(57)【要約】  本発明は、金属／配位子比が１／１のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの新たな亜鉛錯体に関する。特に、本発明は、下記式の化合物に関する。本発明による錯体は、上皮組織のバリア機能を回復するのを助け、免疫細胞の異常な活性を抑制する。本発明はまた、錯体調製の方法、ならびに上皮組織のバリア機能の障害および異常な炎症反応の発症に関連するアトピー性皮膚炎および他の疾患を処置するための前記亜鉛錯体の使用に関する。本発明はまた、グルタミニルシクラーゼを阻害するための調製された錯体の使用に関する。本発明はまた、治療上有効量の本発明の化合物を含む医薬組成物に関する。2021534257.tif 000010【選択図】なし
2021534257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式を有するガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの亜鉛錯体またはその薬学的に許容される塩。
【化１】
2021534257.tif 000009
【請求項２】
ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの亜鉛錯体を調製する方法であって、
酢酸亜鉛とガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの混合物を極性溶媒中で撹拌するステップと、
その生成物を沈殿させるステップと、
金属：配位子比が１：１のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの亜鉛錯体である、得られた生成物を乾燥させるステップと、
を含む方法。
【請求項３】
前記溶媒がメタノール、水、またはこれらの組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
水性酢酸亜鉛、特に酢酸亜鉛二水和物が使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記混合物の混合が、１５〜５０℃、好ましくは、メタノールが溶媒として使用される場合は１５〜４０℃の温度、および水が溶媒として使用される場合は１５〜９０℃の温度で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの亜鉛錯体。
【請求項７】
金属／配位子のモル比が１／１である、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの亜鉛錯体。
【請求項８】
酢酸亜鉛とガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの等モル混合物を溶媒中で撹拌し、続いてその錯体を生成物として単離することによって調製される、請求項７に記載のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの亜鉛錯体。
【請求項９】
錯体の固体試料のＩＲスペクトルが、１６１６ｃｍ−１、１６４６ｃｍ−１および３２７６ｃｍ−１のバンドを示す、請求項７に記載のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの亜鉛錯体。
【請求項１０】
上皮組織のバリア機能の障害によって引き起こされる障害を予防および／または処置するための、請求項１または請求項６〜９のいずれか一項に記載の錯体の使用。
【請求項１１】
グルタミニルシクラーゼ活性に関連する障害を予防および／または処置するための、請求項１または請求項６〜９のいずれか一項に記載の錯体の使用。
【請求項１２】
免疫細胞の異常な活性に関連する障害を予防および／または処置するための、請求項１または請求項６〜９のいずれか一項に記載の錯体の使用。
【請求項１３】
免疫細胞の異常な走化性に関連する障害を予防および／または処置するための、請求項１２に記載の錯体の使用。
【請求項１４】
前記上皮組織のバリア機能の障害および／またはグルタミニルシクラーゼ活性および／または免疫細胞の異常な活性に関連する障害がアトピー性皮膚炎である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、上皮組織のバリア機能を回復し、免疫細胞の異常な活性を抑制する、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの新規な亜鉛錯体に関する。本発明はまた、上皮組織バリア機能の障害および異常な炎症反応の発症に関連するアトピー性皮膚炎および他の疾患を処置するための特定の亜鉛錯体の調製および使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
上皮バリアは、ヒトおよび動物生体で重要な役割を果たしている。上皮バリアは、さまざまな物質、アレルゲンおよび細菌が体内環境に侵入するのを防ぐ。上皮組織のバリア機能の障害は、口腔の炎症性疾患（口内炎、歯肉炎、咽頭炎等）、胃腸管の疾患（大腸炎、腸炎、腸の自家中毒、過敏性腸症候群、吸収不良症候群、再発性下痢等）、アレルギー性疾患（アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎等）などのいくつかの疾患の発病に大いに寄与している［Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ  Ａｎｔｉｉｎｆｅｃｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１５；１０（２）：８４−９７；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１３；１２（２）：１２−１９；Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｓｉｂｅｒｉａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７；１６（２）３２−４６］。炎症性疾患およびアレルギー性疾患の発症における上皮組織のバリア機能の重要な役割を考えると、上皮組織のバリア機能を回復することを目的とした戦略は、ヒトの多くの病的状態の処置にとって最も重要である。特に、局所療法は、損傷した上皮を回復すること、皮膚のバリア機能を改善すること、皮膚を水和すること、ならびに二次感染を予防および排除することを目的とする、アトピー性皮膚炎の処置において最も重要である［Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１４  Ｄｅｃ；１３４（６）：ｅ１７３５−４４］。
【０００３】
