(57)【要約】新生仔発作は、成体発作とは異なり、成体において有効な多くの抗てんかん薬は、新生仔発作を処置することにしばしば失敗する。果実および蜂蜜中に豊富な天然の有機酸であるグルコン酸、ならびにグルコースオキシダーゼ酵素は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で新生仔てんかんを強力に阻害することが、本明細書で示される。グルコン酸ナトリウムは、細胞培養物においててんかん様バースト活動を阻害し、カイニン酸誘導性細胞死からニューロンを保護することが示される。グルコン酸ナトリウムはまた、年かさの動物よりも新生仔動物においてさらに強力な様式で、脳スライスにおけるてんかん様バースト活動を阻害した。これに一致して、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＥＥＧ記録もまた、グルコン酸ナトリウムが、成体動物よりも新生児においてさらに強力な様式でてんかん発作活動を阻害したことを明らかにした。
2021509671.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）
ｉ）グルコースを含み痙攣を示す新生仔患者；および
ｉｉ）グルコースオキシダーゼを含む組成物
を用意するステップ；ならびに
ｂ）前記痙攣が低減されるような条件下で、前記組成物を前記患者に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記条件が、前記グルコースのグルコネートへの変換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、薬学的に許容される組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与するステップが、有効量の前記組成物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支持の陳述
本発明は、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号ＭＨ０８３９１１およびＡＧ０４５６５６の下で政府の支持により行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、神経学的障害の分野に関する。特に、筋強直間代性痙攣、てんかん、ジャクソン障害（Ｊａｃｋｓｏｎｉａｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）および／または不随意振戦が含まれるがこれらに限定されない痙攣性障害の予防および処置である。例えば、一部の実施形態は、新生児および／または乳児において痙攣性障害を処置および予防することに関する。グルコネートベースの組成物およびグルコースオキシダーゼ組成物は、新生児および／または乳児において痙攣性障害を処置および／または予防するのに選択的に有効であることが見出された。
【背景技術】
【０００３】
てんかんの発生率は、生後１年目に最も高く、米国では報告された発生率は１，０００件の生児出生当たりおよそ１．８〜３．５件である。Silverstein  et  al.,  “Neonatal  seizures”  Annals  Of  Neurology  62:112-120  (2007)；およびJensen  F.,  “Neonatal  seizures:  An  update  on  mechanisms  and  management”  Clinics  In  Perinatology  36:881-900  (2009)。多くの抗てんかん薬（ＡＥＤ）が過去数十年にわたって開発されてきたが、新生仔発作は、年かさの小児または成体においてより有効な現在のＡＥＤに対して難治性である場合が多い。Painter  et  al.,  “Phenobarbital  compared  with  phenytoin  for  the  treatment  of  neonatal  seizures”  The  New  England  Journal  Of  Medicine  341:485-489  (1999)；van  Rooij  et  al.,  “Treatment  of  neonatal  seizures”  Seminars  In  Fetal  &  Neonatal  Medicine  18:209-215  (2013)；およびDzhala  et  al.,  “NKCC1  transporter  facilitates  seizures  in  the  developing  brain”  Nature  Medicine  11:1205-1213  (2005)。
【０００４】
一部の場合には、ＡＥＤ適用の後であってさえ、脳波（ＥＥＧ）記録は、新生児において進行中の皮質てんかん活動を示し、これは、認知発達を損ない得、後にてんかんを生じ得る。Connell  et  al.,  “Clinical  and  EEG  response  to  anticonvulsants  in  neonatal  seizures”  Archives  Of  Disease  In  Childhood  64:459-464  (1989)；Glykys  et  al.,  “Differences  in  cortical  versus  subcortical  GABAergic  signaling:  a  candidate  mechanism  of  electroclinical  uncoupling  of  neonatal  seizures”  Neuron  63:657-672  (2009)；およびPuskarjov  et  al.,  “Pharmacotherapeutic  targeting  of  cation-chloride  cotransporters  in  neonatal  seizures”  Epilepsia  55:806-818  (2014)。
【０００５】
てんかん性発作は、脳回路の過剰興奮によって引き起こされる場合が多く、これは、成体脳における主要な阻害性受容体であるＧＡＢＡＡ受容体（ＧＡＢＡＡ−Ｒ）をブーストさせることによって阻害され得る。従って、ベンゾジアゼピンおよびバルビツレート薬物などのＡＥＤが、ＧＡＢＡＡ−Ｒ機能を増加させるためにしばしば開発される。Bialer,  M.  &  White,  H.S.  Key  factors  in  the  discovery  and  development  of  new  antiepileptic  drugs.  Nature  reviews.  Drug  discovery  9,  68-82  (2010)。しかし、ＧＡＢＡＡ−Ｒは、成体脳にでは主に阻害性であるが、発生中の脳では興奮性である。Chen,  G.,  Trombley,  P.Q.  &  van  den  Pol,  A.N.  Excitatory  actions  of  GABA  in  developing  rat  hypothalamic  neurones.  The  Journal  of  physiology  494  (  Pt  2),  451-464  (1996)；およびBen-Ari,  Y.  Excitatory  actions  of  gaba  during  development:  the  nature  of  the  nurture.  Nature  reviews.  Neuroscience  3,  728-739  (2002)。
【０００６】
発生中の脳における興奮性ＧＡＢＡ作動性伝達は、新生仔発作を制御するのにＧＡＢＡアゴニストがしばしば無効であり、ときおり新生仔発作活動を悪化させることさえあり得る理由もまた説明する。Farwell,  J.R.,  et  al.  Phenobarbital  for  febrile  seizures--effects  on  intelligence  and  on  seizure  recurrence.  The  New  England  journal  of  medicine  322,  364-369  (1990)。
【０００７】
古典的に、ＧＡＢＡの興奮性機能対阻害性機能は、Ｃｌ−コトランスポーターＮＫＣＣ１およびＫＣＣ２による調節に帰せられてきた１０。Kaila,  K.,  Price,  T.J.,  Payne,  J.A.,  Puskarjov,  M.  &  Voipio,  J.  Cation-chloride  cotransporters  in  neuronal  development,  plasticity  and  disease.  Nature  reviews.  Neuroscience  15,  637-654  (2014)。Blaesse,  P.,  Airaksinen,  M.S.,  Rivera,  C.  &  Kaila,  K.  Cation-chloride  cotransporters  and  neuronal  function.  Neuron  61,  820-838  (2009)。以前の研究は、ＮＫＣＣ１が、げっ歯類動物において新生仔発作を促進し得ることを見出した１２が、乳児における最近の臨床試験は、ＮＫＣＣ１遮断剤ブメタニドの重症な副作用、および新生仔発作を処置するのに非常に限定的な有効性を見出した１３。Dzhala,  V.I.,  et  al.  NKCC1  transporter  facilitates  seizures  in  the  developing  brain.  Nature  medicine  11,  1205-1213  (2005)；およびPressler,  R.M.,  et  al.  Bumetanide  for  the  treatment  of  seizures  in  newborn  babies  with  hypoxic  ischaemic  encephalopathy  (NEMO):  an  open-label,  dose  finding,  and  feasibility  phase  1/2  trial.  Lancet  Neurol  14,  469-477  (2015)。
【０００８】
残念ながら、今日まで、新生仔発作を首尾よく処置することができる有効な薬物は存在しておらず、新生仔てんかんのための新たな薬物の緊急の研究を促進している。新生仔発作の独自の特徴を処置するための単純で有効かつ安全な抗てんかん薬が、当技術分野で必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Silverstein  et  al.,  “Neonatal  seizures”  Annals  Of  Neurology  62:112-120  (2007)
【非特許文献２】Jensen  F.,  “Neonatal  seizures:  An  update  on  mechanisms  and  management”  Clinics  In  Perinatology  36:881-900  (2009)
【非特許文献３】Painter  et  al.,  “Phenobarbital  compared  with  phenytoin  for  the  treatment  of  neonatal  seizures”  The  New  England  Journal  Of  Medicine  341:485-489  (1999)
【非特許文献４】van  Rooij  et  al.,  “Treatment  of  neonatal  seizures”  Seminars  In  Fetal  &  Neonatal  Medicine  18:209-215  (2013)
【非特許文献５】Dzhala  et  al.,  “NKCC1  transporter  facilitates  seizures  in  the  developing  brain”  Nature  Medicine  11:1205-1213  (2005)
【非特許文献６】Connell  et  al.,  “Clinical  and  EEG  response  to  anticonvulsants  in  neonatal  seizures”  Archives  Of  Disease  In  Childhood  64:459-464  (1989)
【非特許文献７】Glykys  et  al.,  “Differences  in  cortical  versus  subcortical  GABAergic  signaling:  a  candidate  mechanism  of  electroclinical  uncoupling  of  neonatal  seizures”  Neuron  63:657-672  (2009)
【非特許文献８】Puskarjov  et  al.,  “Pharmacotherapeutic  targeting  of  cation-chloride  cotransporters  in  neonatal  seizures”  Epilepsia  55:806-818  (2014)
【非特許文献９】Bialer,  M.  &  White,  H.S.  Key  factors  in  the  discovery  and  development  of  new  antiepileptic  drugs.  Nature  reviews.  Drug  discovery  9,  68-82  (2010)
【非特許文献１０】Chen,  G.,  Trombley,  P.Q.  &  van  den  Pol,  A.N.  Excitatory  actions  of  GABA  in  developing  rat  hypothalamic  neurones.  The  Journal  of  physiology  494  (  Pt  2),  451-464  (1996)
【非特許文献１１】Ben-Ari,  Y.  Excitatory  actions  of  gaba  during  development:  the  nature  of  the  nurture.  Nature  reviews.  Neuroscience  3,  728-739  (2002)
【非特許文献１２】Farwell,  J.R.,  et  al.  Phenobarbital  for  febrile  seizures--effects  on  intelligence  and  on  seizure  recurrence.  The  New  England  journal  of  medicine  322,  364-369  (1990)
【非特許文献１３】Kaila,  K.,  Price,  T.J.,  Payne,  J.A.,  Puskarjov,  M.  &  Voipio,  J.  Cation-chloride  cotransporters  in  neuronal  development,  plasticity  and  disease.  Nature  reviews.  Neuroscience  15,  637-654  (2014)
【非特許文献１４】Blaesse,  P.,  Airaksinen,  M.S.,  Rivera,  C.  &  Kaila,  K.  Cation-chloride  cotransporters  and  neuronal  function.  Neuron  61,  820-838  (2009)
【非特許文献１５】Pressler,  R.M.,  et  al.  Bumetanide  for  the  treatment  of  seizures  in  newborn  babies  with  hypoxic  ischaemic  encephalopathy  (NEMO):  an  open-label,  dose  finding,  and  feasibility  phase  1/2  trial.  Lancet  Neurol  14,  469-477  (2015)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、神経学的障害の分野に関する。特に、筋強直間代性痙攣、てんかん、ジャクソン障害および／または不随意振戦が含まれるがこれらに限定されない痙攣性障害の予防および処置である。例えば、一部の実施形態は、新生児および／または乳児において痙攣性障害を処置および予防することに関する。グルコネートベースの組成物およびグルコースオキシダーゼ組成物は、新生児および／または乳児において痙攣性障害を処置および／または予防するのに選択的に有効であることが見出されている。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）グルコースを含み痙攣を示す新生仔患者；およびｉｉ）グルコースオキシダーゼを含む組成物を用意するステップ；ならびにｂ）前記痙攣が低減されるような条件下で、前記組成物を前記患者に投与するステップを含む方法を企図する。一実施形態では、前記条件は、前記グルコースのグルコネートへの変換を含む。一実施形態では、投与するステップは、補足的グルコースをさらに含む。一実施形態では、組成物は、補足的グルコースをさらに含む。一実施形態では、前記組成物および前記補足的グルコースは、順次投与される。一実施形態では、前記組成物および前記補足的グルコースは、同時に投与される。一実施形態では、前記条件は、前記補足的グルコースのグルコネートへの変換を含む。一実施形態では、前記組成物は、薬学的に許容される組成物である。一実施形態では、前記投与するステップは、有効量の前記組成物をさらに含む。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）痙攣を示す新生仔患者であって、二価カチオンベースの治療を必要としない、患者；およびｉｉ）グルコネート錯体を含む組成物を用意するステップ；ならびにｂ）前記痙攣が低減されるような条件下で、前記組成物を前記患者に投与するステップを含む方法を企図する。一実施形態では、グルコネート錯体は、二価カチオンを欠く。一実施形態では、グルコネート錯体は、グルコン酸ナトリウムである。一実施形態では、二価カチオンベースの治療は、カルシウムベースの治療である。一実施形態では、二価カチオンベースの治療は、マグネシウムベースの治療である。一実施形態では、二価カチオンベースの治療は、亜鉛ベースの治療である。一実施形態では、グルコネート錯体は、グルコン酸誘導体を含む。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）痙攣を示す新生仔患者であって、二価カチオンベースの治療を必要としない、患者；ｉｉ）グルコネート錯体からなる組成物であって、前記錯体が二価カチオンを欠く、組成物を用意するステップ；ならびにｂ）前記痙攣が低減されるような条件下で、前記組成物を前記患者に投与するステップを含む方法を企図する。一実施形態では、グルコネート錯体は、グルコン酸ナトリウムである。一実施形態では、二価カチオンベースの治療は、カルシウムベースの治療である。一実施形態では、二価カチオンベースの治療は、マグネシウムベースの治療である。一実施形態では、二価カチオンベースの治療は、亜鉛ベースの治療である。一実施形態では、グルコネート錯体は、グルコン酸誘導体を含む。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、グルコネート誘導体を含む組成物を企図し、ここで、少なくとも１つのヒドロキシル部分またはカルボン酸部分は、置換または非置換のアリールまたはヘテロアリール、非置換または置換のＣ１〜Ｃ６−アルキル基、置換または非置換の５〜６員の飽和または不飽和の縮合環、置換または非置換の５〜６員の飽和または不飽和の環、天然アミノ酸残基または合成アミノ酸残基、トリハロメチル、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６−アルコキシ、ＮＨ２、ＳＨ、チオアルキル、アミノアシル、アミノカルボニル、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６−アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、１〜３個のヘテロ原子を必要に応じて含む置換または非置換の４〜８員の環式アルキル、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アセトキシ、アミノアシル、スルホキシ、スルホニル、Ｃ１〜Ｃ６−チオアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６−脂肪族アルキル、１〜３個のヘテロ原子を必要に応じて含み、アリールまたはヘテロアリールと必要に応じて縮合される置換または非置換の飽和環式Ｃ４〜Ｃ８−アルキル；置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール（ここで、前記アリールまたはヘテロアリール基は、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６−アルキル、例えばトリハロメチル、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６−アルコキシ、置換または非置換のＣ２〜Ｃ６−アルケニル、置換または非置換のＣ２〜Ｃ６−アルキニル、アミノ、アミノアシル、アミノカルボニル、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６−アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アセトキシ、アミノアシル、スルホキシ、スルホニル、Ｃ１〜Ｃ６−チオアルコキシで必要に応じて置換されている）が含まれるがこれらに限定されない基で置換されている；あるいはＲ５およびＲ６は、一緒になって、置換または非置換の４〜８員の飽和環式アルキルまたはヘテロアルキル基を形成していてもよい。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）痙攣を示す新生仔患者であって、少なくとも１つのクロライドイオンチャネルを含む、患者；ｉｉ）クロライドイオンチャネル遮断剤を含む組成物を用意するステップ；ならびにｂ）前記痙攣が低減されるような条件下で、前記組成物を前記患者に投与するステップを含む方法を企図する。一実施形態では、クロライドイオンチャネル遮断剤は、二価カチオンを欠くグルコネート錯体である。一実施形態では、クロライドイオンチャネル遮断剤には、ニフルミン酸（ＮＦＡ）、フルフェナム酸、４，４’−ジイソチオシアナト−２，２’−スチルベンジスルホン酸二ナトリウム塩（ＤＩＤＳ）および５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸（ＮＰＰＢ）が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、グルコネート錯体は、グルコン酸ナトリウムである。一実施形態では、患者は、二価カチオンベースの治療を必要としない。一実施形態では、二価カチオンベースの治療は、カルシウムベースの治療である。一実施形態では、二価カチオンベースの治療は、マグネシウムベースの治療である。一実施形態では、二価カチオンベースの治療は、亜鉛ベースの治療である。一実施形態では、グルコネート錯体は、グルコン酸誘導体を含む。
【００１６】
定義
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書で定義される用語は、本発明に関連する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」などの用語は、単数形の実体だけでなく複数形の実体を指すことを意図し、そのうちの具体的な例が例示のために使用され得る、一般的なクラスもまた含む。本明細書の術語は、本発明の具体的な実施形態を記載するために使用されるが、それらの用法は、特許請求の範囲に概略されるものを除き、本発明の限界を定めるものではない。
【００１７】
用語「グルコン酸」または「グルコネート」は、本明細書で使用される場合、５つのヒドロキシル部分および１つのカルボン酸部分を含む６  α−炭素鎖を指す。ヒドロキシル部分およびカルボン酸部分の各々は、伝統的な二価カチオン治療と比較して改善された臨床的有効性を有する抗痙攣薬グルコネート誘導体を提供するために、本明細書で開示されるように置換および／または誘導体化され得る。
【００１８】
用語「痙攣」または「発作」は、本明細書で使用される場合、脳における異常な電気的放電から生じる痙攣、感覚障害および／または意識消失が含まれるがこれらに限定されない、筋肉の任意の異常な激烈かつ不随意な収縮もしくは一連の収縮および／または肉体的所見を指す。
【００１９】
用語「新生児」または「新生仔」は、本明細書で使用される場合、一般に１月齢未満の、任意の生まれたばかりの新生乳児を指す。一般に、新生児の齢に対する言及は、「Ｐ＃」によって特徴付けられ、ここで、「Ｐ」は、出生後（ｐｏｓｔｎａｔａｌ）を指し、「＃」は、日齢を示し、Ｐ０は、出生日である。
【００２０】
用語「二価カチオン」は、正の２の価数の電荷（例えば、２＋）を有する任意のイオンを指す。例えば、イオンＣａ２＋、Ｍｇ２＋および／またはＺｎ２＋は、二価カチオンであるとみなされる。
【００２１】
用語「約」は、任意のアッセイ測定値のいずれかとの関連で本明細書で使用される場合、所与の測定値の＋／−５％を指す。
【００２２】
用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、臨床的に有益な結果（すなわち、例えば、症状の低減）を達成する治療剤を含む医薬組成物の特定の量を指す。かかる組成物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよびさらなる動物研究から取得されたデータは、ヒト使用のための投薬量の範囲を製剤化する際に使用され得る。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く有さずに、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に入る。投薬量は、使用される剤形、患者の感度および投与の経路に依存して、この範囲内で変動する。
【００２３】
用語「症状」は、本明細書で使用される場合、患者によって観察される疾患または肉体的障害の任意の主観的または客観的証拠を指す。例えば、主観的証拠は通常、患者自身の報告に基づき、これには、疼痛、頭痛、視覚障害、悪心および／または嘔吐が含まれ得るがこれらに限定されない。あるいは、客観的証拠は通常、体温、全血球数、脂質パネル、甲状腺パネル、血圧、心拍数、心電図、組織および／または身体イメージングスキャンが含まれるがこれらに限定されない、医学的試験の結果である。
【００２４】
用語「疾患」または「医学的状態」は、本明細書で使用される場合、生体機能の性能を妨害または改変する、生きた動物もしくは植物本体またはその部分のうち１つの、正常な状態の任意の障害を指す。典型的には、徴候および症状を識別することによって明らかにされるが、これは通常、以下に対する応答である：ｉ）環境因子（栄養不良、産業危険または気候など）；ｉｉ）特定の感染性因子（虫、細菌またはウイルスなど）；ｉｉｉ）生物の固有の欠損（遺伝子異常など）；および／またはｉｖ）これらの因子の組合せ。
【００２５】
用語「低減させる」、「阻害する」、「弱める」、「抑制する」、「減少させる」、「防止する／予防する」および文法的等価物（「より低い」、「より小さい」などを含む）は、処置された対象と比較した未処置の対象における任意の症状の発現に関連する場合、処置された対象における症状の量および／または大きさが、任意の医学的に訓練された職員によって臨床的に関連すると認識される任意の量分、未処置の対象中よりも低いことを意味する。一実施形態では、処置された対象における症状の量および／または大きさは、未処置の対象における症状の量および／または大きさよりも、少なくとも１０％低い、少なくとも２５％低い、少なくとも５０％低い、少なくとも７５％低いおよび／または少なくとも９０％低い。
【００２６】
