(57)【要約】本出願は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、第１の抗原結合ドメイン、第１の単一ドメイン抗体を含む、第２の抗原結合ドメイン、及び第２の単一ドメイン抗体を含む、第３の抗原結合ドメインを含む、多重特異性、例えば、三重特異性の抗原結合タンパク質を提供する。多重特異性抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、キット、及びその使用方法をさらに提供する。本出願は、完全長４本鎖抗体またはそれ由来の抗原結合断片に融合した２つ以上の異なる単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分
（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、第２の抗原結合部分、及び
（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、第３の抗原結合部分
を含み、
前記第１の抗原結合部分、前記第２の抗原結合部分、及び前記第３の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）。
【請求項２】
前記ＭＡＢＰが、三重特異性抗原結合タンパク質である、請求項１に記載のＭＡＢＰ。
【請求項３】
前記第１の抗原結合部分が、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である、請求項１または２に記載のＭＡＢＰ。
【請求項４】
前記第１の抗原結合部分が、前記ＶＨを含む重鎖、及び前記ＶＬを含む軽鎖を含む抗体断片である、請求項１または２に記載のＭＡＢＰ。
【請求項５】
前記第１のｓｄＡｂ及び／または前記第２のｓｄＡｂが、ＶＨＨである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項６】
前記ＭＡＢＰが、
（１）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１のｓｄＡｂ、及び前記第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び
（２）Ｎ末端からＣ末端において、前記第２のｓｄＡｂ、及び前記第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチド
を含む、請求項５に記載のＭＡＢＰ。
【請求項７】
前記ＭＡＢＰが、
（１）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の重鎖、及び前記第１のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド；及び
（２）Ｎ末端からＣ末端において、前記第２のｓｄＡｂ、及び前記第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチド
を含む、請求項５に記載のＭＡＢＰ。
【請求項８】
前記ＭＡＢＰが、
（１）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１のｓｄＡｂ、及び前記第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び
（２）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の軽鎖、及び前記第２のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチド
を含む、請求項５に記載のＭＡＢＰ。
【請求項９】
前記ＭＡＢＰが、
（１）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の重鎖、及び前記第１のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド；及び
（２）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の軽鎖、及び前記第２のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチド
を含む、請求項５に記載のＭＡＢＰ。
【請求項１０】
前記ＭＡＢＰが、
（１）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１のｓｄＡｂ、前記第１の抗原結合部分の重鎖、及び前記第２のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド；及び
（２）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチド
を含む、請求項５に記載のＭＡＢＰ。
【請求項１１】
前記ＭＡＢＰが、
（１）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び
（２）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１のｓｄＡｂ、前記第１の抗原結合部分の軽鎖、及び前記第２のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチド
を含む、請求項５に記載のＭＡＢＰ。
【請求項１２】
前記ＭＡＢＰが、
（１）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１のｓｄＡｂ、前記第２のｓｄＡｂ、及び前記第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び
（２）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチド
を含む、請求項５に記載のＭＡＢＰ。
【請求項１３】
前記ＭＡＢＰが、
（１）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の重鎖、前記第１のｓｄＡｂ、及び前記第２のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド；及び
（２）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチド
を含む、請求項５に記載のＭＡＢＰ。
【請求項１４】
前記ＭＡＢＰが、
（１）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び
（２）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１のｓｄＡｂ、前記第２のｓｄＡｂ、及び前記第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチド
を含む、請求項５に記載のＭＡＢＰ。
【請求項１５】
前記ＭＡＢＰが、
（１）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び
（２）Ｎ末端からＣ末端において、前記第１の抗原結合部分の軽鎖、前記第１のｓｄＡｂ、及び前記第２のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチド
を含む、請求項５に記載のＭＡＢＰ。
【請求項１６】
前記ＭＡＢＰが、前記第１のポリペプチドの２本鎖及び前記第２のポリペプチドの２本鎖を含む、請求項６〜１５のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項１７】
前記第１のエピトープ、前記第２のエピトープ及び／または前記第３のエピトープが、免疫チェックポイント分子由来である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項１８】
前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される、請求項１７に記載のＭＡＢＰ。
【請求項１９】
前記第１の抗原結合部分が、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片である、請求項１８に記載のＭＡＢＰ。
【請求項２０】
前記抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブ由来である、請求項１９に記載のＭＡＢＰ。
【請求項２１】
前記第２の抗原結合部分は、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項２２】
前記抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、配列番号３１のアミノ酸配列、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、請求項２１に記載のＭＡＢＰ。
【請求項２３】
前記第３の抗原結合部分が、抗ＬＡＧ−３  ｓｄＡｂを含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項２４】
前記抗ＬＡＧ−３  ｓｄＡｂが、配列番号３２のアミノ酸配列、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、請求項２３に記載のＭＡＢＰ。
【請求項２５】
前記ＭＡＢＰが、
（１）配列番号１６、１８、２０、２３、２５、２６、２８のいずれか１つのアミノ酸配列、または最大で約５つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；及び
（２）配列番号１５、１７、１９、２１、２２、２４、２７のいずれか１つのアミノ酸配列、または最大で約５つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチド
を含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項２６】
前記第１のエピトープ、前記第２のエピトープ及び／または前記第３のエピトープが、免疫エフェクター細胞の腫瘍抗原または細胞表面抗原由来である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項２７】
前記第１のエピトープ、前記第２のエピトープ及び／または前記第３のエピトープが、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される腫瘍抗原である、請求項２６に記載のＭＡＢＰ。
【請求項２８】
前記第１の抗原結合部分が、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片である、請求項２７に記載のＭＡＢＰ。
【請求項２９】
前記抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ由来である、請求項２８に記載のＭＡＢＰ。
【請求項３０】
前記第２の抗原結合部分が、抗ＣＤ３  ｓｄＡｂを含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項３１】
前記第３の抗原結合部分が、抗ＥＧＦＲ  ｓｄＡｂを含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項３２】
前記第１のエピトープ、前記第２のエピトープ、及び／または前記第３のエピトープが、炎症促進性分子由来である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項３３】
前記炎症促進性分子が、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ及びエオタキシン−１からなる群から選択される、請求項３２に記載のＭＡＢＰ。
【請求項３４】
前記第１の抗原結合部分が、抗ＴＮＦ−α抗体またはその抗原結合断片である、請求項３３に記載のＭＡＢＰ。
【請求項３５】
前記抗ＴＮＦ−α抗体が、アダリムマブ由来である、請求項３４に記載のＭＡＢＰ。
【請求項３６】
前記第２の抗原結合部分が、抗ＩＬ−１７Ａ  ｓｄＡｂを含む、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項３７】
前記第３の抗原結合部分が、抗ＩＬ−１７Ｆ  ｓｄＡｂを含む、請求項３６に記載のＭＡＢＰ。
【請求項３８】
前記第１のエピトープ、前記第２のエピトープ及び／または前記第３のエピトープが、血管新生因子由来である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項３９】
前記第１の抗原結合部分が、抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片である、請求項３８に記載のＭＡＢＰ。
【請求項４０】
前記抗Ａｎｇ２抗体が、ＬＣ１０由来である、請求項３９に記載のＭＡＢＰ。
【請求項４１】
前記第２の抗原結合部分が、抗ＶＥＧＦ  ｓｄＡｂを含む、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項４２】
前記第２の抗原結合部分が、抗ＤＬＬ４  ｓｄＡｂを含む、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項４３】
前記第１の抗原結合部分が、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項４４】
前記第１の抗原結合部分が、Ｆｃ領域を含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項４５】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１  Ｆｃである、請求項４４に記載のＭＡＢＰ。
【請求項４６】
前記Ｆｃ領域が、Ｓ２２８Ｐ突然変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃである、請求項４４に記載のＭＡＢＰ。
【請求項４７】
前記第１の抗原結合部分、前記第２の抗原結合部分及び／または前記第３の抗原結合部分が、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項４８】
前記ペプチドリンカーが、約３０以下のアミノ酸長である、請求項４７に記載のＭＡＢＰ。
【請求項４９】
前記ペプチドリンカーが、配列番号１〜７のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項４８に記載のＭＡＢＰ。
【請求項５０】
前記第１のｓｄＡｂ及び／または前記第２のｓｄＡｂが、ラクダ科、ヒト化、またはヒトｓｄＡｂである、請求項１〜４９のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項５１】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、少なくとも約５５℃の凝集開始温度を有する、請求項１〜５０のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項５２】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、２５℃で少なくとも約１週間安定である、請求項１〜５０のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項５３】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、少なくとも約５回の凍結融解サイクル後に安定である、請求項１〜５０のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ。
【請求項５４】
請求項１〜５３のいずれか１項に記載のＭＡＢＰ、及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項５５】
個体における疾患の治療方法であって、有効量の請求項５４に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項５６】
前記疾患が、がんである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記がんが、乳がん、腎がん、黒色腫、肺がん、膠芽腫、頭頚部がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記疾患が、炎症性または自己免疫疾患である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記炎症性または自己免疫疾患が、関節炎、大腸炎、乾癬、重症喘息、及び中等度から重度のクローン病からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１月８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７１７２９の利益を主張し、それらの内容は、それらの全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の以下の提出物の内容、すなわち、コンピューターで読取り可能な形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７６１４２２００１０４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１９年１月４日、サイズ：８８ＫＢ）は、その全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、３つ以上の異なる抗原またはエピトープに特異的に結合する多重特異性抗原結合タンパク質、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、様々なヒト疾患、例えば、がん及び自己免疫疾患を治療するための治療剤として広く使用されてきた。現在、ネズミ、完全ヒト化及びキメラ抗体などの３０種を超えるモノクローナル抗体が、治療的使用のためにＦＤＡによって承認されている。これらのうち、リツキシマブ及びトラスツズマブは、最も良く売れているがんに対するタンパク質治療薬である。最近、イピリムマブ及びニボルマブなどの免疫チェックポイント分子を標的とするモノクローナル抗体が、腫瘍に対してＴ細胞免疫を誘導することによって臨床成果を促進することが示されている。多くの患者が単剤療法にあまり応答しないため、モノクローナル抗体は、その効力を高めるために、他の免疫調節法、例えば、他の標的に対するモノクローナル抗体と組み合わせることが多い。例えば、臨床試験では、ニボルマブとイピリムマブとの組み合わせにより、黒色腫患者の客観的奏効率の改善が得られることが示されている。
【０００５】
治療効果を増強し、潜在的有用性を広げるために、多重特異性抗体は、２つ以上の治療標的を同時に調節するように設計されている。二重特異性抗体は、単純に２種類のモノクローナル抗体を併用するよりも有効であり得ることが報告されている。様々な多重特異性抗体フォーマットが開発されている。例えば、二重特異性抗体は、抗原結合性（Ｆａｂ）断片または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をモノクローナル抗体と融合することによって作製されている（例えば、Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１３；１０：１−１８を参照されたい）。異なるフォーマットでサイズが異なる多重特異性抗体は、様々な技術によって頻繁に製造され、異なるインビボ分布、組織浸透性、及び薬物動態特性を有する。
【０００６】
これらの概念的な利点にもかかわらず、既存の二重特異性抗体は、生物学的医薬品としての製造及び開発が難しい。人工構築物としては、二重特異性抗体は、正常Ｂ細胞によって産生できない。二重特異性抗体の作製の初期の試みは、単一特異性抗体の化学的結合及びｍＡｂ発現細胞の融合が関与していたが、これらのアプローチでは、低効率であり、多くの副産物からの精製する必要がある。タンパク質工学及び分子生物学における高度な方法は、様々な新規二重特異性抗体フォーマットの組み換え構築物を可能にしている。しかしながら、これら公知の遺伝子操作を受けた多重特異性抗体フォーマットに採用されると、個々の構成要素、例えば、ｓｃＦｖ及びｍＡｂは、有益な生化学的及び／または生物物理学的特性、血清半減期、及び／または安定性を失い、効力が悪く、不安定で、かつ免疫原性が高くなる。
【０００７】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、各々が単一の単量体抗体可変ドメインを有する抗体断片である。２本の重鎖及び２本の軽鎖を有する一般的なモノクローナル抗体よりも大きさがはるかに小さいにもかかわらず、ｓｄＡｂは、ｍＡｂと同様の親和性及び特異性で抗原に結合することができる。ｓｄＡｂは、構成要素として使用され、ＩｇＧ  Ｆｃドメインと融合して、ＩｇＧ様抗体、例えば、二価かつ二重特異性抗体を作製することができる（例えば、Ｈｍｉｌａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；４５：３８４７−３８５６を参照されたい）。
本明細書に参照される全ての刊行物、特許、特許出願、及び公開特許出願の開示は、それらの全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１３；１０：１−１８
【非特許文献２】Ｈｍｉｌａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；４５：３８４７−３８５６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本出願は、完全長４本鎖抗体またはそれ由来の抗原結合断片に融合した２つ以上の異なる単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質を提供する。
【００１０】
したがって、本出願の一態様は、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質（「ＭＡＢＰ」）が提供される。いくつかの実施形態では、第１のエピトープ、第２のエピトープ、及び第３のエピトープは、同じ抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープ、第２のエピトープ、及び第３のエピトープは、異なる抗原由来である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープ、及び第３のエピトープは、同じ抗原由来であり、及び第１のエピトープは、異なる抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープ及び第３のエピトープは、同じ抗原由来であり、第２のエピトープは、異なる抗原由来である。
【００１１】
上記のＭＡＢＰのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分及び／または第３の抗原結合部分は、単一ポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。
【００１２】
上記のＭＡＢＰのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１のｓｄＡｂ、及び第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第２のｓｄＡｂ、及び第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖、及び第１のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第２のｓｄＡｂ、及び第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１のｓｄＡｂ、及び第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖、及び第２のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖、及び第１のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖、及び第２のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１のｓｄＡｂ、第１の抗原結合部分の重鎖、及び第２のｓｄＡｂドを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１のｓｄＡｂ、第１の抗原結合部分の軽鎖、及び第２のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１のｓｄＡｂ、第２のｓｄＡｂ、及び第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖、第２のｓｄＡｂ、及び第１のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１のｓｄＡｂ、第２のｓｄＡｂ、及び第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖、第２のｓｄＡｂ、及び第１のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、第１のポリペプチドの２本鎖及び第２のポリペプチドの２本鎖を含む。
【００１３】
上記のＭＡＢＰのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び／または第３のエピトープが、免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブ（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））由来である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、配列番号３１のアミノ酸配列、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第３の抗原結合部分は、抗ＬＡＧ−３  ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  ｓｄＡｂは、配列番号３２のアミノ酸配列、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  ｓｄＡｂは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）配列番号１６、１８、２０、２３、２５、２６、２８のいずれか１つのアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）アミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；及び（２）配列番号１５、１７、１９、２１、２２、２４、２７のいずれか１つのアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）アミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（１）配列番号１６、１８、２０、２３、２５、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；及び（２）配列番号１５、１７、１９、２１、２２、２４または２７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む。
【００１４】
上記のＭＡＢＰのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び／または第３のエピトープは、腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び／または第３のエピトープは、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の細胞表面抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ由来である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＣＤ３  ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、第３の抗原結合部分は、抗ＥＧＦＲ  ｓｄＡｂを含む。
【００１５】
上記のＭＡＢＰのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び／または第３のエピトープは、炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、炎症促進性分子は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ及びエオタキシン−１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＴＮＦ−α抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−α抗体は、アダリムマブ由来である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＩＬ−１７Ａ  ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、第３の抗原結合部分は、抗ＩＬ−１７Ｆ  ｓｄＡｂを含む。
【００１６】
上記のＭＡＢＰのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び／または第３のエピトープは、血管新生因子由来である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗Ａｎｇ２抗体は、ＬＣ１０由来である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＶＥＧＦ  ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、第３の抗原結合部分は、抗ＤＬＬ４  ｓｄＡｂを含む。
【００１７】
上記のＭＡＢＰのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１８】
上記のＭＡＢＰのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ、例えば、Ｓ２２８Ｐ突然変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃである。
【００１９】
上記のＭＡＢＰのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び／または第３の抗原結合部分は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１〜７のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分及び／または第３の抗原結合部分は、化学的に互いに融合している。
【００２０】
上記のＭＡＢＰのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、またはヒトｓｄＡｂである。
【００２１】
上記のＭＡＢＰのいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／ｍＬ、またはそれ以上の発現レベルで、例えば、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で組み換え的に産生することができる。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも約５５℃、例えば、約５５℃〜約７０℃の凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、約２５℃で少なくとも約１週間安定である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、３７℃で少なくとも約１週間安定である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、少なくとも約５回の凍結融解サイクル後に安定である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、生理的温度、例えば、約３７℃で、少なくとも約１日、３日、または７日のいずれか１つの間、ヒト血清中で高い長期安定性を有する。
【００２２】
本出願の別の態様は、上記のＭＡＢＰのいずれか１つ、及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のＭＡＢＰの濃度は、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、例えば、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上である。
【００２３】
本出願の一態様では、有効量の上記の医薬組成物のいずれか１つを個体に投与することを含む、個体における疾患の治療方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、腎がん、黒色腫、肺がん、膠芽腫、頭頚部がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、及びリンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患は、炎症性または自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、炎症性または自己免疫疾患は、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び関節炎潰瘍性大腸炎）、大腸炎、乾癬、重症喘息、及び中等度から重度のクローン病からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖を有する単一特異性完全長抗体、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂを含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端は、第１の適宜ペプチドリンカーを介して重鎖のＮ末端に融合され、第２のｓｄＡｂのＣ末端は、第２の適宜ペプチドリンカーを介して軽鎖のＮ末端に融合される、例示の三重特異性抗原結合タンパク質（本明細書では、「ＴＡＢＰ」とも称される）の概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３エピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＨＨ２−ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＨＨ２−ＶＬ−ＣＬ。
【図２】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖を有する単一特異性完全長抗体、第１のｓｄＡｂ、及び第２のｓｄＡｂを含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端は、第１の適宜ペプチドリンカーを介して第２のｓｄＡｂのＮ末端に融合され、第２のｓｄＡｂのＣ末端は、第２の適宜ペプチドリンカーを介して重鎖のＮ末端に融合される、例示の三重特異性抗原結合タンパク質の概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３エピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨＨ１−ＶＨＨ２−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨＨ１−  ＶＨＨ２−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ。
【図３】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖を有する単一特異性完全長抗体、第１のｓｄＡｂ、及び第２のｓｄＡｂを含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端は、第１の適宜ペプチドリンカーを介して第２のｓｄＡｂのＮ末端に融合され、第２のｓｄＡｂのＣ末端は、第２の適宜ペプチドリンカーを介して重鎖のＮ末端に融合される、例示の三重特異性抗原結合タンパク質の概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３エピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＨＨ１−ＶＨＨ２−ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＨＨ１−ＶＨＨ２−ＶＬ−ＣＬ。
【図４】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖を有する単一特異性完全長抗体、第１のｓｄＡｂ、及び第２のｓｄＡｂを含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端は、第１の適宜ペプチドリンカーを介して軽鎖のＮ末端に融合され、第２のｓｄＡｂのＮ末端は、第２の適宜ペプチドリンカーを介して軽鎖のＣ末端に融合される、例示の三重特異性抗原結合タンパク質の概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３エピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＨＨ１−ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＨＨ１−ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２。
【図５】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖を有する単一特異性完全長抗体、第１のｓｄＡｂ、及び第２のｓｄＡｂを含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端が、第１のｓｄＡｂのＣ末端は、第１の適宜ペプチドリンカーを介して重鎖のＮ末端に融合され、第２のｓｄＡｂのＣ末端は、第２の適宜ペプチドリンカーを介して軽鎖のＣ末端に融合される、例示の三重特異性抗原結合タンパク質の概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３エピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２；（２）ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２。
【図６】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖を有する単一特異性完全長抗体、第１のｓｄＡｂ、及び第２のｓｄＡｂを含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端は、第１の適宜ペプチドリンカーを介して重鎖のＮ末端に融合され、第２のｓｄＡｂのＣ末端は、第２の適宜ペプチドリンカーを介して重鎖のＣ末端に融合される、例示の三重特異性抗原結合タンパク質の概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３エピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２；（３）ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２；及び（４）ＶＬ−ＣＬ。
【図７】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖を有する単一特異性完全長抗体、第１のｓｄＡｂ、及び第２のｓｄＡｂを含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端は、第１の適宜ペプチドリンカーを介して軽鎖のＮ末端に融合され、第２のｓｄＡｂのＮ末端は、第２の適宜ペプチドリンカーを介して重鎖のＣ末端に融合される、例示の三重特異性抗原結合タンパク質の概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３エピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＨＨ１−ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２；及び（４）ＶＨＨ１−ＶＬ−ＣＬ。
【図８】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖を有する単一特異性完全長抗体、第１のｓｄＡｂ、及び第２のｓｄＡｂを含み、第１のｓｄＡｂのＮ末端は、第１の適宜ペプチドリンカーを介して重鎖のＣ末端に融合され、第２のｓｄＡｂのＮ末端は、第２の適宜ペプチドリンカーを介して軽鎖のＣ末端に融合される、例示の三重特異性抗原結合タンパク質の概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３エピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ１；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ１；及び（４）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２。
【図９】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖を有する単一特異性完全長抗体、第１のｓｄＡｂ、及び第２のｓｄＡｂを含み、第１のｓｄＡｂのＮ末端は、第１の適宜ペプチドリンカーを介して第２のｓｄＡｂのＣ末端に融合され、第２のｓｄＡｂのＮ末端は、第２の適宜ペプチドリンカーを介して軽鎖のＣ末端に融合される、例示の三重特異性抗原結合タンパク質の概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３エピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２−ＶＨＨ１；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２−ＶＨＨ１。
【図１０】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖を有する単一特異性完全長抗体、第１のｓｄＡｂ、及び第２のｓｄＡｂを含み、第１のｓｄＡｂのＮ末端は、第１の適宜ペプチドリンカーを介して第２のｓｄＡｂのＣ末端に融合され、第２のｓｄＡｂのＮ末端は、第２の適宜ペプチドリンカーを介して重鎖のＣ末端に融合される、例示の三重特異性抗原結合タンパク質の概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３エピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２−ＶＨＨ１；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２−ＶＨＨ１；及び（４）ＶＬ−ＣＬ。
