(57)【要約】  本開示は、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を作製する方法並びにそれを含む組成物及び反応混合物を提供する。本開示は、前記ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を使用する方法を更に提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫エフェクター細胞の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団を提供すること；
ｂ）前記免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸と接触させること；
ｃ）前記免疫エフェクター細胞の集団をＳｔａｔ３アクティベーターと接触させること；及び
ｄ）前記ＣＡＲポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を維持し、それによりＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団を作製すること
を含む方法。
【請求項２】
前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、
ｉ）ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体又はＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子、ＯＳＭ分子；
ｉｉ）例えば、本明細書に記載されるような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）；
ｉｉｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、例えば二量体；
ｉｖ）ＩＬ−６ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＩＬ−３１分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子又はＯＳＭ分子）；
ｖ）ＣＣＬ２０分子；
ｖｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−１０Ｒ２受容体（ＩＬ−１０Ｒ２）アクティベーター、例えばＩＬ−１０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子、ＩＬ−２９分子又はＩＬ−１０Ｒ２に結合する抗体分子；
ｖｉｉ）ＩＬ−１０ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０分子、ＩＬ−１９分子、ＩＬ−２０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２４分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子又はＩＬ−２９分子）；
ｖｉｉｉ）ＩＬ−１７ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ１７Ａ分子、ＩＬ１７Ｂ分子、ＩＬ１７Ｃ分子、ＩＬ１７Ｄ分子、ＩＬ１７Ｅ分子又はＩＬ１７Ｆ分子）；又は
ｉｘ）ＩＬ−２３分子
の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ若しくは全て又はその任意の組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも１つの細胞に、
ｇｐ１３０分子を、例えば前記ｇｐ１３０分子をコードする核酸を、前記ｇｐ１３０分子の翻訳を可能にする条件下で前記免疫エフェクター細胞の集団の前記少なくとも１つの細胞に導入することにより；又は
Ｓｔａｔ３分子（例えば、構成的活性型Ｓｔａｔ３分子（ＳＴＡＴ３Ｃ））を、例えば前記Ｓｔａｔ３分子をコードする核酸を、前記Ｓｔａｔ３分子の翻訳を可能にする条件下で前記免疫エフェクター細胞の集団の前記少なくとも１つの細胞に導入することにより、導入することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫エフェクター細胞の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団を提供すること；
ｂ）前記免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸と接触させること；
ｃ）前記免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも１つの細胞に、
ｇｐ１３０分子を、例えば前記ｇｐ１３０分子をコードする核酸を、前記ｇｐ１３０分子の翻訳を可能にする条件下で前記免疫エフェクター細胞の集団の前記少なくとも１つの細胞に導入することにより；又は
Ｓｔａｔ３分子（例えば、構成的活性型Ｓｔａｔ３分子（ＳＴＡＴ３Ｃ））を、例えば前記Ｓｔａｔ３分子をコードする核酸を、前記Ｓｔａｔ３分子の翻訳を可能にする条件下で前記免疫エフェクター細胞の集団の前記少なくとも１つの細胞に導入することにより、導入すること；及び
ｄ）前記ＣＡＲポリペプチド、ｇｐ１３０分子又はＳｔａｔ３分子の発現を可能にする条件下で前記細胞を維持し、それによりＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団を作製すること
を含む方法。
【請求項５】
前記免疫エフェクター細胞の集団を、
ｉ）ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体又はＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子、ＯＳＭ分子；
ｉｉ）例えば、本明細書に記載されるような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）；
ｉｉｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、例えば二量体；
ｉｖ）ＩＬ−６ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＩＬ−３１分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子又はＯＳＭ分子）；
ｖ）ＣＣＬ２０分子；
ｖｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−１０Ｒ２受容体（ＩＬ−１０Ｒ２）アクティベーター、例えばＩＬ−１０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子、ＩＬ−２９分子又はＩＬ−１０Ｒ２に結合する抗体分子；
ｖｉｉ）ＩＬ−１０ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０分子、ＩＬ−１９分子、ＩＬ−２０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２４分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子又はＩＬ−２９分子）；
ｖｉｉｉ）ＩＬ−１７ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ１７Ａ分子、ＩＬ１７Ｂ分子、ＩＬ１７Ｃ分子、ＩＬ１７Ｄ分子、ＩＬ１７Ｅ分子又はＩＬ１７Ｆ分子）；又は
ｉｘ）ＩＬ−２３分子
の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ若しくは全て又はその任意の組み合わせから選択されるＳｔａｔ３アクティベーターと接触させることを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｇｐ１３０分子又は前記Ｓｔａｔ３分子の発現は、一過性（例えば、誘導性若しくは非誘導性）又は恒常性である。請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｇｐ１３０分子又は前記Ｓｔａｔ３分子は、前記免疫エフェクター細胞の集団を、
ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸；又は
例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーター
と接触させる前、それと同時又はその後に前記免疫エフェクター細胞の集団に導入される、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｓｔａｔ３分子（例えば、構成的活性型Ｓｔａｔ３（ＳＴＡＴ３Ｃ））をコードするヌクレオチドを含む核酸は、ＣＡＲ、例えばＣＤ１９  ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体である、請求項１〜３又は５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
例えば、初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞について濃縮されているＴ細胞、例えばＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の集団をもたらす、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
初期メモリーＴ細胞は、以下の特徴：ＣＤ２７＋及び／又はＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇの一方又は両方を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
疲弊していない初期メモリーＴ細胞は、以下の特徴：（ｉ）ＰＤ−１陰性；（ｉｉ）ＣＤ２７ｈｉ；（ｉｉｉ）ＣＣＲ７ｈｉ；又は（ｉｖ）ＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇの１つ以上、例えば全てを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｔ細胞、例えば初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮集団は、例えば、前記Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されなかった以外には同様のＴ細胞の集団と比較して、増加したレベル又は量の、例えば少なくとも５％、例えば５〜９０％多い（例えば、少なくとも５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜７０又は７０〜９０％多い、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０％多い）初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞を有する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１７分子、ＩＬ−２２分子又はＣＣＬ２０分子の１つ、２つ、３つ又は全てを含む、請求項１〜３又は５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、天然に存在する分子、組換え分子又は精製された分子である、請求項１〜３又は５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、血清中に存在せず、例えば実施例２のアッセイによって測定されるように、例えばチロシン７０５（Ｙ７０５）上のＳｔａｔ３を活性化する、例えばＳｔａｔ３をリン酸化するのに十分な量で存在しない、請求項１〜３又は５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、基質、例えばビーズ又は細胞上に配置、例えば固定化される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、Ｓｔａｔ３アクティベーター細胞上に配置される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｓｔａｔ３アクティベーター細胞は、人工抗原提示細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、前記Ｓｔａｔ３アクティベーター細胞によって発現されるか、又は前記Ｓｔａｔ３アクティベーター細胞の表面にコンジュゲートされる、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
例えば、本明細書に記載されるような前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、例えば、実施例２のアッセイによって測定されるように、例えばチロシン７０５（Ｙ７０５）上のＳｔａｔ３を活性化する、例えばＳｔａｔ３をリン酸化するのに十分な量で提供される、請求項１〜３、５又は９〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
例えば、本明細書に記載されるような前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、前記Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、例えば実施例２のアッセイによって測定されるように、１２日間の培養期間後、前記免疫エフェクター細胞の集団を、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９倍又はそれを超えて増殖させるのに十分な量で提供される、請求項１〜３、５又は９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
例えば、本明細書に記載されるような前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、前記Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、ＣＤ２７＋ＰＤ−１−である前記免疫エフェクター細胞集団中の細胞の割合を、例えば少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５倍又はそれを超えて増加させるのに十分な量で提供される、請求項１〜３、５又は９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
例えば、本明細書に記載されるような前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、前記Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、例えば実施例２のアッセイによって測定されるように、前記免疫エフェクター細胞集団において、ｇｐ１３０の発現レベルを、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０倍又はそれを超えて増加させるのに十分な量で提供される、請求項１〜３、５又は９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
例えば、本明細書に記載されるような前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１７分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ３１分子及びＣＣＬ２０分子の１つ、２つ、３つ、４つ又は全て（例えば、５つ）から選択される、請求項１〜３、５又は９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
例えば、本明細書に記載されるような前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ＩＬ−６分子、例えば組換えＩＬ−６を含む、請求項１〜３、５又は９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ−６分子、例えば組換えＩＬ−６は、少なくとも１、５、１０、１５、２０若しくは３０ｎｇ／ｍｌの量又は１〜２０、１〜１５若しくは５〜１５ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば少なくとも１０ｎｇ／ｍｌで提供される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗ｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｓ１２若しくはＢ−Ｐ８又はＢ−Ｓ１２若しくはＢ−Ｐ８からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つのＣＤＲを有する抗体分子から選択される、請求項２、５又は９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫エフェクター細胞の集団をＢ−Ｓ１２及びＢ−Ｐ８の両方と接触させることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
抗ｇｐ１３０抗体分子の総量は、約０．１〜１０００、０．５〜５００又は１〜１００ｕｇ／ｍｌである、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ｇｐ１３０抗体分子は、少なくとも０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９又は２ｕｇ／ｍｌ、例えば約１ｕｇ／ｍｌの量で提供される、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗ｇｐ１３０抗体は、
ＳＴＡＴ３のリン酸化によって測定されるように、ｇｐ１３０によって媒介されるシグナル伝達を誘導するか、又は
例えば、ＬＩＦ、ＯＳＭ又はＣＮＴＦによる二量体化、例えばｇｐ１３０のホモ二量体化又はｇｐ１３０のヘテロ二量体化を誘導する、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
例えば、本明細書に記載されるように、前記Ｓｔａｔ３アクティベーターの存在下で培養された前記細胞の集団は、前記Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触しされていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、
例えば、実施例２のアッセイによって測定されるような、例えばチロシン７０５（Ｙ７０５）上のＳｔａｔ３の活性化、例えばＳｔａｔ３のリン酸化；
例えば、実施例２のアッセイによって測定されるような、１２日間の培養期間後の、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９倍又はそれを超える前記免疫エフェクター細胞の集団の増殖；
ＣＤ２７＋ＰＤ−１−である前記免疫エフェクター細胞集団中の細胞の割合の、例えば少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５倍又はそれを超える増加；及び／又は
例えば、実施例２のアッセイによって測定されるような、前記免疫エフェクター細胞集団における少なくとも１．５、２、３、４、５、１０倍又はそれを超えるｇｐ１３０の発現レベルの増加
を示す、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２１日間又は１〜７、７〜１４若しくは１４〜２１日間にわたり、前記集団を増殖させることを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
Ｓｔａｔ３転写標的、例えばｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｓｏｘ２、Ｂｃｌ−２又はＲＯＲＣのレベル又は活性を測定することにより、前記免疫エフェクター細胞の集団におけるＳｔａｔ３経路活性化をアッセイして、Ｓｔａｔ３経路活性化の値を決定することを更に含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｓｔａｔ３経路活性化値を基準値と比較することを更に含み、前記基準値は、例えば、本明細書に記載されるような、前記Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されていない以外には同様の条件下で培養された同様の免疫エフェクター細胞の集団から得られる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｓｔａｔ３経路活性化値の基準値との比較に応答して、
前記集団を治療剤としての使用に適切又は不適切なものとして分類すること；
治療的使用のための前記集団又はそのアリコートを処方又はパッケージングすること；又は
培養パラメーターを変更すること、例えば、ｉ）培養の時間の長さを変更すること、又はｉｉ）例えば、本明細書に記載されるように、前記Ｓｔａｔ３アクティベーターの濃度を増加若しくは減少させること
の１つ以上を実行することを更に含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫エフェクター細胞の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団を提供すること；
ｂ）前記免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸と接触させること；
ｃ）前記免疫エフェクター細胞の集団を、解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）と接触させること、及び
ｄ）前記ＣＡＲポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を維持し、それによりＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団を作製すること
を含む方法。
【請求項３９】
前記解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−ＤＧは、前記解糖阻止剤で処置されていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、
前記免疫エフェクター細胞の集団を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれを超えて増加させること；又は
セントラルメモリー表現型を有する、例えばＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋である前記免疫エフェクター細胞集団中の細胞の割合を、例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれを超えて増加させること
のために十分な量で添加される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記解糖阻止剤、例えば２−ＤＧは、少なくとも０．５、１、１．５、２若しくは２．５ｍＭ、０．５〜２．５ｍＭ又は１〜２ｍＭの濃度で添加される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記解糖阻害剤の存在下で培養された前記細胞の集団は、前記解糖阻止剤で処置されていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、
前記免疫エフェクター細胞の集団の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれを超える増加；又は
セントラルメモリー表現型を有する、例えばＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋である前記免疫エフェクター細胞集団中の細胞の割合の、例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれを超える増加
を示す、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２１日間又は１〜７、７〜１４若しくは１４〜２１日間にわたり、前記集団を増殖させること；又は
例えば、実施例１の増殖条件下において、例えば少なくとも１．５、２、２．５、３、４、５、５、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０倍又はそれを超える細胞数の変化、例えば最大約４０又は５０倍だけ前記集団を増殖させること
を含む、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
例えば、２−ＮＢＤＧ取り込みアッセイ、例えば実施例１のアッセイを使用してグルコース代謝値を決定するために、前記免疫エフェクター細胞の集団におけるグルコース代謝をアッセイすることを更に含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記グルコース代謝値を基準値と比較することを更に含む、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記グルコース代謝値の基準値との比較に応答して、
前記集団を治療剤としての使用に適切又は不適切なものとして分類すること；
治療的使用のための前記集団又はそのアリコートを処方又はパッケージングすること；又は
培養パラメーターを変更すること、例えば、ｉ）培養の時間の長さを変更すること、又はｉｉ）前記解糖阻止剤、例えば前記小分子解糖阻止剤、例えば前記小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えば前記グルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）の濃度を増加若しくは減少させること
の１つ以上を実施することを更に含む、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記免疫エフェクター細胞の集団を、請求項１に記載のＳｔａｔ３アクティベーター又は請求項３若しくは４に記載の細胞の集団と接触させることを更に含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記免疫エフェクター細胞の集団を解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）と接触させることを更に含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
（ｂ）は、（ｃ）前に実施されるか、（ｃ）は、（ｂ）前に実施されるか、又は（ｂ）及び（ｃ）は、同時に実施される、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
（ｂ）は、前記核酸を前記免疫エフェクター細胞に送達するためにレンチウイルス形質導入を実施することを含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記免疫エフェクター細胞の集団を、前記ＣＡＲに結合する抗原（例えば、ＣＤ１９）を発現する細胞の集団と接触させることを更に含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体結合シグナルを刺激する薬剤及び前記細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドと接触させることを更に含み、例えば、前記薬剤は、抗ＣＤ３抗体若しくはそのフラグメント及び／又は抗ＣＤ２８抗体若しくはそのフラグメントとコンジュゲートされたビーズである、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＣＤ１２３  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ、ＣＤ２０  ＣＡＲ又はＣＤ３３  ＣＡＲである、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＣＡＲは、ＣＤ１９  ＣＡＲ、例えば配列番号３９〜５１のｓｃＦｖアミノ酸配列を含むＣＡＲ又は配列番号７７〜８９のアミノ酸配列を含むＣＡＲである、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＣＡＲは、抗ＣＤ１９結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む抗体分子を含み、前記抗ＣＤ１９結合ドメインは、表３Ｂに列挙される任意の抗ＣＤ１９軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上並びに表３Ａに列挙される任意の抗ＣＤ１９重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上を含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号４０又は配列番号５１の配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＣＡＲは、配列番号７８又は配列番号８９の配列を有するポリペプチドを含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
反応混合物であって、
ａ）（ｉ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞）、又は（ｉｉ）免疫エフェクター細胞及びＣＡＲをコードする核酸（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ）；及び
ｂ）薬剤であって、
（ｉ）Ｓｔａｔ３アクティベーター；
（ｉｉ）請求項３又は４に記載の細胞又は細胞の集団；又は
（ｉｉｉ）ｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子をコードする核酸
から選択される薬剤
を含む反応混合物。
【請求項５９】
前記Ｓｔａｔ３アクティベーターは、
ｂ−ｉ−ｉ）ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体又はＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子、ＯＳＭ分子；
ｂ−ｉ−ｉｉ）例えば、本明細書に記載されるような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）；
ｂ−ｉ−ｉｉｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、例えば二量体；
ｂ−ｉ−ｉｖ）ＩＬ−６ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＩＬ−３１分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子又はＯＳＭ分子）；
ｂ−ｉ−ｖ）ＣＣＬ２０分子；
ｂ−ｉ−ｖｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−１０Ｒ２受容体（ＩＬ−１０Ｒ２）アクティベーター、例えばＩＬ−１０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子、ＩＬ−２９分子又はＩＬ−１０Ｒ２に結合する抗体分子；
ｂ−ｉ−ｖｉｉ）ＩＬ−１０ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０分子、ＩＬ−１９分子、ＩＬ−２０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２４分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子又はＩＬ−２９分子）；
ｂ−ｉ−ｖｉｉｉ）ＩＬ−１７ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ１７Ａ分子、ＩＬ１７Ｂ分子、ＩＬ１７Ｃ分子、ＩＬ１７Ｄ分子、ＩＬ１７Ｅ分子又はＩＬ１７Ｆ分子）；又は
ｂ−ｉ−ｉｘ）ＩＬ−２３分子
から選択される、請求項５８に記載の反応混合物。
【請求項６０】
（ａ）（ｉ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団を含む、請求項５８又は５９に記載の反応混合物。
【請求項６１】
（ａ）（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ）を含む、請求項５８又は５９に記載の反応混合物。
【請求項６２】
（ｂ）（ｉ）請求項５９に記載のＳｔａｔ３アクティベーターを含む、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項６３】
（ｂ）（ｉｉ）請求項３又は４に記載の細胞又は細胞の集団を含む、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項６４】
（ｂ）（ｉｉｉ）ｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はそれをコードする核酸を含む、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項６５】
（ａ）（ｉ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団；及び（ｂ）（ｉ）請求項５９に記載のＳｔａｔ３アクティベーターを含む、請求項５８に記載の反応混合物。
【請求項６６】
（ａ）（ｉ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団；及び（ｂ）（ｉｉ）請求項３又は４に記載の細胞又は細胞の集団を含む、請求項５８に記載の反応混合物。
【請求項６７】
（ａ）（ｉ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団；及び（ｂ）（ｉｉｉ）ｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はそれをコードする核酸を含む、請求項５８に記載の反応混合物。
【請求項６８】
（ａ）（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸；及び（ｂ）（ｉ）請求項５９に記載のＳｔａｔ３アクティベーターを含む、請求項５８に記載の反応混合物。
【請求項６９】
（ａ）（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸；及び（ｂ）（ｉｉ）請求項３又は４に記載の細胞又は細胞の集団を含む、請求項５８に記載の反応混合物。
【請求項７０】
（ａ）（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸；及び（ｂ）（ｉｉｉ）ｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子をコードする核酸を含む、請求項５３に記載の反応混合物。
【請求項７１】
（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｉ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｉｉ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｉｉｉ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｉｖ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｖ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉｉ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉｉｉ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｉ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｉｉ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｉｉｉ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｉｖ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｖ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉｉ）；並びに（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉｉｉ）の１つ以上を含む、請求項５８〜６２、６５又は６８のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項７２】
反応混合物であって、
ａ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞の集団、及び
ｂ）解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）
を含む反応混合物。
【請求項７３】
反応混合物であって、
ａ）免疫エフェクター細胞の集団、
ｂ）ＣＡＲをコードする核酸、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ、及び
ｃ）解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）
を含む反応混合物。
【請求項７４】
前記解糖阻止剤、例えば２−ＤＧは、少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５ｍＭ、０．５〜２．５ｍＭ又は１〜２ｍＭの濃度で存在する、請求項７２又は７３に記載の反応混合物。
【請求項７５】
Ｓｔａｔ３アクティベーター；細胞若しくは細胞の集団；或いは請求項５８又は５９に記載のｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子をコードする核酸を更に含む、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項７６】
解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を更に含む、請求項５９〜７１のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項７７】
レンチウイルスを更に含み、例えば、ＣＡＲをコードする前記核酸は、レンチウイルス中にパッケージされている、請求項５９〜７６のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項７８】
前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項５８〜７７のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項７９】
前記ＣＡＲに結合する抗原（例えば、ＣＤ１９）を発現する細胞の集団を更に含む、請求項５８〜７８のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項８０】
例えば、ＣＡＲ発現細胞の投与前の、前記ＣＡＲ発現細胞による治療的処置に対する、癌（例えば、本明細書に記載される癌）を有する対象の応答性を評価又は予測する方法であって、前記対象からの免疫エフェクター細胞において、
ｉ）グルコース代謝のレベルであって、
グルコース代謝基準値よりも低いグルコース代謝のレベルは、前記対象が前記ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する、例えば完全応答又は部分応答を示す可能性が高いことを示し、及び
グルコース代謝基準値よりも高いグルコース代謝のレベルは、前記対象が前記ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低く、例えば完全応答又は部分応答を示さないことを示す、グルコース代謝のレベル；又は
ｉｉ）（例えば、チロシン７０５（Ｙ７０５）上の）例えばＳｔａｔ３のリン酸化又はＳｔａｔ３転写標的（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｓｏｘ２若しくはＢｃｌ−２）のレベル若しくは活性によって測定されるようなＳｔａｔ３活性化のレベルであって、
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも高いＳｔａｔ３活性化のレベルは、前記対象が前記ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する、例えば完全応答又は部分応答を示す可能性が高いことを示し、及び
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも低いＳｔａｔ３活性化のレベルは、前記対象が前記ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低く、例えば完全応答又は部分応答を示さないことを示す、Ｓｔａｔ３活性化のレベル
を評価し、それにより前記対象を評価するか、又は前記ＣＡＲ発現細胞に対する前記対象の前記応答性を予測すること
を含む方法。
【請求項８１】
前記免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸と接触されていない、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸と接触されており、例えばＣＡＲポリペプチドを発現する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記免疫エフェクター細胞は、
ｉ）請求項１に記載のＳｔａｔ３アクティベーター；
ｉｉ）請求項３又は４に記載の細胞又は細胞の集団；
ｉｉｉ）ｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子をコードする核酸；又は
ｉｖ）少なくとも０．５、１、１．５、２又は２．５ｍＭの濃度の解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）
と接触されている、請求項８０〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
細胞数、例えばＣＡＲ発現細胞の数の倍率変化を決定することを更に含む、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低い前記対象は、例えば、完全応答（ＣＲ）又は部分応答（ＰＲ）を有しない、例えば非応答者（ＮＲ）であると予測される、請求項８０〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
ｉ）前記グルコース代謝のレベルが前記グルコース代謝基準値よりも低いか；又は
ｉｉ）前記Ｓｔａｔ３活性化のレベルが前記Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも高い
という判定に応答して、前記対象は、ＣＡＲ発現療法の投与のために選択されるか又はそれを投与される、請求項８０〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
ｉ）前記グルコース代謝のレベルが前記グルコース代謝基準値よりも高いか；又は
ｉｉ）前記Ｓｔａｔ３活性化のレベルが前記Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも低い
という判定に応答して、前記対象は、ＣＡＲ発現療法以外の療法の投与のために選択されるか又はそれを投与される、請求項８０〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記グルコース代謝基準値は、実施例１に記載されるような完全応答対象の細胞のグルコース代謝値であり、例えば、前記細胞（例えば、前記細胞を含有するサンプル）は、例えば、実施例１に記載されるように、偽刺激、例えばＣＡＲ抗原以外の抗原による刺激と接触される、請求項８０〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記Ｓｔａｔ３活性化基準値は、例えば、実施例２に記載されるような非応答対象の細胞のＳｔａｔ３活性化値である、請求項８０〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
癌（例えば、本明細書に記載される癌）を有する対象の応答性を評価又は予測する方法であって、前記対象は、ＣＡＲ発現細胞で処置されており、前記方法は、前記対象からのＣＡＲ発現細胞において、
ｉ）グルコース代謝のレベルであって、
グルコース代謝基準値よりも低いグルコース代謝のレベルは、前記対象が前記ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する、例えば完全応答又は部分応答を示す可能性が高いことを示し、及び
グルコース代謝基準値よりも高いグルコース代謝のレベルは、前記対象が前記ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低く、例えば完全応答又は部分応答を示さないことを示す、グルコース代謝のレベル；又は
ｉｉ）（例えば、チロシン７０５（Ｙ７０５）上の）例えばＳｔａｔ３のリン酸化又はＳｔａｔ３転写標的（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｓｏｘ２若しくはＢｃｌ−２）のレベル若しくは活性によって測定されるようなＳｔａｔ３活性化のレベルであって、
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも高いＳｔａｔ３活性化のレベルは、前記対象が前記ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する、例えば完全応答又は部分応答を示す可能性が高いことを示し、及び
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも低いＳｔａｔ３活性化のレベルは、前記対象が前記ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低く、例えば完全応答又は部分応答を示さないことを示す、Ｓｔａｔ３活性化のレベル
を評価し、それにより前記対象を評価するか、又は前記ＣＡＲ発現細胞に対する前記対象の前記応答性を予測すること
を含む、方法。
【請求項９１】
前記ＣＡＲ発現細胞における前記グルコース代謝のレベル又は前記Ｓｔａｔ３活性化のレベルを評価する前に前記対象から前記ＣＡＲ発現細胞を得ることを更に含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低い前記対象は、例えば、完全応答（ＣＲ）又は部分応答（ＰＲ）を有しない、例えば非応答者（ＮＲ）であると予測される、請求項９０又は９１に記載の方法。
【請求項９３】
ｉ）前記グルコース代謝のレベルが前記グルコース代謝基準値よりも低いか；又は
ｉｉ）前記Ｓｔａｔ３活性化のレベルが前記Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも高い
という判定に応答して、前記対象は、ＣＡＲ発現療法の１回以上の追加の投与のために選択されるか又はそれを投与される、請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
ｉ）前記グルコース代謝のレベルが前記グルコース代謝基準値よりも高いか；又は
ｉｉ）前記Ｓｔａｔ３活性化のレベルが前記Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも低い
という判定に応答して、前記対象は、ＣＡＲ発現療法以外の療法の投与のために選択されるか又はそれを投与される、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記グルコース代謝基準値は、実施例１に記載されるような完全応答対象の細胞のグルコース代謝値であり、例えば、前記細胞（例えば、前記細胞を含有するサンプル）は、例えば、実施例１に記載されるように、偽刺激、例えばＣＡＲ抗原以外の抗原による刺激と接触される、請求項９０〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記Ｓｔａｔ３活性化基準値は、例えば、実施例２に記載されるような非応答対象の細胞のＳｔａｔ３活性化値である、請求項９０〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ１９発現細胞（例えば、ＣＴＬ０１９）を評価する方法であって、対象からのサンプル中の前記ＣＡＲ発現細胞において、
ｉ）グルコース代謝のレベルであって、
グルコース代謝基準値よりも低いグルコース代謝のレベルは、前記サンプルが処置に適していることを示し、及び
グルコース代謝基準値よりも高いグルコース代謝のレベルは、前記サンプルが処置により適さないことを示す、グルコース代謝のレベル；又は
ｉｉ）Ｓｔａｔ３活性化のレベルであって、
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも高いＳｔａｔ３活性化のレベルは、前記サンプルが処置に適していることを示し、及び
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも低いＳｔａｔ３活性化のレベルは、前記サンプルが処置により適さないことを示す、Ｓｔａｔ３活性化のレベル
を評価し、それにより前記ＣＡＲ発現細胞を評価すること
を含む方法。
【請求項９８】
前記ＣＡＲ発現細胞における前記グルコース代謝又はＳｔａｔ３活性化のレベルを評価する前に前記対象から前記ＣＡＲ発現細胞を得ることを更に含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
ｉ）前記グルコース代謝のレベルが前記グルコース代謝基準値よりも低いか；又は
ｉｉ）前記Ｓｔａｔ３活性化のレベルが前記Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも高い
という判定に応答して、前記サンプルは、前記対象への投与のために選択されるか又は投与される、請求項９７又は９８に記載の方法。
【請求項１００】
ｉ）前記グルコース代謝のレベルが前記グルコース代謝基準値よりも高い、
ｉｉ）前記Ｓｔａｔ３活性化のレベルが前記Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも低い
という判定に応答して、前記サンプルは、前記対象への投与のために選択されないか又は投与されない、請求項９７又は９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記グルコース代謝基準値は、実施例１に記載されるような完全応答対象の細胞のグルコース代謝値であり、例えば、前記細胞（例えば、前記細胞を含有するサンプル）は、例えば、実施例１に記載されるように、偽刺激、例えばＣＡＲ抗原以外の抗原による刺激と接触される、請求項９７〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記Ｓｔａｔ３活性化基準値は、例えば、実施例２に記載されるような非応答対象の細胞のＳｔａｔ３活性化値である、請求項９７〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を作製する方法並びにそれを含む組成物及び反応混合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己Ｔ細胞、特にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形質導入したＴ細胞での養子細胞移入（ＡＣＴ）治療は、いくつかの血液癌の試験において有望性が示されている。
【０００３】
自己遺伝子改変Ｔ細胞の製造は、現在、ＣＡＲを発現する操作された治療用Ｔ細胞が由来する患者の材料（例えば、白血球アフェレーシスから得られたもの）から開始する複雑なプロセスである。患者の白血球アフェレーシス材料は、高レベルの細胞成分の変動性を有し得る。この出発材料は、細胞組成が患者ごとに且つ１つの病状の範囲内で大きく異なり得る。細胞不純物は、顆粒球、単球、赤血球、循環芽細胞及び血小板を含み得る。自己細胞治療製品の製造プロセスは、患者の異なる処置歴、病状などにも対処する必要があり、これは、出発物質の細胞含有量に更なる影響を与える（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。更に、出発物質からのそのような不純物は、製造プロセス、最終的な製品品質及び製品の治療有効性に負の影響を及ぼし得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４
【非特許文献２】Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５
【非特許文献３】Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ＣＡＲ発現細胞治療製品のより一貫した生産を提供し、それにより製造プロセスを合理化し、製品品質を改善し、製品の治療有効性を最大化する方法及びプロセスに対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を作製する方法並びにそれを含む組成物及び反応混合物に関する。いくつかの実施形態において、作製方法は、免疫エフェクター細胞の集団を、（ｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーター；（ｉｉ）解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方と接触させることを含む。本開示は、いくつかの態様において、ＣＡＲ発現細胞による治療的処置を受ける、受けようとしている、受けた又は受けている対象を評価、予測、選択又は監視する方法も提供する。ＣＡＲ発現細胞による治療的処置に対する、癌（例えば、本明細書に記載の癌）を有する対象の応答性を評価又は予測する方法も本明細書に記載される。
【０００７】
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫エフェクター細胞の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団を提供すること；
ｂ）免疫エフェクター細胞集団を、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸と接触させること；
ｃ）免疫エフェクター細胞集団をＳｔａｔ３アクティベーターと接触させること；及び
ｄ）ＣＡＲポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を維持し、それによりＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団を作製すること
を含む方法が本明細書に開示される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、
ｉ）ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体又はＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子、ＯＳＭ分子；
ｉｉ）例えば、本明細書に記載されるような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）；
ｉｉｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、例えば二量体；
ｉｖ）ＩＬ−６ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＩＬ−３１分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子又はＯＳＭ分子）；
ｖ）ＣＣＬ２０分子；
ｖｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−１０Ｒ２受容体（ＩＬ−１０Ｒ２）アクティベーター、例えばＩＬ−１０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子、ＩＬ−２９分子又はＩＬ−１０Ｒ２に結合する抗体分子；
ｖｉｉ）ＩＬ−１０ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０分子、ＩＬ−１９分子、ＩＬ−２０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２４分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子又はＩＬ−２９分子）；
ｖｉｉｉ）ＩＬ−１７ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ１７Ａ分子、ＩＬ１７Ｂ分子、ＩＬ１７Ｃ分子、ＩＬ１７Ｄ分子、ＩＬ１７Ｅ分子又はＩＬ１７Ｆ分子）；又は
ｉｘ）ＩＬ−２３分子
の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ若しくは全て又はその任意の組み合わせから選択される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、ＩＬ−２１分子、例えばＩＬ−２１を添加することを含むか、又は本明細書の反応混合物は、それを含む。いくつかの実施形態において、本明細書の反応混合物は、ＩＬ−２１分子、例えばＩＬ−２１を含まないか、又は本明細書の方法は、それを添加することを含まない。いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、ＩＬ−３０分子を添加することを含むか、又は本明細書の反応混合物は、それを含む。いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、ＩＬ−６Ｒαアクティベーター、例えばＩＬ−６Ｒαに結合する抗体分子を添加することを含むか、又は本明細書の反応混合物は、それを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−６ファミリーサイトカインは、ＩＬ−６分子を含まない。
【００１２】
いくつかの実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも１つの細胞に、
ｇｐ１３０分子を、例えばｇｐ１３０分子をコードする核酸を、ｇｐ１３０分子の翻訳を可能にする条件下で免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも１つの細胞に導入することにより；又は
Ｓｔａｔ３分子（例えば、構成的活性型Ｓｔａｔ３分子（ＳＴＡＴ３Ｃ））を、例えばＳｔａｔ３分子をコードする核酸を、Ｓｔａｔ３分子の翻訳を可能にする条件下で免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも１つの細胞に導入することにより、導入することを更に含む。
【００１３】
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫エフェクター細胞の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団を提供すること；
ｂ）免疫エフェクター細胞集団を、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸と接触させること；
ｃ）免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも１つの細胞に、
ｇｐ１３０分子を、例えばｇｐ１３０分子をコードする核酸を、ｇｐ１３０分子の翻訳を可能にする条件下で免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも１つの細胞に導入することにより；又は
Ｓｔａｔ３分子（例えば、構成的活性型Ｓｔａｔ３分子（ＳＴＡＴ３Ｃ））を、例えばＳｔａｔ３分子をコードする核酸を、Ｓｔａｔ３分子の翻訳を可能にする条件下で免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも１つの細胞に導入することにより、導入すること；及び
ｄ）ＣＡＲポリペプチド、ｇｐ１３０分子又はＳｔａｔ３分子の発現を可能にする条件下で細胞を維持し、それによりＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団を作製すること
を含む方法が本明細書に開示される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団を、
ｉ）ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体又はＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子、ＯＳＭ分子；
ｉｉ）例えば、本明細書に記載されるような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）；
ｉｉｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、例えば二量体；
ｉｖ）ＩＬ−６ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＩＬ−３１分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子又はＯＳＭ分子）；
ｖ）ＣＣＬ２０分子；
ｖｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−１０Ｒ２受容体（ＩＬ−１０Ｒ２）アクティベーター、例えばＩＬ−１０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子、ＩＬ−２９分子又はＩＬ−１０Ｒ２に結合する抗体分子；
ｖｉｉ）ＩＬ−１０ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０分子、ＩＬ−１９分子、ＩＬ−２０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２４分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子又はＩＬ−２９分子）；
ｖｉｉｉ）ＩＬ−１７ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ１７Ａ分子、ＩＬ１７Ｂ分子、ＩＬ１７Ｃ分子、ＩＬ１７Ｄ分子、ＩＬ１７Ｅ分子又はＩＬ１７Ｆ分子）；又は
ｉｘ）ＩＬ−２３分子
の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ若しくは全て又はその任意の組み合わせから選択されるＳｔａｔ３アクティベーターと接触させることを更に含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体である。
【００１６】
一実施形態において、ＩＬ−６ファミリーサイトカインは、ＩＬ−６分子を含まない。
【００１７】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、ｇｐ１３０分子又はＳｔａｔ３分子の発現は、一過性（例えば、誘導性若しくは非誘導性）又は恒常性である。
【００１８】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、ｇｐ１３０分子又はＳｔａｔ３分子は、免疫エフェクター細胞の集団を、
ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸；又は
例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーター
と接触させる前、それと同時又はその後に免疫エフェクター細胞の集団に導入される。
【００１９】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３分子（例えば、構成的活性型Ｓｔａｔ３（ＳＴＡＴ３Ｃ））をコードするヌクレオチドを含む核酸は、ＣＡＲ、例えばＣＤ１９  ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を更に含む。
【００２０】
本発明に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体である。いくつかの実施形態において、方法は、例えば、初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞について濃縮されている（例えば、そのレベルが増加している）Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の集団をもたらす。いくつかの実施形態において、方法は、例えば、本明細書に記載されるように、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋初期メモリーＴ細胞の濃縮をもたらす。いくつかの実施形態において、初期メモリーＴ細胞は、以下の特徴：ＣＤ２７＋及び／又はＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇの一方又は両方（例えば、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇ）を有する。いくつかの実施形態において、方法は、例えば、本明細書に記載されるように、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋が疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮をもたらす。いくつかの実施形態において、疲弊していない初期メモリーＴ細胞は、以下の特徴：（ｉ）ＰＤ−１陰性；（ｉｉ）ＣＤ２７ｈｉ；（ｉｉｉ）ＣＣＲ７ｈｉ；又は（ｉｖ）ＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇの１つ以上、例えば全てを有する。いくつかの実施形態において、疲弊していない初期メモリーＴ細胞は、ＰＤ−１陰性ＣＤ２７ｈｉＣＣＲ７ｈｉＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞、例えば初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮集団は、例えば、増加したレベルの、例えば少なくとも５〜９０％多い（例えば、少なくとも５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜７０若しくは７０〜９０％多い又は５〜９０、１０〜８５、１５〜８０、２０〜７５、２５〜７０、３０〜７０、３５〜６５、４０〜６０若しくは４５〜５５％多い）初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞を有する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞、例えば初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮集団は、増加したレベルの、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０％多い）初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞を有する。いくつかの実施形態において、増加したレベルの初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞は、例えば、実施例２に記載されているように、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されなかった以外には同様のＴ細胞集団と比較される。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されなかった以外には同様のＴ細胞集団は、同じＴ細胞集団、例えば濃縮が実施されたもの、例えば前濃縮集団、例えば開始集団、例えば実施例２に記載されるようなものである。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されなかった以外には同様のＴ細胞集団は、異なるＴ細胞集団、例えば濃縮が実施されなかった集団である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞、例えば初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮集団は、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されなかった以外には同様のＴ細胞集団と比較して、増加したレベルの、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０％（例えば、少なくとも８％）多い初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮集団は、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されなかった以外には同様のＴ細胞集団と比較して、増加したレベルの、例えば少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０％（例えば、少なくとも２０％）多い初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞を有する。
【００２３】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１７分子、ＩＬ−２２分子又はＣＣＬ２０分子の１つ、２つ、３つ又は全てを含む。一実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、天然に存在する分子、組換え分子又は精製された分子である。一実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、血清中に存在せず、例えば実施例２のアッセイによって測定されるように、例えば、チロシン７０５（Ｙ７０５）上のＳｔａｔ３を活性化する、例えばＳｔａｔ３をリン酸化するのに十分な量で存在しない。
【００２４】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、可溶性であり（例えば、基質に結合せず）、いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、基質（例えば、ビーズ又は細胞）上に配置、例えば固定化される。
【００２５】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、基質、例えばビーズ又は細胞上に配置、例えば固定化される。一実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、例えば、本明細書に記載されるように、Ｓｔａｔ３アクティベーター細胞、例えば人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に配置される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、人工ＡＰＣは、
（ｉ）ＭＨＣ分子（例えば、その表面でＭＨＣ分子を発現する）；
（ｉｉ）共刺激タンパク質（例えば、その表面に共刺激タンパク質を発現するか、又はそれに共刺激タンパク質がコンジュゲートしているもの）；及び／又は
（ｉｉｉ）例えば、本明細書に記載されるような抗原、例えばＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞によって認識される抗原
の１つ、２つ又は全てを含む。
【００２７】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、Ｓｔａｔ３アクティベーター細胞によって発現されるか、又はＳｔａｔ３アクティベーター細胞の表面にコンジュゲートされる。
【００２８】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーターは、例えば、実施例２のアッセイによって測定されるように、例えばチロシン７０５（Ｙ７０５）上のＳｔａｔ３を活性化する、例えばＳｔａｔ３をリン酸化するのに十分な量で提供される。
【００２９】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーターは、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、例えば実施例２のアッセイによって測定されるように、１２日間の培養期間後、免疫エフェクター細胞の集団を、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９倍又はそれを超えて増殖させるのに十分な量で提供される。
【００３０】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーターは、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、ＣＤ２７＋ＰＤ−１−である免疫エフェクター細胞集団中の細胞の割合を、例えば少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５倍又はそれを超えて増加させるのに十分な量で提供される。
【００３１】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーターは、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、例えば実施例２のアッセイによって測定されるように、免疫エフェクター細胞集団において、ｇｐ１３０の発現レベルを、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０倍又はそれを超えて増加させるのに十分な量で提供される。
【００３２】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーターは、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１７分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ３１分子及びＣＣＬ２０分子の１つ、２つ、３つ、４つ又は全て（例えば、５つ）から選択される。
【００３３】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーターは、ＩＬ−６分子、例えば組換えＩＬ−６を含む。一実施形態において、ＩＬ−６分子、例えば組換えＩＬ−６は、少なくとも１、５、１０、１５、２０若しくは３０ｎｇ／ｍｌの量又は１〜２０、１〜１５若しくは５〜１５ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば少なくとも１０ｎｇ／ｍｌで提供される。
【００３４】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、抗ｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｓ１２若しくはＢ−Ｐ８又はＢ−Ｓ１２若しくはＢ−Ｐ８からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つのＣＤＲを有する抗体分子から選択される。一実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団をＢ−Ｓ１２及びＢ−Ｐ８の両方と接触させることを含む。一実施形態において、抗ｇｐ１３０抗体分子の総量は、０．１〜１０００、０．５〜５００又は１〜１００ｕｇ／ｍｌである。一実施形態において、抗ｇｐ１３０抗体分子は、少なくとも０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９又は２ｕｇ／ｍｌ、例えば約１ｕｇ／ｍｌの量で提供される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、抗ｇｐ１３０抗体は、
ＳＴＡＴ３のリン酸化によって測定されるように、ｇｐ１３０によって媒介されるシグナル伝達を誘導するか、又は
例えば、ＬＩＦ、ＯＳＭ又はＣＮＴＦによる二量体化、例えばｇｐ１３０のホモ二量体化又はｇｐ１３０のヘテロ二量体化を誘導する。
【００３６】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載されるように、Ｓｔａｔ３アクティベーターの存在下で培養された細胞の集団は、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、
例えば、実施例２のアッセイによって測定されるような、例えばチロシン７０５（Ｙ７０５）上のＳｔａｔ３の活性化、例えばＳｔａｔ３のリン酸化；
例えば、実施例２のアッセイによって測定されるような、１２日間の培養期間後の、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９倍又はそれを超える免疫エフェクター細胞の集団の増殖；
ＣＤ２７＋ＰＤ−１−である免疫エフェクター細胞集団中の細胞の割合の、例えば少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５倍又はそれを超える増加；
例えば、実施例２のアッセイによって測定されるような、免疫エフェクター細胞集団における少なくとも１．５、２、３、４、５、１０倍又はそれを超えるｇｐ１３０の発現レベルの増加
を示す。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ＣＣＬ２０分子は、全長の天然に存在するＣＣＬ２０（例えば、哺乳動物ＣＣＬ２０、例えばヒトＣＣＬ２０）、ＣＣＬ２０の活性フラグメント又はＣＣＬ２０の天然に存在する野生型ポリペプチド若しくはそのフラグメントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する活性変異体を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、可溶性ＩＬ−６受容体は、全長の天然に存在するＩＬ−６受容体（例えば、哺乳動物ＩＬ−６受容体、例えばヒトＩＬ−６受容体）、ＩＬ−６受容体の活性フラグメント又はＩＬ−６受容体の天然に存在する野生型ポリペプチド若しくはそのフラグメントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する活性変異体を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−１０Ｒ２受容体アクティベーターは、ＩＬ−１０Ｒ２シグナル伝達経路を活性化する分子を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１０Ｒ２受容体アクティベーターは、例えば、ポリペプチド又は小分子を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体は、ＩＬ−６分子とＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）分子との間の複合体を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６Ｒ分子は、全長の天然に存在するＩＬ−６受容体（例えば、哺乳動物ＩＬ−６受容体、例えばヒトＩＬ−６受容体）、ＩＬ−６受容体の活性フラグメント又はＩＬ−６受容体の天然に存在する野生型ポリペプチド若しくはそのフラグメントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する活性変異体を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製造方法は、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２１日間又は１〜７、７〜１４若しくは１４〜２１日間にわたり、集団を増殖させることを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される製造方法は、Ｓｔａｔ３転写標的、例えばｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｓｏｘ２、Ｂｃｌ−２又はＲＯＲＣのレベル又は活性を測定することにより、免疫エフェクター細胞の集団におけるＳｔａｔ３経路活性化をアッセイして、Ｓｔａｔ３経路活性化の値を決定することを更に含む。一実施形態において、方法は、Ｓｔａｔ３経路活性化値を基準値と比較することを含み、基準値は、例えば、本明細書に記載されるような、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されていない以外には同様の条件下で培養された同様の免疫エフェクター細胞集団から得られる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３経路活性化値の基準値との比較に応答して、
集団を治療剤としての使用に適切又は不適切なものとして分類すること；
治療的使用のための集団又はそのアリコートを処方又はパッケージングすること；又は
培養パラメーターを変更すること、例えば、ｉ）培養の時間の長さを変更すること、又はｉｉ）例えば、本明細書に記載されるように、Ｓｔａｔ３アクティベーターの濃度を増加若しくは減少させること
の１つ以上を実行する。
【００４４】
本明細書に開示される製造方法のいくつかの実施形態において、（ｂ）は、（ｃ）前に実施されるか、（ｃ）は、（ｂ）前に実施されるか、又は（ｂ）及び（ｃ）は、同時に実施される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００４６】
いくつかの実施形態において、（ｂ）は、核酸を免疫エフェクター細胞に送達するためにレンチウイルス形質導入を実施することを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＡＲに結合する抗原（例えば、ＣＤ１９）を発現する細胞の集団と接触させることを更に含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体結合シグナルを刺激する薬剤及び細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドと接触させることを更に含み、例えば、薬剤は、抗ＣＤ３抗体若しくはそのフラグメント及び／又は抗ＣＤ２８抗体若しくはそのフラグメントとコンジュゲートされたビーズである。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＣＤ１２３  ＣＡＲ又はＣＤ３３  ＣＡＲである。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９  ＣＡＲ、例えば配列番号３９〜５１のｓｃＦｖアミノ酸配列を含むＣＡＲ又は配列番号７７〜８９のアミノ酸配列を含むＣＡＲである。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む抗体分子を含み、前記抗ＣＤ１９結合ドメインは、表３Ｂに列挙される任意の抗ＣＤ１９軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上並びに表３Ａに列挙される任意の抗ＣＤ１９重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号４０又は配列番号５１の配列を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号７８又は配列番号８９の配列を有するポリペプチドを含む。
