(57)【要約】  本発明は、Ｍ２マクロファージ活性化を阻害する又はリンパ球活性化を促進することにより癌の治療のために用いられる、ＣＤ５Ｌ結合剤又はその医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージにおいて免疫抑制性Ｍ２表現型を阻害することができる治療有効量のＣＤ５Ｌ結合剤を、１つ以上の薬学的に許容可能な担体又は添加剤と共に含む医薬組成物。
【請求項２】
前記ＣＤ５Ｌ結合剤が抗ＣＤ５Ｌ抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
治療方法において炎症促進性応答の支持のために用いられる、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
癌免疫療法のために用いられる、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
癌の治療及び／又は予防において抗癌剤との併用療法のために用いられる、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記癌が、乳頭腫、腺腫、脂肪腫、骨腫、筋腫、血管腫、母斑、成熟奇形腫、癌腫、肉腫、未熟奇形腫、黒色腫、骨髄腫、白血病、ホジキンリンパ腫、基底細胞腫、脊髄腫、乳癌、卵巣癌、子宮癌、肺癌、気管支癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、食道癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、及び頭頸部癌からなる一覧から選択される、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、子宮癌、肺癌、気管支癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、食道癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、及び頭頸部癌からなる一覧から選択される、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
炎症促進性応答を支持し、Ｍ２活性化を阻害する治療方法のために用いられる、パーツキットであって、
ａ．（ａ）請求項１〜６のいずれかで定義される抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントと、
ｂ．（ｂ）任意に、その使用説明書と、
を備えるパーツキット。
【請求項９】
薬物を更に備える、請求項８に記載のパーツキット。
【請求項１０】
前記治療方法が癌免疫療法である、請求項８又は９に記載のパーツキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１７年１０月３０日付けで出願された欧州特許出願第１７３８２７２５．４号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、概して免疫療法の分野に関する。特に、本発明は、治療目的でマクロファージ活性化を調節するための抗ＣＤ５Ｌ抗体の使用に関する。本発明の抗体は、癌免疫療法において特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍微小環境は、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、並びにマクロファージ及び樹状細胞等の炎症細胞を含む多くの細胞型で構成される複雑なシステムである。マクロファージは腫瘍間質の主要な炎症成分であり、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ：tumor-associated macrophage）と定義されている。ＴＡＭは、腫瘍及び間質細胞から生成される様々な微小環境シグナルに応答して、それらの機能的な表現型をシフトさせる能力を持っている。
【０００４】
マクロファージが獲得できる機能的表現型は、一般に古典的なＭ１活性化又は代替Ｍ２活性化として分類される。Ｍ１マクロファージは、強力な炎症促進性及び細胞傷害性活性を特徴とするため、病原体（細菌、ウイルス、及び原生動物）及び腫瘍細胞を死滅させることができる。このため、Ｍ１マクロファージはしばしば抗腫瘍マクロファージと見なされる。Ｍ２マクロファージは、血管新生促進又は組織修復等の抗炎症機能又は解除（resolutive）機能を有することが知られている。さらに、Ｍ２マクロファージは腫瘍の成長及び進行を支持することが知られていることから、一般に腫瘍促進性マクロファージと考えられている。Mantovani A.及び同僚らによって報告されているように（非特許文献１を参照されたい）、ＴＡＭは通常、免疫抑制性Ｍ２表現型を示す。
【０００５】
近年、ＴＡＭは、癌細胞生物学及び他の免疫細胞自体の応答を調節する能力、又は治療への応答により、癌免疫療法の潜在的な標的として浮上している。同様に、ＴＡＭ（及びその活性化状態）は現在、癌の診断及び予後診断に関する潜在的なバイオマーカーとして認識されている。
【０００６】
マクロファージの挙動を更に理解する試みで、John A. Gebe et al.は特許出願の特許文献１においてＣＤ５Ｌの同定を報告した。この従来技術において、著者らは、マクロファージの接着及び遊走（trafficking）におけるＣＤ５Ｌの可能性のある役割について推測しているものの、そのような結論を裏付ける実験データはない。
【０００７】
これまでになされた努力にもかかわらず、ヒトにおいてマクロファージの種々の集団を識別するための信頼できる効率的なマーカーが欠けており、その一方で、マクロファージの活性化に関与する分子プレーヤー及びプロセスへのそれらの正確な貢献についての理解は不完全である。これらの欠点により、癌免疫療法の開発が大幅に制限されている。
【０００８】
上記を考慮して、更なる抗癌アプローチを開発するニーズが依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９８３９４４３号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Mantovani et al. in "Macrophages, innate immunity and cancer: balance, tolerance, and diversity", Curr Opin Immunol. 2010 Apr;22(2):231-7
【発明の概要】
【００１１】
本発明者らは、Ｍ２マクロファージ活性化中のＣＤ５Ｌの新たな予期しない役割を明らかにした。
【００１２】
以下の実施例に示すように、本発明者らは、ＣＤ５Ｌ発現がＭ２活性化プロセス中に強く誘導されることを見出した（図１を参照されたい）。したがって、ＣＤ５Ｌ発現はＭ２マクロファージ集団を識別するための新規の分子マーカーを構成する。
【００１３】
更に重要なことに、ＣＤ５ＬはＭ２ドライバーとして作用することにより、Ｍ２様分子の及び機能的な表現型の獲得に積極的に貢献していることがわかった。以下に示すように（図２を参照されたい）、ヒトマクロファージの初代細胞培養物に組み換えＣＤ５Ｌを添加するだけで、Ｍ２表現型の獲得を誘導する。
【００１４】
さらに、本発明者らは、ＣＤ５ＬがＭ２活性化プロセスを誘発することができるだけでなく、このプロセスを実行するのに必要であることも発見した。したがって、ＣＤ５ＬがＭ２マクロファージ分極化に必須の役割を果たすことが報告されたのは初めてである。
【００１５】
驚くべきことに、本発明者らは、抗体等のＣＤ５Ｌ結合剤とＭ２様マクロファージを接触させることによりＭ２様マクロファージにおいてＣＤ５Ｌが枯渇すると、免疫抑制性Ｍ２表現型が阻害されることを見出した（図３Ａを参照されたい）。さらに、ＬＰＳに対するＭ２マクロファージの炎症反応は、Ｍ２マクロファージが抗ＣＤ５Ｌ抗体等のＣＤ５Ｌ結合剤で処理された場合に回復され得ることがわかった（図３Ｂを参照されたい）。
【００１６】
本発明者らによって報告されたマクロファージの分極化におけるＣＤ５Ｌの役割は、従来技術（特許文献１）に照らして予想外である。この従来技術では、ＣＤ５Ｌは炎症反応の正のエフェクターであることが示唆された。さらに、抗ＣＤ５Ｌ抗体によるＣＤ５Ｌ活性の遮断は、マクロファージの炎症促進活性を妨げる可能性があることが示唆された。しかしながら、そのような結論を支持する最低限の実験データは提供されていない。したがって、かかる示唆は、炎症プロセスにほとんど関連していない試験から導き出された単なる仮説であった。
【００１７】
したがって、本明細書で提供された結果は、抗ＣＤ５Ｌ抗体等のＣＤ５Ｌ結合剤が、免疫応答に対して以前に考えられていたのとは逆の効果を有すること、つまり炎症促進反応の抑制ではなく、炎症促進反応を支持することを明らかにした。
【００１８】
全体として、以下に提供される実施例において、本発明者らは、ＣＤ５Ｌに対する特定のモノクローナル抗体を開発することにより、Ｍ２活性化を防ぐためにＣＤ５Ｌ活性を遮断する有用性を実証した。
【００１９】
したがって、第１の態様では、本発明は、配列番号１の配列であるＶＨ  ＣＤＲ３及び配列番号２の配列であるＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗ＣＤ５Ｌモノクローナル抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントを提供する。好ましくは、かかる抗ＣＤ５Ｌモノクローナル抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントは、次に指定される順序で、配列番号３の配列であるＣＤＲ１又はそのヒト化変異体、配列番号４の配列であるＣＤＲ２又はそのヒト化変異体、及び配列番号１の配列であるＣＤＲ３又はそのヒト化変異体を含むＶＨ配列と、次に指定される順序で、配列番号５の配列であるＣＤＲ１又はそのヒト化変異体、配列番号６の配列であるＣＤＲ２又はそのヒト化変異体、及び配列番号２の配列であるＣＤＲ３又はそのヒト化変異体を含むＶＬ配列とを含む。
【００２０】
更なる態様では、本発明は、第１の態様の抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。
【００２１】
第２の態様では、本発明は、（ａ）本発明の第１の態様で定義される抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントと、（ｂ）任意に、その使用説明書とを備えるパーツキットを提供する。
【００２２】
第３の態様では、本発明は、治療法、診断又は予後診断のために用いられる、本発明の第１の態様による抗体若しくはそのＣＤ５Ｌ結合フラグメント、又は、代替的には本発明の更なる態様によるコンジュゲートを提供する。
【００２３】
第４の態様では、本発明は、治療有効量のＣＤ５Ｌ結合剤を１つ以上の薬学的に許容可能な担体又は添加剤と共に含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
第５の態様では、本発明は、（ａ）本発明の第４の態様によるＣＤ５Ｌ結合剤又は医薬組成物と、（ｂ）薬物と、（ｃ）任意に、その使用説明書とを備えるパーツキットを提供する。
【００２５】
以下の実施例に示されるように、本発明者らは、ＣＤ５Ｌに対するモノクローナル抗体を使用することにより、Ｍ２活性化を防ぐためにＣＤ５Ｌ活性を遮断する有用性を実証した。しかしながら、商業的に入手可能なＣＤ５Ｌに結合することができる任意の抗体又は任意の他の作用物質（ペプチド、小分子等）が、Ｍ２マクロファージ活性化の防止にも有用であり得ることは、合理的な範囲である。
【００２６】
したがって、第６の態様では、本発明は、Ｍ２マクロファージ活性化の阻害のために用いられる、又は、代替的にはＴリンパ球活性化の促進のために用いられる、ＣＤ５Ｌ結合剤、又は第１の態様で定義される抗体若しくはそのフラグメント、又は更なる態様で定義されるコンジュゲート、又は第４の態様で定義される医薬組成物、又は本発明の第２若しくは第５の態様で定義されるキットを提供する。
【００２７】
Ｍ２マクロファージが腫瘍の進行及び腫瘍の成長に有利であることは、当該技術分野で十分に確立されている（上記の非特許文献１）。したがって、Ｍ２活性化を阻害するために本明細書で提供される新たな戦略は、Ｍ２活性化を阻害することによる抗癌治療の分野における有望な手段である。
【００２８】
さらに、本発明者らは、図６に見られるように、Ｔリンパ球におけるＣＤ５Ｌ活性を調節することにより、それらのレベルの活性化を制御し得ることを見出した。当該技術分野では、Ｔリンパ球は腫瘍の制御において格別重要な適応免疫系の決定的な構成要素であることが知られている。したがって、本発明の抗体は、Ｔリンパ球活性化の促進を通じて腫瘍を治療するための有望な手段である。
【００２９】
したがって、第７の態様では、本発明は、癌の治療及び／又は予防のために用いられる、ＣＤ５Ｌ結合剤、又は第１の態様で定義される抗体若しくはそのフラグメント、又は更なる態様で定義されるコンジュゲート、又は第４の態様で定義される医薬組成物、又は本発明の第２若しくは第５の態様で定義されるキットを提供する。この態様はまた、癌の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、ＣＤ５Ｌ結合剤、又は本発明の第１の態様で定義される抗体若しくはそのフラグメント、又は更なる態様で定義されるコンジュゲート、又は第４の態様で定義される医薬組成物の使用として述べられ得る。この態様はまた、癌を治療及び／又は予防するための方法として述べられ得て、該方法は、治療有効量のＣＤ５Ｌ結合剤、又は第１の態様で定義される抗体若しくはそのフラグメント、又は更なる態様で定義されるコンジュゲート、又は第４の態様で定義される医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。この態様の妥当性に関して、また図５に示されるように、ＣＤ５Ｌを標的とすることによって肺癌の前臨床モデルで腫瘍の成長が減少したことは明らかなようである。さらに、Ｍ２表現型へのＴＡＭ分極化は、神経膠芽腫、神経膠腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣腺癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、膵腺癌、腎臓乳頭細胞癌、前立腺腺癌、甲状腺癌、ＨＰＶ関連子宮頸癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び乳癌等の多様な癌において予後不良に関連付けられている。したがって、癌免疫療法のためＣＤ５Ｌを標的とすることは、本明細書で提供される情報及び結果に照らして、合理的な治療選択肢となるはずである。
