(57)【要約】  創傷部位での瘢痕形成は、該創傷部位をプルランヒドロゲル中に配合された有効用量の接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）の阻害剤と接触させる事によって低減される。ＦＡＫ阻害剤の放出プロファイルは、創傷の性質、例えば、切除創、熱傷創等に応じて調節され得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質足場と、
前記足場の細孔内に配置された接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤と、
を含む、組織治癒を促進する組成物であって、前記組成物は、治療時間の間に制御された速度で組織治癒を促進するのに有効な用量のＦＡＫ阻害剤を送達する様に構成されている、組成物。
【請求項２】
前記多孔質足場は、ヒドロゲルフィルムを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記多孔質足場は、プルラン−コラーゲンヒドロゲルを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＦＡＫ阻害剤は、ＶＳ−６０６２（ＰＦ−５６２２７１）又はＰＦ−５６２２７１のベンゼンスルホン酸塩を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、約１μｇ／ｃｍ２〜約５００μｇ／ｃｍ２の前記ＦＡＫ阻害剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、約４０μｇ／ｃｍ２〜約２００μｇ／ｃｍ２の前記ＦＡＫ阻害剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、前記足場の細孔内に配置された前記ＦＡＫ阻害剤の持続放出の為に構成されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、前記足場の細孔内に配置された前記ＦＡＫ阻害剤の最大約９６時間の期間に亘る持続放出の為に構成されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、前記多孔質足場の形成の間の前記ＦＡＫ阻害剤の分子インプリンティングによって作製される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は更に、ＦＡＫ阻害剤の迅速放出の為に作製されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は更に、該組成物の送達表面上にＦＡＫ阻害剤を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は更に、該組成物の前記送達表面からのＦＡＫ阻害剤の迅速放出の為に構成されている、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、該組成物の送達表面からのＦＡＫ阻害剤の約２４時間以内での迅速放出の為に構成されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、前記治療時間の間に実質上全ての前記ＦＡＫ阻害剤を放出する様に作られている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、前記治療時間の間に約３０％の前記ＦＡＫＩ阻害剤から約７５％のＦＡＫ阻害剤迄を放出する様に作られている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、１つ以上の層が前記ＦＡＫ阻害剤の持続放出の為に作製され、１つ以上の層が前記ＦＡＫ阻害剤の迅速放出の為に作製されている複数の層を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、前記ＦＡＫ阻害剤の持続放出と前記ＦＡＫ阻害剤の迅速放出の両方の為に構成された層を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、前記治療時間の間に前記組織の瘢痕化を低減させるのに有効な用量の前記ＦＡＫ阻害剤を送達する様に構成されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、前記治療時間の間に前記組織における毛髪成長を促進するのに有効な用量の前記ＦＡＫ阻害剤を送達する様に構成されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、創傷ドレッシング材として構成されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
組織治癒を促進する方法であって、
前記組織の表面上に、多孔質足場と、前記足場の細孔内に配置された制御放出の為に作製された接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤とを含む組成物を載置する事、及び
前記組織の表面へと、治療時間の間に制御された速度で組織治癒を促進するのに有効な用量の前記ＦＡＫ阻害剤を送達する事、
を含む、方法。
【請求項２２】
前記多孔質足場は、ヒドロゲルフィルムを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒドロゲルは、プルラン−コラーゲンヒドロゲルを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
組織の瘢痕化を低減させる事を更に含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記組織における毛髪成長を促進する事を更に含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物は、創傷ドレッシング材として構成されている、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＦＡＫ阻害剤は、前記組成物の送達表面上に配置される、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記制御された速度は、迅速放出速度及び持続放出速度を含む、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記送達工程は、載置工程後約２４時間以内に前記用量の前記ＦＡＫ阻害剤を前記組織の表面に送達する事を含む、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記用量の前記ＦＡＫ阻害剤は、最大約９６時間の期間に亘って前記組織表面に送達される、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組織表面から前記組成物を取り除く事を更に含む、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記載置工程及び前記送達工程を少なくとも３回繰り返す事を更に含む、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記載置工程及び前記送達工程を少なくとも１０回繰り返す事を更に含む、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＦＡＫ阻害剤は、ＶＳ−６０６２（ＰＦ−５６２２７１）又はＰＦ−５６２２７１のベンゼンスルホン酸塩である、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物中の約３０％の前記ＦＡＫＩ阻害剤から前記組成物中の約７５％の前記ＦＡＫ阻害剤迄を前記組織に送達する事を更に含む、請求項２１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
創傷の治療の為の多孔質足場を含む組成物を製造する方法であって、
接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤、プルラン、コラーゲン、及びポロゲンを含む混合物を形成する事、並びに
前記ポロゲンを除去する及び／又は前記混合物を脱水する事により、多孔質足場の細孔内に配置された制御された薬物放出の為に作製された接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤を有する多孔質足場を含む組成物を作製する事と、
を含む、方法。
【請求項３７】
前記多孔質足場は、ヒドロゲルを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記多孔質足場は、プルラン及びコラーゲンヒドロゲルを含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物の表面上にＦＡＫ阻害剤を載置する事を更に含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記プルランを架橋する事を更に含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記プルランをトリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）及び／又はトリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）で架橋する事を更に含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記除去工程の前に前記ポロゲンを結晶化させる事を更に含む、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物は、ＦＡＫ阻害剤の不均一な分布を含む、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６７２，５１３号及び２０１９年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８４８，５１５号の利益を主張し、これらの各々の内容全体を、引用する事により本明細書に援用する。
【０００２】
（引用による援用）
本明細書で挙げられた全ての刊行物及び特許出願の内容全体を、各個別の刊行物又は特許出願が引用により援用されると具体的且つ個別に示された場合と同じ程度で、引用する事により本明細書に援用する。
【０００３】
（連邦政府による資金提供を受けた研究の記載）
本発明は、アメリカ国防総省により与えられた助成番号Ｗ８１ＸＷＨ−１３−２−００５２及びＷ８１ＸＷＨ−１３−２−００５４、アメリカ国立衛生研究所により与えられた助成番号ＤＥ０２６９１４、並びに米軍再生医療研究所（ＡＦＩＲＭ  ＤｏＤ）により与えられた助成番号ＷＦＵＨＳ４４１０１１ＳＲ０１による政府支援によりなされたものである。アメリカ合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００４】
（分野）
本開示は、一般に、創傷の治療及び創傷の組織治癒の促進に関する。特に、本明細書には、多孔質足場と、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤とを含む組成物、並びにその様な組成物を作製する方法及び使用する方法が記載されている。
【背景技術】
【０００５】
皮膚の瘢痕形成は、創傷及び瘢痕の治療に毎年数十億ドルが費やされる事をもって重大な医療負担を意味する。残念な事に、瘢痕を予防及び／又は治療する為の現在の方略は、根底にある病態生理学の包括的な理解が不足している為、殆ど成功に至っていない。本発明者等の研究室からの最近の報告により、肥厚性瘢痕（ＨＴＳ）形成に関連する生物学的過程の調節における機械的応力の重要性が実証された。これらの研究では、治癒中の切開に加えられた持続的な機械的負荷により線維化反応及びＨＴＳ形成がもたらされた。
【０００６】
この過程の主要な調節因子は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、即ち機械的シグナルを伝達して線維化反応を惹起する際に中心的な役割を担う細胞質チロシンキナーゼである。インテグリン−ＦＡＫ経路は又、様々な悪性腫瘍における腫瘍進行及び転移を媒介する。前臨床試験及び臨床試験において、ＦＡＫの薬理学的阻害剤が抗癌化学療法薬として浮上している。癌及び肥厚性瘢痕は、過増殖の線維増殖性事象及び細胞外基質修復事象がそれらの病因の根底にあるという点で類似点を共有している。
【０００７】
この文脈において、ＦＡＫは、抗瘢痕的な療法の為の興味をそそる潜在的に有望な標的でもある。ノックアウトマウスにおけるＦＡＫの線維芽細胞特異的欠失により、切開ＨＴＳモデルにおいて炎症及び線維症の大幅な低減が示された。しかしながら、ケラチノサイト限定ＦＡＫの欠損は、創傷慢性化に寄与すると思われる皮膚タンパク質分解の増加と関連していた。本発明者等の以前の研究では、局所皮下注射による小分子阻害剤によるＦＡＫの阻害は、ＨＴＳマウスモデルにおいて局所炎症反応を無効にし、瘢痕発生を減少させた。
【０００８】
前臨床試験及び臨床試験では、切開創及び切除創に応力遮蔽装置を使用する機械的歪みの負荷軽減は、大型動物及びヒトにおける瘢痕発生を抑止するのに有効である事が分かっている。しかしながら、機械的歪みを物理的に軽減するアプローチは、広範囲熱傷、外傷性爆傷、又は皮膚切除手術に起因する大面積の創傷には適用する事は出来ない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、薬理学的阻害剤の狙いを絞った制御放出を可能にする局所用の生体材料ベースのドレッシング材に緊急の必要性が存在する。特に瘢痕の回復の為の治癒を改善する方法は非常に興味深い。本発明はこれを扱っている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、創傷の治療及び創傷の組織治癒の促進に関する。特に、本明細書には、多孔質足場と、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤とを含む組成物、並びにその様な組成物を作製する方法及び使用する方法が記載されている。
【００１１】
本発明の一態様は、組織治癒を促進する為の組成物を提供する。幾つかの実施形態では、上記組成物は、多孔質足場を含み得る。幾つかの実施形態では、上記組成物は、足場の細孔内に配置された接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤を含み得る。幾つかの実施形態では、上記組成物は、治療時間の間に制御された速度で組織治癒を促進するのに有効な用量のＦＡＫ阻害剤を送達する様に構成される。
【００１２】
幾つかの実施形態では、多孔質足場は、ヒドロゲルフィルムを含む。幾つかの実施形態では、多孔質足場は、プルラン−コラーゲンヒドロゲルを含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、ＦＡＫ阻害剤は、ＶＳ−６０６２（ＰＦ−５６２２７１）又はＰＦ−５６２２７１のベンゼンスルホン酸塩を含む。幾つかの実施形態では、上記組成物は、約１μｇ／ｃｍ２〜約５００μｇ／ｃｍ２のＦＡＫ阻害剤を含む。幾つかの実施形態では、上記組成物は、約４０μｇ／ｃｍ２〜約２００μｇ／ｃｍ２のＦＡＫ阻害剤を含む。
