(57)【要約】本発明は、生体膜を横切る薬物の送達のための新規送達システムを提供する。それは、とりわけ、様々な医学的障害の治療のための、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの組織および細胞への遺伝子薬物の送達のための、当該送達システム、当該化合物の合成方法、および当該送達システムの利用方法を含む、新規化学的コンジュゲートを提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）に示す構造を有するコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物。
【化１】
2021509406.tif 000133
式中、
Ｄは、生体膜を横切って送達される薬物（すなわち、カーゴ薬物）であり、小分子薬物、ペプチド、タンパク質、およびＯＤ（すなわち、天然の若しくは修飾された、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯ）からなる群から選択され；
ｙ、ｚ、およびｗは、互いに独立して、０、１、２、３、および４からなる群から選択される整数であり、ｙ、ｚ、またはｗのいずれかが０である場合は、そのＥ部分がヌルであることを意味し；ｙ、ｚ、およびｗの少なくとも１つは０ではなく；
Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、互いに同一であっても異なっていてもよく、互いに独立して、下記の式（ＩＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である。
【化２】
2021509406.tif 000134
式中、
Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４は、互いに独立して、Ｎ´、Ｎ´´、ヌル、エーテル、アミド、エステル、チオエーテル、およびチオエステルからなる群から選択され；Ｎ´およびＮ´´は、互いに独立して、−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＮＨ−、および−Ｎ（Ｘ）−からなる群から選択され；Ｘは、アミンの保護基であり；Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｎ´、Ｎ´´は、互いに同一であっても異なっていてもよく；
Ｌ部分は、リンカーであり、ヌル、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６アルキレンもしくはヘテロアルキレン、任意選択でフッ素原子で置換されたＣ５もしくはＣ６アリールもしくはヘテロアリール、ヒドロキシル基、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４は、互いに独立して、水素原子またはメチル基を表し；Ｇ基は、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、またはＧ４基のうちの少なくとも２つは水素原子であり；
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、および６からなる群から選択される整数であり、０＝ヌルであり；ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは、互いに同一であっても異なっていてもよく；ｇは、０、１、２、３、４、または５から選択される整数を表し；
Ｗは、ヌル、ヒドロキシル、ジヒドロキシル、アミド、天然ヌクレオシド、または修飾ヌクレオシドのいずれかの残基、下記の式（ＩＩ１）、（ＩＩ２）、または（ＩＩ３）に示す構造体、および、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【化３】
2021509406.tif 000135
式中、
Ｊは、ヌル、−ＣＨ２−、第二級または第三級アミン、および酸素からなる群から選択され、
Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、Ｄ；本明細書で定義される保護基（例えば、アルコールの保護基）；水素、リン酸、硫酸、およびカルボキシル基からなる群から選択されるＲまたはＲ´基；および固体支持体からなる群から選択されるいずれかの部分と結合することができる。本発明の文脈において、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、１以上の結合点を介して１つのＤ部分に結合され、Ｗは、ＤおよびＲまたはＲ´の両方に同時に結合することができる。
【請求項２】
ｇが、０、１、または２の整数である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
ｃおよびｄが、互いに独立して、１、２、または３の整数を表し、
ｃおよびｄが、互いに同一であっても異なっていてもよい、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
Ｌが、ジフルオロベンジルアミンである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４が全て水素原子である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
Ｘが、ＴＥＯＣ［カルバミン酸２−（トリメチルシリル）エチル］、またはＦｍｏｃである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＩＩＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化４】
2021509406.tif 000136
式中、Ｎ´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項８】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＩＶ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化５】
2021509406.tif 000137
【請求項９】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（Ｖ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化６】
2021509406.tif 000138
式中、Ｎ´およびＮ´´は、互いに独立して、請求項１において定義したとおりである。
【請求項１０】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＶＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化７】
2021509406.tif 000139
式中、Ｎ´およびＮ´´は、互いに独立して、請求項１において定義したとおりである。
【請求項１１】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＶＩＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化８】
2021509406.tif 000140
式中、Ｎ´およびＮ´´は、互いに独立して、請求項１において定義したとおりである。
【請求項１２】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＶＩＩＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化９】
2021509406.tif 000141
式中、Ｎ´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項１３】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＶＩＩＩ−Ｈ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【化１０】
2021509406.tif 000142
【請求項１４】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＶＩＩＩ−Ｍ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【化１１】
2021509406.tif 000143
。
【請求項１５】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＶＩＩＩ−Ｆ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【化１２】
2021509406.tif 000144
式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【請求項１６】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＩＸ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化１３】
2021509406.tif 000145
式中、Ｎ´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項１７】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（Ｘ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化１４】
2021509406.tif 000146
式中、Ｎ´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項１８】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化１５】
2021509406.tif 000147
式中、Ｎ´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項１９】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＩＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化１６】
2021509406.tif 000148
式中、
ｐ、ｑ、ｋ、ｇは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、または６の整数を表し、
０は、ヌルを意味し、
ｐ、ｑ、ｋ、ｇは、互いに同一であっても異なっていてもよく、
Ｚは、ヌル、−Ｏ−、およびＮ´´からなる群から選択され、
Ｎ´およびＮ´´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項２０】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＩＩａ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１９に記載のコンジュゲート。
【化１７】
2021509406.tif 000149
式中、
ｑは、０または１の整数であり、
Ｎ´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項２１】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＩＩＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化１８】
2021509406.tif 000150
式中、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは、互いに独立して、０、１、２、または３の整数を表し、
０は、ヌルを意味し、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅは、互いに同一であっても異なっていてもよく、
Ｑは、ヌルおよび−Ｏ−からなる群から選択され、
Ｎ´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項２２】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＩＩＩａ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項２１に記載のコンジュゲート。
【化１９】
2021509406.tif 000151
式中、
ａは、１または２の整数であり、
Ｎ´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項２３】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＩＶ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化２０】
2021509406.tif 000152
式中、
ｐおよびｑは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、または６の整数であり、
ｐおよびｑは、互いに同一であっても異なっていてもよく、
Ｎ´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項２４】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＩＶ−Ｈ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【化２１】
2021509406.tif 000153
【請求項２５】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＩＶ−Ｍ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【化２２】
2021509406.tif 000154
【請求項２６】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＩＶ−Ｆ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【化２３】
2021509406.tif 000155
式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【請求項２７】
前記Ｌ部分が、ジフルオロベンジルアミンであり、
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＶ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化２４】
2021509406.tif 000156
式中、Ｎ´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項２８】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＶ−Ｈ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項２７に記載のコンジュゲート。
【化２５】
2021509406.tif 000157
【請求項２９】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＶ−Ｍ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項２７に記載のコンジュゲート。
【化２６】
2021509406.tif 000158
【請求項３０】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＶ−Ｆ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項２７に記載のコンジュゲート。
【化２７】
2021509406.tif 000159
式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【請求項３１】
前記Ｌ部分が、テトラフルオロベンジルアミンであり、
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＶＩ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化２８】
2021509406.tif 000160
式中、Ｎ´は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項３２】
前記Ｌ部分が、テトラフルオロベンジルアミンであり、
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＶＩ−Ｈ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項３１に記載のコンジュゲート。
【化２９】
2021509406.tif 000161
【請求項３３】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＶＩ−Ｍ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項３１に記載のコンジュゲート。
【化３０】
2021509406.tif 000162
【請求項３４】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、下記の式（ＸＶＩ−Ｆ）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項３１に記載のコンジュゲート。
【化３１】
2021509406.tif 000163
式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【請求項３５】
アルコールおよび／またはアミンの保護基に結合した、請求項１に記載の前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物を含む前駆体分子。
【請求項３６】
ジメトキシトリチル［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）およびホスホルアミダイトに結合した、請求項１〜３４のいずれかに記載の前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含む、請求項３５に記載の前駆体分子。
【請求項３７】
下記の式（ＶＩＩＩ−Ｆ）−前駆体に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項３５に記載の前駆体分子。
【化３２】
2021509406.tif 000164
【請求項３８】
下記の式（ＶＩＩＩ−Ｍ）−前駆体に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項３５に記載の前駆体分子。
【化３３】
2021509406.tif 000165
【請求項３９】
下記の式（ＶＩＶ−Ｆ）−前駆体に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項３５に記載の前駆体分子。
【化３４】
2021509406.tif 000166
【請求項４０】
下記の式（ＸＩＶ−Ｍ）−前駆体に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項３５に記載の前駆体分子。
【化３５】
2021509406.tif 000167
【請求項４１】
下記の式（ＸＶ−Ｆ）−前駆体に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項３５に記載の前駆体分子。
【化３６】
2021509406.tif 000168
【請求項４２】
下記の式（ＸＶ−Ｍ）−前駆体に示す構造を有する、請求項３５に記載の前駆体分子。
【化３７】
2021509406.tif 000169
【請求項４３】
下記の式（ＸＶＩ−Ｆ）−前駆体に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項３５に記載の前駆体分子。
【化３８】
2021509406.tif 000170
【請求項４４】
下記の式（ＸＶＩ−Ｍ）−前駆体に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項３５に記載の前駆体分子。
【化３９】
2021509406.tif 000171
【請求項４５】
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、または（ＸＶＩ−Ｍ）に示す構造を有し、かつ、薬物に結合されている、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
薬学的組成物であって、
請求項４５に記載のコンジュゲートと、
薬学的に許容される塩または担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項４７】
Ｄが、オリゴヌクレオチド薬物（ＯＤ）であり、
各コンジュゲートの薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレートを含む、請求項４５に記載のコンジュゲート。
【請求項４８】
前記ＯＤが、２４および２７ヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖、２５および２７ヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖、または２７および２７ヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である、Ｄｉｃｅｒ基質である、請求項４７に記載のコンジュゲート。
【請求項４９】
組成が、
（ｉ）．前記ＯＤが、前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分のうちの１つのＥ部分に結合している、
（ｉｉ）．前記ＯＤが、互いに同一であっても異なっていてもよい、前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分のうちの２つのＥ部分に結合している、
（ｉｉｉ）．前記ＯＤは、互いに同一であっても異なっていてもよい、前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分のうちの３つのＥ部分に結合している、および、
（ｉｖ）．前記ＯＤは、互いに同一であっても異なっていてもよい、前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分のうちのいくつかの（ｎ＞３）Ｅ部分に結合している、からなる群から選択され、
各コンジュゲートについて、
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、ＲまたはＲ´部分にも結合してもよく、
前記ＲまたはＲ´部分は、請求項１において定義したとおりである、請求項４７に記載のコンジュゲート。
【請求項５０】
前記ＯＤが、そのオリゴヌクレオチド鎖に沿った内部位置に少なくとも１つのＥ部分を含む、ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡであり、
前記内部位置が、前記オリゴヌクレオチド鎖の１２位または１４位であり、それぞれのヌクレオチドを置換するか、またはヌクレオチド配列に付加される、請求項４７に記載のコンジュゲート。
【請求項５１】
下記の式（Ｃｎ−１）または（Ｃｎ−２）に示す構造を有し、
前記Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、各々、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、または（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）に示す構造を有し、
各コンジュゲートの薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレートを含む、請求項４７に記載のコンジュゲート。
【化４０】
2021509406.tif 000172
式中、ＲおよびＲ´は、各々、請求項１において定義したとおりである。
【請求項５２】
前記ＯＤが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、下記の式（Ｃｎ−３）に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項４７に記載のコンジュゲート。
【化４１】
2021509406.tif 000173
式中、
ＴおよびＴ´は、互いに独立して、ヌル、１´，２´−ジデオキシリボース、ヌクレオチド、および、それらの組み合わせからなる群から選択され、
ＴおよびＴ´は、互いに同一であっても異なっていてもよく、
ＲおよびＲ´部分は、請求項１において定義したとおりである。
【請求項５３】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｈ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化４２】
2021509406.tif 000174
【請求項５４】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化４３】
2021509406.tif 000175
【請求項５５】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｈ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化４４】
2021509406.tif 000176
【請求項５６】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化４５】
2021509406.tif 000177
【請求項５７】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−１−（ＸＶ−Ｈ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化４６】
2021509406.tif 000178
【請求項５８】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−１−（ＸＶ−Ｍ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化４７】
2021509406.tif 000179
【請求項５９】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−２−（ＸＶ−Ｈ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化４８】
2021509406.tif 000180
【請求項６０】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−２−（ＸＶ−Ｍ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化４９】
2021509406.tif 000181
【請求項６１】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−１−（ＸＶＩ−Ｈ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化５０】
2021509406.tif 000182
【請求項６２】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−１−（ＸＶＩ−Ｍ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化５１】
2021509406.tif 000183
【請求項６３】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−２−（ＸＶＩ−Ｈ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化５２】
2021509406.tif 000184
【請求項６４】
前記ＲおよびＲ´が、各々、リン酸基であり、
前記ＥおよびＥ´が、下記の式［Ｃｎ−２−（ＸＶＩ−Ｍ）］に示す構造を有する化合物であるか、またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくは金属キレート、あるいは前記塩の溶媒和物若しくは水和物である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【化５３】
2021509406.tif 000185
【請求項６５】
薬物を、培養物中の生体細胞、または生きている動物若しくはヒト対象中の生体細胞に送達するための方法であって、
前記生体細胞を、請求項４５に記載のコンジュゲート、または請求項４６に記載の薬学的組成物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項６６】
薬物を、リン脂質膜を横切って送達する方法であって、
前記薬物を、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、または（ＸＶＩ−Ｍ）のいずれかに示す構造を有するＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分に結合させてコンジュゲートを作成するステップと、
前記コンジュゲートを、前記リン脂質膜に接触させるステップと、を含む、方法。
【請求項６７】
医学的障害を治療する方法であって、
治療有効量の請求項４６に記載の薬学的組成物を、治療を必要とする患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項６８】
リン脂質膜におけるエンドサイトーシスおよび／またはフリップフロップを誘導する方法であって、
前記リン脂質膜を、本発明のコンジュゲートのいずれかと接触させるステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロおよびインビボでの生物学的目的のための利用に向けた、送達システム、カーゴ化合物、および高分子を含む化合物およびコンジュゲート、ならびに細胞への生体膜を横切る分子および高分子を送達のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「オリゴヌクレオチド薬物」（ＯＤ）は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの配列を含む、高分子薬物である。ＯＤは、多くの医学的障害のための革新的な治療の可能性を秘め得る。ＯＤは、当該技術分野で知られるように、一本鎖もしくは二本鎖、天然もしくは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子、またはそれらの組み合わせである。ＯＤの例は、特に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の基質である、ｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）；Ｄｉｃｅｒエンドヌクレアーゼ（ｄｓｉＲＮＡ）の基質であるｓｉＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）薬物、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）として機能するように設計されたＤＮＡ配列であり、これらの全ては、標的遺伝子の発現の下流調節において活性である。
【０００３】
ＯＤの大きく、重く帯電した構造のため、細胞へ疎水性リン脂質膜を横切ってＯＤを送達することができる送達システムの満たされていないニーズがある。臨床環境におけるＯＤの利用の目的のために、送達システムに結合したＯＤのコンジュゲートのいくつかの特徴は、血漿タンパク質の存在下または不在下の両方での活性など、有利であるか、または細胞外コンパートメントで安定であるが、細胞質において優勢である還元条件において効率的な切断を受け、よってＯＤなどのカーゴ薬物がＤｉｃｅｒもしくはＲＩＳＣなどの細胞質標的に対してその活性を発揮することを可能にする、酸化還元感受性の切断可能な基を含み得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、式（ＩＩ）に示される構造を有する化学的部分であり、高分子ＯＤなどのカーゴ薬物へのコンジュゲーション、よって、式（Ｉ）によるコンジュゲートの作製後、細胞へのリン脂質膜を横切るＯＤの送達を伴い、そこでそれぞれの生物学的活性、例えば、遺伝子サイレンシングを発揮する、新規分子送達システム（ＭＤＳ）に基づく。本発明は、本発明者らによる新規化合物の発見および開発に基づいており、これは、親油性細胞膜を横切る、大きく、重く帯電した高分子薬物のための、巨大な送達障壁を克服することを可能にする。本発明は、とりわけ、様々な医学的障害の治療のための、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの組織および細胞への遺伝子薬物の送達のための、ＭＤＳ、これを含むコンジュゲート、ＭＤＳおよびそのコンジュゲートの合成方法、ならびにＭＤＳの利用方法を提供する。
【０００５】
本発明の一実施形態では、式（Ｉ）に示される構造を有するコンジュゲート、または、式（Ｉ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物が提供される。
【０００６】
【化１】
2021509406.tif 000003
【０００７】
式中、
Ｄは、生体膜を横切って送達される薬物（すなわち、カーゴ薬物）であり、小分子薬物、ペプチド、タンパク質、およびＯＤ（すなわち、天然もしくは修飾、一本鎖もしくは二本鎖、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯ）からなる群から選択され、
