(57)【要約】  本発明は、紫外線照射によりワイルドタイプのストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）菌株に存在するＤａｇＢ遺伝子の塩基配列が点突然変異したストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を提供する。本発明に係るストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株は、ＤａｇＢベータ−アガラーゼをほとんど発現しないか、またはベータ−アガラーゼ活性がほとんどないＤａｇＢ変異酵素を発現するため、培養液から別途、ＤａｇＡ酵素を分離精製する必要がなく、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養液またはこれらの上澄み液を用いて、寒天またはアガロースからネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）よりネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）またはネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）の含有量が比較的高いネオアガロオリゴ糖を製造することができる。
2021509285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株（受託番号：ＫＣＣＭ  １２５７７Ｐ）。
【請求項２】
遺伝子突然変異によって配列番号２の塩基配列からなる変形されたＤａｇＢ遺伝子を有することを特徴とする請求項１に記載のストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株（受託番号：ＫＣＣＭ  １２５７７Ｐ）。
【請求項３】
前記変形されたＤａｇＢ遺伝子によって発現されるＤａｇＢ変異酵素は、配列番号６のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２に記載のストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株（受託番号：ＫＣＣＭ  １２５７７Ｐ）。
【請求項４】
（ａ）炭素源としてガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）が含有された液体培地に、請求項１〜３のいずれか一項に記載のストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株（受託番号：ＫＣＣＭ  １２５７７Ｐ）を接種して培養し、培養液を収得する段階と、及び
（ｂ）前記培養液を遠心分離して上澄み液を収得する段階と、を含むベータ−アガラーゼ生産方法。
【請求項５】
（ａ）炭素源としてガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）が含有された液体培地に、請求項１〜３のいずれか一項に記載のストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株（受託番号：ＫＣＣＭ  １２５７７Ｐ）を接種して培養し、培養液を収得する段階と、
（ｂ）前記培養液を遠心分離して上澄み液を収得する段階と、及び
（ｃ）前記上澄み液に硫酸アンモニウムを添加して上澄み液に含有されたベータ−アガラーゼを沈殿させる段階と、を含むベータ−アガラーゼ生産方法。
【請求項６】
前記液体培地内のガラクトースの濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）〜４％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする請求項４に記載のベータ−アガラーゼ生産方法。
【請求項７】
前記ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株（受託番号：ＫＣＣＭ  １２５７７Ｐ）の培養温度は、２５〜３５℃であり、培養攪拌速度は、２００〜３００ｒｐｍであることを特徴とする請求項４に記載のベータ−アガラーゼ生産方法。
【請求項８】
前記ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株（受託番号：ＫＣＣＭ  １２５７７Ｐ）の培養時間は、４０〜１５０ｈｒであることを特徴とする請求項４に記載のベータ−アガラーゼ生産方法。
【請求項９】
前記硫酸アンモニウムは、上澄み液のタンパク質飽和濃度が４５％〜７０％になるように添加されることを特徴とする請求項５に記載のベータ−アガラーゼ生産方法。
【請求項１０】
（ａ’）請求項１〜３のいずれか一項に記載のストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株（受託番号：ＫＣＣＭ  １２５７７Ｐ）の培養液または前記培養液の上澄み液を準備する段階と、及び
（ｂ’）寒天（ａｇａｒ）またはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を前記培養液または上澄み液に存在するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）と酵素反応させる段階と、を含むネオアガロオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトマイセスセリカラー突然変異菌株、これを用いたベータ−アガラーゼ生産方法及びこれを用いたネオアガロオリゴ糖の製造方法に関する。より詳しくは、親菌株に比べて相対的にＤａｇＡ酵素を主に発現するストレプトマイセスセリカラー突然変異菌株、これを用いてベータ−アガラーゼのうち、ＤａｇＡ酵素を大量に生産する方法、並びにこれを用いて寒天またはアガロースからネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）よりネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）またはネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）の含有量が高いネオアガロオリゴ糖を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
寒天（Ａｇａｒ）は、従来から食品添加物、医薬品、化粧品、家畜飼料及び工業原料などに広く利用されている代表的な藻類由来の多糖類であり、韓国では、毎年その生産量が約２，０００〜５，０００トンにいたる比較的豊富な水産資源の一つである。しかし、実際の利用面では、全体生産量の一部だけが単純加工処理されて安価な原料として使用されるだけであり、その残りは、大部分が放置されており、資源賦存量に比べて付加価値が非常に低いのが実情である。したがって、豊富な韓国内寒天の新規用途開発と付加価値の向上に関する研究が強く要求されているのが実情である。
【０００３】
寒天は、少量のタンパク質、灰分、及び脂肪を除けば大部分が多糖類からなるが、前記寒天を構成する多糖類には、中性多糖類であるアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）と酸性多糖類であるアガロペクチン（ａｇａｒｏｐｅｃｔｉｎ）がある。アガロースは、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）がβ−１，４形態で結合したアガロビオース（ａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）を単位体として有し、アガロビオースがα−１，３結合で繰り返して連結された直鎖構造からなり、ゲル（ｇｅｌ）化力が強い。一方、アガロペクチンは、アガロースと同様にアガロビオースを単位体として有するが、硫酸基などのような酸性基を含有しており、ゲル化力が弱い。その中で、アガロースは、β−１，４結合に作用するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）によってネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）を経て、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）に分解され、次いでα−１，３結合に作用するアルファ−アガラーゼ（α−ａｇａｒａｓｅ）によってガラクトース（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）に最終的に分解される。また、アガロースは、希酸やアルファ−アガラーゼ（α−ａｇａｒａｓｅ）によってアガロビオース（Ａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）に分解される。一般に、ネオアガロオリゴ糖は、寒天またはアガロースをベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）で加水分解して得られるネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）、ネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）、ネオアガロオクタオース（ｎｅｏａｇａｒｏｏｃｔａｏｓｅ）などのように、単糖が２〜１０個ほど結合したオリゴ糖を意味する。また、アガロオリゴ糖は、寒天またはアガロースを希酸やアルファ−アガラーゼ（α−ａｇａｒａｓｅ）に加水分解して得られるアガロビオース（Ａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、アガロテトラオース（Ａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）、アガロヘキサオース（Ａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）、アガロオクタオース（Ａｇａｒｏｏｃｔａｏｓｅ）などのように、単糖が２〜１０個ほど結合したオリゴ糖を意味する。ネオアガロオリゴ糖は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を非還元末端として有する一方、アガロオリゴ糖は、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を非還元末端として有し、このような構造的差異により、生理学的活性の側面から互いに異なる性質を示したりもする。