【００３０】
第８の態様では、本発明は、癌の治療及び／又は予防における抗癌剤との併用療法のために用いられる、ＣＤ５Ｌ結合剤、又は第１の態様で定義される抗体若しくはそのフラグメント、又は更なる態様で定義されるコンジュゲート、又は第４の態様で定義される医薬組成物、又は本発明の第２若しくは第５の態様で定義されるキットを提供する。この態様はまた、患者の癌の治療及び／又は予防における抗癌剤との併用療法のために用いられる医薬の製造のための、ＣＤ５Ｌ結合剤、又は第１の態様で定義される抗体若しくはそのフラグメント、又は更なる態様で定義されるコンジュゲート、又は第４の態様で定義される医薬組成物の使用として述べられ得る。この態様はまた、癌を治療及び／又は予防する方法として述べられ得て、該方法は、抗癌剤と組み合わせて、治療有効量のＣＤ５Ｌ結合剤、又は第１の態様で定義される抗体若しくはそのフラグメント、又は更なる態様で定義されるコンジュゲート、又は本発明の第４の態様で定義される医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
【００３１】
上に言及されるように、本発明者らは、ＣＤ５ＬがＭ２マクロファージ集団を識別するための新規分子マーカーを構成することを見出した。さらに、ＣＤ５Ｌは腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）によって発現され、その発現レベルは癌の予後不良と正の相関があることがわかっている（図４を参照されたい）。
【００３２】
本明細書で提供される実験データから、マクロファージ集団において識別された場合、ＣＤ５Ｌは癌の指標であり、マーカーのレベルの進展に応じて、予後診断に関する有用な情報を提供すると結論付けることができる。
【００３３】
驚くべきことに、本発明者らは、ＣＤ５Ｌがマクロファージの表面に特異的に局在化され得ることを見出した。これは、ＣＤ５Ｌが細胞外培地にのみ存在する分泌型可溶性タンパク質であるという以前の仮定とは対照的である。
【００３４】
したがって、第９の態様では、本発明は、癌を有する被験体の診断又は予後を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供し、該方法は、被験体の単離された生体サンプル中のマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量を決定する工程を含む。
【００３５】
本発明はまた、診断／予後を決定し、癌に罹患している被験体を治療するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供し、該方法は、被験体の単離された生体サンプル中のマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量を決定する工程と、工程（ｂ）で決定されたレベルが基準対照レベルよりも高い場合、被験体に適した癌治療レジメンを開始する工程とを含む。
【００３６】
第１０の態様では、本発明は、単離されたマクロファージ含有生体サンプルにおける、癌の診断若しくは予後マーカーとして、又は癌をモニタリングするためのマーカーとしてのＣＤ５Ｌの使用を提供する。
【００３７】
第１１の態様では、本発明は、本発明の第９の態様の方法における癌の診断又は予後診断のための、被験体の単離された生体サンプル中のマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量を決定する手段の使用を提供する。
【００３８】
第１２の態様では、本発明は、被験体において医療レジメンを開始することを決定又は推奨する方法を提供し、該方法は、（ａ）被験体の単離された生体サンプル中のマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する工程を含む。
【００３９】
第１３の態様では、本発明は、既に癌と診断された患者における医療レジメンの有効性を判断する方法を提供し、該方法は、
（ａ）医療レジメンの適用前に、被験体の単離された生体サンプル中のマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する工程と、
（ｂ）医療レジメンの適用を開始した後に、被験体の単離された生体サンプル中のマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で測定されたマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量が工程（ａ）で測定されたマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量よりも少ない場合、その医療レジメンが癌の治療に有効であることを示すような方法で、工程（ａ）及び工程（ｂ）で測定されたレベルを比較する工程と、
を含むか、又は、代替的には、上記方法は、
（ｉ）医療レジメンの適用を開始した後に、被験体の単離された生体サンプル中のマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で測定されたレベルをマクロファージ内のＣＤ５Ｌの基準対照レベルと比較する工程と、
を含み、
ここで、工程（ｉ）で測定されたマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量が基準対照レベルより高くない場合、その医療レジメンが癌の治療に有効であることを示す。
【００４０】
第１４の態様では、本発明は、被験体に由来する単離サンプル中のＭ２マクロファージの存在を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供し、該方法は、サンプルに由来するマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量を決定する工程を含む。
【００４１】
第１５の態様では、本発明は、Ｍ２マクロファージのマーカーとしてのＣＤ５Ｌの使用を提供する。
【００４２】
更なる態様では、本発明は、癌を有する患者の治療方法のために用いられる抗癌化合物を提供し、該方法は、（ｉ）患者から単離された生体サンプルに由来するマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量を決定することと、（ｉｉ）試験サンプルのマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量が基準値よりも高い場合、患者に有効量の抗癌薬を投与することとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】様々な刺激で分極化した末梢血（ＰＢ）単球におけるＣＤ５Ｌ及びＣＤ１６３の発現を示す図である。（Ａ）は、示される処理の適用後にＰＢ単球においてリアルタイムＰＣＲによって分析されたＣＤ５Ｌ  ｍＲＮＡのレベルを表す棒グラフを示す。ｙ軸は、対照細胞（Ｍ）と比較した、各処理後のＣＤ５Ｌ  ｍＲＮＡレベルの倍率変化の増加を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｔ検定対Ｍ。（Ｂ）は、示される刺激を適用した後にＰＢ単球のフローサイトメトリーによって分析されたタンパク質ＣＤ５Ｌ及びＣＤ１６３の表面レベルを示す。ｙ軸は、各マーカーに対する陽性細胞のパーセンテージ（上のパネル）又は各マーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）（下のパネル）のいずれかを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１  ボンフェローニ事後検定を伴うＡＮＯＶＡ検定、ＩＬ１０対全て。
【図２】（Ａ）は、通常の培地（Ｍ）、ヒトアルブミン（ｈＳＡ）、又は組換えＣＤ５Ｌ（ｒＣＤ５Ｌ）による処理後のＭ２マクロファージ表面マーカーＣＤ１６３陽性のＰＢ単球のパーセンテージを示す棒グラフである。（Ｂ）は、対照培地（Ｍ）、ヒトアルブミン（ｈＳＡ）又は組換えＣＤ５Ｌ（ｒＣＤ５Ｌ）で処理した後の非刺激又はＬＰＳ刺激ＰＢマクロファージによるＴＮＦα又はＩＬ６の産生を示す様々な棒グラフを示す。統計的有意差をｔ検定対Ｍで分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３】（Ａ）示される処理に供した後のＰＢマクロファージにおける幾つかのマクロファージ活性化マーカーのｍＲＮＡ発現レベルを表す様々な棒グラフを示す。これらの実験では、遺伝子発現値をグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルに対して正規化した。棒グラフは未処理の細胞に対応する。破線の棒グラフは、処理されていない細胞に対応し、黒の棒グラフはＩＬ１０で処理した細胞に対応し、「アイソタイプ」という名前の白の棒グラフは、本発明の抗ＣＤ５Ｌ抗体と同じアイソタイプを有する対照抗体（すなわちＩｇＧ２ａ）と共にＩＬ１０による処理に対応し、「４Ｄ７」という名前の白の棒グラフは、本発明のモノクローナル抗ＣＤ５Ｌ抗体と共にＩＬ１０で処理された細胞に対応する。ｙ軸は、ＩＬ  １０処理細胞と比較した、各処理後のｍＲＮＡレベルの倍率変化の増加を表す。ｎ＝４。（Ｂ）は、示される処理に供した後のＰＢマクロファージによって産生され分泌されたＴＮＦを表す棒グラフを示す。黒の棒グラフは未処理の細胞に対応し、破線の棒グラフは、本発明の抗ＣＤ５Ｌ抗体と同じアイソタイプを有する対照抗体（すなわち、ＩｇＧ２ａ）で処理された細胞に対応し、白の棒グラフは、本発明のモノクローナル抗ＣＤ５Ｌ抗体（４Ｄ７）で処理された細胞に対応する。ＰＢ単球をＩＬ１０、ＬＰＳ、又はその両方で更に処理した。ｎ＝４。統計的有意差をｔ検定、４Ｄ７対アイソタイプで分析した。＊ｐ＜０．０５。
【図４】腫瘍で見られたＣＤ６８＋ＣＤ５Ｌ＋マクロファージのパーセンテージによる、肝細胞癌（ＨＣＣ）に罹患している患者の全生存期間（ＯＳ）を示すグラフである。ｙ軸は生存している患者のパーセンテージを表し、ｘ軸は月単位の時間を表す。（ａ）は、腫瘍組織におけるＣＤ５Ｌ＋ＣＤ６８＋マクロファージのパーセンテージが５０％未満の患者を表し、（ｂ）は、腫瘍組織におけるＣＤ５Ｌ＋ＣＤ６８＋マクロファージのパーセンテージが５０％を超える患者を表す。統計的有意差をカプラン−マイヤー法で分析し、曲線間の差を比較するためにログランク検定を行った。ｎ＝４８、ｐ＝０．０４９２。
【図５】抗ＣＤ５Ｌ  ｍｏＡｂ治療は腫瘍の成長を阻害する。（Ａ）ＬＬＣ肺腫瘍モデル及びｍｏＡｂ治療レジメンの概略図である。（Ｂ）対照（ｎ＝５）及び抗ＣＤ５Ｌ  ｍｏＡｂ治療マウス（ｎ＝４）で測定されたＬＬＣ腫瘍成長曲線（実験７日目に対して正規化）である。Ｐ値をマン−ホイットニー検定を使用して計算した（＊ｐ≦０．０５）。
【図６】ｒｈＣ５ＬはＴ細胞の増殖を阻害する。ｎ＝５〜７の異なる健康なドナーについて、対照（培地）における、刺激された（ＣＤ２／３／２８）、又はｒｈＣＤ５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）の存在下で刺激された、Ｔ細胞の％増殖率（Ａ）及び％生存率（Ｂ）を示すグラフである。Ｐ値を、対応のあるｔ検定を使用して計算した（＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１）
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本願の明細書で使用される全ての用語は、特に記載のない限り、当該技術分野で既知の通常の意味で理解されるものとする。本願で使用される或る特定の用語の他のより具体的な定義を下記に説明するが、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して一様に適用されることが意図され、特に明白に説明されない限り、定義はより広い定義を与えるものである。
【００４５】
上記のように、本発明は、任意に、特定の配列のＶＨ  ＣＤＲ及びＶＬ  ＣＤＲ又はそのヒト化変異体を指定の順序で任意に含む、抗ＣＤ５Ｌモノクローナル抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントを提供する。
【００４６】
当業者は、「指定の順序で」はＣＤＲの順序のみを指し、他の配列がこのＣＤＲの間に配置されることを除外しないと理解するであろう。
【００４７】
