(57)【要約】  本発明は、タンパク質Ｔｕｆ、ＮＯＸ、ＭＳ５３−０２８５、またはその組み合わせを活性成分として含む、マイコプラズマ属菌感染を予防または治療するための組成物を提供する。本発明の組成物は、マイコプラズマ属菌感染によって生じる症候を軽減させる効果を有する。
2021501194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｕｆ、ＮＯＸ、ＭＳ５３−０２８５、またはその組み合わせを含む活性成分であって、前記Ｔｕｆが配列番号０１の配列を含み、前記ＮＯＸが配列番号０２の配列を含み、かつ前記ＭＳ５３−０２８５が配列番号０３の配列を含む、活性成分と、
薬学的に許容可能なアジュバントと
を含む、マイコプラズマ・シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ）感染によって生じる症候を軽減するための組成物。
【請求項２】
前記活性成分が、Ｔｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３−０２８５からなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記活性成分が、Ｔｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３−０２８５を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記活性成分が、前記組成物の全容積に基づいて４０〜９００μｇ／ｍＬの濃度を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記薬学的に許容可能なアジュバントが、完全フロイントアジュバントもしくは不完全フロイントアジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、ポリアニオンアジュバント、ペプチド、油エマルジョン、またはその組み合わせである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
薬学的に許容可能な添加物をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記薬学的に許容可能な添加物が、溶媒、安定剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、またはその組み合わせである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候が、気管の病変、気嚢の病変、関節炎、またはその組み合わせである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候が、前記活性成分がＴｕｆを含むならば、少なくとも関節炎である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候が、前記活性成分がＮＯＸ、ＭＳ５３−０２８５、またはその組み合わせを含むならば、少なくとも気嚢の病変である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候が、前記活性成分がＭＳ５３−０２８５を含むならば、少なくとも気管の病変である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候が、気管の病変、気嚢の病変、および関節炎である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１３】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、またはその組み合わせのヌクレオチド配列、
プロモーターおよびリボソーム結合部位を含む発現エレメント、および
融合パートナー配列
を含む、発現ベクター。
【請求項１４】
タンパク質Ｔｕｆ、ＮＯＸ、ＭＳ５３−０２８５、またはその組み合わせとして翻訳されるヌクレオチド配列であって、前記Ｔｕｆが配列番号０１の配列を有し、前記ＮＯＸが配列番号０２の配列を有し、かつ前記ＭＳ５３−０２８５が配列番号０３の配列を有する、ヌクレオチド配列と、
プロモーターおよびリボソーム結合部位を含む発現エレメントと、
融合パートナー配列と
を含む、発現ベクター。
【請求項１５】
前記融合パートナーが、大腸菌由来のＤｓｂＣ、大腸菌由来のＭｓｙＢ、大腸菌由来のＦｋｌＢ、またはその組み合わせである、請求項１３または１４に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
配列番号０７、配列番号０８、または配列番号０９の配列を有する、請求項１３または１４に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる症候を軽減するための組成物を調製するためのタンパク質の使用であって、前記タンパク質が、Ｔｕｆ、ＮＯＸ、ＭＳ５３−０２８５、またはその組み合わせを含み、前記Ｔｕｆが、配列番号０１の配列を有し、前記ＮＯＸが配列番号０２の配列を有し、かつ前記ＭＳ５３−０２８５が配列番号０３の配列を有する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、マイコプラズマ属菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）感染を予防または治療するための組成物、特に、マイコプラズマ・シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ）を予防または治療するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ属菌は、細胞外で自己複製し得る最も小さい原核生物として現在知られている。これらは、０．３〜０．９μｍの直径を有する球状、または１μｍの長さを有するフィラメント様である。選好性の細菌であるため、これらは培養が困難であり、これらの成長速度は非常に遅い。いくつかのタイプのマイコプラズマ属菌が多くのヒトまたは動物の疾患に関連していることが知られている。
研究によって、家禽が、マイコプラズマ疾患に関するＯＩＥ（世界動物保健機関）の文献において列挙されている病原微生物であるマイコプラズマ・シノビエを含む数十のタイプのマイコプラズマ属菌に感染し得ることが示されている。したがって、マイコプラズマ・シノビエは、家禽における予防または治療について考慮に入れるべき重要な病原体である。
マイコプラズマ・シノビエは、滑膜炎または関節炎を生じさせ得る。ブロイラー鶏におけるマイコプラズマ・シノビエ感染では、飼料効率が低下し、死亡率および家禽の屠体廃棄率が上昇する。育種鶏および産卵鶏におけるマイコプラズマ・シノビエ感染では、産卵率が低下し、胚の死亡率が上昇する。鶏におけるマイコプラズマ・シノビエ感染によって、家禽農家にとって著しい財政上の損失を生じさせる、ウイルス性病原体または細菌性病原体によって生じる第２の感染が生じる可能性がより高くなる。世界中の獣医学用ワクチンの製造者が、家禽産業向けの生ワクチンおよび不活化ワクチンを開発してきている。しかし、マイコプラズマ・シノビエの培養は困難であり、コストがかかる。したがって、この分野において、マイコプラズマ・シノビエ感染を予防および治療するために使用され得るワクチンが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
