A、及びF2A)をコードすることがある。別の実施例では、リンカーは、第1の遺伝子及び第2の遺伝子がコードするポリペプチドが、翻訳の中で、別々に生成されるように、配列内リボソーム進入部位(Internal Ribosome Entry Site)(IRES)をコードすることがある。リンカーは、スプライス・アクセプター（例えば、ウィルスのスプライス・アクセプター等）をコードすることがある。一般的に、複数シストロン性システムは、任意の数又は組合せのリンカー(例えば、上記のもの)を使用し、任意の数の遺伝子又はその部分を発現することがある(例えば、外因性の配列は、第1、第2、及び第3の遺伝子をコードすることがあり、各々は、第1、第2、及び第3の遺伝子がコードするポリペプチドを別々に生成するように、リンカーによって分けられている)。同じリンカーを複数を使用する複数シストロン性システムでは、前記リンカーは、同じポリペプチド配列をコードすることがあるが、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列であることがある。
【０２５８】
外因性の配列は、複数のオープン・リーディング・フレーム(ORF)を有することがある、即ち、外因性の配列から複数の別個のmRNA転写産物が生成することがある。外因性の配列は、複数のプロモーターを使用することによって、複数のORFを有することがある、例えば、第1のプロモーターが第1の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列に動作可能的に連結することがある、及び第2のプロモーターが第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列に動作可能的に連結することがある。本明細書中で使用する場合、「リンカー」は、上記の複数シストロン性のリンカー、のどれかを指し、上記の追加のORFに動作可能的に連結している追加のプロモーター、又は第1のポリペプチド配列及び第2のポリペプチド配列を連結するポリペプチド、の何れかをいうことがある。
【０２５９】
第2の遺伝子は、本明細書中に記載される外因性の配列のどれであっても良い(外因性の配列のセクションを参照のこと)。
【０２６０】
追加試薬
いくつかの実施例において、改変した細胞(又は改変されるべき細胞)を、HDR修復を促進する(即ち、相同性組換えの割合及び／又は効率を増大させる)（例えば、NHEJのような他のDNA修復経路と比較してHDR修復を促進すること等が含まれる）試薬と接触させることがある(例えば、培養することがある)。HDR修復を促進する試薬としては、限定されるものではないが、相同組換え修復経路の活性化因子、非-相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)修復経路の阻害因子、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２６１】
一般的に、本明細書に記載される細胞の改変及び編集の技術は、前記改変した細胞に対して、毒性があることがある(即ち、その生存率を低下させる)。従って、ある場合では、改変した細胞の生存率を増大させることができる試薬を提供することは、全体的な編集効率、特にHR編集効率にとって、有利であることがある。生存率を増加させることができる試薬には、TLR9核酸感知(nucleic acid sensing)経路、AIM2核酸感知(nucleic acid sensing)経路、IFI16核酸感知(nucleic acid sensing)経路、cGAS核酸感知(nucleic acid sensing)経路、及び細胞質核酸感知(nucleic acid sensing)経路の阻害剤などの核酸感知(nucleic acid sensing)経路等の阻害剤が含まれることがある。理論に束縛されることを望むものではないが、核酸感知(nucleic acid sensing)経路のこれらの阻害因子によって、種々の導入された(即ち、送達された)核酸(例えば、HRテンプレート及びsgRNA)に応答する細胞応答(例えば、自然免疫シグナル伝達経路)が減少することがあり、前記細胞応答が減少することによって、生存率が改善することがある。例示的な実施例において、生存率を増加させることができる試薬は、タンデム・リピートTTAGGGを有するアンタゴニストA151などのオリゴヌクレオチド・アンタゴニストであることがある。生存率を増加させることができる試薬には、生存因子(例えば、細胞の生存を促進する因子)を発現するようにT細胞を改変する等、細胞培養に提供されるもの以外の因子、例えば、Porttら(Biochim Biophys Acta.2011 Jan; 1813(1): 238-59)により詳細に記載されているものが含まれることがあり、それが教示する全てについて、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６２】
改変したT細胞
特定の態様では、改変した細胞は改変したT細胞である。一般的に、前記改変したT細胞は、それらがゲノム編集されているか、又はゲノム編集されうることがあるように、任意の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で改変されていることがある。前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、内因性のTCR遺伝子座位であることがある。内因性のTCR遺伝子座位は、TCR-アルファ遺伝子座位又はTCR-ベータ遺伝子座位であることがある。前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTA遺伝子座位などの免疫チェックポイント遺伝子座位であることがある。
【０２６３】
一般的に、前記改変したT細胞を、それらがゲノム編集されているか、又はゲノム編集されうることがあるように改変して、目的の任意の外因性の遺伝子を発現することがある。例えば、目的の外因性の遺伝子(「遺伝子の少なくとも一部」)は、TCR遺伝子の少なくとも一部(例えば、TCR-アルファ若しくはTCR-ベータ遺伝子、又はその一部)を含むことがある。TCR遺伝子は、TCR-アルファ遺伝子及びTCR-ベータ遺伝子の両方を含むことがある。TCR-アルファ遺伝子及びTCR-ベータ遺伝子を、リンカーによって連結することがある(複数シストロン性システムの上記に記載したリンカーを参照のこと)。TCR遺伝子は、TCR-ガンマ若しくはTCR-デルタ遺伝子、又はその一部を含むことがある。TCR遺伝子は、TCR-ガンマ及びTCR-デルタ遺伝子の両方を含むことがある。TCR遺伝子には、限定されるものではないが、マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR(domain swapped TCR)、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するのに最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、又は単鎖TCR、を含むことがある。TCR遺伝子は、以下の少なくとも一部を含むことがある：マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR(domain swapped TCR)、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するのに最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、又は単鎖TCR。TCR遺伝子は、内因性TCRポリペプチド配列と比較して、互いにより強く相互作用するように操作したTCR-アルファのポリペプチド配列及びTCR-ベータのポリペプチド配列のような、内因性TCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列と、より強く相互作用するように操作したTCR遺伝子、を含むことがある。
【０２６４】
特定の態様では、改変したT細胞は、以下を有する：a)TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；b)TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；c)第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列； d)第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列。ある実施例では、前記コードされているポリペプチド配列は、N末端からC末端の方向で、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。ある実施例では、前記コードされたポリペプチド配列は、N末端からC末端の方向で、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。
【０２６５】
TCR遺伝子は、MHC上に提示される疾患特異的なエピトープを認識するTCR(例えば、連結したTCR-アルファ及びTCR-ベータの構築物)であることがある。TCR遺伝子は、MHC対立遺伝子上に提示されるがん特異的なネオエピトープ(ネオ抗原)を認識するTCRのような、MHC対立遺伝子上に提示されるがん特異的なエピトープを認識するTCR(例えば、TCR-アルファ及びTCR-ベータ鎖の両方)であることがある。TCRによる認識とは、一般的に、TCRによる結合、又は複数のTCRによる結合の組み合わさり(即ち、TCRのクラスター化)によって免疫反応が導かれ得るように、十分な親和性をもって抗原-MHC複合体にTCRが結合することを指す。ネオエピトープ（特に患者特異的なネオエピトープ）を認識するTCRを同定するための方法及び組成物は、WO2018165475の中で詳細に記載されており、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。更に、ネオ抗原特異的なT細胞が患者サンプル中に存在するかどうかを同定するために有用な方法は、例えば、米国公開第2017/0003288号及びPCT/US17/59598号(それらの全体が参照により本明細書に取り込まれる)に記載されるような、本明細書中に記載される方法と組合せて使用することがある。
【０２６６】
一般的に、改変したT細胞は、任意のT細胞であって良い。改変したT細胞は、ヒトT細胞であることがある。改変したT細胞は、不死化T細胞又はex vivoで発生を進めたT細胞(例えば、胸腺の臓器培養物(organ culture)で発生を進めた細胞)のようなヒト由来のT細胞であることがある。改変したT細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、初代T細胞、腫瘍浸潤T細胞、又は操作したT細胞、であることがある。改変したT細胞は、調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞(例えば、Th1細胞、Th2細胞、又はTh17細胞)、アルファ-ベータT細胞、又はガンマ-デルタT細胞、であることがある。改変したT細胞は、ナイーブT細胞、幹細胞メモリーT細胞(stem cell memory T cell)、セントラル・メモリーT細胞(central memory T cell)、トランジショナル・メモリーT細胞(transitional memory T cell)、エフェクタ・メモリーT細胞(effector memory T cell)、又はエフェクターT細胞、であることがある。改変したT細胞は、初代T細胞であることがある。
【０２６７】
初代T細胞などの改変したT細胞は、がんを有していることが判明している、又は、そのような疑いがある対象などの対象から単離することがある。T細胞を単離する方法は、当業者に公知であり、限定されるものではないが、細胞表面マーカの発現に基づく選別技術(例えば、FACS選別)、ポジティブ単離技術(例えば、CD4及び／又はCD8 MACS(登録商標))、及びネガティブ単離(例えば、CD3 MACS(登録商標))、磁気単離、並びにこれらの組み合わせ、が含まれる。T細胞を単離するために使用する供給源としては、限定されるものではないが、血液、PBMC、アフェレーシスによって回収した血液(例えば、ロイコパック)、及び腫瘍組織が挙げられる。
【０２６８】
改変したT細胞は、ex vivoで培養したT細胞などの培養T細胞であっても良い。改変したT細胞は、対象から単離した初代T細胞などのex vivoで培養した初代T細胞であることがある。培養T細胞を、1種以上のサイトカインとともに培養することがある。培養T細胞を、IL2、IL7、IL15、又はそれらの組み合わせと共に培養することがある。例えば、培養T細胞をIL2と共に培養することがある。別の実施例では、培養T細胞をIL7及びIL15と共に培養することがある。別の実施形態では、培養T細胞をIL2、IL7、及びIL15と共に培養することがある。別の実施例では、培養T細胞を、IL2の非存在下(実質的にIL2を含まない)で、IL7及びIL15と共に培養することがある。別の実施例では、培養T細胞をIL21だけを、IL2、IL7、及び／又はIL15と組み合わせて(例えば、IL2と組み合わせて、IL7と組み合わせて、IL15と組み合わせて、又はIL7及びIL15と組み合わせて)培養することがある。培養T細胞を刺激することがあり、例えば、1種以上の刺激分子(例えば、レセプター・アゴニスト)で培養することがある。刺激分子としては。限定されるものではないが、CD3及びCD28が挙げられる。例えば、培養T細胞をCD3で刺激することがある(CD3刺激T細胞)。別の実施例では、培養T細胞をCD28で刺激することがある(CD28刺激T細胞)。別の実施例では、培養T細胞をCD3及びCD28の両方で刺激することがある(CD3及びCD28刺激T細胞)。刺激分子を、プレートの表面(プレート結合)又はビーズの表面(ビーズ結合)などの表面に固定化することがある。
【０２６９】
例示的な実施例では、改変したT細胞は、腫瘍抗原、ネオ抗原、腫瘍ネオ抗原、ウイルス抗原、ホスホ-抗原(phospho-antigen)、バクテリア抗原、微生物抗原、又はそれらの組み合わせなどの特異的なエピトープ(即ち、抗原)を認識するTCRを発現するように、ゲノム編集した初代T細胞であることがある。
【０２７０】
例示的な実施例では、改変したT細胞は、MHC対立遺伝子上に提示されるがん特異的なネオエピトープ(ネオ抗原)を認識するTCRのような、がん特異的なエピトープを認識するTCRを発現するように、ゲノム編集した初代T細胞であることがある。本明細書中で使用する場合、「ネオ抗原」という用語は、例えば、腫瘍細胞における変異又は腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾を介して、対応する野生型の親抗原とは区別される、少なくとも1つの変化を有する抗原である。ネオ抗原は、ポリペプチド配列又はヌクレオチド配列を含むことがある。変異には、フレームシフト又は非フレームシフトのインデル、ミスセンス若しくはナンセンス置換、スプライス部位の変化、ゲノム再構成若しくは遺伝子融合、又はneoORFを生じる任意のゲノム又は発現の変化が含まれることがある。変異にはまた、スプライス変異体が含まれることもある。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾には、異常なリン酸化が含まれることがある。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾にはまた、プロテアソームでスプライスされた抗原(proteasome-generated spliced antigen)が含まれることもある(Liepe et al., A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides: Science. 2016 Oct 21 ;354(6310):354-358.を参照のこと)。ネオ抗原を、対象に由来する腫瘍、ウイルス、又はバクテリアの配列データを解析することによって、選択し、1つ以上の体細胞変異を同定することがある(例えば、in silico 予測アルゴリズムを使用して配列データを解析すること)。予測アルゴリズムは、対象のネオ抗原とMHC対立遺伝子との間の結合を予測するためのMHC結合アルゴリズムであることがある。
【０２７１】
別の例示的な実施例では、改変したT細胞は、対象から単離し、及びゲノム編集して、対象のMHC対立遺伝子上に提示されたがん特異的なネオエピトープ(ネオ抗原)を認識するTCRのようながん特異的なエピトープを認識するTCRを発現する、初代T細胞であることがある。
【０２７２】
別の例示的な実施例では、改変したT細胞は、対象から単離し、及びゲノム編集をして、対象のMHC対立遺伝子上に提示されると予測されるがん特異的なネオエピトープ(ネオ抗原)を認識するTCRのような、がん特異的なエピトープを認識するTCRを発現する、初代T細胞であることがある。MHCによる提示を予測する方法は、当業者に公知であり、及び、限定されるものではないが、配列データを質量分析及びMHCによる提示の予測と組み合わせること(例えば、米国公開第2017/0199961号、これが教示することの全てが、参照により本明細書に取り込まれる)によって、及び配列データをMHCによる結合親和性の予測と組み合わせること(例えば、米国特許第9,115,402号、これが教示することの全てが、参照により本明細書に取り込まれる)によって、ネオ抗原を同定すること、が含まれる。
【０２７３】
別の例示的な実施例では、改変したT細胞は、対象に対して同種異系であり、及びゲノム編集をして、対象のMHC対立遺伝子上に提示されたがん特異的なネオエピトープ(ネオ抗原)を認識するTCRのような、がん特異的なエピトープを認識するTCRを発現する、初代T細胞であることがある。同種異系のT細胞は、改変したT細胞を投与した結果としての免疫原性が低下していることが所望される実施例におけるように、HLA型が決定され、対象に適合している(HLA適合)ことがある。ヒト白血球抗原(HLA)の型決定(typing)は、前記患者の腫瘍又は血中サンプルから決定することがある。ヒト集団において一般に見出されるHLAはまた、ネオ抗原の予測アルゴリズムに含まれていることもあり、例えば、コーカシアンにおけるHLA-A*02、24、01；HLA-B*35、44、51； DRB1*11、13、07；アフロ-ブラジリアン(afro-brazialians)におけるHLA-A*02、03、30；HLA-B*35、15、44； DRB1*13、11、03；及びアジア人におけるHLA-A*24、02、26；HLA-B*40、51、52；DRB1*04、15、09、である。HLA遺伝子座位に関する特定の対合であることもある。ヒト集団に見出される一般的な対立遺伝子は、Bardiらが更に報告しており(Rev Bras Hematol Hemoter.2012; 34(1): 25-30)、これは、それが教示することの全てが、参照により本明細書に取り込まれる。HLAの情報を、Fritsch et al、2014、Cancer Immunol Res、2:522-529の中で、より詳細に報告されているように（その全内容は参照により本明細書に取り込まれる）、MHC結合の予測アルゴリズムにおいて同定した推定されるネオ抗原ペプチド配列と一緒に利用することがある。
【０２７４】
改変した初代細胞
特定の態様では、改変した細胞は、改変した初代細胞である。一般的に、前記改変した初代細胞は、任意の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で、初代細胞がゲノム編集されているか、又はゲノム編集され得るように改変されている。一般的に、前記改変した初代細胞は、目的の任意の外因性の遺伝子を発現するように、初代細胞がゲノム編集されているか、又はゲノム編集され得るように改変されている。
【０２７５】
一般的に、改変した初代細胞は、任意の初代細胞であって良い。例示的な初代細胞としては、幹細胞、ヒト幹細胞、胚性幹細胞、及び免疫細胞(例えば、造血細胞)が挙げられる。免疫細胞の例としては、限定されるものではないが、B細胞、T細胞, 単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラー(NK)細胞が挙げられる。免疫細胞は、NK細胞であることがある。免疫細胞は、NK-T細胞であることがある。免疫細胞には、適応免疫系の及び／又は自然免疫系の細胞が含まれることがある。ヒト幹細胞等を含む幹細胞は、造血幹細胞であることがある。
【０２７６】
改変した初代細胞は、ヒト初代細胞であることがある。改変した初代細胞は、腫瘍浸潤初代細胞又は操作した初代細胞であることがある。改変した初代細胞は、初代T細胞であることがある。改変した初代細胞は、造血幹細胞(hematopoietic stem cell (HSC))であることがある。改変した初代細胞は、ナチュラル・キラー細胞であることがある。改変した初代細胞は、任意の体細胞であっても良い。
【０２７７】
改変した初代細胞は、例えば、がんを有していることが判明している、又は、そのような疑いがある対象などの対象から単離することがある。初代細胞を単離する方法は、当業者に公知であり、限定されるものではないが、細胞表面マーカの発現に基づく選別技術(例えば、FACS選別)、ポジティブ単離技術、及びネガティブ単離、磁気単離、並びにこれらの組み合わせ、が含まれる。
【０２７８】
改変した初代細胞は、ex vivoで培養した初代細胞などの培養初代細胞であることがある。改変した初代細胞は、対象から単離した初代細胞等の、ex vivoで培養した初代細胞であることがある。培養した初代細胞を、1種以上のサイトカインと共に培養することがある。
【０２７９】
相同組換え修復による細胞編集方法(Homology Repair Directed Cell Editing Methods)
ある態様において、細胞を遺伝的に改変するための方法が提供される。
【０２８０】
細胞を遺伝的に改変するための方法には、本明細書中に記載される任意のHRテンプレートを提供すること、本明細書中に記載される任意のヌクレアーゼ組成物を提供すること、本明細書中に記載される任意の細胞(例えば、T細胞、初代細胞、HSC、又はNK細胞)を前記HRテンプレート及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させること、並びに前記HRテンプレート及び前記ヌクレアーゼ組成物を細胞中に（特にウイルスを介した送達以外の送達方法によって）送達すること、が含まれることがある。前記接触させる工程は、前記細胞を前記HRテンプレート及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させる工程と前記送達する工程との間が、60分未満、45分未満、30分未満、20分未満、15分未満、10分未満、若しくは5分未満、又は1分未満であることがある。送達方法には、本明細書に記載されるCRISPRを介したシステムを送達することについて記載される方法の何れか（例えば、本明細書に記載されるRNP複合体を送達するための方法等）が、含まれることがある。上記のように、例えば、複数のHRテンプレート及び／又はヌクレアーゼ組成物を細胞に同時に送達するなど、複数のHRテンプレート及び／又はヌクレアーゼ組成物を、細胞中に送達することがある。
【０２８１】
理論に束縛されることを望むものではないが、一般的に(及びHRテンプレートの純度に関してのときに議論したように)、編集プロセスの過程で導入される不純物及び混入物質によって、改変した細胞の編集効率及び／又は改変した細胞の生存率が低下することがある。例えば、培養細胞に由来する残留培地によって、編集プロセスにおける不純物及び混入物質が導入されることがある。従って、細胞を遺伝的に改変する方法は、残留培地を最小限にするか又は排除するためにとる工程を含むことがある。
【０２８２】
例示的な実施例では、ヒト初代T細胞(例えば、ヒト対象から単離したT細胞)を遺伝的に改変するための方法には、完全なTCR(TCR-アルファ及びTCR-ベータの両方) をコードするHRテンプレート、TCR遺伝子座位(例えば、TCR-アルファの定常遺伝子座位)にターゲティングすることができるCRISPR RNP複合体、を提供すること、及びエレクトロポレーションを使用して、前記HRテンプレート及びRNP複合体を、T細胞中に送達すること、が含まれることがある。
【０２８３】
本明細書中に記載される改変した細胞の集団の何れかのような、改変した細胞の集団を生成し得る方法もまた、提供される。
【０２８４】
治療方法
ある態様では、治療するための方法も提供される。例えば、がん患者の治療方法が提供される。別の実施例では、非-機能的な遺伝子を機能的な遺伝子で置換するなど(例えば、ヘマグロビン症のためのHSC)、遺伝子を校正することがある(例えば、置換する、遺伝子治療又は遺伝子置換療法としても知られている)。前記発明にかかる前記方法には、治療有効量の改変した細胞（例えば、ゲノム編集した細胞(例えば、ゲノム編集したT細胞)）を投与することが含まれる。前記改変した細胞を、医薬組成物として製剤化することがある。これらの組成物には、1種以上の改変した細胞に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定化剤、又は当業者に周知の他の物質が含まれることがある。このような物質は非-毒性であるべきであり、活性構成成分の有効性を妨げてはならない。前記担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路(例えば、静脈内)に依存することがある。
【０２８５】
前記改変した細胞は、治療を施す対象に由来（例えば、単離）することがある（自己）。
【０２８６】
前記改変した細胞は、前記治療を施す対象に対して同種異系であることがある。同種異系の改変した細胞は、上記のように、前記治療を施す対象に対してHLA適合であることがある。
【０２８７】
改変した細胞を、単独で、又は他の治療と併用して、治療する症状に応じて、同時に又は連続しての何れかで投与することがある。
【０２８８】
ヌクレオチド組成物
本発明に有用な遺伝子（例えば、遺伝子、ベクター、外因性の配列、発現構築物、HRテンプレート）のポリペプチド及びヌクレオチド配列、を本明細書に記載する。本発明に有用なポリペプチド及びヌクレオチド配列は、本明細書中に記載される配列、又はデータベースへのアクセション番号によって本明細書中で参照する配列と、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも99.5%同一である。本発明に有用なポリペプチド及びヌクレオチド配列は、本明細書中に記載される配列、又はデータベースへのアクセション番号によって本明細書中で参照する配列と100%同一であることがある。
【０２８９】
「同一性パーセント」という用語は、2つ以上の核酸又はポリペプチドの配列において、以下に記載する配列比較のアルゴリズム(例えば、BLASTP及びBLASTN、又は当業者に利用可能な他のアルゴリズム)のうちの1つを使用して測定した場合に、又は目視検査によって測定した場合に、最も良く一致するように比較及びアライメントしたときの、2つ以上の配列又は部分配列に関する、同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージ、を指す。その使い方によっては、「同一性」パーセントは、比較対象の配列の領域にわたって（例えば、機能的ドメインにわたって）存在することがある、又は代わりに、比較対象の2つの配列の全長にわたって存在することがある。配列を比較するためには、典型的には、1つの配列が、試験配列と比較する参照配列としての役割をする。配列比較のアルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、部分配列の位置を指定し、及び配列アルゴリズム・プログラム・パラメータを指定する。次いで、配列比較のアルゴリズムによって、指定したプログラム・パラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが計算される。比較する配列を最適にアラインメントすることを、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所ホモロジーのアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジー・アライメントのアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性を検索する方法によって、これらのアルゴリズムをコンピューターで実行することによって(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中のGAP, BESTFIT, FASTA,及びTFASTA)、又は目視検査によって(一般的に、Ausubelらを参照のこと)、行うことがある。配列の同一性パーセント及び配列の類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムのある例はBLASTアルゴリズムであり、これは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)(<www.ncbi.nlm.nih.gov />)を通して公開入手可能である。