【００１４】
幾つかの実施形態では、上記組成物は、足場の細孔内に配置されたＦＡＫ阻害剤の持続放出の為に構成されている。幾つかの実施形態では、上記組成物は、足場の細孔内に配置されたＦＡＫ阻害剤の最大約９６時間の期間に亘る持続放出の為に構成されている。
【００１５】
幾つかの実施形態では、上記組成物は、多孔質足場の形成の間のＦＡＫ阻害剤の分子インプリンティングによって作製される。幾つかの実施形態では、上記組成物は、ＦＡＫ阻害剤の迅速放出の為に作製されている。幾つかの実施形態では、上記組成物は、該組成物の送達表面上にＦＡＫ阻害剤を含む。幾つかの実施形態では、上記組成物は更に、該組成物の送達表面からのＦＡＫ阻害剤の迅速放出の為に構成されている。幾つかの実施形態では、上記組成物は、該組成物の送達表面からのＦＡＫ阻害剤の約２４時間以内での迅速放出の為に構成されている。
【００１６】
幾つかの実施形態では、上記組成物は、治療時間の間に実質上全てのＦＡＫ阻害剤を放出する様に作られている。幾つかの実施形態では、上記組成物は、治療時間の間に約３０％のＦＡＫＩ阻害剤から約７５％のＦＡＫ阻害剤迄を放出する様に作られている。
【００１７】
幾つかの実施形態では、上記組成物は、１つ以上の層がＦＡＫ阻害剤の持続放出の為に作製され、１つ以上の層がＦＡＫ阻害剤の迅速放出の為に作製されている複数の層を含む。幾つかの実施形態では、上記組成物は、ＦＡＫ阻害剤の持続放出とＦＡＫ阻害剤の迅速放出の両方の為に構成された層を含む。
【００１８】
幾つかの実施形態では、上記組成物は、治療時間の間に組織の瘢痕化を低減させるのに有効な用量のＦＡＫ阻害剤を送達する様に構成されている。幾つかの実施形態では、上記組成物は、治療時間の間に組織において毛髪成長を促進するのに有効な用量のＦＡＫ阻害剤を送達する様に構成されている。
【００１９】
幾つかの実施形態では、上記組成物は、創傷ドレッシング材として構成されている。
【００２０】
本発明の更に別の態様は、組織治癒を促進する方法を提供する。幾つかの実施形態では、上記方法は、多孔性足場と、足場の細孔内に配置された制御放出の為に作製された接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤とを含む組成物を組織表面上に載置する事を含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、治療時間の間に制御された速度で組織治癒を促進するのに有効な用量のＦＡＫ阻害剤を組織表面に送達する事を含む。
【００２１】
幾つかの実施形態では、多孔質足場は、ヒドロゲルフィルムを含む。幾つかの実施形態では、ヒドロゲルは、プルラン−コラーゲンヒドロゲルを含む。
【００２２】
幾つかの実施形態では、上記方法は、組織の瘢痕化を低減させる事を更に含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、組織において毛髪成長を促進する事を更に含む。
【００２３】
幾つかの実施形態では、上記組成物は、創傷ドレッシング材として構成されている。
【００２４】
幾つかの実施形態では、ＦＡＫ阻害剤は、上記組成物の送達表面上に配置される。幾つかの実施形態では、制御された速度は、迅速放出速度及び持続放出速度を含む。幾つかの実施形態では、上記方法の送達工程は、載置工程後約２４時間以内に上記用量のＦＡＫ阻害剤を組織表面に送達する事を含む。幾つかの実施形態では、上記用量のＦＡＫ阻害剤は、最大約９６時間の期間に亘って組織表面に送達される。
【００２５】
幾つかの実施形態では、上記方法は、組織表面から上記組成物を取り除く事を更に含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、載置工程及び送達工程を少なくとも３回繰り返す事を含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、載置工程及び送達工程を少なくとも１０回繰り返す事を更に含む。
【００２６】
幾つかの実施形態では、ＦＡＫ阻害剤は、ＶＳ−６０６２（ＰＦ−５６２２７１）又はＰＦ−５６２２７１のベンゼンスルホン酸塩である。
【００２７】
幾つかの実施形態では、上記方法は、上記組成物中の約３０％のＦＡＫＩ阻害剤から上記組成物中の約７５％のＦＡＫ阻害剤迄を組織に送達する事を含む。
【００２８】
本発明の更に別の態様は、創傷を治療する為の多孔質足場を含む組成物を製造する方法を提供する。幾つかの実施形態では、上記方法は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤、プルラン、コラーゲン、及びポロゲンを含む混合物を形成する工程を含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、ポロゲンを除去する及び／又は上記混合物を脱水する事により、足場の細孔内に配置された制御された薬物放出の為に作製された接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤を有する多孔質足場を含む組成物を作製する工程を含む。
【００２９】
幾つかの実施形態では、多孔質足場は、ヒドロゲルを含む。幾つかの実施形態では、多孔質足場は、プルラン及びコラーゲンヒドロゲルを含む。
【００３０】
幾つかの実施形態では、上記方法は、上記組成物の表面上にＦＡＫ阻害剤を載置する工程を含む。
【００３１】
幾つかの実施形態では、上記方法は、プルランを架橋する工程を含む。幾つかの実施形態では、上記方法は、プルランをトリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）及び／又はトリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）を用いて架橋する工程を含む。
【００３２】
幾つかの実施形態では、上記方法は、上記除去工程の前にポロゲンを結晶化させる工程を含む。
【００３３】
幾つかの実施形態では、上記組成物は、ＦＡＫ阻害剤の不均一な分布を含む。
【００３４】
本発明の新規の特徴は、以下の特許請求の範囲に詳細に示されている。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明及び添付の図面を参照する事によって、本発明の特徴及び利点のより良い理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１Ａ乃至図１Ｃは、ＦＡＫ阻害剤（「ＦＡＫＩ」）を放出するプルラン−コラーゲンヒドロゲルの構築及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロファイルを示す図である。（図１Ａ）プルラン−コラーゲンヒドロゲル足場内へのＦＡＫＩの分子インプリンティングの概略図。（図１Ｂ）乾燥プルラン−コラーゲンヒドロゲル（上方）及び吸水後にＰＢＳ中で膨潤したヒドロゲル（下方）のデジタル写真。（図１Ｃ）分子インプリンティング（青色）及び表面取り込み（赤色）により調製された５０μｇのＦＡＫＩを含むプルラン−コラーゲンヒドロゲルからのＦＡＫＩのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロファイル。Ｎ＝示された時点毎に３回の実験。
【図２】図２Ａ乃至図２Ｃは、スプリント装着された全層切除創モデルにおけるヒドロゲルで加速された創傷治癒を介して送達されたＦＡＫＩを示す図である。（図２Ａ）ＦＡＫＩヒドロゲルを用いて又は用いずに治療されたスプリント装着された全層切除創のデジタル写真。（図２Ｂ）損傷後の創傷閉鎖日数及び創傷面積の時間依存的変化の定量化。（図２Ｃ）群：足場又はＦＡＫＩ無し（コントロール）、プルラン−コラーゲンヒドロゲル（ヒドロゲル）、及びＦＡＫＩ放出プルラン−コラーゲンヒドロゲル（Ｈ＋ＦＡＫＩ）。Ｎ＝各状態毎に８つの創傷。統計的差異は、示された各時点についてコントロールに対して＊ｐ＜０．０５で存在する。
【図３】図３Ａ乃至図３Ｈは、スプリント装着された全層切除創モデルにおけるＦＡＫＩ治療による線維化促進活性の減少を示す図である。（図３Ａ）治癒した創傷の代表的なＨ＆Ｅ染色画像及びマッソンのトリクローム染色画像。（図３Ｂ）損傷後１７日目でのコントロール、ヒドロゲル、及びＨ＋ＦＡＫＩにおける治癒した創傷のマッソンのトリクローム染色画像の青色領域の定量化。Ｈ＆Ｅ：細胞質と細胞外基質（赤色）及び細胞核（黒色）。マッソンのトリクローム染色：コラーゲン（青色）、細胞質と筋肉（赤色）及び細胞核（黒色）。スケールバー＝１００μｍ。（図３Ｃ）α−ＳＭＡの免疫蛍光染色、並びに（図３Ｄ）損傷後１７日目でのコントロール、ヒドロゲル、及びＨ＋ＦＡＫＩにおける緑色領域の定量化。α−ＳＭＡ（緑色）及び細胞核（青色）。スケールバー＝５０μｍ。（図３Ｅ）代表的なウエスタンブロッティング画像、並びに（図３Ｆ）損傷後１０日目での創傷溶解物のＦＡＫ及びｐ−ＦＡＫの定量化。Ｎ＝各状態毎に８つの創傷。（図３Ｇ）ｐ−Ａｋｔの免疫蛍光染色、並びに（図３Ｈ）損傷後１７日目でのコントロール、ヒドロゲル、及びＨ＋ＦＡＫＩにおける緑色領域の定量化。ｐ−Ａｋｔ（緑色）及び細胞核（青色）。スケールバー＝１００μｍ。全ての分析について、統計的差異は、＊ｐ＜０．０５（コントロール対Ｈ＋ＦＡＫＩ）、Δｐ＜０．０５（ヒドロゲル対Ｈ＋ＦＡＫＩ）、及び＃ｐ＜０．０５（コントロール対ヒドロゲル）で存在する。
【図４】図４Ａ乃至図４Ｂは、ＦＡＫＩ治療により増強された機械的特性を示す図である。損傷後３週間でのコントロール群、ヒドロゲル群、Ｈ＋ＦＡＫＩ群におけるヤング率（ＭＰａ）（図４Ａ）及び極限引張応力（ＭＰａ）（図４Ｂ）。Ｎ＝各状態毎に８つの創傷。全ての分析について、統計的差異は、＊ｐ＜０．０５（コントロール対Ｈ＋ＦＡＫＩ）、及び＃ｐ＜０．０５（コントロール対ヒドロゲル）で存在する。
【図５−１】図５Ａ乃至図５Ｂは、接触熱傷創モデルにおけるＦＡＫＩ治療による創傷治癒の改善及び筋線維芽細胞沈着の減弱を示す図である。（図５Ａ）ＦＡＫＩヒドロゲルを用いて及び用いずに治療された全層接触熱傷創のデジタル写真。（図５Ｂ）損傷後の創傷面積の時間依存的変化の定量化。
【図５−２】図５Ｃ乃至図５Ｄは、接触熱傷創モデルにおけるＦＡＫＩ治療による創傷治癒の改善及び筋線維芽細胞沈着の減弱を示す図である。（図５Ｃ）α−ＳＭＡの免疫蛍光染色、並びに（図５Ｄ）創面切除後２４日目でのコントロール、ヒドロゲル、及びＨ＋ＦＡＫＩにおける緑色領域の定量化。Ｎ＝各状態毎に７つの創傷。スケールバー＝２５０μｍ。全ての分析について、統計的差異は、＊ｐ＜０．０５（コントロール対Ｈ＋ＦＡＫＩ）、及びΔｐ＜０．０５（ヒドロゲル対Ｈ＋ＦＡＫＩ）で存在する。
【図６】図６Ａ乃至図６Ｂは、ＦＡＫＩの局所皮下注射がマウス切開の瘢痕形成を低減させる事を示す図である。（図６Ａ）１０％のＤＭＳＯ中に溶解されたＦＡＫＩの濃度を漸増させて治療したマウス背側切開のマッソンのトリクローム染色により、１５μＭ及び７５μＭのＦＡＫＩで瘢痕病変の低減が示された。Ｎ＝各状態毎に５つの創傷。スケールバー＝１００μｍ。動物は１５０μＭのＦＡＫＩ注射で２日間より長く生存しなかった。（図６Ｂ）各状態毎の瘢痕面積（破線）の定量化。統計的差異は、コントロールに対して＊ｐ＜０．０５で存在する。
【図７】図７Ａ乃至図７Ｅは、本明細書に記載される様に、レッドデュロックブタモデルにおける深部皮膚創に対するヒドロゲルデバイス中に適用されたＦＡＫＩの局所治療の効果を分析する為に使用される構成及びタイムラインを示す図である。図７Ａは、試験に使用される領域を示している。図７Ｂは、皮膚の除去を伴うブタの深部創の一例を示している。図７Ｃは、無傷のブタの皮膚の断面図を示している。図７Ｄは、０．０６インチ（ｉｎ）の創傷形成深さを有する創傷ブタの皮膚の断面図を示している。図７Ｅは、損傷日（Ｄ０）から術後１８０日（Ｄ１８０）迄のタイムラインを示している。
【図８】図８Ａ乃至図８Ｃは、デュロックブタにおける皮膚深部創をＦＡＫＩヒドロゲルで局所的に治療する事により創傷治癒が加速される事を示す図である。Ｎ＝各状態毎に８つの創傷。初期創傷サイズ＝２５ｃｍ２。図８Ａは、術後（ＰＯＤ）２日目から術後３０日目（ＰＯＤ３０）迄に撮影された創傷の写真を示している。ＰＯＤ１１後にＰＯＤ２１及びＰＯＤ３０を経て、創傷はより一層治癒している様に見える。創傷面積を経時的に測定した。図８Ｂは、ＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷対ヒドロゲルで治療された創傷又は未治療の創傷についての経時的な結果を示している。ヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩで治療された創傷は、ＰＯＤ２１及びＰＯＤ３０で、未治療のままの創傷（コントロール）又はヒドロゲル単独で治療された創傷よりも加速された治癒を示す。ＰＯＤ１４迄に、ＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷はほぼ完全に閉鎖したのに対して、未治療（コントロール）の創傷は依然として２０％の開放創を有し、統計的有意差（＊で示される）があった。ＰＯＤ１７迄に、ＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷は完全に閉鎖したのに対して、未治療（コントロール）の創傷は依然として約１０％の開放創を有し、統計的有意差（図８Ｂにおいて＊で示される）があった。図８Ｃは、未治療の創傷又はヒドロゲル単独で治療された創傷が完全に閉鎖するのに２５日間かかるのに対して、ヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩで治療された創傷はＰＯＤ１４迄に閉鎖する事を示しており、統計的に有意な結果である。
【図９】図９Ａ乃至図９Ｂは、デュロックブタにおける皮膚深部創をＦＡＫＩヒドロゲルで局所的に治療する事により瘢痕の外見が有意に改善される事を示す図である。図９Ａは、術後（ＰＯＤ）４５日目から術後９０日目迄に撮影された創傷の写真を示している。ヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩで治療された創傷（下段）は、術後４５日目から術後９０日目迄で、未治療のままの創傷（上段）又はヒドロゲル単独で治療された創傷（中段）と比較して顕著に改善された外見を示す。更に、ヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩで治療された創傷は、創傷領域内で著しくより多くの毛髪を示している。図９Ｂは、盲検化された瘢痕専門家によって評価された場合にヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩの局所適用で治療された創傷が９０日で改善された外見を有する事を示している。４人の盲検化された瘢痕専門家はビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）を使用して瘢痕を評価した。未治療のコントロールは１００でスコア付けされ、ヒドロゲル単独での治療は９５でスコア付けされ、ヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩでの治療は６０の有意に改善されたスコアを示した：ヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩでの治療はビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）を有し、スコアは４人の盲検化された瘢痕専門家によって評価された（＊ｐ＜０．００１）。
