(57)【要約】  本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびアンジオポエチン（ＡＮＧ）を同時に標的とする二機能性融合タンパク質（ＡＴ）ａ−Ｆｃ−（ＶＴ）ｂを提供し、ここでＡＴは、ＡＮＧ結合モチーフであり；かつＶＴはＶＥＧＦ結合モチーフであり、ＦｃはＩｇＧのＮ末端であり；ａおよびｂのそれぞれは１から１０までの整数である。二機能性融合タンパク質は、ヒトタンパク質の２つ以上のドメインを含有し、全てヒト配列のものであり、ゆえに非免疫原性であると予想され、かつヒトを標的とする血管新生関連疾患において治療に使用できる可能性がある。
2021534186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンジオポエチン（ＡＮＧ）−ＴＩＥシグナル伝達経路および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）シグナル伝達経路を阻害する二機能性融合タンパク質であって、ここで融合タンパク質はＡＮＧ阻害ドメインおよびＶＥＧＦ阻害ドメインを含有し、それにより、ＡＮＧ、ＶＥＧＦ、またはその両方とそれらの受容体との間の相互作用をブロックすることを通して血管新生の阻害において有意に改善された効力を提供する、二機能性融合タンパク質。
【請求項２】
（１）１つ以上のＡＮＧ結合モチーフ含有フラグメントおよび（２）１つ以上のＶＥＧＦ結合モチーフ含有フラグメントを含み、これらがリンカーで融合されている、請求項１に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項３】
ＡＮＧ結合モチーフ含有フラグメントがフラグメント抗原結合（Ｆａｂ）フラグメントであり、ＶＥＧＦ結合モチーフ含有フラグメントが一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）である、請求項２に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項４】
ＦａｂフラグメントがＡｎｔｉ−Ａｎｇ２  Ｆａｂであり、ＳｃＦｖがＬｕｃｅｎｔｉｓ  ＶｈおよびＶｋからなる融合フラグメントである、請求項３に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項５】
配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項６】
（ＡＴ）ａ−Ｆｃ−（ＶＴ）ｂである、請求項１に記載の二機能性融合タンパク質であって、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびアンジオポエチン（ＡＮＧ）を同時に標的とし、このことが有意に改善された抗血管新生効力を提供し、ここでＡＴはＡＮＧ結合モチーフであり、ＶＴはＶＥＧＦ結合モチーフであり；Ｆｃはリンカーであり；ａおよびｂのそれぞれは１から１０までの整数である、二機能性融合タンパク質。
【請求項７】
ＡＮＧ結合モチーフが、２３−４４８のＴｉｅ２  ＥＣＤアミノ酸残基からなるフラグメントである、請求項６に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項８】
２３−４４８のＡＮＧ  Ｔｉｅ２  ＥＣＤアミノ酸残基が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項９】
ＶＥＧＦ結合モチーフが、ＶＥＧＦＲ１  ＥＣＤ  Ｄ２、ＶＥＧＦＲ２  ＥＣＤ  Ｄ３、またはＶＥＧＦＲ１  ＥＣＤ  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  ＥＣＤ  Ｄ３を含有するキメラドメインである、請求項６に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項１０】
ＶＥＧＦ結合モチーフが、ＶＥＧＦＲ１  ＥＣＤ  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  ＥＣＤ  Ｄ３を含有するキメラドメインである、請求項９に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項１１】
ＶＥＧＦＲ１  ＥＣＤ  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  ＥＣＤ  Ｄ３を含有するキメラドメインが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項１２】
リンカーが、ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント、短い柔軟なＧＳリンカーまたはそれらの組み合わせである、請求項６に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項１３】
ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項１４】
短い柔軟なＧＳリンカーが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項１５】
ＡＴが２３−４４８のＴｉｅ２  ＥＣＤアミノ酸残基を含有するＡＴフラグメントであり、ＦｃがＩｇＧ  Ｆｃフラグメントであり、かつＶＴがＶＥＧＦＲ１  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  Ｄ３を含有するキメラドメインを含有するＶＴフラグメントである、請求項６に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項１６】
ＡＴフラグメントおよびＩｇＧ  Ｆｃフラグメントが融合され、次いで短い柔軟なＧＳリンカーでＡＴ−ＦｃフラグメントのＣ末端でＶＴと結合される、請求項１５に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項１７】
リンカーが、ヒト免疫グロブリンアイソタイプ、サブクラス、またはアロタイプの野生型または変異体の免疫グロブリンＦｃ領域であるＦｃフラグメントである、請求項６に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項１８】
ＡＴまたはＶＴフラグメントのそれぞれが、インビボでの長い半減期を有する抗体、または抗体のフラグメントである、請求項６に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項１９】
配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＡＴ―Ｆｃ―ＶＴである、請求項６に記載の二機能性融合タンパク質。
【請求項２０】
アンジオポエチンに結合できる融合タンパク質であって、ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントと融合した２３から４４８までのＴｉｅ２  ＥＣＤアミノ酸残基を含有する、融合タンパク質。
【請求項２１】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
Ｃ末端でＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントと融合したＶＥＧＦＲ１  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  Ｄ３を含有するキメラモチーフを含む、ＶＥＧＦに対する融合タンパク質。
【請求項２３】
配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載のＶＥＧＦに対する融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１に記載の二機能性融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）疾患を予防または処置するための、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