【０００４】
一方、放線菌であるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）は、寒天またはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を分解するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒ ａｓｅ）を細胞外（細胞外に分泌される）タンパク質の形態で生産すると知られており（Ｓｔａｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９４２、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.；Ｈｏｄｇｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｔｅｒ、１９８１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、該アガラーゼは、ＤａｇＡ遺伝子またはＤａｇＢ遺伝子でコーティングされている。ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）が生産するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）のうち、ＤａｇＡ酵素は、寒天またはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を分解して、主にＤＰ４（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びＤＰ６（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を生成し、ＤａｇＢ酵素は、寒天またはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を分解して、主にＤＰ２（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）を生成する。一方、寒天またはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）反応産物の、ＤＰ４（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びＤＰ６（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）が、ＤＰ２（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏ ｓｅ）に比べて高い抗肥満、抗糖尿、高脂血症などの代謝疾患の改善、抗がん、免疫増強効果を奏することが報告されているので、ＤａｇＡ遺伝子は、放線菌を通じたアガラーゼ生産研究において、重要な位置を占める。特に、ストレプトマイセスセリカラーは、放線菌の分子生物学的研究に最も広く使用される菌株であって、２００２年イギリスのＳａｎｇｅｒ  ｃｅｎｔｒｅによって染色体ＤＮＡの配列が解析され、現在公開されている（Ｂａｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｎａｔｕｒｅ） 。
ネオアガロオリゴ糖の製造又は用途と関連して、大韓民国登録特許第１０−０７９４５９３号には、寒天分解能を有するタラソモナス属菌株ＳＬ−５（Ｔｈａｌａｓｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＳＬ−５）ＫＣＣＭ  １０７９０Ｐと、前記菌株が生産するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）を用いてネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースからなる群から選択された１種以上のネオアガロオリゴ糖を製造する方法が開示されている。また、大韓民国登録特許第１０−１０７２５０３号には、寒天分解能を有するグラシエコラ属菌株ＳＬ−１２  ＫＣＣＭ  １０９４５Ｐ（Ｇｌａｃｉｅｃｏｌａ ｓｐ．ＳＬ−１２  ＫＣＣＭ  １０９４５Ｐ）と、前記菌株が生産するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）を用いて、ネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースからなる群から選択された１種以上のネオアガロオリゴ糖を製造する方法が開示されている。また、大韓民国登録特許第１０−１３０３８３９号には、シュードアルテロモナス属（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）菌株から分離されたベータ−アガラーゼ及びこれを用いてネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）からなる群から選択された１種以上のネオアガロオリゴ糖を生産する方法が開示されている。また、大韓民国登録特許第１０−１２９５６５９号には、サッカロファガス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐ．）菌株から分離されたベータ−アガラーゼ及びこれを用いてネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）からなる群から選択された１種以上のネオアガロオリゴ糖を生産する方法が開示されている。また、大韓民国登録特許第１０−１２１２１０６号には、サッカロファガス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｓｐ．）菌株から分離されたベータ−アガラーゼを寒天、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースからなる群から選択された１種以上の基質と反応させて、ネオアガロビオースを生産する方法が開示されている。また、大韓民国登録特許第１０−１２０６００６号には、寒天分解活性を有するフラメオバーガ属ｍｂｒｃ−１菌株ＫＣＣＭ  １１１５１Ｐ（Ｆｌａｍｍｅｏｖｉｒｇａ ｓｐ．ｍｂｒｃ−１  ＫＣＣＭ  １１１５１Ｐ）及び前記菌株が生産するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）を寒天と反応させて、ネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースからなる群から選択された１種以上のネオアガロオリゴ糖を製造する方法が開示されている。また、大韓民国登録特許第１０−１３０２６５５号には、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のアガラーゼ（ａｇａｒａｓｅ）とアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）またはアガ（ａｇａｒ）を反応させることを特徴とするネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）の製造方法が開示されている。また、大韓民国登録特許第１０−１１９００７��号には、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏ ｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のトリプシン遺伝子（ｓｐｒＴ）のプロモーターとシグナルペプチドコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含んでなる配列番号７の塩基配列で表されるＤＮＡ断片；及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のベータ−アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）において、シグナルペプチドコーディング領域が除去された配列番号２の塩基配列で表されるＤＮＡ断片；を含み、原核生物を形質転換させることができるベータ−アガラーゼ組換え発現ベクターとこれを用いてベータ−アガラーゼを生産する方法が開示されている。また、大韓民国公開特許公報第１０−２０１４−００６００４５号には、新規なベータ−アガラーゼ生産遺伝子を用いたネオアガロビオースまたはネオアガロテトラオースの酵素的生産方法が開示されている。また、大韓民国公開特許公報第１０−２００９−００４４９８７号には、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）を有効成分として含む皮膚美白組成物が開示されている。また、大韓民国公開特許公報第１０−２０１３−００８５０１７号には、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を含む皮膚の色素沈着疾患の予防または治療用薬学組成物、３，６−アンヒドロ−Ｌ− ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を含む皮膚美白又は保湿用化粧料組成物、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を含む炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物などが開示されている。以上で説明したように、従来技術は、寒天またはアガロースからネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）に比べてネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）の含有量が相対的に高いネオアガロオリゴ糖を製造するために、遺伝子組換えを利用して、形質転換菌株を製作したり、新規菌株または組換え菌株により発現されたベータ−アガラーゼのうち、ＤａｇＡのみを分離精製する方法を使用してきた。今まで、商業的に適用可能なレベルでＤａｇＡベータ−アガラーゼを生成することができる菌株は、報告されたことがほとんどない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来の技術的な背景下において想到されたものであって、本発明の一目的は、親菌株に比べて相対的に高活性のＤａｇＡベータ−アガラーゼが主に発現し、ＤａｇＢベータ−アガラーゼをほとんど発現しないストレプトマイセスセリカラー突然変異菌株を提供することにある。
