(57)【要約】本明細書は、精子細胞に増強された生存能力および活性を与える培地組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性塩培地を含む培地調合物であって、前記塩基性塩培地が、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム、六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、リン酸ナトリウム一塩基性脱水物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、フルクトース、ソルビトール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、クエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む、前記培地調合物。
【請求項２】
抗酸化剤、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、クマリン化合物、ピラノクマリン化合物、ＮＳＡＩＤ、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を更に含む、請求項１に記載の培地調合物。
【請求項３】
バッファーを更に含む、請求項１または２に記載の培地調合物。
【請求項４】
前記バッファーがＴＲＩＳまたはＨＥＰＥＳである、請求項３に記載の培地調合物。
【請求項５】
前記ＮＳＡＩＤがアセチルサリチル酸である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の培地調合物。
【請求項６】
前記ピラノクマリン化合物がデクルシンである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の培地調合物。
【請求項７】
フッ化ナトリウム濃度が約０ｍＭ〜約６ｍＭである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の培地調合物。
【請求項８】
哺乳動物生殖細胞の活性を増強させる、胚細胞由来の接合子／胚盤胞の形成を増強させる、精子細胞の生存能力、移動性、および／もしくは受精能力を増強させる、精子を受精適格状態に維持する、または凍結融解プロセスによる細胞の減損もしくはＤＮＡの損傷を軽減する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の培地調合物。
【請求項９】
受精適格性が、前記培地調合物に曝露された精子細胞の、人工授精、ならびに体外および生体内の両方における受精、卵割または胚盤胞変換を介して妊娠を生起させる能力である、請求項８に記載の培地調合物。
【請求項１０】
細胞生存能力を少なくとも２４時間延長する、請求項８または９に記載の培地調合物。
【請求項１１】
前記哺乳動物生殖細胞が、配偶子、一倍体細胞、胚細胞、性細胞、精子細胞、および卵細胞からなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の培地調合物。
【請求項１２】
前記哺乳動物生殖細胞が、雄哺乳動物由来の射精液に由来し得る、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の培地調合物。
【請求項１３】
哺乳動物生殖細胞と、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の培地調合物とを含む、哺乳動物生殖細胞組成物。
【請求項１４】
雄哺乳動物由来の射精液と、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の培地調合物とを含む、射精液組成物。
【請求項１５】
凍結保存されている、請求項１４に記載の射精液組成物。
【請求項１６】
哺乳動物生殖細胞試料を準備するステップと、前記哺乳動物生殖細胞試料を処理するステップと、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の培地調合物を添加するステップとを含む、哺乳動物生殖細胞を処理する方法。
【請求項１７】
前記処理が、精液試料の採取、雌雄鑑別、選別、分離、凍結、人工授精、体外受精、冷却、輸送、および関連プロセスからなる群から選択される少なくとも１つのステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記雌雄鑑別が、液滴選別、機械的選別、マイクロ流体処理、マイクロチップ処理、ジェットおよび空気処理、フローサイトメトリー処理、ならびにレーザーアブレーションによって達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物生殖細胞が、雄牛または雄豚に由来する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記処理された哺乳動物生殖細胞が、容器、チューブ、またはストローに捕集される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物生殖細胞が、配偶子、一倍体細胞、胚細胞、性細胞、精子細胞、および卵細胞からなる群から選択される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法により生成される、精子細胞組成物。
【請求項２３】
雌哺乳動物から得られた卵を準備し、前記雌哺乳動物と同じ種の雄哺乳動物由来の請求項２２に記載の精子細胞組成物を準備し、そして１つ以上の卵を前記精子組成物と混合するステップを含む、１つ以上の卵を受精させる方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物が雄牛または雄豚である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の精子細胞組成物を生殖補助医療技術に使用することを含む、胚を生成する方法。
【請求項２６】
前記生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）、人工授精（ＡＩ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、複数回の排卵および胚移植（ＭＯＥＴ）、ならびに他の胚移植技術からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）または人工授精（ＡＩ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
精子細胞試料を準備するステップと、前記精子細胞試料を少なくとも１つの亜集団に雌雄鑑別するステップと、前記精子細胞試料に対し、抗酸化剤、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ピラノクマリン化合物、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、ＮＳＡＩＤ、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加物を添加するステップとを含む、精子細胞集団を雌雄鑑別する方法。
【請求項２９】
前記ＮＳＡＩＤがアセチルサリチル酸である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ピラノクマリン化合物がデクルシンである、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記精子細胞集団が、精液成分および／または未処理射精液を更に含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記雌雄鑑別された亜集団が、Ｘ染色体保有またはＹ染色体保有精子細胞の少なくとも１つの性が富化された集団を含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法により生成される、精子細胞組成物。
【請求項３４】
雌哺乳動物から得られた卵を準備するステップと、前記雌哺乳動物と同じ種の雄哺乳動物由来の請求項３３に記載の精子細胞組成物を準備するステップと、１つ以上の卵を前記精子組成物と混合するステップとを含む、１つ以上の卵を受精させる方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の精子細胞組成物を生殖補助医療技術に使用することを含む、胚を生成する方法。
【請求項３６】
前記生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）、人工授精（ＡＩ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、複数回の排卵および胚移植（ＭＯＥＴ）、ならびに他の胚移植技術からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）または人工授精（ＡＩ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記塩基性塩培地が、精巣上体尾部血漿（ＣＥＰ２）培地と同様に調合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記塩基性塩培地が、抗酸化剤、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、クマリン化合物、ピラノクマリン化合物、ＮＳＡＩＤ、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を補充したものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＮＳＡＩＤがアセチルサリチル酸である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
哺乳動物生殖細胞が、前記培地中で少なくとも２４時間にわたって存続延長される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記哺乳動物生殖細胞が、配偶子、一倍体細胞、胚細胞、性細胞、精子細胞、および卵細胞からなる群から選択される、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
哺乳動物生殖細胞と、請求項３９または４０に記載の培地調合物とを含む、哺乳動物生殖細胞組成物。
【請求項４４】
雄哺乳動物由来の射精液と、請求項３９または４０に記載の培地調合物とを含む、射精液組成物。
【請求項４５】
哺乳動物生殖細胞試料を準備するステップと、前記哺乳動物生殖細胞試料を処理するステップと、請求項３９または４０に記載の培地調合物を添加するステップとを含む、哺乳動物生殖細胞を処理する方法。
【請求項４６】
前記処理が、精液試料の採取、雌雄鑑別、選別、分離、凍結、人工授精、体外受精、冷却、輸送、および関連プロセスからなる群から選択される少なくとも１つのステップを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記雌雄鑑別が、液滴選別、機械的選別、マイクロ流体処理、マイクロチップ処理、ジェットおよび空気処理、フローサイトメトリー処理、ならびにレーザーアブレーションによって達成される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記哺乳動物生殖細胞が、雄牛または雄豚に由来する、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記処理された哺乳動物生殖細胞が、容器、チューブ、またはストローに捕集される、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記哺乳動物生殖細胞が、配偶子、一倍体細胞、胚細胞、性細胞、精子細胞、および卵細胞からなる群から選択される、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法により生成される、精子細胞組成物。
【請求項５２】
雌哺乳動物から得られた卵を準備し、前記雌哺乳動物と同じ種の雄哺乳動物由来の請求項５１に記載の精子細胞組成物を準備し、そして１つ以上の卵を前記精子組成物と混合するステップを含む、１つ以上の卵を受精させる方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物が雄牛または雄豚である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項５１に記載の精子細胞組成物を生殖補助医療技術に使用することを含む、胚を生成する方法。
【請求項５５】
前記生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）、人工授精（ＡＩ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、複数回の排卵および胚移植（ＭＯＥＴ）、ならびに他の胚移植技術からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）または人工授精（ＡＩ）である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
精子細胞試料を準備するステップと、前記精子細胞試料を少なくとも１つの亜集団に雌雄鑑別するステップと、請求項３９または４０に記載の培地調合物を添加するステップとを含む、精子細胞集団を雌雄鑑別する方法。
【請求項５８】
前記精子細胞集団が、精液成分および／または未処理射精液を更に含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記雌雄鑑別された亜集団が、Ｘ染色体保有またはＹ染色体保有精子細胞の少なくとも１つの性が富化された集団を含む、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法により生成される、精子細胞組成物。
【請求項６１】
雌哺乳動物から得られた卵を準備するステップと、前記雌哺乳動物と同じ種の雄哺乳動物由来の請求項６０に記載の精子細胞組成物を準備するステップと、１つ以上の卵を前記精子組成物と混合するステップとを含む、１つ以上の卵を受精させる方法。
【請求項６２】
請求項６０に記載の精子組成物を生殖補助医療技術に使用することを含む、胚を生成する方法。
【請求項６３】
前記生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）、人工授精（ＡＩ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、複数回の排卵および胚移植（ＭＯＥＴ）、ならびに他の胚移植技術からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）または人工授精（ＡＩ）である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
雌哺乳動物から得られた卵を準備するステップと、
前記雌哺乳動物と同じ種の雄哺乳動物由来の精子試料を準備するステップであって、前記精子試料が、精子細胞と、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、１つ以上のクマリン化合物またはピラノクマリン化合物、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、１つ以上のＮＳＡＩＤ、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加物とを含む、前記準備するステップと、
１つ以上の卵を前記精子試料と混合するステップと
を含む、生殖補助医療技術を使用して１つ以上の卵を受精させる方法。
【請求項６６】
前記ＮＳＡＩＤがアセチルサリチル酸である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ピラノクマリン化合物がデクルシンである、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）、人工授精（ＡＩ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、複数回の排卵および胚移植（ＭＯＥＴ）、ならびに他の胚移植技術からなる群から選択される、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）または人工授精（ＡＩ）である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
雄哺乳動物から射精液を得ることと、前記射精液を、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、１つ以上のクマリン化合物またはピラノクマリン化合物、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、１つ以上のＮＳＡＩＤ、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を含む培地調合物に配合することとを含む、精子試料を保管する方法。
【請求項７１】
前記ＮＳＡＩＤがアセチルサリチル酸である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ピラノクマリン化合物がデクルシンである、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項７３】
培地に補充するためのキットであって、抗酸化剤、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、クマリン化合物、ピラノクマリン化合物、ＮＳＡＩＤ、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を含む、前記キット。
【請求項７４】
前記ＮＳＡＩＤがアセチルサリチル酸である、請求項７０に記載のキット。
【請求項７５】
前記ピラノクマリン化合物がデクルシンである、請求項７３または７４に記載のキット。
【請求項７６】
培地を調製すること、哺乳動物生殖細胞を処理すること、１つ以上の卵を受精させること、または胚を生成することに関する指示書を更に含む、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７７】
多成分ストック溶液から調製される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の培地調合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／５７８，９５９号による優先権を主張するものであり、この文献の全容は本明細書において援用されている。
【０００２】
発明の分野
本開示は、畜産および育種の分野に関する。特に、本開示は、培地調合物の改良を含む。本改良は、射精液および精子細胞試料との併用、ならびに受精プロセスにおいて使用することを目的としたものである。そのような培地調合物は、精子細胞の生存能力を向上させ、運動性および受精能等の、精子細胞機能を強化し、且つ接合子形成（すなわち受精）を強化するものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
特に農業における畜産の重要な態様は、精子細胞（精子）の採取および使用である。精子細胞は、雄動物から未処理射精液形態にて採取されるのが、一般的である。引き続き精子細胞を使用しマニピュレートするためには、細胞の生存能力および機能を、数時間または数日間にわたって維持する必要がある。
【０００４】
