(57)【要約】外傷性脊髄損傷もしくは外傷性脳損傷等の神経障害またはパーキンソン病もしくは多発性硬化症等の障害を処置するための方法が提供される。そのような方法は、治療有効量のＧｓｘ１タンパク質（例えばＧｓｘ１−細胞透過性ペプチド融合タンパク質）またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を（例えばウイルスベクターの一部として）投与することにより神経障害を処置することを含む。外側片側切断損傷を有する成体マウス脊髄にＧｓｘ１を形質導入するためのレンチウイルス媒介遺伝子発現系の使用が、損傷部位における細胞増殖およびＮＳＰＣの活性化を促進するＧｓｘ１発現をもたらすことが本明細書に示される。
2021534206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象における神経障害を処置する方法であって、
前記対象に治療有効量のＧｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１をコードする核酸分子を投与することにより前記神経障害を処置すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記Ｇｓｘ１タンパク質がＧｓｘ１−細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）融合タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｇｓｘ１タンパク質または前記Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＧｓｘ１部分が、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むか、またはＧｓｘ１または前記融合タンパク質の前記Ｇｓｘ１部分をコードする前記核酸分子が、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｇｓｘ１または前記Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質の前記Ｇｓｘ１部分をコードする前記核酸分子が、配列番号１または３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｇｓｘ１をコードする前記核酸分子がプラスミドまたはウイルスベクターを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｇｓｘ１または前記Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質の前記Ｇｓｘ１部分をコードする前記核酸分子がプロモーターに作動可能に連結する、および／または
前記プロモーターが神経特異的エンハンサーに作動可能に連結する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プロモーターが構成的プロモーターまたは中枢神経系（ＣＮＳ）特異的プロモーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記構成的プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＮＳ特異的プロモーターが、シナプシン１（Ｓｙｎ１）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ネスチン（ＮＥＳ）プロモーター、ミエリン関連乏突起膠細胞塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーター、またはフォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）プロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞透過性ペプチドが、配列番号６１〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む、請求項２から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経障害が、脊髄損傷、脳損傷、または両方である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記脊髄損傷、脳損傷、または両方が、車両衝突、転落、暴力行為、スポーツ、または他の物理的外傷によって引き起こされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記神経障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、虚血、てんかん、ハンチントン病、多発性硬化症、または筋萎縮性側索硬化症である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与することが注射を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記注射がＣＮＳへの注射を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物対象がヒト対象である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療有効量のＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはＧｓｘ１もしくはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子が医薬組成物中に存在する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与することが、前記治療有効量のＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはＧｓｘ１もしくはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子の少なくとも２回の別個の投与を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも２回の別個の投与が、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも９か月、または少なくとも１年空けられる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与することが、前記神経障害の発症の１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、１か月以内、２か月以内、または３か月以内に行われる、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象に治療有効量の別の神経障害治療剤を投与することをさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
神経発生を増加させるか、
コリン作動性ニューロンの数を増加させるか、
グルタミン酸作動性ニューロンの数を増加させるか、
軸索成長を増加させるか、
軸索誘導を増加させるか、
ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数を減少させるか、
炎症を軽減するか、
細胞死を減少させるか、
前記対象の歩行運動を増加させるか、
例えば脊髄損傷部位またはその近傍における細胞増殖およびＮＳＰＣの活性化を高めるか、または
それらの任意の組合せである、
請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
（１）配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む単離されたＧｓｘ１タンパク質、
配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｘｘ１部分と、配列番号６１〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を必要に応じて含む細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分とを含む単離されたＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質であって、Ｇｓｘ１部分と前記ＣＰＰ部分とがリンカーによって必要に応じて接合する、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、
配列番号１または３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｓｘ１タンパク質をコードするか、または配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｓｘ１タンパク質をコードする核酸分子、あるいは
Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子であって、前記Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＧｓｘ１部分が、配列番号１または３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む核酸分子によってコードされるか、または配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｓｘ１タンパク質をコードし、必要に応じて前記Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＣＰＰ部分をコードする核酸分子が、配列番号６１〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子と、
（２）リポソームと
を含む組成物であって、前記Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、Ｇｓｘ１タンパク質をコードする核酸分子、またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子が前記リポソームに封入される、組成物。
【請求項２５】
細胞をニューロン細胞にリプログラミングする方法であって、
Ｇｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入することにより前記宿主細胞をニューロン細胞にリプログラミングすること
を含む、方法。
【請求項２６】
前記ニューロン細胞がグルタミン酸作動性ニューロンまたはコリン作動性ニューロンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
結果として得られたリプログラミングされた前記細胞が神経障害を有する対象に導入される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）、線維芽細胞、または胚性幹細胞である、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１８年８月２３日に提出された米国仮出願第６２／７２１，６７９号の優先権を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、治療有効量のＧｓｘ１タンパク質（例えばＧｓｘ１−細胞透過性ペプチド融合タンパク質）またはＧｓｘ１をコードする核酸分子を投与することにより神経障害を処置することによって、外傷性脊髄損傷もしくは脳損傷等の神経障害またはパーキンソン病等の障害を処置するための方法を提供する。
【０００３】
政府支援の承認
本発明は、米国教育省によって授与されたＰ２００Ａ１５０１３１の下、米国国立衛生研究所によって授与されたＴ３２ＧＭ００８３３９の下、および米国教育省によって授与されたＰ２００Ａ１５０１３１の下、政府支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
全米脊髄損傷統計センターによると、米国では毎年およそ１７，０００の新たな脊髄損傷（ＳＣＩ）の事例が存在する。ＳＣＩの主な原因としては、車両衝突、仕事に関連する損傷、転落、暴力行為、およびスポーツが挙げられる。ＳＣＩは、乏突起膠細胞、ニューロン、および星細胞の著しい喪失を引き起こし、長期ケアを必要とする病的状態および身体障害の原因となる。広範囲にわたる探究にもかかわらず、ＳＣＩ後の神経再生および機能回復は非常に困難である。
【０００５】
ＳＣＩ後に機能を取り戻すためには、傷害された局所回路網の修復および再構築が必要である。神経の再生における主な課題としては、成体の脊髄における限定されたレベルの神経発生、損傷部位における神経発生、軸索再生、ニューロン中継点形成、およびミエリン形成を阻害する炎症性微小環境が挙げられる（Tran  et  al.,  Physiol  Rev  98:881-917  (2018)）。ＳＣＩは、傷害修復および再生の潜在的な細胞源を提供する、上衣領域における中心管付近に存在する内在性神経幹細胞および前駆細胞（ＮＳＰＣ）を活性化する（Lacroix  et  al.,  PLoS  One  9,:e85916  (2014)）。しかしながら、脊髄における成体ＮＳＰＣは大部分が星細胞および乏突起膠細胞に分化し、ごく一部のみがニューロンに分化する（Sabelstrom  et  al.,  Exp  Neurol  260:44-49  (2014)）。傷害された脊髄を幹細胞療法および神経原性転写因子（Ｓｏｘ２、ＮｅｕｒｏＤ１、およびＯｌｉｇ２）の強制発現によって修復および再生して、損傷した脊髄においてニューロンを生成する取組みがなされている（Chen  et  al.,  Brain  Res  Bull  135,  143-148  (2017)）。しかしながら、これらの手法は、限定的な機能改善をもたらすかまたは機能改善をもたらさない。さらに、損傷に誘導された反応性星細胞は、軸索の成長および発芽を妨げるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を産生し、永続的な機能障害をもたらす。グリア性瘢痕形成を減弱する試みは、この手法の、軸索の再生を促進する可能性を示している。にもかかわらず、瘢痕組織を減少させるだけでは十分な機能改善を促進しない（Dias  et  al.,  Cell  173:153-165  e122  (2018)）。加えて、ＳＣＩは、損傷を免れた軸索を非機能的にするＧＡＢＡ作動性ニューロンによる過剰抑制を誘導する（Courtine  et  al.,  Nat  Med  14:69-74  (2008)）。抑制性介在ニューロンの興奮性を低下させるかまたは興奮／抑制比を再び確立することによって、休眠状態の中継経路が再び活性化し、改善した歩行運動機能をもたらす可能性がある（Chen  et  al.,  Cell  174:1599  (2018)）。
ゲノムスクリーニングホメオボックス１（Ｇｓｘ１またはＧｓｈ１）は、胚形成期の中枢神経系において高度に発現する神経原性因子である（Gong  et  al.,  Nature  425:917-925  (2003)）。脊髄の発生の間、Ｇｓｘ１とその相同体のＧｓｘ２とは神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）の増殖および分化を調節する。成体の脊髄では、Ｇｓｘ１発現は低いかまたは検出されない（Chen  et  al.,  PLoS  One  8,  e72567  (2013)）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tran  et  al.,  Physiol  Rev  98:881-917  (2018)
【非特許文献２】Lacroix  et  al.,  PLoS  One  9,:e85916  (2014)
【非特許文献３】Sabelstrom  et  al.,  Exp  Neurol  260:44-49  (2014)
【非特許文献４】Chen  et  al.,  Brain  Res  Bull  135,  143-148  (2017)
【非特許文献５】Dias  et  al.,  Cell  173:153-165  e122  (2018)
【非特許文献６】Courtine  et  al.,  Nat  Med  14:69-74  (2008)
【非特許文献７】Chen  et  al.,  Cell  174:1599  (2018)
【非特許文献８】Gong  et  al.,  Nature  425:917-925  (2003)
【非特許文献９】Chen  et  al.,  PLoS  One  8,  e72567  (2013)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
外側片側切断損傷を有する成体マウス脊髄にＧｓｘ１を形質導入するためのレンチウイルス媒介遺伝子発現系の使用が、損傷部位における細胞増殖およびＮＳＰＣの活性化を促進するＧｓｘ１発現をもたらすことが本明細書に示される。さらに、損傷部位またはその近傍におけるレンチウイルス媒介Ｇｓｘ１発現（Ｇｓｘ１処置）は、グルタミン酸作動性およびコリン作動性ニューロンの数を増加させ、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数を減少させる。Ｇｓｘ１処置は、損傷したマウスにおいてグリア性瘢痕形成を減弱し、歩行運動機能を劇的に改善した。全ゲノムトランスクリプトーム分析は、Ｇｓｘ１処置がＮＳＰＣ活性化、すなわちニューロン分化と相関するＮｏｔｃｈシグナル伝達経路を誘導することを明らかにし、Ｇｓｘ１媒介機能回復に関する分子的洞察を提供する。
【０００８】
これらの観察に基づいて、ヒトまたは獣医学的対象等の哺乳動物対象における神経障害を処置する方法が本明細書において提供される。神経障害は、脊髄損傷、脳損傷、または両方、例えば頭部および／または脊髄外傷に起因するもの、例えば、車両衝突、転落、暴力行為、またはスポーツによって引き起こされるものであり得る。一部の例では、神経障害は神経変性疾患、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、虚血、てんかん、ハンチントン病、多発性硬化症、または筋萎縮性側索硬化症である。そのような方法は、神経発生を増加させること、炎症を軽減すること、細胞死を減少させること、アストログリオーシスを低減すること、グリア性瘢痕化を低減すること、対象の歩行運動を増加させること、またはそれらの組合せが可能である。一部の例では、方法は、神経発生を増加させ、アストログリオーシスを低減し、グリア性瘢痕化を低減し、対象の歩行運動を増加させる。
【０００９】
一部の例では、方法は、対象に治療有効量のＧｓｘ１タンパク質（例えば配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｓｘ１タンパク質）を投与するか、または対象に治療有効量のＧｓｘ１をコードする核酸分子（例えば配列番号１または３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む核酸分子）を投与することにより神経障害を処置することを含む。一例では、投与されるＧｓｘ１タンパク質は、Ｇｓｘ１融合タンパク質、例えばＧｓｘ１ドメイン（例えば配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｓｘ１ドメイン）と、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ドメイン（例えば配列番号６１〜７９のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＰＰドメイン）とを含み、Ｇｓｘ１ドメインとＣＰＰドメインとが、間接的に（例えば配列番号８０または８１等のリンカーを介して）または直接連結していてもよい、Ｇｓｘ１融合タンパク質である。一例では、Ｇｓｘ１をコードする核酸分子、例えばＣＰＰドメインに作動可能に連結したＧｓｘ１ドメイン（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を含むか、または配列番号２もしくは４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を含むタンパク質をコードするＧｓｘ１ドメイン）をコードする核酸分子（例えば配列番号６１〜７９のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＰＰドメインをコードする核酸分子）は、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする。一部の例では、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはこれらのタンパク質のうちの一方をコードする核酸分子は単離または精製される。投与は注射、例えばＣＮＳ（例えば脊髄または脳）への注射を含むことができる。
【００１０】
一部の例では、Ｇｓｘ１（例えばＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質）をコードする核酸分子は、プラスミドまたはレンチウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等のウイルスベクターを含むかまたはそれらの一部である。Ｇｓｘ１（例えばＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質）をコードする核酸分子は、プロモーター、およびエンハンサー、または両方に作動可能に連結していてもよい。例示的なプロモーターとしては、構成的プロモーター（例えばＣＭＶ）または中枢神経系（ＣＮＳ）特異的プロモーター（例えば、シナプシン（synapasin）１（Ｓｙｎ１）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ネスチン（ＮＥＳ）プロモーター、ミエリン関連乏突起膠細胞塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーター、またはフォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）プロモーター）が挙げられる。例示的なエンハンサーは、神経特異的エンハンサー、例えばＮｏｔｃｈ１ＣＲ２（例えばTzatzalos  et  al.,  Dev  Biol.  372(2):217-28,  2012）またはＯｌｉｇ２ＣＲ５（Hao  et  al.,  Dev  Biol.  393(1):183-93,  2014）である。
【００１１】
１回または複数回用量のＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはＧｓｘ１（例えばＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質）をコードする核酸分子が投与され得る。一例では、治療有効量のＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはＧｓｘ１（例えばＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質）をコードする核酸分子の少なくとも２回の別個の投与が対象に、例えば、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも９か月、または少なくとも１年空けて与えられる。一部の例では、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはＧｓｘ１（例えばＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質）をコードする核酸分子は、神経障害の発症の１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、１か月以内、２か月以内、または３か月以内（例えば神経障害の原因となる外傷性事象後、この量の時間以内）に投与される。他の神経障害治療剤もまた投与することができる。
【００１２】
開示される方法と共に使用することができる組成物もまた提供される。一例では、組成物は、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む単離されたＧｓｘ１タンパク質とリポソームとを含み、Ｇｓｘ１タンパク質はリポソームに封入される。一例では、組成物は、（１）配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｓｘ１ドメインと、（２）細胞透過性ペプチドドメイン（例えば配列番号６１〜７９のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する細胞透過性ペプチドドメイン）とを含む融合タンパク質を含む。そのような融合タンパク質はリポソームに封入することができる。一例では、組成物は、配列番号１または３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｓｘ１をコードする核酸分子とリポソームとを含み、そのような核酸分子は、リポソームに封入され、プラスミドまたはレンチウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等のウイルスベクターを含むかまたはそれらの一部である。一例では、組成物は、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子、例えばＣＰＰドメインに作動可能に連結したＧｓｘ１ドメイン（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を含むか、または配列番号２もしくは４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を含むタンパク質をコードするＧｓｘ１ドメイン）をコードする核酸分子（例えば配列番号６１〜７９のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＰＰドメインをコードする核酸分子）とリポソームとを含み、そのような核酸分子は、リポソームに封入され、プラスミドまたはレンチウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等のウイルスベクターを含むかまたはそれらの一部である。開示される組成物は他の材料、例えば薬学的に許容される担体、例えば水または生理食塩水をさらに含むことができる。開示される組成物は他の材料、例えば薬学的に許容される担体、例えば水または生理食塩水をさらに含むことができる。
【００１３】
本開示の前述および他の目的および特徴は、添付の図面を参照して行われる以下の詳細な説明から、より明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａ〜１Ｇ：Ｇｓｘ１発現は損傷した脊髄において細胞増殖を促進する。外側片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ９〜Ｔ１０レベル付近において実施し、直後に、Ｇｓｘ１をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルスの注射を行った（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ）。レポーターＲＦＰのみをコードするレンチウイルスを対照として使用した（レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）。脊髄組織を、免疫組織化学、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、独創性経路分析（ＩＰＡ）（Ingenuity  Pathway  Analysis）、およびＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって分析した；スケールバー＝１００μｍ（Ａ）。３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよび細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を示す（Ｓｈａｍに関してはｎ＝３、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６）。矢印はＫｉ６７＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ（Ｂ）。全てのＫｉ６７＋細胞（Ｃ）およびＫｉ６７＋／ＲＦＰ＋細胞（Ｄ）の定量。ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、Ｓｈａｍに対して正規化した３ＤＰＩにおけるＫｉ６７  ｍＲＮＡ発現量を示す；ｎ＝４（Ｅ）。ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、レンチ−Ｃｔｒｌ処置と比較したレンチ−Ｇｓｘ１処置後との間の、増殖を阻害することが公知の発現変動遺伝子の一覧表（ｎ＝３）（Ｆ）。ＳＴＡＲおよびｅｄｇｅＲによって作成した、細胞増殖を促進することが公知の遺伝子発現量箱ひげ図；＊＝変動が有意（Ｇ）。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定。
【図１Ｃ−１Ｄ】図１Ａ〜１Ｇ：Ｇｓｘ１発現は損傷した脊髄において細胞増殖を促進する。外側片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ９〜Ｔ１０レベル付近において実施し、直後に、Ｇｓｘ１をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルスの注射を行った（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ）。レポーターＲＦＰのみをコードするレンチウイルスを対照として使用した（レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）。脊髄組織を、免疫組織化学、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、独創性経路分析（ＩＰＡ）（Ingenuity  Pathway  Analysis）、およびＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって分析した；スケールバー＝１００μｍ（Ａ）。３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよび細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を示す（Ｓｈａｍに関してはｎ＝３、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６）。矢印はＫｉ６７＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ（Ｂ）。全てのＫｉ６７＋細胞（Ｃ）およびＫｉ６７＋／ＲＦＰ＋細胞（Ｄ）の定量。ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、Ｓｈａｍに対して正規化した３ＤＰＩにおけるＫｉ６７  ｍＲＮＡ発現量を示す；ｎ＝４（Ｅ）。ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、レンチ−Ｃｔｒｌ処置と比較したレンチ−Ｇｓｘ１処置後との間の、増殖を阻害することが公知の発現変動遺伝子の一覧表（ｎ＝３）（Ｆ）。ＳＴＡＲおよびｅｄｇｅＲによって作成した、細胞増殖を促進することが公知の遺伝子発現量箱ひげ図；＊＝変動が有意（Ｇ）。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定。
【図１Ｅ−１Ｇ】図１Ａ〜１Ｇ：Ｇｓｘ１発現は損傷した脊髄において細胞増殖を促進する。外側片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ９〜Ｔ１０レベル付近において実施し、直後に、Ｇｓｘ１をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルスの注射を行った（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ）。レポーターＲＦＰのみをコードするレンチウイルスを対照として使用した（レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）。脊髄組織を、免疫組織化学、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、独創性経路分析（ＩＰＡ）（Ingenuity  Pathway  Analysis）、およびＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって分析した；スケールバー＝１００μｍ（Ａ）。３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよび細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を示す（Ｓｈａｍに関してはｎ＝３、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６）。矢印はＫｉ６７＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ（Ｂ）。全てのＫｉ６７＋細胞（Ｃ）およびＫｉ６７＋／ＲＦＰ＋細胞（Ｄ）の定量。ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、Ｓｈａｍに対して正規化した３ＤＰＩにおけるＫｉ６７  ｍＲＮＡ発現量を示す；ｎ＝４（Ｅ）。ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、レンチ−Ｃｔｒｌ処置と比較したレンチ−Ｇｓｘ１処置後との間の、増殖を阻害することが公知の発現変動遺伝子の一覧表（ｎ＝３）（Ｆ）。ＳＴＡＲおよびｅｄｇｅＲによって作成した、細胞増殖を促進することが公知の遺伝子発現量箱ひげ図；＊＝変動が有意（Ｇ）。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定。