また、本発明の一目的は、ストレプトマイセスセリカラー突然変異菌株を用いてＤａｇＡベータ−アガラーゼを効率的、かつ大量に生産する方法を提供することにある。
また、本発明の一目的は、ストレプトマイセスセリカラー突然変異菌株を用いて寒天またはアガロースからネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）よりネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）またはネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）の含有量が比較的高いネオアガロオリゴ糖を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者等は、ワイルドタイプのストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）菌株に紫外線を照射して突然変異を誘発し、その中でベータ−アガラーゼを過発現するストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株を１次的に選別し、これを特許出願した（大韓民国公開特許公報第１０−２０１８−００１９８８１号、２０１８．０２．２７）。本発明は、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株の選別及び技術的特徴と関連して、大韓民国公開特許公報第１０−２０１８−００１９８８１号に開示された内容を全部参照する。１次的に選別されたストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株は、ＤａｇＡ及びＤａｇＢベータ−アガラーゼ、両方発現することが確認された。その後、１次的に選別されたストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株に再び紫外線を照射して突然変異を誘発させて、その中で高活性のＤａｇＡベータ−アガラーゼを主に発現し、ＤａｇＢベータ−アガラーゼをほとんど発現しないか、またはベータ−アガラーゼ活性がほとんどないＤａｇＢ変異酵素を発現するストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を最終的に選別して、本発明を完成した。
【０００７】
前記目的を解決すべく本発明の一例では、同一条件で培養し、収得した培養液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性または前記培養液から回収した上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性がワイルドタイプのストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）菌株よりも少なくとも１．２倍、好ましくは１．４倍以上大きく、ワイルドタイプのストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）菌株またはストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株（受託番号：ＫＦＣＣ  １１６６８Ｐ）に比べてＤａｇＡベータ−アガラーゼを主に発現し、ＤａｇＢベータ−アガラーゼをほとんど発現しないか、またはベータ−アガラーゼ活性がほとんどないＤａｇＢ変異酵素を発現するストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株（受託番号：ＫＣＣＭ  １２５７７Ｐ）を提供する。本発明の一例によるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株は、公知の様々な突然変異の方法を通じて得られるが、好ましくは、ワイルドタイプのストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）親菌株に紫外線を照射して突然変異させたものである。具体的には、本発明の一例によるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株は、ワイルドタイプのストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）親菌株を紫外線に照射して突然変異されたストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株を収得し、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株を紫外線で照射して突然変異させることで収得することができる。本発明の一例による前記ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株は、ワイルドタイプのストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）親菌株に比べて活性が顕著に向上されたベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）を生産したり、親菌株に比べてベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）を顕著に高く発現することができる。また、本発明の一例によるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株は、ワイルドタイプのストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）菌株またはストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株（受託番号：ＫＦＣＣ  １１６６８Ｐ）と比較したとき、正常なＤａｇＢ遺伝子（配列番号１参照）の１４２０番目のＤＮＡ塩基配列であるグアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）に置き換��られる点突然変異（ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）によって変形されたＤａｇＢ遺伝子（配列番号２参照）を有する。また、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株に含まれる遺伝子の突然変異によって変形されたＤａｇＢ遺伝子（配列番号２参照）は、菌株培養時、ほとんど発現されない、またはベータ−アガラーゼ活性がほとんどないＤａｇＢ変化酵素として発現される。具体的には、ワイルドタイプのストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）菌株またはストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株（受託番号：ＫＦＣＣ  １１６６８Ｐ）は、配列番号５のアミノ酸配列からなるＤａｇＢベータ−アガラーゼを発現する。その一方で、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株は、変形されたＤａｇＢ遺伝子（配列番号２参照）に対応する配列番号６のアミノ酸配列からなるＤａｇＢ変異酵素を発現する。配列番号６のアミノ酸配列からなるＤａｇＢ変異酵素は、配列番号５のアミノ酸配列からなる正常なＤａｇＢベータ−アガラーゼと比較したとき、４７４番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）がアルギニン（Ｒ）に置き換えられたものであって、ベータ−アガラーゼ活性、特に寒天またはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を分解してＤＰ２（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）に転換する活性がほとんどないことが確認された。
本発明の一例によるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株は、遺伝子の突然変異によって変形されたＤａｇＢ遺伝子を有するため、ＤａｇＡベータ−アガラーゼを主に発現し、ＤａｇＢベータ−アガラーゼをほとんど発現しないか、またはベータ−アガラーゼ活性がほとんどないＤａｇＢ変異酵素を発現する。したがって、本発明の一例によるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養液または前記培養液の上澄み液を用いると、寒天またはアガロースからネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）よりネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）またはネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）の含有量が比較的高いネオアガロオリゴ糖を製造することができる。
【０００８】