生殖細胞を体外マニピュレートすることに伴う実質的な問題は、生殖細胞特性、例えば、脂質二重層の改変、細胞小器官の改変、細胞アポトーシス、または細胞壊死、および精子細胞の運動性の低下が、有意に減損する可能性のあることである。生殖細胞の特性が減損した場合、生殖細胞における受精能低下または生存能力低下、あるいはその両方が発生する可能性がある。生殖細胞の生存能力または受精能の低下は、人工授精ストロー（または他の容器もしくはベッセル）に含まれる精子細胞の調製、冷却、凍結、冷却もしくは冷凍保存、解凍もしくは解凍保存、動物の人工授精、調製、マニピュレーション、冷却、凍結、冷却もしくは冷凍保存、卵母細胞の解凍もしくは解凍保存、卵母細胞の体外受精、またはそれらに類するものとの関連において、有意な不利益となる。
【０００５】
この問題は、精子細胞（その大部分がＸ染色体またはＹ染色体で占有される精子細胞の集団）の性別選択集団を得ることを目的とする精子細胞のフロー分析またはフローソートが近年になって進歩したこととの関連において、更に悪化する可能性がある。フロー分析またはフロー選別された精子細胞は、核ＤＮＡの染色、フロー分析、フロー選別、目的の数の精子細胞の採取など、マニピュレーションの数が増えるため、結果としてフロー選別された採取済み精子細胞は、生体内での生殖細胞の特徴が有意に減損する可能性が高くなる。
【０００６】
雌雄鑑別プロセスでは、精子を細胞傷害に曝露させる（Alvarz and Storey, 1992）。これらのストレスによって、少なくとも２つのステップ：染色前および雌雄鑑別前のインキュベーション（約１９℃）、ならびに長期保存目的で凍結している最中に、生細胞集団が減少し、急速に減損することが予期される。精子において誘発された酸化的ＤＮＡ損傷は、受精率を低下させ、高レベルの損傷は、胚性転写産物の活性化後に発育停止を引き起こす（Aitken et al., 2009; Fatehi et al., 2006）。
【０００７】
生殖補助医療技術（ＡＲＴ）には、体外受精（ＩＶＦ）、人工授精（Ａｌ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）（および除核細胞を使用するその他の技術）、複数回の排卵および胚移植（ＭＯＥＴ）（ならびに他の胚移植技術）のような技術が挙げられ、これらは、ヒトおよび他の動物を含めた動物界全体にわたって使用されている。ＡＲＴ法は、自然環境外において配偶子および胚に生来的な脆弱性があることを前提としたものであり、コストが高くつき、且つ多大な時間を要するため、成功は可変的となるのが通例である。そのうえ、遺伝的に望ましい配偶子および接合子の利用可能性が限られているという理由から、商業的に実現可能な方法により動物育種産業の範囲内でＡＲＴを使用することは更に困難となっている。ＡＲＴのコストを削減し、その商業的な実現可能性を向上させるためには、配偶子および接合子の生存能力、ならびに全般的な品質を向上させることにより、関連するプロセスの効率を増強させるのが、１つの方法である。当該技術分野に対する関心が、過去１０年あまりの間にわたって高まってきているが、ＡＲＴにおいて使用することを目的とする配偶子および接合子の全般的な品質を向上させることに対し、強固なニーズが依然として存在する。育種の焦点の対象が、出産前の性別選択、例えば、それらの生存能力の改善（配偶子および接合子の場合）、それらの運動性および受精能（精子細胞の場合）に置かれている場合は、特にそうである。
【０００８】
例えば、ＩＶＦの場合、既存の技術を利用することで接合子が胚に発育する割合は比較的低い。このように減損率が高いのが原因で、胚およびエンドユーザーに対する関連サービスのコストが有意に増大し、高品質な胚の実効的利用可能性が減じられている。これらのコストおよび可用性の問題は、更に悪化する可能性がある。その原因とされるのが、凍結保存および非凍結輸送を通した後続の胚後処理である。胚の凍結保存は、体外での胚盤胞の成長および同様に、胚の生産の成功率によって制限される。現在、凍結保存に適したＩＶＦ胚の割合は僅少であることから、ＡＲＴ手技の所要コストは継続的に高まりつつある。
【０００９】
特にフラッシュされた卵母細胞および精子細胞のような配偶子（従来型および性別選別済みの両方）を処理する場合、それらがＡＲＴにおいて使用される前に、配偶子細胞に多大なストレスを与え、細胞の完全性および膜構造に悪影響を及ぼし、生存能力、運動性、および受精能を低下させてしまう。ＡＲＴにおいて使用する前に配偶子を処理する例は、性別に基づいて精子細胞を選別すること（「ジェンダー富化」または「性別選別」として公知）である。この手技は、家畜産業における選択的育種にて、間違った性に出産してしまう無駄を最小限に抑えることを目的としたものであり、極めて所望される。しかしながら、多くの場合、コストが非常に高くつくので、育種群が小規模な場合はリスクに曝される恐れがある。
【００１０】
大衆向けフローサイトメトリーに基づく性別選別プロセスは、細胞に深刻なストレスを及ぼし、細胞を損傷させてしまい、有用な精子の割合が低下する。このため、成熟した卵母細胞を受精させることは可能であるが、性別選別プロセスを経た後の、生存能力、運動性、および受精能を低下させてきた。性別選別は典型的に、多くの過酷なステップを伴う。例えば、限定されるものではないが、精子射精液を初期採取し処理するステップ（本射精液は、採取された際、自ら急速に劣化し始める）；精子細胞を染色するステップ（興奮性色素をＤＮＡに結合すること、または有害な膜を選択する手技を含む）；高エネルギー蛍光を利用して精子細胞を物理的選別するステップ（ＤＮＡに結合している色素が物理的に活性化されると、狭いオリフィスを通して配向が強制され、細胞に対し電荷が印加される）；細胞を容器内に物理的に採取するステップ（脆弱な細胞に対しては、接触時に衝撃が及ぶこともしばしばある）；精子液滴を採取培地中で希釈するステップ（浸透圧ストレスを伴う）；ならびに、選別された精子を保存するステップ（通常は凍結により行われ、細胞の膜系で大混乱を引き起こすことが周知である）が挙げられる。各ステップでは、処理された精子を異常なストレス下に置くことにより、精子の全般的な運動性、生存能力、および／または受精能を低下させる。その結果、ＩＶＦおよびＡＩ、ならびに他のタイプの後続処理または更なる処理などのＡＲＴにおいて使用される試料の効率低下につながる可能性がある。
【００１１】
選別されていない処理済み精子でさえ、凍結せずに採取、処理、および輸送を経ると、受精率、生存能力、運動性が有意に減損し、凍結保護剤と混合して凍結融解すると有意なストレスを経験することになる。当該技術分野における業者の多くは、選別されていない従来の精液に対する使用方法を改善し、精液試料の体外での取り扱い、保管、および使用に関連する取り扱いプロセスの減損を最小限に抑えようとして試行してきた。
【００１２】
精子が受精する可能性を失うのは、処理には関係なく、下記：高温；異常なバッファー；汚染；ｐＨ系の変化；配向性の物理的加圧（ノズルを強制的に通過したとき、またはフローサイトメーターで液滴を形成するために振動したときなど）；ＤＮＡ結合色素を照射する目的に使用される放射線；分離および採取技術に関連する物理的なストレス因子；凍結保護剤、凍結、解凍、およびハンドラーによるマイクロマニピュレーションに曝露された場合である。
【００１３】
他の市販の培地では、精子細胞と共に使用された場合に、必要とされる性能特性が提供されない。市販の培地では、精子の生存能力および活性を適切に維持できない可能性がある。加えて、市販の培地は、例えば、性別選別中またはＩＶＦもしくはＡＩ中に、精子の下流における使用を妨害する可能性もある。
【００１４】
細胞ストレス因子を最小限に抑えると、雌雄鑑別プロセス（または他のマニピュレーション）を生き残る精子の数が増えるので、雌雄鑑別済み精液を農業従事者が利用できるようになる。これらのストレスを最小限に抑えるためには、精液存続延長剤を未処理射精液に添加して、生存能力および運動性を維持するのが、１つの手法である。これにより、雌雄鑑別プロセスのストレスに対抗する細胞耐性が向上する。雌雄鑑別の対象となる生存能力のある運動性精子集団を保管する存続延長剤は、２〜３の方法で収量を増強させ、それにより、農業従事者が雌雄鑑別済み精液のコストを有意に削減できるようになる。現在、生細胞のかなりの部分（概算で５０％）が、凍結保存中に授精ストローにパッケージングされるが、上流のストレス因子を存続延長剤で最小限に抑えることにより、凍結に耐える細胞の数を増やすことが可能となる。
【００１５】
今日に至るまで、体外処理中、特に精子の性別選別に関連する過酷な処理最中に、脆弱な配偶子の日常的取り扱いに関与する組成物および方法を改善し、それにより、精子細胞および胚の生存能力、運動性、ならびに受精能を再現可能に改善することに対しかなりのニーズが依然として存在している。コストを削減すること、手技の信頼性を高めること、予算を切り詰めている業者、特に、性別選択育種を高リスク且つ高コストを伴う選択肢であると見なす小規模畜産業者にとって、信頼性が高く且つ商業的に実現性の高いものにすることを目的に、現行のＡＲＴの方法を改善することに対する継続的ニーズが依然として存在している。
【００１６】
存続延長剤調合物を理想的なものとするための要件は、運動性の高い精子集団を維持すること、ならびに雌雄鑑別サイトメトリー計器で２つの細胞集団の分離に必要な蛍光ＤＮＡ染色を使用してＸ集団およびＹ集団を分離する機能を妨げないようにすることである。
【発明の概要】
【００１７】
請求された本発明の或る特定の実施形態を、以下に要約する。これらの実施形態は、請求された本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、寧ろ、本発明の取り得る形態の概要説明としての機能を果たす。本発明は、これらの要約とは異なる多様な形態を包含し得る。
【００１８】
本開示の一態様は、塩基性塩培地を含む培地調合物に関する。別の態様において、塩基性塩培地は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム、六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、リン酸ナトリウム一塩基性脱水物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、フルクトース、ソルビトール、ウシ血清スルブミン（ＢＳＡ）、ＴＲＩＳ塩基、クエン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む。
【００１９】
別の態様において、培地調合物は、添加剤を含む。更に別の態様において、添加剤は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、デクルシン（Decursin）、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０クマリン化合物、ピラノクマリン化合物、ＮＳＡＩＤ、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。更に別の態様において、ＮＳＡＩＤはアセチルサリチル酸である。更に別の態様において、ピラノクマリン化合物はデクルシンである。更に別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地と添加剤とを含む。
【００２０】
本開示の別の態様において、培地調合物は、哺乳動物の生殖細胞の活性を増強させ、胚細胞由来の接合子／胚盤胞の形成を増強させ（すなわち、受精を増強させ）、精子細胞の生存能力、移動性、および／または受精能を増強させ、精子を受精適格状態に維持するか、あるいは凍結融解プロセスによる細胞の減損もしくはＤＮＡの損傷を軽減するものである。受精適格性は、本発明の培地調合物に曝露された精子細胞が、人工授精、ならびに体外および生体内の両方における受精、卵割、または胚盤胞変換を介して妊娠を生起させる能力であるとされる。
【００２１】
別の態様において、培地調合物は、細胞生存能力を少なくとも２４時間延長する。
【００２２】
なお更なる態様において、哺乳動物の生殖細胞は、配偶子、一倍体細胞、胚細胞、性細胞、精子細胞、および卵細胞からなる群から選択される。更に別の態様において、培地調合物は、精子細胞の生存能力または受精能を強化する方法により使用される。更に別の態様において、哺乳動物の生殖細胞は、雄哺乳動物の射精液から得ることができる。
【００２３】
本開示の一態様は、培地調合物と雄哺乳動物由来の射精液とを含む、組成物に関する。別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地を含む。別の態様において、培地調合物は、添加剤を含む。更に別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地と添加剤とを含む。更に別の態様において、本組成物は、凍結保存されている。
【００２４】
本開示の一態様は、哺乳動物の生殖細胞を処理する方法に関し、本方法は、哺乳動物生殖細胞試料を準備するステップと、哺乳動物生殖細胞試料を処理するステップと、本発明の培地調合物を添加するステップとを含む。別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地を含む。別の態様において、培地調合物は、添加剤を含む。更に別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地と添加剤とを含む。更に別の態様において、本処理は、精液試料の採取、雌雄鑑別、選別、分離、凍結、人工授精、体外受精、冷却、輸送、および関連プロセスからなる群から選択される少なくとも１つのステップを含む。なお更なる態様において、雌雄鑑別は、液滴選別、機械的選別、マイクロ流体処理、マイクロチップ処理、ジェットおよび空気処理、フローサイトメトリー処理、ならびにレーザーアブレーションによって達成される。更に別の態様において、雄哺乳動物は、雄牛または雄豚である。なお更なる態様において、処理された哺乳動物の生殖細胞は、容器、チューブ、またはストローに捕集される。更なる態様において、哺乳動物生殖細胞は、配偶子、一倍体細胞、胚細胞、性細胞、精子細胞、および卵細胞からなる群から選択される。更に別の態様において、精子細胞組成物は、本処理方法によって生成される。
【００２５】
本開示の一態様は、精子試料を処理する方法に関する。いくつかの態様において、本方法は、雄哺乳動物から射精液を得ることと、前述の射精液を培地調合物に配合することとを含む。別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地を含む。別の態様において、培地調合物は、添加剤を含む。更に別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地と添加剤とを含む。
【００２６】
本開示の一態様は、１つ以上の卵を受精させる方法に関し、本方法は、雌哺乳動物から得られた卵を準備し、雌哺乳動物と同じ種の雄哺乳動物由来の精子細胞組成物を準備し、そして１つ以上の卵を精子組成物と混合するステップを含む。いくつかの態様において、精子細胞組成物は、本開示の処理方法により生成される。更に別の態様において、精子細胞組成物は、培地調合物と混合される。別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地を含む。別の態様において、培地調合物は、添加剤を含む。更に別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地と添加剤とを含む。更に別の態様において、雄哺乳動物は、雄牛または雄豚である。
【００２７】
本開示の一態様は、胚を作製する方法に関し、本方法は、生殖補助医療技術に対応し、雄哺乳動物由来の精子細胞組成物を使用することを含む。いくつかの態様において、精子細胞組成物は、本開示の処理方法により生成される。更に別の態様において、精子細胞組成物は、培地調合物と混合される。別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地を含む。別の態様において、培地調合物は、添加剤を含む。更に別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地と添加剤とを含む。更に別の態様において、雄哺乳動物は、雄牛または雄豚である。いくつかの態様において、生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）、人工授精（ＡＩ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、複数回の排卵および胚移植（ＭＯＥＴ）、ならびに他の胚移植技術からなる群から選択される。
【００２８】
更なる態様において、本方法は、精子試料を雌雄鑑別することを更に含む。本開示の一態様は、精子細胞集団を雌雄鑑別する方法に関し、本方法は、精子細胞試料を準備するステップと、精子細胞試料を少なくとも１つの亜集団に雌雄鑑別するステップと、本精子細胞試料に対し少なくとも１つの添加物を添加するステップと、を含む。本添加剤は、抗酸化剤、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、アセチルサリチル酸、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである。更なる態様において、精子細胞集団は、精液成分、および／または未処理射精液を更に含む。更に別の態様において、雌雄鑑別済み亜集団は、Ｘ染色体保有またはＹ染色体保有精子細胞の少なくとも１つの性が富化された集団を含む。更なる態様において、本方法は、雌雄鑑別済み精子試料を培地調合物に配合することを含む。別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地を含む。別の態様において、培地調合物は、添加剤を含む。更に別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地と添加剤とを含む。更に別の態様において、精子細胞組成物は、本方法により生成される。
【００２９】
更なる態様において、精子細胞集団の亜集団を採取することは、選択された亜集団、および選択されていない亜集団の両方を一括して、通常は容器、チューブまたはストローに捕集することを含む。これは、精子細胞の亜集団が焼灼される前、および焼灼された以後に、精子細胞の集団の流れが物理的には細分化されず、両方の亜集団が一体的に流出して捕集されることとして、更に定義しても差し支えない。
【００３０】
本開示の一態様は、１つ以上の卵を受精させる方法に関し、本方法は、雌哺乳動物から得られた卵を準備するステップと、この雌哺乳動物と同じ種の雄哺乳動物由来の請求項に記載の雌雄鑑別済み精子細胞組成物を準備するステップと、１つ以上の卵をこの精子組成物と混合するステップと、を含む。
【００３１】
更に別の態様は、胚を作製する方法である。本方法は、生殖補助医療技術に対応し、雄哺乳動物由来の雌雄鑑別済み精子細胞組成物を使用することを含む。いくつかの態様において、雌雄鑑別済み精子細胞組成物は、本開示の処理方法により生成される。更に別の態様において、精子細胞組成物は、培地調合物と混合される。別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地を含む。別の態様において、培地調合物は、添加剤を含む。更に別の態様において、培地調合物は、塩基性塩培地と添加剤とを含む。更に別の態様において、雄哺乳動物は、雄牛または雄豚である。いくつかの態様において、生殖補助医療技術が、体外受精（ＩＶＦ）、人工授精（ＡＩ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、複数回の排卵および胚移植（ＭＯＥＴ）、ならびに他の胚移植技術からなる群から選択される。