【０２９０】
ある態様において、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で相同組換えを指示する際に使用するヌクレオチド組成物(例えば、本明細書中に記載される任意のHRテンプレート)が提供される。
【０２９１】
一例では、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で相同組換えを指示する際に使用するヌクレオチド組成物(即ち、HRテンプレート)は、a)遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；b)内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及びc)前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、を含む、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、長さが100塩基である、前記ヌクレオチド配列の全てはシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、及び前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている。前記ヌクレオチド組成物は環状であることがある。
【実施例】
【０２９２】
下記は、本発明を実施するための特定の実施形態に関する実施例である。実施例は説明のためにのみ提供されるのであって、決して本発明の範囲を限定するためのものではない。使用する数及び順序(例えば、量、温度など)に関して、正確さを保証する努力をしてきているが、もちろん、いくらかの実験誤差及び偏差は許容されるべきである。
【０２９３】
特に明記しない限り、本発明を実施するには、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技術及び薬理学に関する従来の方法を、当該技術分野の範囲内で、使用する。このような技術は文献中に詳しく説明されている。例えば、以下を参照のこと、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A 及び B(1992)。
【０２９４】
実施例１：CRISPRを使用したT細胞編集の方法と材料
目的の遺伝子(即ち、「遺伝子の一部」)を内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込み、そしてそれを分析するために使用する方法及び材料を、以下に記載する。
【０２９５】
T細胞
PBMCを、標準的なフィコール単離方法に従って、血液から単離した(例えば、アフェレーシスによって回収したロイコパック)。単離したPBMCを、標準的なプロトコールに従って、アリコートにして凍結した。前記標準的なプロトコルの一部として、凍結したヒト末梢血の単核球細胞(PBMC)を解凍し、標準的な遺伝子編集のプロトコルの一部として培地(TexMACS、3%ヒトAB血清、サイトカインあり)で培養した。前記プロトコルを改変したものでは、凍結したPBMCを購入した(AllCells)。翌日、CD8及びCD4がポジティブなT細胞を、標準的な遺伝子編集のプロトコルの一部として製造業者のプロトコルに従い、磁気ビーズ(Miltenyi)を用いたポジティブ選択により富化した。前記プロトコルを改変したものでは、以下に示すように、CD3のネガティブ選択又はCD62Lのポジティブ選択を使用して、細胞を富化した。富化した細胞を、エレクトロポレーション手順(以下を参照のこと)の前に、48〜72時間、1:17.5の比率で、製造業者の推奨に基づいて、TransAct(CD3/CD28試薬、Miltenyi)を使用して刺激し、並びに培地(TexMACS、それぞれ12.5ng/mLのIL-7及びIL-15を含む3%ヒト血清)を用いて、並びに標準的な遺伝子編集のプロトコルの一部として培養した。
【０２９６】
患者／ドナーのPBMCを単離することを示す。患者アフェレーシスにより、ロイコパックの細胞を回収した。標準的な遺伝子編集のプロトコルの一部としては、次いで、前記ロイコパックを凍結し、その後、必要に応じて解凍した、又は改変したプロトコルでは、示したように2〜8℃に維持した(新鮮非凍結である)。翌日、CD8及びCD4がポジティブなT細胞を、プロディジー・プラットホーム(ミルテニー)を用いたポジティブ選択により富化した。富化した細胞を上記のように培養した。
【０２９７】
相同組換え(HR)テンプレート
ナノプラスミド(商標)(Nature Technology)を、記載のように使用した(「NTC」として記されるHRテンプレート)。ナノプラスミド(商標)は、Nature Technology社の商標である。抗生物質のいらないRNA-OUT選択ベクター及び細胞株は、それぞれ、国際特許出願WO2008153733、並びに相当する米国特許、欧州特許及びオーストラリア特許：US 2010/0303859；EP2333091；及びAU 2008262478に包含され、それらが教示する全てについて、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。ナノプラスミド(商標)ベクター及び細胞株は、更に、特許協力条約に基づく以下の国際特許：PCT/US 13/000259；PCT/US 13/00067；及びPCT/US 13/00068(それらが教示する全てについて、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる)、によって包含される。
【０２９８】
pUC57ベクターに由来するPBR322複製起点及びカナマイシン(Kan)抗生物質耐性マーカーを含有する標準的なプラスミドもまた、記載するように使用した(「pUCu」として示されるHRテンプレート)。前記抗生物質耐性マーカー及び前記複製起点以外、余分な配列を除去した。
【０２９９】
ここでは、精製したHRテンプレートは、購入するか(Nature Technology)、又は製造業者のプロトコル(Maxiキット、Macherey Nagel)に従い、標準的なDNA精製技術を用いて「イン-ハウス(in-house)」で精製した。
【０３００】
使用したHRテンプレートを表４に記載する。特に断りのない限り、提供する配列には、相同性アーム、遺伝子カセット、及びプラスミド骨格を有する、完全なHRテンプレートが含まれる。
【０３０１】
【表４−１】
2021501581.tif 000056
【表４−２】
2021501581.tif 000057
【表４−３】
2021501581.tif 000058
【表４−４】
2021501581.tif 000059
【表４−５】
2021501581.tif 000060
【表４−６】
2021501581.tif 000061
【表４−７】
2021501581.tif 000062
【表４−８】
2021501581.tif 000063
【表４−９】
2021501581.tif 000064
【表４−１０】
2021501581.tif 000065
【表４−１１】
2021501581.tif 000066
【表４−１２】
2021501581.tif 000067
【表４−１３】
2021501581.tif 000068
【表４−１４】
2021501581.tif 000069
【表４−１５】
2021501581.tif 000070
【表４−１６】
2021501581.tif 000071
【０３０２】
リボ核タンパク質(RNP)複合体
ヌクレアーゼとしてCRISPR spCas9(Aldevron、sNLS-SpCas9-sNLSヌクレアーゼ)を用いて、RNP複合体を生成した。sgRNAを化学的に合成し(Synthego)、エレクトロポレーション・バッファー中で600 μMのストック濃度から120 μMの作業濃度に希釈した。sgRNAをCas9タンパク質と1:6のCas9:sgRNAモル比で複合体化し、室温で少なくとも10分間インキュベートし、次いで使用するまで冷たく保った(4℃又は氷上)。
【０３０３】
目的のターゲット部位(即ち、内因性のゲノム・ターゲット内の規定したヌクレオチド配列)に対して向けられたgRNA配列を、同じヌクレオチド上にcrRNA及びtracrRNA配列の両方を含むsgRNAヌクレオチド骨格に組み込ませることにより、前記sgRNAを、設計した。本明細書で使用するsgRNAを、ホスホロチオエート結合を示す「(ps)」及び2'O-メチル塩基を示す「m」を使って、以下に提示する。
TRAC-1 sgRNA (配列番号(SEQ ID NO): 19):
[mG](ps)[mA](ps)[mG](ps)AAUCAAAAUCGGUGAAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC[mU](ps)[mU](ps)[mU](ps)U
TRBC-2 sgRNA (配列番号(SEQ ID NO): 20):
[mG](ps)[mG](ps)[mC](ps)UCUCGGAGAAUGACGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC[mU](ps)[mU](ps)[mU](ps)U
【０３０４】
エレクトロポレーション／ヌクレオフェクション
T細胞の遺伝子編集に使用したエレクトロポレーション条件を記載する一般的なプロトコールを以下にまとめる：
2021501581.tif 000072
注:20 μLのキュベットの代わりに100 μLのヌクレオフェクション・キュベット(カタログ番号V4XP-3012又はV4XP-3024)を使用してもよく、その場合、細胞の数、トランスフェクトした試薬の量、及び播種する体積の全てをスケールアップしなければならない。代替のエレクトロポレーション装置を使用することもある(それに応じて、バッファー及び体積を置き換える)。
手順：
1. 1 mLのT細胞培養培地(TexMACS、12.5ng/mLのIL-7及びIL-15をそれぞれ含む3%ヒト血清)を、48ウェルプレートの各ウェル(各サンプル及びコントロール[例えば、モック及びGFP]に十分なウェル、培地のみをプラス1、約10%エキストラをプラス)に添加することによって、サンプル・プレートを調製する。注：プロトコルを改変したものとして、以下に示すように、IL-7及びIL-15の代わりにIL-2を含む培地で細胞を培養した。
2. 完全に混合したら、1 mLの培地をウェルに分注する。そのプレートを37℃のインキュベーターに入れる。
3. ヌクレオフェクター・サプリメントをヌクレオフェクター液に加える(4.5:1)。
4. 記載するように、200 μLのストリップ・チューブ中でRNP複合体を組み立てる。モック(ヌクレオフェクション・バッファーのみ)及びヌクレオフェクション・コントロール (例えば、0.5 μgのGFPプラスミド)を入れる。
5. 適量のHR DNAを各チューブに添加する(典型的には0.2〜0.4 μg/μL)。
6. 数を数えるために、少量の細胞(例えば、セロメーター(cellometer)については20 μL)を取り、残りを適当なコニカル・バイアルに移し、細胞をスピン・ダウンする。
7. 室温で10分間、90×gで、細胞をペレットにする。
8. 細胞の数を数える。
9. ペレット化した細胞から上清を除去する。
10. 20 μLのヌクレオキュベットに、それぞれ50〜100万個の細胞が含まれるように、細胞ペレットの体積(1000万個の細胞について約15 μL)を考慮に入れながら、細胞を十分なヌクレオフェクター・バッファー中で再懸濁する。
11. 前記細胞を、サンプルを含む200 μLのストリップ・チューブに分配する。細胞を0〜45分、典型的には10分未満インキュベートする。
12. そのヌクレオフェクションの反応物をヌクレオキュベットに移す。
13. カバーを、カチッと嵌める。
14. 予め温めた培地を含むプレートを、インキュベーターから取り出す。
15. EO-115 プログラムを使用するように4Dユニットをプログラムし、その容器を適切な向き(A1上部がより大きな切り欠きになるように)で4D-Xに配置して、スタートボタンを押す。
16. 約100 μLの温めた細胞の培地を、前記プレートのそれぞれのウェルから前記ヌクレオキュベットのウェルにゆっくりと移す(100 μLキュベットについては500)。
17. 各ヌクレオキュベットから〜120 μL全てを、前記プレートのそれぞれのウェルに移す。
18. 前記細胞を、5〜11日間インキュベートし(即ち、7〜14日目に採取)、その後、解析をする(例えば、導入遺伝子の発現、ゲノムターゲティング、又は機能アッセイ(例えば、T細胞傷害又はサイトカイン産生))。(注： 24時間未満で、典型的に見られるノックアウトのフェノタイプ、24〜48時間で、典型的に見られるノックアウトのフェノタイプ、72時間後に安定化するフェノタイプ)
【０３０５】
フロー・サイトメトリー解析
フロー・サイトメトリーにより、目的の遺伝子の発現について、細胞を評価した。ZsGreen構築物については、前記ZsGreen構築物(GFP)の蛍光を評価した。TCRの発現については、細胞をTCRに特異的な抗体(抗ヒトTCRα/β抗体のクローンIP26ブリリアント・バイオレット510、Biolegend)を用いて染色した。CD3の発現については、細胞をCD3に特異的な抗体(クローンSK7、Biolegend)を用いて染色した。NK細胞の研究については、CD5(クローンUCHT2、Biolegend)及びCD56(クローン5.1H11、Biolegend)を使用した。
【０３０６】
特に断らない限り、T細胞を、FSC/SSC、一重項、生細胞(近赤外線染色)によってゲーティングを行い、次いで特異的なゲーティング(例えば、CD8、デキストラマーなど)によってゲーティングをした。示すところでは、蛍光色素分子-MHCトリマー・デキストラン複合体(「デキストラマー」とも呼ばれる)を用いて、抗原特異的なTCRによる認識を同定した。蛍光色素分子-MHCトリマー・デキストラン複合体は、Bethune, et al. (BioTechniques 62:123-130 Mar. 2017) 及び Bethune, et al. (eLife 5: 2016)に、より詳細に記載されている（それらが教示することは全てに関して、参照により本明細書にそれぞれ取り込まれる）。デキストラマーは、蛍光標識したストレプトアビジン(Life Technologies、Carlsbad、CA)を用いて調製した。抗原特異的なTCRによる認識に使用したペプチドは、以下の通りである：ELAGIGILTV(Mart-1 F5、配列番号(SEQ ID NO): 5)；YLTHRVDVI(Neo12、配列番号(SEQ ID NO): 6)；SLLMWITQV(NY-ESO 1G4、配列番号(SEQ ID NO): 7)。
【０３０７】
レンチウイルスの産生と形質導入
NY-ESO (1G4)及びMART-1(F5)TCRの構築物を、TCRa-F2A-TCRb-P2A-Myc271のフォーマットで、pCCLc-MNDベースのレンチウイルス・ベクター(Add遺伝子#81071)中にサブクローニングした。Myc271は、細胞外のcMycエピトープ・タグと融合したCD271(LNGFR)の膜貫通ドメイン及び一部を欠いた細胞外ドメインを含むキメラの形質導入マーカである。NY-ESO(1G4)及びMART-1をコードするレンチウイルスを、レンチウイルス・ベースのベクター及びそれらのパッケージング・ベクター(pMD2.G)を一過性にトランスフェクションすることにより、HEK-293T細胞で産生した。トランスフェクションの48時間後、ウイルスを収集し、0.45μmのシリンジ・フィルターを通して濾過し、感染させる目的に使用した。
【０３０８】
ヒトCD3+ T細胞を、上記のように、健常者ドナーのPBMCから単離し、サイトカインの存在下で、24時間刺激し、次いで、増殖させた。48時間後に、細胞を、ポリブレンを添加した250 μLの培地に、2x10^6個／ウェルで播種し、これに、500 μLの培地(モック条件)又は特定のウイルスの上清(pCCLc-MND-F5TCR-Myc271又はpCCLc-MND-1G4TCR-Myc271)を加えた。CD3+ T細胞を、ウイルスの存在下、800 g、90分、30℃で、ゆっくりと加速し、ブレーキをかけずに、遠心分離をした。遠心分離後、500 μLの培地を除去し、500 μLの新しい培地又は500 μLのウイルスを添加した。4日後、ヒトT細胞を、TCRの表面での発現に関して、アッセイした。表面での発現について試験するために、細胞を、すすぎ、FACSバッファー中の蛍光抗体及びpHLA多量体で染色し、フロー・サイトメトリーによって解析した。
【０３０９】
生存率解析
細胞数及び生存率を、Nucleocounter NC-200(ケモメティック(Chemometic))を用いて測定した。この装置は、サンプル液を吸引するピペットを内蔵するカセット（Via-2）を使用し、蛍光色素アクリジン・オレンジ(AO)及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)でサンプルを染色する。これらは、流体路を通ってカセットの読み取り窓に移動する際に、それぞれ、総細胞の集団及び死んだ細胞の集団を染色する。カセットを装置に装填し、PBMCサンプル用に設計したプロトコルを使用し、細胞数/mL(AO染料を取り込んだ細胞の数に由来する)の形式で総細胞数を測定し、DAPIマーカがポジティブである集団の分画から外挿される生存率から生細胞の集団(細胞数/mL)を計算する。
【０３１０】
この生存率アッセイのプロトコルを改変したものでは、下記のように、生存率を、アクリジン・オレンジ／ヨウ化プロピジウム(AOPI)及びセロメーター(Cellometer)(Nexcelom)を用いて評価した。
【０３１１】
ゲノム・ターゲティングの解析
2-対のプライマー（1対の上流ジャンクション(junction)をターゲティングするプライマー、及び1対の下流ジャンクションのプライマー）によるイン-アウト(in-out)PCR技術を用いて、TCRα遺伝子座位に目的遺伝子が正確にゲノム組み込みが行われていることを確認した。操作したT細胞について、イン-アウトPCRをした後に、正しい質量の2つの増幅配列を検出することによって、組み込まれたneoTCR配列カセットがTCRα遺伝子座位に正しく挿入されていることを確認した。
【０３１２】
イン-アウトPCR技術に用いたプライマーは、次のようなものであった
上流フォワード： TGCTAATCCTCCGGCAAACC (配列番号(SEQ ID NO): 1)
上流リバース： TTCTTCAACATCGCCAGCCT (配列番号(SEQ ID NO): 2)
下流フォワード： CAGCCATCTGTTGTTTGCCC (配列番号(SEQ ID NO): 3)
下流リバース： AGCTTTCTGGCGTCCTTAGAAT (配列番号(SEQ ID NO): 4)
【０３１３】
操作したT細胞からゲノムDNAを単離し、標準的なPCR技術を用いて、目的のゲノム領域を増幅し、PCR産物をゲル電気泳動により解析した。
【０３１４】
機能解析のためのT細胞／ターゲット細胞共培養
操作したT細胞(100,000個)を、種々の濃度の特定のペプチド(0.01〜1000 nMでの10倍連続希釈)でパルスした、HLA-A2を発現するターゲット細胞(25,000個)と共培養した(エフェクター対ターゲットの比4:1)。前記プロトコルを改変して、T細胞(50,000個)を、以下に示すように、エフェクター対ターゲットの比2:1で、HLA-A2を発現するターゲット細胞(25,000個)と共培養した。凍結乾燥したペプチド(Bio-Synthesis Inc, GenScript)をDMSO中で10 mMに再構成し、DMSOで更に希釈して1 mMの作業ストックとした。次に、1 mMの溶液から始めて、前記ペプチドを10倍連続希釈をし(9 μLのDMSO中に、1 μLの1 mM作業ストック)、これを0.01 nMに達するまで、行った。ターゲットのA2-K562細胞(1M個の総細胞/ペプチド濃度、1×106細胞/mL)を、15 mLのコニカル・チューブ中で、1μLのペプチド連続希釈物でパルスし、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、9mLの培地を各チューブに添加し、次いで1000 rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを10 mLの培地で1回洗浄し、次いで共インキュベーション実験として、4 mLの培地に再懸濁した。「ペプチドなし」又は「0ペプチド」の条件に対しては、ペプチドを使用しなかった。
【０３１５】
示すように、マッチしたペプチド-HLA(pHLA)及びミスマッチのペプチド-HLA(pHLA)を構成的に発現するターゲット細胞もコントロールとして用い、特異性を評価した。K562細胞への形質導入のマーカーとしてZsGreenを有するNeo12、MART1、又はNYESO1ペプチドを含むHLAペプチド分子をコードするレンチウイルス・ベクターを用いて、K562ターゲット細胞に形質導入した。発現したHLA(MHC)ペプチド分子は、Bethuneら(eLife 5: 2016)がより詳細に記載しているように（これが教示することは全て、本明細書に参照により取込まれる）、フレキシブルなGSリンカー及びジスルフィド・トラップ修飾を介して、抗原性ペプチド、β2-ミクログロブリン、及びHLA-A2ドメインが線状に構成するシングル・ポリペプチド(single polypeptide)鎖から構成されている。
【０３１６】
T細胞による細胞傷害の解析
T細胞及びターゲット細胞を、48時間、共培養した後、細胞を、Live/Dead細胞染色キット(Live/Dead Near IR viability stain for flow、cat# NC0584313、ThermoFisher)を用いて、暗所で4℃で20分間染色した。膜が損なわれた細胞では、前記色素は細胞内部及び細胞表面の両方において遊離アミンと反応し、強い蛍光染色が生じる。生存細胞では、前記色素の反応性が細胞表面のアミンに限定され、その結果、生じる蛍光はより弱くなる。強度の差異は、典型的には、生きている細胞と死んでいる細胞との間で50倍より大きく、容易に識別することができる。インキュベーションした細胞を洗浄後、eBioscience IC Fixationバッファー(ThermoFisher、cat# 00-8222-49)で固定し、フロー・サイトメトリーにより解析した。
【０３１７】
増殖解析
共培養する前に、操作したT細胞を、細胞増殖色素e450(ThermoFisher、cat# 65-0842-90)で予めラベルした。この蛍光色素は、第一級アミンを含む任意の細胞タンパク質に結合し、及び細胞が分裂するときに、前記色素は娘細胞間に等しく分配され、前記色素の蛍光強度は連続的に半減していくことが測定されることがある。共培養アッセイを、T細胞による細胞傷害のアッセイについて記載したように行った。T細胞及びターゲット細胞を、72時間、共培養した後、細胞をeBioscience IC Fixationバッファー(ThermoFisher、cat# 00-8222-49)で固定し、フロー・サイトメトリーにより解析した。
【０３１８】
サイトカイン産生解析
共培養の上清において、サイトカインの産生を、サイトカイン・ビーズ・アッセイ(CBA、 BD BioSciencesのBEAD-BASED IMMUNOASSAY)を使用して、評価した。CBAは、抗体被覆ビーズを使用して解析対象物を効率的に捕捉し、これによって、複数のタンパク質を同時に定量することを可能にした、フロー・サイトメトリー多重化ビーズ-ベースのイムノアッセイ・アプリケーションである。T細胞及びターゲット細胞を、24時間、共培養した後、上清を回収し、IFNγ、IL-2及びTNFαの分泌について解析した。
【０３１９】
実施例２：TCRα遺伝子座位へのレポーター遺伝子の組み込み
ZsGreenレポーターの構築物をTCRα遺伝子座位に組み込んだ。図１は、使用した一般的な編集の戦略を表す模式図である。簡単に述べると、一般的なTCRα遺伝子座へのターゲティング戦略は、1 kbの左側及び右側相同アーム(「HR arms」)に挟まれ、及びP2A配列によって隔てられた、プロモーターのないZsGreen及び一部を欠いたLNGRFコーディング配列、並びにZsGreen及びLNGRFのカセットをTCRα遺伝子座位の配列から隔てる5' P2A配列、を含む相同組換え修復テンプレートを、環状ナノプラスミド中にコードして用いた(配列番号(SEQ ID NO): 8参照)。図２は、ZsGreenを組み込ませるための、一般的な編集の時系列を示している。簡単に述べると、上記のように、PBMCを解凍し、初代ヒトT細胞をCD3ネガティブ選択を用いて単離し、抗-CD3/抗-CD28で刺激した。上記のように、内因性のTCRα遺伝子座位(TRAC遺伝子座位とも呼ぶ)をターゲティングするsgRNAを用いたリボ核タンパク質(RNP)複合体を、形成させた。ここで、前記sgRNAには、TRAC gRNAターゲティング配列GAGAATCAAAATCGGTGAAT (配列番号(SEQ ID NO): 21)が組み込まれている。上記のように、前記HRテンプレート、RNP複合体、及びT細胞を混合し、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞をIL-2(20ng/mL)を含む培地で培養した。
【０３２０】
前記ZsGreenレポーターはプロモーターを有さないので、正確なインフレームで融合した場合にのみ、シグナルを検出することが可能なはずである。加えて、前記TCRα遺伝子座位を適切にターゲティングすると、TCRαのノックアウト及びTCR複合体が表面で発現しなくなることが同時にもたらされる。実際に、図３で示すように、HRテンプレートとRNPの両方を含めた場合、ZsGreen-ポジティブ/TCR-ネガティブである細胞が、高い割合(22%以上)で検出された(図３右のパネル「KO-KI」)。注目すべきことに、全てのZsGreen-ポジティブはTCR-ネガティブでもあり、前記ZsGreenレポーターがTCRα遺伝子座位に適切に組み込まれていることが示唆された。コントロールとして、RNPが存在しない場合、バックグラウンドと見なされるレベルを上回る、ZsGreen-ポジティブ細胞又はTCR-ネガティブ細胞がもたらされることはなかった(図３左図)。試験した様々な条件下での編集効率を表５に数値で表す。
【０３２１】
【表５】
2021501581.tif 000073
【０３２２】
実施例３：TCRα遺伝子座位の戦略におけるネオ抗原特異的なTCRの組み込み
ネオ抗原特異的なTCR構築物(neoTCR)をTCRα遺伝子座位に組み込んだ。図４は、使用した一般的なターゲティング戦略を表す概略図を示す。簡単に述べると、一般的なTCRα遺伝子座位へのターゲティング戦略は、1kbの左側及び右側のHRアームに挟まれたneoTCRコーディング配列を含む相同組換え修復テンプレートを用いた。更に、内因性のTCRβ遺伝子座位が破壊されるので、neoTCR構築物がコードするTCR配列のみが発現することになる。前記一般的な戦略には、ナノプラスミド又はpUCuプラスミドである環状のHRテンプレートを用いることを適用した。
【０３２３】
