(57)【要約】超微量の生体サンプル中の無細胞胎児核酸から遺伝子情報を得るためのデバイス、システム、キット、および方法が本明細書で提供される。超微量のサンプルを得る利便性により、デバイス、システム、キット、および方法は必要な場所で少なくとも部分的に使用され得る。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法であって、
ａ）被験体から毛細管血を得る工程であって、毛細管血が無細胞核酸を含む、工程；
ｂ）無細胞核酸を随意に増幅する工程；
ｃ）タグ付けされた無細胞核酸のライブラリーを生成するために、無細胞核酸の少なくとも一部にタグ付けする工程；
ｄ）タグ付けされた無細胞核酸を随意に増幅する工程；
ｅ）タグ付けされた無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程；および、
ｆ）タグ付けされた無細胞核酸の少なくとも一部で少なくとも１つの標的配列の正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
少なくとも０．５の効率を有するライブラリーを生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クラウディング剤の存在下で無細胞核酸あるいはタグ付けされた無細胞核酸を増幅する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
無細胞核酸の末端を修復する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
毛細管血を得る工程は１ミリリットル以下の血液を得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
毛細管血を得る工程は１００マイクロリットル以下の血液を得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
毛細管血を得る工程は４０マイクロリットル以下の血液を得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的無細胞核酸は腫瘍からの無細胞核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標的無細胞核酸は胎児からの無細胞核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的無細胞核酸は移植組織あるいは臓器からの無細胞核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
方法であって、
ａ）被験体から生体サンプルを得る工程であって、生体サンプルが最大で約１０９の無細胞核酸分子を含む、工程；
ｂ）配列決定リードを生成するために無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程；
ｃ）少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程；および、
ｄ）少なくとも１つの染色体領域の正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程、
を含む、方法。
【請求項１２】
生体サンプルは、約５００μｌ未満の量を有する体液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生体サンプルは、約１μＬ〜約１００μｌの量を有する体液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
生体サンプルは、約５μＬ〜約８０μｌの量を有する体液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
生体サンプルは血液、血漿、血清、尿、間質液、膣細胞、膣液、頬側細胞、あるいは唾液を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
生体サンプルは血清または血漿である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
血液サンプルからの血漿または血清を分離する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
分離する工程は、血漿サンプルを生成するために、血液サンプルから、細胞、細胞断片、微小胞、あるいはこれらの組み合わせを取り除くべく、血液サンプルを濾過する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
血液サンプルを得る工程は、指を穿刺することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
生体サンプルは約１０４〜約１０９の無細胞核酸分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
生体サンプルは約１０４〜約１０７の無細胞核酸分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
生体サンプルは３００ｐｇ未満の無細胞核酸分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
生体サンプルは３ｎｇ未満の無細胞核酸分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
被験体は妊娠している被験体であり、無細胞核酸分子は無細胞胎児核酸分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
無細胞核酸は、組織中の腫瘍からの核酸を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
システムであって、
ａ）被験体の流体サンプルを採取するように構成されたサンプル採取装置；
ｂ）流体サンプルからサンプル成分を単離するように構成されるサンプルプロセッサー；
ｃ）流体サンプルあるいはサンプル成分中の核酸を検出するように構成される核酸検出器；および、
ｄ）核酸情報出力部、
を含む、システム。
【請求項２７】
サンプル採取装置は経皮的な穿刺装置を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
経皮的な穿刺装置は、針、ランセット、マイクロニードル、真空、およびマイクロニードルアレイの少なくとも１つを含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
サンプル成分は、細胞、炭水化物、リン脂質、タンパク質、核酸、および微小胞から選択される、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３０】
サンプル成分は血液細胞である、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３１】
サンプル成分は無細胞核酸を含まない、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３２】
サンプル成分は無細胞核酸を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３３】
サンプル成分は血漿または血清である、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３４】
サンプル精製装置は１ミリリットル未満の血液から血漿を単離するように構成される、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
サンプル精製装置は２５０μｌ未満の血液から血漿を単離するように構成される、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３６】
核酸検出器は核酸配列決定装置を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３７】
システムは、流体サンプル中の対象の核酸を標識するように構成され、核酸検出器は、サンプル中の対象の核酸の表現を検出するためにラベルを数える計数システムを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３８】
少なくとも１つの核酸増幅試薬と少なくとも１つのクラウディング剤を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３９】
流体サンプルからの無細胞核酸のライブラリーを生成するための少なくとも第１のラベルと、少なくとも１つの増幅試薬とを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４０】
核酸配列出力は、無線通信装置、有線通信装置、ケーブルポート、および、電子ディスプレイから選択される、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４１】
システムのすべての構成要素は１つの位置に存在する、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４２】
システムのすべての構成要素は１つのデバイスに収容される、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４３】
サンプル採取装置は第１の位置に位置し、サンプル精製装置と核酸検出器の少なくとも１つは第２の位置である、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４４】
サンプル採取装置、およびサンプル精製装置と核酸検出器の少なくとも１つは、同じ位置にある、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４５】
サンプル精製装置はフィルターを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４６】
フィルターは、約０．０５ミクロン〜約２ミクロンの孔径を有する、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
流体サンプルの少なくとも一部を輸送あるいは保存するための輸送あるいは保存区画を含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項４８】
輸送あるいは保存区画は、吸収パッド、流体用容器、サンプル防腐剤、あるいはこれらの組み合わせを含む、請求項４７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／５７８，１７９号の利益を主張する。優先権は３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９条に基づいて主張される。上記の特許出願は、あたかも本明細書に十分に記載されているかのように、引用により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検査は、被験体のＤＮＡおよび／またはそのＤＮＡの発現に関する情報を得るための手段である。遺伝子検査は、被験体のそのＤＮＡのＤＮＡおよび／または発現に関する情報を得るための手段である。遺伝子検査は、被験体に関する生体情報を得るために絶えず開発されている。この生体情報には多くの用途があり、個体の健康状態の判定、感染症または疾患を抱える個体の診断、個体に適した処置の決定、犯罪の解決、および父性の識別が挙げられる。現在、遺伝子検査は主に、診療所や研究所において、訓練を受けた人員が、使用のために技術訓練および専門的知識を必要とする高額かつ広大な器具を用いることにより実行される。通常、患者からの生体サンプルの入手から、患者への遺伝子検査結果の提供まで、数日から数週間を要する。
【０００３】
無細胞核酸は様々な組織型に由来し、個体の循環へ放出される。循環での無細胞核酸のプールはしばしば、組織型に寄与する遺伝的体質を表す。健康な個体の場合には、それは多くのばらつきなく非常に均質なプールであり得る。しかしながら、組織が顕著に異なるゲノムを含むとき、より不均一な無細胞核酸プールが観察され得る。顕著に異なるゲノムを持つ組織を有する被験体の一般的な例は、限定されないが：（ａ）腫瘍ＤＮＡが変異部位を含む癌患者、（ｂ）移植臓器が無細胞ＤＮＡのプールにドナーＤＮＡを放出する、臓器移植患者、および、（ｃ）胎盤が主に胎児のＤＮＡを表す無細胞ＤＮＡに寄与する、妊娠している女性を含む。いくつかの例では、ゲノムが、エピジェネティック修飾により顕著に異なり得る。様々な組織、臓器、および細胞型からのＤＮＡは、特徴的なエピジェネティックパターンを有することが示されてきた。したがって、限定されないが、脳、肝臓、脂肪、膵臓、内皮、および免疫細胞を含む、組織、臓器、および細胞からの無細胞核酸を検出することは可能であり得る。加えて、個体の組織または細胞型が疾患または感染に罹患しているとき、その個体で循環するその組織あるいは細胞型に由来するより多くの無細胞ＤＮＡが存在することもある。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書には、動物（ヒトまたは非ヒト）からのサンプルを含む生体サンプルの成分（例えば、核酸、タンパク質）を解析するためのデバイス、システム、キット、および方法が開示される。一般的に、本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、無細胞ＤＮＡ断片化を利用することにより、超微量のサンプルから遺伝子情報を提供することができる。簡潔にするために、これは「超微量リキッドバイオプシー」と呼ばれることがある。本開示以前は、超微量のサンプルから信頼できる有用な遺伝子情報を得ることができるとは期待されていなかった。なぜなら、超微量が、検出可能なあるいは有益な対象の特定の組織（例えば、脳、肝臓、胎盤、腫瘍）から十分な量の無細胞核酸をもたらすとは信じられていなかったためである。さらに、他の無細胞核酸からのバックグラウンドシグナル、とりわけ、血液細胞からのバックグラウンドシグナルが豊富であり、そのバックグラウンドシグナルが被験体ごとにばらつきがあることから、試験被験体と対照被験体との間での再現性と信頼できる比較は、ほぼ不可能なことのように考えられていた。
【０００５】
細胞内ＤＮＡとは対照的に、無細胞ＤＮＡは断片化されている。超微量のサンプルから無細胞ＤＮＡを解析するために、本明細書で開示される方法、デバイス、システム、および、キットは、反復領域（例えば、共通配列を有する領域）および／または複数の領域からの無細胞ＤＮＡフラグメントを、統計的に独立したマーカーとして利用する。反復領域（例えば、同じあるいは類似する配列の複数のコピーを含有するゲノム領域）あるいは多くの領域からの無細胞ＤＮＡフラグメントは、まとまって非断片化ＤＮＡ配列よりもサンプル中で高い有効濃度で存在するため、本明細書で開示される方法、デバイス、システム、およびキットは可能である。したがって、有用な遺伝子情報を得るのに十分に多くの分析物を含むサンプル量は、以前考えられていたよりも少ない。有利なことに、反復領域からのフラグメントは、単一の１対のプライマーで増幅され得るか、あるいは単一のプローブを用いて検出され得る。代替的に、あるいは、さらに、類似する配列を共有しない複数の検出領域は、例えば、それらにユニバーサルプライマーでタグ付けあるいは増幅するか、または、複数のプライマー対（例えば、マルチプレックスフォーマットの）で増幅することによって、少量で検出され得る。
【０００６】
超微量の生体サンプルから有用な遺伝子情報を得るその能力により、デバイス、システム、キット、および方法は、（１）最小限の侵襲性であること、（２）技術的な訓練をほとんどあるいはまったく受けることなく自宅で適用可能である（例えば、複雑な機器を必要としない）こと；および、（３）ある状態（例えば、妊娠、感染）の初期段階で有益であることという長所を有する。こうした利点は、実験室または専門家に対する要件を減少させるかなくし、それによって、患者の利便性、コンプライアンス、およびモニタリングを改善する。これは最終的には、医療制度への低コストで健康な結果を改善することにつながる。
【０００７】
無細胞循環核酸の解析は、多くの技術的な難題に遭遇する。例えば、血液中の循環核酸の増幅は、全血中の成分のうちのいくつか（例えば、ヘモグロビン）によって阻害され得る。本方法、本システム、および本デバイスがこの技術的な課題を解決する方法のうちの１つは、全血中の成分からの汚染を回避する方法で毛細管血から（無細胞核酸を含有する）血漿を得ることによるものである。
【０００８】
少量のサンプル中の無細胞循環核酸の解析はとりわけ困難である。この目標を達成しようとする過去の試みにもかかわらず、および本明細書に記載された理由により、必要なときに（例えば、指穿刺による毛細管血）採取することができる少量のサンプル中の無細胞ＤＮＡから得ることができるという領域は、懐疑的なままであった。本明細書で開示される方法、システム、およびデバイスは、これらの技術的な難題を克服するだけでなく、必要なときに使用することができ、これは、技術水準を考慮すれば実際には不可能なことであった。
【０００９】
例えば、５ミリリットル以上の血液中の循環無細胞腫瘍ＤＮＡを解析しようとする過去の試みは、サンプルが、変質を検出しやすくする、比較的高い全身腫瘍組織量（例えば、１５−２０％）と１５％の変質したゲノムの画分（ＦＧＡ）を有するときにのみ有益である。しかしながら、ほとんどの患者では、全身腫瘍組織量ははるかに低い。したがって、過去の試みは、患者集団の大部分を除外するものである。さらなる試みにおいて、少量の生体サンプルの解析は、白血球汚染によって失敗した。加えて、個体から５ミリリットル以上の血液を得るには検査技師を必要とし、これは、遺伝子解析の費用と患者の不便さ（例えば、遺伝子解析の時間、不快感、および費用によって引き起こされる不便さ）を増加させる。本方法、本デバイス、および本システムは、必要なときに（例えば、指穿刺による毛細管血）収集することができる５ミリリットル未満の量の毛細管血などの生体サンプルを解析することによって有用で正確な遺伝子情報を提供するように構成される。
【００１０】
たとえ過去の試みが少量のサンプルを解析したとしても、それらは人工的な結果をもたらした。例えば、少量のサンプルを解析するいくつかの過去の試みは、細胞株からのゲノムＤＮＡを希釈して、ゲノムＤＮＡを切断して無細胞（ｃｆＤＮＡ）サロゲートを生成および検出するものである。細胞株ＤＮＡ／切断されたＤＮＡのダウンサンプリングあるいは希釈、およびインシリコの方法は、分子の入力数が少ない個々のサンプルのサイズと長さの分布やビン情報を反映していないため、人工的な結果をもたらす。別の例において、少量のサンプルを解析する過去の試みは、「既知の事象」とも呼ばれ得るあらかじめ定義された突然変異の検出に依存しているため、人工的な結果をもたらす。本開示は、非サロゲートｃｆＤＮＡから正確であらかじめ定められていない遺伝子情報を提供する方式で少量の毛細管血（例えば、指穿刺）から血漿（無細胞核酸を含む）を得るための方法、システム、およびデバイスを示す。
【００１１】
本明細書に記載された過去の試みは、当初の検出工程でローパス／ローカバレッジ全ゲノム配列決定の組み合わせを使用し、その後、遺伝子解析を正確に実施するためにさらなる詳細で追加の解析を実施しなければならないものであった。ローパス／ローカバレッジの全ゲノム配列は、高感度で未知の事象を検出するには最適ではなく、さらに詳細な経過観察アッセイを必要とする。遺伝子解析を提供するために複数のアッセイを使用することは、コストがかかり、非効率的であり、必要なときに代替可能な解決策ではない。対照的に、本方法、本デバイス、および本システムは、少量のサンプル中でも検出可能な高濃度で集団的に存在する無細胞ＤＮＡの複数のフラグメントを使用することにより、超微量のサンプル量から正確な遺伝子解析を得るための方法を提供することにより、上記の問題を解決する。
【００１２】
本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、以下のように要約される。
【００１３】
いくつかの態様において、被験体から毛細管血を得る工程であって、毛細管血が無細胞核酸を含む、工程；配列決定リードを生成するために少なくとも無細胞核酸の一部を配列決定する工程；対象の少なくとも１つの標的配列に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程；および、少なくとも１つの標的配列の正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程、を含む方法が本明細書で開示される。さらに、被験体から毛細管血を得る工程であって、毛細管血が無細胞核酸を含む、工程；無細胞核酸を随意に増幅する工程；タグ付けされた無細胞核酸のライブラリを生成するために、無細胞核酸の少なくとも一部にタグ付けする工程；タグ付けされた無細胞核酸を随意に増幅する工程；タグ付けされた無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程；および、タグ付けされた無細胞核酸の少なくとも一部で少なくとも１つの標的配列の正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程、を含む方法が本明細書で開示される。方法は少なくとも０．５の効率を有するライブラリを生成する工程を含み得る。方法はクラウディング剤の存在下で無細胞核酸あるいはタグ付けされた無細胞核酸を増幅する工程を含み得る。方法は無細胞核酸の末端を修復する工程を含み得る。いくつかの態様において、方法は、被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、生体サンプルは、一緒に全無細胞核酸を構成する、標的無細胞核酸と非標的無細胞核酸を含み、および、標的無細胞核酸が全無細胞核酸の５％未満である、工程；配列決定リードを生成するために標的無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程；対象の少なくとも１つの標的配列に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程；および、少なくとも１つの標的配列の正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程、を含む。生体サンプルは毛細管血を含み得る。生体サンプルは毛細管血から本質的になり得る。生体サンプルを得る工程は、毛細管血を得ることを含み得る。生体サンプルを得る工程は、毛細管血を得ることから本質的になり得る。生体サンプルを得る工程は、静脈血を得ることを含まないことがある。生体サンプルを得る工程は、静脈切開を行うことを含まないことがある。生体サンプルを得る工程は、１ミリリットル以下の血液を得ることを含み得る。生体サンプルを得る工程は、１００マイクロリットル以下の血液を得ることを含み得る。生体サンプルを得る工程は、４０マイクロリットル以下の血液を得ることを含み得る。方法は少なくとも９８％の精度で少なくとも１つの標的配列の正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程を含み得る。方法は全ゲノム増幅を含み得る。方法は全ゲノム増幅を含まないこともある。いくつかの例では、標的無細胞核酸は腫瘍からの無細胞核酸である。いくつかの例では、標的無細胞核酸は胎児からの無細胞核酸である。いくつかの例では、標的無細胞核酸は移植組織あるいは臓器からの無細胞核酸である。
【００１４】
被験体から生体サンプルを得る工程であって、生体サンプルは最大で約１０９の無細胞核酸分子を含む、工程；配列決定リードを生成するために無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程；少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程；および、少なくとも１つの染色体領域の正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程、を含む方法が本明細書で開示される。いくつかの例では、生体サンプルは、約５００μｌ未満の量を有する体液である。いくつかの例では、生体サンプルは、約１μＬ〜約１００μｌの量を有する体液である。いくつかの例では、生体サンプルは、約５μＬ〜約８０μｌの量を有する体液である。いくつかの例では、生体サンプルは、約５μＬ〜約６０μｌの量を有する。方法は配列決定の前に無細胞核酸分子を増幅する工程を含み得る。方法は配列決定の前および増幅の後に、無細胞核酸分子にタグ付けする工程を含み得る。方法は配列決定の前に無細胞核酸分子にタグ付けする工程を含み得る。方法は無細胞核酸分子のタグ付けの後に無細胞核酸分子を増幅する工程を含み得る。方法は無細胞核酸分子のタグ付けの前に無細胞核酸分子を増幅する工程を含み得る。方法は、ランダムなオリゴヌクレオチドプライマーに、無細胞核酸分子を接触させることを含む増幅する工程を含み得る。増幅は等温増幅を含み得る。方法は、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの過剰表現を検出する工程を含み得る。方法は、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの過少表現を検出する工程を含み得る。方法は、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの数を、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの基準数と比較する工程を含み得る。方法は、少なくとも１つの染色体領域に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程を含み得る。方法は、少なくとも１つの非標的染色体領域に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程を含み得る。一般的に、生体サンプルは体液である。生体サンプルは血液、血漿、血清、尿、間質液、膣細胞、膣液、頬側細胞、あるいは唾液を含み得る。生体サンプルは血液、血漿、血清、尿、間質液、膣液、あるいは唾液から本質的になり得る。いくつかの例では、生体サンプルは血清である。いくつかの例では、生体サンプルは血漿である。方法はさらに、血液サンプルからの血漿または血清を分離する工程を含み得る。分離する工程は、血漿サンプルを生成するために、血液サンプルから、細胞、細胞フラグメント、微小胞、あるいはこれらの組み合わせを取り除くべく、血液サンプルを濾過する工程を含み得る。生体サンプルは、約５μｌ〜約１ｍｌの量を有する血液サンプルであり得る。生体サンプルは、約５μｌ〜約１５０μｌの量を有する血液サンプルであり得る。血液サンプルを得る工程は、指を穿刺することを含み得る。血液サンプルを得る工程は、穿刺された指から血液を絞り取るあるいは絞ることを含み得る。いくつかの例では、方法は、穿刺された指から血液を絞り取るあるいは絞ることを含まないこともある。いくつかの例では、血液サンプルを得る工程は静脈切開を含まない。生体サンプルは約１０４〜���１０９の無細胞核酸分子を含み得る。生体サンプルは約１０４〜約１０８の無細胞核酸分子を含み得る。生体サンプルは約１０４〜約１０７の無細胞核酸分子を含み得る。生体サンプルは３００ｐｇ未満の無細胞核酸分子を含み得る。生体サンプルは３ｎｇ未満の無細胞核酸分子を含み得る。方法は、９８％を超える精度で正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程を含み得る。方法は、９９％を超える精度で正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程を含み得る。いくつかの例では、被験体は妊娠している被験体であり、無細胞核酸分子は無細胞胎児核酸分子を含む。方法は、少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの数を、少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの基準数と比較する工程を含み得る。いくつかの例では、基準数は、正倍数体の胎児を有する少なくとも１つの正倍数体の妊娠している被験体からの少なくとも１つのサンプルに基づく。いくつかの例では、基準数は、異数体の胎児を有する少なくとも１つの正倍数体の妊娠している被験体からの少なくとも１つのサンプルに基づく。いくつかの例では、少なくとも１つのサンプルは、生体サンプルと同じサンプル型と同じサンプル量である。いくつかの例では、生体サンプルは、約１０６〜約１０１２の全無細胞核酸分子を含み、ここで、全無細胞核酸分子は本質的に、無細胞胎児核酸分子と母体の無細胞核酸分子からなる。方法は、少なくとも１つの非標的染色体領域に対応する配列決定リードに対する少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの比率が、正倍数体の胎児を有する対照の妊娠している正倍数体の被験体からの対照生体サンプル中のそれぞれの比率とは異なるときに、少なくとも１つの染色体領域の胎児異数性があることを検出する工程を含み得る。方法は、少なくとも１つの非標的染色体領域に対応する配列決定リードに対する少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの比率が、正倍数体の胎児を有する対照の妊娠している正倍数体の被験体からの対照生体サンプル中のそれぞれの比率と同じであるときに、少なくとも１つの染色体領域の胎児異数性があることを検出する工程を含み得る。いくつかの例では、少なくとも１つの染色体領域は、染色体１３、染色体１６、染色体１８、染色体２１、染色体２２、染色体Ｘ、あるいは染色体Ｙの少なくとも１つにある。いくつかの例では、少なくとも１つの非標的染色体領域は、染色体１３、染色体１６、染色体１８、染色体２１、染色体２２、染色体Ｘ、あるいは染色体Ｙ以外の染色体の少なくとも１つである。いくつかの例では、妊娠している被験体は妊娠５週目ほどである。いくつかの例では、妊娠している被験体は正倍数体である。いくつかの例では、生体サンプルは、約１０４〜約１０９の無細胞胎児核酸を含む。いくつかの例では、生体サンプルは、約１０４〜約１０８の無細胞胎児核酸を含む。方法は少なくとも２０００の無細胞胎児核酸を配列決定する工程を含み得る。方法は、少なくとも染色体領域に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程を含み得る。いくつかの例では、少なくとも１つの染色体領域の表現は、対照胎児を身籠っている少なくとも一人の対照の���娠している被験体における対象表現に対するものである。いくつかの例では、少なくとも一人の対照の妊娠している被験体と対照の胎児は、異数体を有していない。いくつかの例では、少なくとも一人の対照の妊娠している被験体と対照の胎児は、遺伝的異常を有していない。いくつかの例では、少なくとも一人の対照の妊娠している被験体と対照の胎児は、染色体領域に対応する異数体を有する。いくつかの例では、少なくとも一人の対照の妊娠している被験体と対照の胎児は、標的染色体領域に対応する遺伝的異常を有する。いくつかの実例では、無細胞核酸は、組織中の腫瘍からの核酸を含む。方法は、少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの数を、少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの基準数と比較する工程を含み得る。いくつかの例では、基準数は、組織中に腫瘍のない被験体からの少なくとも１つのサンプルに基づく。いくつかの例では、基準数は、組織中に腫瘍を有する被験体からの少なくとも１つのサンプルに基づく。いくつかの例では、無細胞核酸は、被験体へ移植された臓器あるいは組織からの核酸を含む。いくつかの例では、無細胞核酸は臓器または組織に特有である。いくつかの例では、配列決定は全ゲノム配列決定を含む。いくつかの例では、配列決定はランダムな超並列配列決定を含む。いくつかの例では、配列決定は標的化された配列決定を含む。いくつかの例では、配列決定はナノポア配列決定を含む。
【００１５】
被験体から生体サンプルを得る工程であって、生体サンプルは最大で約１０１０の無細胞核酸分子を含む、工程；無細胞核酸分子の少なくとも一部の少なくとも１つの染色体領域上のエピジェネティック修飾を分析する工程；および、少なくとも１つの染色体領域の正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程、を含む方法も本明細書で開示される。いくつかの例では、生体サンプルは、最大で約１０９の無細胞核酸分子を含む。さらに、被験体から毛細管血を得る工程；無細胞核酸分子の少なくとも一部の少なくとも１つの染色体領域上のエピジェネティック修飾を分析する工程；および、少なくとも１つの染色体領域の正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程、を含む方法が本明細書で開示される。方法は２００μｌ以下の毛細管血を得る工程を含み得る。方法は１００μｌ以下の毛細管血を得る工程を含み得る。
【００１６】
被験体の流体サンプルを採取するように構成されたサンプル採取装置；流体サンプルからサンプル成分を単離するように構成されるサンプルプロセッサー；流体サンプルあるいはサンプル成分中の核酸を検出するように構成される核酸検出器；および、核酸情報出力部、を含むシステムが本明細書で開示される。本明細書で開示されるシステムは、キットとして提示され得る。いくつかの例では、サンプル採取装置は経皮的な穿刺装置を含む。いくつかの例では、経皮的な穿刺装置は、針、ランセット、マイクロニードル、真空、およびマイクロニードルアレイの少なくとも１つを含む。いくつかの例では、サンプル成分は、細胞、炭水化物、リン脂質、タンパク質、核酸、および微小胞から選択される。いくつかの例では、サンプル成分は血液細胞である。いくつかの例では、サンプル成分は無細胞核酸を含まない。いくつかの例では、サンプル成分は無細胞核酸を含む。いくつかの例では、サンプル成分は血漿または血清である。サンプル精製装置は１ミリリットル未満の血液から血漿を単離するように構成され得る。サンプル精製装置は２５０μｌ未満の血液から血漿を単離するように構成され得る。サンプル精製装置は１５０μｌ未満の血液から血漿を単離するように構成され得る。サンプル精製装置は１００μｌ未満の血液から血漿を単離するように構成され得る。核酸検出器は核酸配列決定装置を含み得る。システムは、流体サンプル中の対象の核酸を標識するように構成され得、核酸検出器は、サンプル中の対象の核酸の表現を検出するためにラベルを数える計数システムを含む。システムはラベルを含み、ラベルは、対象の核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは対象の染色体領域に特異的なこともある。対象の染色体領域は、染色体１３、染色体１６、染色体１８、染色体２１、染色体２２、染色体Ｘ、および染色体Ｙから選択された染色体にあり得る。対象の染色体領域は、疾患または疾病を示す配列を含み得るか、あるいは、含むことができる。対象の染色体領域は、疾患または疾病を示す少なくとも１つのエピジェネティック修飾を含み得るか、あるいは、含むことができる。疾病は遺伝的異常であり得る。疾病は癌であり得る。疾病は移植組織または臓器であり得る。システムは、プライマー、ポリメラーゼ、およびこれらの組み合わせから選択された少なくとも１つの核酸増幅試薬を含み得る。少なくとも１つの核酸増幅試薬は、少なくとも１つの等温増幅試薬を含み得る。少なくとも１つの等温増幅試薬は、レコンビナーゼポリメラーゼ、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質、鎖置換ポリメラーゼ、あるいはこれらの組み合わせを含み得る。システムは少なくとも１つの核酸増幅試薬と少なくとも１つのクラウディング剤を含み得る。システムは、流体サンプルからの無細胞核酸のライブラリを生成するための少なくとも第１のラベルと、少なくとも１つの増幅試薬とを含み得る。システムは少なくとも１つのアンプリコンを生成するために少なくとも１つの増幅試薬で無細胞核酸を増幅するように構成され、ライブラリを生成するために少なくとも第１のラベルに少なくとも１つのアンプリコンを接触させる。システムは第２のラベルに少なくとも１つのアンプリコンを接触させるように構成され得、第２のラベルは検出可能である。システムはライブラリを生成し、および、少なくとも１つの増幅試薬でライブラリの少なくとも１つのメンバーを増幅するように構成され得る。核酸配列出力は、無線通信装置、有線通信装置、ケーブルポート、および、電子ディスプレイから選択され得る。いくつかの例では、システムのすべての構成要素は１つの位置に存在する。いくつかの例では、システムのすべての構成要素は１つのデバイスに収容される。いくつかの例では、サンプル採取装置は第１の位置に位置し、サンプル精製装置と核酸検出器の少なくとも１つは第２の位置である。いくつかの例では、サンプル採取装置、およびサンプル精製装置と核酸検出器の少なくとも１つは、同じ位置にある。いくつかの例では、サンプル精製装置はフィルターを含む。いくつかの例では、サンプル精製装置は、ウィッキング材料、あるいはフィルターを通って体液を押したり引っ張ったりするための毛細管装置を含む。いくつかの例では、フィルターは、約０．０５ミクロン〜約２ミクロンの孔径を有する。いくつかの例では、サンプル精製装置は、体液サンプル中の核酸、タンパク質、細胞表面マーカー、あるいは微小胞表面マーカーと結合する結合部分を含む。いくつかの例では、結合部分は、抗体、抗原結合性抗体フラグメント、リガンド、受容体、ペプチド、小分子、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、結合部分は細胞外小胞と結合することができ、ここで、細胞外小胞は、女性の被験体の胎児の細胞あるいは胎盤の細胞から放出される。いくつかの例では、結合部分は固体の支持体に結合し、ここで、結合部分が生体サンプルと接触した後、固体の支持体は、生体サンプルの残りから分離され得るか、あるいは、生体サンプルは固体の支持体から分離され得る。システムは、流体サンプルの少なくとも一部を輸送あるいは保存するための輸送あるいは保存区画を含み得る。いくつかの例では、輸送あるいは保存区画は、吸収パッド、流体用容器、サンプル防腐剤、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、輸送あるいは保存区画は、輸送または保存される流体サンプルの細胞を安定化させる試薬または材料を含む。システムは、その構成要素のデバイスを冷却あるいは加熱するための、容器、ポーチ、ワイヤー、および、ケーブルの少なくとも１つを含み得る。システムは、無細胞核酸の修復、精製、増幅、および配列決定の少なくとも１つのための少なくとも１つの緩衝液を含み得る。
【００１７】
本明細書で開示される被験体の流体サンプルを採取するように構成されたサンプル採取装置；流体サンプルからサンプル成分を単離するように構成されるサンプルプロセッサー；流体サンプルあるいはサンプル成分中の核酸を検出するように構成される核酸検出器；および、核酸情報出力部、を含むデバイスが本明細書で開示される。いくつかの例では、サンプル採取装置は経皮的な穿刺装置を含む。いくつかの例では、経皮的な穿刺装置は、針、ランセット、マイクロニードル、真空、およびマイクロニードルアレイの少なくとも１つを含む。いくつかの例では、サンプル成分は、細胞、炭水化物、リン脂質、タンパク質、核酸、および微小胞から選択される。いくつかの例では、サンプル成分は血液細胞である。いくつかの例では、サンプル成分は無細胞核酸を含まない。いくつかの例では、サンプル成分は無細胞核酸を含む。いくつかの例では、サンプル成分は血漿または血清である。サンプル精製装置は１ミリリットル未満の血液から血漿を単離するように構成され得る。サンプル精製装置は２５０μｌ未満の血液から血漿を単離するように構成され得る。サンプル精製装置は１５０μｌ未満の血液から血漿を単離するように構成され得る。サンプル精製装置は１００μｌ未満の血液から血漿を単離するように構成され得る。核酸検出器は核酸配列決定装置を含み得る。デバイスは、流体サンプル中の対象の核酸を標識するように構成され得、核酸検出器は、サンプル中の対象の核酸の表現を検出するためにラベルを数える計数システムを含む。デバイスはラベルを含み、ラベルは、対象の核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは対象の染色体領域に特異的なこともある。対象の染色体領域は、染色体１３、染色体１６、染色体１８、染色体２１、染色体２２、染色体Ｘ、および染色体Ｙから選択された染色体にあり得る。対象の染色体領域は、疾患または疾病を示す配列を含み得るか、あるいは、含むことができる。対象の染色体領域は、疾患または疾病を示す少なくとも１つのエピジェネティック修飾を含み得るか、あるいは、含むことができる。疾病は遺伝的異常であり得る。疾病は癌であり得る。疾病は移植組織または臓器であり得る。デバイスは、プライマー、ポリメラーゼ、およびこれらの組み合わせから選択された少なくとも１つの核酸増幅試薬を含み得る。少なくとも１つの核酸増幅試薬は、少なくとも１つの等温増幅試薬を含み得る。少なくとも１つの等温増幅試薬は、レコンビナーゼポリメラーゼ、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質、鎖置換ポリメラーゼ、あるいはこれらの組み合わせを含み得る。デバイスは、少なくとも１つの核酸増幅試薬と少なくとも１つのクラウディング剤を含み得る。デバイスは、流体サンプルからの無細胞核酸のライブラリを生成するための少なくとも第１のラベルと、少なくとも１つの増幅試薬とを含み得る。デバイスは、少なくとも１つのアンプリコンを生成するために少なくとも１つの増幅試薬で無細胞核酸を増幅するように構成され、ライブラリを生成するために少なくとも第１のラベルに少なくとも１つのアンプリコンを接触させる。デバイスは、第２のラベルに少なくとも１つのアンプリコンを接触させるように構成され得、第２のラベルは検出可能である。デバイスは、ライブラリを生成し、および、少なくとも１つの増幅試薬でライブラリの少なくとも１つのメンバーを増幅するように構成され得る。核酸配列出力は、無線通信装置、有線通信装置、ケーブルポート、および、電子ディスプレイから選択され得る。いくつかの例では、デバイスのすべての構成要素は１つの位置に存在する。いくつかの例では、デバイスのすべての構成要素は１つのデバイスに収容される。いくつかの例では、サンプル採取装置は第１の位置に位置し、サンプル精製装置と核酸検出器の少なくとも１つは第２の位置である。いくつかの例では、サンプル採取装置、およびサンプル精製装置と核酸検出器の少なくとも１つは、同じ位置にある。いくつかの例では、サンプル精製装置はフィルターを含む。いくつかの例では、サンプル精製装置は、ウィッキング材料、あるいはフィルターを通って体液を押したり引っ張ったりするための毛細管装置を含む。いくつかの例では、フィルターは、約０．０５ミクロン〜約２ミクロンの孔径を有する。いくつかの例では、サンプル精製装置は、体液サンプル中の核酸、タンパク質、細胞表面マーカー、あるいは微小胞表面マーカーと結合する結合部分を含む。いくつかの例では、結合部分は、抗体、抗原結合性抗体フラグメント、リガンド、受容体、ペプチド、小分子、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、結合部分は細胞外小胞と結合することができ、ここで、細胞外小胞は、女性の被験体の胎児の細胞あるいは胎盤の細胞から放出される。いくつかの例では、結合部分は固体の支持体に結合し、ここで、結合部分が生体サンプルと接触した後、固体の支持体は、生体サンプルの残りから分離され得るか、あるいは、生体サンプルは固体の支持体から分離され得る。デバイスは、流体サンプルの少なくとも一部を輸送あるいは保存するための輸送あるいは保存区画を含み得る。いくつかの例では、輸送あるいは保存区画は、吸収パッド、流体用容器、サンプル防腐剤、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、輸送あるいは保存区画は、輸送または保存される流体サンプルの細胞を安定化させる試薬または材料を含む。デバイスは、その構成要素のデバイスを冷却あるいは加熱するための、容器、ポーチ、ワイヤー、および、ケーブルの少なくとも１つを含み得る。デバイスは、無細胞核酸の修復、精製、増幅、および配列決定の少なくとも１つのための少なくとも１つの緩衝液を含み得る。
【００１８】
被験体の腫瘍の存在を検出するためのシステムの使用が本明細書でさらに開示される。被験体における胎児の異数体を検出するためのシステムの使用が本明細書で開示される。被験体の移植臓器の状態を検出するためのシステムの使用が本明細書でさらに開示される。被験体における腫瘍の存在を検出するためのデバイスの使用が本明細書で開示される。被験体における胎児の異数体を検出するためのデバイスの使用が本明細書でさらに開示される。被験体の移植臓器の状態を検出するためのデバイスの使用が本明細書で開示される。
【００１９】
別の態様では、妊娠している被験体の生体サンプルを得る工程であって、生体サンプルは最大で約１０９の無細胞胎児核酸分子を含む、工程；配列決定リードを生成するために無細胞胎児核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程；少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程；および、少なくとも１つの染色体領域の正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程、を含む方法が本明細書で開示される。いくつかの例では、生体サンプルは、約５００μｌ未満の量を有する。いくつかの例では、生体サンプルは、約１μｌ〜約１００μｌの量を有する。いくつかの例では、生体サンプルは、約５μｌ〜約８０μｌの量を有する。いくつかの例では、生体サンプルは、約５μｌ〜約６０μｌの量を有する。いくつかの例では、方法は配列決定の前に無細胞胎児核酸分子を増幅する工程を含む。いくつかの例では、方法は配列決定の前および増幅の後に、無細胞胎児核酸分子にタグ付けする工程を含み得る。いくつかの例では、方法は配列決定の前に無細胞胎児核酸分子にタグ付けする工程を含む。いくつかの例では、方法は無細胞胎児核酸分子のタグ付けの後に、無細胞胎児核酸分子を増幅する工程を含む。いくつかの例では、方法は、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの過剰表現を検出する工程を含む。いくつかの例では、方法は、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの過少表現を検出する工程を含む。いくつかの例では、方法は、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの数を、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの基準数と比較する工程を含む。いくつかの例では、基準数は、正倍数体の胎児を有する少なくとも１つの正倍数体の妊娠している被験体からの少なくとも１つのサンプルに基づく。いくつかの例では、基準数は、異数体の胎児を有する少なくとも１つの正倍数体の妊娠している被験体からの少なくとも１つのサンプルに基づく。いくつかの例では、少なくとも１つのサンプルは、生体サンプルと同じサンプル型と同じサンプル量である。いくつかの例では、方法は、少なくとも１つの染色体領域に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程を含む。いくつかの例では、方法は、少なくとも１つの非標的染色体領域に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程を含み得る。いくつかの例では、方法は、少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードに対する少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの比率が、正倍数体の胎児を有する対照の妊娠している正倍数体の被験体からの対照生体サンプル中のそれぞれの比率とは異なるときに、少なくとも１つの標的染色体領域の胎児異数性があることを検出する工程を含む。いくつかの例では、方法は、少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードに対する少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの比率が、正倍数体の胎児を有する対照の妊娠している正倍数体の被験体からの対照生体サンプル中のそれぞれの比率と同じであるときに、少なくとも１つの標的染色体の胎児異数性がないことを検出する工程を含む。いくつかの例では、生体サンプ���は体液である。いくつかの例では、生体サンプルは血液、血漿、血清、尿、間質液、膣細胞、膣液、頬側細胞、あるいは唾液を含む。いくつかの例では、生体サンプルは血清あるいは血漿である。いくつかの例では、方法は血液サンプルから血漿あるいは血清を分離する工程を含む。いくつかの例では、分離する工程は、血漿サンプルを生成するために、血液サンプルから、細胞、細胞フラグメント、微小胞、あるいはこれらの組み合わせを取り除くべく、血液サンプルを濾過する工程を含む。いくつかの例では、方法は、妊娠している被験体から血液サンプルを得る工程であって、血液サンプルが、約５μｌ〜約１ｍｌの量を有する、工程を含む。いくつかの例では、方法は、妊娠している被験体から血液サンプルを得る工程であって、血液サンプルが、約５μｌ〜約１５０μｌの量を有する、工程を含む。いくつかの例では、血液サンプルを得る工程は、被験体を経皮的な穿刺装置に接触させることを含む。いくつかの例では、血液サンプルを得る工程は指の穿刺を含む。いくつかの例では、方法は、穿刺された指から血液を絞り取る工程を含む。いくつかの例では、血液サンプルを得る工程は静脈切開を含まない。いくつかの例では、生体サンプルは、約１０４〜約１０９の無細胞胎児核酸分子を含む。いくつかの例では、生体サンプルは、約１０４〜約１０８の無細胞胎児核酸分子を含む。いくつかの例では、生体サンプルは、約１０４〜約１０７の無細胞胎児核酸分子を含む。いくつかの例では、生体サンプルは、約１０６〜約１０１２の全無細胞核酸分子を含み、ここで、全無細胞核酸分子は本質的に、無細胞胎児核酸分子と母体の無細胞核酸分子からなる。いくつかの例では、生体サンプルは、３ｎｇの全無細胞核酸分子を含む。いくつかの例では、生体サンプルは、３００ｐｇ未満の無細胞核酸分子を含む。いくつかの例では、妊娠している被験体は妊娠５週目ほどである。いくつかの例では、増幅する工程は、ランダムなオリゴヌクレオチドプライマーに、無細胞胎児核酸分子を接触させることを含む。いくつかの例では、増幅する工程は等温増幅を含む。いくつかの例では、増幅する工程は室温で生じる。いくつかの例では、状態は９８％よりも高い精度で検出される。いくつかの例では、状態は９９％よりも高い精度で検出される。いくつかの例では、少なくとも１つの染色体領域は、染色体１３、染色体１６、染色体１８、染色体２１、染色体２２、染色体Ｘ、あるいは染色体Ｙの少なくとも１つにある。いくつかの例では、少なくとも１つの非標的染色体領域は、染色体１３、染色体１６、染色体１８、染色体２１、染色体２２、染色体Ｘ、あるいは染色体Ｙ以外の染色体の少なくとも１つである。いくつかの例では、妊娠している被験体は正倍数体である。いくつかの例では、配列決定は全ゲノム配列決定を含む。いくつかの例では、配列決定はランダムな超並列配列決定を含む。いくつかの例では、配列決定は標的化された配列決定を含む。いくつかの例では、生体サンプルは、約１０４〜約１０９の無細胞胎児核酸を含む。いくつかの例では、生体サンプルは、約１０４〜約１０８の無細胞胎児核酸を含む。いくつかの例では、方法は、少なくとも２０００の無細胞胎児核酸を配列決定する工程を含���。いくつかの例では、方法は、少なくとも１つの標的染色体に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程を含む。いくつかの例では、染色体領域の表現は、対照胎児を身籠っている少なくとも一人の対照の妊娠している被験体における対象表現に対するものである。いくつかの例では、対照の妊娠している被験体と対照の胎児の少なくとも一人は、異数体を有していない。いくつかの例では、対照の妊娠している被験体と対照の胎児の少なくとも一人は、遺伝的異常を有していない。いくつかの例では、対照の妊娠している被験体と対照の胎児の少なくとも一人は、染色体領域に対応する異数体を有する。いくつかの例では、対照の妊娠している被験体と対照の胎児の少なくとも一人は、標的染色体領域に対応する遺伝的異常を有する。
【００２０】
別の態様では、妊娠している被験体の生体サンプルを得る工程であって、生体サンプルは最大で約１０９の無細胞胎児核酸分子を含む、工程；タグ付けされた無細胞胎児核酸分子を生成するために、無細胞胎児核酸分子の少なくとも一部にタグ付けする工程；タグ付けされた無細胞胎児核酸分子の数を測定する工程；および、少なくとも１つの染色体領域の正常な表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程、を含む方法が本明細書で開示される。いくつかの例では、無細胞胎児核酸分子の少なくとも一部にタグ付けする工程は、標的染色体領域からの無細胞胎児核酸分子にタグ付けすることを含む。いくつかの例では、方法は配列決定を含まない。いくつかの例では、方法は、少なくとも一人の妊娠している被験体から複数の生体サンプルを得る工程であって、生体サンプルはそれぞれ、最大で約１０９の無細胞胎児核酸分子を含む、工程；および、異なる指標を用いて各生体サンプルから無細胞胎児核酸分子に指標付けする工程であって、それによって、無細胞胎児核酸分子にサンプル識別子を提供する、工程とを含む。いくつかの例では、方法は、標的染色体領域からの無細胞胎児核酸分子にタグ付けする工程を含む。
【００２１】
別の態様では、妊娠している被験体の流体サンプルを集めるためのサンプル採取装置；流体サンプルからサンプル成分を捕捉するか取り除くサンプル精製装置；核酸検出器；および、核酸情報出力部、を含むシステムが本明細書で開示される。いくつかの例では、サンプル採取装置は経皮的な穿刺装置を含む。いくつかの例では、経皮的な穿刺装置は、針、ランセット、マイクロニードル、およびマイクロニードルアレイから選択される。いくつかの例では、サンプル成分は、細胞、タンパク質、核酸、および微小胞から選択される。いくつかの例では、核酸検出器は核酸配列決定装置を含む。いくつかの例では、核酸検出器は、流体サンプルの対象の核酸を標識し、サンプル中の対象の核酸の表現を検出するためにラベルを計測する、計測システムを含む。いくつかの例では、計測システムはラベルを含み、ラベルは、対象の核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの例では、核酸配列出力は、無線通信装置、有線通信装置、ケーブルポート、および、電子ディスプレイから選択される。いくつかの例では、システムのすべての構成要素は１つの位置に存在する。いくつかの例では、システムのすべての構成要素は１つのデバイスに収容される。いくつかの例では、サンプル採取装置は第１の位置に位置し、サンプル精製装置と核酸検出器の少なくとも１つは第２の位置である。いくつかの例では、サンプル精製装置はフィルターを含む。いくつかの例では、サンプル精製装置は、ウィッキング材料、フィルターを通して体液を押したり引っ張ったりするための毛細管装置を含む。いくつかの例では、フィルターは、約０．０５ミクロン〜約２ミクロンの孔径を有する。いくつかの例では、サンプル精製装置は、体液サンプル中の核酸、タンパク質、細胞表面マーカー、あるいは微小胞表面マーカーと結合する結合部分を含む。いくつかの例では、結合部分は、抗体、抗原結合性抗体フラグメント、リガンド、受容体、ペプチド、小分子、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、結合部分は細胞外小胞と結合することができ、ここで、細胞外小胞は、女性の被験体の胎児の細胞あるいは胎盤の細胞から放出される。いくつかの例では、結合部分は固体の支持体に結合し、ここで、結合部分が生体サンプルと接触した後、固体の支持体は、生体サンプルの残りから分離され得るか、あるいは、生体サンプルは固体の支持体から分離され得る。いくつかの例では、システムは、プライマー、ポリメラーゼ、およびこれらの組み合わせから選択された少なくとも１つの核酸増幅試薬を含む。いくつかの例では、少なくとも１つの核酸増幅試薬は、少なくとも１つの等温増幅試薬を含む。いくつかの例では、少なくとも１つの等温増幅試薬は、レコンビナーゼポリメラーゼ、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質、鎖置換ポリメラーゼ、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、システムは、生体サンプルの少なくとも一部を輸送するための輸送あるいは保存区画を含む。いくつかの例では、輸送あるいは保存区画は、吸収パッド、流体用容器、サンプル防腐剤、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、システムは、その構成要素のデバイスを冷却あるいは加熱するための、容器、ポーチ、ワイヤー、および、ケーブルの少なくとも１つを含む。いくつかの例では、システムは、無細胞核酸の修復、精製、増幅、および配列決定の少なくとも１つのための少なくとも１つの緩衝液を含む。
【００２２】
本開示の他の目的、特徴、および利点は、後述する詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。しかしながら、詳細な記載と特定の実施例は、本開示のいくつかの実施形態を示しているが、例示に過ぎず限定するものではないことが理解されよう。本開示の範囲内の多くの変更と修正が、その精神から逸脱することなく行なわれ得、本開示はそのような修正をすべて含む。さらに、１つの実施形態の態様は、他の様々な実施形態で利用され得る。
【００２３】
引用による組み込み
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により本明細書に具体的かつ個別に組み込まれるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本明細書で開示される方法、デバイス、システム、およびキットの新しい特徴は、とりわけ添付の請求項において詳細に明記される。本明細書で開示される本デバイス、本システム、および、本キットの特徴と利点についてのよりよい理解は、本明細書で開示されるデバイス、システム、およびキットの原則が用いられる例示的な実施形態を説明する以下の詳細な記載と、添付の図面を参照することによって得られる：
【図１】本明細書で開示される方法に関する随意のワークフローを示す。
【図２】本明細書で開示される方法およびシステムの構成要素がどのようにして様々な位置（物理的および／または電子的）で分布し得るか、あるいは、主として１つの物理的な位置に集中し得るかの図を示す。
【図３】ローカバレッジの全ゲノムの合成による配列決定（ｌｏｗ  ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって生成された超微量サンプル量からのトリソミー検出の結果を示す。基準と試験のサンプルからの染色体２１の表現に対するＺスコアが描かれる。点線は、３のＺスコアを表す。３以上のＺスコアを示す試験サンプルは、サンプルが染色体２１のより高い表現を含み、染色体２１に対してトリソミーであると考えられることを意味している。サンプルが妊娠している女性からのものである場合、検出された過剰な量の染色体２１は、胎児が原因であり、したがって、胎児が染色体２１のトリソミーであると結論付けられる。
【図４Ａ】リモートシステムと個体に接続されるデバイスのプロセスの概要を示す。
【図４Ｂ】リモートシステムと個体に接続されるデバイスの例示的なインターフェースを示す。
【図５Ａ】モバイルデバイスを示し、および、モバイルアプリケーションが、本明細書で開示されるデバイス、システム、およびキットと接続し、通信し、これらから遺伝子情報および他の情報を受け取るためにどのように構成されているのかを示す。図５Ａは、モバイルアプリケーションが提供する様々な機能を示す。
【図５Ｂ】モバイルデバイスを示し、および、モバイルアプリケーションが、本明細書で開示されるデバイス、システム、およびキットと接続し、通信し、これらから遺伝子情報および他の情報を受け取るためにどのように構成されているのかを示す。図５Ｂは、本明細書で開示されるデバイス、システム、およびキットの使用を介してユーザーをガイドするための段階的なウォークスルーを示す。
【図５Ｃ】モバイルデバイスを示し、および、モバイルアプリケーションが、本明細書で開示されるデバイス、システム、およびキットと接続し、通信し、これらから遺伝子情報および他の情報を受け取るためにどのように構成されているのかを示す。図５Ｃは、ユーザーが試験を開始し、試験結果を見て共有し、他人と交流することを可能にするインターフェース要素を示す。
【図５Ｄ】モバイルデバイスを示し、および、モバイルアプリケーションが、本明細書で開示されるデバイス、システム、およびキットと接続し、通信し、これらから遺伝子情報および他の情報を受け取るためにどのように構成されているのかを示す。図５Ｄは試験の状態のモニタリングするためのインターフェースを示す。
【図５Ｅ】モバイルデバイスを示し、および、モバイルアプリケーションが、本明細書で開示されるデバイス、システム、およびキットと接続し、通信し、これらから遺伝子情報および他の情報を受け取るためにどのように構成されているのかを示す。図５Ｅは結果をどのようにして共有することができるかを示す。
【図６】開始量として８−１０ｍｌの静脈血を使用して、ローカバレッジ全ゲノム配列決定の様々なプロセス工程において予想されたｃｆＤＮＡフラグメントの典型的な量を示す。
【図７】超微量の低ｃｆＤＮＡ入力量を使用して、アプリケーションの感度を著しく改善するために配列決定ライブラリ効率を増大させる重要性を示す。
【図８Ａ】無細胞の（ｃｆＤＮＡ）入力量を減少させることから生成された配列決定ライブラリの電気泳動図を示す。無細胞ＤＮＡの入力量は、図８Ａの２０ゲノム当量（２０ＧＥ）から、図８Ｃの１ゲノム当量（１ＧＥ）までで変動した。ライブラリの全収率は減少しているが、アダプター二量体の量は著しく増加しておらず、配列解析を成功させるために利用可能な十分な量と質のライブラリが残っている。
【図８Ｂ】無細胞の（ｃｆＤＮＡ）入力量を減少させることから生成された配列決定ライブラリの電気泳動図を示す。無細胞ＤＮＡの入力量は、図８Ａの２０ゲノム当量（２０ＧＥ）から、図８Ｃの１ゲノム当量（１ＧＥ）までで変動した。ライブラリの全収率は減少しているが、アダプター二量体の量は著しく増加しておらず、配列解析を成功させるために利用可能な十分な量と質のライブラリが残っている。
【図８Ｃ】無細胞の（ｃｆＤＮＡ）入力量を減少させることから生成された配列決定ライブラリの電気泳動図を示す。無細胞ＤＮＡの入力量は、図８Ａの２０ゲノム当量（２０ＧＥ）から、図８Ｃの１ゲノム当量（１ＧＥ）までで変動した。ライブラリの全収率は減少しているが、アダプター二量体の量は著しく増加しておらず、配列解析を成功させるために利用可能な十分な量と質のライブラリが残っている。
【図９】静脈血から単離させた超微量のｃｆＤＮＡ（１０ゲノム当量）を用いてローカバレッジの全ゲノムの合成による配列決定を使用する、低画分Ｙ染色体（２．５％以上）の検出を示す。
【図１０】女性と男性のＤＮＡの毛細管血／血漿混合物から単離させた超微量のｃｆＤＮＡ低入力量を用いてローカバレッジの全ゲノムの合成による配列決定を使用する、低画分Ｙ染色体（２．５％以上）の検出を示す。
【図１１】毛細管血からのｃｆＤＮＡと、対になった末端配列決定データに基づく静脈血との間のｃｆＤＮＡフラグメント粒度分布比較を示す。
【図１２】妊娠している女性の血液／血漿に由来する超微量のｃｆＤＮＡ入力量を有するローカバレッジの全ゲノムの合成による配列決定を使用する、胎児の染色体の異数体の検出を示す。非トリソミー基準サンプルの超微量のｃｆＤＮＡ入力量は、染色体２１表現の中央値と中央値の絶対偏差を決定するために使用された。試験サンプルは、健常な胎児（トリソミーがない）あるいは染色体２１トリソミーを有する胎児のいずれかを身籠っている妊娠している女性からの超微量のｃｆＤＮＡ（１０ＧＥ）であった。
【図１３】妊娠している女性の血液／血漿に由来する超微量のｃｆＤＮＡ入力量を有するローカバレッジの全ゲノムの合成による配列決定を使用する、胎児の染色体の異数体の検出を示す。解析はトリソミー２１状態を判定するサンプル内部方法を使用して、基準サンプルセットなしで実施された。試験サンプルは、健常な胎児（トリソミーがない）あるいは染色体２１トリソミーを有する胎児のいずれかを身籠っている妊娠している女性からの超微量のｃｆＤＮＡ（１０ＧＥ）であった。
【００２５】
特定の用語
以下の記載は、本明細書で開示される方法、システム、およびキットの理解を補助するために提供される。本明細書に使用される用語の以下の記載は、これらの用語の定義を限定するようには意図されない。これらの用語は、本出願全体にわたってさらに記載されて例示される。
【００２６】
一般的に、用語「無細胞ポリヌクレオチド」、「無細胞核酸」は、本明細書で互換的に使用され、細胞からポリヌクレオチドあるいは核酸を抽出することなく、サンプルから単離可能なポリヌクレオチドと核酸を指す。無細胞核酸はＤＮＡを含み得る。無細胞核酸はＲＮＡを含み得る。無細胞核酸は、細胞膜内に包含されていない核酸であり、すなわち、細胞区画に封入されていない。いくつかの実施形態において、無細胞核酸は、細胞膜により結合されず、かつ、血液または他の流体中で循環または存在する、核酸である。いくつかの実施形態において、無細胞核酸は、それを含む生体サンプルの収集前および／または収集時に無細胞であり、かつ、サンプルの収集時または収集後の操作を含む、意図的でもそうでなくとも、ヒトによるサンプル操作の結果として細胞から放出されない。いくつかの例において、無細胞核酸は細胞中で生成され、かつ、例えば、アポトーシス、および非アポトーシス細胞死、壊死、オートファジー、自発的放出（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡリポタンパク質複合体の）、分泌、および／または有系分裂細胞死を含む物理的手段によって細胞から放出される。いくつかの実施形態において、無細胞核酸は、生物学的機構（例えば、アポトーシス、細胞分泌、小胞放出）により細胞から放出される核酸を含む。さらなるまたは追加の実施形態において、無細胞核酸は、人間による細胞の操作またはサンプル処理（例えば、細胞膜破壊、溶解、ボルテックス、剪断など）によって細胞から抽出された核酸ではない。
【００２７】
いくつかの例において、無細胞核酸は無細胞胎児核酸である。一般的に、用語「無細胞胎児核酸」は、本明細書で使用されるように、本明細書に記載される無細胞核酸を指し、無細胞核酸は、胎児ＤＮＡを含む細胞に由来する。妊娠している女性では、胎盤に由来する無細胞ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡの総量の顕著な部分に寄与することがある。ほとんどの場合、胎盤のＤＮＡは胎児のＤＮＡに高度に類似するため、胎盤のＤＮＡはしばしば胎児のＤＮＡの優れたサロゲートである。絨毛膜絨毛サンプリングのような用途は、診断用途を確立するためにこの事実を利用してきた。しばしば、無細胞胎児核酸の多くは、妊娠している被験体の妊娠中に胎盤組織が規則的に脱落している結果として、母体生体サンプルで見られる。しばしば、脱落した胎盤組織中の細胞の多くは、胎児ＤＮＡを含む細胞である。胎盤から脱落した細胞は胎児の核酸を放出する。ゆえに、いくつかの例において、本明細書で開示される無細胞胎児核酸は、胎盤細胞から放出された核酸である。
【００２８】
本明細書で使用されるように、用語「細胞核酸」とは、生体サンプルの操作により、細胞に含有されているか、細胞から放出されるポリヌクレオチドを指す。生体サンプルの操作の非限定的な例は、生体サンプルが得られたときには生体サンプル中に存在しない試薬（例えば、界面活性剤、緩衝液、塩、酵素）を遠心分離にかけること、ボルテックスすること、切断すること、混合すること、溶解すること、および、試薬を生体サンプルに加えることを含む。いくつかの例では、細胞核酸は、機械、ヒト、あるいはロボットによる細胞の破壊あるいは溶解によって細胞から放出された核酸である。いくつかの例において、細胞核酸（細胞によって含まれる核酸）は、本明細書で開示されるデバイスおよび方法によって細胞から意図的にまたは非意図的に放出される。しかしながら、これらは、本明細書で使用されるような「無細胞核酸」であるとはみなされない。いくつかの例において、本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、生体サンプル中の無細胞核酸の解析をもたらし、および、このプロセスにおいて、同様に細胞核酸を解析する。
【００２９】