【図１１】１０個の例示のＴＡＢＰの抗体産生データを要約した表を示す。ＴＰＴＬ１１は、図１に示すフォーマットを有する。ＴＰＴＬ１２は、図２に示すフォーマットを有する。ＴＰＴＬ１３は、図３に示すフォーマットを有する。ＴＰＴＬ１４は、図４に示すフォーマットを有する。ＴＰＴＬ１５は、図５に示すフォーマットを有する。ＴＰＴＬ１６は、図６に示すフォーマットを有する。ＴＰＴＬ１７は、図７に示すフォーマットを有する。ＴＰＴＬ１８は、図８に示すフォーマットを有する。ＴＰＴＬ１９は、図９に示すフォーマットを有する。ＴＰＴＬ２０は、図１０に示すフォーマットを有する。
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｋは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（陽性対照）のそれぞれのＰＤ−１への結合曲線を示す。
【図１２−２】図１２Ａ〜１２Ｋは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（陽性対照）のそれぞれのＰＤ−１への結合曲線を示す。
【図１２−３】図１２Ａ〜１２Ｋは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（陽性対照）のそれぞれのＰＤ−１への結合曲線を示す。
【図１２−４】図１２Ａ〜１２Ｋは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（陽性対照）のそれぞれのＰＤ−１への結合曲線を示す。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｋは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＨＣＡｂ（陽性対照）のそれぞれのＴＩＧＩへの結合曲線を示す。
【図１３−２】図１３Ａ〜１３Ｋは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＨＣＡｂ（陽性対照）のそれぞれのＴＩＧＩへの結合曲線を示す。
【図１３−３】図１３Ａ〜１３Ｋは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＨＣＡｂ（陽性対照）のそれぞれのＴＩＧＩへの結合曲線を示す。
【図１３−４】図１３Ａ〜１３Ｋは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＨＣＡｂ（陽性対照）のそれぞれのＴＩＧＩへの結合曲線を示す。
【図１３−５】図１３Ａ〜１３Ｋは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＨＣＡｂ（陽性対照）のそれぞれのＴＩＧＩへの結合曲線を示す。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｋは、は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＶＨＨ２  ＨＣＡｂ（陽性対照）のそれぞれのＬＡＧ−３への結合曲線を示す。
【図１４−２】図１４Ａ〜１４Ｋは、は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＶＨＨ２  ＨＣＡｂ（陽性対照）のそれぞれのＬＡＧ−３への結合曲線を示す。
【図１４−３】図１４Ａ〜１４Ｋは、は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＶＨＨ２  ＨＣＡｂ（陽性対照）のそれぞれのＬＡＧ−３への結合曲線を示す。
【図１４−４】図１４Ａ〜１４Ｋは、は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００によって測定される、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）及びＶＨＨ２  ＨＣＡｂ（陽性対照）のそれぞれのＬＡＧ−３への結合曲線を示す。
【図１５】例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）のＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、及びＬＡＧ−３に対するインビトロ結合及びリガンド競合パラメーターを示す。
【図１６】温度誘導凝集による例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）の熱安定性を示す。
【図１７】５回の凍結融解サイクル後の例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）の安定性を示す。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃは、血清の共インキュベーション後の１日目、７日目、及び１４日目の例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ１７）のヒト血清安定性を示す。図１８Ａは、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ１７）のヒトＴＩＧＩＴタンパク質への結合活性を示す。図１８Ｂは、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ１７）のヒトＬＡＧ−３タンパク質への結合活性を示す。図１８Ｃは、例示のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ１７）のヒトＰＤ−１タンパク質への結合活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本出願は、完全長抗体、または重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合断片に融合した２つ以上の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む新規の多重特異性抗原結合タンパク質（「ＭＡＢＰ」）を提供する。各ｓｄＡｂは、異なる標的（例えば、異なるエピトープまたは抗原）に特異的に結合し、ｓｄＡｂの標的は、完全長抗体または抗原結合断片によって認識される標的とも異なる。本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質フォーマットは、異なる標的抗原の多価共連結を可能にし、抗体などのホモ二量体タンパク質の折り畳み及び精製を容易にする新規のホモ二量体化変異体も提供する。
【００２６】
本出願のいくつかの実施形態は、免疫チェックポイント分子、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）、血管新生因子、または炎症促進性分子の組み合わせを含む、種々の疾患関連エピトープ及び／または抗原の組み合わせを標的にするように適用することができる三重特異性抗原結合タンパク質（「ＴＡＢＰ」）を提供する。本明細書に記載のＴＡＢＰは、種々の疾患及び条件、例えば、がん、炎症、及び自己免疫疾患の治療に有用な薬剤を提供する。
【００２７】
したがって、本出願の一態様は、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体を含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体を含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１）に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２の免疫チェックポイント分子（例えば、ＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体を含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３の免疫チェックポイント分子（例えば、ＬＡＧ−３）に特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体を含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の腫瘍抗原（例えば、ＨＥＲ−２）に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＤ−３）に特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体を含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３の腫瘍抗原（例えば、ＥＧＦＲ）に特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体を含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）が提供される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の炎症促進性分子（例えば、ＴＮＦ−α）に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２の炎症促進性分子（例えば、ＩＬ−１７Ａ）に特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体を含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３の炎症促進性分子（例えば、ＩＬ−１７Ｆ）に特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体を含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）が提供される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の血管新生因子（例えば、Ａｎｇ２）に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２の血管新生因子（例えば、ＶＥＧＦ）に特異的に結合する第１の単一ドメイン抗体を含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３の血管新生因子（例えば、ＤＬＬ４）に特異的に結合する第２の単一ドメイン抗体を含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）が提供される。
【００３２】
多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、キット及び製造品、ならびに本明細書に記載の多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質を用いた疾患の治療方法も提供される。
【００３３】
Ｉ．定義
本発明の実施において、具体的な反対の指示がない限り、当該技術分野の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、ＤＮＡ組み換え技術における従来の方法が採用され、その多くを例示の目的で以下に記載する。このような技術は、文献で詳細に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙまたはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）及びその他類似の参考文献を参照されたい。
【００３４】
「多重特異性抗原結合タンパク質」及び「ＭＡＢＰ」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。「三重特異性抗原結合タンパク質」及び「ＴＡＢＰ」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、臨床病理的過程で治療される個体または細胞の自然経過を変更するように設計された臨床的介入を指す。治療の望ましい効果としては、疾患進行率の低下、疾患状態の寛解または緩和、及び寛解または予後の改善が挙げられる。例えば、治療される疾患または状態（例えば、がん、炎症性疾患または自己免疫疾患）に関連する１つ以上の症状が緩和または除去された場合、本出願のＭＡＢＰにより個体は成功裏に「治療」される。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「有効量」は、対象における疾患または状態を治療するのに有効な薬剤または薬物の量を指す。がんの場合、本出願の有効量のＭＡＢＰは、がん細胞数の減少、腫瘍の大きさの縮小、周辺臓器へのがん細胞の浸潤抑制（すなわち、ある程度遅くする、好ましくは停止する）、腫瘍転移の抑制（すなわち、ある程度遅くする、好ましくは停止する）、腫瘍の増殖のある程度の抑制、及び／または、がんに伴う１つ以上の症状のある程度の緩和をすることができる。臨床的に理解されるように、有効量の薬物、化合物、または医薬組成物は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併用して実現しても、実現しなくてもよい。したがって、「有効量」は、１つ以上の治療薬を投与するという観点で考慮されてよく、単剤は、１つ以上の他の薬剤と併用され、所望の結果が実現する、または実現し得る場合、有効量で投与されたとみなされ得る。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「個体」または「対象」は、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類または霊長類を含むが、これらに限定されない、哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
【００３８】
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長４本鎖抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性または三重特異性抗体）、ダイアボディ、及び一本鎖分子、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書では「抗体」と互換的に使用される。本明細書で企図される抗体は、重鎖のみ抗体及び単一ドメイン抗体を含む。
【００３９】
基本的な４本鎖抗体単位は、２つの同一な軽（Ｌ）鎖及び２つの同一な重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる付加的ポリペプチドを伴った５つの基本へテロ四量体単位からなり、１０の抗原結合部位を含有するが、一方、ＩｇＡ抗体は、２〜５つの基本的な４鎖単位からなり、これは重合して、Ｊ鎖と組み合わせて多価集合体を形成し得る。ＩｇＧの場合、４鎖単位は、一般的に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖と連結されるが、一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに依存して、１つ以上のジスルフィド結合により互いに連結される。Ｈ及びＬ鎖は、各々、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）と、その後にα及びγ鎖の各々では３つの定常ドメイン（ＣＨ）ならびにμ及びεアイソタイプでは４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、その後にその他端に定常ドメインを有する。ＶＬは、ＶＨとともに整列され、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列される。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬの対合は一緒になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性に関しては、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ  （ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ  ７１ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。任意の脊椎動物種からのＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明白に異なる型のうちの１つに割り当てられ得る。それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てられ得る。それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる重鎖を有する５つのクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがある。γ及びμクラスは、ＣＨ配列及び機能の相対的に小さな差に基づいてさらにサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２。
【００４０】
「単離された」抗体（または構築物）は、その作製（例えば、天然または組み換え）環境の成分から特定、単離され、及び／または回収されたものである。単離されたポリペプチドは、その作製環境からの他の全ての成分と関連しないのが好ましい。その作製環境の混入汚染成分、例えば、組み換えトランスフェクト細胞から生じるものは、典型的には、抗体の研究、診断、または治療への使用を妨げる物質であり、それらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、（１）例えば、Ｌｏｗｒｙ法で測定した場合に、抗体の９５重量％を超えるまで、いくつかの実施形態では、９９重量％を超えるまで、（１）スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた非還元条件または還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離された抗体には、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分は存在しないことになるため、組み換え細胞内にインサイチュ抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチド、抗体、または構築物は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されることになる。
【００４１】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、「ＶＨ」及び「ＶＬ」と呼ばれ得る。これらのドメインは、一般的に、（同じクラスの他の抗体に対して）抗体の最も可変な部分であり、抗原結合部位を含有している。ラクダ科の種に由来する重鎖のみ抗体は、「ＶＨＨ」と呼ばれる単一重鎖可変領域を有する。従って、ＶＨＨは、特殊型のＶＨである。
【００４２】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定のセグメントが抗体の間の配列で広範囲に異なる、という事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、特定抗体の、その特定抗原に関する特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの全スパンを通して均一に分布しない。代わりに、可変性は、軽鎖及び重鎖の両可変ドメイン内の超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインの、より高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。自然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲ（大部分はβシート立体配置をとり、３つのＨＶＲにより連結される）を含み、これは、βシート構造を連結し、いくつかの場合には、その一部を構成するループを形成する。各鎖中のＨＶＲは、ＦＲ領域により密に接近して一緒に保持され、他の鎖からのＨＶＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、抗体依存的細胞性細胞傷害性の関与といったような種々のエフェクター機能を示す。
【００４３】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に生じる突然変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。典型的に異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、他の免疫グロブリンによって夾雑されないハイブリドーマ培養により合成されるという点で有益である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を指し、任意の特定の方法による抗体作製が必要であると解釈されるべきではない。例えば、本出願に従って使用するモノクローナル抗体は、種々の技術で作製されてよく、例えば、ハイブリドーマ方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組み換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージ提示技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）、ならびに、ヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリンの座位もしくは遺伝子の一部または全部を有する、ヒトまたはヒト様抗体を動物に産生させる技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５���５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；及び同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５を参照されたい）が挙げられる。
【００４４】
「完全長抗体」、「無傷抗体」、または「全抗体」」という用語は、交換可能に使用され、抗体断片とは対照的に、その実質的に無傷な形態の抗体を指す。具体的には、完全長４本鎖抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を伴うものを含む。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。場合によっては、無傷抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有し得る。
【００４５】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合及び／または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）を参照されたい）；抗体断片から形成される一本鎖抗体分子；単一ドメイン抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、ならびに残余「Ｆｃ」断片（この名称は容易に結晶化する能力を反映している）を産生した。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を伴う完全Ｌ鎖からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、それは単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、単一大型Ｆ（ａｂ’）２断片を生じるが、これは、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片におおよそ対応し、依然として抗原に架橋し得る。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含めてＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に２〜３の付加的残基を有することでＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する本明細書中での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。
【００４６】
Ｆｃ断片は、ジスルフィドにより一緒にまとめられた両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域（特定の細胞型で見い出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される領域）中の配列により決定される。
【００４７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は、堅く、非共有的に会合した１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（各々Ｈ及びＬ鎖からの３つのループ）を生じる。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、完全結合部位より低い親和性ではあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【００４８】
「一本鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される）は、単一ポリペプチド鎖に連結されるＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはさらに、ＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを含み、これは、抗原結合のために望ましい構造をｓＦｖに形成させる。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００４９】
本明細書に記載の抗体の「機能的断片」は、無傷抗体の部分を含み、一般的に、無傷抗体の抗原結合領域もしくは可変領域、または修飾されたＦｃＲ結合能を保持するまたは有する抗体のＦｃ領域を含む。抗体断片の例としては、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００５０】
「ダイアボディ」という用語は、鎖内対合ではなくＶドメインの鎖間対合が達成され、それにより二価断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片を生じるよう、ＶＨ及びＶＬドメイン間に短いリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖ断片（前段落を参照）を構築することにより調製される小抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により詳細に記載されている。
【００５１】
本明細書のモノクローナル抗体としては具体的には「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が挙げられ、これにおいて、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における、対応する配列と同一または相同であり、一方、当該鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における、対応する配列と同一または相同であり、そのような抗体の断片についても、それらが所望の生物学的活性を示す限り、抗体の場合と同様である（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書の目的のキメラ抗体には、ＰＲＩＭＡＴＴＺＦＤ（登録商標）抗体が含まれ、抗体の抗原結合領域は、例えば、目的の抗原でマカクサルを免疫化することによって産生される抗体由来である。本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。
【００５２】
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、レシピエントのＨＶＲ（以下に定義される）に由来する残基は、所望の特異性、親和性、及び／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、アルカパ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲに由来する残基で置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基は、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでよい。これらの修飾を、抗体性能（例えば、結合親和性）をさらに洗練させるために作製してもよい。一般的に、ヒト化抗体は、実質的に全てまたは少なくとも１つ、及び典型的に２つの可変ドメインを含み、それにおいて超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン配列のものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものであるが、ＦＲ領域は、抗体性能（例えば、結合親和性、異性化、免疫原性など）を改善する１つ以上の個々のＦＲ残基の置換を含み得る。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、典型的には、Ｈ鎖におけるわずか６つ、及びＬ鎖におけるわずか３つである。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的にヒト免疫グロブリンのものも含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。また、例えば、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）；ならびに米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号を参照されたい。
【００５３】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有し、及び／または、本明細書で開示するヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義では、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が除外される。ヒト抗体を、当該技術分野において公知の種々の技術（ファージ提示ライブラリーを含む）を使用して産生することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。また、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能な方法が、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載される。また、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）を参照されたい。ヒト抗体は、抗原攻撃に応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、しかしながら、その内因性遺伝子座が無能になっているトランスジェニック動物（例えば、免疫化ゼノマウス）に対して抗原を投与することにより調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたい）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体に関しては、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）を参照されたい。
【００５４】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用する場合、配列が超可変である、及び／または構造的に定義されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、４本鎖抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）中に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬ中に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。単一ドメイン抗体は、３つのＨＶＲ：ＶＨＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）中に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）を含む。天然４本鎖抗体では、Ｈ３及びＬ３は、６つのＨＶＲの最大の多様性を示し、Ｈ３は特に、抗体に細かい特異性を付与するのにユニークな役割を果たすと考えられる。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１−２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際、重鎖のみからなる天然のラクダ科抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８（１９９３）；Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
【００５５】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔシステムで定義されるように、超可変領域を指すように使用される。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい。
【００５６】
多くのＨＶＲ描写が本明細書において使用され、包含される。Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づき、最も共通して使用される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造的ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループの間での妥協を表わし、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々からの残基を以下の表１に指摘する。
【表１−１】
2021509896.tif 000002
【表１−２】
2021509896.tif 000003
【００５７】
ＨＶＲは以下の通りの「伸長ＨＶＲ」：ＶＬ内に、２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびに、ＶＨ内に、２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）、及び９３〜１０２、９４〜１０２、もしくは９５〜１０２（Ｈ３）を含み得る。可変ドメイン残基を、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａに従って、これらの定義の各々について番号付けする。
【００５８】
「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置番号付け」という表現、ならびにそのバリエーションは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａにおいて抗体の編集での重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについて使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用し、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮、またはその中への挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従った残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔに従った残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列を伴う抗体の配列の相同性の領域でのアライメントにより所与の抗体について決定することができる。
【００５９】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」または「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も共通して生じるアミノ酸残基を表わすフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般的に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）におけるサブグループである。例は、ＶＬについて、サブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａにおけるサブグループカッパＩ、カッパＩＩ、カッパＩＩＩ、またはカッパＩＶであり得る。さらに、ＶＨについて、サブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａにおけるサブグループＩ、サブグループＩＩ、サブグループＩＩＩであり得る。あるいは、ヒトコンセンサスフレームワークは、上に由来し得るが、それにおいて特定の残基、例えば、ヒトフレームワーク残基が、ドナーフレームワーク配列を種々のヒトフレームワーク配列のコレクションと整列化することにより、ドナーフレームワークとのその相同性に基づいて選択される場合などである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得る、またはそれは、既存のアミノ酸配列変化を含み得る。いくつかの実施形態では、既存のアミノ酸変化の数は、１０またはそれ以下、９またはそれ以下、８またはそれ以下、７またはそれ以下、６またはそれ以下、５またはそれ以下、４またはそれ以下、３またはそれ以下、あるいは２またはそれ以下である。
【００６１】
（例えば、Ｆｃ領域の）特定の位置における「アミノ酸修飾」という用語は、指定された残基の置換もしくは欠失、または指定された残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を指す。指定された残基に「隣接する」挿入は、その１〜２の残基の範囲内への挿入を意味する。挿入は、指定された残基に対してＮ末端またはＣ末端でもよい。本明細書の好ましいアミノ酸修飾は、置換である。
【００６２】
「親和性成熟した」抗体は、その１つ以上のＨＶＲにおいて１つ以上の変化を有する抗体であり、それらの変化（複数可）を持たない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善がもたらされる抗体である。一実施形態では、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモル、さらにはピコモルの親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当該技術分野で公知の手順により作製される。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２）には、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。ＨＶＲ及び／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発は、例えば、：Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−３３１９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、測定可能で再現性のある相互作用、例えば、標的と抗体の間での結合を指し、それは、生物学的分子を含む分子の異種集団の存在において標的の存在を決定可能である。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗体は、より大きな親和性、アビディティを伴い、より容易に、及び／またはそれが他の標的に結合するよりも大きな持続時間を伴いこの標的に結合する抗体である。一実施形態では、無関係な標的への抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される通り、標的への抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、標的に特異的に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗体は、異なる種からのタンパク質間で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、特異的結合は、排他的な結合を含み得るが、それを要求しない。
【００６４】
「特異性」という用語は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質または抗体の選択的認識を指す。天然抗体は、例えば、単一特異性である。「多重特異性」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質または抗体が、そのうちの少なくとも２つが異なる抗原もしくは同じ抗原の異なるエピトープに結合する２つ以上の抗原結合部位を有することを指す。「三重特異性」は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質または抗体が３つの異なる抗原結合特異性を有することを指す。「単一特異性」という用語は、本明細書で使用する場合、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を指す。
【００６５】
「価」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質または抗体分子における特定の数の結合部位の存在を指す。例えば、天然抗体または完全長抗体は、２つの結合部位を有し、二価である。このように、「三価」、「四価」、「五価」、及び「六価」という用語は、抗原結合タンパク質または抗体分子における２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、及び６つの結合部位の存在をそれぞれ指す。
【００６６】
「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害する、または低減させるものである。いくつかの実施形態では、ブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に、または完全に阻害する。
【００６７】
「アゴニスト」または活性化抗体は、それが結合する抗原によるシグナリングを増強する、または開始させるものである。いくつかの実施形態では、アゴニスト抗体は、天然リガンドの存在なしにシグナリングを引き起こす、または活性化する。
【００６８】