本発明の抗体は、モノクローナルであるという或る特定の利点、例えば、それらを臨床治療に適したものにする再現性及び大規模生産を有する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ５Ｌ」という用語は、ＣＤ５抗原様、アポトーシス阻害剤６（Ａｐｉ−６）、可溶性タンパク質アルファ（Ｓｐアルファ）、マクロファージによって発現されるアポトーシス阻害剤（ＡＩＭ）、ＣＴ−２、又はＩｇＭ関連ペプチドと名付けられた可溶性タンパク質を指し、スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーに属する。幾つかの種のタンパク質配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｏ４３８６６＿ＨＵＭＡＮ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ；Ｑ９ＱＷＫ４＿ＭＯＵＳＥ  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ；Ａ６ＱＮＷ７＿ＢＯＶＩＮ  Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ；Ｆ７ＦＵＢ７＿ＭＡＣＭＵ  Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、Ｑ４ＫＭ７５＿ＲＡＴ  Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；Ｈ２Ｑ０Ｂ２＿ＰＡＮＴＲ  Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ；Ｆ７ＨＤＸ２＿ＣＡＬＪＡ  Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ；Ｆ１ＰＡＸ５＿ＣＡＮＬＦ  Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ；Ｈ０ＵＺＭ６＿ＣＡＶＰＯ  Ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ；Ｇ３Ｒ０５８＿ＧＯＲＧＯ  Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ；Ｆ１ＲＮ７６＿ＰＩＧ  Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ；Ａ０Ａ１Ｅ１ＧＥＶ５＿ＦＥＬＣＡ  Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ；Ｆ７ＢＸＤ８＿ＨＯＲＳＥ  Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ等の幾つかのタンパク質データベースにおいて入手可能である。
【００４９】
「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される）及び重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインで構成される。ＶＨ及びＶＬの領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域により分散させられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に分割され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００５０】
本明細書で使用されるＣＤＲの「ヒト化変異体」とは、１つ以上の残基がヒトＣＤＲ（ドナーＣＤＲ）由来の残基で置換されたマウスＣＤＲ（レシピエントＣＤＲ）を指し、得られるＣＤＲは、レシピエントＣＤＲの結合能を維持する。ＣＤＲのヒト化変異体には、患者においてヒト抗マウス抗体反応を誘発するリスクを低下させるという利点がある。ＣＤＲのヒト化変異体を生成する方法は、技術水準においてよく知られており、例えば、ＳＤＲグラフト化（Kashmiri SV et al., "SDR grafting--a new approach to antibody humanization" Methods. 2005, vol. 36(1), pp. 25-34）である。ＣＤＲのヒト化変異体は、ヒト化抗体の一部を形成する可能性がある。
【００５１】
本明細書で使用される場合、本発明の第１の態様で言及される「抗ＣＤ５Ｌ抗体」という用語は、ＣＤ５Ｌに結合し、好ましくはＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３又はそのヒト化バージョンを指定の順序で含む抗体に関する。抗体は、二量体、三量体、多量体、二重特異性、キメラ、ヒト、ヒト化、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギ、更にはカエル、ニワトリ、組み換え型又は遺伝子操作型であり得る。一実施形態では、本発明の第１の態様の抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＭクラスのものである。別の実施形態では、本発明の第１の態様の抗体のサブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３からなる群から選択される。別の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２ａサブクラスのものである。特定の実施形態では、抗体は、キメラ、ヒト化、又は二重特異性抗体である。
【００５２】
本明細書で使用される場合「二重特異性」又は「二官能性」の抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体を指す。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合を含む様々な方法により製造され得る。例えば、Kostelny SA. et al., "Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers", J Immunol. 1992, vol. 148(5), pp. 1547-53を参照されたい。
【００５３】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の起源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残部が異なる起源又は種、通常はマウス種に由来する抗体を指す。
【００５４】
「ヒト化」抗体は、免疫グロブリンの分子、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合部分配列等）であり、ヒト免疫グロブリンに由来する配列（複数の場合もある）及び非ヒト免疫グロブリンに由来する配列（複数の場合もある）を含み、非ヒト免疫グロブリンと同じ又は著しく類似するエピトープ標的化能力を有する。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、ヒト抗体にも非ヒトＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。ヒト化抗体は、ＣＤＲのヒト化変異体を含んでもよく、含まなくてもよい。非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野でよく知られている（Safdari Y. et al., "Antibody humanization methods - a review and update" Biotechnol Genet Eng Rev. 2013, vol. 29, pp. 175-86）（Presta LG et al., "Antibody engineering", Curr Opin Biotechnol. 1992, vol. 3(4), pp. 394-8）。
【００５５】
当業者は、所与の抗体、例えば本発明の抗体のヒト化配列を自動的に得ることを可能にするコンピュータープログラム又はアルゴリズムを知っている。
【００５６】
本発明の第１の態様で言及される「そのＣＤ５Ｌ結合フラグメント」という用語はまた、ＣＤ５Ｌを結合し遮断するため、配列番号１及び配列番号２の配列を有する抗ＣＤ５Ｌ抗体の任意の部分を包含する。適切なフラグメントには、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）及びＦｖが含まれる。フラグメントがＣＤ５Ｌを結合し遮断する能力を維持しているかどうかを試験する方法は、例えば、以下の実施例で説明するように、マクロファージのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分極化試験によって行われ得る。簡潔に言えば、ＣＤ５Ｌ結合フラグメントを、（代わりに他のものも使用できるが）ＩＬ１０等のＭ２誘導サイトカインと共に、ＰＢ単球、ＴＨＰ１細胞、Ｕ９３７細胞、又はＫ５６２細胞等のマクロファージ様細胞に添加し、次いで、マクロファージ活性化マーカーであるＶＥＧＦ、ＣＤ１６３、及びＭｅｒｔｋの１つ以上のｍＲＮＡ発現レベルを測定する。当業者は、活性化マーカーの発現レベルを決定するため適切なプライマーを設計することができる。かかるプライマーの例示的で非限定的な例は、配列番号１７〜配列番号２０及び配列番号２５〜配列番号２６の配列である。抗ＣＤ５Ｌ抗体全体を用いて同じ工程を実施しなければならない。次いで、フラグメント及び抗体全体によって誘導されたｍＲＮＡ発現レベルを比較し、発現レベルが各活性化マーカーで類似している場合、これは、フラグメントがＣＤ５Ｌを結合し遮断する能力を維持していることを示す。
【００５７】
本発明の第１の態様の一実施形態では、抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントは、配列番号３の配列であるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４の配列であるＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号５の配列であるＶＬ  ＣＤＲ１、及び配列番号６の配列であるＶＬ  ＣＤＲ２を更に含む。好ましくは、本発明の第１の態様で言及される抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントにおいて、ＶＨ配列は、次に指定される順序で、配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ１配列と、配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ２配列と、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ３配列とを含み、ＶＬ配列は、次に指定される順序で、配列番号５と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ１配列と、配列番号６の配列であるＣＤＲ２と、配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ３配列とを含む。本発明の第１の態様の別の実施形態では、上記抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントにおいて、ＶＨ配列は、次に指定される順序で、配列番号３の配列であるＣＤＲ１と、配列番号４の配列であるＣＤＲ２と、配列番号１の配列であるＣＤＲ３とを含み、ＶＬ配列は、次に指定される順序で、配列番号５の配列であるＣＤＲ１と、配列番号６の配列であるＣＤＲ２と、配列番号２の配列であるＣＤＲ３とを含む。
【００５８】
別の特定の実施形態では、任意に上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、第１の態様による抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメント：
ＶＨ配列は、配列番号７と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する、又は、代替的には、
ＶＬ配列は、配列番号８と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する、又は、代替的には、
ＶＨ配列は、配列番号７と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、ＶＬドメインは、配列番号８と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列からなる。
【００５９】
本発明において、「同一性」という用語は、配列を最適にアラインメントした場合に２つの配列中で同一の残基のパーセンテージを指す。最適アラインメントにおいて、第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められる場合、配列はその位置に関して同一性を示す。２つの配列間の同一性のレベル（又は「パーセント配列同一性」）は、配列のサイズに対する配列に共通する同一位置の数の比率として測定される（すなわち、パーセント配列同一性＝（同一位置の数／位置の総数）×１００）。
【００６０】
２つ以上の配列間で最適アラインメントを迅速に得て、同一性を算出するための多数の数学アルゴリズムが既知であり、多数の利用可能なソフトウェアプログラムに組み込まれている。かかるプログラムの例としては、特にアミノ酸配列分析のためのＭＡＴＣＨ−ＢＯＸ、ＭＵＬＴＡＩＮ、ＧＣＧ、ＦＡＳＴＡ及びＲＯＢＵＳＴプログラムが挙げられる。好ましいソフトウェア分析プログラムとしては、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ及びＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ  ２.１、ＢＬ２ＳＥＱ及びそれ以降のバージョン）が挙げられる。
【００６１】
アミノ酸配列分析については、ウェイトマトリックス（weight matrix）、例えばＢＬＯＳＵＭマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ５０、ＢＬＯＳＵＭ６２及びＢＬＯＳＵＭ８０マトリックス）、Ｇｏｎｎｅｔマトリックス又はＰＡＭマトリックス（例えば、ＰＡＭ３０、ＰＡＭ７０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ１６０、ＰＡＭ２５０及びＰＡＭ３５０マトリックス）が同一性の決定に用いられる。
【００６２】