前記目的を解決すべく本発明の一例では、（ａ）炭素源としてガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）が含有された液体培地に、前述したストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を接種して培養し、培養液を収得する段階と、（ｂ）前記培養液を遠心分離して上澄み液を収得する段階と、を含むベータ−アガラーゼ生産方法を提供する。本発明の一例によるベータ−アガラーゼ生産方法において、前記液体培地内ガラクトースの濃度は、培養液または培養液から回収した上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を考慮したとき、０．５％（ｗ／ｖ）〜４％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、培養液または培養液から回収した上澄み液のＤａｇＡ酵素活性を考慮したとき、１．０％（ｗ／ｖ）〜２．５％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。また、本発明の一例によるベータ−アガラーゼ生産方法において、前記ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養温度は、培養液または培養液から回収した上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を考慮したとき、２５〜３５℃であることが好ましく、２８〜３２℃であることがより好ましい。また、本発明の一例によるベータ−アガラーゼ生産方法において、前記ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養攪拌速度は、培養液または培養液から回収した上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を考慮したとき、２００〜３００ｒｐｍであることが好ましく、２１０〜２７０ｒｐｍであることがより好ましい。また、本発明の一例によるベータ−アガラーゼ生産方法において、前記ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養時間は、回収した上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を考慮したとき、４０〜１５０ｈｒであることが好ましく、４８〜１２０ｈｒであることがより好ましい。
【０００９】
また、本発明のもう一つの例は、（ａ）炭素源としてガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）が含有された液体培地に、前述したストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を接種して培養し、培養液を収得する段階と、（ｂ）前記培養液を遠心分離して上澄み液を収得する段階と、（ｃ）前記上澄み液に硫酸アンモニウムを添加して上澄み液に含有されたベータ−アガラーゼを沈殿させる段階と、を含むベータ−アガラーゼ生産方法を提供する。本発明のもう一つの例によるベータ−アガラーゼ生産方法において、前記液体培地内ガラクトースの濃度は、培養液または培養液から回収した上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を考慮したとき、０．５％（ｗ／ｖ）〜４％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、培養液または培養液から回収した上澄み液のＤａｇＡ酵素活性を考慮したとき、１．０％（ｗ／ｖ）〜２．５％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。また、本発明のもう一つの例によるベータ−アガラーゼ生産方法において、前記ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養温度は、培養液または培養液から回収した上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を考慮したとき、２５〜３５℃であることが好ましく、２８〜３２℃であることがより好ましい。また、本発明のもう一つの例によるベータ−アガラーゼ生産方法において、前記ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏ ｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養攪拌速度は、培養液または培養液から回収した上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を考慮したとき、２００〜３００ｒｐｍであることが好ましく、２１０〜２７０ｒｐｍであることがより好ましい。また、本発明のもう一つの例によるベータ−アガラーゼ生産方法において、前記ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養時間は、回収した上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を考慮したとき、４０〜１５０ｈｒであることが好ましく、４８〜１２０ｈｒであることがより好ましい。また、本発明のもう一つの例によるベータ−アガラーゼ生産方法において、前記硫酸アンモニウムは、培養液の上澄み液から精製された産物のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を考慮したとき、上澄み液のタンパク質飽和濃度が４５％〜７０％になるように添加されることが好ましく、培養液の上澄み液から精製された産物のＤａｇＡ酵素活性を考慮したとき、上澄み液のタンパク質飽和濃度が４５％〜５５％になるように添加されることがより好ましい。
【００１０】
前記目的を解決すべく本発明の一例では、（ａ’）ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養液または前記培養液の上澄み液を準備する段階と、（ｂ’）寒天（ａｇａｒ）またはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）をストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養液または前記培養液の上澄み液に存在するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）と酵素反応させる段階と、を含むネオアガロオリゴ糖の製造方法を提供する。本発明の一例によるネオアガロオリゴ糖の製造方法において、前記培養液は、好ましくは、炭素原子としてガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）が含有された液体培地に、前述したストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を接種して培養し、収得することができる。また、本発明の一例によるネオアガロオリゴ糖の製造方法において、前記酵素反応温度は、３０〜４５℃であることが好ましく、３５〜４２℃であることがより好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を用いると、非常に活性の高いベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）を大量に生産することができる。また、本発明によるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株は、ＤａｇＢベータ−アガラーゼをほとんど発現しないか、またはベータ−アガラーゼ活性（特に、寒天またはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を分解してＤＰ２（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）に転換する活性）がほとんどないＤａｇＢ変異酵素を発現するため、培養液から別途にＤａｇＡ酵素を分離精製する必要がなく、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養液またはこれらの上澄み液を用いて、寒天またはアガロースからネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）よりネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）またはネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）の含有量が比較的高いネオアガロオリゴ糖を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株のコロニー形態（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を示す写真である。図１において、下段の写真は、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を染色試薬で染色した結果である。
【図２】ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養を通じて得られた上澄み液試料、５０％ＡＳＰ試料（硫酸アンモニウムを上澄み液に含有されたタンパク質の飽和濃度が５０％になるように添加して得られた酵素試料）及び７０％ＡＳＰ試料（硫酸アンモニウムを上澄み液に含有されたタンパク質の飽和濃度が７０％になるように添加して得られた酵素試料）のＤａｇＡ酵素活性を薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒ ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）方法で解析した結果である。