「抗体エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプに伴い変動する。抗体エフェクター機能の例としては、以下：Ｃ１ｑ結合及び補体依存的細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存的細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が挙げられる。「低下または最小化」抗体エフェクター機能は、野生型または非改変抗体から少なくとも５０％（あるいは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）だけ低下されるものを意味する。抗体エフェクター機能の決定は、当業者により容易に決定可能かつ測定可能である。好ましい実施形態では、補体結合の抗体エフェクター機能、補体依存的細胞傷害、及び抗体依存的細胞傷害が影響を受ける。いくつかの実施形態では、エフェクター機能は、グルコシル化を除去する定常領域中の突然変異（例えば、「エフェクターなし突然変異」）を通じて除去される。一態様では、エフェクターなし突然変異は、ＣＨ２領域中のＮ２９７ＡまたはＤＡＮＡ突然変異（Ｄ２６５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）である。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）。あるいは、低下または除去されたエフェクター機能をもたらす追加の突然変異は、Ｋ３２２Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）を含む。あるいは、エフェクター機能は、産生技術、例えば、グリコシル化しない宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）またはそれにおいてエフェクター機能を促進する際に無効または効果が低い変化したグリコシル化パターンをもたらす宿主細胞における発現などを通じて低下または除去することができる（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−３４７３（２００３））。
【００６９】
「抗体依存的細胞媒介性細胞傷害」またはＡＤＣＣは、細胞傷害の形態を指し、それにおいて特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌Ｉｇによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を持つ標的に特異的に結合し、続いて細胞毒素を用いて標的細胞を殺すことが可能になる。抗体は細胞傷害性細胞を「武装」し、この機構による標的細胞の死滅のために必要とされる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための一次細胞は、ＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃ発現が、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ（例えば、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるものなど）を実施してもよい。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、インビボで（例えば、動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるものなど）評価してもよい。
【００７０】
本明細書で別段の指定がない限り、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａと同様のＥＵインデックスのものである。「Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【００７１】
本明細書において「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域（天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む）を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシ末端まで伸展すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）を、抗体の産生もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸の組み換え操作により除去してもよい。したがって、無傷抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基を伴う及び伴わない抗体の混合物を有する抗体集団を含み得る。本明細書に記載の使用のための適当な天然配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。
【００７２】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラス（これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング形態を含む）を含み、ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、それらは、主に細胞質ドメインにおいて異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照されたい）。ＦｃＲｓは、以下において概説される：Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）。他のＦｃＲ（今後、同定されるであろうものを含む）が、本明細書中の「ＦｃＲ」という用語により包含される。
【００７３】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、また、新生児受容体ＦｃＲｎを含み、それは、胎児への母親のＩｇＧの転移に関与する。Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）ａｎｄ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法が公知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：（１２）：５９２−８（１９９７）；Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５（７）：６３７−４０（１９９７）；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６（２００４）；ＷＯ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい）。インビボでのＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清中半減期を、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスまたはトランスフェクションされたヒト細胞株において、または変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類において評価することができる。ＷＯ２００４／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）には、ＦｃＲへの結合を改善または減弱させた抗体変異体が記載される。また、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。
【００７４】
「エフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を行う白血球である。一態様では、エフェクター細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、天然源、例えば、血液から単離されてよい。エフェクター細胞は、一般的に、エフェクター相に関与し、サイトカインを産生するように機能し（ヘルパーＴ細胞）、病原体に感染した細胞を殺滅し（細胞傷害性Ｔ細胞）、または抗体を分泌する（分化したＢ細胞）リンパ球である。
【００７５】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在における標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、その同種抗原に結合した（適切なサブクラスの）抗体への補体系（Ｃ１ｑ）の第１成分の結合により開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載される）を実施してもよい。変化したＦｃ領域アミノ酸配列及び増加または減少したＣ１ｑ結合能を伴う抗体変異体が、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号及びＷＯ９９／５１６４２に記載されている。それらの特許公報の内容は、具体的に、参照することによって本明細書に組み込まれる。また、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）を参照されたい。
【００７６】
「重鎖のみ抗体」または「ＨＣＡｂ」という用語は、重鎖を含むが通常抗体にある軽鎖を欠く、機能性抗体を指す。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、またはアルパカ）は、ＨＣＡｂを産生することで知られている。
【００７７】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、３つの相補的決定領域（ＣＤＲ）を有する単一抗原結合ポリペプチドを指す。ｓｄＡｂは単独で、対応するＣＤＲ含有ポリペプチドと対形成することなく抗原に結合することができる。場合によっては、ｓｄＡｂは、ラクダ科のＨＣＡｂから遺伝子操作を受けており、本明細書ではそれらの重鎖可変ドメインを「ＶＨＨ」と称する。ラクダ科ｓｄＡｂは、最少の既知の抗原結合抗体断片のうちの１種である（例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８−７３（１９９５）；Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ−Ｇｈａｓｓａｂｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），８：１０１３−２６（２０１３）を参照されたい）。
【００７８】
「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間での非共有性相互作用の強度の総和を指す。別段の指定がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体及び抗原）のメンバーの間での１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において既知の一般的な方法により測定することができる。低親和性の抗体は一般的に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向がある一方、高親和性の抗体は一般的に、抗原により早く結合し、より長く結合したままになる傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法は、当該技術分野において既知であり、任意のものを本出願の目的で使用することができる。結合親和性を測定するための特定例かつ代表的な実施形態を、以下に記載する。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、一実施形態では、抗体のＦａｂ部及び抗原分子を用いて行われる放射線標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定され、このアッセイは以下に説明されており、一連の滴定用非標識抗原の存在下で、Ｆａｂを最小限の濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化した後、抗Ｆａｂ抗体をコーティングしたプレートを用いて結合した抗原を捕捉することによって、抗原に対するＦａｂ溶液の結合親和性を測定するものである（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５−８８１）。アッセイ条件を確立するため、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）を用いて一晩コーティングし、続いて、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを用いて、室温（約２３℃）にて２〜５時間ブロッキングする。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ  ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、連続希釈した対象とするＦａｂと混合する（Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９での抗ＶＥＧＦ抗体であるＦａｂ−１２の評価と同じ）。次いで、対象とするＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションをさらに長時間（例えば、６５時間）継続し、平衡に達するのを確実にすることもできる。その後、混合物を捕捉プレートに移し、室温で１時間インキュベートする。続いて、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中の０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０で８回洗浄する。プレートが乾燥した場合、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｈｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートを、Ｔｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間カウントする。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合的結合アッセイで用いるために選択する。
【００８０】
別の実施形態によれば、Ｋｄは、ＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標）−Ｔ２００またはＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．））を、約１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップと共に２５℃で用いる、表面プラズモン共鳴アッセイを用いることによって測定される。簡潔に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）まで希釈した後、５μＬ／分の流速で注入し、およそ１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得る。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンを注入し、未反応基をブロックする。速度論的測定には、２倍に連続希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）  ２０界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、２５℃にて、およそ２５μＬ／分の流速で注入する。結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、結合解離センサーグラムに同時にフィットさせることによる、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上記表面プラズモン共鳴アッセイによるｏｎ速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超えた場合は、分光計、例えば、流れ停止装置付き分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベット付き８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定するとき、濃度増加する抗原の存在下において、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の、２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増減を測定する蛍光消光法を用いて、ｏｎ速度を決定できる。
【００８１】
ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」及び「相同性」は、配列を整列させ、ギャップを導入し（必要な場合）、最高パーセント配列同一性を達成した後（任意の保存的置換を配列同一性の部分として考えず）、特定のペプチドまたはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野内にある種々の方法で、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。当業者は、アライメントを測定するための適切なパラメーター（比較されている配列の全長にわたる最高アライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。
【００８２】
本明細書に記載のＭＡＢＰをコードする「単離」核酸分子は、それが産生された環境において通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から同定及び分離される核酸分子である。好ましくは、単離核酸は、産生環境に関連する全ての成分との会合がない。本明細書に記載のポリペプチド及び抗体をコードする単離核酸分子は、それが天然で見出される形態または設定以外の形態である。単離核酸分子は、従って、細胞中に天然に生じる本明細書に記載のポリペプチド及び抗体をコードする核酸から区別される。
【００８３】
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物のために適した制御配列は、例えば、プロモーター、場合により、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが公知である。
【００８４】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係におかれた場合に「作動可能に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダー用のＤＮＡを、それが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチド用のＤＮＡに作動可能に連結し；プロモーターまたはエンハンサーを、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結し；または、リボソーム結合部位を、それが翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結する。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が近接しており、及び、分泌リーダーの場合では、近接し、リーディング段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、近接する必要はない。連結は、便利な制限部位での連結により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実行に従って使用する。
【００８５】
「担体」は、本明細書で使用する場合、用いられる用量及び濃度でそれらに曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性的である薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を含む。生理学的に許容可能な担体担体は、水性ｐＨ緩衝化溶液であることが多い。生理学的に許容可能な担体担体の例としては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンズアルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール；ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛−タンパク質錯体）及び／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００８６】
本発明の対象とする「希釈剤」は、医薬的に許容可能であり（ヒトへの投与の安全であり毒性がない）、凍結乾燥後再溶解製剤などの液体製剤の調製に有用なものである。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水）、無菌食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が挙げられる。代替的な実施形態では、希釈剤には、塩及び／または緩衝剤の水溶液が含まれ得る。
【００８７】
「保存剤」は、本明細書において製剤に添加し、細菌活性を低下することができる化合物である。保存剤の添加により、例えば、複数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にできる。可能性がある保存剤の例としては、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、及び塩化ベンゼニウムが挙げられる。他の種類の保存剤としては、フェノール、ブチル、及びベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。本明細書において最も好ましい防腐剤は、ベンジルアルコールである。
【００８８】
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効となるような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加成分を含有しない調製物を指す。そのような製剤は、滅菌性である。「滅菌」製剤は、無菌であるか、または全ての生きている微生物及びそれらの胞子を含まない。
【００８９】
「安定」製剤は、含まれるタンパク質が、保管によりその物理学的及び化学的安定性ならびに完全性を実質的に保持しているものである。タンパク質の安定性を測定する様々な分析技術が、当該技術分野において入手可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）で論説されている。安定性は、選択された期間にわたって選択された温度で測定することができる。迅速スクリーニングのため、製剤を４０℃で２週間〜１ヶ月間保管し、その期間での安定性を測定してもよい。製剤が２〜８℃で保管される場合、一般的に、３０℃または４０℃で少なくとも１ヶ月間安定であり、及び／または、２〜８℃で少なくとも２年間安定でなければならない。製剤が３０℃で保管される場合、一般的に、３０℃で少なくとも２年間安定であり、及び／または、４０℃で少なくとも６ヶ月間安定でなければならない。例えば、保管中の凝集の程度は、タンパク質安定性の指標として使用することができる。したがって、「安定」製剤は、約１０％未満、好ましくは約５％未満のタンパク質が、製剤中の凝集体として存在するものであってよい。他の実施形態では、製剤の保管中に凝集体形成のなんらかの増加を判定してもよい。
【００９０】
「再溶解」製剤は、タンパク質が全体に分散するように、凍結乾燥したタンパク質または抗体製剤を希釈剤中に溶解することによって調製されているものである。再溶解製剤は、対象とするタンパク質を用いて治療される患者への投与（例えば、皮下投与）に適しており、ある特定の実施形態では、非経口的または静脈内投与に適したものであってよい。
【００９１】
「等張性」製剤は、ヒト血液と実質的に同じ浸透圧を有するものである。等張性製剤は、一般に約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有することになる。「低張性」という用語は、ヒト血液よりも低い浸透圧を有する製剤を説明する。同様に、「高張性」という用語は、ヒト血液よりも高い浸透圧を有する製剤を説明するのに使用される。等張性は、例えば、蒸気圧式または氷点式浸透圧計を用いて測定することができる。本出願の製剤は、塩及び／または緩衝剤の添加の結果として高張性であってよい。
【００９２】
「免疫チェックポイント分子」は、シグナルを増強するかシグナルを低下するかのいずれかである、免疫系の分子を指す。「刺激性免疫チェックポイント分子」または「共刺激分子」は、免疫系のシグナルを増強する免疫チェックポイント分子である。「抑制性免疫チェックポイント分子」は、免疫系のシグナルを低下する免疫チェックポイント分子である。
【００９３】
本明細書に記載の実施形態は、実施形態「からなる」こと、及び／または実施形態「から本質的になる」を含むことを理解されたい。
【００９４】
「約」に関して、本明細書における値またはパラメーターは、その値またはパラメーターそれ自体を対象とする変化量を含む（記載されている）。例えば、「約Ｘ」という記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【００９５】
本明細書で使用する場合、ある値またはパラメーター「ではない」という言及は、一般にある値またはパラメーター「以外」を意味し、記載する。例えば、方法は、タイプＸのがんを治療するために使用されないということは、この方法は、Ｘ以外のタイプのがんを治療するために使用されることを意味する。
【００９６】
本明細書で使用される「約Ｘ〜Ｙ」という用語は、「約Ｘ〜約Ｙ」と同じ意味を有する。
【００９７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる単数形の「ある」、「または」、及び「その」は、文脈が別段に決定することが明らかでない限り、複数の指示を包含する。
【００９８】
ＩＩ．多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）
本出願の一態様は、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第１の免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１、配列番号１２）由来であり、第２のエピトープは、第２の免疫チェックポイント分子（例えば、ＴＩＧＩＴ、配列番号１３）由来であり、及び第３のエピトープは、第３の免疫チェックポイント分子（例えば、ＬＡＧ−３、配列番号１４）由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは、第２の腫瘍抗原由来であり、及び第３のエピトープは、第３の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第１の腫瘍抗原（例えば、ＨＥＲ−２）由来であり、第２のエピトープは、免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＤ３）上の細胞表面分子由来であり、及び第３のエピトープは、第２の腫瘍抗原（例えば、ＥＧＦＲ）由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第１の炎症促進性分子（例えば、ＴＮＦ−α）由来であり、第２のエピトープは、第２の炎症促進性分子（例えば、ＩＬ−１７Ａ）由来であり、及び第３のエピトープは、第３の炎症促進性分子（例えば、ＩＬ−１７Ｆ）由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第１の血管新生因子（例えば、Ａｎｇ２）由来であり、第２のエピトープは、第２の血管新生因子（例えば、ＶＥＧＦ）由来であり、及び第３のエピトープは、第３の血管新生因子（例えば、ＤＬＬ４）由来である。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【００９９】
本出願のＭＡＢＰは、少なくとも３つの異なるエピトープに特異的に結合することができる少なくとも３つの抗原結合部分を有する。ＭＡＢＰは、対称または非対称であり得る。例えば、ＭＡＢＰは、第１の抗原結合部分の１または２つのコピー、第２の抗原結合部分の１〜８つのコピー、及び第３の抗原結合部分の１〜８つのコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、二重特異性抗体であり得る。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、単一特異性完全長抗体、またはその抗原結合断片、例えば、Ｆａｂである。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の異なる抗原結合部分のいずれか１つを含み、各々は、ｓｄＡｂを含む。各ｓｄＡｂは、第１の抗原結合部分に直接融合され得、または別のｓｄＡｂに融合され得、融合したｓｄＡｂは、第１の抗原結合部分にさらに融合される。
【０１０１】
ＭＡＢＰは、エピトープごとの任意の適当な数の価数、及び任意の適当な数の特異性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、二価、三価、四価、五価、六価、またはそれよりも高い価数の第１のエピトープである。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、二価、三価、四価、五価、六価、またはそれよりも高い価数の第２のエピトープである。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、二価、三価、四価、五価、六価、またはそれよりも高い価数の第３のエピトープである。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、三重特異性である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、四重特異性である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、４つ以上の特異性である。例示的な三重特異性抗原結合タンパク質（「ＴＡＢＰ」）を図１〜１０に示す。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分の１つ以上のコピー（例えば、１または２）、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分の１つ以上のコピー（例えば、２）、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分の１つ以上のコピー（例えば、２）を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。
【０１０３】
第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分は、任意の適当な形態で互いに融合され得る。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の各々は、単一ポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、１つ以上（例えば、２）の重鎖及び１つ以上（例えば、２）の軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合され、及び第３の抗原結合部分のＣ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端は、第３の抗原結合部分のＮ末端に融合され、及び第３の抗原結合部分のＣ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端は、第３の抗原結合部分のＮ末端に融合され、及び第３の抗原結合部分のＣ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＮ末端に融合され、及び第３の抗原結合部分のＮ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合され、及び第３の抗原結合部分のＮ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合され、及び第３の抗原結合部分のＮ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＮ末端に融合され、及び第３の抗原結合部分のＮ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＣ末端に融合され、及び第３の抗原結合部分のＮ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第３の抗原結合部分のＣ末端は、第２の抗原結合部分のＮ末端に融合され、及び第３の抗原結合部分のＮ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第３の抗原結合部分のＣ末端は、第２の抗原結合部分のＮ末端に融合され、及び第３の抗原結合部分のＮ末端が、第１の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＣ末端に融合される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、第１のｓｄＡｂのＣ末端が、第１の抗原結合部分のＶＨのＮ末端に融合され、及び（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第２のｓｄＡｂのＣ末端が、第１の抗原結合部分のＶＬのＮ末端に融合される、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＢＰは、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を各々が含む、第１のポリペプチドの２本鎖、及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨＨ２−ＶＬ−ＣＬを各々が含む、第２のポリペプチドの２本鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂであり、及びＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂである。一例を図１に示す。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端が、第２のｓｄＡｂのＮ末端に融合され、及び第２のｓｄＡｂのＣ末端が、第１の抗原結合部分のＶＨのＮ末端に融合される、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＢＰは、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨＨ１−ＶＨＨ２−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を各々が含む、第１のポリペプチドの２本鎖、及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬを各々が含む、第２のポリペプチドの２本鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂであり、及びＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂである。一例を図２に示す。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端が、第２のｓｄＡｂのＮ末端に融合され、及び第２のｓｄＡｂのＣ末端が、第１の抗原結合部分のＶＬのＮ末端に融合される、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＢＰは、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を各々が含む、第１のポリペプチドの２本鎖、及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨＨ１−ＶＨＨ２−ＶＬ−ＣＬを各々が含む、第２のポリペプチドの２本鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂであり、及びＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂである。一例を図３に示す。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）を含む重鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端が、第１の抗原結合部分のＶＬのＮ末端に融合され、及びＣＬのＣ末端が、第２のｓｄＡｂのＮ末端に融合される、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＢＰは、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を各々が含む、第１のポリペプチドの２本鎖、及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨＨ１−ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２を各々が含む、第２のポリペプチドの２本鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂであり、及びＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂである。一例を図４に示す。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）を含む重鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端が、第１の抗原結合部分のＶＨのＮ末端に融合され、及び第１の抗原結合部分のＣＬのＣ末端が、第２のｓｄＡｂのＮ末端に融合される、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＢＰは、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を各々が含む、第１のポリペプチドの２本鎖、及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２を各々が含む、第２のポリペプチドの２本鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂであり、及びＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂである。一例を図５に示す。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む重鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端が、第１の抗原結合部分のＶＨのＮ末端に融合され、及び第１の抗原結合部分のＣＨ３のＣ末端が、第２のｓｄＡｂのＮ末端に融合される、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＢＰは、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２を各々が含む、第１のポリペプチドの２本鎖、及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬを各々が含む、第２のポリペプチドの２本鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂであり、及びＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂである。一例を図６に示す。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む重鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端が、第１の抗原結合部分のＶＬのＮ末端に融合され、及び第１の抗原結合部分のＣＨ３のＣ末端が、第２のｓｄＡｂのＮ末端に融合される、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＢＰは、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２を各々が含む、第１のポリペプチドの２本鎖、及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨＨ１−ＶＬ−ＣＬを各々が含む、第２のポリペプチドの２本鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂであり、及びＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂである。一例を図７に示す。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む重鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１のｓｄＡｂのＮ末端が、第１の抗原結合部分のＣＨ３のＣ末端に融合され、及び第１の抗原結合部分のＣＬのＣ末端が、第２のｓｄＡｂのＮ末端に融合される、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＢＰは、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ１を各々が含む、第１のポリペプチドの２本鎖、及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２を各々が含む、第２のポリペプチドの２本鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂであり、及びＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂである。一例を図８に示す。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）を含む重鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第２のｓｄＡｂのＮ末端が、第１の抗原結合部分のＣＬのＣ末端に融合され、及び第２のｓｄＡｂのＣ末端が、第１のｓｄＡｂのＮ末端に融合される、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＢＰは、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を各々が含む、第１のポリペプチドの２本鎖、及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２−ＶＨＨ１を各々が含む、第２のポリペプチドの２本鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂであり、及びＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂである。一例を図９に示す。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む重鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第２のｓｄＡｂのＮ末端が、第１の抗原結合部分のＣＨ３のＣ末端に融合され、及び第２のｓｄＡｂのＣ末端が、第１のｓｄＡｂのＮ末端に融合される、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＡＢＰは、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２−ＶＨＨ１を各々が含む、第１のポリペプチドの２本鎖、及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬを各々が含む、第２のポリペプチドの２本鎖を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂであり、及びＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂである。一例を図１０に示す。