ＢＬＡＳＴプログラムは、選択配列をデータベース（例えば、ＧｅｎＳｅｑ）中の複数の配列に対してアラインメントするか、又はＢＬ２ＳＥＱを用いて２つの選択配列間でアラインメントすることによって少なくとも２つのアミノ酸配列の分析をもたらす。ＢＬＡＳＴプログラムは、好ましくはＢＬＡＳＴプログラム動作に組み込まれる、ＤＵＳＴ又はＳＥＧプログラム等の低複雑性フィルタリング（low complexity filtering）プログラムによって修正するのが好ましい。ギャップ存在コスト（又はギャップスコア）を用いる場合、ギャップ存在コストは約−５〜−１５に設定するのが好ましい。同様のギャップパラメーターを必要に応じて他のプログラムと共に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びその基本原理は、例えばAltschul et al., "Basic local alignment search tool", 1990, J. Mol. Biol, v. 215, pages 403-410に更に記載されている。特定のパーセンテージの同一性は、１つ以上のアミノ酸の保存的変異に起因する配列の変化を包含し、依然として有効であって、したがってＣＤ５Ｌエピトープに結合することができる抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントをもたらす。タンパク質の変異はまた、１つ以上のアミノ酸の挿入又は欠失に起因する。
【００６３】
本発明の第１の態様のより特定の実施形態では、抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントは、以下：
配列番号７の配列であるＶＨ、又は、代替的には、
配列番号８の配列であるＶＬ、又は、代替的には、
配列番号７の配列であるＶＨ、及び配列番号８の配列であるＶＬ、
を含む。
【００６４】
本発明の第２の態様の別の実施形態では、抗体は、配列番号９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる重鎖と、配列番号１０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する配列からなる軽鎖とを含む。より詳しくは、抗体は、配列番号９と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列からなる重鎖を含む。更に詳しくは、重鎖は配列番号９の配列からなる。より詳しくは、軽鎖は、配列番号１０と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列からなる。更に詳しくは、軽鎖は配列番号１０の配列からなる。
【００６５】
本発明の第１の態様の特定の実施形態では、抗体は、配列番号９の配列からなる重鎖と、配列番号１０の配列からなる軽鎖とを含む。
【００６６】
配列番号１〜配列番号１０の配列を下記表１に要約する。
【００６７】
【表１】
2021501177.tif 000002
【００６８】
上で言及したように、更なる態様では、本発明はまた、第１の態様で定義される抗体を含むコンジュゲートを提供する。
【００６９】
第１の態様に関連する全ての実施形態は、本発明のコンジュゲートに適用することも意味する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、第１の態様の抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントを、共有結合又は非共有結合のいずれかを介して１つ以上の化合物と結合することによって形成された化合物を指す。
【００７１】
この更なる態様の特定の実施形態では、任意に上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、コンジュゲートは診断剤又は治療剤を更に含む。
【００７２】
より特定の実施形態では、任意に上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、診断剤は標識である。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「標識」という単語は、「標識された」抗体を生成するように抗体に直接的又は間接的に複合化される検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能であり得る（例えば、放射性同位元素標識又は蛍光標識）か、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒し得る。
【００７４】
標識は、直接付着されてもよく、リンカー（アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）等）を介して付着されてもよい。標識は、化学的な複合化によって付着されてもよい。標識を抗体に複合化する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、カルボジイミド複合化は、標識を抗体に複合化するために使用され得る。標識を抗体に複合化させる他の方法を使用することもできる。例えば、グルタルアルデヒド架橋と同様に、過ヨウ素酸ナトリウム酸化とそれに続く適切な反応物の還元的アルキル化を使用することができる。
【００７５】
更なる態様の特定の実施形態では、コンジュゲートの治療剤は細胞傷害性物質である。より特定の実施形態では、細胞傷害性物質は、毒素、薬物部分、及び核溶解酵素からなる群から選択される。代替の実施形態では、細胞傷害性物質は、化学療法剤、抗生物質、及び放射性同位元素からなる群から選択される。特定の実施形態では、コンジュゲートは、化学療法剤又は毒素を更に含む。
【００７６】
かかるコンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は、技術水準で説明されている。使用できる酵素活性毒素及びそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウライツ・フォルディイ（Aleurites fordii）タンパク質、ファイトラカ・アメリカーナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰｎ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス阻害剤、ゲロニン、ミトジェリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン、及びトリコテセンが挙げられる。放射性コンジュゲート抗体の製造には、様々な放射性核種を利用することができる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが挙げられる。
【００７７】
抗体及び細胞傷害性物質のコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタレルアルデヒド等）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリレン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）等の様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、リンカーを介して１つ以上の薬物部分に複合化された抗体を含み得る。
【００７８】
本発明の更なる態様の別の実施形態では、コンジュゲートは、細胞透過剤を更に含む。より特定の実施形態では、細胞透過剤は細胞透過ペプチドである。より特定の実施形態では、細胞透過剤は、生体適合性であり、抗体を分解から保護することが知られているナノ粒子送達システムである。一実施形態では、ナノ粒子送達システムは脂質ナノ粒子である。別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、リポソーム及び固体脂質ナノ粒子からなる群から選択される。別の実施形態では、脂質ナノ粒子はリポソームである。
【００７９】
細胞透過剤は、Ｔ細胞又はマクロファージ表面上の分子を認識して該分子に結合する能力を有する分子を複合化させることによって更に機能化され得る。
【００８０】
本発明の第３の態様では、本発明の第１の態様で定義される抗体若しくはフラグメント、又は、代替的には更なる態様で定義されるコンジュゲートは、癌の治療、診断又は予後診断のために用いられるものである。
【００８１】
第４の態様では、本発明は、治療有効量のＣＤ５Ｌ結合剤を１つ以上の薬学的に許容可能な担体又は添加剤と共に含む医薬組成物を提供する。
【００８２】
「ＣＤ５Ｌ結合剤」という用語は、ＣＤ５Ｌを結合し遮断する能力を有するタンパク質又は非タンパク質のいずれかの種類の任意の種類の分子を含む。すなわち、分子は、ＣＤ５Ｌを結合してその機能を阻害することができる。ＣＤ５Ｌ結合剤は、任意の抗ＣＤ５Ｌ抗体又はそのフラグメント（市販又は本発明の第１の態様の１つの目的のいずれか）、ペプチド又は小分子であり得る。薬剤がＣＤ５Ｌを結合し遮断する能力は、マクロファージのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分極化に基づいて、上に提供される試験に従って決定され得る。本発明の第４の態様の一実施形態では、ＣＤ５Ｌ結合剤は抗ＣＤ５Ｌ抗体又はそのフラグメントである。本発明の第４の態様の別の実施形態では、ＣＤ５Ｌ結合剤は、モノクローナル抗体又はそのフラグメントである。本発明の第４の態様の別の実施形態では、ＣＤ５Ｌ結合剤は、本発明の第１の態様で定義されるモノクローナル抗体又はそのフラグメントである。
【００８３】
本明細書で使用される「治療有効量」という表現は、投与された場合に、対処される疾患の１つ以上の症状の発症を予防する又は或る程度軽減するのに十分であるＣＤ５Ｌ結合剤の量を指す。本発明に従って投与される薬剤の特定の用量は、当然のことながら、投与されるＣＤ５Ｌ結合剤、投与経路、治療されている特定の病状、及び同様の検討事項を含む、症例を取り巻く特定の状況によって決定される。
【００８４】
「医薬組成物」という表現は、ヒトを意図した組成物と非ヒト動物を意図した組成物（すなわち獣医用組成物）との両方を包含する。
【００８５】
「薬学的に許容可能な担体又は添加剤」という表現は、薬学的に許容可能な材料、組成物又はビヒクルを指す。各構成成分は、医薬組成物の他の成分に適合するという意味で薬学的に許容可能でなくてはならない。各構成成分はまた、過大な毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原性又は他の問題若しくは合併症なしにヒト及び非ヒト動物の組織又は器官と接触させた使用に好適であり、適切なベネフィット／リスク比に見合う必要がある。
【００８６】
好適な薬学的に許容可能な添加剤の例は溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散助剤若しくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤若しくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等である。任意の従来の添加剤媒体が、例えば任意の望ましくない生物学的作用を生じるか、又は医薬組成物の任意の他の構成成分（複数の場合もある）と他の形で有害に相互作用することによって物質又はその誘導体と適合しない場合を除き、その使用は本発明の範囲内であることが企図される。
【００８７】
本発明の医薬組成物中のＣＤ５Ｌ結合剤、薬学的に許容可能な添加剤及び／又は任意の付加的な成分の相対量は、治療される被験体の個性、大きさ及び／又は状態に応じ、更には組成物を投与する経路に応じて異なる。
【００８８】
医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容可能な添加剤としては、不活性希釈剤、分散剤及び／又は造粒剤、界面活性剤及び／又は乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、滑剤、及び／又は油が挙げられるが、これらに限定されない。処方者の判断により、着色剤、コーティング剤、甘味料、及び香味料等の添加剤が組成物中に存在してもよい。
【００８９】
本発明のＣＤ５Ｌ結合剤を含む医薬組成物を、任意の剤形、例えば、固体又は液体で提示することができ、任意の適切な経路、例えば、経口、非経口、直腸、局所、鼻腔内又は舌下の経路により投与することができ、それらの経路に対して、所望の剤形、例えば局所製剤（軟膏、クリーム、リポゲル、ヒドロゲル等）、点眼剤、エアロゾルスプレー、注射液、浸透圧ポンプ等の製剤化に必要な薬学的に許容可能な添加剤を含む。
【００９０】
例示的な希釈剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉糖及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
例示的な造粒剤及び／又は分散剤としては、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類果肉（citrus pulp）、寒天、ベントナイト、セルロース及び木製品、天然海綿、陽イオン交換樹脂、炭酸カルシウム、シリケート、炭酸ナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン）（クロスポビドン）、ナトリウムカルボキシメチルデンプン（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（ｓｔａｒｃｈ  １５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ）、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、並びにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