【図１０】図１０Ａ乃至図１０Ｂは、デュロックブタにおける皮膚深部創をＦＡＫＩヒドロゲルで局所的に治療する事により瘢痕の外見が改善され、瘢痕の外見の改善は６ヶ月で残っている事を示す図である。図１０Ａは、術後（ＰＯＤ）４５日目から術後１８０日目（ＰＯＤ１８０）（６ヶ月）迄に撮影された創傷の写真を示している。ヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩで治療された創傷は、術後４５日目から術後１８０日目迄で、未治療のままの創傷又はヒドロゲル単独で治療された創傷と比較して顕著に改善された外見を示す。更に、ヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩで治療された創傷は、創傷領域内に毛髪を示している。図１０Ｂは、盲検化された瘢痕専門家によって評価された場合にヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩの局所適用で治療された創傷が改善された外見を有する事を示している。４人の盲検化された瘢痕専門家はビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）を使用して瘢痕を評価した。未治療のコントロールは１００でスコア付けされ、ヒドロゲル単独での治療は９５でスコア付けされ、ヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩでの治療は６０の有意に改善されたスコアを示した：ＦＡＫＩヒドロゲルでの治療は、ΔＰ＜０．０００１（コントロール対Ｈ＋ＦＡＫＩ）を有する。
【図１１】図１１Ａ乃至図１１Ｃは、皮膚深部創をＦＡＫＩヒドロゲルで局所的に治療する事により、毛包及び皮膚付属器が再生される事を示す図である。図１１Ａは、術後９０日目での、未治療の創傷（上段）及びヒドロゲル単独で治療された創傷（中段）と比較した、ＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷（下段）のトリクローム染色を示している。矢印１は毛包を指している。矢印３は周囲の腺構造を有する毛包を指している。矢印２及び矢印４〜６は皮膚腺（汗腺及び皮脂腺）を指している。図１１Ｂ〜図１１Ｃは、毛包（左側のグラフ）及び皮脂腺と汗腺（右側のグラフ）の数を計数した結果を示している。未治療の創傷は各グラフの左側にあり、ヒドロゲル単独で治療された創傷は中央にあり、ＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷は右側にある。術後９０日目で、ＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷は平均約２．７個の毛包で有意により多くの毛包を有したのに対して、ヒドロゲル単独で治療された創傷は平均で約０．７個の毛包を有し、未治療の創傷は約０．６個の毛包を有した。
【図１２】図１２Ａ乃至図１２Ｃは、皮膚深部創をＦＡＫＩヒドロゲルで局所的に治療する事により、筋線維芽細胞の動員及び活性化が遮断される事を示す図である。図１２Ａは、コントロールで治療した創傷及びＦＡＫＩヒドロゲルで治療した創傷をα平滑筋アクチンについて染色した結果を示している。図１２Ｂ〜図１２Ｃは、ＰＯＤ６０（図１２Ｂ）及びＰＯＤ９０（図１２Ｃ）についての瘢痕病変内の無作為に選択された領域内のα平滑筋アクチンの量を定量化する盲検化された観察者からの結果を示す。ＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷は、コントロールと比較して有意に少ないα平滑筋アクチンを示した（＊ｐ＜０．００１）。
【図１３】図１３Ａ乃至図１３Ｃは、ＦＡＫＩヒドロゲル治療により、創傷の無い正常な皮膚に似たより良好な皮膚構造がもたされる事を示す図である。図１３Ａの左側のパネルは、暗い背景に対する皮膚コラーゲン染色を示している。図１３Ａの右側のパネルは、ＣＴ−ＦＩＲＥ定量的繊維分析アルゴリズムによって抽出された自動化されたコラーゲン線維のセグメント化を示している。異なる色の線維は、コンピュータによる抽出によって生成された異なる線維メトリックを有する個々のコラーゲン線維を表す。図１３Ｂは、図１３Ａに示される様なコラーゲン原線維の長さ（ピクセル）を示している。コラーゲン線維の平均サイズ及び中央値サイズは、ＦＡＫＩヒドロゲルにおいて未治療のコントロールと比較して有意に小さい。図１３Ｃは、ＣＴ−ＦＩＲＥアルゴリズムによって分析された画像毎の特定のタイプの個々のコラーゲン線維の絶対数を示している。
【図１４】組織の治癒を促進し、瘢痕化を低減させる為の、本明細書に記載されるデバイスを示す図である。このデバイスには、ＦＡＫＩヒドロゲル足場を備えた植皮が含まれる。
【図１５】図１５Ａ乃至図１５Ｂは、皮膚に局所的に送達されたＦＡＫＩヒドロゲルの安全性を示す図である。図１５Ａは、ＦＡＫヒドロゲルの局所送達後の微々たるレベルの全身吸収を示している。図１５Ｂは、創傷の無い皮膚への高濃度のＦＡＫＩ溶液の毎日の適用でさえ、皮膚の刺激又は感作をもたらさなかった事を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
組織治癒を促進する為の、例えば創傷部位での瘢痕形成を回復させ、新たな毛髪及び皮膚付属器を形成する為の組成物、並びに該組成物を使用するデバイス及び方法が提供される。該組成物は、足場、例えば多孔質足場と、有効な用量の制御された薬物放出の為に作製された接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）活性の阻害剤とを含む。足場は、治療時間の間に制御された速度で組織治癒を促進するのに有効な用量のＦＡＫ阻害剤を送達表面に送達する様に構成され得る。幾つかの例では、組成物は、例えば、本発明の方法によって治療されていない創傷と比較して組織治癒を促進する及び／又は瘢痕化を低減させるのに十分な期間に亘り創傷部位で皮膚と接触される様に構成される又は接触される。本開示の態様は、有効用量のＦＡＫ阻害剤が創傷と接触される、損傷の治療、創傷の再上皮化、皮膚の創傷の治癒の間の瘢痕の予防又は低減、新たな毛髪及び皮膚付属器の形成の為の方法を提供する。幾つかの実施形態では、被験体はヒト被験体である。幾つかの実施形態では、損傷は、表皮の切開、熱傷、開放型又は閉鎖型であり得る創傷等であり得る切り傷である。開放創の例には、限定されるものではないが、切開、裂傷、擦過傷、穿刺創、貫通創、銃創、及び／又は刺創が含まれる。幾つかの実施形態では、多孔質足場は、プルラン−コラーゲンヒドロゲル等の多孔質ヒドロゲルである。
【００３７】
本発明は、特定の方法論、プロトコル、細胞系統、動物種又は属、及び記載される試薬に限定されず、全ては変化し得る事を理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する事のみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する事を意図するものではない事も理解されたい。
【００３８】
定義
細胞質タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ２）としても知られる接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）は、細胞外基質成分に付着する細胞間に形成する接着斑に集中する細胞質ゾルタンパク質チロシンキナーゼである（アンドレ等（Andre et al.）（１９９３年）バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）第１９０巻：第１４０頁〜第１４７頁を参照）。ＦＡＫは、細胞間の接着斑のダイナミクスの関係物として動員され、運動性及び細胞生存に関与する１２５ｋＤの高度に保存された非受容体型チロシンキナーゼである。ＦＡＫは、インテグリンの結合、成長因子の刺激、及び有糸分裂促進性神経ペプチドの作用に応答してリン酸化される。１５９アミノ酸のカルボキシ末端領域である接着斑標的ドメイン（ＦＡＴ）は、ＦＡＫを接着斑に標的化する役割を担う事が分かっている。接着斑アダプタータンパク質であるパキシリンは、ＦＡＴドメインと重複するカルボキシ末端ドメインでＦＡＫに結合する。アミノ領域とカルボキシ領域との間には、触媒ドメインがある。このキナーゼドメイン内の活性化ループのリン酸化は、ＦＡＫのキナーゼ活性にとって重要である。
【００３９】
ＦＡＫの例示的な阻害剤を以下の表１（表１Ａ、表１Ｂ）に示す。関心が持たれる阻害剤はＰＦ−５６２２７１であり、これは強力で、ＡＴＰ競合的で、選択的且つ可逆的な１．５ｎＭのＩＣ５０を有するＦＡＫの阻害剤である。又、ＰＦ−５６２２７１のベンゼンスルホン酸塩であるＰＦ−００５６２２７１も関心が持たれる。
【００４０】
ＦＡＫの阻害剤。多くのＦＡＫ阻害剤が知られており、当該技術分野で使用されている。
【００４１】
【表１Ａ】
2021524849.tif 000003
【表１Ｂ】
2021524849.tif 000004
【００４２】
多孔質足場。細孔又は開口を有する構造物。該構造物は、天然及び／又は合成のポリマー又はコポリマーを含み得る。多孔質足場を形成するのに適した材料の例には、アクリルポリマー、セルロース、キトサン、コラーゲン、セルロースポリマー、ゼラチン、ガム、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）／ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリビニル基ポリマー、プルラン、及びその他の多糖類が含まれる。細孔は、足場全体を通して延びて足場の第１の表面から第２の表面迄延びていても、又は少なくとも第１の表面が閉じられていても良い。細孔は、相互接続された小さな空隙を有し得る。細孔は不規則的又は規則的であり得る。不規則的な細孔は、サイズの観点（例えば、直径）又は長さの観点において不規則であり得る。規則的な細孔は、サイズ、形状、又は分布が互いに同様であり得る。細孔（特に規則的な細孔）は、足場が固まった後に溶出されるポロゲン又は粒子の塊を使用して形成され得る。利用され得るポロゲンの例には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、スクロース、グルコース、ラクトース、ソルビトール、キシリトール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、及びポリビニルアルコールが含まれる。細孔（特に、規則的な細孔）は、レーザー穿孔又は３Ｄ印刷によって形成され得る。多孔性は、薬物（例えば、ＦＡＫ阻害剤）を所望の時間に亘り又は所望の速度で保持及び放出する為に最適化され得る。多孔性は、薬物（例えば、ＦＡＫ阻害剤）を多孔質足場上の送達表面に保持及び放出する為に最適化され得る。多孔性は、薬物（例えば、ＦＡＫ阻害剤）を多孔質足場上の送達表面から組織表面に保持及び放出する為に最適化され得る。多孔質足場はヒドロゲルであり、水等の流体を保持し得るか、又は水等の流体を保持する様に構成され得る。
【００４３】
ヒドロゲル。創傷ドレッシング材は、創傷を被覆及び保護する為に創傷又は切開部に適用される材料である。例えば、炭水化物ベースのヒドロゲルは、架橋及び細孔形成を提供する条件下でプルラン及びコラーゲンを使用して作製され得る。コラーゲンは、プルラン、架橋剤、及び細孔形成剤（ポロゲン）の混合物に添加する事が出来、ここで、コラーゲンは、プルランの重量に対して少なくとも約１％で約１２．５％以下の濃度で提供される。コラーゲンは、約１％、約２．５％、約５％、約７．５％、約１０％の濃度で、通常は約２．５％〜約１０％の濃度で提供する事が出来、約４％〜約６％であって良く、そのコラーゲンは通常、繊維状コラーゲン、例えば、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ等である。関心が持たれる架橋剤には、トリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）又はトリメタリン酸ナトリウムとトリポリリン酸ナトリウムとの組み合わせ（ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ）が含まれ、例えば、これらはプルランと、約１：５、約１：２、約１：１、約１：２の重量／重量比である。ゲル内結晶化の為の関心が持たれるポロゲンは、あらゆる適切なポロゲン、例えば塩、例えばＫＣｌが含まれ、例えば、これらはプルランと、約１：５、約１：２、約１：１、約１：２の重量／重量比である。分子インプリンティングの為に、ＦＡＫ阻害剤は、混合物中に約１００μｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で添加する事が出来、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌであり得る。表面取り込みの為に、ゲルが形成された後に適切な賦形剤中のＦＡＫ阻害剤の溶液、例えば水溶液、エタノール等を表面に適用する事が出来る。
【００４４】
上記組成物を注入して圧縮する事で、シートを形成する事が出来る。好ましい厚さは、少なくとも約１ｍｍで約５ｍｍ以下、通常は約３ｍｍ以下であり、約１．７５ｍｍ〜２．５ｍｍ、例えば、約２ｍｍの厚さであり得る。
【００４５】
細孔は、膨潤したヒドロゲルの転相による急速な乾燥によってヒドロゲル内に形成され得る。従って、幾つかの実施形態は、上記混合物又は膨潤したヒドロゲルを脱水する工程を含む。脱水は、ポロゲンの局所的な過飽和及び結晶化をもたらす。プルラン及びコラーゲンは、相互接続された網目構造内の結晶の周りに組織化する事が強いられ、ＫＣｌの溶解後に網状の足場の形成がもたらされる。従って、幾つかの実施形態は、ポロゲンを除去する工程を含む。ポロゲンの添加は、ヒドロゲルの粘弾性を増強する。改善された足場の多孔性は、より大きな流体吸収、より高い水対ポリマー比、及びより効果的なヒドロゲル挙動を可能にする。
【００４６】
上記フィルムは乾燥状態で保管する事が出来、任意の適切な水性媒体中で容易に再水和される。ヒドロゲル基質の水性の性質は、創傷治癒における細胞成長及び持続可能性の為の理想的な環境を提供する。
【００４７】
ヒドロゲルの機械的特徴には、平均細孔サイズ及び足場の多孔性が含まれる。プルラン−コラーゲンヒドロゲルの場合に、両方の可変要素は、ヒドロゲル内に存在するコラーゲンの濃度に伴い変動する。５％のコラーゲンを含むヒドロゲルの場合に、平均細孔サイズは、通常、約２５μｍ〜約５０μｍ、約３０μｍ〜約４０μｍの範囲であり、約３５μｍであり得る。１０％のコラーゲンを含むヒドロゲルの場合に、平均細孔サイズは、通常、約１０μｍ〜約２５μｍ、約１２μｍ〜約１８μｍの範囲であり、約１５μｍであり得る。当業者であれば、他のコラーゲン濃度での適切なヒドロゲルを容易に決定するであろう。足場の多孔性は通常、約５０％〜約８５％の範囲であり、約７０％〜約７５％の範囲であって良く、コラーゲンの濃度が増加するにつれて減少する。