【０１１４】
エピトープ及び抗原
本明細書に記載のＭＡＢＰのいずれかは、少なくとも３つの異なるエピトープに特異的に結合することができる。認識される少なくとも３つの異なるエピトープは、同一の抗原上に、または異なる抗原上に位置することができる。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞外分子である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープ、第２のエピトープ、及び／または第３のエピトープは、免疫チェックポイント分子である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、刺激性免疫チェックポイント分子である。例示的な刺激性免疫チェックポイント分子としては、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＨＶＥＭ、及びＴＣＲ（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、阻害性免疫チェックポイント分子である。例示的な阻害性免疫チェックポイント分子としては、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、Ａ２ａ受容体、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＰＤ−１、ＩＤＯ、ＣＤ４７、及びそれらのリガンド、例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、Ｂ７−Ｈ４、ＮＫＴＲ−２１８、及びＳＩＲＰ−α受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の免疫チェックポイント分子に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２の免疫チェックポイント分子に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３の免疫チェックポイント分子に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、第１の免疫チェックポイント分子、第２の免疫チェックポイント分子、及び／または第３の免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）ＴＩＧＩＴに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）ＬＡＧ−３に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体、例えば、ペンブロリズマブである。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び／または第３のエピトープは、細胞表面抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、Ｔ細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞など）、Ｂ細胞、マクロファージ、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞上の抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ３などのＴ細胞表面抗原である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、免疫応答、特に、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発することができる、腫瘍細胞により産生されるタンパク質である。本明細書に記載の標的抗原の選択は、治療されるがんの特定の種類に依存する。例示的な腫瘍抗原としては、例えば、神経膠腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、前立腺、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、ｐｒｏｓｔｅｉｎ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体及びメソセリンが挙げられる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１つ以上の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原となり得る多くのタンパク質を発現する。これらの分子としては、組織特異的抗原、例えば、黒色腫のＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ及びｇｐ１００、ならびに、前立腺がんの前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子の種類に属する。標的抗原のさらに別の種類は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）などのがん胎児抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有の完全に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における他の標的抗原候補である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは、腫瘍細胞特有であり、体内の他の細胞で発生しない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞特有ではなく、その代わり、抗原に対する免疫寛容状態を誘発できない条件下で正常細胞にも発現している。腫瘍上の抗原発現は、免疫系を抗原に応答できるようにする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、胎児発生中、免疫系が未熟で応答できないときに正常細胞上に発現する抗原であり、または、正常細胞上で極めて低いレベルで通常存在している抗原であるが、腫瘍細胞上でははるかに高いレベルで発現する。
【０１２２】
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定例としては、分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ  １００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、及び、腫瘍特異的多系列抗原、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐｌ５；過剰発現胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現がん遺伝子及び変異腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する固有腫瘍抗原、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；ならびに、ウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ、及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７が挙げられる。他の大型のタンパク質系抗原としては、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、Ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ  １、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ−関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが挙げられる。
【０１２３】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２の腫瘍抗原に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）第３の腫瘍抗原に特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、第１の腫瘍抗原、第２の腫瘍抗原及び／または第３の腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）上の細胞表面抗原に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）第２の腫瘍抗原に特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、第１の腫瘍抗原及び／または第２の腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＨＥＲ−２に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）ＥＧＦＲに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体、例えば、トラスツズマブである。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープ、第２のエピトープ、及び／または第３のエピトープは、炎症促進性分子である。「炎症促進性分子」は、炎症性反応を上方制御する免疫細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、白血球など）によって産生され、または発現される任意の分子を指す。いくつかの実施形態では、炎症促進性分子は、リンホカイン、モノカイン、ケモカイン、またはインターロイキンなどの炎症促進性サイトカインである。例示的な炎症促進性分子としては、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、及びエオタキシン−１（すなわち、ＣＣＬ１１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の炎症促進性分子に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２の炎症促進性分子に特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）第３の炎症促進性分子に特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、第１の炎症促進性分子、第２の炎症促進性分子及び／または第３の炎症促進性分子は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、及びエオタキシン−１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＴＮＦ−αに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）ＩＬ−１７Ａに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）ＩＬ−１７Ｆに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体、例えば、アダリムマブである。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び／または第３のエピトープは、Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、及びＤＬＬ４などの血管新生因子である。
【０１３０】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の血管新生因子に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２の血管新生因子に特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）第３の血管新生因子に特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、Ａｎｇ−２に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）ＤＬＬ４に特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体、例えば、ＬＣ１０である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０１３２】
融合ポリペプチド
ＭＡＢＰの第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分は、互いに直接的に、または間接的に融合（すなわち、共有結合）されてよい。したがって、本出願のＭＡＢＰは、１つ以上の融合ポリペプチドを含む。各融合ポリペプチドは、第２の抗原結合部分及び／または第３の抗原結合部分、及び第１の抗原結合部分由来のポリペプチドを含んでよい。
【０１３３】
種々の抗原結合部分は、単一の化学的結合（ペプチド結合など）によって、またはペプチドリンカーを介して化学的に融合することができる。第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分のいずれか一方（それぞれを含む）のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかで融合してよい。第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、互いに直接的に融合してもよく、融合したｓｄＡｂは、第１の抗原結合部分のいずれか一方（それぞれを含む）のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかで融合してよい。融合ポリペプチドは、組み換え的または化学的のいずれかで得ることができる。
【０１３４】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖及び２本の軽鎖からなり、第１のエピトープを特異的に認識する、完全長抗体；（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する、第１のｓｄＡｂ；及び（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する、第２のｓｄＡｂを含み、完全長抗体、第１のｓｄＡｂ、及び第２のｓｄＡｂが互いに融合している、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖からなる完全長モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ４  ＦｃまたはＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１のｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、及び第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第２のｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、及び第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。例えば、図１を参照されたい。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１のｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、第２のｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー及び第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド、及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。例えば、図２を参照されたい。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１のｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、第２のｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、及び第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。。例えば、図３を参照されたい。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖、適宜ペプチドリンカー、及び第１のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖、適宜ペプチドリンカー、及び第２のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチドを含む。例えば、図４を参照されたい。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１のｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖、適宜ペプチドリンカー、及び第２のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチドを含む。例えば、図５を参照されたい。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１のｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、第１の抗原結合部分の重鎖、適宜ペプチドリンカー、第２のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。例えば、図６を参照されたい。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖、適宜ペプチドリンカー、第１のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第２のｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。例えば、図７を参照されたい。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖、適宜ペプチドリンカー、第１のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド、及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖、適宜ペプチドリンカー、及び第２のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチドを含む。例えば、図８を参照されたい。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖、適宜ペプチドリンカー、第２のｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、及び第１のｓｄＡｂを含む、第２のポリペプチドを含む。例えば、図９を参照されたい。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の重鎖、適宜ペプチドリンカー、第２のｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、及び第１のｓｄＡｂを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、第１の抗原結合部分の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。例えば、図１０を参照されたい。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、第１のポリペプチドの２本鎖及び第２のポリペプチドの２本鎖を含む。
【０１４６】
本明細書に記載のＭＡＢＰは、種々の抗原結合部分の間に位置する１つ以上のペプチドリンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、種々の抗原結合部分は、これらの間に配置されるペプチドリンカーを用いずに互いに直接融合している。
【０１４７】
異なる抗原結合部分を連結するペプチドリンカーは、同一であっても異なっていてもよい。各ペプチドリンカーは、独立して最適化することができる。ペプチドリンカーは、任意の好適な長さを有してよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０またはそれ以上のうちいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５またはそれ以下のうちいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーの長さは、約１個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約１個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約１個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸長、約３０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、または約１個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸のうちいずれかである。
【０１４８】
ペプチドリンカーは、天然配列または非天然配列を有してよい。例えば、重鎖のみ抗体のヒンジ領域由来の配列をリンカーとして使用してよい。例えば、ＷＯ１９９６／３４１０３を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、可動性リンカーである。例示的な可動性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号４）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号５）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６）、このとき、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び当該技術分野において既知の他の可動性リンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＩｇＧのヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＩｇＧのヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域由来の修飾配列を含む。例えば、ＩｇＧのヒンジ領域中の１つ以上のシステインは、セリンに置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ（配列番号３）を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、種々の抗原結合部分は、化学的に互いに融合している。例えば、抗原結合部分は、連結基を介して１つ以上の反応部位を用いて結合されてよい。化学的結合に有用なポリペプチド中の反応部位は、当該技術分野において周知であり、アミノ酸残基上に存在する第一級アミノ基、例えば、リジンのεアミノ基及びＮ末端アミノ酸のαアミノ基、システイン残基中のチオール基、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシ基、ならびにグリコシル化抗体中の炭水化物基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、反応部位は、部位特異的突然変異誘発、セレノシステインまたは非天然型アミノ酸の取り込み、二官能性リンカー（ビスアルキル化試薬など）の取り込み、及び／または糖鎖工学によって、第２の抗原結合部分または第１の抗原結合部分内に導入される。いくつかの実施形態では、チオール反応性ポリペプチドへの結合のため、ポリペプチドの１つ以上の第一級アミノ基を、チオール含有基（例えば、システインまたはホモシステイン残基由来）、マレイミド基などの求電子性不飽和基、またはブロモアセチル基などのハロゲン化基に変換することができる。当該技術分野において既知である任意の連結基及び結合方法を用いて、第２の抗原結合部分を第１の抗原結合部分に化学的に融合することができる。いくつかの実施形態では、結合は、例えば、スクシンイミドエステル（例えば、サクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、またはＮ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ））、グルタルアルデヒド、カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ））、ベンジジン（ＢＤＢ）、過ヨウ素酸塩、またはイソチオシアネート（例えば、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン（ＮＡＨＴ））を用いることによって達成することができる。
【０１５０】
例示的な三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）ＬＡＧ−３に特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、配列番号３１のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、配列番号３２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、配列番号３１のアミノ酸配列のＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、配列番号３２のアミノ酸配列のＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、配列番号３１のアミノ酸配列のＶＨＨを含む。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、配列番号３２のアミノ酸配列のＶＨＨを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）ＬＡＧ−３に特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含む、第１の抗原結合部分が、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、第１のｓｄＡｂが、配列番号３１のアミノ酸配列のＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、第２のｓｄＡｂが、配列番号３２のアミノ酸配列のＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み；第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）が提供される。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）ＬＡＧ−３に特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分が、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、第１のｓｄＡｂが、配列番号３１のアミノ酸配列のＶＨＨを含み、第２のｓｄＡｂが、配列番号３２のアミノ酸配列のＶＨＨを含み；第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）が提供される。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）配列番号１６、１８、２０、２３、２５、２６、２８のいずれか１つのアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；及び（２）配列番号１５、１７、１９、２１、２２、２４、２７のいずれか１つのアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）配列番号１６、１８、２０、２３、２５、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；及び（２）配列番号１５、１７、１９、２１、２２、２４または２７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号１６のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号１５のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む（本明細書では以後、「ＴＰＴＬ−１１」と呼ぶ）。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号１８のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号１７のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む（本明細書では以後、「ＴＰＴＬ−１２」と呼ぶ）。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号２０のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号１９のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む（本明細書では以後、「ＴＰＴＬ−１３」と呼ぶ）。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端に配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号２０のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２１のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む（本明細書では以後、「ＴＰＴＬ−１４」と呼ぶ）。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号１６のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２２のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む（本明細書では以後、「ＴＰＴＬ−１５」と呼ぶ）。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２３のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号１７のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む（本明細書では以後、「ＴＰＴＬ−１６」と呼ぶ）。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２５のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号２４のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２５のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む（本明細書では以後、「ＴＰＴＬ−１７」と呼ぶ）。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー及び抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２６のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２２のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー及び抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む（本明細書では以後、「ＴＰＴＬ−１８」と呼ぶ）。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号２０のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー及び抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２７のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み、かつ、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー及び抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む（本明細書では以後、「ＴＰＴＬ−１９」と呼ぶ）。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体、配列番号１〜７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の重鎖、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、配列番号３２のアミノ酸配列を含む抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、配列番号１〜３または７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカー、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含む、第１のポリペプチド；及び（２）Ｎ末端からＣ末端において、配列番号９のアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー及び抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２８のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号１７のアミノ酸配列、または最大で約５つ（例えば、約１、２、３、４、または５のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）は、（１）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー及び抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含み、かつ、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（２）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含み、かつ、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチドを含む（本明細書では以後、「ＴＰＴＬ−２０」と呼ぶ）。
【０１６４】
単一ドメイン抗体を含む抗原結合部分
本出願のＭＡＢＰは、各々がｓｄＡｂを含む少なくとも２つの抗原結合部分を含む。例示的なｓｄＡｂとしては、重鎖のみ抗体由来の重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ）、天然に軽鎖を欠く結合分子、従来の４本鎖抗体由来の単一ドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、ヒト化重鎖のみ抗体、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットによって産生されたヒトｓｄＡｂ、ならびに、抗体由来のもの以外の遺伝子操作を受けたドメイン及び単一ドメインスキャフォールドが挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において既知であるか、または本発明者らが開発した任意のｓｄＡｂを用いて、本出願のＭＡＢＰを構築することができる。ｓｄＡｂは、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシが挙げられるが、これらに限定されない、任意の種由来であってよい。本明細書において想定される単一ドメイン抗体としては、ラクダ科及びサメ以外の種由来の天然に存在するｓｄＡｂ分子も挙げられる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、軽鎖を欠く重鎖抗体（本明細書において「重鎖のみ抗体」とも称される）として既知である、天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子由来である。このような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４／０４６７８及びＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８に開示されている。明確性目的のため、従来の４本鎖免疫グロブリンのＶＨと区別するために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来の可変ドメインは、本明細書においてＶＨＨとして既知である。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科、例えば、ラクダ、ラマ、ビクーニャ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコで生じる抗体由来であってよい。ラクダ科以外の他の種は、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生でき、このようなＶＨＨは、本出願の範囲内にある。
【０１６６】
ラクダ科由来のＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子より約１０倍小さい。これらは単一のポリペプチドであり、非常に安定であって、極端なｐＨ及び温度条件に耐えることができる。また、従来の抗体では見られない、プロテアーゼの作用に抵抗することができる。さらに、ＶＨＨのインビトロ発現により、適切に折り畳まれた機能性ＶＨＨが高収率で産生される。また、ラクダ科で産生された抗体は、抗体ライブラリーの使用によってインビトロで、またはラクダ科以外の哺乳類の免疫化を介して産生された抗体が認識するもの以外のエピトープを認識することができる（例えば、ＷＯ９７４９８０５を参照されたい）。このように、ＶＨＨドメインを含むＭＡＢＰは、従来の抗体よりもより効率的に標的と相互作用できる。ＶＨＨは空洞部や溝部などの「通常ではない」エピトープ内に結合することが知られているため、かかるＶＨＨを含むＭＡＢＰの親和性は、従来の多重特異性ポリペプチドよりも治療的処置に好適であり得る。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のＶＨＨドメインを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のＶＨＨドメインを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、三重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、軟骨魚類に存在する免疫グロブリンの可変領域由来である。例えば、ｓｄＡｂは、サメの血清中に存在する新規の抗原受容体（ＮＡＲ）として知られている免疫グロブリンアイソタイプ由来であってよい。ＮＡＲ（「ＩｇＮＡＲ」）の可変領域由来の単一ドメイン分子の生成法は、ＷＯ０３／０１４１６１号及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２９０１−２９０９に記載されている。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、組み換え体、ＣＤＲグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／またはインビトロ産生させたもの（例えば、ファージディスプレイによって選択される）である。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットによって産生されるヒトｓｄＡｂである。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、親和性成熟している。
【０１７０】
ＶＨＨドメインを含むｓｄＡｂは、ヒト化してヒト様配列を有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＶＨＨドメインのＦＲ領域は、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のうちのいずれか１つであるアミノ酸配列相同性を含む。１つの典型的な種類のヒト化ＶＨＨドメインは、ＶＨＨが、Ｋａｂａｔナンバリングによる４５番目の位置において、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、またはグルタミンからなる群由来のアミノ酸、例えば、Ｌ４５と１０３番目の位置におけるトリプトファンを有することを特徴とする。このように、この種類に属するポリペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、前記ポリペプチドは、それによる望まれない免疫応答が予想されず、さらなるヒト化の負担なく直接ヒトに投与することができる。
【０１７１】