例示的な結合添加剤としては、デンプン（例えば、コーンスターチ及びデンプン糊）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、モラセス、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然及び合成ゴム（例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワールゴム（panwar gum）、ガッチゴム、イサポール（isapol）外皮の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリビニルピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ）及びカラマツアラビノガラクタン；アルギネート；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；蝋；水；アルコール；並びにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
例示的な防腐剤としては、酸化防止剤、キレート剤、抗微生物性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤及び他の防腐剤を挙げることができる。例示的な酸化防止剤としては、αトコフェロール、アスコルビン酸、ステアリン酸アスコルビル、オレイン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸及びエデト酸三ナトリウムが挙げられる。
【００９４】
例示的な緩衝剤としては、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、リン酸水酸化カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去水、等張食塩水、リンガー液、エチルアルコール及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
例示的な滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
記載されるように、本発明はまた、第５の態様では、（ａ）本発明の第４の態様に定義されるＣＤ５Ｌ結合剤又は医薬組成物と、（ｂ）薬物と、（ｃ）任意に、その使用説明書とを備えるパーツキットを提供する。
【００９７】
本発明の第５の態様の特定の実施形態では、任意に上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせて、ＣＤ５Ｌ結合剤は、抗ＣＤ５Ｌ抗体若しくはそのＣＤ５Ｌ結合フラグメント、又は代替的には抗ＣＤ５Ｌ抗体若しくはそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントを含むコンジュゲートである。本発明の第５の態様の別の実施形態では、ＣＤ５Ｌ結合剤は、本発明の第１の態様で定義される抗ＣＤ５Ｌ抗体若しくはそのＣＤ５Ｌ結合フラグメント、又は代替的には本発明の更なる態様で定義されるコンジュゲートである。
【００９８】
本発明の第５の態様の別の実施形態では、任意に上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、薬物は抗癌薬である。
【００９９】
本発明の別の態様は、Ｍ２マクロファージ活性化の阻害のために用いられる、又は代替的には図６に示されるようにＴリンパ球活性化の促進のために用いられる、ＣＤ５Ｌ結合剤、又は本発明の第１の態様で定義される抗体若しくはそのフラグメント、又は第４の態様で定義される医薬組成物、又は第２若しくは第５の態様で定義されるキットを提供する。
【０１００】
「Ｍ２マクロファージ活性化」という用語は、マクロファージに抗炎症性、再生促進性及び寛容性の表現型を誘導する分子又は分子群に曝露された場合にマクロファージが受ける表現型の変化を指す。本明細書ではＭ２活性化マクロファージは、一般に、マクロファージをＩＬ１０又は癌細胞馴化培地（ＣＭ）のいずれかで処理することにより得られる。「Ｍ２マクロファージ活性化」及び「Ｍ２マクロファージ分極化」という用語は同じ意味であり、区別されない。本発明において、「Ｍ２マクロファージ」という用語は、「Ｍ２型マクロファージ」又は「Ｍ２型活性化マクロファージ」と区別なく使用される。
【０１０１】
Ｍ２マクロファージの活性化の阻害を決定するために、幾つかの試験、例えば、以下の実施例に記載されるマクロファージのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分極化試験による試験を行うことができる。簡潔に言えば、試験される薬剤を、（代わりに任意の他のものを使用することもできるが）ＩＬ１０等のＭ２誘導性サイトカインと共に、ＰＢ単球、ＴＨＰ１細胞、Ｕ９３７細胞又はＫ５６２細胞等のマクロファージ様細胞の培養物に添加し、次いで１つ以上のマクロファージ活性化マーカーであるＶＥＧＦ、ＣＤ１６３、及びＭｅｒｔｋのｍＲＮＡ発現レベルを測定する。当業者は、発現レベルを決定するために適切なプライマーを設計することができる。かかるプライマーの例示的で非限定的な例は、配列番号１７〜配列番号２０及び配列番号２５〜配列番号２６の配列である。
【０１０２】
上で詳述したように、本発明の第７の態様は、癌の治療及び／又は予防のために用いられる、ＣＤ５Ｌ結合剤、又は第１の態様で定義される抗体若しくはそのフラグメント、又は更なる態様で定義されるコンジュゲート、又は第４の態様で定義される医薬組成物、又は第２若しくは第５の態様で定義されるキットを提供する。特定の実施形態では、癌の治療及び／又は予防は、Ｍ２マクロファージ活性化の阻害によるか、又は代替的にはＴリンパ球活性化の促進による。
【０１０３】
上で検討したように、Ｍ２活性化の阻害及びＴリンパ球活性化の促進は、癌の治療に直接適用される。従来技術では、Ｍ２マクロファージの活性化が、腫瘍に対する免疫寛容に結びつくことが報告されている（上記の非特許文献１）。ＣＤ５Ｌ結合剤がマクロファージの免疫抑制状態（すなわちＭ２の活性化）を阻害できるという事実は、腫瘍細胞を排除するために、ＣＤ５Ｌ結合剤を使用して免疫系を再プログラムできることを意味する。そして、その結果、これは癌の治療に有益な効果を有し得る。
【０１０４】
「癌」という用語は、概して、任意の腫瘍性疾患を指す。本発明のＣＤ５Ｌ結合剤又は医薬組成物で治療され得る癌の例示的で非限定的な例としては、限定されないが、乳頭腫、腺腫、脂肪腫、骨腫、筋腫、血管腫、母斑、成熟奇形腫、癌腫、肉腫、未熟奇形腫、黒色腫、骨髄腫、白血病、ホジキンリンパ腫、基底細胞腫、脊髄腫、乳癌、卵巣癌、子宮癌、肺癌、気管支癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、食道癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、頭頸部癌等が挙げられる。
【０１０５】
上で詳述したように、本発明の別の態様は、癌の治療及び／又は予防における抗癌剤との併用療法のために用いられる、ＣＤ５Ｌ結合剤、又は第１の態様で定義される抗体若しくはそのフラグメント、又は更なる態様で定義されるコンジュゲート、又は第４の態様で定義される医薬組成物、又は第２若しくは第５の態様で定義されるキットを提供する。特に、ＣＤ５Ｌ結合剤、又は抗体若しくはそのフラグメント、又は医薬組成物は、抗癌剤又はその誘導体と同時に、連続して、又は別々に投与される。より詳しくは、それらは、治療上有効な間隔で、任意の順序で別々に投与される。
【０１０６】
第９の態様では、本発明は、マクロファージにおけるＣＤ５Ｌの決定に基づく診断又は予後診断方法を提供する。
【０１０７】
本明細書で使用される「診断」は、被験体における特定の医学的状態、症候群、合併症若しくはリスクを認識するようになること、疾患若しくは病状の性質の決定、又は或る疾患若しくは病状を別の疾患若しくは病状から区別することと理解されなければならない。診断は、起こり得る疾患又は障害を決定又は識別しようとするプロセスと、このプロセスによって到達される見解の両方を指す。診断は、診断手順の意味で、個人の病状を、行われる治療及び予後診断に関する医学的判断を可能にする個別の異なるカテゴリーに分類する試みと見なすことができる。その後、診断的見解は、しばしば疾患又は他の病状に関して説明される。しかしながら、診断は様々な形式を取り得る。診断は、存在を検出し、疾患、病変、機能障害又は障害に名前を付けることである場合がある。診断は、管理又は予後診断に関してカテゴリーを属性化することである場合がある。診断は、連続体である異常の程度又は分類である異常性の種類のいずれかを示す場合がある。
【０１０８】
本明細書で使用される「予後診断」は、疾患の起こり得る進行及び転帰の予測を指す。予後診断には、新生物の等級付け（退形成の増加が新生物の攻撃性と相関することから、再現可能な用語で新生物における細胞分化のレベルを表現する試み）、新生物の病期分類（再現可能な用語で患者における新生物の程度を表現する試み）が含まれる。
【０１０９】
本明細書で使用される「マクロファージ内のＣＤ５Ｌ」という表現は、それが細胞の内部にあるのか表面にあるのかに関わらず、マクロファージにあるＣＤ５Ｌタンパク質を指す。
【０１１０】
本発明の第９の態様の一実施形態では、マクロファージ内のＣＤ５Ｌの量が基準値よりも高い場合、予後不良の指標となる。
【０１１１】
本発明では、特に明記しない限り、「基準値」という用語は、本件の場合のマクロファージ内のＣＤ５Ｌの所定の値として理解され、サンプル又はサンプル群における上記分子マーカーのレベルから導き出される。サンプルは、疾患の存在、不在、病期、又は経過が以前に適切に実施されている被験体又は被験体群から採取される。この値は、とりわけ、疾患の予後を判断するためのしきい値として使用される。この基準値は、被験体が医療レジメンを開始する必要があるかどうか、及び該レジメンがどれほど有効であるかを判断するためにも役立つ。「基準値」が導き出される被験体（複数の場合もある）は、病状が存在しない被験体（複数の場合もある）、病状が存在する被験体（複数の場合もある）、又はその両方を含み得る。当業者は、一般的な知識を利用して、本発明の方法のそれぞれについての基準値を得るためにより適切な被験体又は被験体群を選択することができる。
【０１１２】
選択された被験体群から基準値を取得する方法は、技術水準でよく知られている（Burtis C. A. et al., 2008, Chapter 14, section "Statistical Treatment of Reference Values"）。特定の場合、「基準値」は、従来のＲＯＣ分析（受信者動作特性分析：Receiver Operating Characteristic analysis）を用いて定義されるカットオフ値である。当業者が理解するように、最適なカットオフ値は、予後診断方法の特定の適用、目的、対象集団、特異度と感度とのバランス等に従って定義される。
【０１１３】
本発明の第９の態様の別の実施形態では、マクロファージ内のＣＤ５Ｌの量は、イムノアッセイ手法によって決定される。本発明の第９の態様の別の実施形態では、イムノアッセイ手法は、免疫組織蛍光法、免疫組織化学、又はフローサイトメトリーである。
【０１１４】
本発明の第９の態様の別の実施形態では、予後不良は死亡のリスクである。
【０１１５】
本発明の第９の態様の別の実施形態では、死亡のリスクは、腫瘍マクロファージ上のＣＤ５Ｌの量に比例して増加する。
【０１１６】
本発明の第９又は第１０の態様の実施形態では、マクロファージはＴＡＭである。
【０１１７】
上で言及されるように、第１０の態様では、本発明は、単離マクロファージ含有生体サンプルにおける、癌の診断若しくは予後マーカーとして、又は癌をモニタリングするためのマーカーとしてのＣＤ５Ｌの使用を提供する。
【０１１８】
「単離マクロファージ含有生体サンプル」という用語は、マクロファージ及び他のものを含むサンプル、並びにそれらの更なる分析のためにマクロファージが単離されたサンプルを包含する。
【０１１９】
第１１の態様では、本発明は、マクロファージ内のＣＤ５Ｌの量の決定に基づく診断又は予後診断の方法のための手段を提供する。一実施形態では、マクロファージはＴＡＭである。
【０１２０】
「手段」という用語は、タンパク質量の決定に有用な任意の反応物又は機器を指す。例えば、手段は、とりわけ抗体又はＥＬＩＳＡキットであり得る。
【０１２１】
本発明の第１１の態様の一実施形態では、手段は、ＣＤ５Ｌに特異的に結合する抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントである。一実施形態では、マクロファージはＴＡＭである。本発明の第１１の態様の別の実施形態では、抗体は、本発明の第１の態様で定義される通りである。本発明の第１１の態様の別の実施形態では、抗体はキットの一部を形成する。
【０１２２】
第１２の態様では、本発明は、医療レジメンの有効性を決定するためのコンパニオン診断方法を提供する。
【０１２３】
本明細書で使用される「コンパニオン診断方法」は、特定の処置による治療に対して感受性の被験体を識別するため、又は治療をモニターするため、及び／又は被験体若しくは被験体の下位群若しくは他の被験体群に対する有効量を特定するために使用されるアッセイである。コンパニオン診断は、患者の疾患、障害、又は病状の重症度レベルを階層化するのに役立ち、コストを削減し、臨床試験の期間を短縮し、安全性を高め、及び／又は有効性を高めるための治療レジメン及び用量の調整を可能にし得る。コンパニオン診断は、疾患、障害又は病状の発生を予測し、予防療法の処方を支援するために使用され得る。幾つかのコンパニオン診断を１つ以上の臨床試験に対する被験体を選択するために使用することができる。場合によっては、コンパニオン診断アッセイが特定の治療と連携して、治療の最適化を促進することがある。特定の実施形態では、コンパニオン診断方法の処置は抗癌治療である。より特定の実施形態では、コンパニオン診断方法の処置は、本発明の抗体、コンジュゲート、又は医薬組成物を用いて行われる。
【０１２４】
本発明では「医療レジメン」という表現は、とりわけ、いずれかの薬物治療（化学療法及び放射線療法等）と並んで、医師がとった他の臨床判断（疾患に侵された組織の一部を切除するための手術等）を包含すると理解される。
【０１２５】
