(57)【要約】  本発明は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ホモポリマーまたはコポリマーと、少なくとも１種の活性剤と、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤とを含むナノ粒子であって、前述のアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、以下の式を有する化合物であり、2021534209.tif 000020  式中、Ｒ１は、Ｈであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、−Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシド、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン化物、カルボン酸、ケトン、またはアルデヒドからなる群から独立して選択され、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、０．００１〜１５重量％の量で存在する、ナノ粒子、ならびにナノ粒子の製造に適した方法を提供する。
2021534209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（アルキルシアノアクリレート）ホモポリマーまたはコポリマー、少なくとも１種の活性剤、ならびにアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤を含むナノ粒子であって、
前記アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、次の式を有する化合物であり、
【化１】
2021534209.tif 000018
式中、
Ｒ1は、Ｈであり、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、独立して、−Ｈ、−ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシド、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ハロゲン化物、カルボン酸、ケトン、またはアルデヒドからなる群から選択され、前記アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、０．００１〜１５重量％の量で存在する、ナノ粒子。
【請求項２】
前記活性剤が、Ｍ−ＮＨ3（式中、Ｍは金属である）、Ｒ−ＮＨ2、Ｒ1Ｒ2−ＮＨ、Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｎ、Ｒ1＝ＮＲ2、Ｒ−ＯＨ、Ｒ−Ｃｌ、Ｒ−Ｂｒ、Ｒ−Ｉ、Ｒ−ＳＨ、Ｒ1Ｎ＝ＮＲ2、Ｒ−ＮＨＯＨ、構造的に会合するＨ2Ｏおよびエノールからなる群から選択される官能基を有する化合物である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
請求項４〜１４のいずれかに記載の方法によって製造された、請求項１または２のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項４】
ポリ（アルキルシアノアクリレート）ホモポリマーまたはコポリマーのナノ粒子を調製するための方法であって、単一のステップで、水中油型ミニエマルションのアニオン重合を含み、前記ミニエマルションは、
（ｉ）少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーと、
（ｉｉ）少なくとも１種の界面活性剤と、
（ｉｉｉ）１種以上の活性剤と、
（ｉｖ）任意選択でアニオン重合開始剤と、
（ｖ）アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤と、を含み、前記アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、以下の式を有する化合物であり、
【化２】
2021534209.tif 000019
式中、
Ｒ1は、Ｈであり、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、独立して、−Ｈ、−ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシド、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ハロゲン化物、カルボン酸、ケトン、またはアルデヒドからなる群から選択される、方法。
【請求項５】
前記アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤が、求核試薬およびラジカルのいずれかと反応することができる単一の化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤が、前記ミニエマルションの油相の０．００１〜１５重量％の量で存在する、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤が、前記少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーよりもラジカルおよび求核試薬に対してより高い親和性を有する、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤が、１．０〜３．０の範囲、好ましくは１．０〜２．５の範囲、またはさらにより好ましくは１．０〜２．０の範囲のオクタノール−水分配係数（ｌｏｇＰ）を有する、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤が、４−ヒドロキシ−３，５−ジメチルベンズアルデヒド、４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシベンズアルデヒド、バニリン、サリチルアルデヒド、およびベンズアルデヒドからなる群から選択される、請求項４〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記活性剤が、治療剤または造影剤である、請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１種の界面活性剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、またはそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのポリアルキレングリコールである、請求項４〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１種の界面活性剤が、アニオン重合反応を開始する、請求項４〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉｉ）における前記少なくとも１種の界面活性剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、またはそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも２つのポリアルキレングリコールを含む、請求項４〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記活性剤が、Ｍ−ＮＨ3（式中、Ｍは金属である）、Ｒ−ＮＨ2、Ｒ1Ｒ2−ＮＨ、Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｎ、Ｒ1＝ＮＲ2、Ｒ−ＯＨ、Ｒ−Ｃｌ、Ｒ−Ｂｒ、Ｒ−Ｉ、Ｒ−ＳＨ、Ｒ1Ｎ＝ＮＲ2、Ｒ−ＮＨＯＨ、構造的に会合するＨ2Ｏおよびエノールからなる群から選択される官能基を含む、請求項４〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれかに定義されるナノ粒子と、１種以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項１６】
医薬で使用するための、好ましくは薬物送達または分子イメージングで使用するための、請求項１〜３のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１７】
農業、水産養殖、抗菌用途、栄養補助食品、食品／飼料用途、化粧品、自己治癒、家庭用用途、およびボディケアにおける請求項１〜３のいずれかに記載のナノ粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子および前記ナノ粒子を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノカプセル化の使用により、揮発性の、敏感な、または有害な材料／化合物を保護する／隠す／被覆する／分離する、所望の標的に送達する／共送達する必要がある多くの市場に活気に満ちた可能性をもたらす。これは、急速に発展しているナノメディシンの分野で特に重要である。
【０００３】
ナノ粒子の使用が特定の価値を実証し始めている２つの領域は、薬物送達および分子イメージングである。しかし、医薬用途に加えて、ナノ粒子は、芳香化合物、芳香剤、香料、色素、栄養補助食品、除草剤、駆除剤などの種々の材料／化合物のナノカプセル化においても非常に有利であり得る。
【０００４】
治療薬の送達のためのナノ粒子は、処方療法に対する患者のコンプライアンスの欠如、有害な副作用、および標的化送達の欠如と、最適ではない生体内分布とによる不十分な臨床効果を含む、従来の送達アプローチに関連する多くの課題を回避する可能性を有する。薬物送達のためのナノ粒子の重要な技術的利点としては、非水溶性薬物および不安定な薬物を送達する能力、疎水性および親水性の両方の治療薬の組み込み、ならびに種々の投与経路を利用する能力が挙げられる。ナノ粒子送達システムはまた、標的化薬物送達用途および徐放用途を容易にし、作用部位での薬物バイオアベイラビリティを高め、投与頻度および全体的な投与量の大きさを低減し、それによって副作用を最小限に抑えることができる。これらの潜在的な利点の結果として、薬物送達ビヒクルとして使用するために多様なナノ粒子システムが研究されてきた。これらには、高分子ミセル、ポリマー、高分子粒子、リポソーム、低密度リポタンパク質、固体脂質ナノ粒子、デンドリマー、親水性薬物−ポリマー複合体、およびセラミックナノ粒子が挙げられる。
【０００５】
ナノ粒子ベースの造影剤は、循環時間を増加させ、水溶性を変化させ、それによって急速なクリアランスを回避することができる。これまで使用されてきた粒子イメージングシステムの多くは、血液プールとリンパ系のイメージング専用に設計されている。ターゲティングイメージングシステムの使用により、標的部位での蓄積が増加することがあり得、感度がより高くなり、したがって、血液プールおよびリンパ系の外部での分子イメージングが可能になる。治療薬および造影剤の両方を含有する標的ナノ粒子は、疾患の診断、治療、および追跡モニタリングのための単一のビヒクルの使用を可能にし得ることが予想される。
【０００６】
高分子ナノ粒子は、医薬の分野で、特にポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）などの生分解性ポリマーを含むものは、大きな注目を集めているが、しかし、これまでに開発されたものは、高いクリアランス速度と、健康な組織を含む全身に分布する傾向のために、有効性が限定されている。したがって、ナノ粒子を使用した活性剤の制御された送達は、依然として課題であり、活性剤単独の投与と比較して長期の循環時間および安定性の向上を提供する活性剤の長期送達が可能な生体適合性組成物の開発が必要である。
【０００７】
長期循環ナノ粒子、すなわち循環系の安定性が向上したナノ粒子は、この点で研究されており、これらの問題の取り組みに寄与している。これらのタイプのナノ粒子は、ステルスコロナとして知られる、ナノ粒子の周りに親水性シェルを有する。これは、通常、親水性ポリマーによってもたらされ、ナノ粒子の血液循環半減期の増加につながり、循環時間が大幅に増加する。親水性シェルは、水を模倣し、免疫保護層として機能し、ナノ粒子を免疫系に対して比較的「見えない」ようにし、食細胞により取り込まれないようにする。ステルス構造のナノ粒子は周知であり、Ｒｅｖ．Ｎａｎｏｍｅｄ．Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００９，１，１１１−１２７，Ｓｔｏｒｍら，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  １９９５，１７：３１−４８  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｎｉｋ，Ｉｌｌｕｍ＆Ｄａｖｉｓ，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  １９９５，１６：１９５−２１４にＮｉｃｏｌａｓとＣｏｕｖｒｅｕｒが考察しているように、多様なナノ粒子コアと多様なポリマーシェルで調製されてきた。治療薬のカプセル化におけるそれらの使用はまた、例えば、ＵＳ２００２／００３４４７４に記載されている。市販の例は、ドキソルビシンを含有するペグ化リポソームを含むＤｏｘｉｌ（登録商標）がある。
