(57)【要約】  本願はＰＫＣα−ＬＳＤ１−ＮＦ−κＢを標的にする炎症反応調節剤スクリーニング方法を開示する。過度な炎症性刺激に反応して、ＰＫＣαは核に移動してＬＳＤ１をリン酸化させる。ＬＳＤ１リン酸化はｐ６５結合に必要で、ｐ６５の脱メチル化を促進してｐ６５タンパク質の安定性を向上させる。従って本願に係る方法は、ＰＫＣαまたはＬＳＤ１活性の抑制により敗血症を含む全身性炎症疾患の治療剤開発に有用に使用されることができる。【選択図】図７
2021501315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＫａ、ＬＳＤ１及びＮＦ−κＢを発現する細胞を提供する段階；
前記細胞にＮＦ−κＢ媒介された炎症反応を誘発することができる刺激を処理する段階で、前記処理によって前記細胞でＰＣＫα→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢ経路による炎症反応が誘発されて、
前記細胞に前記経路による炎症反応を抑制すると期待される試験物質を処理する段階；及び
前記処理結果、前記試験物質で処理されなかった対照群と比較して前記試験物質で処理された細胞で前記経路による炎症反応が抑制された場合、前記試験物質を炎症反応抑制候補物質として選別する段階を含み、
前記経路による前記炎症反応の抑制は、前記ＬＳＤ１のリン酸化減少、前記ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの脱メチル化の抑制または前記ＬＳＤ１と前記ｐ６５サブユニットの結合減少の中の一つ以上で測定されるものである、ＮＦ−κＢによって媒介される炎症反応抑制剤スクリーニング方法。
【請求項２】
前記ＮＦ−κＢ媒介された炎症反応を誘発することができる刺激は、ＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒα）、ＩＬ−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １−ｂｅｔａ）、ＰＡＭＰ（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）またはバクテリアＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、Ｒａｗ  ２６４．７またはＢＭＤＭ（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＣＫａ、ＬＳＤ１及びＮＦ−κＢを発現する細胞の代りに、前記細胞はヒトを除いた動物モデルとして提供される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記炎症抑制剤は、敗血症、自己免疫疾患またはリューマチ関節炎治療剤として使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
炎症調節機序を基にする治療剤開発に関連する技術分野である。
【背景技術】
【０００２】
ＮＦ−κＢシグナルによって媒介される炎症反応は、病原菌の侵入に対する宿主の防御に必須である。ＮＦ−κＢシグナル伝達の調節メカニズムはよく研究されたが、このような炎症反応の後成的な調節はあまり知られていない。
【０００３】
特に炎症反応による敗血症は、致死率が７０％に達して集中治療室入院患者の２０％を占めて全世界的に一日に１５００人以上死亡する深刻な疾患である。しかしながら、他の疾病に比べて死亡率が相当高いにも関わらず、未だ特別な治療薬が開発されていない。現在販売中の唯一の敗血症治療剤は、多国籍製薬会社リリー（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＣＯ．）のジグリス（Ｘｉｇｒｉｓ）がある。ジグリスは、活性化したプロテインＣと類似の物質で炎症を低くし、血液凝固を緩和させる。この治療剤の場合、２００１年感染による高い死亡危険がある成人患者に使用が承認されたが、小児臨床実験の結果ジグリス（Ｘｉｇｒｉｓ）は、重症血液感染小児に効果がなく頭の出血などの深刻な副作用を誘発して臨床実験を中断させた状態である。
【０００４】
近年敗血症から見える初期過度な先天性免疫反応が免疫反応不能（ｉｍｍｕｎｏｐａｒａｌｙｓｉｓ）を誘導して、大多数の死亡患者の場合に初期過度な免疫反応による死亡よりは一次病原菌あるいは二次病原菌に対抗した免疫反応不能によって死亡すると報告された（Ｄｏｃｋｅ，Ｗ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｐｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＩＦＮ−γｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ.３，６７８−８１（１９９７））。このような結果は、初期炎症性サイトカインの抑制技術だけでは敗血症の治療に限界があることを示す。
【０００５】
従って、安全で高い治療効果を得ることができる様々な機序に基づいた新しい薬剤開発が切実な状況である。
【０００６】
敗血症は、エンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）のようなバクテリア生成物がToll様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合して始まり、アダプタ分子を介してシグナリングが中継されて、ＮＦ−κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ−ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ−ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｂｃｅｌｌｓ）を含む転写因子（ＴＦ）までシグナルが続くことが知られている（Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００３；１８７：Ｓ３６４−Ｓ３６９；Ｔｉｒｕｐｐａｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；１５：２３９２４７）。全身性炎症疾患で炎症関連した分子中一つであるＮＦ−κＢシグナル伝達は、炎症反応を微調整するために必ず精巧に調節されなければならない（Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２０１４；２８：２１２０−２１３３）。
【０００７】
米国公開特許公報第２００９−０３１７８３３号は、ＴＬＲ４（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）細胞内領域に結合する物質のスクリーニング方法に関し、ＮＦ−κＢによって転写が調節されるＴＬＲ４に結合してＴＬＲ４に対するシグナル伝達経路を遮断して炎症を調節する機序を開示する。
【０００８】
しかし、免疫体系が病原菌露出の強度と露出の持続期間をどのように感知するのか、または、どのようなシグナル伝達経路またはシグナルカスケードが追加的な活性化を決めるのかに対する分子的メカニズムを根拠とした治療剤の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願は、新しい炎症反応誘発機序に基づいた治療剤スクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一様態で本願は、ＰＣＫａ、ＬＳＤ１及びＮＦ−κＢを発現する細胞を提供する段階；前記細胞にＮＦ−κＢ媒介された炎症反応を誘発することができる刺激を処理する段階で、前記処理によって前記細胞でＰＣＫα→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢ経路による炎症反応が誘発されて、前記細胞に前記経路による炎症反応を抑制すると期待される試験物質を処理する段階；及び前記処理結果、前記試験物質で処理されなかった対照群と比較して前記試験物質で処理された細胞で前記経路による炎症反応が抑制された場合、前記試験物質を炎症反応抑制候補物質として選別する段階を含み、前記経路による前記炎症反応の抑制は、前記ＬＳＤ１のリン酸化減少、前記ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの脱メチル化の抑制または前記ＬＳＤ１と前記ｐ６５サブユニットの結合減少中一つ以上で測定されるものである、ＮＦ−κＢシグナルによって媒介される炎症反応抑制剤スクリーニング方法を提供する。
【００１１】
一実現例で前記ＰＣＫα→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢ経路によるＮＦ−κＢ媒介された炎症反応を誘発し得る刺激は、刺激を受容する受容体は異なるが、ＰＣＫα→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢ経路ＮＦ−κＢによる経路を活性化または誘発または触発及び増幅させることができる刺激で、ＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒα）、ＩＬ−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １−ｂｅｔａ）、ＰＡＭＰ（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）またはバクテリアＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）のような免疫状況特異的に作用する刺激である。
【００１２】
一実現例で本願に係る方法に使用することができる細胞は、マクロファージ、たとえばマウスマクロファージ由来であるＲａｗ  ２６４．７（ｍｏｕｓｅ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）またはＢＭＤＭ（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）が使用される。
【００１３】
一実現例で本願に係る方法でＰＣＫａ、ＬＳＤ１及びＮＦ−κＢを発現する細胞の代りに、または、前記細胞はヒトを除いた動物モデルとして提供されることができる。
【００１４】
本願に係る方法によって選別された候補物質は、ＮＦ−κＢ媒介された炎症疾患の治療、たとえば慢性炎症疾患敗血症、自己免疫疾患またはリューマチ関節炎治療剤として使用され得る。
【発明の効果】
【００１５】
ＮＦ−κＢシグナルによって媒介される炎症反応は、病原菌の侵入に対する宿主の防御に必須である。ＮＦ−κＢシグナル伝達の調節メカニズムはよく研究されているが、炎症反応の後成的な調節はあまり知られていない。本発明では、炎症反応の活性化と増幅にＰＫＣα−ＬＳＤ１−ＮＦ−κＢという新しいシグナル伝達軸が重要であることを確認した。過度な炎症性刺激に反応して、ＰＫＣαは核に移動してＬＳＤ１をリン酸化させる。ＬＳＤ１リン酸化は、ｐ６５結合に必要であり、ｐ６５の脱メチル化を促進してｐ６５タンパク質の安定性を向上させる。本願によると、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスを用いたＬＳＤ１リン酸化の除去及び野生型マウスでＰＫＣαまたはＬＳＤ１活性の抑制が、敗血症が誘発した炎症性肺損傷及び死亡率を減少させることが示された。これは、ＰＫＣα−ＬＳＤ１−ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードが、炎症反応の制御に重要であることを示し、このようなシグナル伝達を標的にする薬物の開発は、敗血症を含む全身性炎症疾患の治療剤開発に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＬＳＤ１がＰＫＣαによって炎症シグナルに反応してリン酸化されるのを示す。（Ａ）野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスにＰＢＳあるいはＬＰＳ（体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ注射）を腹腔内注射して６時間以後肺のＨ＆Ｅ染色した図（各グループ当たり６匹ずつ実験）である。スケールバー、１００μｍ。見られるイメージは３回の独立実験による代表イメージである。（Ｂ）週齢、重さが類似の野生型（１１匹）とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウス（１０匹）にＬＰＳを注射した以後７２時間生存率をモニターした。（＊＊ｐ＜０．０１、ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）（Ｃ）野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスでＢＭＤＭを抽出して、ＬＰＳを２時間処理した後（あるいはＬＰＳを処理しない）表示された抗体で免疫ブロットした。（Ｄ）野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウス（グループ当たり６匹）で抽出した肺組織の免疫ブロットデータである。マウスは、ＬＰＳ腹腔注射（体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ注射、注射後６時間以後に実験する）１時間前にＧｏ６９７６（体重１ｋｇ当り１ｍｇ注射、ｃｏｒｎ  ｏｉｌに溶かす）あるいはＧｏ６９７６の溶媒であるｃｏｒｎ  ｏｉｌを注射した。（Ｅ）表示された時間ＬＰＳを処理した後、野生型ＢＭＤＭで免疫ブロットした結果である。ｔｕｂｉｌｉｎ抗体は、細胞質タンパク質のローディングコントロールとして使用された。ｌａｍｉｎＡ／Ｃ抗体は、核タンパク質のローディングコントロールとして使用された。（Ｆ）ＢＭＤＭ細胞にＧｏ６９７６を６時間処理したり処理しなかった状態でＬＰＳを２時間処理した。その後核タンパク質だけ分離抽出してＰＫＣαとＬＳＤ１の免疫沈降実験を行った。（Ｇ）表示された時間ＢＭＤＭにＬＰＳを処理して核タンパク質だけ分離して表示された抗体で免疫ブロット実験を行った。（Ｈ）ＬＰＳを表示された濃度により２時間処理した後ＢＭＤＭの核タンパク質だけ分離して表示された抗体で免疫ブロット実験を行った。
【図２】ＬＰＳで誘発されたＬＳＤ１のリン酸化はゲノム全体水準でＮＦ−κＢ標的遺伝子の活性化に必要であることを示す。（Ａ）ＲＮＡシーケンシング分析の戦略を示す流れ図である。（Ｂ）階層的クラスタリング結果３，５５８個の異なるように発現する遺伝子（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｇｅｎｅ以下、ＤＥＧ）を確認した。転写開始位置（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｓａｒｔ  Ｓｉｔｅ、以下ＴＳＳ）＋／−２．５ｋｂｐｓ周辺にｐ６５ピークの有無を描いた。（Ｃ）クラスタ１遺伝子のＧＯ（ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ）分析によりサイトカインの産生と炎症反応に関連した遺伝子がクラスタ１遺伝子プールで有意に多く分布することを確認した。（Ｄ）クラスタ１内の遺伝子のＴＳＳ近くにｐ６５ピークに対するＤｅ  ｎｏｖｏ  ｍｏｔｉｆ分析。Ｈｙｐｅｒｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｐ−値を計算した。（Ｅ）野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスのＢＭＤＭでＬＰＳ２時間処理有無によるＬＳＤ１リン酸化依存遺伝子のｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ結果分析である（Ｆ）野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウス（各グループ当たり６匹）の肺組織でＬＰＳ６時間腹腔注射有無に応じだＬＳＤ１リン酸化依存遺伝子のｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ結果分析である（Ｇ）野生型マウスは、ＬＰＳ腹腔注射（体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ注射、注射後６時間以後に実験する）１時間前にＧｏ６９７６（体重１ｋｇ当り１ｍｇ注射、ｃｏｒｎ  ｏｉｌに溶かす）あるいはＧｏ６９７６の溶媒であるｃｏｒｎ  ｏｉｌを注射した（グループ当たり６匹）。マウスの肺組織でＬＳＤ１リン酸化依存遺伝子のｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ結果分析。データは平均±標準偏差で表現された；ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（Ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。