亜鉛は皮膚のバリア機能を維持する重要な微量元素の１つであるため、その抗炎症、抗酸化および抗菌特性により、皮膚科学で最も使用されている微量元素の１つになっている［ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２００８  Ｆｅｂ；２７９（１）：７１−７６］。亜鉛は、上皮リモデリングを制御するマトリックスメタロプロテイナーゼの必須成分であり、上皮細胞増殖、創傷治癒および皮膚バリア機能の維持において重要な役割を果たす［Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ（Ｌａｎｄｍａｒｋ  Ｅｄ）．２０１７  Ｍａｒ  １；２２：１４６９−１４９２］。最近の研究では、アトピー性皮膚炎の症状の重症度が、患者の赤血球中の亜鉛濃度と負の相関関係があることが示されている［Ｐｏｓｔｅｐｙ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ａｌｅｒｇｏｌ．２０１６  Ｏｃｔ；３３（５）：３４９−３５２］。さらに、亜鉛化合物の使用は、前臨床研究および臨床研究でアトピー性皮膚炎の症状の重症度の減少をもたらす［Ｂｉｏｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍ  Ｒｅｓ．２０１７  Ｓｅｐ；１７９（１）：１１０−１１６；Ｃｌｉｎ  Ｃｏｓｍｅｔ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１３  Ｍａｙ  ６；６：１１５−２１；Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．２０１４  Ｓｅｐ；９４（５）：５５８−６２］。アトピー性皮膚炎の動物モデルでは、亜鉛化合物を使用すると上皮組織の厚さが回復し、皮膚の局所炎症の重症度が減少することが示されている［Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１８  Ｊｕｌ  １７：ｅ１２６５９］。
【０００４】
多くの場合、上皮組織のバリア機能の障害は、異常な炎症反応の発症に関連しており、今度はこれが、さらなる細胞破壊および上皮のバリア機能の分解を誘発することに留意すべきである。例えば、アトピー性皮膚炎の患者では、皮膚のバリア機能の障害により、黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）を含む日和見細菌による定着が起こる［Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９８  Ｄｅｃ；１３９  Ｓｕｐｐｌ  ５３：１３−６］。日和見微生物による皮膚の細菌汚染は、過剰な炎症反応の発症および炎症性サイトカインを産生する免疫細胞（主にリンパ球、好酸球、樹状細胞および肥満細胞）の異常な走化性につながる。免疫細胞によって分泌される炎症性サイトカインおよび活性酸素種は、皮膚バリア機能のさらなる分解を誘発し、これが自己持続的な正のフィードバックとして機能し、したがって疾患の慢性期への進行を確実にする［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｒｅｓ．２０１３  Ｄｅｃ；７（１２）：２６８３−２６８５］。したがって、免疫細胞の走化性を阻害することによる免疫細胞の異常な活性の抑制が、アトピー性皮膚炎、ならびにヒトおよび動物の他の疾患の処置における重要な点となり得る。
【０００５】
ＣＣＬファミリーのケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３）は、哺乳動物の単球、マクロファージ、好酸球、Ｔリンパ球および樹状細胞の走化性における強力な因子である［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０１２  Ｍａｒ  １；４４２（２）：４０３−１２；Ｐｏｓｔｅｐｙ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ａｌｅｒｇｏｌ．２０１４  Ｍａｙ；３１（２）：８４−９１］。ＣＣＬファミリーのメンバー（ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３）、フラクタルカイン、ならびにいくつかの他のホルモンおよび分泌タンパク質は、アミノペプチダーゼによる分解から保護する役割を持つピログルタミン酸（ｐＥ）残基を含む［Ｃｈｅｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；７２：４２−５６；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９９  Ｏｃｔ  ５；３８（４０）：１３０１３−２５］。Ｎ末端残基のピログルタミネーション（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）は、酵素グルタミニルシクラーゼ（ＱＰＣＴまたはＱＣ）によって触媒される［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｄｅｃ  １２；２７８（５０）：４９７７３−９；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００８  Ｊｕｎ  ２０；３７９（５）：９６６−８０］。実験研究の過程で、グルタミニルシクラーゼ阻害が、ケモカインＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８およびＣＣＬ１３［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１２）４４２，４０３−４１２］ならびにフラクタルカイン［Ｂｉｏｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１７  Ａｕｇ  ２３；３７（４）］の非ピログルタミン酸型の化学誘因活性の急激な低下をもたらすことが示された。したがって、ＣＣＬファミリーのケモカインのピログルタミネーションは、免疫細胞のＣＣＬ媒介走化性に必要なステップであるため、グルタミニルシクラーゼの阻害を目的とした戦略が、異常な炎症反応を調節し、免疫細胞の活性を低下させるための可能な戦略となり得る。
【０００６】
今日まで、グルタミニルシクラーゼ阻害剤の亜鉛錯体、ならびにそれらの調製および治療的使用は記載されていない。同時に、スルホリピド［国際公開第２０１７／０４６２５６号、２０１７年３月２３日公開、ＨＯＣＨＳＣＨＵＬＥ  ＡＮＨＡＬＴ、ドイツ］、フラボノイド誘導体［Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｍａｙ  １５；２４（１０）：２２８０−６］、ピリジン誘導体［米国特許出願公開第２０１５／０２９１６３２号明細書、２０１５年１０月１５日公開、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ、米国］および最近記載されたいくつかの小分子［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１７  Ｍａｒ  ２３；６０（６）：２５７３−２５９０；国際公開第２０１４／１９３９７４号、米国特許出願公開第２０１５／０２９１５５７号明細書］を含むグルタミニルシクラーゼ阻害剤が知られている。また、グルタミニルシクラーゼ阻害剤は、Ｐｒｏｂｉｏｄｒｕｇ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ社の刊行物［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３  Ｄｅｃ  １２；２７８（５０）：４９７７３−９］に記載されている。これらの論文は、イミダゾール誘導体に基づくグルタミニルシクラーゼ阻害剤を記載している。しかしながら、Ｐｒｏｂｉｏｄｒｕｇ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔの刊行物は、そもそもグルタミニルシクラーゼ阻害剤の亜鉛錯体を含まず、Ｐｒｏｂｉｏｄｒｕｇ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ社によって公開された化合物の構造には、窒素原子の１つに位置する脂肪族置換基を含むイミダゾールが含まれる。脂肪族置換基の導入は、化合物の代謝安定性を低下させる。さらに、脂肪族置換基の存在は、化合物の疎水性を増加させ、化合物の全身バイオアベイラビリティを増加させ、これは、上皮組織のバリア機能の障害に関連するアトピー性皮膚炎および他の疾患の処置には明らかに不要である。