【００４８】
プルラン。真菌のアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）に由来する多糖類ポリマー。プルランは、α−（１−６）結合されたマルトトリオース単位を有する線状ホモ多糖であり、ヒドロゲル状態で保水能力を示し、それにより細胞と生体分子の両方にとって理想的な治療薬媒体となる。更に、プルランは、架橋及び遺伝物質と治療用サイトカインの送達を可能にする複数の官能基を含む。更に、プルランベースの足場は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮細胞と平滑筋細胞の両方の挙動を強化する事が分かっている。
【００４９】
コラーゲン。本明細書で使用される場合に、「コラーゲン」という用語は、存在するタンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％以上が三重らせん構造のコラーゲンである組成物を指す。コラーゲンは脊椎動物種に広く見られ、多くの異なる種について配列決定されている。種間の高度な配列類似性の為に、様々な種由来のコラーゲンを、例えば哺乳動物種間の生体医療目的に使用する事が出来る。典型的な市販の動物性供給源には、ウシのアキレス腱、カーフスキン、及び牛の骨が含まれる。幾つかの実施形態では、配向薄膜の調製に使用されるコラーゲンは、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型のコラーゲンであり、あらゆる適切な供給源、例えば、ウシ、ブタ等、通常は哺乳動物供給源に由来する。
【００５０】
コラーゲンは三重鎖のロープ状のコイル状構造を有する。皮膚、腱、及び骨の主要なコラーゲンはコラーゲンＩであり、２つのα−１ポリペプチド鎖及び１つのα−２鎖を含んでいる。軟骨のコラーゲンには、１種類のポリペプチド鎖α−１しか含まれていない。胎児には特徴的な構造のコラーゲンも含まれている。間質コラーゲンであるＩ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型のコラーゲンについての遺伝子は、三重らせんｇｌｙ−Ｘ−Ｙ部の長さに沿って進化的に保存された位置に多数の比較的小さなエクソン（５４ｂｐ及び１０８ｂｐ）の珍しい特徴的な構造を示す。
【００５１】
コラーゲンの型には、Ｉ型（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２）、ＩＩ型（ＣＯＬ２Ａ１）、ＩＩＩ型（ＣＯＬ３Ａ１）、ＩＶ型（ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ４Ａ６）、Ｖ型（ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ５Ａ３）、ＶＩ型（ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ６Ａ３）、ＶＩＩ型（ＣＯＬ７Ａ１）、ＶＩＩＩ型（ＣＯＬ８Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２）、ＩＸ型（ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ９Ａ３）、Ｘ型（ＣＯＬ１０Ａ１）、ＸＩ型（ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２）、ＸＩＩ型（ＣＯＬ１２Ａ１）、ＸＩＩＩ型（ＣＯＬ１３Ａ１）、ＸＩＶ型（ＣＯＬ１４Ａ１）、ＸＶ型（ＣＯＬ１５Ａ１）、ＸＶＩ型（ＣＯＬ１６Ａ１）、ＸＶＩＩ型（ＣＯＬ１７Ａ１）、ＸＶＩＩＩ型（ＣＯＬ１８Ａ１）、ＸＩＸ型（ＣＯＬ１９Ａ１）、ＸＸ型（ＣＯＬ２０Ａ１）、ＸＸＩ型（ＣＯＬ２１Ａ１）、ＸＸＩＩ型（ＣＯＬ２２Ａ１）、ＸＸＩＩＩ型（ＣＯＬ２３Ａ１）、ＸＸＩＶ型（ＣＯＬ２４Ａ１）、ＸＸＶ型（ＣＯＬ２５Ａ１）、ＸＸＶＩＩ型（ＣＯＬ２７Ａ１）、ＸＸＶＩＩＩ型（ＣＯＬ２８Ａ１）が含まれる。当業者によれば、哺乳動物コラーゲン、例えば、ウシ、ブタ、ウマ等のコラーゲンを含む他のコラーゲンも同様に本発明の方法の為に適していると理解されるであろう。付加的に又は代替的に、コラーゲンを合成により作製する事も出来る。
【００５２】
支持体。変形可能な支持体を含む、様々な固体支持体又は基材を多孔質足場（ヒドロゲル）と共に使用する事が出来る。変形可能とは、支持体の形状を何か他の形状に変える事が出来る事を意味する。変形可能な固体支持体の例には、創傷ドレッシング材の作製に関する技術分野で知られている、ポリアクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステルフィルム、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等が含まれる。
【００５３】
創傷ドレッシング材。創傷ドレッシング材は、創傷を被覆及び保護する為に創傷又は切開部に適用される材料である。例えば、組織治癒を促進する為の（例えば、創傷部位での瘢痕及び／又はケロイドの形成を回復させる為の）ヒドロゲル等の多孔質基材は創傷ドレッシング材の１つの種類である。一般に、ヒドロゲル等の多孔質基材は、皮膚又は他の組織表面に着脱可能に固定される様に構成され、１種以上の活性剤（薬物）を含み得る。他の例では、創傷ドレッシング材又は創傷ドレッシング材の一部は生分解性であり得る。ヒドロゲルは、任意の適切な形状又はサイズを有し得る。
【００５４】
生物学的に活性な創傷ドレッシング材の追加の基準には、載置後すぐの創傷への迅速な付着、創傷からの蒸発による流体損失を抑制し、創傷とドレッシング材との間に滲出液が集まるのを避けるのに適切な蒸気伝達の１つ以上が含まれ得る。生物学的に活性な創傷ドレッシング材は代用皮膚として機能する事が出来ると共に、微生物に対するバリアとして機能し、創傷中に既に存在する微生物の成長を制限し、柔軟性であり、耐久性があり、引裂に対して耐性がある事の１つ以上として機能し得る。代用皮膚は一般に組織適合性を示し、即ち、肉芽組織の形成につながり得る創傷内の炎症又は異物反応を誘発すべきではない。本明細書に記載されるヒドロゲル薄膜の内面構造が提供される事で、線維血管組織の内部成長が可能となり得る。外面構造が提供される事で、流体の伝達は最小限に抑えられ、上皮化が促進され得る。
【００５５】
幾つかの例では、ＦＡＫＩ単独又はＦＡＫＩヒドロゲル（例えば、プルラン／コラーゲンヒドロゲル）は、移植片の一部であり得る。「移植片」という用語は、一般に、身体の一部から取り出された後に、同じ（又は異なる）身体上の新たな部位に移動される（及び取り付けられる）皮膚片を指す。図１４は、ＦＡＫＩ多孔質足場植皮の一例を示している。患者は全層頭皮熱傷を負っている。皮膚片は、採取場所（この場合には右大腿）から採取され、ＦＡＫＩを含む多孔質足場と共に層状化（この場合は重層化）される。説明を目的とするこの例では、移植片は、ＦＡＫＩを含む多孔質基材で重層化されていない領域及びＦＡＫＩを含まない多孔質基材で重層化されている領域を含むコントロール領域も含んでいるが、移植用の移植片はより一般的には、殆どの側面又は全ての側面に沿ってＦＡＫＩを含むヒドロゲルによって大部分が成層される事となる。
【００５６】
「創傷」という用語は、一般に、以下に説明される様に、開放創及び閉鎖創の両方を指す。創傷は更に、急性創又は慢性創として分類する事が出来る。急性創は、根本的な治癒欠陥を有さず、通常、健康な個体における手術又は外傷に続いて発生し、迅速且つ完全に治癒する創傷である。それに対して、慢性創は、組織完全性の損失を有し、長期間又は頻発する傷害又は損傷によって生じる創傷である。本明細書で使用される場合に、「皮膚創」という用語は、皮膚における破断を指す。
【００５７】
「開放創」という用語は、通常、創傷を引き起こした物体に応じて分類される。開放創には、熱傷、切開、裂傷、擦過傷、穿刺創、貫通創、銃創等が含まれる。切開又は切開創は、ナイフ、剃刀、又はガラスの破片等の清潔で鋭利な物体によって引き起こされ得る。表皮のみを含む切開は、切り傷として分類され得る。裂傷は、硬組織の上にある軟組織への鈍的衝撃（例えば、頭蓋骨を覆う皮膚の裂傷）又は皮膚及び他の組織の裂傷（例えば、出産により引き起こされる）によって引き起こされる不規則な創傷である。結合組織又は血管が下にある硬表面にへばりつく為、裂傷は架橋を示す場合がある。擦過傷（擦り傷）は、皮膚の最上層（表皮）が削り取られる表面的な創傷であり、屡々、粗い表面上で滑って転ぶ事によって引き起こされる。穿刺創は、爪又は針等の皮膚に穴を開ける物体によって引き起こされ得る。貫通創は、ナイフ等の物体が身体内に入り込む事によって引き起こされ得る。銃創は、弾丸又は同様の発射体が身体内に飛び込む又は身体内を通過する事によって引き起こされ得る。従って、進入部位に１つ及び進出部位に１つの２つの創傷が存在する場合があり、これは一般的に貫通として知られている。
【００５８】
「閉鎖創」という用語は、皮膚の下の組織に損傷を与える鈍器外傷によって引き起こされる、より一般的には打撲として知られる挫傷、血管への損傷により更に皮膚の下に血液が集まる事によって引き起こされる、血液腫瘍とも呼ばれる血腫、及び長期間に亘って加えられた大きな又は大量の力によって引き起こされ得る圧壊傷害を指す。
【００５９】
「瘢痕」という用語は、以前の損傷又は創傷（例えば、切開、切除又は外傷）に起因する異常な形態学的構造を指す。瘢痕は、主にコラーゲン１型及び３型並びにフィブロネクチンの基質である結合組織から構成されている。瘢痕は、（皮膚の正常瘢痕に見られる様な）異常な組織のコラーゲン線維からなり得るか、又は（中枢神経系の瘢痕又は皮膚の病理学的瘢痕に見られる様な）結合組織の異常な蓄積であり得る。瘢痕の種類には、限定されるものではないが、萎縮性瘢痕、肥厚性瘢痕、及びケロイド性瘢痕、ならびに瘢痕拘縮が含まれる。萎縮性瘢痕は、周囲の皮膚より下に窪み又は穴として平らに窪んでいる。肥厚性瘢痕は、元の病変の境界内にとどまる隆起した瘢痕であり、屡々異常なパターンで配置された過剰なコラーゲンを含む。ケロイド性瘢痕は、元の創傷の縁を越えて広がり、部位特異的に周囲の正常な皮膚を侵害する隆起した瘢痕であり、屡々異常な様式で配置されたコラーゲンの渦巻きを含む。瘢痕拘縮は、関節又は皮膚の皺を直交する、短縮又は拘縮を起こしやすい瘢痕である。瘢痕拘縮は、瘢痕が完全に成熟していないときに発生し、屡々肥厚性となる傾向があり、典型的には不能状態又は機能不全となる。
【００６０】
外科的創傷、熱傷、切り傷、銃創等を含む様々な状態が瘢痕を引き起こす場合がある。瘢痕は通常、限定されるものではないが、皺切除術、眼瞼形成術、鼻形成術、耳形成術、オガイト形成術、フェイスリフト、額リフト、眉リフト、顔面瘢痕修正、顔面瘢痕除去、レーザー手術、スキンリサーフェシング、皺の治療、プラズマ皮膚再生法、顔面脂肪移植、皮膚の引き締め、入れ墨の除去、及びヘアーリプレイスメントを含む顔面形成外科手術の結果として形成する。従って、本開示は、創傷治癒を早め、瘢痕形成を低減させる事によって、特に瘢痕化及び痣の手当の為に顔面形成外科を受ける患者にとって有利である。瘢痕は通常、限定されるものではないが、腹部形成術、乳房縮小術、豊胸手術、ボディリフト法、クモ状静脈治療、ストレッチマーク治療、脂肪吸引術、余剰皮膚除去手術、セルライト減少治療、体輪郭形成、ボディリサーフェシング、及びボディインプラントを含む全身形成外科手術の結果としても形成する。
【００６１】
「投与する」とは、限定されるものではないが、局所的、皮内注射、静脈内、全身、皮下、筋肉内、舌下、及び吸入又は注射、潅注又は浸透圧ポンプを含む特定の経路を介して、被験体に薬学的治療薬又は製剤を投与又は適用する事を指す。
【００６２】
組成物、デバイス、及び方法
本明細書には、治癒の間に組織の瘢痕化の低減を促進する為の組成物が記載されている。上記組成物は、多孔質足場と、有効用量の接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤とを含む。ＦＡＫ阻害剤は制御された薬物放出の為に作製され、足場の細孔内に配置されており、足場は、治療時間の間に制御された速度で組織治癒を促進するのに有効な用量のＦＡＫ阻害剤を送達表面に送達する様に構成されている。多孔質足場は、プルラン−ヒドロゲルフィルム等のヒドロゲルフィルムを含み得る。上記組成物は、治療時間の間に組織の瘢痕化を低減させる及び／又は治療時間の間に組織における毛髪成長を促進するのに有効な用量のＦＡＫ阻害剤を送達表面に送達する様に構成され得る。上記組成物は、創傷ドレッシング材として構成され得、柔軟であり得る。
【００６３】
本明細書には、瘢痕及び／若しくはケロイドの形成の治癒、例えば回復を促進する方法、並びに／又は毛髪を発生させる方法であって、瘢痕化を低減させる、毛髪を形成する、又は皮膚付属器を形成するのに十分な期間に亘って、創傷を本明細書に開示される有効用量のＦＡＫ阻害剤ヒドロゲルと接触させる工程を含む、方法が提供される。本明細書には、多孔質足場と、足場の細孔内に配置された制御された薬物放出の為に作製された接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤とを含む組成物を載置する事、上記組成物を組織表面に適用する事、及び上記組成物の送達表面から組織へと、治療時間の間に制御された速度で組織治癒を促進するのに有効な用量のＦＡＫ阻害剤を送達する事を含む、組織治癒を促進する方法が提供される。幾つかの方法では、上記組成物は、プルラン−コラーゲンヒドロゲル等のヒドロゲルを含む。幾つかの方法では、ＦＡＫ阻害剤の用量は、治療時間の間に組織の瘢痕化を低減させるのに有効である。幾つかの方法では、ＦＡＫ阻害剤は、治療時間の後に、例えば身体内の治癒経路の活性化によって組織の瘢痕化を低減させるのに有効である。幾つかの方法では、ＦＡＫ阻害剤の用量は、治療時間の間（又は後）に組織において毛髪成長を促進するのに有効である。例えば、多孔質足場が取り除かれた後でさえも、毛髪は成長し続ける事が出来る。幾つかの方法では、上記組成物は、創傷ドレッシング材として構成されている。幾つかの方法では、ＦＡＫ阻害剤は、送達表面上に配置される。幾つかの方法では、制御された速度は、迅速放出速度（組織表面への放出の為）及び持続放出速度（組織表面への放出の為）を含む。幾つかの方法では、迅速放出の為のＦＡＫＩは、約１２時間以内、約２４時間以内、又はこれらの時間の間で組織表面に放出される。幾つかの方法では、持続放出の為のＦＡＫＩは、最大約２４時間、４８時間、７２時間若しくは９６時間、又はその間のあらゆる長さの時間の期間に亘って送達表面に放出される。幾つかの方法では、持続放出の為のＦＡＫＩは、最大約２４時間、４８時間、７２時間若しくは９６時間、又はその間のあらゆる長さの時間の期間に亘って組織表面に放出される。幾つかの方法は、例えば上記組成物を組織表面から持ち上げる又は引っ張る事によって組成物を組織表面から取り除く事を含む。幾つかの方法は、上記組成物を生分解させる事を含む。幾つかの方法は、載置工程及び送達工程を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、又は少なくとも３０回繰り返す（例えば、新たな組成物を用いて）事を含む。幾つかの方法では、ＦＡＫ阻害剤は、ＶＳ−６０６２（ＰＦ−５６２２７１）又はＰＦ−５６２２７１のベンゼンスルホン酸塩である。幾つかの方法では、組成物中に存在する総ＦＡＫＩの約３０％から組成物中に存在する総ＦＡＫＩの約７５％が送達される。