【０００８】
ナノ粒子を調製するための多くの方法は、エマルション重合、自己組織化、ナノ沈殿などが知られている。アニオンエマルション重合は、例えば、ＵＳ２００８／０１３８４１８に記載されている。
【０００９】
ミニエマルション方法は、例えば、Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒが２００１，２２，８９６−９３６に、およびＬａｎｄｆｅｓｔｅｒらがＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９９，３２，５２２２−５２２８に開示しているように、通常１〜１０００ｎｍ、最も典型的には５０〜５００ｎｍの範囲の平均粒径を有するナノ粒子の生成について知られている。この方法は、最初に、Ｕｇｅｌｓｔａｄら（１９７３）によってＥｍｕｌｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｎｏｍｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔｓ．Ｊ  Ｐｏｌｙｍ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｌｅｔｔ第１１版：５０３−５１３に記載された。高分子ナノ粒子を調製するためのミニエマルション技術は、分散相の安定したナノエマルションを連続相で重合反応によってナノ粒子分散液に変換することによって分散液を調製する技術である。この技術は、連続相で乳化が行われる前に、分散相で種々の成分を混合することを含み、その結果、各液滴が活性剤およびモノマーと同一の組成を有するエマルションが生成される。これらの液滴ナノリアクターでは、あらゆる種類の重合反応を適用できる。本発明の場合、一般に連続相に開始剤を添加することによって開始される、液滴界面での水中油型ミニエマルションおよびアニオン重合が好ましい実施形態である。形成された粒子は、通常、粒径および粒径分布に関して、それらが調製される液滴と同一またはほぼ同一であり、方法の高い再現性となる。
【００１０】
ミニエマルションは通常、界面活性剤と共安定剤によって安定化され、者はしばしば「疎水性物質」と呼ばれる。共安定剤は、浸透圧を増加させることによってエマルションの浸透圧安定化に寄与し、液滴の表面張力による毛細管圧またはケルビン圧力に反作用し、小さな液滴から大きな液滴へのモノマーの拡散を最小限に抑えることによってオストワルド熟成を低減する。
【００１１】
従来のエマルション重合では、成分は、水、低水溶性のモノマー、水溶性開始剤、および界面活性剤で構成される。界面活性剤濃度が、臨界ミセル濃度を下回る場合、粒子は、連続相で不溶性になる成長中のポリマー鎖の沈殿および凝集によって形成される。界面活性剤濃度が、臨界ミセル濃度を超える場合、モノマーは界面活性剤ミセルに拡散し、続いて開始および重合が起こる。この方法には、モノマーのリザーバーである大きなモノマー液滴（１〜１０μｍ）が含まれる。他方、ミニエマルションは、連続相において小さく、安定した、狭分布のモノマー液滴からなる。この系は、高せん断、例えば、超音波処理または高圧ホモジナイザーによって得られる。液滴の高安定性は、水溶性の両親媒性成分（界面活性剤）と、モノマーに可溶であり、液滴相に均一に分布される共安定剤との組み合わせにより確実になる。次いで、これらの小さな液滴は、液滴の内部または液滴の界面のいずれかで重合が起こり、ナノ粒子の形成をもたらすことができるナノ容器として機能することができる。エマルション重合では、水相に溶解しなければならない有効成分をカプセル化することは、凝集体の形成中の封入に依存し、通常１％以下の範囲の負荷量をもたらす（Ｃ．Ｄｕｓｈｋｉｎ＆Ｇ．Ｙｏｒｄａｎｏｖ，Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１８６（２０１１）：「癌治療のための薬物充填ポリ（アルキルシアノアクリレート）コロイド粒子の調製における最近の進歩：ナノ沈殿対重合）が、有効成分が、エマルションが形成される前にモノマーに溶解されるミニエマルション重合方法では、材料に応じて液滴の５〜５０％の量に達することがあり得、最終的なナノ粒子において５〜５０％の対応する負荷量となる。従来のエマルション方法は、薬物がポリマー内に物理的に分散されるマトリックス系であるナノスフェアをもたらすが、ミニエマルション方法は、薬物が液体コアに可溶化され、薄いポリマー層に囲まれている小胞系であるナノカプセルをもたらす界面重合反応と組み合わせることができる。したがって、従来のエマルション方法とミニエマルション方法はかなり異なり、そこから生成される生成物は構造的に異なることを理解されたい。
【００１２】
ＵＳ２００８／１８２７７６およびＵＳ２０１０／０１５１６５では、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子の調製のためのミニエマルション重合方法が記載されている。使用される重合開始剤は、界面活性剤（プルロニック（登録商標））およびそれぞれ、第一級または第二級アミンであるが、一般に、例えばヒドロキシル基またはアミノ基を含む任意の求核性化合物を使用することができる。開始剤の例としては、水酸化ナトリウム、アミノ酸（例えば、リシン）、およびポリエチレングリコールが挙げられる。開始はまた、例えば、ＵＳ２００９／０２９７６１３で考察されているように、ｐＨの変更を介して行われ得る。
【００１３】
ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子を調製するための有利な方法は、ＷＯ２０１４／１９１５０２にも記載されている。
【００１４】
上で論じたように、ミニエマルション方法によるポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子の製造は、いくつかの利点を提供する。しかし、アルキルシアノアクリレートモノマーは非常に反応性が高く、ラジカル開始剤および／またはアニオン開始剤の存在下で極めて容易に重合する。アルキルシアノアクリレートモノマーの反応性の副作用は、有効成分／薬剤の構造的特徴によって引き起こされる早期重合（アニオン開始またはラジカル開始のいずれか）に対して脆弱であるということである。構造的特徴は、例えばＭ−ＮＨ3（式中、Ｍは金属である、すなわち、金属−アンモニア錯体）、Ｒ−ＮＨ2、Ｒ1Ｒ2−ＮＨ、Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｎ、Ｒ1＝ＮＲ2、Ｒ−ＯＨ、Ｒ−Ｃｌ、Ｒ−Ｂｒ、Ｒ−Ｉ、Ｒ−ＳＨ、Ｒ1Ｎ＝ＮＲ2、Ｒ−ＮＨＯＨ、構造的に会合するＨ2Ｏおよびエノールを含む。この早期重合は、重合前にＡＣＡモノマーに溶解できる有効成分の範囲を大幅に制限し、多くの分野でそのようなナノ粒子の可能性を大幅に減少させている。ミニエマルション重合中のアルキルシアノアクリレートの早期重合を回避するために、メタンスルホン酸（ＭＳＡ、アニオン阻害剤）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、ラジカル阻害剤）などのアニオン阻害剤またはラジカル阻害剤を添加することが知られている。ＭＳＡおよび他の酸阻害剤は、ポリマー液滴のｐＨを調整し、重合を引き起こすアニオンの形成を防ぐことにより、ＡＣＡの重合を防ぐ。これは、アニオンの中和分子への中和（プロトン供与による）、またはカチオンの形成（プロトン供与による）のいずれかによって達成され、孤立電子対（例えば、窒素上の）による求核攻撃を防ぐ。しかし、既知の阻害剤には種々の不利な点がある。例えば、ＭＳＡは強酸であり、酸に不安定な化合物（例えば、医薬品有効成分、すなわちＡＰＩ）を分解し得るが、ＭＳＡもＢＨＴも毒性があるため、臨床現場での使用には適していない。さらに、ラジカル阻害剤単独では、ミニエマルション方法を使用してラジカル開始剤および／またはアニオン開始剤として作用し得る反応性化合物およびＡＰＩをナノカプセル化する場合、早期重合を完全に妨げるほど効率的ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、臨床現場での使用およびそのようなナノ粒子を製造するための方法に適した改善されたポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される。本発明のさらなる任意の特徴および用語の定義は、以下の詳細な説明に開示されている。
【００１７】
第１の態様では、本発明は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ホモポリマーまたはコポリマー、少なくとも１種の活性剤、ならびにアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤を含むナノ粒子を提供し、
アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、次の式を有する化合物である。
【化１】
2021534209.tif 000003
［式中、
Ｒ1は、Ｈであり、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、およびＲ7は、独立して、−Ｈ、−ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシド、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ハロゲン化物、カルボン酸、ケトンまたはアルデヒドからなる群から選択され、前記アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、０．００１〜１５重量％の量で存在する。］
【００１８】
ポリ（アルキルシアノアクリレート）ホモポリマーまたはコポリマーを含むナノ粒子は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子と呼ばれることもある。
【００１９】
ナノ粒子の一実施形態では、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、０．０１〜１０重量％、０．０１〜５重量％、または０．０１〜２重量％の量で存在する。
【００２０】
ナノ粒子の一実施形態では、活性剤は、Ｍ−ＮＨ3（式中、Ｍは金属）、Ｒ−ＮＨ2、Ｒ1Ｒ2−ＮＨ、Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｎ、Ｒ1＝ＮＲ2、Ｒ−ＯＨ、Ｒ−Ｃｌ、Ｒ−Ｂｒ、Ｒ−Ｉ、Ｒ−ＳＨ、Ｒ1Ｎ＝ＮＲ2、Ｒ−ＮＨＯＨ、構造的に会合するＨ2Ｏおよびエノールからなる群から選択される官能基を有する化合物である。
【００２１】
一実施形態では、ナノ粒子は、以下に定義される本発明の第２の態様による方法によって製造される。
【００２２】
第２の態様では、本発明は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ホモポリマーまたはコポリマーのナノ粒子を調製するための方法を提供し、単一のステップにおいて、水中油型ミニエマルションのアニオン重合を含み、前記ミニエマルションは、
（ｉ）少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーと、
（ｉｉ）少なくとも１種の界面活性剤と、
（ｉｉｉ）１種以上の活性剤と、
（ｉｖ）任意選択でアニオン重合開始剤と、
（ｖ）アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤と、を含み、前記アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、以下の式を有する化合物である。
【化２】
2021534209.tif 000004
［式中、
Ｒ1は、Ｈであり、
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、独立して、−Ｈ、−ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシド、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ハロゲン化物、カルボン酸、ケトンまたはアルデヒドからなる群から選択される。
【００２３】
方法の一実施形態では、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、求核試薬およびラジカルのいずれかと反応することができる単一の化合物である。
【００２４】
方法の実施形態では、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、ミニエマルションの油相に対して０．００１〜１５重量％の量で、または０．０１〜１０重量％、０．０１〜５重量％、もしくは０．０１〜２重量％の量で存在する。油相は、ミニエマルションの非水成分、例えば、少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーを含む。
【００２５】
方法の一実施形態では、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーよりもラジカルおよび求核試薬に対してより高い親和性を有する。
