(57)【要約】  本発明は、不活性および親水性のクロマトグラフィー樹脂が充填されたカラムを提供することと、溶媒または溶媒混合物をカラムに通すこととを備える、乾式充填クロマトグラフィーカラムのコンディショニング方法に関する。溶媒は、クロマトグラフィー樹脂よりも親水性が低いように選択され、溶媒流の速度は、システム圧力が予め規定された閾値を超えない速度に制御される。本発明は、熱の発生が例えば高流量でのプラスチックフリットもしくはフィルタおよび／または乾燥樹脂の湿潤などに問題を引き起こし得るＦＬＡＳＨクロマトグラフィーにおいて有利に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾式充填クロマトグラフィーカラムをコンディショニングする方法であって、
ａ）少なくとも１つの不活性および親水性のクロマトグラフィー樹脂を充填したカラムを提供することと、
ｂ）１つ以上の溶媒を前記カラムに通すこととを備え、
前記溶媒は前記クロマトグラフィー樹脂よりも親水性が低く、前記カラムを通過する溶媒の流量は、カラム圧力が予め規定された閾値を超えない速度で制御される、乾式充填クロマトグラフィーカラムをコンディショニングする方法。
【請求項２】
前記溶媒は前記クロマトグラフィー樹脂の平衡を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）は、２カラム容量の溶媒の通過を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記樹脂は多孔質シリカを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記充填カラムは、少なくとも１つのフィルタまたはフリットを含み、少なくとも１つのそのようなフィルタまたはフリットは、前記カラム内の前記樹脂の下流に配置される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのフィルタまたはフリットは、ポリエチレンなどの感熱性材料から製造される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
溶媒が前記溶媒よりも親水性が高いクロマトグラフィー樹脂を通過する際の流量を制御することにより発熱を制御する方法であって、溶媒を、カラム圧力が予め規定された閾値を超えない流量で、カラムに通すことを備える、方法。
【請求項８】
前記制御はコンピュータによって行われる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
乾燥充填クロマトグラフィーカラムをコンディショニングするためのシステムであって、少なくとも１つの不活性および親水性のクロマトグラフィー樹脂が充填されたカラムと、少なくとも１つの溶媒容器と、前記システム内の圧力を測定するための手段と、前記溶媒を、能動的に制御された流量で、前記カラムに通す手段と、前記カラムを通過する前記溶媒の前記流量を、前記カラム内において予め規定された圧力閾値を超えることなく許容される最大値に調整するように設定されるソフトウェアとを備える、システム。
【請求項１０】
１つ以上のポンプおよびセンサを含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
ＦＬＡＳＨクロマトグラフィーカラムの平衡化のためのシステムである、請求項９または１０に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクロマトグラフィーの分野に関し、特にクロマトグラフィーカラムのコンディショニング方法に関する。本発明は、ＦＬＡＳＨクロマトグラフィーにおいて有利に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
背景
液体クロマトグラフィーは、液体から１つ以上の標的化合物を分離するための十分に確立された技術である。液体は移動相を構成し、移動相は、液体中に存在する分子または化合物が異なる態様で相互作用する固定相を通過して送られる。したがって、強い相互作用は、一部の分子または化合物を減速させ、より弱い相互作用は、より迅速な通過を可能にし、異なる時点で溶出する化合物または分子の示差的分画をもたらす。