原発性または転移性がんを処置するための、請求項２４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１８年８月１７日に出願された米国仮出願第６２／７１９，３７７号の利益およびそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、二機能性融合タンパク質である抗血管新生融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血管新生は、既存の血管からの発芽による血管の形成であり、固形腫瘍の増殖および腫瘍の転移に不可欠である。新しい毛細血管の生成は、元の血管の膜の溶解、内皮細胞の遊走および増殖、および新しい血管管の形成を含む多工程プロセスを含む。これらの工程のいずれかを抑制すると、新しい血管の形成が阻害され、従って腫瘍の増殖および転移の生成に影響を及ぼす。実際、単一の内皮細胞の排除が腫瘍細胞の増殖を阻害する可能性があると推定されている。抗血管新生治療は、がん処置のための有望なメカニズムを提供してもよいことが報告されている。
【０００４】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生のプロセスにおいて重要な役割を果たす。加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）または腫瘍増殖などの疾患における新しい血管形成は、主にこの重要な成長因子の過剰発現により引き起こされる[Connolly et al. (1989) J Clinic Invest 84(5):1470-8; Ferrara et al. (1989) Biochem Biophys Res Commun 161(2):851-8; Ferrara et al. (1989) Nat Med 4(3):336-40]。ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、および胎盤成長因子（ＰＧＦ）などのいくつかのメンバーを含む。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦファミリーの典型的なメンバーであり、最も研究されているメンバーでもある。ＶＥＧＦ−Ａは、内皮細胞の有糸分裂を刺激し、細胞の生存および増殖を促進し、細胞の遊走を誘導し、かつ微小血管の透過性を高めることが示されている。抗体、ＶＥＧＦトラップ、またはＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）キナーゼ阻害剤でＶＥＧＦ活性をブロックすることを通して血管新生プロセスを標的にすることは、がんおよびＡＭＤ疾患の処置にも前臨床的および臨床的に有効であることが実証されている[Major et al. (1997) J Pharmacol Exp. Ther 283(1):402-10; Willett et al. (2004) Nat Med 10(2):145-7; Papadopoulos et al. (2012) Angiogenesis 15(2): 171-85; Aiello et al.(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(23):10457-61]。ＶＥＧＦブロッカーの中で、例えば、Ｅｙｌｅａは、ＶＥＧＦＲ１細胞外Ｉｇドメイン２（ＥＣＤ、Ｄ２）、ＶＥＧＦＲ２細胞外Ｉｇドメイン３（ＥＣＤ、Ｄ３）、およびＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、およびＰＧＦを標的とするＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含有する操作されたキメラＦｃ融合タンパク質であり、現在ＦＤＡによりＡＭＤおよび転移性結腸直腸癌を処置するために承認されている[Holash et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(17):11393-8]。
【０００５】
アンジオポエチン（ＡＮＧ）は、血管新生において重要な役割を果たすことが示されている血管成長因子のファミリーである[Alves et al. (2010) BMC Infect Dis 10:143-52]。その中で、ＡＮＧ１およびＡＮＧ２は、ＡＮＧ−ＴＩＥシグナル伝達経路を通した発生および腫瘍誘導血管新生両方の間の血管の安定性および退行のバランスに関与していることが実証された[Augustin et al. (2009) Nat Rev Mol Cell Biol 10(3):165-77]。ＡＮＧ１およびＡＮＧ２は同様の親和性でＴＩＥ２に結合する[Suri et al. (1996) Cell 87(7):1171-80; Maisonpierre et al. (1997) Science 277:55-60]。ＴＩＥ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインおよび第３のＩｇ様ドメイン、それに続く３つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）リピートが隣接する３つのＥＧＦ様モジュールを含有する。構造および機能の分析により、ＡＮＧ結合部位はＩｇ様サブドメインのＮ末端ペアに位置することが明らかになったが、ＴＩＥ２  ＥＣＤ全体と比較してより低い結合活性を有することが示された[Lin et al. (1997) J Clin Invest 100:2072-2078]。最近の研究は、ＡＮＧ１が、内皮細胞およびその周囲の支持細胞と細胞外マトリックスとの間の相互作用を最大化することにより、血管の安定化を促進するアゴニストであることを示した。一方、ＡＮＧ２は、血管新生の発芽または血管の退行を促進する文脈依存性のアンタゴニストであることが見出された[Maisonpierre et al. (1997) Science 277:55-60]。循環ＡＮＧ２レベルは、転移性黒色腫、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、慢性リンパ性白血病など、多くのヒトのがんの予後不良を予測する要因として同定されている[Eklund et al. (2013) Exp Cell Res 319(9):1271-80]。上昇したＡＮＧ２は、内皮の不安定化を引き起こし、血管の退行、低酸素症、およびＡＮＧ２およびＶＥＧＦ両方の増加した発現を引き起こし、これらが一緒になって腫瘍に強力な血管新生を誘導することが報告された[Holash et al. (1999) Science 284(5422): 1994-8]。
【０００６】
しかしながら、血管新生関連疾患の処置において、血管新生を阻害するための新しいアプローチを開発することが望ましい。
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明は、ＡＮＧ−ＴＩＥシグナル伝達経路およびＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路を阻害する融合タンパク質を提供し、ここで融合タンパク質は、ＡＮＧ阻害ドメインおよびＶＥＧＦ阻害ドメインを含有し、それにより、ＡＮＧ、ＶＥＧＦ、またはその両方とそれらの受容体との間の相互作用をブロックすることを通して血管新生の阻害において有意に改善された効力を提供する。
【０００８】
一態様において、本発明は、リンカーと融合される１つ以上のＡＮＧ結合モチーフ含有フラグメントおよび１つ以上のＶＥＧＦ結合モチーフ含有フラグメントを含む二機能性融合タンパク質を提供し、それにより、ＡＮＧ、ＶＥＧＦ、またはその両方とそれらの受容体との間の相互作用をブロックすることを通して血管新生の阻害において有意に改善された効力を提供する。
【０００９】
本発明の一実施形態において、二機能性融合タンパク質は、（１）１つ以上のＡＮＧ結合モチーフ含有フラグメントおよび（２）１つ以上のＶＥＧＦ結合モチーフ含有フラグメントを含み、これらがリンカーで融合されている。
【００１０】
本発明の一例において、ＡＮＧ結合モチーフ含有フラグメントはフラグメント抗原結合（Ｆａｂ）フラグメントであり、ＶＥＧＦ結合モチーフ含有フラグメントは一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）である。
【００１１】
本発明の一実施形態において、二機能性融合タンパク質は、（ＡＴ）ａ−Ｆｃ−（ＶＴ）ｂであり、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびアンジオポエチン（ＡＮＧ）を同時に標的とし、このことが有意に改善された抗血管新生効力を提供し、ここでＡＴはＡＮＧ結合モチーフであり、ＶＴはＶＥＧＦ結合モチーフであり；Ｆｃはリンカーであり；ａおよびｂのそれぞれは１から１０までの整数である。
【００１２】
本発明の一実施形態において、ＡＮＧ結合モチーフは、２３−４４８のＴｉｅ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）アミノ酸残基からなる断片である。
【００１３】