【０００７】
今日まで、上皮組織のバリア機能の障害および／または免疫細胞の異常な活性に関連するアトピー性皮膚炎または他の疾患の処置に使用することができるグルタミニルシクラーゼ阻害剤の亜鉛錯体に基づく薬物は知られておらず、そのため、グルタミニルシクラーゼ阻害剤の亜鉛錯体に基づく新規な有効な薬物の開発および治療的使用に対する満たされていない必要性が依然として残っている。
【０００８】
本発明の目的は、上皮組織のバリア機能を回復するのに有効であり、上皮のバリア機能の障害および免疫細胞の異常な活性に関連するアトピー性皮膚炎または他の疾患の処置においてグルタミニルシクラーゼ酵素を阻害することができる、新たな有効な化合物を開発することである。
【０００９】
［本発明の簡単な要約］
本発明の目的は、上皮組織のバリア機能の障害および免疫細胞の異常な活性に関連する疾患、特にアトピー性皮膚炎、ならびに他の疾患の処置に有効な新規な薬物を開発することである。
【００１０】
本発明の技術的結果は、上皮組織のバリア機能の障害および／または免疫細胞の異常な活性に関連するアトピー性皮膚炎、ならびに他の疾患の処置に有効な新規な化合物を提供することである。
【００１１】
特定の技術的結果は、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体（金属：配位子比＝１：１）の化合物を提供することによって達成される。
【００１２】
本明細書で詳細に記載される、行われた試験に基づいて、本出願人は、得られた錯体の構造を以下の構造式
【化１】
2021534257.tif 000003
によって記載することができることを示唆している。
【００１３】
特定の亜鉛錯体（化合物１）またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩は、上皮組織のバリア機能の障害および免疫細胞の異常な活性に関連するアトピー性皮膚炎、ならびに他の疾患の処置に有効である。
【００１４】
本発明の別の技術的結果は、上皮組織のバリア機能の障害および免疫細胞の異常な活性に関連するアトピー性皮膚炎、ならびに他の疾患を予防および／または処置するための、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体（化合物１）またはその水和物／溶媒和物の使用である。
【００１５】
本発明の別の技術的結果は、免疫細胞の異常な活性、特に免疫細胞の異常な走化性に関連する障害を予防および／または処置するための医薬組成物を調製するための、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの新規な亜鉛錯体、またはその水和物、溶媒和物もしくは薬学的に許容される塩の使用である。
【００１６】
さらに、本発明は、有効量の本発明の化合物と少なくとも１つの薬学的に許容される薬剤／賦形剤とを含む、上皮組織のバリア機能の障害および免疫細胞の異常な活性に関連するアトピー性皮膚炎、ならびに他の疾患を予防および／または処置するための医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤が薬学的に許容される担体および／または賦形剤である。
【００１７】
本発明はまた、生物の上皮組織のバリア機能の障害および免疫細胞の異常な活性に関連するアトピー性皮膚炎、ならびに他の疾患を予防および／または処置する方法であって、本発明による医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を含む。発明実施形態の特定の場合、対象がヒトまたは動物である。
【００１８】
ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体は先行技術に記載されていないが、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの偽ペプチドは知られており、最初にラットおよび軟体動物の神経組織から微量で単離されている［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．−１９７６．−ｖｏｌ．２７．−ｐｐ．１４６１−１４６３；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．−１９７７．−ｖｏｌ．２９．−ｐｐ．６３３−６３８．］。ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの製造は、特許、ロシア特許第２１４１９６８号明細書、１９９９年１１月２７日公開に記載されている。ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンに基づくクリームの使用は、特許、ロシア特許第２２３３１５２号明細書、２００４年７月２７日公開に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミン偽ペプチド（配位子）試料のＩＲスペクトルを示す図である。
【図２】実施例１に従って塩化亜鉛とガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの溶液を混合することによって調製された生成物試料のＩＲスペクトルを示す図である。
【図３】実施例２によるガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体の試料のＩＲスペクトルを示す図である。
【図４】実施例３、合成「Ａ」に関連するガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体の試料のＩＲスペクトルを示す図である。
【図５】実施例３、合成「Ｂ」に関連するガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体の試料のＩＲスペクトルを示す図である。
【図６】実施例２によるガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体を含有する１Ｈ試料の核磁気共鳴スペクトルを示す図である。
【図７】組織学的分析データによるアトピー性皮膚炎のマウスモデルの皮膚病変に施用された化合物１（０．０１％）を含有するクリームの薬理作用を示す図である。
【図８】罹患マウス耳の皮膚の組織切片（アトピー性皮膚炎の動物モデル）を示す図である。
【００２０】
［発明の詳細な説明］
上に示されるように、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体は先行技術に記載されていなかったが、偽ペプチドガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンは、最初にラットおよび軟体動物の神経組織から微量で単離されている物質として知られている［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．−１９７６．−ｖｏｌ．２７．−ｐｐ．１４６１−１４６３；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．−１９７７．−ｖｏｌ．２９．−ｐｐ．６３３−６３８］。ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの調製は、特許、ロシア特許第２１４１９６８号明細書にも開示されている。これらの研究は、抗酸化作用、抗ラジカル作用、脂質調節作用、血糖降下作用、抗喘息作用、抗ウイルス作用、抗菌作用、抗腫瘍作用、抗炎症作用、抗転移作用、適応作用を有する偽ペプチドであり、アラキドン酸の代謝を調節し、糖尿病、肥満、冠動脈疾患、ストレス状態、肝炎、肝硬変、中毒性肝損傷、アルコール依存症、放射線障害および老年医学的変化の徴候を予防することができる、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンを記載している。
