(57)【要約】  非等温核酸増幅反応を実施する方法が開示され、本方法は、以下のステップ：（ａ）プライマーが標的にハイブリダイズするハイブリダイゼーション事象を可能にする条件下で、標的配列を１つ以上の相補的一本鎖プライマーと混合するステップであって、ハイブリダイゼーション事象が、直接的又は間接的に、二重鎖の反対側の末端又はその近くに配置された２つのニッキング部位を含む二重鎖構造の形成を導くステップ；及び以下のステップ：（ｂ）二重鎖の鎖中の前記ニッキング部位の各々にニックを発生させるニッキング酵素を使用するステップ；（ｃ）新たな合成核酸を形成するように、ポリメラーゼを使用してニックの入った鎖を伸長し、ポリメラーゼとの伸長がニッキング部位を再形成するステップ；（ｄ）新たな合成核酸の複数のコピーを産生するように、所望によりステップ（ｂ）及び（ｃ）を反復するステップ；による増幅プロセスを実施するステップを含み、方法が実施される温度が非等温であることを特徴とし、ステップ（ｂ）〜（ｄ）の前記増幅プロセスの間に高温と低温の間で複数回の往復に供され、ここで、高温では、前記ポリメラーゼ又はニッキング酵素の一方は、前記酵素の他方よりも活性が高く、酵素の活性に差異が存在し、低温では、酵素の活性の差異が低下又は逆転する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非等温核酸増幅反応を実施する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
（ａ）前記プライマーが前記標的にハイブリダイズするハイブリダイゼーション事象を可能にする条件下で、標的配列を１つ以上の相補的一本鎖プライマーと混合するステップであって、ハイブリダイゼーション事象が、直接的又は間接的に、二重鎖の反対側の末端又はその近くに配置された２つのニッキング部位を含む二重鎖構造の形成を導くステップ；及び以下のステップ：
（ｂ）前記二重鎖の鎖中の前記ニッキング部位の各々にニックを発生させるニッキング酵素を使用するステップ；
（ｃ）新たな合成核酸を形成するように、ポリメラーゼを使用して前記ニックの入った鎖を伸長し、前記ポリメラーゼとの伸長がニッキング部位を再形成するステップ；
（ｄ）新たな合成核酸の複数のコピーを産生するように、所望によりステップ（ｂ）及び（ｃ）を反復するステップ；
による増幅プロセスを実施するステップ
を含み、前記方法が実施される温度が非等温であり、ステップ（ｂ）〜（ｄ）の前記増幅プロセスの間に高温と低温の間で複数回の往復に供されることを特徴とし、ここで、高温では、前記ポリメラーゼ又はニッキング酵素の一方は、前記酵素の他方よりも活性が高く、酵素の活性に差異が存在し、低温では、酵素の活性の差異が低下又は逆転する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ステップ（ａ）において、前記標的が核酸の２つの相補鎖を含み、前記プライマーが、フォワード及びリバースプライマーを含み、それらは、前記フォワード及びリバースプライマーの３’末端が互いに向かって配向されるように、対応する前記標的の鎖にそれぞれ相補的である、方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）〜（ｄ）が実質的にステップ（ａ）の直後に実施され、ステップ（ａ）〜（ｄ）は好ましくは同一の反応容器中又は同一の固体支持体上で実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
新たな合成核酸を直接的又は間接的に検出するステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記検出ステップが、分子ビーコン又は蛍光色素、側方流動標識プローブ、又は電気化学反応を触媒する酵素の使用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記新たな合成核酸の量が、前記増幅反応の実施中に定量化又は測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記新たな合成核酸の量が、定量的方法で標的配列の量及び／又は濃度を決定するために使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記高温が、前記ポリメラーゼの前記活性に比較的有利である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記高温が、前記ニッキング酵素の前記活性に比較的有利である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼの前記最適温度が、前記ニッキング酵素の前記最適温度と１０〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃の範囲で異なっている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記高温が、５０〜６４℃、好ましくは５５〜６３℃の範囲内である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記低温が、２０．０〜５８．５℃の範囲、好ましくは３５．０〜５７．９℃の範囲、より好ましくは３６．０〜５７．９℃の範囲、最も好ましくは３７．０〜５７．９℃の範囲内である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記温度往復が、複数の往復に対して連続的に、好ましくは少なくとも２分間にわたって、より好ましくは少なくとも３分間にわたって実施される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の往復のそれぞれが実質的に同一である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の温度往復のそれぞれが、５〜６０秒、好ましくは５〜４５秒、より好ましくは５〜３０秒、最も好ましくは５〜２０秒の範囲の持続時間を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の温度往復のそれぞれが、１〜１０秒、好ましくは１〜５秒の範囲の前記高温での滞留時間を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の温度往復のそれぞれが、２〜４０秒、好ましくは２〜３０秒の範囲の前記低温での滞留時間を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数の温度往復のそれぞれが、０．５〜１０秒の範囲、好ましくは１〜５秒の範囲の前記低温と前記高温の間の移行時間を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）の前に逆転写ステップを実施し、目的のＲＮＡ分析物のＤＮＡ転写物を形成するように、前記目的のＲＮＡ分析物を逆転写酵素と接触させることを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ転写物から二本鎖ＤＮＡを作製するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前増幅又は濃縮ステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記プライマーの１つ以上が修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記修飾ヌクレオチドが、前記プライマーの標的相補的部分に存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上のプライマーが２’−修飾ヌクレオチドを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ以上のプライマーが２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上のプライマーが複数の２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上のプライマーが７個までの２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プライマーのうちの１つ以上が自己相補的部分を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記自己相補的部分がヘアピン構造を形成する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヘアピンが５〜１０塩基対を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
試料中の標的ポリヌクレオチドの量及び／又は濃度を決定する方法であって、前記方法が、請求項１〜３０のいずれか一項に従う前記増幅反応を実施して、前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドを増幅するステップ；及び前記試料中の前記標的ポリヌクレオチドの量及び／又は濃度の決定を可能にするために、前記増幅反応の直接的又は間接的な産物を定量的方法で検出するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に定量的な方法で、核酸分子を増幅する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は周知であり、核酸分子を増幅するために使用される標準的な技術である。ＰＣＲの増幅産物は、反応の終わりに検出される。産物の量はプラトーレベルに達する傾向があり、反応混合物をより長く放置しても増加しない。結果として、従来のＰＣＲでは、産物の量は、最初に混合物中に存在する増幅標的配列の濃度と必ずしも相関しない。
【０００３】
定量的データを取得するために、定量的ＰＣＲ（「ｑＰＣＲ」）が実施され、ここで産生された増幅産物の量がリアルタイムでモニター又は検出される（従って、ｑＰＣＲは「リアルタイムＰＣＲ」又は「ＲＴ−ＰＣＲ」とも称されるが、この後者の省略形は、逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ＰＣＲと混同され得るため、役に立たない）一方、反応は依然として標的配列を活発に増幅している。
【０００４】
典型的には、増幅された核酸は、標識実体との相互作用によって検出される（通常、標識はフルオロフォアである）。この相互作用は、非特異的（すなわち、標識実体が本質的に任意の二本鎖ＤＮＡ分子に結合する）又は特異的であり得る（すなわち、標識実体は、ヌクレオチド配列に依存する方法で、所望の増幅産物に存在する特定の核酸配列と優先的に相互作用する）。非特異的な標識実体の例は、色素ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎである。特定の標識実体（例えば、標識されたプローブ分子）は、例えば、それが標的配列へのハイブリダイゼーションにより誘導される立体構造変化を受けるときに蛍光を発する「分子ビーコン」であり得る。
【０００５】
従って、ＰＣＲ中にリアルタイムで観察される蛍光のレベルをモニターすることで、増幅産物の量（例えば、蛍光の検出によって測定される）が、試料中の増幅標的分子の濃度と相関する定量データを生成できる。
【０００６】
米国特許第６，８１４，９４３号明細書に記載されているｑＰＣＲは、サイクルに温度範囲を利用する。典型的には、ｑＰＣＲの場合、次の手順が行われる：約９５℃の変性、約５５℃のアニーリング、約７０℃の伸長。これらは大きな温度変化である（最高温度と最低温度の差は約４０℃）。結果として、「通常の」非定量的ＰＣＲのようなｑＰＣＲは、比較的洗練された熱サイクル装置の使用を必要とする。従って、ｑＰＣＲは研究（例えば、遺伝子発現の定量化）に関連して非常に有用であるが、ポイントオブケア（「ＰｏＣ」）診断試験などに容易に適用することはできない。
【０００７】
熱サイクルの必要性を回避するために、等温で実施される多くの核酸増幅技術が考案されている。そのような増幅技術の非網羅的なリストには、以下が含まれる：ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅（「ＳＭＡＲＴ」；国際公開第９９／０３７８０５号パンフレット）；核酸配列に基づく増幅（「ＮＡＳＢＡ」Ｃｏｍｐｔｏｎ  １９９１  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０，９１−９２）；ローリングサークル増幅（「ＲＣＡ」、例えば、Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，２２５−２３２を参照）；ループ媒介増幅（「ＬＡＭＰ」、Ｎｏｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，（１２）ｅ６３を参照）；リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（「ＲＰＡ」Ｐｉｅｐｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４（７）ｅ２０４を参照）；鎖置換増幅（「ＳＤＡ」）；ヘリカーゼ依存性増幅（「ＨＤＡ」Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．５，７９５−８００）：転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）、単一プライマー等温増幅（「ＳＰＩＡ」、Ｋｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１，１９７３−８１を参照）；自己持続性配列複製（「３ＳＲ」）；及びニッキング酵素増幅反応（「ＮＥＡＲ」）。
【０００８】
ＳＤＡは、標的相補的部分、並びに標的相補的部分の５’、エンドヌクレアーゼの認識及び切断部位を含む、一対のプライマーの使用を含む技術である（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，１６９１−１６９６に開示される）。プライマーは、それぞれ相補的な一本鎖標的分子にハイブリダイズする。標的鎖の３’末端は、鋳型としてプライマーを使用してＤＮＡポリメラーゼ及び少なくとも１つの修飾ヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を用いて伸長される（及び同様にプライマーの３’末端は鋳型として標的を用いて伸長される）。
【０００９】
標的鎖の伸長は、エンドヌクレアーゼの二本鎖認識部位を生成する。しかし、標的は修飾三リン酸を用いて伸長されるため、エンドヌクレアーゼは両方の鎖を切断するのではなく、代わりにプライマーに一本鎖のニックを作る。次いで、ニックにおける３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼ（典型的には、エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片）によって伸長される。ニックの入ったプライマーが伸長すると、これは初期産生伸長産物を置換する。次に、置換された産物は、反対側のプライマーの標的の配列を本質的に複製するため、反対側のプライマーに自由にハイブリダイズすることができる。このようにして、標的配列の両方の鎖の指数関数的な増幅が達成される。