前記ネオ抗原特異的なTCR構築物の設計を図５に概略する。前記ターゲティングTCRα遺伝子座位(「TRAC(Cα)」)をプラスミドHRテンプレートとともに示し、得られる編集配列と下流のmRNA/タンパク質産物を示す。前記ターゲティングTCRα遺伝子座位(内因性TRAC)及びそのCRISPR Cas9ターゲット部位(横縞、矢印で示す切断部位)を示す(図５Ａ、上パネル)。左側及び右側の相同アーム(それぞれ「LHA」と「RHA」)の間に位置する、neoTCRをコードするポリヌクレオチドを有する環状プラスミドHRテンプレートを示す(図５Ａ、下パネル)。コドンを最適化した、HRテンプレートによって導入されるTRACの領域を示す(縦縞)。TCRβ定常ドメインはTRBC2に由来し、TRBC1と機能的に同等であることが示されている。ネオTCRカセット中の他の要素には、2A = P2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)；F=上流のTCRβタンパク質から、2Aタグを除去する、2Aの上流のフリン切断部位；HGH =ヒト成長ホルモン・シグナル配列、が含まれる。neoTCR発現遺伝子カセットのHRテンプレートには、TCRαガイドRNAを有するCRISPR Cas9ヌクレアーゼRNPがターゲットとするTCRαゲノム遺伝子座位の中に、挿入することを指示する、2つのフランキング相同アーム(flanking homology arm)が含まれる。これらの相同アーム(LHA及びRHA)は、neoTCR発現遺伝子カセットのneoE特異的なTCR配列を挟んでいる。
【０３２４】
ゲノムに組み込まれると(図５Ｂ、上パネル)、前記neoTCR発現遺伝子カセットは、内因性のTCRαプロモーターからの単一のメッセンジャーRNAとして転写される。これには、その個々のT細胞に由来する内因性のTCRαポリペプチドの一部が依然として含まれる(図５Ｂ、中央パネル)。この単一のneoTCRメッセンジャーRNAをリボソームがポリペプチドに翻訳する間に、PACT neoTCR配列は、豚のテッショウウイルス-1に由来するP2Aリボソーム・スキップ配列での自己切断によって、内因性のCRISPR破壊TCRαポリペプチドから切り離される(図５Ｂ、下パネル)。コードされたneoTCRα及びneoTCRβのポリペプチドはまた、内因性である細胞性のヒト・フリン・プロテアーゼによる切断、及びneoTCR発現遺伝子カセット中に含まれる第2の自己切断P2A配列モチーフを介して、互いに切り離される(図５Ｂ、下パネル)。neoTCRα及びneoTCRβのポリペプチドは、シグナル・リーダー配列(ヒト成長ホルモンに由来する、HGH)によって小胞体へと別々にターゲットされ、多量体に集合化し、及びそのneoTCRタンパク質複合体がT細胞の表面に輸送される。前記フリン・プロテアーゼ切断部位が中にあることによって、上流のTCRβ鎖から2A配列が除去されることが促進され、TCRβの機能が阻害される可能性が減少する。各々の2Aの前にgly-ser-glyリンカーが中にあることによって(示さず)、3つのポリペプチドが別々になることは更に増強される。
【０３２５】
更に、3つの反復タンパク質配列はゲノム安定性を促進するために、HRテンプレート内で、コドンが異なる(codon diverged)。TCR遺伝子カセット内で、2つのP2Aはお互いに対してコドンが異なる(codon diverged)、並びに2つのHGHシグナル配列はお互いに対してコドンが異なる(codon diverged)、その結果、ex vivoで操作したT細胞のゲノム内に導入されたneoTCRカセット配列の安定性が促進される。同様に、TRACエクソン1の5'末端(縦縞)を再導入することにより、2つの直接反復の介在配列が取り除かれ、その結果、カセット全体が経時的に失われる可能性が減少する。
【０３２６】
図６は、neoTCR構築物を挿入するT細胞を編集するための、一般的な編集の時系列を示す。簡単に述べると、初代ヒトT細胞(新鮮非凍結又は凍結の何れか)を、上記のように、標準的な編集手順に従って培養した。TRAC gRNAターゲティング配列GAGAATCAAAATCGGTGAAT (配列番号(SEQ ID NO): 21)を有する、内因性のTCRα遺伝子座位(TRAC遺伝子座位とも呼ぶ)をターゲティングするsgRNAを用いて、リボ核タンパク質(RNP)複合体を、上記のように、形成させた。更に、TRBC gRNAターゲティング配列GGCTCTCGGAGAATGACGAG (実施配列番号(SEQ ID NO): 22)を有する、内因性のTCRβ遺伝子座位(TRBC遺伝子座位とも呼ぶ)をターゲティングするsgRNAを用いて、RNP複合体を、上記のように、形成させた。上記のように、前記HRテンプレート、RNP複合体、及びT細胞を混合し、エレクトロポレーションした。次いで、エレクトロポレーションしたT細胞(即ち、改変した細胞)を、上記のように、サイトカインの存在下で培養した。
【０３２７】
実施例４：NeoTCRの組み込み(MART-1)
MART-1 neoTCRをTCRα遺伝子座位に組み込んだ。標準的なエレクトロポレーションを介した編集方法に従ってT細胞を編集し、環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA(配列番号(SEQ ID NO): 9)がコードするMART-1 neoTCR構築物を挿入した。
【０３２８】
2-対のプライマー（1対の上流ジャンクション(junction)をターゲティングするプライマー、及び1対の下流ジャンクションのプライマー）によるイン-アウト(in-out)PCR技術を用いて、TCRα遺伝子座位にneoTCR構築物が正確にゲノム組み込みが行われていることを確認した。操作したT細胞について、イン-アウトPCRをした後に、正しい質量の2つのPCR増幅配列を検出することによって、組み込まれたneoTCR配列カセットがTCRα遺伝子座位に正しく挿入されていることを確認した。図７に示すように、プラスミドDNA HRテンプレート単独及びヌクレアーゼなし(「DNAのみ」)で処理した細胞については、組み込みは観察されなかった。上流ジャンクション(junction) (図７左側パネル)及び下流ジャンクション(junction) (図７右側パネル)の両方についての増幅産物は、TCRαヌクレアーゼ単独で(「KOKI」)、又はTCRα+TCRβヌクレアーゼを一緒で(「KOKI KO」)操作した細胞について観察された。従って、本結果は、適切な場合に、neoTCR構築物が適切に組み込まれていて、内因性のTCRβが破壊されていることを実証する。
【０３２９】
フロー・サイトメトリーによりMART-1 neoTCRの発現について、操作したT細胞を評価した。図８Ａに示すように、MART-1 neoTCRの発現は、小さい(20 μL、図８Ａの左下のパネル)編集フォーマット及び大きい(100 μL、図８Ａの右下のパネル)編集フォーマットの両方において、MART-1特異的なデキストラマー染色によって検出された。RNPなしのHRテンプレートのみを使用した場合(図８Ａの左上パネル)又はHRテンプレートなしのRNPのみを使用した場合(図８Ａの右上パネル)には、バックグラウンド・レベルのシグナルのみが検出された。同様の結果が、編集を行った後の様々な時点で見られた。編集を行った後4日目の遺伝子編集の結果を以下の表６に数値で表す。編集を行った後7日目の遺伝子編集の結果を以下の表７に数値で表す。編集を行った後10日目の遺伝子編集の結果を図８Ｂに示す。図８Ｂは、HRテンプレート及びRNP複合体の両方が提供された場合に、neoTCR(縞)が組み込まれていることを示す。このように、本結果は、HRテンプレート及びRNP複合体の両方が提供された場合に、neoTCR構築物がTCRα遺伝子座位中に組み込まれた後に適切に発現することを実証する。
【０３３０】
【表６】
2021501581.tif 000074
【０３３１】
【表７】
2021501581.tif 000075
【０３３２】
抗原特異的なサイトカイン産生について、操作したT細胞を評価した。図９に示すように、MART-1 neoTCRを発現する操作したT細胞は、MART-1のコグネイト・ペプチドを構成的に発現する(図９、「K562 HLA-A02/MART1」)、又はMART-1のコグネイト抗原ペプチドでパルスした(図９、「K562 HLA-A02 (10μM MART1)」)HLA-A02ターゲット細胞(K562)と共インキュベートした場合(E:T比率2:1)、IFNγ及びIL-2の両方を産生した。サイトカイン産生は、コグネイト・ペプチドでパルスしていないHLA-A02ターゲット細胞と共インキュベートをした場合(図９、「K562 HLA-A02」)、又は非コグネイトMHC HLA-A01を発現するターゲット細胞と共インキュベートした場合(図９、それぞれ、「K562 HLA-A01(10μM MART1)」及び「K562 HLA-A01」)、有意なレベルで観察されなかった。このように、MART-1 neoTCRを発現する操作したT細胞は、抗原特異的なサイトカイン産生を示した。
【０３３３】
抗原特異的な増殖及び抗原特異的なT細胞を介した傷害について、操作したT細胞を評価した。図１０Ａに示すように、ペプチド特異的なpHLAを発現する形質導入したK562ターゲット細胞は、小さい編集フォーマット(図１０Ａ、「MART-1」)又は大きい編集フォーマット(図１０Ａ、「MART-1（大）」)の何れかを用いて操作した、MART-1 neoTCRを発現するT細胞と共インキュベートした場合(E:T比率2:1)、ほとんど又は全く増殖を示さなかった。対照的に、ターゲット細胞は、単独でインキュベートした場合(図１０Ａ、「ターゲット細胞単独」)、又はモックの編集手順を行ったが、neoTCRを発現するようには操作しなかった(即ち、HRテンプレート又はRNP無しでエレクトロポレーションした) T細胞と共インキュベートした場合(図１０Ａ、「モック」)、増殖した。図１０Ｂに示すように、ターゲット細胞は、小さい編集フォーマット(図１０Ｂ、「MART-1」)又は大きい編集フォーマット(図１０Ｂ、「MART-1（大）」)の何れかを用いて操作したMART-1 neoTCRを発現するT細胞と共インキュベートした場合(E:T比率2:1)、傷害を受けた。対照的に、ターゲット細胞の死は、単独でインキュベートした場合(図１０Ｂ、「ターゲット細胞単独」)、又はモックの編集手順を行ったが、neoTCRを発現するようには操作しなかったT細胞と共インキュベートした場合(図１０Ｂ、「モック」)、最小であった。このように、MART-1 neoTCRを発現する操作したT細胞は、抗原特異的なターゲット細胞の傷害を示した。
【０３３４】
実施例５：エレクトロポレーション及び形質導入による編集効率の比較
標準的なエレクトロポレーションを介したHR編集の手順又はレンチウイルスによる形質導入の手順の何れかに従い、T細胞を操作して、TCRα遺伝子座位でneoTCRを発現するようにした。環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA (配列番号(SEQ ID NO): 9)がコードするMART-1 neoTCR構築物をエレクトロポレーションを介した編集に使用した。図１１に示すように、MART-1又はNY-ESO neoTCRの何れかを発現する操作したT細胞を、レンチウイルスによる形質導入の手順を使用して作成し(図１１、上パネル)、及びMART-1 neoTCRを発現する操作したT細胞を、小さい又は大きいフォーマットを用いたエレクトロポレーションを介したHR編集を用いて作成した(図１１、下パネル)。そうしたところ、エレクトロポレーションを介したHR編集により、レンチウイルスによる形質導入に匹敵するか又はそれより大きいパーセンテージの操作したT細胞が生成された。
【０３３５】
抗原特異的なT細胞を介した傷害について、操作したT細胞を評価した。図１２に示すように、コグネイト抗原性MART-1ペプチドであるMART-1 TCR(F5)を構成的に発現する(図１２、各群の下の棒)、又はパルスした（図１２、各群の下から２つ目の棒）HLA-A02ターゲット細胞は、HRを介した編集(図１２、「MART1 TCR HR」)又はレンチウイルスによる形質導入(図１２、「MART1 TCR レンチ」)の何れかを用いて操作したMART-1 neoTCR(F5)を発現するT細胞と共インキュベートした場合(E:T比率2:1)、同等に傷害を受けた。対照的に、非コグネイトNY-ESO TCRを発現するT細胞と共インキュベートした場合(図１２、「NY-ESO TCR レンチ」)、又はモックの編集手順を行ったが、neoTCRを発現するようには操作しなかったT細胞と共インキュベートした場合(図１２、「モック」)、ターゲット細胞の死は、最小であった。更に、コグネイト・ペプチドでパルスしていないHLA-A02ターゲット細胞と共インキュベートした場合(図１２、各群の中央の棒)、又は非コグネイトMHC HLA-A01を発現するターゲット細胞と共インキュベートした場合(図１２、各群の上2つの棒、10μM MART1でパルスした上から2つ目の棒)、バックグラウンド・レベルを超えた傷害は観察されなかった。以下の表８に、そのデータを数値で表す。このように、標準的なエレクトロポレーションを介したHR編集の手順又はレンチウイルスによる形質導入の手順の何れかに従い、meoTCRを発現するように操作したT細胞は、同等の傷害を示した。
【０３３６】
【表８】
2021501581.tif 000076
【０３３７】
実施例６：環状又は線状のHRテンプレートを用いた編集効率の比較
HRテンプレートとして、精製した環状プラスミドDNA及びPCRによって生成した線状dsDNAを使用することによるHRを介した編集の効率を、比較試験した。標準的なPCR産物(図１３Ａの上部)並びにヌクレアーゼから保護した5'末端(5'末端ホスホロチオエート骨格結合)を有するプライマーを使用して生成したPCR産物を使用して、標準的な線状dsDNA及び「セミ-プロテクトされた」線状dsDNAを生成した(図１３Ａの下部)。Neo12 neoTCRをTCRα遺伝子座位に組み込んだ。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、及び環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt (配列番号(SEQ ID NO): 13)又は線状HRテンプレートLinear_TRAC(1k)P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 12)のどちらかがコードするNeo12 neoTCR構築物を挿入して、T細胞を編集した。編集効率は、Neo12特異的なデキストラマー染色によって測定したときの、neoTCR(Neo12)を発現するT細胞の割合によって評価した。プラスミドDNAを使用することにより、ある範囲の濃度(本明細書に示す等しい質量)にわたって試験した場合であっても、線状のHRテンプレート(それぞれ、14.3%及び14.4%、図１３Ｂの中央の棒及び右の棒)と比較して、編集は有意により高いレベルとなった(47.3%、図１３Ｂの左の棒)。別の試験では、線状の共有結合的に閉じたDNA(dbDNA、Touchlight)を試験したところ、線状の開放末端であるPCR産物と同様のプロファイルを示した(データーは示さず)。従って、本結果は、線状HRテンプレートと同じHRターゲティング配列を持つ環状プラスミドDNA HRテンプレートは、線状のPCRで生成したDNAに比べて約3倍高い編集効率を有するという結論を支持する。
【０３３８】
実施例７：種々の供給源から生成した環状HRテンプレートの比較
種々の供給源から生成した環状HRテンプレートを使用して、標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順において、生存率を試験した。Neo12 neoTCRをTCRα遺伝子座位に組み込んだ。精製された形態で購入する(図１４「pUC57」、Nature Technology)、又はDNA精製キットを使ってイン-ハウス(in-house)で精製した(図１４「イン-ハウス(in-house)pUC57」、MaxiキットMacherey Nagel)、環状HRテンプレートpUCu-Kan TRAC(1k)_P2A.Neo12.TRBC2opt.f-P2A.TRA(Va) (配列番号(SEQ ID NO): 14)がコードするNeo12 neoTCR構築物を挿入することにより、T細胞を編集した。図１４に示されるように、T細胞は、細胞数で (図１４左パネル)、及び生存アッセイによって評価されるように(AOPI、図１４右パネル)、生存していて、イン-ハウス(in-house)で精製したHRテンプレートでは60%を超える生存率、及び購入したHRテンプレートでは80%を超える生存率、であった。
【０３３９】
注目すべきことに、これらの結果は、線状の産物と比較した場合にT細胞生存率の低下をもたらすものとして、エレクトロポレーションを介した編集における環状プラスミドHRテンプレートの使用を記載した、最近公表された報告(Rothら[Nature,2018 Jul;559(7714):405-409])と一致しない。
【０３４０】
実施例８：NeoTCRの組み込み(Neo12)
Neo12 neoTCRをTCRα遺伝子座位に組み込んだ。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、及び環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 13)がコードするNeo12 neoTCR構築物を挿入して、T細胞を編集した。操作したT細胞を、フロー・サイトメトリーによってNeo12 neoTCRの発現について評価した。Neo12 neoTCRの発現を、Neo12特異的なデキストラマー染色によって検出した。なお、使用したNeo12構築物は、それにpan-TCR抗体が結合しないように改変した。図１５に示すように、36.5%のT細胞がNeo12 neoTCRを発現し、内因性のTCRを発現していなかった(図１５右パネル)。更に、内因性のTCRの発現は、大多数のT細胞(96%)において、破壊されていた。モックの編集手順を行ったT細胞の場合、僅かにバックグラウンド・レベルのneoTCR発現シグナルが検出された(図１５左パネル)。
【０３４１】
環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 13)がコードするNeo12 neoTCR構築物を挿入して、更なる編集の実験も行った。操作したT細胞を上記のように評価した。図１６に示すように、74.5%のT細胞がNeo12 neoTCRを発現し、内因性のTCRを発現していなかった(図１６右パネル)。更に、内因性のTCRの発現は、大多数のT細胞(98.6%)において、破壊されていた。T細胞をモック処理した場合、僅かにバックグラウンド・レベルのneoTCR発現シグナルが検出された(図１６左パネル)。
【０３４２】
実施例９：種々のNeoTCRについてのNeoTCRの組み込み
種々のneoTCRをTCRα遺伝子座位に組み込んだ。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、及び環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 10)がコードするMART-1 neoTCR(F5)構築物、NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 13)がコードするNeo12 neoTCR(Neo12)構築物、又は環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA(配列番号(SEQ ID NO): 11)がコードするNY-ESO neoTCR(1G4)構築物の何れかを挿入して、T細胞を編集した。操作したT細胞を、neoTCR特異的なデキストラマー染色によるフロー・サイトメトリーにより、それぞれのneoTCRの発現について評価した。ここで使用したneoTCR構築物は、それにpan-TCR抗体が結合しないように改変したものである。図１７に示すように、T細胞の39.6%、36.5%、及び28.5%がそれぞれneoTCR MART-1(F5)、Neo12、及びNY-ESO(1G4)を発現しており、内因性のTCRを発現していなかった(それぞれ図17左、中央、右パネル)。更に、内因性のTCRの発現は、大多数のT細胞において破壊されていた(それぞれ97.9%、96%、及び86.6%)。従って、種々のneoTCRを用いたT細胞操作を行うと、一般的に、同様な編集効率となり、編集効率は、本明細書に記載のT細胞編集方法を使用して、種々のTCR発現構築物にわたって再現可能であるという結論が支持される。
【０３４３】
実施例１０：患者由来のT細胞におけるneoTCRの組み込み
種々のneoTCRを、健常者又は患者由来の何れかのT細胞(通常、Bio-options及びConversant Bioから入手したメラノーマ、大腸がん、及び肺がん)のTCRα遺伝子座位に組み込んだ。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、及び環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 10)HRテンプレートがコードするMART-1 neoTCR構築物、NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 13)がコードするNeo12 neoTCR構築物、又は環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA(配列番号(SEQ ID NO): 11)がコードするNY-ESO neoTCR構築物の何れかを挿入して、T細胞を編集した。操作したT細胞を、neoTCR特異的なデキストラマー染色によるフロー・サイトメトリーにより、それぞれのneoTCRの発現について評価した。
【０３４４】
図１８Ａに示すように、健常者サンプル又は患者サンプルに由来するT細胞は、Neo12及びMART-1構築物について同様の効率で編集を受けた。更に、編集効率は、試験した種々のneoTCR構築物にわたって同様であり、及びサンプル間で再現性のある編集効率が実証された。図１８Ｂに示すように、健常者サンプルに由来するT細胞は、75%に近い効率でNeo12 neoTCRが挿入され、編集を受けた。
【０３４５】
前記Neo12 neoTCRを更に試験し、編集効率の結果を表９に示す。特に、同様の編集効率が患者1由来のT細胞のデュープリケートのサンプルについて観察され(レプリカ#1について36.2%、及びレプリカ#2について36.4%)、更に、本明細書に記載するT細胞の編集方法の再現性が実証された。従って、本結果は、本明細書に記載するT細胞の編集方法が、種々の発現構築物に対して広く適用することができること、及び臨床場面で再現可能であること、の両方を実証する。
【０３４６】
【表９】
2021501581.tif 000077
【０３４７】
実施例１１：CD4 T細胞及びCD8 T細胞におけるneoTCRの組み込み
CD4 T細胞及びCD8 T細胞の編集効率を評価した。Neo12 neoTCRをTCRα遺伝子座位に組み込んだ。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、及び環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO):13)がコードするNeo12 neoTCR構築物を挿入して、T細胞を編集した。なお、ここで使用したNeo12構築物は、それにpan-TCR抗体が結合しないように改変した。CD8 T細胞の編集を、Neo12 neoTCRの発現により評価した(Neo12特異的なデキストラマー染色)。デキストラマー染色は、CD4 T細胞上のneoTCR分子を検出するのに十分な感度は無い。これは、MHCクラスI分子上に提示されているペプチドによると思われる。そして、CD8が存在しないのでMHC-I/TCR相互作用が安定化されることはない。従って、CD4 T細胞の編集は、pan-TCR抗体が結合しないCD3複合体を検出することによって評価した。図１９に示すように、CD8 T細胞及びCD4 T細胞の両方は、同様の効率で編集を受けた。従って、本結果は、本明細書に記載するT細胞の編集方法が種々のT細胞の集団に広く適用可能であること、を実証する。
【０３４８】
実施例１２：neoTCRの発現レベル
種々のneoTCRの表面発現レベルを、TCRα遺伝子座位に組み込んだ後に試験した。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt (配列番号(SEQ ID NO): 10)HRテンプレートがコードするMART-1 neoTCR構築物、NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 13)がコードするNeo12 neoTCR構築物、又は環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA(配列番号(SEQ ID NO): 11)がコードするNY-ESO neoTCR構築物の何れかを挿入して、T細胞を編集した。種々のneoTCR及び内因性のTCRの表面発現を、抗-CD3を使った染色によるフロー・サイトメトリーによって評価した。
【０３４９】
図２０に示すように、組み込まれたneoTCRの表面発現は、内因性のTCRの表面発現レベルに匹敵した。平均蛍光強度(Mean-fluorescent intensity (MFI))フローサイトメトリー・プロットによれば、同じ抗体(CD3)を用いて染色した内因性のTCR(図２０Ａ、左側ヒストグラム)及びNeo12 neoTCR TCR(図２０Ａ、右側ヒストグラム)は、大きく重さなった。試験した3つのneoTCR全てについて、計算したMFIを図２０Ｂで定量的に表す。それぞれは、内因性のTCRレベルに匹敵する表面発現を示す。従って、本結果は、本明細書に記載するT細胞の編集方法により、挿入された発現カセットをコードする完全なTCR(即ち、TCRα及びTCRβの両方)の表面発現が、内因性に匹敵するレベルで、もたらされること、を実証する。
【０３５０】
実施例１３：大きいフォーマットの非凍結T細胞におけるNeoTCRの組み込み
新たに単離したPBMC(即ち、凍結されていない)を、ロイコパックに回収し、プロディジー・プラットホーム(Prodigy platform)を用いてT細胞を回収した。環状HRテンプレートpUCu-Kan TRAC(1k)_P2A.Neo12.TRBC2opt.f-P2A.TRA(Va) (配列番号(SEQ ID NO):14)がコードするNeo12 neoTCR構築物を挿入することにより、T細胞を編集した。Neo12 neoTCRの発現を、Neo12特異的なデキストラマー染色によって検出した。
【０３５１】
図２１に示すように、41.6%のCD8ポジティブなT細胞がNeo12構築物を発現した。従って、本結果は、本明細書に記載するT細胞の編集方法が臨床場面に適用可能であること、を実証する。
【０３５２】
実施例１４：編集したT細胞は機能的である
T細胞の機能性について、編集したT細胞を評価した。より具体的には、ペプチドでパルスした(図２２に例示されている)、又はHLA複合体に予め形成されるペプチドを発現するように操作した(図２３に例示されている)、の何れかのターゲット細胞(HLA-A02を発現するK562細胞)を使用して、サイトカインの産生／分泌、T細胞の増殖、及び抗原特異的なターゲット細胞傷害に関して、T細胞を評価した。
【０３５３】
標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、及び環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 10) HRテンプレートがコードするMART-1 neoTCR構築物、NTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 13)がコードするNeo12 neoTCR構築物、又は環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.1G4.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA(配列番号(SEQ ID NO): 11)がコードするNY-ESO neoTCR構築物の何れかを挿入して、T細胞を編集した。
【０３５４】