用語「結合された（ａｔｔａｃｈｅｄ）」は、本明細書で使用される場合、媒体（または担体）と薬物との間の任意の相互作用を指す。結合は、可逆的または不可逆的であり得る。かかる結合には、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス力または摩擦などが含まれるがこれらに限定されない。薬物は、含浸される、組み込まれる、コーティングされる、それとの懸濁物中にある、それとの溶液中にある、それと混合されるなどの場合、媒体（または担体）に結合されている。
【００２７】
用語「媒体」は、本明細書で使用される場合、薬物を処置ポイント（例えば、創傷、手術部位など）に送達するための担体またはビヒクルとして機能する、任意の材料、または材料の組合せを指す。従って、全ての実務的な目的のために、用語「媒体」は、用語「担体」と同義とみなされる。媒体は担体を含み、前記担体が、薬物（単数または複数）に結合されること、前記媒体が、前記担体の処置ポイントへの送達を促進することが、当業者によって認識されるべきである。さらに、担体は、結合された薬物を含み得、前記担体は、前記薬物の処置ポイントへの送達を促進する。好ましくは、媒体は、発泡体、ゲル（ヒドロゲルが含まれるがこれに限定されない）、キセロゲル、ミクロ粒子（すなわち、ミクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル剤など）、生体接着剤または液体を含むがこれらに限定されない群から選択される。ミクロ粒子とヒドロゲル、生体接着剤、発泡体または液体との組合せを含む媒体が、本発明によって具体的に企図される。好ましくは、ヒドロゲル、生体接着剤および発泡体は、本明細書で企図されるポリマーのいずれか１つまたはそれらの組合せを含む。本発明によって企図される任意の媒体は、制御放出製剤を構成し得る。例えば、一部の場合には、媒体は、およそ1日から６カ月まで持続する期間にわたって薬物の制御放出および持続放出を提供する薬物送達系を構成する。
【００２８】
用語「薬物」または「化合物」は、本明細書で使用される場合、所望の効果を達成する、投与されることが可能な任意の薬理学的に活性な物質を指す。薬物または化合物は、合成のまたは天然に存在する、非ペプチド、タンパク質またはペプチド、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド、多糖または糖であり得る。
【００２９】
用語「投与された」または「投与する」は、本明細書で使用される場合、組成物が患者に対してその意図した効果を有するように、組成物を患者に提供する任意の方法を指す。投与する例示的な方法は、直接的機構、例えば、局所組織投与（すなわち、例えば、血管外配置）、経口摂取、静脈内注射、経皮パッチ、外用、吸入、坐剤などによるものである。
【００３０】
用語「患者」または「対象」は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは動物であり、入院している必要はない。例えば、外来患者、養護施設にいる人は、「患者」である。患者は、任意の齢のヒトまたは非ヒト動物を含み得、従って、これには、成体および若年（すなわち、新生児、乳児および／または小児）の両方が含まれる。用語「患者」は、医学的処置の必要を含意しないことが意図され、従って、患者は、臨床的であれ基礎科学研究の支持下であれ、自発的または不本意に、実験の一部であり得る。
【００３１】
用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、臨床的に有益な結果（すなわち、例えば、症状の低減）を達成する治療剤を含む医薬組成物の特定の量を指す。かかる組成物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよびさらなる動物研究から取得されたデータは、ヒト使用のための投薬量の範囲を製剤化する際に使用され得る。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く有さずに、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に入る。投薬量は、使用される剤形、患者の感度および投与の経路に依存して、この範囲内で変動する。
【００３２】
用語「薬学的に」または「薬理学的に許容される」は、本明細書で使用される場合、動物またはヒトに投与された場合に、有害な反応もアレルギー反応も他の厄介な反応も生じない、分子実体および組成物を指す。
【００３３】
用語「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、任意のおよび全ての溶媒、または水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物が含まれるがこれらに限定されない分散媒、ならびに植物油、コーティング、等張剤および吸収遅延剤、リポソーム、市販の洗浄剤などを含む。補足的生理活性成分もまた、かかる担体中に組み込まれ得る。
【００３４】
用語「小さい有機分子」は、本明細書で使用される場合、医薬品において一般に使用される有機分子に匹敵するサイズの任意の分子を指す。この用語は、生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を排除する。好ましい小さい有機分子は、およそ１０Ｄａから約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、最も好ましくは約１０００Ｄａまでのサイズ範囲である。
【００３５】
用語「生物学的に活性な」は、構造的、調節的または生化学的機能を有する任意の分子を指す。例えば、生物活性は、例えば、タンパク質活性を欠く細胞における野生型成長の回復によって決定され得る。タンパク質活性を欠く細胞は、多くの方法（すなわち、例えば、点突然変異およびフレームシフト突然変異）によって産生され得る。補完は、タンパク質活性を欠く細胞に、タンパク質、その誘導体またはその一部分を発現する発現ベクターをトランスフェクトすることによって達成される。
【００３６】
用語「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」は、細胞中への外来ＤＮＡの導入を指す。
【００３７】
用語「結合する（ｂｉｎｄ）」は、本明細書で使用される場合、永続的または一時的であり得る、任意の物理的結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）または密接な会合を含む。一般に、水素結合、疎水性力、ファンデルワールス力、共有結合およびイオン結合などの相互作用は、目的の分子と測定されている分析物との間の物理的結合を促進する。「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」相互作用は、結合が化学反応を生じさせる状況などの場合、短時間であり得る。それは、結合構成要素が酵素であり、分析物が酵素の基質である場合に、典型的である。結合剤と分析物の間の接触から生じる反応もまた、本発明の目的のために、結合の定義の範囲内である。
【００３８】
用語「補足的グルコース」は、本明細書で使用される場合、グルコースオキシダーゼと組み合わせた、静脈内グルコースの小児科患者への投与を指す。例えば、７．３ｍｇ／ｋｇ／分のグルコース注入速度（ＧＩＲ）が好ましい。
【００３９】
本特許のファイルは、カラーで実行される少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許のコピーは、要求および必要な手数料の納付により、特許商標庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１−１】図１は、培養されたニューロンに対するグルコネートの抗バースト活性を示す例示的なデータを示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。  図１Ａ：培養されたニューロンにおける自発的バースト作用電位は、２０ｍＭのＮａＧｃＡの適用によって即座に停止された（ｎ＝１０、３バッチから）。ＮａＧｃＡ適用の前、その間および後の拡大グラフが、下に示される。  図１Ｂ：培養されたニューロンにおけるＣＴＺ誘導性のロバストなバースト活動（上）。これは、１０ｍＭのＮａＧｃＡによって完全に遮断された（下）。  図１Ｃ：ＣＴＺ誘導性バースト活動に対するＮａＧｃＡの用量依存的阻害。黒色の棒は、バースト周波数を示し、灰色の棒は、バースト持続時間を示す（ｎ＝４バッチから１１、対応のあるスチューデントｔ検定）。  図１Ｄ：カイニン酸（２時間にわたって１μＭ）誘導性のロバストなバースト活動の代表的なトレース（上）。これもまた、１０ｍＭのＮａＧｃＡによって劇的に抑制された（下）。  図１Ｅ：ＮａＧｃＡに対するＫＡ誘導性バースト活動の用量依存的応答（ｎ＝３つのバスから１２、対応のあるスチューデントｔ検定）。  図１Ｆ：４−ＡＰ（２時間にわたって５０μＭ）誘導性のロバストな活動の典型的なトレース（上）もまた、１０ｍＭのＮａＧｃＡによって明らかに抑制された（下）。  図１Ｇ：ＮａＧｃＡに対する４−ＡＰ誘導性バースト活動の用量応答（ｎ＝３つのバスから９、対応のあるスチューデントｔ検定）。  図１Ｈ：１０μＭのＣＴＺによって誘導された典型的な再発性てんかん様バースト（上）、ならびにＣＴＺおよびＮａＧｃＡ（１０ｍＭ）の共適用におけるバースト活動の欠如を示す、代表的なトレース。  図１Ｉ（ａ〜ｃ）：パネルｈの定量化されたデータは、５ｍＭおよび１０ｍＭの両方のＮａＧｃＡによる慢性共処理を示しており、これは、バースト活動（図１Ｉ（ａ）、χ２検定）、バースト周波数（図１Ｉ（ｂ）、一元配置ＡＮＯＶＡ）およびバースト持続時間（図１Ｉ（ｃ）および図１Ｉ（ｂ）、一元配置ＡＮＯＶＡ）を示すニューロンの比率を有意に低減させた。ＣＴＺについてｎ＝２２、ＣＴＺ＋５ｍＭのＮａＧｃＡについてｎ＝１６、ＣＴＺ＋１０ｍＭのＮａＧｃＡについてｎ＝１７。全てのデータは、５バッチから得た。対応のあるスチューデントｔ検定。  図１Ｊ：生／死アッセイ画像は、異なる群におけるカルセイン−ＡＭ（生について緑色）およびエチジウムホモダイマー−１（死について赤色）を示した。スケールバー、１００μｍ。  図１Ｋ：細胞生／死アッセイの定量化。結果は、ＮａＧｃＡが、カイニン酸誘導性ニューロン興奮毒性に対するニューロン保護機能を有し、それ自体では、ニューロン生存に対するいずれの副作用も有さないことを明らかにした。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【図１−５】同上。
【図２−１】図２は、グルコネートが培養された皮質ニューロンにおいてクロライド電流を阻害するという例示的なデータを示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。  （ａ〜ｆ）ＮａＧｃＡ（１０ｍＭ）は、Ｎａ＋電流（ａ、ｂ）に対してもＫ＋電流（ｃ、ｄ）に対してもＣａ２＋電流（ｅ、ｆ）に対しても効果を有さなかった。  （ｇ）１０ｍＭのＮａＧｃＡ適用の前（黒色）および後（緑色）に記録された典型的なＣｌ−電流。  （ｈ）Ｃｌ−電流に対する有意なＮａＧｃＡ阻害を示すＩ−Ｖ曲線（ｎ＝３バッチの培養物からの７、対応のあるスチューデントｔ検定）。  （ｉ、ｊ）古典的Ｃｌ−チャネル遮断剤であるＮＰＰＢ（１００μＭ）は、培養された皮質ニューロンにおいてＣｌ−電流を阻害した。  （ｋ、ｌ）培養された皮質ニューロンにおけるＣｌ−電流に対する、別の一般的なＣｌ−チャネル遮断剤ＤＩＤＳ（１００μＭ）の阻害効果。ＤＩＤＳの洗い流し後のＣｌ−電流に対するＤＩＤＳの持続性の阻害に留意されたい。（ｍ、ｎ）ＮＰＰＢ（ｍ）およびＤＩＤＳ（ｎ）は共に、ＣＴＺによって誘導されたてんかん様活動を強力に阻害し、これは、Ｃｌ−チャネルがてんかん発生に関与することを支持している。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図３】図３は、海馬スライスにおけるてんかん活動に対するグルコネートの齢依存的効果を示す例示的なデータを示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。  （ａ）新生仔（Ｐ７）マウスの海馬スライス中のＣＡ３錐体細胞層における細胞外フィールド電位記録。てんかん事象は、Ｍｇ２＋なしのａＣＳＦによって誘導され、Ｍｇ２＋なしのａＣＳＦ中２０ｍＭのＮａＧｃＡの存在下で阻害された。ＮａＧｃＡの適用の前、その間およびその後の拡大されたトレースが、下に示される。  （ｂ）ＮａＧｃＡ適用の前、その間およびその後の、５分間の時間ウインドウにおけるてんかん活動のパワースペクトル。パワーの振幅（スペクトルトレースの下の積分面積）は、ＮａＧｃＡ適用後に劇的に抑制された。  （ｃ、ｄ）ＮａＧｃＡの抗てんかん様活性の匹敵する有効性を、Ｐ１２海馬スライスにおいて試験した。  （ｅ）ＮａＧｃＡは、新生仔スライスと比較して、Ｐ２６海馬スライスにおいて中程度の抗てんかん放電効果を有する。下は、ＮａＧｃＡ灌流の前、その間およびその後の拡大トレースを示した。（ｆ）パワー振幅は、ＮａＧｃＡ適用の間にわずかに減少し、ＮａＧｃＡを洗い流した後にほとんど回復した。  （ｇ）てんかん活動の標準化されたパワーを、ＮａＧｃＡ適用の前、その間およびその後の、連続した５分間ウインドウにおいて、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導した。ＮａＧｃＡは、Ｐ６〜８およびＰ１０〜１２群ではてんかん活動のパワーを劇的に低減させたが、Ｐ２１〜３３群に対してはあまり効果がなく、対照群データは、追加の２０ｍＭのＮａＣｌを８０分の細胞外フィールド電位記録の間に０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ中に添加した後に、有意な変化が存在しなかったことを示した。
【図４】図４は、ＮａＧｃＡの抗てんかん活性を異なる新生仔スライス発作モデルにおいて試験したことを示す例示的なデータを示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。  （ａ）ＣＡ３錐体細胞層における細胞外フィールド電位記録。てんかん活動を、５０μＭの４−ＡＰによって誘導した。ＮａＧｃＡは、５０μＭの４−ＡＰに応答した発作様放電を減弱させた。それぞれのトレースを、下で拡大した。  （ｂ）ＮａＧｃＡ適用の前、その間およびその後の、５分間ウインドウにおけるてんかん活動のパワースペクトル。パワースペクトルの振幅は、ＮａＧｃＡ適用後に顕著に抑制された。  （ｃ）４−ＡＰによって誘導されたてんかん活動の平均パワーは、ＮａＧｃＡの灌流によって明らかに低減された。  （ｄ）ＮａＧｃＡは、新生仔高Ｋ＋モデルにおいてバースト活動を際立って抑制した。下は、ＮａＧｃＡ灌流の前、その間およびその後の拡大図を示した。  （ｅ）パワースペクトル振幅は、ＮａＧｃＡ適用の間に顕著に低減された。  （ｆ）てんかん活動の標準化されたパワーが、ＮａＧｃＡ適用の前、その間およびその後の、連続した５分間ウインドウにおいて、高Ｋ＋ａＣＳＦによって誘導された。ＮａＧｃＡは、高Ｋ＋誘導性てんかん活動のパワーを劇的に減少させた。
【図５−１】図５は、ＣＡ３錐体ニューロンにおけるＣＬＣ−３チャネル媒介性Ｃｌ−電流がグルコネートによって阻害されたことを示す例示的なデータを示す。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。  （ａ）ＣＡ３錐体ニューロンにおける代表的なＣｌ−電流。Ｃｌ−電流は、２０ｍＭのＮａＧｃＡの適用によって、際立って阻害された（緑色）。  （ｂ）Ｉ−Ｖ曲線は、０ｍＶに近い逆転電位で、有意な外向き整流をプロットした。Ｃｌ−電流は、ＮａＧｃＡの存在下で劇的に低減された（緑色）。  （ｃ）正常ＣｓＣｌピペット溶液（左赤色）、抗ＣｌＣ−３抗体（中央オレンジ色）または対照ウサギＩｇＧ（右黒色）による細胞内透析（１０分間）を使用する、ＣＡ３錐体ニューロンから得たＣｌ−電流トレースの例。  （ｄ）Ｉ−Ｖプロットは、抗ＣｌＣ−３抗体透析後に際立つ低減を示したが（オレンジ色）、対照ＩｇＧ透析後には有意な変化を示さなかった（黒色）。  （ｅ）ｅＧＦＰ（左の列）またはＣｌＣ−３−ｅＧＦＰ融合タンパク質プラスミド（右の列）のいずれかをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の免疫染色画像。ＣｌＣ−３免疫反応性（赤色）は、ＣｌＣ−３−ｅＧＦＰトランスフェクトされた細胞では強く検出されたが（矢印）、非トランスフェクト細胞またはｅＧＦＰトランスフェクトされた細胞では検出されなかった。スケールバー、４０μｍ。  （ｆ）ｅＧＦＰ（上）またはＣｌＣ−３−ｅＧＦＰプラスミド（下）のいずれかをトランスフェクトされたＨＥＫ細胞における典型的なＣｌ−電流、および２０ｍＭのＮａＧｃＡに対する応答（中央緑色）。  （ｇ）ＣｌＣ−３−ｅＧＦＰ（右、ｎ＝２バッチからの７）感染細胞についての、ＮａＧｃＡの前、その間および洗い流しのＩ−Ｖ関係。ＣｌＣ−３媒介性電流は、ＮａＧｃＡによって有意に阻害された。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【図６】図６は、ＣＬＣ−３が新生仔てんかんスライスにおいて上方調節されたことを示す例示的なデータを示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。＊＊＊Ｐ＜０．００１。  （ａ）海馬ＣＡ３上のＣｌＣ−３の比較できる発現レベル。ＣｌＣ−３免疫反応性は、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ中で１時間のスライスインキュベーション後に増加した。アスタリスクは、ＣＡ３領域における位相と重ねたＣＬＣ−３免疫シグナル（赤色）を有する拡大された典型的なニューロンを示した。スケールバー＝２０μｍ（拡大画像中では５μｍ）。  （ｂ）ＣｌＣ−３免疫反応性強度の定量化されたデータは、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ中で１時間のスライスインキュベーション後に、有意な増加を示した（ｎ＝対照について、４匹の仔からの１０個のスライス、ｎ＝０  Ｍｇ２＋について、４匹の仔からの１１個のスライス、スチューデントｔ検定）。  （ｃ）対照および０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ（１時間）処理したスライス由来の海馬ＣｌＣ−３タンパク質のウエスタンブロット。  （ｄ）定量化されたデータは、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦで海馬スライスを処理した後の、ＣＬＣ−３タンパク質の有意な増加を示した（ｎ＝群の各々について６匹の仔、スチューデントｔ検定）。  （ｅ）対照、１時間のＭｇ２＋インキュベーション、および次いで２０ｍＭのＮａＧｃＡにおいて記録した１時間のＭｇ２＋インキュベーションの代表的なＣｌ−電流トレース。  （ｆ）Ｃｌ−電流の平均Ｉ−Ｖプロットは、０  Ｍｇ２＋群における有意な増加を示し、これはまた、ＮａＧｃＡによって際立って阻害された。
【図７−１】図７Ａ〜Ｇは、グルコネートがＫＡ誘導性新生仔発作のための有効な治療であることを示す例示的なデータを示す。  図７（ａ）ＫＡ注射（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の１０分後に食塩水（０．１ｍｌ／１０ｇ、ｉ．ｐ．）を注射したＰ１２ラットからの代表的なＥＥＧトレースは、再発性てんかんバースト放電を示した。  図７（ｂ）典型的な発作間、発作−強直性および発作−間代性のトレースを示す、図７ａ中の囲み枠ｂからの、単一のクラスター様てんかん放電の拡大図。  図７（ｃ）スパイク活動における増加を示すが、ロバストなバースト放電は示さない、ＫＡ注射（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の１０分後にＮａＧｃＡ（２ｇ／ｋｇ、ｉｐ）を注射したＰ１２ラットの例ＥＥＧが、ＮａＧｃＡ投与後に発生した。図７ａと同じスケールバー。  図７（ｄ）図７ｃ中の囲み枠ｄの拡大された領域。図７ｂと同じスケールバー。単一のスパイク放電が、２つの隣接するベースライントレースと比較して、拡大されたトレースにおいて観察された。図７ｃと同じスケールバー。  図７（ｅ）パネルａ（黒色）およびｄ（緑色）の１分間の時間ウインドウにおける個々のＥＥＧパワー。  図７（ｆ）食塩水（黒色、Ｐ１０〜１２、ｎ＝１１）およびＮａＧｃＡ投与（緑色、Ｐ１０〜１２、ｎ＝１１）の１分間の時間ウインドウにおける群平均ＥＥＧパワー。黒色の矢頭は、ＫＡ注射の時点を示し、赤色の矢頭は、食塩水またはＮａＧｃＡのいずれかの注射の時点を示す。ＫＡ注射によって誘導されたてんかん活動の平均パワーは、ＮａＧｃＡの存在下で７０％低かった。  図７（ｇ）本発明者らの研究の作業モデル。クロライドチャネルを介したＣｌ−流入は、同期されたネットワーク活動を促進する（左）。しかし、このプロセスは、クロライドチャネルに対するその阻害に起因して、グルコン酸（ＧＡ）によって抑制される（右）。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【図８】図８は、成体てんかんに対するグルコネートの効果を示す例示的なデータを示す。  （ａ〜ｃ）食塩水（ａ）、１ｇ／ｋｇのＮａＧｃＡ（ｂ）、または２ｇ／ｋｇのＮａＧｃＡ（ｃ）がが後に続く、ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の注射によって誘導されたてんかん様活動を示す代表的なＥＥＧ記録。白抜きの三角形は、最初のスパイクを示し、黒色の小さい矢印は、最初のバーストを示す。  （ｄ、ｅ）ＰＴＺ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）によって誘導されたてんかん様スパイク（ｄ）またはてんかん様バースト（ｅ）の潜時を延長させることにおける、ＮａＧｃＡの用量依存的効果を示す棒グラフ。  （ｆ）ＰＴＺ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）によって誘導された行動発作スコアに対するＮａＧｃＡの軽度の阻害効果を示す棒グラフ。  （ｇ）ＮａＧｃＡが発作行動（Ｒａｃｉｎｅスコア３およびそれよりも上）の潜時を用量依存的に延長させたことを示す棒グラフ。
【図９】図９は、以下の種々のクロライドイオンチャネル阻害剤の効果を示す例示的なデータを示す：  （ａ）ニフルミン酸（ＮＦＡ）（１００μＭ）  （ｂ）フルフェナム酸（１００μＭ）  （ｃ）ＤＩＤＳ（１００μＭ）  （ｄ）ＮＰＰＢ（１００μＭ）。
【図１０】図１０は、新生仔海馬スライスにおけるてんかん活動に対する、以下の種々のクロライドイオンチャネル阻害剤の効果を示す例示的なデータを示す：  （ａ）グルコン酸ナトリウム（２０ｍＭ）（ＮａＧｃＡ）  （ｂ）ＮＦＡ（１００μｍ）  （ｃ）ＮＰＰＢ（１００μｍ）
【図１１−１】図１１は、ＣＬＣ−３チャネル媒介性Ｃｌ−電流の発生的変化を示す例示的なデータを示す。  図１１Ａ：異なる齢の動物において取得したマウス海馬スライス由来のＣＡ３錐体ニューロンにおいて記録された代表的なＣｌ−電流（上の列、黒色トレース）。中央の列の緑色のトレースは、２０ｍＭのＮａＧｃＡによる阻害後のＣｌ−電流を示す。下の列は、異なる齢のマウスにおける、対照中およびＮａＧｃＡ処理後のＣｌ−電流のＩ−Ｖ曲線を示す。  図１１Ｂ：対照中（黒色）またはＮａＧｃＡ処理後（緑色）の定量化されたＣｌ−電流密度（ＨＰ＝＋９０ｍＶ）。成体動物におけるＣｌ−電流密度の有意な減少に留意のこと。＊＊＊Ｐ＜０．００１。  図１１Ｃ：Ｃｌ−電流に対するＮａＧｃＡ阻害の用量応答曲線。  図１１Ｄ：対照（黒色）、抗ＣＬＣ−３抗体（オレンジ色）または事前吸収させた対照抗体（灰色）下で記録した典型的なＣｌ−電流トレース。抗ＣＬＣ−３抗体透析後のＣｌ−電流の際立つ低減を示すＩ−Ｖ曲線（オレンジ色）。  図１１Ｅ：ＣＬＣ−３ノックアウトマウスにおけるＣＬＣ−３シグナルの欠如を確認する免疫染色。スケールバー、１０μｍ。  図１１Ｆ：電位依存的外向き整流Ｃｌ−電流は、ＣＬＣ−３  ＫＯマウスではほとんど存在せず、これは、ＣＬＣ−３チャネルがＣｌ−電流を媒介することを支持している。  図１１Ｇ：ＣＬＣ−３  ＫＯマウスにおける残存する小さいＣｌ−電流に対するＮａＧｃＡの阻害がほとんどないことを示すＩ−Ｖ曲線。これは、ＮａＧｃＡがＣＬＣ−３チャネルの阻害剤であることを支持している。  図１１Ｈ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルの発現。スケールバー、４０μｍ。  図１１Ｉ：ＣＬＣ−３チャネルを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から記録された大きいＣｌ−電流（下の列）。２０ｍＭのＮａＧｃＡの適用は、ＣＬＣ−３チャネル媒介性Ｃｌ−電流（緑色トレース）を顕著に阻害した。  図１１Ｊ：ＣＬＣ−３チャネル媒介性Ｃｌ−電流のＮａＧｃＡ阻害を示すＩ−Ｖ曲線（ＣＬＣ−３、９２５±１２４ｐＡ、ｎ＝７；ＣＬＣ−３＋ＮａＧｃＡ、５４４±５９ｐＡ、ｎ＝７；Ｐ＜０．００４、対応のあるｔ検定；ＨＰ＝＋９０ｍＶ）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１１−４】同上。
【図１１−５】同上。
【図１１−６】同上。
【図１２−１】図１２は、ＣＬＣ−３クロライドチャネルと新生仔てんかん発生との間の関連性を示す例示的なデータを示す。  図１２Ａ：０  Ｍｇ２＋人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中でのてんかん様活動の誘導（１時間）後の海馬ＣＡ３ニューロンにおけるＣＬＣ−３チャネル発現（赤色）の上方調節。スケールバー＝５μｍ。  図１２Ｂ：対照および０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦにおける定量化されたＣＬＣ−３免疫強度（対照、ｎ＝４匹の仔からの１０個のスライス；０  Ｍｇ２＋、ｎ＝４匹の仔からの１１個のスライス；ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。  図１２Ｃおよび１２Ｄ：ウエスタンブロット解析もまた、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによる処理後の海馬におけるＣＬＣ−３タンパク質レベルの有意な増加を示した（ｎ＝両方の群について６匹の仔、ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。  図１２Ｅ：対照、０  Ｍｇ２＋（１時間）および０  Ｍｇ２＋＋２０ｍＭのＮａＧｃＡ（１時間）条件における代表的な電位依存的Ｃｌ−電流トレース。  図１２Ｆ：０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ群における外向き整流Ｃｌ−電流の有意な増加（赤色）およびＮａＧｃＡによる際立つ阻害（緑色）を示すＩ−Ｖ曲線。  図１２Ｇ：新生仔マウス（出生後７日、Ｐ７）の海馬スライス中のＣＡ３錐体層における、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導されたてんかん様活動、および２０ｍＭのＮａＧｃＡによるその強い阻害を示す細胞外フィールド電位記録。  図１２Ｈ：ＮａＧｃＡ適用の前（赤色）、その間（緑色）およびその後（黒色）のてんかん様活動（５分間の時間ウインドウ）のパワースペクトル。パワーの振幅（パワースペクトルトレース下の積分面積）は、ＮａＧｃＡ適用後に顕著に低減された。  図１２Ｉおよび１２Ｊ：ＮａＧｃＡは、Ｐ１２海馬スライスにおいても、抗てんかん様活性の強い有効性を示した。  図１２Ｋおよび１２Ｌ：しかし、Ｐ２６海馬スライスでは、ＮａＧｃＡは、てんかん様活動に対する中程度の効果のみを示した。  図１２Ｍ：０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導されたてんかん様活動に対するＮａＧｃＡ阻害の時間経過を示す標準化されたパワー。ＮａＧｃＡは、Ｐ６〜８およびＰ１０〜１２群においててんかん様活動のパワーを劇的に低減させたが、Ｐ２１〜３３群ではかなり低い阻害を有した。対照として、灰色の線は、新生仔（Ｐ８〜１２）てんかん様活動に対する２０ｍＭのＮａＣｌの効果を示す。  図１２Ｎおよび１２Ｏ：ＷＴ、ＷＴ＋２０ｍＭのＮａＧｃＡ、およびＣＬＣ−３  ＫＯマウス（全てＰ８〜１２で）由来の海馬スライスにおける、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導されたてんかん様活動の代表的なトレース。てんかん様活動は、ＣＬＣ−３  ＫＯマウスでは長期にわたっては持続しなかったことに留意されたい。  図１２Ｐ：ＷＴ、ＷＴ＋２０ｍＭのＮａＧｃＡ、およびＣＬＣ−３  ＫＯマウス由来の海馬スライスにおける、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導されたバースト潜時（左パネル）およびバースト周波数（右パネル）を示すまとめられたデータ。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１２−４】同上。