本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦ結合モチーフは、ＶＥＧＦＲ１  ＥＣＤ  Ｄ２、ＶＥＧＦＲ２  ＥＣＤ  Ｄ３、または両方のモチーフを含有するキメラドメインである。１つの好ましい実施形態において、ＶＥＧＦ結合モチーフは、ＶＥＧＦＲ１  ＥＣＤ  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  ＥＣＤ  Ｄ３を含有するキメラドメインである。
【００１４】
本発明の一実施形態において、リンカーは、ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント、短い柔軟なＧＳリンカーまたはそれらの組み合わせである。
【００１５】
本発明の一実施形態において、二機能性タンパク質は融合タンパク質（ＡＴ）−Ｆｃ−（ＶＴ）であり、ここでＡＴは２３−４４８のＴｉｅ２  ＥＣＤアミノ酸残基を含有するＡＴフラグメントであり、ＦｃはＩｇＧ  Ｆｃフラグメントであり、かつＶＴはＶＥＧＦＲ１  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  Ｄ３を含むキメラドメインを含有するＶＴフラグメントである。
【００１６】
本発明の一例において、ＡＴフラグメントおよびＩｇＧ  Ｆｃフラグメントを融合させ、次いで短い柔軟なＧＳリンカーによりＡＴ−ＦｃフラグメントのＣ末端でＶＴと結合させる。
【００１７】
一特異的実施形態において、二機能性融合タンパク質は、ＡＮＧ阻害ドメインを含有するフラグメント抗原結合（Ｆａｂ）およびＶＥＧＦ阻害ドメインを有する一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）により構築される。好ましくは、Ｆａｂは抗Ａｎｇ２  Ｆａｂであり、かつＳｃＦｖはＬｕｃｅｎｔｉｓ  ＶｈおよびＶｋからなる融合フラグメントである。
【００１８】
一実施形態において、Ｆｃフラグメントは、任意のヒト免疫グロブリンアイソタイプ、サブクラス、またはアロタイプの野生型または変異体である。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、本明細書に開示される融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
本発明によれば、医薬組成物は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）疾患または原発性または転移性がんなどの血管新生関連疾患を予防または処置するために使用される。
【００２１】
さらに別の局面において、本発明は、アンジオポエチンに結合することができる融合タンパク質を提供し、これは、ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントと融合した２３から４４８までのＴｉｅ２  ＥＣＤアミノ酸残基を含有する。
【００２２】
さらに別の局面において、本発明は、ＶＥＧＦＲに対する融合タンパク質を提供し、これは、Ｃ末端でＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントと融合したＶＥＧＦＲ１  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  Ｄ３を含有するキメラモチーフを含有する。
【００２３】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明両方が、例示的かつ説明的であり、本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
上記の要約、並びに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的で、現在好ましい実施形態が図面において示される。
【００２５】
図面において：
【００２６】
図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれＡＴ−ＦｃおよびＦｃ−ＶＴタンパク質の構造図を示し、ＡＴ−Ｆｃタンパク質は、ＩｇＧ  ＦｃのＮ末端に融合して、ＡＴ−Ｆｃタンパク質の発現ベクターを構築する３つのＩｇ様ドメインおよび３つのＥＧＦ様リピートを含有する、２３から４４８までのＴｉｅ２  ＥＣＤアミノ酸残基を有する合成ヌクレオチド配列を含み；かつＶＴ−Ｆｃタンパク質は、ＶＥＧＦＲ１  ＥＣＤ  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  ＥＣＤ  Ｄ３からなるキメラＶＥＧＦ結合モチーフを含み、これは、合成され、間のＧＳリンカーでＩｇＧ  ＦｃのＣ末端に融合されて、Ｆｃ−ＶＴタンパク質のための発現ベクターが作成される。
【００２７】
図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれＡＴ−Ｆｃタンパク質およびＦｃ−ＶＴタンパク質のＰＡＧＥ分析を示し、ここでＡＴ−ＦｃおよびＦｃ−ＶＴ発現ベクターは使用されてＨＥＫ２９３細胞を別々にトランスフェクトし、それらは発現され、次いでＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇクロマトグラフィーを使用して細胞培養上清から精製された。精製されたタンパク質（３μｇ／レーン）は、還元または非還元条件下でゲル分析された。図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ約１６０ｋＤおよび１３０ｋＤの分子量で適切に二量体化されたＡＴ−ＦｃおよびＦｃ−ＶＴタンパク質の結果を示し、９０％を超える純度が単一工程Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇクロマトグラフィーにより得られて両方の融合タンパク質が精製される。レーン１、非還元；レーン２、還元。
【００２８】
図３は、改善された抗血管新生活性を提供するＡＴ−Ｆｃ−ＶＴおよびＴｃ３５０−２５３の二機能性融合タンパク質の構造図を示す。
【００２９】
図４は、精製ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ二機能性融合タンパク質を示し、ここでＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ発現ベクターを用いてＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。発現した可溶性ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ融合タンパク質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇクロマトグラフィーを使用して細胞培養上清から精製された。次いで、精製されたタンパク質（３μｇ／レーン）は、ゲル分析の前に還元または非還元された。結果は、融合タンパク質が分子量約２５０ｋＤで適切に二量体化され、単一工程Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇクロマトグラフィーにより９０％を超える純度を得ることができることを示した。レーン１、非還元；レーン２、還元。
【００３０】
図５は、精製Ｔｃ３５０−２５３二機能性融合タンパク質を示す。Ｔｃ３５０−２５３タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞により一過性に発現され、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを介してトランスフェクトされた細胞培養上清から精製された。精製されたタンパク質（５μｇ／レーン）は、還元または非還元条件下でゲル分析された。Ｔｃ３５０−２５３二機能性タンパク質は約７５ｋＤの分子量で適切に発現され、９０％を超える純度が得られた。ＮＲ、非還元；Ｒ、還元。
【００３１】
図６は、直接ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＡＮＧ１およびＡＮＧ２に対するＡＴ−Ｆｃタンパク質の結合活性を示す。リガンドでプレコートされたウェルは、最初に種々の濃度の精製されたＡＴ−Ｆｃタンパク質とともにインキュベートされた。次いで、結合したタンパク質は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体で検出され、ＯＤ４５０の読み取り値がプロットされ；かつ結果は、ＡＴ−Ｆｃがそれぞれ４．２６ｎＭおよび２．０１ｎＭのＥＣ５０でＡＮＧ１またはＡＮＧ２に結合することを示した。
【００３２】
