(57)【要約】  本発明は、特に、ＣＤ３４＋細胞の一つ以上の供給源に由来する造血幹細胞の維持、増加、および増殖のための化合物、方法、システム、および組成物に関する。このＣＤ３４＋細胞の供給源として、骨髄、臍帯血、動員末梢血、および非動員末梢血が挙げられる。本明細書ではまた、式Ｉ2021501198.tif 000140の化合物が提供され、この化合物は、造血幹細胞の維持、増加、増殖に有用である。
2021501198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2021501198.tif 000120
（式中、
Ａは、フェニル、Ｃ3-6シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびヘテロアリールからなる群から選択される縮合環状部分であるか、または存在せず、ここで、
ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１〜３個の窒素原子環員を有する３〜６個の環員を含み、かつ
ヘテロアリールはそれぞれ、１〜３個の窒素原子環員を有する５〜６個の環員を含み、
Ｒ1は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｘ1−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、ハロ、および−ＮＯ2からなる群から選択され、
Ｒ1aは、Ｈ、Ｃ1-10アルキル、およびＣ1-10ハロアルキルからなる群から選択され、
Ｒ1bは、−ＯＲa、−ＮＲaＲb、ヘテロシクロアルキル、およびフェニルからなる群から選択され、ここで、
ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子環員を有する５〜６個の環員を含み、かつ
ヘテロシクロアルキルおよびフェニルはそれぞれ、置換されていないか、１〜４個のＣ1-4アルキル、−ＯＨ、およびハロにより置換されていて、
Ｒ2はそれぞれ、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｃ1-8アルキル、−Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、  −ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒaからなる群から独立して選択され、
Ｒ3はそれぞれ、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｃ1-8アルキル、−Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ3a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択され、
Ｒ2aおよびＲ3aはそれぞれ、Ｈ、Ｃ1-10アルキル、Ｃ1-10ハロアルキル、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択され、
Ｒ4aは、−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒa、およびシアノからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨであり、またはＲ4aとＲ4bは結合してオキソまたはオキシム部分を形成し、
ＲaおよびＲbはそれぞれ、ＨおよびＣ1-4アルキルからなる群から独立して選択され、
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1-4アルキレンであり、
下付きのｎは、０〜３の整数であり、
下付きのｍは、０〜２の整数であり、
ただし、式Ｉの化合物は、２−フルオロ−９Ｈ−フルオレン−９−オン、２−アミノ−９Ｈ−フルオレン−９−オン、２−ニトロ−９Ｈ−フルオレン−９−オン、Ｎ−（９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）アセトアミドではない）
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項２】
式Ｉ
【化２】
2021501198.tif 000121
（式中、
Ａは、フェニル、Ｃ3-6シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびヘテロアリールからなる群から選択される縮合環状部分であり、ここで、
ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１〜３個の窒素原子環員を有する３〜６個の環員を含み、かつ
ヘテロアリールはそれぞれ、１〜３個の窒素原子環員を有する５〜６個の環員を含み、
Ｒ1は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｘ1−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｒ1a、および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ1aは、Ｈ、Ｃ1-10アルキル、およびＣ1-10ハロアルキルからなる群から選択され、
Ｒ1bは、−ＯＲa、および−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ2はそれぞれ、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｃ1-8アルキル、−Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、  −ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、からなる群から独立して選択され、
Ｒ3はそれぞれ、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｃ1-8アルキル、−Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ3a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択され、
Ｒ2aおよびＲ3aはそれぞれ、Ｈ、Ｃ1-10アルキル、Ｃ1-10ハロアルキル、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択され、
Ｒ4aは、−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨであり、またはＲ4aとＲ4bは結合してオキソまたはオキシム部分を形成し、
ＲaおよびＲbはそれぞれ、ＨおよびＣ1-4アルキルからなる群から独立して選択され、
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1-4アルキレンであり、
下付きのｎは、０〜３の整数であり、
下付きのｍは、０〜２の整数である）
を有する、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項３】
Ａは、Ｃ3-6シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびフェニルからなる群から選択される縮合環状部分であり、ここで、
ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１〜３個の窒素原子環員を有する３〜６個の環員を含む、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ａは、Ｃ3-6シクロアルキルおよびフェニルからなる群から選択される縮合環状部分である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
Ａは、縮合Ｃ3-6シクロアルキルである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ4aは−ＯＲaであり、Ｒ4bはＨであり、またはＲ4aとＲ4bは結合してオキソ部分を形成する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ4aは−ＯＲaであり、Ｒ4bはＨである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ4aは−ＮＲaＲbであり、Ｒ4bはＨである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ1は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｒ1a、および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ1は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｒ1a、および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、および−ＮＲb−Ｒ1aからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、および−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1aからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ2はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒaからなる群から独立して選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、−Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ3a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−ＯＲa、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、または−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキル、またはＣ1-6ハロアルキルである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキルである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ1aは、Ｃ2-6アルキル、またはＣ1-6ハロアルキルである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ1aは、Ｃ2-6アルキルである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ1bは、−ＯＲaである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ1bは、−ＯＨである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２６】
ＲaおよびＲbはそれぞれ、ＨおよびＣ1-2アルキルからなる群から独立して選択される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1-2アルキレンである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1アルキレンである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２９】
下付きのｎは、１〜３の整数である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
下付きのｎは、１である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３１】
下付きのｎは、０である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３２】
下付きのｍは、１〜２の整数である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３３】
下付きのｍは、０である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３４】
下付きのｍは、１である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３５】
式Ｉの化合物は、式Ｉ−１またはＩ−２
【化３】
2021501198.tif 000122
（式中、
Ｒ4aは、−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨである）
の構造を有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項３６】
式Ｉの化合物は、式Ｉａ
【化４】
2021501198.tif 000123
の構造を有する、請求項２、または９〜３４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項３７】
式Ｉａの化合物は、式Ｉａ’ 
【化５】
2021501198.tif 000124
の構造を有する、請求項３６に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項３８】
式Ｉａの化合物は、式Ｉａ１またはＩａ２
【化６】
2021501198.tif 000125
（式中、
Ｒ4aは、−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨである）
の構造を有する、請求項３６に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項３９】
式Ｉａ１またはＩａ２の化合物は、式Ｉａ１’またはＩａ２’
【化７】
2021501198.tif 000126
の構造を有する、請求項３８に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項４０】
式Ｉの化合物は、式ＩｂまたはＩｃ
【化８】
2021501198.tif 000127
の構造を有する、請求項２、または９〜３４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項４１】
式Ｉｂの化合物は、式Ｉｂ１またはＩｂ２
【化９】
2021501198.tif 000128
（式中、
Ｒ4aは、−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨである）
の構造を有する、請求項４０に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項４２】
式Ｉｃの化合物は、式Ｉｃ１またはＩｃ２
【化１０】
2021501198.tif 000129
（式中、
Ｒ4aは、−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨである）
の構造を有する、請求項４０に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項４３】
Ｒ4aは、−ＯＨ、または−ＮＨ2である、請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４４】
Ｒ4aは、−ＯＨである、請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４５】
式Ｉの化合物は、式II
【化１１】
2021501198.tif 000130
の構造を有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項４６】
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、および−ＮＨ−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−Ｘ1−ＮＨ2、−Ｘ1−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1-2アルキレンであり、
下付きのｎは、０〜２の整数であり、
下付きのｍは、０または１である、請求項４５に記載の化合物。
【請求項４７】
式IIの化合物は、式IIａ
【化１２】
2021501198.tif 000131
の構造を有する、請求項４５または４６に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項４８】
式IIａの化合物は、式IIａ’
【化１３】
2021501198.tif 000132
の構造を有する、請求項４７に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項４９】
式IIａの化合物は、式IIａ１
【化１４】
2021501198.tif 000133
の構造を有する、請求項４７に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項５０】
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ2は、−ＮＨ2、または−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、
下付きのｎは、０または１である、請求項４８または４９に記載の化合物。
【請求項５１】
式IIの化合物は、式IIｂまたはIIｃ
【化１５】
2021501198.tif 000134
の構造を有する、請求項４５または４６に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項５２】
式IIｂまたはIIｃの化合物は、式IIｂ１またはIIｃ１
【化１６】
2021501198.tif 000135
の構造を有する、請求項５１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項５３】
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ2は、−ＮＨ2または−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、
下付きのｎは、０または１である、請求項５２に記載の化合物。
【請求項５４】
式Ｉの化合物は、式III 
【化１７】
2021501198.tif 000136
の構造を有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項５５】
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、およびハロからなる群から選択され、
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−Ｘ1−ＮＨ2、−Ｘ1−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1-2アルキレンであり、
下付きのｎは、０〜２の整数であり、
下付きのｍは、０または１である、請求項５４に記載の化合物。
【請求項５６】
式III の化合物は、式III ａ
【化１８】
2021501198.tif 000137
の構造を有する、請求項５４または５５に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項５７】
式III の化合物は、式III ａ’
【化１９】
2021501198.tif 000138
の構造を有する、請求項５４または５５に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項５８】
式III の化合物は、式III ａ１
【化２０】
2021501198.tif 000139
の構造を有する、請求項５４または５５に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項５９】
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aであり、
Ｒ2は、−ＮＨ2または−ＯＨからなる群から選択され、
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、
下付きのｎは、０または１である、請求項５７または５８に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【請求項６０】
前記化合物は、表１から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項６１】
培養中の造血幹細胞を増殖する方法であって、培養中のＣＤ３４＋細胞の供給源を、有効量の請求項１〜６０のいずれか一項に記載の化合物と接触させ、それにより培養中の造血幹細胞を増殖することを含む、方法。
【請求項６２】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、骨髄、臍帯血、動員末梢血、および非動員末梢血からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、動員末梢血である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、臍帯血である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、骨髄である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、非動員末梢血である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、（ａ）ＣＤ３４＋造血前駆細胞、（ｂ）ＣＤ３４＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、（ｃ）ＣＤ１３３＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、および／または（ｄ）ＣＤ９０＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞のうちの１つ以上を含む、請求項６２または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、（ａ）ＣＤ３４＋造血前駆細胞、（ｂ）ＣＤ３４＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、（ｃ）ＣＤ１３３＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、（ｄ）ＣＤ９０＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、（ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−初期造血前駆細胞および／または幹細胞、および／または（ｆ）ＣＤ３８低／−初期造血前駆細胞および／または幹細胞のうちの１つ以上を含む、請求項６２または６６に記載の方法。
【請求項６９】
さらにレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む、請求項６１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤は、ＥＲ５０８９１である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記方法はさらに、大気酸素条件で細胞を培養することを含む、請求項６１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記大気酸素条件は、約２０％の酸素を含む雰囲気を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記方法はさらに、低酸素条件で細胞を培養することを含む、請求項６１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記低酸素条件は、約５％以下の酸素を含む雰囲気を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記方法はさらに、細胞を、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＡＬＫ５／ＳＭＡＤ修飾剤または阻害剤からなる群から選択される一つ以上の薬剤と接触させることを含む、請求項６１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記方法はさらに、細胞を、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）と接触させることを含む、請求項６１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記方法はさらに、細胞を、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）と接触させることを含む、請求項６１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記方法はさらに、細胞を、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）と接触させることを含む、請求項６１〜７４のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
前記方法は、造血幹細胞表現型を安定させる、請求項６１〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記造血幹細胞表現型は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ３８低／−を含み、かつＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６を含む主要な造血系統マーカーに対して陰性である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
ＣＤ１３３＋および／またはＣＤ９０＋陽性細胞は、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の化合物と接触させていない培養中の細胞と比較して、増加している、請求項６１〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞は、培養７日後に、請求項２〜６０のいずれか一項に記載の化合物と接触していない培養中の細胞と比較して、ＣＤ１３３＋および／またはＣＤ９０＋陽性細胞の数が少なくとも約２倍である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、ヒトである、請求項６１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
培養中の造血幹細胞を増殖させるための培地であって、以下
（ａ）（ｉ）基本培地または（ii）フィード培地(feed medium)、および
（ｂ）請求項１〜６０のいずれか一項に記載の化合物
を含む、培地。
【請求項８５】
前記培地はさらに、（ｃ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む、請求項８４に記載の培地。
【請求項８６】
前記レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤は、ＥＲ５０８９１である、請求項８５に記載の培地。
【請求項８７】
前記培地はさらに、（ｃ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、赤芽球分化因子（ＥＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、熱ショック因子（ＨＳＦ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アンジオポエチン１（ＡＮＧ１）、ＶＥＧＦ１６５、ＩＬ−１０、ラミニン、カスパーゼ阻害剤、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、Ｏｃｔ４活性化化合物１（ＯＡＣ１）、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、ＶＥＧＦ−ＣおよびＡＬＫ５／ＳＭＡＤ修飾剤または阻害剤、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる群から選択される一つ以上の薬剤を含む、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項８８】
前記ＦＢＳは、熱不活化されている、請求項８７に記載の培地。
【請求項８９】
前記培地はさらに、（ｃ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９０】
前記培地はさらに、（ｃ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）を含む、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９１】
前記培地はさらに、（ｃ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９２】
前記基本培地は、StemSpan無血清増殖培地（ＳＦＥＭ）である、請求項８４〜９１のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９３】
前記基本培地は、基本塩培地である、請求項８４〜９１のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９４】
前記基本塩培地は、α−ＭＥＭである、請求項８８に記載の培地。
【請求項９５】
前記基本塩培地は、基本塩培地を３２０〜３８０ｍＯｓｍに調整するのに十分な量のＣａＣｌ2を含む、請求項９３に記載の培地。
【請求項９６】
培養中の造血幹細胞を増殖する方法であって、培養中のＣＤ３４＋細胞の供給源を、請求項８４〜９５のいずれか一項に記載の培地と接触させ、それにより培養中の造血幹細胞を増殖することを含む、方法。
【請求項９７】
（ａ）培養中のＣＤ３４＋細胞の供給源、および（ｂ）請求項８４〜９５のいずれか一項に記載の培地を含む、培養中の造血幹細胞を増殖するシステム。
【請求項９８】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、骨髄、臍帯血、動員末梢血、および非動員末梢血からなる群から選択される、請求項９７に記載のシステム。
【請求項９９】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、臍帯血である、請求項９８に記載のシステム。
【請求項１００】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、動員末梢血である、請求項９８に記載のシステム。
【請求項１０１】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、非動員末梢血である、請求項９８に記載のシステム。
【請求項１０２】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、（ａ）ＣＤ３４＋造血前駆細胞、（ｂ）ＣＤ３４＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、（ｃ）ＣＤ１３３＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、および／または（ｄ）ＣＤ９０＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞のうちの１つ以上を含む、請求項９８〜１０１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０３】
さらに（ｃ）約２０％の酸素を含む、請求項９７〜１０２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０４】
さらに（ｃ）低酸素を含む雰囲気を含む、請求項９７〜１０２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０５】
前記雰囲気は、約５％以下の酸素を含む、請求項１０４に記載のシステム。
【請求項１０６】
前記ＣＤ３４＋細胞の供給源は、ヒトである、請求項９７〜１０５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０７】
（ａ）（ｉ）基本培地または（ii）フィード培地、および
（ｂ）請求項１〜６０のいずれか一項に記載の化合物、
を含むキット。
【請求項１０８】
さらに（ｃ）培養中の造血幹細胞を維持および／または増殖するための指示書を含む、請求項１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
さらに（ｄ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む、請求項１０７または請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
前記レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤は、ＥＲ５０８９１である、請求項１０９に記載の培地。
【請求項１１１】
さらに、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、赤芽球分化因子（ＥＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、熱ショック因子（ＨＳＦ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アンジオポエチン１（ＡＮＧ１）、ＶＥＧＦ１６５、ＩＬ−１０、ラミニン、カスパーゼ阻害剤、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、Ｏｃｔ４活性化化合物１（ＯＡＣ１）、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、ＶＥＧＦ−ＣおよびＡＬＫ５／ＳＭＡＤ修飾剤または阻害剤、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる群から選択される一つ以上の薬剤を含む、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１２】
前記ＦＢＳは、熱不活性化されている、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１３】
さらに（ｄ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１４】
さらに（ｄ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）を含む、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１５】
さらに（ｄ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１６】
前記基本培地は、StemSpan無血清増殖培地（ＳＦＥＭ）である、請求項１０７〜１１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１７】
前記基本培地は、基本塩培地である、請求項１０７〜１１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１８】
前記基本塩培地は、α−ＭＥＭである、請求項１１７に記載のキット。
【請求項１１９】
前記基本塩培地は、３２０〜３８０ｍＯｓｍのＣａＣｌ2を含む、請求項１１７記載のキット。
【請求項１２０】
請求項６１〜８３または９６のいずれか一項に記載の方法によって生成される造血幹細胞集団。
【請求項１２１】
請求項１２０に記載の造血幹細胞集団を含む治療薬。
【請求項１２２】
請求項１２１に記載の治療薬を個体に投与することを含む、造血再構築を必要とする前記個体を治療する方法。
【請求項１２３】
前記個体は、骨髄ドナーまたはレシピエントである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記個体は、がんと診断されている、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記方法は、化学療法に加えて補助治療として用いられる、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記方法は、化学療法治療の間の期間を短縮するように用いられる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記個体は、自己免疫疾患と診断されている、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２８】
（ａ）基本培地またはフィード培地、および（ｂ）請求項２〜６０のいずれか一項に記載の化合物を組み合わせることを含む、造血幹細胞（ＨＳＣ）を培養するための細胞培養培地を生成する方法。
【請求項１２９】
さらに（ｃ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤は、ＥＲ５０８９１である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
さらにトロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、および／またはｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む、請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
さらにトロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む、請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
さらに、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、赤芽球分化因子（ＥＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、熱ショック因子（ＨＳＦ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アンジオポエチン１（ＡＮＧ１）、ＶＥＧＦ１６５、ＩＬ−１０、ラミニン、カスパーゼ阻害剤、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、Ｏｃｔ４活性化化合物１（ＯＡＣ１）、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、ＶＥＧＦ−ＣおよびＡＬＫ５／ＳＭＡＤ修飾剤または阻害剤、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）のうちの一つ以上を組み合わせることを含む、請求項１２８〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ＦＢＳは、熱不活性化ＦＢＳである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
さらに（ｄ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む、請求項１２８〜１３１に記載の方法。
【請求項１３６】
前記基本培地またはフィード培地は、StemSpan無血清増殖培地（ＳＦＥＭ）である、請求項１２８〜１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記基本培地またはフィード培地は、α−ＭＥＭである、請求項１２８〜１３５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本特許出願は、２０１７年１０月２７日に出願の米国仮特許出願第６２／５７８，２９７号および２０１７年１１月８日に出願の米国仮特許出願第６２／５８３，３２８号の優先権を主張し、各出願の全体の内容は参照により本明細書内に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、特に培養中の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の増殖を維持および／または促進する方法およびシステム、造血幹細胞および造血前駆細胞を培養する培地、ならびに血液疾患を治療するための治療用化合物およびその化合物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
造血系の維持は、適切な前駆細胞を含むすべての血液細胞の系統を自己再生および再増殖させる能力を有する初代多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）に依存している。ＨＳＣは、その自己再生能力および多能でかつ長期に亘る再構築能力により、様々な血液疾患の治療後に、または治療用遺伝子の送達の標的として、造血系を再構築するための移植に最適であると長い間考えられてきた。さらにヒトＨＳＣは、自己免疫疾患の免疫系を回復させ、かつ同種固形臓器の移植への耐性を引き出すための潜在用途を有する。
【０００４】
従来からの造血増殖サイトカインであるトロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）は、ＨＳＣを正確に維持・増殖するには不十分である。これらの培養では、ＨＳＣは通常１週間以内にその効力を喪失する。臍帯血は、細胞の相対的な効力と入手の容易性により、活用可能なＨＳＣの最良の供給源の１つとなる可能性がある。臍帯血バンクは、治療用途に迅速に採用可能な細胞の豊富な保存ストックを持っている。しかしながら、単一の臍帯単位毎に大量の増殖ができないと、各臍帯を複数回の治療投与または異なる治療用途に使用できる可能性は低くなる。
【０００５】
ＨＳＣおよび／または初期造血前駆細胞の維持および増殖または増量が可能となる治療上の利益を考慮すると、積極的かつ効率的で安全な新方式および試薬を開発して、この目標に到達することが重要となる。本開示ではこの必要性に取り組み、同時にそれに伴う利点を提供する。
【０００６】
この明細書全体を通して、種々の特許、特許出願、およびその他の形態の出版物（例えば、雑誌記事、電子データベースへの記載事項など）を参照している。本明細書に引用される全ての特許、特許出願、およびその他の出版物の開示は、あらゆる目的のために、それらの全体が参照により本明細書内に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書では、特に、１つ以上の供給源のＣＤ３４＋細胞に由来する造血幹細胞および／または造血前駆細胞を迅速に増殖し、維持し、かつ増加させる化合物、方法、および組成物を提供する。
【０００８】
従って、態様によっては、本明細書で式Ｉの化合物が提供され、
【化１】
2021501198.tif 000003
ただし、式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4a、Ｒ4b、Ａ、ｍ、およびｎは、後に規定される。
【０００９】
さらに態様によっては、培養中の造血幹細胞および／または造血前駆細胞を増殖する方法を本明細書で提供する。この方法は、培養中のＣＤ３４＋細胞の供給源を、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１の化合物、あるいは表１の化合物の有効量と接触させることを含む。各化合物については後にさらに説明する。実施形態によっては、培養中の造血幹細胞および造血前駆細胞を増殖する方法は、レチノイン酸シグナル伝達を制限する。実施形態によっては、レチノイン酸シグナル伝達は、レチノイン酸の量を制御または低減する培地を用いて制限される。実施形態によっては、この培地は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）の阻害剤または修飾剤を含む。実施形態によっては、ＲＡＲ阻害剤はＥＲ５０８９１である。
【００１０】
態様によっては、ＣＤ３４＋細胞の供給源は、骨髄、臍帯血、動員末梢血、または非動員末梢血である。態様によっては、ＣＤ３４＋細胞の供給源は非動員末梢血である。態様によっては、ＣＤ３４＋細胞の供給源として、（ａ）ＣＤ３４＋造血前駆細胞、（ｂ）ＣＤ３４＋初期造血前駆細胞および／または初期造血幹細胞、（ｃ）ＣＤ１３３＋初期造血前駆細胞および／または初期造血幹細胞、および／または（ｄ）ＣＤ９０＋初期造血前駆細胞および／または初期造血幹細胞が挙げられる。
【００１１】
