(57)【要約】  本発明は、条件付き複製欠損である遺伝的に改変されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、緩衝液、アルカリ又はアルカリ塩、糖、セルロース誘導体及び任意にポリオールを含む、ＣＭＶの安定な製剤に関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；
ｐＨ約６．０〜８．０の緩衝液；
アルカリ又はアルカリ塩；
糖；
カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロース及びメチルセルロースからなる群から選択されるセルロース誘導体又はその薬学的に許容される塩；及び
任意に、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル及び糖アルコールからなる群から選択されるポリオール；
を含む製剤。
【請求項２】
緩衝液が、リン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、ＴＲＩＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩及びクエン酸塩からなる群から選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
アルカリ又はアルカリ塩が、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム又はそれらの組合せである、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
糖がトレハロース又はスクロースである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
セルロース誘導体が、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の薬学的に許容される塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
ポリオールが、プロピレングリコール、グリセロール及びソルビトールからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
ポリオールがプロピレングリコールであり、セルロース誘導体がカルボキシメチルセルロースナトリウムである請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８】
約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜７．５の緩衝液、約５０〜３００ｍＭのＮａＣｌ、約４０〜１５０ｍｇ／ｍｌのスクロース、及び約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースの薬学的に許容される塩を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜７．５の約５〜５００ｍＭの緩衝液、約５０〜３００ｍＭのＮａＣｌ、約４０〜１５０ｍｇ／ｍｌのスクロース、及び約５０，０００〜１，０００，０００の平均分子量を有する約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１０】
約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜７．５の約１０〜１００ｍＭのヒスチジン又はＴＲＩＳ又はＨＥＰＥＳ緩衝液、約５０〜３００ｍＭのＮａＣｌ、約４０〜１５０ｍｇ／ｍｌのスクロース、約２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール（ＰＧ）、及び約９０，０００の平均分子量を有する約３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、請求項１記載の製剤。
【請求項１１】
約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜７．５の約１０〜１００ｍＭのヒスチジン又はＴＲＩＳ又はＨＥＰＥＳ緩衝液、約５０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、約６０〜１１０ｍｇ／ｍｌのスクロース、約３〜７ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール（ＰＧ）、及び約９０，０００の平均分子量を有する約３〜７ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、請求項１記載の製剤。
【請求項１２】
約１００〜３５０μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約７．０の約２５ｍＭのヒスチジン、ＴＲＩＳ又はそれらの組合せの緩衝液、約７５ｍＭのＮａＣｌ、約９０ｍｇ／ｍｌのスクロース、約５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール（ＰＧ）、及び約９０，０００の平均分子量を有する約５ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、請求項１記載の製剤。
【請求項１３】
アルミニウムアジュバントをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１４】
約２００〜７００μｇ／ｍｌのリン酸アルミニウムアジュバントをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１５】
凍結乾燥前の水溶液である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１６】
再構成された溶液である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１７】
再構成された溶液である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤であって、再構成が水で行われる、製剤。
【請求項１８】
再構成された溶液である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤であって、再構成が生理食塩水で行われる、製剤。
【請求項１９】
再構成された溶液である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製剤であって、再構成が、緩衝液、生理食塩水又は水で製剤化された０．５〜１ｍｌのアルミニウムアジュバントを含む希釈剤を用いて行われる、製剤。
【請求項２０】
再構成は、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）及び生理食塩水を含む０．７ｍｌ希釈剤で実施される、請求項１９記載の製剤。
【請求項２１】
ＡＰＡが、再構成溶液中で約４００〜５００μｇ／ｍｌである、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２２】
約２５〜３００μｇのＣＭＶ、約１．３９〜１．９ｍｇのヒスチジン、約６〜６．７ｍｇのＮａＣｌ、約３２．２〜４５ｍｇのスクロース、約１．７９〜２．５ｍｇのプロピレングリコール（ＰＧ）、及び平均分子量が約９０，０００である約１．７９〜２．５ｍｇのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、ＣＭＶの０．５ｍｌ用量である、請求項１９記載の製剤。
【請求項２３】
乾燥固体形態であり、約２５〜３００μｇのＣＭＶ、約１．９〜２．７ｍｇのヒスチジン、ＴＲＩＳ又はそれらの組合せ、約２．２〜３．０７ｍｇのＮａＣｌ、約４５〜６３ｍｇのスクロース、約２．５〜３．５ｍｇのプロピレングリコール（ＰＧ）、及び平均分子量が９０，０００である約２．５〜３．５ｍｇのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、請求項１記載の製剤。
【請求項２４】
ＣＭＶが約１、ヒスチジンが６〜１０８、ＮａＣｌが７〜１２３、スクロースが１５０〜２５２０、プロピレングリコールが８〜１４０、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムが８〜１４０の重量比を含む乾燥固体形態である、請求項１記載の製剤。
【請求項２５】
乾燥された固体形態である請求項１及び２３〜２４のいずれかの製剤であって、ここで、２〜８℃における２年後のＣＭＶ力価が、約７．７７ｘ１０Ｅ４〜３．８ｘ１０Ｅ８ｐｆｕ／ｍｌである製剤。
【請求項２６】
乾燥された固体形態である請求項１及び２３〜２４のいずれかの製剤であって、ここで、２〜８℃における６ヶ月後のＣＭＶが、ＣＭＶ対照試料と比較して約０．２ｌｏｇ１０感染力損失以下である製剤。
【請求項２７】
乾燥された固体形態である請求項１及び２３〜２４のいずれかの製剤であって、ここで、２〜８℃における２年後のＣＭＶが、ＣＭＶ対照試料と比較して約０．５ｌｏｇ１０感染力損失以下である製剤。
【請求項２８】
乾燥された固体形態である請求項１及び２３〜２４のいずれかの製剤であって、ここで、２〜８℃における２年後のＣＭＶが、ＣＭＶ対照試料と比較して約１．０ｌｏｇ１０感染力損失以下である製剤。
【請求項２９】
ＣＭＶが、弱毒生ＣＭＶ、死滅ＣＭＶ又は不活性化ＣＭＶである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３０】
ＣＭＶが、条件付き複製欠損である弱毒生ＣＭＶであり、そして、（ａ）ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ及びｇＬを含む５量体ｇＨ複合体、及び（ｂ）必須タンパク質及び不安定化タンパク質の融合タンパク質をコードする核酸を含み、
ここで、必須タンパク質が、ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ７９及びＵＬ８４からなる群から選択される、請求項２９記載の製剤。
【請求項３１】
不安定化タンパク質が、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）又はＦＫＢＰ誘導体のいずれかであり、
ここで、ＦＫＢＰ誘導体は、Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｆ３６Ｖ、Ｅ６０Ｇ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、Ｋ１０５Ｉ及びＬ１０６Ｐからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むＦＫＢＰである、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３２】
ＦＫＢＰ誘導体が、アミノ酸置換Ｆ３６Ｖ及びＬ１０６Ｐを含むＦＫＢＰである、請求項３１記載の製剤。
【請求項３３】
必須タンパク質がＩＥ１／２である、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３４】
必須タンパク質がＵＬ５１である、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３５】
ＣＭＶが、少なくとも２つの融合タンパク質をコードする核酸を含み、ここで、融合タンパク質の各々における必須タンパク質が異なることを特徴とする、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３６】
融合タンパク質の１つが、ＩＥｌ／２又はＵＬ５１を含む、請求項３５記載の製剤。
【請求項３７】
第１の融合タンパク質がＩＥ１／２を含み、そして、第２の融合タンパク質がＵＬ５１を含む、請求項３５記載の製剤。
【請求項３８】
ＣＭＶが、条件付き複製欠損である弱毒生ＣＭＶであり、そして、（ａ）ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ及びｇＬを含む５量体ｇＨ複合体、及び（ｂ）ＩＥ１／２及び不安定化タンパク質の第１の融合タンパク質、及び、ＵＬ５１及び不安定化タンパク質の第２の融合タンパク質をコードする核酸、を含む請求項２９記載の製剤であって、
ここで、不安定化タンパク質は、アミノ酸置換Ｆ３６Ｖ及びＬ１０６Ｐを含むＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）誘導体であり、ここで、野生型ＩＥ１／２及びＵＬ５１はもはや存在せず、そしてここで、ＣＭＶは、ＵＬ１３１遺伝子の変異の修復に起因してｇＨ複合発現を回復した弱毒化株である、製剤。
【請求項３９】
（ａ）第１の融合タンパク質が配列番号１又は配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列であり、そして、（ｂ）第２の融合タンパク質が配列番号３又は配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列である、請求項３８記載の製剤。
【請求項４０】
第１の融合タンパク質が配列番号１を含み、第２の融合タンパク質が配列番号３を含む、請求項３８記載の製剤。
【請求項４１】
（ａ）第１の融合タンパク質が配列番号２又は配列番号２と少なくとも９５％同一である核酸配列によってコードされ、そして、（ｂ）第２の融合タンパク質が配列番号４又は配列番号４と少なくとも９５％同一である核酸配列によってコードされる、請求項３８記載の製剤。
【請求項４２】
第１の融合タンパク質が配列番号２によってコードされ、そして、第２の融合タンパク質が配列番号４によってコードされる、請求項３８に記載の製剤。
【請求項４３】
ＣＭＶが、条件付き複製欠損である弱毒生ＣＭＶであり、そして、（ａ）ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ及びｇＬを含む５量体ｇＨ複合体、及び（ｂ）必須タンパク質及び不安定化タンパク質の第１の融合タンパク質、及び必須タンパク質及び不安定化タンパク質の第２の融合タンパク質をコードする核酸、を含む請求項２９に記載の製剤であって、
ここで、第１の融合タンパク質が配列番号１を含み、第２の融合タンパク質が配列番号３を含み、ここで、野生型ＩＥ１／２及びＵＬ５１がもはや存在せず、
そしてここで、ＣＭＶがＵＬ１３１遺伝子の変異の修復に起因してｇＨ複合発現を回復した弱毒化株である、製剤。
【請求項４４】
ＣＭＶが、ＵＬ１３１遺伝子における変異の修復に起因するｇＨ複合発現を回復したＡＤ１６９である、請求項４３記載の製剤。
【請求項４５】
条件付き複製欠損ＣＭＶが、配列番号１４に示すようなゲノムを有する、請求項４３記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の安定な製剤に関する。一実施形態において、ＣＭＶは、条件付き複製欠損である遺伝的に改変されたＣＭＶである。
【０００２】
配列表への参照
配列表テキストファイルは、３７  ＣＦＲ§１．５２（Ｅ）（５）に準拠したＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で明細書と同時に提出される。配列表は、「２４５２７−ＰＣＴ−ＳＥＱ−１４ＳＥＰＴ２０１８．ｔｘｔ」のファイル名を有し、２０１８年９月１４日に作成され、サイズは３１６キロバイトである。配列表は、本明細書の一部であり、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
【０００３】
発明の背景
ヒトヘルペスウイルス５（ＨＨＶ−５）として知られているサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、ヘルペスウイルスのベータサブファミリーのメンバーとして分類されるヘルペスウイルスである。疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によると、ＣＭＶ感染は、ヒト集団においてかなり普遍的に発見され、米国の成人人口の推定４０から８０パーセントで感染していた。このウイルスは、主に体液を介して拡散され、頻繁に胎児や新生児へ妊娠中の母親から伝わる。ほとんどの個体ではＣＭＶ感染は潜伏であるが、ウイルス活性化は、高熱、悪寒、倦怠感、頭痛、吐き気及び脾腫を生じ得る。
【０００４】
ほとんどのヒトＣＭＶ感染は無症候性であるが、免疫障害個体（例えば、ＨＩＶ陽性患者、同種移植患者及び癌患者）又は免疫系がまだ完全に開発されていない人（新生児）におけるＣＭＶ感染は、特に問題となり得る（Ｍｏｃａｒｓｋｉら、サイトメガロウイルス、Ｉｎｆｉｅｌｄｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７０１−２７７２、編集：Ｋｎｉｐｅｓ及びＨｏｗｌｅｙ、２００７年）。このような個体におけるＣＭＶ感染は、他の有害な症状の中で、肺炎、肝炎、脳炎、大腸炎、ブドウ膜炎、網膜炎、失明、及び神経障害を含む重度の罹患を引き起こし得る。加えて、妊娠中のＣＭＶ感染は、出生不良の原因である（Ａｄｌｅｒ、２００８年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ、４１：２３１；Ａｒｖｉｎら、２００４年、Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、３９：２３３；ｒｅｖｅｌｌｏら、２００８年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ、８０：１４１５）。ＣＭＶは、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、ニューロン、平滑筋細胞、肝細胞及び間質細胞を含む種々の細胞においてインビボで感染する（Ｐｌｅａｃｔｅｒら、１９９６年、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ，４６：１９５）。臨床的なＣＭＶ単離物は種々の細胞型で複製するが、実験室株ＡＤ１６９（Ｅｌｅｋ及びＳｔｅｒｎ、１９７４、Ｌａｎｃｅｔ  １：１）及びＴｏｗｎｅ（Ｐｌｏｔｋｉｎら、１９７５、Ｉｎｆｅｃｔ．ｉｍｍｕｎ．１２：５２１）は、線維芽細胞中でほとんど排他的に複製する（Ｈａｈｎら、２００４年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１００２３）。線維芽細胞におけるウイルスの連続的な継代及び最終的な適合に起因する指向性の制限は、弱毒化のマーカーであることが規定されている（Ｇｅｒｎａら、２００５年、Ｊ．Ｇｅｎｖｉｒｏｌ．８６：２７５；Ｇｅｒｎａら、２００２年、Ｊ．Ｇｅｎｖｉｒｏｌ．８３：１９９３；Ｇｅｒｎａら、２００３年、Ｊ．Ｇｅｎｖｉｒｏｌ．８４：１４３１；Ｄａｒａｎら、２０１０年、Ｊ．Ｇｅｎｖｉｒｏｌ．９１：１５３５）。ヒトＣＭＶ実験株における上皮細胞、内皮細胞、白血球及び樹状細胞指向性の損失を引き起こす変異は、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１でマッピングされている（ｈａｈｎｅｔａｌ、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１００２３；Ｗａｎｇ及びＳｈｅｎｋ、２００５年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０３３０；Ｗａｎｇ及びＳｈｅｎｋ、２００５年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０２：１８１５３）。生化学的及び再構成研究は、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１が、ｇＨ／ｇＩ足場上に組み立てられて、５量体ｇｈ複合体を形成することを示している（Ｗａｎｇ及びＳｈｅｎｋ、２００５年、ｐｒｏｃｎａｔｌａｃａｄｓｃｉｕｓａ．１０２：１８１５；Ｒｙｃｋｍａｎら、２００８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：６０）。ビリオン中のこの複合体の回復は、実験株におけるウイルス性上皮指向性を回復させる（Ｗａｎｇ及びＳｈｅｎｋ、２００５年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０３３０）。
