(57)【要約】  本発明は、大麦植物またはその一部に関し、前記大麦植物の穀粒は低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する。大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子の変異を有し得、前記変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子は変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大麦植物またはその一部であって、前記大麦植物の穀粒は、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し、前記大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、前記変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子は、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードし、前記変異体ＣｓｌＦ６は、変異体ＣｓｌＦ６がＣｓｌＦ６の膜局在型ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１のＣｓｌＦ６であり、前記置換が非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換、または極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換であり、前記膜局在型ドメインが、配列番号１または配列番号３のアミノ酸８３５〜８５７、またはアミノ酸７００〜７３１、またはアミノ酸７４１〜７５８からなる、ＣｓｌＦ６の膜局在型ドメインからなる群より選択される、大麦植物またはその一部。
【請求項２】
前記大麦植物が、総穀粒乾燥重量の１〜５％、例えば、総穀粒乾燥重量の１．３〜３％の、好ましくは、総穀粒乾燥重量の１．３〜２％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する、請求項１に記載の大麦植物。
【請求項３】
前記大麦植物の穀粒が、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の（１，３；１，４）−β−グルカンの含量の、少なくとも３０％で最大で６０％、好ましくは少なくとも４０％で最大で６０％の前記（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する、請求項１または２に記載の大麦植物。
【請求項４】
前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、ＣｓｌＦ６のアミノ酸８３５〜８５７からなる膜貫通ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項５】
前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸８４７の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換はグリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項６】
前記大麦植物の穀粒が、多くても２．１などの多くても２．５、例えば、１．０〜２．１の範囲のＤＰ３：ＤＰ４比率を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項７】
前記大麦植物が脱穀後の破壊穀粒の出現頻度を有する穀粒を含み、その出現頻度が、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有さないがその他は同じ遺伝子型である大麦植物の穀粒の脱穀後の破壊穀粒の出現頻度よりも、多くて２倍高い、請求項１〜６のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項８】
前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、ＣｓｌＦ６のアミノ酸７４１〜７５８からなる膜貫通ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項９】
前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７４８の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、グリシン（Ｇ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換である、請求項１〜３および８のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１０】
前記大麦植物の穀粒が、２．５〜４の範囲のＤＰ３：ＤＰ４比率を有する、請求項１〜３および８〜９のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１１】
前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、ＣｓｌＦ６のアミノ酸７００〜７３１からなる膜貫通ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１２】
前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７０９の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、トレオニン（Ｔ）のイソロイシン（Ｉ）への置換である、請求項１〜３および１１のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１３】
前記大麦植物の穀粒が、少なくとも４．０などの少なくとも３．５、例えば、４〜６の範囲などの少なくとも４．５のＤＰ３：ＤＰ４比率を有する、請求項１〜３および１１または１２のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１４】
１種または複数の追加の遺伝子中に変異、例えば、１つまたは複数の次の変異：
ａ．機能的ＬＯＸ−１の完全喪失をもたらすＬＯＸ−１コード遺伝子中の変異、
ｂ．機能的ＬＯＸ−２の完全喪失をもたらすＬＯＸ−２コード遺伝子中の変異、
ｃ．機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらすＭＭＴコード遺伝子中の変異、
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１５】
緑麦芽、キルン乾燥麦芽、麦汁および飲料からなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部から作製された、植物生成物。
【請求項１６】
水性抽出物の製造方法であって、
ａ．請求項１〜１４のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．大麦粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップが前記穀粒を水溶液中で長くても７２時間インキュベーションすることを含むステップ；
ｃ．前記発芽穀粒を微粉化し、同時に、前記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップであって、ただし、前記大麦粒が発芽後および前記発芽穀粒を微粉化するまで、常に２０％未満の含水量にならないことが前提である、ステップ；
ｄ．前記粉砕発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、前記大麦の水性抽出物を製造するステップ、
を含む、方法。
【請求項１７】
飲料の製造方法であって、
ａ．請求項１〜１４のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または請求項１５に記載の麦芽の水性抽出物を作成するステップ；または請求項１６に記載の方法により水性抽出物を作製するステップ；
ｃ．前記水性抽出物を飲料に処理するステップ、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された細胞壁特性を有する大麦植物に関する。特に、本発明は、大麦ベース飲料、例えば、ビールの製造に有用な細胞壁特性を有する大麦植物に関する。本発明はさらに、大麦ベース飲料の製造方法、ならびに本発明の大麦植物から作製された生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
商業的製麦工程では、４〜６日間にわたる、デンプン性胚乳の貯蔵デンプンおよびタンパク質の部分的流動化を可能とする制御された条件下で大麦粒を発芽させる、または麦芽にする。製麦工程は通常、乾燥大麦粒を水中に浸漬することにより開始される。この工程は、浸麦として知られ、目的は、穀粒を洗浄するためのみでなく、その含水量を約４０〜４５％（ｗ／ｗ）まで上昇させて、次に続く胚乳可動化ステップをより急速に行わせるためでもある。浸麦中、水を一度排水し、穀粒の再通気を可能とする。このステップは、「エアレスト（ａｉｒ  ｒｅｓｔ）」として知られ、主として、浸漬粒子が約１６時間後に酸素欠乏になるという理由で必要になると考えられる。約８時間の「エアレスト」後、穀粒は水に再浸漬され、さらに８時間にわたる浸麦処理−または一連の再浸麦ステップにより浸麦処理が完結される。乾燥穀粒の含水量を４０％以上にまで増加させる２段階浸麦工程は、全体で約３２時間を要する。
【０００３】
浸麦穀粒は、発芽のために拡散培養され、その間に、酵素がアリューロンおよび胚盤上皮細胞から分泌され（デンプン性胚乳細胞中に先在する若干量と一緒に）、細胞壁、デンプンおよびタンパク質を分解する。麦芽製造業者は通常、大麦粒中の細胞壁多糖、特に（１，３；１，４）−β−グルカンおよびアラビノキシランを分解する高レベルの酵素を生じさせることを目指している。不完全に分解された（１，３；１，４）−β−グルカンは、醸造業者にとって特に面倒な場合がある。理由は、これらは、可溶型の麦芽から抽出されることがあり、これが高粘稠水溶液を形成し、醸造所における濾過工程を遅らせ、最終ビール中の望ましくない濁りの一因となるためである。高（１，３；１，４）−β−グルカン含量での醸造は、麦芽抽出物のレベルに悪影響を与えることがさらに示された。従って、低レベルの可溶性（１，３；１，４）−β−グルカンは、重要な製麦品質パラメーターであり、同時に、高レベルの（１，３；１，４）−β−グルカナーゼ酵素は、依然として重要な麦芽品質の尺度のままである。加えて、麦芽製造業者は、穀粒中で可能な限り多くのデンプン分解酵素の合成を、素早く生じさせることを目指している。デンプン分解酵素（これには、デンプン脱分枝酵素であるαおよびβ−アミラーゼ（例えば、限界デキストリナーゼ）およびα−グルコシダーゼを含む）が、穀粒の貯蔵澱粉を部分的に単糖、オリゴ糖、およびグルコースに解重合する。デンプンの解重合生成物はその後、炭素源として酵母細胞により使用され、ビールエタノールに発酵される。
【０００４】
上述のように、発芽工程は通常、約５日間を要する。制御された発芽ステップ後に、湿潤麦芽の含水量を約４０％から４〜５％まで乾燥する。この乾燥工程は焙燥工程と呼ばれ、極めてエネルギーを消費する工程であり、この産業の大きなコストを占める。キルン乾燥を含む全体工程は通常、６〜７日を要する。
【０００５】
醸造所では、キルン乾燥麦芽を粉砕して穀粒をこじ開け、得られた内容物はマッシング工程として知られる工程で温水により抽出される。上述のように、抽出された物質は、部分的に分解したデンプン、タンパク質および細胞壁分子を含み、これらは、麦芽から抽出された内在性穀物酵素によりさらに分解される。この段階で、一部の醸造業者は、追加の、および通常より安価な炭素源（補助剤）を加え、その後の、酵母発酵工程を補助し、麦芽のより高いコストを相殺する。前記補助剤は、大麦、米、小麦またはその他の未発芽穀粒由来の穀粉であってよいが、それらの追加は、加水分解酵素を共に添加する必要がある。理由は、麦芽中には補助剤の成分を分解するのに不十分な内在性酵素しか存在しないためである。添加される酵素は通常、未精製の比較的安価な真菌および／または細菌培養物の抽出物由来である。外来性酵素の添加は、いくつかの国では、特に、ビールを厳密に調節された状況下で製造しなければならない国では合法的ではない。
【０００６】
温水中で抽出されたデンプン、およびその他の胚乳成分のさらなる分解は、糖化と呼ばれる工程で進められる。マッシング工程後に、抽出物は、多くの場合、麦芽汁濾過機中で濾過され、冷却される。抽出物は、ホップまたはホップ抽出物の存在下で煮沸され、放出された糖のエタノールへの発酵のために、冷却時に酵母培養物が添加され得る。そのように製造されたビールは通常、熟成され、濾過後に瓶詰めされる。ビールはまた、瓶詰めの前に炭酸ガスで飽和され得る。
【０００７】
大麦はビールの製造に使用される最も一般的な穀物である。大麦は、大量のデンプンがその穀粒中に含まれ、これが大麦を醸造産業のための極めて魅力的な原材料にした。大麦粒の醸造潜在力が完全に利用されることを保証するために、デンプン細粒を密封する細胞壁構造体の最適分解を行うことが重要である。その構成を単純化すると、大麦粒は、アリューロン層により取り囲まれたデンプン性胚乳からほぼ構成される。大麦粒アリューロンおよび胚乳細胞壁は主に、非デンプン性多糖類（ＮＳＰ）から構成される。デンプン性胚乳は、７５％の（１−３、１−４）−β−グルカン（ＢＧＬ）および２０％のアラビノキシラン（ＡＸ）からなり、一方、アリューロンは、７１％のＡＸおよび２６％のＢＧＬから構成される。大麦ＢＧＬは、β−（１−３）およびβ−（１−４）結合の両方により連結されたグルコース残基の非分岐鎖で長い直鎖である。大麦ＡＸは、α−（１−２）および  α−（１−３）結合を介して連結されたＬ−アラビノフラノースにβ−（１−４）結合によりランダムに連結されたＤ−キシラノピラノシル分子骨格からなる。
【発明の概要】
【０００８】
前述で概略を述べたように、時間およびエネルギーを消費するビール製造ステップの１つは、製麦である。製麦工程の律速段階は、発芽大麦粒中の（１，３；１，４）−β−グルカンレベルの許容可能な低いレベルまでの低減化である。従って、製麦に必要な時間を低減できる材料と方法の提供に対する必要性が存在する。特に、低レベルの（１，３；１，４）−β−グルカンを有する大麦植物に対する必要性が存在する。しかし、（１，３；１，４）−β−グルカンが完全に非存在の大麦植物は、植物高さ、草勢および収率（対照の約７０％）が低下する（Ｔａｋｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。実際に、Ｔａｋｅｔａらは、”農学的特性が低下し、製麦中のｂｇｌ変異体の有用性は良好でない可能性がある、など”と結論付けている。Ｈｕら（２０１４）は、極めて低いレベルの混合連結（１−３，１−４）β−グルカン（＜１．６％）を含む大麦変異体ｍ３５１について記載している。しかし、ｍ３５１変異体は、その親に比べて、穀粒破壊比率の４倍を超える増加により示されるように、低減した穀粒硬さ、および４００ｍＭの塩条件下で、より低い発芽をもたらす塩に対する低減した感受性を示した。
【０００９】
従って、低レベルの（１，３；１，４）−β−グルカンを有し、同時に、良好な農学的特性および穀粒硬さを有する大麦植物に対する必要性が存在する。
【００１０】
大麦（１，３；１，４）−β−グルカンは、セロトリオシル（ＤＰ３）およびセロテトラオシル（ＤＰ４）残基を、通常２．５〜４の範囲の比率で含む。ＤＰ３／ＤＰ４比率は、（１，３；１，４）−β−グルカンの特性に影響を与える。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、野生型大麦のＤＰ３／ＤＰ４比率と同等のＤＰ３／ＤＰ４比率を有する低レベルの（１，３；１，４）−β−グルカンを有する大麦植物を提供する。このような大麦植物は、農学的に健全で、破壊の傾向が小さい大麦粒を有し得る。本発明により解決された１つの技術的問題は、低レベルの（１，３；１，４）−β−グルカンを有する大麦植物の提供であり、この場合、大麦植物は同時に、許容可能な農業形質、許容可能な頻度の穀粒の破壊（例えば、ＣｓｌＦ６変異がないこと以外は同じ遺伝子型の野生型植物の２倍未満）およびさらに、野生型大麦に類似のＤＰ３／ＤＰ４比率を有する。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、高いまたは低いＤＰ３／ＤＰ４比率を有する低レベルの（１，３；１，４）−β−グルカンを有する大麦植物を提供する。このような大麦植物は、農学的に健全な穀粒を有し、また、高レベルの不溶性（１，３；１，４）−β−グルカンを有し得る。不溶性の（１，３；１，４）−β−グルカンは、醸造工程中に除去される可能性があり、従って、いくつかの実施形態では、これは好ましい。Ｂｕｒｔｏｎ  ＆  Ｆｉｎｃｈｅｒ  ２０１４は、（１，３；１，４）−β−グルカン分子の溶解度は、ＤＰ３：ＤＰ４比率から予測可能であること、および高いおよび低い比率は、より不溶性の凝集体を生じ得ることを推測した。
【００１３】
Ｊｏｂｌｉｎｇら（２０１５）は、タバコの葉の人工系におけるＣｓｌＦの発現について記載し、ＣｓｌＦの第４膜貫通ドメイン中の単一のアミノ酸（Ｉｌｅ７５７）がＤＰ３：ＤＰ４比率を制御することを記載しているが、しかし、そのドメインの改変も、ＤＰ３：ＤＰ４比率も、（１，３；１，４）−β−グルカンの量と相関するという記載はなされていない。
【００１４】
本発明により解決された１つの技術的問題は、低レベルの（１，３；１，４）−β−グルカンを有する大麦植物の提供であり、この場合、大麦植物は同時に、許容可能な農業形質および、さらに有用なＤＰ３／ＤＰ４比率を有する。
【００１５】
一態様では、本発明は、膜貫通ドメイン中に単一アミノ酸の変異を有する大麦植物を提供する。驚くべきことに、本発明は、低レベルの（１，３；１，４）−β−グルカン（通常、１．７〜５％の範囲）を含むこのような大麦植物が生存可能であり、また、農学的に健全で、他の大麦栽培品種と同等の収率を有することを示している。このような大麦植物は、発芽時間を低減した穀物ベース飲料の製造方法に特に有用である。
【００１６】
さらに、本発明は、微調整した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する大麦植物を提供するための方法およびツールを提供する。従って、本発明の大麦植物は、低（１，３；１，４）−β−グルカン含量であるのみでなく、大麦植物のＤＰ３：ＤＰ４比率も制御され得る。
【００１７】
一態様では、本発明は、大麦植物またはその一部を提供し、前記大麦植物の穀粒は、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し、前記大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、前記変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子は、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードし、前記変異体ＣｓｌＦ６は、変異体ＣｓｌＦ６がＣｓｌＦ６の膜局在型ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換が非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換、または極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換であり、ＣｓｌＦ６の膜局在型ドメインが、配列番号１または配列番号３のアミノ酸１０９〜１２８、１３７〜１５８、７００〜７３１、７４１〜７５８、８３５〜８５７、および８６４〜８８２からなる。
【００１８】
前記大麦植物から作製される植物生成物ならびに前記大麦植物から植物生成物を作製する方法を提供することも本発明の一態様である。本発明の大麦植物は、好都合にも、植物生成物、例えば、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を有するが、それ以外は本発明の大麦植物と同じ遺伝子型の大麦植物である大麦植物の穀粒から作製される麦汁に比べて、低減した粘度を有する麦汁を作製するために使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】デジタル変異特定（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＤＭＩ）法（Ｍｕｔ１、２、３および４ならびに対応する参照１）または塩基配列決定（Ｍｕｔ５および対応する参照）により、変異体の（１，３；１，４）−β−グルカン（β−グルカンまたはＢＧＬと略称）含量が特定された。バーは＋／−ＳＤである。
【図２】ＤＭＩ法（Ｍｕｔ１、２、３、４および対応する参照１）または塩基配列決定（Ｍｕｔ５および対応する参照）により特定された変異体のＤＰ３：ＤＰ４比率を示す。
【図３】細胞膜中に埋め込まれたＣｓｌＦ６タンパク質のモデルを示す。示した変異は、ＤＭＩ変異体である。
【図４】緑麦芽を作製するのに有用な装置の例を示す。装置はタンク（２）を備え、その中で穀粒を水溶液中に浸漬し、連続的に通気できる。装置は、穀物粒（１）の入り口、タンク、例えば、浸麦タンク（２）；ガス入り口、例えば、焼結石（３）；ポンプ、例えば、エアポンプ（４）；穀物粒出口（５）；穀物ポンプ（６）；穀物粒を細かく粉砕する装置、例えば、ミル（７）；入口（８）；容器、例えば、マッシング容器（９）；および出口（１０）を備える。
【図５】変異体２（変異体）および栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ（参照）穀粒で製麦中に測定された、α−アミラーゼ（ａ）、β−アミラーゼ（ｂ）および遊離限界デキストリナーゼ（ｃ）活性を示す。
【図６】成熟大麦粒（０日目）中、および１、２、３、４、５、６日目ならびにキルンドモルト（７日目）の緑麦芽中の変異体２（変異体）および栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ（参照）穀粒の（１−３；１−４）−β−グルカン含量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本明細書で使用される場合、それが使われる文脈に応じて、「ａ」は、１つ（１種）または１つ（１種）を超える、を意味し得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語の「補助剤」は、ビールの作製中に加えられる炭素リッチ原材料源を意味する。補助剤は、非発芽穀物粒であってもよく、これは、本発明により作製された発芽穀粒と共に粉砕されてもよい。補助剤はまた、シロップ、糖などであってもよい。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語の「アミノ酸」は、タンパク質を構成するアミノ酸を意味する。好ましくは、タンパク質を構成するアミノ酸は、標準的遺伝子コードによりコードされる２０個のアミノ酸の内の１つである。ＩＵＰＡＣの１文字および３文字コードは、アミノ酸を命名するために使用される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語の「Ｘに対応するアミノ酸」は、参照ポリペプチド（例えば、配列番号１のＣｓｌＦ６）のアミノ酸に対して、所与のポリペプチド（例えば、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチド）のアミノ酸について言及する。前記ポリペプチドと参照ポリペプチドとの間で整列後に、アミノ酸が前記整列中のＸと同じ位置にある場合に、そのアミノ酸は、Ｘに対応する。