【００１０】
ＳＤＡプロセスの増幅段階は本質的に等温であり、典型的にはエンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼの最適温度である３７℃で実施される。しかし、増幅段階に達する前に、プライマー対がその相補的標的鎖にハイブリダイズすることを可能にするために、二本鎖標的を、それを構成する一本鎖へと完全に解離させることが必要である。
【００１１】
この解離又は「融解」は、標的の２つの鎖の間の水素結合を破壊するために、通常、二本鎖標的を高温（通常約９０℃）に加熱することによって達成される。次いで、増幅反応に必要な酵素の添加を可能にするため、反応混合物を冷却する。一本鎖標的を生成するために高温が使用されるため、ＳＤＡ技術はＰｏＣの文脈につき理想的に適するものではない。
【００１２】
米国特許第６，１９１，２６７号明細書は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩニッキング酵素のクローニング及び発現、並びに制限エンドヌクレアーゼ及び修飾三リン酸の代わりのＳＤＡにおけるその使用を開示する。
【００１３】
ＳＤＡに類似した別の増幅技術はニッキング酵素増幅反応（又は「ＮＥＡＲ」）である。
【００１４】
「ＮＥＡＲ」（例えば、米国特許出願公開第２００９／００１７４５３号明細書及び欧州特許第２，１８１，１９６号明細書に開示されるもの）では、フォワード及びリバースプライマー（「鋳型」として米国特許出願公開第２００９／００１７４５３号明細書及び欧州特許第２，１８１，１９６号明細書で言及されている）が、二本鎖標的のそれぞれの鎖にハイブリダイズし、伸長される。フォワード及びリバースプライマー（過剰に存在）のさらなるコピーは、反対側のプライマーの伸長産物にハイブリダイズし、それ自体が伸長され、「増幅二重鎖」を生成する。そのように形成された各増幅二重鎖は、各鎖の５’末端に向かうニッキング部位を含み、これはニッキング酵素によりニックされ、さらなる伸長産物の合成を可能にする。一方で、以前に合成された伸長産物は、相補的プライマーのさらなるコピーとハイブリダイズすることができ、これはプライマーを伸長させ、それにより「増幅二重鎖」のさらなるコピーを作製する。このようにして、指数関数的増幅を達成することができる。
【００１５】
ＮＥＡＲは、特に、初期熱解離ステップが必要でない点で、ＳＤＡとは異なる。増幅プロセスを誘発するために必要な初期プライマー／標的ハイブリダイゼーション事象は、標的が依然として実質的に二本鎖である間に起こる：初期プライマー／標的ハイブリダイゼーションは、標的鎖の局部的解離（「ブリージング」として知られている現象）を利用すると考えられる（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、及びＶｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．のレビュー，２０１３  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９９（１２），９２３−９５４を参照）。ブリージングはＤＮＡ鎖間の塩基対形成の局部的且つ一時的な緩みである。初期プライマー／標的ヘテロ二重鎖の融解温度（Ｔｍ）は、典型的には反応温度よりもはるかに低いので、プライマーは解離する傾向にあるが、一時的なハイブリダイゼーションは、ポリメラーゼがプライマーを伸長させるのに十分なほど長く続き、これはヘテロ二重鎖のＴｍを増加させ、安定化させる。
【００１６】
ＮＥＡＲにおける増幅段階は、一定温度で等温的に実施される。実際、同じ一定温度、通常５４〜５６℃の範囲で、初期標的／プライマーハイブリダイゼーション及びその後の増幅ラウンドの両方を行うことは従来実施されている。
【００１７】
熱サイクルの必要性を回避することは、ＮＥＡＲが、ＰｏＣの文脈においてＰＣＲより潜在的に有用であることを意味する。さらに、非常に低いコピー数の標的分子（例えば、わずか１０個の二本鎖標的分子）から出発しても、有意な量の増幅産物の合成を達成することができる。
【００１８】
国際公開第２０１１／０３０１４５号パンフレット（Ｅｎｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、「等温」核酸増幅（ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、Ｑ−ベータレプリカーゼ、ローリングサークル増幅及び３ＳＲが具体的に言及されている）を、最初は所定温度で、反応の温度を変化させ、その後反応中に少なくとも１回、温度が所定温度に戻ることを許容して、実施するアイデアを開示している。より具体的には、この文書は、「アッセイの完了までの全体の時間及び信号対雑音［比］を改善する」と言われる、増幅反応中の温度振動又は「揺らぎ」を引き起こすことを示唆している。このアイデアは、バクテリアＲＮＡを増幅するために実験的にＴＭＡ増幅技術を使用して検討された。結果は、「揺らいだ」反応が真の等温反応よりも早く標的を増幅し始めたが、蛍光シグナルが初期バックグラウンドレベルを超えるまでに依然として約１３分の遅延があったことを示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、既存の技術に対して１つ以上の利点を有し、特に、定量データを生成することができる、新規の核酸増幅技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
第１の態様では、本発明は、非等温核酸増幅反応を実施する方法を提供し、本方法は、以下のステップ：
（ａ）プライマーが標的にハイブリダイズするハイブリダイゼーション事象を可能にする条件下で、標的配列を１つ以上の相補的一本鎖プライマーと混合するステップであって、ハイブリダイゼーション事象が、直接的又は間接的に、二重鎖の反対側の末端又はその近くに配置された２つのニッキング部位を含む二重鎖構造の形成を導くステップ；及び以下のステップ：
（ｂ）二重鎖の鎖中の前記ニッキング部位の各々にニックを発生させるニッキング酵素を使用するステップ；
（ｃ）新たな合成核酸を形成するように、ポリメラーゼを使用してニックの入った鎖を伸長し、ポリメラーゼとの伸長がニッキング部位を再形成するステップ；
（ｄ）新たな合成核酸の複数のコピーを産生するように、所望によりステップ（ｂ）及び（ｃ）を反復するステップ；
による増幅プロセスを実施するステップ
を含み、当該方法が実施される温度が非等温であり、ステップ（ｂ）〜（ｄ）の増幅プロセスの間に高温と低温との間で複数回の往復に供されることを特徴とし、ここで、高温では、前記ポリメラーゼ又はニッキング酵素の一方は、前記酵素の他方よりも活性が高く、酵素の活性に差異が存在し、低温では、酵素の活性の差異が低下又は逆転する。
【００２１】
ニッキング酵素及びポリメラーゼは、一定の速度の触媒活性を有する。これらは温度によって異なる。酵素のそれぞれの活性速度（所与の基質濃度での酵素１ｍｇあたり、単位時間あたりの反応した基質のモル数で）は、通常、特定の温度で異なっている。各酵素は、その活性速度が最大になる最適温度を有する。一般的に言えば、反応混合物の温度が酵素の最適温度から離れているほど、酵素の活性速度は遅くなる。
【００２２】
一方の酵素が他方の酵素よりも活性が高くなることを可能にする温度条件を使用することによって、又は前記一方の酵素にとって他方の酵素よりも好ましくない温度条件を使用することによって、ある酵素を別の酵素よりも相対的に優先する（ポリメラーゼとニッキング酵素の活性速度の差異を実現するため）ことができる。
【００２３】
説明として、高温で一方の酵素が他方の酵素よりも高い活性を有し、低温で他方の前記酵素がより高い活性を有する場合、酵素の活性の差異は「逆転」したと見なされる。
【００２４】
他の実施形態では、高温及び低温での酵素の活性の差異は逆転せず、単に低下する。典型的には、前記高温又は低温の１つにおける酵素間の活性の差異は、必要に応じて、低温又は高温で少なくとも５％低下する。より好ましくは、差異は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％又は少なくとも４５％低下する。最も好ましくは、差異は、少なくとも５０％、又は少なくとも７５％低下する。
【００２５】
誤解を避けるために、この文脈での「酵素活性」は、ポリメラーゼ及びニッキング酵素について同じ条件下で測定された「比酵素活性」（μｍｏｌ基質反応時間（分）−１ｍｇ−１酵素）を指す。
【００２６】
好ましい一実施形態では、本発明の第１の態様の方法は、一連の温度条件の使用を含み、ここで、前記高温及び低温の一方で、ニッキング酵素及びポリメラーゼの両方が実質的に活性（すなわち、本発明の目的では、他の点では同一の条件で酵素がその最適温度で作動する速度の少なくとも５０％以上の速度で作動し；好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上；最も好ましくはその最適温度でのその活性速度の７０％以上である）であり；前記低温及び高温の他方（場合に応じて）では、ニッキング酵素又はポリメラーゼの少なくとも一方が実質的に阻害される（すなわち、他の点では同一の条件で酵素がその最適温度で作動する速度の４９％以下の速度で作動し；好ましくは４５％未満、より好ましくは４０％未満；最も好ましくはその最適温度でのその活性速度の３５％未満である）。いくつかの実施形態では、ニッキング酵素は、高温又は低温の一方で実質的に阻害される。いくつかの実施形態では、ニッキング酵素は、高温で実質的に阻害される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、高温又は低温の一方で実質的に阻害される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは低温で実質的に阻害され、他の実施形態では、ポリメラーゼは高温で実質的に阻害される。
【００２８】
反応混合物が高温又は低温で一定に保たれる時間の長さは、「滞留時間」と称される場合があり、それらを区別するために、「高温滞留時間」及び「低温滞留時間」と称することができる。高温滞留時間と低温滞留時間は同じであってもよく、又は異なっていてもよい。異なる場合、高温滞留時間は低温滞留時間よりも長くてもよく、又は短くてもよい。
【００２９】
定量分析のための重要なパラメーターは、生成されたデータが決定係数（Ｒ２）として知られる回帰直線にどれだけよく適合するかである。決定係数が低い場合、データは定量的とは見なされない。本発明の目的では、その決定係数が０．８５０以上、典型的には０．９００以上、好ましくは０．９５０以上、より好ましくは０．９７５以上、最も好ましくは０．９９０以上である場合、データは定量的であると見なされる。決定係数（Ｒ２）は、Ｐｆａｆｆｌによって説明されている方法（２００１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（９）ｅ４５）を使用して好都合に計算され得る。
【００３０】
従って、核酸増幅反応を実施する方法及び／又はそのような反応によって試料を分析する方法は、前述の定義に従って定量的であるデータを生成する場合、定量的であると見なされる。驚くべきことに、本発明の方法は、定量データを生成することができる。
【００３１】
本発明の増幅反応は、好ましくは、「ＮＥＡＲ」として知られ、欧州特許第２，１８１，１９６号明細書に開示されているものと概して外見上は類似の方法で実施される。しかし、重要なことであり、ＮＥＡＲ手法とはまったく異なることには、本発明の方法は非等温的に実施され、高温と低温の間で反復的に往復することを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、高温は、ニッキング酵素の活性よりもポリメラーゼの活性に比較的有利であり得、低温は、ポリメラーゼの活性よりもニッキング酵素の活性に比較的有利である。しかし、驚くべきことに、本発明者らは、「温度選好」は、いくつかの実施形態では、高温は、ポリメラーゼの活性よりもニッキング酵素の活性に比較的有利であり得、低温は、ニッキング酵素の活性よりもポリメラーゼの活性に比較的有利であり得るように、完全に逆転され得ることを見出した。
【００３３】
特定の理論に束縛されるものではないが、異なる最適温度を有するポリメラーゼ及びニッキング酵素を適切に選択することにより、増幅反応の高温を、ポリメラーゼ又はニッキング酵素のいずれかに比較的有利なものとし、増幅反応の低温に関してはその逆とすることが可能であるようである。
【００３４】
特定の理論に束縛されるものではないが、酵素にとって相当に準最適である温度を使用することにより、本発明の方法によって達成される急速な増幅のための可能なメカニズムが、ニッキング酵素又はポリメラーゼの一方又は他方の活性を低下させることを引き起こし、潜在的な基質分子の蓄積を導くことが、発明者らによってさらに仮定される。当該酵素につき、より最適に近い温度に反応混合物の温度を調整すると、酵素の活性が有意に増強され、これは、比較的高濃度の蓄積した基質と共に、大幅に加速した反応速度をもたらす。簡単に言えば、この「クイック／スロー」型の平均反応速度は、一定の、又は比較的ゆっくりと変化する温度の「定常状態」システムを使用して達成可能な平均反応速度よりも大きい。
【００３５】
ニッキング酵素の最適温度が本発明の方法で使用されるポリメラーゼの最適温度とは異なる（より高い又はより低い）ことが望ましい場合があることは、当業者には明らかであろう。
【００３６】
典型的には、ニッキング酵素及びポリメラーゼのそれぞれの最適温度は、少なくとも１℃、好ましくは少なくとも３℃、より好ましくは少なくとも５℃、最も好ましくは少なくとも１０℃異なっているべきである。好都合には、それぞれの最適温度は、１０〜３０℃の範囲で、より典型的には１０〜２５℃の範囲で異なっている。
【００３７】
ポリメラーゼの最適温度がニッキング酵素の最適温度よりも高いという絶対的な要件は存在しない。従って、例えば、ニッキング酵素の最適温度よりも低い最適温度を有するポリメラーゼ（例えば、好冷性供給源から得られる）を反応が利用する本発明の実施形態が存在する一方、他の実施形態では、ポリメラーゼは、ニッキング酵素の最適温度よりも高い最適温度を有する。
【００３８】
従って、一般に、高温は、配列特異的ポリメラーゼ媒介伸長段階を比較的有利にするように選択されることが好ましい（すなわち、ポリメラーゼとハイブリダイズした初期プライマー／標的二重鎖との間の複合体の形成、その後のプライマーのポリメラーゼ媒介伸長；及びほぼ直後に、伸長した初期プライマーにハイブリダイズした反対側のプライマーの伸長）。上昇した温度を使用すると、プライマー二量体の形成、及び望ましくないミスハイブリダイズした二重鎖の異常な増幅が低下する傾向がある。ポリメラーゼは、活性の有意な減少なしに反応の持続期間を通してプライマー伸長を実施するために、高温で十分に安定であるように好都合に選択される。本発明の目的では、「有意な減少」とは、ポリメラーゼの比酵素活性の５０％以上の低下を意味する。