【００１５】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ〜２Ｅ：レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰの形質導入はＳＣＩ後にＧｓｘ１を首尾良く送達し過剰発現させる。片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ１０付近において実施した。ＣｔｒｌまたはＧｓｘ１遺伝子をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルス注射の直後。動物を３ＤＰＩ（Ａ）および７ＤＰＩ（Ｂ）に捕獲し、矢状切片を、Ｇｓｘ１抗体を用いて免疫染色する。矢状切片における矢印はＲＦＰとＧｓｘ１との共発現を示す（緑色）。それぞれの画像の右側のモンタージュは、共発現を示す、別個のチャネル（ＤＡＰＩ、ＲＦＰ、およびＧｓｘ１）を用いた矢状切片の小さな領域（白い四角）を示す。スケールバー＝５０μｍ。３ＤＰＩ（Ｃ）および７ＤＰＩ（Ｄ）における、Ｇｓｘ１を用いて同時標識したウイルス形質導入細胞の定量。（Ｅ）Ｓｈａｍに対して正規化した３ＤＰＩにおけるＧｓｘ１  ｍＲＮＡ発現量を示すＲＴ−ｑＰＣＲ分析。ｎ＝３；平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；一元配置分散分析およびテューキー事後分析。ＤＰＩ＝損傷後日数。
【図２Ｃ−２Ｅ】図２Ａ〜２Ｅ：レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰの形質導入はＳＣＩ後にＧｓｘ１を首尾良く送達し過剰発現させる。片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ１０付近において実施した。ＣｔｒｌまたはＧｓｘ１遺伝子をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルス注射の直後。動物を３ＤＰＩ（Ａ）および７ＤＰＩ（Ｂ）に捕獲し、矢状切片を、Ｇｓｘ１抗体を用いて免疫染色する。矢状切片における矢印はＲＦＰとＧｓｘ１との共発現を示す（緑色）。それぞれの画像の右側のモンタージュは、共発現を示す、別個のチャネル（ＤＡＰＩ、ＲＦＰ、およびＧｓｘ１）を用いた矢状切片の小さな領域（白い四角）を示す。スケールバー＝５０μｍ。３ＤＰＩ（Ｃ）および７ＤＰＩ（Ｄ）における、Ｇｓｘ１を用いて同時標識したウイルス形質導入細胞の定量。（Ｅ）Ｓｈａｍに対して正規化した３ＤＰＩにおけるＧｓｘ１  ｍＲＮＡ発現量を示すＲＴ−ｑＰＣＲ分析。ｎ＝３；平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；一元配置分散分析およびテューキー事後分析。ＤＰＩ＝損傷後日数。
【００１６】
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃ：ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析。（Ａ）各群（ＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１）に関して３つの異なる時点（３ＤＰＩ、１４ＤＰＩ、および３５ＤＰＩ）においてＲＮＡ−Ｓｅｑ分析のために使用した生物学的反復の数。（Ｂ）３ＤＰＩ、１４ＤＰＩ、および３５ＤＰＩにおいて上方調節および下方調節する発現変動遺伝子（ＤＥＧ）の総数（ｐ＜０．０５）。（Ｃ）発現変動遺伝子を示す、３ＤＰＩ、１４ＤＰＩ、および３５ＤＰＩにおけるボルケーノプロット。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃ：ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析。（Ａ）各群（ＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１）に関して３つの異なる時点（３ＤＰＩ、１４ＤＰＩ、および３５ＤＰＩ）においてＲＮＡ−Ｓｅｑ分析のために使用した生物学的反復の数。（Ｂ）３ＤＰＩ、１４ＤＰＩ、および３５ＤＰＩにおいて上方調節および下方調節する発現変動遺伝子（ＤＥＧ）の総数（ｐ＜０．０５）。（Ｃ）発現変動遺伝子を示す、３ＤＰＩ、１４ＤＰＩ、および３５ＤＰＩにおけるボルケーノプロット。
【００１７】
【図３Ｄ】図３Ｄ〜３Ｆ。（Ｄ）３ＤＰＩ、（Ｅ）１４ＤＰＩ、および（Ｆ）３５ＣＰＩにおける上位４０の発現変動遺伝子（ＤＥＧ）。３ＤＰＩ、１４ＤＰＩ、および３５ＤＰＩそれぞれにおける、ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群とＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群との間の上位４０のＤＥＧのヒートマップ。青色は遺伝子発現量の下方調節を示し、黄色は上方調節を示す；ｎ＝３。
【図３Ｅ】図３Ｄ〜３Ｆ。（Ｄ）３ＤＰＩ、（Ｅ）１４ＤＰＩ、および（Ｆ）３５ＣＰＩにおける上位４０の発現変動遺伝子（ＤＥＧ）。３ＤＰＩ、１４ＤＰＩ、および３５ＤＰＩそれぞれにおける、ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群とＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群との間の上位４０のＤＥＧのヒートマップ。青色は遺伝子発現量の下方調節を示し、黄色は上方調節を示す；ｎ＝３。
【図３Ｆ】図３Ｄ〜３Ｆ。（Ｄ）３ＤＰＩ、（Ｅ）１４ＤＰＩ、および（Ｆ）３５ＣＰＩにおける上位４０の発現変動遺伝子（ＤＥＧ）。３ＤＰＩ、１４ＤＰＩ、および３５ＤＰＩそれぞれにおける、ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群とＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群との間の上位４０のＤＥＧのヒートマップ。青色は遺伝子発現量の下方調節を示し、黄色は上方調節を示す；ｎ＝３。
【００１８】
【図４】図４：３ＤＰＩにおける発現変動遺伝子（ＤＥＧ）に関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語の機能エンリッチメント。ＲＥＶＩＧＯを使用して二次元意味空間における散布図として表した生物学的プロセスに関するエンリッチメント用語。円のサイズはＧＯ用語のｌｏｇ１０（ｐ値）を示す。
【００１９】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｉ：Ｇｓｘ１発現はＳＣＩ後のＮＳＰＣ活性化を高める。（Ａ）３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよびＮＳＰＣマーカーＮｅｓｔｉｎの発現を示す（Ｓｈａｍに関してはｎ＝３、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６）。矢印はＮｅｓｔｉｎ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）全てのＮｅｓｔｉｎ＋細胞および（Ｃ）Ｎｅｓｔｉｎ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞の定量。（Ｄ）ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、Ｓｈａｍに対して正規化した３ＤＰＩにおけるＮｅｓｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現量を示す；ｎ＝４。（Ｅ）ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、レンチ−Ｃｔｒｌ処置と比較したレンチ−Ｇｓｘ１処置後の、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を促進する発現変動遺伝子の一覧表。（Ｆ）３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよびＮＳＰＣマーカーＮｏｔｃｈ１の発現を示す（ＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してｎ＝４）。矢印はＮｏｔｃｈ１＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）ＲＦＰ＋細胞のうちの全てのＮｏｔｃｈ１＋細胞の定量。（Ｈ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に関与する遺伝子（Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｒａｒｐ、Ｊａｇ１、Ｄｅｌ１、およびＨｅｓ１）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。（Ｉ）幹細胞およびＮａｎｏｇシグナル伝達経路と関連する遺伝子（例えば、Ａｋｔ２、Ｍａｐ２ｋ２、Ｐｉｋ３ｃｄ、Ｐｉｋ３ｃｇ、およびＲａｐ２ｂ）の遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定および一元配置分散分析と、それに続くテューキー事後検定。
【図５Ｂ−５Ｃ】図５Ａ〜５Ｉ：Ｇｓｘ１発現はＳＣＩ後のＮＳＰＣ活性化を高める。（Ａ）３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよびＮＳＰＣマーカーＮｅｓｔｉｎの発現を示す（Ｓｈａｍに関してはｎ＝３、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６）。矢印はＮｅｓｔｉｎ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）全てのＮｅｓｔｉｎ＋細胞および（Ｃ）Ｎｅｓｔｉｎ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞の定量。（Ｄ）ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、Ｓｈａｍに対して正規化した３ＤＰＩにおけるＮｅｓｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現量を示す；ｎ＝４。（Ｅ）ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、レンチ−Ｃｔｒｌ処置と比較したレンチ−Ｇｓｘ１処置後の、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を促進する発現変動遺伝子の一覧表。（Ｆ）３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよびＮＳＰＣマーカーＮｏｔｃｈ１の発現を示す（ＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してｎ＝４）。矢印はＮｏｔｃｈ１＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）ＲＦＰ＋細胞のうちの全てのＮｏｔｃｈ１＋細胞の定量。（Ｈ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に関与する遺伝子（Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｒａｒｐ、Ｊａｇ１、Ｄｅｌ１、およびＨｅｓ１）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。（Ｉ）幹細胞およびＮａｎｏｇシグナル伝達経路と関連する遺伝子（例えば、Ａｋｔ２、Ｍａｐ２ｋ２、Ｐｉｋ３ｃｄ、Ｐｉｋ３ｃｇ、およびＲａｐ２ｂ）の遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定および一元配置分散分析と、それに続くテューキー事後検定。
【図５Ｄ−５Ｅ】図５Ａ〜５Ｉ：Ｇｓｘ１発現はＳＣＩ後のＮＳＰＣ活性化を高める。（Ａ）３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよびＮＳＰＣマーカーＮｅｓｔｉｎの発現を示す（Ｓｈａｍに関してはｎ＝３、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６）。矢印はＮｅｓｔｉｎ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）全てのＮｅｓｔｉｎ＋細胞および（Ｃ）Ｎｅｓｔｉｎ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞の定量。（Ｄ）ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、Ｓｈａｍに対して正規化した３ＤＰＩにおけるＮｅｓｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現量を示す；ｎ＝４。（Ｅ）ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、レンチ−Ｃｔｒｌ処置と比較したレンチ−Ｇｓｘ１処置後の、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を促進する発現変動遺伝子の一覧表。（Ｆ）３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよびＮＳＰＣマーカーＮｏｔｃｈ１の発現を示す（ＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してｎ＝４）。矢印はＮｏｔｃｈ１＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）ＲＦＰ＋細胞のうちの全てのＮｏｔｃｈ１＋細胞の定量。（Ｈ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に関与する遺伝子（Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｒａｒｐ、Ｊａｇ１、Ｄｅｌ１、およびＨｅｓ１）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。（Ｉ）幹細胞およびＮａｎｏｇシグナル伝達経路と関連する遺伝子（例えば、Ａｋｔ２、Ｍａｐ２ｋ２、Ｐｉｋ３ｃｄ、Ｐｉｋ３ｃｇ、およびＲａｐ２ｂ）の遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定および一元配置分散分析と、それに続くテューキー事後検定。
【図５Ｆ−５Ｇ】図５Ａ〜５Ｉ：Ｇｓｘ１発現はＳＣＩ後のＮＳＰＣ活性化を高める。（Ａ）３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよびＮＳＰＣマーカーＮｅｓｔｉｎの発現を示す（Ｓｈａｍに関してはｎ＝３、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６）。矢印はＮｅｓｔｉｎ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）全てのＮｅｓｔｉｎ＋細胞および（Ｃ）Ｎｅｓｔｉｎ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞の定量。（Ｄ）ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、Ｓｈａｍに対して正規化した３ＤＰＩにおけるＮｅｓｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現量を示す；ｎ＝４。（Ｅ）ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、レンチ−Ｃｔｒｌ処置と比較したレンチ−Ｇｓｘ１処置後の、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を促進する発現変動遺伝子の一覧表。（Ｆ）３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよびＮＳＰＣマーカーＮｏｔｃｈ１の発現を示す（ＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してｎ＝４）。矢印はＮｏｔｃｈ１＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）ＲＦＰ＋細胞のうちの全てのＮｏｔｃｈ１＋細胞の定量。（Ｈ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に関与する遺伝子（Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｒａｒｐ、Ｊａｇ１、Ｄｅｌ１、およびＨｅｓ１）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。（Ｉ）幹細胞およびＮａｎｏｇシグナル伝達経路と関連する遺伝子（例えば、Ａｋｔ２、Ｍａｐ２ｋ２、Ｐｉｋ３ｃｄ、Ｐｉｋ３ｃｇ、およびＲａｐ２ｂ）の遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定および一元配置分散分析と、それに続くテューキー事後検定。
【図５Ｈ−５Ｉ】図５Ａ〜５Ｉ：Ｇｓｘ１発現はＳＣＩ後のＮＳＰＣ活性化を高める。（Ａ）３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよびＮＳＰＣマーカーＮｅｓｔｉｎの発現を示す（Ｓｈａｍに関してはｎ＝３、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６）。矢印はＮｅｓｔｉｎ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）全てのＮｅｓｔｉｎ＋細胞および（Ｃ）Ｎｅｓｔｉｎ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞の定量。（Ｄ）ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、Ｓｈａｍに対して正規化した３ＤＰＩにおけるＮｅｓｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現量を示す；ｎ＝４。（Ｅ）ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、レンチ−Ｃｔｒｌ処置と比較したレンチ−Ｇｓｘ１処置後の、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を促進する発現変動遺伝子の一覧表。（Ｆ）３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰおよびＮＳＰＣマーカーＮｏｔｃｈ１の発現を示す（ＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してｎ＝４）。矢印はＮｏｔｃｈ１＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｇ）ＲＦＰ＋細胞のうちの全てのＮｏｔｃｈ１＋細胞の定量。（Ｈ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に関与する遺伝子（Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｒａｒｐ、Ｊａｇ１、Ｄｅｌ１、およびＨｅｓ１）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。（Ｉ）幹細胞およびＮａｎｏｇシグナル伝達経路と関連する遺伝子（例えば、Ａｋｔ２、Ｍａｐ２ｋ２、Ｐｉｋ３ｃｄ、Ｐｉｋ３ｃｇ、およびＲａｐ２ｂ）の遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定および一元配置分散分析と、それに続くテューキー事後検定。
【００２０】
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ〜６Ｇ：Ｇｓｘ１はＳＣＩ後の成体の脊髄において神経発生を誘導する。１４ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰならびに初期ニューロンのマーカー（Ａ）ダブルコルチンＤＣＸ、（Ｂ）星細胞マーカーＧＦＡＰ、および（Ｃ）乏突起膠細胞前駆体マーカーＰＤＧＦＲａの発現を示す。矢印は細胞マーカー＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｄ）ＤＣＸ、ＧＦＡＰ、またはＰＤＧＦＲａを用いて同時標識したウイルス形質導入細胞の定量；ｎ＝６。３５ＤＰＩにおけるＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群とＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群との間の（Ｅ）ＤＣＸ、（Ｆ）ＧＦＡＰ、および（Ｇ）ＰＤＧＦＲａの遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定。
【図６Ｄ−６Ｅ】図６Ａ〜６Ｇ：Ｇｓｘ１はＳＣＩ後の成体の脊髄において神経発生を誘導する。１４ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰならびに初期ニューロンのマーカー（Ａ）ダブルコルチンＤＣＸ、（Ｂ）星細胞マーカーＧＦＡＰ、および（Ｃ）乏突起膠細胞前駆体マーカーＰＤＧＦＲａの発現を示す。矢印は細胞マーカー＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｄ）ＤＣＸ、ＧＦＡＰ、またはＰＤＧＦＲａを用いて同時標識したウイルス形質導入細胞の定量；ｎ＝６。３５ＤＰＩにおけるＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群とＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群との間の（Ｅ）ＤＣＸ、（Ｆ）ＧＦＡＰ、および（Ｇ）ＰＤＧＦＲａの遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定。
【図６Ｆ−６Ｇ】図６Ａ〜６Ｇ：Ｇｓｘ１はＳＣＩ後の成体の脊髄において神経発生を誘導する。１４ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰならびに初期ニューロンのマーカー（Ａ）ダブルコルチンＤＣＸ、（Ｂ）星細胞マーカーＧＦＡＰ、および（Ｃ）乏突起膠細胞前駆体マーカーＰＤＧＦＲａの発現を示す。矢印は細胞マーカー＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｄ）ＤＣＸ、ＧＦＡＰ、またはＰＤＧＦＲａを用いて同時標識したウイルス形質導入細胞の定量；ｎ＝６。３５ＤＰＩにおけるＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群とＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群との間の（Ｅ）ＤＣＸ、（Ｆ）ＧＦＡＰ、および（Ｇ）ＰＤＧＦＲａの遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定。
【００２１】
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ〜７Ｄ：Ｇｓｘ１は脊髄組織の背側および腹側領域において同等のレベルの神経発生を誘導する。１４ＤＰＩにおける脊髄組織の横断切片（背側および腹側）の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰならびに初期ニューロンのマーカー（Ａ）ダブルコルチンＤＣＸ、（Ｂ）星細胞マーカーＧＦＡＰ、および（Ｃ）乏突起膠細胞前駆体マーカーＰＤＧＦＲａの発現を示す。矢印は細胞マーカー＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｄ）脊髄の概略図および低倍率図。スケールバー＝１００μｍ。
【図７Ｄ】図７Ａ〜７Ｄ：Ｇｓｘ１は脊髄組織の背側および腹側領域において同等のレベルの神経発生を誘導する。１４ＤＰＩにおける脊髄組織の横断切片（背側および腹側）の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰならびに初期ニューロンのマーカー（Ａ）ダブルコルチンＤＣＸ、（Ｂ）星細胞マーカーＧＦＡＰ、および（Ｃ）乏突起膠細胞前駆体マーカーＰＤＧＦＲａの発現を示す。矢印は細胞マーカー＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｄ）脊髄の概略図および低倍率図。スケールバー＝１００μｍ。
【００２２】
【図８Ａ】図８Ａ：１４ＤＰＩにおける発現変動遺伝子（ＤＥＧ）に関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語の機能エンリッチメント。ＲＥＶＩＧＯを使用して二次元意味空間における散布図として表した生物学的プロセスに関するエンリッチメント用語。円のサイズはＧＯ用語のｌｏｇ１０（ｐ値）を示す。
【００２３】
【図８Ｂ−８Ｃ】図８Ｂ〜８Ｃ。Ｇｓｘ１処置はＳＣＩ後の乏突起膠細胞の数を変化させない。片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ１０付近において実施した。ＣｔｒｌまたはＧｓｘ１遺伝子をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルス注射の直後。（Ｂ）動物を５６ＤＰＩに捕獲し、矢状切片を、乏突起膠細胞マーカーＯｌｉｇ２を用いて免疫染色する。画像の左下は、共発現を示す、白い破線によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を含む。スケールバー＝２０μｍ。（Ｃ）５６ＤＰＩにおけるＯｌｉｇ２＋／ＲＦＰ＋の定量。ｎ＝６；平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定。
【００２４】
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａ〜９Ｆ：Ｇｓｘ１はグルタミン酸作動性およびコリン作動性介在ニューロンを誘導し、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを減少させる。５６ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰならびに（Ａ）成熟ニューロンのマーカーＮｅｕＮ、（Ｂ）コリン作動性ニューロンのマーカーＣｈＡＴ、（Ｃ）グルタミン酸作動性ニューロンのマーカーｖＧｌｕｔ２、および（Ｄ）ＧＡＢＡ作動性ニューロンのマーカーＧＡＢＡの発現を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｅ）細胞マーカーを用いて同時標識したウイルス形質導入細胞の定量（ｎ＝６）。（Ｆ）シャム群に対して正規化した成熟ニューロンと関連する遺伝子（ＮｅｕＮまたはＨｒｎｂｐ３、ｖＧｌｕｔまたはＳｌｃ１７ａ６、およびＣｈａｔ）のｍＲＮＡレベルを測定するＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝４）。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定および一元配置分散分析と、それに続くテューキー事後検定およびスチューデントのｔ検定。
【図９Ｅ−９Ｆ】図９Ａ〜９Ｆ：Ｇｓｘ１はグルタミン酸作動性およびコリン作動性介在ニューロンを誘導し、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを減少させる。５６ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の共焦点画像は、ウイルスレポーターＲＦＰならびに（Ａ）成熟ニューロンのマーカーＮｅｕＮ、（Ｂ）コリン作動性ニューロンのマーカーＣｈＡＴ、（Ｃ）グルタミン酸作動性ニューロンのマーカーｖＧｌｕｔ２、および（Ｄ）ＧＡＢＡ作動性ニューロンのマーカーＧＡＢＡの発現を示す。左下隅の画像は、白い破線の四角によって指示された区域のより高倍率のｚスタック画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。（Ｅ）細胞マーカーを用いて同時標識したウイルス形質導入細胞の定量（ｎ＝６）。（Ｆ）シャム群に対して正規化した成熟ニューロンと関連する遺伝子（ＮｅｕＮまたはＨｒｎｂｐ３、ｖＧｌｕｔまたはＳｌｃ１７ａ６、およびＣｈａｔ）のｍＲＮＡレベルを測定するＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝４）。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定および一元配置分散分析と、それに続くテューキー事後検定およびスチューデントのｔ検定。
【００２５】
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｉ：減弱したアストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成。（Ａ）３ＤＰＩ（ｎ＝４）および（Ｂ）３５ＤＰＩ（ｎ＝４）の脊髄組織における反応性星細胞マーカー遺伝子ＧｆａｐおよびＳｅｒｐｉｎａ３ｎのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。（Ｃ）１４ＤＰＩおよび３５ＤＰＩにおけるＳＣＩ＋ＣｔｒｌとＳＣＩ＋Ｇｓｘ１との間の、反応性星細胞（ＲＡ）と関連する発現変動遺伝子（ＤＥＧ）（例えば、Ｍｍｍｐ１３、Ｍｍｐ２、Ｎｅｓ、Ａｘｉｎ２、Ｐｌａｕｒ、およびＣｔｎｎｂ１）、瘢痕形成星細胞（ＳＡ）と関連するＤＥＧ（例えばＳｌｉｔ２およびＳｏｘ９）、ならびにＲＡとＳＡの両方と関連するＤＥＧ（例えばＧｆａｐおよびＶｉｍ）。（Ｄ）１４ＤＰＩおよび（Ｅ）３５ＤＰＩにおけるＲＡおよびＳＡ関連遺伝子の発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。５６ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の画像は、ウイルスレポーターＲＦＰ、（Ｆ）グリア性瘢痕マーカーＧＦＡＰ、および（Ｈ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）マーカーＣＳ５６の発現を示す。損傷部位付近の、（Ｇ）抗ＧＦＡＰおよび（Ｉ）抗ＣＳ５６を用いて免疫染色した区域の定量は、ＧＦＡＰおよびＣＳ５６の減少したシグナルを示す。スケールバー＝５０μｍ、Ｓｈａｍに関してはｎ＝４、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定。ＤＰＩ＝損傷後日数。
【図１０Ｃ−１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｉ：減弱したアストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成。（Ａ）３ＤＰＩ（ｎ＝４）および（Ｂ）３５ＤＰＩ（ｎ＝４）の脊髄組織における反応性星細胞マーカー遺伝子ＧｆａｐおよびＳｅｒｐｉｎａ３ｎのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。（Ｃ）１４ＤＰＩおよび３５ＤＰＩにおけるＳＣＩ＋ＣｔｒｌとＳＣＩ＋Ｇｓｘ１との間の、反応性星細胞（ＲＡ）と関連する発現変動遺伝子（ＤＥＧ）（例えば、Ｍｍｍｐ１３、Ｍｍｐ２、Ｎｅｓ、Ａｘｉｎ２、Ｐｌａｕｒ、およびＣｔｎｎｂ１）、瘢痕形成星細胞（ＳＡ）と関連するＤＥＧ（例えばＳｌｉｔ２およびＳｏｘ９）、ならびにＲＡとＳＡの両方と関連するＤＥＧ（例えばＧｆａｐおよびＶｉｍ）。（Ｄ）１４ＤＰＩおよび（Ｅ）３５ＤＰＩにおけるＲＡおよびＳＡ関連遺伝子の発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。５６ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の画像は、ウイルスレポーターＲＦＰ、（Ｆ）グリア性瘢痕マーカーＧＦＡＰ、および（Ｈ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）マーカーＣＳ５６の発現を示す。損傷部位付近の、（Ｇ）抗ＧＦＡＰおよび（Ｉ）抗ＣＳ５６を用いて免疫染色した区域の定量は、ＧＦＡＰおよびＣＳ５６の減少したシグナルを示す。スケールバー＝５０μｍ、Ｓｈａｍに関してはｎ＝４、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定。ＤＰＩ＝損傷後日数。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｉ：減弱したアストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成。（Ａ）３ＤＰＩ（ｎ＝４）および（Ｂ）３５ＤＰＩ（ｎ＝４）の脊髄組織における反応性星細胞マーカー遺伝子ＧｆａｐおよびＳｅｒｐｉｎａ３ｎのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。（Ｃ）１４ＤＰＩおよび３５ＤＰＩにおけるＳＣＩ＋ＣｔｒｌとＳＣＩ＋Ｇｓｘ１との間の、反応性星細胞（ＲＡ）と関連する発現変動遺伝子（ＤＥＧ）（例えば、Ｍｍｍｐ１３、Ｍｍｐ２、Ｎｅｓ、Ａｘｉｎ２、Ｐｌａｕｒ、およびＣｔｎｎｂ１）、瘢痕形成星細胞（ＳＡ）と関連するＤＥＧ（例えばＳｌｉｔ２およびＳｏｘ９）、ならびにＲＡとＳＡの両方と関連するＤＥＧ（例えばＧｆａｐおよびＶｉｍ）。（Ｄ）１４ＤＰＩおよび（Ｅ）３５ＤＰＩにおけるＲＡおよびＳＡ関連遺伝子の発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。５６ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の画像は、ウイルスレポーターＲＦＰ、（Ｆ）グリア性瘢痕マーカーＧＦＡＰ、および（Ｈ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）マーカーＣＳ５６の発現を示す。損傷部位付近の、（Ｇ）抗ＧＦＡＰおよび（Ｉ）抗ＣＳ５６を用いて免疫染色した区域の定量は、ＧＦＡＰおよびＣＳ５６の減少したシグナルを示す。スケールバー＝５０μｍ、Ｓｈａｍに関してはｎ＝４、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定。ＤＰＩ＝損傷後日数。
