(57)【要約】  本発明は、遅延老化を有する植物の生産方法に関し、この生産方法は、植物中のデオキシハイプシン合成酵素（ＤＨＳ）をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーに、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を、誘導することを含み、ヌクレオチドの欠失、挿入、または置換が、植物中の遺伝子によってコードされるＤＨＳの活性を減少させる。本発明はまた、その方法によって生産される植物およびその子孫にも関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遅延老化を有する植物の生産方法であって、前記植物中のデオキシハイプシン合成酵素（ＤＨＳ）をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーに、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入または置換を誘導することを含み、前記ヌクレオチドの欠失、挿入または置換が、前記植物中の前記遺伝子によってコードされるＤＨＳの活性を減少させる、方法。
【請求項２】
前記ヌクレオチドの欠失、挿入または置換が、ＤＨＳ活性に必要な少なくとも１つのアミノ酸のコード領域において生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＨＳ活性が、前記植物中の真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）のハイプシン化である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレオチドの欠失、挿入または置換が、前記植物中の前記遺伝子によってコードされる前記ＤＨＳの活性を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遅延老化が、前記植物における種子収量を増加させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記遅延老化が、葉および根バイオマスを増加させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記遅延老化が、干ばつまたは栄養ストレス中に植物の生存を増強する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記遅延老化が、前記植物の病害抵抗性を増加させる、請求項１〜４のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項９】
前記遅延老化が、前記植物の葉、茎、種子および果実が保存され、使用に好適なままでありうる期間を増加させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物が、一倍体、二倍体、四倍体、または倍数体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物中のＤＨＳをコードする遺伝子の少なくとも２つのコピーに、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入または置換を誘導することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記植物が、アルファルファである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルファルファが、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記植物が、トマト植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記トマト植物が、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記植物におけるが、コムギである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記コムギが、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記植物が、バナナ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記バナナ植物が、Ｍｕｓａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記植物が、キャノーラ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記キャノーラ植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記植物が、ワタ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ワタ植物が、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記植物が、ヒヨコマメ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヒヨコマメ植物が、Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記植物が、ダイズ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ダイズ植物が、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記植物が、インゲンマメ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記マメ植物が、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記植物が、コットンウッド植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記コットンウッド植物が、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記植物が、ビート植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ビート植物が、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記植物が、ジャガイモ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ジャガイモ植物が、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記植物が、イネ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記イネ植物が、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｇｒｏｕｐである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記植物が、モロコシ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記モロコシ植物が、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記植物が、トウモロコシ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記トウモロコシ植物が、Ｚｅａ  ｍａｙｓである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記植物が、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記植物が、ピーナッツ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ピーナッツ植物が、Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記植物が、ブドウ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ブドウ植物が、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａまたはＶｉｔｉｓ  ｌａｂｒｕｓｃａである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記植物が、カカオである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記カカオ植物が、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記植物が、チャ植物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記チャ植物が、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記植物が、コーヒーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記コーヒー植物が、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記植物が、レタスである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記レタス植物が、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記植物が、キャッサバである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記キャッサバ植物が、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記植物が、ランである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ラン植物が、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ  ｅｑｕｅｓｔｒｉｓである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記植物が、バラである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記バラ植物が、Ｒｏｓａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
遺伝子の少なくとも１つのコピーへの前記欠失、挿入、または置換が、配列番号２のＫ３３４、Ｋ２９２、Ｋ３４３、Ｅ３２８、Ａ３２９、Ｖ３３０、Ｓ３３１、Ｗ３３２、Ｇ３３３、Ｋ１４４、Ｄ３１８からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸、または関連植物種における対応するアミノ酸のコード領域にある、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記老化が、加齢性老化である、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記老化が、環境ストレス誘導性老化である、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
請求項１〜６４のいずれか１項に記載の方法によって生産される植物。
【請求項６６】
請求項６５に記載の植物の子孫。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
老化は、植物の生命における生物学的発育の終末期である。それは、死を予兆し、植物全体、器官、花、果実、組織、個々の細胞を含む、さまざまなレベルの生物学的有機体で起きる。
【０００２】
老化の開始は、内部および外部の両方のさまざまな要因によって誘導され得る。老化は、果実、花および葉のような植物または植物組織の生命における複雑で高度に制御された発育段階である。老化は、細胞膜および巨大分子の協調的な分解、およびその後の植物の他の部分への代謝物の動員をもたらす。
【０００３】
正常な植物の発育中に起こるプログラムされた老化に加えて、細胞および組織の死、ならびにその後の代謝物の再動員は、外的な、環境要因に対する協調的な応答として起こる。壊死またはアポトーシスとも呼ばれる時期尚早な老化を誘導する外的要因には、温度、干ばつ、不十分な光または栄養供給などの環境ストレス、および病原体の攻撃が含まれる。また、環境ストレスにさらされた植物組織は、一般にストレスエチレンと呼ばれるエチレンを生産する［Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ  ４８：１８１−１９９；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．（１９７４）Ｐｌａｎｔ  １２０：６３−６９］。エチレンは、一部の植物において老化を引き起こすことが知られている。
【０００４】
老化は、受動的プロセスではなく、むしろ、特定の遺伝子の協調的な発現が関与する能動的に制御されたプロセスである。老化期には、総ＲＮＡのレベルが低下し、多くの遺伝子の発現がオフになる［Ｂａｔｅ  ｅｌ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｂｏｔａｎｙ  ４２：８０１−１１；Ｈｅｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：５５３−６４］。しかしながら、老化プロセスが、核遺伝子のデノボ転写に依存するという証拠が増えている。例えば、老化は、ｍＲＮＡおよびタンパク質合成の阻害剤ならびに除核によって阻止される。インビトロ翻訳実験のための老化葉および緑色葉からのｃＤＮＡを用いた分子研究によって、老化葉における葉タンパク質産物の変化したパターンが示されている［Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３９：４０３−１２］。ディファレンシャルスクリーニングおよびサブトラクティブハイブリダイゼーション技術を使用して、老化誘導遺伝子を代表する多くのｃＤＮＡクローンが、シロイヌナズナ、トウモロコシ、キュウリ、アスパラガス、トマト、イネおよびジャガイモのような単子葉植物および双子葉植物の両方を含む、異なる植物の範囲から同定されてきた。老化中に特異的に発現される遺伝子の同定は、老化が進行するにはデノボ転写が必要であることの確かな証拠である。
【０００５】
老化中に起こるイベントは、壊死および死が起こる前に、細胞成分を最大限に利用できるようにするために高度に協調的であるように見える。特定の特異的シグナルの感受および遺伝子発現のカスケードの誘導を伴う複雑な相互作用は、このプロセスを制御するため生じなければならない。老化関連タンパク質をコードする遺伝子の発現は、おそらく、次に、ホルモンシグナルによって直接的または間接的に活性化される共通のアクチベータータンパク質を介して制御される。そのプロセスの初期のシグナリングまたはその後の協調に関与するメカニズムについては、ほとんど知られていない。
【０００６】
協調的な遺伝子発現は、開始因子を含む転写および翻訳に関与する因子を必要とする。翻訳開始因子の遺伝子は、単離され、植物を含む多様な生物において特徴づけられている。翻訳開始因子は、ｍＲＮＡ集団が核から移動する速度、それらがリボソームに結合する速度を制御することができ、ある程度、特定のｍＲＮＡの安定性に影響を与え得る。［Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯＪ．１７：２９１４−２９２５］。実際に、そのような翻訳開始因子の一つは、全体的な翻訳活性に必要ではないが、翻訳のために特定のサブセットのｍＲＮＡを核から細胞質へとシャトルすると考えられている［Ｊａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８６：５９０−６００；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７５４１−１７５４９；Ｒｏｓｏｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１２：２３６９−２３８０］。この翻訳因子は、真核生物開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）として知られており、アミノ酸ハイプシンを含有することが知られている唯一のタンパク質である［Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５２６４−１５２６９］。