【００２４】
用語の「アミロース」は、α−Ｄ−グルコースのホモポリマーを意味する。アミロースは、そのグルコース単位がほぼ例外なく、α−１−４−グリコシド結合により結合されるので、直鎖分子構造を有する。
【００２５】
用語の「アミロペクチン」は、α−Ｄ−グルコースのホモポリマーを意味する。アミロペクチン分子は、α−１−６−グリコシド結合を高頻度に含む。これらは、本来ならα−１−４−結合グルコース鎖を生ずるはずの鎖中に分岐点を導入し、分子軸に沿って規則的な間隔で現れる並行鎖のクラスターを生じる。
【００２６】
数値に関連して本明細書で使用される場合、用語の「約」は、好ましくは±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％を意味する。
【００２７】
ビールなどの大麦ベース飲料の製造工程、特に、製麦工程を言い表すのに使用される工程に関連する用語の「大麦」は、大麦粒を意味する。別段の指定がない限り、その他のすべての場合では、「大麦」は、大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ，Ｌ．）を意味し、これには、任意の育種系統または栽培品種または変種が含まれ、一方、大麦植物の一部は、大麦植物の任意の部分、例えば、任意の組織または細胞であり得る。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語の「大麦粉」は、粉砕した大麦粒を意味する。
【００２９】
本明細書で定義の「穀類」植物は、主にそれらのデンプン含有種子または穀粒を目的として栽培されたイネ科植物ファミリーのメンバーである。穀類植物には、限定されないが、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、米（Ｏｒｙｚａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ）、オート麦（Ａｖｅｎａ）、サトウモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、およびライ小麦、ライ麦−小麦交配種が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語の「荷電アミノ酸」は、帯電した側鎖を有するアミノ酸を意味する。好ましくは、荷電アミノ酸は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕからなる群から選択される。負に帯電しているアミノ酸は、好ましくはＡｓｐおよびＧｌｕからなる群から選択される。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語の「若葉」は、穀物粒の発芽相中に認められる成長している胚芽を意味する。
用語の「α−アミラーゼ」
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語の「ＤＰ」は、重合度を意味し、アミロペクチン側鎖中のα−１，４−結合グルコース単位数を示す。従って、例としてのＤＰ３は、３つのα−１，４−結合グルコース単位の配列からなるアミロペクチン側鎖を意味する。同様に、ＤＰ４は、４つのα−１，４−結合グルコース単位の配列からなるアミロペクチン側鎖を意味する。本明細書で使用される場合、用語の（１，３；１，４）−β−グルカンの「ＤＰ３：ＤＰ４比率」は、前記（１，３；１，４）−β−グルカン中の３つのα−１，４−結合グルコース単位の配列からなるアミロペクチン側鎖および４つのα−１，４−結合グルコース単位の配列からなるアミロペクチン側鎖の比率を意味する。ＤＰ３：ＤＰ４比率は、（１，３；１，４）−β−グルカンをリケナーゼで消化し、続けて、放出されたＤＰ３およびＤＰ４オリゴマーを、例えば、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより定量することにより決定し得る。特に、ＤＰ３：ＤＰ４比率は、実施例３に記載のように決定し得る。
【００３３】
指定された核酸に関連して、「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」または「コードする（ｅｎｃｏｄｅｄ）」は、指定されたタンパク質への翻訳のための情報を含むことを意味する。タンパク質をコードする核酸またはポリヌクレオチドは、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列、例えば、イントロンを含むか、または例えば、ｃＤＮＡ中で、このような介在非翻訳配列を欠いていてもよい。タンパク質がコードされる情報は、コドンの使用により指定される。
【００３４】
本明細書で使用される場合、核酸に関連して「発現」は、ｍＲＮＡの転写および蓄積と理解されるべきである。タンパク質に関連して使用される「発現」は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味する。
【００３５】
用語の「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、これには、コード領域に先行するおよびそれに続く領域（プロモーターおよびターミネーター）が含まれる。さらに、植物遺伝子は通常、イントロンにより割り込まれるエクソンからなる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語の「発芽穀粒」は、目視可能な若葉および茎を発達させた穀物を意味する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語の「発芽の開始」は、１５％未満の含水量の大麦粒が十分な水と接触して発芽を開始する時点を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語の「β−グルカナーゼ」は、穀物β−グルカンを解重合する潜在力を有する酵素を意味する。従って、別段の指定がない限り、用語の「β−グルカナーゼ」は、（１，３；１，４）−β−および／または（１，４）−β−グルカナーゼ活性を特徴とする細胞内酵素または細胞外酵素またはこれらの混合物を意味する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「（１，３；１，４）−β−グルカン含量」は任意の有用な方法により測定し得る。好ましくは、「（１，３；１，４）−β−グルカン含量」は、Ｇｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ３）およびＧｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ４）オリゴマーの含量の合計として決定される。ＤＰ３およびＤＰ４オリゴマーの含量は、例えば、（１，３；１，４）−β−グルカンのリケナーゼ消化とこれに続く例えば、アンペロメトリック電気化学検出法を備えた高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）による定量により測定し得る。好ましくは、（１，３；１，４）−β−グルカン含量は、本明細書の下記実施例３に記載のように決定される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語の「（１，３；１，４）−β−グルカンシンターゼ」は、（１，３；１，４）−β−グルカンの合成を触媒し、さらに、任意選択で、グルコピラノシル単量体の重合を触媒する任意のタンパク質と見なさなければならない。例えば、（１，３；１，４）−β−グルカンシンターゼは、ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログによりコードされたポリペプチドであり得る。
【００４１】
用語の「穀粒」は、内部種子も意味する穀物穎花を含むように定義される。加えて、穀粒は、外穎および内穎を含み得る。ほとんどの大麦品種では、外穎および内穎は、穎花に付着し、脱穀後の穀粒の一部である。しかし、裸麦品種も発生する。これらでは、穎花は、外穎および内穎を不含であり、小麦の場合のように脱穀して自由に取り出せる。用語の「穀粒（ｋｅｒｎｅｌ）」および「穀粒（ｇｒａｉｎ）」は、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語の「製麦」は、制御された環境条件下で起こる、穀物粒（特に、大麦粒）の制御された発芽を意味する。いくつかの実施形態では、「製麦」は、前記発芽穀物粒を、例えば、キルン乾燥により、乾燥するステップをさらに含む。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語の「緑麦芽」は、発芽穀物粒を意味し、これは、キルン乾燥のステップに供されていない。一般に、前記穀物粒は、制御された環境条件下で発芽されている。いくつかの実施形態では、緑麦芽は、粉砕緑麦芽である。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語の「キルン乾燥麦芽」は、キルン乾燥により乾燥されている発芽穀物粒を意味する。一般に、前記穀物粒は、制御された環境条件下で発芽されている。いくつかの実施形態では、キルン乾燥麦芽は粉砕キルン乾燥麦芽である。
【００４５】
「マッシング」は、粉砕麦芽（例えば、緑麦芽またはキルン乾燥麦芽）および／または非発芽穀物粒の水中でのインキュベーションである。マッシングは、特定の温度および特定の体積の水中で実施されるのが好ましい。
【００４６】
「変異」には、遺伝子のコードおよび非コード領域中の、欠失、挿入、置換、塩基転換、および点変異が含まれる。欠失は、全体遺伝子でも、または遺伝子の一部分にみであってもよい。点変異は、１つの塩基対の変化に関し、未成熟停止コドン、フレームシフト変異、スプライス部位の変異またはアミノ酸置換を生じ得る。変異を含む遺伝子は、「変異体遺伝子」と呼ばれることもある。前記変異体遺伝子が野生型とは異なる配列を有するポリペプチドをコードする場合、前記ポリペプチドは、「変異体ポリペプチド」と呼ばれることもある。
【００４７】
用語の「粉砕された」は、例えば、切断、粉砕、磨砕または圧潰により微粉化された物質（例えば、大麦粒または麦芽）を意味する。大麦粒は、湿った状態で、例えば、グラインダーまたは湿式ミルを用いて粉砕できる。粉砕大麦粒または粉砕麦芽は、水性抽出物に有用な物質の状態にするために十分に微粉化される。粉砕大麦粒または粉砕麦芽は、生物学的方法によっては、本質的に未処理の植物に再生できない。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語の「非極性アミノ酸」は、疎水性側鎖を有するアミノ酸を意味する。好ましくは、非極性アミノ酸は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＧｌｙからなる群より選択され、より好ましくはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＧｌｙからなる群より選択される
【００４９】
用語「植物生成物」は、植物または植物性物質の処理から得られた生成物を意味する。従って、前記植物生成物は、例えば、緑麦芽、キルン乾燥麦芽、麦汁、発酵または非発酵飲料、食品、または飼料製品であり得る
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語の「極性アミノ酸」は、極性の非荷電側鎖を有するアミノ酸を意味する。好ましくは、極性アミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択される。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語の「子孫」は、所与の植物の直接または間接的派生物である植物を意味する。従って、子孫は直接派生物に限定されることなく、多くの世代後の派生物も含む。一般に、特定の変位を有する大麦植物の子孫も同様に、その特定の変位を有する。従って、ＣｓｌＦ６遺伝子中に特定の変位を有する大麦植物の子孫も同様に、その特定の変位を有する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語の「配列同一性」は、整列後に、候補配列と参照配列との間のアミノ酸またはヌクレオチドの同一％を意味する。従って、参照配列と８０％の同一性を共有する候補配列は、整列後に、参照配列中の対応するアミノ酸に対して、候補配列中の８０％のアミノ酸が同一であることが必要である。本発明による同一性は、コンピューター分析、例えば、限定されないが、ポリペプチド配列の整列用のＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａコンピューター整列プログラム（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  7  ：５３９，ＰＭＩＤ：２１９８８８３５；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５  Ａｐｒｉｌ  ０６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３（Ｗ１）：Ｗ５８０−４  ＰＭＩＤ：２５８４５５９６；ＭｃＷｉｌｌｉａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３  Ｍａｙ  １３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５９７−６００  ＰＭＩＤ：２３６７１３３８、およびその中で示唆されたデフォルトパラメーターを用いて決定される。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａソフトウェアは、ＥＭＢＬ−ＥＢＩのｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／から利用できる。このプログラムをそのデフォルト設定で用いて、クエリーの成熟（生理活性）部分および参照ポリペプチドが整列される。完全に保存された残基の数がカウントされ、参照ポリペプチドの長さで除算される。ＭＵＳＣＬＥまたはＭＡＦＦＴアルゴリズムがヌクレオチド配列の整列のために使用され得る。配列同一性は、アミノ酸配列に対して示したものと類似の方法で計算され得る。本明細書で提供される配列同一性は、従って、参照配列の全体長さにわたり計算される。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語の「デンプン」は、個別の高分子：アミロースおよびアミロペクチンの片方または両方の組成物を意味する。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、用語の「浸麦」は、穀物粒の含水量を増大させる工程を意味する。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、穀物の「含水量」という用語は、前記穀物中のＨ２Ｏのｗ／ｗ％を意味する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語の「野生型ＣｓｌＦ６」は、配列番号１または配列番号３のポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、穀物粒の酵素活性は、特定の穀物タイプから作製された粉末で測定された活性を意味する。例えば、１ｇの穀物粒当たり１０Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性は、前記穀物からの１ｇの粉末（乾燥物）由来の水性抽出物中で測定した前記α−アミラーゼ活性（１０Ｕ）を意味する。α−アミラーゼ活性は、Ｋ−ＣＥＲＡ０１／１２により測定される（プロトコルおよびキットは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）。β−アミラーゼ活性は、Ｋ−ＢＥＴＡ３により測定される（プロトコルおよびキットは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）。限界デキストリナーゼ活性は、Ｔ−ＬＤＺ１０００により測定される（プロトコルおよびキットは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）。
【００５８】
本明細書で示すガスの体積は、１気圧、２０℃での前記ガスの体積を意味する。
【００５９】
本明細書で示すＯ２の体積は、１気圧、２０℃でのＯ２の体積を意味する。本発明の実施形態では、Ｏ２がガスの混合物中に含まれる場合、ガス混合物の総体積が決定され得、Ｏ２の体積は、Ｏ２を含む総体積のパーセンテージとして計算され得る。一例では、大気は２１％Ｏ２を含む。従って、本明細書で使用される大気中のＯ２の体積は、大気の総体積の２１％である。
【００６０】
用語の「麦汁」は、粉砕麦芽および／または粉砕穀物粒ならびに追加の補助剤などの麦芽および／または穀物粒の液体抽出物を意味する。麦汁は通常、マッシングにより、続けて、任意選択で、温水でマッシング後、残留物糖類およびその他のビール粕由来の化合物を抽出する工程での「スパージング」により得られる。スパージングは通常、麦芽汁濾過機、マッシュフィルター、または抽出した水のビール粕からの分離を可能とする別の装置で実施される。マッシング後に得られた麦汁は通常、「第一麦汁」と呼ばれ、一方、スパージング後に得られた麦汁は通常、「第二麦汁」と呼ばれる。指定されない場合は、用語の麦汁は第一麦汁、第二麦汁、または両者の組み合わせであり得る。従来のビール製造中、麦汁はホップと一緒に煮沸される。ホップのない麦汁はまた、「甘い麦汁」と呼ばれることもあり、一方、ホップと共に煮沸された麦汁は、「煮沸麦汁」または単に麦汁と呼ばれることもある。
【００６１】
ＣｓｌＦ６
本発明は、大麦植物またはその一部を提供し、前記大麦植物の穀粒は、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し、前記大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、前記変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子は、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする。
【００６２】
オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）栽培品種Ｓｌｏｏｐ由来の野生型セルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６（ＣｓｌＦ６）の全コード配列の配列は、配列番号２として本明細書で提供される。
【００６３】
オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）栽培品種Ｓｌｏｏｐ由来の野生型セルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６ポリペプチド配列の配列は、配列番号１として本明細書で提供される。Ａ．本明細書で配列番号１として提供される配列に加えて、野生型ＣｓｌＦ６ポリペプチドはまた、Ａ５９０Ｔ多型も有し得る（Ｔａｋｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２））。従って、野生型ＣｓｌＦ６ポリペプチドはまた、配列番号３として本明細書で提供される配列も有し得る。
【００６４】
多くの研究努力にもかかわらず、個々のＣｓｌ遺伝子の特定の機能はほとんど知られていない。Ｃｓｌ遺伝子は、ＣｓｌＡ〜ＣｓｌＨと呼ばれる８つのグループに再分割された。本発明では、（１，３；１，４）−β−グルカンシンターゼは、ＣｓｌＦ遺伝子ファミリーのメンバーによりコードされることが明らかになった。
【００６５】
ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物
本発明は、大麦植物またはその一部を提供し、前記大麦植物の穀粒は、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し、前記大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、前記変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子は、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする。ＣｓｌＦ６遺伝子中の変異は、本明細書で記載のいずれかの変異であり得るが、しかし、本発明の好ましい実施形態では、変異は、ＣｓｌＦ６遺伝子のコード領域中の点変異である。
【００６６】
前記変異体ＣｓｌＦ６遺伝子によりコードされる変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、任意の変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドであり得るが、好ましくは、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは１つのアミノ酸置換を含む。
【００６７】
特に、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、ＣｓｌＦ６の膜局在型ドメイン中に１つのアミノ酸の置換を含み得る。変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、好ましくは、膜局在型ドメイン中の１つまたは複数の次の置換を含み得る：
・非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換；および
・極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸ＹＹからアミノ酸ＸＸへの置換」または「アミノ酸ＸＸのアミノ酸ＹＹへの置換」という用語は、アミノ酸ＹＹにより置換されている参照配列（通常、ＣｓｌＦ６野生型配列）中のアミノ酸ＸＸを意味する。
【００６９】
本発明の一実施形態では、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、ＣｓｌＦ６の膜局在型ドメインのいずれか１つ中に１つのアミノ酸の置換を含み得る。ＣｓｌＦ６の膜局在型ドメインは、本明細書の表３で示される。
【００７０】
一実施形態では、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、次のＣｓｌＦ６の膜局在型ドメイン：配列番号１または配列番号３のアミノ酸１０９〜１２８、１３７〜１５８、７００〜７３１、７４１〜７５８、８３５〜８５７、および８６４〜８８２の内の１つまたは複数中の非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換を含み得る。
【００７１】