【図３】アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）をストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養を通じて得られた７０％ＡＳＰ試料と反応させて分解した後、分解産物内のネオアガロオリゴ糖組成をＨＰＬＣ−ＥＬＳＤで解析した結果である。
【図４】ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株のＤａｇＢ遺伝子塩基配列（ｕｐｐｅｒ  ｌｉｎｅ）とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株のＤａｇＢ遺伝子塩基配列（ｌｏｗｅｒ  ｌｉｎｅ）を整列して比較した結果の一部を示したものである。
【図５】１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列に基づいて作成されたストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の生物学的系統と類縁関係を示したものである。
【図６】本発明において、ＤａｇＢ遺伝子をクローニングするために使用されたｐＵＷＬ２０１ｐｗベクターの切断地図である。
【図７】本発明の実施例では、製造した組換え菌株ＷＴ  ｄａｇＢ、組換え菌株Ｍ２２−２Ｃ４３  ｄａｇＢ及び組換え菌株ｐＵＷＬ２０１ｐｗの培養から得られた上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を培養日付別に示したものである。
【図８】培地内の炭素源の種類に応じたストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株培養液のベータ−アガラーゼ活性を還元糖の定量法で測定した結果である。
【図９】様々な条件の炭素源を含む培地でストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を２８℃の温度条件と２１６ｒｐｍの振とう条件で培養したとき、培養液のベータ−アガラーゼ活性を還元糖の定量法で測定した結果である。
【図１０】様々な条件の炭素源を含む培地でストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を３０℃の温度条件と２５０ｒｐｍの振とう条件で培養したときの培養液のベータ−アガラーゼ活性を還元糖の定量法で測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を、実施例を通じてより具体的に説明する。ただし、下記実施例は、本発明の技術的特徴を明確に例示するためだけのものであって、本発明の保護範囲を限定するものではない。
【００１４】
１． 酵素活性の測定方法
（１）試料のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性の測定
試料のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性は、還元糖の定量法（ＤＮＳ  ｍｅｔｈｏｄ）を利用して測定した。具体的には、試料１０ｕｌに０．５％（ｗ／ｖ）の濃度でアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を溶かした２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ  ７）４９０ｕｌを混合し、４０℃で１５分間反応させた後、ここに反応液と同量のＤＮＳ試薬（ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ６．５ｇ、２Ｍ  ＮａＯＨ  ３２５ｍｌ及びｇｌｙｃｅｒｏｌ ４５ｍｌを蒸留水１ｌに溶解させて製造する）を入れ、１０分間沸かしてから冷やし、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。ベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性１Ｕ（Ｕｎｉｔ）は、５４０ｎｍでの吸光度が０．００１である活性と定義した。
【００１５】
（２）試料のＤａｇＡ酵素活性の評価
ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）菌株は、ベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）でＤａｇＡ酵素とＤａｇＢ酵素を生産する。ＤａｇＡ酵素は、寒天またはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を分解して、主にＤＰ４（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びＤＰ６（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を生成することが知られており、ＤａｇＢ酵素は、寒天またはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を分解して、主にＤＰ２（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）を生成することが報告されている。試料のＤａｇＡ酵素活性は、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を試料内の酵素と反応させて分解した後、分解産物を薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）方法で解析して、分解産物に含有されたＤＰ２（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ＤＰ４（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びＤＰ６（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）の量を定性的に比較して評価した。具体的には、試料のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を２５０Ｕ／ｍｌに調整して、これに０．５％（ｗ／ｖ）の濃度でアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を溶かした２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ  ７）１ｍｌを混合し、４０℃で１６ｈｒの間、反応させた。以後、反応液を１０分間沸かした後、遠心分離して上澄み液を回収した。以後、上澄み液５ｕｌをＴＬＣ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  ｇｌａｓｓ  ｐｌａｔｅに点滴して展開溶媒（ブタノール、エタノール、及び滅菌蒸留水をそれぞれ５：３：２（ｖ／ｖ）で混合した溶液）で２回展開した後、１０％（ｖ／ｖ）硫酸溶液（ベース溶媒は、エタノールである）を薄く噴霧し、１１０℃で１５分間反応させた。以後、ＴＬＣ  ｐｌａｔｅに展開された分解産物の様相を比較した。一方、ＤＰ２（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ＤＰ４（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びＤＰ６（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を３０ｍｇ／ｍｌ濃度で混合した溶液を標準物質溶液として使用した。標準物質溶液０．５ｕｌをＴＬＣ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  ｇｌａｓｓ  ｐｌａｔｅに点滴し、前記と同様の方法を使って展開した。
【００１６】
２．紫外線（ＵＶ）照射による放線菌ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）の突然変異誘発及びベータ−アガラーゼを過発現する突然変異菌株の選別
（１）ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株の選別
ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株をプレート（Ｐｌａｔｅ）上の放線菌最小培地（Ｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、ＭＭ；Ｈｏｐｗｏｏｄ、１９６７）で５日間の間、静置培養し、プレートに２０％（ｗ／ｖ）グリセロール溶液２ｍｌを分注した後、胞子（ｓｐｏｒｅ）を集めて、紫外線照射による突然変異誘発実験に使用した。ペトリディッシュ（Ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ）にストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）胞子（ｓｐｏｒｅ）ストック（ｓｔｏｃｋ）液１ｕｌを入れ、一般細菌の栄養培地であるＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ；蒸留水１ｌを基準にｔｒｙｐｔｏｎｅ  １７ｇ、ｓｏｙｔｏｎｅ  ３ｇ、ｇｌｕｃｏｓｅ  ２．５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２．５ｇを含む）培地１０ｍｌを添加して希釈した後、薄い膜を形成した。以後、周辺の照明を遮断した状態で約３０ｃｍの高さで３０Ｗ強の紫外線（ＵＶ）を４５分間照射した次、培養液を集めて、２８℃の温度条件、１８０ｒｐｍの振とう条件及び暗条件で８ｈｒ間培養した。培養液をプレート（Ｐｌａｔｅ）上のＭＭ寒天培地に塗抹した後、暗条件で２８℃の培養器で８日間の間、静置培養した。以後、培養したプレート（ｐｌａｔｅ）で生存コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を計数し、染色試薬（Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ）を用いて染色した。