【図１０Ｆ１０Ｈ】図１０Ａ〜１０Ｉ：減弱したアストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成。（Ａ）３ＤＰＩ（ｎ＝４）および（Ｂ）３５ＤＰＩ（ｎ＝４）の脊髄組織における反応性星細胞マーカー遺伝子ＧｆａｐおよびＳｅｒｐｉｎａ３ｎのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。（Ｃ）１４ＤＰＩおよび３５ＤＰＩにおけるＳＣＩ＋ＣｔｒｌとＳＣＩ＋Ｇｓｘ１との間の、反応性星細胞（ＲＡ）と関連する発現変動遺伝子（ＤＥＧ）（例えば、Ｍｍｍｐ１３、Ｍｍｐ２、Ｎｅｓ、Ａｘｉｎ２、Ｐｌａｕｒ、およびＣｔｎｎｂ１）、瘢痕形成星細胞（ＳＡ）と関連するＤＥＧ（例えばＳｌｉｔ２およびＳｏｘ９）、ならびにＲＡとＳＡの両方と関連するＤＥＧ（例えばＧｆａｐおよびＶｉｍ）。（Ｄ）１４ＤＰＩおよび（Ｅ）３５ＤＰＩにおけるＲＡおよびＳＡ関連遺伝子の発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。５６ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の画像は、ウイルスレポーターＲＦＰ、（Ｆ）グリア性瘢痕マーカーＧＦＡＰ、および（Ｈ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）マーカーＣＳ５６の発現を示す。損傷部位付近の、（Ｇ）抗ＧＦＡＰおよび（Ｉ）抗ＣＳ５６を用いて免疫染色した区域の定量は、ＧＦＡＰおよびＣＳ５６の減少したシグナルを示す。スケールバー＝５０μｍ、Ｓｈａｍに関してはｎ＝４、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定。ＤＰＩ＝損傷後日数。
【図１０Ｇ１０Ｉ】図１０Ａ〜１０Ｉ：減弱したアストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成。（Ａ）３ＤＰＩ（ｎ＝４）および（Ｂ）３５ＤＰＩ（ｎ＝４）の脊髄組織における反応性星細胞マーカー遺伝子ＧｆａｐおよびＳｅｒｐｉｎａ３ｎのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。（Ｃ）１４ＤＰＩおよび３５ＤＰＩにおけるＳＣＩ＋ＣｔｒｌとＳＣＩ＋Ｇｓｘ１との間の、反応性星細胞（ＲＡ）と関連する発現変動遺伝子（ＤＥＧ）（例えば、Ｍｍｍｐ１３、Ｍｍｐ２、Ｎｅｓ、Ａｘｉｎ２、Ｐｌａｕｒ、およびＣｔｎｎｂ１）、瘢痕形成星細胞（ＳＡ）と関連するＤＥＧ（例えばＳｌｉｔ２およびＳｏｘ９）、ならびにＲＡとＳＡの両方と関連するＤＥＧ（例えばＧｆａｐおよびＶｉｍ）。（Ｄ）１４ＤＰＩおよび（Ｅ）３５ＤＰＩにおけるＲＡおよびＳＡ関連遺伝子の発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す遺伝子発現量箱ひげ図。各点は、１つの生物学的反復試料に関して遺伝子発現量をｌｏｇ２（百万当たりのカウント数）として表す。５６ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片の画像は、ウイルスレポーターＲＦＰ、（Ｆ）グリア性瘢痕マーカーＧＦＡＰ、および（Ｈ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）マーカーＣＳ５６の発現を示す。損傷部位付近の、（Ｇ）抗ＧＦＡＰおよび（Ｉ）抗ＣＳ５６を用いて免疫染色した区域の定量は、ＧＦＡＰおよびＣＳ５６の減少したシグナルを示す。スケールバー＝５０μｍ、Ｓｈａｍに関してはｎ＝４、ならびにＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１に関してはｎ＝６。平均±ＳＥＭ；＊＝ｐ＜０．０５；一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定。ＤＰＩ＝損傷後日数。
【００２６】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｇ：ＳＣＩ後の改善した歩行運動機能回復。外側片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ９〜Ｔ１０レベル付近において実施し、直後に、Ｇｓｘ１をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルスの注射を行った（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ）。レポーターＲＦＰのみをコードするレンチウイルスを対照として使用した（レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）。歩行運動機能を、最大５６ＤＰＩまで毎週少なくとも２回ＢＭＳスコアによって評価した。（Ａ）５６ＤＰＩにおける後肢歩行状況の代表的な画像、および（Ｂ）左後肢のＢＭＳスコア（ｎ≧６）。（Ｃ）３５ＤＰＩにおける軸索誘導に関与する発現変動遺伝子（Ｃｔｎｎａ１およびＣｏｌ６ａ２）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝４；二元配置分散分析とそれに続く事後検定）。ヒートマップは、Ｇｓｘ１が（Ｄ）Ｎｅｔｒｉｎシグナル伝達および（Ｅ）軸索の誘導に関与する発現変動遺伝子を上方調節したことを、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析およびＩＰＡから、３ＤＰＩ群と１４ＤＰＩ群と３５ＤＰＩ群とを比較して示す（ｎ≧３）。ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＩＰＡ分析を使用して同定された、３５ＤＰＩにおけるＣｔｒｌ処置とＧｓｘ１処置との間のシナプス形成を（Ｆ）促進するおよび（Ｇ）阻害する遺伝子（ｎ＝４）。平均±ＳＥＭ  ＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｇ：ＳＣＩ後の改善した歩行運動機能回復。外側片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ９〜Ｔ１０レベル付近において実施し、直後に、Ｇｓｘ１をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルスの注射を行った（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ）。レポーターＲＦＰのみをコードするレンチウイルスを対照として使用した（レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）。歩行運動機能を、最大５６ＤＰＩまで毎週少なくとも２回ＢＭＳスコアによって評価した。（Ａ）５６ＤＰＩにおける後肢歩行状況の代表的な画像、および（Ｂ）左後肢のＢＭＳスコア（ｎ≧６）。（Ｃ）３５ＤＰＩにおける軸索誘導に関与する発現変動遺伝子（Ｃｔｎｎａ１およびＣｏｌ６ａ２）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝４；二元配置分散分析とそれに続く事後検定）。ヒートマップは、Ｇｓｘ１が（Ｄ）Ｎｅｔｒｉｎシグナル伝達および（Ｅ）軸索の誘導に関与する発現変動遺伝子を上方調節したことを、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析およびＩＰＡから、３ＤＰＩ群と１４ＤＰＩ群と３５ＤＰＩ群とを比較して示す（ｎ≧３）。ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＩＰＡ分析を使用して同定された、３５ＤＰＩにおけるＣｔｒｌ処置とＧｓｘ１処置との間のシナプス形成を（Ｆ）促進するおよび（Ｇ）阻害する遺伝子（ｎ＝４）。平均±ＳＥＭ  ＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｇ：ＳＣＩ後の改善した歩行運動機能回復。外側片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ９〜Ｔ１０レベル付近において実施し、直後に、Ｇｓｘ１をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルスの注射を行った（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ）。レポーターＲＦＰのみをコードするレンチウイルスを対照として使用した（レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）。歩行運動機能を、最大５６ＤＰＩまで毎週少なくとも２回ＢＭＳスコアによって評価した。（Ａ）５６ＤＰＩにおける後肢歩行状況の代表的な画像、および（Ｂ）左後肢のＢＭＳスコア（ｎ≧６）。（Ｃ）３５ＤＰＩにおける軸索誘導に関与する発現変動遺伝子（Ｃｔｎｎａ１およびＣｏｌ６ａ２）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝４；二元配置分散分析とそれに続く事後検定）。ヒートマップは、Ｇｓｘ１が（Ｄ）Ｎｅｔｒｉｎシグナル伝達および（Ｅ）軸索の誘導に関与する発現変動遺伝子を上方調節したことを、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析およびＩＰＡから、３ＤＰＩ群と１４ＤＰＩ群と３５ＤＰＩ群とを比較して示す（ｎ≧３）。ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＩＰＡ分析を使用して同定された、３５ＤＰＩにおけるＣｔｒｌ処置とＧｓｘ１処置との間のシナプス形成を（Ｆ）促進するおよび（Ｇ）阻害する遺伝子（ｎ＝４）。平均±ＳＥＭ  ＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｇ：ＳＣＩ後の改善した歩行運動機能回復。外側片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ９〜Ｔ１０レベル付近において実施し、直後に、Ｇｓｘ１をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルスの注射を行った（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ）。レポーターＲＦＰのみをコードするレンチウイルスを対照として使用した（レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）。歩行運動機能を、最大５６ＤＰＩまで毎週少なくとも２回ＢＭＳスコアによって評価した。（Ａ）５６ＤＰＩにおける後肢歩行状況の代表的な画像、および（Ｂ）左後肢のＢＭＳスコア（ｎ≧６）。（Ｃ）３５ＤＰＩにおける軸索誘導に関与する発現変動遺伝子（Ｃｔｎｎａ１およびＣｏｌ６ａ２）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝４；二元配置分散分析とそれに続く事後検定）。ヒートマップは、Ｇｓｘ１が（Ｄ）Ｎｅｔｒｉｎシグナル伝達および（Ｅ）軸索の誘導に関与する発現変動遺伝子を上方調節したことを、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析およびＩＰＡから、３ＤＰＩ群と１４ＤＰＩ群と３５ＤＰＩ群とを比較して示す（ｎ≧３）。ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＩＰＡ分析を使用して同定された、３５ＤＰＩにおけるＣｔｒｌ処置とＧｓｘ１処置との間のシナプス形成を（Ｆ）促進するおよび（Ｇ）阻害する遺伝子（ｎ＝４）。平均±ＳＥＭ  ＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。
【図１１Ｅ−１１Ｆ】図１１Ａ〜１１Ｇ：ＳＣＩ後の改善した歩行運動機能回復。外側片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ９〜Ｔ１０レベル付近において実施し、直後に、Ｇｓｘ１をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルスの注射を行った（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ）。レポーターＲＦＰのみをコードするレンチウイルスを対照として使用した（レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）。歩行運動機能を、最大５６ＤＰＩまで毎週少なくとも２回ＢＭＳスコアによって評価した。（Ａ）５６ＤＰＩにおける後肢歩行状況の代表的な画像、および（Ｂ）左後肢のＢＭＳスコア（ｎ≧６）。（Ｃ）３５ＤＰＩにおける軸索誘導に関与する発現変動遺伝子（Ｃｔｎｎａ１およびＣｏｌ６ａ２）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝４；二元配置分散分析とそれに続く事後検定）。ヒートマップは、Ｇｓｘ１が（Ｄ）Ｎｅｔｒｉｎシグナル伝達および（Ｅ）軸索の誘導に関与する発現変動遺伝子を上方調節したことを、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析およびＩＰＡから、３ＤＰＩ群と１４ＤＰＩ群と３５ＤＰＩ群とを比較して示す（ｎ≧３）。ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＩＰＡ分析を使用して同定された、３５ＤＰＩにおけるＣｔｒｌ処置とＧｓｘ１処置との間のシナプス形成を（Ｆ）促進するおよび（Ｇ）阻害する遺伝子（ｎ＝４）。平均±ＳＥＭ  ＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。
【図１１Ｇ】図１１Ａ〜１１Ｇ：ＳＣＩ後の改善した歩行運動機能回復。外側片側切断ＳＣＩを８〜１２週齢マウスに対してＴ９〜Ｔ１０レベル付近において実施し、直後に、Ｇｓｘ１をＲＦＰレポーターと一緒にコードするレンチウイルスの注射を行った（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ）。レポーターＲＦＰのみをコードするレンチウイルスを対照として使用した（レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）。歩行運動機能を、最大５６ＤＰＩまで毎週少なくとも２回ＢＭＳスコアによって評価した。（Ａ）５６ＤＰＩにおける後肢歩行状況の代表的な画像、および（Ｂ）左後肢のＢＭＳスコア（ｎ≧６）。（Ｃ）３５ＤＰＩにおける軸索誘導に関与する発現変動遺伝子（Ｃｔｎｎａ１およびＣｏｌ６ａ２）のＲＴ−ｑＰＣＲ分析（ｎ＝４；二元配置分散分析とそれに続く事後検定）。ヒートマップは、Ｇｓｘ１が（Ｄ）Ｎｅｔｒｉｎシグナル伝達および（Ｅ）軸索の誘導に関与する発現変動遺伝子を上方調節したことを、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析およびＩＰＡから、３ＤＰＩ群と１４ＤＰＩ群と３５ＤＰＩ群とを比較して示す（ｎ≧３）。ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＩＰＡ分析を使用して同定された、３５ＤＰＩにおけるＣｔｒｌ処置とＧｓｘ１処置との間のシナプス形成を（Ｆ）促進するおよび（Ｇ）阻害する遺伝子（ｎ＝４）。平均±ＳＥＭ  ＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。
【００２７】
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｃ：Ｇｓｘ１処置は片側切断ＳＣＩ後の軸索成長に関するシグナル伝達および５−ＨＴニューロンの活性を促進する。（Ａ）３ＤＰＩ、１４ＤＰＩ、および３５ＤＰＩにおけるＳＣＩ＋ＣｔｒｌとＳＣＩ＋Ｇｓｘ１との間のニューロンにおけるＣＲＥＢシグナル伝達に関与する発現変動遺伝子のＩＰＡヒートマップ；ｎ≧３。（Ｂ）Ｎｅｔｒｉｎシグナル伝達に関与する遺伝子と３５ＤＰＩにおけるその遺伝子のｌｏｇ２（倍率変化）；ｎ＝４。（Ｃ）５６ＤＰＩにおける脊髄試料の矢状切片のセロトニン（５−ＨＴ）染色の代表的な顕微鏡写真。「Ｘ」はレンチウイルス注射部位を示し、白線は片側切断部位を示す。ｎ＝５；スケールバー＝１００μｍ。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｃ：Ｇｓｘ１処置は片側切断ＳＣＩ後の軸索成長に関するシグナル伝達および５−ＨＴニューロンの活性を促進する。（Ａ）３ＤＰＩ、１４ＤＰＩ、および３５ＤＰＩにおけるＳＣＩ＋ＣｔｒｌとＳＣＩ＋Ｇｓｘ１との間のニューロンにおけるＣＲＥＢシグナル伝達に関与する発現変動遺伝子のＩＰＡヒートマップ；ｎ≧３。（Ｂ）Ｎｅｔｒｉｎシグナル伝達に関与する遺伝子と３５ＤＰＩにおけるその遺伝子のｌｏｇ２（倍率変化）；ｎ＝４。（Ｃ）５６ＤＰＩにおける脊髄試料の矢状切片のセロトニン（５−ＨＴ）染色の代表的な顕微鏡写真。「Ｘ」はレンチウイルス注射部位を示し、白線は片側切断部位を示す。ｎ＝５；スケールバー＝１００μｍ。
【００２８】
【図１３】図１３：３５ＤＰＩにおける発現変動遺伝子（ＤＥＧ）に関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語の機能エンリッチメント。ＲＥＶＩＧＯを使用して二次元意味空間における散布図として表した生物学的プロセスに関するエンリッチメント用語。円のサイズはＧＯ用語のｌｏｇ１０（ｐ値）を示す。
【００２９】
【図１４】図１４：ＳＣＩを有する哺乳動物において増加した歩行運動をもたらす、様々な経路に対するＧＳＸ１の効果。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
配列表
添付の配列表に列挙した核酸およびアミノ酸配列は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定義されているように、ヌクレオチド塩基に関しては標準的な文字略記、およびアミノ酸に関しては３文字コードを使用して示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、その相補鎖は表示されている鎖に対する任意の言及によって含まれていると理解される。２０１９年７月２２日に作成された３２ｋｂの、本明細書と共に提出される配列表は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００３１】
配列番号１〜２はそれぞれ、例示的なヒトＧｓｘ１コード配列およびタンパク質配列である。
【００３２】
配列番号３〜４はそれぞれ、例示的なマウスＧｓｘ１コード配列およびタンパク質配列である。
【００３３】
配列番号５〜６０は、表２に示される遺伝子の発現を、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を使用して検出するために使用されるプライマーである。
【００３４】
配列番号６１〜７９は例示的な細胞透過性ペプチドである。
【００３５】
配列番号８０〜８１は例示的なリンカーペプチドである。
【００３６】
詳細な説明
別段の指摘がない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin  Lewin,  Genes  VII,  published  by  Oxford  University  Press,  1999、Kendrew  et  al.  (eds.),  The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology,  published  by  Blackwell  Science  Ltd.,  1994、およびRobert  A.  Meyers  (ed.),  Molecular  Biology  and  Biotechnology:  a  Comprehensive  Desk  Reference,  published  by  VCH  Publishers,  Inc.,  1995、ならびに他の同様の参考文献に見出すことができる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈上別段の指示が明確にない限り、単数と複数の両方を指す。本明細書で使用される場合、「含む（comprises）」という用語は「含む（includes）」を意味する。したがって、「核酸分子を含む（comprising  a  nucleic  acid  molecule）」は、他の要素を排除せずに「核酸分子を含む（including  a  nucleic  acid  molecule）」を意味する。核酸に関して与えられる任意のおよび全ての塩基サイズは、別段の指示がない限り、近似値であり、説明を目的として提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載されるものと類似するかまたは等しい多くの方法および材料を使用することができるが、特に好適な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合は、用語の説明を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および例は例証的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。特許出願および特許を含む全ての参考文献、ならびに列挙されるＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号（２０１８年８月２２日現在の）と関連する配列は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００３８】
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、以下の特定の用語の説明が提供される。
【００３９】
Ｉ．用語
投与：任意の効果的な経路によって対象に薬剤、例えばＧｓｘ１核酸分子またはタンパク質（例えばＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質）を提供または与えること。例示的な投与経路としては、これらに限定されないが、注射（例えばＣＮＳへの注射、例えば脊椎または脳への、例えば損傷の部位またはその近傍、例えば損傷部位に対して吻側および／または尾側における注射）が挙げられる。一部の例では、投与は、腰椎／仙骨領域におけるＳＣＩを処置するための髄腔内注射（例えばＧｓｘ１もしくはＧｓｘ１−ＣＰＰ核酸分子またはタンパク質の）、頸椎／胸椎領域におけるＳＣＩを処置するための大槽注射（例えばＧｓｘ１もしくはＧｓｘ１−ＣＰＰ核酸分子またはタンパク質の）、または外傷性脳損傷を処置するための実質内もしくは脳室内注射（例えばＧｓｘ１核酸分子またはタンパク質の）である。
【００４０】
キメラまたは融合タンパク質：第１のペプチド（例えばＧｓｘ１）と第２のペプチド（例えば細胞透過性ペプチド、例えば配列番号６１〜７９において提供されるもののうちの１つまたは複数）とを含むタンパク質であって、第１および第２のタンパク質が異なる、タンパク質。キメラポリペプチドには、同じポリペプチドに由来する２つまたはそれよりも多い非隣接部分を含むポリペプチドも包含される。一部の例では、キメラタンパク質はＧｓｘ１−細胞透過性ペプチド融合タンパク質（Ｇｓｘ１−ＣＰＰ）であり、Ｇｓｘ１部分は、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有することができ、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）はＧｓｘ１のＮまたはＣ末端にある。２つまたはそれよりも多い異なるペプチドは直接、または例えばリンカー（例えば１〜３０アミノ酸）を使用して間接的に接合することができる。
【００４１】
相補性：核酸が、伝統的なワトソン・クリック塩基対形成または他の非伝統的な様式のいずれかによって別の核酸配列と水素結合を形成する能力。相補性パーセントとは、第２の核酸配列と水素結合（例えばワトソン・クリック塩基対形成）を形成することができる核酸分子における残基のパーセンテージを示す（例えば１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての隣接残基が第２の核酸配列における同数の隣接残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはそれよりも多いヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指すか、またはストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする２つの核酸を指す。
【００４２】
接触：固体または液体形態を含む直接的な物理的会合に置くこと。接触させることは、例えば試薬を試料（例えば神経細胞を含有する試料）に添加することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、または対象に投与することによってｉｎ  ｖｉｖｏにおいて行うことができる。
【００４３】
有効量：有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な薬剤（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子）の量。
【００４４】
治療有効量は、当業者によって決定することができる、処置されている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与方式等のうちの１つまたは複数に応じて変えてもよい。有益な治療効果としては、疾患、症状、障害、または病理学的状態の寛解；疾患、症状、障害、または状態の発症を低減または予防すること；および疾患、症状、障害、または病理学的状態を全身的に和らげることを挙げることができる。一実施形態では、「有効量」とは、（１）例えば損傷部位もしくはその近傍における炎症を軽減する、例えば浸潤したマクロファージの数を減少させる（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）、（２）例えば損傷部位もしくはその近傍における神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）の数を増加させる（例えばネスチンおよび／またはＳｏｘ２の発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加）、（３）ＮＳＰＣのニューロン系統に向かう分化を増加させる、例えば、例えば損傷部位もしくはその近傍におけるグルタミン酸作動性ニューロンの数の増加（例えばＮｅｕＮまたはｖＧｌｕｔ２の発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも６００％の増加）、（４）例えば損傷部位もしくはその近傍におけるアストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成を軽減する、例えば星細胞の数を減少させる（例えばＧＦＡＰまたはＣＳＰＧの発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）、（５）対象の歩行運動を増加させる（例えば、バッソマウススケール（ＢＭＳ）スコア、機能的自立度評価法（ＦＩＭ）スコア（Functional  Independence  Measure:  Guide  for  the  Uniform  Data  Set  for  Medical  Rehabilitation  (Adult  FIM),  Version  4.0.  Buffalo,  NY:  State  University  of  New  York  at  Buffalo,  1993）、または米国脊髄損傷協会（ＡＳＩＡ）の運動スコアによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて���例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも６００％の増加）、ならびに／または（６）例えば損傷部位もしくはその近傍における細胞死を減少させる、例えば切断型カスパーゼ３陽性細胞の数を減少させる（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）のに十分な量である。
【００４５】
発現：タンパク質（例えばＧｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質）の合成等、核酸分子、例えばＧｓｘ１核酸分子のコードされた情報が細胞の作動、非作動、または構造部に変換されるプロセス。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡ、そしてタンパク質への経路の任意の場所において調節することができる。調節としては、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡ等の中間体分子の分解に関する、または特異的なタンパク質分子が産生された後の、それらの活性化、不活性化、区画化、もしくは分解を介した制御を挙げることができる。
【００４６】
核酸分子またはタンパク質の発現は、正常な（野生型）核酸分子またはタンパク質（例えば正常な非組換え細胞における）と比べて変更されてもよい。発現変動等の遺伝子発現の変更としては、これらに限定されないが、（１）過剰発現（例えば上方調節）、（２）過小発現（例えば下方調節）、または（３）発現の抑制が挙げられる。核酸分子の発現の変更は、対応するタンパク質の発現の変化と関連し、実際にその変化を引き起こすことができる。
【００４７】
ゲノムスクリーニングホメオボックス（ＧＳＸ１）：（例えばＯＭＩＭ６１６５４２）：Ｇｓｈ１としても公知。この遺伝子は下垂体発生に関与するタンパク質をコードする。マウスタンパク質は２６１アミノ酸であり、ヒトタンパク質は２６４アミノ酸であり、２つのタンパク質は約９６％の配列相同性を共有する。ヒトＧＳＸ１遺伝子は染色体１３ｑ１２．２に位置する。
【００４８】
Ｇｓｘ１配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースから公的に入手可能である（例えば、受託番号ＮＰ＿６６３６３２．１、ＮＰ＿０３２２０４．１、ＸＰ＿００６０６８０９６．２、およびＮＰ＿００１１７８５９２．１は例示的なＧｓｘ１タンパク質配列を提供し、受託番号ＮＭ＿１４５６５７．２、ＮＭ＿００８１７８．２、ＸＭ＿００６０６８０３４．２、およびＮＭ＿００１１９１６６３．１は例示的なＧｓｘ１核酸配列を提供する）。当業者は、Ｇｓｘ１バリアントを含む追加のＧｓｘ１核酸およびタンパク質配列、例えばこれらのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列と（例えば配列番号１、２、３、または４と）少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を同定することができる。そのようなＧｓｘ１配列は、例えばＳＣＩ等の神経障害を本明細書において提供される方法を使用して処置するための治療組換え核酸分子およびタンパク質を生成するために使用することができる。
【００４９】
一例では、Ｇｓｘ１タンパク質はＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質等の融合タンパク質の一部である。
【００５０】
増加または減少：それぞれ、対照値からの数量の統計的に有意な正または負の変化。増加は正の変化、例えば対照値と比較して少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％の増加である。減少は負の変化、例えば対照値と比較して少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％減少という減少である。一部の例では、減少は１００％未満、例えば９０％以下、９５％以下、または９９％以下の減少である。
【００５１】
単離された：「単離された」生物学的成分（例えばタンパク質もしくは核酸、または細胞）は、成分が生じる生物の細胞または組織における他の生物学的成分、例えば、他の細胞、染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離されているか、別個に産生されているか、または別個に精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質としては、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が挙げられる。用語にはまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質（例えばＧｓｘ１タンパク質および核酸分子）、ならびに化学的に合成された核酸およびタンパク質も包含される。単離されたタンパク質、核酸、または細胞は、一部の例では、少なくとも５０％純粋、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％純粋である。
【００５２】