ｙ、ｚ、およびｗは、各々、０、１、２、３、または４からなる群から独立して選択される、整数であり、ｙ、ｚ、またはｗのいずれかが０である場合、それは、それぞれのＥ部分（複数可）がヌルであることを意味し、ｙ、ｚ、またはｗのうちの少なくとも１つは、０とは異なり、
Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、同じまたは異なるものであり得、各々が独立して、一般式（ＩＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＩＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０００８】
【化２】
2021509406.tif 000004
【０００９】
式中、
Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４は、互いに独立して、Ｎ´、Ｎ´´、ヌル、エーテル、アミド、エステル、チオエーテル、およびチオエステルからなる群から選択され、Ｎ´およびＮ´´は、各々−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＮＨ−、および−Ｎ（Ｘ）−からなる群から独立して選択され、式中、Ｘは、アミンの保護基であり、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４は、同じまたは異なるものであり得、Ｎ´、Ｎ´´は、同じまたは異なるものであり得る。
Ｌは、リンカーであり、ヌル、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６アルキレンまたはヘテロアルキレン；フッ素原子（複数可）によって任意に置換された、Ｃ５もしくはＣ６アリールもしくはヘテロアリール、またはヒドロキシル基（複数可）；およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４は、互いに独立して、水素原子またはメチル基を表し、Ｇ基は、同じまたは異なるものであり得、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、またはＧ４基のうちの少なくとも２つは、水素原子であり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは、整数である、各々が独立して、０、１、２、３、４、５、または６からなる群から選択され、０＝ヌルであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは、同じまたは異なるものであり得、
ｇは、整数を表し、０、１、２、３、４、または５から選択され、
Ｗは、ヌル、ヒドロキシル、ジヒドロキシル、アミド、天然または修飾ヌクレオシド、式（ＩＩ１）、（ＩＩ２）、および（ＩＩ３）に示される構造のいずれかの残基、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１０】
【化３】
2021509406.tif 000005
【００１１】
式中、
Ｊは、ヌル、−ＣＨ２−、第二級または第三級アミン、および酸素からなる群から選択され、
Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、Ｄ；本明細書で定義される、保護基（例えば、アルコールの保護基）；水素、リン酸、硫酸、およびカルボキシル基からなる群から選択される、ＲまたはＲ´基；ならびに固体支持体からなる群の任意の部分に結合することができる。本発明の文脈において、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、１つ以上の点を介して１つのＤ部分に結合され得、Ｗは、ＤおよびＲまたはＲ´の両方に同時に結合することができる。
【００１２】
本発明の実施形態の１つでは、ｇは、０、１、または２の整数である。
【００１３】
一実施形態では、ｃおよびｄは、互いに独立して、１、２、または３の整数を表し、ｃおよびｄは、同じまたは異なるものであり得る。
【００１４】
本発明の一実施形態では、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４は、全て水素原子である。
【００１５】
一実施形態では、Ｌは、ジフルオロベンジルアミンである。
【００１６】
別の実施形態では、Ｘは、アミンの保護基ＴＥＯＣ［カルバミン酸２−（トリメチルシリル）エチル］、またはＦｍｏｃである。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（Ｖ）に示される構造を有するか、または、式（Ｖ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´およびＮ´´は、互いに独立して、式（ＩＩ）で定義されるものと同じ意味を有する。
【００１８】
【化４】
2021509406.tif 000006
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＶＩＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´およびＮ´´は、互いに独立して、式（ＩＩ）で定義されるものと同じ意味を有する。
【００２０】
【化５】
2021509406.tif 000007
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＶＩＩＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【００２２】
【化６】
2021509406.tif 000008
【００２３】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＶＩＩＩ−Ｈ）に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩＩ−Ｈ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００２４】
【化７】
2021509406.tif 000009
【００２５】
関連する実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＶＩＩＩ−Ｍ）に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩＩ−Ｍ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００２６】
【化８】
2021509406.tif 000010
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＶＩＩＩ−Ｆ）に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩＩ−Ｆ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【００２８】
【化９】
2021509406.tif 000011
【００２９】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＶ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＶ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、ｐおよびｑは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、または６の整数であり、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【００３０】
【化１０】
2021509406.tif 000012
【００３１】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＶ−Ｈ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＶ−Ｈ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００３２】
【化１１】
2021509406.tif 000013
【００３３】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＶ−Ｍ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＶ−Ｍ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００３４】
【化１２】
2021509406.tif 000014
【００３５】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＶ−Ｆ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＶ−Ｆ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【００３６】
【化１３】
2021509406.tif 000015
【００３７】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｌ部分は、ジフルオロベンジルアミンであり、したがって、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、各々、式（ＸＶ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【００３８】
【化１４】
2021509406.tif 000016
【００３９】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶ−Ｈ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶ−Ｈ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００４０】
【化１５】
2021509406.tif 000017
【００４１】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶ−Ｍ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶ−Ｍ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００４２】
【化１６】
2021509406.tif 000018
【００４３】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶ−Ｆ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶ−Ｆ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【００４４】
【化１７】
2021509406.tif 000019
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｌ部分は、テトラ−フルオロ−ベンジルアミンであり、したがって、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、各々、式（ＸＶＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【００４６】
【化１８】
2021509406.tif 000020
【００４７】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶＩ−Ｈ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶＩ−Ｈ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００４８】
【化１９】
2021509406.tif 000021
【００４９】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶＩ−Ｍ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶＩ−Ｍ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００５０】
【化２０】
2021509406.tif 000022
【００５１】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶＩ−Ｆ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶＩ−Ｆ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【００５２】
【化２１】
2021509406.tif 000023
【００５３】
本発明はまた、アルコールの保護基および／またはアミンの保護基に結合した、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）のいずれかに示される構造を有する、本発明の任意のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分（複数可）である、前駆体分子を提供し、当該保護基は、分子の化学的処理中に、例えば、オリゴヌクレオチド鎖へのコンジュゲーション中に除去される運命にある。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態は、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞への生体膜を横切る薬物の送達のための方法に関し、当該方法は、細胞を本明細書に記載されるコンジュゲートと接触させることを含む。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、必要とする患者において医学的障害を治療するための方法に関し、方法は、患者に、本発明のコンジュゲートを含み、当該患者の疾患の治療に有用である薬物Ｄ、および薬学的に許容される塩または担体を含む、治療有効量の薬学的組成物を投与することを含む。
【００５６】
どのように本発明の実施形態を実際に実施することができるかを示すために、非限定的に、本発明を例示する実施例も記載される。実施例は、本発明の様々な化合物およびコンジュゲートを記載する。全ての記載されるコンジュゲートは、式（Ｃｎ−１）または（Ｃｎ−２）に従い、各々が一般式（ＩＩ）による構造を有するＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含む。実施例は、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）に示される構造を表す、様々なＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を提供する。全てのこれらのコンジュゲートは、上記化合物と構造的類似性を共有し得る、対照化合物とは対照的に、遺伝子サイレンシングにおいて生物学的性能を示すが、これは、式（ＩＩ）による構造モチーフに完全には従わず、それぞれ所望の生物学的活性を示さない。式（Ｉ）および（ＩＩ）による本発明のコンジュゲートによって実証される性能プロファイルは、したがって、インビトロおよびインビボの両方で、結果として生じる有用な生物学的活性の性能で、その関連化合物が細胞へのリン脂質膜を横切る高分子ＯＤの送達において有用であることを可能にする、一般的かつ特有の構造フレームワークを表す。
【００５７】
加えて、実施例は、本発明のＥ部分、それらの前駆体、および有用なコンジュゲートへのそれらのアセンブリの化学合成のための方法を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】式（ＩＩＩ）による本発明のＥ部分のオリゴヌクレオチド鎖への結合様式、およびＥ部分のそれぞれの酸化還元媒介性切断を例示する。図１Ａは、式（ＩＩＩ）によるＥ部分が内部位置で結合している、ＲＮＡ鎖を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、結果としてのＲＮＡ薬物の放出と共に、細胞質内で優勢なものなどの還元条件での式（ＩＩＩ）によるこのＥ部分のジスルフィド基の酸化還元媒介性切断を例示する。
【図２Ａ】本発明のコンジュゲートの作用メカニズム（ＭＯＡ）を例示し、コンジュゲートは、式［Ｃｎ−２−（ＩＩＩ）］による。ＲＮＡ二本鎖は、２５／２７ヌクレオチド長のＤｉｃｅｒ基質であり、各鎖の５´末端で結合したリン酸基を有し、内部に配置されたＥ部分のＷ基は、式（ＩＩ１）に従い、Ｊは、−ＣＨ２−であり、図２Ａは、インタクトなコンジュゲートを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、細胞質において優勢である還元条件でのＥ、Ｅ´、およびＥ´´部分の切断および除去を示し、各Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分に短い残留断端を残す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＲＮＡ二本鎖とＤｉｃｅｒエンドヌクレアーゼとの相互作用を示し、２１／２１ＲＮＡ二本鎖を残す、二本鎖切断、ならびに５´末端およびパッセンジャー鎖の内部位置で結合した、ＥおよびＥ´の残留断端を残す、Ｅ´´部分の断端の除去をもたらす。
【図２Ｄ】図２Ｄは、パッセンジャー鎖に結合した、ＥおよびＥ´部分の残留断端の同時除去と共に、酵素ヘリカーゼ（すなわち、ＲＮＡ鎖を分離することができる、細胞質酵素）によるセンス（パッセンジャー）鎖の除去を示す。
【図２Ｅ】結果として、所望の遺伝子サイレンシングを誘導するために、インタクトなアンチセンス鎖が放出され、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に入る［図２Ｅ］。
【図３Ａ】インビボでの、マウスモデルにおける静脈内投与後、ＡｐｏＣ３遺伝子の発現のサイレンシングにおける、本発明の式［Ｃｎ−１−（ＩＸ）］、すなわち、各々式（ＩＸ）による、ＥおよびＥ´部分を有する、コンジュゲートの性能を記載する（図３Ａ）。
【図３Ｂ】肝臓における遺伝子サイレンシング（図３Ｂ）。実験群は：（ｉ）．ビヒクル：注射用水中５％グルコース、（ｉｉ）．ＡｐｏＣ３の「ネイキッド」ｄｓｉＲＮＡ（分子ナノモーター部分の結合なし）、（ｉｉｉ）．［Ｃｎ−１−（ＩＸ）］−Ｋｒａｓ  ｄｓｉＲＮＡコンジュゲート（Ａｐｏ−Ｓｉ分子ナノモーター送達システムにコンジュゲートされた、非関連ＲＮＡ配列）、（ｉｖ）．標的［Ｃｎ−１−（ＩＸ）］−ＡｐｏＣ３  ｄｓｉＲＮＡコンジュゲートであった。
【図４Ａ】インビトロでのＥＧＦＰ遺伝子の発現のサイレンシングにおける、［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ）］、すなわち、各々式（ＶＩＩＩ）による、Ｅ、Ｅ´、およびＥ´´部分を有する。図４Ａは、培養ヒーラ細胞である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、培養３Ｔ３細胞であり、０〜３００ｎＭの濃度範囲の、用量応答曲線を示す。
【図５】インビトロでの３Ｔ３細胞におけるＥＧＦＰ遺伝子の発現のサイレンシングにおける、本発明の２つのコンジュゲート：コンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］およびコンジュゲート［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］の生物学的性能を記載する。非常に有意な対数減衰を有し、両方の細胞株についてＲ２０．９７の曲線適合を有する、明確な用量／応答が観察された。２つのＥ部分を有する、コンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］（点線）について、ＩＣ５０は、２．２ｎＭであるのに対し、３つのＥ部分を有する、コンジュゲート［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］（実線）について、ＩＣ５０は、０．８ｎＭであることが判明した。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、細胞へリン脂質生体膜を横切ってカーゴ薬物を送達して、標的遺伝子の発現のサイレンシングなどの生物学的活性を発揮することができる新規薬物送達システム（ＭＤＳ）に結合した、ＯＤなどの高分子薬物を含む、コンジュゲートおよびその前駆体に関する。この送達システムは、遺伝子薬物、例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｄｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、または治療タンパク質などの高分子薬物の膜貫通送達を可能にする。本発明は、リン脂質膜を横切る有効な膜貫通送達と、その後の細胞質へのカーゴＯＤのロバストな還元に基づく遊離とを組み合わせ、その生物学的効果を発揮することによって、遺伝子サイレンシングにおいて有利な性能を示すという、本発明者らによる新規化合物の発見および開発に基づく。
【００６０】
本発明の一実施形態では、式（Ｉ）に示される構造を有するコンジュゲート、または、式（Ｉ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物が提供される。
【００６１】
【化２２】
2021509406.tif 000024
【００６２】
式中、
Ｄは、生体膜にわたって送達される薬物（すなわち、カーゴ薬物）であり、小分子薬物、ペプチド、タンパク質、およびＯＤ（すなわち、天然もしくは修飾、一本鎖もしくは二本鎖、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯ）からなる群から選択され、
ｙ、ｚ、ｗは、各々、０、１、２、３、または４から独立して選択される整数であり、ｙ、ｚ、またはｗのいずれかが０である場合、それはそれぞれのＥ部分（複数可）がヌルであることを意味し、ｙ、ｚ、またはｗのうちの少なくとも１つは、０とは異なり、
Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、同じまたは異なるものであり得、各々が独立して、一般式（ＩＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＩＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００６３】
【化２３】
2021509406.tif 000025
【００６４】
式中、
Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４は、互いに独立して、Ｎ´、Ｎ´´、ヌル、エーテル、アミド、エステル、チオエーテル、およびチオエステルからなる群から選択され、Ｎ´およびＮ´´は、各々−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＮＨ−、および−Ｎ（Ｘ）−からなる群から独立して選択され、式中、Ｘは、アミンの保護基であり、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４は、同じまたは異なるものであり得、Ｎ´、Ｎ´´は、同じまたは異なるものであり得る。
Ｌは、リンカーであり、ヌル、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６アルキレンまたはヘテロアルキレン；フッ素原子（複数可）によって任意に置換された、Ｃ５もしくはＣ６アリールもしくはヘテロアリール、またはヒドロキシル基（複数可）；およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４は、互いに独立して、水素原子またはメチル基を表し、Ｇ基は、同じまたは異なるものであり得、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、またはＧ４基のうちの少なくとも２つは、水素原子であり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは、整数である、各々が独立して、０、１、２、３、４、５、または６からなる群から選択され、０＝ヌルであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは、同じまたは異なるものであり得、
ｇは、整数を表し、０、１、２、３、４、または５から選択され、
Ｗは、ヌル、ヒドロキシル、ジヒドロキシル、アミド、天然または修飾ヌクレオシド、ならびに式（ＩＩ１）、（ＩＩ２）、および（ＩＩ３）に示される構造のいずれかの残基、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００６５】
【化２４】
2021509406.tif 000026
【００６６】
式中、
Ｊは、ヌル、−ＣＨ２−、第二級または第三級アミン、および酸素からなる群から選択され、
Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、Ｄ；本明細書で定義される、保護基（例えば、アルコールの保護基）；水素、リン酸、硫酸、およびカルボキシル基からなる群から選択される、ＲまたはＲ´基；ならびに固体支持体からなる群の任意の部分に結合することができる。本発明の文脈において、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、１つ以上の点を介して１つのＤ部分に結合され得、Ｗは、ＤおよびＲまたはＲ´の両方に同時に結合することができる。
【００６７】
本発明の実施形態の１つでは、ｇは、０、１、または２の整数である。
【００６８】
一実施形態では、ｃおよびｄは、互いに独立して、１、２、または３の整数を表し、ｃおよびｄは、同じまたは異なるものであり得る。
【００６９】
本発明の一実施形態では、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４は、全て水素原子である。
【００７０】
一実施形態では、Ｌは、ジフルオロベンジルアミンである。
【００７１】
別の実施形態では、Ｘは、ＴＥＯＣ［カルバミン酸２−（トリメチルシリル）エチル］、またはＦｍｏｃである。
【００７２】
したがって、一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＩＩＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＩＩＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´は、式（ＩＩ）で定義されるものと同じ意味を有する。
【００７３】
【化２５】
2021509406.tif 000027
【００７４】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＩＶ）に示される構造を有するか、または、式（ＩＶ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００７５】
【化２６】
2021509406.tif 000028
【００７６】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（Ｖ）に示される構造を有するか、または、式（Ｖ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´およびＮ´´は、互いに独立して、式（ＩＩ）で定義されるものと同じ意味を有する。
【００７７】
【化２７】
2021509406.tif 000029
【００７８】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＶＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＶＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´およびＮ´´は、互いに独立して、式（ＩＩ）で定義されるものと同じ意味を有する。
【００７９】
【化２８】
2021509406.tif 000030
【００８０】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＶＩＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´およびＮ´´は、互いに独立して、式（ＩＩ）で定義されるものと同じ意味を有する。
【００８１】
【化２９】
2021509406.tif 000031
【００８２】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＶＩＩＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【００８３】
【化３０】
2021509406.tif 000032
【００８４】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＶＩＩＩ−Ｈ）に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩＩ−Ｈ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００８５】
【化３１】
2021509406.tif 000033
【００８６】
関連する実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＶＩＩＩ−Ｍ）に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩＩ−Ｍ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００８７】
【化３２】
2021509406.tif 000034
【００８８】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＶＩＩＩ−Ｆ）に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩＩ−Ｆ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【００８９】
【化３３】
2021509406.tif 000035
【００９０】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＩＸ）に示される構造を有するか、または、式（ＩＸ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【００９１】
【化３４】
2021509406.tif 000036
【００９２】
また別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（Ｘ）に示される構造を有するか、または、式（Ｘ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【００９３】
【化３５】
2021509406.tif 000037
【００９４】
また別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【００９５】
【化３６】
2021509406.tif 000038
【００９６】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【００９７】
【化３７】
2021509406.tif 000039
【００９８】
式中、ｐおよびｑは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、または６の整数を表し、０は、ヌルを意味し、ｐおよびｑは、同じまたは異なるものであり得、ｋおよびｇは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、または６の整数を表し、０は、ヌルを意味し、ｋおよびｇは、同じまたは異なるものであり得、Ｚは、ヌル、−Ｏ−、およびＮ´´からなる群から選択され、Ｎ´およびＮ´´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【００９９】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＩａ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＩａ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、ｑは、０〜１の整数であり、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【０１００】
【化３８】
2021509406.tif 000040
【０１０１】
本発明はまた、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＩＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＩＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１０２】
【化３９】
2021509406.tif 000041
【０１０３】
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは、互いに独立して、０、１、２、または３の整数を表し、０は、ヌルを意味し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅは、同じまたは異なるものであり得、Ｑは、ヌルおよび−Ｏ−からなる群から選択され、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＸＩＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＩＩａ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＩＩａ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、ａは、１または２の整数であり、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【０１０５】