したがって、本開示の１つの目的は、マイコプラズマ・シノビエサブユニットワクチンにおける使用に適した抗原を提供し、それによって、サブユニットワクチンを生産して、疾患を防止するコストを低減させることである。
本開示の別の目的は、マイコプラズマ・シノビエ感染を予防および治療するために使用され得る、複数の抗原を有するサブユニットワクチンを提供することである。このようなワクチンは、単抗原ワクチンよりも優れた防御を提供する。
この目的のために、本開示は、Ｔｕｆ、ＮＯＸ、ＭＳ５３−０２８５、およびその組み合わせを含む活性成分であって、前記Ｔｕｆが配列番号０１の配列を有し、前記ＮＯＸが配列番号０２の配列を有し、かつ前記ＭＳ５３−０２８５が配列番号０３の配列を有する、活性成分と、薬学的に許容可能なアジュバントとを含む、マイコプラズマ・シノビエ感染を予防するための組成物を提供する。
【０００４】
好ましくは、前記活性成分は、Ｔｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３−０２８５からなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質である。さらに好ましくは、前記活性成分は、Ｔｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３−０２８５を含む。
さらに好ましくは、前記活性成分は、前記組成物の全容積に基づいて４０〜９００μｇ／ｍＬの濃度を有する。
場合により、前記薬学的に許容可能なアジュバントは、完全フロイントアジュバントもしくは不完全フロイントアジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、ポリアニオンアジュバント、ペプチド、油エマルジョン、またはその組み合わせである。
好ましくは、前記組成物は、薬学的に許容可能な添加物をさらに含む。場合により、前記薬学的に許容可能な添加物は、溶媒、安定剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、またはその組み合わせである。
【０００５】
好ましくは、マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候は、気管の病変、気嚢の病変、関節炎、またはその組み合わせである。
好ましくは、マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候は、前記活性成分がＴｕｆを含むならば、少なくとも関節炎である。好ましくは、マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候は、前記活性成分がＮＯＸおよびＭＳ５３−０２８５またはその組み合わせを含むならば、少なくとも気嚢の病変である。さらに好ましくは、マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候は、前記活性成分がＭＳ５３−０２８５を含むならば、少なくとも気管の病変である。
好ましくは、マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候は、前記活性成分がＴｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３−０２８５を含むならば、気管の病変、気嚢の病変、および関節炎である。
本開示はまた、配列番号４、配列番号５、配列番号６、またはその組み合わせのヌクレオチド配列と、プロモーターおよびリボソーム結合部位を含む発現エレメントと、融合パートナー配列とを含む、発現ベクターを提供する。
本開示はさらに、タンパク質Ｔｕｆ、ＮＯＸ、ＭＳ５３−０２８５、またはその組み合わせとして翻訳されるヌクレオチド配列であって、前記Ｔｕｆが配列番号０１の配列を有し、前記ＮＯＸが配列番号０２の配列を有し、かつ前記ＭＳ５３−０２８５が配列番号０３の配列を有する、ヌクレオチド配列と、プロモーターおよびリボソーム結合部位を含む発現エレメントと、融合パートナー配列とを含む、発現ベクターを提供する。
【０００６】
好ましくは、前記融合パートナーは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＤｓｂＣ、大腸菌由来のＭｓｙＢ、大腸菌由来のＦｋｌＢ、またはその組み合わせである。
好ましくは、前記発現ベクターは、配列番号０７、配列番号０８、または配列番号０９の配列を有する。
本開示はさらに、マイコプラズマ・シノビエ感染を予防および治療するための組成物を生産するためのタンパク質の使用であって、前記タンパク質がＴｕｆ、ＮＯＸ、ＭＳ５３−０２８５、またはその組み合わせを含み、前記Ｔｕｆが配列番号０１の配列を有し、前記ＮＯＸが配列番号０２の配列を有し、かつ前記ＭＳ５３−０２８５が配列番号０３の配列を有する、使用を提供する。
上記の観点から、本開示は、マイコプラズマ・シノビエ感染を予防および治療するために使用される、またサブユニットワクチンのための活性成分としての、抗原を開示する。本開示の結果は、マイコプラズマ・シノビエ感染を予防するための新規な選択肢を提供するだけではなく、２つ以上の抗原を組み合わせる（すなわち、２つ以上の抗原を活性成分として含有する）「カクテル」サブユニットワクチンがより優れた免疫誘導効果を有することを開示している。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の実施例４の結果を示す図である。（Ａ）タンパク質電気泳動を使用して、本開示において製造された組換え抗原の溶解度を評価した（Ｔは細胞溶解物全体を表し、Ｓは可溶性画分を表す）。（Ｂ）タンパク質電気泳動を使用して、本発明において精製された組換え抗原の純度を評価した。
【図２】本発明の実施例５の、鶏血清における正のマイコプラズマ・シノビエ特異的抗体応答を示す図である。
【図３】本発明の実施例５における、マイコプラズマ・シノビエに感染した鶏の足蹠の厚みの増大のレベルを示す図である。
【図４】本発明の実施例５における、マイコプラズマ・シノビエに感染した鶏の足蹠の温度の上昇のレベルを示す図である。
【図５】本発明の実施例５における、マイコプラズマ・シノビエに感染した鶏の足蹠感染のスコアを示す図である。
【図６】（Ａ）本発明の実施例５における、マイコプラズマ・シノビエに感染した鶏の気嚢の病変のスコア、および（Ｂ）実施例５における鶏の気管粘膜の厚みを示す図である。統計は、本開示のワクチンが陽性対照群と比較して統計的に有意であることを示す（Ｔ検定、†：ｐ＜０．１）。
【図７】本発明の実施例６の、鶏の血清における正のマイコプラズマ・シノビエ特異的抗体応答を示す図である。
【図８】本発明の実施例７の、鶏の血清における正のマイコプラズマ・シノビエ特異的抗体応答を示す図である。
【図９】本発明の実施例７における、マイコプラズマ・シノビエに感染した鶏の１日増体量の平均を示す図である。