態様によっては、この方法は造血幹細胞の表現型を安定にする。態様によっては、造血幹細胞の表現型として、ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ３８低／−、およびＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６を含む主要な造血系統マーカーに対する陰性型が挙げられる。態様によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１の化合物、あるいは表１の化合物と接触していない培養中の細胞に比較して、ＣＤ１３３＋および／またはＣＤ９０＋陽性細胞が増加している。態様によっては、これら細胞は、本明細書に開示される式Ｉまたは下位の実施形態の化合物と接触していない培養中の細胞に比較して、少なくとも約２倍のＣＤ１３３＋および／またはＣＤ９０＋陽性細胞の数を示している。態様によっては、本明細書に開示される式Ｉまたは下位の実施形態の化合物と接触していない培養中の細胞に比較して、ＣＤ９０＋細胞が増加している。態様によっては、本明細書に開示される式Ｉまたは下位の実施形態の化合物と接触していない培養中の細胞に比較して、ＣＤ３８低／−細胞が増加している。態様によっては、本明細書に開示される式Ｉまたは下位の実施形態の化合物と接触していない培養中の細胞に比較して、ＣＤ９０＋およびＣＤ３８低／−細胞が増加している。態様によっては、ＣＤ３４＋細胞の供給源はヒトである。
【００１２】
態様によっては、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞を培養する細胞培養培地を生成する方法を本明細書で提供する。この方法は、基本培地またはフィード培地（feed medium）を、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１の化合物、あるいは表１の化合物と組み合わせることを含む。
【００１３】
態様によっては、、培養中の造血幹細胞の増殖を維持および／または促進するシステムを本明細書で提供する。このシステムには、培養中のＣＤ３４＋細胞の供給源（例えば、骨髄、臍帯血、動員末梢血、および非動員末梢血のうちの１つ以上からのＣＤ３４＋細胞など）、および本明細書で説明する細胞培養培地組成物のいずれかが含まれる。
【００１４】
態様によっては、造血再構築を必要とする個体を治療する方法を本明細書で提供する。この方法は、本発明の方法に従って生成された任意の培養ＨＳＣを含む治療薬を個体に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ−Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、化合物１．００１（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．００１の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図２Ａ−Ｄ】図２Ａ〜Ｄは、化合物１．００２（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．００２の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図３Ａ−Ｄ】図３Ａ〜Ｄは、化合物１．００３（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．００３の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図４Ａ−Ｄ】図４Ａ〜Ｄは、化合物１．００４（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．００４の表示濃度のでの細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図５Ａ−Ｄ】図５Ａ〜Ｄは、化合物１．００５（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．００５の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図６Ａ−Ｄ】図６Ａ〜Ｄは、化合物１．００６（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．００６の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図７Ａ−Ｄ】図７Ａ〜Ｄは、化合物１．００７（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．００７の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図８Ａ−Ｄ】図８Ａ〜Ｄは、化合物１．００８（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．００８の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図９Ａ−Ｄ】図９Ａ〜Ｄは、化合物１．００９（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．００９の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図１０Ａ−Ｄ】図１０Ａ〜Ｄは、化合物１．０１０（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０１０の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図１１Ａ−Ｄ】図１１Ａ〜Ｄは、化合物１．０１１（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０１１の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図１２Ａ−Ｄ】図１２Ａ〜Ｄは、化合物１．０１２（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０１２の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図１３Ａ−Ｄ】図１３Ａ〜Ｄは、化合物１．０１３（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０１３の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図１４Ａ−Ｄ】図１４Ａ〜Ｄは、化合物１．０１４（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０１４の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図１５Ａ−Ｄ】図１５Ａ〜Ｄは、化合物１．０１５（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０１５の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図１６Ａ−Ｄ】図１６Ａ〜Ｄは、化合物１．０１６（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０１６の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図１７Ａ−Ｄ】図１７Ａ〜Ｄは、化合物１．０１７（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０１７の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図１８Ａ−Ｄ】図１８Ａ〜Ｄは、化合物１．０１８（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０１８の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図１９Ａ−Ｄ】図１９Ａ〜Ｄは、化合物１．０１９（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０１９の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図２０Ａ−Ｄ】図２０Ａ〜Ｄは、化合物１．０２０（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０２０の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図２１Ａ−Ｄ】図２１Ａ〜Ｄは、化合物１．０２１（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０２１の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図２２Ａ−Ｄ】図２２Ａ〜Ｄは、化合物１．０２２（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０２２の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図２３Ａ−Ｄ】図２３Ａ〜Ｄは、化合物１．０２３（縦棒）、ならびに基本条件（細い破線）および＋ＳＦ条件（太い破線）の対照について測定した増幅効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の２日目から７日目までの倍率変化を示している。各縦棒は、化合物１．０２３の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。倍率変化は、実施例３３の説明のように計算される。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜Ｅは、「基本条件」（左側の白い縦棒）、「＋ＳＦ条件」（左側から２番目の斜線入り縦棒）、「＋１．００８条件」（右側から２番目の黒い縦棒）、および「＋１．００８／＋ＥＲ条件」（右側の横線入り縦棒）で培養した臍帯血試料中のフローサイトメトリーによる細胞数を示す。図２４Ａは培養中の生細胞の総数を示し、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ、および図２４Ｅは、＋１．００８条件および＋１．００８／＋ＥＲ条件により、ＣＤ３４＋細胞（図２４Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図２４Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図２４Ｄ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞（図２４Ｅ）の総数が増加することを示している。
【図２４Ｂ】図２４Ａ〜Ｅは、「基本条件」（左側の白い縦棒）、「＋ＳＦ条件」（左側から２番目の斜線入り縦棒）、「＋１．００８条件」（右側から２番目の黒い縦棒）、および「＋１．００８／＋ＥＲ条件」（右側の横線入り縦棒）で培養した臍帯血試料中のフローサイトメトリーによる細胞数を示す。図２４Ａは培養中の生細胞の総数を示し、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ、および図２４Ｅは、＋１．００８条件および＋１．００８／＋ＥＲ条件により、ＣＤ３４＋細胞（図２４Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図２４Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図２４Ｄ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞（図２４Ｅ）の総数が増加することを示している。
【図２４Ｃ】図２４Ａ〜Ｅは、「基本条件」（左側の白い縦棒）、「＋ＳＦ条件」（左側から２番目の斜線入り縦棒）、「＋１．００８条件」（右側から２番目の黒い縦棒）、および「＋１．００８／＋ＥＲ条件」（右側の横線入り縦棒）で培養した臍帯血試料中のフローサイトメトリーによる細胞数を示す。図２４Ａは培養中の生細胞の総数を示し、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ、および図２４Ｅは、＋１．００８条件および＋１．００８／＋ＥＲ条件により、ＣＤ３４＋細胞（図２４Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図２４Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図２４Ｄ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞（図２４Ｅ）の総数が増加することを示している。
【図２４Ｄ】図２４Ａ〜Ｅは、「基本条件」（左側の白い縦棒）、「＋ＳＦ条件」（左側から２番目の斜線入り縦棒）、「＋１．００８条件」（右側から２番目の黒い縦棒）、および「＋１．００８／＋ＥＲ条件」（右側の横線入り縦棒）で培養した臍帯血試料中のフローサイトメトリーによる細胞数を示す。図２４Ａは培養中の生細胞の総数を示し、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ、および図２４Ｅは、＋１．００８条件および＋１．００８／＋ＥＲ条件により、ＣＤ３４＋細胞（図２４Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図２４Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図２４Ｄ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞（図２４Ｅ）の総数が増加することを示している。
【図２４Ｅ】図２４Ａ〜Ｅは、「基本条件」（左側の白い縦棒）、「＋ＳＦ条件」（左側から２番目の斜線入り縦棒）、「＋１．００８条件」（右側から２番目の黒い縦棒）、および「＋１．００８／＋ＥＲ条件」（右側の横線入り縦棒）で培養した臍帯血試料中のフローサイトメトリーによる細胞数を示す。図２４Ａは培養中の生細胞の総数を示し、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ、および図２４Ｅは、＋１．００８条件および＋１．００８／＋ＥＲ条件により、ＣＤ３４＋細胞（図２４Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図２４Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図２４Ｄ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞（図２４Ｅ）の総数が増加することを示している。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜Ｅは、図２４に示された臍帯血データに基づく、２日目から表示日までの細胞数の倍率変化を示している。「基本条件」（左側の白い縦棒）、「＋ＳＦ条件」（左側から２番目の斜線入り縦棒）、「＋１．００８条件」（右側から２番目の黒い縦棒）、および「＋１．００８／＋ＥＲ条件」（右側の横線入り縦棒）について、図２５Ａは培養中の生細胞の倍率変化を示し、図２５Ｂ、図２５Ｃ、図２５Ｄ、および図２５Ｅは、それぞれＣＤ３４＋細胞（図２５Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図２５Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図２５Ｄ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞（図２５Ｅ）の総数での倍率変化を示している。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜Ｅは、図２４に示された臍帯血データに基づく、２日目から表示日までの細胞数の倍率変化を示している。「基本条件」（左側の白い縦棒）、「＋ＳＦ条件」（左側から２番目の斜線入り縦棒）、「＋１．００８条件」（右側から２番目の黒い縦棒）、および「＋１．００８／＋ＥＲ条件」（右側の横線入り縦棒）について、図２５Ａは培養中の生細胞の倍率変化を示し、図２５Ｂ、図２５Ｃ、図２５Ｄ、および図２５Ｅは、それぞれＣＤ３４＋細胞（図２５Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図２５Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図２５Ｄ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞（図２５Ｅ）の総数での倍率変化を示している。
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜Ｅは、図２４に示された臍帯血データに基づく、２日目から表示日までの細胞数の倍率変化を示している。「基本条件」（左側の白い縦棒）、「＋ＳＦ条件」（左側から２番目の斜線入り縦棒）、「＋１．００８条件」（右側から２番目の黒い縦棒）、および「＋１．００８／＋ＥＲ条件」（右側の横線入り縦棒）について、図２５Ａは培養中の生細胞の倍率変化を示し、図２５Ｂ、図２５Ｃ、図２５Ｄ、および図２５Ｅは、それぞれＣＤ３４＋細胞（図２５Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図２５Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図２５Ｄ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞（図２５Ｅ）の総数での倍率変化を示している。
【図２５Ｄ】図２５Ａ〜Ｅは、図２４に示された臍帯血データに基づく、２日目から表示日までの細胞数の倍率変化を示している。「基本条件」（左側の白い縦棒）、「＋ＳＦ条件」（左側から２番目の斜線入り縦棒）、「＋１．００８条件」（右側から２番目の黒い縦棒）、および「＋１．００８／＋ＥＲ条件」（右側の横線入り縦棒）について、図２５Ａは培養中の生細胞の倍率変化を示し、図２５Ｂ、図２５Ｃ、図２５Ｄ、および図２５Ｅは、それぞれＣＤ３４＋細胞（図２５Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図２５Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図２５Ｄ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞（図２５Ｅ）の総数での倍率変化を示している。
【図２５Ｅ】図２５Ａ〜Ｅは、図２４に示された臍帯血データに基づく、２日目から表示日までの細胞数の倍率変化を示している。「基本条件」（左側の白い縦棒）、「＋ＳＦ条件」（左側から２番目の斜線入り縦棒）、「＋１．００８条件」（右側から２番目の黒い縦棒）、および「＋１．００８／＋ＥＲ条件」（右側の横線入り縦棒）について、図２５Ａは培養中の生細胞の倍率変化を示し、図２５Ｂ、図２５Ｃ、図２５Ｄ、および図２５Ｅは、それぞれＣＤ３４＋細胞（図２５Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図２５Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図２５Ｄ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞（図２５Ｅ）の総数での倍率変化を示している。
【図２６Ａ−Ｄ】図２６Ａ〜Ｄは、化合物１．００５および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．００５の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図２７Ａ−Ｄ】図２７Ａ〜Ｄは、化合物１．００６および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．００６の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図２８Ａ−Ｄ】図２８Ａ〜Ｄは、化合物１．００７および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．００７の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図２９Ａ−Ｄ】図２９Ａ〜Ｄは、化合物１．００８および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．００８の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図３０Ａ−Ｄ】図３０Ａ〜Ｄは、化合物１．００９および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．００９の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図３１Ａ−Ｄ】図３１Ａ〜Ｄは、化合物１．０１０および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０１０の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図３２Ａ−Ｄ】図３２Ａ〜Ｄは、化合物１．０１３および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０１３の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図３３Ａ−Ｄ】図３３Ａ〜Ｄは、化合物１．０１４および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０１４の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図３４Ａ−Ｄ】図３４Ａ〜Ｄは、化合物１．０１５および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０１５の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図３５Ａ−Ｄ】図３５Ａ〜Ｄは、化合物１．０２１および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０２１の指定濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図３６Ａ−Ｄ】図３６Ａ〜Ｄは、化合物１．０２２および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０２２の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図３７Ａ−Ｄ】図３７Ａ〜Ｄは、化合物１．０２３および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０２３の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図３８Ａ−Ｄ】図３８Ａ〜Ｄは、化合物１．０２４および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０２４の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図３９Ａ−Ｄ】図３９Ａ〜Ｄは、化合物１．０２５および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０２５の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図４０Ａ−Ｄ】図４０Ａ〜Ｄは、化合物１．０２６および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０２６の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図４１Ａ−Ｄ】図４１Ａ〜Ｄは、化合物１．０２７および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０２７の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図４２Ａ−Ｄ】図４２Ａ〜Ｄは、化合物１．０２８および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０２８の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図４３Ａ−Ｄ】図４３Ａ〜Ｄは、化合物１．０２９および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０２９の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図４４Ａ−Ｄ】図４４Ａ〜Ｄは、化合物１．０３０および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０３０の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図４５Ａ−Ｄ】図４５Ａ〜Ｄは、化合物１．０３１および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０３１の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図４６Ａ−Ｄ】図４６Ａ〜Ｄは、化合物１．０３２および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０３２の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図４７Ａ−Ｄ】図４７Ａ〜Ｄは、化合物１．０３３および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０３３の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図４８Ａ−Ｄ】図４８Ａ〜Ｄは、化合物１．０３４および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０３４の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図４９Ａ−Ｄ】図４９Ａ〜Ｄは、化合物１．０３５および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０３５の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図５０Ａ−Ｄ】図５０Ａ〜Ｄは、化合物１．０３６および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０３６の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図５１Ａ−Ｄ】図５１Ａ〜Ｄは、化合物１．０３７および「サイトカインのみ」の対照（破線）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、およびＣ（Ｄ）Ｄ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から７日目までの倍率変化を示している。各データの点は、化合物１．０３７の表示濃度での細胞の倍率変化を示す。倍率変化は、実施例３５の説明のように計算される。
【図５２Ａ−Ｆ】図５２Ａ〜Ｆは、臍帯血由来の造血幹細胞を使用した培養での７日、１０日、１４日、および２１日後の化合物１．０１０（黒色棒）および「サイトカインのみ」の対照（白色棒）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞、（Ｅ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞、および（Ｆ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞での１日目から表示日までの倍率変化を示している。
【図５３Ａ−Ｆ】図５３Ａ〜Ｆは、動員末梢血由来の造血幹細胞を使用した培養での７日、１０日、１４日、および２１日後の化合物１．０１０（黒色棒）および「サイトカインのみ」の対照（白色棒）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞、（Ｅ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞、および（Ｆ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞での１日目から表示日までの倍率変化を示している。
【図５４Ａ−Ｆ】図５４Ａ〜Ｆは、非動員末梢血由来の造血幹細胞を使用した培養での７日、１０日、１４日、および２１日後の化合物１．０１０（黒色棒）および「サイトカインのみ」の対照（白色棒）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞、（Ｅ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞、および（Ｆ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞での１日目から表示日までの倍率変化を示している。
【図５５Ａ−Ｄ】図５５Ａ〜Ｄは、大気酸素中の培養での９日後の化合物１．０１０（黒色棒）および「サイトカインのみ」の対照（白色棒）について測定された増殖効果を示す。このデータは、（Ａ）全生細胞、（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞、（Ｃ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞、および（Ｄ）ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１日目から９日目までの倍率変化を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書に説明する発明は、特に、造血幹細胞（ＨＳＣ）の維持、増加、および増殖のための化合物、組成物、およびそれらを用いる方法を提供する。造血幹細胞（ＨＳＣ）の維持、増加、および増殖のための方法および組成物は、一つ以上のＣＤ３４＋細胞の供給源（非動員末梢血など）に由来する。ＣＤ３４＋細胞の供給源として、末梢血、臍帯血、および骨髄が挙げられる。末梢血は、少数のＣＤ３４＋造血前駆細胞、さらに少数のＣＤ３４＋およびＣＤ１３３＋初期造血前駆細胞および幹細胞を確実に保持することが知られている。この供給源は、本来、効力が最小で濃縮が最小かつ最も希薄であり、また見かけの幹細胞が非実用的なほど少数であり、幹細胞学者は、骨髄細胞、動員末梢血、臍帯血、さらには胚性または人工多能性幹細胞（ｉＰＳとしても知られる）由来のＣＤ３４＋細胞などのＨＳＣの他の有効な供給源と比較して、この供給源は治療には適切ではないと一般的に結論付けていた。骨髄や臍帯血などのより有効な細胞の供給源を用いて血液幹細胞を増殖する試みが失敗しているにもかかわらず、分裂促進因子、生存促進因子、および不活動誘導因子がこれらの細胞の表現型に肯定的な方向で影響を及ぼし、さらには一定期間生体外でこれら細胞の維持を助けるという裏付けがある。
【００１７】
本発明の発明者らは、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１の化合物、あるいは表１の化合物を含む培地でこれら細胞を培養して、多能性の血液幹細胞および前駆細胞をうまく維持、増殖、および増加できることを見出した。それら各々の化合物については、後程説明する。特に、本発明の方法および組成物は、骨髄、臍帯血、および動員末梢血などの以前からの供給源からだけでなく、非動員末梢血などの新規の供給源からもＨＳＣをうまく生成できる。従って、本明細書に説明する方法および組成物は、入手し易く永続的に利用可能な組織供給源、すなわちドナーを重大なリスクや苦痛に曝す必要がなく、臍帯血よりも入手が容易な供給源に由来する治療に適切な幹細胞移植産物の生成を提供する。
【００１８】
Ｉ．一般的な技術
本発明を実施するにあたり、他に明示のない限り、当業者には周知の分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来からの技術が使用される。これらの技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：実験室マニュアル）第４版（Sambrook et al., 2012）およびMolecular Cloning: A Laboratory Manual第３版（Sambrook and Russel, 2001）（本明細書では共に「Sambrook」と呼ぶ）；Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新手順）（F.M. Ausubel et al., eds., 1987、２０１４年までの補遺を含む）；PCR: The Polymerase Chain Reaction（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）（Mullis et al., eds., 1994）；Antibodies: A Laboratory Manual（抗体：実験室マニュアル）第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (Greenfield, ed., 2014), Beaucage et al. eds；Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry（核酸化学の最新手順）（John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000、２０１４年までの補遺を含む）；Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells（哺乳類細胞での遺伝子導入および遺伝子発現）（Makrides, ed., Elsevier Sciences B.V., Amsterdam, 2003）；およびCurrent Protocols in Immunology（免疫学の最新手順）（Horgan K and S. Shaw , 1994、２０１４年までの補遺を含む）などの文献に詳しく説明されている。
【００１９】
II．定義
造血細胞は、ＨＳＣだけでなく、赤血球、好中球、単球、血小板、巨核球、肥満細胞、好酸球および好塩基球、Ｂリンパ球かつＴリンパ球およびＮＫ細胞、ならびにそれぞれの系統前駆細胞を含む。
【００２０】
本明細書中で使用されるＨＳＣの「増殖を維持すること」は、これら細胞が無活動状態をとるのでなく、および／またはそれらの多能性を喪失するのではなく、分裂を継続するようにこれら細胞を培養することを指す。細胞の多能性は、既知の多能性マーカーを用いる当技術分野で既知の方法を用いて判定できる。多能性マーカーの例として、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３８低／−、ＣＤ４５ＲＡ−であるが総合的にはＣＤ４５＋、およびＣＤ３４が挙げられる。実施例によっては、ＣＤ３４低／−細胞は造血幹細胞でもよい。ＣＤ３４低／−細胞が造血幹細胞である実施例では、これらの細胞はＣＤ１３３を発現する。
【００２１】
本明細書で使用される「サイトカイン」という用語は、例えば、成長または増殖を引き起こすなど、細胞に様々な影響を及ぼす多数の因子のうちのいずれかを指す。サイトカインは、ヒト起源であってもよく、または目的の細胞に対して活性な場合にはその他の種に由来していてもよい。野生型サイトカインまたは精製サイトカインと類似の生体活性を持ち、例えば組換え手段によって生成される分子、およびサイトカイン因子受容体に結合しかつ天然のサイトカイン因子と類似の細胞応答を誘発する分子も、これら定義の範囲内に含まれる。
【００２２】
「培養すること」という用語は、様々な種類の培地（例えば本明細書に開示される任意の培地）上または培地中での細胞の増殖を指す。
【００２３】
本明細書で使用される「動員血液（mobilized blood）」という用語は、身体の骨髄から末梢血および／または他の貯留液（例えば滑液）または組織内への細胞の移動を促進する薬剤に曝されていた細胞を指す。
【００２４】
本明細書で使用される「非動員末梢血（non-mobilized peripheral blood）」という語句は、身体の骨髄から末梢血および／または他の貯留液内への細胞の移動を促進する薬剤に曝されていなかった個体から得られた血液試料を指す。場合によっては、「非動員末梢血」とは、身体の骨髄から末梢血および／または他の貯留液内への細胞の移動を促進する薬剤に、少なくとも１日、３日、５日、７日、１０日、またはそれ以上曝されていなかった個体からの血液を指す。場合によっては、「非動員末梢血」とは、身体の骨髄から末梢血および／または他の貯留液内への細胞の移動を促進する薬剤に、少なくとも５日、７日、１０日、１４日、２１日、またはそれ以上曝されていなかった個体からの血液を指す。場合によっては、「非動員末梢血」とは、身体の骨髄から末梢血および／または他の貯留液内への細胞の移動を促進する薬剤に、少なくとも１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、またはそれ以上曝されていなかった個体からの血液を指す。
【００２５】
本明細書で使用される「テトラスパニン」（「テトラスパン」または「膜貫通４スーパーファミリー」（ＴＭ４ＳＦ）とも呼ばれる）は、４つの膜貫通ドメイン、細胞内のＮ末端とＣ末端、および２つの細胞外ドメインを有する全ての多細胞真核生物内に見られる膜タンパク質のファミリーを指し、２つの細胞外ドメインの内の一方は、小細胞外ドメインまたはループ（ＳＥＤ／ＳＥＬまたはＥＣ１）と呼ばれ、他方はそれより長い（典型的には１００アミノ酸残基）ドメインであり、大細胞外ドメインまたはループ（ＬＥＤ／ＬＥＬまたはＥＣ２）と呼ばれる。哺乳類にはテトラスパニンが３４種類あり、その内の３３種類はヒトでも確認されている。テトラスパニンは、細胞の接着性、運動性、活動性および増殖性に生理的重要性を持ち、ならびに転移またはウイルス感染などの病態への影響を示す数多くの特性を示す。
【００２６】
「個体」は脊椎動物、哺乳動物、またはヒトであってもよい。哺乳類には、限定はされないが、家畜、競技動物、ペット、霊長類、マウス、およびラットが含まれる。一態様では、個体はヒトである。
【００２７】
本明細書で使用される「治療」、「治療する」、または「治療すること」は、哺乳動物、例えば、ヒトの疾患または病気の任意の治療を含み、限定はされないが、（ａ）疾患または病気であるとまだ診断されてはいないが、疾患または病気に罹り易い対象での疾患または病気の発生を予防すること、（ｂ）疾患または病気を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、（ｃ）疾患または病気を緩和および／または寛解すること、すなわち疾患または病気を退行させること、または（ｄ）疾患または病気を治癒すること、すなわちその発生または進行を停止することを含む。本発明の方法で治療される個体の集団には、不快な病気または疾患に罹患している個体、ならびに病気または疾患の発症のリスクがある個体が含まれる。
【００２８】
「アルキル」は、指定数の炭素原子を持つ直鎖または分岐鎖の飽和脂肪族基を指す。アルキルには、Ｃ1-2、Ｃ1-3、Ｃ1-4、Ｃ1-5、Ｃ1-6、Ｃ1-7、Ｃ1-8、Ｃ1-9、Ｃ1-10、Ｃ2-3、Ｃ2-4、Ｃ2-5、Ｃ2-6、Ｃ3-4、Ｃ3-5、Ｃ3-6、Ｃ4-5、Ｃ4-6、およびＣ5-6などの任意の数の炭素を含むことができる。例えば、Ｃ1-6アルキルとして、限定はされないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが含まれる。アルキル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。
【００２９】
「アルキレン」は、指定数の炭素原子を持ち、かつ少なくとも２個の他の基すなわち二価の炭化水素基を結合する直鎖または分岐鎖の飽和脂肪族基を指す。アルキレンに結合した２つの部分は、アルキレン基の同一の原子または異なる原子に結合できる。例えば、直鎖アルキレンは、−（ＣＨ2）n−の二価の基であってもよく、式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６である。代表的なアルキレン基として、限定はされないが、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ペンチレン、およびヘキシレンが挙げられる。アルキレン基は、置換されていても置換されていなくてもよい。
【００３０】
「アルケニル」は、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１個の二重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。アルケニルは、Ｃ2、Ｃ2-3、Ｃ2-4、Ｃ2-5、Ｃ2-6、Ｃ2-7、Ｃ2-8、Ｃ2-9、Ｃ2-10、Ｃ3、Ｃ3-4、Ｃ3-5、Ｃ3-6、Ｃ4、Ｃ4-5、Ｃ4-6、Ｃ5、Ｃ5-6、およびＣ6などの任意の炭素数を含んでもよい。アルケニル基は、任意の適切な数の二重結合を有してもよく、その数は限定はされないが、１、２、３、４、５、またはそれ以上を含む。アルケニル基の例としては、限定はされないが、ビニル（またはエテニル）、プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、イソペンテニル、１，３−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，５−ヘキサジエニル、２，４−ヘキサジエニル、または１，３，５−ヘキサトリエニルが挙げられる。アルケニル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。
【００３１】
「アルキニル」は、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１個の三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素のいずれかを指す。アルキニルは、Ｃ2、Ｃ2-3、Ｃ2-4、Ｃ2-5、Ｃ2-6、Ｃ2-7、Ｃ2-8、Ｃ2-9、Ｃ2-10、Ｃ3、Ｃ3-4、Ｃ3-5、Ｃ3-6、Ｃ4、Ｃ4-5、Ｃ4-6、Ｃ5、Ｃ5-6、およびＣ6などの任意の炭素数を含んでもよい。アルキニル基の例としては、限定はされないが、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ−ブチニル、ブタジイニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、イソペンチニル、１，３−ペンタジイニル、１，４−ペンタジイニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１，３−ヘキサジイニル、１，４−ヘキサジイニル、１，５−ヘキサジイニル、２，４−ヘキサジイニル、または１，３，５−ヘキサトリイニルが挙げられる。アルキニル基は、、置換されていても置換されていなくてもよい。
【００３２】
「ハロゲン」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を指す。
【００３３】
「ハロアルキル」は、水素原子の一部または全部がハロゲン原子で置換されている上記に定義されたアルキルを指す。アルキル基について、ハロアルキル基は、Ｃ1-6などの任意の適切な炭素原子数を有してもよい。例えば、ハロアルキルには、トリフルオロメチル、フルオロメチルなどが含まれる。例によっては、「ペルフルオロ」という用語を用いて、全ての水素がフッ素で置換された化合物または基を定義できる。例えば、ペルフルオロメチルは１，１，１−トリフルオロメチルを指す。
【００３４】
「アルコキシ」は、アルキル基を結合点に結合する酸素原子を有するアルキル基、すなわちアルキル−Ｏ−を指す。アルキル基について、アルコキシ基は、Ｃ1-6などの任意の適切な炭素原子数を有してもよい。アルコキシ基として、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、２−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが挙げられる。アルコキシ基は、様々な置換基によりさらに置換されてもよい。アルコキシ基は置換されていても置換されていなくてもよい。
【００３５】
「オキソ」は、二重結合を有する化合物の残部に結合している酸素原子を指す（例えば
【化２】
2021501198.tif 000004
であり、ここで、「波線」
【化３】
2021501198.tif 000005
は、分子の残部への結合点を示す）。
【００３６】
「オキシム」は、二重結合を有する化合物の残部に結合している窒素原子を指し、ヒドロキシル部分へのさらなる共有結合を含む（例えば
【化４】
2021501198.tif 000006