【００３２】
本開示の一態様は、受精の方法に関し、本方法は、雌哺乳動物から得られた卵を準備することと、前述の雌哺乳動物と同じ種の雄哺乳動物から得られた精子試料を準備することであって、前述の精子試料が、精子細胞と、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、１つ以上のクマリン化合物またはピラノクマリン化合物、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、１つ以上のＮＳＡＩＤ、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤と、を含むものである、前記試料を準備することと、前述の卵を前述の精子試料と共に受精させることと、を含む。更なる態様において、受精は、体外受精を含む。別の態様において、受精は、人工授精（ＡＩ）を含む。別の態様において、精子細胞組成物は、精液成分および／または未処理射精液を更に含む。なお更なる態様において、精子試料は、性別選択が可能であり、Ｘ染色体を有する精子細胞またはＹ染色体を有する精子細胞の割合を増強させることを含む。本開示の一態様は、哺乳動物生殖細胞の生存能力を高めるための培地調合物に関し、本培地調合物において、前述の培地はホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む。更なる態様において、培地調合物は、フッ化ナトリウムを更に含む。更に別の態様において、培地調合物は、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、アセチルサリチル酸、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、またはそれらの組み合わせを更に含む。
【００３３】
本開示の一態様は、雄哺乳動物から射精液を得ることと、前述の射精液をホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む培地調合物に配合することとを含む、精子試料を保管する方法に関する。別の態様において、培地調合物は、フッ化ナトリウムを更に含む。更に別の態様において、培地調合物は、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、アセチルサリチル酸、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、またはそれらの組み合わせを更に含む。別の態様において、塩基性塩培地は、CEP2（精巣上体尾部血漿）培地（Verberckmoes, 2004）と同様に調合されている。別の態様において、本塩基性塩培地には、本明細書において精子の生存能力および受精能増強培地（ＳＶＦＥＭ）と呼称される追加的な調合物が補充されている。ＳＶＦＥＭ中で２４時間を超えて存続延長された細胞では、運動性の集団が、採取直後にアセスメントされた対の存続延長無しの射精液試料の１０パーセンテージポイント以内に収まっているのが、認められた。ＳＶＦＥＭ中で存続延長された細胞は、雌雄鑑別済み凍結保存精液産物を生成した。本産物は、出荷時品質管理基準を満たしたものであった。ＳＶＦＥＭで存続延長された分割射精液において、ストロー解凍後の運動性細胞の数（授精用量）が、同日に雌雄鑑別され且つ凍結前と同じ細胞濃度でパッケージされた存続延長無し対照と比較して、増加しており、この増加から、凍結保存に対する耐性が向上したことが示唆される。
【００３４】
先に詳述されたＳＶＦＥＭ存続延長剤に対する精子の反応の予備分析から確証されたように、精子は２４時間インキュベートされた後でも、生存していて且つ運動性を有していた。
【００３５】
いくつかの態様において、培地調合物の成分は、濃縮溶液に群化されて保存される。これらのストック溶液は、液体として保存、冷凍、または凍結乾燥することが可能である。いくつかの態様において、培地調合物はストック溶液から調製される。更なる態様において、培地調合物は、限定されるものではないが、二成分ストック溶液および三成分ストック溶液をはじめとする多成分ストック溶液から調製される。
【００３６】
本開示の他の態様は、培地に補充するためのキットを含む。いくつかの態様において、キットは、抗酸化剤、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、クマリン化合物、ピラノクマリン化合物、ＮＳＡＩＤ、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を含む。１つ以上の成分、添加剤、塩基性塩（salt bases）、または培地調合物を収容するチューブもしくは容器を、キットに更に具備させてもよい。追加的な成分、添加剤、塩基性塩（salt bases）、または培地調合物を収容する追加的なチューブもしくは容器を、キットに更に具備させてもよい。また、培地を調製すること、哺乳動物の生殖細胞を処理すること、１つ以上の卵を受精させること、または胚を生成することに関する指示書が、キットに更に付属する場合もある。
【００３７】
他の態様は、下記の説明、ならびに例示的態様および実施形態を検討することにより、当業者にとって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
本開示を例証するために、本開示の態様および実施形態における或る特定の特徴が、図面に描かれているが、本開示は、本図面に示されている態様における高精度の装置および手段だけに限られるものではない。
【００３９】
【図１】１９℃で０または２４時間保存された精液中に存在する前進運動性細胞の割合を定量化し、且つＳＶＦＥＭによる存続延長が、測定された流入（incoming）値の１０パーセンテージポイント以内に運動性細胞集団を維持することを実証した、プロットである。前進運動性率は、CASAシステムを使用して算定された。Ｎ＝１０の対の射精液。
【図２】フッ化ナトリウムを補充された培地は、２４時間の染色後に、フッ化ナトリウム（ＮａＦ）不含の塩基性ＳＶＦＥＭ培地調合物と比較して、前進運動性細胞の割合が僅かに減少したことを示す。本グラフから明らかなように、３ｍＭ  ＮａＦを補充されたＳＶＦＥＭ培地によるデータは、０ｍＭ  ＮａＦを用いたＳＶＦＥＭに対して正規化されたものである。０時間目には、ほとんどの値が、依然として対照ＳＶＦＥＭ群と同じに維持される。一方、２４時間目には、これらの値がいずれも、対のＳＶＦＥＭ群値を少なくとも２０％下回った。Ｎ＝８の一意な、種馬射精液。値は、０ｍＭ  ＮａＦ対照群に対して正規化されている。この減少から示唆されるように、ＮａＦを補充されたＳＶＦＥＭ調合物は、調合物として最適なものではなかった。
【図３】２日間にわたり６つの別々時点で雌雄鑑別済みの、ＳＶＦＥＭで処置された射精液における、凍結融解された後の授精用量当たりの前進運動性細胞の濃度の数の定量化を示す。グレーの線は、前進性細胞の障害閾値（１Ｍ／ｍＬ）を表す。ＳＶＦＥＭで処置された射精液は、雌雄鑑別プロセスが開始される前の最高３２時間のインキュベーションを経ても、凍結融解プロセスを生き残る。ストロー毎の前進細胞を、平均値±ＳＥとしてプロットする。１５頭の種馬（すなわち、ホルスタイン種馬１１頭、およびジャージー種馬４頭）に由来する、Ｎ＝２４の一意的射精液。
【図４】３つの対の射精液の平均胚盤胞変換を示す。ＳＶＦＥＭ存続延長剤を用いたインキュベーションでは、対の雌雄鑑別済み対照試料と比較して、胚盤胞変換に影響のないことが、示唆される。統計的有意差は、皆無であった。３頭の一意な種馬に由来する、Ｎ＝３の対の射精液。
【図５】ＩＶＦ手技の概略図を示す。
【図６】アセスメントされた各受精効率カテゴリーの代表的な画像を示す。Ａは、２つの脱凝縮済み前核および２つの凝縮済み極体に代表される、単精子である。Ｂは、３つ以上の脱凝縮前核に範疇分けされた多精子である。Ｃは、未受精のため、前核は存在していない。Ｄは、上記以外であり、卵丘細胞からの蛍光を不明瞭にすることにより、適切なスコア付けを妨げている。撮像されている接合子はいずれも、一処置群である雌雄鑑別済み精液対照に由来するものである。
【図７】スコア付けされた推定接合子総数から計算された多精子受精率から明らかなように、Ｔ２４  ＳＶＦＥＭが有意に増加したことを示す。値は、当該の群からの全てのアセスメント済み接合子の平均を表す。自然対数変換されたデータでは、一元配置ＡＮＯＶＡにより測定された群間に有意差が存在していない。全体ｐ値は０．２７９である。Ｔ０に対するｐ値は対照と比較して０．４５０であり、Ｔ２４では対照と比較して０．４８３である。Ｎ＝５０の一意的射精液。
【図８】スコア付けされた推定接合子総数から計算された単精子受精の割合には有意差のないことを示す。値は、正規化されておらず、当該の群からの全てのアセスメント済み接合子の平均を表す。アークサイン変換されたデータの全般的な一元配置ＡＮＯＶＡでは、ｐ＝０．１９７が与えられる。Ｎ＝５０の一意的射精液。
【図９】スコア付けされた推定接合子総数から計算された未受精の卵母細胞の割合を示す。この割合は、両方のＳＶＦＥＭ処置群において有意に減少していることが明らかである。値は、正規化されておらず、当該の群からの全てのアセスメント済み接合子の平均を表す。全般的に、一元配置ＡＮＯＶＡにより測定されたように、有意差が存在する（ｐ＝０．００２）。ボンフェローニ検定では、対照とＳＶＦＥＭ  Ｔ０  ｐ＝０．００４との間、および対照とＴ２４ ｐ＝０．０１３との間の特定の差異が指定される。Ｎ＝５０の一意的射精液。
【図１０】両方のＳＶＦＥＭ処置群において、卵割した接合子の割合が有意に増加したことを示す卵割率を示す。アークサイン変換されたデータの一元配置ＡＮＯＶＡでは、有意差が見られる（ｐ＝０．０００４）。ボンフェローニ検定では、群間で、対照がＴ０  ｐ＝０．００２とは異なり且つＴ２４  ｐ＝０．００１とも異なる、という２つの有意差のあることが同定される。Ｎ＝６０の一意的射精液。
【図１１】７日目の胚盤胞の平均パーセントを示し、両方のＳＶＦＥＭ群の卵母細胞当たりの胚盤胞の割合が有意に増加したことを明らかにしている。アークサイン変換されたデータの一元配置ＡＮＯＶＡでは、全般的な有意差が見られる（ｐ＝０．０００８）。ボンフェローニ分析で、処置と対照との差異が同定された。Ｔ０を対照と比較すると、ｐ＝０．００８が与えられ、Ｔ２４を対照と比較すると、ｐ＝０．００２が与えられる。Ｎ＝６０の一意的射精液。
【図１２】８日目の胚盤胞の平均パーセントを示し、Ｔ０  ＳＶＦＥＭ群の卵母細胞当たりの胚盤胞の割合が増加したことを明らかにしている。一元配置ＡＮＯＶＡでは、全般的な有意差が見られる（ｐ＝０．０３１）。ボンフェローニ分析では、Ｔ０  ＳＶＦＥＭと対照との間の差異が同定され、ｐ値０．０３７が与えられた。Ｔ２４と対照との間には差異がなかった（ｐ＝０．１４３、Ｎ＝６０の一意的射精液）。
【図１３】７日目および８日目の平均胚盤胞発育の差異を示す。群間に有意差はない（ＡＮＯＶＡの全体ｐ値＝０．７２３、Ｎ＝６０の一意的射精液）。
【図１４】各育種の３つの全処置群の転帰を示し、８日目の胚盤胞の平均数を示している。これらのグラフでは、一貫した傾向がはっきりとは見られない。Ａは対照であり、ＬはＴ０  ＳＶＦＥＭであり、ＳはＴ２４  ＳＶＦＥＭである。ＡＮＯＶＡを用いた分析では、際立った一貫した傾向は存在しない。Ｎ＝２０の一意的な雄牛。
【図１５】雄牛の星格付けにより分類された、８日目の平均胚盤胞を示す。本グラフでは、明らかな一貫した傾向は存在しない。Ａは対照であり、ＬはＴ０  ＳＶＦＥＭであり、ＳはＴ２４  ＳＶＦＥＭである。ＡＮＯＶＡを用いた分析では、一貫した傾向は算出されなかった。Ｎ＝２０の一意的な雄牛。
【図１６】８日目の平均胚盤胞を年齢群で除算した値である。グラフでは、一貫した傾向は顕在化していない。Ａは対照であり、ＬはＴ０  ＳＶＦＥＭであり、ＳはＴ２４  ＳＶＦＥＭである。ＡＮＯＶＡ分析では、一貫した傾向は算出されなかった。Ｎ＝２０の一意的な雄牛。
【図１７】従来の雌雄鑑別無し対照精液に対して正規化された平均卵割率（％）を示す。両方のＳＶＦＥＭ群および存続延長無し対照は、卵割が、従来対照よりも有意に低減することが、明らかである。本グラフ上の平均値は、従来の精液試料の平均値とのパーセント差を表す。両方の処置群と雌雄鑑別済み精液対照は有意に異なる（一元配置ＡＮＯＶＡにおいて、ｐ＜０．００１、Ｎ＝２９の一意的射精液）。
【図１８】胚盤胞７日目の、従来の雌雄鑑別無し対照精液に対して正規化された割合の平均を示す。両方のＳＶＦＥＭ群および存続延長無し精液が、胚盤胞に変換されて、７日目には従来対照の精液よりも有意に低減することが、明らかである。本グラフ上の平均値は、従来の精液試料の平均値とのパーセント差を表す。両方の処置群と雌雄鑑別済み精液対照とでは、有意差がある（一元配置ＡＮＯＶＡにおいて、ｐ＜０．００１、Ｎ＝２９の一意的射精液）。
【図１９】胚盤胞８日目の、従来の雌雄鑑別無し対照精液に対して正規化された割合の平均を示す。両方のＳＶＦＥＭ群および存続延長無し対照が、胚盤胞に変換されて、８日目には従来対照の精液よりも有意に低減することが、明らかである。本グラフ上の平均値は、従来の精液試料の平均値とのパーセント差を表す。両方の処置群と雌雄鑑別済み精液対照とでは、有意差がある（一元配置ＡＮＯＶＡにおいて、ｐ＜０．００１、Ｎ＝２９の一意的射精液）。
【図２０】代表的なコメットアッセイ画像による（ＤＮＡ脱凝縮および遊走が欠如していることを呈した）画像を示す。ＡおよびＣは、２００μＭ  Ｈ２Ｏ２で処置された細胞である。ＢおよびＤは、対照ジＨ２Ｏで処置された細胞である。ＣおよびＤは、ゲル包埋前に機械的に均質化されたのに対し、ＡおよびＢは均質化が施されなかった。ＡおよびＢの明視野は、精子頭部の形状を示し、ＤＮＡは内部に密に凝縮されている。ＣおよびＤは、明視野画像内に、明視化された構造を具備していない。にもかかわらず、ＤＮＡが依然として卵形で密に凝縮されている。ＣおよびＤでは蛍光が薄暗く、明視野収束画像では色褪せていた。
【図２１】２４時間の保存後の、ＳＶＦＥＭと対照の運動性を比較して示す。
【図２２】いくつかの運動性細胞に対しＳＶＦＥＭ（Ｆ−１）のＮａＦ濃度が及ぼす影響を示す。
【図２３】従来の方法により処理された試料に対しＳＶＦＥＭ（Ｆ１）を使用したことによる、運動性細胞の収量の向上を示す。
【図２４】精子試料をＳＶＦＥＭ（Ｆ−１）中に２４時間保存したことによる、効果を示す。
【図２５】精子試料を２４時間保存したことによる効果を、ＳＶＦＥＭ（Ｆ１）を使用した場合と対照培地を使用した場合とを比較して示す。試料の前処理と後染色とを比較する。
【図２６】精子試料を２４時間保存したことによる効果を、ＳＶＦＥＭ（Ｆ１）を使用した場合と対照培地を使用した場合とを比較して示す。試料は後処理された精子のストローである。
【図２７】ＳＶＦＥＭ（Ｆ−１）を含む試料を利用した、ＩＶＦデータを示す。対照培地を使用した雌雄鑑別済み試料を、ＳＶＦＥＭ（Ｆ−１）と比較するほか、従来の方法により処理された（雌雄鑑別無しの）試料とも比較している。
【図２８】ＳＶＦＥＭ（Ｆ−１）を含む試料を利用した、更に他のＩＶＦデータを示す。対照培地を使用した雌雄鑑別済み試料を、ＳＶＦＥＭ（Ｆ−１）と比較している。
【図２９】ＳＶＦＥＭ（Ｆ−１）の成分除去により、２４時間後の細胞運動性に対し及んだ影響を示す。
【図３０】三成分ストック溶液から作られたＳＶＦＥＭ（Ｆ−１）の有効性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
様々な態様および実施形態の更なる詳細を引き続き説明するにあたって、本開示が、特定の組成物またはプロセスステップだけに限られたものではなく、多様であり得ることを理解されたい。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されている場合、文脈上他の意味に解釈される場合を除き、複数の指示対象を含む。本明細書中で表されている範囲は、包括的である。
【００４１】
別途定義されていない限り、本明細書中に使用されている全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する当該技術分野の当業者に一般に理解されている意味と同じ意味である。例えば、本発明中に使用されている用語の多くに関する当業者向け汎用辞書は、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press、およびOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressに提供されている。
【００４２】
本開示は、生殖細胞の生存能力および活性を改善するための組成物、ならびに方法に関する。具体的には、本明細書は一形態において、生殖細胞、特に精子細胞に対し活性および生存能力の増強を付与する培地調合物を提供し且つ具備する。本明細書は別の形態において、生殖細胞試料を処理するための方法を提供し且つ具備する。本方法およびプロセスは、精子細胞の生存能力と活性が増強された試料を生成する。また、本明細書は別の形態において、これらの方法により生成された生殖細胞試料を提供し且つ具備する。本試料中の生殖細胞は、生存能力および活性が増強されている。別の形態では、本明細書は、生存能力および活性が増強されたこれら生殖細胞試料を使用する方法を提供し且つ具備する。本方法には、雌雄鑑別（Ｘ染色体を有する細胞またはＹ染色体を有する細胞の選択）、選別、分離、凍結、人工授精、体外受精、冷却および輸送、ならびに関連するプロセスが含まれる。
【００４３】
本明細書中に使用されている「雌雄鑑別」という用語は、Ｘ染色体およびＹ染色体を有する精子細胞の両方の混合物を含む集団から、Ｘ染色体を有するまたはＹ染色体を有する精子細胞を選択する任意のプロセスを指す。精子細胞集団は、未処理射精液、または他の任意の混合物もしくは精子細胞であり得る。雌雄鑑別プロセスを達成するのに用いられる技術としては、液滴選別（出展：米国特許第［  ］号（U.S. Patent No. [ ]））、機械的選別、およびレーザーアブレーション等、数通りを挙げることができる。
【００４４】
本明細書において言及されている「生殖細胞」という用語は、精子、卵、および胚／胚盤胞形成として定義されるほか、配偶子；一倍体細胞；胚細胞；性細胞；精子細胞および卵細胞としても定義される。
【００４５】
本明細書中に使用されている「培地（medium）」または「培地（media）」という用語は、栄養素、塩、および他の物質または構成成分を含有し得る、本質的に液体の組成物を指す。
【００４６】
本明細書中に使用されている「射精液」という用語は、雄哺乳動物が射精液により放出した際に産生される、精液および精子の組み合わせを指す。
【００４７】
本明細書中に言及されている「精液成分」という用語は、哺乳動物の精液を構成する物質であり、且つ／またはこの精液中に一般に見出される物質である。精液成分としては、限定されるものではないが、アミノ酸、前立腺特異抗原、タンパク質分解酵素、クエン酸、クエン酸塩、シアル酸、ビタミンＣ、酸性ホスファターゼ、フィブリノリジン、脂質、フルクトース、プロスタグランジン、ホスホリルコリン、グリセロホスホコリン、フラビン、プトレシン、スペルミンなどの塩基性アミン、スペルミジン、カダベリン、亜鉛、ガラクトース、粘液、ならびに他の有機および無機構成成分が挙げられる。
【００４８】
本開示の雌雄鑑別手技は、新鮮な存続延長無しの射精液と共に使えるように実装することが可能である。ただし、射精液は、採取後に品質が劣化し続けることから、鮮度の高い射精液でも存続延長剤を補充されていないものを使用すれば、生来的な問題を招来する。雌雄鑑別を経る精子は、細胞の処理中に、温度の変動、高希釈、およびｐＨ変化をはじめとする多くの傷害に曝露される。雌雄鑑別の際の傷害としては、サイトメーター上で雌雄鑑別プロセスにより誘発される、せん断応力、高液圧、および高力が挙げられる（Garner and Seidel, 2003; Garner, 2006）。これらの傷害は、処理後に回収される細胞数の減少につながる。