【０００５】
内皮及び上皮指向性の喪失は、Ｔｏｗｎｅのようなワクチンとして以前に評価されたＣＭＶ株の欠損として疑われている（Ｇｅｒｎａら、２００２年、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８３：１９９３；Ｇｅｒｎａら、２００３年、Ｊ．Ｇｅｎｖｉｒｏｌ．８４：１４３１）。天然ＣＭＶ感染のヒト被験者由来の血清中の中和抗体は、線維芽細胞侵入よりもウイルス上皮侵入に対して１５倍高い活性を有する（Ｃｕｉら、２００８年、Ｖａｃｃｉｎｅ、２６：５７６０）。一次感染を伴うヒトは、ウイルス内皮及び上皮侵入に対する中和抗体を急速に発現するが、ウイルス線維芽細胞侵入に対する中和抗体をゆっくりと展開する（Ｇｅｒｎａら、２００８年、Ｊ．Ｇｅｎｖｉｒｏｌ．８９：８５３）。さらに、Ｔｏｗｎｅワクチンを受けたヒト被験者（Ｃｕｉら、２００８、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：５７６０）からの免疫血清には、ウイルス上皮及び内皮侵入に対する中和活性が存在しない。より最近では、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染を有する４人のドナーからのヒトモノクローナル抗体のパネルが記載され、パネルからのより強力な中和クローンが５量体ｇＨ複合体の抗原を認識した（Ｍａｃａｇｎｉら、２０１０年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１００５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開番号ＵＳ２０１６／０２２８５３２号
【特許文献２】米国特許出願公開ＵＳ２０１４／０２９８４８２号
【特許文献３】米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２９４８７２号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／０２１５１６９号
【特許文献５】米国特許第９，１１９，７９４号
【特許文献６】米国特許許第９，５４６，３５５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
全ウイルスは、体液性及び細胞性免疫応答を生成する能力のために、いくつかのワクチン製品中の一般に使用される抗原の１つである。全ウイルスを含有するワクチン製品は、これらが熱、凍結／解凍及び有意な効力損失をもたらす他の処理ストレスに敏感であり、安定化することは困難である。これらの製品は、典型的には冷凍（−２０℃未満）又は乾燥粉末として保存される。冷凍製品は、効力の喪失を防止するために厳しい冷却鎖要件を必要とするので、保存し配送することは容易ではない。全ウイルス、特にエンベロープウイルスの乾燥は、しばしば乾燥工程中に遭遇する凍結及び乾燥ストレスによる効力の著しい損失をもたらす。従って、当技術分野では、ＣＭＶの安定な製剤を生成する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の安定な製剤を提供する。セルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース塩の添加は、乾燥後のＣＭＶ安定性及び／又は収量を改良した。ポリオール、例えばプロピレングリコールのさらなる添加は、乾燥後のウイルス安定性及び／又は収量をさらに改善した。一実施形態において、ＣＭＶ製剤は、２〜８℃において、約７．７７ｘ１０Ｅ４〜３．８ｘ１０Ｅ８ｐｆｕ／ｍｌのＣＭＶ力価によって測定される、２年以上（≧２）の貯蔵寿命を有する。
【０００９】
本発明の一態様において、製剤は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ｐＨ約６．０−８．０の緩衝液、アルカリ又はアルカリ塩、糖、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロース及びメチルセルロースよりなる群から選択されるセルロース誘導体又はその薬学的に許容される塩、及び、任意に、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、及び、糖アルコール、例えばグリセロールからなる群から選択されるポリオールを含む。
【００１０】
本発明の一態様において、製剤は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ｐＨ約６．０−７．５の緩衝液、アルカリ又はアルカリ塩、糖、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロース及びメチルセルロースからなる群から選択されるセルロース誘導体又はそれらの薬学的に許容される塩、及び、任意にプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル、及び、糖アルコール、例えばグリセロールからなる群から選択されるポリオールを含む。
【００１１】
一実施形態において、緩衝液は、リン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、ＴＲＩＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩及びクエン酸塩からなる群から選択されるか、又はそれらの任意の組み合わせである。本実施形態の一態様において、緩衝液は、リン酸塩、ヒスチジン及びＨＥＰＥＳからなる群から選択される。別の実施形態において、アルカリ又はアルカリ塩は、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム又はそれらの組合せである。本実施形態の一態様において、塩は塩化カリウム及び塩化ナトリウムからなる群から選択される。さらなる態様において、糖は、トレハロース又はスクロースである。さらに別の実施形態において、セルロース誘導体は、カルボキシメチルセルロースの薬学的に許容される塩である。
【００１２】
一実施形態において、ポリオールは、プロピレングリコール、グリセロール及びソルビトールである。特定の実施形態において、ポリオールは、プロピレングリコールである。さらなる特定の実施形態において、ポリオールはプロピレングリコールであり、そして、セルロース誘導体はカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣナトリウム）である。
【００１３】
本発明の他の態様において、製剤は、約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜８．０の緩衝液、約５０〜３００ｍＭのアルカリ塩、約４０〜１５０ｍｇ／ｍｌのスクロース又はトレハロース、及び約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロース又はヒドロキシプロピルメチルセルロースの薬学的に許容される塩を含む。別の実施形態において、製剤は、約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜８．０の約５〜５００ｍＭの緩衝液、約５０〜３００ｍＭのＮａＣｌ又はＫＣｌ、約４０〜１５０ｍｇ／ｍｌのスクロース又はトレハロース、及び平均分子量約５０，０００から１，０００，０００を有する約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。
【００１４】
本発明の他の態様において、製剤は、約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜７．５の緩衝液、約５０〜３００ｍＭのＮａＣｌ、約４０〜１５０ｍｇ／ｍｌのスクロース、及び約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースの薬学的に許容される塩を含む。別の実施形態において、製剤は、約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜７．５の約５〜５００ｍＭの緩衝液、約５０〜３００ｍＭのＮａＣｌ、約４０〜１５０ｍｇ／ｍｌのスクロース、及び約５０，０００〜１，０００，０００の平均分子量を有する約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む。
【００１５】
さらなる実施形態において、製剤は、約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜８．０の約１０〜１００ｍＭのヒスチジン又はリン酸塩又はＨＥＰＥＳ緩衝液、又はそれらの任意の組み合わせ、約５０〜３００ｍＭのＮａＣｌ、約４０〜１５０ｍｇ／ｍｌスクロース、約２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌプロピレングリコール（ＰＧ）、及び平均分子量が約９０，０００の約３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む。さらに別の実施形態において、製剤は、約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜７．５の、約１０〜１００ｍＭのヒスチジン、リン酸塩又はＨＥＰＥＳ緩衝液、又はそれらの任意の組み合わせ、約５０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、約６０〜１１０ｍｇ／ｍｌのスクロース、約３〜７ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール（ＰＧ）、及び平均分子量が約９０，０００の約３〜７ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む。さらに他の実施形態において、製剤は、約１００〜３５０μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約７．０の約２５ｍＭのヒスチジン、リン酸塩、ＨＥＰＥＳの緩衝液又はそれらの組み合わせ、約７５ｍＭのＮａＣｌ、約９０ｍｇ／ｍｌのスクロース、約５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール（ＰＧ）、及び平均分子量が約９０，０００の約５ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む。一実施形態において、製剤は、アルミニウムアジュバントをさらに含む。
【００１６】
さらなる実施形態において、製剤は、約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜７．５の、約１０〜１００ｍＭのヒスチジン又はトリス又はＨＥＰＥＳ緩衝液、又はそれらの任意の組み合わせ、約５０〜３００ｍＭＮａＣｌ、約４０〜１５０ｍｇ／ｍｌスクロース、約２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌプロピレングリコール（ＰＧ）、及び平均分子量約９０，０００の約３〜１０ｍｇ／ｍｌカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む。なおさらなる実施形態において、製剤は、約５０〜６００μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約６．０〜７．５の約１０〜１００ｍＭのヒスチジン、ＴＲＩＳ又はＨＥＰＥＳ緩衝液、又はそれらの任意の組み合わせ、約５０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、約６０〜１１０ｍｇ／ｍｌのスクロース、約３〜７ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール（ＰＧ）、及び平均分子量が約９０，０００の約３〜７ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む。さらに別の実施形態において、製剤は、約１００〜３５０μｇ／ｍｌのＣＭＶ、ｐＨ約７．０の約２５ｍＭのヒスチジン、ＴＲＩＳ緩衝液又はそれらの組み合わせ、約７５ｍＭのＮａＣｌ、約９０ｍｇ／ｍｌのスクロース、約５ｍｇ／ｍｌプロピレングリコール（ＰＧ）、及び平均分子量が約９０，０００の約５ｍｇ／ｍｌカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む。一実施形態において、製剤は、アルミニウムアジュバントをさらに含む。
【００１７】
前述の実施形態の一態様において、製剤は、凍結乾燥前の水溶液である。
【００１８】
前述の実施形態の別の態様において、製剤は、水又は生理食塩水で再構成された再構成溶液である。一実施形態において、再構成された溶液は、生理食塩水、水又は緩衝液中に製剤化されたアルミニウムアジュバントを含む０．５〜１ｍｌの希釈剤を用いて行われる。別の実施形態において、再構成は、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）及び生理食塩水を含む希釈剤（０．５ｍｌ又は０．７ｍｌ）で行われる。さらなる実施形態において、リン酸アルミニウムアジュバントは、約４００〜５００μｇ／ｍｌ又は２００〜７００μｇ／ｍｌである。特定の実施形態において、再構成された溶液は、約２５〜３００μｇのＣＭＶ、約１．３９〜１．９ｍｇのヒスチジン、約６〜６．７ｍｇのＮａＣｌ、約３２．２〜４５ｍｇのスクロース、約１．７９〜２．５ｍｇのプロピレングリコール（ＰＧ）、及び平均分子量が約９０，０００の１．７９〜２．５ｍｇのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む０．５ｍｌ用量のＣＭＶである。
【００１９】
本発明の別の態様において、製剤は乾燥した固形であって、約２５〜３００μｇのＣＭＶ、約１．９〜２．７ｍｇのヒスチジン、ＴＲＩＳ、又はそれらの組み合わせ、約２．２〜３．０７ｍｇのＮａＣｌ、約４５〜６３ｍｇのスクロース、約２．５〜３．５ｍｇのプロピレングリコール（ＰＧ）、及び平均分子量９０，０００の約２．５〜３．５ｍｇのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む。本発明のさらなる態様において、製剤は、約ＣＭＶ１、ヒスチジン６〜１０８、ＮａＣｌ７〜１２３、スクロース１５０〜２５２０、プロピレングリコール８〜１４０、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム８〜１４０の重量比を含む乾燥した固体形態である。一実施形態において、製剤は乾燥固体製剤であって、ここで、２〜８℃で２年後のＣＭＶ力価は、約７．７７ｘ１０Ｅ４から３．８ｘ１０Ｅ８ｐｆｕ／ｍｌである。別の実施形態において、製剤は乾燥固形製剤であって、ここで、２〜８℃で６か月後のＣＭＶは、ＣＭＶ対照試料と比較して約０．２ｌｏｇ１０以下の感染力損失を有する。さらなる実施形態において、製剤は乾燥固形製剤であって、ここで、２〜８℃で２年後のＣＭＶは、ＣＭＶ対照試料と比較して約０．５ｌｏｇ１０以下の感染力損失を有する。さらに別の実施形態において、製剤は乾燥固形製剤であって、ここで、２〜８℃で２年後のＣＭＶは、ＣＭＶ対照試料と比較して約１．０ｌｏｇ１０以下の感染力損失を有する。別の実施形態において、乾燥固形製剤は、アルミニウムアジュバント、例えばＡＰＡをさらに含む。
【００２０】
前述の実施形態の一態様において、ＣＭＶは、弱毒生ＣＭＶ、又は死滅又は非活性化ＣＭＶである。一実施形態において、弱毒生ＣＭＶは、以下を含む条件付き複製欠陥ＣＭＶ（ｒｄＣＭＶ）である：
（ａ）ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ及びｇＬを含む五量体ｇＨ複合体；及び（ｂ）必須タンパク質と不安定化タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸であって、必須タンパク質は、ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ７９及びＵＬ８４からなる群から選択される。別の実施形態において、不安定化タンパク質は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）又はＦＫＢＰ誘導体のいずれかであり、ここで、ＦＫＢＰ誘導体は、Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｆ３６Ｖ、Ｅ６０Ｇ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、Ｋ１０５Ｉ及びＬ１０６Ｐからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含むＦＫＢＰである。別の実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体は、アミノ酸置換Ｆ３６Ｖ及びＬ１０６Ｐを含むＦＫＢＰである。一実施形態において、必須タンパク質はＩＥ１／２である。別の実施形態において、必須タンパク質はＵＬ５１である。前述の実施形態の別の実施形態において、ＣＭＶは、少なくとも２つの融合タンパク質をコードする核酸を含み、ここで、各融合タンパク質の必須タンパク質は異なる。一実施形態において、融合タンパク質の１つは、ＩＥ１／２又はＵＬ５１を含む。別の実施形態において、第１の融合タンパク質はＩＥ１／２を含み、第２の融合タンパク質はＵＬ５１を含む。
【００２１】
前述の実施形態の別の態様において、弱毒生ＣＭＶは、以下を含む条件付き複製欠陥ＣＭＶであり；（ａ）ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ及びｇＬを含む五量体ｇＨ複合体；及び（ｂ）ＩＥ１／２及び不安定化タンパク質の第１融合タンパク質、ならびに、ＵＬ５１及び不安定化タンパク質の第２融合タンパク質をコードする核酸、ここで、不安定化タンパク質は、アミノ酸置換Ｆ３６Ｖ及びＬ１０６Ｐを含むＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）誘導体であり、ここで、野生型ＩＥ１／２及びＵＬ５１はもはや存在せず、そしてここで、ＣＭＶはＵＬ１３１遺伝子の変異の修復によりｇＨ複合体発現を回復した弱毒株である。