【００２６】
方法の一実施形態では、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、１．０〜３．０の範囲、好ましくは１．０〜２．５の範囲、またはさらに好ましくは１．０〜２．０の範囲のオクタノール−水分配係数（ｌｏｇＰ）を有する。
【００２７】
方法の一実施形態では、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、４−ヒドロキシ−３，５−ジメチルベンズアルデヒド、４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシベンズアルデヒド、バニリン、サリチルアルデヒドおよびベンズアルデヒドからなる群から選択される。
【００２８】
方法の一実施形態では、活性剤は、治療剤または造影剤である。さらなる実施形態では、活性剤は、芳香化合物、香料、芳香剤、色素、栄養補助食品、除草剤および駆除剤を含む群から選択され得る。
【００２９】
方法の一実施形態では、少なくとも１種の界面活性剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、またはそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのポリアルキレングリコールである。
【００３０】
方法の一実施形態では、少なくとも１種の界面活性剤は、アニオン重合反応を開始する。
【００３１】
方法の一実施形態では、ステップ（ｉｉ）における少なくとも１種の界面活性剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、またはそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも２つのポリアルキレングリコールを含む。
【００３２】
方法の一実施形態では、活性剤は、Ｍ−ＮＨ3（式中、Ｍは金属である）、Ｒ−ＮＨ2、Ｒ1Ｒ2−ＮＨ、Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｎ、Ｒ1＝ＮＲ2、Ｒ−ＯＨ、Ｒ−Ｃｌ、Ｒ−Ｂｒ、Ｒ−Ｉ、Ｒ−ＳＨ、Ｒ1Ｎ＝ＮＲ2、Ｒ−ＮＨＯＨ、構造的に会合するＨ2Ｏおよびエノールからなる群から選択される官能基を含む。
【００３３】
方法の一実施形態では、ミニエマルションは、アニオン重合開始剤、すなわち、少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーのアニオン重合を開始することができる開始剤を含み得る。好ましくは、アニオン重合反応は、少なくとも１種の界面活性剤によって開始される。
【００３４】
方法の一実施形態では、製造されるナノ粒子は、本発明の第１の態様によるナノ粒子である。
【００３５】
一実施形態では、方法は、遠心分離のステップを含まない。
【００３６】
第３の態様では、本発明は、第１の態様によるナノ粒子、または第２の態様による方法によって得られるナノ粒子、および１種以上の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
第４の態様では、本発明は、医薬で使用するために、好ましくは薬物送達または分子イメージングで使用するために、第１の態様によるナノ粒子、または第２の態様による方法によって得られるナノ粒子を提供する。
【００３８】
第５の態様では、本発明は、農業、水産養殖、抗菌用途、栄養補助食品、食品／飼料用途、化粧品、自己治癒、家庭用用途、ボディケアで使用するための、第１の態様によるナノ粒子、または第２の態様による方法によって得られるナノ粒子を提供する。
【００３９】
「アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤」という用語は、本明細書では、望ましくないアニオン性および望ましくないラジカル初期化重合の両方を阻害することができる単一の化合物を定義することを意図している。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子、およびポリ（アルキルシアノアクリレート）ホモポリマーまたはコポリマーからそのようなナノ粒子を調製するための方法を提供し、前記方法は、単一のステップにおいて、水中油型ミニエマルションのアニオン重合による前記ナノ粒子の形成を含む。
【００４１】
ミニエマルション
本明細書で使用される場合、「ミニエマルション」という用語は、５０〜５００ｎｍの範囲内の典型的な平均粒径を有する安定した液滴を含む特定の種類のエマルションを意味する。粒径は、存在する界面活性剤の量、系全体の粘度、液滴の生成に使用されるせん断速度など、いくつかの要因によって影響される。ミニエマルションの典型的な粒径分布曲線（例えば、動的光散乱法を使用して測定）は、形状がガウス分布であり、比較的狭い。本発明のミニエマルションは、好ましくは、０．３以下、より好ましくは０．２以下、例えば約０．１の多分散度指数（ＰＤＩ）を有する。
【００４２】
ミニエマルションは、界面活性剤と共安定剤の存在によって理想的に安定化され、後者はしばしば「疎水性物質」と呼ばれる。共安定剤は、浸透圧を増加させることによってエマルションの浸透圧安定化に寄与し、液滴の表面張力による毛細管圧またはケルビン圧力に反作用し、オストワルド熟成を低減する。オストワルド熟成とは、分子が連続相を介して小さな液滴から大きな液滴に拡散する方法を指す。この方法は、エマルション構造を破壊する。ミニエマルションは、直接（水中油型）または逆（油中水型）であり得るが、本発明の目的のために、「ミニエマルション」という用語は、直接ミニエマルションのみを指すと見なされ得る。したがって、本発明のミニエマルションでは、水が連続相を形成する。油相は、通常、アニオン重合で使用されるモノマー、共安定剤、および存在する場合は活性剤を含む。
【００４３】
上で論じたように、ナノ粒子の調製のためのミニエマルションおよびミニエマルション重合は当技術分野で知られている。
【００４４】
ミニエマルションは、ＵＳ２００９／０２９７６１３に記載されているものなど、当技術分野で知られている任意の既知の方法によって調製することができる。方法は通常、油相および水相を形成し、これらを混合し、混合物を高せん断力、例えば超音波処理または均質化にかけて、表面に安定剤／界面活性剤とともにモノマーを含む油滴の安定したエマルションを形成し、次いで親水性開始剤を添加することを含む。次いで、モノマー液滴の重合は、液滴界面での開始によって起こり、重合前の液滴と同じ粒径を有するポリマー粒子を形成する。親水性開始剤は粒子の表面に付着する。あるいは、重合は、ｐＨの調整によって開始される。本発明の文脈で記述されるミニエマルション重合方法は、ポリマーナノ粒子が溶媒中のモノマーの溶液から直接形成されるエマルション重合方法と、ポリマーナノ粒子がこれらの予め生成されたポリマーの自己組織化によって形成される、予め生成されたポリマーを用いるエマルション方法とは、まったく異なることは、当業者には明らかとなるはずである。
【００４５】
本発明のミニエマルションは、少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーを含む重合可能なモノマーと、少なくとも１種の界面活性剤、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、またはそれらの混合物から選択されるポリアルキレングリコールと、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤との少なくとも３種の成分を含む。ミニエマルションは、任意選択で、１種以上の活性剤も含み得る。本発明の一実施形態では、前記界面活性剤の少なくとも１つ、例えば少なくとも１つのポリアルキレングリコールが、重合可能なモノマーのアニオン重合を開始する。
【００４６】
以下に記載されるアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤の使用は、本発明の重要な特徴であり、いくつかの有利な効果を提供する。
【００４７】
アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤
本発明で使用されるアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、好ましくは、ミニエマルションの油相に対して０．００１〜１５重量％、もしくは０．０１〜１０重量％、０．０１〜５重量％、もしくは０．０１〜２重量％の量を含む。
【００４８】
アニオン重合とラジカル重合の両方を阻害できる任意の化合物／分子は、阻害剤が油溶性で非毒性である（すなわち、臨床使用に適している）場合、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤として使用してもよい。
【００４９】
ラジカル重合を妨げるために、化合物は、モノマーよりも優先的にラジカルを容易に受け入れ、前記ラジカルの伝播を防ぐことができなければならない。理想的には、化合物は、ラジカルがそれ以上伝播されないような方法で、犠牲的に、そして不可逆的に反応する必要がある。
【００５０】
同様に、アニオン阻害剤として作用するために、化合物は、これらに限定されないが、水中のヒドロキシルイオン、ヒドロキシル基、カルボアニオン、酸素アニオン、窒素アニオン、ハロゲンアニオン、および硫黄アニオンからの求核攻撃に対する求電子試薬として作用できなければならない。理想的には、化合物は不可逆的に反応し、アニオンのさらなる伝播が防止されるような方法で反応する必要がある。本明細書で使用するために選択されたアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、酸（例えばプロトン供与体）として作用することなく、求電子試薬として作用することが知られており（例えば、アルドール反応、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ａｌｄｏｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，４１６８−４１７８を参照）、したがって、ＭＳＡおよび他の有機酸などの既知のアニオン重合阻害剤とは機構的に異なる挙動を示す。同様に、選択された化合物は、ラジカル阻害剤を受け入れることができ、一般的な抗酸化剤／ラジカル阻害剤と同様の多くの機能を共有するが、通常、この役割には適用されない。
【００５１】
言い換えれば、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、好ましくは、ラジカルおよび求核試薬に対して、少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーよりもより高い親和性を有し得る。当業者は、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤が、少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーよりもラジカルおよび求核試薬に対して高い親和性を有するかどうかを容易に決定することができる。例えば、当業者は、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤を選択されたアルキルシアノアクリレートモノマーと混合し、モノマーを容易に重合することが知られている活性成分を加えることができる。活性成分は、アニオン重合および／またはラジカル重合を開始することができる材料または材料の混合物である。重合が観察されない場合、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、アルキルシアノアクリレートモノマーよりもラジカルおよび求核試薬に対して高い親和性を有する。
【００５２】
このように、化合物は、ラジカルと反応し、アニオン（すなわち求核試薬）との反応中に求電子試薬として機能することができる官能基、または官能基の組み合わせを特徴とし得る。
【００５３】
官能基、または官能基の組み合わせは、アルファアルデヒド基を含む少なくとも１つの芳香環を含む。追加の官能基は、芳香族ヒドロキシ基、アルデヒド、ケトンおよびキノン、エノンおよびアミンであり得るが、これらに限定されない。芳香環はさらに、少なくとも１つの電子供与性アルキル基またはアルコキシ基で置換され得る。電子供与性アルキル基またはアルコキシ基は、ミニエマルション方法で使用されるモノマーへの溶解度が十分である場合、有利には立体的にかさ高くなり得る。分子がミニエマルション方法の油相に容易に溶解し、水溶性が制限されていることも好ましい。
【００５４】
本発明で使用するためのアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、１．０〜３．０の範囲、好ましくは１．０〜２．５の範囲、さらにより好ましくは１．０〜２．０の範囲のオクタノール−水分配係数（ｌｏｇＰ）を有する。開示されたｌｏｇＰは、本発明による方法で使用されるアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤がミニエマルション全体に最適な分布を有すること、すなわち十分な阻害剤が油相に存在することを確認する。
【００５５】