【図１２−５】同上。
【図１２−６】同上。
【図１２−７】同上。
【図１２−８】同上。
【図１３−１】図１３は、新生仔海馬スライスにおける種々のてんかんモデルにおけるＮａＧｃＡの広い抗てんかん効果を示す例示的なデータを示す。  図１３Ａ：新生仔海馬スライスのＣＡ３錐体細胞層における、５０μＭの４−ＡＰによって誘導されたてんかん活動、およびＮａＧｃＡ（２０ｍＭ）によるその阻害を示す、細胞外フィールド電位記録。  図１３Ｂ：ＮａＧｃＡ適用の前（赤色）、その間（緑色）およびその後（黒色）の、５分間の時間ウインドウにおけるてんかん活動のパワースペクトル。ＮａＧｃＡ（緑色）は、パワー振幅を顕著に低減させたことに留意されたい。  図１３Ｃ：４−ＡＰによって誘導されたてんかん活動に対するＮａＧｃＡの阻害の時間経過を示す標準化されたパワー。  図１３Ｄ：ＮａＧｃＡ（２０ｍＭ）は、新生仔海馬スライスにおける高Ｋ＋てんかんモデルにおいて、てんかん様活動を際立って抑制した。  図１３Ｅ：ＮａＧｃＡ適用の間のてんかん活動の顕著な低減を示すパワースペクトル。  図１３Ｆ：高Ｋ＋ａＣＳＦによって誘導されたてんかん活動に対するＮａＧｃＡ阻害の時間経過を示す標準化されたパワー。  図１３Ｃおよび１３Ｆ中の灰色の線は、新生仔（Ｐ８〜１２）てんかん様活動に対する２０ｍＭのＮａＣｌ対照の効果を示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【図１４−１】図１４は、ＣＬＣ−３チャネル遮断剤グルコネートが新生仔発作活動をｉｎ  ｖｉｖｏで強力に阻害することを示す例示的なデータを示す。  図１４Ａ：１０分間隔での食塩水注射（０．１ｍｌ／１０ｇ、ｉ．ｐ．）が後に続くＫＡ注射（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）後の、Ｐ１２ラットからの再発性てんかんバースト放電を示す代表的なＥＥＧトレース。  図１４Ｂ：図１４Ａ中の囲み枠からのてんかんバースト放電の拡大図。  図１４Ｃおよび１４Ｄ：ＫＡ注射（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の１０分後のＮａＧｃＡ注射（２ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）が、てんかんバースト放電を顕著に阻害したことを示す代表的なＥＥＧトレース（Ｐ１２ラット）。  図１４Ｅおよび１４Ｆ：新生仔ラット（Ｐ１２）におけるてんかんバースト活動に対するフェノバルビタール（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の中程度の効果を示す代表的なＥＥＧトレース。  図１４Ｇおよび１４Ｈ：新生仔ラット（Ｐ１２）におけるてんかんバースト活動に対するブメタニド（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の効果を示す代表的なＥＥＧトレース。  図１４Ｉ、１４Ｊ、１４Ｋおよび１４Ｌ：成体マウスでも、ＫＡ注射（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は、ＥＥＧ記録に示されるように、ロバストなてんかんバースト活動を誘導したが（１４Ｉおよび１４Ｊ）、ＮａＧｃＡ（２ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は、ＫＡ誘導性てんかんバースト活動に対して中程度の効果のみを示した（１４Ｋおよび１４Ｌ）。  図１４Ｍ：食塩水（黒色）、ＮａＧｃＡ（緑色）、フェノバルビタール（マゼンタ色）またはブメタニド（青色）の注射が後に続く、ＫＡ注射の前および後の、平均ＥＥＧパワー（５分間の時間ウインドウ）を示す、新生仔動物におけるまとめられたデータ。ＮａＧｃＡがＫＡによって誘導されたＥＥＧ増加のパワーを強力に阻害したことに留意されたい。  図１４Ｎ：成体動物では、ＮａＧｃＡ（緑色）は、ＫＡによって誘導されたＥＥＧのパワーを中程度に阻害した。  図１４Ｍおよび１４Ｎの両方において、黒色の矢頭は、ＫＡ注射を示し、赤色の矢頭は、薬物注射を示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図１４−２】同上。
【図１４−３】同上。
【図１５−１】図１５は、新生仔ラットにおけるＫＡ誘導性てんかん活動に対するＮａＧｃＡの急性効果を示す例示的なデータを示す。  図１５Ａ：ｉ．ｐ．注射を介してＫＡによって誘導された典型的なてんかんＥＥＧ活動。安定なてんかん活動が記録された後（約１時間）、ＮａＧｃＡ（２ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）をラットに投与した（緑色）。てんかん活動がＮａＧｃＡ注射後に徐々に低減されたことに留意されたい。  図１５Ｂ：ロバストなてんかんバースト活動を示す、図１５Ａ中のひと区分からの拡大されたトレース。  図１５Ｃ：図１５Ａ中のＮａＧｃＡ注射後のＥＥＧ記録の拡大図。  図１５Ｄ：再発性バースト活動を示す、図１５Ｂ中のひと区分からのさらなる拡大図。  図１５Ｅ：ＮａＧｃＡによるてんかん活動の顕著な阻害を示す、図１５Ｃ中のＮａＧｃＡ注射後のＥＥＧのさらなる拡大図。  図１５Ｆ：ＮａＧｃＡ適用（２ｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、ｎ＝６、Ｐ１０〜１２ラット、緑色）によって有意に低減されたてんかんバースト活動のパワーを示す、まとめられたデータ。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図１５−２】同上。
【図１６−１】図１６は、ＣＬＣ−３チャネルの活性化が発生中のニューロンにおいて細胞内Ｃｌ−恒常性を変更することを示す例示的なデータを示す。  図１６Ａ：新生仔ＣＡ３錐体ニューロンにおいて０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導されたてんかん様バースト活動は、長期持続性の膜脱分極を示した。  図１６Ｂ：てんかん様バースト活動に似た長期持続性の膜脱分極パルス（４０ｍＶ、１０秒）は、グラミシジン穿孔ホールセル記録下で、ＧＡＢＡＡ−Ｒアゴニストイソグバシン（１００μＭ）によって誘導されたＧＡＢＡＡ−Ｒ電流を顕著に増強した。かかる脱分極誘導性増強は、ＣＬＣ−３  ＫＯマウスには存在せず、ＣＬＣ−３チャネル遮断剤ＮａＧｃＡ（２０ｍＭ）によって強く阻害された。  図１６Ｃ：ＷＴ、ＣＬＣ−３  ＫＯおよびＷＴ＋ＮａＧｃＡ群におけるＧＡＢＡＡ−Ｒ電流に対する膜脱分極の効果の、まとめられたデータ。  図１６Ｄ：グラミシジン穿孔記録は、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ中でのてんかん様活動の誘導後の、ＣＡ３ニューロンにおけるＧＡＢＡＡ−Ｒ逆転電位（ＥＧＡＢＡ）における正のシフトを明らかにした。  図１６Ｅ：ＮＫＣＣ１阻害剤ブメタニドのバス適用は、正常ａＣＳＦ中でのＥＧＡＢＡにおける負のシフトを誘導したが、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導されたＥＧＡＢＡの正のシフトを無効にしなかった。  図１６Ｆ：ＫＣＣ２阻害剤ＶＵ０２４０５５１は、正常ａＣＳＦ下ではＥＧＡＢＡに対して効果を有さず、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導された正のシフトに対して効果を示さなかった。  図１６Ｇ：ＮａＧｃＡは、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導された正のＥＧＡＢＡシフトを完全に無効にする。グルコネート自体は、正常ａＣＳＦにおいてＥＧＡＢＡに全く影響を与えなかった。  図１６Ｈ：ＣＬＣ−３  ＫＯマウスでは、ＥＧＡＢＡは、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦで処理した場合にも変化しなかった。  図１６Ｉ：新生仔ＣＡ３錐体ニューロン（例えば、Ｐ８〜９）における種々の条件下でのＥＧＡＢＡ変化を示す、定量化されたデータ。  図１６Ｊ：成体ＣＡ３錐体ニューロンにおけるＥＧＡＢＡ変化を示す棒グラフ。ＮａＧｃＡ（２０ｍＭ）が成体動物においてＥＧＡＢＡシフトを変化させなかったことに留意されたい。  図１６Ｋ：新生仔動物（例えば、Ｐ８〜９）における異なる群においてイソグバシン（１０μＭ、３０秒）によって誘導されたスパイク活動を示すセルアタッチ記録の典型的なトレース。  図１６Ｌ：イソグバシンによって興奮させられたニューロンのパーセンテージを示す、まとめられたデータ。ＮａＧｃＡが、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦにおけるＧＡＢＡ興奮性活動を本質的に無効にしたことに留意されたい。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１６−４】同上。
【図１６−５】同上。
【図１７】図１７は、種々の対イオンと錯体化したグルコン酸が、Ｐ８〜１２新生仔マウスにおいてＣｌ−電流を阻害することを示す例示的なデータを示す。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。  図１７Ａ：新生仔ＣＡ３錐体ニューロンにおける外向き整流Ｃｌ−電流の代表的なトレース（黒色、ｎ＝１２）。  図１７Ｂ：２０ｍＭのＮａＧｃＡの存在下でのＣｌ−電流の典型的なトレース（緑色、ｎ＝７）。  図１７Ｃ：１０ｍＭのＭｇ（ＧｃＡ）２の存在下でのＣｌ−電流の典型的なトレース。  図１７Ｄ：２０ｍＭのグルコン酸の存在下でのＣｌ−電流の典型的なトレース（青色、ｎ＝６）。  図１７Ｅ：Ｉ−Ｖプロットは、グルコン酸およびその塩のバス適用後のＣｌ−電流密度の際立つ低減を示した。
【図１８】図１８は、新生仔海馬スライスにおけるてんかん様活動がグルコースオキシダーゼによって強く阻害されることを示す例示的なデータを示す。  図１８Ａ：０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ（人工脳脊髄液、２０ｍＭのグルコースを伴う）によって誘導されたてんかん様活動に対するグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）の用量依存的急性効果。てんかん活動は、１Ｕ／ｍｌを超えるＧＯｘの急性適用によって有効に阻害されたことに留意されたい。  図１８Ｂ：高Ｋ＋によって誘導されたてんかん様活動も、１Ｕ／ｍｌのＧＯｘによって抑制された。
【図１９】図１９は、ａＣＳＦにおける延長されたインキュベーション後のてんかん様活動に対するグルコースオキシダーゼの増強された阻害を示す例示的なデータを示す。  図１９Ａ：てんかん様活動を、４ｍＭのグルコースと共に０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導した。０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ（４ｍＭのグルコース）中に１Ｕ／ｍｌのＧＯｘを添加し、室温で９０分間事前インキュベートした後、てんかん活動は、際立って阻害された。  図１９Ｂ．０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ（２０ｍＭのグルコース）中で９０分間事前インキュベートした０．１Ｕ／ｍｌのＧＯｘであっても、てんかん様活動がまた阻害された。
【図２０−１】図２０は、グルコースオキシダーゼがてんかん様活動を阻害する例示的なデータを示す。  図２０Ａ：海馬スライスにおけるてんかん様活動に対するＧＯｘの急性効果を試験するための実験設定。フィールド電位記録を、ＣＡ３錐体細胞層中に配置し、てんかん様活動を、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導した。安定なてんかん様活動を誘導した後、ＧＯｘを、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ中に添加した。  図２０Ｂ：０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ誘導性てんかん様活動に対する０．１Ｕ／ｍｌのＧＯｘの急性効果。  図２０Ｃ：０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ誘導性てんかん様活動に対する０．３Ｕ／ｍｌのＧＯｘの急性効果。  図２０Ｄ：０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ誘導性てんかん様活動に対する１Ｕ／ｍｌのＧＯｘの急性効果。  図２０Ｅ：０グルコース；０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ誘導性てんかん様活動に対する１Ｕ／ｍｌのＧＯｘの急性効果。グルコースを、５ｍＭラクテートおよび３ｍＭピルベートによって置き換えた。  図２０Ｆ：０．１Ｕ／ｍｌのＧＯｘを、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ中に添加し、室温で１時間を超えてインキュベートし、次いで、誘導されたてんかん様活動について評価した。  図２０Ｇ：異なる条件下でのフィールド電位パワーの相対的変化。グルコースをバスから除去した場合、てんかん様活動に対する１Ｕ／ｍｌのＧＯｘの阻害効果は、ほとんど排除されたことに留意されたい。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【図２１】図２１は、グルコースオキシダーゼが、ｉ）高Ｋ＋ａＣＳＦ；またはｉｉ）４−アミノピリジン（４−ＡＰ）+Ｍｇ２＋なしのａＣＳＦのいずれかによって誘導した場合のてんかん様活動を阻害することを示す例示的なデータを示す。  図２１Ａ：高Ｋ＋（８．５ｍＭ）ａＣＳＦによって誘導されたてんかん様活動は、１Ｕ／ｍｌのＧＯｘによって抑制された。  図２１Ｂ：１Ｕ／ｍｌのＧＯｘは、４−ＡＰ（５０μＭ）＋０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ誘導性てんかん様活動を阻害した。  図２１Ｃ：１Ｕ／ｍｌのＧＯｘの適用の前、その間およびその後の、高Ｋ＋ａＣＳＦ（紫色）または４−ＡＰ（５０μＭ）＋０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ（青色）によって誘導された標準化されたてんかん様活動パワー。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、神経学的障害の分野に関する。特に、筋強直間代性痙攣、てんかん、ジャクソン障害および／または不随意振戦が含まれるがこれらに限定されない痙攣性障害の予防および処置である。例えば、一部の実施形態は、新生児および／または乳児において痙攣性障害を処置および予防することに関する。グルコネート組成物は、新生児および／または乳児において痙攣性障害を処置および／または予防するのに選択的に有効であることが見出されている。
【００４２】
新生仔発作は、成体てんかんと比較して処置が困難である。一実施形態では、本発明は、ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルを標的化することによって新生仔てんかんを強力に抑制する抗てんかん薬、グルコネートの使用を企図する。
【００４３】
グルコン酸は、グルコン酸マグネシウム、グルコン酸カルシウムまたはグルコン酸カリウムなどの塩形態で食品または薬物添加物としてしばしば使用される大きい有機アニオンであり、ここで、グルコネートは、イオンを送達するために使用された。しかし、グルコネート自体の機能的役割は、過去にはほとんど無視された。本明細書に提示されるデータは、グルコン酸自体がＣｌ−チャネル遮断剤として作用し、てんかん様活動を直接阻害することを示している。さらに、グルコネートは、新生仔発作を抑制するのに特に有効であり、その潜在力は、他の現在利用可能な抗てんかん薬よりも優れていることが示される。グルコネートは、ヒトの食物摂取に安全であるので、この化合物は、新生仔てんかんの処置のための新たなプラットフォームを提示する。
【００４４】
グルコネートは、多くの医学的に使用される薬物においてアニオンとして広く使用されているが、不活性成分として表示される場合が多い。関連の研究文献では、グルコネート自体は、てんかんに直接関連付けられたことが決してなかったが、それは、これらの研究の具体的な目的が、カチオン、例えば、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋に焦点を当てていたからである。例えば、１つの症例研究は、てんかん患者をグルコン酸Ｃａで処置したところ、引き続いて、てんかん引き付けが弱まったことを報告した。Boulenguez  et  al.,  “Down-regulation  of  the  potassium-chloride  cotransporter  KCC2  contributes  to  spasticity  after  spinal  cord  injury”  Nature  Medicine  16:302-307  (2010)。この解析は、グルコネートの可能な役割に全く言及せずに、軽快効果をＣａ２＋に帰した。グルコン酸マグネシウムが抗てんかん効果を有し得るという他の観察は、Ｍｇ２＋の機能に起因すると示唆されてきた。
【００４５】
本明細書に提示されるデータは、これらの抗てんかん組成物中の活性成分が、二価カチオンではなくグルコネートである可能性がより高いことを示唆している。グルコネートは、グルコースの酸化から生成され得、従って、果実および蜂蜜などの天然食品製品中に豊富であり得る。Anastassiadis  et  al.,  “Gluconic  acid  production”  Recent  Patents  On  Biotechnology  1:167-180  (2007)。一実施形態では、本発明は、グルコネートが抗てんかん効果を有し、てんかんのためのある特定の伝統的な食餌処置を支持し得ることを企図する。
【００４６】
ＣＬＣ−３チャネルは、ＣＬＣスーパーファミリーに属する電位開口型外向き整流Ｃｌ−チャネルである。以前の研究は、ＣＬＣ−３チャネルが、エンドソーム酸性化、シナプス前性神経伝達物質蓄積、インスリン分泌およびグリオーマ細胞増殖の調節にとって重要であることを示している。Hara-Chikuma  et  al.,  “ClC-3  chloride  channels  facilitate  endosomal  acidification  and  chloride  accumulation”  The  Journal  Of  Biological  Chemistry  280:1241-1247  (2005)；Riazanski  et  al.,  “Presynaptic  CLC-3  determines  quantal  size  of  inhibitory  transmission  in  the  hippocampus”  Nature  Neuroscience  14:487-494  (2011)；Deriy  et  al.,  “The  granular  chloride  channel  ClC-3  is  permissive  for  insulin  secretion”  Cell  Metabolism  10:316-323  (2009):  Li  et  al.,  “Suppression  of  sulfonylurea-  and  glucose-induced  insulin  secretion  in  vitro  and  in  vivo  in  mice  lacking  the  chloride  transport  protein  ClC-3”  Cell  Metabolism  10:309-315  (2009)；Cuddapah  et  al.,  “Bradykinin-induced  chemotaxis  of  human  gliomas  requires  the  activation  of  KCa3.1  and  ClC-3”  The  Journal  Of  Neuroscience  :  The  official  journal  of  the  Society  for  Neuroscience  33:1427-1440  (2013)；およびHabela  et  al.,  “ClC3  is  a  critical  regulator  of  the  cell  cycle  in  normal  and  malignant  glial  cells”  The  Journal  Of  Neuroscience:  the  official  journal  of  the  Society  for  Neuroscience  28:9205-9217  (2008)。
【００４７】
発明の機構を理解することは必要ではないが、ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルは、初期出生後脳では突出するが成体脳ではほとんど消失する、大きい外向き整流Ｃｌ−電流を媒介すると考えられる。結果的に、グルコネートは、新生仔てんかんの処置のためのより強力な抗てんかん薬である。てんかん発生の間のＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルの活性化は、細胞内Ｃｌ−恒常性を変更させ、ＧＡＢＡ機能をより興奮性にするとさらに考えられる。さらに、本明細書に提示されるデータは、ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルが、新生仔てんかんにおいて、以前に考えられたＣｌ−トランスポーターよりも大きい役割を果たし得ることを示している。実際、Ｃｌ−チャネルおよびＣｌ−トランスポーターは、電位依存性におけるそれらの差異に起因して、細胞内Ｃｌ−恒常性を制御する際に異なる役割を果たし得る。例えば、静止条件では、電位感受性ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルは不活性であり、従って、Ｃｌ−トランスポーター、例えばＮＫＣＣ１は、発生中のニューロンにおいて細胞内Ｃｌ−恒常性を維持する主要なプレーヤーである。Ben-Ari,  Y.,  “Excitatory  actions  of  gaba  during  development:  the  nature  of  the  nurture”  Nature  Reviews.  Neuroscience  3:728-739  (2002)；Kaila  et  al.,  “Cation-chloride  cotransporters  in  neuronal  development,  plasticity  and  disease”  Nature  Reviews.  Neuroscience  15:637-654  (2014)；およびBlaesse  et  al.,  “Cation-chloride  cotransporters  and  neuronal  function”  Neuron  61:820-838  (2009)。
【００４８】
しかし、てんかん発生の間、ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルは活性化され、大きいＣｌ−流入［Ｃｌ−］ｉが顕著に増加し、増強された興奮性ＧＡＢＡ作動性伝達および悪化したてんかん活動を生じる。一部の実施形態では、本発明は、ＣＬＣ−３チャネルをグルコネートで遮断することで、この正のループを破壊し、発生中の脳における新生仔てんかんを阻害することを企図する。さらに、ＣＬＣ−３ノックアウトマウスは、大きい外向き整流Ｃｌ−電流を有さず、結果的に、再発性バースト活動は、顕著に弱められる。
【００４９】
グルコネートを他の潜在的な抗てんかん薬（ＡＥＤ）と比較することによって、本明細書に提示されるデータは、グルコネートが、新生仔てんかんを抑制するにあたりフェノバルビタールまたはブメタニドよりも強力であることを示している。グルコネートは、静止条件下でＮＫＣＣ１を遮断しＥＧＡＢＡに影響を与えるブメタニドとは異なる形で作用するが、その一方で、グルコネートは、生理的条件下では、正常なＥＧＡＢＡに影響を与えないが、てんかん発生の間のＣＬＣ−３チャネル活性化を遮断する。
【００５０】
グルコネートは天然の有機酸であるので、最小の副作用で食品および薬物添加物として既に使用されている。一実施形態では、本発明は、グルコネート組成物が、二価カチオンの非存在下で、多くの現在の抗痙攣薬に対して抵抗性である新生仔てんかんの処置のために使用され得る治療薬であることを企図する。
【００５１】
Ｉ．痙攣性障害
痙攣という用語は、発作と相互交換可能に使用される場合が多い。痙攣は、人の身体が迅速にかつ制御されずに震える際に生じる。痙攣の間、人の筋肉は、反復して収縮および弛緩する。多くの異なる型の発作が存在する。一部は、震えを伴わない軽度の症状を有する。一部の発作は、人に意識障害（ｓｔａｒｉｎｇ  ｓｐｅｌｌｓ）を有させるだけである。これらは、気づかれないままの場合がある。痙攣の具体的な症状は、脳のどの部分が関与するかに依存し得る。症状は通常、突然生じ、これには、以下が含まれ得るがこれらに限定されない：短時間のブラックアウトとその後の錯乱の期間（この人は、短時間記憶していることができない）；行動における変化、例えば、人の服をいじる；よだれを垂らすまたは口から泡を吹く；眼の動き；唸り声をあげるおよび鼻を鳴らす；膀胱または腸の制御の喪失；気分の変化、例えば、突然の怒り、説明のつかない恐れ、パニック、歓喜または笑い；全身の震え；突然の転倒、苦味または金属風味の感覚；歯の食いしばり；呼吸における一時的な停止、ならびに／またはピクピクするおよび引き付けを起こす四肢を伴う制御不能な筋肉けいれん。症状は、数秒もしくは数分後に停止し得る、または最大で１５分間にわたって継続し得るが、まれに、より長く継続し得る。
【００５２】
てんかん発作は、脳回路の過剰興奮によって引き起こされる場合が多く、これは、成体脳における主要な阻害性受容体ファミリーであるＧＡＢＡＡ受容体（ＧＡＢＡＡ−Ｒ）をブーストさせることによって阻害され得る。従って、成人患者に対して広く標的化されるベンゾジアゼピンおよびバルビツレート薬物などの抗てんかん薬（ＡＥＤ）が、ＧＡＢＡＡ−Ｒ機能を増加させるためにしばしば開発される。Bialer  et  al.,  “Key  factors  in  the  discovery  and  development  of  new  antiepileptic  drugs.  Nature  reviews.  Drug  discovery  9,  68-82  (2010)。しかし、ＧＡＢＡＡ−Ｒは、成体脳では主に阻害性であるが、ＧＡＢＡＡ−Ｒは、新生児および／または乳児の発生中の脳では主に興奮性である。Chen  et  al.,  “Excitatory  actions  of  GABA  in  developing  rat  hypothalamic  neurones”  The  Journal  Of  Physiology  494(Pt  2):451-464  (1996)；およびBen-Ari  Y.,  “Excitatory  actions  of  gaba  during  development:  the  nature  of  the  nurture”  Nature  Reviews  Neuroscience  3:728-739  (2002)。発生中の脳における興奮性ＧＡＢＡ作動性伝達は、新生仔発作を制御するのにＧＡＢＡアゴニストがしばしば無効であり、ときおり新生仔発作活動を悪化させることさえあり得る理由もまた説明する。Farwell  et  al.,  “Phenobarbital  for  febrile  seizures--effects  on  intelligence  and  on  seizure  recurrence”  The  New  England  Journal  Of  Medicine  322:364-369  (1990)。従って、一部のＡＥＤは、発生中の脳における興奮性ＧＡＢＡＡ−Ｒ機能を増強することによって、新生仔発作を潜在的に悪化させ得る。
【００５３】