【００４９】
処理中に細胞が減損することは、有害ではあるが、予測される産物減損の主原因とはならない。減損の主原因は、新鮮な射精液が採取された後、経時的に死滅細胞集団が着実に増加することにある。この主な要因は、雌雄鑑別プロセスが室温にて発生することから、新鮮な射精液を室温に近い温度で保存する必要のあることである。射精液を（冷温にて、細胞生存性の維持を良好化するのではなく）寧ろ室温に維持することは、より低い温度への平衡化に時間が費やされるのを防げるので、射精液の雌雄鑑別が継続的に可能となる。また、これにより、雌雄鑑別プロセスの開始前に生細胞が減損する迅速度が増す。この継続的な生存能力の喪失は、雌雄鑑別ステップおよびパッケージングステップの実行所要時間と相俟って、雌雄鑑別済み射精液を採取後１２時間以内に凍結するという、標準的な方針につながった。
【００５０】
このポリシーでは、採取後１２時間以内に射精液をパッケージングする必要があることから、射精液の容量が過剰となるのが原因で、大容量の射精液が残存する。これらの過剰容量は利用できない。なぜなら、鮮度の高い射精液が採取された後に消費されるのは、その射精液の一部だけに限られるからである。射精液は、１日２４時間、６時間毎に採取される。そうすることにより、試料不足を原因とする計器の動作時間経過が防止される。つまり、早朝採取によって得られた射精液が、第２の日次採取物が到着したときにまだ生存可能容量を有していることがしばしばあるにしろ、鮮度の落ちた試料が計器上で更に６時間にわたって泳動する可能性は低い。この理由から、依然として古い試料を取り除いて交換し、鮮度の高い射精液が優先されるようにすべきである。射精液の鮮度を優先することは、減損の第２の主原因とされる雌雄鑑別計器のダウンタイムにつながる。所与の時点からの全ての射精液を、毎日同じ時刻に取り除いて置き換える。つまり、計器をシャットダウンし、清掃して、毎日４回再起動することになる。これは、計器毎に、最低４０分の実行時間が、１日４回減損することを意味する。これらの減損数は、細胞数の単位で計算され、採取対象外となった非対称化（skewed）細胞で、１日当たり計器毎に４６．９×１０個であり、１日当たり概算で１，０００授精用量の減損に相当する。
【００５１】
精子の雌雄鑑別施設で使えるように調合された存続延長剤は、減損を軽減する助けになり得る。第１に、存続延長剤は、雌雄鑑別前に室温で保持されている精子細胞の減少を遅延させることにより、単一時点で採取できる射精液を増やせるので、１日当たりの射精液の採取回数を減らすことが可能になる。このモデルでは、必要に応じて雄牛毎に新たな射精液に交換する際に、製造現場全体を一斉にシャットダウンする手間をかけずに寧ろ計器をシャットダウンするだけで済む。これにより、計器毎の充当可能要員数を増やせるので、新たな雄牛交換にかかる時間が短かくて済む。また、細胞生存能力を維持することは、射精液が枯渇に至るまで泳動可能であるいう点で有意義である。結果として、射精液毎に得られる雌雄鑑別済み精子の数が最大限に高まり、計器毎の雄牛交換の１日当たり合計回数が削減されることになる。これらの細胞減損原因を軽減することにより、生成される授精用量の数が増加し、結果として、世界規模で優良な産物を農業従事者が入手できる可能性が高まる。
【００５２】
加えて、凍結融解プロセス中に観察される細胞減損は、膨大な量に及ぶ。従来型（すなわち雌雄鑑別無しの精液）、および雌雄鑑別済み精液は両方とも、保存および流通用にストロー中に収容して冷凍されるのが通例である。以後、ストローを解凍してから、授精または受精に使用する必要がある。この凍結および解凍プロセスにより、ストロー内の大部分の細胞が死に至る。この細胞減損は、凍結融解プロセスに起因するものであることから、本明細書中に開示されている培地調合物およびプロセスを使用して、細胞減損を軽減することが可能である。
【００５３】
存続延長強化培地調合物
本発明の存続延長強化培地調合物によって提供される重要な利点は多数ある。例えば、細胞の生存能力を少なくとも２４時間延長し、前進運動性細胞の減損を１０パーセンテージポイント以下に収め、Hoechst 33342（または代替物）を用いた細胞の染色、および赤色素を用いた生存能力の対比染色（サイトメーターでの適切な雌雄鑑別に必要とされる染色）が妨害されないようになること；ならびに、受精能力および胚発育に対し悪影響が及ばないようになることである。
【００５４】
本発明の実施形態による調合物、すなわち、追加的な補充を行うCEP2調合物（ＳＶＦＥＭ）によれば、市販の存続延長剤と比較して、精子細胞の生存性および運動性の向上が見られる。Andromed（登録商標）（米国ウィスコンシン州デラバンのミニチューブ社（Minitube））およびOptiXell（米国ミネソタ州メープルグローブのIMVテクノロジー社（IMV technologies））、および先に述べられた培地調合物CEP2（Verberckmoes et al., 2004）、ならびに予備データにより実証されたように、市販の存続延長剤は、２４時間のインキュベーション後に、生存性を存続延長無しの射精液よりも高く維持した。一方、プロプラエタリー培地であるＳＶＦＥＭは、運動性細胞集団を流入射精液値１０パーセンテージポイント以内に収まるように特に維持していた（図１）。次いで、３通りの培地選択肢の各々を用いて存続延長された射精液を染色し、雌雄鑑別サイトメーターで泳動させた。試料の５０％超におけるＸおよびＹ精子集団を判別する能力は、Andromed（登録商標）により妨げられた。一方、生存能力の十分高い集団は、OptiXellでは維持されなかった（データ不図示）。ＳＶＦＥＭ処置群では、細胞集団分離が十分な規模であったため、雌雄鑑別計器上で適切な雌雄鑑別が可能となった。
【００５５】
一態様において、本発明の培地調合物は、バッファーを含む。細胞の生存性および保存期間を重要な懸案事項とする用途では、バッファーをTRISまたはＨＥＰＥＳとしてもよい。精子細胞の試料製造において繁用されている他の培地の成分とされているのが、TRISである。ただし、安定したｐＨ範囲がCEP2のｐＨに近いのは、ＨＥＰＥＳの方である。或る特定の実施形態において、TRISが使用される理由として考えられるのは、ｐＨ安定性により測定した場合に、それ以外の調合物よりも保存期間が長期に及ぶことである。
【００５６】
他の態様において、本発明の培地調合物はまた、ＮａＦを補充されたものとされる場合もあり、試験されたＮａＦの用量は、約０ｍＭ〜約６ｍＭの範囲とされた。ＮａＦを、精子不動化薬として含めてもよい。この不動化薬は、細胞のエネルギーを節約でき、且つその細胞運動性の効果は、希釈を行うにより奪回することが可能である。ただし、ＮａＦは、他の試験済み存続延長剤群と同等な前進運動性細胞濃度にて、パッケージングおよび凍結後の生産手技のストレス下に置かれても生き延びた運動性細胞の数を低減し得る（図２）。
【００５７】
本発明の一態様による強化型培地調合物は、雌雄鑑別前の細胞生存性のウィンドウを拡大し、同時に、雌雄鑑別プロセス後も、依然として生存していて且つ運動性を有するものとして測定された細胞を維持した。図３に示すように、ＳＶＦＥＭで処置された精子細胞の凍結融解後の前進運動性細胞の数は、雌雄鑑別前にＳＶＦＥＭ存続延長剤で２４時間インキュベートした後でさえも、運動性細胞の濃度（前進運動性細胞１００万個／ｍＬ）に関する品質管理メトリクスに合格する。定量化された運動性の転帰を、下記３つの群：同日に雌雄鑑別された存続延長無しの精液の群、同日に雌雄鑑別された、ＳＶＦＥＭで存続延長された精液（Ｔ０  ＳＶＦＥＭ）の群、および１９℃にて２４時間インキュベートした後に雌雄鑑別された、ＳＶＦＥＭで存続延長された精液（Ｔ２４  ＳＶＦＥＭ）の群間で比較した。多精子受精の場合、本発明の一態様による培地調合物を強化した場合、結果として、Ｔ２４  ＳＶＦＥＭでスコア付けされた推定接合子が有意に増加する（図７）。更になお、図９に示すように、スコア付けされた推定接合子総数から計算された未受精の卵母細胞の割合を示す。この割合は、両方のＳＶＦＥＭ処置群において有意に減少していることが明らかである。
【００５８】
本発明の一態様による培地調合物を強化した場合、結果として、卵母細胞当たりの胚盤胞の割合が増加する。図１１に示すように、７日目の胚盤胞の平均パーセントは、両方のＳＶＦＥＭで卵母細胞当たりの胚盤胞のパーセントが有意に増加していることを示す。図１２に示すように、８日目の胚盤胞の平均パーセントは、Ｔ０  ＳＶＦＥＭ群の卵母細胞当たりの胚盤胞のパーセントの増加を示す。両方のＳＶＦＥＭ群の７日目および８日目の胚盤胞変換は、従来の対照精液よりも有意に少なくなっている（図１８および図１９）。
【００５９】
本発明の一態様による培地調合物を強化した場合、結果として、卵割が少なくなる。図１７に示すように、両方のＳＶＦＥＭ群は、従来対照よりも卵割が有意に少ない。
【００６０】
ＳＶＦＥＭ存続延長剤は、（例えば、図２３〜図２６に示すように）雌雄鑑別前の２４時間にわたって精子集団の運動性および生存能力を維持することに成功し、結果として、現在の標準的な操作手技と比較して、バッチが失敗するリスクを増大することなしに、品質管理基準を満たす凍結融解された雌雄鑑別済み精液が得られる。ゆえに、培地を使用した場合、総射精液容量の利用率を高め、同時に射精液毎に生成される授精用量の数を増やすことにより、農業従事者が雌雄鑑別済み精液の利用可能性を増強させることが可能である。
【００６１】
本発明による培地調合物は、精子を受精適格状態に維持する。受精適格性としては、限定されるものではないが、本発明による培地調合物に曝露された精子細胞が、人工授精、ならびに体外および生体内の両方における受精、卵割および胚盤胞変換を介して妊娠を生起させる能力が挙げられる。治験中に各３回採取された雄牛２０頭に由来する分割射精液を用いて実施されたＩＶＦ治験においてＳＶＦＥＭで処置された射精液が、受精能力を呈した。図４に示すように、このことから最終的に実証されたように、ＳＶＦＥＭによる存続延長によって、雌雄鑑別済み精液の胚盤胞形成に対し大きな影響が及ぶ。運動性細胞数は、対照とされた雌雄鑑別済み精液と比較して凍結後の細胞生存率に差のないことを示しており、３対の射精液のＩＶＦアセスメントにより、ＳＶＦＥＭで存続延長された射精液と対照との間で同様な胚盤胞変換が示唆された。
【００６２】
一実施形態において、本発明による培地調合物は、雌雄鑑別プロセス中に細胞が受けるストレスの量を低減させる目的で特別に添加された、抗酸化剤を含む。全ての精子は、雌雄鑑別プロセスで紫外線に曝露される。これにより、通例は、ＤＮＡに対し（直接的な鎖の切断ではなく）酸化的損傷が誘発され、精子は、凍結保護段階中に高活性酸素種（ＲＯＳ）の影響を受ける可能性がある（Aitken et al., 2015; Farber, 1994）。また、ＲＯＳは、一本鎖および二本鎖の切断、塩基対の改変などのＤＮＡ損傷を引き起こす場合もある（Richter et al., 1988）。Fatehi et al. (2006)の報告によれば、ＤＮＡ損傷を被ったウシ精子で受精された卵母細胞において見られた卵割率は、対照と同程度であったが、損傷を被った実験群では、実験を更に進行させるのを中止した。ＤＮＡ損傷は、本発明の培地調合物によって軽減される。この損傷軽減は、ＳＶＦＥＭで処置された精子細胞を介した胚盤胞変換の方が、雌雄鑑別済み精液で作製された胚と比較して、同程度であった卵割率に増大が見られたことから明らかである。これは、存続延長無しの精液群においてＤＮＡ損傷の程度が高いことを示している。並行して観察すると、ＳＶＦＥＭ存続延長剤は、雌雄鑑別に起因するＤＮＡ損傷を軽減する。
【００６３】
本発明の培地調合物で処置された精子細胞は、存続延長無しの対の対照と比較して、卵母細胞当たりの胚盤胞生成数が多い。同日（Ｔ０）に、ＳＶＦＥＭによる存続延長および雌雄鑑別を行い、雌雄鑑別前の２４時間（Ｔ２４）、３育種の雄牛２０頭分に相当する合計６０射精液に対しＳＶＦＥＭによる存続延長を行い、雌雄鑑別済み精液の品質に関する商業的要件を満たした。射精液毎に各処置により凍結融解された精子の、卵母細胞への侵入、卵割、および胚盤胞を生起させる能力に関して対の試料と同様に試験した。単精子および多精子受精卵母細胞は、蛍光顕微鏡を介して定量化された。胚発育について視覚的アセスメントを行い、処置群間で比較して、ＳＶＦＥＭによる存続延長によって生じた差異を同定した。
【００６４】
本発明による培地で処置された精子に見られるＤＮＡ損傷は、存続延長無し対照よりも少ない。ＤＮＡ損傷は、３つの処置群ＳＶＦＥＭ  Ｔ０、ＳＶＦＥＭ  Ｔ２４、および対照由来の凍結融解された雌雄鑑別済み精液中で、酸化された塩基対を特異的に検出する修正コメットアッセイを使用して定量化された。
【００６５】
本発明の培地調合物は、受精後７日目および８日目に測定された卵割および胚盤胞変換率として測定される、ＩＶＦ転帰に対し有益な効果をもたらす。これらの有益な効果は、少なくとも部分的には、雌雄鑑別に起因するＤＮＡ損傷の軽減によるものであるものと考えられる。
【００６６】
また、本発明の培地調合物は、各射精液の実行時間の増加を可能にし、それにより、採取済み射精液容量当たりの凍結された雌雄鑑別済み精液産物質を増強させ、各授精用量のコストを削減する。これにより、酪農場において雌雄鑑別済み精液を使用することにより利潤を得る農業従事者にとって、雌雄鑑別済み精液産物の利用可能性が広範化するものと考えられる。更に、存続延長剤は、冷凍された雌雄鑑別済みウシ（bovine）の精液だけでなく、長時間の輸送を要する環境において新鮮な射精液の鮮度保持期間を延長する用途または、特に品質が劣化した射精液を保管する用途にも適用できる。
【００６７】
精子細胞の採取および使用は、畜産および育種の中心的な部分である。精子細胞は、雄動物から未処理射精液の形態で採取され、爾後の使用まで保存する必要がある。保存には数時間または数日間を要する場合がある。加えて、細胞試料は通例、使用前に１つ以上の方法によりマニピュレートされる。ゆえに、プロセス全体を通じて、細胞の生存能力および機能を維持することが重要とされる。
【００６８】
機能的な受精適格精子の回収およびパッケージングを最大化する培地が、本発明者らによって開発されてきた。このため、射精液を枯渇させ、雄牛交換を最適化し、且つバックアップ射精液の必要性を減らすことによって、生産の柔軟性および効率を向上させることが可能である。追加的な利点は、後処理（雌雄鑑別など）により回収された運動性細胞が増強されることである。精液試料を本発明の培地を使用して処理することで、活性の上昇が見られる。活性の上昇は、生存能力の増強、運動性の増強、またはその両方である。しかも、本発明の培地を使用することにより、処理後の精液試料の収量を増やすことが可能となる。
【００６９】
本発明の培地を使用することにより実現される利点としては、ほかにも、射精液を複数回にわたって採取する必要性が減る、あるいは動物をプロセス部位に移動する必要性が減ることが挙げられる。加えて、本発明の培地は、生殖細胞の生存能力および運動性の維持によって、更なる処理（例えば、雌雄鑑別）用に、射精液の輸送を可能にし得る。これにより、動物を移動して隔離する必要がなくなる。
【００７０】
未処理射精液の処理としては、限定されるものではないが、選別、雌雄鑑別（Ｘ染色体を持つ細胞またはＹ染色体を持つ細胞の選択）、凍結、人工授精、およびＩＶＦ（雌雄鑑別有りおよび無し）をはじめとする多くの下流用途を挙げることができる。いくつかの実施形態において、これには、試料の冷却と輸送、精子細胞の濃縮、および懸濁、ならびにそれに続く染色／雌雄鑑別が含まれる。
【００７１】
生殖細胞試料の供給源は通例、当該技術分野において一般に知られている方法により得られる射精液に由来するものである。射精液試料は、単一の供給源としてもよいし、あるいはプールしてもよい。いくつかの実施形態では、精子細胞集団を体外生成することまたは拡大することが想到される。試料は、動物、好ましくは哺乳動物から、より好ましくは、家畜から採取される。試料として最も好ましいのは、ブタまたはウシである。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本組成物は、未処理射精液を保存し、生殖細胞成分の減損を最小限に抑えるための「保持培地」として利用される。他の実施形態において、本組成物は、更なる処理（例えば、雌雄鑑別など）に使用される生殖細胞試料の処理に使用される培地として機能する。更なる実施形態において、本組成物は、処理されてから、育種手技で使用されるまでの間に、単離された精子細胞を保存するための「保持培地」として利用される。この培地は、「存続延長剤培地」と呼称されることもある。その理由は、本発明の培地が使用された場合に、試料の存続能力の維持が長期化されるからである。
【００７３】
或る特定の実施形態において、生殖細胞と本発明の「保持培地」とを含む組成物は、受入れ可能生存能力および／または運動性を数時間維持した。特定の実施形態において、存続延長は２４時間に及んだ。他の実施形態において、本発明の組成物は、細胞処理全体を通して受入れ可能レベルの生細胞を維持した。特定の実施形態において、死滅細胞のパーセンテージは、雌雄鑑別処理期間全体を通じて２５％未満であった。
【００７４】
試料を、改良型培地に配合するための方法は、多岐にわたり得る。未処理射精液試料の採取以降、未処理射精液の採取後ないし設定済み時間以内に、直接的に培地を添加してもよいし、または直接的に未処理射精液を培地内に採取してもよい。
【００７５】
本発明の培地に曝露された精子細胞は、既存の繁用される保持培地に曝露された精子と比較して、運動、生存能力、および機能性（卵子を受精させる能力など）が向上する。それゆえ、これらの培地によって、従来の精液および雌雄鑑別済み精液の両方の収量を増強することが可能である。本発明の培地は、機能的な受精適格精子の回収およびパッケージングを最大化する。
【００７６】
本開示は、保存および処理全体を通じて生殖細胞の生存能力および活性を改善する組成物に関する。一態様において、本組成物は、塩基性塩培地を含むほか、抗酸化剤、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、クマリン化合物またはピラノクマリン化合物、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を含む。いくつかの態様において、本組成物には、フッ化ナトリウムが含有されている。これらの組成物は、生殖細胞の保存および処理用に改善された培地としての機能を果たす。
【００７７】