本明細書に使用されるように、用語「バイオマーカー」は一般的に、被験体の生態または状態の任意のマーカーを指す。バイオマーカーは、疾患または疾病の指標または結果であり得る。バイオマーカーは健康の指標であり得る。バイオマーカーは、遺伝的異常または遺伝性疾病の指標であり得る。バイオマーカーは、循環バイオマーカー（例えば、血液などの体液で見られる）であり得る。バイオマーカーは、組織バイオマーカー（例えば、肝臓または骨髄などの実質器官で見られる）であり得る。バイオマーカーの非限定的な例は、核酸、エピジェネティック修飾、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、脂質、脂肪酸、ステロール、多糖、炭水化物、ウイルス粒子、微生物粒子を含む。場合によっては、バイオマーカーはさらに、細胞全体または細胞フラグメントを含み得る。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「タグ」との用語は一般的に、対象の核酸を同定、検出、あるいは単離するために使用され得る分子を指す。別段の定めのない限り、「タグ」との用語は、「ラベル」、「アダプター」、「オリゴ」、および「バーコード」などの他の用語と交換可能に使用され得る。しかしながら、「アダプター」との用語は、タグとして作用することなく、核酸または複数の核酸の２つの末端を来ゲートするために使用され得る。
【００３１】
本明細書に使用されるように、「遺伝子情報」との用語は通常、１つ以上の核酸配列を指す。いくつかの例において、遺伝子情報は、単一のヌクレオチドまたはアミノ酸であり得る。例えば、遺伝子情報は、一塩基多型の存在（または不在）であり得る。別段の定めのない限り、「遺伝子情報」との用語は、エピジェネティック修飾パターン、遺伝子発現データ、およびタンパク質発現データを指すこともある。いくつかの例において、バイオマーカーの存在、不在、または量は、遺伝子情報を提供する。例えば、コレステロール値は、高コレステロール血症の遺伝学的形態を示し得る。ゆえに、遺伝子情報は核酸配列に限定されてはならない。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「遺伝子突然変異」との用語は通常、ゲノムのヌクレオチド配列の改質を指す。遺伝子突然変異は自然の変動または対立遺伝子の違いとは異なる。遺伝子突然変異は被験体の種の１０％未満で見られることがある。遺伝子突然変異は被験体の種の５％未満で見られることがある。遺伝子突然変異は被験体の種の１％未満で見られることがある。被験体の遺伝子突然変異は、被験体の疾患あるいは疾病を引き起こすことがある。遺伝子突然変異はタンパク質コード配列のフレームシフトをもたらすことがある。遺伝子突然変異はタンパク質コード配列の少なくとも一部の欠失をもたらすことがある。遺伝子突然変異はタンパク質コード配列における終始コドンの喪失をもたらすことがある。遺伝子突然変異はタンパク質コード配列における未成熟な終止コドンをもたらすことがある。遺伝子突然変異は、誤って折り畳まれたタンパク質をコードする配列をもたらすことがある。遺伝子突然変異は、機能障害タンパク質または非機能タンパク質（例えば、結合活性または酵素活性の喪失）をコードする配列をもたらすことがある。遺伝子突然変異は、過活動性のタンパク質（例えば、増大した結合活性あるいは酵素活性）をコードする配列をもたらすことがある。遺伝子突然変異は、単一のヌクレオチド（例えば、単一のヌクレオチド変動あるいは一塩基多型）に影響を与えることがある。遺伝子突然変異は、複数のヌクレオチド（例えば、フレームシフト、転座）に影響を与えることがある。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「健康な個体」と「健康な被験体」との用語は、対象の疾病や疾患のない被験体を指す。例えば、記載されている方法またはデバイスが癌の一種を検出するために使用されている場合、健康な被験体はその種の癌にかかっていない。健康な被験体は癌にまったくかかっていないこともある。いくつかの例では、健康な被験体はいかなる疾患または疾病であるとも診断されない。いくつかの例では、健康な被験体は既知の遺伝子突然変異を持っていない。いくつかの例では、健康な被験体は、既知の遺伝子突然変異を持っていない健康な被験体と、被験体を区別することになる検出可能な表現型をもたらす遺伝子突然変異を持っていない。いくつかの例では、健康な被験体は病原体に感染していない。いくつかの例では、健康な被験体は病原体に感染しているが、既知の遺伝子突然変異をもっていない。
【００３４】
本明細書に使用されるように、「ゲノム当量」との用語は一般的に、すべての遺伝子が存在することを保証するために、精製されたサンプル中に存在する必要があるＤＮＡの量を指す。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「組織特異的」との用語、あるいは「組織に特異的である」という句は通常、特定の組織で優勢的に発現されるポリヌクレオチドを指す。しばしば、本明細書で開示される方法、システム、およびキットは、無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドを利用する。本明細書に記載される無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドは、それらが発現される組織または臓器の損傷あるいは疾患時に体液で定量化され得るレベルで発現されたポリヌクレオチドである。場合によっては、体液中の本明細書で開示される無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、組織または臓器の損傷あるいは疾患時の無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドの放出によるものであり、無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドの発現の変動によるものではない。本明細書で開示される無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドのレベルの上昇は、対応する組織または臓器に対する損傷を示すことがある。いくつかの例では、本明細書で開示される無細胞のポリヌクレオチドは、複数の組織で発現／生成されるが、それらの組織の少なくとも１つでは組織に特異的なレベルで発現／生成される。これらの例では、無細胞の組織特異的ポリヌクレオチドの絶対量あるいは相対量は、特定の組織または臓器に対する損傷、特定の組織または臓器の疾患、あるいは組織または臓器の集合を示す。代替的に、あるいは、さらに、組織特異的ポリヌクレオチドは、組織に特異的な修飾を有する核酸である。組織特異的ポリヌクレオチドはＲＮＡを含むことがある。組織特異的ポリヌクレオチドはＤＮＡを含むことがある。非限定的な例として、本明細書で開示される組織特異的ポリヌクレオチドあるいはマーカーは、組織に特異的なメチル化パターンを有するＤＮＡ分子（例えば、遺伝子または非コード領域の一部）を含む。言い換えれば、ポリヌクレオチドとマーカーは、多くの組織で同様に、あるいは、被験体でも至るところで発現され得るが、修飾は組織特異的である。通常、本明細書で開示される組織特異的ポリヌクレオチドあるいはそのレベルは、疾患に特異的ではない。通常、本明細書で開示される組織特異的ポリヌクレオチドは、疾患メカニズムに関与するタンパク質をコードしない。
【００３６】
いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドは、それが被験体の血液に存在するよりも多くの量、対象の組織に存在する。いくつかの例では、ＲＮＡは、それが血液細胞中に存在するよりも多くの量、対象の組織に存在する。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドは血液細胞によっては発現されない。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、血液中より組織中で少なくとも２倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、血液中より組織中で少なくとも５倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、血液中より組織中で少なくとも１０倍多い。
【００３７】
いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、被験体の任意の他の組織よりも上記組織中で少なくとも３倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、任意の他の組織よりも上記組織中で少なくとも５倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、任意の他の組織よりも上記組織中で少なくとも１０倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、任意の他の組織よりも２つ以下の組織で少なくとも３倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、任意の他の組織よりも２つ以下の組織で少なくとも５倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、任意の他の組織よりも２つ以下の組織で少なくとも１０倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、任意の他の組織よりも３つ以下の組織で少なくとも３倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、任意の他の組織よりも３つ以下の組織で少なくとも５倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、任意の他の組織よりも３つ以下の組織で少なくとも１０倍多い。
【００３８】
いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドは標的細胞型に特異的である。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、非標的細胞型よりも標的細胞型において少なくとも３倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、非標的の他の細胞型よりも標的細胞型において少なくとも５倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、非標的細胞型よりも標的細胞型において少なくとも１０倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、非標的細胞型よりも２つ以下の標的細胞型において少なくとも３倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、非標的細胞型よりも２つ以下の標的細胞型において少なくとも５倍多い。いくつかの例では、ＲＮＡは、非標的細胞型よりも２つ以下の標的細胞型において少なくとも１０倍多く発言される。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、非標的細胞型よりも３つ以下の標的細胞型において少なくとも３倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、非標的細胞型よりも３つ以下の標的細胞型において少なくとも５倍多い。いくつかの例では、組織特異的ポリヌクレオチドの存在は、非標的細胞型よりも３つ以下の標的細胞型において少なくとも１０倍多い。
【００３９】
本明細書で使用されるように、「単離する」、「精製する」、「除去する」、「捉える」、および「分離させる」との用語は、別段の定めのない限り、すべて交換可能に使用され得る。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「診療所」、「診療所環境」、「研究所」、または「研究所環境」との用語は、病院、診療所、薬局、研究機関、病理検査室、または、訓練を受けた人員が生物サンプルおよび／または環境サンプルを処理および／または解析するために雇用されている他の営利事業環境を指す。これらの用語は、ポイントオブケア、遠隔地、家庭、学校、および非営利環境、非施設環境と対比される。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「約」との用語が付く数字は、その数字のプラスあるいはマイナス１０％の数字を指す。範囲の文脈で使用される際の「約」との用語は、最低値のマイナス１０％、および最大値のプラス１０％の範囲を指す。
【００４２】
本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指定していない限り、複数の内容を含む。例えば、「サンプル」との用語は複数のサンプルを含み、その混合物も含む。
【００４３】
「精度」との用語には、明細書を考慮してその最も広い定義が与えられなければならない。しかしながら、「精度」との用語は、二項分類試験がどれだけ正しく条件を特定したり除外したりするかの統計的な尺度を指すために使用され得る。本明細書で使用されるように、「精度」との用語はさらに、検査されたすべてのサンプル中の正確な結果（真の陽性と真の陰性の両方）の割合を指すことがある。本明細書で使用されるように、「精度」との用語は、「ランド精度（Ｒａｎｄ  ａｃｃｕｒａｃｙ）」あるいは「ランド指数（Ｒａｎｄ  ｉｎｄｅｘ）」によって決定されるような精度を包含することがある。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「相同」、「相同性」、または「パーセント相同性」との用語は、第２のアミノ酸配列または核酸配列に対する第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列類似度を記載する。いくつかの例では、相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：  ２２６４−２２６８，  １９９０，  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，  １９９３）によって記載された式を使用して決定され得る。こうした式は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０，  １９９０）のｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムに組み入れられる。配列のパーセント相同性は、この適用の申請日の時点で、ＢＬＡＳＴの最新バージョンを使用して決定可能である。いくつかの例では、２以上の配列は、比較ウィンドウ、あるいは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用してまたは手動アライメントおよび目視検査によって測定される指定された領域にわたって最大対応物と比較され、および最大対応物に対してアライメントを行った場合に、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を共有する場合に、相同であり得る。場合によっては、２以上の配列は、多くとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を共有する場合に、相同であり得る。好ましくは、％同一性または相同性は、少なくとも１６アミノ酸またはヌクレオチド長さである領域に存在するか、場合によっては、約５０〜約１００アミノ酸またはヌクレオチド長さである領域に存在する。場合によっては、％同一性または相同性は、約１００〜約１０００アミノ酸またはヌクレオチド長さである領域に存在する。場合によっては、２つ以上の配列が相同することもあり得、配列の少なくとも１００のアミノ酸にわたって少なくとも２０％の同一性を共有し得る。配列比較のために、一般的に、１つの配列は基準配列として作用し、それに対して試験配列が比較され得る。配列比較アルゴリズムを使用して、試験配列と基準配列をコンピューターに入力すると、その後の座標は必要に応じて指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定され得る。限定されないが、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントアルゴリズム、Ｖｉｔｅｒｂｉ、Ｂａｙｅｓｉａｎｓ、Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖなどを含む、任意の適切なアルゴリズムが使用され得る。デフォルト・プログラム・パラメーターが使用可能であるか、または、代替的なパラメーターが指定可能である。その後、配列比較アルゴリズムは、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を、プログラムパラメーターに基づいて算出するために使用され得る。あらゆる適切なアルゴリズムが使用され、それによりパーセント同一性が算出される。一部のプログラムは、例えば、アライメントされた位置の総数で割った、同一の残基のアライメントされた位置の総数として、パーセント同一性を算出する。「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用されるように、１０〜６００の位置に及ぶ場合がある、隣接位置または非隣接位置の数のいずれか１つのセグメントに対する言及を含む。場合によっては、比較ウィンドウは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００の位置を含み得る。場合によっては、比較ウィンドウは、多くても１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または６００の位置を含み得る。場合によっては、比較ウィンドウは、少なくとも５０〜２００の位置、または少なくとも１００〜１５０の位置を含む場合があり、そこでは、配列が、２つの配列が最適にアライメントされた後に同数の隣接位置または非隣接位置の基準配列と比較され得る。比較のための配列のアライメントの方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２  （１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３  （１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）の類似性方法に関する研究、これらアルゴリズムのコンピューター化された実装（ＧＡＰ，  ＢＥＳＴＦＩＴ，  ＦＡＳＴＡ，  ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）、または手動アライメントと目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  ｅｄｓ．  １９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）により、実行できる。場合によっては、比較ウィンドウは、全体のアライメントのあらゆる部分集合、一次配列におけるいずれかの隣接位置、三次空間において隣接するが一次配列では隣接しない位置、またはアライメントにおける１〜全ての残基の他のあらゆる部分集合を含み得る。
【００４５】
本明細書で使用されるように、過剰表現や過少表現という用語は通常、サンプルと標的核酸の対照表現との間の差を指す。表現は有意に対照表現未満であり得、したがって、過少表現であり得る。表現は有意に対照表現よりも大きく、したがって、過少表現であり得る。有意性は統計的であり得る。統計的な有意性を測定する方法は、当該技術において周知である。非限定的な例によって、統計的な有意性は、標準的な両側ｔ検定（＊：ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）を使用して実施された。
【００４６】
本明細書で使用されるように、「クラウド」との用語は、共有されるか共有可能な電子データのストレージを指す。クラウドは、電子データをアーカイブし、電子データを共有し、および、電子データを解析するために使用され得る。
【００４７】
本出願全体にわたって、「染色体に対応する核酸」と「染色体に対応する配列」との成句が列挙されている。本明細書で使用されるように、これらの成句は、「染色体に対応する核酸」が、その染色体中で見られる配列と同一であるか、相同する核酸配列によって表されることを伝えるように意図されている。「相同」との用語は前述の記載で示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
遺伝子検査は従来、研究所または診療所環境において実行される。しかしながら、遺伝子検査が有益な多くの場合において、研究所または診療所へのアクセスは、利用不能であるか、または実用的ではない。循環腫瘍ＤＮＡまたは胎児のＤＮＡ検査の分析などの非常に複雑な検査は、そのような検査へのアクセスが限られていること（例えば、静脈切開の要件、タイミング、必要とされるアポイントメント、病院／研究所までの距離）、およびそのような検査のコスト（例えば、静脈切開、数ミリリットルのサンプルの処理、サンプルチューブと試薬、輸送、とりわけ冷却輸送のコスト）が理由で、依然として稀である。ゆえに、必要な場所（例えば、研究所および診療所から離れた位置）で実行可能な遺伝子検査が望ましい。必要な場所（例えば、家、学校、農場）で実行される遺伝子検査は、費用対効果が高く、訓練を受けていない個体が簡単に実行できるものが好ましい。必要な場所での遺伝子検査は、少量の生体サンプルのみを必要とすることが好ましい。従来、遺伝子検査は、解析される十分なＤＮＡを含む数ミリリットルの血液を得るために、静脈血引抜（静脈切開）を要求する。しかしながら、静脈切開は必要な場所においては実用的ではない。理想的には、遺伝子検査は、例えば、経皮的な穿刺装置による毛細管血の回収を介して達成される量の血液しか必要としない。このことは、必要な場所における遺伝子検査のためのデバイスおよび方法が、超微量のサンプル入力と検出の対象である低存在量の標的分子を用いて機能するように設計される必要があることを、意味している。
【００４９】
超微量の入力量のサンプルを収容することに加えて、循環無細胞核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、例えば、循環無細胞胎児ＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ、移植されたドナー臓器由来の循環ＤＮＡ、および特定の組織から放出された循環ＤＮＡを、健康関連の問題、疾患の進行、または処置反応の一部として解析することができる遺伝子検査を行うことが望ましい。しかしながら、循環無細胞核酸の解析は、半減期が短く、低存在量であるため、非常に困難である。加えて、白血球溶解を回避すべくサンプルに注意を払わないと、血液中の循環無細胞核酸は、白血球から放出されたＤＮＡによって希釈されかねない。白血球ＤＮＡは、循環無細胞核酸の検出中にバッググラウンドノイズを作り出し、アッセイの感度と特異性を低下させる。
【００５０】
本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少量のサンプル（例えば、１ｍｌ未満）の穏やかで効率的な処理を、循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の高度に断片化された性質を利用する固有の標的領域選択およびアッセイ設計と組み合わせることにより、これらの難題を克服する。例えば、本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、一回の指への穿刺から信頼できる遺伝子情報を提供することができる。本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、標的遺伝子が循環時に断片化される際に標的領域が物理的に分離される可能性が高くなるように十分な間隔を空けた標的遺伝子に沿って、複数の標的領域の解析を提供する。ゆえに、遺伝子検査において従来解析される個々の長いＤＮＡフラグメントに対しては、統計的サンプリングの上記限界が存在するが、サンプリング統計は、ｃｆＤＮＡフラグメントに対しては有利に変化する。毛細管血サンプル中には合計でわずか１ゲノム当量しか存在しないが、多くの個々のｃｆＤＮＡフラグメントが存在する。結果的に、感度の増幅は、超微量の入力量で達成され得る。
【００５１】
一例として、２０の標的領域がゲノム領域に沿って存在し、その標的領域が断片化される際に独立して解析および検出可能となるように十分な間隔を空けられている場合、全サンプルの９９％において少なくとも１つの標的領域を有することを求められる入力量は、１４０μｌから２５μｌに変化し、著しく感度を増大させる。いくつかの例において、標的領域は、同一の配列または類似の配列を含む。これらの標的領域はコピーと呼ばれ得る。
【００５２】
他の例において、標的領域は類似配列を共有しないが、類似のエピジェネティック状態などの別の特徴を共有し得る。例えば、標的領域は異なる配列を有し得るが、すべて過剰メチル化されている。領域間の類似性の根拠に関わらず、それらは、少なくとも１つが少量で検出され得る多くの循環ｃｆＤＮＡフラグメントを生成する、循環無細胞ＤＮＡの断片化パターンに影響を及ぼすべく、適切に間隔を空けられている。非限定的な例として、被験体が癌を抱える場合に、別のｃｆＤＮＡフラグメント上で互いに十分に離れて、かつすべて過剰メチル化される、選択された標的領域は、重亜硫酸塩配列決定で検出可能である。少量のサンプル（例えば、指への穿刺から得た血液）において、これらフラグメントのすべてが存在する可能性は低いが（非断片化ＤＮＡの当量である）、少なくとも１つのフラグメントが存在する可能性は高く、癌を検出することができる。
【００５３】
さらに他の例において、標的領域は類似の配列を含まないこともあれば、類似のエピジェネティック状態を含まないことがある。この場合、検出は、複数の特徴的な標的領域を検出するために、多くのプライマーセットまたはライブラリの調製と、その後のユニバーサルプライマーを用いる増幅とを必要とし得る。非限定的な例として、ＲＨＤ陰性の妊娠している母親における胎児ＲＨＤ遺伝子の検出は、無細胞胎児ＤＮＡフラグメント中でＲＨＤ遺伝子の複数の異なるエクソンを検出するために、プライマーの複数のセットを使用することにより、指穿刺量の血液から達成され得る。感度は、ＲＨＤ遺伝子中で物理的に離れており、したがって、異なる無細胞ＤＮＡフラグメントに存在する可能性が高い領域を増幅するプライマーを選択することによって増加し得る。ＲＨＤ陰性の妊娠している母親における胎児ＲＨＤ遺伝子の検出は、小児の血液に対する抗体を持つ母親による新生児の溶血性疾患を予防するのに重要である。ＲＨＤ検査は現在、適切で確実な結果を達成するために、完全な採血（８ミリリットルの血液）により実行されている。この量は確実な結果を達成するために必要と考えられている。なぜなら、それが、ＲＨＤ遺伝子全体がサンプル中に存在する可能性に基づくものであるからである。この仮定に基づくと、指穿刺量の血液中の全ＲＨＤ遺伝子を得る可能性は低く、偽陰性結果を容易に引き起こすことになる。
【００５４】
標的領域がどのように選択されるかにかかわらず、こうした領域は、増幅または検出が無細胞断片化ＤＮＡ上で実行されるときに個々のバイオマーカーとしてサンプル中に存在する。標的領域を含むフラグメントの濃度は、対応する非断片化ＤＮＡ、または群としては解析できないフラグメントよりも高い。ゆえに、非断片化ＤＮＡから、あるいは、標的領域の１つのコピーに対するアッセイから入手することになるシグナルよりも多くの標的領域由来のシグナルがある。反復されていない、または、別の領域と複数の共通点を共有しない非標的領域よりも、超微量のサンプル中に存在する標的領域を検出する可能性がはるかに高いものもある。複数のＤＮＡフラグメント中の複数の標的領域をアッセイすることにより、アッセイ感度は従来の試験に比べて増大する。
【００５５】
血液は、無細胞核酸の確実なソースである。血液由来の無細胞核酸を解析するための本明細書で開示される方法は、無細胞核酸を含む血漿または血清分画を単離する工程を含む。本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、必要な場所で血液サンプルの緩やかな処理を可能にする。これにより、白血球溶解が回避、予防、または減少され得る。本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、必要な場所で血液サンプルの迅速な処理を可能にする。これにより、血液細胞溶解を引き起こしかねないサンプルの長期保管および出荷を回避する。いくつかの例において、本明細書で開示されるデバイスは、細胞溶解を回避、減少、または予防するために、統合分離、例えば、濾過を介した血漿の即時単離を実行する。試薬（例えば、プローブ、プライマー、抗体）または検出方法が十分な特異性を提供しないときに、ｃｆＤＮＡからの細胞の即時単離は望ましいこともある。いくつかの例において、方法は、あらゆる白血球溶解を回避しようとする試みの中で、全血で実行される。比較的高い特異性を達成可能な場合、全血からの解析がより望ましいこともある。
【００５６】
少量のサンプルしか必要としないことに加えて、本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも以下の理由によって大いに望ましい。本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は一般的に、技術訓練をほとんどあるいはまったく必要としない。ゆえに、遺伝子検査を行うコストは、訓練を受けた人員によって行われる検査のコストに比べて低く、この検査は、訓練を受けた人員へのアクセスを持たない被験体に利用可能である。さらに、結果は、数分以内（例えば、１時間未満）で得られることもある。これはとりわけ、感染症に対する検査時に重要となり得る。感染症に対する検査で陽性である個体または動物は、迅速に隔離かつ処置され、感染症の蔓延を予防する。さらに、結果は私的に入手され得る。場合によっては、試験されている患者だけが、入手された遺伝子情報を内々に知らされる。本明細書で開示されるデバイス、システム、およびキットは一般的に、軽量かつ携帯型であり、遠隔地に適しており、アクセスも可能となる。ゆえに、これらは、家庭、学校、職場、戦場、農場、あるいは、研究所または診療所環境を訪れるのが実用的でないか不便である場合のそれ以外の場所で利用され得る。さらに、サンプルはポイントオブケアで解析され得ることから、サンプルは保管または輸送の必要がなく、サンプルの劣化および誤認（例えば、サンプルの取り間違い）のリスクが減少する。
【００５７】
図１は、本明細書で開示される方法、デバイス、およびシステムが辿ることができる様々な経路を有する一般的なフローチャートを示す。最初に、サンプルは工程（１１０）で得られる。サンプルから有用な情報を集めるために、最小量のサンプルが得られなければならない。サンプルは本明細書で開示される生体サンプルであり得る。サンプルは天然のままの未処理のサンプル（例えば、全血）であり得る。サンプルは処理されたサンプル（例えば、血漿）であり得る。サンプルの量はサンプル型に基づく可能性が高い。典型的には、工程（１２０）において、サンプルが処理されるか、あるいは、分析物（例えば、核酸あるいは他のバイオマーカー）がサンプルから精製されることで、増幅および／または検出可能な分析物が生成される。処理は、サンプルの濾過、分析物を含むサンプルの成分の結合、分析物の結合、分析物の安定化、分析物の精製、あるいはこれらの組み合わせを含み得る。サンプル成分の非限定的な例は、細胞、ウイルス粒子、細菌粒子、エキソソーム、およびヌクレオソームである。いくつかの例では、分析物は核酸であり、これは工程（１３０）で増幅されて分析用のアンプリコンを生成する。他の例では、分析物は核酸であることもあれば核酸でないこともあるが、それとは関係なく増幅されない。分析物またはアンプリコンは、検出と分析の前に随意に修飾される（１４０）。いくつかの例では、修飾が増幅中に生じる（図示せず）。例えば、分析物またはアンプリコンはタグ付けされることもあれば標識されることもある。検出は、配列決定、標的特異的なプローブ、等温増幅および検出方法、定量ＰＣＲ、あるいは単一分子検出を含み得る。図１は本明細書で開示されたデバイスと方法の概観として提供されるが、本明細書で開示されるデバイスおよび方法は図１によっては限定されない。図１で示されないデバイスおよび方法は追加の構成要素と工程をそれぞれ含むことがある。
【００５８】
いくつかの例において、本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、遺伝子情報をユーザー専用にすることができるので、望ましい。実際に、デバイスの使用ですら秘密にしておくことができる。代替的に、デバイス、システム、キット、および方法は、他のものと情報を共有するように構成されるか、または、（例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）シグナルをつけて）情報を共有するためにユーザーにより容易に適合可能である。例えば、情報は、看護師または医師と容易に共有され得る。いくつかの例において、デバイスまたはシステムは、安全なポータルまたはアプリケーション・プログラミング・インターフェース（ＡＰＩ）を介して、オフィスまたは病院にいる医療従事者またはスタッフに検査結果を送信／共有できる。いくつかの例において、ユーザーは、結果を受信後に医療従事者と個人的に情報を共有することを選択し得る。いくつかの例において、情報はさらに、リアルタイムで共有され得る。この種の通信は、例えば、軍事介入、雇用義務、移民政策、および健康問題により離れ離れになっているカップルまたは家族に望ましい。
【００５９】
本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法には無数の用途がある。本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、健康状態の診断およびモニタリングを可能にする。健康状態の非限定的な例には、自己免疫疾病、代謝疾病、癌、および神経学的疾病が挙げられる。本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、マイクロバイオーム検査、個人の適切な薬物用量の決定、および／あるいは、薬物またはその投与量への反応の検出を含む、オーダーメイド医療を可能とする。本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、病原体による感染症、および／または、感染症を処置するために使用され得る薬物に対する被験体の耐性の検出をもたらす。ほぼ全ての場合において、技術訓練または大きく高価な実験装置は、ほとんどまたはまったく必要とされない。
【００６０】
図１は、当業者は、本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、あるいは方法を使用して、被験体からの微量（例えば、１ミリリットル未満）の生体サンプルで始めてもよいことを示している。生体サンプルは通常、５０００ゲノム当量未満の無細胞ＤＮＡを含む。サンプルは解析を可能にするために、濾過、安定化、精製、あるいはこれらの組み合わせによって処理され得る。いくつかの例では、サンプルは、濾過、安定化、あるいは精製などの処理を必要としない。サンプル中の複数の様々な分析物、例えば、無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、微小胞に関連する核酸、無細胞ＤＮＡ上のエピジェネティックマーカーは有益であり得る。これらの分析物の１つ以上が分析され得る。いくつかの例では、分析物は増幅されない。いくつかの例では、分析物は分析物の増幅あるいは修飾なしで配列決定される。いくつかの例では、分析物は分析物のアンプリコンを生成するために増幅される（例えば、ポリメラーゼ媒介された核酸増幅）。いくつかの例では、アンプリコンは配列決定される。いくつかの例では、アンプリコンはそれ以上の調製あるいは修飾なく配列決定される。いくつかの例では、多型、突然変異、エピジェネティックマーク、あるいは、アンプリコンまたは標的領域内の異常などの特徴が詳細な解析に使用される。
【００６１】
いくつかの例では、分析物、アンプリコン、あるいはこれらの組み合わせは、ラベル、バーコード、あるいはタグを用いて分析物を標識することによりライブラリに変換される。ラベル、バーコード、およびタグという用語は、別段の定めがない限り、本明細書では交換可能に使用される。いくつかの例では、ライブラリメンバーは増幅されて、増幅されたライブラリメンバーを生成する。いくつかの例では、ライブラリメンバーは全ゲノム増幅にさらされる。いくつかの例では、ライブラリメンバーは全ゲノム増幅の産物である。いくつかの例では、ライブラリメンバーは、増幅されたライブラリメンバーを生成するためには増幅されない。いくつかの例では、ライブラリメンバーは全ゲノム増幅にさらされない。いくつかの例では、ライブラリメンバーは全ゲノム増幅の産物ではない。いくつかの例では、ライブラリメンバーは捕捉されて、捕捉されたライブラリメンバーを生成する。いくつかの例では、ライブラリメンバーは、捕捉および増幅されることで、捕捉および増幅されたライブラリメンバーを生成する。いくつかの例では、ライブラリメンバーが配列決定される。いくつかの例では、増幅されたライブラリが配列決定される。いくつかの例では、捕捉されたライブラリメンバーが配列決定される。いくつかの例では、捕捉され、増幅されたライブラリメンバーが配列決定される。いくつかの例では、ライブラリメンバーは配列決定されない。例えば、ライブラリメンバーは、プローブのアレイあるいは単一分子計測によって、検出あるいは定量化され得る。いくつかの例では、増幅されたライブラリメンバーは、プローブのアレイあるいは単一分子計測によって、検出あるいは定量化され得る。いくつかの例では、捕捉されたライブラリメンバーは、プローブのアレイあるいは単一分子計測によって、検出あるいは定量化され得る。いくつかの例では、捕捉され、増幅されたライブラリメンバーは、プローブのアレイあるいは単一分子計測によって、検出あるいは定量化され得る。
【００６２】
図２は、本明細書で開示される方法、システム、デバイス、およびキットが複数の位置で分布し得ることを示す。例えば、本明細書で開示される方法は、家庭環境あるいは他の必要な場所で十分に実行され得る。これは、研究所、核酸処理および解析施設、あるいは専門家または医師への（例えば、物理的、財政的な）アクセスを持たない被験体にとって、とりわけ重要である。いくつかの例では、サンプルは研究所（例えば、必要とされつ実験装置）で処理され得る。しかしながら、本明細書で開示される方法、システム、デバイス、およびキットは、自宅でのサンプル採取と報告を可能にすることもできる。一例として、サンプルは自宅で採取され、処理が行われる研究所に送られ、結果は電子通信によって家にいる被験体に届けられる。したがって、研究所での処理が必要とされる場合でさえ、本明細書に開示される方法、システム、デバイス、およびキットは、ユーザーが自分のサンプルを送る／輸送するための手段を持っていることしか必要とせず、依然としてユーザーに便利である。いくつかの例では、被験体に検査成績を伝達することができるクラウドあるいはサーバー上でデータ処理が生じるほうが便利である。いくつかの例では、クラウドまたはインターネットサーバーに依存することなく、研究所でデータ処理を行い、結果を家にいる被験体に報告するほうが便利である。
【００６３】
非侵襲性の出生前診断
本明細書で開示される方法、デバイス、およびシステムの１つの用途は、非侵襲性の出生前診断（ＮＩＰＴ）である。胎児の健康は、妊娠の最初の認識と確認後に期待している親の重要な関心事のうちの１つである。他の一般的な妊娠関連の健康検査に加えて、胎児の染色体あるいは遺伝子異常のリスクの評価は、多くの国々で妊娠の管理における標準治療になっている。現在、胎児からの遺伝子情報を決定するいくつかの方法がある。最初の三半期（１週目〜１２週目）に、項部浮腫の超音波検査は、トリソミー１８あるいはトリソミー２１のように、染色体異常の可能性があるかどうかを明らかにすることができる。加えて、妊娠に関連する血漿タンパクおよびヒト絨毛性ゴナドトロピンのレベルについて試験するために、母体の静脈切開が実施され得る。これらのタンパク質のレベルの上昇は同様に染色体異常を示すことがある。しかしながら、これらの試験は決定的でなく、一般に、異常が確かにあるかどうかを判定するために、追加のさらに侵襲的な試験（例えば、絨毛膜絨毛サンプリング（胎盤組織のサンプリング）あるいは羊水穿刺（針が羊膜腔を貫通する））を必要とする。第２の三半期に追加の検査が行われ得るが、最終的な決定のためには、一般により多くの検査、追加の超音波と羊水穿刺が必要とされる。
【００６４】
前述のスクリーニングは、臨床環境下で技術的な訓練を受けた医療提供者を必要とする。これらの試験の多くは侵襲性で（例えば、羊水穿刺）であり、それによって、胎児だけでなく母親にも健康リスクをもたらすことになる。典型的には、前述のスクリーニングは、染色体異常を検出するために両方の三半期で必要される。したがって、胎児が当該技術の最新の方法を使用して妊娠期間の半ばをすぎるまでは、染色体異常の検出は一般には典型的に達成することができない。
【００６５】
妊娠している女性の血液中の循環無細胞胎児ＤＮＡの存在の発見以来、胎児検診は著しく改良されてきた。母体の血液中で循環する胎児のＤＮＡの存在は、絨毛膜絨毛サンプリングおよび羊水穿刺などの処置に関連するリスクなく、胎児の遺伝子構造を研究し、および、潜在的健康リスクあるいは妊娠合併症を特定する手段をもたらした。循環無細胞胎児ＤＮＡを利用する多くの医学的に関連する試験が開発されているが、最も顕著なものは胎児の染色体異常のためのＮＩＰＴである。
【００６６】
既存のＮＩＰＴは２つの主要なカテゴリーへ分類することができる。それらは、特定の染色体あるいは染色体領域を増幅および解析するだけの標的アッセイであるか、あるいは、それらは全ゲノムアッセイである。不運なことに、既存のＮＩＰＴは、適切なスクリーニング能力を達成するのに十分な母体の血液／血漿の量を得るために、静脈穿刺（例えば、静脈切開）を必要とする。例えば、既存のＮＩＰＴはしばしば１６ｍｌもの血液の採取を必要とする。大量の血液が既存のＮＩＰＴで必要とされることから、利便性および検査へのアクセスには大きな制限がある。加えて、サンプルを取り扱うロジスティクスは、検査のコストと試薬のコストと同様に、負担である。
【００６７】
ＮＩＰＴは従来、静脈切開で得られるもの（例えば、数ミリリットルの血液）などの大量のｃｆＤＮＡコピー数（ゲノム当量）を用いたときだけ実行可能であると考えられていた。複数の統計学的な理由（非常に小さな差を解決するには大規模なサンプル数が必要となる）と従来の理由（ＦＩＳＨで利用できるマーカーが限られている）によって、この方法が定着してきた。本出願は、ｃｆＤＮＡ解析によるＮＩＰＴがどのようにして超微量の入力量から可能であるかを示している。実施例１−５を参照。本明細書で開示される方法、デバイス、システム、およびキットは、最小限のサンプル量からＮＩＰＴを可能にするために、新規な方法で低レベルのＤＮＡ増幅（例えば、８−１０サイクル）に、高効率ライブラリ生成のための既存の方法を組み合わせる。
【００６８】
本明細書で開示される既存のＮＩＰＴとは対照的に、方法、システム、およびデバイスは、胎児の染色体異常の正確なスクリーニングに必要な無細胞の胎児のＤＮＡの量を最小限に抑えて、それによって、大量のサンプル量を必要としなくなる。サンプルが血液である場合、十分な量の血液が指の穿刺により得られ得る。例えば、実施例３を参照。したがって、本明細書で開示される方法およびシステムは、静脈穿刺の必要をなくし、それによって、ポイントオブケアでのＮＩＰＴに検査コストの大幅な削減をもたらす。母体の血液中の胎児の画分が低くなり得、母体の無細胞核酸が変動することがあり得るため、本明細書で開示される方法、システム、およびデバイスが胎児に関する信頼できる有用な遺伝子情報を明らかにすることに成功することになるとは予想されなかった。母体の生態は常に変化しており、母体の被験体の母体の無細胞核酸には多くの可変性がある。循環無細胞核酸に寄与する、母親の様々な臓器（例えば、肝臓、皮膚）に由来する無細胞核酸があり、こうした臓器の生態は、年齢、疾患、感染、および時刻とともに変化し得る。母体の表現が試験被験体からの無細胞胎児核酸と、基準／対照被験体からの無細胞胎児核酸とを比較するのに十分なほど再現可能であることは予測不可能であった。当業者は、トリソミーあるいは他のゲノムの変動を正確に検出することができるように宿主のバックグラウンドＤＮＡが実際に十分に安定した分布を与えているということを実験的に証明しなければならない。
【００６９】
胎児の遺伝子情報を得るためのデバイス、システム、キット、および方法が本明細書で開示される。本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、妊娠の最初期段階で遺伝子情報を有利に得ることができることがある。本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、実験機器の必要なく、かつ、サンプルを取り替えるリスクなく、自宅で胎児の遺伝子情報を得ることができる。遺伝子情報は、本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法を用いて、数分あるいは数秒で検出され得る。
【００７０】
本明細書で開示される、妊娠している被験体の体液サンプルから無細胞胎児核酸を解析するためのデバイス、システム、キット、および方法である。無細胞循環核酸の解析は、多くの技術的な難題に直面する。例えば、血液中の循環核酸の増幅は、全血中の成分の一部によって阻害されることがある。全血中の成分の非限定的な例はヘモグロビンと関連する鉄である。本明細書で開示されたデバイス、システム、キット、および方法は、これらの技術的な難題の多くを克服することを目標としている。加えて、デバイス、システム、キット、および方法には、（１）最小限に侵襲的である、（２）技術的な訓練をほとんどあるいはまったく受けずに自宅で適用可能である；（３）疾病（例えば、妊娠）の初期段階で有益である、という利点がある。さらに、デバイス、システム、キット、および方法は通常、複雑なあるいは高価な装置を必要としない。
【００７１】
いくつかの態様では、本明細書で開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、「無細胞胎児核酸」と本明細書で呼ばれる、胎児からの無細胞核酸を解析するのに役立つ。いくつかの例では、無細胞胎児核酸は、胎児の少なくとも１つの細胞、胎盤の少なくとも１つの細胞、あるいはこれらの組み合わせである。母体の血液中の無細胞胎児核酸の出生前の適用には、無細胞母体核酸の存在下で無細胞胎児核酸を解析するというさらなる難題が掲示され、その後者は前者に対して大きなバックグラウンドシグナルを発生させる。例えば、母体の血液のサンプルは、全血１ミリリットル当たり約５００〜２０００ゲノム当量の全無細胞ＤＮＡ（母体と胎児）を含有することもある。妊娠している女性からサンプリングされた血液中の胎児の画分は、およそ１０％、１ｍｌ当たり約５０〜２００胎児ゲノム当量であり得る。さらに、無細胞核酸を得るプロセスは、血液から血漿または血清を得ることを含み得る。注意深く実施されないと、血液細胞は破壊されて、さらなる細胞核酸をサンプルに放出し、胎児の無細胞核酸に対するさらなるバックグラウンドシグナルを発生させることもある。典型的な白血球数は血液１ｍｌ当たりおよそ４＊１０^６〜１０＊１０^６細胞であり、したがって、利用可能な核ＤＮＡは無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）全体よりも約１０，０００回高い。結果的に、母体の白血球のごく一部分だけが破壊され、核ＤＮＡを血漿または血清に放出しても、胎児の画分は劇的に減少する。例えば、０．０１％の白血球分解は、胎児の画分を１０％〜約５％減少させることがある。本明細書で開示されたデバイス、システム、キット、および方法は、これらのバックグラウンドシグナルを減少させることを目標としている。
【００７２】
Ｉ．方法
一般に、本明細書に開示される方法は生体サンプルを得て、その成分を検出する工程を含む。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、本明細書に記載されるデバイス、システム、またはキットにより実行される。生体サンプルの取得は、非限定的な例として、療所所、病院、科学研究所、病理検査室、または臨床試験研究所などの臨床現場および研究現場おいて行われ得る。代替的に、取得は、非限定的な例として、自宅、家族計画センター、仕事場、学校、農場、または戦場などの臨床現場および研究現場から離れた場所で行われてもよい。一般的に、本明細書に開示される方法は、収集が臨床現場で行われるか離れた場所で行われるかにかかわらず、比較的少ない量の生体サンプルを集めて解析する工程を含む。いくつかの例では、検出が臨床現場および研究現場で行われる。他の例では、検出が臨床現場および研究現場から離れた場所で行われる。本明細書に開示される方法の他の工程、例えば、核酸の増幅は、臨床現場／研究現場で、あるいは離れた場所で行われてもよい。いくつかの例では、上記方法は被験体によって実行される場合がある。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、方法を実行するのに必要な技術トレーニングを受けていないユーザーによって実行される。
【００７３】
いくつかの態様では、方法が本明細書に開示され、上記方法は：被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、上記生体サンプルは無細胞核酸分子を含む、工程と；配列決定リードを生成するために、無細胞核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程と；対象の少なくとも１つの領域に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程と；対象の少なくとも１つの領域の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程と、を含む。生体サンプルは約１０１０未満の無細胞核酸を含み得る。生体サンプルは約１０５〜約１０１０の無細胞核酸を含み得る。生体サンプルは約１０４〜約１０１０の無細胞核酸を含み得る。生体サンプルは約１０３〜約１０１０の無細胞核酸を含み得る。生体サンプルは約１０２〜約１０１０の無細胞核酸を含み得る。生体サンプルは約１０５〜約１０９の無細胞核酸を含み得る。生体サンプルは約１０５〜約１０８の無細胞核酸を含み得る。生体サンプルは約１０５〜約１０７の無細胞核酸を含み得る。生体サンプルは約１０６〜約１０１１の無細胞核酸を含み得る。生体サンプルは約１０６〜約１０９のＤＮＡを含み得る。生体サンプルは約１０７〜約１０９のＤＮＡを含み得る。
【００７４】
いくつかの例では、過剰表現あるいは過少表現は、少なくとも１つの対照被験体における対象の領域の表現に対する、被験者からの試験サンプルにおける対象の領域の表現である。いくつかの例において、対照被験体は健康な被験体である。いくつかの例では、対照被験体は、対象の領域に突然変異を含んでいない。いくつかの例では、対照被験体は、対象の領域の野生型コピー数を有する。いくつかの例では、対象の領域のエピジェネティックに修飾された過剰表現あるいは過少表現がある。いくつかの例では、過剰表現あるいは過少表現は、少なくとも１つの基準サンプルにおける対象の領域の表現に対する、試験サンプルにおける対象の領域の表現である。基準サンプルは、試験サンプルとして同時に解析される場合がある。基準サンプルは、試験サンプルの解析前に解析される場合がある。少なくとも１つの基準サンプルは複数の基準サンプルを含む場合がある。いくつかの例では、過剰表現あるいは過少表現は、複数の基準サンプルにおける対象の領域の平均表現に対する、試験サンプルにおける対象の領域の表現である。
【００７５】
いくつかの例では、方法は対照サンプルにおける遺伝子情報を解析および検出する工程を含む。いくつかの例では、方法は、対照サンプルの遺伝子情報を解析および検出する工程を含み、その代わり、対照基準データから得られた予め決められた対照基準値を使用する。これは、被験体が自宅で自分のサンプルの解析を行い、対照サンプルにアクセスできない場合にとりわけ有益である。しかし、多くの場合、被験体は、対照サンプル（例えば、親族、配偶者、友人からの）を容易に得ることもできる。さらに、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、多数のサンプルに指標付けすることによって、各サンプルを同時に解析することを提供する。
【００７６】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：被験体から生体サンプルを得る工程と；配列決定リードを生成するために無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程と；標的配列に対応する配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの非標的配列に対応する配列決定リードを測定する工程と；９８％を超える精度で、標的配列中に異常があると判定する工程と、を含む。異常は、健康な被験体に存在しない特徴または特性であり得る。異常は、野生型被験体に存在しない特徴または特性であり得る。異常は、対照被験体に存在しない特徴または特性であり得る。異常は、遺伝子突然変異であり得る。異常は、複数の遺伝子突然変異であり得る。遺伝子突然変異は、本明細書および全体にわたって記載される。異常はエピジェネティック修飾であり得る。異常は複数のエピジェネティック修飾であり得る。
【００７７】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：被験体から生体サンプルを得る工程と；配列決定リードを生成するために無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程と；少なくとも１つの非標的配列に対応する配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの非標的配列に対応する配列決定リードを測定する工程と；野生型コピー数と比較して標的配列の異常なコピー数があると、９８％を超える精度で判定する工程と、を含む。
【００７８】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、上記生体サンプルは無細胞核酸を含む、工程と；増幅された核酸を生成するために、無細胞核酸の少なくとも一部を増幅する工程と；配列決定リードを生成するために、増幅された核酸を配列決定する工程と；少なくとも１つの標的配列に対応する配列決定リードの第１の部分を測定する工程と；非標的配列の少なくとも１つの配列に対応する配列決定リードの第２の部分を測定する工程と；配列決定リードの第１の部分対配列決定リードの第２の部分の比率が、対照被験体からの対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率とは異なる場合、標的配列に異常があると、９８％を超える精度で計測する工程と、を含む。いくつかの例では、方法は、増幅前、増幅中、あるいは増幅後、および配列決定の前に、無細胞の核酸にバーコード付けするか、またはタグ付けする工程を含む。
【００７９】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、上記生体サンプルは無細胞核酸分子を含む、工程と；タグ付けされた核酸を生成するために、生体サンプルに存在する無細胞核酸の少なくとも一部にバーコード付けし、および／またはタグ付けする工程と；配列決定リードを生成するために、タグ付けされた核酸を配列決定する工程と；標的配列に対応する配列決定リードの第１の部分を測定する工程と；非標的配列に対応する配列決定リードの第２の部分を測定する工程と；配列決定リードの第１の部分対配列決定リードの第２の部分の比率が、対照被験体からの対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率とは異なる場合、標的配列に異常があると、９８％を超える精度で計測する工程と、を含む。
【００８０】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、上記生体サンプルは無細胞核酸を含む、工程と；配列決定リードを生成するために、無細胞核酸を配列決定する工程と；少なくとも１つの標的配列に対応する配列決定リードの第１の部分を測定する工程と；非標的配列の少なくとも１つの配列に対応する配列決定リードの第２の部分を測定する工程と；配列決定リードの第１の部分対配列決定リードの第２の部分の比率が、対照被験体からの対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率とは異なる場合、少なくとも１つの標的配列に異常があると、９８％を超える精度で計測する工程と、を含む。
【００８１】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：被験体から毛細管血を得る工程であって、ここで、毛細管血は無細胞核酸を含む、工程と；配列決定リードを生成するために無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程と；対象の少なくとも１つの標的配列に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程と；少なくとも１つの標的配列の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程と、を含む。
【００８２】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は、被験体から生体サンプルを得る工程であって、生体サンプルは、ともに全無細胞核酸を構成する標的無細胞核酸および非標的無細胞核酸を含み、標的無細胞核酸は全無細胞核酸の５％未満である、工程と；配列決定リードを生成するために標的無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程と；対象の少なくとも１つの標的配列に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程と；少なくとも１つの標的配列の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程と、を含む。一般に、得る工程は、静脈切開を実行するか、あるいは静脈切開からサンプルを受け取ることを含まない。いくつかの例では、生体サンプルは静脈血を含まない。生体サンプルは毛細管血を含む場合がある。生体サンプルは、毛細管血から本質的になり得る。
【００８３】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は、被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、生体サンプルは最大約１０９の無細胞核酸分子を含む、工程と；配列決定リードを生成するために、無細胞核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程と；少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程と；少なくとも１つの染色体領域の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程と、を含む。方法は、配列決定前に無細胞核酸分子を増幅する工程を含み得る。方法は、配列決定前および増幅後に、無細胞核酸分子にタグ付けする工程を含み得る。方法は、配列決定前に無細胞核酸分子にタグ付けする工程を含み得る。方法は、無細胞核酸分子にタグ付けする工程の後に無細胞核酸分子を増幅する工程を含み得る。方法は、無細胞核酸分子にタグ付けする工程の前に無細胞核酸分子を増幅する工程を含み得る。
【００８４】
非侵襲性出生前検査（ＮＩＰＴ）
いくつかの態様では、方法が本明細書に開示され、上記方法は：妊娠している被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、生体サンプルは、最大約１０９の無細胞胎児核酸分子を含む、工程と；配列決定リードを生成するために、無細胞胎児核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程と；少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程と；少なくとも１つの染色体領域の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程と、を含む。
【００８５】
いくつかの例では、過剰表現あるいは過少表現は、少なくとも１人の対照の妊娠している被験体における染色体または染色体領域の表現に関連する。いくつかの例では、少なくとも１人の対照の妊娠している被験体は、妊娠している正倍数性の被験体である。いくつかの例では、少なくとも１人の対照の妊娠している被験体は、妊娠している異数性の被験体である。いくつかの例では、少なくとも１人の対照の妊娠している被験体は、染色体異常がない妊娠している被験体である。いくつかの例では、少なくとも１人の対照の妊娠している被験体は、少なくとも１つの染色体異常を有している妊娠している被験体である。いくつかの例では、対照の妊娠している被験体は、正倍数性の胎児を有する。いくつかの例では、対照の妊娠している被験体は、異数性の胎児を有する。いくつかの例では、対照の妊娠している被験体は、遺伝的異常がない胎児を有する。いくつかの例では、対照の妊娠している被験体は、少なくとも１つの遺伝的異常がある胎児を有する。いくつかの例では、少なくとも１人の対照の妊娠している被験体は、染色体異常の存在または欠如が同じである複数の妊娠している被験体を含む。
【００８６】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法、デバイス、システム、およびキットは追加の対照を利用する。いくつかの例では、対照は、胎児が正倍数性である場合に予想される染色体の表現である。いくつかの例では、対照は、胎児が異数性である場合に予想される染色体の表現である。いくつかの例では、対照は、胎児が正倍数性である場合に予想される染色体の量である。いくつかの例では、対照は、胎児が異数性である場合に予想される染色体の量である。いくつかの例では、対照は、胎児が正倍数性である場合に予想される染色体に対応する配列決定リードの量である。いくつかの例では、対照は、胎児が異数性である場合に予想される染色体に対応する配列決定リードの量である。いくつかの例では、方法は対照サンプルにおける遺伝子情報を解析および検出する工程を含む。いくつかの例では、方法は、対照サンプルにおける遺伝子情報を解析および検出する工程を含み、その代わりに、対照基準データから得られた予め決められた対照基準値を使用する。これは、妊娠している被験体が自宅で自分のサンプルの解析を行い、対照サンプルにアクセスできない場合にとりわけ有益である。しかし、多くの場合、妊娠している被験体は、対照サンプル（例えば、親族、配偶者、友人からの）を容易に得ることもできる。さらに、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、多数のサンプルに指標付けすることによって、各サンプルを同時に解析することを提供する。
【００８７】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：妊娠している被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、生体サンプルは、最大約１０９の無細胞胎児核酸分子を含む、工程と；配列決定リードを生成するために無細胞胎児核酸の少なくとも一部を配列決定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの標的染色体の胎児異数性があると、９８％を超える精度で測定する工程と、を含む。
【００８８】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：妊娠している被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、生体サンプルは、最大約１０９の無細胞胎児核酸分子を含む、工程と；配列決定リードを生成するために、少なくとも２０００の無細胞胎児核酸を配列決定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの非標的染色体に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの標的染色体の胎児異数性があると、９８％を超える精度で測定する工程と、を含む。生体サンプルの全無細胞核酸分子における無細胞胎児核酸分子の画分が少ない場合でも、これらの数の配列決定リードで十分である。
【００８９】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：妊娠している被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、生体サンプルは、最大約１０９の無細胞胎児核酸分子を含む、工程と；増幅された核酸を生成するために、無細胞胎児核酸分子の少なくとも一部を増幅する工程と；配列決定リードを生成するために、少なくとも２０００の増幅された胎児核酸を配列決定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの非標的染色体に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リード対少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードの比率が、正倍数性胎児を有する対照の妊娠している正倍数性の被験体からの対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異なる場合、少なくとも１つの標的染色体の胎児異数性があると、９８％を超える精度で判定する工程と、を含む。いくつかの例では、方法は、増幅前、増幅中、あるいは増幅後に、または、少なくとも２０００の増幅された胎児核酸を配列決定する前に、核酸にバーコード付けするか、あるいはタグ付けする工程を含む。いくつかの例では、核酸は無細胞核酸である。
【００９０】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：妊娠している被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、生体サンプルは、最大約１０９の無細胞胎児核酸分子を含む、工程と；タグ付けされた核酸を生成するために、生体サンプルに存在する無細胞胎児核酸分子の少なくとも一部にバーコード付けし、および／またはタグ付けする工程と；配列決定リードを生成するために、少なくとも２０００のタグ付けされた核酸を配列決定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの非標的染色体に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リード対少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードの比率が、正倍数性胎児を有する対照の妊娠している正倍数性の被験体からの対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異なる場合、少なくとも１つの標的染色体の胎児異数性があると、９８％を超える精度で測定する工程と、を含む。いくつかの例では、方法は、少なくとも８０００のタグ付けされた核酸を配列決定する前に、バーコード付けされた、あるいはタグ付けされた核酸を増幅する工程を含む。
【００９１】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：妊娠している被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、生体サンプルは、最大約１０１０の無細胞核酸分子を含む、工程と；配列決定リードを生成するために、少なくとも８０００の無細胞核酸分子を配列決定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する少なくとも４０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの非標的染色体に対応する少なくとも４０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リード対少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードの比率が、正倍数性胎児を有する対照の妊娠している正倍数性の被験体からの対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異なる場合、少なくとも１つの標的染色体の胎児異数性があると、９８％を超える精度で判定する工程と、を含む。いくつかの例では、無細胞核酸は血液細胞由来ではない。いくつかの例では、無細胞核酸は血液細胞由来の核酸を含まない。いくつかの例では、無細胞核酸は血液細胞由来の核酸を含む。