【０００７】
真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）は、真核細胞のタンパク質合成の開始に関与する、大きさが約１７ｋＤａの必須なタンパク質因子である。それは、特有な修飾アミノ酸であるハイプシン［Ｎ−（４−アミノ−２−ヒドロキシブチル）リジン］の存在によって特徴づけられ、ｅＩＦ−５Ａのみ存在することが知られている。ハイプシンは、ポリアミン、スペルミジンからのブチルアミン基が、ｅＩＦ−５Ａ中の特定のリジン残基の側鎖アミノ基に転移およびヒドロキシル化されることで、翻訳後に形成される。ｅＩＦ−５Ａの活性化は、スペルミジンのブチルアミン残基をｅＩＦ−５Ａのリジンに転移し、ハイプシンを形成し、ｅＩＦ−５Ａを活性化することを伴う。真核生物では、デオキシハイプシン合成酵素（ＤＨＳ）は、ｅＩＦ−５Ａ中の翻訳後のハイプシン合成を媒介する。ハイプシン修飾は、メチオニル−ピューロマイシンアッセイを用いて、インビトロでのｅＩＦ−５Ａ活性に不可欠であることが示された。
【０００８】
ハイプシンは、デオキシハイプシンシンターゼ合成酵素（ＤＨＳ；ＥＣ１．１．１．２４９）およびデオキシハイプシン水酸化酵素（ＤＯＨＨ；ＥＣ１．１４．９９．２９）の作用により保存されたリジン残基の変換を介して、翻訳後に、ｅＩＦ−５Ａ上に形成される。ＤＨＳ  ｃＤＮＡは、何十もの植物種において、直接的な配列の決定またはゲノム配列からの予測がなされており、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１２０６７４）、アルファルファ（米国特許第８，５６３，２８５号）、バナナ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿００９４０５８５７）、アマナズナ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿０１０４５２５００）、キャノーラ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿０１３８５９７７２）、カーネーション（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ２９６０８０）、カカオ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＧＤ０００６９１４）、コーヒー（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＲ９８６２８１）、ダイズ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＭ０９２５１５）、タバコ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１３２５６２０）、トマト（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１２４７５６６）、コムギ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ３７６３８９）、および他の多くが挙げられる。また、ＤＯＨＨ  ｃＤＮＡ配列は、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿０１３５９４４０４）を含む一部の植物においても同定されている。
【０００９】
ＤＨＳは、スペルミジンに由来するブチルアミン基の付加を介して、ｅＩＦ−５Ａの保存されたリジン残基をデオキシハイプシンに変換する。次いで、このｅＩＦ−５Ａの中間型は、ＤＨＨによってヒドロキシル化されて、ハイプシンになる［Ｐａｒｋ  ｅｌ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｌ．Ｓｉｇｎａｌｓ  ６：１１５−１２３］。ｅＩＦ−５Ａのデオキシハイプシンおよびハイプシン型の両方が、インビトロでｃＤＮＡと結合することができる［Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｌ．Ｓｉｇｎａｌｓ  ６：１６６−１７４］。ｅＩＦ−５Ａの機能は完全には理解されていないが、それが細胞分裂［Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５２６４−１５２６９；Ｔｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｌ．Ｓｉｇｎａｌｓ  ６：１５０−１５６］、および老化［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７５４１−１７５４９］を制御している可能性を示すいくつかの証拠がある。一部の生物は、複数のｅＩＦ−５Ａのアイソフォームを有することが知られているようであり、これは、各アイソフォームが細胞分裂および老化などのプロセスに関与する特定のｍＲＮＡ群に対する特異的のシャトルであるという前提に適合するであろう。
【００１０】
Ｗａｎｇらは、ＤＨＳ  ｃＤＮＡレベルの増加が、トマトの果実の軟化および天然およびストレス誘導葉老化と相関することを実証した［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７５４１−１７５４９；（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５２：１２２３−１２３５；ａｎｄ（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３８：１３７２−１３８２］。さらに、恒常的プロモーターの制御下でＤＨＳのアンチセンスｃＤＮＡ断片を導入することによって、トランスジェニックトマト植物においてＤＨＳの発現が抑制された場合、これらのトランスジェニック植物由来のトマト果実は、遅延した果実の軟化および腐敗によって証明されるように、劇的な遅延老化を示した。米国特許第６，８７８，８６０号、同第６，９００，３６８号、同第７，０７０，９９７号、および同第７，２２６，７８４号を参照されたい。ＤＨＳは、ｅＩＦ−５Ａを活性化することが知られていることから、これらのデータは、ハイプシン修飾ｅＩＦ−５Ａ（活性ｅＩＦ−５Ａ）は、老化に必要なｍＲＮＡ種の選択的な翻訳を通して、老化を制御している可能性を示唆する。これは、恒常的プロモーターの制御下で、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、「ＡＴ」）における、全長または３‘ＵＴＲ  ｃＤＮＡのアンチセンスによるＤＨＳのダウンレギュレーションを介してさらに実証される。シロイヌナズナＤＨＳ（「ＡＴ−ＤＨＳ」）の発現をダウンレギュレーションすること、およびそれがｅｌＦ−５Ａの活性化にあまり利用できないようにすることによって、老化が約２週間遅延した［Ｄｕｇｕａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １６４：４０８−４２０および米国特許第７，２２６，７８４号を参照のこと］。老化が遅延しただけでなく、種子収量の増加、ストレス耐性の増加、およびバイオマスの増加がトランスジェニック植物において観察され、ＤＨＳのダウンレギュレーションの程度が、各表現型の程度を決定した。
【００１１】
アンチセンストランスジェニック植物を用いた植物におけるＤＨＳのダウンレギュレーションは、ストレスに対する耐性、遅延老化および増加した収量のような有利な農学的な特性を有する植物を生成することが期待されるが、一般に、トランスジェニック植物には、いくつかの欠点が有る。トランスジェニックＤＨＳ植物の作出は、アンチセンス遺伝子を含む外来ＤＮＡの導入を必要とし、これは、強力な発現のためのウイルスプロモーターならびに選択遺伝子をしばしば使用する。さらに、ウイルスプロモーターは、多くの場合、植物によって認識されて遮断され、トランスジェニック植物の将来の世代におけるアンチセンス発現の喪失につながる。植物、例えばアルファルファ、におけるＤＨＳのダウンレギュレーションのためのより良好な戦略は、ゲノム編集を使用して、遺伝子を修飾し、翻訳されたＤＨＳタンパク質の活性を低減または排除することである。トマト、シロイヌナズナおよび多くの他の植物は、サザンブロット［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７５４１−１７５４９］、および全ゲノム配列決定で示されるように、それらのゲノム中にＤＨＳを１コピーだけ有する。アルファルファは、四倍体植物であるため、ゲノム編集技術を使用して、同じ実験から別個の子孫で破壊することができ、そのゲノムに見出される４つのＤＨＳのコピーのうちの１つは、それによって、植物組織中のＤＨＳ活性を約２５％減少させ、そのゲノムに見出される４つのＤＨＳのコピーのうちの２つは、それによって、植物組織中の活性を約５０％減少させ、または、そのゲノムに見出される４つのＤＨＳのコピーのうちの３つは、それによって、植物組織中の活性を約７５％減少させる。これらの残存活性レベルの各々を発現する独立した子孫のスクリーニングは、ストレスおよび老化経路に関与するｅＩＦ−５Ａアイソフォームの不完全なハイプシン化を介して、ストレスに対して最大限に向上した耐性および遅延老化示すクローンの特定につながる可能性がある。ＤＨＳのホモ接合ノックアウトは、マウスおよび酵母において、致死的であることが実証されていることを考えると、ＤＨＳのホモ接合ノックアウトは致死イベントであるはずなので、４つ全てのＤＨＳのコピーが破壊された子孫が見つかる可能性は低い［Ｔｅｍｐｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １０：１０４３−９；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８４：１５１−４］。
【００１２】
ゲノム編集は、様々な技術を利用して、植物または動物のいずれかのゲノムを操作するもので、高度に特異的な様式で、特定の遺伝子配列を、挿入、欠失、または置換する。多くのゲノム編集の方法が存在し、これらに限定されるものではないが、意図される修飾部位に相同な配列が隣接するトランスジェニックＤＮＡ配列の使用（相同組換え）、または、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｍｓｌ、転写アクチベーター様エフェクター系ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＡＲＣヌクレアーゼ（ＡＲＣＵＳ）を含む操作されたヌクレアーゼを用いる方法が挙げられる。これらの全ての系において、ヌクレアーゼは、部位特異的な二本鎖ＤＮＡの切断を生成し、その後、相同組換えまたは非相同的な末端結合を介して修復され、所望の変異を生成する。
【００１３】
相同組換えの例としては、高速形質開発システム（Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｉｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＲＴＤＳ）が挙げられる［Ｂｅｅｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：８７７４−８７７８；Ｋｏｃｈｅｖｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２：１７４−１８４］。ＲＴＤＳは、遺伝子修復オリゴヌクレオチド（Ｇｅｎｅ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＧＲＯＮ）を使用して、高度に特異的な様式で標的遺伝子の配列にミスマッチエラーを導入する。次に、このミスマッチは、植物の自然なＤＮＡ修復システムによって修復され、それは、ＧＲＯＮをテンプレートとして使用して所望の修飾を生成する。
【００１４】
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９ゲノム編集システムは、単子葉植物および双子葉植物を含む、多種多様な生物に使用されている。編集の標的となる所望の遺伝子と相同な標的配列を有する１つ以上の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとともに導入し、Ｃａｓ９タンパク質を特定のゲノム部位に導くために使用する［Ｍａ  ａｎｄ  Ｌｉｕ（２０１６）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，ＤＯＩ：１０．１００２／ｃｐｍｂ．１０に概説されている］。Ｃｍｓｌのような他の二本鎖ヌクレアーゼを使用して同様な実験を設計することができる［ＢｅｇｅｍａｎｎとＧｒａｙ、米国特許第９，８９６，６９６号］。
【００１５】
転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、天然に存在する転写エフェクターであり、タンデムリピートの単純なコードを使用して、高い特異性でＤＮＡ配列を認識するカスタマイズ可能なＴＡＬＥの生成を可能にする。ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のような機能ドメインと組み合わせると、標的遺伝子破壊が可能である。その操作された認識配列へのＴＡＬＥＮヌクレアーゼの結合は、二本鎖ＤＮＡの切断をもたらし、その後の非相同末端結合修復機構の動員は、遺伝子機能の破壊につながる小さな欠失または挿入のいずれかをもたらす。ＴＡＬＥＮは、経済的に重要な食用作物およびバイオ燃料を改変するために使用されており、特定のヒト疾患の根底にある遺伝的エラーを修正するために探究されている。ＴＡＬＥＮは、また、相同組換えを使用して標的配列を遺伝子座に特異的に導入するために、切断部位と相同性を有するＤＮＡの標的化断片の同時導入と組み合わせることができる。
【００１６】
メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼとも呼ばれる）は、ゲノム内で非常に稀に、理想的には１回のみ発生する大きな配列（１２〜４０塩基対）を認識するヌクレアーゼである［Ｐｏｒｔｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３］。しかし、メガヌクレアーゼは、通常、回文構造の配列を認識するが、これは、２つの異なる半部位を認識する一対の単量体を生成することによるもので、ヘテロダイマーとしてメガヌクレアーゼを形成して非回文構造部位を切断する。ＡＲＣＵＳは、ＡＲＣヌクレアーゼに基づくゲノム編集技術であり、天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼ由来の完全に合成されたホーミングエンドヌクレアーゼ様酵素である。ＡＲＣヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ配列を認識するようにカスタマイズすることができ、正確なＤＮＡ切断、多くの場合、ゲノム内の唯一の部位での切断を可能にする。このＤＮＡ切断は、相同組換えによる挿入、欠失、または置換を含むゲノム修飾を可能にする。
【００１７】
ＤＨＳ酵素の機能は、よく理解されている。ＤＨＳによって触媒されるデオキシハイプシン合成酵素反応は、３つの異なる基質：スペルミジン、ＮＡＤおよびｅＩＦ−５Ａ前駆体タンパク質［ｅＩＦ−５Ａ（Ｌｙｓ）］との相互作用を伴う。反応の第１のステップは、スペルミジンのＮＡＤ依存性脱水素であり、第２のステップは、ＤＨＳ−イミン中間体を形成するためのトランス−イミノ化を含み、第３のステップは、ｅＩＦ−５Ａ−イミン中間体についてのトランス−イミノ化を含み、第４のステップは、ｅＩＦ−５Ａ−イミン中間体の酵素共役還元である［Ｊｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２６７９−６８５］。酵素−イミン中間体の結合は、スペルミジンの４−アミノ−ブチル部分とヒト酵素中のＬｙｓ３２９のε−アミノ基との間に形成される［Ｊｏｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：３２６７９−６８５］。ｅＩＦ−５Ａ（Ｌｙｓ）前駆体の付加の際、ブチルアミン基がヒトｅＩＦ−５ＡのＬｙｓ５０に転移され、次いで還元されて、デオキシハイプシンが形成される。したがって、ヒトＤＨＳのＬｙｓ３２９は、スペルミジンからｅＩＦ−５Ａへのブチルアミン基の転移に絶対的に必要であるからであるため、ＤＨＳ酵素活性に重要である。