【００５３】
一態様において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫エフェクター細胞の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団を提供すること；
ｂ）免疫エフェクター細胞集団を、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸と接触させること；
ｃ）免疫エフェクター細胞の集団を、解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）と接触させること、及び
ｄ）ＣＡＲポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を維持し、それによりＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団を作製すること
を含む方法が本明細書に開示される。
【００５４】
一実施形態において、（ｂ）は、（ｃ）前に実施されるか、（ｃ）は、（ｂ）前に実施されるか、又は（ｂ）及び（ｃ）は、同時に実施される。
【００５５】
一実施形態において、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００５６】
一実施形態において、（ｂ）は、核酸を免疫エフェクター細胞に送達するためにレンチウイルス形質導入を実施することを含む。
【００５７】
一実施形態において、解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−ＤＧは、解糖阻止剤で処置されていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、
免疫エフェクター細胞の集団を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれを超えて増加させること；又は
セントラルメモリー表現型を有する、例えばＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋である免疫エフェクター細胞集団中の細胞の割合を、例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれを超えて増加させること
のために十分な量で添加される。
【００５８】
一実施形態において、解糖阻止剤、例えば２−ＤＧは、少なくとも０．５、１、１．５、２若しくは２．５ｍＭ、０．５〜２．５ｍＭ又は１〜２ｍＭの濃度で添加される。
【００５９】
一実施形態において、解糖阻害剤の存在下で培養された細胞の集団は、解糖阻止剤で処置されていない以外には同様の条件下で培養された同様の細胞の集団と比較して、
免疫エフェクター細胞の集団の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれを超える増加；又は
セントラルメモリー表現型を有する、例えばＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋である免疫エフェクター細胞集団中の細胞の割合の、例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれを超える増加
を示す。
【００６０】
一実施形態において、方法は、
例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２１日間又は１〜７、７〜１４若しくは１４〜２１日間にわたり、集団を増殖させること；又は
例えば、実施例１の増殖条件下において、例えば少なくとも１．５、２、２．５、３、４、５、５、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０倍又はそれを超える細胞数の変化、例えば最大約４０又は５０倍だけ集団を増殖させること
を含む。
【００６１】
一実施形態において、方法は、例えば、２−ＮＢＤＧ取り込みアッセイ、例えば実施例１のアッセイを使用してグルコース代謝値を決定するために、免疫エフェクター細胞の集団におけるグルコース代謝をアッセイすることを更に含む。
【００６２】
一実施形態において、方法は、グルコース代謝値を基準値と比較することを更に含む。
【００６３】
一実施形態において、方法は、グルコース代謝値の基準値との比較に応答して、
集団を治療剤としての使用に適切又は不適切なものとして分類すること；
治療的使用のための集団又はそのアリコートを処方又はパッケージングすること；又は
培養パラメーターを変更すること、例えば、ｉ）培養の時間の長さを変更すること、又はｉｉ）解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）の濃度を増加若しくは減少させること
の１つ以上を実施することを更に含む。
【００６４】
一実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＡＲに結合する抗原（例えば、ＣＤ１９）を発現する細胞の集団と接触させることを更に含む。
【００６５】
一実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体結合シグナルを刺激する薬剤及び細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドと接触させることを更に含み、例えば、薬剤は、抗ＣＤ３抗体若しくはそのフラグメント及び／又は抗ＣＤ２８抗体若しくはそのフラグメントとコンジュゲートされたビーズである。
【００６６】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＣＤ１２３  ＣＡＲ又はＣＤ３３  ＣＡＲである。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９  ＣＡＲ、例えば配列番号３９〜５１のｓｃＦｖアミノ酸配列を含むＣＡＲ又は配列番号７７〜８９のアミノ酸配列を含むＣＡＲである。
【００６７】
一実施形態において、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む抗体又は抗体フラグメントを含み、前記抗ＣＤ１９結合ドメインは、表３に列挙される任意の抗ＣＤ１９軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上並びに表３に列挙される任意の抗ＣＤ１９重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上を含む。
【００６８】
一実施形態において、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む抗体又は抗体フラグメントを含み、前記抗ＣＤ１９結合ドメインは、表３Ｂに列挙される任意の抗ＣＤ１９軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上並びに表３Ａに列挙される任意の抗ＣＤ１９重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上を含む。
【００６９】
一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号４０又は配列番号５１の配列を含む。
【００７０】
一実施形態において、ＣＡＲは、配列番号７８又は配列番号８９の配列を有するポリペプチドを含む。
【００７１】
いくつか態様において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫エフェクター細胞の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団を提供すること；
ｂ）免疫エフェクター細胞集団を、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸と接触させること；
ｃ）免疫エフェクター細胞集団を、
ｃ−ｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーター；及び
ｃ−ｉｉｉ）解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）
と接触させること；及び
ｄ）ＣＡＲポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を維持し、それによりＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団を作製すること
を含む方法が本明細書に開示される。
【００７２】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、
ｉ）ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体又はＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子、ＯＳＭ分子；
ｉｉ）例えば、本明細書に記載されるような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）；
ｉｉｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、例えば二量体；
ｉｖ）ＩＬ−６ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＩＬ−３１分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子又はＯＳＭ分子）；
ｖ）ＣＣＬ２０分子；
ｖｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−１０Ｒ２受容体（ＩＬ−１０Ｒ２）アクティベーター、例えばＩＬ−１０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子、ＩＬ−２９分子又はＩＬ−１０Ｒ２に結合する抗体分子；
ｖｉｉ）ＩＬ−１０ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０分子、ＩＬ−１９分子、ＩＬ−２０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２４分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子又はＩＬ−２９分子）；
ｖｉｉｉ）ＩＬ−１７ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ１７Ａ分子、ＩＬ１７Ｂ分子、ＩＬ１７Ｃ分子、ＩＬ１７Ｄ分子、ＩＬ１７Ｅ分子又はＩＬ１７Ｆ分子）；又は
ｉｘ）ＩＬ−２３分子
の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ若しくは全て又はその任意の組み合わせから選択される。
【００７３】
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫エフェクター細胞の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団を提供すること；
ｂ）免疫エフェクター細胞集団を、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸と接触させること；
ｃ）免疫エフェクター細胞集団を、
ｃ−ｉ）解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）と、且つ
ｃ−ｉｉ）ｇｐ１３０分子と、例えばｇｐ１３０分子をコードする核酸を、ｇｐ１３０分子の翻訳を可能にする条件下で免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも１つの細胞に導入することにより；又はＳｔａｔ３分子（例えば、構成的活性型Ｓｔａｔ３分子（ＳＴＡＴ３Ｃ））を、例えばＳｔａｔ３分子をコードする核酸を、Ｓｔａｔ３分子の翻訳を可能にする条件下で免疫エフェクター細胞の集団の少なくとも１つの細胞に導入することにより、接触させること；
ｄ）ＣＡＲポリペプチド、ｇｐ１３０分子又はＳｔａｔ３分子の発現を可能にする条件下で細胞を維持し、それによりＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団を作製すること
方法が本明細書に開示される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーター又はｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子を含む細胞の集団を含む製造方法は、免疫エフェクター細胞の集団を解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）と接触させることを更に含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、例えば、本明細書に記載されるような解糖阻止剤を含む製造方法は、免疫エフェクター細胞の集団を、Ｓｔａｔ３アクティベーター又はｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子を含む細胞集団と接触させることを更に含む。
【００７６】
いくつかの態様において、反応混合物であって、
ａ）（ｉ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞）、又は（ｉｉ）免疫エフェクター細胞及びＣＡＲをコードする核酸（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ）；及び
ｂ）薬剤であって、
（ｉ）Ｓｔａｔ３アクティベーター；
（ｉｉ）ｇｐ１３０分子又はＳｔａｔ３分子を発現する細胞又は細胞の集団；又は
（ｉｉｉ）ｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はそれをコードする核酸
から選択される薬剤
を含む反応混合物が本明細書に開示される。
【００７７】
本明細書に開示される反応混合物の一実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、
ｂ−ｉ−ｉ）ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体又はＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子、ＯＳＭ分子；
ｂ−ｉ−ｉｉ）例えば、本明細書に記載されるような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）；
ｂ−ｉ−ｉｉｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、例えば二量体；
ｂ−ｉ−ｉｖ）ＩＬ−６ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＩＬ−３１分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子又はＯＳＭ分子）；
ｂ−ｉ−ｖ）ＣＣＬ２０分子；
ｂ−ｉ−ｖｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−１０Ｒ２受容体（ＩＬ−１０Ｒ２）アクティベーター、例えばＩＬ−１０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子、ＩＬ−２９分子又はＩＬ−１０Ｒ２に結合する抗体分子；
ｂ−ｉ−ｖｉｉ）ＩＬ−１０ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０分子、ＩＬ−１９分子、ＩＬ−２０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２４分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子又はＩＬ−２９分子）；又は
ｂ−ｉ−ｖｉｉｉ）ＩＬ−１７ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ１７Ａ分子、ＩＬ１７Ｂ分子、ＩＬ１７Ｃ分子、ＩＬ１７Ｄ分子、ＩＬ１７Ｅ分子又はＩＬ１７Ｆ分子）
から選択される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ａ）（ｉ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ａ）（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲ、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ）を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ｂ）（ｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーターを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ｂ）（ｉｉ）ｇｐ１３０分子又はＳｔａｔ３分子を含む細胞又は細胞集団を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ｂ）（ｉｉｉ）ｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はそれをコードする核酸を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ａ）（ｉ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団；及び（ｂ）（ｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーターを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ａ）（ｉ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団；及び（ｂ）（ｉｉ）ｇｐ１３０分子又はＳｔａｔ３分子を含む細胞又は細胞集団を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ａ）（ｉ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団；及び（ｂ）（ｉｉｉ）ｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はそれをコードする核酸を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ａ）（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸；及び（ｂ）（ｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーターを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ａ）（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸；及び（ｂ）（ｉｉ）ｇｐ１３０分子又はＳｔａｔ３分子を含む細胞又は細胞の集団を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ａ）（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸；及び（ｂ）（ｉｉｉ）ｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はそれをコードする核酸を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｉ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｉｉ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｉｉｉ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｉｖ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｖ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉｉ）；（ａ）（ｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉｉｉ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｉ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｉｉ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｉｉｉ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｉｖ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｖ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉ）；（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉｉ）；並びに（ａ）（ｉｉ）及びｂ−ｉ−ｖｉｉｉ）の１つ以上を含む。
【００９０】
一態様において、反応混合物であって、
ａ）ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞の集団、及び
ｂ）解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）
を含む反応混合物が本明細書に開示される。
【００９１】
別の態様において、反応混合物であって、
ａ）免疫エフェクター細胞の集団、
ｂ）ＣＡＲをコードする核酸、例えば本明細書に記載されるＣＡＲ、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ、及び
ｃ）解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）
を含む反応混合物が本明細書に開示される。
【００９２】
特定の態様において、本明細書に開示される反応混合物は、
（ｉ）Ｓｔａｔ３アクティベーター；
（ｉｉ）ｇｐ１３０分子又はＳｔａｔ３分子を発現する細胞又は細胞の集団；
（ｉｉｉ）ｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はそれをコードする核酸；及び
（ｉｖ）解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）
を含む。
【００９３】
一実施形態において、本明細書に開示される反応混合物は、レンチウイルスを更に含み、例えば、ＣＡＲをコードする核酸は、レンチウイルス中にパッケージされている。
【００９４】
本明細書に開示される反応混合物の一実施形態において、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００９５】
一実施形態において、本明細書で開示される反応混合物は、ＣＡＲに結合する抗原（例えば、ＣＤ１９）を発現する細胞の集団を更に含む。
【００９６】
本明細書に開示される反応混合物の一実施形態において、解糖阻止剤、例えば、２−ＤＧは、少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５ｍＭ、０．５〜２．５ｍＭ又は１〜２ｍＭの濃度で存在する。
【００９７】
いくつかの態様において、本開示は、例えば、ＣＡＲ発現細胞投与前の、ＣＡＲ発現細胞による治療的処置に対する、癌（例えば、本明細書に記載される癌）を有する対象の応答性を評価又は予測する方法であって、対象からの免疫エフェクター細胞において、
ｉ）グルコース代謝のレベルであって、
グルコース代謝基準値よりも低いグルコース代謝のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する、例えば完全応答又は部分応答を示す可能性が高いことを示し、及び
グルコース代謝基準値よりも高いグルコース代謝のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低く、例えば完全応答又は部分応答を示さないことを示す、グルコース代謝のレベル；又は
ｉｉ）（例えば、チロシン７０５（Ｙ７０５）上の）例えばＳｔａｔ３のリン酸化又はＳｔａｔ３転写標的（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｓｏｘ２、Ｂｃｌ−２若しくはＲＯＲＣ）のレベル若しくは活性によって測定されるようなＳｔａｔ３活性化のレベルであって、
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも高いＳｔａｔ３活性化のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する、例えば完全応答又は部分応答を示す可能性が高いことを示し、及び
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも低いＳｔａｔ３活性化のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低く、例えば完全応答又は部分応答を示さないことを示す、Ｓｔａｔ３活性化のレベル
を評価し、それにより対象を評価するか、又はＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答性を予測すること
を含む方法を提供する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸と接触されていない。
【００９９】
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸と接触されており、例えばＣＡＲポリペプチドを発現する。
【０１００】
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、
ｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーター；
ｉｉ）ｇｐ１３０分子又はＳｔａｔ３分子を含む細胞又は細胞の集団；
ｉｉｉ）ｇｐ１３０分子若しくはＳｔａｔ３分子又はそれをコードする核酸；又は
ｉｖ）少なくとも０．５、１、１．５、２又は２．５ｍＭの濃度の解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）
と接触されている。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、方法は、細胞数、例えばＣＡＲ発現細胞の数の倍率変化を決定することを更に含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低い対象は、無応答（ＮＲ）又は部分応答（ＰＲ）を示すと予測される。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、
ｉ）グルコース代謝のレベルがグルコース代謝基準値よりも低いか；又は
ｉｉ）Ｓｔａｔ３活性化のレベルがＳｔａｔ３活性化基準値よりも高い
という判定に応答して、対象は、ＣＡＲ発現療法の投与のために選択されるか又はそれを投与される。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、
ｉ）グルコース代謝のレベルがグルコース代謝基準値よりも高いか；又は
ｉｉ）Ｓｔａｔ３活性化のレベルがＳｔａｔ３活性化基準値よりも低い
という判定に応答して、対象は、ＣＡＲ発現療法以外の療法の投与のために選択されるか又はそれを投与される。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、グルコース代謝基準値は、例えば、実施例１に記載されるような完全応答対象の細胞のグルコース代謝値であり、例えば、細胞（例えば、細胞を含有するサンプル）は、例えば、実施例１に記載されるように、偽刺激、例えばＣＡＲ抗原以外の抗原による刺激と接触される。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３活性化基準値は、例えば、実施例２に記載されるような非応答対象の細胞のＳｔａｔ３活性化値である。
【０１０７】
一態様において、本開示は、例えば、ＣＡＲ発現細胞投与前の、ＣＡＲ発現細胞による治療的処置に対する、癌（例えば、本明細書に記載される癌）を有する対象の応答性を評価又は予測する方法であって、
対象からの免疫エフェクター細胞におけるグルコース代謝のレベルを評価することであって、
基準値よりも低いグルコース代謝のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する、例えば完全応答又は部分応答を示す可能性が高いことを示し、及び
基準値よりも高いグルコース代謝のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低く、例えば完全応答又は部分応答を示さないことを示す、評価することを行い、それにより対象を評価するか、又はＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答性を予測すること
を含む方法を提供する。
【０１０８】
一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸と接触されていない。
【０１０９】
一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸と接触されており、例えばＣＡＲポリペプチドを発現する。
【０１１０】
一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、少なくとも０．５、１、１．５、２又は２．５ｍＭの濃度の解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）と接触されている。
【０１１１】
一実施形態において、方法は、細胞数の倍率変化を決定することを更に含む。
【０１１２】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低い対象は、無応答（ＮＲ）又は部分応答（ＰＲ）を示すと予測される。
【０１１３】
一実施形態において、グルコース代謝のレベルが基準値よりも低いという判定に応答して、対象は、ＣＡＲ発現療法の投与のために選択されるか又はそれを投与される。
【０１１４】
一実施形態において、グルコース代謝のレベルが基準値よりも高いという判定に応答して、対象は、ＣＡＲ発現療法以外の療法の投与のために選択されるか又はそれを投与される。
【０１１５】
一実施形態において、基準値は、実施例１に記載されるような完全応答対象の細胞のグルコース代謝値であり、例えば、細胞（例えば、細胞を含有するサンプル）は、例えば、実施例１に記載されるように、偽刺激、例えばＣＡＲ抗原以外の抗原による刺激と接触される。
【０１１６】
いくつかの態様において、癌（例えば、本明細書に記載される癌）を有する対象の応答性を評価又は予測する方法であって、対象は、ＣＡＲ発現細胞で処置されている、方法が本明細書に開示され、この方法は、対象からのＣＡＲ発現細胞において、
ｉ）グルコース代謝のレベルであって、
グルコース代謝基準値よりも低いグルコース代謝のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する、例えば完全応答又は部分応答を示す可能性が高いことを示し、及び
グルコース代謝基準値よりも高いグルコース代謝のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低く、例えば完全応答又は部分応答を示さないことを示す、グルコース代謝のレベル；又は
ｉｉ）（例えば、チロシン７０５（Ｙ７０５）上の）例えばＳｔａｔ３のリン酸化又はＳｔａｔ３転写標的（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｓｏｘ２、Ｂｃｌ−２若しくはＲＯＲＣ）のレベル若しくは活性によって測定されるようなＳｔａｔ３活性化のレベルであって、
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも高いＳｔａｔ３活性化のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する、例えば完全応答又は部分応答を示す可能性が高いことを示し、及び
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも低いＳｔａｔ３活性化のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低く、例えば完全応答又は部分応答を示さないことを示す、Ｓｔａｔ３活性化のレベル
を評価し、それにより対象を評価するか、又はＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答性を予測すること
を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、方法は、ＣＡＲ発現細胞におけるグルコース代謝のレベル又はＳｔａｔ３活性化のレベルを評価する前に対象からＣＡＲ発現細胞を得ることを更に含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低い対象は、ＮＲ又はＰＲを示すと予測される。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、
ｉ）グルコース代謝のレベルがグルコース代謝基準値よりも低いか；又は
ｉｉ）Ｓｔａｔ３活性化のレベルがＳｔａｔ３活性化基準値よりも高い
という判定に応答して、対象は、ＣＡＲ発現療法の１回以上の追加の投与のために選択されるか又はそれを投与される。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、
ｉ）グルコース代謝のレベルがグルコース代謝基準値よりも高いか；又は
ｉｉ）Ｓｔａｔ３活性化のレベルがＳｔａｔ３活性化基準値よりも低い
という判定に応答して、対象は、ＣＡＲ発現療法以外の療法の投与のために選択されるか又はそれを投与される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、グルコース代謝基準値は、実施例１に記載されるような完全応答対象の細胞のグルコース代謝値であり、例えば、細胞（例えば、細胞を含有するサンプル）は、例えば、実施例１に記載されるように、偽刺激、例えばＣＡＲ抗原以外の抗原による刺激と接触される。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３活性化基準値は、例えば、実施例２に記載されるような非応答対象の細胞のＳｔａｔ３活性化値である。
【０１２３】
一態様において、癌（例えば、本明細書に記載される癌）を有する対象の応答性を評価又は予測する方法であって、対象は、ＣＡＲ発現細胞で処置されている、方法が本明細書に開示され、この方法は、
対象からのＣＡＲ発現細胞においてグルコース代謝のレベルを評価することであって、
基準値よりも低いグルコース代謝のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する、例えば完全応答又は部分応答（例えば、ＰＲＴＤ）を示す可能性が高いことを示し、及び
基準値よりも高いグルコース代謝のレベルは、対象がＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低く、例えば完全応答又は部分応答、例えばＰＲＴＤを示さないことを示す、評価することを行い、それにより対象を評価するか、又はＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答性を予測すること
を含む。
【０１２４】
一実施形態において、方法は、ＣＡＲ発現細胞におけるグルコース代謝のレベルを評価する前に対象からＣＡＲ発現細胞を得ることを更に含む。
【０１２５】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞による処置に応答する可能性がより低い対象は、ＮＲ又はＰＲを示すと予測される。
【０１２６】
一実施形態において、グルコース代謝のレベルが基準値よりも低いという判定に応答して、対象は、ＣＡＲ発現療法の１回以上の追加の投与のために選択されるか又はそれを投与される。
【０１２７】
一実施形態において、グルコース代謝のレベルが基準値よりも高いという判定に応答して、対象は、ＣＡＲ発現療法以外の療法の投与のために選択されるか又はそれを投与される。
【０１２８】
一実施形態において、基準値は、実施例１に記載されるような完全応答対象の細胞のグルコース代謝値であり、例えば、細胞（例えば、細胞を含有するサンプル）は、例えば、実施例１に記載されるように、偽刺激、例えばＣＡＲ抗原以外の抗原による刺激と接触される。
【０１２９】
いくつかの態様において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ１９発現細胞（例えば、ＣＴＬ０１９）を評価する方法であって、対象からのサンプル中のＣＡＲ発現細胞において、
ｉ）グルコース代謝のレベルであって、
グルコース代謝基準値よりも低いグルコース代謝のレベルは、サンプルが処置に適していることを示し、及び
グルコース代謝基準値よりも高いグルコース代謝のレベルは、サンプルが処置により適さないことを示す、グルコース代謝のレベル；又は
ｉｉ）Ｓｔａｔ３活性化のレベルであって、
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも高いＳｔａｔ３活性化のレベルは、サンプルが処置に適していることを示し、及び
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも低いＳｔａｔ３活性化のレベルは、サンプルが処置により適さないことを示す、Ｓｔａｔ３活性化のレベル
を評価し、それによりＣＡＲ発現細胞を評価すること
を含む方法を提供する。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、方法は、細胞を選択すること又は複数の細胞を濃縮することを更に含み、その細胞又は複数は、処置に適している。いくつかの実施形態において、方法は、細胞を除去すること又は複数の細胞を希釈することを更に含み、その細胞又は複数は、処置により適さない。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、方法は、細胞を選択すること又は複数の細胞を濃縮することを更に含み、ここで、
グルコース代謝のレベルがグルコース代謝基準値よりも低いか；又は
Ｓｔａｔ３活性化基準値よりも高いＳｔａｔ３活性化のレベル
である。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、方法は、複数の細胞のうちの細胞を対象に投与することを更に含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、方法は、ＣＡＲ発現細胞におけるグルコース代謝のレベル又はＳｔａｔ３活性化を評価する前に対象からＣＡＲ発現細胞を得ることを更に含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、
ｉ）グルコース代謝のレベルがグルコース代謝基準値よりも低いか；又は
ｉｉ）Ｓｔａｔ３活性化のレベルがＳｔａｔ３活性化基準値よりも高い
という判定に応答して、サンプルは、対象への投与のために選択されるか又は投与される。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、
ｉ）グルコース代謝のレベルがグルコース代謝基準値よりも高い、
ｉｉ）Ｓｔａｔ３活性化のレベルがＳｔａｔ３活性化基準値よりも低い
という判定に応答して、サンプルは、対象への投与のために選択されないか又は投与されない。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、グルコース代謝基準値は、実施例１に記載されるような完全応答対象の細胞のグルコース代謝値であり、例えば、細胞（例えば、細胞を含有するサンプル）は、例えば、実施例１に記載されるように、偽刺激、例えばＣＡＲ抗原以外の抗原による刺激と接触される。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３活性化基準値は、例えば、実施例２に記載されるような非応答対象の細胞のＳｔａｔ３活性化値である。
【０１３８】
一態様において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ１９発現細胞（例えば、ＣＴＬ０１９）を評価する方法を提供し、前記方法は、
対象からのサンプル中のＣＡＲ発現細胞においてグルコース代謝のレベルを評価することであって、
基準値よりも低いグルコース代謝のレベルは、サンプルが処置に適していることを示し、及び
基準値よりも高いグルコース代謝のレベルは、サンプルが処置により適さないことを示す、評価することを行い、それによりＣＡＲ発現細胞を評価すること
を含む。
【０１３９】
一実施形態において、方法は、ＣＡＲ発現細胞におけるグルコース代謝のレベルを評価する前に対象からＣＡＲ発現細胞を得ることを更に含む。
【０１４０】
一実施形態において、グルコース代謝のレベルが基準値よりも低いという判定に応答して、サンプルは、対象への投与のために選択されるか又は対象に投与される。
【０１４１】
一実施形態において、グルコース代謝のレベルが基準値よりも高いという判定に応答して、サンプルは、対象への投与のために選択されないか又は対象に投与されない。
【０１４２】
一実施形態において、基準値は、実施例１に記載されるような完全応答対象の細胞のグルコース代謝値であり、例えば、細胞（例えば、細胞を含有するサンプル）は、例えば、実施例１に記載されるように、偽刺激、例えばＣＡＲ抗原以外の抗原による刺激と接触される。
【０１４３】
本明細書の態様のいずれか、例えば上記の免疫エフェクター細胞組成物及び方法は、本明細書の１つ以上の実施形態、例えば以下の実施形態と組み合わせることができる。
【０１４４】
一実施形態において、本明細書における方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製又は濃縮することを含み、方法は、水簸を実施することを含む。方法は、免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプルを提供すること、凍結したインプットサンプルを解凍して、解凍したサンプルを産生すること、及び解凍したサンプルの水簸を行い、免疫エフェクター細胞を回収し、それによりＣＡＲの発現に適した免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを産生することを含み得る。
【０１４５】
一実施形態において、凍結インプットサンプルは、血漿アフェレーシスサンプルである。
【０１４６】
一実施形態において、方法は、
ｉ）流動条件下でＣＤ１９＋細胞を枯渇させること；
ｉｉ）イオジキサノール、例えば水中６０％イオジキサノールを含み、且つ／又はフィコールより高い密度（例えば、１．０７７ｇ／ｍＬ超、例えば約１．３２ｇ／ｍＬ）を有する培地（例えば、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ培地）を使用して密度遠心分離を実施すること；
ｉｉｉ）デキストロース及び／又は塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えばＤ５  １／２  ＮＳ培地（５％デキストロース及び０．４５％塩化ナトリウム）で洗浄工程を（例えば、解凍されたサンプルについて）実施することであって、例えば、洗浄工程は、細胞プロセシング装置、例えば細胞洗浄装置又は密度勾配遠心分離に使用される装置、例えばＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）機器を使用して行われる、実施すること；及び
ｉｖ）流動条件下でＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞のポジティブ選択を実施すること
の１つ、２つ、３つ又は全てを更に含む。
【０１４７】
一実施形態において、方法は、例えば、解凍されたサンプルに等張溶液、例えばＰＢＳを加えることにより、解凍されたサンプルの粘度を調整する工程を更に含む。
【０１４８】
一実施形態において、水簸は、約３０〜８２ｍＬ／分又は５０〜８０ｍＬ／分の流速を使用して実施され、及び／又は回収体積は、各画分について約２５０〜１２５０ｍＬ又は３００〜１０００ｍＬである。一実施形態において、水簸は、約３０、４０、５０、６０、７０、７２又は８２ｍＬ／分、例えば約７０又は７２ｍＬ／分の流速を使用して実施される。一実施形態において、水簸は、約３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜７２、７０〜８２、７２〜８２ｍＬ／分の流速を使用して実施される。一実施形態において、水簸は、約２５０、４００、５００、９００又は９７５ｍＬ、例えば約４００又は９７５ｍＬの回収体積を使用して実施される。一実施形態において、水簸は、約２５０〜４００、４００〜５００、５００〜９００、９００〜１０００又は１０００〜１２５９ｍＬの回収体積を使用して実施される。一実施形態において、水簸は、約２４００ｒｐｍで実施される。一実施形態において、水簸は、約２０００〜２８００、２２００〜２６００又は２３００〜２５００ｒｐｍで実施される。
【０１４９】
一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３５％又は４０％の単球を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％又は２０％未満のＴ細胞を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＢ細胞を含む。
【０１５０】
一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０．５％、０．２％又は０．１％未満の単球を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＴ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０．５％、０．２％又は０．１％未満のＢ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％のＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞を含む。
【０１５１】
一実施形態において、方法は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＴ細胞のＴ細胞回収収率をもたらす。
【０１５２】
一実施形態において、アウトプットサンプルは、ＣＡＲをコードする核酸と接触される。一実施形態において、アウトプットサンプルを、ＣＡＲをコードする核酸と接触させた後、アウトプットサンプルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％のＣＡＲ＋細胞を含む。そのような実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＣＡＲ＋ＣＤ４＋セントラルメモリー細胞を含む。そのような実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＣＡＲ＋ＣＤ８＋セントラルメモリー細胞を含む。
【０１５３】
一実施形態において、アウトプットサンプルを、ＣＡＲをコードする核酸と接触させた後、アウトプットサンプルは、１つのＣＡＲ発現細胞、例えば形質導入細胞あたり１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２又は０．１ｐｇ未満のＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−γ）を産生する。ＩＦＮγ（ＩＦＮ−γ）放出アッセイは、本明細書、例えば実施例に記載される。一実施形態において、アウトプットサンプルを、ＣＡＲをコードする核酸と接触させた後、アウトプットサンプルは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５又は３０の細胞毒性レベル（例えば、ＥＣ５０ｒｅｃ）を含む。細胞毒性アッセイは、本明細書、例えば実施例に記載されている。
【０１５４】
一実施形態において、本明細書における方法は、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製又は濃縮することを含み、方法は、密度勾配遠心分離（本明細書では密度遠心分離とも称される）を実施することを含む。方法は、免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを提供すること、及びイオジキサノール、例えば水中６０％イオジキサノールを含み、且つ／又はフィコールより高い密度（例えば、１．０７７ｇ／ｍＬ超、例えば約１．３２ｇ／ｍＬ）を有する培地、例えば、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ培地を使用して密度遠心分離工程を実施し、それによりＣＡＲの発現に適した免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを産生することを含み得る。
【０１５５】
一実施形態において、本明細書に記載される密度勾配遠心分離法は、
ｉ）流動条件下でＣＤ１９＋細胞を枯渇させること；
ｉｉ）インプットサンプルが、任意選択により、解凍されたインプットサンプルである、インプットサンプルの水簸；
ｉｉｉ）デキストロース及び／又は塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えばＤ５  １／２  ＮＳ培地（５％デキストロース及び０．４５％塩化ナトリウム）で洗浄工程を（例えば、密度遠心分離前に）実施することであって、例えば、洗浄工程は、ＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）機器を使用して行われる、実施すること；及び流動条件下でのＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞のポジティブ選択
の１つ、２つ、３つ又は全てを実施することを更に含む。
【０１５６】
一実施形態において、本明細書に記載される密度勾配遠心分離法は、グリコールを含む溶液、例えばフィコール溶液を使用すること；又はデキストロース及び／又は塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えばＤ５  １／２  ＮＳ培地中で洗浄工程を実施することであって、例えば、洗浄工程は、ＣＳ５機器を使用して行われる、実施すること；又はポジティブ選択工程を実施することの１つ以上を含まない。
【０１５７】
一実施形態において、密度遠心分離は、細胞分離装置、例えばＳｅｐａｘ２装置を使用して実施される。
【０１５８】
一実施形態において、インプットサンプルは、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％又は１５％未満のＴ細胞を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％の単球を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又は８０％のＢ細胞を含む。
【０１５９】
一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＴ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０．５％、０．２％又は０．１％未満の単球を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％又は０．０１％未満のＢ細胞を含む。
【０１６０】
一実施形態において、本明細書に記載の密度勾配遠心分離方法は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＴ細胞の回収収率をもたらす。
【０１６１】
一実施形態において、本明細書における方法は、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製することを含み、ここで、方法は、癌関連抗原発現細胞、例えばＣＤ１９発現（ＣＤ１９＋）細胞を除去するためのネガティブ選択工程を含む。方法は、免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを提供すること、及び流動条件下で例えばフロースルーデバイス、例えば本明細書に記載の細胞プロセシングシステムを使用して、インプットサンプルからＣＤ１９＋細胞を除去し、それによりＣＡＲの発現に適した免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを産生することを含み得る。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、Ｂ細胞を含む。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、リンパ芽球を含む。
【０１６２】
一実施形態において、本明細書に記載されるネガティブ選択方法は、
ｉ）インプットサンプルが、任意選択により、解凍されたインプットサンプルである、インプットサンプルの水簸；
ｉｉ）イオジキサノール、例えば水中６０％イオジキサノールを含み、且つ／又はフィコールより高い密度（例えば、１．０７７ｇ／ｍＬ超、例えば約１．３２ｇ／ｍＬ）を有する培地（例えば、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ培地）を使用した密度遠心分離工程；
ｉｉｉ）デキストロース及び／又は塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えばＤ５  １／２  ＮＳ培地（５％デキストロース及び０．４５％塩化ナトリウム）で洗浄工程を（例えば、ＣＤ１９＋細胞の除去前及び／又はインプットサンプルの解凍後に）実施することであって、例えば、洗浄工程は、ＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）機器を使用して行われる、実施すること；及び
ｉｖ）流動条件下でのＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞のポジティブ選択
の１つ、２つ、３つ又は全てを実施することを更に含む。
【０１６３】
一実施形態において、本明細書に記載されるネガティブ選択方法は、水簸又は密度遠心分離を実施することを含まない。
【０１６４】
一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、磁気分離によってインプットサンプルから除去される。一実施形態において、磁気分離は、細胞を分離試薬と接触させることを含む。一実施形態において、分離試薬は、磁性又は常磁性のメンバー及びＣＤ１９結合メンバーを含む。一実施形態において、磁気分離は、フローサイトメトリー又はＦＡＣＳを含む。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、ＦＡＣＳによって除去される。一実施形態において、磁気分離は、磁気細胞分離装置、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣｓ装置の使用を含む。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣｓ装置によって除去される。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、本明細書に記載されるようなフロースルー装置、例えば本明細書に記載されるような細胞プロセシングシステムによって除去される。
【０１６５】
一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％のＣＤ１９＋細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％又は０．０１％未満のＣＤ１９＋細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、インプットサンプルと比較して５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％又は１％未満の割合のＣＤ１９＋細胞を含む。
【０１６６】
一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３５％又は４０％の単球を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％又は２０％未満のＴ細胞を含む。一実施形態において、インプットサンプル（例えば、洗浄後のインプットサンプル）は、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又は８０％のＢ細胞を含む。
【０１６７】
一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０．５％、０．２％又は０．１％未満の単球を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＴ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％又は０．０１％未満のＢ細胞を含む。
【０１６８】
一実施形態において、本明細書に記載のネガティブ選択方法は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＴ細胞の回収収率をもたらす。
【０１６９】
一実施形態において、本明細書における方法は、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製することを含み、方法は、ポジティブ選択を含む。方法は、免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを提供すること、及び流動条件下でインプットサンプルからＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞をポジティブ選択し、それによりＣＡＲの発現に適した免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを産生することであって、例えば、ポジティブ選択は、流動条件下で実施される、産生することを含み得る。
【０１７０】
一実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ選択方法は、
ｉ）ＣＤ１９＋細胞を例えば流動条件下で枯渇させること；インプットサンプルが、任意選択により、解凍されたインプットサンプルである、インプットサンプルの水簸；
ｉｉ）イオジキサノール、例えば水中６０％イオジキサノールを含み、且つ／又はフィコールより高い密度（例えば、１．０７７ｇ／ｍＬ超、例えば約１．３２ｇ／ｍＬ）を有する培地（例えば、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ培地）を使用して密度遠心分離を実施すること；及び
ｉｉｉ）デキストロース及び／又は塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えばＤ５  １／２  ＮＳ培地（５％デキストロース及び０．４５％塩化ナトリウム）で洗浄工程を（例えば、ＣＤ１９＋細胞の除去前及び／又はインプットサンプルの解凍後に）実施することであって、例えば、洗浄工程は、ＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）機器を使用して行われる、実施すること
の１つ、２つ、３つ又は全てを実施することを更に含む。
【０１７１】
一実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ選択方法は、インプットサンプルの水簸（例えば、インプットサンプルは、解凍されたインプットサンプルである）を実施することを更に含む。任意選択により、水簸は、ＣＤ１９＋細胞を枯渇させること（例えば、上記（ｉ）に記載されるように）、密度遠心分離を実施すること（例えば、上記（ｉｉ）に記載されるように）、及び洗浄工程を実施すること（例えば、上記（ｉｉｉ）に記載されるように）の１つ以上（例えば、１つ、２つ又は全て）と共に実施される。
【０１７２】
一実施形態において、本明細書に記載のポジティブ選択方法は、ポジティブ選択を実施する前に水簸、洗浄工程（任意選択による）及び密度遠心分離（例えば、フィコール又はＯｐｔｉＰｒｅｐ培地を使用）を実施することを更に含む。一実施形態において、本明細書に記載のポジティブ選択方法は、ポジティブ選択を実施する前に洗浄工程（任意選択による）及び密度遠心分離（例えば、フィコール又はＯｐｔｉＰｒｅｐ培地を使用）を実施することを更に含む。一実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ選択方法は、水簸を実施することを含まない。一実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ選択方法は、デキストロース及び／又は塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えばＤ５  １／２  ＮＳ緩衝液で例えばＣＳ５＋機器を使用して洗浄を実施することを更に含む。
【０１７３】
一実施形態において、ポジティブ選択は、インプットサンプルを分離試薬と接触させることを含み、この分離試薬は、磁性又は常磁性のメンバー並びにＣＤ３及び／又はＣＤ２８結合メンバーを含む。一実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞のポジティブ選択は、約１０〜９０分間、約１０〜６０分間、約１０〜４５分間、約１２〜９０分間、約１２〜６０分間、約１２〜４５分間、約１５〜９０分間、約１５〜６０分間、約１５〜４５分間、例えば約３０分間又は約２０分間にわたり、インプットサンプルを分離試薬とインキュベートすることを含む。一実施形態において、分離試薬は、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体にカップリングされる（例えば、共有結合的又は非共有結合的にカップリングされる）ビーズを含む。一実施形態において、ポジティブ選択は、約３：１の比率の磁気分離メンバー（例えば、ビーズ）対Ｔ細胞を使用する。
【０１７４】
一実施形態において、ポジティブ選択は、免疫エフェクター細胞及び磁気分離メンバーを含む流体を、磁気分離が発生する閉鎖系、例えばチャンバー又はバッグ内に流動させることを含む。１つの実施形態において、流動は、メンバー（任意選択により免疫エフェクター細胞に結合される）の磁気分離が発生するような速度で実施される。一実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞のポジティブ選択は、約６、５、６、３、２若しくは１分未満又は約５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２若しくは１秒未満の分離又は滞留時間を含む。
【０１７５】
一実施形態において、ポジティブ選択は、磁気装置、例えばＤｙｎａｍａｇ  ＣＴＳ、本明細書に記載されるような磁気要素を含むフロースルー装置又は磁気要素の他の設備で実施される。
【０１７６】
一実施形態において、ポジティブ選択は、少なくとも１つの細胞懸濁液モジュール；少なくとも１つのフロースルー磁気分離／ビーズ除去モジュール；少なくとも１つの非磁気アウトプットモジュール；少なくとも１つの磁気アウトプットモジュール；任意選択により、磁力及び／又は勾配を生成する、磁気分離／ビーズ除去モジュールの外部にある少なくとも１つの磁気成分；及び任意選択により、少なくとも１つのバッファーモジュールを含む装置を使用して実施される。一実施形態において、装置は、磁力及び／又は勾配を生成する、磁気分離／ビーズ除去モジュールの外部にある少なくとも１つの磁気成分を更に含む。一実施形態において、装置は、少なくとも１つのバッファーモジュールを更に含む。一実施形態において、磁気分離／ビーズ除去モジュールは、壁によって画定され、ｘ方向、ｙ方向及びｚ方向を有するチャンバー；チャンバーの両端（例えば、ｘ方向、ｙ方向又はｚ方向）に配置された入口及び出口；チャンバーの壁に隣接又は近接し、入口と出口との間のチャンバー内でゼロ勾配線を確立するように配置された少なくとも２つの磁石を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、チャンバーを通って流れ、チャンバー内の各点は、磁石から２ｃｍ以内にある。
【０１７７】
一実施形態において、ポジティブ選択方法は、免疫エフェクター細胞を、デキストロース及び／又は塩化ナトリウムを含む溶液、例えばＤ５  １／２  ＮＳ培地（５％デキストロース及び０．４５％塩化ナトリウム）と接触させることを（例えば、工程ａ）及びｂ）間に）含み、任意選択により、溶液は、環境温度、例えば約２０〜２５℃である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、例えば工程ａ）及びｂ）間において可撓性容器、例えばバッグ内に存在する。一実施形態において、方法は、バッグを、断熱材、例えば紙、例えばペーパータオル又はワイプを含む複数の層の上に置くことを（例えば、工程ａ）及びｂ）間、例えば免疫エフェクター細胞を生理食塩水と接触させた後に）含む。一実施形態において、方法は、細胞を約３７℃で約１０分間にわたりインキュベートすることを（例えば、工程ｂ後に）含む。一実施形態において、方法は、細胞を約３６〜３８、３５〜３９又は３４〜４０℃、例えば約１０分間にわたりインキュベートすることを（例えば、工程ｂ後に）含む。一実施形態において、インキュベーション工程は、約８〜１２、５〜１５又は５〜２０分間続く。一実施形態において、インキュベーションは、Ｐｌａｓｍａｔｈｅｒｍ装置で実施される。
【０１７８】
ポジティブ選択方法の一実施形態において、免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルは、少なくとも２０％の単球を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％の単球を含む。
【０１７９】
一実施形態において、ポジティブ選択方法は、
ａ）血液悪性腫瘍を有する患者からの免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）を解凍することであって、任意選択により、サンプルは、２０％を超えるリンパ芽球を含む、解凍すること；
ｂ）免疫エフェクター細胞を例えば環境温度、例えば２０〜２５℃において洗浄溶液、例えば「改変培地」（ＭＭ）と呼ばれるＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で洗浄すること；
ｃ）インプットサンプルを、磁性又は常磁性のメンバー並びにＣＤ３及び／又はＣＤ２８結合メンバーを含む分離試薬と接触させること；
ｄ）インプットサンプル及び分離試薬を回転子上において例えば２〜６ｒｐｍ、例えば４ｒｐｍで回転させることであって、回転は、例えば、１０〜３０分間、例えば２０分間続く、回転させること；及び
ｅ）ポジティブ選択を実施して、分離試薬に結合する細胞を例えば３０秒間〜２分間、例えば１分間にわたり濃縮すること
の１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ又は全て）を、例えば列挙された順で含む。
【０１８０】
一実施形態において、ポジティブ選択方法は、
ａ）血液悪性腫瘍を有する患者からの免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）を解凍することであって、任意選択により、サンプルは、２０％を超える単球を含む、解凍すること；
ｂ）免疫エフェクター細胞を例えば環境温度、例えば２０〜２５℃において洗浄溶液、例えば約５％のデキストロース及び０．４５％の塩化ナトリウムを含むもの、例えばＤ５  １／２ＮＳ中で洗浄すること；
ｃ）細胞を含む可撓性容器を、断熱材、例えば紙、例えばペーパータオル又はワイプを含む複数の層の上に置くこと；
ｄ）インプットサンプルを、磁性又は常磁性のメンバー並びにＣＤ３及び／又はＣＤ２８結合メンバーを含む分離試薬と接触させること；
ｅ）インプットサンプルと分離試薬とを例えば３７℃において例えば５〜１５分間、例えば１０分間にわたりインキュベートすること；
ｆ）インプットサンプル及び分離試薬を回転子上において例えば２〜６ｒｐｍ、例えば４ｒｐｍで回転させることであって、回転は、例えば、１０〜３０分間、例えば２０分間続く、回転させること；及び
ｇ）ポジティブ選択を実施して、分離試薬に結合する細胞を例えば３０秒間〜２分間、例えば１分間にわたり濃縮すること
の１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は全て）を、例えば列挙された順で含む。
【０１８１】
一実施形態において、サンプル、例えばインプットサンプルは、血液学的悪性腫瘍、例えば本明細書に記載の血液学的悪性腫瘍、例えばＡＬＬ又はＤＬＢＣＬを有する患者からのものである。
【０１８２】
一実施形態において、インプットサンプルは、約１×１０５有核細胞／ｍｌ、２×１０５有核細胞／ｍｌ、５×１０５有核細胞／ｍｌ、７×１０５有核細胞／ｍｌ、１×１０６有核細胞／ｍｌ、２×１０６有核細胞／ｍｌ、５×１０６有核細胞／ｍｌ、７×１０６有核細胞／ｍｌ、１×１０７有核細胞／ｍｌ、２×１０７有核細胞／ｍｌ、５×１０７有核細胞／ｍｌ、７×１０７有核細胞／ｍｌ、１×１０７有核細胞／ｍｌ、２×１０８有核細胞／ｍｌ、５×１０８有核細胞／ｍｌ及び７×１０８有核細胞／ｍｌを含む。一実施形態において、インプットサンプルは、約１〜１．５×１０７個のＴ細胞を含む。
【０１８３】
一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の単球を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の腫瘍細胞、例えばリンパ芽球を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％又は２０％未満の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも約５％、１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＢ細胞、例えばＣＤ４５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも約５％、１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％のＢ細胞、例えばＣＤ４５−ＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む。
【０１８４】
一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０．５％、０．２％又は０．１％未満の単球を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０．５％、０．２％又は０．１％未満の腫瘍細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％又は９９．９％の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のＴ細胞、例えばＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満のＢ細胞、例えばＣＤ４５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満のＢ細胞、例えばＣＤ４５−ＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％又は２０％のＴ細胞を含む。
【０１８５】
一実施形態において、本明細書における方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製することを含み、方法は、
ｉ）インプットサンプル、例えば免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプル又は新鮮なインプットサンプルを提供すること；任意選択により、インプットサンプルが凍結インプットサンプルであり、凍結インプットサンプルを解凍して解凍サンプルを生成すること；
ｉｉ）インプットサンプルが、任意選択により、解凍されたインプットサンプルである、インプットサンプルの水簸を実施すること；又はイオジキサノール、例えば水中６０％イオジキサノールを含み、且つ／又はフィコールより高い密度（例えば、１．０７７ｇ／ｍＬ超、例えば約１．３２ｇ／ｍＬ）を有する培地、例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ培地を使用して密度遠心分離工程を実施することを含む、濃縮工程を実施すること；及び
ｉｉｉ）選択工程を実行することであって、選択は、ポジティブ選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞のポジティブ選択又はネガティブ選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋又はＣＤ１４＋細胞のネガティブ選択である、実行することを行い、それによりＣＡＲの発現に適した免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを産生すること
を含む。
【０１８６】
一実施形態において、本明細書における方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製することを含み、方法は、
ｉ）インプットサンプル、例えば免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプル又は新鮮なインプットサンプルを提供すること；
ｉｉ）任意選択により、インプットサンプルが凍結インプットサンプルであり、凍結インプットサンプルを解凍して解凍サンプルを生成すること；
ｉｉｉ）
１）インプットサンプルが、任意選択により、解凍されたインプットサンプルである、インプットサンプルの水簸を実施すること；又は
２）イオジキサノール、例えば水中６０％イオジキサノールを含み、且つ／又はフィコールより高い密度（例えば、１．０７７ｇ／ｍＬ超、例えば約１．３２ｇ／ｍＬ）を有する培地、例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ培地を使用して密度遠心分離工程を実施すること
を含む、濃縮工程を実施すること；及び
ｉｖ）選択工程を実行することであって、選択は、ポジティブ選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞のポジティブ選択又はネガティブ選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋又はＣＤ１４＋細胞のネガティブ選択である、実行することを行い、それによりＣＡＲの発現に適した免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを産生すること
を含む。
【０１８７】
一実施形態において、本明細書における方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製することを含み、方法は、
ｉ）インプットサンプル、例えば免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプル又は新鮮なインプットサンプルを提供すること；
ｉｉ）水簸又は密度遠心分離を（例えば、フィコール又はＯｐｔｉｐｒｅｐ培地を使用して）実施することを含む、濃縮工程を実施すること；及び
ｉｉｉ）選択工程を実行することであって、選択は、ポジティブ選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞のポジティブ選択又はネガティブ選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋又はＣＤ１４＋細胞のネガティブ選択である、実行することを行い、それによりＣＡＲの発現に適した免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを産生すること
を含む。一実施形態において、選択工程は、例えば、フロースルー装置を使用することによって流動条件下で実施される。
【０１８８】
本明細書に記載の方法又は組成物のいずれかの追加の特徴又は実施形態は、以下の１つ以上を含む。
【０１８９】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態におけるインプットサンプルは、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を含む対象からの生体サンプルである。一実施形態において、インプットサンプルは、血液サンプル、例えば全血サンプルである。一実施形態において、インプットサンプルは、アフェレーシスサンプル、例えば白血球アフェレーシスサンプルである。一実施形態において、インプットサンプルは、新鮮なサンプルであり、サンプルは、対象から得られ、対象から得てから１日、２日、５日又は７日以内に本明細書に記載の方法のいずれかを使用してプロセスされる。一実施形態において、インプットサンプルは、凍結又は凍結保存されたサンプルであり、例えば−２０℃又は液体窒素で凍結されるか、又は毎分１°の速度で−８０℃に凍結され、液体窒素保存タンクの蒸気相に保存される。
【０１９０】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の単球（及び任意選択により最大４０％、７０％又は９５％の単球）を含む。本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の腫瘍細胞、例えばリンパ芽球（及び任意選択により最大５０％又は９５％の単球）を含む。本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、インプットサンプルは、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％又は２０％未満の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞（及び任意選択により２０％を超えるＴ細胞）を含む。
【０１９１】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０．５％、０．２％又は０．１％未満の単球（及び任意選択により１％又は０．１％を超える単球）を含む。本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０．５％、０．２％又は０．１％未満の腫瘍細胞（及び任意選択により１％又は０．１％を超える腫瘍細胞）を含む。本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％又は９９．９％の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞（及び任意選択により最大６０％又は９５％のＴ細胞）を含む。
【０１９２】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、アウトプットサンプルは、インプットサンプルと比較して５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％又は１％未満の割合の単球を含む。本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、アウトプットサンプルは、インプットサンプルと比較して５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％又は１％未満の割合の腫瘍細胞を含む。本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、アウトプットサンプルは、インプットサンプルと比較して少なくとも５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％又は１％の割合の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を含む。
【０１９３】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、方法は、例えば、形質導入により、ＣＡＲをコードする核酸をアウトプットサンプル中の１つ以上の免疫エフェクター細胞に導入することを更に含む。ＣＡＲをコードする核酸を導入するための他の方法は、本明細書に記載されている。
【０１９４】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、例えば一次シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０１９５】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、方法は、形質導入効率をアッセイする工程を更に含む。本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、形質導入は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％の形質導入効率をもたらす。
【０１９６】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、方法は、デキストロース及び／又は塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えばＤ５培地で例えばＣＳ５＋機器を使用してインプットサンプルに洗浄工程を実施することを更に含む。
【０１９７】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ヒト免疫エフェクター細胞である。