【化４０】
2021509406.tif 000042
【０１０６】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＶ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＶ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、ｐおよびｑは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、または６の整数であり、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【０１０７】
【化４１】
2021509406.tif 000043
【０１０８】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＶ−Ｈ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＶ−Ｈ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１０９】
【化４２】
2021509406.tif 000044
【０１１０】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＶ−Ｍ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＶ−Ｍ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１１１】
【化４３】
2021509406.tif 000045
【０１１２】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＩＶ−Ｆ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＩＶ−Ｆ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【０１１３】
【化４４】
2021509406.tif 000046
【０１１４】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｌ部分は、ジフルオロベンジルアミンであり、したがって、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、各々、式（ＸＶ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、ｐおよびｑは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、または６の整数であり、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【０１１５】
【化４５】
2021509406.tif 000047
【０１１６】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶ−Ｈ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶ−Ｈ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１１７】
【化４６】
2021509406.tif 000048
【０１１８】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶ−Ｍ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶ−Ｍ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１１９】
【化４７】
2021509406.tif 000049
【０１２０】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶ−Ｆ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶ−Ｆ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【０１２１】
【化４８】
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【０１２２】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｌ部分は、テトラ−フルオロ−ベンジルアミンであり、したがって、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、各々、式（ＸＶＩ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶＩ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｎ´は、式（ＩＩ）におけるものと同じ意味を有する。
【０１２３】
【化４９】
2021509406.tif 000051
【０１２４】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶＩ−Ｈ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶＩ−Ｈ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１２５】
【化５０】
2021509406.tif 000052
【０１２６】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶＩ−Ｍ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶＩ−Ｍ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【化５１】
2021509406.tif 000053
【０１２７】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）によるコンジュゲートを提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´は、式（ＸＶＩ−Ｆ）に示される構造を有するか、または、式（ＸＶＩ−Ｆ）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。式中、Ｘは、アミンの保護基である。
【０１２８】
【化５２】
2021509406.tif 000054
【０１２９】
Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´が、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）のいずれかに示される構造を有する場合、それはアルコールまたはアミンの保護基に結合することができ、アルコールの保護基は、多くの場合、限定なしに、ジメトキシトリチル［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）およびホスホラミダイトである。これらの部分は、とりわけ、オリゴヌクレオチド薬物（ＯＤ）の構築プロセス中の、本発明のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分のオリゴヌクレオチド鎖へのコンジュゲーションプロセスに有用である。
【０１３０】
加えて、アミンによく使用される保護基は、ＦｍｏｃおよびＴＥＯＣ［カルバミン酸２−（トリメチルシリル）エチル］であり、これは、ＯＤの合成中にＥ、Ｅ´、またはＥ´´に結合した様々な官能基を保護するために使用することができる。基本的な条件で除去されるため、そのような保護基は、したがって、ＯＤ合成の最後に、保護基の除去のステップ中に効果的に除去することができ、よって、以前は保護部分（複数可）によってマスクされていた、最終的なＯＤコンジュゲート上の所望の官能基を露出する。
【０１３１】
本発明の文脈における前駆体分子は、アルコールおよび／またはアミンの保護基に結合した、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）のいずれかに示される構造を有する、任意のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分であり、当該保護基は、分子の化学処理中に、例えば、オリゴヌクレオチド鎖へのコンジュゲーション中に除去される運命にあり、それぞれの薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１３２】
非限定的に提供される、本発明の前駆体分子の例は、式（ＶＩＩＩ）の構造に基づいており、以下の式（ＶＩＩＩ−Ｆ）−前駆体に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩＩ−Ｆ）−前駆体に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１３３】
【化５３】
2021509406.tif 000055
【０１３４】
式（ＶＩＩＩ）の構造に依然として基づく、本発明の前駆体分子の別の例は、以下の式（ＶＩＩＩ−Ｍ）−前駆体に示される構造を有するか、または、式（ＶＩＩＩ−Ｍ）−前駆体に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１３５】
【化５４】
2021509406.tif 000056
【０１３６】
本発明の前駆体分子の別の例は、式（ＸＩＶ）の構造に基づいており、以下の式（ＸＩＶ−Ｆ）−前駆体を有するか、または、式（ＸＩＶ−Ｆ）−前駆体に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１３７】
【化５５】
2021509406.tif 000057
【０１３８】
式（ＸＩＶ）の構造に依然として基づく本発明の前駆体分子の別の例は、以下の式（ＸＩＶ−Ｍ）−前駆体を有するか、または、式（ＸＩＶ−Ｍ）−前駆体に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１３９】
【化５６】
2021509406.tif 000058
【０１４０】
本発明の前駆体分子のまた別の例は、式（ＸＶ）の構造に基づいており、以下の式（ＸＶ−Ｆ）−前駆体を有するか、または、式（ＸＶ−Ｆ）−前駆体に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１４１】
【化５７】
2021509406.tif 000059
【０１４２】
本発明の前駆体分子の別の例は、式（ＸＶ）の構造に依然として基づいており、以下の式（ＸＶ−Ｍ）−前駆体を有するか、または、式（ＸＶ−Ｍ）−前駆体に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１４３】
【化５８】
2021509406.tif 000060
【０１４４】
本発明の前駆体分子の別の例は、式（ＸＶＩ）の構造に基づいており、以下の式（ＸＶＩ−Ｆ）−前駆体を有するか、または、式（ＸＶＩ−Ｆ）−前駆体に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１４５】
【化５９】
2021509406.tif 000061
【０１４６】
本発明の前駆体分子の別の例は、式（ＸＶＩ）の構造に依然として基づいており、以下の式（ＸＶＩ−Ｍ）−前駆体を有するか、または、式（ＸＶＩ−Ｍ）−前駆体に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１４７】
【化６０】
2021509406.tif 000062
【０１４８】
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）のいずれかによる化合物（複数可）は、薬物、Ｄへの結合のための、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分として機能し、よって、細胞へのＤの膜貫通送達における生物学的性能を目的とする、本発明の所望のコンジュゲートを形成することができる。
【０１４９】
本発明の一実施形態では、コンジュゲートを提供し、Ｄは、各々が式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）のいずれかによる、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分に結合した、ｓｉＲＮＡまたはＤｉｃｅｒの基質などのＯＤであり、それぞれのコンジュゲートの薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレートを含む。
【０１５０】
事例では、そのＤは、オリゴヌクレオチド薬物（ＯＤ）であり、コンジュゲートは、とりわけ、以下の選択肢のいずれか１つに従い得る。
（ｉ）．ＯＤは、単一のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分に結合している。
（ｉｉ）．ＯＤは、同じまたは異なる、２つのＥ部分に結合し、各々は、任意に各オリゴヌクレオチド鎖の１つの末端（例えば、５´末端）で結合している。
（ｉｉｉ）．ＯＤは、同じまたは異なる、３つのＥ部分に結合し、ＥおよびＥ´部分は、各オリゴヌクレオチド鎖の末端（例えば、５´末端）で結合しているが、Ｅ´´は、オリゴヌクレオチド鎖内の内部位置で結合している。
（ｉｖ）．ＯＤは、同じまたは異なる、いくつかの（ｎ＞３）Ｅ部分に結合し、Ｅ部分は、各オリゴヌクレオチド鎖の末端（例えば、５´末端）で結合しているが、いくつかの他のＥ部分は、オリゴヌクレオチド鎖に沿ったいくつかの内部位置で結合している。
【０１５１】
Ｅ部分がオリゴヌクレオチド鎖に沿った内部位置で挿入される場合、それは、所望のような、任意の点に配置され得る。Ｄが、ｓｉＲＮＡ  ＲＮＡ二本鎖である、ＯＤである場合、パッセンジャー鎖上に内部Ｅ部分を挿入することが好ましい。遺伝子サイレンシングにおける構築物の活性に干渉しないパッセンジャー鎖に沿った潜在的に有益な位置は、１２位または１４位であり得る。Ｅ部分は、鎖に沿ってヌクレオチドを置き換えるか、または配列への付加であるかのいずれかであり、よって、ｓｉＲＮＡ二本鎖を生成するアニーリングプロセス後、ＲＮＡ二本鎖の構造における「バルジ」を形成することができる。
【０１５２】
各コンジュゲートについて、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´はまた、各々が式（ＩＩ）で定義される通り（リン酸、硫酸、またはカルボキシル基）である、ＲまたはＲ´部分に結合することができる。Ｅ、Ｅ´、Ｅ´´部分は、同じまたは異なるものであり得、またＲおよびＲ´部分は、同じまたは異なるものであり得る。
【０１５３】
例えば、本発明のコンジュゲートは、以下の式（Ｃｎ−１）、（Ｃｎ−２）、（Ｃｎ−３）に示される構造を有し得、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含み、各々は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）のいずれかによる構造を有し、ＲおよびＲ´は、各々式（ＩＩ）で定義される通りであり、それぞれのコンジュゲートの薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレートを含む。
【０１５４】
【化６１】
2021509406.tif 000063
【０１５５】
本発明の一実施形態では、１５〜２５ヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、上記で定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であるＤを含むコンジュゲートを提供する。このＡＳＯは、天然もしくは修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）（ヌクレオチドは、ホスホトリエステル基、ホスホロチオエート基、当該技術分野で知られる、他の核酸結合戦略を介して結合している）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。このコンジュゲートは、式（Ｃｎ−３）に示される、Ｅ、Ｅ´部分への結合を含む。
【０１５６】
【化６２】
2021509406.tif 000064
【０１５７】
式中、ＴおよびＴ´は、各々、ヌル、および１´，２´−ジデオキシリボース、ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、ＴおよびＴ´は、同じまたは異なるものであり得、ＲおよびＲ´部分は、式（ＩＩ）で定義される通りであり、式（Ｃｎ−３）に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１５８】
その実施形態のうちの１つでは、本発明は、式（Ｃｎ−１）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＶＩＩＩ−Ｈ）に従い、当該コンジュゲートは、したがって、以下の式［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｈ）］に示される構造を有し、
【０１５９】
【化６３】
2021509406.tif 000065
【０１６０】
式［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｈ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１６１】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｃｎ−１）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＶＩＩＩ−Ｍ）に従い、以下の式［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］に示される構造を有し、
【０１６２】
【化６４】
2021509406.tif 000066
【０１６３】
式［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１６４】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｃｎ−２）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＶＩＩＩ−Ｈ）に従い、以下の式［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｈ）］に示される構造を有するか、または、式［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｈ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１６５】
【化６５】
2021509406.tif 000067
【０１６６】
また別の実施形態では、本発明は、式（Ｃｎ−２）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＶＩＩＩ−Ｍ）に従い、以下の式［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］に示される構造を有するか、または、式［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１６７】
【化６６】
2021509406.tif 000068
【０１６８】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｃｎ−１）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＸＶ−Ｈ）に従い、以下の式［Ｃｎ−１−（ＸＶ−Ｈ）］に示される構造を有するか、または、式［Ｃｎ−１−（ＸＶ−Ｈ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１６９】
【化６７】
2021509406.tif 000069
【０１７０】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｃｎ−１）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＸＶ−Ｍ）に従い、以下の式［Ｃｎ−１−（ＸＶ−Ｍ）］に示される構造を有するか、または、式［Ｃｎ−１−（ＸＶ−Ｍ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１７１】
【化６８】
2021509406.tif 000070
【０１７２】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｃｎ−２）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＸＶ−Ｈ）に従い、以下の式［Ｃｎ−２−（ＸＶ−Ｈ）］に示される構造を有するか、または、式［Ｃｎ−２−（ＸＶ−Ｈ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１７３】
【化６９】
2021509406.tif 000071
【０１７４】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｃｎ−２）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＸＶ−Ｍ）に従い、以下の式［Ｃｎ−２−（ＸＶ−Ｍ）］に示される構造を有するか、または、式［Ｃｎ−２−（ＸＩＶ−Ｍ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１７５】
【化７０】
2021509406.tif 000072
【０１７６】
一実施形態では、本発明は、式（Ｃｎ−１）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＸＶＩ−Ｈ）に従い、以下の式［Ｃｎ−１−（ＸＶＩ−Ｈ）］に示される構造を有し、
【０１７７】
【化７１】
2021509406.tif 000073
【０１７８】
式［Ｃｎ−１−（ＸＶＩ−Ｈ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１７９】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｃｎ−１）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＸＶＩ−Ｍ）に従い、以下の式［Ｃｎ−１−（ＸＶＩ−Ｍ）］に示される構造を有するか、または、式［Ｃｎ−１−（ＸＶＩ−Ｍ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１８０】
【化７２】
2021509406.tif 000074
【０１８１】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｃｎ−２）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＸＶＩ−Ｈ）に従い、以下の式［Ｃｎ−２−（ＸＶＩ−Ｈ）］に示される構造を有するか、または、式［Ｃｎ−２−（ＸＶＩ−Ｈ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１８２】
【化７３】
2021509406.tif 000075
【０１８３】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｃｎ−２）によるコンジュゲートを提供し、式中、ＲおよびＲ´は、各々リン酸基であり、ＥおよびＥ´は、各々式（ＸＶＩ−Ｍ）に従い、以下の式［Ｃｎ−２−（ＸＶＩ−Ｍ）］に示される構造を有するか、または、式［Ｃｎ−２−（ＸＶＩ−Ｍ）］に示される構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および金属キレート、ならびに塩の溶媒和物および水和物を含む。
【０１８４】
【化７４】
2021509406.tif 000076
【０１８５】
本発明の文脈における「薬物」または「カーゴ薬物」（すなわち、部分Ｄ）は、本発明のコンジュゲートによってリン脂質膜を横切って細胞へ送達されることを目的とする分子を指し、Ｄは、小分子薬物、またはペプチド、タンパク質、もしくはオリゴヌクレオチド薬物（ＯＤ）などの高分子のいずれかである。
【０１８６】
本発明の文脈における「薬物」または「医薬品」という用語は、疾患に罹患している患者に投与される場合、患者に対して有益な効果を発揮することができる化学物質に関する。有益な効果は、症状の改善から、疾患プロセスにおいて役割を果たす薬剤または物質（例えば、タンパク質）の効果を打ち消すことまでにわたることができる。薬物は、小分子を含んでもよく、または遺伝子発現を阻害するために投与される、タンパク質、または一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡなどの高分子であってもよい。とりわけ、薬物は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯを含み得る。いくつかの実施形態では、薬物は、変性障害、癌、虚血性、感染性、毒性、もしくは外傷性発作、遺伝性もしくは後天性代謝疾患、または免疫媒介性障害を治療することを目的とする。
【０１８７】
以降「ＯＤ」とも呼ばれる、「オリゴヌクレオチド薬物」という用語は、本発明の文脈では、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む薬物を指す。オリゴヌクレオチド薬物（ＯＤ）の例は、一本鎖または二本鎖、天然または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡである。ＯＤは、ｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）、Ｄｉｃｅｒ酵素の基質（ｄｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）として機能するように設計された、ＤＮＡ配列であり得る。ＯＤのヌクレオチドビルディングブロック間の結合は、とりわけ、リン酸−トリエステル架橋を介し、ホスホロチオエート結合を介し、または当該技術分野で知られる任意の他の方法を介し得る。ＯＤのビルディングブロックとして機能するヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）などの天然または修飾ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１８８】
本発明の実施形態である、より具体的なＯＤは、ＲＮＡ二本鎖である、「ｓｉＲＮＡ」であって、各ＲＮＡ鎖は、１９〜２１ヌクレオチド長であり、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）細胞質タンパク質を介して遺伝子発現をサイレンシングすることを目的とし、ＲＮＡ二本鎖である、ＤｉｃｅｒのｓｉＲＮＡ基質、（「ｄｓｉＲＮＡ」）であって、各ＲＮＡ鎖は、２４〜３０ヌクレオチド長である。一実施形態では、ｄｓｉＲＮＡ二本鎖は、２５ヌクレオチドの１つの鎖からなり、第２の鎖は、２７ヌクレオチドからなる。別の実施形態では、ｄｓｉＲＮＡ二本鎖は、２４ヌクレオチドの１つの鎖からなり、第２の鎖は、２７ヌクレオチドからなる。さらに別の実施形態では、ｄｓｉＲＮＡ二本鎖は、各々２７ヌクレオチドからなる、等しい長さのＲＮＡ鎖を含む。
【０１８９】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（ＡＳＯ）は、合成、一本鎖、天然または修飾ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、通常は１５〜２０ヌクレオチド長である。ＡＳＯの配列は、アンチセンスであり、すなわち、合成が阻害されることが求められる、タンパク質をコードする特定のｍＲＮＡのセンス配列に相補的である。当該相補的配列へのＡＳＯの結合は、リボソームがｍＲＮＡに沿って移動する能力をブロックし、よってタンパク質の合成を防止するか、またはあるいは、ｍＲＮＡの分解速度を速める。
【０１９０】
本発明の文脈における「ヌクレオシド」は、窒素塩基（核酸塩基）、および５個または６個の炭素原子の糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む化学的部分として定義される。核酸塩基は、天然または修飾プリン（例えば、アデニン、グアニン）および天然または修飾ピリミジン（例えば、チミン、シトシン、ウラシル）から選択される。核酸塩基は、当該技術分野で知られる、様々な修飾（例えば、メチル化、アセチル化）によって修飾することができる。加えて、ヌクレオシドの糖部分はまた、当該技術分野で知られるように、修飾することができる［例えば、２´−デオキシ誘導体、リボースの２´位でのメチル化、２´−フルオロ原子もしくは２´−Ｏ−メトキシエチルの導入、または２´酸素と４´炭素原子とを接続する架橋を有し、ロックド核酸（ＬＮＡ）を生成する］。したがって、本発明のＥ部分にコンジュゲートされた、そのような修飾ヌクレオシドの使用はまた、本発明の範囲内である。一実施形態では、ヌクレオシドは、天然または修飾シトシン、チミン、およびウラシルから選択される、ピリミジン誘導体を含み、糖部分は、リボースまたはデオキシリボースのいずれかである。
【０１９１】
「ヌクレオチド」は、本発明の文脈において、リン酸基に結合した、上記で定義されるヌクレオシドである。ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのビルディングブロックである。
【０１９２】
本発明の文脈における「前駆体分子」は、以下に定義される、アルコールまたはアミンの保護基に結合した、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）のいずれかに示される構造を有する、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分として定義される。
【０１９３】
本発明の文脈における「保護基」は、本発明のコンジュゲートの合成中に除去または修飾される運命にある化学基として定義される。そのような除去または修飾は、合成の様々な段階、例えば、限定なく、Ｄがオリゴヌクレオチド薬物（ＯＤ）などの高分子薬物である場合、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分のＤへの結合中に発生し得る。本発明の好ましい実施形態では、保護基は、以下に定義される、アルコールの保護基である。
【０１９４】
本発明の文脈における「アルコールの保護基」は、特定の化学反応中にそれを「マスク」するために、ヒドロキシル基に結合し、当該技術分野で知られるように、その後潜在的に除去される、化学基を指す。そのような保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシ−ベンジルエーテル（ＰＭＢ）、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル（トリフェニルメチル、Ｔｒ）、シリルエーテル［例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、およびトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテル］、エトキシエチルエーテル（ＥＥ）、ホスホルアミダイト、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）である。ＯＤなどの高分子薬物への部分のコンジュゲーションのためのアルコールのよく使用される保護基は、ジメトキシトリチル［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）、およびホスホルアミダイトである。
【０１９５】
本発明の文脈における「アミンの保護基」という用語［式（ＩＩ）による、Ｘ部分］は、特定の化学反応中にそれを「マスク」するために、アミン基に結合し、当該技術分野で知られるように、その後潜在的に除去される、化学基を指す。非限定的に提供される、本発明の範囲内の、アミンの保護基の例は、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）基、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基、フェノキシアセチル（ＰＡＣ）基、４−ｔｅｒｔブチルフェノキシアセチル（ｔ−ＰＡＣ）基、アセチル（Ａｃ）基、ベンゾイル（Ｂｚ）基、ベンジル（Ｂｎ）基、カルバメート基、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、３，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）基、トシル（Ｔｓ）基、Ｔｒｏｃ（クロロギ酸トリクロロエチル）基、カルバミン酸２−（トリメチルシリル）エチル（ＴＥＯＣ）である。
【０１９６】
本発明の文脈における「固体支持体への結合点」という用語は、化学合成中のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分の固体支持体への結合点を意味する。例えば、制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）は、本発明のオリゴヌクレオチド鎖の合成中のオリゴヌクレオチドの３´末端の結合のために、固体支持体として使用され得る。
【０１９７】
本発明による「生体膜」という用語は、生物学的システムに関する任意のリン脂質膜を指す。そのようなリン脂質膜の例は、血液脳関門（ＢＢＢ）、血液眼関門（ＢＯＢ）、または血液胎盤関門などの生物学的障壁に関連する細胞の形質膜、細胞内膜、またはリン脂質膜である。
【０１９８】
本発明による「フリップフロップ」という用語は、両親媒性化合物（すなわち、疎水性要素および親水性要素の両方を有する分子）の、リン脂質膜二重層の一方の葉から他方の葉への移動を指す。
【０１９９】