【００９２】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：妊娠している被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、生体サンプルは、最大約１０１０の無細胞核酸分子を含む、工程と；増幅された無細胞核酸分子を生成するために無細胞核酸分子を増幅する工程と；配列決定リードを生成するために、少なくとも８０００の増幅された無細胞核酸分子を配列決定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する少なくとも４０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの非標的染色体に対応する少なくとも４０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リード対少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードの比率が、正倍数性胎児を有する対照の妊娠している正倍数性の被験体からの対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異なる場合、少なくとも１つの標的染色体の胎児異数性があると、９８％を超える精度で判定する工程と、を含む。いくつかの例では、方法は、少なくとも８０００の増幅された無細胞核酸分子を配列決定する工程の前に、増幅された無細胞核酸分子にタグ付けする工程を含む。
【００９３】
いくつかの態様では、方法が本明細書に記載され、上記方法は：妊娠している被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、生体サンプルは、最大約１０１０の無細胞核酸分子を含む、工程と；タグ付けされた無細胞核酸分子を生成するために無細胞核酸分子にタグ付けする工程と；配列決定リードを生成するために、存在する少なくとも８０００のタグ付けされた無細胞核酸分子を配列決定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する少なくとも４０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの非標的染色体に対応する少なくとも４０００の配列決定リードを測定する工程と；少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リード対少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードの比率が、正倍数性胎児を有する対照の妊娠している正倍数性の被験体からの対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異なる場合、少なくとも１つの標的染色体の胎児異数性があると、９８％を超える精度で測定する工程と、を含む。いくつかの例では、方法は、少なくとも８０００のタグ付けされた無細胞核酸分子を配列決定する工程の前に、タグ付けされた無細胞ＤＮＡフラグメントを増幅する工程を含む。
【００９４】
サンプル取得
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は本明細書に記載される生体サンプルを得る工程を含む。サンプルは直接得られてもよい（例えば、医者は被験体から血液サンプルを採取する）。サンプルは間接的に得られてもよい（例えば、輸送を介して、医者または被験体から専門家よって）。いくつかの実施形態において、生体サンプルは体液である。いくつかの例では、生体サンプルはスワブサンプル（例えば、頬側スワブ、膣スワブ）である。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、全血、血漿、血清、尿、唾液、間質液、または膣液を含む。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、指穿刺を介して血液サンプルを得る工程を含む。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、単一の指穿刺により血液サンプルを得る工程を含む。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、１回を超えない指穿刺で血液サンプルを得る工程を含む。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、毛細管血（例えば、指または皮膚の穿刺から得られた血液）を含む。いくつかの例では、方法は、対象の量の血液を得るために、穿刺からの血液を絞り取るか、あるいは絞る工程を含む。いくつかの例では、方法は、対象の量の血液を得るために、穿刺から血液を絞り取るか、あるいは絞る工程を含まない。指穿刺は毛細管血を得るための一般的な方法であるが、身体の他の場所、例えば、つま先、踵、腕、手のひら、肩、耳たぶにも適している。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は静脈切開なしで血液サンプルを得る工程を含む。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は毛細管血を得る工程を含む。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は静脈血を得る工程を含む。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、静脈血（例えば、静脈から得られた血液）を得る工程を含まない。いくつかの例では、方法は生検を介して生体サンプルを得る工程を含む。いくつかの例では、方法はリキッドバイオプシーを介して体液を得ることを含む。
【００９５】
いくつかの例では、方法は、断片化された核酸を有するサンプルを得る工程を含む。サンプルは、核酸の完全性を保つのに助けにならない条件にさらされている場合がある。非限定的な例として、サンプルは法医学サンプルであってもよい。法医学サンプルは、空気、熱、光などに晒されて、多くの場合、汚染されている。サンプルは冷凍および解凍されている場合がある。サンプルは、核酸を分解する化学物質または酵素に晒されている場合がある。いくつかの例では、方法は組織サンプルを得る工程を含み、ここで、組織サンプルは断片化された核酸を含む。いくつかの例では、方法は、核酸を含む組織サンプルを得て、断片化された核酸を生成するために核酸を断片化する工程を含む。いくつかの例では、組織サンプルは冷凍サンプルである。いくつかの例では、サンプルは保存されたサンプルである。いくつかの例では、組織サンプルは、固定されたサンプル（例えば、ホルムアルデヒド固定）である。方法は、サンプルから（断片化された）核酸を単離する工程を含み得る。方法は、遺伝子解析のために、溶液中の断片化された核酸を提供する工程を含み得る。
【００９６】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、５０μｌ未満の体液サンプルで実行される。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、７５μｌ未満の体液サンプルで実行される。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、１００μｌ未満の体液サンプルで実行される。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、１２５μｌ未満の体液サンプルで実行される。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、１５０μｌ未満の体液サンプルで実行される。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、２００μｌ未満の体液サンプルで実行される。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、３００μｌ未満の体液サンプルで実行される。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、４００μｌ未満の体液サンプルで実行される。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、５００μｌ未満の体液サンプルで実行される。
【００９７】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、超微量の体液サンプルを得る工程を含み、ここで、超微量はサンプル量の範囲内である。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約１ミリリットルである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約９００μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約８００μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約７００μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約６００μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約５００μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約４００μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約３００μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約２００μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約１５０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は５μｌ〜約１００μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約９０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約８５μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約８０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約７５μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約７０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約６５μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約６０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約５５μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約５μｌ〜約５０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約１５μｌ〜約１５０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約１５μｌ〜約１２０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は１５μｌ〜約１００μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約１５μｌ〜約９０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約１５μｌ〜約８５μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約１５μｌ〜約８０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約１５μｌ〜約７５μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約１５μｌ〜約７０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約１５μｌ〜約６５μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約１５μｌ〜約６０μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約１５μｌ〜約５５μｌである。いくつかの例では、サンプル量の範囲は約１５μｌ〜約５０μｌである。
【００９８】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、体液サンプルの超微量を得る工程を含み、ここで、超微量は約１００μｌ〜約５００μｌである。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、超微量の体液サンプルを得る工程を含み、ここで、超微量は約１００μｌ〜約１０００μｌである。いくつかの例では、超微量は約５００μｌ〜約１ｍｌである。いくつかの例では、超微量は約５００μｌ〜約２ｍｌである。いくつかの例では、超微量は約５００μｌ〜約３ｍｌである。いくつかの例では、超微量は約５００μｌ〜約５ｍｌである。
【００９９】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、超微量の生体サンプルを得る工程を含み、ここで、生体サンプルは全血である。超微量は約１μｌ〜約２５０μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約２５０μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約２５μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約３５μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約４５μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約５０μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約６０μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約８０μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約１００μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約１２０μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約１４０μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約１５０μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約１６０μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約１８０μｌであり得る。超微量は約１０μｌ〜約２００μｌであり得る。
【０１００】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、超微量の生体サンプルを得る工程を含み、ここで、生体サンプルは血漿または血清である。超微量は約１μｌ〜約２００μｌであり得る。超微量は約１μｌ〜約１９０μｌであり得る。超微量は約１μｌ〜約１８０μｌであり得る。超微量は約１μｌ〜約１６０μｌであり得る。超微量は約１μｌ〜約１５０μｌであり得る。超微量は約１μｌ〜約１４０μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約１５μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約２５μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約３５μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約４５μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約５０μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約６０μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約７０μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約８０μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約９０μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約１００μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約１２５μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約１５０μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約１７５μｌであり得る。超微量は約５μｌ〜約２００μｌであり得る。
【０１０１】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、超微量の生体サンプルを得る工程を含み、ここで、生体サンプルは尿である。一般に、尿中のＤＮＡの濃度は、約４０ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌである。いくつかの例では、超微量の尿は約０．２５μｌ〜１ミリリットルである。いくつかの例では、超微量の尿は約０．２５μｌ〜約１ミリリットルである。いくつかの例では、超微量の尿は少なくとも約０．２５μｌである。いくつかの例では、超微量の尿は最大で約１ミリリットルである。いくつかの例では、超微量の尿は、約０．２５μｌ〜約０．５μｌ、約０．２５μｌ〜約０．７５μｌ、約０．２５μｌ〜約１μｌ、約０．２５μｌ〜約５μｌ、約０．２５μｌ〜約１０μｌ、約０．２５μｌ〜約５０μｌ、約０．２５μｌ〜約１００μｌ、約０．２５μｌ〜約１５０μｌ、約０．２５μｌ〜約２００μｌ、約０．２５μｌ〜約５００μｌ、約０．２５μｌ〜約１ミリリットル、約０．５μｌ〜約０．７５μｌ、約０．５μｌ〜約１μｌ、約０．５μｌ〜約５μｌ、約０．５μｌ〜約１０μｌ、約０．５μｌ〜約５０μｌ、約０．５μｌ〜約１００μｌ、約０．５μｌ〜約１５０μｌ、約０．５μｌ〜約２００μｌ、約０．５μｌ〜約５００μｌ、約０．５μｌ〜約１ミリリットル、約０．７５μｌ〜約１μｌ、約０．７５μｌ〜約５μｌ、約０．７５μｌ〜約１０μｌ、約０．７５μｌ〜約５０μｌ、約０．７５μｌ〜約１００μｌ、約０．７５μｌ〜約１５０μｌ、約０．７５μｌ〜約２００μｌ、約０．７５μｌ〜約５００μｌ、約０．７５μｌ〜約１ミリリットル、約１μｌ〜約５μｌ、約１μｌ〜約１０μｌ、約１μｌ〜約５０μｌ、約１μｌ〜約１００μｌ、約１μｌ〜約１５０μｌ、約１μｌ〜約２００μｌ、約１μｌ〜約５００μｌ、約１μｌ〜約１ミリリットル、約５μｌ〜約１０μｌ、約５μｌ〜約５０μｌ、約５μｌ〜約１００μｌ、約５μｌ〜約１５０μｌ、約５μｌ〜約２００μｌ、約５μｌ〜約５００μｌ、約５μｌ〜約１ミリリットル、約１０μｌ〜約５０μｌ、約１０μｌ〜約１００μｌ、約１０μｌ〜約１５０μｌ、約１０μｌ〜約２００μｌ、約１０μｌ〜約５００μｌ、約１０μｌ〜約１ミリリットル、約５０μｌ〜約１００μｌ、約５０μｌ〜約１５０μｌ、約５０μｌ〜約２００μｌ、約５０μｌ〜約５００μｌ、約５０μｌ〜約１ミリリットル、約１００μｌ〜約１５０μｌ、約１００μｌ〜約２００μｌ、約１００μｌ〜約５００μｌ、約１００μｌ〜約１ミリリットル、約１５０μｌ〜約２００μｌ、約１５０μｌ〜約５００μｌ、約１ミリリットル〜約１５０μｌ、約２００μｌ〜約５００μｌ、約２００μｌ〜約１ミリリットル、または約５００μｌ〜約１ミリリットルである。いくつかの例では、使用される尿の量は、約０．２５μｌ、０．５μｌ、約０．７５μｌ、約１μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、約５０μｌ、約１００μｌ、約１５０μｌ、約２００μｌ、５００μｌ、または約１ミリリットルである。
【０１０２】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９０％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約５μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９０％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９０％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１５μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９０％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９０％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９５％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９８％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９９％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９０％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０〜約１２０μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９５％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０〜約１２０μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９７％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０〜約１２０μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９８％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０〜約１２０μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９９％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０〜約１２０μＬの血液を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９９．５％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０〜約１２０μＬの血液を得る工程を含む。
【０１０３】
いくつかの例において、体液サンプルは血漿または血清である。血漿または血清は、全血のおよそ５５％を占める。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９０％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０μＬの血漿または血清を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９８％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０μＬの血漿または血清を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９０％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１２μＬの血漿または血清を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９５％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１２μＬの血漿または血清を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９８％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１２μＬの血漿または血清を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９９％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１２μＬの血漿または血清を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９０％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０〜約６０μＬの血漿または血清を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９５％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０〜約６０μＬの血漿または血清を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９７％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０〜約６０μＬの血漿または血清を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９８％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０〜約６０μＬの血漿または血清を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９９％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０〜約６０μＬの血漿または血清を得る工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約９９．５％の信頼または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０〜約６０μＬの血漿または血清を得る工程を含む。
【０１０４】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から生体サンプルを得る工程を含み、生体サンプルは、ある量の無細胞核酸分子を含んでいる。いくつかの例において、生体サンプルを得る工程は、生体サンプル中の細胞の分裂または溶解をもたらす。ゆえに、いくつかの例において、生体サンプルは細胞核酸分子を含む。いくつかの例において、細胞核酸分子は、生体サンプル中の全細胞核酸分子の約１％未満を占める。いくつかの例において、細胞核酸分子は、生体サンプル中の全細胞核酸分子の約５％未満を占める。いくつかの例において、細胞核酸分子は、生体サンプル中の全細胞核酸分子の約１０％未満を占める。いくつかの例において、細胞核酸分子は、生体サンプル中の全細胞核酸分子の約２０％未満を占める。いくつかの例において、細胞核酸分子は、生体サンプル中の全細胞核酸分子の約５０％より多くを占める。いくつかの例において、細胞核酸分子は、生体サンプル中の全細胞核酸分子の約９０％未満を占める。
【０１０５】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から超微量の体液サンプルを得る工程を含み、体液サンプルは、超微量の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、超微量は、約４ｐｇ〜約１００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約４ｐｇ〜約１５０ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約４ｐｇ〜約２００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約４ｐｇ〜約３００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約４ｐｇ〜約４００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約４ｐｇ〜約５００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約４ｐｇ〜約１ｎｇである。いくつかの例において、超微量は、約１０ｐｇ〜約１００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約１０ｐｇ〜約１５０ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約１０ｐｇ〜約２００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約１０ｐｇ〜約３００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約１０ｐｇ〜約４００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約１０ｐｇ〜約５００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約１０ｐｇ〜約１ｎｇである。いくつかの例において、超微量は、約２０ｐｇ〜約１００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約２０ｐｇ〜約２００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約２０ｐｇ〜約５００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約２０ｐｇ〜約１ｎｇである。いくつかの例において、超微量は、約３０ｐｇ〜約１５０ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約３０ｐｇ〜約１８０ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約３０ｐｇ〜約２００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約３０ｐｇ〜約３００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約３０ｐｇ〜約４００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約３０ｐｇ〜約５００ｐｇである。いくつかの例において、超微量は、約３０ｐｇ〜約１ｎｇである。いくつかの例において、被験体は妊娠被験体であり、無細胞核酸は無細胞胎児ＤＮＡを含む。いくつかの例において、被験体は腫瘍を抱え、無細胞核酸は無細胞腫瘍ＤＮＡを含む。いくつかの例において、被験体は臓器移植レシピエントであり、無細胞核酸は臓器提供者のＤＮＡを含む。
【０１０６】
いくつかの例において、方法は、約１ｎｇ未満の無細胞胎児核酸を得る工程を含む。いくつかの例において、方法は、約５００ｐｇ未満の無細胞胎児核酸を得る工程を含む。いくつかの例において、方法は、約１００ｐｇ未満の無細胞胎児核酸を得る工程を含む。いくつかの例において、方法は、少なくとも３．５ｐｇの無細胞胎児核酸を得る工程を含む。いくつかの例において、方法は、少なくとも１０ｐｇの無細胞胎児核酸を得る工程を含む。いくつかの例において、方法は、約１００ｐｇ以下の無細胞胎児核酸を得る工程を含む。いくつかの例において、方法は、約５００ｐｇ以下の無細胞胎児核酸を得る工程を含む。いくつかの例において、方法は、約１ｎｇ以下の無細胞胎児核酸を得る工程を含む。
【０１０７】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から体液サンプルを得る工程を含み、体液サンプルは、少なくとも１ゲノム当量の無細胞ＤＮＡを含んでいる。当業者は、ゲノム当量が、全ての遺伝子が存在することを保証するためにサンプル中に存在する必要のあるＤＮＡの量であると理解する。本明細書に開示される超微量の体液サンプルは、極めて少ない数のゲノム当量を含み得る。いくつかの例において、体液サンプルは、１ゲノム当量未満の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、少なくとも５ゲノム当量の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、少なくとも１０ゲノム当量の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、少なくとも１５ゲノム当量の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、少なくとも２０ゲノム当量の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、約５〜約５０ゲノム当量を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、約１０〜約５０ゲノム当量を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、約１０〜約１００ゲノム当量を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、５０ゲノム当量以下の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、６０ゲノム当量以下の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、８０ゲノム当量以下の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、１００ゲノム当量以下の無細胞核酸を含んでいる。
【０１０８】
本明細書に開示される超微量の体液サンプルは、極めて少ない数の細胞当量を含み得る。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から体液サンプルを得る工程を含み、体液サンプルは、少なくとも１細胞当量の無細胞ＤＮＡを含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、少なくとも２細胞当量の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、少なくとも５細胞当量の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、約５〜約４０細胞当量の無細胞核酸細胞を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、少なくとも５〜約１００細胞当量の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、３０細胞当量以下の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、５０細胞当量以下の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、８０細胞当量以下の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、体液サンプルは、１００細胞当量以下の無細胞核酸を含んでいる。
【０１０９】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から生体サンプルを得る工程を含み、生体サンプルは、少なくとも１つの目的の無細胞核酸を含んでいる。非限定的な例として、目的の無細胞核酸は、無細胞胎児核酸、無細胞腫瘍ＤＮＡ、または移植臓器由来のＤＮＡであり得る。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から生体サンプルを得る工程を含み、生体サンプルは、約１〜約５の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から生体サンプルを得る工程を含み、生体サンプルは、約１〜約１５の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から生体サンプルを得る工程を含み、生体サンプルは、約１〜約２５の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から生体サンプルを得る工程を含み、生体サンプルは、約１〜約１００の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から生体サンプルを得る工程を含み、生体サンプルは、約５〜約１００の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、少なくとも１つの無細胞核酸は、本明細書に開示される標的染色体に特有の配列によって表される。
【０１１０】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から生体サンプルを得る工程を含み、生体サンプルは、約１０２〜約１０１０の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、生体サンプルは、約１０２〜約１０９の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、生体サンプルは、約１０２〜約１０８の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、生体サンプルは、約１０２〜約１０７の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、生体サンプルは、約１０２〜約１０６の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、生体サンプルは、約１０２〜約１０５の無細胞核酸を含んでいる。
【０１１１】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から生体サンプルを得る工程を含み、生体サンプルは、約１０３〜約１０１０の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、生体サンプルは、約１０３〜約１０９の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、生体サンプルは、約１０３〜約１０８の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、生体サンプルは、約１０３〜約１０７の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、生体サンプルは、約１０３〜約１０６の無細胞核酸を含んでいる。いくつかの例において、生体サンプルは、約１０３〜約１０５の無細胞核酸を含んでいる。
【０１１２】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、被験体から生体サンプルを得る工程を含み、生体サンプルは、典型的なサンプルタイプの体積に対応する多くの無細胞核酸を含んでいる。非限定的な例として、妊娠被験体の４ｍｌのヒト血液は典型的に、約１０１０の無細胞胎児核酸を含んでいる。しかし、サンプル中の無細胞胎児核酸の濃度、ゆえに、胎児遺伝学に関して有益となるのに必要なサンプル体積は、サンプルタイプに依存する。本明細書に提供される実施例７も、どのようにして当業者が十分な数の無細胞胎児核酸を得るのに必要な最少体積を決定するのかを実証する。
【０１１３】
サンプル処理
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルから無細胞核酸分子を単離または精製する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルから無細胞胎児核酸分子を単離または精製する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、本明細書に記載される生体サンプルから非核酸成分を除去する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから不要な非核酸成分を減らす工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから不要な非核酸成分を除去する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから不要な非核酸成分の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を除去する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから不要な非核酸成分の少なくとも９５％を除去する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから不要な非核酸成分の少なくとも９７％を除去する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから不要な非核酸成分の少なくとも９８％を除去する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから不要な非核酸成分の少なくとも９９％を除去する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから不要な非核酸成分の少なくとも９５％を除去する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから不要な非核酸成分の少なくとも９７％を除去する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから不要な非核酸成分の少なくとも９８％を除去する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから不要な非核酸成分の少なくとも９９％を除去する工程を含む。
【０１１４】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルの１つ以上の非核酸成分から核酸を単離または精製する工程を含む。非核酸成分はまた、不要な物質と考慮され得る。非核酸成分の非限定的な例には、細胞（例えば血液細胞）、細胞フラグメント、細胞外小胞、脂質、タンパク質、またはそれらの組み合わせが挙げられる。追加の非核酸成分は、本明細書全体にわたり記載される。方法は核酸を単離／精製する工程を含み、また、核酸精製工程において不要な物質と考慮されるサンプルの非核酸成分を解析する工程も含み得ることに、留意されたい。単離または精製する工程は、核酸の増幅または検出などの、後の処理工程を阻害し、それに干渉し、またはそれに好ましくない、生体サンプルの成分を除去する工程を含み得る。
【０１１５】
単離または精製する工程は、本明細書に開示されるデバイスまたはシステムにより実行され得る。単離または精製する工程は、本明細書に開示されるデバイスまたはシステム内で実行され得る。単離および／または精製する工程は、本明細書に開示されるサンプル精製装置の使用により行われ得る。いくつかの例において、核酸の単離または精製は、本明細書に記載される生体サンプルからの非核酸成分の除去を含む。いくつかの例において、核酸の単離または精製は、生体サンプルから非核酸成分を廃棄することを含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、非核酸成分の採取、処理、および解析を含む。いくつかの例において、非核酸成分は、被験体に関する追加情報を提供するので、バイオマーカーと考慮され得る。
【０１１６】
いくつかの例において、核酸の単離または精製は、細胞の溶解を含む。いくつかの例において、核酸の単離または精製は、細胞の溶解を回避する。いくつかの例において、核酸の単離または精製は、細胞の溶解を含まない。いくつかの例において、核酸の単離または精製は、細胞の溶解を意図した動的工程を含まない。いくつかの例において、核酸の単離または精製は、意図的な細胞の溶解を含まない。意図的な細胞の溶解は、機械的な細胞膜の分裂（例えば剪断）を含み得る。意図的な細胞の溶解は、細胞と溶解試薬との接触を含み得る。典型的な溶解試薬は本明細書に記載される。
【０１１７】
いくつかの例において、核酸の単離または精製は、溶液中の「ベイト（ｂａｉｔ）」を用いた標的核酸の溶解、およびその配列特異的な捕捉の実行、その後に、磁器ビーズなどの固体支持体への「ベイト」の結合を含む。例えば、Ｌｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ｆｒｅｅ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４０ （２００９）， １５３−１５７を参照。いくつかの例において、方法は、レコンビナーゼまたはヘリカーゼの存在下で配列特異的な捕捉を実行する工程を含む。レコンビナーゼまたはヘリカーゼの使用は、核酸の熱変性の必要性を避け、検出工程を速めることができる。
【０１１８】
いくつかの例において、単離または精製する工程は、本明細書に開示される生体サンプルの成分の分離を含む。非限定的な例として、単離または精製する工程は、血液から血漿を分離する工程を含み得る。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルを遠心分離する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルの成分を分離するために生体サンプルを濾過する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから非核酸成分を除去するために生体サンプルを濾過する工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプルから核酸を捉えるために生体サンプルを濾過する工程を含む。
【０１１９】
いくつかの例において、生体サンプルは血液であり、核酸を単離または精製する工程は、血液から血漿を得るまたは単離する工程を含む。血漿を得る工程は、血液サンプルの細胞成分から血漿を分離する工程を含み得る。血漿を得る工程は、血液を遠心分離する工程、血液を濾過する工程、またはそれらの組み合わせ含み得る。血漿を得る工程は、血液が重力を受けるのを可能にする工程（例えば沈降）を含み得る。血漿を得る工程は、血液を、血液の非核酸成分から離れた血液の部分を運ぶ材料にさらす工程を含み得る。いくつかの例において、方法は、血液を垂直濾過にさらす工程を含む。いくつかの例において、方法は、血液を、全血を受けるためのフィルターマトリクスを含むサンプル精製装置にさらす工程を含み、フィルターマトリクスは、細胞の通過を妨げる一方で血漿がフィルターマトリクスを自由に通過できる孔径を有している。そのような垂直濾過およびフィルターマトリクスは、本明細書に開示されるデバイスに対して記載される。
【０１２０】
いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプル、その画分、またはその修飾版を結合部分にさらす工程を含む。結合部分は、生体サンプルの成分に結合し、それを除去することで、不要なまたは対象でない細胞、細胞フラグメント、核酸、またはタンパク質を除去した修飾サンプルを産生できる。いくつかの例において、単離または精製する工程は、生体サンプル中の不要な物質または非核酸成分を減らすために生体サンプルを結合部分にさらす工程を含む。いくつかの例において、単離または精製する工程は、標的細胞、標的細胞フラグメント、標的核酸、または標的タンパク質により富化された修飾サンプルを産生するために生体サンプルを結合部分にさらす工程を含む。非限定的な例として、単離または精製する工程は、胎盤により養われた血小板を捕捉するために生体サンプルを結合部分にさらす工程を含み、血小板は胎児ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを含み得る。結果として生じる細胞結合部分は、抗体または他の方法、例えば低速遠心分離により、捕捉／富化され得る。
【０１２１】
単離または精製する工程は、結合部分により生体サンプル中の細胞外小胞または細胞外微粒子を捉える工程を含み得る。いくつかの例において、細胞外小胞は、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも１つを含む。いくつかの例において、細胞外小胞は、胎児／胎盤由来である。方法は、母体細胞から生じる生体サンプル中の細胞外小胞または細胞外微粒子を捉える工程を含み得る。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、胎児／胎盤の核酸に対してサンプルを富化するために、母体細胞からの細胞外小胞または細胞外微粒子を捉えて破棄する工程を含む。
【０１２２】
いくつかの例において、方法は、生体サンプル中のヌクレオソームを捉える工程、およびヌクレオソームに結合した核酸を解析する工程を含む。いくつかの例において、方法は、生体サンプル中のエキソソームを捉える工程、およびエキソソームに結合した核酸を解析する工程を含む。ヌクレオソームおよび／またはエキソソームを捉える工程は、溶解工程または試薬の必要性を排除し、それにより、方法を単純化し、かつサンプル採取から検出までの時間を短くする。
【０１２３】
いくつかの例において、方法は、胎児ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを含み得る、胎盤により養われた血小板を捉えるために生体サンプルを細胞結合部分にさらす工程を含む。捕捉は、胎盤により養われた血小板を結合部分（例えば細胞表面マーカーでは抗体）に接触させる工程、生体サンプルを低速遠心分離にさらす工程、またはそれらの組み合わせ含み得る。いくつかの例において、結合部分は本明細書に開示される固形支持体に結合され、方法は、結合部分が生体サンプルと接触した後に生体サンプルの残りから固形支持体を分離する工程を含む。
【０１２４】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルから不要な非核酸成分を除去する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルから非核酸成分を除去かつ廃棄する工程を含む。非核酸成分の非限定的な例には、細胞（例えば血液細胞）、細胞フラグメント、細胞外小胞、脂質、タンパク質、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの例において、非核酸成分を除去する工程は、生体サンプルを遠心分離刷る工程を含み得る。いくつかの例において、非核酸成分を除去する工程は、体液サンプルを濾過する工程を含み得る。いくつかの例において、非核酸成分を除去する工程は、本明細書に記載される結合部分により生体サンプルを接触させる工程を含み得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、サンプル中の核酸を精製する工程を含む。いくつかの例において、精製する工程は、洗浄緩衝液により核酸を洗浄する工程を含む。いくつかの例において、核酸は無細胞胎児核酸である。いくつかの実施形態において、精製する工程は、捕捉された核酸を産生するために核酸捕捉部分により核酸を捉える工程を含む。核酸捕捉部分の非限定的な例は、シリカ粒子および常磁性粒子である。いくつかの実施形態において、精製する工程は、捉えられた核酸を含むサンプルを、疎水性相（例えば液体またはワックス）に通す工程を含む。疎水性相は、核酸のさらなる操作（例えば増幅、配列決定）を阻害する、サンプル中の不純物を保持する。
【０１２６】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、本明細書に記載される生体サンプルから核酸成分を除去する工程を含む。いくつかの例において、除去した核酸成分は廃棄される。非限定的な例として、方法は、ＤＮＡのみを解析する工程を含み得る。ゆえに、ＲＮＡは不要であり、ＤＮＡの好ましくないバックグラウンドノイズまたは汚染を作り出してしまう。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルからＲＮＡを除去する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルからｍＲＮＡを除去する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルからマイクロＲＮＡを除去する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルから母体ＲＮＡを除去する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルからＤＮＡを除去する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、妊娠中の被験体の生体サンプルから母体ＤＮＡを除去する工程を含む。いくつかの例において、核酸成分を除去する工程は、核酸成分を、核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、オリゴヌクレオチドは、捕捉デバイス（例えばビーズ、カラム、マトリクス、ナノ粒子、磁性粒子など）に抱合され、付けられ、または結合される。いくつかの例において、除去した核酸成分は廃棄される。
【０１２７】
いくつかの例において、核酸成分を除去する工程は、サイズによりゲル上の核酸成分を分離する工程を含む。例えば、循環無細胞胎児ＤＮＡフラグメントは通常、長さが２００未満の塩基対である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルから無細胞ＤＮＡを除去する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルから無細胞ＤＮＡを捕捉する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、生体サンプルから無細胞ＤＮＡを選択する工程を含む。いくつかの例において、無細胞ＤＮＡは最小の長さを持つ。いくつかの例において、最小の長さは約５０の塩基対である。いくつかの例において、最小の長さは約１００の塩基対である。いくつかの例において、最小の長さは約１１０の塩基対である。いくつかの例において、最小の長さは約１２０の塩基対である。いくつかの例において、最小の長さは約１４０の塩基対である。いくつかの例において、無細胞ＤＮＡは最大の長さを持つ。いくつかの例において、最大の長さは約１８０の塩基対である。いくつかの例において、最大の長さは約２００の塩基対である。いくつかの例において、最大の長さは約２２０の塩基対である。いくつかの例において、最大の長さは約２４０の塩基対である。いくつかの例において、最大の長さは約３００の塩基対である。サイズに基づく分離は、当該技術分野で周知の、サイズ制限された範囲を持つ核酸の他のカテゴリー（例えばマイクロＲＮＡ）に有用である。
【０１２８】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つの増幅産物を産生するためにサンプル中の少なくとも１つの核酸を増幅する工程を含む。少なくとも１つの核酸は無細胞核酸であり得る。サンプルは、本明細書に開示される生体サンプル、その画分、または一部であり得る。いくつかの例において、方法は、サンプル中の核酸のコピーを産生する工程、および少なくとも１つの増幅産物を産生するためにコピーを増幅する工程を含む。いくつかの例において、方法は、サンプル中の核酸の逆転写をもたらす工程、および少なくとも１つの増幅産物を産生するために逆転写を増幅する工程を含む。
【０１２９】
いくつかの例において、方法は、全ゲノム増幅の実行を含む。いくつかの例において、方法は、全ゲノム増幅の実行を含まない。用語「全ゲノム増幅」は、生体サンプル中の無細胞核酸の全ての増幅を指す場合がある。用語「全ゲノム増幅」は、生体サンプル中の無細胞核酸の少なくとも９０％の増幅を指す場合がある。全ゲノムは多数のゲノムを指す場合がある。全ゲノム増幅は、被験体の生体サンプルからの無細胞核酸を増幅させる工程を含む場合があり、ここで生体サンプルは、被験体および外来組織由来の無細胞核酸を含む。例えば、全ゲノム増幅は、被験体（宿主ゲノム）、および被験体へと移植された臓器または組織（ドナーゲノム）の両方に由来する無細胞核酸を増幅する工程を含み得る。また、非限定的な例として、全ゲノム増幅は、妊娠中の被験体の生体サンプル由来の無細胞核酸を増幅させる工程を含む場合があり、ここで、生体サンプルは、妊娠中の被験体および胎児由来の無細胞核酸を含む。全ゲノム増幅は、癌を患う被験体の生体サンプル由来の無細胞核酸を増幅させる工程を含む場合があり、ここで、生体サンプルは、被験体の良性組織および腫瘍に由来する無細胞核酸を含む。全ゲノム増幅は、感染症を患う被験体の生体サンプル由来の無細胞核酸を増幅させる工程を含む場合があり、ここで、生体サンプルは、被験体および病原体に由来する無細胞核酸を含む。
【０１３０】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は核酸を増幅する工程を含み、ここで、増幅する工程は、核酸の等温増幅を実行する工程を含む。等温増幅の非限定的な例は以下のとおりである：ループ媒介性等温増幅法（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、およびレコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）。
【０１３１】
当該技術分野で既知のあらゆる適切な核酸増幅方法は、本明細書に記載されるデバイスおよび方法に使用することを企図されている。いくつかの例において、等温増幅が使用される。いくつかの例において、等温増幅を開始する前に、増幅は、最初の加熱工程を例外として等温である。それぞれに異なる考慮事項があり異なる利点をもたらす、多数の等温増幅方法が、当技術分野で既知であり、文献、例えばそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｚａｎｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓｐｏｔｏ，  ２０１３，「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ」，  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ３：  １８−４３、およびＦａｋｒｕｄｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＰＣＲ）」，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｌｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５（４）：  ２４５−２５２にて議論されている。いくつかの例において、あらゆる適切な等温増幅方法が使用される。いくつかの例において、使用される等温増幅方法は、以下から選択される：ループ媒介性等温増幅法（ＬＡＭＰ）；核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）；多重置換増幅（ＭＤＡ）；ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）；ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）；ラミフィケーション増幅方法（ＲＡＭ）；およびレコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）。
【０１３２】
いくつかの例において、使用される増幅方法は、ＬＡＭＰである（例えば、それぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｎｏｔｏｍｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，「Ｌｏｏｐ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」  ＮＡＲ  ２８（１２）：  ｅ６３  ｉ−ｖｉｉ、および米国特許第６，４１０，２７８号「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ」を参照）。ＬＡＭＰは、自己循環鎖置換デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成を使用する、一工程の増幅システムである。いくつかの例において、ＬＡＭＰは、熱安定性ポリメラーゼ、例えばバチルス−ステアロテルモフィルス（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、デオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）、特異的なプライマー、および標的ＤＮＡ鋳型の存在下で、４５〜６０分間、６０〜６５℃で実行される。いくつかの例において、鋳型はＲＮＡであり、逆転写酵素活性および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ活性、例えばＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼの両方を持つポリメラーゼが使用され、または、逆転写酵素の活性を持つポリメラーゼは逆転写酵素工程に使用され、逆転写酵素活性がないポリメラーゼは鎖置換ＤＮＡ合成工程に使用される。
【０１３３】
いくつかの例において、増幅方法は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）である。ＮＡＳＢＡ（３ＳＲ、および転写媒介性増幅としても知られる）は、等温の転写ベースのＲＮＡ増幅システムである。３つの酵素（鳥類骨髄芽細胞症ウイルス逆転写酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＴ７  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）が、一本鎖ＲＮＡを生成するために使用される。ある場合には、ＮＡＳＢＡは、ＤＮＡを増幅するために使用可能である。増幅反応は、典型的には約６０〜約９０分間、一定の温度を維持しながら４１℃で実行される（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｋｒｕｄｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＮＡＳＢＡ）  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓ．  ２（１）：Ｌ１０６−Ｌ１２１を参照）。
【０１３４】
いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は、約４０℃〜約４２℃で実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は４１℃で実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は最大約４２℃で実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は、約４０℃〜約４１℃、約４０℃〜約４２℃、または約４１℃〜約４２℃で実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は、約４０℃、約４１℃、または約４２℃で実行される。
【０１３５】
いくつかの例において、増幅方法は鎖置換増幅（ＳＤＡ）である。ＳＤＡは４つの異なるプライマーを使用する等温増幅方法である。制限部位（ＨｉｎｃＩＩエキソヌクレアーゼのための認識配列）を含むプライマーは、ＤＮＡ鋳型にアニールされる。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１（ｅｘｏ−クレノウ）のエキソヌクレアーゼ欠如フラグメントは、プライマーを伸長させる。各ＳＤＡサイクルは、（１）置換された標的フラグメントに結合するプライマー、（２）ｅｘｏ−クレノウによるプライマー／標的複合体の伸長、（３）結果として生じたヘミホスホチオエートＨｉｎｃＩＩ部位のニッキング、（４）ニッキング部位からのＨｉｎｃＩＩの解離、（５）ｅｘｏ−クレノウによる下流鎖のニッキングおよび置換の伸長から成る。
【０１３６】
いくつかの例において、方法は、サンプル中のＤＮＡをヘリカーゼと接触させる工程を含む。いくつかの例において、増幅方法は、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）である。ＨＤＡは、ヘリカーゼが熱の代わりにＤＮＡを変性させるために使用されることから、等温反応である。
【０１３７】
いくつかの例において、増幅方法は多置換増幅（ＭＤＡ）である。ＭＤＡは、高忠実度でゲノム全体を増幅させるための修飾ランダムプライマーと組み合わせて、バクテリオファージφ２９からの高度に前進的かつ鎖置換のＤＮＡポリメラーゼの使用に基づく、等温の鎖置換方法である。これは、非常に少量の出発材料からサンプル中の全てのＤＮＡを増幅するように開発されている。ＭＤＡにおいて、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼは、１６〜１８時間、３０℃でｄＮＴＰ、ランダム六量体、および変性鋳型ＤＮＡによりインキュベートされ、酵素は１０分間、高温（６５℃）で不活性化されねばならない。再循環の反復は必要とされないが、短い初期の変性工程、増幅工程、および酵素の最終不活性化は、必要となる。
【０１３８】
いくつかの例において、増幅方法は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。ＲＣＡは、単一の温度、典型的に約３０℃で、１０９倍より多くプローブＤＮＡ配列の増幅を可能にする、等温核酸増幅方法である。多数回の等温酵素合成がφ２９  ＤＮＡポリメラーゼにより実行され、これは、環状ＤＮＡプローブのまわりで継続的に進行することにより、サークルハイブリダイズされた（ｃｉｒｃｌｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）プライマーを伸長させる。いくつかの例において、増幅反応は、約２８℃〜３２℃で、ＲＣＡを使用して実行される。
【０１３９】
追加の増幅方法が当該技術分野で見出されており、本明細書に開示されるデバイスおよび方法に組み込み可能である。理想的には、増幅方法は従来のＰＣＲに比べて等温かつ高速である。いくつかの例において、増幅は、指数関数的な増幅反応（ＥＸＰＡＲ）を実行することを含み、これは、１つの反応の産物が同産物を作り出すさらなる反応を触媒するという点で、等温分子鎖反応である。いくつかの例において、増幅は、エンドヌクレアーゼの存在下で行われる。エンドヌクレアーゼは、ニッキングエンドヌクレアーゼであり得る。例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｌｉｇｎｅｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１８）を参照。いくつかの例において、増幅は、標的ＤＮＡの初期の熱変性を必要としない。例えば、Ｔｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ｉＳＤＡ）：  ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」，  Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｔ  （２０１５）を参照。パルスは、ＧＮＡ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨにより開発された超高速増幅方法において増幅を制御した。
【０１４０】
いくつかの例において、方法は、一対のプライマーで核酸増幅の多数のサイクルを実行する工程を含む。増幅サイクルの回数は重要であり、なぜなら増幅はバイアスを領域の表現へと導入し得るからである。極めて低い入力量により、増幅はバイアスをさらに作成する傾向があり、そのため、増幅前の効率の増大は、高精度のために重要である。全ての領域は同じ効率で増幅するわけではなく、そのため、解析の精度に影響を与える全体的な表現は、一定でない場合もある。増幅が全く必要でない場合、通常より少ないサイクルが理想的である。いくつかの例において、方法は、３０未満の増幅サイクルを実行する工程を含む。いくつかの例において、方法は、２５未満の増幅サイクルを実行する工程を含む。いくつかの例において、方法は、２０未満の増幅サイクルを実行する工程を含む。いくつかの例において、方法は、１５未満の増幅サイクルを実行する工程を含む。いくつかの例において、方法は、１２未満の増幅サイクルを実行する工程を含む。いくつかの例において、方法は、１１未満の増幅サイクルを実行する工程を含む。いくつかの例において、方法は、１０未満の増幅サイクルを実行する工程を含む。いくつかの例において、方法は、少なくとも３の増幅サイクルを実行する工程を含む。いくつかの例において、方法は、少なくとも５の増幅サイクルを実行する工程を含む。いくつかの例において、方法は、少なくとも８の増幅サイクルを実行する工程を含む。いくつかの例において、方法は、少なくとも１０の増幅サイクルを実行する工程を含む。