古典的に、発生中のニューロンにおけるＧＡＢＡＡ−Ｒの興奮性機能は、クロライドイオン（Ｃｌ−）トランスポーターＮＫＣＣ１およびＫＣＣ２による調節に帰せられてきた。Ben-Ari  et  al.,  “GABA:  a  pioneer  transmitter  that  excites  immature  neurons  and  generates  primitive  oscillations”  Physiol  Rev  87:1215-1284  (2007)；Kahle  et  al.,  “Roles  of  the  cation-chloride  cotransporters  in  neurological  disease”  Nat  Clin  Pract  Neurol  4:490-503  (2008)；およびKaila  et  al.,  “Cation-chloride  cotransporters  in  neuronal  development,  plasticity  and  disease”  Nature  Reviews.  Neuroscience  15:637-654  (2014)。以前の研究は、ＮＫＣＣ１が、げっ歯類動物において新生仔発作を促進し得ることを見出した。Dzhala  et  al.,  “NKCC1  transporter  facilitates  seizures  in  the  developing  brain”  Nature  Medicine  11:1205-1213  (2005)。しかし、乳児における最近の臨床試験は、ＮＫＣＣ１遮断剤ブメタニドの重症な副作用、および新生仔発作を処置するのに非常に限定的な有効性を見出した。Pressler  et  al.,  “Bumetanide  for  the  treatment  of  seizures  in  newborn  babies  with  hypoxic  ischaemic  encephalopathy  (NEMO):  an  open-label,  dose  finding,  and  feasibility  phase  1/2  trial”  Lancet  Neurol  14:469-477  (2015)。興奮性ＧＡＢＡ作動性伝達は、多くの神経発生プロセスにおいて基礎的な役割を果たすので、ＮＫＣＣ１を遮断することは、生理的条件下でＧＡＢＡ機能を顕著に変更させ得、正常な脳発生を破壊する潜在的なリスクを生じ得る。Ben-Ari,  Y.,  “Excitatory  actions  of  gaba  during  development:  the  nature  of  the  nurture”  Nature  reviews.  Neuroscience  3:728-739  (2002)；Kaila  et  al.,  “Cation-chloride  cotransporters  in  neuronal  development,  plasticity  and  disease”  Nature  reviews.  Neuroscience  15:637-654  (2014)；Wang  et  al.,  “Blocking  early  GABA  depolarization  with  bumetanide  results  in  permanent  alterations  in  cortical  circuits  and  sensorimotor  gating  deficits”  Cerebral  cortex  21:574-587  (2011)；およびDeidda  et  al.,  “Early  depolarizing  GABA  controls  critical-period  plasticity  in  the  rat  visual  cortex”  Nature  neuroscience  18:87-96  (2015)。より最近の研究は、Ｃｌ−コトランスポーター以外の因子、例えば、不透過アニオン、電位開口型内向き整流クロライドチャネルＣＬＣ−２および電位開口型外向き整流クロライドチャネルＣＬＣ−３もまた、Ｃｌ−恒常性に寄与し得ることを示唆している。Glykys  et  al.,  “Local  impermeant  anions  establish  the  neuronal  chloride  concentration”  Science  343:670-675  (2014)；Foldy  et  al.,  “Regulation  of  fast-spiking  basket  cell  synapses  by  the  chloride  channel  ClC-2”  Nature  neuroscience  13:1047-1049  (2010)；Rinke  et  al.,  “ClC-2  voltage-gated  channels  constitute  part  of  the  background  conductance  and  assist  chloride  extrusion”  The  Journal  of  neuroscience:  the  official  journal  of  the  Society  for  Neuroscience  30:4776-4786  (2010)；Kawasaki  et  al.,  “Cloning  and  expression  of  a  protein  kinase  C-regulated  chloride  channel  abundantly  expressed  in  rat  brain  neuronal  cells”  Neuron  12:597-604  (1994)；およびWang  et  al.,  “CLC-3  channels  modulate  excitatory  synaptic  transmission  in  hippocampal  neurons”  Neuron  52:321-333  (2006)。
【００５４】
最近の研究は、Ｃｌ−チャネル、例えばＣＬＣ−３チャネルもまた、細胞内Ｃｌ−濃度（［Ｃｌ−］ｉ）の変化に寄与し得ることを示唆している。Zhou  et  al.,  “Regulation  of  intracellular  Cl-  concentration  through  volume-regulated  ClC-3  chloride  channels  in  A10  vascular  smooth  muscle  cells”  The  Journal  Of  Biological  Chemistry  280:7301-7308  (2005)。ＣＬＣ−３チャネルは、電位依存的外向き整流Ｃｌ−チャネルのサブファミリーに属する。Jentsch  T.  J.,  “Chloride  and  the  endosomal-lysosomal  pathway:  emerging  roles  of  CLC  chloride  transporters”  The  Journal  of  Physiology  578:633-640  (2007)；Graves  et  al.,  “The  Cl-/H+  antiporter  ClC-7  is  the  primary  chloride  permeation  pathway  in  lysosomes”  Nature  453:788-792  (2008)；Picollo  et  al.,  “Chloride/proton  antiporter  activity  of  mammalian  CLC  proteins  ClC-4  and  ClC-5”  Nature  436:420-423  (2005)；Scheel  et  al.,  “Voltage-dependent  electrogenic  chloride/proton  exchange  by  endosomal  CLC  proteins”  Nature  436:424-427  (2005)；およびHara-Chikuma  et  al.,  “ClC-3  chloride  channels  facilitate  endosomal  acidification  and  chloride  accumulation”  The  Journal  Of  Biological  Chemistry  280:1241-1247  (2005)。ＣＬＣ−３チャネルは、海馬および小脳における高い発現レベルを伴って、脳の至る所で遍在的に発現される。Duran  et  al.,  “Chloride  channels:  often  enigmatic,  rarely  predictable”  Annual  Review  Of  Physiology  72:95-121  (2010)；Verkman  et  al.,  “Chloride  channels  as  drug  targets”  Nature  Reviews.  Drug  discovery  8:153-171  (2009)；およびKawasaki  et  al.,  “Cloning  and  expression  of  a  protein  kinase  C-regulated  chloride  channel  abundantly  expressed  in  rat  brain  neuronal  cells”  Neuron  12:597-604  (1994)。例えば、ＣＬＣ−３ノックアウトマウスは、海馬において選択的な出生後神経変性を示す。Stobrawa  et  al.,  “Disruption  of  ClC-3,  a  chloride  channel  expressed  on  synaptic  vesicles,  leads  to  a  loss  of  the  hippocampus”  Neuron  29:185-196  (2001)；およびDickerson  et  al.,  “Altered  GABAergic  function  accompanies  hippocampal  degeneration  in  mice  lacking  ClC-3  voltage-gated  chloride  channels”  Brain  Research  958:227-250  (2002)。しかし、てんかん発生の間の電位依存的Ｃｌ−チャネルの正確な役割は、ほとんど未知である。
【００５５】
新生仔発作は、成体てんかんと比較して処置が困難である。新生仔発作は、成体発作とは異なり、成体において有効な多くの抗てんかん薬（ＡＥＤ）が、新生仔発作を処置することにしばしば失敗する。例えば、本明細書に提示されるデータは、発生中の初期脳には存在するが成体脳には存在しないＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルによって媒介される大きい電位依存的外向き整流Ｃｌ−電流を示している。発明の機構を理解することは必要ではないが、天然に存在する有機酸であるグルコネートは、ＣＬＣ−３クロライドチャネルを遮断することによって、新生仔発作を強力に阻害すると考えられる。
【００５６】
興味深いことに、ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルは、てんかん発生の間に上方調節され得、グルコネートによるＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルの阻害は、他のＡＥＤと比較して顕著に改善された潜在力で、新生仔発作活動を本質的に無効にする。この結果は、ＣＬＣ−３ノックアウトマウスが発生中の脳において外向き整流Ｃｌ−電流を有さず、低減された再発性てんかん様活動を示すという観察によって、説明され得ると考えられる。発明の機構を理解することは必要ではないが、てんかん発生の間のＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルの活性化は、細胞内Ｃｌ−恒常性を顕著に変更し、ＧＡＢＡ興奮性機能を増強すると考えられ、これは、他のＣｌ−モジュレーターでも観察された効果である。本明細書に提示されるデータは、グルコネートを、ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルを阻害することを介して新生仔発作を処置する強力な抗てんかん薬として同定している。本明細書に記載される一部の実施形態では、新生仔発作を抑制するにあたり特に強力な抗てんかん薬であるグルコン酸が同定される。
【００５７】
ＩＩ．二価カチオンベースの痙攣性治療
低カルシウム血症に関連する痙攣を有する４〜７日齢の乳児への、グルコン酸カルシウム、硫酸マグネシウムまたはフェノバルビトン（ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔｏｎｅ）の投与が報告されている。３つ全ての組成物が、痙攣の率を低減させるようであり、処置内比較は、硫酸マグネシウムが、グルコン酸カルシウムまたはフェノバルビトンのいずれよりも有効であったことを示した。しかし、参考文献は、カチオンベースの治療を必要としない乳児におけるグルコネート組成物の有効性に関して、いずれの開示も提供していない。Turner,  T.,  “Comparisons  of  phenobarbitone,  magnesium  sulphate,  and  calcium  gluconate  in  treatment  of  neonatal  hypocalcaemic  convulsions”  Paediatric  Research  Society  Abstracts,  pg  244。
【００５８】
痙攣の管理のための、２０日未満の乳児へのグルコン酸カルシウムの投与が報告されている。この処置に引き続いて、左脚は、腫脹を受け、炎症、骨外（extraosseus）石灰化および血清カルシウムレベルは、正常範囲内であると決定された。これらの症状は、医原性皮膚石灰沈着症の診断によるグルコン酸カルシウム処置の休止後に軽減された。しかし、参考文献は、二価カチオンベースの治療、例えばカルシウムを必要としない乳児におけるグルコネート組成物の有効性に関して、いずれの開示も提供していない。Arora  et  al.,  “Iatrogenic  calcinosis  cutis-a  rare  differential  diagnosis  of  soft-tissue  infection  in  a  neonate:  A  case  report”  Journal  of  Orthopaedic  Surgery  13(2):195-198  (2005)。
【００５９】
発作障害および／またはてんかんを処置するための植物抽出物の投与が報告されている。例えば、植物抽出物は、グルコネートの種々の製剤、例えば、グルコン酸カリウム、グルコン酸亜鉛および／またはグルコン酸銅と組み合わされ、公知のマウス電気ショッククローヌスモデルを使用して抗痙攣活性についてスクリーニングされている。さらに、市販の製品ＮｕｔｒｉｉＶｅｄａ（商標）が、発作および／またはてんかんを低減させるために、４．５歳〜３７歳の間の年齢範囲のヒト患者に投与された。しかし、ＮｕｔｒｉｉＶｅｄａ（商標）の詳細な組成解析は開示されておらず、従って、この製品中のグルコネートの正確な量および二価カチオンとのその関連性は未知であることに留意すべきである。しかし、参考文献は、二価カチオンベースの治療、例えば、カルシウムまたは亜鉛を必要としない乳児におけるグルコネート組成物の有効性に関して、いずれの開示も提供していない。Geng  L.、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」、米国特許第８，９６２，０４２号（参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６０】
低カルシウム血症、高リン血症および上昇した副甲状腺ホルモンに関連する早期発症型発作を有した新生児の症例が提示された。この乳児は、偽性副甲状腺機能低下症のいずれの標徴も有さなかった。低カルシウム血症は最初、カルシウム治療に対して抵抗性であったが、ビタミンＤアナログ治療に対して応答した。「新生仔偽性副甲状腺機能低下症」の診断が受け入れられた；この乳児は、３カ月間および８カ月間の追跡の間、正常な血清生化学で、安定で発作なしのままであった。Narang  et  al.,  “Neonatal  pseudohypoparathyroidism”  Indian  J  Pediatr.  73(1):97-98  (2006)；およびManzar  et  al.,  “Transient  pseudohypoparathyroidism  and  neonatal  seizure”  J  Trop  Pediatr.  47(2):113-114  (2001)。
【００６１】
カルシウムベースの痙攣治療の失敗は、９歳の時に全般性強直間代性発作を発症した患者に関して報告されており、これらは、低カルシウム血症に関連した。カルシウムによる処置にもかかわらず、発作は持続し、患者は、抗てんかん薬物療法を必要とした。彼女は、オクスカルバゼピンによって最終的に制御された。頭部のＭＲＩは正常であった。ＥＥＧは、独立したスパイクならびに左側頭領域および右前頭領域から発する波放電（ｗａｖｅ  ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）を示した。ＥＥＧ上の限局的知見の存在、カルシウム治療に対する完全奏効の欠如、および抗てんかん薬治療の必要性は、これらの患者の一部が、てんかんを固有に発症しやすい可能性があることを示している。Gonzalez  et  al.,  “Seizures  and  EEG  findings  in  an  adult  patient  with  DiGeorge  syndrome:  a  case  report  and  review  of  the  literature”  Seizure  18(9):648-651  (2009)。
【００６２】
低カルシウム血症は、比較的珍しいが、乳児および小児における左心室機能不全の可逆的な原因である。特発性低カルシウム血症を有する３０日齢の男児は、うっ血性心不全および痙攣性発作を呈した。彼は、根底にある心疾患の証拠は有さなかった。心不全は、カルシウム治療に応答した。低カルシウム血症は、乳児における左心室機能不全の可能な原因とみなされるべきであることが示唆される。Karademir  et  al.,  “Left  ventricular  dysfunction  due  to  hypocalcemia  in  a  neonate”  JPN  Heart  J.  34(3):355-359  (1993)。
【００６３】
上記のような報告は、グルコン酸二価カチオン治療を投与することの目的が、痙攣性障害を管理するための有効成分として二価カチオン（例えば、カルシウム、マグネシウム、亜鉛など）を提供することであることを、当業者に教示している。例えば、「低カルシウム血症」の状態は、痙攣状態の先行状態として記載されている。他方、カルシウム過剰は、痙攣処置の間に、グルコン酸カルシウムの処置に引き続いて経験される重篤な副作用を生じた。このように、これらの観察は、グルコン酸二価カチオン錯体を新生児に投与することの目的が、二価カチオン補充が痙攣管理のために必要とされ、グルコネートが単に適切な対イオンであったと考えられたからであることを教示している。結果的に、本発明は、グルコン酸二価カチオン組成物が、驚くべきことに、痙攣状態を処置するのにより有効であることを実証している。
【００６４】
ＩＩＩ．グルコネートベースの痙攣性治療
一実施形態では、本発明は、電位依存的ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルが、特に新生仔てんかんの間に、細胞内Ｃｌ−濃度（［Ｃｌ−］ｉ）を制御する際に役割を果たし得ることを企図する。例えば、ＣＬＣ−３チャネルは、成体脳ではなく新生仔脳において大きい電位依存的外向き整流Ｃｌ−電流を媒介し得るが、これは、グルコン酸によって阻害することができる。例えば、データは、グルコネートが、新生仔てんかん活動を強力に抑制し、成体動物では効果がより少なかったことを示している。さらに、ＣＬＣ−３ノックアウトマウスは、新生仔脳における電位依存的外向き整流Ｃｌ−電流の非存在、および低減された再発性てんかん活動を示した。ＥＥＧ記録もまた、グルコネートが、成体動物ではより有効性が低いが、新生仔動物において発作バースト活動を阻害するのにより有効であったことを確認した。最後に、新生仔てんかんの間に観察されたＣＬＣ−３チャネル活性化は、［Ｃｌ−］ｉを顕著に増加させたが、グルコネートを使用してＣＬＣ−３チャネルを遮断することは、［Ｃｌ−］ｉ蓄積を阻害した。一実施形態では、本発明は、グルコネート（天然の有機化学物質）が、有効なＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネル遮断剤であり、新生仔てんかんを処置するための抗痙攣薬として有効であり得ることを企図する。
【００６５】
グルコン酸は、グルコン酸マグネシウム、グルコン酸カルシウムまたはグルコン酸カリウムなどの塩形態で食品または薬物添加物としてしばしば使用される大きい有機アニオンであり、ここで、グルコネートは、カルシウムまたはマグネシウムまたはカリウムを送達することを助けるために使用された。しかし、グルコネート自体の機能的役割は、過去にはほとんど無視された。本明細書に提示されるデータは、グルコン酸自体がＣｌ−チャネル遮断剤として作用し、てんかん様活動を直接阻害することを実証している。一部の実施形態では、本発明は、グルコネートが、新生仔発作を抑制するのに特に有効であり、それによって、新生仔てんかんの処置のための選択的治療を提供することを提供する。
【００６６】
グルコネートは、以下の構造を有するアルカノイル有機化合物である：
【化１】
2021509671.tif 000003
【００６７】
種々のヒドロキシル基およびカルボン酸基が、官能化および／または誘導体化が可能な反応性の種を提供することに留意されたい。かかる反応性基は、置換または非置換のアリールまたはヘテロアリール、非置換または置換のＣ１〜Ｃ６−アルキル基、置換または非置換の５〜６員の飽和または不飽和の縮合環、置換または非置換の５〜６員の飽和または不飽和の環、天然アミノ酸残基または合成アミノ酸残基、トリハロメチル、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６−アルコキシ、ＮＨ２、ＳＨ、チオアルキル、アミノアシル、アミノカルボニル、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６−アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール、１〜３個のヘテロ原子を必要に応じて含む置換または非置換の４〜８員の環式アルキル、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アセトキシ、アミノアシル、スルホキシ、スルホニル、Ｃ１〜Ｃ６−チオアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６−脂肪族アルキル、１〜３個のヘテロ原子を必要に応じて含み、アリールまたはヘテロアリールと必要に応じて縮合される置換または非置換の飽和環式Ｃ４〜Ｃ８−アルキル；置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール（ここで、前記アリールまたはヘテロアリール基は、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６−アルキル、例えばトリハロメチル、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６−アルコキシ、置換または非置換のＣ２〜Ｃ６−アルケニル、置換または非置換のＣ２〜Ｃ６−アルキニル、アミノ、アミノアシル、アミノカルボニル、置換または非置換のＣ１〜Ｃ６−アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アセトキシ、アミノアシル、スルホキシ、スルホニル、Ｃ１〜Ｃ６−チオアルコキシで必要に応じて置換されている）が含まれるがこれらに限定されない部分で置換され得る；あるいはＲ５およびＲ６は、一緒になって、置換または非置換の４〜８員の飽和環式アルキルまたはヘテロアルキル基を形成していてもよい。これらの企図されるグルコネート誘導体のうち少なくとも１つまたは複数は、伝統的に使用される二価カチオン治療のものよりも優れた抗痙攣効果を有すると期待される。
【００６８】
グルコネートは、多くの医学的に使用される薬物においてアニオンとして広く使用されており、通常は不活性成分として表示される。対イオンとしてグルコネートを有する抗痙攣化合物を報告する当業者は、グルコネートがいずれの抗てんかん効果に関連付けられることもこれまで示唆したことがない。その代わり、上で議論したように、以前の研究は、抗痙攣効果を媒介するとして、二価カチオン、例えば、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋に主に焦点を当てている。例えば、１つの症例研究は、てんかん患者をグルコン酸Ｃａで処置したところ、てんかん引き付けが弱まったことを報告した。Boulenguez  et  al.,  “Down-regulation  of  the  potassium-chloride  cotransporter  KCC2  contributes  to  spasticity  after  spinal  cord  injury”  Nature  Medicine  16:302-307  (2010)。著者らは、グルコネートが何らかの役割を果たし得るかどうかに関する疑問を完全に無視して、この効果をＣａ２＋に帰している。同様に、マグネシウム関連抗痙攣製品、例えばグルコン酸マグネシウムが抗てんかん効果を有し得ることは当該分野で一般に受容されているが、抗痙攣効果はまたも、Ｍｇ２＋の機能に起因すると考えられている。これらの一般に抱かれている考えとは対照的に、本明細書に提示されるデータは、グルコネートが、二価カチオン単独と同程度に有効またはそれよりも有効であり得ることを実証している。
【００６９】
グルコネートは、グルコースの酸化から生成され得、従って、果実および蜂蜜などの天然食品製品中に豊富に見出される。Anastassiadis  et  al.,  “Gluconic  acid  production”  Recent  Patents  On  Biotechnology  1:167-180  (2007)。結果的に、グルコネートの食餌供給源もまた、抗てんかん治療に寄与し得る。グルコネートは天然の有機酸であり、最小の副作用で食品および薬物添加物として既に使用されているので、グルコネート誘導体は、新生仔てんかんの処置のための新世代の治療薬をもたらし得る。
【００７０】
一実施形態では、本発明は、グルコン酸（例えば、グルコネート）が、ニューロン培養物だけでなく海馬スライスにおいて、てんかん様バースト活動を強力に阻害したことを企図する。さらに、海馬スライスにおけるフィールド電位記録は、グルコン酸ナトリウムが、新生仔てんかん活動を強力に抑制し、年かさの動物では効果がより少なかったことを明らかにした。脳波（ＥＥＧ）記録は、グルコン酸ナトリウムが、成体動物ではより有効性が低いが、新生仔動物においててんかん発作を阻害するのにより有効であったことを確認した。ホールセルパッチクランプ記録は、グルコン酸ナトリウムが、海馬錐体ニューロンにおいて、ＣＬＣ−３チャネルによって主に媒介される電位依存的Ｃｌ−電流を顕著に阻害したことを実証した。本明細書に提示されるデータは、天然の有機化学物質、グルコン酸およびその誘導体を、以前は未知であり、新生仔てんかんのための有効な抗痙攣薬として同定している。
【００７１】
Ａ．てんかん様活動の阻害
てんかん発生の間のＣｌ−の機能的役割を、バス溶液中の細胞外Ｃｌ−（すなわち、例えば、１３７ｍＭのＣｌ−）を、グルコン酸などの大きいアニオンで置き換えることによって調査した。驚くべきことに、バス溶液中のおよそ５〜２０ｍＭの間の濃度のグルコン酸ナトリウム（ＮａＧｃＡ）が、培養された皮質ニューロンにおいて、自発的てんかん様活動を阻害した。図１Ａを参照のこと。バス溶液中に１１７ｍＭを超えるＣｌ−がなおも存在したので、低濃度のＮａＧｃＡによるてんかん様活動のかかる強力な阻害は、Ｃｌ−濃度変化によって単純に説明することはできなかった。ＮａＧｃＡがてんかん様活動を直接阻害し得るかどうかを決定するために、シクロチアジド（ＣＴＺ）を使用して、ニューロン培養物においてロバストなてんかん様バースト活動を惹起した。Qi  et  al.,  “Cyclothiazide  induces  robust  epileptiform  activity  in  rat  hippocampal  neurons  both  in  vitro  and  in  vivo”  The  Journal  Of  Physiology  571:605-618  (2006)。データは、ＣＴＺ誘導性てんかん様活動が、１０ｍＭのＮａＧｃＡによって完全に遮断され、阻害が用量依存的であったことを実証した。それぞれ、図１Ｂおよび図１Ｃを参照のこと。バースト活動は、ＮａＧｃＡを洗い流した後に、対照レベルまで回復したので、ＮａＧｃＡの効果は可逆的であった。図１Ａおよび図１Ｃを参照のこと。これらのデータは、ＮａＧｃＡが、培養されたニューロンにおけるてんかん様バースト活動に対して強力な阻害効果を発揮することを示している。
