(57)【要約】  本発明は、新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラムＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９に関し、具体的には、炎症疾患の予防および治療に有用な新規な乳酸菌を含む組成物に関する。
2021501586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐ。
【請求項３】
前記ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐは、配列番号１の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含む、請求項１に記載のラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ。
【請求項４】
前記ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐは、配列番号２の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含む、請求項２に記載のビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐ。
【請求項５】
ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐまたはこれらの混合物を含む炎症疾患の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項６】
前記ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐは、その生菌体、その死菌体、その培養物、その破砕物またはその抽出物である、請求項５に記載の炎症疾患の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項７】
前記ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐは、その生菌体、その死菌体、その培養物、その破砕物またはその抽出物である、請求項５に記載の炎症疾患の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項８】
前記炎症疾患は、関節炎、痛風、肝炎、喘息、肥満、角膜炎、胃炎、腸炎、腎臓炎、大腸炎、糖尿、結核、気管支炎、胸膜炎、腹膜炎、脊椎炎、膵臓炎、炎症痛、尿道炎、膀胱炎、膣炎、動脈硬化症、敗血症、火傷、皮膚炎、歯周炎および歯肉炎を含む群より選択されるいずれか一つ以上である、請求項５に記載の炎症疾患の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項９】
前記炎症疾患は大腸炎または膣炎である、請求項５に記載の炎症疾患の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項１０】
ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐまたはこれらの混合物を含む炎症疾患の予防または改善用の健康機能食品。
【請求項１１】
前記ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐは、その生菌体、その死菌体、その培養物、その破砕物またはその抽出物である、請求項５に記載の炎症疾患の予防または改善用の健康機能食品。
【請求項１２】
前記ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐは、その生菌体、その死菌体、その培養物、その破砕物またはその抽出物である、請求項１０に記載の炎症疾患の予防または改善用の健康機能食品。
【請求項１３】
前記炎症疾患は、関節炎、痛風、肝炎、喘息、肥満、角膜炎、胃炎、腸炎、腎臓炎、大腸炎、糖尿、結核、気管支炎、胸膜炎、腹膜炎、脊椎炎、膵臓炎、炎症痛、尿道炎、膀胱炎、膣炎、動脈硬化症、敗血症、火傷、皮膚炎、歯周炎および歯肉炎を含む群より選択されるいずれか一つ以上である、請求項１０に記載の炎症疾患の予防または改善用の健康機能食品。
【請求項１４】
前記炎症疾患は大腸炎または膣炎である、請求項１０に記載の炎症疾患の予防または改善用の健康機能食品。
【請求項１５】
ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐまたはこれらの混合物を対象体に投与するステップを含む炎症疾患の予防または治療方法。
【請求項１６】
前記炎症疾患は、関節炎、痛風、肝炎、喘息、肥満、角膜炎、胃炎、腸炎、腎臓炎、大腸炎、糖尿、結核、気管支炎、胸膜炎、腹膜炎、脊椎炎、膵臓炎、炎症痛、尿道炎、膀胱炎、膣炎、動脈硬化症、敗血症、火傷、皮膚炎、歯周炎および歯肉炎を含む群より選択されるいずれか一つ以上である、請求項１５に記載の炎症疾患の予防または治療方法。
【請求項１７】
炎症疾患の治療のための薬剤を製造するためのラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐまたはこれらの混合物の使用。
【請求項１８】
前記炎症疾患は、関節炎、痛風、肝炎、喘息、肥満、角膜炎、胃炎、腸炎、腎臓炎、大腸炎、糖尿、結核、気管支炎、胸膜炎、腹膜炎、脊椎炎、膵臓炎、炎症痛、尿道炎、膀胱炎、膣炎、動脈硬化症、敗血症、火傷、皮膚炎、歯周炎および歯肉炎を含む群より選択されるいずれか一つ以上である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
炎症疾患の治療に用いるためのラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐまたはこれらの混合物を含む組成物。
【請求項２０】
前記炎症疾患は、関節炎、痛風、肝炎、喘息、肥満、角膜炎、胃炎、腸炎、腎臓炎、大腸炎、糖尿、結核、気管支炎、胸膜炎、腹膜炎、脊椎炎、膵臓炎、炎症痛、尿道炎、膀胱炎、膣炎、動脈硬化症、敗血症、火傷、皮膚炎、歯周炎および歯肉炎を含む群より選択されるいずれか一つ以上である、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラムおよびビフィドバクテリウム・ロンガムに関し、具体的には、炎症疾患の予防および治療に有用な新規な乳酸菌を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、任意の外部刺激に対して生体組織または器官に現れる一種の防御反応の一つである。正常な場合、炎症反応は、外部から感染した物質を除去し、損傷した組織を再生して機能を回復するようになる。しかし、炎症誘発サイトカインの分泌に応じた炎症反応が持続的に起こると、炎症反応が起こった部位に応じて様々な炎症疾患が発生するようになる。
【０００３】
一方、女性の炎症疾患の一つである膣炎は、膣内に正常に存在する細菌の代わりに、様々な嫌気性細菌が増殖して発生する膣内感染症であり、最近、女性の衛生用品の使用増加およびストレスの増加によりその発生が増加している。膣炎は細菌性膣炎と真菌性膣炎が大半であるが、細菌性膣炎の場合は代表的に嫌気性菌株であるガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）またはアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）により発生し、真菌性膣炎の場合はカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）により主に発生する（Ｓｅｘｕａｌｌｙ  Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００６、ｖｏｌ  ３３、Ｎｏ．１１、６６３−６６５）。
【０００４】
一方、細菌性膣炎の場合は抗生剤を用い、真菌性膣炎の場合はアゾール系抗真菌剤を用いて症状を改善させることができるが、このような治療剤の場合、また他の菌の交代現象を引き起こして根本的な治療効果を期待し難いという問題がある。したがって、膣内の膣炎原因菌を除去すると同時に正常乳酸菌が原状回復するように炎症反応を抑制できる治療剤の開発が必要な実情であるが、十分な研究が行われていない。
【０００５】