【０１４１】
いくつかの例において、増幅反応は約３０〜約９０分間、実行される。いくつかの例において、増幅反応は少なくとも約３０分間実行される。いくつかの例において、増幅反応は多くとも約９０分間実行される。いくつかの例において、増幅反応は、約３０分〜約３５分、約３０分〜約４０分、約３０分〜約４５分、約３０分〜約５０分、約３０分〜約５５分、約３０分〜約６０分、約３０分〜約６５分、約３０分〜約７０分、約３０分〜約７５分、約３０分〜約８０分、約３０分〜約９０分、約３５分〜約４０分、約３５分〜約４５分、約３５分〜約５０分、約３５分〜約５５分、約３５分〜約６０分、約３５分〜約６５分、約３５分〜約７０分、約３５分〜約７５分、約３５分〜約８０分、約３５分〜約９０分、約４０分〜約４５分、約４０分〜約５０分、約４０分〜約５５分、約４０分〜約６０分、約４０分〜約６５分、約４０分〜約７０分、約４０分〜約７５分、約４０分〜約８０分、約４０分〜約９０分、約４５分〜約５０分、約４５分〜約５５分、約４５分〜約６０分、約４５分〜約６５分、約４５分〜約７０分、約４５分〜約７５分、約４５分〜約８０分、約４５分〜約９０分、約５０分〜約５５分、約５０分〜約６０分、約５０分〜約６５分、約５０分〜約７０分、約５０分〜約７５分、約５０分〜約８０分、約５０分〜約９０分、約５５分〜約６０分、約５５分〜約６５分、約５５分〜約７０分、約５５分〜約７５分、約５５分〜約８０分、約５５分〜約９０分、約６０分〜約６５分、約６０分〜約７０分、約６０分〜約７５分、約６０分〜約８０分、約６０分〜約９０分、約６５分〜約７０分、約６５分〜約７５分、約６５分〜約８０分、約６５分〜約９０分、約７０分〜約７５分、約７０分〜約８０分、約７０分〜約９０分、約７５分〜約８０分、約７５分〜約９０分、または約８０分〜約９０分の間、実行される。いくつかの例において、増幅反応は、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、または約９０分の間、実行される。
【０１４２】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つの温度で核酸を増幅する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、単一の温度で核酸を増幅する工程（例えば等温増幅）を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、核酸を増幅する工程を含み、増幅する工程は２つ以下の温度で行われる。増幅する工程は、一工程または複数工程で行われ得る。増幅する工程の非限定的な例には、二本鎖変性、プライマーハイブリダイゼーション、およびプライマー伸長法が挙げられる。
【０１４３】
いくつかの例において、少なくとも１つの増幅する工程が、室温で行われる。いくつかの例において、全ての増幅する工程が、室温で行われる。いくつかの例において、少なくとも１つの増幅する工程が、ある温度範囲で行われる。いくつかの例において、全ての増幅する工程が、ある温度範囲で行われる。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約２５℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約３５℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約５５℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約６５℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約２５℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約３５℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約５５℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約６５℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約６０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約２５℃〜約６０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約３５℃〜約６０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約４０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−２０℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−２０℃〜約９０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−２０℃〜約５０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−２０℃〜約４０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−２０℃〜約１０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約４０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約３０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約２０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約１０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約９０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約７０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約６０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約５０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約３０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１０℃〜約３０℃である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は室温で実行され、冷却、冷凍、または加熱を必要としない。いくつかの例において、増幅する工程は、サンプルをランダムオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程を含む。いくつかの例において、増幅する工程は、本明細書に開示される無細胞核酸分子をランダム・オリゴヌクレオチド・プライマーと接触させる工程を含む。いくつかの例において、増幅する工程は、本明細書に開示される無細胞胎児核酸分子をランダム・オリゴヌクレオチド・プライマーと接触させる工程を含む。いくつかの例において、増幅する工程は、本明細書に開示されるタグ付けした核酸分子をランダム・オリゴヌクレオチド・プライマーと接触させる工程を含む。複数のランダムプライマーにより増幅する工程は一般的に、異なる配列の複数の核酸の非標的増幅、または、サンプル中の大半の核酸の全体的な増幅をもたらす。
【０１４４】
いくつかの例において、増幅する工程は、標的増幅（例えば、選別機方法（ＵＳ６５５８９２８に記載）、分子逆位プローブ）を含む。いくつかの例において、核酸を増幅する工程は、核酸を、標的の染色体配列に対応する配列を有する少なくとも１つのプライマーと接触させる工程を含む。典型的な染色体配列は本明細書に開示される。いくつかの例において、増幅する工程は、核酸を、非標的の染色体配列に対応する配列を有する少なくとも１つのプライマーと接触させる工程を含む。いくつかの例において、増幅する工程は、核酸を、多くとも一対のプライマーと接触させる工程を含み、対における各プライマーは、本明細書に開示される標的染色体上の配列に対応する配列を含む。いくつかの例において、増幅する工程は、核酸を複数セットのプライマーと接触させる工程を含み、第１のセットの第１の対の各々と、第１のセットの対の各々は、すべて異なっている。
【０１４５】
いくつかの例において、増幅する工程は、サンプルを、本明細書に開示される標的染色体上の配列に対応する配列を有する少なくとも１つのプライマーと接触させる工程を含む。いくつかの例において、増幅する工程は、サンプルを、本明細書に開示される非標的染色体上の配列に対応する配列を有する少なくとも１つのプライマーと接触させる工程を含む。いくつかの例において、増幅する工程は、サンプルを、多くとも一対のプライマーと接触させる工程を含み、対における各プライマーは、本明細書に開示される標的染色体上の配列に対応する配列を含む。いくつかの例において、増幅する工程は、サンプルを複数セットのプライマーと接触させる工程を含み、第１のセットの第１の対の各々と、第１のセットの対の各々は、すべて異なっている。
【０１４６】
いくつかの例において、増幅する工程は多重化（１つの反応における複数の核酸の核酸増幅）を含む。いくつかの例において、多重化は、生体サンプルの核酸を複数のオリゴヌクレオチドプライマー対と接触させる工程を含む。いくつかの例において、多重化は、第１の核酸と第２の核酸とを接触させる工程を含み、第１の核酸は第１の配列に対応し、第２の核酸は第２の配列に対応する。いくつかの実施形態において、第１の配列および第２の配列は、同じである。いくつかの実施形態において、第１の配列および第２の配列は、異なっている。いくつかの例において、増幅する工程は多重化を含まない。いくつかの例において、増幅する工程は多重化を必要としない。いくつかの例において、増幅する工程は、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー増幅を含む。方法は、多数の領域のマルチプレックスＰＣＲを含み、各領域は一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。多重化は、１つのチューブの中で行われ得る。いくつかの例において、方法は、１００より多くの領域のマルチプレックスＰＣＲを含み、各領域はＳＮＰを含む。いくつかの例において、方法は、５００より多くの領域のマルチプレックスＰＣＲを含み、各領域はＳＮＰを含む。いくつかの例において、方法は、１０００より多くの領域のマルチプレックスＰＣＲを含み、各領域はＳＮＰを含む。いくつかの例において、方法は、２０００より多くの領域のマルチプレックスＰＣＲを含み、各領域はＳＮＰを含む。いくつかの例において、方法は、３００より多くの領域のマルチプレックスＰＣＲを含み、各領域はＳＮＰを含む。
【０１４７】
いくつかの例において、方法は、サンプル中の核酸を増幅する工程を含み、増幅する工程はサンプルを少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程を含み、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、サンプルと接触するまで、活性でなく、または伸長可能でない。いくつかの例において、増幅する工程は、サンプルを少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程を含み、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、選択された温度にさらされるまで活性でなく、または伸長可能でない。いくつかの例において、増幅する工程は、サンプルを少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程を含み、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、活性化試薬に接触されるまで活性でなく、または伸長可能でない。非限定的な例として、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは保護基を含み得る。そのようなオリゴヌクレオチドプライマーの使用は、プライマー二量体を最小化し、未使用のプライマーの認識を可能にし、および／または未使用のプライマーにより引き起こされる誤った結果を回避し得る。いくつかの例において、増幅する工程は、サンプルを、本明細書に開示される標的染色体上の配列に対応する配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程を含む。
【０１４８】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、１つ以上のタグの使用を含む。１つ以上のタグの使用は、本明細書に開示される方法の効率、速度、および精度のうち少なくとも１つを増大できる。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドプライマーはタグを含み、タグは標的配列に特異的でない。そのようなタグは、ユニバーサルタグと称され得る。いくつかの例において、方法は、標的配列に特異的でないタグで、サンプル中の標的配列またはフラグメントにタグ付けする工程を含む。いくつかの例において、タグは、ヒト染色体上の配列に特異的でない。代替的に、または付加的に、方法は、サンプルを、タグ、および標的配列に対応する配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程を含み、タグはオリゴヌクレオチドプライマーから分離されている。いくつかの例において、タグは、オリゴヌクレオチドプライマーの伸長部により産生された増幅産物に組み込まれ、その後、標的配列にハイブリダイズする。タグは、オリゴヌクレオチド、小分子、またはペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、タグはヌクレオチドを含まない。いくつかの例において、タグはオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの例において、タグはアミノ酸を含まない。いくつかの実施形態において、タグはペプチドを含まない。いくつかの例において、タグは配列に特異的でない。いくつかの例において、タグは、任意の特定の標的配列に対応しない一般的な配列を含む。いくつかの例において、タグは、増幅産物が、配列の増幅にかかわらず産生されるときに検出可能である。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドプライマーおよびタグの少なくとも１つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドプライマーおよびタグの少なくとも１つは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【０１４９】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、複数のタグの使用を含み、それにより、前記方法の精度、前記方法の速度、および前記方法により得られた情報の少なくとも１つを増大させる。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、複数のタグの使用を含み、それにより、確実な結果を得るのに必要なサンプルの容量を減らす。いくつかの例において、複数のタグは少なくとも１つの捕捉タグを含む。いくつかの例において、複数のタグは少なくとも１つの検出タグを含む。いくつかの例において、複数のタグは、少なくとも１つの捕捉タグおよび少なくとも１つの検出タグの組み合わせを含む。捕捉タグは通常、他の領域から特定の配列または領域を単離または分離するために使用される。捕捉タグの代表例は、ビオチン（例えばストレプトアビジンを被覆した表面を捕捉可能）である。検出タグの例は、ジゴキシゲニンおよび蛍光タグである。検出タグは、発光アッセイまたは酵素アッセイなどの第２の検出システムを実行する、またはそれと相互作用する抗体を介して直接的（例えばレーザー照射および／または計量放出光）または間接的に検出され得る。いくつかの例において、複数のタグは、少なくとも１つの捕捉タグ（分析物を単離するために使用されるタグ）および少なくとも１つの検出タグ（分析物を検出するために使用されるタグ）を含む。いくつかの例において、単一のタグは、検出タグおよび捕捉タグとして作用する。
【０１５０】
いくつかの例において、方法は、サンプル中の少なくとも１つの循環無細胞核酸を第１のタグおよび第２のタグと接触させる工程を含み、第１のタグは、循環無細胞核酸のセンス鎖に相補的な第１のオリゴヌクレオチドを含み、第２の捕捉タグは、循環無細胞核酸のアンチセンス鎖に相補的な第２のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの例において、方法は、サンプル中の少なくとも１つの循環無細胞核酸を第１のタグおよび第２のタグと接触させる工程を含み、第１のタグは第２のタグと同じラベルを運ぶ。いくつかの例において、方法は、サンプル中の少なくとも１つの循環無細胞核酸を第１のタグおよび第２のタグと接触させる工程を含み、第１のタグは第２のタグとは異なるラベルを運ぶ。いくつかの例において、タグは同じものであり、検出された全てのプローブ／領域の凝集体である単一の質的または量的シグナルが存在する。いくつかの例において、タグは異なっている。１つのタグが精製に使用され、別のタグは検出に使用され得る。いくつかの例において、第１のオリゴヌクレオチドタグは、領域（例えばｃｆＤＮＡフラグメント）に特異的であり、蛍光ラベルを運び、および、第２のオリゴヌクレオチドは隣接領域に特異的であり、凝集シグナルのみが望まれることから同じ蛍光ラベルを運ぶ。他の例において、第１のオリゴヌクレオチドタグは領域（例えばｃｆＤＮＡフラグメント）に特異的であり、蛍光ラベルを運び、および、第２のオリゴヌクレオチドは隣接領域に特異的であり、２つの別個の領域を検出するために異なる蛍光ラベルを運ぶ。
【０１５１】
いくつかの例において、方法は、増幅産物を検出する工程を含み、増幅産物は、本明細書に開示される標的染色体の少なくとも一部、またはそのフラグメントの増幅により産生される。標的染色体の一部またはフラグメントは、少なくとも５つのヌクレオチドを含み得る。標的染色体の一部またはフラグメントは、少なくとも約１０のヌクレオチドを含み得る。標的染色体の一部またはフラグメントは、少なくとも約１５のヌクレオチドを含み得る。いくつかの例において、本明細書に開示される増幅産物を検出する工程は、増幅産物にタグ付けする、または標識する工程を含まない。いくつかの例において、方法は、その量に基づいて増幅産物を検出する。例えば、方法は、サンプル中の二本鎖ＤＮＡの量の増加を検出し得る。いくつかの例において、増幅産物を検出する工程は、そのサイズに基づいて少なくとも部分的に行われる。いくつかの例において、増幅産物は、約５０〜約５００の塩基対の長さを有している。
【０１５２】
いくつかの例において、増幅産物を検出する工程は、増幅産物をタグと接触させる工程を含む。いくつかの例において、タグは、増幅産物の配列に相補的な配列を含む。いくつかの例において、タグは、増幅産物の配列に相補的な配列を含まない。タグの非限定的な例は、前述と以下の開示に記載されている。
【０１５３】
いくつかの例において、増幅産物を検出する工程は、タグ付きでもタグ付きでなくても、増幅産物を本明細書に開示されるデバイス、システム、またはキットのシグナル検出器またはアッセイアセンブリにさらす工程を含む。いくつかの例において、方法は、本明細書に開示されるデバイス、システム、またはキットのアッセイアセンブリ上で増幅する工程および検出する工程を含む。いくつかの例において、アッセイアセンブリは増幅試薬を含む。いくつかの例において、方法は、側方流動アッセイを介して、生体サンプル、溶液、またはそれらの組み合わせの流れを制御するために、本明細書に開示されるアッセイアセンブリ（例えば側方流動アッセイ）に器機または試薬を適用する工程を含む。いくつかの例において、器機は、バキューム、ピペット、ポンプ、またはそれらの組み合わせである。
【０１５４】
配列決定
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、核酸を配列決定する工程を含む。核酸は、本明細書に開示される核酸、例えば、タグ付き核酸、増幅核酸、無細胞核酸、無細胞胎児核酸、標的染色体に対応する配列を持つ核酸、標的染色体の領域に対応する配列を持つ核酸、非標的染色体に対応する配列を持つ核酸、またはそれらの組み合わせなどである。いくつかの例において、核酸はＤＮＡである。いくつかの例において、核酸はＲＮＡである。いくつかの例において、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの例において、核酸はＲＮＡを含む。
【０１５５】
いくつかの例において、配列決定する工程は、標的配列決定を含む。いくつかの例において、配列決定する工程は、全ゲノム配列決定を含む。いくつかの例において、配列決定する工程は、標的配列決定、および全ゲノム配列決定を含む。いくつかの例において、全ゲノム配列決定は、次世代配列決定または第二世代配列決定として当技術分野で言及される、超並列配列決定を含む。いくつかの例において、全ゲノム配列決定は、ランダムな超並列配列決定を含む。いくつかの例において、配列決定する工程は、全ゲノムライブラリから捉えられた標的領域のランダムな超並列配列決定を含む。
【０１５６】
いくつかの例において、方法は、本明細書に開示される増幅核酸を配列決定する工程を含む。いくつかの例において、増幅核酸は、標的増幅（例えば、目的の標的配列に特異的なプライマーを持つ）によりもたらされる。いくつかの例において、増幅核酸は、非標的増幅（例えば、ランダム・オリゴヌクレオチド・プライマーを持つ）によりもたらされる。いくつかの例において、方法は、増幅核酸を配列決定する工程を含み、配列決定する工程は、超並列配列決定を含む。
【０１５７】
いくつかの例において、方法は、アルゴリズムを使用してゲノム配列アライメントを実行する工程を含む。非限定的な例として、アルゴリズムは、染色体コピー数を認識するよう設計され得る。アルゴリズムは、様々なＳＮＰ遺伝子座にある各関連対立遺伝子に関連付けられる配列読み取りの観察数を明らかにするよう設計され得る。アルゴリズムは、インシリコで測定された遺伝子座にて一染色体性、二染色体性、およびトリソミー性胎児の遺伝子型を作成するために親の遺伝子型およびクロスオーバー振動データを使用する場合があり、これらは後に、各遺伝子型の配列決定データを予測するために使用される。ベイズモデルを使用して、最大尤度を持つ配列決定データは、コピー数と胎児の画分として選択され、尤度は算出された精度である。異なる確率分布が、各ＳＮＰに対して２つの可能な対立遺伝子の各々に予測され、観察された対立遺伝子と比較され得る。これは、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  （２０１２）  ３２：１２３３−１２４１に記載されている。しかし、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．は、４．０％未満の胎児の画分を含有するサンプルは有益ではなく、かつ、少なくとも２０ｍｌの一定量の血液が、この種の解析の実行に十分な無細胞ＤＮＡを得るのに必要であったと考えた。対照的に、本出願の方法は、４％未満の胎児の画分を有するサンプル、およびほぼ同等のサンプルを必要としないサンプルを用いたこの解析を利用できる。
【０１５８】
ライブラリ調製
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、検出のために無細胞核酸のライブラリを産生するべく生体サンプル中の無細胞核酸を修飾する工程を含む。いくつかの例において、方法は、核酸配列決定のために無細胞核酸を修飾する工程を含む。いくつかの例において、方法は、検出のために無細胞核酸を修飾する工程を含み、検出は核酸配列決定を含まない。いくつかの例において、方法は、検出のために無細胞核酸を修飾する工程を含み、検出は、タグ検出の実行に基づいてタグ付き無細胞核酸を計数する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、無細胞核酸のライブラリを産生するために生体サンプル中の無細胞核酸を修飾する工程を含み、該方法は、無細胞核酸を増幅する工程を含む。いくつかの例において、修飾する工程は増幅する工程の前に行われる。いくつかの例において、修飾する工程は増幅する工程の後に行われる。
【０１５９】
いくつかの例において、無細胞核酸を修飾する工程は、核酸のフラグメントである無細胞核酸の端部を修復する工程を含む。非限定的な例として、端部を修復する工程は、５’リン酸基、３’ヒドロキシ基、またはそれらの組み合わせを無細胞核酸へと回収する工程を含み得る。いくつかの例において、修復する工程は、５’−リン酸化、Ａ−テーリング、間隙充填、ニッキング部位の閉鎖、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの例において、修復する工程は、オーバーハングを除去する工程を含み得る。いくつかの例において、修飾する工程は、オーバーハングを相補的なヌクレオチドで満たす工程を含み得る。
【０１６０】
いくつかの例において、ライブラリを調製するために無細胞核酸を修飾する工程は、アダプターの使用を含む。アダプターはまた、本明細書で配列決定アダプターと称される場合がある。いくつかの例において、アダプターは配列決定を補助する。一般的に、アダプターはオリゴヌクレオチドを含む。非限定的な例として、アダプターは、方法における他の工程、例えば増幅、精製、および配列決定などを単純化する場合があり、なぜなら、修飾後にサンプル中のすべてではないが複数の核酸に普遍的な配列であるからである。いくつかの例において、無細胞核酸を修飾する工程は、アダプターを核酸にライゲートする工程を含む。ライゲートする工程は、鈍的ライゲーションを含み得る。いくつかの例において、無細胞核酸を修飾する工程は、アダプターを核酸にハイブリダイズする工程を含む。
【０１６１】
ライブラリ調製工程（例えば、アダプターの末端修復、テーリング、およびライゲーション）および増幅の効率は、サンプルまたは増幅反応へのクラウディング剤の追加により利益を得る場合がある。それらの自然環境での酵素プロセス（例えば、細胞中のＤＮＡ複製）は多くの場合、クラウディング環境で生じる。これら酵素プロセスの一部は、クラウディング環境においてより効率的である。例えば、クラウディング環境は、ＤＮＡヘリカーゼの活性、およびＤＮＡポリメラーゼの感度を増強し得る。ゆえに、クラウディング剤は、クラウディング環境を模倣するべく添加され得る。クラウディング剤はポリマーでもよい。クラウディング剤はタンパク質でもよい。クラウディング剤は多糖であり得る。クラウディング剤の非限定的な例は、ポリエチレングリコール、デキストラン、およびフィコールである。インビボでのクラウディングを模倣する濃度が、多くの場合望ましい。例えば、４％（４０ｍｇ／ｍｌ）のＰＥＧ  １ｋＤａは、インビボで見出される近似のクラウディング効果をもたらす。いくつかの例において、クラウディング剤の濃度は、増幅反応において約２〜約２０％  ｗ／ｖである。いくつかの例において、クラウディング剤の濃度は、増幅反応において約２〜約１５％  ｗ／ｖである。いくつかの例において、クラウディング剤の濃度は、増幅反応において約２〜約１０％  ｗ／ｖである。いくつかの例において、クラウディング剤の濃度は、増幅反応において約２〜約８％  ｗ／ｖである。いくつかの例において、クラウディング剤の濃度は、増幅反応において約３〜約６％  ｗ／ｖである。
【０１６２】
いくつかの例において、ライブラリを調製するために無細胞核酸を修飾する工程は、タグの使用を含む。タグはまた、本明細書でバーコードと称される場合がある。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、目的の染色体領域に対応するタグを有する無細胞核酸を修飾する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、目的でない染色体領域に特異的なタグを有する無細胞核酸を修飾する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、目的である少なくとも１つの染色体領域に対応する第１のタグを持つ無細胞核酸の第１の部分、および目的でない少なくとも１つの染色体領域に対応する第２のタグを持つ無細胞核酸の第２の部分を修飾する工程を含む。いくつかの例において、核酸を修飾する工程は、タグを無細胞核酸にライゲートする工程を含む。ライゲートする工程は、鈍的ライゲーションを含み得る。いくつかの例において、無細胞核酸を修飾する工程は、タグを核酸にハイブリダイズする工程を含む。いくつかの実施形態において、タグはオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの例において、タグは、核酸解析とは別の手段により検出可能な、非オリゴヌクレオチドマーカーまたはラベルを含む。非限定的な例として、非オリゴヌクレオチドマーカーまたはラベルは、蛍光分子、ナノ粒子、染料、ペプチド、または他の検出可能／定量可能な小分子を含み得る。
【０１６３】
いくつかの例において、ライブラリを調製するために無細胞核酸を修飾する工程は、サンプル指標の使用を含み、これは単に、本明細書で指標と称される場合がある。非限定的な例として、指標は、オリゴヌクレオチド、小分子、ナノ粒子、ペプチド、蛍光分子、染料、または他の検出可能／定量可能な部分を含み得る。いくつかの例において、第１の生体サンプルからの無細胞核酸の第１の群は第１の指標により標識され、第１の生体サンプルからの無細胞核酸の第１の群は第２の指標により標識され、第１の指標および第２の指標は異なるものである。ゆえに、複数の指標により、複数のサンプルを一度に解析したときに複数のサンプルから無細胞核酸を判別できる。いくつかの例において、方法は、無細胞核酸を増幅する工程を開示し、無細胞核酸を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは指標を含む。
【０１６４】
ＤＮＡ損失は、ＤＮＡの単離および解析の工程ごとに生じる場合があり、最大の損失は典型的に、ライブラリ調製の工程に生じる。従来の方法は、材料の８０％から９０％の損失を示す。多くの場合、この損失は、ＤＮＡの濃度を次世代配列決定に必要なレベルにまで上げるために後続の増幅工程により補われるが、増幅は、先の工程中に生じた情報の損失を補えない。サンプル中の初期のＤＮＡの８０％の損失に悩むライブラリは、２０％の効率または０．２の効率を有するライブラリとして記載され得る。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約０．２、少なくとも約０．３、少なくとも約０．４、少なくとも約０．５、少なくとも約０．６、または少なくとも約０．８の効率を有するライブラリを達成する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約０．４の効率を有するライブラリを産生する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも約０．５の効率を有するライブラリを産生する工程を含む。そのような効率を有するライブラリを産生する方法は、クラウディング剤を使用し、無細胞ＤＮＡフラグメント末端を修復し、ライゲーション法、精製法、循環パラメーター、および本明細書に記載されるような理論混合比により、これらの効率を達成し得る。
【０１６５】
遺伝子情報の検出
一般的に、本明細書に開示される方法は、バイオマーカー、分析物、またはそれらの修飾形態を検出する工程を含む。いくつかの例において、方法は、核酸を検出する工程を含む。いくつかの例において、方法は、無細胞核酸を検出する工程を含む。いくつかの例において、方法は、核酸のタグを検出する工程を含む。いくつかの例において、方法は、核酸のアンプリコンを検出する工程を含む。代替的に、または付加的に、方法は、非核酸成分を検出する工程を含む。非限定的な例として、非核酸成分は、タンパク質、ペプチド、脂質、脂肪酸、ステロール、リン脂質、炭水化物、ウイルス成分、微生物成分、およびそれらの組み合わせから選択され得る。ウイルス成分または微生物成分の場合、方法は、検出前にウイルスまたは細菌から核酸を放出する工程、精製する工程、および／または増幅する工程を含み得る。
【０１６６】
検出する工程は、目的の核酸を配列決定する工程を含み得る。検出する工程は、目的の核酸上のタグを検出する工程を含み得る。検出する工程は、目的のバイオマーカー上のタグを検出する工程を含み得る。バイオマーカーはエピジェネティック修飾であり得る。バイオマーカーはエピジェネティックプロファイル（複数のエピジェネティック修飾）であり得る。バイオマーカーはエピジェネティック修飾された核酸であり得る。検出する工程は、重亜硫酸塩配列決定を含み得る。検出する工程は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを実行する工程を含み得る。検出する工程は、目的のバイオマーカー上のタグを配列決定する工程を含み得る。
【０１６７】
検出する工程は、本明細書に記載されるような増幅する工程を含み得る。例えば、増幅する工程は、標的分析物の有無に基づいてシグナルが生成されるｑＰＣＲを含み得る。いくつかの例において、増幅する工程はＰＣＲを含む。いくつかの例において、増幅する工程はＰＣＲを含まない。いくつかの例において、増幅する工程はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む。いくつかの例において、ｃｆＤＮＡは、ｃｆＤＮＡにハイブリダイズするよう設計されたＤＮＡリガーゼおよびプローブと接触される。いくつかの例において、ｃｆＤＮＡは、ｃｆＤＮＡフラグメントを産生するために最初に切断され（例えば、制限酵素にさらされる）、ｃｆＤＮＡフラグメントはリガーゼおよびプローブにより接触される。リガーゼは、プローブで標識された円形状のｃｆＤＮＡを作成する。随意に、バックボーンオリゴを使用して、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＤＮＡフラグメントを円形にする。これら円形状のフラグメントは、コンカテマーを産生するためにＲＣＡにより複製される。プローブは、検出可能なオリゴヌクレオチド（例えば蛍光）により認識され、画像化可能である。
【０１６８】
方法は、生体サンプルの核酸中の遺伝子突然変異を検出する工程を含み得る。方法は、生体サンプルの核酸中の複数の遺伝子突然変異を検出する工程を含み得る。方法は、生体サンプルの複数の核酸の各々における遺伝子突然変異を検出する工程を含み得る。方法は、生体サンプルの複数の核酸における複数の遺伝子突然変異を検出する工程を含み得る。
【０１６９】
方法は、生体サンプルの核酸のエピジェネティック修飾を検出する工程を含み得る。いくつかの例において、エピジェネティック修飾を検出する工程は、重亜硫酸塩配列決定を実行する工程を含む。いくつかの例において、エピジェネティック修飾を検出する工程は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを実行する工程を含む。いくつかの例において、エピジェネティック修飾は遺伝性改質である。いくつかの例において、エピジェネティック修飾は、細胞が１つ以上の環境刺激に応じて転写に影響を及ぼすのを可能にする改質である。非限定的な例として、エピジェネティック修飾は、シトシンまたはアデニンの残基のメチル化であり得る。いくつかの例において、エピジェネティック修飾はメチル基の欠如である。典型的にメチル化は、遺伝子のサイレンシングを促進する。エピジェネティック修飾には、ヒストンのアセチル化、メチル化、ユビキチン化、およびリン酸化が挙げられる。エピジェネティック修飾は、生物学的プロセス（例えば免疫応答、細胞増殖）を促進する、阻害する、妨げる、または減少し得る。方法は、生体サンプルの核酸の複数のエピジェネティック修飾を検出する工程を含み得る。方法は、生体サンプルの複数の核酸の各々のエピジェネティック修飾を検出する工程を含み得る。方法は、生体サンプルの複数の核酸のエピジェネティック修飾を検出する工程を含み得る。方法は、試験サンプルと対照／基準サンプルとの間の差動的にメチル化された領域を同定するために、エピジェネティック修飾のゲノム幅の解析を実行する工程を含み得る。
【０１７０】
方法は、組織に特異的な１つ以上のエピジェネティック修飾を検出する工程を含む。例えば、組織には、無細胞核酸の起源を追跡するために使用可能な別個のメチル化プロファイルがある。これは、無細胞核酸が生じた場所の判定に有用であり得る。非限定的な例として、エピジェネティック修飾は、脳および無細胞核酸に特異的であり、すなわち、エピジェネティック修飾は神経変性疾患または脳腫瘍を示し得る。方法はさらに、そのような無細胞核酸が検出された場合に、組織を検査し、生検し、撮像し、または処理する工程を含む。方法は、２つの組織にのみ特異的な１つ以上のエピジェネティック修飾を検出する工程を含む。方法は、３未満の組織に特異的な１つ以上のエピジェネティック修飾を検出する工程を含む。方法は、５未満の組織に特異的な１つ以上のエピジェネティック修飾を検出する工程を含む。
【０１７１】
方法は、核酸または非核酸成分の検出可能なラベルまたは検出可能なシグナルを検出する工程を含み得る。方法は、核酸または非核酸成分に結合する結合部分（例えば小分子、ペプチド、アプタマー、抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント）の検出可能なラベルまたは検出可能なシグナルを検出する工程を含み得る。非限定的な例として、検出可能なラベルまたはシグナルは、蛍光分子、生物発光分子、発光分子、放射性シグナル、磁気シグナル、電気シグナル、または染料であり得る。例えば、方法は、結合部分と目的のタンパク質との相互作用を検出する工程を含み得る。非限定的な例として、検出する工程は、ＩＰＣＲまたはＰＬＡを実行する工程を含み得る。
【０１７２】
検出する工程は、検査の結果が表示される、本明細書に開示されたデバイスまたはシステムのインターフェースを観察する工程を含み得る。例えば、図４および図５Ａ−Ｅを参照。検出する工程は、側方流動デバイス上の色の外観または蛍光シグナルを観察する工程を含み得る。検出する工程は、本明細書に開示されるデバイス上で検査の結果を受信する工程を含み得る。検出する工程は、検査の結果をモバイル機器、コンピューター、ノートパッド、または本明細書に開示されるシステムのデバイスと通信状態にある他の電子デバイス上で受信する工程を含み得る。
【０１７３】
一般的に、本明細書に開示される方法、キット、システム、およびデバイスは、短時間で遺伝子情報を提供できる。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約１分未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約２分未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約５分未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約１０分未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約１５分未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約２０分未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約３０分未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約４５分未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約６０分未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約９０分未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約２時間未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約３時間未満で実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、約４時間未満で実行可能である。
【０１７４】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、最小限の技術訓練しか必要としない。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、何の技術訓練も必要としない。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される方法を実施する個人がサンプルや溶液を転移および混合させる単純なプロトコルに従うことしか必要としない。例えば、本明細書に開示される方法は、専門家または医療従事者の補助なしに、妊娠中の被験体により自宅で使用され得る。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、医学訓練または技術訓練を受けていないユーザーにより実行可能である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法、キット、システム、およびデバイスは、ユーザーが生体サンプルをシステムまたはデバイスに追加し、随意にシステムまたはデバイスを起動し、かつ結果を確認して遺伝子情報を得ることを単に要求する。
【０１７５】
方法は、検出に基づいて疾患または疾病の存在を検出する工程を含み得る。方法は、検出に基づいて疾患または疾病のリスクを検出する工程を含み得る。方法は、検出に基づいて疾患または疾病の状態を検出する工程を含み得る。方法は、検出に基づいて疾患または疾病の状態をモニタリングする工程を含み得る。方法は、検出に基づいて治療を施す工程を含み得る。方法は、検出に基づいて被験体に投与されている薬物の投与量を修正する工程を含み得る。方法は、検出に基づいて治療中の被験体の反応をモニタリングする工程を含み得る。例えば、疾患は癌であり、治療は化学療法であり得る。他の癌治療には、限定されないが、抗体、抗体と薬物の抱合体、アンチセンス分子、操作されたＴ細胞、および放射が挙げられる。方法はさらに、検出に基づいて被験体を検査する工程を含み得る。例えば、疾患は癌であり、更なる検査には、限定されないが、画像化（例えばＣＡＴ−ＳＣＡＮ、ＰＥＴ−ＳＣＡＮ）、および生検の実行が挙げられる。
【０１７６】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つの標的接触体の胎児異数性の存在を検出する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、配列決定リードの量が本明細書に開示されるサンプル中で検出されたときに少なくとも１つの標的接触体の胎児異数性の存在を検出する工程を含む。いくつかの例において、配列決定リードの量は、本明細書に記載のように、ヒト集団中の異数性を示すと知られる染色体または染色体領域由来の配列に対応する。
【０１７７】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードと、少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードとの比率が、正倍数性の胎児を持つ対照の妊娠被験体の対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異なる場合、少なくとも１つの標的染色体の胎児異数性の存在を検出する工程を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つの標的染色体の胎児異数性の存在を検出する工程を含み、なぜなら、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードと、少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードとの比率が、正倍数性の胎児を持つ対照の妊娠被験体の対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異なるからである。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つの標的染色体の胎児異数性の不在を検出する工程を含み、なぜなら、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードと、少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードとの比率が、正倍数性の胎児を持つ対照の妊娠被験体の対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異ならないからである。
【０１７８】
いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードは、少なくとも１つの標的染色体の染色体領域に対応する配列決定リードを含む。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードは、非標的染色体の染色体領域に対応する配列決定リードを含む。いくつかの例において、染色体領域は、長さが少なくとも約１０の塩基対である。いくつかの例において、染色体領域は、長さが少なくとも約２０の塩基対である。いくつかの例において、染色体領域は、長さが少なくとも約５０の塩基対である。
【０１７９】
いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体１３、染色体１６、染色体１８、染色体２１、染色体２２、染色体Ｘ、または染色体Ｙのうち少なくとも１つである。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体１３、染色体１８、および染色体２１のうち少なくとも１つである。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体１３、染色体１８、染色体２１、および染色体Ｘのうち少なくとも１つである。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体１３、染色体１８、染色体２１、および染色体Ｙのうち少なくとも１つである。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体１３、染色体１８、染色体２１、染色体Ｘ、および染色体Ｙのうち少なくとも１つである。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体１３である。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体１６である。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体１８である。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体２１である。いくつかの例において、標的染色体は、染色体２２である。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、性染色体である。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体Ｘである。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体Ｙである。
【０１８０】
いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１３、染色体１６、染色体１８、染色体２１、染色体２２、染色体Ｘ、または染色体Ｙ以外の染色体のうち少なくとも１つである。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１３、染色体１６、染色体１８、染色体２１、染色体２２、染色体Ｘ、または染色体Ｙではない。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１、染色体２、染色体３、染色体４、染色体５、染色体６、染色体７、染色体８、染色体９、染色体１０、染色体１１、染色体１２、染色体１４、染色体１５、染色体１７、染色体１９、および染色体２０から選択される。いくつかの例において、非標的染色体は、染色体１である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体２である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体３である。いくつかの例において、非標的染色体は、染色体４である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体５である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体６である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体７である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体８である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体９である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１０である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１１である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１２である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１４である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１５である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１７である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１９である。いくつかの例において、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体２０である。
【０１８１】
いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体１３であり、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１３以外の染色体である。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体１６であり、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１６以外の染色体である。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体１８であり、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体１８以外の染色体である。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体２１であり、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体２１以外の染色体である。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体２２であり、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体２２以外の染色体である。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体Ｘであり、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体Ｘ以外の染色体である。いくつかの例において、少なくとも１つの標的染色体は、染色体Ｙであり、少なくとも１つの非標的染色体は、染色体Ｙ以外の染色体である。
【０１８２】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、妊娠中の被験体の胎児が遺伝的異常を持つことを検出する工程を含む。いくつかの例において、遺伝的異常は、標的染色体領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの挿入が原因である。いくつかの例において、遺伝的異常は、標的染色体領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの欠失が原因である。いくつかの例において、遺伝的異常は、第１の標的染色体領域と第２の染色体標的領域との間のヌクレオチドの転座が原因である。一般的に、第１の標的染色体領域および第２の染色体標的領域は、異なる染色体に位置する。
【０１８３】
いくつかの例において、標的染色体領域は、最小の長さにより定められる。いくつかの例において、核酸は、長さが少なくとも約５０の塩基対である。いくつかの例において、核酸は、長さが少なくとも約１００の塩基対である。いくつかの例において、核酸は、長さが少なくとも約２００の塩基対である。いくつかの例において、核酸は、長さが少なくとも約３００の塩基対である。いくつかの例において、核酸は、長さが少なくとも約５００の塩基対である。いくつかの例において、核酸は、長さが少なくとも約１０００の塩基対である。
【０１８４】
いくつかの例において、標的染色体領域は、最大の長さにより定められる。いくつかの例において、標的染色体領域は、約１００，０００の塩基対もの長さである。いくつかの例において、標的染色体領域は、約５００，０００の塩基対もの長さである。いくつかの例において、標的染色体領域は、約１，０００，０００の塩基対もの長さである。いくつかの例において、標的染色体領域は、約１０，０００，０００の塩基対もの長さである。いくつかの例において、標的染色体領域は、約１００，０００，０００の塩基対もの長さである。いくつかの例において、標的染色体領域は、約２００，０００，０００の塩基対もの長さである。
【０１８５】
いくつかの例において、遺伝的異常は、コピー数変異である。いくつかの例において、コピー数変異は、少なくとも１つの染色体上の遺伝子の欠失を含む。いくつかの例において、コピー数変異は、少なくとも１つの染色体上の遺伝子の重複を含む。いくつかの例において、コピー数変異は、少なくとも１つの染色体上の遺伝子の三重化を含む。いくつかの例において、コピー数変異は、遺伝子の３より多くのコピーを含む。いくつかの例において、コピー数変異は、少なくとも１つの染色体上の非タンパク質コード配列の重複を含む。いくつかの例において、コピー数変異は、少なくとも１つの染色体上の非コード領域の三重化を含む。いくつかの例において、コピー数変異は、少なくとも１つの染色体上の非コード領域の重複を含む。
【０１８６】
いくつかの例において、遺伝的異常は、染色体の腕の少なくとも約０．００１％を重複させる。いくつかの例において、遺伝的異常は、染色体の腕の少なくとも約０．０１％を重複させる。いくつかの例において、遺伝的異常は、染色体の腕の少なくとも約０．１％を重複させる。いくつかの例において、遺伝的異常は、染色体の腕の少なくとも約１％を重複させる。いくつかの例において、遺伝的異常は、染色体の腕の少なくとも約１０％を重複させる。いくつかの例において、染色体の腕の少なくとも約２０％が重複される。いくつかの例において、染色体の腕の少なくとも約３０％が重複される。いくつかの例において、染色体の腕の少なくとも約５０％が重複される。いくつかの例において、染色体の腕の少なくとも約７０％が重複される。いくつかの例において、染色体の腕の少なくとも約９０％が重複される。いくつかの例において、染色体の腕すべてが重複される。
【０１８７】
いくつかの例において、遺伝的異常は、染色体の腕の少なくとも約０．００１％を欠失させる。いくつかの例において、遺伝的異常は、染色体の腕の少なくとも約０．０１％を欠失させる。いくつかの例において、遺伝的異常は、染色体の腕の少なくとも約０．１％を欠失させる。いくつかの例において、遺伝的異常は、染色体の腕の少なくとも約１％を欠失させる。いくつかの例において、遺伝的異常は、染色体の腕の少なくとも約１０％を欠失させる。いくつかの例において、染色体の腕の少なくとも約２０％が欠失される。いくつかの例において、染色体の腕の少なくとも約３０％が欠失される。いくつかの例において、染色体の腕の少なくとも約５０％が欠失される。いくつかの例において、染色体の腕の少なくとも約７０％が欠失される。いくつかの例において、染色体の腕の少なくとも約９０％が欠失される。いくつかの例において、染色体の腕すべてが欠失される。
【０１８８】
いくつかの例において、方法は、標的染色体領域に対応する配列決定リードの量が検出された場合に、胎児に遺伝的異常があると検出する工程を含み、量は、遺伝的異常を示す。
【０１８９】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、核酸を配列決定する工程を含む。いくつかの例において、核酸は無細胞核核酸である。いくつかの例において、核酸は無細胞胎児核酸である。いくつかの例において、核酸は無細胞胎児核酸である。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、少なくとも最小量の配列決定リードをもたらす工程を含む。いくつかの例において、配列決定リードの最小量は、約１００である。いくつかの例において、配列決定リードの最小量は、約１０００である。いくつかの例において、配列決定リードの最小量は、約２０００である。いくつかの例において、配列決定リードの最小量は、約３０００である。いくつかの例において、配列決定リードの最小量は、約４０００である。いくつかの例において、配列決定リードの最小量は、約５０００である。いくつかの例において、配列決定リードの最小量は、約６０００である。いくつかの例において、配列決定リードの最小量は、約７０００である。いくつかの例において、配列決定リードの最小量は、約８０００である。いくつかの例において、配列決定リードの最小量は、約９０００である。いくつかの例において、配列決定リードの最小量は、約１０，０００である。
【０１９０】
いくつかの例において、方法は、（１）標的染色体領域に対応する配列決定リードと（２）少なくとも１つの非標的染色体領域に対応する配列決定リードとの比率が、遺伝的異常のない胎児を持つ対照の妊娠被験体の対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異なる場合に、胎児に遺伝的異常があると検出する工程を含む。いくつかの例において、方法は、胎児に遺伝的異常があると検出する工程を含み、なぜなら、（１）標的染色体領域に対応する配列決定リードと（２）少なくとも１つの非標的染色体領域に対応する配列決定リードとの比率が、遺伝的異常のない胎児を持つ対照の妊娠被験体の対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異なるからである。いくつかの例において、方法は、胎児に遺伝的異常がないと検出する工程を含み、なぜなら、（１）標的染色体領域に対応する配列決定リードと（２）少なくとも１つの非標的染色体領域に対応する配列決定リードとの比率が、遺伝的異常のない胎児を持つ対照の妊娠被験体の対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異ならないからである。いくつかの例において、染色体領域および非標的染色体領域は、同じ染色体上にある。いくつかの例において、染色体領域および非標的染色体領域は、異なる染色体上にある。
【０１９１】
いくつかの例において、遺伝子情報は、ある程度正確に検出される。遺伝子情報の非限定的な例には、胎児異数性、遺伝的異常、腫瘍ＤＮＡの存在／量、および移植臓器／組織ＤＮＡの存在／量が挙げられる。いくつかの例において、遺伝子情報は少なくとも約９５％の精度で検出される。いくつかの例において、遺伝子情報は少なくとも約９６％の精度で検出される。いくつかの例において、遺伝子情報は少なくとも約９７％の精度で検出される。いくつかの例において、遺伝子情報は少なくとも約９８％の精度で検出される。いくつかの例において、遺伝子情報は少なくとも約９９％の精度で検出される。いくつかの例において、遺伝子情報は少なくとも約９９．５％の精度で検出される。いくつかの例において、遺伝子情報は少なくとも約９９．９％の精度で検出される。いくつかの例において、遺伝子情報は少なくとも約９９．９９％の精度で検出される。
【０１９２】
各染色体からの読み取りは、染色体の長さに従って大まかに表される。大半の読み取りは染色体１から得られ、一方で常染色体からの最小の読み取りは、染色体２１から得られる。トリソミーサンプルを検出する一般的な方法は、正倍数性サンプルの集団中の染色体から得られる読み取りのパーセンテージを測定することである。次に、この染色体パーセンテージ値のセットに対する平均と標準偏差を算出する。カットオフ値を、３つの標準偏差を平均に加えることで決定する。新たなサンプルにカットオフ値より上の染色体パーセンテージ値がある場合、その染色体の過剰表現を想定でき、過剰表現は多くの場合、染色体のトリソミーと一貫している。染色体の過剰表現の検出の予測例を、実施例１３に提示する。
【０１９３】
いくつかの例において、（１）少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードと（２）少なくとも１つの非標的染色体に対応する配列決定リードが、正倍数性胎児を持つ対照の妊娠被験体の対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と少なくとも約０．１％異なる場合、胎児異数性が検出される。いくつかの例において、比率は少なくとも１％相違する。
【０１９４】
いくつかの例において、対照の妊娠被験体は、正倍数性の妊娠被験体である。いくつかの例において、対照は、妊娠被験体の群からの平均値または中央値である。いくつかの例において、対照は、妊娠被験体の血漿サンプルのプールからの平均値または中央値である。いくつかの例において、対照は、正倍数性胎児を持つ妊娠被験体を模倣する核酸の人工混合物からの得られた値と同様である。いくつかの例において、対照の妊娠被験体は、正倍数性染色体組を持った胎児を身籠る正倍数性の妊娠被験体である。いくつかの例において、対照の妊娠被験体には、遺伝的異常、例えばコピー数変異がない。いくつかの例において、対照の妊娠被験体が身籠る胎児には、遺伝的異常、例えばコピー数変異がない。いくつかの例において、対照の妊娠被験体には、本明細書に開示される標的染色体中の遺伝的異常がない。いくつかの例において、対照の妊娠被験体が身籠る胎児には、本明細書に開示される標的染色体中の遺伝的異常がない。いくつかの例において、対照の妊娠被験体およびその胎児の少なくとも一人に、異数性がある。いくつかの例において、対照の妊娠被験体およびその胎児の少なくとも一人に、本明細書に開示される遺伝的異常がある。いくつかの例において、対照の妊娠被験体およびその胎児の少なくとも一人に、本明細書に開示される標的染色体中の遺伝的異常がある。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、対照の妊娠集団の対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率の使用を含む。いくつかの例において、それぞれの比率は、対照の妊娠集団におけるそれぞれの平均比率に由来する。いくつかの例において、それぞれの比率は、対照の妊娠集団におけるそれぞれの中央比率に由来する。
【０１９５】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、以下のデバイス、システム、およびキットを利用する。
【０１９６】
ＩＩ．デバイス、システム、およびキット
いくつかの態様において、本明細書には、生体サンプルから遺伝子情報を得るためのデバイス、システム、およびキットが開示される。本明細書に記載されるように、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、サンプル中の標的分析物の存在および／または量を検出するために、ユーザーが選択された場所にて生体サンプルを採取かつ検査することを可能にする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システムおよびキットは前述の方法において使用される。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、被験体の生体サンプルから少なくとも１つの成分（例えば細胞、細胞フラグメント、タンパク質）を取り除くサンプル精製装置；生体サンプル中の少なくとも１つの核酸を配列決定するための核酸配列決定装置；および配列情報をデバイス、システム、またはキットのユーザーに伝えるための核酸配列出力部を含む。
【０１９７】
通常、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、複数の機能、例えば、標的分析物（その増幅産物を含む）の精製、増幅、判定、およびそれらの組み合わせを統合している。いくつかの例において、複数の機能は、単一のアッセイ・アセンブリ・ユニット、または単一のデバイス内で実行される。いくつかの例において、機能のすべてが、単一ユニットまたはデバイスの外部で行われる。いくつかの例において、機能の少なくとも１つが、単一ユニットまたはデバイスの外部で行われる。いくつかの例において、機能のうち１つだけが、単一ユニットまたはデバイスの外部で行われる。いくつかの例において、サンプル精製装置、核酸増幅試薬、オリゴヌクレオチド、および検出試薬または成分は、単一のデバイスに収容される。通常、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、生体サンプルに関する情報を１人以上に中継するために、ディスプレイ、ディスプレイへの接続部、またはディスプレイへの通信部を備えている。
【０１９８】
いくつかの例において、デバイス、システム、およびキットは、本明細書に開示される追加の構成要素を含む。追加の構成要素の非限定的な例には、サンプル輸送区画、サンプル保管区画、サンプルおよび／または試薬用レセプタクル、温度計、電子ポート、通信接続部、通信デバイス、サンプル採取デバイス、およびハウジングユニットが挙げられる。いくつかの例において、追加の構成要素はデバイスに統合されている。いくつかの例において、追加の構成要素はデバイスに統合されていない。いくつかの例において、追加の構成要素は、サンプル精製装置、核酸増幅試薬、オリゴヌクレオチド、および検出試薬または成分とともに、単一のデバイスに収容される。いくつかの例において、追加の構成要素は単一のデバイス内に収容されない。
【０１９９】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システムおよびキットは、サンプルを得て、無細胞核酸を抽出し、および無細胞核酸を精製するための構成部分を含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、サンプルを得て、無細胞核酸を抽出し、無細胞核酸を精製し、および無細胞核酸のライブラリを調製するための構成部分を含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、サンプルを得て、無細胞核酸を抽出し、無細胞核酸を精製し、および無細胞核酸を配列決定するための構成部分を含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、サンプルを得て、無細胞核酸を抽出し、無細胞核酸を精製し、無細胞核酸のライブラリを調製し、および無細胞核酸を配列決定するための構成部分を含む。非限定的な例として、サンプルを得るための構成部分は、血液から血漿を得るための経皮穿刺器具およびフィルターである。また非限定的な例として、無細胞核酸を抽出かつ精製するための構成部分は、緩衝液、ビーズ、および磁石を含む。緩衝液、ビーズ、および磁石は、指の穿刺から得た一般的なサンプル容量（例えば５０−１５０μｌの血液）を受けるのに適切な容量で提供され得る。
【０２００】