【図１０】本発明の実施例７における、マイコプラズマ・シノビエに感染した鶏によって示される足蹠の厚みの変化を示す図である。統計は、本開示のワクチンが陽性対照群と比較して統計的に有意であることを示す（Ｔ検定、†：ｐ＜０．１）。
【図１１】本発明の実施例７における、マイコプラズマ・シノビエに感染した鶏によって示される足蹠の温度の変化を示す図である。統計は、本開示のワクチンが陽性対照群と比較して統計的に有意であることを示す（Ｔ検定、*：ｐ＜０．０５）。
【図１２】本発明の実施例８の、鶏の血清における正のマイコプラズマ・シノビエ特異的抗体応答を示す図である。
【図１３】本発明の実施例８における、マイコプラズマ・シノビエに感染した鶏の１日増体量の平均を示す図である。統計は、本開示のワクチンが陽性対照群と比較して統計的に有意であることを示す（Ｔ検定、*：ｐ＜０．０５）。
【図１４】本発明の実施例８における、マイコプラズマ・シノビエに感染した鶏によって示される足蹠の温度の変化を示す図である。統計は、本開示のワクチンが陽性対照群と比較して統計的に有意であることを示す（Ｔ検定、†：ｐ＜０．１、*：ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示の開発成果は、Ｔｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３−０２８５がマイコプラズマ・シノビエ感染を予防および治療するためのサブユニットワクチンにおける活性成分として使用され得ることを証明している。本明細書における表現「マイコプラズマ・シノビエ感染を予防および治療すること」は、家禽におけるマイコプラズマ・シノビエの感染レベルを低減させること、例えば、マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる疾患を軽減させることを指す。前記疾患としては、限定はしないが、気管の病変、気嚢の病変、または関節炎（足蹠の腫れもしくは足蹠の炎症など）が含まれる。科学的観点から、対象が前記病原微生物に全く感染していないかどうかを実証することは不可能である。したがって、疾患予防の分野における当業者には、「予防および治療する」行為が、対象が前記病原微生物のいずれかに感染することを防ぐことを意図しているわけではないことが理解され得る。
【０００９】
一態様では、本開示は、マイコプラズマ・シノビエ感染を予防および治療するための組成物に関する。好ましい一実施形態では、組成物は、サブユニットワクチンである。好ましい一実施形態では、組成物は、Ｔｕｆを活性成分として含み、前記Ｔｕｆは配列番号０１の配列を有する。別の好ましい実施形態では、組成物はＮＯＸを活性成分として含み、前記ＮＯＸは配列番号０２の配列を有する。さらに別の好ましい実施形態では、組成物は、ＭＳ５３−０２８５を活性成分として含み、前記ＭＳ５３−０２８５は配列番号０３の配列を有する。
当業者には、前記タンパク質上の抗原決定基が影響を受けない限りにおいて、前記アミノ酸配列がある程度改変され得、そして依然として本発明の範囲に含まれることが容易に理解されよう。例えば、前記配列内のわずかなアミノ酸が当業者によって改変され得るが、本明細書において記載される免疫誘導効果は依然として生じ得る。あるいは、当業者の要求に基づいて、他の配列を前記配列に付加して、本明細書において記載される免疫誘導効果に影響することなく生産を容易にすることができる。これに関して、修飾された配列は、依然として本発明の範囲に含まれる。
【００１０】
一実施形態では、前記活性成分がＴｕｆを含む場合、マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候は、少なくとも関節炎である。それでも、前記活性成分がＴｕｆを含むという事実は、前記活性成分が他の疾患の予防において効果を有さないことを示唆するわけではなく、むしろ、前記活性成分が関節炎の予防においてより効果的であることを示唆する。
一実施形態では、前記活性成分がＮＯＸ、ＭＳ５３−０２８５、またはその組み合わせを含む場合、マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候は、少なくとも気嚢の病変である。それでも、前記活性成分がＮＯＸ、ＭＳ５３−０２８５、またはその組み合わせを含むという事実は、前記活性成分が他の疾患の予防において効果を有さないことを示唆するわけではなく、むしろ、前記活性成分が気嚢の病変の予防においてより効果的であることを示唆する。
一実施形態では、前記活性成分がＭＳ５３−０２８５を含む場合、マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候は、少なくとも気管の病変である。それでも、前記活性成分がＭＳ５３−０２８５を含むという事実は、前記活性成分が他の疾患の予防において効果を有さないことを示唆するわけではなく、むしろ、前記活性成分が気管の病変の予防においてより効果的であることを示唆する。
【００１１】
一実施形態では、前記活性成分がＴｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３−０２８５を含む場合、マイコプラズマ・シノビエ感染によって生じる前記症候は、少なくとも気管の病変、気嚢の病変、および関節炎である。
別の態様では、本開示は、マイコプラズマ・シノビエ感染の予防または治療に使用されるカクテルワクチンに関する。本明細書において記載されるカクテルワクチンは、２つ以上の抗原を含有する。好ましい実施形態では、本明細書において記載されるカクテルワクチンは、同一タイプの病原微生物に由来する２つ以上の抗原を含有する。通常、２つ以上の抗原を単一のワクチンにおいて組み合わせることは、ワクチンの免疫誘導効果に対して必ずしも相乗的に寄与するわけではない。逆に、このことによって、２つ以上の抗原の免疫誘導効果が互いに打ち消し合うという好ましくない結果が生じ得る。コストの点では、２つ以上の抗原の免疫誘導効果が互いに打ち消し合わないとしても、相乗効果がなければ、これらの２つ以上の抗原を単一のワクチンにおいて組み合わせることは有意義ではない。
【００１２】
好ましい実施形態では、前記カクテルの活性成分は、タンパク質Ｔｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３−０２８５からなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質である。さらに好ましくは、前記活性成分は、Ｔｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３−０２８５を含む。考えられる実施形態では、フォールディング形態の前記アミノ酸配列上の抗原決定基が破壊されていない限りにおいて、前記活性成分は、前記アミノ酸配列のいずれか２つ以上を有する融合タンパク質であり得る。別の考えられる実施形態では、前記カクテルワクチンは、互いに独立している前記タンパク質を使用する。