【００２１】
同時に、これらの研究は、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体についても、その調製方法についても、それらの生物学的活性の研究データについてもデータを提供していない。同時に、これらの条件下では、亜鉛塩と遊離ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの混合物が形成されるので、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体を、亜鉛塩とガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの単純な混合によって得ることができないことに留意すべきである。
【００２２】
本発明に取り組んで、本著者／出願人は、金属／配位子比が１／１のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの安定な亜鉛錯体を製造する方法を開発した。（化合物１）。
【００２３】
アトピー性皮膚炎のモデルにおいて、本出願人によって調製されたガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミン亜鉛錯体（化合物１）の特定の薬理活性に焦点を当てた研究の過程で、化合物１が、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの遊離配位子と比較して有意に高い治療活性を示すことが示された。化合物Ｉ（０．０１重量％クリーム）を皮膚に投与すると、炎症細胞（単球、樹状細胞、好酸球および好中球）の皮膚の表皮および真皮への流入がインタクト動物のレベルまで減少すると同時に、アトピー性皮膚炎の他の顕微鏡的徴候も減少する。したがって、化合物１は免疫細胞の走化性に影響を及ぼすことが示されている。免疫細胞の流入の減少を、免疫細胞の異常な活性に関連するいくつかの疾患の処置に使用することができる。
【００２４】
本出願人によって行われた調査研究は、観察された化合物１の治療効果が、この化合物がグルタミニルシクラーゼの活性を阻害する能力に関連していることを示した。
【００２５】
したがって、化合物１（金属／配位子比が１／１のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体）は、上皮組織バリア機能の障害および免疫の異常な活性に関連するアトピー性皮膚炎および他の疾患の処置に有用な新規な化合物である。
【００２６】
用語および定義
「化合物Ｉ」という用語は、金属：配位子比が１：１のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体を指す。
【００２７】
具体的には、この錯体は以下の構造式：
【化２】
2021534257.tif 000004
またはその薬学的に許容される塩によって表すことができる。
【００２８】
温度に関して使用される場合の「Ｃ」という用語は、摂氏またはセルシウス温度目盛を意味する。
【００２９】
「ＩＣ５０」という用語は、酵素の半数阻害をもたらす試験化合物濃度を表す。
【００３０】
「溶媒和物」という用語は、本発明の化合物と薬学的に許容される溶媒、例えばエタノールの１つまたは複数の分子とを含む分子複合体を記載するために使用される。「水和物」という用語は、特定の溶媒が水である場合に使用される。
【００３１】
この文書における免疫細胞の「異常な活性」という用語は、病理の非存在下での対象における免疫細胞活性のベースラインレベルとは有意に異なる活性を指す。異常な活性は、器官または組織への免疫細胞の過剰な流入、免疫細胞の活性化につながるプロセスの混乱、免疫細胞死に関連するプロセスの調節解除、ならびにその他の因子によって引き起こされ得る。
【００３２】
「賦形剤」という用語は、医薬品の組成物に含まれる、または必要な物理化学的特性を付与するために製造プロセス、医薬品の調製に使用される、無機起源または有機起源の任意の薬学的に許容される物質を意味する。
【００３３】
「グルタミニルシクラーゼ」という用語は、さまざまなペプチド基質におけるＮ末端グルタミンのピログルタミンへの変換に関与するアミノアシルトランスフェラーゼ酵素を指す。Ｎ末端ピログルタミン酸の形成は、生物活性ペプチド、ホルモンおよびケモカイン（例えば、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、β−ケモカインリガンド−２）をエキソペプチダーゼによる分解から保護し、場合によってはそれらの受容体に対するリガンドの親和性を高めることができる。
【００３４】
「走化性」という用語は、化学的刺激に応答した細胞の方向付けられた動きを指す。走化性は、細胞が走化性メディエータの濃度勾配に応答する能力に基づく。走化性は、免疫細胞が血管床を離れ、損傷した組織に移動するプロセスである。走化性の主な役割は、走化性物質、または化学誘引物質によって果たされる。ＣＣＬ２ケモカインは、単球およびマクロファージにとって最も強力な化学誘引物質の１つである。
【００３５】
「処置」、「治療」、「処置する」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける病的状態の処置を包含し、ａ）改善すること、ｂ）疾患の経過を断ち切る（終結させる）こと、ｃ）疾患の重症度を軽減すること、すなわち、疾患の退行の開始、ｄ）用語が適用される疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の逆転を含む。
【００３６】
「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、危険因子の排除、ならびに疾患の臨床段階の発生の可能性を低減することを目的とした、哺乳動物、好ましくはヒトにおける疾患の無症状期の予防的処置を包含する。予防的治療の対象は、一般集団と比較して臨床疾患のリスク増加に関連することが知られている因子に基づいて選択される。予防的治療には、ａ）一次予防およびｂ）二次予防が含まれる。一次予防は、まだ疾患の臨床段階に達していない患者のための予防処置／予防策を指す。二次予防は、疾患の同じまたは類似の臨床状態の再発の予防である。
【００３７】
本発明の主題である化合物Ｉは、上皮組織のバリア機能の障害および免疫細胞の異常な活性に関連する疾患の処置、特に、免疫細胞の異常な走化性に関連する疾患の処置、好ましくは、アトピー性皮膚炎の治療に有望である。いくつかの特定の実施形態では、本発明の化合物が、上皮組織のバリア機能の障害および免疫細胞の異常な活性によって引き起こされる他の疾患の処置に使用され得る。
【００３８】
化合物の治療的使用のための方法
本発明の主題はまた、治療上有効量の本発明の化合物を、適切な処置を必要とする対象に投与するステップを含む。治療上有効量は、患者が処置（予防）に対する所望の応答を示す可能性が最も高いように患者に投与または送達される化合物の量である。正確な必要量は、対象の年齢、体重および全身状態、疾患の重症度、薬物投与の方法、他の薬物と組み合わせて使用されるかどうかなどに応じて、対象ごとに異なり得る。
【００３９】
本発明の化合物または化合物を含む医薬組成物は、疾患を処置または予防するのに有効な任意の量および任意の投与経路で、必要とする対象に投与することができる（局所投与経路が好ましい）。
【００４０】
化合物を特定の適切な薬学的に許容される担体と所望の投与量で混合した後、本発明の組成物を、ヒトまたは他の動物などに局所的に投与することができる。
【００４１】