このような背景下、本発明者らは、炎症疾患、具体的には膣炎の予防および治療剤を研究している最中、キムチおよびヒトの糞便から分離した新規な乳酸菌が、炎症反応を抑制するだけでなく、膣炎原因菌の成長を抑制すると同時に膣炎の治療効果を示し、炎症疾患、具体的には膣炎の予防および治療に有用に使用できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、新規なラクトバチルス・プランタラムおよびビフィドバクテリウム・ロンガム乳酸菌を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、新規な乳酸菌を含む炎症疾患の予防または治療用の組成物を提供することにある。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、新規な乳酸菌を含む炎症疾患の予防または改善用の健康機能食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するための一様態として、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）（寄託機関：韓国微生物保存センター、寄託日：２０１７．０８．０４、受託番号：ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ）を提供する。
【００１０】
本発明のラクトバチルス・プランタラムＮＫ３は、伝統醗酵食品であるキムチから分離および同定されたラクトバチルス・プランタラムの新規な乳酸菌であることを特徴とする。
【００１１】
本発明のラクトバチルス・プランタラムＮＫ３の同定および分類のための１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列は、本明細書に添付された配列番号１の通りである。したがって、本発明のラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）は、配列番号１の１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むことができる。
【００１２】
前記配列番号１の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の分析結果、公知のラクトバチルス・プランタラム菌株と９９％の相同性を示しており、ラクトバチルス・プランタラムと最も高い分子系統学的類縁関係を示した。したがって、前記乳酸菌をラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に同定し、ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３に命名し、韓国微生物保存センターに２０１７年８月４日付で寄託した（受託番号ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ）。
【００１３】
本発明のラクトバチルス・プランタラムＮＫ３はグラム陽性菌であり、細胞の形態は桿菌である。より具体的なラクトバチルス・プランタラムＮＫ３の生理学的特性は当該技術分野における通常の方法により分析することができ、その結果は下記表２の通りである。具体的には、ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３は、炭素源として、Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ゲンチオビオース、Ｄ−ツラノースおよびグルコネートを用いることができる。
【００１４】
前記目的を達成するための他の一様態として、本発明は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）（寄託機関：韓国微生物保存センター、寄託日：２０１７．０８．０４、受託番号：ＫＣＣＭ１２０８８Ｐ）を提供する。
【００１５】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９は、ヒトの糞便から分離および同定されたビフィドバクテリウム・ロンガムの新規な乳酸菌であることを特徴とする。
【００１６】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９の同定および分類のための１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列は、本明細書に添付された配列番号２の通りである。したがって、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）は、配列番号２の１６Ｓ  ｒＤＮＡを含むことができる。
【００１７】
前記配列番号２の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の分析結果、公知のビフィドバクテリウム・ロンガム菌株と９９％の相同性を示しており、ビフィドバクテリウム・ロンガムと最も高い分子系統学的類縁関係を示した。したがって、前記乳酸菌をビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）に同定し、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９に命名し、韓国微生物保存センターに２０１７年８月４日付で寄託した（受託番号ＫＣＣＭ１２０８８Ｐ）。
【００１８】
本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９はグラム陽性菌であり、細胞の形態は桿菌である。より具体的なビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９の生理学的特性は当該技術分野における通常の方法により分析することができ、その結果は下記表３の通りである。具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９は、炭素源として、Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−グルコシド、エスクリン、サリシン、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノースおよびＤ−ツラノースを用いることができる。
【００１９】
前記目的を達成するための他の一様態として、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐまたはこれらの混合物を含む炎症疾患の予防または治療用の薬学組成物を提供する。
【００２０】
本発明の「ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）」は、前記で説明した通りである。
具体的には、本発明の薬学組成物に含まれるラクトバチルス・プランタラムＮＫ３は、その生菌体、その死菌体、その培養物、その破砕物またはその抽出物であってもよいが、炎症疾患の予防または治療の効果を達成できるラクトバチルス・プランタラムＮＫ３の形態であれば、特に制限されない。
【００２１】
本発明の「ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）」は、前記で説明した通りである。
具体的には、本発明の薬学組成物に含まれるビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９は、その生菌体、その死菌体、その培養物、その破砕物またはその抽出物であってもよいが、炎症疾患の予防または治療の効果を達成できるラクトバチルス・プランタラムＮＫ３の形態であれば、特に制限されない。
【００２２】
本発明における用語「培養物」は乳酸菌を公知の液体培地または固体培地で培養させて得たものを意味し、本発明においては新規な乳酸菌を含む概念である。
【００２３】
本発明の炎症疾患は、関節炎、痛風、肝炎、喘息、肥満、角膜炎、胃炎、腸炎、腎臓炎、大腸炎、糖尿、結核、気管支炎、胸膜炎、腹膜炎、脊椎炎、膵臓炎、炎症痛、尿道炎、膀胱炎、膣炎、動脈硬化症、敗血症、火傷、皮膚炎、歯周炎および歯肉炎を含む群より選択されるいずれか一つ以上であってもよい。
【００２４】