記載のように、抗原特異的なT細胞を介した傷害について、操作したT細胞を評価した。図２４に示すように、ターゲット細胞は、T細胞と共インキュベートした場合、ターゲット細胞を、それらのそれぞれのコグネイト・ペプチドでペプチド濃度依存的な様式でパルスした場合(図２４、0〜1000ng/ml)、又はペプチド/HLA複合体を発現するように操作した場合(図２４、pHLA)、傷害を受けた(E:T比率4:1)。注目すべきことに、ペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞は、ほとんど完全に傷害をうけた。これは、ペプチドでパルスした細胞とは対照的である（おそらく、HLAが提示するパルス・ペプチドの一過性の性質に起因する）。これは、より生理学的に関連している状況(例えば、抗原ペプチドの非一過性の提示)により、高いレベルでの傷害がもたらされ得ることを示唆している。更に、T細胞の抗原特異的な傷害性はまた、Neo12発現T細胞とペプチド/HLA複合体を発現する操作したターゲット細胞とを共インキュベートして、アネキシンV細胞死アッセイを使用して、も実証された(E:T比率4:1、データーは示さず)。従って、操作したT細胞は、ターゲット細胞を抗原特異的に傷害すること、を示した。
【０３５５】
操作したT細胞を、記載するように、抗原特異的なT細胞増殖について評価した。図２５に示すように、Neo12発現T細胞は、Neo12コグネイト・ペプチドでペプチド濃度依存的にパルスしたターゲット細胞(図２５Ａ及び２５Ｂ、0〜1000ng/ml)、又はペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞(図２５Ｂ、pHLA)、と共インキュベートした場合、増殖した(E:T比率2:1)。図２５Ａは、図２５Ｂで算出される分裂細胞のパーセンテージで増殖することを示す、代表的なヒストグラム・プロットを示す。従って、操作したT細胞は、ターゲット細胞が提示するコグネイト・ペプチドと共インキュベートした場合、抗原特異的な増殖を示した。
【０３５６】
抗原特異的なサイトカイン産生について、操作したT細胞を評価した。図２６に示すように、Neo12発現T細胞は、Neo12コグネイト・ペプチドでペプチド濃度依存的にパルスしたターゲット細胞(図２６Ａ〜Ｄ、0〜1000ng/ml)、又はペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞(図２６Ａ〜Ｄ、pHLA)、と共インキュベートした場合、サイトカインを産生した(E:T比率4:1)。注目すべきことに、前記サイトカインのプロファイルによれば、Th1向炎症性サイトカインIFNγ、IL-2、TNFα、及び少量のIL-6(それぞれ図２６Ａ−Ｄに提示した)の産生が見られるが、Th2サイトカインIL-4又はIL-10の産生は見られなかった(データは示していない)。従って、操作したT細胞は、ターゲット細胞と共インキュベートした場合、抗原特異的な向炎症性のTh1サイトカインのプロファイルを示した。
【０３５７】
実施例１５：編集したドナー由来のT細胞は機能的である
ドナー由来のT細胞を、編集後のT細胞の機能性について、評価した。Neo12 neoTCRをTCRα遺伝子座位に組み込んだ。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、及び環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 13)がコードするNeo12 neoTCR構築物を挿入して、T細胞を編集した。neoTCR特異的なデキストラマー染色によるフロー・サイトメトリーによって、編集効率について、操作したT細胞を評価した。図２７Ａに示すように、健常者ドナーと患者ドナーに由来するT細胞は、同様の効率で編集を受けた。
【０３５８】
記載のように、抗原特異的なT細胞を介した傷害について、操作したT細胞を評価した。図２７Ｂに示されるように、ターゲット細胞は、健常者ドナー及び患者ドナーに由来する編集したNeo12発現T細胞と共インキュベートしたとき、ターゲット細胞を、それらのそれぞれのコグネイト・ペプチドでペプチド濃度依存的な様式でパルスした場合(図２７Ｂ、0〜1000ng/ml)、又はペプチド/HLA複合体を発現するように操作した場合(図２７Ｂ、「Neo12 HLA」)、傷害を受けた(E:T比率4:1)。注目すべきことに、非コグネイト・ペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞は、有意な傷害を示さなかった(図２７Ｂ、「MART1 HLA」)。更に、モックの編集手順を行ったT細胞を用いた場合には、傷害は観察されなかった。従って、操作した健常者ドナー由来及び患者由来のT細胞は、臨床場面での適用可能性を実証するターゲット細胞の抗原特異的な傷害、を実証した。
【０３５９】
操作した健常者及び患者ドナー由来のT細胞を、記載されているように、抗原特異的なT細胞増殖について評価した。図２７Ｃに示すように、Neo12発現ドナーT細胞は、Neo12コグネイト・ペプチドでペプチド濃度依存的にパルスしたターゲット細胞(図２７Ｃ、0〜1000ng/ml)、又はペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞(図２７Ｃ、「Neo12 HLA」)と共インキュベートした場合に、増殖した(E:T比率4:1)。注目すべきことに、非コグネイト・ペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞は、T細胞増殖を示さなかった(図２７Ｃ、「MART1 HLA」)。更に、T細胞にモックの処理をした場合、T細胞増殖は観察されなかった。従って、操作した健常者ドナー及び患者ドナー由来のT細胞は、コグネイト・ペプチドを提示するターゲット細胞と共インキュベートした場合、抗原特異的な増殖を示した。
【０３６０】
操作した健常者ドナー及び患者ドナー由来T細胞を、抗原特異的なサイトカイン産生について評価した。図２７Ｄに示すように、Neo12発現T細胞は、100nMのNeo12コグネイト・ペプチドでパルスしたターゲット細胞と共インキュベートした場合、サイトカインを産生した(E:T比率4:1)。注目すべきことに、前記サイトカインのプロファイルによれば、Th1向炎症性サイトカインIFNγ、IL-2、TNFα、及び少量のIL-6の産生が見られた。従って、操作した健常者ドナー及び患者ドナー由来T細胞は、ターゲット細胞と共インキュベートした場合、抗原特異的な向炎症性のTh1サイトカインのプロファイルを示した。
【０３６１】
注目すべきことに、操作したドナー由来のT細胞は、実施したアッセイの前に選別を行っておらず、これは、操作したドナー由来のT細胞が、更なる富化工程が無くても、機能的であること、を実証する。
【０３６２】
実施例１６：種々のneoTCRを発現するドナー由来T細胞は機能的である
編集後、T細胞の機能性について、T細胞を評価した。Neo12 neoTCR及びMART-1 neoTCRの両方を、TCRα遺伝子座位に組み込んだ。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、及び環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 10) HRテンプレートがコードするMART-1 neoTCR構築物、又はNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 13)がコードするNeo12 neoTCR構築物を挿入して、同じドナー由来のT細胞を編集した。neoTCR特異的なデキストラマー染色によるフロー・サイトメトリーによって、編集効率について、操作したT細胞を評価した。図２８Ａに示すように、同じドナーに由来するT細胞は、Neo12及びMART-1(「F5」)TCR構築物の両方について、同様の効率で編集を受けた。
【０３６３】
次いで、これらの操作したT細胞を、記載されているように、抗原特異的なT細胞を介した傷害について、評価した(4:1 E:T比率)。図２８Ｂに示すように、ターゲット細胞は、編集したNeo12発現T細胞(白四角)又はMART-1発現T細胞(黒四角)と共インキュベートしたとき、ターゲット細胞を、それらのコグネイト・ペプチドでペプチド濃度依存的にパルスした(0〜1000ng/ml)、又はペプチド/HLA複合体を発現するように操作した場合(「Neo12 HLA」及び「MART-1 HLA」)、傷害を受けた(E:T比率4:1)。注目すべきことに、非コグネイト・ペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞は、有意に傷害を受けなかった（即ち、Neo12 T細胞はMART1 HLA発現細胞に傷害を与えない、及びMART-1 T細胞(「F5」)はNeo12 HLA細胞に傷害を与えない）。操作したドナー由来T細胞を、記載するように、抗原特異的なT細胞増殖について評価した。図２８Ｃに示すように、Neo12(白四角)又はMART-1(黒四角)を発現するドナーT細胞は、それぞれのコグネイト・ペプチドでペプチド濃度依存的な様式でパルスした(0〜1000ng/ml)ターゲット細胞、又はペプチド/HLA複合体(「Neo12 HLA」及び「MART-1 HLA」)を発現するように操作したターゲット細胞と共インキュベートした場合に、増殖した(E:T比率4:1)。注目すべきことに、非コグネイト・ペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞は、T細胞増殖を示さなかった、即ち、Neo12 T細胞はMART1 HLA発現細胞と共インキュベートした場合には増殖しなかった、及びMART-1 T細胞(「F5」)はNeo12 HLA細胞と共インキュベートした場合には増殖しなかった。従って、操作したドナー由来T細胞は、コグネイト・ペプチドを提示するターゲット細胞と共インキュベートした場合、抗原特異的な増殖を示し、これは、複数のTCR構築物について、臨床場面で適用可能であることを示している。
【０３６４】
注目すべきことに、操作したドナー由来のT細胞は、実施したアッセイの前に選別を行っておらず、これは、操作したドナー由来のT細胞が、更なる富化工程が無くても、機能的であること、を実証する。
【０３６５】
実施例１７：編集したT細胞は機能的な活性を維持している
操作したT細胞の、培養を延長してもそれらの機能性を維持する性能、を評価した。Neo12 neoTCR及びMART-1 neoTCRの両方をTCRα遺伝子座位に組み込んだ。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 10) HRテンプレートがコードするMART-1 neoTCR構築物、又はNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO):13)がコードするNeo12 neoTCR構築物の何れかを挿入して、T細胞を編集した。
【０３６６】
図２９に示すように、Neo12及びMART-1の操作したT細胞は、同等な効率で製造した後14日目(図２９左側パネル)及び2ヶ月目(図２９右側パネル)において、抗原特異的な様式で、ターゲット細胞に傷害を与えることが可能であった。ターゲット細胞は、同じドナー由来である、Neo12(白丸)又はMART-1(黒丸)の何れかを発現する編集したT細胞と共インキュベートしたとき、ターゲット細胞を、それらのそれぞれコグネイト・ペプチドでペプチド濃度依存的な様式でパルスした(0〜1000ng/ml)、又はペプチド/HLA複合体(「Neo12 HLA」及び「MART-1 HLA」)を発現するように操作した場合、傷害を受けた(E:T比率4:1)。注目すべきことに、非コグネイト・ペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞は、有意に傷害を受けなかった（即ち、Neo12 T細胞はMART1 HLA発現細胞に傷害を与えない、及びMART-1 T細胞(「F5」)はNeo12 HLA細胞に傷害を与えない）。細胞を、IL7及びIL-15(抗原なし)を含む培地中に維持したところ、培養中において健常であった。従って、編集したT細胞は、延長した期間にわたって、TCRの発現及び抗原特異的な活性を維持し、臨床場面での適用可能性が示された。
【０３６７】
注目すべきことに、操作したT細胞は、実施したアッセイの前に選別を行っておらず、これは、操作したT細胞が、更なる富化工程が無くても、機能的であること、を実証する。
【０３６８】
実施例１８：編集したT細胞の特性評価
操作したドナー由来(健常者ドナー)T細胞を、編集後のT細胞の機能性について評価した。Neo12 neoTCR及びMART-1 neoTCRの両方を、TCRα遺伝子座位に組み込んだ。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、及び環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 10)HRテンプレートがコードするMART-1 neoTCR構築物、又はNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO):13)がコードするNeo12 neoTCR構築物を挿入して、T細胞を編集した。
【０３６９】
neoTCRを発現する操作したT細胞について、細胞毎に、単一細胞セクレトーム解析(single cell secretome analysis)を行った(Isoplexis)。Isoplexisプラットホームは、単一細胞の32-プレックスのサイトカイン・アッセイ・マイクロデバイス(単一細胞バーコード・チップ)を利用して、抗原特異的な刺激に対するT細胞の反応性を表す。CD4+ T細胞及びCD8+T細胞のサブセットを、抗CD4又は抗CD8マイクロビーズ(Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)を用いて分離した。CD4及びCD8細胞を、特定のペプチド／ターゲット細胞(10又は100nMの特定のペプチドでパルスしたターゲット細胞、又は特定のペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞、との共培養)、又は対照により、37℃、5% CO2で、1:2の比率で、19〜21時間、別々に刺激した。CD4+ T細胞又はCD8+ T細胞が存在することは、Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Cell Therapy Systems、Waltham、MA)をコンジュゲートさせた、抗CD4抗体又は抗CD8抗体を用いて、室温で10分間染色することによって確認し、リン酸緩衝生理食塩水で1回リンスし、及び1×106細胞/mLの密度で培地に再懸濁した。約30μLの細胞懸濁液を、単一細胞セクレトームの評価用の単一細胞バーコード・マイクロチップに装填した。それぞれのサンプルについて、32-プレックスのアッセイによって、〜2000個のT細胞からの分泌タンパク質を測定した。単一細胞バーコード・チップ上に負荷した細胞サンプルに関する顕微鏡の及びマイクロアレイ・スキャンの、並びにタンパク質分泌の生のデータを、Isoplexisソフトウエアを用いて、解析し、各々の個々の細胞がどのような組合せのタンパク質を分泌しているかを決定した。
【０３７０】
図３０に示すように、Isoplexis解析は、CD4 T細胞及びCD8 T細胞の両方に対して、多機能性プロファイルを示した。Neo12 neoTCRを発現する操作したT細胞(図３０Ａ)及びMART-1 neoTCR(「F5」)を発現する操作したT細胞(図３０Ｂ)について、CD4(左パネル)及びCD8(右パネル)のプロファイルを示す。CD8+T細胞は、Neo12 neoTCRのT細胞(図３０Ａ、右パネル)及びMART-1(“F5”)のT細胞(図３０Ｂ、右パネル)の両方について、約40%ほどの細胞が2種以上のサイトカインを産生し(この実験で編集されたTCRである細胞の%を表している、従って、編集したT細胞の全てが多機能性である)、用量依存性の多機能プロファイル（複数のサイトカインの分泌）を、示した。CD4の応答性は、CD8の応答性よりも弱く、これは、おそらくMHC-I/TCR相互作用を安定化するCD8が存在しないことによる。注目すべきことに、CD4+ MART-1 neoTCR(「F5」)T細胞は、ペプチドでパルスした(図３０Ｂ、左パネル「10nM」及び「100nM」)、又はMART-1ペプチド/HLA複合体を発現するように操作した(図３０Ｂ、左パネル「MART1 HLA」)、何れかのターゲット細胞を用いて抗原刺激をした後、多機能性プロファイルを示した。対照的に、CD4+Neo12 T細胞は、Neo12ペプチド/HLA複合体を発現するように操作したターゲット細胞で刺激した場合、多機能プロファイルを検出することが可能であったが(図３０Ａ、左パネル「Neo12 HLA」)、ペプチドでパルスしたターゲット細胞(図３０Ａ、左パネル「10nM」及び「100nM」)とインキュベートした場合には、サイトカイン産生を検出することができなかった。これもまた、おそらくMHC-I/TCR相互作用を安定化するCD8が存在しないためであろう。
【０３７１】
更に、図３０Ｃに示すように、操作したT細胞は、IFNγの全体的なレベルに対して最も大きく寄与するが(図３０Ｃ、左図)、本研究のneo12 neoTCR及びMART-1 neoTCR(F5)遺伝子の編集効率は約45%であったため(データは示さず)、IFNγを産生するT細胞の割合は編集を受けた細胞の数よりも少ない(図３０Ｃ、右パネル)。対照的に、TNFαを産生するT細胞の割合は、編集効率とより良く相関する、即ち、TNFの量(〜45%)は遺伝子編集の量(〜45%)と相関した。(図３０Ｃ、右パネル及びデータは示されていない)。このように、Isoplexisの結果によれば、操作したT細胞によるTNFαの分泌は、IFNγの分泌と比較して、それらのin vitro傷害活性のより良い予測因子である可能性があること、が実証された。
【０３７２】
このように、Isoplexis解析によれば、neoTCRを発現する操作した細胞の集団は、多機能性の活性を有することが実証され、重要なことに、抗原刺激が低い場合であっても、多機能性の活性を有していた(in vivo での有効性に対して重要な考慮事項である)。
【０３７３】
実施例１９：エレクトロポレーション・タイミング効果の効率
エレクトロポレーション前の、細胞とRNP複合体とのインキュベーション工程のタイミングを評価した。活性化したT細胞を採取し、遠心分離し、エレクトロポレーション・バッファー中に再懸濁した後、エレクトロポレーション及びその後の培養の前に、細胞をRNP複合体と混合し、室温で種々の時間(5、10、15、20、30、45、60分及び1分未満)静置した。細胞を、neoE特異的なデキストラマー染色による、編集を受けたT細胞のパーセントについてのフロー・サイトメトリーによって、及び細胞カウンターを使用する生存率%によって、解析した。生存率は、インキュベーション期間が45分以下で約20から約100%の範囲であったが、60分のインキュベーションでは、ほぼ0%であった(データは示さず)。正しく編集を受けたT細胞の割合(デトラマー+/内因性のTCR-)は、試験した全ての時間点に関して、20%を超えていた(データは示さず)。
【０３７４】
実施例２０：HSCの編集
ヒトHSC(HSPCとも呼ばれる)を編集してneoTCRを挿入した。HSCを編集するための一般的なワークフローを図３１に示す。単離したHSC(CD34+細胞)CD34+細胞を、刺激前の培地(pre-stim media)中で48時間培養した(X-VIVO +50ng/ml SCF、TPO、FL-3L及び20ng/mlのIL-3)。ヌクレオフェクションを、以下の表１０に記載した条件を用いて実施した。エレクトロポレーションした細胞(即ち、改変した初代細胞)を、BBMM培地(IMDM、20% FBS、35% BSA、IL3 5ng/ml、IL6 10ng/ml、SCF:25ng/ml)中に播種し；培地を定期的に交換し、ヌクレオフェクションの16日後に細胞を回収した。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO):13)がコードするNeo12 neoTCR構築物を挿入して、T細胞を編集した。
【０３７５】
【表１０】
2021501581.tif 000078
【０３７６】
編集を評価するために、gDNAを抽出し、そしてイン及びアウトPCRを行った。図３２に示すように、群5、6、7、及び10は、正確に組み込まれたことを示す、1Kbの増幅PCRバンドを示した。このように、HSCは、TCRα遺伝子座位で正確に編集を受けた。
【０３７７】
HSCにおける編集を更に評価するために、上記にように、1kbの左側及び右側の相同アーム(「HRアーム」)に挟まれ、及びP2A配列によって隔てられた、MNDプロモーターによって駆動するZsGreen遺伝子及び一部を欠いたLNGRFコーディング配列を含み、環状プラスミド（pUCu-Kan TRAC(1k)_MNDZsGreen.f-P2A.LNGFRt.P2A；配列番号(SEQ ID NO):15）の中にコードした、HRテンプレートを4μg使用して、編集手順を行った。HSC(0.4×106))を、1.13pmolのRNP(Cas9/sgRNA)を使用して、20μL中、プログラムEK100を使用してエレクトロポレーションした。明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡によって評価したところ、14日目のメチルセルロース・コロニーはZsGreenを発現していた(データは示さず)。
【０３７８】
実施例２１：HRアーム長編集
MART-1 neoTCRをTCRα遺伝子座位に組み込んだ。標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、及び300塩基対、600塩基対、1000塩基対(標準)、又は2000塩基対を含むHRアーム長である環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.F5.TRBopt.f-P2A.TRAopt.BGHpA がコードするMART-1 neoTCR構築物を挿入して、T細胞を編集した。
【０３７９】
MART-1 neoTCRの発現について(MART-1特異的なデキストラマー染色)、及び内因性のTCRの発現が無くなることについて、フロー・サイトメトリーにより、操作したT細胞を評価した。表１１にまとめたように、正確に編集を受けたT細胞を生成することについての編集効率(デキストラマー+/内因性のTCR-)は、試験した全てのアーム長について17.6%以上であった、及び試験した600塩基対以上の全てのアーム長について20%以上であった。
【０３８０】
【表１１】
2021501581.tif 000079
【０３８１】
実施例２２：A151阻害因子は生存率を改善する
標準的なエレクトロポレーションを介した編集手順に従って、環状HRテンプレートNTC9385R-TRAC(1k)DTS_P2A.neo12.TRBopt.f-P2A.TRA(Va)opt(配列番号(SEQ ID NO): 13)がコードするNeo12 neoTCR構築物を挿入して、T細胞を編集した。Neo12 neoTCRの発現について、操作したT細胞を、フロー・サイトメトリーによって評価した。Neo12 neoTCRの発現を、Neo12特異的なデキストラマー染色によって検出した。なお、ここで使用したNeo12構築物は、それにpan-TCR抗体が結合しないように改変した。
【０３８２】
T細胞を、種々の濃度のA151を添加したプレ-インキュベーションをして、編集した。表１２にまとめたように、正しく編集されたT細胞を生成するための編集効率(デキストラマー+/内因性のTCR-)は、A151の場合、有意に変化しなかったが、細胞生存率(細胞の数により評価した)は0.1μM又は10μMのA151の添加で改善した。
【０３８３】
0.1μM A151を編集工程の種々の段階で添加して、T細胞を編集した。表１３にまとめたように、正しく編集されたT細胞を生成するための編集効率(デキストラマー+/内因性のTCR-)は、試験した種々の段階でのA151で、有意に変化しなかったが、編集した細胞の細胞生存率(編集した細胞の数によって評価した)は、RNP及び細胞をプレ-インキュベーションしている間にA151を添加すること、並びにプレ-インキュベーション及びポスト-エレクトロポレーションの間の両方でA151を添加することによって、改善された。
【０３８４】
【表１２】
2021501581.tif 000080
【０３８５】
【表１３】
2021501581.tif 000081
【０３８６】
実施例２３：腫瘍モデルにおける操作したT細胞の有効性
特異的なネオ抗原及びHLA分子を発現するヒト腫瘍細胞（例えば、特異的な抗原及びHLAを構成的に発現するように形質導入したK562、又は特異的なネオ抗原及び適合したHLAを内因的に発現する初代ヒト腫瘍細胞等）に対して、TCRを操作したヒトT細胞のin vivoでの有効性を評価した。腫瘍細胞(1×106個又は3×106個)を、8週齢のNSGマウス(Jackson Laboratory)の側腹の皮下に接種する。腫瘍の増殖を、1週間に2〜3回(キャリパーを使用して)腫瘍寸法を測定することによってモニターする。(長さ × 幅2)/2 の計算式により、腫瘍サイズを算出する。腫瘍の大きさが〜100mm3に達したら、マウスに、1×106個若しくは5×106個のTCRを操作したヒトT細胞(処置群)、又はPBS若しくはモックのT細胞(RNP若しくはHRテンプレート無しでエレクトロポレーションした)コントロール群を投与する。腫瘍の増殖を経時的にモニターし、腫瘍の大きさが2000 mm3に達したらマウスを安楽死させる。初期の時点で(T細胞を投与した4〜7日後)、各群のマウスのコホートをサクリファイス(sacrifice)する。血液、脾臓及び腫瘍を採取する。編集したヒトT細胞が血中に存在することを、qPCR及びフロー・サイトメトリーにより評価する。腫瘍中に編集したヒトT細胞の存在すること／浸潤していることを、qPCR、フロー・サイトメトリー及び免疫組織化学により評価する。
【０３８７】
本結果は、ヒト腫瘍細胞に対して、TCRを操作したヒトT細胞のin vivoでの有効性が評価されること、を実証する。
【０３８８】
実施例２４：NKの編集
ヒト・ナチュラル・キラー細胞(NK細胞)を、TCRα遺伝子座位にZsGreenレポーター構築物を組み込んで編集した。NK細胞を、まずCD4/CD8のポジティブ選択による単離(Miltenyi、CliniMACS)の際、フロー-スルーを回収することにより分離した。単核細胞をフィコールを用いて単離し(標準的な手順)、次いでNK細胞をNK細胞単離キット(Miltenyi)を用いて特異的に単離した。単離したNK細胞(1×106)を、NK MACS完全培地(Miltenyi)、5% hABS(Valley Biomedical)、200 ng/mL IL-2(Miltenyi)、12.5 ng/mL IL-15(Miltenyi)、及びMiltenyi NK活性化ビーズ(製造業者の説明書に従って5 uLビーズ/106個の細胞)を含む培養中で、活性化した。活性化後3日目に、活性化したNK細胞(3x106)を下表１４にあるパラメータの概要に従って、100 μLの体積で、エレクトロポレーションした。1kbの左側及び右側の相同アーム(「HRアーム」)に挟まれ、及びP2A配列によって隔てられた、MNDプロモーターによって駆動するZsGreen遺伝子及び一部を欠いたLNGRFコーディング配列、を含む相同組換え修復テンプレートを、環状プラスミド(pUCu-Kan TRAC(1k)_MNDZsGreen.f-P2A.LNGFRt.P2A；配列番号(SEQ ID NO):15))の中にコードした。
【０３８９】
群を、4、7及び11日目に、フローサイトメトリーによって、GFP発現について評価した。表１４にまとめるように、ZsGreenの発現は、4日目には見られた(群12及び13)。11日目までに、20%を超える細胞が、プログラムEN-138及びEK-100(群11、12、14、及び15)を使用して、ZsGreenを発現していた。11日目(群12)でのZsGreenの発現を示す代表的なプロットを図３３に示す。
【０３９０】
イン-アウトPCR技術を用いて組み込みに対する分子的な解析を行い、TCRα遺伝子座位に、前記発現構築物が正確にゲノム組み込みが行われていることを確認した。前記PCRは、先のTCR組み込み解析で使用した上流フォワード・プライマーを使用し(配列番号(SEQ ID NO): 1)、一方、MND挿入に対する特異的な上流リバース・プライマーは、リバース・プライマー(AGGGTCATTTCAGGTCCTT、配列番号(SEQ ID NO): 23)（編集したT細胞由来のgRNAを使用したポジティブ・コントロールを除く）及び、そのそれぞれのリーバス・プライマー(配列番号(SEQ ID NO): 2)を使用した。表１４にまとめ、図３４に示すように、群11〜18では、正確に組み込まれたことを示す1Kbの増幅したPCRバンドが見られた。従って、NK細胞は、TCRα遺伝子座位で正確に編集されている。注目すべきことに、PCRバンドの強さは、ZsGreenを発現する細胞の割合と相関していた（即ち、ZsGreenが最も高いパーセンテージであるサンプルは、最も明るいPCRバンドを生成した）。