【００６４】
ヒドロゲルは、一定期間、例えば、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約１週間、少なくとも約１０日、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、又はそれ以上の間、創傷（組織表面）との接触を維持する事が出来る。例えば、幾つかの変形形態では、損傷後約１日から約３日迄、即ち、増殖段階の早期部分等の初期期間の間に、ヒドロゲルを創傷部位に適用する事が望ましい。ヒドロゲルは、瘢痕除去処置によって引き起こされた新たな創傷に適用され得る。場合によっては、ヒドロゲルは損傷後７日迄、即ち、増殖段階の後期に適用される。例えば、腫脹及び創傷滲出液は、ヒドロゲルが損傷後３日より後に適用される事を指摘し得る。幾つかの用途では、第１のヒドロゲルを、損傷後の初期期間内に、例えば、最初の３日以内に適用した後に取り除く事が出来、その後に第２のヒドロゲルを適用する事が出来る。第２のヒドロゲルは、初期期間の後に起こり得る創傷を取り囲む皮膚及び組織の変化、例えば腫脹及び滲出液の減少に適合され得る。
【００６５】
本明細書には、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤、プルラン、コラーゲン、及びポロゲンを含む混合物を形成する事、並びにポロゲンを除去する及び／又は上記混合物を脱水する事により、多孔質足場の細孔内に配置された制御された薬物放出の為に作製された接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤を有する多孔質足場を含む組成物を作製する事を含む、創傷の治療の為の多孔質足場を含む組成物を製造する方法が提供される。幾つかの実施形態では、多孔質足場は、ヒドロゲル、例えばプルラン及びコラーゲンヒドロゲルを含む。幾つかの方法は、上記組成物の表面上にＦＡＫ阻害剤を載置する事を含む。幾つかのその様な方法は、プルランをトリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）及び／又はトリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）又は別の架橋剤を用いて架橋する事を更に含む。
【００６６】
幾つかの方法は、上記除去工程の前にポロゲンを結晶化させる事を含む。例えば、カリウム若しくはナトリウム等の塩のポロゲン、又は本明細書の他の箇所に記載されている別の塩を使用する事が出来る。幾つかの方法では、組成物は、ＦＡＫ阻害剤の不均一な分布を含む。例えば、ＦＡＫ阻害剤は、細孔に沿って集中し得る。ＦＡＫ阻害剤は更に又はその代わりに、多層構造物内の特定の層に沿って又は組成物の外側表面（例えば、デバイスの外側表面）に集中し得る。
【００６７】
主題の方法は、被験体の創傷の治療が望まれるあらゆる用途で使用される。一般に、その様な被験体は「哺乳類」又は「哺乳動物」であり、これらの用語は、食肉目（例えば、イヌ及びネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモット、及びラット）、及び霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、及びサル）を含む哺乳動物の範囲内の生物を記載する為に広範に使用される。多くの実施形態では、被験体はヒトである。
【００６８】
従って、主題の方法は、広範な開放皮膚創及び閉鎖皮膚創を治療するのに使用され得る為、主題の方法は、様々な原因から、例えば、病態等の状態、転倒、掠り傷、刺創、銃撃、手術創、感染症等の身体外傷、爆弾、弾丸、破片等の戦時中の損傷の結果として引き起こされた創傷を治療する為に使用され得る。同様に、主題の方法は、様々な寸法の創傷を治療する事が出来る。例えば、主題の方法は、特定の創傷が筋肉に到達する深さを有する場合がある深部組織創と浅い創傷又は表在性創傷の両方で使用され得る。創傷は、真皮層へと貫入しない様に表皮に限定されても良く、真皮と同じ深さ又はそれより深くても良く、例えば、真皮に貫入又は真皮を貫通しても良く、更には皮下組織層に貫入又は皮下組織層を貫通しても又はより深くても良く、例えば、筋層以降を貫通又は筋層以降に貫入しても良い。例えば、主題の方法は、約０．００５ｍｍ〜約２．３５ｍｍ、例えば、約０．００７ｍｍ〜約２．３ｍｍ、例えば、約０．０１ｍｍ〜約２ｍｍの範囲の深さを有する創傷を創面切除する為に使用され得る。
【００６９】
創傷ドレッシング材は、プルラン／コラーゲンヒドロゲルにインプリント又は表面適用された有効用量のＦＡＫ阻害剤を含み得、そのヒドロゲルは、例えば、基材、例えば通気性のある保護層又は他の保護フィルムに取り付けられ又は接着され得る。代替的に、該ドレッシング材は、保護ドレッシング材と別個に構成され得る。支持体は、一般に、人体の動きに適合する事が出来るフレキシブルな材料で出来ており、それには、例えば、様々な非織布、織布、スパンデックス、フランネル、又はこれらの材料とポリエチレンフィルム、ポリエチレングリコールテレフタレートフィルム、ポリ塩化ビニルフィルム、エチレン−酢酸ビニルコポリマーフィルム、ポリウレタンフィルム等とのラミネートが含まれる。「フレキシブル」とは、支持体を、破断、引裂、裂け等なく、実質的に曲げる事が出来る又は折り畳む事が出来る事を意味する。支持体は、多孔質又は非多孔質であり得るが、典型的には、非多孔質であるか、又はヒドロゲル組成物、使用される場合は活性剤、及び流体、例えば、創傷部位から滲出するあらゆる流体に対して不浸透性である。
【００７０】
支持体の長さ及び幅の寸法は、典型的には、関連するパッチ組成物の長さ及び幅の寸法と正確に等しい事を含めて実質的に等しい。支持体層は、典型的には、約１０μｍ〜約１０００μｍの範囲の厚さを有し得るが、特定の実施形態では、約１０μｍ未満及び／又は１０００μｍを超えても良い。
【００７１】
ヒドロゲル及び任意の支持体層に加えて、ドレッシング材は、環境からパッチ層を保護する裏張りの反対側のヒドロゲル組成物層の表面上に剥離フィルムも含み得る。剥離フィルムは、代表的な剥離フィルムが、ＰＥＴ又はＰＰ等のポリエステルを含む、あらゆる適切な材料であり得る。
【００７２】
ドレッシング材の形状は様々であり、代表的な形状には、正方形、長方形、楕円形、円形、三角形等が含まれる。ドレッシング材のサイズも様々であって良く、多くの実施形態では、ヒドロゲルのサイズは、約１ｃｍ２以下から約１０００ｃｍ２以上の範囲であり、例えば、特定の実施形態では、約１０ｃｍ２〜約３００ｃｍ２の範囲であり、例えば、約２０ｃｍ２〜約２００ｃｍ２、例えば、約１３０ｃｍ２〜約１５０ｃｍ２の範囲である。特定の実施形態では、表面積は、実質的な部分、又は更に全トラック、又は更に被験体の全身の実質的な部分、又は更に全身を覆うのに十分である。従って、表面積は、約１０００ｃｍ２〜約５０００ｃｍ２以上の範囲であり得る。上記製造プロトコルは単なる代表的なものである事に留意されたい。上記の様に、主題のヒドロゲルパッチ組成物を製造する事が出来るあらゆる適切なプロトコルを使用する事が出来る。
【００７３】
本明細書に記載されるデバイス及びバンデージは、任意の適切な形状を有し得る。例えば、デバイス又はバンデージは、長方形、正方形、円形、楕円形、トロイダル形、又はそれらの区分若しくは組み合わせであり得る。多くの変形形態では、デバイスはフレキシブルであり平坦であり、皮膚に対してコンフォーマルに載置する事が出来る。当然ながら、デバイス及びバンデージは、様々な創傷に対処する為に、あらゆる適切なサイズであっても良い。幾つかの変形形態では、デバイス及びバンデージは、創傷部位の適切な被覆を確実にする為に、バンデージのロール又はシートから使用の直前に切り出され得る。デバイス及びバンデージは、場合によっては創傷から約２０ｃｍ（約８インチ）に迄達して良く、他の場合には、デバイス又はバンデージは、創傷から約２ｃｍ、４ｃｍ、６ｃｍ、８ｃｍ、１０ｃｍ、１２ｃｍ、１４ｃｍ、１６ｃｍ、又は１８ｃｍに達して良く、ここで、「約」は各距離を修飾している。更に他の変形形態では、バンデージは、創傷から約２２ｃｍ、約２４ｃｍ、約２６ｃｍ、又は更にそれ以上に達しても良い。幾つかの変形形態では、デバイスは、ポリマー、例えば、形状記憶ポリマーから出来ている。あらゆる適切な形状記憶ポリマー、例えば、スチレンベース、エポキシベース、又はアクリレートベースの形状記憶ポリマーを使用する事が出来る。
【００７４】
瘢痕及び／若しくはケロイドの形成を回復、並びに／又は毛髪及び皮膚付属器を発生させる為のキットも本明細書に記載されている。一般に、キットは、パッケージされた組合せ物において、本明細書に記載される有効量のＦＡＫＩを含むヒドロゲルの単位用量を含む。キット内の複数の用量は、並行して適用される様に設計され得る。例えば、幾つかのキットは、例えば、損傷後３日間迄の創傷治癒の増殖段階の早期部分等の初期期間の間に適用された後に取り除かれるべき１つのヒドロゲルと、その後に適用されるべき第２のヒドロゲルとを含み得る。幾つかのキットは、少なくとも１つの創傷ドレッシング材、又は少なくとも１つの創傷洗浄剤、又は創傷治癒用途に望ましい若しくは適切な他の構成要素を含み得る。キットは、デバイス及び／又はそこに含まれる他の構成要素を使用する為の説明書も含み得る。
【００７５】
本発明は又、本発明の医薬組成物の１種以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む医薬品パック又はキットを提供する。医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知であって、製造、使用又は販売の機関によるヒトの投与についての承認を表す通知が、その様な１つ以上の容器に付属し得る。
【００７６】
以下の実施例は、当業者に本発明をどの様に行い使用するかの完全な開示及び記載を提供する様に述べられており、本発明者等が発明とみなす範囲を制限するとは意図されず、以下の実験が、実施される全て又は唯一の実験である事を表すとも意図されない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証する為の努力がなされたが、幾らかの実験誤差及び偏差が考慮に入れられるべきである。特段の指示が無い限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧であるか又は大気圧の近くである。
【００７７】
本明細書で引用された全ての刊行物及び特許出願を、各個別の刊行物又は特許出願が引用により援用されると具体的且つ個別に示されたかの様に、引用する事により本明細書に援用する。
【００７８】
本発明は、本発明者によって本発明の実施の為の好ましい形態を含む事が見出され又は提案された特定の実施形態に関して記載されている。当業者によれば、本開示を踏まえて、本発明の意図された範囲から逸脱する事なく、例示された特定の実施形態において多数の変更及び変化を加える事が出来ると理解されるであろう。
【００７９】
実験
接着斑キナーゼ阻害剤の制御送達により、創傷閉鎖の加速と共に瘢痕形成の減少がもたらされる。
【００８０】
創傷形成又は外傷後の瘢痕形成は、経済に毎年数十億ドルを費やす重大な医療負担を意味する。接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）の活性化は、機械的シグナルを伝達して、創傷修復の間に線維化反応及び瘢痕形成を誘発するに当たり極めて重要な役割を担う事が分かっている。本発明者等は以前に、小分子ＦＡＫ阻害剤（ＦＡＫＩ）の局所注射を使用したＦＡＫの阻害が、肥厚性瘢痕モデルの瘢痕発生を減弱し得る事を示した。しかしながら、ＦＡＫＩ療法の臨床的橋渡しは、広範囲の熱傷、爆傷、及び大規模な切除損傷に対する効果的な薬物送達システムの欠如の為困難であった。この問題に対処する為に、本発明者等は、ＦＡＫＩをマウスにおける切除創及び熱傷創に送達するプルランコラーゲンベースのヒドロゲルを開発した。具体的には、熱傷創及び切除創をそれぞれ治療する為にＦＡＫＩを迅速放出又は持続放出する為に、２つの異なる薬物負荷ヒドロゲルを開発した。プルランコラーゲンヒドロゲルを介したＦＡＫＩの制御送達は、両方の創傷治癒モデルにおいて、創傷治癒を加速し、コラーゲン沈着と瘢痕形成性筋線維芽細胞の活性化を低減させた。本発明者等の研究は、重要な橋渡し的意義を有する創傷及び瘢痕管理の為の生体材料ベースの薬物送達アプローチを強調している。
【００８１】
プルラン−コラーゲンベースのヒドロゲルシステムは、創傷治癒の為のＦＡＫＩの送達に使用される。ＦＡＫＩヒドロゲル療法の有効性は、大きく深いマウスの切除創及び熱傷創モデルで評価された。２つの異なるタイプのヒドロゲル：ｉ．）持続放出性ヒドロゲル、及びｉｉ．）迅速放出性ヒドロゲルが開発された。持続放出性ヒドロゲルを開発する為に、分子インプリンティング技術を使用して、ＦＡＫＩを多孔質ヒドロゲルに組み込む事により、数日間に亘る創傷環境へのＦＡＫＩの徐放及び持続放出が可能となった。これらのヒドロゲルを、マウスにおけるスプリント装着された切除創へのＦＡＫＩの制御送達の為に使用した。しかしながら、熱傷創は漿液性排液の増加を伴い、より頻繁なドレッシング材の交換が必要とされる。これに対応する為に、本発明者等は、数時間以内でのＦＡＫＩの迅速放出を可能にするＦＡＫＩ表面取り込み法を使用した。
【００８２】
本明細書では、ＦＡＫＩがマウスの創傷の創傷治癒を有意に改善し、創傷治癒後の線維形成活性を減弱させた事が報告される。本発明者等の研究は、創傷及び瘢痕管理の為の生体材料ベースの抗瘢痕的な薬物送達アプローチを強調している。
【００８３】
プルラン−コラーゲンヒドロゲルからのＦＡＫＩのｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出プロファイル。本発明者等は以前に、細胞又は小分子薬物の取り込み能力を有する、柔らかく、真皮の様なプルラン−コラーゲンヒドロゲルマトリックスの作製方法及び特性評価を報告した（ウォン等（Wong et al.），２０１１ｃ及び図１Ａ）。ヒドロゲルの膨潤及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解挙動は、ＦＡＫＩの負荷によって変化しなかった（ＦＡＫＩ無しの膨潤比３０．８７±０．８４に対して、ＦＡＫＩありの膨潤比３２．１５±０．５６）（図１Ｂ）。質量分析により、ＦＡＫＩの構造的完全性がヒドロゲルへの組み込み後にも維持される事が確認された。
【００８４】