【００２２】
前述の実施形態の一実施形態において、（ａ）第１の融合タンパク質は、配列番号１、又は配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列であり、そして（ｂ）第２の融合タンパク質は、配列番号３又は配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列である。前述の実施形態の別の実施形態において、第１の融合タンパク質は配列番号１を含み、そして、第２の融合タンパク質は配列番号３を含む。前述の実施形態の別の実施形態において、（ａ）第１の融合タンパク質は、配列番号２又は配列番号２と少なくとも９５％同一である核酸配列によってコードされ；そして、（ｂ）第２の融合タンパク質は、配列番号４又は配列番号４と少なくとも９５％同一である核酸配列によってコードされる。前述の実施形態のさらに別の実施形態において、第１の融合タンパク質は配列番号２によってコードされ、第２の融合タンパク質は配列番号４によってコードされる。
【００２３】
前述の実施形態の別の態様において、弱毒生ＣＭＶは、条件付き複製欠陥ＣＭＶであり、以下を含み；（ａ）ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ及びｇＬを含む五量体ｇＨ複合体、及び（ｂ）必須タンパク質と不安定化タンパク質の第１の融合タンパク質及び必須タンパク質と不安定化タンパク質の第２の融合タンパク質をコードする核酸；ここで、第１の融合タンパク質は配列番号１を含み、第２の融合タンパク質は配列番号３を含み、ここで、野生型ＩＥ１／２及びＵＬ５１はもはや存在せず、そしてここで、ＣＭＶは、ＵＬ１３１遺伝子の変異の修復によりｇＨ複合体発現を回復した弱毒株である。一実施形態において、ＣＭＶは、ＵＬ１３１遺伝子の変異の修復によりｇＨ複合体発現を回復したＡＤ１６９である。別の実施形態において、条件付き複製欠陥ＣＭＶは、配列番号１４に示されるゲノムを有する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＣＭＶ凍結乾燥収量の製剤賦形剤スクリーニングを示す。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図２】ＣＭＶ安定性のための製剤賦形剤スクリーニングを示す。異なる保存条件にさらされた安定性試料は、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともに、細胞ベースの感染力アッセイを使用して１週間でテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。
【図３】ＣＭＶ凍結乾燥収量のための製剤賦形剤の最適化を示す。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図４】ＣＭＶの安定性のための製剤賦形剤の最適化を示す。異なる時間（１か月、３か月、６か月）で２〜８℃の保存に供された安定性試料は、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と共に、細胞ベースの感染力アッセイを使用してテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。
【図５Ａ】ＣＭＶ凍結乾燥プロセスの収量に対する製剤のｐＨの影響を示す。異なるＣＭＶ製剤の凍結乾燥収量（Ａ：ｐＨ６．０、６．５、７．０及び７．５；Ｂ：ｐＨ６．０、７．０及び８．０）である。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図５Ｂ】ＣＭＶ凍結乾燥プロセスの収量に対する製剤のｐＨの影響を示す。異なるＣＭＶ製剤の凍結乾燥収量（Ａ：ｐＨ６．０、６．５、７．０及び７．５；Ｂ：ｐＨ６．０、７．０及び８．０）である。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図６Ａ】ＣＭＶの安定性に対する製剤のｐＨの影響を示す。異なるＣＭＶ製剤の安定性試験（Ａ：ｐＨ６．０、６．５、７．０及び７．５；Ｂ：ｐＨ６．０、７．０及び８．０）である。２〜８℃で１か月間及び３か月間（Ａ）又は２〜８℃又は２５℃で１週間（Ｂ）保存された安定性試料は、細胞ベースの感染アッセイを用いて、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともにテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図６Ｂ】ＣＭＶの安定性に対する製剤のｐＨの影響を示す。異なるＣＭＶ製剤の安定性試験（Ａ：ｐＨ６．０、６．５、７．０及び７．５；Ｂ：ｐＨ６．０、７．０及び８．０）である。２〜８℃で１か月間及び３か月間（Ａ）又は２〜８℃又は２５℃で１週間（Ｂ）保存された安定性試料は、細胞ベースの感染アッセイを用いて、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともにテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図７】プロピレングリコール濃度がＣＭＶ凍結乾燥収量に及ぼす影響を示す。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図８】ＣＭＶの安定性に対するプロピレングリコール濃度の影響を示す。異なるＣＭＶ製剤の安定性試験である。１５℃（１週間）及び２〜８℃（１週間及び１か月）の保存に供された安定性試料は、細胞ベースの感染力アッセイを用いて−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともにテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図９】ＣＭＶ凍結乾燥収率に対するＣＭＣナトリウム濃度の影響を示す。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図１０】ＣＭＶの安定性に対するナトリウムＣＭＣ濃度の影響を示す。異なるＣＭＶ製剤の安定性研究である。１５℃（１週間）及び２〜８℃（１週間及び１か月）の保存に供された安定性試料は、細胞ベースの感染力アッセイを使用して、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともにテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図１１】ＣＭＶ凍結乾燥収率に対する充填量の影響を示す。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図１２】充填量がＣＭＶの安定性に及ぼす影響を示す。２〜８℃（１か月、３か月及び６か月）の保存に供された安定性試料は、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともに、細胞ベースの感染力アッセイを使用してテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図１３】静的光散乱によって測定された液体及び凍結乾燥ＡＰＡ製剤の粒子サイズデータを示す。
【図１４Ａ】（Ａ）静的光散乱により測定された、ＣＭＶ−２０２製剤中のＡＰＡを含む液体、凍結／解凍及び凍結乾燥ＣＭＶの粒子サイズデータを示す。１か月間２〜８℃又は２５℃で保存された安定性試料は、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともに、細胞ベースの感染力アッセイを使用してテストされた。３つの試料がテストされ、３つのテストからの平均パーセント相対感染性データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告された。
【図１４Ｂ】（Ｂ）ＣＭＶ−２０２製剤におけるＣＭＶ安定性に対するＡＰＡの存在下での製剤の効果を示す。１か月間２〜８℃又は２５℃で保存された安定性試料は、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともに、細胞ベースの感染力アッセイを使用してテストされた。３つの試料がテストされ、３つのテストからの平均パーセント相対感染性データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告された。
【図１５】図１５ＡからＣは、五量体ｇＨ複合体の発現が回復したＣＭＶ株の構築の略図を示す。（Ａ）ＡＤ１６９ウイルスゲノムを操作するための自己切除可能な細菌人工染色体（ＢＡＣ）の生成のための戦略である。（Ｂ）その発現を復元するためのＵＬ１３１のフレームシフト変異の修復である。（Ｃ）自己切除可能なＣＭＶ  ＢＡＣを作成するためのＧＦＰのｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子による置換である。
【図１６】ＣＭＶ−２０２製剤の凍結乾燥プロセスの収率に対するｐＨ７．０のバッファー種の影響を示す。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告された。
【図１７】ＣＭＶ−２０２製剤のＣＭＶ安定性に対するｐＨ７．０のバッファー種の影響を示す。２〜８℃又は２５℃で１週間保存された安定性試料、及び試料は、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともに、セルベースの感染力アッセイを使用してテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図１８】ＣＭＶ−２０２製剤の凍結乾燥工程におけるスクロース濃度の影響を示す。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告された。
【図１９】ＣＭＶ−２０２製剤のＣＭＶ安定性に対するスクロース濃度の影響を示す。２〜８℃又は２５℃で１週間保存された安定性試料、及び試料は、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともに、セルベースの感染力アッセイを使用してテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図２０】ＣＭＶ−２０２製剤の凍結乾燥工程におけるトレハロース濃度の影響を示す。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告された。
【図２１】ＣＭＶ−２０２製剤のＣＭＶ安定性に対するトレハロース濃度の影響を示す。２〜８℃又は２５℃で１週間保存された安定性試料、及び、試料は、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともに、セルベースの感染力アッセイを使用してテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図２２】ＣＭＶ−２０２製剤の凍結乾燥工程における糖の種類（スクロース対トレハロース）の影響を示す。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告された。
【図２３】ＣＭＶ−２０２製剤のＣＭＶ安定性に対する糖の種類（スクロース対トレハロース）の影響を示す。１〜２℃又は２５℃で１週間保存された安定性試料は、−７０℃で保存した凍結乾燥対照試料とともに、細胞ベースの感染力アッセイを使用してテストされた。安定性試料のｌｏｇ１０感染力損失は、各製剤について−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均（ｓｅｍ）の標準誤差が計算され、２ｘｓｅｍが報告された。
【図２４】ＣＭＶ−２０２製剤の凍結乾燥工程におけるアルカリ塩（塩化ナトリウム対塩化カリウム）の効果を示す。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告された。
【図２５】ＣＭＶ−２０２製剤のＣＭＶ安定性に対するアルカリ塩（塩化ナトリウム対塩化カリウム）の影響を示す。２〜８℃又は２５℃で１週間保存された安定性試料、及び、試料は、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともに、セルベースの感染力アッセイを使用してテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【図２６】ＣＭＶ−２０２製剤の凍結乾燥工程におけるセルロースタイプ（ＣＭＣ対ＨＰＭＣ）の影響を示す。パーセント凍結乾燥収率は、凍結液体製剤の測定された感染力を１００パーセントとして使用して計算された。−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して凍結液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告された。
【図２７】ＣＭＶ−２０２製剤のＣＭＶ安定性に対するセルロースの種類（ＣＭＣ対ＨＰＭＣ）の影響を示す。２〜８℃又は２５℃で１週間保存された安定性試料、及び、試料は、−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料とともに、セルベースの感染力アッセイを使用してテストされた。安定性試料のＬｏｇ１０感染力損失は、各製剤について−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料と比較して計算された。３つの試料がテストされ、３つのテストの平均データが報告された。試料の平均の標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
「約」という用語は、物質又は組成物の量（ｍＭ、Ｍなど）、製剤成分のパーセンテージ（ｖ／ｖ又はｗ／ｖ）、溶液／製剤のｐＨ、又は方法におけるステップを特徴づけるパラメーターの値などを変更する場合、起こりうる数値の変化を指し、例えば、物質又は組成物の調製、特性評価、及び／又は使用に関連する、典型的な測定；取り扱い及びサンプリング手順を通じて；これらの手順の機器エラーによる、製造又は原料による相違、又は、組成物の製造又は使用又は手順の実施に使用される成分の純度、などである。特定の実施形態において、「約」は、±０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％又は１０％の変動を意味し得る。
【００２６】
「増量剤」という用語は、凍結乾燥製品の構造を提供する薬剤を含む。増量剤に使用される一般的な例には、マンニトール、グリシン及びラクトースが含まれる。薬学的にエレガントなケーキを提供することに加えて、増量剤は、崩壊温度の変更、凍結融解保護の提供、及び長期保存にわたるタンパク質安定性の強化に関して有用な品質を付与することもできる。これらの薬剤はまた、張度調整剤としても役立つ。
【００２７】
「ＣＭＶ対照試料」は、ＣＭＶ製剤試験試料と同じＣＭＶ処方を有し、ＣＭＶ製剤試験試料と同じ条件（すなわち、凍結乾燥、マイクロ波乾燥、リゾスフェア乾燥）でＣＭＶ製剤を乾燥させた直後の乾燥固体組成物を指すか、又はＣＭＶウイルスの感染力損失がないか又は最小限の感染力損失である条件で保存された（つまり、−７０℃以下で保存された）前述の乾燥した固形組成物を指す。
【００２８】
「不活化ウイルス」は、死滅した又は不活性な全ウイルスを指し、ここで、ウイルスは、化学物質、熱又は放射線を含む任意の手段によって不活性化される。不活化ウイルスは、不活化後の残存感染性が低くなり、例えば、不活性化後のプラーク形成単位（ＰＦＵ）は５ｍＬ未満である。好ましい実施形態において、不活化後、非常に少量の残存感染性が存在し、例えば、≦４ＰＦＵ／ｍＬ、≦３ＰＦＵ／ｍＬ、≦２ＰＦＵ／ｍＬ、＜１ＰＦＵ／ｍＬ、≦０．５ＰＦＵ／ｍＬ又は≦０．１ＰＦＵ／ｍＬである。特定のウイルス又はその製剤のＰＦＵは、例えば、プラークアッセイ、免疫染色アッセイ、又はウイルス感染性を検出するための当技術分野で既知の他の方法を使用することによって決定することができる。
【００２９】
「感染力喪失」とは、当技術分野で公知の方法を使用してＣＭＶ試験試料のウイルス複製の喪失をＣＭＶ対照試料と比較することを指す。一実施形態において、ＣＭＶ対照試料へのＣＭＶ試験試料におけるウイルス複製に必須のウイルスタンパク質の発現の喪失が測定される。別の実施形態において、感染力損失は、実施例３の相対感染力アッセイ（例えば、ＩＲＶＥアッセイ）を使用して測定される。別の実施形態において、感染力損失は、プラークアッセイを使用して測定される。
【００３０】
「凍結乾燥」（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、「凍結乾燥した」、及び「凍結乾燥」（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）という用語は、乾燥させる材料を最初に凍結し、次に真空環境での昇華によって氷又は凍結溶媒を除去するプロセスを指す。保存時の凍結乾燥製品の安定性を高めるために、賦形剤を前凍結乾燥製剤に含めることができる。
【００３１】
本明細書で使用される「リオスフェア」（Ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）は、実質的に球形又は卵形の治療活性剤を含む乾燥凍結単一体を指す。いくつかの実施形態において、リオスフェアの直径は、約２から約１２ｍｍ、好ましくは２から８ｍｍ、例えば２．５から６ｍｍ又は２．５から５ｍｍである。いくつかの実施形態において、リオスフェアの容量は、約２０から５５０μＬ、好ましくは２０から１００μＬ、例えば２０から５０μＬである。リオスフェアが実質的に球形ではない実施形態においては、リオスフェアのサイズは、より長い寸法のより短い寸法に対する比であるアスペクト比に関して説明することができる。リオスフェアのアスペクト比は、０．５から２．５、好ましくは０．７５から２、例えば１から１．５であり得る。
【００３２】
「弱毒生ＣＭＶ」は、ウイルスが疾患を引き起こす能力が野生型ＣＭＶと比較して低下しているＣＭＶを指す。一実施形態において、疾患を引き起こす能力の低下は、ＣＭＶの感染力の低下によって測定される。
【００３３】
本明細書で使用される「マイクロ波真空乾燥」は、昇華によるワクチン製剤の乾燥ワクチン製品（好ましくは、＜６％水分）の形成のために、マイクロ波放射（放射エネルギー又は非電離放射としても知られている）を利用する乾燥方法を指す。特定の実施形態において、マイクロ波乾燥は、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１６／０２２８５３２号に記載されているように行われる。一実施形態において、マイクロ波放射は進行波形式である。
【００３４】
「再構成された溶液」は、ウイルスが再構成された溶液中に分散されるように、固体形態（凍結乾燥ケーキなど）の乾燥ウイルスを希釈剤に溶解することによって調製されたものである。再構成された溶液は、投与（例えば、筋肉内投与）に適しており、場合により皮下投与に適している場合がある。