【００１８】
Ｌｙｓ３２９は、ヒトＤＨＳの活性部位における重要な残基であることが実証されている（表１）。この保存されたリジン（Ｋ３２９ＡまたはＫ３２９Ｒ）の単一点突然変異は、スペルミジンのブチルアミン基のｅＩＦ５Ａの保存されたＬｙｓ５０残基への転移を触媒してデオキシハイプシンを生成するヒトＤＨＳの能力を完全に破壊する［Ｊｏｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：３２６７９−６８５、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１５８６５−７１、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．（２００１）３５５：８４１−９］。また、酵母において対応する残基Ｌｙｓ３５０は、デオキシハイプシン合成酵素の活性に重要であることが実証されている［Ｗｏｌｆｆ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ（１９９９）Ｙｅａｓｔ  １５：４３−５０］。ヒトＤＨＳ中のＬｙｓ３２９を含みそれを取り巻く領域は、植物種において高度に保存されており、Ｇｌｕ３２３からＬｙｓ３２９への活性部位における７つのアミノ酸の保存領域（ヒトＤＨＳ番号）は、調査された植物ＤＨＳ配列（図１）において完全に保存されている。この高度な保存は、植物において対応する残基の変異が、デオキシハイプシンの合成を触媒する発現酵素の能力の完全な消失につながることを示唆する。
表１：
ヒトＤＨＳの活動領域。
【表１】
2021509023.tif 000003
【００１９】
ヒトＤＨＳ中のＮＡＤ＋結合に関与していると同定されたアミノ酸残基Ａｓｎ１０６、Ａｓｐ２３８、Ｈｉｓ２８８、およびＡｓｐ３１３は、全ての調査された植物ＤＨＳ配列において保存されている（図１および表１）。また、ヒトＤＨＳにおいて、スペルミジン結合およびデオキシハイプシン合成の触媒に関与する残基Ｈｉｓ２８８，Ｔｒｐ３２７、Ｌｙｓ３２９、Ａｓｐ３１６、およびＧｌｕ３２３は、植物ＤＨＳ配列においても保存されている［図１および表１；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３５５：８４１−９］。共有結合中間体の形成に重要なＬｙｓ２８７［Ｊｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２６７９−６８５］、ならびに、触媒中心であり、ＤＨＳの酵素活性およびスペルミジンのブチルアミン部分の転移を伴う中間体の形成に重要なＬｙｓ３２９、も高度に保存されている（図１および表１）。
【００２０】
その配列は、ＤＨＳの活性領域において高度に保存されているが、重要な残基の番号付けは、ヒトと比較して、植物種では異なっている。Ｍ．ｓａｔｉｖａにおける重要な残基の番号付け、およびヒトＤＨＳの対応する残基番号は、表２に示されている。例えば、ヒトＤＨＳのＬｙｓ２８７とＬｙｓ３２９は、Ｍ．ｓａｔｉｖａのＬｙｓ２９２とＬｙｓ３３４にそれぞれ対応する。
表２：
ＤＨＳの機能活性に重要であることが実証されているヒトＤＨＳ中のアミノ酸残基、およびアルファルファ（Ｍ．ｓａｔｉｖａ）中の対応する残基。
【表２】
2021509023.tif 000004
【００２１】
ＮＡＤ＋および／またはスペルミジンの結合に関与する他の残基も、ヒトＤＨＳ酵素活性に重要であると同定されている（表３）。これらは、Ｌｙｓ２８７を含み、その変異は、酵素がスペルミジンを切断してデオキシハイプシンを合成する能力において（野生型酵素に対して）９９％の減少につながる［Ｊｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２６７９−６８５］。Ｌｙｓ２８７は、高度に保存された残基であり、機能活性に対して重要であると見られるサイドポケットの空洞の形成に関与している［Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３５５：８４１−９、Ｕｍｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２８６９７−７０５］。この残基は、Ｈｉｓ２８８に隣接し、おそらく、プロトン受容体／供与体として作用することにより、スペルミジンのＮＡＤ脱水素化に役割を果たすことが予測されている［Ｕｍｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２８６９７−７０５］。また、Ｈｉｓ２８８の変異は、スペルミジン結合および酵素活性のほぼ完全な喪失をもたらした［Ｌｅｅ，２００１］。スペルミジン結合に関与する他の残基は、アラニンに変異した場合、デオキシハイプシン合成酵素活性の劇的な低下をもたらした。これらには、Ｄ２４３Ａ、Ｗ３２７Ａ、Ｈ２８８Ａ、Ｄ３１６Ａ、Ｅ３２３Ａ、Ｋ３２９Ａ、およびＫ３２９Ｒが含まれる［表３を参照；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３５５：８４１−９］。Ｌｙｓ３２７とともに、残基Ａｓｐ３１６、Ｈｉｓ２８８、およびＧｌｕ３２３は、サイドポケットの空洞を定義するのに役立つように見える［Ｕｍｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２８６９７−７０５］。また、ＮＡＤ＋結合に関与する残基は、アラニンに変異した場合、酵素活性のほぼ完全な喪失をもたらすことが判明した。これらには、Ｄ３４２Ａ、Ｄ３１３Ａ、Ｄ２３８Ａ、Ｅ１３７Ａが含まれる［表３を参照；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５５：８４１−９］。
【００２２】
ヒトＤＨＳ中のある残基、例えばＫ１４１、は特定されており、変異すると、一定の活性を保持するＤＨＳタンパク質をもたらす。例えば、ヒトＤＨＳ中のＫ１４１Ｒ変異では、ＤＨＳ活性が２０％保持された（表３、Ｊｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２６７９−６８５］。デオキシハイプシン合成酵素の活性を完全に消失させる欠失、挿入、または置換をＤＨＳに生成するのではなく、修飾遺伝子の活性を低下させるが、それを除去しないＫ１４１（Ｍ．ｓａｔｉｖａでのＫ１４４、表２）などの機能的に重要な残基に特異的な単一点突然変異を導入することが可能であり得る。１、２、３、または４つの遺伝子コピーが修飾されたかどうかに応じて、様々な残存活性レベルを発現する独立した子孫をスクリーニングすることで、ストレスおよび老化経路に関与するｅＩＦ−５Ａアイソフォームの不完全なハイプシン化を介して、ストレスに対して最大限に改善された耐性および遅延老化を示すクローンの同定につながり得る。この場合、致死性を防ぐのに十分な残存ＤＨＳ活性があるかもしれないので、４つ全てのＤＨＳコピーが修飾された子孫を見つけることが可能であり得る。
【００２３】
表３：
３６９アミノ酸のヒトＤＨＳタンパク質における、前述の変異、置換または欠失、およびそれらのＮＡＤ＋結合、スペルミジン結合、ｅＩＦ５Ａ（Ｌｙｓ）結合、およびデオキシハイプシン合成酵素活性を含むＤＨＳ活性に対する影響。
【表３】
2021509023.tif 000005
【００２４】
ＤＨＳタンパク質の触媒機能を低減するが除去しないホモ接合変異を構築する能力は、ハイブリッド種子から生長させた作物において特に重要である。例としては、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、穀物用モロコシ、ワタ、ピーナッツ、その他多くの作物が挙げられる。これらの場合、エリート近交系株は、ほとんどの遺伝子座においてホモ接合性である親として使用される。それらのＤＨＳ遺伝子における標的変異に起因する活性の低下を有する親系統の一方または両方は、農家に販売される得られたハイブリッド種子において特に有利であろう。
【００２５】
現在、内的または外的のいずれか、例えば、環境ストレス、因子によって引き起こされるプログラム細胞死（老化を含む）の開始を制御するための広く適用可能な方法は存在しない。したがって、あらゆる種類の植物に適用可能で、かつ老化につながるイベントのカスケードの最初の段階で有効な老化を調節する技術を開発することが興味の対象となる。ＤＨＳのゲノム編集は、環境ストレスによる植物収量の損失を低減するとともに、果物、野菜、花などの生鮮農産物の保存期間を延長するための可能な解決策である。
【発明の概要】
【００２６】
本発明は、アルファルファを含む植物種由来のデオキシハイプシン合成酵素のタンパク質配列、ならびにゲノム配列を含むこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、ＤＨＳデオキシハイプシン合成酵素活性に重要なアミノ酸残基を標的とすることによって、これらのＤＨＳタンパク質の活性を破壊するためのゲノム編集または塩基編集（欠失、挿入、または置換のいずれかを含む）を伴う方法に関する。
【００２７】
本発明は、加齢性老化または環境ストレス誘導性老化のいずれかで、老化の開始を制御するための植物の遺伝子修飾の方法を提供する。限定されないが、ＲＴＤＳ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｍｓｌ、ＡＲＣＵＳまたは塩基編集を含むいくつかのゲノム編集技術のうちの１つは、ＤＨＳ機能に重要なアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を導入するために使用され、ＤＨＳタンパク質活性の低減または除去をもたらし、それによって、機能的に活性な内因性老化誘導ＤＨＳタンパク質のレベルを低減し、ｅＩＦ−５Ａの活性化やその後老化を媒介する下流の遺伝子発現を低減および／または阻止する。
【００２８】
米国特許第９，８９６，６９６号、Ｂｅｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７，Ａｒｔｉｃｌｅ  １１６０６（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｄｃｕ．ｂｅ／ｂｅｍｓＴ）、およびＢｅｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）ｂｉｏＲｘｉｖ（ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／ｌ０．Ｈ０ｌ／ｌ９２７９９）に記載されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｍｓｌシステムおよびその成分に関連する、ゲノム撹乱または遺伝子編集などの配列標的化を伴うＤＨＳタンパク質活性の制御のための方法および組成物が本明細書に提供される。Ｃｍｓｌは以前、Ｃｓｍｌと称された（米国特許第９，８９６，６９６号を参照のこと）。
【００２９】
その開示は、参照により本明細書に援用される。特定の実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃｍｓ酵素であり、例えば、Ｃｍｓｌオーソログ、特に、ＭｉＣｍｓｌである。本方法および組成物は、標的ＤＮＡ配列に結合する核酸を含む。これは、核酸が、例えば、ペプチドに比べてはるかに生成しやすく、かつ安価であるため有利であり、特異性は、相同性が求められるストレッチの長さに応じて変化することができる。例えば、複数の指の複雑な３次元位置決めは必要ではない。また、Ｃｍｓｌ酵素は、Ｃａｓ９よりも小さく、植物内でより効率的に働き、ＤＮＡ切断後に平滑断端の代わりに粘着末端を残す。
【００３０】
ＤＨＳゲノム配列に有用な変更を行うゲノム編集の代替物は、ＣＲＩＳＲ塩基編集であり、特に、活性部位またはそのＮＡＤ＋結合部位のいずれかにおけるＤＨＳ遺伝子のコード領域における点突然変異を行う。この最近の技術は、特定のＤＮＡ配列への遺伝子修飾を標的とするために、多様な機能ドメインに融合された、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）などの触媒として不活性化されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用する［Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＪ．（２０１８）４７５：１９５５−１９６４］。二本鎖切断は生成されず、ｄＣａｓ９は、それらの標的ヌクレオチドを他のＤＮＡ塩基に変換するためにアデニンまたはシチジンデアミナーゼを標的とする。２９の植物種におけるＬｙｓ１４９コドン（ＮＡＤ＋結合部位の１つ）を塩基編集する特定の標的の多くの例は、実施例１３に提供される。
【００３１】
本発明の方法を使用すると、ゲノム編集または塩基編集された植物が生成され、生長、発育、ならびに自然老化または遅延老化のいずれかについてモニターされる。老化誘導ＤＨＳ、老化誘導ｅＩＦ−５Ａまたはこれらの両方のレベルの減少による、延長された寿命または保存期間（例えば、花の寿命の延長、果実または野菜の腐敗の減少）、バイオマスの増加、種子収量の増加、生理病に対する耐性の増加（例えば、しり腐れ、種子の老化の減少、および／または葉の黄化の減少）を示す植物または植物の剥離部分（例えば、挿し穂、花、野菜、果実、種子または葉）は、輸送および貯蔵中の葉の黄化の減少、花弁の脱離の減少、果実や野菜の腐敗の減少を含む向上した特性を有する所望の産物として選択される。これらの優れた植物が繁殖される。同様に、環境ストレス（例えば、高温または低温、干ばつ、低栄養レベル、高塩、叢生、病原体感染、および／または生理病）に対して増加した耐性を示す植物が、優れた産物として選択される。
【００３２】
本発明の方法で使用することができる植物の種類は、限定されないが、例えば、エチレン感受性およびエチレン非感受性の植物、アンズ、リンゴ、オレンジ、バナナ、グレープフルーツ、ナシ、トマト、イチゴ、アボカド、ブドウなどの着果植物を含む。一部の実施形態では、植物は、ニンジン、マメ、レタス、キャベツ、カブ、ジャガイモ、ブロッコリー、アスパラガスなどの野菜である。一部の実施形態では、植物は、カーネーション、バラ、キクなどの花である。一部の実施形態では、植物は、農作物植物であり、森林種を含み、例えば、トウモロコシ、イネ、ダイズ、アルファルファ、コムギ、ワタ、サトウダイコン、キャノーラ、モロコシ、ヒマワリ、アマナズナ、ピーナッツ、木などが挙げられる。一般に、ゲノム編集のためにＤＮＡ分子を取り込むことができる任意の植物は、本発明の方法において使用することができ、一倍体、二倍体、四倍体、および倍数体を含む様々な倍数性レベルの植物を含み得る。植物は、単子葉植物または双子葉植物のいずれかであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】様々な植物ＤＨＳタンパク質とヒトＤＨＳタンパク質とのアライメント。レーン１：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＤＨＳ（受入番号ＮＰ  ００１９２１）（配列番号１０）、レーン２：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（受入番号ＮＰ  １９６２１１）（配列番号１１）、レーン３：Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ０１０４５２５００）（配列番号４４）、レーン４：Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ００９１２２１９６）（配列番号３６）、レーン５：Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ０１３７１５２２６）（配列番号３８）、レーン６：Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ０１６７００３６２）（配列番号３２）、レーン７：Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ  ＤＨＳ（配列はＧｅｎＢａｎｋにはない；配列は米国特許出願第ＵＳ２０１０／０３３３２３３号の図１０９ｂによる）（配列番号４６）、レーン８：Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ＤＨＳ（ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｋｉｎｇｄｏｍｇｄｂ．