図７は、ＶＥＧＦ−Ａに対するＦｃ−ＶＴタンパク質の結合活性を示す。ＶＥＧＦ−Ａでプレコートされたウェルは、最初に種々の濃度の精製Ｆｃ−ＶＴタンパク質とともにインキュベートされた。洗浄後の結合したタンパク質は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体で検出され、ＯＤ４５０の読み取り値がプロットされ、結果は、Ｆｃ−ＶＴが０．３３ｎＭのＥＣ５０でＶＥＧＦ−Ａに結合することを示した。
【００３３】
図８および図９は、それぞれＡＮＧ２およびＶＥＧＦ−Ａに対する精製ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ融合タンパク質の直接リガンド結合活性を示す。リガンドでプレコートされたウェルは、最初に種々の濃度の精製ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴタンパク質とともにインキュベートされた。次いで、結合したタンパク質は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体で検出され、ＯＤ４５０の読み取り値がプロットされた。結果は、ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴがＡＮＧ２およびＶＥＧＦ−Ａにそれぞれ２．５７ｎＭおよび０．３５ｎＭのＥＣ５０で結合できることを示し、これはＡＴ−Ｆｃ（０．２８ｎＭ）またはＦｃ−ＶＴ（０．４６ｎＭ）の結合活性に匹敵した。
【００３４】
図１０は、ＶＥＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ細胞増殖アッセイに対する融合タンパク質の阻害効果を示す。ヒト臍帯静脈内皮細胞は、融合タンパク質であるＦｃ−ＶＴおよびＡＴ−Ｆｃ−ＶＴのＶＥＧＦへの結合によるＶＥＧＦ依存性細胞増殖阻害を実証するために使用される。実験において、ＨＵＶＥＣは２％ＦＢＳを含むＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）中に維持される。９６ウェル平底マイクロタイタープレートは、コラーゲンでコーティングされ、次いで、５０μｌの１ｎＭのＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）および種々の濃度の融合タンパク質Ｆｃ−ＶＴまたはＡＴ−Ｆｃ−ＶＴと各ウェルにおいて３７℃で１時間インキュベートした後、Ｍｅｄｉｕｍ−１９９（１０％ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．）中に１ｘ１０５細胞／ｍｌで５０μｌのＨＵＶＥＣを加える。５％ＣＯ２とともに３７℃で７２時間インキュベートした後、各ウェルに１０μｌのＭＴＳ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）を加え、次いで４５０／６５０ｎｍでのＯＤ吸収を測定することにより、細胞増殖がアッセイされた。この実験において。結果は、Ｆｃ−ＶＴおよびＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ両方が、Ｆｃ−ＶＴと比較してＶＥＧＦに対する同様の阻害活性を有することを示した（０．２７ｎＭ対０．２０ｎＭ）。この研究において、Ｃ末端でＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントと融合している陽性対照であるＶＥＧＦＲ１  ＥＣＤ  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  ＥＣＤ  Ｄ３も含まれ、０．１９ｎＭのＩＣ５０を有することが示された。
【００３５】
図１１は、可溶性ＡＮＧ２結合分析を示す。このアッセイにおいて、精製された融合タンパク質、ＡＴ−ＦｃおよびＡＴ−Ｆｃ−ＶＴは、ＡＮＧ２結合活性を調べるために使用された。１００μｌのＡＴ−ＦｃまたはＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ（１μｇ／ｍｌ）融合タンパク質は、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）上に４℃で一晩コーティングされた。コーティングされたウェルは、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで室温（ＲＴ）で１時間ブロックされた。１００ｎＭから始まる３倍段階希釈ＡＴ−ＦｃまたはＡＴ−Ｆｃ−ＶＴは、等量の５００ｐＭ組換えＡＮＧ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）とＲＴで２時間インキュベートされた後、コーティングされたタンパク質を含む９６ウェルに移された。インキュベーション後、各それぞれのウェルに移された試料は、ＲＴで１時間インキュベートされた。プレートは、洗浄バッファー（Ａｂｃａｍ）で３回洗浄され、ビオチン化抗ＡＮＧ２抗体（Ａｂｃａｍ）とＲＴで１時間インキュベートされた。洗浄後、プレートは、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）とともにＲＴで４５分間インキュベートされた。最終洗浄後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が加えられ、プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで吸光度が測定された。阻害率を計算するために、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してデータが分析された。
【００３６】
図１２は、二機能性融合タンパク質によるＶＥＧＦ誘導内皮細胞遊走の阻害を示す。
【００３７】
図１３は、二機能性融合タンパク質によるＶＥＧＦ誘導内皮細胞管形成の阻害を示す。
【００３８】
図１４は、二機能性タンパク質Ｔｃ３５０−２５３によるＡＮＧ２誘導内皮管形成の阻害を示す。
【００３９】
図１５は、二機能性血管新生ブロッカーによるＶＥＧＦ誘導内皮細胞浸潤の阻害を示す。
【００４０】
図１６は、二機能性タンパク質Ｔ３５０−２５３によるＶＥＧＦ／ＡＮＧ２誘導内皮細胞管形成の阻害を示す。
【００４１】
図１７は、二機能性タンパク質によるマウスにおけるレーザー誘導脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の阻害を示す。
【００４２】
発明の詳細な説明
本明細書で他に定義されない限り、本明細書で使用される科学的および技術的用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「抗体」なる語は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質である。典型的な抗体は、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアで構成される四量体であり、各ペアは１つの「軽い」鎖および１つの「重い」鎖を有する。
【００４４】
本明細書で使用される「抗体可変領域」なる語は、主に抗原認識に関与するアミノ酸残基を含む抗体可変鎖のＮ末端領域を指す。当業者は、抗体可変領域を容易に同定し、抗原認識を与えるために必要とされる最小サイズを決定することができる。抗体可変領域は、一本鎖抗体、例えば、可変重鎖領域および可変軽鎖領域が一緒に（直接またはペプチドリンカーを通して）結合されて連続ポリペプチドを形成する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）であってもよい。ｓｃＦｖ抗体は、化学的に合成されても、または直接結合されたかまたはペプチドをコードするリンカーにより結合された、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を含む核酸から発現されてもよい。
【００４５】
本発明は、アンジオポエチン（ＡＮＧ）−ＴＩＥシグナル伝達経路および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）シグナル伝達経路を阻害する二機能性融合タンパク質を提供する。本発明において、融合タンパク質は、ＡＮＧ阻害ドメインおよびＶＥＧＦ阻害ドメインを含有し、それにより、ＡＮＧ、ＶＥＧＦ、またはその両方とそれらの受容体との間の相互作用をブロックすることを通して血管新生の阻害において有意に改善された効力を提供する。
【００４６】