ＬｏｇＰは、振とうフラスコ、ｐＨメトリック、逆相ＨＰＬＣ、電気化学などのいくつかの方法で決定するか、または適切なソフトウェアを使用して算出することができる。本明細書に開示され、本発明のアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤を定義するために使用されるｌｏｇＰ値は、ＡＣＤ／Ｌａｂｓ  ｌｏｇＰ予測モデルによって算出した。以下の表１を参照されたい。
【００５６】
以下の支持実験で使用されるアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、バニリン、４−ヒドロキシ−３，５−ジメチルベンズアルデヒド、４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシベンズアルデヒド、サリチルアルデヒド、ベンズアルデヒド、ビタミンＥ、ビタミンＫ３、およびビタミンＫ１である。ビタミン、ＭＳＡ、ＢＨＴ、およびＢＨＡは、比較例として含まれている。
【表１】
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【００５７】
界面活性剤
本発明のミニエマルションは、少なくとも１種の界面活性剤を含み得る。当技術分野で知られている任意の典型的な界面活性剤を使用することができるが、しかし好ましい界面活性剤としては、グリセロールの脂肪酸、ソルビトールおよび他の多官能アルコール、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリソルベート、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル、エトキシル化トリグリセリド、エトキシル化フェノールおよびジフェノール、多糖類（例えば、ヒアルロン酸とシアル酸）、タンパク質、脂肪酸の金属塩、脂肪アルコール硫酸塩の金属塩、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸塩の金属塩、ならびにそれらの混合物が挙げられる。特に好ましい界面活性剤としては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリソルベートが挙げられる。
【００５８】
界面活性剤は、好ましくは、ミニエマルションの水相の０．０５〜５重量％、より好ましくは０．１〜２重量％を含む。
【００５９】
これらの成分に加えて、ミニエマルションは、油相に共安定剤をさらに含み得る。共安定剤は、典型的には非常に非水溶性であり、すなわち、５×１０-5ｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは５×１０-6ｍｏｌ／Ｌ未満、さらにより好ましくは５×１０-7ｍｏｌ／Ｌ未満の溶解度を有し、炭化水素、シラン、オルガノシラン、脂肪酸エステル、油（例えば、ナス油）、疎水性染料または脂質などの重合性モノマー（複数可）と適合性のある任意の物質であってよい。適切な共安定剤の例としては、ヘキサデカン、セチルアルコール、ミグリオール、およびオリーブオイルが挙げられる。特に好ましい共安定剤としては、ミグリオールおよび植物油が挙げられる。代替の実施形態では、活性剤は、共安定剤の役割を果たすことができる。
【００６０】
共安定剤は、好ましくは、ミニエマルションの油相の０．５〜５重量％、より好ましくは１〜３重量％を含む。
【００６１】
さらなる実施形態では、本発明の方法で使用されるミニエマルションは、好ましくは油相（すなわち、不連続相）に架橋剤（特に生分解性架橋剤）を含む。架橋剤は、好ましくは、無水物、アクリレート、またはビスシアノアクリレート、例えば、モノもしくはポリエチレングリコールジメタクリレート、無水メタクリル酸、１，６−ヘキサンジオールビスシアノアクリレート、またはメチレンジメタクリレートである。
【００６２】
本発明のミニエマルションの油相含有量は、最大５０％であり得るが、一般的には、最大１５〜２５重量％、好ましくは最大１５重量％、または５〜１５重量％の範囲である。当業者は、本発明のミニエマルションの油相含有量が固形分とも呼ばれ得ることを理解するであろう。したがって、「固形分」および「油相含有量」という用語は、本発明の文脈において交換可能である。
【００６３】
重合性モノマー
本発明のミニエマルション中の重合性モノマーは、少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーを含む。これらは生分解性モノマーであり、ナノ粒子の調製での使用が広く報告されている。アルキルシアノアクリレートは、単官能アクリレートまたは二官能アクリレート、すなわち単一または複数のアクリレート官能基を含み得る。任意の直鎖または分枝鎖アルキルシアノアクリレートモノマーまたはその誘導体が使用されてもよいが、しかし、好ましいモノマーは、Ｃ1〜Ｃ10アルキルシアノアクリレート、より好ましくはＣ2〜Ｃ8アルキルシアノアクリレートである。単一モノマーを使用してもよく、または異なるアルキルシアノアクリレートの混合物を使用してもよい。好ましいアルキルシアノアクリレートには、エチルシアノアクリレート、ブチル（ｎ−ブチル）シアノアクリレート、２−エチルブチルシアノアクリレート、ｎ−オクチルシアノアクリレート、ならびにそれらの誘導体および混合物が挙げられる。ブチルシアノアクリレート、２−エチルブチルシアノアクリレートおよびｎ−オクチルシアノアクリレートが特に好ましい。
【００６４】
理論に拘束されることを望まないが、モノマーの性質がポリマーの分解速度に影響を与えると考えられる。モノマーの疎水性が高いほど（すなわち、アルキル鎖が長いほど）、おそらく疎水性の高いポリマー内の水位が低いため、分解速度が遅くなる。したがって、本発明の別の実施形態は、異なる鎖長のアルキルシアノアクリレートの混合物、例えば、短いアルキル鎖との混合、および２−エチルブチルシアノアクリレートまたはｎ−オクチルシアノアクリレートと混合されたブチルシアノアクリレートなどの長いアルキル鎖との混合物を使用することである。
【００６５】
一実施形態では、シアノアクリレートホモポリマーが使用される、すなわち、単一モノマーから形成される。
【００６６】
アルキルシアノアクリレートモノマーは、好ましくは、モノマーの総量の１〜１００重量％、より好ましくは７５〜１００重量％、さらにより好ましくは９５〜１００重量％の量で存在する。
【００６７】
アルキルシアノアクリレートモノマーに加えて、他のコモノマーも本発明のミニエマルション中に存在し得る。これらのコモノマーも生体適合性または生分解性であることが好ましい。適切なコモノマーとしては、アクリレート、ビニルエステル、ビニルエーテル、ビニルエポキシド、環状シロキサン、およびラクトンが挙げられるが、これらに限定されない。前記コモノマーはまた、所望の粒子特性に応じて架橋剤であり得る。
【００６８】
重合性モノマーは、好ましくは、ミニエマルションの油相の２５〜９９．５重量％、より好ましくは３０〜７０重量％を含む。
【００６９】
ポリアルキレングリコール
本発明で使用するための好ましい界面活性剤は、ポリアルキレングリコールである。本発明のミニエマルションは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、またはそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのポリアルキレングリコールを含み得る。ポリアルキレングリコールの少なくとも１つが、好ましくは、アニオン重合反応を開始する。
【００７０】
ポリアルキレングリコールは通常、ミニエマルションの連続相、すなわち水相に添加される。ポリアルキレングリコールの１つは、場合によっては、標的部分に共有結合し得る。ポリアルキレングリコールは水溶性が非常に高いため、ミニエマルションに加えるように均一な溶液を調製することができる場合は特に好ましい。
【００７１】
「ポリエチレングリコール」（ＰＥＧ）という用語は、主にエチレンオキシド繰り返し単位、すなわち−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−単位を含む任意のポリマーを意味する。一般的なポリエチレングリコールは、２００００ｇ／ｍｏｌ未満、好ましくは１００００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。「ポリプロピレングリコール」（ＰＰＧ）という用語は、主にプロピレンオキシド繰り返し単位、すなわち−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−単位を含むポリマーを意味する。
【００７２】
ポリアルキレングリコールは、ヒドロキシ末端基またはアミノ末端基、あるいはそれらの混合物を有し得る。ポリアルキレングリコールは水溶性である。水溶性とは、水で均一な溶液を形成できるように十分に高く、次いでミニエマルションに加えることができる、水への溶解度、すなわち、室温および室内圧力（ＲＴＰ）で１０ｇ／Ｌを超える溶解度が必要であることを意味する。
【００７３】
適切なポリアルキレングリコールの例としては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールホモポリマーならびにそれらのコポリマーが挙げられる。「ポリエチレングリコール」という用語は、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を包含することを意図していることに留意されたい。最も重要なことに、コポリマーはブロックコポリマーであり得る。適切なコポリマーの例としては、ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）ブロックコポリマー、ポリアルキルアミン−ポリアルキレングリコールブロックコポリマー、脂質−ポリアルキレングリコールブロックコポリマー、およびポリリジン−ポリアルキレングリコールブロックコポリマーが挙げられる。
【００７４】
各ポリマーのブロックの長さは、コポリマーが水溶性のままであるという条件で、コポリマーの特性を変えるように変えることができる。例えば、ＰＰＧの含有量を増やすと、水溶性が低下する。一実施形態では、好ましくは、ＰＰＧに直接結合したヒドロキシルまたはアミノ末端基が存在する。好ましくは、末端基はアミノ末端基である。
【００７５】
好ましくは、ポリエチレングリコール単位とＰＰＧ単位との比は、１：５〜５：１の範囲、例えば１：１である。各ブロックには、２〜４０個のモノマーユニットを含み得る。しかし、ポリエチレングリコール単位が過剰である場合はさらに好ましい。
【００７６】
本発明のポリアルキレングリコール−ＰＰＧブロックコポリマーの典型的な分子量は、２００００ｇ／ｍｏｌより低い、好ましくは１００００ｇ／ｍｏｌより低い、例えば、１０００〜８０００である。
【００７７】
ポリエチレングリコールが使用される場合、すなわち、ポリエチレングリコール単位が大部分に存在することが好ましく、そのポリエチレングリコールが、特性を最適化し、油相中のモノマーとの効率的な疎水性相互作用を可能にするために、疎水性成分をさらに含む場合が好ましい。好ましくは、疎水性成分は、ポリエチレングリコールに共有結合し、最も好ましくは、アミノ末端基またはヒドロキシル末端基と残りのポリエチレングリコール部分との間を結合する。
【００７８】
疎水性成分は、通常、アルキル鎖、ポリエーテル、または脂質である。特に好ましい疎水性成分は、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）であり、したがって、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロックコポリマーを形成する。ＰＰＧはＰＰＯと同等であることを理解すべきである。
【００７９】
少なくとも１つのポリアルキレングリコール（複数可）のうちの１つは、場合によっては、標的部分に共有結合し得る。標的部分は、対象内の特定の部位に粒子が局在するようになるように向けられる、または生じさせる任意の適切な部分であり得る。標的部分は、ポリアルキレングリコールのアミノ基末端の反対側の末端と反応することができる官能基を含有する必要がある。適切な官能基は、アミノ、ヒドロキシ、アジド、アルキン、およびチオなどのポリアルキレングリコールと共有結合を形成することができる官能基である。標的部分のポリアルキレングリコールへの結合は、「クリック」化学などの当技術分野で日常的に使用される任意の方法によって行うことができ、例えば、Ｋｏｌｂら，”Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｆｅｗ  Ｇｏｏｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ”．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．２００１版，４０（１１）：２００４−２０２１を参照されたい。
【００８０】
好ましくは、標的化部分は、１００〜２０００００Ｄａ、より好ましくは２００〜５００００Ｄａ、さらにより好ましくは３００〜１５０００Ｄａの範囲の分子量を有する。
【００８１】
単一の標的化部分または異なる標的化部分の混合物が使用され得ることが理解されるべきである。
【００８２】