【０００３】
順相クロマトグラフィーでは、親水性化合物に対してより強い親和性を有する親水性固定相を、より親水性の低い、すなわち、より極性の低い移動相と共に使用する。そのような移動相が、固定相を含むカラムを、例えば、圧送または正圧の印加によって通過させられる場合、この技術は、ＦＬＡＳＨクロマトグラフィー−異なる極性および官能基を有する化合物を分離するのに頻繁に使用される迅速かつ比較的簡単な方法−として公知である。
【０００４】
ＦＬＡＳＨクロマトグラフィーにおいて一般に使用される固定相は、非改質シリカであり、これは有利なことに多孔質であり、乾燥材料としてカラムに充填される。その極性を増加させるために、シリカは時にはシラノール基などの親水性基で官能基化される。
【０００５】
ＦＬＡＳＨクロマトグラフィーによって実施される大抵の分離の前には、移動相の通過によって固定相をコンディショニングする工程が行われる。目的に応じて、コンディショニングに使用される移動相は、分離中に標的化合物を溶出するために使用される溶媒、または異なる液体のいずれかであってもよい。コンディショニングは、望ましくない不純物を除去するため、実施と実施との間において固定相を再生するため、または単に乾燥固定相を湿潤させるために、行われてもよい。必要に応じて、適切なｐＨを確立するために緩衝液を塗布することによってコンディショニングを行ってもよい。
【０００６】
順相ＦＬＡＳＨクロマトグラフィーでは、固定相は一般に乾式で供給され、そのコンディショニングはそれを湿潤させることを含む。乾燥シリカのコンディショニングにおいては、極性溶媒は極性基と相互作用し、細孔内で空気と置き換わる。溶媒がシリカ表面に吸着すると、発熱反応により熱が発生する。摩擦もプロセス中に蓄積し得、追加の熱を発生させ得る。
【０００７】
発熱の問題を克服するために、シリカＦＬＡＳＨカートリッジは、通常、試料注入の前にイソクラティックにコンディショニングされ、溶媒の流量は、他の態様では固定相および設備の他の部分に悪影響を及ぼし得る過度の熱を避けるために慎重に制御される。これは、時として、カラムの効率的な湿潤が達成される前に数カラム容量の溶媒を必要とする、比較的時間のかかるコンディショニングプロセスをもたらす結果となる。
【０００８】
Grivel et al. (In J Chromatogr A 2010 Jan 22; 1217(4):459-72: "Selection of suitable operating conditions to minimize the gradient equilibration time in the separation of drugs by Ultra-High-Pressure Liquid Chromatography with volatile (mass spectrometry-compatible buffers)は、逆相クロマトグラフィーに関する。より具体的には、この論文は、問題がフラッシュクロマトグラフィーにおける長い平衡化時間に関連することを認識しており、平衡化のために使用される移動相に対する温度変化、異なる流量、および様々な添加剤の研究を提示している。保持変動性および特定の平衡化添加物に関する特定の結論を引き出す一方で、平衡化を支配するメカニズムは依然として非常に複雑なままであり、さらなる作業を必要とすることも、著者らによって結論付けられている。
【０００９】
ＷＯ２０１５／１４０３２６（Biotage AB）は、クロマトグラフィーカラムの平衡化に関し、具体的には、増加した流量での順相ＦＬＡＳＨクロマトグラフィーにおいて生じ得る熱に関連する問題に関する。より具体的には、ＷＯ２０１５／１４０３２６によれば、平衡化ステップにおける勾配としての溶媒の組み合わせの使用により、カラム充填の平衡化の間に発生する熱はより良好に制御され得、全体の試料処理は高速化され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上で提案した解決策にもかかわらず、極性溶媒による親水性固定相のコンディショニングは、依然として、精製または単離プロセスの、時間のかかるステップのままである。したがって、親水性の固定相が親水性の低い溶媒の流れで処理されるときに伴う発熱反応によって引き起こされる問題に対処する代替技術が当該分野において依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