いくつかの例において、デバイス、システム、およびキットは、生体サンプルを受けるためのレセプタクルを含む。レセプタクルは、１μｌ〜１ｍｌの生体サンプルの容量を保持するように構成され得る。レセプタクルは、１μｌ〜５００μｌの生体サンプルの容量を保持するように構成され得る。レセプタクルは、１μｌ〜２００μｌの生体サンプルの容量を保持するように構成され得る。レセプタクルは、デバイス／システムの構成部分の残りによる処理および解析のためのサンプルの適切な容量と同じと定められた、容量を有し得る。これにより、デバイス、システム、またはキットのユーザーがサンプルの特定容量を量り分ける必要性が排除される。ユーザーはレセプタクルを満たし、それにより適切な容量のサンプルがデバイス／システムに送達されるのを確実にすることしか必要としない。いくつかの例において、デバイス、システム、およびキットは、生体サンプルを受けるためのレセプタクルを含まない。いくつかの例において、サンプル精製装置が生体サンプルを直接受ける。レセプタクルに関する上述の記載と同様、サンプル精製装置は、デバイス／システムの構成部品の残りによる処理および解析に適した、定められた容量を有し得る。通常、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、ポイントオブケアにおいて全体的に使用されるよう意図される。しかし、いくつかの例において、ユーザーは、ポイントオブケアにて得られた結果の追加の解析または確認のために、解析サンプルを保持し、他の場所（例えば研究所、診療所）に送ることを望んでいる。非限定的な例として、デバイス／システムは血液から血漿を分けるかもしれない。血漿はポイントオブケアにて解析され、血液細胞は解析のための他の場所に送られてもよい。いくつかの例において、デバイス、システム、およびキットは、これらの目的のための輸送区画または保管区画を備えている。輸送区画または保管区画は、生体サンプル、その構成成分、またはその一部を包含可能である。輸送区画または保管区画は、直接のユーザーから離れた場所への移送中に、生体サンプル、その一部、またはその構成成分を包含可能である。輸送区画またはストレージ区画は、生体サンプルから除去される細胞を包含可能であるので、細胞は検査のために直接のユーザーから離れた場所に送ることができる。直接のユーザーから離れた場所の非限定的な例は、直接のユーザーが家にいるとき、研究所または診療所であり得る。いくつかの例において、家は、生体サンプルの追加の解析を実行するための機械または追加のデバイスを備えていない。輸送区画または保管区画は、生体サンプルをデバイスに加えると生じる反応またはプロセスの産物を包含可能である。いくつかの例において、反応またはプロセスの産物は、核酸増幅産物または逆転写産物である。いくつかの例において、反応またはプロセスの産物は、本明細書に記載される結合部分に結合される生体サンプル構成成分である。生体サンプル構成成分は、核酸、細胞フラグメント、細胞外小胞、タンパク質、ペプチド、ステロール、脂質、ビタミン、またはグルコースを含み、それらの何れかが、ユーザーから離れた場所で解析され得る。いくつかの例において、輸送区画また��保管区画は、吸収パッド、紙、ガラス容器、プラスチック容器、ポリマーマトリクス、液体溶液、ゲル、防腐剤、またはそれらの組み合わせを含む。吸収パッドまたは紙は、スクリーニングのためにタンパク質または他のバイオマーカーを含む乾燥体液を安定化させて運ぶのに有用であり得る。
【０２０１】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイスおよびシステムは、サンプルの無細胞核酸（例えば循環ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）および非核酸成分の解析を提供する。無細胞核酸および非核酸成分の解析はともに、必要な場所で行われ得る。いくつかの例において、システムおよびデバイスは、必要な場所での無細胞核酸の解析、および、必要な場所から離れた場所での非核酸成分の解析のためにサンプルの少なくとも一部または成分の保存を提供する。いくつかの例において、システムおよびデバイスは、必要な場所での非核酸成分の解析、および、必要な場所から離れた場所での非核酸成分の解析のためにサンプルの少なくとも一部または成分の保存を提供する。これらのデバイスおよびシステムは、本明細書に開示されるものなどの遺伝病を検査かつ検出するための担体に有用であり得る。
【０２０２】
いくつかの例において、輸送区画または保管区画は、防腐剤を含む。防腐剤は、本明細書では安定化剤または生物安定化剤とも称され得る。いくつかの例において、デバイス、システム、またはキットは、保管および／または輸送中に酵素活性を減らす防腐剤を含む。いくつかの例において、防腐剤は全血保存液である。全血保存液、またはその成分の非限定的な例には、グルコース、アデニン、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、デキストロース、二リン酸ナトリウム、および一塩基リン酸ナトリウムである。いくつかの例において、防腐剤はＥＤＴＡを含む。ＥＤＴＡは、核酸を劣化させる酵素活性を減らし得る。いくつかの例において、防腐剤はホルムアルデヒドを含む。いくつかの例において、防腐剤はホルムアルデヒドの既知の誘導体である。ホルムアルデヒド、またはその誘導体は、タンパク質を架橋し、したがって細胞を安定させ、細胞溶解を防ぐことができる。
【０２０３】
一般的に、本明細書に開示されるデバイスおよびシステムは、個人が携帯可能なものである。いくつかの例において、デバイスおよびシステムは携帯型である。いくつかの例において、デバイスおよびシステムには、最大長さ、最大幅、または最大高さがある。いくつかの例において、デバイスおよびシステムは、最大長さ、最大幅、または最大高さがある単一ユニットに収容される。いくつかの例において、最大長さは１２インチ以下である。いくつかの例において、最大長さは１０インチ以下である。いくつかの例において、最大長さは８インチ以下である。いくつかの例において、最大長さは６インチ以下である。いくつかの例において、最大幅は１２インチ以下である。いくつかの例において、最大幅は１０インチ以下である。いくつかの例において、最大幅は８インチ以下である。いくつかの例において、最大幅は６インチ以下である。いくつかの例において、最大幅は４インチ以下である。いくつかの例において、最大高さは１２インチ以下である。いくつかの例において、最大高さは１０インチ以下である。いくつかの例において、最大高さは８インチ以下である。いくつかの例において、最大高さは６インチ以下である。いくつかの例において、最大高さは４インチ以下である。いくつかの例において、最大高さは２インチ以下である。いくつかの例において、最大高さは１インチ以下である。
【０２０４】
サンプル採取
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、サンプル採取装置を備えている。いくつかの例において、サンプル採取装置は、デバイス、システム、またはキットの残りとは別個に設けられる。いくつかの例において、サンプル採取装置は、デバイス、システム、またはキット、またはそれらの構成部分に物理的に統合されている。いくつかの例において、サンプル採取装置は、本明細書に記載されるレセプタクルに統合される。いくつかの例において、サンプル採取装置は、体液を入れるためのカップ、チューブ、キャピラリー、またはウェルであり得る。いくつかの例において、サンプル採取装置は、尿を入れるためのカップであり得る。いくつかの例において、サンプル採取装置は、カップ中の尿をデバイス、システム、またはキットに入れるためのピペットを備え得る。いくつかの例において、サンプル採取装置は、血液を入れるための、本明細書に開示されるデバイスに統合されたキャピラリーであり得る。いくつかの例において、サンプル採取装置は、唾液を入れるための、本明細書に開示されるデバイスに統合されたチューブ、ウェル、パッド、または紙であり得る。いくつかの例において、サンプル採取装置は、汗を入れるためのパッドまたは紙であり得る。
【０２０５】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、経皮穿刺デバイスを備えている。経皮穿刺デバイスの非限定的な例には、針およびランセットが挙げられる。いくつかの例において、サンプル採取装置は経皮穿刺デバイスを備えている。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、マイクロニードル、マイクロニードルアレイ、またはマイクロニードルパッチを備えている。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、中空のマイクロニードルを備えている。非限定的な例として、経皮穿刺デバイスは、ウェルまたはキャピラリーに統合され、それにより、被験体が自分の指を穿刺すると、血液がウェルまたはキャピラリーに流れて、その構成成分の解析のためにシステムまたはデバイスが利用可能となる。いくつかの例において、経皮穿刺デバイスは、凹曲面状の、針またはランセットを備えた押しボタンデバイスである。いくつかの例において、針はマイクロニードルである。いくつかの例において、経皮穿刺デバイスはマイクロニードルのアレイを備えている。凹曲面の針なし側にあるアクチュエーター、ボタン、または場所を押すことにより、針が、ランセットよりもさらに制御された様式で、被験体の皮膚を穿刺する。さらに、押しボタンデバイスは、穿刺部位からの採血を補助するための真空源またはプランジャーを備えてもよい。
【０２０６】
サンプル処理および精製
本明細書には、サンプルプロセッサーデバイス、システム、およびキットが開示され、サンプルプロセッサーは、サンプルの成分を除去する、またはサンプルを複数の画分（例えば、血液細胞画分と血漿または血清）に分離するために生体サンプルを修飾する。サンプルプロセッサーはサンプル精製装置を備え、サンプル精製装置は、生体サンプルの不要な物質または非標的成分を除去することでサンプルを修飾するよう構成されている。生体サンプルのソースに応じて、不要な物質は、限定されないが、タンパク質（例えば抗体、ホルモン、酵素、血清アルブミン、リポタンパク質）、遊離アミノ酸および他の代謝産物、微小小胞体、核酸、脂質、電解質、尿素、ウロビリン、医薬品薬物、粘液、細菌、および他の微生物、およびそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの例において、サンプル精製装置は、本明細書に開示される生体サンプルの成分を分離する。いくつかの例において、本明細書に開示されるサンプル精製装置は、核酸の増幅または検出などの後処理工程を阻害する、それに干渉する、またはその支障となる、サンプルの成分を除去する。いくつかの例において、結果として生じる修飾サンプルは、標的分析物に対して富化される。これは、標的分析物の間接的な富化と考慮され得る。代替的に、または付加的に、標的分析物は直接捕捉されてもよく、これは標的分析物の直接富化と考慮される。
【０２０７】
いくつかの例において、サンプル精製装置は、生体サンプル由来の患者細胞とは別の、不要な物質を除去するための分離材料を備えている。有用な分離材料は、物質に結合する、またはそれに会合する特異的結合部分を含み得る。結合は共有結合、または非共有結合であり得る。特定の物質を除去するための、当該技術分野で既知のあらゆる適切な結合部分が使用され得る。例えば、抗体およびそのフラグメントは一般的に、サンプルからのタンパク質切除のために使用される。いくつかの例において、本明細書に開示されるサンプル精製装置は、生体サンプル中の核酸、タンパク質、細胞表面マーカー、または微小小胞体表面マーカーに結合する、結合部分を含む。いくつかの例において、結合部分は、抗体、抗原結合性抗体フラグメント、リガンド、受容体、ペプチド、小分子、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２０８】
いくつかの例において、本明細書に開示されるサンプル精製装置はフィルターを備えている。いくつかの例において、本明細書に開示されるサンプル精製装置は膜を備えている。一般的に、フィルターまたは膜は、本明細書に開示される生体サンプルから、細胞、細胞粒子、細胞フラグメント、無細胞核酸とは別の血液成分、またはそれらの組み合わせを分離または除去することができる。
【０２０９】
いくつかの例において、サンプル精製装置は、血液サンプルの細胞成分からの血漿または血清の分離を促進する。いくつかの例において、サンプル精製装置は、分子の増幅反応または配列決定反応を開始する前に、血液サンプルの細胞成分からの血漿の分離を促進する。血漿または血清の分離は、遠心分離、沈降、または濾過などの様々な異なる方法により達成され得る。いくつかの例において、サンプル精製装置は、全血を受けるためのフィルターマトリクスを備えており、該フィルターマトリクスには、細胞の通過を妨げる一方、血漿または血清がフィルターマトリクスを自由に通過できる、細孔径がある。いくつかの例において、フィルターマトリクスは、フィルターの上部の大きな孔径と、下部にある小さな孔径を組み合わせたものであり、これにより、濾過プロセス中に、細胞の劣化または溶解を妨げる、細胞の非常に穏やかな処置が行われる。これは特に都合の良いものであり、細胞の劣化または溶解が結果として、標的無細胞核酸を汚染する血液細胞または母体細胞からの核酸の放出をもたらすからである。そのようなフィルターの非限定的な例には、Ｐａｌｌ  Ｖｉｖｉｄ（商標）ＧＲ膜、Ｍｕｎｋｔｅｌｌ  Ａｈｌｓｔｒｏｍフィルターペーパー（例えばＷＯ２０１７０１７３１４を参照）、ＴｅｒａＰｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓフィルターが挙げられる。
【０２１０】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、サンプル（例えば血液由来の血漿）から成分または画分を分離するための毛管力により駆動される、垂直濾過を利用する。非限定的な例として、垂直濾過は、重力により促進される血漿分離を含み得る。高性能の超疎水性血漿セパレーターが、例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｕｐｅｒｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｐｌａｓｍａ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ２０１５に記載されている。
【０２１１】
サンプル精製装置は、側方フィルターを含み得る（例えば、サンプルは重力方向に動かず、またはサンプルは重力方向に垂直に動く）。サンプル精製装置は、垂直フィルターを含み得る（例えば、サンプルは重力方向に動く）。サンプル精製装置は、垂直フィルターおよび側方フィルターを含み得る。サンプル精製装置は、垂直フィルター、続いて側方フィルターにより、サンプルまたはその一部を受けるように構成される。サンプル精製装置は、側方フィルター、続いて垂直フィルターにより、サンプルまたはその一部を受けるように構成される。いくつかの例において、垂直フィルターはフィルターマトリクスを含む。いくつかの例において、垂直フィルターのフィルターマトリクスは、細胞が通過するのを妨げ、一方で血漿がフィルターマトリクスを自由に通過可能な孔径を有する、孔を含む。いくつかの例において、フィルターマトリクスは、本出願に特に適した膜を備えており、この膜は、フィルターの上部の大きな孔径と、下部にある小さな孔径を組み合わせ、これにより、濾過プロセス中に、細胞の劣化を妨げる、細胞の非常に穏やかな処置が行われるためである。
【０２１２】
いくつかの例において、サンプル精製装置は、適切な分離材料、例えば、無細胞の核酸を除去することなく生体サンプルから不要な物質を除去するフィルターまたは膜を備えている。いくつかの例において、分離材料は、サイズに基づいて生体サンプル中の物質を分離し、例えば、分離材料には、細胞を除外するが無細胞核酸を通過させる孔径がある。それゆえ、生体サンプルが血液である場合、血漿または血清は、サンプル精製装置中の分離材料を介して血液細胞よりも迅速に動くことができ、あらゆる無細胞核酸を含む血漿または血清は、分離材料の穴を通る。いくつかの例において、生体サンプルは血液であり、遅くされおよび／または分離材料中に閉じ込められる細胞は、赤血球、白血球、または血小板である。いくつかの例において、細胞は、膀胱または尿路上皮細胞（尿における）、または頬側細胞（唾液における）を含むがこれらに限定されない、身体中の生体サンプルと接触した組織に由来する。いくつかの例において、細胞は細菌または他の微生物である。
【０２１３】
いくつかの例において、サンプル精製装置は、細胞を傷つけることなく細胞を遅くするおよび／または捕捉することができ、これにより、無細胞の核酸の後の評価に干渉しかねない、細胞核酸および他のタンパク質または細胞フラグメントを含む細胞含有物の放出を回避する。これは、例えば、細胞移動を穏やかに遅くして、これにより細胞上の力を最小限にするべく、側方流動片または他の適切なアッセイフォーマットの経路に沿った、孔径の段階的で漸進的な減少によって、達成される。いくつかの例において、生体サンプル中の細胞の少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大１００％は、分離材料に捕捉されても無傷のままである。サイズ分離に加えて、またはそれとは無関係に、分離材料は、サイズを除く細胞の特性に基づいて不要な物質を捕捉または分離でき、例えば、分離材料は、細胞表面マーカーに結合する結合部分を含み得る。いくつかの例において、結合部分は、抗体、または抗原結合性抗体フラグメントである。いくつかの例において、結合部分は、血液細胞または微小小胞体上の受容体に対するリガンドまたは受容体結合タンパク質である。
【０２１４】
いくつかの例において、本明細書に開示されるシステムおよびデバイスは、サンプル精製装置、フィルター、システムおよび／または膜を通って生体サンプルを動かす、引き抜く、押し出す、または引きつける、分離材料を備える。いくつかの例において、分離材料はウィッキング材料である。細胞を除去するためにサンプル精製装置中で使用される適切な分離材料の例には、限定されないが、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、アセチルセルロース、ニトロセルロース、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ガラス繊維、硼珪酸塩、塩化ビニル、銀が挙げられる。適切な分離材料は、細胞の通過を妨げることを特徴とし得る。いくつかの例において、分離材料は、赤血球の継代を予防可能な特性を持つ限り、限定されない。いくつかの例において、分離材料は、疎水性フィルター、例えばガラス繊維フィルター、複合フィルター、例えばＣｙｔｏｓｅｐ（例えば、Ａｈｌｓｔｒｏｍ  ＦｉｌｔｒａｔｉｏｎまたはＰａｌｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＮＹ）、または親水性フィルター、例えばセルロース（例えばＰａｌｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）である。いくつかの例において、全血は、市販のキット（例えば、Ａｒｒａｙｉｔ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｒｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｃａｔ．  ＡＢＣＳ，  Ａｒｒａｙｉｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を使用した本明細書に開示される方法に従い、更なる処理を行うために赤血球、白血球、および血清成分へと画分され得る。
【０２１５】
いくつかの例において、サンプル精製装置は、少なくとも１つの孔径を特徴とする少なくとも１つのフィルターまたは少なくとも１つの膜を含む。いくつかの例において、サンプル精製装置は、複数のフィルターおよび／または膜を含み、少なくとも第１のフィルターまたは膜の孔径は、第２のフィルターまたは膜とは異なる。いくつかの例において、少なくとも１つのフィルター／膜の少なくとも１つの孔径は、約０．０５ミクロン〜約１０ミクロンである。いくつかの例において、孔径は約０．０５ミクロン〜約８ミクロンである。いくつかの例において、孔径は約０．０５ミクロン〜約６ミクロンである。いくつかの例において、孔径は約０．０５ミクロン〜約４ミクロンである。いくつかの例において、孔径は約０．０５ミクロン〜約２ミクロンである。いくつかの例において、孔径は約０．０５ミクロン〜約１ミクロンである。いくつかの例において、少なくとも１つのフィルター／膜の少なくとも１つの孔径は、約０．１ミクロン〜約１０ミクロンである。いくつかの例において、孔径は約０．１ミクロン〜約８ミクロンである。いくつかの例において、孔径は約０．１ミクロン〜約６ミクロンである。いくつかの例において、孔径は約０．１ミクロン〜約４ミクロンである。いくつかの例において、孔径は約０．１ミクロン〜約２ミクロンである。いくつかの例において、孔径は約０．１ミクロン〜約１ミクロンである。
【０２１６】
いくつかの例において、サンプル精製装置は緩やかなサンプル精製装置であることを特徴とする。緩やかなサンプル精製装置、例えばフィルターマトリクス、垂直フィルター、ウィッキング材料、または細胞の通過を不能にする孔を持つ膜を備えた精製装置は、特に無細胞核酸の解析に有用である。例えば、母体血液中の無細胞胎児核酸の出生前の適用は、無細胞母体核酸の存在下で無細胞胎児核酸を解析する付加的な困難と共に提示され、無細胞母体核酸は、無細胞胎児核酸に大きなバックグラウンドシグナルを作り出す。非限定的な例として、母体血液のサンプルは、サンプル採取方法により引き起こされる細胞溶解または他の細胞破壊を伴うことなく得られると、全血１ミリリットルごとに無細胞ＤＮＡ（母体および胎児）の合計約５００〜７５０のゲノム当量を含み得る。妊婦からサンプル採取した血液中の胎児の画分は、１ｍｌにつき約１０％、約５０〜７５のゲノム当量であり得る。無細胞核酸を得るプロセスは通常、血液から血漿を得ることを含み得る。慎重に実行されなければ、母体白血球は破壊され、追加の細胞核酸をサンプルへと放ち、大量のバックグラウンドノイズを胎児無細胞核酸に作り出す。典型的な白血球数は、血液１ｍｌにつき約４＊１０＾６〜１０＊１０＾６の細胞であり、したがって、利用可能な核ＤＮＡは、全無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）よりも約４，０００〜１０，０００倍多い。結果的に、母体白血球の小さな画分のみが破壊され、核ＤＮＡを血漿に放ったとしても、胎児の画分は劇的に減少する。例えば、０．０１％の白血球分解は、１０％〜約５％、胎児の画分を減少させ得る。本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、これらバックグラウンドシグナルを減少することを目的とする。
【０２１７】
いくつかの例において、サンプルプロセッサーは、全血から血液細胞を分離するように構成される。いくつかの例において、サンプルプロセッサーは、全血から血漿を単離するように構成される。いくつかの例において、サンプルプロセッサーは、全血から血清を単離するように構成される。いくつかの例において、サンプルプロセッサーは、１ミリリットル未満の全血から血漿または血清を単離するように構成される。いくつかの例において、サンプルプロセッサーは、１ミリリットル未満の全血から血漿または血清を単離するように構成される。いくつかの例において、サンプルプロセッサーは、５００μＬ未満の全血から血漿または血清を単離するように構成される。いくつかの例において、サンプルプロセッサーは、４００μＬ未満の全血から血漿または血清を単離するように構成される。いくつかの例において、サンプルプロセッサーは、３００μＬ未満の全血から血漿または血清を単離するように構成される。いくつかの例において、サンプルプロセッサーは、２００μＬ未満の全血から血漿または血清を単離するように構成される。いくつかの例において、サンプルプロセッサーは、１５０μＬ未満の全血から血漿または血清を単離するように構成される。いくつかの例において、サンプルプロセッサーは、１００μＬ未満の全血から血漿または血清を単離するように構成される。
【０２１８】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、不要とされる、または目的でない、細胞、細胞フラグメント、核酸、またはタンパク質が枯渇した修飾サンプルを産生するための結合部分を含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、生体サンプル中で、不要とされる、または目的でない、細胞、細胞フラグメント、核酸、またはタンパク質を減少させるための結合部分を含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、標的細胞、標的細胞フラグメント、標的核酸、または標的タンパク質により富化された修飾サンプルを産生するための結合部分を含む。
【０２１９】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、核酸、タンパク質、ペプチド、細胞表面マーカー、または微小小胞体表面マーカーに結合可能な、結合部分を含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、生体サンプル中の細胞外小胞または細胞外微粒子を捉えるための結合部分を含む。いくつかの例において、細胞外小胞は、ＤＮＡおよびＲＮＡの少なくとも１つを含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、細胞外小胞に含まれるＤＮＡまたはＲＮＡを解析するための試薬または成分を含む。いくつかの例において、結合部分は、抗体、抗原結合性抗体フラグメント、リガンド、受容体、タンパク質、ペプチド、小分子、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２２０】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、細胞から放たれる細胞外小胞と相互作用する、またはそれを捕捉可能な、結合部分を含む。いくつかの例において、細胞は胎児細胞である。いくつかの例において、細胞は胎盤細胞である。胎児細胞または胎盤細胞は、妊娠中の女性被験体の体液（例えば血液）において循環している場合がある。いくつかの例において、細胞外小胞は、臓器、腺、または組織から放たれる。非限定的な例として、臓器、腺、または組織は、罹患している、老化している、感染している、または成長している。臓器、腺、および組織の非限定的な例は、脳、肝臓、心臓、腎臓、結腸、膵臓、筋肉、脂肪、甲状腺、前立腺、乳房組織、および骨髄である。
【０２２１】
非限定的な例として、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、胎児／胎盤の核酸に対しサンプルを富化するために、母体サンプルから細胞外小胞または細胞外微粒子を捉え、破棄することができる。いくつかの例において、細胞外小胞は、胎児／胎盤由来である。いくつかの例において、細胞外小胞は、胎児細胞由来である。いくつかの例において、細胞外小胞は、胎児細胞により放たれる。いくつかの例において、細胞外小胞は、胎盤細胞により放たれる。胎盤細胞は、栄養膜細胞でもよい。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、胎盤により養育された血小板（ｐｌａｃｅｎｔａ ｅｄｕｃａｔｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）を捉えるための細胞結合部分を含み、これには胎児ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントが含まれ得る。これらは、抗体または他の方法（低速度遠心分離）により捕捉され／富化され得る。そのような場合、胎児ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントは、染色体の情報（例えば性別）を判定または提示するべく、本明細書に記載されるように解析され得る。代替的に、または付加的に、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、母体細胞から生じる生体サンプル中の細胞外小胞または細胞外微粒子を捉えるための結合部分を含む。
【０２２２】
いくつかの例において、結合部分は固形支持体に結合し、ここで、結合部分が生体サンプルと接触した後、固形支持体が生体サンプルの残りから分離され、または生体サンプルが固形支持体から分離され得る。固形支持体の非限定的な例には、ビーズ、ナノ粒子、磁性粒子、チップ、マイクロチップ、繊維片、ポリマー片、膜、マトリクス、カラム、プレート、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２２３】
本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、細胞溶解試薬を含み得る。細胞溶解試薬の非限定的な例には、ＮＰ−４０、ドデシル硫酸ナトリウム、および、アンモニウム、塩化物、またはカリウムを含む食塩水などの、洗浄剤が挙げられる。本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、細胞溶解成分を有し得る。細胞溶解成分は、構造的または機械的であり、または細胞を溶解できる。非限定的な例として、細胞溶解成分は、核酸などの細胞内成分を放出するために細胞を剪断し得る。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは細胞溶解試薬を含まない。本明細書に開示されるいくつかのデバイス、システム、およびキットは、無細胞核酸を解析するように意図される。
【０２２４】
核酸増幅
一般的に、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、核酸を増幅可能である。多くの場合、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、本明細書に開示される生体サンプル中のＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を産生するために逆転写酵素を含み、ｃＤＮＡは、本明細書に記載されるようなゲノムＤＮＡと同様に増幅および／または解析され得る。本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットはまた、多くの場合、ＤＮＡポリメラーゼおよびヘリカーゼのような酵素の効率を増加可能なクラウディング剤を含み得る。クラウディング剤は、本明細書に記載されるように、ライブラリの効率を増大できる。クラウディング剤は、ポリマー、タンパク質、多糖類、またはそれらの組み合わせを含み得る、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットに使用され得るクラウディング剤の非限定的な例は、デキストラン、ポリ（エチレングリコール）およびデキストランである。
【０２２５】
従来のポリメラーゼ連鎖反応は熱循環を要する。これは可能なものであるが、サーモサイクラーマシンなしでは、家にいる一般的なユーザーにとっては不都合なものである。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、デバイスまたはシステム、またはそれらの構成部分の温度を変化させることなく核酸を増幅可能である。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、核酸を等温で増幅可能である。等温増幅の非限定的な例は以下のとおりである：ループ媒介性等温増幅法（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、およびレコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）。ゆえに、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、等温増幅を実行するのに必要な試薬を含み得る。等温増幅試薬の非限定的な例には、レコンビナーゼポリメラーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、および鎖置換ポリメラーゼが挙げられる。一般的に、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を使用する等温増幅は、３つのコアエンザイム、すなわちレコンビナーゼ、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質、および単置換ポリメラーゼを利用することで、（１）オリゴヌクレオチドプライマーを対合し、（２）プライマー置換を妨げるべく置換ＤＮＡ鎖を安定させ、および（３）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させる。対合したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、指数関数的なＤＮＡ増幅が、室温（３７℃が最適）でのインキュベーションにより生じ得る。
【０２２６】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、１つの温度で核酸を増幅可能である。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、２つ以下の温度で核酸を増幅可能である。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、３つ以下の温度で核酸を増幅可能である。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、１つの試薬、またはデバイス、システム、またはキットの構成部分を最初に加熱することのみを要する。
【０２２７】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、ある温度範囲で核酸を増幅可能である。いくつかの例において、温度範囲は、約−５０℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−５０℃〜約９０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−５０℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−５０℃〜約７０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−５０℃〜約６０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−５０℃〜約５０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−５０℃〜約４０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−５０℃〜約３０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−５０℃〜約２０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約−５０℃〜約１０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約９０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約７０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約６０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約５０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約４０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約３０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約２０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約０℃〜約１０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約９０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約７０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約６０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約５０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約４０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１５℃〜約３０℃である。いくつかの例において、温度範囲は、約１０℃〜約３０℃である。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、それらの全ての構成部分、および全ての試薬は、室温で完全に作動可能であり、冷却、冷凍、または加熱を必要としない。
【０２２８】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキット少なくとも一部は、約２０℃〜約５０℃で作動する。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキット少なくとも一部は、約３７℃で作動する。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキット少なくとも一部は、約４２℃で作動する。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システムおよびキットは、室温に有利に作動する。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットの少なくとも一部は、約２０℃〜約３０℃で核酸を等温増幅可能である。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットの少なくとも一部は、約２３℃〜約２７℃で核酸を等温増幅可能である。
【０２２９】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、増幅をモニタリングするために脱塩基部位、フルオロフォア、およびクエンチャーを伴うハイブリダイゼーションプローブを含む。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、脱塩基部位を切断し、クエンチャーを放出することで蛍光励起を可能とするべく、導入され得る。いくつかの例において、増幅産物は、検出を可能とする捕捉のために、増幅プライマーの１つに捕捉分子（例えばビオチン）を結合させ、かつハイブリダイゼーションプライマーを５’−抗原分子（例えばフルオレセイン誘導ＦＡＭ）で標識することにより、側方流動を介して検出またはモニタリングされる。そのため、いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、側方流動デバイス上の核酸および増幅産物の検出をもたらす。側方流動デバイスは本明細書に記載される。
【０２３０】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、ゲノム中の第１の配列および第２の配列を増幅可能な、少なくとも１つの核酸増幅試薬および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、第１の配列および第２の配列は類似しており、第１の配列が第２の配列から物理的に十分に離れていることで、第１の配列は被験体の第１の無細胞核酸に存在し、第２の配列は被験体の第２の無細胞核酸に存在する。いくつかの例において、少なくとも２つの配列は真隣にある。いくつかの例において、少なくとも２つの配列は少なくとも１つのヌクレオチドにより分離される。いくつかの例において、少なくとも２つの配列は少なくとも２つのヌクレオチドにより分離される。いくつかの例において、少なくとも２つの配列は、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、または少なくとも約１００のヌクレオチドにより分離される。いくつかの例において、少なくとも２つの配列は少なくとも約５０％同一である。いくつかの例において、少なくとも２つの配列は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％同一である。いくつかの例において、第１の配列および第２の配列は各々、長さが少なくとも１０のヌクレオチドである。いくつかの例において、第１の配列および第２の配列は各々、長さが少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約５０、または少なくとも約１００のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１の配列および第２の配列は、同じ染色体上にある。いくつかの実施形態において、第１の配列は第１の染色体上にあり、第２の配列は第２の染色体上にある。いくつかの例において、第１の配列および第２の配列は、機能的に結合した状態にある。例えば、遺伝子ＡＯＸ１の助触媒領域におけるＣｐＧ部位はすべて、前立腺癌において同じ過剰メチル化を示し、それにより、これらの部位は、機能的に同じ情報を伝えるが、１つ以上のヌクレオチドだけ離れて位置することから、機能的に結合した状態にある。
【０２３１】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、無細胞核酸の鎖にアニール可能なオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つを含み、無細胞核酸は、目的の領域またはその一部に対応する配列を含む。いくつかの例において、目的の領域はＹ染色体の領域である。いくつかの例において、目的の領域はＸ染色体の領域である。いくつかの例において、目的の領域は常染色体の領域である。いくつかの例において、目的の領域、またはその一部は、一回より多くゲノムに存在する、本明細書に記載されるような反復配列を含む。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１０〜約１，０００，０００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが少なくとも１０のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが少なくとも１００のヌクレオチドである。いくつかの例において、領域は、長さが少なくとも１０００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１０〜約５０００００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１０〜約３０００００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１００〜約１００００００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１００〜約５０００００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１００〜約３００，０００の塩基対である。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１０００〜約１００００００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１０００〜約５０００００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１０００〜約３０００００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１００００〜約１００００００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１００００〜約５０００００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約１００００〜約３０００００のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域は、長さが約３０００００のヌクレオチドである。
【０２３２】
いくつかの例において、目的の領域に対応する配列は、長さが少なくとも約５のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域に対応する配列は、長さが少なくとも約８のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域に対応する配列は、長さが少なくとも約１０のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域に対応する配列は、長さが少なくとも約１５のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域に対応する配列は、長さが少なくとも約２０のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域に対応する配列は、長さが少なくとも約５０のヌクレオチドである。いくつかの例において、目的の領域に対応する配列は、長さが少なくとも約１００のヌクレオチドである。いくつかの例において、配列は、長さが約５〜約１０００のヌクレオチドである。いくつかの例において、配列は、長さが約１０〜約１０００のヌクレオチドである。いくつかの例において、配列は、長さが約１０〜約５００のヌクレオチドである。いくつかの例において、配列は、長さが約１０〜約４００のヌクレオチドである。いくつかの例において、配列は、長さが約１０〜約３００のヌクレオチドである。いくつかの例において、配列は、長さが約５０〜約１０００のヌクレオチドである。いくつかの例において、配列は、長さが約５０〜約５００のヌクレオチドである。
【０２３３】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、無細胞核酸の鎖にアニール可能なオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つを含み、無細胞核酸は、本明細書に開示される目的のサブ領域に対応する配列を含む。いくつかの例において、サブ領域は、一回より多く目的の領域に存在する配列により表される。いくつかの例において、サブ領域は、長さが約１０〜約１０００のヌクレオチドである。いくつかの例において、サブ領域は、長さが約５０〜約５００のヌクレオチドである。いくつかの例において、サブ領域は、長さが約５０〜約２５０のヌクレオチドである。いくつかの例において、サブ領域は、長さが約５０〜約１５０のヌクレオチドである。いくつかの例において、サブ領域は、長さが約１００のヌクレオチドである。
【０２３４】
当該技術分野で既知のあらゆる適切な核酸増幅方法は、本明細書に記載されるデバイスおよび方法に使用することを企図されている。いくつかの例において、等温増幅が使用される。いくつかの例において、等温増幅を開始する前に、増幅は、最初の加熱工程を例外として等温である。それぞれに異なる考慮事項があり異なる利点をもたらす、多数の等温増幅方法が、当技術分野で既知であり、文献、例えばそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｚａｎｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓｐｏｔｏ，  ２０１３，「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ」，  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ３：  １８−４３、およびＦａｋｒｕｄｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＰＣＲ）」，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｌｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５（４）：  ２４５−２５２にて議論されている。いくつかの例において、あらゆる適切な等温増幅方法が使用される。いくつかの例において、使用される等温増幅方法は、以下から選択される：ループ媒介性等温増幅法（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ラミフィケーション増幅方法（ＲＡＭ）、およびレコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）。
【０２３５】
いくつかの例において、使用される増幅方法は、ＬＡＭＰである（例えば、それぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｎｏｔｏｍｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，「Ｌｏｏｐ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」  ＮＡＲ  ２８（１２）：  ｅ６３  ｉ−ｖｉｉ、および米国特許第６，４１０，２７８号「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ」を参照）。ＬＡＭＰは、自己循環鎖置換デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成を使用する、一工程の増幅システムである。いくつかの例において、ＬＡＭＰは、熱安定性ポリメラーゼ、例えばバチルス−ステアロテルモフィルス（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、デオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）、特異的なプライマー、および標的ＤＮＡ鋳型の存在下で、４５〜６０分間、６０〜６５℃で実行される。いくつかの例において、鋳型はＲＮＡであり、逆転写酵素活性および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ活性、例えばＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼの両方を持つポリメラーゼが使用され、または、逆転写酵素の活性を持つポリメラーゼは逆転写酵素工程に使用され、逆転写酵素活性がないポリメラーゼは鎖置換ＤＮＡ合成工程に使用される。
【０２３６】
いくつかの例において、増幅反応は、約５５℃〜約７０℃で、ＬＡＭＰを使用して実行される。いくつかの例において、ＬＡＭＰ反応は５５℃以上で実行される。いくつかの例において、ＬＡＭＰ反応は７０℃以下で実行される。いくつかの例において、ＬＡＭＰ反応は、約５５℃〜約５７℃、約５５℃〜約５９℃、約５５℃〜約６０℃、約５５℃〜約６１℃、約５５℃〜約６２℃、約５５℃〜約６３℃、約５５℃〜約６４℃、約５５℃〜約６５℃、約５５℃〜約６６℃、約５５℃〜約６８℃、約５５℃〜約７０℃、約５７℃〜約５９℃、約５７℃〜約６０℃、約５７℃〜約６１℃、約５７℃〜約６２℃、約５７℃〜約６３℃、約５７℃〜約６４℃、約５７℃〜約６５℃、約５７℃〜約６６℃、約５７℃〜約６８℃、約５７℃〜約７０℃、約５９℃〜約６０℃、約５９℃〜約６１℃、約５９℃〜約６２℃、約５９℃〜約６３℃、約５９℃〜約６４℃、約５９℃〜約６５℃、約５９℃〜約６６℃、約５９℃〜約６８℃、約５９℃〜約７０℃、約６０℃〜約６１℃、約６０℃〜約６２℃、約６０℃〜約６３℃、約６０℃〜約６４℃、約６０℃〜約６５℃、約６０℃〜約６６℃、約６０℃〜約６８℃、約６０℃〜約７０℃、約６１℃〜約６２℃、約６１℃〜約６３℃、約６１℃〜約６４℃、約６１℃〜約６５℃、約６１℃〜約６６℃、約６１℃〜約６８℃、約６１℃〜約７０℃、約６２℃〜約６３℃、約６２℃〜約６４℃、約６２℃〜約６５℃、約６２℃〜約６６℃、約６２℃〜約６８℃、約６２℃〜約７０℃、約６３℃〜約６４℃、約６３℃〜約６５℃、約６３℃〜約６６℃、約６３℃〜約６８℃、約６３℃〜約７０℃、約６４℃〜約６５℃、約６４℃〜約６６℃、約６４℃〜約６８℃、約６４℃〜約７０℃、約６５℃〜約６６℃、約６５℃〜約６８℃、約６５℃〜約７０℃、約６６℃〜約６８℃、約６６℃〜約７０℃、または約６８℃〜約７０℃で実行される。いくつかの例において、ＬＡＭＰ反応は、約５５℃、約５７℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６８℃、または約７０℃で実行される。
【０２３７】
いくつかの例において、増幅反応は約３０〜約９０分間、実行される。いくつかの例において、ＬＡＭＰ反応は少なくとも約３０分間実行される。いくつかの例において、ＬＡＭＰ反応は多くとも約９０分間実行される。いくつかの例において、ＬＡＭＰ反応は、約３０分〜約３５分、約３０分〜約４０分、約３０分〜約４５分、約３０分〜約５０分、約３０分〜約５５分、約３０分〜約６０分、約３０分〜約６５分、約３０分〜約７０分、約３０分〜約７５分、約３０分〜約８０分、約３０分〜約９０分、約３５分〜約４０分、約３５分〜約４５分、約３５分〜約５０分、約３５分〜約５５分、約３５分〜約６０分、約３５分〜約６５分、約３５分〜約７０分、約３５分〜約７５分、約３５分〜約８０分、約３５分〜約９０分、約４０分〜約４５分、約４０分〜約５０分、約４０分〜約５５分、約４０分〜約６０分、約４０分〜約６５分、約４０分〜約７０分、約４０分〜約７５分、約４０分〜約８０分、約４０分〜約９０分、約４５分〜約５０分、約４５分〜約５５分、約４５分〜約６０分、約４５分〜約６５分、約４５分〜約７０分、約４５分〜約７５分、約４５分〜約８０分、約４５分〜約９０分、約５０分〜約５５分、約５０分〜約６０分、約５０分〜約６５分、約５０分〜約７０分、約５０分〜約７５分、約５０分〜約８０分、約５０分〜約９０分、約５５分〜約６０分、約５５分〜約６５分、約５５分〜約７０分、約５５分〜約７５分、約５５分〜約８０分、約５５分〜約９０分、約６０分〜約６５分、約６０分〜約７０分、約６０分〜約７５分、約６０分〜約８０分、約６０分〜約９０分、約６５分〜約７０分、約６５分〜約７５分、約６５分〜約８０分、約６５分〜約９０分、約７０分〜約７５分、約７０分〜約８０分、約７０分〜約９０分、約７５分〜約８０分、約７５分〜約９０分、または約８０分〜約９０分の間、実行される。いくつかの例において、ＬＡＭＰ反応は、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、または約９０分の間、実行される。
【０２３８】
いくつかの例において、増幅方法は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）である。ＮＡＳＢＡ（３ＳＲ、および転写媒介性増幅としても知られる）は、等温の転写ベースのＲＮＡ増幅システムである。３つの酵素（鳥類骨髄芽細胞症ウイルス逆転写酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＴ７  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）が、一本鎖ＲＮＡを生成するために使用される。ある場合には、ＮＡＳＢＡは、ＤＮＡを増幅するために使用可能である。増幅反応は、典型的には約６０〜約９０分間、一定の温度を維持しながら４１℃で実行される（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｋｒｕｄｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＮＡＳＢＡ）  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓ．  ２（１）：Ｌ１０６−Ｌ１２１を参照）。
【０２３９】
いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は、約４０℃〜約４２℃で実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は４１℃で実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は約４２℃で実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は、約４０℃〜約４１℃、約４０℃〜約４２℃、または約４１℃〜約４２℃で実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は、約４０℃、約４１℃、または約４２℃で実行される。
【０２４０】
いくつかの例において、増幅反応は、約４５分〜約１２０分間、ＮＡＳＢＡを使用して実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は、約３０分〜約１２０分間、実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は少なくとも約３０分間実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は多くとも約１２０分間実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は最大約１８０分間実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は、約３０分〜約４５分、約３０分〜約６０分、約３０分〜約６５分、約３０分〜約７０分、約３０分〜約７５分、約３０分〜約８０分、約３０分〜約８５分、約３０分〜約９０分、約３０分〜約９５分、約３０分〜約１００分、約３０分〜約１２０分、約４５分〜約６０分、約４５分〜約６５分、約４５分〜約７０分、約４５分〜約７５分、約４５分〜約８０分、約４５分〜約８５分、約４５分〜約９０分、約４５分〜約９５分、約４５分〜約１００分、約４５分〜約１２０分、約６０分〜約６５分、約６０分〜約７０分、約６０分〜約７５分、約６０分〜約８０分、約６０分〜約８５分、約６０分〜約９０分、約６０分〜約９５分、約６０分〜約１００分、約６０分〜約１２０分、約６５分〜約７０分、約６５分〜約７５分、約６５分〜約８０分、約６５分〜約８５分、約６５分〜約９０分、約６５分〜約９５分、約６５分〜約１００分、約６５分〜約１２０分、約７０分〜約７５分、約７０分〜約８０分、約７０分〜約８５分、約７０分〜約９０分、約７０分〜約９５分、約７０分〜約１００分、約７０分〜約１２０分、約７５分〜約８０分、約７５分〜約８５分、約７５分〜約９０分、約７５分〜約９５分、約７５分〜約１００分、約７５分〜約１２０分、約８０分〜約８５分、約８０分〜約９０分、約８０分〜約９５分、約８０分〜約１００分、約８０分〜約１２０分、約８５分〜約９０分、約８５分〜約９５分、約８５分〜約１００分、約８５分〜約１２０分、約９０分〜約９５分、約９０分〜約１００分、約９０分〜約１２０分、約９５分〜約１００分、約９５分〜約１２０分、または約１００分〜約１２０分の間、実行される。いくつかの例において、ＮＡＳＢＡ反応は、約３０分、約４５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１２０分、約１５０分、または約１８０分の間、実行される。
【０２４１】
いくつかの例において、増幅方法は鎖置換増幅（ＳＤＡ）である。ＳＤＡは４つの異なるプライマーを使用する等温増幅方法である。制限部位（ＨｉｎｃＩＩエキソヌクレアーゼのための認識配列）を含むプライマーは、ＤＮＡ鋳型にアニールされる。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１（ｅｘｏ−クレノウ）のエキソヌクレアーゼ欠如フラグメントは、プライマーを伸長させる。各ＳＤＡサイクルは、（１）置換された標的フラグメントに結合するプライマー、（２）ｅｘｏ−クレノウによるプライマー／標的複合体の伸長、（３）結果として生じたヘミホスホチオエートＨｉｎｃＩＩ部位のニッキング、（４）ニッキング部位からのＨｉｎｃＩＩの解離、（５）ｅｘｏ−クレノウによる下流鎖のニッキングおよび置換の伸長から成る。
【０２４２】
いくつかの例において、増幅方法は多置換増幅（ＭＤＡ）である。ＭＤＡは、高忠実度でゲノム全体を増幅させるための修飾ランダムプライマーと組み合わせて、バクテリオファージφ２９からの高度に前進的かつ鎖置換のＤＮＡポリメラーゼの使用に基づく、等温の鎖置換方法である。これは、非常に少量の出発材料からサンプル中のすべてのＤＮＡを増幅するように開発されている。ＭＤＡにおいて、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼは、１６〜１８時間、３０℃でｄＮＴＰ、ランダム六量体、および変性鋳型ＤＮＡによりインキュベートされ、酵素は１０分間、高温（６５℃）で不活性化されねばならない。再循環の反復は必要とされないが、短い初期の変性工程、増幅工程、および酵素の最終不活性化は、必要となる。
【０２４３】
いくつかの例において、増幅方法は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。ＲＣＡは、単一の温度、典型的に約３０℃で、１０９倍より多くプローブＤＮＡ配列の増幅を可能にする、等温核酸増幅方法である。多数回の等温酵素合成がφ２９  ＤＮＡポリメラーゼにより実行され、これは、環状ＤＮＡプローブのまわりで継続的に進行することにより、サークルハイブリダイズされた（ｃｉｒｃｌｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）プライマーを伸長させる。いくつかの例において、増幅反応は、約２８℃〜３２℃で、ＲＣＡを使用して実行される。
【０２４４】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列を有する。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、オリゴヌクレオチドプライマーの対を含み、オリゴヌクレオチドプライマーの対は、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列を有する。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列を含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、オリゴヌクレオチドプライマーの対を含み、オリゴヌクレオチドプライマーの対は、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列を含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列から成る。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、オリゴヌクレオチドプライマーの対を含み、オリゴヌクレオチドプライマーの対は、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列から成る。いくつかの例において、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列は、野生型ヒトＹ染色体配列と少なくとも７５％相同する。いくつかの例において、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列は、野生型ヒトＹ染色体配列と少なくとも８０％相同する。いくつかの例において、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列は、野生型ヒトＹ染色体配列と少なくとも８５％相同する。いくつかの例において、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列は、野生型ヒトＹ染色体配列と少なくとも８０％相同する。いくつかの例において、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列は、野生型ヒトＹ染色体配列と少なくとも９０％相同する。いくつかの例において、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列は、野生型ヒトＹ染色体配列と少なくとも９５％相同する。いくつかの例において、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列は、野生型ヒトＹ染色体配列と少なくとも９７％相同する。いくつかの例において、Ｙ染色体配列に相補的である、または対応する配列は、野生型ヒトＹ染色体配列と少なくとも１００％相同する。
【０２４５】
核酸検出器
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、核酸検出器を備えている。いくつかの例において、核酸検出器は核酸配列決定装置を備える。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、核酸を増幅し、結果として生じる増幅さ核酸を配列決定するように構成される。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、核酸を増幅することなく核酸を配列決定するように構成される。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、核酸配列決定装置を備えるが、核酸増幅試薬または核酸増幅成分を含まない。いくつかの例において、核酸配列決定装置は、増幅の成功または失敗を反映するシグナルを検出する、シグナル検出器を備える。いくつかの例において、核酸配列決定装置はシグナル検出器である。いくつかの例において、シグナル検出器は核酸配列決定装置を備える。
【０２４６】
いくつかの例において、核酸配列決定装置は、核酸配列決定装置からの配列決定リードを解析する電子デバイスとの通信接続部を有する。いくつかの例において、通信接続部は配線接続されている。いくつかの例において、通信接続部は無線である。例えば、本明細書に開示されるものなどの、モバイル機器アプリケーションまたはコンピューターソフトウェアは、配列決定リードを受信し、配列決定リードに基づいて、サンプルに関する遺伝子情報（例えば、疾患／感染症の存在、薬物への反応、胎児の遺伝的異常または突然変異）を表示または報告する。
【０２４７】
いくつかの例において、核酸配列決定装置はナノポア配列決定装置を備える。いくつかの例において、ナノポア配列決定装置はナノポアを含む。いくつかの例において、ナノポア配列決定装置は膜と溶液を含み、該溶液は、膜全体に電流を作り出し、ナノポアを介して荷電分子（例えば核酸）の移動を誘導する。いくつかの例において、ナノポア配列決定装置は、膜貫通タンパク質、その部分、またはその修飾を含む。いくつかの例において、膜貫通タンパク質は細菌タンパク質である。いくつかの例において、膜貫通タンパク質は細菌タンパク質ではない。いくつかの例において、ナノポアは合成されたものである。いくつかの例において、ナノポアは、固態ナノポア配列決定を実行する。いくつかの例において、ナノポア配列決定装置は、ポケットサイズ、携帯式、またはほぼ携帯電話のサイズとして記載される。いくつかの例において、ナノポア配列決定装置は、ＲＮＡおよびＤＮＡの少なくとも１つを配列決定するように構成される。ナノポア配列決定デバイスの非限定的な例には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭｉｎＩＯＮ、およびＳｍｉｄｇＩＯＮのナノポア配列決定ＵＳＢデバイスが挙げられる。これらデバイスは共に、携帯できるほど小さい。ナノポア配列決定デバイスおよび構成部分は、Ｈｏｗｏｒｋａの評論（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１７  Ｊｕｌ  ６；１２（７）：６１９−６３０）、およびＧａｒｒｉｄｏ−Ｃａｒｄｅｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｓｅｎｓｏｒｓ  （Ｂａｓｅｌ）．  ２０１７  Ｍａｒ  １４；１７（３））に詳しく記載されており、両文献は参照により本明細書に組み込まれる。ナノポア配列決定デバイスの他の非限定的な例は、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｗｏ  Ｐｏｒｅ  Ｇｕｙｓ、Ｓｔｒａｔｏｓ、およびＡｇｉｌｅｎｔ（元々Ｇｅｎｉａの技術）により提供される。
【０２４８】
いくつかの例において、核酸検出器は、エピジェネティック修飾を検出するための重亜硫酸塩配列決定に必要な試薬と成分を含む。例えば、多くのメチル化マーカーを含む長い領域が、断片化され得る。ここで、メチル化マーカーを運ぶ各フラグメントは、独立したシグナルであり得る。すべてのフラグメントからの信号は、有益な遺伝子情報を得るために十分に組み合わせられている。
【０２４９】
いくつかの例において、核酸検出器は核酸配列決定装置を備えない。いくつかの例において、核酸検出器は、タグ付き核酸を計数するように構成され、核酸検出器は１つ以上のタグからのシグナルの集まりを定量する。
【０２５０】
捕捉および検出