【００３５】
本明細書で使用される「塩（類）」は、無機及び／又は有機酸で形成された酸性塩、ならびに無機及び／又は有機塩基で形成された塩基性塩を示す。他の塩もまた有用であるが、薬学的に許容される（すなわち、非毒性の生理学的に許容される）塩が好ましい。例示的な塩基性塩には、アンモニウム塩、ナトリウム、リチウム及びカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、亜鉛塩、Ｎ−Ｍｅ−Ｄ−グルカミン、コリン、トロメタミン、ジシクロヘキシルアミン、ｔ−ブチルアミンのような有機塩基（例えば、有機アミン）との塩、及びアルギニン、リジンなどのようなアミノ酸との塩を含む。
【００３６】
「糖アルコール」は、一般式ＨＯＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｎＣＨ２ＯＨ、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０を有する糖から誘導されたポリオールを指す。例には、マンニトール、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール及びグリセロールが含まれ、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「ｘ％（ｗ／ｖ）」は、ｘｇ／１００ｍｌと同等である（例えば、５％ｗ／ｖは、５０ｍｇ／ｍｌに等しい）。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「免疫応答を誘発する」という用語は、それが投与される患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて免疫応答を生じさせる弱毒生、死滅又は不活化ＣＭＶの能力を指し、ここで、応答には、ＣＭＶに特異的に結合し、好ましくは中和し、及び／又はＴ細胞活性化を引き起こす要素（抗体など）の産生が含まれるが、これに限定されない。「防御免疫応答」とは、患者がＣＭＶ感染（一次、再発、及び／又は重複感染を含む）にかかる可能性を低下させ、及び／又はＣＭＶ感染に関連する少なくとも１つの病理を改善及び／又はＣＭＶ感染の重症度／長さを低下させる免疫応答である。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「免疫学的有効量」という用語は、ＣＭＶ感染（一次、再発、及び／又は超免疫を含む）から保護できる患者に投与したときに、ＣＭＶに対する免疫応答を誘発でき、及び／又はＣＭＶ感染に関連する少なくとも１つの病状を改善し、及び／又は患者のＣＭＶ感染の重症度／長さを軽減できる免疫原の量をいう。この量は、ＣＭＶ感染の可能性又は重症度を大幅に軽減するのに十分でなければならない。当技術分野で公知の動物モデルを使用して、免疫原の投与の保護効果を評価することができる。例えば、免疫原を投与された個体からの免疫血清又は免疫Ｔ細胞は、抗体又は細胞傷害性Ｔ細胞による中和能力、又は免疫Ｔ細胞によるサイトカイン産生能力についてアッセイすることができる。そのような評価に一般的に使用されるアッセイには、ウイルス中和アッセイ、抗ウイルス抗原ＥＬＩＳＡ、インターフェロン−ガンマサイトカインＥＬＩＳＡ、インターフェロン−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内マルチサイトカイン染色（ＩＣＳ）、及び５１クロム放出細胞毒性アッセイが含まれ、これらに限定されない。動物チャレンジモデルは、免疫学的に有効な量の免疫原を決定するためにも使用できる。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「条件付き複製欠陥ＣＭＶ」という用語は、ウイルス複製に必須の１以上のタンパク質が不安定化したＣＭＶを指す。野生型の不安定化されていない必須タンパク質をコードする核酸は、条件付き複製欠損ウイルスにはもはや存在しない。１以上の必須タンパク質が不安定化する条件下で、ウイルス複製は、不安定な必須タンパク質を含まないウイルスと比較して、好ましくは５０％、７５％、９０％、９５％、９９％又は１００％以上減少する。しかし、不安定化した必須タンパク質を安定化させる条件下では、ウイルス複製は、不安定化された必須タンパク質を含まないＣＭＶの複製量の好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％で起こり得る。より好ましい実施形態において、１以上の必須タンパク質は、ＦＫＢＰ又はその誘導体のような不安定化タンパク質との融合によって不安定化される。このような融合タンパク質は、Ｓｈｉｅｌｄ−１のような安定剤の存在によって安定化できる。本明細書で使用する場合、「ｒｄＣＭＶ」という用語は、条件付き複製欠陥サイトメガロウイルスを指す。
【００４１】
好ましい実施形態において、複製生ウイルスによって誘発される免疫応答は、その生ウイルスの対応物と比較して、程度及び／又は幅において同一であるか又は実質的に類似している。他の好ましい実施形態において、電子顕微鏡分析による複製欠陥ウイルスの形態は、区別できないか又はその生ウイルスの対応物と実質的に類似している。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ＦＫＢＰ」という用語は、配列番号１１の不安定化タンパク質を指す。ＦＫＢＰを含む融合タンパク質は、宿主細胞によって機械的に分解される。本明細書で使用する場合、「ＦＫＢＰ誘導体」という用語は、１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によって変更されているＦＫＢＰタンパク質又はその一部を指す。ＦＫＢＰ誘導体は、タンパク質に融合された場合、ＦＫＢＰの不安定化特性の実質的にすべてを保持し、ＦＫＢＰがＳｈｉｅｌｄ−１によって安定化される能力の実質的にすべてを保持する。好ましいＦＫＢＰ誘導体は、以下のアミノ酸位置Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｆ３６Ｖ、Ｅ６０Ｇ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、Ｋ１０５Ｉ及びＬ１０６Ｐにおいて示される置換の１つ以上を有する。Ｆ３６Ｖ及びＬ１０６Ｐ置換（配列番号１２）を有するＦＫＢＰ誘導体が特に好ましい。好ましい実施形態において、ＦＫＢＰ又はＦＫＢＰ誘導体をコードする核酸は、内因性ＦＫＢＰのためにヒトで一般的に使用されない少なくともいくつかのコドンを含む。これにより、融合タンパク質のＦＫＢＰ又はＦＫＢＰ誘導体は、ヒトゲノムの対応物と再配置又は再結合する可能性が減少する。配列番号１３の核酸配列は、そのようなコドンを使用して配列番号１２をコードする。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「Ｓｈｉｅｌｄ−１」又は「Ｓｈｌｄ−１」という用語は、野生型ＦＫＢＰ及びその誘導体に結合し、安定剤として作用する合成小分子を指す。野生型ＦＫＢＰと比較して、Ｆ３６Ｖ誘導体への結合は約１，０００倍強くなる（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１０４３７−４２）。Ｓｈｉｅｌｄ−１は合成でき（基本的にはＨｏｌｔら、１９９３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：９９２５−３８、及び、Ｙａｎｇら、２０００、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：１１３５−４２、及びＧｒｉｍｌｅｙら、２００８、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．１８：７５９に記載される）、又は、Ｃｈｅｍｉｎｐｈａｒｍａ  ＬＬＣ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＣＴ）、又は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＮＣ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）から市販されている。Ｓｈｉｅｌｄ−１の塩も本発明の方法で使用することができる。Ｓｈｉｅｌｄ−１の構造は次のとおりである。
【００４４】
【化１】
2021501173.tif 000003
【００４５】
本明細書で使用される場合、「融合したタンパク質」又は「融合タンパク質」という用語は、２つのポリペプチドが同一の連続したアミノ酸配列の一部としてインフレームで配置されたものを指す。融合は、ポリペプチド間に追加のアミノ酸残基がないように直接的であるか、又は性能を改善するか又は機能性を追加する小さなアミノ酸リンカーが存在するように間接的であり得る。好ましい実施形態において、融合は直接的である。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「五量体ｇＨ複合体」又は「ｇＨ複合体」という用語は、ＣＭＶビリオンの表面上の５つのウイルスタンパク質の複合体を指す。複合体は、ｇＨ／ｇＬ足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）に組み立てられたＵＬ１２８、ＵＬ１３０、及びＵＬ１３１によってコードされるタンパク質で構成されている（Ｗａｎｇ及びＳｈｅｎｋ、２００５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１８１５；Ｒｙｃｋｍａｎら、２００８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：６０）。ＣＭＶ株ＡＤ１６９の複合タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿７８３７９７．１（ＵＬ１２８）、ＮＰ＿０４００６７（ＵＬ１３０）、ＣＡＡ３５２９４．１（ＵＬ１３１）、ＮＰ＿０４０００９（ｇＨ、別名ＵＬ７５）及びＮＰ＿７８３７９３（ｇＬ、ＵＬ１１５とも呼ばれる）に示される。一部の弱毒ＣＭＶ株は、ＵＬ１３１に１以上の変異がありタンパク質が発現せず、したがってｇＨ複合体が形成されない。このような場合、ｇＨ複合体がｒｄＣＭＶで発現されるように、ＵＬ１３１を修復する必要がある（Ｗａｎｇ及びＳｈｅｎｋ、２００５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０３３０のような方法を使用）。これらのウイルスは、五量体ｇＨ複合体を構成し、ウイルスエンベロープ上で五量体ｇＨ複合体を組み立てる５つのウイルスタンパク質を発現する。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「必須タンパク質」という用語は、インビボ及び組織培養において、ウイルス複製に必要なウイルスタンパク質を指す。ＣＭＶの必須タンパク質の例には、ＩＥ１／２、ＵＬ３７ｘ１、ＵＬ４４、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５６、ＵＬ７７、ＵＬ７９、ＵＬ８４、ＵＬ８７及びＵＬ１０５が含まれ、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「不安定化された必須タンパク質」という用語は、ウイルス複製において発現され、その機能を果たし、そして、安定剤の非存在下で分解される必須タンパク質を指す。好ましい実施形態において、必須タンパク質は、ＦＫＢＰ又はその誘導体のような不安定化タンパク質に融合される。通常の成長条件下（すなわち、安定剤が存在しない場合）では、融合タンパク質は発現されるが、宿主細胞の機構によって分解される。分解により、必須タンパク質がウイルス複製で機能することができなくなり、必須タンパク質が機能的にノックアウトされる。Ｓｈｉｅｌｄ−１のような安定剤が存在する条件下で、融合タンパク質は安定化され、ウイルス複製を維持できるレベルでその機能を実行でき、このレベルは、好ましくは、不安定化した必須タンパク質を含まないＣＭＶの複製量の少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％である。
【００４９】
複製欠陥ＣＭＶ
本発明の一態様において、製剤では、五量体ｇＨ複合体を発現する複製欠陥ＣＭＶ（ｒｄＣＭＶ）を使用する。五量体ｇＨ複合体を発現する任意の弱毒ＣＭＶは、本明細書に記載されるように複製欠損にすることができる。１つの実施形態において、弱毒ＣＭＶは、ＵＬ１３１遺伝子における変異の修復のためにｇＨ複合体発現を回復したＡＤ１６９である（実施例１を参照のこと）。
【００５０】
条件付き複製欠陥ウイルスは、１以上の必須ウイルスタンパク質が、必須タンパク質の不安定化した対応物に置き換わった変異体である。不安定化された対応物は、必須タンパク質と不安定化タンパク質との間の融合タンパク質をコードする核酸によってコードされる。不安定化した必須タンパク質は、安定化剤が存在する場合にのみウイルス複製をサポートするように機能できる。好ましい実施形態において、米国特許出願公開第２００９／０２１５１６９号に記載されている方法を使用して、条件付き複製欠陥表現型を、ＣＭＶを発現する五量体ｇＨ複合体に付与する。手短に言えば、ＣＭＶ複製に必須の１以上のタンパク質は、不安定化タンパク質、例えば、ＦＫＢＰ又はＦＫＢＰ誘導体に融合される。野生型必須タンパク質をコードする核酸は、もはやｒｄＣＭＶには存在しない。外から加えられた細胞透過性の小分子安定剤であるＳｈｉｅｌｄ−１（Ｓｈｌｄ−１）の存在下で、融合タンパク質は安定化され、そして、必須タンパク質は、ウイルス複製をサポートするように機能することができる。安定剤の存在下でのｒｄＣＭＶの複製は、好ましくは、不安定化融合タンパク質を含まないＣＭＶ（例えば、ｒｄＣＭＶを構築するために使用される親の弱毒ＣＭＶ）の複製量の少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％である。Ｓｈｉｅｌｄ−１がない場合、融合タンパク質の不安定化タンパク質は、融合タンパク質が機械的に宿主細胞によって実質的に分解されるようにする。必須タンパク質が存在しない又は最小限の量では、ＣＭＶは患者のＣＭＶ感染を生成又は維持する量で複製できない。安定化剤の非存在下でｒｄＣＭＶの複製は起こらないか、又は、不安定化融合タンパク質を含まないＣＭＶ（たとえば、ｒｄＣＭＶを構築するために使用される親の弱毒ＣＭＶ）と比較して好ましくは５０％、７５％、９０％、９５％又は９９％以上減少する。
【００５１】
本発明での使用に適した融合タンパク質は、安定剤の存在下で宿主細胞におけるウイルス複製を促進するために十分な必須タンパク質活性を保持し、そして安定剤がない場合は、ＣＭＶ複製の減少（好ましくは５０％、７５％、９０％、９５％以上、９９％の減少）を起こす。好ましくは、融合タンパク質で使用するための必須タンパク質は、非構造的タンパク質をコードし、したがって、ｒｄＣＭＶビリオンにパッケージされない。本明細書で同定される適切な必須タンパク質には、必須遺伝子ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ７９及びＵＬ８４によってコードされるＣＭＶタンパク質が含まれる。
【００５２】
当技術分野で周知の組換えＤＮＡ法を使用して、ＣＭＶ複製及び／又はＣＭＶ感染の確立／維持に必須のタンパク質をコードする核酸を、ＦＫＢＰ又はその誘導体をコードする核酸に付着させる。コード化された融合タンパク質は、必須タンパク質にインフレームで融合されたＦＫＢＰ又はＦＫＢＰ誘導体を含む。コード化された融合タンパク質は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下で安定である。しかしながら、コード化された融合タンパク質はＳｈｉｅｌｄ−１がないと不安定化し、破壊の対象となる。好ましい実施形態において、ＦＫＢＰは、配列番号１１である。他の好ましい実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体は、Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｆ３６Ｖ、Ｅ６０Ｇ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、Ｋ１０５Ｉ及びＬ１０６Ｐからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含むＦＫＢＰである。より好ましい実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体は、Ｆ３６Ｖ及び／又はＬ１０６Ｐ置換（配列番号１２）を含む。より好ましい実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体は、配列番号１３によってコードされる。
【００５３】
ＦＫＢＰ又はその誘導体との融合による不安定化の標的となる必須タンパク質は、１）ウイルス複製に必須であり；２）必須タンパク質の機能を実質的に妨害することなく、不安定化タンパク質の融合に対応でき；そして、３）他の周囲のウイルス遺伝子のＯＲＦを実質的に破壊することなく、必須タンパク質をコードするウイルスＯＲＦの５’又は３’末端においてＦＫＢＰ又はその誘導体をコードする核酸の挿入に対応することができる。好ましい実施形態において、ＦＢＢＰ又はその誘導体との融合による不安定化の標的となる必須タンパク質は、非構造タンパク質をコードし、したがって、組換えＣＭＶビリオンにパッケージされる可能性が低い。表１は、前述の基準を満たすＣＭＶ遺伝子を示す。
【００５４】
【表１】
2021501173.tif 000004
【００５５】
本発明は、不安定化タンパク質に融合された必須タンパク質又はその誘導体との融合タンパク質を含むｒｄＣＭＶの製剤を包含する。必須タンパク質誘導体は、野生型必須タンパク質と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、追加、及び／又は削除を含み、Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下でウイルス複製をサポートするのに十分な必須タンパク質の活性を提供できる。ウイルス活性を測定する例は、以下の実施例に提供されている。当該分野で公知の方法を使用して、目的のＣＭＶ必須タンパク質と誘導体との間の差異の程度を決定し得る。一実施形態において、関連性を決定するために配列同一性が使用される。本発明の誘導体は、好ましくは、塩基配列に対して少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一であろう。同一性パーセントは、同一残基の数を残基の総数で割って１００を掛けたものとして定義される。アラインメント内のシーケンスの長さが異なる場合（ずれ又は拡張のため）、合計の長さの値を表す最も長いシーケンスの長さが計算に使用される。
【００５６】