、ここで、「波線」
【化５】
2021501198.tif 000007
は分子の残部への結合点を示す）。
【００３７】
「ヒドロキシアルキル」は、水素原子の少なくとも１個がヒドロキシ基で置換されている上記で定義されたアルキル基を指す。アルキル基に関しては、ヒドロキシアルキル基はＣ1-6などの任意の適切な炭素原子数を有してもよい。ヒドロキシアルキル基の例として、限定はされないが、ヒドロキシメチル、（ヒドロキシが１または２位にある）ヒドロキシエチル、（ヒドロキシが１、２、または３位にある）ヒドロキシプロピル、（ヒドロキシが１、２、３、または４位にある）ヒドロキシブチル、（ヒドロキシが１、２、３、４、または５位にある）ヒドロキシペンチル、（ヒドロキシが１、２、３、４、５、または６位にある）ヒドロキシヘキシル、および１，２−ジヒドロキシエチルなどが挙げられる。
【００３８】
「ヘテロアリール」は、５〜６個の環原子を含む単環式環集合を指し、１〜３個の環原子がＮ、ＯまたはＳなどのヘテロ原子である。限定はされないが、Ｂ、Ａｌ、Ｓｉ、およびＰを含むさらなるヘテロ原子も使用されてもよい。ヘテロ原子はまた、限定はされないが、−Ｓ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）2−のように酸化されていてもよい。ヘテロアリール基として、ピロール、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアジン（１，２，３−、１，２，４−、および１，３，５−異性体）、チオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、およびイソキサゾールなどの基が挙げられる。ヘテロアリール基は置換されていても置換されていなくてもよい。
【００３９】
「ヘテロシクロアルキル」は、３〜６個の環員および１〜３個のＮ、Ｏ、およびＳのヘテロ原子を有する飽和環系を指す。限定はされないが、Ｂ、Ａｌ、Ｓｉ、およびＰを含む追加のヘテロ原子も使用されてもよい。ヘテロ原子はまた、限定はされないが、−Ｓ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）2−のように酸化されていてもよい。１、２、３、または１〜２、１〜３、２〜３などの任意の適切なヘテロ原子数を、ヘテロシクロアルキル基に含んでもよい。ヘテロシクロアルキル基として、アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、アゾカン、キヌクリジン、ピラゾリジン、イミダゾリジン、ピペラジン（１，２−、１，３−および１，４−異性体）、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロフラン、オキサン（テトラヒドロピラン）、オキセパン、チイラン、チエタン、チオラン（テトラヒドロチオフェン）、チアン（テトラヒドロチオピラン）、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ジオキソラン、ジチオラン、モルホリン、チオモルホリン、ジオキサン、またはジチアンなどの基を挙げることができる。ヘテロシクロアルキル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。例えば、ヘテロシクロアルキル基は、特に、Ｃ1-6アルキルまたはオキソ（＝Ｏ）で置換されていてもよい。
【００４０】
「含む（including）」、「含有する（containing）」、または「特徴とする（characterized by）」と同義である「含む（comprising）」という移行用語は、包括的または限定が無い用語であり、記載のない追加の要素または方法や工程を除外するものではない。対照的に、「からなる（consisting of）」という移行句では、請求項で明示されていない要素、工程、または成分は除外される。「から本質的になる（consisting essentially of）」という移行句では、請求項の範囲を明示された材料または工程に限定し、かつ請求された発明の「基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさない材料または工程」に限定する。
【００４１】
本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明に関連する当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
【００４２】
本明細書で使用される単数形の用語「a」、「an」、および「the」は、文脈で別段の明示がない限り、複数の引用も含む。
【００４３】
本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有し、ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体、位置異性体、および個々の異性体（例えば異なる鏡像異性体）を、すべて本発明の範囲内に含むことを意図している。実施形態によっては、本発明の化合物は、他の形態を実質的に含まない特定の鏡像異性体またはジアステレオマーである。
【００４４】
「実質的に含まない」という用語は、異なる形態の含量として、１０％以下、好ましくは８％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、またはそれ以下を指す。実施形態によっては、異性体は立体異性体である。
【００４５】
III ．本発明の組成物
本明細書では、増殖造血幹細胞（ＨＳＣ）の細胞培養物、培養中の造血幹細胞の増殖を維持および／または促進するための細胞培養培地、ならびにＨＳＣを含む細胞集団を提供する。ＨＳＣを含むこの細胞集団は、本明細書に記載の方法により生成できる。造血幹細胞は、哺乳類および鳥類の造血幹細胞を含んでもよい。造血細胞集団は、生体内治療用途への効力を持つことできる。この培地は、基本培地またはフィード培地、ならびに式Ｉの化合物を含む。哺乳動物細胞を培養するための任意の適切な基本培地またはフィード培地は、本発明の文脈に示すように用いられてもよい。この培地として、限定はされないが、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、StemSpan無血清増殖培地（ＳＦＥＭ）、１９９／１０９培地、ハムＦ１０／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地、α−ＭＥＭ培地（フェノールレッド不含および含有）、およびＲＰＭＩ１６４０培地などの市販培地を挙げることができる。実施形態によっては、基本培地またはフィード培地は、α−ＭＥＭ培地（フェノールレッド不含）である。
【００４６】
実施形態によっては、本明細書で提供される方法、培地、システム、およびキットは、テトラスパニンを含まない。実施形態によっては、本明細書で提供される方法、培地、システム、およびキットはまた、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む。実施形態によっては、ＲＡＲ阻害剤はＥＲ５０８９１である。
【００４７】
本明細書で提供されるＨＳＣを含む細胞集団は、臍帯血に見られる幹細胞と同一または類似の利点をもたらす。当業者は、臍帯血からの幹細胞の特徴およびそれが持つ有効な特性をよく分かっている。実施形態によっては、本明細書で提供されるＨＳＣを含む細胞集団のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は、増殖ＨＳＣ細胞である。実施形態によっては、細胞集団中の増殖ＨＳＣ細胞は、それらの幹細胞表現型を長期間保持している。例えば、実施形態によっては、ＨＳＣを含む細胞集団は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−、および／またはＣＤ３８低／−を含む細胞表面表現型を有する増殖ＨＳＣ細胞を含み、少なくとも３、７、１０、１３、１４、２０、２５、３０、４０、または５０日間、あるいはそれ以上の期間、生体外で培養されている。実施形態によっては、ＨＳＣを含む細胞集団は、ＣＤ１３３＋および／またはＣＤ９０＋を含む細胞表面表現型を有する増殖ＨＳＣ細胞を含み、少なくとも３、７、１０、１３、１９、または２１日間、あるいはそれ以上の期間、生体外で培養されている。
【００４８】
Ａ．式Ｉの化合物
一態様では、本明細書で式Ｉ
【化６】
2021501198.tif 000008
（式中、
Ａは、フェニル、Ｃ3-6シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびヘテロアリールからなる群から選択される縮合環状部分であるか、または存在せず、ここで、
ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１〜３個の窒素原子環員を有する３〜６個の環員を含み、かつ
ヘテロアリールはそれぞれ、１〜３個の窒素原子環員を有する５〜６個の環員を含み、
Ｒ1は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｘ1−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、ハロ、および−ＮＯ2からなる群から選択され、
Ｒ1aは、Ｈ、Ｃ1-10アルキル、およびＣ1-10ハロアルキルからなる群から選択され、
Ｒ1bは、−ＯＲa、−ＮＲaＲb、ヘテロシクロアルキル、およびフェニルからなる群から選択され、ここで、
ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子環員を有する５〜６個の環員を含み、かつ
ヘテロシクロアルキルおよびフェニルはそれぞれ、置換されていないか、１〜４個のＣ1-4アルキル、−ＯＨ、およびハロにより置換されていて、
Ｒ2はそれぞれ、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｃ1-8アルキル、−Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、  −ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒからなる群から独立して選択され、
Ｒ3はそれぞれ、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｃ1-8アルキル、−Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ3a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択され、
Ｒ2aおよびＲ3aはそれぞれ、Ｈ、Ｃ1-10アルキル、Ｃ1-10ハロアルキル、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択され、
Ｒ4aは、−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒa、およびシアノからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨであり、またはＲ4aとＲ4bは結合してオキソまたはオキシム部分を形成し、
ＲaおよびＲbはそれぞれ、ＨおよびＣ1-4アルキルからなる群から独立して選択され、
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1-4アルキレンであり、
下付きのｎは、０〜３の整数であり、
下付きのｍは、０〜２の整数である）
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物が提供される。
【００４９】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、２−フルオロ−９Ｈ−フルオレン−９−オン、２−アミノ−９Ｈ−フルオレン−９−オン、２−ニトロ−９Ｈ−フルオレン−９−オン、Ｎ−（９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）アセトアミドではない。
【００５０】
態様によっては、式Ｉの化合物は、ＰＴＥＮの活性を阻害または変化させることができ、それにより、培養中の造血幹細胞を増殖および維持する条件の改善を提供する。
【００５１】
ＰＴＥＮは、高頻度のがんで変異する腫瘍抑制因子として知られている。このタンパク質は、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ3）の細胞内濃度を負方向に調節し、Ａｋｔ／ＰＫＢシグナル伝達経路を負方向に調節して腫瘍抑制因子として機能する。ＰＴＥＮの阻害剤は、ＰＴＥＮの本来の活性を低下、遮断、制止、または低減させる化合物である。
【００５２】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、式Ｉ−１
【化７】
2021501198.tif 000009
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、Ｒ4aは−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、Ｒ4bはＨである）。
【００５３】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、式Ｉ−２
【化８】
2021501198.tif 000010
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、Ｒ4aは−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、Ｒ4bはＨである）。
【００５４】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、およびＩ−２中のＡは、Ｃ3-6シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびフェニルからなる群から選択される縮合環状部分であり、ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１〜３個の窒素原子環員を有する３〜６個の環員を含む。
【００５５】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−２、およびＩ−２中のＡは、Ｃ3-6シクロアルキルおよびフェニルからなる群から選択される縮合環状部分である。
【００５６】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−２、およびＩ−２中のＡは、縮合Ｃ3-6シクロアルキルである。
【００５７】
実施形態によっては、式Ｉ中のＲ4aは−ＯＲaであり、Ｒ4bはＨであり、またはＲ4aとＲ4bが結合してオキソ部分を形成する。
【００５８】
実施形態によっては、式Ｉ中のＲ4aは−ＯＲaであり、Ｒ4bはＨである。
【００５９】
実施形態によっては、式Ｉ中のＲ4aは、−ＮＲaＲbであり、Ｒ4bはＨである。
【００６０】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、式Ｉａ
【化９】
2021501198.tif 000011
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００６１】
実施形態によっては、式Ｉａの化合物は、式Ｉａ’ 
【化１０】
2021501198.tif 000012
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００６２】
実施形態によっては、式Ｉａの化合物は、式Ｉａ１
【化１１】
2021501198.tif 000013
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、Ｒ4aは−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、Ｒ4bはＨである）。
【００６３】
実施形態によっては、式Ｉａ１の化合物は、式Ｉａ１’
【化１２】
2021501198.tif 000014
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００６４】
実施形態によっては、式Ｉａの化合物は、式Ｉａ２
【化１３】
2021501198.tif 000015
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、Ｒ4aは−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、Ｒ4bはＨである）。
【００６５】
実施形態によっては、式Ｉａ２の化合物は、式Ｉａ２’
【化１４】
2021501198.tif 000016
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００６６】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、式Ｉｂ
【化１５】
2021501198.tif 000017
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００６７】
実施形態によっては、式Ｉｂの化合物は、式Ｉｂ１
【化１６】
2021501198.tif 000018
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、Ｒ4aは−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、Ｒ4bはＨである）。
【００６８】
実施形態によっては、式Ｉｂの化合物は、式Ｉｂ２
【化１７】
2021501198.tif 000019
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、Ｒ4aは−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、Ｒ4bはＨである）。
【００６９】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、式Ｉｃ
【化１８】
2021501198.tif 000020
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００７０】
実施形態によっては、式Ｉｃの化合物は、式Ｉｃ１
【化１９】
2021501198.tif 000021
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、Ｒ4aは−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、Ｒ4bはＨである）。
【００７１】
実施形態によっては、式Ｉｃの化合物は、式Ｉｃ２
【化２０】
2021501198.tif 000022
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、Ｒ4aは−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、Ｒ4bはＨである）。
【００７２】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、式II
【化２１】
2021501198.tif 000023
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００７３】
実施形態によっては、式IIの化合物は、式IIａ
【化２２】
2021501198.tif 000024
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００７４】
実施形態によっては、式IIａの化合物は、式IIａ’
【化２３】
2021501198.tif 000025
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００７５】
実施形態によっては、式IIａの化合物は、式IIａ１
【化２４】
2021501198.tif 000026
の構造を有する。
【００７６】
実施形態によっては、式IIの化合物は、式IIｂ
【化２５】
2021501198.tif 000027
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００７７】
実施形態によっては、式IIｂの化合物は、式IIｂ１
【化２６】
2021501198.tif 000028
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００７８】
実施形態によっては、式IIの化合物は、式IIｃ
【化２７】
2021501198.tif 000029
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００７９】
実施形態によっては、式IIｃの化合物は、式IIｃ１
【化２８】
2021501198.tif 000030
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００８０】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、式II
【化２９】
2021501198.tif 000031
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００８１】
実施形態によっては、式IIの化合物は、式IIａ
【化３０】
2021501198.tif 000032
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００８２】
実施形態によっては、式IIａの化合物は、式IIａ’
【化３１】
2021501198.tif 000033
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００８３】
実施形態によっては、式IIａの化合物は、式IIａ１
【化３２】
2021501198.tif 000034
の構造を有する。
【００８４】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、式III 
【化３３】
2021501198.tif 000035
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００８５】
実施形態によっては、式III の化合物は、式III ａ
【化３４】
2021501198.tif 000036
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００８６】
実施形態によっては、式III ａの化合物は、式III ａ’
【化３５】
2021501198.tif 000037
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００８７】
実施形態によっては、式III ａの化合物は、式III ａ１
【化３６】
2021501198.tif 000038
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する。
【００８８】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ1は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｒ1a、および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択される。
【００８９】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ1は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｒ1a、および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択される。
【００９０】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、および−ＮＲb−Ｒ1aからなる群から選択される。
【００９１】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aおよび−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1aからなる群から選択される。
【００９２】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aである。
【００９３】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ1は、ハロである。
【００９４】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ1は、フッ素である。
【００９５】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ2はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される。
【００９６】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ2はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される。
【００９７】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ2はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される。
【００９８】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ2はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される。
【００９９】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ2はそれぞれ、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、または−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される。
【０１００】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIｂ、IIｃ、III 、III ａ、またはIII ａ’のＲ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、−Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ3a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される。
【０１０１】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIｂ、IIｃ、III 、III ａ、またはIII ａ’のＲ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される。
【０１０２】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIｂ、IIｃ、III 、III ａ、またはIII ａ’のＲ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される。
【０１０３】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIｂ、IIｃ、III 、III ａ、またはIII ａ’のＲ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される。
【０１０４】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIｂ、IIｃ、III 、III ａ、またはIII ａ’のＲ3はそれぞれ、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、または−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される。
【０１０５】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ1aは、Ｃ1-6アルキルまたはＣ1-6ハロアルキルである。
【０１０６】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ1aは、Ｃ1-6アルキルである。
【０１０７】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ1aは、Ｃ2-6アルキルまたはＣ2-6ハロアルキルである。
【０１０８】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１のＲ1aは、Ｃ2-6アルキルである。
【０１０９】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１のＲ1bは、−ＯＲaである。
【０１１０】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１のＲ1bは、−ＯＨである。
【０１１１】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１のＲ1bは、ヘテロシクロアルキルであり、ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、窒素、酸素、および硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子環員を有する５〜６個の環員を含み、置換されていないか、または１〜４個のＣ1-4アルキル、−ＯＨ、およびハロにより置換されている。
【０１１２】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１のＲ1bは、テトラヒドロピランである。
【０１１３】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１のＲ1bは、置換されていないか、または１〜４個のＣ1-4アルキル、−ＯＨ、およびハロにより置換されているフェニルである。
【０１１４】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１のＲ1bは、４−ヒドロキシフェニルである。
【０１１５】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１のＲ1bは、−ＮＨ2または−Ｎ（ＣＨ3）2である。
【０１１６】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１のＲaおよびＲbはそれぞれ、ＨおよびＣ1-2アルキルからなる群から独立して選択される。
【０１１７】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１のＸ1はそれぞれ、Ｃ1-2アルキレンである。
【０１１８】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１のＸ1はそれぞれ、Ｃ1アルキレンである。
【０１１９】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１の下付きのｎは、１〜３の整数である。
【０１２０】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１の下付きのｎは、１である。
【０１２１】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、またはIIｃ１の下付きのｎは、０である。
【０１２２】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIｂ、IIｃの下付きのｍは、１〜２の整数である。
【０１２３】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIｂ、IIｃの下付きのｍは、０である。
【０１２４】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIｂ、IIｃの下付きのｍは、１である。
【０１２５】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、またはＩｃ２のＲ4aは、−ＯＨまたは−ＮＨ2である。
【０１２６】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、またはＩｃ２のＲ4aは、−ＯＨである。
【０１２７】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、またはＩｃ２のＲ4aは、−Ｏ−Ｃ1-4アルキルである。
【０１２８】
実施形態によっては、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、またはＩｃ２のＲ4aは、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ1-4アルキルである。
【０１２９】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、式II
【化３７】
2021501198.tif 000039
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、および−ＮＨ−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−Ｘ1−ＮＨ2、−Ｘ1−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ1aは、Ｃ2-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1-2アルキレンであり、
下付きのｎは、０〜２の整数であり、かつ
下付きのｍは、０または１である）。
【０１３０】
実施形態によっては、式IIａの化合物は、式IIａ１
【化３８】
2021501198.tif 000040
の構造を有する（式中、
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ2は、−ＮＨ2または−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ1aは、Ｃ2-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、かつ
下付きのｎは、０または１である）。
【０１３１】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、式Ｉａ
【化３９】
2021501198.tif 000041
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ2は、−ＮＨ2または−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ1aは、Ｃ2-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、
Ｒ4aは、−ＯＨであり、
Ｒ4bは、Ｈであり
下付きのｎは、０または１であり、かつ
下付きのｍは、０である）。
【０１３２】
実施形態によっては、式IIｂの化合物は、式IIｂ１
【化４０】
2021501198.tif 000042
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ2は、−ＮＨ2または−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ1aは、Ｃ2-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、かつ
下付きのｎは、０または１である）。
【０１３３】
実施形態によっては、式IIｃの化合物は、式IIｃ１
【化４１】
2021501198.tif 000043
の構造、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物を有する（式中、
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ2は、−ＮＨ2または−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ1aは、Ｃ2-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、かつ
下付きのｎは、０または１である）。
【０１３４】
実施形態によっては、式Ｉの化合物は、表１から選択される。
【０１３５】
【表１−１】
2021501198.tif 000044
【表１−２】
2021501198.tif 000045
【表１−３】
2021501198.tif 000046
【表１−４】
2021501198.tif 000047
【表１−５】
2021501198.tif 000048
【表１−６】
2021501198.tif 000049
【表１−７】
2021501198.tif 000050
【表１−８】
2021501198.tif 000051
【表１−９】
2021501198.tif 000052
【０１３６】
本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約１０〜１６，０００ｎＭの濃度、例えば、約５０〜４５０ｎＭ、１００〜４００ｎＭ、約１５０〜３５０ｎＭ、約２００〜３００ｎＭ、約２２５〜２７５ｎＭ、または約２４０〜２６０ｎＭ、例えば約３００〜３０００ｎＭ、５００〜２０００ｎＭ、約５５０〜１５５０ｎＭ、約８００〜１２００ｎＭ、約９００〜１１００ｎＭ、または約９５０〜１０５０ｎＭの濃度の本明細書に開示される式Ｉまたは下位の実施形態の化合物、あるいは、例えば約１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１０５ｎＭ、１１０ｎＭ、１１５ｎＭ、１２０ｎＭ、１２５ｎＭ、１３０ｎＭ、１３５ｎＭ、１４０ｎＭ、１４５ｎＭ、１５０ｎＭ、１５５ｎＭ、１６０ｎＭ、１６５ｎＭ、１７０ｎＭ、１７５ｎＭ、１８０ｎＭ、１８５ｎＭ、１９０ｎＭ、１９５ｎＭ、２００ｎＭ、２０５ｎＭ、２１０ｎＭ、２１５ｎＭ、２２０ｎＭ、２２５ｎＭ、２３０ｎＭ、２４０ｎＭ、２４５ｎＭ、２５０ｎＭ、２５５ｎＭ、２６０ｎＭ、２６５ｎＭ、２７０ｎＭ、２７５ｎＭ、２８０ｎＭ、２８５ｎＭ、２９０ｎＭ、２９５ｎＭ、３００ｎＭ、３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４２５ｎＭ、４５０ｎＭ、４７５ｎＭ、５００ｎＭ、５２５ｎＭ、５５０ｎＭ、５７５ｎＭ、６００ｎＭ、６２５ｎＭ、６５０ｎＭ、６７５ｎＭ、７００ｎＭ、７２５ｎＭ、７５０ｎＭ、７７５ｎＭ、８００ｎＭ、８２５ｎＭ、８５０ｎＭ、８７５ｎＭ、９００ｎＭ、９２５ｎＭ、９５０ｎＭ、９７５ｎＭ、１０００ｎＭ、１１００ｎＭ、１２００ｎＭ、１３００ｎＭ、１４００ｎＭ、１５００ｎＭ、１６００ｎＭ、１７００ｎＭ、１８００ｎＭ、１９００ｎＭ、２０００ｎＭ、２１００ｎＭ、２２００ｎＭ、２３００ｎＭ、２４００ｎＭ、２５００ｎＭ、２６００ｎＭ、２７００ｎＭ、２８００ｎＭ、２９００ｎＭ、３０００ｎＭ、３１００ｎＭ、３２００ｎＭ、３３００ｎＭ、３４００ｎＭ、３５００ｎＭ、３６００ｎＭ、３７００ｎＭ、３８００ｎＭ、３９００ｎＭ、４０００ｎＭ、５０００ｎＭ、６０００ｎＭ、７０００ｎＭ、８０００ｎＭ、９０００ｎＭ、１０，０００ｎＭ、１１，０００ｎＭ、１２，０００ｎＭ、１３，０００ｎＭ、１４，０００ｎＭ、１５，０００ｎＭ、１６，０００ｎＭ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度の本明細書に開示される式Ｉまたは下位の実施形態の化合物を含んでもよい。実施形態によっては、本発明の方法に用いられる培養培地組成物は、約５００ｎＭの本明細書に開示される式Ｉまたは下位の実施形態の化合物を含んでもよい。実施形態によっては、本発明の方法に用いられる培養培地組成物は、約８００ｎＭの本明細書に開示される式Ｉまたは下位の実施形態の化合物を含んでもよい。実施形態によっては、本発明の方法に用いられる培養培地組成物は、約１，６００ｎＭの本明細書に開示される式Ｉまたは下位の実施形態の化合物を含んでもよい。実施形態によっては、本発明の方法に用いられる培養培地組成物は、約８，０００ｎＭの本明細書に開示される式Ｉまたは下位の実施形態の化合物を含んでもよい。
【０１３７】
化合物の調製
本発明の特定の化合物は、本明細書の実施例部分に説明される方法に従って調製できる。さらに、本発明の化合物の調製に有用な特定の中間化合物の合成もまた説明されている。
【０１３８】
Ｂ．サイトカインおよび成長因子
本明細書に開示の方法で用いられる細胞培養培地（例えば、基本培地またはフィード培地）は、１つ以上のサイトカインまたは成長因子を含んでいてもよい。これらの薬剤は、ＨＳＣの生存、維持、増殖、または増加を促進し、市販の供給元を通して調達できる。
【０１３９】
ＨＳＣを培養するための細胞培養培地は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）を含んでもよい。トロンボポエチンは、肝臓および腎臓が生成する糖タンパク質ホルモンであり、血小板の産生を調節する。このトロンボポエチンは、大量の血小板を成長させる巨核球である骨髄細胞の産生および分化を刺激する。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約５０〜２５０ｎｇ／ｍＬ、例えば約７５〜２２５ｎｇ／ｍＬ、約１００〜２００ｎｇ／ｍＬ、または約１２５〜１７５ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＰＯ、あるいは、例えば約７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０５ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４１ｎｇ／ｍＬ、１４２ｎｇ／ｍＬ、１４３ｎｇ／ｍＬ、１４４ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１４６ｎｇ／ｍＬ、１４７ｎｇ／ｍＬ、１４８ｎｇ／ｍＬ、１４９ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５１ｎｇ／ｍＬ、１５２ｎｇ／ｍＬ、１５３ｎｇ／ｍＬ、１５４ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１５６ｎｇ／ｍＬ、１５７ｎｇ／ｍＬ、１５８ｎｇ／ｍＬ、１５９ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、１９５ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０５ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２１５ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２３５ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２４５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＴＰＯを含んでもよい。実施形態によっては、培地中のＴＰＯの濃度は約１５０ｎｇ／ｍＬである。
【０１４０】
本明細書に開示される任意の細胞培養培地はまた、幹細胞因子（ＳＣＦ、ＫＩＴ−リガンドすなわちＫＬ、または鋼因子としても知られる）を含んでもよい。ＳＣＦは、ｃ−ＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）に結合し、骨髄中のＨＳＣを調節する役割を果たすサイトカインである。ＳＣＦは、生体外でのＨＳＣの生存率を高め、生体内でのＨＳＣの自己再生と維持に寄与することが示されている。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約５〜１００ｎｇ／ｍＬ、例えば約１０〜９０ｎｇ／ｍＬ、約２０〜８０ｎｇ／ｍＬ、約３０〜７０ｎｇ／ｍＬ、約４０〜６０ｎｇ／ｍＬ、または約４５〜５５ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＣＦ、あるいは、例えば約５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、４１ｎｇ／ｍＬ、４２ｎｇ／ｍＬ、４３ｎｇ／ｍＬ、４４ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、４６ｎｇ／ｍＬ、４７ｎｇ／ｍＬ、４８ｎｇ／ｍＬ、４９ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５１ｎｇ／ｍＬ、５２ｎｇ／ｍＬ、５３ｎｇ／ｍＬ、５４ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、５６ｎｇ／ｍＬ、５７ｎｇ／ｍＬ、５８ｎｇ／ｍＬ、５９ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、６５ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＳＣＦを含んでもよい。実施形態によっては、本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、１００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度を含んでもよい。従って、ＳＣＦの濃度としてはまた、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上の濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＳＣＦを含んでもよい。実施形態によっては、培地中のＳＣＦの濃度は約１００ｎｇ／ｍＬである。