別の例示の種類のヒト化ラクダ科ｓｄＡｂは、ＷＯ０３／０３５６９４に記載されており、ヒト由来または他の種の従来の抗体に典型的に見られる疎水性ＦＲ２残基を含むが、二重鎖抗体由来のＶＨに存在する保存されたトリプトファン残基を置換している、１０３番目の位置の荷電アルギニン残基による親水性の損失を代償している。このように、これら２つの種類に属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、前記ペプチドは、それによる望まれない免疫応答が予想されず、さらなるヒト化の負担なく直接ヒトに投与することができる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、天然に産生されたｓｄＡｂまたはその誘導体、例えば、ラクダ科ｓｄＡｂ、またはラクダ科ｓｄＡｂ由来のヒト化ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ラマから得られる。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂをさらに遺伝子操作し、ヒト抗体に通常は見られない配列（例えば、ＣＤＲ領域またはＣＤＲ−ＦＲ接合部）を除去する。
【０１７３】
ＭＡＢＰの第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは、それらのエピトープに好適な親和性を有する。例えば、各ｓｄＡｂの親和性は、全体的親和性と、ＭＡＢＰの標的細胞または組織への結合活性に影響を与える場合があり、それがさらにＭＡＢＰの効力に影響を与え得る。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、高い親和性でそのエピトープに結合する。高親和性ｓｄＡｂは、低いナノモル（１０−９Ｍ）範囲の解離定数（Ｋｄ）、例えば、約５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、５ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、またはそれ以下のうち任意でそのエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、低い親和性でそのエピトープに結合する。低親和性ｓｄＡｂは、低いマイクロモル（１０−６Ｍ）範囲以上のＫｄで、例えば、約１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、またはそれ以上のうち任意でそのエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、中程度の親和性でそのエピトープに結合する。中程度の親和性のｓｄＡｂは、低親和性ｓｄＡｂよりも低いが、高親和性ｓｄＡｂよりも高いＫｄでそのエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、中程度の親和性のｓｄＡｂは、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約５００ｎＭ、約５００ｎＭ〜約１μｍ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、または約１０ｎＭ〜約５００ｎＭ、または約１ｎＭ〜約１μｍのうち任意の１つのＫｄで、そのエピトープに結合する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分よりも、そのエピトープに対する強い親和性を有する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分よりも、そのエピトープに対する弱い親和性を有する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂとそのエピトープと、ＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分とそのエピトープとの間の親和性間の差は、少なくとも約２×、５×、１０×、１００×、１０００×、またはそれ以上のうちいずれかである。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂとそのエピトープとの間の親和性は、ＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分とそのエピトープとの間のそれに匹敵する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、刺激性免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、阻害性免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、免疫チェックポイント分子に対するアゴニストである。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストである。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴに高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴに中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴに低い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、ＬＡＧ−３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、ＬＡＧ−３に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、ＬＡＧ−３に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、ＬＡＧ−３に低い親和性で結合する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、配列番号３１のアミノ酸配列、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＴＩＧＩＴに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＴＩＧＩＴに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、配列番号３２のアミノ酸配列、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＬＡＧ−３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＬＡＧ−３に特異的に結合する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、細胞表面抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞上の細胞表面抗原に特異的に結合する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、ＣＤ３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、ＣＤ３に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、ＣＤ３に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂは、ＣＤ３に低い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、ＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、ＥＧＦＲ抗原に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、ＥＧＦＲに中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第２のｓｄＡｂは、ＥＧＦＲに低い親和性で結合する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、細胞外タンパク質、例えば、分泌タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、またはエオタキシン−１などの炎症促進性分子に特異的に結合する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、またはＤＬＬ４などの血管新生因子に特異的に結合する。
【０１８２】
ＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分
本出願のＭＡＢＰは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、少なくとも１つの抗原結合部分を含む。このような抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる従来の完全長抗体、またはそれら由来の抗原結合断片であってよい。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨドメインを含む重鎖、及びＶＬドメインを含む及び軽鎖を含む抗原結合断片である。本明細書で想定される例示的な抗原結合断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ：線状抗体；単鎖抗体分子（ｓｃＦｖなど）；ならびに、抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ分子、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスのうち任意の１つ由来である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及び／またはＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）などの抗体エフェクター機能を媒介することができる。例えば、野生型Ｆｃ配列を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３サブクラスの抗体は、通常、ＣＩｑ及びＣ３結合を含む補体活性化を示す一方、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、ＣＩｑ及び／またはＣ３に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体への結合親和性を低下させる修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃは、２３３〜２３６番目の位置に、例えば、Ｌ２３４Ａ及び／またはＬ２３５Ａなどの１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃは、３２７、３３０及び／または３３１番目の位置に突然変異を含む。例えば、Ａｒｍｏｕｒ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；２９：２６１３；及びＳｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：６５９１を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｐ３２９Ｇ突然変異を含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、２つの同一ではない重鎖のヘテロ二量体形成を促進する修飾を含む。このような修飾されたＦｃ領域は、非対称性設計を有する本明細書に記載のＭＡＢＰに対して特に興味深いものであり得る。いくつかの実施形態では、前記修飾は、重鎖または重鎖融合ポリペプチドの一方へのノブ修飾と、重鎖または重鎖融合ポリペプチドの他方へのホール修飾を含む、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ修飾である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメイン中の２本の重鎖間の境界部内に修飾を含み、このとき、ｉ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基を側鎖がより大きいアミノ酸残基に置換することによって、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の境界部内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の境界部内の空洞部（「ホール」）中に配置できる突出部（「ノブ」）が作製されており、ｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基を側鎖がより小さいアミノ酸残基に置換することによって、第１のＣＨ３ドメイン中の境界部内の突出部（「ノブ」）を内部に配置できる空洞部（「ホール」）が、第２のＣＨ３ドメイン中の境界部内に作製されている。ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ修飾の例は、例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、及びＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：７８１−７８８に記載されている。ヘテロ二量体形成を促進する別のＦｃ領域への修飾も本明細書において想定される。例えば、静電的操作効果をＦｃ領域内に遺伝子操作によって含め、Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を提供することができる（例えば、ＵＳ４６７６９８０及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆａｂアーム交換を阻害する修飾を含む。例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃ中のＳ２２８Ｐ突然変異は、Ｆａｂアーム交換を阻害する。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、κ軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、λ軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなるモノクローナル抗体（本明細書では「４本鎖抗体」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる多重特異性（例えば、三重特異性）完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１サブクラス、または突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスである、完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ２サブクラスである完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ３サブクラスである完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ４サブクラス、または追加の突然変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラスである、完全長抗体を含む。
【０１８９】
当該技術分野において既知である任意の完全長４本鎖抗体またはそれら由来の抗原結合断片を、本出願のＭＡＢＰにおける第１の抗原結合部分として使用することができる。臨床的に効力、安全性、及び薬物動態プロファイルが証明されている抗体または抗体断片が特に興味深い。いくつかの実施形態では、当該技術分野において既知の抗体または抗体断片をさらに遺伝子操作し、例えば、ヒト化または変異誘発し、好適な親和性を有する変異体を選択した後、第２の抗原結合部分と融合してＭＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、当該技術分野において既知のモノクローナル抗体または抗体断片のＶＨ及びＶＬドメイン、及び修飾重鎖定常領域及び／または軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、当該技術分野において既知のモノクローナル抗体、及び修飾Ｆｃ領域、例えば、Ｓ２２８Ｐ突然変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒト、ヒト化、またはキメラ型の完全長抗体または抗体断片を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、承認されている（例えば、ＦＤＡ及び／またはＥＭＡによって）または開発中のモノクローナル抗体または抗体断片（例えば、Ｆａｂ）由来である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、承認されている（例えば、ＦＤＡ及び／またはＥＭＡによって）または開発中のモノクローナル抗体または抗体断片（例えば、Ｆａｂ）である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、阻害性免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する、完全長抗体（例えば、アンタゴニスト抗体）またはそれ由来の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、刺激性免疫チェックポイント分子に特異的に結合する、完全長抗体（例えば、アゴニスト抗体）またはそれ由来の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合断片である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペンブロリズマブ由来である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペンブロリズマブまたはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１９３】
ペンブロリズマブ（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））は、がん免疫療法で使用されるヒト化抗体である。これは、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体を標的とする。この薬物は、転移性黒色腫の治療において最初に使用された。２０１４年９月４日、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ＦＤＡのファストトラック開発プログラム下でＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）を承認した。進行性黒色腫における使用が承認されている。２０１５年１０月２日に、米国ＦＤＡは、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）を、その腫瘍がＰＤ−Ｌ１を発現しており、別の化学療法剤による治療に失敗した患者における転移性非小細胞肺がんの治療に対して承認した。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、トラスツズマブ由来である。
【０１９５】
最も良く売れている５大治療用抗体の１つであるトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））は、ＨＥＲ２陽性乳がん患者の生存率を有意に増加させている、ヒト化抗ＨＥＲ２受容体モノクローナル抗体である。ＨＥＲ受容体は、細胞膜に埋め込まれており、細胞外由来の分子シグナル（ＥＧＦと称される分子）を細胞内に伝え、遺伝子のオンオフを行うタンパク質である。ＨＥＲタンパク質、ヒト上皮成長因子受容体は、ヒト上皮成長因子に結合し、細胞増殖を刺激する。一部のがん、特にある種の乳がんでは、ＨＥＲ２が過剰発現しており、がん細胞の無制限な複製の原因となる。しかしながら、乳がん患者のうち、１５〜２０％のみがヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を増幅かつ過剰発現を呈しており、ほとんどのＨＥＲ２患者は、トラスツズマブに反応しない。また、ＨＥＲ２＋患者の一部は、初期治療後にトラスツズマブに対する抵抗性を生じる。上皮成長因子であるＲＴＫファミリーは４つのメンバー、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４からなるため、これらの抗原のうち２つを標的とするためにいくつかの多重特異性抗体が開発されており、従来の単一特異性抗体に対する利点を示している。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、血管新生因子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＬＣ１０由来である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、炎症促進性分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、炎症促進性分子は、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及びエオタキシン−１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＴＮＦ−α抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、アダリムマブ由来である。
【０１９８】
ＭＡＢＰの特性
本明細書に記載のＭＡＢＰは、生物学的医薬品としての製造及び開発に適している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、高発現レベルで組み換え的に産生することができる。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、工業的製造に十分なレベルで組み換え的に産生することができる。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、哺乳類細胞において一過性に発現することができる。いくつかの実施形態では、組み換え発現により産生されたＭＡＢＰは、サイズ排除クロマトグラフィーによって均質または実質的に均質になるまで精製することができる。いくつかの実施形態では、精製ＭＡＢＰ中の単分散性分子（例えば、４本のポリペプチド鎖からなる二量体タンパク質などの、単量体ＭＡＢＰ分子として）の割合は、例えば、クロマトグラフィーによって測定されるとき、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上のうちいずれか１つである。組成物中のＭＡＢＰの均質性は、当該技術分野において既知の方法、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、動的光散乱（ＤＬＳ）、またはＨＰＬＣもしくはＦＰＬＣを用いる分析によって測定することができる。いくつかの実施形態では、精製によるＭＡＢＰの収率は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のうちいずれか１つである。いくつかの実施形態では、精製によるＭＡＢＰの収率は、約７０％〜約９５％である。
【０１９９】
本明細書に記載のＭＡＢＰは、生物学的医薬品としての使用に適する様々な生物物理学的特性、例えば、高い溶解性、高い長期安定性、及び熱安定性などをさらに有する。ＭＡＢＰの安定性は、粒径に基づいて溶解している異なる分子集団を特徴付ける、動的光散乱（ＤＳＬ）などの当該技術分野において既知の方法を用いて測定することができる。いくつかの実施形態では、組成物中のＭＡＢＰの少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、またはそれ以上は、非凝集体構造、すなわち、単一の単量体ＭＡＢＰ分子、例えば、４本のポリペプチド鎖からなる二量体タンパク質である。いくつかの実施形態では、組成物中の凝集レベル、すなわち、複数のＭＡＢＰ分子が複合体として会合しているレベルは、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれより高い割合以下のうち、いずれか１つである。いくつかの実施形態では、組成物中のＭＡＢＰの少なくとも約５％が凝集体を形成するまでの期間は、約４℃において、少なくとも約１日、３日、７日、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上のうちいずれか１つである。いくつかの実施形態では、組成物中のＭＡＢＰの少なくとも約５％が凝集体を形成するまでの期間は、室温付近、例えば、２５℃において、少なくとも約１日、３日、７日、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上のうちいずれか１つである。いくつかの実施形態では、組成物中のＭＡＢＰの少なくとも約１０％が凝集体を形成するまでの期間は、生理的温度、例えば、３７℃において、少なくとも約１日、２日、３日、４日、６日、７日、１０日、２週間、またはそれ以上のうちいずれか１つである。
【０２００】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、親４本鎖抗体またはその抗原結合断片に匹敵する熱安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、親４本鎖抗体またはその抗原結合断片よりも高い熱安定性を有する。熱安定性は、当該技術分野において既知の方法、例えば、キャピラリー示差走査熱量測定（ＤＳＣ）及び段階的加熱を組み合わせたＤＬＳを用いて測定することができる。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも約５５℃、例えば、少なくとも５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、またはそれ以上のうちいずれか１つの凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、約５５℃〜約７０℃の凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を有する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、高い長期安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、約４℃において、少なくとも約１日、３日、７日、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上のうちいずれか１つの期間安定である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、高温で高い長期安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、室温、例えば、約２５℃以上において、少なくとも約１日、３日、７日、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上のうちいずれか１つの期間安定である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、生理的温度、例えば、約３７℃以上において、少なくとも約１日、２日、３日、４日、６日、７日、１０日、２週間、またはそれ以上のうちいずれか１つの期間安定である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰの安定性を、加速安定性評価法、例えば、約４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、またはそれ以上のうちいずれか１つにおいて試験し、より低温でのＭＡＢＰの安定性を導き出す。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、高濃度、例えば、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、またはそれ以上のうちいずれか１つにおいて高い長期安定性を有する。本明細書で使用する場合、「安定」な組成物は、沈殿物及び／または凝集体を実質的に含まない（例えば、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または以下のうちいずれか未満）。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、約４℃において、少なくとも約１日、３日、７日、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上のうちいずれか１つの期間、ヒト血清中で高い長期安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、生理的温度、例えば、約３７℃において、少なくとも約１日、３日、７日、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上のうちいずれか１つの期間、ヒト血清中で高い長期安定性を有する。沈殿物は、光学分光法によって検出することができる。凝集体は、例えば、ＤＬＳによって検出することができる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、凍結融解サイクルにおいて高い安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰを含む組成物は、ＭＡＢＰの構造的完全性（例えば、凝集体形成）及び／または活性を失うことなく、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれ以上のうちいずれか１つ、凍結融解することができる。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰを含む組成物は、高濃度、例えば、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、またはそれ以上のうちいずれか１つにおいて凍結融解することができる。
【０２０３】
ＩＩＩ．医薬組成物
本出願によって、ＭＡＢＰのうち任意の１つ、及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物がさらに提供される。医薬組成物は、所望の程度の純度を有するＭＡＢＰを、任意の医薬的に許容可能な担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合し、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる。
【０２０４】
インビボ投与に使用される医薬組成物のためには、それらは無菌でなければならない。医薬組成物は、無菌濾過膜を通す濾過によって無菌化されてよい。本明細書の医薬組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈輸液バッグまたはバイアル内に入れられる。
【０２０５】
投与経路は、好適な方法、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、動脈内もしくは関節内経路による注射もしくは注入、局所投与、吸入、または、持続放出もしくは長期間放出手段において、長期間にわたる単回または複数回のボーラスまたは持続など、既知の許容される方法に従う。
【０２０６】
また、本明細書の医薬組成物は、治療される特定の適応に対して必要な、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する２種類以上の活性化合物も含有してよい。あるいは、または追加的に、組成物は、細胞傷害性剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、または成長阻害剤を含んでよい。このような分子は、適応とする目的に有効な量の組み合わせで好適に存在する。
【０２０７】
また活性成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）またはマクロエマルションで閉じ込められてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。
【０２０８】
ＩＶ．使用方法
本明細書に記載のＭＡＢＰ（例えば、ＴＡＢＰ）、及びその組成物（例えば、医薬組成物）は、診断、分子アッセイ、及び治療などの様々な用途に有用である。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質、及び医薬的に許容可能な担体を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、疾患または状態の治療を必要とする個体におけるその治療方法があり、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第１の免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１、配列番号１２）由来であり、第２のエピトープは、第２の免疫チェックポイント分子（例えば、ＴＩＧＩＴ、配列番号１３）由来であり、及び第３のエピトープは、第３の免疫チェックポイント分子（例えば、ＬＡＧ−３、配列番号１４）由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは、第２の腫瘍抗原由来であり、及び第３のエピトープは、第３の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第１の腫瘍抗原（例えば、ＨＥＲ−２）由来であり、第２のエピトープは、免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＤ３）上の細胞表面分子由来であり、及び第３のエピトープは、第２の腫瘍抗原（例えば、ＥＧＦＲ）由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第１の炎症促進性分子（例えば、ＴＮＦ−α）由来であり、第２のエピトープは、第２の炎症促進性分子（例えば、ＩＬ−１７Ａ）由来であり、及び第３のエピトープは、第３の炎症促進性分子（例えば、ＩＬ−１７Ｆ）由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第１の血管新生因子（例えば、Ａｎｇ２）由来であり、第２のエピトープは、第２の血管新生因子（例えば、ＶＥＧＦ）由来であり、及び第３のエピトープは、第３の血管新生因子（例えば、ＤＬＬ４）由来である。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２１０】
がんの治療方法
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質、及び医薬的に許容可能な担体を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、がんの治療を必要とする個体における治療方法であって、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、腎がん、黒色腫、肺がん、膠芽腫、頭頚部がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、及びリンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質、及び医薬的に許容可能な担体を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、がんの治療を必要とする個体における治療方法であって、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１）に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２の免疫チェックポイント分子（例えば、ＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第１のｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）第３の免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＬＡＧ−３）に特異的に結合する第２のｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、腎がん、黒色腫、肺がん、膠芽腫、頭頚部がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、及びリンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、ペンブロリズマブ由来である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質、及び医薬的に許容可能な担体を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、がんの治療を必要とする個体における治療方法であって、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の腫瘍抗原（例えば、ＨＥＲ−２）に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＤ３）の細胞表面抗原に特異的に結合する第１のｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）第２の腫瘍抗原（例えば、ＥＧＦＲ）に特異的に結合する第２のｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、腎がん、黒色腫、肺がん、膠芽腫、頭頚部がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、及びリンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、トラスツズマブ由来である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質、及び医薬的に許容可能な担体を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、がんの治療を必要とする個体における治療方法であって、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の血管新生因子（例えば、Ａｎｇ２）に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２の血管新生因子（例えば、ＶＥＧＦ）に特異的に結合する第１のｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）第３の血管新生因子（例えば、ＤＬＬ４）に特異的に結合する第２のｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、腎がん、黒色腫、肺がん、膠芽腫、頭頚部がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、及びリンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、ＬＣ１０由来である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０２１４】
本明細書に記載の方法は、固形がん及び液性がんの両方を含む様々ながんの治療に好適である。この方法は、初期、進行期及び転移性がんなどの、全ての段階のがんに適用可能である。本明細書に記載の方法を、アジュバント療法またはネオアジュバント療法中の、第１の療法、第２の療法、第３の療法、または、当該技術分野において既知である他の種類のがん療法、例えば、化学療法、手術、放射線、遺伝子治療、免疫療法、骨髄移植、幹細胞移植、標的療法、低温療法、超音波療法、光線力学的療法、高周波アブレーションなどとの併用療法として用いることができる。
【０２１５】
炎症性疾患または自己免疫疾患の治療方法
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質、及び医薬的に許容可能な担体を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療を必要とする個体における治療方法であって、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、炎症性または自己免疫疾患は、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び関節炎潰瘍性大腸炎）、大腸炎、乾癬、重症喘息、及び中等度から重度のクローン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば、三重特異性）抗原結合タンパク質及び医薬的に許容可能な担体を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療を必要とする個体における治療方法であって、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の炎症促進性分子（例えば、ＴＮＦ−α）に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する、第１の抗原結合部分、（ｂ）第２の炎症促進性分子（例えば、ＩＬ−１７Ａ）に特異的に結合する第１のｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分、及び（ｃ）第３の炎症促進性分子（例えば、ＩＬ−１７Ｆ）に特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分を含み、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分が互いに融合している、治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、炎症性または自己免疫疾患は、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び関節炎潰瘍性大腸炎）、大腸炎、乾癬、重症喘息、及び中等度から重度のクローン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ＶＨＨである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域は、アダリムマブ由来である。いくつかの実施形態では、抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して一緒に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５以下のいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０２１７】
投与量及び投与経路