第１の態様では、本発明は、乾式充填クロマトグラフィーカラムをコンディショニングする方法に関し、この方法は、
ａ）少なくとも１つの不活性および親水性のクロマトグラフィー樹脂が充填されたカラムを提供することと、
ｂ）１つ以上の溶媒をカラムに通すこととを備え、
溶媒はクロマトグラフィー樹脂よりも親水性が低く、カラムを通過する溶媒の流量は、カラム圧力が予め規定された閾値を超えない速度で制御される。
【００１２】
本発明の他の態様、詳細および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
定義
「極性」溶媒という用語は、本明細書において、酸素および水素などの非常に異なる電気陰性度を有する原子間に形成された極性結合に起因して実質的な双極子モーメントを有する溶媒について使用される。
【００１３】
「非極性」溶媒という用語は、本明細書において、炭素および水素など、原子が、より類似した双極子モーメントを有する溶媒のために使用される。
【００１４】
用語「親水性」は、本明細書において、固定相がどのように「水を好む」かの尺度として使用される。
【００１５】
用語「疎水性」は、本明細書では、固定相または移動相がどのように「水を避ける」かの尺度として使用される。
【００１６】
用語「平衡化」は、本明細書において、２つの異なる特性を平衡化することを含めて、広範な意味で使用される。例えば、完全に湿潤した乾燥材料は平衡していると考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、例えばＦＬＡＳＨクロマトグラフィーにおいて溶媒を高い流量で樹脂に通す場合に生じることが知られている発熱は、溶媒流量を、圧力閾値を超えないようにしながら可能な限り高く維持することによって制御され得る、という知見に基づく。換言すれば、予め充填されたクロマトグラフィー充填の日常的な試験を実施して、どの圧力で、発熱が望ましくなくなるか、または使用される設備（具体的にはフリット）にとって許容できなくなるかを試験してもよい。圧力閾値が既知であり、規定されると、同じ樹脂を含む同じ寸法のクロマトグラフィーカラムは、カラムの通過の際に流量の能動的な調節によってコンディショニングされてもよく、圧力を予め定められた値で維持するために、流量を時には増加させ、時には減少させて、圧力閾値を超えることなく可能な限り迅速にコンディショニングを駆動する。したがって、本発明は、カラムコンディショニングにおいて、フリット材料への損傷などの熱損傷を回避するために、圧力制御された流量調節を用いる。
【００１８】
より具体的には、本発明は、乾燥充填クロマトグラフィーカラムをコンディショニングする方法に関し、この方法は、
ａ）少なくとも１つの不活性および親水性のクロマトグラフィー樹脂が充填されたカラムを提供することと、
ｂ）１つ以上の溶媒をカラムに通すこととを備え、
溶媒はクロマトグラフィー樹脂よりも親水性が低く、カラムを通過する溶媒の流量は、カラム圧力が予め規定された閾値を超えない速度で制御される。当業者が理解するように、２つの異なる溶媒が、一般に、例えばクロマトグラフィーカラムの平衡化において、混合物として使用される。本文脈において、そのような混合物は、カラムを通過する１つの流れを構成するので、「溶媒」という用語によって包含される。
【００１９】
したがって、本発明者らは、溶媒の量を節約し、時間を節約するために、流れが設備に過度の加熱を引き起こさない速度で維持される従来のコンディショニングの代わりに、そのようなコンディショニングは、カラムを通過する溶媒の流量を、カラム圧力が予め規定された閾値を超えない速度で維持することによって成功裏に実行され得ることを見いだした。有利なことに、圧力閾値は、発熱がカラムまたは設備、例えばフリットまたはフィルタに損傷をもたらすのに実質的に十分である圧力未満のレベルに設定される。当業者が理解するように、効率的なプロセスを得るために、流れを可能な限り高い速度に維持することが望ましい。