本発明の一実施例においては、マウスから分離したマクロファージに炎症反応誘導物質であるリポポリサッカライドと共にラクトバチルス・プランタラムＮＫ３またはビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９の処理時に炎症反応が顕著に抑制されることを確認した（図１および２）。それにより、前記ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９またはこれらの混合物を含む薬学組成物が炎症疾患の予防および治療に有用に使用できることを確認した。
具体的には、前記炎症疾患は膣炎であってもよい。
【００２５】
本発明の一実施例においては、ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９またはこれらの混合物が膣炎誘発細菌であるガードネレラ・バギナリスおよびアトポビウム・バギナエに対して成長抑制効果を示し、前記ガードネレラ・バギナリスの感染を抑制する効果に優れることを確認した（図３〜５）。また、本発明の一実施例においては、膣炎が誘導された動物モデルにラクトバチルス・プランタラムＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９またはこれらの混合物を投与した結果、膣炎細菌により発生した浮腫を伴った炎症および膣炎細菌数が減少し、膣の代表的な炎症指標であるミエロペルオキシダーゼの活性が減少し、膣粘膜において、ＴＮＦ−αの発現が増加し、ＩＬ−１０の発現が増加することを確認した（図６〜１０）。それにより、前記ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９またはこれらの混合物を含む薬学組成物が具体的な炎症疾患である膣炎の予防および治療に有用に使用できることを確認した。
具体的には、前記炎症疾患は大腸炎であってもよい。
【００２６】
本発明の一実施例においては、大腸炎が誘導された動物モデルにラクトバチルス・プランタラムＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９またはこれらの混合物を投与した結果、大腸の長さが回復し、ミエロペルオキシダーゼの活性が減少し、炎症指標であるサイトカインの発現量および活性が抑制されることを確認した（表６）。それにより、前記ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９またはこれらの混合物を含む薬学組成物が具体的な炎症疾患である大腸炎の予防および治療に有用に使用できることを確認した。
【００２７】
本発明に係る薬学組成物は、哺乳動物に投与された後に活性成分の迅速、持続または徐放を提供することができるように当業界で周知の方法を利用して薬学的剤形に製造できる。剤形の製造において、本発明に係る薬学組成物は、新規な乳酸菌の活性を阻害しない範囲内で薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。
【００２８】
前記薬剤学的に許容可能な担体は、通常用いられるもの、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油などを含むが、これらに制限されるものではない。また、本発明の薬学的組成物は、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤、その他の薬剤学的に許容可能な添加剤を含むことができる。
【００２９】
本発明に係る薬学組成物の投与量は、薬剤学的に有効な量でなければならない。「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率で炎症疾患を予防または治療するのに十分な量を意味する。有効用量レベルは、製剤化方法、患者の状態および体重、患者の性別、年齢、疾患の程度、薬物の形態、投与経路および期間、排泄速度、反応感応性などのような要因に応じて当業者により多様に選択できる。有効量は、当業者に認識されているように、処理の経路、賦形剤の使用および他の薬剤と共に使用できる可能性に応じて異なりうる。しかし、好ましい効果のために、経口投与剤の場合、一般に、成人に１日に体重１ｋｇ当たりに本発明の組成物を１日に０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。上記のように投与剤を投与する場合、本発明のラクトバチルス・プランタラムＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９またはこれらの混合物を１日に１×１０2ＣＦＵ／ｋｇ〜１×１０11ＣＦＵ／ｋｇで投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００３０】
本発明の薬学組成物は、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路を通して投与できる。具体的には、本発明の薬学組成物は、経口または非経口投与（例えば、塗布または静脈内、皮下、腹腔内注射）してもよいが、経口投与が好ましい。膣炎の予防および治療のためには膣内に投与することができる。経口投与のための固形製剤には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、丸剤などが含まれる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、エアロゾルなどが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤としては、各々通常の方法により滅菌された水溶液、液剤、非水性溶剤、懸濁剤、エマルション、点眼剤、眼軟膏剤、シロップ、坐剤、エアロゾルなどの外用剤および滅菌注射製剤の形態に剤形化して用いることができ、好ましくは、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、眼軟膏剤、点眼剤、ペースト剤またはカタプラズマ剤の薬剤学的組成物を製造して用いることができるが、これらに限定されるものではない。局所投与のための製剤は、臨床的処方に応じて無水型または水性型であってもよい。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としてはウィテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【００３１】
前記目的を達成するための他の一様態として、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）またはこれらの混合物を対象体に投与するステップを含む炎症疾患の予防または治療方法を提供する。
【００３２】
本発明の「ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）」、「ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）」、「投与」および「炎症疾患」などの用語は、前記で説明した通りである。
【００３３】
前記対象体は動物を言い、典型的には、本発明の新規な乳酸菌を用いた治療により有益な効果を奏することができる哺乳動物であってもよい。このような対象体の好ましい例には、ヒトのような霊長類が含まれる。また、このような対象体には、炎症疾患の症状を有するかまたはこのような症状を有する危険のある対象体は全て含まれる。
【００３４】
他の一様態として、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐまたはこれらの混合物を含む炎症疾患の予防または改善用の健康機能食品を提供する。
【００３５】
本発明の「ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）」、「ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）」、「投与」および「炎症疾患」などの用語は、前記で説明した通りである。
【００３６】
前記健康機能食品は、食品の生体調節機能を強調した食品であり、物理的、生化学的、生物工学的な方法を利用して特定の目的に作用および発現するように付加価値を付与した食品である。このような健康機能食品の成分は、生体防御と身体リズムの調節、疾患の防止および回復に関係する身体調節機能を生体に対して十分に発揮するように設計して加工し、食品として許容可能な食品補助添加剤、甘味料または機能性原料を含有することができる。
【００３７】