本発明の第１２の態様の一実施形態では、上記方法は、工程（ａ）で得られた量を基準値と比較する工程（ｂ）を更に含み、工程（ａ）で検出されたマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量が基準値よりも高い場合、被験体が医療レジメンから利益を得るであろうことを示す。
【０１２６】
本発明の第１２及び第１３の態様の一態様では、上記手段は、ＣＤ５Ｌに特異的に結合する抗体又はそのＣＤ５Ｌ結合フラグメントである。一実施形態では、マクロファージはＴＡＭである。本発明の第１２及び第１３の態様の別の実施形態では、抗体は、本発明の第１の態様で定義される通りである。本発明の第１２及び第１３の態様の一実施形態では、抗体はキットの一部を形成する。
【０１２７】
本発明の第９、第１１、第１２、又は第１３の態様の一実施形態では、任意に上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、生体サンプルは組織及び末梢血からなる群から選択される。別の実施形態では、生体サンプルは腫瘍組織サンプルである。
【０１２８】
「生体サンプル」という用語は、被験体から直接得られたサンプルと、細胞培養物の形態のサンプルとの両方を包含する。
【０１２９】
第１４の態様では、本発明は、被験体に由来する単離サンプル中のＭ２マクロファージの存在を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供し、該方法は、サンプルに由来するマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量を決定する工程を含む。
【０１３０】
本発明の第１４の態様の一実施形態では、ＣＤ５Ｌはマクロファージの表面に局在化する。
【０１３１】
本発明の第１４の態様の一実施形態では、ＣＤ５Ｌの量を決定する工程は、イムノアッセイ手法によって行われる。本発明の第１４の態様の別の実施形態では、イムノアッセイ手法は、免疫蛍光、免疫化学、又はフローサイトメトリーである。本発明の第１４の態様の別の実施形態では、イムノアッセイ手法は、抗ＣＤ５Ｌ抗体を使用して実施される。本発明の第１４の態様の別の実施形態では、抗ＣＤ５Ｌ抗体は、本発明の第１の態様で定義される通りである。本発明の第１４の態様の別の実施形態では、抗ＣＤ５Ｌ抗体はキットの一部を形成する。
【０１３２】
本発明の第１４の態様の一実施形態では、方法は、ＣＤ５Ｌの量を決定する前の工程を含み、マクロファージ画分は、生体サンプルから単離される。
【０１３３】
マクロファージは、免疫学の分野における通例の手法に従って、生体サンプルから識別及び／又は単離することができる。当業者は、最適な結果のために手法のパラメータを調整することができる。説明の目的で、表面タンパク質ＣＤ１４に対する抗体を使用して、フローサイトメトリー手法により生体サンプルのマクロファージ集団を識別及び分離することが可能である。或いは、表面タンパク質ＣＤ６８に対する抗体を使用して、免疫化学又は免疫蛍光の手法により生体サンプルのマクロファージを識別することができる。
【０１３４】
本発明の第１４の態様の一実施形態では、マクロファージ内のＣＤ５Ｌの量が基準値よりも高い場合、Ｍ２の存在の指標となる。本発明の第１４の態様のこの実施形態で言及される「基準値」という用語は、不活性化マクロファージにおける（すなわち、Ｍ０期における）ＣＤ５Ｌの所定の値として理解される。
【０１３５】
第１５の態様では、本発明は、Ｍ２マクロファージのマーカーとしてのＣＤ５Ｌの使用を提供する。
【０１３６】
本発明はまた、癌を有する患者の治療方法のために用いられる抗癌化合物を提供し、該方法は、（ｉ）患者に由来する試験サンプルからのマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量を決定することと、（ｉｉ）試験サンプルのマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量が基準値よりも高い場合、有効量の抗癌薬を患者に投与することとを含む。特定の実施形態では、抗癌薬は既知の抗癌薬である。より特定の実施形態では、抗癌薬は、本発明の抗体、コンジュゲート又は医薬組成物である。
【０１３７】
本明細書で使用される「抗癌化合物」は、癌の発生又は進行を停止又は阻害する任意の化合物を指す。さらに、上記化合物は、細胞増殖の阻害若しくは停止、又は増殖している細胞の生存に作用し得るが、他の細胞活動にも影響を与える可能性がある。
【０１３８】
本発明はまた、被験体において癌を治療する方法を提供し、該方法は、（ｉ）患者由来の試験サンプルからのマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量を決定することと、（ｉｉ）試験サンプルからのマクロファージ内のＣＤ５Ｌの量が基準値よりも高い場合、有効量の抗癌薬を薬学的な添加剤又は担体と共に患者に投与することとを含む。特定の実施形態では、抗癌薬は既知の抗癌薬である。より特定の実施形態では、抗癌薬は、本発明の抗体、コンジュゲート又は医薬組成物である。
【０１３９】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含む（comprise）」という単語及びこの単語の変化形は他の技術的特徴、添加物、構成成分又は工程を除外することを意図したものではない。さらに、「含む」という単語は、「からなる（consisting of）」という場合も包含する。本発明の付加的な目的、利点及び特徴が本明細書を検討することで当業者に明らかとなるか、又は本発明の実施によって理解され得る。以下の実施例及び図面は実例として提示され、本発明を限定することを意図したものではない。図面に関連し、特許請求の範囲の括弧内にある参照符号は、単に特許請求の範囲を理解しやすくしようとするものであり、特許請求の範囲を限定するものと解釈してはならない。さらに、本発明は本明細書に記載される特定の好ましい実施形態の考え得る全ての組合せを包含する。
【実施例】
【０１４０】
実施例１
材料及び方法
組み換えヒトＣＤ５Ｌ（ｒｈＣＤ５Ｌ）の生産
ヒトＣＤ５ＬのｃＤＮＡは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５８８５（バージョンＮＰ＿００５８８５．１）に従って遺伝子合成（米国ニュージャージー州ピスカタウェイのGenScript）によって取得され、免疫グロブリンｇ鎖シグナルペプチドがｈＣＤ５Ｌのペプチドに置き換わった修飾を有する。ｃＤＮＡをｐ．ｅｖｉベクターにクローニングし、ｅｖｉＦｅｃｔシステム（スイス国のEvitria AG）を使用してＣＨＯ  Ｋ１細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞を、化学的に定義された血清不含の動物性成分を含まない培地であるｅｖｉＭａｋｅ（商標）で成長させた。細胞培養上清をトランスフェクション後８日目に採取し、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４で透析し、ＭｏｎｏＱクロマトグラフィーに供した。組み換えｈＣＤ５Ｌ（ｒｈＣＤ５Ｌ）を塩化ナトリウム勾配で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製をモニターした。精製されたタンパク質をＰＢＳに透析し、Ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ（Millipore、ＵＦＣ９０１０２４）での遠心分離により濃縮し、可能性のあるエンドトキシン汚染をＥｎｄｏｔｒａｐカラム（Hyglos GmbH、３２１０６３）により、製造業者のプロトコルに従って除去した。精製したｒｈＣＤ５Ｌを予備実験で試験したところ、マクロファージ（ＭФ）ＴＮＦα分泌に関するその活性と並んで、シクロヘキシミド処理によって誘導されるアポトーシスの阻害は、商業的に入手可能なｒｈＣＤ５Ｌ（R&D Systems）のものに匹敵した（データは示していない）。
【０１４１】
動物
動物の維持管理は欧州連合に従い、動物実験及び治療プロトコルに関する国のガイドラインは、ＣＮＢ／ＣＳＩＣ動物研究倫理委員会によって承認された。研究は、共同研究に関するＣＮＢ／ＣＢＭＳＯ／ＣＳＩＣ倫理委員会、及びバルセロナサイエンスパーク（Parc Cientific de Barcelona）及びバルセロナ大学の倫理委員会によって承認された。
【０１４２】
本発明のモノクローナル抗ＣＤ５Ｌ抗体（４Ｄ７）の生成
ヒトＣＤ５Ｌに対するマウスｍＡｂを、２５μｇのＫＬＨ結合ｒＣＤ５Ｌを用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下免疫によって産生させた。SIGMA（マレイミド活性化ＢＳＡ、ＫＬＨコンジュゲーションキット、米国ミズーリ州）において推奨されている標準手順に従って、マレイミド活性化ＫＬＨを使用して、ＫＬＨへの結合を行って免疫原性を高めた。０．１５ｍＬの滅菌ＰＢＳに結合させた２５μｇのＫＬＨを、同量のフロイント完全アジュバント（Difco）で乳化した。２８日目及び５６日目にフロイントの不完全アジュバントに含まれる同量のタンパク質でマウスを皮下追加免疫した。
【０１４３】
免疫したマウスに由来する血清を最後の追加免疫から１０日後に収集し、ｒＣＤ５Ｌに対する特異的抗体の存在を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で特定した。簡潔に言うと、５００ｎｇのｒＣＤ５ＬをＥＬＩＳＡプレート（デンマーク国のNunc）のウェルにおいて４℃で一晩固定化した。５％ＢＳＡ（SIGMA）を含むＰＢＳでプレートを２２℃で１時間ブロックした。次いで、血清をブロッキングバッファーで１：１、１：５、１：１０に希釈して加え、２２℃で１時間インキュベートした。各工程の間に、プレートをＰＢＳ  ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。結合した抗体を検出するために、ペルオキシダーゼ（ＰＯ）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（SIGMA）の１：１０００希釈液を最後の工程で添加し、２２℃で３０分間インキュベートした。非結合抗体をＰＢＳ  ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。３，３０，５，５０−テトラメチルベンジジン液体基質（Sigma）を加えることにより発色させ、光学密度を４０５ｎｍで読み取った。
【０１４４】
ポリエチレングリコール４０００（Merck）を使用して脾臓リンパ球とＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３マウス形質細胞腫（ＣＲＬ１５８０、American Type Culture Collection）とを融合させる３日前に、滅菌ＰＢＳ中の３０μｇのＫＬＨ複合化タンパク質を用いて、選択したマウスを静脈内追加免疫した。細胞融合を標準的な手順を使用して行った（Galfre G. et al., "Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines". Nature. 1977; 266:550-552.及びHarlow E. and Lane D.E., "Antibodies:A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor, New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.を参照されたい）。融合の２週間後、陰性対照としてウシ血清アルブミンを使用して、ＣＤ５Ｌ特異的抗体の存在について培養上清を上記に示されるＥＬＩＳＡでスクリーニングした。
【０１４５】
陽性ハイブリドーマを標準的な手順に従って限界希釈することによりクローン化した（上記Galfre G. et al.及びHarlow E. et al.を参照されたい）。ｍＡｂを組織培養上清中で合成し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（GE Healthcare）を使用するアフィニティークロマトグラフィーで精製した。製造業者の指示に従い、Ｒａｐｉｄ  ＥＬＩＳＡマウスｍＡｂアイソタイピングキット（Thermo Fisher-Pierce）を使用して、マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＭ）の重鎖に対する特定のペルオキシダーゼ複合化抗体を使用するＥＬＩＳＡによって、免疫グロブリンサブクラスを決定した。
【０１４６】
本出願で使用されるｍＡｂはサブクラスＩｇＧ２ａのものであると結論付けられた。
【０１４７】
４Ｄ７抗ＣＤ５Ｌ抗体の配列決定及び配列分析
抗ＣＤ５Ｌモノクローナル抗体を、ＲＮｅａｓｙミニキット（ドイツ国、Qiagen）を使用し、４Ｄ７産生ハイブリドーマ細胞株から抽出されたｍＲＮＡから製造業者の指示に従って配列決定した。次いで、製造業者の指示に従い、ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡエコドライキット（日本国、タカラバイオ株式会社）を用いてｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。該ｃＤＮＡを使用して、表２に収載されているプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行った。増幅されたｃＤＮＡをアガロースゲルで分解し、ゲルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を使用して精製し、ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１サイクルシーケンシングキット（米国ミシシッピ州のThermofisher）及びＩＧＴＰ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓプラットフォームサービスを使用して、ＳＡＮＧＥＲシーケンシングにより同じプライマーで配列決定した。ＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定に使用したプライマーを表２に示す。