【０１９８】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、アウトプットサンプルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、アウトプットサンプルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。
【０１９９】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、インプットサンプルは、腫瘍抗原に関連する疾患を有する患者由来であり、例えば本明細書に記載の腫瘍抗原、例えばＣＤ１９は、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄異形成、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌状態から選択されるか、又は本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する非癌関連適応症である。一実施形態において、疾患は、本明細書に記載の癌、例えば本明細書に記載の標的と関連した本明細書に記載の癌である。一実施形態において、血液癌は、白血病である。一実施形態において、癌は、これらに限定されないが、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を包含する１種以上の急性白血病；これらに限定されないが、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を包含する１種以上の慢性白血病；これらに限定されないが、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症及び骨髄の血液細胞の無効な産生（又は異形成）を併せもつ血液学的な状態の多様な集合体である「前白血病状態」を包含する、追加の血液癌又は血液学的状態からなる群から選択され、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する疾患には、限定されないが、本明細書に記載されるような腫瘍抗原を発現する非定型的及び／又は非典型的な癌、悪性腫瘍、前癌状態又は増殖性疾患；並びにそれらの任意の組み合わせが含まれる。別の実施形態において、本明細書に記載の腫瘍抗原に関連する疾患は、固形腫瘍、例えば本明細書に記載の固形腫瘍、例えば前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、胃癌、卵巣癌、頭部癌又は肺癌である。
【０２００】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、インプットサンプルは、これらに限定されないが、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を包含する１種以上の急性白血病；これらに限定されないが、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を包含する１種以上の慢性白血病；これらに限定されないが、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、前白血病状態、非定型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態又は増殖性疾患を含む追加の血液癌又は血液学的状態並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される癌を有する患者からのものである。
【０２０１】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、インプットサンプルは、ＡＬＬを有する患者由来である。
【０２０２】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、方法は、アウトプットサンプル中の細胞上の１つ以上の細胞表面マーカー、例えばＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２５又はＣＤ１４をアッセイする工程を更に含む。
【０２０３】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞の増殖を刺激する、例えばＣＤ３／ＴＣＲ複合体結合シグナルを刺激する薬剤及び／又はＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンド、例えば抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でアウトプットサンプルを刺激することを更に含む。
【０２０４】
本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態において、方法は、ＣＡＲをコードする核酸を例えば形質導入、トランスフェクション又はエレクトロポレーションによって導入することを更に含む。
【０２０５】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示される方法、例えば上記に開示される方法によって産生された反応混合物を特徴とする。
【０２０６】
別の実施形態において、本明細書の反応混合物は、少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％のＴ細胞及び１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満の単球を含み、反応混合物中の細胞の総数は、合計で１００％になる。一実施形態において、反応混合物は、合計で少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８又は５×１０８の細胞を含む。一実施形態において、反応混合物は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満のＢ細胞を含む。一実施形態において、反応混合物は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満の癌細胞、例えばリンパ芽球を含む。
【０２０７】
本明細書に記載の反応混合物のいずれかにおいて、１つ以上のＴ細胞は、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載の任意のＣＡＲを発現する。
【０２０８】
本明細書に記載の反応混合物のいずれかにおいて、反応混合物は、ＣＡＲをコードする核酸を更に含み、例えば、核酸は、Ｔ細胞の内部又はＴ細胞の外部に配置される。
【０２０９】
本明細書に記載のものと同様の又は均等な方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献（例えば、配列データベース参照番号）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書で（例えば、本明細書の任意の表において）言及される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ及びＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれる。特に指定がない限り、本明細書で指定されている配列受託番号は、２０１７年１０月２５日現在のデータベースエントリーを参照する。１つの遺伝子又はタンパク質が複数の配列受託番号を参照する場合、全ての配列変異体が包含される。
【０２１０】
更に、材料、方法及び例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。見出し、副見出し又は番号若しくは文字が振られた要素、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｉ）等は、単に読み易いように提供される。本明細書で見出し又は番号若しくは文字が振られた要素を使用しても、ステップ若しくは要素がアルファベット順に実施される必要はないか、又はステップ若しくは要素が必ず互いに別個のものである必要はない。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面並びに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１Ａ−１Ｄ】臨床応答に関連するＴ細胞固有の品質属性を明らかにする、ＣＡＲ  Ｔ細胞産物の転写プロファイルを示す。各点は、個々の患者の細胞産物サンプルにおけるこれらの特性の相対的な濃縮を表し、バーは、最小値から最大値を反映している。各遺伝子セットの正規化された濃縮スコアがｙ軸にプロットされる（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（両側ウェルチｔ検定による））。図１Ａは、初期メモリー−後期メモリー遺伝子セットの相対的濃縮を示す。図１Ｂは、メモリー−エフェクター遺伝子セットの相対的濃縮を示す。図１Ｃは、高解糖−低解糖遺伝子セットの相対的濃縮を示す。図１Ｄは、高疲弊−低疲弊遺伝子セットの相対的濃縮を示す。
【図２】フローサイトメトリーによって評価された偽刺激又はＣＡＲ刺激レトロスペクティブ患者ＣＴＬ０１９細胞における蛍光グルコース類似体２−ＮＢＤＧの取り込みを示す（＊＊Ｐ＜０．０１、対応のある両側ｔ検定）。
【図３】応答者（ＣＲ、ｎ＝４；ＰＲＴＤ、ｎ＝２；ＰＲ、ｎ＝２）と非応答者（ＮＲ、ｎ＝６）とのＣＴＬ０１９サンプル（＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定；ＮＳ、有意でない）間の２−ＮＢＤＧ取り込みの比較を示す。
【図４】解糖を阻害する２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）の非存在下（対照）又は存在下で９日間培養した後のＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞の分化表現型を示す代表的なフローサイトメトリーを示す。
【図５】２−ＤＧの存在下又は非存在下で培養した後のＣＤ８＋及びＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞内のＴ細胞サブセットの頻度（％）を示す（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、対応のある両側ｔ検定）。次のＴ細胞サブセットが示される：ナイーブ様（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ−）；セントラルメモリー（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋）；エフェクターメモリー（ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＯ＋）；及びエフェクター（ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＯ−）。
【図６】２−ＤＧの存在下又は非存在下で製造されたＣＴＬ０１９細胞の増殖能力を示す。矢印で示されているように、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、培養の０、７、１２日目にＣＤ１９又はメソテリン（無関係な標的抗原）を発現するように操作されたＫ５６２細胞で連続的に再刺激された。２人の代表的な対象からのデータが示される。
【図７Ａ−７Ｄ】ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＩＬ−６／ＳＴＡＴ３経路の濃縮を示す。図７Ａは、各応答カテゴリーからの評価可能な患者サンプルにおいて、匹敵する未刺激の対照によって産生されたベースラインレベルを超える、ＣＡＲ刺激ＣＴＬ０１９細胞から産生された可溶性サイトカインのレベルを示す（ＣＲ、ｎ＝６；ＰＲＴＤ、ｎ＝３；ＰＲ、ｎ＝５；ＮＲ、ｎ＝２１；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、両側マンホイットニー検定による）。グラフは、平均値を標準誤差と共に示す。図７Ｂは、各応答群の患者からのＣＡＲ刺激ＣＴＬ０１９細胞におけるＩＬ−６／ＳＴＡＴ３経路の単一サンプル濃縮分析を示す（両側非対応ｔ検定を使用して＊Ｐ＜０．０５）。バーは、平均値及び標準誤差を表す。図７Ｃは、アイソタイプ対照抗体被覆ビーズ（偽刺激）又はＣＡＲ１９に対する抗イディオタイプ抗体でコーティングされたビーズ（ＣＡＲ１９刺激）による、一晩の刺激後のＣＲ及びＮＲ患者からの注入前のＣＴＬ０１９細胞におけるｐＳＴＡＴ３のレベルを示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す（左パネル）。高機能（ＣＲ、ｎ＝３；ＰＲＴＤ、ｎ＝２）対低機能（ＰＲ、ｎ＝３；ＮＲ、ｎ＝１１）のＣＡＲ  Ｔ細胞を有する患者からのプールされたデータがボックスプロットに示される（右パネル）。ひげは、最小値から最大値を表し；ボックスは、２５〜７５パーセンタイルを表し；中央の線は、中央値を示す。蛍光強度の変化（ＭＦＩ）は、刺激された細胞におけるｐＳＴＡＴ３のＭＦＩを、未刺激の細胞におけるものから差し引くことによって計算された。図７Ｄは、養子移入されたＣＡＲ  Ｔ細胞の最大ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖能力と、血清ＩＬ−６のピークレベル（ＣＴＬ０１９注入後２８日以内；左パネル）又は患者適合ＣＡＲ刺激（上記の通り）ＣＴＬ０１９細胞におけるＩＬ−６／ＳＴＡＴ３遺伝子濃縮（右パネル）とのスピアマンのロー相関を示す。
【図８Ａ−８Ｃ】ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３経路の阻害を示す。図８Ａは、アイソタイプ対照ビーズ（偽）又はＣＡＲ１９に対する抗イディオタイプ抗体でコーティングされたビーズで一晩刺激されたＣＴＬ０１９細胞におけるｐＳＴＡＴ３のレベルを表す代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ＣＡＲ固有の刺激は、ＳＴＡＴ３活性化の小分子阻害剤である５μＭ  Ｓｔａｔｔｉｃの存在下又は非存在下で実施された。図８Ｂは、５μＭ  Ｓｔａｔｔｉｃ又は同等量のＤＭＳＯ（対照）の存在下又は非存在下で製造されたＣＴＬ０１９細胞の増殖能力を示す。次いで、この代表的な対象からのＣＡＲ  Ｔ細胞を、矢印で示されているように、培養の０、７及び１２日目にＣＤ１９を発現するように操作されたＫ５６２細胞で連続的に再刺激した。ベースラインからのＣＡＲ  Ｔ細胞数の倍率変化は、破線（右のｙ軸）で表示される細胞生存率と平行して実線（左のｙ軸）で表示される。図８Ｃは、再刺激前に５μＭ  Ｓｔａｔｔｉｃを使用して又は使用せずに増殖したｎ＝８の異なる対象からのＣＴＬ０１９細胞の細胞増殖及び生存率データの概要を示す。
【図９】組換えＩＬ−６又は同等量のＤＭＳＯ（対照）の存在下又は非存在下で製造されたＣＴＬ０１９細胞の増殖能力を表すグラフを示す。次いで、この代表的な対象からのＣＴＬ０１９細胞を、矢印で示されているように、培養の０、７及び１２日目にＣＤ１９又はメソテリン（ネガティブ対照）を発現するように操作されたＫ５６２細胞で連続的に再刺激した。
【図１０】応答患者（ｎ＝１４）と非応答患者（ｎ＝２１）とに注入された異なる表現型を有するＣＡＲ  Ｔ細胞の総用量（細胞／ｋｇ）に基づく被投与者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】ＩＬ−６に応答したＣＤ２７＋ＰＤ−１−ＣＤ８  Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ３のレベルを示す。図１１Ａは、蛍光活性化細胞選別により精製され、組換えＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるｐＳＴＡＴ３のレベルを示す代表的なヒストグラム（左パネル）を示す。ｎ＝４の異なる対象からのＣＤ２７及びＰＤ−１発現によって定義されたＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるＩＬ−６誘導性ｐＳＴＡＴ３レベルの概要を右のパネルに示す。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の変化は、ＩＬ−６処置細胞におけるｐＳＴＡＴ３のＭＦＩを、匹敵する未刺激の細胞における同じパラメーターから差し引くことによって決定された。図１１Ｂは、代表的なフローサイトメトリー（左パネル）及びｎ＝７の異なる対象（右パネル）からのプールされたデータを示し、ＣＤ２７及びＰＤ−１発現によって定義されるＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるインターロイキン６受容体サブユニットβ（ＣＤ１３０）のレベルを示す。
【図１２】ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上のｇｐ１３０発現（左パネル）又はｇｐ１３０を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの頻度（右パネル）を表すグラフを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットは、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ２７−ＣＤ４５ＲＯ＋及びＣＤ２７−ＣＤ４５ＲＯ−細胞に分類される。
【図１３】構成的に活性なＳＴＡＴ３（ＳＴＡＴ３Ｃ）構築物を含むベクターを示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】Ｔ細胞上のｇｐ１３０発現及びｇｐ１３０によるＴ細胞の選択を示す。図１４Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（上段）又はＣＤ８＋Ｔ細胞（下段）におけるｇｐ１３０の発現を示す。ドットプロットは、ｘ軸上にｇｐ１３０、ｙ軸上にＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＰＤ１又はＣＤ４５ＲＯでフローサイトメトリーデータを示す。図１４Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（上段）又はＣＤ８＋Ｔ細胞（下段）のｇｐ１３０ベースのポジティブ選択を示す。左側のパネルは、選択前のＴ細胞におけるＣＤ２７及びＣＤ４５ＲＯの発現を示し、右側のパネルは、ｇｐ１３０による選択後の同じマーカーの発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２１２】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
【０２１３】
用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１つ又は１つより多い（すなわち少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味する。
【０２１４】
用語「約」は、量、時間的な継続期間などの計測可能な値を参照するとき、指定される値から±２０％又は一部の例では±１０％、又は一部の例では±５％、又は一部の例では±１％、又は一部の例では±０．１％の変動が、かかる変動が本開示の方法の実施に適切であるものとして包含されることを意味する。
【０２１５】
「グルコース代謝」という用語は、生物体におけるグルコースの形成、分解又は転換を含むプロセス、例えば１つ以上の生化学的プロセスを指す。本明細書で使用される場合、「グルコース代謝値」は、例えば、２−ＮＢＤＧ（蛍光標識デオキシグルコース類似体）を含むグルコース取り込み細胞ベースのキット又はグルコース比色アッセイキットによってアッセイされるようなグルコース代謝の測定値を指す。
【０２１６】
用語「キメラ抗原受容体」又は代わりに「ＣＡＲ」は、一連のポリペプチド、典型的には最も単純な実施形態で２ポリペプチドを指し、免疫エフェクター細胞にあるとき、細胞に標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性及び細胞内シグナル産生を与える。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、下に定義されるような、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激分子を含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称する）を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのセットは、同じポリペプチド鎖中にある（例えば、キメラ融合タンパク質を含む）。いくつかの実施形態において、一連のポリペプチドは、互いに隣接しておらず、例えば異なるポリペプチド鎖にある。いくつかの実施形態において、一連のポリペプチドは、二量体化分子存在下において、互いにポリペプチドを結合できる、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる二量体化スイッチを含む。一実施形態において、ＣＡＲの刺激性分子は、Ｔ細胞受容体複合体と関係するζ鎖である。一態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。一実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、下に定義するような少なくとも１つの共刺激分子の１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを更に含む。一実施形態において、共刺激分子は、本明細書に記載の共刺激分子、例えば４−１ＢＢ（すなわちＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ及び／又はＣＤ２８である。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン及び刺激分子の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン並びに共刺激分子の機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン並びに１つ以上の共刺激分子の２つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン並びに１つ以上の共刺激分子の少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意選択によるリーダー配列を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端のリーダー配列を更に含み、リーダー配列は、細胞プロセシング及びＣＡＲの細胞膜への局在化中に抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から任意選択により切断される。
【０２１７】
本明細書に記載のものなどの特定の腫瘍抗原Ｘを標的とする抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ又はＴＣＲ）を含むＣＡＲは、ＸＣＡＲとも称される。例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲと称される。
【０２１８】
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、セカンドメッセンジャーを生成することにより、又はそのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、特定されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために細胞内で情報を伝達することにより作用するタンパク質の機能的部分を指す。
【０２１９】
用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質又はポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル、多重鎖又は単鎖又はインタクトな免疫グロブリンであり得、及び天然の供給源又は組換え供給源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
【０２２０】
用語「抗体フラグメント」は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布による）能力を保持する抗体の少なくとも一部分を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、線形抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（ＶＬ又はＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２個のＦａｂフラグメント及び単離ＣＤＲを含む二価フラグメントなどの抗体フラグメントから形成される多特異性抗体又は抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントは、シングルドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖにも取り込まれ得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６，２００５を参照されたい）。抗原結合フラグメントは、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドをベースとする足場にもグラフトされ得る（フィブロネクチンポリペプチドミニボディについて記載している米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。
【０２２１】
用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントと、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントとを含む融合タンパク質を指し、軽鎖及び重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば短い可動性ポリペプチドリンカーによって近接して連結されており、単鎖ポリペプチドとして発現することが可能であり、及びｓｃＦｖは、その由来であるインタクトな抗体の特異性を保持している。指定されない限り、本明細書で使用されるとき、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域を例えばポリペプチドのＮ端側及びＣ端側末端に対していずれの順序でも有し得、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含み得るか又はＶＨ−リンカー−ＶＬを含み得る。
【０２２２】
抗体又はその抗体フラグメントを含むＣＡＲの一部分は、種々の形態で存在し得、抗原結合ドメインは、例えば、シングルドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）及びヒト化抗体を含め、連続したポリペプチド鎖の一部として発現する（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。一実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。更なる実施形態において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【０２２３】
本明細書で使用されるとき、用語「結合ドメイン」又は「抗体分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン鎖又はそのフラグメントを指す。用語「結合ドメイン」又は「抗体分子」は、抗体及び抗体フラグメントを包含する。ある実施形態において、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、これは、複数個の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、複数個のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数個のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対して特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列及び第２のエピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。
【０２２４】
本発明のＣＡＲの抗体又は抗体そのフラグメントを含む部分は、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体又は二機能性抗体を含む、抗原結合ドメインが連続的ポリペプチド鎖の一部として発現される多様な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。一態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。更なる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【０２２５】
用語「抗体重鎖」は、その天然に存在するコンホメーションをとる抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の大きい方を指し、通常、これが抗体の属するクラスを決定する。
【０２２６】
用語「抗体軽鎖」は、その天然に存在するコンホメーションをとる抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の小さい方を指す。カッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖が２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【０２２７】
本明細書で使用される「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性及び結合親和性を与える抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。例えば、一般に、各重鎖可変領域（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）には３つのＣＤＲがあり、各軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）には３つのＣＤＲがある。ある所与のＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）により記載のもの又はその組み合わせを含む、多くの周知のスキームのいずれかを使用して決定できる。Ｋａｂａｔ番号付けスキームでは、いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基には、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付され、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基には、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）の番号が付される。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームでは、いくつかの実施形態において、ＶＨのＣＤＲアミノ酸には、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付され、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基には、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）の番号が付される。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａを組み合わせた番号付けスキームでは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの一部、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの一部又はその両方であるアミノ酸残基に対応する。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば哺乳動物ＶＨ、例えばヒトＶＨにおけるアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）；並びにＶＬ、例えば哺乳動物ＶＬ、例えばヒトＶＬにおけるアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）に対応する。
【０２２８】
用語「組換え抗体」は、例えば、バクテリオファージ又は酵母発現システムによって発現される抗体など、組換えＤＮＡ技術を用いて作成される抗体を指す。この用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子であって、抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子又はその抗体を指定するアミノ酸配列の合成によって作成された抗体を意味するとも解釈されるべきであり、ＤＮＡ又はアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能な周知の組換えＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を用いて得られたものである。
【０２２９】
用語「抗原」又は「Ａｇ」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答には、抗体産生又は特異的免疫適格細胞の活性化のいずれか又は両方が含まれ得る。当業者は、任意の巨大分子が、事実上あらゆるタンパク質又はペプチドを含め、抗原となり得ることを理解するであろう。更に、抗原は、組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、したがって、免疫応答を生じさせるタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、その用語が本明細書において使用される通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。更に、当業者は、抗原がある遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明には、限定されないが、２つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用が含まれること、及びそれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を生じさせるポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配列されることが容易に明らかである。更に、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、合成して作成され得るか、又は生体試料から得られ得るか、又はポリペプチド以外の巨大分子である可能性もあることが容易に明らかである。かかる生体試料には、限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞又は体液が他の生物学的成分と共に含まれ得る。
【０２３０】
用語「自己」は、同じ個体に由来する任意の材料であって、後にその個体に再導入されることになる材料を指す。
【０２３１】
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系であると言われる。一部の態様において、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。
【０２３２】
用語「異種」は、異なる種の動物に由来する材料を指す。
【０２３３】
用語「癌」は、異常細胞の無制御の成長によって特徴付けられる疾患を指す。癌細胞は、局所的に又は血流及びリンパ系を通じて体の他の部位に広がり得る。様々な癌の例が本明細書に記載され、限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられる。用語「腫瘍」及び「癌」は、本明細書では同義的に使用され、例えば、両方の用語とも固形及び液性、例えばびまん性又は循環性腫瘍を包含する。本明細書で使用されるとき、用語「癌」又は「腫瘍」は、前癌性並びに悪性の癌及び腫瘍を含む。
【０２３４】
「由来する」は、この用語が本明細書で使用される場合、第１の分子と第２の分子との間の関係を指す。これは、概して、第１の分子と第２の分子との間の構造的類似性に言及するものであり、第２の分子に由来する第１の分子に関する方法又は供給源を限定することを含意又は包含しない。例えば、ＣＤ３ζ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、求められる機能、すなわち適切な条件下でシグナルを生成する能力を有するような十分なＣＤ３ζ構造を保持している。これは、細胞内シグナル伝達ドメインの特定の作製方法に限定することを含意又は包含せず、例えば細胞内シグナル伝達ドメインを提供するためにＣＤ３ζ配列で開始して不要な配列を欠失させるか、又は変異を付与して細胞内シグナル伝達ドメインに至らせなければならないことを意味しない。
【０２３５】
語句「本明細書に記載されるような腫瘍抗原の発現に関連する疾患」には、限定されないが、例えば癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌病態を含めた、本明細書に記載されるような腫瘍抗原の発現に関連する疾患又は本明細書に記載されるような腫瘍抗原を発現する細胞に関連する病状又は本明細書に記載されるような腫瘍抗原を発現する細胞に関連する非癌関連の適応症が含まれる。一実施形態において、本明細書に記載されるような腫瘍抗原の発現と関連する癌は、血液癌である。一実施形態において、本明細書に記載されるような腫瘍抗原の発現と関連する癌は、固形癌である。更に、本明細書に記載されるような腫瘍抗原の発現に関連する疾患としては、限定されないが、例えば、本明細書に記載されるような腫瘍抗原の発現に関連する、非定型的及び／又は非典型的な癌、悪性腫瘍、前癌状態又は増殖性疾患が挙げられる。本明細書に記載されるような腫瘍抗原の発現に関連する非癌関連の適応症には、限定されないが、例えば自己免疫疾患（例えば、狼瘡）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）及び移植が含まれる。いくつかの態様において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するか、又は任意のときに発現している。一実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型又は変異体）を産生し、腫瘍抗原タンパク質は、正常レベル又は低下したレベルで存在し得る。一実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生し、その後、検出可能な腫瘍抗原タンパク質を実質的に生成しなかった。
【０２３６】
「ＣＤ１９の発現に関連する疾患」という句は、例えば、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は脊髄形成異常症、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌状態を含む、ＣＤ１９の発現に関連する疾患又はＣＤ１９を発現する細胞に関連する状態；又はＣＤ１９を発現する細胞に関連する非癌関連の適応症を含むが、これらに限定されるものではない。一態様において、ＣＤ１９の発現と関係する癌は、血液癌である。一態様において、血液癌は、白血病又はリンパ腫である。一態様において、ＣＤ１９の発現に関連する癌には、限定されないが、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を例えば含むがそれに限定されない１つ以上の急性白血病、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を例えば含むがそれに限定されない１つ以上の慢性白血病を含めた癌及び悪性腫瘍が含まれる。ＣＤ１９の発現に関連する追加の癌又は血液学的病態は、限定されないが、例えばＢ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄増殖性新生物；組織球性障害（例えば、肥満細胞障害又は芽球性形質細胞様樹状細胞新生物）；マスト細胞障害、例えば全身性肥満細胞症又は肥満細胞白血病；Ｂ細胞前リンパ球性白血病、形質細胞骨髄腫及び骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）によってまとめられる種々の血液学的病態の群である「前白血病」などを含む。更に、ＣＤ１９発現の発現に関連する疾患には、限定されないが、例えばＣＤ１９の発現に関連する非定型の及び／又は非古典的な癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患が含まれる。ＣＤ１９の発現に関連する非癌関連徴候には、限定されないが、例えば自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）及び移植が含まれる。一部の実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するか、又はいずれかの時点で発現した。ある実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型又は突然変異体）を産生し、腫瘍抗原タンパク質は、正常レベル又は低下したレベルで存在し得る。一実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生し、その後、検出可能な腫瘍抗原タンパク質を実質的に生成しなかった。他の実施形態において、疾患は、ＣＤ１９陰性の癌、例えばＣＤ１９陰性の再発癌である。いくつかの態様において、腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９）発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するか、又は任意のときに発現している。一実施形態において、腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９）発現細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型又は変異体）を産生し、腫瘍抗原タンパク質は、正常レベル又は低下したレベルで存在し得る。一実施形態において、腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９）発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生し、その後、検出可能な腫瘍抗原タンパク質を実質的に産生しなかった。
【０２３７】
語句「Ｂ細胞抗原の発現に関連する疾患」は、例えば、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は脊髄形成異常症、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌状態を含む、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２若しくはＲＯＲ１の１つ以上の発現に関連する疾患又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２若しくはＲＯＲ１の１つ以上を発現するか若しくは任意の時点で発現していた細胞に関連する状態又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２若しくはＲＯＲ１の１つ以上を発現する細胞に関連する非癌関連の適応症を含むが、これらに限定されるものではない。疑義を回避するために、Ｂ細胞抗原の発現に関連する疾患は、例えば、Ｂ細胞抗原を標的とする分子（例えば、Ｂ細胞標的ＣＡＲ）であるが、かつてはＢ細胞抗原を発現していた分子を用いた処置により、抗原発現が下方制御されているため、現在Ｂ細胞抗原を発現していない細胞に関連する状態を含み得る。語句「Ｂ細胞抗原の発現に関連する疾患」は、本明細書に記載のように、ＣＤ１９の発現に関連する疾患を含む。実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、Ｂ細胞抗原に関連する疾患を処置するために使用される。実施形態において、本明細書の方法によって産生されるＣＡＲは、Ｂ細胞抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。
【０２３８】
本明細書で使用される「再発」という用語は、初期の応答性期間（例えば、完全応答又は部分応答）後、例えばある治療（例えば、癌治療）による先の処置後の疾患（例えば、癌）の再出現を指す。初期の応答性期間は、癌細胞のレベルの、ある閾値未満、例えば２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％又は１％未満への低下を含み得る。再出現は、癌細胞のレベルの、ある閾値を越える、例えば２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％又は１％を超える増加を含み得る。例えば、再出現は、例えば、Ｂ−ＡＬＬに関連して、完全応答後の、例えば血液、骨髄（＞５％）又は任意の髄外部位における芽球の再出現を含み得る。これに関連して、完全応答は、５％未満のＢＭ芽球を含み得る。より一般的には、一実施形態において、応答（例えば、完全応答又は部分応答）は、検出可能なＭＲＤ（微小残存病変）の非存在を含み得る。一実施形態において、応答性の初期期間は、少なくとも１、２、３、４、５又は６日間；少なくとも１、２、３又は４週間；少なくとも１、２、３、４、６、８、１０又は１２ヶ月間；又は少なくとも１、２、３、４又は５年間続く。
【０２３９】
「難治性」は、本明細書で使用される場合、処置に応答しない疾患、例えば癌を指す。実施形態において、難治性癌は、処置の開始前又は開始時点で処置に抵抗性であり得る。他の実施形態において、難治性癌は、処置中に抵抗性になり得る。難治性癌は、抵抗性癌とも称される。
【０２４０】
用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含む抗体又は抗体フラグメントの結合特性が大きい影響又は変化を被ることのないアミノ酸改変を指す。かかる保存的改変には、アミノ酸置換、付加及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発など、当技術分野において公知の標準技法によって本発明の抗体又は抗体フラグメントに導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、本明細書に記載のＣＡＲ内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に置き換えることができ、及び変化したＣＡＲは、本明細書に記載される機能アッセイを用いて試験することができる。
【０２４１】
用語「刺激」は、刺激性分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体又はＣＡＲ）とその同族のリガンド（又はＣＡＲの場合には腫瘍抗原）との結合によって誘導される一次応答を指し、それにより、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達又は適切なＮＫ受容体若しくはＣＡＲのシグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介する。刺激は、特定の分子の発現変化を媒介することができる。
【０２４２】
用語「刺激性分子」は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）によって発現され、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様について、免疫細胞の活性化を刺激的に調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する分子を指す。一態様において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、ペプチドを載せたＭＨＣ分子との結合により開始される一次シグナルであり、これは、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の媒介をもたらす。刺激性方向に作用する初代細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列の例には、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２由来のものが含まれるが、これらに限定されない。本発明の具体的なＣＡＲにおいて、本発明の任意の１つ以上のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えばＣＤ３−ζの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ζの一次シグナル伝達配列は、配列番号９（変異体ＣＤ３ζ）として提供される配列又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの同等の残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ζの一次シグナル伝達配列は、配列番号１０（野生型ヒトＣＤ３ζ）に提供される配列又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの同等の残基である。
【０２４３】
用語「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」は、その表面上に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を提示するアクセサリー細胞などの免疫系細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）を指す。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこうした複合体を認識し得る。ＡＰＣは、抗原をプロセシングしてそれをＴ細胞に提示する。
【０２４４】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えばＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成することができる。例えば、ＣＡＲＴ細胞における免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性及びサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性が挙げられる。実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に特殊な機能を果たすよう指示するタンパク質の部分である。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された一部を使用する範囲内で、このような切断された一部を、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全鎖の代わりに使用し得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、そのため、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断された一部を含むことを意図する。
【０２４５】
ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激又は抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナル又は抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインがＴ細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、及び共刺激細胞内シグナル伝達ドメインが共受容体又は共刺激分子からの細胞質配列を含むことができる。
【０２４６】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例には、限定されないが、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」）、ＦｃεＲＩ及びＣＤ６６ｄ、ＣＤ３２、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれる。
【０２４７】
用語「ζ」若しくは代わりに「ζ鎖」、「ＣＤ３−ζ」又は「ＴＣＲ−ζ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基として定義され、「ζ刺激ドメイン」若しくは代わりに「ＣＤ３−ζ刺激ドメイン」又は「ＴＣＲ−ζ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分なζ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義される。一態様において、ζの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２〜１６４又はその機能性オルソログである非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基を含む。一態様において、「ζ刺激ドメイン」又は「ＣＤ３−ζ刺激ドメイン」は、配列番号９として提供される配列である。一態様において、「ζ刺激ドメイン」又は「ＣＤ３−ζ刺激ドメイン」は、配列番号１０として提供される配列である。
【０２４８】
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、Ｔ細胞の、限定されないが、増殖などによる共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されるものではない。
【０２４９】
共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体若しくは天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体又はその機能的フラグメントを含み得る。
【０２５０】
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体若しくは天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体又はその機能的フラグメントを含み得る。
【０２５１】
用語「４−１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、及び「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基として定義される。一態様において、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号７として提供される配列又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基である。
【０２５２】
「免疫エフェクター細胞」は、その用語が本明細書で使用される場合、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例には、Ｔ細胞、例えばα／βＴ細胞及びγ／δＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞及び骨髄由来食細胞が含まれる。
【０２５３】
「免疫エフェクター機能又は免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書で使用されるとき、標的細胞の免疫攻撃を亢進させる又は促進する例えば免疫エフェクター細胞の機能又は応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能又は応答は、標的細胞の死滅又は成長若しくは増殖阻害を促進するＴ細胞又はＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞の場合、一次刺激及び共刺激が免疫エフェクター機能又は応答の例である。
【０２５４】
用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
【０２５５】
本明細書で互換的に使用される「枯渇」又は「枯渇すること」という用語は、プロセス、例えば選択工程、例えばネガティブ選択が実施された後の、サンプル中の細胞、タンパク質又は高分子のレベル又は量の減少又は低下を指す。枯渇は、細胞、タンパク質又は高分子の完全又は部分的な枯渇であり得る。一実施形態において、枯渇は、プロセスが実施される前のサンプル中の細胞、タンパク質又は高分子のレベル又は量と比較した、細胞、タンパク質又は高分子のレベル又は量の少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の減少又は低下である。
【０２５６】
本明細書で互換的に使用される「濃縮された」又は「濃縮」という用語は、プロセス、例えば選択工程、例えばポジティブ選択が実施された後の、サンプル中の細胞、タンパク質又は高分子のレベル又は量の増加を指す。濃縮は、細胞、タンパク質又は高分子の完全又は部分的な濃縮であり得る。一実施形態において、濃縮は、参照サンプル中の細胞、タンパク質又は高分子のレベル又は量と比較した、細胞、タンパク質又は高分子のレベル又は量の少なくとも１％、例えば、少なくとも１〜２００％、例えば少なくとも１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜７０、７０〜９０、９０〜１１０、１１０〜１３０、１３０〜１５０、１５０〜１７０又は１７０〜２００％の増加である。いくつかの実施形態において、濃縮は、参照サンプル中の細胞、タンパク質又は高分子のレベル又は量と比較した、細胞、タンパク質又は高分子のレベル又は量の少なくとも少なくとも５％、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％の増加である。いくつかの実施形態において、濃縮は、参照サンプル中の細胞、タンパク質又は高分子のレベル又は量と比較した、細胞、タンパク質又は高分子のレベル又は量の少なくとも１．１倍、例えば１．１〜２００倍、例えば、１．１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜７０、７０〜９０又は９０〜１００倍の増加である。いくつかの実施形態において、参照サンプルは、同じサンプル、例えばプロセスが実施される前のサンプルであり得る。いくつかの実施形態において、同じサンプルは、濃縮がその後実施されるサンプル、例えば前濃縮集団、例えば開始集団を指す。いくつかの実施形態において、参照サンプルは、異なるサンプル、例えばプロセスが実施されないサンプルであり得る。
【０２５７】
用語「コードする」は、定義付けられたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は定義付けられたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的過程における他のポリマー及び巨大分子の合成の鋳型としての役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチド内の特異的ヌクレオチド配列の固有の特性及びそれによってもたらされる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ又はＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞又は他の生体系のタンパク質が産生される場合にタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一の且つ通常配列表に提供されるものであるコード鎖及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写鋳型として使用される非コード鎖の両方は、その遺伝子のｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると称することができる。
【０２５８】
特記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の全てを含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句には、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかのバージョンで１つ又は複数のイントロンを含み得る限りにおいて、イントロンも含まれ得る。
【０２５９】
「内因性」という用語は、生物体、細胞、組織若しくは系からの又はその内部で生成された任意の物質を指す。
【０２６０】
用語「外因性」は、生物、細胞、組織又は系の外側から導入されるか又はその外側で産生される任意の材料を指す。
【０２６１】
用語「発現」は、プロモーターによってドライブされる特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を指す。
【０２６２】
用語「トランスファーベクター」は、単離核酸を含む組成物であって、細胞内部への単離核酸の送達に使用し得る組成物を指す。当技術分野では、限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含め、多くのベクターが公知である。したがって、用語「トランスファーベクター」には自己複製プラスミド又はウイルスが含まれる。この用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸のトランスファーを促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物も更に含むものと解釈されなければならない。ウイルストランスファーベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
【０２６３】
用語「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、他の発現用エレメントは、宿主細胞によって供給されるか、又はインビトロ発現系に供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド又はリポソームに含まれる）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含め、当技術分野において公知のもの全てが含まれる。
【０２６４】
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させることができる点でレトロウイルスの中でユニークであり、レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡに多量の遺伝情報を送達することができ、そのため、遺伝子デリバリーベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
【０２６５】
用語「レンチウイルスベクター」は、特に、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に提供される通りの自己不活性化レンチウイルスベクターを含め、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。臨床で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例としては、限定されないが、例えばＯｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子デリバリー技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどが挙げられる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に公知であろう。
【０２６６】
用語「相同」又は「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子など、２つの核酸分子間又は２つのポリペプチド分子間におけるサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占有されるとき、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占有される場合、それらは、その位置で相同又は同一である。２つの配列間の相同性は、一致する位置又は相同な位置の数の直接の関数である。例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５個の位置）が相同である場合、それらの２つの配列は、５０％相同である。位置の９０％（例えば、１０個中９個）が一致するか又は相同である場合、それらの２つの配列は、９０％相同である。
【０２６７】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は他の抗原結合部分配列など）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体及びその抗体フラグメントは、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体又は抗体フラグメント）においてレシピエントの相補決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基に置き換えられているものである。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。更に、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも、移入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。これらの改変は抗体又は抗体フラグメントの性能を更に精緻化及び最適化し得る。一般に、ヒト化抗体又はその抗体フラグメントは、少なくとも１つ及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、及びＦＲ領域の全て又は大部分がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体又は抗体フラグメントは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含むことができる。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２を参照されたい。
【０２６８】
「完全にヒト」は、分子全体がヒト起源であるか、又はヒト形態の抗体又は免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなる抗体又は抗体フラグメントなどの免疫グロブリンを指す。
【０２６９】
用語「単離されている」は、自然状態から改変されているか又は取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸又はペプチドは、「単離されている」のではないが、その自然状態の共存する材料から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは、「単離されている」。単離核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができるか、又は例えば宿主細胞など、非天然環境中に存在することができる。
【０２７０】
本発明との関連において、一般的に存在する核酸塩基に関して以下の略称が使用される。「Ａ」は、アデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、及び「Ｕ」は、ウリジンを指す。
【０２７１】
用語「作動可能に連結された」又は「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列との間における後者の発現をもたらす機能的な連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関係した状態に置かれているとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、互いに連続し得、例えば２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。
【０２７２】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、又は胸骨内注射、腫瘍内、又は輸注技法を含む。
【０２７３】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）又はそれらのＤＮＡ又はＲＮＡの組み合わせ及びそれらのポリマーを指す。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを含む。一実施形態において、核酸分子は、合成（例えば、化学合成）又は組換えである。具体的に限定しない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、且つ天然に存在するヌクレオチドと同じように代謝される、天然ヌクレオチドの類似体又は誘導体を含む核酸が包含される。特に指示されない限り、ある詳細な核酸配列は、黙示的に、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ及び相補配列並びに明示的に指示される配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択の（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって達成し得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０２７４】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列又はペプチドの配列を含むことのできるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合によってつなぎ合わされた２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、この用語は、当技術分野では一般に例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短鎖と、当技術分野では概してタンパク質と称される、多数の種類があるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド又はこれらの組み合わせが含まれる。
【０２７５】
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要である、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
【０２７６】
用語「プロモーター／調節配列」は、そのプロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の例では、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の例では、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントも含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであり得る。
【０２７７】
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、細胞のほとんど又は全ての生理条件下で細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
【０２７８】
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的にプロモーターに対応する誘発物質が細胞に存在する場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
【０２７９】
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするか又はそれによって指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
【０２８０】
用語「癌関連抗原」又は「腫瘍抗原」は、互換的に、癌細胞の表面上に、完全に又は代わりにフラグメント（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として、正常細胞と比較して優先的に発現する分子（典型的にはタンパク質、炭水化物又は脂質）であって、癌細胞への薬理学的薬剤の優先的な標的化に有用な分子を指す。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、正常細胞及び癌細胞の両方が発現するマーカー、例えば系列マーカー、例えばＢ細胞上のＣＤ１９である。特定の態様において、本発明の腫瘍抗原は、原発性又は転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌及び乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの腺癌などを含むが、これらに限定されない癌に由来する。いくつかの実施形態において、癌関連抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過剰発現する（例えば、正常細胞と比較して１倍の過剰発現、２倍の過剰発現、３倍の過剰発現又はそれを超える）細胞表面分子である。いくつかの実施形態において、癌関連抗原は、癌細胞で不適切に合成される細胞表面分子、例えば正常細胞に発現する分子と比較して欠失、付加又は変異を含む分子である。いくつかの実施形態において、癌関連抗原は癌細胞の細胞表面にのみ、完全に又は代わりにフラグメント（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現することになり、正常細胞の表面に合成されないか又は発現しない。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体フラグメント）を含むＣＡＲを含む。通常、内因性タンパク質に由来するペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のポケットに嵌まり、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、あらゆる有核細胞によって構成的に発現される。癌では、ウイルス特異的及び／又は腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体が免疫療法用のユニークなクラスの細胞表面標的となる。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ１又はＨＬＡ−Ａ２のコンテクストでウイルス又は腫瘍抗原由来のペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体が記載されている（例えば、Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１１  ８５（５）：１９３５−１９４２；Ｓｅｒｇｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１１  １１７（１６）：４２６２−４２７２；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０  １８４（４）：２１５６−２１６５；Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００１  ８（２１）：１６０１−１６０８；Ｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１３  ５（１７６）：１７６ｒａ３３；Ｔａｓｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１２  １９（２）：８４−１００を参照されたい）。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリなど、ライブラリのスクリーニングによって同定することができる。
【０２８１】
用語「可動性ポリペプチドリンカー」又は「リンカー」は、ｓｃＦｖとの関連で使用されるとき、可変重鎖領域と可変軽鎖領域とを共に連結するために単独又は組み合わせで使用されるグリシン及び／又はセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１５）（式中、ｎは、１以上の正の整数、例えばｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０である）を含む。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーには、限定されないが、（Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ）４（配列番号２７）又は（Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ）３（配列番号２８）が含まれる。別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）又は（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）（配列番号２９）の複数の繰り返しを含む。また、国際公開第２０１２／１３８４７５号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるリンカーも本発明の範囲内に含まれる。
【０２８２】
本明細書で使用されるとき、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップ又はＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも称される）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「前」又は５’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、１番目の転写ヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びＲＮアーゼからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結び付いており、それぞれが他方に影響を与えるようにして同時転写的に起こる。転写開始直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端に、ＲＮＡポリメラーゼに関連するキャップ合成複合体が結合する。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡのその安定性又は翻訳効率などの機能を調整するために改変することができる。
【０２８３】
本明細書で使用されるとき、「インビトロ転写ＲＮＡ」は、インビトロ合成されたＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを指す。概して、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから作成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの作成に使用される鋳型を含む。
【０２８４】
本明細書で使用されるとき、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付加される一連のアデノシンである。一過性発現用のコンストラクトのいくつかの実施形態において、ポリＡは、５０〜５０００（配列番号３０）、例えば６４より多く、例えば１００より多く、例えば３００又は４００より多い。ポリ（Ａ）配列は、局在性、安定性又は翻訳効率などのｍＲＮＡ機能を調整するために化学的又は酵素的に改変することができる。
【０２８５】
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポリアデニリル部分又はその改変変異体の共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってｍＲＮＡ前駆体に付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列（多くの場合に数百個）である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ（Ａ）テール及びそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するのに役立つ。ポリアデニル化は、転写終結、ｍＲＮＡの核外移行及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写直後に核内で起こるが、更に後に細胞質でも起こり得る。転写が終結した後、ＲＮＡポリメラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用によってｍＲＮＡ鎖が切断される。切断部位は、通常、切断部位近傍の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位の遊離３’末端にアデノシン残基が付加される。
【０２８６】
本明細書で使用されるとき、「一過性」は、数時間、数日間又は数週間の期間にわたる組み込まれないトランス遺伝子の発現を指し、この発現期間は、宿主細胞においてゲノムに組み込まれた場合又は安定プラスミドレプリコン中に含まれている場合の遺伝子の発現期間よりも短い。
【０２８７】
アフェレーシスは、全血が個体から取り出され、選択成分に分離され、残りが循環に戻されるプロセスである。一般に、血液成分の分離には、遠心分離と非遠心分離の２つの方法がある。白血球アフェレーシスは、患者の白血球の活性な選択及び除去をもたらす。