ｃｏｍ／ｔｅａ  ｔｒｅｅ／ｄａｔａ／ｐｅｐ／Ｔｅａｔｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．ｆａｓ、Ｘｉａ（２０１７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  １０：８６６−８７７）（配列番号５４）、レーン９：Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ＤＨＳ（配列番号５２）、レーン１０：Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳ（配列はＧｅｎＢａｎｋにはない、配列は米国特許第８，５６３，２８５号の図１０７ａおよび１０７ｂによる）（配列番号２）、レーン１１：Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ００４５０４５５９．１）（配列番号５０）、レーン１２：Ａｒａｃｈｉｓ  ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ０１５９６６４１４）（配列番号１８）、レーン１３：Ａｒａｃｈｉｓ  ｉｐａｅｎｓｉｓ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ０１６２０３８２０）（配列番号２０）、レーン１４：Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ＤＨＳ１（受入番号ＮＰ  ００１２３５６０４）（配列番号２２）、レーン１５：Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ＤＨＳ２（受入番号ＮＰ  ００１２３７７５２）（配列番号２４）、レーン１６：Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ００７１５２９３５）（配列番号４８）、レーン１７：Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ（受入番号ＸＰ  ０１０６８１２８７）（配列番号３４）、レーン１８：Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ＤＨＳ（受入番号ＮＰ  ００１２３４４９５）（配列番号１２）、レーン１９：Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ００６３４８１３６）（配列番号４２）、レーン２０：Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＤＨＳ（配列番号５６）、レーン２１：Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  ＤＨＳ（受入番号ＡＣＰ２８１３３）（配列番号１３）、レーン２２：Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｇｒｏｕｐ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ０１５６２８１５８）（配列番号３０）、レーン２３：Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＤＨＳ１（受入番号ＮＰ  ００１１４９０８４）（配列番号２６）、レーン２４：Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ００��４６６４８７）（配列番号４０）、レーン２５：Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＤＨＳ２（受入番号ＮＰ  ００１１３０８０６）（配列番号２８）、レーン２６：Ｍｕｓａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ  ＤＨＳ（受入番号ＸＰ  ００９４０４１３２）（配列番号１４）、レーン２７：Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  ＤＨＳ（ｗｗｗ．ｃａｃａｏｇｅｎｏｍｅｄｂ．ｏｒｇ  ＣＧＤ０００６９１４）（配列番号５３）、レーン２８：Ｍｅｎｔｈａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ  ＤＨＳの部分的アミノ酸配列（Ｍｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、ｗｗｗ．ｌａｎｇｅｌａｂｔｏｏｌｓ．ｗｓｕ．ｅｄｕ／ｍｇｒ／：ＴＲＩＮＩＴＹ  ＤＮ６６６８５  ｃｌ  ｇ８  ｉｌ）（配列番号５５）、レーン２９：Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳ（受入番号ＡＡＵ３４０１６）（配列番号６４）。コンセンサス配列（配列番号５１）を最後のレーンに示す（！は、Ｌ、Ｑ、ＩまたはＶのいずれかであり、＄は、ＬまたはＭのいずれかであり、％は、Ｒ、ＦまたはＹのいずれかであり、＃は、Ｈ、Ｔ、Ｋ、Ｎ、Ａ、Ｄ、ＱまたはＥのいずれかである）。Ｅ３２３〜Ｋ３２９の活性部位における７つのアミノ酸の保存領域（ヒトＤＨＳの番号付け）を、黒色の太字で示し、ボックスで囲む。ＮＡＤ＋結合領域を、紫色の太字で示す。触媒リジン残基（ヒトＤＨＳのＫ３２９）を、黒色の太字および下線で示す。他の重要な残基を、強調表示する（ヒトＤＨＳ番号付け）、青（Ｋ２８７）、緑（Ｋ３３８）、黄（Ｋ１４１）、赤（Ｗ３２７）、紫（Ｄ３１３）。
【図２】異なる生物由来のＤＨＳタンパク質の系統発生解析により、ＤＨＳタンパク質が密接に関連していることが明らかになる。２６種の異なる生物に由来する２８の異なるＤＨＳタンパク質間の進化的関係を、デンドログラムに示す。系統樹クラスター化は、ＣｌｕｓｔａｌＷ配列アライメントおよび非加重結合法（ＵＰＧＭＡ）系統樹作成アルゴリズムを備えたＢｉｏＥｄｉｔ  ７．２ソフトウェア［ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｉｎｆｏｒｍｅｒ．ｅｏｍ／７．２／］を使用して、図１に列挙される全てのタンパク質について実施した。
【図３】様々な植物種由来のＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ。ボックスは、エキソンを表す。線は、イントロンを表す。コード配列を、網掛けで示す。赤線および下矢印（↓）は、ブチルアミン部分と共有結合性中間体を形成するリジン残基を表す。ピンクの線とアスタリスク（＊）は、活性部位を示す。
【図４】Ｂ．ｎａｐｕｓ［配列番号３７］のＤＨＳ遺伝子のヌクレオチド配列。開始および終止コドン（それぞれ、８４および１１８８）を斜体化し、下線で示す。３つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡによって標的化される領域（６００、６３５および１１５７から始まる）を、太字および下線で示す。Ｂ．ｎａｐｕｓ系統＃１６のＤＨＳ遺伝子中の５６９で欠失したグアニン（Ｇ）ヌクレオチドおよび結果として生じた６５２でのＴＧＡ終止コドンを、強調表示し、下線で示す。
【図５】Ｂ．ｎａｐｕｓ系統＃１６植物（左）および野生型コントロールＢ．ｎａｐｕｓ植物（右）。Ｂ．ｎａｐｕｓ系統１６は、矮小で、よい濃い緑色の葉を有し、花の出芽が遅れ、老化が遅延した。
【図６】ＧＥ０５６８−ＤＨＳ１イネ  カルス由来のＤＮＡ配列のアライメントで、内部欠失の場所を示す。太字は、ＭｉＣｍｓｌ  ＰＡＭ部位（ＴＴＴＣ）の逆相補を表す。
【図７】ＧＥ０５６８−ＤＨＳ１  Ｔ０イネ植物由来のＤＮＡ配列のアライメントで、内部欠失および挿入の位置を示す。太字は、ＭｉＣｍｓｌ  ＰＡＭ部位（ＴＴＴＣ）の逆相補を表す。
【図８】カルス３０から生じたＴ０植物の分子分析。（Ａ）植物抽出物からのＤＨＳ１のＰＣＲ増幅（左）。ＰＣＲ産物のＴ７ヌクレアーゼ処理（右）。Ｔ７ヌクレアーゼで処理後の下のバンドの出現は、ヘテロ二本鎖形成を示し、内部欠失の存在を示唆する。（Ｂ）カルス３０Ｔおよびカルス３０Ｓから再生されたＴ０植物から単離された２つのＤＨＳ１対立遺伝子の配列アライメント。赤字は、ＭｉＣｍｓｌ  ＰＡＭ部位（ＴＴＴＣ）の逆相補を表す。
【図９】イネＤＨＳ１の活性部位を破壊するための戦略。（Ａ）イネＤＨＳ１遺伝子のゲノム構造で、イントロンを細い折れ線で、エキソンを塗りつぶした黒色のボックスで示す。活性部位（ＥＡＶＳＷＧＫ）は、エキソン６にある。（Ｂ）ＰＡＭ部位およびｇＲＮＡ配列を含む、ＷＧＫおよび下流の６つのコドンの配列。ガイドＲＮＡは、センス鎖（ＣＤＳ）を標的とするように設計され、アンチセンス配列に基づいて設計される。
【図１０】ヘテロ接合Ｔ０系統＃２から単離された２つのＤＨＳ１対立遺伝子の配列アライメント。下の配列は、Ｃ末端４１アミノ酸を切断するＴＧＡ終止コドン（太字）の形成につながる１０ｂｐの内部欠失を有する。アンチセンス鎖中の太字は、ＰＡＭ部位を表す。
【図１１】２つの野生型ＤＨＳ１対立遺伝子（左）、または１つの切断ＤＨＳ１対立遺伝子および１つの野生型対立遺伝子（右）、を有するＴ１植物の視覚的外観。ヘテロ接合体は、より濃い緑色の呈色を有する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書で使用される場合、「対応する残基」は、第２のＤＨＳタンパク質アミノ酸配列（例えば、ヒトＤＨＳ）とアライメントした場合に、Ｎ末端からＣ末端への番号付けに基づくと異なる位置にあり、任意の配列アライメントによって導入されたギャップに起因する異なる番号付けでなければ、同じ位置にありうるＤＨＳタンパク質中の任意のアミノ酸を指す。対応する残基の例は、本明細書に記載され、例えば、図１に示される。植物ＤＨＳアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列の例としては、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのコード領域の配列（配列番号１）およびその対応するアミノ酸翻訳（配列番号２）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ  １２０６７４）（配列番号４）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＨＳのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ  １９６２１１）（配列番号１１）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１２４７５６６）（配列番号５）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＪ３７６３８９）（配列番号６）、Ｍｕｓａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ  ００９４０５８５７）（配列番号７）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ  ＤＨＳの部分ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＭ＿０１３５９１００１）（配列番号８）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（米国特許第８，５６３，２８５号に既述）（配列番号９）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ＤＨＳのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ  ００１２３４４９５）（配列番号１２）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  ＤＨＳのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＰ２８１３３）（配列番号１３）、Ｍｕｓａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ  ＤＨＳのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００９４０４ｌ３２）（配列番号１４）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ  ＤＨＳの部分アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ  ０１３４４６４５５）（配列番号１５）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのアミノ酸配列（米国特許第８，５６３，２８５号に既述）（配列番号２）、Ａｒａｃｈｉｓ  ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿０１６１１０９２８）（配列番号１７）、Ａｒａｃｈｉｓ  ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ  ０１５９６６４１４）（配列番号１８）、Ａｒａｃｈｉｓ  ｉｐａｅｎｓｉｓ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ  ０１６３４８３３４）（配列番号１９）、Ａｒａｃｈｉｓ  ｉｐａｅｎｓｉｓのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿０１６２０３８２０）（配列番号２０）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列１（ＬＯＣ１００３０５４５３）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１２４８６７５）（配列番号２１）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘのアミノ酸配列１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ  ００１２３５６０４）（配列番号２２）、Ｇｌｙｃｉ���ｅ  ｍａｘ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列２（ＬＯＣ  １００４９９６５０）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ  ００１２５０８２３）（配列番号２３）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘのアミノ酸配列２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００ｌ２３７７５２）（配列番号２４）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１１５５６１２）（配列番号２５）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  のアミノ酸配列１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１４９０８４）（配列番号２６）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１１３７３３４）（配列番号２７）、Ｚｅａ  ｍａｙのアミノ酸配列２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ  ００１１３０８０６）（配列番号２８）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｇｒｏｕｐ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿０１５７７２６７２）（配列番号２９）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｇｒｏｕｐのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ  ０１５６２８１５８）（配列番号３０）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＬＯＣ１０７９１５７３７）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ  ０１６８４４８７３）（配列番号３１）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ  ０１６７００３６２）（配列番号３２）、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＬＯＣ  １０４８９６２６９）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ  ０１０６８２９８５）（配列番号３３）、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ  ０１０６８１２８７）（配列番号３４）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＬＯＣ  １０３８４６９３８）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ  ００９１２３９４８）（配列番号３５）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＲ＿００９１２２１９６）（配列番号３６）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＬＯＣ  １０６４１９０２６）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ  ０１３８５９７７２）（配列番号３７）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿０１３７１５２２６）（配列番号３８）、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ  ００２４６６４４２）（配列番号３９）、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ  ００２４６６４８７）（配列番号４０）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＬＯＣ  １０２６０２６００）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ  ００６３４８０７４）（配列番号４１）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ  ００６３４８１３６）（配列番号４２）、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＬＯＣ１０４７３４５９５）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＭ＿０１０４５４１９８）（配列番号４３）、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ  ０１０４５２５００）（配列番号４４）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（米国特許出願第２０１０／０３３３２３３号に既述）（配列番号４５）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓのアミノ酸配列（米国特許出願第２０１０／０３３３２３３号に既述）（配列番号４６）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿００７１５２８７３）（配列番号４７）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００７１５２９３５）（配列番号４８）、Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＬＯＣ１０１５０５９０１）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ  ００４５０４５０２）（配列番号４９）、およびＣｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿００４５０４５５９）（配列番号５０）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ｇｒａｐｅ）ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＥＮＡＩＣＢＩ１５６００１ＣＢＩ１５６００．３）（配列番号５８）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ｇｒａｐｅ）ＤＨＳのアミノ酸配列（配列番号５２）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ｗｗｗ．ｃａｃａｏｇｅｎｏｍｅｄｂ．ｏｒｇ  ＣＧＤ０００６９１４）（配列番号５９）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  ＤＨＳのアミノ酸配列（ｗｗｗ．ｃａｃａｏｇｅｎｏｍｅｄｂ．ｏｒｇ  ＣＧＤ０００６９１４）（配列番号５３）、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（配列番号６０）、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ＤＨＳのアミノ酸配列（ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｋｉｎｇｄｏｍｇｄｂ．ｃｏｍ／ｔｅａ  ｔｒｅｅ／ｄａｔａ／ｐｅｐ／Ｔｅａｔｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．ｆａｓ；Ｘｉａ  ｅｌ  ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  １０：８６６−８７７）（配列番号５４）、Ｍｅｎｔｈａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ  ＤＨＳの部分ｃＤＮＡ配列（配列番号６１）、Ｍｅｎｔｈａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ  ＤＨＳのアミノ酸配列（Ｍｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ；ｗｗｗ．ｌａｎｇｅｌａｂＴｏｏｌｓ．ｗｓｕ．ｅｄｕ／ｍｇｄ；ＴＲＩＮＩＴＹ  ＤＮ６６６８５  ｃｌ  ｇ８  ｉｌ）（配列番号５５）、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｍｐｈｏｒ  ａ  ＤＨＳの部分ｃＤＮＡ配列（配列番号６２）、Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  ＤＨＳのアミノ酸配列（配列番号５６）、藻類Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ  ＣＣＭＰ２７１２  ＤＨＳのｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＭ  ００５８３１２７５．１）（配列番号６３）、藻類Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ  ＣＣＭＰ２７１２  ＤＨＳのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿００５８３１３３２．１）（配列番号５７）、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ  ７３１２３１）（配列番号６５、隣接領域を含む配列）、およびＬａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａのアミノ酸配列（配列番号６４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
明確化のために、栽培されたピーナッツ種（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅｄ）は、２つの野生種のピーナッツ：Ａ．ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓおよびＡ．ｉｐａｅｎｓｉｓの間のハイブリッドから生じた［Ｓｅｉｊｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔ．９４（１２）１９６３−７１；Ｋｏｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔ．８３：１２８２−９１；Ｍｏｒｅｔｚｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎｎ．Ｂｏｔ．１１１：１１３−１２６．］。これらの親二倍体Ａ．ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓおよびＡ．ｉｐａｅｎｓｉｓとの間のＤＨＳタンパク質のアミノ酸配列が同一である（配列番号１８と２０）。したがって、栽培ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）のＤＨＳタンパク質のアミノ酸配列は、両方の両親と同一であることが予想される。
【００３６】
内因性ＤＨＳ遺伝子をゲノム編集して、特異的に定義された機能的に重要な残基を欠失または修飾することによって、得られたゲノム編集植物は、ｅＩＦ−５Ａを活性化するためのＤＨＳタンパク質を有しないか、または実質的に少ない。前述したように、ｅＩＦ−５Ａは、ＤＨＳによって活性化され、それを生物学的に有用にさせなければならない。したがって、ゲノム編集によってＤＨＳの活性を阻害または低減することによって、得られたゲノム編集植物は、低減された活性ｅＩＦ−５Ａを有する。これらのゲノム編集された植物は、植物のバイオマスの増加、種子収量の増加および／または種子サイズの増加を示し、また、非生物ストレスへの耐性が高く、腐敗しやすい果実または野菜を産生する植物の場合、収穫後の保存期間の延長が期待される。
【００３７】
ＤＨＳおよびｅＩＦ−５Ａが老化における制御的役割を果たすという主張を裏付けるさらなる証拠は、カーネーションの花をＤＨＳに特異的な阻害剤で処理することによって提供された。スペルミジンおよびｅＩＦ−５Ａは、ＤＨＳ反応の基質である［Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ  ４：９５−１０４；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｌ．Ｓｉｇｎａｌｓ．６：１１５−１２３］。スペルミジンと同様の構造的特徴を有するいくつかのモノ−、ジ−、およびポリアミンは、インビトロでＤＨＳ活性を阻害する［Ｊａｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１３１５１−１３１５９］。スペルミジン、プトレシン、スペルミンなどの一部のポリアミンは、カーネーションの花瓶での日持ちを延ばすために一般的に使用されてきた［Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ（１９８０）Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．１５：８０５−８０６］。未処理の花と比較して、真空浸潤して一過性感染系でアンチセンスＤＨＳを発現させたカーネーションでは、収穫後の花弁の老化が６日間遅れた［Ｈｏｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．１７５：２０１−２１４］
【００３８】
ストレスによる生長の損失に加えて、農業におけるさらなる大きな損失は、収穫後のストレス誘導性老化である［ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７：５０５−５１６］。カットレタスなど、一部加工されている植物については、特にそうである。レタスをカットすることよる病徴は、フェノール類の産生の結果としての褐変である［Ｍａｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０：６７−９５］。レタスｅＩＦ−５Ａ（ＬｅＩＦ−５Ａ）またはアンチセンス全長ＤＨＳのアンチセンスポリヌクレオチドを有するレタスの野外試験は、トランスジェニックレタスがコントロールレタスよりも切断後の褐色に対して有意に耐性であったことを実証した。収穫によるストレス誘導性老化が明確な回路を有するにもかかわらず［Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２５：７１８−７２７］、褐変の上流の翻訳制御、および、おそらく他の老化病徴は、ＤＨＳおよびｅＩＦ−５Ａによって少なくとも部分的に調節されているように思われる。老化性の調節の下流には実行遺伝子がある。これらは老化のエフェクターであり、老化症候群をもたらす代謝性の変化を引き起こす。ｅＩＦ−５ＡおよびＤＨＳは、活性がダウンレギュレーションまたは低下すると、老化によって引き起こされる全ての範囲の病徴を抑制することができるように思われる。
【実施例】
【００３９】
実施例１：ゲノムＤＮＡ配列を、２８の植物種およびヒト由来の３１のＤＨＳ遺伝子について同定し、エキソンおよびイントロンで描写した。Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（ダイズ）、Ｒｏｓａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（バラ）、およびＺｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）について、２つのＤＨＳ遺伝子を示す。他の種（例えば、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ−トマト）は、１つしか与えられていないが、複数のＤＨＳ遺伝子を有し得る。ＤＨＳ遺伝子を編集するためのガイドＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ内のエキソンまたはイントロンを標的とすることができる。これらのゲノムＤＮＡのエキソン−イントロン境界を、図３に示す。
【００４０】