一実施形態では、大麦植物は、置換を含む変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする変異体ＣｓｌＦ６遺伝子をもたらす変異をＣｓｌＦ６遺伝子中に有し、置換は、次のＣｓｌＦ６の膜局在型ドメイン：配列番号１または配列番号３のアミノ酸１０９〜１２８、１３７〜１５８、７００〜７３１、７４１〜７５８、８３５〜８５７、および８６４〜８８２の内の１つまたは複数中の非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換であり得る。
【００７２】
一実施形態では、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、ＣｓｌＦ６のアミノ酸８３５〜８５７からなる膜貫通ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり得、前記置換は、非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換である。前記非極性アミノ酸は、例えば、アミノ酸８３５〜８５７のいずれか１つであり得、これは表３で下線を付している。例えば、前記置換は、非極性アミノ酸の負に帯電しているアミノ酸への置換であり得る。
【００７３】
例えば、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸８４７の荷電アミノ酸への置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり得る。例えば、前記置換は、位置８４７のグリシン（Ｇ）の負に帯電しているアミノ酸、例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐへの置換であり得る。
【００７４】
好ましくは、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸８４７の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり得、前記置換は、位置に８４７のグリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換である。
【００７５】
一実施形態では、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、ＣｓｌＦ６のアミノ酸７４１〜７５８からなる膜貫通ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり得、前記置換は、非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換である。前記非極性アミノ酸は、例えば、アミノ酸７４１〜７５８のいずれか１つであり得、これは表３で下線を付している。例えば、前記置換は、非極性アミノ酸の負に帯電しているアミノ酸への置換であり得る。
【００７６】
例えば、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸７４８の荷電アミノ酸への置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり得る。例えば、前記置換は、位置７４８のグリシン（Ｇ）の負に帯電しているアミノ酸、例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐへの置換であり得る。好ましくは、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸７４８の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり得、前記置換は、位置に７４８のグリシン（Ｇ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換である。従って、大麦植物は、配列番号１のアミノ酸７４８のＧｌｙ→Ａｓｐ変異を含む変異体ＨｖＣｓｌＦ６タンパク質をコードする変異導入ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子を有し得る。
【００７７】
一実施形態では、大麦植物は、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド２２４３のＧ→Ａ変異を有し得る。
【００７８】
一実施形態では、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、ＣｓｌＦ６の膜局在型ドメインのいずれか１つ中に１つのアミノ酸の置換を含み得る。例えば、置換は、次のＣｓｌＦ６の膜局在型ドメイン：配列番号１または配列番号３のアミノ酸１０９〜１２８、１３７〜１５８、７００〜７３１、７４１〜７５８、８３５〜８５７、および８６４〜８８２の内の１つまたは複数中の極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換であり得る。
【００７９】
変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、ＣｓｌＦ６のアミノ酸７００〜７３１からなる膜貫通ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり得、前記置換は、極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換である。前記極性アミノ酸は、例えば、アミノ酸７００〜７３１のいずれか１つであり得、これは表３で下線を付している。
【００８０】
例えば、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸７０９の非極性アミノ酸への置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり得る。
【００８１】
好ましくは、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸７０９の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり得、前記置換は、位置に７０９のトレオニン（Ｔ）のイソロイシン（Ｉ）への置換である。
【００８２】
本特許出願においては、ブダペスト条約に基づいて、「変異体２」と命名された大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）の種子はＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ  Ｓｃｏｔｌａｎｄに寄託された。変異体２大麦植物は、２０１８年１１月１２日に寄託され、受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７３を受け取った。
【００８３】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、２０１８年１０月１２日にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７３で寄託され、「変異体２」と呼ばれる大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）またはその子孫である。従って、本発明の大麦植物は、２０１８年１０月１２日にＮＣＩＭＢに寄託された受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７３を有する大麦植物変異体２またはその任意の子孫大麦植物であり得、大麦植物は、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド２２４３のＧ→Ａ変異を有し、および／または前記大麦植物のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子は、配列番号１のアミノ酸７４８のＧｌｙ→Ａｓｐ変異を含む変異体ＨｖＣｓｌＦ６タンパク質をコードする。
【００８４】
興味深いことに、ＣｓｌＦ６遺伝子中に、膜局在型アミノ酸以外の変異（Ｇ７３２Ｄ）を有する変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする変異体ＣｓｌＦ６遺伝子をもたらす変異を有する大麦植物は、（１，３；１，４）−β−グルカン含量の何らの有意な低減も示さなかった。ＣｓｌＦ６遺伝子中に未成熟停止コドン（Ｔ６７６Ｓｔｏｐ）をもたらす変異を含む大麦植物では、（１，３；１，４）−β−グルカンのレベルは極端に低く、このような大麦植物は、良好な農学的特性を有さなかった。従って、このような植物は、有意に低下した稔性および植物成長を有した。
【００８５】
大麦植物
本発明による大麦植物は、任意の育種系統または栽培品種または変種を含む、種Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）の任意の植物であり得る。
【００８６】
「野生大麦」であるＨｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ亜種のホルデウム・スポンタネウムは、大麦の今日の栽培品種の祖先と考えられる。培養植物化しているが、大麦の不均一な混合物は、大麦在来種と呼ばれる。今日では、ほとんどの在来種は、先進農業では純系栽培品種により置き換えられている。在来種と比較して、最近の大麦栽培品種は、多くの改善された特性を有する（Ｎｅｖｏ，１９９２；Ｐｅｌｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【００８７】
本発明中では、用語「大麦植物」は、大麦在来種または最近の大麦栽培品種などの大麦植物を含む。従って、本発明は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を含む任意の大麦植物に関する。
【００８８】
しかし、本発明での使用のために好ましい大麦植物は、最近の大麦栽培品種または純系である。本発明で使用され得る大麦栽培品種は、例えば、Ｐａｕｓｔｉａｎ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｑｕｅｎｃｈ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｋｌａｇｅｓ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｌｅｎｈｅｉｍ、Ａｒｉｅｌ、Ｌｅｎｋａ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｓｔｅｆｆｉ、Ｇｉｍｐｅｌ、Ｃｈｅｒｉ、Ｋｒｏｎａ、Ｃａｍａｒｇｕｅ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｅｒｋａｄｏ、Ｐｒｉｓｍａ、Ｕｎｉｏｎ、Ｂｅｋａ、Ｋｙｍ、Ａｓａｈｉ  ５、ＫＯＵ  Ａ、Ｓｗａｎ  Ｈａｌｓ、Ｋａｎｔｏ  Ｎａｋａｔｅ  Ｇｏｌｄ、Ｈａｋａｔａ  Ｎｏ．２、Ｋｉｒｉｎ−ｃｈｏｋｕ  Ｎｏ．１、Ｋａｎｔｏ  ｌａｔｅ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｇｏｌｄ、Ｆｕｊｉ  Ｎｉｊｏ、Ｎｅｗ  Ｇｏｌｄｅｎ、Ｓａｔｕｋｉｏ  Ｎｉｊｏ、Ｓｅｉｊｏ  Ｎｏ．１７、Ａｋａｇｉ  Ｎｉｊｏ、Ａｚｕｍａ  Ｇｏｌｄｅｎ、Ａｍａｇｉ  Ｎｉｊｐｏ、Ｎｉｓｈｉｎｏ  Ｇｏｌｄ、Ｍｉｓａｔｏ  ｇｏｌｄｅｎ、Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、ＲｏｓａｌｉｎａおよびＪｅｒｓｅｙからなる群より選択され、好ましくは、Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｑｕｅｎｃｈ、Ｃｅｌｅｓｔｅ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、ＮｅｒｕｄａおよびＰｏｗｅｒからなる群より選択され、好ましくは、Ｐａｕｓｔｉａｎ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｋｌａｇｅｓ、Ｍａｎｌｅｙ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｃｌｉｐｐｅｒ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ａｌｅｘｉｓ、Ｂｌｅｎｈｅｉｍ、Ａｒｉｅｌ、Ｌｅｎｋａ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｓｔｅｆｆｉ、Ｇｉｍｐｅｌ、Ｃｈｅｒｉ、Ｋｒｏｎａ、Ｃａｍａｒｇｕｅ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｅｒｋａｄｏ、Ｐｒｉｓｍａ、Ｕｎｉｏｎ、Ｂｅｋａ、Ｋｙｍ、Ａｓａｈｉ  ５、ＫＯＵ  Ａ、Ｓｗａｎ  Ｈａｌｓ、Ｋａｎｔｏ  Ｎａｋａｔｅ  Ｇｏｌｄ、Ｈａｋａｔａ  Ｎｏ．２、Ｋｉｒｉｎ−ｃｈｏｋｕ  Ｎｏ．１、Ｋａｎｔｏ  ｌａｔｅ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｇｏｌｄ、Ｆｕｊｉ  Ｎｉｊｏ、Ｎｅｗ  Ｇｏｌｄｅｎ、Ｓａｔｕｋｉｏ  Ｎｉｊｏ、Ｓｅｉｊｏ  Ｎｏ．１７、Ａｋａｇｉ  Ｎｉｊｏ、Ａｚｕｍａ  Ｇｏｌｄｅｎ、Ａｍａｇｉ  Ｎｉｊｐｏ、Ｎｉｓｈｉｎｏ  Ｇｏｌｄ、Ｍｉｓａｔｏ  ｇｏｌｄｅｎ、Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ、ＳｃａｒｌｅｔｔおよびＪｅｒｓｅｙからなる群より選択され、好ましくは、Ｐａｕｓｔｉａｎ、Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ、Ｓｅｂａｓｔｉａｎ、Ｔａｎｇｅｎｔ、Ｌｕｘ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｎｅｒｕｄａ、Ｐｏｗｅｒ、Ｑｕｅｎｃｈ、ＮＦＣ  Ｔｉｐｐｌｅ、Ｂａｒｋｅ、Ｃｌａｓｓ、Ｖｉｎｔａｇｅ、Ａｐｐｌａｕｓ、Ｂｏｗｉｅ、Ｂｒｏａｄｗａｙ、Ｃｈａｍｐ、Ｃｈａｎｓｏｎ、Ｃｈａｒｌｅｓ、Ｃｈｉｍｂｏｎ、Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔａｎ、Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｄｒａｇｏｏｎ、Ｅｌｌｉｎｏｒ、Ｅｍｂｒａｃｅ、Ｅｔｏｉｌｅ、Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ、Ｆｌａｉｒ、Ｈｉｇｈｗａｙ、ＫＷＳ  Ｂｅｃｋｉｅ、ＫＷＳ  Ｃａｎｔｔｏｎ、ＫＷＳ  Ｃｏｒａｌｉｅ、ＫＷＳ  Ｆａｎｔｅｘ、ＫＷＳ  Ｉｒｉｎａ、ＫＷＳ  Ｊｏｓｉｅ、ＫＷＳ  ��ｅｌｌｉｅ、ＬＧ  Ｄｉａｂｌｏ、ＬＧ  Ｆｉｇａｒｏ、ＬＧ  Ｎａｂｕｃｏ、ＬＧ  Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｌａｕｒｅａｔｅ、Ｌａｕｒｉｋｋａ、Ｌａｕｘａｎａ、Ｌｕｔｈｅｒ、Ｏｄｙｓｓｅｙ、Ｏｖａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＲＧＴ  Ｅｌｙｓｉｕｍ、ＲＧＴ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ、ＲＧＴ  Ｐｌａｎｅｔ、Ｒｏｔａｔｏｒ、Ｓａｒｂｉ、Ｓｃｈｏｌａｒ、ＳｕｂｗａｙおよびＧｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅからなる群より選択され得る。
【００８９】
大麦植物は、任意の好適な形態であり得る。例えば、本発明による大麦植物は、生存可能大麦植物、乾燥植物、ホモジナイズした植物、または粉砕大麦粒であり得る。植物は、成熟植物、胚芽、穀粒、発芽穀粒、麦芽化穀粒（例えば、緑麦芽またはキルン乾燥麦芽の形態の）、粉砕麦芽化穀粒、粉砕穀粒、などであり得る。
【００９０】
大麦植物の部分は、穀粒、胚芽、葉、茎、根、花、またはそれらの一部などの任意の好適な部分であり得る。一部は、例えば、穀粒、胚芽、葉、茎、根、花、の断片であり得る。大麦植物の部分はまた、ホモジネートの一部、または粉砕大麦植物または穀粒の一部であり得る。
【００９１】
本発明の一実施形態では、大麦植物の部分は、前記大麦植物の、組織培養物中にインビトロで増殖され得る生存細胞などの細胞であり得る。しかし、他の実施形態では、大麦植物の部分は、全体大麦植物に成熟できない生存細胞、すなわち、生殖物質ではない細胞であり得る。
【００９２】
ＣｓｌＦ６中に変異を有する大麦植物の特性
本発明は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物を提供する。このような大麦植物の１つの大きな利点は、前記大麦植物の穀粒が低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有することである。
【００９３】
ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する大麦植物により提供される１つの利点は、穀粒中のより低い含量の（１，３；１，４）−β−グルカンは、最適量の糖類がマッシングの終わりに酵母発酵に確実に利用できるのを支援し、従って、原材料の全体コストを減らすことができるために、醸造工程で有益であり得ることである。ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量の穀粒を有する大麦植物により提供される別の利点は、濾過性などの工業的手順を改善する可能性があることである。さらに、このような大麦植物は、省エネ製麦工程に特に有用である。（１，３；１，４）−β−グルカンの低減は有益であり得るが、低すぎるレベルの（１，３；１，４）−β−グルカンはまた、問題であり、より不十分な農学的特性をもたらす場合がある。
【００９４】
従って、一実施形態では、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物は、総穀粒乾燥重量の１〜３％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する穀粒を含む大麦植物であり得る。
【００９５】
ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量の穀粒を有する本発明の大麦植物は、野生型と同等の農業品質などの良好な農業品質を有することをさらに特徴とする。
【００９６】
大麦植物は、総穀粒乾燥重量の１〜５％、例えば、総穀粒乾燥重量の１．３〜４％などの総穀粒乾燥重量の１〜３％、例えば、総穀粒乾燥重量の１．３〜３％、好ましくは総穀粒乾燥重量の１．３〜２％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する穀粒を含む大麦植物であり得る。
【００９７】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする大麦植物であり得、ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、次のＣｓｌＦ６の膜局在型ドメイン：配列番号１または配列番号３のアミノ酸１０９〜１２８、１３７〜１５８、７００〜７３１、７４１〜７５８、８３５〜８５７、および８６４〜８８２の内の１つまたは複数中の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６ポリペプチドであり、置換は非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換、または極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換であり、前記大麦植物の穀粒は、総穀粒乾燥重量の１．０〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、例えば、総穀粒乾燥重量の１．０〜２．５％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量などの総穀粒乾燥重量の１．０〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、好ましくは、総穀粒乾燥重量の１．０〜２．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、例えば、総穀粒乾燥重量の１．５〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量などの総穀粒乾燥重量の１．３〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、好ましくは、総穀粒乾燥重量の１．７〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し得る。
【００９８】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする大麦植物であり得、ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸８４７の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６ポリペプチドであり、前記置換は、グリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換であり、前記大麦植物の穀粒は、総穀粒乾燥重量の１．０〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、例えば、総穀粒乾燥重量の１．０〜２．５％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量などの総穀粒乾燥重量の１．０〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、好ましくは、総穀粒乾燥重量の１．０〜２．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、例えば、総穀粒乾燥重量の１．５〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量などの総穀粒乾燥重量の１．３〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、好ましくは、総穀粒乾燥重量の１．７〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し得る。
【００９９】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする大麦植物であり得、ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７４８の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６ポリペプチドであり、前記置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からグリシン（Ｇ）への置換であり、前記大麦植物の穀粒は、総穀粒乾燥重量の１．０〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、例えば、総穀粒乾燥重量の１．０〜２．５％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量などの総穀粒乾燥重量の１．０〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、好ましくは、総穀粒乾燥重量の１．０〜２．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、例えば、総穀粒乾燥重量の１．５〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量などの総穀粒乾燥重量の１．３〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、好ましくは、総穀粒乾燥重量の１．７〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し得る。