いくつかの態様において、本組成物は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む。このＮＳＡＩＤは、主にシクロオキシゲナーゼ酵素（ＣＯＸ−１および／またはＣＯＸ−２）の阻害を介して、炎症を軽減する能力を有するクラスの薬物および化合物である。本組成物は、１つ以上のＮＳＡＩＤを含み得る。例えば、限定されるものではないが、サリチル酸塩類、例えばアスピリン（アセチルサリチル酸）、ジフルニサル（ドロビド）；サリチル酸および他のサリチル酸塩、ならびにサルサレート（ジサルシド（disalcid））；イブプロフェン、デキシブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジンおよびロキソプロフェンをはじめとするプロピオン酸誘導体類；インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラック、ジクロフェナク、アセクロフェナクおよびナブメトンをはじめとする酢酸誘導体類；エノール酸（オキシカム）誘導体類、例えばピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカムおよびフェニルブタゾン（ブテ）；メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、およびトルフェナム酸をはじめとするアントラニル酸誘導体類（フェナメート）；セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブおよびフィロコキシブをはじめとする選択的ＣＯＸ−２阻害剤類（コキシブ）；ニメスリドをはじめとするスルホンアニリド類；ならびに他のＮＳＡＩＤ、例えばクロニキシン、リコフェロンおよびＨ−ハーパギド（フィグワートまたはデビルズクロー内）が挙げられる。いくつかの実施形態において、本組成物は、クマリン化合物またはピラノクマリン化合物を含む。或る特定の実施形態において、クマリン化合物またはピラノクマリン化合物は、デクルシンを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、塩基性塩培地は、文献（１）に記載されている合成の精巣上体尾部血漿（CEP2）である。この調製物には、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム無水物（ＣａＣｌ２（Ｈ２Ｏ）２）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２（Ｈ２Ｏ）６）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、リン酸ナトリウム二水和物（ＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）２）、リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、フルクトース、ソルビトール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＴＲＩＳ塩基およびクエン酸が含有されている。一実施形態において、本発明の培地は、塩基性塩培地としてCEP2を含有するほか、添加剤としてホスファチジルセリン（ＰＳ）、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、アセチルサリチル酸（アスピリン）、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、およびフッ化ナトリウムを含有する。
【００７９】
本発明の培地を作製する際に使用される塩基性塩培地としては、それ以外のものも想到される。一実施形態では、タイロード液の乳酸ピルビン酸アルブミン（ＴＡＬＰ）が想到される。タイロード液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、リン酸二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）および塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２（Ｈ２Ｏ）６を含有する等張液調合物である。一実施形態において、ｐＨは約６．６〜６．８である。
【００８０】
塩基性塩培地には、所望される特性を提供し且つ本発明の培地を作製するための、添加剤が含有される。一態様において、添加剤は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、アセチルサリチル酸（アスピリン）、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、全ての添加剤が、調合物中に含まれている。他の実施形態では、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、アセチルサリチル酸（アスピリン）、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、またはフッ化ナトリウムのうちの１つ以上が、省略される。添加剤成分の濃度範囲を、表１に示す。
（表１）添加剤成分の濃度範囲
2021500927.tif 000002
【００８１】
具体的には、ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、繁用されている保持培地中の他のリン脂質（ホスファチジルコリンなど）に取って換わる、主要な成分であることが、発明者らによって発見されてきた（図９）。他のリン脂質類も想到されるが、ＰＳは他のものよりも有利であることが立証されてきた。この発見は、意外であり且つ予期しないものであった。ホスファチジルセリン含有の培地は、調合が困難である場合があり、ホスファチジルセリンが不要であるか、またはホスファチジルセリンの代替物で十分であることが、当該技術分野において一般的に受け入れられている。
【００８２】
いくつかの態様では、精子細胞組成物が想到されている。本組成物は、下記：精子細胞、ならびにホスファチジルセリン（ＰＳ）、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、アセチルサリチル酸（アスピリン）、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含有する組成物である。本組成物は、精液成分を含み得る。
【００８３】
他の態様では、精子細胞容器が想到されている。本精子細胞は、複数の精子細胞、塩基性塩培地を含むほか、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、アセチルサリチル酸（アスピリン）、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、フッ化ナトリウム、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。本容器に、精液成分を更に収容してもよい。そのような容器は、保存に使用される場合もあれば、またはＩＶＦもしくはＡＩのような更なる手技に使用される場合もある。
【００８４】
他の態様では、胚細胞由来の接合子／胚盤胞形成の増強（すなわち、生殖細胞の受精増強または活性増強）を生起させる組成物が、想到される。一態様において、本組成物は、塩基性塩培地を含むほか、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、デクルシン、塩化亜鉛、コエンザイムＱ１０、アセチルサリチル酸（アスピリン）、リノレン酸、脂肪酸、Ｄ−アスパラギン酸、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含むいくつかの態様において、本組成物には、フッ化ナトリウムもまた含有されている。そのような組成物における運動性、受精もしくはその両方を測定することにより、保存および／またはマニピュレートされた試料の生殖細胞活性が維持されるようにすることもあれば、あるいは更には増強されるようにすることもある。受精は、胚盤胞の形成によって測定できる。本発明者らの発見によれば、ＩＶＦおよび／またはＡＩにおける雌雄鑑別済み精液受精率は、本発明の培地によって向上する。
【００８５】
体外受精は、当該技術分野において公知の方法および手技により遂行することが可能である。ＩＶＦの成功に影響を与える要因としては、限定されるものではないが、卵の供給源；精子試料および追加的な処理／マニピュレーション；受精、受精ステップ中の培地成分／精子細胞の存在／濃度；胚盤胞形成／胚発育中の培地成分の存在／濃度など、多数の要因が挙げられる。
【００８６】
培地に細胞を配合するには、例えば、培地を、一定容量（培地対試料の測定アスペクト）にて使用する方法、または試料の測定アスペクト（すなわち、精子細胞濃度）に関連して設定された容量にて提供して使用する方法など、多様な方法がある。或る特定の態様では培地を試料に加えるのに対し、他の実施形態では試料を培地に加える。他の実施形態では、試料および培地の両方を、第３の容器／レセプタクルに加える。
【００８７】
本開示におけるいくつかの態様および実施形態を、下記の実施例により例証する。これらの実施例は、本技術の特定の実施形態を説明することを目的に提供されたものであって、本開示の範囲を制限するものではない。本開示の全範囲は、本明細書に付属されている特許請求の範囲、およびそれら特許請求の範囲における任意の改変、修正または均等物により定義されることが、当業者に理解されるであろう。
【実施例】
【００８８】
実施例１
雌雄鑑別手技では、精子が多数の傷害に耐えることが要求される。ＳＶＦＥＭ存続延長剤が採取後最大３６時間にわたって雌雄鑑別の成功を促進することが、予備データによって実証されたが、存続延長済み精子の受精能力に関する評価は、未だ為されてきた試しがない。体外精子の特徴を受精の転帰に相関させようという試みが科学者らによって為されてきたが、この種のアッセイはゴールドスタンダード（gold standard）にはなっていない。CASAシステムまたはウシ頸管粘液浸透試験（ＢＣＭＰＴ）を使用した速度パラメーターの試験、原形質膜、細胞内構造の細胞アセスメントでは、その結果が、ＩＶＦまたはＡＩの受胎能と関連する仕組みにおいて矛盾したものとなることがしばしばある。例えば、原形質膜完全性のＰＩ染色は、Januskauskas et al. (2003)の実地受精率（field fertility）に対しては相関する反面、Oliveira et al. (2012)に対しては相関しない。また、BCMPTにおける移動距離はNRRと相関性があるように見えた（Tas et al., 2007; Bacinoglu et al., 2007）にもかかわらず、本アッセイとＩＶＦ転帰との相関性は不十分であった（Keel and Schalue, 2009）。これらの結果が矛盾したものであることから、精子の生存能力または運動性の測定値を、ＩＶＦまたはＡＩの性能に関連付けることが妨げられている。ゆえに、精子の受精能を高精度にてアセスメントするには、ＩＶＦまたはＡＩを実施する必要がある。
【００８９】
ＳＶＦＥＭによる存続延長を商用製品に適用するには、ＡＩ治験が必要とされる。それに対し、ＩＶＦ治験では、卵割および胚盤胞変換率を定量化し、それにより、生成された胚数における明白な変化の根底にある機序を洞察することが可能となる（Bermejo-Alvarez et al., 2010; Blondin et al., 2009, Greve and Madison, 1991）。このＩＶＦ治験において定量化された転帰としては、７日目および８日目の受精率、卵割変換、および胚盤胞変換率が挙げられるであろう。これらの２つの時点での、胚盤胞発育の定量化は、雌雄鑑別済み精液を用いたＩＶＦにおける発育が遅延することを明らかにした文献（Lu et al., 1999）に基礎を置くものであり、且つＳＶＦＥＭによる存続延長により胚発育率が変化するかどうかを示唆するものでもある。
【００９０】
ＩＶＦおよびＡＩの性能の相関関係は確証されていない（Holden et al., 2016）にしろ、ＩＶＦ治験はまた、初期胚時点のアセスメントでのリスクが低い。こうした低リスクの理由として、動物を受胎させないようにすることにより、動物に対し健康上有害となる恐れ、または実現可能な妊娠に帰結しない場合に農場に対し経済的な影響が及ぶ恐れが回避されることが挙げられる。この治験が成功した場合、ＡＩの実地治験を通じて実際の妊娠分娩率を更に分析することもまた、正当化される。それ以外の場合、ＩＶＦの胚移植によって胚盤胞を生成する。
【００９１】
図４のＳＶＦＥＭを用いたインキュベーション後に凍結後に測定された速度のデータ、および３対の射精液による予備のＩＶＦアセスメントに基づき、ＳＶＦＥＭ培地による存続延長は、存続延長無しの射精液と同様に機能する、という仮説が立てられる。ＳＶＦＥＭで存続延長された射精液は、ＩＶＦにおける存続延長無しの射精液と同様に機能する能力を有することから、ＳＶＦＥＭ存続延長剤を雌雄鑑別済み精液製品中で使用できること、ならびに受精および初期胚発育が依然として可能となることが、検証される。これにより、射精液容量の雌雄鑑別に利用可能な時間が増大し、採取済み射精液の容量当たりの生成済み雌雄鑑別済み授精用量数の増加が可能となる。こうした産物の増加によって、これらの遺伝的に検証された性別非対称の（sex-skewed）授精用量に対する農業従事者のアクセスが改善される。
【００９２】
材料および方法：
培地調合物の概要は、以下の通りである。
【００９３】
ＩＶＦ試験可能なユニット生成デザイン：
本研究では、ホルスタイン、ジャージー、およびアンガスの３育種の種馬を利用した。研究デザインには、一意な種馬２０頭に由来する３つの射精液採取物が含まれていた。これは、雌雄鑑別済み精液ユニットを生成し、雄牛１頭の変動によってデータが有意に非対称化（skewed）されるのを防ぐことを目的としたものである。予備データを用いた前向き（prospective）検出力の計算から示唆されるように、雄牛２０頭に由来する３つの採取物によって、２つのＳＶＦＥＭで処置された精液および対の対照を含む分割射精液デザインによる胚盤胞変換転帰に対して、統計的検出力０．９以上が提供される。
【００９４】
その採取物の最終的育種は、ホルスタイン種馬１６頭、ジャージー種馬２頭、およびアンガス種馬３頭と集計された。これらの雄牛の年齢は、ユニット採取時に、１．５歳〜９．５歳の範囲内にあった。アメリカンブリーダーズサービス（American Breeders Service）では、計算受精率の最高の雄牛が五ツ星格付けとして表示されるように、一ツ星〜五ツ星の野外受精率（自然サービス）星格付けを提供している。本治験中に採取された射精液は、星格付けの全範囲、すなわちランク外から五ツ星までの、種馬に由来するものであった。これにより、ＳＶＦＥＭ存続延長剤が、野外受精率の高および低受精卵由来の射精液に対しどのように影響するか、ならびに、本ＳＶＦＥＭ存続延長剤が、異なる年齢または育種の種馬に対しそれぞれ異なる様式にて影響を与えるかどうかに関する調査が可能になる。
【００９５】
本治験において使用するために選択された射精液を、標準的な生産手技に従って処理した。この概要については、以下に詳述されている。授精用量、凍結杖、および関連する全ての文献に対し、入荷時品質検査時に、非盲検ラベル（blind label）が付された。これは、凍結融解後およびＩＶＦ転帰の定量化アセスメント中に、品質管理アセスメントに対して技師が偏見を抱くのを防ぐことを目的としたものであった。
【００９６】
処理後の、雌雄鑑別済み精液を、標準的なＳＯＰに従って定期的にスケジュールされた生産凍結中にパッケージングし、凍結した。ユニット生成以後の１週間以内に、熟練ＱＣ技師によって出荷時品質管理測定が実施された。解凍後の運動濃度、および細菌汚染の有無を確認した。授精用量は、ＩＶＦ治験において使用されるパラメーターである、標準的な生産出荷時品質管理に合格する必要があった。
【００９７】
ＩＶＦ治験：
ＩＶＦは、２つの別個の施設で実施された。ＩＶＦ治験中に、施設間に差異が生ずるのを防ぐため、各施設でそれぞれ異なる別個のＩＶＦプロトコールを並行して試験した。マルチウェルプレート中、およびミネラルオイル下の液滴中の、受精および成熟の試験を実施した後、最適なプロトコールを同定した。両方の施設において、同じ射精液由来の授精用量を、同じプロトコールに従ってＩＶＦに使用し、卵割および胚盤胞変換率を比較した。両方の施設においてプロトコールを検証し、施設間の平衡な胚盤胞変換率が達成されたら、ＳＶＦＥＭ  ＩＶＦで生成された授精用量に関して進捗状況の試験を実施した。プロトコールは、図５に視覚的に概説されている。
【００９８】
各施設で、個別の射精液毎に３つの処置群を受理した。各分割射精液からの３つの処置物を同時に使用し、卵母細胞を受精させた。この卵母細胞は、畜場の卵母細胞と同じプール済みバッチからのものであった。以前に受精能力が検証済みであった従来の雌雄鑑別無しの対照ストローもまた、同時に実行し、卵母細胞の生存能力を検証した。発育の疑似的失敗（false failure）が卵子の品質不良に起因するものでないことを保証するため、従来の対照群もまた概算で１５％の胚盤胞変換にて発育に失敗した場合は、射精液に対するＩＶＦ反応が繰り返された。これは、卵母細胞の品質に問題のあることを示唆するものである。
【００９９】
両方の施設において熟練ＩＶＦ技師によって、概説されている受精が実施された。受精後７日目および８日目に、胚盤胞をスコア付けし、採取して固定した。ばらつきが大きいために結論が不適切なものとなるのを防ぐため、技術的レプリケート間のばらつきが２０％を超える場合は、射精を繰り返した。
【０１００】
射精液採取：
全ての射精液採取は、有経験技師が標準的な採取手技に従って、現場で実施した。
【０１０１】
射精液の存続延長、および入荷時品質アセスメント：
射精液の容量を、血清学的ピペットを使用して算定し、２つのチューブに均等に分割した。１５分以内に、直ちに、ＳＶＦＥＭ存続延長剤が１：１の比率で、分割射精液のＳＶＦＥＭにより存続延長された半分に加えられた。その後、温度変動を防ぐために、断熱クーラーで第２の施設に輸送した。到着時に、ＧＴＬＳ抗生物質溶液を加えて、２％ｖ／ｖの射精液にした。
【０１０２】
初期の射精液採取から４５分以内に、細胞濃度および流入（incoming）運動性パラメーターを収集した。濃度は、試薬S100およびSP100カセットを備えたNucleocounter SP-100（商標）（デンマークのケモメテックアレロッド社（ChemoMetec Allerod））を使用して算定された。運動特性は、１０μＬの試料を９９０μＬの運動性希釈液で希釈し、HTCasa IIソフトウェアを使用して、ハミルトンソーン（Hamilton Thorne）IVOS IIのチャンバー深度が公知であるLeja 4チャンバーキャピラリースライドの２チャンバーで、それぞれ７フレームを読み取り、Zeiss １０×対物レンズを備えた３７℃密閉ステージにて６０Ｈｚのフレーム捕捉速度で計算した。細胞濃度が５億／ｍＬを超え、試料中の前進運動性細胞の割合が６５％以上の場合は、射精液を利用した。
【０１０３】
精子の雌雄鑑別用の試料の調製：
染料ＴＡＬＰ中で最終容量０．０６ｍｇ／ｍＬに希釈されたHoechst 33342中に、精子細胞を２００Ｍ／ｍＬにて入れて、染色済み試料を室温で調製した。次いで、試料を３７℃の水浴中で４５分間インキュベートした。４５分後に、赤色染料ＴＡＬＰを染色済み試料に２：１ｖ／ｖ比で添加した。次いで、試料＋赤色ＴＡＬＰを、反転により完全に混合し、チューブトップ２０μｍ Partecフィルター（Partec＃04-0042-2315）を使用して濾過し、丸底５ｍＬチューブに等分した。
【０１０４】
雌雄鑑別サイトメーターのメトリクス：
染色して濾過した試料を、プロプラエタリー雌雄鑑別サイトメーターで実行した。試料のスループットは１７，５００細胞／秒に調整され、検出レーザーおよびキルレーザーをフォーカスした。適切なレーザーのフォーカスを確証するため、殺滅計数のアセスメントを実施した後、性別非対称の（sex skewed）試料を採取する。殺滅計数が成功した場合、集団は７５％超が死滅、９５％超がスライス済み、少なくとも２００個の細胞が計数される。上記のメトリクスを計器で達成できなかった場合、その計器は性別非対称の（sex skewed）精液を採取する目的に使用しないものとした。殺滅計数の成功後、ゲートを配置し、Ｘ染色体細胞を採取した。この細胞集団は、３５５ｎｍの波長の励起レーザーで測定された、高輝度Hoechst 33342蛍光を有する。計器がセットアップされてから１５分後、および最後の試料採取チューブが配置されてから１５分後に、サイトメーターの性能メトリクス、例えば、Ｙピークの高さ、Ｘピークの高さ、放出された蛍光強度毎のイベントのヒストグラムからの谷の高さ、ゲート率（％）、および死滅率（％）を採取した。
【０１０５】
性別非対称の（sex skewed）試料の選択および処理：