【００７２】
ＮａＧｃＡのかかる阻害効果がＣＴＺてんかんモデルに限定されなかったことを確実にするために、ＮａＧｃＡを、２つのさらなるてんかんモデルにおいてさらに試験した。第１に、皮質ニューロンを、強力な神経毒であるカイニン酸（ＫＡ）１μＭで２時間処理して、てんかんバースト活動を誘導した。ホールセルパッチ−クランプ記録は、１０ｍＭのＮａＧｃＡが、ＫＡによって誘導されたてんかん様バースト活動を大きく抑制したことを示した。図１Ｄおよび図１Ｅを参照のこと。第２に、皮質ニューロンを、これもまた長期持続性のてんかん様バースト活動を誘導する、４−アミノピリジン（４−ＡＰ）５０μＭ中で２時間インキュベートした。同様に、１０ｍＭのＮａＧｃＡの適用は、４−ＡＰ誘導性てんかん様活動を完全に遮断した。図１Ｆおよび図１Ｇを参照のこと。併せて考えると、これらの結果は、ＮａＧｃＡが、培養されたニューロンにおけるてんかん様活動に対する強力かつ一般的な阻害剤であることを実証している。
【００７３】
次いで、ＮａＧｃＡがてんかん活動の誘導を阻害できるかどうかを決定した。この目的のために、ＮａＧｃＡおよびＣＴＺの組合せを、誘導期間の間に添加した。ＣＴＺ単独によって処理したニューロンは、ロバストなてんかん様活動を示した；しかし、１０ｍＭのＮａＧｃＡと一緒に１０μＭのＣＴＺで処理したニューロンは、てんかん様活動の大きい低減を示した。上部分を下部分と比較して、図１Ｈを参照のこと。対照ニューロンのほぼ９０％（例えば、２２個のニューロンのうちおよそ１９個）は、ＣＴＺ処理後にてんかん様活動を示したが、１０ｍＭのＮａＧｃＡで共処理したニューロンの１８％のみ（例えば、１７個のニューロンのうちおよそ３個、ｐ＜０．００１、χ２検定）が、てんかん様活動を示した。図１Ｉ（ａ）を参照のこと。てんかん様バーストの平均周波数および持続時間もまた、ＮａＧｃＡで共処理したニューロンにおいて有意に低減された。図１Ｉ（ｂ）および図１Ｉ（ｃ）を参照のこと。併せて考えると、これらのデータは、急性および慢性の両方のＮａＧｃＡ適用が、培養されたニューロンにおいててんかん様活動を抑制できることを実証している。
【００７４】
Ｂ．カイニン酸誘導性細胞死保護
ニューロン死は、てんかんの重篤な副作用である。Sagar  et  al.,  “Hippocampal  neuron  loss  in  temporal  lobe  epilepsy:  correlation  with  early  childhood  convulsions”  Annals  of  Neurology  22:334-340  (1987)；およびSass  et  al.,  “Verbal  memory  impairment  resulting  from  hippocampal  neuron  loss  among  epileptic  patients  with  structural  lesions”  Neurology  45:2154-2158  (1995)。本明細書に提示されるデータは、グルコネートが、抗てんかん効果を有するだけでなく、ＫＡ誘導性ニューロン死に対する神経保護効果を発揮することを実証している。
【００７５】
てんかん活動は、てんかん患者および動物モデルの両方において、細胞死を誘導し得る。Chen  et  al.,  “Differential  roles  of  NR2A-  and  NR2B-containing  NMDA  receptors  in  activity-dependent  brain-derived  neurotrophic  factor  gene  regulation  and  limbic  epileptogenesis”  The  Journal  Of  Neuroscience  :  the  official  journal  of  the  Society  for  Neuroscience  27:542-552  (2007)；およびNaseer  et  al.,  “Maternal  epileptic  seizure  induced  by  pentylenetetrazol:  apoptotic  neurodegeneration  and  decreased  GABAB1  receptor  expression  in  prenatal  rat  brain”  Molecular  Brain  2:20  (2009)。ＮａＧｃＡの抗てんかん効果が神経保護的であり得るかどうかを評価するために、カイニン酸（ＫＡ）誘導性細胞死モデルを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌ３２２４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と併せて使用して、ニューロン生存率を解析した。Wu  et  al.,  “Protective  effect  of  resveratrol  against  kainate-induced  temporal  lobe  epilepsy  in  rats”  Neurochemical  Research  34:1393-1400  (2009)。対照群では、ほとんどのニューロンは、形態学において健康に見え、カルセイン（緑色、生）によって染色されたが、エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１、赤色、死）によっては染色されなかった。図１Ｊ、左を参照のこと。１０μＭのＫＡへの２４時間の曝露後に、ほとんどのニューロンは、ＥｔｈＤ−１染色によって示されるように死んでいた。図１Ｊ、中央左を参照のこと。興味深いことに、ＫＡ誘導性ニューロン死は、２０ｍＭのＮａＧｃＡの共適用によって無効にされた。図１Ｊ、中央右を参照のこと。２０ｍＭのＮａＧｃＡ単独に曝露されたニューロンは、その生存率に対して副作用を有さなかった。図１Ｊ、右を参照のこと。定量的データは、ＮａＧｃＡの神経保護効果が用量依存的でもあったことを示した。図１Ｋを参照のこと。これらの実験は、グルコネートがてんかん様活動を阻害するだけでなく、神経保護効果を発揮することを示唆している。
【００７６】
Ｃ．クロライドイオン電流阻害
本明細書に提示される研究は、グルコン酸がＣｌ−チャネルを遮断することを実証している。発明の機構を理解することは必要ではないが、グルコン酸は、負の荷電を有する大きい有機化合物であるので、これらのチャネルを遮断すると考えられる。例えば、大きいアニオンとして、グルコン酸は、Ｃｌ−イオン自体と同様に容易にはＣｌ−チャネルを通過しない可能性があると考えられる。Ｃｌ−チャネルは、ヒトてんかん患者に関連付けられてきた。ＣＬＣ−１チャネルにおける突然変異は、多くの特発性てんかん患者において同定されている。Chen  et  al.,  “Novel  brain  expression  of  ClC-1  chloride  channels  and  enrichment  of  CLCN1  variants  in  epilepsy”  Neurology  80:1078-1085  (2013)。ＣＬＣ−２チャネル突然変異もまたヒト患者において見出されているが、一部の研究は、突然変異がてんかんに寄与しない可能性があることを示唆している。Haug  et  al.,  “Mutations  in  CLCN2  encoding  a  voltage-gated  chloride  channel  are  associated  with  idiopathic  generalized  epilepsies”  Nat  Genet  33:527-532  (2003)；Kleefuss-Lie  et  al.,  “CLCN2  variants  in  idiopathic  generalized  epilepsy”  Nat  Genet  41:954-955  (2009)；およびNiemeyer  et  al.,  “No  evidence  for  a  role  of  CLCN2  variants  in  idiopathic  generalized  epilepsy”  Nat  Genet  42:3  (2010)。ＣＬＣ−３チャネルは、異なる脳領域において広く発現され、海馬は、最も高い発現領域のうち１つである。Duran  et  al.,  “Chloride  channels:  often  enigmatic,  rarely  predictable”  Annual  Review  Of  Physiology  72:95-121  (2010)；Verkman  et  al.,  “Chloride  channels  as  drug  targets”  Nature  Reviews.  Drug  Discovery  8:153-171  (2009)；およびKawasaki  et  al.,  “Cloning  and  expression  of  a  protein  kinase  C-regulated  chloride  channel  abundantly  expressed  in  rat  brain  neuronal  cells”  Neuron  12:597-604  (1994)。
【００７７】
実験を、何がグルコネートの分子標的であるかという疑問に回答するために設計した。イオンチャネル調節を最初に調査し、ナトリウム、カリウムまたはカルシウムチャネルに対するＮａＧｃＡの比較を行った。データは、ＮａＧｃＡ処理後にＮａ＋、Ｋ＋およびＣａ２＋電流において有意な変化が存在しなかったことを示している。図２Ａ〜２Ｆを参照のこと。発明の機構を理解することは必要ではないが、グルコン酸は有機アニオンであるので、ニューロンのアニオンチャネルに影響を与え得ると考えられる。
【００７８】
本明細書に提示されるデータは、培養された皮質ニューロンにおけるＣｌ−電流が、外向き整流性であり、１０ｍＭのＮａＧｃＡの存在下で有意に低減されたことを示している。図２Ｇ、Ｈを参照のこと；対照、９１３±１７１ｐＡ；ＮａＧｃＡ、４９９±８９ｐＡ；ｎ＝７；Ｐ＜０．００７、対応のあるｔ検定；＋９０ｍＶにおいて記録。従って、ＮａＧｃＡの１つの標的は、Ｃｌ−チャネルであり得る。Ｃｌ−チャネルとてんかん発生との間の密接な関連を固めるために、以下の２つの古典的Ｃｌ−チャネル遮断剤の効果を試験した；５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸（ＮＰＰＢ）および４，４’−ジイソチオシアナト−２，２’−スチルベンジスルホン酸二ナトリウム塩（ＤＩＤＳ）。ＮＰＰＢ（１００μＭ）またはＤＩＤＳ（１００μＭ）の適用は、培養されたニューロンにおいてＣｌ−電流を有意に抑制した。図２Ｉ、Ｌを参照のこと。ＮＰＰＢ（１００μＭ）およびＤＩＤＳ（１００μＭ）が共に、ＣＴＺ（１０μＭ、２４時間）によって誘導されたてんかん様活動を顕著に阻害したこともまた実証された。図２Ｍ、Ｎを参照のこと；ｎ＝９。併せて考えると、これらの結果は、ＮａＧｃＡが、てんかん発生に関与するＣｌ−チャネルを阻害できることを示唆している。
【００７９】
Ｄ．新生仔海馬スライスてんかん様活動阻害
培養されたニューロンに対するグルコネートの上記効果がアーチファクトであった可能性、ＮａＧｃＡの抗てんかん活性を、比較的インタクトなニューロン回路を有する海馬スライスにおいて試験した。フィールド電位を、ＣＡ３錐体層において記録し、Ｍｇ２＋なしの人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中でてんかんバースト活動を誘導した。安定なてんかんバースト活動の誘導後（約３０分）、２０ｍＭのＮａＧｃＡを、Ｍｇ２＋なしのａＣＳＦ中に適用して、てんかん活動に対するその影響を試験した。データは、ＮａＧｃＡが、Ｐ６〜Ｐ１２の新生仔動物由来の脳スライスにおいて抗てんかん効果を発揮したが（図２Ａおよび２ｃ）、およそ１カ月年かさの動物では、中程度の効果を発揮したことを示している。図３Ｅと比較して図３Ａおよび３Ｃを参照のこと。次いで、フィールド電位のパワースペクトルを、ＮａＧｃＡ適用の前、その間およびその後に解析した。パワーの振幅は、新生仔動物ではＮａＧｃＡの適用後に顕著に低減されたが、年かさの動物（例えば、Ｐ２６）ではわずかにのみ低減された。図３Ｆと比較して図３Ｂおよび３Ｄを参照のこと。定量的に、ＮａＧｃＡは、新生仔動物においててんかん活動の平均パワーの６０％を阻害したが（Ｐ６〜８、５９．６±４．３％、ｎ＝５匹の仔からの１０個のスライス；Ｐ１０〜１２、６２．１±３．８％、ｎ＝５匹の仔からの１０個のスライス；Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）、年かさの動物では２０％だけ低減させた（Ｐ２１〜３３、２３．８±４．１％、ｎ＝４匹の仔からの７個のスライス；ｐ＜０．００５、対応のあるｔ検定）。図３Ｇを参照のこと。これらの結果は、ＮａＧｃＡが、新生仔脳において強力な抗てんかん活性を有し得ることを示唆している。
【００８０】
てんかん活動に対するＮａＧｃＡの効果が、Ｐ６〜Ｐ１２新生仔動物における０  Ｍｇ２＋モデルに加えて、他のてんかんモデルに一般に適用可能であるかどうかを、さらに決定した。例えば、４−ＡＰモデルは、Ｋ＋チャネル遮断剤４−ＡＰ（５０μＭ）のバス適用が、ＣＡ３錐体層においてロバストなてんかんバースト活動を誘導した使用であった。４−ＡＰ含有バス溶液への２０ｍＭのＮａＧｃＡのさらなる添加は、てんかん活動を顕著に低減させたが、これは、ＮａＧｃＡの洗い流し後に可逆的であった。図４Ａを参照のこと。パワーの振幅もまた、ＮａＧｃＡの存在下で有意な低減を示し、まとめられたデータは、ＮａＧｃＡによるパワー振幅の平均７０．２±５．３％の低減を示した（ｎ＝４匹の仔からの９個のスライス；Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。それぞれ図４Ｂおよび図４Ｃを参照のこと。上昇した細胞外Ｋ＋（＋８．５ｍＭ）がＣＡ３錐体層においててんかんバースト活動を惹起した、高Ｋ＋モデルもまた使用した。図４Ｄを参照のこと。同様に、高Ｋ＋ａＣＳＦにおける２０ｍＭのＮａＧｃＡの添加もまた、てんかんバースト活動を遮断し、パワー振幅を低減させた。図４Ｄ、Ｅを参照のこと。統計的解析は、ＮａＧｃＡが、高Ｋ＋モデルにおいて、パワーの振幅を７０．８±４．９％、有意に低減させたことを明らかにした（ｎ＝２匹の仔からの５個のスライス；Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。図４Ｆを参照のこと。まとめると、これらの結果は、ＮａＧｃＡが、種々のてんかんモデルにおいて新生仔てんかんを強力に抑制できることを実証している。
【００８１】
Ｅ．ＣＬＣ−３クロライドイオンチャネル阻害
上で議論したように、ＮａＧｃＡは、培養されたニューロンにおいてＣｌ−電流を阻害した。図２を参照のこと。以前の研究は、海馬の培養されたニューロンが、電位依存的ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルを有したことを報告した。Wang  et  al.,  “CLC-3  channels  modulate  excitatory  synaptic  transmission  in  hippocampal  neurons”  Neuron  52:321-333  (2006)。本明細書に示されるように、グルコネートは、ＣＬＣ−３チャネルによって媒介される外向き整流Ｃｌ−電流に対する強い阻害効果を有する。ＣＬＣ−３チャネルを介したシナプス後Ｃｌ−流入は、ＮＭＤＡ受容体媒介性興奮性電流を強化することができ、ＮＭＤＡ受容体の過剰活性化は、発作誘導性ニューロン細胞死に関与する。従って、グルコネートの神経保護効果は、ＮＭＤＡ受容体機能の間接的抑制を介してであり得る。
【００８２】
海馬の形成は、げっ歯類脳における最も高頻度のてんかん原性構造の１つであることが公知であるが、今までのところ、ＣＬＣ−３ノックアウトマウスがＰＴＺ誘導性てんかんに対する顕著な抵抗性を示したという報告以外、ＣＬＣ−３チャネルとてんかんとの間の関連性を直接調査している研究はほとんど存在しない。Dickerson  et  al.,  “Altered  GABAergic  function  accompanies  hippocampal  degeneration  in  mice  lacking  ClC-3  voltage-gated  chloride  channels”  Brain  Research  958:227-250  (2002)。本明細書に提示される電気生理学的研究は、ＣＬＣ−３チャネルが、海馬ＣＡ３錐体ニューロンにおいてＣｌ−電流を媒介し、グルコン酸ナトリウムが、ＣＬＣ−３チャネルを強く阻害することを見出した。さらに、データは、てんかん活動の誘導後に、ＣＬＣ−３チャネルが、新生仔海馬スライスにおいて上方調節され、グルコン酸ナトリウムが、増加したクロライド電流を無効にすることができることもまた示している。
【００８３】
従って、ＣＬＣ−３チャネルは、新生仔てんかん発生に関与しているようである。これらの観察を支持することには、ＣＬＣ−３チャネルは、ヒトグリオーマ細胞において高度に発現されることが見出されており、グルコネートによって遮断することができる。Olsen  et  al.,  “Expression  of  voltage-gated  chloride  channels  in  human  glioma  cells”  The  Journal  Of  Neuroscience:  the  official  journal  of  the  Society  for  Neuroscience  23:5572-5582  (2003)。さらに、高い発生率がグリオーマとてんかんとの間で明らかであり、Ｃｌ−恒常性の誤調節がグリオーマ関連てんかんに関与することが報告されている。Buckingham  et  al.,  “Glutamate  release  by  primary  brain  tumors  induces  epileptic  activity”  Nature  Medicine  17:1269-1274  (2011)；およびPallud  et  al.,  “Cortical  GABAergic  excitation  contributes  to  epileptic  activities  around  human  glioma’  Sci  Transl  Med  6:244ra289  (2014)。併せて考えると、これらの知見は、Ｃｌ−チャネルと新生仔てんかん発生との間の潜在的な関連性を示唆している。ＣＬＣ−３チャネルの強力な阻害剤として、グルコネートは、新生仔てんかんの処置のための以前には知られていなかった抗てんかん薬であり得る。
【００８４】
一貫して、本明細書に提示されるデータは、海馬スライス中のＣＡ３錐体ニューロンにおける電位依存的外向き整流Ｃｌ−電流を示す。図５Ａ、左を参照のこと。例えば、Ｃｌ−電流は、ＮａＧｃＡ（２０ｍＭ）の適用後に劇的に低減された。図５Ａ、右を参照のこと。ＮａＧｃＡの前および後のＣｌ−電流のＩ−Ｖ曲線の定量的データ解析。図５Ｂを参照のこと。電位感受性Ｃｌ−電流がＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルによって媒介されたかどうかを直接試験するために、ＣＬＣ−３特異的抗体を、ピペット溶液中に導入して、ＣＬＣ−３チャネルを遮断した。Wang  et  al.,  “Functional  effects  of  novel  anti-ClC-3  antibodies  on  native  volume-sensitive  osmolyte  and  anion  channels  in  cardiac  and  smooth  muscle  cells”  American  Journal  Of  Physiology.  Heart  and  circulatory  physiology  285:  H1453-1463  (2003)；およびDuan  et  al.,  “Functional  inhibition  of  native  volume-sensitive  outwardly  rectifying  anion  channels  in  muscle  cells  and  Xenopus  oocytes  by  anti-ClC-3  antibody”  The  Journal  Of  Physiology  531:437-444  (2001)。
【００８５】
実際、外向き整流Ｃｌ−電流は、ＣＬＣ−３抗体（１：１００）の１０分間の透析後に大きく低減されたが、対照ＩｇＧ透析されたニューロンでは、明らかな変化は観察されなかった。図５Ｃを参照のこと。定量的に、対照条件におけるＣｌ−電流密度は、９０ｍＶにおいて３６．２±１．４ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝４匹の仔からの１０個の細胞）であり、ＩｇＧ群において３３．５±２．３ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝３匹の仔からの１０個の細胞）であったが、ＣＬＣ−３抗体群では１３．７±２．３ｐＡ／ｐＦまで減少した（ｎ＝４匹の仔からの１１個の細胞；Ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ事後検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡ）。図５Ｄを参照のこと。従って、ＣＡ３錐体ニューロンにおけるＣｌ−電流は、ＣＬＣ−３−／−海馬ニューロンにおける以前の知見と一致して、ＣＬＣ−３チャネルによって主に媒介される。
【００８６】
ＮａＧｃＡを、この化合物がＣＬＣ−３チャネルを特異的に阻害できるかどうかを決定するためにも試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＬＣ−３−ＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクトし、ＣＬＣ−３チャネルの発現を、ＣＬＣ−３特異的抗体を用いて確認した。図５ＥおよびMatsuda  et  al.,  “Overexpression  of  CLC-3  in  HEK293T  cells  yields  novel  currents  that  are  pH  dependent”  American  Journal  Of  Physiology.  Cell  physiology  294:C251-262  (2008)を参照のこと。ホールセル記録は、ＣＬＣ−３トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における大きい外向き整流電流もまた明らかにしたが（対照、＋９０ｍＶにおいて１０１２±１２３ｐＡ、ｎ＝２バッチの培養物からの７個の細胞）、ＥＧＦＰトランスフェクトされた対照細胞では電流は観察されなかった。図５Ｆを参照のこと。さらに、２０ｍＭのＮａＧｃＡの適用は、ＣＬＣ−３媒介性Ｃｌ−電流を有意に低減させたが（ＮａＧｃＡ、＋９０ｍＶにおいて５４４±５９ｐＡ、ｎ＝２バッチからの７個の細胞；対照と比較してＰ＜０．００４、対応のあるｔ検定）、これもまた、ＮａＧｃＡの洗い流し後に可逆的であった（＋９０ｍＶにおいて９２５±１２４ｐＡ、ｎ＝２バッチからの７個の細胞；対照と比較してＰ＞０．４、対応のあるｔ検定）。図５Ｆ、Ｇを参照のこと。併せて考えると、これらのデータは、ＮａＧｃＡが、ＣＡ３錐体ニューロンにおいて主要な外向き整流Ｃｌ−電流を媒介するＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルの強力な阻害剤であることを実証している。
【００８７】
Ｆ．ＣＬＣ−３チャネルのてんかん原性上方調節
ＣＬＣ−３チャネルがてんかん発生に関与するかどうかを決定するために、ＣＬＣ−３発現レベルを、Ｐ８〜Ｐ１２新生仔脳スライスにおいててんかん活動の誘導の前および後に決定した。海馬スライスを、Ｍｇ２＋なしのａＣＳＦ中で１時間インキュベートして、てんかん活動を誘導し、次いで、ＣＬＣ−３免疫染色を実施して、ＣＬＣ−３発現レベルを試験した。対照スライスは、それに応じて正常ａＣＳＦ中で１時間インキュベートした。興味深いことに、海馬ＣＡ３錐体層におけるＣＬＣ−３免疫反応性は、対照と比較して、０  Ｍｇ２＋処理したスライスにおいて有意な増加を示した。図６Ａ、Ｂを参照のこと；対照、１１．２±１．５ａ．ｕ．、ｎ＝４匹の仔からの１０個のスライス；０  Ｍｇ２＋、２０．４±２．８ａ．ｕ．、ｎ＝４匹の仔からの１１個のスライス；Ｐ＜０．０２、スチューデントｔ検定。かかる上昇した発現レベルのＣＬＣ−３を、ウエスタンブロットによってさらに確認した。図６Ｃ、Ｄを参照のこと。従って、ＣＬＣ−３チャネルは、新生仔てんかんスライスにおいて上方調節される。
【００８８】
さらに、パッチ−クランプ記録が、対照および０  Ｍｇ２＋処理したスライス中のＣＡ３錐体ニューロンのＣｌ−電流を直接測定した。免疫染色およびウエスタンブロットの結果と一致して、ホールセル記録もまた、０  Ｍｇ２＋処理したニューロンにおけるＣｌ−電流の有意な増加を明らかにした。図６Ｅ、Ｆを参照のこと；対照、＋９０ｍＶにおいて３１．２±１．８ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３匹の仔からの１５個の細胞；０  Ｍｇ２＋、４２．２±２．４ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３匹の仔からの１５個の細胞；Ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ事後検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡ。さらに、０  Ｍｇ２＋処理後のＣｌ−電流の大部分は、ＮａＧｃＡによって有意に阻害された。図６Ｅ、Ｆを参照のこと；ＮａＧｃＡ、７．３±０．６ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝２匹の仔からの１１個の細胞；Ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ事後検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡ。これらの結果は、ＣＬＣ−３チャネルが、新生仔てんかん発生の間に役割を果たし得ることを示唆している。
【００８９】
Ｇ．新生仔発作阻害
新生仔発作を誘導するために、一般に使用されるＫＡモデルを使用した。Ｐ１０〜Ｐ１２新生仔マウス中へのＫＡの注射（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＥＥＧ記録によって明らかなように、ロバストなてんかん発作バーストを惹起した。図７Ａ、Ｂを参照のこと。ＮａＧｃＡ（２ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）をＫＡ注射の１０分後に注射した場合、てんかん発作活動は、本質的に無効にされた。図７Ｃ、Ｄを参照のこと。パワー解析は、パワーの振幅が、ＮａＧｃＡ注射によって顕著に阻害されたことを確認した。図７Ｅ、Ｆを参照のこと。これらのデータは、ＮａＧｃＡが強力なｉｎ  ｖｉｖｏ抗新生仔発作薬物であることを示している。
【００９０】
Ｈ．成体発作阻害
ＮａＧｃＡを、この化合物が成体てんかんを処置するためにも使用することができるかどうかに関して決定した。予備データは、ＫＡ痙攣モデルが高い死亡率を有することを示した。しかし、類似のＰＴＺモデルは、成体マウスにおいて信頼性のあるてんかん発作を生じた。図８Ａを参照のこと。データは、ＮａＧｃＡが、ＰＴＺによって誘導されたてんかん発作バーストの潜時を延長させたが、新生仔動物において見られるものと同様に有効には、てんかんバースト活動を抑制しなかったことを示している。図８を参照のこと。従って、ＮａＧｃＡは、新生仔発作を処置するにあたり、成体てんかんについてよりも強力な独自の抗てんかん薬であり得る。
【００９１】
Ｉ．クロライドイオンチャネル遮断剤ホールセル阻害