損傷の種類に応じて、ＦＡＫＩを効果的に送達する為に、２つの異なる薬物放出動態を採用した。分子インプリンティング技術により、創傷形成後の最初の数日間に最適な局所濃度のＦＡＫＩを示す持続放出動態がもたらされた（図１Ｃ）。以前に報告されたマウスＨＴＳモデル（アーラビー等（Aarabi et al.），２００７、ウォン等（Wong et al），２０１１ａ）を使用すると、このＦＡＫＩ濃度は、１０日間連続で毎日創傷部位に局所注射した場合に瘢痕形成を低減させるのに有効であった（図６）。持続放出性ＦＡＫＩヒドロゲルを、スプリント装着された切除創に使用した。熱傷創はドレッシング材を汚損する創面切除後の大量の漿液性排液を生じる為、任意の感染症の予防の為にヒドロゲル及びバンデージの頻繁な交換が必要であり、迅速放出プロファイルが望ましい。両方の創傷タイプに適用されるＦＡＫＩの用量を標準化する為に、ＦＡＫＩを迅速に放出する表面薬物取り込み法によって調製されたヒドロゲル足場を採用した。
【００８５】
分子インプリンティングで製造されたヒドロゲルは、数日間に亘って絶え間なくＦＡＫＩを放出し、ＦＡＫＩは凡そ４日目にほぼ完全に放出された。表面取り込み法は２４時間以内に完了した。どちらのタイプのヒドロゲルも、最初に組み込まれた総量の約４０％〜４５％を放出した（図１Ｃ）。迅速に放出されるＦＡＫＩの場合に、２４時間以内に放出された薬物の総量は、その皮膚毒性レベルを超えなかった（図６）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では、ヒドロゲルの分解は視覚的に観察する事は出来なかった。ヒドロゲル及びドレッシング材は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用される場合に頻繁に交換される為、最初の７２時間迄の本発明者等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出研究は生物学的に関連している。
【００８６】
ヒドロゲルを介して送達されるＦＡＫＩは、切除創の治癒を促進する。ヒトに見られる様な再上皮化を介した創傷治癒のメカニズムを再現するマウスにおけるスプリント装着創（ウォン等（Wong et al.），２０１１ｂ）を、創傷が完全に閉鎖する迄、持続放出性のＦＡＫＩ負荷ヒドロゲルで毎日治療した。０日目（創傷が作られたとき）から、切除創に、持続的にＦＡＫＩを放出するＦＡＫＩヒドロゲルを与えた。使用済みのヒドロゲルを取り除き、１日置きに新しいヒドロゲル及び接着バンデージと交換した。ＦＡＫＩで治療された切除創は、無治療の創傷よりも有意に早く治癒し、コントロール創傷についての損傷後１４日目に対して、損傷後１１日目に完全に閉鎖された（Ｐ＜０．０５、図２）。ブランクのヒドロゲルも創傷閉鎖を加速した事から、以前の報告（ウォン等（Wong et al.），２０１１ｃ、ウォン等（Wong et al.），２０１１ｄ）と一致して、足場単独で切除創に対して有益な創傷治癒環境をもたらし得る事を示唆している。目視検査によって評価されたヒドロゲルのバルク分解は、試験された時間経過内では発生しなかった為、ｉｎ  ｖｉｖｏでの足場分解を伴う大量のＦＡＫＩ放出はなかったと推測される。全ての動物は局所的なＦＡＫＩ療法を許容し、全ての創傷は感染症の兆候を示さなかった。
【００８７】
ヒドロゲルを介して送達されるＦＡＫＩは、切除創における瘢痕を形成する線維化促進活性を抑制する。瘢痕を促進する刺激（例えば、機械的歪み）が無いと、マウスの皮膚は典型的にはＨＴＳの上昇を生じないが、損傷後の線維化促進事象は、コラーゲン沈着の量と、創傷が治癒した後の筋線維芽細胞の存在とによって測定され得る。損傷後１７日目に、コラーゲン染色の組織学的分析により、コラーゲン沈着がコントロール創傷において最大であり、ＦＡＫＩで治療された創傷において最小量のコラーゲンが観察される事が実証された。筋線維芽細胞分化及び線維形成のマーカーであるα−ＳＭＡのタンパク質発現は、ＦＡＫＩ治療により有意に減少した。これらの結果は、損傷後１０日目に収集された創傷組織溶解物におけるＦＡＫ（ｐ−ＦＡＫ）のリン酸化レベルの減少と一致した（図３Ｅ及び図３Ｆ）。
【００８８】
興味深い事に、１０％のＤＭＳＯ中に溶解されたＦＡＫＩを１０日間に亘り毎日創傷部位に滴下した場合には、ｐ−ＦＡＫ阻害は検出されなかった事から、ＦＡＫＩがインプリンティングされたヒドロゲル足場が、ＦＡＫＩの局所部位への持続的且つ制御された送達を可能にして活性を改善した事を裏付けている。１７日目に採取された組織において、Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）の活性化及びＦＡＫＩに媒介されるＡｋｔリン酸化の阻害も調べた。Ａｋｔの活性化は、この修復段階の間に表皮層で顕著であり、局所的に送達されたＦＡＫＩはＡｋｔ活性化を実質的に阻害した（図３Ｇ及び図３Ｈ）。
【００８９】
治癒した切除創の機械的特性は、ＦＡＫＩ治療によって改善される。創傷治癒後に形成される皮膚瘢痕は、屡々、構造的完全性の変化及び弱い皮膚の機械的特性を伴う。ＦＡＫＩ治療が、治癒した創傷の機械的プロファイルを改善し得るかどうかを試験した。治癒した皮膚のヤング率は、コントロールと比較して、ヒドロゲル単独及びＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷において有意に高かった事から（図４）、治癒した皮膚の機械的完全性が改善され、従って外部の機械的応力に抵抗する能力が強化される事を裏付けている。ヤング率はＦＡＫＩ治療で最も高かった。又、伸張されたときに皮膚が耐える事が出来る最大応力を測定する極限引張強さ（ＵＴＳ）を調べたところ、ＦＡＫＩ治療された皮膚が最大のＵＴＳを示した。まとめると、ＦＡＫＩは、恐らく創傷治癒及び修復過程の間のコラーゲン沈着及び真皮の細胞外基質組成の調節を介して、治癒した皮膚の物理的完全性を改善するのに有益である。
【００９０】
ヒドロゲルを介して送達されるＦＡＫＩは、接触熱傷創の治癒を促進する。重度の深部皮膚熱傷に関連する長期治癒は、一般的にＨＴＳ形成につながる可能性がある。マウスの全層接触熱傷創モデルを使用して、ＦＡＫＩの抗線維化効果、及びＦＡＫＩが熱傷創の治癒を加速し得るかどうかを研究した。損傷後７２時間で創面切除した後に、ＦＡＫＩを迅速に放出するヒドロゲルを用いて熱傷創を治療した。切除創とは異なり、熱傷創は、創傷が再上皮化する迄、創傷部位及び隣接組織からの排液の増加を示した。その結果、より頻繁なドレッシング材の交換が必要であった。最初の治療後の最初の３日間は、ヒドロゲル及びバンデージを毎日交換し、その後は１日置きに交換した。ヒドロゲル単独又はコントロール創傷と比較して、ＦＡＫＩで治療された熱傷創は合併症無しに創傷閉鎖の加速を示した（図５）。切除創での観察と同様に、ヒドロゲルのバルク分解は起こらなかった。完全な閉鎖後に、創傷病変におけるα−ＳＭＡ発現が測定されたが、これはＦＡＫＩ治療で有意に減少した（図５）。
【００９１】
接着斑キナーゼ阻害剤の局所送達は、治癒の加速、瘢痕形成の減少をもたらすと共に、毛包及び皮膚付属器を再生させる。
【００９２】
ここでは、プルラン−コラーゲンデバイス内のＦＡＫＩが、ヒトの皮膚に最も類似している事が分かっている大型動物モデルにおいて、創傷治癒を有意に加速し、瘢痕形成を減少させ、毛包及び皮膚付属器を再生させた事を報告する。レッドデュロックブタは、深部皮膚創が形成されると、厚い永続的なヒトの様な瘢痕を発生し得る。持続放出性ＦＡＫＩヒドロゲル（図１Ａ〜図１Ｃに示され、本明細書の他の箇所に記載される）を、レッドデュロックブタの深部皮膚創に使用した。図７Ａ〜図７Ｄは、レッドデュロックブタモデルにおける深部皮膚創に対するヒドロゲルデバイス中に適用されたＦＡＫＩの局所治療の効果を分析する為の構成を示している。図７Ａは、試験に使用されるブタの背部に沿った領域を示している。図７Ｂは、皮膚の除去を伴うブタの深部創を示している。図７Ｃは、無傷のブタの皮膚の断面図を示している。図７Ｄは、０．０６インチ（ｉｎ）の創傷深さを有する創傷ブタの皮膚の断面図を示している。図７Ｅは、損傷日（Ｄ０）から術後１８０日（Ｄ１８０）迄のタイムラインを示している。プルラン−コラーゲンデバイス内のＦＡＫＩを創傷上に載置し、最初の２１日間は１日置きに交換した。２２日目から９０日目迄は、ＦＡＫＩプルラン−コラーゲンデバイスを週に２回交換した。術後９１日目から術後１８０日目迄は、プルラン−コラーゲンデバイスを適用せずに創傷を治癒させた。生検試料、写真、及び組織採取は指示通りに行われた。
【００９３】
ヒドロゲルを介して送達されるＦＡＫＩは、深部皮膚創の創傷治癒を有意に加速させる。図８Ａ〜図８Ｃは、デュロックブタにおける皮膚深創傷をＦＡＫＩヒドロゲルで局所的に治療する事により創傷治癒が加速される事を示している。Ｎ＝各状態について試験された８つの創傷。初期創傷サイズ＝２５ｃｍ２。図８Ａは、上記で図７Ａ〜図７Ｅに記載される様に術後（ＰＯＤ）２日目から術後３０日目（ＰＯＤ３０）迄に撮影された創傷の写真を示している。ＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷は、未治療の創傷又はヒドロゲル単独で治療された創傷と比較して、ＰＯＤ１１、ＰＯＤ２１、及びＰＯＤ３０で目に見えてより一層治癒している。目に見えて改善された外見に加えて、ＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷は有意により小さかった。ヒドロゲルを介して送達されたＦＡＫＩで治療された創傷の残りの創傷領域を、未治療のコントロール創傷及びヒドロゲル単独で治療された創傷と比較した。創傷サイズを測定し、元の創傷面積の％としてグラフ化し、結果を図８Ｂに示す。ＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷は、ＰＯＤ４後にコントロールと比較してより小さく、ＰＯＤ１４迄にＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷のほぼ全てが閉鎖されたのに対して、未治療（コントロール）の創傷の約２０％は閉鎖されておらず、開放したままであり、統計的有意差（＊）があった。ＰＯＤ１７迄に、ＦＡＫＩヒドロゲルで治療された創傷の全ては閉鎖されたのに対して、未治療（コントロール）の創傷の約１０％は依然として開放したままであり、統計的有意差（＊）があった。ヒドロゲル単独が創傷治癒を加速させた事から、上記の様に、足場単独が切除創に有益な創傷治癒環境をもたらし得る事を示唆している。図８Ｃは、未治療の創傷又はヒドロゲル単独で治療された創傷が完全に閉鎖するのに２５日間かかるのに対して、ヒドロゲルデバイス内のＦＡＫＩで治療された創傷はＰＯＤ１４迄に閉鎖し、統計的に有意な結果（Δ）である。
【００９４】
ヒドロゲルを介して送達されるＦＡＫＩは、瘢痕の外見を有意に改善する。図９Ａ〜図９Ｂ及び図１０Ａ〜図１０Ｂは、ヒドロゲルを介して送達されるＦＡＫＩにより深部皮膚創を局所的に治療すると、ＰＯＤ４５、ＰＯＤ６０、ＰＯＤ９０（３ヶ月）、及びＰＯＤ１８０（６ヶ月）で瘢痕の外見を有意に改善する事を示している。図９Ｂは、瘢痕のビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）分析からの結果を示している。ビジュアルアナログスケールスコアは、未治療のコントロール、ヒドロゲル治療、及びヒドロゲル治療を介したＦＡＫＩについて４人の盲検化された瘢痕の専門家によって評価された。コントロールにおける瘢痕形成を独断的に１００に設定し、結果をコントロールに対して基準化した。ヒドロゲルを介したＦＡＫＩで治療された創傷は、未治療のコントロールと比較して、１００のスケールに対して約５８の有意により少ない瘢痕化及びより良好な視覚的外見を示した（図９Ｂ、ΔＰ＜０．００１）。ヒドロゲル治療単独では、未治療のコントロールと比較して僅かな改善しか見られなかった。その傾向はＰＯＤ１８０でも残っている（図１０Ｂ、ΔＰ＜０．００１）。
【００９５】
ヒドロゲルを介して送達されるＦＡＫＩは、顕著な毛髪形成並びに毛包及び皮膚付属器の再生につながる。驚くべき事に、ヒドロゲルを介して送達されたＦＡＫＩで局所的に治療された深部皮膚創は、図１０Ｂに示される様に、コントロール治療又はヒドロゲル単独で治療された創傷には見られない顕著な毛髪成長を示している。図１１Ａ〜図１１Ｃは、ＰＯＤ９０からの結果を示している。図１１Ａの画像は、ＰＯＤ９０でのトリクローム染色を示している。矢印１は毛包を指している。矢印３は周囲の腺構造を有する毛包を指している。矢印２及び矢印４〜６は皮膚腺（汗腺及び皮脂腺）を指している。ヒドロゲルを介して送達されたＦＡＫＩで治療された創傷は、ＰＯＤ９０で有意により多くの毛包を有し（コントロールでの０．６に対して平均約２．８、＃Ｐ＜０．０１（コントロール対Ｈ＋ＦＡＫＩ））、この差はＰＯＤ１８０でも残っている。ヒドロゲルを介して送達されたＦＡＫＩで治療された創傷は、ＰＯＤ９０で有意により多数の腺（皮脂腺及び汗腺）を有し（コントロールでの０．１に対してヒドロゲル＋ＦＡＫＩで治療された創傷において約７、＊Ｐ＜０．００１（コントロール対Ｈ＋ＦＡＫＩ））、この差はＰＯＤ１８０でも残っている（コントロールのＸに対する概数）。
【００９６】
ヒドロゲルを介して送達されるＦＡＫＩは、切除創における瘢痕を形成する線維化促進活性を抑制する。マウスの切除創について先に示されたのと同様に、図１２Ａは、ヒドロゲルを介して送達されたＦＡＫＩが、ＰＯＤ６０及びＰＯＤ９０で、未治療のコントロールに対して、ヒドロゲルを介して送達されたＦＡＫＩで治療された創傷においてα平滑筋作用（α−ＳＭＡ）の発現を有意に減少させる事を示している。図１２Ｂ（ＰＯＤ６０）は、α−ＳＭＡ発現のレベルが、治療された創傷において有意により低い事を示しており（未治療のコントロールにおける約２８％に対して、治療された試料において、領域の約２％が緑色（α−ＳＭＡの指標）に染色されている；＊ｐ＜０．００１）、この傾向はＰＯＤ９０でも残っている（図１２Ｃ）。α平滑筋作用（α−ＳＭＡ）は、盲検化された観察者によって瘢痕病変内の無作為に選択された領域について定量化された。
【００９７】
ヒドロゲルを介して送達されるＦＡＫＩは、創傷の無い皮膚に似た皮膚コラーゲン構造をもたらす。図１３Ａ〜図１３Ｃは、ヒドロゲルを介して送達されるＦＡＫＩで治療された創傷が、創傷の無い皮膚に似た皮膚コラーゲン構造をもたらす事を示している。図１３Ａは、ヒドロゲルを介して送達されたＦＡＫＩで局所的に治療されたブタ由来の組織が、未治療のコントロール創傷又はヒドロゲルで治療された創傷のいずれかと比較してより短い原線維を有する事を示している（図１３Ａにおける３段目のパネルを最上段のパネル及び２段目のパネルと比較する）。むしろ、ＦＡＫＩで局所的に治療されたブタ由来の組織からのコラーゲン原線維は、創傷の無い動物由来の組織に遙かにより良く似ている（最下段のパネル）。図１３Ｂは、図１３Ａに示される様に染色された試料からのコラーゲン原線維の長さを定量化した結果を示している。ヒドロゲルを介して送達されたＦＡＫＩで局所的に治療された創傷は、未治療のコントロール創傷と比較して有意により短い原線維を示した（ｐ＜０．０１）。図１３Ｃは、図１３Ａに示される様に染色されたパネルからのコラーゲン原線維の数を示している。ヒドロゲルを介して送達されたＦＡＫＩで局所的に治療された創傷は、未治療のコントロール創傷と比較して有意により多くの原線維を示した（ｐ＜０．０５）。棒グラフの中央にある水平線は中央値を表し、Ｘは平均値を表している。Ｎ＝コントロール、ヒドロゲル、及びヒドロゲル＋ＦＡＫＩについての９つの画像。Ｎ＝創傷無しについての４つの画像。