いくつかの実施形態において、不安定化の標的となるウイルス複製に必須の１以上のウイルスタンパク質は、ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ８４、ＵＬ７９、ＵＬ８７、ＵＬ３７ｘ１、ＵＬ７７及びＵＬ５３又はそれらの誘導体からなる群から選択される。特定の実施形態において、不安定化の標的となるウイルス複製に必須の１以上のウイルスタンパク質は、ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ８４、ＵＬ７９、ＵＬ８７からなる群から選択される。より具体的な実施形態において、不安定化の標的となるウイルス複製に必須の１以上のウイルスタンパク質は、ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ７９及びＵＬ８４からなる群から選択される。
【００５７】
ＦＫＢＰ又はその誘導体への融合により、２つ以上の必須タンパク質を不安定化することができる。いくつかの実施形態において、必須タンパク質は、ＣＭＶ複製及び／又は感染の異なる段階で機能する（限定されないが、即時初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）、初期（ｅａｒｌｙ）又は後期（ｌａｔｅ）段階を含む）。好ましい実施形態において、不安定化の標的となるウイルス複製に必須のウイルスタンパク質の組み合わせは、ＩＥ１／２及びＵＬ５１、ＩＥ１／２及びＵＬ５２、ＩＥ１／２及びＵＬ７９、ＩＥ１／２及びＵＬ８４、ＵＬ８４及びＵＬ５１、並びに、ＵＬ８４及びＵＬ５２からなる群から選択される。より好ましい実施形態において、ＩＥ１／２及びＵＬ５１は、同じ組換えＣＭＶにおける不安定化を標的とする。最も好ましい実施形態において、ＩＥ１／２を含む融合タンパク質は配列番号１であり、ＵＬ５１を含む融合タンパク質は配列番号３である。配列番号１及び３は、それぞれ、配列番号２及び４によってコードされ得る。不安定化されたＩＥ１／２及びＵＬ５１を有するｒｄＣＭＶのゲノムは、配列番号１４に示される。
【００５８】
ＦＫＢＰ又はその誘導体は、必須タンパク質に直接的又は間接的に融合させることができる。好ましい実施形態において、ＦＫＢＰ又はその誘導体は、必須タンパク質に直接融合される。
【００５９】
ＦＫＢＰ又はその誘導体は、必須タンパク質のＮ末端又はＣ末端のいずれかで必須タンパク質に融合することができる。好ましい実施形態において、ＦＫＢＰは、必須タンパク質のＮ末端に融合される。
【００６０】
２以上のＦＫＢＰ又はその誘導体を、必須タンパク質に融合させることができる。必須タンパク質に融合した２つ以上のＦＫＢＰ又はその誘導体が存在する実施形態において、個々のＦＫＢＰ又はその誘導体のそれぞれは、同じでも異なっていてもよい。好ましい実施形態において、必須タンパク質に融合した１つのＦＫＢＰ又はその誘導体がある。
【００６１】
不活化ＣＭＶ
いくつかの実施形態において、上記のｒｄＣＭＶ又はＣＭＶは、化学的又は物理的不活化を使用してさらに不活化される。そのような例には、熱処理、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）とのインキュベーション又はガンマ線照射が含まれる。好ましい方法は、限定されるものではないが、五量体ｇＨ複合体によって誘発される免疫原性を含む免疫原性を破壊しないか、又は実質的に破壊しない。そのように、さらに不活化されたＣＭＶによって誘発された免疫応答は、追加の不活化処理を行わないｒｄＣＭＶと比較して、維持されるか又は実質的に維持される。好ましい実施形態において、中和抗体を誘導するさらなる不活化ＣＭＶの能力は、追加の不活化処理のないｒｄＣＭＶによって誘導される能力に匹敵する。五量体ｇＨ複合体を含むＣＭＶの免疫原性を確保するために、化学的方法又は物理的方法のいずれか１つ又は組み合わせによる不活化レジメンが経験的に決定される。
【００６２】
ウイルス複製の評価
当業者は、ウイルス複製アッセイを使用して、ＦＫＢＰ又はその誘導体に融合された特定の必須タンパク質の機能を決定することができる。遺伝子発現／コード化された製品の機能は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下での必須タンパク質へのＦＫＢＰ又はその誘導体の結合によって実質的に影響されるべきではないため、ｒｄＣＭＶは、Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下で親ＣＭＶに匹敵する速度で複製する必要がある（できれば、親のウイルスレベルの７５％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％で）。ｒｄＣＭＶの複製は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下では、親ＣＭＶから実質的に変更される（不安定化融合タンパク質が含まれていないＣＭＶと比較して、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％又は１００％以上減少することが好ましい）。
【００６３】
好ましい実施形態において、少なくとも２μＭのＳｈｉｅｌｄ−１の存在下でのｒｄＣＭＶは、非ｒｄＣＭＶが複製する量の好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％複製する。
【００６４】
一実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶを含む組成物は、少なくとも２μＭのＳｈｉｅｌｄ−１の存在下で、少なくとも１０５ｐｆｕ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０７ｐｆｕ／ｍｌのウイルス力価を有する。
【００６５】
逆に、ｒｄＣＭＶは、Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下では実質的に複製すべきではない。複製欠陥メカニズムの質は、コントロールがウイルス複製を許容しない条件下、すなわち、これらの条件下で子孫ビリオンの感染力価がどの程度ストリンジェントであるかによって判断される。ここで説明するｒｄＣＭＶは、Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在なしでは、実質的に（細胞培養内又は患者内で）複製できない。ＡＲＰＥ−１９細胞及び他の種類のヒト初代細胞での複製は条件付きであり、ウイルス複製を維持するには、培養培地に０．１μＭ以上、好ましくは少なくとも２μＭのＳｈｉｅｌｄ−１のモル濃度が必要である。
【００６６】
一実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶを含む組成物は、Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下では、２ｐｆｕ／ｍｌ未満、より好ましくは１ｐｆｕ／ｍｌ未満のウイルス力価を有する。
【００６７】
ＣＭＶ複製を評価する方法を使用して、Ｓｈｉｅｌｄ−１が存在しない場合と存在する場合のｒｄＣＭＶ複製を評価できる。しかしながら、好ましい実施形態において、ＴＣＩＤ５０が使用される。
【００６８】
別の実施形態において、ｒｄＣＭＶ力価は、５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイによって決定される。簡潔には、この希釈アッセイは、感染した宿主の５０％を殺すのに必要なウイルスの量を定量する。宿主細胞（例えば、ＡＲＰＥ−１９細胞）をプレーティングし、ウイルスの段階希釈液を加える。インキュベーション後、細胞死（すなわち感染細胞）のパーセンテージが観察され、各ウイルス希釈について記録される。結果は、ＴＣＩＤ５０を数学的に計算するために使用される。
【００６９】
別の実施形態において、ｒｄＣＭＶ力価は、プラークアッセイを使用して決定される。ウイルスプラークアッセイは、ウイルス試料中のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の数を決定する。簡潔には、宿主細胞（例えばＡＲＰＥ−１９細胞）のコンフルエントな単層をさまざまな希釈率でｒｄＣＭＶに感染させ、寒天やカルボキシメチルセルロースのような半固形培地で覆い、ウイルス感染が無差別に広がるのを防ぐ。ウイルスプラークは、ウイルスが固定細胞単層内の細胞に感染すると形成される。ウイルス感染細胞は溶解し、隣接する細胞に感染を広げ、そこで感染から溶解のサイクルが繰り返される。感染した細胞領域は、目視又は光学顕微鏡で確認できるプラーク（感染していない細胞に囲まれた感染領域）を作成する。プラークをカウントし、プレートの準備に使用した希釈係数と組み合わせた結果を使用して、試料単位体積あたりのプラーク形成単位の数（ｐｆｕ／ｍＬ）を計算する。ｐｆｕ／ｍＬの結果は、試料内の感染性粒子の数を表し、形成された各プラークは１つの感染性ウイルス粒子を表すという仮定に基づいている。本発明の特定の実施形態において、製剤は、凍結乾燥後、２．５ｘ１０Ｅ０５〜１．２ｘ１０Ｅ０９ｐｆｕ／ｍＬの弱毒生ＣＭＶ又はｒｄＣＭＶを含む。
【００７０】
アジュバント
アジュバントは、免疫原が免疫応答を引き起こすのを補助することができる物質である。アジュバントは、以下の１つ以上のようなさまざまなメカニズムによって機能することができる；抗原の生物学的又は免疫学的半減期の増加；抗原提示細胞への抗原送達の改善；抗原提示細胞による抗原プロセッシングと提示の改善；用量節約を達成し、免疫調節性サイトカインの産生を誘導する（Ｖｏｇｅｌ、２０００、Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ３０：Ｓ２６６）。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ｒｄＣＭＶ及びアジュバントを含む。アジュバントは、凍結乾燥、マイクロ波乾燥、リオスフェアの形成前に製剤に添加するか、又は乾燥したＣＭＶ製剤の再構成時に添加することができる。
【００７１】
免疫応答の生成を補助するために、さまざまな異なるタイプのアジュバントを使用することができる。特定のアジュバントの例には、水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム、無定形ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸アジュバント（ＡＡＨＳＡ）又はアルミニウムの他の塩；リン酸カルシウム；ＤＮＡ  ＣｐＧモチーフ；モノホスホリルリピドＡ；コレラ毒素；大腸菌熱不安定毒素；百日咳毒素；ムラミルジペプチド；フロイントの不完全アジュバント；ＭＦ５９；ＳＡＦ；免疫刺激複合体；リポソーム；生分解性ミクロスフェア；サポニン；非イオン性ブロックコポリマー；ムラミルペプチド類似体；ポリホスファゼン；合成ポリヌクレオチド；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−２；ＩＬ−１２；及びＩＳＣＯＭＳを含む。例えば、Ｖｏｇｅｌ，２０００，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ３０：Ｓ２６６；Ｋｌｅｉｎら，２０００，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ８９：３１１；Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら，２００１，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１１８０；Ｋｅｒｓｔｅｎ，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：９１５；Ｏ’Ｈａｇｅｎ，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．１：２７３を参照のこと。
【００７２】
他の実施形態において、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバント及び／又はリン酸アルミニウムアジュバントを含む粒子状アジュバントが本発明の組成物において使用されるが、これらに限定されない。リン酸アルミニウムアジュバントは、凍結乾燥前に水溶液に添加するか、又は凍結乾燥製剤の再構成のために希釈剤に添加することができる。
【００７３】
製剤
特定の実施形態において、本発明の製剤は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ｐＨ約６．０〜８．０の緩衝液、アルカリ又はアルカリ塩、糖；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロース及びメチルセルロースからなる群から選択されるセルロース誘導体を含み、そして任意に、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル及び糖アルコールからなる群から選択されるポリオールを含む。
【００７４】
特定の実施形態において、本発明の製剤は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ｐＨ約６．０〜７．５の緩衝液、アルカリ又はアルカリ塩、糖；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（２−ＨＥＣ）、クロスカルメロース及びメチルセルロースからなる群から選択されるセルロース誘導体を含み、そして任意に、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル及び糖アルコールからなる群から選択されるポリオールを含む。
【００７５】
好ましい実施形態において、セルロース誘導体はアニオン性であり、ＣＭＶ製剤中で、塩、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はカリウムを、約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌ、１〜１０ｍｇ／ｍｌ、３〜７ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌで形成する。カルボキシメチルセルロース塩は、平均分子量が約７００，０００の高粘度タイプ、平均分子量が約２５０，０００の中粘度タイプ、及び、平均分子量約９０，０００の低粘度タイプで入手できる。一実施形態において、セルロース誘導体は、ＣＭＶ製剤中で、平均分子量が約７００，０００の約０．３〜１．５ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロース塩である。別の実施形態において、セルロース誘導体は、平均分子量が約２５０，０００の約１〜４ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロース塩である。さらなる実施形態において、セルロース誘導体は、平均分子量が約９０，０００の約３〜７又は３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロース塩である。なおさらなる実施形態において、セルロース誘導体は、平均分子量が約５０，０００〜１，０００，０００の約０．３〜１０ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロース塩である。
【００７６】
一実施形態において、緩衝液は、約５〜５００ｍＭ、５０〜３００ｍＭ、１０〜１００ｍＭ又は２０〜３０ｍＭの、リン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、ＴＲＩＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩、クエン酸塩からなる群から選択される。一実施形態において、緩衝液は、約５〜５００ｍＭ、５０〜３００ｍＭ、１０〜１００ｍＭ又は２０〜３０ｍＭのリン酸塩、ヒスチジン及びＨＥＰＥＳからなる群から選択される。
【００７７】
アルカリ又はアルカリ塩は、安定化効果を提供することができ、約５０〜３００ｍＭ、５０〜１５０ｍＭ又は６０〜８０ｍＭの、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム又はそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。特定の実施形態において、塩は、約５０〜３００ｍＭ、５０〜１５０ｍＭ又は６０〜８０ｍＭの塩化カリウム及び塩化ナトリウムからなる群から選択される。
【００７８】
糖及びポリオールは、凍結防止剤又は安定化賦形剤として機能する。一実施形態において、糖は、約４０〜１５０ｍｇ／ｍｌ、６０〜１１０ｍｇ／ｍｌ又は８０〜１００ｍｇ／ｍｌの、トレハロース又はスクロースである。別の実施形態において、ポリオールは、約２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、３〜７ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌの、プロピレングリコール、グリセロール又はソルビトールである。
【００７９】
本発明の組成物は、当業者に知られている１以上の方法、例えば、非経口的、経粘膜的、経皮的、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、腹腔内によって対象に投与することができ、そしてそれに応じて製剤化され得る。
【００８０】
一実施形態において、本発明の組成物は、液体製剤の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、動脈内、皮下注射又は呼吸器内粘膜注射を介して投与される。注射用の液体製剤には、溶液などが含まれる。本発明の組成物は、単回用量バイアル、複数回用量バイアル又は事前充填シリンジとして製剤化され得る。
【００８１】
別の実施形態において、本発明の組成物は経口投与され、したがって、経口投与に適した形態で、すなわち固体又は液体調製物として製剤化される。固体経口製剤には、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレットなどが含まれる。液体経口製剤には、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、油などが含まれる。
【００８２】
本発明の一態様において、製剤は、凍結乾燥、凍結、マイクロ波乾燥から又はリゾスフェアの生成によって調製された固体乾燥製剤である。製剤は、−７０℃、−２０℃、２〜８℃又は室温で保存できる。乾燥した製剤は、単位用量バイアルの成分の重量で表すことができ、しかしながら、これは、用量やバイアルサイズによって異なる。あるいは、本発明の乾燥製剤は、同じ試料（バイアルなど）の原薬（ＤＳ）の重量と比較した成分の重量の比率として成分の量で表すことができる。この比率はパーセンテージで表すことができる。そのような比率は、バイアルのサイズ、投与及び再構成プロトコルとは独立して、本発明の乾燥製剤の固有の特性を反映している。一実施形態において、製剤は、２０、１５、１０又は５μｍ未満のｄ（０．５）μｍを有する。他の実施形態において、製剤はリオスフェア中にある。
【００８３】