リンカー：例えばキメラタンパク質を生成するために、２つまたはそれよりも多い別々の離れたペプチドまたはタンパク質、例えば単量体ドメインを接合または接続する部分または部分群。一例では、リンカーは実質的に直鎖状の部分である。本明細書において提供されるキメラタンパク質を生成するために使用することができる例示的なリンカーとしては、これらに限定されないが、ペプチド、核酸分子、ペプチド核酸、および１つまたは複数の酸素原子が炭素骨格に組み入れられている必要に応じて置換されたアルキレン部分が挙げられる。リンカーは、本来の配列、そのバリアント、または合成配列の一部分であり得る。リンカーは、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、または両方の組合せを含むことができる。一例では、リンカーは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０アミノ酸、例えば５〜１０、５〜２０、または５〜５０アミノ酸から構成される。一例では、リンカーはポリアラニンである。一例では、リンカーは可動性リンカー、例えばＧｌｙおよびＳｅｒ残基を含むリンカー（例えばＧＳＧＳＧＳ（配列番号８０）、またはＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧである配列番号８１）である。
【００５３】
天然に存在しないまたは改変された：本明細書で交換可能に使用される、人間の手の関与を示す用語。用語は、核酸分子またはポリペプチドに言及している場合、核酸分子またはポリペプチドが、自然界において天然に会合し自然界において見出される少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを示す。加えて、用語は、核酸分子またはポリペプチドが自然界において見出されない配列を有する核酸分子またはポリペプチドであることを示すことができる。
【００５４】
作動可能に連結した：第１の核酸配列は、第２の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、第２の核酸配列と作動可能に連結する。例えば、プロモーターは、コード配列（例えばＧｓｘ１コード配列）の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結する。全体として、作動可能に連結したＤＮＡ配列は隣接しており、２つのタンパク質コード領域を接合することが必要な場合は、同じ読み枠に存在する。
【００５５】
薬学的に許容される担体：本発明において有用な薬学的に許容される担体は従来のものである。Remington’s  Pharmaceutical  Sciences,  by  E.  W.  Martin,  Mack  Publishing  Co.,  Easton,  PA,  15th  Edition  (1975)は、組換え核酸分子またはタンパク質（例えばＧｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質）の薬学的送達に好適な組成物および製剤を記載している。
【００５６】
全般に、担体の性質は用いられる特定の投与形式に依存する。例えば、非経口製剤は通例、薬学的および生理学的に許容される流体、例えば、水、生理的食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。
【００５７】
ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質：任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって割り込まれていてもよい。用語にはまた、修飾された、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば標識成分とのコンジュゲーションが行われたアミノ酸ポリマーも包含される。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語には、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣体を含む、天然ならびに／または非天然もしくは合成アミノ酸が含まれる。
【００５８】
プロモーター：核酸、例えばＧｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質コード配列の転写を導く核酸制御配列の配置。プロモーターは、転写の開始部位近傍の必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、必要に応じて遠位エンハンサーまたは抑制エレメントを含む。「構成的プロモーター」とは、絶えず活性であり、外部のシグナルまたは分子による調節を受けないプロモーターである。対照的に、「誘導性プロモーター」の活性は、外部のシグナルまたは分子（例えば転写因子）によって調節される。一例では、使用されるプロモーターは、プロモーターが発現させている核酸分子に本来備わっており（内在性プロモーター）、例えばＧｓｘ１に内在している。一例では、使用されるプロモーターは、プロモーターが発現させている核酸分子に本来備わっていない（外来性プロモーター）。「組織特異的プロモーター」とは、特定の細胞または組織、例えば中枢神経系における核酸分子の発現を導くプロモーターである。Ｇｓｘ１の発現を駆動するために使用することができる例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ベータアクチンプロモーター、または誘導性テトラサイクリン（Ｔｅｔ）誘導性レンチウイルス系（Ｔｅｔオンまたはオフ系）が挙げられる。
【００５９】
組換えまたは宿主細胞：組換えプラスミドまたはベクター等の外因性ポリヌクレオチドの導入によって、遺伝子的に変更されたかまたは遺伝子的に変更することが可能な細胞。典型的には、宿主細胞は、組換え核酸分子が増大する、および／またはそのＤＮＡが発現することができる細胞である。そのような細胞は神経細胞であり得る。用語にはまた、対象宿主細胞の任意の後代も含まれる。複製中に生じる変異が存在し得るため、全ての後代は親細胞と同一でない場合があることが理解される。しかしながら、そのような後代は、「宿主細胞」という用語が使用される場合、含まれる。
【００６０】
調節エレメント：プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば転写終結シグナル、例えばポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列）が含まれる。そのような調節エレメントは、例えば、これによりその全体が参照により本明細書に組み入れられるGoeddel,  GENE  EXPRESSION  TECHNOLOGY:  METHODS  IN  ENZYMOLOGY  185,  Academic  Press,  San  Diego,  Calif.  (1990)に記載されている。調節エレメントとしては、多くの種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を導く調節エレメント、およびある特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現を導く調節エレメント（例えば組織特異的調節配列）が挙げられる。組織特異的プロモーターは、主として目的の所望の組織、例えば神経組織または細胞における発現を導くことができる。調節エレメントはまた、時間依存的な方式、例えば細胞周期依存的または発生段階依存的な方式において発現を導くことができ、組織または細胞型特異的であってもそうでなくてもよい。
【００６１】
一部の実施形態では、Ｇｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰコード配列は、プロモーター、例えば構成的プロモーター、例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ  ＩＩプロモーター、またはｐｏｌ  Ｉプロモーターに作動可能に連結する。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例としては、これらに限定されないが、Ｕ６およびＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例としては、これらに限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じてＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（必要に応じてＣＭＶエンハンサーを含む）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＲＯＳＡプロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、Ｇｓｘ１コード配列は組織特異的プロモーター、例えばＣＮＳ特異的プロモーターに作動可能に連結する。
【００６２】
また、エンハンサーエレメント、例えばＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Mol.  Cell.  Biol.,  Vol.  8(1):466-472,  1988）；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβグロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.,  78(3):1527-31,  1981）も「調節エレメント」という用語に包含される。一部の実施形態では、Ｇｓｘ１コード配列はエンハンサー、例えば神経特異的エンハンサー（例えばＮｏｔｃｈ１ＣＲ２またはＯｌｉｇ２ＣＲ５）に作動可能に連結する。
【００６３】
一部の実施形態では、Ｇｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰコード配列は、プロモーターとエンハンサー、例えば構成的プロモーター（例えばＣＭＶ）と神経特異的エンハンサー（例えばＮｏｔｃｈ１ＣＲ２またはＯｌｉｇ２ＣＲ５）の両方に作動可能に連結する。
【００６４】
配列同一性／類似性：アミノ酸（またはヌクレオチド）配列間の類似性は、配列同一性とも称される配列間の類似性において表現される。配列同一性は多くの場合、同一性（または類似性または相同性）パーセンテージに換算して測定され、パーセンテージが高いほど、２つの配列は類似している。
【００６５】
比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Smith  and  Waterman,  Adv.  Appl.  Math.  2:482,  1981、Needleman  and  Wunsch,  J.  Mol.  Biol.  48:443,  1970、Pearson  and  Lipman,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  85:2444,  1988、Higgins  and  Sharp,  Gene  73:237,  1988、Higgins  and  Sharp,  CABIOS  5:151,  1989、Corpet  et  al.,  Nucleic  Acids  Research  16:10881,  1988、およびPearson  and  Lipman,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  85:2444,  1988に記載されている。Altschul  et  al.,  Nature  Genet.  6:119,  1994は、配列アラインメント法および相同性算出に関する詳細な考察を提示している。
【００６６】
ＮＣＢＩ基本局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Altschul  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  215:403,  1990）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘに関連した使用のために、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源およびインターネット上から入手可能である。このプログラムを使用してどのように配列同一性を決定するかの説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトにおいて入手可能である。
【００６７】
タンパク質および核酸配列（本明細書において提供されるＧｓｘ１配列を含む）のバリアントは典型的には、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ２．０の初期パラメーターに設定したギャップありｂｌａｓｔｐを使用してアミノ酸配列との全長アラインメントにわたって計数した、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性の所有によって特徴付けられる。約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較の場合は、初期パラメーター（ギャップ存在コスト１１、および残基当たりギャップコスト１）に設定した初期設定のＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用するＢｌａｓｔ２配列関数が用いられる。短いペプチド（概ね３０アミノ酸未満）をアラインメントする場合、アラインメントは、初期パラメーター（ギャップ開始ペナルティ９、ギャップ伸長ペナルティ１）に設定したＰＡＭ３０行列を用いるＢｌａｓｔ２配列関数を使用して実施されるべきである。参照配列とのより一層大きい類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価される場合、増加した同一性パーセンテージ、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を示す。全体よりも短い配列が配列同一性のために比較されている場合、相同体およびバリアントは、典型的には１０〜２０アミノ酸という短い区分にわたって少なくとも８０％の配列同一性を所有し、参照配列との類似性に応じて少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を所有する場合もある。そのような短い区分にわたる配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトにて入手可能である。当業者は、これらの配列同一性範囲が指針のためにのみ提供されており、提供された範囲から外れる非常に有意な相同体が取得され得ることは十分に起こり得るということを理解するだろう。
【００６８】
対象：ヒトまたは獣医学的対象等の哺乳動物。哺乳動物としては、これらに限定されないが、ネズミ科動物、類人猿、ヒト、家畜動物、スポーツ動物、および愛玩動物が挙げられる。一実施形態では、対象は非ヒト哺乳動物対象、例えば、サルもしくは他の非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、イノシシ、雄ウシ、ウマ、または雌ウシである。一部の例では、対象は実験動物／生物、例えば、マウス、ウサギ、またはラットである。一部の例では、対象は、本明細書において提供される方法を使用して処置することができる、神経変性疾患等の神経障害を有するかまたは外傷性脳損傷もしくは外傷性ＳＣＩを患っている。
【００６９】
治療剤：対象への投与の際にいくらかの有益な効果を付与する１つまたは複数の分子または化合物を指す。有益な治療効果としては、診断上の決定を可能にすること；疾患、症状、障害、または病理学的状態の寛解；疾患、症状、障害、または状態の発症を低減すること；および疾患、症状、障害、または病理学的状態、例えば神経障害を全身的に和らげることを挙げることができる。
【００７０】
形質導入された、形質転換された、トランスフェクトされた：ウイルスまたはベクターが核酸分子を細胞に移入する場合、ウイルスまたはベクターは細胞に「形質導入する」。核酸が、細胞ゲノムへの核酸の組入れまたはエピソーム複製のいずれかにより、細胞によって安定に複製されるようになる場合、細胞は、細胞に形質導入された核酸によって「形質転換される」かまたは「トランスフェクトされる」。
【００７１】
これらの用語には、ウイルスベクターを用いるトランスフェクション、プラスミドベクターを用いる形質転換、ならびに電気穿孔、リポフェクション、粒子銃加速、および当技術分野における他の方法による裸のＤＮＡの導入を含む、核酸分子がそのような細胞に導入され得る全ての技法が包含される。一部の例では、方法は、化学的方法（例えばリン酸カルシウムトランスフェクションまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション）、物理的方法（例えば、電気穿孔、マイクロインジェクション、微粒子銃）、融合（例えばリポソーム）、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ／カプシド−ＤＮＡ複合体）、および組換えウイルス等のウイルスによる生物学的感染である（Wolff,  J.  A.,  ed,  Gene  Therapeutics,  Birkhauser,  Boston,  USA,  1994）。核酸分子の細胞への導入のための方法は公知である（例えば米国特許第６，１１０，７４３号を参照のこと）。
【００７２】
導入遺伝子：例えばベクター（例えばウイルスベクター）によって供給される外来性遺伝子。一例では、導入遺伝子は、例えばプロモーター配列に作動可能に連結したＧｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰコード配列を含む。
【００７３】
トランスジェニック：導入遺伝子を保有する細胞または動物（例えばヒトまたはマウス）。
【００７４】
処置すること、処置、および療法：症状の緩解または逓減等の任意の客観的または主観的パラメーターを含む、病態または状態の減弱または寛解における任意の成功または成功の兆候。処置は、身体検査および他の臨床検査等の結果を含む客観的または主観的パラメーターによって評価され得る。一例では、開示される方法を使用する処置は、（１）例えば損傷部位もしくはその近傍における炎症を軽減する、例えば浸潤したマクロファージの数を減少させる（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）、（２）例えば損傷部位もしくはその近傍における神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）の数を増加させる（例えばネスチンおよび／またはＳｏｘ２の発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加）、（３）ＮＳＰＣのニューロン系統に向かう分化を増加させる、例えば、例えば損傷部位もしくはその近傍におけるグルタミン酸作動性ニューロンの数の増加（例えばＮｅｕＮまたはＧｌｕｔ２の発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも６００％の増加）、（４）例えば損傷部位もしくはその近傍におけるアストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成を軽減する、例えば星細胞の数を減少させる（例えばＧＦＡＰまたはＣＳＰＧの発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）、（５）対象の歩行運動を増加させる（例えばバッソマウススケール（ＢＭＳ）スコアまたは機能的自立度評価法（ＦＩＭ）スコアによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも６００％の増加）、ならびに／または（６）例えば損傷部位もしくはその近傍における細胞死を減少させる、例えば切断型カスパーゼ３陽性細胞の数を減少させる（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）。
【００７５】
上方調節した：遺伝子またはタンパク質（例えばＧｓｘ１）等の分子の発現に関して使用される場合、遺伝子産物の産生量の増加をもたらす任意のプロセスを指す。遺伝子産物はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および構造ＲＮＡ）またはタンパク質であり得る。したがって、上方調節には、遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を増加させる、したがってタンパク質または核酸の存在量を増加させるプロセスが含まれる。開示される方法はＧｓｘ１を上方調節するために使用することができる。
【００７６】
転写を増加させるプロセスの例としては、転写開始速度を増加させるプロセス、転写伸長速度を増加させるプロセス、転写の処理能力を高めるプロセス、および転写抑制を低減するプロセスが挙げられる。遺伝子上方調節には、発現量を、既存のレベルを超えて増加させることが含まれ得る。翻訳を増加させるプロセスの例としては、翻訳の開始を増加させるプロセス、翻訳の伸長を増加させるプロセス、およびｍＲＮＡ安定性を高めるプロセスが挙げられる。
【００７７】
上方調節には、遺伝子産物の産生量の任意の検出可能な増加が含まれる。ある特定の例では、細胞（例えばＣＮＳの細胞）における検出可能なＧｓｘ１タンパク質または核酸発現量は、対照（対応する正常または非組換え細胞において検出されるそのようなタンパク質または核酸発現の量）と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加する。一例では、対照は、正常細胞（例えば非組換えＣＮＳ細胞、例えば神経細胞）における発現の相対量である。
【００７８】
に十分な条件下：所望の活性を可能とする任意の環境を説明するために使用される語句。一例では、所望の活性とは、神経障害を処置するＧｓｘ１核酸分子の発現である。
【００７９】
ベクター：宿主細胞において複製するおよび／または宿主細胞に組み込むベクターの能力を妨害することなく外来核酸分子が導入され得る核酸分子。ベクターとしては、これらに限定されないが、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子；１つまたは複数の自由末端を含む核酸分子、自由末端を含まない（例えば環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含む核酸分子；および他の種類の当技術分野で公知のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００８０】
ベクターは、ベクターが宿主細胞において複製することを可能とする核酸配列、例えば複製起点を含むことができる。ベクターはまた、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子（例えば抗生物質耐性または蛍光タンパク質）、および他の遺伝因子を含むこともできる。組込みベクターは自らを宿主核酸に組み込むことが可能である。発現ベクターとは、挿入された１つまたは複数の遺伝子の転写および翻訳を可能にする調節配列を含有するベクターである。
【００８１】
ある種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントが例えば標準的な分子クローニング技法によって挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、ウイルス由来ＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）にパッケージングするためにベクターに存在するウイルスベクターである。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって保有されるポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクター（例えば第３世代組込み欠損レンチウイルスベクター）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００８２】
ある特定のベクターは導入される宿主細胞において自律複製が可能である（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。
【００８３】
ある特定のベクターは、ベクターが作動的に連結する遺伝子、例えばＧｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰコード配列の発現を導くことが可能である。そのようなベクターは本明細書において「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法において有用である一般的な発現ベクターは多くの場合プラスミドの形態である。組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に好適な形態の本明細書において提供される核酸（例えばＧｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰコード配列）を含むことができ、これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動的に連結する、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され得る１つまたは複数の調節エレメントを含むことができることを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結した」とは、目的のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）ように調節エレメントに連結することを意味することが意図される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望される発現のレベル、トランスジェニックの積み荷のサイズ等のような因子に依存し得る。ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載される核酸（例えばＧｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰ）によってコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む転写物、タンパク質、またはペプチドを産生することができる。
【００８４】
ＩＩ．概要
限定された神経発生、増加した反応性アストログリオーシス、および瘢痕形成は、ＳＣＩ後の神経再生および機能回復の主な障壁である。損傷部位またはその近傍におけるＧｓｘ１処置がＮＳＰＣの活性化および介在ニューロンの特異的亜型（例えばグルタミン酸作動性およびコリン作動性ニューロン）の生成を促進することが本明細書において示される。Ｇｓｘ１発現はまた、反応性アストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成を阻害し、外側片側切断ＳＣＩを有するマウスにおいて劇的な歩行運動機能回復をもたらす。ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、Ｇｓｘ１処置が細胞増殖、ＮＳＰＣ活性化、神経発生、アストログリオーシス、および瘢痕形成と関連する遺伝子の発現量を変更し、これがＳＣＩ後の機能回復と相関することを実証する。
【００８５】
転写因子、例えばＳｏｘ２およびＮｅｕｒｏＤ１を使用する以前の研究は、それらによる首尾良いニューロンの誘導を示している。しかしながら、限定的な機能回復、または機能回復がないことが報告されている。機能回復に関する新たに生成されたニューロンの不首尾は、以下の側面に原因があると考えることができる：１）Ｓｏｘ２およびＮｅｕｒｏＤ１が一般神経原性転写因子であるが、脊髄ニューロン形成に特異的な転写因子ではない；２）Ｓｏｘ２に誘導されるニューロンがＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに似ている。追加の抑制性介在ニューロンが興奮／抑制比のさらなる不均衡を引き起こしたおそれがある；ならびに３）機能回復が様々な特異的細胞型、例えばグルタミン酸作動性およびコリン作動性介在ニューロンの生成を必要とし得る。脊髄抑制性介在ニューロンは、損傷後、下行性入力の中継回路への組込みを限定する路上障害物として作用する。Ｇｓｘ１処置がＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの生成を阻害することが本明細書において示される。したがって、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの、Ｇｓｘ１処置に誘導される低下は、興奮／抑制比の回復に寄与し得る。
【００８６】
Ｇｓｘ１はＮｏｔｃｈ１エンハンサーとの相互作用を介してＮｏｔｃｈシグナル伝達を調節する。胚形成期において、Ｇｓｘ１およびＮｏｔｃｈ１の増加はより高いレベルのグルタミン酸神経伝達物質を生じる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、ＮＳＰＣ増殖および自己再生のため、ならびに時宜を得ないＮＳＰＣのニューロン分化の予防のために必要とされる通常の経路である。ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＲＴ−ｑＰＣＲデータは本明細書において、Ｇｓｘ１がＳＣＩの急性期の間にＮｏｔｃｈおよびＮａｎｏｇシグナル伝達経路を一過性に上方調節することを示す（図５Ｅ〜５Ｇ）。
【００８７】
Ｇｓｘ１処置は、損傷部位において、グルタミン酸作動性およびコリン作動性ニューロンの数を増加させ、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを減少させた（図９Ａ〜９Ｆ）。これらの上方調節したシグナル伝達経路（図５Ａ〜５Ｉ）は、内在性ＮＳＰＣの活性化および増大を支持する。
【００８８】
Ｇｓｘ１処置が反応性アストログリオーシスおよび瘢痕形成を低減するという観察は機能回復と一致し、Ｇｓｘ１のそのような役割は以前に報告されていない。実際、成体ＮＳＰＣは大半がＣＮＳ損傷後に星細胞を生じる（Benner  et  al.,  Nature  497:369-373  (2013)）。しかしながら、Ｇｓｘ１処置は、反応性星細胞（ＲＡ）および瘢痕形成星細胞（ＳＡ）と関連する遺伝子の発現量を大幅に減少させる。Ｇｓｘ１に誘導される、ニューロン系統へのＮＳＰＣ分化は、星細胞系統を犠牲にし得る。アストログリオーシスの低減は、瘢痕形成の減弱をもたらす（図１０Ａ〜１０Ｉ）。
【００８９】
Ｇｓｘ１に誘導されるニューロンが機能的となるために、Ｇｓｘ１に誘導されるニューロンは適当な接続を確立する必要がある。本明細書において提供される方法は、軸索誘導シグナル伝達、Ｎｅｔｒｉｎシグナル伝達、ＣＲＥＢシグナル伝達経路、およびシナプス形成を上方調節する（図６Ａ〜６Ｇ、１２Ａ、１２Ｂ）。
【００９０】
これらの観察に基づいて、（ｉ）グリア性瘢痕を低減する（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％の低減）、（ｉｉ）神経発生を誘導する（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも２０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％の神経発生の増加）、および／または（ｉｉｉ）ＳＣＩ後の歩行運動を改善する（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも３００％の歩行運動の増加）、損傷した脊髄においてＧｓｘ１を発現させるための方法が提供される。Ｇｓｘ１処置の、ＳＣＩを有するマウスにおける、特異的な種類の成熟ニューロンおよび低減されたグリア性瘢痕だけでなく、大幅な歩行運動機能回復も成功裏に生じさせる能力は、Ｇｓｘ１がＳＣＩおよび他の中枢神経関連損傷の処置のための治療剤であることを実証する（図１４）。
【００９１】
ＩＩＩ．処置の方法
ヒトまたは獣医学的対象等の哺乳動物対象における神経障害を処置するための方法が本明細書において提供される。方法は、対象に治療有効量のＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはＧｓｘ１もしくはＧｓｘ１−ＣＰＰをコードする核酸分子を投与することにより神経障害を処置することを含むことができる。一例では、投与は注射、例えばＣＮＳ（例えば脊髄または脳）への注射を介する。例えば、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはＧｓｘ１もしくはＧｓｘ１−ＣＰＰをコードする核酸分子は、脳もしくは脊髄損傷の部位の近傍またはその部位、例えば損傷部位に対して吻側および／または尾側に投与することができる。
【００９２】
一例では、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＧｓｘ１タンパク質が投与される。別の例では、Ｇｓｘ１タンパク質と細胞透過性ペプチドとを含むＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質が投与され、融合タンパク質のＧｓｘ１部分は、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＣＰＰドメインは、配列番号６１〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。したがって、一部の例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＧｓｘ１部分は、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＣＰＰドメインは、配列番号６１〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＣＰＰドメインはＧｓｘ１ドメインに対してＣ末端である。一部の例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＣＰＰドメインはＧｓｘ１ドメインに対してＮ末端である。一部の例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＣＰＰドメインはＧｓｘ１ドメインに直接連結する。一部の例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＣＰＰドメインはＧｓｘ１ドメインに間接的に、例えばペプチドリンカー、例えば１〜３０アミノ酸のリンカー、例えば配列番号８０または８１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するリンカーを介して連結する。