【０２８８】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、１つ以上の療法（例えば、本発明のＣＡＲなどの１つ以上の療法剤）の投与によってもたらされる増殖性障害の進行、重症度及び／若しくは持続期間の低減若しくは改善又は増殖性障害の１つ以上の症状（例えば、１つ以上の認識し得る症状）の改善を指す。具体的な実施形態において、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、患者には必ずしも認識できない、腫瘍の増殖などの増殖性障害の少なくとも１つの計測可能な理学的パラメーターの改善を指す。他の実施形態において、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、増殖性障害の進行の物理的な、例えば認識し得る症状の安定化による阻害、生理学的な、例えば理学的パラメーターの安定化による阻害のいずれか又は両方を指す。他の実施形態において、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、腫瘍サイズ又は癌性細胞数の低減又は安定化を指す。
【０２８９】
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。語句「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、且つ細胞の膜を越えてシグナルを伝える能力を有する分子及び分子複合体を含む。
【０２９０】
用語「対象」は、免疫応答を生じさせることのできる生きている生物（例えば、哺乳類、ヒト）を含むことが意図される。
【０２９１】
用語の「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞とは、その天然に存在する状態でそれが通常結び付いている他の細胞型と分離されている細胞も指す。一部の例では、実質的に精製された細胞集団とは、均質な細胞集団を指す。他の例では、この用語は、単に、その自然状態でそれが天然に結び付いている細胞から分離されている細胞を指す。一部の態様において、これらの細胞は、インビトロで培養される。他の態様において、これら細胞は、インビトロで培養されない。
【０２９２】
本発明に関連して、「腫瘍抗原」又は「過剰増殖性障害抗原」又は「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。特定の実施形態において、腫瘍抗原は、原発性又は転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌及び乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの腺癌などを含むが、これらに限定されない癌に由来する。
【０２９３】
用語「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」は、外因性核酸を宿主細胞に移入させるか又は導入するプロセスを指す。「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換又は形質導入されたものである。細胞には初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
【０２９４】
用語「特異的に結合する」は、試料中に存在するコグネイト結合パートナータンパク質を認識し、結合する抗体又はリガンドであって、しかし、試料中の他の分子は、実質的に認識又は結合しない、抗体又はリガンドを指す。
【０２９５】
範囲：本開示全体を通じて、本発明の様々な態様が範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での記載は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する確固たる限定と解釈されてはならないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値を有すると考えられなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示される部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６を有すると考えられなければならない。別の例として、９５〜９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するものを含み、及び９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％及び９８〜９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅に関わらず適用される。
【０２９６】
本明細書で使用される場合、用語「Ｓｔａｔ３アクティベーター」は、Ｓｔａｔ３経路を活性化して、例えばＳｔａｔ３のリン酸化の増加（例えば、チロシン７０５（Ｙ７０５）上）を引き起こすか若しくはＳｔａｔ３活性化遺伝子の転写を増加させるか、又はＳｔａｔ３阻害遺伝子の転写を減少させることにより、Ｓｔａｔ３経路を活性化する分子を指す。Ｓｔａｔ３アクティベーターは、例えば、ポリペプチド又は小分子を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、例えば、ｇｐ１３０に結合することにより、Ｓｔａｔ３の上流で作用する。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、Ｓｔａｔ３に結合する。Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ＩＬ−６ファミリーサイトカイン；ＩＬ−１０ファミリーサイトカイン；ＩＬ−１７ファミリーサイトカイン；ＣＣＬ２０分子；ｇｐ１３０アクティベーター；ＩＬ−１０Ｒ２受容体アクティベーター；可溶性ＩＬ−６受容体；及びＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、例えば、インビトロ又はインビボで、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖をもたらすことができる。
【０２９７】
本明細書で使用される「Ｓｔａｔ３アクティベーター細胞」という用語は、Ｓｔａｔ３アクティベーター（例えば、可溶性タンパク質として又は細胞の表面上）を含む（例えば、発現する）細胞又はＳｔａｔ３アクティベーターがその細胞の表面にコンジュゲートしている、例えばその上に位置している、細胞を指す。
【０２９８】
本明細書で使用される「ＩＬ−６ファミリーサイトカイン」という用語は、ＩＬ−６サイトカインファミリーの分子を指し、全長の天然に存在するＩＬ−６サイトカインファミリーメンバー、その活性フラグメント又は活性変異体を指す。実施形態において、ＩＬ−６ファミリーサイトカインは、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＩＬ−３１分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子又はＯＳＭ分子から選択される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６ファミリーサイトカインは、受容体、例えばα受容体（例えば、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−１１Ｒα又はＣＮＴＦＲα）に結合する。いくつかの実施形態において、α受容体に結合したＩＬ−６ファミリーサイトカインは、複合体、例えばα受容体とシグナル伝達β受容体、例えばｇｐ１３０とを含む複合体の形成をもたらす。実施形態において、ＩＬ−６ファミリーサイトカインは、シグナル伝達β受容体、例えばｇｐ１３０を介してシグナル伝達する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６ファミリーサイトカインは、Ｓｔａｔ３経路を活性化し、例えばチロシン７０５をリン酸化するか、又はＳｔａｔ３活性化遺伝子の転写を増加させるか若しくはＳｔａｔ３阻害遺伝子の転写を減少させる。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６ファミリーサイトカインは、例えば、インビトロ又はインビボでＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖をもたらす。
【０２９９】
本明細書で使用される「ＩＬ−６分子」という用語は、全長の天然に存在するＩＬ−６（例えば、哺乳動物ＩＬ−６、例えば、ヒトＩＬ−６、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ６８２７８．１）、ＩＬ−６の活性フラグメント又はＩＬ−６の天然に存在する野生型ポリペプチド又はそのフラグメントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する活性変異体を指す。いくつかの実施形態において、変異体、例えば活性変異体は、野生型ポリペプチド又はそれをコードする核酸の誘導体、例えば変異体である。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６変異体、例えばＩＬ−６の活性変異体は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の、例えば実施例２のアッセイによって測定されるような、野生型ＩＬ−６ポリペプチドの活性を有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６分子は、ｇｐ１３０受容体を介してシグナル伝達する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６分子は、Ｓｔａｔ３経路を活性化し、例えばチロシン７０５をリン酸化するか、又はＳｔａｔ３活性化遺伝子の転写を増加させるか若しくはＳｔａｔ３阻害遺伝子の転写を減少させる。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６分子は、１つ以上の翻訳後修飾を含む。
【０３００】
本明細書で使用される場合、サイトカイン分子の「活性変異体」は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の、例えば当技術分野で認識されているアッセイによって測定されるような、野生型サイトカインの活性を有するサイトカイン変異体を指す。
【０３０１】
本明細書で使用される「ＩＬ−１０ファミリーサイトカイン」という用語は、ＩＬ−１０サイトカインファミリーの分子を指し、全長の天然に存在するＩＬ−１０サイトカインファミリーメンバー、その活性フラグメント又は活性変異体を指す。実施形態において、ＩＬ−１０ファミリーサイトカインは、ＩＬ−１０分子、ＩＬ−１９分子、ＩＬ−２０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２４分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子又はＩＬ−２９分子から選択される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１０ファミリーサイトカインは、ＩＬ−１０Ｒ２受容体を介してシグナル伝達する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１０ファミリーサイトカインは、例えば、インビトロ又はインビボでＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖をもたらす。
【０３０２】
本明細書で使用される「ＩＬ−１７ファミリーサイトカイン」という用語は、ＩＬ−１７サイトカインファミリーの分子を指し、全長の天然に存在するＩＬ−１７サイトカインファミリーメンバー、その活性フラグメント又は活性変異体を指す。実施形態において、ＩＬ−１７ファミリーサイトカインは、ＩＬ１７Ａ分子、ＩＬ１７Ｂ分子、ＩＬ１７Ｃ分子、ＩＬ１７Ｄ分子、ＩＬ１７Ｅ分子又はＩＬ１７Ｆ分子から選択される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１７ファミリーサイトカインは、例えば、インビトロ又はインビボでＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖をもたらす。
【０３０３】
本明細書で使用される「ｇｐ１３０アクティベーター」という用語は、ｇｐ１３０を活性化し、例えば二量体化、例えばｇｐ１３０のホモ二量体化又は例えばＬＩＦ、ＯＳＭ又はＣＮＴＦとのｇｐ１３０のヘテロ二量体化を引き起こす分子を指す。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０アクティベーターは、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子、ＯＳＭ分子又はｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば抗ｇｐ１３０抗体分子から選択される。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０アクティベーターは、ｇｐ１３０を介したシグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０アクティベーターは、Ｓｔａｔ３経路を活性化し、例えばチロシン７０５をリン酸化するか、又はＳｔａｔ３活性化遺伝子の転写を増加させるか若しくはＳｔａｔ３阻害遺伝子の転写を減少させる。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０アクティベーターは、例えば、インビトロ又はインビボでＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖をもたらす。
【０３０４】
「ｇｐ１３０分子」という用語は、全長の天然に存在するｇｐ１３０（例えば、哺乳動物ｇｐ１３０、例えばヒトｇｐ１３０、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＩ１７４０３）、ｇｐ１３０の活性フラグメント又はｇｐ１３０の天然に存在する野生型ポリペプチド又はそのフラグメントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する活性変異体を指す。いくつかの実施形態において、変異体は、野生型ポリペプチド又はそれをコードする核酸の誘導体、例えば変異体である。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０変異体、例えばｇｐ１３０の活性変異体は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の野生型ｇｐ１３０ポリペプチドの活性を有する。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０分子は、Ｓｔａｔ３経路を活性化し、例えばチロシン７０５をリン酸化するか、又はＳｔａｔ３活性化遺伝子の転写を増加させるか若しくはＳｔａｔ３阻害遺伝子の転写を減少させる。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０アクティベーターは、例えば、インビトロ又はインビボでＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖をもたらす。ｇｐ１３０は、ＣＤ１３０又はＩＬ−６受容体サブユニットβ（ＩＬ−６ＲＢ）とも称される。
【０３０５】
本明細書で使用される「Ｓｔａｔ３分子」という用語は、Ｓｔａｔ３経路を活性化して、例えばＳｔａｔ３のリン酸化の増加（例えば、チロシン７０５（Ｙ７０５）上）を引き起こすか、又はＳｔａｔ３活性化遺伝子の転写を増加させることにより若しくはＳｔａｔ３阻害遺伝子の転写を減少させることにより、Ｓｔａｔ３経路を活性化する分子を指す。「Ｓｔａｔ３分子」という用語は、全長の天然に存在するＳｔａｔ３（例えば、哺乳動物Ｓｔａｔ３、例えばヒトＳｔａｔ３、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＳ６６９８６．１）、Ｓｔａｔ３の活性フラグメント又はＳｔａｔ３の天然に存在する野生型ポリペプチド又はそれをコードする核酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する活性変異体を含む。いくつかの実施形態において、変異体は、野生型ポリペプチド又はそれをコードする核酸の誘導体、例えば変異体である。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３変異体、例えばＳｔａｔ３の活性変異体は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の、例えば実施例２のアッセイによって測定されるような、野生型Ｓｔａｔ３ポリペプチドの活性を有する。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３分子は、例えば、インビトロ又はインビボでＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖をもたらす。
【０３０６】
説明
本開示は、とりわけ、ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＡＲ１９発現細胞）の改善された作製方法、例えば製造方法を提供する。本開示は、それを含む組成物及び反応混合物も提供する。いくつかの実施形態において、作製方法は、免疫エフェクター細胞集団を、（ｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＳｔａｔ３アクティベーター；（ｉｉ）解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤、例えば小分子ヘキソキナーゼ阻害剤、例えばグルコース類似体、例えば２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方と接触させることを含む。本開示は、いくつかの態様において、ＣＡＲ発現細胞による治療的処置を受ける、受けようとしている、受けた又は受けている対象を評価、予測、選択又は監視する方法も提供する。ＣＡＲ発現細胞による治療的処置に対する、癌（例えば、本明細書に記載の癌）を有する対象の応答性を評価又は予測する方法も本明細書に記載される。
【０３０７】
一態様において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞を製造する改善された方法を提供する。本明細書の実施例１に記載されているように、グルコース代謝を低下させることは、ＣＡＲ発現細胞の有効性の改善につながり得る。したがって、免疫エフェクター細胞をより低いグルコース代謝を有することに基づいてＣＡＲ治療のために選択することができるか、又はグルコース代謝の阻害剤を製造プロセスに加えてＣＡＲ発現細胞の有効性を改善することができる。更に、本明細書の実施例２は、ＣＡＲ発現細胞の有効性を改善する方法としてＳｔａｔ３経路活性化を説明している。
【０３０８】
本開示は、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲで操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の製造方法並びにそのような細胞を含む反応混合物及び組成物も説明する。本明細書で提供される方法は、ＣＡＲの発現に適した細胞の収量及び品質、例えば純度を改善する。理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＡＲを発現するように操作することができる細胞の改善された収量及び品質は、ＣＡＲをコードする核酸を導入する効率を改善し、得られるＣＡＲ発現細胞の増殖を改善すると考えられている。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物は、対象の疾患の処置における使用のための改善されたＣＡＲ発現細胞産物を提供する。
【０３０９】
本開示は、ＣＡＲの発現又はＣＡＲ発現細胞の治療有効性に負の影響を及ぼし得る望ましくない物質、非標的細胞又は細胞を除去する方法も説明する。例えば、本明細書で取り上げられる方法は、単球、顆粒球、赤血球、血小板、Ｂ細胞、癌細胞、例えば、リンパ芽球、抗凍結剤（凍結サンプル由来）、ヘモグロビン又は細胞破片のいずれかの１つ以上を除去するか又は枯渇させるために使用することができる。例えば、本明細書で取り上げられる方法は、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、樹状細胞のいずれかの１つ以上を濃縮するか又はその数を増加させるために使用することができる。本明細書に記載の各方法を単独で又は本明細書に記載の方法のそれぞれ若しくは全てと任意に組み合わせて実行することで、ＣＡＲを発現するように操作するのに適した改善された出発物質が得られる。
【０３１０】
新鮮なアフェレーシス材料は、ＣＡＲの発現に適した細胞の製造に一般的に使用される。凍結された、例えば凍結保存されたアフェレーシス材料の使用は、容易に輸送され、それによりＣＡＲ発現細胞産物の製造施設への患者の位置の近接性に関する制限が取り除かれ、ＣＡＲ発現細胞製造プロセスの工業化及びそれを必要とする患者への治療製品のより大きいアクセス性を可能にするという利点を提供する。ＣＡＲ発現細胞の製造に現在使用されている方法は、新鮮なアフェレーシス材料のプロセシング用に最適化されており、冷凍アフェレーシスサンプルからＣＡＲ発現に適した細胞の同様の品質又は収量を得るために使用することができない。対照的に、本明細書に記載の方法は、冷凍、例えば凍結保存されたアフェレーシスサンプルから、ＣＡＲ発現に適した細胞をプロセス及び製造するために使用することができる。出発材料が凍結される、例えば凍結保存される実施形態において、本明細書に記載の方法は、任意選択により、凍結細胞が、例えば解凍プロセスを加速するためのオペレーター又は装置による干渉なしに解凍することが許容されるか、又は凍結細胞が、例えば解凍装置、例えばＰｌａｓｍａＴｈｅｒｍの使用により、解凍プロセスを加速する装置又はプロセスに供される、解凍工程を含む。そのような実施形態において、解凍された材料は、周囲環境と同じ温度、例えば部屋の環境温度と同じ温度又は解凍された材料が加えられるか、洗浄されるか若しくはインキュベートされる緩衝液と同じ温度を有する。本明細書に記載の方法は、凍結又は解凍されたインプットサンプル、例えば凍結又は解凍されたアフェレーシスサンプルからＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を生成又は濃縮するために特に有用である。
【０３１１】
本明細書で言及されるプロセスＢは、現在使用されているＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞を濃縮するための標準的なプロトコルである。プロセスＢは、フィコールによる密度勾配精製及びＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用したポジティブ選択を実施することを含み、ここで、インプットサンプルは、新鮮なアフェレーシス材料である。本明細書に記載の方法は、ＣＡＲの発現に適した所望の免疫エフェクター細胞のより高い濃縮、改善された品質及び収量を提供する。
【０３１２】
別の態様において、本開示は、例えば、本明細書に記載の製造方法のいずれかによって作製され、ＣＡＲを発現するように操作された、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を特徴とし、ここで、操作された免疫エフェクター細胞は、抗腫瘍特性を示す。一実施形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な抗原は、本明細書に記載の癌関連抗原（すなわち腫瘍抗原）である。一態様において、細胞は、ＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲは、細胞表面に発現される。いくつかの実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかのこのような実施形態において、細胞は、ＣＡＲを安定に発現し得る。別の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）に、ＣＡＲをコードする核酸、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡをトランスフェクトする。いくつかのこのような実施形態において、細胞は、ＣＡＲを一過性に発現し得る。
【０３１３】
更に、本開示は、ＣＡＲ発現細胞組成物及び数ある疾患の中で、癌又は本明細書に記載されるような腫瘍抗原を発現する細胞又は組織が関与するあらゆる悪性腫瘍若しくは自己免疫性疾患を処置するための医薬又は方法におけるそれらの使用を提供する。
【０３１４】
水簸
一態様において、本明細書に記載の方法は、望ましくない細胞、例えば単球及び芽球を除去し、それによりＣＡＲ発現に適した所望の免疫エフェクター細胞の濃縮の改善をもたらす水簸方法を特徴とする。一実施形態において、本明細書に記載の水簸方法は、凍結されていたサンプル、例えば解凍されたサンプルからのＣＡＲ発現に適した所望の免疫エフェクター細胞の濃縮のために最適化される。一実施形態において、本明細書に記載の水簸方法は、当技術分野で公知の水簸プロトコルから回収された細胞の調製物と比較して改善された純度を有する細胞の調製物を提供する。
【０３１５】
製造物流（リモートサンプルの回収、出荷、保管及び生産ユニットのスケジューリング）を容易にするために、細胞原料は、典型的には、製造開始前に解凍する必要のある凍結保存された全血又はアフェレーシス材料である。しかしながら、解凍した凍結材料からの細胞の密度及びサイズは、新鮮な材料のものと非常に異なっている。そのため、ＣＡＲ発現を操作するための細胞分離に一般的に使用される標準的な水簸プロトコルは、凍結保存及び解凍された全血又はアフェレーシス材料から単球、顆粒球又は任意のより大きいサイズの細胞を大いに除去し損なっている。この状況は、後続のＣＡＲＴ製造工程の結果に負の影響を及ぼし、収率の不良、製品品質の問題、仕様外のプロセス偏差につながる。水簸は、単球を除去できるものの、芽球細胞は、Ｔリンパ球と同様の密度及びサイズを有するため、芽球細胞の除去に効率的でない。
【０３１６】
一実施形態において、本明細書に記載の水簸方法は、特定の等張溶液（例えば、ＰＢＳ）で希釈することにより、出発サンプル、例えば細胞サンプル、例えば解凍された細胞サンプルの最適化された粘度を使用すること、並びに水簸装置によって回収された各画分について、流速及び回収体積の最適化された組み合わせを使用することを含む。改変水簸プログラムの例は、実施例１に記載される。
【０３１７】
単球からリンパ球、例えばＴ細胞を分離するための水簸設定の例示的な範囲が表４に提供される。例示的な水簸プログラムの流速、遠心分離及び体積の設定も、表４の「Ｅｘ．」と指定された列に提供される。
【０３１８】
【表１】
2021500894.tif 000002
【０３１９】
一実施形態において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０又はそれを超える画分が水簸工程から回収される。一実施形態において、５つの画分が水簸工程から回収される。５つの画分が回収される実施形態において、第３の画分（Ｆ３）若しくは第４の画分（Ｆ４）又は第３の画分と第４の画分との組み合わせは、最小量の単球、顆粒球、他の非リンパ球細胞を伴う所望のリンパ球集団を含有する。一実施形態において、各画分は、異なる流速を使用して回収される。一実施形態において、各画分について、流速は、前の画分を回収するために使用された流速から増加される。一実施形態において、１つ以上の画分は、異なる回収体積を使用して回収される。
【０３２０】
一実施形態において、水簸は、約２０〜９０ｍＬ／分、約３０〜９０ｍＬ／分、約４０〜９０ｍＬ／分、約５０〜９０ｍＬ／分、約６０〜９０ｍＬ／分、約７０〜９０ｍＬ／分、約４０〜８５ｍＬ／分、約５０〜８２ｍＬ／分、約６０〜８２ｍＬ／分、約７０〜８２ｍＬ／分、約５０〜８０ｍＬ／分、約６０〜８０ｍＬ／分、約７０〜８０ｍＬ／分の流速を使用して実施される。一実施形態において、水簸は、約３０〜８２ｍＬ／分又は約５０〜８０ｍＬ／分の流速を使用して実施される。一実施形態において、水簸は、約３０、４０、５０、６０、７０、７２、８０又は８２ｍＬ／分の流速を使用して実施される。一実施形態において、水簸は、約７０ｍＬ／分又は７２ｍＬ／分の流速を使用して実施される。
【０３２１】
一実施形態において、最小量の単球、顆粒球、他の非リンパ球細胞及び他の望ましくない成分を伴う所望のリンパ球集団を含有する１つ以上の画分の流速は、約２０〜９０ｍＬ／分、約３０〜９０ｍＬ／分、約４０〜９０ｍＬ／分、約５０〜９０ｍＬ／分、約６０〜９０ｍＬ／分、約７０〜９０ｍＬ／分、約４０〜８５ｍＬ／分、約５０〜８２ｍＬ／分、約６０〜８２ｍＬ／分、約７０〜８２ｍＬ／分、約５０〜８０ｍＬ／分、約６０〜８０ｍＬ／分、約７０〜８０ｍＬ／分である。一実施形態において、所望のリンパ球集団を含有する１つ以上の画分の流速は、約５０〜８２ｍＬ／分、約５０〜８０ｍＬ／分、約６０〜８２ｍＬ／分、約６０〜８０ｍＬ／分、約７０〜８２ｍＬ／分、約７０〜８０ｍＬ／分、約７０〜７５ｍＬ／分、約７０〜７２ｍＬ／分である。一実施形態において、所望のリンパ球集団を含有する１つ以上の画分の流速は、約７０ｍＬ／分又は７２ｍＬ／分である。
【０３２２】
一実施形態において、水簸は、約２５０〜１２５０ｍＬ、約２５０〜１０００ｍＬ、約３００〜１０００ｍＬ、約４００〜１０００ｍＬ、約５００〜１０００ｍＬ、約６００〜１０００ｍＬ、約７００〜１０００ｍＬ、約８００〜１０００ｍＬ、約９００〜１０００ｍＬ、約２５０〜９７５ｍＬ、約３００〜９７５ｍＬ、約４００〜９７５ｍＬ、約５００〜９７５ｍＬ、約６００〜９７５ｍＬ、約７００〜９７５ｍＬ、約８００〜９７５ｍｌ、約３００〜９００ｍＬ、約３００〜８００ｍＬ、約３００〜７００ｍＬ、約３００〜６００ｍＬ、約３００〜５００ｍＬ又は約３００〜４００ｍＬの回収体積を使用して実施される。一実施形態において、水簸は、約２５０、４００、５００、９００又は９７５ｍＬの回収体積を使用して実施される。一実施形態において、水簸は、約４００ｍＬ又は約９７５ｍＬの回収体積を使用して実施される。
【０３２３】
一実施形態において、最小量の単球、顆粒球、他の非リンパ球細胞及び他の望ましくない成分を伴う所望のリンパ球集団を含有する１つ以上の画分の回収体積は、約２５０〜１２５０ｍＬ、約２５０〜１０００ｍＬ、約３００〜１０００ｍＬ、約４００〜１０００ｍＬ、約５００〜１０００ｍＬ、約６００〜１０００ｍＬ、約７００〜１０００ｍＬ、約８００〜１０００ｍＬ、約９００〜１０００ｍＬ、約２５０〜９７５ｍＬ、約３００〜９７５ｍＬ、約４００〜９７５ｍＬ、約５００〜９７５ｍＬ、約６００〜９７５ｍＬ、約７００〜９７５ｍＬ、約８００〜９７５ｍｌ、約３００〜９００ｍＬ、約３００〜８００ｍＬ、約３００〜７００ｍＬ、約３００〜６００ｍＬ、約３００〜５００ｍＬ又は約３００〜４００ｍＬである。一実施形態において、所望のリンパ球集団を含有する１つ以上の画分の回収体積は、約２５０、４００、５００、９００又は９７５ｍＬである。一実施形態において、所望のリンパ球集団を含有する１つ以上の画分の回収体積は、約４００ｍＬ又は約９７５ｍＬである。
【０３２４】
一実施形態において、本明細書で説明される水簸方法は、水簸装置によって実施される。例えば、水簸装置は、Ｃａｒｉｄｉａｎ  ＢＣＴ  ＥｌｕｔｒａＴＭ細胞分離システム（Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴ  Ｍｏｄｅｌ  ７１８００）である。Ｃａｒｉｄｉａｎ  ＢＣＴ  ＥｌｕｔｒａＴＭ細胞分離システム（Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴモデル７１８００）は、連続的な逆流水簸技術を利用して、第一にサイズ、第二に比重によって細胞分離を行う閉鎖系である。分離チャンバーへの培地の流れと、遠心力によって生成される沈降速度とによって生成される反力により、細胞がサイズ及び密度によって分離チャンバー内で整理され、そこで自動的に回収バッグに吸引される。カスタマイズされたＥｌｕｔｒａ設定は、異なる画分で顆粒球と組み合わせたリンパ球及び単球の分布を可能にするように設計されている。Ｅｌｕｔｒａは、製造元の指示に従って操作することができる。
【０３２５】
密度勾配遠心分離
養子細胞治療製品の製造は、末梢血アフェレーシス出発材料に存在する血液細胞及び血液要素の複合混合物から離れて、所望の細胞、例えば免疫エフェクター細胞をプロセシングすることを必要とする。末梢血由来のリンパ球サンプルは、フィコール溶液による密度勾配遠心分離を使用した分離に成功している。しかしながら、フィコールは、臨床使用に適格ではないため、フィコールは、治療用途で細胞を分離するための好ましい試薬ではない。更に、フィコールは、グリコールを含有し、これは、細胞に対して毒性を有する可能性がある。更に、凍結保存後に解凍したアフェレーシス産物のフィコール密度勾配遠心分離は、例えば、本明細書の実施例に記載されるように、準最適なＴ細胞産物をもたらす。例えば、フィコール溶液による密度勾配遠心分離によって分離された細胞調製物では、非Ｔ細胞、特に望ましくないＢ細胞、芽細胞及び単球の相対的な増加を伴う、最終製品でのＴ細胞の喪失が観察された。
【０３２６】
理論に拘束されることを望むものではないが、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、凍結保存中に脱水して、新鮮な細胞よりも密度が高くなると考えられている。理論に拘束されることを望むものではないが、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、他の血液細胞よりも長い間密度が高いままであり、したがって他の細胞と比較してより容易にフィコール密度勾配分離中に失われると考えられている。したがって、理論に拘束されることを望むものではないが、フィコールより大きい密度の培地は、フィコール又はフィコールと同じ密度、例えば１．０７７ｇ／ｍＬの他の培地と比較して、望ましい免疫エフェクター細胞の分離の改善を提供すると考えられている。
【０３２７】
一実施形態において、本明細書に記載の密度勾配遠心分離法は、イオジキサノールを含む密度勾配媒体の使用を含む。一実施形態において、密度勾配媒体は、水中に約６０％のイオジキサノールを含む。
【０３２８】
一実施形態において、本明細書に記載の密度勾配遠心分離法は、フィコールより大きい密度を有する密度勾配媒体の使用を含む。一実施形態において、本明細書に記載の密度勾配遠心分離法は、１．０７７ｇ／ｍＬ超、例えば１．０７７ｇ／ｍＬ超、１．１ｇ／ｍＬ超、１．１５ｇ／ｍＬ超、１．２ｇ／ｍＬ超、１．２５ｇ／ｍＬ超、１．３ｇ／ｍＬ超、１．３１ｇ／ｍＬ超の密度を有する密度勾配媒体の使用を含む。一実施形態において、密度勾配媒体は、約１．３２ｇ／ｍＬの密度を有する。
【０３２９】
一実施形態において、本明細書に記載の密度勾配遠心分離法は、イオジキサノール、例えば水中に約６０％のイオジキサノールを含む密度勾配媒体の使用を含み、フィコールより高い、例えば１．０７７ｇ／ｍＬ超、例えば約１．３２ｇ／ｍＬの密度を有する。一実施形態において、本明細書に記載される密度勾配遠心分離法は、密度勾配媒体ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）（Ｓｉｇｍａ）の使用を含む。ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）は、密度が１．３２０±０．００１ｇ／ｍｌの６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノールの既製の無菌エンドトキシンテスト済み溶液である。対照的に、フィコール密度勾配溶液の密度は、わずか１．０７７ｇ／ｍｌである。フィコールに対するＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）の別の利点は、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）がＧＭＰグレードで利用できるため、治療用途に適していることである。
【０３３０】
理論に拘束されることを望むものではないが、ＯｐｔｉＰｒｅｐ密度勾配遠心分離工程の、例えば解凍したアフェレーシス材料での利用は、望ましくないＢ細胞及び単球を保持する可能性がより低いと考えられており、したがって、その後の活性化及び形質導入工程のために、所望の標的免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の回収を更に改善すると考えられている。したがって、理論に拘束されることを望むものではないが、フィコールと比較してより高いＯｐｔｉＰｒｅｐの密度は、所望の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の精製及び回収の両方の強化並びにＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の製品製造の一貫して成功した結果を妨害し得る、他の場合に望ましくない非Ｔ細胞型の同時除去を可能にすると考えられている。
【０３３１】
一実施形態において、密度勾配遠心分離は、細胞分離装置を使用して実施される。細胞分離装置の例には、Ｓｅｐａｘ２（Ｂｉｏｓａｆｅ）が含まれる。例えば密度勾配遠心分離工程前又は後に、洗浄工程、例えば本明細書に記載されるような改善された洗浄工程が実施される実施形態において、洗浄工程は、密度勾配遠心分離工程で使用されるものと同じ装置を使用して実行することができる。
【０３３２】
選択による濃縮
ＣＡＲ発現に適した所望の免疫エフェクター細胞の濃縮を改善するための特定の細胞の選択方法が本明細書に提供される。一実施形態において、選択は、ポジティブ選択、例えば所望の免疫エフェクター細胞の選択を含む。別の実施形態において、選択は、ネガティブ選択、例えば望ましくない細胞の選択、例えば望ましくない細胞の除去を含む。実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ又はネガティブ選択方法は、フロースルー装置、例えば本明細書に記載のフロースルー装置を使用することによって流動条件下で実施される。
【０３３３】
現在の選択方法、例えばポジティブ選択、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８  ＣＴＳ（商標）を使用するものは、濃縮のために更に最適化できる。第一に、選択中に使用されるＤｙｎａｂｅａｄｓの量は、典型的には、密度勾配遠心分離後のサンプル、例えばＳｅｐａｘフィコールサンプル中に存在するＣＤ４５＋／３＋細胞、例えばＣＤ４５＋／３＋細胞の割合に基づくものではなく、元の患者材料に存在する細胞、例えばＣＤ４５＋／３＋細胞の割合に基づくものである。密度勾配遠心分離工程、例えばＳｅｐａｘフィコール分離手順によって引き起こされる組成の有意な変化を考慮すると、この計算は、典型的には、Ｔ細胞の割合の減少及び単球の含有量の増加をもたらす。第二に、２時間のインキュベーション時間は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の非標的細胞（すなわち非ＣＤ３及び／又は非ＣＤ２８細胞）への両方の非特異的結合並びにエンドサイトーシスを介した非標的細胞（例えば、単球）によるビーズの取り込みの十分な機会を提供し、ポジティブ選択産物におけるＴ細胞の収率及び純度を損ない得る問題を提供する。最後に、選択を用いた磁気装置及び操作は、準最適であり得る。現在、磁気分離は、大きい体積の液体（２００ｍｌ）内で行われ、これは、磁気標識された細胞と磁気面との間の大きい距離をもたらす。これにより、分離に利用できる磁力が制限されるため、分離感度が低下し、より長い分離時間が要求される。更に、現在、磁気分離は、統計的に実施されており、サンプルは、負の画分を除去する前に５分間磁気面の上に配置される。このような長い分離時間は、細胞に有害であり、その生存率は、「パイルアップ」効果により手順中に負の影響を受けることが多く、非標的細胞がビーズに結合又は内部移行する機会が更に提供される。
【０３３４】
現在の選択方法とは対照的に、本明細書に記載の選択方法は、現在の「静的」分離手順とは反対に、例えば流動条件下で「動的に」発生する分離を含む。一実施形態において、流動条件下での分離は、磁気分離試薬、例えば標的抗原、インプットサンプル及び磁石に選択的に結合する磁気ビーズと磁石とを含み、磁気分離試薬及びインプットサンプルは、磁石上を通過する、例えば流れる。特定の実施形態において、磁気分離試薬及びインプットサンプルは、連続的に磁石上を通過する、例えば流れる。理論に拘束されるものではないが、この動的な手法により、インキュベーション時間（すなわちサンプルと分離試薬の接触）及び分離時間を短縮でき、したがって標的細胞への負の影響を最小限に抑え、非標的集団による非特異的結合及び／又はビーズの取り込みの可能性を有意に低減できる。更に、本明細書に記載の選択方法は、選択試薬（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８  ＣＴＳ（商標））又は選択に使用する試薬の量（３対１のビーズ対Ｔ細胞比率）の改変を要しない。
【０３３５】
一実施形態において、本明細書に記載されるような流動条件下での分離又は選択は、フロースルー抗体ベースの選択技術（ＦＡＳＴ、Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）プロトコルを含む。表１２は、現在の選択技術とＦＡＳＴプロトコルとで異なるパラメーターの概要を示す。
【０３３６】
【表２】
2021500894.tif 000003
【０３３７】
一実施形態において、本明細書に記載の選択方法は、分離試薬及びインプットサンプルの現在の標準プロトコルよりも短いインキュベーション期間を含み、その後、磁気分離が続く。一実施形態において、インキュベーション期間は、２時間未満、例えば、１１０分未満、１００分未満、９０分未満、８０分未満、７０分未満、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２５分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満又は５分未満である。一実施形態において、インキュベーションは穏やかな回転下で実施される。
【０３３８】
選択のための例示的なキットは、例えば、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレットに記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、一実施形態において、キットは、スパイクを介して又は無菌溶接により、追加のサンプル／緩衝液バッグに接続できる３つのバッグのアセンブリから構成される。更に、改変されたＤｙｎａＭａｇの蓋が分離で使用され、これは、分離中の最大容量を低容量、例えば、１００ｍＬ未満、９０ｍＬ未満、８０ｍＬ未満、７０ｍＬ未満、６０ｍＬ未満、５０ｍＬ未満、４０ｍＬ未満、例えば、約５０ｍＬに制限する。理論に拘束されることを望むものではないが、分離中に使用される低容量は、分離手順中に作用する磁力を最適化し、分離時間を最小化すると考えられている。改変されたＤｙｎａＭａｇの蓋は、ビーズ：細胞コンジュゲートが磁石から移動する最大距離も制限し、位置選択中に経験者のために磁力を標準化する。
【０３３９】
一実施形態において、本明細書に記載のキットのバッグの１つ以上は、三角形のバッグである。一実施形態において、選択バッグは三角形のバッグであり、バッグが選択バッグの両端にポートを提供するため、「フロースルー」モードでの磁気分離を可能にする。そのような実施形態において、細胞を磁気要素（例えば、ＤｙｎａＭａｇなどの磁気プレート）上に連続的に流すことができ、それにより、磁気標識粒子のリアルタイム分離を可能にする一方で、非標識細胞は磁場に引き寄せられず、外向きに流れる。このフロースルー構成により、システムは特に自動化に適するようになる。改変された分離バッグは、追加のポートを収容するための改変された蓋を含む。
【０３４０】
一実施形態において、選択バッグは三角形のバッグではない。選択バッグが三角形のバッグではない実施形態において、インキュベーション時間は、２時間未満、例えば、１１０分未満、１００分未満、９０分未満、８０分未満、７０分未満、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２５分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満又は５分未満である。
【０３４１】
ポジティブ選択
実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ選択方法は、所望の免疫エフェクター細胞を選択、例えば、濃縮することを含む。一実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ選択方法は、ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞を選択することを含む。他の実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ選択方法は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞又はＣＤ４５＋細胞の１つ以上を選択することを含む。
【０３４２】
本明細書に記載される選択方法で使用される分離試薬は、磁性又は常磁性メンバー及び抗原結合メンバーを含む。１つの実施形態において、分離試薬は、例えば抗原結合メンバーに（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に）カップリングされた磁性又は常磁性特性を有する、ビーズを含む。一実施形態において、抗原結合メンバーは、抗体又はその抗体フラグメントである。一実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞のポジティブ選択で使用される分離試薬は、ＣＤ３及び／又はＣＤ２８結合メンバー、例えば抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体又は抗体フラグメントに（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に）カップリングされたビーズを含む。
【０３４３】
ネガティブ選択
望ましくない細胞、例えば、単球、顆粒球、赤血球、血小板及びＢ細胞のインプットサンプルをネガティブ選択又は枯渇させ、それにより、得られるアウトプットサンプルを所望の免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞で濃縮するネガティブ選択方法も本明細書に提供される。一実施形態において、本明細書に記載されるネガティブ選択方法は、フロースルー装置、例えば本明細書に記載のフロースルー装置を使用して、流動条件下で実施される。
【０３４４】
一実施形態において、本明細書に記載のネガティブ選択方法は、単球、顆粒球、赤血球、血小板、Ｂ細胞又は癌細胞、例えばリンパ芽球の１つ以上のネガティブ選択を含む。
【０３４５】
単球、顆粒球、赤血球、血小板又はＢ細胞の１つ以上の枯渇又は除去が望まれる実施形態において、ネガティブ選択方法は、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ１４又は単球、顆粒球、赤血球、血小板若しくはＢ細胞によって発現される他の表面マーカー又はタンパク質の１つ以上を発現する細胞を選択する。
【０３４６】
対象が血液癌を有する実施形態において、癌細胞がアフェレーシスサンプル中に存在する場合があり、癌細胞の除去が望ましい場合がある。一実施形態において、本明細書に記載のネガティブ選択方法は、ＣＤ１９＋細胞、例えばリンパ芽球をネガティブに選択することを含む。別の実施形態において、本明細書に記載されるネガティブ選択方法は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１又はＦＬＴ３の１つ以上を発現する癌細胞をネガティブに選択することを含む。
【０３４７】
本明細書に記載される選択方法で使用される分離試薬は、磁性又は常磁性メンバー及び抗原結合メンバーを含む。１つの実施形態において、分離試薬は、例えば抗原結合メンバーに（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に）カップリングされた磁性又は常磁性特性を有する、ビーズを含む。一実施形態において、抗原結合メンバーは、抗体又はその抗体フラグメントである。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞のネガティブ選択で使用される分離試薬は、ＣＤ１９結合メンバー、例えば抗ＣＤ１９抗体又は抗体フラグメントに（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に）カップリングされたビーズを含む。一実施形態において、ＣＤ１４＋細胞のネガティブ選択で使用される分離試薬は、ＣＤ１４結合メンバー、例えば抗ＣＤ１４抗体又は抗体フラグメントに（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に）カップリングされたビーズを含む。一実施形態において、ＣＤ２５＋細胞のネガティブ選択で使用される分離試薬は、ＣＤ２５結合メンバー、例えば抗ＣＤ２５抗体又は抗体フラグメントに（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に）カップリングされたビーズを含む。
【０３４８】
いくつかの実施形態において、選択方法は、例えばフロースルー装置を使用することによって流動条件下で実施することができる。例示的なフロースルー装置は、２０１６年１２月２７日に出願された国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレットの５７〜８６ページに記載されており、これは、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０３４９】
改善された洗浄工程
アフェレーシス、例えば白血球アフェレーシスの産物の細胞組成は、患者によって大きく異なる。顆粒球（例えば、好中球）の割合が高い白血球アフェレーシス産物は、プロセスＢを使用したＣＡＲ  Ｔ細胞製造中の上昇した細胞凝集の例と相関している。理論に拘束されることを望むものではないが、そのような不可逆的な凝集は、利用可能な細胞数を減らし、濃縮プロセス（例えば、ポジティブ選択）を妨害することにより、細胞収率に負の影響を与え、これが細胞数及び純度の全体的な低下をもたらすと考えられている。更に、理論に拘束されることを望むものではないが、細胞の純度及び収率の低下は、後続のプロセスのパフォーマンス（例えば、形質導入効率と増殖）及び最終産物の細胞数及び品質に直接影響する。この正味の結果は、プロセシングサイクルの最後に用量仕様を満たすことができる製品を製造する能力を低下させる。したがって、理論に拘束されることを望むものではないが、凝集の防止により、細胞の損失を低減し、Ｔ細胞の純度を改善することができ、これにより、後続のプロセシング工程について、より良い質及び量の開始材料を生成でき、全体的に改善された治療製品をもたらすことができると考えられている。
【０３５０】
当技術分野における現在の製造プロセス、例えばプロセスＢでは、患者の細胞白血球アフェレーシス材料をＰｌａｓｍａｔｈｅｒｍ（Ｇｅｎｅｓｉｓ）で解凍し、ＣｅｌｌＳａｖｅｒ  ５＋機器（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）を使用して洗浄した後、その後のリンパ球のフィコール選択のために、「改変培地」と呼ばれるＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａに基づく細胞増殖培地）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝等張生理食塩水のいずれかに再懸濁する。改変培地は、実施例２で提供されるプロトコルに従って調製される。しかしながら、実施例２に記載されているように、解凍した細胞を改変培地又はＰＢＳ溶液のいずれかに移すと、細胞の凝集を引き起こし得る。
【０３５１】
したがって、凝集を防止するために細胞を洗浄するための改善された方法も本明細書に提供され、これは後続の製造工程、例えば刺激による（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８  ＣＴＳ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）による）ポジティブ選択と適合する。更に、本明細書に記載の改善された洗浄工程は、例えば解凍された細胞に対して実施されて、細胞内破片、遊離ヘモグロビン及び抗凍結剤を除去し、体積の減少を達成し、その後の密度勾配分離を可能にする。一実施形態において、洗浄工程は、改変培地又はＰＢＳ溶液に対する代替の細胞再懸濁緩衝液を用いて行われる。一実施形態において、洗浄工程は、デキストロース及び／又は塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いて行われる。一実施形態において、緩衝液は、約５％及び約０．４５％の塩化ナトリウム、例えば、Ｄ５  １／２  ＮＳ培地を含む。一実施形態において、緩衝液は、細胞懸濁液を安定化し、例えば少なくとも３０分間、４５分間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間又は６時間にわたり、凝集を防止する。
【０３５２】
一実施形態において、本明細書に記載される改善された洗浄工程は、装置、例えば細胞分離装置、例えば密度勾配遠心分離に使用されるものと同じ装置を使用して実施される。例えば、改善された洗浄工程は、Ｓｅｐａｘ２  ＲＭ装置（Ｂｉｏｓａｆｅ）を使用して実施される。
【０３５３】
一実施形態において、本明細書に開示される洗浄工程は、新鮮なアフェレーシスサンプル又は凍結されていた、例えば解凍された、アフェレーシスサンプルに使用することができる。実施形態において、本明細書に開示される洗浄工程は、本明細書に記載の水簸、密度勾配遠心分離又は選択方法のいずれかの前又は後に使用することができる。別の実施形態において、本明細書に開示される洗浄工程は、密度勾配遠心分離工程、例えば、ＯｐｔｉＰｒｅｐ培地を使用した密度勾配遠心分離後に実施される。
【０３５４】
改善された製造プロセス
ＣＡＲを発現するのに適した免疫エフェクター細胞の品質及び収率を、当技術分野で現在使用されている方法よりも大幅に改善する方法が本明細書に提供される。一実施形態において、水簸、密度勾配遠心分離、流動条件下でのポジティブ及びネガティブ選択並びに先の項に記載した改善された洗浄工程は、ＣＡＲの発現に適した所望の免疫エフェクター細胞を単離又は濃縮するために、互いに又は当技術分野で現在使用されている若しくは本明細書に記載の追加の方法と任意の組み合わせで使用できる。
【０３５５】
一般に、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を産生又は濃縮するための方法は、インプットサンプルを提供すること、濃縮工程を実施すること、及び選択工程を実施すること、それにより、ＣＡＲの発現に適した免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを産生することを含む。ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の集団を作製する方法は、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を産生又は濃縮するための方法を含み、刺激工程を更に含み、例えば、ここで、細胞は増殖又は存続するように刺激され、ＣＡＲをコードする核酸の導入を更に含む。ＣＡＲの刺激及び導入／発現に関する追加の開示は、次項で更に説明される。
【０３５６】
一実施形態において、インプットサンプルは、対象から得られた新鮮なサンプル、例えば新鮮なアフェレーシス、白血球アフェレーシス又は全血サンプルである。別の実施形態において、インプットサンプルは凍結サンプルである。インプットサンプルが凍結サンプル、例えば、凍結若しくは凍結保存アフェレーシス、白血球アフェレーシス又は全血サンプルである実施形態において、方法は、凍結サンプルを解凍するか、又は解凍サンプルを提供することを含む。凍結、例えば凍結保存されたサンプルは、受動的又は能動的手段によって解凍することができる。受動的手段による解凍は、サンプルを解凍すること、例えば、周囲環境の温度に到達すること、例えば、室温に到達すること、又はサンプルが移動又は混合される緩衝液又は溶液の温度に到達することを可能にすることを含む。能動的手段による解凍は、サンプルを解凍する、例えば、受動的手段により解凍した場合よりも速くサンプルを周囲環境の温度にする装置の使用を含む。
【０３５７】
一実施形態において、濃縮工程は、水簸又は密度勾配遠心分離を実施することを含む。水簸は、当技術分野で公知の水簸条件又は凍結サンプル又は凍結されていたサンプルの水簸のために本明細書に記載の改善された設定を使用して実施することができる。密度勾配遠心分離は、フィコール又はイオジキサノールを含む媒体、例えば、水中約６０％のイオジキサノール、例えば、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）を使用して実施することができる。
【０３５８】
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、選択工程は、ポジティブ選択工程及び／又はネガティブ選択工程を実施することを含む。ポジティブ選択工程は、静止又は流動条件下のいずれかで（例えばａを使用）、例えば分離剤（例えば、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体にカップリングしたビーズ）を使用して、ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞を選択することを含み得る。ネガティブ選択工程は、例えば分離剤（例えば、抗ＣＤ１９抗体にカップリングしたビーズ）を使用して、ＣＤ１９＋Ｂ細胞又はＣＤ１９＋リンパ芽球をネガティブ選択することを含み得る。
【０３５９】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、洗浄工程は、サンプル回収後、サンプルの解凍後、濃縮工程前、濃縮工程後、選択工程前若しくは選択工程後又はそれらの任意の組み合わせで実施することができる。
【０３６０】
水簸、密度勾配遠心分離、ポジティブ又はネガティブ選択（例えば、流動条件下）又は改善された洗浄工程の１つ以上を含む、ＣＡＲを発現するように操作できる免疫エフェクター細胞の集団を産生又は濃縮するための例示的な方法は、更に本明細書に記載される。
【０３６１】
一実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を産生又は濃縮するための方法は、免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプルを提供すること；凍結したインプットサンプルを解凍して、解凍したサンプルを産生すること；インプットサンプルが、任意選択により解凍されたインプットサンプルである、インプットサンプルの水簸を実施することを含む、濃縮工程を実施すること；及び選択工程を実行することであって、選択は、ポジティブ選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞のポジティブ選択又はネガティブ選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋又はＣＤ１４＋細胞のネガティブ選択である、実行することを含む。
【０３６２】
別の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を産生又は濃縮するための方法は、免疫エフェクター細胞を含む新鮮又は凍結インプットサンプルを提供すること；及び任意選択により、インプットサンプルが凍結インプットサンプルであり、凍結インプットサンプルを解凍して解凍サンプルを生成すること；イオジキサノール、例えば水中６０％イオジキサノールを含み、且つ／又はフィコールより高い密度（例えば１．０７７ｇ／ｍＬ超、例えば約１．３２ｇ／ｍＬ）を有する培地、例えばＯｐｔｉＰｒｅｐ培地を使用して密度遠心分離工程を実施することを含む、濃縮工程を実施すること；及び選択工程を実行することであって、選択は、ポジティブ選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞のポジティブ選択又はネガティブ選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋又はＣＤ１４＋細胞のネガティブ選択である、実行することを含む。
【０３６３】
別の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を産生又は濃縮するための方法は、免疫エフェクター細胞を含む新鮮又は凍結インプットサンプルを提供すること；水簸又は密度遠心分離を（例えば、フィコール又はＯｐｔｉｐｒｅｐ培地を使用して）実施することを含む、濃縮工程を実施すること；及び流動条件下で例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞についてポジティブ選択工程を実施することを含む。
【０３６４】
別の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を産生又は濃縮するための方法は、免疫エフェクター細胞を含む新鮮又は凍結インプットサンプルを提供すること；水簸又は密度遠心分離を（例えば、フィコール又はＯｐｔｉｐｒｅｐ培地を使用して）実施することを含む、濃縮工程を実施すること；及び流動条件下で例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋又はＣＤ１４＋細胞についてネガティブ選択工程を実施することを含む。
【０３６５】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、洗浄工程は、サンプル回収後、サンプルの解凍後、濃縮工程前、濃縮工程後、選択工程前若しくは選択工程後又はそれらの任意の組み合わせで実施することができる。
【０３６６】
所望の免疫エフェクター細胞の濃縮を最適化し、製造の成功及び製品品質を確保するために、インプットサンプル又は本明細書に記載の方法の１つ以上の工程後の特性の範囲又は閾値を特定し、次の工程を指示又は決定する、管理限界が定義され得る。実施形態において、管理限界は、インプットサンプルが得られる対象の癌のタイプに応じて異なり得る。例として、ＡＬＬ又はＤＬＢＣＬを有する対象から得られたインプットサンプル中の単球の存在に関する管理限界は、以下の通りである：単球がインプットサンプル、例えば白血球アフェレーシス全血細胞の２０％を超える場合、最適な方法は、水簸及び／又は流動条件下でのＣＤ３／ＣＤ２８ポジティブ選択を含む；又は単球がインプットサンプルの２０％未満の場合、インプットサンプルは洗浄され、芽球の含有量に基づいて最適な方法が決定される。別の例において、ＡＬＬ又はＤＬＢＣＬを有する対象から得られたインプットサンプル中の芽球細胞の存在に関する管理限界は、以下の通りである：芽球細胞が、入ってくる白血球アフェレーシスＷＢＣの２０％以上である場合、水簸（単球、顆粒球、細胞破片を除去するため）及び／又は改変されたＣＤ１９ネガティブ選択（芽球を除去するため）又は芽球を枯渇させる他の技術を実施すべきである；又は芽球細胞が、入ってくる白血球アフェレーシスの２０％未満である場合、白血球アフェレーシス材料は洗浄され、プロセスは単球の含有量に基づいて決定される。
【０３６７】
ＣＡＲを発現するのに適した免疫エフェクター細胞を濃縮した後、一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、例えば「免疫エフェクター細胞の活性化及び増殖」と題された項に記載されているように、当技術分野で公知の又は本明細書に記載の方法のいずれかを使用して、例えば増殖するように刺激される。
【０３６８】
ＣＡＲを発現するのに適した免疫エフェクター細胞を濃縮した後、及び任意選択により、本明細書に記載されるような刺激及び／又は増殖後、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を免疫エフェクター細胞に導入することができる。核酸（例えば、ＣＡＲをコードするもの）を導入する方法は、当技術分野で周知であり、例えば「ＣＡＲをコードする核酸構築物」、「ＲＮＡトランスフェクション」及び「非ウイルス性送達方法」と題された項に記載されているように、本明細書に記載される。
【０３６９】
免疫エフェクター細胞の供給源
この項では、所望の免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを取得し、所望の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を分離及びプロセシングし、望ましくない物質、例えば望ましくない細胞を除去するための追加の方法又は工程を提供する。この項に記載する追加の方法又は工程は、水簸、密度勾配遠心分離、流動条件下での選択又は先の項に記載した改善された洗浄工程のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【０３７０】
細胞の供給源、例えば、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、対象から得ることができる。対象の例は、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びそれらのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。
【０３７１】
本開示の特定の態様において、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、当業者に公知の任意の数の技術及び本明細書に開示される方法のいずれかを使用して、それらの工程の任意の組み合わせで、対象から回収した血液の単位から得ることができる。一態様において、個体の循環血液からの細胞をアフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は、典型的にはＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含む、リンパ球、赤血球及び血小板を含む。一態様において、アフェレーシスにより回収した細胞は血漿画分を除去するために洗浄し、任意選択により細胞を続くプロセシング工程のために適切な緩衝液又は媒体に入れる。一実施形態において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るか、又は全てではないとしても多くの二価カチオンを欠き得る。別の実施形態において、細胞は、本明細書に記載の改善された洗浄工程を使用して洗浄される。
【０３７２】
カルシウム非存在下の初期活性化工程は、活性化の増強に至り得る。当業者には容易に認識されるように、洗浄工程は、製造業者の指示に従う、半自動化「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）により達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ又は他の緩衝剤を含む又は含まない食塩水溶液など、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。代わりに、アフェレーシスサンプルの望ましくない要素を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
【０３７３】
一態様において、所望の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離又は向流遠心水簸により単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。
【０３７４】
本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の、例えば、陰性選択技術を使用する、例えば、Ｔ制御性細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞の特異的亜集団、例えば、Ｔ細胞の選択を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
【０３７５】
一実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド、例えば、ＩＬ−２を使用して集団から除去する。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンドを、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートするか又は他に基質、例えば、ビーズ上に被覆させる。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメントを、本明細書に記載されるような基質にコンジュゲートさせる。
【０３７６】
一実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）からのＣＤ２５枯渇剤を使用して集団から除去する。一実施形態において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤の比は１ｅ７細胞対２０μＬ又は１ｅ７細胞対１５μＬ又は１ｅ７細胞対１０μＬ又は１ｅ７細胞対５μＬ又は１ｅ７細胞対２．５μＬ又は１ｅ７細胞対１．２５μＬである。一実施形態において、例えば、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇のために、５億細胞／ｍｌを使用する。更なる態様において、６億、７億、８億又は９億細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。
【０３７７】
一実施形態において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。他の態様において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９〜１×１０１０（及びその間の任意の整数値）ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。一実施形態において、得られたＴ制御性枯渇細胞集団は、２×１０９Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞又はそれ未満（例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７又はそれ未満のＣＤ２５＋細胞）を含む。
【０３７８】
一実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞を、例えば、チュービング１６２−０１など、枯渇チュービングセットと共にＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して集団から除去する。一実施形態において、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系を、例えば、ＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２．１などの枯渇設定において動かす。
【０３７９】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、アフェレーシス前又はＣＡＲ発現細胞産物の製造中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少（例えば、望まない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数の減少）は、対象の再発リスクを有意に減少させる。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇する方法は当分野で知られる。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体（抗ＧＩＴＲ本明細書に記載の抗体）、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害剤及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０３８０】
いくつかの実施形態において、製造法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴＲＥＧ細胞の数の減少（例えば、枯渇）を含む。例えば、製造法は、例えば、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルと抗ＧＩＴＲ抗体及び／又は抗ＣＤ２５抗体（又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド）を接触させ、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。
【０３８１】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、アフェレーシス前又はＣＡＲ発現細胞産物の製造中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少（例えば、望まない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数の減少）は、対象の再発リスクを減らし得る。一実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞採取前にＴＲＥＧ細胞を減らす１つ以上の治療で前処置されており、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再び必要とするリスクを軽減する。一実施形態において、ＴＲＥＧ細胞を低減する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇又はこれらの組み合わせの１つ以上の投与を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、ＴＲＥＧ細胞を低減する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害剤又はこれらの組み合わせの１つ以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇又はこれらの組み合わせの１つ以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物注入前、注入中又は注入後に行い得る。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害剤又はこれらの組み合わせの１つ以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物注入前、注入中又は注入後に行い得る。
【０３８２】
いくつかの実施形態において、製造法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴＲＥＧ細胞の数の減少（例えば、枯渇）を含む。例えば、製造法は、例えば、サンプル、例えば、アフェレーシスサンプルと抗ＧＩＴＲ抗体及び／又は抗ＣＤ２５抗体（又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド）を接触させ、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。
【０３８３】
一実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置（例えば、ＣＴＬ０１９処置）を再発するリスクを軽減する。一実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）産物製造のための細胞の採取前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。
【０３８４】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）製造プロセスは、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物（例えば、ＣＴＬ０１９産物）の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させるように改変される。一実施形態において、ＣＤ２５枯渇を使用して、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物（例えば、ＣＴＬ０１９産物）の製造前に、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる。
【０３８５】
一実施形態において、除去すべき細胞の集団は、制御性Ｔ細胞又は腫瘍細胞ではなく、ＣＡＲＴ細胞の増殖及び／又は機能に他に負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５又は潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。一実施形態において、このような細胞は、制御性Ｔ細胞及び／又は腫瘍細胞と同時に又は前記枯渇後に又は別の順番で除去することが意図される。
【０３８６】
本明細書に記載の方法は、２つ以上の選択工程、例えば２つ以上の枯渇工程を含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、例えば、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。一つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫粘着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含み得る。
【０３８７】
本明細書に記載の方法は、更に腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４又はＣＤ１１ｂを発現する細胞の集団からの除去を含み、それによりＣＡＲ、例えば、本明細書に記載のＣＡＲの発現に適するＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇及び腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供する。一実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗腫瘍抗原抗体又はそのフラグメントを同じ基質、例えば、ビーズに結合でき、これを、細胞の除去に使用でき又は抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗腫瘍抗原抗体又はそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去及び腫瘍抗原発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番でも生じ得る。
【０３８８】
チェックポイント阻害剤、例えば、本明細書に記載のチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞及びＴＩＭ３＋細胞の１つ以上の集団からの除去を含み、それによりＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞及びチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋及び／又はＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦ（例えば、ＴＧＦβ）、例えば本明細書に記載されるようなものを含む。一実施形態において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はそのフラグメントを同じビーズに結合でき、それを細胞の除去に使用でき又は抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去及びチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順序の順番でも生じ得る。
【０３８９】
本明細書に記載の方法は、陽性選択工程を含み得る。例えば、Ｔ細胞を、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３ｘ２８）コンジュゲートビーズとインキュベーションすることにより単離することができる。一実施形態において、時間は、約３０分である。更なる実施形態において、時間は、３０分〜３６時間又はそれより長い範囲及びその間の任意の整数値である。更なる実施形態において、時間は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間又は６時間である。更に別の実施形態において、時間は、１０〜２４時間、例えば、２４時間である。腫瘍組織又は免疫不全状態個体から腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を単離するような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況において、Ｔ細胞を単離するために長いインキュベーション時間が使用され得る。更に、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕獲効率を高め得る。そのため、単にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと結合させる時間を短くする又は長くする及び／又はビーズ対Ｔ細胞比を増加又は減少させる（更に本明細書に記載の通り）ことにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時又は工程中の他の時点で優先的に選択される。更に、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体比を増加又は減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時又は工程中の他の所望の時点で優先的に選択される。
【０３９０】
一実施形態において、Ｔ細胞ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ及びパーフォリン又は他の適切な分子、例えば、他のサイトカインの１つ以上を発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、国際公開第２０１３／１２６７１２号パンフレットに記載する方法により決定できる。
【０３９１】