【００３９】
低温は、ニッキング酵素が二重鎖上のニック部位を切断できるように選択されることが好ましい。ニッキング酵素は、典型的には（必須ではないが）、ポリメラーゼの最適温度よりも低い最適温度を有し、従って、低温への移行は、典型的には、反応温度をニッキング酵素の最適温度に近づける。
【００４０】
本明細書に例示されるような本発明の方法のいくつかの実施形態では、高温は、好ましくは５０．０〜６４．０℃の範囲内、より好ましくは５５．０〜６３．０℃の範囲内である。しかし、当業者は、好ましい「高温」が、存在する酵素の同一性に応じて、また、おそらくプライマーの長さ及び配列、及び／又は意図される増幅標的にも応じて、変動し得ることを理解するであろう。
【００４１】
例えば、いくつかの実施形態では、高温は６８℃であり得るが、そのような条件では、
（ａ）通常は、高温での滞留時間が短縮された熱往復プロファイル（例えば、１往復あたり約１〜２秒以下）の使用が望まれ；
（ｂ）そのような高温は、試料内の比較的高いコピー数の標的配列（例えば、約１０３コピー以上）でのみうまく機能する。
【００４２】
本明細書に例示されるような本発明の方法では、低温は、好ましくは２０．０〜５８．５℃の範囲内、より好ましくは３５．０〜５７．９℃の範囲内である。しかし、再び、上記のように、当業者は、好ましい「低温」が、存在する酵素の同一性に応じて、また、おそらくプライマーの長さ及び配列、及び／又は意図される増幅標的にも応じて、変動し得ることを理解するであろう。
【００４３】
一般的な規則として、当業者に周知であるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは（制限内で）温度の上昇と共に増加し、その結果、より高温では一般にミスマッチのプライマーと試料中に存在する非相補的なポリヌクレオチド配列との間などの非特異的相互作用が減少する。従って、温度が特定のプライマー／標的配列ハイブリダイゼーションの融解温度を超えない限り、ハイブリダイゼーション反応のより高い温度は、通常、より低い温度より好ましい。
【００４４】
望ましくは、好ましい実施形態では、高温と低温との温度差は、４〜１２℃の範囲内、より好ましくは４〜１０℃の範囲内、最も好ましくは４〜８℃の範囲内である。
【００４５】
必須ではないが、一般的に、反応混合物は、低温よりも短い時間（「滞留時間」）、高温で保持されることが好ましい場合があるが、高温及び低温での「滞留時間」は等しいか、又は同一であり得る。他の実施形態では、高温での滞留時間は、低温よりも長くてもよいが、これは一般的には好ましくない。
【００４６】
特定の制限内では、一般に熱往復の周波数が高いほど、増幅反応が速く進むと想定される。従って、１つの完全な熱往復の持続時間は、好ましくは３．０分未満、より好ましくは２．０分未満、最も好ましくは１．０分未満である。最も有利には、熱往復の持続時間は４５秒未満であり、最も好ましくは３０秒未満である。熱往復の最小持続時間は、典型的には、少なくとも１秒、好ましくは少なくとも２秒、より好ましくは少なくとも５秒である。１つの完全な熱往復の典型的な好ましい持続時間は、５〜３０秒、好ましくは５〜２０秒、最も好ましくは５〜１５秒である。
【００４７】
高温での典型的な好ましい滞留時間は、１〜１０秒、好ましくは１〜５秒、最も好ましくは１〜３秒であり得る。
【００４８】
低温での典型的な好ましい滞留時間は、２〜４０秒、より好ましくは３〜３０秒、最も好ましくは３〜１５秒であり得る。
【００４９】
高温と低温との間を往復するのにかかる時間は、好ましくは実質的に最小に保たれる。増幅反応混合物の典型的な容量は５００μｌ未満、おそらく２５０μｌ未満であり、高温と低温が典型的には１０℃未満離れていることを考慮すると、約０．５〜１０．０秒、より好ましくは１〜５秒の範囲で低温から高温（又はその逆）に移行することが可能であり、好ましいだろうと想定される。
【００５０】
好都合には、複数の往復のそれぞれの持続時間／温度プロファイルは、本質的に同一であり、これは方法の実施を単純化する。従って、例えば、複数の熱往復のそれぞれは、好都合には、同一の全体の持続時間、同一の高温での滞留時間、同一の低温での滞留時間などを有する。
【００５１】
しかし、いくつかの実施形態（特に、増幅反応の直接的又は間接的な産物のリアルタイム検出がある実施形態）では、反応の進行中に熱往復のプロファイルを変更することが望ましい場合があるため、全ての往復が同一というわけではない。より具体的には、増幅反応産物のリアルタイム定量化（直接的又は間接的）が、反応が望ましいものよりもゆっくりと進行していることを示している場合、この情報は、反応混合物の温度を調節する温度調節装置にフィードバックされ得、これは、反応速度を上昇させるために、装置に熱往復のプロファイルを調整させる。これは、例えば、標的配列が非常に低いコピー数で存在する場合に必要とされ得る。装置は、高温及び／又は低温を上昇又は低下させることによって、及び／又は高温及び／又は低温での滞留時間を増加又は減少させることによって、熱往復プロファイルを調整し得る。装置は、高温と低温との間の移行にかかる時間を増加又は減少させる（すなわち、上方温度移行又は下方温度移行のいずれか、又はその両方の時間を増加又は減少させる）ことも可能である。
【００５２】
実質的に、反応混合物の全ての必要な成分を合わせた直後に、熱往復が開始され得る。
或いは、遅延間隔の後に熱往復が開始され得る。例えば、反応混合物は上昇した温度（熱往復で使用される高温と同じであるか、又は異なる場合がある）で維持することが可能であり、潜在的に望ましい場合がある。例として、そのような遅延間隔は、例えば、５秒〜１又は２分であってもよい。
【００５３】
さらに、熱往復は、好都合には、増幅反応中に実質的に連続的に実施されてもよく、又は１つ以上の休止を受けてもよい。典型的には、そして好ましくは、いったん開始すると、熱往復は、増幅反応が所望の時点に到達するまで、典型的には検出可能な蛍光（又は他の）シグナルが得られ、試料中の標的配列の量及び／又は濃度の有利な定量的決定を可能にするまで、中断されない。
【００５４】
増幅反応混合物の熱往復は、ＰＣＲで熱往復を実施するために市販されているような自動化された熱調節装置を使用して好都合に行われ得る。明らかに、装置によって生成された温度プロファイルは、本発明の実施に適用可能な好ましい条件に一致する必要がある。
【００５５】
第２の態様において、本発明は、核酸増幅を実施するための反応混合物を提供し、混合物は、増幅される標的配列、２つ以上のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及びニッキング酵素を含み、前記プライマーの１つは標的の第１の鎖に相補的であり、前記プライマーの他方は標的の第２の鎖に相補的であり、前記反応混合物は、プログラム可能な温度調節手段と関連して熱調節されており、前記温度調節手段は、本発明の第１の態様に関して以前に定義されたように、高温と低温の間で熱往復を実施するようにプログラムされている。
【００５６】
第３の態様では、本発明は、試料中の標的ポリヌクレオチドの量及び／又は濃度を決定する方法を提供し、方法は、以下のステップ：上記で定義された本発明の第１の態様に従って増幅反応を実施して標的を増幅するステップ、及び試料中の標的ポリヌクレオチドの量及び／又は濃度の決定を可能にするために、増幅反応の直接的又は間接的な産物を定量的方法で検出するステップを含む。
【００５７】
本発明の方法の増幅プロセスは、ポリメラーゼ及びニッキング酵素を利用した、ＳＤＡ及びＮＥＡＲを含む一般的に知られている従来の増幅技術に適用され得る。
【００５８】
従って、例えば、増幅プロセスは、鎖置換増幅において使用される増幅プロセスに基づくか、又はＮＥＡＲで使用される増幅プロセス、若しくは実際上、一本鎖ニックの形成及びニックの入った鎖の３’末端からのその後の伸長に依存する任意の他の核酸増幅プロセスに基づき得る。増幅中に一定温度を維持することに関連する先行技術の教示以外、ＳＤＡ又はＮＥＡＲの増幅段階に関連する先行技術の教示は、一般に、本発明の方法の増幅プロセスに等しく適用可能である。
【００５９】
本発明の方法は、国際公開第２０１８／００２６４９号パンフレットに記載されている選択的温度増幅反応（又は「ＳＴＡＲ」）と命名された増幅技術の改良である。本発明の方法は、好ましい実施形態では、標的配列のリアルタイム定量的検出を可能にし、本明細書では「ｑＳＴＡＲ」と呼ばれるが、これは、本発明の方法が、全ての条件下で定量的リアルタイムの結果を提供することを示すことを意図するものではない。
【００６０】
好ましくは、ステップ（ａ）は、二本鎖標的を含有する試料を２つの一本鎖プライマーと混合することを含み、２つのプライマーが標的にハイブリダイズし、前記プライマーの遊離の３’末端が互いに向かい合うように、前記プライマーの１つが標的の第１の鎖に相補的であり、前記プライマーの他方は標的の第２の鎖に相補的である。
【００６１】
２つのプライマーは、便宜上、「フォワード」及び「リバース」プライマーとして記載され得る。
【００６２】
望ましくは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方が、ニッキング酵素認識部位の配列を含む。典型的には、ニッキング酵素によって生成されるニックは、ニッキング酵素認識部位のすぐ外側及び典型的には３’である。
【００６３】
好ましい実施形態では、フォワードプライマーは、標的配列アンチセンス鎖の３’末端に相補的であり、それとハイブリダイズすることができるその３’末端又はその付近の部分を含む一方、リバースプライマーは、標的配列センス鎖の３’末端に相補的であり、それとハイブリダイズすることができるその３’末端又はその付近の部分を含む。
【００６４】
このようにして、ニッキング酵素認識部位が標的配列の両端に導入され、標的配列の増幅（ニック部位の下流のプライマーの任意の介在配列と共に）は、二本鎖ニッキング酵素認識部位を形成するようにフォワード及びリバースプライマーのポリメラーゼ伸長の複数のサイクルを実施することによって、及びニッキング酵素でその部位をニッキングし、ニックの入ったプライマーのポリメラーゼなどによるさらなる伸長を可能にすることによって達成され、これは本質的に、例えば、米国特許出願公開第２００９／００１７４５３号明細書に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
標的は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、又はそれら２つの混合物を含んでいてもよい。標的は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はこれら２つの混合物を含み得る。特に、標的は、必須ではなく実際には好ましくないが、１つ以上の修飾ヌクレオチド三リン酸（すなわち、天然に存在する核酸には通常見られないヌクレオチド三リン酸）を組み込んでもよい。
【００６６】
標的は、以下の非網羅的なリストから選択され得る：ゲノム核酸（この用語は、任意の動物、植物、真菌、細菌又はウイルスのゲノム核酸を包含する）、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又は合成オリゴヌクレオチド又は他の核酸分子。
【００６７】
特に、本方法は、初期逆転写ステップをさらに含み得る。例えば、当業者に周知の方法によって、逆転写酵素を用いてＤＮＡ又はｃＤＮＡを合成するために、ＲＮＡ（例えば、ウイルスゲノムＲＮＡ、又は細胞ｍＲＮＡ、又は他の供給源由来のＲＮＡ）を使用してもよい。次いで、ＤＮＡは、本発明の方法における標的配列として使用し得る。元のＲＮＡは、典型的には、逆転写酵素のリボヌクレアーゼ活性によって分解されるが、必要に応じて、逆転写が完了した後にさらなるＲＮａｓｅＨを添加してもよい。ＲＮＡ分子は、対応する（例えば、ゲノム）ＤＮＡ配列よりも大きなコピー数で試料中に存在することが多く、それゆえに、ＤＮＡ配列のコピー数を効果的に増加させるためにＲＮＡ分子からＤＮＡ転写物を作製することが便利であり得る。
【００６８】
「標的配列」とは、標的核酸中の塩基の配列であり、二本鎖標的のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖を指し得、また、文脈上他の記載がない限り、初期標的核酸の増幅されたコピー、伸長産物又は増幅産物において再現又は複製されるものと同じ塩基配列も包含する。
【００６９】
標的配列は、任意の種類の試料、例えば、生物学的又は環境的試料（水、空気など）中に存在してもよい。生物学的試料は、例えば、食品試料又は臨床試料であってもよい。臨床試料には、以下が含まれ得る：尿、唾液、血液、血清、血漿、粘液、喀痰、涙液又は便。
【００７０】
試料は、プライマーと接触する前に処理されてもよく、されなくてもよい。そのような処理は、濾過、濃縮、部分精製、超音波処理、化学溶解などの１つ以上を含み得る。そのようなプロセスは、当業者に周知である。
【００７１】
本発明の方法は、ニック部位の使用及びニック部位にニックを作製するための手段を含む。「ニック」は、完全に、又は少なくとも部分的に二本鎖核酸分子のうち一本鎖のみのホスホジエステル骨格の切断である。ニック部位は、ニックが形成される分子内の位置である。
【００７２】
好ましい実施形態では、「ニッキング認識部位」は、ニック部位に、又はその中に、又はその隣に存在する。（この文脈において、「隣」とはニッキング認識部位の最も近い塩基がニック部位の１０塩基以内、好ましくはニック部位の５塩基以内であることを意味する）。
【００７３】
ニッキング認識部位は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位の少なくとも１つの鎖を含んでもよく、ニック部位は、二本鎖分子として存在する場合に制限エンドヌクレアーゼによって切断される核酸塩基配列の少なくとも１つの鎖を含んでもよい。典型的には、制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸分子の両方の鎖を切断する。本発明では、ニック部位又はその近くに１つ以上の修飾塩基を組み込むことによって二本鎖切断を回避することができ、修飾塩基は核酸の鎖を制限エンドヌクレアーゼによる切断の影響を受けないようにする。このようにして、二本鎖核酸分子の両方の鎖を通常切断する制限エンドヌクレアーゼを用いて、一本鎖ニックを二本鎖分子に導入することができる。これを達成するのに適した修飾塩基等は、当業者に周知であり、例えば、全てのアルファホスフェート修飾ヌクレオシド三リン酸及びアルファボラノ修飾ヌクレオシド三リン酸、具体的には、２’−デオキシアデノシン５’−Ｏ−（チオ三リン酸）、５−メチルデオキシシチジン５’−三リン酸、２’−デオキシウリジン５’三リン酸、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン５’−三リン酸、２’−デオキシグアノシン−５’−Ｏ−（１−ボラノ三リン酸）などが含まれる。修飾塩基を含む三リン酸は、増幅プロセスを実施するために使用される反応混合物中に存在してもよく、その結果、修飾塩基は、その後の増幅ラウンドの間に、対応する位置に組み込まれ、エンドヌクレアーゼによって切断可能な二本鎖部位の形成を妨げる。