【図３】ＬＰＳ誘発ＬＳＤ１リン酸化が標的遺伝子のプロモーターにｐ６５をリクルートするのに必要であるいうことを示す。（Ａ）ＢＭＤＭ細胞でＬＰＳの２時間処理して、ｐ６５とＬＳＤ１の結合を核タンパク質だけ抽出した以後免疫沈降実験により行った。（Ｂ）ＰＫＣαの野生型とｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ形態を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ実験。ＧＳＴ−ＬＳＤ１とＧＳＴ−ｐ６５をＥ．ｃｏｌｉで精製して基質として使用し。（Ｃ）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＳＴ  ｐｕｌｌｄｏｗｎ実験は、リン酸化されたＧＳＴ−ＬＳＤ１（ＧＳＴ  ｐｕｌｌｄｏｗｎ実験が実行される前にＰＫＣαを使用したキナーゼ実験が先行した）とｐ６５を使用して行われた。この時、１，０００  ｕｎｉｔのλ−ｐｏｓｐｈａｔａｓｅ有無で実験が行われた。（Ｄ）野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスのＢＭＤＭでＬＰＳ２時間処理による、ＬＳＤ１リン酸化依存標的プロモーターでのＣｈＩＰ実験。（Ｅ）予め６時間Ｇｏ６９７６を処理したＲａｗ２６４．７細胞でＬＰＳ２時間処理してＬＳＤ１リン酸化依存標的プロモーターでのＣｈＩＰ実験を実行。データは平均±標準偏差で表現された；ｎ＝３、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（Ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（Ｄ、Ｅ）。
【図４】ＬＳＤ１によるｐ６５の脱メチル化がｐ６５のタンパク質安定化を増大させることを示す。（Ａ）Ｒａｗ２６４．７細胞にＬＳＤ１のｆｌａｇ  ｔａｇを有している野生型（ＷＴ）、ＳＡ、そしてＫＡ突然変異をトランスフェクションしてＭＧ１３２を４時間処理した後、ＬＰＳを２時間追加処理した。この細胞の核タンパク質だけ抽出してｐ６５とＷＴ、ＳＡ、ＫＡ間の免疫沈降実験を行った。（Ｂ）Ｒａｗ２６４．７細胞にＭＧ１３２を４時間処理してＬＰＳを２時間追加して、核タンパク質だけ抽出した以後ｉｎ  ｖｉｖｏ脱メチル化実験を行った。ｐ６５抗体を用いた免疫沈降実験以後、ｐ６５のメチル特異抗体を利用してｐ６５のメチル化を探知した。（Ｃ）細胞ｌｙｓａｔｅで基質であるｆｌａｇ−ｐ６５を精製して、メチル化酵素としてＧＳＴ−ＳＥＴ７／９をＥ．ｃｏｌｉで精製して、脱メチル化酵素であるＨｉｓ−ＬＳＤ１は、Ｅ．ｃｏｌｉで精製してｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱メチル化実験を行った。脱メチル化実験前にリン酸化されたＬＳＤ１を得るためにＰＫＣαを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ実験が先行された。反応物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ以後、ｐ６５Ｋ３１４／３１５メチル化を認知する抗体を用いてｐ６５のメチル化を探知した。（Ｄ）ＭＧ１３２が４時間予め処理された野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスのＢＭＤＭにＬＰＳ追加２時間処理して核タンパク質だけ抽出した以後表記された抗体を用いて免疫ブロット実験を実行した。（Ｅ）Ｒａｗ２６４．７細胞にＬＳＤ１のｆｌａｇ  ｔａｇを有している野生型（ＷＴ）、ＳＡ、そしてＫＡ突然変異をトランスフェクションしてＭＧ１３２を４時間処理した後ＬＰＳを２時間追加処理した。このタンパク質抽出物をＮｉ２＋−ＮＴＡ  ｂｅａｄを使用してｐｕｌｌｄｏｗｎ下した。ｐ６５のユビキチン化はｐ６５抗体を介して検出された。（Ｆ）ＭＧ１３２を４時間処理した後ＬＰＳを２時間追加処理したＲａｗ２６４．７細胞でｐ６５抗体を用いて免疫沈降した。ｐ６５のユビキチン化はＦＫ２抗体を介して検出された。（Ｇ）ＬＳＤ１リン酸化を媒介したｐ６５の脱メチル化がｐ６５の安定化を引き起こすとの内容の図である。
【図５】ＰＫＣα−ＬＳＤ１リン酸化軸が持続的な炎症反応を調節することを示す。（Ａ）野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスのＢＭＤＭに表記された時間によりＬＰＳを処理して、Ｍｃｐ−１、Ｉｌ−６、ＣｅｂｐｄのｍＲＮＡをｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲにより検出した。（Ｂ）Ｇｏ６９７６を野生型マウスのＢＭＤＭに６時間先処理した後、表記された時間によりＬＰＳを処理して、Ｍｃｐ−１、Ｉｌ−６、ＣｅｂｐｄのｍＲＮＡをｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲにより検出した。（Ｃ）ＢＭＤＭでＬＰＳを表記された時間により処理して核タンパク質だけ抽出してｐ６５とＬＳＤ１のｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ結合状態を確認した（Ｄ）野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスのＢＭＤＭに表記された時間帯でＬＰＳを処理して、表記された抗体を用いてＬＳＤ１リン酸化依存標的プロモーターでのＣｈＩＰ実験を実行した。（Ｅ）ＢＭＤＭで表記された抗体を用いてＬＳＤ１リン酸化依存的な標的プロモーターでＣｈＩＰ実験進行。６時間Ｇｏ６９７６を先処理した後、細胞収集前に指定された時間ＬＰＳを処理した。データは、平均±標準偏差で表現された；ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（Ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）。（Ｆ）過度なＬＰＳが持続的な炎症反応の間核でｐ６５安定化を促進する時期と方法に対する概略図である。
【図６】核内でｐ６５の持続的な発現とそれに伴う炎症反応の活性化がＰＫＣα−ＬＳＤ１−ＮＦκＢシグナル伝達により行われることを示す。（Ａ）野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスのＢＭＤＭに表記された時間によりＬＰＳを処理して核タンパク質を抽出して指定された抗体を用いて免疫ブロットが行われた。（Ｂ）免疫蛍光分析実験の代表イメージである。免疫蛍光分析実験は、Ｌｓｄ１−／−ＭＥＦ細胞にＨＡ  ｔａｇが付いたＷＴ、ＳＡ、ＫＡ突然変異形態をトランスフェクションした後、指定された時間ＬＰＳを処理して行われた。ＨＡ（緑）；ｐ６５（赤）；ＤＡＰＩ（青）、スケールバー、２０μｍ。（Ｃ、Ｄ）ＢＭＤＭ（Ｃ）とＲａｗ２６４．７（Ｄ）細胞の核タンパク質で指定された抗体を用いた免疫ブロット実験が行われた。Ｇｏ６９７６あるいはＧＳＫ−ＬＳＤ１が６時間前処理されて細胞収集前に指定された時間ＬＰＳが処理された。（Ｅ）Ｒａｗ２６４．７細胞の核タンパク質で指定された抗体を用いて免疫ブロット実験が行われた。Ｇｏ６９７６とＧＳＫ−ＬＳＤ１が６時間前処理されてＬＰＳを２時間追加処理した。この時、細胞収集４時間前にＭＧ１３２が処理された。
【図７】ＰＫＣαやＬＳＤ１の活性をマウスで抑制することが敗血症による死亡率を減少させることを示す。（Ａ）野生型マウス（各グループ当たり３匹）の肺組織で免疫ブロット実験をした。マウスにＬＰＳ腹腔注射（体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ注射、注射後６時間以後に実験した）１時間前にＧｏ６９７６（（ＣＡＳ１３６１９４−７７−９）、選別的ＰＫＣ抑制剤、体重１ｋｇ当り１ｍｇ注射）あるいはＧＳＫ−ＬＳＤ１（体重１ｋｇ当り１ｍｇ注射）を腹腔で注射した。（Ｂ）野生型（青線）、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡ（赤線）マウスはＣＬＰ手術（各グループ当たり２０匹）を受けた。動物の生存率は、ＣＬＰ手術以後１４４時間毎６時間単位でモニタリングされた。（Ｃ、Ｄ）ＣＬＰ手術後で１２時間、５０時間にそれぞれ静脈注射により、体重１ｋｇ当り１ｍｇのＧｏ６９７６を注射（緑線、それそれ２０匹）（Ｃ）またはＧＳＫ−ＬＳＤ１を注射（紫線、それそれ２０匹）した。ＣＬＰ手術以後１４４時間毎６時間単位で生存率がモニタリングされた。＊＊ｐ＜０．０１（ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）（Ｂ−Ｄ）（Ｅ）ＣＬＰ手術以後肺組織のＨ＆Ｅ代表写真。野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウス。あるいは野生型マウスにＧｏ６９７６、ＧＳＫ−ＬＳＤ―又はｖｅｈｉｃｌｅを体重１ｋｇ当り１ｍｇでそれぞれ手術以後１２時間、５０時間に静脈注射した（グループ当たり６匹ずつ）。マウスはＣＬＰ手術以後７２時間で安楽死させた。スケールバー、２００μｍ。（Ｆ、Ｇ）ＣＬＰ手術以後７２時間に、血中サイトカイン（ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）の濃度。野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウス（Ｆ）、あるいは野生型マウスにＧｏ６９７６、ＧＳＫ−ＬＳＤ―又はｖｅｈｉｃｌｅを体重１ｋｇ当り１ｍｇでそれぞれ手術以後１２時間、５０時間に静脈注射した（Ｇ）。（Ｈ、Ｉ）敗血症マーカーであるＡＬＴ、ＬＤＨ、ＢＵＮがＣＬＰ手術以後７２時間に測定された。野生型とＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウス（Ｈ）、あるいは野生型マウスにＧｏ６９７６、ＧＳＫ−ＬＳＤ―又はｖｅｈｉｃｌｅを体重１ｋｇ当り１ｍｇでそれぞれ手術以後１２時間、５０時間に静脈注射した（Ｉ）。データは、平均±標準偏差で表現された；ｎ＝５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（Ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（Ｆ、Ｈ）。データは、平均±標準偏差で表現された；ｎ＝５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）（Ｇ、Ｉ）。（Ｊ）ＰＫＣαあるいはＬＳＤ１の活性を防ぐことがｐ６５のタンパク質安定性を減少させて急性全身炎症に対する抵抗性を誘導して野生型に比べてＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスで敗血症による生存率を増加させることを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本願は、過度な炎症刺激に応じた炎症反応の活性化及び増幅においてＰＫＣα→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢにつながる新しいシグナル伝達軸が重要であるとの発見に基づいたものである。具体的にＬＳＤ１（ｌｙｓｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  １）が、炎症反応の重要な後成因子として、過度な炎症性刺激に反応して核に移動したＰＫＣα（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃα）によりリン酸化されてＮＦ−κＢのｐ６５を脱メチル化させて安定化を増大させて、炎症反応を活性化することを解明した。ＬＳＤ１による脱メチル化がｐ６５タンパク質を安定化させるようになりＮＦＫＢの活性を持続させて炎症反応が増幅される。従って、一実現例で図５及び６等の実験結果及び図７Ｊに図示した通りＰＫＣαまたはこれによるＬＳＤ１の脱メチル化活性を抑制してＮＦ−κＢを構成するｐ６５のタンパク質安定性を減少させると急性全身炎症に対する抵抗性を誘導して生存率を増加させることができる。
【００１８】
そこで一様態で本願は、本願で解明された、炎症反応誘発で重要な役割をするＰＣＫａ→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢ経路を標的にする炎症反応抑制剤のスクリーニング方法に関するものである。
【００１９】
本願に係る方法は、ＰＣＫａ、ＬＳＤ１及びＮＦ−κＢを発現する細胞を提供する段階；前記細胞にＮＦ−κＢ媒介された炎症反応を誘発することができる刺激を処理する段階で、前記処理によって前記細胞でＰＣＫα→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢ経路による炎症反応が誘発、触発または始まり、前記細胞に前記経路を抑制、または前記経路による炎症反応を抑制すると期待される試験物質を処理する段階；及び前記処理結果、前記試験物質で処理されなかった対照群と比較して前記試験物質で処理された細胞で前記経路が抑制された場合、または、前記経路による炎症反応が抑制された場合、前記試験物質を炎症反応抑制候補物質として選別する段階を含む。
【００２０】
プロテインキナーゼＣアルファ（ＰＫＣα）によるＬＳＤ１の調節は、明暗周期リズム調節で知られていて、ＮＦ−κＢは炎症因子として知られているが、炎症反応調節機序でＰＣＫａ→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢ経路は本願で初めて解明されたものである。ＰＫＣαは、ＰＫＣα、ＰＫＣβ１／β２及びＰＫＣγの活性剤であるｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）をマウスに処理すると、表皮で炎症性サイトカインの発現が増幅されて同時に急性炎症反応が誘導されることが報告されている（Ｓｉｌｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．１９９６；４５：２８９２９２）。またＰＫＣシグナリングが炎症反応の活性化に決定的な役割をするが（Ｌａｎｇｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４０：５０５５１５）、ＰＫＣの基質とＰＫＣによる炎症反応活性化と関連した標的遺伝子に対する分子メカニズムがまだ明確に明らかになっていない。本願では、ＰＫＣαの直接的な基質がＬＳＤ１でありＬＳＤ１をリン酸化してｐ６５はリン酸化しないことを解明した（図１等参照）。
【００２１】
リジン特異的脱メチル化酵素１（ＬＳＤ１、ＡＯＦ２またはＢＨＣ１１０ともいう）は、ＦＡＤ依存性アミン酸化酵素反応によりヒストン脱メチル化酵素として作用する（Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００５；４３７：４３６−４３９）。その他ＬＳＤ１はＳＥＴ７／９によってメチル化された非ヒストンタンパク質のリジン基を脱メチル化する。炎症反応でＬＳＤ１とＮＦ−κＢとの関連性については知られていなく、本願ではＬＳＤ１は後述するようにＮＦ−κＢを構成するｐ６５と結合してこれを脱メチル化することを明らかにした。脱メチル化は、ｐ６５を安定化させて、結果ＮＦ−κＢ媒介された炎症反応に関与する転写因子の活性を調節して炎症反応を増幅するのを解明した（図４等参照）。