陽性又は陰性選択により所望の細胞の集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は変わり得る。特定の態様において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞を一緒に混合する体積を有意に低下させる（例えば、細胞濃度を増加させる）ことが望まれ得る。例えば、一態様において、１００億細胞／ｍｌ、９０億／ｍｌ、８０億／ｍｌ、７０億／ｍｌ、６０億／ｍｌ又は５０億／ｍｌの濃度が使用される。一態様において、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。更なる態様において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの濃度が使用される。更なる態様において、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用できる。
【０３９２】
高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加できる。更に、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞の又は多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（例えば、白血病性血液、腫瘍組織など）からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有しており、取得することが望ましい。例えば、高濃度細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０３９３】
関連する態様において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を有意に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量で発現する細胞で選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕獲される。一態様において、使用する細胞の濃度は５×１０６／ｍｌである。他の態様において、使用する濃度は約１×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌ及びその間の任意の整数値であり得る。
【０３９４】
他の態様において、細胞を、種々の長さの時間、種々の速度で、２〜１０℃又は室温で、ローテータでインキュベートし得る。
【０３９５】
一実施形態において、集団の複数の免疫エフェクター細胞は、ジアグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）を発現せず、例えば、ＤＧＫ欠損性である。一実施形態において、集団の複数の免疫エフェクター細胞は、Ｉｋａｒｏｓを発現せず、例えば、Ｉｋａｒｏｓ欠損性である。一実施形態において、集団の複数の免疫エフェクター細胞は、ＤＧＫ及びＩｋａｒｏｓを発現せず、例えば、ＤＧＫ及びＩｋａｒｏｓ両方の欠損性である。
【０３９６】
刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄工程後に凍結させ得る。理論に縛られることを望まないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団から顆粒球及びある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液及びパラメーターが当分野で知られ、これに関連して有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ又は１０％Ｄｅｘｔｒａｎ  ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ又は３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ  ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯを含む培養培地又は例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１°／分の速度で−８０℃に凍結し、気相の液体窒素貯蔵タンクに保存する。制御凍結の他の方法並びに直ちに−２０℃又は液体窒素の非制御凍結も使用できる。
【０３９７】
特定の態様において、凍結保存細胞を本明細書に記載されるように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化前に室温で１時間休息させる。
【０３９８】
本発明に関連して、本明細書に記載されるような増殖細胞が必要となり得る時点前の期間における、対象からの血液サンプル又はアフェレーシス産物の採取も企図されている。したがって、増殖する細胞の供給源は、必要な任意の時点で採取でき、Ｔ細胞などの所望の細胞は、本明細書に記載のものなど、免疫エフェクター細胞治療からの利益があるであろう任意の数の疾患及び状態について、免疫エフェクター細胞治療におけるその後の使用のために単離及び凍結され得る。一態様において、血液サンプル又はアフェレーシスを、一般に健常対象から採取する。一態様において、血液サンプル又はアフェレーシスを、一般に、疾患を発症するリスクにあるが、まだ疾患を発症していない健常対象から採取し、目的の細胞をその後の使用のために単離及び凍結する。特定の態様において、Ｔ細胞は、増殖され、凍結され、後に使用され得る。特定の態様において、サンプルを、本明細書に記載されるような特定の疾患の診断の直後に、しかし、何らかの処置前に患者から採取する。更なる態様において、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８及び照射などの抗体又は他の免疫除去剤による処置を含むが、これらに限定されない、任意の数の関連する処置モダリティー前に対象からの血液サンプル又はアフェレーシスから細胞を単離する。
【０３９９】
本発明の更なる態様において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後、患者から直接得る。この点について、ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置の直後、患者が通常その処置から回復するまでの間、得られるＴ細胞の品質がエクスビボで増殖する能力について最適である又は改善されていることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着及びインビボ増殖増強について好ましい状態であり得る。そのため、本発明に関連して、Ｔ細胞、樹状細胞又は造血細胞系統の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが企図される。更に、特定の態様において、可動化（例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動化）及びコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生及び／又は増殖に好都合である条件を、特に、治療後の定められた時間枠中に、対象に形成できる。細胞型の例には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及び免疫系の他の細胞を含む。
【０４００】
一実施形態において、免疫エフェクターＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば、本明細書に記載のＣＡＲ分子は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得る。一実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作される免疫エフェクター細胞の集団、例えば、Ｔ細胞を、対象又は対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベル又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が少なくとも一過性に増加するように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投薬から十分な時間後又は十分な用量後に採取する。
【０４０１】
他の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作されている又は操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増やす又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増やす量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理できる。
【０４０２】
本出願の方法は、５％以下、例えば２％の、ヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、既知培養培地条件及び組成物、例えばＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ＣＴＳ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ”Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１５）４，ｅ３１；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．３１に記載のものを用いることができることは認識される。
【０４０３】
一実施形態において、適用方法は、無血清培地を含む培地条件を利用することができる。一実施形態において、無血清培地は、ＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ  ＸＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣｅｌｌＧｒｏ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、ＴｅｘＭａｃｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）、Ｘｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ）、ＰｒｉｍｅＸＶ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＳｔｅｍＸＶｉｖｏ（ＲａｎｄＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）である。無血清培地には、ＬｉｆｅＴｅｃｈのＩＣＳＲ（免疫細胞血清代替品）などの血清代替物を添加できる。血清代替物（例えば、ＩＣＳＲ）のレベルは、例えば最大５％、例えば、約１％、２％、３％、４％又は５％であり得る。
【０４０４】
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ  ＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか又はＤＧＫ活性が低下した又は阻害された細胞である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ発現を低減又は阻止するための遺伝的方法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により生成できる。代わりに、ＤＧＫ欠損細胞は、本明細書に記載のＤＧＫ阻害剤での処置により生成できる。
【０４０５】
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか又はイカロス活性が低下した又は阻害された細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減又は阻止するための遺伝的方法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により生成できる。代わりに、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えば、レナリドマイドでの処置により生成できる。
【０４０６】
実施形態において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損及びイカロス欠損であり、例えば、ＤＧＫ及びイカロスを発現せず又はＤＧＫ及びイカロス活性が低下又は阻害されている。このようなＤＧＫ及びイカロス欠損細胞は、本明細書に記載の方法のいずれかにより生成できる。
【０４０７】
一実施形態において、ＮＫ細胞を対象から得る。別の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
【０４０８】
同種ＣＡＲ発現細胞
本明細書に記載の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば、機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えば、ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩの発現を欠く同種Ｔ細胞である。
【０４０９】
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に何ら機能的ＴＣＲを発現しないように操作され、機能的ＴＣＲを含む１つ以上のサブユニットを発現しないように操作され（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＴＣＲイプシロン及び／又はＴＣＲζの発現がない（又は発現の減少を示す）ように操作される）又はその表面に微少の機能的ＴＣＲを産生するように操作され得る。代わりに、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１つ以上の変異した又は切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現する。用語「実質的に障害されたＴＣＲ」は、このＴＣＲが、宿主で有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。
【０４１０】
本明細書に記載のＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作され得る。例えば、本明細書に記載のＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラス１及び／又はＨＬＡクラスＩＩが下方制御されるように操作され得る。いくつかの実施形態において、ＨＬＡの下方制御は、β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現の減少又は排除を伴い得る。
【０４１１】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲ及び機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩを欠き得る。
【０４１２】
機能的ＴＣＲ及び／又はＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲ又はＨＬＡの１つ以上のサブユニットのノックアウト又はノックダウンを含む、任意の適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡのノックダウンを含み得る。
【０４１３】
いくつかの実施形態において、同種細胞は、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにより、阻害性分子を発現しない又は低レベルで発現する細胞であり得る。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下できる、阻害分子を発現しない又は阻害分子を低レベルで発現する細胞であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦ（例えば、ＴＧＦβ）を含む。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質レベルでの阻害による、阻害分子の阻害はＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。実施形態において、例えば、本明細書に記載されるような、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用できる。
【０４１４】
ＴＣＲ又はＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ発現及び／又はＨＬＡ発現を、細胞、例えば、Ｔ細胞における、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ及び／又は本明細書に記載の阻害分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦβ）をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用して、阻害できる。
【０４１５】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの発現系及び例示的なｓｈＲＮＡは、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６４９及び６５０に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１６】
ＴＣＲ又はＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
本明細書で使用する「ＣＲＩＳＰＲ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ」は、一連の群生性等間隔短回文反復配列又はこのような一連の反復を含む系を指す。本明細書で使用する「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系は、細胞、例えば、Ｔ細胞における、ＴＣＲ及び／又はＨＬ遺伝子及び／又は本明細書に記載の阻害分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦβ）の発現抑制又は変異に使用できる、ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓ由来の系を指す。
【０４１７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びその使用は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６５１〜６５８に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１８】
ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ」又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ」は、細胞、例えば、Ｔ細胞における、ＨＬＡ及び／又はＴＣＲ遺伝子及び／又は本明細書に記載の阻害分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦβ）の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼを指す。
【０４１９】
ＴＡＬＥＮ及びその使用は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６５９〜６６５に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４２０】
ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
「ＺＦＮ」又は「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲに対するＺＦＮ」又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ」は、細胞、例えば、Ｔ細胞における、ＨＬＡ及び／又はＴＣＲ遺伝子及び／又は本明細書に記載の阻害分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦβ）の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを指す。
【０４２１】
ＺＦＮ及びその使用は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６６６〜６７１に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４２２】
テロメラーゼ発現
テロメアは、体細胞の持続に重要な役割を果たし、その長さはテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）によって維持される。ＣＬＬ細胞のテロメア長は非常に短い可能性があり（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｓｈｏｒｔｅｒ  ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ  ｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＺＡＰ−７０＋／ＣＤ３８  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ”Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１４３，３８３−３８６．，２００８年８月２８日）、製造されたＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ１９細胞では、更に短くなる可能性があり、患者への養子移入後にそれが増殖する可能性を制限する。テロメラーゼの発現は、ＣＡＲ発現細胞を複製疲弊から救済することができる。
【０４２３】
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、いくつかの実施形態において、治療的Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短縮されたテロメアのために、患者における残留性が短く、したがって、テロメラーゼ遺伝子を用いるトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の残留性を改善し得る。Ｃａｒｌ  Ｊｕｎｅ，“Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１７：１４６６−１４７６（２００７）を参照されたい。そのため、一実施形態において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、異所性にテロメラーゼサブユニットを、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴ発現する。いくつかの態様において、本開示は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法を提供する。細胞を、ＣＡＲをコードする構築物と接触させる前に、同時に又は後に核酸と接触させ得る。
【０４２４】
テロメラーゼの発現は安定しているか（例えば、核酸が細胞のゲノムに組み込まれ得る）、又は一過性である（例えば、核酸が組み込まれず、一定の時間、例えば数日後に発現が低下する）可能性がある。安定した発現は、テロメラーゼサブユニット及び選択可能なマーカーをコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクト又は形質導入し、安定な組み込み体を選択することによって達成され得る。代替的に又は組み合わせて、安定した発現は、例えばＣｒｅ／Ｌｏｘ又はＦＬＰ／ＦＲＴシステムを使用した、部位特異的組換えによって達成され得る。
【０４２５】
一過性の発現は、核酸、例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡなどのＲＮＡによるトランスフェクション又は形質導入を含み得る。いくつかの実施形態において、一過性のｍＲＮＡトランスフェクションは、ＴＥＲＴによる安定したトランスフェクションに関連する場合のある遺伝的不安定性を回避する。外因性テロメラーゼ活性の一過性発現は、例えば、国際公開第２０１４／１３０９０９号パンフレットに記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態において、テロメラーゼサブユニットのｍＲＮＡベースのトランスフェクションは、Ｍｏｄｅｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって商品化されたメッセンジャーＲＮＡ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（商標）プラットフォームに従って実施される。例えば、方法は、米国特許第８７１０２００号、同第８８２２６６３号、同第８６８００６９号、同第８７５４０６２号、同第８６６４１９４号又は同第８６８００６９号明細書に記載の方法であり得る。
【０４２６】
一実施形態において、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ＡＡＣ５１７２４．１のアミノ酸配列を有する（Ｍｅｙｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ｈＥＳＴ２，ｔｈｅ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｇｅｎｅ，Ｉｓ  Ｕｐ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ”Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ９０，Ｉｓｓｕｅ  ４，２２  Ａｕｇｕｓｔ  １９９７，Ｐａｇｅｓ  ７８５−７９５）。
【化１】
2021500894.tif 000004
【０４２７】
一実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１０８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列を有する。一実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１０８の配列を有する。一実施形態において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端又は両方に欠失（例えば、５、１０、１５、２０又は３０アミノ酸を超えない）を含む。一実施形態において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端又は両方にトランスジェニックアミノ酸配列（例えば、５、１０、１５、２０又は３０アミノ酸を超えない）を含む。
【０４２８】
一実施形態において、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０１８１６７の核酸配列によりコードされる（Ｍｅｙｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ｈＥＳＴ２，ｔｈｅ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｇｅｎｅ，Ｉｓ  Ｕｐ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ”Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ９０，Ｉｓｓｕｅ  ４，２２  Ａｕｇｕｓｔ  １９９７，Ｐａｇｅｓ  ７８５−７９５）。
【化２】
2021500894.tif 000005
【化３】
2021500894.tif 000006
【０４２９】
一実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を有する核酸によりコードされる。一実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２３の核酸によりコードされる。
【０４３０】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、免疫エフェクター細胞を、癌に指向させる、１つ以上のＣＡＲを含有するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を提供する。これは、癌関連抗原に対して特異的であるＣＡＲ上の抗原結合ドメインを通して達成される。本明細書に記載のＣＡＲにより標的化され得る２つのクラスの癌関連抗原（腫瘍抗原）が存在する：（１）癌細胞の表面に発現される癌関連抗原；及び（２）それ自体は細胞内であるが、そのような抗原（ペプチド）のフラグメントがＭＨＣ（主要組織適合複合体）により癌細胞の表面に提示される、癌関連抗原。
【０４３１】
したがって、免疫エフェクター細胞（例えば、本明細書に記載の方法によって得られるもの）は、以下の癌関連抗原（腫瘍抗原）の１つを標的とするＣＡＲを含有するように操作することができる：ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−β、ＰＲＳＳ２１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ及びｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２。
【０４３２】
二特異性ＣＡＲ
一実施形態において、多特異性抗体分子は二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、２以下の抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列及び第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。一実施形態において、第１及び第２のエピトープは同じ抗原、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）である。一実施形態において、第１及び第２のエピトープは重複する。一実施形態において、第１及び第２のエピトープは重複しない。一実施形態において、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）にある。一実施形態において、二特異性抗体分子は、第１のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列並びに第２のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、二特異性抗体分子は、第１のエピトープに結合特異性を有する半抗体及び第２のエピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。一実施形態において、二特異性抗体分子は、第１のエピトープに結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメント及び第２のエピトープに結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメントを含む。一実施形態において、二特異性抗体分子は、第１のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメント及び第２のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントを含む。
【０４３３】
特定の実施形態において、抗体分子は、多特異性（例えば、二特異性又は三特異性）抗体分子である。二重特異性又はヘテロ二量体性抗体分子を産生するためのプロトコル及び二重特異性抗体分子の様々な構成は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落４５５〜４５８に記載されており、その全体が参照により組み込まれる。
【０４３４】
一態様において、二特異性抗体分子は、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えば、ｓｃＦｖにより特徴付けられ、これは、ＣＤ１９に結合特異性を有し、例えば、本明細書に記載されるようなｓｃＦｖを含むか、又は本明細書に記載のｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲ及び／又は重鎖ＣＤＲ及び第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を異なる抗原に含む。
【０４３５】
キメラＴＣＲ
一態様において、本発明の抗原及び抗原フラグメント（例えば、ＣＤ１９抗体及びフラグメント）を、キメラＴＣＲを作るために、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）鎖の１つ以上の定常ドメイン、例えば、ＴＣＲα又はＴＣＲβ鎖に移植できる。理論に縛られないが、キメラＴＣＲは、抗原結合によりＴＣＲ複合体を経てシグナル伝達すると考えられる。例えば、本明細書に記載するようなｓｃＦｖを、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖の定常ドメイン、例えば、少なくとも細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの部分に移植できる。別の例として、抗体フラグメント、例えば本明細書に記載されるようなＶＬドメインを、ＴＣＲα鎖の定常ドメインに移植でき、抗体フラグメント、例えば本明細書に記載されるようなＶＨドメインを、ＴＣＲβ鎖の定常ドメインに移植できる（又は代わりにＶＬドメインをＴＣＲβ鎖の定常ドメインに移植し得、ＶＨドメインを、ＴＣＲα鎖に移植し得る）。別の例として、抗体又は抗体フラグメントのＣＤＲは、キメラＴＣＲを作るために、ＴＣＲα鎖及び／又はβ鎖に移植され得る。例えば、本明細書に記載のＬＣＤＲをＴＣＲα鎖の可変ドメインに移植し得、本明細書に記載のＨＣＤＲをＴＣＲβ鎖の可変ドメインに移植し得るか又はその逆も可能である。このようなキメラＴＣＲは、例えば、当技術分野で公知の方法により産生し得る（例えば、Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０００；７：１３６９−１３７７；Ｚｈａｎｇ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００４；１１：４８７−４９６；Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ａｐｒ；１９（４）：３６５−７４）。
【０４３６】
非抗体足場
実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小モジュラー免疫医薬品、マキシボディ、プロテインＡ又はアフィリンを含む。非抗体足場は、細胞上の標的抗原に結合する能力を有する。実施形態において、抗原結合ドメインは、細胞上で発現される天然に存在するタンパク質のポリペプチド又はそのフラグメントである。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場を含む。得られるポリペプチドが標的細胞上の標的抗原に特異的に結合する少なくとも１つの結合領域を含む限り、多様な非抗体足場を使用することができる。
【０４３７】
非抗体足場は、フィブロネクチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ及びＡｂｌｙｎｘ  ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、ベルギー）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、ドイツ）、小モジュラー免疫医薬品（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ、スウェーデン）及びアフィリン（γクリスタリン又はユビキチン）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、ドイツ）を含む。
【０４３８】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、標的細胞の表面上の対リガンドに結合する分子の細胞外ドメイン又はその対リガンド結合フラグメントを含む。
【０４３９】
免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする配列を含む組換えＤＮＡ構築物を含むことができ、ＣＡＲは、腫瘍抗原、例えば本明細書に記載の腫瘍抗原及び細胞内シグナル伝達ドメインに特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体フラグメント、ＴＣＲ又はＴＣＲフラグメント）を含む。細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ζ鎖を含み得る。他の箇所に記載されるように、本明細書に記載される方法は、細胞（例えば、Ｔ制御性枯渇細胞の集団からのもの）を、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸で形質導入することを含み得る。
【０４４０】
具体的な態様において、ＣＡＲはｓｃＦｖドメインを含み、ｓｃＦｖの前には、配列番号１に提供されるような任意選択のリーダー配列があり得、後ろには、配列番号２又は配列番号３６又は配列番号３８に提供されるような任意選択のヒンジ配列、配列番号６に提供されるような膜貫通領域、配列番号７又は配列番号１６を含む細胞内シグナル伝達ドメイン及び配列番号９又は配列番号１０を含むＣＤ３ζ配列があり得、例えば、これらのドメインは、連続しており、同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。
【０４４１】
一態様において、例示的ＣＡＲ構築物は、任意選択のリーダー配列（例えば、本明細書に記載されるリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載される抗原結合ドメイン）、ヒンジ（例えば、本明細書に記載されるヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載される膜貫通ドメイン）及び細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載される細胞内刺激ドメイン）を含む。一態様において、例示的ＣＡＲ構築物は、任意選択のリーダー配列（例えば、本明細書に記載されるリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載される抗原結合ドメイン）、ヒンジ（例えば、本明細書に記載されるヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載される膜貫通ドメイン）、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載される共刺激シグナル伝達ドメイン）及び／又は細胞内一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載される一次シグナル伝達ドメイン）を含む。
【０４４２】
例示的なリーダー配列は、配列番号１として提供される。ヒンジ／スペーサー配列の例は、配列番号２又は配列番号３６又は配列番号３８として提供される。例示的な膜貫通ドメイン配列は、配列番号６として提供される。例示的な４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの配列は、配列番号７として提供される。例示的なＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの配列の例は、配列番号１６として提供される。例示的なＣＤ３ζドメイン配列は、配列番号９又は配列番号１０として提供される。
【０４４３】
一態様において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸構築物を含み、核酸分子は、抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、この配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に連続しており、それと同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲに使用し得る例示的細胞内シグナル伝達ドメインには、限定されないが、例えばＣＤ３−ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。一部の例では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含み得る。
【０４４４】
所望の分子をコードする核酸配列は、標準的な技法を用いて、例えば核酸分子を発現する細胞からのライブラリをスクリーニングすることによるか、それを含むことが知られるベクターから核酸分子を誘導することによるか、又はそれを含む細胞及び組織から直接単離することによるなど、当技術分野において公知の組換え方法を用いて得ることができる。代わりに、目的の核酸はクローニングでなく、むしろ合成的に作製することができる。
【０４４５】
ＣＡＲをコードする核酸は、例えばレトロウイルス又はレンチウイルスベクター構築物を使用して、免疫エフェクター細胞に導入することができる。
【０４４６】
ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、細胞に直接トランスフェクトされ得るＲＮＡ構築物を使用しても免疫エフェクター細胞に導入され得る。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡの作成方法には、特別に設計したプライマーによるテンプレートのインビトロ転写（ＩＶＴ）と、続くポリＡ付加が含まれ、それにより、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）（例えば、本明細書に記載の３’及び／又は５’ＵＴＲ）、５’キャップ（例えば、本明細書に記載の５’キャップ）及び／又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、本明細書に記載のＩＲＥＳ）、発現させようとする核酸及びポリＡテールを含む構築物、典型的には５０〜２０００塩基長（例えば、実施例に記載されるもの、例えば、配列番号３５）が産生される。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞において効率的にトランスフェクトされ得る。一実施形態において、テンプレートは、ＣＡＲの配列を含む。一実施形態において、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターは、電気穿孔によって細胞、例えばＴ細胞に、形質導入される。
【０４４７】
抗原結合ドメイン
一態様において、複数の免疫エフェクター細胞、例えばＴ制御性枯渇細胞の集団は、抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合要素を含むＣＡＲをコードする核酸を含む。結合要素の選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドのタイプ及び数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、本明細書に記載のＣＡＲにおいて抗原結合ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌及び寄生虫感染、自己免疫疾患並びに癌細胞に関連するものが含まれる。
【０４４８】
一態様において、抗原結合ドメインを含むＣＡＲの一部分は、腫瘍抗原、例えば本明細書に記載される腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。
【０４４９】
抗原結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びその機能性フラグメント、例えば、限定されないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ科動物由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）などのシングルドメイン抗体及び組換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はそのフラグメント、例えば、単鎖ＴＣＲなど、抗原結合ドメインとして機能することが当技術分野において公知の代替的足場を含め、抗原に結合する任意のドメインであり得る。一部の例において、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが最終的に使用されることになる同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトでの使用には、ＣＡＲの抗原結合ドメインが抗体又は抗体フラグメントの抗原結合ドメインにヒト又はヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【０４５０】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９抗体又はそのフラグメント、例えばｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合ドメインは、表１に列挙されている可変重鎖及び可変軽鎖を含む。可変重鎖及び可変軽鎖を連結するリンカー配列は、例えば、本明細書中に記載される任意のリンカー配列であり得るか、又はＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１０４）であり得る。
【０４５１】
【表３】
2021500894.tif 000007
【０４５２】
【表４】
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【０４５３】
【表５】
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【０４５４】
【表６】
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【０４５５】
【表７】
2021500894.tif 000011
【０４５６】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、表１に列挙する重鎖結合ドメインアミノ酸配列のいずれかのＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、更にＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３を含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、表１に列挙する軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のいずれかのＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３を含む。
【０４５７】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、表１に記載する軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のいずれかのＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３の１、２又は全て及び表１に記載する重鎖結合ドメインアミノ酸配列のいずれかのＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３の１、２又は全てを含む。
【０４５８】
任意のＣＤ１９  ＣＡＲ、例えば、任意の公知のＣＤ１９  ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合ドメインは、本開示に従って使用することができる。例えば、ＬＧ−７４０；米国特許第８，３９９，６４５号明細書に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ；米国特許第７，４４６，１９０号明細書；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２０１３  ５４（２）：２５５−２６０（２０１２）；Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２２（１７）：２９６５−２９７３（２０１３）；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８（１８）：４８１７−４８２８（２０１１）；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１６（２０）：４０９９−１０２（２０１０）；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２２（２５）：４１２９−３９（２０１３）；及び１６ｔｈ  Ａｎｎｕ  Ｍｅｅｔ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｇｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒ（ＡＳＧＣＴ）（Ｍａｙ  １５−１８，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ）２０１３，Ａｂｓｔ  １０。
【０４５９】
ＣＡＲ発現細胞を使用して標的とすることができる例示的な標的抗原には、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレット、国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレット及び国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載されるように、とりわけ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソテリンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０４６０】
一実施形態において、ＣＤ１９に特異的に結合するＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＵＳＡＮ名ＴＩＳＡＧＥＮＬＥＣＬＥＵＣＥＬ−Ｔを有する。ＣＴＬ０１９は、Ｔ細胞の遺伝子改変によって作製され、この改変は、ＥＦ−１αプロモーターの制御下のＣＴＬ０１９導入遺伝子を含有する自己不活性化、複製欠損レンチウイルス（ＬＶ）ベクターでの形質導入による安定的挿入によって媒介される。ＣＴＬ０１９は、パーセント導入遺伝子陽性Ｔ細胞に基づいて対象に送達される導入遺伝子陽性Ｔ細胞と導入遺伝子陰性Ｔ細胞の混合物であり得る。
【０４６１】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ヒトＣＤ１９に特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットの表３に記載のＣＡＲ分子又は抗原結合ドメイン（例えば、ヒト化抗原結合ドメイン）を含み得る。
【０４６２】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３に特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレットの表１〜２に記載のＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲ１〜ＣＡＲ８のいずれか）又は抗原結合ドメインを含み得る。
【０４６３】
ある実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のＣＤ１２３  ＣＡＲ、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＣＤ１２３  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＣＤ１２３  ＣＡＲは、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。
【０４６４】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットの表２又は配列番号１１に記載のＣＡＲ分子又は抗原結合ドメインを含み得る。
【０４６５】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載されるＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ分子、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５Ａ１号パンフレットに記載されるＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５Ａ１に示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。
【０４６６】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、メソテリンに特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットの表２〜３に記載のＣＡＲ分子又は抗原結合ドメインを含み得る。
【０４６７】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のメソテリンＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載されるメソテリンＣＡＲを含む。実施形態において、メソテリンＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。
【０４６８】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のＢＣＭＡ  ＣＡＲ分子、例えば、米国特許出願公開第２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書に記載されるＢＣＭＡ  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書に示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。
【０４６９】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のＣＬＬ１  ＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書に記載されるＣＬＬ１  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＣＬＬ１  ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書に示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。
【０４７０】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のＣＤ３３  ＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書に記載されるＣＤ３３  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＣＤ３３  ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書に示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。
【０４７１】
本明細書に記載の任意の方法又は組成物に従って、ある実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のＣＤ１２３  ＣＡＲ、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＣＤ１２３  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＣＤ１２３  ＣＡＲは、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。他の実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ分子、例えば、米国特許出願公開第２０１５−０２８３１７８−Ａ１号明細書に記載されるＣＤ１９  ＣＡＲ分子、例えば、ＣＴＬ０１９を含む。実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５−０２８３１７８−Ａ１号明細書に示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のＢＣＭＡ  ＣＡＲ分子、例えば、米国特許出願公開第２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書に記載されるＢＣＭＡ  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書に示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のＣＬＬ１  ＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書に記載されるＣＬＬ１  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＣＬＬ１  ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書に示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のＣＤ３３  ＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書に記載されるＣＤ３３  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＣＤ３３  ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書に示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載されるＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ分子、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５Ａ１号パンフレットに記載されるＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５Ａ１に示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のメソテリンＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載されるメソテリンＣＡＲを含む。実施形態において、メソテリンＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに示される、アミノ酸を含むか、又はヌクレオチド配列を有する。
【０４７２】
例示的なＣＤ１９  ＣＡＲは、例えば、本明細書、例えば本明細書の１つ以上の表に記載されるＣＤ１９  ＣＡＲ又はＸｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２３．２４（２０１４）：３７５０−９；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２２．２５（２０１３）：４１２９−３９，Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２２．１７（２０１３）：２９６５−７３、ＮＣＴ００５８６３９１、ＮＣＴ０１０８７２９４、ＮＣＴ０２４５６３５０、ＮＣＴ００８４０８５３、ＮＣＴ０２６５９９４３、ＮＣＴ０２６５０９９９、ＮＣＴ０２６４０２０９、ＮＣＴ０１７４７４８６、ＮＣＴ０２５４６７３９、ＮＣＴ０２６５６１４７、ＮＣＴ０２７７２１９８、ＮＣＴ００７０９０３３、ＮＣＴ０２０８１９３７、ＮＣＴ００９２４３２６、ＮＣＴ０２７３５０８３、ＮＣＴ０２７９４２４６、ＮＣＴ０２７４６９５２、ＮＣＴ０１５９３６９６、ＮＣＴ０２１３４２６２、ＮＣＴ０１８５３６３１、ＮＣＴ０２４４３８３１、ＮＣＴ０２２７７５２２、ＮＣＴ０２３４８２１６、ＮＣＴ０２６１４０６６、ＮＣＴ０２０３０８３４、ＮＣＴ０２６２４２５８、ＮＣＴ０２６２５４８０、ＮＣＴ０２０３０８４７、ＮＣＴ０２６４４６５５、ＮＣＴ０２３４９６９８、ＮＣＴ０２８１３８３７、ＮＣＴ０２０５０３４７、ＮＣＴ０１６８３２７９、ＮＣＴ０２５２９８１３、ＮＣＴ０２５３７９７７、ＮＣＴ０２７９９５５０、ＮＣＴ０２６７２５０１、ＮＣＴ０２８１９５８３、ＮＣＴ０２０２８４５５、ＮＣＴ０１８４０５６６、ＮＣＴ０１３１８３１７、ＮＣＴ０１８６４８８９、ＮＣＴ０２７０６４０５、ＮＣＴ０１４７５０５８、ＮＣＴ０１４３０３９０、ＮＣＴ０２１４６９２４、ＮＣＴ０２０５１２５７、ＮＣＴ０２４３１９８８、ＮＣＴ０１８１５７４９、ＮＣＴ０２１５３５８０、ＮＣＴ０１８６５６１７、ＮＣＴ０２２０８３６２、ＮＣＴ０２６８５６７０、ＮＣＴ０２５３５３６４、ＮＣＴ０２６３１０４４、ＮＣＴ０２７２８８８２、ＮＣＴ０２７３５２９１、ＮＣＴ０１８６０９３７、ＮＣＴ０２８２２３２６、ＮＣＴ０２７３７０８５、ＮＣＴ０２４６５９８３、ＮＣＴ０２１３２６２４、ＮＣＴ０２７８２３５１、ＮＣＴ０１４９３４５３、ＮＣＴ０２６５２９１０、ＮＣＴ０２２４７６０９、ＮＣＴ０１０２９３６６、ＮＣＴ０１６２６４９５、ＮＣＴ０２７２１４０７、ＮＣＴ０１０４４０６９、ＮＣＴ００４２２３８３、ＮＣＴ０１６８０９９１、ＮＣＴ０２７９４９６１又はＮＣＴ０２４５６２０７に記載される抗ＣＤ１９  ＣＡＲを含み、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４７３】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５−０２８３１７８−Ａ１号明細書、２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５Ａ１号明細書又は国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載の抗体）及び／又は本明細書に記載の抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５−０２８３１７８−Ａ１号明細書、２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５Ａ１号明細書又は国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載の抗体）を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。
【０４７４】
実施形態において、抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５−０２８３１７８−Ａ１号明細書、２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５Ａ１号明細書又は国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載の抗原結合ドメインである。
【０４７５】
実施形態において、抗原結合ドメインはＢＣＭＡを標的とし、米国特許出願公開第２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書に記載されている。
【０４７６】
実施形態において、抗原結合ドメインはＣＤ１９を標的とし、米国特許出願公開第２０１５−０２８３１７８−Ａ１号明細書に記載されている。
【０４７７】
実施形態において、抗原結合ドメインはＣＤ１２３を標的とし、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書に記載されている。
【０４７８】
実施形態において、抗原結合ドメインはＣＬＬ１を標的とし、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書に記載されている。
【０４７９】
実施形態において、抗原結合ドメインはＣＤ３３を標的とし、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書に記載されている。
【０４８０】
ＣＡＲ発現細胞を使用して標的とすることができる例示的な標的抗原には、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット、国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレット、国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレット、国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレット、国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４５３５号パンフレット及び国際公開第２０１６／０２５８８０号パンフレットに記載されるように、とりわけ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ３３、メソテリン、ＢＣＭＡ及びＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０４８１】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ヒト化ＣＤ１９に特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットの表３に記載のＣＡＲ分子又は抗原結合ドメイン（例えば、ヒト化抗原結合ドメイン）を含み得る。ＣＤ１９  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメインをコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列（例えば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ及びＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）は、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットで特定されている。
【０４８２】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３に特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレットの表１〜２に記載のＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲ１〜ＣＡＲ８のいずれか）又は抗原結合ドメインを含み得る。ＣＤ１２３  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメインをコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列（例えば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ及びＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）は、国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレットで特定されている。
【０４８３】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３に特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレットの表２，６，及び９に記載のＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲ１２３−１〜ＣＡＲ１２３−４及びｈｚＣＡＲ１２３−１〜ｈｚＣＡＲ１２３−３２のいずれか）又は抗原結合ドメインを含み得る。ＣＤ１２３  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメインをコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列（例えば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ及びＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）は、国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレットで特定されている。
【０４８４】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットの表２又は配列番号１１に記載のＣＡＲ分子又は抗原結合ドメインを含み得る。ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメインをコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列（例えば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ及びＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）は、国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットで特定されている。
【０４８５】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ３３に特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレットの表２又は９に記載のＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲ３３−１〜ＣＡＲ３３−９のいずれか）又は抗原結合ドメインを含み得る。ＣＤ３３  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメインをコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列（例えば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ及びＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）は、国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレットで特定されている。
【０４８６】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、メソテリンに特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットの表２〜３に記載のＣＡＲ分子又は抗原結合ドメインを含み得る。メソテリンＣＡＲ分子及び抗原結合ドメインをコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列（例えば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ及びＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）は、国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットで特定されている。
【０４８７】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＢＣＭＡに特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレットの表１〜１６、配列番号２７１又は配列番号２７３に記載のＣＡＲ分子又は抗原結合ドメインを含み得る。ＢＣＭＡ  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメインをコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列（例えば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ及びＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）は、国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレットで特定されている。
【０４８８】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＬＬ−１に特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０１４５３５号パンフレットの表２に記載のＣＡＲ分子又は抗原結合ドメインを含み得る。ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメインをコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列（例えば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ及びＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）は、国際公開第２０１６／０１４５３５号パンフレットで特定されている。
【０４８９】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４に特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０２５８８０号パンフレットの表２に記載のＣＡＲ分子又は抗原結合ドメインを含み得る。ＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメインをコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列（例えば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ及びＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）は、国際公開第２０１６／０２５８８０号パンフレットで特定されている。
【０４９０】
一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ分子のいずれか（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ３３、メソテリン、ＢＣＭＡ及びＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４のいずれか）の抗原結合ドメインは、上に列挙した抗原結合ドメインからの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３並びに／又は上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙又は記載した抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。
【０４９１】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３並びに／又は上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙又は記載した抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。
【０４９２】
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日出願の国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットに記載の腫瘍抗原である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、１９Ａ２４とも称される）；Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ−１又はＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ  Ａｇ）又は（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットα２（ＩＬ−１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体α（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テスティシン又はＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ−β）；ステージ特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体α；受容体チロシンタンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロテアーゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異体（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ���ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲγ代替オープンリーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；染色体１２ｐ上に位置するＥＴＳ転座変異体遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫癌精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫癌精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）；生存；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１又はガレクチン８）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫由来アポトーシス阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型プロテーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロムＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ、すなわちＢｒｏｔｈｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｓｉｔｅｓ）；Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘ染色体切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎ユビキタス１（ＲＵ１）；腎ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ  Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ  Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２変異体（ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ又はＣＤ８９）；白血球関連免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー���２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；並びに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）の１つ以上から選択される。
【０４９３】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３並びに／又は上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙又は記載した抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。
【０４９４】
一態様において、抗腫瘍抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一態様において、本明細書に記載されるような抗癌関連抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２又は二機能性（例えば、二特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））である。一態様において、本発明の抗体及びそのフラグメントは、野生型又は増強した親和性で本明細書に記載されるような癌関連抗原に結合する。
【０４９５】
ある例において、ｓｃＦｖｓは、当技術分野で公知の方法により製造できる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。ＳｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域とＶＬ領域を一緒に連結することにより産生できる。ｓｃＦｖ分子は、最適長及び／又はアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカーを用いる場合、（例えば、５〜１０アミノ酸）、鎖内折りたたみは阻止される。鎖内折りたたみは、２可変領域が一体となって機能的エピトープ結合部位を形成させるためにも必要である。リンカー方向及びサイズの例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、同第２００５／０１７５６０６号、同第２００７／００１４７９４号明細書及び国際公開第２００６／０２０２５８号パンフレット及び国際公開第２００７／０２４７１５号パンフレットを参照されたい。