本発明のラクトバチルス・プランタラムＮＫ３またはビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９を健康機能食品（または健康機能飲料添加物）として用いる場合、前記新規な乳酸菌をそのまま添加するかまたは他の食品または食品成分と共に使用し、通常の方法に従って適切に使用できる。前記ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３またはビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９の混合量は、その使用目的（予防、健康または改善、治療的処置）に応じて適宜に決定できる。
【００３８】
前記健康機能食品は、種々の栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、保存剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。また、本発明の健康機能食品は、果物および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は単独でまたは組み合わせて使用でき、このような添加剤の比率は組成物の全体重量当たりに０．００１〜５０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【００３９】
前記健康機能食品の種類に特に制限はない。前記ラクトバチルス・プランタラムＮＫ３またはビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９を添加できる食品としては、ソーセージ、肉類、パン、チョコレート類、スナック類、キャンデー類、菓子類、ラーメン、ピザ、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などが挙げられる。飲料に剤形化する場合、新規な乳酸菌の他に添加される液体成分としては、これらに限定されるものではないが、通常の飲料のように種々の香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物は、単糖類（例えば、ブドウ糖、果糖など）、二糖類（例えば、マルトース、スクロースなど）および多糖類（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖）、およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールであってもよい。
【００４０】
他の一様態として、本発明は、炎症疾患の治療のための薬剤を製造するためのラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐまたはこれらの混合物の使用を提供する。
【００４１】
他の一様態として、本発明は、炎症疾患の治療に用いるためのラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐまたはこれらの混合物を含む組成物を提供する。
【００４２】
他の一様態として、本発明は、炎症疾患の治療のためのラクトバチルス・プランタラムＮＫ３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＫ３）  ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＫ４９）  ＫＣＣＭ１２０８８Ｐまたはこれらの混合物の使用を提供する。
【００４３】
以上、本明細書に記載された数値は、特に明示していない限り、均等範囲まで含むものと解釈しなければならない。
【００４４】
以下では、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。但し、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【発明の効果】
【００４５】
本発明に係る新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラムＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＫ４９またはこれらの混合物は、炎症反応を抑制するという効果がある。したがって、本発明に係る新規な乳酸菌は、炎症疾患の予防または治療用の組成物として用いることができ、特に、大腸炎および膣炎の治療および予防に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９のマクロファージに対するＮＦ−ｋＢの活性（ｐ−ｐ６５／ｐ６５）抑制能を示すグラフである。
【図２】新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９のマクロファージに対するＴＮＦ−αの発現量抑制能を示すグラフである。
【図３】新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９のガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）に対する抗菌効果を示すグラフである。
【図４】新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９のアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）に対する抗菌効果を示すグラフである。
【図５】新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９のガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）に対する感染抑制能を示すグラフである。  Ｇ：ガードネレラ・バギナリスのみを処理した群；ＧＬ５、ＧＬ６、ＧＬ７：ガードネレラ・バギナリスを処理し、ラクトバチルス・プランタラムを各々１×１０6ＣＦＵ／ｍＬ、１×１０7ＣＦＵ／ｍＬ、１×１０8ＣＦＵ／ｍＬ処理した群；ＧＢ５、ＧＢ６、ＧＢ７：ガードネレラ・バギナリスを処理し、ビフィドバクテリウム・ロンガムを各々１×１０6ＣＦＵ／ｍＬ、１×１０7ＣＦＵ／ｍＬ、１×１０8ＣＦＵ／ｍＬ処理した群。
【図６】新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９およびこれらの混合物の膣と子宮の炎症抑制効果を確認した図である。  Ｎ：正常群；ＧＣ：ガードネレラ・バギナリスのみを感染させた群；ｏＧＬ、ｏＧＢ、ｏＧＭ：ガードネレラ・バギナリスを感染させた実験動物に各々ラクトバチルス・プランタラム、ビフィドバクテリウム・ロンガムまたはこれらの混合物を経口で投与した群；ｖＧＬ、ｖＧＢ、ｖＧＭ：ガードネレラ・バギナリスを感染させた実験動物に各々ラクトバチルス・プランタラム、ビフィドバクテリウム・ロンガムまたはこれらの混合物を膣内に投与した群。以下同一。
【図７】新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９およびこれらの混合物の感染したガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）に対する抑制能を示すグラフである。
【図８】新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９およびこれらの混合物のミエロペルオキシダーゼ活性抑制能を示すグラフである。
【図９】新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９およびこれらの混合物のＴＮＦ−αの発現抑制能を示すグラフである。
【図１０】新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９およびこれらの混合物のＩＬ−１０の発現増加能を示すグラフである。
【図１１】新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９およびこれらの混合物の膣内乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）の回復効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。但し、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、これらにより本発明の内容が限定されるものではない。
【００４８】
実施例１：乳酸菌の分離および同定