【０１４１】
本明細書に開示される細胞培養培地はまた、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１；ソマトメジンＣとも呼ばれる）を含んでもよい。ＩＧＦ−１は、分子構造がインスリンに類似しているホルモンである。このＩＧＦ−１は、小児期の成長に重要な役割を果たし、成人期には同化促進作用を有する。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約１００〜４００ｎｇ／ｍＬ、例えば約１２５〜３７５ｎｇ／ｍＬ、約１５０〜３５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５〜３２５ｎｇ／ｍＬ、約２００〜３００ｎｇ／ｍＬ、約２２５〜２７５ｎｇ／ｍＬ、約２４０〜２６０ｎｇ／ｍＬ、または約２４５〜２５５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＧＦ−１、あるいは、例えば約１００ｎｇ／ｍＬ、１０５ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、１９５ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０５ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２１５ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２３５ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２４１ｎｇ／ｍＬ、２４２ｎｇ／ｍＬ、２４３ｎｇ／ｍＬ、２４４ｎｇ／ｍＬ、２４５ｎｇ／ｍＬ、２４６ｎｇ／ｍＬ、２４７ｎｇ／ｍＬ、２４８ｎｇ／ｍＬ、２４９ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２５１ｎｇ／ｍＬ、２５２ｎｇ／ｍＬ、２５３ｎｇ／ｍＬ、２５４ｎｇ／ｍＬ、２５５ｎｇ／ｍＬ、２５６ｎｇ／ｍＬ、２５７ｎｇ／ｍＬ、２５８ｎｇ／ｍＬ、２５９ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２６５ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２７５ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２８５ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、２９５ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３０５ｎｇ／ｍＬ、３１０ｎｇ／ｍＬ、３１５ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ、３２５ｎｇ／ｍＬ、３３０ｎｇ／ｍＬ、３３５ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ、３４５ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３５５ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ、３６５ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、３７５ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ、３８５ｎｇ／ｍＬ、３９０ｎｇ／ｍＬ、３９５ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＩＧＦ−１を含んでもよい。実施形態によっては、培地中のＩＧＦ−１の濃度は約２５０ｎｇ／ｍＬである。
【０１４２】
本明細書に提供されるＨＳＣを培養するための細胞培養培地は、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）をさらに含んでもよい。ＦＬＴ３Ｌは、細胞の成長、増殖、分化を刺激するサイトカインである。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約２０〜４００ｎｇ／ｍＬ、例えば約４０〜３７５ｎｇ／ｍＬ、約６０〜３５０ｎｇ／ｍＬ、約８０〜３２５ｎｇ／ｍＬ、約１００〜３００ｎｇ／ｍＬ、約１４０〜２７５ｎｇ／ｍＬ、約１６０〜２６０ｎｇ／ｍＬ、または約１８０〜２５５ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＬＴ３Ｌ、あるいは、例えば約２０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０５ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、１９５ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０５ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２１５ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２３５ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２４１ｎｇ／ｍＬ、２４２ｎｇ／ｍＬ、２４３ｎｇ／ｍＬ、２４４ｎｇ／ｍＬ、２４５ｎｇ／ｍＬ、２４６ｎｇ／ｍＬ、２４７ｎｇ／ｍＬ、２４８ｎｇ／ｍＬ、２４９ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２５１ｎｇ／ｍＬ、２５２ｎｇ／ｍＬ、２５３ｎｇ／ｍＬ、２５４ｎｇ／ｍＬ、２５５ｎｇ／ｍＬ、２５６ｎｇ／ｍＬ、２５７ｎｇ／ｍＬ、２５８ｎｇ／ｍＬ、２５９ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２６５ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２７５ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２８５ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、２９５ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３０５ｎｇ／ｍＬ、３１０ｎｇ／ｍＬ、３１５ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ、３２５ｎｇ／ｍＬ、３３０ｎｇ／ｍＬ、３３５ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ、３４５ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３５５ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ、３６５ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、３７５ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ、３８５ｎｇ／ｍＬ、３９０ｎｇ／ｍＬ、３９５ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＦＬＴ３Ｌを含んでもよい。実施形態によっては、培地中のＦＬＴ３Ｌの濃度は約１００ｎｇ／ｍＬである。
【０１４３】
本明細書に提供されるＨＳＣを培養するための細胞培養培地は、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）をさらに含んでもよい。ＨＧＨは、細胞の成長、増殖、分化を刺激するタンパク質ホルモンである。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約１００〜４００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１２５〜３７５ｎｇ／ｍＬ、約１５０〜３５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５〜３２５ｎｇ／ｍＬ、約２００〜３００ｎｇ／ｍＬ、約２２５〜２７５ｎｇ／ｍＬ、約２４０〜２６０ｎｇ／ｍＬ、または約２４５〜２５５ｎｇ／ｍＬの濃度のＥＧＦ、あるいは、例えば約１００ｎｇ／ｍＬ、１０５ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、１９５ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０５ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２１５ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２３５ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２４１ｎｇ／ｍＬ、２４２ｎｇ／ｍＬ、２４３ｎｇ／ｍＬ、２４４ｎｇ／ｍＬ、２４５ｎｇ／ｍＬ、２４６ｎｇ／ｍＬ、２４７ｎｇ／ｍＬ、２４８ｎｇ／ｍＬ、２４９ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２５１ｎｇ／ｍＬ、２５２ｎｇ／ｍＬ、２５３ｎｇ／ｍＬ、２５４ｎｇ／ｍＬ、２５５ｎｇ／ｍＬ、２５６ｎｇ／ｍＬ、２５７ｎｇ／ｍＬ、２５８ｎｇ／ｍＬ、２５９ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２６５ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２７５ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２８５ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、２９５ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３０５ｎｇ／ｍＬ、３１０ｎｇ／ｍＬ、３１５ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ、３２５ｎｇ／ｍＬ、３３０ｎｇ／ｍＬ、３３５ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ、３４５ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３５５ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ、３６５ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、３７５ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ、３８５ｎｇ／ｍＬ、３９０ｎｇ／ｍＬ、３９５ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＥＧＦを含んでもよい。実施形態によっては、培地中のＨＧＨの濃度は約２５０ｎｇ／ｍＬである。
【０１４４】
本明細書に提供されるＨＳＣを培養するための細胞培養培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）をさらに含んでもよい。ＥＧＦは、その受容体であるＥＧＦＲに結合して、細胞の成長、増殖、分化を刺激する成長因子である。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約１００〜４００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１２５〜３７５ｎｇ／ｍＬ、約１５０〜３５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５〜３２５ｎｇ／ｍＬ、約２００〜３００ｎｇ／ｍＬ、約２２５〜２７５ｎｇ／ｍＬ、約２４０〜２６０ｎｇ／ｍＬ、または約２４５〜２５５ｎｇ／ｍＬの濃度のＥＧＦ、あるいは、例えば約１００ｎｇ／ｍＬ、１０５ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、１９５ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０５ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２１５ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２３５ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２４１ｎｇ／ｍＬ、２４２ｎｇ／ｍＬ、２４３ｎｇ／ｍＬ、２４４ｎｇ／ｍＬ、２４５ｎｇ／ｍＬ、２４６ｎｇ／ｍＬ、２４７ｎｇ／ｍＬ、２４８ｎｇ／ｍＬ、２４９ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２５１ｎｇ／ｍＬ、２５２ｎｇ／ｍＬ、２５３ｎｇ／ｍＬ、２５４ｎｇ／ｍＬ、２５５ｎｇ／ｍＬ、２５６ｎｇ／ｍＬ、２５７ｎｇ／ｍＬ、２５８ｎｇ／ｍＬ、２５９ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２６５ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２７５ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２８５ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、２９５ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３０５ｎｇ／ｍＬ、３１０ｎｇ／ｍＬ、３１５ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ、３２５ｎｇ／ｍＬ、３３０ｎｇ／ｍＬ、３３５ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ、３４５ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３５５ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ、３６５ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、３７５ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ、３８５ｎｇ／ｍＬ、３９０ｎｇ／ｍＬ、３９５ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＥＧＦを含んでもよい。
【０１４５】
本明細書に開示される任意の細胞培養培地はまた、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含んでもよい。ＨＧＦは、傍分泌細胞の成長因子、運動性因子、かつ形態形成因子である。ＨＧＦは、間葉系細胞から分泌され、主に上皮細胞や内皮細胞に作用するだけでなく、造血前駆細胞やＴ細胞にも作用する。ＨＧＦは、胚器官の発達、特に筋形成、成体器官の再生、および創傷治癒に主要な役割を果たすことが示されている。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約１００〜４００ｎｇ／ｍＬ、例えば約１２５〜３７５ｎｇ／ｍＬ、約１５０〜３５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５〜３２５ｎｇ／ｍＬ、約２００〜３００ｎｇ／ｍＬ、約２２５〜２７５ｎｇ／ｍＬ、約２４０〜２６０ｎｇ／ｍＬ、または約２４５〜２５５ｎｇ／ｍＬの濃度のＨＧＦ、あるいは、例えば約１００ｎｇ／ｍＬ、１０５ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、１９５ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０５ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２１５ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２３５ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２４１ｎｇ／ｍＬ、２４２ｎｇ／ｍＬ、２４３ｎｇ／ｍＬ、２４４ｎｇ／ｍＬ、２４５ｎｇ／ｍＬ、２４６ｎｇ／ｍＬ、２４７ｎｇ／ｍＬ、２４８ｎｇ／ｍＬ、２４９ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２５１ｎｇ／ｍＬ、２５２ｎｇ／ｍＬ、２５３ｎｇ／ｍＬ、２５４ｎｇ／ｍＬ、２５５ｎｇ／ｍＬ、２５６ｎｇ／ｍＬ、２５７ｎｇ／ｍＬ、２５８ｎｇ／ｍＬ、２５９ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２６５ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２７５ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２８５ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、２９５ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３０５ｎｇ／ｍＬ、３１０ｎｇ／ｍＬ、３１５ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ、３２５ｎｇ／ｍＬ、３３０ｎｇ／ｍＬ、３３５ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ、３４５ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３５５ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ、３６５ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、３７５ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ、３８５ｎｇ／ｍＬ、３９０ｎｇ／ｍＬ、３９５ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＨＧＦを含んでもよい。
【０１４６】
本明細書に開示される細胞培養培地はまた、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）を含んでもよい。ＰＴＮは、察するに腫瘍血管新生を活性化して、腫瘍の成長および転移に関与すると示されている発生調節タンパク質である。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約１００〜４００ｎｇ／ｍＬ、例えば約１２５〜３７５ｎｇ／ｍＬ、約１５０〜３５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５〜３２５ｎｇ／ｍＬ、約２００〜３００ｎｇ／ｍＬ、約２２５〜２７５ｎｇ／ｍＬ、約２４０〜２６０ｎｇ／ｍＬ、または約２４５〜２５５ｎｇ／ｍＬの濃度のＰＴＮ、あるいは、例えば約１００ｎｇ／ｍＬ、１０５ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、１９５ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０５ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２１５ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２３５ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２４１ｎｇ／ｍＬ、２４２ｎｇ／ｍＬ、２４３ｎｇ／ｍＬ、２４４ｎｇ／ｍＬ、２４５ｎｇ／ｍＬ、２４６ｎｇ／ｍＬ、２４７ｎｇ／ｍＬ、２４８ｎｇ／ｍＬ、２４９ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２５１ｎｇ／ｍＬ、２５２ｎｇ／ｍＬ、２５３ｎｇ／ｍＬ、２５４ｎｇ／ｍＬ、２５５ｎｇ／ｍＬ、２５６ｎｇ／ｍＬ、２５７ｎｇ／ｍＬ、２５８ｎｇ／ｍＬ、２５９ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２６５ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２７５ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２８５ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、２９５ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３０５ｎｇ／ｍＬ、３１０ｎｇ／ｍＬ、３１５ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ、３２５ｎｇ／ｍＬ、３３０ｎｇ／ｍＬ、３３５ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ、３４５ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３５５ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ、３６５ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、３７５ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ、３８５ｎｇ／ｍＬ、３９０ｎｇ／ｍＬ、３９５ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＰＴＮを含んでもよい。実施形態によっては、ＰＴＮは、造血幹細胞の維持または増加を改善させない。
【０１４７】
別の実施形態によっては、本明細書に開示される細胞培養培地組成物は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、またはＦＧＦ−β）をさらに含んでもよい。ｂＦＧＦは、ヒト胚性幹細胞培養培地の重要成分である。但し、この増殖因子は細胞を未分化状態のままとするために必要であるが、そのメカニズムは十分に解明されていない。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約２５〜２２５ｎｇ／ｍＬ、例えば約５０〜２００ｎｇ／ｍＬ、約１００〜２００ｎｇ／ｍＬ、約１００〜１５０ｎｇ／ｍＬ、または約１１５〜１３５ｎｇ／ｍＬの濃度のｂＦＧＦ、あるいは、例えば約７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０５ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１１６ｎｇ／ｍＬ、１１７ｎｇ／ｍＬ、１１８ｎｇ／ｍＬ、１１９ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２１ｎｇ／ｍＬ、１２２ｎｇ／ｍＬ、１２３ｎｇ／ｍＬ、１２４ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１２６ｎｇ／ｍＬ、１２７ｎｇ／ｍＬ、１２８ｎｇ／ｍＬ、１２９ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３１ｎｇ／ｍＬ、１３２ｎｇ／ｍＬ、１３３ｎｇ／ｍＬ、１３４ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４１ｎｇ／ｍＬ、１４２ｎｇ／ｍＬ、１４３ｎｇ／ｍＬ、１４４ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１４６ｎｇ／ｍＬ、１４７ｎｇ／ｍＬ、１４８ｎｇ／ｍＬ、１４９ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５１ｎｇ／ｍＬ、１５２ｎｇ／ｍＬ、１５３ｎｇ／ｍＬ、１５４ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１５６ｎｇ／ｍＬ、１５７ｎｇ／ｍＬ、１５８ｎｇ／ｍＬ、１５９ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、１９５ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０５ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２１５ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２３５ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２４５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のｂＦＧＦを含んでもよい。
【０１４８】
本明細書に開示される任意の細胞培養培地はまた、アンジオポエチン１（ＡＮＧ１）を含んでもよい。ＡＮＧ１は、胚性血管新生および出生後血管新生の役割を果たす血管成長因子のアンジオポエチンファミリーの一員である。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約２５〜２２５ｎｇ／ｍＬ、例えば約５０〜２００ｎｇ／ｍＬ、約１００〜２００ｎｇ／ｍＬ、約１００〜１５０ｎｇ／ｍＬ、または約１１５〜１３５ｎｇ／ｍＬの濃度のＡＮＧ１、あるいは、例えば約７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０５ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１１６ｎｇ／ｍＬ、１１７ｎｇ／ｍＬ、１１８ｎｇ／ｍＬ、１１９ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２１ｎｇ／ｍＬ、１２２ｎｇ／ｍＬ、１２３ｎｇ／ｍＬ、１２４ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１２６ｎｇ／ｍＬ、１２７ｎｇ／ｍＬ、１２８ｎｇ／ｍＬ、１２９ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３１ｎｇ／ｍＬ、１３２ｎｇ／ｍＬ、１３３ｎｇ／ｍＬ、１３４ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４１ｎｇ／ｍＬ、１４２ｎｇ／ｍＬ、１４３ｎｇ／ｍＬ、１４４ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１４６ｎｇ／ｍＬ、１４７ｎｇ／ｍＬ、１４８ｎｇ／ｍＬ、１４９ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５１ｎｇ／ｍＬ、１５２ｎｇ／ｍＬ、１５３ｎｇ／ｍＬ、１５４ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１５６ｎｇ／ｍＬ、１５７ｎｇ／ｍＬ、１５８ｎｇ／ｍＬ、１５９ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、１９５ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０５ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２１５ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２３５ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２４５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＡＮＧ１を含んでもよい。
【０１４９】
インターロイキン１０（ＩＬ−１０）はまた、本明細書に開示されるいずれかの細胞培養培地組成物の成分であってもよい。ＩＬ−１０は、免疫調節および炎症に複数の多面的な効果を持つサイトカインである。このＩＬ−１０は、マクロファージでのＴｈ１サイトカイン、ＭＨＣクラスII抗原、および共刺激分子の発現を減少させ、またＢ細胞の生存、増殖、および抗体産生を促進させる。ＩＬ−１０は、ＮＦ−κＢ活性を遮断でき、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の調節に関与する。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約１〜２５ｎｇ／ｍＬ、例えば約５〜２０ｎｇ／ｍＬ、１０〜２０ｎｇ／ｍＬ、または１２〜１８ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１０、あるいは、例えば約１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、１９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２１ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２３ｎｇ／ｍＬ、２４ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬのいずれかの濃度のＩＬ−１０を含んでもよい。
【０１５０】
インターロイキン３（ＩＬ−３）はまた、本明細書に開示されるいずれかの細胞培養培地組成物の成分であってもよい。ＩＬ−３は、免疫調節および炎症に複数の多面的な効果を持つサイトカインである。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約１〜２５ｎｇ／ｍＬ、例えば約５〜２０ｎｇ／ｍＬ、１０〜２０ｎｇ／ｍＬ、または１２〜１８ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−３、あるいは、例えば約１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、１９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２１ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２３ｎｇ／ｍＬ、２４ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬのいずれかの濃度のＩＬ−３を含んでもよい。実施形態によっては、本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、２５ｎｇ／ｍＬ以上の濃度を含んでもよい。従ってＩＬ−３の濃度として、さらに１０〜１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０〜１３０ｎｇ／ｍＬ、約５０〜１２０ｎｇ／ｍＬ、約７０〜１１０ｎｇ／ｍＬ、または約９５〜１０５ｎｇ／ｍＬの濃度、あるいは、例えば約３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、４１ｎｇ／ｍＬ、４２ｎｇ／ｍＬ、４３ｎｇ／ｍＬ、４４ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、４６ｎｇ／ｍＬ、４７ｎｇ／ｍＬ、４８ｎｇ／ｍＬ、４９ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５１ｎｇ／ｍＬ、５２ｎｇ／ｍＬ、５３ｎｇ／ｍＬ、５４ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、５６ｎｇ／ｍＬ、５７ｎｇ／ｍＬ、５８ｎｇ／ｍＬ、５９ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、６５ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含むＩＬ−３の濃度が挙げられる。実施形態によっては、培地中のＩＬ−３の濃度は約１００ｎｇ／ｍＬである。
【０１５１】
インターロイキン６（ＩＬ−６）はまた、本明細書に開示されるいずれかの細胞培養培地組成物の成分であってもよい。ＩＬ−６は、免疫調節および炎症に複数の多面的な効果を持つサイトカインである。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約１〜２５ｎｇ／ｍＬ、例えば約５〜２０ｎｇ／ｍＬ、１０〜２０ｎｇ／ｍＬ、または１２〜１８ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−６、あるいは、例えば約１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、１９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２１ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２３ｎｇ／ｍＬ、２４ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−６を含んでもよい。実施形態によっては、本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、２５ｎｇ／ｍＬ以上の濃度を含んでもよい。従ってＩＬ−６の濃度として、さらに１０〜１４０ｎｇ／ｍＬ、約３０〜１３０ｎｇ／ｍＬ、約５０〜１２０ｎｇ／ｍＬ、約７０〜１１０ｎｇ／ｍＬ、または約９５〜１０５ｎｇ／ｍＬの濃度、あるいは、例えば約３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、４１ｎｇ／ｍＬ、４２ｎｇ／ｍＬ、４３ｎｇ／ｍＬ、４４ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、４６ｎｇ／ｍＬ、４７ｎｇ／ｍＬ、４８ｎｇ／ｍＬ、４９ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５１ｎｇ／ｍＬ、５２ｎｇ／ｍＬ、５３ｎｇ／ｍＬ、５４ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、５６ｎｇ／ｍＬ、５７ｎｇ／ｍＬ、５８ｎｇ／ｍＬ、５９ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、６５ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１１５ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１３５ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１４５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１５５ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１６５ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１７５ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１８５ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含むＩＬ−６の濃度が挙げられる。実施形態によっては、培地中のＩＬ−６の濃度は約１００ｎｇ／ｍＬである。
【０１５２】
本明細書に開示される細胞培養培地はまた、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ成長因子ファミリーに属する血管内皮成長因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）を含んでもよい。多くの細胞種はＶＥＧＦ１６５を分泌し、このＶＥＧＦ１６５は、強力な血管新生因子であり、かつ内皮細胞の増殖、遊走、および形成を刺激する分裂促進因子である。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約５〜１００ｎｇ／ｍＬ、例えば約１０〜９０ｎｇ／ｍＬ、約２０〜８０ｎｇ／ｍＬ、約３０〜７０ｎｇ／ｍＬ、約４０〜６０ｎｇ／ｍＬ、または約４５〜５５ｎｇ／ｍＬの濃度のＶＥＧＦ１６５、あるいは、例えば約５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、４１ｎｇ／ｍＬ、４２ｎｇ／ｍＬ、４３ｎｇ／ｍＬ、４４ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、４６ｎｇ／ｍＬ、４７ｎｇ／ｍＬ、４８ｎｇ／ｍＬ、４９ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５１ｎｇ／ｍＬ、５２ｎｇ／ｍＬ、５３ｎｇ／ｍＬ、５４ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、５６ｎｇ／ｍＬ、５７ｎｇ／ｍＬ、５８ｎｇ／ｍＬ、５９ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、６５ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＶＥＧＦ１６５を含んでもよい。
【０１５３】
本明細書に開示される細胞培養培地はまた、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ成長因子ファミリーに属する血管内皮成長因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）を含んでもよい。多くの細胞種はＶＥＧＦ−Ｃを分泌し、このＶＥＧＦ−Ｃは、血管新生および内皮細胞の増殖に機能して増殖および遊走を刺激し、また血管透過性にも影響を及ぼす。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約５０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、例えば約１００〜９００ｎｇ／ｍＬ、約２００〜８００ｎｇ／ｍＬ、約３００〜７００ｎｇ／ｍＬ、約４００〜６００ｎｇ／ｍＬ、または約４５０〜５５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＶＥＧＦ−Ｃ、あるいは、例えば約５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４１０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ、４３０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、４６０ｎｇ／ｍＬ、４７０ｎｇ／ｍＬ、４８０ｎｇ／ｍＬ、４９０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、５１０ｎｇ／ｍＬ、５２０ｎｇ／ｍＬ、５３０ｎｇ／ｍＬ、５４０ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ、５６０ｎｇ／ｍＬ、５７０ｎｇ／ｍＬ、５８０ｎｇ／ｍＬ、５９０ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、９５０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＶＥＧＦ−Ｃを含んでもよい。
【０１５４】
さらに別の実施形態によっては、本明細書に開示される細胞培養培地組成物は、細胞外マトリックスの高分子量（約４００ｋＤａ）タンパク質であるラミニンを含んでもよい。これらラミニンは、基底膜（基底膜層のうちの１層）の主要な成分であり、大部分の細胞および器官のためのタンパク質ネットワーク基盤である。ラミニンは、基底膜の重要かつ生体活性な部分であり、細胞の分化、遊走、および接着に影響を及ぼす。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約５００〜１０００ｎｇ／ｍＬ、例えば約６００〜９００ｎｇ／ｍＬ、約７００〜８００ｎｇ／ｍＬ、約７２５〜７７５ｎｇ／ｍＬ、または約７４５〜７５５ｎｇ／ｍＬの濃度のラミニン、あるいは、例えば約５００ｎｇ／ｍＬ、５２５ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ、５７５ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、６２５ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、６７５ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、７０５ｎｇ／ｍＬ、７１０ｎｇ／ｍＬ、７１５ｎｇ／ｍＬ、７２０ｎｇ／ｍＬ、７２５ｎｇ／ｍＬ、７３０ｎｇ／ｍＬ、７３５ｎｇ／ｍＬ、７４０ｎｇ／ｍＬ、７４１ｎｇ／ｍＬ、７４２ｎｇ／ｍＬ、７４３ｎｇ／ｍＬ、７４４ｎｇ／ｍＬ、７４５ｎｇ／ｍＬ、７４６ｎｇ／ｍＬ、７４７ｎｇ／ｍＬ、７４８ｎｇ／ｍＬ、７４９ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、７５１ｎｇ／ｍＬ、７５２ｎｇ／ｍＬ、７５３ｎｇ／ｍＬ、７５４ｎｇ／ｍＬ、７５５ｎｇ／ｍＬ、７５６ｎｇ／ｍＬ、７５７ｎｇ／ｍＬ、７５８ｎｇ／ｍＬ、７５９ｎｇ／ｍＬ、７６０ｎｇ／ｍＬ、７６５ｎｇ／ｍＬ、７７０ｎｇ／ｍＬ、７７５ｎｇ／ｍＬ、７８０ｎｇ／ｍＬ、７８５ｎｇ／ｍＬ、７９０ｎｇ／ｍＬ、７９５ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８２５ｎｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬ、８７５ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、９２５ｎｇ／ｍＬ、９５０ｎｇ／ｍＬ、９７５ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のラミニンを含んでもよい。
【０１５５】
Ｃ．その他の小分子
本明細書に開示の方法に用いられる細胞培養培地は、カスパーゼ阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、および／またはＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤などの種々の小分子阻害剤をさらに含んでもよい。一実施形態では、細胞培養培地のＤＭＳＯ濃度は、０．０２５％（ｖ／ｖ）を超えない。
【０１５６】
実施形態によっては、本明細書に開示の方法に用いられる細胞培養培地は、一種以上のカスパーゼ阻害剤を含む。カスパーゼは、アポトーシス（プログラム細胞死）、細胞壊死、および炎症に不可欠な役割を果たすシステインプロテアーゼのファミリーである。２００９年１１月の時点で、１２種のカスパーゼがヒト中に確認されている。アポトーシスカスパーゼには、イニシエーター（アピカル）・カスパーゼ、およびエフェクター（エグゼキューショナー）・カスパーゼの２種類がある。イニシエーター・カスパーゼ（例えばＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、およびＣＡＳＰ１０）は、エフェクター・カスパーゼの不活性な前駆形態を切断し、それによりエフェクター・カスパーゼを活性化する。エフェクター・カスパーゼ（例えば、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、およびＣＡＳＰ７）は、順番に細胞内のその他のタンパク質基質を切断して、アポトーシス工程を開始させる。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約１〜１０μｇ／ｍＬ、例えば約２〜８μｇ／ｍＬ、約３〜７μｇ／ｍＬ、または約４〜６μｇ／ｍＬの濃度のカスパーゼ阻害剤、あるいは、例えば約１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、７μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、またはそれ以上の濃度のカスパーゼ阻害剤を含んでもよい。一実施形態では、カスパーゼ阻害剤はＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫである。