好ましい実施形態では、本開示の組成物はさらに、薬学的に許容可能なアジュバントおよび／または薬学的に許容可能な添加物を含む。前記薬学的に許容可能なアジュバントは、ワクチンとして使用される場合の、活性成分の免疫誘導効果を増強させるため、活性成分の安定性を維持するため、および前記組成物の安全性を増強させるために使用される。前記薬学的に許容可能なアジュバントとしては、限定はしないが、完全フロイントアジュバントもしくは不完全フロイントアジュバント、アルミナゲル、界面活性剤、ポリアニオンアジュバント、ペプチド、油エマルジョン、またはその組み合わせが含まれる。前記薬学的に許容可能な添加物としては、限定はしないが、溶媒、安定剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、またはその組み合わせが含まれ得る。
【００１３】
考えられる実施形態では、本開示の組成物は、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、筋肉内投与、または腹腔内投与される製剤に作製することができる。考えられる実施形態では、本開示の組成物中の活性成分は、前記組成物の全容積に基づいて４０〜９００μｇ／ｍＬの濃度を有する。別の考えられる実施形態では、本開示の組成物中の活性成分は、前記組成物の全容積に基づいて４０〜６００μｇ／ｍＬの濃度を有する。本発明のカクテルワクチンでは、前記活性成分の濃度は、前記カクテルワクチンに含有される全ての抗原の総濃度である。一実施形態では、例えば、本開示のカクテルワクチンが前記Ｔｕｆ抗原および前記ＮＯＸ抗原を活性成分として含有する場合、前記「活性成分の濃度」は、前記Ｔｕｆ抗原の濃度および前記ＮＯＸ抗原の濃度の合計である。別の実施形態では、本開示のカクテルワクチンが前記Ｔｕｆ抗原、前記ＮＯＸ抗原、および前記ＭＳ５３−０２８５を活性成分として含有する場合、前記「活性成分の濃度」は、前記Ｔｕｆ抗原の濃度、前記ＮＯＸ抗原の濃度、およびＭＳ５３−０２８５抗原の濃度の合計である。
【００１４】
他方、前記活性成分を原核生物発現系において発現させる上で支障となるものは、発現した活性成分を前記原核生物発現系から精製することである。原核生物発現系において発現した組換えタンパク質は、典型的には不溶性であり、そのため、精製プロセスがより困難となり、コストがかかる。これに関して、本開示の抗原発現ベクターの１つの利点は、可溶性の組換え抗原を発現させ、それによって、精製プロセスを簡素化し、そのコストを低下させる能力である。
したがって、別の態様では、本開示は、前記Ｔｕｆ、ＮＯＸ、またはＭＳ５３−０２８５を生産するために使用される発現ベクターに関する。本開示の発現ベクターは、ヌクレオチド配列、発現エレメント、および融合パートナー配列を含む。前記ヌクレオチド配列は、Ｔｕｆ、ＮＯＸ、ＭＳ５３−０２８５、またはその組み合わせとして翻訳され得る。
前記発現エレメントは、発現系における転写プロセスおよび翻訳プロセスを開始するために必要なエレメントを指す。前記発現エレメントは、プロモーターおよびリボソーム結合部位を少なくとも含んでいる。好ましくは、前記発現エレメントは、オペレーター、翻訳／転写を増強させるためのエンハンサー配列、またはその組み合わせをさらに含み得る。好ましい実施形態では、前記発現ベクターは大腸菌発現系において使用され、前記発現エレメントは大腸菌によって認識され得る。
【００１５】
好ましい実施形態では、本開示の調査は、大腸菌由来のＤｓｂＣ、大腸菌由来のＭｓｙＢ、大腸菌由来のＦｋｌＢ、またはその組み合わせが、本発明の前記抗原の発現のための融合パートナーとして好ましくは使用され、それによって、組換えタンパク質が原核生物発現系において可溶性形態として生産されることを証明した。好ましい実施形態では、精製プロセスを容易にするために、前記発現ベクターは、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、またはその組み合わせをコードする配列をさらに含み得、その結果、得られた組換えタンパク質は、ニッケルイオンアフィニティーカラムまたはグルタチオンアフィニティーカラムを使用して精製することができる。
さらに別の態様では、本開示は、マイコプラズマ・シノビエ感染を予防および治療するための、前記Ｔｕｆ、ＮＯＸ、またはＭＳ５３−０２８５が使用される組成物の使用に関する。マイコプラズマ・シノビエ感染を予防および治療するための前記組成物については、さらなる詳細は、これまでに記載されているため、不要である。
以下の実施例は、本開示の特徴および利点をさらに説明するために、本開示の開発のために実施された実験を記載する。以下に列挙する実施例は本発明の典型であるにすぎず、特許請求の範囲を限定するために使用されるべきではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００１６】
（実施例１）マイコプラズマ・シノビエ遺伝子のクローニング
遺伝子特異的なプライマーを、様々な抗原について設計する（表１）。マイコプラズマ・シノビエのゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、遺伝子特異的なプライマーを組み合わせて、標的遺伝子を増幅した。
【表１】
2021501194.tif 000003
【００１７】
１．  マイコプラズマ・シノビエのゲノムＤＮＡの抽出
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ  ＷＶＵ  １８５３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（登録商標）２５２０４（商標））のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ精製キット（Ｔｉｓｓｕｅ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット、ＧＭｂｉｏｌａｂ、台湾）を使用して抽出した。まず、４．５ｍＬのマイコプラズマ・シノビエの液体培養物を遠心チューブに添加した。遠心分離（５８７０×ｇ、５分間）した後、上清を除去し、ペレットを回収した。次いで、２０μＬのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）および２００μＬの抽出試薬を添加し、５６℃で３時間反応させた。２００μＬの結合溶液を添加し、７０℃で１０分間反応させた。反応が完了したら、２００μＬの無水アルコールを添加し、混合物をマイクロ遠心チューブに移して、完全に混合した。得られた溶液（沈殿物を含む）をスピンカラムにピペットで移し、スピンカラムを次いでコレクションチューブに入れた。２分間遠心分離（１７９７０×ｇ）した後、上清を除去し、３００μＬの結合溶液をスピンカラムに再び添加した。２分間遠心分離（１７９７０×ｇ）した後、上清を除去した。７００μＬの洗浄溶液をスピンカラムに添加し、混合物を２分間遠心分離し（１７９７０×ｇ）、次いで、上清を除去し、上記のステップを１回繰り返した。最後に、混合物を１７９７０×ｇで５分間遠心分離して、残留アルコールを除去した。スピンカラムを、滅菌したマイクロ遠心チューブに入れ、適量の無菌脱イオン水を添加して、ゲノムＤＮＡをドレインした。
２．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する標的遺伝子の増幅