本発明において、血管新生のプロセスにおいて重要な役割を果たすＶＥＧＦおよびＡＮＧ両方は、ＩｇＧ  Ｆｃ融合ブロッカーの構築のために使用された。それぞれＡＮＧおよびＶＥＧＦ結合活性を有するＡＴ−ＦｃおよびＦｃ−ＶＴタンパク質が最初に生成され、ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ二機能性タンパク質が作成され、従って（ＡＮＧおよびＶＥＧＦ結合活性を有する）二機能性融合タンパク質が提供された。これらのＡＴ−ＦｃおよびＦｃ−ＶＴタンパク質は、それぞれのリガンドに高い親和性で結合でき、細胞ベースのアッセイにおいてそれぞれ抗ＡＮＧおよび抗ＶＥＧＦ機能を提供できることが示された。本発明において、Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトタンパク質のドメインを含有し、全てヒト起源であり、非免疫原性であると予想され、ゆえに、血管新生関連疾患を処置するための治療薬としてさらに開発できる可能性がある。
【００４７】
本発明において、ＶＥＧＦ活性をブロックする任意のモチーフ、ペプチド、タンパク質、またはフラグメント、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦトラップ、またはＤ１−Ｄ７などのＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）細胞外Ｉｇドメイン、特にＶＥＧＦＲ１細胞外Ｉｇドメイン２（ＥＣＤ、Ｄ２）、ＶＥＧＦＲ２細胞外Ｉｇドメイン３（ＥＣＤ、Ｄ３）は、使用されてもよい。
【００４８】
本発明において、アンジオポエチン（ＡＮＧ）に結合する任意のモチーフ、ペプチド、タンパク質、またはフラグメント、例えば、ＴＩＥ２に結合するＡＮＧ１およびＡＮＧ２は、使用されてもよい。ＴＩＥ２  ＥＣＤは、２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインおよび第３のＩｇ様ドメイン、それに続く３つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）リピートが隣接する３つのＥＧＦ様モジュールを含有する。ＡＮＧ結合部位は、Ｉｇ様サブドメインのＮ末端ペアに位置していた。
【００４９】
ＶＥＧＦおよびＡＮＧ２は、さまざまながん細胞タイプにおいてアップレギュレートされ、ＶＥＧＦブロッカーあり／なしでＡＮＧ−ＴＩＥ相互作用をブロックするため、本発明において、がんおよび加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）疾患の処置のために、ＡＮＧ２およびＶＥＧＦに対する二機能性融合が作成される。
【００５０】
種々の実施形態において、血管新生関連疾患は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）疾患、または原発性および転移性がんであってもよい。
【００５１】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）疾患は、読書、裁縫および運転などの「直進」活動に必要な鋭い中心視力をぼかす疾患である。通常、ＡＭＤは、目の一部である黄斑に影響する。
【００５２】
原発性および転移性がんは、乳、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢および胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱および尿路上皮を含む）、女性生殖管（子宮頸部、子宮および卵巣、並びに絨毛癌および妊娠性絨毛疾患を含む）、男性生殖管（前立腺、精巣、精巣、胚細胞腫瘍を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎、および下垂体を含む）、および皮膚の癌腫、並びに血管腫、黒色腫、肉腫（骨および軟組織から生じるもの並びにカポジ肉腫を含む）、脳、神経、眼、および髄膜（星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫瘍、神経芽細胞腫、神経鞘腫、および髄膜腫を含む）の腫瘍、造血器悪性腫瘍、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、造血器悪性腫瘍、カポジ肉腫、悪性リンパ腫、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、悪性の腫瘍随伴症候群/高カルシウム血症から生じる腫瘍、または固形腫瘍であってもよい。
【００５３】
本発明の一実施形態において、２３から４４８までのＴｉｅ２  ＥＣＤアミノ酸残基（配列番号１）を有するフラグメントを使用して、Ｃ末端にＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント（配列番号２）を有するＡＴ−Ｆｃタンパク質を生成し、ＡＴ−Ｆｃタンパク質を操作する。
【００５４】
本発明の別の実施形態において、ＶＥＧＦＲ１  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  Ｄ３キメラモチーフ（配列番号３）を含有するフラグメントは、ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント（配列番号２）のＣ末端に融合され、折り畳みが正しく、立体障害が最小限に抑えられることを保証するために、それらの間に短い柔軟なＧＳリンカー（配列番号４）を有するＦｃ−ＶＴタンパク質を構築した。
【００５５】
さらなる一実施形態において、ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ融合タンパク質は、融合を通して操作され、ＡＴ−ＦＣタンパク質とＶＴタンパク質との間にＧＳリンカー（配列番号４）も含有されるＡＴ−ＦｃのＣ末端にＶＥＧＦＲ１  ＥＣＤ  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  ＥＣＤ  Ｄ３（配列番号３）を含有するドメインを得た。
【００５６】
特定の実施形態において、二機能性タンパク質Ｔｃ３５０−２５３は、ジスルフィド結合Ｔｃ３５０−Ｔｃ２５３タンパク質として操作および発現され、ここでＴｃ３５０は、Ａｎｔｉ−Ａｎｇ２フラグメント抗原結合（Ｆａｂ）重鎖（ＨＣ）（配列番号７）のＣ末端でＬｕｃｅｎｔｉｓ可変重鎖ドメイン（Ｖｈ）（配列番号５）および可変カッパドメイン（Ｖｋ）（配列番号６）を、間で短い柔軟なＧＳリンカー（配列番号４）で、融合することにより構築され、Ｔｃ２５３は、Ａｎｔｉ−Ａｎｇ２−Ｆａｂ軽鎖（ＬＣ）フラグメント（配列番号８）を有するように構築された。
【００５７】
さらなる実施形態において、本発明において記載される全ての融合タンパク質は、発現されたタンパク質の分泌のためのシグナルペプチド（配列番号９）により導かれた。
【００５８】
ＡＴ−Ｆｃ、Ｆｃ−ＶＴ、ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ、およびＴｃ３５０のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３に記載されるものであった。
【００５９】
本発明において、上記のＡＴ−Ｆｃおよび／またはＦｃ−ＶＴタンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞により一過性に発現され、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇクロマトグラフィーを介してトランスフェクトされた細胞培養上清から精製された。９０％を超える純度を有する生成物が単一工程精製プロセスにおいて得られ、全ての融合タンパク質が適切に形成され、発現されることが見出された。
【００６０】
本発明によれば、ＶＥＧＦおよびＡＮＧを同時に標的とする二機能性融合タンパク質ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴは、ＡＮＧタンパク質のＣ末端でＶＥＧＦ結合モチーフを融合することを通して作成された。結果において示されるように、本発明によるＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ融合タンパク質は、それぞれＦｃ−ＶＴまたはＡＴ−Ｆｃタンパク質と同等の、ＶＥＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ細胞増殖、細胞遊走、管形成を阻害すること、並びにＡＮＧ２タンパク質に結合することにおいて二機能的効力を提供した。
【００６１】