試料を泳動させて、３００〜４００ ｍＬの性別非対称の試料を採取した。その組成は、ＴＲＩＳ  Ａバッファーおよそ１７％、鞘液８０％、および細胞試料２％である。試料を、５ｍＬのＴＲＩＳ  Ａの入った５０ｍＬコニカルチューブに採取し、各チューブを最大容量３０ｍＬまで充填してから、交換した。総所要量を採取した後、雌雄鑑別済み精子を室温にて２４００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引し、廃棄して、ペレット容量を１ｍＬにした。再懸濁後、ＧＴＬＳ抗生物質溶液１７μＬを、各ペレットに加えた。次いで、チューブを室温の水１５０ｍＬで充満されたビーカーに入れてコールドショックを防止してから、４℃の冷蔵室に移した。
【０１０６】
４℃で９０分間平衡化した後、ＴＲＩＳ  Ｂ（グリセロール含有）を１５分間隔で３回に分けて試料の最終濃度２０％ｖ／ｖになるまで試料に添加することにより、試料を凍結保護した。前進運動性細胞の濃度を算定するため、ハミルトンソーン（Hamilton Thorne）IVOS II、およびHTCasa Animal Breeders IIソフトウェアを上記と同じ捕捉設定値に設定し、ただしXenon光源およびOlympus 10x UplanSApo対物レンズを使用した。
凍結保護された試料を、パッケージング存続延長剤（Packaging Extender）で運動性生細胞を最終濃度２．５Ｍ／ｍＬに希釈してから、MX4ストロー充填およびシーリングマシン（米国ミネソタ州メープルグローブのIMVテクノロジー社（IMV technologies）を使用して、０．２５ｍLの容量（米国ミネソタ州メープルグローブのIMVテクノロジー社製）を保持するミニストロー中に収容した。充填済みストローを、凍結トンネルを使用して急速に冷却した後、液体窒素中で保存した。
【０１０７】
出荷時品質管理アセスメント：
凍結プロセスを生き残った運動性細胞の数のアセスメントを行うため、ストロー１本を３７℃の水浴中で４５秒間解凍する。次いで、ストローを、予熱されたエッペンドルフチューブに入れる。続いて、試料を１０秒間穏やかにボルテックスして、試料を均質化する。その後、試料２０μＬをＱＣ希釈液２０μＬに加え、５秒間穏やかにボルテックスして、上記のCASA蛍光設定値で読み取る。ストロー体積の残部を、血液寒天プレート上に広げ、３７℃で２４時間放置した後、細菌コロニーを計数する。
【０１０８】
体外受精およびアセスメント：
卵母細胞の調製：
４つのウェル全てに４００μＬのBO-IVF（ウィスコンシン州ベロナのMOFA社製）を充填して４つのウェル受精プレートを調製し、３７℃、５％ＣＯ２で少なくとも１時間平衡化した。これと同時に、BO-IVC（ウィスコンシン州ベロナのMOFA社製）四ウェル胚培養プレートに、BO-IVC（ウィスコンシン州ベロナのMOFA社製）４５０μＬを充填したものを作製し、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２にて平衡化した。これら受精中に使用された各ロットのBO-IVC試料を等分し、条件付き胚培地のアセスメントを行う目的で、対照培地として−８０℃で保存した。卵母細胞および接合子の取り扱いはいずれも、熱引きガラスピペットを用いて行った。
【０１０９】
卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）は、畜場の卵巣から吸引することにより、採取された。ＣＯＣは、卵母細胞成熟培地（ウィスコンシン州ベロナのMOFA社製）で保温され、３７℃の加熱ステージで処理した。ＣＯＣを群化し、四ウェルプレートの処置群毎に卵母細胞６０個ずつ×３つのウェルに分けた。
【０１１０】
精液の調製：
処置群当たり３本の授精ストローを３７℃で４５秒間解凍した。次いで、８０％BoviPure（商標）（スウェーデンのニダコンインターナショナルAB社（Nidacon international AB）製）の密度勾配の上に重ねた。試料を５００ｘｇで１５分間遠心分離し、ペレットの付近で吸引してから、温かいＴＬ  ＨＥＰＥＳ（ウィスコンシン州ベロナのMOFA社製）中に再懸濁させた。それらの試料を３００ｘｇで５分間遠心分離し、１００μＬになるまで吸引し、その低容量物中にペレットを再懸濁させた。５μＬの試料アリコートを９５μＬの４％ＮａＣｌに加えて、細胞を固定化し、血球計算盤を使用して細胞濃度を定量化した。膜損傷が顕在化している細胞は、細胞密度計算の際に計数対象外とされた。精子懸濁液を、ＣＯＣ含有のウェル内に、ウェル当たり精子１２０万個（精子２万個／卵母細胞）にて加えた。
【０１１１】
卵丘卵母細胞複合体の除去：
精子を加えてから２４時間後に、同じ処置群のＣＯＣを、０．５ｍＬのＴＬ  ＨＥＰＥＳと１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼとを含有する１５ｍＬコニカルチューブにプールした。ＣＯＣを１分間ボルテックスし、３７℃の加熱ブロックに１分間戻してから、再び１分間ボルテックスした。推定接合子をＴＬ  ＨＥＰＥＳプレートで洗浄してから、使用前に２４時間平衡化した成熟培地（ウィスコンシン州ベロナのMOFA社製）の入った胚培養プレート中に収容した（上記の卵母細胞調製物）。次いで、接合子を含むものであると推定されるプレートを、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２にて静置してから、残りのＩＶＦ治験を実施した。
【０１１２】
発育アセスメント：
８日間の受精後のインキュベーション中に、発育アセスメントを３回にわたって実施した。卵割イベントを、初期受精の４８時間後に定量化した。胚盤胞は、発育段階に基づいて、胚盤胞を可／否（yes/no）の双対尺度でスコア付けした。胚が少なくとも初期の胚盤胞期に到達した場合は、胚盤胞として記録した。初期、拡大、および孵化した胚盤胞間の相違点は記録せず、胚盤胞のスコアも記録しなかったが、将来の特性評価を容易にするため胚盤胞は修正された。初期受精後７日目および８日目の両日に、卵母細胞当たりの胚盤胞変換を、視覚的に判別した。発育段階における全ての判別は、３７℃に設定された加熱ステージにて解剖スコープを使用して、熟練ＩＶＦ技師によって実施された。
【０１１３】
初期受精イベントのアセスメント：
初期受精から２４時間後に、推定接合子からＣＯＣを取り除いてから、接合子２０〜３０個のサブセットを固定し、単精子／多精子イベントのアセスメントを行うために作製された専用キットを使用して染色した。ＤＮＡ染料は、Hoechst 33342である。全ての推定接合子を、４つのカテゴリー：単精子受精、多精子受精、未受精、またはその他のうちの１つでスコア付けした。他のカテゴリーには、存在していたにもかかわらず、スコア付け不可能となった接合子が含まれる。原因は。ＣＯＣからの不明瞭な蛍光が一部しか除去されなかったこと、または接合子が断片化したことである。２つの前核を呈する接合子は単精子と見なされる一方、３つ以上の前核を呈する接合子は多精子としてスコア付けされた（Yang et al., 1993）。各スコアの代表的な画像を示す画像を、図６に示す。
【０１１４】
受精後８日目の試料の固定：
８日目の胚盤胞変換の最終的アセスメント後に、試料をInvitrogen（商標）RNAlater（商標）（米国マサチューセッツ州サーモフィッシャーのウォルサム社（ThermoFisher Waltham）製）で固定した。胚盤胞を２つの群に分けて２本のチューブに入れ、遺伝子アセスメントの反復測定を可能にした。変性した接合子を３本目のチューブに加えた。胚盤胞当たり４０μｌのRNAlater（商標）または縮退を各チューブに加え、サーモフィッシャー社（ThermoFisher）推奨の１０：１ｖ／ｖを加えた。これらの試料を、４℃で少なくとも２４時間ないし最大１時間まで静置した後、サーモフィッシャー社（ThermoFisher）提供の取扱説明書に従って、長期保存のため−２０℃に移した。また、液滴からの馴化成熟培地も採取し、ＲＮＡが保全されるように−８０℃で保存した（Vaught and Henderson, 2011）。
【０１１５】
統計的分析：
統計的分析はいずれも、OriginPro 2017 ６４ビットソフトウェアを使用して実行された。有意性に対する閾値は、ａ＝０．０５に設定した。生データの変換を行ってデータを正規化することにより、ＡＮＯＶＡ分析を可能にした。下記の２つ：代わりに自然対数変換を使用して変換された多精子率、および未受精率、を除く全てのデータを正規化するには、アークサイン変換で十分とされた。
【０１１６】
結果：
本実験中にアセスメントされた、最早の接合子の時点は、処置群間の受精有効性であった。受精イベントは、各処置用ウェルからサンプリングされた、アセスメント済み接合子（初期卵母細胞）の総数の割合として定量された。報告された生データで正規分布を達成するため、２つのイベント（多精子性イベントおよび未受精イベント）を除く全てのデータセットに対してアークサイン変換を実行した。この実行には、正規性を達成するため自然対数変換を要した。正規性検定は、OriginProで実行された（不図示）。
【０１１７】
単精子性イベントは、群間で有意差がなかった。Ｔ０  ＳＶＦＥＭ処置群：５５．７％；単精子受精対照：４５．３％（ボンフェローニ検定では、Ｔ０と対照との比較でｐ＝０．２４０を意味し）、対照との比較でＴ２４  ＳＶＦＥＭ：５４．３％、ｐ＝０．６５１（図８）。未受精卵母細胞は、対照と比較してＳＶＦＥＭ処置群で有意に低い割合で発生した。対照＝４５．２％、Ｔ０  ＳＶＦＥＭ＝２６．０％、およびＴ２４  ＳＶＦＥＭ＝２３．７％未受精卵母細胞（図９、ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．００２、ボンフェローニ検定では、Ｔ０  ＳＶＦＥＭと対照の比較でｐ＝０．００４を意味し、Ｔ２４  ＳＶＦＥＭと対照の比較でｐ＝０．０１４を意味する）。ＳＶＦＥＭで処置された試料では、多精子イベントの割合が上昇しているように見えた。対照では８．７％の多精子受精、Ｔ０  ＳＶＦＥＭでは１７．１％、Ｔ２４  ＳＶＦＥＭでは２０．０％であったが、群間に有意差はなかった。自然対数変換されたデータに対する一元配置ＡＮＯＶＡでは、全体ｐ値は０．２７９であった（図７）。これらのデータから示唆されるように、ＳＶＦＥＭ処置群では、受精イベント総数が他の群よりも多く見られた。これらの特定のＩＶＦ条件下で多精子受精を増強させる潜在的なリスクを伴った。
【０１１８】
受精後２日目の卵割イベントを定量化することにより、胚発育のアセスメントを行った。接合子母細胞当たりの卵割済み接合子率は、対照で６５．５％、Ｔ０  ＳＶＦＥＭで７４．４％、Ｔ２４  ＳＶＦＥＭで７６．０％であった（図１０）卵割された胚の割合は、両方の処置群で有意に高かった。ボンフェローニ検定では、Ｔ０と対照との比較でｐ値＝０．００２、Ｔ２４と対照との比較でｐ値０．００１であった。ＳＶＦＥＭ処置群Ｔ０とＴ２４の両方が、受精卵母細胞当たりの卵割胚のパーセンテージを増強させたことが示唆される。
【０１１９】
また、受精後７日目に定量化された卵母細胞当たりの胚盤胞の割合も、ＡＮＯＶＡ分析を容易にする目的でアークサイン変換された。７日目の胚盤胞の平均パーセントは、対照、Ｔ０  ＳＶＦＥＭ、およびＴ２４  ＳＶＦＥＭでそれぞれ９．０％、１２．４％、および１１．７％であった（図１１）。両方の処置群は対照とは有意に異なっていた。ボンフェローニ検定では、Ｔ０  ＳＶＦＥＭと対照との比較でｐ＝０．００８を意味し、Ｔ２４  ＳＶＦＥＭと対照との比較でｐ＝０．００２を意味する。これらのデータにより実証されたように、ＳＶＦＥＭで処置された精子により受精した卵母細胞当たりの胚盤胞変換は、存続延長無し対照とされた雌雄鑑別済み精液と比較して、受精後７日目に増加した。
【０１２０】
胚発育の最終アセスメントは、受精後８日目に実施された。受精卵母細胞当たりの平均胚盤胞率は、対照、Ｔ０  ＳＶＦＥＭ、およびＴ２４  ＳＶＦＥＭでそれぞれ１２．７％、１６．１％、および１５．０％であった（図１２、ｎ＝４６）。雌雄鑑別済み対照とＴ０  ＳＶＦＥＭとの間には有意差があった（ｐ＝０．０３７、ボンフェローニ検定における比較を意味する）。Ｔ２４  ＳＶＦＥＭと対照との比較では、ｐ＝０．１４３。同日に雌雄鑑別された、ＳＶＦＥＭによる存続延長済み精子による受精は、８日目に分割射精雌雄鑑別済み対照に対して測定されたように、受精卵母細胞当たりの胚盤胞の数より３パーセンテージポイント、または２５％増加した。２４時間のインキュベーション後に雌雄鑑別された、ＳＶＦＥＭによる存続延長済み射精液の胚盤胞変換率に、対照の存続延長無しの雌雄鑑別済み精液とは統計的差異のないことが認められた。単精子イベントが増加した可能性のあることから、ピアソン相関分析を行って、単精子受精率が８日目の胚盤胞の数と相関しているかどうかを判別した。ピアソン相関において計算されたｐ値は０．００１未満であったことから、これら２つの転帰の間に正の関係が存在することが示唆される。
【０１２１】
８日目に測定された胚盤胞変換の違いが、雄牛の育種、星格付け、または年齢に起因し得るかどうかを判断するため、追加的な分析を実施した。８日目に受精した卵母細胞当たりの平均胚盤胞パーセントは、本治験中にＩＶＦでアセスメントされた全ての採取済み射精液による転帰を平均することによって、各雄牛について計算された。図１４の育種、図１５の星格付け、および図１６の年齢範囲に基づいて、雄牛を分離する散布図を作製したが、必然的帰結の傾向は、いっさい顕在化されていない。これらのカテゴリーへの分離は不均一であり、多くの場合、少なくとも１つのカテゴリーは、種馬１頭だけで表され、本分析から統計的結論を導き出す能力が制限されていた。
【０１２２】
第２の分析セットでは、ＳＶＦＥＭで処置された精液および雌雄鑑別済み精液対照の両方を、卵母細胞の品質管理として使用された従来の雌雄鑑別無しの精液と比較した。ＩＶＦ治験中に測定された全てのパラメーターについて、卵割、７日目の卵母細胞当たりの胚盤胞、および８日目の卵母細胞当たりの胚盤胞では、従来の雌雄鑑別無し対照精液は、両方の処置群と雌雄鑑別済み精液対照よりも有意に大きかった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１、図１７、図１８および図１９）。従来精液の受精効率は、単精子分析ではアセスメント対象外とされた。これらのデータから明らかなように、ＳＶＦＥＭで処置された射精液は、対照とされた雌雄鑑別済み精液と比較して卵割または胚盤胞変換率を増強する可能性がある一方、精液存続延長剤は、精子受精能力を増強させず、雌雄鑑別無しの従来の精液に匹敵する通常の精液に匹敵するレベルに達した。
【０１２３】
考察：
先に概説されている結果から示唆されるように、ＳＶＦＥＭで処置された射精液は、受精適格精子を生成する。このことは、存続延長無し対照と比較して、両方のＳＶＦＥＭ射精で統計的に同様な割合で発生する単精子受精イベントによって実証された。また、これらの受精済み接合子は、約8細胞期（Viuff et al., 1996）の胚性転写物の活性化の時点を過ぎて、形態学的にアセスメントされた胚盤胞期まで胚発育を生起し得る。単子精子受精の数は、ピアソンの相関係数検定で８日目に計数された胚盤胞の平均数とｐ値＜０．００１にて正に相関する。このように８日目の胚盤胞変換率が増加した原因としては、単精子受精が増加したことが考えられることを示唆するものである。
【０１２４】
いずれの試験群に関する歴史的公報に基づけば、多精子の発生率が予期されたレベルを超過しているようには見えない。以前の研究では、約１５％の雌雄鑑別無しの精液を使用して、ウシＩＶＦの成熟卵母細胞における多精子発生率を定量化した（Cebrian-Serrano et al., 2012）。多精子受精の発生率が、従来の雌雄鑑別無しの精液で１５％と報告された文献（片側ｔ検定）を有意に上回ることは、対照、Ｔ０  ＳＶＦＥＭ、またはＴ２４  ＳＶＦＥＭのどちらの群によっても実証されなかった。生成された従来の雌雄鑑別無しの精液で受精した接合子は前核染色でアセスメントされなかったため、雌雄鑑別無しのウシ精液を用いた特定の試験条件下での多精子イベントの数との直接比較はできない。
【０１２５】
両方のＳＶＦＥＭ処置群において、７日目の胚盤胞変換と８日目のＴ０  ＳＶＦＥＭのみで有意性を達成することに差異が見られたことから、処置群の胚盤胞の数が対照よりも早く胚盤胞ステージに到達したのか、それとも、７日目および８日目の間に対照が、胚盤胞数がＳＶＦＥＭ処置群よりも急速に増加したのかに関して、疑問が生じた。７日目および８日目の差異を見て分かるように、平均して全ての群が約３．５％増加している。このことから、７日目から８日目までの増加は、試験された全ての群で一貫していることが、示唆される。更に、群間で７日目から８日目の胚盤胞のパーセント差に有意差はなく、７日目および８日目の有意差における相違点は、直ちに説明されるであろう。７日目および８日目の胚盤胞の変化率の全体ＡＮＯＶＡ分析０．７２３のｐ値を与えた。ただし、７日目から８日目までの平均の変化を見ているＡＮＯＶＡ分析は、０．１０と検出力が低い。測定された差を比較した箱ひげ図を、図１３に示す。採取されたデータから、Ｔ２４  ＳＶＦＥＭと対照とされた雌雄鑑別済み精液との間の有意性の喪失した原因を同定することはできない。
【０１２６】
このＩＶＦ治験中の受精および胚発育イベントが増加した原因としては、いくつかの異なる理論的機序が考えられる。第１に、ＳＶＦＥＭで処置された精子細胞がＢＯ−ＩＶＦ培地中のヘパリンの用量に対して反応性が高まったことである。エバージェンバイオテクノロジーズインク（Evergen Biotechnologies, Inc.）による以前の研究から実証されたように、受精培地中のヘパリンのカスタム計算されたレベルは、雌雄鑑別済み精液で行われるＩＶＦにおける胚発育の増加につながる可能性がある。この原因は、異なる種馬由来の射精液がヘパリンによる活性化に対して特異的に感受性であることである（Xu et al., 2009）。本治験に使用されたヘパリン添加培地は、一定用量のヘパリンを含んでいたため、ＳＶＦＥＭ存続延長剤が精子のヘパリンに反応する能力に影響を及ぼし、受精率および胚発育率を変化させた可能性がある。この仮説を試験するため、ＳＶＦＥＭで処置された受精用量を、可変ヘパリン濃度を使用するＩＶＦ治験で評価する。それにより、単精子受精および胚盤胞変換が改変されて、ヘパリン投与量が変化するかどうかを判別できる。
【０１２７】
第２の機序として考えられるのは、ＳＶＦＥＭ存続延長剤を用いたインキュベーション中にＳＶＦＥＭが精子を受精能化する可能性のあることである。透明帯（zona pellucida）との相互作用を可能にするには、受精能獲得を完了すべきである（Yanagimachi, 1994）。受精能獲得の全プロセスは、完全には理解されていないが、カルシウムは受精能獲得プロセスをトリガーする一助となる。カルシウムはまた、受精能獲得により活性化される過活性を増強させることでも公知である（Lopez and Jones, 2013）。受精能獲得の完了は過活性化につながり、ひいては、運動および受精の効能が高まる（Smith and Yanagimachi, 1989）。ＳＶＦＥＭ調合物にカルシウムが含有されていることを把握すれば、インキュベーション時間を長くすることによって受精能獲得が増強される可能性があり、結果として、精子の受精が、未処置対照群と比較して短時間のインキュベーション後に、準備される。この理論を試験するために、凍結融解したＳＶＦＥＭで処置された精液および対の対照の精液の運動性パラメーターを融解し、ＢＯ−ＩＶＦ受精能獲得培地でインキュベートし、測定された速度を比較する。また、先体反応を明視化するため、蛍光顕微鏡を使用して受精能獲得をアッセイしてもよい。
【０１２８】
第３の可能性は、ＳＶＦＥＭ存続延長剤中に存在する抗酸化物質が、雌雄鑑別プロセスにおける精子の酸化ストレスおよびＤＮＡ損傷を最小限に抑え、最終的に胚の発育を改善できることである。雌雄鑑別プロセス中には、紫外線を使用して、全ての精子中のHoechstを興奮させ、これにより、鎖を切断し、酸化された塩基対に損傷を与えてしまう恐れのあるＲＯＳを生成してしまう（Richter et al., 1988; Kong et al., 2009）。放射線によって精子においてＤＮＡ損傷が誘発された場合、後期の胚発育が防げられるが、初期受精率または卵割率には変化がない（Fatehi et al., 2006）。ＳＶＦＥＭ処置群では、卵割率および胚盤胞発育の両方が、対照群と比較して有意に向上されている。このことから、ＳＶＦＥＭによる存続延長が及ぼす影響によって、細胞の挙動における差異が複数生じ得ることが示唆される。