【０１５７】
本明細書に開示の方法に用いられる細胞培養培地は、一種以上のＤＮＡメチル化阻害剤を含んでもよい。ＤＮＡメチル化は、メチル基がＤＮＡに付加され、その機能を修飾する工程である。遺伝子プロモーター中では、ＤＮＡメチル化は、典型的には遺伝子転写を抑制する働きをする。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約３００〜７００ｎＭ、例えば約３５０〜６５０ｎＭ、約４００〜６００ｎＭ、約４５０〜５５０ｎＭ、約４７５〜５２５ｎＭ、または約４９０〜５１０ｎＭの濃度のＤＮＡメチル化阻害剤、あるいは、例えば約３００ｎＭ、３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４２５ｎＭ、４３０ｎＭ、４３５ｎＭ、４４０ｎＭ、４４５ｎＭ、４５０ｎＭ、４５５ｎＭ、４６０ｎＭ、４６５ｎＭ、４７０ｎＭ、４７５ｎＭ、４８０ｎＭ、４８５ｎＭ、４９０ｎＭ、４９１ｎＭ、４９２ｎＭ、４９３ｎＭ、４９４ｎＭ、４９５ｎＭ、４９６ｎＭ、４９７ｎＭ、４９８ｎＭ、４９９ｎＭ、５００ｎＭ、５０１ｎＭ、５０２ｎＭ、５０３ｎＭ、５０４ｎＭ、５０５ｎＭ、５０６ｎＭ、５０７ｎＭ、５０８ｎＭ、５０９ｎＭ、５１０ｎＭ、５１５ｎＭ、５２０ｎＭ、５２５ｎＭ、５３０ｎＭ、５３５ｎＭ、５４０ｎＭ、５４５ｎＭ、５５０ｎＭ、５５５ｎＭ、５６０ｎＭ、５６５ｎＭ、５７０ｎＭ、５７５ｎＭ、６００ｎＭ、６２５ｎＭ、６５０ｎＭ、６７５ｎＭ、７００ｎＭ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＤＮＡメチル化阻害剤を含んでもよい。実施形態によっては、ＤＮＡメチル化阻害剤は、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）である。他の実施形態によっては、本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約０．２５〜３μＭ、例えば約０．５〜２．５μＭ、約１〜２μＭ、または約１．２５〜１．７５μＭの濃度のＤＮＡメチル化阻害剤、あるいは、例えば約０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＤＮＡメチル化阻害剤を含んでもよい。実施形態によっては、ＤＮＡメチル化阻害剤は、Ｏｃｔ４活性化化合物１（ＯＡＣ１）である。
【０１５８】
本明細書に開示される任意の細胞培養培地はまた、ｐ３８分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）阻害剤を含んでもよい。このｐ３８ＭＡＰＫは、サイトカイン、紫外線照射、熱ショック、浸透圧ショックなどのストレス刺激に反応し、かつ細胞分化、アポトーシス、およびオートファジーに関与する分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼのうちの1つの部類である。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約４００〜８００ｎＭ、例えば約５００〜７００ｎＭ、約５５０〜６５０ｎＭ、約６００〜６５０ｎＭ、または約６１５〜６３５ｎＭの濃度のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、あるいは、例えば約４００ｎＭ、４２５ｎＭ、４５０ｎＭ、４７５ｎＭ、５００ｎＭ、５２５ｎＭ、５５０ｎＭ、５７５ｎＭ、６００ｎＭ、６０５ｎＭ、６１０ｎＭ、６１５ｎＭ、６１６ｎＭ、６１７ｎＭ、６１８ｎＭ、６１９ｎＭ、６２０ｎＭ、６２１ｎＭ、６２２ｎＭ、６２３ｎＭ、６２４ｎＭ、６２５ｎＭ、６２６ｎＭ、６２７ｎＭ、６２８ｎＭ、６２９ｎＭ、６３０ｎＭ、６３１ｎＭ、６３２ｎＭ、６３３ｎＭ、６３４ｎＭ、６３５ｎＭ、６４０ｎＭ、６４５ｎＭ、６５０ｎＭ、６５５ｎＭ、６６０ｎＭ、６６５ｎＭ、６７０ｎＭ、６７５ｎＭ、６８０ｎＭ、６８５ｎＭ、６９０ｎＭ、６９５ｎＭ、７００ｎＭ、７２５ｎＭ、７５０ｎＭ、７７５ｎＭ、８００ｎＭ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を含んでもよい。実施形態によっては、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ＢＩＲＢ７９６である。
【０１５９】
さらに別の実施形態によっては、本明細書に開示される細胞培養培地組成物は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を含んでもよい。このＧＳＫ３は、セリンおよびスレオニンのアミノ酸残基へのリン酸分子の付加を媒介するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。ＧＳＫ−３によるタンパク質のリン酸化は、通常、その下流にある標的の活性を阻害する。ＧＳＫ−３は、細胞増殖、遊走、グルコース調節、アポトーシスを含む複数の中央細胞内シグナル伝達経路中で活性である。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約０．２５〜２μＭ、例えば約０．５〜１．５μＭ、または１．７５〜１．２５μＭの濃度のＧＳＫ３阻害剤、あるいは、例えば約０．２５μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭ、１．６μＭ、１．７μＭ、１．８μＭ、１．９μＭ、２μＭ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＧＳＫ３阻害剤を含んでもよい。実施形態によっては、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。
【０１６０】
さらに別の実施形態によっては、本明細書に開示される細胞培養培地組成物は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）拮抗剤をさらに含んでもよく、すなわちこの培地は、レチノイン酸の量を制御または低減して、レチノイン酸シグナル伝達を制限してもよい。このＲＡＲは、核内受容体であり、ならびに全トランス型レチノイン酸と９−シス型レチノイン酸の両方によって活性化される転写因子である。実施形態によっては、培地中のレチノイン酸の量を制限することにより、レチノイン酸シグナル伝達を低減させる。
【０１６１】
さらに別の実施形態によっては、本明細書に開示される細胞培養培地組成物は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）拮抗剤をさらに含んでもよい。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約１０〜３００ｎＭ、例えば約２５〜１７５ｎＭ、約５０〜１５０ｎＭ、または約７５〜１２５ｎＭの濃度のＲＡＲ拮抗剤、あるいは、例えば約１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１０５ｎＭ、１１０ｎＭ、１１５ｎＭ、１２０ｎＭ、１２５ｎＭ、１３０ｎＭ、１３５ｎＭ、１４０ｎＭ、１４５ｎＭ、１５０ｎＭ、１５５ｎＭ、１６０ｎＭ、１６５ｎＭ、１７０ｎＭ、１７５ｎＭ、１８０ｎＭ、１８５ｎＭ、１９０ｎＭ、１９１ｎＭ、１９２ｎＭ、１９３ｎＭ、１９４ｎＭ、１９５ｎＭ、１９６ｎＭ、１９７ｎＭ、１９８ｎＭ、１９９ｎＭ、２００ｎＭ、２０１ｎＭ、２０２ｎＭ、２０３ｎＭ、２０４ｎＭ、２０５ｎＭ、２０６ｎＭ、２０７ｎＭ、２０８ｎＭ、２０９ｎＭ、２１０ｎＭ、２１５ｎＭ、２２０ｎＭ、２２５ｎＭ、２３０ｎＭ、２３５ｎＭ、２４０ｎＭ、２４１ｎＭ、２４２ｎＭ、２４３ｎＭ、２４４ｎＭ、２４５ｎＭ、２４６ｎＭ、２４７ｎＭ、２４８ｎＭ、２４９ｎＭ、２５０ｎＭ、２５１ｎＭ、２５２ｎＭ、２５３ｎＭ、２５４ｎＭ、２５５ｎＭ、２５６ｎＭ、２５７ｎＭ、２５８ｎＭ、２５９ｎＭ、２６０ｎＭ、２６５ｎＭ、２７０ｎＭ、２７５ｎＭ、２８０ｎＭ、２８５ｎＭ、２９０ｎＭ、２９５ｎＭ、３００ｎＭ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＲＡＲ拮抗剤を含んでもよい。実施形態によっては、ＲＡＲ拮抗剤は、ＥＲ５０８９１である。実施形態によっては、ＥＲ５０８９１の濃度は、約１００ｎＭである。
【０１６２】
本明細書に開示される細胞培養培地はまた、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤を含んでもよい。ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路は、細胞外化学シグナルからの情報を細胞核に伝達して、免疫、増殖、分化、アポトーシス、発癌に関与する遺伝子のＤＮＡ転写および発現につながる。本発明の方法に用いられる細胞培養培地組成物は、約３００〜７００ｎＭ、例えば約３５０〜６５０ｎＭ、約４００〜６００ｎＭ、約４５０〜５５０ｎＭ、約４７５〜５２５ｎＭ、または約４９０〜５１０ｎＭの濃度のＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、あるいは、例えば約３００ｎＭ、３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４２５ｎＭ、４３０ｎＭ、４３５ｎＭ、４４０ｎＭ、４４５ｎＭ、４５０ｎＭ、４５５ｎＭ、４６０ｎＭ、４６５ｎＭ、４７０ｎＭ、４７５ｎＭ、４８０ｎＭ、４８５ｎＭ、４９０ｎＭ、４９１ｎＭ、４９２ｎＭ、４９３ｎＭ、４９４ｎＭ、４９５ｎＭ、４９６ｎＭ、４９７ｎＭ、４９８ｎＭ、４９９ｎＭ、５００ｎＭ、５０１ｎＭ、５０２ｎＭ、５０３ｎＭ、５０４ｎＭ、５０５ｎＭ、５０６ｎＭ、５０７ｎＭ、５０８ｎＭ、５０９ｎＭ、５１０ｎＭ、５１５ｎＭ、５２０ｎＭ、５２５ｎＭ、５３０ｎＭ、５３５ｎＭ、５４０ｎＭ、５４５ｎＭ、５５０ｎＭ、５５５ｎＭ、５６０ｎＭ、５６５ｎＭ、５７０ｎＭ、５７５ｎＭ、６００ｎＭ、６２５ｎＭ、６５０ｎＭ、６７５ｎＭ、７００ｎＭ、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤を含んでもよい。実施形態によっては、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤は、トファシチニブである。
【０１６３】
上記の阻害剤分子に加えて、本明細書に開示される任意の細胞培養培地組成物はまた、１〜２０％（ｖ／ｖ）、例えば約２〜１８％（ｖ／ｖ）、約５〜１５％（ｖ／ｖ）、約７．５〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、あるいは、例えば約１％（ｖ／ｖ）、２％（ｖ／ｖ）、３％（ｖ／ｖ）、４％（ｖ／ｖ）、５％（ｖ／ｖ）、６％（ｖ／ｖ）、７％（ｖ／ｖ）、８％（ｖ／ｖ）、９％（ｖ／ｖ）、１０％（ｖ／ｖ）、１１％（ｖ／ｖ）、１２％（ｖ／ｖ）、１３％（ｖ／ｖ）、１４％（ｖ／ｖ）、１５％（ｖ／ｖ）、１６％（ｖ／ｖ）、１７％（ｖ／ｖ）、１８％（ｖ／ｖ）、１９％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）、またはそれ以上のいずれかの濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度のＦＢＳを含んでもよい。実施形態によっては、ＦＢＳは熱不活性化ＦＢＳである。実施形態によっては、培地中のＦＢＳの濃度は、約１０％（ｖ／ｖ）である。
【０１６４】
上記の阻害剤分子に加えて、本明細書に開示される任意の細胞培養培地組成物はまた、添加塩、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、またはＣａＣｌ2を含んでもよい。一例では、３００〜３８０ｍＯｓｍの範囲の濃度、例えば約３００ｍＯｓｍ、約３１０ｍＯｓｍ、約３２０ｍＯｓｍ、約３３０ｍＯｓｍ、約３４０ｍＯｓｍ、約３５０ｍＯｓｍ、約３６０ｍＯｓｍ、約３７０ｍＯｓｍ、約３８０ｍＯｓｍ、またはそれ以上の濃度、あるいはこれら濃度の間にある数値を含む濃度に到達するように、ＣａＣｌ2を添加してもよい。高浸透圧であるＣａＣｌ2はまた、非多能性細胞に対する選択に用いてもよく、ＨＳＣ表現型の選択に用いてもよい。
【０１６５】
上記の阻害剤分子に加えて、本明細書に開示される任意の細胞培養培地組成物は、全体的により高い浸透圧を持つように調整されてもよい。多能性幹細胞を、非定型な浸透圧にも耐えるように、より適切に適合させてもよい（例えば、高浸透圧培地は非幹細胞表現型に対して選択できる）。浸透圧は、例えば上述のような塩の添加、またはグルコースによって調節できる。
【０１６６】
IV．本発明の方法
Ａ．培養中の造血幹細胞の増殖の維持および／または促進
本明細書では、培養中の造血幹細胞（ＨＳＣ）の増殖を維持および／または促進する方法が提供される。この方法は、培養中のＣＤ３４＋細胞の供給源を、式Ｉ、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉａ、Ｉａ’、Ｉａ１、Ｉａ１’、Ｉａ２、Ｉａ２’、Ｉｂ、Ｉｂ１、Ｉｂ２、Ｉｃ、Ｉｃ１、Ｉｃ２、II、IIａ、IIａ’、IIａ１、IIｂ、IIｂ１、IIｃ、IIｃ１、III 、III ａ、III ａ’、またはIII ａ１の化合物、あるいは表１の化合物と接触させることを含む。実施形態によっては、本明細書に提供される方法は、テトラスパニンを含まない。実施形態によっては、本明細書に提供される方法はまた、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む。実施形態によっては、ＲＡＲ阻害剤はＥＲ５０８９１である。
【０１６７】
１．ＣＤ３４＋細胞の供給源
本発明の方法では、ＣＤ３４＋血液細胞の供給源、またはいくつかの例ではＣＤ３４低／−細胞、ＣＤ１３３＋細胞の供給源を必要とする。これらの細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、胎盤血、動員末梢血、非動員末梢血など、またはそれらの組み合わせなどの組織源から得ることができる。
【０１６８】
実施形態によっては、造血幹細胞および／または造血前駆細胞は、１つ以上のＣＤ３４＋細胞の供給源に由来する。ＣＤ３４＋細胞は、特定の実施形態では、ＣＤ１３３細胞マーカーを発現してもよく、または含まなくてもよい。結果として、特定の実施形態では、本明細書に開示の方法で有用な造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋、またはＣＤ３４＋ＣＤ１３３−である。他の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ９０細胞マーカーを発現してもよく、または含まなくてもよい。結果として、これらの実施形態では、本明細書に開示の方法で有用な造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋、またはＣＤ３４＋ＣＤ９０−である。従って、ＣＤ３４＋細胞の集団、または例によってはＣＤ３４低／−細胞、ＣＤ１３３＋細胞の集団を、未分化状態を表示するマーカーの存在に基づいて、または少なくともいくつかの系統分化が起こったことを表示する系統マーカーの不在に基づいて、本明細書に開示の方法での使用に向けて選択できる。
【０１６９】
本明細書に開示の方法に用いられるＣＤ３４＋細胞は、単一の個体から、例えば非動員末梢血の供給源から得ることができ、あるいは複数の個体から得ることができ、例えば蓄えることができる。実施形態によっては、単一の個体からのＣＤ３４＋細胞は、非動員末梢血、動員末梢血、胎盤血、または臍帯血から供給される。ＣＤ３４＋細胞が複数の個体から得られて蓄えられる場合に、造血細胞は同じ組織源から得られるのが好ましい。従って種々の実施形態では、蓄えられた造血細胞はすべて、例えば、胎盤血、臍帯血、（動員または非動員）末梢血などに由来する。
【０１７０】
興味深いことに、本発明の方法によって増加および増殖させた細胞は、例えば、表現型として臍帯血に類似している。従って、本明細書に記載の方法によって増殖および増加させた細胞を、さらなる増殖および増加のための供給源として用いることは可能である。例えば、初期の増殖および増加に続いて、細胞を分化させる、または徐々に分化を促進させることは可能である。これらの細胞は、増殖が可能であり、初期の増殖／増加工程で利用された本発明の方法に従って、分化状態または分化に近い状態から再生させることができる。多能性の状態への再生が可能な分化状態の細胞、または分化状態に近い細胞のこの様な増殖は、複数回のサイクルで実施できる。
【０１７１】
ＣＤ３４＋細胞、または実施例によってはＣＤ３４低／−細胞、ＣＤ１３３＋細胞は、限定はされないが、幹細胞マーカーに対する陽性選択、系統マーカーに対する陰性選択、サイズ排除、細胞中での代謝差異の検出、細胞による物質の排除差異または蓄積差異の検出、接着性差異の検出、幹細胞のみを支持する条件での軟膜の直接培養などの当技術分野で知られる任意の従来からの手段を使用して、供給源から単離することができる。本発明の方法に用いられるＣＤ３４＋細胞の供給源は、限定はされないが、ＣＤ３４＋造血前駆細胞、ＣＤ３４＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、ＣＤ１３３＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、ＣＤ９０＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、ＣＤ４５ＲＡ−初期造血前駆細胞および／または幹細胞、および／またはＣＤ３８低／−初期造血前駆細胞および／または幹細胞のうちの１つ以上を含む造血前駆細胞の複数の亜種を含んでいてもよい。
【０１７２】
２．培養中のＨＳＣの維持
上記の供給源に由来するＣＤ３４＋細胞は、本明細書に記載のいずれかの細胞培養培地で培養される。これらの培地は、造血幹細胞の表現型を維持および強化する。さらに、本明細書に開示される式Ｉまたは下位の実施形態の化合物の添加は、これらの効果を高める。具体的には、培養培地での本明細書に記載の式Ｉまたは下位の実施形態の化合物の使用は、基準となる全ての幹細胞マーカー（例えば、限定はされないが、ＣＤ１３３およびＣＤ９０陽性細胞）を維持しながら（通常は増加させながら）、ＨＳＣの増殖率を高める。これらの増加は、わずか３日間の培養後に確認できる。実施形態によっては、本明細書に提供される培地は、テトラスパニンを含まない。実施形態によっては、本明細書で提供される培地はまた、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む。実施形態によっては、ＲＡＲ阻害剤はＥＲ５０８９１である。
【０１７３】
特に、本明細書に記載のいずれかの細胞培養培地で培養された供給源細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日、またはそれ以上のいずれかの日数での培養後に、本明細書に記載のいずれかの培地で培養されていない供給源細胞と比較して、ＣＤ１３３＋および／またはＣＤ９０＋陽性細胞の数が増加することを示している。具体的には、本明細書に開示の方法を使用して本明細書に記載の培地で培養された供給源細胞は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日、またはそれ以上の日数での培養後に、本明細書に記載のいずれかの培地で培養されていない供給源細胞と比較して、約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、７．５、１０倍、またはそれ以上のＣＤ１３３＋および／またはＣＤ９０＋陽性細胞の数を示していた。
【０１７４】
本明細書に記載の細胞培養培地で培養された供給源細胞はまた、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日、またはそれ以上の日数での培養後に、本明細書に記載のいずれかの培地で培養されていない供給源細胞と比較して、ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞の数が増加することを示している。具体的には、本明細書に開示の方法を使用して本明細書に記載の培地で培養された供給源細胞は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日、またはそれ以上の日数での培養後に、本明細書に記載のいずれかの培地で培養されていない供給源細胞と比較して、約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０倍、またはそれ以上のＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞の数を示していた。
【０１７５】
本明細書に開示の細胞培養方法は、低酸素条件で細胞を培養することを含む。本明細書に用いる「低酸素条件」という語句は、約１０％未満の酸素濃度、例えば約１０％、９．５％、９％、８．５％、８％、７．５％、７％、６．５％、６％、５．５％、または５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．７５％、２．５％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５％、１．２５％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、またはそれ未満のいずれかの酸素濃度を有する、培養細胞が曝される雰囲気を指す。「低酸素条件」はまた、０．５％〜１０％のいずれかの酸素濃度範囲を指してもよい。細胞培養時の雰囲気中酸素は、窒素の添加などによる当技術分野で知られている任意の手段によって制御できる。
【０１７６】
本明細書に開示の細胞培養方法は、大気酸素条件で細胞を培養することを含む。本明細書で用いられる「大気酸素条件」という語句は、約２０％の酸素を含む雰囲気を指す。
【０１７７】
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって生成される細胞集団を意図している。本明細書に提供されるＨＳＣを含む細胞集団は、臍帯血に見出される利点を付与する。当業者は臍帯血からの幹細胞の特徴およびその細胞が持つ有効な特性を容易に認識できる。実施形態によっては、本明細書で提供されるＨＳＣを含む細胞集団の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は、増殖ＨＳＣ細胞である。実施形態によっては、細胞集団中の増殖ＨＳＣ細胞は、それらの幹細胞表現型を長期間保持している。例えば、実施形態によっては、ＨＳＣを含む細胞集団は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−、および／またはＣＤ３８低／−を含む細胞表面表現型を有する増殖ＨＳＣ細胞を含み、かつ少なくとも３、７、１０、１３、１４、２０、２５、３０、４０、５０日間、またはそれ以上、生体外で培養されている。実施形態によっては、ＨＳＣを含む細胞集団は、ＣＤ１３３＋および／またはＣＤ９０＋を含む細胞表面表現型を有する増殖ＨＳＣ細胞を含み、かつ少なくとも３、７、１０、１３、１４日間、またはそれ以上、生体外で培養されている。
【０１７８】
Ｂ．治療方法
本明細書では、造血の再構築を必要とする個体を治療する方法が提供される。この方法は、本発明の方法に従って得られたいずれかの培養ＨＳＣを含む治療薬を個体に投与することを含む。
【０１７９】
当業者は、治療薬の投与のために本明細書に開示の培養ＨＳＣの適切な濃度または用量を容易に決定できる。当業者には、好ましい用量とは、それを必要とする患者での疾患、障害、および損傷の予防、治療、および／または軽減などの治療効果をもたらす用量であることが分かっている。当然のことながら、細胞の適切な用量は、限定はされないが、治療される疾患、損傷、障害、または病気の重症度および形態；患者の年齢、体重、性別、健康状態；患者に投与中のその他の薬物療法および治療などを含むいくつかの変数に基づいて、使用時に経験的に決定される。
【０１８０】
有効量の細胞を１回の投与で投与してもよいが、１回の投与には限定されない。従って投与は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の回数での医薬組成物の投与であってもよい。本方法の治療薬を複数回で投与する場合には、これら投与は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、またはそれ以上の時間間隔としてもよく、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間などの時間間隔としてもよい。時間に関する文脈での「約」という用語は、任意の時間間隔の±３０分以内を示している。これら投与はまた、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、およびそれらの組み合わせの時間間隔としてもよい。本発明は、時間的に等間隔である投与間隔に限定されず、不等間隔での投与も含む。
【０１８１】
例えば、１回／週、２回／週、３回／週、４回／週、５回／週、６回／週、７回／週、１回／２週間、１回／３週間、１回／４週間、１回／５週間などの投与計画が、本発明では利用可能である。投与計画は、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月の合計期間での投与を含む。
【０１８２】
上記の投与計画でのサイクルが提供される。このサイクルは、例えば、約７日毎、約１４日毎、約２１日毎、約２８日毎、約３５日毎、約４２日毎、約４９日毎、約５６日毎、約６３日毎、約７０日毎などで繰り返してもよい。投与の無い間隔は、サイクル間に発生し、この間隔は、例えば、約７日間、約１４日間、約２１日間、約２８日間、約３５日間、約４２日間、約４９日間、約５６日間、約６３日間、約７０日間などであってもよい。この文脈での「約」という用語は、±１日間、±２日間、±３日間、±４日間、±５日間、±６日間、または±７日間を示している。
【０１８３】
本発明の方法に由来する細胞は、当技術分野での標準的な技術を使用して凍結保存し、かつその後の使用のために貯蔵できる。本発明の方法に由来する細胞の採取後は、凍結保存細胞バンクおよび組織バンク中に同時に貯蔵できる。
【０１８４】
本発明の方法に由来する細胞は、本明細書に開示のいずれかに方法による投与のために、必要なら賦形剤および助剤を含む一種以上の生理学的に許容可能な担体を用いる任意の通常の方法により製剤化してもよい。適切な製剤は、選択される投与方式によって異なる。一種以上の生理学的に許容可能な担体中のこれら組成物はまた、個体に投与できる。細胞用の担体として、限定はされないが、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理的濃度で塩の混合物を含む乳酸リンゲル溶液、または細胞培養液が挙げられる。
【０１８５】
本発明のＨＳＣ集団およびそれらを含む治療薬を使用して、骨髄移植用の骨髄細胞を増加させることができ、あるいは骨髄細胞に取って代わることができる。ヒトの自家骨髄移植および同種異系骨髄移植は、現状では、白血病、リンパ腫、およびその他の生命を脅かす障害などの疾患の治療法として使用されている。但しこれら手法の欠点として、大量のドナー骨髄を取り除いて、移植に十分な細胞であることを保証する必要がある。
【０１８６】
本発明のＨＳＣ集団およびそれらを含む治療薬は、大量の骨髄提供の必要性を低減させる幹細胞および前駆細胞を提供できる。本発明の方法によれば、少量の骨髄提供を得て、次いでレシピエントへの注入または移植の前に、胎盤中で培養および増殖して幹細胞および前駆細胞の数を増加させることも可能となる。あるいは、非動員末梢血のみを使用して、本発明の方法に従って十分な数量のＨＳＣを得ることができ、それにより骨髄提供の必要性を完全に排除できる。
【０１８７】
本発明の組成物および方法は、幹細胞の増殖に有用である。実施形態によっては、増殖は、従来の増殖方法と比較して迅速に実施できる。実施形態によっては、増殖は、数時間、数日間、または数週間で発生させることが可能である（例えば、選択的な増殖は、約２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週、３週、４週、またはそれ以上の期間で発生させることが可能である）。実施形態によっては、幹細胞集団を、細胞の総数でみると、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍、１０００倍、１２５０倍、１５００倍、１７５０倍、２０００倍、またはそれ以上の倍数で増殖できる。実施形態によっては、幹細胞集団を、幹細胞表現型を有する細胞の相対数でみると、より大きな細胞集団として増殖できる（例えば、幹細胞表現型を有する細胞は、細胞集団のうちの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、または１００％を占めてもよい）。増殖は、例えば細胞の総数が２倍になるまでの時間（例えば５００細胞が１，０００細胞になるまでの時間）、または集団のうちの相対百分率が２倍になるまでの時間（例えば１０％の幹細胞が２０％の幹細胞になるまでの時間）など、２倍となるまでの時間を含むいくつかの計量によって測定されてもよい。
【０１８８】
別の実施形態では、本発明のＨＳＣ集団およびそれらを含む治療薬は、化学療法に加えて補助治療として用いてもよい。癌細胞を標的にして破壊するのに用いられる多くの化学療法剤は、増殖中の全ての細胞、すなわち細胞分裂中の細胞を死滅させるように作用する。骨髄は体内で最も活発に増殖している組織の１つであるので、造血幹細胞は化学療法薬によって頻繁に損傷または破壊されて、結果として血液細胞の産生が低下または停止する。化学療法は、次の化学療法を再開する前に、患者の造血系が血液細胞の供給を補充できるように、定期的に停止させる必要がある。過去に不活動であった幹細胞が白血球数が許容濃度まで増殖・増加して、化学療法が再開できる（再度、骨髄幹細胞が破壊される）には、１か月以上要する場合がある。
【０１８９】
血液細胞は異なる化学療法処置の間の休止期に再生するが、癌も増殖時間を持つことになり、おそらく自然選択により化学療法薬に対しより耐性が高くなる。従って、化学療法の実施時間が長いほど、かつ治療間の期間が短いほど、癌をうまく死滅させる確率は高くなる。化学療法処置の間の期間を短縮するために、本発明のＨＳＣ集団および本発明の方法に従って培養されたその集団を含む治療薬を個体に注入することもできる。この治療は、個体中の血液細胞数が少なくなる時間を短縮して、それによって化学療法治療のより早い再開を可能にする。
【０１９０】
Ｃ．細胞培養培地の生成方法
本明細書ではさらに、造血幹細胞（ＨＳＣ）を培養するための細胞培養培地（例えば本明細書に開示の任意の細胞培養培地）を作製する方法が提供される。この方法は、基本培地またはフィード培地を、本明細書に開示の式Ｉまたは下位の実施形態の化合物と組み合わせることを含む。実施形態によっては、本明細書に提供される方法はまた、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む。実施形態によっては、ＲＡＲ阻害剤はＥＲ５０８９１である。さらに別の実施形態によっては、この方法はまた、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３ｌ）、および／またはインターロイキン６（ＩＬ−６）のうちの１つ、２つ、３つ、または４つ全てを組み合わせることを含む。この方法はまた、カスパーゼ阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＲＡＲ受容体拮抗剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤、および／または（熱不活性化ＦＢＳなどの）ＦＢＳのうちの１つ以上を組み合わせることを含む。実施形態によっては、本明細書に提供される方法は、テトラスパニンを含まない。
【０１９１】
本明細書で使用される「基本培地」は、細胞を培養するのに用いられる培地であり、それ自体が細胞の培養に直接使用され、かつ他の培地への添加物としては使用されない培地であるが、種々の成分が基本培地に添加されていてもよい。基本培地の例として、限定はされないが、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、StemSpan無血清増殖培地（ＳＦＥＭ）、１９９／１０９培地、ハムＦ１０／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地、α−ＭＥＭ培地（フェノールレッド不含および含有）、およびＲＰＭＩ１６４０培地が挙げられる。基本培地は、例えば、塩、グルコース、または他の添加剤の添加によって修飾されてもよい。
【０１９２】
「フィード培地（feed medium）」は、ＣＤ３４＋細胞の供給源（例えば、骨髄、臍帯血、動員末梢血、および非動員末梢血細胞）の培養中の供給物として使用される培地である。基本培地と同様に、フィード培地は、培養される特定の細胞の要件に沿って設計される。従って基本培地は、フィード培地の設計のための基礎として使用できる。フィード培地は、基本培地の全てではないが大半の成分をより高い濃度で含んでいてもよい。例えば、塩などのいくつかの成分は、供給物を基本培地と等張に保つ要望がある際には、基本培地濃度を約１倍に維持してもよい。従って、実施形態によっては、フィード培地を生理的状態に保つように様々な成分が添加され、細胞培養に栄養素を補充するようにその他の成分が添加される。例えば栄養素などのその他の成分は、基本培地での通常濃度の約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上の濃度としてもよい。
【０１９３】
Ｖ．システムおよびキット
本明細書ではまた、培養中の造血幹細胞の増殖を維持および／または強化するシステムが提供される。このシステムには、培養中のＣＤ３４＋細胞の供給源（骨髄、臍帯血、動員末梢血、非動員末梢血の１つ以上からのＣＤ３４＋細胞など）、および本明細書に説明されるいずれかの細胞培養培地組成物が含まれる。特定の実施形態では、本発明のシステムは低酸素培養条件を維持する。従って、このシステムは、約１０％未満の酸素濃度、例えば約１０％、９．５％、９％、８．５％、８％、７．５％、７％、６．５％、６％、５．５％、または５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．７５％、２．５％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５％、１．２５％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、またはそれ未満のいずれかの酸素濃度を有する、培養細胞が曝される雰囲気を提供する。実施形態によっては、このシステムは、０．５％〜１０％内の任意の範囲の酸素を有する、培養細胞が曝される雰囲気を提供する。システム内の雰囲気酸素の制御は、窒素の添加など、当技術分野で知られる任意の手段によって達成できる。
【０１９４】
別の態様では、本明細書に開示される発明は、一つ以上のキットを提供する。これらキットには、基本培地またはフィード培地のいずれか（例えば、限定はされないが、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、StemSpan無血清増殖培地（ＳＦＥＭ）、１９９／１０９培地、ハムＦ１０／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地、α−ＭＥＭ培地（フェノールレッド不含および含有）、およびＲＰＭＩ１６４０培地）、ならびに本明細書に開示の式Ｉまたは下位の実施形態の化合物を含んでもよい。実施形態によっては、本明細書に提供されるキットは、テトラスパニンを含まない。
【０１９５】
キットはまた、キットの細胞培養培地成分を用いて細胞を培養して、培養中のＨＳＣの増殖を維持および／または強化するための指示書を含んでもよい。キットにはまた、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、赤芽球分化因子（ＥＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、熱ショック因子（ＨＳＦ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンジオポエチン１（ＡＮＧ１）、ＶＥＧＦ１６５、ＩＬ−１０、ラミニン、カスパーゼ阻害剤、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、Ｏｃｔ４活性化化合物１（ＯＡＣ１）、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、ＶＥＧＦ−ＣおよびＡＬＫ５／ＳＭＡＤ修飾剤または阻害剤、および（熱不活性化ＦＢＳを含む）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のうちの１つ以上など、細胞培養培地中に添加する付加成分を含んでもよい。
【０１９６】
実施形態によっては、キットはまた、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む。実施形態によっては、ＲＡＲ阻害剤または修飾剤はＥＲ５０８９１である。実施形態によっては、キットはまた、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。
【０１９７】
本明細書の全体を通して示される最大限界値はそれぞれ、それよりも低い限界値を、本明細書内に明示的にその低い限界値を記載したものと見做して含むことを意図している。本明細書の全体を通して示される最小限界値はそれぞれ、それよりも高い限界値を、本明細書内に明示的にその高い限界値を記載したものと見做して含むことになる。本明細書の全体を通して示される数値範囲はそれぞれ、それよりも広い数値範囲内にあるそれよりも狭い数値範囲を、本明細書内に明示的にその狭い数値範囲を記載したものと見做して含むことになる。
【０１９８】
本発明は、以下の実施例を参照してさらに理解を深めることができるが、これら実施例は、実例として提供されるものであり、限定することを意味していない。
【０１９９】
VI．本開示の特定の実施形態
実施形態１：式Ｉ
【化４２】
2021501198.tif 000053
（式中、
Ａは、フェニル、Ｃ3-6シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびヘテロアリールからなる群から選択される縮合環状部分であり、
ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１〜３個の窒素原子環員を有する３〜６個の環員を含み、かつ
ヘテロアリールはそれぞれ、１〜３個の窒素原子環員を有する５〜６個の環員を含み、
Ｒ1は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｘ1−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｒ1a、および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ1aは、Ｈ、Ｃ1-10アルキル、およびＣ1-10ハロアルキルからなる群から選択され、
Ｒ1bは、−ＯＲa、−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ2はそれぞれ、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｃ1-8アルキル、−Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、  −ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択され、
Ｒ3はそれぞれ、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｃ1-8アルキル、−Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ3a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択され、
Ｒ2aおよびＲ3aはそれぞれ、Ｈ、Ｃ1-10アルキル、Ｃ1-10ハロアルキル、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択され、
Ｒ4aは、−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨであり、またはＲ4aとＲ4bは結合してオキソまたはオキシム部分を形成し、
ＲaおよびＲbはそれぞれ、ＨおよびＣ1-4アルキルからなる群から独立して選択され、
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1-4アルキレンであり、
下付きのｎは、０〜３の整数であり、
下付きのｍは、０〜２の整数である）
の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２００】
実施形態２：式中、
Ａは、Ｃ3-6シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびフェニルからなる群から選択される縮合環状部分であり、
ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１〜３個の窒素原子環員を有する３〜６個の環員を含む、実施形態１の化合物。
【０２０１】
実施形態３：式中、
Ａは、Ｃ3-6シクロアルキルおよびフェニルからなる群から選択される縮合環状部分である、実施形態１の化合物。
【０２０２】
実施形態４：式中、
Ａは、縮合Ｃ3-6シクロアルキルである、実施形態１の化合物。
【０２０３】
実施形態５：式中、
Ｒ4aは−ＯＲaであり、Ｒ4bはＨであり、またはＲ4aとＲ4bは結合してオキソ部分を形成する、実施形態１〜４のいずれか１つの化合物。
【０２０４】
実施形態６：式中、
Ｒ4aは−ＯＲaであり、Ｒ4bはＨである、実施形態１〜４のいずれか１つの化合物。
【０２０５】
実施形態７：式中、
Ｒ4aは−ＮＲaＲbであり、Ｒ4bはＨである、実施形態１〜４のいずれか１つの化合物。
【０２０６】
実施形態８：式中、
Ｒ1は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−Ｘ1−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1b、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲb−Ｒ1a、−ＮＲb−Ｒ1a、および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択される、実施形態１〜７のいずれか１つの化合物。
【０２０７】
実施形態９：式中、
Ｒ1は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｒ1a、および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択される、実施形態１〜７のいずれか１つの化合物。
【０２０８】
実施形態１０：式中、
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、および−ＮＲb−Ｒ1aからなる群から選択される、実施形態１〜７のいずれか１つの化合物。
【０２０９】
実施形態１１：式中、
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aおよび−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1aからなる群から選択される、実施形態１〜７のいずれか１つの化合物。
【０２１０】
実施形態１２：式中、
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aである、実施形態１〜７のいずれか１つの化合物。
【０２１１】
実施形態１３：式中、
Ｒ2はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される、実施形態１〜１２のいずれか１つの化合物。
【０２１２】
実施形態１４：式中、
Ｒ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、−Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ3a、−ＳＲa、−Ｘ1−ＳＲa、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される、実施形態１〜１３のいずれか１つの化合物。
【０２１３】