【００７４】
しかし、好ましい実施形態では、ニックは、ニッキング酵素によってニック部位に作られる。ニッキング酵素は、通常の状況下では、二本鎖核酸分子中の一本鎖切断のみを生じる分子である。ニッキング酵素は、典型的にはニッキング認識部位を有し、ニック部位はニッキング認識部位内にあってもよく、又は認識部位の５’又は３’のいずれかであってもよい。多くのニッキング酵素が当業者に知られており、市販されている。ニッキング酵素の例の非網羅的なリストは、Ｎｂ．Ｂｓｍｌ、Ｎｂ．Ｂｔｓ、Ｎｔ．Ａｌｗｌ、Ｎｔ．ＢｂｖＣ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、及びＮｔ．Ｂｐｕ１０１を含む。後者の酵素はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されており、他のものは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能である。
【００７５】
好ましい実施形態では、ニッキング酵素は、方法の初めに（例えば、試料をプライマー及びＤＮＡポリメラーゼと接触させて１分以内に）反応混合物に導入される。しかし、場合によっては、より長い遅延（例えば、温度がニッキング酵素の最適温度に近づくことを可能にする）の後にニッキング酵素を反応混合物に導入することが望ましいことがあり得る。
【００７６】
本発明の方法は、ＤＮＡポリメラーゼの使用を含む。必須ではないが、好ましくは、本発明の方法は、少なくとも１つの好熱性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、６０℃を超える最適温度を有する）の使用を含む。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換ポリメラーゼである。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性を有しない。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を有しない鎖置換ポリメラーゼであり、また、好ましくは好熱性である。
【００７７】
好ましいＤＮＡポリメラーゼの例には、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮポリメラーゼ、Ｍａｎｔａ１．０ポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＢｓｔＸポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ  ＧｍｂＨ）、Ｂｓｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、大きな断片（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、大きな断片（ＮＥＢ）、及び「Ｉｓｏｐｏｌ」（商標）ポリメラーゼ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ製）が含まれる。
【００７８】
以下の表は、ニッキング酵素とＤＮＡポリメラーゼの組み合わせの例を、例示された酵素の組み合わせを使用して本発明の方法を実施する際に使用することが提案される高温及び低温と共に提供する。表は特定のＤＮＡポリメラーゼを列挙しているが、これらは例に過ぎず、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（エキソ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ、Ｍａｎｔａ  １．０  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＩｓｏＰｏｌ  ＤＮＡなどの、鎖置換エキソヌクレアーゼマイナスであり、記載される温度範囲で活性を有するポリメラーゼで十分である。ポリメラーゼ
【００７９】
【表１】
2021509814.tif 000003
【００８０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、好都合には、前増幅又は濃縮ステップを含み得る。これは、標的配列をフォワード及びリバースプライマー並びにＤＮＡポリメラーゼと接触させるが、ニッキング酵素とは接触させないステップである。これは典型的には約１〜５分間持続し、約１，０００倍の標的配列の初期（線形）増幅を産生し、これは標的配列が低コピー数で試料中に存在する場合に特に有用であり得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、前増幅又は濃縮ステップは、５０℃未満の温度で、ケナルカエウム・シュンビオスム（Ｃｅｎａｒｃｈａｅｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）由来のＥｘｏ−ＭｉｎｕｓクレノウＤＮＡポリメラーゼ又はＥｘｏ−Ｍｉｎｕｓ好冷菌ＤＮＡポリメラーゼなどの中温性ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施され、その後、混合物を、易熱性ＤＮＡポリメラーゼを変性又は不活性化するために５０℃超に加熱し、次いで、好熱性ＤＮＡポリメラーゼを下流増幅のために添加する。
【００８２】
典型的には、本発明の方法は、増幅プロセスの直接的又は間接的産物の１つ以上が検出され、任意選択により定量化される検出ステップを含み、これは試料中の標的の存在及び／又は量を示す。ゲル電気泳動、質量分析、側方流動捕捉、標識ヌクレオチドの組み込み、インターカレート若しくは他の蛍光色素、酵素標識、電気化学検出技術、分子ビーコン及び他のプローブ、特に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又は他の核酸含有分子を含む、多くの優れた適切な検出及び／又は定量技術が知られている。
【００８３】
検出ステップにおいて検出される産物は、本明細書において「検出標的」と称され得る。検出ステップに関する「標的」は、増幅プロセスにおける「標的」と必ずしも同じではなく、実際には、２つの分子は、いくつかの配列（典型的には１０〜２０塩基）を共通で有し得るが、通常少なくともある程度異なっており、ここで、検出標的は核酸分子又はオリゴヌクレオチドを含む。
【００８４】
核酸検出法は、二本鎖ＤＮＡの特異的検出を可能にする色素の使用を採用し得る。ＤＮＡ又はＲＮＡへの結合の際に増強された蛍光を示すインターカレート色素は周知である。色素は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡインターカレート・フルオロフォアであってもよく、とりわけ、以下を含み得る：アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＢＲ  Ｉ、ＳＹＢＲ  ＩＩ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＴＯＴＯ−３（チアゾールオレンジダイマー）、Ｏｌｉ  Ｇｒｅｅｎ及びＹＯＹＯ（オキサゾールイエローダイマー）。
【００８５】
核酸検出法はまた、検出標的配列、又は目的の検出標的に相補的又は実質的に相補的な配列を含むプローブ、に直接的に組み込まれた標識ヌクレオチドの使用を採用し得る。適切な標識は、放射性及び／又は蛍光性であってもよく、当技術分野で慣用的な任意の方法で分解され得る。検出することができるが、他の点では天然ヌクレオチドとして機能する（例えば、天然酵素の基質により認識され、基質として作用し得る）標識ヌクレオチドは、天然ヌクレオチドとして機能しない修飾ヌクレオチドとは区別されるべきである。
【００８６】
標的核酸及び核酸配列の存在及び／又は量は、分子ビーコンを用いて検出及びモニターし得る。分子ビーコンは、一端にフルオロフォア及び反対側にクエンチング色素（「クエンチャー」）を含む、ヘアピン型オリゴヌクレオチドである。ヘアピンのループは、検出標的配列に相補的又は実質的に相補的なプローブ配列を含み、ステムは、プローブ配列のいずれかの側に位置する自己相補的又は実質的に自己相補的な配列のアニーリングによって形成される。
【００８７】
フルオロフォア及びクエンチャーはビーコンの反対側の端部に結合されている。分子ビーコンがその標的にハイブリダイズするのを妨げる条件下で、又は分子ビーコンが溶液中に遊離状態である場合、フルオロフォア及びクエンチャーは互いに近接して、蛍光を妨げる。分子ビーコンが検出標的分子に遭遇すると、ハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造は、フルオロフォア及びクエンチャーの分離を引き起こして、蛍光が起こることを可能にする、安定でより堅固な立体構造に変換される（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８）。プローブの特異性により、蛍光の生成は、実質的に、意図された増幅産物／検出標的の存在にのみ起因する。
【００８８】
一般的な規則として、信号対雑音比は温度の上昇と共に減少するため、分子ビーコンは、より低いハイブリダイゼーション温度でより良く機能する。これは、低温では、分子ビーコンの自己相補的な「ステム」部分がしっかりとハイブリダイズしたままであり、クエンチャーにフルオロフォアをクエンチさせるが、温度が上昇すると、分子のステム部分が溶け始め、非特異的な蛍光バックグラウンド「ノイズ」を増加させるためである。
【００８９】
分子ビーコンは非常に特異的であり、単一の塩基（例えば一塩基多型）で異なる核酸配列を区別することができる。分子ビーコンは、異なる着色フルオロフォア及び異なる検出標的相補配列を用いて合成することができ、同じ反応における複数の異なる検出標的を同時に検出及び／又は定量することを可能にし、単一のＰｏＣアッセイの「多重化」が複数の異なる病原体又は生化学マーカーを検出することを可能にする。定量的増幅プロセスにつき、分子ビーコンは、増幅後に増幅された検出標的に特異的に結合することができ、ハイブリダイズされていない分子ビーコンは蛍光を発しないため、増幅産物の量を定量的に決定するためにプローブ−標的ハイブリッドを単離する必要はない。生じるシグナルは、増幅産物の量に比例する。これはリアルタイムで行うことができる。他のリアルタイムフォーマットと同様に、特定の反応条件は、正確さ及び精度を保証するため、各プライマー／プローブセットにつき最適化されなければならない。
【００９０】
検出標的核酸及び核酸配列の産生又は存在はまた、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって検出及びモニターされてもよい。ＦＲＥＴは、２つのフルオロフォア：ドナー及びアクセプター分子、の間のエネルギー転移機構である。簡潔には、ドナーフルオロフォア分子が特定の励起波長で励起される。ドナー分子がその基底状態に戻るときのドナー分子からのその後の放出は、（遠距離双極子−双極子相互作用を介して）アクセプター分子に励起エネルギーを転移し得る。ＦＲＥＴは、例えば分子ビーコンで見られるＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用において、分子動態を定量するのに有用なツールである。特定の産物の産生をモニターするため、一方の末端にドナー分子、他方の末端にアクセプター分子でプローブを標識することができる。プローブ検出標的ハイブリダイゼーションは、ドナー及びアクセプターの距離又は配向の変化を生じ、ＦＲＥＴ特性の変化が観察される。（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ．“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，第２版（１９９９年７月１日））。
【００９１】
検出標的核酸の産生又は存在は、側方流動装置によって検出及び監視することもできる。横流装置は周知である。これらの装置は、一般に、毛管力によって流体が流れる固相流体透過性流路を含む。例としては、ディップスティックアッセイ及び様々な適切なコーティングを有する薄層クロマトグラフィープレートが含まれるが、これらに限定されない。試料に関する様々な結合試薬、試料に関する結合パートナー又は結合パートナーを含むコンジュゲート、及びシグナル産生システムが、流路中又は流路上に固定化される。分析物の検出は、酵素検出、電気化学検出、ナノ粒子検出、比色検出、及び蛍光検出を含むいくつかの異なる方法で達成することができる。酵素検出は、側方流動装置の表面上の相補的又は実質的に相補的な核酸検出標的にハイブリダイズされる酵素標識プローブを含み得る。得られた複合体は、読み取り可能なシグナルを発生させるために適切なマーカーで処理することができる。ナノ粒子検出は、金コロイド、ラテックス及び常磁性ナノ粒子を使用し得るビーズ技術を含む。一例では、ビーズを抗ビオチン抗体にコンジュゲートすることができる。標的配列は直接ビオチン化されてもよく、又は標的配列は配列特異的ビオチン化プローブにハイブリダイズされてもよい。金及びラテックスは、裸眼で見える比色シグナルを発生し、常磁性粒子は、磁場中で励起されたときに非可視シグナルを発生し、専門のリーダーによって解釈され得る。
【００９２】
蛍光ベースの側方流動検出法、例えば、二重フルオレセイン及びビオチン標識オリゴプローブ法、又は量子ドットの使用もまた知られている。
【００９３】
核酸は、側方流動装置で捕捉することもできる。捕捉の手段は、抗体依存性及び抗体非依存性の方法を含み得る。抗体非依存性捕捉は、一般に、２つの結合パートナー間の非共有結合的相互作用、例えば、ビオチン化プローブとストレプトアビジン捕捉分子との間の高親和性及び不可逆的結合を使用する。捕捉プローブは、側方流動膜に直接固定されてもよい。
【００９４】
本発明の方法全体、又は少なくとも本方法の増幅プロセス部分は、反応容器（例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）による、従来の実験室用プラスチック試薬チューブなど）中で実施されてもよく、又は固体支持体中及び／又は固体支持体上で実施されてもよい。固体支持体は、多孔質でも非多孔質でもよい。特定の実施形態では、固体支持体は、多孔質膜材料（ニトロセルロースなど）を含み得る。より特定的には、固体支持体は、上記のように、多孔質側方流動アッセイ装置を含むか又はその一部を形成し得る。或いは、固体支持体は、アッセイ装置に沿って液体を輸送するために、１つ以上の固体細孔毛細管を使用するマイクロ流体型アッセイを含むか又はその一部を形成してもよい。
【００９５】
好ましい実施形態では、本発明の方法の全部又は少なくとも一部は、ポイントオブケア（ＰｏＣ）アッセイ装置を使用して実施され得る。ＰｏＣデバイスは、典型的には、製造が安価であり、単回使用後に処分され、一般にアッセイを実施又は解釈するために他の装置又は機器を必要としない自己内蔵型であり、望ましくは、使用に臨床知識又は訓練を必要としない、という特徴を有する。
【００９６】