【０１００】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする大麦植物であり得、ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７０９の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６ポリペプチドであり、前記置換は、イソロイシン（Ｉ）からトレオニン（Ｔ）への置換であり、前記大麦植物の穀粒は、総穀粒乾燥重量の１．０〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、例えば、総穀粒乾燥重量の１．０〜２．５％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量などの総穀粒乾燥重量の１．０〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、好ましくは、総穀粒乾燥重量の１．０〜１．７％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量などの総穀粒乾燥重量の１．０〜２．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、例えば、総穀粒乾燥重量の１．５〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量などの総穀粒乾燥重量の１．２〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量、好ましくは、総穀粒乾燥重量の１．３〜３．０％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し得る。
【０１０１】
一実施形態では、大麦植物は、穀粒中に、（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し得、これは、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦の穀粒中で多くても７０％、好ましくは多くても６０％、例えば、多くても５５％の（１，３；１，４）−β−グルカン含量に低減されている。
【０１０２】
大麦植物は、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦の穀粒中で、少なくとも３０％で最大で６０％、好ましくは少なくとも４０％で最大で６０％、例えば、少なくとも４０％で最大で５５％に低減された穀粒中の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する大麦植物であり得る。
【０１０３】
一実施形態では、大麦植物は、栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎの大麦植物の穀粒中の（１，３；１，４）−β−グルカン含量の、少なくとも３０％で最大で６０％、好ましくは少なくとも４０％で最大で６０％、例えば、少なくとも４０％で最大で５５％に低減された穀粒中の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する大麦植物であり得る。
【０１０４】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする大麦植物であり得、ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸８４７の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６ポリペプチドであり、前記置換は、グリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換であり、前記大麦植物の穀粒は、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦の穀粒中の、少なくとも４０％で最大で６０％などの少なくとも３０％で最大で６０％の（１，３；１，４）−β−グルカン含量に低減された（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し得る。
【０１０５】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする大麦植物であり得、ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７４８の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６ポリペプチドであり、前記置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からグリシン（Ｇ）への置換であり、前記大麦植物の穀粒は、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦の穀粒中の、少なくとも４０％で最大で６０％などの少なくとも３０％で最大で６０％の（１，３；１，４）−β−グルカン含量に低減された（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し得る。
【０１０６】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする大麦植物であり得、ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７０９の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６ポリペプチドであり、前記置換は、トレオニン（Ｔ）のイソロイシン（Ｉ）への置換であり、前記大麦植物の穀粒は、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦の穀粒中の、少なくとも４０％で最大で６０％などの少なくとも３０％で最大で６０％の（１，３；１，４）−β−グルカン含量に低減された（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し得る。
【０１０７】
ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、変異導入ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードし、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量の穀粒を有する本発明の大麦植物は、所与のＤＰ３：ＤＰ４比率、例えば、野生型植物のＤＰ３：ＤＰ４比率より低いまたは野生型植物のＤＰ３：ＤＰ４比率より高いまたは野生型植物のＤＰ３：ＤＰ４比率に類似のＤＰ３：ＤＰ４比率を有する穀粒をさらに特徴とし得る。
【０１０８】
各種要因に応じて、異なるＤＰ３：ＤＰ４比率が望ましい場合がある。
【０１０９】
野生型大麦植物は通常、２．５〜４の範囲のＤＰ３：ＤＰ４比率を特徴とする。
【０１１０】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、穀粒中に多くても２．５、例えば、多くても２．２などの１．０〜２．２の範囲のＤＰ３：ＤＰ４比率を有する（１，３；１，４）−β−グルカンを含む。
【０１１１】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする大麦植物であり得、ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸８４７の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６ポリペプチドであり、前記置換は、グリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換であり、前記大麦植物の穀粒は、多くても２．５、例えば、多くても２．２などの１．０〜２．２の範囲のＤＰ３：ＤＰ４比率を有し得る。
【０１１２】
一実施形態では、前記大麦植物の穀粒は、２．５〜４の範囲のＤＰ３：ＤＰ４比率を有し得る。
【０１１３】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする大麦植物であり得、ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７４８の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６ポリペプチドであり、前記置換は、グリシン（Ｇ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換であり、前記大麦植物の穀粒は、２．５〜４の範囲のＤＰ３：ＤＰ４比率を有し得る。
【０１１４】
一実施形態では、前記大麦植物の穀粒は、少なくとも４．０などの少なくとも３．５の、例えば、４〜６の範囲などの少なくとも４．５のＤＰ３：ＤＰ４比率を有し得る。
【０１１５】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする大麦植物であり得、ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７０９の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６ポリペプチドであり、前記置換は、トレオニン（Ｔ）のイソロイシン（Ｉ）への置換であり、前記大麦植物の穀粒は、少なくとも４．０などの少なくとも３．５の、例えば、４〜６の範囲などの少なくとも４．５のＤＰ３：ＤＰ４比率を有し得る。
【０１１６】
（１，３；１，４）−β−グルカンは、細胞壁成分であり、（１，３；１，４）−β−グルカンレベルの低下は、大麦植物に影響を与える可能性がある。例えば、（１，３；１，４）−β−グルカンレベルの低下および／または（１，３；１，４）−β−グルカンのＤＰ３／ＤＰ４比率の変化は、高い比率の破壊穀粒を有する脆い大麦粒を生じ得る。
【０１１７】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、許容可能な穀粒硬さの穀粒を有することが好ましい。従って、一実施形態では、大麦植物は、本明細書中下記の実施例６に記載のように測定される場合、５％未満、例えば、３％未満の破壊穀粒の出現頻度を有する穀粒を有し得る。
【０１１８】
特に、本発明の大麦植物の脱穀後の破壊穀粒の出現頻度が、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有さないがその他は同じである大麦植物の脱穀後の破壊穀粒の出現頻度よりも、多くて３倍高い、より好ましくは多くて２倍高いことが好ましい。例えば、配列番号１または配列番号３のアミノ酸７４８の変異（例えば、Ｇｌｙ→Ａｓｐ）を含む変異体ＨｖＣｓｌＦ６タンパク質をコードするＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物は、前記変異を有さないがその他は同じである大麦植物の脱穀後の破壊穀粒の出現頻度よりも、多くて３倍高い、より好ましくは多くて２倍高い脱穀後の破壊穀粒の出現頻度を有する。破壊穀粒の出現頻度は、好ましくは、本明細書中以下の実施例６で記載のように決定される。
【０１１９】
２つ以上の変異を含む大麦植物
本明細書で記載の変異に加えて、大麦植物はまた、１つまたは複数のさらなる変異も含み得る。従って、大麦植物は、１つまたは複数の次の変異を含み得る。
上記した１つまたは複数の変異に加えて、大麦植物は、機能的ＬＯＸ−１の完全喪失をもたらすＬＯＸ−１コード遺伝子中の変異も含み得る。前記変異は、例えば、国際出願第２００５／０８７９３４号に記載のいずれかの変異であり得る。例えば、大麦植物は、未成熟停止コドンを含むＬＯＸ−１をコードする遺伝子を含み得、前記コドンは、国際公開第２００５／０８７９３４号の配列番号２の塩基番号３５７２〜３５７４またはスプライス部位変異に対応し、前記変異は、国際公開第２００５／０８７９３４号の配列番号２の塩基番号２３１１に対応する。
【０１２０】
上記した１つまたは複数の変異に加えて、大麦植物は、機能的ＬＯＸ−２の完全喪失をもたらすＬＯＸ−２コード遺伝子中の変異も含み得る。前記変異は、例えば、国際公開第２０１０／０７５８６０号に記載のいずれかの変異であり得る。例えば、大麦植物は、国際公開第２０１０／０７５８６０号の配列番号１のヌクレオチド位置２６８９に、未成熟停止コドンの形成をもたらす変異を含むＬＯＸ−２コード遺伝子を含み得る。
【０１２１】
上記した１つまたは複数の変異に加えて、大麦植物は、機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらすＭＭＴコード遺伝子中の変異も含み得る。前記変異は、例えば、国際公開第２０１０／０６３２８８号に記載のいずれかの変異であり得る。例えば、大麦植物は、国際公開第２０１０／０６３２８８号の配列番号３の塩基番号３０７６のＧ→Ａ変異を含むＭＭＴコード遺伝子または国際公開第２０１０／０６３２８８号の配列番号１６の塩基番号１４６２のＧ→Ａ変異を含むＭＭＴコード遺伝子を含み得る。
【０１２２】
上記１つまたは複数の変異に加えて、大麦植物はまた、本出願と同じ出願者に譲渡され、同じ出願日を有する「Ｂａｒｌｅｙ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」と題する同時係属出願に記載のアルファアミラーゼ活性の増大をもたらすいずれかの変異を含み得る。
【０１２３】
植物生成物
本発明はまた、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し、ＣｓｌＦ６遺伝子またはその子孫中に変異を有する大麦植物から作製された植物生成物を提供し、前記変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子は、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチド、例えば、本明細書で記載のいずれかの大麦植物をコードする。
【０１２４】
植物生成物は、大麦植物から作製された任意の産物、例えば、食品、飼料または飲料であり得る。従って、植物生成物は、本明細書の下記セクション「飲料およびその製造方法」で記載のいずれかの飲料であり得る。植物生成物はまた、大麦植物の水性抽出物および／または前記大麦植物の穀粒から作製された麦芽であり得、例えば、植物生成物は麦汁であり得る。前記水性抽出物は、例えば、本明細書の下記セクション「水性抽出物およびその製造方法」で記載のように作製され得る。
【０１２５】
一実施形態では、植物生成物は麦芽、例えば、本明細書の下記セクション「緑麦芽、キルン乾燥麦芽およびその製造製方法」で記載のいずれかの麦芽などの緑麦芽またはキルン乾燥麦芽、または麦芽ベース飲料などの麦芽ベース産物であり得る。麦芽の主要用途は飲料製造用であるが、これは、その他の産業工程でも、例えば、製パン工業で酵素源として、または食品産業で香味剤および着色剤として、例えば、麦芽または麦芽粉末で、または麦芽シロップとして間接的に、等々に使用できる。従って、本発明による植物生成物は、いずれかの上述の産物であり得る。
【０１２６】
本発明の一実施形態では、植物生成物は、大麦粉、すなわち、本発明による大麦植物の穀粒から作製された大麦粉である。
【０１２７】
別の態様では、本発明による植物生成物は、大麦シロップ、または大麦麦芽シロップなどのシロップを含む、あるいは、これからなる。植物生成物はまた、大麦または麦芽の抽出物であり得る。従って、植物生成物は麦汁であり得る。
【０１２８】
緑麦芽、キルン乾燥麦芽およびその製造方法
本発明はまた、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物、例えば、本明細書で記載のいずれかの大麦植物から作製された麦芽も提供する。前記麦芽は、ＣｓｌＦ６遺伝子またはその子孫中に変異を有する大麦植物由来の大麦粒から作製された緑麦芽またはキルン乾燥麦芽であり得る。前記変異は、本明細書で上記のＣｓｌＦ６遺伝子中のいずれかの変異であり得る。
【０１２９】
緑麦芽は、製麦、すなわち、穀物粒の制御された環境条件下での発芽により作製され得る。通常、前記発芽は、大麦粒の浸麦ステップとこれに続く発芽ステップを含み得る。浸麦および発芽はまた、同時にまたは一部を同時に実施することも可能である。いくつかの実施形態では、麦芽の製造は、発芽穀粒の乾燥ステップを含み得る。前記乾燥ステップは、好ましくは、発芽穀粒の高温でのキルン乾燥であり得る。従って、キルン乾燥麦芽は、緑麦芽をキルン乾燥ステップに供すことにより作製され得る。
従って、一実施形態では、製麦方法は、下記ステップを含み得る：
（ａ）大麦植物、特に、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物の穀粒を用意するステップ；
（ｂ）前記大麦粒を浸麦するステップ；
（ｂ）前記大麦粒を発芽させるステップ；および
（ｃ）前記発芽大麦粒を、好ましくはキルン乾燥により乾燥するステップ。
【０１３０】
発芽大麦粒は、次のステップを含む方法によって作製され得る：
（ａ）大麦植物、特に、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物の穀粒を用意するステップ；
（ｂ）前記大麦粒を浸麦するステップ；
（ｂ）前記大麦粒を発芽させるステップ。
【０１３１】
浸麦および発芽ステップは、逐次に、同時にまたは一部を同時に実施することも可能である。
【０１３２】
好ましい一実施形態では、浸麦および発芽は発芽工程で同時に実施され、この工程は通常、通気下で大麦粒を水溶液中、多くても７２時間インキュベーションすることを含む。
【０１３３】
浸麦は、当業者に既知の任意の従来法により実施され得る。１つの非限定例には、乾湿交互条件下、１０〜２５℃の範囲の温度での浸麦を含む。浸麦中、例えば、大麦粒は、湿潤下、３０分〜３時間の範囲、続けて、乾燥下で３０分〜３時間の範囲でインキュベーションされ、任意選択で、２〜５回の範囲の前記インキュベーションスキームが反復され得る。浸麦後の最終含水量は、例えば、４０〜５０％の範囲、例えば、４０〜４５％の範囲であり得る。
【０１３４】
本発明により提供される大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、それにより、変異導入ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードすることを特徴とする。このような大麦植物の１つの主要な利点は、穀粒が低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量および適切なＤＰ３：ＤＰ４比率を有することである。低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有するこれらの大麦植物の穀粒は、有利にも、短い発芽工程で発芽され得る。有用な短い発芽工程の例は、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４９８号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。有用な短い発芽工程の一例は、通常、通気下で大麦粒が水溶液中でインキュベーションされるステップを含む発芽工程で、全体発芽工程は長くても７２時間で実施される。実際に、発芽中、（１，３；１，４）−β−グルカンは通常、少なくとも部分的にβ−グルカナーゼなどの酵素により加水分解される。（１，３；１，４）−β−グルカンに特異的な加水分解酵素は通常、発芽工程の始めに小量で存在する。（１，３；１，４）−β−グルカンに特異的な加水分解酵素の存在は、発芽工程が続くに伴い増大する。通常、多くても７２時間実施される発芽工程は、（１，３；１，４）−β−グルカン含量が開始時から高い場合には、所望の低レベルまで加水分解するために十分な時間を提供しない。しかし、本発明の大麦植物は、開始時から既に、低レベルの（１，３；１，４）−β−グルカンを有し、従って、発芽中の（１，３；１，４）−β−グルカンの加水分解は、あまり気にかけなくてもよい。
【０１３５】
上述のように、発芽は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物の穀粒を通気下の水溶液中でインキュベーションするステップを含み得る。大麦粒は、前記水溶液中で大部分の前記大麦粒の発芽を可能とするのに十分な時間にわたり、インキュベーションされ得る。大麦粒はまた、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも３７％、例えば、３５〜６０％の範囲の含水量を得るために十分な時間にわたり、前記水溶液中でインキュベーションされ得る。通常、大麦粒は、水溶液中で、少なくとも２４時間などの少なくとも２０時間、インキュベーションされる。通常、穀粒は、前記水溶液中で、長くても６０時間などの長くても７２時間、例えば、長くても４８時間インキュベーションされる。従って、いくつかの実施形態では、大麦粒は、前記水溶液中で、２０〜６０時間の範囲などの２０〜７２時間、例えば、２０〜４８時間の範囲、例えば、２２〜２６時間の範囲などの２０〜３０時間の範囲にわたりインキュベーションされる。
【０１３６】
全体インキュベーション中に大麦粒が前記水溶液により完全に覆われるのが好ましい場合もある。
【０１３７】
前記大麦粒は、多くの場合、前記水溶液中でインキュベーションされ、同時に、Ｏ２をその水溶液中に通過させる。前記Ｏ２は、前記水溶液に純粋なＯ２として添加され得る。しかし、多くの場合、前記Ｏ２はガス混合物中に含まれる。一実施形態では、Ｏ２は大気中に含まれる。
【０１３８】
一般に、１ｋｇの大麦粒当たり、１時間当たり、少なくとも２Ｌ、好ましくは少なくとも３Ｌ、より好ましくは少なくとも４Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも５Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも６ＬのＯ２を前記水溶液中に通過させる。前記大麦粒の重量は乾燥重量である。例えば、１ｋｇの大麦粒（乾燥重量）当たり、１時間当たり、２〜１００Ｌの範囲、例えば、２〜５０Ｌの範囲などの２〜７５Ｌの範囲、例えば、４〜１００Ｌの範囲、例えば、４〜５０Ｌの範囲などの４〜７５Ｌの範囲、例えば、６〜１００Ｌの範囲、例えば、６〜５０Ｌの範囲などの６〜７５Ｌの範囲のＯ２を前記水溶液／大麦粒混合物中に通過させる。
【０１３９】