実施形態１５：式中、
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、−Ｘ1−ＮＲaＲb、−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲb、−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2Ｒa、および−Ｘ1−Ｓ（Ｏ）2ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される、実施形態１〜１４のいずれか１つの化合物。
【０２１４】
実施形態１６：式中、
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−Ｃ1-8アルコキシ、−Ｘ1−Ｃ1-8アルコキシ、−ＯＲa、−ＮＲb−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2a−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される、実施形態１〜１４のいずれか１つの化合物。
【０２１５】
実施形態１７：式中、
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、ハロゲン、−Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、および−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される、実施形態１〜１４のいずれか１つの化合物。
【０２１６】
実施形態１８：式中、
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、−ＯＲa、−Ｘ1−ＯＲa、−ＮＲaＲb、または−Ｘ1−ＮＲaＲbからなる群から独立して選択される、実施形態１〜１４のいずれか１つの化合物。
【０２１７】
実施形態１９：式中、
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキル、またはＣ1-6ハロアルキルである、実施形態１〜１８のいずれか１つの化合物。
【０２１８】
実施形態２０：式中、
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキルである、実施形態１〜１８のいずれか１つの化合物。
【０２１９】
実施形態２１：式中、
Ｒ1bは、−ＯＲaである、実施形態１〜１８のいずれか１つの化合物。
【０２２０】
実施形態２２：式中、
Ｒ1bは、−ＯＨである、実施形態１〜１８のいずれか１つの化合物。
【０２２１】
実施形態２３：式中、
ＲaおよびＲbはそれぞれ、ＨおよびＣ1-2アルキルからなる群から独立して選択される、実施形態１〜２２のいずれか１つの化合物。
【０２２２】
実施形態２４：式中、
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1-2アルキレンである、実施形態１〜２３のいずれか１つの化合物。
【０２２３】
実施形態２５：式中、
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1アルキレンである、実施形態１〜２３のいずれか１つの化合物。
【０２２４】
実施形態２６：式中、
下付きのｎは、１〜３の整数である、実施形態１〜２５のいずれか１つの化合物。
【０２２５】
実施形態２７：式中、
下付きのｎは、１である、実施形態１〜２５のいずれか１つの化合物。
【０２２６】
実施形態２８：式中、
下付きのｎは、０である、実施形態１〜２５のいずれか１つの化合物。
【０２２７】
実施形態２９：式中、
下付きのｍは、１〜２の整数である、実施形態１〜２８のいずれか１つの化合物。
【０２２８】
実施形態３０：式中、
下付きのｍは、０である、実施形態１〜２８のいずれか１つの化合物。
【０２２９】
実施形態３１：式中、
下付きのｍは、１である、実施形態１〜２８のいずれか１つの化合物。
【０２３０】
実施形態３２：式Ｉの化合物は、式Ｉ−１またはＩ−２
【化４３】
2021501198.tif 000054
（式中、
Ｒ4aは、−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨである）
の構造を有する、実施形態１〜３１のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２３１】
実施形態３３：式Ｉの化合物は、式Ｉａ
【化４４】
2021501198.tif 000055
の構造を有する、実施形態１、または８〜３１のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２３２】
実施形態３４：式Ｉａの化合物は、式Ｉａ’ 
【化４５】
2021501198.tif 000056
の構造を有する、実施形態３３の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２３３】
実施形態３５：式Ｉａの化合物は、式Ｉａ１またはＩａ２
【化４６】
2021501198.tif 000057
（式中、
Ｒ4aは、−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨである）
の構造を有する、実施形態３３の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２３４】
実施形態３６：式Ｉａ１またはＩａ２の化合物は、式Ｉａ１’またはＩａ２’
【化４７】
2021501198.tif 000058
の構造を有する、実施形態３５の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２３５】
実施形態３７：式Ｉの化合物は、式ＩｂまたはＩｃ
【化４８】
2021501198.tif 000059
の構造を有する、実施形態１、または８〜３１のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２３６】
実施形態３８：式Ｉｂの化合物は、式Ｉｂ１またはＩｂ２
【化４９】
2021501198.tif 000060
（式中、
Ｒ4aは、−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨである）の構造を有する、実施形態３７の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２３７】
実施形態３９：式Ｉｃの化合物は、式Ｉｃ１またはＩｃ２
【化５０】
2021501198.tif 000061
（式中、
Ｒ4aは、−ＯＲaおよび−ＮＲaＲbからなる群から選択され、
Ｒ4bはＨである）
の構造を有する、実施形態３７の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２３８】
実施形態４０：式中、
Ｒ4aは、−ＯＨ、または−ＮＨ2である、実施形態３２〜３９のいずれか１つの化合物。
【０２３９】
実施形態４１：式中、
Ｒ4aは、−ＯＨである、実施形態３２〜３９のいずれか１つの化合物。
【０２４０】
実施形態４２：式Ｉの化合物は、式II
【化５１】
2021501198.tif 000062
の構造を有する、実施形態１〜３１のいずれか１つの化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２４１】
実施形態４３：式中、
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ1a、−ＮＨ−Ｘ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1a、および−ＮＨ−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ2およびＲ3はそれぞれ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−Ｘ1−ＮＨ2、−Ｘ1−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、
Ｘ1はそれぞれ、Ｃ1-2アルキレンであり、
下付きのｎは、０〜２の整数であり、
下付きのｍは、０または１である、実施形態４２の化合物。
【０２４２】
実施形態４４：式IIの化合物は、式IIａ
【化５２】
2021501198.tif 000063
の構造を有する、実施形態４２または実施形態４３の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２４３】
実施形態４５：式IIａの化合物は、式IIａ’
【化５３】
2021501198.tif 000064
の構造を有する、実施形態４４の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２４４】
実施形態４６：式IIａの化合物は、式IIａ１
【化５４】
2021501198.tif 000065
の構造を有する、実施形態４４の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２４５】
実施形態４７：式中、
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ2は、−ＮＨ2、または−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、
下付きのｎは、０または１である、実施形態４５または実施形態４６の化合物。
【０２４６】
実施形態４８：式IIの化合物は、式IIｂまたはIIｃ
【化５５】
2021501198.tif 000066
の構造を有する、実施形態４２または実施形態４３の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２４７】
実施形態４９：式IIｂまたはIIｃの化合物は、式IIｂ１またはIIｃ１
【化５６】
2021501198.tif 000067
の構造を有する、実施形態４８の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和物。
【０２４８】
実施形態５０：式中、
Ｒ1は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ1aからなる群から選択され、
Ｒ2は、−ＮＨ2、または−ＯＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ1aは、Ｃ1-6アルキルおよびＣ1-6ハロアルキルからなる群から選択され、
下付きのｎは、０または１である、実施形態４９の化合物。
【０２４９】
実施形態５１：表１から選択される、実施形態１の化合物。
【０２５０】
実施形態５２：培養中のＣＤ３４＋細胞の供給源を、実施形態１〜５１のいずれか１つの有効量の化合物と接触させ、それにより培養中の造血幹細胞を増殖することを含む、培養中の造血幹細胞を増殖する方法。
【０２５１】
実施形態５３：ＣＤ３４＋細胞の供給源は、骨髄、臍帯血、動員末梢血、および非動員末梢血からなる群から選択される、実施形態５２の方法。
【０２５２】
実施形態５４：ＣＤ３４＋細胞の供給源は、非動員末梢血である、実施形態５２の方法。
【０２５３】
実施形態５５：ＣＤ３４＋細胞の供給源は、（ａ）ＣＤ３４＋造血前駆細胞、（ｂ）ＣＤ３４＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、（ｃ）ＣＤ１３３＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、および／または（ｄ）ＣＤ９０＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞のうちの１つ以上を含む、実施形態５３または実施形態５４の方法。
【０２５４】
実施形態５６：前記方法はさらに、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む、実施形態５２〜５５のいずれか１つの方法。
【０２５５】
実施形態５７：レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤は、ＥＲ５０８９１である、実施形態１１の方法。
【０２５６】
実施形態５８：前記方法はさらに、低酸素条件で細胞を培養することを含む、実施形態５２〜５７のいずれか１つの方法。
【０２５７】
実施形態５９：低酸素条件は、約５％以下の酸素を含む雰囲気を含む、実施形態５８の方法。
【０２５８】
実施形態６０：前記方法はさらに、細胞を、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＡＬＫ５／ＳＭＡＤ修飾剤または阻害剤からなる群から選択される一つ以上の薬剤と接触させることを含む、実施形態５２〜５９のいずれか１つの方法。
【０２５９】
実施形態６１：前記方法はさらに、細胞を、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）と接触させることを含む、実施形態５２〜５９のいずれか１つの方法。
【０２６０】
実施形態６２：前記方法はさらに、細胞を、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）と接触させることを含む、実施形態５２〜５９のいずれか１つの方法。
【０２６１】
実施形態６３：前記方法は、造血幹細胞表現型を安定させる、実施形態５２〜６２のいずれか１つの方法。
【０２６２】
実施形態６４：造血幹細胞表現型は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ３８低／−を含み、かつＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６を含む主要な造血系統マーカーに対して陰性である、実施形態６３の方法。
【０２６３】
実施形態６５：ＣＤ１３３＋および／またはＣＤ９０＋陽性細胞は、実施形態１〜５１のいずれか１つの化合物と接触させていない培養中の細胞と比較して、増加している、実施形態５２〜６４のいずれか１つの方法。
【０２６４】
実施形態６６：細胞は、培養７日後に、実施形態１〜５１のいずれか１つの化合物と接触していない培養中の細胞と比較して、少なくとも約２倍のＣＤ１３３＋および／またはＣＤ９０＋陽性細胞数を示す、実施形態６５の方法。
【０２６５】
実施形態６７：ＣＤ３４＋細胞の供給源は、ヒトである、実施形態５２〜６６のいずれか１つの方法。
【０２６６】
実施形態６８：（ａ）（ｉ）基本培地または（ii）フィード培地、および
（ｂ）実施形態１〜５１のいずれか１つの化合物を含む、培養中の造血幹細胞を増殖させるための培地。
【０２６７】
実施形態６９：前記培地はさらに、（ｃ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む、実施形態６８の培地。
【０２６８】
実施形態７０：レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤は、ＥＲ５０８９１である、実施形態６９の培地。
【０２６９】
実施形態７１：前記培地はさらに、（ｃ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、赤芽球分化因子（ＥＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、熱ショック因子（ＨＳＦ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アンジオポエチン１（ＡＮＧ１）、ＶＥＧＦ１６５、ＩＬ−１０、ラミニン、カスパーゼ阻害剤、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、Ｏｃｔ４活性化化合物１（ＯＡＣ１）、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、ＶＥＧＦ−ＣおよびＡＬＫ５／ＳＭＡＤ修飾剤または阻害剤、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる群から選択される一つ以上の薬剤を含む、実施形態６８〜７０のいずれか１つの培地。
【０２７０】
実施形態７２：ＦＢＳは、熱不活性化されている、実施形態７１の培地。
【０２７１】
実施形態７３：前記培地はさらに、（ｃ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む、実施形態６８〜７０のいずれか１つの培地。
【０２７２】
実施形態７４：前記培地はさらに、（ｃ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む、実施形態６８〜７０のいずれか１つの培地。
【０２７３】
実施形態７５：基本培地は、基本塩培地である、実施形態６８〜７４のいずれか１つの培地。
【０２７４】
実施形態７６：基本塩培地は、α−ＭＥＭである、実施形態７２の培地。
【０２７５】
実施形態７７：基本塩培地は、基本塩培地を３２０〜３８０ｍＯｓｍに調整するのに十分な量のＣａＣｌ2を含む、実施形態７５の培地。
【０２７６】
実施形態７８：培養中のＣＤ３４＋細胞の供給源を、実施形態６８〜７７のいずれか１つの培地と接触させ、それにより培養中の造血幹細胞を増殖することを含む、培養中の造血幹細胞を増殖する方法。
【０２７７】
実施形態７９：（ａ）培養中のＣＤ３４＋細胞の供給源、および（ｂ）実施形態６８〜７７のいずれか１つの培地を含む、培養中の造血幹細胞を増殖するシステム。
【０２７８】
実施形態８０：ＣＤ３４＋細胞の供給源は、骨髄、臍帯血、動員末梢血、および非動員末梢血からなる群から選択される、実施形態７９のシステム。
【０２７９】
実施形態８１：ＣＤ３４＋細胞の供給源は、非動員末梢血である、実施形態８０のシステム。
【０２８０】
実施形態８２：ＣＤ３４＋細胞の供給源は、（ａ）ＣＤ３４＋造血前駆細胞、（ｂ）ＣＤ３４＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、（ｃ）ＣＤ１３３＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞、および／または（ｄ）ＣＤ９０＋初期造血前駆細胞および／または幹細胞のうちの１つ以上を含む、実施形態８０または実施形態８１のシステム。
【０２８１】
実施形態８３：さらに（ｃ）低酸素を含む雰囲気を含む、実施形態７９〜８２のいずれか１つのシステム。
【０２８２】
実施形態８４：雰囲気は、約５％以下の酸素を含む、実施形態８３のシステム。
【０２８３】
実施形態８５：ＣＤ３４＋細胞の供給源は、ヒトである、実施形態７９〜８４のいずれか１つのシステム。
【０２８４】
実施形態８６：（ａ）（ｉ）基本培地または（ii）フィード培地、および（ｂ）実施形態１〜５１のいずれか１つの化合物を含むキット。
【０２８５】
実施形態８７：さらに（ｃ）培養中の造血幹細胞を維持および／または増殖するための指示書を含む、実施形態８６のキット。
【０２８６】
実施形態８８：さらに（ｄ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む、実施形態８６または実施形態８７のキット。
【０２８７】
実施形態８９：レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤は、ＥＲ５０８９１である、実施形態８８の培地。
【０２８８】
実施形態９０：前記キットはさらに、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、赤芽球分化因子（ＥＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、熱ショック因子（ＨＳＦ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アンジオポエチン１（ＡＮＧ１）、ＶＥＧＦ１６５、ＩＬ−１０、ラミニン、カスパーゼ阻害剤、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、Ｏｃｔ４活性化化合物１（ＯＡＣ１）、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、ＶＥＧＦ−ＣおよびＡＬＫ５／ＳＭＡＤ修飾剤または阻害剤、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる群から選択される一つ以上の薬剤を含む、実施形態８６〜８９のいずれか１つのキット。
【０２８９】
実施形態９１：ＦＢＳは、熱不活性化されている、実施形態９０のキット。
【０２９０】
実施形態９２：さらに（ｄ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む、実施形態８６〜８９のいずれか１つのキット。
【０２９１】
実施形態９３：さらに（ｄ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む、実施形態８６〜８９のいずれか１つのキット。
【０２９２】
実施形態９４：基本培地は、基本塩培地である、実施形態８６〜９３のいずれか１つのキット。
【０２９３】
実施形態９５：基本塩培地は、α−ＭＥＭである、実施形態９４のキット。
【０２９４】
実施形態９６：基本塩培地は、３２０〜３８０ｍＯｓｍのＣａＣｌ2を含む、実施形態９４のキット。
【０２９５】
実施形態９７：実施形態５２〜６７または７８のいずれか１つの方法によって生成される造血幹細胞集団。
【０２９６】
実施形態９８：実施形態９７の造血幹細胞集団を含む治療薬。
【０２９７】
実施形態９９：前記個体に実施形態９８の治療剤を投与することを含む、造血再構築を必要とする個体を治療する方法。
【０２９８】
実施形態１００：個体は、骨髄ドナーまたはレシピエントである、実施形態９９の方法。
【０２９９】
実施形態１０１：個体は、がんと診断されている、実施形態１００の方法。
【０３００】
実施形態１０２：前記方法は、化学療法に加えて補助治療として用いられる、実施形態１０１の方法。
【０３０１】
実施形態１０３：前記方法は、化学療法治療の間の期間を短縮するように用いられる、実施形態１０２の方法。
【０３０２】
実施形態１０４：個体は、自己免疫疾患と診断されている、実施形態９９の方法。
【０３０３】
実施形態１０５：前記方法は、（ａ）基本培地またはフィード培地、および（ｂ）実施形態１〜５１のいずれか１つの化合物を組み合わせることを含む、造血幹細胞（ＨＳＣ）を培養するための細胞培養培地を生成する方法。
【０３０４】
実施形態１０６：さらに（ｃ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤を含む、実施形態１０５の方法。
【０３０５】
実施形態１０７：レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）阻害剤または修飾剤は、ＥＲ５０８９１である、実施形態１０６の方法。
【０３０６】
実施形態１０８：さらに、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、および／またはｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む、実施形態１０５〜１０７のいずれか１つの方法。
【０３０７】
実施形態１０９：さらに、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む、実施形態１０５〜１０７のいずれか１つの方法。
【０３０８】
実施形態１１０：さらに、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、赤芽球分化因子（ＥＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、熱ショック因子（ＨＳＦ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アンジオポエチン１（ＡＮＧ１）、ＶＥＧＦ１６５、ＩＬ−１０、ラミニン、カスパーゼ阻害剤、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、Ｏｃｔ４活性化化合物１（ＯＡＣ１）、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、ＶＥＧＦ−ＣおよびＡＬＫ５／ＳＭＡＤ修飾剤または阻害剤、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）のうちの一つ以上を組み合わせることを含む、実施形態１０５〜１０９のいずれか１つの方法。
【０３０９】
実施形態１１１：ＦＢＳは、熱不活性化ＦＢＳである、実施形態１１０の方法。
【０３１０】
実施形態１１２：さらに、（ｄ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む、実施形態１０５〜１０８のいずれか１つの方法。
【０３１１】
実施形態１１３：基本培地またはフィード培地は、α−ＭＥＭである、実施形態１０５〜１１２のいずれか１つの方法。
【実施例】
【０３１２】
以下の実施例は、例証のために提供されるが、本請求の発明を限定するものではない。
【０３１３】
以下で用いられる試薬および溶媒は、MilliporeSigma社（St. Louis, Missouri, USA）などの販売元から入手できる。
【０３１４】
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Varian MercuryのＮＭＲ分光計により４００ＭＨｚで取得した。化学シフトは、ＣＤＣｌ3（７．２６ｐｐｍ）での残留プロトン共鳴を内部参照とした。化学シフトとして、多重度（ｓ：1重線、ｄ：２重線、ｔ：３重線、ｑ：４重線、ｍ：多重線）およびプロトン数を順番に表示している。13Ｃ  ＮＭＲを１００ＭＨｚで取得した。プロトン。炭素の化学シフトは、ＣＤＣｌ3（７７．２０ｐｐｍ）での重水素化した溶媒の信号を内部参照とした。
【０３１５】
質量分析の結果は、電荷に対する質量の比として得られ、（因みに）各イオンの相対存在量が示される。実施例では、最も一般的な原子の同位体を含むＭ＋Ｈ（または、注記があればＭ−Ｈ）イオンの単一のｍ／ｚ値が示される。同位体の形態は、いずれの場合も予測式に対応している。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析を、島津製のLC-MS2020により、Agilent C18カラム（Eclipse XDB-C18、５μｍ、２．１×５０ｍｍ）を用いて、１ｍＬ／分の流量で実施した。移動相Ａは０．１％のギ酸水溶液であり、移動相Ｂは０．１％のギ酸アセトニトリル溶液であった。通常、検体を０．１ｍｇ／ｍＬでメタノール中に溶解し、１μＬを送達溶媒と共に質量分析計に注入し、１００〜１５００Ｄａで走査した。全ての化合物を、正帯電ＥＳＩ方式で分析でき、あるいは負帯電ＥＳＩ方式で分析できた。
【０３１６】
分析ＨＰＬＣは、Zorbax Eclipse XDB C18カラム（２．１×１５０ｍｍ）を備えたAgilent 1200 HPLCにより、１ｍＬ／分の流量で実施した。移動相Ａは０．１％のＴＦＡ水溶液であり、移動相Ｂは０．１％のＴＦＡアセトニトリル溶液であった。
【０３１７】
分取ＨＰＬＣは、、Hamilton C18 PRP-1カラム（１５×２５０ｍｍ）を使用するVarian ProStarにより、２０ｍＬ／分の流量で実施した。移動相Ａは０．１％のＴＦＡ水溶液であり、移動相Ｂは０．１％のＴＦＡアセトニトリル溶液であった。
【０３１８】
以下の略語は、実施例で、かつ本発明の説明の全体を通して用いられる。
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＥＡ：トリエチルアミン
Ｔｏｌ：トルエン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＣＥ：１，２−ジクロロエタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＡ：ジフェニルホスホリルアジド
ＭｅＯＨ：メタノール
ＢＩＮＡＰ：（２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル）
Ｐｄ2（ｄｂａ）3：トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）
ＰＰＡ：ポリリン酸
ＰＤＣ：二クロム酸ピリジニウム（コーンフォース試薬）
ＰＥ：石油エーテル
ＥＡ：酢酸エチル
ＸＰｈｏｓ：２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル
ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ｔ−Ｂｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
Ｅｔ：エチル
ＯＡｃ：酢酸基
Ｐｉｖ：ピバリル（ｔ−ＢｕＣ（Ｏ）−）
【０３１９】
本発明の範囲内の化合物は、当業者に知られる種々の反応を使用して、以下の説明のように合成できる。当業者はまた、本発明の目標化合物の合成に別の方法を使用してもよいこと、かつ本明細書の本文内に説明される手法は、全てを網羅してはいないが、目的の化合物に広く適用可能で実用的な手順を提供していることを認識している。
【０３２０】
本特許で請求される特定の分子は、異なる鏡像異性体形態およびジアステレオマー形態で存在することができ、これら化合物のその全ての変異体は、本開示の範囲内に含まれる。
【０３２１】
本発明の重要化合物の合成に用いられる実験手順の詳細な説明により、複数の分子が得られ、これら分子は、これらを同定する物理データ、ならびにこれらに関連する構造図により説明される。
【０３２２】
当業者はまた、有機化学での標準的な製造手順中に、酸類および塩基類が頻繁に用いられることを認識している。親化合物の塩は、それら親化合物が必要とする固有の酸性または塩基性を保有しているのなら、本特許に記載される実験手順中に生成される場合がある。
【０３２３】
実施例１：Ｎ−（８−オキソ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロシクロペンタ［ａ］インデン−６−イル）ピバル酸アミド（化合物１．００１）の合成
【化５７】
2021501198.tif 000068
【０３２４】
化合物１．１（４．９ｇ、４３７ｍｍｏｌ、１．０当量）のベンゼン混合溶液（５０ｍＬ）に、ＡｌＣｌ3（１７．５ｇ、１３１１ｍｍｏｌ、３．０当量）を３回に分けて加え、次に３時間加熱還流した。この反応を３ＭのＨＣｌで停止して、水溶液を酢酸エチルで抽出した。混合有機層を乾燥させ、濃縮して残留物とし、これをカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝１００：１）により精製して、化合物１．２（３．４ｇ、４５％）を得た。
【０３２５】
化合物１．２（３．４ｇ、１９．７ｍｍｏｌ、１．０当量）を濃硝酸（３２ｍＬ）および濃硫酸（４ｍＬ）に溶かした混合物を、８０℃で１時間加熱した。水を加えて、粗混合物を酢酸エチルで抽出した。混合有機層を乾燥・濃縮して残留物とし、これをカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝３０：１）により精製して、化合物１．３（２．７ｇ、６３％）を黄色の固形物として得た。
【０３２６】
１．３（２．７ｇ、１２．４４ｍｍｏｌ、１．０当量）、鉄粉（３．５ｇ、６２．２ｍｍｏｌ、５．０当量）、ＮＨ4Ｃｌ（６．６５ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、１０．０当量）のエタノール／水混合溶液（ｖ／ｖ＝２：１、２０ｍＬ／１０ｍＬ）を、８０℃で１時間、窒素雰囲気で撹拌した。反応が完全に終了した後に、固形分を濾過して、濾液を真空中で濃縮して１．４（１．８ｇ、７７％）を得た。
【０３２７】
１．４（５０ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した混合物に、Ｎａ2ＣＯ3（１１４ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ、４．０当量）および１．５（６５ｍｇ、０．５３５ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。この混合物を、室温で３０分間、窒素雰囲気で撹拌した。次に混合物を濾過して、Ｈ2Ｏ（３ｍＬ）を加え、ＥＡ（９ｍＬで２回）で抽出した。残留物をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残留物を得て、これを分取により精製して、化合物１．００１（４０ｍｇ、５６％）を白色の固形物として得た。LCMS: [M+1] = 272。1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 9.32 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 8.08-7.82 (m, 1H), 7.31-7.29 (m, 1H), 3.39-3.37 (m, 1H), 3.01-2.98 (m, 1H), 2.51-2.50 (m, 2H), 2.19-2.10 (m, 1H), 1.84-1.79 (m, 1H), 1.78-1.40 (m, 2H), 1.12 (s, 9H)。
【０３２８】
実施例２：Ｎ−（９−オキソ−２，３，４，４ａ，９，９ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−フルオレン−７−イル）ピバル酸アミド（化合物１．００２）の合成
【化５８】
2021501198.tif 000069
【０３２９】
化合物２．１（４００ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＡｌＣｌ3（１．２７ｇ、９．５ｍｍｏｌ、３．０当量）をベンゼン（１０ｍＬ）に溶解した混合物を、２時間加熱還流した。反応を３ＭのＨＣｌで停止させ、水溶液を酢酸エチルで抽出した。混合有機層を乾燥させ、濃縮して残留物として、これをカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝１００：１）により精製して、化合物２．２（１５０ｍｇ、２５％）を得た。
【０３３０】
化合物２．２（１４０ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、１．０当量）を濃硝酸（１．３ｍＬ）および濃硫酸（０．１６ｍＬ）に溶解した混合物を、８０℃で２時間加熱した。水を加えて、粗混合物を酢酸エチルで抽出した。混合有機層を乾燥させ、濃縮して残留物とし、これをカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝３０：１）により精製して、化合物２．３（５１ｍｇ、２９％）を白色の固形物として得た。
【０３３１】
２．３（５１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．０当量）、鉄粉（６２ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、５．０当量）、ＮＨ4Ｃｌ（１１８ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ、１０．０当量）のエタノール／水（ｖ／ｖ＝２：１、５ｍＬ／２．５ｍＬ）に溶解した混合物を、８０℃で１時間、窒素雰囲気で撹拌した。反応が完全に終了した後に、固形分を濾過して、濾液を真空中で濃縮して２．４（３０ｍｇ、６８％）を得た。
【０３３２】
２．４（３０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解した混合物に、Ｎａ2ＣＯ3（６３．６ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ、４．０当量）および２．５（３６ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。この混合物を、室温で３０分間、窒素雰囲気で撹拌した。次に混合物を濾過し、Ｈ2Ｏ（５ｍＬ）を加え、ＥＡ（３ｍＬで５回）で抽出した。残留物をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残留物を得て、これを分取ＴＬＣにより精製して化合物１．００２（１２ｍｇ、２８％）を白色の固形物として得た。LCMS: [M+1] = 286。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.36 (s, 1H), 8.14 (m, 1H), 7.91-7.85 (m, 1H), 7.30-7.27 (m, 1H), 3.15 (s, 1H), 2.61 (s, 1H), 2.18-2.21 (m, 1H), 1.74-1.72 (m, 4H), 1.58-1.53 (m, 3H), 1.23 (s, 9H)。
【０３３３】
実施例３：（９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（化合物１．００３）の合成
【化５９】
2021501198.tif 000070
【０３３４】
化合物３．１（２２４ｍｇ、１ｍｍｏｌ、１．０当量）、Ｅｔ3Ｎ（１５８ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ、１．５５当量）およびｔ−ＢｕＯＨ（１２０ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ、１．６２当量）をトルエン（１００ｍＬ）に溶解した混合物に、室温でＤＰＰＡ（４１３ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。この混合物を１０５℃で１時間還流した。反応はＬＣＭＳで監視した。反応混合物を水（２０ｍＬ）で希釈して濾過した。濾液をＥＡ（２０ｍＬで２回）で抽出した。有機層を混合して、水（３０ｍＬ）および塩水（３０ｍＬ）で洗浄、乾燥、濾過し、濃縮して残留物を得て、これを分取ＴＬＣ（ＰＥ／ＥＡ＝５：１）で精製して化合物１．００３（５４ｍｇ、１８％）を黄色の固形物として得た。LCMS: [M+Na] = 318。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.67 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.75-7.63 (m, 2H), 7.59-7.52 (m, 3H), 7.29-7.25 (m, 1H), 1.47 (s, 9H)。
【０３３５】
実施例４：２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−９Ｈ−フルオレン−９−オン（化合物１．００４）の合成
【化６０】
2021501198.tif 000071
【０３３６】
化合物４．１（２００ｍｇ、０．７７２ｍｍｏｌ、１．０当量）をＰｈＭｅ（５ｍＬ）に溶解した混合物に、化合物１２（６７ｍｇ、０．９２７ｍｍｏｌ、１．２当量）、Ｐｄ2（ｄｂａ）3（１．３ｍｇ、０．００５７９ｍｍｏｌ、０．００７５当量）、ＢＩＮＡＰ（１．２ｍｇ、０．００１９３ｍｍｏｌ、０．００２５当量）およびＮａＯｔＢｕ（１０４ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ、１．４当量）を加えた。この混合物を１００℃で３０分間、マイクロ波加熱した。反応はＬＣＭＳで監視した。次に、この混合物を水（５ｍＬ）で反応停止した。沈殿した固形物を濾過し、ＴＨＦ（５ｍＬ）で洗浄した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１．００４（５ｍｇ、３％）をオレンジ色の固形物として得た。LCMS: [M+1] = 252。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.50-7.35 (m, 4H), 7.15-7.10 (m, 1H), 6.92 (s, 1H), 6.83 (d, J=8.0 Hz, 1H), 5.83 (s, 1H), 1.32 (s, 9H)。
【０３３７】
実施例５：Ｎ−（９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．００５）の合成
【化６１】
2021501198.tif 000072
【０３３８】
化合物５．１（１．５ｇ、７．７ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＴＥＡ（２．３３ｇ、２３ｍｍｏｌ、３．０当量）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解した混合物に、化合物５（１．１ｇ、９ｍｍｏｌ、１．２当量）を、０℃の窒素雰囲気で加えた。この混合物を、室温で１時間撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次に混合物を濾過し、Ｈ2Ｏ（２０ｍＬ）を加え、ＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出した。残留物をＥＡで処理し、濾過して化合物１．００５（１．７ｇ、７９％）をオレンジ色の固形物として得た。TLC:DCM:MeOH = 20:1 , UV 254 nm. Rf (化合物5.1) = 0.3. Rf (化合物1.005) = 0.8.。LCMS: [M+1] = 280。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.43 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.85-7.83 (m, 1H), 7.73-7.69 (m, 2H), 7.60-7.55 (m, 2H), 7.35-7.26 (m, 1H), 1.24 (s, 9H)。
【０３３９】
実施例６：Ｎ−（６−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．００６）の合成
【化６２】
2021501198.tif 000073
【化６３】
2021501198.tif 000074
【０３４０】
化合物６．１（２．０ｇ、７．７ｍｍｏｌ、１．０当量）のトルエン（２０ｍＬ）／ＥｔＯＨ（５ｍＬ）／Ｈ2Ｏ（５ｍＬ）溶液に、化合物６．２（１．２９ｇ、８．５ｍｍｏｌ、１．１当量）、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4（９２ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ、０．１当量）およびＮａ2ＣＯ3（２．４ｇ、２３．１ｍｍｏｌ、３．０当量）を窒素雰囲気で加えた。この混合物を９０℃で２時間撹拌した。次に混合物を濾過し、ＥＡおよびＨ2Ｏにより抽出・分離して、さらに有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、真空中で濃縮した。残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ、２０：１〜１５：１）によって精製して、黄色の油分として化合物６．３（２．２ｇ、１００％）を得た。TLC: PE:EA=8:1, Rf (6.1) =0.7, Rf (6.3) =0.5。
【化６４】
2021501198.tif 000075
【０３４１】
化合物６．３（２．２ｇ、７．７ｍｍｏｌ、１．０当量）のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）／ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、２．５ＭのＮａＯＨ（６．２ｍＬ、１５．４ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。この混合物を室温で２時間撹拌した。次に混合物に１ＭのＨＣｌを加えてｐＨ＝３に調整して、濾過し、真空中で乾燥して化合物６．４（１．７８ｇ、８５％）を白色の固形物として得た。TLC: PE:EA=1:3, Rf (6.3) =1, Rf (6.4) =0.1。
【化６５】
2021501198.tif 000076
【０３４２】
化合物６．４（１．７ｇ、６．２ｍｍｏｌ、１．０当量）をＰＰＡ（３０ｍＬ）に加え、この混合物を１２０℃で４時間撹拌した。次に混合物を氷水中に注いで濾過し、Ｈ2ＯおよびＭｅＯＨで洗浄し、次いで濾過し、真空乾燥して化合物６．５ａおよび６．５ｂの混合物（１．４ｇ、８９％）を黄色の固形物として得た。TLC: PE:EA=1:3, Rf (6.4) =0.1, Rf (6.5) =0.8,0.9。
【化６６】
2021501198.tif 000077
【０３４３】
化合物６．５ａおよび６．５ｂ（０．７ｇ、２．７ｍｍｏｌ、１．０当量）のＭｅＯＨ（３０ｍＬ）／ＴＨＦ（３０ｍＬ）溶液に、Ｐｄ／Ｃ（７０ｍｇ、１０重量％）を加えた。得られた溶液を、室温で３時間、Ｈ2雰囲気で撹拌した。この混合液を濾過し、真空中で濃縮して化合物６．６ａおよび６．６ｂの混合物（０．５７ｇ、９２％）を褐色の固形物として得た。TLC: PE:EA=1:1, Rf (6.5) = 0.6, Rf (6.6) = 0.4。
【化６７】
2021501198.tif 000078
【０３４４】