標的化部分の例は、アミノ酸、タンパク質、ミニタンパク質（例えば、システインノットタンパク質）、ペプチド、抗体、抗体断片、糖類、炭水化物、グリカン、サイトカイン、ケモカイン、ヌクレオチド、レクチン、脂質、受容体、ステロイド、神経伝達物質、細胞表面マーカー、がん抗原、糖タンパク質抗原、アプタマー、またはそれらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、標的化部分または標的化部分の混合物は、線状および環状ペプチドまたは抗体断片を含む。
【００８３】
好ましくは、ポリアルキレングリコール（複数可）の量（総計）は、ミニエマルションの水相の０．０５〜５重量％、より好ましくは０．１〜２重量％である。ポリアルキレングリコール（複数可）の量（総計）は、好ましくは１５重量％を超えてはならず、より好ましくは１０重量％を超えてはならない。
【００８４】
活性剤
活性剤は、医薬用途を有する任意の薬剤、例えば、治療薬または造影剤、ならびに芳香化合物、香料、芳香剤、色素、栄養補助食品、除草剤および駆除剤を含むがこれらに限定されない、ナノカプセル化のための関心のある他の任意の化合物であってよい。活性剤は、水溶性または非水溶性であってもよいが、非水溶性が好ましい。活性剤が水溶性である場合、活性剤は通常、油中の微粉末として添加されるか、または非水溶性型に変えた後に添加される（例えば、ＡＰＩの水溶性塩型を非水溶性中性型に酸性化することによって、または非水溶性対イオンとのイオン対化によって）。好ましい実施形態では、活性剤は、ミニエマルションの油相の１〜７５重量％、より好ましくは１０〜３０重量％を含む。
【００８５】
もちろん本発明を制限しない例示的な治療薬としては、化学療法剤、診断剤、抗腫瘍剤、予防剤、栄養補助食品剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤、小分子キナーゼ阻害剤、核酸、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、ホルモン、金属、セラミック、薬物、ワクチン、免疫剤、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００８６】
好ましい治療薬としては、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ダウノルビシン、プロカルバジン、ドセタキセル、パクリタキセル、カバジタキセル、５−フルオロウラシル、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、クロキサシリン、オキサシリン、ダプトマイシン、イリノテカン、塩酸ミトキサントロン、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ダカルバジン、フトラフル、５’デオキシフルオロウリジン、エニルウラシル、デオキシシチジン、５−アザシトシン、５−アザデオキシシトシン、アロプリノール、２−クロロアデノシン、トリメトレキサート、アミノプテリン、メチレン−１０−デアザアミノプテリン、シスプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、テトラプラチン、サトラプラチン、プラチナ−ＤＡＣＨ、オルマプラチン、エピルビシン、エトポシドホスフェート、９−アミノカンプトテシン、ビンデシン、Ｌ−フェニルアラニンマスタード、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アムサクリン、カレニテシン、アシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、アマンタジン、リマンタジン、ラミブジン、ジドブジン、ベバシズマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、イマチニブ、ソラフェニブ、カペシタビン、オシメルチニブ、トリフルリジン、アファチニブ、トラメチニブ、アビラテロン、エルロチニブ、ゲフィチニブ、シクロホスファミド、スニチニブ、エリブリン、カボザンチニブ、イデラリシブ、タモキシフェン、ボルテゾミブ、ベリノスタット、セリチニブ、ラップチニブ、アレクチニブ、オラパリブ、フルベストラント、アノストロゾール、Ｎ−（４−（（３−（２−アミノピリミジン−４−イル）ピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチルチオフェン−２−イル）フタラジン−１−アミン（ＡＭＧ９００）、プロテインキナーゼＤ１阻害剤、プロテインキナーゼＤ２阻害剤、プロテインキナーゼＤ３阻害剤、１２−（２−シアノエチル）−６，７，１２，１３−テトラヒドロ−１３−メチル−５−オキソ−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール（Ｇｏ６９７６）、Ｎ−［２−（ｐ−ブロモシンナミルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド（Ｈ８９）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８７】
特に好ましい治療薬は、ドセタキセル、シクロホスファミド、エベロリムス、カペシタビン、ボルテゾミブ、ベリノスタット、カバジタキセル、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、クロキサシリン、オキサシリン、ダプトマイシンである。
【００８８】
他の非常に好ましい治療薬としては、カルボプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、テトラプラチン、サトラプラチン、シスプラチン、プラチナ−ＤＡＣＨ、およびオルマプラチンが挙げられる。
【００８９】
例示的な造影剤としては、金属（例えば、コバルト、鉄、金）、金属塩（例えば、酸化鉄、ガドリニウム塩）、近赤外色素、ＰＥＴキレート剤、ＳＰＥＣＴキレート剤、ＭＲＩまたはラマン分光法に適した薬剤、蛍光染料、および放射性医薬品が挙げられる。好ましい造影剤は、ナイルレッド、ＮＲ６６８、脂質７８０、クロリンｅ６、およびＰＰ９である。
【００９０】
本発明は、ミニエマルション中のアルキルシアノアクリレートモノマーの早期重合を開始することができる官能基を特徴とする活性剤に特に適している。このような官能基としては、Ｍ−ＮＨ3（式中、Ｍは金属である）、Ｒ−ＮＨ2、Ｒ1Ｒ2−ＮＨ、Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｎ、Ｒ1＝ＮＲ2、Ｒ−ＯＨ、Ｒ−Ｃｌ、Ｒ−Ｂｒ、Ｒ−Ｉ、Ｒ−ＳＨ、Ｒ1Ｎ＝ＮＲ2、Ｒ−ＮＨＯＨ、構造的に会合するＨ2Ｏおよびエノールが挙げられる。
【００９１】
重合
本発明による方法は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ホモポリマーまたはコポリマーのナノ粒子の調製を提供し、前記方法は、単一のステップにおいて、水中油型ミニエマルションのアニオン重合を含み、前記ミニエマルションは、
（ｉ）少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーを含む重合性モノマーと、
（ｉｉ）少なくとも１種の界面活性剤、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、またはそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのポリアルキレングリコールと、
（ｉｉｉ）任意選択で１種以上の活性剤と、
ｉｖ）任意選択でアニオン重合開始剤と、
ｖ）アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤とを含む。
【００９２】
ミニエマルションは、前記少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマー、前記アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤、ならびに任意選択で前記１種以上の活性剤を含む水中油型ミニエマルションに前記少なくとも１種の界面活性剤を添加することによって調製することができる。好ましい実施形態では、この添加ステップおよびアニオン重合ステップは連続して行われる、すなわち、アニオン重合ステップは、添加ステップの直後（例えば、０〜１０分、例えば、０〜５分）に行われる。
【００９３】
別の態様から見ると、本発明の方法は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ホモポリマーまたはコポリマーのナノ粒子の調製を含み、前記方法は、少なくとも１種の界面活性剤、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、またはそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのポリアルキレングリコールを水中油型ミニエマルションへ添加することを含み、前記ミニエマルションは、
（ｉ）少なくとも１つのアルキルシアノアクリレートモノマーを含む重合性モノマーと、
（ｉｉ）任意選択で１種以上の活性剤と、
ｉｖ）アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤とを含み、得られた混合物をアニオン重合により重合することを含む。
【００９４】
好ましくは、少なくとも１つの界面活性剤は、アニオン重合反応を開始する。しかし、追加のアニオン重合開始剤、またはｐＨ変化は、代わりにミニエマルションに加えることができる。
【００９５】
ミニエマルションは、一般的には、モノマー（複数可）、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤、共安定剤、ならびに任意選択で活性剤を含む油相を、少なくとも１種の界面活性剤を含有する水溶液に添加し、水中にモノマー（複数可）を含有する油滴を形成するように、これを高せん断力にかけることによって、例えば、超音波処理により調製される。この段階で形成される液滴がミニエマルションである。アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤が存在することにより、例えば、反応性活性剤によって引き起こされるモノマーの早期重合を防ぐ。好ましくは、少なくとも１つのポリアルキレングリコールが、水溶液中に存在し、界面活性剤として作用する。
【００９６】
好ましくは、重合反応は、低ｐＨ、例えば、ｐＨ１〜７で行われる。重合反応が５０℃未満の温度、例えば４〜３０℃で行われる場合が好ましい。得られた混合物は、分散液である。
【００９７】
好ましくは、少なくとも１種の界面活性剤、好ましくは少なくとも１つのポリアルキレングリコールは、アニオン重合方法を開始する。ポリアルキレングリコール開始剤がアミノまたは水酸化物末端基を有する場合、開始は、好ましくは、アニオン性または両性イオン性重合反応をもたらすモノマー二重結合への求核攻撃によって達成される。
【００９８】
そのような方法は当技術分野でよく知られており、したがって、関与する機構は当業者によく知られているであろう。
【００９９】
特に好ましい実施形態では、アニオン重合は、追加の開始剤によるラジカル重合と組み合わされる。この追加の開始剤は、通常、油溶性であり、したがって、一般に、ミニエマルションの油相、すなわち油滴内にある。これらの２つの種類の重合が組み合わされると、本発明の方法は、ラジカル重合を開始する温度の上昇を組み込むように修正される。一般的なラジカル重合開始剤としては、過酸化物、およびアゾ化合物、例えば、アゾビスジメチルバレロニトリルおよびアゾイソブチロニトリルが挙げられる。
【０１００】
一実施形態では、本発明の方法は、アルキルシアノアクリレートモノマー、および存在する場合はコモノマーの架橋を含むように修正することができる。これは、架橋剤、好ましくはラジカル重合性架橋剤を、好ましくは油相内でミニエマルションに組み込むことによって容易にすることができる。架橋剤は、一般に、水相との接触時に加水分解され、それにより、薬物放出速度およびナノ粒子の生分解性を制御する。例示的な架橋剤としては、無水物、アクリレートまたはビス−シアノアクリレート、例えば、モノエチレングリコールジメタクリレートおよびポリエチレングリコールジメタクリレート、無水ジメタクリレート、１，６−ヘキサンジオールビス−シアノアクリレートまたはメチレンジメタクリレートなどのビス−シアノアクリレートが挙げられる。
【０１０１】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、すべての残留モノマーが確実に反応し、および／または架橋を開始するために、温度を（例えば、５０〜７０℃に）上昇させるステップを含み得る。
【０１０２】
本発明の方法は、ナノ粒子が分離されるさらなるステップを含み得る。これは、当技術分野で知られている任意の方法によって行われてよい。
【０１０３】
本発明に詳述のアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤の使用することで、２つの主な利点が提供される。
【０１０４】