上述のように、多くの場合、水溶液中に通過させるのは大気である。従って、方法は、１ｋｇの大麦粒当たり、１時間当たり、少なくとも１０Ｌ、好ましくは少なくとも１５Ｌ、より好ましくは少なくとも２０Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも２５Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも３０Ｌの大気を前記水溶液中に通過させることを含む。前記大麦粒の重量は乾燥重量である。例えば、１ｋｇの大麦粒（乾燥重量）当たり、１時間当たり例えば、１０〜５００Ｌの範囲、例えば、１０〜２５０Ｌの範囲などの、１０〜３７５Ｌの範囲、例えば、２０〜５００Ｌの範囲、例えば、２０〜２５０Ｌの範囲などの２０〜３７５Ｌの範囲、例えば、３０〜５００Ｌの範囲、例えば、３０〜２５０Ｌの範囲などの３０〜３７５Ｌの範囲の大気を前記水溶液中に通過させる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、発芽のステップは、次記を含む：
ａ．前記穀粒を水溶液中でインキュベーションする少なくとも１つのステップであって、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／ｋｇ大麦粒乾燥重量を前記水溶液中に通過させるステップ；および
ｂ．前記大麦粒を空気中でインキュベーションする少なくとも１つのステップ。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、前記水溶液中で大麦粒のインキュベーション後、大麦粒は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、例えば、３０〜５０％の範囲などの３０〜６０％の範囲、例えば、３０〜５０％の範囲などの３０〜６０％の範囲の含水量を有する。
【０１４２】
前記大麦粒を空気中でインキュベーションする前記ステップ中で、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／ｋｇ大麦粒乾燥重量が、前記大麦粒中を通され得る。例えば、空気中のインキュベーション中に、上述した前記水溶液中でのインキュベーション中と同じ量のＯ２が大麦粒を通過し得る。
【０１４３】
この方法により作製した発芽大麦粒は、本明細書では緑麦芽とも呼ばれる。
【０１４４】
大麦粒の含水量は、大麦粒の重量を測定し、続けて、前記大麦粒を乾燥し、乾燥大麦粒の重量を測定することにより、決定され得る。湿潤および乾燥大麦粒の重量の差異は、水とみなされ、含水量は、水の重量を大麦粒の総重量（湿潤大麦粒）により除算した値として与えられる。％で与えられる含水量は、従ってｗ／ｗ％である。
【０１４５】
大麦粒は任意の有用な温度でインキュベーションされ得るが、含水量の急速増加を可能とするのに十分高い温度でインキュベーションが実施されるのが好ましいであろう。
【０１４６】
特に、大麦粒が２０〜３０℃の範囲の温度でインキュベーションされる本発明の実施形態では、前記大麦粒は、２０〜４８時間の範囲でインキュベーションされ得る。
【０１４７】
穀粒の発芽は、当業者に既知の任意の従来法によっても実施され得る。１つの非限定例には、乾湿交互条件下、任意選択で１〜４日の範囲で温度を変えて、１０〜２５℃の範囲の温度での発芽を含む。
【０１４８】
前述のように、本発明のいくつかの実施形態では、発芽大麦粒（すなわち、緑麦芽）は、キルン乾燥され得る。いくつかの実施形態では、緑麦芽はキルン乾燥されないのが好ましい。特に、緑麦芽が、通気下の水溶液中で前記大麦粒をインキュベーションするステップを含む発芽により作製される場合は、緑麦芽はキルン乾燥しないのが好ましい。
【０１４９】
緑麦芽がキルン乾燥される場合、これは、少なくとも７５℃などの従来の温度、例えば、８０〜８５℃の範囲などの、８０〜９０℃の範囲で行われ得る。従って、麦芽は、例えば、Ｈｏｕｇｈら（１９８２）により記載のいずれかの方法により製造され得る。しかし、限定されないが、麦芽を焙焼する方法を含む、特殊麦芽の製造方法などの麦芽の製造方法のための任意の他の方法も、本発明で使用され得る。
【０１５０】
キルン乾燥麦芽および緑麦芽は、例えば、粉砕によりさらに処理され得る。従って、本発明による植物生成物は、任意の種類の麦芽、例えば、未処理麦芽または粉末などの粉砕麦芽であり得る。従って、植物生成物は、例えば、粉砕、キルン乾燥麦芽または粉砕緑麦芽であり得る。粉砕麦芽およびその粉末は、麦芽および再発芽の能力を欠く死細胞の化学成分を含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、大麦は皮麦であり、方法は、水溶液中で前記穀粒をインキュベーションする前に、少なくとも一部の前記外皮を取り除くステップを含む。外皮のある穀物粒は、穀物粒を、外皮を取り除く物理的処理に供することにより、外皮を取り除くように処理され得る。前記物理的処理は、例えば、研磨、研摩、剥皮および平滑化からなる群より選択され得る。好ましくは、物理的処理は、外皮の減少を生じる。外皮の減少は、全体減量として測定され得る。従って、物理的処理は、好ましくは、穀物粒の合計重量の１〜４％、例えば、１．５〜３．０％の範囲の減少になる。
【０１５２】
水性抽出物およびその製造方法
本発明は、大麦ベース飲料ならびにそれを作製する方法を提供し、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子またはその子孫中に、変異を有する。本発明は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物の穀粒の水性抽出物も提供する。前記水性抽出物は、例えば、緑麦芽またはキルン乾燥麦芽から作製され得る。
【０１５３】
多くの場合、飲料の作製方法は、本発明の大麦植物の穀粒および／または本発明の大麦植物から作製される麦芽の水性抽出物の作製ステップを含む。
【０１５４】
水性抽出物は、一般的に、大麦粉、緑麦芽の粉末および／またはキルン乾燥麦芽の粉末を水中、または水溶液中でインキュベーションすることにより作製され得る。前記水溶液は、本明細書では「マッシング溶液」とも呼ばれる。特に、水性抽出物はマッシングにより作製され得る。
【０１５５】
本発明はまた、水性抽出物の製造方法を提供し、前記方法は、次のステップを含む：
ａ．大麦植物の穀粒を用意するステップであって、前記大麦植物が、本明細書に記載のように、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有するステップ；
ｂ．大麦粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップが前記穀粒を水溶液中で長くても７２時間インキュベーションすることを含むステップ；
ｃ．前記発芽穀粒を細かく粉砕し、同時に、前記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップであって、ただし、前記大麦粒がステップｂ）とｃ）との間で常に２０％未満の含水量にならないことが前提である、ステップ；
ｄ．前記粉砕発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、大麦の水性抽出物を製造するステップ。
【０１５６】
発芽ステップは、上記セクション「緑麦芽、キルン乾燥麦芽およびその製造方法」で詳細に記載されている。
【０１５７】
一般に、前記マッシング溶液は、水道水などの水であってよく、これに対し１種または複数の追加の薬剤が添加され得る。追加の薬剤は、開始時から水溶液中に存在し得るか、または水性抽出物を作製する工程中に添加され得る。前記追加の薬剤は酵素であり得る。従って、マッシング溶液は、１種または複数の酵素を含み得る。前記酵素は、開始時から水溶液中に加えられ得るか、またはその後、工程中に添加され得る。
【０１５８】
前記酵素は、例えば、１種または複数の加水分解酵素であり得る。好適な酵素には、リパーゼ、デンプン分解酵素（例えば、アミラーゼ）、グルカナーゼ［好ましくは（１−４）−および／または（１，３；１，４）−β−グルカナーゼ］、および／またはキシラナーゼ（例えば、アラビノキシラナーゼ）、および／またはプロテアーゼ、または１種または複数の上述の酵素を含む酵素混合物、例えば、Ｃｅｒｅｆｌｏ、Ｕｌｔｒａｆｌｏ、またはＯｎｄｅａ  Ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）が挙げられる。例えば、水溶液には、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、限界デキストリナーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ（例えば、エンド−（１，３；１，４）−β−グルカナーゼまたはエンド−１，４−β−グルカナーゼ）、キシラナーゼ（例えば、エンド−またはエキソ−１，４−キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼまたはフェルラ酸エステラーゼ）、グルコアミラーゼおよびプロテアーゼからなる群より選択される１種または複数の加水分解酵素が含まれ得る。
【０１５９】
一実施形態では、β−グルカナーゼは添加されないか、または限られた量のみのβ−グルカナーゼが前記マッシング溶液に添加される。
【０１６０】
好ましくは食品等級品質の前記追加の薬剤は、塩、例えば、ＣａＣｌ２または酸、例えば、Ｈ３ＰＯ４であり得る。
【０１６１】
水性抽出物は、一般的に、大麦粉、緑麦芽の粉末および／またはキルン乾燥麦芽の粉末をマッシング溶液中、１種または複数の所定の温度でインキュベーションすることにより作製される。前記所定の温度は、本明細書では「マッシング温度」とも呼ばれる。前記マッシング温度は、例えば、マッシングに使用される従来の温度であり得る。マッシング温度は一般的に、一定に保持される（等温マッシング）か、または徐々に、例えば、逐次的に高められる。いずれの場合でも、大麦粒および／または麦芽中の可溶性物質は、前記マッシング溶液中に遊離し、それにより、水性抽出物を形成する。
【０１６２】
マッシング温度は通常、４０〜８５℃の範囲などの３０〜９０℃の範囲、例えば、５０〜８５℃の範囲の温度である。マッシング温度は、使用される大麦タイプに応じて選択され得る。特に、比較的低い仕込み開始温度、例えば、５０〜６０℃の範囲の温度が使用され得る。多くの場合、マッシング溶液を用いたインキュベーションは、より高い温度、例えば、７５〜８０℃の範囲の温度に加熱する最終ステップを含む。
【０１６３】
例えば、マッシング容器の水溶液中のインキュベーションの後で水溶液は、別の容器、例えば、麦芽汁濾過機に移され、追加の時間、高温でインキュベーションされ得る。
【０１６４】
有用なマッシングプロトコルの非限定的例は、醸造文献、例えば、Ｈｏｕｇｈら（前出）で見つけることができる。
【０１６５】
マッシング（すなわち、大麦粉、緑麦芽の粉末および／またはキルン乾燥麦芽の粉末のマッシング溶液中でのインキュベーション）は、補助剤の存在下で起こり、これは、麦芽以外の任意の炭水化物源または発芽大麦粒、例えば、限定されないが、大麦、大麦シロップ、またはトウモロコシ、または米を、全粒または粗びき穀物、シロップまたはデンプンなどの処理生成物として含むと理解される。すべての上述の補助剤は、主として、追加の抽出物源（シロップは通常、麦汁加熱中に加えられる）として使用され得る。醸造所での補助剤の処理のための要件は、使われる補助剤の状態とタイプに依存する。
【０１６６】
マッシング溶液中でインキュベーション後、水性抽出物は通常、例えば、濾過により水性抽出物と残留非溶解固体粒子とに分離され得、後者は「ビール粕」とも表記される。濾過は、例えば、麦芽汁濾過機中で実施され得る。あるいは、濾過は、マッシュフィルターを用いた濾過であり得る。こうして得られた水性抽出物は、「第一麦汁」とも表記される。スパージングとも表記される工程中に、水などの追加の液体をビール粕に加え得る。スパージングおよび濾過の後で、「第二麦汁」が得られ得る。さらなる麦汁は、手順の反復により作製され得る。従って、水性抽出物は、麦汁、例えば、第一麦汁、第二麦汁、さらなる麦汁またはこれらの組み合わせであり得る。
【０１６７】
一実施形態では、水性抽出物の作製方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４９８号に記載のいずれかの装置、例えば、その中のページ２０〜２２に記載のいずれかの装置を用いて実施され得る。有用な装置の非限定的例は、本明細書の図４に提供されている。
【０１６８】
不完全に分解された（１，３；１，４）−β−グルカンは、醸造業者にとって特に面倒な場合がある。理由は、これらは、可溶型の麦芽から抽出されることがあり、これが高粘稠水溶液を形成し、醸造所における濾過工程を遅らせるためである。興味深いことに、本発明の大麦植物は、低レベルの（１，３；１，４）−β−グルカンを含み、従って、このような大麦植物から作製された麦汁は通常、低粘度を有する。一実施形態では、本発明はＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物から作製された麦汁を提供し、前記麦汁は、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を有するが、それ以外は本明細書で開示の大麦植物の同じ遺伝子型である大麦植物から作製された麦汁に比べて、より低い粘度を有する。前記麦汁は通常、大麦粒および／または麦芽の抽出により作製される。
【０１６９】
一実施形態では、本発明は麦汁を提供し、前記麦汁は、本明細書で記載のＣｓｌＦ６遺伝子中のいずれかの変異を有する大麦植物から作製され、前記麦汁は、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を有するが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物から同様にして作製された麦汁の粘度より、０．５〜０．８ｍＰａ＊ｓの範囲だけ低いなどの０．５〜１．０ｍＰａ＊ｓの範囲だけ低い粘度を有する。一実施形態では、本発明は麦汁を提供し、前記麦汁は、本明細書で記載のＣｓｌＦ６遺伝子中のいずれかの変異を有する大麦植物から作製され、前記麦汁は、１．８〜２．５ｍＰａ＊ｓの範囲などの１．７〜２．５ｍＰａ＊ｓの範囲、例えば、２．１〜２．５ｍＰａ＊ｓなどの２．０〜２．５ｍＰａ＊ｓ、例えば、約２ｍＰａ＊ｓなどの１．８〜２．２ｍＰａ＊ｓ、例えば、約２．２ｍＰａ＊ｓなどの約２．１ｍＰａ＊ｓの粘度を有する。特に、大麦植物は、配列番号１のアミノ酸７４８の変異（例えば、Ｇｌｙ→Ａｓｐ）変異を含む変異体ＨｖＣｓｌＦ６タンパク質をコードする変異導入ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子を有し得る。
【０１７０】
一実施形態では、本発明は麦汁を提供し、前記麦汁は、本明細書で記載のＣｓｌＦ６遺伝子中のいずれかの変異を有する大麦植物から得られた麦芽から作製され、前記麦汁は、多くても２．２ｍＰａ＊ｓの粘度を有する。
【０１７１】
１〜２日間の浸麦および５〜７日間の発芽に続けて、キルン乾燥により作製された標準的麦芽から作製され麦汁の粘度は、約２ｍＰａ＊ｓである。
【０１７２】
飲料およびその製造方法
本発明はまた、大麦ベース飲料ならびにこのような飲料を製造する方法を提供し、大麦植物は、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し、ＣｓｌＦ６遺伝子またはその子孫中に、変異を有する。本発明はまた、ＣｓｌＦ６遺伝子またはその子孫中に変異を有する大麦植物から作製された大麦ベース飲料も提供する。
【０１７３】
前記飲料は、アルコール性大麦ベース飲料または非アルコール性大麦ベース飲料であり得る。アルコール性大麦ベース飲料は、例えば、ビールまたは醸造アルコールであり得る。
【０１７４】
前記ビールは、任意の種類のビール、例えば、ラガーまたはエールであり得る。従って、ビールは、例えば、アルトビール、アンバーエール、バーレイワイン、ベルリーナー・ヴァイセ、ビエールドギャルド、ビター、ブロンドエール、ボック、ブラウン・エール、カリフォルニアコモン、クリーム・エール、ドルトムンダーエクスポート、ドッペルボック、デュンケル、デュンケルバイツェン、アイスボック、フルーツランビック、ゴールデンエール、ゴーゼ、グーズ、ヘーフェヴァイツェン、ヘレス、インディア・ペールエール、ケルシュ、ランビック、ライトエール、マイボック、モルト・リカー、マイルド、メルツェンビア、オールドエール、オード・ブライン、ペールエール、ピルスナー、ポーター、レッドエール、ロッゲンビア、セゾン、スコッチエール、スチームビール、スタウト、シュヴァルツビール、ラガー、ウィットビア、ヴァイスビアおよびヴァイツェンボックからなる群より選択され得る。
【０１７５】
前記醸造アルコールは、任意の種類の醸造アルコールであり得る。特に、醸造アルコールは、大麦、例えば、大麦麦芽をベースにし得る。このような醸造アルコールの非限定的例には、ウイスキーおよびウォッカが挙げられる。
【０１７６】
飲料は、非アルコール性飲料、例えば、非アルコール性大麦ベース飲料、例えば、非アルコール性ビールまたはマルチナなどの非アルコール性麦芽飲料であり得る。
飲料は、例えば、次のステップを含む方法により作製され得る：
（ｉ）本発明による大麦植物の穀粒および／または本発明による大麦植物の穀粒から作製された緑麦芽および／またはキルン乾燥麦芽を用意するステップ、
（ｉｉ）前記穀粒および／または前記麦芽の水性抽出物を、例えば、本明細書で上記した水性抽出物作製セクションで記載のように、作製するステップ、
（ｉｉｉ）前記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
【０１７７】
水性抽出物は、ホップの含有または非含有下で煮沸され得るが、これはその後、煮沸麦汁と呼ばれることもある。第一、第二およびさらなる麦汁を混合し、その後、煮沸に供し得る。水性抽出物は、任意の好適な時間、例えば、６０分〜１２０分の範囲で煮沸され得る。
【０１７８】
ステップ（ｉｉｉ）は、次記を含み得る：
ａ．前記水性抽出物を、任意選択で、ホップまたはホップ抽出物の存在下で加熱するステップ；
ｂ．水性抽出物を冷却するステップ；
ｃ．前記水性抽出物を酵母で発酵させ、それにより、発酵飲料を製造するステップ。
【０１７９】
ステップ（ｉｉｉ）は特に、前記水性抽出物の発酵、例えば、麦汁の発酵を含む。従って、飲料は、水性抽出物の酵母による発酵により作製され得る。
【０１８０】
水性抽出物が作製されると、それは、従来の醸造方法を含む任意の方法により、ビールへと処理され得る。好適な醸造方法の例の非限定的記載は、例えば、Ｈｏｕｇｈら（１９８２）による報告で見つけることができる。多くの定期的に更新される大麦ビールおよびビール産物の分析方法は、例えば、限定されないが、米国穀物化学者学会（１９９５）、米国醸造化学者学会（１９９２）、欧州醸造学会（１９９８）、および英国醸造協会（１９９７）から入手できる。多くの特定の手順が特定の醸造所に採用され、最も大きく変化するのは現地の消費者の好みによることがわかっている。いずれかのこのようなビール製造方法を本発明で用い得る。
【０１８１】
水性抽出物からのビール製造の第１のステップは、好ましくは、本明細書で上記したように前記水性抽出物を煮沸させ、その後続けて、冷却および任意選択でワールプールレストを含む。１種または複数の追加の化合物、例えば、下記セクション「追加の化合物」に記載の１種または複数の追加の化合物、を水性抽出物に加えてもよい。冷却後、水性抽出物を、酵母、例えば、ビール酵母または出芽酵母などの醸造酵母を含む発酵タンクに移し得る。水性抽出物は、任意の好適な期間、一般的には、１〜１０日間などの１〜２０日間にわたり発酵され得る。発酵は、任意の有用な温度、例えば、１０〜２０℃の範囲の温度で実施される。方法はまた、１種または複数の酵素の追加を含み得、例えば、１種または複数の酵素が、発酵の前に、または発酵中に麦汁に添加され得る。特に、前記酵素は、プロリン−特異的エンドプロテアーゼであり得る。プロリン−特異的エンドプロテアーゼの非限定的例は、ＤＳＭから入手可能な「Ｂｒｅｗｅｒ’ｓ  Ｃｌａｒｅｘ」である。他の実施形態では、方法中に外来性の酵素は添加されない。
【０１８２】
数日間の長さの発酵工程中、糖はアルコールおよびＣＯ２に同時に転換され、いくつかの香味物質が発生する。任意の望ましい時間に、例えば、％Ｐの低下が観察されなくなると、発酵を終了させ得る。
【０１８３】
その後、ビールは、さらに処理、例えば、冷却され得る。それはまた、濾過および／またはラガーにするため貯蔵され得る−−この工程で、酵母様香味の少ない、心地よい香が発生する。添加物をさらに添加してもよい。さらに、ＣＯ２を添加し得る。最終的に、ビールは、低温殺菌および／または濾過された後に、包装され得る（例えば、容器またはビア樽に移される、瓶詰、または缶詰にされる）。ビールはまた、標準的な方法で低温殺菌され得る。
【０１８４】
追加の化合物
本発明の方法は、１種または複数の追加の化合物を加えるステップを含み得る。前記追加の化合物は、例えば、風味化合物、保存剤、機能性成分、染料、甘味剤、ｐＨ調整剤または塩であり得る。ｐＨ調整剤は、例えば、緩衝剤またはリン酸などの酸であり得る。
【０１８５】
機能性成分は、所与の機能を得るために添加される任意の成分であり得る。好ましくは、機能性成分は、飲料をより健康によいものにする。機能性成分の非限定例としては、ビタミンまたはミネラルが挙げられる。
【０１８６】
保存剤は、任意の食品等級保存剤であり得、例えば、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸塩（例えば、ソルビン酸カリウム）、亜硫酸塩および／またはその塩であり得る。
【０１８７】
追加の化合物はまた、ＣＯ２であり得る。特に、ＣＯ２は炭酸飲料を得るために添加され得る。
【０１８８】
本発明で使用される香味化合物は、任意の有用な香味化合物であり得る。香味化合物は、例えば、芳香剤、植物抽出物、植物濃縮物、植物部分およびハーブ浸剤からなる群より選択され得る。特に、風味化合物はホップであり得る。
【０１８９】
ＣｓｌＦ６中に変異を有する大麦植物の作製方法
ＣｓｌＦ６中に、変異、例えば、本明細書で記載のいずれかの特異的変異、を有する大麦植物は、任意の有用な方法で作製され得る。
【０１９０】
例えば、このような大麦植物は、次のステップを含む方法により作製できる：
・複数の大麦植物または大麦粒を、例えば、照射または化学処理、例えば、アジ化ナトリウムによる処理により、ランダム変異誘発に供するステップ；
・ＣｓｌＦ６中に変異を有する大麦植物または大麦粒を特定するステップ。
【０１９１】
このような方法はまた、それぞれランダム変異を含む複数の大麦植物／穀粒を得るために、前記大麦植物／大麦粒を複製する１つまたは複数のステップも含み得る。
【０１９２】
特に、ＣｓｌＦ６中の特定の変異を有する大麦植物が作製され、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号で記載されているように、ＣａｌＦ６遺伝子中の変異を特定するように設計されたプライマーおよびプローブを用いて本質的に特定され得る。変異Ｇ８４７ＥまたはＧ７４８Ｄの１つを有する変異体ＣｓｌＦ６タンパク質をコードする前記遺伝子をもたらすＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物の特定に有用なプライマーおよびプローブの例は、表２で提供されている。当業者なら、共通の一般知識および／または国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号（参照により本明細書に組み込まれる）で提供された手引きに基づいて、その他の変異体の特定のための有用なプライマーおよびプローブを設計できるであろう。
【０１９３】