本発明の方法は、典型的な実施形態では、熱往復の高温と低温の間の温度差が非常に小さいため、ＰｏＣ型の装置を使用した実施に特に適している。結果として、対照的に、ｑＰＣＲを実施するには比較的単純な熱往復／温度調節で十分である。
【００９７】
それにもかかわらず、本発明の増幅方法は、ｑＰＣＲの代わりに、ＰｏＣ装置ではなく実験室ベースのシステムで使用することもでき、典型的には、ｑＰＣＲを実施することによって達成できるよりもはるかに迅速に定量結果を達成できる。
【００９８】
本発明における使用に適したプライマーの例は、本明細書に開示されている。本発明の方法での使用に適切であり得る他の例は、とりわけ、米国特許出願公開第２００９／００１７４５３号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０３３０７７７号明細書、及び欧州特許第２，１８１，１９６号明細書に開示されており、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、過度の実験をすることなく、他の標的配列の増幅に適した他のプライマーを容易に設計することができよう。
【００９９】
他で説明されるように、本発明における使用のプライマーは、好ましくは、標的相補的部分だけでなく、ニッキングエンドヌクレアーゼ結合部位及びニッキング部位、並びに安定化部分も含む。
【０１００】
本発明の方法における使用のプライマーは、修飾ヌクレオチド（すなわち、天然に存在する核酸分子には見られないヌクレオチド）を含み得る。そのような修飾ヌクレオチドは、好都合には、プライマーの標的相補部分及び／又はプライマーの他の部分に存在し得る。多くの他の修飾ヌクレオチドが当業者に知られているが、修飾ヌクレオチドの好ましい例は、２’−修飾ヌクレオチド、特に２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである。
【０１０１】
ここで、本発明の特徴を、例示的な実施例及び添付の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１Ａ】本発明の方法を実施するのに適切な核酸増幅反応のそれぞれの開始段階及び指数関数的増殖段階の概略図である。
【図１Ｂ】本発明の方法を実施するのに適切な核酸増幅反応のそれぞれの開始段階及び指数関数的増殖段階の概略図である。
【図２】本発明の方法の実施中の反応混合物につき典型的な温度プロファイルを示すグラフ（分での時間に対する℃での温度）である。
【図３】本発明の方法を実施するのに有用なプライマーオリゴヌクレオチド分子の典型的な実施形態の概略図である。
【図４】２’Ｏ−メチル化塩基を含まないか、又は異なる数で含む、プライマー分子を使用して、本発明の方法に従って実施された増幅反応の、時間（秒）に対する（バックグラウンドを差し引いた）蛍光（任意単位）のグラフである。
【図５Ａ】２’Ｏ−メチル化塩基を含まないか、又は異なる数で含む、プライマー分子を使用して、本発明の方法に従って実施された増幅反応の、時間（秒）に対する（バックグラウンドを差し引いた）蛍光（任意単位）のグラフである。
【図５Ｂ】２’Ｏ−メチル化塩基を含まないか、又は異なる数で含む、プライマー分子を使用して、本発明の方法に従って実施された増幅反応の、時間（秒）に対する（バックグラウンドを差し引いた）蛍光（任意単位）のグラフである。
【図５Ｃ】２’Ｏ−メチル化塩基を含まないか、又は異なる数で含む、プライマー分子を使用して、本発明の方法に従って実施された増幅反応の、時間（秒）に対する（バックグラウンドを差し引いた）蛍光（任意単位）のグラフである。
【図６】本発明に従った方法（左側のプロット）、及び国際公開第２０１８／００２６４９号パンフレットに開示されているＳＴＡＲプロトコル（中央のプロット）、又は等温反応プロトコル（右側のプロット）に従って実施される方法について、バックグラウンド閾値を超える蛍光信号の生成によって判断される、増幅を達成するための平均時間（ＡＴ、分）を示す散布図である。
【図７】それぞれ、本発明の方法を特徴付ける際に使用される、ポリメラーゼ活性アッセイ及びニッキング活性アッセイの概略図である。
【図８】それぞれ、本発明の方法を特徴付ける際に使用される、ポリメラーゼ活性アッセイ及びニッキング活性アッセイの概略図である。
【図９Ａ】様々な温度で実施された、ポリメラーゼ活性アッセイの時間（分）に対する相対蛍光（任意単位）の（３回の反復試行の）平均のグラフである。
【図９Ｂ】様々な温度で実施された、ニッキング活性アッセイの時間（分）に対する相対蛍光（任意単位）の（３回の反復試行の）平均のグラフである。
【図１０Ａ】従来のＰＣＲ条件を使用した、様々な異なるポリメラーゼ酵素を使用して試行された増幅反応のサイクル数に対する相対蛍光（任意単位）のグラフである。
【図１０Ｂ】従来のＰＣＲ条件を使用した、様々な異なるポリメラーゼ酵素を使用して試行された増幅反応のサイクル数に対する相対蛍光（任意単位）のグラフである。
【図１１Ａ】本発明に従うがニッキング酵素の不存在下での「ｑＳＴＡＲ」熱往復条件を使用した、様々な異なるポリメラーゼ酵素を使用して試行された増幅反応のサイクル数に対する相対蛍光（任意単位）のグラフである。
【図１１Ｂ】本発明に従うがニッキング酵素の不存在下での「ｑＳＴＡＲ」熱往復条件を使用した、様々な異なるポリメラーゼ酵素を使用して試行された増幅反応のサイクル数に対する相対蛍光（任意単位）のグラフである。
【図１１Ｃ】本発明に従うがニッキング酵素の不存在下での「ｑＳＴＡＲ」熱往復条件を使用した、様々な異なるポリメラーゼ酵素を使用して試行された増幅反応のサイクル数に対する相対蛍光（任意単位）のグラフである。
【図１１Ｄ】本発明に従うがニッキング酵素の不存在下での「ｑＳＴＡＲ」熱往復条件を使用した、様々な異なるポリメラーゼ酵素を使用して試行された増幅反応のサイクル数に対する相対蛍光（任意単位）のグラフである。
【図１２】未知濃度の開始試料を使用した、従来のｑＰＣＲ増幅の実施から得られたデータを示す図である。
【図１３Ａ】未知濃度の開始試料を使用した、本発明の方法に従う「ｑＳＴＡＲ」増幅の実施から得られたデータを示す図である。
【図１３Ｂ】図１２、図１３Ａの結果の概要を示す図である。
【図１４Ａ】時間（秒）に対する蛍光（任意単位）のグラフであり、異なる温度範囲にわたって本発明の方法に従って実施された増幅反応の結果を示す。
【図１４Ｂ】時間（秒）に対する蛍光（任意単位）のグラフであり、異なる温度範囲にわたって本発明の方法に従って実施された増幅反応の結果を示す。
【図１４Ｃ】時間（秒）に対する蛍光（任意単位）のグラフであり、異なる温度範囲にわたって本発明の方法に従って実施された増幅反応の結果を示す。
【図１４Ｄ】時間（秒）に対する蛍光（任意単位）のグラフであり、異なる温度範囲にわたって本発明の方法に従って実施された増幅反応の結果を示す。
【図１５】時間（分）に対する蛍光（任意単位）のグラフであり、３８〜４５℃の範囲の温度で本発明の方法に従って実施された増幅反応の結果を示す。
【図１６】時間（分）に対する蛍光（任意単位）のグラフであり、逆転写されたＲＮＡ標的配列を使用して、本発明の方法に従って実施された増幅反応の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０３】
実施例１：定量的選択的温度増幅反応（ｑＳＴＡＲ）を試験するためのプロトコル
国際公開第２０１８／００２６４９号パンフレットに記載される選択的温度増幅反応（ＳＴＡＲ）、若しくはＰＣＲ、ＳＤＡなどの同様に関連する他のＤＮＡ／ＲＮＡ増幅技術、又は等温増幅技術による遺伝子発現の定量化は、いくらよく見ても信頼性が低いであろう。生成される産物の量は、初期の開始試料の標的ＤＮＡの量と直接相関しないプラトーに達する。増幅反応に対する制御された温度往復の帯状効果（ｚｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）を確立することにより、増幅産物が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその他の既知の核酸の初期開始量に直接関連する鎖置換ポリメラーゼ及びニッキングエンドヌクレアーゼを使用して定量的増幅を達成できる。本発明に従って、ニッキング酵素に基づいた選択温度増幅反応は、本明細書では定量的選択的温度増幅反応（ｑＳＴＡＲ）と呼ぶ。特に明記しない限り、プロトコルはさらに以下に記載される。
酵素、オリゴヌクレオチド、及び標的
クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（Ｃｔ）は、ｑＳＴＡＲ機構の開発のための初期標的として用いられた。クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８８６）ゲノムＤＮＡをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。潜在性プラスミドのオープンリーディングフレーム６領域をプライマーｑＳＴＡＲｃｔＦ６１ａ（配列番号１  ５’−ＣＧＡＣＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＴＴＡ−３’）及びｑＳＴＡＲｃｔＲ６１ｃ（配列番号２  ５’−ＧＧＡＣＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＴＴＡＣ−３’）で増幅した。得られたＤＮＡ鋳型を分子ビーコン、欧州特許第０７２８２１８号明細書に記載されるＳＴＡＲｃｔＭＢ１（配列番号３、５’−ＦＡＭ／ｃｃａｔｔＣＣＴＴＧＴＴＴＡＣＴＣＧＴＡＴＴＴＴＴＡＧＧａａｔｇｇ／ＢＨＱ１−３’）を用いて検出した。Ｂｓｔ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から購入した。これは、米国特許第６，１９１，２６７号明細書に記載される。特に明記しない限り、同じポリメラーゼ及びニッキングエンドヌクレアーゼを、本明細書に記載される他の実施例でも使用した。
【０１０４】
オリゴヌクレオチド及び分子ビーコンは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）及びＢｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）によって合成された。ｑＳＴＡＲ反応に使用したプライマーの一般的特徴は、国際公開第２０１８／００２６４９号パンフレットに記載の通りである。
【０１０５】
本発明の一実施形態における反応で見られるオリゴヌクレオチド及び増幅機構の概要は、（ｉ）標的核酸分子；（ｉｉ）標的核酸分子に相補的ないくつかのオリゴヌクレオチドを含む２つ以上のプライマーオリゴヌクレオチド分子、及び（ｉｉｉ）ニッキング酵素によってニックされ得るプライマー内の部位で構成される。本方法は、選択的温度増幅条件下で、標的核酸分子をポリメラーゼ、それぞれが標的ヌクレオチド分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマーオリゴヌクレオチド、及びニッキング酵素、と接触させることを含み、プライマーオリゴヌクレオチドが結合した標的配列の少なくとも一部を含む検出可能なアンプリコンを生成する。全体的なｑＳＴＡＲ反応は、２つの異なる段階、すなわち、それぞれ図１Ａ及び図１Ｂに概略的に図示される開始及び指数関数的増幅、を経ることが理解され得る。開始段階は、指数関数的増幅が起こり得るタンパク質プライマー二重鎖の初期形成である。指数関数的段階は、ニッキング酵素がポリメラーゼと共に活性化し、指数関数的増幅を引き起こすときである。図１Ａでは、プライマーと標的核酸の初期接触が発生し（ステップａ）、続いてポリメラーゼ伸長（ステップｂ）が行われ、フォワード開始鋳型（ｃ）が生成される。反対側の鎖のプライマーは、新たに生成したフォワード開始鋳型に結合し（ステップｄ）、開始鋳型のニック部位に向かって、及びそれを通って伸長する（ステップｅ）。この開始は、フォワード鎖及びリバース鎖の両方で同時に発生する可能性がある。この初期プロセスは、主に伸長のためのポリメラーゼを含むが、本質的にニッキング酵素の関与がほとんどないか全くないものとして理解することができる。
【０１０６】
図１Ａでは、標的は一本鎖であるとして示されている。これは、明確性と単純性を目的としている。実際には、本発明の方法は、二本鎖標的ポリヌクレオチド鎖を「融解」又は分離するために高温を使用する必要なく実施され、むしろ、プライマーは、鎖間の水素結合の局所的な緩和（「ブリージング」として知られている現象）、を利用することによって（二本鎖）標的分子と結合することができる。
【０１０７】
（この実施形態では、より低い）第２の選択温度では、いずれかの鎖でニッキングが好都合であり、鎖置換ポリメラーゼが反対側のプライマーに向かって、ニック部位を介して伸長することを可能にする。ニッキング／ポリメラーゼ伸長のこのサイクルにより、指数関数的二重鎖が形成される（図１Ｂ）。ニックと伸長から生成された新しい各鋳型が別のプライマーの標的になると、この指数関数的二重鎖が双方向増幅に送られる。ポリメラーゼ特異的伸長のために温度を開始段階に戻し、バックグラウンド増幅を制限し、慎重段階（ｄｉｓｃｒｅｅｔ  ｐｈａｓｅｓ）で指数関数的増幅を制御する。
【０１０８】
温度の制御、及びポリメラーゼ及びニッキングエンドヌクレアーゼの活性を制御することにより、本出願人らは、未知の標的入力の定量化を可能にする、急速且つ制御された増幅のための方法を達成した。
【０１０９】
本発明に従った増幅反応の一実施形態につき図２（分での時間に対する℃）は、典型的な温度プロファイルを示す。示された実施形態では、ポリメラーゼは、ニッキング酵素の最適温度よりも高い最適温度を有する。高温は６３℃、低温は５７℃である。低温での滞留時間（約５秒）は、高温での滞留時間（約２秒）より長い。各完全な温度往復は約８〜９秒続き、１分あたり約７つの熱往復が完了する。往復の高温側の半分（＞６０℃）では、反応の開始段階（図１Ｂを参照）が優先され、支配的である。当業者は、増幅反応の２つの相の間にはっきりとした温度差はなく、図２に示される分割線は単に理解を助けるためのものであることを理解するであろう。
【０１１０】
定量的選択的温度増幅のアプローチは、驚くべきことに、以下でさらに詳細に説明及び図示されるように、以前の既存の方法よりも有意に優れた性能を備えた、定量的、急速、特異的、及び高収量の増幅反応をもたらした。
増幅条件