本発明による「エンドサイトーシス」という用語は、生きた細胞がその表面に結合した分子を取り込むプロセスを指し、当該プロセスは、形質膜を内側に折り畳み、よって当該分子を細胞にもたらすことを含む。
【０２００】
本発明の実施形態はさらに、それを必要とする対象における、医学的障害の治療のための、タンパク質またはＯＤ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯ）などの治療的に有用な薬物を含む、本発明によるコンジュゲートの使用に関する。医学的障害は、限定なく、変性障害、癌、血管障害、代謝障害、外傷性、毒性、もしくは虚血性発作、感染（例えば、ウイルス性もしくは細菌性）、または免疫媒介性障害であり得、特定のタンパク質（複数可）は、疾患の病因学または発病学のいずれかにおいて役割（複数可）を果たす。そのような医学的障害について、ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスメカニズムを通して、これらの疾患関連タンパク質をコードする遺伝子（複数可）の発現の調節、または治療タンパク質による、例えば、抗体による、もしくはシグナル伝達において機能するタンパク質による、もしくはタンパク質置換療法による、それぞれの疾患関連タンパク質の活性の調節は、疾患関連プロセスの阻害、または疾患の根本原因の治療に有益な効果を有し得る。
【０２０１】
例えば、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、一本鎖もしくは二本鎖核酸配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはその化学的類似体）を含み、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、またはタンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のいずれかに結合する、治療の形態である、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、またはｄｓｉＲＮＡ療法として使用され得る。この治療は、疾患関連遺伝子の発現を阻害するように作用し、それによって、疾患の病因学または発病学において役割を果たし得る、疾患関連タンパク質の産生を防止し得る。あるいは、本発明のコンジュゲートは、治療タンパク質、または遺伝子編集を行うことができる、Ｃａｓ９−ＲＮＡ複合体などのタンパク質／核酸複合体を含み得る。
【０２０２】
本発明の実施形態はまた、本明細書に記載されるコンジュゲート、および薬学的に許容される担体（複数可）または塩（複数可）を含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態によると、本発明のコンジュゲートおよび薬学的組成物は、臨床環境を含む、生きた対象において、インビトロ（例えば、細胞培養）、エクスビボ、またはインビボで使用され得る。
【０２０３】
本発明の他の実施形態は、それを必要とする患者における、医学的障害の治療における使用のための、本発明のコンジュゲート、または本発明のコンジュゲートを含む薬学的組成物を含む。本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする患者における、医学的障害の治療のための薬学的組成物の調製における、本発明のコンジュゲートの使用を含む。いくつかの実施形態では、医学的障害は、癌、代謝性疾患、感染性疾患、変性疾患、血管疾患、外傷、または免疫媒介性疾患である。当該薬学的組成物は、徐放、滞留時間の延長、分散、または安全性などの態様において、当該組成物に有益な特性を可能にするために含まれる、当該技術分野で知られる薬学的に許容される成分を含むことができる。
【０２０４】
本発明の実施形態によるコンジュゲートは、本発明のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を欠いた、同じ治療剤の送達の有効性と比較して、細胞膜を通した、または血液脳関門（ＢＢＢ）などの追加の生物学的障壁を通した、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、または抗体などの治療タンパク質の送達の有効性を改善するのに有利であり得る。よって、本発明のコンジュゲートは、有効性、例えば、安全性または薬物動態に加えて、１つ以上の態様において高分子薬物の性能を改善し得る。本発明のコンジュゲートは、とりわけ、経口、静脈内、筋肉内、皮下、気管内、気管支内、腹腔内、または髄腔内を含む、当該技術分野で知られる任意の投与様式を介して投与され得る。
【０２０５】
ＤがＯＤである、本発明のコンジュゲートは、非限定的に、以下の方法に従って合成することができる：最初に、サイレンシングされる遺伝子が、疾患の病因学または発病学におけるその役割に基づいて選択される。次いで、当該技術分野で知られるバイオインフォマティック方法論に基づいて、コンジュゲートに組み込まれるヌクレオチド配列が設計および決定される［典型的には、ＲＩＳＣ基質の１９〜２１塩基対二本鎖ｓｉＲＮＡ、またはＤｉｃｅｒ基質の２４〜２９塩基対二本鎖ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）］。合成は、オリゴヌクレオチドの３´から５´の方向で行われる。固相合成は、保護された２´−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵ）、または化学的に修飾されたヌクレオシド、例えば、［ＬＮＡ（ロックド核酸）、もしくはＢＮＡ（架橋核酸）］などの保護されたビルディングブロックを用いて適用される。ビルディングブロックは、ヌクレオシド前駆体として提供され、５´−および３´−ヒドロキシル基は、それぞれ、ＤＭＴおよびホスホルアミダイトによって保護される。これらの基は、合成中にヌクレオチドを成長するオリゴヌクレオチド鎖にカップリングする反応中に、所望のヌクレオチド配列によって決定される順序で順次除去される。
【０２０６】
本発明のコンジュゲートの合成の目的のために、Ｅ基は、前駆体分子として提供され、各々、上記のような保護基（複数可）に結合した、本発明のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分である。保護基は、当該技術分野で知られるヒドロキシルの任意の保護基であり得るが、ホスホラミダイトおよびＤＭＴ［ジメトキシトリチルビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］は、オリゴヌクレオチド合成において慣習的にしばしば使用される。本発明のコンジュゲートの主な利点は、上記のコンジュゲート（Ｃｎ−１）および（Ｃｎ−２）で例示されるように、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分を、オリゴヌクレオチド鎖の５´末端、オリゴヌクレオチド鎖の３´末端、またはオリゴヌクレオチド鎖に沿った内部位置（複数可）でも結合する選択肢を提供することである。それによって、本発明のＥ部分は、固有、天然オリゴヌクレオチドビルディングブロックと同様に、オリゴヌクレオチド鎖内に組み込まれることができる。ヌクレオチド間の結合は、標準的なホスホトリエステル結合を介するか、または血液中の安定性、もしくは血液タンパク質への好ましい結合などの利点を提供し得る、合成ホスホロチオエート結合を通すか、または当該技術分野で知られる任意の他のヌクレオチド結合戦略を介することができる。鎖のアセンブリの完了後、生成物は、固体支持体から溶液に放出され、脱保護され、収集される。本発明の所望のコンジュゲートを高純度で得るために、所望のコンジュゲートは次いで、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって単離される。ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡの場合、相補的ＲＮＡ鎖の各々は、別々に合成され、次いで２つの鎖のアニーリングは、当該技術分野で知られるように行われて、所望の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡがもたらされ、これは次いで精製およびアリコーティングに供される。
【０２０７】
本発明の一実施形態では、細胞膜および生物学的障壁からなる群から選択される、リン脂質生体膜を横切る薬物の送達方法を提供し、当該生物学的障壁は、血液脳関門、血液眼関門、または血液胎児関門から選択され、方法は、細胞またはそれぞれの生物学的障壁を本発明のコンジュゲートと接触させることを含む。
【０２０８】
本発明の実施形態では、生体細胞への薬物の送達方法を提供し、当該細胞は、培養中、または生きた動物、もしくはヒト対象中にあり、方法は、細胞をコンジュゲートと、または本発明のコンジュゲートを含む薬学的組成物と接触させることを含む。インビボでの投与の場合、細胞との接触は、当該技術分野で知られる薬物投与の任意の経路、例えば、経口、静脈内、皮下、または筋肉内投与を通して達成することができる。
【０２０９】
本発明の一実施形態では、本発明のコンジュゲート、または式（Ｉ）によるコンジュゲートを含む薬学的組成物を提供し、式中、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´の各々は、独立して、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）のいずれかに示される構造を有する。本発明はまた、インビトロまたはインビボでの、遺伝子発現の特異的阻害方法を含む。本発明の一実施形態では、方法は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）、（Ｃｎ−１）、（Ｃｎ−２）、（Ｃｎ−３）のいずれかによるコンジュゲート、または当該コンジュゲートを含む薬学的組成物の利用を含み得、式中、Ｄは、特定の遺伝子の発現をサイレンシングするように設計された、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯである。いくつかの実施形態では、遺伝子は、疾患の病因学または発病学において役割を有する病原性タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ｄは、治療タンパク質である。
【０２１０】
本発明のさらに別の実施形態では、非限定的に、生体膜内のエンドサイトーシスおよび／またはフリップフロップの誘導方法を提供し、当該方法は、生体膜を本発明のコンジュゲートと、または当該コンジュゲートを含む薬学的組成物と接触させることを含み、当該コンジュゲートは、ＯＤおよび、各々が式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）のいずれかに示される構造を有する、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含み、よって生体膜で、当該コンジュゲートのエンドサイトーシスおよび／またはフリップフロップを達成する。
【０２１１】
非限定的な仮説では、エンドサイトーシスまたはフリップフロップの当該誘導の根拠は、本発明のコンジュゲートの構造に関する。ＯＤが、Ｅ部分に結合した、ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡである場合、コンジュゲートは、膜の外葉に近づき、その円筒状ＲＮＡ二本鎖は、膜表面に平行であり、そのＥ部分は、膜表面に垂直な、膜コアへ配向される。この配向はよって、ＲＮＡ二本鎖を膜の外葉に固定する。高度に負に帯電したＲＮＡの外膜葉への結果として生じる強制的な近接は、エネルギー的に好ましくない焦点ひずみを、外リン脂質葉の表面積の拡大、リン脂質ヘッドグループの周りの水和シェルの乱れ、および膜の焦点曲げと共に引き起こす。この曲げエネルギーの緩和は、次いでエンドサイトーシスおよび／またはフリップフロップのいずれかを通して行うことができる。両方のプロセスは、その高分子カーゴ薬物を含む、細胞への本発明のコンジュゲートの膜貫通送達の開始および／または伝播を支持する。したがって、リン脂質膜におけるエンドサイトーシスまたはフリップフロップの誘導方法は、本発明の範囲内にあり、当該方法は、膜を本発明のコンジュゲートと接触させることを含む。
【０２１２】
本発明の実施形態によるコンジュゲートは、医学的障害の治療に使用され得る。本発明の実施形態は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）、（Ｃｎ−１）、（Ｃｎ−２）、（Ｃｎ−３）のいずれかによるコンジュゲートを含む、治療有効量の薬学的組成物の、必要とする患者への投与を含む、医学的治療方法を含み、式中、Ｄは、それぞれの医学的障害の治療に有用な薬物である。
【０２１３】
一実施形態では、方法は、治療剤としてのｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯでの遺伝子治療のためのものである。当該方法は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）、（Ｃｎ−１）、（Ｃｎ−２）、（Ｃｎ−３）のいずれかによる、本発明のコンジュゲートを含む、治療有効量の薬学的組成物の、必要とする患者への投与を含み、式中、Ｄは、遺伝子の発現の阻害において、または特定の患者における疾患の病因学または発病学で役割を果たす、それぞれのタンパク質の活性をブロックすることにおいて有用な、ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＡＳＯ、または治療タンパク質である。
【０２１４】
当該治療は、インビトロ、エクスビボのいずれかでの培養における細胞（すなわち、任意に治療操作後に患者に戻されるために、生体組織から取り出された細胞）へ、またはインビボでの生きた動物もしくはヒト対象における細胞への、薬物の送達を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、新生細胞である。いくつかの実施形態では、新生細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、新生細胞は、転移内の細胞である。細胞は、真核細胞、発癌剤によってトランスフェクトされた真核細胞、ヒト細胞、細胞株、前癌細胞である細胞、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０２１５】
本発明のさらに別の実施形態では、Ｄは、置換療法として、すなわち、突然変異機能不全タンパク質を置換し、よって生理学的必要性に対処するために投与される、タンパク質である。別の実施形態では、Ｄは、とりわけ、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集（特定の遺伝子の配列の付加、破壊、または変更）において役割を有するタンパク質を含む、遺伝子調節において役割を有するタンパク質である。一実施形態では、当該タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復）関連タンパク質のメンバーであり得る。具体的には、当該タンパク質は、潜在的にそのガイドオリゴヌクレオチド配列が装填された、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ酵素、またはその類似体であり得る。
【０２１６】
本発明の実施形態の１つでは、医学的障害の遺伝子治療のための方法を記載し、当該方法は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）、（Ｃｎ−１）、（Ｃｎ−２）、（Ｃｎ−３）のいずれかによるコンジュゲートを含む、治療有効量の薬学的組成物の、必要とする患者への投与を含み、式中、Ｄは、適切なガイドオリゴヌクレオチドと一緒に投与され、よって、細胞へのそれぞれのガイドオリゴヌクレオチドが装填されたタンパク質の送達を達成する、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲタンパク質であり、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、そのゲノム編集活性を発揮することができる。この文脈におけるガイドオリゴヌクレオチドは、その部位での二本鎖ＤＮＡ切断を誘導して、よってゲノムにおける局所欠陥の修復を可能にするために、Ｃａｓ９タンパク質をゲノムＤＮＡ上の特定の遺伝子座（場所）にガイドするＲＮＡまたはＤＮＡの配列である。Ｃａｓ９の場合、ガイドオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの短いセグメントであり、その配列は、標的ＤＮＡ遺伝子座の配列に相補的である。
【０２１７】
したがって、本発明の実施形態によるコンジュゲートおよびそれぞれの薬学的組成物、ならびにそれぞれの方法は、とりわけ、癌、毒性発作、代謝性疾患、虚血性疾患、感染性疾患、血管障害、タンパク質蓄積疾患、外傷、免疫媒介性疾患、変性疾患、遺伝性または後天性医学的障害から選択される、医学的障害の治療において有益であり得る。
【０２１８】
したがって、本発明の実施形態では、医学的障害の治療方法を提供し、当該方法は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｍ）、（ＸＶ）、（ＸＶ−Ｈ）、（ＸＶ−Ｍ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩ−Ｈ）、（ＸＶＩ−Ｍ）、（Ｃｎ−１）、（Ｃｎ−２）、（Ｃｎ−３）のいずれかによるコンジュゲートを含む、治療有効量の薬学的組成物の、必要とする患者への投与を含み、式中、Ｄは、この医学的障害の治療に有用な薬物である。
【０２１９】
いくつかの実施形態によれば、医学的障害は、癌である。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、制御されない増殖、特殊な機能の喪失、不死、有意な転移能、抗アポトーシス活性の有意な増加、急速な成長および増殖速度、または癌に関連することが知られる特定の特徴的な形態および細胞マーカーなどの癌原因細胞に典型的である特徴を示す細胞の存在を指す。典型的には、癌細胞は、腫瘍の形態であり、動物内に局所的に存在するか、または、例えば、白血病細胞のような、独立細胞として血流中を循環するかのいずれかである。
【０２２０】
神経障害の分野では、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、とりわけ、アルツハイマー病、運動ニューロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、およびクロイツフェルト・ヤコブ病などの神経変性障害の治療において有用であり得る。
【０２２１】
感染障害の分野では、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、とりわけ、細菌、真菌、もしくは他の寄生虫感染と闘うための抗生物質の送達、またはウイルス感染と闘うための抗ウイルス剤の送達に有用であり得る。したがって、本発明のコンジュゲートのＤは、抗感染特性を有し、したがって、細菌またはウイルス感染などの感染性疾患の治療に有用であり得る。本発明のコンジュゲートが有用であり得る、ウイルス感染の例は、限定なく、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などの肝指向性ウイルス；インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、またはパラインフルエンザウイルスなどのオルソミクソウイルス科による感染である。したがって、本発明の実施形態は、抗ウイルスまたは抗細菌薬に結合した、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分（複数可）のコンジュゲートである。そのような薬物は、とりわけ、ＯＤであり得、その配列は、感染因子の遺伝子材料と相互作用し、よって当該病原体の複製、代謝、感染性、または生存において役割を有する遺伝的プロセスに干渉することを目的とする。そのような遺伝子配列は、感染因子（例えば、ウイルス）の遺伝子（複数可）の発現をサイレンシングするように特異的に設計された、ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡであり得る。
【０２２２】
感染との闘いにおける本発明のコンジュゲートの有用性は、以下の利用：宿主（例えば、ヒト患者）の細胞への生体膜を横切る、または病原体（例えば、細菌またはウイルス）の細胞への生体膜を横切る治療的に有用な薬剤の送達のいずれかのうちの少なくとも１つにおけるものであり得る。
【０２２３】
代謝障害の分野では、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、とりわけ、当該代謝障害の原因である遺伝子（複数可）の発現を下方調節することを目的とした、遺伝子治療の送達、または疾患の病因学もしくは発病学において役割を果たす、欠陥突然変異タンパク質を置き換えるための、タンパク質の投与のために有用であり得る。
【０２２４】
他の実施形態では、本発明は、植物の細胞へのリン脂質膜を横切る化合物の送達を増強し、よって農業における利用に潜在的に有益であるための、本発明の化合物の潜在的利用に関する。結合した化合物、および所望の適応症に応じて、そのような送達は、農業において様々な有用な利用を有することができる。例えば、植物におけるそのような送達は、とりわけ、植物の遺伝学を改善することによって、または様々な病原体：昆虫、細菌、もしくは真菌の根絶によって、作物の質および量の改善を助けることができる。
【実施例】
【０２２５】
以下の実施例は、本発明の実施形態を実際にどのように実施することができるかを実証するために、非限定的に本発明を例示する。実施例は、本発明の様々な化合物およびコンジュゲートを記載する。全ての記載されるコンジュゲートは、式（Ｃｎ−１）または（Ｃｎ−２）に従い、各々が一般式（ＩＩ）による構造を有するＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含む。実施例は、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩａ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＩＩａ）、（ＸＩＶ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、または（ＸＩＶ−Ｍ）に示される構造から選択される、様々なＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を提供する。これらのコンジュゲートは、遺伝子サイレンシングにおける生物学的活性を示す。この性能は、式（Ｉ）および（ＩＩ）を含むコンジュゲートが、結果としての有用な生物学的性能（この場合、遺伝子サイレンシング）と共に、細胞へのリン脂質膜を横切る高分子ＯＤの有用な送達を可能にする、一般的かつ統一的な構造モチーフを表すという概念を支持する。加えて、実施例は、本発明のＥ部分、それらの前駆体、および有用なコンジュゲートへのそれらのアセンブリの化学合成のための方法を記載する。
【０２２６】
実施例１：Ｄ部分がオリゴヌクレオチドである、本発明の実施形態によるコンジュゲートの一般的な合成方法：
【０２２７】
最初に、サイレンシングされる遺伝子が、疾患の病因学または発病学におけるその役割に基づいて選択される。次いで、当該技術分野で知られるバイオインフォマティック方法論に基づいて、コンジュゲートに組み込まれるヌクレオチド配列が設計および決定される［典型的には、ＲＩＳＣ基質の１９〜２１塩基対二本鎖ｓｉＲＮＡ、またはＤｉｃｅｒ基質の２４〜２９塩基対二本鎖ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）］。
【０２２８】
合成は、オリゴヌクレオチドの３´から５´の方向で行われる。固相合成は、保護された２´−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵ）、または化学的に修飾されたヌクレオシド、例えば、［ＬＮＡ（ロックド核酸）、もしくはＢＮＡ（架橋核酸）］に由来する、保護されたビルディングブロックを用いて適用される。ビルディングブロックは、ヌクレオシド前駆体として提供され、５´−および３´−ヒドロキシル基は、それぞれ、ＤＭＴおよびホスホルアミダイトによって保護される。これらの基は、ヌクレオチドを成長するオリゴヌクレオチド鎖にカップリングする反応中に、所望のヌクレオチド配列によって決定される順序で順次除去される。
【０２２９】
本発明のコンジュゲートの合成の目的のために、Ｅ基は、前駆体分子として提供され、各々、上記のような保護基に結合した、本発明のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分である。保護基は、当該技術分野で知られるヒドロキシルの任意の保護基であり得るが、ホスホラミダイトおよびＤＭＴ［ジメトキシトリチルビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］は、オリゴヌクレオチド合成において慣習的にしばしば使用される。本発明のコンジュゲートの主な利点は、コンジュゲート（Ｃｎ−１）および（Ｃｎ−２）で例示されるように、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分を、オリゴヌクレオチド鎖の５´末端、オリゴヌクレオチド鎖の３´末端、またはオリゴヌクレオチド鎖に沿った内部位置でも結合する選択肢を提供することである。それによって、本発明のＥ部分は、固有、天然オリゴヌクレオチドビルディングブロックと同様に、オリゴヌクレオチド鎖内に組み込まれることができる。ヌクレオチド間の結合は、標準的なホスホトリエステル結合を介するか、または血液中の安定性、もしくは血液タンパク質への結合などの利点を提供し得る、合成ホスホロチオエート結合を通すか、または当該技術分野で知られる任意の他のヌクレオチド結合方法論を介することができる。鎖のアセンブリの完了後、生成物は、固体支持体から溶液に放出され、脱保護され、収集される。所望のコンジュゲートは次いで、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって単離され、本発明の所望のコンジュゲートが高純度で得られる。ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡの場合、各相補的ＲＮＡ鎖は、別々に合成され、次いで２つの鎖のアニーリングは、当該技術分野で知られるように標準的な条件で行われて、所望の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡがもたらされ、これは次いで精製およびアリコーティングに供される。
【０２３０】
実施例２：本発明のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を含む、前駆体分子の化学合成方法：
【０２３１】
実施例２Ａ：主要な中間体フェノール１の合成：
【０２３２】
【化７５】
2021509406.tif 000077
【０２３３】
エストラジオールを過剰の水素化ナトリウムで処理し、続いて臭化アリルを加え、化合物３へのクリーンな変換をもたらした。１．５当量の９−ＢＢＮでのその後のヒドロホウ素化は、末端ヒドロキシ基のみをもたらしたが、ＢＨ３でのヒドロホウ素化は、選択性がはるかに低く、付加物の混合物を提供した。アルコール５を光延反応条件に供して、過フッ素化ｔｅｒｔ−ブタノールと結合して、化合物６を得た。化合物８のベンジル基の水素化分解は、フェノール１を供給した。結論として、フェノール１は、エストラジオールから５つの合成ステップを介して４５％全収率で調製した。
【０２３４】
２ｂＡ１．（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−ベンジルオキシ−１７−ヒドロキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン（２）：
【０２３５】
（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−ベンジルオキシ−１７−ヒドロキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン（２）の合成は、本明細書で上記のセクション２ａＡ１に開示されている。
【０２３６】
２ｂＡ２．（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−アリルオキシ−３−ベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン（３）：
【０２３７】
（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−アリルオキシ−３−ベンジルオキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン（３）の合成は、本明細書で上記のセクション２ａＡ２に開示されている。
【０２３８】
２ｂＡ３．（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−ベンジルオキシ−１７−（３−ヒドロキシプロポキシ）エストラ−１，３，５（１０）−トリエン（７）：
【０２３９】
９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（８００ｍＬ、ＴＨＦ中の０．５Ｍ溶液、安定化、４００ｍｍｏｌ）を、０℃のＴＨＦ（１Ｌ）中の粗製アルケン３（１０１．２ｇ、２５１ｍｍｏｌ）の溶液に滴下し、完全な添加後、混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を０℃に冷却し、水性３０％ＮａＯＨ（１５０ｍＬ、１．３ｍｏｌ）および３５％水性（１２０ｍＬ、１．３ｍｏｌ）をゆっくりと同時に滴下し、得られた不均一な混合物を室温で約１時間激しく撹拌した。反応混合物を次いでＥｔＯＡｃ（２Ｌ）とブライン（５００ｍＬ）との間で分配した。有機相をさらに５００ｍＬのブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。この手順を同様の方法で繰り返し、両方の部分を組み合わせた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の２５％〜３５％ＥｔＯＡｃの勾配）による濃縮物のさらなる精製は、アルコール５（１３０ｇ、３１０ｍｍｏｌ）を白色の固体として６１％収率（３ステップ）でもたらした。
【０２４０】
２ｂＡ４．（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−ベンジルオキシ−１７−［３−（パーフルオロ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）プロポキシ］エストラ−１，３，５（１０）−トリエン（８）：
【０２４１】
アゾジカルボン酸ジイソプロピル（８０ｍＬ、４０７ｍｍｏｌ）をアルコール７（１３０ｇ、３０１ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１６２ｇ、６１８ｍｍｏｌ）、パーフルオロ−ｔｅｒｔ−ブタノール（７０ｍＬ、４９７ｍｍｏｌ）、および乾燥ＴＨＦ（２Ｌ）の撹拌混合物に窒素雰囲気下で滴下した。混合物を室温で約１８時間撹拌した。反応混合物を部分的に濃縮し、ヘプタン（１Ｌ）を加えた。ＴＨＦの完全な除去後、沈殿が始まった。固体を濾過を用いて除去し、濾液を濃縮した。アセトニトリル（１．５Ｌ）を加え、沈殿が始まるまで混合物を３０分間撹拌した。固体を濾過によって収集し、真空で乾燥させた。化合物８（１６０ｇ、２５１ｍｍｏｌ）を白色の固体として８１％収率で単離した。
【０２４２】
２ｂＡ５．（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−ヒドロキシ−１７−［３−（パーフルオロ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）プロポキシ］エストラ−１，３，５（１０）−トリエン（フェノール１）
【０２４３】
Ｐａｒｒ容器にＥｔＯＡｃ（１Ｌ）中のベンジルエーテル８（１６０ｇ、２５１ｍｍｏｌ）を入れ、これに炭素上の１０％パラジウム（４ｇ）を加えた。混合物を水素圧（５バール）下、室温で撹拌した。反応を１Ｈ  ＮＭＲで監視した。約７２時間後、反応混合物を（ＥｔＯＡｃで洗い流した）セライトのパッドを通して濾過し、新鮮な１０％木炭担持パラジウム（４ｇ）を水素雰囲気（５バール）に再送した。約１６時間後、反応混合物を（ＥｔＯＡｃで洗い流した）セライトのパッドを通して濾過し、濃縮して、フェノール１（１２５ｇ、２２８ｍｍｏｌ）を灰色がかった固体として９１％収率で提供した。
【０２４４】
実施例２ｂ：主要なビルディングブロックＫ−９３−Ａ−１の合成：
【０２４５】
合成は、以下の合成スキームに従って行われる。
【０２４６】
【化７６】
2021509406.tif 000078
【０２４７】
実施例２ｃ：式（ＩＩＩ）−前駆体の合成：
【０２４８】
【化７７−１】
2021509406.tif 000079
【０２４９】
【化７７−２】
2021509406.tif 000080
【０２５０】
中間体Ｋ−９３−Ａ−１は、上記のように合成されるが、中間体Ｋ−１０３−５の合成は、以下の合成スキームに従って行われる。
【０２５１】
【化７８】
2021509406.tif 000081
【０２５２】
実施例２ｄ：式（ＩＶ）−前駆体の合成：
【０２５３】
【化７９】
2021509406.tif 000082
【０２５４】
式（ＩＶ）−前駆体の合成は、フェノール１の誘導体であるＫ−１０３Ａ−２と主要なビルディングブロックＫ−９３−Ａ−１とのコンジュゲーションによって行われる。合成は、以下の合成スキームに従って行われる。
【０２５５】
【化８０】
2021509406.tif 000083
【０２５６】
実施例２ｅ：式（Ｖ）−前駆体の合成方法：
【０２５７】
【化８１】
2021509406.tif 000084
【０２５８】
チオアセテート１１の合成：
【０２５９】
【化８２】
2021509406.tif 000085
【０２６０】
合成は、１，３−プロパンジオールでのケトンの保護によって開始して、化合物２を良好な純度で提供した。アセタールのＬｉＡｌＨ４およびＡｌＣｌ３開環は、約８５：１５の比の化合物３およびエストラジオールの混合物を与え、後者は反応性が低く、次のステップで除去される。