本出願の医薬組成物の投与量及び所望の薬物濃度は、想定される特定用途に応じて変わり得る。適切な投与量または投与経路の決定は、当業者の能力の十分に範囲内である。動物実験は、ヒトの治療に対する有効量の決定において、信頼性のあるガイダンスを提供する。有効量の外挿は、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」，Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−４６に著される原則に従って実施することができる。
【０２１８】
本明細書に記載のＭＡＢＰのインビボでの投与を使用する場合、通常の投与量は、哺乳類の体重１日あたり約１０ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上で可変であってよく、投与経路によって、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。異なる製剤が異なる治療及び異なる疾患に有効であり、特定の器官または組織の治療に意図された投与が、別の器官または組織とは異なる方法での送達を必要とし得ることは、本出願の範囲内である。さらに、投与量を、１回または複数回の別々の投与によって、または持続的注入によって投与してもよい。数日以上にわたる繰り返し投与において、その状態に応じて、疾患症状の所望される抑制が生じるまで、治療を継続する。しかしながら、他の投与計画が有用であってよい。治療の進行は、従来技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回（例えば、２、３、４、５、６、またはそれ以上の回数のいずれか）投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、または１年に１回、投与される。いくつかの実施形態では、投与間隔は、約１週間〜２週間、２週間〜１ヶ月、２週間〜２ヶ月、１ヶ月〜２ヶ月、１ヶ月〜３ヶ月、３ヶ月〜６ヶ月、または６ヶ月〜１年のうち、いずれか１つである。特定の患者に対する最適な投与量及び治療計画は、疾患の兆候について患者をモニタリングし、それに応じて治療を調整することによって、医療分野における当業者によって容易に決定できる。
【０２２０】
再溶解製剤または液体製剤などが挙げられるが、これらに限定されない本出願の医薬組成物は、ＭＡＢＰによる治療を必要とする個体、好ましくはヒトに、既知の方法、例えば、単回または一定時間にわたる持続的注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路によって投与される。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮下（すなわち、皮膚の下）投与により個体に投与される。そのような目的のために、医薬組成物は、シリンジを使用して注射してもよい。しかしながら、医薬組成物の投与のための他のデバイス、例えば、注射デバイス；インジェクターペン；オートインジェクターデバイス、無針デバイス；及び皮下パッチ送達システムが利用可能である。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、点滴静注などの注入によって個体に投与される。免疫療法に対する注入技術は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）を参照されたい）。
【０２２３】
Ｖ．調製方法
本出願は、ＭＡＢＰをコードする単離された核酸、かかる単離された核酸を含むベクター及び宿主細胞、ならびに、ＭＡＢＰ産生のための組み換え法も提供する。
【０２２４】
ＭＡＢＰの組み換え産生では、完全長抗体または第１の抗原結合部分の抗原結合断片、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。いくつかの実施形態では、完全長抗体または第１の抗原結合部分の抗原結合断片をコードする核酸は、ペプチドリンカーをコードする核酸を任意に介して、第１または第２のｓｄＡｂをコードする核酸に、互いに対して全てが翻訳に対してインフレームで組み換え的に融合され、ＭＡＢＰをコードする核酸を提供する。ＭＡＢＰまたはその成分をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離され、配列決定される（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブの使用による）。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用する宿主細胞に一部依存する。一般的に、好ましい宿主細胞は、原核生物または真核生物（通常は哺乳類）由来のいずれかである。
【０２２５】
あるいは、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分は、それぞれ第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分をコードする核酸を含む原核生物または真核生物の宿主細胞を用いて、それぞれ組み換え的に調製される。その後、発現された第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分を化学的に結合し、精製して、ＭＡＢＰを提供する。
【０２２６】
１．原核細胞におけるタンパク質産生
ａ）ベクター構築
本出願のＭＡＢＰのポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組み換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、抗体産生細胞、例えば、ハイブリドーマ細胞から単離し、配列決定してもよい。あるいは、ポリヌクレオチドをヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を使用して合成することができる。一旦得られると、ポリペプチドをコードする配列を、原核生物宿主において異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組み換えベクター中に挿入する。当該技術分野において利用可能で公知の多くのベクターを、本出願の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクター中に挿入される核酸のサイズ及びそのベクターを用いて形質転換される特定の宿主細胞に主に依存するであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅または発現、あるいは両方）及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に依存して、種々の成分を含む。ベクター成分は、一般的に、限定はされないが、以下：複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート、及び転写終結配列を含む。
【０２２７】
一般的に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン配列及び制御配列を含むプラスミドベクターを、これらの宿主に関連して使用する。ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を提供することができる標識配列を持つ。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミド）を使用して形質転換する。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含み、このように形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージは、また、内因性タンパク質の発現のために微生物により使用されることができるプロモーターを含んでもよい、または含むように修飾してもよい。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例が、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載されている。
【０２２８】
また、宿主微生物と適合するレプリコン配列及び制御配列を含むファージベクターを、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、バクテリオファージ（例えば、ＧＥＭ（商標）−１１など）を、感受性宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２など）を形質転換するために使用することができる組み換えベクターを作製する際に利用してもよい。
【０２２９】
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置付けられる非翻訳調節配列である。原核生物プロモーターは、典型的には、２つのクラス（誘導的及び恒常的）に分類される。誘導的プロモーターは、培養条件における変化（例えば、栄養分の存在もしくは非存在または温度における変化）に応答したその制御下での増加レベルのシストロンの転写を開始するプロモーターである。
【０２３０】
種々の潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが、周知である。選択されたプロモーターを、制限酵素消化を介した供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、単離したプロモーター配列を本発明のベクター中に挿入することにより、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに機能的に連結することができる。天然プロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方を使用し、標的遺伝子の増幅及び／または発現に向けてもよい。いくつかの実施形態では、異種プロモーターを利用する。なぜなら、それらは、一般的に、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現された標的遺伝子のより大きな転写及びより高い産出を許すからである。
【０２３１】
原核生物宿主との使用のために適したプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、及びハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃまたはｔｒｃプロモーターなど）を含む。しかしながら、細菌において機能的である他のプロモーター（例えば、他の公知の細菌またはファージのプロモーターなど）も適している。それらのヌクレオチド配列が発表されており、それにより当業者が、それらを、標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロン（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）に、任意の要求される制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを使用して機能的に連結することが可能になる。
【０２３２】
一態様では、組み換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドの膜を横断する直接的な転位に向ける分泌シグナル配列成分を含む。一般的に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得る、または、それは、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。本出願の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞により認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。異種ポリペプチドに対して天然であるシグナル配列を認識し、処理しない原核生物宿主細胞について、シグナル配列が、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群より選択される原核生物シグナル配列により置換される。いくつかの実施形態では、発現系の両シストロンにおいて使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異体である。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰの産生は、宿主細胞の細胞質中で起こり得るが、従って、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在を必要としない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド成分は、発現され、折り畳まれ、組み立てられて、細胞質内に機能的なＭＡＢＰが形成される。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｘＢ−株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質状態を提供し、それにより発現されたタンパク質サブユニットの適切な折り畳み及び組み立てを許す。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０２３４】
本出願は、発現されるポリペプチド成分の定量的比率を、分泌されて適切に組み立てられる本出願のＭＡＢＰの産出を最大限にするために調節することができる発現系を提供する。そのような調節は、少なくとも部分的に、ポリペプチド成分についての翻訳強度を同時に調節することにより達成される。翻訳強度を調節するための１つの技術が、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４０，５２３号に開示される。それは、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。所与のＴＩＲについて、一連のアミノ酸または核酸配列変異体を、翻訳強度の範囲を用いて作製することができ、それにより特定の鎖の所望の発現レベルについてこの因子を調整するための便利な手段を提供する。ＴＩＲ変異体を、アミノ酸配列を変化させることができるコドン変化をもたらす従来の突然変異誘発技術により生成することができるが、ヌクレオチド配列におけるサイレントな変化が好ましい。ＴＩＲにおける変化は、例えば、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の数または間隔における変化を、シグナル配列における変化と共に含むことができる。突然変異シグナル配列を生成するための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コード配列の開始での「コドンバンク」の生成である。これは、各コドンの３番目のヌクレオチド位置を変化させることにより達成することができる；加えて、いくつかのアミノ酸、例えば、ロイシン、セリン、及びアルギニンなどは、バンクを作製する際に複雑度を加えることができる複数の１番目及び２番目の位置を有する。突然変異誘発のこの方法は、Ｙａｎｓｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４：１５１−１５８に詳細に記載される。
【０２３５】
好ましくは、一連のベクターは、その中の各シストロンについてのＴＩＲ強度の範囲を用いて生成する。この限定されたセットは、各鎖の発現レベルの比較ならびに種々のＴＩＲ強度の組み合わせ下の所望のＭＡＢＰ生成物の産出を提供する。ＴＩＲ強度を、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４０，５２３号に詳細に記載されるレポーター遺伝子の発現レベルを定量化することにより決定することができる。翻訳強度比較に基づき、所望の個々のＴＩＲを選択し、本出願の発現ベクター構築物において組み合わせる。
【０２３６】
ｂ）原核生物宿主細胞
本出願のＭＡＢＰを発現させるために適した原核生物宿主細胞は、古細菌と真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物などを含む。有用な細菌の例としては、エシェリキア属（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス属（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、腸内細菌、シュードモナス属（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ・チフィリウム、セラチア・マルセッセンス、クレブシエラ属、プロテウス属、シゲラ属、根粒菌、ビトレオシラ属、またはパラコッカス属が挙げられる。一実施形態では、グラム陰性細胞を使用する。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を宿主として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例としては、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０−１２１９；ＡＴＣＣ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｎｏ．２７，３２５）及びその誘導体が挙げられ、遺伝子型Ｗ３１１０  ＡｆｈｕＡ  （ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ＡｏｍｐＴ  Ａ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する３３Ｄ３株を含む。他の株及びその誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  １７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉ  ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１，６０８）なども適する。これらの例は、限定的よりも、むしろ説明的である。定義された遺伝子型を有する上記の細菌のいずれかの誘導体を構築するための方法が、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載される。一般的に、細菌の細胞におけるレプリコンの複製能を考慮に入れて適切な細菌を選択することが必要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、セラチア属、またはサルモネラ属が、周知のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０など）を、レプリコンを供給するために使用する場合、宿主として使用するのに適し得る。
【０２３７】
典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤が望ましくは細胞培養に取り込まれ得る。
【０２３８】
ｃ）タンパク質産生
宿主細胞を上記の発現ベクターを用いて形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜修飾された従来の栄養培地中で培養する。形質転換は、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、ＤＮＡが、染色体外エレメントとしてまたは染色体組み込み体のいずれかとして複製可能であることを意味する。使用する宿主細胞に依存して、形質転換は、そのような細胞に適切である標準的な技術を使用して行う。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含む細菌細胞のために一般的に使用される。形質転換のための別の方法では、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術は、エレクトロポレーションである。
【０２３９】
本出願のＭＡＢＰを産生するために使用される原核細胞は、当該技術分野において公知の、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖される。適した培地の例としては、Ｌｕｒｉａ培地（ＬＢ）＋必要な栄養分補給が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地はまた、発現ベクターの構築に基づき選択された選択剤を含み、発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択的に許す。例えば、アンピシリンを、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用の培地に加える。
【０２４０】
任意の必要な補給剤（炭素、窒素、及び無機リン酸供給源の他）も、単独でまたは別の補給剤を伴う混合物もしくは培地（例えば、複雑な窒素供給源など）として導入された適切な濃度で含んでもよい。場合により、培養液は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール、及びジチオスレイトールからなる群より選択される１つ以上の還元剤を含んでもよい。
【０２４１】
原核生物宿主細胞を適した温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉ増殖について、例えば、好ましい温度は、約２０℃〜約３９℃、より好ましくは２５℃〜約３７℃の範囲、さらにより好ましくは３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に依存して、約５〜約９の範囲の任意のｐＨであり得る。Ｅ．ｃｏｌｉについて、ｐＨは、好ましくは約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０２４２】
誘導性プロモーターを発現ベクター中で使用する場合、タンパク質発現を、プロモーターの活性化のために適した条件下で誘導する。いくつかの実施形態では、ＰｈｏＡプロモーターをポリペプチドの転写を制御するために使用する。したがって、形質転換された宿主細胞を、誘導用のリン酸制限培地中で培養する。好ましくは、リン酸制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７を参照されたい）。種々の他の誘導因子を、用いられるベクター構築物に応じて、当該技術分野において公知の通りに使用してもよい。
【０２４３】
本出願の発現されたＭＡＢＰは、宿主細胞のペリプラズム中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、典型的には、微生物の破壊（一般的に、浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段による）を含む。一旦、細胞が破壊されると、細胞片または全細胞を遠心分離またはろ過により除去してもよい。タンパク質を、さらに、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーにより精製してもよい。あるいは、タンパク質を培養液中に輸送し、その中で単離することができる。細胞を培養物から除去してもよく、培養上清を、産生されたタンパク質のさらなる精製のためにろ過及び濃縮する。発現されたポリペプチドを、さらに、一般的に公知の方法（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイなど）を使用して単離及び同定することができる。
【０２４４】
あるいは、タンパク質産生は、発酵プロセスにより大量に行われる。種々の大規模流加発酵手順を、組み換えタンパク質の産生のために利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの能力、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの能力を有する。これらの発酵槽ではアジテーターインペラを使用し、酸素及び栄養分、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー供給源）を分布させる。小規模発酵は、一般的に、わずか約１００リットルの容積である、約１リットル〜約１００リットルの範囲であり得る発酵槽中での発酵を指す。
【０２４５】
発酵プロセスの間に、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が適した条件下で所望の密度（例えば、ＯＤ５５０が約１８０〜２２０）まで増殖させた後に開始され、その段階で細胞は初期の静止期にある。種々の誘導因子を、用いられるベクター構築物に応じて、当該技術分野において公知であり、上に記載する通りに使用してもよい。細胞を、誘導前に短い期間にわたり増殖させてもよい。細胞を、通常、約１２〜５０時間にわたり誘導するが、より長いまたはより短い誘導時間を使用してもよい。
【０２４６】
本出願のＭＡＢＰの産出及び質を改善するために、種々の発酵プロセスを修飾することができる。例えば、分泌されたポリペプチドの適切な組み立て及び折り畳みを改善するために、シャペロンタンパク質、例えば、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を伴うペプチジルプロリルシス、トランスイソメラーゼ）などを過剰発現する追加のベクターを使用して、宿主原核細胞を同時形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞において産生される異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解性を促進することが実証されている。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１−１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０２４７】
発現された異種タンパク質（特に、タンパク分解に感受性であるもの）のタンパク質分解を最小限にするために、タンパク質分解酵素が欠損したある特定の宿主株を本発明のために使用することができる。例えば、宿主細胞株を修飾し、公知の細菌プロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びその組み合わせなど）をコードする遺伝子における遺伝的突然変異（複数可）に効果を及ぼしてもよい。一部のＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株を利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），ｓｕｐｒａ；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載される。
【０２４８】
タンパク質分解酵素が欠損し、１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドを用いて形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を、本出願のＭＡＢＰをコードする発現系において宿主細胞として使用してもよい。
【０２４９】
ｄ）タンパク質精製
本明細書において産生されるＭＡＢＰをさらに精製し、さらなるアッセイ及び使用のための実質的に均質である調製物を得る。当該技術分野において公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の手順：免疫親和性カラムまたはイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上または陽イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥなど）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫安塩析、及びゲルろ過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用）は、適した精製手順の例示である。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、固相に固定化されるプロテインＡは、本明細書に記載のＦｃ領域を含むＭＡＢＰの免疫親和性精製のために使用される。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌からの４１１（Ｄ細胞壁タンパク質であり、高親和性を伴い抗体のＦｃ領域に結合する。Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。プロテインＡが固定化される固相は、好ましくは、ガラスまたはシリカ表面を含むカラム、より好ましくは制御された細孔ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。一部の適用において、カラムを、混入物の非特異的付着を予防するために、試薬（例えば、グリセロールなど）を用いて被覆している。固相を次に洗浄し、固相に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、目的のＭＡＢＰを、溶出により固相から回収する。
【０２５１】
２．真核細胞におけるタンパク質産生
真核生物での発現のために、ベクター成分は、一般的に、限定はされないが、以下：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、ならびにエンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列の１つ以上を含む。
【０２５２】
ａ）シグナル配列成分
真核生物宿主における使用のためのベクターはまた、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドをコードするインサートを含んでもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞により認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺乳動物細胞での発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルを利用可能である。
【０２５３】
そのような前駆体領域のためのＤＮＡを、リーディングフレーム中で、本出願のＭＡＢＰをコードするＤＮＡに連結する。
【０２５４】
ｂ）複製起点
一般的に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターのために必要とされない（ＳＶ４０起点を典型的に使用してもよい。なぜなら、ただ、それは初期プロモーターを含むからである）。
【０２５５】
ｃ）選択遺伝子成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択遺伝子（選択可能マーカーとも称される）を含んでもよい。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対して耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複雑な培地から利用可能ではない決定的な栄養分を供給するタンパク質をコードする（例えば、バシラス属についてのＤアラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０２５６】
選択計画の１例では、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を利用する。異種遺伝子を用いて成功裏に形質転換されるそれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、このように選択計画中に生存する。そのような優性選択の例では、薬物（ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシン）を使用する。
【０２５７】
哺乳動物細胞のための適した選択マーカーの別の例は、本出願のＭＡＢＰをコードする核酸を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするものである（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）。
【０２５８】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子を用いて形質転換された細胞は、最初に、メトトレキサート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト）を含む培養液中で形質転換体の全てを培養することにより同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合での適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６）である。
【０２５９】
あるいは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び別の選択マーカー、例えば、アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などを用いて形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）を、選択マーカー用の選択薬剤（例えば、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８など）を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０２６０】
ｄ）プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、所望のポリペプチド配列をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む。事実上、全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置付けられるＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、そこでＮは任意のヌクレオチドであり得る。大半の真核生物の３’末端は、ＡＡＴＡＡＡ配列であり、それはコード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得る。これらの配列の全てを、真核生物発現ベクター中に挿入してもよい。
【０２６１】
原核生物宿主との使用のために適した他のプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、ラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、及びハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーターなど）を含む。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが適する。細菌システムにおける使用のためのプロモーターはまた、ＭＡＢＰをコードするＤＮＡに機能的に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含み得る。
【０２６２】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチド転写は、例えば、以下のウイルスのゲノムから得られるプロモーターにより制御される：例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくははサルウイルス４０（ＳＶ４０）、異種哺乳動物プロモーターから、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターから（そのようなプロモーターが宿主細胞系に適合するという条件で）。
【０２６３】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として便利に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として便利に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるためのシステムが、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。このシステムの修飾が、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、マウス細胞における単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのヒトインターフェロンｃＤＮＡの発現に関するＲｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）を参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列をプロモーターとして使用することができる。
【０２６４】
ｅ）エンハンサーエレメント成分
より高い真核生物による本出願のＭＡＢＰをコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増加される。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子から公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）。典型的には、しかしながら、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用され得る。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントに関するＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）を参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列に対する位置５’または３’でベクター中にスプライシングされ得るが、しかし、好ましくはプロモーターから部位５’に位置付けられる。
【０２６５】
ｆ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結のために及びｍＲＮＡを安定化させるために必要な配列も含み得る。そのような配列は、一般的に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’及び、時には３’の非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びその中で開示される発現ベクターを参照されたい。
【０２６６】
ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書におけるベクター中でＤＮＡをクローン化または発現するための適した宿主細胞は、本明細書に記載のより高い真核細胞（脊椎動物宿主細胞を含む）を含む。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、通常の手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、以下：ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞または浮遊培養中での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚がん細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳がん（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞がん株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２６７】
宿主細胞を、ＭＡＢＰ産生のための上記の発現またはクローニングベクターを用いて形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜修飾された従来の栄養培地中で培養する。
【０２６８】
ｈ）宿主細胞の培養
本出願のＭＡＢＰを産生するために使用される宿主細胞を、種々の培地中で培養してもよい。商業的に利用可能な培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などが、宿主細胞を培養するために適する。また、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許Ｒｅ．３０，９８５に記載される培地のいずれかを宿主細胞用の培養液として使用してもよい。これらの培地のいずれかに、必要に応じて、以下を補給してもよい：ホルモン及び／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸など）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、及びグルコースまたは等価のエネルギー供給源。任意の他の必要な補給剤を、また、当業者に公知であり得る適切な濃度で含めてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されたものであり、当業者に明らかであろう。
【０２６９】
ｉ）タンパク質精製
組み換え技術を使用する場合、ＭＡＢＰは、細胞内に、ペリプラズム間隙中に産生され得る、または培地中に直接的に分泌され得る。ＭＡＢＰが細胞内に産生される場合、最初の工程として、微粒子細片、宿主細胞または溶解断片のいずれかを、例えば、遠心分離または限外ろ過により除去する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）には、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム間隙に分泌される抗体を単離するための手順が記載される。簡単に説明すると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在において約３０分にわたり溶解させる。細胞片を遠心分離により除去することができる。ＭＡＢＰが培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、一般的に、商業的に利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して最初に濃縮する。プロテアーゼ阻害剤、例えば、ＰＭＳＦなどを、先の工程のいずれかに含め、タンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含め、外来性混入菌の増殖を予防してもよい。
【０２７０】
細胞から調製されたタンパク質組成物を、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、ＭＡＢＰ中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用し、１、２、または４の重鎖を含むヒト免疫グロブリンに基づくＭＡＢＰを精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧが全てのマウスアイソタイプについて及びヒト３について推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが付着するマトリクスは、最もしばしばアガロースであるが、しかしながら、他のマトリクスを利用可能である。機械的に安定なマトリクス、例えば、制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレン−ジビニル）ベンゼンによって、アガロースを用いて達成することができるよりも速い流速及び短い処理時間が可能になる。ＭＡＢＰがＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製のために有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫安塩析も、回収されるＭＡＢＰに依存して利用可能である。