【００４９】
（１）ヒトの糞便から乳酸菌の分離
ヒトの糞便をＧＡＭ液体培地（ＧＡＭ  ｂｒｏｔｈ；Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｊａｐａｎ）に入れて懸濁した。その後、上澄みを取ってＢＬ寒天培地（ＢＬ  ａｇａｒ  ｍｅｄｉｕｍ；Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｊａｐａｎ）に移植し、３７℃で約４８時間嫌気的に培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を形成した菌株を分離した。
【００５０】
（２）キムチから乳酸菌の分離
白菜キムチ、大根キムチまたはネギギムチを各々破砕し、破砕上澄みを取ってＭＲＳ寒天培地（ＭＲＳ  ａｇａｒ  ｍｅｄｉｕｍ；Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）に移植し、３７℃で約４８時間嫌気的に培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を形成した菌株を分離した。
【００５１】
（３）分離した乳酸菌の同定
ヒトの糞便またはキムチから分離した菌株の生理学的特性および１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を分析して菌株の種を確定し、菌株名を付与した。付与された乳酸菌の菌株名は下記表１の通りである。具体的には、キムチから分離した乳酸菌は、５種のラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（表１の管理番号１〜５）、５種のラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）（表１の管理番号６〜１０）、５種のラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）（表１の管理番号１１〜１５）、および５種のラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）（表１の管理番号１６〜２０）であった。ヒトの糞便から分離した乳酸菌は、５種のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（表１の管理番号２１〜２５）、５種のラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（表１の管理番号２６〜３０）、５種のラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）（表１の管理番号３１〜３５）、４種のラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（表１の管理番号３６〜３９）、３種のラクトバチルス・ムコサエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｃｏｓａｅ）（表１の管理番号４０〜４２）、３種のビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）（表１の管理番号４３〜４５）、および５種のビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）（表１の管理番号４６〜５０）であった。
【表１】
2021501586.tif 000003
【００５２】
（４）新規な乳酸菌ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３の生理学的特性
前記表１に記載された菌株のうちラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３（受託番号ＫＣＣＭ１２０８９Ｐ）は、グラム陽性桿菌であることが確認された。また、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、配列番号１の塩基配列を有することが明らかになった。ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をＢＬＡＳＴ検索で比較した結果、同一な１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を有するラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株は検索されず、公知のラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示すことを確認した。
【００５３】
ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３の生理学的特性中の炭素源利用性をＡＰＩ  ５０  ＣＨＬキットを用いて糖発酵試験で分析した。その結果は下記表２の通りである。下記表２において、「＋」は炭素源利用性が陽性の場合を示し、「−」は炭素源利用性が陰性の場合を示す。
【表２】
2021501586.tif 000004
【００５４】
（５）新規な乳酸菌ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９の生理学的特性
前記表１に記載された菌株のうちビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９（受託番号ＫＣＣＭ１２０８８Ｐ）は、グラム陽性桿菌であることが確認された。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、配列番号２の塩基配列を有することが明らかになった。ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をＢＬＡＳＴ検索で比較した結果、同一な１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を有するビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）菌株は検索されず、公知のビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示すことを確認した。
【００５５】
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９の生理学的特性中の炭素源利用性をＡＰＩ  ５０  ＣＨＬキットを用いて糖発酵試験で分析した。その結果は下記表３の通りである。下記表３において、「＋」は炭素源利用性が陽性の場合を示し、「−」は炭素源利用性が陰性の場合を示す。
【表３】
2021501586.tif 000005
【００５６】
実施例２：分離した乳酸菌の活性比較
【００５７】
（１）抗酸化活性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
ＤＰＰＨ（２，２−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）を０．２ｍＭ濃度になるようにエタノールに溶かしてＤＰＰＨ溶液を製造した。前記ＤＰＰＨ溶液０．１ｍＬに乳酸菌の懸濁液（１×１０6ＣＦＵ／ｍＬ）またはビタミンＣ溶液（１ｇ／ｍＬ）を入れて２０分間３７℃で培養した。培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄みを得た。その後、５１７ｎｍで上澄みの吸光度を測定して、分離した乳酸菌の抗酸化活性を計算した。各乳酸菌別の抗酸化活性は下記表４の通りである。
【００５８】
（２）マクロファージでの炎症指標の測定