本発明によれば、二機能性タンパク質Ｔｃ３５０−２５３は、ＶＥＧＦおよび／またはＡＮＧ２誘導血管新生関連表現型に対して有益な効果を提供する。特に、二機能性タンパク質Ｔｃ３５０−２５３は、レーザー誘導脈絡膜血管新生を予想外に改善し、これは、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の滲出型の研究において広く使用されている。
【００６２】
開示がより容易に理解されてもよいように、以下に選択した用語を定義する。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」なる語は、２つ以上の結合タンパク質、またはモチーフ、または異なる遺伝子をコードするペプチド／アミノ酸フラグメントの接続を通して作成されるタンパク質を指し、その遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する多機能特性を有する単一または複数のポリペプチドをもたらす。融合タンパク質は、抗体にコンジュゲートしたタンパク質、異なる抗体にコンジュゲートした抗体、またはＦａｂフラグメントにコンジュゲートした抗体を含むことができる。
【００６４】
ＡＴまたはＶＴフラグメントのそれぞれは、インビボでの長い半減期を有する抗体、または抗体のフラグメントである。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「リンカー」なる語は、アミノ酸残基またはフラグメント、または２つのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を連結するために使用されるペプチド結合により結合された２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを指す。リンカーは、ヒト免疫グロブリンアイソタイプ、サブクラス、またはアロタイプの野生型または変異体の免疫グロブリンＦｃ領域であるＦｃフラグメントであってもよい。
【００６６】
「Ｆｃ領域」なる語は、抗体の免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する。Ｆｃ領域は、ネイティブ配列のＦｃ領域またはバリアントＦｃ領域であってもよい。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」なる語は、溶剤、分散媒、等張剤などを含む任意の薬学的に許容される担体と本発明による融合タンパク質を混合することにより調製することができる、本発明による融合タンパク質を含む組成物または製剤を指す。担体は、液体、半固体、または固体の担体であることができる。いくつかの実施形態において、担体は、水、食塩水または他の緩衝液（血清アルブミンおよびゼラチンなど）、炭水化物（単糖、二糖、およびグルコース、スクロース、トレハロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、またはデキストリンを含む他の炭水化物など）、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔質マトリックス、結合剤、充填剤、コーティング、安定剤、保存剤、抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、非イオン性界面活性剤［ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など］、またはそれらの組み合わせであることができる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、処置される前記疾患または障害を予防または処置するための１つの追加の治療剤をさらに含む。例えば、追加の薬剤は、治療剤、化学療法剤、造影剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤、キナーゼ阻害剤、共刺激分子ブロッカー（抗Ｂ７．１、抗Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ２０を含むがこれらに限定されない）、接着分子ブロッカー（抗ＬＦＡ−１抗体、抗Ｅ／Ｌセレクチン抗体、小分子阻害剤を含むがこれらに限定されない）、および抗サイトカイン抗体またはその機能性断片（抗−ＩＬ−１８、抗ＴＮＦ、および抗ＩＬ−６／サイトカイン受容体抗体を含むがこれらに限定されない）であってもよい。
【００６９】
本発明は、さらなる限定として解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに説明される。
【００７０】
実施例
【００７１】
実施例１  血管新生ブロッカーの発現および精製
【００７２】
２３−４４８のＴＩＥ２  ＥＣＤアミノ酸残基をＡＮＧ結合モチーフとして使用し、ＶＥＧＦＲ１  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  Ｄ３のキメラドメインをＶＥＧＦ結合トラップとして使用した。対応するＤＮＡを合成し、間に配置された短い柔軟なＧＳリンカーで、ＡＮＧブロッカーについてＣ末端（ＡＴ−Ｆｃ）（図１Ａ）またはＶＥＧＦブロッカーについてＮ末端（Ｆｃ−ＶＴ）（図１Ｂ）でＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント遺伝子と融合した。二機能性ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ発現ベクターを構築するために、ＡＴ−Ｆｃを、ＧＳリンカーおよびＶＥＧＦモチーフとＣ末端で順次融合させた（図３）。これらの融合構築物を、ＣＭＶプロモーターの制御下でＥｃｏＲ  Ｉ制限部位とＮｏｔ  Ｉ制限部位との間でｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）発現ベクターにクローン化した。該ベクターは、哺乳類細胞の選択および大腸菌の増殖のためのＮｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子およびＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ耐性遺伝子を含有する。全ての融合構築物は、可溶性融合タンパク質の分泌のためのシグナルペプチドをＮ末端に含有した。これらの発現構築物を使用して、５０ｍｌのＨＥＫ２９３細胞を１ｍｌあたり１ｘ１０６細胞の密度で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後に培地を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇクロマトグラフィーにより融合タンパク質を精製した。
【００７３】
図２および図４において示すように、９０％を超える純度を有する融合タンパク質約３ｍｇ（１トランスフェクションあたり）を得た。
【００７４】
二機能性タンパク質Ｔｃ３５０−２５３発現ベクター（図３）を構築するために、Ａｎｔｉ−Ａｎｇ２  Ｆａｂ  ＨＣをＧＳリンカーにより分離したＬｕｃｅｎｔｉｓ  ＶｈおよびＬｕｃｅｎｔｉｓ  Ｖｋと順次融合させた。Ｔｃ３５０−２５３タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞により一過性に発現させ、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを介してトランスフェクトされた細胞培養上清から精製した。精製されたタンパク質（５μｇ／レーン）を、還元または非還元条件下でゲル分析した。Ｔｃ３５０−２５３二機能性タンパク質を、約７５ｋＤの分子量で適切に発現させ、９０％を超える純度を得た（図５）。
【００７５】
実施例２  血管新生ブロッカーのインビトロ結合
【００７６】
一晩リガンドでプレコートされた（１００ｎｇ／ウェル）ウェルを、１ｘＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の４００ｕｌ  ５％脱脂乳で２時間ブロックした。ブロッキング後、３０ｎＭから開始した１００μｌの３倍段階希釈精製タンパク質を、対応する各ウェルに２重で加え、シェーカー上で室温で１時間インキュベートした。結合後、ウェルをＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１ｘＰＢＳ）で３回洗浄した後、１００μｌの１：２５００希釈ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を各ウェルに加え、もう１時間シェーカー上でインキュベートした。最終洗浄後、ＴＭＢ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を加え、４５０ｎｍでのＯＤ吸収を測定した。Ｐｒｉｓｍ  ４を使用したシグモイド曲線フィッティングにより分析されたデータ。ＡＴ−Ｆｃ、Ｆｃ−ＶＴ、およびＡＴ−Ｆｃ−ＶＴのＡＮＧまたはＶＥＧＦへの結合を、同様のアッセイにより評価した。