投与は、１日に、１週間に１回もしくは数回（もしくは任意の他の時間間隔により）、または必要に応じて時々行うことができる。さらに、化合物を、特定の日数（例えば、２〜１０日）の間毎日対象に投与し、これに薬物を投与しない間隔（例えば、１〜３０日）が続くことができる。
【００４２】
本発明の化合物が併用療法レジメンの一部として使用される場合、併用療法成分の各々の用量が所望の処置期間にわたって投与される。併用療法を構成する有効成分は、一括して、全ての成分を含む投与量の形態で、または成分の個々の投与量の形態で、対象に投与することができる。
【００４３】
医薬組成物
本発明はまた、本発明の化合物（またはプロドラッグまたは他の薬理学的に許容される誘導体）と、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤および／または賦形剤、例えば、この化合物の薬理活性に影響を及ぼさず、治療量の化合物を送達するのに十分な用量で投与した場合に、非毒性である条件下で、本発明の化合物と組み合わせて対象に同時投与することができるものとを含有する医薬組成物に関する。
【００４４】
本発明はまた、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの亜鉛錯体を製造する方法であって、酢酸亜鉛とガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの混合物を極性溶媒中、好ましくは極性溶媒中で撹拌するステップと、生成物沈殿を単離するステップと、金属／配位子比が１／１のガンマ−Ｌ  β−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体を表す、得られた生成物を乾燥させるステップとを含む方法に関する。好ましい溶媒は、メタノールもしくは水、またはこれらの組み合わせである。このプロセスは、好ましくは、水性酢酸亜鉛、特に酢酸亜鉛二水和物を使用する。混合物の攪拌は、１５〜５０℃、好ましくは、メタノールが溶媒として使用される場合は１５〜４０℃の温度範囲、または水が溶媒として使用される場合は１５〜９０℃の温度で行われる。
【００４５】
本発明の化合物は、その薬学的に許容される塩の形態で使用することができる。具体的には、当業者に周知の有機酸および無機酸付加塩、例えば、塩酸塩または酢酸塩を調製することができる。
【００４６】
本発明による医薬組成物は、特定の剤形に適した、当業者に知られている任意の溶媒、希釈剤、分散剤または懸濁剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤および乳化剤、保存剤、結合剤、潤滑剤等を含み得る、薬学的に許容される担体と共に本発明の化合物を含む。薬学的に許容される担体として働くことができる適切な材料には、単糖およびオリゴ糖、ならびにその誘導体；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、サフロール油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張液、リンゲル液；エチルアルコールおよびリン酸塩緩衝液が含まれる。また、組成物は、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性適合性潤滑剤、ならびに着色剤、膜形成剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、保存剤および抗酸化剤を含み得る。
【００４７】
本発明の主題はまた、剤形、医薬組成物のクラスを網羅し、その組成物は、例えば、対象への局所投与のために、治療上有効用量でそれを必要とする対象に投与する特定の経路に最適化される。
【００４８】
本発明の剤形は、リポソーム法、マイクロカプセル化法、ナノフォーム（ｎａｎｏｆｏｒｍ）調製法、または当技術分野で知られている他の方法によって調製された製剤を含み得る。
【００４９】
局所投与のために、薬理学的に適合性の薬剤、例えば、プロピレングリコールまたはブチレングリコールを含有する軟膏、クリームおよび懸濁剤などの当業者に知られている形態を使用することができる。
【００５０】
医薬組成物の例
本発明に記載される化合物は、以下の組成物の形態で、ヒトまたは動物の疾患を予防および／または処置するために使用することができる：
【００５１】
軟膏、ｍｌ
有効成分  ４０ｍｇ
エタノール  ３００μｌ
水  ３００μｌ
１−ドデシルアザシクロヘプタノン  ５０μｌ
プロピレングリコール  １ｍｌまで
【００５２】
クリームＩ  重量％
有効成分  ０．００５〜０．５
油成分  １０．０〜１５．０
化粧品用ステアリン  ２．０〜３．０
乳化剤  １．０〜３．０
エマルジョンワックス  １．０〜３．０
トリエタノールアミン  ０．１〜０．６
ビタミンＡ  ０．００３〜０．０５
蒸留グリセリン  ２．０〜３．０
抗酸化剤  ０．０５〜０．０７５
保存剤  ０．１５〜０．２５
ティーツリーオイル  ０．３〜０．５
精製飲料水  １００％まで
【００５３】
クリームＩＩ  重量％
有効成分  ０．０１
植物油  １５．０
化粧品用ステアリン  ０．７５
乳化剤ＰＧ−３  ２．２５
エマルジョンワックス  ２．２５
トリエタノールアミン  ０．１
ビタミンＡ  ０．０２８
ソルビトール  ２．０〜３．０
ビタミンＥ  １．５
Ｍｏｎｏｍｕｌｓ（登録商標）９０−Ｏ１８  ０．７５
ニパゾール  ０．２
ニパギン  ０．３
ティーツリーオイル  ０．３〜０．５
精製飲料水  １００％まで
【００５４】
クリームＩＩＩ  重量％
有効成分  ０．１
植物油  １５．０
化粧品用ステアリン  ０．７５
乳化剤ＰＧ−３  ２．２５
エマルジョンワックス  ２．２５
トリエタノールアミン  ０．１
ビタミンＡ  ０．０２８
ソルビトール  ２．０〜３．０
ビタミンＥ  １．５
Ｍｏｎｏｍｕｌｓ（登録商標）９０−Ｏ１８  ０．７５
ニパゾール  ０．２
ニパギン  ０．３
ティーツリーオイル  ０．３〜０．５
精製飲料水  １００％まで
【００５５】
クリームＩＶ  重量％
有効成分  ０．３
植物油  １５．０
化粧品用ステアリン  ０．７５
乳化剤ＰＧ−３  ２．２５
エマルジョンワックス  ２．２５
トリエタノールアミン  ０．１
ビタミンＡ  ０．０２８
ソルビトール  ２．０〜３．０
ビタミンＥ  １．５
Ｍｏｎｏｍｕｌｓ（登録商標）９０−Ｏ１８  ０．７５
ニパゾール  ０．２
ニパギン  ０．３
ティーツリーオイル  ０．３〜０．５
精製飲料水  １００％まで
【００５６】
軟膏の場合、好ましい油成分は植物油、鉱油またはこれらの混合物である。植物油はオリーブ油、ヒマワリ油または両方の混合物であることができる。鉱油は流動ワセリンであることができる。グリセリン中不飽和脂肪酸のポリエステル（乳化剤ＰＧ−３）を乳化剤として使用することができる。ビタミンＡはパルミチン酸レチノールとして存在し得る。好ましい抗酸化剤は酢酸トコフェロールであり、保存剤はパラオキシ安息香酸の少なくとも１つの低級アルキルエステル、例えばメチルまたはプロピルエステルである。
【００５７】
これらの製剤は、標準的な製薬手順に従って調製することができる。
【００５８】
併用療法における化合物Ｉの使用
本発明の化合物Ｉは、独立した有効成分として投与することができるが、これはまた、１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて使用することができ、特に、他の薬剤が、抗生物質、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）または他の抗炎症剤、糖質コルチコイド、カルシニューリン阻害剤、抗ヒスタミン剤、膜安定剤、免疫向性剤（ｉｍｍｕｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔ）等によって表され得る。一緒に投与する場合、治療剤が同時にもしくは異なる時間に順次に投与される異なる剤形であることができる、または治療剤を組み合わせて単一剤形にすることができる。