これらのうち、透明環（ｃｌｅａｒ  ｚｏｎｅ）のサイズが大きいコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）１，５８１種を１次選別した。１次選別されたコロニーのうち、１，４００種のコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）をＭＭ液体培地［炭素源として２％（ｗ／ｖ）の濃度のアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を含有する］が塗布されたｇｌａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒに個別に分注し、２８℃で５日間の間、静置培養した後、多くの胞子（ｓｐｏｒｅ）を形成した菌株３１３種を２次選別した。２次選別された菌株を２％（ｗ／ｖ）濃度のアガロオリゴ糖（ａｇａｒｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）が含有されたＲＳＭ３（蒸留水１ｌを基準にＭｇＣｌ２ ・７Ｈ２Ｏ  ５ｇ、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １１ｇ、ＣａＣＯ３  ０．５ｇを含む）液体培地に接種し、２８℃の温度条件及び１８０ｒｐｍの振とう条件で２．５日間培養した。以後、培養液を遠心分離して細胞破片（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、上澄み液を回収した。以後、上澄み液を０．４５ｕｍ ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒで除菌及びろ過して精製された上澄み液を回収した。それから、還元糖の定量法（ＤＮＳ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて精製された上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を測定した。また、親菌株であるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株も同様の方法及び条件で培養した後、精製された上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を測定した。２次選別された菌株等とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を比較し���その中、ベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性が最も高い突然変異菌株を最終菌株に選別し、これをストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２と命名した。
【００１７】
（２）ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株の寄託情報
本発明の発明者等は、最終選別されたストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株を２０１６年６月１７日に国際寄託機関である韓国微生物保存センター（住所：大韓民国ソウル特別市西大門区弘済内２ガギル４５儒林ビル３Ｆ）に国内特許寄託し、受託番号ＫＦＣＣ  １１６６８Ｐを付与された。
【００１８】
３．紫外線照射によるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株の突然変異誘発及びＤａｇＡベータ−アガラーゼを過発現する突然変異菌株の選別
（１）ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株選別
ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株の突然変異菌株であるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株をプレート（Ｐｌａｔｅ）上の放線菌の完全培地（ＩＳＰ４  ｍｅｄｉｕｍ）で５日間の間、静置培養し、プレートに２０％（ｗ／ｖ）グリセロール溶液２ｍｌを分注した後、胞子（ｓｐｏｒｅ）を集めて、紫外線照射による突然変異誘発実験に用いた。ペトリディッシュ（Ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ）にストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株の胞子ストック（ｓｐｏｒｅ  ｓｔｏｃｋ）液１ｕｌを入れ、一般細菌の栄養培地であるＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ；蒸留水１ｌを基準に、ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １７ｇ、ｓｏｙｔｏｎｅ  ３ｇ、ｇｌｕｃｏｓｅ  ２．５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ２．５ｇを含む）培地５ｍｌを添加して希釈した後、薄い膜を形成した。それから、周辺の照明を遮断した状態で約３５〜５０ｃｍの距離から３０〜４０Ｗ強の紫外線（ＵＶ）を２４〜６０分間照射した後、培養液を集めて、２８℃の温度条件、１８０ｒｐｍの振とう条件及び暗条件で８ｈｒ間培養した。培養液をＭＭ寒天培地に塗抹した後、暗条件で２８℃の培養器で５日間、静置培養した。それから、培養したプレートにおいて生存コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を計数し、この時の死滅率は９９．２％であった。これらの透明環（ｃｌｅａｒ  ｚｏｎｅ）は、染色試薬（Ｌｕｇｏｌ’ｓ  Ｉｏｄｉｎｅ）を用いて染色し、その大きさを比較した後、形（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）別に他のコロニーの菌株を選別してプレート上のＭＭ寒天培地に２８℃で５日間、静置培養した。以後、選別された菌株を０．５％（ｗ／ｖ）濃度のアガロースが含有された液体培地（蒸留水１ｌを基準にＭｇＣｌ２・７Ｈ２Ｏ  ５ｇ、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １１ｇ、ＣａＣＯ３  ０．５ｇを含む）に接種し、２８℃の温度条件及び２１６ｒｐｍの振とう条件で２．５日間、振とう培養した。それから、培養液を遠心分離して細胞破片（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、上澄み液を回収した。その後、上澄み液を０．４５ｕｍ ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒで除菌及びろ過して精製された上澄み液を回収した。それから、精製され上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性及びＤａｇＡ酵素活性を測定し、ベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性及びＤａｇＡ酵素活性が最も高い突然変異菌株を最終菌株として選別し、これをストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３と命名した。
【００１９】
（２）ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の寄託情報
本発明の発明者等は、最終選別されたストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を、２０１７年９月２２日に国際寄託機関である韓国微生物保存センター（住所：大韓民国ソウル特別市西大門区弘済内２ガギル４５儒林ビル３Ｆ）に国内特許寄託し、受託番号ＫＦＣＣ  １１７４２Ｐを付与された。また、本発明の発明者等は、前記国内特許寄託されたシリコンカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株（受託番号：ＫＦＣＣ  １１７４２Ｐ）を２０１９年８月２３日にブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ）に基づく国際特許寄託に移管申請して受託番号ＫＣＣＭ  １２５７７Ｐを付与された。
【００２０】
４．ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の比較
（１）各菌株のコロニー形態（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）の比較
図１は、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株のコロニー形態（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を示す写真である。図１において、下段の写真は、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を染色試薬で染色した結果である。
【００２１】
（２）各菌株の培養及びベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）を含有した酵素試料の製造