【００７７】
図６において示すように、ＡＮＧ１およびＡＮＧ２に対するＡＴ−Ｆｃの計算されたＥＣ５０は、それぞれ４．２６ｎＭおよび２．０１ｎＭである。本明細書で収集された結果は、可溶性細胞外ドメイン（アミノ酸残基２３−４４８）がアンジオポエチン結合において機能的に活性であり、アンジオポエチンと競合することにより膜結合型の活性を調節できることを示した。
【００７８】
図７において示すように、Ｆｃ−ＶＴは、ＶＥＧＦ−Ａ結合評価において抗ＶＥＧＦ効力を有した。ＶＥＧＦ−Ａに対する計算されたＥＣ５０は、０．３３ｎＭであった。収集された結果において示されるように、Ｃ末端に局在するＶＥＧＦＲ１  Ｄ２およびＶＥＧＦＲ２  Ｄ３キメラＶＥＧＦトラップは高親和性で機能的であり、ＶＥＧＦの生物活性を中和することができた。
【００７９】
図８および図９において示すように、精製ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ二機能性融合タンパク質のＡＮＧ２およびＶＥＧＦへの結合活性を評価し、結果は、ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ融合タンパク質がそれぞれ２．５７ｎＭおよび０．３５ｎＭのＥＣ５０でＡＮＧ２およびＶＥＧＦ−Ａに結合できることを示し、ＡＮＧ２に対するＡＴ−ＦｃおよびＶＥＧＦに対するＦｃ−ＶＴと比較して有意に改善された結合活性を提供した。
【００８０】
結論として、ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ融合タンパク質は、リガンド結合および受容体活性化の阻害を通して、ＡＮＧ−ＴＩＥおよびＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ経路を調節する二機能を有することが確認された。
【００８１】
実施例３  血管新生ブロッカーによるＶＥＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ増殖阻害アッセイ
【００８２】
Ｆｃ−ＶＴおよびＡＴ−Ｆｃ−ＶＴを使用して、細胞ベースのアッセイにおいてＶＥＧＦ活性を阻害した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞、Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＶＥＧＦブロッカーにより阻害できるＶＥＧＦ依存性細胞増殖を実証した。実験において、ＨＵＶＥＣを、２％ＦＢＳを含むＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）中で維持した。コラーゲンでプレコートされたウェルに、５０ｍｌの１ｎＭ  ＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）およびウェルあたり種々の濃度のＦｃ−ＶＴまたはＡＴ−Ｆｃ−ＶＴを３７℃で１時間ロードした後、Ｍｅｄｉｕｍ−１９９（１０％ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．）中の１ｘ１０５細胞／ｍｌで５０ｍｌのＨＵＶＥＣを各ウェルに加えた。５％ＣＯ２で３７℃で７２時間のインキュベーション後、１０ｍｌのＭＴＳ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）を各ウェルに加え、次いで４５０／６５０ｎｍでのＯＤ吸収を測定することにより、細胞増殖をアッセイした。
【００８３】
図１０において示すように、ＶＥＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ細胞増殖アッセイにおけるＡＴ−Ｆｃ−ＶＴの５０％阻害活性（ＩＣ５０）は０．２６ｎＭであり、この実施例におけるＦｃ−ＶＴのもの（０．２０ｎＭ）と同様であった。
【００８４】
実施例４  血管新生ブロッカーによる内皮細胞管形成の阻害
【００８５】
ＡＴ−ＦｃおよびＡＴ−Ｆｃ−ＶＴを使用して、管形成アッセイにおける抗ＡＮＧ２活性を決定した。ヒト臍帯静脈内皮細胞を使用して、ＡＴ−ＦｃまたはＡＴ−Ｆｃ−ＶＴのＡｎｇ２への結合により阻害できるＡｎｇ２依存性細胞管形成を実証した。ＨＵＶＥＣを、２％ＦＢＳを含むＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）中で維持する。アッセイの前に、ＨＵＶＥＣ細胞を血清を含まない基礎培地中で２時間培養し、次いでトリプシン処理して１％血清中に１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。１．５ｘ１０４細胞をＭａｔｒｉｇｅｌでプレコートされたウェルごとに播種し、種々の濃度のＡＴ−ＦｃまたはＡＴ−Ｆｃ−ＶＴあり／なしで２００ｎｇ／ｍｌ  Ａｎｇ２。３７℃で１８時間のインキュベーション後、各ウェルから３重で繰り返して撮影した３つの重複しない画像で管形成を記録する（９画像／試料）。管の長さを、ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を使用して計算した。
【００８６】
図１１において示すように、管形成に対するＡＴ−Ｆｃ−ＶＴの５０％阻害活性（ＩＣ５０）は２．４５ｎＭであり、この実施例におけるＡＴ−Ｆｃ（３．６８ｎＭ）より低かった。
【００８７】
実施例５  二機能性融合タンパク質ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴは、ＶＥＧＦ誘導内皮細胞遊走を有意に阻害する
【００８８】
ＶＥＧＦ誘導走化性に対する二機能性タンパク質ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴの阻害効果を、トランスウェルプレート（８μｍ孔サイズ、Ｃｏｓｔａｒ）上でＨＵＶＥＣを使用して評価した。Ｍ１９９無血清培地と共にＨＵＶＥＣ細胞（１Ｘ１０５）を、上部ウェル中に配置した。リガンドヒトＶＥＧＦ（０．２μｇ／ｍｌ）を、１０％ＦＢＳ  Ｍ１９９培地中でＥｙｌｅａ（２μｇ／ｍｌ）またはＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ（２μｇ／ｍｌ）と混合し、下部ウェル中に配置した。トランスウェルプレートを５％インキュベーター中で２４時間インキュベートして、上部ウェルから下部チャンバーに向かって細胞を移動（transmigrade）させた。次いで、メンブレンインサートを固定し、１％クリスタルバイオレットで染色した。メンブレンインサートの下面に付着した細胞を顕微鏡で可視化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して３つのインサート上の５つの代表的なフィールドからの遊走した細胞の平均数を計算した。
【００８９】
ＶＥＧＦ刺激に対する内皮細胞の生理学的反応に対するＡＴ−Ｆｃ−ＶＴタンパク質の効果を調べた。ＨＵＶＥＣ細胞を上部チャンバーに加え、ビヒクルを用いたＶＥＧＦ、Ｅｙｌｅａを用いたＶＥＧＦ、ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴを用いたＶＥＧＦに個別に曝露した。２４時間後、膜の下部チャンバーに遊走した細胞をカウントした。ＶＥＧＦはＨＵＶＥＣ細胞の遊走を有意に増加させた。しかしながら、血管新生ブロッカーＡＴ−Ｆｃ−ＶＴは、ＶＥＧＦにより誘導される遊走を有意に阻害した（図１２）。
【００９０】
実施例６  二機能性融合タンパク質ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴは、ＶＥＧＦ誘導ＨＵＶＥＣ細胞管形成を阻害する
【００９１】
血管新生における二機能性血管新生ブロッカーＡＴ−Ｆｃ−ＶＴの機能を研究するために、インビトロＭａｔｒｉｇｅｌ管形成アッセイをヒト臍帯静脈内皮細胞において実施した。ＨＵＶＥＣ細胞を血清を含まない基礎培地中で２時間インキュベートした後、アキュターゼによりトリプシン処理した。４ｘ１０３ＨＵＶＥＣ細胞を、ＶＥＧＦ（１μｇ／ｍｌ）とＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ（１００μｇ／ｍｌ）またはＥｙｌｅａ（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＭａｔｒｉｇｅｌでプレコートされたウェル上に３７℃で４．５時間播種した。内皮ネットワーク形成の定量化を、Ｉｍａｇｅ  Ｊ血管新生システム（５画像／試料）により実施した。
【００９２】