【００５９】
他の医薬品と組み合わせた本発明の化合物に関する「併用療法」という句は、薬物組み合わせの有益な効果を提供する全ての薬剤の同時または順次投与を意味する。同時投与とは、特に、例えば、１つの軟膏、クリーム、錠剤、カプセル剤、注射または他の形態での、一定の比の活性物質との薬剤の同時送達、ならびにそれぞれ、いくつかの別個の剤形での各化合物の同時送達を意味する。
【００６０】
したがって、本発明の化合物の投与は、抗菌薬、細胞増殖抑制薬および細胞毒性薬、症状または薬物の１つの副作用を抑制する薬物の使用を含む、予防医学および関連疾患の処置の分野の当業者に知られている追加の療法と組み合わせて行うことができる。
【００６１】
製剤が剤形によって表される場合、このような組み合わせは、許容可能な用量範囲の本発明の化合物を含むべきである。本発明の化合物Ｉはまた、他の薬物の組み合わせが不可能である場合、これらの薬物と順次に患者に投与することができる。本発明は、投与の順序に限定されない；本発明の化合物は、別の薬物の投与の前または後に対象に同時投与することができる。
【００６２】
発明実施形態の例
試料の元素分析
試料の元素組成試験をマルチＥＡ  ５０００  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａを使用して行った。分析のために、秤量した試料約２０ｍｇ（正確に秤量）をオートサンプラーセルに入れた。装置に不活性ガス（ヘリウム）を充填した後、窒素、炭素および水分から精製した酸素１０ｃｍ３を添加し、試験試料を約１０００℃の温度で燃焼させた。過剰な酸素を除去するために、燃焼生成物を７５０℃の温度で金属銅に通した。次いで、ガスの混合物（ＣＯ２、Ｎ２およびＨ２Ｏ）を吸着トラップに通して水分を捕捉し、水素の量を決定した。次いで、窒素と一酸化炭素の混合物をガスクロマトグラフィーカラムに供給し、成分に分離し、これらをキャリアガスによって化学発光検出器ＣＬＤ（ガス混合物中の窒素含有量を分析する）およびＮＤＩＲ赤外線検出器（ガス混合物中の一酸化炭素の含有量を分析する）に移した。試験試料で決定された元素の各々の含有量の計算を、ソフトウェアパッケージｍｕｌｔｉＷｉｎを使用して行った。
【００６３】
ＩＲスペクトルを、ＩＦＳ−１１３ｖ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＩＲ分光計で、４０００〜４００ｃｍ−１の範囲で、１ｃｍ−１の分解能で記録した。試料を調製するために、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体をＫＢｒ（ＫＢｒ  １００ｍｇ当たり物質５ｍｇ）で粉砕し、圧力をかけて錠剤にし、スペクトルの評価に使用した。
【００６４】
実施例１（本発明に含まれない）．塩化亜鉛とガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの混合
この実施例は、これらの条件下では、亜鉛塩と遊離ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの混合物が形成されるので、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体を、亜鉛塩とガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンなどの成分の単純な混合によって調製することができなかったことを実証している。例えば、塩化亜鉛水溶液をガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンと１：２の比で混合し、アンモニア水を（媒体がわずかにアルカリ性になるまで）添加し、引き続いて生成物を沈殿させると、白色結晶性物質が形成される。元素分析データ（表１参照）は、錯体化合物の計算値に近いデータ値を示しているが、このデータを錯体形成の証拠と見なすことはできない。試料中の炭素および窒素の過小評価された含有量は、おそらく分析中に部分的に水を失う水酸化亜鉛の形成が他の元素の値を過小評価し得ることを示している。追加の冷水洗浄後に錯体の元素分析を繰り返すと、試料中の水素量がさらに過大評価される。
【００６５】
【表１】
2021534257.tif 000005
【００６６】
さらに、ＩＲ分光法のデータによると、元のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンと混合生成物のＩＲスペクトルは一致する（図１および図２参照）。シフトがなく、Ｃ＝Ｏ、−ＯＨ、および−ＮＨ基の吸収バンドの相対強度が一致していることは、実施例１で塩化亜鉛をガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンと混合すると、元のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンが単離され、亜鉛が無機化合物の形で放出されることを示している。
【００６７】
実施例２．本発明による亜鉛錯体の調製（方法１）
さらなる試験で、本著者は、水性酢酸亜鉛の使用を含む、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの亜鉛錯体を得る方法を開発した。
【００６８】
Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２＊２Ｈ２Ｏ  ２．２０ｇ（０．０１ｍｏｌ）をメタノール２０ｍｌに溶解し、激しく攪拌しながら、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミン２．４０ｇ（０．０１ｍｏｌ）および新たに調製したナトリウムメトキシド１．０８ｇ（０．０２ｍｏｌ）のメタノール５０ｍｌ中溶液に室温で一滴ずつ添加した。酢酸亜鉛溶液のおよそ半分の体積を添加した後、白色沈殿の形成が観察された。全ての酢酸亜鉛溶液を添加した後、撹拌を約４時間続け、生成物を濾別し、水（４ｘ１０ｍｌ）で洗浄し、重量が一定のままになるまで真空中６５℃で乾燥させる。収量２．６７ｇ（８８％）。
【００６９】
方法実施形態のこの技術の２回の試験操作を実施し、元素分析のための試料を各操作から得た。方法の実行の結果として得られたこれら２つの試料の元素分析データの分析によると、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミン／亜鉛のモル比のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの亜鉛錯体が形成される−１／１（表２参照）。
【００７０】
【表２】
2021534257.tif 000006
【００７１】
亜鉛のフォローアップ錯滴定を実施して、錯体組成および得られた金属／配位子比を確認した。亜鉛含有量を決定するために、生成物を以下のように鉱化した：重量約７０ｍｇの生成物の試料を、試料が完全に炭化するまで５倍量の濃硫酸で加熱した。次いで、３０体積％過酸化水素約１．５ｍｌを残渣に添加し、約１０分間煮沸した。残渣を２５ｍｌコニカルフラスコに移し、アンモニア緩衝液混合物（ｐＨ＝１０）約１０ｍｌおよび少量のエリオクロムブラックＴの乾燥指示薬を添加した。指示薬が完全に溶解し、溶液がラズベリー色になるまで、フラスコの内容物を完全に混合した。深紅色が紫から瑠璃色に変わるまで、試料を０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ溶液で滴定した。最後に、調製された生成物中の亜鉛の含有量は２１．５％であり、金属：配位子比が１：１の亜鉛錯体に対応する理論計算値（２１．１％）と一致することが示された。