【０２６１】
フェノールをブロモ酢酸メチルでアルキル化し、化合物４を得た。パーフルオロ−ｔｅｒｔ−ブタノール部分を光延条件を用いて導入した（化合物５）。化合物５をメチルアミンで処理して、アミド６を提供した。ＢＨ３．ＤＭＳを用いるアミドの還元は、アミン７を提供した。アミンを臭化物８でアルキル化して、エステル９を提供した。エステルをＬｉＡｌＨ４で対応するアルコール（１０）に還元した。最後に、光延条件を用いてチオアセテートを導入して、所望のビルディングブロック１１を提供した。
【０２６２】
アミン７のアルキル化は、予想されるよりも簡単ではないようである。室温では変換は達成されず、塩基（Ｅｔ３ＮまたはＫ２ＣＯ３など）の存在が必要であると考えられる。しかしながら、得られた収率は、通常、４０％の範囲であった。ＬｉＡｌＨ４でのエステルのアルコール１０へのその後の還元は、良好な変換および簡単なワークアップをもたらした。アルミナ塩は、通常、水性２０％ＫＯＨ（１モルあたり１６０ｍＬ）を加えることによって破壊され、これは、簡単な濾過後、ＴＨＦ中の所望の材料を与える。アルコールのチオアセテートへの変換は、光延条件を介して達成される。添加の順序について、チオ酢酸が最後の成分として添加されるべきであることに留意しなければならない。ワークアップおよび注意深い精製後、チオエステル１１を得ることができた。
【０２６３】
チオトシレート１８の合成：
【０２６４】
【化８３】
2021509406.tif 000086
【０２６５】
以前の化合物の合成中に、チオトシレートビルディングブロック中のアミンの存在が非常に低い収率の原因であることが観察された。したがって、Ｂｏｃ保護チオトシレート１８が必要であった。Ｂｏｃ基は、ジスルフィド形成後に除去され、アミンは、次いでアルキル化される。アミノプロパノールをＢｏｃ基で保護し、これをその後ＬｉＡｌＨ４によって対応するメチルアミン１３に還元した。ここで第二級アミンを次いで新たなＢｏｃ基で保護して、化合物１４を提供した。アルコールをエチルジアゾアセテートと反応させて、エーテル官能基を導入した（１５）。ＬｉＡｌＨ４を使用してエステルを還元して、アルコール１６を提供した。ＮＢＳでの臭素化は、臭化物１７を提供した。チオトシル酸カリウムでの臭化物の置換は、所望のチオトシレートビルディングブロック１８をもたらした。
【０２６６】
ヨウ化物２２の合成：
【０２６７】
【化８４】
2021509406.tif 000087
【０２６８】
マロン酸ジエチルを４−ブロモ酪酸メチルでアルキル化して、トリエステル１９を提供した。全ての３つのエステルをＬｉＡｌＨ４での処理によって同時に還元して、トリオール２０を提供した。アセトニド保護基がジメトキシプロパンとの反応によって導入され、アルコール２１をもたらした。アルコールをヨウ化物に変換して、所望のビルディングブロック２２を提供した。
【０２６９】
式（Ｖ）−前駆体の合成の統合：
【０２７０】
【化８５−１】
2021509406.tif 000088
【０２７１】
【化８５−２】
2021509406.tif 000089
【０２７２】
チオアセテート１１とチオトシレート１８との間のジスルフィド形成は、ジスルフィド２３を良好な収率で提供した。Ｂｏｃ基を除去するＴＦＡでの処理は、アミン２４を提供した。アミンをヨウ化物２２でアルキル化して、２５を４０％収率で提供した。アセトニドを酸での処理によって除去して、ジオール２６を提供した。ＤＭＴ基を導入して、化合物２７をもたらした。最終的なホスホラミダイト形成は、式（Ｖ）−前駆体を提供した。
【０２７３】
実験セクション：
【０２７４】
チオアセテート１１の合成：
【０２７５】
（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ）−１３−メチル−６，７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６−デカヒドロスピロ［シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７，２´−［１，３］ジオキサン］−３−オール（２）
【０２７６】
トルエン（１．５Ｌ）中のエストロン（２５２グラム、０．９３ｍｏｌ）の懸濁液に、トリメトキシメタン（２９７ｇ、３５０ｍＬ、２．８０ｍｏｌ）、プロパン−１，３−ジオール（２１３ｇ、２５０ｍＬ、２．８０ｍｏｌ）、およびｐＴｓＯＨ（２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加えた。６０℃に温め、１６時間撹拌した。トリエチルアミン（６ｍＬ）および水（６００ｍＬ）を加え、さらに１時間撹拌を続けた。相を分離し、有機層を水（３×４００ｍｌ）およびブラインで洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、部分的に約１Ｌに濃縮した。ヘプタン（４Ｌ）に注ぎ、白色の固体を濾別した。ヘプタンで洗浄し、真空乾燥させた。化合物２（２７１グラム、８２５ｍｍｏｌ）を白色の固体として８８．５％収率で単離した。
【０２７７】
（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−ヒドロキシプロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オール（３）
【０２７８】
０℃のＴＨＦ中の（１３Ｓ）−１３−メチル−６，７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６−デカヒドロスピロ［シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７，２´−［１，３］ジオキサン］−３−オール（２、６０．７ｇ、１８５ｍｍｏｌ）の溶液に、注意深く水素化リチウムアルミニウム（８．４２ｇ、２２２ｍｍｏｌ）を加え、続いて塩化アルミニウム（９８．６ｇ、７３９ｍｍｏｌ）（非常に発熱性！）を少量ずつ加えた。０℃で１５分撹拌し、次いで５０℃に温めた。（ロータリーエバポレーターの目詰まりのため）５０℃で２時間撹拌し、次いで０℃に冷却し、ＮＨ４Ｃｌ（水性）（５００ｍＬ）の滴下でクエンチを始めた。室温で１時間撹拌した。相を分離し、有機層をブラインで洗浄し、濃縮した。エストラジオール（約１５％）で汚染された、白色の固体（６５グラム）を得た。
【０２７９】
２−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−ヒドロキシプロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）酢酸メチル（４）
【０２８０】
粗製材料３（８９．４グラム）をアセトン（１．２５Ｌ）およびＭｅＯＨ（０．２Ｌ）に溶解し、炭酸カリウム（６０グラム、４３５ｍｍｏｌ）およびブロモ酢酸メチル（５０ｍＬ、４３５ｍｍｏｌ）で処理した。懸濁液を６０℃に温め、撹拌を１６時間続けた。ＴＬＣに基づいて、全てのフェノール部分はアルキル化されていた。混合物を室温に冷却し、濾過した。濾液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（全ての不純物を除去する、ヘプタン中の２０％〜３０％ＥｔＯＡｃ、所望の材料を得るための１００％のＥｔＯＡｃの溶離液）を使用してさらに精製した。
【０２８１】
化合物４（５６．７グラム、１４０．３ｍｍｏｌ）を黄色の油として６５％収率で単離した。
【０２８２】
２−（（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ））プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）酢酸メチル（５）
【０２８３】
ＴＨＦ（１Ｌ）中の化合物４（５６．７グラム、１４０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（５５．４グラム、２１１ｍｍｏｌ）、ノナフルオロ−ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（３０ｍＬ）、およびアゾジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３８．５グラム、１６７ｍｍｏｌ）を加えた。ＴＬＣが完全な変換を示した場合、混合物を３０分間撹拌した。ヘプタン（５００ｍＬ）を加え、混合物を部分的に約５００ｍＬに濃縮した。さらにヘプタン（１Ｌ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。沈殿物が形成され、これを濾別し、濾液を濃縮して、微量のＤＢＡＤおよびトリフェニルホスフィンで汚染されているが、化合物５を黄色のシロップとして提供した。
【０２８４】
２−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）−Ｎ−メチルアセトアミド（６）
【０２８５】
化合物５の粗製シロップをＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）で希釈し、４０％水性メチルアミン（３５０ｍＬ）を加えた。ＴＬＣが完全な変換を示した場合、白色の沈殿物を１時間撹拌した。水（１Ｌ）を加え、固体を濾別した。残渣を水で洗浄し、ジクロロメタン（１Ｌ）に吸収した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。約７ｃｍのシリカおよびヘプタン中の１５％ＥｔＯＡｃでの最初の溶出を使用して、さらなる精製を行った。全ての不純物がカラムから除去されたとき、化合物６を１００％ＥｔＯＡｃで溶出した。微量のトリフェニルホスホキシドが存在したままであるが、化合物６（８２．０グラム、１３２ｍｍｏｌ）を白色の固体として９４％収率で単離した。
【０２８６】
２−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）−Ｎ−メチルエタン−１−アミン（７）
【０２８７】
６５℃のＴＨＦ（５００ｍＬ）中の化合物６（５６．０グラム、９０．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＨ３．ＤＭＳ（５６ｍＬ、５９０ｍｍｏｌ）を滴下した。還流をさらに５時間続け、次いで混合物を室温に冷却した。混合物をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に注意深く溶解し、ＨＣｌ（５０ｍＬ）中の４Ｍジオキサンを加えた。溶液を３０分間還流し、次いで室温に冷却し、濃縮した。混合物をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し、３０分間還流した。冷却および濃縮後、シロップをＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）に吸収し、水性飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。化合物７（５０．０グラム、８２．６ｍｍｏｌ）を、９１％収率でゆっくり固化した透明な油として単離した。微量のトリフェニルホスホキシドでの不純物プロファイルを化合物６と同様であった。
【０２８８】
２−（３−ブロモプロポキシ）酢酸エチル（８）
【０２８９】
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の２−ジアゾ酢酸エチル（１００ｇ、０．７４ｍｏｌ）および３−ブロモプロパン−１−オール（０．１０ｋｇ、７４ｍＬ、０．７４ｍｏｌ）の溶液に、０°ＣでＢＦ３．ＯＥｔ２（１．１ｇ、０．９４ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応を０℃で１５分間および室温で３時間、ガス発生が観察されなくなるまで撹拌した。混合物をＤＣＭ（５００ｍＬ）で希釈し、混合物をＨ２Ｏ（５００ｍＬ）およびブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空で除去して、２−（３−ブロモプロポキシ）酢酸エチル（８、１８０ｇ、０．８０ｍｏｌ、１１０％）を透明な黄色の油として提供した。
【０２９０】
２−（３−（（２−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（フルオロ−メチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカ−ヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）プロポキシ）酢酸エチル（９）
【０２９１】
アセトニトリル（３００ｍＬ）中の２−（３−ブロモプロポキシ）酢酸エチル（１１ｇ、５０ｍｍｏｌ）、化合物７（２５ｇ、４１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１１ｇ、８３ｍｍｏｌ）、およびヨウ化カリウム（０．６９ｇ、４．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を７０℃に１６時間温めた。混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中の２０％〜３０％アセトン＋１％Ｅｔ３Ｎの勾配）を使用したさらなる精製は、化合物８（１２．０グラム、１６ｍｍｏｌ）を３９％で、ゆっくりと固化した透明な油として提供した。
【０２９２】
２−（（３−（（２−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン）−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナンスレン−３−イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）プロポキシ）エタン−１−オール（１０）
【０２９３】
０℃のＴＨＦ（２００ｍＬ）中の化合物９（１２ｇ、１６ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化アルミニウムリチウム（０．９１ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に温め、１時間３０分撹拌した。ＴＬＣは、完全な消費を与えた。反応混合物を２０％ＫＯＨ（１６０ｍＬ／ｍｏｌ、Ｖ＝４．２ｍＬ）でクエンチし、１時間撹拌し、濾過し、真空中で濃縮した。化合物１０（１０．２グラム、１４．４ｍｍｏｌ）を透明として単離した。
【０２９４】
Ｓ−（２−（３−（（２−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）プロポキシ）エチル）エタンチオエート（１１）
【０２９５】
ＴＨＦ中の化合物１０（２０．２ｇ、２８．５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（９．７３ｇ、３７．１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＡＤ（６．９３ｇ、６．６６ｍＬ、３４．３ｍｍｏｌ）を加え、次いで５分後にチオ酢酸（３．２６ｇ、３．０７ｍＬ、４２．８ｍｍｏｌ）を加えた。撹拌を３時間続け、ヘプタン（２０ｍＬ）を加え、濃縮した。
【０２９６】
フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中の１０％アセトン＋１％Ｅｔ３Ｎ）を使用して精製した。化合物１１（１５．４グラム、２０．１ｍｍｏｌ）を透明な粘性油として７１％収率で単離した。
【０２９７】
チオトシレート１８の合成：
【０２９８】
（３−ヒドロキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１２）
【０２９９】
ＤＣＭ（５００ｍＬ）中の３−アミノプロパン−１−オール（２８．５ｇ、３７９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３８．４ｇ、５３ｍＬ、３７９ｍｍｏｌ）の溶液に、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（９１．１ｇ、４１７ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。混合物をイミダゾール（スクープ）でクエンチし、５分間撹拌した。混合物を１Ｍ  ＨＣｌ（３００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、化合物１２（５５ｇ、０．３１ｍｏｌ、８３％）を透明な油として提供した。
【０３００】
３−（メチルアミノ）プロパン−１−オール（１３）
【０３０１】
ＴＨＦ（５００ｍＬ）中の水素化リチウムアルミニウム（２６ｇ、０．６７ｍｏｌ）の氷冷懸濁液に、０℃でＴＨＦ（２５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３−ヒドロキシプロピル）カルバミン酸エチル（１２、８８ｇ、０．３４ｍｏｌ）の溶液を滴下した。完全添加後、混合物を室温で３０分間および７０℃で１６時間撹拌した。混合物を室温に冷却し、次いで０℃でのＫＯＨ（２０％、１０７ｍＬ）の滴下によってクエンチした。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。混合物をセライトで濾過し、濾液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。ＮＭＲは、依然として一部のＢｏｃがインタクトであることを示した。材料をＴＨＦ（５００ｍＬ）に溶解し、ＬｉＡｌＨ４（１３ｇ、０．３４１ｅｑ．）を加えた。混合物を８０℃で１６時間撹拌した。混合物を室温に冷却した。０℃で、ＫＯＨ（２０％、５４ｍＬ）をゆっくりと加えて反応をクエンチし、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。混合物をセライトで濾過し、濾液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、Ｂｏｃ−メチルアミノプロパノール（２２．６ｇ、１７０ｍｍｏｌ、５０％）を透明な油として提供した。
【０３０２】
（３−ヒドロキシプロピル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１４）
【０３０３】
ＤＣＭ（５００ｍＬ）中の３−（メチルアミノ）プロパン−１−オール（１３、２２．６ｇ、２５４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２５．７ｇ、３５ｍＬ、２５４ｍｍｏｌ）の溶液に、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（５５．３ｇ、２５４ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。得られた混合物を、ガス発生が観察されなくなるまで、室温で１時間撹拌した。混合物を１Ｍ  ＨＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、Ｂｏｃ保護アミン１４（４３ｇ、２３０ｍｍｏｌ、９０％）を透明な油として提供した。
【０３０４】
２−（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）プロポキシ）酢酸エチル（１５）
【０３０５】
ＤＣＭ（５００ｍＬ）中のアルコール１４（３６ｇ、０．１９ｍｏｌ）の溶液に、２−ジアゾ酢酸エチル（２５ｇ、２３ｍＬ、０．１９ｍｏｌ）および三フッ化ホウ素エーテラート（２．７ｇ、２．４ｍＬ、１９ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を１６時間撹拌した。混合物を水およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の２０％ＥｔＯＡｃ）を使用して精製して、エステル１５（１１ｇ、４０ｍｍｏｌ、２１％）を透明な油として提供した。
【０３０６】
（３−（２−ヒドロキシエトキシ）プロピル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１６）
【０３０７】
ＴＨＦ中の水素化リチウムアルミニウム（２．７ｇ、７１ｍｍｏｌ）の氷冷懸濁液に、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のエステル１５（１３ｇ、４７ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で滴下した。混合物を室温で１時間撹拌した。ＫＯＨ（２０％、１１ｍＬ）を０℃で滴下することによって反応をクエンチした。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物をセライトで濾過し、Ｎａ２ＳＯで乾燥させ、濃縮して、アルコール１６（８．５ｇ、３６ｍｍｏｌ、７７％）を透明な油として提供した。
【０３０８】
（３−（２−ブロモエトキシ）プロピル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１７）
【０３０９】
ＤＣＭ（３００ｍＬ）中のアルコール１６（８．５ｇ、３６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（１３ｇ、５１ｍｍｏｌ）およびＮＢＳ（７．８ｇ、４４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物をＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。ヘプタンを加え、ＤＣＭを蒸発によって除去した。形成された固体を濾別し、濾液を濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）を使用して精製して、臭化ｔｅｒｔ−ブチル１７（７．６ｇ、２６ｍｍｏｌ、７０％）を透明な油として提供した。
【０３１０】
Ｓ−（２−（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）プロポキシ）エチル）４−メチルベンゼンスルホノチオエート（１８）
【０３１１】
ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の臭化物１７（７．６ｇ、２６ｍｍｏｌ）およびカリウム４−メチルベンゼンスルホノチオエート（８．７ｇ、３８ｍｍｏｌ）の溶液を５０℃で１６時間撹拌した。混合物を室温に冷却し、水（１Ｌ）で希釈した。混合物をＥｔＯＡｃ／ヘプタン（３ｘ２００ｍＬ  １：１）で抽出し、組み合わされた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）によって精製して、チオトシレート１８（９．１ｇ、２３ｍｍｏｌ、８８％）を透明な油として提供した。
【０３１２】
ヨウ化物２２の合成：
【０３１３】
ブタン−１，１，４−トリカルボン酸１，１−ジエチル４−メチル（１９）
【０３１４】
ＤＭＦ（５００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（１０ｇ、０．２６ｍｏｌ）の氷冷懸濁液に、マロン酸ジエチル（４２ｇ、４０ｍＬ、０．２６ｍｏｌ）をゆっくりと加え、混合物が浄化するまで反応混合物を室温で１時間撹拌した。４−ブロモブタン酸メチル（４７ｇ、０．２６ｍｏｌ）を０℃で加え、得られた混合物を室温で１８時間撹拌した。混合物を部分的に濃縮し、残渣を１Ｎ  ＨＣｌ（３００ｍＬ）および水（１．３Ｌ）でクエンチした。混合物をＨｅｐｔ／ＥｔＯＡｃ（１／１、２ｘ２５０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層をブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）によって精製して、トリエステル１９（６３ｇ、０．２４ｍｏｌ、９２％）を透明な油として提供した。
【０３１５】
２−（ヒドロキシメチル）ヘキサン−１，６−ジオール（２０）
【０３１６】
ＴＨＦ（５００ｍＬ）中の水素化リチウムアルミニウム（２５ｇ、０．６６ｍｏｌ）の氷冷懸濁液に、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のトリエステル１９（６３ｇ、０．２４ｍｏｌ）の溶液をゆっくりと０℃で加え、得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。ＫＯＨ（２０％水性１０６ｍＬ）を０℃でゆっくりと加えることによって反応をクエンチした。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物をセライトで濾過し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、トリオール２０（１６ｇ、０．１１ｍｏｌ、４５％）を透明な黄色の油として提供した。
【０３１７】
４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）ブタン−１−オール（２１）
【０３１８】
ＴＨＦ（２００ｍＬ）中のトリオール２０（１６ｇ、０．１１ｍｏｌ）の溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸（５．１ｇ、２７ｍｍｏｌ）および２，２−ジメトキシプロパン（３４ｇ、４０ｍＬ、０．３２ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解した。混合物をＮａＨＣＯ３（水性飽和２００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、褐色の油としてのアセトニド２１（９．０ｇ、４８ｍｍｏｌ、４４％）に濃縮した。
【０３１９】
５−（４−ヨードブチル）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン（２２）
【０３２０】
ＤＣＭ（２５０ｍＬ）中のアルコール２１（３．７ｇ、２０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（６．２ｇ、２４ｍｍｏｌ）、およびイミダゾール（１．６ｇ、２４ｍｍｏｌ）の溶液に、ヨウ素（５．５ｇ、２２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物をチオ硫酸ナトリウム（飽和水性２×１００ｍＬ）およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の１５％ＥｔＯＡｃ）を使用して精製して、ヨウ化物２２（３．７ｇ、１２ｍｍｏｌ、６３％）を透明な黄色の油として提供した。
【０３２１】
式（Ｖ）−前駆体の合成：
【０３２２】
（１−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）−３−メチル−７，１４−ジオキサ−１０，１１−ジチア−３−アザヘプタデカン−１７−イル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２３）
【０３２３】
ＤＣＭ（２００ｍＬ）およびＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中のチオトシレート１８（３．４ｇ、８．５ｍｍｏｌ）およびチオアセテート１１（５．０ｇ、６．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＨ（５．４Ｍ）中のナトリウムメトキシド（１．１ｇ、３．６ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を２００ｍＬのＤＣＭで希釈し、ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の１０％アセトン＋１％ＮＥｔ３）によって精製して、ジスルフィド２３（６．５ｇ、６．７ｍｍｏｌ、定量的）を透明な油として提供した。
【０３２４】
Ｎ−（２−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）エチル）−Ｎ−メチル−３−（２−（（２−（３−（メチルアミノ）プロポキシ）エチル）ジスルファニル）エトキシ）プロパン−１−アミン（２４）
【０３２５】
ＤＣＭ（２００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルジスルフィド２３（６．５ｇ、６．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１５ｇ、１０ｍＬ、０．１３ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。追加のＴＦＡ（５ｍＬ）を加え、３０分間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をＤＣＭ（２５０ｍＬ）に溶解した。混合物をＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、アミン２４（５．３ｇ、６．１ｍｍｏｌ、９１％）をわずかに黄色の透明な油として提供した。
【０３２６】
４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）−Ｎ−（１−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）−３−メチル−７，１４−ジオキサ−１０，１１−ジチア−３−アザヘプタデカン−１７−イル）−Ｎ−メチルブタン−１−アミン（２５）
【０３２７】
アセトニトリル（２００ｍＬ）中のアミン２４（５．３ｇ、６．１ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（０．８４ｇ、６．１ｍｍｏｌ）およびヨウ化物２２（１．８ｇ、６．１ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を５０℃で１６時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をＤＣＭ（３００ｍＬ）に溶解した。混合物をＮａＨＣＯ３（半飽和水性２５０ｍＬ）およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の２５％アセトン＋１％ＮＥｔ３）を使用して精製して、アセトニド２５（２．５ｇ、３９％）を透明な油として提供した。
【０３２８】
２−（１−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）−３，１８−ジメチル−７，１４−ジオキサ−１０，１１−ジチア−３，１８−ジアザドコサン−２２−イル）プロパン−１，３−ジオール（２６）
【０３２９】
ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中のアセトニド２５の溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸（１．１ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解した。混合物をＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、ジオール２６（２．１ｇ、２．１ｍｍｏｌ、８７％）を透明な油として提供した。
【０３３０】
２３−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−１−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）−３，１８−ジメチル−７，１４−ジオキサ−１０，１１−ジチア−３，１８−ジアザテトラコサン−２４−オール（２７）
【０３３１】
ＤＣＭ（２００ｍＬ）中のジオール２６（２．１ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．４２ｇ、０．５８ｍＬ、４．２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２６ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、および４，４´−（クロロ（フェニル）メチレン）ビス（メトキシベンゼン）（０．７１ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物をＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の２５〜４０％アセトン＋１％ＮＥｔ３、ＮＥｔ３で前処理されたシリカ）を用いて精製して、ＤＭＴ保護化合物２７（２．３ｇ、１．８ｍｍｏｌ、８４％）を黄色がかった油として提供した。
【０３３２】
２３−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−１−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）−３，１８−ジメチル−７，１４−ジオキサ−１０，１１−ジチア−３，１８−ジアザテトラコサン−２４−イル（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホラミダイト（Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｋ−１０５−Ｂ）
【０３３３】
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の化合物２７（２．３ｇ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）オキシ）プロパンニトリル（０．６９ｇ、０．７２ｍＬ、２．３ｍｍｏｌ）、ならびにＤＣＭ中のＮＭＭおよびＴＦＡ（４．６ｍＬ、０．５Ｍ  ＮＭＭおよび０．２５Ｍ  ＴＦＡ、１．３ｅｑ．ＮＭＭ）の溶液を加えた。得られた混合物を室温で３時間撹拌した。混合物をＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の３０％アセトン＋１％ＮＥｔ３、不活性化するためにヘプタン／ＮＥｔ３で前処理されたシリカ）を使用して精製して、式（Ｖ）−前駆体（２．２ｇ、８３％）を透明な油として提供した。
【０３３４】
実施例２ｆ：式（ＶＩＩ）−前駆体の合成方法：
【０３３５】
【化８６】
2021509406.tif 000090
【０３３６】
式（ＶＩＩ）−前駆体の合成は、以下の合成スキームに従って行われる。合成は、３つの主要なビルディングブロックに焦点を当てる。
【０３３７】
ビルディングブロックＫ−１０５−６：
【０３３８】
【化８７】
2021509406.tif 000091
【０３３９】