【０３９１】
【表１４】
2021501581.tif 000082
【０３９２】
実施例２５：初代細胞の編集
上記の手順に従って、初代細胞の編集を行う。前記手順（限定されるものではないが、エレクトロポレーション条件及び試薬の変更を含む）は、特に編集対象の初代細胞に応じて調整する。初代細胞には、幹細胞、ヒト幹細胞、胚性幹細胞、及び免疫細胞が含まれる。免疫細胞の例としては、限定されるものではないが、B細胞、T細胞, 単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラー細胞が挙げられる。
【０３９３】
追加の実施形態及び参考文献の組み込み
本発明を、好ましい実施形態及び様々な代替的な実施形態を参照しながら、具体的に示し、説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更を行うことができることが、当業者には理解されよう。
【０３９４】
本明細書の本文内で引用した全ての参考文献、発行済み特許及び特許出願は全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変した細胞、前記改変した細胞は以下を含む：
外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドであって、前記外因性のヌクレオチド配列は以下を含む：
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、並びに、
ここで、前記改変した細胞は実質的にウイルスを介した送達の構成成分を含まない。
【請求項２】
T細胞を含む改変した細胞、前記T細胞は以下を含む：
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
c)  第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
d)  第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、内因性のTCR-アルファの遺伝子座位の中に組み込まれている、
前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、各々のポリペプチド配列をシングル・ポリペプチド(single polypeptide)として発現することができるように配向されている、ここで、前記第2リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列と前記TCR-ベータのポリペプチド配列との間に位置する、
前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドは、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列がそれぞれ別個のポリペプチドを形成するように、前記T細胞中で切断され得る切断可能なリンカーのポリペプチドである、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に会合して機能的なTCRを形成することができる、
ここで、前記改変した細胞は、実質的にウイルスを介した送達の構成成分を含まない、並びに、
ここで、内因性のTCR-ベータ遺伝子座位は破壊されている。
【請求項３】
請求項１に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む、ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含む、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれている、並びに前記組み込まれたヌクレオチド配列は、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の規定したヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【請求項５】
T細胞を含む改変した細胞、前記T細胞は以下を含む：
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
c)  第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
d)  第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、内因性のTCRの遺伝子座位の中に組み込まれている、
前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、各々のポリペプチド配列をシングル・ポリペプチド(single polypeptide)として発現することができるように配向されている、ここで、前記第2リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列と前記TCR-ベータのポリペプチド配列との間に位置する、並びに
前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドは、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列がそれぞれ別個のポリペプチドを形成するように、前記T細胞中で切断され得る切断可能なリンカーのポリペプチドである、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に会合して機能的なTCRを形成することができる。
【請求項６】
請求項５に記載の改変した細胞、ここで前記改変した細胞は、外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記外因性のヌクレオチド配列は、以下を含む： 
a)  前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、並びに前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、をコードするヌクレオチド配列；
b)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに
前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のTCR遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、実質的にウイルスを介した送達の構成成分を含まない。
【請求項８】
請求項５〜７の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、前記内因性のTCR遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を更に含む。
【請求項１０】
請求項９に記載の改変した細胞、ここで、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、以下からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域における変異を含む：翻訳されるタンパク質のフレームに変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及びあるアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)。
【請求項１１】
請求項９に記載の改変した細胞、ここで、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、以下からなる群より選択される前記遺伝子のノン-コーディング領域における変異を含む：前記遺伝子がコードするmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子がコードするmRNA産物の安定性を変える変異。
【請求項１２】
請求項９〜１１の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、前記改変した細胞内の前記第2の規定したヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【請求項１３】
請求項４又は請求項８〜１２の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ又はその誘導体、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)又はその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)又はその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)又はその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。
【請求項１４】
請求項１３に記載の改変した細胞、ここで、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。
【請求項１５】
請求項４又は請求項８〜１４の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。
【請求項１６】
請求項４又は請求項８〜１４の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、前記改変した細胞内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。
【請求項１７】
請求項４又は請求項８〜１６の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を含む。
【請求項１８】
請求項１７に記載の改変した細胞、ここで、前記crRNAはガイドRNA(gRNA)を含む、ここで、前記gRNAは前記規定されたヌクレオチド配列に対して相補的である。
【請求項１９】
請求項１８に記載の改変した細胞、ここで、前記crRNA及び前記tracrRNAは、シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある。
【請求項２０】
請求項１８に記載の改変した細胞、ここで、前記crRNA及び前記tracrRNAは、別個のポリヌクレオチド上にある。
【請求項２１】
請求項１〜２０の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又はそのコードされたポリぺプチド配列の発現は、、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は内因性のTCR遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。
【請求項２２】
請求項１〜２０の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又はそのコードされたポリぺプチド配列の発現は、、外因性プロモーターによって指示される。
【請求項２３】
請求項２２に記載の改変した細胞、ここで、前記外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターが融合したもの、プロモーターの2つの部分が融合したもの、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター・システム、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター・システム、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター・システム、からなる群より選択される。
【請求項２４】
請求項１〜２３の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、長さが100塩基以上である。
【請求項２５】
請求項１〜２３の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【請求項２６】
請求項１〜２５の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項２７】
請求項１〜２６の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項２８】
請求項１〜２５の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列、及び前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、それぞれ長さが600塩基以上である。
【請求項２９】
請求項４又は請求項８〜２８の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記規定されたヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列の組み込み後に破壊される。
【請求項３０】
請求項１〜２９の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位と動作可能的に関連している内因性の遺伝子の発現は、破壊される。
【請求項３１】
相同組換え率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項１〜３０の何れか一項に記載の改変した細胞。
【請求項３２】
請求項３１に記載の改変した細胞、ここで、前記相同組換え率を増加させることができる追加の試薬は、相同組換え修復経路の活性化因子、非-相同末端結合(non-homologous end joining)(NHEJ)修復経路の阻害因子、又はそれらの組み合わせを含む。
【請求項３３】
改変した細胞の生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項１〜３２の何れか一項に記載の改変した細胞。
【請求項３４】
請求項３３に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞の生存率を増加させることができる追加の試薬が、核酸感知(nucleic acid sensing)経路の阻害因子を含む。
【請求項３５】
請求項３４に記載の改変した細胞、ここで、前記核酸感知(nucleic acid sensing)経路は、以下から選択される群を含む：TLR9核酸感知(nucleic acid sensing)経路、AIM2核酸感知(nucleic acid sensing)経路、IFI16核酸感知(nucleic acid sensing)経路、cGAS核酸感知(nucleic acid sensing)経路、及び細胞質ゾル核酸感知(nucleic acid sensing)経路。
【請求項３６】
請求項３４に記載の改変した細胞、ここで、前記核酸感知(nucleic acid sensing)経路の阻害因子は、オリゴヌクレオチド・アンタゴニストを含む。
【請求項３７】
請求項３６に記載の改変した細胞、ここで、前記オリゴヌクレオチド・アンタゴニストは、配列TTAGGG又はそのタンデム・リピートを含む。
【請求項３８】
請求項１〜４の何れか一項又は請求項６〜３３の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、プラスミド又はナノプラスミドを含む。
【請求項３９】
請求項３８に記載の改変した細胞、ここで、前記プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、並びにここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ではない、第1の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、及び第2の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、ヌクレオチド配列である。
【請求項４０】
請求項１〜４の何れか一項又は請求項６〜３９の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【請求項４１】
請求項１〜４０の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。
【請求項４２】
請求項１〜４０の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、イントロンを含む。
【請求項４３】
請求項１〜４２の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む。
【請求項４４】
請求項４３に記載の改変した細胞、ここで、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子は、破壊されたTCR-ベータ遺伝子である。
【請求項４５】
請求項１〜４２の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記TCR-ベータ遺伝子座位を含む。
【請求項４６】
請求項４５に記載の改変した細胞、ここで、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子は、破壊されたTCR-アルファ遺伝子である。
【請求項４７】
請求項１〜４の何れか一項又は請求項９〜４２の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記内因性のゲノム・ターゲットは、免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。
【請求項４８】
請求項４７に記載の改変した細胞、ここで、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【請求項４９】
請求項１〜４の何れか一項又は請求項９〜４８の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む。
【請求項５０】
請求項４９に記載の改変した細胞、ここで、前記リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。
【請求項５１】
請求項５０に記載の改変した細胞、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、フリン切断部位を含む。
【請求項５２】
請求項５〜５１の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記リンカー配列の何れか1つは、以下からなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む：T2A、E2A、P2A、及びF2A。
【請求項５３】
請求項５〜５２の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、Gly-Ser-Glyリンカーを含む、任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端にある、及び任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、N末端からC末端の方向で、フリン切断部位：Gly-Ser-Glyリンカー：2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)、の並びの中にある。
【請求項５４】
請求項４９に記載の改変した細胞、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項５５】
請求項４９に記載の改変した細胞、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、外因性のプロモーターを含む。
【請求項５６】
請求項５〜５５の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【請求項５７】
請求項５〜５６の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、シグナル・ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ここで、前記シグナル・ペプチドは、遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチド、に動作可能的に連結している。
【請求項５８】
請求項５７に記載の改変した細胞、ここで、前記シグナル・ペプチドは外因性のシグナル・ペプチドである、任意選択的に、ここで、前記外因性のシグナル・ペプチドはヒト成長ホルモンのシグナル・ペプチドである。
【請求項５９】
請求項５〜５８の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。
【請求項６０】
請求項５９に記載の改変した細胞、ここで、同じリンカーのポリペプチド配列をコードする、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが異なる(codon diverged)。
【請求項６１】
請求項１〜４の何れか一項又は請求項９〜５６の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。
【請求項６２】
請求項６１に記載の改変した細胞、ここで、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群より選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【請求項６３】
請求項１〜４の何れか一項又は請求項９〜５６の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、ノン-コーディング領域(non-coding region)をコードする。
【請求項６４】
請求項６３に記載の改変した細胞、ここで、前記ノン-コーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。
【請求項６５】
請求項１〜４の何れか一項又は請求項９〜５６の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部はTCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【請求項６６】
請求項６５に記載の改変した細胞、ここで、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む：
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及び
c)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項６７】
請求項５〜６６の何れか一項に記載の改変細胞、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される：マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するのに最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部。
【請求項６８】
請求項５〜６７の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチドは、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列と、より強く相互作用する、任意選択的に、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して互いにより強く相互作用する。
【請求項６９】
請求項５〜６８の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端の方向で、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。
【請求項７０】
請求項５〜６８の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端の方向で、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。
【請求項７１】
請求項１〜７０の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドンが異なる(codon diverged)。
【請求項７２】
請求項１〜７１の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は免疫細胞を含む。
【請求項７３】
請求項７２に記載の改変した細胞、ここで、前記免疫細胞はT細胞を含む。
【請求項７４】
請求項７３に記載の改変した細胞、ここで前記T細胞は、以下からなる群より選択される：細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、初代T細胞、腫瘍浸潤T細胞、操作したT細胞、調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、アルファ-ベータT細胞、及びガンマ-デルタT細胞。
【請求項７５】
請求項７２に記載の改変した細胞、ここで、前記免疫細胞は、ナチュラル・キラー細胞を含む。
【請求項７６】
請求項７２に記載の改変した細胞、ここで、前記免疫細胞は、以下からなる群より選択される：B細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラーT細胞。
【請求項７７】
請求項１〜７１の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は幹細胞を含む。
【請求項７８】
請求項７８に記載の改変した細胞、ここで、前記幹細胞は造血幹細胞を含む。
【請求項７９】
請求項７８に記載の改変した細胞、ここで、前記幹細胞は胚性幹細胞を含む。
【請求項８０】
請求項１〜７９の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は初代細胞である。
【請求項８１】
請求項１〜８１の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は単離した細胞である、ここで、前記単離した細胞は対象から単離する。
【請求項８２】
請求項８１の改変した細胞、ここで、前記対象はがんを有していることが判明している、又は、そのような疑いがある。
【請求項８３】
請求項１〜８２の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞はヒト細胞又はヒト由来細胞を含む。
【請求項８４】
請求項１〜８３の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、ex vivoで培養した細胞である。
【請求項８５】
請求項８４に記載の改変した細胞、ここで、前記ex vivoで培養した細胞は、刺激された細胞を含む。
【請求項８６】
請求項８５に記載の改変した細胞、ここで、前記刺激された細胞はサイトカインで刺激されたT細胞を含み、任意選択的に、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞はCD3で刺激されたT細胞、CD28で刺激されたT細胞、又はCD3及びCD28で刺激されたT細胞、を含む。
【請求項８７】
請求項８６に記載の改変した細胞、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL7、IL15、又はそれらの組合せの存在下で培養する。
【請求項８８】
請求項８６又は８７に記載の改変した細胞、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2の存在下で培養する。