【０１４８】
【表２】
2021501177.tif 000003
【０１４９】
配列の分析、並びに種々の領域及びドメインの識別は、ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ、NCBI；米国）、及びＩＭＧＴ（商標）、フランス国CNRSのｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（商標）（http://www.imgt.org）の使用により行われた。
【０１５０】
したがって、４Ｄ７抗体は、配列番号９の配列である重鎖及び配列番号１０の配列である軽鎖を含むことがわかった。
【０１５１】
初代細胞及び細胞株
Blood and Tissue Bank（スペイン国バルセロナ）によって提供されるバフィーコートは、献血及び加工に関する機関の標準業務手続に従って、健康な献血者から入手した。
【０１５２】
単球の分離のため、ＣＤ３＋細胞をＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ３枯渇カクテル（カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバーのStemCell Technologies、１５６２１）で枯渇させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を以前に記載される通り（Sanjurjo L, et al., The human CD5L/AIM-CD36 axis:A novel autophagy inducer in macrophages that modulates inflammatory responses. Autophagy. Taylor and Francis Inc.; 2015;11(3):487-502）、４００ｇで２５分間のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（米国ニュージャージー州ピスカタウェイのGE Healthcare、１７−１４４０）密度勾配遠心分離によって単離した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、製造業者の指示に従って、ＭａｇｎｉＳｏｒｔヒトＴ細胞濃縮抗体カクテル及びＭａｇｎｉＳｏｒｔ陰性選択ビーズ（Thermo Fisher ScientificによるInvitrogen）を使用して陰性選択によりＰＢＭＣから分離した。回収された細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｐｅｒｆｅｃｔ−Ｃｏｕｎｔミクロスフェア（スペイン国サラマンカのCytognos、ＣＹＴ−ＰＣＭ）を使用して、製造業者の指示に従って計数した。細胞をＰｅｒｆｅｃｔ−Ｃｏｕｎｔミクロスフェアを使用して計数した。１ウェル当たり２×１０６個又は２×１０５個のＰＢＭＣを、それぞれ６ウェルプレート（デンマーク国、Nunc）又はＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＥＺスライド（米国マサチューセッツ州ビレリカのMerck Millipore、ＰＥＺＧＳ０８１６）に播種し、末梢血単球（ＰＢ単球）を５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて３０分間の付着により単離した。非付着細胞を除去し、付着細胞をＰＢＳで２回洗浄し、実験前２４時間に亘りＲＰＭＩ  １０％ＦＢＳ（スイス国バーゼルのLonza、ＤＥ１４−８４０Ｅ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（米国ミズーリ州セントルイスのSigma-Aldrich、Ｐ０７８１）中でインキュベートした。通例得られる付着細胞ＣＤ１４＋（ＰＢ単球）のパーセンテージは９４．９８％（＋／−３．２６％）であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージは常に９０％を超えていた。細胞生存率は通例で９４％超であった。
【０１５３】
ルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞株３ＬＬＲは、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び１０％ＦＢＳで補完したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、ニューヨーク州のInvitrogen）で培養した。
【０１５４】
肝癌細胞馴化培地
ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞及びＳＮＵ３９８細胞をＡＴＣＣ（The American Type Culture Collection）から購入し、２ｍＭグルタミン（スイス国バーゼルのLonza）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及びストレプトマイシン（Sigma-Aldrich）、並びに１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Lonza）で補完したＥＭＥＭ（ＨｅｐＧ２）、ＤＭＥＭ（Ｈｕｈ７）、又はＲＰＭＩ（ＳＮＵ３９８）で培養した。
【０１５５】
細胞を９０％コンフルエンシーまで増殖させ、次いでＰＢＳで洗浄し、２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩで培地を置き換えた。２４時間後、上清を収集し、１００００ｒｐｍで４℃にて１０分間遠心分離して、細胞残屑を除去した。
【０１５６】
マクロファージのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分極化
培養培地にＩＮＦ（インターフェロン）／ＬＰＳ（リポ多糖）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＩＬ１０（インターロイキン１０）、ＤＸＭ（デキサメタゾン）又は肝癌細胞ＣＭ（馴化培地）を次の通り添加することでＰＢ単球を分極化させた：
ＩＮＦ／ＬＰＳ：５０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγ（米国ニュージャージー州ロッキーヒルのPreprotech、３００−０２−Ａ）に加えて１００ｎｇ／ｍＬのＥ．コリＯ１１１：Ｂ４に由来するＬＰＳ（Sigma-Aldrich、ｌ４３９１）；
ＩＬ４、４０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Preprotech；２００−０４−Ａ）；
ＩＬ１０、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０（Preprotech；２００−１０−Ａ）；
ＤＸＭ、４０ｎｇ／ｍｌのデキサメタゾン（スペイン国テラサのKern pharma、６７２０６６．０）；
ＣＭ、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、又はＳＮＵ−３９８細胞から収集した馴化培地のプール（上記を参照されたい）。
【０１５７】
分極化サイトカインなしで培養されたＰＢ単球の対照集団をＭ又は培地と称する。
【０１５８】
ＰＢ単球に対する組換えヒトＣＤ５Ｌ（ｒｈＣＤ５Ｌ、上記のように生成）の影響を評価するため、これらの細胞を、対照タンパク質（スペイン国バルセロナのGrifols、６７０６１２．１）として使用されるヒト血漿から精製した１μｇ／ｍｌのアルブミン、又は１μｇ／ｍｌのエンドトキシンフリーｒｈＣＤ５Ｌを用いて上記の通り培養培地中で２４時間インキュベートした。
【０１５９】
ＩＬ−１０誘導分極化に対する４Ｄ７抗体の役割を評価するため、培養物へのＩＬ−１０の添加の４５分前に、この抗体又はＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体（米国ミネソタ州ミネアポリスのR&D systems）を最終濃度５μｇ／ｍｌで添加した（リアルタイムＰＣＲの場合については以下に説明する）。
【０１６０】
ＬＰＳによるマクロファージ刺激
５０．０００不活性化又はＩＬ１０活性化されたＰＢマクロファージを１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．コリＯ１１１：Ｂ４、米国カリフォルニア州サンディエゴのInvivogen）で４時間刺激した。次いで、上清中のサイトカインを、製造業者の指示に従って、ＯｐｔＥＩＡ  ＥＬＩＳＡ（BD Biosciences）を用いるＥＬＩＳＡによって測定した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン液体基質（Sigma-Aldrich、Ｔ８６６５）を添加することによって発色させ、光学密度をＶａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈマイクロプレートリーダー（Thermo Fisher Scientific Inc.）により４５０ｎｍで読み取った。
【０１６１】
マクロファージ分極化マーカーのフローサイトメトリー分析
分極化マクロファージをＡｃｃｕｔａｓｅ（Sigma-Aldrich）で剥離させ、ＰＢＳで２回洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清、２％ＦＢＳ、及び０．０２％ＮａＮ３（ブロッキングバッファー）を含むＰＢＳ  ５０μｌと共に氷上で３０分間インキュベートした。
【０１６２】
次いで、細胞を、蛍光複合化抗ヒトＣＤ１６３モノクローナル抗体（BD Biosciences製５６３８８９）と組み合わせて、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色バッファー（BD Biosciences、５６３７９４）中で２０分間インキュベートした。次いで、それらを洗浄バッファー（２％ＦＢＳ及び０．０２％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）で濯ぎ、１％パラホルムアルデヒドで固定した。
【０１６３】
フローサイトメトリー分析をＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ装置でＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（BD Biosciences）を使用して製造業者の指示に従って行い、各サンプルについて１００００の事象を取得した。
【０１６４】
ＲＮＡ抽出及び定量ＲＴ−ＰＣＲ
ＰＢ単球（１×１０６細胞／ウェル）を、５％ＦＣＳ及び上記の分極化刺激又はＬＸＲアゴニストＴ１３１７（英国ブリストルのTocris Bioscience）に加えてＣＤ５Ｌ  ｍＲＮＡ誘導の陽性対照として使用される９−ｃｉｓ−レチノイン酸（９ｃＲａ）（Sigma-Aldrich）（Ｔ１３＋９ＣＲ）、１μＭを含むＲＰＭＩ培地中で２４時間インキュベートした。
【０１６５】
次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ドイツ国ヒルデンのQiagen、７９３０６）で破壊し、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen、２１７００４）を使用して全ＲＮＡを抽出した。
【０１６６】
全ＲＮＡ（１μｇ）をＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  ＥｃｏＤｒｙ（商標）プレミックス（米国カリフォルニア州マウンテンビューのClontech、６３９５４９）を使用して逆転写した。次いで、各ＲＴ−ＰＣＲ反応物を、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（米国マサチューセッツ州ウォーバンのKAPA Biosystems、５１２３０−１００）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）４８０  ＰＣＲシステムで増幅した。サンプルを９５℃で５分間初期変性のためインキュベートし、次いで、以下の条件：９５℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で１０秒間を使用して４０のＰＣＲサイクルを実施した。この研究で使用した全てのプライマー対を表３に収載する。
【０１６７】
【表３】
2021501177.tif 000004
【０１６８】
遺伝子発現値をＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）の発現レベルに対して正規化した。倍率誘導レベルを未処理の細胞（−）における各遺伝子の発現レベルを基準として使用して計算した。
【０１６９】
フローサイトメトリーによるＣＤ５Ｌ細胞表面発現分析
上記の培養培地中の２×１０５個のＰＢ単球、又は図面に示す刺激で７２時間分極化したものをアキュターゼ（Sigma-Aldrich、Ａ６９６４）で剥離させ、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのブロッキングバッファー、１０％ＦＣＳ（Lonza）及び１０％ヒトＡＢ血清（Sigma-Aldrich、Ｈ４５２２）を含むＰＢＳと共に氷上で３０分間インキュベートした。
【０１７０】