【０４９６】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域との間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれを超えるアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。一実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸グリシン及びセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ここで、ｎは１つ以上の正の整数である）など、一連のグリシン及びセリン反復を含む（配列番号２５）。一実施形態において、リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２７）又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号２８）であり得る。リンカー長の変動は、活性を維持又は増強し、活性試験において優れた有効性を生じ得る。
【０４９７】
別の態様において、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）又はそのフラグメント、例えば単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。そのようなＴＣＲを作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、ｉｌｌｅｍｓｅｎ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１３６９−１３７７（２０００）；Ｚｈａｎｇ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：４８７−４９６（２００４）；Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９（４）：３６５−７４（２０１２）（参考文献はその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。例えば、リンカー（例えば、柔軟なペプチド）によって連結されたＴ細胞クローン由来のＶα及びＶβ遺伝子を含むｓｃＴＣＲを操作することができる。このアプローチは、それ自体が細胞内にある癌関連標的にとって非常に有用であるが、そのような抗原（ペプチド）のフラグメントは、ＭＨＣによって癌細胞の表面に提示される。
【０４９８】
追加の例示的な抗原結合ドメイン
一実施形態において、ＣＤ２２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｈａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２１（７）：１１６５−１１７４（２０１３）；Ｗａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６（６）：１８９４−１９０３（２０１０）；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ  ３７（１）：８３−８８（２０１３）；Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＭａｒｔ（ｃｒｅａｔｉｖｅｂｉｏｍａｒｔ．ｎｅｔ）：ＭＯＭ−１８０４７−Ｓ（Ｐ）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０４９９】
一実施形態において、ＣＳ−１に対する抗原結合ドメインは、エロツズマブ（ＢＭＳ）の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含み、例えば、Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｏｄ  １１２（４）：１３２９−３７；Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｌｏｏｄ．１１０（５）：１６５６−６３を参照されたい。
【０５００】
一実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍｕｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７（４）：１０９８−１１０４（１９８７）；Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５（６）：２６４２−２６４９（１９８５）、Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ５（９）：１４３０−１４４０（１９８７）、Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １６（９）：３０５３−３０６０（１９９８）、．Ｈａｎｄｇｒｅｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３５（３）：１９９−２０４（１９９２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、ｍＡｂ  １４．１８、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４．１８、ｈｕ１４．１８、３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、３Ｇ６、８Ｂ６、６０Ｃ３、１０Ｂ８、ＭＥ３６．１及び８Ｈ９（例えば、国際公開第２０１２０３３８８５号パンフレット、国際公開第２０１３０４０３７１号パンフレット、国際公開第２０１３１９２２９４号パンフレット、国際公開第２０１３０６１２７３号パンフレット、国際公開第２０１３１２３０６１号パンフレット、国際公開第２０１３０７４９１６号パンフレット及び国際公開第２０１３８５５５２号パンフレットを参照されたい）から選択される抗体の抗原結合部分である。いくつかの実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１００１５０９１０号明細書又は国際公開第２０１１１６０１１９号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合部分である。
【０５０１】
一実施形態において、Ｔｎ抗原に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第８，４４０，７９８号明細書、Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７（２２）：１００５６−１００６１（２０１０）及びＳｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（６）：８６３−８７３（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５０２】
一実施形態において、ＰＳＭＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ８９（２）：１３６−１４５（２０１３）、米国特許出願公開第２０１１０２６８６５６号明細書（Ｊ５９１  ＳｃＦｖ）；Ｆｒｉｇｅｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４９（９）：２２２３−２２３２（２０１３）（ｓｃＦｖＤ２Ｂ）；国際公開第２００６１２５４８１号パンフレット（ｍＡｂｓ  ３／Ａ１２、３／Ｅ７及び３／Ｆ１１）に記載されている抗体及び単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ  Ａ５及びＤ７）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５０３】
一実施形態において、ＲＯＲ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９（１２）：３１５３−３１６４（２０１３）；国際公開第２０１１１５９８４７号パンフレット；及び米国特許出願公開第２０１３０１０１６０７号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５０４】
一実施形態において、ＦＬＴ３に対する抗原結合ドメインは、例えば国際公開第２０１１０７６９２２号パンフレット、米国特許第５７７７０８４号明細書、欧州特許第０７５４２３０号明細書、米国特許出願公開第２００９０２９７５２９号明細書及びいくつかの市販カタログ抗体（Ｒ＆Ｄ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍ）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５０５】
一実施形態において、ＴＡＧ７２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｈｏｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１３（４）：１１６３−１１７０（１９９７）に記載されている抗体；及びＡｂｃａｍ  ａｂ６９１の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５０６】
一実施形態において、ＦＡＰに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｏｓｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：４５８４−４５９２（２００８）（ＦＡＰ５）、米国特許出願公開第２００９／０３０４７１８号明細書；シブロツズマブ（例えば、Ｈｏｆｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ２６（１），２００３を参照されたい）；及びＴｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０（６）：１１２５−１１３５（２０１３）に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５０７】
一実施形態において、ＣＤ３８に対する抗原結合ドメインは、ダラツムマブ（例えば、Ｇｒｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１６（２１）：１２６１−１２６２（２０１０）；ＭＯＲ２０２（例えば、米国特許第８，２６３，７４６号明細書を参照されたい）；又は米国特許第８，３６２，２１１号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５０８】
一実施形態において、ＣＤ４４ｖ６に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｃａｓｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２２（２０）：３４６１−３４７２（２０１３）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５０９】
一実施形態において、ＣＥＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４３（４）：１０９５−１１０７（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５１０】
一実施形態において、ＥＰＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、ＭＴ１１０、ＥｐＣＡＭ−ＣＤ３二特異性Ａｂ（例えば、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００６３５５９６を参照されたい）；エドレコロマブ；３６２２Ｗ９４；ＩＮＧ−１；及びアデカツムマブ（ＭＴ２０１）から選択される抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５１１】
一実施形態において、ＰＲＳＳ２１に対する抗原結合ドメインは、米国特許第８，０８０，６５０号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５１２】
一実施形態において、Ｂ７Ｈ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、抗体ＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５１３】
一実施形態において、ＫＩＴに対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７９１５３９１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２８８５０６号明細書に記載されている抗体及びいくつかの市販のカタログ抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５１４】
一実施形態において、ＩＬ−１３Ｒａ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２００８／１４６９１１号パンフレット、国際公開第２００４０８７７５８号パンフレット、いくつかの市販カタログ抗体及び国際公開第２００４０８７７５８号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５１５】
一実施形態において、ＣＤ３０に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７０９０８４３Ｂ１号明細書及び欧州特許第０８０５８７１号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５１６】
一実施形態において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７２５３２６３号明細書；米国特許第８，２０７，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２７６０４６号明細書；欧州特許第１０１３７６１号明細書；国際公開第２００５０３５５７７号パンフレット；及び米国特許第６４３７０９８号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５１７】
一実施形態において、ＣＤ１７１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３７（２）：９３−１０４（２０１４）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５１８】
一実施形態において、ＩＬ−１１Ｒａに対する抗原結合ドメインは、Ａｂｃａｍ（カタログ番号ａｂ５５２６２）又はＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｓ（カタログ番号ＥＰＲ５４４６）から入手可能な抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。別の実施形態において、ＩＬ−１１Ｒａに対する抗原結合ドメインは、ペプチドである、例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７２（１）：２７１−２８１（２０１２）を参照されたい。
【０５１９】
一実施形態において、ＰＳＣＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍｏｒｇｅｎｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６７（１０）：１１２１−１１３１（２００７）（ｓｃＦｖ  ７Ｆ５）；Ｎｅｊａｔｏｌｌａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１３（２０１３），ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ８３９８３１（ｓｃＦｖ  Ｃ５−ＩＩ）；及び米国特許出願公開第２００９０３１１１８１号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５２０】
一実施形態において、ＶＥＧＦＲ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０（１１）：３９５３−３９６８（２０１０）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５２１】
一実施形態において、ルイスＹに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  ２３（４）：４１１−４２３（２００８）（ｈｕ３Ｓ１９３  Ａｂ（ｓｃＦｖｓ））；Ｄｏｌｅｚａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（１）：４７−５６（２００３）（ＮＣ１０  ｓｃＦｖ）に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５２２】
一実施形態において、ＣＤ２４に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍａｌｉａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４３（５）：１３７５−１３８４（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５２３】
一実施形態において、ＰＤＧＦＲβに対する抗原結合ドメインは、抗体Ａｂｃａｍ  ａｂ３２５７０の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５２４】
一実施形態において、ＳＳＥＡ−４に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＣ８１３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又は他の市販の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５２５】
一実施形態において、ＣＤ２０に対する抗原結合ドメインは、抗体リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ若しくはＧＡ１０１の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５２６】
一実施形態において、葉酸受容体αに対する抗原結合ドメインは、抗体ＩＭＧＮ８５３又は米国特許出願公開第２０１２０００９１８１号明細書；米国特許第４８５１３３２号明細書、ＬＫ２６：米国特許第５９５２４８４号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５２７】
一実施形態において、ＥＲＢＢ２に対する抗原結合ドメイン（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）は、抗体トラスツズマブ又はペルツズマブの抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５２８】
一実施形態において、ＭＵＣ１に対する抗原結合ドメインは、抗体ＳＡＲ５６６６５８の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５２９】
一実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合ドメインは、抗体セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ又はマツズマブの抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５３０】
一実施形態において、ＮＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン２−２Ｂ：ＭＡＢ５３２４（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５３１】
一実施形態において、エフリンＢ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ａｂｅｎｇｏｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１９（１９）：４５６５−４５７６（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５３２】
一実施形態において、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第８３４４１１２Ｂ２号明細書；欧州特許出願公開第２３２２５５０Ａ１号明細書；国際公開第２００６／１３８３１５号パンフレット又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２００６／０２２９９５号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５３３】
一実施形態において、ＣＡＩＸに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン３０３１２３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５３４】
一実施形態において、ＬＭＰ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７，４１０，６４０号明細書又は米国特許出願公開第２００５０１２９７０１号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５３５】
一実施形態において、ｇｐ１００に対する抗原結合ドメインは、抗体ＨＭＢ４５、ＮＫＩｂｅｔａＢ、又は国際公開第２０１３１６５９４０号パンフレット、又は米国特許出願公開第２０１３０２９５００７号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５３６】
一実施形態において、チロシナーゼに対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第５８４３６７４号明細書；又は米国特許出願公開第１９９５０５０４０４８号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５３７】
一実施形態において、ＥｐｈＡ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２２（１）：１０２−１１１（２０１４）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５３８】
一実施形態において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７２５３２６３号明細書；米国特許第８，２０７，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２７６０４６号明細書；欧州特許出願公開第１０１３７６１Ａ３号明細書；２０１２０２７６０４６；国際公開第２００５０３５５７７号パンフレット；又は米国特許第６４３７０９８号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５３９】
一実施形態において、フコシルＧＭ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許出願公開第２０１００２９７１３８号明細書；又は国際公開第２００７／０６７９９２号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５４０】
一実施形態において、ｓＬｅに対する抗原結合ドメインは、抗体Ｇ１９３（ルイスＹについて）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。Ｓｃｏｔｔ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：３２５４−６１（２０００）を参照されたく、Ｎｅｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍａｙ  ２０１３  １９０（Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）１７７．１０にも記載される。
【０５４１】
一実施形態において、ＧＭ３に対する抗原結合ドメインは、抗体ＣＡ２５２３４４９（ｍＡｂ  １４Ｆ７）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５４２】
一実施形態において、ＨＭＷＭＡＡに対する抗原結合ドメインは、Ｋｍｉｅｃｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３（１）：ｅ２７１８５（２０１４）（ＰＭＩＤ：２４５７５３８２）（ｍＡｂ９．２．２７）；米国特許第６５２８４８１号明細書；国際公開第２０１００３３８６６号パンフレット；又は米国特許出願公開第２０１４０００４１２４号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５４３】
一実施形態において、ｏ−アセチル−ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、抗体８Ｂ６の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５４４】
一実施形態において、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２３５（２）：２９８−３０８（２００６）；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６３（２）：２２１−２３２（２０１１）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５４５】
一実施形態において、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合ドメインは、抗体ＩＭＡＢ０２７（Ｇａｎｙｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。例えば、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．ｇｏｖ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２０５４３５１を参照されたい。
【０５４６】
一実施形態において、ＴＳＨＲに対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第８，６０３，４６６号明細書；米国特許第８，５０１，４１５号明細書；又は米国特許第８，３０９，６９３号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５４７】
一実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合ドメインは、抗体ＦＡＢ６３００Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；又はＬＳ−Ａ４１８０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５４８】
一実施形態において、ＣＤ９７に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第６，８４６，９１１号明細書；ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３（６）：４１２７−４１３４（２００９）に記載されている抗体；又はＲ＆Ｄ：ＭＡＢ３７３４からの抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５４９】
一実施形態において、ＡＬＫに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍｉｎｏ−Ｋｅｎｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６（５）：１５６１−１５７１（２０１０）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５５０】
一実施形態において、プリシアル酸（ｐｌｙｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｎａｇａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８（４７）：３３７８４−３３７９６（２０１３）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５５１】
一実施形態において、ＰＬＡＣ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｇｈｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１３  ｄｏｉ：１０．１００２／ｂａｂ．１１７７に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５５２】
一実施形態において、ＧｌｏｂｏＨに対する抗原結合ドメインは、抗体ＶＫ９；又は例えばＫｕｄｒｙａｓｈｏｖ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．１５（３）：２４３−９（  １９９８）、Ｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１１（７）：２４８２−２４８７（２０１４）；ＭＢｒ１：Ｂｒｅｍｅｒ  Ｅ−Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５９：１４７７３−１４７７７（１９８４）に記載されている抗体の抗原結合部分を含む。
【０５５３】
一実施形態において、ＮＹ−ＢＲ−１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  １５（１）：７７−８３（２００７）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５５４】
一実施形態において、ＷＴ−１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５（１７６）：１７６ｒａ３３（２０１３）；又は国際公開第２０１２／１３５８５４号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５５５】
一実施形態において、ＭＡＧＥ−Ａ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４（１２）：７８５３−７８５８（２００５）（ＴＣＲ様ｓｃＦｖ）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５５６】
一実施形態において、精子タンパク質１７に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１３  Ａｕｇ  １４（ＰＭＩＤ：２３９４３３１３）；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ  ２９（４）：２９２３−２９３１（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５５７】
一実施形態において、Ｔｉｅ２に対する抗原結合ドメインは、抗体ＡＢ３３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５５８】
一実施形態において、ＭＡＤ−ＣＴ−２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＭＩＤ：２４５０９５２；米国特許第７６３５７５３号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５５９】
一実施形態において、Ｆｏｓ関連抗原１に対する抗原結合ドメインは、抗体１２Ｆ９（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５６０】
一実施形態において、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１に対する抗原結合ドメインは、欧州特許第２５１４７６６Ａ２号明細書；又は米国特許第７，７４９，７１９号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５６１】
一実施形態において、肉腫転座切断点に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４（６）：４５３−４６１（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５６２】
一実施形態において、ＴＲＰ−２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８４（６）：２２０７−１６（１９９６）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５６３】
一実施形態において、ＣＹＰ１Ｂ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍａｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  １０２（９）：３２８７−３２９４（２００３）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５６４】
一実施形態において、ＲＡＧＥ−１に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＡＢ５３２８（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５６５】
一実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素に対する抗原結合ドメインは、抗体カタログ番号：ＬＳ−Ｂ９５−１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５６６】
一実施形態において、腸管カルボキシルエステラーゼに対する抗原結合ドメインは、抗体４Ｆ１２：カタログ番号：ＬＳ−Ｂ６１９０−５０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５６７】
一実施形態において、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２に対する抗原結合ドメインは、抗体Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：モノクローナル：カタログ番号：ＬＳ−Ｃ１３３２６１−１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５６８】
一実施形態において、ＣＤ７９ａに対する抗原結合ドメインは、Ａｂｃａｍから入手可能な抗体抗ＣＤ７９ａ抗体［ＨＭ４７／Ａ９］（ａｂ３１２１）；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能な抗体ＣＤ７９Ａ抗体番号３３５１；又はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なウサギにおいて産生した抗ＣＤ７９Ａ抗体である抗体ＨＰＡ０１７７４８の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５６９】
一実施形態において、ＣＤ７９ｂに対する抗原結合ドメインは、抗体ポラツズマブベドチン、Ｄｏｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ７９ｂ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ａｎｔｉ−ＣＤ７９ｂ−ｖｃ−ＭＭＡＥ，ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ”Ｂｌｏｏｄ．２００９  Ｓｅｐ  ２４；１１４（１３）：２７２１−９．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００９−０２−２０５５００．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｌ  ２４に記載の抗ＣＤ７９ｂ又は“４５０７  Ｐｒｅ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｎｔｉ−ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３  Ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ”Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ５６ｔｈＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ６−９  ２０１４に記載の二特異性抗体抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５７０】
一実施形態において、ＣＤ７２に対する抗原結合ドメインは、Ｍｙｅｒｓ及びＵｃｋｕｎ，“Ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ７２  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｂ−ｌｉｎｅａｇｅ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．”Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１９９５  Ｊｕｎ；１８（１−２）：１１９−２２に記載の抗体Ｊ３−１０９又はＰｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ：Ｔａｒｇｅｔ  ａｎｄ  Ｌｉｎｋｅｒ−Ｄｒｕｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｍａｒｃｈ  １５，２００９  ６９；２３５８に記載の抗ＣＤ７２（１０Ｄ６．８．１，ｍＩｇＧ１）の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５７１】
一実施形態において、ＬＡＩＲ１に対する抗原結合ドメインは、ＰｒｏＳｐｅｃから入手可能な抗体ＡＮＴ−３０１  ＬＡＩＲ１抗体；又はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能な抗ヒトＣＤ３０５（ＬＡＩＲ１）抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５７２】
一実施形態において、ＦＣＡＲに対する抗原結合ドメインは、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から入手可能な抗体ＣＤ８９／ＦＣＡＲＡｎｔｉｂｏｄｙ（カタログ番号１０４１４−Ｈ０８Ｈ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲを含む。
【０５７３】
一実施形態において、ＬＩＬＲＡ２に対する抗原結合ドメインは、Ａｂｎｏｖａから入手可能な抗体ＬＩＬＲＡ２モノクローナル抗体（Ｍ１７）、クローン３Ｃ７又はＬｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なマウス抗ＬＩＬＲＡ２抗体、モノクローナル（２Ｄ７）の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５７４】
一実施形態において、ＣＤ３００ＬＦに対する抗原結合ドメインは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能な抗体マウス抗ＣＭＲＦ３５様分子１抗体、モノクローナル［ＵＰ−Ｄ２］又はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なラット抗ＣＭＲＦ３５様分子１抗体、モノクローナル［２３４９０３］の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５７５】
一実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａに対する抗原結合ドメインは、抗体二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）ｓｃＦｖ抗体及びＮｏｏｒｄｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＣＬＥＣ１２Ａ  Ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｂｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＬＬ−１ｘＣＤ３  ＢｉＴＥ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”５３ｒｄＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １０−１３，２０１１に記載のＡＤＣ及びＭＣＬＡ−１１７（Ｍｅｒｕｓ）の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５７６】
一実施形態において、ＢＳＴ２（ＣＤ３１７とも称される）に対する抗原結合ドメインは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｏｎｌｉｎｅから入手可能な抗体マウス抗ＣＤ３１７抗体、モノクローナル［３Ｈ４］又はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なマウス抗ＣＤ３１７抗体、モノクローナル［６９６７３９］の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５７７】
一実施形態において、ＥＭＲ２（ＣＤ３１２とも称される）に対する抗原結合ドメインは、Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な抗体マウス抗ＣＤ３１２抗体、モノクローナル［ＬＳ−Ｂ８０３３］又はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なマウス抗ＣＤ３１２抗体、モノクローナル［４９４０２５］の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５７８】
一実施形態において、ＬＹ７５に対する抗原結合ドメインは、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能な抗体マウス抗リンパ球抗原７５抗体、モノクローナル［ＨＤ３０］又はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なマウス抗リンパ球抗原７５抗体、モノクローナル［Ａ１５７９７］の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５７９】
一実施形態において、ＧＰＣ３に対する抗原結合ドメインは、Ｎａｋａｎｏ  Ｋ，Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ，Ｋｏｎｉｓｈｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ｇｌｙｐｉｃａｎ  ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ．２０１０  Ｎｏｖ；２１（１０）：９０７−９１６に記載の抗体ｈＧＣ３３、又はＭＤＸ−１４１４、ＨＮ３、又はＹＰ７の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含み、これら３つは全て、Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．”ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２０１４  Ｊａｎ  ２１；５８８（２）：３７７−８２に記載される。
【０５８０】
一実施形態において、ＦＣＲＬ５に対する抗原結合ドメインは、Ｅｌｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，“ＦｃＲＬ５  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ”Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｏｃｔ；１１（１０）：２２２２−３２に記載の抗ＦｃＲＬ５抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５８１】
一実施形態において、ＩＧＬＬ１に対する抗原結合ドメインは、Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な抗体マウス抗免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１抗体、モノクローナル［ＡＴ１Ｇ４］、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能なマウス抗免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１抗体、モノクローナル［ＨＳＬ１１］の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲを含む。
【０５８２】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１つ以上の更なるアミノ酸、例えば膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域と関係する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜最大で１５のアミノ酸）及び／又は膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と関係する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜最大で１５のアミノ酸）を含み得る。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインの１つに関連するものである。ある例において、膜貫通ドメインは、このようなドメインが、同一又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合するのを避けるように、例えば受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように選択され又はアミノ酸置換による改変ができる。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の別のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲＴに存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように改変又は置換され得る。
【０５８３】
膜貫通ドメインは、天然由来又は組換え源由来であり得る。源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合又は膜貫通タンパク質由来であり得る。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合したときは常に細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。一実施形態において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ又はＣＤ１９の少なくとも膜貫通領域を含み得る。
【０５８４】
ある例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに結合できる。例えば、一実施形態において、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジ又はＣＤ８ａヒンジであり得る。一実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号２のアミノ酸配列を含む（例えば、これからなる）。一態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の膜貫通ドメインを含む（例えば、これからなる）。
【０５８５】
一態様において、ヒンジ又はスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、一実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、アミノ酸配列
【化４】
2021500894.tif 000012
のヒンジを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、
【化５】
2021500894.tif 000013
のヌクレオチド配列によりコードされたヒンジを含む。
【０５８６】
一態様において、ヒンジ又はスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、一実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、アミノ酸配列
【化６】
2021500894.tif 000014
のヒンジを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、
【化７】
2021500894.tif 000015
のヌクレオチド配列によりコードされたヒンジを含む。
【０５８７】
一態様において、膜貫通ドメインは組換えであり得、その場合、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。一態様において、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットを、組換え膜貫通ドメインの各末端に見ることができる。
【０５８８】
任意選択により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴ又はポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域との間に結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは特に適当なリンカーを提供する。例えば、一態様において、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む（配列番号５）。一実施形態において、リンカーは、ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣのヌクレオチド配列によりコードされる（配列番号８）。
【０５８９】
一態様において、ヒンジ又はスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【０５９０】
細胞質ドメイン
本ＣＡＲの細胞質ドメイン又は領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般的に、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。
【０５９１】
本明細書に記載のＣＡＲにおいて使用する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して機能する共受容体の細胞質配列並びにこれらのあらゆる誘導体又はバリアント及び同じ機能的能力を有するあらゆる組換え配列を含む。
【０５９２】
ＴＣＲ単独により産生されたシグナルはＴ細胞の完全活性化には不十分であり、二次及び／又は共刺激性シグナルも必要であることが知られている。そのため、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列が介在するということができる：ＴＣＲ（初代細胞内シグナル伝達ドメイン）を介して抗原依存性一次活性化を開始するもの及び二次又は共刺激性シグナル（二次細胞質ドメイン、例えば共刺激ドメイン）を提供するように抗原非依存的方法で作用するもの。
【０５９３】
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性方向又は阻害性方向のいずれかで制御する。刺激性方向で作用する初代細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
【０５９４】
本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても知られる）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及びＣＤ６６ｄのものを含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζ、例えば本明細書に記載のＣＤ３ζ配列の一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０５９５】
一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭドメインと比較して改変された（例えば、増加又は減少した）活性を有する、修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば変異ＩＴＡＭドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば最適化及び／又は切断されたＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれを超えるＩＴＡＭモチーフを含む。
【０５９６】
共刺激性シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインをそれ自体で含むことができ又は本発明のＣＡＲに関連して、有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせ得る。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分及び共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激性シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。一実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及びＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
【０５９７】
共刺激性分子は、リンパ球の抗原に対する効率的応答に必要である、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子であり得る。そのような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンド等が含まれる。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の増殖、エフェクター機能及び生存を増強し、インビボでヒトＴ細胞残留性及び抗腫瘍活性を増強することが示されている（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（３）：６９６−７０６）。そのような共刺激分子の更なる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ及びＰＡＧ／Ｃｂｐを含む。
【０５９８】
ＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、互いに無作為に又は特定の順序で連結し得る。任意選択により、例えば、２〜１０アミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸）長の短オリゴ又はポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間に結合を形成し得る。一実施形態において、グリシン−セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。一実施形態において、単一アミノ酸、例えばアラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。
【０５９９】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超える共刺激性シグナル伝達ドメインを含むように設計される。一実施形態において、２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超える共刺激性シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば本明細書に記載のリンカー分子により分けられる。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、リンカー分子はグリシン残基である。一実施形態において、リンカー分子はアラニン残基である。
【０６００】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号７のシグナル伝達ドメインである。一態様において、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインは、配列番号９のシグナル伝達ドメインである。
【０６０１】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＲＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、
【化８】
2021500894.tif 000016
の核酸配列によりコードされる。
【０６０２】
一態様において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＡＲ、例えば同じ標的又は異なる標的（例えば、本明細書に記載の癌関連抗原以外の標的又は本明細書に記載の異なる癌関連抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３又は葉酸受容体β）に対する、例えば第２のＣＡＲの異なる抗原結合ドメインを更に含み得る。一実施形態において、第２のＣＡＲは、癌関連抗原と同じ癌細胞型を発現する標的に対する抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、第１の抗原を標的とし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ及び第２の、異なる、抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。理論に拘束されることを望まないが、第１のＣＡＲへの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７又はＯＸ−４０及び一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζの第２のＣＡＲへの配置は、両標的が発現される細胞に対してＣＡＲ活性を制限する。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載の標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含む第１の癌関連抗原ＣＡＲ及び異なる標的抗原（例えば、第１の標的抗原と同一の癌細胞型に発現される抗原）を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載の標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ及び第１の標的抗原以外の抗原（例えば、第１の標的抗原と同一の癌細胞型に発現される抗原）を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。
【０６０３】
別の態様において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の集団を特徴とする。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、種々のＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。
【０６０４】
例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、本明細書に記載の癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第１の細胞及び異なる抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の異なる癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、第１の細胞によって発現されるＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合された癌関連抗原と異なる、本明細書に記載の癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第２の細胞を含み得る。
【０６０５】
別の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、本明細書に記載の癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第１の細胞及び本明細書に記載されるような癌関連抗原以外の標的に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第２の細胞を含み得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第１の細胞及び二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第２の細胞を含む。
【０６０６】
他の態様において、本開示は細胞の集団を特徴とし、ここで、集団内の少なくとも１細胞は、本明細書に記載の癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第２の細胞は他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、ＰＤ−１は、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦ（例えば、ＴＧＦβ）を含む。一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第２のポリペプチド、例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインに結合した、第１のポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦβ又はこれらのいずれかのフラグメントなどの阻害分子の第１のポリペプチド及び本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインである第２のポリペプチド（例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０又はＣＤ２８）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む）である第２のポリペプチドを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ−１又はそのフラグメントの第１のポリペプチド並びに本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び／又は本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）の第２のポリペプチドを含む。
【０６０７】
抗ＣＤ１９結合ドメインの配列は、本明細書において表１に提供される。全長ＣＡＲ構築物は、表１に記載される抗原結合ドメインのいずれかを、以下に提供される１つ以上の追加のＣＡＲ成分と共に使用して生成することができる。
・リーダー（アミノ酸配列）（配列番号１）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
・リーダー（核酸配列）（配列番号１２）
【化９】
2021500894.tif 000017
・リーダー（核酸配列２）（配列番号１２７）
【化１０】
2021500894.tif 000018
・リーダー（核酸配列３）（配列番号１２８）
【化１１】
2021500894.tif 000019
・ＣＤ８ヒンジ（アミノ酸配列）（配列番号２）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ
・ＣＤ８ヒンジ（核酸配列）（配列番号１３）
【化１２】
2021500894.tif 000020
・ＣＤ８ヒンジ（核酸配列２）（配列番号１２９）
【化１３】
2021500894.tif 000021
・ＣＤ８膜貫通（アミノ酸配列）（配列番号６）
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
・膜貫通（核酸配列）（配列番号１７）
【化１４】
2021500894.tif 000022
・膜貫通（核酸配列２）（配列番号１３０）
【化１５】
2021500894.tif 000023
・４−１ＢＢ細胞内ドメイン（アミノ酸配列）（配列番号７）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
・４−１ＢＢ細胞内ドメイン（核酸配列）（配列番号１８）
【化１６】
2021500894.tif 000024
・４−１ＢＢ細胞内ドメイン（核酸配列２）（配列番号１３１）
【化１７】
2021500894.tif 000025
・ＣＤ３ζドメイン（アミノ酸配列）（配列番号９）
【化１８】
2021500894.tif 000026
・ＣＤ３ζ（核酸配列）（配列番号２０）
【化１９】
2021500894.tif 000027
・ＣＤ３ζ（核酸配列２）（配列番号１３２）
【化２０】
2021500894.tif 000028
・ＣＤ３ζドメイン（アミノ酸配列；ＮＣＢＩ対照配列ＮＭ＿０００７３４．３）（配列番号１０）
【化２１】
2021500894.tif 000029
・ＣＤ３ζ（核酸配列；ＮＣＢＩ対照配列ＮＭ＿０００７３４．３）；（配列番号２１）
【化２２】
2021500894.tif 000030
ＩｇＧ４ヒンジ（アミノ酸配列）（配列番号３６）
【化２３】
2021500894.tif 000031
ＩｇＧ４ヒンジ（ヌクレオチド配列）（配列番号３７）
【化２４】
2021500894.tif 000032
ＥＦ１αプロモーター
【化２５】
2021500894.tif 000033
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２５）
ＧＧＧＧＳ
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２６）この配列は、１〜６「Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ」反復単位を含み得る
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２７）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２８）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２９）
ＧＧＧＳ
ポリＡ（配列番号３０）：Ａ５０００
ポリＡ（配列番号３１）：Ａ１００
ポリＴ（配列番号３２）：Ｔ５０００
ポリＡ（配列番号３３）：Ａ５０００
ポリＡ（配列番号３４）：Ａ４００
ポリＡ（配列番号３５）”Ａ２０００
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号１５）：この配列は、１〜１０「Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ」反復単位を含み得る。
ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ  ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ  ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ  ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ
【０６０８】
本明細書に記載の方法で使用できる例示的なＣＤ１９  ＣＡＲ構築物を表３に示す。
【０６０９】
【表８】
2021500894.tif 000034
【０６１０】
【表９】
2021500894.tif 000035
【０６１１】
【表１０】
2021500894.tif 000036
【０６１２】
【表１１】
2021500894.tif 000037
【０６１３】
【表１２】
2021500894.tif 000038
【０６１４】
【表１３】
2021500894.tif 000039
【０６１５】
【表１４】
2021500894.tif 000040
【０６１６】
【表１５】
2021500894.tif 000041
【０６１７】
【表１６】
2021500894.tif 000042
【０６１８】
【表１７】
2021500894.tif 000043
【０６１９】
【表１８】
2021500894.tif 000044
【０６２０】
【表１９】
2021500894.tif 000045
【０６２１】
【表２０】
2021500894.tif 000046
【０６２２】
【表２１】
2021500894.tif 000047
【０６２３】
【表２２】
2021500894.tif 000048
【０６２４】
【表２３】
2021500894.tif 000049
【０６２５】
【表２４】
2021500894.tif 000050
【０６２６】
【表２５】
2021500894.tif 000051
【０６２７】
【表２６】
2021500894.tif 000052
【０６２８】
【表２７】
2021500894.tif 000053
【０６２９】
【表２８】
2021500894.tif 000054
【０６３０】
【表２９】
2021500894.tif 000055
【０６３１】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、表３に列挙する重鎖結合ドメインアミノ酸配列のいずれかのＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、更にＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３を含む。実施形態において、抗原結合ドメインは、表３に列挙する軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のいずれかのＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３を含む。
【０６３２】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、表３に記載する軽鎖結合ドメインアミノ酸配列のいずれかのＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３の１、２又は全て及び表３に記載する重鎖結合ドメインアミノ酸配列のいずれかのＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３の１、２又は全てを含む。
【０６３３】
いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム又はそれらの組み合わせに従って定義される。
【０６３４】
ｓｃＦｖドメインのヒト化ＣＤＲ配列の配列を重鎖可変ドメインについて表３Ａ及び軽鎖可変ドメインについて表３Ｂに示す。「ＩＤ」は、各ＣＤＲの各配列番号を意味する。
【０６３５】
【表３０】
2021500894.tif 000056
【０６３６】
【表３１】
2021500894.tif 000057
【０６３７】
ＣＡＲと他の分子又は薬剤との共発現
第２のＣＡＲの共発現
一態様において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＡＲ、例えば同じ標的（例えば、ＣＤ１９）又は異なる標的（例えば、ＣＤ１９以外の標的、例えば、本明細書に記載の標的）に対する、例えば第２のＣＡＲの異なる抗原結合ドメインを更に含み得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、第１の抗原を標的とし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ及び第２の、異なる、抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。第１のＣＡＲへの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０又はＩＣＯＳ及び一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζの第２のＣＡＲへの配置は、両標的が発現される細胞に対してＣＡＲ活性を制限する。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含む第１のＣＡＲ及び他の抗原を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ及び他の抗原を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激性シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。
【０６３８】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載のＸＣＡＲ及び阻害性ＣＡＲを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えばＸも発現する正常細胞で見られるが、癌細胞で見られない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦ（例えば、ＴＧＦβ）の細胞内ドメインであり得る。
【０６３９】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞が２以上の異なるＣＡＲを含むとき、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものである。例えば、第１及び第２のＣＡＲを発現する細胞は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えばＶＨＨである第２のＣＡＲの抗原結合ドメインと結合を形成しない、例えばフラグメント、例えばｓｃＦｖとしての第１のＣＡＲの抗原結合ドメインを有し得る。
【０６４０】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子を含み、相補的決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の４鎖抗体由来の単一ドメイン、操作されたドメイン及び抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当技術分野の又は将来的な単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ及びウシを含むが、これらに限定されない任意の種由来であり得る。この用語は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）及びサメ以外の種由来の天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
【０６４１】
一態様において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来であるような、魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲ（「ＩｇＮＡＲ」）の可変領域由来の単一ドメイン分子を製造する方法は、国際公開第０３／０１４１６１号パンフレット及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２９０１−２９０９に記載されている。
【０６４２】
別の態様によると、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、国際公開第９４０４６７８号パンフレット及びＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８に記載されている。明確化するために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来のこの可変ドメインは、ここでは、４鎖免疫グロブリンの慣用のＶＨと区別するためにＶＨＨ又はナノボディとして知られている。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコ由来であり得る。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）以外の他の種は、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生し得、このようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
【０６４３】
ＳＤＡＢ分子は、組換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化及び／又はインビトロ産生され得る（例えば、ファージディスプレイにより選択）。
【０６４４】
受容体の抗原結合ドメイン間を相互作用する抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞は、例えば、抗原結合ドメインの１つ以上がその同族抗原に結合することを阻止するため、望ましくない可能性があることも判明した。したがって、本明細書に開示されるのは、このような相互作用を最小化する、抗原結合ドメインを含む第１及び第２の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞である。また、本明細書に開示されるのは、このような相互作用を最小化する抗原結合ドメインを含む第１及び第２の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸並びにこのような細胞及び核酸を製造及び使用する方法である。一実施形態において、第１及び第２の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の抗原結合ドメインの一方は、ｓｃＦｖを含み、他方は、単一ＶＨドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。
【０６４５】
一実施形態において、本明細書における組成物は、第１及び第２のＣＡＲを含み、ここで、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメイン及び可変重ドメインを含まない。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、他方は、ｓｃＦｖではない。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
【０６４６】
一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、単一ＶＨドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、ナノボディを含む。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
【０６４７】
一実施形態において、細胞の表面上に存在するとき、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第２のＣＡＲの存在により実質的に低減されない。一実施形態において、第２のＣＡＲの存在下の第１のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第２のＣＡＲの非存在下の第１のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。
【０６４８】
一実施形態において、細胞の表面上に存在するとき、第１及び第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より少なく互いに結合する。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％少なく、例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％少なく互いに結合する。
【０６４９】
ＣＡＲ活性を強化する薬剤の共発現
別の態様において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、別の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性又は適応度を増強する薬剤を更に発現できる。
【０６５０】
例えば、一実施形態において、薬剤は、Ｔ細胞機能を調節又は制御する、例えば、阻害する分子を阻害する薬剤であり得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞機能を調節又は制御する分子は、阻害分子である。阻害分子、例えば、ＰＤ１は、いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン又はＴＧＦβを含む。
【０６５１】