関連の疑問は、新生仔発作をこれもまた阻害する他のＣｌ−チャネル遮断剤、例えば、ＮＰＰＢおよびＮＦＡもまた、Ｃｌ−イオンチャネル関連活動を遮断するということである。図９および図１０を参照のこと。一実施形態では、本発明は、グルコネート、ＮＰＰＢ、ニフルミン酸、ＤＩＤＳ、フルフェナム酸が含まれるがこれらに限定されない化合物が、新生仔発作を阻害するにあたり同様に作用し得ることを企図する。発明の機構を理解することは必要ではないが、新生仔発作阻害は、クロライドイオンチャネル阻害によって生じ得ると考えられる。
【００９２】
ＩＶ．グルコースオキシダーゼベースの痙攣性治療
一実施形態では、本発明は、グルコースオキシダーゼが、発作活動を阻害するための抗痙攣薬として使用され得ることを企図する。発明の機構を理解することは必要ではないが、グルコースオキシダーゼは、グルコースを、てんかん様活動を低減させることが本明細書で示されたグルコネート（上記）に変換すると考えられる。本明細書に提示されるデータは、グルコン酸が、おそらくはＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルを遮断することによって、発生中の脳における発作活動に対して強い阻害効果を有することを実証している。データは、グルコースをグルコン酸へと酸化する酵素であるグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）もまた、新生仔マウス由来の海馬スライスにおいて抗てんかん様活性を有することもまた示している。
【００９３】
世界の人口のおよそ１％が、てんかんに罹患する。てんかん患者における多くの発作は、薬物によって部分的に制御することができ、てんかん患者の約３分の１は、抗てんかん薬に対して抵抗性である。Sada  et  al.,  “Epilepsy  treatment.  Targeting  LDH  enzymes  with  a  stiripentol  analog  to  treat  epilepsy”  Science  347:1362-1367  (2015)；およびJuge  et  al.,  “Metabolic  control  of  vesicular  glutamate  transport  and  release”  Neuron  68:99-112  (2010)。幸いなことに、いくつかの新たな抗てんかん薬が過去数年間にわたって開発され、薬物抵抗性患者においていくらかのさらなる効果を示している。Bialer  et  al.,  “Key  factors  in  the  discovery  and  development  of  new  antiepileptic  drugs”  Nature  Reviews:  Drug  Discovery  9:68-82  (2010)。残念ながら、新生仔発作の抑制のために特に開発された新たな薬物は存在しない。
【００９４】
例えば、ＧＡＢＡ受容体のアゴニストであるフェノバルビタールは、１９１２年に発見され、最も古いが今もなお新生仔てんかんを処置するための第１選択薬であるが、わずか５０％の有効性に制限され、いくつかの副作用を示す。Chamberlain  et  al.,  “Lorazepam  vs  diazepam  for  pediatric  status  epilepticus:  a  randomized  clinical  trial”  JAMA  311:1652-1660  (2014)；Painter  et  al.,  “Phenobarbital  compared  with  phenytoin  for  the  treatment  of  neonatal  seizures”  The  New  England  Journal  Of  Medicine  341:485-489  (1999)；およびKhanna  et  al.,  “Limitations  of  Current  GABA  Agonists  in  Neonatal  Seizures:  Toward  GABA  Modulation  Via  the  Targeting  of  Neuronal  Cl(-)  Transport”  Front  Neurol  4:78  (2013)。ビデオ−ＥＥＧ研究は、フェノバルビタールが、臨床的外見上の痙攣よりも低い有効性で、ＥＥＧてんかん様活動を抑制することを示している。臨床症状と電子写真記録との間の差異は、「電気臨床的解離」と呼ばれ、これは、抗痙攣薬処置後の新生児において８０％に達し得る。Glykys  et  al.,  “Differences  in  cortical  versus  subcortical  GABAergic  signaling:  a  candidate  mechanism  of  electroclinical  uncoupling  of  neonatal  seizures”  Neuron  63:657-672  (2009)。
【００９５】
従って、一部の研究は、フェノバルビタールが、発生中の脳における対応する根底にある異常なてんかん様活動を修正することなしに、鎮静に起因して発作の臨床症状を解決し得、これが、フェノバルビタールの真の有効性の過大評価をもたらし得ることを示唆している。Boylan  et  al.,  “Phenobarbitone,  neonatal  seizures,  and  video-EEG”  Arch  Dis  Child  Fetal  Neonatal  Ed  86:F165-170  (2002)。あるいは、絶食およびケトン食治療が、発作を処置するために長く使用されており、小児において難治性てんかんを処置するためになおも主に使用されている。しかし、絶食／ケトン食効果の機構は、完全には理解されていない。Zupec-Kania  et  al.,  “An  overview  of  the  ketogenic  diet  for  pediatric  epilepsy”  Nutr  Clin  Pract  23:589-596  (2008)。
【００９６】
絶食またはケトン食治療は、身体に、炭水化物よりむしろ脂肪を燃焼させると一般に考えられている。通常、炭水化物（例えば、グルコース）は、特に脳において、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の身体の主要な燃料源を生成するための主要なエネルギー物質である。しかし、炭水化物を欠く場合、脂肪は、肝臓においてケトン体に変換されると考えられ、ここで、ケトン体は、脳に入り、エネルギー源としてのグルコースを置き換える。これらのケトン体もまた、脳てんかん様活動を抑制し得ることが報告されている。Lima  et  al.,  “Neurobiochemical  mechanisms  of  a  ketogenic  diet  in  refractory  epilepsy”  Clinics  (Sao  Paulo)  69:699-705  (2014)。てんかんを有するほとんどの患者について、ケトン食は、いくつかの有害効果をもたらすことが示唆されている。Wheless  J.W.,  “The  ketogenic  diet:  an  effective  medical  therapy  with  side  effects”    Journal  Of  Child  Neurology  16:633-635  (2001):およびNeal  et  al.,  “The  ketogenic  diet  for  the  treatment  of  childhood  epilepsy:  a  randomised  controlled  trial”  Lancet  Neurol  7:500-506  (2008)。従って、小児科てんかんを処置するための代替的治療アプローチを開発する必要がある。
【００９７】
ケトン食は、患者の食餌構成要素を強制的に変化させることによっててんかんの制御を達成するようであり、本明細書のデータは、グルコースが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で新生仔てんかん様活動に対する強い阻害効果を有することを示しているので、１つの可能な機構は、グルコネートが、グルコースオキシダーゼによってグルコースを酸化することを介して局所的に生成され得ることである。グルコースオキシダーゼは、いくつかの種の真菌および昆虫において一般に見出される酵素の型であることが公知であり、食品添加物として広く使用される。グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）は、グルコースが過酸化水素およびグルコノラクトンを産生する反応を触媒し、グルコノラクトンは、グルコン酸へと加水分解し得る。本明細書のデータは、グルコン酸（例えば、グルコネート）がてんかん様活動を抑制することを示している。
【００９８】
新生仔てんかん様活動に対するＧＯｘの効果を試験するために、ベースラインフィールド電位を、海馬スライス（Ｐ１０〜１２）の水平切片中のＣＡ３において記録し、次いで、ＧＯｘを、少なくとも２０分間にわたる０  Ｍｇ２＋による安定なてんかん様活動の誘導後に、バス中に添加した。図２０Ａ。このデータは、てんかん様活動が、０．３Ｕ／ｍｌのＧＯｘおよび１Ｕ／ｍｌのＧＯｘによって有意に阻害されたが、０．１Ｕ／ｍｌのＧｏｘによっては阻害されなかったことを示している（ｎ＝８、ｐ＜０．００１）。図２０Ｂ〜２０Ｄ。
【００９９】
グルコースがこのＧＯｘ媒介性阻害に関与することを確認するために、グルコースを、ラクテート（５ｍＭ）およびピルベート（３ｍＭ）で置き換え、次いで、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ中でインキュベートしたところ、ＧＯｘが新生仔てんかん様活動に対して効果を有さなかったことが観察された。図２０Ｅ。
【０１００】
細胞外溶液中のグルコースから生成されたグルコン酸の利用可能な濃度は、酵素活性および反応時間の両方に依存すると一般に考えられる。従って、低用量のＧＯｘ（例えば、０．１Ｕ／ｍｌ）の存在下で反応時間を増加させることで、発生中の脳におけるてんかん様活動を抑制するのに十分な用量のグルコン酸を生成し得る。例えば、０．１Ｕ／ｍｌのＧＯｘを、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ中で１時間を超えてインキュベートした。図２Ｆ；９５％のＯ２／５％のＣＯ２で泡立てた。これらのデータは、１時間のインキュベーション後に、０．１Ｕ／ｍｌのＧＯｘが、新生仔マウス由来の脳スライスにおけるてんかん様活動に対して強い阻害効果を示したことを示した。図２０Ｆ；図２０Ｂと比較。これらの種々のＧＯｘ濃度は、平均パワーを、それぞれ６４．３±８．２％（０．３Ｕ／ｍｌ、ｎ＝９、ｐ＜０．００１）、８３．３±２．２％（１Ｕ／ｍｌ、ｎ＝６、ｐ＜０．００１）および８１．４±２．０％（１時間インキュベートした０．１Ｕ／ｍｌ、ｎ＝５、ｐ＜０．００１）低減させたことに留意すべきである。図２０Ｇ。
【０１０１】
０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ誘導性てんかん様活動に対するＧＯｘの効果を評価することに加えて、ＧＯｘ（１Ｕ／ｍｌ）が、ｉ）高Ｋ＋；またはｉｉ）４−アミノピリジン（４−ＡＰ）＋０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導される新生仔てんかん様活動を阻害することができるかどうかについてさらに決定した。データは、１Ｕ／ｍｌのＧＯｘがまた、発生中の脳（Ｐ１０〜１２）由来の海馬スライスにおいて高Ｋ＋ａＣＳＦまたは４−ＡＰ＋０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦのいずれによって誘導されたてんかん様活動に対しても強力な阻害を示したことを確認した。図２１Ａ〜２１Ｃ。従って、これらのデータは、ＧＯｘが、新生仔てんかん様活動を強く抑制する活性を有することを実証している。
【０１０２】
Ｖ．ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルは、発生中のニューロンにおいて大きい外向き整流電流を媒介する
ＧＡＢＡ機能の変更は、てんかんと密接に関連している。ＧＡＢＡ機能は、細胞内Ｃｌ−濃度（［Ｃｌ−］ｉ）によって決定され得るが、それは、ＧＡＢＡＡ受容体（ＧＡＢＡＡ−Ｒ）が、リガンド開口型Ｃｌ−チャネルであると考えられるからである。例えば、以前の研究は、［Ｃｌ−］ｉおよび従ってＧＡＢＡ機能を調節する際の、Ｃｌ−トランスポーター、例えば、ＫＣＣ２およびＮＫＣＣ１の役割を大々的に調査した。しかし、他のＣｌ−チャネルがどのように［Ｃｌ−］ｉおよびＧＡＢＡ機能に影響を与え得るかは、十分には理解されていない。
【０１０３】
本明細書に提示されるデータは、電位依存的Ｃｌ−チャネルが［Ｃｌ−］ｉ恒常性に寄与するかどうかおよび／またはＧＡＢＡ機能を調節するかどうかを調査している。以前、新生仔マウス（例えば、Ｐ８〜１２）由来の海馬スライスのＣＡ３錐体ニューロンにおける大きい外向き整流Ｃｌ−電流（３．３±０．３ｎＡ）を明らかにした電位依存的Ｃｌ−電流が記録された。図１１Ａ、左上パネル。驚くべきことに、かかる電位依存的外向き整流Ｃｌ−電流は、成体脳（例えば、Ｐ６０〜６２）において有意に減少した。図１１Ａおよび１１Ｂ。これらのデータは、脳発生の間のＣｌ−チャネルの発生的変化を示唆した。本発明者らがＣＡ３錐体ニューロンから記録したＣｌ−電流は、培養された海馬ニューロンにおいて以前に報告された電位依存的ＣＬＣ−３  Ｃｌ−電流と似ていた。Wang  et  al.,  “CLC-3  channels  modulate  excitatory  synaptic  transmission  in  hippocampal  neurons”  Neuron  52:321-333  (2006)；およびHuang  et  al.,  “Calcium-activated  chloride  channels  (CaCCs)  regulate  action  potential  and  synaptic  response  in  hippocampal  neurons”  Neuron  74:179-192  (2012)。
【０１０４】
ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルが新生仔ＣＡ３ニューロンにおいてＣｌ−電流を媒介したかどうかを試験するために、ＣＬＣ−３特異的抗体を、ＣＬＣ−３チャネルの遮断について試験した。Wang  et  al.,  “Functional  effects  of  novel  anti-ClC-3  antibodies  on  native  volume-sensitive  osmolyte  and  anion  channels  in  cardiac  and  smooth  muscle  cells”  American  Journal  Of  Physiology.  Heart  And  Circulatory  Physiology  285:H1453-1463  (2003)；およびDuan  et  al.,  “Functional  inhibition  of  native  volume-sensitive  outwardly  rectifying  anion  channels  in  muscle  cells  and  Xenopus  oocytes  by  anti-ClC-3  antibody”  The  Journal  Of  Physiology  531:437-444  (2001)。実際、外向き整流Ｃｌ−電流は、ＣＬＣ−３抗体（１：１００）による１０分間の透析後に大きく低減されたが、事前吸収させた対照抗体で透析した場合、明らかな変化は存在しなかった。図１１Ｄ。
【０１０５】
さらに、Ｃｌ−電流を、ＣＬＣ−３ノックアウトマウスにおいて直接試験した。Huang  et  al.,  “ClC-3  deficiency  protects  preadipocytes  against  apoptosis  induced  by  palmitate  in  vitro  and  in  type  2  diabetes  mice”  Apoptosis:  An  International  Journal  On  Programmed  Cell  Death  19:1559-1570  (2014)；Liu  et  al.,  “ClC-3  deficiency  prevents  apoptosis  induced  by  angiotensin  II  in  endothelial  progenitor  cells  via  inhibition  of  NADPH  oxidase”  Apoptosis:  An  International  Journal  On  Programmed  Cell  Death  18:1262-1273  (2013)；およびZheng  et  al.,  “Deficiency  of  volume-regulated  ClC-3  chloride  channel  attenuates  cerebrovascular  remodeling  in  DOCA-salt  hypertension”  Cardiovascular  Research  100:134-142  (2013)。免疫染色は、ＣＬＣ−３  ＫＯマウスのＣＡ３領域におけるＣＬＣ−３シグナルの非存在を確認した。図１１Ｅ。従って、外向き整流Ｃｌ−電流は、ＣＬＣ−３  ＫＯマウスのＣＡ３ニューロンにおいてもほとんど存在しなかった（ＷＴ、３３．１±１．３ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝１０；ＣＬＣ−３  ＫＯ、９．０±１．６ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝６）。図１１Ｆおよび１１Ｇ。併せて考えると、これらの結果は、ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルが、新生仔脳では大きい外向き整流Ｃｌ−電流を媒介するが、かかるＣｌ−電流が、成体脳では顕著に弱まったことを示している。
【０１０６】
さらなる試験は、新生仔脳におけるＣｌ−電流を遮断するための強力な阻害剤として、グルコン酸ナトリウム（ＮａＧｃＡ）を見出した。図１１Ａ〜Ｃ；緑色のトレーシング。成体脳またはＣＬＣ−３  ＫＯマウスでは、ＮａＧｃＡは、Ｃｌ−電流に対して効果を有さなかった。図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｇ。これらのデータは、ＮａＧｃＡがＣＬＣ−３チャネルの阻害剤であり得ることを示唆している。Olsen  et  al.,  “Expression  of  voltage-gated  chloride  channels  in  human  glioma  cells”  The  Journal  Of  Neuroscience:  The  Official  Journal  Of  The  Society  For  Neuroscience  23:5572-5582  (2003)。
【０１０７】
この考えを直接試験するために、ＣＬＣ−３チャネルを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において過剰発現させ、発現を、ＣＬＣ−３特異的抗体結合を用いて確認した。図１１ＨおよびMatsuda  et  al.,  “Overexpression  of  CLC-3  in  HEK293T  cells  yields  novel  currents  that  are  pH  dependent”  American  Journal  Of  Physiology.  Cell  Physiology  294:C251-262  (2008)。ホールセル記録は、ＣＬＣ−３トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における大きい外向き整流Ｃｌ−電流を明らかにしたが（１０１２±１２３ｐＡ、ｎ＝７）、ＥＧＦＰトランスフェクトされた対照細胞ではしなかった。図１１Ｉ。さらに、２０ｍＭのＮａＧｃＡの適用は、ＣＬＣ−３チャネル媒介性Ｃｌ−電流を有意に低減させた。図１１Ｉおよび１１Ｊ。従って、本明細書のデータは、ＮａＧｃＡをＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルの強力な阻害剤として同定している。
【０１０８】
グルコネートは、二価カチオン（例えば、カルシウムまたはマグネシウム）の存在下または非存在下でＣｌ−電流を阻害できることもまた見出された。本明細書に提示されるデータは、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウムおよびグルコン酸の間で、Ｃｌ−電流阻害の有効性を比較している。このデータは、等価なＣｌ−電流阻害が３つ全ての対イオンで観察されることを実証している。図１７Ａ〜Ｅ。従って、これらのデータは、それが保持するカチオンではなくグルコン酸が、有効な構成要素であることを示している。グルコネート塩を使用する以前の研究は、臨床効果を、それが保持するカチオンにしばしば帰しており、グルコン酸は、重要なエフェクターではなく単なる食品／薬物添加物と考えられた。データは、技術水準がこの解釈において間違っていたこと、より具体的には、二価カチオンが、グルコネートが抗てんかん有効性を有するのに必要な構成要素ではないことを示している。
【０１０９】
ＶＩ．ＣＬＣ−３チャネルおよび新生仔てんかん
新生仔てんかんにおけるＣＬＣ−３チャネルの機能的役割を理解するために、ＣＬＣ−３チャネル発現レベルを、新生仔脳スライスを０  Ｍｇ２＋人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）で処理することによるてんかん様活動の誘導後に決定した。
【０１１０】
Ｍｇ２＋なしのａＣＳＦ誘導性てんかん活動は、新生仔脳スライス（例えば、Ｐ８〜Ｐ１２）におけるＣＬＣ−３チャネル発現を有意に上方調節した。図１２Ａおよび１２Ｂ；対照：１１．２±１．５人工単位（ｎ＝１０）；０  Ｍｇ２＋：２０．４±２．８人工単位（ｎ＝１１）；Ｐ＜０．０２、スチューデントｔ検定。てんかん様活動に引き続くＣＬＣ−３チャネル発現のこの上方調節を、ウエスタンブロットによってさらに確認した。図１２Ｃおよび１２Ｄ。さらに、パッチ−クランプ記録は、てんかん様活動の誘導後の外向き整流Ｃｌ−電流の顕著な増加もまた明らかにし、ＮａＧｃＡの適用は、Ｃｌ−電流を顕著に遮断した。図１２Ｅおよび１２Ｆ；対照：３１．２±１．８ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝１５）；０  Ｍｇ２＋：４２．２±２．４ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝１５）；ＮａＧｃＡ：７．３±０．６ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝１１）；Ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙ事後検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡ。これらの結果は、ＣＬＣ−３チャネルが、新生仔てんかんの間に役割を果たし得ることを示唆している。
【０１１１】
この仮説を直接試験するために、ＣＬＣ−３チャネルを、ＮａＧｃＡで阻害し、てんかん活動に対する効果について試験した。際立つことに、データは、ＮａＧｃＡが若い出生後動物（Ｐ６〜１２）由来の脳スライスにおいて強力な抗てんかん効果を発揮したことを示した。図１２Ｇ、１２Ｈ、１２Ｉおよび１２Ｊ。しかし、ＮａＧｃＡの抗てんかん効果は、年かさの動物、例えば、およそ１月齢（例えば、Ｐ２６）の動物では、かなり小さくなった。図１２Ｋおよび１２Ｌ。定量的に、ＮａＧｃＡは、初期出生後動物においててんかん様活動の平均パワーの６０％を阻害した（Ｐ６〜８：５９．６±４．３％（ｎ＝１０）；Ｐ１０〜１２：６２．１±３．８％（ｎ＝１０）；Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。しかし、年かさの動物では、パワーは、離乳後に２０％だけ低減された（Ｐ２１〜３３：２３．８±４．１％（ｎ＝７）；ｐ＜０．００５、対応のあるｔ検定）。図１２Ｍ。新生児動物と成体動物との間のてんかん活動のＮａＧｃＡ阻害におけるかかる劇的な差異は、異なる齢の動物におけるＣＬＣ−３  Ｃｌ−電流に対するＮａＧｃＡの相対的阻害と一致しており、これは、ＣＬＣ−３チャネルが、新生仔てんかんにおいて役割を果たし得ることを示唆している。
【０１１２】
てんかん様活動におけるＣＬＣ−３チャネルの機能的役割をさらに調査するために、てんかん様バースト活動を、ＣＬＣ−３  ＫＯマウス海馬スライスにおいてＭｇ２＋なしのａＣＳＦによって誘導することができたが、ＷＴマウスと比較した場合、かなり短い期間にわたってであった。興味深いことに、ＷＴマウス由来の海馬スライスをＮａＧｃＡで事前処理してＣＬＣ−３チャネルを遮断した場合、てんかん様活動はまた、ＣＬＣ−３  ＫＯマウスにおいて観察されたものと似て、非常に長くは持続しなかった。図１２Ｎおよび１２Ｏ。定量化されたデータは、ＣＬＣ−３チャネルを阻害またはノックアウトした場合、バースト潜時は有意に延長され、総バースト活動は有意に低減されたことを示した。図１２Ｐ。併せて考えると、これらのデータは、ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルが、発生中の初期脳におけるてんかん発生の間に役割を果たし得ることを示唆している。
【０１１３】
新生仔てんかん活動に対するＮａＧｃＡの効果が、０  Ｍｇ２＋モデルを超えて他のてんかんモデルに一般に適用可能であり得るかどうかもまた試験した。例えば、Ｋ＋チャネル遮断剤４−ＡＰ（５０μＭ）をバス溶液中に添加して、浸漬された海馬スライスにおいてロバストなてんかんバースト活動を誘導した。図１３Ａ。４−ＡＰ溶液への２０ｍＭのＮａＧｃＡの添加は、てんかん活動を有意に低減させ、これは、ＮａＧｃＡの洗い流し後に可逆的であった。図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃ。ＮａＧｃＡによる、パワー振幅の７０．２±５．３％の低減（ｎ＝９）。（Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。上昇した細胞外Ｋ＋（８．５ｍＭ）もまた使用して、てんかんバースト活動を惹起した。図１３Ｄ。同様に、高Ｋ＋ａＣＳＦ中の２０ｍＭのＮａＧｃＡの添加もまた、てんかんバースト活動を劇的に低減させた。図１３Ｄ、１３Ｅおよび１３Ｆ。ＮａＧｃＡは、パワー振幅を７０．８±４．９％低減させた（ｎ＝５）。（Ｐ＜０．００１、対応のあるｔ検定）。まとめると、これらの結果は、ＮａＧｃＡが、種々のてんかんモデルにおいて新生仔てんかんを強力に抑制できることを実証している。
【０１１４】
ＶＩＩ．グルコネートは、新生仔てんかんを阻害する
一実施形態では、本発明は、新生仔てんかんをグルコネート化合物で処置するステップを含む方法を企図する。一実施形態では、グルコネート化合物は、全身投与される。
【０１１５】
例えば、新生仔ラットにグルコネートを投与して、新生仔動物および成体動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏてんかん発作に対する効果を決定した。発作を誘導するために、神経毒カイニン酸（ＫＡ）（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を新生仔ラット（Ｐ１０〜１２）中に注射して、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＥＥＧ記録によって明らかにされるような、ロバストな発作活動を惹起した。図１４Ａおよび１４Ｂ；Dzhala  et  al.,  “NKCC1  transporter  facilitates  seizures  in  the  developing  brain”  Nature  Medicine  11:1205-1213  (2005)。さらに、ＮａＧｃＡ（２ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）をＫＡ注射の１０分後に注射した場合、てんかん発作活動は、新生仔動物では本質的に無効にされた。図１４Ｃおよび１４Ｄ。
【０１１６】