【００９３】
別の例では、Ｇｓｘ１コード核酸分子が投与され、Ｇｓｘ１をコードする核酸分子は、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むタンパク質をコードする。一部の例では、Ｇｓｘ１をコードする核酸分子は、配列番号１または３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む。一例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰコード核酸分子が投与され、Ｇｓｘ１−ＣＰＰをコードする核酸分子は、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＧｓｘ１ドメインをコードする部分を含む。一部の例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰをコードする核酸分子は、配列番号６１〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＰＰドメインをコードする部分を含む。一部の例では、Ｇｓｘ１−ＣＰのＧｓｘ１ドメインをコードする核酸分子は、配列番号１または３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む。
【００９４】
そのようなＧｓｘ１およびＧｓｘ１−ＣＰＰコード配列は他のエレメントを含むことができる。一例では、Ｇｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰをコードする核酸分子は、プラスミドまたはレンチウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターの一部である。一部の例では、Ｇｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰをコードする核酸分子は、プロモーター、例えば構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶ、ベータアクチン、または本来のＧｓｘ１プロモーター）または組織特異的プロモーター、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）特異的プロモーター（例えば、シナプシン１（Ｓｙｎ１）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ネスチン（ＮＥＳ）プロモーター、ミエリン関連乏突起膠細胞塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーター、またはフォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）プロモーター）に作動可能に連結する。一部の例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子は、プロモーター、例えば構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶ、ベータアクチン、または本来のＧｓｘ１プロモーター）に作動可能に連結し、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＧｓｘ１部分は、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【００９５】
開示される方法を用いて処置することができる例示的な神経障害としては、脊髄損傷、脳損傷、または両方が挙げられる。一例では、脊髄損傷、脳損傷、または両方は、外力、例えば頭部に対する打撃もしくは激しい揺さぶりまたは穿通性頭部損傷、例えば、車両衝突（例えば、自動車、オートバイ、ＡＴＶ、または自転車）、転落、暴力行為（例えば銃創または刺創）、またはスポーツ（例えば、フットボール、サッカー、野球、ホッケー、ダイビング、スキー、ラグビー、ラクロス、乗馬、またはバスケットボール中に生じる激突もしくは転落）からの外傷によって引き起こされる。脊髄損傷は通例、椎骨を骨折または脱臼させる、脊椎に対する突然の外傷性打撃から始まる。脊椎に対する大半の損傷は、脊椎を完全に切り離すのではなく、椎骨の骨折または圧迫を引き起こし、次いで、脊髄を上行および下行してシグナルを伝える軸索を押し潰し、破壊する。脊髄損傷は、脊椎の頸椎、胸椎、腰椎、仙骨、または尾骨領域におけるもの、例えば、Ｃ４、Ｃ６、Ｔ６、Ｔ９、Ｔ１０、またはＬ１損傷であり得る。したがって、一部の例では、開示される方法を用いて処置される対象は四肢麻痺または対麻痺を有する。
【００９６】
一例では、神経障害は、頭蓋に対する突然の加速もしくは減速、または運動と突然の衝撃との組合せのために生じる外傷性脳損傷（ＴＢＩ）である。傷害は、損傷時とその数分〜数日後の両方において、例えば頭蓋内の血流および血圧の変化のために生じる。ＴＢＩは軽度（脳震盪を含む）から重度まで分類される。一部の例では、開示される方法を用いて処置することができる神経障害は神経変性障害、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、虚血、てんかん、ハンチントン病、多発性硬化症、または筋萎縮性側索硬化症である。そのような神経変性障害は、例えばニューロン細胞が低下した生存を表す場合かまたはニューロンがもはやシグナルを伝播することができない場合にニューロンの統合性が脅かされる、哺乳動物対象の神経系における異常である。
【００９７】
一例では、治療有効量のＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子は、医薬組成物、例えば生理食塩水または水等の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物中に存在する。
【００９８】
一部の例では、単回用量のみのＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子が投与される。しかしながら、他の例では、方法は、治療有効量のＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも２回の別個の投与、例えば少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、または少なくとも２０回の別個の投与を含む。一部の例では、少なくとも２回の別個の投与は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも９か月、または少なくとも１年空けられる。
【００９９】
一部の例では、治療有効量のＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を（例えばウイルスベクターの一部として）投与することは、神経障害の発症の１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、１か月以内、２か月以内、または３か月以内に行われる。
【０１００】
開示される方法は、対象に治療有効量の別の神経障害治療剤を投与することをさらに含むことができる。
【０１０１】
一部の例では、方法は、外傷性脊髄もしくは脳損傷等の神経障害または神経変性疾患を有する対象を選択することを含む。これらの対象は、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を用いた処置のために選択することができる。
【０１０２】
一部の例では、開示される方法を使用して神経障害を処置することは、（１）例えば損傷部位またはその近傍における炎症を軽減すること、例えば浸潤したマクロファージの数を減少させること（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）、（２）例えば損傷部位またはその近傍における神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）の数を増加させること（例えば、ネスチン、Ｋｉ６７、および／またはＳｏｘ２の発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも５００％の増加）、（３）ＮＳＰＣの特異的ニューロン系統に向かう分化を増加させること、例えば、例えば損傷部位またはその近傍における、グルタミン酸作動性ニューロンの数の増加、コリン作動性ニューロンの数の増加（例えば、ＮｅｕＮ、ＣｈＡＴ、および／またはＧｌｕｔ２の発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも６００％の増加）、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数を減少させる（例えばＧＡＢＡの発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数を減少させる、またはそれらの組合せ、（４）例えば損傷部位またはその近傍におけるアストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成を軽減すること、例えば星細胞の数を減少させること（例えば、ＧＦＡＰ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、および／またはＣＳＰＧの発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）、（５）対象の歩行運動を増加させること（例えばバッソマウススケール（ＢＭＳ）スコアまたは機能的自立度評価法（ＦＩＭ）によって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも６００％の増加）、（６）例えば損傷部位またはその近傍における細胞死を減少させること、例えば切断型カスパーゼ３陽性細胞の数を減少させること（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）、ならびに（７）例えば損傷部位またはその近傍における神経発生、軸索成長、および／または軸索誘導を増加させること（例えば、Ｃｔｎｎａ１および／もしくはＣｏｌ６ａ２発現、Ｎｅｔｒｉｎシグナル伝達、軸索誘導遺伝子の発現、ならびに／またはＣＲＥＢシグナル伝達によって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも５００％の増加）のうちの１つまたは複数を含む。一部の例では、そのような応答は、処置後約３日以内、約１週間以内、約２週間以内、約４週間以内、約８週間以内、約１２週間以内、約４か月以内、約６か月以内、または約５２週間以内に達成される。一部の実施形態では、開示される方法は、対象を処置する前および／または後に、例えば損傷部位またはその近傍における炎症、細胞増殖、アストログリオーシス、グリア性瘢痕化、神経発生、ＮＳＰＣ活性化、および／または細胞死を測定することを含む。一部の実施形態では、開示される方法は、対象を処置する前および後に、対象の歩行運動を測定することを含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、開示される方法は、対象を処置する前および／または後に歩行運動を測定することを含む。例えば、ヒトにおける脊髄損傷後の機能的転帰は、修正バーセル指数（ＭＢＩ）、機能的自立度評価法（ＦＩＭ）、機能的四肢麻痺指数（ＱＩＦ）、および／または脊髄障害自立度評価法（ＳＣＩＭ）を使用して決定または測定することができる。そのような方法の例は、Furlan  et  al.,  Journal  of  Neurotrauma.  2011;28(8):1413-1430、Chumney  et  al.,.  (2010).  The  Journal  of  Rehabilitation  Research  and  Development.  47  (1):  17-30、Ota  et  al.,  Spinal  Cord.  1996;  34(9):531-5、およびFunctional  Recovery  Outcome  Measures  Work  Group:,  Anderson  et  al.,  The  Journal  of  Spinal  Cord  Medicine.  2008;31(2):133-144に記載されている。
【０１０４】
一部の例では、（１）例えば損傷部位もしくはその近傍における炎症、（２）例えば損傷部位もしくはその近傍におけるＮＳＰＣの増殖、（３）例えば損傷部位もしくはその近傍における、ＮＳＰＣのニューロン系統、例えばグルタミン酸作動性ニューロンに向かう分化、（４）例えば損傷部位もしくはその近傍におけるアストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成、（５）対象の歩行運動、ならびに／または（６）例えば損傷部位もしくはその近傍における細胞死の量は対照と比較される。一部の実施形態では、対照は処置前に取得された値である。一部の実施形態では、対照は、歴史的対照または標準参照値または値域（例えば以前に試験された対照試料、例えば神経障害を有するまたは有しない対象の群）である。さらなる例では、対照は参照値、例えば、正常な個体または神経障害（例えばＳＣＩまたはＴＢＩ）を有することが知られている個体の集団から取得された標準値である。対照集団と同様に、処置された対象から取得された値は、平均参照値と、または参照値域（例えば参照群における高い値と低い値、または９５％信頼区間）と比較することができる。他の例では、対照は、クロスオーバー研究においてＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を用いて処置される対象（または対象の群）と比較される、プラセボを用いて処置される同じ対象（または対象の群）である。さらなる例では、対照は、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰタンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を用いる処置前の対象（または対象の群）である。
【０１０５】
Ａ．Ｇｓｘ１タンパク質
例示的な全長Ｇｓｘ１タンパク質は、配列番号２（ヒト）および４（マウス）に示される。一部の例では、Ｇｓｘ１タンパク質は、配列番号２または４のタンパク質配列を含むかまたはそれからなる。一部の例では、Ｇｓｘ１タンパク質は、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むタンパク質配列を含むかまたはそれからなる。例示的なＧｓｘ１コード配列は、配列番号１（ヒト）および３（マウス）に示される。一部の例では、Ｇｓｘ１核酸配列は、配列番号１または３の配列を含むかまたはそれからなり、一部の例ではプラスミドまたはベクターの一部であり、一部の例ではプロモーター（例えば構成的またはＣＮＳ特異的プロモーター）に作動可能に連結する。
【０１０６】
一例では、開示される方法はＧｓｘ１タンパク質（例えば哺乳動物Ｇｓｘ１タンパク質）を利用する、すなわちＧｓｘ１タンパク質が対象に投与される。他の一部の例では、開示される方法はＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質（例えば哺乳動物Ｇｓｘ１タンパク質および細胞透過性ペプチドから構成される融合タンパク質）を利用する、すなわちＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質が対象に投与される。Ｇｓｘ１−ＣＰＰタンパク質のＧｓｘ１ドメインを生成するために使用することができるＧｓｘ１タンパク質の例は、配列番号２（ヒト）および４（マウス）に示される。本来のまたはバリアントＧｓｘ１タンパク質を使用することができる。一例では、バリアントＧｓｘ１ペプチドは、Ｇｓｘ１ヌクレオチド配列を操作することによって作製される。一部の例では、バリアントＧｓｘ１配列、例えばアミノ酸置換、付加、欠失、またはそれらの組合せを含むバリアントＧｓｘ１配列は、タンパク質が神経発生を増加させる、アストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成を低減する、ならびに脊髄損傷後の歩行運動を増加させる能力を保持する限り、使用される。神経発生、アストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成、ならびに歩行運動を測定する方法が本明細書に記載される。置換を許容する可能性がより高いＧｓｘ１の領域は、配列（例えば配列番号２および４）をアラインメントすることによって決定することができ、種間で保存されるアミノ酸は置換を許容する可能性がより低い一方、特定の位置において異なっているアミノ酸は置換を許容する可能性がより高い。
【０１０７】
バリアントＧｓｘ１タンパク質、例えば配列番号２および４のバリアントは、１つまたは複数の変異、例えば、単一の挿入、単一の欠失、単一の置換を含有することができる。一部の例では、バリアントＧｓｘ１タンパク質は、１〜２０の挿入、１〜２０の欠失、１〜２０の置換、またはそれらの任意の組合せ（例えば単一の挿入と１〜１９の置換と）を含む。一部の例では、バリアントＧｓｘ１タンパク質（例えば配列番号２または４）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸変化を有する。一部の例では、配列番号２または４は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のアミノ酸変化、例えば、１〜８の挿入、１〜１５の欠失、１〜１０の置換、またはそれらの任意の組合せ（例えば、１〜１５、１〜４、または１〜５のアミノ酸欠失と、１〜１０、１〜５、または１〜７のアミノ酸置換と）を有する。ある種類の修飾には、アミノ酸への、類似した生化学的特性を有するアミノ酸残基の置換、すなわち保存的置換（例えば、１〜４、１〜８、１〜１０、または１〜２０の保存的置換）が含まれる。典型的には、保存的置換は、結果として得られるペプチドの活性に対する影響をほとんどまたは全く有しない。例えば、保存的置換は、哺乳動物において、神経発生を増加させる、アストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成を低減する、ならびに脊髄損傷後の歩行運動を増加させるＧｓｘ１ペプチドの能力に実質的に影響を及ぼさない、配列番号２または４におけるアミノ酸置換である。アラニンスキャンは、Ｇｓｘ１タンパク質（またはＧｓｘ１−ＣＰＰタンパク質）、例えば配列番号２または４におけるどのアミノ酸残基がアミノ酸置換を許容することができるかを同定するために使用することができる。一例では、Ｇｓｘ１（例えば配列番号２または４）のこれらの活性は、アラニンまたは他の保存的アミノ酸が１〜４、１〜８、１〜１０、または１〜２０の天然アミノ酸に代わって用いられる場合、２５％を超えて、例えば２０％を超えて、例えば１０％を超えて変更されない。タンパク質における元来のアミノ酸に代わって用いることができ、保存的置換と考えられるアミノ酸の例としては、Ａｌａに対するＳｅｒ；Ａｒｇに対するＬｙｓ；Ａｓｎに対するＧｌｎまたはＨｉｓ；Ａｓｐに対するＧｌｕ；Ｃｙｓに対するＳｅｒ；Ｇｌｎに対するＡｓｎ；Ｇｌｕに対するＡｓｐ；Ｇｌｙに対するＰｒｏ；Ｈｉｓに対するＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅに対するＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕに対するＩｌｅまたはＶａｌ；Ｌｙｓに対するＡｒｇまたはＧｌｎ；Ｍｅｔに対するＬｅｕまたはＩｌｅ；Ｐｈｅに対するＭｅｔ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒ；Ｓｅｒに対するＴｈｒ；Ｔｈｒに対するＳｅｒ；Ｔｒｐに対するＴｙｒ；Ｔｙｒに対するＴｒｐまたはＰｈｅ；およびＶａｌに対するＩｌｅまたはＬｅｕが挙げられる。
【０１０８】
より実質的な変化は、より保存的でない置換を使用すること、例えば（ａ）置換の区域における、例えばシートもしくはヘリックス立体構造としてのポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位におけるポリペプチドの電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持することに対する効果の点でより大幅に異なる残基を選択することによってもたらされ得る。ポリペプチド機能の最も大きな変化を生み出すと全般に予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリンもしくはトレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、もしくはアラニンに代わって（またはそれによって）用いられるか、（ｂ）システインもしくはプロリンが、任意の他の残基に代わって（またはそれによって）用いられるか、（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンが、電気陰性残基、例えばグルタミン酸もしくはアスパラギン酸に代わって（またはそれによって）用いられるか、または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有しない残基、例えばグリシンに代わって（またはそれによって）用いられる置換である。これらのアミノ酸置換（または他の欠失もしくは付加）の効果は、Ｇｓｘ１タンパク質、例えば配列番号２もしくは４、またはＧｓｘ１−ＣＰＰタンパク質の機能を分析することによって、あるいは、哺乳動物において、神経発生を増加させる、アストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成を低減する、ならびに脊髄損傷後の歩行運動を増加させるバリアントＧｓｘ１タンパク質の能力を分析することによって評価することができる。
【０１０９】
一部の例では、開示される方法において使用されるＧｓｘ１タンパク質（またはＧｓｘ１−ＣＰＰタンパク質）は、１つまたは複数の位置においてＰＥＧ化される。一部の例では、開示される方法において使用されるＧｓｘ１タンパク質（またはＧｓｘ１−ＣＰＰタンパク質）は、免疫グロブリン（immunoglobin）ＦＣドメインを含む。抗体の保存ＦＣ断片は、Ｇｓｘ１タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに組み入れることができ、タンパク質の安定性、したがって血清半減期を増強することができる。ＦＣドメインはまた、プロテインＡまたはプロテインＧセファロースビーズにおいてタンパク質を精製する手段として使用することもできる。
【０１１０】
Ｇｓｘ１タンパク質は、細胞の取込みを促進するために細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をタグ付けすることができる。したがって、一部の例では、使用されるＧｓｘ１タンパク質は、（１）Ｇｓｘ１タンパク質と、（２）細胞透過性ペプチドとを含む融合またはキメラタンパク質（本明細書においてＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質と称される）である。細胞透過性ペプチドドメインは、Ｇｓｘ１タンパク質ドメインのＮ末端にあってもＣ末端にあってもよい。細胞透過性ペプチドは通例、高度に陽イオン性であり、細胞によるタンパク質の摂取／取込みを容易にすることができるアルギニンおよびリシンが通例豊富である、短いペプチド（４０アミノ酸またはそれよりも短い）である。使用することができる例示的な細胞透過性ペプチドとしては、親水性ペプチド（例えば、ＴＡＴ［ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号６１］、ＳｙｎＢ１［ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ；配列番号６２］、ＳｙｎＢ３［ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ；配列番号６３］、ＰＴＤ−４［ＰＩＲＲＲＫＫＬＲＲＬＫ；配列番号６４］、ＰＴＤ−５［ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ；配列番号６５］、ＦＨＶ  Ｃｏａｔ−（３５−４９）［ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ；配列番号６６］、ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７−２５）［ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ；配列番号６７］、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４−１６）［ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ；配列番号６８］、Ｄ−Ｔａｔ［ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ；配列番号６９］、Ｒ９−Ｔａｔ［ＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＰＰＱ；配列番号７０］、およびペネトラチン［ＲＱＩＫＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；配列番号７１］）、両親媒性ペプチド（例えば、ＭＡＰ［ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＬＡＬＡＬＫＬＡ；配列番号７２］、ＳＢＰ［ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号７３］、ＦＢＰ［ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号７４］、ＭＰＧ  ａｃ−ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号７５］、ＭＰＧ（ΔＮＬＳ）［ａｃ−ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号７６］、Ｐｅｐ−２［ａｃ−ＫＥＴＷＦＥＴＷＦＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号７７］、およびトランスポータン［ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ；配列番号７８］）、周期配列（例えば、ｐＶｅｃ、ポリアルギニンＲｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラ、ポリリシンＫｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラ、（ＲＡｃａ）６Ｒ、（ＲＡｂｕ）６Ｒ、（ＲＧ）６Ｒ、（ＲＭ）６Ｒ、（ＲＴ）６Ｒ、（ＲＳ）６Ｒ、Ｒ１０、（ＲＡ）６Ｒ、Ｒ７、およびｐｅｐ−１［ａｃ−ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号７９］）、およびＣｒ１０（環状ｐｏｌ−アルギニンＣＰＰ）が挙げられる。
【０１１１】
Ｂ．Ｇｓｘ１タンパク質の生成
組換え発現したＧｓｘ１タンパク質（およびＧｓｘ１−ＣＰＰタンパク質）の単離および精製は、分取クロマトグラフィーおよび免疫学的分離等の従来の手段によって実行することができる。発現すると、Ｇｓｘ１タンパク質（およびＧｓｘ１−ＣＰＰタンパク質）は、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー等を含む標準的手順に従って精製することができる（一般には、R.  Scopes,  Protein  Purification,  Springer-Verlag,  N.Y.,  1982を参照のこと）。少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な組成物が本明細書に開示され、９８〜９９％またはそれよりも高い均一性が医薬品目的のために使用され得る。
【０１１２】
組換え方法に加えて、Ｇｓｘ１タンパク質（およびＧｓｘ１−ＣＰＰタンパク質）はまた、標準的なペプチド合成を使用して全体的または部分的に構築することもできる。一例では、Ｇｓｘ１タンパク質（およびＧｓｘ１−ＣＰＰタンパク質）は、より短い断片のアミノ末端とカルボキシル末端との縮合によって合成される。ペプチド結合は、カルボキシル末端の活性化（例えばカップリング試薬Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（dicylohexylcarbodimide）の使用による）によって形成することができる。
【０１１３】
Ｃ．Ｇｓｘ１核酸分子およびベクター
例示的なＧｓｘ１コード配列は、配列番号１（ヒト）および３（マウス）に示される。一部の例では、Ｇｓｘ１コード核酸分子は、配列番号１または３の配列を含むかまたはそれからなる。一部の例では、Ｇｓｘ１核酸分子は、配列番号２もしくは４のタンパク質またはそのバリアント（例えば上に記載したもの）をコードする。一部の例では、Ｇｓｘ１コード核酸配列は、配列番号１または３の配列を含むかまたはそれからなり、一部の例ではプラスミドまたはベクターの一部であり、一部の例ではプロモーター（例えば構成的またはＣＮＳ特異的プロモーター）に作動可能に連結する。一例では、核酸分子は、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードし、Ｇｓｘ１部分をコードする（例えば配列番号２もしくは４のタンパク質をコードするか、または配列番号１もしくは３の配列を含むかもしくはそれからなる）部分を含むことができ、ＣＰＰをコードする（例えば配列番号６１〜７９のいずれか１つをコードする）部分を含む。一例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質は、２つまたはそれよりも多い別個の核酸分子、例えば別個のベクター、例えばＧｓｘ１ドメインをコードする（例えば配列番号２もしくは４のタンパク質をコードするか、または配列番号１もしくは３の配列を含むかもしくはそれからなる）第１の核酸分子と、ＣＰＰドメインをコードする（例えば配列番号６１〜７９のいずれか１つをコードする）第２の核酸分子とによってコードされる。
【０１１４】
一例では、開示される方法はＧｓｘ１（またはＧｓｘ１−ＣＰＰ）核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム、またはＲＮＡ配列）を利用する、すなわちＧｓｘ１（またはＧｓｘ１−ＣＰＰ）核酸分子が対象に投与され、コードされたＧｓｘ１（またはＧｓｘ１−ＣＰＰ）タンパク質が、核酸分子が導入される細胞において発現する。Ｇｓｘ１（またはＧｓｘ１−ＣＰＰ）核酸分子は、上に記載した本来のまたはバリアントＧｓｘ１タンパク質をコードすることができる。
【０１１５】
遺伝暗号に基づいて、任意のＧｓｘ１タンパク質（例えば配列番号２または４）またはＧｓｘ１−ＣＰＰをコードする核酸配列を生成することができる。一部の例では、そのような配列は、宿主細胞、例えばＧｓｘ１（またはＧｓｘ１−ＣＰＰ）タンパク質を発現させるために使用される宿主細胞における発現に最適化される。そのような核酸は、直接使用する（例えば対象に投与する）ことも、対象に投与されるＧｓｘ１（またはＧｓｘ１−ＣＰＰ）タンパク質を産生するために使用することもできる。
【０１１６】
一例では、Ｇｓｘ１タンパク質（またはＧｓｘ１−ＣＰＰのＧｓｘ１ドメイン）をコードする核酸分子は、配列番号１または３の配列を含むかまたはそれからなる。Ｇｓｘ１（またはＧｓｘ１−ＣＰＰ）コード配列に作動可能に連結したプロモーターを含むこともできる、そのような核酸を含む細胞、プラスミド、およびウイルスベクターもまた提供される。
【０１１７】
一例では、Ｇｓｘ１タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１または３と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。したがって、一部の例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＧｓｘ１部分は、配列番号１または３と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によってコードされる。そのような配列は、本明細書において提供され、公的に入手可能なアミノ酸配列、および遺伝暗号を使用して容易に作製することができる。加えて、当業者は、機能的に等価な核酸、例えば配列の点で異なるが、同じＧｓｘ１タンパク質配列をコードする核酸を含有する多様なクローンを容易に構築することができる。
【０１１８】
核酸分子は、Ｇｓｘ１タンパク質をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびＲＮＡ配列を含む。コード配列におけるサイレント変異は、遺伝暗号の縮重（すなわち冗長性）に起因し、それによって１つよりも多いコドンが同じアミノ酸残基をコードする可能性がある。したがって、例えば、ロイシンは、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧによってコードされる可能性があり、セリンは、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣによってコードされる可能性があり、アスパラギンは、ＡＡＴまたはＡＡＣによってコードされる可能性があり、アスパラギン酸は、ＧＡＴまたはＧＡＣによってコードされる可能性があり、システインは、ＴＧＴまたはＴＧＣによってコードされる可能性があり、アラニンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧによってコードされる可能性があり、グルタミンは、ＣＡＡまたはＣＡＧによってコードされる可能性があり、チロシンは、ＴＡＴまたはＴＡＣによってコードされる可能性があり、イソロイシンは、ＡＴＴ、ＡＴＣ、またはＡＴＡによってコードされる可能性がある。標準的な遺伝暗号を示す表は、様々な供給源において見出すことができる（例えば、Stryer,  1988,  Biochemistry,  3rd  Edition,  W.H.  5  Freeman  and  Co.,  NYを参照のこと）。