ビルディングブロックＫ−１０９Ｂ−１：
【０３４０】
【化８８】
2021509406.tif 000092
【０３４１】
ビルディングブロックＫ−５３−２：
【化８９】
2021509406.tif 000093
【０３４２】
次いで、全てのビルディングブロックを最終化合物式（ＶＩＩ）−前駆体に統合する。
【０３４３】
【化９０】
2021509406.tif 000094
【０３４４】
実施例２ｇ：式（ＶＩＩＩ−Ｆ）−前駆体の合成方法：
【０３４５】
エストロンから出発して、既知の化学物質を使用して、既知の中間体であるメチルエステル５を作製することができる。窒素を次いでアミノプロパノールとの反応によって導入することができる。これは、以前にメチルアミンについて行われたように直接可能であり得る。そうでなければ、メチルエステルを加水分解し、標準ペプチドカップリングプロトコルを使用して窒素を導入することができる。アミドを次いで還元して、所望の第二級アミンＫ−９３−Ｆ−２をもたらすことができる。その後のＢｏｃ基の導入および光延によるチオアセテート官能基の導入は、所望のビルディングブロックＫ−９３−Ｆ−４を提供するであろう。
【０３４６】
【化９１】
2021509406.tif 000095
【０３４７】
【化９２】
2021509406.tif 000096
【０３４８】
最終式（ＶＩＩＩ−Ｆ）−前駆体へのフラグメントの統合：
【０３４９】
式（ＶＩＩＩ−Ｆ）−前駆体のアセンブリは、ビルディングブロックＫ−９３−Ｆ−４とチオトシレート６との間のジスルフィド形成で始まる。次いで、アセトニド部分およびＢｏｃ基を酸での処理によって同時に除去する。遊離第二級アミンを次いでＦｍｏｃ基で保護する。その後のＤＭＴ結合およびホスホルアミダイト形成は、式（ＶＩＩＩ−Ｆ）−前駆体を提供する（スキーム１６）。
【０３５０】
【化９３】
2021509406.tif 000097
【０３５１】
実施例２ｈ：式（ＸＩＩａ）−前駆体の合成方法：
【０３５２】
【化９４】
2021509406.tif 000098
【０３５３】
この合成を以下のスキームに示す。合成は、ジスルフィド部分の両側を収束し、これについて左部分はチオアセテートとして、ステロイド含有右部分はチオトシレートとして官能化される。これらはマージされ、最終化合物を提供するために小さな修飾を必要する。
【０３５４】
チオトシレート８の合成：
【０３５５】
【化９５】
2021509406.tif 000099
【０３５６】
この合成は、１，３−プロパンジオールでのケトンの保護によって開始して、化合物２を良好な純度で提供した。アセタールのＬｉＡｌＨ４およびＡｌＣｌ３開環は、約８５：１５の比の化合物３およびエストラジオールの混合物を与え、後者は反応性が低く、次のステップで除去される。フェノールをブロモ酢酸メチルでアルキル化して、メチルエステル４を提供した。パーフルオロブタノール部分が次いで光延条件を用いて導入され、化合物５を提供した。メチルエステルを水素化リチウムアルミニウムによって還元し、形成されたアルコール６を臭素化して、臭化物７を提供した。チオトシル酸カリウムでの処理は、所望のビルディングブロックチオトシレート８をもたらした。
【０３５７】
チオアセテート１６の合成：
【０３５８】
【化９６】
2021509406.tif 000100
【０３５９】
ビルディングブロック１６の合成は、４−アミノブタン−１−オールから開始した。アミンをＢｏｃ基で保護した。アルコールをその後、対応する臭化物（１０）に変換し、これを次いでマロン酸ジエチルにアルキル化して、ビスエステル１１を提供することができた。化合物１１が室温でＬｉＡｌＨ４で処理される場合、エステルは還元されるが、Ｂｏｃ基はそのままである。ジオール１２をその後、触媒量の酸の存在下でジメトキシプロパンでの処理によって保護して、アセトニド１３を提供した。高温でのＬｉＡｌＨ４での処理は、Ｂｏｃ部分を所望のメチルアミン（１４）に還元した。最後に、アルデヒド１５での還元的アミノ化は、チオアセテート１６を提供した。アルデヒド１５は、一段階反応、すなわち、アクロレインへのチオ酢酸のマイケル付加を通して、容易に入手可能であった。
【０３６０】
式（ＸＩＩａ）−前駆体の統合：
【０３６１】
【化９７】
2021509406.tif 000101
【０３６２】
チオトシレート８とチオアセテート１６との間のジスルフィド形成は、アセテートがＮａＯＭｅによってインサイチュで除去され、得られるチオールがチオトシレートを攻撃する、既知の反応条件で行われた。アセトニドの除去およびその後のＤＭＴ−Ｃｌの結合は、１８を提供した。最終的なホスホラミダイト形成は、式（ＸＩＩａ）−前駆体をもたらした。
【０３６３】
実験セクション：
【０３６４】
チオトシレート８の合成：
【０３６５】
（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ）−１３−メチル−６，７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６−デカヒドロスピロ［シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７，２´−［１，３］ジオキサン］−３−オール（２）
【０３６６】
トルエン（１．５Ｌ）中のエストロン（２５２グラム、０．９３ｍｏｌ）の懸濁液に、トリメトキシメタン（２９７ｇ、３５０ｍＬ、２．８０ｍｏｌ）、プロパン−１，３−ジオール（２１３ｇ、２５０ｍＬ、２．８０ｍｏｌ）、およびｐＴｓＯＨ（２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加えた。６０℃に温め、１６時間撹拌した。トリエチルアミン（６ｍＬ）および水（６００ｍＬ）を加え、さらに１時間撹拌を続けた。相を分離し、有機層を水（３ｘ４００ｍＬ）およびブラインで洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、部分的に約１Ｌに濃縮した。ヘプタン（４Ｌ）に注ぎ、白色の固体を濾別した。ヘプタンで洗浄し、真空乾燥させた。化合物２（２７１グラム、８２５ｍｍｏｌ）を白色の固体として８８．５％収率で単離した。
【０３６７】
（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−ヒドロキシプロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オール（３）
【０３６８】
０℃のＴＨＦ中の（１３Ｓ）−１３−メチル−６，７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６−デカヒドロスピロ［シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７，２´−［１，３］ジオキサン］−３−オール（２、６０．７ｇ、１８５ｍｍｏｌ）の溶液に、注意深く水素化リチウムアルミニウム（８．４２ｇ、２２２ｍｍｏｌ）を加え、続いて塩化アルミニウム（９８．６ｇ、７３９ｍｍｏｌ）（非常に発熱性！）を少量ずつ加えた。０℃で１５分撹拌し、次いで５０℃に温めた。（ロータリーエバポレーターの目詰まりのため）５０℃で２時間撹拌し、次いで０℃に冷却し、ＮＨ４Ｃｌ（水性）（５００ｍＬ）の滴下でクエンチを始めた。室温で１時間撹拌した。相を分離し、有機層をブラインで洗浄し、濃縮した。エストラジオール（約１５％）で汚染された、白色の固体（６５グラム）を得た。
【０３６９】
２−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−ヒドロキシプロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）酢酸メチル（４）
【０３７０】
粗製材料３（８９．４グラム）をアセトン（１．２５Ｌ）およびＭｅＯＨ（０．２Ｌ）に溶解し、炭酸カリウム（６０グラム、４３５ｍｍｏｌ）およびブロモ酢酸メチル（５０ｍＬ、４３５ｍｍｏｌ）で処理した。懸濁液を６０℃に温め、撹拌を１６時間続けた。ＴＬＣに基づいて、全てのフェノール部分はアルキル化されていた。混合物を室温に冷却し、濾過した。濾液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（全ての不純物を除去する、ヘプタン中の２０％〜３０％ＥｔＯＡｃ、所望の材料を得るための１００％のＥｔＯＡｃの溶離液）を使用してさらに精製した。化合物４（５６．７グラム、１４０．３ｍｍｏｌ）を黄色の油として６５％収率で単離した。
【０３７１】
２−（（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ））プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）酢酸メチル（５）
【０３７２】
ＴＨＦ（１Ｌ）中の化合物４（５６．７グラム、１４０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（５５．４グラム、２１１ｍｍｏｌ）、ノナフルオロ−ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（３０ｍＬ）、およびアゾジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３８．５グラム、１６７ｍｍｏｌ）を加えた。ＴＬＣが完全な変換を示した場合、混合物を３０分間撹拌した。ヘプタン（５００ｍＬ）を加え、混合物を部分的に約５００ｍＬに濃縮した。さらにヘプタン（１Ｌ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。沈殿物を濾別し、濾液を濃縮して、化合物５を黄色のシロップとして提供した。
【０３７３】
２−（（（１３Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）エタン−１−オール（６）
【０３７４】
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中の水素化リチウムアルミニウム（２．０ｇ、５３ｍｍｏｌ）の氷冷懸濁液に、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のメチルエステル５（１７ｇ、２７ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。ＫＯＨ（８．５ｍＬ、２０％水性１６０ｍＬ／ｍｏｌ  ＬｉＡｌＨ４）を０℃でゆっくりと加え、得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物をセライトで濾過し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、アルコール６（１５ｇ、９４％）をゆっくりと結晶化する透明な油として提供した。
【０３７５】
（１３Ｓ，１７Ｓ）−３−（２−ブロモエトキシ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン（７）
【０３７６】
ＤＣＭ（３００ｍＬ）中の化合物６（１５ｇ、２５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（９．８ｇ、３８ｍｍｏｌ）およびＮＢＳ（５．３ｇ、３０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物をＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。濃緑色の残渣にヘプタン（５００ｍＬ）を加え、得られた混合物を３０分間撹拌した。固体を濾過によって除去し、濾液を濃縮した。混合物をヘプタン（２５０ｍＬ）に吸収し、１時間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を濃縮して、臭化物７（１５．４ｇ、９４．１％）を透明なわずかに黄色の油として提供した。残留ＰＰｈ３を除去するために、材料をＥｔ２Ｏ（３００ｍＬ）に溶解し、水性ＫＭｎＯ４溶液、水、およびブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。Ｐ（Ｏ）Ｐｈ３を次いでカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の５％ＥｔＯＡｃ）によって除去して、生成物を透明な油として提供した。
【０３７７】
Ｓ−（２−（（（１３Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）エチル）４−メチルベンゼンスルホノチオエート（８）
【０３７８】
ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の臭化物７（２．９ｇ、４．４ｍｍｏｌ）の溶液に、カリウム４−メチルベンゼンスルホノチオエート（２．０ｇ、８．８ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を５０℃で１６時間および室温で１２８時間撹拌した。水（５００ｍＬ）を加え、混合物をＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１／１、２×２５０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、チオトシレート８（２．２ｇ、６５％）を提供した。
【０３７９】
チオアセテート１４の合成：
【０３８０】
（４−ヒドロキシブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（９）
【０３８１】
ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の４−アミノブタン−１−オール（２５ｇ、０．２８ｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（１５０ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（６１ｇ、０．２８ｍｏｌ）の溶液をゆっくりと加えた。得られた混合物を９０分間撹拌し、その後ガス発生はもはや観察されなかった。混合物をＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（４００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、（４−ヒドロキシブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４３ｇ、２３０ｍｍｏｌ、８２％）を透明な油として提供した。
【０３８２】
（４−ブロモブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１０）
【０３８３】
（４−ヒドロキシブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（７、４３ｇ、２３０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解し、トリフェニルホスフィン（９０ｇ、３４０ｍｍｏｌ）およびＮＢＳ（４５ｇ、２５０ｍｍｏｌ）を水によって冷却しながらゆっくりと加えた。得られた混合物を室温で９０分間撹拌した。ＮＭＲは、完全な変換を示した。混合物を水性飽和重炭酸ナトリウム（飽和３００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、体積の３分の１まで濃縮した。ヘプタン（５００ｍＬ）を加え、残ったＤＣＭを真空で除去した。追加のヘプタン（２００ｍＬ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を濾過し、濃縮して、粗製（４−ブロモブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１０、７５ｇ、７４％）を黄色の油として提供した。ＮＭＲは、４３％のＰＰｈ３および５７％の正しい生成物を示した。
【０３８４】
２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブチル）マロン酸ジエチル（１１）
【０３８５】
ＤＭＦ（５００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（６．８ｇ、０．１７ｍｏｌ）の氷冷懸濁液に、マロン酸ジエチル（２７ｇ、２６ｍＬ、０．１７ｍｏｌ）をゆっくりと加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を再び０℃に冷却し、（４−ブロモブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１０、７５ｇ、０．１７ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に到達させ、１８時間撹拌した。反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌ（３００ｍＬ）および水（１．３Ｌ）でクエンチした。混合物をＨｅｐｔ／ＥｔＯＡｃ（１／１）（２ｘ２５０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層をブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）によって精製して、化合物１１（４８ｇ、８５％）を透明な油として提供した。ＮＭＲは、少量のマロン酸ジエチルが依然として存在することを示した。材料をそのまま還元に使用した。
【０３８６】
（６−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１２）
【０３８７】
ＴＨＦ（７５０ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（２５ｇ、０．６６ｍｏｌ）の氷冷溶液に、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブチル）マロン酸ジエチル（１１、４８ｇ、０．１４ｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を０℃で２．５時間撹拌した。２０％ＫＯＨ（１０６ｍＬ）を０℃をゆっくりと加えることによって反応をクエンチした。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、その後それをセライトで濾過した。濾液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、（６−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１２、２２．３ｇ、６２％）を透明な油として提供した。
【０３８８】
（４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）ブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１３）
【０３８９】
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中の（６−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１２、２２．３ｇ、９０．２ｍｍｏｌ）の溶液に、２，２−ジメトキシプロパン（２８．２ｇ、３４ｍＬ、２７０ｍｍｏｌ）および４−メチルベンゼンスルホン酸水和物（３．４３ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、その後ＮＭＲは完全な変換を示した。混合物をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液（３００ｍＬ）で洗浄した。水層をＥｔＯＡｃでもう一度抽出した。組み合わされた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）ブチル）（１３、２１．６ｇ、８３．４％）を透明な油として提供した。
４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）−Ｎ−メチルブタン−１−アミン（１４）
【０３９０】
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（４．２８ｇ、１１３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の（４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）ブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１３、２１．６ｇ、７５．２ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと加えた。得られた混合物を７０℃で１６時間還流した。混合物を０℃に冷却し、その後ＫＯＨ（２０％水性、１８ｍＬ）をゆっくりと加えることによって反応をクエンチした。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物をセライトで濾過し、濾液を真空で濃縮する前にＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、化合物１４（１３ｇ、８６％）をわずかに黄色がかった透明な油として得た。
【０３９１】
Ｓ−（３−オキソプロピル）エタンチオエート（１５）
【０３９２】
ＤＣＭ（２００ｍＬ）中のアクリルアルデヒド（１５ｇ、１８ｍＬ、０．２７ｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（６．８ｇ、９．３ｍＬ、６７ｍｍｏｌ）およびゆっくりとチオ酢酸（２０ｇ、１９ｍＬ、０．２７ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１８時間撹拌した。混合物を濃縮し、粗製材料をカラムクロマトグラフィー（１５％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）によって精製して、Ｓ−（３−オキソプロピル）エタンチオエート（１５、２６．３ｇ、７４％）を濃黄色／オレンジ色の油として提供した。
【０３９３】
Ｓ−（３−（（４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）ブチル）（メチル）アミノ）プロピル）エタンチオエート（１６）
【０３９４】
１，２−ジクロロエタン（４００ｍＬ）中の４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）−Ｎ−メチルブタン−１−アミン（１４、９．２ｇ、４６ｍｍｏｌ）の溶液および酢酸（１１ｇ、１０ｍＬ、０．１８ｍｏｌ）に、Ｓ−（３−オキソプロピル）エタンチオエート（１５  ７．２ｇ、５５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を５分間撹拌した。次いで、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３９ｇ、１８０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で９０分間撹拌した。水性飽和重炭酸ナトリウム（１００ｍＬ）を加えて、反応をクエンチし、混合物を１５分間撹拌した。混合物を水性飽和重炭酸ナトリウム（３００ｍＬ）で希釈し、相を分離した。水相をジクロロメタンで抽出し、組み合わされた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の４０−５０％ＥｔＯＡｃ＋１％ＮＥｔ３）を使用して精製して、Ｓ−（３−（（４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）ブチル）（メチル）アミノ）プロピル）エタンチオエート（１６、１１．５ｇ、７９％）をオレンジ色の油として提供した。
【０３９５】
式（ＸＩＩａ）−前駆体の合成：
【０３９６】
４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）−Ｎ−（３−（（２−（（（１３Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）エチル）ジスルファネイル）プロピル）−Ｎ−メチルブタン−１−アミン（１７）
【０３９７】
ＤＣＭ（２００ｍＬ）およびＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中のチオトシレート８（３．３ｇ、４．３ｍｍｏｌ）およびチオアセテート１６（２．３ｇ、７．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＨ中のナトリウムメトキシド（０．４７ｇ、１．６ｍＬ、８．７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を２時間撹拌した。ＮＭＲは、チオトシレートの完全な消費を示した。混合物をＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の１０％アセトン＋１％ＮＥｔ３）によって精製して、ジスルフィド１７（０．８５ｇ、２２％）を透明な油として提供した。
【０３９８】
２−（４−（（３−（（２−（（（１３Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）エチル）ジスルファネイル）プロピル）（メチル）アミノ）ブチル）プロパン−１，３−ジオール
【０３９９】
ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中のアセトニド１７（２．１ｇ、２．３ｍｍｏｌ）の溶液に、トシル酸（５３０ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１時間撹拌し、その後ＴＬＣが完全な変換を示した。揮発物を真空で除去した。粗製材料をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、ＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、生成物（１．７ｇ、２．０ｍｍｏｌ、８７％）を白色の固体として提供した。
【０４００】
２−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−６−（（３−（（２−（（（１３Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）エチル）ジスルファネイル）プロピル）（メチル）アミノ）ヘキサン−１−オール（１８）
【０４０１】
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中のジオール（１．７ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．２５ｇ、０．３４ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（２５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の溶液に、４，４´−（クロロ（フェニル）メチレン）ビス（メトキシベンゼン）（０．６８ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加え、得られた黄色の混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物をＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（２５％アセトン／ヘプタン＋１％ＮＥｔ３）によって精製して、生成物１８（１．３ｇ、１．１ｍｍｏｌ、５６％）を透明な油として提供した。
【０４０２】
２−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−６−（（３−（（２−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−ｌ）オキシ）エチル）ジスルファネイル）プロピル）（メチル）アミノ）ヘキシル（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト（Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｋ−１１３）
【０４０３】
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の化合物１８（１．３ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（０．５  Ｍ  ＮＭＭ、０．２５Ｍ  ＴＦＡ）中のＮ−メチルモルホリン（０．１５ｇ、３．０ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）およびＴＦＡ（８４ｍｇ、３．０ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。次いで、３−（（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）オキシ）プロパンニトリル（０．４５ｇ、０．４７ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌し、反応をＴＬＣによって監視した。完全な変換後、混合物をＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の１５％アセトン＋１％ＮＥｔ３）を使用して精製して、Ａｐｏ−Ｓｉ−Ｋ−１１３（１．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ、９８％）を透明な油として提供した。
【０４０４】
実施例２ｉ：式（ＸＩＩｂ）−前駆体の合成方法：
【０４０５】
【化９８】
2021509406.tif 000102
【０４０６】
式（ＸＩＩｂ）−前駆体の合成は、以下の合成スキームに従って行われる。
【０４０７】
【化９９−１】
2021509406.tif 000103
【０４０８】
【化９９−２】
2021509406.tif 000104
【０４０９】
実施例２ｊ：式（ＸＩＩＩａ）−前駆体の合成方法：
【０４１０】
【化１００】
2021509406.tif 000105
【０４１１】
式（ＸＩＩＩａ）−前駆体の合成は、以下の合成スキームに従って行われる。
【０４１２】
【化１０１−１】
2021509406.tif 000106
【０４１３】
【化１０１−２】
2021509406.tif 000107
【０４１４】
実施例２ｋ：式（ＸＩＩＩｂ）−前駆体の合成方法：
【化１０２】
2021509406.tif 000108
【０４１５】
式（ＸＩＩＩｂ）−前駆体の主要な特徴は、ジスルフィドとステロイド部分との間のエーテル基である。ジスルフィドの他の側には、別のエーテルおよび第三級アミンが存在する。
【０４１６】
チオトシレート１０の合成：
【化１０３】
2021509406.tif 000109
【０４１７】
合成は、１，３−プロパンジオールでのケトンの保護によって開始して、化合物２を良好な純度で提供した。アセタールのＬｉＡｌＨ４およびＡｌＣｌ３開環は、約８５：１５の比の化合物３およびエストラジオールの混合物を与え、後者は反応性が低く、次のステップで除去される。臭化アリルを反応性求電子剤として使用した。フェノールの選択的アルキル化は、光延条件を使用して脂肪族アルコールへのパーフルオロ化ｔｅｒｔ−ブタノールのその後の結合を可能にし、化合物５を提供した。９−ＢＢＮ処理によるアリルのさらなる官能基化およびその後の還元は、アルコール６を提供した。このアルコールをジアゾ酢酸エチルで伸長して、化合物７を提供することができた。アルコールへの還元、対応するヨウ化物への変換、およびその後のチオトシル化は、化合物１０を提供した。
【０４１８】
チオアセテート１８の合成：
【０４１９】
【化１０４】
2021509406.tif 000110
【０４２０】
ビルディングブロック１８の合成の第１のステップは、アミノブタノールのアミンを保護して、アルコール１１を提供することであった。アルコールをその後ＮＢＳおよびＰＰｈ３での処理によって臭化物１２に変換した。臭化物を次いでマロン酸ジエチルにアルキル化して、ジエステル１３を提供した。室温でのＬｉＡｌＨ４での処理は、エステルを還元するが、Ｂｏｃ基を還元せず、よってジオール１４をもたらした。ジオールを次いでアセトニド（１５）として保護した。Ｂｏｃ基を高温でのＬｉＡｌＨ４での処理によって還元して、アミン１６を提供した。適切な塩化物でのアミンのアルキル化は、化合物１７を提供した。光延条件を用いてヒドロキシ部分をチオアセテートに変換して、ビルディングブロック１８を提供した。
【０４２１】
式（ＸＩＩＩｂ）−前駆体の合成：
【０４２２】
【化１０５】
2021509406.tif 000111
【０４２３】
チオトシレート１０およびチオアセテート１８の混合物をＮａＯＭｅで処理して、ジスルフィド１９を提供した。アセトニド基を酸での処理によって除去して、ジオール２０を提供した。ＤＭＴ基をアルコールのうちの１つに結合して、化合物２１をもたらした。最後に、ホスホラミダイト形成は、式（ＸＩＩＩｂ）−前駆体を提供した。
【０４２４】
実験セクション：
【０４２５】
チオトシレート１０の合成：
【０４２６】
（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ）−１３−メチル−６，７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６−デカヒドロスピロ［シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７，２´−［１，３］ジオキサン］−３−オール（２）
【０４２７】
トルエン（１．５Ｌ）中のエストロン（２５２グラム、０．９３ｍｏｌ）の懸濁液に、トリメトキシメタン（２９７ｇ、３５０ｍＬ、２．８０ｍｏｌ）、プロパン−１，３−ジオール（２１３ｇ、２５０ｍＬ、２．８０ｍｏｌ）、およびｐＴｓＯＨ（２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を６０℃に温め、１６時間撹拌した。トリエチルアミン（６ｍＬ）および水（６００ｍＬ）を加え、さらに１時間撹拌を続けた。相を分離し、有機層を水（３×４００ｍＬ）およびブラインで洗浄した。混合物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、部分的に約１Ｌに濃縮した。混合物をヘプタン（４Ｌ）に注ぎ、白色の固体を濾別し、ヘプタンで洗浄し、真空で乾燥させた。化合物２（２７１グラム、８２５ｍｍｏｌ）を白色の固体として８８．５％収率で単離した。