基本的なｑＳＴＡＲ混合物には、２つのプライマー、ポリメラーゼ及びニッキング酵素（上記参照）が含まれていた。反応は、１．０μＭのフォワードプライマー、０．５μＭのリバースプライマー、０．２５μＭの分子ビーコン、１０μｌのｑＳＴＡＲマスターミックス及び５μｌのＤＮＡ試料を含む２５μｌの最終容量で実施した。ｑＳＴＡＲマスターミックスには以下の試薬：１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４、９０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３００μＭの各ｄＮＴＰ、２０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ、３０ｍＭのＮａＯＡｃ、２ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のトリトンＸ−１００、１５Ｕのニッキングエンドヌクレアーゼ及び６０Ｕのポリメラーゼが含まれていた。反応の温度は、固有の酵素活性を利用するために、２つの慎重温度段階（ｄｉｓｃｒｅｅｔ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｈａｓｅｓ）の間で制御された。主にポリメラーゼ活性からなる開始段階では、２秒間で６２℃の上昇した温度にあった。（この温度では、ニッキング酵素が大幅に阻害された−図９Ｂ参照）。ポリメラーゼ及びニッキング酵素の両方が中程度又は高度に活性である指数関数的段階を、５７℃で５秒間保持した。完全な往復の合計時間は１５秒であった。これは、温度の変化における装置の制限により、各温度での滞留時間の２倍超である（より応答性の高い機器では、高温と低温間を高速での往復を可能にする）。増幅及びｑＳＴＡＲ産物の検出は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｘ３００５  Ｐ  ｑＰＣＲ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて実施した。
【０１１１】
全ての反応は、試薬が反応温度になるために、及び温度が増幅動態、酵素性能、及びシグナル蛍光に及ぼす温度の影響を試験するためにプレインキュベーションを有した。
増幅手順
増幅反応が実施された正確なステップは次の通りである：１）マスターミックスを調製する；２）標的を有するか又は標的を有しないプライマーを調製する；３）プレートごとに行われる反応の数に依存して９６ウェルプレートのＡ〜Ｇ列にプライマーミックスを添加する；４）同じ９６ウェルプレートのＨ列にマスターミックスを添加する；５）プレートを封鎖し、反応前インキュベーションを１５秒間行う；６）Ｈ列から各プライマーミックスの列にマスターミックスを転移させる；７）封鎖して、予め選択した温度プロファイル及びデータ収集を開始する。
【０１１２】
反応中、増幅産物は、以下に記述するように、分子ビーコンを使用して、全ての指数関数段階の終わりに測定された。反応混合物中の分子ビーコンの蛍光をモニターし、クエンチャーからフルオロフォアを分離する分子ビーコンに結合して蛍光を生成する反応中に生成される特異的な産物の量を測定した。
実施例２：未修飾のプライマーを使用した結果
この新規の増幅技術の可能性を実証するために、ゲノムＤＮＡ入力の６ログにわたり目標希釈ごとに４回繰り返し、無標的対照（ＮＴＣ）に対して２回繰り返して、ｑＳＴＡＲを実行した。未修飾プライマー（すなわち、化学修飾された異常な核酸塩基を含まないプライマー分子）を使用した実験の結果を図４に示す。「無標的対照」のシグナル（バックグラウンドを減算した蛍光）の量は、暗色の線（「ｎｔｃ」）で示される。２０ｃｐ、２００ｃｐ、２ｋ、２０ｋ、２００ｋ及び２Ｍコピーの標的（Ｃ．トラコマティス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）のゲノムＤＮＡ）の存在下で生成されるシグナルの量は、それぞれの線によって示される。
【０１１３】
ｑＳＴＡＲ反応は、標的入力からの線形決定係数を表示すると同時に、速度、感度、及び全蛍光の改善を実証する。標的入力間のこのような改善と分離が、近接しているが明確に異なる２つの温度領域間の反応の温度を制御することによって達成し得ることは、驚くべきことであり、予期しないことである。
【０１１４】
本発明者らを特定の理論に制限するものではないが、増幅の改善は、少なくとも２つの特性に起因し得ると考えられる。ほとんどの核酸増幅反応において、プライマー二量体は最終的に形成され、限定された試薬に対して競合し、低標的濃度ではプライマー二量体が反応の主増幅経路になる可能性があり得る。プライマー二量体の形成を、たとえ少量であっても、制限又は遅延させることで、有意な利益がもたらされる。増幅反応が急速であるという性質のために、プライマー二量体形成の遅延により、増幅の全ての局面を改善する有利な好ましい増幅経路（すなわち、鋳型生成）が可能となる。上昇した温度で反応を開始することにより、これらの鋳型経路が有利となり、さらに好ましい。これは、ｑＳＴＡＲ法における感度及び速度の向上、蛍光シグナルの向上、より厳密な複製及び速度の向上により見られる。
【０１１５】
開始段階では、反応は、上昇した温度、６２℃で行われる。この上昇した温度は、ニッキング酵素を永久的に機能的に損傷することなく選択的に阻害する（他の場所で説明されている増幅及び図９Ｂに関連して示される）。この開始段階では、反応温度がポリメラーゼの最適温度に比較的近いため、ポリメラーゼが比較的有利になり、急速且つ特異的な伸長が可能になる。
【０１１６】
反応の開始段階の後、温度はニッキング酵素の最適温度に近い温度に低下し、その結果、効率が向上し、鋳型生成が増加する。望ましい鋳型経路が不規則な経路よりも有利であったため、特異性及び感度が大幅に向上し、これは、ｑＳＴＡＲの温度往復及び酵素の選択的活性調節によってさらに促進される。
【０１１７】
反応混合物は、継続的に６２℃及び５７℃の間を往復し、正確な定量のために使用されることができる制御された急速増幅技術を提供する。
【０１１８】
本発明の新規の非等温増幅法は、等温反応及び二重鎖解離のために高温に依存するものを含む既存の増幅反応の多くのタイプに対して実質的な改善を提供する。「温度ゲーティング」によって酵素活性を制御し、反応動態を最適化することにより、本発明の方法は、検出の感度を向上しながら、増幅の一貫性及び制御を改善し、信頼性があり正確な定量を可能にする。
実施例３：２’Ｏ−メチル修飾プライマーを用いた結果
米国特許第６，７９４，１４２号明細書及び米国特許第６，１３０，０３８号明細書に記載されているように、２’Ｏ−メチル修飾プライマーの使用は、増幅中のプライマー二量体形成を減少させることが知られている。米国特許出願公開第２００５−００５９００３号明細書は、ＳＤＡプライマーの３’末端に位置する２’Ｏ−メチル修飾の使用を記載しており、これは、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩ及び誘導体は、ＤＮＡ合成のためのプライマーとして２’−修飾リボヌクレオチドを効率的に利用することができることを示唆している。１つ以上の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、２’−ヒドロキシル（ＲＮＡ）、４’−チオ、４’−ＣＨ３−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ３）３−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮ  Ａ、及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート、２’−Ｓｕｃ−ＯＨ））を含む標的特異的プライマー領域は、増幅反応を改善するであろう。単一の２’−Ｏ−メチル化塩基又はプライマーの３’側に位置する２’−Ｏ−メチル化塩基のストリングとともに、前の実施例で記述されるように反応は、酵素選択的温度往復（６２〜５７℃）を使用して、実行された（図３に概略的に図示される）。
【０１１９】
３’末端に１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドを含むプライマーを使用した増幅の結果を図５Ａ〜５Ｃに示す。反応は、５つのログ入力ｇＤＮＡ濃度の全てにおいて、最低４回の複製で行われ、標的対照反応はなかった。実証されているように、反応は５ログの範囲にわたり定量的であり、決定係数は、０．９９を超える（データは簡素化のために省略された）。決定係数は、Ｐｆａｆｆｌによって「Ａ  ｎｅｗ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ」，（２００１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（９）ｅ４５）に記載されたものと同様の方法を使用することにより計算された。指数関数的段階の開始点である増幅のＥＰは、ＥＰがバックグラウンド蛍光を超えて始まった場所を特定することによって決定された。バックグラウンド蛍光は、各反応の最初の３つの読み取りを平均することによって計算された。次に、各反応の相対蛍光が２，０００に達した時期に基づいてＥＰを決定した。各反応の既知の入力を使用して、線形回帰アルゴリズムを使用してＥＰを評価し、ログ値全体の決定係数を特定した。この標準曲線は、直線性について生成及び計算され、典型的には、ｑＳＴＡＲ反応では、Ｒの２乗値が．９９以上である。
【０１２０】
データは、単一の２’Ｏ−メチル化ヌクレオチドを組み込んだプライマーを使用すると増幅反応が停止し、入力の全ての濃度にわたってより良い分解能のために反応速度が遅くなることを図示している（図５Ａ）。さらに、ｑＳＴＡＲ法の使用は、２’Ｏ−メチル増幅の使用を改善しただけでなく、既知の増幅修飾による方法の機能性を示している。図５Ｂ及び５Ｃに示すように、プライマーに沿って追加の２’Ｏ−メチル化塩基を組み込むと、増幅の分離が改善されるか、又はベースラインから上昇して、より高い分解能を可能にし、技術の定量的能力が向上する。基本的に、各濃度間の分離は、２’Ｏ−メチル化塩基の使用によって引き起こされる反応の減速により改善される。例えば、未修飾のプライマーを使用した場合、ベースラインから上昇して１サイクル分離する反応は、２’ｏ−メチル化塩基を組み込んだプライマーを使用する場合には、２サイクルの分離を示す。これは、２’Ｏ−メチル修飾が本発明の例示された方法における非特異的、不規則な増幅の産生を減少させるが、これらの修飾のより大きな利点は、より高い分解能、及びより定量的な増幅を可能にするように反応速度を制御することであることを示唆している。
【０１２１】
本出願人を特定の理論に制限するものではないが、プライマー領域中の１つ以上の２’修飾ヌクレオチドを用いることによって得られる潜在的改善は、増幅の開始段階における増強に大きく起因すると仮定される。初期伸長段階中に、２つの事象が、本発明の増幅反応における２’修飾ヌクレオチドの活性を説明するのに役立つ。第一に、２’Ｏ−メチル化塩基は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の融解温度を下げることが知られており、鋳型：：鋳型相互作用を阻害する傾向があるため、開始がより制御され、そのために、プライマー間の相互作用によって形成される非特異的複合体のポリメラーゼ伸長の機会が減少する。第二に、ヌクレオチドが結合ポケットに入ると、ポリメラーゼが機能停止する可能性がある。非生産的反応（すなわち、オフ標的又はプライマー二量体形成）では、鋳型結合がその融解温度に近いため、機能停止効果は、異常伸長を最小限にするのに十分である。その結果として、２’修飾は、反応が鈍るため望ましくない増幅経路を制限することができる。ｑＳＴＡＲは、２’修飾を活用し、標的増幅をより調節して反応を調整し、定量能力を向上することができる。このポリメラーゼの機能停止は、ｑＳＴＡＲが２’Ｏ−メチル修飾と併せて互いに改善する理由をさらに説明する。本発明の例示された方法で見られる初期のポリメラーゼ温度領域は、プライマー二量体形成を減少されることに加えて、制御され信頼性のある方法で開始を遅くする。さらに、ｑＳＴＡＲは繰り返し低温へ往復するため、反応の進行に伴い、２’修飾による融解温度の低下を抑制することができる。
実施例４：再現性
ｑＳＴＡＲ技術の検証のために、米国特許第９，５６２，２６３号明細書に記載されているようにＳＴＡＲ及び他の公表された等温条件の性能に対して、ｑＳＴＡＲの性能を比較する大規模な反復研究が行われた。増幅（ｑＳＴＡＲ対ＳＴＡＲ対等温）は、標的を含有する反応については１００以上の複製を用い、標的を含まない対照反応混合物については１６の複製を用いて行った。全ての条件で、同じ緩衝液、ポリメラーゼ、ニッキング酵素及び標的を使用した。図６の散布図に示されるように、ｑＳＴＡＲ及びＳＴＡＲ増幅は、等温増幅反応と比較して、蛍光の閾値レベル（ＴＬ）への増幅を達成するための平均時間（ＡＴ）の明らかな改善、感度の向上、及び複製間の標準偏差の減少を示す。本発明に従って行われた反応のＡＴ時間は２．３８分であった一方、従来の等温プロトコルに従って実施された反応のＡＴ値は４．１２分であり、この差は統計学的に有意である（両側検定）。（注−失敗した反応は、１０分間の増幅時間−反応が実行された最大時間を有するとして示される）。さらに、ｑＳＴＡＲ法は、速度に関してＳＴＡＲ法よりも改善されている。ｑＳＴＡＲ技術は、最小数の外れ値で、最も厳密な複製、最高の感度、最速の増幅を実証した。本出願人を特定の理論に制限するものではないが、増幅時間の有意な減少は、反応の開始の改善によるものと考えられ、これは、より効率的な低コピー増幅、最小化されたプライマー二量体事象、及び以前に開示された方法よりも速い産物生成を可能とする増加した特異的産物の伸長、を可能とする。ニッキング酵素及びポリメラーゼの活性を活用することにより、より厳密な複製が実現され、望ましい鋳型の特異的で迅速な制御された増幅のための複数の機会が生成される。
実施例５：ｑＳＴＡＲ機能
本発明の方法の特徴は、増幅プロセス中に少ない温度変化を使用することによる酵素活性の調節を含み、その温度変化は、例えばｑＰＣＲの実施中に受けた変化よりもはるかに小さい。ニッキング酵素が開始段階で活性が低下しているが、指数関数的段階では活性が高いことを確認するために、発明者らは２つの独自のタンパク質活性アッセイ：ポリメラーゼ活性アッセイ（「ＰＡＡ」）及びニッキング活性アッセイ（「ＮＡＡ」）を開発した。
ポリメラーゼ活性アッセイの設計、酵素及びオリゴヌクレオチド：
ＰＡＡの合成オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成された。設計は、３つのオリゴヌクレオチドで構成される；鋳型オリゴ（ＮＥＦ）、（配列番号４  ５’−／５６−ＦＡＭ／ＡＣＣＧＣＧＣＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴ−３’）、プライミングオリゴ（ＰＯ）、（配列番号５  ５’−ＡＧＣＧＧＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＡ−３’）、及びクエンチングオリゴ（ＰＯＱ）、（配列番号６  ５’−ＧＧＴＧＣＧＣＧＣＧＧＴ／３ＢＨＱ＿１／−３’）。図７に示すように、これらの３つのオリゴヌクレオチドは、それぞれが独自の機能を持つ溶液中で複合体を形成する。ＮＥＦは、５’フルオロフォアを有し、ＰＯＱは、５’鋳型オリゴフルオロフォアにより放出された光量子を吸収する３’クエンチング部分を有する。ＰＯは、鎖置換ポリメラーゼがクエンチングオリゴを伸長及び置換する開始部位として機能し、クエンチングオリゴがもはや鋳型オリゴに近接していないため、蛍光を生成できる。活性の高い鎖置換ポリメラーゼは、活性の低いポリメラーゼ又は鎖（ｓｔａｎｄ）置換活性を欠くポリメラーゼと比較して、蛍光シグナルの生成速度が速くなる。
ポリメラーゼ活性アッセイ条件