第１に、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤を使用すると、望ましくないバルク重合またはタイミングのずれた重合を防止または制限し、当業者には入手できない活性成分を有するナノ粒子の合成が可能になる。これは、２つの方法で観察される。まず、活性成分（複数可）が溶解したときにＡＣＡモノマーのバルク重合を防ぎ、ナノ粒子の合成を可能にする。さらに、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤を使用することで、ミニエマルションが形成されるまで油相の安定性を維持し、過剰な沈殿または微粒子形成なしに、低いＰＤＩ（理想的には０．２００未満）および３００ｎｍ未満の粒径のナノ粒子が生成される。
【０１０５】
第２に、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤の使用によるこの重合の改善は、副生成物のバルク重合生成物または微粒子を除去するために必要とされる、当技術分野で知られているあらゆるクリーンアップ手順の必要性を取り除く。クリーンアップ手順はナノ粒子の収量を減少させ、かつそのような方法は実験室規模では許容でき得るが、大規模製造ではひどく高価で複雑になる。一般的なクリーンアップ手順は、現在の開示では、溶液中に懸濁されたナノ粒子を残しながら、大きな副生成物粒子を除去するために一般的に用いられる遠心分離方法により例示されている。この方法には、溶液中のナノ粒子の最終濃度（または乾燥重量）が所望の１０〜２０％から＜１〜５％に減少するという重要な欠点がある。
【０１０６】
本発明による方法においてアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤の使用は、例えば遠心分離によって、最終生成物溶液から沈殿物／微粒子を除去する必要性を除去または最小化する。
【０１０７】
本発明の方法で使用されるアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤の有利で有益な効果は、特にこれらの阻害剤が既知のアニオン阻害剤またはラジカル阻害剤よりも優れているため、意外なものである。
【０１０８】
ナノ粒子
本発明による、および本発明の方法によって生成されるナノ粒子は、エマルション重合によって生成されるものとは構造が異なる。特に、エマルション重合によって生成されたナノ粒子は、任意の活性剤がそのマトリックス中に物理的に分散しているポリマーマトリックスを含む。
【０１０９】
逆に、ミニエマルション界面重合によって生成されたナノ粒子は、通常、小胞系であり、ポリマーシェルに囲まれたナノ粒子のコアに活性剤を含む。
【０１１０】
本発明によって提供され、それに従って製造されるナノ粒子は、１種以上の医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とともにナノ粒子を含む医薬組成物として調製され得る。そのような担体、希釈剤および賦形剤は当技術分野でよく知られている。医薬組成物はまた、追加の活性剤を含み得る。重要なことに、本発明によるナノ粒子は、ＭＳＡおよびＢＨＴなどの毒性阻害剤を含んでなく、これらはナノ粒子を臨床／医薬使用に適さないものにする。
【０１１１】
用途
ナノ粒子およびその組成物は、医薬、特に薬物送達およびイメージング応用で使用することができる。さらに、ナノ粒子は、芳香化合物、芳香剤、香料、色素、栄養補助食品、除草剤、駆除剤などの種々の材料／化合物のナノカプセル化にも非常に有利であり得る。したがって、本発明は、医薬で使用するため、および芳香化合物、芳香剤、香料、色素、栄養補助食品、除草剤、および駆除剤などの種々の材料／化合物のナノカプセル化で使用するための本発明によるナノ粒子に関する。
【０１１２】
ナノ粒子およびその組成物は、医薬、特に薬物送達および画イメージング応用で使用することができる。したがって、本発明は、医薬で使用するための本発明によるナノ粒子に関する。さらなる実施形態では、本発明は、治療または予防、あるいは特定の障害および疾患の診断において使用するための本発明によるナノ粒子に関する。本発明に従って治療または予防することができる障害または疾患の例としては、感染症、炎症性疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、ならびに肺癌、乳癌、前立腺癌、脳癌、頭頸部癌、卵巣癌、皮膚癌、精巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、子宮頸癌、胃腸癌、膀胱癌、およびそれらの組み合わせなどの癌が挙げられる。
【０１１３】
ナノ粒子またはその組成物は、好ましくは、治療上有効量で投与される。「治療有効量」とは、特定の疾患または障害を治療または予防するために必要なナノ粒子の量を指す。ナノ粒子を対象に送達するために、任意の投与経路を使用することができる。適切な投与経路としては、筋肉内注射、経皮投与、吸入、局所適用、経口投与、直腸または膣投与、腫瘍内投与および非経口投与（例えば、静脈内、腹膜、動脈内または皮下）が挙げられる。好ましい投与経路は注射である。
【０１１４】
投与の的確な投与量および頻度は、当業者によく知られているように、使用される特定のナノ粒子、活性剤および最適な標的薬剤、治療される特定の状態、治療される状態の重症度、特定の患者の年齢、体重、性別、障害の程度および全身的な身体状態、ならびにその個人が服用している可能性のある他の薬物に依存する。さらに、前述の１日あたりの有効量は、治療される対象の反応に応じて、および／または本発明に従ってナノ粒子を処方する医師の評価に応じて、増減され得ることは明らかである。
【０１１５】
実験部
以下に、本発明による方法を用いたナノ粒子の調製の詳細な例を説明する。
【０１１６】
実験例の結果を表２にまとめる。
ナノ粒子は、その粒径、多分散度指数、およびゼータ電位、ならびに不要な沈殿物／微粒子の形成のためにナノ粒子を分離するようにナノ粒子の最終溶液の遠心分離が必要であったかどうかによって特徴付けられる。
【０１１７】
多分散度指数は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍａｌｖｅｒｎｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｌｅａｒｎ／ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｃｅｎｔｅｒ／ｗｈｉｔｅｐａｐｅｒｓ／ＷＰ１１１２１４ＤＬＳＴｅｒｍｓＤｅｆｉｎｅｄ．ｈｔｍｌを参照）によって与えられた動的光散乱による粒径測定のコンテキストで定義されており、相関データ（キュムラント分析）への２パラメーターフィットから算出された数である。この算出は、ＩＳＯ標準文書ＩＳＯ１３３２１：１９９６ＥおよびＩＳＯ２２４１２：２００８で定義されている。０．７を超えると粒径の分布が非常に広くなり、ＤＬＳ手法には適さないことが一般的に認められており、０．０５は高度に単分散である。本発明の粒子の目的のために、０．０５〜０．３００が好ましく、０．１００〜０．２００が最も好ましい。
【０１１８】
ゼータ電位は、懸濁粒子の界面二重層の電位の尺度であり、コロイド分散の安定性の尺度として与えられることがよくある（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍａｌｖｅｒｎｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ．ｃｏｍ／ｅｎ／ａｓｓｅｔｓ／ＴＮ１０１１０４ＺｅｔａＰｏｔｅｎｔｉａｌＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ−６＿ｔｃｍ５０−３７００８．ｐｄｆを参照）。ゼータ電位が高い生物医学的応用のナノ粒子は、タンパク質を吸着する傾向があるため、免疫系の標的となり、循環時間と効果が減少する。ゼータ電位が低く、水素結合供与体（例えば、界面活性剤を含むＰＥＧ）を含む立体安定化している粒子は、循環時間が長くなる。したがって、２０〜−２０のゼータ電位が好ましく、１０〜−１０がより好ましく、５〜−５が最も好ましい。
【０１１９】
乾燥重量ｗ／ｗ％は、ナノ粒径ではない固体を遠心分離して除去した後の、バッチの不揮発性材料含有量である。乾燥重量は、一般に、１〜２５ｗ／ｗ％、好ましくは５〜２０ｗ／ｗ％、最も好ましくは１０〜２０ｗ／ｗ％の範囲である。ｗ／ｗは、ナノ粒子の重量と混合物（通常は水とＨＣｌ）中の揮発性物質の重量を指す。
【０１２０】
実験データによって裏付けられているように、芳香族アルデヒド基、すなわちバニリン、４−ヒドロキシ−３，５−ジメチルベンズアルデヒド、４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシベンズアルデヒド、サリチルアルデヒドおよびベンズアルデヒドを含むアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤は、ビタミンＥ、ビタミンＫ３およびビタミンＫ１よりも優れている。注目すべきことに、芳香族アルデヒド基を含むアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤の使用によって得られたナノ粒子の溶液は、沈殿物／微粒子が形成されなかったか、または最小限の量しか形成されなかったので、遠心分離する必要はなかった。
【０１２１】
ビタミンＥ、ビタミンＫ３およびビタミンＫ１のアニオン阻害剤活性は、ベンズアルデヒド型阻害剤よりもはるかに弱いことが注目される。弱いアニオン阻害剤活性は、少なくとも部分的に、これらの阻害剤について観察された沈殿物／微粒子の形成の増加の原因であると考えられる。
【実施例】
【０１２２】
以下に、いくつかの実験例を示す。これらには、アニオン阻害剤およびラジカル阻害剤（すなわち、アニオン重合およびラジカル重合の両方を阻害することができる単一の化合物）を使用する本発明の実施形態、ならびに比較例が含まれる。比較例には、既知のアニオン阻害剤またはラジカル阻害剤が使用される例が含まれる。
【０１２３】
実験例の選択は、以下により詳細に提示される。残りの例は、関連する反応物と溶媒を表２に収載されているものに置き換えるだけで、開示されたものと同様の実験手順で行った。
【０１２４】
遠心分離前後の選択した例の分布プロットによる粒径を表３に示す。芳香族アルデヒド型のアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤を使用することの有利な効果は、芳香族アルデヒド基を含まないアニオン阻害剤およびラジカル阻害剤（すなわち、ビタミンＥ、Ｋ１およびＫ３）を使用する実験例と比較すると明らかである。
【０１２５】
実験例には、以下のアニオンおよびラジカル阻害剤（すなわち二重阻害剤）が含まれる。
【化３−１】
2021534209.tif 000006
【化３−２】
2021534209.tif 000007
実験例には、以下の従来技術のアニオン阻害剤またはラジカル阻害剤が含まれる。
【化４】
2021534209.tif 000008
すべての例は、ミニエマルション法を使用して行った。
【０１２６】
実施例１（比較例）：ラジカル阻害剤（ＢＨＴ）とともに０．１８％ＤｉＲ色素を使用した粒子合成。
溶液１（水相）：１２０ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１２０ｇのＢｒｉｊＬ２３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１２．０ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液２（モノマー相）：０．８０ｇのｎ−ブチルシアノアクリレート（モノマー、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｌｏｃｔｉｔｅ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、０．０１０ｇのブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、Ｆｌｕｋａ）、およびＭｉｇｌｙｏｌ８１２（Ｃａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｔｚ  ＧｍＢＨ、１．６ｍｇのＤｉＲを混合物に添加するように）で溶解した０．０６０ｇの色素ＤｉＲ（Ｍａｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）溶液をガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液１および２を、氷上に置いた２０ｍＬのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６×３０秒間隔）超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、２５％振幅）。超音波処理後、形成されたミニエマルションを室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させ、次いでｐＨをｐＨ５に調整した。
粒径およびそのゼータ電位を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。
得られたナノ粒子は、多分散度指数が０．６３で、６１５ｎｍ（ｚ平均直径）であった。結果は十分に悪かったので、さらなる分析を行わなかった。
【０１２７】
実施例５：二重阻害剤（バニリン）とともに０．１０％ＤｉＲ色素を使用した粒子合成。