【００２２】
ＮＦ−κＢは、ｐ６５／ＲｅｌＡ、ｐ５０／ＮＦ−κＢ１、ｐ５２、ＲｅｌＢ及びｃ−Ｒｅｌのサブユニットで構成された炎症因子である（Ｏｅｃｋｉｎｇｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｇｈｏｓｈ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００９；１：ａ００００３４）。これらは、二量体形成に重要なＮ−末端Ｒｅｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ領域、ＤＮＡ結合領域及びＣ−末端に核に入ることができる配列を共通で持っている。ｐ６５−ｐ５０ヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）は最も多く存在して活性が最も高い形態で知られている。刺激されなかった細胞で、ＩκＢタンパク質はＮＦ−κＢサブユニットに結合してこれらを細胞質に隔離させる。炎症性刺激が存在する場合、ＩκＢのリン酸化依存性プロテアソーム分解を起こして、ＮＦ−κＢサブユニットは細胞質から核に移動するようになる（Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９９；１８：２０３９−２０４６）。核に移動したＮＦ−κＢサブユニットは、ＤＮＡのκＢ  ｅｌｅｍｅｎｔに結合して、炎症反応に関与する標的遺伝子の発現を活性化させる。例えば、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）のようなｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒの動員は標的遺伝子の追加活性化に決定的であると知らされている。持続的なＬＰＳ刺激は、ＮＦ−κＢによるＣ／ＥＢＰδの発現を誘導して、誘導されたＣ／ＥＢＰδは、ＮＦ−κＢと共に作用してサイトカインコーディング遺伝子の転写を追加で刺激してＣ／ＥＢＰδは炎症反応の増幅役割をすると知られている。本願に係る一実現例では、ＬＰＳで誘発されたＰＣＫα→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢ経路でＬＳＤ１のリン酸化はゲノム全体水準でＮＦ−κＢ標的遺伝子の活性化に必要で（図２参照）、ＬＰＳ処理によるＬＳＤ１リン酸化が標的遺伝子のプロモーターにＮＦ−κＢｐ６５をプロモーターでリクルートするのに必要で（図３参照）、ＬＳＤ１とｐ６５の結合及びこれによるｐ６５脱メチル化がｐ６５のタンパク質安定化を増大させることを示している（図４参照）。このようなＮＦ−κＢ  ｐ６５のタンパク質安定化は結果的に炎症反応を引き起こす。
【００２３】
本願に係る方法に使用されるＰＫＣα、ＬＳＤ１及びＮＦ−κＢ（ｐ６５）は、遺伝子及びタンパク質配列は公示されたもので、たとえばヒトタンパク質配列はＬＳＤ１：ＮＰ＿００１３４３４９６．１、ＰＫＣα：ＮＰ＿０３５２３１．２、ＮＦ−κＢ（ｐ６５）：ＮＰ＿０３３０７１．１と公示なされている．タンパク質配列が知られていると、核酸配列はこれらから容易に導き出されるのは当業者に自明である。
【００２４】
本願に係る方法では、前記のような機能を持つ限り様々な由来、そして各由来のタンパク質配列及びこれと実質的に同じ配列を持つ全長または断片が使用され得る。実質的に同じとは、タンパク質及び核酸配列水準にともに適用でき、参照または基準となる配列と比較して、塩基またはアミノ酸残基に一つ以上の置換、欠損、または付加があり得るが、全体から見ると機能に差がなかったり、機能を悪くしない水準の機能を持つことを意味する。相同性は、対象になる配列を最大限対応するようにアラインし、当業界に通常利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合に、最小６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、さらに好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％以上、特に９５％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアライメント方法は当業界に公示されている。例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．（１９７０）４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）２４：３０７−３１；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：２３７−４４；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）５：１５１−３；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．（１９９２）８：１５５−６５及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）２４：３０７−３１に開示されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３-１０）は、ＮＢＣＩなどで接近可能で、ｂｌａｓｔ、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動されて利用することができる。ＢＬＳＡＴはｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能で、このプログラムを利用した配列相同性比較方法は、ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ.ｈｔｍｌで確認することができる。
【００２５】
一実現例で、ＰＫＣα、ＬＳＤ１及びＮＦ−κＢタンパク質はこれを発現する細胞の形態で提供されることができる。例えば、タンパク質を発現（ＴｒａｎｓｉｅｎｔまたはＳｔａｂｌｅ形質移入または内因性発現）する哺乳類細胞、例えばこれで制限しないが、ＰＫＣα、ＬＳＤ１及びＮＦ−κＢが発現して、作用できる代表的な細胞ではマクロファージが挙げられる。マクロファージは、動物で採取したものまたは確立された細胞株を使用することができる。特にＲａｗ２６４.７細胞株またはＢＭＤＭ（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）を使用することができる。一実現例では、Ｒａｗ２６４．７細胞株に前記タンパク質を発現するプラスミドを公示された方法または本願の実施例に記載された方法を利用して形質移入して使用することができる。
【００２６】
本願に係る前記方法で、刺激存在時ＰＫＣα→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢ経路が活性化して、ＰＫＣαの基質は、ＬＳＤ１でＰＫＣαはＬＳＤ１をリン酸化させて、リン酸化されたＬＳＤ１は、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットを脱メチル化させる。従って、一実現例で本願に係る方法で、ＰＫＣα→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の抑制は、前記ＰＫＣαによるＬＳＤ１のリン酸化減少または抑制、及び／または前記ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの脱メチル化の抑制、及び／またはＬＳＤ１とｐ６５の結合抑制または減少で測定されることができる。また、前記シグナル伝達経路の活性化は、炎症反応を誘発するので、前記経路の抑制は、前記経路による炎症反応の抑制であるといえる。このような経路または炎症反応の抑制は、上述したような前記本願で解明された機序を構成するタンパク質を発現する細胞を細胞培養プレートに培養した後、ここに試験物質を添加した後、一定時間後に細胞から、総タンパク質を抽出して、ＬＳＤ１のリン酸化程度、またはＬＳＤ１脱メチル化活性の有無、ＬＳＤ１とＮＦ−κＢ  ｐ６５の結合及びまたはＬＳＤ１によるＮＦ−κＢ  ｐ６５脱メチル化程度で確認することができる。対照群（試験物質を処理しなかった場合）と比較して、前記ＬＳＤ１のリン酸化減少、前記ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの脱メチル化の抑制または前記ＬＳＤ１と前記ｐ６５サブユニットの結合をＮＦ−κＢシグナルによって媒介される炎症反応候補物質で選別することができる。
【００２７】
本願に係る方法で、リン酸化抑制程度は公示された方法を利用して測定でき、例えばタンパク質ブラット方法を利用して確認することができる。タンパク質確認のための使用可能な抗体があって全長ＬＳＤ１だけでなくリン酸化されたＬＳＤ１を確認する抗体は市販のものを購入することができる。このような抗体を利用してＬＳＤ１の全体発現量またはリン酸化されなかったまたはリン酸化されたＬＳＤ１の量を特異的に確認することができるが、これに制限しない。対照群（試験物質を処理しなかった場合）と比較して、ＬＳＤ１タンパク質のリン酸化程度を抑制したものを敗血症治療剤候補物質として選別することができる。この場合タンパク質は検出の便宜のために様々な標識物質、例えばタンパク質タグ、ビオチン、蛍光物質、アセチル化、放射線同位元素のようなもので公示された方法または市販のタンパク質標識キットを使用して標識することができて、標識された物質に適合した検出機器を使用して検出され得る。
【００２８】
本願に係る方法でメチル化または脱メチル化は、公示された方法を利用して行われ、例えばメチル化されたタンパク質を特異的に認識する抗体の使用を含むが、これに制限されず、また本願実施例を参照することができる。
【００２９】
本願に係る方法でＬＳＤ１と前記ｐ６５サブユニットの結合または相互作用は、当業界に公示された様々な方法を利用して測定されることができる。例えば、細胞内タンパク質の結合／相互作用を確認するイーストツーハイブリッド法、コンフォーカル顕微鏡法、共同免疫沈殿法、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）及びスペクトロスコピー法を含むが、これに制限されず、このような方法に関する比較及び詳しい実験法に関する追加の参考文献は、Ｂｅｒｇｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅＩｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”、ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ  Ｖｏｌ７：ｐｐ２８３３−２８４２に記載されたものを参考にすることができる。
【００３０】
本願に係る方法は、細胞にＮＦ−κＢシグナルによって媒介される炎症反応を誘発する段階を含み、これによって上述した通り本願に解明されたＰＣＫα、ＬＳＤ１及びＮＦ−κＢで構成される経路が活性化される。
【００３１】
一実現例で細胞にＮＦ−κＢシグナルによって媒介される炎症反応を誘発することができる様々な刺激が本願に使用され、例えば前記ＮＦ−κＢ媒介された炎症反応を誘発することができる刺激は、ＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒα）、ＩＬ−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １−ｂｅｔａ）、ＰＡＭＰ（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）またはバクテリアＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）を含む（Ｃｏｕｒｔｏｉｓ  Ｇ、Ｇｉｌｍｏｒｅ  ＴＤ（２００６）Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００６  Ｏｃｔ  ３０；２５（５１）：６８３１-４３；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  Ｈ、Ｄａｖｉｅｓ  ＡＭ（２０１１）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｇｒｏｗｔｈ、ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ＮＦ−κＢ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１  Ｊｕｎ；３４（６）：３１６−２５．）。
【００３２】
本願で炎症または炎症反応とは、病原菌、刺激物質、または損傷された細胞などのような組織に危害な刺激に対する組織の複合的な生物学的反応で、免疫細胞、血管及び分子媒介子を含む保護的な反応である。炎症反応は、細胞損傷を引き起こす初期原因を除去して、損傷した細胞または組織を除去して組織復旧を開始するものである。炎症反応は、熱、痛み、発赤及び腫れなどの症状を伴う。
【００３３】
本願でＮＦ−κＢシグナルによって媒介される炎症反応とは、先述した免疫シグナル刺激によってＮＦ−κＢタンパク質が活性化する場合を意味する。本願では、特にＮＦ−κＢを活性化させる経路の中で、特にＬＳＤ１によるｐ６５サブユニットの脱メチル化による経路である。炎症反応が活性化すると、分子水準でサイトカインの発現、たとえばＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−αなどの発現が増加して、これを検出して炎症反応が活性化を決めることができる。
【００３４】
本願に係る方法で細胞は、ＰＣＫα→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢ経路を抑制すると期待される試験物質で処理される。
【００３５】
前記経路の抑制は、前記ＬＳＤ１のリン酸化減少及び／または前記ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの脱メチル化及び／またはＬＳＤ１とｐ６５の結合減少または抑制と測定されることができる。このような減少または抑制は、試験物質で処理されなかった対照群と比較して抑制または減少を意味して、当業者なら本願に開示された内容及び／または当業界の常識を根拠に抑制または減少した程度を簡単に決めることができる。抑制または減少を決めるに当たり、炎症反応の活性化と共に増加するサイトカインの発現量の変化をも測定することができる。
【００３６】
本願で調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）とは、特定生物学的機能の活性化、刺激または上向き調節、または低下または下向き調節、または両方を含み、イン・ビトロ状態での調節、イン・ビボ状態での調節、エクス・ビボ状態での調節をいずれも含むものである。一実現例で調節は、炎症反応の抑制である。
【００３７】
本願の方法に使用される試験物質は、ＰＣＫα→ＬＳＤ１→ＮＦ−κＢ経路シグナル伝達システムに作用して、ＬＳＤ１のリン酸化を減少させて、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの脱メチル化を調節特に抑制すると期待される物質で、低分子量化合物、高分子量化合物、化合物の混合物（例えば、天然抽出物または細胞または組織培養物）、またはバイオ医薬物（例えば、タンパク質、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、アプタマー、ＲＮＡｚｙｍｅ及びＤＮＡｚｙｍｅ）または糖及び脂質などを含むがこれに限定しない。
【００３８】