【請求項８９】
請求項８６又は８７に記載の改変した細胞、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2を実質的に含まない培地中で培養する。
【請求項９０】
請求項１〜８９の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は組み込まれたウイルスを含まない、ここで、前記組み込まれたウイルスは前記ウイルスを介した送達の構成成分と動作可能的に関連している。
【請求項９１】
請求項１〜８９の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞の表面上のMHCクラスIは、ウイルスを介した送達の構成成分又は組み込まれたウイルスに由来するペプチドを含まない、ここで、前記組み込まれたウイルスは前記ウイルスを介した送達の構成成分と動作可能的に関連している。
【請求項９２】
請求項１〜８９の何れか一項に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は、第2の外因性ヌクレオチド組成物を含む第2の環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記第2の外因性ヌクレオチド組成物は、以下を含む： 
a)  第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに、
前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の前記第1領域及び前記第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている。
【請求項９３】
請求項９２に記載の改変した細胞、ここで、前記改変した細胞は第2の組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む、ここで、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれている、及び前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている。
【請求項９４】
請求項３〜９３の改変した細胞の何れか一種を含む細胞の集団、ここで前記集団の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超は組み込まれたヌクレオチド配列を含む。
【請求項９５】
請求項９４に記載の細胞の集団、ここで、前記改変した細胞は、前記組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、選別、選択、又は単離されていない。
【請求項９６】
以下を含む細胞の集団：
組み込まれたヌクレオチド配列、
ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は遺伝子の少なくとも一部を含み、前記組み込まれたヌクレオチド配列は内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位で組み込まれている、及び前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている、
ここで、前記細胞の集団はウイルスを介した送達の構成成分を実質的に含まない、並びに
ここで、前記集団中のT細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超は前記組み込まれたヌクレオチド配列を含む。
【請求項９７】
請求項９６に記載の細胞の集団、ここで、前記T細胞は、前記組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、選別、選択、又は単離されていない。
【請求項９８】
請求項９６又は９７に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、前記内因性のTCR遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【請求項９９】
請求項９６〜９８の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、外因性のヌクレオチド配列を含む環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記外因性のヌクレオチド配列は以下を含む： 
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  前記内因性の遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列、及び
c)  前記内因性の遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、並びに
前記内因性の遺伝子座位の前記第1領域及び前記第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性の遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている。
【請求項１００】
請求項９６〜９９の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、少なくとも1×106 個のT細胞、少なくとも2×106 個のT細胞、少なくとも5×106 個のT細胞、少なくとも1×107 個のT細胞、又は少なくとも5×107 個のT細胞である。
【請求項１０１】
請求項９６〜１００の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異を更に含む。
【請求項１０２】
請求項１０１に記載の細胞の集団、ここで、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、以下からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む：翻訳されるタンパク質のフレームに変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及びあるアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)。
【請求項１０３】
請求項１０１に記載の細胞の集団、ここで、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、以下からなる群より選択される前記遺伝子のノン-コーディング領域(non-coding region)における変異を含む：前記遺伝子がコードするmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子がコードするmRNA産物の安定性を変える変異。
【請求項１０４】
請求項１０１〜１０３の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、前記細胞の集団内の前記第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を更に含む。
【請求項１０５】
請求項９８〜１０４の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)若しくはその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)若しくはその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)若しくはその誘導体、からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。
【請求項１０６】
請求項１０５に記載の細胞の集団、ここで、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。
【請求項１０７】
請求項９８〜１０６の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。
【請求項１０８】
請求項９８〜１０６の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、前記細胞の集団内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。
【請求項１０９】
請求項９８〜１０８の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、規定されたヌクレオチド配列でヌクレアーゼを介した切断を指示するガイドRNAを含む。
【請求項１１０】
請求項１０９に記載の細胞の集団、ここで、前記ガイドRNAは、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を含む。
【請求項１１１】
請求項１１０に記載の細胞の集団、ここで、前記crRNA及び前記tracrRNAは、シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある。
【請求項１１２】
請求項１１０に記載の細胞の集団、ここで、前記crRNA及び前記tracrRNAは、別個のポリヌクレオチド上にある。
【請求項１１３】
請求項９６〜１１２の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。
【請求項１１４】
請求項９６〜１１２の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指示される。
【請求項１１５】
請求項１１４に記載の細胞の集団、ここで、前記外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターが融合したもの、プロモーターの2つの部分が融合したもの、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター・システム、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター・システム、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター・システム、からなる群より選択される。
【請求項１１６】
請求項９６〜１１５の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが100塩基以上である。
【請求項１１７】
請求項９６〜１１５の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【請求項１１８】
請求項９９〜１１７の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項１１９】
請求項９９〜１１８の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項１２０】
請求項９９〜１１９の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列及び前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、それぞれ長さが600塩基以上である。
【請求項１２１】
請求項９８〜１２０の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記規定されたヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列の組み込み後に破壊される。
【請求項１２２】
請求項９６〜１２１の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位と動作可能的に関連している内因性の遺伝子の発現は、破壊される。
【請求項１２３】
相同組換え率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項９６〜１２２の何れか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１２４】
前記細胞の集団の生存率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項９６〜１２３の何れか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１２５】
請求項９９〜１２４の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、プラスミド又はナノプラスミドを含む。
【請求項１２６】
請求項１２５に記載の細胞の集団、ここで、前記プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、並びにここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列ではない、前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ではない、前記第1の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、及び前記第2の内因性のターゲット・ゲノム座位又は内因性のTCR遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない、ヌクレオチド配列である。
【請求項１２７】
請求項９９〜１２６の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【請求項１２８】
請求項９６〜１２７の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。
【請求項１２９】
請求項９６〜１２７の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、イントロンを含む。
【請求項１３０】
請求項９６〜１２９の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、前記T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む。
【請求項１３１】
請求項１３０に記載の細胞の集団、ここで、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子は、破壊されたTCR-ベータ遺伝子である。
【請求項１３２】
請求項９６〜１２９の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、前記TCR-ベータ遺伝子座位を含む。
【請求項１３３】
請求項１３２に記載の細胞の集団、ここで、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子は、破壊されたTCR-アルファ遺伝子である。
【請求項１３４】
請求項９６〜１２９の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記内因性のゲノム・ターゲットが免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。
【請求項１３５】
請求項１３４に記載の細胞の集団、ここで、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【請求項１３６】
請求項９６〜１３５の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む。
【請求項１３７】
請求項１３６に記載の細胞の集団、ここで、前記リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。
【請求項１３８】
請求項１３７に記載の細胞の集団、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは、以下からなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む：T2A、E2A、P2A、及びF2A。
【請求項１３９】
請求項１３７〜１３８の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは、フリン切断部位を含む。
【請求項１４０】
請求項１３７〜１３９の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは、Gly-Ser-Glyリンカーを含む、任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端にある、及び任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、N末端からC末端の方向で、フリン切断部位：Gly-Ser-Glyリンカー：2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)、の並びの中にある。
【請求項１４１】
請求項１３６に記載の細胞の集団、ここで、前記リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項１４２】
請求項１３６に記載の細胞の集団、ここで、前記リンカー配列は、外因性のプロモーター配列を含む。
【請求項１４３】
請求項１３６〜１４２の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記リンカー配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【請求項１４４】
請求項９６〜１３５の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、第1リンカーのポリペプチド配列及び第2リンカーのポリペプチド配列を含む。
【請求項１４５】
請求項１４４に記載の細胞の集団、ここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。
【請求項１４６】
請求項１４５に記載の細胞の集団、ここで、同じリンカーのポリペプチド配列をコードする、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが異なる(codon diverged)。
【請求項１４７】
請求項９６〜１４６の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。
【請求項１４８】
請求項１４７に記載の細胞の集団、ここで、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群より選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【請求項１４９】
請求項９６〜１４６の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部はノン-コーディング領域(non-coding region)をコードする。
【請求項１５０】
請求項１４９に記載の細胞の集団、ここで、前記ノン-コーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。
【請求項１５１】
請求項９６〜１４６の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで前記遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【請求項１５２】
請求項１５１に記載の細胞の集団、ここで、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む： 
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及び
c)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１５３】
請求項１５１又は１５２に記載の細胞の集団、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される：マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するのに最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部。
【請求項１５４】
請求項１５１〜１５３の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチドは、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列と、より強く相互作用する、任意選択的に、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、操作した結果、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して互いにより強く相互作用する。
【請求項１５５】
請求項１５２〜１５４の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。
【請求項１５６】
請求項１５２〜１５４の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。
【請求項１５７】
請求項１５１〜１５６の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドンが異なる(codon diverged)。
【請求項１５８】
請求項９６〜１５７の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、ヒト細胞又はヒト由来細胞を含む。
【請求項１５９】
請求項９６〜１５８の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、免疫細胞の集団を含む。
【請求項１６０】
請求項１５９に記載の細胞の集団、ここで、前記免疫細胞の集団は、T細胞の集団を含む。
【請求項１６１】
請求項１６０に記載の集団、ここで、前記T細胞の集団は、以下からなる群より選択される：細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、初代T細胞、腫瘍浸潤T細胞、操作したT細胞、調節性T細胞(Treg)、ヘルパーT細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、アルファ-ベータT細胞、及びガンマ-デルタT細胞。
【請求項１６２】
請求項１５９に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、以下からなる群より選択される集団を含む：B細胞, 単球、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラル・キラーT細胞。
【請求項１６３】
請求項９６〜１５８の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、幹細胞の集団を含む。
【請求項１６４】
請求項１６３に記載の細胞の集団、ここで、前記幹細胞の集団は、造血幹細胞の集団を含む。
【請求項１６５】
請求項１６３に記載の細胞の集団、ここで、前記幹細胞の集団は、胚性幹細胞の集団を含む。
【請求項１６６】
請求項９６〜１６５の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、初代細胞である。
【請求項１６７】
請求項９６〜１６６の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は単離した細胞の集団である、ここで、前記単離した細胞の集団は対象から単離する。
【請求項１６８】
請求項１６７に記載の細胞の集団、前記対象はがんを有していることが判明している、又は、そのような疑いがある。
【請求項１６９】
請求項９６〜１６８の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、ex vivoで培養した細胞を含む。
【請求項１７０】
請求項１６９に記載の細胞の集団、ここで、前記ex vivoで培養した細胞は、刺激された細胞を含む。
【請求項１７１】
請求項１７０に記載の細胞の集団、ここで、前記刺激された細胞はサイトカインで刺激されたT細胞を含み、任意選択的に、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞はCD3で刺激されたT細胞、CD28で刺激されたT細胞、又はCD3及びCD28で刺激されたT細胞、を含む。
【請求項１７２】
請求項１７１に記載の細胞の集団、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL7、IL15、又はそれらの組合せの存在下で培養する。
【請求項１７３】
請求項１７１又は１７２に記載の細胞の集団、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2の存在下で培養する。
【請求項１７４】
請求項１７１又は１７２に記載の細胞の集団、ここで、前記サイトカインで刺激されたT細胞を、IL2を実質的に含まない培地中で培養する。
【請求項１７５】
請求項９６〜１７４の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は第2の組み込まれたヌクレオチド配列を更に含む、ここで、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれている、及び前記第2の組み込まれたヌクレオチド配列は前記第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向されている。
【請求項１７６】
請求項１７５に記載の細胞の集団、ここで、前記細胞の集団は、第2の外因性ヌクレオチド組成物を含む第2の環状ポリヌクレオチドを更に含み、前記第2の外因性ヌクレオチド組成物は、以下を含む： 
a)  前記第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の前記第1領域及び前記第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている。
【請求項１７７】
治療を必要とする対象のためのその治療方法、ここで、前記治療は、治療有効量の請求項１〜１７６の何れか一項に記載の改変した細胞又は細胞の集団を投与することを含む。
【請求項１７８】
請求項１７７に記載の治療方法、ここで、前記改変した細胞又は細胞の集団は、前記対象に由来する。
【請求項１７９】
請求項１７７に記載の治療方法、ここで、前記改変した細胞又は細胞の集団は、前記対象に関して同種異系である。
【請求項１８０】
細胞を遺伝子改変するための方法、前記方法は以下の工程を含む：
1)  シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)を含むヌクレオチド組成物を提供すること、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は以下を含む：
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている；並びに
2)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を提供すること；
3)  前記細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させること、
4)  前記細胞をウイルスで感染させること以外の手段によって、前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物を前記細胞中に送達すること。
【請求項１８１】
前記細胞内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を提供することを更に含む、ここで、前記第2ヌクレアーゼ組成物を、前記接触させる工程において前記細胞と接触させる、及び前記送達する工程において前記細胞中に送達する、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