【０１２９】
ＩＶＦ治験中に採取されたデータから、アセスメントされた全てのパラメーターで、Ｔ０  ＳＶＦＥＭはＩＶＦにおいて対の対照よりも性能が良好であったという、包括的な結論が為された。また、Ｔ２４  ＳＶＦＥＭの性能は、卵母細胞当たりの卵割および胚盤胞の７日目の変換では対照を上回っていた一方、他の測定済み転帰では対照とは有意な差がなかった。事実上、ＡＮＯＶＡ分析において、Ｔ２４  ＳＶＦＥＭで処置された試料は、対照の存続延長無しの精液よりもＴ０  ＳＶＦＥＭが有意に大きかった場合でさえも、Ｔ０  ＳＶＦＥＭおよび対照精液と比較して、いずれの群とも差異がなかったことが明らかにされた。このことから示唆されるように、Ｔ２４  ＳＶＦＥＭ試料の性能は、少なくとも対照と同様であるが、ただし、Ｔ０  ＳＶＦＥＭの性能よりも有意に低いとは限らない。したがって、ＳＶＦＥＭで存続延長し、雌雄鑑別前に最大２４時間インキュベートすると、卵母細胞を受精させ、存続延長無しの雌雄鑑別済み精液と同等以上の初期胚発育イベントが発育する、雌雄鑑別済み精液産物が生成される。雌雄鑑別プロセス開始前の時間を増やすことにより、卵母細胞を受精させる能力、および形態学的には正常な卵割済み胚盤胞を生成する能力が維持される一方、採取された射精液容量当たりの雌雄鑑別済み精液受精用量の数の増加と同様に、現行の手技が有意に改善されるのが、通例である。この試験の初期段階では、生成されたものと推定される胚盤胞の生存能力がアセスメントされなかったが、視覚的にアセスメントされた正常な胚盤胞構造が生じたことから確証されたように、ＳＶＦＥＭで処置された細胞は、胚性転写物を活性化するという域を超えて、受精能力を有するだけでなく、初期胚発育を完了させる能力をも有する。ＳＶＦＥＭを当社の雌雄鑑別済み精液製品に実装することを可能にするには、事前に、生体内での受精効率、妊娠率、および出産率の評価を目的とした、将来の試験を実施する必要がある。
【０１３０】
実施例２
種馬２頭の射精液は、分割射精液として処理され、その半分は、対照とされた雌雄鑑別済み精液を生成し、残りの半分は、２４時間ＳＶＦＥＭで存続延長してから、雌雄鑑別済み精液を生成した。相対的受胎率は、［（ＳＶＦＥＭによる存続延長済みの妊娠率（％））／（対照の妊娠率（％））］＊１００として報告される。
【０１３１】
種馬１では、相対ＳＶＦＥＭ／対照受胎率（相対受胎率）が９２％であった。
【０１３２】
種馬２では、相対的受胎率が１２６％であった。
【０１３３】
両種馬間の平均は１０９％である。
【０１３４】
このデータから示唆される場合、妊娠は、２４時間のＳＶＦＥＭによる存続延長済み精液で達成できる。
【０１３５】
初期データポイントである妊娠率は、対照と同様に見える。
【０１３６】
実施例３
（表２）試験用希釈培地中で解凍後のＩＶＦ転帰を速度測定に関連付ける、ピアソンの相関係
数値強調表示されている値は、ａ＝０．０５にて勾配値がゼロとは有意に異なることを示す。報告されるＲ２は、調整されたＲ２値である。
2021500927.tif 000003
【０１３７】
培地レシピ：
別途明記されていない限り、全ての化学物質はSigma-Aldrichを通して購入されたものである。
【０１３８】
タイロード液：１リットルＨ２Ｏ溶液
９４．５ｍＭ  ＮａＣｌ
３ｍＭ  ＫＣｌ
３００μ  Ｎａ２ＨＰＯ４
１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３
４００μΜ  ＭｇＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ
浸透圧１８０〜１９０ｍＯｓｍ
０．２２μｍボトルトップＰＴＦＥフィルターで濾過
【０１３９】
染料ＴＡＬＰ：
１リットルのタイロード溶液
２５ｍＭ乳酸ナトリウムシロップ（６０％ｗ／ｗ）
５ｍＭグルコース
４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム
３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（画分Ｖ）
ｐＨ７．６
浸透圧２９０〜３２０ｍＯｓｍ
０．２２μｍボトルトップＰＴＦＥフィルターで濾過
【０１４０】
赤色ＴＡＬＰ：
１９２８ｍＬの染料ＴＡＬＰ
６０ｍＬ卵黄
１２ｍＬの１％食紅
ｐＨ５．８
デカンテーション前に２４時間静置
【０１４１】
運動性希釈液：
３００ｍＬの染料ＴＡＬＰ
６００ｍＬの赤色ＴＡＬＰ
０．２２μｍボトルトップＰＴＦＥフィルターで濾過
【０１４２】
ＴＲＩＳ  Ａ：
１４４０ｍＬの滅菌ミリ（Milli）Ｑ  Ｈ２Ｏ
１６０ｍＬの１０×ＴＲＩＳストック
４００ｍＬ卵黄
反転させて混合
デカンテーション前に４８時間待機
２％ｖ／ｖデカンテーション済みＴＲＩＳ  ＡにＧＴＬＳを添加
【０１４３】
ＴＲＩＳ  Ｂ：
１０１２ｍＬの滅菌ミリＱ  Ｈ２Ｏ
２００ｍＬの１０×ＴＲＩＳストック
６６ｍＬ卵黄
７２０ｍＬグリセロール
２．０ｍＬ緑色の食用色素
０．１％ＧＴＬＳ  ｖ／ｖ  ＴＲＩＳ  Ｂ
【０１４４】
パッケージング存続延長剤：
４００ｍＬのＴＲＩＳ  Ａ
８０ｍＬのＴＲＩＳ  Ｂ
【０１４５】
ゲンタマイシン硫酸塩溶液：
５２．０ｇゲンタマイシン硫酸塩（粉末、アムレスコ社（Amresco）＃０３０４）
５００ｍＬの滅菌ミリＱ  Ｈ２Ｏ
【０１４６】
タイロシン溶液：
８．８５タイロシン（酒石酸タイロシン；ミッドウェストヴェテリナリーサプライ社（Midwest Vet Supply））
５００ｍＬ滅菌ミリＱ  Ｈ２Ｏ
【０１４７】
ＧＴＬＳ：
４ｍＬゲンタマイシン硫酸塩溶液
３ｍＬタイロシン溶液
３ｍＬリンコ−スペクチン（Linco-Spectin）ストック（５０ｍｇリンコマイシン／１００ｍｇスペクチノマイシン；ミッドウエストベットサプライ社（Midwest Vet Supply））
【０１４８】
ＱＣ希釈液：
１０ｍＬのウシＴＦシース液（米国テキサス州のキャタバイオシステムフォートワース社（Chata Biosystems Fort Worth））
２ｍＬのＴＲＩＳ  Ｂ
２４０μＬの１％食紅
【０１４９】
Ｍｇ２＋およびＣａ２＋不含ＰＢＳ：
８ｇのＮａＣｌ
０．２ｇのＫＣｌ
１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４
０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４
ｐＨ７．４のジＨ２Ｏ溶液１リットルを作製し、濾過して室温で保存
【０１５０】
溶解液：
２．５Ｍ  ＮａＣｌ
０．１Ｍ  ＥＤＴＡ  Ｎａ２
１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ
ｐＨ１０、濾過して４℃で保存
【０１５１】
１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：
１０ｍＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
９０ｍＬの溶解バッファー
４℃で保存
【０１５２】
中和用バッファー：
０．４Ｍ  ＴＲＩＳ
ｐＨ７．５、室温で保存
【０１５３】
電気泳動溶液：
０．３Ｍ  ＮａＯＨ
１ｍＭ  ＥＤＴＡ  Ｎａ２
ｐＨ１３
使用の都度新鮮にし、少なくとも１時間４℃に予冷
【０１５４】
酵素反応バッファー：
４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
０．１Ｍ  ＫＣｌ
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ  Ｎａ２
０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ
ｐＨ８．０
１０×ストックとして作製し、−２０℃で凍結されたアリコート
【０１５５】
アガロース：
ジＨ２Ｏで作製されたアガロース希釈液
低融点の標準アガロースは、インビトロジェン社（Invitrogen）から購入されたものであった。
【０１５６】
プレコーティング付きアガローススライド：
ガラスビーカーで、１％アガロース１００ｍＬを溶かす。片面擦りガラススライドを、アガロース中に浸漬した。スライドの裏側を拭いて、汚れを落とした。室温にてスライドを倒した状態で平置し、塵埃から保護して、一晩乾燥させた。翌日、スライドボックス内のスライドを交換して保存してもよい。
【０１５７】
エンドヌクレアーゼを介したアルカリコメットアッセイの方法の最適化
１９８４年にOstlingおよびJohansonが初期のアッセイを開発して以来、コメットアッセイを使用して、多くの種類の細胞における単一細胞ＤＮＡ損傷が定量化されてきた。異なる電気泳動バッファーｐＨ条件を用いた２通りのコメット技術としては、二本鎖の切断の程度を定量化すると報告されているアルカリコメットアッセイ（Singh et al., 1988）、および一本鎖の切断の特異性の高いニュートラルコメットアッセイ（Olive et al., 1991）が台頭した。グリコシラーゼおよびヌクレアーゼの消化ステップを追加する機能によって、コメットアッセイの用途が増強されており、鎖の切断のほか、他の種類のＤＮＡ損傷も顕在化している（Piperakis 2008）。特定のエンドヌクレアーゼ切断は、ＤＮＡが酸化された箇所だけに限られる。エンドヌクレアーゼが、酸化された部位を鎖の切断に変換するので、それにより、標準コメットアッセイ電気泳動後に、鎖切断が定量化可能となる（Collins et al., 2008）。
【０１５８】
精子のＤＮＡの整合性は、エンドヌクレアーゼを介したアルカリコメットアッセイを使用してアセスメントされ、受精能プロファイルに関連してきた。これにより、コメットアッセイによって定量化されたＤＮＡ損傷と精子受精能との相関関係が確証されている（Bittner et al., 2018（ウシ）；Hughes et al., 1996（ヒト）；Mukhopadhyay et al., 2010（ウシ））。過酸化水素を投与してＲＯＳを増加させた後、エンドヌクレアーゼを介したアルカリコメットアッセイにより、精子のＤＮＡ断片化が、有意に増加した（Hughes et al., 1996）。人工的に酸化ストレスを受けた精子による受精に関する評価によって、受精率が悪影響を受けることが明らかにされてきた（Aitken et al., 2009）。別のウシ研究によって明らかにされたように、卵母細胞が、特に酸化的損傷を被った精子により受精したとき、胚発育が低減する（Bittner et al., 2018）。
【０１５９】
精子は、ほとんどのＤＮＡ修復機序を欠いているのが原因で、外因性ＤＮＡ傷害に対し特に敏感である（Aitken and Baker, 2006）。精子の雌雄鑑別時にＲＯＳ（ひいてはＤＮＡ損傷）を助長させてしまう恐れのある２つのプロセスは、ＤＮＡ結合色素を励起するのに使用されるＵＶ光、および凍結保護ステップにおいて使用されるグリセロールである（Aitken et al., 2015; Farber, 1994）。正常な精子の活性化および受精能獲得には、ＲＯＳを低レベルとする必要がある（Agarwal et al., 2003; Aitken and Baker、2002）反面、細胞内ＲＯＳの濃度が高い場合は、一本鎖および二本鎖の切断（Aitken and Krausz、2001）、ならびに塩基の改変、欠失、およびフレームシフト（Twigg et al., 1998b; Duru et al., 2000）を増加させてしまうことが明らかにされてきた。これらのＤＮＡ傷害が精子に蓄積する原因は、細胞の抗酸化酵素不足にあるとされている（Aitken and Fisher, 1994）。ＤＮＡ損傷が蓄積されると、受精および胚発育に悪影響が及ぶ恐れがある（Aitken et al., 2009およびBittner et al., 2018）。
【０１６０】
以前の文献では、ＤＮＡの二本鎖および一本鎖の切断は、雌雄鑑別済み精子および雌雄鑑別無しの精子において定量化されており、このことから結論付けられたように、雌雄鑑別済み精液では、雌雄鑑別無しの精液と比較して、ＤＮＡ損傷のレベルの増加が見られない（Boe-Hansen et al., 2005; Gonsalvez et al., 2010）。しかしながら、これら雌雄鑑別済み精子のアセスメントに使用されたのは、ベルトビル（Beltsville）法であって、本出願に開示されている雌雄鑑別手技（所望されない細胞集団をＵＶレーザーで除去する手技）は使用されなかった。この差異は、細胞の曝露される紫外線損傷が多くなり、且つ誘発されたＤＮＡ損傷を助長させてしまう恐れがある。ＵＶレーザーアブレーションによって生成された雌雄鑑別済み精液は、この方法ではまだアセスメントされていない。加えて、雌雄鑑別済み精液のＤＮＡの完全性に関する以前の研究では、特定のＤＮＡ塩基対修飾による損傷を露呈させる目的に、いかなるエンドヌクレアーゼ処置も使用していなかった。このエンドヌクレアーゼ処置は、ＲＯＳ固有の損傷を理解するのに重要とされるものである。
【０１６１】
ＳＶＦＥＭには、酸化シンクとして機能し得る抗酸化剤およびリン脂質が含有されているため、精子へのＲＯＳ蓄積を緩和する可能性がある。エンドヌクレアーゼを媒介したアルカリコメットアッセイを使用することにより、精子の雌雄鑑別中に発生する酸化的ＤＮＡ修飾がＳＶＦＥＭによる存続延長によって軽減されるかどうかを、判別できる。酸化ストレスを受けた精子受精の比較で報告された文献の転帰と同様な、ＳＶＦＥＭで処置された試料における胚発育および受精率の向上により、雌雄鑑別に起因する酸化的ＤＮＡ損傷がＳＶＦＥＭによる存続延長によって軽減されるという仮説が立てられている。
【０１６２】
材料および方法：
下記実験に使用された培地の概要は、上述されている。
【０１６３】
コメットアッセイ：
全体的なコメットの実験概要は、Hartmann et al., 2003に記載されている手順に従ったものである。概略説明すると、細胞を単離し、低融点アガロースゲルに埋め込み、溶解条件に曝して、電気泳動溶液で平衡化し、０．７Ｖ／ｃｍで最低３０分間電気泳動させてから、中和し、染色して、撮像した。溶解液界面活性剤の混合物および濃度が変化し、それにつれて、溶解条件の期間および温度も変化した。全ての実験には、２００μＭ  Ｈ２Ｏ２で処置された陽性対照スライド（Hughes et al., 1996において以前に記載されたような、ＤＮＡ損傷の誘発が見られることが、予期されるもの）と、ジＨ２Ｏで処置された陰性対照スライド（ベースラインのＤＮＡ損傷のみが予想されるもの）と、が含まれていた。実験にはエンドヌクレアーゼ処置（Endo III）も含まれていた。この処置に関しては、鎖の切断の誘導に起因するＤＮＡ損傷の増加が見られることが、予期されるであろう（Kushwaha et al., 2011）。これにより、コメットアッセイ用に、４つの処置群：Ｈ２Ｏ２＋Ｅｎｄｏ  ＩＩＩ（陽性／陽性スライド）、Ｈ２Ｏ２＋１×酵素反応バッファー（陽性／陰性スライド）、ジＨ２Ｏ＋Ｅｎｄｏ  ＩＩＩ（陰性／陽性、およびジＨ２Ｏ＋１×酵素反応バッファー（陰性／陰性スライド）が含まれた。
【０１６４】
溶解バッファーを改質するには、界面活性剤の化学組成を変えるためドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはＮ−ラウリルサルコシンを添加することを要する。両方とも、コメットアッセイでマトリックスからＤＮＡを遊離させる目的に使用されてきた（Ward, 2013; Bittner et al., 2018）。溶解の温度および期間の変化は、溶解バッファーの化学組成およびラボでの以前のコメット溶解試行の転帰に基づいて、実験毎に改変された。プロタミン除去用のプロテイナーゼＫと、ジスルフィド結合切断用のジチオトレイトール（ＤＴＴ）とを含めることも、以前に公開された精子コメットデータに基づいて試験された（Donnelly et al., 2000; Hughes et al., 1996）。
【０１６５】
全ての実験は、８０％BoviPure（商標）勾配を用いて開始し、死滅した精子またはスライスされた精子を精子調製物から取り除いた。そのため、ＤＮＡ損傷の測定は、雌雄鑑別プロセスおよび凍結プロセスを生き残った精子における損傷だけに限られている。エチジウムモノアジドブロミド（ＥＭＡ）は、ＤＮＡに共有結合し、且つ励起／発光波長がコメットテールを明視化する目的に使用されてきたHoechst 33342とオーバーラップしないライヴ／デッド（live／dead）染料である。このＥＭＡを、この勾配ステップおよび遠心分離ステップの前に含めることにより、コメットアッセイ前に死滅した細胞で、BoviPure（商標）ステップ中に除去されなかったものを、画像分析中に定量化の対象とならないように除外した。スイングバケット遠心分離機で、５００ｇにて１５分間遠心分離を実行し、試料を１００μＬまで吸引してから、室温１ｘＴＲＩＳバッファー１ｍＬ中に再懸濁させた。次いで、試料を、再度３００ｇにて５分間遠心分離した。上清を吸引し、再び廃棄して、１００μＬラインにした。細胞密度は、血球計算盤、Nucleocounter SP-100、またはCAS Aのいずれかで測定した。精子は、１ｘＴＲＩＳバッファーで希釈された。エッペンドルフチューブで室温にて１５分間過酸化水素処置を行ってから、スライドに添加した。精子を１％ＬＭＰアガロースと混合し、１：１希釈率にて最終細胞濃度を達成した。精子／ＬＭＰアガロースミックスを、プレコーティング付きアガローススライドに素早く加え、氷上で固化させた。スライドをコプリン瓶に加え、溶解条件のうちの１つを遂行した。事前に（４℃に）冷却した電気泳動溶液を用い、室温にて２０分間電気泳動平衡化を行った後、０．７Ｖ／ｃｍ、３００ｍＡにて３０分間電気泳動を行った。スライドを中和用バッファーで室温で中和し、風乾した後で、染色および撮像した。
【０１６６】
結果：
精子は、体細胞と比較して特殊化されたＤＮＡパッケージングシステムを利用して、ヒストンをプロタミンに置き換える。コメットアッセイでは、細胞を溶解してアガロースゲル中の核を露出させるだけでなく、ＤＮＡを脱凝縮させて電気泳動場で遊走できるようにする必要もある。コメットアッセイを雌雄鑑別済み精液に適用する最初のステップは、ＤＮＡを効率的に脱凝縮する溶解条件を同定することとされた。実験的な溶解条件には、溶解温度および溶解時間の改変、ＳＤＳ、サルコシン、プロテイナーゼＫ、ならびにＤＴＴを用いた処置が含まれる。濃度が各溶解成分ごとに異なっていた。以前に報告されたプロトコールに従って、濃度を上昇させ、且つ／あるいはインキュベーション時間を増加させた。
【０１６７】
初期の実験では、溶解バッファーの洗剤成分としてＳＤＳおよびＴＸ−１００の両方を使用した（Ward, 2013）。ただし、溶解バッファーの濃度が０．５％の場合、４℃の溶解中にＳＤＳが溶液から沈殿した。溶解温度を室温に変更することによってＳＤＳが析出するのを回避した一方で、核は視覚的に無傷のままに維持した。室温溶解ステップ（Enciso et al., 2009）にてＳＤＳ濃度を１％に上昇させると、ゲルの完全性の問題が生じた。明視野顕微鏡法で清澄な膜を備えた精子の視覚的に無傷の核によって実証されたように、ＤＮＡの脱凝縮は改善されなかった。そのため、サルコシンをＳＤＳの代替として試験した。
【０１６８】
Ｎ−ラウリル−サルコシンは、膜溶解、ならびにヒストンおよびプロタミン除去用のコメットアッセイにおいて繁用されるもう１つのアニオン性洗剤であるが、ＳＤＳとは異なり、４℃において可溶性の状態のままに維持される。０．５％または１％のサルコシン（依然として１％ＴＸ−１００を含む）を含有する溶解バッファーを、４℃にて最大溶解時間２４時間で試験した（Fairbairn and O'Neill 1996; Bittner et al., 2018）。核膜は溶解後も依然として可視であったが、更なる最適化が必要であることが示唆された。