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、生体サンプル中の核酸の検出のための核酸検出器、捕捉構成部分、シグナル検出器、および検出試薬のうち少なくとも１つを含む。いくつかの例において、捕捉構成部分およびシグナル検出器は一体化されている。いくつかの例において、捕捉構成部分は固形支持体を含む。いくつかの例において、固形支持体は、ビーズ、チップ、細片、膜、マトリクス、カラム、プレート、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２５１】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、染色体またはそのフラグメントのエピジェネティック修飾領域に対して少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの例において、染色体のエピジェネティック修飾領域のエピジェネティック修飾は、性別、または性別のマーカーを示す。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、母体ＤＮＡに存在しない父性遺伝配列に対して少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、父性遺伝性の一塩基多型に対して少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの例において、染色体はＹ染色体である。いくつかの例において、染色体はＸ染色体である。いくつかの例において、染色体はＹ染色体である。いくつかの例において、染色体は常染色体である。いくつかの例において、プローブは、ペプチド、抗体、抗原結合性抗体フラグメント、核酸、または小分子を含む。
【０２５２】
いくつかの例において、デバイス、システム、およびキットは、本明細書に開示されるサンプル精製装置、および本明細書に開示される捕捉構成部分を備える。いくつかの例において、サンプル精製装置は捕捉構成部分を含む。いくつかの例において、サンプル精製装置および捕捉構成部分は一体化されている。いくつかの例において、サンプル精製装置および捕捉構成部分は別個である。
【０２５３】
いくつかの例において、捕捉構成部分は、本明細書に記載される結合部分を含む。いくつかの例において、結合部分は、側方流動アッセイに存在する。いくつかの例において、サンプルが側方流動アッセイに加えられる前に、結合部分はサンプルに加えられる。いくつかの例において、結合部分はシグナル分子を含む。いくつかの例において、結合部分は、シグナル分子に物理的に関連付けられる。いくつかの例において、結合部分は、シグナル分子に物理的に関連付け可能である。いくつかの例において、結合部分はシグナル分子に接続される。シグナル分子の非限定的な例には、金粒子、蛍光粒子、発光粒子、および色素分子が挙げられる。いくつかの例において、捕捉構成部分は、本明細書に記載される増幅産物と相互作用可能な結合部分を含む。いくつかの例において、捕捉構成部分は、本明細書に記載される増幅産物上のタグと相互作用可能な結合部分を含む。
【０２５４】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、検出システムを備えている。いくつかの例において、検出システムはシグナル検出器を備えている。シグナル検出器の非限定的な例には、蛍光リーダー、比色計、センサー、ワイヤー、回路、受信機が挙げられる。いくつかの例において、検出システムは検出試薬を含む。検出試薬の非限定的な例には、フルオロフォア、化学薬品、ナノ粒子、抗体、および核酸プローブが挙げられる。いくつかの例において、検出システムは、ｐＨセンサーおよび相補性金属酸化膜半導体を備えており、これらを使用してｐＨの変化を検出できる。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、または方法による増幅産物の産生は、ｐＨを変化させ、それにより性別を示す。
【０２５５】
いくつかの例において、検出システムはシグナル検出器を備えている。いくつかの例において、シグナル検出器は、光子を検出する光検出器である。いくつかの例において、シグナル検出器は蛍光を検出する。いくつかの例において、シグナル検出器は、化学薬品または化合物を検出する。いくつかの例において、シグナル検出器は、増幅産物の産生時に放たれる化学薬品を検出する。いくつかの例において、シグナル検出器は、増幅産物を検出システムに加えたときに放たれる化学薬品を検出する。いくつかの例において、シグナル検出器は、増幅産物の産生時に産生される化合物を検出する。いくつかの例において、シグナル検出器は、増幅産物が検出システムに加えられるときに産生される化合物を検出する。
【０２５６】
いくつかの例において、シグナル検出器は、電気シグナルを検出する。いくつかの例において、シグナル検出器は電極を備えている。いくつかの例において、シグナル検出器は、回電流、または電流発生機を備えている。いくつかの例において、回路または電流は、２つ以上の溶液またはポリマーの勾配により設けられる。いくつかの例において、回路または電流は、エネルギー源（例えばバッテリー、携帯電話、電気取出口からのワイヤー）により設けられる。いくつかの例において、本明細書に開示される核酸、増幅産物、化学薬品、または化合物は、電流を中断させることにより電気シグナルをもたらし、シグナル検出器は電気シグナルを検出する。
【０２５７】
いくつかの例において、シグナル検出器は光を検出する。いくつかの例において、シグナル検出器は光センサーを備えている。いくつかの例において、シグナル検出器はカメラを備えている。いくつかの例において、シグナル検出器は、携帯電話カメラまたはその構成部分を備えている。
【０２５８】
いくつかの例において、シグナル検出器は、核酸中の異なる塩基の電荷を検出するナノワイヤーを備えている。いくつかの例において、ナノワイヤーの直径は、約１ｎｍ〜約９９ｎｍである。いくつかの例において、ナノワイヤーの直径は、約１ｎｍ〜約９９９ｎｍである。いくつかの例において、ナノワイヤーは、無機分子、例えばニッケル、白金、ケイ素、金、亜鉛、グラフェン、またはチタンを含む。いくつかの例において、ナノワイヤーは有機分子（例えばヌクレオチド）を含む。
【０２５９】
いくつかの例において、検出システムはアッセイアセンブリを備えており、アッセイアセンブリは、標的の分析物（例えば核酸増幅産物）を検出可能である。いくつかの例において、アッセイアセンブリは側方流動片を含み、これは本明細書および当該技術分野において、側方流動アッセイ、側方流動試験、または側方流動デバイスとも呼ばれる。いくつかの例において、側方流動アッセイは、本明細書に開示される増幅産物を検出するための、迅速で、コストの低い、かつ技術的に単純な方法を提供する。一般的に、本明細書に開示される側方流動アッセイは、流体を輸送する多孔質材料または多孔性マトリクス、および存在時に増幅産物を検出する検出器を備えている。多孔質材料は、多孔性の紙、ポリマー構造、焼結ポリマー、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの例において、側方流動アッセイは、体液またはその一部（例えば血液サンプルの血漿）を輸送する。いくつかの例において、側方流動アッセイは、体液またはその一部を含む溶液を輸送する。例えば、方法は、デバイスまたはシステムへのサンプルの追加前または追加中に、溶液を体液に加える工程を含み得る。溶液は、側方流動アッセイを介したサンプルおよび／または増幅産物の輸送を促進する、塩、ポリマー、または他のあらゆる成分を含み得る。いくつかの例において、側方流動片を介して移動後、核酸は増幅される。
【０２６０】
いくつかの例において、デバイス、検出システムは、側方流動デバイスを備えており、側方流動デバイスは複数のセクターまたはゾーンを含み、所望の機能は各々、別個のセクターまたはゾーンに存在し得る。通常、側方流動デバイスにおいて、液体サンプル、例えば本明細書に記載されるような体液サンプルは、標的分析物を含んで、側方流動デバイスのセクターまたはゾーンを通って外力の補助により、または補助なしに移動する。いくつかの例において、標的分析物は、外力の補助なしに、例えば毛細管現象により移動する。いくつかの例において、標的分析物は、外力の補助により、例えば側方流動デバイスの動作による毛細管現象の促進により移動する。移動は、外部入力、例えば、振盪、回転、遠心分離、電場または磁場の適用、アクティブポンプの適用、真空の適用、または側方流動デバイスのロッキングにより引き起こされる任意の動作を含み得る。
【０２６１】
いくつかの例において、側方流動デバイスは、例えば互いの前後といった、側方に位置するゾーンまたはセクターを含む、側方流動試験片である。一般的に、側方流動試験片は、機能的なゾーンまたはセクターそれぞれの大きな表面領域の暴露の結果として、試験片（例えば、上と下）の各側からの、機能的なゾーンまたはセクターのアクセシビリティを可能にする。これにより、サンプル精製、または標的分析物の増幅、および／または検出に使用される試薬を含む、試薬の追加が容易になる。
【０２６２】
当業者に既知のあらゆる適切な側方流動試験片検出フォーマットは、本明細書に開示されるアッセイアセンブリでの使用を企図されている。側方流動試験片検出フォーマットは周知であり、文献に記載されている。側方流動試験片アッセイフォーマットは通常、例えば参照により本明細書に全体が組み込まれる、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ５：５７７−６０１に記載されている。側方流動試験片のサンドイッチ・アッセイ・フォーマットを使用する核酸の検出は、例えば参照により本明細書に全体が組み込まれる、米国特許第９，１２１，８４９号「Ｌａｔｅｒａｌ  Ｆｌｏｗ  Ａｓｓａｙｓ」に記載されている。側方流動試験片の競合アッセイフォーマットを使用する核酸の検出は、例えば参照により本明細書に全体が組み込まれる、米国特許第９，４２３，３９９号「Ｌａｔｅｒａｌ  Ｆｌｏｗ  Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｔａｇｇｅｄ Ａｎａｌｙｔｅｓ」に記載されている。
【０２６３】
いくつかの例において、側方流動試験片は、サンドイッチフォーマット、競合フォーマット、または多重検出フォーマットを使用して、試験サンプル中の標的分析物を検出する。従来のサンドイッチ・アッセイ・フォーマットにおいて、検出されたシグナルは、サンプルに存在する標的分析物の量に正比例し、その結果、標的分析物の量の増加は、シグナル強度の増加を引き起こす。従来の競合アッセイフォーマットにおいて、検出されたシグナルは、存在する分子物の量との逆相関を有しており、分析物の量の増加はシグナル強度の減少を引き起こす。
【０２６４】
「サンドイッチアッセイ」とも称される側方流動サンドイッチフォーマットにおいて、試験サンプルは典型的に、試験片の一端にてサンプル・アプリケーション・パッドに適用される。適用された試験サンプルは試験片を通過し、サンプル・アプリケーション・パッドから、サンプル・アプリケーション・パッドに隣接する抱合体パッドへと流れ、ここで抱合体パッドは、サンプル流の方向において下流にある。いくつかの例において、抱合体パッドは、標識され、可逆的に固定されたプローブ、例えば、染料、酵素、またはナノ粒子で標識された抗体またはアプタマーを含む。標的分析物が試験サンプルに存在する場合、標識されたプローブ標的分析物複合体が形成される。その後、この複合体は、標的分析物に特異的な固定された第２のプローブを含む、第１の検査ゾーンまたはセクター（例えば検査線）へと流れ、それにより、標識されたプローブ標的分析物複合体を捕捉する。いくつかの例において、第１の検査ゾーンまたはセクターでのシグナルの強度または規模、例えば色は、試験サンプル中の標的分析物の有無、質量、または存在と質量を示すために使用される。第２の検査ゾーンまたはセクターは、過度の標識されたプローブに結合する第３のプローブを含み得る。適用された試験サンプルが標的分析物を含む場合、過度の標識されたプローブは、抱合体パッド上の標識されたプローブによる標的分析物の捕捉後、試験片にはほとんど、または全く存在しない。結果的に、第２の検査ゾーンまたはセクターは、あらゆる標識されたプローブに結合せず、シグナル（例えば、色）は、第２の検査ゾーンまたはセクターでの観察がほとんど、または全く予想されない。ゆえに、第２の検査ゾーンまたはセクターでのシグナルの不在は、第１の検査ゾーンまたはセクターに観察されたシグナルが標的分析物の存在によるものであるという確信を提供できる。
【０２６５】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイスおよびシステムは、サンドイッチアッセイを含む。いくつかの例において、サンドイッチアッセイは、本明細書に開示される生体サンプルを受け、サンプル成分（例えば核酸、細胞、微粒子）を保持するように構成される。いくつかの例において、サンドイッチアッセイは、生体サンプルの非核酸成分（例えばタンパク質、細胞、微粒子）を流す流動溶液を受けて、生体サンプルの核酸を残すように構成される。いくつかの例において、サンドイッチアッセイは、流動溶液の適用時に核酸の保持を補助するために核酸に結合する膜を含む。核酸に結合する膜の非限定的な例には、キトサン修飾ニトロセルロースが挙げられる。
【０２６６】
同様に、側方流動競合フォーマットにおいて、試験サンプルは、試験片の一端にあるサンプル・アプリケーション・パッドに適用され、標的分析物は、標識されたプローブに結合することで、サンプル・アプリケーション・パッドの下流にある抱合体パッドにおいてプローブ標的分析物複合体を形成する。競合フォーマットにおいて、第１の検査ゾーンまたはセクターは典型的に、標的分析物または標的分析物のアナログを含む。第１の検査ゾーンまたはセクターにおける標的分析物は、抱合体パッド中の検査分析物に結合しなかった任意の遊離の標識されたプローブに結合する。ゆえに、第１の検査ゾーンまたはセクターに観察されるシグナルの量は、標的分析物が存在するときよりも、適用された試験サンプルに標的分析物が存在しないときの方が高い。第２の検査ゾーンまたはセクターは、プローブ標的分析物複合体に特異的に結合するプローブを含む。この第２の検査ゾーンまたはセクターに観察されるシグナルの量は、標的分析物が、適用された試験サンプルに存在するときの方が高い。
【０２６７】
側方流動試験片の多重検出フォーマットにおいて、１より多くの標的分析物が、例えば標的分析物の各々に特異的なプローブを含む追加の検査ゾーンまたはセクターの使用と共に、試験片を使用して検出される。
【０２６８】
いくつかの例において、側方流動デバイスは、例えば互いの上下といった、内側に位置する層に存在するゾーンまたはセクターを含む、層状の側方流動デバイスである。いくつかの例において、１つ以上のゾーンまたはセクターは、所定の層に存在する。いくつかの例において、各ゾーンまたはセクターは、個々の層に存在する。いくつかの例において、層は、複数のゾーンまたはセクターを含む。いくつかの例において、層は積層される。層状の側方流動デバイスにおいて、拡散により制御され、かつ濃度勾配により配向されるプロセスは、駆動力により可能である。例えば、サンプル液体に含まれる分析物の蛍光測定アッセイまたは蛍光測定定量アッセイのための多層の解析要素は、参照により本明細書に組み込まれるＥＰ００９７９５２「Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ」に記載されている。
【０２６９】
側方流動デバイスは１つ以上の機能的なゾーンまたはセクターを含み得る。いくつかの例において、検査アセンブリは、１〜２０の機能的なゾーンまたはセクターを含む。いくつかの例において、機能的なゾーンまたはセクターは、少なくとも１つのサンプル精製ゾーンまたはセクター、少なくとも１つの標的分析物増幅ゾーンまたはセクター、少なくとも１つの標的分析物検出ゾーンまたはセクター、および少なくとも１つの標的分析物検出ゾーンまたはセクターを含む。
【０２７０】
いくつかの例において、標的分析物は核酸配列であり、側方流動デバイスは核酸側方流動アッセイである。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、核酸側方流動アッセイを含み、核酸側方流動アッセイは核酸増幅機能を含む。いくつかの例において、核酸増幅機能により実行される標的核酸増幅は、増幅された核酸種の検出の前、またはそれと同時に生じる。いくつかの例において、検出は、標的分析物の存在の質的、半量的、または量的な検出のうち１つ以上を含む。
【０２７１】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、アッセイアセンブリを備えており、標的核酸分析物は、標識された増幅産物、または、増幅後に標識可能な増幅産物を生成するために、側方流動試験片において増幅される。いくつかの例において、ラベルは、１つ以上の増幅プライマーに存在する、または、増幅後に１つ以上の増幅プライマーに抱合される。いくつかの例において、少なくとも１つの標的核酸増幅産物は、側方流動試験片に検出される。例えば、側方流動試験片上の１つ以上のゾーンまたはセクターは、標的核酸増幅産物に特異的なプローブを含み得る。
【０２７２】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、検出器を備えており、検出器はグラフェンバイオセンサーを備えている。グラフェンバイオセンサーは、例えば、Ａｆｓａｈｉ ｅｔ ａｌ．により、題目「Ｎｏｖｅｌ ｇｒａｐｈｅｎｅ−ｂａｓｅｄ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ」（２０１８） １００：８５−８８に記載されている。
【０２７３】
いくつかの例において、本明細書に開示される検出器は、ナノポア、ナノセンサー、またはナノスイッチを備えている。例えば、検出器は、ナノポア配列決定、すなわち膜にわたる電流に基づいてナノポアを通って核酸を輸送する方法を可能とし、検出器は、特異的なヌクレオチドに対応する電流の中断を測定する。ナノスイッチまたはナノセンサーは、検出可能なシグナルへの暴露後に構造変化を受ける。例えば、Ｋｏｕｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．，「ＤＮＡ  ｎａｎｏｓｗｉｔｃｈｅｓ：  Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｇｅｌ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ」（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １２（２）：  １２３−１２６を参照。
【０２７４】
いくつかの例において、検出器は、目的の分析物のためのプローブが、リアルタイム検出に使用されるチップに産生される場合、迅速な多重バイオマーカーアッセイを含む。故に、タグ、ラベル、またはレポーターは必要ではない。これらプローブへの分析物の結合は、分析物の濃度に対応する屈折率の変化を引き起こす。すべての工程が自動化されてもよい。インキュベーションは必要でない場合もある。結果は、１時間未満（例えば１０−３０分）で入手可能であり得る。そのような検出器の非限定的な例には、Ｇｅｎａｌｙｔｅ Ｍａｖｅｒｉｃｋ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。
【０２７５】
追加の検査
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、核酸に加えて、生物成分の検出または解析のための追加の特徴、試薬、検査、またはアッセイを含む。非限定的な例として、生物成分は、タンパク質、ペプチド、脂質、脂肪酸、ステロール、炭水化物、ウイルス成分、微生物成分、およびそれらの組み合わせから選択され得る。生物成分は抗体であり得る。生物は、被験体中のペプチドに応じて産生された抗体であり得る。これら追加のアッセイは、本明細書および全体にわたり開示される小さな容量またはサンプルサイズにおける生物成分を検出または解析可能な場合もある。追加の検査は、目的の生物成分と相互作用可能な試薬を含み得る。そのような試薬の非限定的な例には、抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、および小分子、およびそれらの組み合わせが挙げられる。試薬は検出可能なラベルを含み得る。試薬は、検出可能なラベルと相互作用可能な場合がある。試薬は、検出可能なシグナルを提供可能な場合もある。
【０２７６】
追加の検査は１つ以上の抗体を必要とし得る。例えば、追加の検査は、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）の実行を提供する試薬または成分を含み得る。ＩＰＣＲは、目的のタンパク質のための第１の抗体が固定され、サンプルにさらされる方法である。サンプルが目的のタンパク質を含む場合、サンプルは第１の抗体により捉えられる。その後、捉えられた目的のタンパク質は、目的のタンパク質に結合する第２の抗体にさらされる。第２の抗体は、リアルタイムＰＣＲにより検出可能なポリヌクレオチドに結合されている。代替的に、または付加的に、追加の検査は、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）の実行を提供する試薬または成分を含み、サンプルは、目的のタンパク質に特異的な２つの抗体にさらされ、各抗体はオリゴヌクレオチドを含む。両抗体が目的のタンパク質に結合する場合、各抗体のオリゴヌクレオチドは、増幅および／または検出されるのに十分に近接する。
【０２７７】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、被験体が妊娠していることを確認するための妊娠検査を含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、Ｙ染色体の有無に関する検査（性別検査）を含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、在胎齢の検査を含む。
【０２７８】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、多胎妊娠、例えば双子や三つ子の検査を含む。いくつかの例において、本明細書に開示される方法は、母体サンプル中の胎児核酸の総量（絶対的または相対的）、および、様々な常染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体により表される配列の両を定量することで、特徴の１つ、両方、またはすべてが男性または女性、正倍数性、または異数性かどうか検出する。
【０２７９】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、女性被験体が妊娠していることを示す、判定する、または検証するための妊娠検査を含む。いくつかの例において、妊娠検査は、妊娠に関連する因子を測定するための試薬または成分を含む。非限定的な例として、妊娠に関連する因子は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンタンパク質（ｈＣＧ）、および抗ｈＣＧ抗体を含むｈＣＧに対する試薬または成分であり得る。また、非限定的な例として、妊娠に関連する因子はｈＣＧ転写産物であり、ｈＣＧ転写産物を測定するための試薬または成分は、ｈＣＧ転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーである。いくつかの例において、妊娠に関連する因子は、妊娠初期因子（ＥＰＦ）としても知られる、熱ショックタンパク質１０ｋＤａタンパク質１である。
【０２８０】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、胎児の年齢を伝えることができる。例えば、シグナルは、デバイスまたはシステムから生成可能であり、シグナルのレベルは、被験体のサンプル中のｈＣＧの量に対応する。このシグナルのレベルまたは強度は、サンプル中のｈＣＧの量を表す数値により翻訳され、または曖昧に表現され得る。ｈＣＧの量は、胎児のおよその年齢を示し得る。
【０２８１】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、妊娠の示唆または検証、妊娠期間の示唆または検証、および性別の示唆または検証を提供する。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９０％の信頼（例えば、時間、示唆の９０％が正確である）により、妊娠、妊娠期間、および／または性別の示唆を提供する。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼により、妊娠、妊娠期間、および／または性別の示唆を提供する。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼により、妊娠、妊娠期間、および／または性別の示唆を提供する。
【０２８２】
パフォーマンスパラメーター
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、１つ以上の温度で動作可能である。いくつかの例において、デバイス、システム、またはキットの構成部分または試薬の温度は、デバイス、システム、またはキットが動作可能となるために変更する必要がある。通常、デバイス、システム、およびキットは、生体サンプル中のバイオマーカー（例えばＲＮＡ／ＤＮＡ、ペプチド）により伝達される情報を提供するときに、動作可能と考慮される。いくつかの例において、デバイス、システム、キット、それらの構成部分、または試薬が動作可能な温度は、一般的な世帯において達成される。非限定的な例として、一般的な世帯で達成される温度は、室温、冷蔵庫、冷凍装置、マイクロウェーブ、ストーブ、電気熱ポット、熱い／冷たい槽、またはオーブンにより提供される。
【０２８３】
いくつかの例において、本明細書に記載されるようなデバイス、システム、キット、それらの構成部分、または試薬は、単一の温度で動作可能である。いくつかの例において、本明細書に記載されるようなデバイス、システム、キット、それらの構成部分、または試薬は、動作可能となるために単一の温度のみを必要とする。いくつかの例において、本明細書に記載されるようなデバイス、システム、キット、それらの構成部分、または試薬は、動作可能となるために２つの温度のみを必要とする。いくつかの例において、本明細書に記載されるようなデバイス、システム、キット、それらの構成部分、または試薬は、動作可能となるために３つの温度のみを必要とする。
【０２８４】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、ユーザーが少なくとも１つの温度を達成できるようにする加熱装置または冷却装置を備える。加熱装置と冷却装置の非限定的な例は、材料のパウチまたはバッグであり、これらは、冷蔵庫または冷凍庫で冷却可能、レンジ加熱可能またはコンロの上で沸騰可能、または電気ソケットに挿入可能であり、かつ、後に本明細書に開示されるデバイスまたはその構成部分に適用されることで、デバイスまたはその構成部分を加熱し、またはそれらを冷却する。加熱装置の他の非限定的な例は、デバイスまたはその部分に張り巡らされたワイヤーまたはコイルである。電気ワイヤーまたはコイルを、外部（例えば、太陽、コンセント）または内部（例えばバッテリー、携帯電話）の動力により起動することで、デバイスまたはその部分に熱を伝達することができる。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、ユーザーによる温度範囲内での温度の評価を補助するために温度計または温度表示器を備える。代替的に、または付加的に、ユーザーは、温度を評価するために典型的な家庭環境におけるデバイス（例えば、温度計、携帯電話など）を利用する。
【０２８５】
いくつかの例において、デバイス、システム、キット、それらの構成部分、または試薬は、ある温度範囲にて、または温度範囲内にある少なくとも１つの温度で動作可能である。いくつかの例において、温度範囲は約−５０℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は約−５０℃〜９０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約−５０℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約−５０℃〜約７０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約−５０℃〜約６０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約−５０℃〜約５０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約−５０℃〜約４０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約−５０℃〜約３０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約−５０℃〜約２０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約−５０℃〜約１０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約０℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は約０℃〜約９０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約０℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約０℃〜約７０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約０℃〜約６０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約０℃〜約５０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約０℃〜約４０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約０℃〜約３０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約０℃〜約２０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約０℃〜約１０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約１５℃〜約１００℃である。いくつかの例において、温度範囲は約１５℃〜約９０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約１５℃〜約８０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約１５℃〜約７０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約１５℃〜約６０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約１５℃〜約５０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約１５℃〜約４０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約１５℃〜約３０℃である。いくつかの例において、温度範囲は約１０℃〜約３０℃である。いくつかの例において、それらの全ての構成部分と全ての試薬を含む、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、室温で完全に動作可能であり、冷却、冷凍、または加熱を必要としない。
【０２８６】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、生体サンプルを受ける時間範囲内で生体サンプルの成分またはその産物（例えば、増幅産物、抱合産物、結合産物）を検出する。いくつかの例において、検出は、本明細書に記載されるシグナル分子を介して行われる。いくつかの例において、時間範囲は、約１秒〜約１分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１０秒〜約１分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１０秒〜約１分である。いくつかの例において、時間範囲は、約３０秒〜約１分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１０秒〜約２分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１０秒〜約３分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１０秒〜約５分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１０秒〜約１０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１０秒〜約１５分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１０秒〜約２０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約３０秒〜約２分である。いくつかの例において、時間範囲は、約３０秒〜約５分である。いくつかの例において、時間範囲は、約３０秒〜約１０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約３０秒〜約１５分である。いくつかの例において、時間範囲は、約３０秒〜約２０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約３０秒〜約３０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１分〜２分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１分〜３分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１分〜５分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１分〜１０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１分〜２０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約１分〜３０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約５分〜１０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約５分〜１５分である。いくつかの例において、時間範囲は、約５分〜２０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約５分〜３０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約５分〜６０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約３０分〜６０分である。いくつかの例において、時間範囲は、約３０分〜２時間である。いくつかの例において、時間範囲は、約１時間〜２時間である。いくつかの例において、時間範囲は、約１時間〜４時間である。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、所定の時間未満で、生体サンプルの成分またはその産物（例えば増幅産物、抱合産物、結合産物）を検出する。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、所定の時間未満で生体サンプルの成分またはその産物の解析を提供する。いくつかの例において、時間は１分未満である。いくつかの例において、時間は５分未満である。いくつかの例において、時間は１０分未満である。いくつかの例において、時間は１５分である。いくつかの例において、時間は２０分未満である。いくつかの例において、時間は３０分未満である。いくつかの例において、時間は６０分未満である。いくつかの例において、時間は２時間未満である。いくつかの例において、時間は８時間未満である。
【０２８７】
伝達＆情報記憶
一般的に、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、核酸情報出力部を含む。核酸情報出力部は、サンプルからユーザーに遺伝子情報を伝達するように構成される。いくつかの例では、得られた遺伝子情報を物理的に存在しない他の人（例えば、家族、医師、あるいは遺伝カウンセラー）と共有することができるように、核酸情報出力部は通信接続またはインターフェースを含む。通信接続あるいはインターフェースは、他のソースからの入力も可能にする。いくつかの例では、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、得られた遺伝子情報に基づいて情報を受け取るためのインターフェースを含む。インターフェースまたは通信接続は、ユーザーから非遺伝子情報（例えば、病歴、健康状態、年齢、体重、心拍数、血圧、身体活動など）を受け取ることもできる。インターフェースまたは通信接続は、ユーザー以外の誰かあるいは何かによって提供される情報を受け取ることもできる。非限定的な例として、これは、ウェブベースの情報、医師からの情報、および保険会社からの情報を含む。いくつかの例では、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、得られた遺伝子情報に基づいて情報を伝達するためのインターフェースを含む。いくつかの例では、インターフェースは、遺伝的異常または染色体異常の説明を提供する。いくつかの例では、インターフェースは、遺伝的異常または染色体異常を有する小児の家族を支援する医者、サポートグループ、店、およびサービスプロバイダなどの地域の連絡先のリストを提供する。いくつかの例では、インターフェースは、遺伝学的異常または染色体異常を有する小児にとって有益な製品またはサービスのオンラインリストを提供する。いくつかの例では、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、情報記憶ユニット（例えば、コンピューターチップ）を含む。いくつかの例では、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、遺伝子情報を安全に記憶する手段を含む。例えば、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、データチップ、あるいはハードドライブ、サーバー、データベース、またはクラウドへの接続（有線あるいは無線）を含み得る。本明細書に開示されるデバイスおよびシステムのためのインターフェースの非限定的な例は、図４Ｂならびに図５Ａ−Ｅに示される。
【０２８８】
いくつかの例では、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、安全な方法でユーザーからの情報を収集し、暗号化し、および／または記憶することができる。そのような情報の非限定的な例は、健康情報、ウェアラブルからの情報、行われたあるいは行われる予定の他の検査、人口統計情報などを含む。
【０２８９】
いくつかの例では、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、生体サンプルのバイオマーカーに関する情報を通信デバイスに伝達することができる。いくつかの例では、通信デバイスは、（例えば、ポートあるいは無線接続を介して）インターネットに接続することができる。いくつかの例では、通信デバイスはインターネットに接続される。いくつかの例では、通信デバイスはインターネットに接続されない。いくつかの例では、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、通信デバイスを介して、生体サンプルのバイオマーカーに関する情報をインターネットに伝達することができる。通信デバイスの非限定的な例は、携帯電話、電子ノートパッド、およびコンピューターである。
【０２９０】
いくつかの例では、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、通信接続あるいは通信インターフェースを含む。いくつかの実施形態では、通信インターフェースは、有線通信インターフェースを提供する。さらなる実施形態では、有線通信インターフェースは、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）（ｍｉｎｉ−ＵＳＢ、ｍｉｃｒｏ−ＵＳＢ、ＵＳＢ  Ｔｙｐｅ  Ａ、ＵＳＢ  Ｔｙｐｅ  Ｂ、およびＵＳＢ  Ｔｙｐｅ  Ｃ）、ＩＥＥＥ  １３９４（ファイアーワイヤ）、サンダーボルト、イーサネット、および光インターコネクトを利用する。
【０２９１】
いくつかの実施形態において、通信インターフェースは無線インターフェースを提供する。例えば、図５Ａ−５Ｅを参照。さらなる実施形態では、無線通信インターフェースは、赤外線、近距離無線通信（ＮＦＣ）（ＲＦＩＤを含む）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）Ｌｏｗ  Ｅｎｅｒｇｙ（ＢＬＥ）、ＺｉｇＢｅｅ、ＡＮＴ、ＩＥＥＥ  ８０２．１１（Ｗｉ−Ｆｉ）、無線ローカルエリアネットワーク（ＷＬＡＮ）、無線パーソナルネットワーク（ＷＰＡＮ）、無線ワイドエリアネットワーク（ＷＷＡＮ）、ＷｉＭＡＸ、ＩＥＥＥ  ８０２．１６（ワールドワイド・インターオペラビリティ・フォー・マイクロウェーブ・アクセス（ＷｉＭＡＸ））、あるいは３Ｇ／４Ｇ／ＬＴＥ／５Ｇセルラー方式通信方法などの、無線通信プロトコルを利用する。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるデバイス、システム、キット、および方法は、デジタル処理装置、またはその使用を含む。さらなる実施形態では、デジタル処理装置は、装置の機能を実行する１つ以上のハードウェア中央処理装置（ＣＰＵ）あるいは汎用グラフィック処理装置（ＧＰＧＰＵ）を含んでいる。また更なる実施形態において、デジタル処理装置は、実行可能命令を実行するように構成されるオペレーティングシステムを更に含む。いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、１つ以上の周辺機器、１つ以上の別個のデジタル処理装置、１つ以上のコンピューティングシステム、１つ以上のコンピューターネットワーク、および／または１つ以上の通信ネットワークと通信するための通信インターフェース（例えば、ネットワークアダプタ）を含む。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、通信インターフェースの助けを借りて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）に通信可能に接続される。適切なネットワークは、パーソナルエリアネットワーク（ＰＡＮ）、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、イントラネット、エクストラネット、インターネット（ワールドワイドウェブへのアクセスを提供する）、およびこれらの組み合わせを含む。場合によっては、ネットワークは、電気通信および／またはデータのネットワークである。様々な場合では、ネットワークは、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にする、１つ以上のコンピュータサーバーを含む。ネットワークは、場合によっては、装置の助けを借りて、装置に接続された装置がクライアントまたはサーバーとして機能することを可能にするピアツーピアネットワークを実行する。
【０２９４】
本明細書の記載に従って、適切なデジタル処理装置は、非限定的な例として、サーバコンピュータ、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、ノート型コンピューター、サブノート型コンピューター、ネットブックコンピュータ、ネットパッドコンピュータ、セットトップコンピュータ、メディアストリーミング装置、ハンドヘルドコンピュータ、インターネットアプライアンス、フィットネストラッカー、スマートウォッチ、モバイルスマートフォン、タブレットコンピュータ、および携帯情報端末を含む。当業者は、多くのスマートフォンが、本明細書に記載されるシステムでの使用に適していることを認識する。当業者はまた、随意のコンピューターネットワークの接続性を備えた、選択したテレビ、ビデオプレーヤー、およびデジタル音楽プレーヤーが、本明細書に記載されるシステムでの使用に適していることを認識する。適切なタブレットコンピュータは、当業者に既知の、ブックレット、スレート、および変換可能な構成を備えたものを含む。
【０２９５】
いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、実行可能命令を実行するように構成されるオペレーティングシステムを備える。オペレーティングシステムは、例えば、上記装置のハードウェアを管理し、アプリケーションの遂行のためのサービスを提供するプログラムおよびデータを含むソフトウェアである。当業者は、適切なサーバーオペレーティングシステムが、非限定的な例として、ＦｒｅｅＢＳＤ、ＯｐｅｎＢＳＤ、ＮｅｔＢＳＤ（登録商標）、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）、Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ  Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）Ｓｏｌａｒｉｓ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、およびＮｏｖｅｌｌ（登録商標）ＮｅｔＷａｒｅ（登録商標）を含むことを認識する。当業者は、適切なパーソナルコンピュータオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、および、ＧＮＵ／Ｌｉｎｕｘ（登録商標）などのＵＮＩＸ（登録商標）のようなオペレーティングシステムを含むことを認識する。いくつかの実施形態では、オペレーティングシステムは、クラウドコンピューティングによって提供される。当業者は、適切なモバイルスマートフォンのオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Ｎｏｋｉａ（登録商標）Ｓｙｍｂｉａｎ（登録商標）ＯＳ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＯＳ（登録商標）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎ  Ｍｏｔｉｏｎ（登録商標）ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｐｈｏｎｅ（登録商標）ＯＳ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｍｏｂｉｌｅ（登録商標）ＯＳ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、およびＰａｌｍ（登録商標）ＷｅｂＯＳ（登録商標）を含むことも認識する。当業者は、適切なメディアストリーミングデバイスのオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Ａｐｐｌｅ  ＴＶ（登録商標）、Ｒｏｋｕ（登録商標）、Ｂｏｘｅｅ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ  ＴＶ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ  Ｃｈｒｏｍｅｃａｓｔ（登録商標）、Ａｍａｚｏｎ  Ｆｉｒｅ（登録商標）、およびＳａｍｓｕｎｇ（登録商標）ＨｏｍｅＳｙｎｃ（登録商標）を含むことも認識する。いくつかの例では、オペレーティングシステムは、モノのインターネット（ＩｏＴ）デバイスを含む。ＩｏＴデバイスの非限定的な例は、Ａｍａｚｏｎ（登録商標）のＡｌｅｘａ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）のＣｏｒｔａｎａ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ  Ｈｏｍｅ  Ｐｏｄ（登録商標）、およびＧｏｏｇｌｅ  Ｓｐｅａｋｅｒ（登録商標）を含む。いくつかの例では、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、仮想現実および／または拡張現実システムを含む。
【０２９６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、ストレージデバイスおよび／またはメモリデバイスを含む。ストレージデバイスおよび／またはメモリデバイスは、一時的または恒久的に、データまたはプログラムを記憶するために使用される１以上の物理的な装置である。いくつかの実施形態において、上記デバイスは揮発性メモリであり、記憶した情報を維持するための電力を必要とする。いくつかの実施形態において、上記デバイスは不揮発性メモリであり、デジタル処理装置に電力が供給されないときに、記憶した情報を保持する。更なる実施形態において、不揮発性メモリはフラッシュメモリを含む。いくつかの実施形態において、不揮発性メモリはダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）を含む。いくつかの実施形態において、不揮発性メモリは強誘電体ランダムアクセスメモリ（ＦＲＡＭ（登録商標））を含む。いくつかの実施形態において、不揮発性メモリは相変化ランダムアクセスメモリ（ＰＲＡＭ）を含む。他の実施形態において、デバイスは、非限定的な例として、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリデバイス、磁気円板、光ディスクドライブ、およびクラウドコンピューティングベースの記憶装置を含む、記憶デバイスである。更なる実施形態において、ストレージデバイスおよび／またはメモリデバイスは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組み合わせである。
【０２９７】
いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、ユーザーに視覚情報を送信するためのディスプレイを備える。いくつかの実施形態において、ディスプレイは液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）である。更なる実施形態において、ディスプレイは薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＴＦＴ−ＬＣＤ）である。いくつかの実施形態において、ディスプレイは有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）ディスプレイである。様々な更なる実施形態において、ＯＬＥＤディスプレイは、パッシブマトリクスＯＬＥＤ（ＰＭＯＬＥＤ）またはアクティブマトリクスＯＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）のディスプレイである。いくつかの実施形態において、ディスプレイはプラズマディスプレイである。他の実施形態において、ディスプレイはビデオプロジェクターである。さらに他の実施形態では、ディスプレイは、ＶＲヘッドセットなどのデジタル処理装置と通信するヘッドマウントディスプレイである。
【０２９８】
いくつかの実施形態において、デジタル処理装置は、ユーザーから情報を受信するための入力デバイスを備える。いくつかの実施形態において、入力デバイスはキーボードである。いくつかの実施形態において、入力デバイスは、非限定的な例として、マウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラ、またはスタイラスを含む、ポインティングデバイスである。いくつかの実施形態において、入力デバイスは、タッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンである。他の実施形態において、入力デバイスは、声または他の音入力を捕らえるマイクロホンである。他の実施形態では、入力デバイスは、動作入力または視覚入力を捕らえるためのビデオカメラあるいは他のセンサーである。更なる実施形態において、入力デバイスは、Ｋｉｎｅｃｔ、Ｌｅａｐ  Ｍｏｔｉｏｎなどである。また更なる実施形態において、入力デバイスは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組み合わせである。
【０２９９】
モバイルアプリケーション
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、デジタル処理装置またはその使用を含み、ここで、モバイルアプリケーションの形態の実行可能な命令が上記デジタル処理装置に提供される。いくつかの実施形態において、モバイルアプリケーションは、製造時にモバイルデジタル処理装置に設けられている。他の実施形態において、モバイルアプリケーションは、本明細書に記載されるコンピューターネットワークを介してモバイルデジタル処理装置に設けられている。本明細書に開示されるモバイルアプリケーションは、情報を探し出し、暗号化し、指標付けし、および／またはアクセスするように構成され得る。本明細書に開示されるモバイルアプリケーションは、データを獲得し、暗号化し、作成し、操作し、指標付けし、および閲覧するように構成され得る。
【０３００】
図５Ａを参照すると、特定の実施形態では、モバイルアプリケーションは、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットと接続し、通信し、および、それらからの遺伝子情報および他の情報を受け取るように構成される。図５Ａは、モバイルアプリケーションがユーザーに随意に提供する様々な機能を表す図形である。本実施形態において、モバイルアプリケーションは、以下のものを随意に提供する：１）ユーザーの個人情報および好みに基づく、パーソナライズ化および適合したユーザーエクスペリエンス（ＵＸ）；２）デバイス、システム、およびキットの利用方法をユーザーに知らせるための、インタラクティブなテキスト駆動、音声駆動、および／または映像駆動の教育体験；３）記事、ニュース、メディア、ゲームなどへのアクセスをユーザーを提供する、コンテンツプラットフォーム；ならびに、４）情報、試験結果、およびイベントを追跡ならびに共有するためのツール。
【０３０１】
図５Ｂを参照すると、特定の実施形態では、モバイルアプリケーションは、対話型インターフェースを随意に含み、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットの使用を介してユーザーを誘導するための、段階的ウォークスルー（ｓｔｅｐ−ｂｙ−ｓｔｅｐ  ｗａｌｋｔｈｒｏｕｇｈ）を提供する。様々な実施形態において、対話型ウォークスルーは、ユーザーに通知し、教えるために、テキスト、画像、アニメーション、音声、映像などを含む。
【０３０２】
図５Ｃを参照すると、特定の実施形態では、モバイルアプリケーションは、ユーザーが本明細書に開示されるモバイルアプリケーション機能にアクセスするのを可能にする、ホーム画面を随意に含む。本実施形態において、ホーム画面は、ユーザーが、テストを開始すること、現在および過去の検査結果を見ること、検査結果を共有すること、およびユーザーのより大きなコミュニティーと相互作用することを可能にするインターフェース要素、ならびにパーソナライズ化された挨拶を含む。
【０３０３】
図５Ｄを参照すると、特定の実施形態では、モバイルアプリケーションは、本明細書に開示されるデバイス、システム、またはキットに接続するプロセスの状態をユーザーに通知する、進行図（ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｄｉａｇｒａｍ）を随意に含む。本実施形態において、上記図は、工程のすべてを表し、現在のステップを指し示す。工程は以下である：１）例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）を介して上記デバイスとペアリングする；２）上記デバイス内のサンプルを検出する；および、３）サンプルが処理されるのを待つ。いくつかの実施形態において、上記図は、インタラクティブであるか、アニメーション化されるか、あるいはメディアまたは他のコンテンツで拡張される。
【０３０４】
図５Ｅを参照すると、特定の実施形態では、モバイルアプリケーションは、ユーザーが機能にアクセスして検査結果を共有するのを可能にするソーシャルシェアリングスクリーンを随意に含む。多くのサービス、プラットフォーム、およびネットワークは、検査結果および他の情報ならびにイベントを共有するのに適している。適切なソーシャルネットワーキングおよび共有プラットフォームは、非限定的な例として、Ｆａｃｅｂｏｏｋ、ＹｏｕＴｕｂｅ（登録商標）、Ｔｗｉｔｔｅｒ、ＬｉｎｋｅｄＩｎ、Ｐｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ＋、Ｔｕｍｂｌｒ、Ｉｎｓｔａｇｒａｍ、Ｒｅｄｄｉｔ、ＶＫ、Ｓｎａｐｃｈａｔ、Ｆｌｉｃｋｒ、Ｖｉｎｅ、Ｍｅｅｔｕｐ、Ａｓｋ．ｆｍ、Ｃｌａｓｓｍａｔｅｓ、ＱＱ、ＷｅＣｈａｔ、Ｓｗａｒｍ  ｂｙ  Ｆｏｕｒｓｑｕａｒｅ、Ｋｉｋ、Ｙｉｋ  Ｙａｋ、Ｓｈｏｔｓ、Ｐｅｒｉｓｃｏｐｅ、Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｏｕｎｄｃｌｏｕｄ、Ｔｉｎｄｅｒ、ＷｈａｔｓＡｐｐ、Ｓｎａｐ  Ｃｈａｔ、Ｓｌａｃｋ、Ｍｕｓｉｃａｌ．ｌｙ、Ｐｅａｃｈ、Ｂｌａｂ、Ｒｅｎｒｅｎ、Ｓｉｎａ  Ｗｅｉｂｏ、Ｒｅｎｒｅｎ、Ｌｉｎｅ、およびＭｏｍｏを含む。いくつかの実施形態において、検査結果は、ＳＭＳ、ＭＭＳ、またはインスタントメッセージによって共有される。いくつかの実施形態において、検査結果は電子メールによって共有される。
【０３０５】
いくつかの実施形態において、モバイルアプリケーションは、随意に共有される検査結果に関連する重要な情報およびイベントのブログおよびタイムラインなどの追加の機能に、ユーザーがアクセスすることを可能にするホーム画面を随意に含む。様々な実施形態において、適切な情報およびイベントは、臨床試験の結果、新しく市販される治療薬、栄養、運動、胎児発育、健康などに関するものを含む。本実施形態において、ホーム画面は、ユーザーのプレファレンスおよび設定へのアクセスをさらに含む。
【０３０６】
いくつかの例では、本明細書に開示されるデバイスおよびシステムは、モバイルアプリケーションと通信する。モバイルアプリケーションは、患者ＩＤおよび電子カルテ（ＥＨＲ）の取得、デバイス発送（ユーザーからおよび／またはユーザーから）の手配、検査結果のオンライン注文を提供することができる。モバイルアプリケーションは、ある地点から他の地点までの、デバイスまたはその一部（例えば、輸送／保存の区画）の追跡、あるいはデバイスを用いて得られた情報を提供することができる。様々な地点は、発送、自宅、サンプル処理研究所、および医院から選択され得る。
【０３０７】
本明細書で提供される開示を考慮して、モバイルアプリケーションは、当該技術分野で既知のハードウェア、言語、および開発環境を使用した、当業者に既知の技術によって作成される。当業者は、モバイルアプリケーションが様々な言語で書かれることを認識する。適切なプログラミング言語は、限定されないが、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｊａｖａ（商標）、Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ、Ｐａｓｃａｌ、Ｏｂｊｅｃｔ  Ｐａｓｃａｌ、Ｐｙｔｈｏｎ（商標）、Ｒｕｂｙ、ＶＢ．ＮＥＴ、ＷＭＬ、および、ＣＳＳの有無にかかわらずＸＨＴＭＬ／ＨＴＭＬ、またはそれらの組み合わせを含む。
【０３０８】
適切なモバイルアプリケーション開発環境は様々なソースから利用可能である。市販で入手可能な開発環境は、非限定的な例として、ＡｉｒｐｌａｙＳＤＫ、ａｌｃｈｅＭｏ、Ａｐｐｃｅｌｅｒａｔｏｒ（登録商標）、Ｃｅｌｓｉｕｓ、Ｂｅｄｒｏｃｋ、Ｆｌａｓｈ  Ｌｉｔｅ、．ＮＥＴ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ、Ｒｈｏｍｏｂｉｌｅ、およびＷｏｒｋＬｉｇｈｔ  Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを含む。他の開発環境が無料で利用可能であり、非限定的な例として、Ｌａｚａｒｕｓ、ＭｏｂｉＦｌｅｘ、ＭｏＳｙｎｃ、およびＰｈｏｎｅｇａｐを含む。また、モバイルデバイスのメーカーは、非限定的な例として、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）およびｉＰａｄ（登録商標）（ｉＯＳ）ＳＤＫ、Ａｎｄｒｏｉｄ（商標）ＳＤＫ、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）ＳＤＫ、ＢＲＥＷ  ＳＤＫ、Ｐａｌｍ（登録商標）ＯＳ  ＳＤＫ、Ｓｙｍｂｉａｎ  ＳＤＫ、ｗｅｂＯＳ  ＳＤＫ、およびＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｍｏｂｉｌｅ  ＳＤＫを含む、ソフトウェア開発キットを流通させている。
【０３０９】
当業者は、様々な商用のフォーラムがモバイルアプリケーションの流通に利用可能であることを認識し、それらの非限定的な例として、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ａｐｐ  Ｓｔｏｒｅ、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）Ｐｌａｙ、Ｃｈｒｏｍｅ（登録商標）ＷｅｂＳｔｏｒｅ、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）Ａｐｐ  Ｗｏｒｌｄ、Ｐａｌｍ  ｄｅｖｉｃｅｓのＡｐｐ  Ｓｔｏｒｅ、ｗｅｂＯＳのＡｐｐ  Ｃａｔａｌｏｇ、ＭｏｂｉｌｅのＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｍａｒｋｅｔｐｌａｃｅ、Ｎｏｋｉａ（登録商標）デバイスのＯｖｉ  Ｓｔｏｒｅ、およびＳａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ａｐｐｓが挙げられる。
【０３１０】
デバイス、システム、キット、および方法に関連する態様
以下の態様は、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法に関する。本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、女性の被験体の生体サンプルにおける無細胞核酸を処理ならびに解析するように一般的に設計される。無細胞核酸、生体サンプル、および被験体の以下の説明は、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法の有用性を理解するのに役立ち得る。
【０３１１】
疾患および疾病
被験体における疾患または疾病の存在、不在、あるいは重症度を検出するためのデバイス、システム、キット、および方法が本明細書に開示される。いくつかの例では、疾患または疾病は遺伝子突然変異が原因である。遺伝子突然変異は遺伝性であり得る（例えば、突然変異は祖先または親族に存在した）。遺伝子突然変異は、自然突然変異（例えば、ＤＮＡ複製または修復のエラー）であり得る。遺伝子突然変異は、環境要因（例えば、紫外線、発癌物質）への暴露が原因であり得る。非限定的な例として、遺伝子突然変異は、フレームシフト変異、挿入変異、欠失変異、置換突然変異、一塩基多型、コピー数多型、および染色体転座から選択され得る。
【０３１２】
いくつかの例では、疾患または疾病は、環境要因（例えば、発癌物質、食事、ストレス、病原体）が原因である。いくつかの例では、環境要因は遺伝子突然変異を引き起こす。他の例では、環境要因は遺伝子突然変異を引き起こさない。いくつかの例では、環境要因は、健康な個体と比較して、被験体において１以上のエピジェネティック修飾の変化を引き起こす。いくつかの例では、環境要因は、前の時点の被験体のエピジェネティック修飾に対して、１以上のエピジェネティック修飾の変化を引き起こす。
【０３１３】
本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、１つ以上の組織、臓器、または細胞型に影響を与える疾患または疾病を検出あるいはモニタリングするために使用され得る。疾患または疾病は、１つ以上の組織、臓器、または細胞型からの核酸の放出を引き起こす場合がある。疾患または疾病は、健康な個体で発生する対応する放出と比較して、１つ以上の組織、臓器、または細胞型からの核酸の放出を増大させ得る。組織は、上皮組織、結合組織、筋肉組織、または神経組織に分類され得る。組織の非限定的な例は、脂肪、筋肉、結合組織、乳腺組織、および骨髄である。臓器の非限定的な例は、脳、胸腺、甲状腺、肺、心臓、脾臓、肝臓、腎臓、膵臓、胃、小腸、大腸、結腸、前立腺、卵巣、子宮、および膀胱である。細胞型の非限定的な例は、内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、肝細胞、膵β細胞、脂肪細胞、ニューロン、子宮内膜細胞、免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、クッパー細胞、ミクログリア）である。
【０３１４】
本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、総体的な健康を検出あるいはモニタリングするために使用され得る。本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、適応度を検出あるいはモニタリングするために使用され得る。本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、臓器移植レシピエントの健康および／または移植臓器の健康を検出あるいはモニタリングするために使用され得る。
【０３１５】
疾患または疾病は、異常な細胞成長または細胞増殖を含む場合がある。疾患または疾病は白血病を含み得る。白血病の非限定的な型は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、およびヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）を含む。疾患または疾病はリンパ腫を含み得る。リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症）あるいはホジキンリンパ腫であり得る。疾患または疾病は癌を含み得る。癌は乳癌であり得る。癌は肺癌であり得る。癌は食道癌であり得る。癌は膵臓癌であり得る。癌は卵巣癌であり得る。癌は子宮癌であり得る。癌は子宮頚癌であり得る。癌は精巣癌であり得る。癌は前立腺癌であり得る。癌は膀胱癌であり得る。癌は結腸癌であり得る。癌は肉腫であり得る。癌は腺癌であり得る。癌は単離される可能性があり、つまり、癌が発生した臓器または組織以外の他の組織に広がっていない。癌は転移性であり得る。癌は近隣組織に広がっている場合もある。癌は、癌が発生した臓器または組織と物理的に接触している細胞、組織、または臓器に広がっている場合がある。癌は、癌が発生した臓器または組織と物理的に接触していない細胞、組織、または臓器に広がっている可能性がある。癌は、ステージ０（癌になる可能性がある異常細胞）またはステージ１（小さく、１つの組織に限局される）などの初期段階である可能性がある。癌は、ステージ２またはステージ３などの中等度であり、原発腫瘍の組織と物理的に接触している組織およびリンパ節へと成長する可能性がある。癌はステージ４またはステージ５などに進行し、ここで、癌は、原発腫瘍の組織から離れている（例えば、隣接していないか、あるいは物理的に接触していない）組織に転移している。いくつかの例において、癌は進行していない。いくつかの例において、癌は転移性ではない。いくつかの例において、癌は転移性である。
【０３１６】
疾患または疾病は自己免疫異常を含み得る。自己免疫不全および免疫不全としては、限定されないが、１型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、狼瘡、炎症性腸感染、アジソン病、グレーヴス病、クローン病、およびセリアック病が挙げられる。
【０３１７】
疾患または疾病は代謝障害を含み得る。代謝性疾病または代謝性疾患としては、限定されないが、肥満症、甲状腺障害、高血圧症、１型糖尿病、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎、冠動脈疾患、およびアテローム動脈硬化症が挙げられる。
【０３１８】
疾患または疾病は心血管疾患を含み得る。心血管疾患の非限定的な例は、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞、心膜炎、心筋炎、虚血性脳卒中、高血圧性心疾患、リウマチ心疾患、心筋症、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢血管疾患、血栓塞栓症、および静脈血栓症である。
【０３１９】