実施形態において、例えば本明細書に記載されるような、薬剤、例えば阻害性核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ；又は例えば阻害性タンパク質若しくはシステム、例えば群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）、転写−アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、ＣＡＲ発現細胞においてＴ細胞の機能を調節又は制御する、例えば阻害する、分子の発現を阻害できる。一実施形態において、薬剤は、ｓｈＲＮＡ、例えば、本明細書に記載のｓｈＲＮＡである。一実施形態において、Ｔ細胞機能を調節又は制御する、例えば阻害する薬剤は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。例えば、Ｔ細胞機能を調節又は制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの成分、例えば全ての成分をコードする核酸に連結される。
【０６５２】
一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第２のポリペプチド、例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインに結合した、第１のポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン若しくはＴＧＦβ又はこれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの少なくとも細胞外ドメインの部分）などの阻害分子の第１のポリペプチド及び本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインである第２のポリペプチド（例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載のような例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む）である第２のポリペプチドを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１又はそのフラグメント（例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメインの部分）の第１のポリペプチド並びに本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び／又は本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）の第２のポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞に発現される（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７５）。ＰＤ１に対する２リガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３）。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌において豊富である（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８１：２８１−７；Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５４：３０７−３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５０９４）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との局所相互作用の阻害により逆転できる。
【０６５３】
一実施形態において、薬剤は、阻害分子、例えばプログラム細胞死１（ＰＤ１）（本明細書ではＰＤ１  ＣＡＲと称する）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、膜貫通ドメイン及び４１ＢＢ及びＣＤ３ζなどの細胞内シグナル伝達ドメインに融合され得る。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、本明細書に記載のＸＣＡＲと組み合わせで使用したとき、Ｔ細胞の残留性を改善する。一実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１０５において下線で示すＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＣＡＲである。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。
【化２６】
2021500894.tif 000058
【０６５４】
一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、下記アミノ酸配列を含む（配列番号１０６）。
【化２７】
2021500894.tif 000059
【０６５５】
一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１  ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載のＰＤ１  ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、下記配列番号１０７でＰＤ１  ＥＣＤに下線を付して、ＰＤ１  ＣＡＲの核酸配列を下に示す。
【化２８】
2021500894.tif 000060
【０６５６】
別の例において、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、共刺激分子又は共刺激分子リガンドであり得る。共刺激分子の例には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体並びにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が含まれる。そのような共刺激分子の更なる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、例えば本明細書に記載されるようなものを含む。共刺激分子リガンドの例には、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ及びＬＩＧＨＴが含まれる。実施形態において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインと異なる共刺激分子のリガンドである。実施形態において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインと同一の共刺激分子のリガンドである。一実施形態において、共刺激分子リガンドは４−１ＢＢＬである。一実施形態において、共刺激リガンドは、ＣＤ８０又はＣＤ８６である。一実施形態において、共刺激分子リガンドはＣＤ７０である。実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、１つ以上の追加の共刺激分子又は共刺激分子リガンドを発現するように更に操作され得る。
【０６５７】
ＣＡＲとケモカイン受容体の共発現
実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞は、更に、ケモカイン受容体分子を含む。Ｔ細胞におけるケモカイン受容体ＣＣＲ２ｂ又はＣＸＣＲ２のトランスジェニック発現は、黒色腫及び神経芽腫を含むＣＣＬ２−又はＣＸＣＬ１分泌固形腫瘍への輸送を促進する（Ｃｒａｄｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１０  Ｏｃｔ；３３（８）：７８０−８及びＫｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００２  Ｎｏｖ  １；１３（１６）：１９７１−８０）。そのため、理論に拘束されることを望むものではないが、腫瘍、例えば、固形腫瘍により分泌されるケモカインを認識するＣＡＲ発現細胞で発現されるケモカイン受容体は、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍への帰巣を改善し、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍への浸潤を促進し、及びＣＡＲ発現細胞の抗腫瘍効果を増強すると考えられる。ケモカイン受容体分子は、天然に存在する又は組換えケモカイン受容体又はそのケモカイン結合フラグメントを含み得る。本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔｘ）における発現に適するケモカイン受容体分子は、ＣＸＣケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６又はＣＸＣＲ７）、ＣＣケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０又はＣＣＲ１１）、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体（例えば、ＣＸ３ＣＲ１）、ＸＣケモカイン受容体（例えば、ＸＣＲ１）又はそのケモカイン結合フラグメントを含む。一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲと共に発現するケモカイン受容体分子は、腫瘍により分泌されるケモカインに基づき選択する。一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、更に、ＣＣＲ２ｂ受容体又はＣＸＣＲ２受容体を含む、例えば、発現する。一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ及びケモカイン受容体分子は、同じベクターにある又は２つの異なるベクターにある。本明細書に記載のＣＡＲ及びケモカイン受容体分子が同じベクターに実施形態において、ＣＡＲ及びケモカイン受容体分子は、各々、２つの異なるプロモーターの制御下にあるか又は同じプロモーターの制御下にある。
【０６５８】
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明は、本明細書に記載される１つ以上のＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を含む免疫エフェクター細胞、例えば本明細書に記載の方法によって作製されたものも提供する。一態様において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一態様において、核酸分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。
【０６５９】
本明細書に記載される核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子又はそれらの組み合わせであり得る。一実施形態において、核酸分子は、本明細書に記載されるようなＣＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。他の実施形態において、核酸分子は、前述の核酸分子のいずれかを含むベクターである。
【０６６０】
一態様において、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、その配列が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。一態様において、本発明のＣＡＲ構築物全体は、その配列全体が哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。コドン最適化とは、コーディングＤＮＡにおける同義コドン（すなわち同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が異なる種に偏っているという発見を指す。そのようなコドン縮重は、同一のポリペプチドが様々なヌクレオチド配列によってコードされることを可能にする。様々なコドン最適化方法が当技術分野で知られており、例えば、少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号明細書及び同第６，１１４，１４８号明細書に開示される方法が含まれる。
【０６６１】
したがって、一態様において、免疫エフェクター細胞、例えば本発明の方法により作製されたものは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含み、ＣＡＲは、本明細書に記載の腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）並びに刺激ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメイン）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載の一次シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載のζ鎖）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。
【０６６２】
本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子、例えば、本明細書に記載の核酸分子が挿入されているベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組み込み及び娘細胞への伝播を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコ−レトロウイルス由来のベクターを超える更なる利点を有する。更に、それらは、低免疫原性であるという付加的利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、γレトロウイルスベクターでもあり得る。γレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル（ψ）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、１つ以上の（例えば、２）末端反復配列（ＬＴＲ）及び目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含み得る。γレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖなどのウイルス構造的遺伝子を欠き得る。例示的なγレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）及び骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）及びそれら由来のベクターを含む。他のγレトロウイルスベクターは、例えば、Ｔｏｂｉａｓ  Ｍａｅｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１１  Ｊｕｎ；３（６）：６７７−７１３に記載される。
【０６６３】
別の実施形態において、所望のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成できる。参照により本明細書に包含される下記のＪｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９．１０：７０４−７１６を参照されたい。
【０６６４】
概説すると、ＣＡＲをコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸又はその一部をプロモーターに操作可能に連結させ、その構築物を発現ベクターに取り込むことにより達成される。ベクターは、真核生物での複製及び組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列及びプロモーターを含む。
【０６６５】
核酸は、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクター及びシークエンシングベクターを含む。
【０６６６】
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供され得る。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １  −４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ及び他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ以上の選択可能マーカーを含む（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット；国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；及び米国特許第６，３２６，１９３号明細書）。
【０６６７】
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当分野で知られる技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装できる。次いで、組換えウイルスが単離され、対象の細胞にインビボ又はエクスビボで送達され得る。多数のレトロウイルス系が当分野で知られる。一実施形態において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当分野で知られる。一実施形態において、レンチウイルスベクターを使用する。
【０６６８】
更なるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらは、開始部位の上流３０〜１１０ｂｐの領域に位置するが、多数のプロモーターが、同様に開始部位の下流に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の空間はしばしば可動性であり、そのため、要素が互いに逆になったとき又は移動したときにプロモーター機能が保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素間の空間は、活性が落ち始める前、５０ｂｐ離れるまで増加し得る。プロモーターにより、個々の要素は、転写を活性化するために協調的又は独立的に機能できるように見える。代表的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ又はホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。
【０６６９】
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲコード核酸分子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う伸長因子−１複合体のαサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された核酸分子からＣＡＲ発現を駆動するのに有効であることが示されている。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。一態様において、ＥＦ１ａプロモーターは、実施例で提供される配列を含む。
【０６７０】
プロモーターの別の例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる、強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列並びにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターなど、しかし、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターも使用し得る。更に、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部であるとして意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、発現が望まれるときに発現を活性化し、発現が望まれないときに発現を遮断することができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０６７１】
プロモーターの別の例は、ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。実施形態において、切断ＰＧＫプロモーター（例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較したとき、１つ以上の、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００又は４００ヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター）が望ましいことがある。
【０６７２】
ＰＧＫプロモーター例のヌクレオチド配列を下に提供する。
ＷＴ  ＰＧＫプロモーター：
【化２９】
2021500894.tif 000061
例示的な切断型ＰＧＫプロモーター：
ＰＧＫ１００：
【化３０】
2021500894.tif 000062
ＰＧＫ２００：
【化３１】
2021500894.tif 000063
ＰＧＫ３００：
【化３２】
2021500894.tif 000064
ＰＧＫ４００：
【化３３】
2021500894.tif 000065
【０６７３】
ベクターは、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子から）、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にする要素（例えばＳＶ４０起源及びＣｏｌＥ１又は当分野で知られるその他）及び／又は選択を可能にする要素（例えば、アンピシリン耐性遺伝子及び／又はゼオシンマーカー）も含み得る。
【０６７４】
ＣＡＲポリペプチド又はその一部の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクター遺伝子導入又はウイルスベクターによる感染が探求される細胞の集団から発現細胞から発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又は両者も含み得る。他の態様において、選択可能マーカーは、ＤＮＡの別の断面に担持され、共トランスフェクション法において使用される。選択可能マーカー及びレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞における発現が可能であるように、適切な制御配列が隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子を含む。
【０６７５】
レポーター遺伝子は、恐らく遺伝子導入されている細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物又は組織に存在又は発現されず、発現がある容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてから適当な時間後にアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。適当な発現系は周知であり、既知技術により製造でき又は商業的に入手できる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物をプロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するのに使用し得る。
【０６７６】
実施形態において、ベクターは、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲ、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ及び第２のＣＡＲ、例えば阻害性ＣＡＲ又はＣＤ１９以外の抗原に特異的に結合するＣＡＲをコードする２つ以上の核酸配列を含み得る。このような実施形態において、２以上のＣＡＲをコードする核酸配列は、同じフレームにおいて単一核分子により且つ単一ポリペプチド鎖としてコード化される。この態様において、２以上のＣＡＲは、例えば、１つ以上のペプチド開裂部位により分けられ得る（例えば、自己開裂部位又は細胞内プロテアーゼのための基質）。ペプチド切断部位の例には、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａ部位が含まれる。
【０６７７】
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は当分野で知られる。発現ベクターに関連して、ベクターは、任意の方法、例えば当技術分野で知られたものにより、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫細胞に容易に導入できる。例えば、例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的手段により、宿主細胞に移入される。
【０６７８】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクター及び／又は外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １  −４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照されたい）。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入するための適切な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０６７９】
宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書及び同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
【０６８０】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散体系を含む。インビトロ及びインビボで送達媒体として使用するための代表的コロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。標的化ナノ粒子又は他の適当なサブミクロンサイズの送達系を用いるポリヌクレオチドの送達など、最新式の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能である。
【０６８１】
非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入のために意図される（インビトロ、エクスビボ又はインビボ）。別の態様において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含又は複合体化又は他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとして又は「崩壊」構造を有して存在し得る。それらはまた、単に溶液に分散され、恐らくサイズ又は形が均一ではない凝集体を形成し得る。脂質は、天然に存在する又は合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴並びに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群及びその誘導体を含む。
【０６８２】
使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得ることができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）はＫ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から得ることができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ．）から得ることができる。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質の原液を、約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に揮発するために、唯一の溶媒として使用する。「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集体の産生により形成される多様な単及び多層状脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体を伴う小胞構造を有することにより特徴付けられる。多層状リポソームは、水性媒体により分離された、複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに自然に形成される。脂質要素は、閉構造形成前に自己凝集し、水及び溶解した溶質を脂質二重層間に封入する（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。しかしながら、通常の小胞構造と異なる構造を溶液で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であるか又は単に脂質分子の不均一凝集体として存在すると考えられ得る。リポフェクタミン−核酸複合体も考慮される。
【０６８３】
外来性核酸を宿主細胞に導入する又はそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝す方法に関係なく、宿主細胞における組換え核酸配列の存在を確認するために、多様なアッセイを行い得る。このようなアッセイは、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、薬剤の同定に使用するための、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）により、特定のペプチドの存在又は不在を検出するような「生化学的」アッセイ又は本発明の範囲内に入る本明細書に記載のアッセイを含む。
【０６８４】
ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）ＣＡＲ
一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ分子はナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）の１つ以上の成分を含み、それによりＮＫＲ−ＣＡＲを形成する。ＮＫＲ成分は、次のナチュラルキラー細胞受容体のいずれか由来の膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン又は細胞質ドメインであり得る：キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１及びＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー、例えばＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ及びＣＤ２Ｆ−１０；Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、例えばＣＤ１６及びＣＤ６４；及びＬｙ４９受容体、例えばＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃ。本明細書に記載のＮＫＲ−ＣＡＲ分子は、アダプター分子又は細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＤＡＰ１２と相互作用し得る。ＮＫＲ要素を含むＣＡＲ分子の例示的な配置及び配列は、国際公開第２０１４／１４５２５２号パンフレットに記載され、その内容が参照により本明細書に援用される。
【０６８５】
スプリットＣＡＲ
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、国際公開第２０１４／０５５４４２号パンフレット及び国際公開第２０１４／０５５６５７号パンフレットにより詳細に記載されている。簡潔には、スプリットＣＡＲ系は、第１の抗原結合ドメイン及び共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ）を有する第１のＣＡＲを発現する細胞を含み、細胞は、第２の抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を有する第２のＣＡＲも発現する。細胞が第１の抗原に遭遇したとき、共刺激ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第２の抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、殺細胞活性が開始される。そのため、ＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原の存在下でのみ完全活性化される。
【０６８６】
キメラ抗原受容体を制御するための戦略
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ活性が制御できる制御可能ＣＡＲ（ＲＣＡＲ）は、ＣＡＲ治療の安全性及び有効性を最適化するために望ましい。ＣＡＲ活性が制御され得る多くの方法がある。例えば、誘導性アポトーシス（例えば二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用するもの）（例えば、Ｄｉ  Ｓｔａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１１  Ｎｏｖ．３；３６５（１８）：１６７３−１６８３を参照されたい）を本発明のＣＡＲ治療における安全スイッチとして使用できる。一実施形態において、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、誘導性アポトーシススイッチを更に含み、ヒトカスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）又は改変バージョンは、条件付き二量体化を可能にするヒトＦＫＢタンパク質の改変に融合される。ラパログ（例えば、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７）などの小分子の存在下では、誘導性カスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）が活性化され、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の急速なアポトーシス及び死をもたらす。カスパーゼベースの誘導性アポトーシススイッチ（又はそのようなスイッチの１つ以上の態様）の例は、例えば、米国特許出願公開第２００４０４００４７号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２８６９８０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２５５３６０号明細書；国際公開第１９９７０３１８９９号パンフレット；国際公開第２０１４１５１９６０号パンフレット；国際公開第２０１４１６４３４８号パンフレット；国際公開第２０１４１９７６３８号パンフレット；国際公開第２０１４１９７６３８号パンフレットに記載され、参照により全て本明細書に組み込まれる。
【０６８７】
別の例において、ＣＡＲ発現細胞は、誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐａｓｅ−９）分子も発現でき、これは、二量体化因子薬物（例えば、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ（ＡＰ１９０３（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）又はＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ）とも呼ばれる）の投与により、細胞のカスパーゼ−９活性化及びアポトーシスに至る。ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、二量体化（ＣＩＤ）結合ドメインの化学誘導因子を含み、これは、ＣＩＤの存在下で二量体化に介在する。これは、ＣＡＲ発現細胞の誘導的及び選択的枯渇に至る。ある場合、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲコードベクターと別の核酸分子によりコードされる。ある場合、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲコードベクターと同じ核酸分子によりコードされる。ｉＣａｓｐａｓｅ−９は、ＣＡＲ発現細胞の何らかの毒性を避けるための安全スイッチを提供できる。例えば、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８；１５（１０）：６６７−７５；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｄ．Ｎｏ．ＮＣＴ０２１０７９６３；及びＤｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１１；３６５：１６７３−８３を参照されたい。
【０６８８】
本発明のＣＡＲ治療を制御するための代替的戦略は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘発により、例えばＣＡＲ発現細胞を消失させることにより、ＣＡＲ活性の脱活性化又は遮断する小分子又は抗体の利用を含む。例えば、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、細胞死、例えばＡＤＣＣ又は補体誘導性細胞死を誘発できる分子により認識される抗原も発現し得る。例えば、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、抗体又は抗体フラグメントにより標的化され得る受容体も発現し得る。このような受容体の例は、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７及びＥＧＦＲ並びにその切断バージョン（例えば、１つ以上の細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の１つ以上の領域を欠くバージョン）を含む。
【０６８９】
例えば、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、シグナル伝達能力を欠くが、ＡＤＣＣを誘発できる分子、例えばセツキシマブ（アービタックス（登録商標））により認識されるエピトープを保持する切断型上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）も発現し、その結果、セツキシマブの投与がＡＤＣＣ及び続くＣＡＲ発現細胞の枯渇を誘発する（例えば、国際公開第２０１１／０５６８９４号パンフレット及びＪｏｎｎａｌａｇａｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１３；２０（８）８５３−８６０を参照されたい）。別の戦略は、例えば、ＡＤＣＣによりＣＡＲ発現細胞の選択的枯渇をもたらす、リツキシマブに結合する、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞におけるＣＤ３２及びＣＤ２０抗原の両方からの標的エピトープをあわせる、高度に小型のマーカー／自殺遺伝子の発現を含む（例えば、Ｐｈｉｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４（８）１２７７−１２８７を参照されたい）。本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を枯渇させる他の方法は、例えば、ＡＤＣＣ誘発により、破壊するために成熟リンパ球、例えばＣＡＲ発現細胞に選択的に結合し、標的とするモノクローナル抗ＣＤ５２抗体であるＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）の投与を含む。他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体を使用して選択的に標的化され得る。一実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えばＡＤＣＣ又はＡＤＣ活性を引き起こし、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことができる。他の実施形態において、ＣＡＲリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体は、細胞致死を誘発する薬剤、例えばトキシンに結合させ、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことができる。代わりに、ＣＡＲ分子自体、下記のように、活性が制御され得る、例えば活性化又は遮断され得るように配置できる。
【０６９０】
他の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞除去剤により認識される標的タンパク質も発現し得る。一実施形態において、標的タンパク質は、ＣＤ２０であり、Ｔ細胞除去剤は、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブである。このような実施形態において、ＣＡＲ発現細胞を減少又は除去する、例えばＣＡＲ誘発毒性を軽減することが望まれるときにＴ細胞除去剤を投与する。他の実施形態において、Ｔ細胞除去剤は、本明細書の実施例に記載されるように、抗ＣＤ５２抗体、例えばアレムツズマブである。
【０６９１】
他の実施形態において、ＲＣＡＲは、本明細書に記載の標準的ＣＡＲの要素、例えば抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインが個別のポリペプチド又はメンバーに配置された、一連の典型的には最も単純な実施形態において２つのポリペプチドを含む。一部の実施形態において、一連のポリペプチドは、二量体化分子の存在下で互いにポリペプチドを結合できる、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる二量体化スイッチを含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２７２６１号パンフレットに記載されるような二量体化スイッチを利用する。このような制御可能ＣＡＲの更なる記載及び例示定期配置は、本明細書及び２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／０９０２２９号パンフレット（例えば、段落５２７〜５５１）に提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＲＣＡＲは、スイッチドメイン、例えば、配列番号１１４に記載されるようなＦＫＢＰスイッチドメインを含むか、又は例えば配列番号１１５に示されるような、ＦＲＢと結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ＲＣＡＲは、例えば配列番号１１６に示されるような、ＦＲＢ配列を含むスイッチドメイン又は例えば配列番号１１７〜１２２のいずれかに記載されるような、変異型ＦＲＢ配列を含む。
【化３４】
2021500894.tif 000066
【０６９２】
【表３２】
2021500894.tif 000067
【０６９３】
ＲＮＡトランスフェクション
インビトロで転写されたＲＮＡ  ＣＡＲを産生する方法が本明細書に開示される。ＲＮＡ  ＣＡＲ及びそれを使用する方法は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落５５３〜５７０に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０６９４】
免疫エフェクター細胞は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされたＣＡＲを含み得る。一態様において、本明細書に記載のＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＣＡＲ発現細胞の産生のために、例えば本明細書に記載される方法により作製される、免疫エフェクター細胞に導入される。
【０６９５】
一実施形態において、インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲを一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入できる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産生鋳型を使用するインビトロ転写により産生される。任意の供給源からの目的のＤＮＡを、適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型にＰＣＲにより直接変換できる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列又はＤＮＡのあらゆる他の適切な供給源であり得る。インビトロ転写のための所望の鋳型は本明細書中に記載されるＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ  ＣＡＲの鋳型は、本明細書に記載の腫瘍関連抗原に対する抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域（例えば、本明細書に記載のヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメインなどの本明細書に記載の膜貫通ドメイン）；及び細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むものを含む細胞質領域を含む。
【０６９６】
一実施形態において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であり得る。一実施形態において、核酸は、５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のいくらか又は全てを含み得る。核酸は、エクソン及びイントロンを含み得る。一実施形態において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の実施形態において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、代わりに、天然に存在する生物で通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。例示的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するようにライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。ライゲートされたＤＮＡの部分は、単一生物由来又は１つを超える生物由来であり得る。
【０６９７】
ＰＣＲを使用して、トランスフェクションに使用するｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型を産生する。ＰＣＲを実施する方法は、当技術分野で周知である。ＰＣＲにおいて使用するプライマーは、ＰＣＲのための鋳型として使用するＤＮＡの領域に実質的に相補的である領域を有するように設計する。本明細書で使用する「実質的に相補的」は、プライマー配列の残基の大部分又は全てが相補的であるか又は１つ以上の塩基が非相補的又はミスマッチである、ヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用するアニーリング条件下においてＤＮＡ標的とアニール又はハイブリダイズできる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される（オープンリーディングフレーム）核酸の部分を増幅するように設計できる。プライマーは、目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計できる。一実施形態において、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲの全て又は一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコーディング領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当技術分野で周知の合成法により産生できる。「順方向プライマー」は、増幅するＤＮＡ配列の上流であるＤＮＡ鋳型上にヌクレオチドに対して実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配列に対する５位を指すために本明細書で使用する。「逆方向プライマー」は、増幅するＤＮＡ配列の下流である、二本鎖ＤＮＡ鋳型に対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配列に対する３’位を指すために本明細書で使用する。
【０６９８】
ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼを本明細書に開示する方法で使用できる。試薬及びポリメラーゼは、多数の供給元から市販されている。
【０６９９】
安定性及び／又は翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用し得る。実施形態において、ＲＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを有する。一実施形態において、５’ＵＴＲは、１〜３０００ヌクレオチド長である。コーディング領域に付加する５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域をアニールするＰＣＲのためのプライマーの設計を含むが、これに限定されない異なる方法により変わり得る。このアプローチを使用して、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクション後、最適翻訳効率を達成するのに必要な５’及び３’ＵＴＲ長を修飾できる。
【０７００】
５’及び３’ＵＴＲは、目的の核酸のための天然に存在する内在性５’及び３’ＵＴＲであり得る。代わりに、目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列を順方向及び逆方向プライマーへのＵＴＲ配列の取り込みにより又は鋳型の任意の他の修飾により付加できる。目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率の修飾のために有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列のＡＵリッチ要素は、ｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られる。したがって、３’ＵＴＲを、当技術分野で周知であるＵＴＲの特性に基づき、転写されたＲＮＡの安定性を増加するように選択及び設計できる。
【０７０１】
一実施形態において、５’ＵＴＲは、内在性核酸のＫｏｚａｋ配列を含み得る。代わりに、目的の核酸に対して内在性ではない５’ＵＴＲを上記のようにＰＣＲにより付加するとき、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を５’ＵＴＲ配列の付加により再設計できる。Ｋｏｚａｋ配列は、あるＲＮＡ転写物の翻訳効率を上げることができるが、効率的翻訳を可能とするために全ＲＮＡで必要であるように見えない。多くのｍＲＮＡについてのＫｏｚａｋ配列に対する必要性は、当技術分野で公知である。他の実施形態において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の実施形態において、種々のヌクレオチドアナログを、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために３’又は５’ＵＴＲにおいて使用できる。
【０７０２】
遺伝子クローニングの必要性なしにＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするために、転写のプロモーターは、転写する配列の上流のＤＮＡ鋳型に結合すべきである。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列が順方向プライマーの５’末端に追加されるとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に取り込まれる。一実施形態において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載するような、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列が当技術分野で公知である。
【０７０３】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、リボソーム結合、翻訳開始及び細胞におけるｍＲＮＡの安定性を決定する、５’末端及び３’ポリ（Ａ）テールの両者にキャップを有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えばプラスミドＤＮＡ上において、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞における発現に適しない長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直線化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後ポリアデニル化されても、真核トランスフェクションに有効ではない正常サイズのｍＲＮＡを生じる。
【０７０４】
直鎖状ＤＮＡ鋳型で、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を越えて転写物の３’末端を伸長できる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：６２２３−３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５−６５（２００３））。
【０７０５】
ＤＮＡ鋳型に伸びるポリＡ／Ｔの組込みの慣用法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミド不安定性を生じ得、これは、細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型が多くの場合に欠失及び他の異常で高度に汚染されている理由である。これにより、クローニング工程は、困難で時間がかかるだけでなく、多くの場合に信頼できないものとなる。これが、クローニングを伴わないポリＡ／Ｔ  ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の産生を可能にする方法が非常に望ましい理由である。
【０７０６】
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００ＴテールなどのポリＴテールを含む逆方向プライマーを使用するＰＣＲ中（配列番号１２３）（サイズは、５０〜５０００Ｔであり得る（配列番号３２））又はＤＮＡライゲーション若しくはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない任意の他の方法によりＰＣＲ後に産生できる。ポリ（Ａ）テールはまた、ＲＮＡに安定性を提供し、その分解を減らす。一般に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正に相関する。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１００〜５０００アデノシンである（例えば、配列番号３３）。
【０７０７】
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）のなどのポリ（Ａ）ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後更に伸長できる。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールの１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチドへの長さの延長（配列番号３４）は、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍増加を生じる。更に、３’末端への異なる化学基の付加は、ｍＲＮＡ安定性を増加させ得る。このような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰアナログは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールに取り込まれ得る。ＡＴＰアナログは、ＲＮＡの安定性を更に高め得る。
【０７０８】
５’キャップもＲＮＡ分子に安定性を提供する。一実施形態において、本明細書に開示する方法により産生されたＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載の技術を使用して提供される（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６−４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８−９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８−９６６（２００５））。
【０７０９】
本明細書に開示する方法により産生されたＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始し、翻訳開始を促進するあらゆるイルス、染色体又は人工設計配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤及び界面活性剤などの細胞透過性及び生存能を促進する因子を含有し得る、細胞電気穿孔に適した任意の溶質が含まれ得る。
【０７１０】
ＲＮＡを、多数の異なる方法、例えば商業的に利用可能な方法のいずれかを使用して標的細胞に導入でき、これは、電気穿孔（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、（ＥＣＭ  ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）又はＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ，Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマー封入、ペプチド介在トランスフェクション又は「遺伝子銃」などの微粒子銃粒子送達系（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１−７０（２００１）を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。
【０７１１】
非ウイルス送達方法
いくつかの態様において、非ウイルス方法を使用して、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を細胞又は組織又は対象に送達できる。
【０７１２】
いくつかの実施形態において、非ウイルス方法は、トランスポゾン（転位因子とも呼ばれる）の使用を含む。いくつかの実施形態において、トランスポゾンは、ゲノムの位置にそれ自体挿入できるＤＮＡのフラグメント、例えば自己複製性であり、そのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡのフラグメント又は長い核酸の外にスプライシングされ、ゲノムの別の場所に挿入されることができるＤＮＡのフラグメントである。例えば、トランスポゾンは、転位のための逆位反復フランキング遺伝子からなるＤＮＡ配列を含む。
【０７１３】
例示的なトランスポゾンを使用する核酸送達法は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系（ＳＢＴＳ）及びｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾン系を含む。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０．Ｒ１（２０１１）：Ｒ１４−２０；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５（２００８）：２９６１−２９７１；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２００８）：５８０−５８９；Ｇｒａｂｕｎｄｚｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８（２０１０）：１２００−１２０９；Ｋｅｂｒｉａｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．１２２．２１（２０１３）：１６６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６．９（２００８）：１５１５−１６；Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２．１２（２００７）：３１５３−６５；及びＤｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．１２２．３（２００５）：４７３−８３（これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０７１４】
ＳＢＴＳは２つの成分：１）導入遺伝子を含むトランスポゾン、及び２）トランスポサーゼ酵素の供給源を含む。トランスポサーゼは、担体プラスミド（又は他のドナーＤＮＡ）から、宿主細胞染色体／ゲノムなどの標的ＤＮＡにトランスポゾンを転位できる。例えば、トランスポサーゼは、担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、トランスポゾン（導入遺伝子含有）をプラスミドの外に切り出し、宿主細胞のゲノムに入れる。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．上掲を参照されたい。
【０７１５】
例示的なトランスポゾンは、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、全て参照により本明細書に組み込まれるＧｒａｂｕｎｄｚｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１．３（２０１３）：１８２９−４７；及びＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８．８（２００８）：２９６１−２９７１を参照されたい。例示的なトランスポサーゼは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポサーゼ、例えばＳＢ１０トランスポサーゼ又はＳＢ１１トランスポサーゼを含む（例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現できる機能亢進トランスポサーゼ）。例えば、全て参照により本明細書に組み込まれるＡｒｏｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．；Ｋｅｂｒｉａｅｉ  ｅｔ  ａｌ．；及びＧｒａｂｕｎｄｚｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０７１６】
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸の効率的組込み及び発現を可能にする。例えば、ＳＢＴＳなどのトランスポゾン系を使用する、本明細書に記載のＣＡＲを安定に発現する細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を産生する方法が本明細書に提供される。
【０７１７】
本明細書に記載の方法により、いくつかの実施形態において、ＳＢＴＳ成分を含む１つ以上の核酸、例えばプラスミドが細胞に送達される（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）。例えば、核酸は、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）送達の標準法、例えば本明細書に記載の方法、例えば電気穿孔、トランスフェクション又はリポフェクションにより送達される。いくつかの実施形態において、核酸は、導入遺伝子、例えば本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸）を含むトランスポゾン並びにトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の実施形態において、例えば、デュアルプラスミド系、例えば第１のプラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第２のプラスミドがトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、２核酸の系が提供される。例えば、第１及び第２の核酸は、宿主細胞に共送達される。
【０７１８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞は、ヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系又は操作されたメガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ）を使用するＳＢＴＳ及び遺伝子編集の遺伝子挿入の組み合わせを使用して産生される。
【０７１９】
いくつかの実施形態において、非ウイルス送達方法の使用は、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の再プログラミング及び対照への細胞の直接注入を可能にする。非ウイルスベクターの利点は、患者集団に見合うために必要な十分量の産生が容易且つ比較的安価であること、保存中の安定性及び免疫原性の欠如を含むが、これらに限定されない。
【０７２０】
製造／生産の方法
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、細胞（例えば、本明細書に記載されるような免疫エフェクター細胞）での処置後にＴ細胞枯渇剤を投与すること、それにより、ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）を減少させる（例えば、枯渇させる）ことを更に含む。そのようなＴ細胞枯渇剤は、ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）を効果的に枯渇させて、毒性を緩和するために使用することができる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書の方法に従って製造され、例えば、本明細書の方法に従ってアッセイされた（例えば、トランスフェクション又は形質導入前又は後）。
【０７２１】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、本明細書に記載の細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団の投与の１、２、３、４又は５週間後に投与される。
【０７２２】
一実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体誘導性細胞死を誘導することにより、ＣＡＲ発現細胞を枯渇させる薬剤である。例えば、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、細胞死、例えば、ＡＤＣＣ又は補体誘導性細胞死を誘発できる分子により認識される抗原（例えば、標的抗原）も発現し得る。例えば、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、抗体又は抗体フラグメントにより標的化され得る標的タンパク質（例えば、受容体）も発現し得る。このような標的タンパク質の例は、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７及びＥＧＦＲ及びその切断バージョン（例えば、１つ以上の細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の１つ以上の領域を欠くバージョン）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０７２３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲ及び標的タンパク質を共発現し、例えば、天然で標的タンパク質を発現するか、又は標的タンパク質を発現するように操作される。例えば、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＡＲ核酸（例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＲ核酸）及び標的タンパク質をコードする核酸を含む核酸（例えば、ベクター）を含み得る。
【０７２４】
一実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、ＣＤ５２阻害剤、例えば、抗ＣＤ５２抗体分子、例えば、アレムツズマブである。
【０７２５】
他の実施形態において、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載されるようなＣＡＲ分子（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ）及びＴ細胞枯渇剤によって認識される標的タンパク質を発現する。一実施形態において、標的タンパク質はＣＤ２０である。標的タンパク質がＣＤ２０である実施形態において、Ｔ細胞除去剤は抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブである。
【０７２６】
前述の方法のいずれかの更なる実施形態において、方法は、細胞、例えば造血幹細胞又は骨髄を、哺乳動物に移植することを更に含む。
【０７２７】
別の態様において、本発明は、細胞移植前に哺乳動物をコンディショニングする方法を特徴とする。方法は、哺乳動物に、ＣＡＲ核酸又はポリペプチド、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ核酸又はポリペプチドを含む、有効量の細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、細胞移植は、幹細胞移植、例えば、造血幹細胞移植又は骨髄移植である。他の実施形態において、細胞移植前に対象をコンディショニングすることは、対象における標的発現細胞、例えば、ＣＤ１９発現正常細胞又はＣＤ１９発現癌細胞の数を減少させることを含む。
【０７２８】
免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）の活性化及び増殖
本明細書に記載の方法により生成又は濃縮されたＴ細胞などの免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に記載する方法を使用して、一般的に活性化及び増殖され得る。
【０７２９】
一般に、免疫エフェクター細胞、例えばＴ制御性細胞枯渇細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体結合シグナルを刺激する薬剤が結合したその表面と、Ｔ細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドを接触させることにより増殖できる。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は抗ＣＤ２抗体との接触又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触により、本明細書に記載のように刺激し得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドである。例えば、Ｔ細胞集団を、Ｔ細胞の増殖刺激に適する条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用できる。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８を含み（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、当技術分野で一般に知られる他の方法のように使用できる（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０７３０】
一態様において、Ｔ細胞のための一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中でも表面と結合し得る。表面に結合しているとき、薬剤は、同じ表面（すなわち「シス」形態）又は別の表面（すなわち「トランス」形態）に結合し得る。代わりに、一方の薬剤が表面に結合し、他方が溶液にあり得る。一態様において、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中であるか又は表面と結合する。一態様において、両剤は、溶液中にあり得る。一態様において、薬剤は、不溶性形態であり、Ｆｃ受容体又は抗体又は薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面に架橋され得る。この点に関して、例えば本発明におけるＴ細胞の活性化及び増殖のために意図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書及び同第２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
【０７３１】
一態様において、２剤は、ビーズに、同じビーズ、すなわち「シス」又は別のビーズ、すなわち「トランス」で固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合フラグメントであり、両剤は、均等な分子量で同じビーズに共固定化される。一態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及びＴ細胞増殖のためのビーズに結合した１：１比の各抗体を使用する。本発明の一態様において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、Ｔ細胞増殖の増殖が観察されるように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を使用する。特定の一態様において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して約１〜約３倍増加が観察される。一態様において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体比は、１００：１〜１：１００及びその間の全ての整数値の範囲である。一態様において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合しており、すなわちＣＤ３：ＣＤ２８比が１未満である。一態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体比は、２：１より大きい。特定の一態様において、ビーズに結合した１：１００  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：７５  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。更なる態様において、ビーズに結合した１：５０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：３０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：１０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：３  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。更なる態様において、ビーズに結合した３：１  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。
【０７３２】
１：５００〜５００：１及びその間の任意の整数値の粒子対細胞比をＴ細胞又は他の標的細胞の刺激のために使用し得る。当業者に容易に認識され得るように、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは、少ない細胞にのみ結合でき、大きいビーズは、多く結合できる。一態様において、細胞対粒子比は、１：１００〜１００：１及びその間の任意の整数値の範囲であり、更なる態様において１：９〜９：１及びその間の任意の整数値からなる比をＴ細胞刺激に使用し得る。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は、上記のように変わり得るが、しかしながら、ある好適な値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１及び１５：１を含み、１つの好適な比は少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。一態様において、１：１以下の粒子対細胞比を使用する。特定の一態様において、好適な粒子：細胞比は、１：５である。更なる態様において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、一態様において、粒子対細胞比は、１日目は１：１〜１０：１であり、更なる粒子をその後１０日目まで連日又は隔日で細胞に添加し、最終比１：１〜１：１０である（添加の比の細胞数に基づく）。特定の一態様において、粒子対細胞比は、刺激１日目に１：１であり、刺激３日目及び５日目に１：５に調節する。一態様において、粒子を、１日目の１：１及び刺激３日目及び５日目の１：５の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。一態様において、粒子対細胞比は、刺激１日目は２：１であり、刺激３日目及び５日目に１：１０に調節する。一態様において、粒子を、１日目の１：１及び３日目及び５日目の１：１０の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が本発明における使用に適し得ることを認識する。特に、比は、粒子径並びに細胞サイズ及びタイプによる。一態様において、使用するための最も典型的な比は、１日目の１：１、２：１及び３：１付近である。
【０７３３】
更なる態様において、Ｔ細胞などの細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズ及び細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。異なる態様において、培養前に薬剤被覆ビーズ及び細胞を分離するが、一緒に培養する。更なる態様において、ビーズ及び細胞を磁気力などの力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。
【０７３４】
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ（３ｘ２８ビーズ）とＴ細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。一態様において、細胞（例えば、１０４〜１０９Ｔ細胞）及びビーズ（例えば、ＤＹＮＡビーズＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズを１：１比）を緩衝液、例えばＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなどの二価カチオンなし）中で合わせる。再び、任意の細胞濃度を使用し得ることが当業者に容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、試料中で極めて稀であり、試料の０．０１％のみが含まれるか又は試料全体（すなわち１００％）が目的の標的細胞で構成され得る。したがって、あらゆる細胞数が本発明に関連して一体となる。一態様において、細胞と粒子との最大接触を確実にするために、粒子及び細胞を混合する体積を有意に減少させる（すなわち細胞の濃度を高める）ことが望ましいことがある。例えば、一態様において、約１００億細胞／ｍｌ、９０億細胞／ｍｌ、８０億細胞／ｍｌ、７０億細胞／ｍｌ、６０億細胞／ｍｌ、５０億細胞／ｍｌ又は２０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。一態様において、１億細胞／ｍｌ超を使用する。更なる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万又は５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。更なる態様において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの濃度を使用する。更なる態様において、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加できる。更に、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有し得、及び特定の態様では得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度細胞の使用は、通常、ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０７３５】
一実施形態において、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸が形質導入された細胞を例えば本明細書に記載の方法により増殖する。一実施形態において、細胞を数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間）〜約１４日（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日）の期間の培養により増殖する。一実施形態において、細胞は、４〜９日の期間増殖される。一実施形態において、細胞は、８日以下、例えば７日、６日又は５日の期間増殖される。一実施形態において、細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件において９日間培養で増殖された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、多様なＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死、サイトカイン産生、活性化、遊走又はそれらの組み合わせにより規定され得る。一実施形態において、５日増殖された細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍又は４倍増加を示す。一実施形態において、細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞を発現する細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えばＩＦＮ−γ及び／又はＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。一実施形態において、５日増殖された細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生、例えばＩＦＮ−γ及び／又はＧＭ−ＣＳＦレベルのｐｇ／ｍｌで少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれを超えて増加する。