基本的なポリメラーゼ活性アッセイ（ＰＡＡ）混合物は、５’−ＦＡＭ修飾を含む鋳型オリゴ（ＮＥＦ）、鋳型の３’末端にアニールするプライミングオリゴ（ＰＯ）、鋳型の５’末端にアニールする３’−ＢＨＱ１修飾を含むクエンチングオリゴ（ＰＯＱ）、及びテスト中のポリメラーゼ（上記を参照）が含まれている。反応は、０．２μＭのＮＥＦ、０．３μＭのＰＯ、０．７μＭのＰＯＱ、及び１Ｘ  ＰＡＡマスターミックスを含む２５μｌの最終容量で実施した。１Ｘ濃度のＰＡＡマスターミックスには、次の試薬：１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４、９０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３００μＭの各ｄＮＴＰ、１５ｍＭのＮＨ４ＣＨ３ＣＯ２、１５ｍＭのＮａ２ＳＯ４、５ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのＲｂ２ＳＯ４、１０ｍＭのＬ−スレオニン、及び０．０３Ｕ／μｌのポリメラーゼが含まれる。反応は、等温で行われ、特定の温度で選択的酵素活性を測定する。ＰＡＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｘ３００５Ｐ  ｑＰＣＲ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）で実施した。全ての反応は、試薬を選択した温度の影響を試験するための温度とし、反応が加熱されるのに伴う変動を防ぐことを可能にするための、反応前インキュベーションを有していた。各反応は、増幅動態、酵素性能、及びシグナル蛍光を評価した。
ニッキング活性アッセイ（ＮＡＡ）の設計、酵素及びオリゴヌクレオチド：
ＮＡＡの合成オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成された。アッセイには２つのオリゴヌクレオチド、鋳型オリゴ（ＮＥＱ）、（配列番号７  ５’−ＡＣＣＧＣＧＣＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＧＣＡ／３ＢＨＱ＿１／−３’）及びプライミングオリゴ（ＰＯＦ、配列番号８  ５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＴＧＣＣＧＡＣＡＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＧＣＧＣＧＧＴ−３’）が含まれる。図８に示すように、これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれが独自の機能を持つ溶液中で複合体を形成する。鋳型オリゴは、ニッキングエンドヌクレアーゼ活性及び下流の３’クエンチャーにつきニッキング部位を有する。プライミングオリゴは、相補的なニッキング部位配列及び５’フルオロフォアを有する。溶液中では、この２つがニッキング結合部位を完成させる複合体を形成し、ニッキングエンドヌクレアーゼを切断できる。ニッキングエンドヌクレアーゼによるニックに続くニック部位のオリゴヌクレオチドクエンチャー３’は、現在、低い融解温度を有している。反応は、この融解温度を超えて実施されるため、クエンチャーを含む短縮フラグメントが複合体から放出され、その結果、クエンチされない蛍光が生じる。ニッキング酵素がより活性化されるほど、蛍光シグナルがより速くより大きく生成される。
ニッキング活性アッセイ条件
基本的なＮＡＡ混合物には、３’−ＢＨＱ１修飾を含む鋳型オリゴ（ＮＥＱ）、及び鋳型にアニールする５’−ＦＡＭ修飾を含むプライミングオリゴ（ＰＯＦ）、及び試験されるためのニッキングエンドヌクレアーゼが含まれている。反応は、１．３μＭのＮＥＱ、１．６μＭのＰＯＦ、及び１Ｘ  ＮＡＡマスターミックスを含む２５μｌの最終容量で実施した。１Ｘ濃度のＮＡＡマスターミックスには、次の試薬：１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４、９０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５ｍＭのＮＨ４ＣＨ３ＣＯ２、１５ｍＭのＮａ２ＳＯ４、５ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのＲｂ２ＳＯ４、１０ｍＭのＬ−スレオニン、及び０．００８Ｕ／μｌのニッキングエンドヌクレアーゼが含まれる。反応は、等温で行われ、特定の温度で選択的酵素活性を測定する。ＮＡＡは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｘ３００５Ｐ  ｑＰＣＲ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）で実施した。全ての反応は、試薬を選択した温度の影響を試験するための温度とし、反応が加熱されるのに伴う変動を防ぐことを可能にするための、反応前インキュベーションを有していた。各反応は、増幅動態、酵素性能、及びシグナル蛍光を評価した。
酵素の温度プロファイル
図９Ａは、６つの等温条件のポリメラーゼ活性アッセイを示す。６３℃で、ポリメラーゼは、蛍光曲線の傾き及び全蛍光によって決定されるように、最も強力な活性と動態を有する。４０℃に到達するまで、６０℃、５５℃、５０℃及び４５℃と温度が継続して下がるごとに、活性は減少した。この低温では、ポリメラーゼの活性は実質的に存在しないように見える。
【０１２２】
図９Ｂは、６つの等温条件につきニッキング活性アッセイを示す。ｑＳＴＡＲ法の好ましい温度範囲の上限に向かって明確な最適温度を示すポリメラーゼアッセイとは異なり、ニッキング活性アッセイは、ｑＳＴＡＲ法の好ましい温度範囲の下限に向かって最適（約５５℃）を示すが、６３℃でほとんど又はまったく活性を示さない。他の全ての温度は、ニッキング酵素に対してある程度の活性を示す。
【０１２３】
これらのアッセイからのデータは、ｑＳＴＡＲ技術の特徴的な性質を示している。鎖置換及び／又は温度分離に依存する他の増幅方法とは異なり、ｑＳＴＡＲは独自に「温度ゲーティング」を使用し、酵素活性を調整し、急速な増幅を制御する。これらの酵素の独特の特徴及び活性に対する温度依存性を認識して、本発明者らは、未知の試料入力を６分未満で定量化できる新しい急速且つ特異的で制御された増幅技術を開発した。
【０１２４】
特定の理論に束縛されるものではないが、この実施例では、ｑＳＴＡＲはニッキング酵素が２つの温度間で増幅するため、ニッキング酵素の活性調節に関与すると考えられている。任意の定量的技術の要件である制御された増幅を可能にするため、６３℃と５７℃は、（現在のタンパク質活性プロファイルに基づく）上記の例示的なシステムにおいて好ましい温度選択である。さらに、未知の核酸物質の定量のための既知の効率的な増幅事象を管理するために、いずれかの酵素の活性を制御することが望ましいと考えられている。
実施例６：ｑＰＣＲポリメラーゼを使用したｑＳＴＡＲ増幅結果
ＰＣＲなどの他の増幅技術と比較してｑＳＴＡＲの予想外の特性を実証するために、一般的なＰＣＲポリメラーゼの比較が実施され、一般的なＰＣＲポリメラーゼ及び方法がｑＳＴＡＲ法で不活性であることを示した。４つのポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、Ｔａｑ及びＰｈｕｓｉｏｎは、以下の記述のように、ｑＰＣＲ法での増幅に使用され、ｑＳＴＡＲ法と比較された。分子ビーコンは特定の一本鎖ＤＮＡ産物の総量の増加のみを測定するため、非特異的増幅産物は、意図された増幅産物と独立して測定されることがない。全ての増幅産物の生成（例えば、プライマー二量体形成から生じるものを含む）を測定するために、反応は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの存在下で行われた。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉは、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び二本鎖ＤＮＡを検出するために知られている最も高感度な色素の１つである。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉは、低い固有の蛍光があるため、特異的及び非特異的反応両方の全増幅を検出するのに適しており、ｑＳＴＡＲ法で一般的なＰＣＲポリメラーゼが不活性であることを実証する。
ｑＰＣＲ／ｑＳＴＡＲアッセイの設計、マスターミックス、及びオリゴヌクレオチド：
インハウスｑＰＣＲアッセイ（Ｃｔｘ）用の合成オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成され、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ゲノムＤＮＡの増幅用に設計された。この設計は、２つのオリゴヌクレオチドで構成される；フォワードプライミングオリゴ（Ｃｔｘ＿Ｌ．Ｆ１、配列番号９ＡＡＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＴＴＡＧ）、及びリバースプライミングオリゴ（Ｃｔｘ＿Ｌ．Ｒ１＿３’（−２）、配列番号１０ＡＧＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＴＴ）。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により合成された。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核酸染色（Ｌｏｎｚａ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｉｎｃ．Ｐ／Ｎ  ５０５１３）は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）産物を検出するための挿入色素として使用された。使用したＰＣＲマスターミックス及びポリメラーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）からのものであった；１０Ｘ  Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反応緩衝液、Ｖｅｎｔ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ／Ｎ  Ｍ０２５７Ｓ）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（エキソ）（Ｐ／Ｎ  Ｍ０２５７Ｓ）、及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ／Ｎ  Ｍ０２６７Ｓ）、５Ｘ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液、及びＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ／Ｎ  Ｍ０５３０Ｓ）。ゲノムＤＮＡクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（系統：ＵＷ−３６／Ｃｘ）（Ｐ／Ｎ  ＶＲ−８８６Ｄ）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。
ｑＰＣＲ／ｑＳＴＡＲアッセイ条件
基本的なインハウスｑＰＣＲアッセイ（Ｃｔｘ）混合物には、フォワードプライマーオリゴ、リバースプライマーオリゴ、ｄｓＤＮＡ挿入色素、既知の濃度のゲノムＤＮＡ鋳型、市販の１Ｘ濃度のＰＣＲマスターミックス、及びそれに対応するポリメラーゼ（上記）を含んだ。反応は、０．３μＭのＦ１、０．３μＭのＲ１、０．１Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、市販の１Ｘ  ＰＣＲ  マスターミックス、０．０３Ｕ／μｌのポリメラーゼ、及び５，０００コピーのゲノムＤＮＡ鋳型を含む２５μｌの最終容量で実施した。
【０１２５】
インハウスｑＰＣＲアッセイは、ｑＳＴＡＲ技術又は従来のｑＰＣＲを複製した温度プロファイルの２つの方法を使用して実行した。ｑＳＴＡＲ法では、反応の温度は、酵素活性を利用するため２つの慎重温度間で制御された。実質的には開始段階（ポリメラーゼのみ活性）では、２秒間で６２℃の上昇した温度であった。指数関数段階（ポリメラーゼ及びニッキング酵素活性）は、５秒間で５７℃のニッキング酵素活性につき最適温度に近づいた。完全な往復の合計時間は１５秒で、これは、温度の変化による装置の限界により、最高温度と最低温度での滞留時間の２倍超である。ｑＰＣＲ反応は、２ステッププログラム；９５℃１５秒の後に６０℃６０秒、サイクル５０Ｘ倍を使用して実施された。増幅及びｑＳＴＡＲ産物の検出は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｘ３００５  Ｐ  ｑＰＣＲ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて実施した。
結果
図１０Ａ〜Ｂでは、無標的対照（「ｎｔｃ」）と比較した、ゲノムのクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ＤＮＡの５０００コピーのｑＰＣＲ増幅のリアルタイムデータを示す。明らかに見られるのは、ｑＰＣＲ法を使用した全てのポリメラーゼの増幅又は活性である。また、４つのポリメラーゼのうち３つは、おそらくプライマー二量体形成による、無標的条件で活性を示すことにも注意するべきである。ｑＳＴＡＲ法がｑＰＣＲ又は以前に報告された熱サイクリング増幅技術に類似している場合、ｑＳＴＡＲ法を使用してこれらのポリメラーゼの全て又は少なくとも１つが活性化されていることが予想される。
【０１２６】
図１１Ａ〜１１Ｄは、リアルタイムデータが、ｑＳＴＡＲ温度往復プロトコルの下で、無標的反応又はゲノムクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ＤＮＡの１０、１００、１Ｋ、１０Ｋコピーを使用した反応において、前述の４つ全てのポリメラーゼが任意の活性を示すことができないことを実証している。驚くべきことに、最適温度範囲で使用されているが、これらのポリメラーゼのうちのひとつも、インキュベーションの過程中、少量の活性でさえも示すことができない。本発明者らを特定の理論に限定するものではないが、これは以下に起因するものであると考えられている；（ａ）ｑＳＴＡＲ条件では、ニッキング酵素と連動して鎖置換ポリメラーゼを必要とする。この酵素の組み合わせがないと、産物のターンオーバーが進行できないため、増幅を進めることができない；及び（ｂ）ＰＣＲ及びその他のサイクリング法は、増幅の進行のためのアンプリコンを鎖分離するため上昇した温度（約９５℃）に依存している。ｑＳＴＡＲ法は、そのような上昇した温度を使用せず、代わりに（鎖分離ではなく）酵素活性の制御につき、より穏やかな温度往復を使用するため、これらの酵素がｑＳＴＡＲプロトコル条件で任意の活性を示すことができないことを説明するのに役立つ。
実施例７：ｑＳＴＡＲとｑＰＣＲを比較した結果