次いで、細胞をｍＡｂ抗ＣＤ５Ｌ（Ｃ１８、Abnova、Ｈ０００００９２２−Ｍ０１、すなわち４Ｄ７）と共に、４℃にて６０分間ブロッキングバッファー中でインキュベートした。細胞を、２％ＦＣＳ及び０．０２％ＮａＮ３（洗浄バッファー）を含む３ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート複合化抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（BD）又はヤギ抗ウサギＩｇＧのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Molecular Probes、Thermo Fisher Scientific、Ａ−２１２４６）と共に、４℃にて４５分間ブロッキングバッファー中でインキュベートした。３ｍｌの洗浄バッファーで細胞を洗浄した後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ装置（BD）でＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（BD）を使用し、製造業者の指示に従ってフローサイトメトリー分析を行った。
【０１７１】
ＨＣＣ組織マイクロアレイの免疫蛍光（ＩＦ）分析
ヒトに関する研究はいずれも、ヘルシンキ宣言の原則及び個人データの機密性に関する現在の法律に従って行われ、Germans Trias i Pujol大学病院のヒト倫理委員会によって承認された。ＨＣＣ患者からのレトロスペクティブサンプルを様々なスペインの病院：Josep Trueta、HuGTiP、Mar、Universitario Central de Asturias、及びParc Tauli Consortiumから得た。徹底的な病理検査の後、腫瘍又は隣接する組織の最も代表的な領域を、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を構築するために選択した。
【０１７２】
簡潔に言えば、これらの領域から直径０．６ｍｍの組織円柱を、０．７ｍｍ〜０．８ｍｍに及ぶ領域でパラフィンブロックに含めた。次に、５μｍの切片をシラン化ガラススライド（スペイン国バルセロナのDako）に、組織の不均質性に応じて２つ又は３つずつマウントした。
【０１７３】
さらに、扁桃体、結腸、及び胎児の肝臓を内部対照としてＴＭＡに含めた。
【０１７４】
ＶＥＮＴＡＮＡベンチマークＩＨＣプラットフォーム（米国アリゾナ州ツーソンのVentana Medical Systems）を使用してＴＭＡ切片に対して免疫蛍光（ＩＦ）を行った。
【０１７５】
１：１００の使用希釈でｈＣＤ５Ｌに対する抗体（４Ｄ７）、及びＣＤ６８に対する抗体（Sigma）を使用した。一次抗体に応じて、Ａｌｅｘａ−４８８又はＡｌｅｘａ−６４７（Invitrogen）と結合した抗マウス又はウサギＩｇＧを二次抗体として使用した。
【０１７６】
最後に、８００ｎＭ  ＤＡＰＩ（Sigma-Aldrich）を含むＰＢＳで室温にて１０分間、核を染色した。
【０１７７】
二次抗体単独をバックグラウンド免疫蛍光分析に使用した。
【０１７８】
共焦点顕微鏡画像をＦｌｕｏＶｉｅｗ（商標）ＦＶ１０００スペクトル共焦点顕微鏡で撮影し、ＦｌｕｏＶｉｅｗ（商標）ＦＶ１０−ＡＳＷ  ３．１ソフトウェア（日本国東京都新宿区のオリンパス株式会社）で分析した。
【０１７９】
免疫療法のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
野生型Ｃ５７ＢＬ／６の脇腹に３×１０６個の３ＬＬＲ細胞を皮下注射した。腫瘍を７日間成長させた後、ＰＢＳ中１５０μｇのＣＤ５Ｌ  ｍｏＡｂ  Ｄ７又は対照として同量のＰＢＳ（ｎ＝５マウス／群）を３日毎に７日間、腹腔内（ｉ．ｐ．）に与えた。腫瘍のサイズは、７日目から毎日カリパスを用いて手作業で測定し、腫瘍体積を（ｖ＝π×［ｗ＾２×ｌ］／６）（幅、ｗ、及び長さ、ｌ）により計算した。１５日目にマウスを屠殺し、更なる分析のため腫瘍及び脾臓を収集した。
【０１８０】
Ｔ細胞増殖アッセイ
ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット（Invitrogen）で製造業者の指示に従って染色した。細胞を一晩静置した後、１μｇ／ｍｌのｒｈＣＤ５Ｌの存在下／不在下で３７℃、５％ＣＯ２にて５日間Ｔ細胞活性化／拡張キット（Miltenyi Biotech）を使用して、１：１０の比率（ビーズ／Ｔ細胞）でＣＤ２／３／２８被覆ビーズにより刺激した。５日後にＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（BD Biosciences）でＴ細胞の増殖を測定し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ９．８．２の増殖モジュールを使用してＦＳＣ／ＳＳＣによってゲートされた生細胞のうちＦＳＣｈｉｇｈＶｉｏｌｅｔｌｏｗ細胞のパーセンテージとして表した。
【０１８１】
統計分析
統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖ．５ソフトウェア（米国カリフォルニア州ラホール）を使用して行った。特定の統計的検定は、各図の凡例に示されている。生存分析のために、カプラン−マイヤー法及びログランク検定を実施して、曲線間の違いを比較した。＊ｐ≦０．０５の値を有意であると見なした。
【０１８２】
結果
Ｍ２活性化マクロファージはＣＤ５Ｌを発現する
本発明者らは、マクロファージのｉｎ  ｖｉｒｏでのＭ２分極化がＣＤ５Ｌ発現に何らかの変化を誘導するかどうかを試験した。
【０１８３】
末梢血（ＰＢ）単球を、インターフェロン（ＩＦＮ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＩＦＮ／ＬＰＳ、インターロイキン４（ＩＬ４）、及びインターロイキン１０（ＩＬ１０）、デキサメタゾン（Ｄｅｘａ）、又は肝癌細胞順化培地対照（ＣＭ  ｃｔ）、Ｈｕｈ７細胞に由来する馴化培地（ＣＭ  Ｈｕｈ７）、ＨｅｐＧ２細胞に由来する馴化培地（ＣＭ  ＨｅｐＧ２）若しくはＳＮＵ細胞に由来する馴化培地（ＣＭ  ＳＮＵ）を用いて分極化した。陽性対照として、核内受容体リガンドＴ１３＋９ｃＲ又は組み換えＣＤ５Ｌを使用した。陰性対照として、通常の培地（Ｍ）又はヒトアルブミン（ｈＳＡ）を使用した。次いで、ＣＤ５Ｌ  ｍＲＮＡ（図１Ａ）及びタンパク質レベル（図１Ｂ）をリアルタイムＰＣＲ、ＩＦ、及びフローサイトメトリーで調べた。
【０１８４】
結果は、非常に低レベルのＣＤ５Ｌ  ｍＲＮＡ（図１Ａ）及びＣＤ５Ｌタンパク質（図１Ｂ）が非刺激（Ｍ）、ＩＦＮ、ＬＰＳ又はＩＬ４で処理したマクロファージで検出されたことを示した。
【０１８５】
しかしながら、ＩＦＮ／ＬＰＳ、及びより大きな程度までＩＬ１０は、ＣＤ５Ｌ  ｍＲＮＡの強力な誘導因子であった（図１Ａ）。ＣＤ５Ｌタンパク質レベルに関しては、ＩＬ１０は有意な増加をもたらすことができた（図１Ｂ）。
【０１８６】
さらに、肝癌馴化培地（ＣＭ）はＣＤ５Ｌ  ｍＲＮＡレベルを高め、Ｈｕｈ７細胞からのＣＭが最も強力な誘導因子であった。
【０１８７】
興味深いことに、ＣＤ５Ｌは分泌タンパク質であると説明されているが、本発明者らは２つの異なるモノクローナル抗体（４Ｄ７及び１Ｃ８、Novus biologicals）を用いたフローサイトメトリーによってマクロファージの表面でその存在を検出した（図１Ｂ）。
【０１８８】
細胞表面ＣＤ５Ｌレベルは、Ｍ２マクロファージ（すなわち、ＩＬ１０及び肝癌細胞ＣＭで分極化されたもの）で陽性であった。これらのアッセイでは、ＣＤ１６３がＭ２マクロファージのゴールドスタンダードマーカーであることを考慮して、このマーカーの発現を陽性対照として使用した。驚くべきことに、細胞表面ＣＤ５Ｌの検出は、未処理とＩＬ１０又は肝癌のＣＭ分極化マクロファージとの区別において、陽性細胞（図１Ｂ、上のパネル）及びその蛍光強度（図１Ｂ、下のパネル）の両方のパーセンテージで、ＣＤ１６３の検出を改善した。
【０１８９】
したがって、これらの結果は、ＣＤ５ＬをＭ２分極化マクロファージの細胞表面マーカーとして使用できることを示し、これは現在使用されているマーカーであるＣＤ１６３よりも更に特異的である。
【０１９０】
ＣＤ５ＬはＭ２マクロファージ分極化を誘導する
ＣＤ５Ｌの高発現がＭ２マクロファージで観察されたことを考慮して、本発明者らは次に、ＣＤ５Ｌ自体がこの細胞表現型を誘導することができたかどうかを試験した。図２で観察されるように、初代細胞培養物（すなわちＰＢ単球）に組換えヒトＣＤ５Ｌ（ｒｈＣＤ５Ｌ）を添加すると、未処理（Ｍ）又はアルブミン（ｈＳＡ）で処理した細胞と比較して、これらの細胞でＣＤ１６３の発現の増加を促進した。したがって、ＣＤ５ＬはＭ２様分子及び機能的表現型の獲得における活発な分子プレーヤーである。
【０１９１】
さらに、ｒｈＣＤ５ＬがＬＰＳ刺激マクロファージのＴＮＦアルファ及びＩＬ６分泌を阻害できることがわかった（図２Ｂ）。
【０１９２】
抗ＣＤ５Ｌ抗体はＭ２マクロファージの活性化を阻害する
ＣＤ５ＬがＭ２分極化を誘導し、ＩＬ−１０と同様に肝癌ＣＭの分極化マクロファージで過剰発現することを考慮して、本発明者らは次に、抗体によるＣＤ５Ｌの阻害がＩＬ１０（Ｍ２）分極化に影響するかどうかを試験した。
【０１９３】
これらの実験では、ＰＢ単球を、抗ＣＤ５Ｌモノクローナル抗体（４Ｄ７）又は対照アイソタイプ抗体の存在下で、ＩＬ１０を含む又は含まない培地中で培養した。
【０１９４】
次いで、マクロファージ分極化マーカーＣＤ８０、ＴＮＦ、ＴＧＭ２、ＣＤ１６３、ＭｅｒｔＫ、ＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルを測定した（図３Ａ）。
【０１９５】
結果は、抗ＣＤ５Ｌ抗体とのインキュベーションがＭ１マーカーＣＤ８０又はＴＧＭ２のｍＲＮＡレベルに影響を与えないことを示した。
【０１９６】
しかしながら、興味深いことに、抗ＣＤ５Ｌ抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、ＩＬ１０が媒介するＭ２マーカーＣＤ１６３、Ｍｅｒｔｋ、及びＶＥＧＦの増強を強力に阻害することができた（図３Ａ）。この阻害は、ＣＤ１６３の場合は４０％、Ｍｅｒｔｋの場合は４８％、及びＶＥＧＦは５３％であった。
【０１９７】
このデータから、４Ｄ７等の抗ＣＤ５Ｌモノクローナル抗体、及びＣＤ５Ｌに結合する能力を持つ任意の他の薬剤をＭ２マクロファージ活性化の強力な阻害剤として使用可能であると結論付けることができる。
【０１９８】
抗ＣＤ５Ｌ抗体はマクロファージの炎症促進活性を回復する
抗ＣＤ５Ｌ抗体がＭ２活性化を阻害することができたことを考慮して、本発明者らは次に、上記抗体がＭ２活性化マクロファージの炎症反応を回復できるかどうかを試験した。
【０１９９】
その目的で、ＩＬ１０活性化マクロファージの炎症反応を、既知の炎症性活性化因子であるリポ多糖（ＬＰＳ）に対する腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）応答を測定することによって分析した。これらの実験では、ＩＬ１０分極化はＬＰＳに対してはるかに低いＴＮＦ応答を誘導した（図３Ｂ）。驚いたことに、抗ＣＤ５Ｌ抗体（４Ｄ７）を添加すると、ＬＰＳの分泌が正常レベルに回復し、ＣＤ５Ｌの遮断がＭ２（抗炎症）マクロファージの活性及び表現型を阻害するために使用可能であるという概念が確認された。
【０２００】
ＣＤ５Ｌは腫瘍マクロファージで発現され、そのレベルの増加は肝細胞癌（ＨＣＣ）の予後不良に関連している
ＨＣＣにおけるＣＤ５Ｌの肝臓マクロファージ発現を評価するために、ｎ＝６０のＨＣＣ腫瘍（Ｔ）／４４の隣接する肝臓（ＮＴ）を含むＴＭＡでＩＦ染色を行った。
【０２０１】
これらの研究では、マクロファージをＣＤ６８に対する抗体（ウサギ抗ヒトＣＤ６８、SIGMA）及びＣＤ５Ｌに対する抗体（４Ｄ７）で検出した。興味深いことに、腫瘍組織にＣＤ５Ｌ＋マクロファージが５０％未満の患者は、ＣＤ５Ｌ＋マクロファージのランクが５０％を超える患者よりも全生存率（ＯＳ）が良好であった（図４）。これらの結果は、腫瘍マクロファージにおけるＣＤ５Ｌの発現増加がより悪い予後に関連していることを示唆している。
【０２０２】
ＣＤ５Ｌを標的とする免疫療法は腫瘍の成長を停止する
本発明者らは次に、ＣＤ５Ｌを免疫療法の標的として使用できるかどうかを評価した。ｎ＝５マウスの野生型マウスの脇腹にルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を皮下注射し、３日毎に腹腔内（ｉ．ｐ．）にＣＤ５Ｌ特異的ｍｏＡｂ  Ｄ７を与え、続いて腫瘍の成長をモニタリングした。対照動物には同量のＰＢＳを与えた。本発明者らは、抗ＣＤ５Ｌ  ｍｏＡｂ  Ｄ７で処理したＬＬＣ担腫瘍マウスは、ＰＢＳ注射マウスと比較して、腫瘍体積として測定された腫瘍がより小さいことを見出した（図５を参照されたい）。
【０２０３】
ｒｈＣ５ＬはＴ細胞の増殖を阻害する
ｒｈＣＤ５ＬがＴ細胞生物学に影響を与えるかどうかを評価するため、本発明者らは、ｒｈＣＤ５Ｌの添加がポリクローナル刺激に応答してＴ細胞の増殖を変更し得るかどうかを判断した。このため、Ｔ細胞をｒｈＣＤ５Ｌの存在下又は不在下でＣＤ２／３／２８ビーズを用いて刺激した。図６で観察されるように、ｒｈＣＤ５Ｌの存在は生存率（Ｂ）に影響を与えることなく、Ｔ細胞の増殖（Ａ）を低下させた。
【０２０４】
引用一覧
WO9839443
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【図１】
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【図２】
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【図３】
2021501177.tif 000007
【図４】
2021501177.tif 000008
【図５】
2021501177.tif 000009
【図６】
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【配列表】
2021501177000001.app
【国際調査報告】
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2021501177.tif 000012
2021501177.tif 000013