本願に係る一実現例では、低分子化合物が試験物質として使用される。前記試験物質は、合成または天然化合物のライブラリーから得ることができ、このような化合物のライブラリーを得る方法は当業界に公示されている。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ＵＳＡ）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＵＳＡ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（ＵＳＡ）及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入可能であり、天然化合物のライブラリーは、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）及びＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＵＳＡ）から購入可能である。試験物質は、当業界に公示された様々な組合ライブラリー方法によって得ることができて、例えば、生物学的ライブラリー、空間アドレッサブルパラレル固相または液相ライブラリー（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、デコンボリューションが求められる合成ライブラリー方法、“１-ビズ１-化合物”ライブラリー方法、そして親和性クロマトグラフィー選別を利用する合成ライブラリー方法によって得ることができる。分子ライブラリーの合成方法は、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６９０９，１９９３；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，１１４２２，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８，１９９４；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１３０３，１９９３；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３、２０５９，１９９４；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３、２０６１；Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３，１９９４等に開示されている。例えば、薬物のスクリーニング目的のためには化合物は低分子量の治療効果を持つものが使用されることができる。例えば、重量が４００Ｄａ、６００Ｄａまたは８００Ｄａのような約１０００Ｄａ内外の化合物が使用されることができる。目的に応じてこのような化合物は化合物ライブラリーの一部を構成することができ、ライブラリーを構成する化合物の数も数十個から数百万個まで多様である。このような化合物ライブラリーは、ペプチド、ペプトイド及びその他環状または線状のオリゴマー性化合物、及び鋳型を基本とする低分子化合物、例えばベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、カーボサイクル及びポリサイクル化合物（例えばナフタレン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイドなど）、カーボハイドレート及びアミノ酸誘導体、ジハイドロピリジン、ベンズヒドリル及びへテロサイクル（例えばトリアジン、インドール、チアゾリジンなど）を含むこともできるが、これは単に例示的なものであり、これに限定されない。
【００３９】
また、たとえばバイオロジックスがスクリーニングに使用されることができる。バイオロジックスとは、細胞またはバイオ分子を称するもので、バイオ分子とは、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質または生体内及び生体外で細胞システムなどを利用して産生された物質を称する。バイオ分子を単独でまたは他のバイオ分子または細胞と組み合わせて提供されることができる。バイオ分子は、たとえば、ポリヌクレオチド、ペプチド、抗体、またはその他血しょうで発見されるタンパク質または生物学的有機物質を含むものである。
【００４０】
実験結果、試験物質と接触しなかった対照群と比較して試験物質の存在下でＬＳＤ１のリン酸化及び／またはＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの脱メチル化及び／またはＬＳＤ１とｐ６５の結合を抑制すると期待される物質を候補物質として選別する。対照群と比較して約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、または約１００％以上、または、これ以上を増加または減少したものを候補物質として選別することができる。
【００４１】
本願に用いられるタンパク質は、当業界に公示された方法を使用して製造されることができる。特に遺伝子組換え技術を利用する。例えば、前記タンパク質をコーディングする相応する遺伝子を含むプラスミドを原核細胞または真核細胞、たとえば昆虫細胞、哺乳類細胞に伝達して過発現させた後精製して使用することができる。前記プラスミドは、たとえば本願の例示的実現例で使用したような動物細胞株にトランスファクションした後、発現したタンパク質を精製して使用することができるが、これに制限しない。この場合、タンパク質は検出の便宜のために様々な標識物質、例えばビオチン、蛍光物質、アセチル化、放射線同位元素のようなもので公示された方法または市販のタンパク質標識キットを使用して標識することができて、標識された物質に適合した検出機器を使用して検出されることができる。
【００４２】
または、スクリーニングタンパク質を暗号化するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を適当な宿主細胞で発現させてその細胞破砕物を作ったり前記スクリーニングタンパク質のｍＲＮＡを試験管内で翻訳後当業界に公示されたタンパク質分離方法によってスクリーニングタンパク質を精製することができる。通常、細胞残屑（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）等を除去するために、前記細胞破砕物または試験管内翻訳した結果を遠心分離した後、沈殿、透析、各種カラムクロマトグラフィーなどを適用する。イオン交換クロマトグラフィー、ゲルパーミエオションクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相−ＨＰＬＣ、プレプ用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、親和性カラムなどはカラムクロマトグラフィーの例である。親和性カラムは、例えば、抗スクリーニングタンパク質抗体を利用して作ることができる。
【００４３】
その他前記方法に使用される試験物質の種類などは先述したものを参照することができる。
【００４４】
本願に係る方法によって選別された炎症反応調節、特に抑制物質は炎症疾患の治療剤として使用されることができる。
【００４５】
本願で炎症性疾患は、炎症または炎症反応による様々な症状または疾患を含み、例えば敗血症、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、肝炎、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、再灌流障害及び移植拒否などのような種々の症状または疾患を含む。
【００４６】
本願では特にＮＦ−κＢを媒介とする炎症反応による疾患は、これに制限しないが、敗血症、リューマチ関節炎または自己免疫疾患を含む。
【００４７】
本願に係る一実現例では、本願に係る方法は、特に敗血症治療剤物質のスクリーニングに使用される。また、他の実現例で本願に係る方法によってスクリーニングされた物質は、敗血症治療剤として有用である。本願で使われた用語“敗血症”とは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａｅ  ｆａｍｉｌｙ，Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｐｐ．及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．などのようなバクテリアまたは寄生虫感染による全身炎症反応で、心拍動増加、低血圧、低または高体温症、はやい呼吸及び白血球数の増加または減少のような症状を示す疾患を称する。特に本願に係る一実現例でＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスは敗血症を模倣する条件下でWTマウスに比べて低い炎症性サイトカインの産生と共に、さらに高い生存率を示した。このようなデータによりＰＫＣα−ＬＳＤ１シグナル伝達をターゲッティングすることが、敗血症のような炎症性疾患に強力な治療戦略になれることを証明した。
【００４８】
本願で使われた用語“治療”とは、疾患、または疾患による症状または状態の抑制、除去、軽減、緩和、改善、及び／または予防を含む概念である。
【００４９】
以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし、下記実施例は本発明をより理解しやすくするために提供されるだけで、本発明が下記実施例に限定されるのではない。
【実施例】
【００５０】
実験方法及び材料
細胞培養：Ｒａｗ２６４．７（ＫＣＬＢ）、Ｌ９２９、ＭＥＦｓ細胞は。ＺｅｌＳｈｉｅｌｄ（Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＧｍｂＨ）１％、１０％ＦＢＳが添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’s培地（ＤＭＥＭ，Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養された。マイコプラズマがない条件を保障するために、日常的にすべての細胞のマイコプラズマ検査を行った。
【００５１】
ＢＭＤＭ製作：マウスはＣＯ２過吸入により安楽死させて、マウスから大腿骨と脛骨を取得した。７０％エタノールと冷たいＰＢＳで洗浄した後に、骨髄を大腿骨と脛骨から分離した。骨髄細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、１％  ＺｅｌＳｈｉｅｌｄ、１０％  ＦＢＳ添加）に１Ｘ１０６〜２Ｘ１０６／ｍｌ濃度で培養された。その後Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（１０ｎｇ／ｍｌ，ｓｉｇｍａ）と１０％Ｌ９２９−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地が細胞に添加されたし７〜８日間分化された。
【００５２】
抗体及び試薬：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製品：ｐ６５抗体（ｓｃ−３７２、免疫ブロットのために１：１０００で希釈して使用、免疫蛍光分析のために１：２００で希釈して使用）、ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（ｓｃ−６２１５、免疫ブロットをために１：１０００で希釈して使用）、ＧＦＰ抗体（ｓｃ−９９９６、免疫ブロットをために１：５０００で希釈して使用）、ＧＳＴ抗体（ｓｃ−４５９、免疫ブロットをために１：５０００で希釈して使用）；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製品：ＬＳＤ１抗体（＃２１３９、免疫ブロットをために１：１０００で希釈して使用）、ＰＫＣα抗体（＃２０５６、免疫ブロットをために１：１０００で希釈して使用）；Ａｂｃａｍ製品：ｐ６５抗体（ａｂ７９７０）、ＬＳＤ１抗体（ａｂ１７７２１）、Ｈ３Ｋ９Ａｃ抗体（ａｂ４４４１）、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２抗体（ａｂ１２２０）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２抗体（ａｂ３２３５６）；Ｎｏｖｕｓ製品：ＬＳＤ１抗体（ＮＢ−１００−１７６２）、ＰＫＣα抗体（ＮＢ−１１０−５７３５６、免疫ブロットをために１：１０００で希釈して使用）、Ｃ／ＥＢＰδ抗体（ＮＢ−１１０−８５５１９、免疫ブロットをために１：１０００で希釈して使用）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製品：ｐ−ＰＫＣａ  Ｓ６５７抗体（＃０６−８２２、免疫ブロットをために１：１０００で希釈して使用）ｐ−ＬＳＤ１抗体（ＡＢＥ１４６２、免疫ブロットをために１：２００で希釈して使用）；Ｓｉｇｍａ製品：β−ａｃｔｉｎ抗体（Ａ１９７８、免疫ブロットをために１：５０００で希釈して使用）、Ｆｌａｇ抗体（Ｆ３１６５、免疫ブロットをために１：５０００で希釈して使用）、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＬＰＳ）ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１２７：Ｂ８（Ｌ３１２９）、ＧＳＫ−ＬＳＤ１（ＳＭＬ１０７２）；そのほか他社製品：ＨＡ抗体（ＭＭＳ−１０１Ｒ、免疫ブロットをために１：５０００で希釈して使用、免疫蛍光分析のために１：２００で希釈して使用、Ｃｏｖａｎｃｅ製品）、Ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（ＬＦ−ＰＡ０１４６Ａ、免疫ブロットをために１：１０００で希釈して使用、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ製品）、ｍｏｎｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｐ６５（Ｋ３１４／３１５）抗体（ＥＮＨ００６、免疫ブロットをために１：５００で希釈して使用、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製品）ＦＫ２抗体（ＢＭＬ−ＰＷ８８１０、免疫ブロットをために１：１０００で希釈して使用、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製品）、Ｇｏ６９７６（１３３１０、Ｃａｙｍａｎ製品）、ＭＧ１３２（Ｍ−１１５７、Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製品）、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌ１１７０、Ｐｒｏｍｅｇａ製品）、λ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｐ０７５３、ＮＥＢ製品）。
【００５３】
動物飼育：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄのＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスを作る方法はすでに記述されている（Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２０１４；５３：７９１−８０５）。８−１０週齢の野生型及びＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスを実験に使用した。マウスは２２−２３℃室内温度と光条件（１２時間明：１２時間暗、明かりは朝８時につく）で維持された。餌物と水は自由に摂取できるよう供給した。すべての動物実験はソウル大学動物実験及び利用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けた。
【００５４】
ＬＰＳ処理：細胞を２４時間ＦＢＳがない状態で育てた以後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌあるいは表記された濃度）を表記された時間だけ処理した。細胞は、免疫ブロットあるいはｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲあるいはＣｈＩＰ実験に使用するにそれぞれの実験方法に従って収集されて溶解した。