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｍａｌｅ、６週齢、２０〜２３ｇ）の腹腔に滅菌された４％チオグリコレート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ）２ｍＬを投与した。９６時間の経過後にマウスを麻酔し、マウスの腹腔にＲＰＭＩ  １６４０培地８ｍＬを投与した。５〜１０分後にマウスの腹腔内のＲＰＭＩ培地（マクロファージ）を抜き取り、１０００ｇで１０分間遠心分離し、さらにＲＰＭＩ  １６４０培地で２回洗浄した。前記マクロファージを各ウェル当たりに０．５×１０6の数で２４−ウェルプレートに敷き、分離した乳酸菌（最終処理濃度：１×１０4ＣＦＵ／ｍＬ、以下同一）と炎症反応誘導物質であるリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）を２時間または２４時間処理した後に上澄みおよび細胞を得た。得られた細胞をＲＩＰＡバッファ（Ｇｉｂｃｏ社）に入れて均質化した。２４時間処理した培養上澄みにおいてＴＮＦ−α、ＩＬ−１０などのサイトカイン発現量を、２時間処理して得られた細胞からｐ６５（ＮＦ−ｋＢ）、ｐ−ｐ６５（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＮＦ−ｋＢ）およびβ−ａｃｔｉｎの発現量を免疫ブロット法（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）により測定した。各乳酸菌別の炎症指標の発現レベルは下記表４の通りである。
【００５９】
（表４の活性測定時の基準：＋＋＋、＞９０％、非常に強い；＋＋、＞６０−９０％、強い；＋、＞２０−６０％、弱い；−、＜２０％、効果が微小、表５も同一）
【表４】
2021501586.tif 000006
2021501586.tif 000007
【００６０】
（３）Ｃａｃｏ２細胞のＺＯ−１タンパク質の発現効果
大腸癌細胞であるＣａｃｏ２細胞を韓国細胞株バンクから分譲してＲＰＭＩ  １６４０培地で４８時間培養した後、Ｃａｃｏ２細胞をウェル当たりに２×１０6の量になるように１２−ウェルプレートに分株した。各ウェルにＬＰＳ  １μｇを単独で処理するか、またはＬＰＳ  １μｇと乳酸菌１×１０4ＣＦＵを共に処理した後、２４時間培養した。その後、各ウェルから培養された細胞を集め、免疫ブロット法（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）により密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＺＯ−１の発現量を測定した。各乳酸菌別のＺＯ−１の発現量は下記表５の通りである。
【表５】
2021501586.tif 000008
2021501586.tif 000009
【００６１】
（５）実験結果
分離した乳酸菌の活性を評価した結果、分離した乳酸菌のうち新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９が密着結合タンパク質であるＺＯ−１の発現量を増加させつつ、抗酸化活性および炎症反応の抑制効果に優れることを確認した（表４および表５）。
【００６２】
実施例３：マクロファージに対する炎症反応抑制能の測定
【００６３】
前記実施例２において抗酸化活性および炎症反応の抑制効果に優れる新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９に対し、投与濃度に応じた炎症反応の抑制効果を確認した。
【００６４】
具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、２０〜２３ｇ）の腹腔に滅菌された４％チオグリコレート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ）２ｍＬを投与した。９６時間の経過後にマウスを麻酔し、マウスの腹腔にＲＰＭＩ  １６４０培地８ｍＬを投与した。５〜１０分後にマウス腹腔内のＲＰＭＩ培地（マクロファージ）を抜き取り、１０００ｇで１０分間遠心分離し、さらにＲＰＭＩ  １６４０培地で２回洗浄した。２４−ウェルプレートにおいて５時間培養して付着した細胞をマクロファージとして用いた。前記マクロファージを各ウェル当たりに０．５×１０6の数で敷き、１０3、１０4および１０5ＣＦＵ／ｍＬの新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９と炎症反応誘導物質であるリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）を９０分間または２４時間処理した後に上澄みおよび細胞を得た。得られた細胞をＲＩＰＡバッファ（Ｇｉｂｃｏ社）に入れて均質化した。９０分間処理して得られた細胞からｐ６５（ＮＦ−ｋＢ）、ｐ−ｐ６５（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＮＦ−ｋＢ）およびβ−ａｃｔｉｎの発現量を免疫ブロット法（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）により測定した。２４時間処理した後に得られた培養上澄みでは、ＴＮＦ−αのサイトカインの発現量をＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
その結果、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９を処理した全ての群において、ＮＦ−ｋＢの活性が抑制され、ＴＮＦ−αの発現量が抑制されることを確認した（図１および図２）。
【００６５】
実施例４：膣炎原因菌に対する抗菌力
【００６６】
（１）乳酸菌の抗菌試験
ＧＡＭ培地に、分離した新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９（１×１０6、１×１０7、１×１０8ＣＦＵ／ｍＬ）と共にガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）またはアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）（１×１０6ＣＦＵ／ｍＬ）を移植した。３７℃、嫌気的条件でＢＨＩ  ｂｒｏｔｈに酵母抽出物（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）（１％）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）（０．１％）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）（０．１％）および馬血清（ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ）（１０％）を添加したＢＨＩＳ培地において２４時間培養して抗菌力を測定した。
【００６７】
その結果、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９のいずれもガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）およびアトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ）に対して９５％以上の成長抑制効果を示すことを確認した（図３および図４）。
【００６８】
（２）乳酸菌の感染抑制能
【００６９】
ヒト子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ細胞を３７℃、５％  ＣＯ2および９５％空気条件でＲＰＭＩ  １６４０培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）含有）において培養しつつ、分離した乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９（１×１０4、１×１０6ＣＦＵ／ｍＬ）のみ、または前記乳酸菌（１×１０5、１×１０6、１×１０7ＣＦＵ／ｍＬ）と共にガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（１×１０5ＣＦＵ／ｍＬ）を移植して２４時間後に、ＨｅＬａ細胞に付着した細菌数をｑＰＣＲにより測定した。
【００７０】
その結果、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９を共に移植したＨｅＬａ細胞においては、付着したガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）数が顕著に減少することを確認した（図５）。
【００７１】
上記の実験結果から、新規な乳酸菌は、膣炎誘発細菌の成長抑制効果を示すだけでなく、細菌の感染を抑制させる効果も奏することが分かった。
【００７２】
実施例５：動物モデルでの乳酸菌の膣炎治療効果
【００７３】
（１）膣炎動物モデルの作製および乳酸菌の投与