ｑＳＴＡＲの定量的な性質を示すために、対ｑＰＣＲで比較が実施された。ｑＳＴＡＲが定量的である場合、技術は決定係数が高く、ｑＰＣＲと比較してブラインド試料（ｂｌｉｎｄｅｄ  ｓａｍｐｌｅｓ）のゲノムＤＮＡの量を正確に予測できることが期待される。
Ｃ．トラコマティス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｑＰＣＲアッセイの設計、マスターミックス、及びオリゴヌクレオチド：
Ｃ．トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｑＰＣＲアッセイ（ＣｔＰ）の合成オリゴヌクレオチド（１）は、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ゲノムＤＮＡの増幅用に設計された。このアッセイは、３つのオリゴヌクレオチド；フォワードプライミングオリゴ、リバースプライミングオリゴ、及び二重標識プローブの使用が含まれる。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により合成された。使用したＰＣＲマスターミックスであるＰｒｉｍｅＴｉｍｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐ／Ｎ  １０５５７７０）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入された。ゲノムＤＮＡクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（系統：ＵＷ−３６／Ｃｘ）（Ｐ／Ｎ  ＶＲ−８８６Ｄ）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。
Ｃ．トラコマティス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｑＰＣＲアッセイ条件
基本的なｑＰＣＲアッセイ（ＣｔＰ）混合物には、２つのプライマー、ポリメラーゼ及びゲノムＤＮＡが含まれていた。反応は、０．３μＭのフォワードプライマー、０．３μＭのリバースプライマー、０．１μＭの二重標識プローブ、市販の１Ｘ  ＰＣＲマスターミックス、及び１００，０００コピーから開始される様々な濃度のゲノムＤＮＡ鋳型を含む２５μｌの最終容量で実施された。ゲノムＤＮＡの１０倍希釈を使用して、標準曲線を作成した。ｑＳＴＡＲは、前述の標準曲線とともに前述のように実施された。ｑＰＣＲ反応は、２ステッププログラム；９５℃１５秒の後に６０℃６０秒、サイクル５０Ｘ倍を使用して実施された。
結果
図１２は、標準曲線及び５つの未知の試料につきｑＰＣＲリアルタイムデータを示す。標準曲線の決定係数は、５ログの範囲にわたり０．９９８４であった。ｑＰＣＲは５つの全ての未知試料を正しく呼び出すことができた。図１３は、標準曲線及び５つの未知の試料につきｑＳＴＡＲリアルタイムデータを示す。標準曲線の決定係数は、６ログの範囲にわたり０．９９８１であった。ｑＳＴＡＲは５つの全ての未知の試料を正しく呼び出すことができた。表２は、２つの技術の概要の比較を示し、この定量化の技術を使用した場合、ｑＳＴＡＲがｑＰＣＲと同等であることは概要から明らかである。
【０１２７】
【表２】
2021509814.tif 000004
【０１２８】
実施例８：ｑＳＴＡＲの上昇した温度の範囲
ｑＳＴＡＲ技術のさらなる利点は、様々な温度範囲にわたって増幅が可能であることである。米国特許第５，７１２，１２４号明細書、同第９，５６２，２６３号明細書、同第５，３９９，３９１号明細書、及び同第６，８１４，９４３号明細書に記載されているように、ほとんどの技術は、増幅が起こり得る厳密な温度範囲を有し、これらの範囲から逸脱すると反応が阻害される。ｑＳＴＡＲの汎用性を実証するために、以下の表３に記載のように増幅を行った。
【０１２９】
【表３】
2021509814.tif 000005
【０１３０】
図１４Ａ，１４Ｂ、１４Ｃ及び１４Ｄは、時間（分）に対する蛍光（任意単位）のグラフである。図１４Ａは、６３℃から反応を開始した結果を示す。図１４Ｂは、６４℃から反応を開始した結果を示す。図１４Ｃは６５℃から反応を開始した結果を示し、図１４Ｄは６６℃から反応を開始しｃた結果を示す。全てのケースで、「無標的」の陰性対照反応は全く蛍光シグナルを生成しなかったが、１０、１００、及び１，０００コピーの増幅は良好であった。６３℃で反応の蛍光シグナルはわずかに高かったが、全ての温度条件では、３分未満で強力な増幅を実証した。酵素調節が達成される限り、ｑＳＴＡＲ法は十分に増幅することができる。６２℃を超える温度では、ニッキング酵素活性が顕著に低下すると考えられている（例示のニッキング酵素に関して、Ｎｔ．Ｂｓｔ  ＮＢＩ）。
実施例９：既知の温度範囲外のｑＳＴＡＲ
米国特許第６，８１４，９４３号明細書に記載されている定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、熱サイクルの温度範囲を記載している。典型的には、ｑＰＣＲの場合、次の手順が行われる：約９５℃の変性、約５５℃のアニーリング、約７０℃の伸長。技術が明らかに異なる温度領域で増幅できるならば、それは驚くべきことであり、予想外のことである。さらに、当技術分野の知識を有する個人は、技術が機能するためにそのような大きな温度幅を期待しないであろう。国際公開第２０１１／０３０１４５Ａ１号パンフレットは、アッセイ温度が１５℃以下、より好ましくは約５℃の公表されている等温度設定点あたりで振動する「揺らぎ」を記載する。一部の等温技術のこの温度「振動」により、増幅動態が向上した。ｑＳＴＡＲが、劇的に異なる温度範囲で機能し、それでも増幅に達成することができるとしたら、それは驚くべきことである。
増幅条件
低温ｑＳＴＡＲ混合物は２つのプライマーを含む（配列番号１１（５’−ｔＧＡＣＴＣＣＡｃＡｃＧＧＡＧＴＣａｔａａＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣｍＵＡ−３’）及び配列番号１２（５’−ＴＧＡＣＴＣＣＡｃＡｃＧＧＡＧＴＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡ−３’））、ＡｒｔｉｃＺｙｍｅｓ（Ｔｒｏｍｓｏ、Ｎｏｒｗａｙ）によって供給されるＩｓｏｐｏｌポリメラーゼ、及びニッキング酵素（前述）。反応は、１．０μＭのフォワードプライマー、０．５μＭのリバースプライマー、０．２５μＭの分子ビーコン（配列番号１３（５’−／５６−ＦＡＭ／ｔｇａｇｇＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’））、１０μｌのｑＳＴＡＲマスターミックス及び５μｌのＤＮＡ試料を含む２５μｌの最終容量で実施した。ｑＳＴＡＲマスターミックスには、以下の試薬：１２．５ｍＭのＭｇＳＯ４、９０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、３００μＭの各ｄＮＴＰｓ、２０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ、３０ｍＭのＮａＯＡｃ、２ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１２．５Ｕのニッキングエンドヌクレアーゼ、７５Ｕのポリメラーゼが含まれていた。反応の温度は、固有の酵素活性を利用するために、２つの慎重温度段階（ｄｉｓｃｒｅｅｔ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｈａｓｅｓ）の間で制御された。主にポリメラーゼ及びニッキング活性からなる指数関数段階では、２秒間で４５℃の上昇した温度であった。ポリメラーゼの活性が高く、ニッキング酵素の活性が大幅に低下していた開始段階では、５秒間、３８℃に保持された。完全な往復の合計時間は１５秒であり、これは、温度の変化による装置の限界により、各最高温度と最低温度での滞留時間の２倍超である。増幅及びｑＳＴＡＲ産物の検出は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｘ３００５  Ｐ  ｑＰＣＲ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて実施した。
結果
図１５は、上記の参照範囲で増幅するｑＳＴＡＲのリアルタイム定量データを示す。最初に注意する必要があるのは、この実施例では、前の実施例と比較して、温度段階が切り替わっていることであり、高温段階は指数関数的増幅用で、両方の酵素が活性化している。一方で、低温は開始用であり、ポリメラーゼは非常に活性であり、ニッキング酵素は比較的抑制されている。ｑＳＴＡＲ及びそのような「低温」ｑＳＴＡＲの温度差は、２４℃である。技術がそのような広範囲の温度で機能できることは、驚くべきことであり、予期せぬことである。さらに、本発明者の知る限りでは、技術はこの増幅法が既知の増幅法と異なることを示している。
【０１３１】
本発明者らを特定の理論に限定するものではないが、ニッキング酵素活性はより低温度で大幅に低下するので、ｑＳＴＡＲはこれらの低温でも増幅を達成することができると考えられている。この酵素のゲーティングにより、鋳型の制御された正確な増幅が可能になり、本発明者は、複数の酵素、プライマー、及び温度スキームを単独の反応で使用して、新しく迅速で定量的な結果を達成できる多くの方法を想定できる。
実施例１０：リボ核酸を使用した結果
ｑＳＴＡＲは、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ及びｇＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、ＲＮＡ／ＤＮＡ類似体、糖類似体、ハイブリッド、ポリアミド核酸及び他の既知のアナログの任意の組成物を用いて、任意の核酸から増幅することができる。リボソームＲＮＡの増幅は以下に記述するように行った。
酵素、オリゴヌクレオチド、及び標的：
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ｑＳＴＡＲ  ＲＮＡアッセイの開発の標的として用いられた。リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８８６）ゲノムＤＮＡをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。初期スクリーニングをｇＤＮＡ上で実施し、リボソームＲＮＡの２３Ｓ領域がプライマーＬＭＯＮＦ７２  ＡＣＡＣ  ５−ＯＭ（配列番号１４、５’−ＧＧＡＣＴＣＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＣＣＡＧＴＴＡＣＧＡＴＴｍＴｍＧｍＴｍＴｍＧ−３’）及びＬＭＯＮＲ８６  ＡＴＡＴ（配列番号１５、５’−ｇＧＡＣＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＴＣＣＴＡＣＧＧＣＴＣＣＧＣＴＴＴＴ−３’）で増幅されることが見出された。得られたＤＮＡ鋳型を分子ビーコン、欧州特許第０７２８２１８号明細書に記載されるＬＭＯＮＭＢ１（配列番号１６、５’−ＦＡＭ／ｇｃｔｇｃＧＴＴＣＣＡＡＴＴＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＧＣａｇｃ／ＢＨＱ１−３’）を用いて検出した。
【０１３２】
Ｍｉｎｉ  Ｂｅａｄ  Ｍｉｌｌ  ４（ＶＷＲ）での急速機械溶解と組み合わせ、ＲＮｅａｓｙ  ＰｌｕｓミニキットＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて全ＲＮＡを単離した。リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−２６６０）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、脳−心臓注入寒天プレート（ＢＨＩ）上にプレーティングすることによって再生した。単一コロニーを用い、３７℃で１８時間増殖させて定常段階に達した２５ｍＬのＢＨＩ培地に接種した。次に、培養物を２５０ｍＬフラスコに入れた２つのＢＨＩの５０ｍＬ量に逆希釈し、回収前にさらに４時間培養した。５，０００ｘｇで１５分間逆希釈した培養液の３０ｍＬアリコートから細菌を回収した。ペレットを再懸濁し、５ｍＬのＲＮＡｌａｔｅｒ  ＲＮＡ安定化試薬（Ｑｉａｇｅｎ）に混合し、室温で１０分間インキュベートした。細菌は回収され、５ｍＬのＲＬＴ細胞溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）で再懸濁し、設定５（３ｘ３０秒、パルス間に氷上で１分）のＭｉｎｉ  Ｂｅａｄ  Ｍｉｌｌ（ＶＷＲ）でホモジナイズした。
【０１３３】
全ＲＮＡを製造業者の指示に従って精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。ゲノムＤＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ精製キット中に提供されるＤＮＡ結合カラムに溶解物を通過させることによって除去した。ゲノムＤＮＡ汚染は、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ結合カラムでの試料のカラム上ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを利用することによってさらに減少した。Ｂｓｔ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｅｖｅｒｌｙ  Ｑｉａｇｅｎ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。逆転写酵素であるＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔはＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。米国特許第６，１９１，２６７号明細書に記載されるＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から購入した。オリゴヌクレオチド及び分子ビーコンは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成された。
増幅条件：
基本のｑＳＴＡＲ混合物は、上記実施例１に記載されたもの全てを含有し、さらに、４Ｕの逆転写酵素（上記参照）を含む。
結果
結果を時間（分）に対する蛍光（任意単位）のグラフである図１６に示す。陰性対照反応は蛍光シグナルを全く生成しなかったが、１００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００コピー数の標的反応は、閾値を超える蛍光シグナルを生成した。結果は、逆転写ＲＮＡ標的からｑＳＴＡＲは効果的に増幅することができることを示す。さらに、このデータは、未知のＲＮＡ試料入力の定量化に使用できることを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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