【００５５】
定量ＲＴ−ＰＣＲ：全ＲＮＡは、肺組織、ＢＭＤＭ、あるいはＲａｗ２６４．７細胞からＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品）を利用して分離した。ＲＮＡは、ｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマーとＭ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ製品）を使用して逆転写された。得られたｃＤＮＡは、ＴＯＰｒｅａｌＴＭ  ｑＰＣＲ  ２Ｘ  ＰｒｅＭｉｘ（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｎｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ＲＯＸ、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ製品）と遺伝子特異プライマーでＰＣＲをした。ｍＲＮＡ量は、ＡＢＩ−７５００で検出した。プライマー情報は以下のとおりである。
mouse  Mcp-１  Forward  ５’-GGCTCAGCCAGATGCAGTTAAC-３’、
mouse  Mcp-１  Reverse  ５’-AGCCTACTCATTGGGATCATCTTG-３’、
mouse  Il-６  Forward  ５’-CATAAAATAGTCCTTCCTACCCCAAT-３’、
mouse  Il-６  Reverse  ５’-CACTCCTTCTGTGACTCCAGCTTA-３’、
mouse  Il-１b  Forward  ５’-GATGATAACCTGCTGGTGTGTGA-３’、
mouse  Il-１b  Reverse  ５’-GTTGTTCATCTCGGAGCCTGTAG-３’、
mouse  Cebpd  Forward  ５’-CTCCACGACTCCTGCCATGT-３’、
mouse  Cebpd  Reverse  ５’-GAAGAGGTCGGCGAAGAGTTC-３’、
mouse  RelA  Forward  ５’-TGTGGAGATCATCGAACAGCCG-３’、
mouse  RelA  Reverse  ５’-TTCCTGGTCCTGTGTAGCCATTGAT-３’．
ＲＮＡ−ｓｅｑ分析：ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーは、生産者の指針に従ってＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して製作した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉ−ｓｅｑ  ３０００／４０００ＳＢＳ ｋｉｔ  ｖ３（ＭＡＣＲＯＧＥＮ  Ｉｎｃ．）でｐａｉｒ−ｅｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇされた。すべてのＲＮＡ−ｓｅｑデータは、Ｔｏｐｈａｔパッケージ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２０１３；１４：Ｒ３６）を使用してマウスゲノム（ｍｍ９）でマッピングされた。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ分析は、１Ｘ１０−４のＦＤＲ（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）カットオフ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２０１３；１４：Ｒ３６；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１０；２６：１３９-１４０）を使用してＥｄｇｅＲパッケージを介して行われた。ＤＥＧの遺伝子発現値を使用して階層的クラスタリング分析を行った。特に距離測定値で１−（相関係数）がある遺伝子に対するＷａｒｄの基準を用いた。クラスタヒットマップは、各遺伝子に対するサンプルでz点数を使用して描いた。ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータは、Ｂｏｗｔｉｅを用いてマウスゲノムにマッピングされた。ｐ６５に対するピークは一致する入力値対照群を使用してＨｏｍｅｒのｆｉｎｄＰｅａｋｓ命令で行われた。それぞれＤＥＧで、ＴＳＳの１０ｋｂｐｓ以内に位置したｐ６５ピークを調べた。Ｄｅ  ｎｏｖｏ ｐ６５ピークはＨｏｍｅｒでｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅ命令を使用して行われた。ｎａｓｃｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔの量を得るためにマクロファージでＬＰＳ処理前後のグローバルラン−オンシーケンシング（ＧＲＯ−ｓｅｑ）を用いた。ＧＲＯ−ｓｅｑ  ｆａｓｔｑファイルは、ｐｏｌｙＡとアダプ夕シークエンスを捨てるためにｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ.ｂａｂｒａｈａｍ.ａｃ.ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ／）を利用してトリミングされた（Ｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１５；１１２：Ｅ２９７−Ｅ３０２）。トリミングされたｒｅａｄ値は−ｂｅｓｔ−ｖ２−ｍ１オプシヨンを用いてｂｏｗｔｉｅ（ｖ１．０．０）とマッピングされた。ｂｏｗｔｉｅファイルにはＨＯＭＥＲのｍａｋｅＴａｇＤｉｒｅｃｔｏｒｙ機能でタギングされた。平均プロファイルはマッピングされたｒｅａｄ値を１Ｘ１０−７で正規化した後に得られた。
【００５６】
ＣｈＩＰ実験：細胞を１％ホルムアルデヒドで１０分間ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋと冷たいＰＢＳで二回洗浄した。細胞を１ｍｌのｈａｒｖｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９.４］、実験前に１０ｍＭ  ＤＴＴ追加）を入れてスクレーパで掻いて１．５ｍｌチューブに入れて３０℃で１５分間置いた後、６０００ｒｐｍに３分間遠心分離した。細胞のペレットを冷たいＰＢＳで洗浄した後、ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ６．５］、及び０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ）とｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ６．５］、及び０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ）を順に入れて洗浄した。ＣｈＩＰ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．１］、１％  ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ７．６］、実験前にｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ追加）を入れてソニケーションによりクロマチン切片を作る。平均の長さ２５０ｂｐのＤＮＡ断片で作られたクロマチン抽出物をｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．１］、実験前にｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ追加）で希釈して抗体を入れて４℃で一晩中免疫沈殿させた。翌日ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを４０ｕｌずついれて２時間４℃でローテーションをさせた。ビーズはＴＳＥ  Ｉ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１％  ＳＤＳ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．１］、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）、ＴＳＥ  ＩＩ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１％  ＳＤＳ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．１］、及び５００ｍＭ  ＮａＣｌ）、ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（０．２５Ｍ  ＬｉＣｌ、１％  ＮＰ−４０、１％  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８.１］及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、三回のＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８.０］、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）順で洗浄された。尚、ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１％  ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３）を使用してビーズで湧出させた。湧出された抽出物を６５℃で一晩置いてｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇをさせてＤＮＡはＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製された。精製されたＤＮＡは、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲにより分析された。合計５０ｕｌのＤＮＡ中２μｌがＰＣＲに使用された。ＰＣＲプライマーのシークエンス情報は下記のとおりである。
mouse  Mcp-１  Forward  ５’-CACCCCATTACATCTCTTCCCC-３’、
mouse  Mcp-１  Reverse  ５’-TGTTTCCCTCTCACTTCACTCTGTC-３’、
mouse  Il-６  Forward  ５’-AGCTACAGACATCCCCAGTCTC-３’、
mouse  Il-６  Reverse  ５’-TGTGTGTCGTCTGTCATGCG-３’．
ＣｈＩＰ−ｓｅｑ分析：ＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーは、生産者の指示事項に従ってＫＡＰＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用して準備した。ＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉ−ｓｅｑ  ４０００  ＳＢＳ  ｋｉｔ  ｖ３（ＭＡＣＲＯＧＥＮ  Ｉｎｃ．）でシングルエンドシーケンシングされた。ＣｈＩＰ−ｓｅｑ  ｒｅａｄは、Ｂｏｗｔｉｅ（Ｌａｎｇｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：Ｒ２５）を使用してマウスｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ（ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３７、ｍｍ９）にａｌｉｇｎされた。ｕｎｉｑｕｅ  ｐｅａｋだけＨＯＭＥＲによってｐｅａｋ呼び出しと注釈付けが使用された（Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２０１０；３８：５７６−５８９）。ＬＰＳ処理後、ＬＳＤ１と重なるｐ６５ピークが考慮された。ＢｅｄＧｒａｐｈファイルは、カリフォルニア大学のＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒで生成及び照会された。ＣｈＩＰ−ｓｅｑにｐ６５（ＳＣ−３７２）とＬＳＤ１（ａｂ１７７２）抗体を用いた。
【００５７】
組織ｌｙｓａｔｅの準備：肺組織は、血を除去するために、ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅする前に冷たいＰＢＳで洗浄した。肺は、ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、及び２ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］、実験前ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ追加）でｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅされて、以後４℃、１４，０００ｇで遠心分離して、きれいな上層液を免疫ブロット実験に使用した。
【００５８】
全細胞ｌｙｓａｔｅと細胞内分画化（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）：すべての細胞は冷たいＰＢＳで洗浄した。全細胞ｌｙｓａｔｅを作るためにｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを入れたＲＩＰＡバッファーに再懸濁して、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０を使用してｏｕｔｐｕｔ  ３、ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅは３０、５ｐｕｌｓｅｓでソニケーションした。細胞質と核の分離のために、細胞はＢｕｆｆｅｒＡ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、実験前ＤＴＴ、ＰＭＳＦ、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ追加）で溶解して氷に１５分間置いて以後０.５％  ＮＰ−４０を追加して、１２０ｇ４℃で１分間遠心分離した。上層液（細胞質の部分）は新しいチューブに移された。核の部分であるペレットは、１２０ｇ４℃で１分間遠心分離した。上層液は捨ててペレットはｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、実験前ＤＴＴ、ＰＭＳＦ、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ追加）で再溶解した後全細胞ｌｙｓａｔｅのようにソニケーションした。すべてのｌｙｓａｔｅをＢｒａｄｆｏｒｄで定量だったし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００５９】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ実験：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ｌｙｓａｓｔでＰＫＣαを免疫沈降してキナーゼ実験を準備して、基質であるＧＳＴ−ＬＳＤ１、ＧＳＴ−ｐ６５はＥ．ｃｏｌｉ．で精製した。ＰＫＣα、ＧＳＴ−ＬＳＤ１、ＧＳＴ−ｐ６５はｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭＤＴＴ、及び５μＣｉｏｆ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）に３０℃３０分間反応した。反応物に５Ｘ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを追加して１０分間沸かした。サンプルでＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験を進めて、リン酸化はａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙにより検出された。