溶液１（水相）：１２５ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１２５ｇのＢｒｉｊＬ２３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１１．５ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液２（モノマー相）：２．２５ｇのｎ−ブチルシアノアクリレート（モノマー、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｌｏｃｔｉｔｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、０．２４０ｇのバニリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＭｉｇｌｙｏｌ８１２（Ｃａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｔｚ  ＧｍＢＨ、２．６ｍｇのＤｉＲを混合物に添加するように）で溶解した０．１００ｇの色素ＤｉＲ（Ｍａｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）溶液をガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液１および２を、氷上に置いた２０ｍＬのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６×３０秒間隔）超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、２５％振幅）。超音波処理後、形成されたミニエマルションを室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させ、次いでｐＨをｐＨ５に調整した。
粒径およびそのゼータ電位を、ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。
得られたナノ粒子は、多分散度指数が０．１１、ゼータ電位が−３．４ｍＶ、ナノ粒子濃度が１５．１％（ｗ／ｗ）で、１５８ｎｍ（ｚ平均直径）であった。
【０１２８】
実施例７（比較例）：阻害剤を用いない（陰性対照）、０．６％のＮＲ６６８色素を使用した粒子合成。
溶液１（水相）：１２０ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１２０ｇのＢｒｉｊＬ２３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１２．０ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液２（モノマー相）：０．８０ｇのｎ−ブチルシアノアクリレート（モノマー、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｌｏｃｔｉｔｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、およびＭｉｇｌｙｏｌ８１２（Ｃａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｔｚ  ＧｍＢＨ、５．１ｍｇのＮＲ６６８を混合物に添加するように）で溶解した０．０４８ｇの色素ＮＲ６６８（修飾ナイルレッド、ＳＩＮＴＥＦ）溶液をガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液１および２を、氷上に置いた２０ｍｌのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６×３０秒間隔）超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、２５％振幅）。超音波処理後、形成されたミニエマルションを室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させ、次いでｐＨをｐＨ５に調整した。
粒径およびそのゼータ電位を、ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。
上記の方法は、溶液を混ぜる前に部分重合をもたらした。残った液体モノマー溶液を使用し、得られたナノ粒子は、多分散度指数が０．２７、ゼータ電位が−３．６６ｍＶ、ナノ粒子濃度が４．１％（ｗ／ｗ）で、１４８ｎｍ（ｚ平均直径）であった。
【０１２９】
実施例１０（比較例）：ラジカル阻害剤（ＢＨＴ）とともに０．６％のＮＲ６６８色素を使用した粒子合成。
溶液１（水相）：１２０ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１２０ｇのＢｒｉｊＬ２３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１２．０ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液２（モノマー相）：０．８０ｇのｎ−ブチルシアノアクリレート（モノマー、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｌｏｃｔｉｔｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、０．０４３ｇのブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、Ｆｌｕｋａ）、およびＭｉｇｌｙｏｌ８１２（Ｃａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｔｚ  ＧｍＢＨ、５．３ｍｇのＮＲ６６８を混合物に添加するように）で溶解した０．０５０ｇの色素ＮＲ６６８（修飾ナイルレッド、ＳＩＮＴＥＦ）溶液をガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液１および２を、氷上に置いた２０ｍＬのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６×３０秒間隔）超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、２５％振幅）。超音波処理後、形成されたミニエマルションを室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させ、次いでｐＨをｐＨ５に調整した。
粒径およびそのゼータ電位を、ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。
得られたナノ粒子は、多分散度指数が０．２４、ゼータ電位が−３，９０ｍＶで、１６４，２ｎｍ（ｚ平均直径）であった。
【０１３０】
実施例１２（比較例）：アニオン性阻害剤（ＭＳＡ）とともに０．２％ＮＲ６６８色素を使用した粒子合成。
溶液１（水相）：１２０ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１２０ｇのＢｒｉｊＬ２３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１２．０ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液２（モノマー相）：０．８０ｇのｎ−ブチルシアノアクリレート（モノマー、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｌｏｃｔｉｔｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、０．００２ｇのメタンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＭｉｇｌｙｏｌ８１２（Ｃａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｔｚ  ＧｍＢＨ、２．１ｍｇのＮＲ６６８を混合物に添加するように）で溶解した０．０２０ｇの色素ＮＲ６６８（修飾ナイルレッド、ＳＩＮＴＥＦ）溶液をガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液１および２を、氷上に置いた２０ｍＬのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６×３０秒間隔）超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、２５％振幅）。超音波処理後、形成されたミニエマルションを室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させ、次いでｐＨをｐＨ５に調整した。
粒径およびそのゼータ電位を、ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。
得られたナノ粒子は、多分散度指数が０．３３、ゼータ電位が−４，７９ｍＶ、ナノ粒子濃度が６．０％（ｗ／ｗ）で、２０１ｎｍ（ｚ平均直径）であった。
【０１３１】
実施例１３（比較例）：ラジカル阻害剤（ＢＨＡ）とともに０．２％ＮＲ６６８色素を使用した粒子合成。実施例１３の粒子は、バニリンの代わりにＢＨＡを使用して、実施例１６に開示されたものと同じ実験手順を用いることによって得られた。
【０１３２】
実施例１６：二重阻害剤（バニリン）とともに０．２％ＮＲ６６８色素を使用した粒子合成。
溶液１（水相）：１２０ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１２０ｇのＢｒｉｊＬ２３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１２．０ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液２（モノマー相）：０．８０ｇのｎ−ブチルシアノアクリレート（ＢＣＡ、モノマー、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｌｏｃｔｉｔｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、０．０４０ｇのバニリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＭｉｇｌｙｏｌ８１２（ＣａｅｓｅｒおよびＬｏｒｅｔｚ  ＧｍＢＨ、２．１ｍｇのＮＲ６６８を混合物に添加するように）で溶解した０．０２０ｇの色素ＮＲ６６８（修飾ナイルレッド、ＳＩＮＴＥＦ）溶液をガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液１および２を、氷上に置いた２０ｍＬのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６ｘ３０秒間隔）超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、２５％振幅）。超音波処理後、形成されたミニエマルションを室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させ、次にｐＨをｐＨ５に調整した。
粒径およびそのゼータ電位は、ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。
得られたナノ粒子は、多分散度指数が０．２３、ゼータ電位が−３，４５ｍＶ、およびナノ粒子濃度が６．６％（ｗ／ｗ）で、１１２ｎｍ（ｚ平均直径）であった。
【０１３３】
実施例２０：ミニエマルション法を使用し、二重阻害剤（ＨＤＭＢ）とともに０．６％ＮＲ６６８色素を使用した粒子合成。
溶液１（水相）：１２０ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１２０ｇのＢｒｉｊＬ２３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１２．０ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液２（モノマー相）：０．８０ｇのｎ−ブチルシアノアクリレート（モノマー、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｌｏｃｔｉｔｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、０．０４３ｇの４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシベンズアルデヒド（ＨＭＤＢ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＭｉｇｌｙｏｌ８１２（Ｃａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｔｚ  ＧｍＢＨ、５．３ｍｇのＮＲ６６８を混合物に添加するように）で溶解した０．０５０ｇの色素ＮＲ６６８（修飾ナイルレッド、ＳＩＮＴＥＦ）溶液をガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液１および２を、氷上に置いた２０ｍＬのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６×３０秒間隔）超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、２５％振幅）。超音波処理後、形成されたミニエマルションを室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させ、次いでｐＨをｐＨ５に調整した。