【００９８】
図１５Ａ〜図１５Ｂは、ヒドロゲルを介して局所的に送達されたＦＡＫＩの安全性を示している。図１５Ａ〜図１５Ｂは、ヒドロゲルを介して局所的に送達されたＦＡＫＩの毒物学及び薬物動態的研究を示している。ＦＡＫＩ分子の全身吸収を適用後の様々な時点で血清から調べ、結果は図１５Ａに示されている。局所的に送達されたＦＡＫＩの体表面全体の５％〜７％への全身吸収は僅かであった（１ｎｇ／ｍｌ＝２ｎＭのＦＡＫＩ）。ＦＡＫＩヒドロゲル試料を、高濃度のＦＡＫＩ（１５０μｍのＦＡＫＩ、１．５ｍＭのＦＡＫＩ）で創傷の無い皮膚に毎日適用し、これらの結果は図１５Ｂに示されている。ＦＡＫＩを毎日高濃度で適用したとしても、皮膚の炎症又は感作は生じなかった。
【００９９】
現在、熱傷創及び外傷性創傷に関連する異常な治癒及び瘢痕化を抑える為の臨床的に利用可能な療法は、科学的根拠が弱く有効性は最小限である。インテグリン／ＦＡＫメカノトランスダクションシグナル伝達経路は、機械的応力シグナルを媒介して炎症性メディエーターにより線維形成過程を促進する事によって、損傷後の皮膚瘢痕形成において中心的な役割を担っている。従って、ＦＡＫシグナル伝達物質の抑制は、大きく深い皮膚創における瘢痕の無い創傷治癒の為の有望な方略である。ＶＳ−６０６２及び改良されたＶＳ−６０６３／デファクチニブを含むＦＡＫのより新世代の小分子阻害剤は、臨床試験で進行した固形腫瘍の治療に有効である事が証明されている。ＶＳ−６０６２は、これらの試験で望ましい薬物動態を示したが、経口投与された場合の潜在的な薬物間相互作用の為、抗癌剤としては打ち切られた。経口投与では、これらの試験で悪心／嘔吐及び胃腸関連の有害作用を伴う主要な全身毒性が観察された。この化合物の局在化された局所送達は全身吸収及びその後の毒性から免れ、本発明者等の研究で使用された。
【０１００】
以前のマウスの研究では、小分子ＦＡＫ阻害剤（ＰＦ５７３２２８）の皮内注射は炎症性ケモカイン経路を抑制し、切開ＨＴＳモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで瘢痕化を減弱させた。しかしながら、大面積の深部皮膚創は皮膚注射によって治療する事が困難であり、薬理学的作用物質の狙いを絞った局所送達が、診療所において好まれる理学療法である可能性が高い。創傷治療の為の生体材料ベースのアプローチは、過去に広く研究されてきた。様々なキトサン又はヒアルロン酸ヒドロゲル複合材料が皮膚創に対して試験されており、皮膚の治癒及び再生に有益な効果を有した。
【０１０１】
以前、本発明者等のグループは、生分解性プルラン−コラーゲン皮膚ヒドロゲル単独で、マウスの創傷において早期の創傷治癒が増強され得る事を報告した。プルランヒドロゲルは無毒で修飾可能であり、理想的な保水能力を示す。多孔質マトリックスは又、架橋を可能にする複数の官能基を有し、様々な皮膚治癒障害の為の細胞ベース及び／又は生体分子送達の為の構造化されたテンプレートとして機能する可能性がある。この生体工学によって作られたマトリックスを使用して、間葉系幹細胞を高酸化ストレス創傷に送達し、皮膚細胞集団を再生させた。
【０１０２】
本研究の成果は、開放創用のプルラン−コラーゲンヒドロゲル内で抗瘢痕化剤を送達した最初のものである。独自のヒドロゲル製造方法と組み合わせたＦＡＫＩを封入する分子インプリンティング技術により、持続放出、迅速放出、又は２つの組み合わせの為に正確に制御されたヒドロゲル足場からのＦＡＫＩの持続放出が可能となった。本明細書に示される様に、ＦＡＫＩ療法は、全層切除及び熱傷創の治癒を有意に加速し、瘢痕形成を低減させた。創傷治癒の加速は、早期の免疫細胞応答（例えば、増殖及び遊走）及び炎症に対するＦＡＫＩの阻害効果による可能性が高い。
【０１０３】
本研究は、ＦＡＫに媒介されるメカノトランスダクション及び抗線維化治療薬への機構的洞察を与える。ＦＡＫＩがＡＫＴの活性化を阻害する事が裏付けられ、ＦＡＫは治癒中の皮膚において複数の下流のエフェクタータンパク質を介して作用し、線維化過程を増強し得る事が示唆される（図３）。プルラン−コラーゲンヒドロゲル単独は治癒を促進するのに有益である事が示されたが、熱傷創には殆ど又は全く効果がなかった。
【０１０４】
熱傷創は、外科的に切除された創傷とは病理学的に異なり、屡々代謝的及び炎症的変化を引き起こす為、これらの効果の差は、異なるタイプの損傷に対して生理学的応答が異なる事に起因し得ると想定している。更に、ＦＡＫＩ治療後に再構成された皮膚の機械的完全性も改善される。引張試験を使用した機械的完全性の直接的な調査を使用して、ヤング率及び極限引張強さを計算した（図４）。ＦＡＫＩで治療された皮膚は、両者とも治癒した皮膚の物理的完全性の尺度である、最大のヤング率と共に極限引張強さを示した。従って、治癒した皮膚が外力又は応力に応じた変形及び破壊に耐える能力は、ヒドロゲル単独と比較して、ＦＡＫＩ治療によって強化される。
【０１０５】
結論として、プルラン−コラーゲンヒドロゲル足場を介したＦＡＫＩ療法は瘢痕形成の低減に有効であると同時に、マウスモデルにおいて切除創及び熱傷創の治癒を促進する事が示された。本発明者等の生体材料ベースのＦＡＫＩの送達は、大きく深い皮膚創の瘢痕管理の為の効果的な治療方略として大きな可能性を秘めている。この研究の結果は、ヒトの臨床試験で使用する為の高度に橋渡し的な前臨床大型動物モデルにおけるＦＡＫＩ瘢痕低減療法の橋渡しを可能にする。
【０１０６】
材料及び方法
生体適合性のＦＡＫＩ放出ヒドロゲル足場の構築。ＦＡＫＩであるＶＳ−６０６２（以前はＰＦ−５６２２７１）は、ベラステム社（Verastem, Inc.）（マサチューセッツ州、ニーダム）によって供給された。多孔質プルランコラーゲンヒドロゲルを、以前に記載された様に作製した（ウォン等（Wong et al.），２０１１ｃ）。ＦＡＫＩを含むヒドロゲル構築物を、分子インプリンティング（持続放出）又は表面取り込み（迅速放出）のいずれかによって調製した。簡単に説明すると、１ｇのプルラン（東京化成工業株式会社（TCI）、日本、東京）を、１ｇのトリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）（シグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州、セントルイス）及び１ｇの塩化カリウム（フィッシャー・サイエンティフィック社（Fisher Scientific）、ニューハンプシャー州、ハンプトン）と混合した。該混合物に５０ｍｇのラット尾コラーゲンＩ型、５％（重量／重量）の重量のプルランを含有するコラーゲン溶液（コーニング社（Corning）、ニューヨーク州、コーニング）を添加した。分子インプリンティング（図１Ａ）の為に、該混合物に１ｍｌの５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０ｍｇのＶＳ−６０６２（ＦＡＫＩ）を添加した。次いで、水酸化ナトリウム（０．６５ｍｌの１Ｎの溶液）を加え、引き続き、脱イオン水を加えて合計１０ｍｌにした。該混合物を均質分布の為に１５分間穏やかにボルテックスに掛けた。プルランの架橋により混合物の粘度が上昇したら、該混合物をテフロン（登録商標）シート上に注ぎ、圧縮して２ｍｍ厚のフィルムを作製した。フィルムを乾燥させ、洗浄液のｐＨが７．０になる迄水で洗浄した。この洗浄工程の後に、凡そ５０％のＦＡＫＩがヒドロゲル中に存在していた。膨潤したヒドロゲルを−８０℃で凍結させた後に、凍結乾燥させた。表面取り込み法の為に、最初にブランクのヒドロゲルを作製し、その後にエタノール中に溶解された５ｍｇのＦＡＫＩを、乾燥したヒドロゲル上に均一に広げ、引き続き溶剤を蒸発させた。最後に、ヒドロゲルフィルムを水分を含まない容器中で使用する迄４℃で保管した。
【０１０７】
吸水／膨潤特性：ＦＡＫＩを用いて及び用いずに構築されたヒドロゲルを、ＰＢＳ中での膨潤挙動について試験した。ＦＡＫＩを含む又は含まない５％のコラーゲンを含有する凍結乾燥されたヒドロゲルを、０．８ｍｍの生検パンチを使用して円形パッチに切り出し、秤量し、ＰＢＳ中で２５℃でインキュベートした。余分な溶液を穏やかに除去し、膨潤比を次の式：膨潤比＝（ヒドロゲルの湿重量−ヒドロゲルの乾燥重量）／ヒドロゲルの乾燥重量を使用して計算した。
【０１０８】
ヒドロゲルからのＦＡＫＩの抽出：２．５ｍｇの重量の乾燥ヒドロゲルを０．５ｍｌの水と混合した後に、Ｂｕｌｌｅｔ  Ｂｌｅｎｄｅｒビーズミルホモジナイザー（ネクストアドバンス社（Next Advance）、ニューヨーク州、アベリルパーク）を使用して均質化した。均質物を０．５ｍＬのメタノールで希釈し、ＦＡＫＩを抽出し、次いで５０００ｇで５分間遠心分離した。９０％超の試料回収率が達成され、それは以下に記載されるＨＰＬＣ法及び質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法によって分析された。
【０１０９】
プルラン−コラーゲンヒドロゲルからのＦＡＫＩについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出プロファイル。２つの異なるテンプレート調製方法を比較する為に、ＦＡＫＩのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出動態を研究した。５０μｇのＦＡＫＩを含む２．５ｍｇの重量の乾燥ヒドロゲルを、１ｍｌのＰＢＳを含む２５０００ＭＷＣＯの透析膜チューブに入れた。透析チューブの両側を密閉した後に、バイアル内で９ｍｌのＰＢＳに浸した。バイアルを穏やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。少量のアリコートを定期的に抜き出して、ヒドロゲルから放出されたＦＡＫＩの完全性を定量化して測定した。
【０１１０】
ＬＣ−ＭＳ分析：実験はＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ４０００  ＱＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムで実施した。ＨＰＬＣ装置は、システムコントローラーＣＢＭ−２０Ａ、バイナリＬＣ−２０ＡＤポンプ、及びＳＩＬ−２０ＡＣオートサンプラーを備えた株式会社島津製作所（Shimadzu）製のＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅのＬＣシステムであった。ＨＰＬＣは、次の仕様を使用して実施した：移動相：９０％のメタノール／１０％の水／０．１％のギ酸、カラム：ダイオネクス社（Dionex）のＡｃｃｌａｉｍ  １２０  Ｃ８、５μｍ、５０×２．１ｍｍ、流速：０．３ｍｌ／分、及び注入容量：１０μＬ。ＨＰＬＣは、エレクトロスプレーイオン化によるＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ４０００  ＱＴＲＡＰ（登録商標）トリプル四重極質量分析計に直接接続した。質量分析計は、正の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モード、イオン源：ターボスプレー、分解能：Ｑ１ユニット、Ｑ３ユニット、質量ＭＲＭトランジション（ｍ／ｚ）：５０８．３０＞１２１．００において作動させた。
【０１１１】
データ分析：ＦＡＫＩの構造的完全性を、分子量及びＨＰＬＣ保持時間によって決定した。３連で実施されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験からの累積放出を、平均±ＳＤ．３として表現した。
【０１１２】
動物並びにスプリント装着された切除創モデル及び接触熱傷創モデル
動物（マウス）：全ての動物処置法は、スタンフォード大学の実験動物管理に関する行政パネル及び米国陸軍医学研究司令部の動物管理使用評価室（Animal Care and Use Review Office）によって承認された。８週齢〜１０週齢の野生型の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ジャクソン研究所（The Jackson Laboratory）、メイン州、バーハーバー）を使用して、公開された方法（ワン等（Wang et al.），２０１３、ウォン等（Wong et al.），２０１１ｂ、スルタン等（Sultan et al.），２０１２）に従って、スプリント装着された全層切除創又は第３度熱傷創のいずれかを作成した。
【０１１３】
切除創形成：外科手術により作成された切除創については、６ｍｍのパンチ生検ツールを用いて２つの全層創傷（背側正中線の各側に１つの創傷）が作られた。創傷を取り囲むシリコーンリングを皮膚に縫合する事で、創傷の収縮を防止したが（齧歯類の創傷治癒の主な手段）、再上皮化によって創傷を閉鎖させた（ヒトの創傷治癒と同様に）。
【０１１４】
熱傷創形成：熱湯浴中で１００℃で２０秒間加熱されたアルミニウム棒を用いて背側の片側にのみに接触熱傷創を作成した。創傷を直ちに冷水で３０秒間冷却した。全層のヒト熱傷の通常の臨床現場をシミュレートする為に、最初の損傷から７２時間後に、壊死組織を創傷縁に沿って下にある皮下脂肪のレベル迄切除した。両方のモデルにおいて、創傷を負った動物を無作為に３つの群に分け、標準的なドレッシング材（テガダーム）又はブランクのヒドロゲル又はＦＡＫＩ負荷されたヒドロゲルのいずれかを与えた。ドレッシング材及びヒドロゲルは２日〜３日毎に交換した。熱傷創をスプリント装着せずに治癒させ、ヒドロゲル及びバンデージを最初の３日間は毎日交換し、その後は１日置きに交換した。一部の切除創については、１０％のＤＭＳＯ中に溶解されたＦＡＫＩを１０日間毎日創傷部位に直接滴下した後に、細胞溶解物をウエスタンブロッティング用に収集した。全てのデジタル写真は、２人の盲検化された調査者によって米国国立衛生研究所（NIH）のＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析された。
【０１１５】
肥厚性瘢痕モデル及びＦＡＫＩの局所皮下注射：マウスの背側の切開創形成及び肥厚性瘢痕の発生は、以前に記載された方法（アーラビー等（Aarabi et al.），２００７、ウォン等（Wong et al.），２０１１ａ）によって実施された。動物を無作為に割り当てて、創傷部位に隣接する毎日の局所皮下注射を介して１０％のＤＭＳＯ中に溶解された１５μＭ、７５μＭ、又は１５０μＭの濃度のＦＡＫＩを与えた。１５０μＭのＦＡＫＩが与えられた動物は、未確認の全身合併症の為２日より長く生存しなかった。組織学の為に損傷後１４日目に標本を採取し、瘢痕面積を定量化した（図６）。
【０１１６】