ＣｓｌＦ６遺伝子中に、変異を有する大麦植物も同様に、種々の部位特異的変異誘発法を用いて作製され得、この方法は、例えば、本明細書で提供されるＣｓｌＦ６遺伝子の配列に基づいて設計できる。一実施形態では、大麦植物は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、および国際公開第２０１７／１３８９８６号に記載のＤＮＡ切断抗生物質の内のいずれか１つを用いて作製される。一実施形態では、大麦植物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使って、例えば、ＲＮＡ誘導性Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使って作製される。これは、シングルガイドＲＮＡ配列が本明細書で提供される遺伝子配列に基づいて設計されること以外は、Ｌａｗｒｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）１６：２５８；ＤＯＩ  １０．１１８６／ｓ１３０５９−０１５−０８２６−７に記載のようにして実施され得る。一実施形態では、大麦植物は、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の組み合わせを使って、例えば、ＲＮＡ誘導性Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使って作製される。これは、ＴＡＬＥＮおよびシングルガイドＲＮＡ配列が本明細書で提供される遺伝子配列に基づいて設計されること以外は、Ｈｏｌｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１７）９５：１１１−１２１；ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１１０３−０１７−０６４０−６に記載のようにして実施され得る。
【０１９４】
一実施形態では、穀類植物は、相同組み換え修復、ＤＮＡ切断ヌクレアーゼとドナーＤＮＡフラグメントの組み合わせを用いて作製される。これは、ＤＮＡ切断ヌクレアーゼが本明細書で提供される遺伝子配列に基づいて設計され、ドナーＤＮＡフラグメントが本明細書で提供される変異導入した穀物変種のコード配列に基づいて設計されること以外は、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ（２０１６）９：６２８−６３１；ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｐ．２０１６．０１．００１に記載のようにして実施され得る。
【０１９５】
本発明の一実施形態では、目的は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に、変異を有する農学的に有用な大麦植物を提供することである。ＣｓｌＦ６遺伝子中の変異に加えて、商業的大麦変種生成の技術分野において、製麦および／または醸造にとって、および／または飲料のための基材として有用であると考えられ得る追加の因子、例えば、穀粒収率およびサイズ、ならびに製麦性能または醸造性能に関連する他のパラメーターが存在する。全てではないにしても多くの関連形質は、遺伝的制御下にあることが示されているので、本発明はまた、本報告で開示される大麦植物との交雑により作製され得る、最新のホモ接合高収率製麦栽培品種を提供する。熟練大麦品種改良家は、他の大麦植物と交雑後、優れた栽培品種を生ずる大麦植物を選択し、発生させることができる。あるいは、品種改良家は、本発明の植物を、さらに変異誘発して、ＣｓｌＦ６遺伝子中の変異に加えて、追加の変異を有する新規栽培品種を生成するために利用し得る。
【０１９６】
本発明はまた、自家受粉、戻し交雑、集団に対する交雑、などの方法を含む植物育種法により作製されたＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する大麦植物を含む。戻し交雑法は、ＣｓｌＦ６遺伝子中の変異を、別の栽培品種に導入するために本発明で使用できる。
【０１９７】
一実施形態では、本発明は、２０１８年１１月１２日にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７３で寄託され、「変異体２」と呼ばれる大麦植物の子孫に関する。前記子孫は、限定されないが、自家受粉、戻し交雑、または他の集団との交雑を含む任意の有用な方法により作製され得る。特に、前記子孫は、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド２２４３のＧ→Ａ変異も有し得る。
【０１９８】
植物育種の工程を加速する方法は、組織培養物および再生技術の適用による生成変異体の初期増殖を含む。従って、本発明の別の態様は、成長および分化時に、ＣｓｌＦ６遺伝子の変異を有する大麦植物を生成する細胞を提供することである。例えば、育種は、従来の交雑、稔性葯由来植物の作製または小胞子培養の使用を必要とし得る。
【０１９９】
一実施形態では、本発明の大麦植物は、基本的な生物学的プロセスにより得られるとは限らない。技術的プロセスにより得られた大麦植物の子孫は、基本的な生物学的プロセスにより得られるとは限らないと本明細書では見なされる。理由は、親植物が技術的プロセスにより得られるためである。
【０２００】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、前記変異は、化学的および／または物理的薬剤により誘導されている。
【０２０１】
一実施形態では、大麦植物は誘導された変異誘発のステップを含む方法により作製された、または前記植物は、誘導された変異誘発のステップを含む方法により作製された植物の子孫である。従って、大麦植物は、次のステップを含む方法により作製された大麦植物または次のステップを含む方法により作製された植物の子孫であり得る：
・大麦植物またはその一部を、例えば、ＮａＮ３などの化学的変異誘発剤で変異誘発するステップ、
ＣｓｌＦ６遺伝子中の上述のいずれかの変異を有する大麦植物を選択するステップ。
一実施形態では、前記ＣｓｌＦ６遺伝子の変異は、ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする変異体ＣｓｌＦ６遺伝子をもたらし、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸８４７の荷電アミノ酸、例えば、グルタミン酸への置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６である。特に、前記変異体ＣｓｌＦ６遺伝子は、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド２２４３のＧ→Ａ変異を有し得る。
【０２０２】
項目
本発明は、下記の項目によりさらに規定され得る：
１．大麦植物またはその一部であって、前記大麦植物の穀粒は、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し、前記大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、前記変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子は、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードし、前記変異体ＣｓｌＦ６は、変異体ＣｓｌＦ６がＣｓｌＦ６の膜局在型ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１のＣｓｌＦ６であり、前記置換が荷電アミノ酸から非極性アミノ酸への置換、または非極性アミノ酸から極性アミノ酸への置換であり、ＣｓｌＦ６の膜局在型ドメインが、配列番号１または配列番号３のアミノ酸１０９〜１２８、１３７〜１５８、７００〜７３１、７４１〜７５８、８３５〜８５７、および８６４〜８８２からなる、大麦植物またはその一部。
２．大麦植物またはその一部であって、前記大麦植物の穀粒は、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し、前記大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、前記変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子は、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードし、前記変異体ＣｓｌＦ６は、変異体ＣｓｌＦ６がＣｓｌＦ６の膜局在型ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１のＣｓｌＦ６であり、前記置換が非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換、または極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換であり、膜局在型ドメインが、配列番号１または配列番号３のアミノ酸８３５〜８５７、またはアミノ酸７００〜７３１、またはアミノ酸７４１〜７５８からなる、ＣｓｌＦ６の膜局在型ドメインからなる群より選択される、大麦植物またはその一部。
３．項目１または２に記載の大麦植物であって、前記大麦植物が、総穀粒乾燥重量の１〜５％、例えば、総穀粒乾燥重量の１．３〜３％の、好ましくは、総穀粒乾燥重量の１．３〜２％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する、大麦植物。
４．項目１〜３のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記大麦植物の穀粒が、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の（１，３；１，４）−β−グルカンの含量の、少なくとも３０％で最大で６０％、好ましくは少なくとも４０％で最大で６０％の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する、大麦植物。
５．項目１〜４のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記大麦植物の穀粒が、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の（１，３；１，４）−β−グルカンの含量の、少なくとも３０％で最大で６０％、好ましくは少なくとも４０％で最大で６０％の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する、大麦植物。
６．項目１〜５のいずれか１項に記載の大麦植物であって、大麦植物が、脱穀後の破壊穀粒の出現頻度を有する穀粒を含み、その出現頻度が、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有さないがその他は同じ遺伝子型である大麦植物の脱穀後の破壊穀粒の出現頻度よりも、多くて３倍高い、大麦植物。
７．項目１〜６のいずれか１項に記載の大麦植物であって、大麦植物が、脱穀後の破壊穀粒の出現頻度を有する穀粒を含み、その出現頻度が、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有さないがその他は同じ遺伝子型である大麦植物の脱穀後の破壊穀粒の出現頻度よりも、多くて２倍高い、大麦植物。
８．項目１〜７のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記置換が非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換である、大麦植物。
９．項目１〜８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、ＣｓｌＦ６のアミノ酸８３５〜８５７からなる膜貫通ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換である、大麦植物。
１０．項目１〜９のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸８４７の荷電アミノ酸への置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６である、大麦植物。
１１．項目１〜１０のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸８４７の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換はグリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換である、大麦植物。
１２．項目１〜１１のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記大麦植物がＣｓｌＦ６遺伝子の変異を有し、前記変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子が配列番号２７の変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする、大麦植物。
１３．項目１〜１２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記大麦植物がＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のコード配列のヌクレオチド２２４３のＧ→Ａ変異を有する、大麦植物。
１４．項目１３に記載の大麦植物であって、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のコード配列が配列番号２である、大麦植物。
１５．項目１〜１４のいずれか１項に記載の大麦植物であって、大麦植物が、受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７３によりＮＣＩＭＢに寄託された変異体２、またはその子孫である、大麦植物。
１６．大麦植物またはその子孫またはその一部であって、前記植物のゲノムが、受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７３によりＮＣＩＭＢに寄託された大麦植物変異体２のＣｓｌＦ６遺伝子を含む、大麦植物またはその子孫またはその一部。
１７．項目１〜１６に記載の大麦植物であって、前記大麦植物の穀粒が、総穀粒乾燥重量の１．７〜５．０％の範囲のβ−グルカン含量を有する、大麦植物。
１８．項目１〜１７のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記大麦植物の穀粒が、多くても２．１などの多くても２．５、例えば、１．０〜２．１の範囲のＤＰ３：ＤＰ４比率を有する、大麦植物。
１９．項目１〜１８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、ＣｓｌＦ６のアミノ酸７４１〜７５８からなる膜貫通ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換である、大麦植物。
２０．項目１〜８および１９のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７４８の荷電アミノ酸への置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６である、大麦植物。
２１．項目１〜８および１９または２０のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７４８の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からグリシン（Ｇ）への置換である、大麦植物。
２２．項目１〜８および１９〜２１のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記大麦植物の穀粒が、総穀粒乾燥重量の１．７〜３％の範囲のβ−グルカン含量を有する、大麦植物。
２３．項目１〜８および１９〜２２のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記大麦植物の穀粒が、２．５〜４の範囲のＤＰ３：ＤＰ４比率を有する、大麦植物。
２４．項目１〜８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、ＣｓｌＦ６のアミノ酸７００〜７３１からなる膜貫通ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換である、大麦植物。
２５．項目１〜８および２４のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、ＣｓｌＦ６のアミノ酸７００〜７１１からなる膜局在型ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換である、大麦植物。
２６．項目１〜８および２４または２５のいずれか1項に記載の大麦植物であって、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７０９の非極性アミノ酸への置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６である、大麦植物。
２７．項目１〜８および２４〜２６のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が、アミノ酸７０９の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、トレオニン（Ｔ）のイソロイシン（Ｉ）への置換である、大麦植物。
２８．項目１〜８および２４〜２７のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記大麦植物の穀粒が、総穀粒乾燥重量の１．３〜３％の範囲のβ−グルカン含量を有する、大麦植物。
２９．項目１〜８および２４〜２８のいずれか１項に記載の大麦植物であって、前記大麦植物の穀粒が、少なくとも４．０などの少なくとも３．５、例えば、４〜６の範囲などの少なくとも４．５のＤＰ３：ＤＰ４比率を有する、大麦植物。
３０．項目１〜２９のいずれか１項に記載の大麦植物であって、本質的に生物学的方法により作製されているとは限らない、大麦植物。
３１．項目１〜３０のいずれか１項に記載の大麦植物またはその子孫であって、次のステップを含む方法により作製される大麦植物：
・ 大麦植物またはその一部を、例えば、化学的変異誘発剤で変異誘発するステップ、
・ ＣｓｌＦ６遺伝子中の上述のいずれかの変異を有する大麦植物を選択するステップ。
３２．項目１〜３１のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部を含む植物生成物。
３３．項目３２に記載の植物生成物であって、前記大麦植物の穀粒から作製した緑麦芽またはキルン乾燥麦芽である、植物生成物。
３４．項目３２に記載の植物生成物であって、前記大麦植物の穀粒からおよび／または前記大麦植物の処理穀粒を含む緑麦芽またはキルン乾燥麦芽から作製した麦汁である、植物生成物。
３５．項目３２〜３４のいずれか１項に記載の植物生成物であって、植物生成物が麦汁であり、前記麦汁が多くても２．５ｍＰａ＊ｓ、好ましくは、多くても２．２ｍＰａ＊ｓの粘度である、植物生成物。
３６．項目３２に記載の植物生成物であって、前記大麦植物またはその一部から作製された飲料である、植物生成物。
３７．項目３２に記載の飲料であって、前記大麦植物の穀粒から、および／または前記大麦植物の処理穀粒を含む麦芽から作製される、飲料。
３８．項目３６または３７に記載の飲料であって、ビールである、飲料。
３９．緑麦芽の作製方法であって、次記のステップを含む方法：
ａ．項目１〜３１のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．前記穀粒を浸麦するステップ；
ｃ．所定の状態下で浸麦穀粒を発芽させるステップ。
４０．キルン乾燥麦芽の作製方法であって、次記のステップを含む方法：
ａ．項目１〜３１のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．前記穀粒を浸麦するステップ；
ｃ．所定の状態下で浸麦穀粒を発芽させるステップ；
ｄ．前記発芽穀粒を乾燥するステップ。
４１．飲料の製造方法であって、次記のステップを含む方法：
ａ．項目１〜３１のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または項目３３に記載の麦芽を用意するステップ、
ｂ．前記穀粒および／または前記麦芽の水性抽出物を作製するステップ、
ｃ．前記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
４２．水性抽出物の製造方法であって、次記のステップを含む方法：
ａ．項目１〜３１のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．大麦粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップが前記穀粒を水溶液中で長くても７２時間インキュベーションすることを含むステップ；
ｃ．前記発芽穀粒を微粉化し、同時に、前記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップであって、ただし、前記大麦粒がステップｂ）とｃ）との間で常に２０％未満の含水量にならないことが前提である、ステップ；
ｄ．前記粉砕発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、大麦の水性抽出物を製造するステップ。
４３．水性抽出物の製造方法であって、次記のステップを含む方法：
ａ．項目１〜３１のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ；
ｂ．大麦粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップが前記穀粒を水溶液中で長くても７２時間インキュベーションすることを含むステップ；
ｃ．前記発芽穀粒を微粉化し、同時に、前記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップであって、ただし、前記大麦粒が発芽後および発芽穀粒を微粉化するまで、常に２０％未満の含水量にならないことが前提である、ステップ；
ｄ．前記粉砕発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、大麦の水性抽出物を製造するステップ。
４４．項目４２または４３に記載の方法であって、前記発芽ステップ（ｂ）が、前記穀粒が少なくとも３０％の含水量を有するまで水溶液中で前記穀粒をインキュベーションすることを含み、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／（ｋｇ乾燥重量大麦粒）を、前記水溶液中を通過させるステップを含む、方法。
４５．項目４２〜４４のいずれか１項に記載の方法であって、大麦の穀粒が発芽の全ステップ中で水溶液中に浸漬される、方法。
４６．項目４２〜４５のいずれか１項に記載の方法であって、発芽ステップが下記を含む方法：
ａ．前記穀粒を水溶液中でインキュベーションする少なくとも１つのステップであって、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／ｋｇ大麦粒乾燥重量を前記水溶液中に通過させるステップ；および