本発明の別の態様において、製剤は再構成された溶液である。乾燥固形製剤は、投与経路や投与量のような臨床的要因に応じて異なる濃度で再構成できる。例えば、乾燥製剤は、皮下投与に必要な場合、高濃度で（すなわち、少量で）再構成することができる。特定の対象に高用量が必要な場合、特に注射量を最小限に抑えなければならない場合に皮下投与する場合、高濃度が必要になる場合もある。その後の水又は等張緩衝液による希釈は、医薬品をより低い濃度に希釈するために容易に使用できる。より低い薬物濃度で等張性が望まれる場合、乾燥粉末を標準的な少量の水で再構成し、次に０．９％塩化ナトリウムのような等張希釈剤でさらに希釈することができる。
【００８４】
再構成は、完全な水和を確実にするために一般に約２５℃の温度で行われるが、必要に応じて他の温度を使用することもできる。再構成に必要な時間は、例えば、希釈剤の種類、賦形剤及びタンパク質の量に依存する。例示的な希釈剤には、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー溶液又はブドウ糖溶液が含まれる。再構成容量は、約０．５〜１．０ｍｌ、好ましくは０．５ｍｌ又は０．７ｍｌであり得る。
【００８５】
本発明の別の実施形態において、製剤は、凍結乾燥、凍結、マイクロ波乾燥又はリオスフェアの生成の前に調製された水溶液である。
【００８６】
一部の実施形態において、ｒｄＣＭＶは、免疫応答を誘発するために患者に投与される。免疫原性組成物の保存中にｒｄＣＭＶ組成物の感染力の損失を最小限にするか又は回避することが望ましい。そのような目的を支持する条件には、限定されるものではないが、（１）保存中の持続的な安定性、（２）ストレスのかかった凍結融解サイクルに対する耐性、（３）周囲温度で１週間までの安定性、（４）免疫原性の維持、及び（５）アジュバント戦略との互換性、を含む。ｒｄＣＭＶの安定性に影響を与える条件には、バッファーのｐＨ、バッファーのイオン強度、特定の賦形剤の有無及び温度が含まれ、これらに限定されない。組成物は、ワクチン組成物に適した精製されたｒｄＣＭＶウイルス粒子の安定性を高めるために緩衝液を含む。
【００８７】
ウイルス粒子の完全性の保存は、マウスの免疫原性アッセイ及び／又はウイルス侵入アッセイによって評価される。ウイルス侵入イベントは、五量体ｇＨ複合体を含むウイルス糖タンパク質の完全性と機能に依存する。五量体ｇＨ複合体は、ｒｄＣＭＶの実質的な免疫原性も提供するため、２つの特性がリンクされている。
【００８８】
リオスフェアを調製するためのプロセス
リオスフィアを調製するためのプロセスは、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／０２９８４８２号に開示されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。この方法は、形状が実質的に球形である乾燥ペレットを製造するために、実質的に球状の形状を有する少なくとも１つの液滴を固体及び平坦な表面（すなわち、試料ウェル又は空洞がない）上に分配し、液滴を極低温物質と接触させずに表面上の液滴を凍結し、そして、凍結した液滴を凍結乾燥することを含む。米国特許第９，１１９，７９４号（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にも、リオスフェアを形成するためのプロセスが開示されている。水性媒体混合物を含む単一体積は、空洞を含む固体要素上に形成される。固体要素は、混合物の凝固温度未満に冷却され、キャビティは混合物で満たされ、そして、混合物はキャビティ内に存在する間に固化し、単一型（the unitary forms）を形成する。単一型は、真空中で乾燥されてリオスフェアを提供する。
【００８９】
他の実施形態において、リオスフェアは、実質的に球形に形成され、平坦な固体表面、特に、空洞のない表面上で、所望の生物学的材料の液体組成物の液滴を凍結し、続いて単一型を凍結乾燥することにより調製される。米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２９４８７２号）は、リオスフェアを形成するための同様のプロセスを開示し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
簡単に言えば、いくつかの実施形態において、プロセスは、実質的に球状の形状を有する少なくとも1つの液滴を固体及び平坦な表面（すなわち、試料ウェル又はキャビティがない）上に分配し、液滴を極低温物質と接触させずに表面上の液滴を凍結し、そして凍結した液滴を凍結乾燥して、形状が実質的に球形の乾燥したペレットを生成することを含む。このプロセスをハイスループットモードで使用して、固体の平らな表面に望ましい数の液滴を同時に分注し、液滴を凍結し、そして、凍結した液滴を凍結乾燥することにより複数の乾燥ペレットを準備できる。このプロセスにより液体製剤から調製されたペレットは、高濃度の生物学的物質（タンパク質治療薬など）を含んでいてもよく、乾燥ペレットのセットに組み合わせることができる。
【００９１】
一部の実施形態において、固体の平らな表面は、金属板の上面を−９０℃以下の温度に保つため、ヒートシンクと物理的に接触している底面を含む金属板の上面である。金属板の上面は液体製剤の凝固点よりかなり下にあるので、液滴の底面が金属板の上面に接触する液滴は、本質的に瞬時に凍結する。
【００９２】
他の実施形態において、固体の平坦な表面は疎水性であり、分配ステップ中に０℃を超えて維持される薄膜の上面を含む。分配された液滴は、製剤の凝固温度よりも低い温度に薄膜を冷却することにより凍結される。
【００９３】
凍結乾燥プロセス
本発明の凍結乾燥製剤は、前凍結乾燥溶液の凍結乾燥（フリーズドライ）により形成される。凍結乾燥は、製剤を凍結し、その後、一次乾燥に適した温度で水を昇華させることによって達成される。この条件下では、製品の温度は共晶点又は製剤の崩壊温度より低い。典型的には、一次乾燥の棚温度は、約３０〜２５０ｍＴｏｒｒの範囲の適切な圧力で、約−５０〜２５℃（但し、製品が一次乾燥中に凍結したままである）の範囲である。製剤、試料を保持する容器（例えばガラスバイアル）、サイズ、種類、及び液体の容量が乾燥に必要な時間を決定し、それは、数時間から数日（たとえば、４０〜６０時間）の範囲である。二次乾燥段階は、主に容器のタイプとサイズ、及び使用するタンパク質のタイプに応じて、約０〜４０℃で実行され得る。二次乾燥時間は、製品の望ましい残留水分レベルによって決まり、通常は少なくとも約５時間かかる。典型的には、凍結乾燥製剤の含水量は、約５％未満、好ましくは約３％未満である。圧力は、一次乾燥工程中に使用される圧力と同じであってもよい。凍結乾燥条件は、製剤、バイアルのサイズ及び凍結乾燥トレイに応じて変化する。
【００９４】
いくつかの例では、移送工程を回避するために、再構成が行われる容器内でタンパク質−多糖製剤を凍結乾燥又はマイクロ波乾燥してもよい。この場合の容器は、例えば、２、３、５、１０又は２０ｍｌバイアルであり得る。
【００９５】
投与
本明細書に記載されるように処方されたｒｄＣＭＶは、当技術分野で周知の技術と共に本明細書に提供されるガイダンスを使用して患者に投与することができる。一般的な医薬品投与のガイドラインは、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｅｄｓ．Ｐｌｏｔｋｉｎ及びＯｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ２０００；及び、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．Ｂａｎｋｅｒ及びＲｈｏｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０、で提供される。
【００９６】
ワクチンは、皮下、筋肉内、静脈内、粘膜、非経口、経皮、皮内のような異なる経路で投与できる。皮下及び筋肉内投与は、例えば、針又はジェットインジェクターを使用して行うことができる。一実施形態において、本発明のワクチンは筋肉内に投与される。経皮又は皮内送達は、皮内注射針注射器を介して又はミクロン針又はミクロンアレイパッチのような可能なデバイスで達成される。
【００９７】
本明細書に記載の製剤は、単位投与量に適合する方法で、そしてＣＭＶ感染（一次、再発及び／又は超を含む）の可能性を治療及び／又は軽減するのに免疫原性のある量で投与することができる。本発明の文脈において、患者に投与される用量は、ＣＭＶ感染のレベルの低下、ＣＭＶ感染に関連する疾患の症状の改善、及び／又は、ＣＭＶ感染の長さ及び／又は重症度を短くするのに、又はＣＭＶによる感染の可能性を減少させる（一次、再発、及び／又は超を含む）のに十分であるべきである。
【００９８】
適切な投与レジメは、当業者によって容易に決定され得、そして好ましくは、患者の年齢、体重、性別及び医学的症状、投与経路；望ましい効果；使用した特定の組成物を含む当該分野で周知の因子を考慮して決定される。ＣＭＶに対する治療又は予防において投与されるｒｄＣＭＶの有効量を決定する際に、医師は、ウイルスの循環血漿レベル、疾患の進行、及び／又は抗ＣＭＶ抗体の産生を評価することができる。ワクチン組成物の用量は、１０３〜１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲からなる。異なる実施形態において、投与量範囲は、１０４〜１０１０ｐｆｕ、１０５〜１０９ｐｆｕ、１０６〜１０８ｐｆｕ、又はこれらの規定された範囲内の任意の用量である。２以上のワクチンが投与される場合（すなわち、混合ワクチンにおいて）、各ワクチン剤の量はそれらの記載された範囲内である。
【００９９】
ワクチン組成物は、単回投与又は複数投与の形式で投与することができる。ワクチンは、安定化緩衝液及び適切なアジュバント組成物を同定して、投与の数時間又は数日前にアジュバントとともに調製することができる。ワクチンは、一般的に行われている量である、０．１ｍＬから０．５ｍＬの範囲で投与できる。
【０１００】
投与のタイミングは、当技術分野でよく知られている要因に依存する。最初の投与後、抗体力価及びＴ細胞免疫を維持及び／又はブーストするために、１回以上の追加用量が投与されてもよい。抗体価やＥＬＩＳＰＯＴのようなＴ細胞免疫に反映される免疫応答の保護レベルを維持するには、追加のブーストが必要になりうる。そのような免疫応答のレベルは、臨床調査の対象である。
【０１０１】
混合ワクチン接種の場合、免疫原のそれぞれは、１つの組成物中に一緒に又は異なる組成物中で別々に投与することができる。本明細書に記載されるｒｄＣＭＶは、１以上の所望の免疫原と同時に投与することができる。「同時に」という用語は、正確に同時に治療薬を投与することに限定されず、しかし、むしろ、ここで説明されているｒｄＣＭＶと他の望ましい免疫原が、他の方法で投与された場合よりも一緒に作用して効果を高めることができるように、順番に、時間間隔内に対象に投与されることを意味する。例えば、各治療薬は、同時に又は異なる時点で任意の順序で順次投与されてもよく；しかしながら、同時に投与されない場合、それらは、所望の治療効果を提供するように、時間的に十分に接近して投与されるべきである。各治療薬は、任意の適切な形態で及び任意の適切な経路で、別々に投与することができる。
【０１０２】
実施形態はまた、（ａ）治療（例えば、人体の）；（ｂ）薬；（ｃ）ＣＭＶ複製の阻害；（ｄ）ＣＭＶによる感染の治療又は予防、又は（ｅ）ＣＭＶ関連疾患の治療、予防、又は発症又は進行の遅延において、（ｉ）そのための使用、（ｉｉ）医薬としての使用、又は（ｉｉｉ）医薬の調製において使用、するために、前記ＣＭＶ又は組成物を含むか又はそれらからなるＣＭＶの製剤を含む。これらの使用において、前記ＣＭＶ又は組成物を含む又はそれからなるＣＭＶの製剤は、任意に１以上の抗ウイルス剤（例えば、抗ウイルス化合物又は抗ウイルス免疫グロブリン；以下に記載する混合ワクチン）と組み合わせて使用できる。
【０１０３】
患者集団
「患者」は、ＣＭＶに感染することができる哺乳動物を指す。好ましい実施形態において、患者はヒトである。患者は予防的又は治療的に処置され得る。予防的処置は、一次感染、再発性感染（すなわち、潜伏ＣＭＶの再活性化に起因する感染）及び重複感染（すなわち、以前に患者が経験したものとは異なるＣＭＶの染色による感染に起因する感染）を含む、ＣＭＶ感染の可能性又は重症度を軽減するのに十分な防御免疫を提供する。治療的処置は、ＣＭＶ感染の重症度を軽減したり、再発や重感染の可能性／重症度を低下させるために行うことができる。
【０１０４】
本明細書に記載のｒｄＣＭＶを含む医薬組成物を使用して、処置を行うことができる。医薬組成物は、一般集団、特にＣＭＶ感染のリスクが高い人（一次、再発、超のいずれか）又はＣＭＶ感染が特に問題となる人（例えば免疫不全の人、移植患者、妊婦）に投与される。一実施形態において、妊娠可能年齢の女性、特に思春期前の女性は、妊娠中のＣＭＶ感染（一次、再発、超）の可能性を減らすためにワクチン接種を受ける。
【０１０５】
処置を必要とする人には、すでに感染している人、ならびに感染しやすい人、又は感染の可能性の低減が望まれる人を含む。処置は、ＣＭＶ感染に関連する疾患の徴候を改善し、及び／又は、潜在的なＣＭＶの再活性化による感染を含め、ＣＭＶ感染の長さ及び／又は重症度を短くできる。
【０１０６】
ＣＭＶ感染のリスクが高い人（一次、再発又は超）には、免疫力が低下している患者、又は免疫力が低下する治療に直面している患者が含まれる（たとえば、癌の化学療法又は放射線療法を受けているか、免疫抑制薬を服用している）。本明細書中で使用される場合、「低下した免疫」は、正常に機能していないか、又は正常な健康な成人のレベルで機能していない免疫応答のために感染と闘う能力が低い免疫系を指す。免疫力が低下した患者の例は、乳児、幼児、高齢者、妊娠中の患者、又はＨＩＶ感染やＡＩＤＳのような免疫系の機能に影響を与える疾患のある患者を含む。
【０１０７】
添付の説明及び図面を参照して本発明の様々な実施形態を説明してきたが、本発明はそれらの正確な実施形態には限定されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、当業者によって様々な変更及び修正が行われ得ることを理解されたい。
【０１０８】
以下の実施例を例示するが、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１０９】
実施例１：五量体ｇＨ複合体の回復
感染性ＣＭＶバクテリア人工染色体クローンは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなる五量体ｇＨ複合体を発現するコード化されたビリオンがｇＨ／ｇＬ足場（scaffold）に組み立てられるように構築された。
【０１１０】
ＣＭＶ株ＡＤ１６９株は、もともと７歳の女の子のアデノイドから分離された（Ｅｌｅｋ及びＳｔｅｒｎ、１９７４、Ｌａｎｃｅｔ、１：１）。ウイルスを弱毒化するために、ウイルスはいくつかのタイプのヒト線維芽細胞で５８回継代された（Ｎｅｆｆら、１９７９、Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ、１６０：３２、ＷＩ−３８ヒト線維芽細胞での最後の５継代）。本研究ではメルクＡＤ１６９（ＭＡＤ１６９）と呼ばれるこの継代されたＡＤ１６９ウイルスの変異体を、感染性ＢＡＣクローンを構築するための親ウイルスとして使用した。親ウイルスＡＤ１６９も継代変異ウイルスＭＡＤ１６９も、ＵＬ１３１又は五量体ｇＨ複合体を発現しなかった。
【０１１１】
ＭＡＤ１６９は、感染性細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを構築するための親ウイルスとして使用された。ＢＡＣベクターは、大腸菌でＣＭＶゲノム（約２３０Ｋｂ）のような大きなサイズのＤＮＡ断片を遺伝子操作できる分子ツールである。ＧＦＰマーカー遺伝子と一緒にＢＡＣ要素を、ＵＳ２８オープンリーディングフレーム（ウイルスゲノム中のＵＳ２８とＵＳ２９  ＯＲＦの間）の停止コドンの直後に挿入し、ＬｏｘＰ部位を断片の両端に作成した（図１５Ａ）。簡単に言えば、２つのｌｏｘＰサイトとＣＭＶ  ＵＳ２８−ＵＳ２９配列が隣接するＧＦＰ発現カセットを含むＤＮＡフラグメントを合成し、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクターにクローニングした。ＢＡＣベクターを制限酵素ＰｍｅＩで線形化し、精製したビリオンから抽出したＭＡＤ１６９  ＤＮＡをＭＲＣ−５細胞に共トランスフェクトした。緑色蛍光発現により同定された組換え変異体は、プラーク精製された。１ラウンドの増幅後、ウイルスゲノムの環状型が感染細胞から抽出され、大腸菌ＤＨ１０細胞にエレクトロポレーションされた。細菌コロニーは、ＵＳ２８及びＵＳ２９領域の存在についてＰＣＲによってスクリーニングされた。候補となるクローンは、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈｉｎｄ  ＩＩ、ＳｐｅＩ及びＢａｍＨＩ制限分析によってさらに検査された。スクリーニング後、１つのクローンｂＭＡＤ−ＧＦＰは、親のＭＡＤ１６９ウイルスと同一の制限パターンを示した。
【０１１２】
ＭＡＤ１６９の上皮指向性欠損症の根底にあるＵＬ１３１の最初のエクソンのフレームシフト変異は、大腸菌で遺伝的に修復された（図１５Ｂ）。具体的には、ＵＬ１３１遺伝子の７  ｎｔ  Ａストレッチから１つのアデニンヌクレオチド（ｎｔ）が削除された（図１５Ｂ）。ＵＬ１３１による上皮及び内皮細胞指向性を救うには、１  ｎｔの削除で十分であり、よって、五量体ｇＨ複合体が発現される。発現はＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットにより確認された（データは示されていない）。このクローンは、ＬｏｘＰ／Ｃｒｅ組換えによってＢＡＣセグメントを削除することでさらに変更された。ＢＡＣ  ＤＮＡをＡＲＰＥ−１９細胞、ヒト網膜色素上皮細胞（ＡＴＣＣアセッション番号ＣＲＬ−２３０２）にトランスフェクトして、感染性ウイルスを回収した（図１５Ｃ）。結果として生じる感染性ウイルスは、ＢＡＣ由来の上皮指向性ＭＡＤ１６９ウイルス（ｂｅＭＡＤ）と呼ばれ、ＭＡＤ１６９とは２つの遺伝子座、（１）ＵＬ１３１  ＯＲＦ（ここで、単一のアデニンヌクレオチドは削除されている）、及び、（２）ＵＳ２８とＵＳ２９  ＯＲＦの間に挿入された３４ｂｐ  ＬｏｘＰサイト、のみが異なる（表２を参照）。
【０１１３】
ＢＡＣクローンｂｅＭＡＤのゲノムは完全に配列決定された。ｂｅＭＡＤの全体的なゲノム構造は、ＡＴＣＣ  ＡＤ１６９バリアント（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号Ｘ１７４０３）で報告されているものと同一であり、ユニークロング（ＵＬ）とユニークショート（ＵＳ）の２つのユニークな領域で構成されている。各ユニーク領域は、２つのリピートシーケンス、ターミナルリピートロング（ＴＲＬ）−内部リピートロング（ＩＲＬ）、ターミナルリピートショート（ＴＲＳ）−内部リピートショート（ＩＲＳ）で囲まれている。継代された変異型ＭＡＤ１６９及びｂｅＭＡＤ由来ウイルスの成長速度論は、ヒト線維芽細胞株であるＭＲＣ−５細胞（ＡＴＣＣアセッション番号ＣＣＬ−１７１）では区別できなかった（データ示さず）。５量体ｇＨ複合体は線維芽細胞での増殖には必要ないため、ＭＡＤ１６９とｂｅＭＡＤの間の５量体ｇＨ複合体発現の相違は関係ない。
【０１１４】
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【０１１５】
実施例２：ＣＭＶへの従来の不活化方法の影響