マイコプラズマ・シノビエのゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、ｔｕｆ遺伝子、ｎｏｘ遺伝子、およびｍｓ５３−０２８５遺伝子について設計されたプライマーを、ＰＣＲ反応にそれぞれ使用した。ＰＣＲにおいて使用されたプライマーおよびＰＣＲ反応条件を、以下の表２に示し（プライマー配列は表１に示す）、この条件において、５０μＬのＰＣＲ反応混合物は、１×ＧＤＰ−ＨｉＦｉ  ＰＣＲバッファーＢ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰの２００μＭの混合物、１μＭの増幅プライマー、２００ｎｇのマイコプラズマ・シノビエゲノムＤＮＡ、ならびに１ＵのＧＤＰ−ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼを含有していた。ＰＣＲ反応が完了した後、ゲル電気泳動を行って、予想されたサイズを有するＤＮＡ断片の存在について確認した。
【００１８】
【表２】
2021501194.tif 000004
【００１９】
３．  ＰＣＲ産物の回収およびクローニング
ＰＣＲ産物の回収を、ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐシステムキット（ＧＭｂｉｏｌａｂ、台湾）を使用して、かつ操作マニュアルに従って行った。標的遺伝子のクローニングを次いで、製造者の操作マニュアルに従ってＣｌｏｎｅＪＥＴ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して行った。ライゲーション混合物を、大腸菌株ＥＣＯＳ（商標）９−５に形質転換した。形質転換の条件はマニュアルにおいて提供されているか、または当技術分野における標準的な実験手順に基づいて変更され得る。
【００２０】
形質転換された細菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ固体培地上で培養した。コロニーが形成された後、コロニーＰＣＲを行って、株をスクリーニングした。まず、１×Ｔａｑ反応バッファー、２００μＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ）、１μＭの増幅プライマー、ならびに２．５ＵのＤｒｅａｍＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）を混合して、１００μＬのＰＣＲ試薬を製剤した。混合した後、ＰＣＲ混合物を、いくつかのＰＣＲチューブに分配した（１０μＬ／チューブ）。プレート上のコロニーをかき取ってＰＣＲチューブに入れ、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の条件は、９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃でＸ分間（２５サイクル）；７２℃で７分間であり、ここで、「Ｘ」は、ＤＮＡポリメラーゼに必要な伸長時間によって決定された。ｔｕｆ遺伝子およびｎｏｘ遺伝子についての時間は１分３０秒間で設定し、ｍｓ５３−０２８５遺伝子についての時間は２分３０秒間で設定した。ＰＣＲ反応の後、ゲル電気泳動を行って、ＰＣＲの結果を確認した。コロニーＰＣＲを使用して、形質転換された株における組換えプラスミドがインサートＤＮＡを有していることを確認し、その中のプラスミドを次いで抽出し、ＤＮＡシーケンシングを行った（Ｔｒｉ−Ｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）。ｔｕｆ遺伝子、ｎｏｘ遺伝子、およびｍｓ５３−０２８５遺伝子を有するプラスミドを、ｐＪＥＴ−ＴＵＦ、ｐＪＥＴ−ＮＯＸ、およびｐＪＥＴ−ＭＳ５３とそれぞれ名付けた。
【００２１】
４．  ｎｏｘ遺伝子の部位特異的突然変異生成
ｎｏｘ遺伝子は、３つのＴＧＡコドンを有する。ＴＧＡコドンは、マイコプラズマ属菌においてはトリプトファンとして、また大腸菌においては停止コドンとして翻訳され得る。大腸菌発現系を使用しての無傷のタンパク質の生産の失敗を避けるために、ｎｏｘ遺伝子内のＴＧＡコドンを、大腸菌によって認識され得、トリプトファンとして翻訳され得るコドン（ＴＧＧ）で置き換えるための、前記コドンでの点突然変異を誘発しなくてはならない。
突然変異誘発性のプライマーを設計するための基準は、少なくとも７８℃のＴｍで、突然変異をプライマーの中央に置くことを含んでいた。プライマーのＴｍ値は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅによって提供される以下の式を使用して計算し：
Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（ＧＣ％）−６７５／Ｎ−ミスマッチ％、
式中、「ＧＣ％」は、プライマー内のＧヌクレオチドまたはＣヌクレオチドのパーセンテージであり、「Ｎ」はプライマーの長さであり、「ミスマッチ％」は、プライマー内の突然変異した塩基のパーセンテージである。ＮＯＸＢＡＭＨＩＦ／ＮＯＸＭ２、ＮＯＸＭ１／ＮＯＸＭ４、ＮＯＸＭ３／ＮＯＸＭ６、およびＮＯＸＭ５／ＮＯＸＳＡＬＩＲを含む、ｎｏｘ遺伝子の点突然変異に使用したプライマーを、以下の表３に列挙する。
【００２２】
【表３】
2021501194.tif 000005
【００２３】
５０μＬのＰＣＲ混合物は、１×ＧＤＰ−ＨｉＦｉ  ＰＣＲバッファーＢ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰの２００μＭの混合物、１μＭの増幅プライマー、１００ｎｇのｐＪＥＴ−ＮＯＸ、ならびに１ＵのＧＤＰ−ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼを含有していた。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で２分間；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で３０秒間（３５サイクル）；６８℃で５分間であった。
ＰＣＲ反応の後、ゲル電気泳動を行って、予想されたサイズを有するＤＮＡ断片の存在について確認した。ＰＣＲ産物を、Ｇｅｌ−Ｍ（商標）ゲル抽出システムキットを使用して回収した。回収した４つのＰＣＲ産物を、ＮＯＸＢＡＭＨＩＦ／ＮＯＸＳＡＬＩＲプライマー対を使用する遺伝子増幅のための鋳型として使用した。ＰＣＲ反応条件は、９６℃で２分間；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で４５秒間（３５サイクル）；６８℃で５分間であった。このステップの後、完全長の点突然変異したｎｏｘ遺伝子を得た。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐキットを使用して回収した。
【００２４】
５．  ｍｓ５３−０２８５遺伝子の部位特異的突然変異生成
ｍｓ５３−０２８５遺伝子は、６つのＴＧＡコドンを有する。ＭＳ５３ＢＡＭＨＩＦ／ＭＳ５３Ｍ２、ＭＳ５３Ｍ１／ＭＳ５３Ｍ４、ＭＳ５３Ｍ３／ＭＳ５３Ｍ６、ＭＳ５３Ｍ５／ＭＳ５３Ｍ８、ＭＳ５３Ｍ７／ＭＳ５３Ｍ１０、ＭＳ５３Ｍ９／ＭＳ５３Ｍ１２、およびＭＳ５３Ｍ１１／ＭＳ５３ＳＡＬＩＲを含む、ｍｓ５３−０２８５遺伝子の点突然変異に使用したプライマーを、以下の表４に列挙する。
【００２５】
【表４】
2021501194.tif 000006