疾患または疾病は神経障害を含み得る。神経障害は神経変性疾患を含み得る。神経変性障害および神経障害の非限定的な例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動ニューロン疾患、慢性疼痛、および脊髄筋萎縮症である。本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、被験体の精神疾患、および／または精神疾患を処置する薬物に対する応答を検査、検出、および／またはモニタリングするために使用され得る。
【０３２０】
疾患または疾病は感染症を含み得る。疾患または疾病は感染症によって引き起こされ得る。疾患または疾病は感染症によって悪化させられ得る。感染症はウイルス感染症であり得る。感染症は細菌感染症であり得る。感染症は真菌感染症であり得る。
【０３２１】
疾患または疾病は老化に関連し得る。老化に関連する疾患および疾病としては、限定されないが、癌、骨粗鬆症、痴呆、黄斑変性、代謝性疾病、および神経変性障害が挙げられる。
【０３２２】
疾患または疾病は血液疾患であり得る。血液疾患の非限定的な例は、貧血症、血友病、血液凝固、および栓友病である。例えば、栓友病の検出は、Ｖ因子ライデン（ＦＶＬ）、プロトロンビン遺伝子（ＰＴ  Ｇ２０２１０Ａ）、およびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）から選択される遺伝子に存在する多形性の検出を含み得る。
【０３２３】
疾患または疾病は、食物、液体、または薬物に対するアレルギーあるいは不耐性であり得る。非限定的な例として、被験体は、ラクトース、小麦、大豆、乳製品、カフェイン、アルコール、ナッツ、甲殻類、および卵に対してアレルギーまたは不耐性を有し得る。被験体はさらに、薬物、サプリメント、または化粧品に対してアレルギーまたは不耐性を有し得る。いくつかの例において、方法は、皮膚のタイプまたは皮膚の健康を予測する遺伝マーカーを解析する工程を含む。
【０３２４】
いくつかの例において、疾病はアレルギーに関連する。いくつかの例において、被験体は、疾患または疾病と診断されてないが、疾患または疾病の存在を示す症状を経験している。他の例において、被験体は既に疾患または疾病と診断されており、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法が、疾患または疾病、あるいは、疾患または疾病に対する薬物の効果をモニタリングするのに有用である。
【０３２５】
染色体異常
染色体異常を検出するためのデバイス、システム、キット、および方法が本明細書で開示される。当該分野の当業者は、染色体異常（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）を染色体異常（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ）と呼ぶ場合もある。いくつかの例では、染色体異常は染色体重複である。いくつかの例では、染色体異常は染色体欠失である。いくつかの例では、染色体異常は染色体の腕の欠失である。いくつかの例では、染色体異常は染色体の腕の部分的な欠失である。いくつかの例では、染色体異常は、遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む。いくつかの例では、染色体異常は染色体の破損が原因である。いくつかの例では、染色体異常は、第１の染色体の部分の第２の染色体の部分への転座が原因である。
【０３２６】
多くの既知の染色体異常は、染色体障害を結果として引き起こす。したがって、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、染色体障害を検出するために使用され得る。非限定的な例として、染色体障害は、ダウン症候群（２１トリソミー）およびエドワーズ症候群（１８トリソミー）、パトー症候群（１３トリソミー）、ネコ鳴き症候群（５番染色体短腕の部分的欠失）、ウォルフ・ヒルショルン症候群（４番染色体短腕の欠失）、ヤコブセン症候群（１１番染色体長腕の欠失）、ディジョージ症候群（２２番染色体の小さな欠失）、クラインフェルター症候群（男性における追加のＸ染色体の存在）、およびターナー症候群（女性における単一のＸ染色体のみの存在）を含む。
【０３２７】
生体サンプル
生体サンプルの無細胞核酸を解析するためのデバイス、システム、キット、および方法が本明細書に開示される。生体サンプルの非限定的な例は、全血、血漿、血清、唾液、尿、汗、涙および腟液のサンプルを含む。いくつかの例において、生体サンプルは全血を含む。いくつかの例では、生体サンプルは生体物質を含む環境サンプルである。例えば、生体サンプルは、ウイルス、細菌、またはそれらのフラグメント／粒子を含んでいる食物サンプルまたは水サンプルであってもよい。
【０３２８】
本明細書に記載される方法、システム、およびキットは、一般に、無細胞核酸を検出および定量化する。このような理由で、本明細書に記載される生体サンプルは、一般に、実質的に無細胞であるか、無細胞体液に改変され得る体液である。被験体からのサンプルは、非限定的な例として、細胞が除去される血液、血漿、血清、尿、唾液または膣液であり得る。例えば、無細胞核酸は、被験体の血流中で循環している可能性があり、したがって、検出試薬は被験体からの血液または血清のサンプル中のマーカーを検出および定量化するために使用され得る。「血漿」、「血清」という用語は、特に明記しない限り、本明細書においては交換可能に使用される。しかしながら、場合によっては、その両方は、明細書または請求項によってカバーされることを示すために、サンプル種の単一のリストに含まれている。いくつかの例では、体液は羊水を含まない。
【０３２９】
いくつかの例では、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、生体サンプルから細胞を除去することができる。結果としてもたらされるサンプルは、細胞除去サンプルと呼ばれ得る。細胞除去サンプルは、生体サンプルより少なくとも９５％少ない全無傷細胞を有し得る。細胞除去サンプルは、生体サンプルより少なくとも９０％少ない全無傷細胞を有し得る。細胞除去サンプルは、生体サンプルより少なくとも８０％少ない全無傷細胞を有し得る。細胞除去サンプルは、生体サンプルより少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約２５％少ない全無傷細胞を有し得る。細胞除去サンプルは、全無傷細胞を完全に含まない場合もある。
【０３３０】
毛細管（例えば、指、つま先のような四肢の血管）から得られた血液は、本明細書において「毛細管血」と呼ばれる場合がある。静脈（例えば、腕、手の真ん中）から得られた血液は、本明細書において「静脈血」と呼ばれる場合がある。静脈血を得るための静脈穿刺に一般的な静脈は、肘正中皮静脈、橈側皮静脈、尺側皮静脈、および背側中手静脈である。いくつかの例において、生体サンプルは毛細管血を含む。いくつかの例において、生体サンプルは毛細管血から本質的になる。いくつかの例において、生体サンプルは毛細管血からなる。いくつかの実施形態では、生体サンプルは静脈血を含まない。いくつかの例において、生体サンプルは血漿を含む。いくつかの例において、生体サンプルは血漿から本質的になる。いくつかの例において、生体サンプルは血漿からなる。いくつかの例において、生体サンプルは血清を含む。いくつかの例において、生体サンプルは血清から本質的になる。いくつかの例において、生体サンプルは血清からなる。いくつかの例において、生体サンプルは尿を含む。いくつかの例において、生体サンプルは尿から本質的になる。いくつかの例において、生体サンプルは尿からなる。いくつかの例において、生体サンプルは唾液を含む。いくつかの例において、生体サンプルは唾液から本質的になる。いくつかの例において、生体サンプルは唾液からなる。いくつかの例において、体液は腟液である。いくつかの例において、体液は腟液から本質的になる。いくつかの例において、体液は膣液体からなる。いくつかの例において、膣液は、妊娠している被験体の膣スワブを行うことにより得られる。いくつかの例において、体液は間質液を含む。いくつかの例において、体液は間質液から本質的になる。いくつかの例において、体液は滑液を含む。いくつかの例において、体液は滑液から本質的になる。いくつかの例において、体液はリキッドバイオプシーからの流体を含む。いくつかの例において、体液はリキッドバイオプシーからの流体から本質的になる。リキッドバイオプシーの一例は、癌患者から血液を得て、腫瘍または癌細胞から血流に放出された核酸について試験することである。核酸は、ネクローシス、アポトーシス、オートファジー、および癌細胞に死亡／損傷を引き起こす癌治療のために、腫瘍または癌細胞から放出され得る。
【０３３１】
いくつかの例において、生体サンプルは全血である。一般的に、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、全血の非常に少量のサンプルからの無細胞核酸を解析することができる。いくつかの例では、全血の少量のサンプルは、指穿刺により得ることができ、例えば、ランセットあるいはピン／針により実行される。いくつかの例では、全血の少量のサンプルは、静脈切開なしに得られ得る。
【０３３２】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約３０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約４０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約５０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約６０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約７０μＬの血液を必要とする。
【０３３３】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約３０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約４０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約６０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約８０μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９０％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１００μＬの血液を必要とする。
【０３３４】
いくつかの例では、上記方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、わずか約１μＬ〜約５００μＬの血液を得る工程含む。いくつかの例では、上記方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、わずか約１０μＬ〜約２００μＬの血液を得る工程含む。いくつかの例では、上記方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、わずか約１５μＬ〜約１５０μＬの血液を得る工程含む。いくつかの例では、上記方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、わずか約２０μＬ〜約１００μＬの血液を得る工程含む。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９８％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、わずか約２０〜約１００μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、わずか約２０〜約１００μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、約９９．５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、わずか約２０〜約１００μＬの血液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、約９９．９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、わずか約２０〜約１００μＬの血液を必要とする。
【０３３５】
いくつかの例では、生体サンプルは血漿あるいは血清である。血漿あるいは血清は、全血のおよそ５５％を占める。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約３０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約４０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約５０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約３０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約４０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約５０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、わずか約１０μＬ〜約５０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、わずか約２０μＬ〜約６０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットは、少なくとも約９９％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、わずか約１０μＬ〜約５０μＬの血漿あるいは血清を必要とする。
【０３３６】
いくつかの例では、生体サンプルは唾液である。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１００μＬの唾液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２００μＬの唾液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約５００μＬの唾液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１ｍｌの唾液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２ｍｌの唾液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約３ｍｌの唾液を必要とする。
【０３３７】
いくつかの例において、生体サンプルは膣液である。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約５０μＬの膣液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１００μＬの膣液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２００μＬの膣液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約５００μＬの膣液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約１ｍｌの膣液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約２ｍｌの膣液を必要とする。いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、少なくとも約９５％の信頼度または精度で検査結果を提供するために、少なくとも約３ｍｌの膣液を必要とする。
【０３３８】
いくつかの例では、本明細書に開示される生体サンプルは無細胞核酸を含み、ここで、無細胞核酸の画分は、外来組織または異常組織に由来する。画分中の無細胞核酸は、「外来性の無細胞核酸（ｆｏｒｅｉｇｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」と呼ばれる場合がある。非限定的な例として、外来組織あるいは異常組織は、被験体に移植組織または臓器を含んでいる場合がある。外来組織あるいは異常組織は、ドナー組織と呼ばれる場合があり、被験体は宿主組織と呼ばれる場合がある。また、非限定的な例として、異常組織は腫瘍を含み得る。いくつかの例では、上記画分は、生体サンプル中のすべての（合計）無細胞核酸の画分であり、ここで、上記画分は、外来性あるいは異常性の無細胞核酸を含む。いくつかの例では、画分は、外来細胞あるいは異常細胞を含まない核酸から本質的になる。いくつかの例では、外来細胞あるいは異常細胞を含まない核酸はＤＮＡを含む。いくつかの例では、外来細胞あるいは異常細胞を含まない核酸はＲＮＡを含む。いくつかの例では、外来細胞あるいは異常細胞を含まない核酸はＤＮＡから本質的になる。いくつかの例では、外来細胞あるいは異常細胞を含まない核酸はＲＮＡから本質的になる。
【０３３９】
外来組織あるいは異常組織由来である無細胞核酸の画分は、サンプルにおける全無細胞核酸のパーセンテージとして特徴付けられ得る。いくつかの例では、外来組織あるいは異常な組織由来の無細胞核酸の画分は、２５％未満である。いくつかの例では、外来組織あるいは異常な組織由来の無細胞核酸の画分は、２０％未満である。いくつかの例では、画分は１５％未満である。いくつかの例では、画分は１０％未満である。いくつかの例では、画分は８％未満である。いくつかの例では、画分は６％未満である。いくつかの例では、画分は５％未満である。いくつかの例では、画分は４％未満である。いくつかの例では、画分は２％未満である。いくつかの例では、画分は少なくとも１％である。いくつかの例では、画分は約１．５％〜約１５％である。いくつかの例では、画分は約２％〜約１２％である。いくつかの例では、画分は約４％〜約１０％である。いくつかの例では、画分は約４％〜約９％である。いくつかの例では、胎児の画分は約４％〜約８％である。いくつかの例では、胎児の画分は約１％〜約５％である。いくつかの例では、胎児の画分は約１％〜約４％である。
【０３４０】
いくつかの例では、本明細書に開示される生体サンプルは無細胞核酸を含み、ここで、無細胞核酸の画分は胎児由来である。この画分は胎児の画分と呼ばれる場合がある。いくつかの例では、胎児の画分は、生体サンプル中の全ての（合計）核酸の画分であり、ここで、上記画分は胎児核酸からなる。いくつかの例では、核酸および／または胎児核酸はＤＮＡを含む。いくつかの例では、核酸および／または胎児核酸はＲＮＡを含む。いくつかの例では、核酸および／または胎児核酸はＤＮＡから本質的になる。いくつかの例では、核酸および／または胎児核酸はＤＮＡおよびＲＮＡを含む。いくつかの例では、胎児の画分は、生体サンプル中の全無細胞核酸の約１．５％〜約１５％である。いくつかの例では、胎児の画分は、生体サンプル中の全無細胞核酸の約２％〜約１２％である。いくつかの例では、胎児の画分は、生体サンプル中の全無細胞核酸の約４％〜約１０％である。いくつかの例では、胎児の画分は、生体サンプル中の全無細胞核酸の約４％〜約９％である。いくつかの例では、胎児の画分は、生体サンプル中の全無細胞核酸の約４％〜約８％である。いくつかの例では、胎児の画分は、生体サンプル中の全無細胞核酸の約１％〜約５％である。いくつかの例では、胎児の画分は、生体サンプル中の全無細胞核酸の約１％〜約４％である。いくつかの例では、胎児核酸の少なくとも一部は胎児に由来する。いくつかの例では、胎児核酸の少なくとも一部は胎座に由来する。いくつかの例では、胎児核酸の少なくとも一部は胎児に由来し、胎児核酸の少なくとも一部は胎座に由来する。いくつかの例では、胎児核酸は胎児のみに由来する。いくつかの例では、胎児核酸は胎座のみに由来する。いくつかの例では、胎児核酸は胎児および胎座由来の全核酸である。いくつかの例では、胎児核酸は母体組織または母体流体からではない。いくつかの例では、母体組織は胎座以外の母体組織である。いくつかの例では、母体液は羊水以外の母体液である。
【０３４１】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、生体サンプルを増幅または配列決定に適合させるために体液を改変する工程を含む。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、緩衝液、塩、タンパク質、または核酸を生体サンプルに加える工程を含む場合がある。非限定的な例として、ＥＤＴＡは、凝血を防ぐために血液サンプルに加えられる場合がある。話を分かりやすくするために、そのような修飾された生体サンプルは依然として「生体サンプル」と呼ばれる。
【０３４２】
無細胞核酸
いくつかの例では、本開示の組成物および方法は、生体サンプル中の無細胞核酸を評価するのに有用である。無細胞核酸は動物由来であり得る。無細胞核酸は哺乳動物由来であり得る。無細胞核酸はヒト被験体由来であり得る。無細胞核酸は植物由来であり得る。無細胞核酸は病原体由来であり得る。無細胞核酸は生体サンプル中に存在する病原体由来であり得、ここで、上記生体サンプルは動物由来である。無細胞核酸は生体サンプル中に存在する病原体由来であり得、ここで、上記生体サンプルはヒト被験体由来である。病原体は細菌またはその成分を含み得る。病原体はウイルスまたはその成分であり得る。病原体は菌類またはその成分であり得る。
【０３４３】
いくつかの例では、無細胞核酸はＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）である。いくつかの例では、無細胞核酸はゲノムＤＮＡである。いくつかの例では、無細胞核酸はＲＮＡ（ｃｆ−ＲＮＡ）である。いくつかの例では、無細胞核酸は、無細胞胎児核酸と本明細書で呼ばれる、胎児の細胞由来の核酸である。いくつかの例において、無細胞胎児核酸は、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆ−ＤＮＡ）または無細胞胎児ＲＮＡ（ｃｆｆ−ＲＮＡ）である。いくつかの例において、ｃｆ−ＤＮＡまたはｃｆｆ−ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。いくつかの例では、無細胞核酸は、ｃｆ−ＲＮＡまたはｃｆｆ−ＲＮＡの逆転写によって生成される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の形態である。いくつかの例において、ｃｆ−ＤＮＡはミトコンドリアＤＮＡを含む。いくつかの例において、ｃｆ−ＲＮＡまたはｃｆｆ−ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ミトコンドリアＲＮＡ、または天然アンチセンスＲＮＡ（ＮＡＳ−ＲＮＡ）である。いくつかの例において、無細胞核酸は、母体核酸と胎児核酸の混合物である。母体の血流中で循環する無細胞胎児核酸は、「循環無細胞核酸」または「循環細胞外ＤＮＡ」と呼ばれる場合がある。いくつかの例において、無細胞核酸はエピジェネティック修飾を含む。いくつかの例において、無細胞核酸は、対象の性別または他の遺伝子情報に対応するエピジェネティック修飾のパターンを含む。いくつかの例において、無細胞核酸はメチル化シトシンを含む。いくつかの例において、無細胞核酸は、対象の性別または他の遺伝子情報に対応するシトシンメチル化パターンを含む。
【０３４４】
いくつかの例において、本明細書に開示される方法、デバイス、システム、およびキットは、破壊細胞または溶解細胞からの核酸などの細胞核酸を検出あるいは定量化するように構成される。いくつかの例において、細胞核酸は、意図的に破壊または溶解される細胞に由来する。いくつかの例において、細胞核酸は、非意図的に破壊または溶解される細胞に由来する。本明細書に開示される方法、デバイス、システム、およびキットは、非意図的に破壊または溶解された細胞ではなく、意図的に破壊または溶解された細胞を解析するように構成され得る。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約０．１％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約１％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約５％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約１０％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約２０％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約３０％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約４０％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約５０％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約６０％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約７０％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約８０％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、生体サンプル中の全核酸の約９０％未満が細胞核酸である。いくつかの例において、デバイス、システム、キット、および方法は、実験対照またはその使用を含む。いくつかの例において、実験対照は、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原結合性抗体フラグメント、結合部分を含む。いくつかの例において、実験対照は、実験対照の検出のためのシグナルを含む。シグナルの非限定的な例は、蛍光分子、色素分子、ナノ粒子、および比色定量指標である。いくつかの例において、実験対照は無細胞核酸を含む。いくつかの例において、無細胞核酸は無細胞胎児核酸を含む。いくつかの例において、無細胞核酸は母体無細胞核酸を含む。いくつかの例において、無細胞核酸は、母体無細胞核酸を含む（例えば、サンプル処理中に生じる細胞の破壊／溶解の量を評価するために）。いくつかの例において、無細胞核酸は、常染色体に対応する配列を含む。いくつかの例において、無細胞核酸は、性染色体に対応する配列を含む。いくつかの例では、無細胞核酸は、おそらく異数性である染色体（例えば、１３、１６、１８、２１、２２番染色体、Ｘ染色体、Ｙ染色体）に対応する配列を含む。いくつかの例では、無細胞核酸は、異数性である可能性が非常に低い染色体（例えば、１−１２、１４、１５、１７、１９、または２０番染色体）に対応する配列を含む。
【０３４５】
いくつかの例では、生体サンプルは母体液サンプルを含む。いくつかの例において、母体液サンプルは、血液、例えば全血、末梢血サンプル、または血液画分（血漿、血清）を含む。いくつかの例では、母体液サンプルは、汗、涙、痰、尿、耳流体（ｅａｒ  ｆｌｏｗ）、リンパ、唾液、脳脊髄液、骨髄懸濁液、膣液、大腿骨頸部洗浄液（ｔｒａｎｓｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌａｖａｇｅ，）、脳液、腹水、または母乳を含む。いくつかの例では、母体液サンプルは、呼吸器、腸、および尿生殖路の分泌物、羊水、またはロイコフォレーシス（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）サンプルを含む。いくつかの例において、体液サンプルは、非侵襲的処置により容易に得られる母体液サンプル、例えば、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、耳流体（ｅａｒ  ｆｌｏｗ）、または唾液である。いくつかの例において、サンプルは少なくとも２つの体液サンプルの組み合わせである。いくつかの例において、無細胞胎児核酸は、胎盤子宮部、例えば、アポトーシス化（ａｐｏｐｔｏｓｅｄ）された胎盤の細胞に由来する。いくつかの例において、生体サンプルは胎盤血液である。
【０３４６】
いくつかの例において、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法により評価または解析される核酸は、望ましい長さを有する。いくつかの例において、核酸は無細胞胎児ＤＮＡフラグメントである。いくつかの例において、無細胞胎児ＤＮＡフラグメントはＹ染色体由来である。いくつかの例において、核酸は、約１５ｂｐ〜約５００ｂｐの長さである。いくつかの例において、核酸は、約５０ｂｐ〜約２００ｂｐの長さである。いくつかの例において、核酸は、少なくとも約１５ｂｐの長さである。いくつかの例において、核酸は、多くとも約５００ｂｐの長さである。例において、核酸は、約１５ｂｐ〜約５０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約７５ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約１００ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約２００ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約５０ｂｐ〜約７５ｂｐの長さ、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐの長さ、約５０ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約５０ｂｐ〜約２００ｂｐの長さ、約５０ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約５０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約５０ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約５０ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約５０ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約７５ｂｐ〜約１００ｂｐの長さ、約７５ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約７５ｂｐ〜約２００ｂｐの長さ、約７５ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約７５ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約７５ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約７５ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約７５ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約７５ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約２５０ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約２５０ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約２５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約２５０ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約３００ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約３００ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約３５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約３５０ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、または約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐの長さである。いくつかの例において、核酸は、約１５ｂｐの長さ、約５０ｂｐの長さ、約７５ｂｐの長さ、約１００ｂｐの長さ、約１５０ｂｐの長さ、約２００ｂｐの長さ、約２５０ｂｐの長さ、約３００ｂｐの長さ、約３５０ｂｐの長さ、約４００ｂｐの長さ、約４５０ｂｐの長さ、または約５００ｂｐの長さである。
【０３４７】
本開示のデバイス、システム、キット、および方法を使用して評価された無細胞核酸のサイズは、例えば、使用される特定の体液サンプルに応じて異なり得る。例えば、ｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、母体ｃｆ−ＤＮＡ配列よりも短く、ｃｆｆ−ＤＮＡおよび母体ｃｆ−ＤＮＡの両方は、血漿サンプルよりも尿において短いことが観察されている。
【０３４８】
いくつかの例において、尿において評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、長さが約２０ｂｐ〜約３００ｂｐにおよぶ。いくつかの例において、尿サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、長さが約１５ｂｐ〜約３００ｂｐである。いくつかの例において、尿サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、少なくとも約１５ｂｐの長さである。いくつかの例において、尿サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、多くとも約３００ｂｐの長さである。いくつかの例において、尿サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、約１５ｂｐ〜約２０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約３０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約６０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約９０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約１２０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約１８０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約２１０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約２４０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約２７０ｂｐの長さ、約１５ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約２０ｂｐ〜約３０ｂｐの長さ、約２０ｂｐ〜約６０ｂｐの長さ、約２０ｂｐ〜約９０ｂｐの長さ、約２０ｂｐ〜約１２０ｂｐの長さ、約２０ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約２０ｂｐ〜約１８０ｂｐの長さ、約２０ｂｐ〜約２１０ｂｐの長さ、約２０ｂｐ〜約２４０ｂｐの長さ、約２０ｂｐ〜約２７０ｂｐの長さ、約２０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約３０ｂｐ〜約６０ｂｐの長さ、約３０ｂｐ〜約９０ｂｐの長さ、約３０ｂｐ〜約１２０ｂｐの長さ、約３０ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約３０ｂｐ〜約１８０ｂｐの長さ、約３０ｂｐ〜約２１０ｂｐの長さ、約３０ｂｐ〜約２４０ｂｐの長さ、約３０ｂｐ〜約２７０ｂｐの長さ、約３０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約６０ｂｐ〜約９０ｂｐの長さ、約６０ｂｐ〜約１２０ｂｐの長さ、約６０ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約６０ｂｐ〜約１８０ｂｐの長さ、約６０ｂｐ〜約２１０ｂｐの長さ、約６０ｂｐ〜約２４０ｂｐの長さ、約６０ｂｐ〜約２７０ｂｐの長さ、約６０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約９０ｂｐ〜約１２０ｂｐの長さ、約９０ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約９０ｂｐ〜約１８０ｂｐの長さ、約９０ｂｐ〜約２１０ｂｐの長さ、約９０ｂｐ〜約２４０ｂｐの長さ、約９０ｂｐ〜約２７０ｂｐの長さ、約９０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約１２０ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約１２０ｂｐ〜約１８０ｂｐの長さ、約１２０ｂｐ〜約２１０ｂｐの長さ、約１２０ｂｐ〜約２４０ｂｐの長さ、約１２０ｂｐ〜約２７０ｂｐの長さ、約１２０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約１８０ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約２１０ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約２４０ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約２７０ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約１８０ｂｐ〜約２１０ｂｐの長さ、約１８０ｂｐ〜約２４０ｂｐの長さ、約１８０ｂｐ〜約２７０ｂｐの長さ、約１８０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約２１０ｂｐ〜約２４０ｂｐの長さ、約２１０ｂｐ〜約２７０ｂｐの長さ、約２１０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約２４０ｂｐ〜約２７０ｂｐの長さ、約２４０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、または約２７０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さである。いくつかの例において、尿サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、約１５ｂｐの長さ、約２０ｂｐの長さ、約３０ｂｐの長さ、約６０ｂｐの長さ、約９０ｂｐの長さ、約１２０ｂｐの長さ、約１５０ｂｐの長さ、約１８０ｂｐの長さ、約２１０ｂｐの長さ、約２４０ｂｐの長さ、約２７０ｂｐの長さ、または約３００ｂｐの長さである。
【０３４９】
いくつかの例において、血漿または血清サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、少なくとも約２０ｂｐの長さである。いくつかの例において、血漿または血清サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、少なくとも約４０ｂｐの長さである。いくつかの例において、血漿または血清サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、少なくとも約８０ｂｐの長さである。いくつかの例において、血漿または血清サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、最大で約５００ｂｐの長さである。いくつかの例において、血漿または血清において評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、長さが約１００ｂｐ〜約５００ｂｐにおよぶ。いくつかの例において、血漿または血清サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、約５０ｂｐの長さ〜約５００ｂｐの長さである。いくつかの例において、血漿または血清サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、約８０ｂｐ〜約１００ｂｐの長さ、約８０ｂｐ〜約１２５ｂｐの長さ、約８０ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約８０ｂｐ〜約１７５ｂｐの長さ、約８０ｂｐ〜約２００ｂｐの長さ、約８０ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約８０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約８０ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約８０ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約８０ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約８０ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約１２５ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約１７５ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約１００ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約１２５ｂｐ〜約１５０ｂｐの長さ、約１２５ｂｐ〜約１７５ｂｐの長さ、約１２５ｂｐ〜約２００ｂｐの長さ、約１２５ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約１２５ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約１２５ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約１２５ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約１２５ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約１２５ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約１７５ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約１５０ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約１７５ｂｐ〜約２００ｂｐの長さ、約１７５ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約１７５ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約１７５ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約１７５ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約１７５ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約１７５ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約２００ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐの長さ、約２５０ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約２５０ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約２５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約２５０ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐの長さ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約３００ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約３００ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約３５０ｂｐ〜約４００ｂｐの長さ、約３５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約３５０ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、約４００ｂｐ〜約４５０ｂｐの長さ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐの長さ、または約４５０ｂｐ〜約５００ｂｐの長さである。いくつかの例において、血漿または血清サンプルにおいて評価されたｃｆｆ−ＤＮＡ配列は、約８０ｂｐの長さ、約１００ｂｐの長さ、約１２５ｂｐの長さ、約１５０ｂｐの長さ、約１７５ｂｐの長さ、約２００ｂｐの長さ、約２５０ｂｐの長さ、約３００ｂｐの長さ、約３５０ｂｐの長さ、約４００ｂｐの長さ、約４５０ｂｐの長さ、または約５００ｂｐの長さである。
【０３５０】
被験体
被験体のサンプル中の生体成分を解析するためのデバイス、システム、キット、および方法が本明細書で開示される。被験体はヒトであり得る。被験体はヒト以外であり得る。被験体は哺乳類以外であり得る（例えば、鳥類、爬虫類、昆虫類）。いくつかの例において、被験体は哺乳動物である。いくつかの例において、哺乳類はメスである。いくつかの例において、被験体はヒト被験体である。いくつかの例において、哺乳動物は霊長類（例えば、ヒト、類人猿、小型類人猿、サル）である。いくつかの例において、哺乳動物はイヌ科（例えばイヌ、キツネ、オオカミ）である。いくつかの例において、哺乳動物はネコ科（例えば、家猫、大型猫）である。いくつかの例において、哺乳動物はウマ科（例えば、ウマ）である。いくつかの例において、哺乳動物はウシ科（例えば、雌ウシ、水牛、バイソン）である。いくつかの例において、哺乳動物はヒツジである。いくつかの例において、哺乳動物はヤギである。いくつかの例において、哺乳動物はブタである。いくつかの例において、哺乳動物はげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）である。
【０３５１】
いくつかの例において、本明細書に記載される被験体は、疾患または疾病の影響を受けている。本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、疾患または疾病を検査し、疾患または疾病を検出し、および／または疾患または疾病をモニタリングするために使用され得る。本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、遺伝形質の存在を検査し、適応度をモニタリングし、および家族のつながりを検出するために使用され得る。
【０３５２】
本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、被験体の癌を検査、検出、および／またはモニタリングするために使用され得る。癌の非限定的な例としては、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、肺癌、大腸癌／結腸癌、膀胱癌、膵臓癌、リンパ腫、および白血病が挙げられる。
【０３５３】
本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、被験体の免疫不全または自己免疫不全を検査、検出、および／またはモニタリングするために使用され得る。自己免疫不全および免疫不全としては、限定されないが、１型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、狼瘡、炎症性腸感染、アジソン病、グレーヴス病、クローン病、およびセリアック病が挙げられる。
【０３５４】
本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、被験体の老化に関連する疾患または疾病を検査、検出、および／またはモニタリングするために使用され得る。老化に関連する疾患および疾病としては、限定されないが、癌、骨粗鬆症、痴呆、黄斑変性、代謝性疾病、および神経変性障害が挙げられる。
【０３５５】
本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、血液疾患を検査、検出、および／またはモニタリングするために使用され得る。血液疾患の非限定的な例は、貧血症、血友病、血液凝固、および栓友病である。例えば、栓友病の検出は、Ｖ因子ライデン（ＦＶＬ）、プロトロンビン遺伝子（ＰＴ  Ｇ２０２１０Ａ）、およびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）から選択される遺伝子中に存在する多形性の検出を含み得る。
【０３５６】
本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、被験体の神経傷害または神経変性障害を検査、検出、および／またはモニタリングするために使用され得る。神経変性障害および神経傷害の非限定的な例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動ニューロン疾患、慢性疼痛、および脊髄筋萎縮症である。本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、被験体の精神疾患、および／または精神疾患を処置する薬物に対する応答を検査、検出、および／またはモニタリングするために使用され得る。
【０３５７】
本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、代謝性疾病または代謝性疾患を検査、検出、および／またはモニタリングするために使用され得る。代謝性疾病または代謝性疾患としては、限定されないが、肥満症、甲状腺障害、高血圧症、１型糖尿病、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎、冠動脈疾患、およびアテローム動脈硬化症が挙げられる。
【０３５８】
本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法は、食物、液体、または薬物に対するアレルギーまたは不耐性を検査、検出、および／またはモニタリングするために使用され得る。非限定的な例として、被験体は、ラクトース、小麦、大豆、乳製品、カフェイン、アルコール、ナッツ、甲殻類、および卵に対してアレルギーまたは不耐性を有し得る。被験体はさらに、薬物、サプリメント、または化粧品に対してアレルギーまたは不耐性を有し得る。いくつかの例において、方法は、皮膚のタイプまたは皮膚の健康を予測する遺伝マーカーを解析する工程を含む。
【０３５９】
いくつかの例において、疾病はアレルギーに関連する。いくつかの例において、被験体は、疾患または疾病を有すると診断されてないが、疾患または疾病の存在を示す症状を経験している。他の例において、被験体は既に疾患または疾病を有すると診断されており、本明細書に開示されるデバイス、システム、キット、および方法が、疾患または疾病、あるいは、疾患または疾病に対する薬物の効果をモニタリングするのに有用である。
【０３６０】
妊娠している被験体からの母体生体サンプル中の胎児無細胞核酸を解析するためのデバイス、システム、キット、および方法が本明細書に開示される。一般的に、妊娠している被験体はヒトの妊娠している被験体である。しかし、当業者は、本開示が、おそらく農場または動物園での繁殖目的のために、他の哺乳動物に適用され得ることを理解するだろう。いくつかの例において、妊娠している被験体は正倍数性である。いくつかの例において、妊娠している被験体は異数性を含む。いくつかの例では、妊娠している被験体は、遺伝子またはその一部のコピー変異を有する。いくつかの例では、妊娠している被験体は遺伝子挿入変異がある。いくつかの例では、妊娠している被験体は遺伝学子欠失変異がある。いくつかの例では、妊娠している被験体は遺伝子ミスセンス変異がある。いくつかの例では、妊娠している被験体は一塩基多型を有する。いくつかの例では、妊娠している被験体は一塩基多型を有する。いくつかの例では、妊娠している被験体は、融合遺伝子を結果としてもたらす転座突然変異がある。非限定的な例として、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子は、多くの白血病患者の２２番染色体上で発見され得る融合遺伝子である。修飾された２２番染色体はフィラデルフィア染色体と呼ばれる。
【０３６１】
いくつかの例において、妊娠している被験体は、妊娠約２〜約４２週目である。いくつかの例において、妊娠している被験体は、妊娠約３〜約４２週目である。いくつかの例において、妊娠している被験体は、妊娠約４〜約４２週目である。いくつかの例において、妊娠している被験体は、妊娠約５〜約４２週目である。いくつかの例において、妊娠している被験体は、妊娠約６〜約４２週目である。いくつかの例において、妊娠している被験体は、妊娠約７〜約４２週目である。いくつかの例において、妊娠している被験体は、妊娠約８〜約４２週目である。
【０３６２】
いくつかの例では、妊娠している被験体は、妊娠約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約１２週目、約１６週目、約２０週目、約２１週目、約２２週目、約２４週目、約２６週目、または約２８週目である。いくつかの例では、妊娠している被験体は、わずか妊娠５週間目である。いくつかの例において、ヒト被験体は、少なくとも約５週目、少なくとも約６週目、少なくとも約７週目、または少なくとも約８週目の妊娠期間に達している妊娠しているヒト女性である。いくつかの例において、ヒト被験体は、少なくとも約５〜約８週目の妊娠期間に達している妊娠しているヒト女性である。いくつかの例では、ヒト被験体は、少なくとも約５〜約８、少なくとも約５〜約１２、少なくとも約５〜約１６、少なくとも約５〜約２０、少なくとも約６〜約２１、少なくとも約６〜約２２、少なくとも約６〜約２４、少なくとも約６〜約２６、少なくとも約６〜約２８、少なくとも約６〜約９、少なくとも約６〜約１２、少なくとも約６〜約１６、少なくとも約６〜約２０、少なくとも約６〜約２１、少なくとも約６〜約２２、少なくとも約６〜約２４、少なくとも約６〜約２６、または少なくとも約６〜約２８週目に達している妊娠しているヒト女性である。いくつかの例では、ヒト被験体は、少なくとも約７〜約８、少なくとも約７〜約１２、少なくとも約７〜約１６、少なくとも約７〜約２０、少なくとも約７〜約２１、少なくとも約７〜約２２、少なくとも約７〜約２４、少なくとも約７〜約２６、少なくとも約７〜約２８、少なくとも約８〜約９、少なくとも約８〜約１２、少なくとも約６〜約１６、少なくとも約８〜約２０、少なくとも約８〜約２１、少なくとも約６〜約２２、少なくとも約８〜約２４、少なくとも約８〜約２６、または少なくとも約８〜約２８週目に達している妊娠しているヒト女性である。いくつかの例において、妊娠期間は、最終月経期の初日から妊娠期間を測定することによって決定される。
【０３６３】
いくつかの例において、生体サンプルは、妊娠している被験体、妊娠の疑いのある被験体、または、最近、例えば１日以内に出産した被験体から得られる、母体液サンプルである。いくつかの例において、被験体は哺乳動物である。いくつかの例において、哺乳動物はメスである。いくつかの例では、哺乳動物は、霊長類（例えば、ヒト、類人猿、小型類人猿、サル）、イヌ科の動物（例えば、イヌ、キツネ、オオカミ）、ネコ科の動物（例えば、家ネコ、大型の猫科動物）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、ウシ属の動物（例えば、雌牛、水牛、バイソン）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、めん羊（ｓｈｅｅｐ））、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）（例えば、ヤギ（ｇｏａｔ））豚（ｐｏｒｃｉｎｅ）（例えば、ブタ（ｐｉｇ））、サイ、あるいは、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）である。いくつかの例において、被験体は、妊娠第１期  、妊娠第２期  、または妊娠第３期の妊娠しているヒト女性である。いくつかの例では、ヒト被験体は、妊娠期間が約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、または約４０週目未満の妊娠しているヒト女性である。
【０３６４】
番号付き実施形態
【０３６５】
本開示は、本明細書に列挙される番号付き実施形態の検討によってさらに理解される。１．方法であって、上記方法は、被験体から毛細管血を得る工程であって、ここで、毛細管血は無細胞核酸を含む、工程と；配列決定リードを生成するために、無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程と；対象の少なくとも１つの標的配列に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程と；少なくとも１つの標的配列の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程とを含む、方法。２．方法であって、上記方法は、被験体から毛細管血を得る工程であって、ここで、毛細管血は無細胞核酸を含む、工程と；随意に無細胞核酸を増幅する工程と；タグ付けされた無細胞核酸のライブラリを生成するために、無細胞核酸の少なくとも一部にタグ付けする工程と；タグ付けされた無細胞核酸を随意に増幅する工程と；タグ付けされた無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程と；タグ付けされた無細胞核酸の少なくとも一部において、少なくとも１つの標的配列の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程とを含む、方法。３．少なくとも０．５の効率を有するライブラリを生成する工程を含む、実施形態１または２に記載の方法。４．クラウディング剤の存在下において、無細胞核酸あるいはタグ付けされた無細胞核酸を増幅する工程を含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。５．無細胞核酸の末端を修復する工程を含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。６．方法であって、上記方法は、被験体から生体サンプルを得る工程を含み、ここで、上記生体サンプルは、ともに全無細胞核酸を構成する標的無細胞核酸と非標的無細胞核酸とを含み、ならびに、上記標的無細胞核酸は全無細胞核酸の５％未満である、工程と；配列決定リードを生成するために、標的無細胞核酸の少なくとも一部を配列決定する工程と；対象の少なくとも１つの標的配列に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程と；少なくとも１つの標的配列の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程とを含む、方法。７．生体サンプルは毛細管血を含む、実施形態６に記載の方法。８．生体サンプルは毛細管血から本質的になる、実施形態６に記載の方法。９．生体サンプルを得る工程は毛細管血を得ることを含む、実施形態６に記載の方法。１０．生体サンプルを得る工程は毛細管血を得ることを含む、実施形態６に記載の方法。１１．生体サンプルを得る工程は毛細管血を得ることから本質的になる、実施形態６に記載の方法。１２．生体サンプルを得る工程は静脈血を得ることを含まない、実施形態６に記載の方法。１３．生体サンプルを得る工程は静脈切開を行うことを含まない、実施形態６に記載の方法。１４．生体サンプルを得る工程は１ミリリットル以下の血液を得ることを含む、実施形態１〜１３のいずれかに記載の方法。１５．生体サンプルを得る工程は１００マイクロリットル以下の血液を得ることを含む、実施形態１〜１４のいずれかに記載の方法。１６．生体サンプルを得る工程は４０マイクロリットル以下の血液を得ることを含む、実施形態１〜１５のいずれかに記載の方法。１７．標的無細胞核酸は腫瘍由来の無細胞核酸である、実施形態１〜１６のいずれかに記載の方法。１８．標的無細胞核酸は胎児由来の無細胞核酸である、実施形態１〜１７のいずれかに記載の方法。１９．標的無細胞核酸は移植組織あるいは臓器由来の無細胞核酸である、実施形態１〜１８のいずれかに記載の方法。２０．上記方法は、少なくとも９８％の精度で、少なくとも１つの標的配列の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程を含む、実施形態１〜１９のいずれかに記載の方法。２１．上記方法は全ゲノム増幅を含まない、実施形態１〜２０のいずれかに記載の方法。２２．方法であって、上記方法は、被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、上記生体サンプルは最大約１０９の無細胞核酸分子を含有する、工程と；配列決定リードを生成するために、無細胞核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程と；少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの少なくとも一部を測定する工程と；少なくとも１つの染色体領域の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程とを含む、方法。２３．生体サンプルは、約５００μｌ未満の量を有する体液である、実施形態１〜２２のいずれかに記載の方法。２４．生体サンプルは、約１μＬ〜約１００μｌの量を有する体液である、実施形態１〜２３のいずれかに記載の方法。２５．生体サンプルは、約５μＬ〜約８０μｌの量を有する体液である、実施形態１〜２４のいずれかに記載の方法。２６．生体サンプルは約５μＬ〜約６０μｌの量を有する、実施形態１〜２５のいずれかに記載の方法。２７．配列決定前に無細胞核酸分子を増幅する工程を含む、実施形態１〜２６のいずれかに記載の方法。２８．配列決定前および増幅後に無細胞核酸分子にタグ付けする工程を含む、実施形態１〜２７のいずれかに記載の方法。２９．配列決定前に無細胞核酸分子にタグ付けする工程を含む、実施形態１〜２８のいずれかに記載の方法。３０．無細胞核酸分子にタグ付けした後に無細胞核酸分子を増幅する工程を含む、実施形態１〜２９のいずれかに記載の方法。３１．無細胞核酸分子にタグ付けする前に無細胞核酸分子を増幅する工程を含む、実施形態１〜３０のいずれかに記載の方法。３２．増幅する工程は、無細胞核酸分子をランダムオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることを含む、実施形態１〜３１のいずれかに記載の方法。３３．増幅する工程は等温増幅を含む、実施形態１〜３２に記載の方法。３４．少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの過剰表現を検出することを含む、実施形態１〜３３のいずれかに記載の方法。３５．少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの過少表現を検出することを含む、実施形態１〜３４のいずれかに記載の方法。３６．少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの数と、少なくとも１つの標的染色体に対応する配列決定リードの基準数を比較する工程を含む、実施形態１〜３５のいずれかに記載の方法。３７．少なくとも１つの染色体領域に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定することを含む、実施形態１〜３７のいずれかに記載の方法。３８．少なくとも１つの非標的染色体領域に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定することを含む、実施形態１〜３８のいずれかに記載の方���。３９．生体サンプルは体液である、実施形態１〜３８のいずれかに記載の方法。４０．生体サンプルは、血液、血漿、血清、尿、間質液、膣細胞、膣液、頬側細胞あるいは唾液を含む、実施形態１〜３９のいずれかに記載の方法。４１．生体サンプルは血清あるいは血漿である、実施形態１〜４０のいずれかに記載の方法。４２．血漿あるいは血清を血液サンプルから分離する工程をさらに含む、実施形態４１に記載の方法。４３．分離する工程は、細胞、細胞フラグメント、微小胞、あるいはそれらの組み合わせを血液サンプルから除去して、血漿サンプルを生成するために、血液サンプルを濾過することを含む、実施形態４１に記載の方法。４４．生体サンプルは、約５μｌ〜約１ｍｌの量を有する血液サンプルである、実施形態１〜４３のいずれかに記載の方法。４５．生体サンプルは、約５μｌ〜約１５０μｌの量を有する血液サンプルである、実施形態１〜４４のいずれかに記載の方法。４６．血液サンプルを得る工程は指を穿刺することを含む、実施形態４４または４５に記載の方法。４７．穿刺された指から血液を絞り取るか、あるいは絞ることをさらに含む、実施形態４６に記載の方法。４８．方法は、穿刺された指から血液を絞り取るか、あるいは絞ることを含まない、実施形態４６に記載の方法。４９．血液サンプルを得ることは静脈切開を含まない、実施形態１〜４８に記載の方法。５０．生体サンプルは約１０４〜約１０９の無細胞核酸分子を含む、実施形態１〜４９のいずれかに記載の方法。５１．生体サンプルは約１０４〜約１０８の無細胞核酸分子を含む、実施形態１〜５０のいずれかに記載の方法。５２．生体サンプルは約１０４〜約１０７の無細胞核酸分子を含む、実施形態１〜５１のいずれかに記載の方法。５３．生体サンプルは３００ｐｇ未満の無細胞核酸分子を含む、実施形態１〜５２のいずれかに記載の方法。５４．生体サンプルは３ｎｇ未満の無細胞核酸分子を含む、実施形態１〜５３のいずれかに記載の方法。５５．９８％を超える精度で、正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程を含む、実施形態１〜５４のいずれかに記載の方法。５６．９９％を超える精度で、正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程を含む、実施形態１〜５５のいずれかに記載の方法。５７．被験体は妊娠している被験体であり、無細胞核酸分子は無細胞胎児核酸分子を含む、実施形態１〜１６のいずれかに記載の方法。５８．少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの数と少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの基準数を比較する工程を含む、実施形態１〜５７のいずれかに記載の方法。５９．上記基準数は、正倍数性の胎児を有する少なくとも１人の正倍数性の妊娠している被験体からの少なくとも１つのサンプルに基づく、実施形態５８に記載の方法。６０．上記基準数は、異数性の胎児を有する少なくとも１人の正倍数性の妊娠している被験体からの少なくとも１つのサンプルに基づく、実施形態５８に記載の方法。６１．少なくとも１つのサンプルは、生体サンプルと同じサンプルタイプおよび生体サンプルと同じサンプル量である、実施形態６０に記載の方法。６２．生体サンプルは約１０６〜約１０１２の全無細胞核酸分子を含���、ならびに、全無細胞核酸分子は、無細胞の胎児核酸分子および母体無細胞核酸分子から本質的になる、実施形態５７に記載の方法。６３．少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リード対少なくとも１つの非標的染色体領域に対応する配列決定リードの比率が、正倍数性の胎児を有する対照の妊娠している正倍数性の被験体からの対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と異なる場合、少なくとも１つの染色体領域の胎児異数性があることを検出する工程を含む、実施形態１〜６２のいずれかに記載の方法。６４．少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リード対少なくとも１つの非標的染色体領域に対応する配列決定リードの比率が、正倍数性の胎児を有する対照の妊娠している正倍数性の被験体からの対照生体サンプルにおけるそれぞれの比率と同じ場合、少なくとも１つの染色体領域の胎児異数性がないことを検出する工程を含む、実施形態１〜６３のいずれかに記載の方法。６５．少なくとも１つの染色体領域は、１３番染色体、１６番染色体、１８番染色体、２１番染色体、２２番染色体、Ｘ染色体、あるいはＹ染色体の少なくとも１つ上に位置する、実施形態６３または６４に記載の方法。６６．少なくとも１つの非標的染色体領域は、１３番染色体、１６番染色体、１８番染色体、２１番染色体、２２番染色体、Ｘ染色体、あるいはＹ染色体以外の染色体の少なくとも１つである、実施形態６４または６５に記載の方法。６７．妊娠している被験体は、わずか妊娠５週間目である、実施形態５７〜６６のいずれか１つに記載の方法。６８．妊娠している被験体は正倍数性である、実施形態５７に記載の方法。６９．生体サンプルは約１０４〜約１０９の無細胞の胎児核酸を含む、実施形態５７に記載の方法。７０．生体サンプルは約１０４〜約１０８の無細胞の胎児核酸を含む、実施形態５７に記載の方法。７１．少なくとも２０００の無細胞の胎児核酸を配列決定する工程を含む、実施形態５７に記載の方法。７２．少なくとも染色体領域に対応する少なくとも１０００の配列決定リードを測定する工程を含む、実施形態５８に記載の方法。７３．少なくとも１つの染色体領域の表現は、対照胎児を有する少なくとも１人の対照妊娠している被験体における対照表現に関