【０１１９】
特定の種に関するコドン選択性およびコドン使用頻度表は、その特定の種のコドン使用頻度の偏りを活用する、Ｇｓｘ１タンパク質をコードする単離された核酸分子（例えば配列番号２または４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子）を操作するために使用することができる。例えば、開示される方法において使用されるＧｓｘ１タンパク質は、目的の特定の生物（例えばヒトまたはマウス）によって優先的に使用されるコドンを有するように設計することができる。
【０１２０】
Ｇｓｘ１タンパク質をコードする核酸（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するか、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子）、またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベース増幅系（ＴＡＳ）、自家持続配列複製系（３ＳＲ）、およびＱβレプリカーゼ増幅系（ＱＢ）によってクローニングするかまたは増幅することができる。加えて、Ｇｓｘ１タンパク質をコードする核酸（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するか、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子）、またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸は、クローニング技法（例えばSambrook  et  al.  (ed.),  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  2nd  ed.,  vol.  1-3,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring,  Harbor,  N.Y.,  1989、およびAusubel  et  al.,  (1987)  in  "Current  Protocols  in  Molecular  Biology,"  John  Wiley  and  Sons,  New  York,  N.Y.に見出されるクローニング技法）によって調製することができる。
【０１２１】
Ｇｓｘ１タンパク質をコードする核酸配列（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するか、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子）、またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸配列は、例えば適切な配列のクローニングを含む任意の好適な方法によって、または例えば、例えばNeedham-VanDevanter  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.  12:6159-6168,  1984に記載されている自動合成装置、および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法を使用する、Narang  et  al.,  Meth.  Enzymol.  68:90-99,  1979のホスホトリエステル法、Brown  et  al.,  Meth.  Enzymol.  68:109-151,  1979のホスホジエステル法、Beaucage  et  al.,  Tetra.  Lett.  22:1859-1862,  1981のジエチルホスホルアミダイト法、Beaucage  &  Caruthers,  Tetra.  Letts.  22(20):1859-1862,  1981によって記載されている固相ホスホルアミダイトトリエステル法等の方法による直接化学合成によって、調製することができる。化学合成は一本鎖オリゴヌクレオチドを作製する。一本鎖オリゴヌクレオチドは、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖を鋳型として使用するＤＮＡポリメラーゼを用いる重合によって二本鎖ＤＮＡに変換することができる。ＤＮＡの化学合成は全体として約１００塩基の配列に限定されるが、より長い配列がより短い配列のライゲーションによって取得されてもよい。
【０１２２】
一例では、Ｇｓｘ１タンパク質（例えば配列番号２または４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＧｓｘ１タンパク質）は、Ｇｓｘ１タンパク質をコードするｃＤＮＡ（例えば配列番号１または３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸分子）をベクターに挿入することによって調製される。挿入は、Ｇｓｘ１タンパク質が枠において、Ｇｓｘ１タンパク質が産生されるように読まれるように行うことができる。類似の方法を、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードするために使用することができる。
【０１２３】
Ｇｓｘ１核酸コード配列（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するか、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子）は、配列の挿入または組入れを可能にするように操作することができ、原核生物または真核生物のいずれかにおいて発現することができる、プラスミド、ウイルス、または他のビヒクルを含むがこれらに限定されない発現ベクターに挿入することができる。宿主としては、微生物、酵母、昆虫、植物、および哺乳類生物を挙げることができる。ベクターは、チミジンキナーゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または蛍光タンパク質等の選択マーカーをコードすることができる。類似の方法は、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸のために使用することができる。
【０１２４】
Ｇｓｘ１タンパク質をコードする核酸配列（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％，少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するか、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子）は、発現制御配列に作動的に連結することができる。Ｇｓｘ１タンパク質コード配列に作動的に連結する発現制御配列は、Ｇｓｘ１コード配列の発現が発現制御配列と適合する条件下において達成されるようにライゲーションされる。例示的な発現制御配列としては、これらに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、転写終結因子、Ｇｓｘ１タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのための、すなわちｍＲＮＡの適当な翻訳を可能とする、その遺伝子の正しい読み枠の維持のためのスプライシングシグナル、および停止コドンが挙げられる。類似の方法は、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸のために使用することができる。
【０１２５】
一実施形態では、ベクターが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ等の酵母における発現のために使用される。酵母発現系における使用のための例示的なプロモーターとしては、構成的プロモーター、形質膜Ｈ＋−ＡＴＰアーゼ（ＰＭＡ１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ−１（ＡＤＨ１）、および多剤耐性ポンプ（ＰＤＲ５）が挙げられる。加えて、誘導性プロモーター、例えば、ＧＡＬ１−１０（ガラクトースによって誘導される）、ＰＨＯ５（低細胞外無機リン酸塩によって誘導される）、およびタンデム熱ショックＨＳＥエレメント（３７℃への温度上昇によって誘導される）は有用である。滴定可能な誘導因子に応答して可変的な発現を導くプロモーターとしては、メチオニン応答性ＭＥＴ３およびＭＥＴ２５プロモーター、ならびに銅依存性ＣＵＰ１プロモーターが挙げられる。これらのプロモーターのいずれも、発現レベルにおける追加のレベルの制御を与えるために多コピー（２μ）または単一コピー（ＣＥＮ）プラスミドにクローニングされ得る。プラスミドは、酵母における選択のための栄養マーカー（例えば、ＵＲＡ３、ＡＤＥ３、ＨＩＳ１等）および細菌における増大のための抗生物質耐性マーカー（ＡＭＰ）を含むことができる。ｐＫＬＡＣ１等のＫ．ｌａｃｔｉｓにおける発現のためのプラスミドは公知である。したがって、一例では、細菌における増幅後、プラスミドは、細菌形質転換と類似した方法によって対応する酵母栄養要求株に導入することができる。Ｇｓｘ１タンパク質をコードする核酸分子（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するか、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子）、またはＧｓｘ１−ＣＰＰコード核酸分子はまた、昆虫細胞において発現するように設計することもできる。
【０１２６】
Ｇｓｘ１タンパク質（例えば配列番号２または４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＧｓｘ１タンパク質）、またはＧｓｘ１−ＣＰＰは、酵母菌株において発現することができる。例えば、７つの多剤耐性輸送体ＹＯＲ１、ＳＮＱ２、ＰＤＲ５、ＹＣＦ１、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１１、およびＰＤＲ１５と、それらの活性化転写因子ＰＤＲ１およびＰＤＲ３とは、酵母宿主細胞において同時に欠失し、結果として生じる菌株を薬物に感受性にしている。形質膜の変更された脂質組成物を有する酵母菌株、例えばエルゴステロール生合成ができないｅｒｇ６変異株もまた利用することができる。タンパク質分解に高度に感受性のタンパク質は、他の液胞加水分解酵素の活性化を制御する主要液胞エンドペプチダーゼＰｅｐ４を欠く酵母細胞において発現することができる。遺伝子の温度感受性（ｔｓ）アレルを保有する菌株における異種発現は、対応するヌル変異株が生存不能である場合、用いることができる。
【０１２７】
Ｇｓｘ１タンパク質をコードするウイルスベクター（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むウイルスベクター）、またはＧｓｘ１−ＣＰＰをコードするウイルスベクターもまた調製することができる。例示的なウイルスベクターとしては、ポリオーマ、ＳＶ４０、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、アルファウイルス、ならびにトリ、マウス、およびヒト起源のレトロウイルスが挙げられる。バキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス、ＡｃＭＮＰＶ）ベクターもまた使用することができる。他の好適なベクターとしては、レトロウイルスベクター、オルソポックスベクター、鳥ポックスベクター、鶏痘ベクター、カプリポックスベクター、ブタポックスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびポリオウイルスベクターが挙げられる。具体的な例示的なベクターは、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、および高度に弱毒化したワクシニアウイルス（ＭＶＡ）等のポックスウイルスベクター、アデノウイルス、バキュロウイルス等である。有用なポックスウイルスとしては、オルソポックス、ブタポックス、鳥ポックス、およびカプリポックスウイルスが挙げられる。オルソポックスとしては、ワクシニア、エクトロメリア、およびアライグマポックスが挙げられる。有用なオルソポックスの一例はワクシニアである。鳥ポックスとしては、鶏痘、カナリアポックス、および鳩痘が挙げられる。カプリポックスとしては、ヤギ痘および羊痘が挙げられる。一例では、ブタポックスは豚痘である。使用することができる他のウイルスベクターとしては、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルス等の他のＤＮＡウイルス、ならびにレトロウイルスおよびポリオ等のＲＮＡウイルスが挙げられる。
【０１２８】
Ｇｓｘ１タンパク質をコードするウイルスベクター（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むウイルスベクター）は、Ｇｓｘ１タンパク質をコードする核酸配列に作動するように連結した少なくとも１つの発現制御エレメントを含むことができる。発現制御エレメントは、核酸配列の発現を制御および調節するためにベクターに挿入される。これらのベクターにおいて有用な発現制御エレメントの例としては、これらに限定されないが、ｌａｃ系、ラムダファージのオペレーターおよびプロモーター領域、酵母プロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、またはＳＶ４０に由来するプロモーターが挙げられる。追加の作動エレメントとしては、これらに限定されないが、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、およびＧｓｘ１タンパク質をコードする核酸配列の、宿主系における適切な転写とその後の翻訳とに必要な任意の他の配列が挙げられる。発現ベクターは、核酸配列を含有する発現ベクターの、宿主系への移入と宿主系におけるその後の複製とに必要な追加のエレメントを含有することができる。そのようなエレメントの例としては、これらに限定されないが、複製起点および選択マーカーが挙げられる。そのようなベクターは、従来の方法（Ausubel  et  al.,  (1987)  in  "Current  Protocols  in  Molecular  Biology,"  John  Wiley  and  Sons,  New  York,  N.Y.）を使用して構築することができ、また市販されている。類似のベクターは、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸と共に使用することができる。
【０１２９】
一例では、Ｇｓｘ１タンパク質をコードするウイルスベクター（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むウイルスベクター）は、レンチウイルスまたはＡＡＶベクターであり、Ｇｓｘ１コード配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。一部の例では、プロモーターは、構成的プロモーター、例えばＣＭＶ、ベータアクチン、もしくはＴ７、または組織特異的プロモーター、例えばＣＮＳ特異的プロモーター（例えば、シナプシン１（Ｓｙｎ１）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ネスチン（ＮＥＳ）プロモーター、ミエリン関連乏突起膠細胞塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーター、またはフォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）プロモーター）である。類似のプロモーターは、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸と共に使用することができる。
【０１３０】
Ｇｓｘ１タンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を含有する組換えウイルス（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む組換えウイルス）を調製するための方法は公知である。そのような技法は、例えば、ドナープラスミドにおけるＧｓｘ１コード配列と隣り合うウイルス配列と、親ウイルスに存在する相同配列との間の相同組換えを伴う。ベクターは、例えば親ウイルスベクターに天然に存在するかまたは人工的に挿入される特有の制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して、異種ＤＮＡを挿入することによって構築することができる。類似の方法は、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸のために使用することができる。
【０１３１】
Ｇｓｘ１コード配列が導入される細胞が真核細胞である場合、トランスフェクション法としては、リン酸カルシウム共沈殿、マイクロインジェクション等の機械的手順、電気穿孔、リポソームに包まれたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターが挙げられる。真核細胞は、Ｇｓｘ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むポリヌクレオチド配列）と、選択可能な表現型、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子をコードする第２の外来ＤＮＡ分子とを用いて同時形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルス等の真核ウイルスベクターを使用して、真核細胞を一過性に感染させるかまたは形質転換し、タンパク質を発現させることである（例えば、Eukaryotic  Viral  Vectors,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  Gluzman  ed.,  1982を参照のこと）。プラスミドおよびベクター等の発現系は、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、および骨髄腫細胞株等の高等真核細胞を含む細胞においてＧｓｘ１タンパク質を産生するために使用することができる。類似の細胞は、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸と共に使用することができる。
【０１３２】
Ｄ．Ｇｓｘ１タンパク質を発現する細胞
Ｇｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子は、細胞を形質転換し、形質転換された細胞を作製するために使用することができる。したがって、Ｇｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質を発現する細胞（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質（またはそのＧｓｘ１部分）をコードする核酸分子を含む細胞）が開示される。一例では、細胞は、例えば神経障害を処置するための、哺乳動物に存在する哺乳動物細胞である。別の例では、細胞は、例えば治療Ｇｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質を発現させるために使用される、培養中の（例えばｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける）細胞、例えば真核または原核細胞（例えば、細菌、古細菌、植物、真菌、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞、例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、および不死化哺乳動物神経細胞株）である。
【０１３３】
Ｇｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質を発現する細胞は、形質転換されたまたは組換え細胞である。そのような細胞は、Ｇｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含むことができる（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質（またはそのＧｓｘ１部分）をコードする核酸分子を含む細胞）。複製中に生じる変異が存在し得るため、全ての後代は親細胞と同一でない場合があることが理解される。一例では、Ｇｓｘ１タンパク質をコードする１つの外因性核酸分子は安定に移入され、これは、外来ＤＮＡが形質転換された細胞に絶えず維持されることを意味する。
【０１３４】
組換え核酸を用いた宿主細胞の形質転換は従来の技法によって実行され得る。宿主が原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉである場合、ＤＮＡ取込みが可能なコンピテント細胞は、指数増殖期後に採取され、その後ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、またはＲｂＣｌを用いて処理された細胞から調製することができる。形質転換は、所望の場合は宿主細胞のプロトプラストを形成した後に、ポリエチレングリコール形質転換を使用して、または電気穿孔によって実施することもできる。一般的に使用される哺乳動物宿主細胞株の例はＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ならびにＷＩ３８、ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞株である。
【０１３５】
Ｅ．医薬組成物および投薬
Ｇｓｘ１タンパク質もしくはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を含む医薬組成物が提供される。一例では、組成物は、例えばリポソームに封入される、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する単離されたＧｓｘ１タンパク質を含む。一例では、組成物は、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｘｘ１部分と細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分とを含む単離されたＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質であって、Ｇｓｘ１部分とＣＰＰ部分とがリンカーによって必要に応じて接合する、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質を含む。一部の例では、ＣＰＰ部分は、配列番号６１〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の例では、組成物におけるＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質はリポソームに封入される。一例では、組成物は、配列番号１もしくは３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＧｓｘ１タンパク質をコードするか、または配列番号２もしくは４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＧｓｘ１タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。一例では、組成物は、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＧｓｘ１部分が、配列番号１もしくは３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるか、または配列番号２もしくは４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＧｓｘ１タンパク質をコードし、必要に応じてＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＣＰＰ部分をコードする核酸分子が、配列番号６１〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。一部の例では、組成物における核酸分子はリポソームに封入される。そのような組成物はまた、薬学的に許容される担体を含むこともできる。
【０１３６】
一部の実施形態では、医薬組成物は、Ｇｓｘ１タンパク質（例えば配列番号２または４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質）、（１）配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｓｘ１タンパク質と、（２）細胞透過性ペプチド（例えば配列番号６１〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むタンパク質）とから構成されるＧｓｘ１融合タンパク質、またはＧｓｘ１タンパク質をコードする核酸（例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子、またはＧｓｘ１タンパク質もしくはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子から本質的になり、必要に応じてＧｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質（またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子）はリポソームおよび薬学的に許容される担体に封入される。これらの実施形態では、追加の治療的に効果的な薬剤は組成物に含まれない。
【０１３７】
そのような組成物は、選択される特定の投与形式に応じて、適切な薬学的に許容される担体（例えば水または生理食塩水）と共に製剤化することができる。そのような組成物は、開示される方法を使用して、神経障害を有する対象に投与することができる。一例では、医薬組成物は注射、例えばＣＮＳへの、例えば損傷の部位またはその近傍（例えば損傷部位に対して吻側および／または尾側）における注射に好適である。一部の例では、実質内、脳室内、または髄腔内（脳槽および腰椎）注射が、脳および／または脊髄を標的とするために使用される。
【０１３８】
医薬組成物は治療有効量の別の薬剤を含むことができる。そのような薬剤の例としては、限定されないが、以下の「Ｆ」節に列挙される薬剤、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１３９】
本開示において有用な薬学的に許容される担体および賦形剤は従来のものである。例えば、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy,  The  University  of  the  Sciences  in  Philadelphia,  Editor,  Lippincott,  Williams,  &  Wilkins,  Philadelphia,  PA,  21st  Edition  (2005)を参照のこと。例えば、非経口製剤は通例、薬学的および生理学的に許容される流体ビヒクル、例えば、水、生理的食塩水、他の平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等である注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態）の場合、従来の非毒性固体担体としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、保存剤、ｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。含まれ得る賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物等の他のタンパク質である。
【０１４０】
一部の実施形態では、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子は、放出制御製剤、例えばマイクロカプセル製剤に含まれる。様々な種類の生分解性および生体適合性ポリマー、方法を使用することができ、多様な合成化合物、タンパク質、および核酸を封入する方法を使用することができる（例えば、米国特許公開第２００７／０１４８０７４号、同第２００７／００９２５７５号、および同第２００６／０２４６１３９号、米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，７５３，２３４号、および同第７，０８１，４８９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２００６／０５２２８５号、Benita,  Microencapsulation:  Methods  and  Industrial  Applications,  2nd  ed.,  CRC  Press,  2006を参照のこと）。
【０１４１】
他の実施形態では、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子はナノ分散系に含まれる。例えば、米国特許第６，７８０，３２４号、米国特許公開第２００９／０１７５９５３号を参照のこと。例えば、ナノ分散系としては、生物学的に活性な薬剤、および分散剤（例えば、ポリマー、コポリマー、または低分子量界面活性剤）が挙げられる。使用することができる例示的なポリマーまたはコポリマーとしては、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（エチレングリコール）が挙げられる。例示的な低分子量界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、塩化ヘキサデシルピリジニウム、ポリソルベート、ソルビタン、ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、ポリ（オキシエチレン）アルキルエステル、およびそれらの組合せが挙げられる。一例では、ナノ分散系としては、ＰＶＰおよびＯＤＰ、またはそれらのバリアント（例えば８０／２０ｗ／ｗ）が挙げられる。一部の例では、ナノ分散剤は溶媒蒸発法を使用して調製される、例えば、Kanaze  et  al.,  Drug  Dev.  Indus.  Pharm.  36:292-301,  2010、Kanaze  et  al.,  J.  Appl.  Polymer  Sci.  102:460-471,  2006を参照のこと。核酸の投与に関して、核酸の投与の１つの手法は、レンチウイルスまたはＡＡＶベクター等のウイルスベクターを用いる直接処置である。上に記載したように、Ｇｓｘ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば配列番号２または４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質、あるいは例えば配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子、または配列番号２もしくは４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子）は、Ｇｓｘ１タンパク質の発現量を増加させるためにプロモーターの制御下に置くことができる。
【０１４２】
多くの種類の放出送達系が使用され得る。例としては、ポリマーベース系、例えば、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物が挙げられる。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセル剤は、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達系としてはまた、非ポリマー系、例えば、コレステロール、コレステロールエステル等のステロール、ならびに脂肪酸または中性脂肪、例えばモノ、ジ、およびトリグリセリドを含む脂質；ヒドロゲル放出系；シラスティック系；ペプチドベース系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分的に融合した埋込剤等も挙げられる。具体例としては、これらに限定されないが、（ａ）Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子がある形態でマトリックス内に含有される浸食系、例えば米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，７４８，０３４号、同第５，２３９，６６０号、および同第６，２１８，３７１号に記載されている浸食系、ならびに（ｂ）活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散系、例えば米国特許第３，８３２，２５３号および同第３，８５４，４８０号に記載されている拡散系が挙げられる。加えて、ポンプベースのハードウェア送達系を使用することができ、そのうちの一部は埋込に適合される。
【０１４３】
長期徐放性埋込剤は、神経障害等の慢性状態の処置に好適であり得る。長期放出とは、本明細書で使用される場合、埋込剤が治療レベルの有効成分を少なくとも３０日間、または少なくとも６０日間送達するように構築および配置されることを意味する。長期徐放性埋込剤としては、上に記載した放出系のうちの一部が挙げられる。これらの系は核酸との使用に関して記載されている（米国特許第６，２１８，３７１号を参照のこと）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用の場合、核酸およびペプチドは分解（例えばエンドおよびエキソヌクレアーゼを介した）に比較的耐性である。したがって、Ｃ末端のアミドの包含等のＧｓｘ１タンパク質の修飾を使用することができる。