【００６０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＳＴ  ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ実験：ＧＳＴ融合ｃｏｎｓｔｒｕｃｔはＲｏｓｅｔｔａ  Ｅ．ｃｏｌｉバクテリア（Ｎｏｖａｇｅｎ）で発現された。ＧＳＴ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．８］、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％  ＮＰ−４０、０．５ｍＭ  ＤＴＴ実験前ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ追加）でソニケーションしてｃｒｕｄｅ  ｅｘｔｒａｃｔを準備して、１３０００ｒｐｍで３０分間溶解物を遠心分離した。上層液だけ分離してｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１００ｕｌ入れて４℃で一晩中ローテーションした。ｐ６５タンパク質は生産者の指示とおり、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｌ１１７０）のｃｏｌｄ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅを使用して製作した。ｃｏｌｄ  ＡＴＰを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ実験が、ＧＳＴ  ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ実験前にリン酸化されたＧＳＴ−ＬＳＤ１を作るために行われた。リン酸化されたＬＳＤ１を同量ずつ二つのチューブに分けて、二つ中一方のチューブに１０００ｕｎｉｔのλ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＮＥＢ、Ｐ０７５３）を処理して３０℃３０分間反応した。ビーズに結合したＧＳＴ融合タンパク質はバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％  ＮＰ−４０、ａｎｄ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄してｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたｐ６５タンパク質と混ぜてＧＳＴ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１時間４℃でローテーションした。ビーズはＧＳＴ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで７回洗浄して、サンプルバッファーを入れて１０分間沸かした後ＳＤＳ−ＰＡＧＥと免疫ブロットで分析した。
【００６１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化脱メチル化実験：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化実験方法は、以前に報告されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１０３４７）。Ｆｌａｇ−ｐ６５はＦｌａｇ  Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅビーズ（Ｓｉｇｍａ、Ａ２２２０）を使用してＦｌａｇ−ｔａｇ付きｐ６５を発現するＨＥＫ２９３Ｔ抽出物で精製した。４℃で一晩中インキュベーションした後に、ビーズに結合したタンパク質を除去するためにＢＣ５００  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．９］、１５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．０５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、及び５００ｍＭ  ＫＣｌ）で洗浄された。きれいに洗浄した後に、ビーズはｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．５］、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ｂ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、及び２５０ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ）で３回洗浄した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化実験は、ビーズに結合したｆｌａｇ−ｐ６５、ビーズから分離したＧＳＴ−ＳＥＴ７／９タンパク質（Ｌ−Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｄで分離した、Ｓｉｇｍａ  Ｇ４２５１）、ＳＡＭ（Ｓｉｇｍａ、Ａ７００７）をｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒに入れて３０℃で一晩中行われた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱メチル化実験をする前にビーズに結合されたｆｌａｇ−ｐ６５に結合したＳＥＴ７／９タンパク質を完璧に除去するためにｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４［ｐＨ８．０］、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）できれいに洗浄して、ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．５］、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、及び０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ）に変えた後、ＬＳＤ１タンパク質あるいはリン酸化されたＬＳＤ１タンパク質を追加した。３７℃で一晩中反応した後に２Ｘ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを入れて１０分間沸かしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、免疫ブロットで分析した。
【００６２】
ユビキチン化実験：細胞にＨｉｓｍａｘ−ユビキチンと共にＤＮＡプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションしてから４８時間後にＭＧ１３２（５μｇ／ｍｌ）を４時間処理した。その後ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（６Ｍ  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５ｍＭイミダゾール及び１０ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）で細胞を破砕して、Ｎｉ２＋−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）と共に常温で４時間インキュベーションさせた。ビーズをｂｕｆｆｅｒ  Ａ、ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（８Ｍ  ｕｒｅａ、０．１Ｍ  Ｎａ２ＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ８．０］、及び１０ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（８Ｍ  ｕｒｅａ、０．１Ｍ  Ｎａ２ＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ６．３］、及び１０ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）順に洗浄した後ビーズに付いているタンパク質をｂｕｆｆｅｒ  Ｄ（２００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．１５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ６．７］、３０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．７２Ｍ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、及び５％  ＳＤＳ）で抽出した。そして免疫ブロットで分析した。
【００６３】
Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓユビキチン化分析のためのｄｅｎａｔｕｒｅｄ免疫沈殿：Ｒａｗ２６４．７細胞をｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、７０ｍＭ  β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、及び１％  ＳＤＳ）に破砕して９５℃５分間沸かした。ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で希釈した後ｐ６５抗体を用いて免疫沈殿させた。サンプルは、ＦＫ２抗体を用いた免疫ブロットで分析された。
【００６４】
免疫蛍光分析法：Ｌｓｄ１−／−ＭＥＦｓを１％ゼラチンがコーティングされたカバースリップで育てた。免疫蛍光実験のために細胞をＰＢＳで二回洗浄して、２％ホルムアルデヒドで３０分間固定させた。そして細胞を０．１％  ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００が溶けられているＰＢＳで二回洗浄した。抗体の浸透のために細胞を０．５％  ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶けられているＰＢＳに５分間インキュベーションさせた後、抗体の非特異的な結合を防ぐためにｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５％  ＢＳＡ  ｉｎ  ０．１％  ＰＢＳ−Ｔ）でブロッキングさせた。一次抗体（ＨＡ、ＭＭＳ−１０１Ｒ  Ｃｏｖａｎｃｅ製品、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１：２００に希薄；ａｎｔｉ−ｐ６５、ｓｃ−３７２  ｆｒｏｍ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ製品、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１：２００で希薄）をブロッキング溶液に入れて細胞とインキュベーションさせた。以後、０．１％  ＰＢＳ−Ｔ溶液で８回洗浄した後二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１：２００に希薄）と共に１時間インキュベーションさせた。以後再び０．１％  ＰＢＳ−Ｔ溶液で８回洗浄した後、ベクターシールド（ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）（Ｈ−１０００）でマウンティングし、コンフォーカル顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ７００）で写真を得た。
【００６５】
敗血症誘導：盲腸を縛って穿孔を行う手術（Ｃｅｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｎｃｔｕｒｅ、以下ＣＬＰ）のために、雄マウスを小げっ歯類ガス麻酔機械（ＲＣ２、Ｖｅｔｅｑｕｉｐ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ）を介して酸素の供給と共に、２％  ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（Ｆｏｒａｎｅ、ＪＷ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で麻酔させた。まず呼吸チャンバーで、そして顔面マスクを介して麻酔させたので、手術途中自然に呼吸ができるようにした。ＣＬＰ誘発性敗血症は、以前に記述された通り実行された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００４；１０：１２１６-１２２１）。簡単に説明すると、盲腸と隣接した腸の露出のために、２ｃｍ中間線切開を配置した。次に盲腸を３．０−シルク縫合糸を使用して盲腸の端から５．００ｍｍに堅く縛って２２ゲージの針を使用して穴をあけた。次に盲腸を柔らかく絞って穿孔部位から少量の便を外に流出させて腹腔の元の位置に戻した。開腹手術部位を４．０−シルク縫合糸で縫合した。
【００６６】
Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）染色：マウス肺の組織学的変化を分析するために、肺サンプルをそれぞれのマウスで摘出し、血を除去するために３回ＰＢＳに洗浄して４％ホルムアルデヒド溶液（Ｊｕｎｓｅｉ）で４℃２０時間固定した。固定を終えた後、サンプルをエタノールシリーズで脱水させて、パラフィンを内蔵させた。４μｍ厚さで切片を作ってスライドに載せた。スライドを６０℃オーブンで脱パラフィン化して再水和した以後、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。過度な染色を除去するためにスライドを酸性アルコールに３回早く漬け、ｅｏｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ）で対照染色した。その後エタノールシリーズで洗浄してｘｙｌｅｎｅに漬けた後マウンティングした。肺組織の肺構造、組織浮腫及び炎症細胞の浸潤を評価するために光顕微鏡でブラインド分析した。
【００６７】
敗血症マウス血しょうの臨床化学及びサイトカイン分泌水準測定：新鮮な血清を使用してａｌａｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ（ＡＬＴ）、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、及びＬＤＨをｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｋｉｔｓ（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）で測定した。ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、及びＴＮＦ−αの濃度を確認するために、ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を生産者の指示に従って使用した。値はＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、ＧｍｂＨ）を使用して測定した。
【００６８】