動物（マウス）：レッドデュロックブタを使用して、公開された方法（チュー  ＫＱ等（Zhu KQ et al.），バーンズ（Burns）２００３年１１月；第２９巻（第７号）：第６４９頁〜第６６４頁．バーンズ（Burns）；チュー  ＫＱ等（Zhu KQ et al.），ワウンド・リペアー・アンド・リジェネレーション（Wound Repair Regen.）２００７年９月〜１０月；第１５巻補足１：第３２頁〜第３９頁）に従って、深部皮膚創形成時に厚い永続的なヒトの様な瘢痕を生成した。ブタの皮膚はヒトの皮膚に最も類似している事が分かっている（例えば、同様の表皮の厚さ、同様の真皮−表皮の厚さ比、毛包及び血管のパターン）。６週齢〜８週齢の１６ｋｇ〜２０ｋｇの重量の７頭の雌のレッドデュロックブタを使用した。複数の５×５ｃｍの０．０７インチの切除創（図７Ｂ及び図７Ｅの挿入図）を電動デルマトームで作成した。創傷は中央がほぼ全層創傷であり、周辺に向かって深い部分層創傷であった。創傷をコントロール（治療無し）、ヒドロゲルのみ（プラセボ）、又はＦＡＫＩ治療薬を伴うヒドロゲルに無作為に割り当てた。
【０１１７】
組織学的染色及び免疫蛍光染色。それぞれ切除創及び熱傷創について、損傷後１７日目及び創面切除後２４日目に標本を採取し、４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、脱水した後に、パラフィン包埋した。ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色及びマッソンのトリクローム染色を、通常のプロトコルに従って実施した。マッソンのトリクローム染色の画像の青色領域のパーセンテージを、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。マウスα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）に対する一次抗体を使用して免疫蛍光染色を行った。ＦＩＴＣにコンジュゲートさせた二次抗体を使用し、画像を蛍光顕微鏡下で観察した。緑色領域のパーセンテージを、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。
【０１１８】
ウエスタンブロッティング。ウエスタンブロッティングを実施して、切除創溶解物中のＦＡＫ発現及びチロシン−３９７でのリン酸化を研究した。タンパク質を収集し、ＢＣＡアッセイを使用して定量化した。等量のタンパク質をプレキャスト４％ゲルの各ウェルにロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。タンパク質を転写した後に、ニトロセルロースメンブレンをＦＡＫ（セルシグナリング社（Cell Signaling）、マサチューセッツ州、ダンバース）又はｐ−ＦＡＫ（アブカム社（Abcam）、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）のいずれかに対する一次抗体と一緒にインキュベートし、引き続きＨＲＰコンジュゲート二次抗体とインキュベートした。抗体の化学発光検出は、製造業者のプロトコルに従って実施した。バンド強度をＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。
【０１１９】
ＣＴ−ＦＩＲＥ。切片をコラーゲンについて染色し、ＣＴ−ＦＩＲＥソフトウェアを使用して分析した。ＣＴ−ＦＩＲＥソフトウェアにより、ユーザーは画像からコラーゲン線維を自動的に抽出し、線維の角度、長さ、真直度、及び幅を含む記述統計学を用いて線維を定量化する事が出来る。このプログラムは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）によりサポートされている画像ファイルを読み取り、ＣＴ−ＦＩＲＥ（ソフトウェア実装ではｃｔＦＩＲＥと呼ばれる）と呼ばれる組み合わせ法を介して個々のコラーゲン線維を抽出する。ＣＴ−ＦＩＲＥのアプローチは、ブレッドフェルト  ＪＳ（Bredfeldt JS），リュー  Ｙ（Liu Y），ペールケ  ＣＡ（Pehlke CA）等著（２０１４年）「乳癌の第二次高調波発生画像からのコラーゲン線維のコンピュータによるセグメンテーション（Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer）」ジャーナル・オブ・バイオメディカル・オプティクス（J Biomed Opt）第１９巻：第１６００７頁〜第１６００７頁に記載されており、これは、画像のノイズ除去及び線維エッジ特徴を増強する為の離散カーブレット変換（カンデス  Ｅ（Candes E），デマネット  Ｌ（Demanet L），ドノホ  Ｄ（Donoho D）、イン  Ｌ（Ying L）著（２００６年）「高速離散カーブレット変換（Fast discrete curvelet transforms）」マルチスケール・モデリング・アンド・シミュレーション（Multiscale Model Simul）第５巻：第８６１頁〜第８９９頁）の利点と、個々の線維の抽出の為の線維抽出（ＦＩＲＥ）アルゴリズム［３］の利点とを兼ね備えている。
【０１２０】
皮膚の機械的試験。スプリント装着された切除創を作成してから３週間後に、創傷組織を収集し、機械的試験用のＭＴＳ  Ｂｉｏｎｉｘ（登録商標）引張試験機（エムティエスシステムズ社（MTS Systems）、ミネソタ州、エデンプレイリー）に取り付けた。試料ゲージの距離を１０ｍｍに設定し、試料の厚さ及び幅を手動で測定した。皮膚組織を、破断する迄１００□ｍ／秒の一定速度で延伸した後に、真応力対真歪み曲線をプロットした。極限引張強さ（ＵＴＳ）を、破断前に達成された最大応力として決定し、ＵＴＳに対応する歪みを臨界歪みとして定義した。ヤング率を、線形最小二乗回帰（Ｒ２≧０．９９）を介して計算した。
【０１２１】
データ解析。結果は平均±ＳＤとして報告される。統計的差異は、一元配置ＡＮＯＶＡと共に多重比較の為のテューキーの事後検定を使用して決定した。差異はｐ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
【０１２２】
特徴又は要素が本明細書で別の特徴又は要素の「上にある（on）」と言及される場合に、その特徴又は要素は他の特徴若しくは要素上に直接存在しても良く、又は介在する特徴及び／若しくは要素が存在しても良い。それに対して、特徴又は要素が別の特徴又は要素の「直上にある（directly on）」と言及される場合には、介在する特徴及び／若しくは要素は存在しない。又、特徴又は要素が別の特徴又は要素に「接続される（connected）」、「取り付けられる（attached）」又は「カップリングされる（coupled）」と言及される場合に、その特徴又は要素は他の特徴若しくは要素に直接接続され、取り付けられ、若しくはカップリングされても良く、又は介在する特徴若しくは要素が存在しても良い。それに対して、特徴又は要素が別の特徴又は要素に「直接的に接続される（directly connected）」、「直接的に取り付けられる（directly attached）」又は「直接的にカップリングされる（directly coupled）」と言及される場合には、介在する特徴又は要素は存在しない。一実施形態に関して記載され又は示されているが、こうして記載され又は示された特徴及び要素は他の実施形態に適用する事が出来る。別の特徴に「隣接して（adjacent）」配置されている構造又は特徴についての言及は、隣接する特徴と重複する部分又は隣接する特徴の下にある部分を有し得る事も当業者には理解されるであろう。
【０１２３】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する事のみを目的とし、本発明を限定する事を意図するものではない。例えば、本明細書で使用される場合に、単数形（"a"、"an"、及び"the"）は、文脈上特に明記されていない限り、複数形も同様に含む事が意図される。本明細書で使用される場合に、「含む（comprises）」及び／又は「含む（comprising）」という用語は、指定された特徴、工程、操作、要素、及び／又は構成要素が存在する事を特定するが、１つ以上の他の特徴、工程、操作、要素、構成要素、及び／又はそれらの群が存在する事又は追加される事を排除するものではない事が更に理解されるであろう。本明細書で使用される場合に、「及び／又は」という用語は、関連する列挙された事項の１つ以上のあらゆる全ての組み合わせを含み、「／」として略記する事も出来る。
【０１２４】
「〜の下方（under）」、「〜の下（below）」、「〜より低い（lower）」、「〜の上方（over）」、「〜より上（upper）」等の様な空間的に相対的な用語は、本明細書では説明を容易にする為に、図面に示されている或る要素又は特徴と１つ以上の別の要素又は特徴との関係を説明する為に使用され得る。空間的に相対的な用語は、図面に示される方向に加えて、使用中又は動作中のデバイスの異なる方向を包含する事が意図されると理解されるであろう。例えば、図中のデバイスが反転している場合に、他の要素又は特徴の「下方（under）」又は「下（beneath）」と記載される要素は、他の要素又は特徴の「上方（over）」に向きが合わせられる事となる。従って、「下方（under）」という例示的な用語は、上方（over）及び下方（under）の両方の方向を包含し得る。該デバイスは、それ以外に方向付けられ（９０度又は他の方向に回転され）る場合もあり、本明細書で使用される空間的に相対的な記述子がそれに応じて解釈され得る。同様に、「上向き（upwardly）」、「下向き（downwardly）」、「垂直（vertical）」、「水平（horizontal）」等の用語は、本明細書では、特段の具体的な指示が無い限り、説明の目的でのみ使用される。
【０１２５】
本明細書では「第１」及び「第２」という用語を使用して様々な特徴／要素（工程を含む）が説明され得るが、これらの特徴／要素は、文脈上特に指示が無い限り、これらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、或る特徴／要素を別の特徴／要素と区別する為に使用され得る。従って、本発明の教示から逸脱する事なく、以下で論じられる第１の特徴／要素は、第２の特徴／要素と呼ぶ事が出来、同様に、以下で論じられる第２の特徴／要素も第１の特徴／要素と呼ぶ事が出来る。
【０１２６】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の解釈を必要としない限り、「含む（comprise）」という単語、並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等の別形は、様々な構成要素を方法及び物品（例えば、組成物及びデバイスを含む装置及び方法）において一緒に使用する事が出来る事を意味する。例えば、「含む（comprising）」という用語は、任意の指定された要素又は工程を包含する事を意味するが、任意の他の要素又は工程を排除する事を意味するものではないと理解されるであろう。
【０１２７】
一般に、本明細書に記載される装置及び方法のいずれかも包括的であると理解されるべきであるが、その一方で構成要素及び／又は工程の全て又は部分集合は排他的である場合があり、様々な構成要素、工程、部分構成要素又は部分工程「からなる（consisting of）」或いは「実質的にからなる（consisting essentially of）」として表現され得る。
【０１２８】
実施例で使用されるものを含めて本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合に、特段の明示的な指示が無い限り、全ての数は、明示的に見られないとしても、「約」又は「凡そ」という単語が前置きされるかの様に読む事が出来る。「約」又は「凡そ」という語句は、大きさ及び／又は位置を記載する場合に、記載される値及び／又は位置が値及び／又は位置の合理的な期待範囲内にある事を示す為に使用する事が出来る。例えば、数値は、指定された値（又は値の範囲）の±０．１％、指定された値（又は値の範囲）の±１％、指定された値（又は値の範囲）の±２％、指定された値（又は値の範囲）の±５％、指定された値（又は値の範囲）の±１０％等である値を有し得る。本明細書に示される任意の数値は又、文脈上別段の指示が無い限り、その値の約の値又は凡その値を含むと理解されるべきである。例えば、「１０」という値が開示される場合に、「約１０」も開示されている。本明細書に列挙される任意の数値範囲は、その中に含まれる全ての部分範囲を含む事が意図される。当業者によって適切に理解される様に、値が開示されている場合に、その値「以下」、「その値以上」及び値間の可能な範囲も開示されていると理解される。例えば、「Ｘ」という値が開示される場合に、「Ｘ以下」と共に「Ｘ以上」（例えば、Ｘが数値である場合）も開示されている。又、本出願全体を通して、データは多くの様々な形式で示され、このデータは終点及び開始点、並びに該データ点の任意の組み合わせについての範囲を表すとも理解される。例えば、特定のデータ点「１０」及び特定のデータ点「１５」が開示される場合に、１０及び１５より大きい、１０及び１５以上、１０及び１５未満、１０及び１５以下、並びに１０及び１５と等しい事だけでなく、１０から１５の間も開示されているとみなされる事が理解される。又、２つの特定の単位間の各単位も開示されているとも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合に、１１、１２、１３、及び１４も開示されている。
【０１２９】
様々な例示的な実施形態が先に記載されているが、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱する事なく、様々な実施形態にあらゆる多くの変更を加える事が出来る。例えば、記載された様々な方法工程が実施される順序は、屡々代替的な実施形態では変更されても良く、他の代替的な実施形態では１つ以上の方法工程が完全に飛ばされても良い。様々なデバイス及びシステムの実施形態の任意の特徴は、幾つかの実施形態では含まれる場合があるが、その他では含まれない場合がある。従って、上述の説明は、主に例示的な目的で提供されており、特許請求の範囲に示されている様に、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１３０】
本明細書に含まれる例及び図は、限定するものではなく例示的なものとして、主題が実施され得る特定の実施形態を示している。上述の様に、他の実施形態を利用し、そこから他の実施形態を導き出す事が出来、こうして、本開示の範囲から逸脱する事なく、構造的及び論理的な置換及び変更を加える事が出来る。本発明の主題のその様な実施形態は、本明細書において、単に便宜の為に、そして実際に２つ以上が開示されているのであれば、本出願の範囲を任意の単一の発明又は発明の概念に自発的に限定する事を意図する事なく、「発明」という用語によって個別に又は集合的に参照され得る。従って、特定の実施形態が本明細書で例示及び記載されているが、同じ目的を達成する様に計算された任意の構成を、示された特定の実施形態に置き換える事が出来る。この開示は、様々な実施形態のあらゆる全ての適応又は変形を対象に含める事が意図される。上記の実施形態、及び本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態の組み合わせは、上記の説明を検討すれば、当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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