ｂ．前記大麦粒を空気中でインキュベーションする少なくとも１つのステップ。
４７．項目４２〜４６のいずれか１項に記載の方法であって、１時間当たり、１ｋｇの大麦粒乾燥重量当たり、少なくとも３Ｌ、より好ましくは少なくとも４Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも５Ｌ、またさらにより好ましくは少なくとも６ＬのＯ２を前記水溶液中に通過させる、方法。
４８．項目４２〜４７のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｏ２がガス混合物内に含まれ、ガス混合物が大気である、方法。
４９．項目４２〜４８のいずれか１項に記載の方法であって、全体発芽ステップが７２時間を超えない、より好ましくは、６０時間を超えない、さらにより好ましくは、５４時間を超えない、方法。
５０．項目４２〜４９のいずれか１項に記載の方法であって、大麦は皮麦であり、方法は、水溶液中で前記穀粒をインキュベーションする前に、少なくとも一部の前記外皮を取り除くステップを含む、方法。
５１．飲料の製造方法であって、次記のステップを含む方法：
ａ．項目４２〜５０のいずれか１項に記載の方法により水性抽出物を作製するステップ；
ｂ．前記抽出物を飲料に処理するステップ。
５２．項目５１に記載の方法であって、ステップｂ．が次記ステップを含む方法：
ｉ．前記水性抽出物を、任意選択で、ホップまたはホップ抽出物の存在下で加熱するステップ；
ｉｉ．水性抽出物を冷却するステップ；
ｉｉｉ．前記水性抽出物を酵母で発酵させ、それにより、発酵飲料を製造するステップ。
５３．項目５１または５２に記載の方法であって、飲料がビールである、方法。
５４．総穀粒乾燥重量の１〜５％の範囲のβ−グルカン含量を有する大麦植物を作製する方法であって、次のステップを含む方法。
ａ．大麦粒を用意するステップ；および
ｂ．前記大麦粒をランダムに変異誘発し、それにより、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を導入するステップであって、前記変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子が、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードし、前記変異体ＣｓｌＦ６は、変異体ＣｓｌＦ６がＣｓｌＦ６の膜貫通ドメイン中の１つのアミノ酸の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換が荷電アミノ酸から非極性アミノ酸への置換、または非極性アミノ酸から極性アミノ酸への置換であり、ＣｓｌＦ６の膜貫通ドメインが、アミノ酸１０９〜１２８、１３７〜１５８、７００〜７３１、７４１〜７５８、８３５〜８５７、および８６４〜８８２からなる、ステップ；および
ｃ．変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子を有する大麦粒またはその子孫を選択するステップ。
５５．項目５４に記載の方法であって、大麦植物または変異が項目１〜３１のいずれか１項で定義の通りである、方法。
５６．項目１〜３１のいずれか１項に記載の大麦植物であって、１種または複数の追加の遺伝子中に変異、例えば、１つまたは複数の次の変異を含む、大麦植物：
ａ．機能的ＬＯＸ−１の完全喪失をもたらすＬＯＸ−１コード遺伝子中の変異、
ｂ．機能的ＬＯＸ−２の完全喪失をもたらすＬＯＸ−２コード遺伝子中の変異、
ｃ．機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらすＭＭＴコード遺伝子中の変異。
【０２０３】
配列
＞配列番号１、セルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６配列（ジェンバンク番号：ＥＵ２６７１８１．１に基づく）
MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVELGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGFSWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCYVSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARINSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASADNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKAGAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMVGRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCFPRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYAAAAEGIVADEATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDVVTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLRWSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLGIVLSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADLYVVRWTPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVVVLVWWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLH
＞配列番号２：Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅセルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６（ＣｓｌＦ６）、全コード領域（ジェンバンク番号ＮＣＢＩ：ＥＵ２６７１８１．１に基づく）
ATGGCGCCAGCGGTGGCCGGAGGGGGCCGCGTGCGGAGCAATGAGCCGGTTGCTGCTGCTGCCGCCGCGCCGGCGGCCAGCGGCAAGCCCTGCGTGTGCGGCTTCCAGGTTTGCGCCTGCACGGGGTCGGCCGCGGTGGCCTCCGCCGCCTCGTCGCTGGACATGGACATCGTGGCCATGGGGCAGATCGGCGCCGTCAACGACGAGAGCTGGGTGGGCGTGGAGCTCGGCGAAGATGGCGAGACCGACGAAAGCGGTGCCGCCGTTGACGACCGCCCCGTATTCCGCACCGAGAAGATCAAGGGTGTCCTCCTCCACCCCTACCGGGTGCTGATTTTCGTTCGTCTGATCGCCTTCACGCTGTTCGTGATCTGGCGTATCTCCCACAAGAACCCAGACGCGATGTGGCTGTGGGTGACATCCATCTGCGGCGAGTTCTGGTTCGGTTTCTCGTGGCTGCTAGATCAGCTGCCCAAGCTGAACCCCATCAACCGCGTGCCGGACCTGGCGGTGCTGCGGCAGCGCTTCGACCGCCCCGACGGCACCTCCACGCTCCCGGGGCTGGACATCTTCGTCACCACGGCCGACCCCATCAAGGAGCCCATCCTCTCCACCGCCAACTCGGTGCTCTCCATCCTGGCCGCCGACTACCCCGTGGACCGCAACACATGCTACGTCTCCGACGACAGTGGCATGCTGCTCACCTACGAGGCCCTGGCAGAGTCCTCCAAGTTCGCCACGCTCTGGGTGCCCTTCTGCCGCAAGCACGGGATCGAGCCCAGGGGTCCGGAGAGCTACTTCGAGCTCAAGTCACACCCTTACATGGGGAGAGCCCAGGACGAGTTCGTCAACGACCGCCGCCGCGTTCGCAAGGAGTACGACGAGTTCAAGGCCAGGATCAACAGCCTGGAGCATGACATCAAGCAGCGCAACGACGGGTACAACGCCGCCATTGCCCACAGCCAAGGCGTGCCCCGGCCCACCTGGATGGCGGACGGCACCCAGTGGGAGGGCACATGGGTCGACGCCTCCGAGAACCACCGCAGGGGCGACCACGCCGGCATCGTACTGGTGCTGCTGAACCACCCGAGCCACCGCCGGCAGACGGGCCCGCCGGCGAGCGCTGACAACCCACTGGACTTGAGCGGCGTGGATGTGCGTCTCCCCATGCTGGTGTACGTGTCCCGTGAGAAGCGCCCCGGGCACGACCACCAGAAGAAGGCCGGTGCCATGAACGCGCTTACCCGCGCCTCGGCGCTGCTCTCCAACTCCCCCTTCATCCTCAACCTCGACTGCGATCATTACATCAACAACTCCCAGGCCCTTCGCGCCGGCATCTGCTTCATGGTGGGACGGGACAGCGACACGGTTGCCTTCGTCCAGTTCCCGCAGCGCTTCGAGGGCGTCGACCCCACCGACCTCTACGCCAACCACAACCGCATCTTCTTCGACGGCACCCTCCGTGCCCTGGACGGCATGCAGGGCCCCATCTACGTCGGCACTGGGTGTCTCTTCCGCCGCATCACCGTCTACGGCTTCGACCCGCCGAGGATCAACGTCGGCGGTCCCTGCTTCCCCAGGCTCGCCGGGCTCTTCGCCAAGACCAAGTACGAGAAGCCCGGGCTCGAGATGACCACGGCCAAGGCCAAGGCCGCGCCCGTGCCCGCCAAGGGTAAGCACGGCTTCTTGCCACTGCCCAAGAAGACGTACGGCAAGTCGGACGCCTTCGTGGACACCATCCCGCGCGCGTCGCACCCGTCGCCCTACGCCGCGGCGGCTGAGGGGATCGTGGCCGACGAGGCGACCATCGTCGAGGCGGTGAACGTGACGGCCGCCGCGTTCGAGAAGAAGACCGGCTGGGGCAAAGAGATCGGCTGGGTGTACGACACCGTCACGGAGGACGTGGTCACCGGCTACCGGATGCATATCAAGGGGTGGCGGTCACGCTACTGCTCCATCTACCCACACGCCTTCATCGGCACCGCCCCCATCAACCTCACGGAGAGGCTCTTCCAGGTGCTCCGCTGGTCCACGGGATCCCTCGAGATCTTCTTCTCCAAGAACAACCCGCTCTTCGGCAGCACATACCTCCACCCGCTGCAGCGCGTCGCCTACATCAACATCACCACTTACCCCTTCACCGCCATCTTCCTCATCTTCTACACCACCGTGCCGGCGCTATCCTTCGTCACCGGCCACTTCATCGTGCAGCGCCCGACCACCATGTTCTACGTCTACCTGGGCATCGTGCTATCCACGCTGCTCGTCATCGCCGTGCTGGAGGTCAAGTGGGCCGGGGTCACAGTCTTCGAGTGGTTCAGGAACGGCCAGTTCTGGATGACAGCAAGTTGCTCCGCCTACCTCGCCGCCGTCTGCCAGGTGCTGACCAAGGTGATATTCCGGCGGGACATCTCCTTCAAGCTCACATCCAAGCTACCCTCGGGAGACGAGAAGAAGGACCCCTACGCCGACCTCTACGTGGTGCGCTGGACGCCGCTCATGATTACACCCATCATCATCATCTTCGTCAACATCATCGGATCCGCCGTGGCCTTCGCCAAGGTTCTCGACGGCGAGTGGACGCACTGGCTCAAGGTCGCCGGCGGCGTCTTCTTCAACTTCTGGGTGCTCTTCCACCTCTACCCCTTCGCCAAGGGCATCCTGGGGAAGCACGGAAAGACGCCAGTCGTGGTGCTCGTCTGGTGGGCATTCACCTTCGTCATCACCGCCGTGCTCTACATCAACATCCCCCACATGCATACCTCGGGAGGCAAGCACACAACGGTGCATGGTCACCATGGCAAGAAGTTGGTCGACACAGGGCTCTATGGCTGGCTCCATTGA
＞配列番号３、セルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６配列（Ａ５９０Ｔ多型を含む）
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＞配列番号２７、配列番号１、セルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６配列（ジェンバンク番号ＮＣＢＩ：ＥＵ２６７１８１．１に基づく）に基づく細胞壁変異体２（ＣＷ３ａ）
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【０２０４】
実施例
実施例１
デジタル変異体特定プローブの設計
ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子のコード配列を、受入番号ＡＢ６２１３３２により（米国）国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から収集した。この配列をｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｂｌａｓｔ．ｉｐｋ−ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ．ｄｅ／ｂａｒｌｅｙ／でのＢＬＡＳＴ探索のために使用した。ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子および転写物配列を、受入番号：ＭＬＯＣ＿５７２００によりｈｔｔｐ：／／ｐｌａｎｔｓ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｒｄｅｕｍ＿ｖｕｌｇａｒｅ／を用いて検索した。デジタル変異体特定プローブをＭＬＯＣ＿５７２００．２のコード化ＤＮＡおよびタンパク質配列に基づいて設計した。
【０２０５】
実施例２
セルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６の遺伝子中の特異的変異を用いた大麦変異体のスクリーニング
セルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６（ＨｖＣｓｌＦ６）中のアミノ酸残基の置換をもたらす特異的変異を有する全体で５種の変異体を特定した（表１）。
【表１】
2021509807.tif 000003
【０２０６】
変異体１、変異体２、変異体３および変異体４は、ｄｄＰＣＲスクリーニング方法を用いて、基本的に国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号に記載のようにして、特定した。より具体的には、ランダムに変異誘発させた大麦粒のプールを作製し、続けて、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号のｐ．６６〜６９のＷＳ１およびＷＳ２ならびに実施例１〜２に記載のように、順序付きライブラリーを作製した。国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号のｐ．６７〜７２のＷＳ３およびＷＳ４ならびに以下の表２で示しているように実施例３〜１５に記載のようにして、変異体１、変異体２、変異体３および変異体４を特定し、選択した。特に、スクリーニングは、基本的に、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号のＷＳ３および実施例３〜７に記載されているようにして、下記表２に指定したプライマーおよびプローブを用いて実施した。遺伝子変異を有する個別の大麦粒は、基本的に、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５５１６号のＷＳ４（ｐ．６９〜７２）および実施例８〜１５に記載されているようにして、下表２に指定したプライマーおよびプローブを用いて特定した。ＨｖＣｓｌＦ６座位に位置する特定の変異体の特定のためにプライマーおよびプローブを特に設計し、表２に記載している。
【表２】
2021509807.tif 000004
【０２０７】
変異体５は、特異的プライマー（順方向プライマー５’−ＡＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＴＡＣＣＣＡＣＡＣ−３’；逆方向プライマー５’−ＧＡＴＧＡＣＧＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＣＣＣ−３’）を使って、ＨｖＣｓｌＦ６座位の部分を増幅し、６０００種の変異誘発Ｍ３大麦変異体の直接塩基配列決定手法を用いて特定された。
【０２０８】
変異体１、変異体２、変異体３、変異体４および変異体５は、本明細書では、それぞれ、Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ３、Ｍｕｔ４およびＭｕｔ５とも称される
【０２０９】
変異位置を可視化するために、プログラムＳｗｉｓｓｐｒｏｔ（ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）を用いてＣｓｌＦ６タンパク質をモデル化した。最初に、全体タンパク質配列を「ｍｏｄｅｌ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｆｅａｔｕｒｅ」にアップロードした後、モデルを利用可能なデータに基づいて計算する。ＣｓｌＦ６タンパク質配列については、これは、「セルロースシンターゼサブユニットＡ」に類似の構造体配列中に埋め込まれていると認識されている。プログラムはその後、認識された配列（ポリペプチド位置１０９〜８８３）を利用してモデルを構築する。この段階で、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔプログラムは、ヘリックスがモデルの片側に配列されているが、タンパク質が膜結合型であることを認識していない。文献は、ＣｓｌＦ６タンパク質が膜結合型であることを示している。従って、これをさらに試験するために、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔのＱＭＥＡＮＢｒａｎｅ  ｆｅａｔｕｒｅを使用した。このモデリング用プログラムは、最初のモデリング中に位置１０９〜８８３を網羅するＰＤＢファイルを利用し、ＣｓｌＦ６タンパク質の膜および選択部分を一緒にモデル化した新規構造が構築される。２つのドット付き灰色面は、二重層膜に似ている。より低い（１，３；１，４）−β−グルカン含量を誘導する３つの変異（Ｔ７０９Ｉ、Ｇ７４８Ｄ、Ｇ８４７Ｅ）は全て、膜中に埋め込まれたヘリックス構造体中に存在するが、一方、（１，３；１，４）−β−グルカン含量に影響を与えない変異（Ｇ７３２Ｄ）は、外側に面し、２つの膜貫通ドメインを連結するリンカー配列中に位置する（図３）。ＣｓｌＦ６の膜局在型アミノ酸は、表３に示される。
【表３】
2021509807.tif 000005
【０２１０】
実施例３
（１，３；１，４）−β−グルカン含量および成熟変異体穀粒のＤＰ３：ＤＰ４比率
【０２１１】
実施例１で記載のように特定された変異体は、成熟まで成長させて、ホモ接合穀粒を数列に植え付けた。成熟時に、植物を収穫し、穀粒を数平方メートルの小さい区画での増殖のために使用した。変異体１、２、４および５の全ては、圃場でうまくいき、参照に類似の収率を得た。従って、これらの変異体は、許容可能な農業形質を有している。変異体１、２、３および４に対しては、参照は、栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎであり、変異体５に対しては栽培品種Ｑｕｅｎｃｈであった。変異体３は、極めて低減した稔性を示し、従って、収率試験には含めなかった。
【表４】
2021509807.tif 000006
【０２１２】
収穫した穀粒の総（１，３；１，４）−β−グルカン含量を分析し、ＤＰ３：ＤＰ４比率を決定した。１０ｍｌの大麦粒をＲｅｔｃｈ  ｃｙｃｌｏｎｅミルで粉砕した。全ての試料を３回繰り返して分析した。２０ｍｇの粉末を２ｍｌのエッペンドルフチューブに秤取し、オーブン中、１００℃で２時間加熱し、続けて、室温まで冷却した。全体で５００μｌの５０％水性メタノールを加え、試料を１４００ｒｐｍで１時間震盪した。１６０００ｇで１０分間遠心分離後、上清を廃棄し、試料を一晩乾燥した。次に、１０ｍｇの粉末当たり、１Ｕ／ｍｌのリケナーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）含有２０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ６．５）の４００μｌを加え、５０℃で２．５時間インキュベーションした。試料を１６０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、放出されたＧｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ３）およびＧｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ４）をアンペロメトリック電気化学検出を備えたオリゴマーを高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により定量した。Ｇｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ３）およびＧｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ４）オリゴマーは、２ｘ２５０ｍｍ寸法およびプレカラムを有する４μｍのＳＡ−１０カラムを備えたＤｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ５０００＋ＤＣシステムを用いてＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで定量された。実施条件は、０．４ｍｌ／分、カラム温度４０℃、無勾配の１００ｍＭ  ＮａＯＨ溶出液で１５分間であった。定量化のための標準は、ＤＰ３とＤＰ４との間の等モルＰＡＤ応答比率を仮定して、２０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ６．５）中の既知の量の中間的粘度の（１，３；１，４）−β−グルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）の、１Ｕ／ｍｌのリケナーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）消化により生成した。総（１，３；１，４）−β−グルカン含量は、ＤＰ３およびＤＰ４オリゴマーの含量の合計であると見なした。
【０２１３】
結果。変異体１、２および５の（１−３；１−４）−β−グルカン含量は全て、１．４〜２％の範囲であったが、一方、変異体３は、（１−３；１−４）−β−グルカンがほとんど存在しなかった（図１および表６）。ＤＰ３：ＤＰ４比率の試験では、変異体１は、参照よりも低い比率を示し、変異体２は、参照と同等であり、変異体３および４は、参照よりわずかに低く、変異体５は、遙かに高いＤＰ３：ＤＰ４比率を示した（図２および表６）。