【００２０】
圧力閾値は、各特定のカラムおよび条件について当業者によって決定されてもよく、有利には、特定の圧力について、放出された熱を測定する試験実施によって決定されてもよい。サイズ１ｇ〜１５００ｇのフラッシュクロマトグラフィーカラムの例示的な圧力閾値は、１バール〜２０バールの範囲にある。
【００２１】
本プロセスの目的は、湿潤カラム、平衡カラム、またはその他のコンディショニングされたカラムを達成することであり得る。本文脈において、コンディショニングされるという用語は、その最も広い意味において、１つもしくは複数の特性を変更または修正するために液体で処理されるものとして解釈され得ることが理解される。ＦＬＡＳＨカラムが溶媒によって完全に湿潤しているかどうかを判断するために、親水性樹脂を含むカラムを通る溶媒の通過を視覚的に追跡してもよく、なぜならば、溶媒の前部は従来の透明または実質的に透明なＦＬＡＳＨカラムを通して明瞭に現れるからである。
【００２２】
上記から明らかなように、本発明に従って使用されるクロマトグラフィー樹脂は、疎水性ではなく親水性である。別の言い方をすれば、その材料は、順相ＦＬＡＳＨクロマトグラフィーにおいて従来使用され、上記の背景技術の項で論じた理由から、コンディショニングおよび／または溶出に好適な溶媒と共に発熱の危険性の増大にさらされる、任意の好適な材料であり得る。樹脂は、従来の粒子形態における、非改質シリカのような、多孔質シリカであってもよい。代替的に、樹脂は、別の親水性樹脂である、アルミナを含む。好適なシリカ樹脂は、意図される用途のために適切なレベルの親水性を提供するためにシラノール基または他の極性配位子で官能基化されていてもよい。
【００２３】
当業者は、特に特定の粒径および流量で上述の種類の親水性樹脂と共に使用される場合に過度の発熱の危険性を伴う可能性がある溶媒の種類を認識するであろう。例示的なそのような溶媒は、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、アセトン、メチルエチルケトン、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ギ酸、酢酸、トリエチルアミン、およびＮ−エチルジイソプロピルアミンである。
【００２４】
充填カラムは、ＦＬＡＳＨクロマトグラフィーに好適な任意の従来の形式であり得る。したがって、カラムは、樹脂の上流で試料を添加するための特定のコンパートメント、樹脂の下流および／もしくは上流に配置された１つ以上のフリットもしくはフィルタ、ならびに／または任意の他の一般に使用される構成要素を含むことができる。本発明によって得られる制御された発熱のため、クロマトグラフィーカラムは、感熱性材料から形成された１つ以上の部分を含み得る。したがって、カラム内の樹脂の下流に少なくとも１つのフリットまたはフィルタが配置され得る。本発明の使用から恩恵を得る感熱性材料の例は、例えばポリエチレンのような感熱性プラスチックである。本発明は、有利なことに、そのようなフィルタと共に使用されてもよく、それにより、軟化または溶融のリスクは、有利な高流量において、実質的に低減される。
【００２５】
本発明の第２の態様は、充填クロマトグラフィーカラムのコンディショニングの間に流量を制御する方法であり、親水性樹脂を充填されたカラムが、予め規定された圧力を超えることなく、より親水性の低い溶媒でコンディショニングされる。このようなコンディショニングを制御する方法は、最適な、すなわちできるだけ高い流量を可能にし、乾式クロマトグラフィー樹脂の従来のコンディショニングよりも少ない量の溶媒を利用することが、本発明者らによって示された。例示的な実施形態において、親水性樹脂を、より親水性の低い溶媒で完全に湿潤させるのに、２つのカラム容量（ＣＶ）で十分である。本発明の第１の態様に関連する上述のすべての詳細は、この第２の態様に等しく適用可能である。
【００２６】