五量体ｇＨ複合体を発現するＣＭＶについて、従来の２つのウイルス不活性化方法であるγ線照射とβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）の効果を調査した。
【０１１６】
γ線照射は凍結乾燥したビリオンに行われた。ＨＮＳ（２５ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、９％ｗ／ｖスクロース、ｐＨ６．０）製剤中の濃度０．１５ｍｇ／ｍＬの組換えＣＭＶを、保存的な凍結乾燥サイクル（−５０℃の凍結及び−３５℃で〜３０時間の一次乾燥、続いて２５℃での６時間の二次乾燥）を使用して凍結乾燥し、乾燥粉末を取得した。ワクチンは、各バイアルに０．５ｍｌを充填した３ｍＬガラスバイアルで凍結乾燥した。凍結乾燥の最後に、バイアルに窒素環境で栓をし、試料を取り出し、ラベルを付け、圧着し、ガンマ線照射まで−７０℃で保存した。バイアルは、所望の照射量のために、Ｃｏ照射器の下で照射された。
【０１１７】
ＢＰＬ処理では、ＡＲＰＥ−１９細胞での増殖からの粗ウイルス培養上清にＢＰＬストック溶液を加え、最終濃度を０．０１％又は０．１％（ｖ／ｖ）にした。反応は、種々の時点でチオ硫酸ナトリウムで停止させた。次に、ＢＰＬ処理された五量体ｇＨ複合体発現ＣＭＶを、超遠心分離で精製した。
【０１１８】
実施例３：ＦＫＢＰ必須タンパク質融合体の構築とスクリーニング
ＣＭＶは、条件付き複製欠陥を持ちながら上皮親和性を取り戻す弱毒ＡＤ１６９株のバックボーンを使用して構築させた。実施例１に記載された方法を使用して、上皮指向性を回復させた。
【０１１９】
ＦＫＢＰ誘導体に融合されるウイルスタンパク質は、２つの基準に基づいて選択された。第一に、プロテオミクス分析によりＣＭＶビリオンで目的のタンパク質が検出されなかった（Ｖａｒｎｕｍら、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１０９６０）ので、ＦＫＢＰ融合タンパク質がウイルスに組み込まれる可能性が低くなる。第二に、目的のタンパク質は、組織培養におけるウイルス複製に不可欠である。
【０１２０】
親ウイルスとしてｂｅＭＡＤを使用して、ＦＫＢＰ誘導体（配列番号１２）は、ＩＥ１／２（配列番号１）、ｐＵＬ３７ｘ１、ｐＵＬ４４、ｐＵＬ５１（配列番号３）、ｐＵＬ５２（配列番号５）、ｐＵＬ５３、ｐＵＬ５６、ｐＵＬ７７、ｐＵＬ７９（配列番号７）、ｐＵＬ８４（配列番号９）、ｐＵＬ８７及びｐＵＬ１０５を含む、１２の必須ウイルスタンパク質と個別に融合された。ＩＥ１／２とＵＬ５１のそれぞれをＦＫＢＰ誘導体と融合した２つの異なる必須タンパク質がＦＫＢＰに融合したウイルスも構築された（不安定化されたＩＥ１／２とＵＬ５１を含むｒｄＣＭＶのゲノムを配列番号１４に示す）。構築後、すべての組換えＢＡＣ  ＤＮＡをＡＲＰＥ−１９細胞にトランスフェクトし、Ｓｈｌｄ−１を含む培地で培養した。
【０１２１】
実施例４：凍結乾燥プロセスの収量と短期安定性のための製剤添加剤スクリーニング
材料：ヒスチジンは米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ又は米国ペンシルバニア州センターバレーのＡｖａｎｔｏｒから購入した。トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）及び塩化カルシウムは、米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。カルボキシメチルセルロースナトリウム（平均分子量９０，０００）は、米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ又は米国デラウェア州ウィルミントンのＡｓｈｌａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓから購入した。塩化ナトリウムは、米国ペンシルベニア州センターバレーのＡｖａｎｔｏｒから購入した。プロピレングリコールは、米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ又は米国ミシガン州ミッドランドのダウケミカル社から購入した。ソルビトールとグリセロールと尿素は、米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ又は米国フィッシャーサイエンティフィックから購入した。希塩酸及び水酸化ナトリウムは、米国ペンシルベニア州センターバレーのＡｖａｎｔｏｒから購入した。
【０１２２】
製剤の調製：
上記及び米国特許許第９，５４６，３５５号（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）で記載されるように調製されたｒｄＣＭＶ（配列番号：１４）バルクは、２５ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、ｐＨ６．０で、又は、２５ｍＭヒスチジン、７５ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、ｐＨ７．０で製剤化され、−７０℃で保存された。製剤組成物は、１．２５〜２倍の濃度でストックとして調製され、ＣＭＶバルクとの混合後に示される最終組成物を達成するために製剤において使用された。ＣＭＶバルクを解凍し、１００〜３５０単位のＣＭＶ／ｍＬ（１００〜３５０μｇ／ｍＬ又は２．５ｘ１０Ｅ０５〜１．２ｘ１０Ｅ０９ｐｆｕ／ｍＬ）で適切な製剤組成物に製剤化した。
【０１２３】
製剤を０．７ｍＬ又は０．５ｍＬの２ｍＬガラスバイアルに充填した。液体対照用のバイアルをストッパーで閉じ、アルミキャップで圧着し、バイアルを−７０℃の冷凍庫又は窒素冷却高速冷凍庫で凍結し、分析するまで−７０℃で保存した。
【０１２４】
凍結乾燥用のバイアルを、凍結乾燥トレイ上に０．７ｍＬ又は０．５ｍＬのいずれかで満たし、凍結乾燥ストッパーで部分的に栓をした。バイアルは、≦−５０℃に設定された窒素冷却高速冷凍庫で、又は≦−５０℃で事前に冷却された凍結乾燥機の棚で凍結された。凍結乾燥は、Ｌｙｏｓｔａｒ  ＩＩ又はＩＩＩ（ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｒｍｉｎｓｔｅｒ、ＰＡ）を利用して行われた。液体製剤又は凍結製剤を、予冷して−５０℃に保持した凍結乾燥機の棚に載せた。−５０℃に浸した後、一次乾燥のために棚の温度を−５０℃から−３０から−１７℃の間まで、０．１℃〜０．５℃／ｍｉｎの上昇率で上昇させた。棚の温度は、二次乾燥のために、０．１〜０．５℃／ｍｉｎの昇温速度で１５〜３０℃の設定値に上昇させた。
【０１２５】
ウイルス複製（感染力）の測定：
相対ウイルス発現（ＩＲＶＥ）イメージングアッセイ：ＣＭＶ感染性は、細胞ベースの相対感染力アッセイ、相対ウイルス発現（ＩＲＶＥ）イメージングアッセイを使用して測定された。この安定性を示す方法は、ＣＭＶの前初期（ＩＥ）タンパク質１（ＩＥ１）の発現に基づく細胞ベースの相対感染力アッセイである。このアッセイでは、ＡＲＰＥ−１９細胞を３８４ウェルマイクロタイタープレートに植え、２４時間±４時間インキュベートした後、ｒｄＣＭＶ（配列番号１４）の標準希釈液、陽性対照、及び試験アーティクルの段階希釈液に感染させる。感染は、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間進行した後、希ホルムアルデヒド溶液で細胞を固定する。この方法は、過剰なＳｈｌｄ−１を配合した培地を使用して実行された。固定された細胞を透過処理し、次に一次抗体をプレートに加え、１時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒコンジュゲート）をウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした後、洗い流した。プレートを洗浄した後、Ｎｕｃｌｅｉ染色液（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２  ＤＮＡ染色液）をウェルに加え、室温で５分間インキュベートした後、洗い流した。ＰＢＳをプレートに加え、Ｃｙｔａｔｉｏｎ  ３イメージングリーダーを使用して読み取った。対照に対する試料の効力は、試料のＥＣ５０と対照ＥＣ５０の値から、４パラメーターロジスティック回帰の低減、４−ＰＬ％ＲＰ＝（試料ＥＤ５０）／（対照ＥＤ５０）ｘ１００を使用して計算された（％ＲＰ）。ＩＲＶＥアッセイで使用される対照標準のＣＭＶ力価（ｐｆｕ／ｍＬ）は、ＣＭＶプラークアッセイを使用して測定され、％ＲＰを被験物質のＩＲＶＥアッセイからｐｆｕ／ｍＬに変換するために使用できる。
【０１２６】
試験前に、凍結した液体対照試料を周囲温度で解凍した。試験前に、凍結乾燥したバイアルを滅菌水又は滅菌９ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム溶液で再構成した。
【０１２７】
データ分析
報告された各データポイントについて、ｎ＝３の個別の試料がテストされ、３つのテストからの平均データが報告された。試料の標準偏差（ＳＴＤＥＶ）又は平均の標準誤差（ＳＥＭ）がデータに対して計算され、２ｘＳＥＭが報告される。
【０１２８】
凍結乾燥プロセスの収量：
凍結乾燥収量については、−７０℃で保存された凍結乾燥バイアルは、細胞ベースの感染力アッセイを使用して液体対照バイアル（−７０℃で保存）とともにテストされ、凍結乾燥収率は、液体対照試料のパーセンテージとして計算された。予想されるアッセイの変動は約３０％である。
【０１２９】
凍結乾燥安定性
異なる時点での安定性試料は、細胞ベースの感染力アッセイと−７０℃で保存された凍結乾燥対照試料を使用してテストされ、凍結乾燥安定性は、凍結乾燥対照試料と比較したＬｏｇ１０の損失として計算された。
【０１３０】
ＣＭＶの基本製剤は、１２．５ｍＭヒスチジン、１２．５ｍＭＴｒｉｓ、７５ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍｇ／ｍＬ  ｗ／ｖスクロース、ｐＨ７．０（ＣＭＶ−０９８）であった。賦形剤のスクリーニングは、凍結乾燥プロセスの収率と２〜８℃（４℃）と１５℃での短期ウイルス感染性安定性の安定性を改善するために行われた。製剤を表３に記載する。
【０１３１】
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【０１３２】
パーセント凍結乾燥収率データ（図１）は、スクロースのみの製剤（ＣＭＶ−０９８）へのプロピレングリコール及びカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＶ−１８８及びＣＭＶ−１８９）の添加により、凍結乾燥プロセスの収率が約２倍に大幅に向上したことを示している。異なる保存条件（図２）での凍結乾燥ｒｄＣＭＶ（配列番号１４）の安定性は、スクロース単独製剤（ＣＭＶ−０９８）と比較して、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＶ−１６５）、グリセロール（ＣＭＶ−１４２）、グリセロール及びカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＶ−１７０）、ソルビトール及びカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＶ−１８２）、プロピレングリコール及びカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＶ−１８８及び１８９）、を含む製剤類で低い感染性の損失を示した。加えて、ＣＭＶ−０９８製剤は、より高いＳＥＭで示されているように、安定性に大きなばらつきを示した。
【０１３３】
実施例５：凍結乾燥プロセスの収量と２〜８℃での長期安定性のための製剤添加剤スクリーニング：
最初のスクリーニング研究に続いて、安定化製剤を特定するために長期安定性研究が行われた。ｒｄＣＭＶ（配列番号１４）の基本製剤は、１２．５ｍＭヒスチジン、１２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７５ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍｇ／ｍＬｗ／ｖスクロース、ｐＨ７．０であった（ＣＭＶ−０９８）。賦形剤スクリーニングは、凍結乾燥プロセスの収率と２〜８℃（４℃）での長期ウイルス感染性安定性の安定性を改善するために行われた。試験した製剤を表４に示す。
【０１３４】
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【０１３５】
パーセント凍結乾燥収率データ（図３）は、ベーススクロース製剤（ＣＭＶ−０９８）へのプロピレングリコール及びカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＶ−１８８、ＣＭＶ−２０２）の添加により約２倍の大幅な改善を示したことを再度示した。ＣＭＶ−１８８での凍結乾燥プロセスの収量は、図１と同様である。塩化カルシウム（ＣＭＶ−２２０）をＣＭＶ−２０２製剤に添加しても、プロセスの歩留まりに影響はなかった（図３）。尿素（ＣＭＶ−０９９）の添加は、スクロース製剤（ＣＭＶ−０９８）と比較してｒｄＣＭＶ（配列番号１４）のプロセス収率又は安定性のいずれも改善しなかった。カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＶ−１６５）、グリセロール（ＣＭＶ−１６５）、プロピレングリコール及びカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＶ−１８８及びＣＭＶ−２０２）、プロピレングリコール及びカルボキシメチルセルロースナトリウム及び塩化カルシウム（ＣＭＶ−２２０）の添加により、ｒｄＣＭＶ（配列番号１４）の安定性が、６か月時点で約３倍著しく改善した（図４）。製剤ＣＭＶ−１８８及びＣＭＶ−２０２及びＣＭＶ−２２０は、６か月後に２〜８℃で０．２ｌｏｇ１０未満の感染力損失を示した（図４）。製剤ＣＭＶ−１８８、ＣＭＶ−２０２及びＣＭＶ−２２０の場合、２〜８℃で２年間保存した後、感染性の損失は０．５ｌｏｇ１０未満になると予想される。
【０１３６】
実施例６：ＣＭＶ−２０２製剤における凍結乾燥プロセスの収率とＣＭＶの安定性に対するｐＨの影響：
製剤のｐＨを調整することにより、ＣＭＶ−２０２組成物のｐＨ範囲６．０〜７．５でｐＨの影響を研究した。製剤及びｐＨを表５に記載する。液体製剤は２００単位／ｍＬのｒｄＣＭＶ（配列番号１４）を用いて調製し、０．７ｍＬを２ｍＬガラスバイアルに充填し、栓をし、圧着し、液体管理のために−７０℃で凍結保存した。凍結乾燥のために、製剤を０．７ｍＬで２ｍＬガラスバイアルに充填し、凍結乾燥ストッパーで部分的に栓をして凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスが完了したら、対照の凍結乾燥製品を−７０℃で保存し、安定性試料を１〜３か月間リアルタイム（２〜８℃）の安定条件にさらす。
【０１３７】
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【０１３８】
ｐＨ７．０でのＣＭＶ−２０２（図５Ａ）の凍結乾燥プロセスの収量は、ＣＭＶ−０９８と比較して一貫して高い凍結乾燥収量を示した（図１及び３を参照）。試験した他のｐＨレベルの凍結乾燥収量は、ＣＭＶ−０９８よりも高く（図１及び３に示すように）、ＣＭＶ−２０２と同様であった（図５Ａ）。２〜８℃で１及び３か月にテストされたすべてのｐＨレベル（図６Ａ）でのＣＭＶ−２０２の感染力損失は、ＣＭＶ−０９８と比較して低かった（図４を参照）。
【０１３９】
その後の研究は、ｐＨ６．０、７．０及び８．０でのＣＭＶ−２０２組成物におけるｐＨの影響を決定するために行われた。製剤とｐＨを表５−１に示す。液体製剤は、２８０単位／ｍＬのｒｄＣＭＶ（配列番号１４）を用いて調製し、２ｍＬガラスバイアルに０．５ｍＬで充填し、栓をし、圧着し、液体管理のために−７０℃で凍結保存した。凍結乾燥のために、製剤を２ｍＬのガラスバイアルに０．５ｍＬで充填し、凍結乾燥ストッパーで部分的に栓をして凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスが完了したら、対照の凍結乾燥製品を−７０℃で保存し、安定性試料をリアルタイム（２〜８℃）安定条件又は加速安定条件（２５℃）に１週間供する。試料は、試験用に０．７ｍＬの生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）溶液で再構成した。
【０１４０】
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【０１４１】
ｐＨ７．０でのＣＭＶ−２０２（図５Ｂ）の凍結乾燥プロセスの収量は、ｐＨ６．０（ＣＭＶ−２１４）及びｐＨ８．０（ＣＭＶ−２５３）での製剤と同様であった。また、プロピレングリコールとカルボキシメチルセルロースナトリウムを含まないＣＭＶ−２４０製剤と比較して、プロピレングリコールとカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む製剤では、凍結乾燥の収率が大幅に高くなる。２〜８℃及び２５℃で１週間試験したすべてのｐＨレベル（図６Ｂ）でのＣＭＶ−２０２の感染性の低下は、ＣＭＶ−２４０と比較して類似しており、大幅に低かった。これらのデータは、本発明の製剤が６．０〜８．０のｐＨ範囲で使用できることを示している。
【０１４２】
実施例７：プロピレングリコール濃度の影響
プロピレングリコール濃度の影響は、ＣＭＶ−２０２と共にＣＭＶ−１８８製剤で研究された。製剤組成を表６に記載する。液体製剤は２００単位／ｍＬのｒｄＣＭＶ（配列番号１４）を用いて調製し、０．７ｍＬを２ｍＬガラスバイアルに充填し、栓をし、圧着し、液体管理のために−７０℃で凍結保存した。凍結乾燥のために、製剤を０．７ｍＬで２ｍＬガラスバイアルに充填し、凍結乾燥ストッパーで部分的に栓をして凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスが完了したら、対照の凍結乾燥製品を−７０℃で保存し、安定性試料を加速（１５℃）及びリアルタイム（２〜８℃）安定条件に１週間及び１か月間さらす。
【０１４３】
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【０１４４】
０．２５％ｗ／ｖ（２．５ｍｇ／ｍＬ）から０．７５％ｗ／ｖ（７．５ｍｇ／ｍＬ）のプロピレングリコール（図７）を用いる凍結乾燥プロセスの収率は、ＣＭＶ−０９８よりも高かった（図１を参照）。テストしたすべてのプロピレングリコールレベルの感染力損失（図８）は、ＣＭＶ−０９８と比較して低かった（図２及び４に示すように）。２〜８℃と１５℃での安定性は、試験したすべての濃度のプロピレングリコールで同等であった。
【０１４５】
実施例８：カルボキシメチルセルロースナトリウム濃度の影響