菌株をそれぞれ０．５％（ｗ／ｖ）濃度のアガロースが含有された液体培地（蒸留水１ｌを基準にＭｇＣｌ２・７Ｈ２Ｏ  ５ｇ、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １１ｇ、ＣａＣＯ３  ０．５ｇを含む）１０００ｍｌに接種し、２８℃の温度条件及び２１６ｒｐｍの振とう条件で２．５日間、振とう培養した。それから、培養液を遠心分離して細胞破片（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、上澄み液を回収した。回収した上澄み液を試料として使用し、ベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を測定し、ＤａｇＡ酵素活性を評価した。その後、上澄み液を０．４５ｕｍ ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒで除菌及びろ過して精製された上澄み液を回収した。それから、精製された上澄み液に硫酸アンモニウムを上澄み液に含有されたタンパク質の飽和濃度が、それぞれ５０％及び７０％になるように添加し、塩析法の一種である硫酸アンモニウム沈殿法（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎは、ＡＳＰ）により、ベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）酵素を沈殿させ、遠心分離を通じてペレット（ｐｅｌｌｅｔ）形態の精製されたベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）酵素を収得した。ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株に係る特許出願（大韓民国公開特許公報第１０−２０１８−００１９８８１号、２０１８．０２．２７）の明細書に開示された内容によれば、硫酸アンモニウムが添加された上澄み液のタンパク質飽和濃度が５０％の場合、主にＤａｇＡ酵素が沈殿し、硫酸アンモニウムが添加された上澄み液のタンパク質飽和濃度が７０％の場合には、ＤａｇＡ酵素及びＤａｇＢ酵素の両方が沈殿されることを間接的に確認することができる。ペレット形態の精製されたベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）酵素を５ｍｌの蒸留水に溶かした後、これを試料として使用してベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を測定し、ＤａｇＡ酵素活性を評価した。
【００２２】
（３）各菌株から得られた酵素試料のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性の比較
下記表１は、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養を通じて得られた上澄み液試料、５０％ＡＳＰ試料（硫酸アンモニウムを上澄み液に含有されたタンパク質の飽和濃度が５０％になるように添加して得られた酵素試料）及び７０％ＡＳＰ試料（硫酸アンモニウムを上澄み液に含有されたタンパク質の飽和濃度が７０％になるように添加して得られた酵素試料）のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性の測定結果を示したものである。ベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性の単位は、Ｕ／ｍｌである。
【表１】
2021509285.tif 000003
前記表１から見られるように、主にＤａｇＡ酵素からなるものと予想される５０％ＡＳＰ試料の場合、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養液から収得した５０％ＡＳＰ試料から最も高いベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を示した。
（４）各菌株から得られた酵素試料のＤａｇＡ酵素活性の比較
図２は、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養を通じて得られた上澄み液試料、５０％ＡＳＰ試料（硫酸アンモニウムを上澄み液に含有されたタンパク質の飽和濃度が５０％になるように添加して得られた酵素試料）及び７０％ＡＳＰ試料（硫酸アンモニウムを上澄み液に含有されたタンパク質の飽和濃度が７０％になるように添加して得られた酵素試料）のＤａｇＡ酵素活性を薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）方法で解析した結果である。図２における「Ｍ」は、標準物質溶液を表し、レーン「１」、「４」及び「７」は、いずれもストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株の培養液から得られた酵素試料であり、レーン「２」、「５」及び「８」は、いずれもストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株の培養液から得られた試料であり、レーン「３」、「６」及び「９」は、いずれもストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養液から得られた試料である。また、レーン「１」、「２」及び「３」は、いずれも上澄み液試料であり、レーン「４」、「５」及び「６」は、いずれも７０％ＡＳＰ試料であり、レーン「７」、「８」及び「９」は、いずれも５０％ＡＳＰ試料である。
図２に示すように、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養液から得られた酵素試料は、いずれも分離精製レベルに関係なくアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を分解して、主にＤＰ４（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びＤＰ６（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を生成させた。その一方、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株の培養液から得られた上澄み液試料及び７０％ＡＳＰ試料は、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を分解して、主にＤＰ２（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）を生成させた。
図３は、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）をストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の培養を通じて得られた７０％ＡＳＰ試料と反応させて分解した後、分解産物内のネオアガロ糖組成をＨＰＬＣ−ＥＬＳＤで解析した結果である。アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）の分解反応条件は、ＤａｇＡ酵素活性の評価で用いた条件と同じであり、アガロース分解反応は、同じ条件で計４回繰り返した。分解産物内のネオアガロ糖組成をＨＰＬＣ−ＥＬＳＤで解析する際のカラムとしてＮＨ２  Ｐ−５０  ４Ｅ  ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  ｃｏｌｕｍｎ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を用いており、移動相としてアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）と水の混合溶液（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ：ｗａｔｅｒの混合重量比は６５：３５である）を用いた。図３に見られるようにアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）分解産物内のＤＰ４（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）の含有量は、ＤＰ２（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）の５〜５．５ 倍であり、ＤＰ６（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）の含有量は、ＤＰ２（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）の３〜３．５倍であることが示された。
【００２３】
（５）各菌株のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）遺伝子情報
ＰＣＲ反応を利用して、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株のＤａｇＡ遺伝子及びＤａｇＢ遺伝子を増幅し、増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ塩基配列を解析した。ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株のＤａｇＢ遺伝子は、いずれも配列番号１の同一塩基配列を有することが示された。その一方、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株のＤａｇＢ遺伝子は、組み換え遺伝子突然変異によって変形され、配列番号２の塩基配列を有することが示された。図４は、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株のＤａｇＢ遺伝子塩基配列（ｕｐｐｅｒ  ｌｉｎｅ）とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株のＤａｇＢ遺伝子塩基配列（ｌｏｗｅｒ  ｌｉｎｅ）を並べて比較した結果の一部を示したものである。一方、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株のＤａｇＡ遺伝子は、すべて配列番号３の同一塩基配列を有することが示された。したがって、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株は、いずれも配列番号４のアミノ酸配列を有するＤａｇＡ酵素を発現することが予測される。さらに、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２菌株は、配列番号５のアミノ酸配列を有する正常なＤａｇＢ酵素を発現することが予測される。その一方、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株は、正常なＤａｇＢ酵素を発現しないか、または配列番号６のアミノ酸配列を有し、ベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性がほとんどないＤａｇ��変異酵素を発現することが予測される。