上記のようなＦＬＡＳＨクロマトグラフィーカラムのコンディショニング時の発熱制御方法は、コンピュータによって行うことができる。したがって、本発明は、上述のクロマトグラフィープロセスの制御、およびそのような方法を実行するためのソフトウェアも包含する。
【００２７】
本発明の第３の態様は、乾式充填クロマトグラフィーカラムをコンディショニングするためのシステムであり、このシステムは、少なくとも１つの不活性および親水性のクロマトグラフィー樹脂が充填されたカラムと、少なくとも１つの溶媒容器と、システム内の圧力を測定するための手段と、溶媒を、能動的に制御された流量で、カラムに通すための手段と、カラムを通過する溶媒の流量をカラム内の予め規定された圧力閾値を超えることなく許容される最大値に調整するように設定されるソフトウェアとを備える。
この文脈において、「能動的に制御される」という用語は、システム圧力が予め定められた値を超えない値に流量が変えられることを意味すると理解される。システムは、有利なことに、チュービングなどのその動作を可能にする、適切なポンプ、センサ、および任意の追加の標準的な設備を含む。
【００２８】
本発明のシステムは、約５０〜５００ｇの樹脂、例えばシリカ、例えば約５０ｇ超、約１００ｇ超、または約３００ｇ超の樹脂、例えば約３５０ｇまたは５００ｇの樹脂を保持するように設計されたクロマトグラフィーカラムを含むことができる。システムのカラムは、ポリエチレンもしくはポリプロピレンなどのプラスチック、またはクロマトグラフィーカラムにおいて一般に使用される任意の他のプラスチック材料であってもよい。同様に、少なくとも底部フリット、または底部フリットおよび樹脂の上流に位置する頂部フリットの両方は、カラムと同じ材料からなってもよい。本発明は、熱感度が従来のコンディショニングに適さないフリット材料と共に、ならびに／または熱感受性のため、本発明の圧力制御された流量調節を用いない限り、長期間、および／もしくは大量の溶媒を使用して、コンディショニングされる必要があるフリット材料と共に使用される、という有利な点がある。
【００２９】
本方法に関連して本明細書で説明されるすべての詳細は、本システムに等しく適用可能であり、逆に、本システムは、本方法に関連して本明細書で説明されるすべての詳細に等しく適用可能である。
【００３０】
したがって、本発明は、本発明による方法において本発明によるシステムを使用することも含む。
【００３１】
実験の部
本実施例は、本明細書において例示目的のためだけに提供され、特許請求の範囲によって規定される本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本願において以下または他の部分に示されるすべての参考文献は、ここに引用により援用される。
【００３２】
実施例１−（本発明による）圧力制御下での流量の変動による平衡化
５０ｇの２０μｍ球状シリカ（カラム容量８０ｍＬ）を含むカートリッジを、合計１６０ｍＬの、７０：３０の比率のｎ−ヘプタン：酢酸エチルのイソクラティック混合物を使用して、１０バールの最大許容圧力で平衡化した。この混合物において、酢酸エチルは熱を発生することが知られている溶媒である。流量は、最大システム圧力を超えないように制御され、１５０ｍＬ／分の最大値に到達させた。
【００３３】
平衡化プロセス全体は、１分３６秒の間行った。本発明による平衡化プロセスの間、圧力は１０バールに維持され、流量は数秒間最低でも２０ｍＬ／分に自動的に下方調節され、そのとき、「熱ゾーン」は約８０ｍＬ（１カラム容量）後にカートリッジの底部フリットに到達した。
【００３４】
カートリッジの表面温度を継続的に監視したところ、最大で３４℃であることがわかった。追加の８０ｍＬのイソクラティック混合物（合計１６０ｍＬ、２カラム容量）を１０バールまたは１５０ｍＬ／分で圧送した後、カートリッジの表面温度を継続的に監視したところ、２６℃であることがわかり、圧力は１５０ｍＬ／分で６．３バールまで低下した。カートリッジを目視で慎重に検査したところ、完全に平衡していることがわかった。
【００３５】
実施例２−固定流量での平衡化（比較例）
上記カートリッジについて、実施例１と同じ溶媒を用い、本発明の圧力制御を行わずに、一定流量で平衡化法を行った。