【０７３６】
Ｔ細胞の培養期間が６０日以上となり得るような数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清（例えば、胎児ウシ又はヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ−α又は当業者に知られる細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート、及びＮ−アセチル−システイン、及び２−メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、無血清又は適切な量の血清（又は血漿）が添加されたか、又は規定されたセットのホルモン及び／又はＴ細胞の増殖及び拡大に十分な量のサイトカインが添加されたＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５及びＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシンは、実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養に含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。
【０７３７】
一実施形態において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーなどの本明細書に記載の方法により測定して、１４日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）増加をもたらす１つ以上のインターロイキンを含む適切な培地（例えば、本明細書に記載の培地）で増殖させる。一実施形態において、細胞は、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−７（例えば、ＩＬ−１５及びＩＬ−７）の存在下で増殖させる。
【０７３８】
実施形態において、本明細書に記載の方法、例えばＣＡＲ発現細胞製造法は、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞を、例えば抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して細胞集団から除去することを含む。細胞集団からＴ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞を除去する方法は、本明細書に記載される。実施形態において、方法、例えば製造法は、細胞集団（例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞などのＴ制御性細胞が枯渇されている細胞集団；又は抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンドと前に接触された細胞集団）とＩＬ−１５及び／又はＩＬ−７との接触を更に含む。例えば、細胞集団（例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンドと先に接触されている）をＩＬ−１５及び／又はＩＬ−７の存在下で増殖させる。
【０７３９】
一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチド又はＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの組み合わせ、例えばｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物とＣＡＲ発現細胞の製造中に例えばエクスビボで接触させることを含む。実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞をＣＡＲ発現細胞の製造中に例えばエクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞をＣＡＲ発現細胞の製造中に例えばエクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチド及びＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組み合わせを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞をＣＡＲ発現細胞の製造中に例えばエクスビボで、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
【０７４０】
一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチド及びＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。一実施形態において、接触は、リンパ球亜集団、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞の生存及び増殖をもたらす。
【０７４１】
種々の刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液又はアフェレーシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性又はサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体での刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８〜９日目前まで主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を産生するが、約８〜９日目後、Ｔ細胞集団は、徐々に大きくなるＴＣ細胞集団を含む。したがって、処置の目的により、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することは有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットを大きい程度まで増殖させることが有利であり得る。
【０７４２】
更に、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中、有意に、しかし、主に再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物をもたらす能力を可能とする。
【０７４３】
本明細書に記載のＣＡＲが構築されると、適切なインビトロ及び動物モデルにおける抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのＴ細胞増殖の持続及び抗癌活性など、しかし、これらに限定されない分子の活性を評価するために種々のアッセイが使用され得る。本発明のＣＡＲの効果を評価するためのアッセイは、以下に更に詳細に記載される。
【０７４４】
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６９５に記載されるように、単量体及び二量体の存在を検出するために使用できる。
【０７４５】
抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビトロ増殖をフローサイトメトリーにより測定できる。例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８  ａＡＰＣで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下において、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。代表的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ又はホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの培養６日目にフローサイトメトリーにより評価する。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。代わりに、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用するＣＡＲとｅＧＦＰを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、１日目にＣＡＲを形質導入する。培養物を本明細書に記載されるような癌関連抗原＋Ｋ５６２細胞（本明細書に記載されるような癌関連抗原を発現するＫ５６２）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体存在下でｈＣＤ３２及び４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）でのいずれかで再刺激し、続いて洗浄する。外来性ＩＬ−２を、１００ＩＵ／ｍｌを隔日で培養物に添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。
【０７４６】
再刺激非存在下の持続するＣＡＲ＋Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。簡潔には、平均Ｔ細胞体積（ｆｌ）を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激及び１日目の記載するＣＡＲの形質導入後、培養８日目にＣｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ粒子カウンター、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｃｅｐｔｅｒを使用して測定する。
【０７４７】
動物モデルも、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６９８に記載されるように、ＣＡＲ発現細胞活性の測定に使用できる。
【０７４８】
用量依存的ＣＡＲ処置応答は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６９９に記載されるように、評価できる。
【０７４９】
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落７００に記載されるように、以前に説明されている。
【０７５０】
細胞毒性は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落７０１に記載されるように、標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。
【０７５１】
細胞毒性は、例えば、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞アナライザー（ＲＴＣＡ）を使用して、付着細胞の電気インピーダンスの変化を測定することによっても評価できる。いくつかの実施形態において、細胞毒性は複数の時点で測定される。
【０７５２】
造影テクノロジーは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落７０２に記載されるように、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送及び増殖を評価するために使用することができる。
【０７５３】
本明細書の実施例部分に記載のもの並びに当分野で知られるものを含む、他のアッセイも、本明細書に記載のＣＡＲの評価に使用できる。
【０７５４】
ここに開示する方法の代わりに又はこれと組み合わせて、ＣＡＲリガンドの使用を含む、ＣＡＲ発現細胞（例えば、インビトロ又はインビボ（例えば、臨床モニタリング））、免疫細胞増殖及び／又は活性化及び／又はＣＡＲ特異的選択の１つ以上の検出及び／又は定量のための方法及び組成物が開示される。一つの例示的実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ分子に結合する、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに結合する抗体である（例えば、抗原結合ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体；又は細胞外結合ドメインの定常領域に結合する抗体）。他の実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ抗原分子である（例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＲ抗原分子）。
【０７５５】
一態様において、ＣＡＲ発現細胞を検出及び／又は定量する方法が開示される。例えば、ＣＡＲリガンドは、インビトロ又はインビボでＣＡＲ発現細胞の検出及び／又は定量に使用できる（例えば、患者におけるＣＡＲ発現細胞の臨床モニタリング又は患者への投薬）。方法は、
ＣＡＲリガンド（任意選択により、標識ＣＡＲリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射活性又は蛍光標識を含むＣＡＲリガンド）を提供し；
ＣＡＲ発現細胞を獲得し（例えば、製造サンプル又は臨床サンプルなどのＣＡＲ発現細胞含有サンプルの獲得）；
ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドを、結合が生じる条件下で接触させ、それにより、存在するＣＡＲ発現細胞のレベル（例えば、量）を検出することを含む。ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドの結合は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなどのような標準技術を使用して検出できる。
【０７５６】
別の態様において、増殖及び／又は活性化細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）を増殖する方法が開示される。方法は、
ＣＡＲ発現細胞（例えば、第１のＣＡＲ発現細胞又は一過性に発現されるＣＡＲ細胞）を提供し）；
前記ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンド、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＲリガンドを、免疫細胞増殖及び／又は増殖が生じる条件下で接触させ、それにより、活性化及び／又は増殖集団を産生することを含む。
【０７５７】
特定の実施形態において、ＣＡＲリガンドは基質上に存在する（例えば、基質、例えば、天然に存在しない基質に固定化又は結合される）。いくつかの実施形態において、基質は、非細胞基質である。非細胞基質は、例えば、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、膜（例えば、ニトロセルロース膜）、マトリックス、チップ又はビーズから選択される固体支持体であり得る。実施形態において、ＣＡＲリガンドは、基質に存在する（例えば、基質表面上）。ＣＡＲリガンドを、基質に共有又は非共有（例えば、架橋）により固定、結合又は会合させ得る。一実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ビーズに結合（例えば、共有結合）する。前記実施形態において、免疫細胞集団をインビトロ又はエクスビボで増殖できる。方法は、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ分子のリガンド存在下、免疫細胞の集団を培養することを更に含む。
【０７５８】
他の実施形態において、細胞を増殖及び／又は活性化する方法は、更に第２の刺激性分子、例えば、ＣＤ２８の添加を含む。例えば、ＣＡＲリガンド及び第２の刺激性分子を基質、例えば、１つ以上のビーズに固定し、それにより細胞増殖及び／又は活性化を増加させ得る。
【０７５９】
更に別の態様において、ＣＡＲ発現細胞を選択又は富化する方法を提供する。方法は、ＣＡＲ発現細胞と本明細書に記載されるようなＣＡＲリガンドを接触させ、ＣＡＲリガンドの結合に基づき細胞を選択することを含む。
【０７６０】
更に他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞を枯渇、減少及び／又は死滅する方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞と本明細書に記載されるようなＣＡＲリガンドを接触させ；及び細胞を、ＣＡＲリガンドの結合に基づき標的化し、それによりＣＡＲ発現細胞の数を減らす及び／又は殺傷することを含む。一実施形態において、ＣＡＲリガンドは、毒性剤と結合する（例えば、トキシン又は細胞除去剤）。別の実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣ又はＡＤＣ活性を生じ得る。
【０７６１】
本明細書に開示する方法において使用できる例示的な抗ＣＡＲ抗体は、例えば、国際公開第２０１４／１９０２７３号パンフレット及びＪｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔ  ＣＤ１９−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ”，ＰＬＯＳ  Ｍａｒｃｈ  ２０１３  ８：３  ｅ５７８３８に記載され、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０７６２】
いくつかの態様及び実施形態において、本明細書における組成物及び方法は、例えば、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年７月３１日出願の米国特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０４３２１９号明細書に記載のような、Ｔ細胞の特定のサブセットのために最適化される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の最適化サブセットは、対照Ｔ細胞、例えば、同じ構築物を発現する異なるタイプ（例えば、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋）のＴ細胞と比較して、残留性の増強を示す。
【０７６３】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲを含み、そのＣＡＲは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に適する（例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る）細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲを含み、そのＣＡＲは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に適する（例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る）細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン又はＩＣＯＳドメイン以外の共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲは、本明細書に記載の抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含む。
【０７６４】
一態様において、本明細書に記載されるのは、対象、例えば、癌を有する対象を処置する方法である。方法は、前記対象に、有効量の：
１）抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；及び
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば第１の共刺激ドメイン、例えばＩＣＯＳドメイン
を含む、ＣＡＲを含むＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＡＲＣＤ４＋）；並びに
２）ＣＡＲを含むＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＡＲＣＤ８＋）であって、
抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；及び
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば第２の共刺激ドメイン、例えば４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン又はＩＣＯＳドメイン以外の別の共刺激ドメイン
を含むもの
を投与することを含み、ここで、ＣＡＲＣＤ４＋とＣＡＲＣＤ８＋は互いに異なる。任意選択により、方法は、更に、
３）ＣＡＲを含む第２のＣＤ８＋Ｔ細胞（第２のＣＡＲＣＤ８＋）であって、
抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；及び
第２のＣＡＲＣＤ８＋が、ＣＡＲＣＤ８＋上に存在しない細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインを含み、任意選択により、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインを含まない、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０７６５】
バイオポリマー送達方法
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する１つ以上のＣＡＲ発現細胞を、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与又は送達し得る。バイオポリマー足場は、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞の送達、増殖及び／分散を支持又は強化することができる。バイオポリマー足場は、生体適合性（例えば、炎症性又は免疫応答を実質的に誘発しない）及び／又は天然に存在し得るか又は合成である生分解性ポリマーを含む。例示的なバイオポリマーは、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落１００４〜１００６に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０７６６】
医薬組成物及び処置
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるように産生されたＣＡＲ発現細胞を、任意選択により１つ以上の他の治療と組み合わせて、投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるようなＣＡＲ発現細胞を含む反応混合物を、任意選択により１つ以上の他の治療と組み合わせて、投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるようなＣＡＲ発現細胞を含む反応混合物を発送又は受領する方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるように産生されたＣＡＲ発現細胞を受領することを含み、ＣＡＲ発現細胞を、任意選択により１つ以上の他の治療と組み合わせて、患者に投与することを更に含む、患者を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるようなＣＡＲ発現細胞を産生することを含み、ＣＡＲ発現細胞を、任意選択により１つ以上の他の治療と組み合わせて、患者に投与することを更に含む、患者を処置する方法を提供する。他の療法は、例えば、化学療法などの癌療法であり得る。
【０７６７】
一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞を、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて対象に投与する。Ｔｒｅｇ細胞数を減らす（例えば、枯渇させる）方法は当分野で知られ、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与、ＧＩＴＲ機能修飾を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、アフェレーシス前又は本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞投与前に対象におけるＴｒｅｇ細胞数を減らすことは、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）の数を減らし、対象の再発のリスクを減らすと考えられる。
【０７６８】
一実施形態において、本明細書に記載の治療、例えば、ＣＡＲ発現細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させるＧＩＴＲアゴニスト及び／又はＧＩＴＲ抗体などのＧＩＴＲを標的とする及び／又はＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて対象に投与される。実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞を、対象にシクロホスファミドと組み合わせて投与する。一実施形態において、ＧＩＴＲ結合分子及び／又はＧＩＴＲ機能を調節する分子（例えば、ＧＩＴＲアゴニスト及び／又はＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体）を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストを細胞のアフェレーシス前に投与できる。実施形態において、シクロホスファミドを、対象にＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入又は再注入）前又は細胞のアフェレーシス前に投与する。実施形態において、シクロホスファミド及び抗ＧＩＴＲ抗体を、対象にＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入又は再注入）前又は細胞のアフェレーシス前に投与する。一実施形態において、対象は癌（例えば、固形癌又はＡＬＬ又はＣＬＬなどの血液癌）を有する。一実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。実施形態において、対象はＡＬＬを有する。実施形態において、対象は固形癌、例えば、本明細書に記載の固形癌を有する。例示的なＧＩＴＲアゴニストは、例えば、米国特許第６，１１１，０９０号明細書、欧州特許第０９０５０５Ｂ１号明細書、米国特許第８，５８６，０２３号明細書、国際公開第２０１０／００３１１８号パンフレット及び同２０１１／０９０７５４号パンフレットに記載のＧＩＴＲ融合タンパク質又は例えば米国特許第７，０２５，９６２号明細書、欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号明細書、米国特許第７，８１２，１３５号明細書、米国特許第８，３８８，９６７号明細書、米国特許第８，５９１，８８６号明細書、欧州特許出願公開第ＥＰ１８６６３３９号明細書、国際公開第２０１１／０２８６８３号パンフレット、国際公開第２０１３／０３９９５４号パンフレット、国際公開第２００５／００７１９０号パンフレット、国際公開第２００７／１３３８２２号パンフレット、国際公開第２００５／０５５８０８号パンフレット、国際公開第９９／４０１９６号パンフレット、国際公開第２００１／０３７２０号パンフレット、国際公開第９９／２０７５８号パンフレット、国際公開第２００６／０８３２８９号パンフレット、国際公開第２００５／１１５４５１号パンフレット、米国特許第７，６１８，６３２号明細書及び国際公開第２０１１／０５１７２６号パンフレットに記載される抗ＧＩＴＲ抗体など、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質及び抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）を含む。
【０７６９】
一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、本明細書に記載のＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて対象に投与する。一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストを、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストを細胞のアフェレーシス前に投与できる。一実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。
【０７７０】
本明細書に記載の方法は、医薬組成物中にＣＡＲ発現細胞を製剤化することを更に含み得る。医薬組成物は、本明細書に記載のように、ＣＡＲ発現細胞、例えば複数のＣＡＲ発現細胞を１つ以上の薬学的に又は生理学的に許容される担体、希釈剤又は添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチド又はアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。組成物は、例えば静脈内投与のために、製剤化することができる。
【０７７１】
一実施形態において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞又はプラスミド成分、細菌及び真菌からなる群から選択される汚染物が実質的になく、例えば検出可能なレベルで存在しない。一実施形態において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ａ群からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０７７２】
「免疫学的に有効量」、「抗癌有効量」、「癌阻害有効量」又は「治療量」が示されるとき、組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染の程度又は転移及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して医師が決定できる。本明細書に記載の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を含む医薬組成物を、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、いくつかの例において１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の範囲の用量（これらの範囲内の全整数値を含む）で投与し得ると一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物をまたこの用量で複数回投与し得る。細胞を、免疫療法において一般に知られる注入技術を使用して投与できる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。
【０７７３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８又は５×１０８細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、少なくとも約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８又は５×１０８細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、最大約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８又は５×１０８細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、約１．１×１０６〜１．８×１０７細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９又は５×１０９細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、少なくとも約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９又は５×１０９細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、最大約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９又は５×１０９細胞を含む。
【０７７４】
特定の態様において、活性化された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を対象に投与し、その後、血液を再採取し（又はアフェレーシスを実施し）、そこから免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化し、これらの活性化及び増殖した免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を患者に再注入することが望ましい場合がある。この過程を数週間毎に複数回実施できる。特定の態様において、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血した血液から活性化することができる。特定の態様において、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ又は１００ｃｃの採血した血液から活性化される。
【０７７５】
対象組成物の投与は、任意の簡便な方法により実施し得る。本明細書に記載の組成物は、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により又は腹腔内に、例えば、皮内又は皮下注射により患者に投与し得る。免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の組成物を、腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注射し得る。
【０７７６】
本明細書に開示される実施形態の例示は、例えば、２０１６年１２月２７日に出願された国際公開第２００７／１１７１１２号パンフレットの２０４〜２１９ページの実施例１〜１０に記載されており、これは、前記実施例に関連する図面及び図面の説明文を含め、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０７７７】
例示的な解糖阻害剤
いくつかの実施形態において、解糖は、解糖阻止剤、例えば、本明細書に記載される小分子解糖阻止剤を用いて、阻害、例えば、抑制することができる。いくつかの実施形態において、解糖阻止剤は、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）の阻害剤、ミトコンドリアヘキソキナーゼ２（ＨＫ２）の阻害剤、ホスホフルクトキナーゼ２（ＰＦＫ２）の阻害剤、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ１）の阻害剤及びピルビン酸キナーゼ２（ＰＫＭ２）の阻害剤、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）の阻害剤、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）の阻害剤、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の阻害剤、トランスケトラーゼ様１（ＴＫＴＬ１）の阻害剤又は表５に開示された阻害剤から選択される。
【０７７８】
いくつかの実施形態において、解糖阻止剤、例えば小分子解糖阻止剤は、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）、３−ブロモピルビン酸（３−ＢＰ）、ロニダミン、（２Ｅ）−３−（３−ピリジニル）−１−（４−ピリジニル）−２−プロペン−１−オン（３ＰＯ）、Ｎ４Ａ、ＹＺ９、ＰＧＭＩ−００４Ａ、ＭＪＥ３、ＴＴ−２３、シコニン／アルカンニン、ＦＸ１１、キノリン３−スルホンアミド、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、６−アミノニコチンアミド（６−ＡＮ）又はオキシチアミンから選択される。
【０７７９】
いくつかの実施形態において、解糖阻止剤は、２−ＤＧである。２−デオキシ−Ｄ−マンノース又は２−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘキソースとしても知られる２−ＤＧは、グルコース類似体であり、例えば、グルコース代謝の競合的阻害剤として作用する。２−ＤＧは、化学名：（４Ｒ、５Ｓ、６Ｒ）−６−（ヒドロキシメチル）オキサン−２，４，５−トリオール及び以下の化学構造を有する。
【化３５】
2021500894.tif 000068
【０７８０】
【表３３】
2021500894.tif 000069
【０７８１】
例示的な解糖阻害剤は、Ｑｉａｎ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ；３（２）：３７−５７に開示され、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０７８２】
実施形態において、本明細書に開示される方法、反応混合物又は組成物は、０．５〜２０ｍＭ、１〜１０ｍＭ又は１．５〜２．５ｍＭの範囲の濃度で２−ＤＧを含む。いくつかの実施形態において、２−ＤＧの濃度は、少なくとも０．５、１．０、１．５、２．０又は２．５ｍＭである。他の実施形態において、２−ＤＧの濃度は２ｍＭである。
【０７８３】
本明細書に開示される方法、反応混合物又は組成物のいずれかの実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞集団は、２−ＤＧ、例えば、１ｍＭの２−ＤＧと、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４４、４８、５２、６０、７０、８０、９０、１００時間以上（例えば、最大約２又は３週間）にわたり、接触される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞集団は、２−ＤＧ、例えば、２ｍＭの２−ＤＧと、少なくとも４８時間にわたり、接触される。
【０７８４】
２−ＤＧによる解糖の阻害は、例えば、Ｈｕａｎｇ  ＣＣ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ＆Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ８：１２４７−１２５４に開示され、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０７８５】
Ｓｔａｔ３アクティベーター及びＳｔａｔ３分子
本明細書に開示される方法、使用又は反応混合物のいずれかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、
ｉ）ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体又はＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子、ＯＳＭ分子；
ｉｉ）例えば、本明細書に記載されるような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）；
ｉｉｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、例えば二量体；
ｉｖ）ＩＬ−６ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＩＬ−３１分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子又はＯＳＭ分子）；
ｖ）ＣＣＬ２０分子；
ｖｉ）例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−１０Ｒ２受容体（ＩＬ−１０Ｒ２）アクティベーター、例えば、ＩＬ−１０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子、ＩＬ−２９分子又はＩＬ−１０Ｒ２に結合する抗体分子；
ｖｉｉ）ＩＬ−１０ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０分子、ＩＬ−１９分子、ＩＬ−２０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２４分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子又はＩＬ−２９分子）；
ｖｉｉｉ）ＩＬ−１７ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ１７Ａ分子、ＩＬ１７Ｂ分子、ＩＬ１７Ｃ分子、ＩＬ１７Ｄ分子、ＩＬ１７Ｅ分子又はＩＬ１７Ｆ分子）；又は
ｉｘ）ＩＬ−２３分子
を含む。
【０７８６】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体である。
【０７８７】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、例えば本明細書に記載されるような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）である。
【０７８８】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、例えば本明細書に記載されるようなＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、例えば二量体である。
【０７８９】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ＩＬ−６ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ−６分子、ＩＬ−１１分子、ＩＬ−２７分子、ＩＬ−３１分子、ＣＮＴＦ分子、ＣＴ−１分子、ＣＬＣ分子、ＬＩＦ分子、ＮＰ分子又はＯＳＭ分子）である。
【０７９０】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ＣＣＬ２０分子である。
【０７９１】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−１０Ｒ２受容体（ＩＬ−１０Ｒ２）アクティベーター、例えば、ＩＬ−１０分子、ＩＬ−２２分子、ＩＬ−２６分子、ＩＬ−２８Ａ分子、ＩＬ−２８Ｂ分子、ＩＬ−２９分子又はＩＬ−１０Ｒ２に結合する抗体分子である。
【０７９２】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ＩＬ−１７ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ１７Ａ分子、ＩＬ１７Ｂ分子、ＩＬ１７Ｃ分子、ＩＬ１７Ｄ分子、ＩＬ１７Ｅ分子又はＩＬ１７Ｆ分子）である。
【０７９３】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ＩＬ−２３分子である。
【０７９４】
本明細書に開示される方法、使用又は反応混合物のいずれかの実施形態において、Ｓｔａｔ３分子は、配列番号１０００のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３分子は、配列番号１０００のアミノ酸配列を含む。
【０７９５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＳｔａｔ３分子は、配列番号１００１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３分子は、配列番号１００１のヌクレオチド配列又は配列番号１００１のヌクレオチド２４１〜２５５３によってコードされる。
【０７９６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞、例えばＣＡＲ発現細胞は、配列番号１００１の配列又は配列番号１００１のヌクレオチド２４１〜２５５３を含む、核酸配列、例えば導入遺伝子を含む。
Ｓｔａｔ３アミノ酸配列；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６４４８０５．１（配列番号１０００）
【化３６】
2021500894.tif 000070
Ｓｔａｔ３ヌクレオチド配列；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿１３９２７６．２（配列番号１００１）
【化３７】
2021500894.tif 000071
【化３８】
2021500894.tif 000072
【０７９７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＳｔａｔ３分子は、Ｓｔａｔ３ポリペプチド、例えば、野生型Ｓｔａｔ３又は構成的に活性なＳｔａｔ３ポリペプチド、例えば、ＳＴＡＴ３Ｃである。Ｓｔａｔ３の構成型は、Ｓｔａｔ３遺伝子のＳｔａｔ３−Ｃ変異型によってコードされる。Ｓｔａｔ３−Ｃでは、Ｓｔａｔ３のＳＨ２ドメインのＣ末端ループ内の２つのシステイン残基の置換により、自然に二量体化し、ＤＮＡに結合し、転写を活性化する分子が産生され、こうして構成的に活性な分子が生じる（Ｂｒｏｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９８：２９５−３０３）。
【０７９８】
本明細書に開示される方法、使用又は反応混合物のいずれかの実施形態において、ＩＬ−６分子は、配列番号１００２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６分子は、配列番号１００２のアミノ酸配列を含む。
【０７９９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ−６分子は、配列番号１００３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６分子は、配列番号１００３のヌクレオチド配列又は配列番号１００３のヌクレオチド１２２〜７６０によってコードされる。
【０８００】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞、例えばＣＡＲ発現細胞は、配列番号１００３の配列又は配列番号１００３のヌクレオチド１２２〜７６０を含む、核酸配列、例えば導入遺伝子を含む。
ＩＬ−６アミノ酸配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ６８２７８．１（配列番号１００２）
【化３９】
2021500894.tif 000073
ＩＬ−６ヌクレオチド配列；ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００６００．４（配列番号１００３）
【化４０】
2021500894.tif 000074
【０８０１】
本明細書に開示される方法、使用又は反応混合物のいずれかの実施形態において、ｇｐ１３０分子は、配列番号１００４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０分子は、配列番号１００４のアミノ酸配列を含む。
【０８０２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｇｐ１３０分子は、配列番号１００５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０分子は、配列番号１００５のヌクレオチド配列又は配列番号１００５のヌクレオチド１１３〜２８６９によってコードされる。
【０８０３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞、例えばＣＡＲ発現細胞は、配列番号１００５の配列又は配列番号１００５のヌクレオチド１１３〜２８６９を含む、核酸配列、例えば導入遺伝子を含む。
ｇｐ１３０アミノ酸配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＩ１７４０３．１（配列番号１００４）
【化４１】
2021500894.tif 000075
ｇｐ１３０ヌクレオチド配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ１１７４０２．１（配列番号１００５）
【化４２】
2021500894.tif 000076
【０８０４】
抗ｇｐ１３０抗体
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ｇｐ１３０アクティベーター、例えばｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体である。
【０８０５】
抗ｇｐ１３０抗体分子も本明細書に開示される。抗ｇｐ１３０抗体分子は、例えば、Ｇｕ  Ｚ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０００）１４：１８８−１９７に開示され、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０８０６】
本明細書に開示される方法、使用又は反応混合物のいずれかの実施形態において、抗ｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｓ１２抗ｇｐ１３０抗体若しくはＢ−Ｐ８抗ｇｐ１３０抗体又はＢ−Ｓ１２及びＢ−Ｐ８抗体の両方を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、いくつかの実施形態において、Ｂ−Ｓ１２及び／又はＢ−Ｐ８抗体分子は、ｇｐ１３０の二量体化をもたらすと考えられている。
【０８０７】
いくつかの実施形態において、抗ｇｐ１３０抗体は、以下の特徴：
ｉ）ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２のリン酸化によって測定されるような、ｇｐ１３０によって媒介されるシグナル伝達を誘導すること；
ｉｉ）ＩＬ−６阻害剤、例えばＳｔｔａｔｉｃ又は本明細書に記載の阻害剤によって阻害されないこと；
ｉｉｉ）骨髄腫細胞株の増殖を促進すること；
ｉｖ）初代骨髄腫細胞の生存を支持すること、又は
ｖ）二量体化、例えばｇｐ１３０のホモ二量体化又はｇｐ１３０のヘテロ二量体化、例えばＬＩＦ、ＯＳＭ若しくはＣＮＴＦによるものを誘導すること
の１つ、２つ、３つ、４つ又はそれを超える数（例えば、全て）を有する。
【０８０８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｓ１２又はＢ−Ｐ８からの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＣＤＲを有する抗体分子を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ又はそれらの組み合わせに従って定義される。
【０８０９】
いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｓ１２からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｓ１２の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｓ１２の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｓ１２の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上並びにＢ−Ｓ１２の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上を含む。
【０８１０】
いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｐ８からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｐ８の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｐ８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０抗体分子は、Ｂ−Ｐ８の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上並びにＢ−Ｐ８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上を含む。
【０８１１】
いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０抗体、例えばＢ−Ｓ１２又はＢ−Ｐ８抗体分子は、少なくとも０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９又は２ｕｇ／ｍｌ、且つ任意選択により最大約２ｕｇ／ｍｌ、例えば、約１ｕｇ／ｍｌの量で提供される。いくつかの実施形態において、ｇｐ１３０抗体、例えばＢ−Ｓ１２又はＢ−Ｐ８抗体分子は、１ｕｇ／ｍｌの量で提供される。
【０８１２】
いくつかの実施形態において、抗ｇｐ１３０抗体分子は、第１及び第２の抗ｇｐ１３０抗体分子、例えば、Ｂ−Ｓ１２及びＢ−Ｐ８抗体分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｂ−Ｓ１２及びＢ−Ｐ８抗体分子は、約１：１の比率で提供される。いくつかの実施形態において、Ｂ−Ｓ１２及びＢ−Ｐ８抗体は、０．１〜１０００、０．５〜５００又は１〜１００ｕｇ／ｍｌの合計量で提供される。いくつかの実施形態において、Ｂ−Ｓ１２及びＢ−Ｐ８抗体分子は、それぞれ少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９又は２ｕｇ／ｍｌ、且つ任意選択により最大約２ｕｇ／ｍｌ、例えば、それぞれ約０．５ｕｇ／ｍｌの量で提供される。いくつかの実施形態において、Ｂ−Ｓ１２及びＢ−Ｐ８抗体分子は、それぞれ０．５ｕｇ／ｍｌの量で提供される。
【０８１３】
いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターは、ｇｐ１３０に結合する抗体分子、例えば、本明細書に記載されるような抗ｇｐ１３０抗体である。
【０８１４】
いくつかの実施形態において、作製方法、例えば製造方法、例えば本明細書に記載されるようなものは、例えば初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞が濃縮されている（例えば、そのレベルが増加している）、Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の集団をもたらす。
【０８１５】
いくつかの実施形態において、方法は、例えば本明細書に記載されるように、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋初期メモリーＴ細胞の濃縮をもたらす。いくつかの実施形態において、初期メモリーＴ細胞は、以下の特徴の一方又は両方を有する：ＣＤ２７＋及び／又はＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇ（例えば、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇ）。いくつかの実施形態において、方法は、例えば本明細書に記載されるように、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋が疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮をもたらす。
【０８１６】
いくつかの実施形態において、方法は、例えば本明細書に記載されるように、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋が疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮をもたらす。いくつかの実施形態において、疲弊していない初期メモリーＴ細胞は、以下の特徴：（ｉ）ＰＤ−１陰性；（ｉｉ）ＣＤ２７ｈｉ；（ｉｉｉ）ＣＣＲ７ｈｉ；又は（ｉｖ）ＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇの１つ以上、例えば全てを有する。いくつかの実施形態において、疲弊していない初期メモリーＴ細胞は、ＰＤ−１陰性ＣＤ２７ｈｉＣＣＲ７ｈｉＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇである。
【０８１７】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞、例えば、初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮された集団は、増加したレベルの、例えば、少なくとも５〜９０％多い（例えば、少なくとも５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜７０若しくは７０〜９０％多い又は少なくとも５〜９０、１０〜８５、１５〜８０、２０〜７５、２５〜７０、３０〜７０、３５〜６５、４０〜６０若しくは４５〜５５％多い）、初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞を有する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞、例えば、初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮された集団は、増加したレベルの、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０％多い）、初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞を有する。
【０８１８】
いくつかの実施形態において、増加したレベルの初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞は、例えば実施例２に記載されているように、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されなかった以外には同様のＴ細胞集団と比較される。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されなかった以外には同様のＴ細胞集団は、同じＴ細胞集団、例えば濃縮が実施されたもの、例えば、前濃縮集団、例えば開始集団、例えば、実施例２に記載されるようなものである。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されなかった以外の点では同様のＴ細胞集団は、異なるＴ細胞集団、例えば、濃縮が実施されなかった集団である。
【０８１９】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞、例えば、初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮集団は、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されなかった以外には同様のＴ細胞集団と比較して、増加したレベルの、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０％多い（例えば、少なくとも８％多い）、初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞を有する。
【０８２０】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば、初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞の濃縮集団は、Ｓｔａｔ３アクティベーターと接触されなかった以外には同様のＴ細胞集団と比較して、増加したレベルの、例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０％多い（例えば、少なくとも２０％多い）、初期メモリーＴ細胞又は疲弊していない初期メモリーＴ細胞を有する。
【実施例】
【０８２１】
本発明を、次の実験的実施例を参照して更に詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみを目的として提供し、特に断らない限り限定を意図しない。したがって、本発明は、決して次の実施例に限定されると解釈してはならず、むしろ本明細書に提供する教示の結果として明らかとなる任意且つ全ての変形形態を含むと解釈すべきである。
【０８２２】
実施例１：ＣＴＬ０１９細胞の解糖代謝
ＣＤ１９指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞を少なくとも１回投与された、高度に前処置されたハイリスクＣＬＬの症状の進行した４１人の患者からのＣＡＲ  Ｔ細胞サンプルの代謝変化について評価した。
【０８２３】
結果
部分応答（ＰＲ）又は応答なし（ＮＲ）の患者からのＣＡＲ  Ｔ細胞は、解糖遺伝子の特性を示した。遡及的細胞注入産物サンプルのＣＡＲ特異的刺激は解糖及びグルコース類似体の取り込みを増加させ（図２）、これはＣＬＬ患者Ｔ細胞が合成ＣＡＲのライゲーションによって代謝調節を受けることができるという証拠を提供する。ＣＡＲは、ＣＲ／ＰＲＴＤ（部分応答、輸血依存性）患者と比較してＰＲ／ＮＲからＴ細胞を刺激し、これらの細胞の転写プロファイルと一致する（図１Ａ−１Ｄ）グルコース類似体のより高い取り込みを示した（図３）。更に、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を使用した解糖の遮断により、エフェクター分化が減少し、セントラルメモリー表現型を有するＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度が増加した（図４及び図５）。
【０８２４】
解糖系の薬理学的阻害は、ＣＤ１９発現腫瘍細胞による再刺激後、増殖能力が増強されたメモリーＣＴＬ０１９リンパ球の形成を付随的に促進した（図６）。これらの結果は、ＣＲ患者とＰＲＴＤ患者から生成されたＴ細胞が、持続性と強力な抗腫瘍効力の特性を付与できる遺伝子発現プロファイルを示し、解糖代謝の低下がＣＡＲ  Ｔ細胞効力を高めるための使用可能な細胞生産の改善を表す可能性があることを示す。
【０８２５】
この実施例で説明された知見は、腫瘍制御の媒介に関与するメカニズム的に関連する亜集団の高い絶対数又はより高い相対存在量を持つ培養物の選択及び／又はこれらの亜集団のより高い絶対数又は相対存在量に対して、リンパ球集団（ＣＡＲ＋Ｔリンパ球集団を含む）を偏らせる生産条件を提供することにより、養子導入Ｔリンパ球の治療有効性を高める潜在的有効性を強調する。最適な分化能とエフェクター活性を備えたＣＡＲ  Ｔ細胞注入産物の生成は、培養時間の最小化、代替サイトカインの使用及び代謝工学によっても達成できる可能性がある。
【０８２６】
材料及び方法
ベクター産生、Ｔ細胞の分離及びＣＴＬ０１９細胞の生成
４−１ＢＢ／ＣＤ３ζドメイン（ＧｅＭＣＲＩＳ０６０７−７９３）を備えたＣＤ−１９特異的ＣＡＲをコードする導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターが、構築及び産生された。自己Ｔ細胞を白血球アフェレーシスにより回収し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体でコーティングした臨床グレードの常磁性ポリスチレンビーズで活性化した後、上記のレンチウイルスベクターで形質導入した。ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、エクスビボで９〜１１日間増殖した。大規模ＣＴＬ０１９細胞培養中の絶対細胞数は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して取得された。集団の倍増は、方程式Ａｔ＝Ａ０２ｎを使用して計算された。ｎは集団の倍増の数、Ａ０は細胞のインプット数、Ａｔは細胞の総数である。
【０８２７】
フローサイトメトリー
ＣＴＬ０１９細胞の増殖と持続性及び末梢Ｂ−ＣＬＬ負荷の定期的な縦方向の測定は、前述の通り、６パラメーターのＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行われた。Ｔ細胞の深部免疫表現型検査では、ＰＢＭＣ又はＣＴＬ０１９注入産物（バルクＴ細胞又は蛍光活性化セルソーティングにより精製された特定のサブセット）をアクアブルー死細胞除去色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とプレインキュベートし、その後、市販のフローサイトメトリー抗体で表面染色した。ＣＡＲ１９タンパク質発現は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲート抗イディオタイプモノクローナル抗体を使用し検出された。この研究で使用された全ての抗体は、使用前に滴定され、ポジティブイベントのゲートを設定するために各抗体パネルに対して蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照が作成された。細胞は、カスタム１７色、１９パラメーターの特別注文ＬＳＲフォルテッサ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用しデータを分析した。
【０８２８】
ＣＬＬ患者のＣＡＲ  Ｔ細胞によるグルコース取り込みの測定
遡及的ＣＬＬ患者のＣＴＬ０１９細胞を解凍し、２４ウェル組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に１×１０６細胞／ｍｌで静置した後、抗イディオタイプ抗体被覆ビーズで一晩刺激して、同族ＣＤ１９抗原による抗ＣＤ１９ＢＢζＣＡＲのトリガーを再現した。同様にコンジュゲートされたアイソタイプ抗体被覆ビーズを偽対照として使用した。ビーズは、各患者の注入産物の形質導入効率に応じて、３ビーズ：１細胞の割合で追加した。酵素診断キットは、製造元（Ｓｉｇｍａ）の取扱説明書に従い使用された。この代謝産物のさまざまな濃度から生成されたシグナルを使用して、標準曲線を作成した。偽刺激及びＣＡＲ刺激Ｔ細胞からの細胞上清を回収し、機器に適応した。一晩刺激した後、細胞を洗浄し、新鮮なＲＰＭＩでｒｅ−４５８を補給し、２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＮＢＤＧ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を最終濃度５００μＭで添加した。２−ＮＢＤＧと３０分間のインキュベーション後、細胞を氷上に置き、フローサイトメトリー用に染色して、蛍光標識されたグルコース類似体を取り込んだＣＡＲ＋Ｔ細胞を検出した。
【０８２９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の代謝調節
解糖阻害剤２−デオキシグルコース（２−ＤＧ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の有無にかかわらず、抗ＣＤ１９ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成した。培養の９日後、これらの細胞の分化表現型をフローサイトメトリーにより決定した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分取し、ＣＤ１９（Ｋ５６２−ＣＤ１９）を発現するよう操作された照射Ｋ５６２細胞を１：１で組み合わせた。ＣＴＬ０１９細胞はＫ５６２−ＣＤ１９標的で３倍に再刺激された。増殖アッセイ中に、ＬＵＮＡ自動細胞計数装置（Ｌｏｇｏｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して絶対細胞数を取得した。
【０８３０】
実施例２：ＣＤ１９発現キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３経路の活性化
ＣＤ１９指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞を少なくとも１回投与された、高度に前処置されたハイリスクＣＬＬの症状の進行した患者からのＣＡＲ  Ｔ細胞サンプルのＳＴＡＴ３経路活性化について評価した。
【０８３１】
材料及び方法
患者サンプル
ペンシルベニア大学承認の単剤ＣＴＬ０１９療法の臨床試験について施設内治験審査委員会（ＩＲＢ）に登録されているＣＬＬ患者からサンプルを取得した。全ての参加者は、ヘルシンキ宣言及び臨床試験実施基準のための調和ガイドラインに関する国際会議に従って、書面によるインフォームドコンセントを提出した。これらの研究は、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖに登録されている（識別子：ＮＣＴ０１０２９３６６、ＮＣＴ０１７４７４８６及びＮＣＴ０２６４０２０９）。
【０８３２】
ベクター産生、Ｔ細胞の分離及びＣＴＬ０１９細胞の生成
４−１ＢＢ／ＣＤ３ζドメイン（ＧｅＭＣＲＩＳ  ３７７  ０６０７−７９３）を備えたＣＤ−１９特異的ＣＡＲをコードする導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターが、構築及び産生された。自己Ｔ細胞を白血球アフェレーシスにより回収し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体でコーティングした臨床グレードの常磁性ポリスチレンビーズで活性化した後、上記のレンチウイルスベクターで形質導入した。ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は、エクスビボで９−１１日間増殖した。大規模ＣＴＬ０１９細胞培養中の絶対細胞数は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して取得された。集団の倍増は、方程式Ａｔ＝Ａ０２ｎを使用して計算された。ｎは集団の倍増の数、Ａ０は細胞のインプット数、Ａｔは細胞の総数である。
【０８３３】
ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ３遮断の測定。
ＣＬＬ患者からのＣＴＬ０１９細胞注入産物を解凍し、抗イディオタイプ抗体被覆ビーズ又は偽ビーズで刺激した。一部の実験では、細胞を最終濃度１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．）で１０分間刺激した。細胞サブセット評価実験では、ＩＬ−６による急性刺激前に、対象となる集団を表面マーカーで染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分取した。刺激後、細胞をＰｈｏｓｆｌｏｗ  Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、１２分間３７℃で固定し、Ｐｈｏｓｆｌｏｗ  Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して氷上で３０分間透過処理した。細胞内染色は、製造元の推奨する濃度において、抗ＳＴＡＴ３（ｐＹ７０５）抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し室温で６０分間行われた。サンプルは、ＬＳＲフォルテッサ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で直ちに取得された。ＳＴＡＴ３経路の遮断は、最終濃度５μＭで、ＳＴＡＴ３特異的阻害剤であるＳｔａｔｔｉｃ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）の存在の有無にかかわらず、抗ＣＤ１９ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞を産生することにより行われた。当量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、ネガティブビヒクルのみの対照として役割を果たす。ＳＴＡＴ３シグナル伝達を阻害するＳｔａｔｔｉｃの能力は、上記のフォスフロー染色で評価した。分取されたＣＡＲ  Ｔ細胞及び照射されたＫ５６２−ＣＤ１９細胞を使用した連続再刺激アッセイは上記のように実施された。ＬＵＮＡ自動細胞計数装置（Ｌｏｇｏｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖の過程で絶対細胞数及び生存率を同時に測定した。
【０８３４】
サイトカイン分析
ＣＴＬ０１９産物を、上記のように抗イディオタイプ抗体被覆ビーズ又はアイソタイプ対照抗体被覆ビーズと一晩培養し、上清を回収した。血清は、ベースライン時及び定義されたＣＴＬ０１９後の処置時点で遠心分離により患者の全血から分離された。これらのサンプルは、使い捨てアリコートで分配され、−８０℃で保存された。上記の培養上清及び血清サンプル中のサイトカインの測定は、製造元（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の取扱説明書に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアレイプラットフォームを使用して行った。全てのサンプルを３回分析し、９ポイントの標準曲線を使用して複数の内部標準と比較した。データの取得はＦｌｅｘＭＡＰ−３Ｄシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）で行われ、分析はＸＰｏｎｅｎｔ４．０ソフトウェアと５パラメーターロジスティック回帰分析７を使用して実行された。
【０８３５】
フローサイトメトリー
ＣＴＬ０１９細胞の増殖４３５と持続性及び末梢Ｂ−ＣＬＬ負荷の定期的な縦方向の測定は、前述の通り、６パラメーターのＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行われた。Ｔ細胞の深部免疫表現型検査では、ＰＢＭＣ又はＣＴＬ０１９注入産物（バルクＴ細胞又は蛍光活性化セルソーティングにより精製された特定のサブセット）をアクアブルー死細胞除去色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とプレインキュベートし、その後、市販のフローサイトメトリー抗体で表面染色した。ＣＡＲ１９タンパク質発現は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲート抗イディオタイプモノクローナル抗体を使用し検出された。この研究で使用された全ての抗体は、使用前に滴定され、ポジティブイベントのゲートを設定するために各抗体パネルに対して蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照が作成された。細胞は、カスタム１７色、１９パラメーターの特別注文ＬＳＲフォルテッサ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用しデータを分析した。
【０８３６】
結果
ＣＡＲ刺激後のＣＲ、ＰＲＴＤ、ＰＲ及びＮＲ患者注入産物に由来するＣＴＬ０１９細胞から産生されたサイトカイン及びケモカインのプロファイルを評価した。図７Ａに示すように、ＣＲ及びＰＲＴＤの対象から製造されたＣＤ１９指向性Ｔ細胞は、ＰＲｓ及びＮＲｓと比較して、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−３１及びＣＣＬ２０を含むＳＴＡＴ３シグナル伝達メディエーター及び標的のレベルが高いことが示された。この発見は、ＣＡＲ刺激された評価可能なＣＲ及びＰＲＴＤ患者のＣＴＬ０１９細胞におけるＩＬ−６／ＳＴＡＴ３経路の上方制御と一致していた（図７Ｂ）。これらの知見は、ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３の活性化が、分化の少ない多能性Ｔリンパ球の生成に関与している可能性があることを示唆している。
【０８３７】
次いで、リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）のレベルが、非常に強力なＣＲ／ＰＲＴＤ患者ＣＡＲ  Ｔ細胞注入産物を、機能性が不十分なＰＲ／ＮＲ対象の産物から分離できるかどうかを判断した。ＣＡＲ特異的ｐＳＴＡＴ３活性は、ＰＲ／ＮＲ患者から増殖されたＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＣＲ／ＰＲＴＤ患者からのＣＴＬ０１９細胞において有意に上昇した（図７Ｃ）。これらの知見に一致して、刺激後の注入前のＣＴＬ０１９細胞において、インビボでのＣＡＲ  Ｔ細胞の最大増殖及び血清ＩＬ−６とＩＬ−６／ＳＴＡＴ３経路遺伝子濃縮との間に強い直接的な相関が観察された（図７Ｄ）。したがって、ＣＴＬ０１９細胞におけるＳＴＡＴ３シグナル伝達の薬理学的遮断は、生存率に影響を与えることなく（図８Ｃ）、ＣＤ１９発現白血病細胞（図８Ａ−８Ｂ）での連続再刺激時にそれらの増殖能力を減少させた。ＣＴＬ０１９細胞の製造中に外因性のＩＬ−６を培地に添加することによりｐＳＴＡＴ３の活性を増加させると、ＣＤ１９発現腫瘍標的で繰り返し刺激した後、増殖能及びＣＡＲ  Ｔ細胞の絶対数が増加した（図９）。メモリーＴ細胞の形成と維持におけるＳＴＡＴ３シグナル伝達の新たな役割を考慮すると、この経路の誘導は、ＣＡＲ  Ｔ細胞産物におけるあまり分化していない細胞の境界であるだけでなく、注入後、その増殖と長期生存のために機能的にも重要である可能性があり得る。
【０８３８】
図１０に示すように、ＣＴＬ０１９療法に対する応答を有する可能性及び高用量のＣＤ２７＋ＰＤ−１−ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＣＴＬ０１９産物の注入との間に非常に有意な関連が観察された。ＣＤ２７＋ＰＤ−１−ＣＤ８＋サブセットは、ＩＬ−６受容体−ｂ鎖（ＣＤ１３０又はｇｐ１３０としても知られている）（図１１Ｂ）の著しく高いレベルに起因するＩＬ−６刺激に応答するｐＳＴＡＴ３を上方制御する集団から構成される（図１１Ａ）。図１２（左パネル）は、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ２７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ２７−ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ２７−ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ２７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、より高いレベルのｇｐ１３０を発現することを示している。図１２（右パネル）は、他のサブセットと比較して、より高い頻度のｇｐ１３０発現細胞がＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ２７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団で観察されることを示している。更に、図１４Ａに示すように、ＰＤ−１陰性ＣＤ２７ｈｉＣＣＲ７ｈｉＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇ非疲弊初期メモリーＴ細胞表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｇｐ１３０を発現、例えば、選択的に発現する。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞のｇｐ１３０ベースのポジティブ選択は濃縮、例えば初期メモリー表現型Ｔ細胞を選択的に濃縮した（図１４Ｂ）。濃縮されたＴ細胞、例えば初期メモリー表現型Ｔ細胞は、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇの表現型を有し得る。図１４Ｂに示すように、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｇｐ１３０ベースの濃縮は、濃縮前と比較して、ＣＤ２７＋及びＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇの表現型を有するＴ細胞の集団の増加をもたらした。ｇｐ１３０による濃縮後、濃縮前の３８．４％と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の４６％がＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇであった。ｇｐ１３０による濃縮後、濃縮前の５５．１％と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の７６．１％がＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯｄｉｍ／ｎｅｇであった。
【０８３９】
したがって、これらの治験は、ＣＬＬに対するＣＡＲ  Ｔ細胞療法の有効性が、増加し得ることを示唆しており、例えば、ＣＤ２７＋ＰＤ−１−ＣＤ８＋細胞の絶対数が多いリンパ球を含む培養液を養子移入することによるものである。
【０８４０】
均等物
本明細書に引用するそれぞれの及び全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。本発明は、具体的態様を参照して開示しているが、本発明の他の態様及び変形形態は、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の当業者によって考案され得ることが明らかである。下記の特許請求の範囲は、全てのこのような態様及び均等な変形形態を含むと解釈されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021500894.tif 000094
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