請求項１８１に記載の方法、ここで、前記切断により、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異が起きる。
【請求項１８３】
請求項１８２に記載の方法、ここで、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、翻訳されるタンパク質のフレームに変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及びあるアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)、からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む。
【請求項１８４】
請求項１８２に記載の方法、ここで、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、前記遺伝子がコードするmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子がコードするmRNA産物の安定性を変える変異、からなる群より選択される前記遺伝子のノン-コーディング領域(non-coding region)における変異を含む。
【請求項１８５】
更に以下を含む、請求項１８１に記載の方法：
第2ヌクレオチド組成物を提供すること、その第2組成物は以下を含む：
a)  第2の遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び
c)  前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記ヌクレオチド配列の全てはシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある、
前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、
前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記第2の遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている、並びに、
前記第2ヌクレオチド組成物を、前記接触させる工程において前記細胞と接触させる、及び前記送達する工程において前記細胞中に送達する。
【請求項１８６】
請求項１８０〜１８５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)若しくはその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)若しくはその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)若しくはその誘導体、からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。
【請求項１８７】
請求項１８６に記載の方法、ここで、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。
【請求項１８８】
請求項１８０〜１８７の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。
【請求項１８９】
請求項１８０〜１８７の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、前記細胞内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。
【請求項１９０】
請求項１８０〜１８９の何れか一項に記載の方法、ここで、前記接触させる工程は、前記細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させる工程と前記送達する工程との間が、60分未満、45分未満、30分未満、20分未満、15分未満、10分未満、5分未満、又は1分未満である。
【請求項１９１】
請求項１８０〜１９０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記送達する工程は、エレクトロポレーション、トランスフェクション、物理的な方法による細胞膜の変形、脂質ナノ粒子(LNP)、ウイルス様粒子(VLP)、及び超音波処理、からなる群より選択される。
【請求項１９２】
請求項１８０〜１９０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記送達する工程は、エレクトロポレーションを含む。
【請求項１９３】
請求項１８０〜１９２の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリペプチド配列の発現は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。
【請求項１９４】
請求項１８０〜１９２の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指示される。
【請求項１９５】
請求項１９４に記載の方法、ここで、前記外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターが融合したもの、プロモーターの2つの部分が融合したもの、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター・システム、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター・システム、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター・システム、からなる群より選択される。
【請求項１９６】
請求項１８０〜１９５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、長さが100塩基以上である。
【請求項１９７】
請求項１８０〜１９５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【請求項１９８】
請求項１８０〜１９７の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域又は第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基、長さが100塩基、長さが200塩基、長さが400塩基、長さが600塩基、長さが800塩基、長さが1500塩基、長さが2000塩基、又は長さが4000塩基である。
【請求項１９９】
請求項１８０〜１９８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記規定されたヌクレオチド配列は、組み込み後に破壊される。
【請求項２００】
請求項１８０〜１９９の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に動作可能的に関連している内因性の遺伝子の発現は、破壊される。
【請求項２０１】
相同組換え率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項１８０〜２００の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０２】
請求項１８０〜２０１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、環状プラスミド、線状DNAフラグメント、ミニサークル、及びssDNAからなる群より選択される。
【請求項２０３】
請求項２０２に記載の方法、ここで、前記環状プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、ここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記第1の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列、又は前記第2の内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列のどれでもない、ヌクレオチド配列を含む。
【請求項２０４】
請求項１８０〜２０３の何れか一項に記載の方法、ここで、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【請求項２０５】
請求項１８０〜２０４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、混入物質を実質的に含まない。
【請求項２０６】
請求項１８０〜２０５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、細胞生存率を低下させる構成成分を実質的に含まない。
【請求項２０７】
請求項１８０〜２０６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。
【請求項２０８】
請求項１８０〜２０６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、イントロンを含む。
【請求項２０９】
請求項１８０〜２０８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、前記細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位である。
【請求項２１０】
請求項１８０〜２０８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、TCR-ベータ遺伝子座位である。
【請求項２１１】
請求項１８０〜２０８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、免疫チェックポイント遺伝子座位である。
【請求項２１２】
請求項２１１に記載の方法、ここで、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【請求項２１３】
請求項１８０〜２１２の何れか一項に記載の方法。ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む、
【請求項２１４】
請求項２１３に記載の方法、ここで、前記リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。
【請求項２１５】
請求項２１４に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。
【請求項２１６】
請求項２１４又は２１５に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。
【請求項２１７】
請求項２１３に記載の方法、ここで、前記リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項２１８】
請求項２１３に記載の方法、ここで、前記リンカー配列は、外因性のプロモーターを含む。
【請求項２１９】
請求項２１３〜２１８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記リンカー配列は、スプライス・アクセプター配列を更に含む。
【請求項２２０】
請求項１８０〜２１９の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。
【請求項２２１】
請求項２２０に記載の方法、ここで、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群より選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【請求項２２２】
請求項１８０〜２１９の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、ノン-コーディング領域(non-coding region)をコードする。
【請求項２２３】
請求項２２２に記載の方法、ここで、前記ノン-コーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。
【請求項２２４】
請求項１８０〜２１９の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【請求項２２５】
請求項２２４に記載の方法、ここで、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するのに最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部、からなる群より選択される。
【請求項２２６】
請求項２２４に記載の方法、ここで、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む： 
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及び
c)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２２７】
請求項２２６に記載の方法、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列は、マウス化TCR-アルファ、ヒト化TCR-アルファ、ドメイン・スワップをしたTCR-アルファ、点変異を入れたTCR-アルファ、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR-アルファ、コドンを最適化したTCR-アルファ（ヒトで発現するのに最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-アルファ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、からなる群より選択される。
【請求項２２８】
請求項２２６又は２２７に記載の方法、ここで、前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、マウス化TCR-ベータ、ヒト化TCR-ベータ、ドメイン・スワップをしたTCR-ベータ、点変異を入れたTCR-ベータ、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR-ベータ、コドンを最適化したTCR-ベータ（ヒトで発現するのに最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-ベータ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、からなる群より選択される。
【請求項２２９】
請求項２２６〜２２８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。
【請求項２３０】
請求項２２６〜２２８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。
【請求項２３１】
請求項２２６〜２３０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列は、切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含む。
【請求項２３２】
請求項２３１に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。
【請求項２３３】
請求項２３１又は２３２に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。
【請求項２３４】
請求項２２６〜２３０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項２３５】
請求項２２６〜２３０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列は、外因性のプロモーターを含む。
【請求項２３６】
請求項１８５〜２３５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子、からなる群より選択される。
【請求項２３７】
請求項１８５〜２３５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2の遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【請求項２３８】
請求項１８０〜２３７の何れか一項に記載の方法によって産生される改変した細胞、ここで、前記細胞は組み込まれたヌクレオチド配列を含む、ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれ、及び前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される。
【請求項２３９】
請求項１８０〜２３７の何れか一項に記載の方法によって産生される細胞の集団、ここで、前記集団中の細胞の10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、又は70%超は前記組み込まれたヌクレオチド配列を含む、ここで、前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と同一の配列を含み、前記組み込まれたヌクレオチド配列は内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に組み込まれ、及び前記組み込まれたヌクレオチド配列は前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される。
【請求項２４０】
請求項２３８又は２３９に記載の改変した細胞又は細胞の集団、ここで、前記細胞は、前記組み込まれたヌクレオチド配列の組み込み後に、選別、選択、又は単離されていない。
【請求項２４１】
請求項２３８〜２４０の何れか一項に記載の細胞の集団、ここで、送達する工程後の細胞の集団の生存率は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも40%、少なくとも60%、又は少なくとも80%である。
【請求項２４２】
請求項２４１に記載の細胞の集団、ここで、前記生存率を、前記送達する工程の4日後に評価する。
【請求項２４３】
治療を必要とする対象のためのその治療方法、ここで、前記治療は、治療有効量の請求項２３８〜２４０の何れか一項に記載の細胞又は細胞の集団を投与することを含む。
【請求項２４４】
請求項２４３に記載の治療方法、ここで、前記細胞又は細胞の集団は、前記対象に由来する。
【請求項２４５】
請求項２４３に記載の治療方法、ここで、前記細胞又は細胞の集団は、前記対象に関して同種異系である。
【請求項２４６】
細胞を遺伝子改変するための方法、前記方法は以下の工程を含む：
1)  以下を含むヌクレオチド組成物を提供すること：
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、
c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、長さが100塩基である、
前記ヌクレオチド配列の全てはシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている；並びに、
2)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるCRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物を提供すること；
3)  前記細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物と接触させること、並びに
4)  エレクトロポレーションによって、前記ヌクレオチド組成物及び前記CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ組成物を前記細胞中に送達すること。
【請求項２４７】
規定されたT細胞レセプターを有する改変したT細胞を生成する方法、前記方法は以下の工程を含む：
1)  以下を含むヌクレオチド組成物を提供すること：
a)  TCR-アルファのポリぺプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリぺプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
c)  第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
d)  第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
e)  内因性のTCR遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、
f)  前記内因性のTCR遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記ヌクレオチド配列はシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある、
前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域及び第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のTCR遺伝子座位における相同組換えを促進するように配向されている、
前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、並びに第1リンカー及び第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、前記内因性のTCR遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記ポリペプチド配列のそれぞれがシングル・ポリペプチド(single polypeptide)として発現することができるように配向されている、
前記第1リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部、前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部、及び第2リンカーのポリペプチド配列の前に位置する、
前記第2リンカーのポリペプチド配列は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列と前記TCR-ベータのポリペプチド配列との間に位置する、並びに、
前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、それぞれ別個のポリペプチドを形成する、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に相互作用して機能的なTCRを形成することができる；
2)  前記内因性のTCR遺伝子座位内の規定されたヌクレオチド配列を切断することができるヌクレアーゼ組成物を提供すること；
3)  前記T細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させること、並びに
4)  前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物を前記T細胞中に送達すること。
【請求項２４８】
前記T細胞内の第2の規定されたヌクレオチド配列を切断することができる第2ヌクレアーゼ組成物を提供することを更に含む、請求項２４７に記載の方法、ここで、前記第2ヌクレアーゼ組成物を、前記接触させる工程において前記T細胞と接触させる、及び前記送達する工程において前記T細胞中に送達する。
【請求項２４９】
請求項２４８に記載の方法、ここで、前記切断により、前記第2の規定されたヌクレオチド配列がコードする非-機能的な遺伝子を生成する変異が生じる。
【請求項２５０】
請求項２４９に記載の方法、ここで、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、翻訳されるタンパク質のフレームに変化をもたらすフレームシフト変異、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こすナンセンス変異(nonsense mutation)、及びあるアミノ酸から別のアミノ酸への置換をもたらすミスセンス変異(missense mutation)、からなる群より選択される前記遺伝子のコーディング領域(coding region)における変異を含む。
【請求項２５１】
請求項２４９に記載の方法、ここで、前記非-機能的な遺伝子を生成する変異は、前記遺伝子がコードするmRNA産物の発現を変える変異、及び前記遺伝子がコードするmRNA産物の安定性を変える変異、からなる群より選択される前記遺伝子のノン-コーディング領域(non-coding region)における変異を含む。
【請求項２５２】
更に以下を含む、請求項２４９に記載の方法：
第2ヌクレオチド組成物を提供すること、その第2組成物は以下を含む：
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、
c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記ヌクレオチド配列の全てはシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている；並びに、
前記第2ヌクレオチド組成物を、前記接触させる工程において前記T細胞と接触させる、及び前記送達する工程において前記T細胞中に送達する。
【請求項２５３】
請求項２４７〜２５２の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム繰り返し(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)ファミリーのヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ(Transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)若しくはその誘導体、ジンクフィンガー・ヌクレアーゼ(zinc-finger nuclease)(ZFN)若しくはその誘導体、及びホーミング・エンドヌクレアーゼ(homing endonuclease)(HE)若しくはその誘導体からなる群より選択されるヌクレアーゼを含む。
【請求項２５４】
請求項２５３に記載の方法、ここで、前記CRISPRファミリーのヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼである。
【請求項２５５】
請求項２４７〜２５４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、予め形成されたタンパク質複合体を含む。
【請求項２５６】
請求項２４７〜２５４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記ヌクレアーゼ組成物は、前記T細胞内で前記ヌクレアーゼを発現させることができるヌクレオチド・ベクターを含む。
【請求項２５７】
請求項２４７〜２５６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記接触させる工程は、前記T細胞を前記ヌクレオチド組成物及び前記ヌクレアーゼ組成物と接触させる工程と前記送達する工程との間が、60分未満、45分未満、30分未満、20分未満、15分未満、10分未満、又は5分未満である。
【請求項２５８】
請求項２４７〜２５７の何れか一項に記載の方法、ここで、前記送達する工程は、エレクトロポレーション、トランスフェクション、物理的な方法による細胞膜の変形、脂質ナノ粒子(LNP)、ウイルス様粒子(VLP)、及び超音波処理、からなる群より選択される。
【請求項２５９】
請求項２４７〜２５７の何れか一項に記載の方法、ここで、前記送達する工程は、エレクトロポレーションを含む。
【請求項２６０】
請求項２４７〜２５９の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位内の内因性プロモーターによって指示される。