粒径とそのゼータ電位を、ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。
得られたナノ粒子は、多分散度指数が０．２０、ゼータ電位が−３，９０ｍＶ、およびナノ粒子濃度が６．０％（ｗ／ｗで、）で、１５４ｎｍ（ｚ平均直径）であった。
【０１３４】
比較例８、９、１１、１４、ならびに実施例１５、１７、１８、および１９。
実施例８、９、１１、１４、１５、１７、１８、および１９の粒子は、実施例２０について開示された実験手順と同じ手順を用い、阻害剤の種類を変えることによって得られた。
【０１３５】
実施例３９：約０．１５％の標的部分を有するステルス粒子（ＰＥＧ葉酸標的）。
溶液１（ＰＥＧ／標的リガンド）：１５ｍｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−葉酸および５．０ｇの蒸留水をガラスバイアル中で混合し、ｐＨを５Ｍ  ＨＣｌでｐＨ６に調整し、１５分間Ｎ2を用いて脱気した。
溶液２（モノマー相）：０．４５ｇのｎ−ブチルシアノアクリレート（モノマー、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｌｏｃｔｉｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、およびＭｉｇｌｙｏｌ８１２（Ｃａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｔｚ  ＧｍＢＨ、２．０ｍｇのＮＲ６６８を混合物に添加するように）で溶解した０．０１５ｇの色素ＮＲ６６８（修飾ナイルレッド、ＳＩＮＴＥＦ）溶液をガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液３（安定剤）：３０ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、３０ｍｇのＢｒｉｊＬ２３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および５．０ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液１、２、および３を、氷上に置いた５ｍＬのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６×３０秒間隔）超音波処理し（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、振幅２５％）、室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させた。ｐＨをｐＨ５に調整し、溶液を室温で蒸留水に対して十分に透析し（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＭＷＣＯ１２−１４０００）て、界面活性剤および未反応のＰＥＧを除去した。粒径およびそのゼータ電位を、ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。上記の方法により、多分散度指数が０．１７、ゼータ電位が−９ｍＶ、ナノ粒子濃度が１．８０％（ｗ／ｗ）で、１７０ｎｍ（ｚ平均直径）のＰＥＧ化された標的ナノ粒子が得られた。
【０１３６】
実施例４１：二重阻害剤（バニリン）とともに１．８％ＰＰ９色素を使用した粒子合成。
溶液１（水相）：６０ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、６０ｍｇのＢｒｉｊＬ２３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および６．０ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液２（モノマー相）：１．０１ｇのｎ−オクチルシアノアクリレート（モノマー、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｌｏｃｔｉｔｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、０．０５０ｇのバニリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０２０ｇの色素ＰＰ９（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＸ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液、および０．０１９ｇのＭｉｇｌｙｏｌ８１２（Ｃａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｔｚ  ＧｍＢＨ）を、ガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液１および２を、氷上に置いた２０ｍＬのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６×３０秒間隔）超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、２５％振幅）。超音波処理後、形成されたミニエマルションを室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させ、ｐＨをｐＨ５に調整し、試料を透析した（３×１Ｌ、１ｍＭＨＣｌ）。粒径およびそのゼータ電位を、ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。得られたナノ粒子は、多分散度指数が０．２６、ゼータ電位が−２．６ｍＶ、およびナノ粒子濃度が６．９％（ｗ／ｗ）で、１７４ｎｍ（ｚ平均直径）であった。
【０１３７】
実施例４２：二重阻害剤（バニリン）とともに０．２２％ＮＲ６６８色素およびＡＰＩ（１８．６％カバジタキセル）を使用した粒子合成。
溶液１（水相）：５０ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１００ｇのＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、および６．０ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液２（モノマー相）：０．５ｇのエチルブチルシアノアクリレート（モノマー、ＳＩＮＴＥＦ）、０．０３０ｇのバニリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１２５ｇのカバジタキセル（Ｂｉｏｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ，Ｃｈｉｎａ）、およびＭｉｇｌｙｏｌ８１２（Ｃａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｔｚ  ＧｍＢＨ、２．１ｍｇのＮＲ６６８を混合物に添加するように）で溶解した０．０１５ｇの色素ＮＲ６６８（修飾ナイルレッド、ＳＩＮＴＥＦ）溶液をガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液１および２を、氷上に置いた２０ｍＬのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６×３０秒間隔）超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、２５％振幅）。超音波処理後、形成されたミニエマルションを室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させ、次いでｐＨをｐＨ５に調整し、蒸留水に対して十分に透析した。
粒径およびそのゼータ電位を、ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。
得られたナノ粒子は、多分散度指数が０．２２、ゼータ電位が−３，１０ｍＶ、ナノ粒子濃度が１．１９％（ｗ／ｗ）で、１７５ｎｍ（ｚ平均直径）であった。
【０１３８】
実施例４３：二重阻害剤（バニリン）とともに０．２４％脂質７８０およびＡＰＩ（２３％のカバジタキセル）を使用した粒子合成。
溶液１（水相）：３０ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１３０ｇのＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、および６ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液２（モノマー相）：０．４５０ｇのエチルブチルシアノアクリレート（モノマー、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｌｏｃｔｉｔｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、０．０３０ｇのバニリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および０．１５０ｇのカバジタキセル（Ｂｉｏｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ，Ｃｈｉｎａ）、Ｍｉｇｌｙｏｌ  ８１２（Ｃａｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｒｅｔｚ  ＧｍＢＨ、１４ｍｇのＬｉｐｉｄ７８０を混合物に添加するように）で溶解した０．０２４ｇの色素Ｌｉｐｉｄ７８０（ＣＥＡ化学物質）溶液をガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液１および２を、氷上に置いた２０ｍＬのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６×３０秒間隔）超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、２５％振幅）。超音波処理後、形成されたミニエマルションを室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させ、次いでｐＨをｐＨ５に調整した。
粒径およびそのゼータ電位を、ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。
得られたナノ粒子は、多分散度指数が０．１８、ゼータ電位が−２，００ｍＶ、およびナノ粒子濃度が１，０５％（ｗ／ｗ）で、１１８ｎｍ（ｚ平均直径）であった。
【０１３９】
実施例４４：二重阻害剤（バニリン）とともにＡＰＩ（１０％カバジタキセル）を使用した粒子合成。
溶液１（水相）：１５０ｍｇのＫｏｌｌｉｐｈｏｒＨＳ  １５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１５０ｇのＢｒｉｊＬ２３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１８．０ｇの０．１Ｍ塩酸溶液（Ｍｅｒｃｋ）水を、固体が完全に溶解するまでガラスバイアル中で混合した。
溶液２（モノマー相）：２．２５ｇのエチルブチルシアノアクリレート（モノマー、Ｃｕａｎｔｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｐａｉｎ）、０．０６０ｇのバニリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、および０．２７０ｇのカバジタキセル（Ｂｉｏｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ，Ｃｈｉｎａ）をガラスバイアル中で完全に混合した。
溶液１および２を、氷上に置いた２０ｍＬのガラスバイアル中でマグネチックスターラーを使用して３０秒間混合した。氷上で直ちに水中油型エマルションを３分間（６×３０秒間隔）超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０ＣＥ、２５％振幅）。超音波処理後、形成されたミニエマルションを室温で、一晩回転（１５ｒｐｍ）により重合させ、次いでｐＨをｐＨ５に調整し、溶液を１ｍＭ塩酸（水性、Ｍｅｒｃｋ）に対して透析した。
粒径およびそのゼータ電位を、ＭａｌｖｅｒｎＮａｎｏシリーズゼータサイザーを使用して測定した。必要に応じて、遠心分離を使用して大きな副産物粒子からナノ粒子を分離し、ナノ粒子溶液を再分析した（表２を参照）。
得られたナノ粒子は、多分散度指数が０．１４、ゼータ電位が−２，８０ｍＶ、ナノ粒子濃度が１０．５％（ｗ／ｗ）で、１６３ｎｍ（ｚ平均直径）であった。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【国際調査報告】
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