Ａｒａｃｈｉｓ  ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号６６であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号６７〜配列番号８１である。Ａｒａｃｈｉｓ  ｉｐａｅｎｓｉｓのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号８２であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号８３〜配列番号９７である。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号９８であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号９９〜配列番号１１１である。Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１１２であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号１１３〜配列番号１２５である。Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１２６であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号１２７〜配列番号１３９である。Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ＶｕｌｇａｒｉｓのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１４０であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号１４１〜配列番号１５３である。Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１５４であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号１５５〜配列番号１６７である。Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１６８であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号１６９〜配列番号１８１である。Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１８２であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号１８３〜配列番号１９５である。Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１９６であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号１９７〜配列番号２０９である。Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２１０であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号２１１〜配列番号２２５である。Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２２６であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号２２７〜配列番号２４０である。Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘのＤＨＳ遺伝子の第２のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２４１であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号２４２〜配列番号２５３である。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２５４であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号２５５〜配列番号２７１である。Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２７２であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号２７３〜配列番号２８５である。Ｍｕｓａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２８６であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号２８７〜配列番号２９９である。Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号３００であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号３０１〜配列番号３１５である。Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号３１６であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号３１７〜配列番号３３１である。Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＪａｐｏｎｉｃａのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号３３２であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号３３３〜配列番号３４５である。Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号３４６であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号３４７〜配列番号３５９である。Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ  ｅｑｕｅｓｔｒｉｓのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号３６０であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号３６１〜配列番号３７３である。Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号３７４であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号３７５〜配列番号３８７である。Ｒｏｓａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号３８８であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号３８９〜配列番号４０１である。Ｒｏｓａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓのＤＨＳ遺伝子の第２のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号４０２であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号４０３〜配列番号４１５である。Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号４１６であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号４１７〜配列番号４２９である。Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号４３０であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号４３１〜配列番号４４３である。Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号４４４であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号４４５〜配列番号４５７である。Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号４５８であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号４５９〜配列番号４７２である。Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号４７３であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号４７４〜配列番号４８４である。Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号４８５であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号４８６〜配列番号４９８である。Ｚｅａ  ｍａｙｓのＤＨＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号４９９であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号５００〜配列番号５１４である。Ｚｅａ  ｍａｙｓのＤＨＳ遺伝子の第２のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号５１５であり、対応するエキソンおよびイントロンは、配列番号５１６〜配列番号５３１である。
【００４１】
実施例２：ＡＲＣＵＳとして知られる操作されたホーミングエンドヌクレアーゼは、そのデオキシハイプシン合成酵素活性に必要とされるＭ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳの領域内で二本鎖切断を生成することが可能なヌクレアーゼを産生するように操作され得る。切断の標的となるこれらの領域は、翻訳されると、例えば、Ｌｙｓ３３４（ヒトＤＨＳのＬｙｓ３２９に対応する−表３を参照）またはＬｙｓ２９２（ヒトＤＨＳにおけるＬｙｓ２８７）のいずれかを含む領域を取り囲む核酸を含み得る。操作されたＡＲＣヌクレアーゼによって生成されるＤＮＡ切断は、そのデオキシハイプシン合成酵素活性にとって重要であることが知られている植物ＤＨＳの標的領域における小さな欠失、挿入、または単一塩基対置換の生成を可能にし得る。Ｍ．ｓａｔｉｖａにおいて、酵素の活性は、１つ以上の以下の残基を欠失することによって破壊され得る：Ｌｙｓ３３４（ヒトＤＨＳのＬｙｓ３２９に対応する−表３を参照）またはＬｙｓ２９２（ヒトＤＨＳにおけるＬｙｓ２８７）。一つの実施形態では、デオキシハイプシン合成酵素活性を消失するために、Ｍ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのＬｙｓ３３４を含みかつそれを取り巻く領域をコードするヌクレオチド領域が欠失されるであろう。別の実施形態では、デオキシハイプシン合成酵素活性を消失するために、Ｍ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのＬｙｓ２９２を含みかつそれを取り巻く領域をコードするヌクレオチド領域が欠失されるであろう。
【００４２】
実施例３：機能ドメイン、例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）と組み合わせた操作された転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、そのデオキシハイプシン合成酵素活性に必要とされるＭ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳの領域内で二本鎖切断を生成することが可能なヌクレアーゼを産生するように操作される。切断の標的となるこれらの領域は、翻訳されると、例えば、Ｌｙｓ３３４（ヒトＤＨＳのＬｙｓ３２９に対応する−表３を参照）またはＬｙｓ２９２（ヒトＤＨＳにおけるＬｙｓ２８７）のいずれかを含む領域を取り囲む核酸を含む。操作されたヌクレアーゼによって生成されるＤＮＡ切断は、そのデオキシハイプシン合成酵素活性にとって重要であることが知られている植物ＤＨＳの標的領域における小さな欠失、挿入、または単一塩基対置換を可能にする。Ｍ．ｓａｔｉｖａにおいて、酵素の活性は、１つ以上の以下の残基を欠失することによって破壊される：Ｌｙｓ３３４（ヒトＤＨＳのＬｙｓ３２９に対応する−表３を参照）またはＬｙｓ２９２（ヒトＤＨＳにおけるＬｙｓ２８７）。例えば、デオキシハイプシン合成酵素活性を消失するために、Ｍ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのＬｙｓ３３４を含みかつそれを取り巻く領域をコードするヌクレオチド領域が欠失される。別の例では、デオキシハイプシン合成酵素活性を消失するために、Ｍ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのＬｙｓ２９２を含みかつそれを取り巻く領域をコードするヌクレオチド領域が欠失される。
【００４３】
実施例４：ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  システム）とともに植物に導入されるとき、そのデオキシハイプシン合成酵素活性に必要なＭ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳの領域内で二本鎖切断を生成することが可能なガイドＲＮＡを産生するように操作される。切断の標的となるこれらの領域は、翻訳されると、例えば、Ｌｙｓ３３４（ヒトＤＨＳのＬｙｓ３２９に対応する−表３を参照）またはＬｙｓ２９２（ヒトＤＨＳにおけるＬｙｓ２８７）のいずれかを含む領域を取り囲む核酸を含む。Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断は、そのデオキシハイプシン合成酵素活性にとって重要であることが知られている植物ＤＨＳの標的領域における小さな欠失、挿入、または単一塩基対置換の生成を可能にする。Ｍ．ｓａｔｉｖａにおいて、酵素の活性は、１つ以上の以下の残基を欠失することによって破壊される：Ｌｙｓ３３４（ヒトＤＨＳのＬｙｓ３２９に対応する−表３を参照）またはＬｙｓ２９２（ヒトＤＨＳにおけるＬｙｓ２８７）。例えば、デオキシハイプシン合成酵素活性を消失するために、Ｍ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのＬｙｓ３３４を含みかつそれを取り巻く領域をコードするヌクレオチド領域が欠失される。別の例では、デオキシハイプシン合成酵素活性を消失するために、Ｍ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのＬｙｓ２９２を含みかつそれを取り巻く領域をコードするヌクレオチド領域が欠失される。
【００４４】
実施例５：ＧＲＯＮは、そのデオキシハイプシン合成酵素活性に必要なＭ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳの領域内で所望の置換または欠失を生成するように、ＧＲＯＮをテンプレート（ＲＴＤＳ（商標））として使用してミスマッチエラーおよびその後の修復を生成するオリゴヌクレオチドを産生するために操作される。切断の標的となるこれらの領域は、翻訳されると、例えば、Ｌｙｓ３３４（ヒトＤＨＳのＬｙｓ３２９に対応する−表３を参照）またはＬｙｓ２９２（ヒトＤＨＳにおけるＬｙｓ２８７）のいずれかを含む領域を取り囲む核酸を含む。ＧＲＯＮによって生成されるミスマッチは、そのデオキシハイプシン合成酵素活性にとって重要であることが知られている植物ＤＨＳの標的領域における小さな欠失、挿入、または単一塩基対置換を生成する。Ｍ．ｓａｔｉｖａにおいて、酵素の活性は、１つ以上の以下の残基を欠失することによって破壊される：Ｌｙｓ３３４（ヒトＤＨＳのＬｙｓ３２９に対応する−表３を参照）またはＬｙｓ２９２（ヒトＤＨＳにおけるＬｙｓ２８７）。例えば、デオキシハイプシン合成酵素活性を消失するために、Ｍ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのＬｙｓ３３４を含みかつそれを取り巻く領域をコードするヌクレオチド領域が欠失される。別の例では、デオキシハイプシン合成酵素活性を消失するために、Ｍ．ｓａｔｉｖａ  ＤＨＳのＬｙｓ２９２を含みかつそれを取り巻く領域をコードするヌクレオチド領域が欠失される。
【００４５】
実施例６：アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）における所定のゲノム遺伝子座の編集
１つ以上のｇＲＮＡは、アルファルファのゲノム内の所望の部位とアニールし、１つ以上のＣｍｓｌまたは他のＣＲＩＳＰＲ二本鎖ヌクレアーゼタンパク質との相互作用を可能にするように設計される。これらのｇＲＮＡを、植物細胞で動作可能なプロモーターに動作可能に連結されるように、ベクターにクローニングする（ｇＲＮＡカセット）。Ｃｍｓｌまたは他のＣＲＩＳＰＲ二本鎖ヌクレアーゼタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を、植物細胞で動作可能なプロモーターに動作可能に連結されるように、ベクターにクローニングする（ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセット）。ｇＲＮＡカセットおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットを、それぞれ植物形質転換に好適なベクターにクローニングし、その後、このベクターを、アグロバクテリウム細胞に形質転換する。これらの細胞を、形質転換に好適なアルファルファ組織と接触させる。このアグロバクテリウム細胞とのインキュベーションの後、アルファルファ細胞を、アグロバクテリウム細胞に対する選択を有するインタクトな植物の再生に好適な組織培養培地で培養する。アルファルファ植物を、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットを含むベクターを保有するアグロバクテリウム細胞と接触させた細胞から再生する。アルファルファ植物の再生後、植物組織を収穫し、組織からＤＮＡを抽出する。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイおよび／または配列決定アッセイを、必要に応じて実施し、所望のゲノム位置でＤＮＡ配列に変化が生じたかどうかを決定する。