【０２７１】
任意の予備精製工程（複数可）に続き、目的のＭＡＢＰ及び混入物を含む混合物を、ｐＨが約２．５〜４．５の溶出緩衝液を使用し、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）で実施される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
【０２７２】
３．抗体の製造
ＭＡＢＰの成分、例えば、従来の４本鎖抗体、抗原結合断片、及びｓｄＡｂは、以下に記載する方法を含む、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて製造することができる。
【０２７３】
ｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）は、当該技術分野において公知の方法を用いて、例えば、ラクダ科種（例えば、ラクダまたはラマ）を免疫化し、そこからハイブリドーマを得ることによって、または、当該技術分野において公知の分子生物学的技術を用いてｓｄＡｂのライブラリーをクローニングし、未選択ライブラリーの個々のクローンを用いるＥＬＩＳＡにより、またはファージディスプレイにより引き続き選択することによって得ることができる。
【０２７４】
１）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を実質的に均質な抗体の集団から得る、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、天然に生じる突然変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。従って、修飾語「モノクローナル」は、別々の抗体の混合物ではないとして抗体の特徴を示す。
【０２７５】
例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製してもよく、または組み換えＤＮＡ方法により作製してもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【０２７６】
ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスターまたはラマなど）を本明細書で上に記載する通りに免疫化し、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。リンパ球を、次に、ミエローマ細胞と、適した融合剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）を使用して融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０２７７】
免疫化薬剤は、典型的には、抗原性タンパク質またはその融合変異体を含み得る。一般的に、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が、ヒト由来細胞が所望である場合に使用され、または、脾細胞またはリンパ節細胞が、非ヒト哺乳動物の供給源が所望である場合に使用される。リンパ球を、次に、不死化細胞株と、適した融合剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）を使用して融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６），ｐｐ．５９−１０３。
【０２７８】
不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシ、及びヒトに由来するミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞株を用いる。このように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適した培養液中に播種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）（ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を予防する物質である）を含み得る。
【０２７９】
好ましい不死化ミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を支持し、培地（例えば、ＨＡＴ培地など）に感受性であるものである。これらの内、マウスミエローマ株、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから利用可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．ＵＳＡから利用可能なＳＰ−２細胞（及びその誘導体、例えば、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３）などが好ましい。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０２８０】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）により決定する。
【０２８１】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、所望の抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、モノクローナル抗体の結合親和性及び特異性を、免疫沈降によりまたはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）により決定することができる。そのような技術及びアッセイは、当該技術分野において公知である。例えば、結合親和性を、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャチャード分析により決定してもよい。
【０２８２】
所望の特異性、親和性、及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈手順によりサブクローン化し、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，ｓｕｐｒａ）により増殖してもよい。この目的のための適した培養液は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。また、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腫瘍としてインビボで増殖し得る。
【０２８３】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水、または血清から、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーなどにより適切に分離される。
【０２８４】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるもの、及び上記のような、組み換えＤＮＡ方法によって作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来手順を用いて容易に単離され、配列決定される（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブの使用による）。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。一旦、単離されると、ＤＮＡを発現ベクター中に置いてもよく、それを次に、本来なら免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞などにトランスフェクションする（そのような組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成するために）。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現に関する概説文献は、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８（１９９２）が挙げられる。
【０２８５】
さらなる実施形態では、抗体を、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を用いて作製された、抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）には、ファージライブラリーを用いる、それぞれネズミ及びヒト抗体の単離について記載されている。後続の文献は、チェインシャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに、巨大ファージライブラリー構築戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組み換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））について記載している。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離に対する従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替手段である。
【０２８６】
また、ＤＮＡを、例えば、相同的なネズミ配列の代わりに、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置き換えることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって修飾してもよい。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、または、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換され、ある抗原への特異性を有する１つの抗原結合部位と、別の抗原への特異性を有する別の抗原結合部位と、を含む、キメラ二価抗体が形成される。
【０２８７】
本明細書に記載のモノクローナル抗体は一価であってよく、その調製は、当該技術分野において周知である。例えば、１つの方法として、免疫グロブリン軽鎖及び修飾重鎖の組み換え発現が挙げられる。重鎖は、重鎖の架橋を防止するため、Ｆｃ領域中の任意の点において一般的に切断される。あるいは、架橋を防止するため、適切なシステイン残基を別のアミノ酸に置換し、または、欠失させてもよい。一価抗体の調製には、インビトロ方法も適している。抗体の断片、特に、Ｆａｂ断片を産生するための消化は、当該技術分野において公知の常用技術を用いて達成することができる。
【０２８８】
キメラまたはハイブリッド抗体も、架橋剤を含むものなどの合成タンパク質化学における公知の方法を用いて、インビトロで調製することができる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築することができる。この目的のために好適な試薬の例としては、イミノチオラート及びメチル−４−メルカプトブチリミダートが挙げられる。
【０２８９】
２）ヒト化抗体
抗体は、ヒト化またはヒト抗体をさらに含んでよい。非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブ配列）である。ヒト化抗体としては、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置換される。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても見られない、残基も含んでよい。一般的に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのものと一致し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むだろう。Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）。
【０２９０】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「移入」可変ドメインから取り込まれた「移入」残基と呼ばれることが多い。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共著者、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）の方法に従って、つまり、げっ歯類ＣＤＲまたはヒト抗体の配列に対応するＣＤＲ配列を置き換えることによって、本質的に実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、実質的に完全ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種の対応する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によりいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位由来の残基で置換された、ヒト抗体である。
【０２９１】
ヒト化抗体の作製に使用される、ヒト可変ドメイン（軽鎖及び重鎖の両方）の選択は、抗原性の低減に非常に重要である。いわゆる「最適フィット」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列について、公知のヒト可変ドメイン配列の完全ライブラリーをスクリーニングする。続いて、このげっ歯類に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として認める。Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）。別の方法は、全ヒト抗体の軽鎖及び重鎖の特定のサブグループのコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）。
【０２９２】
抗体が、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持したままヒト化されることがさらに重要である。この目的を達成するため、好ましい方法に従って、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いる親配列及び様々な概念的ヒト化生成物の解析プロセスによって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体配座構造を示して表示する、コンピュータープログラムが利用することができる。これらの表示を精査すると、候補免疫グロブリン配列の機能におけるその残基の考えられる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンの抗原結合能に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原（複数可）に対する親和性が増大するなど所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接的に、かつ最も実質的に関与する。
【０２９３】
種々の形態のヒト化抗体が意図される。例えば、ヒト化抗体は、免疫複合体を生成するために１つ以上の細胞傷害性剤（複数可）と任意に結合する、Ｆａｂなどの抗体断片であってよい。あるいは、ヒト化抗体は、無傷ＩｇＧ１抗体などの無傷抗体であってよい。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、抗原に対するドメインの従来の親和性を低下させることなく、かつ異種種に対するその免疫原性を減少させて、修飾、例えば、ヒト化される。例えば、ラマ抗体の抗体可変ドメイン（ＶＨＨ）のアミノ酸残基を決定してよく、例えば、フレームワーク領域内の１つ以上のラクダ科アミノ酸を、そのポリペプチドが典型的な特性を失うことなく、すなわち、ヒト化が得られるポリペプチドの抗原結合能に顕著な影響を及ぼさずに、ヒトコンセンサス配列中に見られるヒト対応アミノ酸で置き換える。ラクダ科ｓｄＡｂのヒト化は、単一ポリペプチド鎖中の限られた量のアミノ酸の導入及び突然変異誘発を必要とする。これは、２本鎖、軽鎖と重鎖のアミノ酸変化の導入と、両鎖の集合の保存を必要とする、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２及びＩｇＧのヒト化とは対照的である。
【０２９５】
３）ヒト抗体
ヒト化の代替として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、今では、免疫化によって、内因性免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体の完全なレパートリーを産生可能な、トランスジェニック動物（例えば、マウス）の作製が可能である。例えば、キメラ及び生殖系変異マウスの抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ結合型欠失により、内因性抗体産生の完全阻害をもたらすことが記載されている。ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系変異マウスに導入すると、抗原誘発によってヒト抗体が産生する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５９１，６６９号及びＷＯ９７／１７８５２を参照されたい。完全ヒトｓｄＡｂ産生能があるトランスジェニックマウスまたはラットは、当該技術分野において公知である。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。
【０２９６】
あるいは、ファージディスプレイ技術を用いて、非免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体及び抗体断片をインビトロで製造することができる。ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）。この技術によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を、繊維状バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３またはｆｄのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかに、インフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上の機能性抗体断片として提示する。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能性に基づく選択によって、その特性を提示する抗体をコードする遺伝子も選択する。これにより、ファージは、Ｂ細胞の一部の特性を模倣する。ファージディスプレイは、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：５６４−５７１（１９９３）に論評されるように、様々な形態で実施することができる。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムコンビナトリアルライブラリーから、多種多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーを構築でき、多種多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）に記載される方法に本質的には従って単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号も参照されたい。
【０２９７】
Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されている、トランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することができる。誘発時、遺伝子再配列、集合、及び抗体レパートリーなどの全ての点において、ヒトで見られるものとよく似たヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、ならびに、次の科学文献、すなわち、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０２９８】
最終的に、ヒト抗体を、活性化Ｂ細胞によってインビトロで産生することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたい）。
【０２９９】
４）抗体断片
ある特定の実施形態では、全抗体よりも抗体断片、例えば、抗原結合断片を用いることが有利である。小さいサイズの断片は、迅速なクリアランスを可能にし、固形腫瘍へのアクセスを向上につながり得る。
【０３００】
抗体断片の産生のために、様々な技術が開発されている。従来は、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解によって得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄ．２４：１０７−１１７（１９９２）；及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、今では、組み換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ抗体断片は、全て、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現し、そこから分泌され得るので、大量のこれらの断片を容易に製造することができる。抗体断片は、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片をＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的に連結して、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を、組み換え宿主細胞培養から直接単離することができる。インビボ半減期が延長したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。他の実施形態では、選択される抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような「線状抗体」であってもよい。このような線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であってもよい。
【０３０１】
５）多重特異性抗体
第１の抗原結合部分は、二重特異性抗体などの多重特異性抗体を含み得る。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、同じまたは別のタンパク質上のものなど、少なくとも２つの異なるエピトープへの結合特異性を有する抗体である。あるいは、標的抗原発現細胞に対する細胞防御機構を集中させ、局在化するために、一方のアームは標的抗原に結合でき、別のアームは、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）などの白血球上のトリガー分子、または、ＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えば、ＦｃγＲ１（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組み合わせることができる。このような抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）由来であってよい。
【０３０２】
また、二重特異性抗体は、標的抗原を発現する細胞に細胞傷害性剤を局所化するためにも使用することができる。このような抗体は、所望の抗原に結合する一方のアームと、細胞傷害性剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位元素ハプテン）に結合する別のアームとを有する。公知の二重特異性抗体の例としては、抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃｇＲＩＩＩ（ＷＯ９６／１６６７３）、抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃｇＲＩ（米国特許第５，８３７，２３４号）、抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３（米国特許第５，８２１，３３７号）が挙げられる。
【０３０３】
二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野において公知である。完全長二重特異性抗体の従来の製造は、２本の免疫グロブリン重鎖／軽鎖対（この２本鎖は異なる特異性を有する）の共発現に基づくものである。Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の任意の組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種類の異なる抗体分子を含む可能性がある混合物を生成し、これらのうち１種類のみが、正しい二重特異性構造を有する。通常は親和性クロマトグラフィー工程によって行われるが、正しい分子の精製はやや煩雑であり、生成物の収率は低い。類似の手順が、ＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０３０４】
異なるアプローチによると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合体は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリンの重鎖定常ドメインとである。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及び所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物に同時トランスフェクトされる。これにより、構築物に使用される３本のポリペプチド鎖の比率が異なると最適な収率が得られる実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に、高い自由度を与える。しかしながら、少なくとも２本のポリペプチド鎖が同じ比率で発現すると高い収率が得られるとき、または、比率が重要ではないときに、２本または３本全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０３０５】
このアプローチの好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームに、第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームに、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）と、から構成される。この非対称構造によって、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することで簡便な分離方法を提供するため、不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物を分離することを促進することが発見された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成にさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０３０６】
ＷＯ９６／２７０１１または米国特許第５，７３１，１６８号に記載の他の方法によると、一対の抗体分子間の境界部を遺伝子操作し、組み換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化することができる。好ましい境界部は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界部の１つ以上の小型アミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置換する。第２の抗体分子の境界部上に、大型アミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）と置換することによって、大側鎖（複数可）と同一または類似の大きさの補完「空洞部」が形成される。これは、ホモ二量体などの別の不要な最終生成物よりも、ヘテロ二量体の収率を増加させる仕組みを提供する。
【０３０７】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技術は、文献に記載されている。例えば、化学的結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、無傷抗体がタンパク質分解を受けて切断され、Ｆ（ａｂ’）２断片を生じる手順について記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ素ナトリウムの存在下で還元され、近接したジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次に、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体に再変換して、二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体を、酵素の選択的固定の薬剤として使用することができる。
【０３０８】
Ｆａｂ’断片は、大腸菌から直接回収でき、化学的に結合させて、二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製について記載している。各Ｆａｂ’断片を、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌させ、インビトロで化学的結合させて、二重特異性抗体を形成した。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞に結合することができると共に、ヒトの乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解作用を引き起こすことができた。
【０３０９】
二価抗体断片を、組み換え細胞培養から直接作製し、単離する様々な技術についても説明されている。例えば、二価のヘテロ二量体は、ロイシンジッパーを用いて産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体のホモ二量体を、ヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後再酸化して、抗体のヘテロ二量体を形成した。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって説明される「ダイアボディ」技術は、二重特異性／二価抗体断片の作製の別の仕組みを提供している。この断片は、同一鎖上で２つのドメイン間に対形成させるには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一方の断片のＶＨ及びＶＬドメインが、別の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対形成させられることによって、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用することによって、二重特異性／二価抗体断片を作製する別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０３１０】
３価以上の抗体が意図される。例えば、三重特異性抗体を調製してよい。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０３１１】
例示的な二重特異性抗体は、所与の分子上の２の異なるエピトープに結合し得る。あるいは、特定のタンパク質を発現している細胞に細胞防御機構を集中させるために、抗タンパク質アームは、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７）などの白血球上のトリガー分子、または、ＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと結合することができる。また、二重特異性抗体は、特定のタンパク質を発現する細胞に細胞傷害性剤を局所化するためにも使用することができる。このような抗体は、タンパク質結合アームと、細胞傷害性剤や放射性核種キレート剤、例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡに結合するアームと、を有する。別の目的の二重特異性抗体は、目的のタンパク質に結合し、組織因子（ＴＦ）にさらに結合する。
【０３１２】
６）多価抗体
第１の抗原結合部分は、多価抗体を含み得る。多価抗体は、その抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速く内部移行（及び／または分解）され得る。本出願のＭＡＢＰにおいて第１の抗原結合部分として使用される抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外）（例えば、四価抗体）であってよく、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組み換え発現によって容易に製造することができる。多価抗体は、二量体化ドメイン及び３つ以上の抗原結合部位を含んでよい。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはからなる）。この状況では、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端にある３つ以上の抗原結合部位とを含む。本明細書の好ましい多価抗体は、３〜約８つ、ただし好ましくは４つの抗原結合部位を含む（またはからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、このときポリペプチド鎖（複数可）は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含んでよく、このときＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＨ−ＣＨ１−可動性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖、または、ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含んでよい。本明細書の多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。本明細書の多価抗体は、例えば、約２〜約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでよい。本明細書で意図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、所望により、ＣＬドメインをさらに含む。
【０３１３】
７）ヘテロ共役抗体
ヘテロ共役抗体を、本出願のＭＡＢＰの第１の抗原結合部分として用いることもできる。ヘテロ共役抗体は、共有結合した２つの抗体からなる。例えば、ヘテロ共役体中の一方の抗体をアビジンに、もう一方をビオチンに結合することができる。このような抗体は、例えば、ＨＩＶ感染を治療するため、不要な細胞に対する免疫系細胞を標的化のために提案されている（米国特許第４，６７６，９８０号）。ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９３６。抗体が、架橋剤を含むものなどの合成タンパク質化学における既知の方法を用いて、インビトロで調製することができることが意図される。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築することができる。この目的のための好適な試薬の例としては、イミノチオオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミド、及び、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものが挙げられる。ヘテロ共役抗体は、任意の適当な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は、当該技術分野において周知であり、多くの架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０３１４】
８）エフェクター機能操作
本出願のＭＡＢＰを、Ｆｃエフェクター機能に関して修飾する、例えば、抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変更する（例えば、増強または排除する）ことが望ましい場合がある。好ましい実施形態では、ＭＡＢＰのＦｃエフェクター機能を低減または排除する。これは、抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。あるいはまたはさらに、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入することにより、この領域での鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このように生成されたホモ二量体ＭＡＢＰは、内部移行能が向上している、及び／または、補体媒介性細胞殺滅及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増加していることがある。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照されたい。向上した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、それによって補体溶解及びＡＤＣＣ能が増強された抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照されたい。
【０３１５】
抗体の血清半減期を増加させるに、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるように、ＭＡＢＰ内にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことができる。本明細書で使用する場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープであって、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期に延長に貢献するものを指す。
【０３１６】
９）他のアミノ酸配列修飾
本明細書に記載のＭＡＢＰの単鎖抗体または抗体成分などの、抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／またはその他生物学的特性を改善するのに望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸内に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、またはペプチド合成により調製される。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の、欠失及び／または挿入及び／または置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換のいずれかの組み合わせを施して最終構築物に到達させる。アミノ酸変化により、グリコシル化部位の数や位置の変更など、抗体の翻訳後工程も変更することができる。
【０３１７】
突然変異誘発に好ましい位置として抗体の特定の残基または領域を同定する有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載されている。ここでは、標的残基の１つまたは群の残基が同定され（例えば、アルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、及びグルタミン酸などの荷電残基）、中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換されて、アミノ酸抗原の相互作用に影響を及ぼす。その後、置換に対する機能感受性を呈するアミノ酸位置は、置換部位に、またはそれに対してさらなるまたは別の変異を導入することによって洗練される。そのため、アミノ酸配列変異を導入する部位が予め定められる一方で、突然変異自体の性質を予め定める必要がない。例えば、ある部位における突然変異の性能を分析するため、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域にて実施し、発現した抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０３１８】
アミノ酸配列挿入としては、１つの残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまで長さに幅がある、アミノ及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに、単一もしくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端がメチオニル残基である抗体、または、細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入変異体としては、酵素に対する抗体のＮ−またはＣ末端への融合（例えば、ＡＤＥＰＴ向け）または、抗体の血清半減期を延長するポリペプチドが挙げられる。
【０３１９】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子内に、異なる残基によって置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換型突然変異誘発に最も所望される部位として超可変領域が挙げられるが、ＦＲ変化も想定される。保存的置換を、「好ましい置換」という見出しで以下の表２に示す。このような置換が生物活性の変化をもたらす場合、表２に「例示的な置換」と示されているか、またはアミノ酸分類に関して以下にさらに記載されているように、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングすることができる。
【表２−１】
2021509896.tif 000004
【表２−２】
2021509896.tif 000005
【０３２０】