【００７２】
生成物のＩＲスペクトル（図３参照）では、カルボニル基の２つの強いバンドが１６１６ｃｍ−１および１６４６ｃｍ−１で観察される。同時に、吸収の構造および周波数は、遊離ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンのスペクトルのものとは大幅に異なる（図１参照）；カルボキシル基のバンドは、亜鉛との配位により、より高い周波数にシフトする。また、生成物のＩＲスペクトルには、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンのスペクトルには存在しない３２７６ｃｍ−１の強い吸収バンドがある。これは、アミドフラグメントのＮ−Ｈ結合の振動、またはイミダゾール系のＮ−Ｈ結合に起因し得る。さらに、生成物のＩＲスペクトルでは、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンのスペクトルと比較して、指紋領域およびＣＨ結合の振動領域に複数の変化があり、試料に遊離ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンが存在しないことを示している。
【００７３】
調製された得られた生成物は、ＮＭＲスペクトルを記録するために使用される溶媒に不溶性である。
【００７４】
例として、図６は、５００．１３ＭＨｚの動作周波数で、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ５００，１３４００装置で記録されたＤ２Ｏ  ＮＭＲスペクトルを示している。
【００７５】
これは主に、非重水素化溶媒の残留シグナル、および元のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンに対応する低強度シグナルを含んでいる。
【００７６】
これは、不純物が存在せず、水性懸濁液中での得られた生成物の解離がわずかであることを示している。
【００７７】
実施例３．本発明による亜鉛錯体の取得（方法２）
本発明による本方法の修正の目標は、得られた生成物の濾過性を改善すること、ならびに反応混合物中の水酸化亜鉛の最も均一な分布を確実にすることである。
【００７８】
水酸化亜鉛の表面にガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンと亜鉛錯体が形成されると反応がさらに進行するのが妨げられるので、この技術では、スケーリングのために、分布の均一性の問題が極めて重要である。この問題を解決するために、水酸化ナトリウム溶液と酢酸亜鉛溶液の同時添加によって、その場で水酸化亜鉛を得ることが提案される。
【００７９】
合成「Ａ」：７０℃に加熱した懸濁液に対して、水１５０ｍｌ中ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミン１２．０ｇ（０．０５ｍｏｌ）、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液５０ｍｌおよび酸化亜鉛二水和物１１．０（０．０５ｍｏｌ）の水８０ｍｌ中溶液を、２つの漏斗を同時に使用して、一滴ずつ添加した。反応混合物を７０℃で４時間撹拌し、室温に冷却し、一晩放置した。沈殿を濾別し、フィルタ上で水３ｘ５０ｍｌで洗浄し、一定重量に達するまで、真空中４５〜５０℃で乾燥させた。収量は２１．５ｇ（生成物７１％）であった。
【００８０】
この方法によって得られたポリアモルファス（ｐｏｌｙａｍｏｒｐｈｏｕｓ）錯体は、ナトリウムメトキシドを使用してメタノール中で得られた実施例２による錯体と比較して、濾液の形態で分離するのが容易であった。
【００８１】
この技術を、合成「Ｂ」に従ってスケールアップおよび再現した。
【００８２】
合成「Ｂ」：７０℃に加熱した懸濁液に対して、水３００ｍｌ中ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミン２４．０ｇ（０．１ｍｏｌ）、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌおよび酸化亜鉛二水和物２２．０（０．１ｍｏｌ）の水１２０ｍｌ中溶液を、２つの漏斗を同時に使用して、一滴ずつ添加した。反応混合物を７０℃で４時間撹拌し、室温に冷却し、一晩放置した。沈殿を濾別し、フィルタ上で水４ｘ５０ｍｌで洗浄し、その重量が４４．１ｇ（生成物７１％）の一定のままになるまで、真空中４５〜５０℃で乾燥させた。
【００８３】
この方法の２回の試験操作を実施し、元素分析のための試料を各操作から得た。これら２つの試料の元素データの分析によると、反応の結果として、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミン／亜鉛のモル比−１／１のガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンとの亜鉛錯体が形成される（表３参照）。
【００８４】
【表３】
2021534257.tif 000007
【００８５】
得られた生成物のＩＲスペクトル（図４および図５参照）は、方法１によって合成されたガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体のスペクトルと類似であり、これらのスペクトルは、指紋領域に有意な差がなかった。
【００８６】
亜鉛の錯滴定を実施して、錯体組成および得られた金属／配位子比を確認した（表４参照）。結果として、方法２によって得られた生成物中の亜鉛含有量は約２２．０％であり、金属：配位子比が１：１の対応する亜鉛錯体の理論計算値（２１．１％）と一致することが示された。
【００８７】
【表４】
2021534257.tif 000008
【００８８】
本発明の化合物１の生物学的活性を、インビトロおよびインビボでのさまざまな実験で試験した。特に、免疫細胞の走化性に対する化合物１の阻害効果が、アトピー性皮膚炎のインビボモデルにおける化合物１の活性に焦点を当てた実験で示された。インビトロでの化合物１の生物学的活性の試験は、化合物１が酵素グルタミニルシクラーゼの阻害剤であり、したがって、免疫細胞の走化性に対する化合物１の効果は、グルタミニルシクラーゼの活性の阻害によって媒介され得ることを確立した。
【００８９】
実施例４．インビトロでのヒトグルタミニルシクラーゼの酵素活性に対する化合物１の効果の試験
インビトロでのグルタミニルシクラーゼの酵素活性に対する化合物１（本発明の主題である）の効果の試験において、組換え細胞内ヒトグルタミニルシクラーゼに対する化合物１の直接的阻害効果が発見された。
【００９０】
さまざまな化合物１濃度でのグルタミニルシクラーゼの活性を、蛍光基質Ｌ−グルタミニル２−ナフチルアミド（Ｇｌｎ−ｂＮＡ）を使用して２５℃で試験した［Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２  Ａｐｒ  １；３０３（１）：４９−５６］。体積１００μｌの反応混合物は、５０マイクロモルのトリスアミノメタンＨＣｌおよび５％グリセロール、ｐＨ８．０中５０μＭの蛍光原基質；約０．２ユニットのヒトピログルタミニルアミノペプチダーゼ（１ユニットは、１分当たり１マイクロモルのｐＧｌｕ−ｂＮＡを加水分解する量として定義される）および組換え細胞内ヒトグルタミニルシクラーゼ（ｇＱＣ）のアリコートを含有していた。化合物１と共に５分間インキュベートしたグルタミニルシクラーゼのアリコートを反応混合物に添加することによって、反応を開始した。
【００９１】