【０４２８】
（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−ヒドロキシプロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オール（３）
【０４２９】
０℃のＴＨＦ中の（１３Ｓ）−１３−メチル−６，７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６−デカヒドロスピロ［シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７，２´−［１，３］ジオキサン］−３−オール（２、６０．７ｇ、１８５ｍｍｏｌ）の溶液に、注意深く水素化リチウムアルミニウム（８．４２ｇ、２２２ｍｍｏｌ）を加え、続いて塩化アルミニウム（９８．６ｇ、７３９ｍｍｏｌ）（非常に発熱性！）を少量ずつ加えた。０℃で１５分撹拌し、次いで５０℃に温めた。（ロータリーエバポレーターの目詰まりのため）５０℃で２時間撹拌し、次いで０℃に冷却し、ＮＨ４Ｃｌ（水性）（５００ｍＬ）の滴下でクエンチを始めた。室温で１時間撹拌した。相を分離し、有機層をブラインで洗浄し、濃縮した。エストラジオール（約１５％）で汚染された、白色の固体（６５グラム）を得た。
【０４３０】
３−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−（アリルオキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）オキシ）プロパン−１−オール（４）
【０４３１】
ＭｅＯＨ／アセトン中の化合物３（１０．１ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（８．４５ｇ、６１．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を臭化アリル（７．３９ｇ、５．２８ｍＬ、６１．１ｍｍｏｌ）で処理した。４時間加熱して還流し、次いで完全な変換が観察された。室温に冷却し、濾過し、濃縮した。ジクロロメタン（２５０ｍＬ）を加え、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。
粗製材料（１２．８グラム、３４．５ｍｍｏｌ）をそのまま追跡化学で使用した。
【０４３２】
（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−（アリルオキシ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン（５）
【０４３３】
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中の化合物４（１２．７８ｇ、３４．４９ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１３．５７ｇ、５１．７４ｍｍｏｌ）の溶液に、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−オール（１２．２１ｇ、７．２３ｍＬ、５１．７４ｍｍｏｌ）および（Ｅ）−ジアゼン−１，２−ジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１０．３２ｇ、４４．８４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１６時間撹拌し、次いで濃縮した。
【０４３４】
フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中の５％〜１０％ＥｔＯＡｃの勾配）を使用した精製後、化合物５（１６．７グラム、２８．４ｍｍｏｌ）を黄色がかった油として８２％収率で単離した。
【０４３５】
３−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）プロパン−１−オール（６）
【０４３６】
９−ＢＢＮ（５．５４ｇ、９０ｍＬ、４５．４ｍｍｏｌ）を０℃のＴＨＦ（２５０ｍＬ）中の粗製化合物５（１６．７ｇ、２８．４ｍｍｏｌ）の溶液に滴下し、完全な添加後、混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を０℃に冷却し、ゆっくりと水酸化ナトリウム（２０ｇ、１６ｍＬ、１４８ｍｍｏｌ）および過酸化水素（１４ｇ、１３ｍＬ、１４８ｍｍｏｌ）を同時に滴下し、得られた不均一な混合物を室温で約１時間激しく撹拌した。反応混合物をデカントし、ＥｔＯＡｃ（７００ｍＬ）とブライン（１００ｍＬ）との間で分配した。有機相を追加量のブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘプタン中の２５％〜３５％ＥｔＯＡｃの勾配）による濃縮物のさらなる精製は、化合物６（１３．６ｇ、２２．４ｍｍｏｌ）を７９．０％収率でもたらした。
【０４３７】
２−（３−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）プロポキシ）酢酸エチル（７）
【０４３８】
化合物６（１３．６ｇ、２２．４ｍｍｏｌ）および２−ジアゾ酢酸エチル（３．０ｇ、２．８ｍＬ、２２．４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２５０ｍＬ）に溶解し、０℃でＢＦ３．ＯＥｔ２（３１．８ｍｇ、２８．４μＬ、２２４μｍｏｌ）を加えた。反応を０℃で１５分間および室温で３時間、ガス発生が観察されなくなるまで撹拌した。ＴＬＣに基づいて、完全な変換は観察されなかった。さらなる２−ジアゾ酢酸エチル（５ｍＬ）およびＢＦ３．ＯＥｔ２を加え、２時間撹拌を続けた。混合物をＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、トリエチルアミン（１ｍＬ）を加え、混合物を水（１００ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中の５％〜１０％ＥｔＯＡｃの勾配）を使用したさらなる精製は、化合物７（５．５グラム、７．９ｍｍｏｌ）を透明な黄色がかった油として３５％収率で提供した。
【０４３９】
２−（（３−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ））−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）プロポキシ）エタン−１−オール（８）０℃のＴＨＦ（１００ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（０．３６ｇ、９．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、化合物７（５．５ｇ、７．９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。混合物を室温で２時間撹拌し、次いで水（１．７ｍＬ）中の２０％ＫＯＨの添加によってクエンチした。懸濁液をさらに１時間撹拌し、次いでセライトの短経路で濾過した。濃縮した。化合物８（４．８１グラム、７．４ｍｍｏｌ）を９３％収率で単離し、そのまま追跡化学で使用した。
【０４４０】
（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−（３−（２−ブロモエトキシ）プロポキシ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン（９）
【０４４１】
ジクロロメタン（２５０ｍＬ）中の化合物８（４．８１ｇ、７．３９ｍｍｏｌ）、イミダゾール（６０４ｍｇ、８．８７ｍｍｏｌ）、およびトリフェニルホスフィン（２．３３ｇ、８．８７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でヨウ素（２．０６ｇ、８．１３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１６時間撹拌し、次いで水性飽和チオ硫酸ナトリウムを加え、相を分離した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。残渣をヘプタンに溶解し、沈殿のために静置し、固体を濾別した。濃縮した。
【０４４２】
フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中の５％ＥｔＯＡｃ）を使用したさらなる精製は、化合物９（３．９０ｇ、５．１３ｍｍｏｌ）を透明な油として６９％収率で与えた。
【０４４３】
Ｓ−（２−（３−（（（８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）プロポキシ）エチル）４−メチルベンゼンスルホノチオエート（１０）
【０４４４】
化合物９（３．９０ｇ、５．１３ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、カリウム４−メチルベンゼンスルホノチオエート（１．７２ｇ、７．６ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁液を室温で１６時間撹拌した。ＴＬＣは、部分的な変換のみを示した。混合物を４時間５０℃に温め、次いで室温に冷却した。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）、続いてヘプタン（１００ｍＬ）を加え、水で３回、次いでブラインで１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中の５％〜１５％ＥｔＯＡｃ）を使用したさらなる精製。化合物１０（３．４５ｇ、４．２ｍｍｏｌ）をクリーンな油として８３％収率で単離した。
【０４４５】
チオアセテート１８の合成：
【０４４６】
（４−ヒドロキシブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１１）
ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の４−アミノブタン−１−オール（２５ｇ、０．２８ｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（１５０ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（６１ｇ、０．２８ｍｏｌ）の溶液をゆっくりと加えた。得られた混合物を９０分間撹拌し、その後ガス発生はもはや観察されなかった。混合物をＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（４００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、（４−ヒドロキシブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１１、４３ｇ、８２％）を透明な油として提供した。
【０４４７】
（４−ブロモブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１２）
【０４４８】
ＤＣＭ（５００ｍＬ）中の（４−ヒドロキシブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１１、２３ｇ、１２０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（４４ｇ、１７０ｍｍｏｌ）およびゆっくりとＮＢＳ（２５ｇ、１４３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。混合物をＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。ヘプタン（５００ｍＬ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。形成された固体を濾過によって除去し、濾液を濃縮して、（４−ブロモブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１２、３２．８ｇ、１３０ｍｍｏｌ、定量的）を透明な油として提供した。
【０４４９】
２−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ブチル）マロン酸ジエチル（１３）
【０４５０】
ＤＭＦ（５００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（６．８ｇ、０．１７ｍｏｌ）の氷冷懸濁液に、マロン酸ジエチル（２７ｇ、２６ｍＬ、０．１７ｍｏｌ）をゆっくりと加え、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を再び０℃に冷却し、（４−ブロモブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１２、７５ｇ、０．１７ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に到達させ、１８時間撹拌した。反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌ（３００ｍＬ）および水（１．３Ｌ）でクエンチした。混合物をヘプタン／ＥｔＯＡｃ（１／１、２ｘ２５０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層をブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）によって精製して、ジエステル１３（４８ｇ、０．１４ｍｏｌ、８５％）を透明な油として提供した。
【０４５１】
（６−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１４）
【０４５２】
ＴＨＦ（７５０ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（８．７ｇ、０．２３ｍｏｌ）の氷冷溶液に、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のジエステル１３（１９ｇ、５７ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。２０％ＫＯＨ（水性３７ｍＬ）を０℃でゆっくりと加えることによって反応をクエンチした。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、その後それをセライトで濾過した。濾液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、ジオール１４（１２ｇ、５０ｍｍｏｌ、８６％）を透明な油として提供した。
【０４５３】
（４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）ブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１５）
【０４５４】
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中のジオール１４（２２ｇ、９０ｍｍｏｌ）の溶液に、２，２−ジメトキシプロパン（２８ｇ、３４ｍＬ、２７０ｍｍｏｌ）および４−メチルベンゼンスルホン酸水和物（３．４ｇ、１８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液（３００ｍＬ）で洗浄した。水層をＥｔＯＡｃでもう一度抽出した。組み合わされた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、アセトニド１５（２１．６ｇ、８３．４％）を透明な油として提供した。
【０４５５】
４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）−Ｎ−メチルブタン−１−アミン（１６）
【０４５６】
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（２．２ｇ、５８ｍｍｏｌ）の懸濁液に、アセトニド１５（１１ｇ、３９ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を７０℃で１６時間撹拌した。混合物を室温まで放冷した。次いで、混合物を０℃に冷却し、０℃でＫＯＨ（２０％、９．３ｍＬ）をゆっくりと加えることによって反応をクエンチした。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物をセライトで濾過し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、メチルアミン１６（７．８ｇ、３９ｍｍｏｌ、定量的）を透明な油として提供した。
【０４５７】
２−（２−（（４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）ブチル）（メチル）アミノ）エトキシ）エタン−１−オール（１７）
【０４５８】
ＭｅＣＮ（１５０ｍＬ）中のアミン１６（４．１ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液に、２−（２−クロロエトキシ）エタン−１−オール（２．５ｇ、２．１ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（０．３４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（５．６ｇ、４１ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を８０℃で４０時間撹拌した。混合物を水（１００ｍＬ）およびＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（２×２００ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ中３％７Ｍ  ＮＨ３：９７％ＤＣＭ）を使用して精製して、アルコール１７（２．９ｇ、１０ｍｍｏｌ、４９％）を黄色がかった油として提供した。
【０４５９】
Ｓ−（２−（２−（（４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）ブチル）（メチル）アミノ）エトキシ）エチル）エタンチオエート（１８）
【０４６０】
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のアルコール１７（２．９ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（４．２ｇ、１６ｍｍｏｌ）および（Ｅ）−ジアゼン−１，２−ジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３．０ｇ、１３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を５分間撹拌した。次いで、チオ酢酸（０．９９ｇ、０．９４ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）を加え、混合物の大部分を脱色した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の２０％アセトン＋１％ＮＥｔ３）によって精製して、チオアセテート１８（３．５ｇ、１０ｍｍｏｌ、定量的）を黄色の油として提供した。
【０４６１】
式（ＸＩＩＩｂ）−前駆体の統合：
【０４６２】
４−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）−Ｎ−（２−（２−（（２−（３−（（（１３Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）プロポキシ）エチル）ジスルファネイル）エトキシ）エチル）−Ｎ−メチルブタン−１−アミン（１９）
【０４６３】
ＤＣＭ（１００ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中のチオトシレート１０（１．１ｇ、１．３ｍｍｏｌ）およびチオアセテート１８（０．７０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ナトリウムメトキシド（５．４Ｍ、０．５０ｍＬ、２．７ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。得られた混合物を１時間撹拌した。混合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（１０〜２０％アセトン／ヘプタン＋１％ＮＥｔ３）によって精製して、ジスルフィド１９（０．５８ｇ、０．６ｍｍｏｌ、４５％）を透明な油として提供した。
【０４６４】
２−（１−（（（１３Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）−１４−メチル−４，１１−ジオキサ−７，８−ジチア−１４−アザオクタデカン−１８−イル）プロパン−１，３−ジオール（２０）
【０４６５】
（溶解性のために追加のＤＣＭを加えた）ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中のジスルフィド２０（０．５８ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）の溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸（０．１４ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解した。混合物をＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、ジオール２０（０．５３ｇ、０．５７ｍｍｏｌ、９５％）を透明な油として提供した。
【０４６６】
１９−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−１−（（（１３Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）−１４−メチル−４，１１−ジオキサ−７，８−ジチア−１４−アザイコサン−２０−オール（２１）
【０４６７】
ＤＣＭ（５０ｍＬ）中のジオール２０（１．０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．２２ｇ、０．３０ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、および最後に４，４´−（クロロ（フェニル）メチレン）ビス（メトキシベンゼン）（０．３６ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物をＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ＮＥｔ３で前処理されたシリカを使用する、ヘプタン中の２０〜２５％アセトン＋１％ＮＥｔ３）によって精製して、化合物２１（０．９６ｇ、０．７８ｍｍｏｌ、７２％）を透明な黄色がかった油として提供した。
【０４６８】
１９−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−１−（（（１３Ｓ，１７Ｓ）−１７−（３−（（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−（トリフルオロメチル）プロパン−２−イル）オキシ）プロポキシ）−１３−メチル−７，８，９，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−デカヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル）オキシ）−１４−メチル−４，１１−ジオキサ−７，８−ジチア−１４−アザイコサン−２０−イル（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホラミダイト［式（ＸＩＩＩｂ）−前駆体］
【０４６９】
ＤＣＭ（５０ｍＬ）中のアルコール２１（０．９６ｇ、０．７８ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスファネイル）オキシ）プロパンニトリル（０．３１ｇ、０．３２ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）、ならびにＤＣＭ中のＮＭＭおよびＴＦＡ（２．０ｍＬ、０．５Ｍ  ＮＭＭおよび０．２５Ｍ  ＴＦＡ、１．３ｅｑ．ＮＭＭ）の溶液を加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、その後、ＴＬＣは、部分的な変換を示した。追加のホスファネイル（０．５ｅｑ．）およびＮＭＭ／ＴＦＡ溶液（０．５ｅｑ．ＮＭＭ）を加え、混合物を１時間撹拌した。ＴＬＣは、完全な変換を示した。混合物をＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製材料をカラムクロマトグラフィー（ＮＥｔ３で前処理されたシリカを使用する、ヘプタン中の２０％アセトン＋１％ＮＥｔ３）を使用して精製して、式（ＸＩＩＩｂ）−前駆体（０．９６ｇ、０．６７ｍｍｏｌ、８６％）を透明な油として提供した。
【０４７０】
実施例２Ｌ：式（ＸＩＶ−Ｆ）前駆体の合成：
【０４７１】
【化１０６】
2021509406.tif 000112
【０４７２】
化合物３から出発して、臭化物Ｋ−１０５−Ｆ−１を使用してフェノールをアルキル化することができる（下記参照）。パーフルオロ部分を次いで、光延条件を用いて導入することができる（Ｋ−１５０−Ｆ−３）。アミドおよびエステルは同時に還元され、形成された第三級アミンは次いでＢｏｃ基で保護することができる。光延条件を用いるチオアセテート基の最終的な導入は、ビルディングブロックＫ−１５０−Ｆ−６を提供する。
【０４７３】
【化１０７】
2021509406.tif 000113
【０４７４】
所望のビルディングブロックＫ−１５０−Ｆへの最短ルートは、１，５−ジオキセパン−２−オンのベータ−アラニンでの開環である。ベータ−アラニンでの開環は、アミドＫ−１５０−Ｆ−７を提供する。ＥｔＯＨでのエステル化は、カルボン酸を保護する。その後のアルコールの臭化物ｍへの変換は、ビルディングブロックＫ−１０５−Ｆ−１を提供し、これを次いでフェノールにアルキル化する。
【０４７５】
【化１０８】
2021509406.tif 000114
【０４７６】
式（ＸＩＶ−Ｆ）前駆体の統合
【０４７７】
アセンブリは、ビルディングブロックＫ−１５０−Ｆ−６とチオトシレート６との間のジスルフィド形成で始まる。次いで、アセトニド部分およびＢｏｃ基は、酸での処理によって同時に除去されるであろう。遊離第三級アミンを次いでＦｍｏｃ基で保護することができる。その後のＤＭＴ結合およびホスホルアミダイト形成は、式（ＸＩＶ−Ｆ）−前駆体を提供するであろう。
【０４７８】
実施例２ｍ：式（ＸＶ−Ｆ）前駆体の合成：
【０４７９】
【化１０９】
2021509406.tif 000115
【０４８０】
式（ＸＶ−Ｆ）前駆体は、チオトシレート１３（スキーム２２）およびビルディングブロック７（スキーム２３）から調製される。
【０４８１】
【化１１０】
2021509406.tif 000116
【０４８２】
第２のビルディングブロック、化合物７は、スキーム２３に示されるように合成される。
【化１１１】
2021509406.tif 000117
【０４８３】
式（ＸＶ−Ｆ）−前駆体の合成の統合および完了：
【０４８４】
【化１１２】
2021509406.tif 000118
【０４８５】
実施例２ｎ：式（ＶＩＩＩ−Ｆ）前駆体の合成方法：
【０４８６】
【化１１３】
2021509406.tif 000119
【０４８７】
合成は、以下のスキーム２５に従って行われる、主要なビルディングブロックであるチオトシレート１６の合成によって始まる。
【０４８８】
【化１１４】
2021509406.tif 000120
【０４８９】
合成は、以下の合成スキーム２６に従って行われる、チオアセテートＫ−９３−Ｆ−４の合成を進む。
【０４９０】
【化１１５】
2021509406.tif 000121
【０４９１】
化合物Ｆ−２をＴｅｏｃ保護して、化合物Ｆ−３を９５％収率で提供した。チオアセテートＦ−４の合成は、約６０％収率で行われた。１．７６グラムを単離した。主要なフラグメントであるチオトシレート１６およびチオアセテートＫ−９３−Ｆ−４を有して、合成は、次いで以下のスキーム２７に従って進んだ。
【０４９２】
【化１１６】
2021509406.tif 000122
【０４９３】
最初に、フラグメントであるチオトシレート１６およびチオアセテートＫ−９３−Ｆ−４をジスルフィド結合の生成と組み合わせて、中間体Ｋ−９５−Ｆ−５を提供した。Ｆ−５をＭｅＯＨ中のｐＴｓＯＨで処理して、ジオールを遊離し、よってＦ−６（９３％収率、１．３グラム）を生成した。Ｆ−６を次いでＤＭＴ−Ｃｌでモノ保護して、化合物Ｆ−８を提供した。ホスホラミダイトを次いで結合し、式（ＶＩＩＩ−Ｆ）−前駆体（Ｔｅｏｃ）による化合物を１．００４グラムで単離し、出荷のためにバイアルに保存した。保護基としてのＴｅｏｃが、酸、塩基、ならびに還元剤および酸化剤に対して比較的安定であるが、フッ化物の添加によって容易に除去することができ、よってオリゴヌクレオチドの合成中、アミンの保護基として有用となることは、注目に値する。本発明のＥ部分の合成において、この保護基は、したがって、式（ＶＩＩＩ−Ｈ）、（ＸＩＶ−Ｈ）、および（ＸＶ−Ｈ）による化合物に導入される、第三級アミンの生成において役割を有することができる。
【０４９４】
実施例２ｐ：式（ＸＶＩ−Ｆ）前駆体の合成方法：
【０４９５】
【化１１７】
2021509406.tif 000123
【０４９６】
合成は、実施例２ｍに記載される、２つの例外を除き、式（ＸＶ−Ｆ）前駆体の合成と同一である：（ｉ）．Ｌ部分の出発材料は、ペンタフルオロベンゾエート（Ａ）であり、ジフルオロベンゾエート（Ｂ）ではない。（ｉｉ）、アミンの保護基は、実施例２ｎに記載されるように導入された、ＴＥＯＣである。
【０４９７】
【化１１８】
2021509406.tif 000124
【０４９８】
実施例３：膜貫通送達における、Ｄｉｃｅｒ基質である、本発明のコンジュゲートの潜在的な作用メカニズム（ＭＯＡ）：
【０４９９】
ＯＤを含む本発明のコンジュゲートの潜在的な作用メカニズムは、本明細書において非限定的に記載される。当該ＭＯＡは、４つのステップを含む。
【０５００】
１．コンジュゲートと外膜葉との相互作用：
【０５０１】
本発明のコンジュゲートが、２〜３つのＥ部分に結合した、ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡである場合、コンジュゲートは、円筒状ＲＮＡ二本鎖が、膜表面に平行であり、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分が、膜表面に垂直な、膜コアへ配向される位置において、膜の外葉に近接する。このアプローチは、ＯＤを膜表面に固定するように作用する。高度に負に帯電したＲＮＡの外膜葉への結果として生じる強制的な近接は、エネルギー的に好ましくない焦点膜ひずみ、外リン脂質葉の表面積の拡大、およびリン脂質ヘッドグループの水和シェルの乱れをもたらし、これらは全て膜の焦点曲げを引き起こす。
【０５０２】
２．曲げエネルギーの緩和：
【０５０３】
不利な膜の曲げの緩和は、エンドサイトーシス、フリップフロップ、または両方のいずれかを通して行うことができる。両方のプロセスは、本発明のコンジュゲートの膜貫通送達の開始および／または伝播を支持し、直接、またはエンドソームコンパートメントを通してのいずれかでの、細胞質への高分子薬物を含む。
【０５０４】
３．カーゴ薬物の放出を伴う、酸化還元媒介性プロセスにおける細胞質内のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分の分離。
【０５０５】
上記のような、１つ以上のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡコンジュゲートの膜貫通透過に必要であるが、コンジュゲートが細胞質に到達すると、これらの送達部分を除去し、体から排泄し、よってカーゴ薬を遊離して、その細胞質作用部位に接近させることが望ましい。カーゴ薬物がｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡである場合、この切断は、ｓｉＲＮＡまたはｄｓｉＲＮＡと遺伝子サイレンシングタンパク質複合体（ＤｉｃｅｒおよびＲＩＳＣ）との相互作用における立体障害を回避することを可能にする。加えて、Ｅ部分からのカーゴ薬物のそのような分離は、細胞リン脂質膜に対するコンジュゲートの負担を最小限に抑え、これは、安全性の観点から有利な手段である。この目的のために、本発明のＥ部分は、ジスルフィド部分を含む。細胞外環境において優勢であるような、酸化条件下では、ジスルフィドは、高い安定性を示し、したがって、本発明のコンジュゲートを、その全身投与後、体内に広く分布させ、巨大な細胞膜プールに接触させることを可能にする。
【０５０６】
対照的に、細胞質は、主に、任意の生きた細胞の細胞質内で継続的に生成され、細胞質では、細胞外空間との比較：１〜５ｍＭ対３〜５μＭにおいて、約３〜４桁高い、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）のその高濃度のため、高度に還元的な環境である。
【０５０７】
細胞質内のこれらの著しい還元条件のため、Ｅ部分のジスルフィド基は、細胞質環境においてロバストな還元を受ける。結果として、細胞質におけるその標的部位で（例えば、遺伝子サイレンシングのためのＤｉｃｅｒおよび／またはＲＩＳＣタンパク質複合体で）その薬理作用を発揮するために、カーゴ薬物（例えば、ｄｓｉＲＮＡ）が放出される。ジスルフィド切断後、本発明のＥ部分は、他のステロール系分子（例えば、エストロゲン）と同様に、直接または代謝（例えば、肝臓におけるシトクロム−Ｐ−４５０媒介性ヒドロキシル化またはグルクロン酸化）後のいずれかで、胆汁および／または尿を介して体から排泄される。
【０５０８】
４．遺伝子サイレンシングのための遊離されたＯＤと細胞質部位との相互作用
【０５０９】