統計分析：ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して、グループの差を見るためにＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔとｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを、そしてグループ差と条件差を共に見るためにｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを行ってデータを分析した。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。
【００６９】
実施例１  ＰＫＣαによるＬＳＤ１のリン酸化の生体内炎症反応の重要性分析
生体内炎症反応にＬＳＤ１のリン酸化が重要であるか否かを確認するために、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスでＬＰＳによって誘発される炎症反応がきちんと起きるか否かを確認した。野生型（ＷＴ）及びＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスを用いて、ＬＰＳ誘発炎症及び急性肺損傷マウスモデルで分析した。組織病理学的検査でＬＰＳが注射されたＷＴマウスは激しい肺損傷及び肺胞損傷を示すがＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウス（図１Ａ）では反応が顕著に弱くなっていることを確認した。ＷＴマウスの場合、ＬＰＳ投与６６時間以内に８０％が死亡したが、同じ期間内にＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスは３０％だけ死亡した（図１Ｂ）。本発明者はＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスがＬＰＳで誘発された炎症反応、急性肺損傷が起き難く、それに伴って死亡率が低いことを発見した。ＷＴマウスで得た骨髄由来マクロファージ（以下、ＢＭＤＭ）でＬＰＳを処理すると、ＰＫＣαとＬＳＤ１のリン酸化が誘導される一方、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスで得たＢＭＤＭではＰＫＣαのリン酸化は誘導されるがＬＳＤ１のリン酸化は起きないことを確認した（図１Ｃ）。ＢＭＤＭだけでなく、ＬＰＳ誘発ＬＳＤ１のリン酸化は、ＷＴマウスの肺組織ｌｙｓａｔｅでも検出された。マウスにＧｏ６９７６を事前注入してＬＰＳを注射した時には、ＬＳＤ１のリン酸化が完全に遮断されることも確認した（図１Ｄ）。
【００７０】
ＬＰＳがＬＳＤ１のリン酸化を誘導する方法を確認するために、ＢＭＤＭ細胞を細胞質と核に分画化して免疫ブロット実験を進めた。ＬＰＳ処理がＰＫＣαの活性形態であるＰＫＣαのリン酸化を誘導してリン酸化されたＰＫＣαが核中に入ったことを発見した（図１Ｅ）。またＬＰＳで誘導されたＰＫＣαの核への移動が、ＬＳＤ１とＰＫＣαの核内結合を誘発した（図１Ｆ）。いつリン酸化が起きるのか確認しようと時間帯別にＬＰＳを処理して、ＬＰＳ処理後６０分からＬＳＤ１のリン酸化と共にＰＫＣαのリン酸化が増大するのをＢＭＤＭで観察した（図１Ｇ）。ＰＫＣαとＬＳＤ１のリン酸化は高濃度（＞１００ｎｇ／ｍｌ）のＬＰＳを処理した際に誘発されることも確認した（図１Ｈ）。ＬＳＤ１のリン酸と関連した炎症反応の分子メカニズムを確認するために、以後高濃度のＬＰＳで実験を進めた。ｉｎ  ｖｉｖｏマウス実験を介して、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスがＬＰＳによる炎症反応、急性肺損傷が誘発され難くさらに死亡率が低いのを確認した。高容量のＬＰＳ（＞１００ｎｇ／ｍｌ）を６０分以上処理した時にだけリン酸化されたＰＫＣαが核に移動してＬＳＤ１のリン酸化を誘導することもマクロファージで確認した。
【００７１】
実施例２  ＬＰＳ誘発ＬＳＤ１のリン酸化はゲノム全体水準でＮＦ−κＢ標的遺伝子の活性化への必要性分析
ＬＰＳが誘発する転写モジュールが炎症反応のシグナル開始と増幅のために精巧に調節されるので（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  ａｎｄ  Ｈｏｒｎｇ、２００９）、炎症反応の転写調節でＬＳＤ１リン酸化に依存的な遺伝子セットが何かを確認しようとした。ＷＴとＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスで抽出したＢＭＤＭにＬＰＳを処理した後ＲＮＡ−シーケンシングを行った（図２Ａ）。ＬＰＳ処理時、ＷＴとＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭの全体転写量を比較して、監督しなかった階層的クラスタ分析（実験方法参照）により合計３，５５８個の異なるように発現する遺伝子（以下、ＤＥＧ）を確認した。この遺伝子中、ＷＴ  ＢＭＤＭでＬＰＳと処理時活性化するがＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭでは活性化しない遺伝子プール（図２Ｂのｃｌｕｓｔｅｒ１）に特に関心を寄せた。リン酸化されたＬＳＤ１が転写のｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒとして作用すると考えたためである。他のクラス夕の遺伝子とは異なりクラスタ１の遺伝子は転写開始部位（以下、ＴＳＳ）周囲のｐ６５ピーク（ｈｙｐｅｒ−ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｐ−ｖａｌｕｅ＜１ｅ−１３０）が有意に多く見られた。これは、ｐ６５がＬＰＳ処理時クラスタ１に存在する遺伝子の発現を誘発する主要転写因子（以下、ＴＦ）であることを意味する（図２Ｂ）。Ｅｎｒｉｃｈｒ（ｈｔｔｐ：／／ａｍｐ.ｐｈａｒｍ.ｍｓｓｍ.ｅｄｕ／Ｅｎｒｉｃｈｒ／）を利用したＧｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）分析を介してクラスタ１にサイトカイン生成及び炎症反応に関連した遺伝子が多く存在するのを確認した（図２Ｃ）。さらに、Ｄｅ  ｎｏｖｏモチーフ分析を介してｐ６５がクラスタ１遺伝子の主なＴＦであることを再確認した（図２Ｄ）。ＲＮＡ−ｓｅｑデータの結果を定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を介して再度確認した（例：クラスタ１のＭｃｐ−１、Ｉｌ−６、Ｉｌ−１β及びＣｅｂｐｄ）（図２Ｅ）。さらに、マウスの肺組織で抽出したｍＲＮＡを利用してクラスタ１でＬＳＤ１リン酸化依存性遺伝子のｍＲＮＡレベルを確認してみた結果、対照群であるＷＴマウスと比較してＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡで有意に低いことをマウス個体水準で確認した。一貫して、ＷＴマウスにＧｏ６９７６を事前注入すると、肺組織ｍＲＮＡでＬＳＤ１リン酸化依存性遺伝子の発現が対照群に比べて低いのが確認された（図２Ｇ）。このデータは、ＬＰＳで誘発されたＬＳＤ１のリン酸化がｐ６５と関連したＮＦ−κＢ標的遺伝子の活性化に必であることを示す。
【００７２】
実施例３  ＬＰＳで誘導されたＬＳＤ１リン酸化はＮＦ−ｋｂのｐ６５を標的プロモーターへのリクルートに重要であることを分析
ｐ６５がリン酸化されたＬＳＤ１によって調節される主要ＴＦ（転写因子）と確認されたので、ＬＳＤ１がＬＰＳに反応してｐ６５と結合するか否かを調べた。ＬＰＳ処理時ＬＳＤ１が核でｐ６５と結合するのをＢＭＤＭ細胞で確認した（図３Ａ）。ＬＳＤ１がＬＰＳに反応してリン酸化されたので、リン酸化されたＬＳＤ１がｐ６５に結合すると推測した。ＰＫＣαがＬＳＤ１だけでなくｐ６５を直接リン酸化する可能性もあるので、ｉｎｖｉｔｒｏキナーゼ実験をｐ６５を基質に行った。ＰＫＣαは、ｐ６５をリン酸化することができなかった（図３Ｂ）。これはＬＰＳ−ＰＫＣαシグナル伝達でＰＫＣαの直接的な基質がｐ６５でないＬＳＤ１であることを意味する。ＬＳＤ１リン酸化がｐ６５との結合に重要であるか否かを確認するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリン酸化されたＬＳＤ１を使用してＧＳＴプルダウン分析を行った。ＧＳＴプルダウン分析前に、リン酸化されたＬＳＤ１を得るためにＰＫＣαを使用するキナーゼ実験を行った。ＧＳＴプルダウン分析結果、ｐ６５がリン酸化されたＬＳＤ１に直接結合して、フォスファターゼの処理がＬＳＤ１とｐ６５との間の結合を略完全に除去するのを明らかにした（図３Ｃ）。このデータは、ＬＰＳが誘導したＰＫＣαによるＬＳＤ１リン酸化が核内のｐ６５との結合に必ず必要であることを意味する。
【００７３】
ｍＲＮＡ−ｓｅｑ分析（図２）で得たように、Ｍｃｐ−１及びＩｌ−６の遺伝子がＬＳＤ１リン酸化依存的に発現した。ＬＳＤ１リン酸化がＮＦ−κＢ標的プロモーターでＬＳＤ１及びｐ６５のリクルート（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）に影響を与えるか否かを確認するために、ＷＴ及びＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭ細胞で染色質免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析を行った。ＣｈＩＰ分析結果、ＬＰＳで処理するとＷＴ  ＢＭＤＭのＭｃｐ−１及びＩｌ−６プロモーターでＬＳＤ１及びｐ６５のリクルートが有意に増加したが、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭではそれらのリクルートが弱くなることが見られた（図３Ｄ）。ＬＰＳ処理がヒストンメチル化状態の変化を誘導するか否かを調べるために、ＬＳＤ１によって調節されることができるヒストンＨ３Ｋ４またはＨ３Ｋ９メチル化状態を調べた（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００４；１１９：９４１９５３）。ＷＴとＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭ細胞のＭｃｐ−１及びＩｌ−６プロモーターをＣｈＩＰ分析した結果、ヒストンＨ３Ｋ４ｍｅ２及びＨ３Ｋ９ｍｅ２水準が互いに類似することを確認した。これは、ＬＰＳによるＬＳＤ１リン酸化と関連した標的遺伝子活性化は、ヒストンの脱メチル化とは関係ないことを示す。一方、ヒストンＨ３Ｋ９アセチル化水準は、ＬＰＳ処理時、ＷＴ  ＢＭＤＭでＭｃｐ−１及びＩｌ−６プロモーターで増加したが、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭでは増加しなかった（図３Ｄ）。ＬＰＳ処理後Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭでＴＦであるｐ６５が標的プロモーターにリクルートされないため、ヒストンＨ３Ｋ９アセチル化も増加しなかったと推測される。さらに、Ｒａｗ２６４．７マクロファージでＧｏ６９７６を処理するとＭｃｐ−１及びＩｌ−６プロモーターに対するヒストンＨ３Ｋ９アセチル化、ＬＳＤ１及びｐ６５のリクルートが略完全に遮断された（図３Ｅ）。このようなデータは、ＬＰＳ誘発ＬＳＤ１のリン酸化がｐ６５との結合に重要であり一部ＮＦ−κＢ標的プロモーターのＬＳＤ１とｐ６５リクルートをＬＳＤ１のリン酸化が制御することを示す。
【００７４】
実施例４  ＬＳＤ１によるｐ６５の脱メチル化はｐ６５タンパク質安定性向上に重要であることを分析
ＬＳＤ１リン酸化がＬＰＳに対する反応でｐ６５を適切に標的プロモーターにリクルートするのに重要であるため、ＬＳＤ１がｐ６５をどのように調節するのかに焦点を合わせて研究を進めた。ｐ６５はＫ３１４／３１５部位がＳＥＴ７／９メチル化酵素によってメチル化され、ｐ６５のメチル化はｐ６５の分解を誘発することが明らかにされた（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ.２００９；２８：１０５５-１０６６）。しかしｐ６５脱メチル化及びそれに伴うｐ６５タンパク質の安定化を担う脱メチル化酵素の正体は知られていない。本発明者はまずＬＳＤ１がｐ６５の脱メチル化を担うか否かを調べた。酵素活性が欠乏したＬＳＤ１  Ｋ６６１Ａ（ＫＡ）突然変異体を利用してｉｎ  ｖｉｖｏ脱メチル化分析を行う前に、ＬＳＤ１  ＫＡ突然変異体がｐ６５との結合に影響があるかからまず確認した。ＬＳＤ１  ＷＴ及びＬＳＤ１  ＫＡ突然変異体は、ＬＰＳ処理時ｐ６５と類似の結合の有無を示すが、リン酸化欠陥があるＬＳＤ１  Ｓ１１２Ａ（ＳＡ）突然変異体はｐ６５との結合に失敗した（図４Ａ）。その後、ｐ６５の脱メチル化分析を行って、ＳＥＴ７／９によるｐ６５のメチル化がＬＳＤ１ＷＴによってなくなる一方、ＬＳＤ１のＳＡ又はＫＡ突然変異体はｐ６５メチル化をなくすことができないことを発見した（図４Ｂ）。ＬＳＤ１ＳＡ突然変異体は、ＷＴと類似の脱メチル化酵素活性を有しているが、ｐ６５との結合にはＬＳＤ１のリン酸化が必要なので、ｐ６５を脱メチル化することができなかった。さらに、本発明者はＫ３１４／３１５部位にｐ６５メチル化特異的抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱メチル化分析を行って、ＳＥＴ７／９に誘導されたｐ６５メチル化がリン酸化されたＬＳＤ１によって低下することを発見した（図４Ｃ）。このデータは、ＬＰＳに反応して、ＬＳＤ１がｐ６５の脱メチル化酵素（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）として作用して、ＬＳＤ１のリン酸化がｐ６５に対する結合に重要であることを示す。ＬＳＤ１リン酸化状態がｐ６５タンパク質安定化に影響を与えるかを明確にするために、ＷＴ及びＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭで核内のｐ６５タンパク質水準を比較した。興味深いことに、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭでＬＰＳ処理以後、核内ｐ６５タンパク質が検出されず、２６Ｓプロテアソーム抑制剤であるＭＧ１３２を処理するとＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭの核内ｐ６５タンパク質発現が回復した（図４Ｄ）。さらに、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭの核でＭＧ１３２処理によって回復したｐ６５タンパク質がメチル化されたｐ６５であることも確認した（図４Ｄ）。これはリン酸化されたＬＳＤ１がｐ６５に結合することができれ、ＬＳＤ１の脱メチル化酵素機能により核内のｐ６５メチル化依存的なタンパク質分解を防げることを意味する。ｐ６５に対するユビキチン化実験も行われた。ＬＳＤ１ＳＡまたはＫＡ突然変異の細胞内導入は、核でｐ６５ユビキチン化を増加させたが、細胞質ではそのような現象が見られなかった（図４Ｅ）。さらに、ＰＫＣαの活性を遮断するＧｏ６９７６またはＬＳＤ１の活性を遮断するＧＳＫ−ＬＳＤ１の処理は、核でｐ６５のｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓユビキチン化を顕著に誘導した（図４Ｆ）。一連のデータにより、本発明者はＬＳＤ１のリン酸化状態と脱メチル化活性がいずれもｐ６５タンパク質の安定化に重要であるとの証拠を示した（図４Ｇ）。
【００７５】
実施例５  ＰＫＣα−ＬＳＤ１リン酸化軸は持続的な炎症反応を調節する軸として作用