グルコネートの抗てんかん効果を、新生仔動物において、以前に報告された抗痙攣薬、例えば、フェノバルビタールおよびブメタニドとも比較した。フェノバルビタールは現在、わずか約５０％の有効性および潜在的な負の神経発生結果にもかかわらず、新生仔発作を処置するための第１選択の薬物である。Slaughter  et  al.,  “Pharmacological  treatment  of  neonatal  seizures:  a  systematic  review”  Journal  Of  Child  Neurology  28:351-364  (2013)。ブメタニドは、現在有望な抗てんかん薬としての評価段階にある、強力なループ利尿薬である。Loscher  et  al.,  “Cation-chloride  cotransporters  NKCC1  and  KCC2  as  potential  targets  for  novel  antiepileptic  and  antiepileptogenic  treatments”  Neuropharmacology  69:62-74  (2013)。フェノバルビタールおよびブメタニドは共に、新生仔動物においてある程度までてんかん活動を阻害したが、それらの阻害は、グルコネートほど強力ではなかった。図１４Ｃおよび１４Ｄと共に図１４Ｅ〜１４Ｈを参照のこと。定量的に、ＥＥＧパワーを、ＫＡ注射後２時間の記録期間の間の最後の３０分間において計算した場合、相対的パワーは、ＮａＧｃＡ群では７２．３％、フェノバルビタール群では３５．５％、ブメタニド群では５４．３％、それぞれ低減された。図１４Ｍ。従って、グルコネートは、新生仔発作の処置のための強力な抗てんかん薬であるようである。
【０１１７】
グルコネートの抗てんかん効果を、成体動物においても比較した。新生仔発作の強い阻害とは異なり、グルコネートは、成体発作活動に対してより少ない阻害を示した。図１４Ｉ〜１４Ｌおよび１４Ｎ。これらのデータは、脳スライス記録結果と一致している。図１４Ｇ〜１４Ｍ。さらに、新生仔動物を、ＫＡによって誘導される安定なてんかん活動に対するＮａＧｃＡの効果に関して試験したところ、ＮａＧｃＡが、ＫＡ注射の１時間後に発作活動をなおも抑制したことが見出された。図１５。従って、これらのデータは、ＮａＧｃＡが新生仔発作を処置するための有効な薬物であるという結論を可能にする。
【０１１８】
ＶＩＩＩ．ＣＬＣ−３チャネルは、てんかん発生の間Ｃｌ−恒常性を調節する
発明の機構を理解することは必要ではないが、ＣＬＣ−３チャネルは電位依存的外向き整流Ｃｌ−チャネルであるので、［Ｃｌ−］ｉにおける変化は、新生仔てんかんにおけるＣＬＣ−３チャネルの少なくとも１つの分子機構を代表し得ると考えられる。例えば、てんかんバースト活動は、１０秒よりも長く持続する場合が多かった。図１６Ａ。
【０１１９】
ＧＡＢＡ機能に対するかかる長期持続性てんかん様バーストの効果を調査するために、グラミシジン穿孔ホールセル記録を実施して、新生仔動物において細胞内Ｃｌ−をインタクトに維持した。てんかん様バースト活動を模倣する、膜脱分極シフト（１０秒間にわたって４０ｍＶ）の前および後の受容体アゴニストイソグバシン（１００μＭ、５０ミリ秒）によって誘導されるＧＡＢＡＡ受容体（ＧＡＢＡＡ−Ｒ）電流。興味深いことに、ＧＡＢＡＡ−Ｒ電流は、ＷＴでは膜脱分極シフト後に有意に増加したが、ＣＬＣ−３  ＫＯニューロンでもＣＬＣ−３チャネル遮断剤ＮａＧｃＡの存在下でも、増加しなかった。図１６Ｂおよび１６Ｃ。これらのデータは、ＣＬＣ−３チャネルが、新生仔動物においててんかん発生の間にＧＡＢＡ機能を調節し得ることを示唆している。
【０１２０】
この考えをさらに試験するために、ＧＡＢＡの興奮性機能対阻害性機能を支配するＧＡＢＡＡ−Ｒ逆転電位（ＥＧＡＢＡ）を、新生仔マウス脳スライス（例えば、Ｐ８〜Ｐ９）においてグラミシジン穿孔ホールセル記録を使用して直接測定した。予想通り、てんかん様活動は、海馬スライスを０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦで１時間処理した後に、ＥＧＡＢＡにおける大きい脱分極シフトを誘導した（ａＣＳＦ：−５９．２±２．０ｍＶ、ｎ＝１３；０  Ｍｇ２＋：−４８．２±１．１ｍＶ、ｎ＝１０）。図１６Ｄ。低濃度でのＮＫＣＣ１の特異的遮断剤ブメタニド（Ｂｕｍ、１０μＭ）による処理は、対照ＥＧＡＢＡ（破線）と比較して、ＥＧＡＢＡ（青色の線）において過分極シフトを誘導した。図６Ｅ。これらの結果は、ＮＫＣＣ１がＣｌ−をニューロン細胞中にインポートするという報告と一致している。Kaila  et  al.,  “Cation-chloride  cotransporters  in  neuronal  development,  plasticity  and  disease”  Nature  Reviews.  Neuroscience  15:637-654  (2014)；Dzhala  et  al.,  “NKCC1  transporter  facilitates  seizures  in  the  developing  brain”  Nature  Medicine  11:1205-1213  (2005)；  およびLoscher  et  al.,  “Cation-chloride  cotransporters  NKCC1  and  KCC2  as  potential  targets  for  novel  antiepileptic  and  antiepileptogenic  treatments”  Neuropharmacology  69:62-74  (2013)。しかし、ブメタニドの存在下で、てんかん様活動は、ＥＧＡＢＡの脱分極シフトをなおも引き起こし、これは、ＮＫＣＣ１以外の因子が、てんかん発生の間にＥＧＡＢＡを調節していることを示唆している。図１６Ｅ、黄色の線；Ｂｕｍ、−６８．０±１．７ｍＶ（ｎ＝９）；０  Ｍｇ２＋＋Ｂｕｍ、−５０．２±１．４ｍＶ（ｎ＝９）；（ｐ＜０．００２）。
【０１２１】
ＫＣＣ２遮断剤ＶＵ０２４０５５１（１０μＭ）による処理は、新生仔動物においてＥＧＡＢＡに影響を与えなかった。図１６Ｆ、紫色の線；−６０．８±１．９ｍＶ（ｎ＝６）。これらのデータはおそらく、この初期時点でのＫＣＣ２の低い発現レベルに起因すると説明され得る。てんかん活動は、ＥＧＡＢＡにおける正のシフトも惹起した。図１６Ｆ、オレンジ色の線；−４８．９±１．３ｍＶ（ｎ＝８）。従って、てんかん様活動誘導性ＥＧＡＢＡシフトは、新生仔動物では、ＮＫＣＣ１によってもＫＣＣ２によっても制御されない。
【０１２２】
他方、ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルをＮａＧｃＡ（２０ｍＭ）で阻害した場合、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦに曝露された場合、ＥＧＡＢＡは、さらには変更されなかった。図１６Ｇ；０  Ｍｇ２＋＋ＮａＧｃＡ：−５９．３±１．７ｍＶ（ｎ＝６）。さらに、ＣＬＣ−３  ＫＯマウスでは、ＥＧＡＢＡは、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦにおいても変化しなかった。図１６Ｈ；ＣＬＣ−３  ＫＯ＋０  Ｍｇ２＋：−５５．６±２．１ｍＶ（ｎ＝１０）。さらに、ＣＬＣ−３  ＫＯマウスにおけるＮａＧｃＡの適用は、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦではＥＧＡＢＡに対してそれ以上影響を有さなかった（−５６．６±２．４ｍＶ、ｎ＝５）。ＮａＧｃＡによるＣＬＣ−３チャネルの阻害またはノックアウトＣＬＣ−３は、正常条件では正常ＥＧＡＢＡを変化させなかった。図１６Ｇ；ＮａＧｃＡ：−６０．３±０．９ｍＶ（ｎ＝５）；ＣＬＣ−３  ＫＯ：−５５．４±２．９ｍＶ（ｎ＝９）。
【０１２３】
従って、これらの結果は、ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルが、新生仔動物においててんかん発生の間にＥＧＡＢＡを制御する際に役割を果たすことを示唆している。しかし、年かさの動物（例えば、Ｐ３０〜９０）では、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦは、ＮａＧｃＡの存在下で、ＥＧＡＢＡにおける大きい脱分極シフトをなおも誘導した。図１６Ｊ。これらのデータは、ＣＬＣ−３チャネル媒介性外向き整流Ｃｌ−電流が成体動物において実質的に減少されるという観察と一致している。図１６Ａ。
【０１２４】
ＥＧＡＢＡに加えて、てんかん発生の間のＧＡＢＡ誘導性ニューロン活動に対する異なる薬物の効果を、新生仔動物（例えば、Ｐ８〜９）において調査した。ＧＡＢＡ誘導性ニューロン活動を正確に測定するために、細胞接着記録が、ＧＡＢＡＡ−Ｒアゴニストイソグバシン（１０μＭ、３０秒）の局所適用によって惹起されるスパイク発火をモニタリングした。Tyzio  et  al.,  “Maternal  oxytocin  triggers  a  transient  inhibitory  switch  in  GABA  signaling  in  the  fetal  brain  during  delivery”  Science  314:1788-1792  (2006)。静止ＣＡ３錐体ニューロンの大部分は、イソグバシンに応答しなかった。図１６Ｋ、対照（ｎ＝３２）。しかし、０  Ｍｇ２＋処理後、ニューロンの６８％は、イソグバシン適用の際にスパイク活動を示した。図１６Ｋ、０  Ｍｇ２＋（ｎ＝１９）。ブメタニドでＮＫＣＣ１を遮断することまたはＶＵ０２４０５５１でＫＣＣ２を遮断することは、イソグバシンによって惹起されるスパイク活動を変化させなかった。図１６Ｋ；０  Ｍｇ２＋＋Ｂｕｍ（ｎ＝１９）；および０  Ｍｇ２＋＋ＶＵ（ｎ＝２１）。対照的に、ＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルを阻害するためのＮａＧｃＡの適用は、０  Ｍｇ２＋処理後に、イソグバシンによって誘導されるスパイク活動を本質的に無効にした。図１６Ｋ；０  Ｍｇ２＋＋ＮａＧｃＡ（ｎ＝１８）。これらの観察についての定量化されたデータは、図４Ｌに示される。
【０１２５】
これらのデータは、新生仔動物におけるＣＬＣ−３  Ｃｌ−チャネルの活性化が、てんかん発生の間のＧＡＢＡ興奮性活動を増強すること、およびＣＬＣ−３チャネルを遮断することが、興奮性ＧＡＢＡ活動を低減させることを介して新生仔発作を阻害するための有効な方法であることを示している。
【０１２６】
ＩＸ．医薬製剤および／または組成物
本発明は、医薬組成物（例えば、上記化合物を含む）をさらに提供する。本発明の医薬組成物は、局所処置が所望されるか全身処置が所望されるか、および処置される領域に依存して、いくつかの方法で投与され得る。投与は、外用（点眼、ならびに膣および直腸送達を含む粘膜へのものを含む）、肺（例えば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹き入れによる；気管内、鼻腔内、表皮および経皮）、経口または非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは注入；または頭蓋内、例えば、くも膜下腔内もしくは脳室内投与が含まれる。特に、グルコン酸ナトリウムの筋肉内注射および／または静脈内注射は、無菌食塩水溶液中で、１〜１００ｍＭのグルコネートのおおよその濃度範囲で送達され得る。発明の機構を理解することは必要ではないが、これらの濃度範囲は、グルコン酸ナトリウムが高度に水溶性であるために達成可能であると考えられる。
【０１２７】
外用投与のための医薬組成物および製剤には、経皮パッチ剤、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、スプレー剤、液体剤および散剤が含まれ得る。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要であり得るまたは望まれ得る。
【０１２８】
経口投与のための組成物および製剤には、散剤もしくは粒剤、水もしくは非水性媒体中の懸濁物もしくは液剤、カプセル剤、サシェ剤または錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望まれ得る。
【０１２９】
非経口、くも膜下腔内または脳室内投与のための組成物および製剤には、緩衝剤、希釈剤、ならびに例えば浸透増強剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤であるがこれらに限定されない他の適切な添加物もまた含み得る無菌水溶液が含まれ得る。
【０１３０】
本発明の医薬組成物には、液剤、エマルジョン剤およびリポソーム含有製剤が含まれるがこれらに限定されない。これらの組成物は、事前に作られた液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体が含まれるがこれらに限定されない種々の構成要素から生成され得る。
【０１３１】
単位剤形で簡便に提示され得る本発明の医薬製剤は、医薬品産業において周知の従来の技術に従って調製され得る。かかる技術は、活性成分を医薬担体または賦形剤と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を、液体担体もしくは微細に分割された固体担体またはその両方と、均一かつ緊密に会合させ、次いで、必要に応じて、製品を成形することによって、調製される。
【０１３２】
本発明の組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、液体シロップ剤、軟質ゲル剤、坐剤および浣腸であるがこれらに限定されない多くの可能な剤形のいずれかへと製剤化され得る。本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体中の懸濁物としても製剤化され得る。水性懸濁物は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、懸濁物の粘度を増加させる物質をさらに含み得る。懸濁物は、安定剤もまた含み得る。
【０１３３】
本発明の一実施形態では、医薬組成物は、発泡体として製剤化および使用され得る。医薬発泡体には、例えば、エマルジョン剤、マイクロエマルジョン剤、クリーム剤、ゼリー剤およびリポソーム剤であるがこれらに限定されない製剤が含まれる。性質は基本的に類似しているが、これらの製剤は、最終製品の構成要素および稠性が異なる。
【０１３４】
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取り込みを増強する薬剤もまた、本発明の医薬組成物および他の組成物に添加され得る。例えば、カチオン性脂質、例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えば、ポリリシン（ＷＯ９７／３０７３１）もまた、オリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強する。
【０１３５】
本発明の組成物は、医薬組成物において従来から見出される他の補助的構成要素をさらに含み得る。従って、例えば、組成物は、さらなる適合性の薬学的に活性な材料、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬もしくは抗炎症剤などを含み得、または本発明の組成物の種々の剤形を物理的に製剤化する際に有用なさらなる材料、例えば、色素、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定剤を含み得る。しかし、かかる材料は、添加された場合に、本発明の組成物の構成要素の生物活性を過度に妨害すべきではない。製剤は、無菌化され得、所望に応じて、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色物質、香味物質および／または芳香物質などと混合され得る。
【０１３６】
投薬は、処置される疾患状態の重症度および応答性に依存し、処置の過程は、数日間〜数カ月間持続する、または治癒がもたらされるまで、もしくは疾患状態の減少が達成されるまで持続する。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積の測定値から計算され得る。投与する医師は、最適な投薬量、投薬方法論および反復率を容易に決定することができる。最適な投薬量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的潜在力に依存して変動し得、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であることが見出されたＥＣ５０に基づいて、または本明細書に記載される例に基づいて、一般に推定され得る。一般に、投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇであり、毎日、毎週、毎月または毎年１回または複数回与えられ得る。処置する医師は、体液または組織中の薬物の測定された滞留時間および濃度に基づいて、投薬のための反復率を推定できる。首尾よい処置の後、疾患状態の再発を予防するために、対象に維持治療を受けさせることが望まれ得、化合物は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で、毎日１回または複数回〜２０年毎に１回、投与される。
【０１３７】
Ｘ．薬物送達系
本発明は、大まかに均一な分布を提供するいくつかの薬物送達系が、制御可能な速度の放出を有することを企図する。薬物送達系を創出する際に有用な種々の異なる媒体が、以下に記載される。いずれか１つの媒体または担体が本発明を限定することは意図しない。任意の媒体または担体が、別の媒体または担体と組み合わされ得ることに留意されたい；例えば、一実施形態では、化合物に結合されたポリマーミクロ粒子担体は、ゲル媒体と組み合わされ得る。
【０１３８】
本発明によって企図される担体または媒体は、ゼラチン、コラーゲン、セルロースエステル、デキストラン硫酸、ペントサンポリ硫酸、キチン、サッカライド、アルブミン、フィブリンシーラント、合成ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのブロックポリマー、ポリエチレングリコール、アクリレート、アクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレートが含まれるがこれに限定されないメタクリレート、ポリ（オルトエステル）、シアノアクリレート、ゼラチン−レゾルシン−アルデヒド型生体接着剤、ポリアクリル酸ならびにそれらのコポリマーおよびブロックコポリマーを含む群から選択される材料を含む。
【０１３９】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載される治療剤を含む薬物送達系を企図する。
ミクロ粒子
【０１４０】
本発明の一実施形態は、ミクロ粒子を含む媒体を企図する。好ましくは、ミクロ粒子は、リポソーム、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、マイクロカプセルおよびナノカプセルを含む。好ましくは、本発明によって企図される一部のミクロ粒子は、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ−グリコール酸およびポリ−乳酸が含まれるがこれらに限定されない脂肪族ポリエステル、ヒアルロン酸、改変多糖、キトサン、セルロース、デキストラン、ポリウレタン、ポリアクリル酸、シュード−ポリ（アミノ酸）（psuedo-poly(amino  acids)）、ポリヒドロキシ酪酸（polyhydroxybutrate）関連コポリマー、ポリ酸無水物、ポリメチルメタクリレート、ポリ（エチレンオキシド）、レシチンならびにリン脂質を含む。
【０１４１】
リポソーム
本発明の一実施形態は、本明細書に記載される治療剤を結合および放出することが可能なリポソームを企図する。リポソームは、リン脂質などの両親媒性分子でできた、水性コアを囲む微視的球状脂質二重層である。例えば、リポソームは、リン脂質ミセルの疎水性テイル間に治療剤を捕捉し得る。水溶性薬剤は、コア中に捕捉され得、脂溶性薬剤は、シェル様二重層中に溶解され得る。リポソームは、水溶性化学物質および水不溶性化学物質が界面活性剤の使用も他の乳化剤の使用もなしに媒体中で一緒に使用されるのを可能にするという点で、特別な特徴を有する。リポソームは、リン脂質（phosopholipid）を水性媒体中に力強く混合することによって、自発的に形成し得る。水溶性化合物は、リン脂質を水和させることが可能な水溶液中に溶解される。従って、リポソームの形成の際に、これらの化合物は、水性リポソーム中心内に捕捉される。リン脂質膜であるリポソーム壁は、油などの脂溶性材料を保持する。リポソームは、組み込まれた化合物の制御放出を提供する。さらに、リポソームは、薬物動態学的半減期を増加させるために、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーでコーティングされ得る。本発明の一実施形態は、リポソーム産生を洗練するための超高せん断テクノロジーを企図し、具体的に設計された構造的特徴を有する安定な単層（単一層）リポソームを生じる。リポソームのこれらの独自の特性は、通常は不混和性の化合物の同時貯蔵、およびそれらの制御放出の能力を可能にする。
【０１４２】
一部の実施形態では、本発明は、カチオン性およびアニオン性リポソーム、ならびに中性脂質を有するリポソームを企図する。好ましくは、カチオン性リポソームは、材料および脂肪酸リポソーム構成要素を混合し、それらを荷電関連させることによって、負に荷電した材料を含む。明らかに、カチオン性リポソームまたはアニオン性リポソームの選択は、最終リポソーム混合物の所望のｐＨに依存する。カチオン性リポソームの例には、リポフェクチン、リポフェクタミンおよびｌｉｐｏｆｅｃｔａｃｅが含まれる。
【０１４３】
本発明の一実施形態は、少なくとも１つの治療剤の制御放出を提供するリポソームを含む媒体を企図する。好ましくは、制御放出が可能なリポソームは、以下である：ｉ）生分解性かつ非毒性である；ｉｉ）水溶性化合物および油溶性化合物の両方を運搬する；ｉｉｉ）扱いにくい（ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ）化合物を可溶化する；ｉｖ）化合物の酸化を防止する；ｖ）タンパク質安定化を促進する；ｖｉ）水和を制御する；ｖｉｉ）例えば、脂肪酸鎖長、脂肪酸脂質組成、飽和および不飽和脂肪酸の相対的な量、ならびに物理的配置であるがこれらに限定されない、二重層組成におけるバリエーションによって、化合物の放出を制御する；ｖｉｉｉ）溶媒依存性を有する；ｉｖ）ｐＨ依存性を有する、ならびにｖ）温度依存性を有する。
【０１４４】
リポソームの組成物は、２つの分類へと広くカテゴライズされる。従来のリポソームは一般に、糖脂質を含んでも含まなくてもよい合成の同一鎖リン脂質を含み得る安定化された天然レシチン（ＰＣ）の混合物である。
【０１４５】
特別なリポソームは、以下を含み得る：ｉ）両極性脂肪酸；ｉｉ）組織標的化治療のために抗体を結合する能力；ｉｉｉ）例えば、リポタンパク質および炭水化物であるがこれらに限定されない材料でコーティングされる；ｉｖ）多重カプセル化、ならびにｖ）エマルジョン適合性。
【０１４６】
リポソームは、例えば、超音波処理および振動であるがこれらに限定されない方法によって、実験室で容易に作製され得る。あるいは、化合物送達リポソームは、市販される。例えば、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．は、具体的な送達要件のためのカスタム設計されたリポソームを製造していることが公知である。
【０１４７】
ミクロスフェア、ミクロ粒子およびマイクロカプセル剤
ミクロスフェアおよびマイクロカプセル剤は、一般に均一な分布を維持するそれらの能力に起因して有用であり、安定な制御された化合物放出を提供し、産生および調剤するのに経済的である。好ましくは、関連した送達ゲルもしくは化合物含浸ゲルは、透明であり、またはあるいは、前記ゲルは、医療関係者による容易な視覚化のために着色される。
【０１４８】
ミクロスフェアは、商業的に取得可能である（Ｐｒｏｌｅａｓｅ（登録商標）、Ａｌｋｅｒｍｅ’ｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）。例えば、少なくとも１つの治療剤を含むフリーズドライされた媒体が、２０〜９０μｍの範囲のミクロスフェアを製造するために、適切な溶媒中にホモジナイズされ、噴霧される。次いで、精製、カプセル化および貯蔵の局面の間に持続放出の完全性を維持する技術に従う。Scott  et  al.,  Improving  Protein  Therapeutics  With  Sustained  Release  Formulations,  Nature  Biotechnology,  Volume  16:153-157  (1998)。
【０１４９】
生分解性ポリマーの使用によるミクロスフェア組成物の改変は、治療剤放出の速度を制御する能力を提供し得る。Miller  et  al.,    Degradation  Rates  of  Oral  Resorbable  Implants  {Polylactates  and  Polyglycolates:  Rate  Modification  and  Changes  in  PLA/PGA  Copolymer  Ratios,    J.  Biomed.  Mater.  Res.,  Vol.  II:711-719  (1977)。
【０１５０】
あるいは、持続放出または制御放出ミクロスフェア調製物は、水中乾燥法（ｉｎ−ｗａｔｅｒ  ｄｒｙｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して調製され、生分解性ポリマー金属塩の有機溶媒溶液が、最初に調製される。引き続いて、治療剤の溶解または分散された媒体が、生分解性ポリマー金属塩溶液に添加される。治療剤の生分解性ポリマー金属塩に対する重量比は、例えば、約１：１０００００〜約１：１、好ましくは約１：２００００〜約１：５００、より好ましくは約１：１００００〜約１：５００であり得る。次に、生分解性ポリマー金属塩および治療剤を含む有機溶媒溶液が、油／水エマルジョン剤を調製するために、水相中に注がれる。次いで、油相中の溶媒が、ミクロスフェアを提供するために、蒸発により除かれる。最後に、これらのミクロスフェアは次いで、回収、洗浄および凍結乾燥される。その後、ミクロスフェアは、残余の水および有機溶媒を除去するために、減圧下で加熱され得る。
【０１５１】
生分解性ポリマー金属塩および治療剤混合物と適合性のミクロスフェアを産生する際に有用な他の方法は、以下である：ｉ）コアセルベート化剤の段階的添加の間の相分離；ｉｉ）水中乾燥法または相分離法、抗凝集剤が、粒子凝集を防止するために添加される、ならびにｉｉｉ）噴霧乾燥法による。
【０１５２】
一実施形態では、本発明は、およそ１日から６カ月の間の持続時間にわたって治療剤の制御放出を送達することが可能なミクロスフェアまたはマイクロカプセルを含む媒体を企図する。一実施形態では、ミクロスフェアまたはミクロ粒子は、医師が、それが調剤される際に媒体を明瞭に見ることができるようにするために、着色され得る。別の実施形態では、ミクロスフェアまたはマイクロカプセルは、透明であり得る。別の実施形態では、ミクロスフェアまたはミクロ粒子には、放射線不透過性蛍光透視鏡色素が含浸される。
【０１５３】
制御放出マイクロカプセルは、公知のカプセル化技術、例えば、遠心押出、パンコーティングおよび空気懸濁（ａｉｒ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を使用することによって産生され得る。かかるミクロスフェアおよび／またはマイクロカプセルは、所望の放出速度を達成するために操作され得る。例えば、Ｏｌｉｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）（Ｍａｃｒｏｍｅｄ）は、制御放出ミクロスフェア系である。これらの特定のミクロスフェアは、５μｍ〜５００μｍの間の範囲の均一なサイズで利用可能であり、生体適合性ポリマーおよび生分解性ポリマーから構成される。ミクロスフェアの特定のポリマー組成は、バースト効果の有効な管理を含む、カスタム設計されたミクロスフェアが可能なように、治療剤放出速度を制御することができる。ＰｒｏＭａｘｘ（登録商標）（Ｅｐｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）は、タンパク質−マトリックス送達系である。この系は、性質が水性であり、標準的な医薬品送達モデルに適応可能である。特に、ＰｒｏＭａｘｘ（登録商標）は、小分子薬物および高分子薬物の両方を送達する生体腐食性（bioerodible）タンパク質ミクロスフェアであり、ミクロスフェアのサイズおよび所望の放出特徴の両方に関してカスタマイズされ得る。