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくはらせん構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または、（ｃ）側鎖の大きさ、を維持することについて、その効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。自然に存在する残基を、共通する側鎖特性に基づいて分類する。
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
（２）中性親水性：システイン、セリン、スレオニン
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸
（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン
（５）鎖の向きに影響を与える残基：グリシン、プロリン、及び
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【０３２１】
非保存的置換は、これらの分類のうち１つを別の分類のものに交換することを伴う。
【０３２２】
抗体の正しい立体配座の維持に関与していない任意のシステイン残基を、一般的にはセリンと置換し、分子の酸化安定性を向上し、異常な架橋を防ぐこともできる。反対に、システイン結合（複数可）を抗体に加え、その安定性を向上することもできる（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片のとき）。
【０３２３】
特に好ましい置換変異体の種類は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般的に、結果として得られ、さらなる開発のために選択された変異体（複数可）は、元になった親抗体に対して改善された生物学的特性を有するであろう。このような置換変異体を生成するための簡便な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を含む。簡潔に言うと、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を変異させ、各部位において可能な全てのアミノ置換を生じさせる。このようにして生成された抗体変異体を、各粒子内にパッケージングされたＭ１３のｇｅｎｅ  ＩＩＩ生成物への融合体として、繊維状ファージ粒子から一価でディスプレイする。次に、このファージディスプレイ変異体を、本明細書に開示されるように、生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。変異に関する超可変領域部位の候補を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行い、抗原結合に大きく寄与する超可変領域の残基を同定することができる。あるいは、または追加的に、抗原とその標的（例えば、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１）との間の接点を特定するため、抗原抗体複合体の結晶構造分析が有用な場合がある。このような接触残基及び隣接する残基は、本明細書に詳述される技術による置換の候補である。このような変異体が生成されると、一連の変異体を本明細書に記載のスクリーニングにかけ、１つ以上の関連アッセイで優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択することができる。
【０３２４】
抗体の別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の従来のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体内にある１つ以上の炭水化物部分の欠損、及び／または、その抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。
【０３２５】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を意味する。アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンのトリペプチド配列（このとき、Ｘはプロリン以外のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付加のための認識配列である。そのため、ポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することで、潜在的グリコシル化部位をもたらす。Ｏ−結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち１つへの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンの付加を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが用いられる場合もある。
【０３２６】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上記トリペプチド配列のうちの１つ以上を含むように、アミノ酸配列を変更することにより簡便に達成される（Ｎ−結合型グリコシル化部位）。変更は、元の抗体の配列に１つ以上のセリンまたはスレオニン残基を付加、またはこれで置換することによっても達成することができる（Ｏ−結合型グリコシル化部位）。
【０３２７】
本出願のＭＡＢＰに対するアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において既知の様々な方法によって調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、または、先に調製された変異体もしくは非変異体のオリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、もしくはカセット突然変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２８】
１０）他の修飾
本出願のＭＡＢＰをさらに修飾し、当該技術分野において既知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含有することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロ−ル）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中安定性から、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝型または非分枝型であってよい。抗体に付加されたポリマー数は可変であってよく、２種類以上のポリマーが付加されている場合、それらは同一であっても異なっていてもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善する抗体の特定の性質または機能が挙げられるが、これらに限定されない点、抗体誘導体を特定の条件下での治療に使用するか、などに基づいて決定することができる。かかる技術及び他の好適な処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．，Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）に開示されている。
【０３２９】
ＶＩ．キット及び製造品
本明細書に記載のＭＡＢＰのうちいずれかを含む、キット、単位用量製品、及び製造品がさらに提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物のうち任意の１つを含み、好ましくは使用説明書を提供するキットが提供される。
【０３３０】
本出願のキットは、適当に包装されている。適当な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、可動性包装（例えば、密封マイラーまたはビニール袋）などがあるが、これらに限定されない。キットは、例えば、緩衝剤及び解説情報などの追加の成分を適宜提供する。従って、本出願は、バイアル（例えば、密封バイアル）、ボトル、ジャー、可動性包装などを含む製造品も提供する。
【０３３１】
製造品は、容器、及び容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含み得る。適当な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど種々の材料で形成され得る。一般的に、容器は、本明細書に記載の疾患または疾病（例えば、がん）を治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであってよい）。ラベルまたは添付文書は、その組成物が個体における特定の状態の治療に使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、組成物を個体に投与するための説明書をさらに含むであろう。ラベルは、再構成及び／または使用のための指示を示し得る。医薬組成物を保持する容器は、再構成製剤の反復投与（例えば、２〜６回投与）を可能にする複数回使用バイアルであり得る。添付文書は、そのような治療用製品の使用に関する適応、用途、投与量、投与、禁忌及び／または警告についての情報を含む、治療用製品の市販包装に通例含まれる指示書を指す。さらに、製造品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの医薬的に許容可能な緩衝剤を含む、第２の容器をさらに含み得る。商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料、例えば、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針及びシリンジをさらに含み得る。
【０３３２】
キットまたは製造品は、複数単位用量の医薬組成物及び使用説明書を含んでもよく、薬局、例えば、病院薬局及び調剤薬局で貯蔵及び使用するために十分な量で包装されている。
【実施例】
【０３３３】
以下の実施例は、完全に本発明の例であることを意図しており、したがって決して本発明を限定すると考えられるべきではない。以下の実施例及び詳細な説明は、限定としてではなく例証として提供される。
【０３３４】
実施例１：ＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３三重特異性抗原結合タンパク質の構築及び発現
この実施例では、例示のＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３三重特異性抗原結合タンパク質（ＴＡＢＰ）の構築及び発現について説明する。それぞれ２本のポリペプチド鎖を以下のように含む、１０類の構築物（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）を設計して発現させた。抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブ由来である。抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨは、ＡＳ１９５８４ＶＨ２８（配列番号３１）由来である。抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨは、ＶＨＨ２（配列番号３２）由来である。
【０３３５】
ＴＰＴＬ１１：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み；及び第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む。図１を参照されたい。
【０３３６】
ＴＰＴＬ１２：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み；及び第２のポリペプチドは、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む。図２を参照されたい。
【０３３７】
ＴＰＴＬ１３：第１のポリペプチドは、抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み；及び第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む。図３を参照されたい。
【０３３８】
ＴＰＴＬ１４：第１のポリペプチドは、抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み；及び第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー、及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含む。図４を参照されたい。
【０３３９】
ＴＰＴＬ１５：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み；及び第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー、及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含む。図５を参照されたい。
【０３４０】
ＴＰＴＬ１６：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー、及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み；及び第２のポリペプチドは、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む。図６を参照されたい。
【０３４１】
ＴＰＴＬ１７：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー、及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含み；及び第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む。図７を参照されたい。
【０３４２】
ＴＰＴＬ１８：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー、及び抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含み；及び第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー及び抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨを含む。図８を参照されたい。
【０３４３】
ＴＰＴＬ１９：第１のポリペプチドは、抗ＰＤ−１抗体の重鎖を含み；及び第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー及び抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含む。図９を参照されたい。
【０３４４】
ＴＰＴＬ２０：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端において、抗ＰＤ−１抗体の重鎖、ペプチドリンカー、抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ、ペプチドリンカー、及び抗ＴＩＧＩＴ  ＶＨＨを含み；及び第２のポリペプチドは、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖を含む。図１０を参照されたい。
【０３４５】
各ＴＡＢＰは、第１のポリペプチドの２本鎖及び第２のポリペプチドの２本鎖からなる。Ｓ２２８Ｐ突然変異をＩｇＧ４  Ｆｃ領域に導入して、Ｆａｂアーム交換を阻害した。さらに、ＴＡＢＰのＦｃ領域は、異なるアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ  Ｆｃと交換してもよい。ＩｇＧ４アイソタイプのＦｃ領域は、ＦｃγＲへの結合親和性が低いため、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、またはＬＡＧ−３陽性細胞のＡＤＣＣ介在性の枯渇を避けるために、いくつかの実施形態ではＩｇＧ１アイソタイプより好ましい。
【０３４６】
１０個のＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３  ＴＡＢＰ構築物を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の各々を生成した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用して、ＴＡＢＰを発現させて、プロテインＡアガロース樹脂を含有するカラムに続くサイズ排除カラムを通じたクロマトグラフィーによって精製した。１０個のＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）の産生に関するデータを図１１にまとめる。例示のＴＡＢＰのアミノ酸配列を表３に提供する。
【０３４７】
実施例２：ＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３  ＴＡＢＰの結合親和性
精製後、ＴＡＢＰの結合親和性パラメーターを測定し、対応する単一特異性抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体ペンブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））、抗ＴＩＧＩＴ  ＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＨＣＡｂ（配列番号２９）、または抗ＬＡＧ−３  ＶＨＨ２  ＨＣＡｂ（配列番号３０））と比較した。
【０３４８】
簡単に言えば、ＰＤ−１への結合親和性を決定するため、各ＴＡＢＰまたはペンブロリズマブを、抗ヒトＦｃ抗体を介して、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）チップ上に捕捉し、Ｈｉｓ標識ＰＤ−１タンパク質を、５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、及び６４０ｎＭのそれぞれの濃度で、被験物質としてチップ上に流した。異なる被検物質濃度での結合曲線を使用して、動態パラメーターｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを算出した（図１２Ａ〜１２Ｋ）。
【０３４９】
ＴＩＧＩＴへの結合親和性を決定するため、各ＴＡＢＰまたはＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＨＣＡｂを、抗ヒトＦｃ抗体を介して、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）チップ上に捕捉し、Ｈｉｓ標識ＴＩＧＩＴタンパク質を、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、及び１６０ｎＭのそれぞれの濃度で、被験物質としてチップ上に流した。異なる被検物質濃度での結合曲線を使用して、動態パラメーターｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを算出した（図１３Ａ〜１３Ｋ）。
【０３５０】
ＬＡＧ−３への結合親和性を決定するため、各ＴＡＢＰまたはＶＨＨ２  ＨＣＡｂをＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）チップ上に固定化し、Ｈｉｓ標識ＬＡＧ−３タンパク質を、１．５６、３．１２５、６．２５、１２．５、２５及び５０ｎＭのそれぞれの濃度で、被験物質としてチップ上に流した。異なる被検物質濃度での結合曲線を使用して、動態パラメーターｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを算出した（図１４Ａ〜１４Ｋ）。親和性として示す算出したＫｄを図１５に記載した。親抗体と比較して、ＴＰＴＬ−１１〜ＴＰＴＬ−１７は、キイトルーダに匹敵する親和性を有した一方、ほとんどのＴＡＢＰのＴＩＧＩＴ及びＬＡＧ−３への親和性は、４倍以内である。
【０３５１】
実施例３：ＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３  ＴＡＢＰのＦＡＣＳに基づく特徴付け
実施例１で調製したＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３  ＴＡＢＰを、以下に記載のＦＡＣＳ系アッセイで試験し、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ及びＬＡＧ−３に対するそれらの標的結合能力を評価した。
【０３５２】
標的結合
ＣＨＯ細胞に発現したヒトＰＤ−１へのＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３  ＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）の結合を、ＦＡＣＳ系アッセイを用いて測定した。ヒトＰＤ−１を発現しているＣＨＯ細胞を、接着培養フラスコから剥がし、９６ウェルプレートで、様々な濃度の各ＴＡＢＰ、ペンブロリズマブ（陽性対照としてキイトルーダ（登録商標））、またはヒトＩｇＧ（陰性対照として）と混合した。混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、二次抗体として使用されるＦＩＴＣ共役抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、混合物を室温で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で解析し、ＥＣ５０値を算出した。図１５に示すように、ＦＡＣＳ結合アッセイにより、ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０が、ペンブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））に匹敵するＰＤ−１結合能力を呈したことが示され、ＥＣ５０値は、４倍以内であった。
【０３５３】
ＣＨＯ細胞に発現したヒトＴＩＧＩＴへのＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３  ＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）の結合を、ＦＡＣＳ系アッセイを用いて測定した。ヒトＴＩＧＩＴを発現しているＣＨＯ細胞を、接着培養フラスコから剥がし、９６ウェルプレートで、様々な濃度の各ＴＡＢＰ、ＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＨＣＡｂ（陽性対照として）、またはヒトＩｇＧ（陰性対照として）と混合した。混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、二次抗体として使用されるＦＩＴＣ共役抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、混合物を室温で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で解析し、ＥＣ５０値を算出した。図１５に示すように、ＦＡＣＳ結合アッセイにより、ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０が、ＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＨＣＡｂに匹敵するＴＩＧＩＴ結合能力を呈したことが示され、ＥＣ５０値は、２倍以内であった。
【０３５４】
ＣＨＯ細胞に発現したヒトＬＡＧ−３へのＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３  ＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）の結合を、ＦＡＣＳ系アッセイを用いて測定した。ヒトＬＡＧ−３を発現しているＣＨＯ細胞を、接着培養フラスコから剥がし、９６ウェルプレートで、様々な濃度の各ＴＡＢＰ、ＶＨＨ２  ＨＣＡｂ（陽性対照として）、またはヒトＩｇＧ（陰性対照として）と混合した。混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、二次抗体として使用されるＦＩＴＣ共役抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、室温で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で解析し、ＥＣ５０値を算出した。図１５に示すように、ＦＡＣＳ結合アッセイにより、ほとんどのＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ１３、ＴＰＴＬ１５〜ＴＰＴＬ１８、及びＴＰＴＬ２０）が、ＶＨＨ２  ＨＣＡｂに匹敵するＬＡＧ−３結合能力を呈したことが示され、ＥＣ５０値は、４倍以内であった。ＬＡＧ−３へのＴＰＴＬ１４及びＴＰＴＬ１９の結合親和性は、ＶＨＨ２  ＨＣＡｂよりも５倍弱かった。
【０３５５】
リガンド結合の阻害
また、ＴＡＢＰによるリガンド結合の阻害をＦＡＣＳアッセイによって評価した。ＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）によるＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２結合の阻害を評価するため、ヒトＰＤ−１を発現しているＣＨＯ細胞を、接着培養フラスコから剥がし、様々な濃度の各ＴＡＢＰ、及びビオチン標識を有する定常濃度のｈＰＤ−Ｌ１  ＦｃまたはＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合タンパク質と混合した。各混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を各混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で解析し、ＩＣ５０値を算出した。図１５に示すように、競合アッセイにより、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２相互作用に対する、低濃度（１〜１０μｇ／ｍＬ）でのＴＡＢＰの効率的阻害能が示された。１０個全てのＴＡＢＰは、同程度のリガンド遮断活性を有し、ＩＣ５０値は、３倍以内であった。
【０３５６】
ＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）によるＴＩＧＩＴへのＣＤ１５５結合の阻害を評価するため、ヒトＴＩＧＩＴ細胞を発現しているＣＨＯ細胞を、接着培養フラスコから剥がし、様々な濃度の各ＴＡＢＰ、及びビオチン標識を有する定常濃度のｈＣＤ１５５  Ｆｃ融合タンパク質と混合した。各混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を各混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で解析し、ＩＣ５０値を算出した。図１５に示すように、競合アッセイにより、ＴＩＧＩＴ−ＣＤ１５５相互作用に対する、低濃度（１〜１０μｇ／ｍＬ）でのＴＡＢＰの効率的阻害能が示された。１０個全てのＴＡＢＰは、同程度のリガンド遮断活性を有し、ＩＣ５０値は、３倍以内であった。ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ１７は、ＴＰＴＬ１８〜ＴＰＴＬ２０よりも強い阻害活性を呈し、抗ＰＤ−１抗体の重鎖のＣ末端への融合が、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂのその標的への結合を阻害し得ることを示唆する。
【０３５７】
ＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）によるＬＡＧ−３リガンド結合の阻害を評価するため、ヒトＴＩＧＩＴリガンド（ＭＨＣクラスＩＩ）を発現しているＡ３７５細胞を、接着培養フラスコから剥がし、様々な濃度の各ＴＡＢＰ、及びビオチン標識を有する定常濃度のＬＡＧ−３  Ｆｃ融合タンパク質と混合した。各混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を各混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で解析し、ＩＣ５０値を算出した。図１５に示すように、競合アッセイにより、ＬＡＧ−３−ＭＨＣ  ＩＩ相互作用に対する、低濃度（１〜１０μｇ／ｍＬ）でのＴＡＢＰの効率的阻害能が示された。ＴＰＴＬ１２、ＴＰＴＬ１７、及びＴＰＴＬ１８は、ＬＡＧ−３リガンド結合に対する阻害活性の低下を示した。
【０３５８】
実施例４：ＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３  ＴＡＢＰの発展性
実施例１で調製したＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３  ＴＡＢＰを、以下に記載する発展性アッセイで試験して、それらの安定性を評価した。
【０３５９】
開始凝集温度（Ｔａｇｇ）
５ｍｇ／ｍＬの試料について、約０．７５℃の温度間隔で２５℃〜８０℃の温度勾配を、ＤｙｎａＰｒｏ  ＮａｎｏＳｔａｒ（Ｗｙａｔｔ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて行った。２０μＬの各タンパク質試料を、Ｗｙａｔｔ使い捨てキュベットに加え、その後、蒸発を防ぐために試料を１０μＬの鉱物油（Ｓｉｇｍａ  ８４１０）でカバーした。測定は３回行い（各測定当たり５回取得）、各タンパク質試料を平均した。
【０３６０】
選択された温度間隔での実験中、熱走査速度は、１．５℃／分と算出された。目標温度である８０℃に達するまで熱を連続的に加えながら（約４０分）、各試料を測定した。凝集温度（Ｔａｇｇ）を、ＤＹＮＡＭＩＣＳ  ７．６．０．４８ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）におけるオンセット分析法を用いて分析した。
【０３６１】
図１６に示すように、ＴＰＴＬ１１、ＴＰＴＬ１９、及びＴＰＴＬ２０のＴａｇｇは、残りのＴＡＢＰよりもそれぞれ低く、これら３つのＴＡＢＰが他のものよりも不安定であることを示唆している。
【０３６２】
凍結融解プロセス（５回の凍結融解サイクル）
ＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＬＡＧ−３  ＴＡＢＰ（ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ２０）を、５回反復の凍結融解サイクルで試験した。特殊緩衝液（ｐＨ６．０、４％スクロース、５０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭアルギニン）で、各試料を５０ｍｇ／ｍｌに濃縮した後、試料を２部で調製し、一方を対照として−８０℃で凍結し、他方を５回の凍結融解サイクルで試験し；凍結融解サイクルのラウンドごとに、凍結を−８０℃で少なくとも３時間実施した後、室温で少なくとも２時間融解し、−８０℃に再凍結した；
【０３６３】
５回の凍結融解サイクル後、試料をＳＥＣ−ＨＰＬＣで評価した。凍結融解サイクルを施した試料の主ピーク高さを、対照１に対して算出し、得られた比は回収率であった。９０％を上回る回収率は、凍結融解サイクル基準を通過したと考えた。図１７に示すように、ＴＰＴＬ１８、ＴＰＴＬ１９、及びＴＰＴＬ２０の回収率は、９０％未満であった。ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ１７の回収率は、９０％より大きかった。
【０３６４】
ヒト血清安定性
ＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ１７  ＴＡＢＰを選択して、ヒト血清安定性評価を行った。試験される抗体を、５０％ヒト血清中で０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。その後、溶液を等分して、０日目、１日目、７日目及び１４日目にそれぞれ３７℃でインキュベートし、インキュベーションが完了すると、各アリコートを−２０℃で保管した。
【０３６５】
全試料が１００％活性対照として０日目試料で準備できた際に、各試料の結合活性（ＥＣ５０値）をＥｌｉｓａによって測定した。この実験では、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＬＡＧ−３及びヒトＰＤ−１に対するＴＡＢＰ１１〜ＴＡＢＰ１７  ＴＡＢＰの結合活性を決定した。ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＬＡＧ−３、及びヒトＰＤ−１の抗原タンパク質を、９６ウェルプレート上に２μｇ／ｍｌで一晩被覆した。遮断後、連続濃度のＴＰＴＬ１１〜ＴＰＴＬ１７  ＴＡＢＰを、被覆ウェルに加えた。濃度は、３倍希釈で５μｇ／ｍｌから開始した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で解析し、ＥＣ５０値を算出した。０日目の全試料のＥＣ５０値を１００％として設定した。１日目、７日目、及び１４日目のＥＣ５０値の変化は、（１／７／１４日目のＥＣ５０−０日目のＥＣ５０）／０日目のＥＣ５０によって決定した。図１８Ａは、ＴＡＢＰ１１〜ＴＡＢＰ１７  ＴＡＢＰのヒトＴＩＧＩＴへの結合活性を示す。図１８Ｂは、ＴＡＢＰ１１〜ＴＡＢＰ１７  ＴＡＢＰのヒトＬＡＧ−３への結合活性を示す。図１８Ｃは、ＴＡＢＰ１１〜ＴＡＢＰ１７  ＴＡＢＰのヒトＰＤ−１への結合活性を示す。図に示すように、ＴＰＴＬ−１２、ＴＰＴＬ−１５、及びＴＰＴＬ−１６は、陽性対照抗体ＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＨＣＡｂに匹敵する、ヒトＴＩＧＩＴへの結合を有する。ＴＰＴＬ−１４、ＴＰＴＬ−１５、及びＴＰＴＬ−１７は、陽性対照抗体  ＶＨＨ２  ＨＣＡｂに匹敵する、ヒトＬＡＧ−３への結合を有する。ＴＰＴＬ−１３、ＴＰＴＬ−１４、ＴＰＴＬ−１５、ＴＰＴＬ−１６、及びＴＰＴＬ−１７は、陽性対照抗体キイトルーダバイオシミラーに匹敵する、ヒトＰＤ−１への結合を有する。
【０３６６】
本開示全体の全ての引用文献は、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。
【０３６７】
配列表
配列番号１  ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ
配列番号２  ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号３  ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ
配列番号４  （ＧＳ）ｎ
配列番号５  （ＧＳＧＧＳ）ｎ
配列番号６  （ＧＧＧＳ）ｎ
配列番号７  ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
配列番号８  キイトルーダ重鎖
ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号９  キイトルーダ軽鎖
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１０  キイトルーダＶＨドメイン
ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１１  キイトルーダＶＬドメイン
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号１２  ヒトＰＤ−１
ＰＧＷＦＬＤＳＰＤＲＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＰＡＧＱＦＱＴＬＶＶＧＶＶＧＧＬＬＧＳＬＶＬＬＶＷＶＬＡＶＩＣＳＲＡＡＲＧＴＩＧＡＲＲＴＧＱＰＬＫＥＤＰＳＡＶＰＶＦＳＶＤＹＧＥＬＤＦＱＷＲＥＫＴＰＥＰＰＶＰＣＶＰＥＱＴＥＹＡＴＩＶＦＰＳＧＭＧＴＳＳＰＡＲＲＧＳＡＤＧＰＲＳＡＱＰＬＲＰＥＤＧＨＣＳＷＰＬ
配列番号１３  ヒトＴＩＧＩＴ
ＭＭＴＧＴＩＥＴＴＧＮＩＳＡＥＫＧＧＳＩＩＬＱＣＨＬＳＳＴＴＡＱＶＴＱＶＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨＩＳＰＳＦＫＤＲＶＡＰＧＰＧＬＧＬＴＬＱＳＬＴＶＮＤＴＧＥＹＦＣＩＹＨＴＹＰＤＧＴＹＴＧＲＩＦＬＥＶＬＥＳＳＶＡＥＨＧＡＲＦＱＩＰＬＬＧＡＭＡＡＴＬＶＶＩＣＴＡＶＩＶＶＶＡＬＴＲＫＫＫＡＬＲＩＨＳＶＥＧＤＬＲＲＫＳＡＧＱＥＥＷＳＰＳＡＰＳＰＰＧＳＣＶＱＡＥＡＡＰＡＧＬＣＧＥＱＲＧＥＤＣＡＥＬＨＤＹＦＮＶＬＳＹＲＳＬＧＮＣＳＦＦＴＥＴＧ
配列番号１４  ヒトＬＡＧ−３
ＶＰＶＶＷＡＱＥＧＡＰＡＱＬＰＣＳＰＴＩＰＬＱＤＬＳＬＬＲＲＡＧＶＴＷＱＨＱＰＤＳＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳＷＧＰＲＰＲＲＹＴＶＬＳＶＧＰＧＧＬＲＳＧＲＬＰＬＱＰＲＶＱＬＤＥＲＧＲＱＲＧＤＦＳＬＷＬＲＰＡＲＲＡＤＡＧＥＹＲＡＡＶＨＬＲＤＲＡＬＳＣＲＬＲＬＲＬＧＱＡＳＭＴＡＳＰＰＧＳＬＲＡＳＤＷＶＩＬＮＣＳＦＳＲＰＤＲＰＡＳＶＨＷＦＲＮＲＧＱＧＲＶＰＶＲＥＳＰＨＨＨＬＡＥＳＦＬＦＬＰＱＶＳＰＭＤＳＧＰＷＧＣＩＬＴＹＲＤＧＦＮＶＳＩＭＹＮＬＴＶＬＧＬＥＰＰＴＰＬＴＶＹＡＧＡＧＳＲＶＧＬＰＣＲＬＰＡＧＶＧＴＲＳＦＬＴＡＫＷＴＰＰＧＧＧＰＤＬＬＶＴＧＤＮＧＤＦＴＬＲＬＥＤＶＳＱＡＱＡＧＴＹＴＣＨＩＨＬＱＥＱＱＬＮＡＴＶＴＬＡＩＩＴＶＴＰＫＳＦＧＳＰＧＳＬＧＫＬＬＣＥＶＴＰＶＳＧＱＥＲＦＶＷＳＳＬＤＴＰＳＱＲＳＦＳＧＰＷＬＥＡＱＥＡＱＬＬＳＱＰＷＱＣＱＬＹＱＧＥＲＬＬＧＡＡＶＹＦＴＥＬＳＳＰＧＡＱＲＳＧＲＡＰＧＡＬＰＡＧＨＬＬＬＦＬＩＬＧＶＬＳＬＬＬＬＶＴＧＡＦＧＦＨＬＷＲＲＱＷＲＰＲＲＦＳＡＬＥＱＧＩＨＰＰＱＡＱＳＫＩＥＥＬＥＱＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＱＬ
【表３−１】
2021509896.tif 000006
【表３−２】
2021509896.tif 000007
【表３−３】
2021509896.tif 000008
配列番号２９  ＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＨＣＡｂ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＫＹＧＶＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＧＶＳＡＩＣＳＧＧＲＴＴＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＮＱＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＰＬＷＴＧＤＣＤＬＳＳＳＷＹＫＴＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号３０  ＶＨＨ２  ＨＣＡｂ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＶＳＳＹＣＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＧＶＳＡＩＤＳＤＧＳＶＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＫＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＡＤＬＣＷＶＤＱＤＱＧＥＹＮＴＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号３１  ＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ｓｄＡｂ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＫＹＧＶＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＧＶＳＡＩＣＳＧＧＲＴＴＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＮＱＩＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＲＰＬＷＴＧＤＣＤＬＳＳＳＷＹＫＴＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３２  ＶＨＨ２  ｓｄＡｂ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＶＳＳＹＣＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＧＶＳＡＩＤＳＤＧＳＶＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＫＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＡＤＬＣＷＶＤＱＤＱＧＥＹＮＴＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【図１】
2021509896.tif 000009
【図２】
2021509896.tif 000010
【図３】
2021509896.tif 000011
【図４】
2021509896.tif 000012
【図５】
2021509896.tif 000013
【図６】
2021509896.tif 000014
【図７】
2021509896.tif 000015
【図８】
2021509896.tif 000016
【図９】
2021509896.tif 000017
【図１０】
2021509896.tif 000018
【図１１】
2021509896.tif 000019
【図１２−１】
2021509896.tif 000020
【図１２−２】
2021509896.tif 000021
【図１２−３】
2021509896.tif 000022
【図１２−４】
2021509896.tif 000023
【図１３−１】
2021509896.tif 000024
【図１３−２】
2021509896.tif 000025
【図１３−３】
2021509896.tif 000026
【図１３−４】
2021509896.tif 000027
【図１３−５】
2021509896.tif 000028
【図１４−１】
2021509896.tif 000029
【図１４−２】
2021509896.tif 000030
【図１４−３】
2021509896.tif 000031
【図１４−４】
2021509896.tif 000032
【図１５】
2021509896.tif 000033
【図１６】
2021509896.tif 000034
【図１７】
2021509896.tif 000035
【図１８】
2021509896.tif 000036
【配列表】
2021509896000001.app
【国際調査報告】
2021509896.tif 000037
2021509896.tif 000038
2021509896.tif 000039
2021509896.tif 000040
2021509896.tif 000041
2021509896.tif 000042
2021509896.tif 000043