転写は、一連の転写因子の順次的段階によって調節される。ＬＰＳ依存的転写モジュールの誘導は多くのＴＦによって調整される（Ｌｉｔｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１０：４３７４４３）。ＮＦ−κＢを含むｃｌａｓｓ  Ｉ  ＴＦはＬＰＳ誘導２時間以内に炎症反応の開始を制御する。Ｃ／ＥＢＰδを含むＣｌａｓｓ  ＩＩ  ＴＦは２時間のＬＰＳ刺激後ｄｅ  ｎｏｖｏで合成されて、炎症シグナルの増幅のために後続で炎症反応関連遺伝子の活性化を調節する。ＰＵ．１及びＣ／ＥＢＰβを含むＣｌａｓｓ  ＩＩＩ  ＴＦは系統特異的転写調節因子である。すべてのＴＦはＬＰＳで誘発された転写反応を調節するために互いに協力する。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析で、クラスタ１遺伝子を利用したｄｅ  ｎｏｖｏモチーフ分析を介して、主なＴＦとしてｐ６５だけでなくＰＵ．１及びＣ／ＥＢＰを確認した（図２Ｄ）。さらに、我々はＣｅｂｐｄをクラスタ１でＬＳＤ１リン酸化依存的方式で誘導された遺伝子中一つであると確認した。Ｃｌａｓｓ  Ｉ  ＴＦとＣｌａｓｓ  ＩＩ  ＴＦが中継される時点である、ＬＰＳ高容量投与後６０分でＬＳＤ１のリン酸化が誘導されたので（図１）、ＬＳＤ１リン酸化が後続シグナル活性化及び炎症反応の増幅を調節するとの仮設を立てた。従ってＷＴ及びＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭで炎症反応遺伝子の発現をＬＰＳ処理の経時的に分析した。興味深いことに、３０分まで、ＷＴとＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭでＭｃｐ−１及びＩｌ−６  ｍＲＮＡの発現が類似したが、６０分から１２０分まではＭｃｐ−１及びＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現がＷＴと比較して有意にＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭで弱くなった（図５Ａ）。さらに、Ｃｅｂｐｄ  ｍＲＮＡ発現は、ＬＰＳ処理後９０分から、ＷＴと比較してＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭで有意に弱くなった（図５Ａ）。ＬＰＳ処理前にＷＴ  ＢＭＤＭにＧｏ６９７６の処理したことは、ＬＰＳが処理されたＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭと類似したｍＲＮＡ発現パターンが見られた（図５Ｂ）。またＬＳＤ１がリン酸化される時期であるＬＰＳ処理後６０分から、ｐ６５がＬＳＤ１に結合するのを確認した（図５Ｃ）。これはＬＳＤ１によるｐ６５の向上したタンパク質安定化が炎症反応遺伝子の持続的な活性化に重要であることを意味する。Ｃ／ＥＢＰδは、炎症反応遺伝子の後続活性化のためのＴＦとして機能するので、我々はプロモーター占有の動力学を確認するために、ＬＳＤ１、ｐ６５及びＣ／ＥＢＰδ抗体を用いてＬＰＳ時間過程に亘ってＣｈＩＰ分析を行った。ＬＰＳ処理後６０分からＬＳＤ１はＷＴ  ＢＭＤＭのＭｃｐ−１及びＩｌ−６プロモーターにリクルートされたがＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭではそうではなかった（図５Ｄ）。標的プロモーターに対するｐ６５のリクルートは、ＬＳＤ１リン酸化が誘導されなかったＬＰＳ処理後３０分にＷＴ及びＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭ共に検出された。しかしＬＰＳ処理後６０分からはＷＴ ＢＭＤＭでｐ６５リクルートが維持されるか増加したのに対し得、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭのＭｃｐ−１及びＩｌ−６プロモーターではｐ６５リクルートが有意に減少した（図５Ｄ）。このデータは、ＬＳＤ１リン酸化がＬＰＳ処理の後半時点（６０分以後）のｐ６５リクル��トを維持するのに重要な役割をすることを示す。またＣ／ＥＢＰδは、ＷＴ  ＢＭＤＭでＬＰＳ処理後１２０にリクルートされて、これは炎症反応の中継と増幅を誘導する（図５Ｄ）。それと並行して、Ｇｏ６９７６の処理をすると、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭで得たＣｈＩＰ結果と類似の結果を得た（図５Ｅ）。このデータは、ＰＫＣα−ＬＳＤ１−ＮＦ−κＢシグナルカスケードが、炎症反応遺伝子の転写活性化及び後続増幅をするためにＬＰＳ処理後６０分から作動することを示す（図５Ｆ）。
【００７６】
実施例６  ｐ６５の持続的な発現及びこれによる炎症の活性化はＰＫＣα−ＬＳＤ１−ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードに依存的であることを分析
我々はＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭでＬＰＳ処理後６０分から標的プロモーターのｐ６５のリクルートが減少したものを観察したので、ＷＴとＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭで経時による核内ｐ６５タンパク質ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ水準を確認した。ＬＰＳ処理後３０分にＷＴとＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭで同じｐ６５タンパク質を検出して、これはＬＰＳで誘導されたｐ６５の核に移動がＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭで全く損傷しないことを意味する（図６Ａ）。しかし核内ｐ６５タンパク質はＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡＢＭＤＭｓでずっと維持されることができなく、ＬＰＳ処理後１２０分でＣ／ＥＢＰδのｄｅ  ｎｏｖｏ合成も失敗した（図６Ａ）。さらに、免疫蛍光分析結果、ＬＳＤ１  ＷＴ−、ＳＡ−またはＫＡ−をいれたＬｓｄ１−／−マウス胚芽線維芽細胞（ＭＥＦｓ）にＬＰＳを３０分処理すると同じ水準のｐ６５と観察される。しかしＬＰＳを１２０分処理すると、ＬＳＤ１  ＷＴをいれたＬｓｄ１−／−ＭＥＦｓだけ核で安定化されたｐ６５タンパク質発現を示してＬＳＤ  ＳＡまたはＫＡ突然変異をいれたＬｓｄ１−／−ＭＥＦｓはそうではなかった（図６Ｂ）。核内ｐ６５タンパク質水準の維持及びＣ／ＥＢＰδの順次的ｄｅ  ｎｏｖｏ合成がＰＫＣα−ＬＳＤ１シグナリング軸に依存することを追加で確認するために、Ｇｏ６９７６またはＧＳＫ−ＬＳＤ１で処理した核分画物で免疫ブロット分析を行った。Ｇｏ６９７６またはＧＳＫ−ＬＳＤ１の処理は、ＷＴ  ＢＭＤＭ（図６Ｃ）またはＲａｗ２６４．７マクロファージ（図６Ｄ）でＬＰＳ処理後６０分でｐ６５を安定化させるのに失敗した。さらに、ＭＧ１３２の処理は、Ｇｏ６９７６またはＧＳＫ−ＬＳＤ１による核内に低下したｐ６５タンパク質水準を回復させた（図６Ｅ）。このデータは、ＰＫＣα−ＬＳＤ１−ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードが核内ｐ６５タンパク質水準の維持及びＣ／ＥＢＰδの順次的ｄｅ  ｎｏｖｏ合成に影響を与えて持続的な炎症反応の延長に重要であることを示す。
【００７７】
実施例７  マウスでのＰＫＣα活性またはＬＳＤ１活性の抑制による敗血症誘発による死亡率減少
Ｇｏ６９７６またはＧＳＫ−ＬＳＤ１の生体内効果を調べるためにマウスにＧｏ６９７６またはＧＳＫ−ＬＳＤ１を注入して肺組織を核分画した後、免疫ブロット分析を行った。Ｇｏ６９７６またはＧＳＫ−ＬＳＤ１注射すると、ＬＰＳを処理してもｐ６５が核内に安定化されずしＣ／ＥＢＰδも新しく合成できなかった（図７Ａ）。ＬＰＳ誘発全身炎症がＷＴ対照群よりＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスでずっと低いため（図１Ａ及び１Ｂ）、さらに深刻な敗血症マウスモデルで以前の研究結果を再確認しようとした。ＬＰＳ注入及び盲腸を縛って穿孔を行う手術（ｃｅｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｎｃｔｕｒｅ、以下ＣＬＰ）は、マウスでヒトの敗血症を模倣するのに広く使用されるマウスモデルである。ＬＰＳ注射は、敗血症の初期臨床的特徴を模倣して全身炎症を誘導するが、ＣＬＰ誘導性敗血症モデルは、排便が分泌されて免疫反応を引き起こすもので、ヒト敗血症と類似のサイトカインプロファイルを示すモデルである。年齢、性別及び体重が一致するＷＴ及びＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスでＣＬＰ手術を介して、種々の菌株で誘発された敗血症誘導した。興味深いことにＷＴマウスはＣＬＰ手術以後、９０時間以内に１００％の死亡率を示すのに対して、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスは５０％がＣＬＰ手術後１４４時間以上生存していた（図７Ｂ）。次にＰＫＣαまたはＬＳＤ１活性を遮断すると死亡率と肺損傷が減少する可能性を調べた。Ｇｏ６９７６、ＧＳＫ−ＬＳＤ―又は同等体積の溶媒をＣＬＰ手術後１２時間及び５０時間に二回注射した。ＣＬＰ手術以後、７８時間内に溶媒だけ注入したマウスは１００％死亡率を示したが、Ｇｏ６９７６注入マウスの４０％とＧＳＫ−ＬＳＤ１注射マウスの５０％だけが同じ期間中死亡して、このマウスはＣＬＰ手術以後１４４時間以上生存した（図７Ｃ及び７Ｄ）。このようなデータと一貫して、組織病理学的検査を介して、ＷＴマウスがＣＬＰ後深刻な肺損傷及び肺胞損傷が見られるが、これらの反応はＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウス、ＷＴにＧｏ６９７６またはＧＳＫ−ＬＳＤ１注射されたマウスでは共に有意に減少したことを示した（図７Ｅ）。敗血症で炎症反応遺伝子の調節にＧｏ６９７６またはＧＳＫ−ＬＳＤ１処理が効果があるか否かを調べた。ＣＬＰによるＭＣＰ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの上昇は、Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウス（図７Ｆ）、Ｇｏ６９７６注入マウスまたはＧＳＫ−ＬＳＤ１注入マウス（図７Ｇ）で有意に減少した。敗血症発病時全身炎症は、肝臓及び腎臓が主な標的臓器になり、多臓器機能不全を引き起こす場合が多い。ＣＬＰは、ＡＬＴ（肝の損傷マーカー）、ＬＤＨ（組織損傷マーカー）及びＢＵＮ（腎臓損傷マーカー）の血しょう水準を有意に増加させた。血しょう内ＡＬＴ、ＬＤＨ及びＢＵＮの濃度は、ＷＴマウス（図７Ｈ）と比較してＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスで有意に減少して、Ｇｏ６９７６またはＧＳＫ−ＬＳＤ１が注入されたマウスの血しょうでも同様に減少した（図７Ｈ、７Ｉ）。ＰＫＣα活性またはその下位タンパク質であるＬＳＤ１活性を遮断すると、核内ｐ６５タンパク質安定性が減少して、従って敗血症時急性全身炎症が減少して生存率が増加することを発見した（図７Ｊ）。
【００７８】
炎症反応は、侵入する病原菌に対する主な防御機構であり、病原菌によって誘発された疾病の発病を防ぐために病原菌が完全に除去される時まで維持されなければならない。一方、炎症反応は、敗血症のように過度な炎症の活性化による有害な影響もあるので、これを避けるため、病原体が除去された後に適時に終了しなければならない。従って過度な炎症反応がどのように検出されて維持されるのかに対する分子メカニズムを理解することが、敗血症誘発死亡率や臓器損傷を緩和するのに必ず必要である。本発明でＰＫＣαによるＬＳＤ１リン酸化が、ｐ６５のタンパク質安定性を維持して、過度なＬＰＳ処理後持続的な炎症反応を維持するのに重要な役割をするとの証拠を示した。Ｌｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスを利用した生体内研究を介して、激しい炎症反応でＰＫＣαによるＬＳＤ１リン酸化の機能を解明できるようになった。ＬＳＤ１のリン酸化が起きることができないＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスの場合、敗血症ショックで過度な炎症反応及び組織損傷を顕著に減少した。またＧｏ６９７６またはＧＳＫ−ＬＳＤ１処理は過度な全身性炎症反応を顕著に減少させて、ＰＫＣα活性及びＬＳＤ１活性が炎症反応の活性化に決定的であることを証明した。ＰＫＣα−ＬＳＤ１−ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードが過度な炎症刺激に反応して炎症反応の増幅とそれに伴う敗血症を含む炎症性疾患の誘発に重要な役割をすることを確認した。
【００７９】
高容量のＬＰＳに反応するＬＳＤ１リン酸化依存性遺伝子に敗血症と関連した遺伝子及びＣｌａｓｓＩＩ／ＩＩＩＴＦと関連した遺伝子が含むという点は重要である。クラスタ１のＩＬ−６とＭｃｐ−１遺伝子は敗血症に関連したもので知られている遺伝子である（Ｒｉｎｃｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；３３：５７１-５７７）。
興味深いことにＣｅｂｐｄ−／−マウスはＷＴに比べてＬＰＳ誘発急性肺損傷があまり見られなく、減少したＩｌ−６遺伝子の発現を示し、これはＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスと類似の表現型であるといえる。
【００８０】
ＰＫＣα−ＬＳＤ１−ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードが作動する時に現れるＣｅｂｐｄ  ｍＲＮＡの発現増大は、このシグナル伝達カスケードが炎症反応の後続増幅に決定的であり窮極的に敗血症につながることを意味する。本発明により、過度な炎症性刺激と炎症反応に伴う後成調節間の機能的つながりを見つけた。ＰＫＣ活性剤であるＰＭＡによって誘導された急性及び慢性炎症が以前に報告されたが、下位のＰＫＣ基質とその標的遺伝子は明らかになっていない。本発明により、ＰＫＣαが過度な炎症性刺激により核に入ってきてＬＳＤ１をリン酸化することを発見したので、ＰＫＣαが細胞質と核を連結して炎症反応の追加活性化のために外部の過度な炎症刺激を認知して伝達するセンサーとして機能をすると考える。過度な炎症性刺激によってＬＳＤ１がＰＫＣαの基質になり、ｐ６５の脱メチル化酵素として機能してｐ６５タンパク質の安定化が増大することを発見した。敗血症を誘発したＬｓｄ１ＳＡ／ＳＡマウスの表現型分析だけでなく、ＧＳＫ−ＬＳＤ１を使用してＬＳＤ１の活性を抑制するか、Ｇｏ６９７６を使用してＰＫＣαの活性を抑制すると、ＣＬＰ手術による組織損傷が少なく生存率が高まることも立証した。たとえ初期段階で敗血症患者に対する抗生剤治療が死亡率を低くするが、敗血性ショックが起きる間過度な炎症反応自体を抗生剤が調節することはできない。抗生剤とともに、先述した過度な炎症反応を誘発するＰＫＣα−ＬＳＤ１−ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードを標的にする薬物を共に使用すると、全身性炎症に進行される敗血症患者の新しい治療剤が開発できると考えられる。つまり、本発明により、炎症性疾患でＰＫＣα−ＬＳＤ１−ＮＦ−κＢシグナル伝達軸が、可能性のある治療標的なり得ることを示す。
【００８１】
本発明で使われるすべての技術用語は、特に定義されない限り、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解するようなものと同じ意味で使われる。本明細書に参考文献と記載されるすべての刊行物の内容は本発明に受け入れられる。以上、本願の例示的な実施例について詳細に説明したが、本願の権利範囲はこれに限定されず、次の請求範囲で定義している本願の基本概念を利用した当業者の様々な変形及び改良形態も本願の権利範囲に属する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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