【０１５４】
一実施形態では、ミクロスフェアまたはミクロ粒子は、内部腸間膜のｐＨよりも低いｐＨにおいて安定なｐＨ感受性カプセル化材料を含む。内部腸間膜における典型的な範囲は、ｐＨ７．６〜ｐＨ７．２である。結果的に、マイクロカプセルは、７未満のｐＨで維持すべきである。しかし、ｐＨ変動性が予測される場合、ｐＨ感受性材料は、マイクロカプセルの溶解に必要な異なるｐＨ基準に基づいて選択され得る。従って、カプセル化された化合物は、溶解が所望されるｐＨ環境のために選択され、安定性を維持するために事前選択されたｐＨで貯蔵される。カプセル化物質として有用なｐＨ感受性材料の例は、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ−１００またはＳ−１００（Ｒｏｈｍ  ＧＭＢＨ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ポリビニルアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレートおよびセルロースアセテートトリメリテート（cellulose  acetate  trimellitate）である。一実施形態では、脂質が、マイクロカプセルの内部コーティングを構成する。これらの組成物では、これらの脂質は、脂肪酸の部分エステルおよびヘキシトール無水物、ならびに食用脂肪、例えば、トリグリセリドであり得るが、これらに限定されない。Ｌｅｗ  Ｃ．Ｗ．、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  ｐＨ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｃａｐｓｕｌｅ  Ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ。米国特許第５，３６４，６３４号（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１５５】
一実施形態では、本発明は、ゼラチン、またはゼラチンと類似の電荷密度を有する他のポリマー性カチオン（即ち、ポリ−Ｌ−リシン）を含むミクロ粒子を企図し、一次ミクロ粒子を形成するための複合体として使用される。一次ミクロ粒子は、以下の組成の混合物として産生される：ｉ）ゼラチン（６０ブルーム、ブタ皮膚由来のＡ型）、ｉｉ）コンドロイチン−４−硫酸（０．００５％〜０．１％）、ｉｉｉ）グルタルアルデヒド（２５％、グレート１）、ならびにｉｖ）１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ塩酸塩）、および超高純度スクロース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）。ゼラチンの供給源は、重要とは考えられていない；ゼラチンは、ウシ、ブタ、ヒトまたは他の動物供給源由来であり得る。典型的には、ポリマー性カチオンは、１９，０００ダルトン〜３０，０００ダルトンの間である。次いで、コンドロイチン硫酸が、コアセルベーション剤としての硫酸ナトリウムまたはエタノールとの複合体に添加される。
【０１５６】
ミクロ粒子の形成後、治療剤は、ミクロ粒子の表面に直接結合される、または「架橋」もしくは「スペーサー」を使用して間接的に結合される。ゼラチンのリシン基のアミノ基は、化合物の直接的カップリングのための部位を提供するために、容易に誘導体化される。あるいは、スペーサー（すなわち、連結分子、および標的化リガンド上の誘導体化部分）、例えば、アビジン−ビオチンもまた、標的化リガンドをミクロ粒子に間接的にカップリングするために有用である。ミクロ粒子の安定性は、ＥＤＣ塩酸塩によって誘導されるグルタルアルデヒド−スペーサー架橋結合の量によって制御される。制御放出媒体もまた、グルタルアルデヒド−スペーサー架橋結合の最終密度によって、実験的に決定される。
【０１５７】
一実施形態では、本発明は、治療剤と共にフィブリノーゲンまたはトロンビンを含む組成物を噴霧乾燥させることによって形成されるミクロ粒子を企図する。好ましくは、これらのミクロ粒子は、可溶性であり、選択されたタンパク質（すなわち、フィブリノーゲンまたはトロンビン）は、ミクロ粒子の壁を創出する。結果的に、治療剤は、ミクロ粒子のタンパク質壁内に、およびそれらの間に組み込まれる。Ｈｅａｔｈら、Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  Ｉｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ。米国特許第６，１１３，９４８号（参照により本明細書に組み込まれる）。生組織へのミクロ粒子の適用後、フィブリノーゲンとトロンビンとの間の引き続く反応が、組織シーラントを創出し、それによって、組み込まれた化合物を、すぐ周囲の領域中に放出する。
【０１５８】
当業者は、ミクロスフェアの形状が正確に球状である必要がないことを理解する；非常に小さい粒子のみが、手術部位（すなわち、開放または閉鎖のいずれか）中またはその上に、噴霧されるまたは広げられることが可能だからである。一実施形態では、ミクロ粒子は、ポリラクチド、ポリグリコリド、およびラクチド／グリコリドのコポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、改変多糖ならびに任意の他の周知の材料からなる群から選択される生体適合性および／または生分解性材料から構成される。
【０１５９】
実験
細胞培養および脳スライスのための動物プロトコールは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＡＣＵＣによって承認された。成体マウスまたは新生仔ラットに対するｉｎ  ｖｉｖｏ実験について、全ての手順は、動物研究のための倫理ガイドラインに従って、それぞれ、Ｆｕｄａｎ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙまたはＳｏｕｔｈ  Ｃｈｉｎａ  Ｎｏｒｍａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎによって承認された。動物部屋は、１２時間の明／暗サイクルで自動的に制御し、水および食物は、自由に利用可能にした。
【実施例】
【０１６０】
（実施例Ｉ）
細胞培養およびトランスフェクション
マウス皮質ニューロンを、以前に記載されたように、新生Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製した。Qi  et  al.,  “Cyclothiazide  induces  robust  epileptiform  activity  in  rat  hippocampal  neurons  both  in  vitro  and  in  vivo”  The  Journal  Of  Physiology  571:605-618  (2006)。簡潔に述べると、新生マウス大脳皮質を、氷冷ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水溶液中でばらばらにし、洗浄し、０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡで３７℃で２０分間消化した。血清含有培地によるトリプシンの非活性化後、細胞を遠心分離し、再懸濁し、２４ウェルプレート中に、１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で、皮質アストロサイトの単層上に播種した。ニューロン培養培地は、ＭＥＭ（５００ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％の胎仔ウシ血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１０ｍｌのＢ−２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｍｇのＮａＨＣＯ３、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびに２５単位／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを含有した。ＡｒａＣ（４μＭ、Ｓｉｇｍａ）を添加して、アストロサイトの過剰な増殖を阻害した。細胞培養物を、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃で１４〜２１日間維持した。
【０１６１】
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、１０％のＦＢＳおよび２５単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持した。ＰＥＩキット（分子量２５，０００、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を、ＨＥＫ細胞トランスフェクションのために適用した。簡潔に述べると、１μｇのＤＮＡを、５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈し、次いで、４μｌのＰＥＩ（１μｇ／μｌ）と混合し、５分間インキュベートし、５００μｌの培地を含有する培養ウェルに一滴ずつ添加した。５時間のインキュベーション後、トランスフェクション試薬を、新たな培養培地で洗い流した。トランスフェクションの２日後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、電気生理学的研究に使用した。ｅＧＦＰプラスミドに融合させたラットＣＬＣ−３の短い転写物（ｐＣＬＣ３ｓＧＦＰ）を、Ａｄｄｇｅｎｅから購入した（プラスミド番号５２４２３）。Li  et  al.,  “The  ClC-3  chloride  channel  promotes  acidification  of  lysosomes  in  CHO-K1  and  Huh-7  cells”  American  Jjournal  Of  Physiology”  Cell  Physiology  282:C1483-1491  (2002)。
【０１６２】
（実施例ＩＩ）
細胞生存度アッセイ
エチジウムホモダイマー−１およびカルセイン−ＡＭを含有するＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌ３２２４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞生存度を試験した。エチジウムホモダイマー−１は、細胞ＤＮＡに結合し、典型的には、死細胞を赤色蛍光で標識するが、カルセイン−ＡＭは、生細胞中のエステラーゼによって切断されて、強い緑色蛍光を生じ得る。薬物処理後、ニューロンを、１μＭのカルセイン−ＡＭおよび４μＭのエチジウムホモダイマー−１を含有するバス溶液中で、室温で４０分間インキュベートした。細胞の生存および死の比率を、それぞれ、緑色蛍光細胞および赤色蛍光細胞のパーセンテージを定量化することによって測定した。各群について、各カバーガラスの少なくとも５つの視野を、データ解析のためにイメージングした。
【０１６３】
（実施例ＩＩＩ）
マウス脳スライス調製
脳スライスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄性および雌性）から調製した。動物を、Ａｖｅｒｔｉｎ（トリブロモエタノール、２５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、断頭した。海馬水平切片（４００μｍ）を、以下の氷冷人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中で、Ｌｅｉｃａ  ＶＴ１２００Ｓビブラトームによって調製した（ｍＭで）：１２５  ＮａＣｌ、２６  ＮａＨＣＯ３、１０  グルコース、２．５  ＫＣｌ、２．５  ＣａＣｌ２、１．２５  ＮａＨ２ＰＯ４および１．３  ＭｇＳＯ４、モル浸透圧濃度２９０〜３００ｍＯｓｍ、９５％のＯ２／５％のＣＯ２を通気。次いで、スライスを、カルボゲン（９５％のＯ２／５％のＣＯ２）で飽和させた正常ａＣＳＦを含有するインキュベーションチャンバーに３３℃で３０分間移し、その後、使用前に室温で１時間回復させた。個々のスライスを、浸された記録チャンバーに移し、これらを、９５％のＯ２／５％のＣＯ２で飽和させたａＣＳＦで３１〜３３℃（ＴＣ−３２４Ｂ、Ｗａｒｎｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ）で持続的に灌流した（２〜３ｍｌ／分）。スライスを、ＤＩＣオプティックを備えたＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して、赤外線光学で可視化した。
【０１６４】
（実施例ＩＶ）
電気生理学
細胞培養
培養されたニューロンを、以下からなるバス溶液の連続的灌流を伴って、記録チャンバー中に配置した（ｍＭ）：１２８  ＮａＣｌ、１０  グルコース、２５  ＨＥＰＥＳ、５  ＫＣｌ、２  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＳＯ４、ＮａＯＨでｐＨ７．３に調整、モル浸透圧濃度約３００ｍＯｓｍ。電流クランプモード下で自発的発火を記録するために、ピペットに、以下を含有する内部溶液を満たした（ｍＭで）：１２５  Ｋ−グルコネート、５  Ｎａ−ホスホクレアチン、５  ＥＧＴＡ、１０  ＫＣｌ、１０  ＨＥＰＥＳ、４  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．３  Ｎａ−ＧＴＰ、２８０〜２９０ｍＯｓｍ、ＫＯＨでｐＨ７．３に調整。培養されたニューロンにおけるてんかん様活動を、１０μＭのＣＴＺで２４時間、または１μＭのＫＡで２時間、または５０μＭの４−ＡＰで２時間、誘導した。バースト活動は、以前に記載されたように定義した。Qi  et  al.,  “Cyclothiazide  induces  robust  epileptiform  activity  in  rat  hippocampal  neurons  both  in  vitro  and  in  vivo”  The  Journal  Of  Physiology  571:605-618  (2006)。簡潔に述べると、大きい脱分極シフト（≧１０ｍＶの脱分極、持続時間≧３００ミリ秒）の上を覆う少なくとも５つの連続した作用電位。
【０１６５】
Ｃｌ−電流記録のために、０  Ｃａ２＋ピペット溶液は、以下を含有した（ｍＭ）：１２５  ＣｓＣｌ、５  Ｎａ−ホスホクレアチン、１０  ＨＥＰＥＳ、５  ＥＧＴＡ、５  ＴＥＡＣｌ、４  ＭｇＡＴＰ（ＣｓＯＨでｐＨ７．３に調整、２８０〜２９０ｍＯｓｍ）。
【０１６６】
Ｃｌ−電流を単離するために：（１）細胞外Ｎａ＋を、ＮＭＤＧ＋によって置き換え、電位依存的Ｎａ＋チャネルを、テトロドトキシン（ＴＴＸ）によって遮断した；（２）Ｋ＋およびＣａ２＋を、バス溶液から除去した；（３）Ｋ＋チャネルを、ピペット溶液中のＣｓ＋およびテトラエチルアンモニウム（tetraethylamonium）（ＴＥＡ）、ならびにバス溶液中の４−ＡＰで遮断した；（４）ＣｄＣｌ２をバス溶液中に添加して、Ｃａ２＋チャネルを遮断した；（５）ピクロトキシン（５０μＭ）もまた含めて、ＧＡＢＡＡ受容体を遮断した。従って、外部溶液は、以下を含有した（ｍＭで）：１３５  ＮＭＤＧ−Ｃｌ、２０  ＨＥＰＥＳ、２０  グルコース、５  ４−ＡＰおよび２  ＭｇＳＯ４、１μＭのＴＴＸ、２００μＭのＣｄＣｌ２および５０μＭのピクロトキシンを補充、モル浸透圧濃度約３００ｍＯｓｍ、９５％のＯ２／５％のＣＯ２を通気後にｐＨ７．３〜７．４。−８０ｍＶから＋９０ｍＶまでの電位ステップ（１０ｍＶ増分）を、０ｍＶの保持電位（ＥＣｌ−  約０ｍＶ）から適用した。データを、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ａ増幅器およびｐＣＬＡＭＰ９ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて収集した。
【０１６７】
脳スライス記録
フィールド電位記録を、外部溶液を満たしたガラス電極（２〜４ΜΩの先端抵抗）を用いて実施した。ガラス電極を、ＣＡ３錐体層中に配置した。電流クランプ（Ｉ＝０）記録のために、増幅器を、０．１〜５ＫＨｚのバンドパスフィルターと共に、１００×に設定した。全ての記録を、３１〜３３℃で実施した。てんかん活動を、Ｍｇ２＋なしのａＣＳＦによって、またはａＣＳＦ中５０μＭの４−ＡＰもしくは８．５ｍＭのＫ＋の添加によって惹起した。
【０１６８】
ハミング窓関数を、パワースペクトル解析の前に適用した。パワーを、薬物適用の前、その間およびその後に、順次的な５分間の時間ウインドウにおいて、０．１〜１０００Ｈｚの周波数バンドにおけるシグナルの二乗平均平方根値を積分することによって計算した。スライス毎の電極接触変動性を回避するために、パワー値を、各スライスについて薬物適用の前の対照条件に対して標準化し、次いで、統計解析のために異なるスライスにわたって平均した。
【０１６９】
（実施例Ｖ）
免疫染色およびウエスタンブロット
脳スライスを、免疫染色のために２００μｍの厚さ、ウエスタンブロットのために４００μｍの厚さで、上記電気生理学プロトコールに従って調製した。一般に、スライスを、室温で１時間回復させ、次いで、２つの群にランダムに分割した。スライスの１つの群を、正常ａＣＳＦ中で３３℃で１時間インキュベートした。スライスの別の群を、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦ中で３３℃で１時間インキュベートした。次いで、スライスを、４％のＰＦＡによって４℃で一晩固定した。
【０１７０】
免疫染色
ＣＬＣ−３染色のために、スライスを、ブロッキング溶液（０．１ＭのＰＢＳ中、０．３％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘならびに５％の正常ロバおよびヤギ血清）で２時間事前処理し、次いで、ＣＬＣ−３一次抗体（ウサギ、１：２００、Ａｌｏｍｏｎｅ、ＡＣＬ−００１）と共に７２時間インキュベートした。一部のスライスを、対照としてウサギＩｇＧと共にインキュベートした。０．０１％のｔｒｉｔｏｎ−Ｘを有するＰＢＳ中で３回洗浄した後、脳切片を、Ｃｙ３にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ二次抗体（１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に、室温で２時間インキュベートした。脳切片を、退色防止マウント溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、ガラススライド上にマウントした。蛍光画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦点顕微鏡システム（ＦＶ１０００）で獲得した。各スライスについて、ＣＡ３の少なくとも２〜３個の視野をイメージングした。ＣＡ３錐体層におけるＣＬＣ３蛍光強度を定量化するために、共焦点画像を、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して解析した。
ウエスタンブロット
【０１７１】
４００μｍの厚さの海馬スライスを、室温で１時間回復させた後に、２つの群にランダムに分割したが、これらは、免疫染色について上記したものと同じであった。海馬を、氷冷ａＣＳＦ中でばらばらにした。タンパク質を、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１：１００のフッ化フェニルメチルスルホニルおよび１：２００のプロテアーゼ阻害剤を含有）で抽出した。次いで、１×ローディング色素緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液（４×））および１％のベータ−ＭＥをタンパク質試料中に添加し、完全に混合する。タンパク質抽出物（２μｇ／μｌ、１レーン当たり１５μｌ）を、５５℃で２０分間煮沸し、１０％ゲル上にロードし、室温でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して分離した（７０Ｖで５０分間、次いで、９０Ｖに切り替えて２時間）。次いで、ゲルを、ＰＶＤＦ膜上にブロットした。ブロットを、Ｔｒｉｓ−緩衝溶液（１×ＴＢＳ）中１％のＴｗｅｅｎ−２０中、５％のミルクの溶液を使用して、室温で１時間ブロッキングした。ＣＬＣ３に対する一次抗体（ウサギ、１：３００、Ａｌｏｍｏｎｅ、ＡＣＬ−００１）およびＧＡＰＤＨに対する一次抗体（ウサギ、１：２００００、Ｓｉｇｍａ、Ｇ９５４５）を、１×ＴＢＳ中に５％のミルクおよび１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するブロッキング溶液中で、４℃でローテータ上で一晩適用した。次いで、ブロットを、１：２００００希釈の抗ウサギ二次抗体と共に室温で１．５時間インキュベートし、１×ＴＢＳを使用して３回洗浄し、次いで、Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてシグナルをイメージングした。
【０１７２】
（実施例ＶＩ）
脳波（ＥＥＧ）記録
新生仔および成体げっ歯類におけるグルコネートのｉｎ  ｖｉｖｏ抗てんかん効果を試験するために、Ｐ８〜１２のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットまたは２月齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ペントバルビタールナトリウム（新生仔ラットに対して５０ｍｇ／ｋｇ、成体マウスに対して１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で深く麻酔した。２つのステンレス鋼スクリュー（直径１ｍｍ）を、ＥＥＧ記録電極として、皮質の上の頭蓋骨中に挿入し、１つの接地電極ならびに１つの参照電極を、十字縫合の＋１．８ｍｍ前、正中線に対して±０．５ｍｍ側方、および皮質表面の下１ｍｍに位置づけた。全ての電極を、マイクロコネクターに取り付け、歯科用セメントで頭蓋骨上に固定した。手術後に、新生仔ラットを母親の元に戻し、引き続くＥＥＧ記録の前に２日間にわたって回復させた。成体マウスを、移植した電極の損傷を予防するために１匹で収容し、ＥＥＧ記録の前に少なくとも５日間回復させた。
【０１７３】
ＥＥＧのベースラインを、０．５〜１時間記録して、動物を環境に順応させた。カイニン酸（２ｍｇ／ｋｇ）を、新生仔てんかん誘導のために腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。Ｄ−グルコン酸ナトリウム塩（２ｇ／ｋｇ）または０．９％食塩水を、ＫＡ投与の１０分後にｉ．ｐ．注射した。ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）を、成体マウスにおいて安定なてんかんバースト活動を誘導するために腹腔内投与し、Ｄ−グルコン酸ナトリウム塩（１ｇ／ｋｇおよび２ｇ／ｋｇ）または０．９％食塩水を、ＰＴＺ投与の１０分前にｉ．ｐ．注射した。てんかん様活動を、ＰＴＺ注射後１時間にわたってモニタリングした。Qian  et  al.,  “Epileptiform  response  of  CA1  neurones  to  convulsant  stimulation  by  cyclothiazide,  kainic  acid  and  pentylenetetrazol  in  anaesthetized  rats”  Seizure  20:312-319  (2011)。実験後、動物にジアゼパムを注射して、動物を再発性てんかんから保護した。
【０１７４】
電気生理学的シグナルを、ＮｅｕｒｏＬｏｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｇｉｔｉｍｅｒ  Ｌｔｄ、Ｈｅａｒｔｓ、ＵＫ）を使用することによって、増幅（１０００×）およびフィルタリングし（０〜５００Ｈｚ）、Ｄ−Ａコンバーター、ＣＥＤ  １４０１  ｍｉｃｒｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を介して可視化し、ＰＣ中に保存した。
ＥＥＧの解析
【０１７５】
新生仔ＥＥＧシグナルにおける異なる周波数構成要素のパワーレベルを、パワースペクトル解析によって明らかにした。パワーを、１〜１００Ｈｚの支配的な周波数バンド（ＥＥＧバンド）のパワーを積分することによって、１分の時間ウインドウにおいて計算した。
【０１７６】
成体ＥＥＧシグナルを、ｓｐｉｋｅ  ２ソフトウェア（ＣＥＤ  １４０１のための解析プログラム、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）によって解析した。ＥＥＧスパイクは、ベースライン振幅の２倍を上回ると定義し、ＥＥＧバーストは、高い周波数（＞１Ｈｚ）および１０秒よりも長く持続する高い振幅の複数のスパイクを有すると定義した。スパイクまたはバーストの潜時は、ＰＴＺ注射から最初のスパイクまたは最初のバーストのいずれかまでの時間として定義した。
【０１７７】
（実施例ＶＩＩ）
発作行動試験
雄性マウスを、以下の３つの群に分割した：ビヒクル対照群（食塩水、ｎ＝９）、１ｇ／ｋｇのＤ−グルコン酸ナトリウム群（ｎ＝１０）、および２ｇ／ｋｇのＤ−グルコン酸ナトリウム群（ｎ＝１１）。ＰＴＺ（５０ｍｇ／ｋｇ）を、薬物処置の１時間後に腹腔内投与した。ＰＴＺ注射後、行動を、１時間にわたってモニタリングおよび観察した。発作行動を、Ｒａｃｉｎｅスコアに従って分類した：ステージ０、応答なし；ステージ１、顔面のピクつき；ステージ２、うなずき；ステージ３、前肢間代性、直立した尾；ステージ４、前肢間代性を伴って立ち上がる；ステージ５、立ち上がりおよび転倒、ジャンプ、全般間代性発作、全般間代性および強直性発作または死。Racine  et  al.,  “Modification  of  seizure  activity  by  electrical  stimulation.  3.  Mechanisms”  Electroencephalogr  Clin  Neurophysiol  32:295-299  (1972)。
【０１７８】
（実施例ＶＩＩＩ）
データ解析
データを、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示した。スチューデントｔ検定（対応のあるまたは対応のない）を、２群比較のために実施し、χ２検定を使用して、２つの群間のパーセンテージの差異を比較した。複数の群中での比較のために、事後検定と共に一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。統計的有意性を、Ｐ＜０．０５に設定した。
【０１７９】
（実施例ＩＸ）
グルコースオキシダーゼによるてんかん様活動の低減
この実施例は、グルコースオキシダーゼがてんかん様活動を有効に阻害することができることを実証する予備データを示している。
【０１８０】
海馬スライスを、新生仔マウスから調製した。てんかん様活動を、Ｍｇ２＋なしのａＣＳＦ（人工脳脊髄液）または高Ｋ＋（８．５ｍＭ）ａＣＳＦによって惹起した。グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を、スライスに急性適用したか、またはスライスへの適用前にａＣＳＦ中で９０分間にわたって事前インキュベートした。
【０１８１】
データは、グルコースオキシダーゼが、０  Ｍｇ２＋ａＣＳＦによって誘導されたてんかん様活動を用量依存的に阻害したことを示している。図１８Ａ。グルコースオキシダーゼは、高Ｋ＋によって誘導されたてんかん様活動もまた阻害することが見出された。図１８Ｂ。
【０１８２】
４ｍＭから２０ｍＭまでの範囲の異なるグルコース濃度もまた試験した。１単位のグルコースオキシダーゼ／ｍｌを提供した場合に、てんかん様活動の阻害が観察された。図１９Ａ。対照的に、０．１単位グルコースオキシダーゼ／ｍｌの急性適用は、顕著な効果を有さなかった。図１８Ａ、上の列。しかし、９０分間の事前インキュベーション後、０．１Ｕ／ｍｌのグルコースオキシダーゼもまた、てんかん様活動を阻害した。図１９Ｂ。
【０１８３】
これらの結果は、グルコースオキシダーゼが、抗てんかん薬として有用であり得ることを示唆した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｃ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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