５０μＬのＰＣＲ混合物は、１×ＧＤＰ−ＨｉＦｉ  ＰＣＲバッファーＢ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰの２００μＭの混合物、１μＭの増幅プライマー、１００ｎｇのｐＪＥＴ−ＭＳ５３、ならびに１ＵのＧＤＰ−ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼを含有していた。ＰＣＲ反応条件は、９６℃で２分間；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で３０秒間（３５サイクル）；６８℃で５分間であった。
【００２６】
ＰＣＲ反応の後、ゲル電気泳動を行って、予想されたサイズを有するＤＮＡ断片の存在について確認した。ＰＣＲ産物を、Ｇｅｌ−Ｍ（商標）ゲル抽出システムキットを使用して回収した。回収した７つのＰＣＲ産物を、ＭＳ５３ＢＡＭＨＩＦ／ＭＳ５３ＳＡＬＩＲプライマー対を使用する遺伝子増幅のための鋳型として使用した。ＰＣＲ反応条件は、９６℃で２分間；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分１５秒間（３５サイクル）；６８℃で５分間であった。このステップの後、完全長の点突然変異したｍｓ５３−０２８５遺伝子を得た。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐキットを使用して回収した。
上記の操作の後、ｔｕｆ遺伝子（配列番号０４）、ｎｏｘ遺伝子（配列番号０５）、およびｍｓ５３−０２８５遺伝子（配列番号０６）を得た。これらは、Ｔｕｆ（配列番号０１）、ＮＯＸ（配列番号０２）、およびＭＳ５３−０２８５（配列番号０３）としてそれぞれ翻訳され得る。
【００２７】
（実施例３）マイコプラズマ・シノビエ抗原発現プラスミドの構築
大腸菌のｄｓｂＣ遺伝子を有するプラスミドを、マイコプラズマ・シノビエ抗原発現プラスミドを構築するための骨格として使用した。発現プラスミドの構築プロセスは、以下の通りである。
１．  Ｔｕｆ発現ベクターの構築
増幅されたｔｕｆ遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、得られたＤＮＡ断片を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、同一の制限酵素によって事前に切断されたＤｓｂＣ融合体発現プラスミドｐＥＴ−ＨＩＳＤｓｂＣと繋ぎ合わせた。ライゲーション産物を次いで、大腸菌ＥＣＯＳ  ９−５に形質転換した。形質転換体を、コロニーＰＣＲによってスクリーニングした。ゲル電気泳動を行って、予想されたサイズを有する増幅されたＤＮＡ断片の存在について確認した。形質転換体がその組換えプラスミド内にインサートＤＮＡを含有していることが確認されたら、そのプラスミドを抽出し、ＤＮＡシーケンシングを行った。正確なＤＮＡ配列を有するプラスミドを、ｐＥＴ−ＨＩＳＤｓｂＣ−ＭＳＴＵＦ（配列番号０７）と名付けた。
【００２８】
２．  ＮＯＸ発現プラスミドの構築
突然変異したｎｏｘ遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、得られたＤＮＡ断片を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、同一の制限酵素によって事前に切断されたＤｓｂＣ融合体発現プラスミドｐＥＴ−ＤｓｂＣと繋ぎ合わせた。ライゲーション産物を次いで、大腸菌ＥＣＯＳ  ９−５に形質転換した。形質転換体を、コロニーＰＣＲによってスクリーニングした。ゲル電気泳動を行って、予想されたサイズを有する増幅されたＤＮＡ断片の存在について確認した。形質転換体がその組換えプラスミド内にインサートＤＮＡを含有していることが確認されたら、そのプラスミドを抽出し、ＤＮＡシーケンシングを行った。正確なＤＮＡ配列を有するプラスミドを、ｐＥＴ−ＤｓｂＣ−ＭＳＮＯＸ（配列番号０８）と名付けた。
【００２９】
３．  ＭＳ５３−０２８５発現プラスミドの構築
突然変異したｍｓ５３−０２８５遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、得られたＤＮＡ断片を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって、同一の制限酵素によって事前に切断されたＤｓｂＣ融合体発現プラスミドｐＥＴ−ＤｓｂＣと繋ぎ合わせた。ライゲーション産物を次いで、大腸菌ＥＣＯＳ  ９−５に形質転換した。形質転換体を、コロニーＰＣＲによってスクリーニングした。ゲル電気泳動を行って、予想されたサイズを有する増幅されたＤＮＡ断片の存在について確認した。形質転換体がその組換えプラスミド内にインサートＤＮＡを含有していることが確認されたら、そのプラスミドを抽出し、ＤＮＡシーケンシングを行った。正確なＤＮＡ配列を有するプラスミドを、ｐＥＴ−ＤｓｂＣ−ＭＳ５３（配列番号０９）と名付けた。
【００３０】
（実施例４）組換えマイコプラズマ・シノビエ抗原の発現および精製
マイコプラズマ・シノビエ抗原を発現させるためのプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にそれぞれ形質転換した。抗原を発現する株の単一のコロニーを選択し、カナマイシンを含有する（最終濃度：３０μｇ／ｍＬ）１２ｍＬのＬＢ培地に接種した。得られた混合物を、一晩、３７℃および１８０ｒｐｍで培養した。次いで、１０ｍＬの液体培養物を、カナマイシンを含有する（最終濃度：３０μｇ／ｍＬ）１ＬのＬＢ培地に添加し、ＯＤ600が約０．４〜０．６に達するまで、振とう培養した（３７℃、１８０ｒｐｍ）。０．１ｍＭのＩＰＴＧを次いで、２８℃で添加して、タンパク質の発現を誘導した。４時間誘導した後、培養物を遠心分離し（１００００×ｇ、１０分間、４℃）、細菌細胞ペレットを回収した。細菌細胞ペレットを、１０ｍＬのリン酸バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁し、超音波処理によって崩した。懸濁液を遠心分離し（３０９６６×ｇ、３０分間）、上清を回収した。最後に、上清を、０．２２μＭの孔サイズを有するフィルター膜を通して濾過した。タンパク質の電気泳動を行って、組換え抗原の発現の状態および溶解度を観察した。
【００３１】