【００４６】
あるいは、微粒子銃は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットをアルファルファ細胞に導入するために使用される。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットを含むベクターを、金ビーズまたはチタンビーズ上にコーティングし、次いで、再生に好適なアルファルファ組織に照射するために使用する。照射後、アルファルファ組織を、アルファルファ植物の再生のための組織培養培地に移す。アルファルファ植物の再生後、植物組織を収穫し、組織からＤＮＡを抽出する。Ｔ７ＥＩアッセイおよび／または配列決定アッセイを、必要に応じて実施し、所望のゲノム位置でＤＮＡ配列に変化が生じたかどうかを決定する。
【００４７】
実施例７：イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）における所定のゲノム遺伝子座の編集
１つ以上のｇＲＮＡは、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａのゲノム内の所望の部位とアニールし、１つ以上のＣｍｓｌまたは他のＣＲＩＳＰＲ二本鎖ヌクレアーゼタンパク質との相互作用を可能にするように設計される。これらのｇＲＮＡを、植物細胞で動作可能なプロモーターに動作可能に連結されるように、ベクターにクローニングする（ｇＲＮＡカセット）。Ｃｍｓｌまたは他のＣＲＩＳＰＲ二本鎖ヌクレアーゼタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を、植物細胞で動作可能なプロモーターに動作可能に連結されるように、ベクターにクローニングする（ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセット）。ｇＲＮＡカセットおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットを、それぞれ植物形質転換に好適なベクターにクローニングし、その後、このベクターを、アグロバクテリウム細胞に形質転換する。これらの細胞を、アグロバクテリウム細胞に対する選択を有し、形質転換に好適なＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ組織と接触させる。このアグロバクテリウム細胞とのインキュベーションの後、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ細胞を、インタクトな植物の再生に好適な組織培養培地で培養する。Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ植物を、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットを含むベクターを保有するアグロバクテリウム細胞と接触させた細胞から再生する。Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ植物の再生後、植物組織を収穫し、組織からＤＮＡを抽出する。Ｔ７ＥＩアッセイおよび／または配列決定アッセイを、必要に応じて実施し、所望のゲノム位置でＤＮＡ配列に変化が生じたかどうかを決定する。
【００４８】
あるいは、微粒子銃は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットをＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ細胞に導入するために使用される。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットを含むベクターを、金ビーズまたはチタンビーズ上にコーティングし、次いで、再生に好適なＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ組織に照射するために使用する。照射後、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ組織を、インタクトな植物の再生のための組織培養培地に移す。植物の再生後、植物組織を収穫し、組織からＤＮＡを抽出する。Ｔ７ＥＩアッセイおよび／または配列決定アッセイを、必要に応じて実施し、所望のゲノム位置でＤＮＡ配列に変化が生じたかどうかを決定する。
【００４９】
実施例８：キャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）における所定のゲノム遺伝子座の編集
１つ以上のｇＲＮＡは、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓのゲノム内の所望の部位とアニールし、１つ以上のＣｍｓｌまたは他のＣＲＩＳＰＲ二本鎖ヌクレアーゼタンパク質との相互作用を可能にするように設計される。これらのｇＲＮＡを、植物細胞で動作可能なプロモーターに動作可能に連結されるように、ベクターにクローニングする（ｇＲＮＡカセット）。Ｃｍｓｌまたは他のＣＲＩＳＰＲ二本鎖ヌクレアーゼタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を、植物細胞で動作可能なプロモーターに動作可能に連結されるように、ベクターにクローニングする（ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセット）。ｇＲＮＡカセットおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットを、それぞれ植物形質転換に好適なベクターにクローニングし、その後、このベクターを、アグロバクテリウム細胞に形質転換する。これらの細胞を、形質転換に好適なＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ組織と接触させる。このアグロバクテリウム細胞とのインキュベーションの後、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ細胞を、アグロバクテリウム細胞に対する選択を有するインタクトな植物の再生に好適な組織培養培地で培養する。Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ植物を、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットを含むベクターを保有するアグロバクテリウム細胞と接触させた細胞から再生する。Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ植物の再生後、植物組織を収穫し、組織からＤＮＡを抽出する。Ｔ７ＥＩアッセイおよび／または配列決定アッセイを、必要に応じて実施し、所望のゲノム位置でＤＮＡ配列に変化が生じたかどうかを決定する。
【００５０】
あるいは、微粒子銃は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットをＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ細胞に導入するために使用される。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットを含むベクターを、金ビーズまたはチタンビーズ上にコーティングし、次いで、再生に好適なＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ組織に照射するために使用する。照射後、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ組織を、インタクトな植物の再生のための組織培養培地に移す。植物の再生後、植物組織を収穫し、組織からＤＮＡを抽出する。Ｔ７ＥＩアッセイおよび／または配列決定アッセイを、必要に応じて実施し、所望のゲノム位置でＤＮＡ配列に変化が生じたかどうかを決定する。
【００５１】
実施例９：非相同末端結合を使用した、所定のゲノム遺伝子座からのＤＮＡの欠失
第１のｇＲＮＡは、目的の植物のゲノム内の第１の所望の部位とアニールし、１つ以上のＣｍｓｌまたは他のＣＲＩＳＰＲ二本鎖ヌクレアーゼタンパク質との相互作用を可能にするように設計される。第２のｇＲＮＡは、目的の植物のゲノム内の第２の所望の部位とアニールし、１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質との相互作用を可能にするように設計される。
これらのｇＲＮＡを、それぞれ植物細胞で動作可能なプロモーターに動作可能に連結し、その後、植物形質転換に好適なベクターにクローニングする。Ｃｍｓｌまたは他のＣＲＩＳＰＲ二本鎖ヌクレアーゼタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を、植物細胞で動作可能なプロモーターに動作可能に連結されるように、ベクターにクローニングする（「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセット」）。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットを、単一の植物形質転換ベクターにクローニングし、その後、アグロバクテリウム細胞に形質転換する。これらの細胞を、形質転換に好適な植物組織と接触させる。このアグロバクテリウム細胞とのインキュベーションの後、植物細胞を、アグロバクテリウム細胞に対する選択を有するインタクトな植物の再生に好適な組織培養培地で培養する。あるいは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットを含むベクターを、植物細胞の照射に好適な金またはチタンビーズ上にコーティングする。細胞に照射し、その後、インタクトな植物の再生に好適な組織培養培地に移す。ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体は、所望のゲノム遺伝子座で二本鎖切断を引き起こし、一部の場合、ＤＮＡ修復機構は、ｇＲＮＡ配列の近くまたはその中に位置したいくつかの天然ＤＮＡ配列が欠失されるように、ＤＮＡを修復する。植物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセットおよびｇＲＮＡカセットを含むベクターを有するアグロバクテリウム細胞と接触させた細胞から、またはこのベクターでコーティングされたビーズで照射された細胞から再生される。植物の再生後、植物組織を収穫し、組織からＤＮＡを抽出する。Ｔ７ＥＩアッセイおよび／または配列決定アッセイを、必要に応じて実施し、所望のゲノム位置または複数の位置でＤＮＡ配列に変化が生じたかどうかを決定する。
【００５２】
実施例１０：相同性指向修復を使用した、所定のゲノム遺伝子座でのＤＮＡにおける塩基置換
ｇＲＮＡは、目的の植物のゲノム内の所望の部位とアニールし、１つ以上のＣｍｓｌまたは他のＣＲＩＳＰＲ二本鎖ヌクレアーゼタンパク質との相互作用を可能にするように設計される。ｇＲＮＡを、植物細胞内で動作可能なプロモーターに動作可能に連結し、その後、植物の形質転換に適したベクターにクローニングする。Ｃｍｓｌまたは他のＣＲＩＳＰＲ二本鎖ヌクレアーゼタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を、ベクターにクローニングし、それらが、宿主ゲノム内の標的ＤＮＡに相同であるが、相同性指向修復によって生じる１つ以上の標的変異を引き起こす特異的塩基変化を含有する配列から構成される高発現の一本鎖または二本鎖ドナーＤＮＡオリゴヌクレオチドとともに、植物細胞内で動作可能なプロモーター（ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセット）に動作可能に連結されるようにする［Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．９：１９６７−１９７５］。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセット、ｇＲＮＡカセット、および高発現オリゴヌクレオチドを、単一の植物形質転換ベクターにクローニングし、その後、アグロバクテリウム細胞に形質転換する。これらの細胞を、形質転換に好適な植物組織と接触させる。上記ドナーＤＮＡオリゴヌクレオチドは、植物ゲノム内の所望の部位に挿入されるＤＮＡ分子を含み、上流および下流隣接領域に隣接する。上流隣接領域は、ｇＲＮＡの標的となるゲノム遺伝子座の上流のゲノムＤＮＡ領域と相同であり、下流隣接領域は、ｇＲＮＡの標的となるゲノム遺伝子座の下流のゲノムＤＮＡ領域と相同である。上流および下流隣接領域は、ＤＮＡの植物ゲノムの所望の部位への組み換えを媒介する。アグロバクテリウム細胞とのインキュベーションおよびドナーＤＮＡの導入後、植物細胞を、アグロバクテリウム細胞に対する選択を有するインタクトな植物の再生に好適な組織培養培地で培養する。植物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼカセット、ｇＲＮＡカセット、およびドナーＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むベクターを有するアグロバクテリウム細胞と接触させた細胞から再生される。植物の再生後、植物組織を収集し、組織からＤＮＡを抽出する。Ｔ７ＥＩアッセイおよび／または配列決定アッセイは、所望の塩基変化が、所望のゲノムのある位置または複数の位置で生じたかどうかを決定するために、必要に応じて実施される。
【００５３】
実施例１１：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用したＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓにおけるＤＨＳ編集
Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（キャノーラ）は、重要な油料種子の作物であり、双子葉植物である。Ｂ．ｎａｐｕｓの複二倍体ゲノムは、２つのコピーのＤＨＳ遺伝子を有し、Ｂ．ｒａｐａ（ＡＡ）およびＢ．ｏｌｅｒａｃｅａ（ＣＣ）のゲノムからそれぞれ１つが寄与される。Ｂ．ｎａｐｕｓのＬＯＣ１０６４１９０２６  ＤＨＳ遺伝子（ＤＨＳ１）を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを使用して編集し、老化を遅延させることができるかどうかを決定した。この実施例のための方法は、Ｂ．ｎａｐｕｓにおける以前の遺伝子編集研究から適合されたもので、それらの全体が本明細書に援用される［Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７：７４８９，２０１７］。
【００５４】
ベクター構築：ガイドＲＮＡによって標的化するために選択されたＢ．ｎａｐｕｓＤＨＳ遺伝子のＤＮＡ配列は、特定されている図４である。３つのガイドＲＮＡ配列を含む植物送達ベクターを、Ｌｏｗｄｅｒらの方法に従い、３ステップで構築した［Ｌｏｗｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １６９：９７１−９８５，２０１５］。
【００５５】
ステップ１）サブクローニングのバックグラウンドを低減するために、公開されている多重ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｔ−ＤＮＡベクターの組み立てのためのプロトコルに従って、最初に、ＡｔＵ６に基づくカセットドナーベクターを、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＳａｌ  Ｉの制限エンドヌクレアーゼで消化して、次いで、Ｅｓｐ３Ｉで第２の消化を行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌ／ｓｕｐｐｌ／２０ｌ  ５／０８／２ｌ／ｐｐ．１５．００６３６．ＤＣ１／Ｐ  Ｐ２０ｌ５−００６３６Ｒｌ＿Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ＿Ｍａｔｅｒｉａｌｓ＿ａｎｄ＿ｍｅｔｈｏｄｓ．ｐｄｆ）。３つのＤＨＳガイドＲＮＡに対応する配列を有するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成して、アニールし、次いでドナーベクターに個別に挿入した。得られたプラスミド、ｐＹＰＱｌ３  ｌＡ，ｐＹＰＱｌ３２ＡおよびｐＹＰＱｌ３３Ａの配列を、サンガーの配列決定によって確認した。