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、１９〜２２ｇ、６週齢）を１群当たりに６匹ずつ用いて実験を行った。前記マウスにβ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  １７−ｂｅｎｚｏａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社、ＭＯ、米国）０．１２５ｍｇをオリーブオイルに溶かして皮下注射した。３日後、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（１×１０8ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ）をマウスの膣内に移植した。移植して８日目から１４日間、毎日１回ずつ１×１０9ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅの分離した新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９またはこれらの１：１の混合物を経口または膣内に直接投与した。乳酸菌を投与して７日目（移植して１４日目）に最後に投与し、２４時間後に動物モデルを犠牲死させて実験を行った。
【００７４】
（２）膣内炎症の発生有無の確認
上記のようにガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）をマウスの膣に移植した結果、膣と子宮に浮腫を伴った炎症が発生した。しかし、新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９またはこれらの混合物を経口または膣内に投与した結果、膣と子宮の外観上の炎症が有意に減少することを確認した（図６）。
【００７５】
（３）乳酸菌およびガードネレラ・バギナリス菌株の定量
新規な乳酸菌を上記のように投与してから２４時間および４８時間に、滅菌された生理食塩水０．５ｍｌで膣内を洗い出した。洗い出した膣洗浄液をＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて分離した後、ＰＣＲにより乳酸菌およびガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）菌株を定量した。
【００７６】
その結果、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９またはこれらの混合物を経口または膣内に投与した群においては、感染したガードネレラ・バギナリスの菌数が９９％以上減少することを確認した（図７）。
【００７７】
（４）ミエロペルオキシダーゼ活性の測定
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０）１ｍｌに上記のように洗い出した膣洗浄液を加えて超音波処理した。溶かして凍らせる過程を３回実施した後に遠心分離した。上層液１００μＬにＯ−ジアニシジン（ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ、０．１２９ｍｇ／ｍＬ）３９８μＬを加えた。Ｈ2Ｏ2の最終濃度を０．０００５％に合わせた後、２５℃および４９２ｎｍ条件で経時的（ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ）にミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）の活性を測定した。
【００７８】
その結果、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）で感染させた群の場合は、膣の代表的な炎症指標であるミエロペルオキシダーゼの活性が有意に増加した。しかし、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９またはこれらの混合物を経口または膣内に投与した群においては、ミエロペルオキシダーゼの活性が顕著に減少することを確認した（図８）。
【００７９】
（５）膣粘膜における転写因子およびサイトカインの分析
前記犠牲死させた動物モデルの大腸または膣粘膜組織にｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．４ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｅｉｔｏｌ、０．５ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、２０μｇ／ｍＬトリプシン阻害剤、１％  ｎｏｎｉｄｅｔ  ｐ−４０、２０％グリセロール）を入れて均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ）した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙによりタンパク質を定量して、タンパク質５０μｇ／μＬが含まれるように検体を製造した。前記検体に電気泳動サンプルバッファ（Ｌａｅｍｍｌｉ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ９５０μＬ＋βＭｅ  ５０μＬ）１０μｇ／μＬを加えた後、１００℃で３分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させ、電気泳動（１５０Ｖ、３０ｍＡ）を行った。電気泳動したゲルを３０Ｖにおいて２時間メンブレンにトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。前記メンブレンを５％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ／ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ）に１５ｍＬ入れ、１時間揺すった。１次抗体１０μｇ／μＬに１％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ／ＰＢＳ−Ｔ  １０ｍＬを入れて１２時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ溶液で５分間３回洗浄した。そして、各サイトカインおよび転写因子に対する２次抗体１０μｇ／μＬに１％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ／ＰＢＳ−Ｔ  ２０ｍＬを入れて１時間揺すって反応させた。ＰＢＳ−Ｔ溶液で５分間３回洗浄した後、最後にＥＣＬ溶液で発光させた。
【００８０】
その結果、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）で感染させた群の場合は、膣組織における、ＴＮＦ−αの発現が増加し、ＩＬ−１０の発現が減少した。しかし、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９またはこれらの混合物を経口または膣内に投与した群においては、ＴＮＦ−αの発現が抑制され、ＩＬ−１０の発現が増加することを確認した（図９および図１０）。
【００８１】
（６）膣内乳酸菌の増加
マウスの膣を滅菌された生理食塩水０．５ｍｌで膣内を２回洗い出した。洗い出した膣洗浄液を集めて遠心分離（１０，０００ｇ、１０分間）し、沈殿物をｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  Ｆｅｃｅｓ  ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡ  １０ｎｇをＱｉａｇｅｎ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒにおいて下記のプライマーを入れ、ＳＹＢＥＲ  ｐｒｅｍｉｘを入れて、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（９５℃、３０秒間）、ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ（９５℃、５秒間）およびａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（６３℃、３０秒間）を３８回繰り返してＰＣＲを行った。
【００８２】