タンパク質の精製を次いで、組換え抗原上のＨｉｓタグとニッケルイオンまたはコバルトイオンとの間の共有結合を用いる固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを使用して行った。組換え抗原を、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ（商標）Ｎｉ  ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）を備えたＡＫＴＡ  ｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）によって精製した。まず、カラムを２５ｍＬのリン酸バッファー溶液で平衡化した後に、前記上清をＨｉＴｒａｐ（商標）Ｎｉ  ｅｘｃｅｌカラムに導入した。試料を完全に導入した後、３０ｍＭのイミダゾールを含有する１００ｍＬの洗浄バッファー溶液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）を使用して、カラムを洗浄し、カラムに接着していた非特異的タンパク質を除去した。最後に、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する１５０ｍＬの溶出バッファー溶液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）を使用して、組換え抗原を樹脂から洗い流したが、ここで、高濃度のイミダゾールは樹脂上の結合部位について組換え抗原と競合し得、それによって、組換え抗原が洗い流される。精製抗原溶液をＡｍｉｃｏｎ（商標）ｕｌｔｒａ−１５  ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋ遠心チューブ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）に入れて、それが適切な容積に達するまで４℃で遠心分離し（２６００×ｇ）、次いで、後に使用するために４℃で保管した。
結果を図１に示す。図１Ａから、この実施例の発現抗原が、その後に精製され商業化されるために非常に優れた溶解度を有することが分かる。図１Ｂは、精製を介して得られた抗原が信頼できる純度を有することを示す。
【００３２】
（実施例５）単抗原ワクチンの生産および鶏での実験
４週齢の特定の病原体を有さない鶏（Ａｎｉｍａｌ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｂｒａｎｃｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｙｕａｎ、台湾から購入した）を使用し、検査支部の動物飼育施設で維持した。組換えマイコプラズマ・シノビエ抗原Ｔｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３−０２８５を、操作マニュアルに従って、市販されているアジュバントＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）Ｇｅｌ  ０１（Ｓｅｐｐｉｃ）と個別に混合して、各単抗原ワクチンの最終用量を５０μｇ／０．５ｍＬとした。０．５ｍＬのこれらの単抗原ワクチンを、４週齢の鶏の頚部の後ろ側に皮下投与した。２回目のワクチン接種を、６週齢に達する鶏に対して行った。ワクチン接種した後、鶏を２週間にわたり観察した。血液試料を次いで回収し、遠心分離して（２０００×ｇ、４℃、１５分間）、血清試料を得た。マイコプラズマ・シノビエ抗体を、市販のキット（ＩＤＥＸＸ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ抗体試験キット）を使用してアッセイした。
【００３３】
結果を以下の表５および図２に示す。本発明に従ったＴｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３＿０２８５の単抗原ワクチンを投与した鶏の血清中の特異的抗体は、全て陽性であり、陽性率はそれぞれ５７％、７１％、および７５％であった。
【表５】
2021501194.tif 000007
【００３４】
次に、８週齢の鶏を、気管および足蹠を介して、マイコプラズマ・シノビエでチャレンジした。使用したチャレンジ株はＡＴＲＩ  ２０１４（以下、「ＭＳ−ｆ１」）であり、これは、台湾の商業的な地鶏の養鶏場から単離されたものであった。チャレンジ株を、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ培地において３２℃および７５ｒｐｍで３２時間培養した。
気管でのチャレンジでは、鶏を保定し、給餌チューブを鶏の気管に挿入した。１０6ＣＣＵのチャレンジ株の培養液１ｍＬを次いで、シリンジを使用して注入した。最後に、培養液が均等に広がるように、鶏の頚部を優しくこすった。足蹠でのチャレンジでは、足蹠をアルコールワイプで消毒し、１０3ＣＣＵのチャレンジ株の培養液０．５ｍＬを、針を使用して足蹠に注射した。チャレンジの後、血液試料を回収し、血清を単離して、マイコプラズマ・シノビエ特異的抗体を評価した。様々な時点での鶏の体重、足蹠の温度、および足蹠の厚みもまた記録した。実験の最後に解剖を行って、鶏の間の気管、気嚢、および足蹠の腫れの症候を観察した。観察された結果を、以下の表６に記載する器官の機能障害についての診断基準に従って記録した。
【００３５】
【表６】
2021501194.tif 000008
【００３６】
鶏の足蹠の厚みから、単抗原ワクチンを投与された鶏の群が陽性群よりも軽度の腫れを有していたことが分かる（図３を参照されたい）。他方、足蹠の温度の測定結果は、本開示の単抗原ワクチンが鶏の足蹠の炎症を軽減することを示した（図４）。足蹠感染のさらなる評価および記録は、本開示の単抗原ワクチンを投与された鶏の足蹠の感染レベルがそれほど高くはなく、Ｔｕｆワクチンが最も効果的であることを示した（図５）。
気嚢の病変は、マイコプラズマ・シノビエ感染の結果としての別の一般的なタイプの感染である。健康な鶏の気嚢は透明であり、排出物で覆われていない。図６Ａは、前記単抗原ワクチンを投与されていない鶏の間で、その気嚢が厚みを増し、肉眼で見られる様式でイエローチーズ様の線維タンパク質で覆われていたことを示す。他方、気嚢の病変は、本発明の単抗原ワクチンを投与することによって効果的に予防することができる。結果はまた、ＮＯＸワクチンおよびＭＳ５３−０２８５ワクチンが気嚢の病変の予防において特に効果的であることを示した。
【００３７】
鶏の気管をさらに切片化した。Ｈ＆Ｅ染色を行って、気管輪の粘液の厚みの変化を観察した。結果は、粘膜の感染が、本発明の単抗原ワクチンを投与することによって、ワクチン接種された群の間で、ワクチン接種されていないチャレンジ鶏と比較して、効果的に予防され得、ＭＳ５３−０２８５サブユニットワクチンが最も効果的であることを示した（図６Ｂ）。
上記の結果から、有効性はわずかに異なるものの、本開示のＴｕｆワクチン、ＮＯＸワクチン、およびＭＳ５３−０２８５ワクチンが、マイコプラズマ・シノビエによって誘発される症候の軽減において全体的に効果的であることが理解され得る。
【００３８】
（実施例６）多抗原ワクチン（カクテルワクチン）の生産および鶏での実験
４週齢の特定の病原体を有さない鶏（Ａｎｉｍａｌ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｂｒａｎｃｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｙｕａｎ、台湾から購入した）を使用し、検査支部の動物飼育施設で維持した。様々な組み合わせの抗原（Ｔｕｆ＋ＮＯＸ、Ｔｕｆ＋ＭＳ５３−０２８５、ＮＯＸ＋ＭＳ５３−０２８５、およびＴｕｆ＋ＮＯＸ＋ＭＳ５３−０２８５）を、市販されているアジュバントと個別に混合して、カクテルワクチンを得た。各用量のワクチン（０．５ｍＬ）中の各抗原は５０μｇであった。
０．５ｍＬの前記組換え抗原ワクチンを、４週齢の鶏の頚部の後ろ側に皮下投与した。２回目のワクチン接種を、６週齢に達する鶏に対して行った。ワクチン接種した後、鶏を２週間にわたり観察した。血液試料を次いで回収し、遠心分離して（２０００×ｇ、４℃、１５分間）、血清試料を得た。マイコプラズマ・シノビエ特異的抗体を、市販のキット（ＩＤＥＸＸ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ抗体試験キット）を使用して検出した。