化合物６．６ａおよび６．６ｂ（０．５７ｇ、２．５ｍｍｏｌ、１．０当量）の脱水ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気でＮａ2ＣＯ3（１．０６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、４．０当量）を加え、次いで塩化ピバロイル（１．５ｇ、１２．７ｍｍｏｌ、５．０当量）を加えた。この混合物を、室温で０．５時間撹拌した。次に混合物をＥＡおよびＨ2Ｏで希釈・分離し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液および塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させて、真空中で濃縮した。残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ、６：１〜２：１）により精製して、化合物６．７ａおよび６．７ｂの混合物（０．４６ｇ、５６％）を黄色の固形物として得た。TLC: PE:EA=1:1, Rf (6.6) = 0.4, Rf (6.7) = 0.5。
【化６８】
2021501198.tif 000079
【０３４５】
化合物６．７ａおよび６．７ｂ（０．４５ｇ、１．４５ｍｍｏｌ、１．０当量）のＤＣＭ溶液（３０ｍＬ）に、ＰＤＣ（１．６ｇ、４．３４ｍｍｏｌ、３．０当量）およびＳｉＯ2（１ｇ）を加えた。この混合物を、室温で２時間撹拌した。次に混合物を濾過して、真空中で濃縮した。残留物を、シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ、６：１〜２：１）により精製して、化合物６．８ａ（０．１７ｇ、３８％）および６．８ｂ（０．２８ｇ、６２％）を黄色の固形物として得た。TLC: PE:EA=2:1、Rf (6.7) = 0.2、Rf (6.8) = 0.3。
【化６９】
2021501198.tif 000080
【０３４６】
化合物６．８ａ（１００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１．０当量）のＤＣＭ溶液（３０ｍＬ）に、２ＭのＢＢｒ3（１．６ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ、１０．０当量）を加えた。この混合物を室温で０．５時間攪拌した。次に混合物をＭｅＯＨで反応停止し、ＤＣＭおよびＨ2Ｏで抽出・分離し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液および塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させて、真空中で濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１．００６（５１ｍｇ、４１％）を黄色の固形物として得た。TLC: PE:EA=1:1, Rf (6.8a) =0.5, Rf (1.006) =0.8。LCMS: [M+1]+ = 296。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.31 (s, 1H), 7.78-7.75 (m, 1H), 7.59-7.58 (m, 1H), 7.40-7.38 (m, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.30-7.27 (m, 1H), 6.92-6.90 (m, 1H),  6.67-6.64 (m, 1H), 1.27 (s, 9H)。
【０３４７】
実施例７：Ｎ−（７−ヒドロキシ−９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．００７）の合成
【化７０】
2021501198.tif 000081
【０３４８】
７．１（１．３ｇ、５ｍｍｏｌ、１．０当量）および水（６ｍＬ）の混合物を１１０℃で加熱した。次に、ＨＮＯ3（６５％、６ｍＬ）およびＨ2ＳＯ4（９６％、９ｍＬ）を滴下した。この混合物を１１０℃で６時間加熱した。水を加え、粗生成物を濾過して、水で洗浄し乾燥させた。化合物をアセトンを加え摩砕して、化合物７．２（１ｇ、６７％）を黄色の固形物として得た。
【０３４９】
２（１００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１．０当量）、鉄粉（９２ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ、５．０当量）、ＮＨ4Ｃｌ（１７５ｍｇ、３．２８ｍｍｏｌ、１０．０当量）をエタノール／水（ｖ／ｖ＝２：１、６ｍＬ／３ｍＬ）に溶解した混合物を、８０℃で１時間、窒素雰囲気で撹拌した。反応が完了した後に、固形物を濾過して濾液を真空中で濃縮した。次に残留物を、分取ＴＬＣ（ＰＥ／ＥＡ、１：１）により精製して、７．３（７０ｍｇ、７８％）を得た。
【０３５０】
７．３（７０ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した混合物に、Ｎａ2ＣＯ3（１０８ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、４．０当量）および７．４（６２ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。この混合物を、室温で３０分間、窒素雰囲気で撹拌した。次に混合物を濾過して、Ｈ2Ｏ（６ｍＬ）を加え、ＥＡ（８ｍＬで２回）で抽出した。残留物をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を分取ＴＬＣにより精製して、７．５（８０ｍｇ、８８％）を黄色の固形物として得た。
【０３５１】
化合物７．５（４０ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ、１．０当量）、Ｂ2（ＯＨ）4（５０ｍｇ、０．５５６ｍｍｏｌ、５．０当量）、ＸＰｈｏｓＰｄＧ２（１０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、０．１当量）、ＸＰｈｏｓ（１２ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、０．２当量）、ＫＯＡｃ（５４ｍｇ、０．５５６ｍｍｏｌ、５．０当量）をＥｔＯＨ（６ｍＬ）に溶解した混合物を、Ｎ2で３回脱気し、８０℃で３時間加熱した。反応はＴＬＣで監視した。溶媒を除去して、黄色の固形物として粗化合物７．６（４０ｍｇ）を得た。
【０３５２】
化合物７．６を、ＴＨＦ（５ｍＬ）および酢酸（０．４ｍＬ）に溶解して、過酸化水素（１．６ｍＬ）で処理した。この反応物を１５分間撹拌し、次に標準ＮａＨＳＯ3水溶液で反応停止させた。反応物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬで２回）で抽出した。有機層を混合し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させて真空中で濃縮して残留物を得て、これを分取ＴＬＣ（ＰＥ／ＥＡ＝１：１）で精製して、化合物１．００７（１０．５ｍｇ、３２％）を黄色の固形物として得た。LCMS: [M+1] = 296。1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 9.97 (s, 1H), 9.35 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.77-7.15 (m, 1H), 7.53-7.47 (m, 2H), 6.94-6.90 (m, 2H), 1.25-1.23 (m, 9H)。
【０３５３】
実施例８：Ｎ−（７−アミノ−９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．００８）の合成
【化７１】
2021501198.tif 000082
【化７２】
2021501198.tif 000083
【０３５４】
化合物８．５（５ｇ、１８．５ｍｍｏｌ、１．０当量）をＥｔＯＨ（２００ｍＬ）に溶解した混合物に、Ｎａ2Ｓ・９Ｈ2Ｏ（２０ｇ、８３．２ｍｍｏｌ、４．５当量）およびＮａＯＨ（８ｇ、２００ｍｍｏｌ、１０．８当量）の水溶液（３４５ｍＬ）を加えた。この混合物を室温で５時間還流し、次に０℃で一晩撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次に混合物を濾過して、Ｈ2Ｏ（５０ｍＬで２回）、５％ＮａＯＨ（５０ｍＬで２回）、Ｈ2Ｏ（５０ｍＬで３回）、冷ＥｔＯＨ（２５ｍＬで２回）、エーテル（２５ｍＬ）、およびヘキサン（２０ｍＬ）で洗浄して、化合物８．６（３．２ｇ、８２％）を得た。
【化７３】
2021501198.tif 000084
【０３５５】
化合物８．６（２００ｍｇ、０．９５２ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した混合物に、Ｎａ2ＣＯ3（２０２ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ、２．０当量）および化合物８．４（１１４ｍｇ、０．９５２ｍｍｏｌ、１．０当量）を加えた。この混合物を−７８℃で１時間撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次に、混合物を水（１０ｍＬ）で反応停止した。沈殿した固形物を濾過して、ＴＨＦ（１０ｍＬ）で洗浄した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１．００８（５ｍｇ、４％）を黒色の固形物として得た。LCMS: [M+42] = 336。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.30 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.70 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.45-7.30 (m, 2H), 6.85 (s, 1H), 6.73 (d, J=8.0 Hz, 1H), 1.22 (s, 9H)。
【０３５６】
実施例９：Ｎ−（９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）アセトアミド（化合物１．００９）の合成
【化７４】
2021501198.tif 000085
【０３５７】
９．１（５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解した混合物に、Ｎａ2ＣＯ3（８３ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ、３．０当量）および９．２（４１ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。この混合物を、室温で３０分間、窒素雰囲気中で撹拌した。次に混合物を濾過して、Ｈ2Ｏ（５ｍＬ）を加え、ＥＡ（５ｍＬで３回）で抽出した。残留物をＭｅＯＨを加え摩砕して、化合物１．００９（３５ｍｇ、５８％）を赤色の固形物として得た。LCMS: [M+1] = 238。1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 10.19 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.70-7.65 (m, 3H), 7.57-7.54 (m, 2H), 7.31-7.27 (m, 1H), 2.06 (s, 3H)。
【０３５８】
実施例１０：３，３−ジメチル−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−オキサジン４−オキシド（化合物１．０１０）の合成
【化７５】
2021501198.tif 000086
【０３５９】
化合物１．００５は、実施例５の説明のように調製した。化合物１．００５（６２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をメタノール（３ｍＬ）に溶解した混合物に、ＮａＢＨ4（１０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。ＬＣ−ＭＳおよびＴＬＣ分析で出発物質が観察されなくなった後に、反応混合物を濃縮してメタノールを除去した。得られた残留物を、シリカゲルの分取ＴＬＣにより精製して、３９ｍｇの生成物（化合物１．０１０）を６３％の収率で得た。TLC: ヘキサン／酢酸エチル= 3/1; Rf (出発物質) = 0.6; Rf (化合物1.010) = 0.2; LC-MS(ESI): 282.4 [M+H]+; 1H NMR (300 MHz, CDCl3):  7.82 (s, 1 H), 7.64- 7.53 (m, 4 H), 7.34- 7.26 (m, 2 H), 5.49 (s, 1 H), 1.32 (s, 9 H)。
【０３６０】
実施例１１：１，１’−（９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２，７−ジイル）二尿素（化合物１．０１１）の合成
【化７６】
2021501198.tif 000087
【０３６１】
化合物８．６を、実施例８の説明のように調製した。化合物８．６（５０ｍｇ、０．２３８ｍｍｏｌ、１．０当量）をＨＯＡｃ／Ｈ2Ｏ（５ｍＬ／１０ｍＬ）に溶解した混合物に、シアン酸ナトリウム（６１．９７ｍｇ、０．９５２ｍｍｏｌ、４．０当量）の水溶液（６ｍＬ）を加えた。この混合物を５０℃で２時間撹拌した。反応はＴＬＣにより監視した。次に、混合物を水（５ｍＬ）で反応停止した。沈殿した固形物を濾過して、ＥＡ（２０ｍＬ）で抽出した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１．０１３（７ｍｇ、１０％）を褐色の固形物として得た。LCMS: [M+42] = 338。1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 8.74 (s, 2H), 7.71 (s, 2H), 7.45-7.30 (m, 4H), 5.92 (s, 4H)。
【０３６２】
実施例１２：Ｎ、Ｎ’−（９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２，７−ジイル）ジアセトアミド（化合物１．０１２）の合成
【化７７】
2021501198.tif 000088
【０３６３】
化合物８．６を、実施例８の説明のように調製した。化合物８．６（５０ｍｇ、０．２３８ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した混合物に、Ｎａ2ＣＯ3（１００．９５ｍｇ、０．９５２ｍｍｏｌ、４．０当量）およびＡｃＣｌ（７４．８２ｍｇ、０．９５２ｍｍｏｌ、４．０当量）を加えた。この混合物を室温で１０分間撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次に混合物を、水（１０ｍＬ）で反応停止した。沈殿した固形物を濾過して、ＴＨＦ（１０ｍＬ）で洗浄した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１．０１２（５ｍｇ、７％）を赤色の固形物として得た。LCMS: [M+42] = 336。1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 10.17 (s, 2H), 7.90 (s, 2H), 7.65-7.55 (m, 4H), 2.07 (s, 6H)。
【０３６４】
実施例１３：Ｎ−（９−（ヒドロキシイミノ）−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．０１３）の合成
【化７８】
2021501198.tif 000089
【０３６５】
化合物１．００５を、実施例５の説明のように調製した。化合物１．００５（２００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）をＥｔＯＨ（５ｍＬ）に溶解した混合物に、ＨＯＮＨ2・ＨＣｌ（１００ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。この混合物を、室温で１６時間還流した。反応はＴＬＣで監視した。次に混合物を水（５ｍＬ）で反応停止した。沈殿した固形物を濾過した。残留物をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮した。残留物を分取ＴＬＣ（ＰＥ：ＥＡ、５：１）により４回精製して、化合物１．０１３（４ｍｇ、２％）を黄色の固形物として得た。TLC: PE:EA =  2:1 , UV 254 nm。Rf (化合物1.013) = 0.5。LCMS: [M+42] = 336。1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.34 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.70-7.60 (m, 2H), 7.55-7.50 (m, 1H), 7.42-7.36 (m, 1H), 7.28-7.24 (m, 1H), 1.31 (s, 9H)。
【０３６６】
実施例１４：Ｎ−（３−ヒドロキシ−９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．０１４）の合成
【化７９】
2021501198.tif 000090
【０３６７】
化合物１４．１（１００ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＨＯＡｃ（２．０ｍＬ）に溶解した。Ｂｒ2（１００ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ、１．２当量）を室温で滴下した。この混合物を、室温で１時間撹拌した。水を加えて固形分を濾過し、それを水で洗浄して化合物１４．２（１４０ｍｇ、８１％）を黄色の固形物として得た。
【０３６８】
１４．２（１４０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解した混合物に、Ｎａ2ＣＯ3（１３４ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、３．０当量）および１４．３（１００ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。この混合物を、室温で３０分間、窒素雰囲気で撹拌した。次に混合物を濾過して、Ｈ2Ｏ（５ｍＬ）を加え、ＥＡ（５ｍＬで３回）で抽出した。残留物をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮して、１４．４（１００ｍｇ、６６％）を黄色の固形物として得た。
【０３６９】
化合物１４．４（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１．０当量）、Ｂ2（ＯＨ）4（１２５ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ、５．０当量）、ＸＰｈｏｓＰｄＧ２（２３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、０．１当量）、ＸＰｈｏｓ（２９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、０．２当量）、ＫＯＡｃ（１３７ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ、５．０当量）をＥｔＯＨ（１０ｍＬ）に溶解した混合物を、Ｎ2で３回脱気して、８０℃で６時間加熱した。反応はＴＬＣで監視した。溶媒を除去して、黄色の粗残留物を得た。この粗油分を、ＴＨＦ（４ｍＬ）および酢酸（０．５ｍＬ）に溶解して、過酸化水素（２ｍＬ）で処理した。この反応物を１５分間撹拌し、次に標準ＮａＨＳＯ3水溶液で反応停止した。反応物をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬで３回）で抽出した。有機層を混合して、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、真空中で濃縮して残留物とし、これを分取ＨＰＬＣで精製して、化合物１．０１４（１５ｍｇ、１８％）を黄色の固形物として得た。LCMS: [M+1] = 296。1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 8.56 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.66-7.65 (m, 1H), 7.58-7.52 (m, 2H), 7.36-7.32 (m, 1H), 7.23 (s, 1H), 1.27 (m, 9H)。
【０３７０】
実施例１５：Ｎ−（９−アミノ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．０１５）の合成
【化８０】
2021501198.tif 000091
【０３７１】
化合物１．００５を実施例５の説明のように調製した。化合物１．００５（５０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）をＥｔＯＨ（３ｍＬ）に溶解した混合物に、ＨＯＮＨ2・ＨＣｌ（１００ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ、８．０当量）を加えた。この混合物を室温で一晩還流した。次に混合物を濃縮し、ＡｃＯＨ（６ｍＬ）に溶解した混合物にＺｎ（１２０ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ、１０．０当量）を加えた。混合物を８０℃で２時間還流した。反応はＴＬＣで監視した。次に、混合物を濾過して、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮した。残留物をＥＡで処理し濾過して、化合物１．０１５（１４ｍｇ、２８％）をＡｃＯＨの形態の白色の固形物として得た。LCMS: [M+42] = 322.。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.28 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.70-7.60 (m, 4H), 7.35-7.25 (m, 2H), 4.72 (s, 1H), 1.90 (s, 3H), 1.25 (s, 9H)。
【０３７２】
実施例１６：Ｎ−（６−ヒドロキシ−９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．０１６）の合成
【化８１】
2021501198.tif 000092
【０３７３】
化合物６．８ｂを実施例６の説明のように調製した。化合物６．８ｂ（２３０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解した混合物に、２ＭのＢＢｒ3（３．７ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ、１０．０当量）を加えた。この混合物を、室温で０．５時間攪拌した。次に、混合物をＭｅＯＨで反応停止し、ＤＣＭおよびＨ2Ｏで抽出・分離し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液および塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させて真空中で濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１．０１６（４．７ｍｇ、５％）を黄色の固形物として得た。LCMS: [M+1]+ = 296. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.76-7.75 (m, 1H), 7.68-7.65 (m, 1H), 7.49-7.42 (m, 2H), 6.95-6.94 (m, 1H), 6.61-6.58 (m, 1H), 1.29 (s,9H)。
【０３７４】
実施例１７：Ｎ−（９−ヒドロキシ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ホルムアミド（化合物１．０１７）の合成
【化８２】
2021501198.tif 000093
【０３７５】
化合物１７．１（１００ｍｇ、０．５１３ｍｍｏｌ、１．０当量）をギ酸（３ｍＬ）に溶解した混合物に、Ａｃ2Ｏを（３滴）加えた。この混合物を室温で０．５時間攪拌した。反応を水で停止して濾過した。濾塊をＥＡに溶解させ、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。ＥＡを除去して、化合物１７．２（１０５ｍｇ、９２％）を淡黄色の固形物として得た。
【０３７６】
化合物１７．２（１０５ｍｇ、０．４７１ｍｍｏｌ、１．０当量）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解した混合物に、０℃でＮａＢＨ4（５４ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ、３．０当量）を加えた。この混合物を０．５時間攪拌した。混合物をＥＡおよび水で抽出した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、圧力を掛けて濃縮して残留物を得て、それをＭｅＯＨで洗浄して化合物１．０１７（７０ｍｇ、６６％）を白色の固形物として得た。LCMS: [M-1]- = 224.  1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 10.23 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.68-7.66 (m, 2H), 7.51 (d, J = 7.6 Hz,1H), 7.36-7.18 (m, 2H), 5.81 (m, 1 H), 5.41 (d, J = 7.6 Hz,1H)。
【０３７７】
実施例１８：２−（メチルアミノ）−９Ｈ−フルオレン−９−オール（化合物１．０１８）の合成
【化８３】
2021501198.tif 000094
【０３７８】
化合物１８．１（１ｇ、３．８８ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物１８．２（５２０ｍｇ、７．７６ｍｍｏｌ、２．０当量）、Ｐｄ2（ｄｂａ）3（３４８ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、０．１当量）、ＢＩＮＡＰ（４８６ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ、０．２当量）、およびＮａＯtＢｕ（１．４９ｇ、１５．５２ｍｍｏｌ、４．０当量）をＰｈＭｅ（１０ｍＬ）に溶解した混合物を、１００℃で１６時間還流した。反応はＴＬＣで監視した。次に、混合物をＨ2Ｏ（１０ｍＬ）で希釈し、ＥＡ（１０ｍＬで３回）で抽出した。有機層を塩水で洗浄した。残留物をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮した。残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ、５：１）で精製して、化合物１８．３（５００ｍｇ、６２％）を得た。TLC: PE:EA =  5:1 , UV 254 nm. Rf (化合物18.1) = 0.7.  Rf (化合物18.3) = 0.5。
【０３７９】
化合物１８．３（５００ｍｇ、２．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解した混合物に、ＮａＢＨ4（１８１ｍｇ、４．７８ｍｍｏｌ、２．０当量）を窒素雰囲気で加えた。この混合物を室温で２時間撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次に、混合物をＨ2Ｏで反応停止し、ＥＡ（１０ｍＬで２回）で抽出した。有機層を塩水で洗浄した。残留物をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１．０１８（１５０ｍｇ、３０％）を黄色の固形物として得た。LCMS: [M+42] = 253  1H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ 7.64-7.60 (m, 2H), 7.52-7.48 (m, 1H), 7.30-7.25 (m, 1H), 7.24-7.20 (m, 1H), 7.13 (s, 1H), 6.93-6.89 (m, 1H), 5.40 (s, 1H), 2.83 (s, 3H)。
【０３８０】
実施例１９：Ｎ−（３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−５−イル）アセトアミド（化合物１．０１９）の合成
【化８４】
2021501198.tif 000095
【０３８１】
化合物１９．１（１ｇ、５．６ｍｍｏｌ、１．０当量）のＣＨ3ＯＨ溶液（２０ｍＬ）に、Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ、１０重量％）を加えた。得られた溶液を、室温で１４時間、Ｈ2中で撹拌した。この混合物を濾過して濾液を得て、真空中で除去して化合物１９．２（０．８ｇ、９６％）を褐色の固形物として得た。これをさらに精製することなく次の工程で直接使用した。
【０３８２】
化合物１９．２（１００ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＴＥＡ（２０６ｍｇ、２．０４ｍｍｏｌ、３．０当量）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した混合物に、化合物１９．３を０℃、Ｎ2中で徐々に加えた。この混合物を、室温まで温めて１４時間撹拌した。反応混合物を５０ｍＬの水に注ぎ込み、ＥＡ（５０ｍＬで３回）で抽出した。有機相を塩水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。混合物を減圧濃縮して残留物を得て、この残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝３：１）により精製して、化合物１．０１９（７０ｍｇ、４５％）を白色の固形物として得た。TLC: PE:EA=3:1, Rf (化合物1.019) = 0.4, LC-MS: [M+MeCN+H]+ = 273.15. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (dd, J = 4.0 and 8.0 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 4.0,1H), 7.54 (s, 1H), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.10 (m, J = 8.0 Hz, 2H)。
【０３８３】
実施例２０：Ｎ−（９−エトキシ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）アセトアミド（化合物１．０２１）およびＮ−（９−ヒドロキシ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）アセトアミド（化合物１．０２９）の合成
【化８５】
2021501198.tif 000096
【０３８４】
化合物２０．１（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１．０当量）をテトラヒドロフラン／メタノール（３ｍＬ／１ｍＬ）に溶解した混合物に、水素化ホウ素ナトリウム（３２ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ、２．０当量）を０℃で加えた。この混合物を、室温で３０分間、窒素雰囲気で撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次に混合物に、水（３ｍＬ）、酢酸エチル（３ｍＬ）を加えて、濾過した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して化合物１．０２９（６１ｍｇ、６１％）を白色の固形物として得た。TLC: 石油エーテル: 酢酸エチル, 1:1, UV 254 nm. Rf: (化合物20.1) = 0.5; Rf: (化合物1.029) = 0.2. LCMS: [M-1]: 238. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 9.84 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.65-7.62 (m, 2H), 7.52-7.48 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.33-7.29 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.23-7.20 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 5.79 (s, 1H), 5.39 (s, 1H)および2.04-2.03 (d, J = 1.6 Hz, 3H)。
【化８６】
2021501198.tif 000097
【０３８５】
化合物１．０２９（８０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、１．０当量）、酸化銀（４６５ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、６．０当量）、およびヨウ化エチル（１５６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、３．０当量）を１，２−ジクロロエタン（５ｍＬ）に溶解した混合物を、６０℃で１６時間撹拌した。反応はＬＣＭＳで監視した。次にこの混合物を濾過した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残留物を分取ＴＬＣにより精製して、化合物１．０２１（２０ｍｇ、１２％）を淡黄色の固形物として得た。LCMS: [M+1]: 268. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 10.05 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.70.7.68 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.57-7.52 (m, 2H), 7.38-7.35 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.27-7.23 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 5.52 (s, 1H), 3.36-3.32 (m, 2H), 2.05(s, 3H)および1.10-1.07 (t, J = 7.0 Hz, 3H)。
【０３８６】
実施例２１：酢酸２−アセトアミド−９Ｈ−フルオレン−９−イル（化合物１．０２２）の合成
【化８７】
2021501198.tif 000098
【０３８７】
化合物１．０２９（５０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．０当量）および４−ジメチルアミノピリジン（２．４４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、０．１当量）を酢酸／無水酢酸（１ｍＬ／１ｍＬ）に溶解した混合物を、７０℃で１６時間撹拌した。反応はＬＣＭＳで監視した。次に混合物を濾過し、水（２ｍＬ）を加えて、酢酸エチル（２ｍＬで３回）で抽出した。次に、混合物をメタノールで洗浄して、化合物１．０２２（８ｍｇ、１４％）を白色の固形物として得た。LCMS: [M+23]: 304. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 10.07 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.73-7.71 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.65-7.63 (dd, J = 8.4 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.51-7.49 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.42-7.39 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.27-7.23 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.66 (s, 1H), 2.14-2.12 (d, J = 4.8 Hz, 3H) および2.03 (s, 3H)。
【０３８８】
実施例２２：Ｎ−（９−エトキシ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．０２３）の合成
【化８８】
2021501198.tif 000099
【０３８９】
化合物１．０１０は、実施例１０の説明ように調製した。化合物１．０１０（１００ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ、１．０当量）、酸化銀（２４７ｍｇ、１．０６８ｍｍｏｌ、３．０当量）、およびヨウ化エチル（１６６ｍｇ、１．０６８ｍｍｏｌ、３．０当量）を１，２−ジクロロエタン（１０ｍＬ）に溶解した混合物を、６５℃で１６時間撹拌した。反応はＬＣＭＳで監視した。次にこの混合物を濾過した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥させて、減圧濃縮した。残留物を分取ＴＬＣにより精製して、化合物１．０２３（１３ｍｇ、１２％）を白色の固形物として得た。TLC: 石油エーテル: 酢酸エチル, 5:1, UV 254 nm. Rf: (化合物1.010) = 0.1; Rf: (化合物1.023) = 0.5. LCMS: [M+1]: 310. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 9.29 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.72-7.67 (m, 3H), 7.54-7.53 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.38-7.34 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.27-7.23 (td, J = 7.4 Hz, 0.8 Hz, 1H), 5.51 (s, 1H), 3.42-3.35 (m, 2H), 1.23(s, 9H)および1.18-1.07 (m, 3H)。
【０３９０】
実施例２３：２−ピバル酸アミド−９Ｈ−フルオレン−９−イル酢酸（化合物１．０２４）の合成
【化８９】
2021501198.tif 000100
【０３９１】
化合物１．０１０を、実施例１０の説明のように調製した。化合物１．０１０（５０ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ、１．０当量）および４−ジメチルアミノピリジン（２１．７ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ、１．０当量）を酢酸／無水酢酸（３ｍＬ／３ｍＬ）に溶解した混合物を、７０℃で１６時間撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次に混合物を濾過し水（５ｍＬ）を加えて、酢酸エチル（５ｍＬで３回）で抽出した。続いて混合物をメタノールで洗浄して、化合物１．０２４（２３ｍｇ、４０％）を白色の固形物として得た。TLC: 石油エーテル: 酢酸エチル, 5:1, UV 254 nm. Rf: (化合物1.010) = 0.1; Rf: (化合物1.024) = 0.4. LCMS: [M-1]: 322. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 9.34 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.74-7.73 (m, 3H), 7.51-7.49 (m, 1H), 7.41 (m, 1H), 7.26 (m, 1H), 6.68 (s, 1H), 2.15 (s, 3H)および1.22 (s, 9H)。
【０３９２】
実施例２４：Ｎ−（９−メトキシ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．０２５）の合成
【化９０】
2021501198.tif 000101
【０３９３】
化合物１．０１０は、実施例１０の説明のように調製した。化合物１．０１０（５０ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ、１．０当量）、酸化銀（１２３．７ｍｇ、０．５３４ｍｍｏｌ、３．０当量）、およびヨウ化エチル（３８ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ、１．５当量）を１，２−ジクロロエタン（１０ｍＬ）に溶解した混合物を、４０℃で１６時間撹拌した。反応はＬＣＭＳで監視した。次にこの混合物を濾過した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残留物を分取ＴＬＣにより精製して、化合物１．０２５（６．６ｍｇ、１２．５％）を白色の固形物として得た。TLC: 石油エーテル: 酢酸エチル, 5:1, UV 254 nm. Rf:  (化合物1.010) = 0.1; Rf: (化合物1.025) = 0.5. LCMS: [M+23]: 318. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 9.29 (s, 1H), 7.95 (m, 1H), 7.72-7.70 (m, 3H), 7.54-7.53 (m, 1H), 7.38-7.36 (m, 1H), 7.28-7.27 (m, 1H), 5.51 (s, 1H), 3.09 (s, 3H)および1.30-1.23 (m, 9H)。
【０３９４】
実施例２５：Ｎ−（９−シアノ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．０２６）の合成
【化９１】
2021501198.tif 000102
【０３９５】
化合物２１．１（５２．４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１．５当量）をエタノール（５ｍＬ）に溶解した混合物に、ｔＢｕＯＫ（３０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、室温で５分間撹拌した。この混合物に、実施例５の説明のように調製された化合物１．００５（５０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）を加えた。この混合物を、室温で２時間、窒素雰囲気で撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次に混合物を濾過して、水（２０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２０ｍＬで３回）で抽出した。有機層を塩水で洗浄した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残留物を分取ＴＬＣにより精製して、化合物１．０２６（２０ｍｇ、３８％）を白色の固形物として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 8.80 (s, 1H), 7.68-7.58 (m, 4H), 7.53-7.33 (m, 4H), 4.56 (s, 1H)および1.31 (s, 9H)。
【０３９６】
実施例２６：二酢酸９−オキソ−９Ｈ−フルオレン−２，７−ジイル（化合物１．０２７）の合成
【化９２】
2021501198.tif 000103
【０３９７】