【０１４４】
医薬組成物の剤形は選択される投与形式によって決定することができる。例えば、注射可能な流体に加えて、外用、吸入、経口、および坐剤製剤が用いられ得る。外用調製物としては、点眼薬、軟膏剤、スプレー剤、貼付剤等を挙げることができる。吸入調製物は、液体（例えば溶液剤または懸濁剤）であり得、ミスト剤、スプレー剤等を挙げることができる。経口製剤は、液体（例えば、シロップ剤、溶液剤、または懸濁剤）または固体（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤）であり得る。坐剤調製物もまた、固体、ゲル、または懸濁剤形態であり得る。固体組成物の場合、従来の非毒性固体担体としては、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、セルロース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。
【０１４５】
一部の例では、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の治療有効量は、（１）例えば損傷部位もしくはその近傍における炎症を軽減する、例えば浸潤したマクロファージの数を減少させる（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）、（２）例えば損傷部位もしくはその近傍における神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）の数を増加させる（例えばネスチンおよび／またはダブルコルチンの発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加）、（３）ＮＳＰＣの特異的ニューロン系統に向かう分化を増加させる、例えば、例えば損傷部位もしくはその近傍におけるグルタミン酸作動性ニューロンとコリン作動性ニューロンとの数の増加（およびＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数の減少）（例えばＮｅｕＮ、ＣｈＡＴ、および／またはＧｌｕｔ２の発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも６００％の増加）、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数を減少させる（例えばＧＡＢＡの発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）、（４）例えば損傷部位もしくはその近傍におけるアストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成を軽減する、例えば星細胞の数を減少させる（例えばＧＦＡＰ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、および／またはＣＳＰＧの発現量を測定することによって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）、（５）対象の歩行運動を増加させる（例えば、バッソマウススケール（ＢＭＳ）スコアまたは機能的自立度評価法（ＦＩＭ）によって決定される）（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも６００％の増加）、ならびに／または（６）例えば損傷部位もしくはその近傍における細胞死を減少させる、例えば切断型カスパーゼ３陽性細胞の数を減少させる（例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の無投与と比べて、例えば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の減少）のに必要な量である。
【０１４６】
Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を含む医薬組成物は、正確な投薬量の個々の投与に好適な単位剤形に製剤化することができる。非限定的な一例では、単位投薬量は、約１ｍｇ〜約１ｇのＧｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰタンパク質、例えば約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約９００ｍｇ、約２５０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、または約４００ｍｇ〜約６００ｍｇを含有する。他の例では、治療有効量のＧｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰタンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。他の例では、治療有効量のＧｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、例えば約２ｍｇ／ｋｇである。特定の例では、治療有効量のＧｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約２ｍｇ／ｋｇである。
【０１４７】
他の好適な範囲としては、約１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重またはそれよりも多い（例えば約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約１〜２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜５０ｍｇ／ｋｇ、または約１０〜１００ｍｇ／ｋｇ）Ｇｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質の用量が挙げられる。ある特定の実施形態では、有効投薬量は、例えば、５〜４０ｍｇ／ｋｇ、１０〜３５ｍｇ／ｋｇ、または２０〜２５ｍｇ／ｋｇのより狭い範囲内である。他の例では、投薬量は、約１〜１００ｍｇ、例えば、約１〜１０ｍｇ、約５〜２５ｍｇ、約１０〜５０ｍｇ、約２５〜６０ｍｇ、または約５０〜１００ｍｇ（例えば、約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、または１００ｍｇ）である。特定の例では、用量は約２０〜６０ｍｇであり、非限定的な一例では、約２５ｍｇである。
【０１４８】
Ｇｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰコード配列を含む医薬組成物は、正確な投薬量の個々の投与に好適な単位剤形に製剤化することができる。全体として、投与されるＧｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質の核酸コード配列を保有する組換えウイルスベクターの数量は、ウイルス粒子の力価に基づく。非限定的な一例では、例えばウイルスベクターがＧｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸の投与に利用される場合、単位投薬量（例えば０．５〜１．５μｌ）は哺乳動物１匹当たり約１０５〜約１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌを含有する。したがって、一部の例では、レシピエント対象は、組成物において、哺乳動物１匹当たり約１０５〜約１０１０ｐｆｕ／ｍｌの用量の組換えウイルスを投与される。一部の例では、レシピエント対象は、哺乳動物１匹当たり少なくとも１０５ｐｆｕ／ｍｌ、哺乳動物１匹当たり少なくとも１０６ｐｆｕ／ｍｌ哺乳動物１匹当たり少なくとも１０７ｐｆｕ／ｍｌ哺乳動物１匹当たり少なくとも１０８ｐｆｕ／ｍｌ、哺乳動物１匹当たり少なくとも１０９ｐｆｕ／ｍｌ、または哺乳動物１匹当たり少なくとも１０１０ｐｆｕ／ｍｌの用量を投与される。組成物を哺乳動物に投与するための方法の例としては、これらに限定されないが、組成物の罹患組織への（例えば脳または脊髄への）注射、またはウイルスの静脈内、皮下、皮内、もしくは筋肉内投与が挙げられる。
【０１４９】
Ｇｓｘ１またはＧｓｘ１−ＣＰＰタンパク質を含む本開示の組成物は、ヒトまたは他の動物に任意の手段によって、例えば、経口的に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内に、皮内に、実質内に、脳室内に、髄腔内（例えば脳槽および腰椎）に、皮下に、吸入を介して、または坐剤を介して投与することができる。非限定的な一例では、組成物は注射を介して投与される。一部の例では、組成物の部位特異的投与は、例えばＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはコード配列をＣＮＳ組織（例えば脳または脊髄、例えば損傷の区域またはその近傍、例えば損傷部位に対して吻側および／または尾側）に投与することによって使用することができる。一部の例では、投与は、腰椎／仙骨領域におけるＳＣＩを処置するための髄腔内注射（例えば、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の）、頸椎／胸椎領域におけるＳＣＩを処置するための大槽注射（例えば、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の）、または外傷性脳損傷を処置するための実質内もしくは脳室内注射（例えば、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子の）である。
【０１５０】
処置は、単回投与、または複数回投与（例えば少なくとも２回の別個の投与）、例えば数日から数か月、またはさらには数年の期間にわたる用量を伴い得る。例えば、治療有効量のＧｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子は、単回用量で投与する、または数回の用量で、例えば処置の経過の間毎日、毎週、毎月、もしくは毎年投与することができる。特定の非限定的な例では、処置は、毎月１回、毎年１回、または隔月の投与を伴う。一部の例では、複数回用量が投与される場合、少なくとも２回の別個の投与は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも９か月、または少なくとも１年空けてもよい。
【０１５１】
一部の例では、投与される第１の用量（および一部の例では唯一の用量）は、神経障害の発症の１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、１か月以内、２か月以内、または３か月以内、例えば神経障害の発症の１〜２４時間、２〜２４時間、４〜２４時間、または１〜９６時間以内に生じる。
【０１５２】
Ｆ．追加の療法の投与
一部の例では、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子は、１つまたは複数の他の薬剤、例えば神経障害の処置において有用な薬剤と組み合わせて（例えば、逐次、同時、または同時期に）投与される。「組み合わせた投与」または「同時投与」という用語は、活性な薬剤の同時投与と逐次投与の両方を指す。
【０１５３】
一部の例では、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする配列は、外傷性脊髄または脳損傷を有する対象に、有効用量の、幹細胞、ステロイド薬（例えばメチルプレドニゾロン）、およびｉｖ流体のうちの１つまたは複数と組み合わせて投与される。一部の例では、対象はまた、外科的処置、低体温処置、または両方も受ける。Ｇｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１コード配列の投与はまた、増加した身体活動等の生活習慣の修正、理学療法、または固定（例えば硬質のカラーにおける）と組み合わせてもよい。
【０１５４】
一部の例では、Ｇｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１コード配列は、脳の神経障害、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中（虚血性または出血性）、虚血、てんかん、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症を有する対象に、有効用量の１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて投与される。例えば、対象がパーキンソン病を有する場合、方法は、治療有効量の、幹細胞、深部脳刺激、外科的処置（例えば淡蒼球破壊術または視床破壊術）、ベンズトロピンメシレート（コゲンチン）、エンタカポン（コムタン）、ドパール、ドーパミンアゴニスト（例えば、アポモルヒネ（アポカイン）、プラミペキソール（ミラペックス）、ロピニロールＨＣｌ（レキップ）、およびロチゴチン（ニュープロ））、ラロドパ、レボドパおよびカルビドパ（シネメット）、ラサギリン（アジレクト）、サフィナミド（キサダゴ（Xadago））、タスマール（tasmar）、ならびにトリヘキシフェニジル（trihexphenidyl）（アーテン）のうちの１つまたは複数を投与することをさらに含むことができる。例えば、対象がアルツハイマー病を有する場合、方法は、治療有効量の、幹細胞、コリンエステラーゼ阻害薬（例えば、Ｒａｚａｄｙｎｅ（登録商標）（ガランタミン）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）（リバスチグミン）、またはＡｒｉｃｅｐｔ（登録商標）（ドネペジル））、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト（例えばメマンチン）、Ｃｅｌｅｘａ（登録商標）（シタロプラム）、Ｒｅｍｅｒｏｎ（登録商標）（ミルタザピン）、Ｚｏｌｏｆｔ（登録商標）（セルトラリン）、Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ（登録商標）（ブプロピオン）、Ｃｙｍｂａｌｔａ（登録商標）（デュロキセチン）、およびＴｏｆｒａｎｉｌ（登録商標）（イミプラミン）のうちの１つまたは複数を投与することをさらに含むことができる。例えば、対象が脳卒中を有する場合、方法は、治療有効量の、虚血性脳卒中のための組織プラスミノーゲン活性化因子（例えばアルテプラーゼＩＶ  ｒ−ｔＰＡ）、または出血性脳卒中のための外科的処置（例えばコイルまたはクリップを設置して血液喪失を止める）のうちの１つまたは複数を投与することをさらに含むことができる。例えば、対象が虚血（例えば心虚血または腸間膜動脈虚血）を有する場合、方法は、治療有効量の、血管拡張薬、抗凝固薬（例えば、ヘパリン、アスピリン）、ニトレート、ＡＣＥ阻害薬、ラノラジン、および外科的処置のうちの１つまたは複数を投与することをさらに含むことができる。例えば、対象がてんかんを有する場合、方法は、治療有効量の、抗発作または抗てんかん薬（例えば、カルバマゼピン、バルプロエート、ラモトリギン、ジランチンまたはフェニテック（phenytek）、フェノバルビタール（ohenobarbital）、テグレトールまたはカルバトロール、ミソリン、ザロンチン、デパケン、デパコート、デパコートＥＲ、バリウムならびにトランキセンおよびクロノピン等の類似した精神安定薬、フェルバトール、ガビトリル、ケプラ、ラミクタール、リリカ、ニューロンチン、トパマックス、トリレプタル、ならびにゾネグラン）、外科的処置、迷走神経刺激、深部脳刺激、ならびにケトン食療法のうちの１つまたは複数を投与することをさらに含むこ��ができる。例えば、対象がハンチントン病を有する場合、方法は、治療有効量の、モノアミン枯渇薬（例えばテトラベナジンまたはアマンタジン）、ＳＳＲＩ抗うつ薬（例えば、フルオキセチン、シタロプラム、パロキセチン、およびセルトラリン）または他の抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン、ミルタザピン、デュロキセチン、およびベンラファキシン）、抗精神病薬（例えば、クエチアピン、リスペリドン、またはオランザピン）、気分安定薬（例えばバルプロエートまたはカルバマゼピン）、および高タンパク食療法のうちの１つまたは複数を投与することをさらに含むことができる。例えば、対象が多発性硬化症を有する場合、方法は、治療有効量の、幹細胞、コルチコステロイド（例えばメチルプレドニゾロンまたはプレドニゾン）、インターフェロンベータ遮断薬（例えば、コパキソン、テリフルノミド、またはミトキサントロン）のうちの１つまたは複数を投与することをさらに含むことができる。
【０１５５】
例えば、対象が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する場合、方法は、治療有効量の、グルタミン酸アンタゴニスト（例えばリルゾール）、および神経保護剤（例えばエダラボン）のうちの１つまたは複数を投与することをさらに含むことができる。したがって、一部の例では、Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする配列を含む医薬組成物は、これらの治療剤のうちの１つまたは複数をさらに含む。Ｇｓｘ１タンパク質、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質、またはそのようなタンパク質をコードする配列の投与はまた、増加した身体活動、言語聴覚療法、作業療法、理学療法、またはそれらの組合せと組み合わせてもよい。
【０１５６】
ＩＶ．組成物
開示される方法と共に使用することができる組成物もまた提供される。一例では、組成物は、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む単離されたＧｓｘ１タンパク質とリポソームとを含み、Ｇｓｘ１タンパク質はリポソームに封入される。
【０１５７】
一例では、組成物は、（１）配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｓｘ１タンパク質と、（２）細胞透過性ペプチドとから構成されるＧｓｘ１融合タンパク質（またはそのようなＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子）を含む。使用することができる例示的な細胞透過性ペプチドとしては、親水性ペプチド（例えば、ＴＡＴ［YGRKKRRQRRR；配列番号６１］、ＳｙｎＢ１［RGGRLSYSRRRFSTSTGR；配列番号６２］、ＳｙｎＢ３［RRLSYSRRRF；配列番号６３］、ＰＴＤ−４［PIRRRKKLRRLK；配列番号６４］、ＰＴＤ−５［RRQRRTSKLMKR；配列番号６５］、ＦＨＶ  Ｃｏａｔ−（３５−４９）［RRRRNRTRRNRRRVR；配列番号６６］、ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７−２５）［KMTRAQRRAAARRNRWTAR；配列番号６７］、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４−１６）［TRRQRTRRARRNR；配列番号６８］、Ｄ−Ｔａｔ［GRKKRRQRRRPPQ；配列番号６９］、Ｒ９−Ｔａｔ［GRRRRRRRRRPPQ；配列番号７０］、およびペネトラチン［RQIKWFQNRRMKWKK；配列番号７１］）、両親媒性ペプチド（例えば、ＭＡＰ［KLALKLALKLALALKLA；配列番号７２］、ＳＢＰ［MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV；配列番号７３］、ＦＢＰ［GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV；配列番号７４］、ＭＰＧ  ａｃ−GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya；配列番号７５］、ＭＰＧ（ΔＮＬＳ）［ac-  GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya；配列番号７６］、Ｐｅｐ−２［ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya；配列番号７７］、およびトランスポータン［GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL；配列番号７８］）、周期配列（例えば、ｐＶｅｃ、ポリアルギニンＲｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラ、ポリリシンＫｘＮ（４＜Ｎ＜１７）キメラ、（ＲＡｃａ）６Ｒ、（ＲＡｂｕ）６Ｒ、（ＲＧ）６Ｒ、（ＲＭ）６Ｒ、（ＲＴ）６Ｒ、（ＲＳ）６Ｒ、Ｒ１０、（ＲＡ）６Ｒ、Ｒ７、およびｐｅｐ−１［ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya；配列番号７９］）、およびＣｒ１０（環状ｐｏｌ−アルギニンＣＰＰ）が挙げられる。そのようなＧｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質はリポソームに封入することができる。
【０１５８】
一例では、組成物は、配列番号１もしくは３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＧｓｘ１タンパク質をコードするか、または配列番号２もしくは４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＧｓｘ１タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。一例では、組成物は、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＧｓｘ１部分が、配列番号１もしくは３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるか、または配列番号２もしくは４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＧｓｘ１タンパク質をコードし、必要に応じてＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＣＰＰ部分をコードする核酸分子が、配列番号６１〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。一部の例では、組成物における核酸分子はリポソームに封入される。そのような組成物はまた、薬学的に許容される担体を含むこともできる。
【０１５９】
開示される組成物は、上に記載したように、他の材料、例えば薬学的に許容される担体、例えば水もしくは生理食塩水、および／または他の治療剤をさらに含むことができる。
【０１６０】
Ｖ．細胞のプログラミング
細胞の特異的ニューロン細胞（例えばグルタミン酸作動性またはコリン作動性ニューロン）へのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおけるプログラミングの方法もまた提供される。例えば、宿主細胞、例えば神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）、線維芽細胞、または胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、本明細書において提供される核酸分子（例えばＧｓｘ１タンパク質またはＧｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードするウイルスベクターまたはプラスミド）をトランスフェクトすることができる。Ｇｓｘ１核酸分子は、配列番号２または４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧｓｘ１タンパク質をコードすることができる。一部の例では、Ｇｓｘ１をコードする核酸分子は、配列番号１または３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、一部の例ではプラスミドまたはベクター（例えばレンチウイルスまたはＡＡＶベクター）の一部であり、プロモーター、エンハンサーエレメント、または両方に作動可能に連結することができる。
【０１６１】
細胞は、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＧｓｘ１部分が、配列番号１もしくは３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされ得るか、または配列番号２もしくは４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＧｓｘ１タンパク質をコードする、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質のＣＰＰ部分をコードする核酸分子の部分は、配列番号６１〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードすることができる。一部の例では、Ｇｓｘ１−ＣＰＰ融合タンパク質をコードする核酸分子は、プラスミドまたはベクター（例えばレンチウイルスまたはＡＡＶベクター）の一部であり、プロモーター、エンハンサーエレメント、または両方に作動可能に連結することができる。
【０１６２】
一部の例では、トランスフェクション後、組換え宿主細胞はｅｘ  ｖｉｖｏにおいて培養される。例えば、線維芽細胞が使用される場合、線維芽細胞はＭＥＦ培地［ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、および０．００８％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール］中で培養することができる。例えば、ＮＳＰＣおよびＥＳＣが使用される場合、ＮＳＰＣおよびＥＳＣはニューロン分化培地、例えば１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２５μｇ／ｍｌのインスリン、５０μｇ／ｍｌのアポトランスフェリン、１．２８ｎｇ／ｍｌのプロゲステロン、１６ｎｇ／ｍｌのプトレシン、および０．５２μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムを含み、１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養することができる。
【０１６３】
このようにニューロン表現型にプログラミングされる、結果として得られる形質転換された（例えば組換え）宿主細胞は、神経障害、例えば、ＳＣＩもしくはＴＢＩ、またはパーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、虚血、てんかん、ハンチントン病、多発性硬化症、または筋萎縮性側索硬化症を有する対象に導入する（例えば移植する）ことができる。したがって、そのようなプログラミングされた細胞は、対象、例えばヒト対象におけるそのような神経障害の処置を達成するために使用することができる。
【０１６４】
本開示は以下の非限定的な実施例によって例証される。
【実施例】
【０１６５】
（実施例１）
材料および方法
本実施例は、実施例２〜７に示す結果を取得するために使用した材料および方法を提供する。
【０１６６】
レンチウイルス作製
Ｇｓｘ１とレポーターＲＦＰとをコードするレンチウイルス（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ）および対照レンチウイルス（レポーターＲＦＰのみをコードする、レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）（ＡＢＭ（登録商標）ＬＶ４６５３６６およびＬＶ０８４）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に標的ベクター（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰまたはレンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）、エンベローププラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ／ＶＳＶＧ、Ａｄｄｇｅｎｅ  １２２５９）、および第３世代パッケージングプラスミド（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、Ａｄｄｇｅｎｅ  １２２５１、およびｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、Ａｄｄｇｅｎｅ  １２２５３）の混合物をトランスフェクトすることによって生成した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸（ＭＥＭ  ＮＥＡＡ１００ｘ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１１４００５０）、および１％Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ１００Ｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３５０５００６１）を補充した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎）細胞のトランスフェクションを、培養が約５０〜６０％の集密度に達する時に実施した。ウイルス含有上清をトランスフェクション後２日目および４日目に収集した。ウイルスを、ウイルス上清をポリエチレングリコール６０００（ＰＥＧ６０００）法により沈殿させることによって濃縮した（Kutner  et  al.,  Nat  Protoc  4,  495-505  (2009)）。ウイルス力価を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染させることによって決定した（Kutner  et  al.,  Nat  Protoc  4,  495-505  (2009)）。
【０１６７】
動物
若い成体（８〜１２週）マウスを動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認の下で使用した。全ての動物を動物飼養施設に１２時間明／暗周期で収容した。各実験条件下のマウスを、可能な場合は等しい数の雄および雌マウスを用いて、無作為に割り当てた。
【０１６８】
片側切断脊髄損傷およびレンチウイルス注射
片側切断ＳＣＩおよびレンチウイルス注射のために、マウスを初めに３〜４分間の５％イソフルラン吸入により麻酔し、次いで残りの外科的処置の間２．５％イソフルランに維持した。次に、皮膚を、ベタジンスクラブおよび７０％エタノールシートを用いて消毒した。椎弓切除術をＴ９〜Ｔ１０付近において実施して、脊髄を露出した。次に、局所麻酔（０．１２５％マーカイン）をかけ、背側血管を、焼灼器を使用して焼いた。次いで、外側切断を脊髄の左側に対して実施し、切断は、片側切断ＳＣＩのため、脊髄の正中線で終える。損傷直後、約１〜２μＬのウイルス（１×１０８ＴＵ／ｍｌ）を病変中心点に対して約１ｍｍ吻側および尾側に注射した。ウイルスを約１μＬ／分において注射し、針を２〜３分間そのままにして、拡散を可能にし、漏出または逆流を予防した。シャム動物に関しては、皮膚および筋肉を切断して、脊髄を露出した。筋肉を縫合し、皮膚をステープルにより元通りに閉じた。外科的処置直後、１ｍｇ／ｋｇのメロキシカム、鎮痛薬、および抗生物質として５０ｍｇ／ｋｇのセファゾリンを皮下投与した。
【０１６９】
動物を以下の３つの群（３〜６匹／群）に分けた：１）シャムマウス（損傷を有しない脊椎を露出、Ｓｈａｍ）、２）レンチ−対照−ＲＦＰの注射を伴うＳＣＩマウス（ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ）、および３）レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ注射を伴うＳＣＩマウス（ＳＣＩ＋Ｇｓｘ１）。
【０１７０】
行動／歩行運動評価
各動物の歩行運動を、オープンフィールド試験によるバッソマウススケール（ＢＭＳ）スコアに基づいて評価した（Basso  et  al.,  J  Neurotrauma  23:635-659  (2006)）。ＢＭＳスケールは、０（完全に麻痺している）〜９（正常）の歩行運動の範囲である。ＢＭＳスコア評価は、処置の種類について盲検化されている３名の独立した観察者によって、動物１匹当たり２〜３分の観察の後に与えられた。ＢＭＳ評価は、損傷前、その後は損傷の最大８週間後まで週に２回実施する。
【０１７１】
組織プロセシング
損傷３、７、１４、および５６日後（ＤＰＩ）の脊髄組織を、１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とそれに続く４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）とを用いた心臓内灌流後に採取した。次いで、脊髄組織を顕微鏡手術によりで切り分け、ローター上で４％ＰＦＡにおいて一晩（１８〜２４時間）固定した。固定した脊髄組織を、１ｘＰＢＳを用いて３０分間３回洗浄し、次いで組織が底に沈むまで３０％（ｗ／ｖ）スクロース中に一晩置いた。次に、組織をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）最適切断温度（Ｏ．Ｃ．Ｔ．）に包埋することによって凍結保存し、必要となるまで−８０℃で保管した。脊髄組織の矢状切片または横断切片（１２μｍ厚）を、クリオスタット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して生成した。
【０１７２】
免疫組織化学