【００３９】
結果を以下の表７および図７に示し、これらは、二重抗原ワクチンおよび三重抗原ワクチンの両方が鶏において抗体産生レベルを向上させたことを示唆している。言い換えると、組み合わせて使用すると、組換え抗原は相互の干渉を生じさせず、逆にこれらは、免疫誘導能力を強め得る相乗効果をもたらした。
【表７】
2021501194.tif 000009
【００４０】
（実施例７）多抗原ワクチン（カクテルワクチン）の生産および鶏での実験
４週齢の特定の病原体を有さない鶏（Ａｎｉｍａｌ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｂｒａｎｃｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｙｕａｎ、台湾から購入した）を使用し、検査支部の動物飼育施設で維持した。組換え抗原Ｔｕｆ、ＮＯＸ、およびＭＳ５３−０２８５を、市販されているアジュバントＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）  ＩＳＡ  ７１  ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ）と混合して、本発明のカクテルワクチンを得た。各用量のワクチン（０．５ｍＬ）中の各抗原は、５０μｇであった。前記アジュバントを、前記抗原と７：３の質量混合比で混合した。前記アジュバントの比重が約０．８１６であることを考慮すると、この実験において生産されたワクチンは、およそ０．３７ｍＬのアジュバントを含有していた。
０．５ｍＬの前記組換え抗原ワクチンを、４週齢の鶏の頚部の後ろ側に皮下投与した。２回目のワクチン接種を、６週齢に達する鶏に対して行った。ワクチン接種した後、鶏を２週間にわたり観察した。血液試料を次いで回収し、遠心分離して（２０００×ｇ、４℃、１５分間）、血清試料を得た。マイコプラズマ・シノビエ特異的抗体を、市販のキット（ＩＤＥＸＸ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ抗体試験キット）を使用して検出した。
【００４１】
結果を以下の表８および図８に示し、これらは、三重抗原ワクチンが鶏において抗体産生を誘導したことを示唆している。言い換えると、組み合わせて使用すると、組換え抗原は相互の干渉を生じさせず、逆にこれらは、免疫誘導能力を強め得る相乗効果をもたらした。これらの結果は、図７で示す結果と一致している。
【表８】
2021501194.tif 000010
【００４２】
次に、８週齢の鶏を次いで、気管および足蹠を介して、マイコプラズマ・シノビエ  ＭＳ−ｆ１でチャレンジした。チャレンジの後、血液試料を回収し、血清を単離してマイコプラズマ・シノビエ特異的抗体を評価した。様々な時点での各鶏の体重、足蹠の温度、および足蹠の厚みもまた記録した。実験の最後に解剖を行って、鶏の間の気管、気嚢、および足蹠の腫れの症候を観察した。観察された結果を、表６に記載する器官の機能障害についての診断基準に従って記録した。
結果は、本開示の三重抗原ワクチンが、感染した鶏で生じる体重減少を軽減させ得ることを示した（図９）。さらに、三重抗原ワクチンはまた、足蹠の腫れおよび温度に関する症候の低減において効果的であった（図１０および１１）。鶏をさらに屠殺し、解剖した。足蹠および気嚢の病変のスコアから、三重抗原ワクチンが足蹠および気嚢の病変の重症度の低下において効果的であることが分かった。以下の表９を参照されたい。
【００４３】
【表９】
2021501194.tif 000011
【００４４】
（実施例８）三重抗原ワクチンについての投薬量試験
組換え抗原を、市販されているアジュバントＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ  ７１  ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ）と混合して、組換え抗原を用量当たり４つの濃度：１５０μｇ、１００μｇ、５０μｇ、および２０μｇ（０．５ｍＬ）でそれぞれ有するサブユニットワクチンを製剤した。前記アジュバントを、前記抗原と７：３の質量混合比で混合した。前記アジュバントの比重が約０．８１６であることを考慮すると、この実験において生産されたワクチンは、およそ０．３７ｍＬのアジュバントを含有していた。群は、表１０で示す通りに設計した。
【表１０】
2021501194.tif 000012
【００４５】
４週齢の特定の病原体を有さない鶏（Ａｎｉｍａｌ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｂｒａｎｃｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｙｕａｎ、台湾から購入した）を使用し、検査支部の動物飼育施設で維持した。前記組換え抗原ワクチンを、ワクチン接種のために、２週間ごとに２回、鶏に投与した。ワクチン接種の２週間後、鶏を、気管および足蹠を介して、マイコプラズマ・シノビエ  ＭＳ−ｆ１でチャレンジした。チャレンジの後、血液試料を回収し、血清を単離してマイコプラズマ・シノビエ特異的抗体を評価した。様々な時点での鶏の体重、足蹠の温度、および足蹠の厚みもまた記録した。実験の最後に、解剖を行って、鶏の間の気嚢の病変の症候を観察した。観察された結果を、表５に記載する器官の機能障害についての診断基準に従って記録した。
【００４６】
結果は、この実験で使用した４つの用量の抗原ワクチン全てが、鶏における抗体産生を誘導し得ることを示した。さらに、この実験で試験した４つの用量全てが、体重および足蹠の温度に関する症候の軽減において効果的であった（図１３および１４）。鶏をさらに屠殺し、解剖した。気嚢の病変のスコアから、試験した４つの用量のワクチン全てが、気嚢の病変の改善において効果的であることが分かった（表１２を参照されたい）。
【００４７】
【表１１】
2021501194.tif 000013
【００４８】
【表１２】
2021501194.tif 000014
【図１Ａ】
2021501194.tif 000015
【図１Ｂ】
2021501194.tif 000016
【図２】
2021501194.tif 000017
【図３】
2021501194.tif 000018
【図４】
2021501194.tif 000019
【図５】
2021501194.tif 000020
【図６】
2021501194.tif 000021
【図７】
2021501194.tif 000022
【図８】
2021501194.tif 000023
【図９】
2021501194.tif 000024
【図１０】
2021501194.tif 000025
【図１１】
2021501194.tif 000026
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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