化合物２２．１（５０ｍｇ、０．２３６ｍｍｏｌ、１．０当量）、無水酢酸（９６．２８ｍｇ、０．９４４ｍｍｏｌ、４．０当量）、および４−ジメチルアミノピリジン（２．８７９ｍｇ、０．０２３６ｍｍｏｌ、０．１当量）をピリジン（１０ｍＬ）に溶解した混合物を、室温で５分間撹拌した。反応はＬＣＭＳで監視した。次にこの混合物を濾過し、水（５ｍＬ）を加えて酢酸エチル（５ｍＬで３回）で抽出した。次に混合物を１ＮのＨＣｌで洗浄した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、黄色の固形物として化合物１．０２７（５．３ｍｇ、７．５％）を得た。LCMS: [M+42]: 338. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 8.85-7.83 (m, 1H), 7.41-7.42 (m, 2H), 7.39-7.37 (m, 2H)および 2.30 (s, 6H)。
【０３９８】
実施例２７：Ｎ−（９−（ヒドロキシイミノ）−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ピバル酸アミド（化合物１．０２８）の合成
【化９３】
2021501198.tif 000104
【０３９９】
化合物１．００５を実施例５の説明のように調製した。化合物１．００５（２００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）をエタノール（５ｍＬ）に溶解した混合物に、化合物２２．１（１００ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。この混合物を、窒素雰囲気で１６時間、還流しながら撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次にこの混合物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残留物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物１．０２８（１５０ｍｇ、７１％）を白色の固形物として得た。TLC: 石油エーテル: 酢酸エチル, 2:1, UV 254 nm. Rf: (化合物1.005) = 0.4; Rf: (化合物1.028) = 0.2. LCMS: [M+42]: 336. 1H NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 8.58 (s, 1H), 7.67-7.62 (m, 4H), 7.34-7.32 (m, 1H), 7.24-7.22 (m, 1H), 4.56 (s, 1H)および1.30 (s, 9H)。
【０４００】
実施例２８：ピバリン酸９−ヒドロキシ−９Ｈ−フルオレン−２−イル（化合物１．０３０）の合成
【化９４】
2021501198.tif 000105
【０４０１】
化合物２４．１（１００ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（１６２ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ、３．０当量）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した混合物を、０℃に冷却し、化合物２４．２（７４ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。得られた混合物を、０℃から室温まで一晩で攪拌した。反応混合物の進行は、ＴＬＣで監視した。反応が完了した後に、混合物を濾過し、水（１５００ｍＬ）で希釈し、次にジクロロメタン（１００ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残留物を分取ＴＬＣ（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝１０：１）により精製して、化合物２４．３（１０５ｍｇ、７３％）を黄色の固形物として得た。
【０４０２】
化合物２４．３（１０５ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ、１．０当量）のメタノール溶液（５ｍＬ）に、水素化ホウ素ナトリウム（１７ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、１．２当量）を窒素雰囲気で加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物の進行は、ＴＬＣで監視した。反応が完了した後、混合物を減圧濃縮して、残留物を分取ＴＬＣ（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝１０：１）により精製した。所望の化合物１．０３０を、１９％の収率で、２０．１ｍｇの黄色の固形物として得た。TLC:ヘキサン/ 酢酸エチル(10:1)。Rf: (化合物24.3) = 0.5; Rf: (化合物1.030) = 0.3; LC-MS: 281.00 [M-1]-. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.64 - 7.57 (m, 3H), 7.40 - 7.27 (m, 3H), 7.08 - 7.03 (m, 1H), 5.55 (s, 1H), 3.46 (s, 1H), 1.36 (s, 9H)。
【０４０３】
実施例２９：Ｎ−（９−ヒドロキシ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボキサミド（化合物１．０３１）の合成
【化９５】
2021501198.tif 000106
【化９６】
2021501198.tif 000107
【０４０４】
化合物２５．１（１６０ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ、１．０当量）を塩化チオニル（５ｍＬ）に溶解した混合物を、８５℃で２時間、窒素雰囲気で還流した。反応はＴＬＣで監視した。次にこの混合物を水で希釈して濾過し、水で洗浄した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して化合物２５．２（１６０ｍｇ、粗製物）を得て、それをさらに精製することなく次の工程で直接使用した。
【０４０５】
化合物２５．３（１９０ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（４３６．７２ｍｇ、４．１２ｍｍｏｌ、４．０当量）を無水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解した混合物に、化合物２５．２（１６０ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ、１．２当量）を０℃で加えた。この混合物を窒素雰囲気中で、室温で一晩攪拌した。反応はＬＣＭＳで監視した。次に混合物を水で希釈し、濾過して、水で洗浄した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して、化合物２５．４（２６０ｍｇ、粗製物）を黄色の固形物として得た。TLC: 石油エーテル:酢酸エチル, 5:1, UV 254 nm. Rf: (化合物25.3) = 0.5, Rf: (化合物25.4) = 0.45。
【０４０６】
化合物２５．４（１５０ｍｇ、０．４８８ｍｍｏｌ、１．０当量）をメタノール（５ｍＬ）に溶解した混合物に、０℃で水素化ホウ素ナトリウム（９２．３２ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ、４．５当量）を加えた。この混合物を窒素雰囲気下、室温で５分間撹拌した。反応をＴＬＣで監視した。混合物に水を加え、それを濾過して水で洗浄した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１．０３１（７３ｍｇ、４８％）を白色の固形物として得た。TLC: 石油エーテル: 酢酸エチル, 5:1, UV 254 nm. Rf: (化合物25.4) = 0.6; Rf: (化合物1.031) = 0.2. LCMS: [M+1]: 310. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 9.57 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.63 (m, 2H), 7.57 (m, 1H), 7.50 (m, 1H), 7.33-7.29 (m, 1H), 7.24-7.20 (m, 1H), 5.40 (s, 1H), 4.02-3.99 (m, 2H), 3.52-3.46 (m, 1H), 1.91-1.81 (m, 2H)および1.56-1.43 (m, 4H)。
【０４０７】
実施例３０：４−ヒドロキシ−Ｎ−（９−ヒドロキシ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）ベンズアミド（化合物１．０３２）の合成
【化９７】
2021501198.tif 000108
【０４０８】
化合物２６．１（２１６ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１．０当量）を塩化チオニル（２ｍＬ）に溶解した混合物を、８０℃で１時間、窒素雰囲気で撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次にこの混合物をメタノールで反応停止した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して、化合物２６．２（２４５ｍｇ、粗製物）を淡黄色の油分として得て、これをさらに精製することなく次の工程で直接使用した。
【０４０９】
化合物２６．３（１９５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（５３０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ、５．０当量）を無水テトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解した混合物に、化合物２６．２（２３８．２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１．２当量）を０℃で加えた。この混合物を、室温で２時間、窒素雰囲気で撹拌した。反応はＬＣＭＳで監視した。次に混合物を濾過し、濾液を減圧濃縮して化合物２６．４（５３０ｍｇ、粗製物）を淡黄色の固形物として得て、これをさらに精製することなく次の工程で直接使用した。
【０４１０】
化合物２６．４（５３０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、１．０当量）のテトラヒドロフラン溶液（５ｍＬ）に、炭酸カリウム（２７６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。この混合物を、室温で一晩、窒素雰囲気で攪拌した。反応はＬＣＭＳで監視した。次に懸濁液を濾過し、濾液を減圧濃縮して化合物２６．５（４００ｍｇ、粗製物）を赤色の固形物として得て、これをさらに精製することなく次の工程で直接使用した。
【０４１１】
化合物２６．５（４００ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、１．０当量）をメタノール（５ｍＬ）に溶解した混合物に、０℃で水素化ホウ素ナトリウム（１２９ｍｇ、３．８１ｍｍｏｌ、３．０当量）を加えた。この混合物を、室温で４時間、窒素雰囲気で撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。この溶液を、酸性分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１．０３２（８６．７ｍｇ、２１％）を白色の固形物として得た。LCMS: [M+1]: 318。1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 10.07-10.05 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 8.06 (s, 1H), 7.84 (m, 2H), 7.60 (m, 3H), 7.52 (m, 1H), 7.31 (m, 1H), 7.21 (m, 1H), 6.85-6.83 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.82-5.80 (d, J = 7.6 Hz, 1H)およびd 5.44-5.42 (d, J = 7.6 Hz, 1H)。
【０４１２】
実施例３１：３−（９−ヒドロキシ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）−１，１−ジメチル尿素（化合物１．０３３）の合成
【化９８】
2021501198.tif 000109
【０４１３】
化合物２７．１（２００ｍｇ、１．０２６ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物２７．２（２２０ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ、２．０当量）、４−ジメチルアミノピリジン（１２５ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、１．０当量）、およびピリジン（３２４ｍｇ、４．１ｍｍｏｌ、４．０当量）を、攪拌棒および隔壁を備えた反応管に空気中で連続的に加えた。ジクロロメタン（１０ｍＬ）をシリンジで加えて、得られた混合物を周囲温度で２４時間激しく撹拌した。この後に、フラスコの内容物を酢酸エチルで抽出した。得られた溶液を、シリカゲルおよび無水硫酸マグネシウムの充填物を通して濾過して、次いで回転式蒸発により濃縮した。ヘキサン／酢酸エチルで溶出するフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して、化合物２７．３（１５０ｍｇ、５５％）を得た。TLC:石油エーテル:酢酸エチル, 2:1, UV 254 nm Rf: (化合物27.1) = 0.5; Rf: (化合物27.3) = 0.2。
【０４１４】
化合物２７．３（１２０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、１．０当量）をメタノール（５ｍＬ）に溶解した混合物に、０℃で水素化ホウ素ナトリウム（６８．６ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ、４．０当量）を加えた。この混合物を、室温で１時間、窒素雰囲気で撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次に混合物に水を加え、濾過して水で洗浄した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残留物をメタノールで洗浄して、化合物１．０３３（４６ｍｇ、８１％）を白色の固形物として得た。TLC:石油エーテル:酢酸エチル, 3:1, UV 254 nm. Rf: (化合物27.3) = 0.5; Rf: (化合物1.033) = 0.3. LCMS: [M+1]: 269. 1H NMR (d6-DMSO, 400 MHz): δ 8.33 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.55 (m, 2H), 7.50-7.48 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.44-7.43 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.42-7.41 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.29-7.27 (m, 1H), 7.21-7.19 (m, 1H), 5.74-5.72 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.38-5.36 (d, J = 7.6 Hz, 1H)および2.91 (s, 6H)。
【０４１５】
実施例３２：２，２，２−トリクロロ−Ｎ−（９−ヒドロキシ−９Ｈ−フルオレン−２−イル）アセトアミド（化合物１．０３４）の合成
【化９９】
2021501198.tif 000110
【０４１６】
化合物２７．１（１５０ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（３２６ｍｇ、３．０８ｍｍｏｌ、４．０当量）を無水テトラヒドロフラン（６ｍＬ）に溶解した混合物に、化合物２８．１（２７７ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ、２．０当量）を０℃で加えた。この混合物を、室温で１０分間、窒素雰囲気で撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次に混合物を水で希釈し、濾過して水で洗浄した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して化合物２８．２（１５０ｍｇ、５８％）を白色の固形物として得た。TLC:石油エーテル:酢酸エチル, 2:1, UV 254 nm, Rf: (化合物27.1) = 0.4; Rf: (化合物28.2) = 0.6。
【０４１７】
化合物２８．２（１５０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、１．０当量）をメタノール（５ｍＬ）に溶解した混合物に、水素化ホウ素ナトリウム（６８ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、４．０当量）を加えた。この混合物を、室温で１時間、窒素雰囲気で撹拌した。反応はＴＬＣで監視した。次に混合物を飽和塩化アンモニウムで反応停止し、水で希釈し、濾過して水で洗浄した。残留物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して化合物１．０３４（４５ｍｇ、３０％）を白色の固形物として得た。LCMS: [M+1]: 343。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 10.86 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.77-7.71 (dd, J = 16.0 Hz 8.0 Hz, 2H), 7.62-7.60 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.55-7.54 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.35-7.33 (m, 1H), 7.29-7.27 (m, 1H), 5.88-5.86 (d, J = 7.6 Hz, 1H)および 5.47-5.45 (d, J = 7.6 Hz, 1H)。
【０４１８】
実施例３３：式Ｉの化合物を用いた、非動員末梢血に由来する造血幹細胞の単離および増殖
【０４１９】
この実施例では、式Ｉの化合物を用いた培養でのＨＳＣの増殖を示す。
【０４２０】
材料および方法
ＣＤ３４＋細胞は、ドナーの末梢血から単離された。フィコール・パク（ficoll paque）を使用した標準的なバフィーコート（buffy coat）の分離を行った。細胞をペレットにして、非標識ＣＤ６４抗体により培養した。次にこれら細胞に、ビオチン化したＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ２３５を用いて（例によっては、ＣＤ１５、ＣＤ２５、および他の系統特異抗体を用いてもよい）、陰性細胞の除去を実施した。これらの抗体に結合する細胞は、ストレプトアビジン・ビーズを用いて除去される。その後、濃縮された前駆細胞の蓄積物に、ＣＤ３４＋の細胞選別を実施する。
【０４２１】
単離されたＣＤ３４＋細胞を、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むフェノールレッド不含のα−ＭＥＭの生体外培養培地で培養した。式Ｉの化合物を試験する際には、２つの内部対照：陽性対照（＋ＳＦ条件）および基準対照（すなわち基本条件である「サイトカインのみ」）が用いられた。試験された化合物に用いた培地成分および濃度を表２に示す。培養には、雑菌混入を避けるように、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンＢを含む抗生物質溶液も含まれていた。得られる試料の増殖量は個体毎に異なるので、対照を含むようにした。
【０４２２】
【表２】
2021501198.tif 000111
【０４２３】
培養物を、（窒素により制御された）３％酸素および５％ＣＯ2で増殖した。
【０４２４】
小分子成分を、培地の再活性の必要がある度に、個別に新規に加えた。サイトカインを同時に供給してもよい。培地の更新は、少なくとも数日毎に行う必要がある。
【０４２５】
表示日に、細胞培養容量の半分をデータ解析（BD FACS ARIA IIを使用したフローサイトメトリー）のために取り出した。培養容量には、試験条件に従って、新鮮な培地が補充された。測定データには、この手順で導入された希釈要因を考慮に入れる。
【０４２６】
試験化合物（化合物１．００１〜１．０２３）それぞれについて、個別に実験を行った。
【０４２７】
結果
化合物１．００１〜１．０２３の増殖効果を、図１〜図２３に示す。各図のグラフは、２日目から７日目までの細胞の倍率変化を示している。図の各縦棒は、試験した式Ｉの化合物の表示濃度での細胞の倍率変化を示している。細い破線は、基本条件（すなわちサイトカインのみ）での増殖効果を示し、太い破線は、＋ＳＦ条件（５００ｎＭのＳＦ１６７０）の増殖効果を示す。纏めると、これらデータは、式Ｉの化合物が培養中のＨＳＣの増殖にプラスの効果をもたらすことを示している。
【０４２８】
以下の表３は、表示濃度での化合物１．００１〜１．０２３（試料化合物）の相対増殖効果を纏めたものである。表３中のデータは、相対増殖効果として示されている。相対増殖効果は、図１〜図２３のそれぞれに示される倍数変化の正規化された数値であり、それは以下のように計算される。
（「試料化合物」での倍率変化−「基本条件」での倍率変化）／（「＋ＳＦ条件」での倍率変化−「基本条件」での倍率変化）＝相対倍率変化
【０４２９】
【表３】
2021501198.tif 000112
【０４３０】
表３に示されるＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞における式Ｉの化合物の相対増殖効果についての表示値（例えば、＋、＋＋、および＋＋＋）は、以下に示す通りであり、「ｘ」は相対倍率変化の計算値である。
【０４３１】
【表４】
2021501198.tif 000113
【０４３２】
実施例３４：式Ｉの化合物を用いた、培養中の臍帯血に由来する造血幹細胞の増殖
【０４３３】
この実施例では、化合物１．００８の存在で培養した場合の臍帯血由来の造血幹細胞の培養を説明する。培養中のＨＳＣの数は、生体外培養で１９日間まで連続的に増加する。
【０４３４】
材料および方法
凍結した臍帯血試料を解凍し、徐々に室温に戻した。解凍された臍帯血を、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むフェノールレッド不含のα−ＭＥＭの生体外培養培地で培養した。基本条件、＋ＳＦ条件、＋１．００８条件、および＋１．００８／＋ＥＲ条件の４種の試料を試験した。各条件に含まれる成分を表４に示す。試験条件ではそれぞれ、雑菌混入を避けるように、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンＢを含む抗生物質溶液を含んだ。
【０４３５】
【表５】
2021501198.tif 000114
【０４３６】
培養物を（窒素により制御された）３％酸素および５％ＣＯ2で増殖した。
【０４３７】
小分子成分を、培地の再活性の必要がある度に、個別に新規に加えた。サイトカインを同時に供給してもよい。培地の更新は、少なくとも数日毎に行う必要がある。
【０４３８】
表示日に、細胞培養の異なる量をデータ解析（BD FACS ARIA IIを用いるフローサイトメトリー）のために、かつ細胞の過度の集積を避けるように取り出した。培養容量には、試験条件に従って、新鮮な培地が補充された。測定データには、この手順で導入された希釈要因を考慮に入れる。
【０４３９】
結果
＋１．００８条件のフローサイトメトリー分析は、造血幹細胞が維持され、培養の１９日後でさえも増殖し続けることを示している（図２４Ａ〜Ｅ）。事実、図２５Ａ〜Ｅは、＋１．００８の存在で培養された臍帯血試料での培養１９日後に、ＣＤ３４＋細胞（図２５Ｂ）およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図２５Ｃ）では２日目に対し５０倍を超える増加があり、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図２５Ｄ）では２日目に対し約２０倍の増加があり、かつＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞（図２５Ｅ）では２日目に対し１２倍を超える増加があることを示している。これらの増加の程度は、ＥＲ５０８９１の添加によりさらに向上する。
【０４４０】
実施例３５：式Ｉの化合物を用いた、臍帯血由来の造血幹細胞の増殖
【０４４１】
材料および方法
臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞は、STEMCELL Technologies社から購入した。初代ヒトＣＤ３４＋細胞は、陽性免疫磁気分離法を用いて臍帯血試料から単離された。細胞を解凍し、徐々に室温に戻した。試料を洗浄して、次にＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、およびＩＬ−６のそれぞれ１００ｎｇ／ｍＬを添加したStemSpanで一晩培養した。１８〜２４時間後（１日目）に、細胞を計数し、（Invitrogen Attune NxT cytometerでのフローサイトメトリーにより）免疫表現型を判定した。
【０４４２】
約１０００個の生細胞を９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに播種した。ウェル毎に分注された正確な細胞数を、その後の計算に向けてフローサイトメトリーで定量した。
【０４４３】
式Ｉの化合物を試験する培地は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清を含むフェノールレッド不含のα−ＭＥＭを用いて調製した。培養条件には、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢを含む抗生物質溶液も含まれ、雑菌混入を回避した。試験化合物に用いた追加培地成分および濃度を、表５に示す。
【０４４４】
【表６】
2021501198.tif 000115
【０４４５】
化合物１．００５、１．００６、１．００７、１．００８、１．００９、１．０１０、１．０１３、１．０１４、１．０１５、１．０２１、１．０２２、１．０２３、１．０２４、１．０２５、１．０２６、１．０２７、１．０２８、および１．０２９は、０．５、２、および８μＭの２個のウェルで試験した。化合物１．０３０〜１．０３５は、０．１、０．３１６、１．０、３．１６、および１０μＭの３個のウェルで試験した。化合物１．０３６は、０．１４９、０．３１０、０．６４７、１．３５１、２．８１９、および１０μＭの２個のウェルで試験した。化合物１．０３７は、０．２５３、０．５２７、１．１００、２．２９６、４．７９２、および１０μＭの1個のウェルで試験した。
【０４４６】
この実験での全ての培養は、（窒素で制御される）３％酸素および５％ＣＯ2で実施した。７日間の培養後に、ウェルから細胞を採取し、表現型を分析した（Invitrogen Attune NxT cytometerでのフローサイトメトリー）。
【０４４７】
結果
化合物１．００５、１．００６、１．００７、１．００８、１．００９、１．０１０、１．０１３、１．０１４、１．０１５、１．０２１、１．０２２、１．０２３、１．０２４、１．０２５、１．０２６、１．０２７、１．０２８、１．０２９、１．０３０、１．０３１、１．０３２、１．０３３、１．０３４、１．０３５、１．０３６、および１．０３７の増殖効果を、図２６〜図５１に示す。
【０４４８】
各図のグラフは、１日目に対する７日目の細胞の倍率変化を示す。図中のそれぞれの点は、試験した式Ｉの化合物の表示濃度での増殖数の平均倍率変化を示している。エラーバーは、その濃度で測定された倍率変化の最大および最小を表示する。破線は、基本条件（すなわちサイトカインのみ）の増殖効果を示す。纏めると、これらデータは、式Ｉの化合物での処理により、培養中の臍帯血由来のＨＳＣにプラスの増殖効果をもたらすことを示している。
【０４４９】
以下の表６は、表示濃度で試験した化合物の相対増殖効果を纏めたものである。表６のデータは、相対増殖効果が示されている。相対増殖効果とは、それぞれの図に示される倍数変化を正規化した値である。この値は、以下のように計算される。
（試料化合物の倍率変化）／（基本条件の倍率変化）＝相対倍率変化
【０４５０】
【表７】
2021501198.tif 000116
【０４５１】
表６に示されるＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞での式Ｉの化合物の相対増殖効果についての表示値（例えば、＋、＋＋、および＋＋＋）は、以下に示す通りであり、「ｘ」は相対倍率変化の計算値である。
【０４５２】
【表８】
2021501198.tif 000117
【０４５３】
実施例３６：式Ｉの化合物を用いた、動員末梢血、非動員末梢血、および臍帯血由来の造血幹細胞の長期増殖。
【０４５４】
この実施例は、様々な供給源に由来するＨＳＣを用いて、２１日間の培養での造血幹細胞の増加および増殖を示す。
【０４５５】
材料および方法
動員末梢血由来のＣＤ３４＋細胞は、STEMCELL Technologies社から購入した。ボランティアのドナーからの血液は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を用いて動員された。ボランティアは、採取前の３〜５日間、最大１０μｇ／ｋｇ／日のＧ−ＣＳＦを投与された。初代ヒトＣＤ３４＋細胞は、陽性免疫磁気分離法を用いて、動員末梢血の白血球除去試料から単離された。
【０４５６】
臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞は、STEMCELL Technologies社から購入した。初代ヒトＣＤ３４＋細胞は、陽性免疫磁気分離法を用いて、臍帯血試料から単離された。
【０４５７】
非動員末梢血由来のＣＤ３４＋細胞は、STEMCELL Technologies社から購入した。初代ヒトＣＤ３４＋細胞は、陽性免疫磁気分離法を用いて、血液試料から単離された。
【０４５８】
各供給源からの凍結保存されたＣＤ３４＋細胞試料を解凍し、徐々に室温に戻した。試料を洗浄し、その後ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、およびＩＬ−６をそれぞれ１００ｎｇ／ｍＬ有するStemSpanで一晩培養した。
【０４５９】
培養物を、（窒素により制御した）３％酸素および５％ＣＯ2で増殖した。
【０４６０】
２４時間後（１日目）に、細胞を計数し、免疫表現型を判定した（Invitrogen Attune NxT cytometerによるフローサイトメトリー）。試験した化合物に用いた培地成分と濃度を表７に示す。培養条件にはまた、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンＢを含む抗生物質溶液を含み、雑菌混入を避けた。約１０００個の細胞を、臍帯血および動員末梢血のフラスコ（５ｍＬの総容量）または９６ウェルプレートのウェル（２００μＬの総容量）のそれぞれに加えた。約２０００個の細胞を、非動員末梢血のフラスコ（５ｍＬの総容量）または９６ウェルプレートのウェル（２００μＬの総容量）のそれぞれに加えた。条件ごとに分注された正確な細胞数を、１日目に対する倍数変化のその後の計算のために定量した。
【０４６１】
ウェルを７日目および１０日目に分析し、フラスコを培養の１４日目および２１日目に分析した。細胞数および表現型を、フローサイトメトリーで定量した。１４日目に、１日目と同様にフラスコを新規の条件に調製し、細胞を新規のフラスコ内に１：２０で分割した。さらに７日後（培養の２１日目）に、細胞数および表現型を、再度フローサイトメトリーで定量した。２１日目に計算された細胞数は、細胞の継代を考慮している。
【０４６２】
【表９】
2021501198.tif 000118
【０４６３】
９６ウェルプレートの条件は四連で調製し、フラスコの条件は二連で調製した。上記の培養日数で、ウェルまたはフラスコから細胞を採取して、表現型を分析した（Invitrogen Attune NxT cytometerでのフローサイトメトリー）。
【０４６４】
結果
＋１．０１０条件のフローサイトメトリー分析は、種々の供給源からの造血幹細胞が維持され、培養の２１日目まで増殖が継続することを示している（図５２〜図５４を参照）。事実、図５２は、臍帯血では、ＣＤ３４＋細胞の３００倍を超える増殖（図５２Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞の６００倍を超える増殖（図５２Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の１０００倍を超える増殖（図５２Ｄ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞の１５００倍を超える増殖（図５２Ｅ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞の２００倍を超える増殖（図５２Ｆ）が見られることを示している。動員末梢血（図５３）では、ＣＤ３４＋細胞の２０倍を超える増殖（図５３Ｂ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞の４０倍を超える増殖（図５３Ｃ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞の６０倍を超える増殖（図５３Ｄ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞の６０倍を超える増殖（図５３Ｅ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞の３０倍を超える増殖（図５３Ｆ）が見られる。非動員末梢血（図５４）では、ＣＤ３４＋細胞の９倍を超える増殖（図５４Ｂ）、ＣＤ１３３＋細胞の４０倍を超える増殖（図５４Ｃ）、ＣＤ９０＋細胞の６０倍を超える増殖（図５４Ｄ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ３８低／−細胞の２００倍を超える増殖（図５４Ｅ）、およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞の３０倍を超える増殖（図５４Ｆ）が見られる。いずれの場合でも、化合物１．０１０による増殖は、サイトカインのみによる増殖をはるかに上回る。
【０４６５】
実施例３７：式Ｉの化合物を用いた、大気Ｏ2での造血幹細胞の増殖
【０４６６】
この実施例は、式Ｉの化合物を用いた大気酸素での造血幹細胞の増加および増殖を示す。
【０４６７】
材料および方法
臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞は、STEMCELL Technologies社から購入した。初代ヒトＣＤ３４＋細胞を、陽性免疫磁気分離法を用いて臍帯血試料から分離した。細胞を解凍し、徐々に室温まで戻した。試料を洗浄後に、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、およびＩＬ−６を有するStemSpan SFEMで一晩培養した。
【０４６８】
培養物を、大気酸素（約２０％）および５％ＣＯ2で増殖した。
【０４６９】
１８時間後（１日目）に、細胞を計数して免疫表現型を判定した（Invitrogen Attune NxT cytometerでのフローサイトメトリー）。培地は、StemSpan SFEMを用いて調製し、試験化合物に用いられた追加成分および濃度を、表８に示す。培養条件にはまた、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンＢを含む抗生物質溶液を含み、雑菌混入を避けた。それぞれの条件の５ｍＬを、２５ｃｍ2フラスコに加えた。フラスコにぞれぞれ、約１０００個の細胞を加え、フラスコ当たりの正確な細胞数を、１日目に対する倍数変化のその後の計算のために定量した。
【０４７０】
９日目の培養で、細胞数および表現型をフローサイトメトリーで定量した。
【０４７１】
【表１０】
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【０４７２】
条件は二連で調製した。
【０４７３】
結果
＋１．０１０条件のフローサイトメトリー分析は、大気酸素で９日間培養した際に、化合物１．０１０が造血幹細胞にプラスの増殖効果を持つことを示している。事実、図５５は、ＣＤ３４＋細胞の１５０倍を超える増殖（図５５Ｂ）、ならびにＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞（図５５Ｃ）およびＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋細胞（図５５Ｄ）の両方の２００倍を超える増殖を示している。
【０４７４】
上述の発明を、理解を深める目的で、例証および実施例を通してある程度詳細に説明してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および改変を実施してもよいことを認識している。さらに本明細書内に提示されるそれぞれの参考文献は、そのそれぞれの参考文献が個々に参照により組み込まれたものと見做して、その全体が同程度に参照により組み込まれている。本出願と本明細書内に提示される参考文献との間に矛盾が存在する場合には、本出願が優先するものとする。
【図１Ａ−Ｄ】
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【図２Ａ−Ｄ】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図５Ａ−Ｄ】
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【図６Ａ−Ｄ】
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【図７Ａ−Ｄ】
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【図８Ａ−Ｄ】
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【図９Ａ−Ｄ】
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【図１０Ａ−Ｄ】
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【図１１Ａ−Ｄ】
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【図１２Ａ−Ｄ】
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【図１３Ａ−Ｄ】
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【図１４Ａ−Ｄ】
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【図１５Ａ−Ｄ】
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【図１６Ａ−Ｄ】
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【図１７Ａ−Ｄ】
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【図１８Ａ−Ｄ】
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【図１９Ａ−Ｄ】
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【図２０Ａ−Ｄ】
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【図２１Ａ−Ｄ】
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【図２２Ａ−Ｄ】
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【図２３Ａ−Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６Ａ−Ｄ】
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【図２７Ａ−Ｄ】
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【図２８Ａ−Ｄ】
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【図２９Ａ−Ｄ】
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【図３０Ａ−Ｄ】
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【図３１Ａ−Ｄ】
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【図３２Ａ−Ｄ】
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【図３３Ａ−Ｄ】
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【図３４Ａ−Ｄ】
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【図３５Ａ−Ｄ】
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【図３６Ａ−Ｄ】
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【図３７Ａ−Ｄ】
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【図３８Ａ−Ｄ】
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【図３９Ａ−Ｄ】
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【図４０Ａ−Ｄ】
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【図４１Ａ−Ｄ】
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【図４２Ａ−Ｄ】
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【図４３Ａ−Ｄ】
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【図４４Ａ−Ｄ】
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【図４５Ａ−Ｄ】
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【図４６Ａ−Ｄ】
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【図４７Ａ−Ｄ】
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【図４８Ａ−Ｄ】
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【図４９Ａ−Ｄ】
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【図５０Ａ−Ｄ】
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【図５１Ａ−Ｄ】
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【図５２Ａ−Ｆ】
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【図５３Ａ−Ｆ】
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【図５４Ａ−Ｆ】
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【図５５Ａ−Ｄ】
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【国際調査報告】
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