【０１６９】
プロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ）は通例、ＤＮＡマトリックスからタンパク質を除去する目的で、精子コメットアッセイ溶解バッファー中に使用される（Hughes et al., 1996）。酵素を機能的に活性化するためには、３７℃でインキュベートする必要がある。また、精子コメットアッセイでは、ジスルフィド結合を切断する還元剤であるＤＴＴを、プロテイナーゼＫと併用して（２ｍＭ〜５ｍＭ）配合するのが通例である（Castro et al., 2018; Hisano et al 2013）。プロテイナーゼＫ／ＤＴＴ消化ステップが、初期の界面活性剤溶解後に追加され、インキュベーションは３時間〜２４時間の範囲で実施した。しかし、追加された消化ステップにおいて、コメットアッセイスライド上の清澄な核膜の観察は変化しなかった（図２０）。
【０１７０】
核膜への界面活性剤のアクセスを改善するため、化学的溶解に先立って、１ミリリットルのＤｏｕｎｃｅホモジナイザー（米国ペンシルベニア州ピッツバーグのサーモフィッシャーサイエンティフィック社（Fisher Scientific））を使用した機械的細胞溶解ステップにて、大小両方のクリアランス乳棒（０．０６ｍｍおよび０．１３ｍｍクリアランス）を加えた 。機械的溶解後の溶解条件には、市販のコメットアッセイ溶解バッファー（トレビゲン社（Trevigen）製）＋５ｍＭ  ＤＴＴ、プロテイナーゼＫを配合して、４℃にて一晩置くことを含めた。この併用により、明視野画像では不可視になった核膜が除去されたようであるが、電気泳動後もＤＮＡは遊走しなかった（図２０）。このことは、ＤＮＡはプロタミンから解放されていないことを示唆しているか、またはこれらの試験済み電気泳動条件下でテストされた過酸化水素陽性対照によって誘発された未処理射精液には検出可能なＤＮＡ損傷のないことを示唆している可能性がある。陽性対照にコメットテールが欠けていることは、アッセイ条件がまだ最適化されていないことを示唆している。
【０１７１】
スライド解析用の推奨プロトコール：
コメットテールに歪みを招来してしまう可能性のあるスライドの端および気泡に、コメットが隣接しないように注意しながら、スライドの画像をZeiss Calibriで捕捉する（Collins, 2004）。３５５／４９７ｎｍ励起／発光を用いたコメットテールを、Hoechst 33342を使用して、明視化する。非生細胞を除外する目的に用いられるＥＭＡ陽性細胞は、５０４／６００ｎｍの励起および発光で明視化する。ＥＭＡがＤＮＡ分子と共有結合することから、染色中に膜が損傷しない細胞内では、蛍光の発光が不可能である。この結合は、細胞溶解ステップおよびＤＮＡ変性ステップ中には変化しない。統計的な厳密さがもたらされるように、２連スライド（duplicate slide）毎に少なくとも５０個の細胞を定量化する（Collins, 2004, Hartmann et al., 2003, Boe-Hansen et al., 2005, Hughes et al., 1996）。
【０１７２】
ImageJ用のOpenCometプラグインである「Olive Moment」を使用して、テール長の乗数値を定量化する。これにより、蛍光強度が計算され、分析される（Tice et al., 2000; Olive and Bananth, 1993）。Olive Tail Momentを使用して、処置群間で測定されたＤＮＡ損傷のレベルを比較する。
【０１７３】
推奨の統計的分析：
統計分析は、OriginPro 2018 ６４ビットソフトウェアを使用して実行される。採取されることが予期されたデータに基づき、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、ＳＶＦＥＭおよび対照処置群の比較を行う。
【０１７４】
考察：
エンドヌクレアーゼを介したアルカリコメットアッセイの最適化が進行中である。コメットテールを生成する試みによる画像は、精子頭部形態のコンパクトなＤＮＡを示している。これにより示唆されるように、核基質からのＤＮＡヘリックスが、完全には遊離していない。精子のDNAの圧縮は、体細胞と比較して増加する。この理由から、精子のコメットアッセイを具体的に適応させる必要がある。具体的な改変点としては、精子クロマチンを脱凝縮すること、および同じ目的でＳＤＳを添加することが挙げられる（Rousseaux and Chevret, 1995）。繁用されている追加的な改変は、プロタミンを分解するためのプロテイナーゼＫを含めることである。この場合、ヒストンでなくＤＮＡパッケージングに対して精子が使用される（Singh et al, 1989）。溶解液の洗剤組成物を最適化することが継続されている。Triton X-100を同様の非イオン性洗剤であるNP-40で置き換えることと、ＤＮＡ脱凝縮のためのジヨードサリチル酸リチウム（ＬＩＳ）を取り込むことと、を含めてもよい。
【０１７５】
ＤＮＡ損傷の低減：
ＳＶＦＥＭ処置群のＤＮＡ修飾が、対照のＤＮＡ修飾よりも少ないことが、コメットデータから分かる場合、ＳＶＦＥＭによる存続延長が雌雄鑑別プロセス中にＤＮＡ修飾から精子が保護されることが示唆される。したがって、ＳＶＦＥＭ存続延長剤中に抗酸化物質が存在することを想定した場合、この損傷の低減はＲＯＳの減少に起因するものであると仮定され、雌雄鑑別プロセスの様々な段階において、精子±ＳＶＦＥＭによる存続延長におけるＲＯＳ蓄積をアッセイするための、デザイン実験が準備されるであろう。授精ユニットは、抗酸化剤有りおよび無しのＳＶＦＥＭ（ＳＶＦＥＭ−Ａ）で存続延長された精子から生成されることになるであろう。Ｅｎｄｏ  ＩＩＩを使用したコメット分析は、これら試験群中に存在するＤＮＡ損傷のアセスメントを行う目的に使用されてきた。ＳＶＦＥＭ−Ａ群が、存続延長無し対照と同程度のＤＮＡ損傷を示す場合、抗酸化物質の補給が特にＤＮＡ損傷を媒介していることが推測できる。
【０１７６】
精子のＲＯＳ含有量は、分光光度計を使用して測定できる（Balamurugan et al., 2018）。この実験的アプローチは、遷移金属が、漸増レベルのＲＯＳ溶液に曝露されたときに、色を変化させることによるものである（Hyashi et al., 2007）。このアプローチはまた、ＲＯＳの有害なレベルの増加が蓄積する場所を追跡することも、且つその蓄積をＳＶＦＥＭで防止されるかどうかを判別することもできる。
【０１７７】
ＤＮＡ損傷における差異は存在しなかった。つまり、３つある処置群全てを対象としてアセスメントされたＤＮＡ損傷が、有意差無しに存在する場合、ＩＶＦ転帰に差異が存在した。この場合、その原因として考えられる仮説は、運動性プロファイルまたは受精能獲得状態が相違したことである。
【０１７８】
活性化因子を含まない培地における運動性メトリクスは、治験中に採取されてきたものである。以前の研究において、希釈培地無しでCASA速度メトリクスを調べ、ＩＶＦ転帰との関係が見出されてきた（Kasimanickam et al., 2006）。測定された運動性パラメーターとＩＶＦ転帰との相関関係を計算して、何らかの関係があるかどうかを判断できる。ＩＶＦ受精手順中に使用された、ヘパリン添加培地における追加的な速度測定は、収集される。ヘパリンは、先体反応の活性化因子であり、受精のため精子を体外で活性化するために必要とされる（Parrish et al., 1988）。ヘパリンは、精子の速度特性を変化させる（Chamberland et al., 2001）。ヘパリン添加培地での速度測定が、ＩＶＦ転帰と相関するかどうかは、今後の研究において判別される可能性がある。
【０１７９】
また、ＳＶＦＥＭで処置された精液と存続延長無し対照精液との間の受精能獲得状態の差異も、ＩＶＦにおける行動に影響を与える可能性がある。ＳＶＦＥＭ存続延長剤による受精能獲得反応の加速は、特にカルシウムシグナル伝達（Lopez and Jones, 2013）を介して行われる場合もあれば、または別の経路を介して行われる場合もある。受精反応を発生させるには、事前に受精能獲得反応を完了させる必要がある。この反応のヘパリン活性化の所要時間は、最低４時間とされる（Parrish, 2013）。ただし、ＳＶＦＥＭで処置された受精能獲得状態が、存続延長無し対照の射精液よりも先に進行する場合、精子細胞は、存続延長無し対照よりも早期に受精する能力を有する。受精能形成は、先体反応の完了で終了することから、先体の蛍光染色を通して容量状態をアセスメントできる（Roldan and Harrison, 1990）。
【０１８０】
雌雄鑑別済み精液試料に検出可能なＤＮＡ損傷はない。つまり、コメットアッセイで陽性対照細胞の定量可能なＤＮＡ損傷を特定した場合、これらの試料はＨ２Ｏ２で処置することにより、ＤＮＡ損傷が誘発される。一方、雌雄鑑別済み精液試料において、このエンドヌクレアーゼを介したアルカリコメットアッセイの使用を確証して、ウシの雌雄鑑別済み精液の酸化的ＤＮＡ損傷を算定することが可能ではあるが、定量化可能な損傷は明白ではない。また、ＩＶＦ（rVF）治験において定量化された差異にはＤＮＡ損傷が関与しないことも、示唆される。代替的に、雌雄鑑別済み精液においてはＤＮＡ損傷が誘発されるのが認められたのに対し、エンドヌクレアーゼＥｎｄｏ  ＩＩＩを使用しても明視化されないことが、示唆され得る。なぜなら、このエンドヌクレアーゼＥｎｄｏ ＩＩＩにより切断されるのは、酸化されたピリミジンだけに限られるからである。エンドヌクレアーゼ処置をホルムアミドピリミジン−グリコシラーゼまたはｈＯＧＧ１に改変し、これらを異なる酸化済み塩基対にて切断することも、存在する厳密なＤＮＡ損傷タイプを完全に特定するうえで必要とされる場合がある。
【０１８１】
実施例４
本発明の培地（呼称：ＳＶＦＥＭ（SVFEMSVFEM））は、Ｂ培地CEP2（表３）に表４の添加剤を配合することにより、調合された。
（表３）塩基性塩培地（ＣＥＰ２）
2021500927.tif 000004
（表４）ＳＶＦＥＭに対する添加剤濃度
2021500927.tif 000005
【０１８２】
塩基性塩培地中、ＴＲＩＳ塩基を、有機化学緩衝剤である２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸））で置き換えてもよい。脂肪酸サプリメントは、シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich）から市販されている混合物である。
【０１８３】
培地に保存された精子試料（ｎ＝３）ＳＶＦＥＭには、２４時間保持後に、測定可能な運動性低下が見られなかった。従来の培地を使用した対照試料から明らかにされたように、同じ期間にわたって運動性が有意に低下した。図３１を参照のこと。
【０１８４】
使用される対照／従来の培地は、当該技術分野において公知のものであり、例としては、限定されるものではないが、ブドウ糖溶液をはじめとする、塩または砂糖（サッカリド）溶液が挙げられる。対照培地は、当該技術分野において公知の標準的なバッファーも含み得る。
【０１８５】
ＮａＦは、従来の精液処理に適用された場合に、培地には添加されない。ゆえに、ＮａＦが、運動性を阻害してしまう恐れがあるという理由から、代替調合物によっては、ＮａＦを含有しないものもある。しかしながら、試験から実証されたように、２４時間にわたる存続延長後に、凍結／解凍を生き残った多くの運動性細胞の有効性が改善された。試料処理では、精液を、ＮａＦによって提供された運動抑制が逆転されるように十分に希釈した。ゆえに、ＮａＦはＳＶＦＥＭ中に含まれており、また、文献中に同定されている他の運動抑制剤を培地と併用する場合もある。ＮａＦの効果が図示されている、図３２を参照のこと。図２のプロットには、同日または２４時間保持後に処理された射精液中の試料当たりの融解後運動性細胞の数が、様々なＮａＦ濃度と共に例証されている。その濃度はｘ軸に沿って図示されており、濃度範囲は０〜６ｍＭ  ＮａＦに及んでいる。
【０１８６】
実施例５
精液試料の作製：
実施例１の培地を、１：１の容量比で精液と混合させる。最適な性能が見られるのは、培地を３７℃に加温してからアンガス雄牛の精液と混合した際、および射精後１０〜３０分を経て培地を精液に加えたときであった。ただし、射精後１時間を経て細胞と混合した場合でも、培地の効能は相変わらず維持された状態のままである。培地の添加後、細胞を１９℃にて保存する。図３から明らかなように、本発明の培地ＳＶＦＥＭでは、運動性細胞が、従来の方法で処理された試料よりも１０％増加したのが確認された。図３３の、対応のあるｔ検定では、ｐ＝０．０１７である。
【０１８７】
実施例６
試料の、２４時間保存後の細胞運動性の維持に関する試験を実施した。アンガス雄牛（ｎ＝４）由来の精液試料は、採取時に採取、試験された後、実施例１の培地（ＳＶＦＥＭ）中に２４時間保存された。試料は、保存された後も、十分な運動性を保持していた。図４を参照のこと。
【０１８８】
加えて、同じ試料を、雌雄鑑別プロセス（ＤＮＡに興奮性色素を結合することを含む）用に染色した。また、本ステップの後も、ＳＶＦＥＭにおける細胞の運動性が維持された。図３４も参照のこと。
【０１８９】
実施例７
別の試験を実施して、２４時間保存後の試料を比較した。アンガス雄牛（ｎ＝１０）由来の精液試料を取り、培地に配合した。本発明の培地ＳＶＦＥＭを使用する試料を、従来の培地を使用する対照試料と比較した。保存により細胞運動性が減損したかどうかを判別するため、試料を分析した。本発明の培地（ＳＶＦＥＭ）を使用することにより、２４時間の保存後も細胞運動性が維持されるようにできる。図５を参照のこと。
【０１９０】
加えて、同じ試料を、雌雄鑑別プロセス（ＤＮＡに興奮性色素を結合することを含む）用に染色した。本発明の培地（ＳＶＦＥＭ）を使用した場合には、本工程後に、細胞の運動性も維持された。図３５も参照のこと。
【０１９１】
実施例８
ＳＶＦＥＭ培地を、更に使用するため、試料の作製（ＡＶＦまたはＡＩなど）に関して試験した。これらの試料、またはストローには、処理済みの精子細胞が含有されている。この実例において、細胞は雌雄鑑別済みである。ストローの、試料当たりの運動性細胞を試験した。試料の細胞運動性は、２４時間保存された本発明の培地ＳＶＦＥＭ（ｎ＝８）を使用した場合と、対照培地（ｎ＝３）を使用した場合とで、同様であることが明らかにされた。図３６を参照のこと。試料を、ストロー当たり細胞２．３×１０６個にてパッケージングした。
【０１９２】
実施例９
本発明の培地ＳＶＦＥＭを使用することにより、ＩＶＦおよび／またはＡＩにおける雌雄鑑別済み精液における受精率を改善することが可能である。ＳＶＦＥＭを使用した試料を、胚盤胞／受精卵母細胞の生成に関して試験した。ＳＶＦＥＭおよび対照培地の両方を使用した雌雄鑑別済み試料（ｎ＝１０）を、従来の試料（雌雄鑑別無し）と比較した。ＳＶＦＥＭによれば、この２つの雌雄鑑別した試料間で、受精した卵母細胞当たりの胚盤胞が同数であることが明らかである。図３７を参照のこと。従来の培地およびＳＶＦＥＭを使用して、雌雄鑑別済み精液の試料（ｎ＝３の射精／処置、対を成す）を更に比較することにより、本発明の培地を使用した場合に、受精した卵母細胞当たりの胚盤胞が増強されたことが、確認される。図３８を参照のこと。
【０１９３】
実施例１０
ＳＶＦＥＭ培地から成分を除去したことによる影響を、調査した。２４時間保存された試料の運動性を比較する際、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の場合を除いて、添加剤を個別に滴下したとしてもＳＶＦＥＭ保持培地の効能は減損しない。図３９を参照のこと。ＰＳは主要成分であるため、ＰＳの除去は運動性低下の原因となる。
【０１９４】
実施例１１
培地は、使い勝手を良くすることを期して、３成分からなる混合物中に調合される場合もある。３つの部分は、以下の通り：（１）ＺｎＣｌ、脂肪酸、およびＤ−アスパラギン酸を補充されている、４℃で保存されたCEP2、（２）デクルシン、アスピリン、コエンザイムＱ１０、リノレン酸が含有されている、−２０℃で保存された１０００Ｘ有機ストック溶液、（３）−２０℃で保存されたホスファチジルセリンである。本方法により調製されたストックＳＶＦＥＭ培地から調製された精液試料では、全ての成分を配合して作製されたＳＶＦＥＭと同様に、２４時間後も運動性が維持されたことが、明らかにされている。図４０を参照のこと。
【０１９５】
本明細書中に言及されている全ての公報および特許は、あたかも個々の各公報または特許が参照により援用されていることが、具体的且つ個別的に示唆されているかのように、その全体が本明細書において参照により援用されている。
【０１９６】
主題の本開示の特定の態様について考察してきたが、上記明細書は例証であって、限定されるものではない。本明細書および下記特許請求の範囲を検討すれば、本開示の多くの変形態様が当業者に明らかになるであろう。本開示の全範囲は、等価物の全範囲と共に特許請求の範囲を参照することにより、且つそのような変形形態と共に明細書を参照することにより、特定すべきである。
【０１９７】
参考文献一覧
2021500927.tif 000006
2021500927.tif 000007
2021500927.tif 000008
2021500927.tif 000009
2021500927.tif 000010
2021500927.tif 000011
2021500927.tif 000012
【図１】
2021500927.tif 000013
【図２】
2021500927.tif 000014
【図３】
2021500927.tif 000015
【図４】
2021500927.tif 000016
【図５】
2021500927.tif 000017
【図６】
2021500927.tif 000018
【図７】
2021500927.tif 000019
【図８】
2021500927.tif 000020
【図９】
2021500927.tif 000021
【図１０】
2021500927.tif 000022
【図１１】
2021500927.tif 000023
【図１２】
2021500927.tif 000024
【図１３】
2021500927.tif 000025
【図１４】
2021500927.tif 000026
【図１５】
2021500927.tif 000027
【図１６】
2021500927.tif 000028
【図１７】
2021500927.tif 000029
【図１８】
2021500927.tif 000030
【図１９】
2021500927.tif 000031
【図２０】
2021500927.tif 000032
【図２１】
2021500927.tif 000033
【図２２】
2021500927.tif 000034
【図２３】
2021500927.tif 000035
【図２４】
2021500927.tif 000036
【図２５】
2021500927.tif 000037
【図２６】
2021500927.tif 000038
【図２７】
2021500927.tif 000039
【図２８】
2021500927.tif 000040
【図２９】
2021500927.tif 000041
【図３０】
2021500927.tif 000042
【国際調査報告】
2021500927.tif 000043
2021500927.tif 000044
2021500927.tif 000045
2021500927.tif 000046
2021500927.tif 000047
2021500927.tif 000048
2021500927.tif 000049
2021500927.tif 000050