【００２４】
（６）ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の系統と類縁関係
コロニー（Ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲを通じてストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列を解析した。図５は、１６ＳｒＲＮＡ塩基配列に基づいて作成されたストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の生物学的系統と類縁関係を示したものである。
【００２５】
（７）ＤａｇＢ遺伝子別発現レベルの比較
ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株のＤａｇＢ遺伝子を図６の切断地図を有するｐＵＷＬ２０１ｐｗベクターにクローニングして組換えベクターを作製し、該組換えベクターでベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）遺伝子を有さないストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４菌株を形質転換して、組換え菌株ＷＴ  ＤａｇＢを製造した。さらに、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株のＤａｇＢ遺伝子をｐＵＷＬ２０１ｐｗベクターにクローニングして組換えベクターを作製し、該組換えベクターでストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４菌株を形質転換して、組換え菌株Ｍ２２−２Ｃ４３  ＤａｇＢを製造した。また、ｐＵＷＬ２０１ｐｗベクターでストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４菌株を形質転換して、組換え菌株ｐＵＷＬ２０１ｐｗを製造した。それから、３つの組換え菌株を培養して、培養１日目、２日目及び３日目に培養液を回収して、上澄み液を収得した。それから、還元糖の定量法（ＤＮＳ  ｍｅｔｈｏｄ）を利用して、上澄み液試料のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を測定した。図７は、本発明の実施例にて製造した組換え菌株ＷＴ  ｄａｇＢ、組換え菌株Ｍ２２−２Ｃ４３  ＤａｇＢ及び組換え菌株ｐＵＷＬ２０１ｐｗの培養から得られた上澄み液のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を培養日付別に示したものである。図７に示すようにストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）ワイルドタイプ（ＷＴ）菌株のＤａｇＢ遺伝子は、ベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性を有する正常なＤａｇＢ酵素として高いレベルで発現される一方、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株の変形されたＤａｇＢ遺伝子は、正常なＤａｇＢ酵素として発現されないか、またはベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）活性がほとんどないＤａｇＢ変異酵素として発現されることが示された。
【００２６】
５．ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株のベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）のための最適培養条件の確立
（１）培地内の炭素源の種類及び含有量
炭素源として１．５重量％濃度の寒天が含まれた放線菌寒天培地上でストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を４日間培養した。それから、１．５％（ｗ／ｖ）濃度のガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、２％（ｗ／ｖ）濃度のコハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１．５％（ｗ／ｖ）濃度のグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）、０．２％（ｗ／ｖ）濃度の寒天（ａｇａｒ）及び０．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天（ａｇａｒ）の中から選択されるいずれかを炭素源として含むＲＳＭ３液体培地５０ｍｌに１ｃｍ×１ｃｍサイズの菌株コロニー３つを接種し、２８℃の温度条件と２１６ｒｐｍの振とう条件で２．５日間培養した。それから、培養液から上澄み液を回収して、上澄み液に含有されたベータ−アガラーゼ活性を測定した。
図８は、培地内炭素源の種類に応じたストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株培養液のベータ−アガラーゼ活性を還元糖の定量法で測定した結果である。図８において、Ｙ軸は、ベータ−アガラーゼ活性を表し、Ｘ軸は、培養時間を表す。下記において表２は、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を９６ｈｒの間培養したときの培地内炭素源の種類に応じた培養液のベータ−アガラーゼ活性を示したものである。
【００２７】
【表２】
2021509285.tif 000004
図８及び前記表２から見られるように、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株からベータ−アガラーゼの最適生産のための培地内の炭素源は、ガラクトースであり、その濃度は、１．５％（ｗ／ｖ）であることが確認された。
【００２８】
（２）培養温度及び培養攪拌速度（ｒｐｍ）
１％（ｗ／ｖ）濃度のガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）及び０．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天（ａｇａｒ）を炭素源として含むＲＳＭ３液体培地５０ｍｌ、１．５％（ｗ／ｖ）濃度のガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）及び０．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天（ａｇａｒ）を炭素源として含むＲＳＭ３液体培地５０ｍｌ及び０．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天（ａｇａｒ）を炭素源として含むＲＳＭ３液体培地５０ｍｌそれぞれに１ｃｍ×１ｃｍサイズの菌株コロニー３つを接種し、２８℃の温度条件と２１６ｒｐｍの振とう条件または３０℃の温度条件と２５０ｒｐｍの振とう条件で２．５日間培養した。それから、培養液から上澄み液を回収して、上澄み液に含有されたベータ−アガラーゼ活性を測定した。
図９は、様々な条件の炭素源を含む培地において、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を２８℃の温度条件と２１６ｒｐｍの振とう条件で培養したとき、培養液のベータ−アガラーゼ活性を還元糖の定量法で測定した結果である。図１０は、様々な条件の炭素源を含む培地において、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を３０℃の温度条件と２５０ｒｐｍの振とう条件で培養したとき、培養液のベータ−アガラーゼ活性を還元糖の定量法で測定した結果である。図９及び図１０において、Ｙ軸は、ベータ−アガラーゼ活性を表し、Ｘ軸は、培養時間を表す。図９及び図１０に示すようにストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）＿Ｍ２２−２Ｃ４３菌株を培養する際、ベータ−アガラーゼを最適に生産するための培養条件は、３０℃の温度及び２５０ｒｐｍの振とう（攪拌速度）であることが確認された。
【００２９】
上述の通り、本発明を前記の実施例を通して説明したが、本発明が必ずしもこれらだけに限定するものではなく、本発明の範疇と思想を逸脱しない範囲内で様々な変形が実施可能であることはもちろんである。したがって、本発明の保護範囲は、本発明に添付された特許請求の範囲に属するすべての実施形態を含むものと解釈されるべきである。
【受託番号】
【００３０】
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＦＣＣ  １１６６８Ｐ
受託日：２０１６．０６．１７
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＦＣＣ  １１７４２Ｐ
受託日：２０１７．０９．２２
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ  １２５７７Ｐ
移管日：２０１９．０８．２３
【００３１】
2021509285.tif 000005
【００３２】
2021509285.tif 000006
【００３３】
2021509285.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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