第１の方法では、２４０ｍＬ（３カラム容量）の溶媒混合物を５０ｍＬ／分で用い、溶媒によって、カラムの底に到達することから視覚的に判定した通りでは、平衡化を完了するために７分１２秒を要した。
第２の方法では、４００ｍＬ（５カラム容量）の溶媒混合物を１００ｍＬ／分用い、溶媒によって、カラムの底に到達することから視覚的に判定した通りでは、平衡化を完了するのに６分かかる。
したがって、上記で比較した２つの従来の方法からわかるように、平衡化プロセスの所要時間は、より大きな流量およびより大きな溶媒量を使用することによって低減され得る。しかしながら、このような従来の方法は、より大きな溶媒量など、コストがかかり、環境に対する影響など、欠点を依然として伴う。
【００３６】
実施例３−（本発明に従う）１００ｇクロマトグラフィーカラムの平衡化
１００ｇの２０μｍ球状シリカ（カラム容量１５０ｍＬ）を含むカートリッジを、合計３００ｍＬの、比率７０：３０のｎ−ヘプタン：酢酸エチルのイソクラティック混合物を使用して、１０バールの最大許容圧力で平衡化した。流量を制御し、最大１００ｍＬ／分に到達させた。
全平衡化プロセスは３分で行った。本発明による新規な平衡化プロセスの間、圧力は１０バールに維持され、流量は数秒間最低１７ｍＬ／分に自動的に下方調節され、そのとき、「熱ゾーン」は約１５０ｍＬ（１カラム容量）後にカートリッジの底部フリットに到達した。
【００３７】
カートリッジの内部温度を継続的に監視したところ、最大で１１６℃であることがわかった。追加の１５０ｍＬのイソクラティック混合物（合計３００ｍＬ、２カラム容量）を１０バールまたは１００ｍＬ／分で圧送した後、カートリッジの内部温度を継続的に監視したところ、２８℃であることがわかり、圧力は１５０ｍＬ／分で３．１バールまで低下した。カートリッジを目視で慎重に検査したところ、完全に平衡していることがわかった。次いで、カートリッジは、３００ｍＬ／分の流量および１０．３バールの圧力で実施することができた。
【００３８】
本発明の圧力調節なしで同じカートリッジを実施した場合、カートリッジの内部温度を監視したところ、１２３℃であることがわかり、圧力は約１カラム容量（１５０ｍＬ）後に＞２０バールに達した。カートリッジは遮断され、排出された。
【００３９】
実施例４−（本発明に従う）３５０ｇクロマトグラフィーカラムの平衡化
３５０ｇの２０μｍ球状シリカ（カラム容量５３０ｍＬ）を含むカートリッジを、合計１０６０ｍＬの、比率５０：５０のジクロロメタン：メタノールのイソクラティック混合物を使用して、１０バールの最大許容圧力で平衡化した。この混合物において、メタノールは、熱を発生することが知られている溶媒である。流量を制御し、最大２００ｍＬ／分に到達させた。
【００４０】
全平衡化プロセスは１０分間行った。本発明の平衡化プロセスの間、圧力は１０バールに維持され、流量は数秒間最低でも４９ｍＬ／分に自動的に下方調節され、そのとき、「熱ゾーン」は約５３０ｍＬ（１カラム容量）後にカートリッジの底部フリットに到達した。
【００４１】
カートリッジの表面温度を継続的に監視したところ、最大５３℃であることがわかった。追加の５３０ｍＬのイソクラティック混合物（合計１０６０ｍＬ、２カラム容量）を１０バールまたは２００ｍＬ／分で圧送した後、カートリッジの内部温度を継続的に監視したところ、２８℃であることがわかり、圧力は２００ｍＬ／分で６．０バールまで低下した。カートリッジを目視で慎重に検査したところ、完全に平衡していることがわかった。
次いで、カートリッジは、３００ｍＬ／分の流量および８．７バールの圧力で実施することができた。
【００４２】
同じカートリッジを圧力調整なしで２００ｍＬ／分の固定流量で実施した場合、カートリッジの内部温度を監視すると、５９℃であることがわかり、圧力は約１ＣＶ（５３０ｍＬ）後に＞２０バールに達した。
【００４３】
カートリッジを遮断し、排出した。
したがって、従来使用されているコンディショニングは、本発明による方法よりも多くの溶媒を使用し、より長い時間を要することが示された。
【国際調査報告】
2021524913.tif 000002
2021524913.tif 000003
2021524913.tif 000004