連する、実施形態５８に記載の方法。７４．少なくとも１人の対照の妊娠している被験体および対照胎児は異数性を有していない、実施形態７３に記載の方法。７４．少なくとも１人の対照の妊娠している被験体および対照胎児は遺伝的異常を有していない、実施形態７３に記載の方法。７５．少なくとも１人の対照の妊娠している被験体および対照胎児は染色体領域に対応する異数性を有する、実施形態７３に記載の方法。７６．少なくとも１人の対照妊娠している被験体および対照胎児は標的染色体領域に対応する遺伝的異常を有する、実施形態７３に記載の方法。７７．無細胞核酸は組織内の腫瘍由来の核酸を含む、実施形態１〜７６のいずれかに記載の方法。７８．少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの数と少なくとも１つの染色体領域に対応する配列決定リードの基準数を比較する工程を含む、実施形態７７に記載の方法。７９．基準数は、組織内に腫瘍がない被験体由来の少なくとも１つのサンプルに基づく、実施形態７８に記載の方法。８０．基準数は、組織内に腫瘍を有する被験体由来の少なくとも１つのサンプルに基づく、実施形態７８に記載の方法。８１．無細胞核酸は、被験体に移植臓器あるいは組織由来の核酸を含む、実施形態１〜８０のいずれかに記載の方法。８２．無細胞核酸は上記臓器または組織に特異的である、実施形態１〜８１のいずれかに記載の方法。８３．配列決定は全ゲノム配列決定を含む、実施形態１〜８２のいずれかに記載の方法。８４．配列決定はランダムな超並列配列決定を含む、実施形態１〜８３のいずれかに記載の方法。８５．配列決定は標的化配列決定を含む、実施形態１〜８４のいずれかに記載の方法。８６．配列決定はナノポア配列決定を含む、実施形態１〜８５のいずれかに記載の方法。８７．方法であって、上記方法は、被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、上記生体サンプルは最大約１０９の無細胞核酸分子を含有する、工程と；無細胞核酸分子の少なくとも一部の少なくとも１つの染色体領域上のエピジェネティック修飾を分析する工程と；少なくとも１つの染色体領域の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程とを含む、方法。８８．方法であって、上記方法は、被験体から毛細管血を得る工程と；無細胞核酸分子の少なくとも一部の少なくとも１つの染色体領域上のエピジェネティック修飾を分析する工程と；少なくとも１つの染色体領域の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程とを含む、方法。８９．２００μｌ以下の毛細管血を得る工程を含む、実施形態８８に記載の方法。９０．１００μｌ以下の毛細管血を得る工程を含む、実施形態８８に記載の方法。９１．方法であって、上記方法は、妊娠している被験体から生体サンプルを得る工程であって、ここで、上記生体サンプルは最大約１０９の無細胞の胎児核酸分子を含有する、工程と；タグ付けされた無細胞の胎児核酸分子を生成するために、無細胞の胎児核酸分子の少なくとも一部にタグ付けする工程と；タグ付けされた無細胞の胎児核酸分子の数を測定する工程と；少なくとも１つの染色体領域の正常表現、過剰表現、あるいは過少表現を検出する工程とを含む、方法。９２．生体サンプル中の個々の無細胞の胎児核酸分��にタグ付けする工程を含む、実施形態９１に記載の方法。９３．無細胞の胎児核酸分子の少なくとも一部にタグ付けする工程は、標的染色体領域からの無細胞の胎児核酸分子にタグ付けすることを含む、実施形態９１に記載の方法。９４．方法は配列決定を含まない、実施形態９１に記載の方法。９５．少なくとも１人の妊娠している被験体から複数の生体サンプルを得る工程であって、ここで、上記生体サンプルはそれぞれ、最大約１０９の無細胞の胎児核酸分子を含有する、工程と；各生体サンプルからの無細胞の胎児核酸分子を異なる指標で指標付けする工程であって、それにより、無細胞の胎児核酸分子のサンプル識別子を提供する、工程とを含む、実施形態９１に記載の方法。９６．標的染色体領域からの無細胞の胎児核酸分子にタグ付けする工程を含む、実施形態９１に記載の方法。９７．システムであって、上記システムは：被験体の液体サンプルを収集するように構成されるサンプルコレクターと；液体サンプルからサンプル成分を単離するように構成されるサンプルプロセッサーと；液体サンプルあるいはサンプル成分中の核酸を検出するように構成される核酸検出器と；核酸情報出力部と、を備える、システム。９８．サンプルコレクターは経皮穿刺デバイスを含む、実施形態９７に記載のシステム。９９．経皮穿刺デバイスは、針、ランセット、マイクロニードル、真空、およびマイクロニードルアレイの少なくとも１つを備える、実施形態９７に記載のシステム。１００．サンプル成分は、細胞、炭水化物、リン脂質、タンパク質、核酸、および微小胞から選択される、実施形態９７に記載のシステム。１０１．サンプル成分は血液細胞である、実施形態１００または１０１に記載のシステム。１０２．サンプル成分は無細胞核酸を含まない、実施形態９７に記載のシステム。１０３．サンプル成分は無細胞核酸を含む、実施形態９７に記載のシステム。１０４．サンプル成分は血漿または血清である、実施形態９７に記載のシステム。１０５．サンプル精製器は１ミリリットル未満の血液から血漿を単離させるように構成される、実施形態１０４に記載のシステム。１０６．サンプル精製器は２５０μｌ未満の血液から血漿を単離させるように構成される、実施形態１０５に記載のシステム。１０７．サンプル精製器は１５０μｌ未満の血液から血漿を単離させるように構成される、実施形態１０５に記載のシステム。１０８．サンプル精製器は１００μｌ未満の血液から血漿を単離させるように構成される、実施形態１０５に記載のシステム。１０９．核酸検出器は核酸シークエンサーを含む、実施形態９７に記載のシステム。１１０．システムは液体サンプル中の対象の核酸を標識するように構成され、核酸検出器は、サンプル中の対象核酸の表現を検出するためにラベルを数える計数システムを含む、実施形態９７に記載のシステム。１１１．ラベルを含み、ここで、上記ラベルは対象の核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１１０に記載のシステム。１１２．オリゴヌクレオチドは対象の染色体領域に特異的である、実施形態１１１に記載のシステム。１１３．対象の染色体領域は、１３番染色体、１６番染色体、１８番染色体、２１番染色体、２２番染色体、Ｘ染色体��およびＹ染色体から選択される染色体上に位置する、実施形態１１２に記載のシステム。１１４．対象の染色体領域は疾病または疾患を示す配列を含むか、あるいは含むことができる、実施形態１１２に記載のシステム。１１５．対象の染色体領域は疾病または疾患を示す少なくとも１つのエピジェネティック修飾を含むか、あるいは含むことができる、実施形態１１２に記載のシステム。１１６．疾病は遺伝的異常である、実施形態１１４または１１５に記載のシステム。１１７．疾患は癌である、実施形態１１４または１１５に記載のシステム。１１８．疾病は移植組織あるいは臓器である、実施形態１１４または１１５に記載のシステム。１１９．プライマー、ポリメラーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される、少なくとも１つの核酸増幅試薬を含む、実施形態９７に記載のシステム。１２０．少なくとも１つの核酸増幅試薬は、少なくとも１つの等温増幅試薬を含む、実施形態１１９に記載のシステム。１２１．少なくとも１つの等温増幅試薬は、レコンビナーゼポリメラーゼ、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質、鎖置換ポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１１９に記載のシステム。１２２．少なくとも１つの核酸増幅試薬および少なくとも１つのクラウディング剤を含む、実施形態９７〜１２１のいずれかに記載のシステム。１２３．少なくとも液体サンプルから無細胞核酸のライブラリを生成するための第１のラベルと、少なくとも１つの増幅試薬とを含む、実施形態９７に記載のシステム。１２４．少なくとも１つのアンプリコンを生成するために、無細胞核酸を少なくとも１つの増幅試薬で増幅し、および、ライブラリを生成するために、少なくとも１つのアンプリコンを少なくとも第１のラベルに接触させるように構成される、実施形態１２３に記載のシステム。１２５．システムは少なくとも１つのアンプリコンを第２のラベルと接触させるように構成され、ここで、第２のラベルは検出可能である、実施形態１２４に記載のシステム。１２６．システムは、ライブラリを生成し、かつライブラリの少なくとも１つのメンバーを少なくとも１つの増幅試薬で増幅するように構成される、実施形態９７に記載のシステム。１２７．核酸配列出力部は、無線通信装置、有線通信装置、ケーブルポート、および電子ディスプレイから選択される、実施形態９７に記載のシステム。１２８．システムの構成要素はすべて一つの場所に存在する、実施形態９７に記載のシステム。１２９．システムの構成要素はすべて一つのデバイス内に収容される、実施形態９７に記載のシステム。１３０．サンプルコレクターは第１の位置に配置され、サンプル精製器および核酸検出器の少なくとも１つは第２の位置に配置される、実施形態９７に記載のシステム。１３１．サンプルコレクターと、サンプル精製器および核酸検出器の少なくとも１つは同じ位置にある、実施形態９７に記載のシステム。１３２．サンプル精製器はフィルターを備えている、実施形態９７に記載のシステム。１３３．サンプル精製器は、フィルターを介して体液を押すか、あるいは引くためのウィッキング材料またはキャピラリーデバイスを備えている、実施形態９７に記載のシステム。１３４．フィルターの孔径は約０．０��〜約２ミクロンである、実施形態１４７に記載のシステム。１３５．サンプル精製器は、体液サンプル中の核酸、タンパク質、細胞表面マーカー、または微小胞表面マーカーに結合する、結合部分を含む、実施形態９７に記載のシステム。１３６．結合部分は、抗体、抗原結合性抗体フラグメント、リガンド、受容体、ペプチド、小分子、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１３５に記載のシステム。１３７．結合部分は、細胞外小胞に結合可能であり、細胞外小胞は、胎児の細胞または女性被験体の胎盤細胞から放出される、実施形態１３５に記載のシステム。１３８．結合部分は固体の支持体に結合し、ここで、結合部分が生体サンプルと接触した後、固体の支持体は生体サンプルの残りから分離され得るか、あるいは、生体サンプルは固の体支持体から分離され得る、実施形態１３５に記載のシステム。１３９．液体サンプルの少なくとも一部を輸送するか、あるいは保存するための輸送区画または保存区画を含む、実施形態９７に記載のシステム。１４０．輸送区画または保存区画は、吸収パッド、流体容器、サンプル防腐剤、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１３９に記載のシステム。１４１．輸送区画または保存区画は、輸送または保存のための液体サンプルの細胞を安定化させる試薬あるいは材料を含む、実施形態１３９に記載のシステム。１４２．デバイスまたはその構成要素を加熱あるいは冷却するための、容器、パウチ、ワイヤー、およびケーブルの少なくとも１つを含む、実施形態９７に記載のシステム。１４３．無細胞核酸の修復、精製、増幅、および配列決定の少なくとも１つを行うための少なくとも１つの緩衝液を含む、実施形態９７のシステム。１４５．被験体における腫瘍の存在を検出するための、実施形態９７に記載のシステムの使用。１４６．被験体における胎児の異数性を検出するための、実施形態９７に記載のシステムの使用。１４７．被験体における移植臓器の状態を検出するための、実施形態９７に記載のシステムの使用。
【実施例】
【０３６６】
以下の実施例は、本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットの様々な実施形態を例証する目的で与えられ、いかなる様式においても本デバイス、システム、およびキットを限定することを意味しない。本明細書に記載される方法とともに、本実施例は、好ましい実施形態の代表例であるかつ典型的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして意図されない。その中での変更、および、請求項の範囲によって定義される、本明細書に記載されるデバイス、システム、およびキットの趣旨内に包含される他の用途が当業者に想到される。
【０３６７】
実施例１：超微量（〜２０μｌ）の母体血液におけるトリソミー検出。
トリソミー検出は、他の染色体に由来する遺伝子材料と比較して、染色体に由来する遺伝子材料の正確な表現に依存する。この比率は正倍数性の集団における比率の分布と比較される。（（ｃｈｒ２１／ｃｈｒ．ａｌｌ）−ＭＥＤＩＡＮ（ｃｈｒ２１））／ＭＡＤ（ｃｈｒ２１）の比率がその分布と統計的に十分に異なる場合に、トリソミーと呼ばれる。
【０３６８】
１０％の胎児の画分が９週の妊娠期間以上の典型的な集団の中央値であるが、全てのサンプルが１０％と同じくらい高い胎児の画分レベルを有するわけではなく、サンプルの一部はさらに高いレベルを有する可能性がある。胎児の画分の典型的なカットオフは４％である。典型的な集団における胎児の画分の分布を考慮し、特異性（９９．９％）および感度（９９％）のより一般的なカットオフ値を必要とするモデルは、この方法のための入力必要条件を例示するのに役立ち得る。約５００万のマーカー数（配列リード）により、この感度は達成され得る。しかし、１つの染色体当たり１つのマーカーを解析する場合、これは３０，０００細胞当量を必要とし、実現可能でない。
【０３６９】
本明細書に開示される方法およびシステムは、アポトーシスのプロセスを通して各ゲノム当量が２０００万のｃｆＤＮＡフラグメントへと本質的に分割されるという事実に基づいている（１５０の塩基対平均サイズのｃｆＤＮＡで割られた１ゲノム当たり３０億の塩基対）。すべてのｃｆＤＮＡの単一分子が血液からシークエンサーに移される場合、解析のためには正倍数性のゲノムの四分の一と同等量で十分であることを意味する。
【０３７０】
しかし、実際に、プロセス中のすべて工程は様々な量のＤＮＡ損失によって損なわれる。したがって、はるかに多い量がサンプリングされ、ライブラリ生成および配列決定プロセスを介して移動する。ＤＮＡ欠損はプロセスのすべての工程で起こるが、典型的にはライブラリ調製の工程で最も多い欠損が起こる。従来の方法では、材料の８０％〜９０％の損失を示す。多くの場合、この欠損は続く増幅工程（一般的なＰＣＲ）によって補償され、ＤＮＡの濃縮を次世代シーケンシングに必要なレベルにする。増幅は、配列決定に利用可能な核酸材料全体を増やすには良い方法であるが、特定条件下では、増幅は、前の工程中に起こった情報の損失を補償することができない。情報の損失を理解するためには、単純な思考実験が役立ち得る。２０＊１０９のｃｆＤＮＡフラグメントを表す、１０００ゲノム当量で出発すると仮定する。莫大な欠損を仮定すると、２つのフラグメントのみが増幅に利用可能である：基準領域からの１つのフラグメントと標的領域からの１つのフラグメント。２つのフラグメントだけでは配列決定装置をロードするのに十分ではないが、増幅（ＰＣＲ）により、各々フラグメントは何十億回も容易にコピーすることができる。増幅後、十分な材料が配列決定プロセスを開始するために利用可能であるが、サンプル中の情報をそれらの２つのコピーに保持される情報に減らした。および、この場合には、両方のサンプル型は識別不能な５０％の画分を示すため、上記情報は、正倍数性およびトリソミーのサンプルの分類には不十分である。
【０３７１】
典型的な次世代シークエンサーのための仕様は、５μｌの４ｎＭ溶液を９９５μｌのＮａＯＨ中で希釈して、２０ｐＭの溶液を生成し、そのうち６００μｌがシークエンサーにロードされることを必要とする。それゆえ、２０００万の配列決定数を作成するために、１．２＊１０１０のＤＮＡフラグメントの合計が必要である。上に示されるように、４つのサンプルには２０００万の数で十分であり、したがって、各サンプルは〜３＊１０９のＤＮＡフラグメントに寄与しなければならない。（各ゲノム当量が２０００万のＤＮＡフラグメントに寄与するので、欠損および増幅が起こらない場合には、合計１５０ゲノム当量が必要である。）これは図６に概説される。
【０３７２】
典型的なＮＩＰＴプロトコルは、大量のｃｆＤＮＡ（６０００ゲノム当量）で出発し、これは、ライブラリ調製中に大量の欠損を可能にする。その後、材料を増幅し、配列決定に適するように高度に希釈する。典型的なＮＩＰＴプロトコルの問題は、ライブラリ調製中の大量の欠損が、その後高度に希釈され、染色体に由来する遺伝子材料の不正確な表現をもたらすことである。
【０３７３】
例えば、典型的なサンプルは、１ｍｌの血漿中１５００ゲノム当量のｃｆＤＮＡを含んでいる。８〜１０ｍｌの血液の定期的な採血により約４ｍｌの血漿を得て、利用可能な６０００ゲノム当量のｃｆＤＮＡを結果として得た。ＤＮＡ抽出効率（９０％）およびライブラリ調製効率（１０％）の典型的な数値を仮定すると、約５４０ゲノム当量が増幅（典型的には、８〜１０サイクル、本実施例の場合は１０００倍の増幅）に移る。増幅後、合計５４００００ゲノム当量または１．０８＊１０１３のＤＮＡフラグメントが配列決定に利用可能である。１０００倍を超える希釈を行い、増幅されたライブラリを必要な４ｎＭに調整する。表１を参照する。
【０３７４】
【表１】
2021500883.tif 000003
【０３７５】
このデータは、非常に多いＤＮＡフラグメントがプロセスにおいて作成されるために、反応を単純にスケールダウンして、１００μｌ未満の血液量に対応することができることを誤って示唆する可能性がある。しかし、情報には前記欠損があるために、これは可能ではない。表２を参照する。ＤＮＡ抽出（効率９０％）およびライブラリ調製（効率１０％）ならびにＰＣＲ増幅（〜１０サイクル）中の欠損を考慮した、胎児の画分（４％）の下限でシミュレーションを実行すると、感度が入力ＤＮＡ材料の２５以下（１０の屈曲点）のコピーに低下することを示す。１０のコピーの感度は８９％に低下し、５のコピーの感度は８１％に低下し、この両方の値は、４％の胎児の画分に対して〜９５％のサンプルの理論感度を必要とする市場では受け入れられない。図７を参照する。
【０３７６】
【表２】
2021500883.tif 000004
【０３７７】
これに対して、本開示は、ライブラリ調製効率を増大させ、ライブラリ調製中の大量の損失を防ぎ、過剰増幅および高希釈の必要性を除去する方法、システム、およびデバイスを提供する。したがって、本開示は、染色体に由来する遺伝子材料の正確な表現を維持することにより、典型的なＮＩＰＴプロトコルに関連する問題を解決する。本実施形態による、ライブラリ効率の増大および増幅の減少（例えば、クラウディング剤、末端修復（ｅｎｄ−ｒｅｐａｉｒ）を用いた）は、より多くの保存される遺伝子情報と、５未満のコピー数（ゲノム当量）での９５％以上の感度を結果としてもたらす。表３および図７を参照する。
【０３７８】
【表３】
2021500883.tif 000005
【０３７９】
実施例２．超微量のｃｃｆＤＮＡの入力量の（１−２０ゲノム当量）を使用する、ローカバレッジの全ゲノムの合成による配列決定の実行可能性
静脈穿刺により男性全血（１０ｍｌ）をＳｔｒｅｃｋ無細胞ＤＮＡ  ＢＣＴへと集めて、ダブルスピン遠心分離によって血漿を以下のように処理した：
スピン１−１３３０ｒｐｍで２０分間  
スピン２−３３００ｒｐｍで１０分間
【０３８０】
血漿を使用するまで４°Ｃまたは−８０°Ｃで保存した。Ｑｉａｇｅｎ循環核酸抽出キットの４ｍｌのプロトコルを、５５μｌのＥＢにおいて溶出する製造者のプロトコル従って使用して、循環無細胞ＤＮＡを血漿から抽出した。Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏの６リアルタイム器機上でＳＲＹ／リボヌクレアーゼＰ  Ｔａｑｍａｎ  ｂｉｐｌｅｘ  ｑＰＣＲアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、各サンプルのゲノム当量を決定した。ＤＮＡライブラリは、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｎｄｅｘ  Ｓｅｔ  Ｐｒｉｍｅｒｓ１）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＤＮＡライブラリ調整キットを使用して調製した。ライブラリ調製のための鋳型ｃｃｆＤＮＡを、１つのライブラリ当たり９６ＧＥから１ＧＥまで、１：５に滴定した。より少ない鋳型量の化学量論を説明するために、減少した量を使用してライブラリを生成した。使用する量は鋳型の入力量に依存した。ライブラリ調製は以下からなった：
１．末端修復、２０°Ｃで３０分間のインキュベーションと、その後の６５°Ｃで３０分間のインキュベーションを伴う、５’−リン酸化およびＡテーリング。
２．２０°Ｃで１５分間のインキュベーションを伴うアダプターライゲーション、その後の３７°Ｃで１５分間のインキュベーションを伴う連結されたアダプターループの切断。アダプターを１：２５に希釈し、０．６μＭの作用濃度にした。その後、切断されたアダプター連結ライブラリは、ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔビーズを使用したビーズベースの精製を受けた。アダプターライゲーション後、高度に断片化された低濃度のｃｃｆＤＮＡの結合をさらに強化するために、ビーズの量を１１６μｌに増加した。
３．９８°Ｃで１分間の初期変性と、その後の９８°Ｃで１０秒間の変性の１３サイクルとを伴うライブラリ増幅／指標付け、および６５°Ｃで５分間の最終伸長を伴う６５°Ｃで７５秒間のアニーリング／伸長。その後、増幅されたライブラリを、ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔビーズ（４５μｌ）を使用して精製した。
【０３８１】
高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００を使用して、全てのライブラリをサイズ分類し、特徴づけた。配列決定前にライブラリ希釈のためのキュービットｖ３．０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、濃度を決定した。各ライブラリを２ｎＭの濃度に正規化し、配列決定前に変性および希釈のためにプールした。１．５ｐＭの負荷濃度でＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５５０を使用して、合成による配列決定を実施した。７５サイクルのペアエンド配列決定（２ｘ７５）を各指標／サンプルについて実施した。一般に、各サンプルは、各方向におよそ４００万の通過フィルターリード（ｐａｓｓｅｄ−ｆｉｌｔｅｒ  ｒｅａｄｓ）を生成した。アライメントパラメータ“−ｋ  −１ｎ  ０”を用いたＢｏｗｔｉｅを使用して、全ての配列決定データ（ｆａｓｔａ．ｇｚファイル）をヒト参照ゲノムビルドｈｇ３８に対してアライメントした。さらなる解析のために、ヒトゲノムを、５０ｋｂのビンとも呼ばれる、連続する５０，０００の塩基対領域に分割し、および塩基「Ｇ」および「Ｃ」の画分を、各ビンについて最大小数点以下３桁の精度で算出した。各ビンについて、ビンにおいて始まるアライメントされた配列リードを計数した。さらなる解析のために、１番染色体〜２２番染色体上にないビンを除去することによって、データを減らした（例えば、Ｘ染色体およびＹ染色体を除外した）。このフィルタリング後、ＧＣ含有量と１つのビン当たりのリード数との間のＬｏｅｓｓ回帰を実行し、ビン数の中央値を算出した。Ｌｏｅｓｓ回帰は、期待値と呼ばれる、各ＧＣ含有値について予想されるビン数をもたらした。この期待値をビン数の中央値で割ることで補正係数を得た。その後、測定されたビン数を補正係数で割ることによりＧＣ補正ビン数を得て、ＧＣ補正ビン数の中央値を算出した。全ての５０ｋｂのビンをＧＣ補正ビン数の中央値で割ることによりＧＣ正規化ビンを得て、および、各ビンの中央値および中央絶対偏差（ＭＡＤ）を算出した。低いＭＡＤおよび期待値が約１の中央値を有するビンを選択した（ＭＡＤ＞＝０．２５、または中央値＜０．７、または中央値＞１．３を有するビンを除去した）。
【０３８２】
ライブラリの電気泳動図はｃｃｆＤＮＡ入力の量の減少から生成され、全ライブラリ生成物が入力とともに減少することを示したが、アダプターダイマーの量は大幅に増大しない。図８Ａ−図８Ｃを参照する。Ｙ軸は相対蛍光単位（強度）を示し、Ｘ軸は秒単位の時間を示す。７０秒の主要なピークは、所望の３００ｂｐのライブラリ生成物である。図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｃでは、入力ゲノム当量は２０ＧＥから１：５で滴定される。はるかに高い鋳型入力を有する他の正倍数性のサンプルと比較して、１ＧＥまでの入力は、容認可能な配列決定メトリックで実行可能な合成による配列決定のために十分なライブラリを生成した。
【０３８３】
実施例３．毛細管血から単離された超微量のｃｃｆＤＮＡの入力量（１０ゲノム当量）を用いた、ローカバレッジの全ゲノムの合成による配列決定を使用する、低い画分のＹ染色体（２．５％以上）の検出
接触活性化ランセット（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）を用いた指尖毛細血管床穿刺によって、女性または男性の全血を集め、ＳＡＦＥ−Ｔ＿ＦＩＬＬのキャピラリー収集デバイス（ＫＡＢＥ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ＧＭＢＨ）へと血液を集めた。以下のようにダブルスピンの遠心分離によって毛細管血を血漿に処理した：
スピン１−１３３０ｒｐｍで２０分間  
スピン２−３３００ｒｐｍで１０分間
【０３８４】
血漿を使用するまで４°Ｃで保存した。男性の血漿を、２．５−２０容量％の様々なパーセンテージで女性の血漿にスパイクした。その後、ＭａｇＭａｘ無細胞ＤＮＡ単離キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた１０ｕｌの血漿の修正されたプロトコルを使用して、循環無細胞ＤＮＡを血漿から抽出した。単離は以下の工程からなった：
１．６０°Ｃで２０分間のプロテイナーゼＫ（開始入力に応じた量）での血漿のインキュベーション。
２．室温で１０分間の結合を伴う、ＤｙｎａＢｅａｄｓのＭｙＯｎｅ  Ｓｉｌａｎｅ常磁性ビーズ（２．５−５ｕｌ）への血漿の溶解／結合。
３．ビーズ／ｃｃｆＤＮＡ複合体（開始入力に応じた量）の洗浄。
４．８０％のエタノール（開始入力に応じた量）でのビーズ／ｃｃｆＤＮＡ複合体のすすぎ。
５．室温で２分間のインキュベーションを伴う、ビーズ（開始入力に応じた量）からのｃｃｆＤＮＡの溶出。
【０３８５】
１０μｌ−４０００μｌの量での先の抽出および公開されたデータに基づいて、各サンプルのゲノム当量を１ＧＥ／μｌの血漿であると推測した。溶出したｃｃｆＤＮＡはすべて、ライブラリ生成のための入力として使用した。ＤＮＡライブラリは、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｎｄｅｘ  Ｓｅｔ  Ｐｒｉｍｅｒｓ１）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＤＮＡライブラリ調整キットを使用して調製した。より少ない鋳型量の化学量論を説明するために、減少した量を使用してライブラリを生成した。使用する量は鋳型の入力量に依存した。ライブラリ調製は以下からなった：
１．末端修復、２０°Ｃで３０分間のインキュベーションと、その後の６５°Ｃで３０分間のインキュベーションを伴う、５’−リン酸化およびＡテーリング。
２．２０°Ｃで１５分間のインキュベーションを伴うアダプターライゲーションと、その後の３７°Ｃで１５分間のインキュベーションを伴う連結されたアダプターループの切断。アダプターを１：２５に希釈し、０．６μＭの作用濃度にした。その後、切断されたアダプター連結ライブラリは、ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔビーズを使用したビーズベースの精製を受けた。アダプターライゲーション後、高度に断片化された低濃度のｃｃｆＤＮＡの結合をさらに強化するために、ビーズの量を１１６μｌに増加した。
３．９８°Ｃで１分間の初期変性、その後の９８°Ｃで１０秒間の変性の１３サイクルを伴うライブラリ増幅／指標付け、および６５°Ｃで５分間の最終伸長を伴う６５°Ｃで７５秒間のアニーリング／伸長。その後、増幅されたライブラリを、ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔビーズ（４５μｌ）を使用して精製した。
【０３８６】
高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００を使用して、全てのライブラリをサイズ分類し、特徴づけた。配列決定前にライブラリ希釈のためのキュービットｖ３．０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、濃度を決定した。各ライブラリを２ｎＭの濃度に正規化し、配列決定前に変性および希釈のためにプールした。１．５ｐＭの負荷濃度でＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５５０を使用して、合成による配列決定を実施した。７５サイクルのペアエンド配列決定（２ｘ７５）を各指標／サンプルについて実施した。一般に、各サンプルは、およそ４００万の通過フィルターリードを生成した。アライメントパラメータ“−ｋ  −１ｎ  ０”を用いたＢｏｗｔｉｅを使用して、全ての配列決定データ（ｆａｓｔａ．ｇｚファイル）をヒト参照ゲノムビルドｈｇ３８に対してアライメントした。さらなる解析のために、ヒトゲノムを、５０ｋｂのビンとも呼ばれる、連続する５０，０００の塩基対領域に分割し、および塩基「Ｇ」および「Ｃ」の画分を、各ビンについて最大小数点以下３桁の精度で算出した。各ビンについて、ビンにおいて始まるアライメントされた配列リードを算出した。さらなる解析のために、１番染色体〜２２番染色体上にないビンを除去することによって、データを減らした（例えば、Ｘ染色体およびＹ染色体を除外した）。この除去後、ＧＣ含有量と１つのビン当たりのリード数との間のＬｏｅｓｓ回帰を実行し、ビン数の中央値を算出した。Ｌｏｅｓｓ回帰は、期待値と呼ばれる、各ＧＣ含有値について予想されるビン数を提供した。この期待値をビン数の中央値で割って、補正係数を得た。その後、測定されたビン数を補正係数で割ることによりＧＣ補正ビン数を得て、ＧＣ補正ビン数の中央値を算出した。全ての５０ｋｂのビンをＧＣ補正ビン数の中央値で割ることによりＧＣ正規化ビンを得て、および、各ビンの中央値および中央絶対偏差（ＭＡＤ）を算出した。低いＭＡＤおよび期待値が約１の中央値を有するビンを選択した（ＭＡＤ＞＝０．２５、または中央値＜０．７、または中央値＞１．３を有するビンを除去した）。特に、Ｙ染色体表現の算出のために、Ｙ染色体に由来するビンについてＬＯＥＳＳ回帰を実行した。図１０および図１１を参照する。図１０は、女性および男性のＤＮＡの毛細管血／血漿の混合物から単離された超微量のｃｆＤＮＡの入力量を用いた、ローカバレッジの全ゲノムの合成による配列決定を使用した、低い画分のＹ染色体（２．５％以上）の検出を示す。指穿刺によって集められた毛細管血に由来する女性／男性の血漿の混合物中の超微量のｃｆＤＮＡにより、男性の毛細管血由来の血漿の増加に伴い、Ｙ染色体の表現が対応して増加する。図１１は、ペアエンド配列決定データに基づく、毛細管血および静脈血からのｃｆＤＮＡ間のｃｆＤＮＡフラグメントサイズ分布比較を示す。静脈血と毛細管血に由来する超微量の血漿からのｃｆＤＮＡのサイズプロファイルは、同じように見える。Ｙ染色体に由来する配列リードのパーセンテージ表現は、Ｙ染色体に由来するビンのすべてのＧＣ正規化値を合計し、２１番染色体および１９番染色体に由来するも��を除いたすべてのＧＣの正規化値を割ることによって計算した。
【０３８７】
実施例４．超微量のｃｃｆＤＮＡ（１０ゲノム当量）を用いたローカバレッジの全ゲノムの合成による配列決定を使用する、低い画分のＹ染色体（２．５％以上）の検出
静脈穿刺により女性または男性の全血（１０ｍｌ）をＳｔｒｅｃｋ無細胞ＤＮＡ  ＢＣＴへと集めて、ダブルスピン遠心分離によって血漿を以下のように処理した：
スピン１−１３３０ｒｐｍで２０分間  
スピン２−３３００ｒｐｍで１０分間
【０３８８】
血漿を使用するまで４°Ｃで保存した。男性の血漿を、２．５−２０容量％の様々なパーセンテージで女性の血漿にスパイクした。その後、ＭａｇＭａｘ無細胞ＤＮＡ単離キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた、１０μｌまたは２０μｌの血漿の修正されたプロトコルを使用して、循環無細胞ＤＮＡを血漿から抽出した。単離は以下の工程からなった：
６．２０分間の６０°ＣのプロテイナーゼＫ（開始入力に応じた量）での血漿のインキュベーション。
７．室温で１０分間の結合を伴う、ＤｙｎａＢｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｉｌａｎｅ常磁性ビーズ（２．５−５μｌ）への血漿の溶解／結合。
８．ビーズ／ｃｃｆＤＮＡ複合体（開始入力に応じた量）の洗浄。
９．８０％のエタノール（開始入力に応じた量）でのビーズ／ｃｃｆＤＮＡ複合体のすすぎ。
１０．室温で２分間のインキュベーションを伴う、ビーズ（開始入力に応じた量）からのｃｃｆＤＮＡの溶出。
【０３８９】
各サンプルのゲノム当量は、１０ｕｌ−４０００ｕｌの量での先の抽出および公開されたデータに基づいて、１ＧＥ／ｕｌの血漿であると推測された。溶出したｃｃｆＤＮＡはすべて、ライブラリ生成のための入力として使用した。ＤＮＡライブラリは、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｎｄｅｘ  Ｓｅｔ  Ｐｒｉｍｅｒｓ１）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＤＮＡライブラリ調整キットを使用して調製した。より少ない鋳型量の化学量論を説明するために、減少した量を使用してライブラリを生成した。使用される量は鋳型の入力量に依存した。ライブラリ調製は以下からなった：
４．末端修復、２０°Ｃで３０分間のインキュベーションと、その後の６５°Ｃで３０分間のインキュベーションを伴う、５’−リン酸化およびＡテーリング。
５．２０°Ｃで１５分間のインキュベーションを伴うアダプターライゲーションと、その後の３７°Ｃで１５分間のインキュベーションを伴う連結されたアダプターループの切断。アダプターを１：２５に希釈し、０．６ｕＭの作用濃度にした。その後、切断されたアダプター連結ライブラリは、ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔビーズを使用したビーズベースの精製を受けた。アダプターライゲーション後、高度に断片化された低濃度のｃｃｆＤＮＡの結合をさらに強化するために、ビーズの量を１１６μｌに増加した。
６．９８°Ｃで１分間の初期変性、その後の９８°Ｃで１０秒間の変性の１３サイクルを伴うライブラリ増幅／指標付け、および６５°Ｃで５分間の最終伸長を伴う６５°Ｃで７５秒間のアニーリング／伸長。その後、増幅されたライブラリを、ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔビーズ（４５μｌ）を使用して精製した。
【０３９０】
高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００を使用して、全てのライブラリをサイズ分類し、特徴づけた。配列決定前にライブラリ希釈のためのキュービットｖ３．０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、濃度を決定した。各ライブラリを２ｎＭの濃度に正規化し、配列決定前に変性および希釈のためにプールした。１．５ｐＭの負荷濃度でＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５５０を使用して、合成による配列決定を実施した。７５サイクルペアエンド配列決定（２ｘ７５）を各指標／サンプルについて実施した。一般に、各サンプルは、およそ４００万の通過フィルターリードを生成した。アライメントパラメータ“−ｋ  −１ｎ  ０”を用いたＢｏｗｔｉｅを使用して、全ての配列決定データ（ｆａｓｔａ．ｇｚファイル）をヒト参照ゲノムビルドｈｇ３８に対してアライメントした。さらなる解析のために、ヒトゲノムを、５０ｋｂのビンとも呼ばれる、連続する５０，０００の塩基対領域に分割し、および塩基「Ｇ」および「Ｃ」の画分を、各ビンについて最大小数点以下３桁の精度で算出した。各ビンについて、ビンにおいて始まるアライメントされた配列リードを計数した。さらなる解析のために、１番染色体〜２２番染色体上にないビンを除去することによって、データを減らした（例えば、Ｘ染色体およびＹ染色体を除外した）。このフィルタリング後、１つのビン当たりのＧＣ含有量とリード数との間のＬｏｅｓｓ回帰を実行し、中央値のビン数を算出した。Ｌｏｅｓｓ回帰により、期待値と呼ばれる、各ＧＣ含有値についての予想されるビン数を得た。この期待値を中央値のビン数で割って、補正係数を得た。その後、測定されたビン数を補正係数で割ることによりＧＣ補正ビン数を得て、ＧＣ補正ビン数の中央値を算出した。全ての５０ｋｂのビンをＧＣ補正ビン数の中央値で割ることによりＧＣ正規化ビンを得て、および、各ビンについて中央値および中央絶対偏差（ＭＡＤ）を算出した。低いＭＡＤおよび期待値が約１の中央値を有するビンを選択した（ＭＡＤ＞＝０．２５、または中央値＜０．７、または中央値＞１．３を有するビンを除去した）。
【０３９１】
特に、Ｙ染色体表現の計算のために、Ｙ染色体に由来するビンについてＬＯＥＳＳ回帰も実行した。Ｙ染色体に由来する配列リードのパーセンテージ表現は、Ｙ染色体に由来するビンのすべてのＧＣ正規化値を合計し、２１番染色体および１９番染色体に由来するものを除いたすべてのＧＣの正規化値を割ることによって計算した。図９を参照する。図９は、静脈血から単離された超微量のｃｆＤＮＡ（１０ゲノム当量）を用いたローカバレッジの全ゲノムの合成による配列決定を使用した、低い画分のＹ染色体（２．５％以上）の検出を示す。男性の血漿を一定量の女性の血漿に混合して、女性／男性の血漿の混合物を作成した。ｃｆＤＮＡを血漿混合物から抽出して、配列決定した。Ｙ染色体の表現は女性の血漿に混合された男性の血漿の量の増加に伴う、Ｙ染色体の表現の対応する増加が、依然として、超微量のｃｆＤＮＡの入力量から正確に検出可能であることを示すと判定された。
【０３９２】
実施例５．超微量のｃｃｆＤＮＡの入力量（１０ゲノム当量）を用いたローカバレッジの全ゲノムの合成による配列決定を使用する、胎児の染色体の異数性の検出
静脈穿刺により全血（１０ｍｌ）をＳｔｒｅｃｋ無細胞ＤＮＡ  ＢＣＴへと集めて、ダブルスピン遠心分離によって血漿を以下のように処理した：血漿を新鮮に処理し、使用するまで４°Ｃまたは−８０°Ｃで保存した。その後、常磁性ビーズを用いた１．２ｍｌの血漿のための修正されたプロトコルを使用して、循環無細胞ＤＮＡを血漿から抽出した。単離は以下の工程から成った：
１．溶解／結合のための、プロテイナーゼＫ、グリコゲン、および溶解緩衝液およびビーズを用いた室温で２０分間の血漿のインキュベーション。
２．ビーズ／ｃｃｆＤＮＡ複合体の洗浄。
３．５５°Ｃの温度で１０分間のインキュベーションを伴う、ビーズ（４２μｌ）からのｃｃｆＤＮＡの溶出。
【０３９３】
抽出されたＤＮＡを、上流アプリケーションのために定量化した。全てのサンプルを１つのライブラリ当たりの３３ｐｇ（１０ＧＥｓ）の総入力へと正規化した。ＤＮＡライブラリは、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｎｄｅｘ  Ｓｅｔ  Ｐｒｉｍｅｒｓ１）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＤＮＡライブラリ調整キットを使用して調製した。より少ない鋳型量の化学量論を説明するために、減少した量を使用してライブラリを生成した。使用される量は鋳型の入力量に依存した。ライブラリ調製は以下からなった：
１．末端修復、２０°Ｃで３０分間のインキュベーションと、その後の６５°Ｃで３０分間のインキュベーションを伴う、５’−リン酸化およびＡテーリング。
２．２０°Ｃで１５分間のインキュベーションを伴うアダプターライゲーションと、その後の３７°Ｃで１５分間のインキュベーションを伴う連結されたアダプターループの切断。アダプターを１：２５に希釈し、０．６ｕＭの作用濃度にした。その後、切断されたアダプター連結ライブラリは、ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔビーズを使用したビーズベースの精製を受けた。アダプターライゲーション後、高度に断片化された低濃度のｃｃｆＤＮＡの結合をさらに強化するために、ビーズの量を１１６μｌに増加した。
３．９８°Ｃで１分間の初期変性、その後の９８°Ｃで１０秒間の変性の１３サイクルを伴うライブラリ増幅／指標付け、および６５°Ｃで５分間の最終伸長を伴う６５°Ｃで７５秒間のアニーリング／伸長。その後、増幅されたライブラリを、ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔビーズ（４５μｌ）を使用して精製した。
【０３９４】
高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００を使用して、全てのライブラリをサイズ分類し、特徴づけた。配列決定前にライブラリ希釈のためのキュービットｖ３．０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、濃度を決定した。各ライブラリを２ｎＭの濃度に正規化し、配列決定前に変性および希釈のためにプールした。１．５ｐＭの負荷濃度でＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５５０を使用して、合成による配列決定を実施した。７５サイクルペアエンド配列決定（２ｘ７５）を各指標／サンプルについて実施した。一般的に、各サンプルは、およそ４００万の通過フィルターリードを生成した。アライメントパラメータ“−ｋ  −１ｎ  ０”を用いたＢｏｗｔｉｅを使用して、全ての配列決定データ（ｆａｓｔａ．ｇｚファイル）をヒト参照ゲノムビルドｈｇ３８に対してアライメントした。さらなる解析のために、ヒトゲノムを、５０ｋｂのビンとも呼ばれる、連続する５０，０００の塩基対領域に分割し、および塩基「Ｇ」および「Ｃ」の画分を、各ビンについて最大小数点以下３桁の精度で算出した。各ビンについて、ビンにおいて始まるアライメントされた配列リードを計数した。さらなる解析のために、１番染色体〜２２番染色体上にないビンを除去することによって、データを減らした（例えば、Ｘ染色体およびＹ染色体を除外した）。このフィルタリング後、１つのビン当たりのＧＣ含有量とリード数との間のＬｏｅｓｓ回帰を実行し、ビン数の中央値を算出した。Ｌｏｅｓｓ回帰により、期待値と呼ばれる、各ＧＣ含有値について予想されるビン数を得た。この期待値を中央値のビン数で割って補正係数を得た。その後、測定されたビン数を補正係数で割ることによりＧＣ補正ビン数を得て、ＧＣ補正ビン数の中央値を算出した。全ての５０ｋｂのビンをＧＣ補正ビン数の中央値で割ることでＧＣ正規化ビンを得て、および、各ビンの中央値および中央絶対偏差（ＭＡＤ）を算出した。低いＭＡＤおよび期待値が約１の中央値を有するビンを選択した（ＭＡＤ＞＝０．２５、または中央値＜０．７、または中央値＞１．３を有するビンを除去した）。
【０３９５】
減少したおよび正規化されたデータから、２１番染色体に由来する全ての配列ビンを同定した。２１番染色体に由来する全てのＧＣ正規化値を合計し、その合計を、２１番染色体および１９番染色体（ならびに、先の工程で既に除外された他の染色体、例えば、ＸおよびＹ、１−２２とは別の染色体）に由来するビンのＧＣ正規化値を除いた全てのＧＣ正規化値の合計で割ることによって、２１番染色体に由来する配列リードのパーセンテージ表現を算出した。その後、２１番染色体の表現の中央値およびＭＡＤを、既知の正倍数性のサンプル（基準サンプル）のセットから算出した。各サンプルについて、中央値の２１番染色体の表現を、サンプル特異的な２１番染色体の表現から差し引いて、サンプル特異的差を得た。このサンプル特異的差を２１番染色体の表現ＭＡＤで割ることで、Ｚ−スコアと呼ばれる値を得た。その後、試験サンプルをそれらのＺ−スコアに基づいて分類し、３およびそれ以上のＺ−スコアを有するサンプルをトリソミーとして分類し、３未満のＺ−スコアを有するサンプルを正倍数体として分類した。図１２を参照する。使用される基準サンプルセットは、全体で３６の配列決定の結果からなっていた。２０は１人の男性個体から得られた。ライブラリを、様々な量の超微量の循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の入力量で生成した：２つの配列決定ライブラリが、１ゲノム当量（ＧＥ）のｃｆＤＮＡの入力量（〜３．５ｐｇのｃｆＤＮＡ）から生成された；２つの配列決定ライブラリが４ＧＥのｃｆＤＮＡ（〜１４ｐｇのｃｆＤＮＡ）から生成された；４つの配列決定ライブラリが１０ＧＥのｃｆＤＮＡ（〜３５ｐｇｃｆＤＮＡ）から生成された；２つの配列決定ライブラリが１９ＧＥのｃｆＤＮＡから生成された；３つの配列決定ライブラリが２５ＧＥのｃｆＤＮＡから生成された；３つの配列決定ライブラリが５０ＧＥのｃｆＤＮＡから生成された；１つの配列決定ライブラリが９６ＧＥのｃｆＤＮＡから生成された；２つの配列決定ライブラリが１００ＧＥのｃｆＤＮＡから生成された；１つの配列決定ライブラリが２０００ＧＥのｃｆＤＮＡから生成された。
【０３９６】
データを解析し、基準サンプルに依存しない方法を確立して、妊婦の血液からの超微量の循環無細胞ＤＮＡの入力からの胎児トリソミー（ｆｅｔａｌ  ｔｒｉｓｏｍｙ）の存在を判定した。アライメントパラメータ“−ｋ  −１ｎ  ０”を用いたＢｏｗｔｉｅを使用して、全ての配列決定データ（ｆａｓｔａ．ｇｚファイル）をヒト参照ゲノムビルドｈｇ３８に対してアライメントした。さらなる解析のために、ヒトゲノムを、５０ｋｂのビンとも呼ばれる、連続する５０，０００の塩基対領域に分割し、および塩基「Ｇ」および「Ｃ」の画分を、各ビンについて最大小数点以下３桁の精度で算出した。各ビンについて、ビンにおいて始まるアライメントされた配列リードを計数した。
【０３９７】
さらなる解析のために、１番染色体〜２２番染色体上にないビンを除去することによって、データを減らした（例えば、Ｘ染色体およびＹ染色体を除外した）。このフィルタリング後、ＧＣ含有量と１つのビン当たりのリード数との間のＬｏｅｓｓ回帰を実行し、ビン数の中央値を算出した。Ｌｏｅｓｓ回帰により、期待値と呼ばれる、各ＧＣ含有値について予想されるビン数を得た。この期待値をビン数の中央値で割って補正係数を得た。その後、測定されたビン数を補正係数で割ることによりＧＣ補正ビン数を得て、ＧＣ補正ビン数の中央値を算出した。
【０３９８】
全ての５０ｋｂのビンをＧＣ補正ビン数の中央値で割ることによりＧＣ正規化ビンを得て、および、各ビンについて中央値および中央絶対偏差（ＭＡＤ）を算出した。低いＭＡＤおよび期待値が約１の中央値を有するビンを選択した（ＭＡＤ＞＝０．２５、または中央値＜０．７、または中央値＞１．３を有するビンを除去した）。
【０３９９】
各試験サンプルについて、潜在的な染色体異常（例えば、トリソミー）を検出するために、１つの染色体に由来する全てのビンを選択し、補正係数を差し引いた。この解析に使用される特定の補正値は以下の通りであった：Ｃｈｒ１  ０．０１８２４６８９１、Ｃｈｒ２  ０．０２０４３４１８５、Ｃｈｒ３  ０．０１１９８２３５３、Ｃｈｒ４  ０．００１０４９６８６、Ｃｈｒ５  ０．０２０５８１１５０、Ｃｈｒ６  ０．００９１５２０７５、Ｃｈｒ７  ０．００５６７７２６１、Ｃｈｒ８  ０．０２２７５４３９９、Ｃｈｒ９  ０．０１５０５９１１９、Ｃｈｒ１０  ０．０２１１８８７５３、Ｃｈｒ１１  ０．０１７１４３９６４、  Ｃｈｒ１２  ０．００７０６９２０２、Ｃｈｒ１３  ０．００２１５７４７１、Ｃｈｒ１４  ０．０１０３５６８９２、Ｃｈｒ１５  ０．０１９０３７５７３、Ｃｈｒ１６  ０．００９９２９２３９、Ｃｈｒ１７  ０．００４９９０３５９、Ｃｈｒ１８  ０．０２３１７７４８６、Ｃｈｒ１９  −０．０６３９９８３６８、Ｃｈｒ２０  ０．０４２３３５５１６、Ｃｈｒ２１  ０．００４９８７８２、Ｃｈｒ２２  ０．０２５００８５５３。
【０４００】
その後、このフィルタリングされたセット中の２１番染色体に由来するビンの数を計数し（このデータセットにおいて６５７）、その後、それらが様々な異なる染色体から始まるビンを含んでいるように、同じ量のビン（６５７）を全ての入手可能なビンから無作為に選択した。その後、パーセンテージ表現を、このセットの無作為に選択されたビンについて算出した。このセットの無作為に選択されたビンについて、全てのＧＣ正規化値を合計し、全てのＧＣ正規化値の合計で割った。最後の工程を１万回繰り返し、各値を保存した。その後、２１番染色体に由来する配列リードのパーセンテージ表現は、２１番染色体に由来するビンの全てのＧＣ正規化値を合計し、全てのＧＣ正規化値の合計で割ることによって算出した。２１番染色体に由来するビンのパーセンテージ表現が、選択されたビンの１万の繰り返しからの染色体表現より何倍高いかを算出した。図１３を参照する。１０，０００で割られた合計は、本明細書において「百分位数」と呼ばれ、０と１との間の値である。サンプルをその百分位数値に基づいて分類した：１万の値（百分位数１）は、サンプルをトリソミーとして分類し、１万未満の値（１未満の百分位数）はサンプルを正倍数体として分類する。
【０４０１】
実施例６．在宅非侵襲性出生前検査
流産歴のある妊婦は、彼女が再び妊娠していて、恐らく妊娠約６週目であると疑っている。彼女は本当に妊娠しているのか、および、胎児にリスクをもたらす遺伝的異常があるのか否かをできるだけ早く知りたい。彼女は、本明細書に開示される非侵襲性出生前検査デバイスを購入し、家へと持ち帰る。最も親しい家族および友人の情緒的なサポートにより、彼女は、デバイスのウェル中のマイクロニードルアレイに彼女の指を押しつけることによって、検査を始める。デバイス中のナノポアシークエンサーは、彼女の血液サンプル中の十分な量の核酸（１０９未満の胎児の核酸）を配列決定し、約１時間未満で所望の遺伝子情報を明らかにする。ＵＳＢポートまたはワイヤレス技術は、彼女の電話のアプリケーションまたは彼女のコンピューターのウェブサイトに配列情報を中継する。アプリケーションまたはウェブサイトは、ソフトウェアを利用して配列決定リードから遺伝子情報を得て、女性が確認するために結果のパネルを明らかにする。代替的に、デバイスそれ自体は、配列を読み取り、デバイスのウインドウにパネルを生成するためのソフトウェアを備える。パネルは、女性が妊娠していることを確認し、胎児が既知の染色体異常（例えば、１３番、１６番、１８番、２１番、２２番、および／またはＸ／Ｙの染色体のトリソミー）あるいは他の遺伝的異常を有しているか否かに関する情報を含んでいる。パネルはさらに、彼女が妊娠していて、彼女が男の子を妊娠していることを確認する。
【０４０２】
実施例７：微容量の母体サンプルでの非侵襲性出生前検査
ＤＮＡ抽出（効率９０％）およびライブラリ調製（効率１０％）、ならびにＰＣＲ増幅（〜１０サイクル）中の標準方法の損失を考慮に入れた、胎児の画分の下限（４％）でのシミュレーションの実行は、精度が入力ＤＮＡ材料の２５（１０の屈曲点）コピー以下に低下することを示す。１０のコピーの精度は８９％に低下し、５のコピーの精度は８１％に低下し、この両方の値は、〜９５％のサンプルの理論感度を必要とする市場では受け入れられない。図７の薄灰色の線を参照する。
【０４０３】
ライブラリ効率（５０％まで、１０％に対して）が増加し、増幅が減少する場合、より多くの情報が保存され、５以下のコピー数（ゲノム当量）でも９５％以上の感度を達成することができる。図７の濃い灰色の線を参照する。
【０４０４】
【表４】
2021500883.tif 000006
【０４０５】
実施例８：妊婦からの無細胞ＤＮＡの全ゲノム配列決定による胎児の染色体異常の解析
１８０ｐｇの無細胞ＤＮＡを妊婦の体液から得た（約１００μｌの血液中の無細胞ＤＮＡの量に相当する量）。無細胞ＤＮＡをＤＮＡ修復キットで精製し、その完全性を保つために緩衝液に含まれていた。
【０４０６】
配列決定のための無細胞ＤＮＡを調製するために、無細胞ＤＮＡフラグメントの末端をＤＮＡフラグメント末端修復キットで修復した。次に、修復された末端をアダプターに連結し、アダプター連結ＤＮＡを生成した。
【０４０７】
ＤＮＡに結合することができるビーズでアダプター連結ＤＮＡをインキュベートすることによって、アダプター連結ＤＮＡを精製した。ビーズを捕捉するための磁石を使用して、アダプター連結ＤＮＡをビーズから溶出する前に、ＤＮＡを有するビーズをエタノール溶液で数回洗浄した。
【０４０８】
アダプター連結ＤＮＡのサイクル増幅を、初期の変性工程では９８°Ｃで３０秒間、その後、９８°Ｃで１０秒間および６５°Ｃで７５秒間を１０のサイクル、その後、６５°Ｃで５分間の最終伸長で実行した。随意に、アダプター連結ＤＮＡは、指標プライマーの使用により増幅することができ、これは、同じシークエンサー実行で複数のサンプルを実行する場合に有用であり得る。これらは、ライブラリ増幅前に導入された固有のバーコード／タグとは異なっていた。アダプター連結ＤＮＡと同様に、増幅ＤＮＡをビーズおよび磁石システムで精製した。得られた、精製された増幅ＤＮＡを配列決定にかけた。
【０４０９】
３０〜５００の塩基対のリード長を有する何百万もの配列決定リードを生成するハイスループット配列決定マシンで、配列決定を実行した。この指標は、複数のサンプルから同時に配列決定リードを得ることを可能にした。配列決定の実行ごとに、１つのサンプル当たりおよそ４００万のリードが得られた。
【０４１０】
各サンプルについて以下の工程を実行した：
【０４１１】
全ての配列リードのゲノムの起源を検出するための配列アラインメント。
【０４１２】
５０ｋｂの長さの重複しないビンにゲノムのサブセットを入れた。ＧＣ含有量を、基準ゲノムに基づいて各ビンについて算出した。ビン領域の各々にある配列リード数を計数した。ＧＣ含有量とビンの数の関連性の線形モデルを、ｙ＝ａｘ＋ｂ（ｙ：予想数、ａ：勾配、ｘ：ＧＣ含有量、ｂ：切片）に従って算出した。線形モデルに基づいて１つのビン当たりの数を調整してＧＣバイアスを減らした。各ビンについて、全てのビンの数の中央値の間の差を算出し、予想される数値を線形適合から差し引いた。この差を、それぞれのビンについて観察された数値に加えた。対象の染色体に由来する配列リードのパーセンテージを算出した。この例では、対象の染色体は２１番染色体であった。
【０４１３】
基準サンプルのセットを使用して、２１番染色体（ｒｅｆ．ｐ２１と呼ばれる）に由来する配列リードのパーセンテージを算出した。中央値（ｒｅｆ．ｍｅｄと呼ばれる）を、ｒｅｆ．ｐ２１のサンプルのセットの中央絶対偏差（ＭＡＤ）（ｒｅｆ．ｍａｄと呼ばれる）とともに算出した。
【０４１４】
同様の値を、少なくとも１つの試験サンプル（上記のものと同じプロトコル）で測定した。２１番染色体に由来する配列リードのパーセンテージを算出した（ｔｅｓｔ．ｐ２１と呼ばれる）。各サンプルについて、２１番染色体に由来する配列リードの試験サンプルのパーセンテージと基準の中央値との差を算出し（ｔｅｓｔ．ｐ２１−ｒｅｆ．ｍｅｄ）、基準セットの中央絶対偏差でこの差を割ること（［ｔｅｓｔ．ｐ２１ｒｅｆ．ｍｅｄ］／ｍａｄ．ｒｅｆ）によって、Ｚ−スコアを算出した。結果について図３を参照する。
【０４１５】
もしＺ−スコア値が予め決められたカットオフ（典型的には、カットオフは３に等しい）を超えることが分かった場合、サンプルは２１染色体に由来するゲノム材料の過剰表現を有すると解釈することができる。この過剰表現は胎児の２１トリソミーを示していた。反対に、もしＺ−スコアが予め決められたカットオフよりも下である場合、サンプルゲノム材料の正常表現または過少表現を有すると解釈することができる。この解析は、他の染色体または染色体領域に適用することができる。
【０４１６】
実施例９．母体の血漿中の無細胞胎児核酸を配列決定することによる、遺伝的異常の検出
妊娠している被験体から血液サンプルを集める。妊娠している被験体は妊娠５週目ほどであり得る。場合によっては、彼女は妊娠７週間目ほどである。いくつかの例では、妊娠している被験体は、自宅で、彼女の指をデバイスで刺すことにより、自分で採血する。妊娠している被験体は、サンプル処理装置および配列決定装置を備えている研究室に、デバイスまたは容器中の自分のサンプルを送る。代替的に、デバイスがサンプル処理（例えば、精製、標的濃縮）および／または配列決定を実行し、したがって、妊娠している被験体は研究室に自分のサンプルを送る必要はない。指穿刺により約１００μｌの血液が得られ、そのうち約５０μｌの血漿または血清が得られる。サンプリングの時点での、血漿サンプルの全無細胞核酸における無細胞胎児核酸のパーセンテージが平均して１０％であるため、５０μｌの血漿は約１．５ｘ１０＾８の無細胞胎児核酸を含んでいる。いくつかの例では、胎児の画分はわずか４％であり、１００μｌの血液サンプルは、約６ｘ１０＾７の無細胞胎児核酸を含んでいる。血漿サンプルの全無細胞核酸における無細胞胎児核酸のパーセンテージが１％しかないので、妊娠のいかなる段階でも信頼性の高い情報を保証するために被験体から得られるべき血液の最少量は、約２μｌである。
【０４１７】
実施例１０：母体の尿中の無細胞胎児核酸を配列決定することによる、遺伝的異常の検出
妊娠している被験体から尿サンプルを集める。妊娠している被験体は妊娠５週目ほどであり得る。場合によっては、彼女は妊娠７週目ほどである。いくつかの例では、妊娠している被験体は、自宅で尿を自分で採取する。妊娠している被験体は、サンプル処理装置および配列決定装置を備えている研究室に、デバイスまたは容器中の自分のサンプルを送る。代替的に、妊娠している被験体は、サンプル処理（例えば、精製、標的濃縮）および／または配列決定を実行する家庭用デバイスに尿サンプルを入れ、したがって、妊娠している被験体は研究室に自分のサンプルを送る必要はない。場合によっては、尿サンプルは約１００μｌの量を有する。サンプリング時の尿サンプルの全無細胞核酸中の無細胞胎児核酸のパーセンテージは４％であるため、１００μｌの尿は約８のｘ１０＾１０ｍｐの無細胞胎児核酸を含んでおり、尿中の無細胞核酸の典型的な濃度は１ｍｌ当たり８ｘ１０＾１１のフラグメントである。いくつかの例では、胎児の画分は４％であり、尿サンプルは約３．２ｘ１０＾９の無細胞胎児核酸を含んでいる。尿サンプルの全無細胞核酸中の無細胞胎児核酸のパーセンテージが１％しかないので、妊娠のあらゆる段階でも信頼性の高い情報を保証するために被験体から得られるべき血液の最少量は、約２μｌである。
【０４１８】
実施例１１．自宅で採取されたサンプルから、研究室において母体の血漿中の無細胞胎児核酸を計数することによる、遺伝的異常の検出
妊娠している被験体から血液サンプルを採取する。妊娠している被験体は妊娠５週目ほどであり得る。場合によっては、彼女は妊娠７週目ほどである。いくつかの例では、妊娠している被験体は、自宅で、デバイスで、例えば、自分の指を刺すことにより、自分で毛細管血を採取する。いくつかの例では、デバイスは血液を血漿へと分ける。妊娠している被験体は、デバイスまたは容器中の自分の血液（または、血漿サンプル）を、サンプル処理、核酸ライブラリ調製、および配列決定のための試薬および装置がある研究室に送る。いくつかの例では、ライブラリ調製は、計数されるか定量化されるラベルまたは信号で無細胞胎児核酸にタグ付けることを含む。いくつかの例では、ラベルまたは信号は、特定の無細胞胎児核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに接続される。
【０４１９】
特定の無細胞胎児核酸の量は、信号またはラベルを介して量に変換され、それは、妊娠している被験体、デバイス、または解析を行う専門家によって検出される。指穿刺により約１００μｌの血液が得られ、そのうち約５０μｌの血漿または血清が得られる。サンプリングの時点での、血漿サンプルの全無細胞核酸における無細胞胎児核酸のパーセンテージが平均して約１０％であるため、５０μｌの血漿は約１．５ｘ１０＾８の無細胞胎児核酸を含んでいる。いくつかの例では、胎児の画分はわずか約４％であり、１００μｌの血液サンプルは、約６ｘ１０＾７の無細胞胎児核酸を含んでいる。血漿サンプルの全無細胞核酸における無細胞胎児核酸のパーセンテージが１％しかないので、妊娠のあらゆる段階でも信頼性の高い情報を保証するために被験体から得られるべき血液の最少量は、約２μｌである。
【０４２０】
研究室での解析の結果は、妊娠している被験体に電子的に送信される。
【０４２１】
実施例１２．自宅で処理されたサンプルから、研究室において母体の血漿中の無細胞胎児核酸を計数することによる、遺伝的異常の検出
妊娠している被験体から血液サンプルを採取する。妊娠している被験体は妊娠５週目ほどであり得る。場合によっては、彼女は妊娠７週目ほどである。いくつかの例では、妊娠している被験体は、自宅で、彼女の指をデバイスで刺すことにより、自分で採血する。デバイスはサンプル処理（例えば、精製、標的濃縮）およびライブラリ調製を実行する。したがって、妊娠している被験体は、処理あるいは調製された自分のサンプルを、配列決定施設、または核酸を配列決定することが可能な施設に送るだけでよい。
【０４２２】
特定の無細胞胎児核酸の量は、信号またはラベルを介して量に変換され、それは、妊娠している被験体、デバイス、または解析を行う専門家によって検出される。指穿刺により約１００μｌの血液が得られ、そのうち約５０μｌの血漿または血清が得られる。サンプリングの時点での、血漿サンプルの全無細胞核酸における無細胞胎児核酸のパーセンテージが平均して約１０％であるため、５０μｌの血漿は約１．５ｘ１０＾８の無細胞胎児核酸を含んでいる。いくつかの例では、胎児の画分はわずか約４％であり、１００μｌの血液サンプルは、約６ｘ１０＾７の無細胞胎児核酸を含んでいる。血漿サンプルの全無細胞核酸における無細胞胎児核酸のパーセンテージが１％しかないので、妊娠のあらゆる段階でも信頼性の高い情報を保証するために被験体から得られるべき血液の最少量は、約２μｌである。
【０４２３】
研究室での解析の結果は、妊娠している被験体に電子的に送信される。
【０４２４】
実施例１３．胎児のトリソミーの検出
各染色体からのリードは、染色体の長さに従っておよそで表される。大半のリードは１番染色体から得られるが、常染色体からの最少のリードは２１番染色体に由来する。トリソミーのサンプルを検出する一般的な方法は、正倍数性のサンプルの集団における染色体に由来するリードのパーセンテージを測定することである。次に、染色体のパーセンテージ値のこのセットの平均および標準偏差を算出する。カットオフ値は、３つの標準偏差を平均に加えることにより決定される。新たなサンプルがカットオフ値を超える染色体パーセンテージ値を有している場合、その染色体の過剰表現を想定することができ、それは多くの場合染色体のトリソミーと一致している。
【０４２５】
正倍数性の胎児を有する妊娠している被験体について、２１番染色体から得られたリードのパーセンテージの平均値は１．２７％であり、標準偏差は０．０１パーセントである。したがって、トリソミーを示すカットオフは１．３０％である。この理論的実施例は、胎児の画分が１０％および２１番染色体パーセンテージが１．３４であるトリソミーのサンプルを示す。サンプルはカットオフよりも上であり、トリソミーサンプルとして正確に分類される。正倍数性の胎児を有する正倍数性の被験体のサンプルにおける全ての染色体における染色体パーセンテージ、ならびに異数性の胎児を有する正倍数性の被験体のサンプルにおける全ての染色体のパーセンテージの典型的な平均が表５に示される。
【０４２６】
【表５】
2021500883.tif 000007
【０４２７】
実施例１４．母体の血液からの胎児無細胞核酸を解析するためのデバイス
無細胞核酸を解析する目的で、全血から血漿を分離するためのデバイスは６層を含む。これらは、下から上に以下の通りである：
【０４２８】
（１）下方粘着シート
【０４２９】
（２）下方分離ディスク：下方粘着シートに面する側に接着剤を備える、粘着シート材料（ＤＮＡまたは血漿に不活性の高分子材料）の１６ｍｍの直径ディスク、
【０４３０】
（３）ポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）膜、様々なサイズ、典型的に６〜１６ｍｍ、好ましい設計は１０ｍｍのＰＥＳ膜を特徴とする。膜は、毛管力を介してフィルターから血漿を引きつけるウィッキング材料として機能する。
【０４３１】
（４）フィルターディスク（例えば、Ｐａｌｌ  Ｖｉｖｉｄ（商標）膜）、１６ｍｍの直径、上を向いた荒い側、ＰＥＳ膜に面する光沢の側。
【０４３２】
（５）上方分離ディスク：下方ディスクと同じ材料、サイズ１２または１４ｍｍの直径、中心に４ｍｍの穴を含む。ここで、粘着シート材料を使用する場合、接着面が上を向き、上方の粘着剤シートと接触する。上方ディスクは、直径がフィルターディスクよりも小さい。これにより、上方粘着シートからの接着剤がフィルターディスクの縁と相互作用し、それによって、縁においてそれを密封することを可能にする。
【０４３３】
（６）上方粘着シート、６ｍｍの穴はデバイスの中心が位置する場所であけられる。
【０４３４】
全ての層をそれらの中心に並べ、その後、標準的なオフィス用積層機器を使用して積層する。
【０４３５】
デバイスは、実施例６に記載される検査を実行するように構成される。
【０４３６】
デバイスへの血液の適用および濾過が以下のように行われる：
【０４３７】
上方粘着シートにおける穴および上ディスクにおける穴を介して、１００μｌの全血をデバイスの中心に適用する。血液を、毛管力によってフィルターディスク全体にわたって求心的に分配する。血漿はさらに、毛管力によって、フィルターディスクを通ってＰＥＳ膜へと吸い上げられる。約２分後、最大量の血漿をＰＥＳ膜へと移した。ＰＥＳ膜を有するデバイスまたはその一部はＤＮＡ鑑定のための実験室へと出荷される。
【０４３８】
無細胞核酸を含むＰＥＳ細胞膜を以下のように回収する：
【０４３９】
ＰＥＳ膜をデバイスから取り除く。例えば、デバイスをＰＥＳ膜の縁のまわりで切り取る。膜をフィルターおよび下方ディスクから容易に分離する。
【０４４０】
ＤＮＡを膜から以下のように溶出する：
【０４４１】
血漿を含むＰＥＳ膜をエッペンチューブ（０．５ｍｌ）に移し、１００μｌの溶出緩衝液を加える（溶出緩衝液は、Ｈ２Ｏ、ＥＢ緩衝液（ＱＧＥＮ）、ＰＢＳ、ＴＥ、または続く分子解析に適した他のもの）。膜からのＤＮＡの溶出後、溶出したｃｆＤＮＡを含む緩衝液は、核酸増幅、タグ付け、配列決定、またはそれらの組み合わせを含む遺伝子解析を受ける。
【０４４２】
本明細書で開示されるデバイス、システム、およびキットの好ましい実施形態が示され、かつ記載されているが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。多くの変形、変化、および置換が、本明細書で開示されるデバイス、システム、およびキットから逸脱することなく、当業者に想到されるであろう。本明細書に開示されるデバイス、システム、およびキットの実施形態の様々な代替物が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲はデバイス、システム、およびキットの範囲を定義するものであり、これらの特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造が、それにより包含されることが意図されている。
【図１】
2021500883.tif 000008
【図２】
2021500883.tif 000009
【図３】
2021500883.tif 000010
【図４Ａ】
2021500883.tif 000011
【図４Ｂ】
2021500883.tif 000012
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
2021500883.tif 000019
【図８Ａ】
2021500883.tif 000020
【図８Ｂ】
2021500883.tif 000021
【図８Ｃ】
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【図９】
2021500883.tif 000023
【図１０】
2021500883.tif 000024
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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