乳酸菌 (Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ)  ｆｏｒｗａｒｄ（５’−３’）  ＣＴＣ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＴＴＣ（配列番号３）；
乳酸菌 (Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ)  ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−３’）  ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＣＧＴ（配列番号４）；
Ｃｏｎｔｒｏｌ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ｆｏｒｗａｒｄ（５’−３’）  ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＡＧ（配列番号５）；および
Ｃｏｎｔｒｏｌ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−３’）  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＷＴＣ  ＣＡＲ  ＣＣ（配列番号６）。
【００８３】
その結果、ガードネレラ・バギナリスにより感染した場合、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）が顕著に減少する反面、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９またはこれらの混合物を経口または膣内に投与時、前記乳酸菌が増加することを確認した（図１１）。これは、ガードネレラ・バギナリスにより膣炎が誘導されて減少した乳酸菌が、前記乳酸菌の投与により回復して、膣内酸性条件を回復したことを意味する。
【００８４】
前記実験結果から、新規な乳酸菌は、膣炎の予防および治療に効果があることを確認した。
【００８５】
実施例５：動物モデルでの乳酸菌の大腸炎の治療効果
【００８６】
（１）大腸炎動物モデルの作製および乳酸菌の投与
【００８７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、２１〜２３ｇ、６週齢）を１群当たりに６匹ずつ用いて１週間実験室に適応させた後に実験を行った。１群を正常群にし、残りの群のマウスは２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＮＢＳ）で大腸炎を誘発した。具体的には、実験動物をエーテルで麻酔した後、５０％エタノールに混合したＴＮＢＳ溶液を先の丸い１ｍＬ容量の注射器を用いて肛門を通して大腸内に０．１ｍＬずつ投与し、垂直に持ち上げて３０秒間保持して炎症を誘発した。一方、正常群には生理食塩水０．１ｍＬを経口投与した。投与して翌日から、毎日１回ずつ３日間新規な乳酸菌であるラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９またはこれらの１：１の混合物を生理食塩水に懸濁して１×１０9ＣＦＵの量で経口投与した。乳酸菌の投与が終了した翌日に実験動物を犠牲死させた後、大腸部位のうち盲腸から肛門の直前部位までの大腸を摘出して長さを測定した。その後、これより、下記の各種指標を確認した。一方、正常群の実験動物には、新規な乳酸菌の代わりに、乳酸菌懸濁液である１％デキストロース溶液を経口投与した。また、陽性対照群の実験動物には、新規な乳酸菌の代わりに、大腸炎治療薬物であるスルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）を５０ｍｇ／ｋｇの量で経口投与した。
【００８８】
（２）ミエロペルオキシダーゼ活性の測定
大腸組織１００ｍｇに０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）含有１０ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．０）２００μＬを入れ、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）した。４℃および１０，０００ｇの条件で１０分間遠心分離して上澄みを得た。上澄み５０μＬを０．９５ｍＬの反応液（１．６ｍＭテトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）と０．１ｍＭ  Ｈ2Ｏ2含有）に入れ、３７℃で反応させつつ、６５０ｎｍで経時的に吸光度を測定した。前記ミエロペルオキシダーゼ活性は、反応物として生じたＨ2Ｏ2  １μｍｏｌ／ｍＬを１ユニットに計算した。
【００８９】
（３）炎症指標の測定
ウェスタンブロット法を利用して、ｐ−ｐ６５、ｐ６５、ＣＯＸ−２およびβ−ａｃｔｉｎのような炎症反応指標物質を測定した。具体的には、前記ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性測定実験と同様の方法により得られた上澄み５０μｇを取り、免疫ブロット法を行った。また、サイトカイン（ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α）の発現量は、ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用いて測定した。
【００９０】
（４）実験結果
前記で行った実験結果は下記表６の通りである。
【表６】
2021501586.tif 000010
【００９１】
具体的には、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９またはこれらの混合物を投与した群での体重変化が大きくなく毒性がないことを確認した。また、大腸炎の誘導時に大腸の長さが短くなったが、乳酸菌を投与した群においては大腸長さの回復効果を奏することを確認した。さらに、乳酸菌を投与した群においては、大腸炎の誘導により増加したミエロペルオキシダーゼ活性が減少し、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７のサイトカインの発現量が抑制され、ＮＦ−ｋＢの活性およびＣＯＸ−２の活性が抑制されることを確認した。
それにより、新規な乳酸菌は、毒性を示さず、且つ、大腸炎の予防および治療に効果があることを確認した。
【００９２】
＜乳酸菌の受託情報＞
本発明の発明者らは、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＫ３を２０１７年８月４日に公認寄託機関である韓国微生物保存センター（アドレス：大韓民国、ソウル西大門区弘済内２街ギル４５ユリムビル）に特許寄託してＫＣＣＭ１２０８９Ｐの受託番号を与えられた。
また、本発明の発明者らは、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＫ４９を２０１７年８月４日に公認寄託機関である韓国微生物保存センター（アドレス：大韓民国、ソウル西大門区弘済内２街ギル４５ユリムビル）に特許寄託してＫＣＣＭ１２０８８Ｐの受託番号を与えられた。
【表７】
2021501586.tif 000011
【表８】
2021501586.tif 000012
【図１】
2021501586.tif 000013
【図２】
2021501586.tif 000014
【図３】
2021501586.tif 000015
【図４】
2021501586.tif 000016
【図５】
2021501586.tif 000017
【図６】
2021501586.tif 000018
【図７】
2021501586.tif 000019
【図８】
2021501586.tif 000020
【図９】
2021501586.tif 000021
【図１０】
2021501586.tif 000022
【図１１】
2021501586.tif 000023
【配列表】
2021501586000001.app
【国際調査報告】
2021501586.tif 000024
2021501586.tif 000025
2021501586.tif 000026
2021501586.tif 000027
2021501586.tif 000028
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