反応のさらなる進行を分光光度的に監視した（励起波長および発光波長は３２０ｎｍおよび４１０ｎｍであった）。酵素活性を、較正曲線に基づいて計算された、放出された２−ナフチルアミド（ｂＮＡ）の量によって決定した。ＩＣ５０値を、「阻害剤濃度」−「酵素活性」曲線の非線形回帰を使用して計算した。
【００９２】
実験は、化合物１がＩＣ５０＝２６μＭでグルタミニルシクラーゼの活性を阻害することを示した。
【００９３】
実施例５．マウスアトピー性皮膚炎モデルにおける化合物１の活性の試験
実験技術．アトピー性皮膚炎のモデルにおける化合物１活性の試験を、標準的な技術を使用して行った［Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２．Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ５４５４９７，９  ｐａｇｅｓ］。実験群では、偏差の兆候のない平均的外観の動物を選択し、動物の体重は性別の平均値から±２０％以下とした。
【００９４】
実験の０日目および１２日目に、ｂａｌｂ／ｃ系統の雄マウスを、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ）のエタノール中２％溶液１００μｌで処置し、背中の事前に剪毛した領域に施用して体を感作させた。１７日目に、ＤＮＣＢの２％アルコール溶液２０μｌを、１時間の間隔で２回、動物の「試験」右耳に施用した。活性物質含有量が０．０１重量％の化合物１クリームを、最後にＤＮＣＢを耳に施用した１時間後および１３時間後の２回、「試験」右耳に局所投与した。以下を比較／参照／対照薬物として使用した：メチルプレドニゾロンアセポネート（外用０．１％軟膏）、ピリチオン亜鉛（外用０．２％クリーム）、ピメクロリムス（外用１％クリーム）およびガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミン０．０１％を含有する外用クリーム。１８日目に、動物を安楽死させ、罹患耳の組織学的分析を実施した。厚さ５μｍの組織切片をヘマトキシリン−エオシンで染色した。皮膚炎を示す顕微鏡的変化の評価を、以下のスケールに従って行った：
１）表皮肥厚−乳頭間突起の伸長を伴う表皮および上皮の肥厚：
０点−病理なし；
０．５点−病理が検出されたが、極めて弱く発現；
１点−中等度から重度の病理；
２点−重度の病理。
２）角質増殖は、角質層の著しい肥厚または正常な拒絶反応の遅延を特徴とする皮膚状態の非炎症性特徴である：
０点−病理なし；
０．５点−病理が検出されたが、極めて弱く発現；
１点−示される病理の明確な存在。
３）膿疱（膿瘍）−化膿性内容物を伴う空洞性の急性炎症要素：
０．５点−病理の単一徴候；
１点−軽度の病理；
２点−中等度から重度の病理；
３点−重度の病理；
４点−全体的病理。
４）嚢胞は、重層扁平角質化上皮によって裏打ちされ、角質塊の層で満たされた、上皮の過形成（表皮肥厚）が存在する場合に発生する、丸みを帯びたまたは楕円形の構造である：
０点−病理なし；
０．５点−病理が検出されたが、極めて弱く発現；
１点−示される病理の明確な存在。
５）炎症：
０点−病理なし；
０．５点−病理の単一徴候；
１点−軽度の病理；
２点−中等度から重度の病理；
３点−重度の病理；
４点−全体的病理。
６）浮腫：
０点−病理なし；
０．５点−病理の単一徴候；
１点−軽度の病理；
２点−中等度から重度の病理；
３点−重度の病理；
４点−全体的病理。
【００９５】
得られたデータを、データセット内の外れ値を検出するために使用される検定である最大正規化残差検定としても知られるグラブスの検定を使用して検証した。この検定で「外れ値」として識別された値は、以降の分析には使用しなかった。全てのデータに記述統計を使用した：平均（Ｍ）および平均の標準誤差（ｍ）を計算した。実験で得られた値の正規分布を、コルモゴロフ−スミルノフ検定を使用して検証した。正規分布の場合、スチューデントのｔ検定を使用して群間差を評価した。非正規分布の場合、クラスカル−ウォリス検定（ダンの事後解析を使用）を使用して、いくつかの群を比較した。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア５．０を使用して実施した。差は５％信頼水準で決定した。
【００９６】
実験の結果を図７および図８に示す。図７に示されるデータから分かるように、組織学的分析によるマウスアトピー性皮膚炎モデルの皮膚病変に対する化合物１（０．０１重量％）を含有するクリームの薬理学的効果を、以下によって評価した：ａ）表皮肥厚（点）、ｂ）角質増殖（点）、ｃ）膿疱（点）、ｄ）嚢胞（点）、ｅ）炎症（点）、ｆ）浮腫（点）。実験を以下に従って行った：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２．Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ５４５４９７，９  ｐａｇｅｓ．注：＊−インタクト群との差の有意性（Ｐ＜０．０５）、＆−対照との差の有意性（Ｐ＜０．０５）。
【００９７】
図８は、ヘマトキシリン−エオシンで染色されたマウスアトピー性皮膚炎モデルの罹患耳の皮膚の組織切片を２０倍の倍率で示している。
【００９８】
Ａ−インタクト動物群；Ｂ−病理対照；Ｃ−Ａｄｖａｎｔａｎ（メチルプレドニゾロンアセポネート、軟膏０．１％）；Ｄ−ピメクロリムス（Ｅｌｉｄｅｌ  １％クリーム）；Ｅ−化合物Ｉクリーム０．０１％。１−表皮；２−真皮；３−炎症性浸潤。実験を以下に従って行った：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２．Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ５４５４９７，９  ｐａｇｅｓ．
【００９９】
化合物１（０．０１重量％クリーム）を皮膚に施用すると、炎症細胞（単球、樹状細胞、好酸球および好中球）の皮膚の表皮および真皮への流入がインタクト動物のレベルまで減少すると同時に、アトピー性皮膚炎の他の顕微鏡的徴候も減少した。作用に関しては、化合物１（ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミンの亜鉛錯体）が、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミン配位子の作用と比較して有意な改善を示すことに留意することが重要である。したがって、化合物１の治療活性は、ガンマ−Ｌ−グルタミルヒスタミン単独の活性によって説明することはできない。有効性に関しては、化合物１クリームは、参照薬であるメチルプレドニゾロンアセポネート、ピリチオン亜鉛およびピメクロリムスと比較して優れた性能を示した。得られた結果により、化合物１がアトピー性皮膚炎の処置において改善された治療効果を示したと結論付けることができる。
【０１００】
結論
したがって、行われた試験は、化合物１がグルタミニルシクラーゼ酵素を阻害するのに有効であることを示した。アトピー性皮膚炎のモデルでは、化合物１が、インビボでの炎症細胞（単球、樹状細胞、好酸球および好中球）の流入、ならびにアトピー性皮膚炎の他の顕微鏡的徴候を阻害することが示された。
【０１０１】
本発明を、開示される実施形態を参照して説明してきたが、詳細に説明された特定の実験は、本発明を例示する目的でのみ提供され、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが当業者に明らかであるべきである。本発明の本質から逸脱することなく、さまざまな修正が可能であり得ることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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