【０２１４】
実施例４
加速発芽中の変異体穀粒の（１，３；１，４）−β−グルカン含量
変異体１、２、および４、ならびに参照（参照は、１、２、３および４に対しては栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎであり、変異体５に対しては栽培品種Ｑｕｅｎｃｈであった）を、基本的に、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４９８号の実施例１に記載されているようにして、タンク中で一段階浸麦および発芽に供した。発芽穀粒の試料を２４時間および４８時間後に採取した。
【０２１５】
全ての試料をＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＣｏＭＰＰ）（Ｍｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を用いて分析した。２０ｍｇの各試料を、１ｍｌのＨ２Ｏを用いて８５℃で１０００ｒｐｍ下、１時間抽出し、続けて、０．１％ｖ／ｖのＮａＢＨ４含有１ｍｌの４Ｍ  ＮａＯＨを用いて２０℃で１０００ｒｐｍ下、２時間抽出し、分析した（３回繰り返して）。各抽出を３ｍｍのガラス玉を含む２ｍｌのエッペンドルフチューブ中で行い、１０，０００ｇで１０分間遠心分離したのち、上清を集めた。
【０２１６】
抽出物をアレイジェット印刷緩衝液（５５．２％のグリセロール、４４％の水、０．８％のトリトンＸ−１００）と５０／５０に混合し、０．４５μｍの細孔径のニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，ＵＫ）上にＡｒｒａｙｊｅｔ  Ｓｐｒｉｎｔ（Ａｒｒａｙｊｅｙ，Ｒｏｓｌｉｎ，ＵＫ）を用いてスポットした。各試料を、４回の技術的反復と３つの５倍希釈で印刷し、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、２０１２に記載のように検出した。アレイをフラットベットスキャナー（ＣａｎｏＳｃａｎ  ９０００  ＭａｒｋＩＩ，Ｃａｎｏｎ，Ｓｏｅｂｏｒｇ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて２４００ｄｐｉでスキャンし、Ａｒｒａｙ−Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ６，３（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて定量した。各サンプルに対し、４つの希釈物および４つの技術的反復に基づいて平均値を計算し、試料反復処理シグナル値当たり、１６個の測定値を得た。データセット中の最大値を１００に設定し、それに従って残りのデータを調節した。表５に、３回の試料反復処理の平均を示すデータを示す。
【表５】
2021509807.tif 000007
【０２１７】
分析は、変異体１および２は、空気を供給したタンク中での発芽中２４時間および４８時間後に、参照および変異体４に比べて、より低い（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有しており、変異体１および２の固有のより低い（１，３；１，４）−β−グルカン含量を実証することを示す。
【０２１８】
実施例６
穀粒強度の分析
変異体１、２、３、４および５ならびに参照系統の栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎおよび栽培品種Ｑｕｅｎｃｈを圃場の７．５ｍ２の区画で増殖させた。それらは、試験用Ｗｉｎｔｅｒｓｔｅｉｇｅｒ  Ｃｌａｓｓｉｃ（Ｗｉｎｔｅｒｓｔｅｉｇｅｒ（ＷＩＮＴＥＲＳＴＥＩＧＥＲ  ＡＧ，Ｊｏｈａｎｎ−Ｍｉｃｈａｅｌ−Ｄｉｍｍｅｌｓｔｒａｓｓｅ  ９４９１０  Ｒｉｅｄ  ｉｍ  Ｉｎｎｋｒｅｉｓ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて収穫された。穀粒のさらなる清浄化は、Ｐｆｅｕｆｆｅｒ  ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｅｒ，モデルＳＬＮ４（Ｐｆｅｕｆｆｅｒ  ＧｍｂＨ，Ｆｌｕｇｐｌａｔｚｓｔｒａβｅ  ７０，９７３１８  Ｋｉｔｚｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、２．５ｍｍスクリーンを用いて実施した。破壊穀粒は、約１０ｇのランダムに選択された４種の試料で計数し、破壊穀粒の量を重量基準で計算した。脱穀（Ｗｉｎｔｅｒｓｔｅｉｇｅｒ試験）後およびスクリーニングの前の破壊穀粒の数は、穀粒強度の指標である。脱穀後の破壊穀粒に比率を、変異体植物中の破壊穀粒の参照野生型植物（表６ａに示される参照植物）に対する倍数増加として計算した。
【表６】
2021509807.tif 000008
【０２１９】
破壊穀粒の比率（脱穀破壊比率）の類似の測定を、ニュージーランドで２０１６〜２０１７年に成長させた大麦植物由来の５０ｇの試料（Ｍｕｔ１；Ｍｕｔ２；Ｍｕｔ４；Ｍｕｔ５）およびデンマークで２０１８年に成長させた大麦由来の５０ｇの試料（Ｍｕｔ２）で実施した。脱穀後の破壊穀粒の出現頻度（脱穀破壊比率）を上記のように測定し、野生型参照大麦植物（Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２およびＭｕｔ４に対しては栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ、Ｍｕｔ５に対しては栽培品種Ｑｕｅｎｃｈ）の出現頻度と比較した。野生型参照大麦植物に対する倍数増加を下表６ｂに示す。
【表７】
2021509807.tif 000009
【０２２０】
興味深いことに、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４は、ＣｓｌＦ６タンパク質のＡ８４９Ｔ変位をもたらすＣｓｌＦ６遺伝子中に変位を有する大麦系統（ｍ３５１）を開示している。前記大麦系統は、野生型対照に比べて、破壊穀粒比率の４．２倍の増加を示す。
【０２２１】
実施例７：麦芽試料の加水分解酵素活性
変異体２および参照（栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ）の大麦粒の各５０ｇ試料を３回繰り返し処理した。上記実施例２に記載のように変異体２を処理した。ステンレス鋼ビーカー中に置いた乾燥大麦粒から、標準的な方法によりマイクロ製麦した。手短に説明すると、大麦粒を１５℃の淡水中に、最初の日に約７時間、２日目に３時間、３日目に１時間、浸漬させて、各浸麦の終わりに、それぞれ３５％、４０％および４５％の含水量になるようにした。各浸麦後、試料を含むステンレス鋼ビーカーを１５℃の発芽ボックスに移動し、工程の次のステップまでそこに保持した。浸麦水の最後の廃液時に、試料を１２０時間（３〜７日間）発芽ボックス中で保持し、４５％の水と平衡化し、呼吸水の減少を克服するために、噴霧した。
発芽工程の終わりに（７日目）、試料をＴｅｒｍａｋｓインキュベーター中のステンレス鋼ボックスで２１日間、次の昇温プログラムによりキルン乾燥した：
２５℃〜５５℃（２℃／時間）
５５℃〜８５℃（４℃／時間）
８５℃で１．５時間。
【０２２２】
発芽およびキルン乾燥のステップは、８０％の新鮮な空気による再循環空気流を用いて実施した。
【０２２３】
それぞれのマイクロ製麦日の終わりに、試料を３回反復分析用に収集し、４８時間凍結乾燥した。
【０２２４】
酵素活性分析の前に、発芽試料をタングステンカーバイド粉砕リング（Ｆｏｓｓ１０００４４６３）、ニッケルメッキインペラ（Ｆｏｓｓ１０００２６６６）および１ｍｍの出口スクリーン（Ｆｏｓｓ１０００１９８９）を備えた標準的Ｆｏｓｓ  Ｃｙｃｌｏｔｅｃｈミルを用いて粉砕した。大麦麦芽の酵素活性の全ての測定は、乾燥試料の粉砕の４８時間後以内に行われた。α−アミラーゼ活性アッセイは、標準的実験装置を用いてＭｅｇａｚｙｍｅのＣｅｒａｌｐｈａ  ｋｉｔ（Ｋ−ＣＥＲＡ）を使用して測定した。アミラーゼアッセイは、製造業者のプロトコル（Ｋ−ＣＥＲＡ  ０１／１２）に従って実施した。アミラーゼ活性の計算は、Ｍｅｇａｚｙｍｅプロトコル（Ｋ−ＣＥＲＡ  ０１／１２）中の式をベースにした。β−アミラーゼ活性アッセイは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ標準的実験装置を用いて、ＭｅｇａｚｙｍｅのＢｅｔａｍｙｌ  ｋｉｔ（Ｋ−ＢＥＴＡ３）を使用して測定した。アミラーゼアッセイは、製造業者のプロトコル（Ｋ−ＢＥＴＡ３  １０／１０）に従って実施した。β−アミラーゼ活性の計算は、Ｍｅｇａｚｙｍｅプロトコル（Ｋ−ＢＥＴＡ３  １０／１０）中の式をベースにした。限界デキストリナーゼ活性アッセイは、標準的実験装置を用いてＭｅｇａｚｙｍｅのプルラナーゼ／限界デキストリナーゼＡｓｓａｙkit（ＰｕｌｌＧ６  法）ｋｉｔ（Ｋ−ＰｕｌｌＧ６）を使用して測定した。限界デキストリナーゼアッセイは、製造業者のプロトコル（Ｋ−ＰｕｌｌＧ６  ０５／１７）に従って実施した。限界デキストリナーゼ活性の計算は、Ｍｅｇａｚｙｍｅプロトコル（Ｋ−ＰｕｌｌＧ６  ０５／１７）中の式をベースにした。
【０２２５】
結果：
α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよび遊離限界デキストリナーゼに対し測定した総酵素活性は、変異体２および参照大麦系統と同一パターンに従った（図５）。驚くべきことに、限界デキストリナーゼ活性は、変異体中でわずかに多いように見えるが、限界デキストリナーゼ遺伝子発現はわずかに少なく、これは、早くも３日目に始まる。
【０２２６】
実施例８
（１−３；１−４）−β−グルカン含量
実施例７に記載のように作成した発芽穀粒の総（１，３；１，４）−β−グルカン含量を分析した。１０ｍＬの大麦粒をＲｅｔｃｈ  ｃｙｃｌｏｎｅミルで粉砕した。全ての試料を３回繰り返して分析した。２０ｍｇの粉末を２ｍＬのエッペンドルフチューブに秤取し、オーブン中、１００℃で２時間加熱し、続けて、室温まで冷却した。全体で５００μＬの５０％水性メタノールを加え、試料を１４００ｒｐｍで１時間震盪した。１６０００ｘｇで１０分間遠心分離後、上清を廃棄し、試料を一晩乾燥した。次に、１０ｍｇの粉末当たり、１Ｕ／ｍＬのリケナーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）含有２０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ６．５）の４００μＬを加え、５０℃で２．５時間インキュベーションした。試料を１６０００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、放出されたＧｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ３）およびＧｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ４）を、アンペロメトリック電気化学検出を備えたオリゴマーを高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により定量した。Ｇｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ３）およびＧｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ４）オリゴマーは、２ｘ２５０ｍｍ寸法およびプレカラムを有する４μｍのＳＡ−１０カラムを備えたＤｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ５０００＋ＤＣシステムを用いてＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで定量された。実施条件は、０．４ｍＬ／分、カラム温度４０℃、無勾配の１００ｍＭ  ＮａＯＨ溶出液で１５分間であった。定量化のための標準は、ＤＰ３とＤＰ４との間の等モルＰＡＤ応答比率を仮定して、２０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ６．５）中の既知の量の中間的粘度の（１，３；１，４）−β−グルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）の、１Ｕ／ｍＬのリケナーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）消化により生成した。総（１，３；１，４）−β−グルカン含量は、ＤＰ３およびＤＰ４オリゴマーの含量の合計として計算した。
【０２２７】
結果：
大麦中および緑麦芽中で製麦工程の１、２、３、４、５、６日目に、ならびにキルンドモルト中（図６の７日目）の変異体２（変異体）および栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ（参照）の（１−３；１−４）−β−グルカン含量を監視した（図６）。全製麦工程中で、変異体２の（１−３；１−４）−β−グルカン含量は、参照の５０％に過ぎず、５日目では、変異体（１−３；１−４）−β−グルカン含量は、参照キルンドモルトと類似であった。
【０２２８】
実施例９
粘度
製麦：
試料カップ当たり５０ｇの大麦を用いて、大麦試料を２回繰り返して麦芽を形成させた。大麦試料を密閉試料グリッドチャンバー中で、１５℃の水中に浸漬させて浸麦した。各浸麦の終わりに、それぞれ、３５％、４０％および４５％の含水量になるように、浸麦手順を最初の３日間実施した。試料を発芽ボックス中、１５℃で次の３日間保持し、４５％の水と平衡化し、水で噴霧することにより調節して、呼吸水の減少を克服した。これらの６日間の後で、試料をＴｅｒｍａｋｓインキュベーター中で２１時間キルン乾燥し、マニュアル除根システムを用いて保存処理した。３日間の緑麦芽に対し、製麦の３日目の後で、試料を４％含水量に凍結乾燥した。
【０２２９】
マッシング：
マッシングする前に、試料を微細粉に粉砕した。７０ｇの乾燥物を５：１の水：醸造用麦芽比で混合し、次のマッシングプログラムに従って、Ｌｏｃｈｎｅｒマッシング装置でマッシュにした：５２℃で１０分、６５℃で５０分および７８℃で５分とし、温度の昇降温傾斜１℃／分により間隔をあける。マッシングプログラムに従い試料を収集する。
【０２３０】
マッシング後、麦汁をＭＮ６１４  １／４、Φ３２０ｍｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）ペーパーフィルターを通して濾過する。濾過麦汁のレオロジー挙動を、ペルチェ温度システム（Ｃ−ＰＴＤ  １８０／ＡＩＲ／ＱＣ）およびダブルギャップ測定システム（Ｃ−ＤＧ４２／ＳＳ，Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＧｍｂＨ）をサポートするＲｈｅｏｌａｂＱＣ回転レオメーター（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＧｍｂＨ）で測定する。
【０２３１】
結果：
マイクロ製麦したＭｕｔ２およびＭｕｔ５変異体の３日麦汁（３日間の製麦後の大麦）の粘度を、測定し、対照（栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎおよび栽培品種Ｑｕｅｎｃｈのマイクロ製麦した野生型穀粒の３日麦汁）と比較した。表７および図６で示されるように、粘度は、いずれかの変異体から作製された麦汁では、対照に比べて有意に低い。プラトー値は、変異体または参照から作製された麦汁間で同等であった。
【０２３２】
１〜２日間の浸麦および５〜７日間の発芽に続けて、キルン乾燥により作製された標準的麦芽から作製された麦汁の粘度は、約２ｍＰａ＊ｓである。
【表８】
2021509807.tif 000010
【０２３３】
参考文献
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Ｔａｋｅｔａ  Ｓ，Ｙｕｏ  Ｔ，Ｔｏｎｏｏｋａ  Ｔ，Ｔｓｕｍｕｒａｙａ  Ｙ，Ｉｎａｇａｋｉ  Ｙ，Ｈａｒｕｙａｍａ  Ｎ，Ｌａｒｒｏｑｕｅ  Ｏ  ａｎｄ  Ｊｏｂｌｉｎｇ  ＳＡ（２０１２）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｒｌｅｙ  ｂｅｔａｇｌｕｃａｎｌｅｓｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＣｓｌＦ６  ｉｎ（１，３；１，４）−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ．６３（１）：３８１−９２．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月18日(2020.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大麦植物またはその一部であって、前記大麦植物の穀粒は、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有し、前記大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し、前記変異型ＣｓｌＦ６遺伝子は、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードし、前記変異体ＣｓｌＦ６は、変異体ＣｓｌＦ６が配列番号１または配列番号３のアミノ酸７４８の荷電アミノ酸への置換、または配列番号１または配列番号３のアミノ酸７０９の非極性アミノ酸への置換、または配列番号１または配列番号３のアミノ酸８４７の荷電アミノ酸への置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記荷電アミノ酸は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕからなる群より選択される、大麦植物またはその一部。
【請求項２】
前記大麦植物が、総穀粒乾燥重量の１〜５％、例えば、総穀粒乾燥重量の１．３〜３％の、好ましくは、総穀粒乾燥重量の１．３〜２％の範囲の（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する、請求項１に記載の大麦植物。
【請求項３】
前記大麦植物の穀粒が、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を含むがそれ以外は同じ遺伝子型である大麦植物の（１，３；１，４）−β−グルカンの含量の少なくとも３０％且つ最大で６０％の、好ましくは少なくとも４０％且つ最大で６０％の、（１，３；１，４）−β−グルカン含量を有する、請求項１または２に記載の大麦植物。
【請求項４】
前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸８４７の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換はグリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項５】
前記大麦植物の穀粒が、多くても２．１などの多くても２．５、例えば、１．０〜２．１の範囲のＤＰ３：ＤＰ４比率を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項６】
前記大麦植物が、ＣｓｌＦ６遺伝子中に前記変異を有さないがその他は同じ遺伝子型である大麦植物の穀粒の脱穀後の破壊穀粒の出現頻度よりも多くて２倍高い、脱穀後の破壊穀粒の出現頻度を有する穀粒を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項７】
前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸７４８の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、グリシン（Ｇ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項８】
前記大麦植物の穀粒が、２．５〜４の範囲のＤＰ３：ＤＰ４比率を有する、請求項１〜３および７のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項９】
前記変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸７０９の置換を含むこと以外は、配列番号１または配列番号３のＣｓｌＦ６であり、前記置換は、トレオニン（Ｔ）のイソロイシン（Ｉ）への置換である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１０】
前記大麦植物の穀粒が、少なくとも４．０などの少なくとも３．５、例えば、４〜６の範囲などの少なくとも４．５のＤＰ３：ＤＰ４比率を有する、請求項１〜３および９のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１１】
１種または複数の追加の遺伝子中に変異、例えば、以下の変異のうちの１つ以上：
ａ．機能的ＬＯＸ−１の完全喪失をもたらすＬＯＸ−１コード遺伝子中の変異、
ｂ．機能的ＬＯＸ−２の完全喪失をもたらすＬＯＸ−２コード遺伝子中の変異、
ｃ．機能的ＭＭＴの完全喪失をもたらすＭＭＴコード遺伝子中の変異、
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の大麦植物。
【請求項１２】
緑麦芽、キルン乾燥麦芽、麦汁および飲料からなる群より選択される植物生成物であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の大麦植物またはその一部から作製される、植物生成物。
【請求項１３】
水性抽出物の製造方法であって、
ａ．請求項１〜１１のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒を用意する工程；
ｂ．大麦穀粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得る工程であって、前記発芽ステップが前記穀粒を水溶液中で長くても７２時間インキュベーションすることを含む、工程；
ｃ．前記発芽穀粒を微粉化する工程であって、前記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有し、ただし、前記大麦穀粒が発芽後および前記発芽穀粒を微粉化するまで、常に２０％未満の含水量にならないことが前提である、工程；
ｄ．粉砕された発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、前記大麦の水性抽出物を製造する工程、
を含む、方法。
【請求項１４】
飲料の製造方法であって、
ａ．請求項１〜１１のいずれか１項に記載の大麦植物の穀粒および／または請求項１２に記載の麦芽の水性抽出物を作成するステップ；または請求項１３に記載の方法により水性抽出物を作製するステップ；
ｂ．前記水性抽出物を飲料に処理するステップ、
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2021509807.tif 000019
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