ＶＥＧＦ処置下、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で４．５時間培養すると、ＨＵＶＥＣ細胞は一次血管ネットワークを示した。しかしながら、二機能性タンパク質ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴは、管状構造の形成を有意に破壊した（図１３）。
【００９３】
実施例７  二機能性タンパク質Ｔｃ３５０−２５３は、ＨＵＶＥＣ細胞のＡＮＧ２誘導管形成を阻害する
【００９４】
ＨＵＶＥＣ細胞を、血清を含まない基礎培地中で２時間インキュベートした。４ｘ１０３ＨＵＶＥＣ細胞を、Ｔｃ３５０−２５３（５０μｇ／ｍｌ）またはＴｃ２９３−２４０（５０μｇ／ｍｌ）と共にＡＮＧ２（０．５μｇ／ｍｌ）を含有するＭａｔｒｉｇｅｌでプレコートされたウェル上に３７℃で４．５時間播種した。内皮ネットワーク形成の定量化を、Ｉｍａｇｅ  Ｊ血管新生システム（５画像／試料）により実施した。
【００９５】
高レベルのＡＮＧ２は、ヒト湿性加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の疾患重症度、および血管新生、転移および炎症を含むがんの進行と相関する。ＶＥＧＦおよびＡｎｇ２を同時標的化する革新的な設計を生成した。血管新生における二機能性タンパク質の機能に取り組むために、インビトロＭａｔｒｉｇｅｌ管形成アッセイを実施した。結果は、二機能性タンパク質Ｔｃ３５０−２５３またはＴｃ２９３−２４０がインビトロでＡＮＧ２誘導ＨＵＶＥＣ細胞管形成を抑制することを示した（図１４）。
【００９６】
実施例８  二機能性タンパク質ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴおよびＴｃ３５０−２５３は、ＶＥＧＦ誘導ＨＵＶＥＣ細胞浸潤を阻害する
【００９７】
浸潤アッセイを、トランスウェルインサートをＭａｔｒｉｇｅｌ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）で製造業者の指示に従ってプレコートすることにより実施した。Ｍｅｄｉｕｍ−１９９と共にＨＵＶＥＣ細胞（２ｘ１０５）を、上部ウェル中に配置した。リガンドヒトＶＥＧＦ（０．２μｇ／ｍｌ）を、下部チャンバー中でＥｙｌｅａ（２μｇ／ｍｌ）、ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ（２μｇ／ｍｌ）またはＴｃ３５０−２５３（２μｇ／ｍｌ）と個別に混合した。トランスウェルプレートを、５％インキュベーター中で２４時間インキュベートして、上部ウェルから下部チャンバーに向かって細胞を移動させた。次いで、メンブレンインサートを固定し、１％クリスタルバイオレットで染色した。メンブレンインサートの下面に付着した細胞を顕微鏡で可視化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して遊走した細胞の平均数を計算した。
【００９８】
ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴおよびＴｃ３５０−２５３の二機能性タンパク質を使用して、ボイデンチャンバー浸潤アッセイを使用して抗ＶＥＧＦ活性を決定した。遊走研究の結果と同様に、血管新生ブロッカーＡＴ−Ｆｃ−ＶＴおよびＴｃ３５０−２５３は、ＶＥＧＦにより誘導される浸潤能を阻害した（図１５）。
【００９９】
実施例９  二機能性タンパク質Ｔｃ３５０−２５３は、ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２誘導ＨＵＶＥＣ細胞管形成を阻害する
【０１００】
ＨＵＶＥＣ細胞を、血清を含まない基礎培地中で２時間インキュベートし、次いでアキュターゼによりトリプシン処理した。４ｘ１０３のＨＵＶＥＣ細胞を、Ｅｙｌｅａ（５０μｇ／ｍｌ）、Ｔｃ３５０−２５３（５０μｇ／ｍｌ）またはその他の抗Ａｎｇ２抗体（５０μｇ／ｍｌ）と共にＶＥＧＦ（０．５μｇ／ｍｌ）／ＡＮＧ２（０．５μｇ／ｍｌ）を含有するＭａｔｒｉｇｅｌでプレコートされたウェル上に、３７℃で４．５時間個別に播種した。内皮ネットワーク形成の定量化を、Ｉｍａｇｅ  Ｊ血管新生システム（５画像／試料）により実施した。
【０１０１】
血管新生における二重標的化タンパク質Ｔｃ３５０−２５３の機能を研究するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞においてインビトロＭａｔｒｉｇｅｌ管形成アッセイを実施した。二機能性血管新生ブロッカーＴｃ３５０−２５３は、管状構造の形成を有意に破壊した（図１６）。このアッセイにおいて、二機能性タンパク質Ｔｃ３５０−２５３の生物活性は、Ｅｙｌｅａまたは抗Ａｎｇ２抗体（ＮｅｓｖａｃｕｍａｂおよびＴｃ２５２−２５３）より優れていた。
【０１０２】
実施例１０  二機能性タンパク質ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴおよびＴｃ３５０−２５３は、レーザー誘導脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）マウスモデルにおいて血管新生を阻害する
【０１０３】
レーザー誘導ＣＮＶを湿性ＡＭＤについての動物モデルとして使用し、血管新生ブロッカーの活性を評価した。マウスを、塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、瞳孔を１％トロピカミドで拡張した後、５３２ｎｍのダイオードレーザー光凝固の３回の焼き(burn）を各網膜に照射した。焼きを、網膜の後極の９時、１２時、および３時の位置で実施した。ブルッフ膜の破裂を示すレーザー時の気泡の生成は、ＣＮＶを得る上で重要な要素であった。
【０１０４】
レーザー誘導ＣＮＶモデルにおいて、１日目に、オスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、ビヒクル対照、Ｅｙｌｅａ（４０μｇ）、ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴ（４０μｇ）またはＴｃ３５０−２５３（４０μｇ）を右眼に硝子体内注入した（ｎ＝５／群）。網膜血管新生を、０、７、１４および２１日目にフルオレセイン血管造影および光干渉断層撮影により検査した。フルオレセイン血管造影について、１０％フルオレセインナトリウムを静脈内に注入し、連続画像をすぐにキャプチャした（１０分間１０秒ごと）。注入されたフルオレセインナトリウムは、２４時間後に完全に排泄される。Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＩＩ網膜イメージング顕微鏡（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、サンラモン、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して画像をキャプチャし、ＣＮＶ形成の程度を決定した。ＯＣＴ分析について、楕円体の体積を、式Ｖ＝４／３πａｂｃにより計算し、ここでａ（幅）、ｂ（深さ）およびｃ（長さ）は、楕円体の水平面または垂直面の半径である。
【０１０５】
ＶＥＧＦおよびＡＮＧ−２は、眼の血管新生疾患の特徴である病理学的血管新生および血管透過性に強く関連するようである。レーザー誘導脈絡膜血管新生マウスモデルによる血管新生に対する二機能性タンパク質ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴまたはＴｃ３５０−２５３の効果を、テストした。二機能性タンパク質ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴおよびＴｃ３５０−２５３は、眼底フルオレセイン血管造影（ＦＦＡ）分析を使用して、このモデルにおける血管新生を有意に阻害することを示した（図１７）。光干渉断層撮影（ＯＣＴ）による楕円体としてのレーザーＣＮＶ病変の定量化も、二機能性タンパク質ＡＴ−Ｆｃ−ＶＴまたはＴｃ３５０−２５３処置後の病変体積の有意な減少を示した（図１７）。
【０１０６】
本発明は好ましい実施形態として開示されているが、それは本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、改変および装飾を実施することを許可されるものとする。従って、本発明の保護の範囲は、後に添付される特許請求の範囲により定義されるものにより支配されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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