【００５６】
ステップ２）３つ全てのガイド配列を、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ（登録商標）組換えシステムを使用して、ｐＹＰＱｌ４３に構築した。ｐＹＰＱ１４３へのＣａｓ９発現モジュールの挿入により、組換えプラスミドベクターｐＹＰＱ１５０が得られ、これは、Ｂ．ｎａｐｕｓ  ＤＨＳ遺伝子の標的編集に必要なすべてのＣＲＩＳＰＲ成分を含んだ。
【００５７】
ステップ３）ＣＲＩＳＰＲカセットをＧａｔｅｗａｙ（登録商標）組換えシステムを使用して植物送達ベクターに組み込み、形質転換体を回収するためのＰＡＴおよびカナマイシン選択マーカーを有する第３のモジュールを含むバイナリーデスティネーションプラスミドを作製した。形質転換ベクターにおけるＣＲＩＳＰＲカセットの配列を、サンガー配列決定によって確認した。この誘導体の組換えバイナリーベクターを、トランスで提供されるｖｉｒ機能を有する武装解除されたＴｉプラスミドを保有するアグロバクテリウムＭＰ９０に導入した。
【００５８】
トランスジェニック系統の生産：組換えＴ−ＤＮＡを受容Ｂ．ｎａｐｕｓ細胞に送達した。子葉の葉柄を、無菌条件下でジャーで生長させた４〜５日齢のＢ．ｎａｐｕｓ苗から採取し、組織培養で増やした［Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８：２３８−４２，１９８９；Ｂａｂｉｃ  ｅｔ  ａｈ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １７：１８３−８８，１９９８］。子葉の外植片を濾紙上に置き、１ｍｇ／ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２−４  Ｄ）を含む培地中で、２２℃で２日間、続いて４℃で４日間、ＣＲＩＳＰＲに基づくＤＨＳ標的構築物を保有するアグロバクテリウムと共培養した。次いで、外植片を４ｍｇ／ｌの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび２．５ｍｇ／ｌのＰＰＴを有する選択培地（ＭＳ）に移した。４〜６週間後、一部の外植片は、選択培地上の葉柄から新芽を生成した。推定上の形質転換された苗条の数を増加させるために、これらのステップを各実験で約７００の外植片を使用して４回繰り返した。これらの実験から回収された新芽を、０．０５ｍｇ／ｌのＢＡＰおよび０．０２ｍｇ／ｌのジベレリンＡ３（ＧＡ３）を含む「伸長培地」に移した。ガラス化されなかった新芽を、５０％のＭＳ＋０．１ｍｇ／ｌのＢＡＰ、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび５ｍｇ／ｌのホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を含む発根培地に移した。根を正常に生成した芽をポットに移してＴ０植物を確立し、ＰＣＲによって導入遺伝子の存在について分析した。合計５５のＢ．ｎａｐｕｓトランスジェニック系統が特定された。厳密な二重選択および確認の分子分析で、これらのトランスジェニック系統が組換えＤＨＳ構築物を保有することを確実にした。これらの３８系統から、ＤＨＳ遺伝子をＰＣＲで増幅し、プラスミドにサブクローニングし、次いで配列を決定した。１株を除き、全て野生型と同一であった。例外のクローン＃１６は、ガイドＲＮＡによって標的化された配列に隣接する１ｂｐの欠失を有し、切断ＤＨＳタンパク質をもたらした（図４）。この切断対立遺伝子は、ＤＨＳのＣ末端活性部位を欠いており、完全に不活性であることが予想される。クローン＃１６は、野生型ＤＨＳ遺伝子も含み、それがヘテロ接合体であることを示す。
【００５９】
編集されたＢ．ｎａｙｕｓ  ＤＨＳ遺伝子に起因する表現型：トランスジェニックＤＨＳ系統を、２２℃で、１６時間／８時間の明暗サイクルで、制御された温室条件下、ポットで生長させた。それらの発育および生長について、非トランスジェニックのコントロール系統と比較した。トランスジェニック系統の大部分は、野生型と同一のＤＨＳ遺伝子配列を有し、正常な生長および発育パターンを有した。対照的に、編集されたＤＨＳ遺伝子を有するＢ．ｎａｐｕｓ系統＃１６は、より濃い葉を有する矮小な植物を産生した。また、系統＃１６は、遅延した葉の老化を示し、生長と種子生産サイクルを完了するのに１５〜２０日長くかかった（図５）。
【００６０】
Ｂ．ｎａｐｕｓ  ＤＨＳ遺伝子の編集による有益な効果：編集されたＤＨＳ遺伝子を有するＢ．ｎａｐｕｓ植物のコンパクトで矮小な表現型、より濃い緑色の葉、および遅延した老化は、農学的利点を提供する。コンパクトで矮小な表現型は、倒伏が少なく、日光を捕捉するためのより良い芽の構造を提供する。これは、光合成の効率を向上させることができ、それによって、この重要な油糧種子作物における油脂産量および種子収量を増加させることができる。より濃い緑色の葉は、より高いクロロフィル含有量と光合成能力の増加を示唆する。遅延老化は、特に生殖生長の重要で最終的な段階で「緑を長く保つ」ことにつながり、他の多様な作物種で観察されるように、Ｂ．ｎａｐｕｓにおける種子の登熟と生産を強化することが期待される。
【００６１】
実施例１２：Ｋ１４９の上流のイントロンを標的とするガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ−Ｃｍｓｌを使用したジャポニカ米におけるＤＨＳ１編集。
【００６２】
Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖ．キタアケ（ジャポニカ米）は、単子葉植物である。Ｏ．ｓａｔｉｖａ  ｃｖキタアケのＤＨＳ１遺伝子のＫ１４９に隣接するＮＡＤ＋結合部位の上流のイントロンにおいて編集を生成した。ほとんどは、３〜２１ｂｐの欠失をもたらし、エキソン配列に影響しないが、ｍＲＮＡのミススプライシングを引き起こし得る。いくつかのより大きな（＞５０ヌクレオチド）の欠失および挿入を伴う欠失も観察された。これらは、タンパク質産物に影響を及ぼすことが予測され、機能の喪失をもたらす可能性がある。より大きな修飾で生成されるＴ０イベントを、より小さな修飾で同時に生成されたＴ０イベントと比較した。より大きな修飾は、開花の遅延およびクロロフィル含有量の増加を伴った。
【００６３】
ガイドＲＮＡの設計：キタアケイネは、高発現のＤＨＳ１遺伝子（ＯｓＫｉｔａａｋｅ  ０３ｇ３３２３００（ＤＨＳ１）、染色体３上の位置３１５４９６１６〜３１５５４１７６）、および相同であるがまれに発現するＤＨＳ２遺伝子（ＯｓＫｉｔａａｋｅ  ０９ｇ１０２４００（ＤＨＳ２）、染色体９上の位置１４８９７３４９〜１４９００８２６）を有する。ＤＨＳ１遺伝子に特異的であるガイドＲＮＡ、互換性のある（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｍｓｌ化学は、第２と第３のエキソンとの間のイントロンを標的にするように設計された。それは、以下の配列、ＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴＡＡＧＧＧＧＧＡＴＴＡＧＣＴＡＣＡＴＣＡＴＡＧＧ［配列番号５３２］を有し、下線はｃｒＲＮＡヘアピン構造を示す。
【００６４】
遺伝子編集イネ植物の生産：未成熟Ｏ．ｓａｔｉｖａ  ｃｖに由来するカルス。キタアケ種子を、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、およびハイグロマイシンに対する耐性を提供するマーカー別々に含む３つのプラスミドで照射した。４週間の選択の後、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイで、編集の存在について、カルス材料をスクリーニングした。次世代シーケンシングによって、明白な編集を有するカルス材料由来のＤＮＡには、標的部位において３〜６５塩基対の範囲の欠失があることが明らかになった（図６）。ＤＨＳ１において内部欠失を有するカルス片から植物を再生した。Ｔ７エキソヌクレアーゼアッセイでＴ０植物をスクリーニングして、検証のために配列を決定した（図７および８）。系統Ｃ３１Ｇ、Ｃ３１Ｈ、およびＣ３１Ｉは、より大きな挿入を有する。系統Ｃ３１Ｈ由来のＤＮＡを配列決定すると、Ｃ３０Ｓの場合と同じ挿入／欠失を有していることが判明し、これらの２つの系統は、一般的な編集イベントに由来することが示唆された。
【００６５】
Ｔ０イネ植物の表現型：Ｔ０イネ植物物を再生し、温室条件下で栽培し、同じカルス材料から再生し、同じ日に土壌に移植した他のＴ０植物と比較した。クロロフィル含有量を、ＳＰＡＤ  ５０２  Ｐｌｕｓ  Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  Ｍｅｔｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｐｅｃｍｅｔｅｒｓ．ｃｏｍ／ｎｕｔｒｉｅｎｔ−ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ／ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ−ｍｅｔｅｒｓ／ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ／ｓｐａｄ５０２ｐ／＃ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）で測定した。系統Ｃ３０Ｓ、Ｃ３１Ｇ、Ｃ３１Ｈ、およびＣ３１Ｉは、全て、系統Ｃ３０Ｔと比較して、開花が相対的に１０日遅延し、クロロフィル含有量が１１％超増加しており、大きな挿入／欠失が、開花遅延およびクロロフィル含有量の増加を引き起こすことを意味する（表４）。イントロン内の小さな内部欠失、または未検出の編集のいずれかを有する別々のカルス片（ＧＥ５６８−８）に由来する系統間で、有意な表現型の違いは観察されなかった（表５）。
【００６６】
表４：
カルス３０と３１から再生された、キタアケイネＧＥ０５６８  Ｔ０植物の表現型。
【表４】
2021509023.tif 000006
【００６７】
表５：
カルス８から再生されたキタアケイネＧＥ０５６８  Ｔ０植物の表現型。
【表５】
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【００６８】
Ｔ０イネ植物で観察された表現型の違いを確認するために、Ｔ１植物を生成し、ＤＮＡ配列決定によって遺伝子型を決定する。各ＤＮＡ編集イベントについて、ヘテロ接合植物をヌル分離体コントロールおよび野生型コントロールと比較する。万一、ホモ接合変異植物が生き残った場合でも、検査を行う。遺伝子型ごとに、１２の植物を温室で育て、バイオマス、開花期、老化までの日数、クロロフィル含有量および種子収量の表現型を決定する。
【００６９】
実施例１３：活性部位リジンを標的とするガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ−Ｃｍｓｌを使用したジャポニカ米におけるＤＨＳ１の編集。ガイドＲＮＡ：ガイドＲＮＡ［配列番号５８１］は、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖのエキソン６における保存された活性部位（ＥＡＶＳＷＧＫ；配列番号５４６）に変異を導入するように設計された。図９に例示された、キタアケＤＨＳ１遺伝子。ガイドＲＮＡに対応する配列を、植物送達ベクター内のイネＵ６核内低分子遺伝子プロモーターの後ろに挿入した。ベクターは、さらに、トウモロコシユビキチン遺伝子プロモーター下のＣｍｓｌ遺伝子と、ハイグロマイシン耐性マーカーとを含む。
【００７０】
遺伝子編集イネ植物の生産：キタアケイネの形質転換のために、植物送達ベクターをアグロバクテリウムに導入した。標的部位における変異について、７つのハイグロマイシン耐性Ｔ０植物を再生し、遺伝子型を決定した。１つのＴ０植物（＃２）は、１つの野生型対立遺伝子を有する単一対立遺伝子（またはヘテロ接合）変異体であり、もう１つの対立遺伝子は、標的活性部位で１０ｂｐの欠失を保有した。他のＴ０植物は、野生型（ホモ接合正常型）または遺伝子型決定のために生存するには弱すぎる（ホモ接合変異体）のいずれかであった。植物＃２から抽出されたＤＮＡの配列決定により、終止コドンにつながるフレームシフトをもたらす１０ｂｐの欠失が明らかになった（図１０；配列番号５７９）。得られたタンパク質は、保存された活性部位から４アミノ酸およびその後の３７アミノ酸を欠損しており、野生型の３７５アミノ酸の代わりに３３４個のアミノ酸のタンパク質が産生され、タンパク質の総アミノ酸の１１％が除去されることから、酵素的には不活性であることが予想された。
【００７１】
Ｃ末端切断ＤＨＳ１を保有するイネ植物の表現型：ヘテロ接合Ｔ０系統＃２は、ホモ接合野生型植物と比較して、種子サイズの有意な増加以外は、明らかな形態上の差はなく、温室内で正常に生長した。Ｔ１子孫には、４つのヘテロ接合体および６つのホモ接合野生型が含まれていたが、ホモ接合ＤＨＳ１切断変異体は存在せず、ホモ接合切断が致死性であることが示唆された。Ｔ１植物が成熟するまで温室で育てた。野生型コントロールと比較して、ヘテロ接合Ｔ１植物は、より短く、分げつ数がやや多く、類似した小穂数で、約２５％大きい種子を有する（表６）。加えて、Ｃ末端切断ＤＨＳ１対立遺伝子を保有するＴ１植物は、より濃い緑色の外観を有し、クロロフィル含有量がより高いことを示唆する（図１１）。
【００７２】
ヘテロ接合性Ｃ末端切断ＤＨＳ１対立遺伝子を有するイネにおいて観察される表現型は、ゲノム編集作物における特異的変異または欠失の導入を通じて、ＤＨＳ活性を低減することによる有益な効果を実証するものであり、アンチセンスＲＮＡを用いた、シロイヌナズナ、トマト、およびキャノーラにおけるＲＮＡｉを用いたＤＨＳ発現の低減の以前の知見と一致している［Ｄｕｇｕａｙ  ２００７；Ｗａｎｇ  ２００１；Ｗａｎｇ  ｅｌ  ａｌ（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５２，１２２３−１２３５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１２４，４９３−５０３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３８，１３７２−１３８２］。ゲノム編集方法を使用して重要な変異を作出するのに、ＤＨＳ活性を５０％低減するのは「スイートスポット」にあるとみられ、これらの著者らは、いくつかの作物において、野生型ＤＨＳの非常に異なるトランスジェニックアンチセンス誘導体を使用して得ることができた。ＤＨＳは、四量体に会合するため、活性の低下は、全長（活性）およびＣ末端切断（非活性）のサブユニットが混合した四量体の形成、全長およびＣ末端切断ＤＨＳポリペプチドの別々の四量体への分離、またはＣ末端切断ポリペプチドの早期分解によって引き起こされ得る。
【００７３】
表６：
Ｔ１イネ植物の表現型比較．値は、平均±標準偏差として提示される。
【表６】
2021509023.tif 000008
【００７４】
実施例１４：各種植物におけるＤＨＳの塩基編集に関する一般的な戦略。ＤＨＳ活性は、Ｌｙｓ１４９に隣接するＮＡＤ＋結合部位および／またはＣ末端付近の活性部位のゲノムまたは塩基編集によって破壊される。Ｌｙｓ１４９は、Ｌｙｓコドン中の第２のアデニンをグアニンに置換してＡｒｇコドンを形成することによって、または欠失によって編集することができる。活性部位をコードする２１ヌクレオチドは、特定の変異によって改変され得るか、またはＣ末端切断の一部として欠失され得る（表７）。
【００７５】
表７：
ＤＨＳ遺伝子のゲノムエキソン３／４におけるＬｙｓ１４９付近のＮＡＤ＋結合部位への部位特異的コドン変化、および２１−ヌクレオチドの活性部位配列。
【表７−１】
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【表７−２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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