本発明のコンジュゲートの上記ＭＯＡは、限定なく、図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、および２Ｅに例示される。各々式（ＩＩＩ）による構造を有する、ＥおよびＥ´を有する、［Ｃｎ−１−（ＩＩＩ）］によるコンジュゲートが例示される。Ｗは、式（ＩＩ１）に従う。例示されるＲＮＡ二本鎖は、各鎖の５´末端に結合したリン酸基を有する、２５／２７ヌクレオチド長のＤｉｃｅｒ基質である。膜貫通送達後、細胞質に到達すると、著しく還元的な周囲条件のために、Ｅ、Ｅ´、およびＥ´´部分の切断および除去が行われ、各Ｅ部分毎に短い断端が残り、短い炭化水素鎖に結合した、チオール基を含むＲＮＡ二本鎖に依然として結合している（図２Ｂ）。ＲＮＡ二本鎖は、次いでＤｉｃｅｒエンドヌクレアーゼと相互作用する。この相互作用は、２ヌクレオチドオーバーハングを有する、ガイド（アンチセンス）鎖二本鎖の３´末端の、Ｄｉｃｅｒタンパク質の疎水性ポケットへの結合、およびパッセンジャー（センス）鎖のリン酸基と、タンパク質表面のそれぞれの正に帯電したポケットとの相互作用によって開始される。この固定は、ＲＮＡ二本鎖をタンパク質表面に配置し、酵素がＲＮＡ二本鎖の正確な二本鎖切断を行うことを可能にし、パッセンジャー（センス）鎖上に残る２つのＥ断端を有する、２１／２１−ヌクレオチド二重らせんを残す（図２Ｃ）。図２Ｄは、酵素ヘリカーゼ（ＲＮＡ鎖を分離することができる、細胞質酵素）によるセンス鎖のその後の除去を示す。この作用は、所望の遺伝子サイレンシングを誘導するために、Ｅ部分の残留断端を除去し、よってインタクトなアンチセンス鎖を放出して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に入る（図２Ｅ）。
【０５１０】
実施例４：インビボでのマウスモデルにおける静脈内投与後の遺伝子サイレンシングの誘導における本発明のコンジュゲートの生物学的性能：
【０５１１】
目的：
【０５１２】
本発明の２つのＥ部分に結合した、ｄｓｉＲＮＡを含む、本発明のコンジュゲートの、静脈内投与後に遺伝子サイレンシングを誘導する能力の実証。
【０５１３】
方法：
【０５１４】
（１）．本発明のＥ部分にコンジュゲートされた、ｄｓｉ−ＲＮＡ二本鎖：
【０５１５】
ＡＰＯＣ３遺伝子をサイレンシングするように設計された、２５／２７ヌクレオチド長ｄｓｉＲＮＡ二本鎖を使用した。このＲＮＡ二本鎖は、各鎖の５´末端で、以下に記載される構造を有する、式（ＩＸ）による、本発明のＥ部分に結合した。ＡＰＯＣ３遺伝子は、肝臓によって合成され、トリグリセリドの分布および代謝において極めて重要な役割を有するタンパク質である、ＡＰＯＣ３タンパク質をコードする。ＡＰＯＣ３の発現は、主に肝臓および腎臓に限定される。
【０５１６】
実験に利用されたＥ部分は、式（ＩＸ）に従った。それは、前駆体分子としてＳｙｎｃｏｍ  ＢＶ（オランダ）によって合成され、ＤＭＴおよびホスホルアミダイトを保護基として有する。Ａｐｏ−Ｓｉ−ＡＰＯＣ３−ｄｓｉＲＮＡコンジュゲートは、上記の実施例１に記載されるように、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、Ｌｅｕｖｅｎ、ベルギー）によって合成した。それは、［Ｃｎ−１−（ＩＸ）］−ＡＰＯＣ３−ｄｓｉＲＮＡコンジュゲートであり、すなわち、各々が、ＡＰＯＣ３遺伝子をサイレンシングするために、ｄｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた、式（ＩＸ）に示される構造を有する、２つのＥ部分を含んだ。したがって、コンジュゲートは、以下の構造を有した。
【０５１７】
【化１１９】
2021509406.tif 000125
【０５１８】
この研究で使用された遺伝子配列は以下であった。
標的ＡｐｏＣ３−ｄｓｉＲＮＡ−コンジュゲート：
センス鎖の配列：
／５´−（ＩＸ）／ｍＧｍＧｒＡｍＵｒＧｍＧｒＡｒＣｒＡｒＡｒＵｍＣｒＡｍＣｒＵｍＵｒＣｍＡｒＧｒＡｒＵｒＣｒ  ＣＣＴ
アンチセンス鎖の配列：
／５´（ＩＸ）／ｒＡｒＧｍＧｒＧｒＡｒＵｒＣｒＵｍＧｒＡｍＡｒＧｍＵｒＧｒＡｒＵｒＵｒＧｒＵｒＣｒＣｒＡｍＵｒＣｍＣｍＡｍＧ
ｍは、メチル化を意味し、ｒは、リボヌクレオチドを意味する。
【０５１９】
対照＃１：ネイキッドＡｐｏＣ３−ｄｓｉＲＮＡコンジュゲート（ＡｐｏＣ３遺伝子のサイレンシングに特異的であるが、Ａｐｏ−Ｓｉ分子ナノモーター送達システムを欠いた配列を有する、ＲＮＡ二本鎖）。
センス鎖の配列：
ｍＧｍＧｒＡｍＵｒＧｍＧｒＡｒＣｒＡ  ｒＡｒＵｍＣｒＡｍＣｒＵｍＵｒＣｍＡ  ｒＧｒＡｒＵ  ｒＣｒＣＣＴ
アンチセンス鎖の配列：
ｒＡｒＧｍＧ  ｒＧｒＡｒＵ  ｒＣｒＵｍＧ  ｒＡｍＡｒＧ  ｍＵｒＧｒＡ  ｒＵｒＵｒＧ  ｒＵｒＣｒＣｒＡｍＵｒＣｍＣｍＡｍＧ
【０５２０】
対照＃２：［Ｃｎ−１−（ＩＸ）］−ＫＲＡＳ−ｄｓｉＲＮＡコンジュゲート、（Ａｐｏ−Ｓｉ分子ナノモーター送達システムにコンジュゲートされた、非関連ＲＮＡ配列）。
センス鎖の配列：
／５´−（ＩＸ）／ｍＡｍＡｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｒＡｒＣｒＡｒＧｍＵｒＵｍＡｒＵ  ｍＧｒＵｍＧｒＡｒＡｒＵｒＡｒＣＴＴ
アンチセンス鎖の配列：
／５´−（ＩＸ）／ｒＡｒＡｍＧｒＵｒＡｒＵｒＵｒＣｍＡｒＣｍＡｒＵｍＡｒＡｒＣｒＵｒＧｒＵｒＡｒＣｒＡｒＣｍＣｒＵｍＵ  ｍＧｍＵ
【０５２１】
対照＃３：ビヒクル、注射用水中の、５％グルコース溶液。
【０５２２】
（２）．製剤：
【０５２３】
全ての試験および対照物品（複数可）は、５％グルコースを含有したＲＮａｓｅフリーの注射用滅菌水に溶解した。５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を投与前に新たに調製した。
【０５２４】
（３）．動物飼育および収容：
【０５２５】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、２２〜２９ｇｒ）は、Ｅｎｖｉｇｏ（Ｉｓｒａｅｌ  Ｌｔｄ．）から入手した。マウスを１２時間の昼／夜サイクル条件で保ち、自由に飼料を与え、実験を行う前に少なくとも３日間順応させた。各実験群は、７匹の動物を含んだ。
【０５２６】
（４）．研究設計：
【０５２７】
研究は、以下の４つの処理群を含んだ。ビヒクル：（ｉ）．注射用水中５％グルコース、（ｉｉ）．ＡｐｏＣ３の「ネイキッド」ｄｓｉＲＮＡ（分子ナノモーター部分の結合なし）、（ｉｉｉ）．［Ｃｎ−１−（ＩＸ）］−ＫＲＡＳ−ｄｓｉＲＮＡコンジュゲート（Ａｐｏ−Ｓｉ分子ナノモーター送達システムにコンジュゲートされた、非関連ＲＮＡ配列）、（ｉｖ）．標的［Ｃｎ−１−（ＩＸ）］−ＡｐｏＣ３  ｄｓｉＲＮＡコンジュゲートであった。
【０５２８】
研究群の各々は、５〜７匹のマウスを含んだ。マウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した各用量が５０ｍｇ／Ｋｇである、３回の連続した１日１回用量を、尾静脈を通して、１０ｍｌ／Ｋｇの用量体積で注射した。プロトコルは、変更なしに、Ｗｏｌｆｒａｍ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１１４９−５７，２００７）から採用した。４日目、最後の用量から２４時間後、マウスの体重を測定し、ＣＯ２ナルコーシスを使用して屠殺し、肝臓を採取し、直ちにＲＮＡ抽出に供した。
【０５２９】
（５）．ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ：
１０〜１００ｍｇの肝臓試料を抽出し、ＴＲＩｚｏｌ試薬に浸漬した。次いで、ステンレス鋼ビーズ（０．９〜２．０ｍｍ）の存在下で、ブレットブレンダーホモジナイザー（Ｎｅｘｔ  Ａｄｖａｎｃｅ）によって組織を均質化した。混合物を短時間遠心分離して、デブリおよびブレットを除去した。製造元の指示に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを無限Ｍ２００−Ｐｒｏ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）で定量化した。ＲＮＡをＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ）で逆転写し、ＡｐｏＣ３  ｍＲＮＡ発現をベータ−アクチン（Ｓｔｅｐ−ｏｎｅ−Ｐｌｕｓ、ＡＢＩ）に正規化された、Ｔａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ手順で測定した。
【０５３０】
（６）．データ分析
【０５３１】
データ分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアを使用して行った。群間の統計的有意性は、対応のないスチューデントｔ検定（両側）を使用して評価し、有意性は、ｐ＜０．０５として決定した。データは、平均±ＳＤとして示す。
【０５３２】
結果：
【０５３３】
図３Ａに示されるように、［Ｃｎ−１−（ＩＸ）］−ＡｐｏＣ３  ｄｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＡｐｏＣ３遺伝子の発現の顕著なノックダウンを誘導した（４０％）。この遺伝子発現の低減は、全ての他の実験群と比較して、非常に統計的に有意であった。
【０５３４】
図３Ｂに示されるように、ＡｐｏＣ３遺伝子の発現の統計的に有意なノックダウンはまた、腎臓において観察された（２１％）。重要なことに、腎臓においても、この差は、全ての３つの対照群と比較して統計的に有意であった。
【０５３５】
結論：
【０５３６】
ＡｐｏＣ３遺伝子の発現をサイレンシングするように設計されたｄｓｉＲＮＡに結合した、２つのＥ部分を含む、本発明のコンジュゲートは、肝臓および腎臓の両方における、標的遺伝子の発現の選択的ノックダウンの誘導において、インビボでの全身静脈内投与時に有意な活性を示した。これらの結果は、Ａｐｏ−ｓｉ薬物送達システムが、全身活性様式を有し、静脈内投与後、ｄｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた、Ａｐｏ−Ｓｉシステムは、遺伝子薬物の全身分布、ならびにそれぞれの多臓器および特定の遺伝子のサイレンシングを可能にするという概念を支持する。
【０５３７】
実施例５：インビトロでの遺伝子サイレンシングにおける、ＥおよびＥ´が各々式（ＩＶ）による、本発明のコンジュゲートの生物学的性能：
【０５３８】
研究目的：
インビトロでのＥＧＦＰ遺伝子の発現のサイレンシングにおける、本発明のコンジュゲート、各々が式（ＩＶ）に示される構造を有し、ＥＧＦＰ特異的ｄｓｉＲＮＡに結合した、ＥおよびＥ´部分を含む、［Ｃｎ−１−（ＩＶ）］−ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡの性能の評価。
【０５３９】
方法：
【０５４０】
ｄｓｉＲＮＡ二本鎖：
【０５４１】
ｓｉＲＮＡ二本鎖は、ＥＧＦＰ遺伝子をサイレンシングするように設計された、Ｄｉｃｅｒの基質であった。式（ＩＶ）に示される構造のＥ部分は、その５´末端で、各ＲＮＡ鎖に結合していた。したがって、この研究で使用されたコンジュゲートは、以下の構造を有する、［Ｃｎ−１−（ＩＶ）］−ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡであった。
【０５４２】
【化１２０】
2021509406.tif 000126
【０５４３】
ヌクレオチド配列は、次の通りであった。
センス：５´−ｐｈｏｓ／ｉＡｐｏ−Ｓｉ−Ｋ１０３Ａ／ｍＡｍＣｒＣｍＣｒＵｍＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＵｍＣｒＡｍＵｒＣｍＵｒＧｍＣｒＡｒＣｒＣｒＡｒＣｍＣＧｒＵｒＣｒＡ
アンチセンス：５´−ｐｈｏｓ／ｉＡｐｏ−Ｓｉ−Ｋ１０３Ａ／ｒＣｒＧｍＧｒＵｒＧｒＧｒＵｒＧｍＣｒＡｍＧｒＡｍＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＵｒＧｍＧｒＧｍＵｍＣｍＡ
【０５４４】
インビトロでの研究：ヒーラ−ＧＦＰ細胞株は、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）、およびブラストサイジン１０μｇ／ｍｌが補足された、ダルベッコの改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で成長させた。細胞を、５％ＣＯ２加湿空気を有する、３７℃インキュベーターに維持した。トランスフェクションの１日前、細胞を２４ウェルブラックガラス底プレートに播種した（４０，０００細胞／ウェル）。翌日、細胞を１０％血清の存在下でコンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＩＶ）］−ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡに曝露した。無血清トランスフェクションについて、培地を吸引し、細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、培地を２４時間無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で置き換え、続いてさらに４８時間インキュベーションのために血清を加えた。タンパク質発現の下方調節を、トランスフェクションの７２時間後に測定した。この目的のために、培地を吸引し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。ＥＧＦＰ蛍光強度は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００−Ｐｒｏ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５３５ｎｍによって定量化した。未処理細胞を対照として使用した。実験は、三重に行い、結果は、平均±ＳＤとして示し、群間の差異は、両側ｔ検定によって評価し、統計的有意性は、ｐ＜０．０５として定義した。
【０５４５】
結果：
【０５４６】
［Ｃｎ−１−（ＩＶ）］−ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＥＧＦＰの発現の有効なノックダウンを次のように誘導した。
【０５４７】
血清の存在下で、６００ｎＭのコンジュゲートは、ＥＧＦＰ発現を対照の７３．７％±１．３（平均±ＳＤ）に低減した。無血清条件では、ロバストなＥＧＦＰノックダウンは、コンジュゲートによって用量依存的に誘導され、細胞がそれぞれ１０、４０、および１５０ｎＭのコンジュゲートによって処理された場合（全て群間比較においてｐ＜０．００１）、ＥＧＦＰ発現は、対照の５５．０％±２．６％、２９．９％±０．５％、および７．４％±０．６％に低減した。
【０５４８】
結論：
【０５４９】
本発明のコンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＩＶ）］−ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡは、細胞へのリン脂質膜を横切る高分子ｄｓｉＲＮＡ構築物の送達のため、およびそれぞれの有意な遺伝子サイレンシングの誘導のための強力な部分である。
【０５５０】
実施例６：インビトロでの遺伝子サイレンシングにおける、各々式（ＶＩＩＩ−Ｍ）によるＥ、Ｅ´、およびＥ´´を含む、本発明のコンジュゲートの生物学的性能、用量／応答研究：
【０５５１】
研究目的：
【０５５２】
本発明のコンジュゲート［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］、すなわち、各々が式（ＶＩＩＩ−Ｍ）に従い、ＥＧＦＰ遺伝子をサイレンシングするように設計された、２５／２７ヌクレオチドＤｉｃｅｒの基質二本鎖に結合した、Ｅ、Ｅ´、およびＥ´´部分を有する、ｄｓｉＲＮＡの、インビトロでの生物学的性能の評価。
【０５５３】
方法：
【０５５４】
コンジュゲート［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］の構造は、次の通りである。
【０５５５】
【化１２１】
2021509406.tif 000127
【０５５６】
細胞培養：
【０５５７】
ヒーラ−ＧＦＰおよび３Ｔ３細胞株は、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。各細胞タイプの細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）、およびブラストサイジン１０μｇ／ｍｌが補足された、ダルベッコの改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で成長させた。細胞を５％ＣＯ２加湿空気を有する３７℃インキュベーターに維持した。トランスフェクションの前日、細胞を２４ウェルブラックプレートガラス底に播種した（４０，０００細胞／ウェル）。翌日、細胞は、コンジュゲート［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］との、２ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、８０ｎＭ、１５０ｎＭ、および３００ｎＭの濃度での、７２時間のインキュベーションを開始し、その最初の２４時間は、無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中であり、続いて１０％血清を含む培地におけるインキュベーションをさらに４８時間行った。タンパク質発現の下方調節を、トランスフェクションの７２時間後に測定した。この目的のために、培地を吸引し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。ＥＧＦＰ蛍光強度は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００−Ｐｒｏ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５３５ｎｍによって定量化した。未処理細胞を対照として使用した。実験は、三重に行い、結果は、平均±ＳＤとして示した。遺伝子発現対コンジュゲート濃度の曲線を描き、ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｐｒｉｓｍ−５ソフトウェアを使用して曲線適合を計算した。
【０５５８】
結果：
【０５５９】
図４Ａおよび４Ｂに示されるように、ヒーラ細胞および３Ｔ３細胞両方について、非常に有意な対数減衰を有し、両方の細胞株についてＲ２０．９５の曲線適合を有する、明確な用量／応答が観察された。ヒーラ細胞について、ＩＣ５０は、１３．５４ｎＭであり、１９．２５ｎＭのＩＣ５０を示した、３Ｔ３細胞と同様であることが判明した。
【０５６０】
結論：
【０５６１】
２つの細胞株においてインビトロで調査されるように、コンジュゲート［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］−ＥＧＦＰは、タンパク質レベルの評価を通して評価されるように、培養中の細胞へのロバストな送達、および遺伝子サイレンシングの強力な誘導を示す。観察された低いナノモルＥＣ５０値は、二本鎖あたり３つのＥ部分の結合を有する、コンジュゲートの設計が、遺伝子サイレンシングにおける有効な生物学的性能を可能にするのに有用であるという概念を支持する。
【０５６２】
実施例７：インビトロでの遺伝子サイレンシングにおける、各々式（Ｘ）による、ＥおよびＥ´を含む、本発明のコンジュゲートの生物学的性能
【０５６３】
研究目的：
【０５６４】
本発明のコンジュゲート［Ｃｎ−１−（Ｘ）］、すなわち、各々が式（Ｘ）に従い、ＥＧＦＰ遺伝子をサイレンシングするように設計された、２５／２７ヌクレオチドＤｉｃｅｒの基質二本鎖に結合した、ＥおよびＥ´部分を有する、ｄｓｉＲＮＡの、インビトロでの生物学的性能の評価。
【０５６５】
方法：
【０５６６】
コンジュゲート［Ｃｎ−１−（Ｘ）］−ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡの構造は、次の通りである。
【０５６７】
【化１２２】
2021509406.tif 000128
【０５６８】
ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡの配列、ヒーラおよび３Ｔ３細胞両方の細胞培養、ならびに処理プロトコルは、全て実施例５に記載される通りであった。ＥＧＦＰ蛍光強度の定量化は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００−Ｐｒｏ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５３５ｎｍを使用して行った。未処理細胞を対照として使用した。実験は、三重に行い、結果は、平均±ＳＤとして示し、群間の差異は、両側ｔ検定によって評価し、統計的有意性は、ｐ＜０．０５として定義した。
【０５６９】
結果：
【０５７０】
［Ｃｎ−１−（Ｘ）］−ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＥＧＦＰの発現の有効なノックダウンを次のように誘導した。
【０５７１】
ヒーラ細胞において：血清の存在下で、６００ｎＭのコンジュゲートは、ＥＧＦＰ発現を対照の７６％±２（平均±ＳＤ）に低減した。無血清条件では、ＥＧＦＰ発現のロバストなノックダウンは、コンジュゲートによって用量依存的に誘導され、細胞がそれぞれ１０、４０、および１５０ｎＭのコンジュゲートによって処理された場合（全て群間比較においてｐ＜０．００１）、ＥＧＦＰ発現は、対照の５７．４％±４．８％、３２．１％±５．０％、および１５．９％±４．２％に低減した。
【０５７２】
３Ｔ３細胞において：無血清条件では、ＥＧＦＰ発現の顕著なノックダウンは、コンジュゲートによって用量依存的に誘導され、細胞がそれぞれ１０、４０、および１５０ｎＭのコンジュゲートによって処理された場合（全て群間比較においてｐ＜０．００１）、ＥＧＦＰ発現は、対照の９１％±２．０％、５０．０％±５．０％、および２７％±４．０％に低減した。
【０５７３】
結論：
【０５７４】
本発明のコンジュゲート［Ｃｎ−１−（Ｘ）］−ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡは、細胞へのリン脂質膜を横切る高分子ｄｓｉＲＮＡ構築物の送達のため、および結果としてのそれぞれの有意な遺伝子サイレンシングの誘導のための強力な部分である。
【０５７５】
実施例８：インビトロでの遺伝子サイレンシングにおける、各々式（ＸＩ）による、ＥおよびＥ´を含む、本発明のコンジュゲートの生物学的性能
【０５７６】
研究目的：
【０５７７】
本発明のコンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＸＩ）］、すなわち、各々が式（ＸＩ）に従い、ＥＧＦＰ遺伝子をサイレンシングするように設計された、２５／２７ヌクレオチドＤｉｃｅｒの基質二本鎖に結合した、ＥおよびＥ´部分を有する、ｄｓｉＲＮＡの、インビトロでの生物学的性能の評価。
【０５７８】
方法：
【０５７９】
コンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＸＩ）］−ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡの構造は、次の通りである。
【０５８０】
【化１２３】
2021509406.tif 000129
【０５８１】
研究は、ヒーラ細胞において行った。ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡの配列、細胞培養、および処理プロトコルは、全て実施例５に記載される通りであった。ＥＧＦＰ蛍光強度の定量化は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００−Ｐｒｏ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５３５ｎｍを使用して行った。未処理細胞を対照として使用した。実験は、三重に行い、結果は、平均±ＳＤとして示し、群間の差異は、両側ｔ検定によって評価し、統計的有意性は、ｐ＜０．０５として定義した。
【０５８２】
結果：
【０５８３】
［Ｃｎ−１−（ＸＩ）］−ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ＥＧＦＰの発現の有効なノックダウンを次のように誘導した。血清の存在下で、６００ｎＭのコンジュゲートは、ＥＧＦＰ発現を対照の８３％±４（平均±ＳＤ）に低減した。無血清条件では、ＥＧＦＰ発現の顕著なノックダウンは、コンジュゲートによって用量依存的に誘導され、細胞がそれぞれ１０、４０、および１５０ｎＭのコンジュゲートによって処理された場合（全て群間比較においてｐ＜０．０１）、ＥＧＦＰ発現は、対照の５５．２％±１０％、３４．５％±８％、および１５．９％±４．２％に低減した。
【０５８４】
結論：
【０５８５】
本発明のコンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＸＩ）］−ＥＧＦＰ−ｄｓｉＲＮＡは、細胞へのリン脂質膜を横切る高分子ｄｓｉＲＮＡ構築物の送達のため、および結果としてのそれぞれの有意な遺伝子サイレンシングの誘導のための強力な部分である。
【０５８６】
実施例９：インビトロでのＥＧＦＰ遺伝子の発現のサイレンシングにおける、様々なＥ、Ｅ´、およびＥ´´部分を有する、本発明の（Ｃｎ−１）および（Ｃｎ−２）コンジュゲートの生物学的性能。
【０５８７】
研究目的：
【０５８８】
全て一般式（Ｉ）および（ＩＩ）に関し、よって式（Ｉ）および（ＩＩ）を、細胞へのリン脂質膜を横切るｄｓｉＲＮＡの膜貫通送達を可能にし、結果として生物学的活性を発揮する、一般的な統一された構造モチーフとして例示する、様々なＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分を有する、本発明の様々なコンジュゲートによってインビトロで発揮される遺伝子サイレンシングの評価。
【０５８９】
方法：
【０５９０】
研究は、培養された３Ｔ３細胞で行い、ＥＦＧＰ遺伝子のサイレンシングは、本発明の様々なコンジュゲートとのインキュベーション後に評価した。研究の方法論は、上記の実施例５〜８に記載される通りであった。インキュベーションを７２時間行い、その最初の２４時間のインキュベーションは、無血清であり、その後に１０％血清が添加された。全ての評価において、コンジュゲートの濃度は、４０ｎＭまたは１５０ｎＭのいずれかであった。ＥＧＦＰ発現は、上記の実施例に記載されるように、ＥＬＩＳＡを介してタンパク質の蛍光を測定することによって評価した。ＥＧＦＰ発現はまた、対照として機能した未処理細胞において測定した。評価された本発明のＥ部分は、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ−Ｍ）、（ＩＸ）であった。上記で特定されるように、全てのこれらの部分は、一般式（ＩＩ）に関する。加えて、６つの対照Ｅ部分を合成し、ＥＧＦＰ遺伝子のサイレンシングのためにｄｓｉＲＮＡにコンジュゲートした。対照部分（表３）の構造的特徴は、一般式（ＩＩ）に従って構築されたＥ部分と同様であった。しかしながら、それらは、主要な構造式（ＩＩ）との完全なアラインメントを欠いた。
【０５９１】
結果：
【０５９２】
結果を以下の表１、２、および３に示す。
【０５９３】
【表１】
2021509406.tif 000130
【０５９４】
【表２】
2021509406.tif 000131
【０５９５】
【表３】
2021509406.tif 000132
【０５９６】
結果の要約：
【０５９７】
表１および表２に示されるように、構造が一般式（Ｉ）および（ＩＩ）に従う全てのコンジュゲートは、様々なコンジュゲートバックボーンおよびＥ部分を有するが、調査されたナノモル濃度（４０および１５０ｎＭ）で、調査された遺伝子ＥＧＦＰのロバストなサイレンシングを示した。対照的に、全ての対照コンジュゲート（表３）は、比較的高濃度（最大４００ｎＭ）で試験された場合でも、遺伝子サイレンシングを示さなかった。
【０５９８】
結論：
【０５９９】
この性能プロファイルは、よって、式（Ｉ）および（ＩＩ）によるコンジュゲートが、結果としての有用な生物学的性能（この場合、遺伝子サイレンシング）と共に、細胞へのリン脂質膜を横切る高分子ＯＤの有用な送達を可能にする、一般的かつ特徴的な構造モチーフを有するという概念を支持する。
【０６００】
実施例１０：インビトロでの遺伝子サイレンシングにおける、各々式（ＶＩＩＩ−Ｍ）によるＥ部分を含む、本発明のコンジュゲートの生物学的性能、（Ｃｎ−１）および（Ｃｎ−２）コンジュゲートの用量／応答研究、および比較分析：
【０６０１】
研究目的：
【０６０２】
本発明のコンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］および［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］、すなわち、それぞれ、各Ｅ部分が式（ＶＩＩＩ−Ｍ）に従い、ＥＧＦＰ遺伝子をサイレンシングするように設計された、２５／２７ヌクレオチドＤｉｃｅｒの基質二本鎖に結合した、２つまたは３つのＥ部分のいずれかを有する、ｄｓｉＲＮＡの、インビトロでの生物学的性能の評価。
【０６０３】
方法：
【０６０４】
細胞培養：
【０６０５】
３Ｔ３細胞株は、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。各細胞タイプの細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）、およびブラストサイジン１０μｇ／ｍｌが補足された、ダルベッコの改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で成長させた。細胞を５％ＣＯ２加湿空気を有する３７℃インキュベーターに維持した。トランスフェクションの前日、細胞を２４ウェルブラックプレートガラス底に播種した（４０，０００細胞／ウェル）。翌日、細胞は、コンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］、またはコンジュゲート［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］との、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、および４０ｎＭの濃度での、４８時間のインキュベーションを開始し、その最初の２４時間は、無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中であり、続いて１０％血清を含む培地におけるインキュベーションをさらに２４時間行った。タンパク質発現の下方調節を、トランスフェクションの４８時間後に測定した。この目的のために、培地を吸引し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。
【０６０６】
ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ：
【０６０７】
製造元の指示に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを無限Ｍ２００−Ｐｒｏ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）で定量化した。ＲＮＡをＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ）で逆転写し、ＡｐｏＣ３  ｍＲＮＡ発現をベータ−アクチン（Ｓｔｅｐ−ｏｎｅ−Ｐｌｕｓ、ＡＢＩ）に正規化された、Ｓｙｂｅｒ  ｑＲＴ−ＰＣＲ手順で測定した。
【０６０８】
結果：
【０６０９】
図５に示されるように、コンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］およびコンジュゲート［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］の両方は、３Ｔ３細胞をインビトロで評価されるように、ＥＧＦＰ遺伝子の発現のロバストなサイレンシングを誘導した。非常に有意な対数減衰を有し、両方の細胞株についてＲ２０．９７の曲線適合を有する、明確な用量／応答が観察された。２つのＥ部分を有する、コンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］（点線）について、ＩＣ５０は、２．２ｎＭであるのに対し、３つのＥ部分を有する、コンジュゲート［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］（実線）について、ＩＣ５０は、０．８ｎＭであることが判明した（図５）。
【０６１０】
結論：
【０６１１】
２つのコンジュゲート：コンジュゲート［Ｃｎ−１−（ＶＩＩＩ）］−ＥＧＦＰ、およびコンジュゲート［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］について調査されるように、本発明のコンジュゲートは、ＲＮＡレベルの測定を介して評価されるように、非常に低いＩＣ５０値で、ロバストな遺伝子サイレンシングを発揮する。興味深いことに、３つのＥ部分を含むコンジュゲート［Ｃｎ−２−（ＶＩＩＩ−Ｍ）］は、２つのＥ部分を含むコンジュゲートと比較して、遺伝子サイレンシングにおいてより高い効力を示し、より低いＩＣ５０値（０．８対２．２ｎＭ）を反映した。この観察は、本発明の送達システムが、ポジティブな協同作用効果を示し、各Ｅ部分が遺伝子サイレンシングにおけるコンジュゲートの全体的な性能に寄与し、これを増強するという概念を支持する。
【図１Ａ】
2021509406.tif 000186
【図１Ｂ】
2021509406.tif 000187
【図２Ａ】
2021509406.tif 000188
【図２Ｂ】
2021509406.tif 000189
【図２Ｃ】
2021509406.tif 000190
【図２Ｄ】
2021509406.tif 000191
【図２Ｅ】
2021509406.tif 000192
【図３Ａ】
2021509406.tif 000193
【図３Ｂ】
2021509406.tif 000194
【図４Ａ】
2021509406.tif 000195
【図４Ｂ】
2021509406.tif 000196
【図５】
2021509406.tif 000197
【国際調査報告】
2021509406.tif 000198
2021509406.tif 000199
2021509406.tif 000200