カルボキシメチルセルロースナトリウム濃度（２ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ）の影響を、ＣＭＶ−２０２製剤で検討した。表７に記載されている製剤組成物が試験された。液体製剤は２００単位／ｍＬのｒｄＣＭＶ（配列番号１４）を用いて調製し、０．７ｍＬを２ｍＬガラスバイアルに充填し、栓をし、圧着し、液体管理のために−７０℃で凍結保存した。凍結乾燥のために、製剤を０．７ｍＬで２ｍＬガラスバイアルに充填し、凍結乾燥ストッパーで部分的に栓をして凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスが完了したら、対照の凍結乾燥製品を−７０℃で保存し、安定性試料を加速（１５℃）及びリアルタイム（２〜８℃）安定条件に１週間供する。
【０１４６】
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【０１４７】
ＣＭＣナトリウムの濃度が低いほど凍結乾燥の収率は低くなり、２ｍｇ／ｍＬは５ｍｇ／ｍＬと比較して低い凍結乾燥収率を示した（図９）。ＣＭＶの感染性の安定性は、ＣＭＣナトリウム濃度が低いほど安定性が低下する傾向を示した（図１０）。
【０１４８】
０．２％ｗ／ｖ（２ｍｇ／ｍＬ）、０．３％ｗ／ｖ（３ｍｇ／ｍＬ）及び０．５％ｗ／ｖ（５ｍｇ／ｍＬ）のＣＭＣナトリウム（図９）を使用した凍結乾燥プロセスの収量は、ＣＭＶ−０９８よりも高かった（図１に示すとおり）。テストされたすべてのナトリウムＣＭＣレベル（図１０）の感染力損失は、ＣＭＶ−０９８と比較して低かった（図２に示すように）。
【０１４９】
実施例９：ＣＭＶ−２０２製剤中のｒｄＣＭＶの凍結乾燥における充填量の影響（０．７ｍＬ対０．５ｍＬ）
ｒｄＣＭＶ（配列番号１４）は、２００単位／ｍＬ及び０．７ｍＬで又は２８０単位／ｍＬ及び０．５ｍＬで製剤され、２ｍＬバイアルに充填され、凍結乾燥された。凍結乾燥したバイアルを０．７ｍＬの水で再構成し、凍結乾燥の収率と２〜８℃の保存条件での経時安定性をテストした。凍結乾燥プロセスの収量（図１１）、２〜８℃保存（図１２）での感染性損失は、０．７ｍＬと０．５ｍＬの充填の両方で類似していることがわかった。
【０１５０】
実施例１０：リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）の存在下でのＣＭＶの凍結乾燥
アルミニウムアジュバント、特にＡＰＡの凝集／凝集を防止する能力を、ＣＭＶなしの３つの製剤（表８）を使用してテストした。ＡＰＡは３つの製剤で４５０μｇ／ｍＬで製剤化され、試料は０．７ｍＬで２ｍＬガラスバイアルに充填された。液体対照用の試料は２〜８℃で保存され、凍結乾燥用の試料は窒素冷却高速冷凍庫を使用して凍結され、試料は凍結乾燥機にロードされた。
【０１５１】
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【０１５２】
粒子サイズ分析
アルミニウムアジュバントは、凍結及び凍結乾燥プロセス中に凝集する傾向がある。ＡＰＡの存在下での凍結及び凍結乾燥ｒｄＣＭＶ製剤は、物理的安定性を静的光散乱（ＳＬＳ）を使用して解凍又は再構成した試料の粒度分布を測定することにより評価した。粒子サイズの評価は、Ｍａｌｖｅｒｎ（コピーライト）Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００システムを使用して行われた。
【０１５３】
粒子サイズデータは、Ｄ［３，２］、ｄ（０．５）及びＤ［４，３］として表示される。Ｄ［３，２］は、表面積加重平均であり、この値は、粒子サイズ分布の小さい直径の粒子に影響される。ｄ（０．５）は中央の体積直径であり、粒子を２つの等しい半分に分割する粒子の直径を示し、即ち、粒子の５０％がこの値を上回り、５０％がこの値を下回る。Ｄ［４，３］は、体積加重平均（Ｄｅ  Ｂｒｏｕｃｋｅｒｅの平均直径）を表し、試料ボリュームのバルクを構成する粒子の直径を示し、これは、粒子サイズ分布でより大きな直径の粒子に敏感である。
【０１５４】
粒子サイズ分布データは、カルボキシメチルセルロースナトリウムのみ（ＣＭＶ−１６５）を含む又はプロピレングリコール（ＣＭＶ−１８８）と組み合わせたｒｄＣＭＶ（配列番号１４）安定化製剤が、スクロース製剤（ＣＭＶ−０９８）と比較して凍結又は凍結乾燥により導かれるＡＰＡ粒子の凝集を防ぐことを示した（図１３）。
【０１５５】
その後の研究は、ＣＭＶ−２０２製剤において４５０μｇ／ｍＬのＡＰＡと共に製剤化された２００単位／ｍＬのＣＭＶで行われた。液体製剤は、ＣＭＶ−２０２組成物（２５ｍＭヒスチジン、７５ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、５ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、５ｍｇ／ｍＬ  ＣＭＣナトリウム、ｐＨ７．０）で調製し、２ｍＬガラスバイアルに０．７ｍＬで充填し、栓をし、圧着し、液体制御のために２〜８℃で保存された。凍結液体試料用のバイアルは、窒素冷却高速冷凍庫を使用して凍結され、試料は−７０℃で保存された。凍結乾燥のために、製剤を２ｍＬガラスバイアルに０．７ｍＬで充填し、凍結乾燥ストッパーで部分的に栓をした。バイアルを、窒素冷却高速冷凍庫を使用して凍結し、凍結したバイアルを凍結乾燥チャンバーに装填した。凍結乾燥プロセスが完了した後、凍結乾燥された製品は２〜８℃で保存された。液体対照、凍結液体、及び凍結乾燥試料を、凍結及び凍結乾燥プロセス中の物理的安定化の尺度として、粒子サイズ分析について試験された。
【０１５６】
ＣＭＶ−２０２組成中でＡＰＡとともに製剤したＣＭＶの粒子サイズデータは、液体対照試料（２〜８℃で保存）と凍結試料及び凍結乾燥試料との間に有意差を示さなかった（図１４Ａ）。このデータは、ＣＭＶ及びＡＰＡの両方に対して安定化している組成物中のＡＰＡの存在下でのＣＭＶの凍結及び凍結乾燥の実現可能性を実証した。
【０１５７】
安定性分析
リン酸アルミニウムアジュバントの存在下でのＣＭＶ−２０２製剤における凍結乾燥の実現可能性とＣＭＶの安定性を評価する追加の研究が行われた。あるケースでは、ＣＭＶはＣＭＶ−２０２処方で製剤され、その後凍結乾燥され、凍結乾燥された製品がテスト前にＡＰＡ希釈剤で再構成された。別のケースでは、ＣＭＶは、ＡＰＡとともにＣＭＶ−２０２製剤中で製剤化され、その後、試験前に凍結乾燥し、生理食塩水希釈液で製品を再構成した。
【０１５８】
凍結乾燥プロセスが完了した後、凍結乾燥対照試料を−７０℃で保存し、安定性試料は、１か月間リアルタイム（２〜８℃）安定条件又は加速安定条件（１５℃及び２５℃）にさらされた。ＡＰＡなしで凍結乾燥したＣＭＶ試料を、テスト用に０．７ｍＬのＡＰＡ希釈液（４５０μｇ／ｍＬ）溶液で再構成した。ＡＰＡで凍結乾燥したＣＭＶ試料を、テスト用に０．７ｍＬの生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）溶液で再構成した。どちらの製剤も、再構成後ＣＭＶとＡＰＡの含有量が類似していると予想された。
【０１５９】
図１４Ｂに示すように、凍結乾燥の収量とＣＭＶの安定性は、凍結乾燥前に製剤にＡＰＡを添加することの実現可能性を示している。
【０１６０】
実施例１１：ＣＭＶ製剤組成
ｒｄＣＭＶ（配列番号１４）は、凍結乾燥前に、２５ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、７５ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍｇ／ｍＬスクロース、５ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、及び５ｍｇ／ｍＬナトリウムＣＭＣ、ｐＨ７．０に製剤された。製剤を０．５ｍＬ〜０．７ｍＬで無菌の２ｍＬバイアルに充填し、凍結乾燥した。
【０１６１】
以下の表９は、凍結乾燥前のｒｄＣＭＶ（配列番号１４）製剤の製剤組成を示す。
【０１６２】
2021501173.tif 000013
【０１６３】
以下の表１０は、最終的な容器で凍結乾燥されたｒｄＣＭＶ（配列番号１４）の製剤組成を示す。
【０１６４】
2021501173.tif 000014
【０１６５】
ｒｄＣＭＶ（配列番号１４）の凍結乾燥したケーキを、ワクチン投与前に０．７ｍＬの水又は９ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム溶液又はＡＰＡ希釈剤（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム中４５０μｇ／ｍＬのＡＰＡで製剤）で再構成した。以下の表１１は、ＡＰＡ希釈剤（注射用滅菌水中０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）の組成を示す。
【０１６６】
2021501173.tif 000015
【０１６７】
投与前に、ｒｄＣＭＶ（配列番号１４）活性凍結乾燥ケーキを０．７０ｍＬのＡＰＡ希釈液で再構成し、合計約０．７０ｍＬの再構成ウイルスを得た。ウイルスの投与量は０．５０ｍＬの容量で投与され、１００μｇのｒｄＣＭＶ（配列番号１４）と２２５μｇのＡＰＡの目標臨床投与量が含まれている。表１２は、ＡＰＡ希釈剤で再構成した後のｒｄＣＭＶ（配列番号１４）の目標製剤組成をまとめた。
【０１６８】
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【０１６９】
実施例１２：ＣＭＶ−２０２製剤における凍結乾燥プロセスの収率とＣＭＶの安定性に対するｐＨ７．０でのバッファー種の影響：
異なる緩衝液を使用して、ｐＨ７．０のＣＭＶ−２０２組成物における緩衝液種の影響を検討した。製剤を表１３に示す。液体製剤は、２８０単位／ｍＬのｒｄＣＭＶ（配列番号１４）で調製し、０．５ｍＬを２ｍＬガラスバイアルに充填し、栓をし、圧着し、液体管理のために−７０℃で凍結保存した。凍結乾燥のために、製剤を２ｍＬのガラスバイアルに０．５ｍＬで充填し、凍結乾燥ストッパーで部分的に栓をして凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスが完了したら、対照凍結乾燥製品を−７０℃で保存し、安定性試料をリアルタイム（２〜８℃）安定条件又は加速安定条件（２５℃）に１週間供する。試料は、テスト用に０．７ｍＬの生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）溶液で再構成した。
【０１７０】
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【０１７１】
凍結乾燥プロセスの収量は、ｐＨ７．０における異なるバッファー種で同様であった（図１６）。データは、プロピレングリコールとカルボキシメチルセルロースナトリウムを含まないＣＭＶ−２４０製剤と比較して、プロピレングリコールとカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む製剤の凍結乾燥収率が大幅に高いことも示している。２〜８℃及び２５℃での１週間での異なる緩衝液種（図１７）によるＣＭＶ−２０２の感染力損失は類似しており、ＣＭＶ−２４０と比較して大幅に低下した。
【０１７２】
このデータは、本発明の製剤に様々な緩衝液を使用できることを示している。
【０１７３】
実施例１３：ＣＭＶ−２０２製剤における凍結乾燥プロセスの収量及びＣＭＶの安定性に対する糖（スクロース及びトレハロース）及び糖濃度の影響：
糖の種類と糖濃度の影響を、４０、９０、１５０ｍｇ／ｍＬのスクロースとトレハロースを含むＣＭＶ−２０２組成物で検討した。製剤を表１４に示す。液体製剤は、２８０単位／ｍＬのｒｄＣＭＶ（配列番号１４）で調製し、２ｍＬガラスバイアルに０．５ｍＬで充填し、栓をし、圧着し、液体管理のために−７０℃で凍結保存した。凍結乾燥のために、製剤を２ｍＬのガラスバイアルに０．５ｍＬで充填し、凍結乾燥ストッパーで部分的に栓をして凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスが完了した後、対照の凍結乾燥製品を−７０℃で保存し、安定性試料をリアルタイム（２〜８℃）安定条件又は加速安定条件（２５）に１週間供した。試料は、テスト用に０．７ｍＬの生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）溶液で再構成した。
【０１７４】
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【０１７５】
ＣＭＶ−２０２製剤中で試験したすべてのスクロース濃度での凍結乾燥プロセスの収量（図１８）は、プロピレングリコールとカルボキシメチルセルロースナトリウムを欠くＣＭＶ−２４０製剤と比較して有意に高い収量を示した。安定性データ（図１９）は、プロピレングリコールとカルボキシメチルセルロースナトリウムを含まないＣＭＶ−２４０製剤と比較して、ＣＭＶ−２０２製剤でテストしたすべてのスクロース濃度で有意に優れた安定性を示した。スクロースを別の糖であるトレハロースで置き換えた場合も、同様の結果が得られた（図２０及び２１）。凍結乾燥の収量（図２２）と安定性（図２３）は、ＣＭＶ−２０２製剤中でのスクロースとトレハロースが９０ｍｇ／ｍＬの場合と同様であることが判明した。
【０１７６】
実施例１４：ＣＭＶ−２０２製剤中のＣＭＶの凍結乾燥プロセスの収率と安定性に対するアルカリ塩の影響：
ＣＭＶ−２０２組成物中のアルカリ塩の影響は、塩化ナトリウムを塩化カリウムで置き換えることによって検討された。製剤を表１５に示す。液体製剤は、２８０単位／ｍＬのｒｄＣＭＶ（配列番号１４）で調製し、０．５ｍＬを２ｍＬガラスバイアルに充填し、栓をし、圧着し、液体管理のために−７０℃で凍結保存した。凍結乾燥のために、製剤を２ｍＬのガラスバイアルに０．５ｍＬで充填し、凍結乾燥ストッパーで部分的に栓をして凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスが完了したら、対照の凍結乾燥製品を−７０℃で保存し、安定性試料をリアルタイム（２〜８℃）安定条件又は加速安定条件（２５℃）に１週間供する。試料は、テスト用に０．７ｍＬの生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）溶液で再構成した。
【０１７７】
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【０１７８】
ＣＭＶ−２０２製剤中の塩化ナトリウムを塩化カリウムで置き換えた場合、凍結乾燥の収率（図２４）と安定性（図２５）は同様であることが判明した。このデータは、本発明の製剤にアルカリ塩を使用できるという考えを支持している。
【０１７９】
実施例１５：ＣＭＶ−２０２製剤中の凍結乾燥プロセスの収率とＣＭＶの安定性に対するセルロースの種類の影響：
ＣＭＶ−２０２組成物中のセルロースの種類の影響は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）をヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）で置き換えることにより検討された。製剤を表１６に示す。液体製剤は、２８０単位／ｍＬのｒｄＣＭＶ（配列番号１４）で調製し、０．５ｍＬを２ｍＬガラスバイアルに充填し、栓をし、圧着し、液体管理のために−７０℃で凍結保存した。凍結乾燥のために、製剤を２ｍＬのガラスバイアルに０．５ｍＬで充填し、凍結乾燥ストッパーで部分的に栓をして凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスが完了した後、対照の凍結乾燥製品を−７０℃で保存し、安定性試料をリアルタイム（２〜８℃）安定条件又は加速安定条件（２５℃）に１週間供した。試料は、テスト用に０．７ｍＬの生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）溶液で再構成した。
【０１８０】
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【０１８１】
ＨＰＭＣ製剤（ＣＭＶ−２６０）の凍結乾燥収率（図２６）は、カルボキシメチルセルロースナトリウム製剤（ＣＭＶ−２０２）と比較して大幅に低かった。ただし、ＣＭＶの安定性は、ＨＰＭＣとＣＭＣの両方の製剤で同様であることが判明した（図２７）。セルロース（ＨＰＭＣ又はＣＭＣ）を含む製剤におけるＣＭＶの安定性は、セルロースを含まない製剤（ＣＭＶ−２４０）よりも著しく優れていた。このデータは、ＣＭＶワクチンの臨床製剤用のカルボキシメチルセルロースナトリウムの選択を支持している。凍結乾燥収率とウイルス安定性の両方で改善が見られた。ヒドロキシメチルセルロースの使用は、ＣＭＣナトリウムほど好ましいものではないが、安定したＣＭＶ製剤の設計を可能にするであろう。ただし、凍結乾燥の収率を考慮する必要がある。
【０１８２】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。いくつかの実施形態を示して説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の修正を行うことができよう。
【０１８３】
ここに引用されているすべての参考文献は、個々の出版物、データベースエントリ（たとえば、Ｇｅｎｂａｎｋシーケンス又はＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願又は特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に参照により組み込まれる。この参照による組み込みの声明は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従って出願人が意図したものであり、個々のすべての出版物、データベースエントリ（Ｇｅｎｂａｎｋシーケンス又はＧｅｎｅＩＤエントリなど）、特許出願又は特許に関連し、そのような引用は、参照により組み込まれた専用の声明に直接隣接していない場合でも、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に準拠して明確に識別される。本明細書における参考文献の引用は、その参考文献が関連する先行技術であることの自認として意図されておらず、これらの刊行物又は文書の内容又は日付に関する自認を構成するものでもない。参照が本明細書で提供される定義と矛盾する請求項の用語の定義を提供する程度に、本明細書で提供される定義は、請求された発明を解釈するために使用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2021501173.tif 000027
【図６Ｂ】
2021501173.tif 000028
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021501173.tif 000032
【図１１】
2021501173.tif 000033
【図１２】
2021501173.tif 000034
【図１３】
2021501173.tif 000035
【図１４Ａ】
2021501173.tif 000036
【図１４Ｂ】
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【図１５】
2021501173.tif 000038
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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