免疫染色を、以前に確立されたプロトコールに若干の修正を加えたものに従って実施した（Li  et  al.,  Sci  Rep  6,  38665  (2016)）。簡潔に述べると、切片を、冷メタノールを用いて、室温で１０分間、固定および抗原回収のために処理した。全ての抗体を、０．０５％トリトンＸ−１００、２％ロバ血清、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびＰＢＳ（１Ｘ）を含有するｐＨ７．４のブロッキング溶液中に希釈した。切片を、一次抗体（表１）と共に４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳを用いて１０分間３回洗浄した。次いで、二次抗体（表１）を室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳを用いて１０分間３回洗浄した。核染色に関しては、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、２００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、次いで試料を、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ８３１０−４）を用いて封止する。
【０１７３】
【表１−１】
2021534206.tif 000003
【表１−２】
2021534206.tif 000004
【０１７４】
イメージングおよび画像分析
各スライド／動物からの少なくとも５つの切片を分析した。画像を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡またはＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｉｍａｇｅｒ  Ａ．１を使用して、条件ごとに同じ露出および閾値、ならびに同じ強度において捕捉した。ＩｍａｇｅＪにおける自動セルカウンター（Rueden  et  al.,  BMC  Bioinformatics  18:529  (2017)、Schneider  et  al.,  Nat  Methods  9:671-675  (2012)）を使用して、細胞の総数を計数した。細胞型特異的マーカーとＲＦＰとの同時標識を手動で計数した。試料サイズを、以前の実験から実施された検出力分析に基づいて決定した。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。全てのデータを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ソフトウェアを使用して分析した。２つの条件間の統計的有意性はスチューデントのｔ検定によって算出し、多群比較は一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定とを使用して実施する。０．０５未満のＰ値を統計的に有意と考える。
【０１７５】
ＲＮＡ抽出および品質管理
３、１４、３５ＤＰＩの脊髄組織（各時点に関してｎ≧３、（図３Ａ））を切り出し、損傷／注射セグメント（病変の各側から約２〜３ｍｍに及ぶ実質セグメント）を液体窒素中に迅速に急速凍結した。総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ脂質組織ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４８０４）を製造業者のプロトコールに従って使用して、脊髄組織から単離した。総ＲＮＡの濃度を、Ｑｕｂｉｔ  ＲＮＡ  ＢＲアッセイキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して決定し、総ＲＮＡの品質を、２１００バイオアナライザー自動電気泳動システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてＲＮＡ６０００ナノチップを使用して決定した。
【０１７６】
ライブラリー調製およびＲＮＡ配列決定
ライブラリー調製およびＲＮＡ配列決定は、Ａｄｍｅｒａ  Ｈｅａｌｔｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）によって実施された。総ＲＮＡを各試料のライブラリー調製のために使用し、その後、製造業者の使用説明書（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってバーコードを付して調製した。ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑペアエンドキットを使用して調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑにおいて、ペアエンド、２×１５０ｂｐとして配列決定した。配列決定ランを製造業者の使用説明書に従って実施し、試料１つ当たり総計４０００万のリードを生成した。
【０１７７】
ＲＮＡ−Ｓｅｑデータ分析および経路分析
ＦａｓｔＱＣ（www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）を使用した生ｆａｓｔｑファイルの品質チェックの後、全ての配列を、ＳＴＡＲバージョン２．０（Dobin  et  al.,  Bioinformatics  29:15-21  (2013)）を用いて、マウス参照ゲノムｍｍ１０に対してアラインメントした。生リードカウントを、ＨＴＳｅｑ（バージョン０．６．０）（Anders  et  al.,  Bioinformatics  31:166-169  (2015)）を使用して生成した。Ｒ／ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージのＤＥＳｅｑ２（Love  et  al.,  Genome  Biol  15:550  (2014)、Anders  &  Huber,  Genome  Biol  11:R106  (2010)）を使用して、カウントを正規化し、ＨＴＳｅｑによって生成したカウント行列における変動遺伝子発現量を求めた。Ｇｓｘ１処置群と対照群との間で発現変動した転写物／遺伝子を、統計的有意性（ｐ値）および生物学的関連性（倍率変化）によって定義した。下流経路分析を、ＱＩＡＧＥＮの独創性経路分析（ＩＰＡ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis）を使用して実行した。
【０１７８】
箱ひげ図の遺伝子発現量は、ＳＴＡＲＴ（kcvi.shinyapps.io/START/）を使用してｅｄｇｅＲアルゴリズムによりＨＴＳｅｑからのカウント行列から生成する。箱ひげ図の各点は１つの生物学的試料を表す。
【０１７９】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、製造業者のプロトコールを使用してＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０８００５１）を使用し、総ＲＮＡから合成した。ｑＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して、パワーＳＹＢＲ（商標）グリーンＰＣＲマスターミックスおよび遺伝子特異的プライマー（表２）を用いて実施した。ＧＡＰＤＨを参照ハウスキーピング遺伝子として使用する。リバック（Levak）法を使用して、倍率変化を、Ｓｈａｍに対して正規化することによって算出する。
【０１８０】
【表２】
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【０１８１】
（実施例２）
方法の概要
ＳＣＩ後の成体の脊髄におけるＧｓｘ１の異所性発現がＮＳＰＣ活性化および神経発生を促進するかどうかを決定するために、胸椎（Ｔ）１０レベルにおいて、脊髄の正中線から左側に対する外側片側切断を実施した。外側片側切断ＳＣＩの完全性および無矛盾性は、左後肢における麻痺の観察によって確認した。ＳＣＩ直後、Ｇｓｘ１とレポーター赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）とをコードするレンチウイルス（レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ）１μＬ／部位（１×１０８ＴＵ／ｍｌ）を損傷した脊髄に、損傷部位に対しておよそ１ｍｍ吻側および尾側に注射した（図１Ａ）。ＲＦＰレポーターのみをコードするレンチウイルス（レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ）を対照として使用する。動物を以下の３つの群（３〜６匹／群）に無作為に割り当てた：１）シャムマウス（損傷を有しない脊椎を露出、Ｓｈａｍ）、２）レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰの注射を伴うＳＣＩマウス（ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ）、および３）レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ注射を伴うＳＣＩマウス（ＳＣＩ＋Ｇｓｘ１）。免疫組織化学によって損傷３日後（ＤＰＩ）および７ＤＰＩでの、ならびにＲＴ−ｑＰＣＲによって３ＤＰＩでの脊髄組織におけるレンチウイルス媒介Ｇｓｘ１発現が初めに確認された（図２Ａ〜２Ｅ）。対照と比較して、Ｇｓｘ１処置は、Ｇｓｘ１発現を有するウイルス形質導入ＲＦＰ＋細胞のパーセンテージを大幅に増加した。
【０１８２】
（実施例３）
Ｇｓｘ１処置は損傷した脊髄において細胞増殖を高める
ＳＣＩは病変部位において細胞増殖を高める。損傷３日後（ＤＰＩ）において細胞増殖に対するＧｓｘ１処置の効果を決定するために、細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を、免疫組織化学とそれに続く共焦点イメージング分析とによって検査した（図１Ｂ）。ＲＦＰ＋およびＫｉ６７＋細胞は注射部位付近に位置付けられることが見出された。以下の３つの対照および実験群：Ｓｈａｍ（ｎ＝３）、ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ（ｎ＝６）、およびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１（ｎ＝６）における損傷／注射区域付近の、ＤＡＰＩ＋細胞のうちのＫｉ６７＋細胞のパーセンテージ（図１Ｃ）。Ｋｉ６７＋細胞のパーセンテージの大幅な増加が、Ｓｈａｍマウスと比較して、ウイルス注射を受けた両損傷群において観察され、ＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群において最も大きい増加であった（図１Ｃ）。加えて、ＲＦＰ＋細胞のうちのＫｉ６７＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞の大幅に高いパーセンテージが、レンチ−Ｃｔｒｌ−ＲＦＰ注射を受けたマウスと比較して、レンチ−Ｇｓｘ１−ＲＦＰ注射を伴うマウスにおいて見出された（図１Ｄ）。さらに、Ｋｉ６７  ｍＲＮＡ発現量の増加がＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって確かめられた。Ｇｓｘ１処置は、ＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群において、ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群と比較して大幅に高いレベルのＫｉ６７  ｍＲＮＡレベルを誘導する（約４倍；図１Ｅ）。これらの結果は、Ｇｓｘ１処置が成体の損傷した脊髄において細胞増殖を促進することを示す。
【０１８３】
細胞増殖を促進することに対するＧｓｘ１の効果は、細胞増殖と関連する遺伝子のＧｓｘ１による調節に起因し得る。ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用する全ゲノムトランスクリプトーム解析を実施し（図３Ａ〜３Ｃ）、続いてＩＰＡ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．、www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuitypathway-analysis、Kramer  et  al.,  Bioinformatics  30,  523-530  (2014)）による経路分析を行った。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析は、３、１４、および３５ＤＰＩにおいてそれぞれ４７５、１４４７、および３９４６の発現変動遺伝子（ＤＥＧ）を同定した（図３Ｂ〜３Ｃ）。上位４０のＤＥＧ（表３）を、３ＤＰＩ（図３Ｄ）、１４ＤＰＩ（図３Ｅ）、および３５ＤＰＩ（図３Ｆ）におけるヒートマップに示した。ＲＥＶＩＧＯ（Supek  et  al.,  PLoS  One  6,  e21800  (2011)）を使用した４７５のＤＥＧのさらなる遺伝子オントロジーエンリッチメント分析は、細胞増殖がレンチ−Ｇｓｘ１処置による影響を受けていた重要な生物学的プロセスのうちの１つであることを明らかにした（図４）。特に、Ｇｓｘ１処置は、細胞増殖を阻害する遺伝子の下方調節（例えば、Ｗｉｆ１、Ｄｃｎ、Ｍｍｐ９；図１Ｆ）、および細胞増殖を促進する遺伝子の上方調節（例えば、Ｇａｂ、Ｇｐｒ５６、Ｉｇｆｂｐ２、Ｒｈｏｇ；図１Ｇ）を誘導した。これらのデータは、Ｇｓｘ１処置が３ＤＰＩの急性期においてＳＣＩを有するマウスにおける細胞増殖を高めることを確認する。
【０１８４】
【表３−１】
2021534206.tif 000006
【表３−２】
2021534206.tif 000007
【０１８５】
（実施例４）
Ｇｓｘ１処置はＳＣＩ後のＮＳＰＣ活性化を促進する
成体の脊髄において、ＮＳＰＣは、正常な状態の下では静止状態にて存在するが、損傷後は活性化する。ＮＳＰＣの活性化に対するＧｓｘ１処置の効果を調査するために、免疫組織化学および共焦点イメージング分析を介した、３ＤＰＩでの損傷した脊髄におけるＮＳＰＣマーカー（ＮｅｓｔｉｎおよびＮｏｔｃｈ１）の発現を検査した。
【０１８６】
ＲＦＰ＋およびＮｅｓｔｉｎ＋細胞は注射部位付近に見出された（図５Ａ）。Ｎｅｓｔｉｎ＋細胞のパーセンテージの大幅な増加が、Ｓｈａｍマウスと比較して、ウイルス注射を受けた損傷群（ＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１）において、病変部位のＤＡＰＩ＋細胞のうちに観察され、ＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群において最も多い増加であった（図５Ｂ）。さらに、ＲＦＰ＋細胞のうちのＮｅｓｔｉｎ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞の大幅に高いパーセンテージが、ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群と比較して、ＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群において見出された（図５Ｃ）。加えて、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、Ｇｓｘ１処置がＮｅｓｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現量を大幅に増加したことを確認した（図５Ｄ）。
【０１８７】
Ｇｓｘ１処置後のＮＳＰＣ活性化における誘導を解明するために、３ＤＰＩでのＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ（ｎ＝３）およびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１（ｎ＝３）群におけるＧｓｘ１に誘導されたシグナル伝達経路を、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ＩＰＡ、およびＲＥＶＩＧＯを使用した遺伝子オントロジー分析を介して調査した。細胞分化の負の調節はレンチ−Ｇｓｘ１処置後に影響を受けた重要な生物学的プロセスのうちの１つであったことが観察された（図４）。ＩＰＡ分析は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に関与する遺伝子（例えばＨｅｓ７およびＲｂｐｊ）の大幅な上方調節、および転写抑制遺伝子Ｈｅｓ１の下方調節を示した（図５Ｅ）。３ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片に対して抗Ｎｏｔｃｈ１抗体を使用した免疫組織化学分析は、Ｇｓｘ１処置において、対照と比較してＮｏｔｃｈ１＋／ＲＦＰ＋細胞の数の大幅な増加を示した（図５Ｆおよび５Ｇ）。ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、ＳＣＩ（ＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１）後に、Ｓｈａｍ群と比較してＮｏｔｃｈ１およびＪａｇ１のｍＲＮＡ発現量の大幅な増加、ならびにレンチ−Ｇｓｘ１処置において、対照と比較してＮｏｔｃｈ１  ｍＲＮＡレベルのさらなる増加を確認した（図５Ｈ）。
【０１８８】
Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）と物理的に相互作用し、Ｎｏｔｃｈ転写を遮断するＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の負の調節因子であるＮｒａｒｐは、ＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群において下方調節した（図５Ｈ）。さらに、Ｇｓｘ１処置は、Ｄｅｌ１およびＨｅｓ１遺伝子の発現量を減少させた（図５Ｈ）。Ｄｅｌ１はグリア系統に至る幹細胞分化を促進するが、Ｈｅｓ１は転写抑制因子である。Ｈｅｓ１の発現はニューロンの未熟な分化を生じる。
【０１８９】
加えて、Ｎａｎｏｇシグナル伝達経路の活性化と関連する遺伝子（例えば、Ａｋｔ２、Ｍａｐ２ｋ２、Ｐｉｋ３ｃｄ、Ｐｉｋ３ｃｇ、およびＲａｐ２ｂ）の増加が観察された（図５Ｉ）。Ｎａｎｏｇは胚性幹細胞（ＥＳＣ）における必須の経路であり、Ｎａｎｏｇ遺伝子はＮＳＰＣにおいて一般的に発現する。対照的に、Ｎｏｔｃｈ／Ｎａｎｏｇシグナル伝達経路における遺伝子の発現は、３５ＤＰＩまでには検出されなかった。
【０１９０】
したがって、これらの結果は、Ｎｏｔｃｈ／Ｎａｎｏｇシグナル伝達経路の、Ｇｓｘ１に誘導された一過性上方調節が、損傷した脊髄における内在性ＮＳＰＣ活性化において役割を果たすことを示す。
【０１９１】
（実施例５）
損傷した脊髄における神経発生の誘導
成体の脊髄において、損傷活性化ＮＳＰＣは大半が星細胞および乏突起膠細胞を生成する。Ｇｓｘ１処置がＮＳＰＣ系統発生における細胞運命決定を変更するか否かを決定するために、１４ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片（図６Ａ〜６Ｄ）および横断切片（図７Ａ〜７Ｄ）を、ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ（ｎ＝６）およびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１（ｎ＝６）群において初期ニューロンのマーカーダブルコルチン（ＤＣＸ）（図６Ａ）、星細胞マーカーＧＦＡＰ（図６Ｂ）、および乏突起膠細胞前駆体マーカーＰＤＧＦＲａ（図６Ｃ）を用いて検査した。ＤＣＸは、大半が神経芽細胞および未成熟ニューロンにおいて発現し、成体の神経発生と関連するが、反応性グリオーシスとは関連しない。ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群と比較して、Ｇｓｘ１処置は、ＲＦＰ＋細胞のうちの、ＤＣＸ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞のパーセンテージを大幅に増加させ、ＧＦＡＰ＋／ＲＦＰ＋およびＰＤＧＦＲａ＋／ＲＦＰ＋同時標識細胞のパーセンテージを減少させた（図６Ｄ）。ＤＣＸ＋、ＧＦＡＰ＋、およびＰＤＧＦＲ＋細胞の数における顕著な差は、ＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群内の１４ＤＰＩにおける脊髄の背側領域と腹側領域との間において見出されなかった（図７Ａ〜７Ｄ）。
【０１９２】
１４ＤＰＩにおける１４４７のＤＥＧ（ＲＮＡ−ＳＥＱによって同定された；図３Ｂ〜３Ｃ）の遺伝子オントロジー分析は、Ｇｓｘ１処置後に影響を受けていた重要な生物学的プロセスのうちの一部としての細胞分化、ニューロン投射発達、シナプス組織化、および中枢神経系発生に関与するＤＥＧのエンリッチメントを明らかにした（図８Ａ）。加えて、ＲＥＶＩＧＯ分析は、Ｇｓｘ１処置の際に影響を受けていた数少ない重要な生物学的プロセスとしての神経発生および神経系発生を明らかにした（図１３）。３５ＤＰＩにおける２２７３のＤＥＧ（図３Ｂ〜３Ｃ）は、ＮＳＰＣ系統分類において１４ＤＰＩのＤＥＧと類似した傾向、例えば、ＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群では、ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群と比較した場合、ＤＣＸにおける上方調節（図６Ｅ）、ＧＦＡＰ（図６Ｆ）およびＰＤＧＦＲａ（図６Ｇ）における下方調節を共有した。しかしながら、５６ＤＰＩにおける対照群とＧｓｘ１処置群との間には、Ｏｌｉｇ２＋／ＲＦＰ＋細胞における有意差は存在しなかった（ＮＳ）（補足図８Ｂ〜８Ｃ）。
【０１９３】
これらの結果は、Ｇｓｘ１処置がＳＣＩの慢性期の間にグリア系統よりもニューロン系統に向かうＮＳＰＣ分化を誘導することを示す。
【０１９４】
（実施例６）
Ｇｓｘ１処置は介在ニューロンの特異的亜型の数を増加させる
Ｇｓｘ１処置によって誘導された成熟ニューロンの特異的亜型を同定した。５６ＤＰＩにおける脊髄組織の矢状切片を、成熟ニューロンのマーカーＮｅｕＮ（図９Ａ）、コリン作動性ニューロンのマーカーＣｈＡＴ（図９Ｂ）、グルタミン酸作動性介在ニューロンのマーカーｖＧｌｕｔ２（図９Ｃ）、およびＧＡＢＡ作動性介在ニューロンのマーカーＧＡＢＡ（図９Ｄ）を用いて染色した。ＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群（ｎ＝６）におけるＲＦＰ＋細胞のうちの、ＮｅｕＮ＋、ＣｈＡＴ＋、およびｖＧｌｕｔ２＋細胞のパーセンテージの大幅な増加、ならびにＧＡＢＡ＋細胞の減少がＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群（ｎ＝６）と比較して観察された（図９Ｅ）。さらに、誘導された細胞が成熟に達する３５ＤＰＩにおけるＳｈａｍ（ｎ＝４）、ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ（ｎ＝４）、およびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１（ｎ＝４）群からの脊髄組織のＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、ＮｅｕＮ（またはＨｒｎｂｐ３）のわずかに増加したｍＲＮＡ発現量を伴って、ｖＧｌｕｔ（またはＳｌｃ１７ａ６）およびＣｈａｔの大幅に増加した発現量を示した（図９Ｆ）。
【０１９５】
これらの結果は、Ｇｓｘ１処置がグルタミン酸作動性およびコリン作動性介在ニューロンの数を優先的に増加させ、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの数を減少させたことを示す。
【０１９６】
（実施例７）
Ｇｓｘ１処置はグリア性瘢痕形成を低減する
ＳＣＩは、反応性アストログリオーシスおよびグリア性瘢痕形成の原因となるミクログリアおよび星細胞の活性化を引き起こす。グリア性瘢痕は、大半の場合、反応性星細胞（ＲＡ）、非ニューロン細胞（例えば周皮細胞および髄膜細胞）、およびプロテオグリカン豊富細胞外基質（ＥＣＭ）から構成される。活性化星細胞は、グリア性瘢痕の主な成分を構成するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を分泌する。
【０１９７】
アストログリオーシスおよび瘢痕形成におけるＧｓｘ１の役割を調査するために、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって、２つのマーカー遺伝子ＧＦＡＰおよびＳｅｒｐｉｎａ３ｎのｍＲＮＡ発現レベルを測定して、アストログリオーシスおよび瘢痕形成に関与する反応性星細胞（ＲＡ）を検出した５３。ＳＣＩは、３ＤＰＩ（図１０Ａ）および３５ＤＰＩ（図１０Ｂ）でＳｈａｍマウス（ｎ＝４）と比較してＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ（ｎ＝６）およびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１（ｎ＝６）マウスにおいてＧＦＡＰおよびＳｅｒｐｉｎａ３ｎのｍＲＮＡ発現レベルを大幅に増加させ、損傷がアストログリオーシスおよび瘢痕形成を引き起こしたことを確認した。対照的に、Ｇｓｘ１処置は、３ＤＰＩでのＧＦＡＰ（図１０Ａ）および３５ＤＰＩでの損傷した脊髄におけるＳｅｒｐｉｎａ３ｎのｍＲＮＡ発現量を大幅に低下した（図１０Ｂ）。ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析は、ＲＡと関連する遺伝子（例えば、Ｍｍｐ１３、Ｍｍｐ２、Ｎｅｓ、Ａｘｉｎ２、Ｓｌｉｔ２、Ｐｌａｕｒ、およびＣｔｎｎｂ１）、瘢痕形成星細胞（ＳＡ）と関連する遺伝子（例えばＳｌｉｔ２およびＳｏｘ９）、およびＲＡ＋ＳＡの両方と関連する遺伝子（例えばＧｆａｐおよびＶｉｍ）の発現量５１が１４ＤＰＩおよび３５ＤＰＩにおいて下方調節したことを明らかにした（図１０Ｃ〜１０Ｅ）。
【０１９８】
ＧＦＡＰ（図１０Ｆ〜１０Ｇ）およびＣＳＰＧ（図１０Ｈ〜１０Ｉ）タンパク質発現レベルを、それぞれ抗ＧＦＡＰおよび抗ＣＳ５６抗体を使用した免疫組織化学分析によって決定した。Ｓｈａｍ群において、ベースラインレベルのＧＦＡＰ（図１０Ｆ）は観察されたが、検出可能なレベルのＣＳＰＧ発現（図１０Ｈ）は観察されなかった。対照的に、損傷は、２つのＳＣＩ群（すなわちＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１）においてより高いタンパク質レベルのＧＦＡＰ（図１０Ｇ）およびＣＳ５６（図１０Ｉ）を誘導した。重要なことに、Ｇｓｘ１処置は、ＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群において病変部位付近のＧＦＡＰ＋およびＣＳ５６＋免疫染色区域を大きく減少させた（図１０Ｇ、１０Ｉ）。
【０１９９】
これらの結果は、Ｇｓｘ１処置がＲＡおよびＳＡを減少させ、ＳＣＩ後のグリア性瘢痕形成の減弱をもたらすことを示す。
【０２００】
（実施例８）
Ｇｓｘ１処置はＳＣＩ後の歩行運動機能を改善する
Ｔ１０レベルにおける外側片側切断ＳＣＩを有する全てのマウスは、損傷後、左後肢に麻痺を呈した（図１１Ａ）。機能回復に対するＧｓｘ１処置の効果を実証するために、歩行運動行動を、確立されたオープンフィールド歩行運動試験およびＢＭＳスコアスケール（Basso  et  al.,  J  Neurotrauma  23:635-659  (2006)）を使用して、損傷前日（−１ＤＰＩ）から５６ＤＰＩ（ＳＣＩの８週間後）まで評価した。各マウスに関して、ＢＭＳスコアは３名の観察者によって二重盲検で割り当てられた。ＢＭＳスコアは０（完全麻痺および足首の運動がない）〜９（正常な歩行）の範囲である。Ｓｈａｍ動物は、正常な歩行運動行動を表し、ＢＭＳスコアは−１〜５６ＤＰＩまで約９のままであった（図１１Ｂ）。損傷群（ＳＣＩ＋ＣｔｒｌおよびＳＣＩ＋Ｇｓｘ１）におけるマウスは、片側切断損傷の当日（０ＤＰＩ）に０のＢＭＳスコアで、左後肢に麻痺を呈し（図１１Ａ〜１１Ｂ、およびstemcell.rutgers.edu/Treatment.mov、stemcell.rutgers.edu/Control.mov、stemcell.rutgers.edu/Sham.movにおいて見られる動画）、外側片側切断ＳＣＩを誘導することの成功を確認した。ＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群におけるマウス（ｎ≧６）に関しては、ＢＭＳスコアは５６ＤＰＩまでに約３（背側での歩み）まで漸進的に改善した（図１１Ｂ）。対照的に、ＳＣＩ＋Ｇｓｘ１群におけるマウス（ｎ≧６）は大幅に改善した歩行運動機能を有し、ＢＭＳスコアは３０ＤＰＩまでに約０から約５まで漸進的に増加した（図１１Ｂ）。約３０ＤＰＩから、Ｇｓｘ１処置動物は、Ｓｈａｍマウスと比較して正常に近い歩行運動（ＢＭＳスコアは約６〜７に達する）を示した（図１１Ｂ）。これらの結果は、Ｇｓｘ１処置がＳＣＩ後の歩行運動機能回復を劇的に改善したことを実証する（図１１Ａ〜１１Ｂ）。
【０２０１】
改善した歩行運動機能に関する分子基盤を同定するために、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析を使用して、軸索成長に関与する選択した１組の遺伝子の発現を評価した。Ｇｓｘ１処置（ｎ＝４）は、３５ＤＰＩにおいてＳＣＩ＋Ｃｔｒｌ群（ｎ＝４）と比較してＣｔｎｎａ１およびＣｏｌ６ａ２のｍＲＮＡレベルを大幅に増加した（図１１Ｃ）。ＤＥＧに関するＲＮＡ−ＳＥＱ、ＩＰＡ、および遺伝子オントロジー分析を実施した。Ｇｓｘ１処置は、Ｎｅｔｒｉｎシグナル伝達（図１１Ｄ；図１２Ｂ）、および軸索誘導経路（図１１Ｅ）、およびニューロンにおけるＣＲＥＢシグナル伝達（図１２Ａ）の活性化をもたらした。ＣＲＥＢは、軸索成長および再生を担う転写因子である５５。ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＩＰＡ分析は、３５ＤＰＩでのＧｓｘ１処置における、シナプス形成を促進する遺伝子の発現量の増加（図１１Ｆ）およびシナプス形成を阻害することが公知の遺伝子の発現量の減少（図１１Ｇ）をさらに同定した。
【０２０２】
脊髄におけるセロトニン（５−ＨＴ）の神経伝達は、感覚、運動、および自律機能を調整するために必要とされる。ＳＣＩ後、損傷部位に対して尾側の５−ＨＴ軸索は変性する一方、損傷部位に対して吻側の５−ＨＴ軸索は発芽する。したがって、セロトニン作動性ニューロンの発現レベルを、５６ＤＰＩでの脊髄試料において抗５−ＨＴ抗体を使用して測定して、５−ＨＴニューロンの活性の回復に対するＧｓｘ１処置の効果を決定した。免疫染色結果は、５−ＨＴ＋軸索のレベルが、対照とＧｓｘ１処置の両方において、損傷部位に対して吻側の領域で同等であったことを示す。他方、尾側領域では、Ｇｓｘ１処置は５−ＨＴ軸索のレベルを増加させた（図１２Ｃ）。この結果は、Ｇｓｘ１が損傷した脊髄において５−ＨＴニューロンの活性を促進することを示す。最後に、遺伝子オントロジー分析は、ＤＥＧが重要な生物学的プロセスとしての細胞情報伝達、神経系発生、神経発生、および歩行運動に関与したことを明らかにした（図１３）。これらの結果は、Ｇｓｘ１処置が軸索成長および誘導と関連するシグナル伝達経路を上方調節し、これがＳＣＩ後の改善した歩行運動機能と相関することを示す。
【０２０３】
本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すると、例証された実施形態は本発明の例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではないということが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲およびその趣旨に当てはまる全てのものを本発明者らの発明として特許請求する。
【図１Ａ−１Ｂ】
2021534206.tif 000008
【図１Ｃ−１Ｄ】
2021534206.tif 000009
【図１Ｅ−１Ｇ】
2021534206.tif 000010
【図２Ａ−２Ｂ】
2021534206.tif 000011
【図２Ｃ−２Ｅ】
2021534206.tif 000012
【図３Ａ−３Ｂ】
2021534206.tif 000013
【図３Ｃ】
2021534206.tif 000014
【図３Ｄ】
2021534206.tif 000015
【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2021534206.tif 000019
【図５Ｂ−５Ｃ】
2021534206.tif 000020
【図５Ｄ−５Ｅ】
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【図５Ｆ−５Ｇ】
2021534206.tif 000022
【図５Ｈ−５Ｉ】
2021534206.tif 000023
【図６Ａ−６Ｃ】
2021534206.tif 000024
【図６Ｄ−６Ｅ】
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【図６Ｆ−６Ｇ】
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【図７Ａ−７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2021534206.tif 000028
【図８Ａ】
2021534206.tif 000029
【図８Ｂ−８Ｃ】
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【図９Ａ−９Ｄ】
2021534206.tif 000031
【図９Ｅ−９Ｆ】
2021534206.tif 000032
【図１０Ａ−１０Ｂ】
2021534206.tif 000033
【図１０Ｃ−１０Ｄ】
2021534206.tif 000034
【図１０Ｅ】
2021534206.tif 000035
【図１０Ｆ１０Ｈ】
2021534206.tif 000036
【図１０Ｇ１０Ｉ】
2021534206.tif 000037
【図１１Ａ】
2021534206.tif 000038
【図１１Ｂ】
2021534206.tif 000039
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ−１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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