【請求項２６１】
請求項２４７〜２６０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列の発現は、外因性のプロモーターによって指示される。
【請求項２６２】
請求項２６１に記載の方法、ここで、前記外因性プロモーターは、哺乳動物プロモーター、ヒト・プロモーター、ウイルス・プロモーター、レトロウイルス又はレンチウイルスに由来する長い末端リピート(long-terminal repeat)(LTR)プロモーター、2つのプロモーターが融合したもの、プロモーターの2つの部分が融合したもの、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1a、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、低分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター, 低分子コンディショナル・プロモーター、Cre-LoxPコンディショナル・プロモーター・システム、Flp-FRTコンディショナル・プロモーター・システム、及びタモキシフェン・コンディショナル・プロモーター・システム、からなる群より選択される。
【請求項２６３】
請求項２４７〜２６２の何れか一項に記載の方法、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又は前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが100塩基以上である。
【請求項２６４】
請求項２４７〜２６２の何れか一項に記載の方法、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列又は前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、又は長さが4000塩基以上である。
【請求項２６５】
請求項２４７〜２６４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位の第1領域又は第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基、長さが100塩基、長さが200塩基、長さが400塩基、長さが600塩基、長さが800塩基、長さが1500塩基、長さが2000塩基、又は長さが4000塩基である。
【請求項２６６】
請求項２４７〜２６５の何れか一項に記載の方法、ここで、前記規定されたヌクレオチド配列は、組み込み後に破壊される。
【請求項２６７】
請求項２４７〜２６６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位と機能的に関連している内因性の遺伝子の発現は、破壊される。
【請求項２６８】
相同組換え率を増加させることができる追加の試薬を更に含む、請求項２４７〜２６７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６９】
請求項２４７〜２６８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、環状プラスミド、線状DNAフラグメント、ミニサークル、及びssDNAからなる群より選択される。
【請求項２７０】
請求項２６９に記載の方法、ここで、前記環状プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、ここで、前記ベクター骨格は、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、前記第1リンカー及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列のどれでもない、ヌクレオチド配列である。
【請求項２７１】
請求項２４７〜２７０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【請求項２７２】
請求項２４７〜２７１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記シングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)は、ｄ混入物質を含まない。
【請求項２７３】
請求項２４７〜２７２の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。
【請求項２７４】
請求項２４７〜２７２の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位は、イントロンを含む。
【請求項２７５】
請求項２４７〜２７４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記TCR-アルファ遺伝子座位を含む。
【請求項２７６】
請求項２４７〜２７４の何れか一項に記載の方法、ここで、前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記TCR-ベータ遺伝子座位を含む。
【請求項２７７】
請求項２４７〜２７６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第1リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含む、ここで、発現した後に、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記TCR-アルファのポリペプチド配列の少なくとも一部、前記TCR-ベータのポリペプチド配列の少なくとも一部、及び前記第2リンカーのポリペプチド配列、をコードすることによってのみコードされるポリペプチド、が産生される。
【請求項２７８】
請求項２７７に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。
【請求項２７９】
請求項２７８又は２７９に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。
【請求項２８０】
請求項２４７〜２７６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列は、IRESを含む。
【請求項２８１】
請求項２４７〜２８０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第1リンカー配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【請求項２８２】
請求項２４７〜２８１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列を含む、ここで、発現した後に、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、それぞれ別個のポリペプチドを形成する、ここで、前記別個のポリペプチドは一緒に相互作用して機能的なTCRを形成することができる。
【請求項２８３】
請求項２７７に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、T2A、E2A、P2A、及びF2Aからなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む。
【請求項２８４】
請求項２８２又は２８３に記載の方法、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチド配列は、フリン切断部位配列を含む。
【請求項２８５】
請求項２４７〜２８１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項２８６】
請求項２４７〜２８１の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2リンカー配列は、外因性のプロモーターを含む。
【請求項２８７】
請求項２４７〜２８６の何れか一項に記載の方法、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列は、マウス化TCR-アルファ、ヒト化TCR-アルファ、ドメイン・スワップをしたTCR-アルファ、点変異を入れたTCR-アルファ、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR-アルファ、コドンを最適化したTCR-アルファ（ヒトで発現するのに最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-アルファ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、からなる群より選択される。
【請求項２８８】
請求項２４７〜２８７の何れか一項に記載の方法、ここで、前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、マウス化TCR-ベータ、ヒト化TCR-ベータ、ドメイン・スワップをしたTCR-ベータ、点変異を入れたTCR-ベータ、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR-ベータ、コドンを最適化したTCR-ベータ（ヒトで発現するのに最適化した）、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び配列を最適化したTCR-ベータ（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、からなる群より選択される。
【請求項２８９】
請求項２４７〜２８８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、第1リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。
【請求項２９０】
請求項２４７〜２８８の何れか一項に記載の方法、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。
【請求項２９１】
請求項２４８〜２９０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記規定されたヌクレオチド配列が内因性TCR-アルファ遺伝子座位内にある場合、前記第2の規定されたヌクレオチド配列は内因性TCR-ベータ遺伝子座位内にある。
【請求項２９２】
請求項２４８〜２９０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記規定されたヌクレオチド配列が内因性TCR-ベータ遺伝子座位内にある場合、前記第2の規定されたヌクレオチド配列は内因性TCR-アルファ遺伝子座位内にある。
【請求項２９３】
請求項２４８〜２９０の何れか一項に記載の方法、ここで、前記第2の規定されたヌクレオチド配列は、免疫チェックポイント遺伝子座位内にある。
【請求項２９４】
請求項２５２〜２９３の何れか一項に記載の方法、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、shRNA、siRNA、miRNA、サイトカイン、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子、からなる群より選択される。
【請求項２９５】
以下を含む環状ポリヌクレオチドを含む、内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを指示する際に使用するためのヌクレオチド組成物：
a)  遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列；
b)  内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列；及び、
c)  前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列、
ここで、前記ヌクレオチド配列の全てはシングル・ポリヌクレオチド(single polynucleotide)上にある、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と第2領域と同一のヌクレオチド配列は、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位での相同組換えを促進するように配向されている、
前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位に前記組成物が組み込まれた後に、前記遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は配向されている。
【請求項２９６】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが100塩基以上である。
【請求項２９７】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、長さが200塩基以上、長さが400塩基以上、長さが600塩基以上、長さが800塩基以上、長さが1500塩基以上、長さが2000塩基以上、長さが4000塩基以上である。
【請求項２９８】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項２９９】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、長さが50塩基以上、長さが100塩基以上、長さが200塩基以上、長さが300塩基以上、長さが600塩基以上、長さが1000塩基以上、又は長さが2000塩基以上である。
【請求項３００】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第1領域と同一のヌクレオチド配列及び前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位の第2領域と同一のヌクレオチド配列は、それぞれ、長さが600塩基以上である。
【請求項３０１】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、プラスミド又はナノプラスミドを含む。
【請求項３０２】
請求項３０１に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記プラスミドは、500塩基未満のベクター骨格を有する、並びにここで、前記ベクター骨格は、前記遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列ではない、及び前記第1の内因性の遺伝子座位と同一のヌクレオチド配列ではない。
【請求項３０３】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記環状ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅させたポリヌクレオチドではない。
【請求項３０４】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、コーディング領域(coding region)を含む。
【請求項３０５】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位は、イントロンを含む。
【請求項３０６】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記T細胞レセプター(TCR)-アルファ遺伝子座位を含む。
【請求項３０７】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノムのターゲット遺伝子座位又は前記内因性のTCR遺伝子座位は、前記T細胞レセプター(TCR)-ベータ遺伝子座位を含む。
【請求項３０８】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記内因性のゲノム・ターゲットは、免疫チェックポイント遺伝子座位を含む。
【請求項３０９】
請求項３０８に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記免疫チェックポイント遺伝子座位は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、及びVISTAからなる群より選択される。
【請求項３１０】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、リンカー配列を含む。
【請求項３１１】
請求項３１０に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記リンカー配列は切断可能なリンカーのポリペプチド配列をコードする、ここで、発現した後に、前記切断可能なリンカーのポリペプチドは切断されて、前記遺伝子の少なくとも一部によってのみコードされるポリペプチドが産生される。
【請求項３１２】
請求項３１１に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つは、フリン切断部位を含む。
【請求項３１３】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記リンカー配列の何れか1つが、以下からなる群より選択される2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)を含む：T2A、E2A、P2A、及びF2A。
【請求項３１４】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記切断可能なリンカーのポリペプチドの何れか1つが、Gly-Ser-Glyリンカーを含む、任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)のN末端にある、及び任意選択的に、ここで、前記Gly-Ser-Glyリンカーは、N末端からC末端の方向で、フリン切断部位：Gly-Ser-Glyリンカー：2Aリボソーム・スキッピング・エレメント(ribosome skipping element)、の並びの中にある。
【請求項３１５】
請求項３１０に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列内リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)(IRES)を含む。
【請求項３１６】
請求項３１０に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、外因性のプロモーターを含む。
【請求項３１７】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記リンカー配列、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、スプライス・アクセプター配列を含む。
【請求項３１８】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部はシグナル・ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ここで、前記シグナル・ペプチドは、前記遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチド、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチドに動作可能的に連結している。
【請求項３１９】
請求項３１８に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記シグナル・ペプチドは外因性のシグナル・ペプチドであり、任意選択的に、ここで、前記外因性のシグナル・ペプチドはヒト成長ホルモンのシグナル・ペプチドである。
【請求項３２０】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列は、同じリンカーのポリペプチド配列を含む。
【請求項３２１】
請求項３２０に記載のヌクレオチド組成物、ここで、同じリンカーのポリペプチド配列をコードする、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記第1リンカーのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列及び前記第2リンカーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、互いに対してコドンが異なる(codon diverged)。
【請求項３２２】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、コーディング領域(coding region)をコードする。
【請求項３２３】
請求項３２２に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記コーディング領域(coding region)は、以下からなる群より選択される：免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、T-細胞の機能を促進する因子、及び免疫チェックポイント阻害因子。
【請求項３２４】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、ノン-コーディング領域(non-coding region)をコードする。
【請求項３２５】
請求項３２４に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記ノン-コーディング領域(non-coding region)は、以下からなる群より選択される：shRNA、siRNA、miRNA、免疫系を調節する因子、サイトカイン、T細胞の機能を調節する因子、T-細胞の生存を促進する因子、及びT-細胞の機能を促進する因子。
【請求項３２６】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部は、TCR遺伝子の少なくとも一部を含む。
【請求項３２７】
請求項３２６に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下を含む： 
a)  TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；
b)  TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；及び
c)  第2リンカー配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項３２８】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部は、以下からなる群より選択される：マウス化TCR、ヒト化TCR、ドメイン・スワップをしたTCR、点変異を入れたTCR、ジスルフィド結合を形成できるように操作したシステインを有するように操作したTCR、コドンを最適化したTCR（ヒトで発現するのに最適化した）、配列を最適化したTCR（コドンの使用頻度及びRNA不安定性エレメント(RNA instability element)を除去することに最適化した）、TCR遺伝子の可変領域の配列、キメラ抗原レセプター(CAR)、及び単鎖TCR、の少なくとも一部。
【請求項３２９】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部がコードするポリペプチドは、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して第2の外因性のTCRポリペプチド配列と、より強く相互作用するように操作されている、任意選択的に、ここで、前記TCR-アルファのポリペプチド配列及び前記TCR-ベータのポリペプチド配列は、内因性のTCRポリペプチド配列と比較して、互いにより強く相互作用するように操作されている。
【請求項３３０】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端の方向で、リンカー：TCR-アルファ：第2リンカー：TCR-ベータ、の並びの中にある。
【請求項３３１】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記コードされたポリぺプチド配列は、N末端からC末端の方向で、リンカー：TCR-ベータ：第2リンカー：TCR-アルファ、の並びの中にある。
【請求項３３２】
上記ヌクレオチド組成物に関する請求項の何れか一項に記載のヌクレオチド組成物、ここで、前記遺伝子の少なくとも一部、前記TCR-アルファのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、前記TCR-ベータのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、又は前記TCR遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列を含む、並びにここで、前記コドンが異なる(codon diverged)ヌクレオチド配列は、内因性のヌクレオチド配列に対してコドンが異なる(codon diverged)。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2021501581.tif 000083
【図２】
2021501581.tif 000084
【図３】
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【図４】
2021501581.tif 000086
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
2021501581.tif 000089
【図７】
2021501581.tif 000090
【図８Ａ】
2021501581.tif 000091
【図８Ｂ】
2021501581.tif 000092
【図９】
2021501581.tif 000093
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
2021501581.tif 000096
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2021501581.tif 000102
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
2021501581.tif 000106
【図２１】
2021501581.tif 000107
【図２２】
2021501581.tif 000108
【図２３】
2021501581.tif 000109
【図２４】
2021501581.tif 000110
【図２５】
2021501581.tif 000111
【図２６Ａ】
2021501581.tif 000112
【図２６Ｂ】
2021501581.tif 000113
【図２６Ｃ】
2021501581.tif 000114
【図２６Ｄ】
2021501581.tif 000115
【図２７−１】
2021501581.tif 000116
【図２７−２】
2021501581.tif 000117
【図２８−１】
2021501581.tif 000118
【図２８−２】
2021501581.tif 000119
【図２９】
2021501581.tif 000120
【図３０Ａ】
2021501581.tif 000121
【図３０Ｂ】
2021501581.tif 000122
【図３０Ｃ】
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【図３１】
2021501581.tif 000124
【図３２】
2021501581.tif 000125
【図３３】
2021501581.tif 000126
【図３４】
2021501581.tif 000127
【国際調査報告】
2021501581.tif 000128
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