(57)【要約】  本発明は、標的核酸の存在下で任意の代理標的が共に増幅されるように誘導する標的核酸検出方法に関し、より詳細には、標的核酸が存在する場合、標的核酸と任意の代理標的間の融合増幅産物（ｆｕｓｉｏｎ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）が生成されるように誘導し、前記融合増幅産物を増幅して標的核酸検出の高効率及び高敏感度を具現する方法及び前記方法の具現のための重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）用組成物に関する。本発明に係る標的核酸検出方法は、重合酵素連鎖反応産物の塩基配列の一部を任意に調整することができ、結果的に標的核酸塩基配列に対する依存度が最小化し、仮にグアニン／シトシンの割合が過度に高いため当該部位の検出が難しい標的核酸であってもそれに対する検出を効果的に行うことができ、前記代理標的の標的核酸相補的塩基配列部位と増幅プライマー相補的塩基配列部位との間に任意の塩基配列を挿入できるので、このような任意の塩基配列部位と混成化する汎用（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）プローブを作製することによって、標的核酸の塩基配列が変更されても前記汎用プローブは継続して使用できるという長所がある。また、本発明に係る標的核酸検出方法は、前記代理標的の注入量を調節して容易に標的核酸検出の敏感度だけを独立して調整することができ、診断製品開発時に敏感度の最適化過程で検出効率が変動することを最小化できるので、分子診断、産前診断、早期診断、癌診断、遺伝関連診断、遺伝形質診断、感染菌の診断、薬剤耐性菌の判別、法医学、生物体の種判別などに有用である。【選択図】図１
2021509821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含む標的核酸増幅方法：
（ａ）検体試料から核酸を分離する段階；
（ｂ）ｉ）標的核酸と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）できる１個以上の探索プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）；ｉｉ）前記探索プライマーが結合しない標的核酸部位と結合する配列及び標的核酸に結合しない任意の配列を含む１個以上の代理標的（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ）；及びｉｉｉ）前記代理標的が増幅できる１個以上の増幅プライマー；を注入して重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行う段階；及び
（ｃ）融合増幅産物の存在有無を判別する段階。
【請求項２】
前記探索プライマーが結合しない標的核酸部位は、探索プライマーのダウンストリーム（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に存在し、前記探索プライマーのダウンストリームは、探索プライマーが標的核酸と結合した後、ＰＣＲによって伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）される方向であることを特徴とする、請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項３】
前記代理標的は、３’末端に核酸重合が抑制される官能基又は塩基をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項４】
前記核酸重合が抑制される官能基又は塩基は、アミン基（ａｍｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）、リン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）、アルキル基（ａｌｋｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、アルカンジオール（ａｌｋａｎｅ−ｄｉｏｌ）、ホスホロチオエート（ｐｈｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、非塩基性リンカー（ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋｅｒ）、Ｃ３〜１８スぺーサー（Ｃ３−１８  ｓｐａｃｅｒ）、ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｉ−ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｄｄＮＴＰ）、逆方向デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＮＴＰ）、及び逆方向ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｉ−ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｄＮＴＰ）から構成された群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項３に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項５】
前記探索プライマー、代理標的及び増幅プライマーは、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）及びＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）のいずれか一つ又はそれらの混合からなることを特徴とする、請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項６】
前記代理標的は、１０〜５００個の塩基配列長に作製されたオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であることを特徴とする、請求項５に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項７】
前記代理標的は、２０〜１５０個の塩基配列長に作製された一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であることを特徴とする、請求項６に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項８】
前記代理標的は、１〜１００個の塩基配列長に作製された一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であるスぺーサー（ｓｐａｃｅｒ）をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項９】
前記代理標的は、２〜２０個の塩基配列長に作製された一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であるスぺーサー（ｓｐａｃｅｒ）をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項１０】
前記スぺーサーのＧＣ割合は３０％以下であることを特徴とする、請求項８に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項１１】
前記代理標的は、探索プライマーが混成化する標的核酸鎖と同一の鎖又は反対側の鎖に混成化することを特徴とする、請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項１２】
前記増幅プライマーは、代理標的の任意の配列と同一であるか、或いは任意の配列に相補的であることを特徴とする、請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項１３】
前記融合増幅産物の長さは５０ｂｐ〜１ｋｂｐであり、ＧＣ割合は３５〜６５％であることを特徴とする、請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項１４】
前記（ｃ）段階の融合増幅産物の存在有無を判別する段階は、前記融合増幅産物に結合できる核酸結合染料（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｙｅ）又はプローブ（ｐｒｏｂｅ）を使用することを特徴とする、請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項１５】
前記核酸結合染料は、臭化エチジウム（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、サイバーグリーン１（ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）、サイバーグリーンゴールド（ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｏｌｄ）、エバーグリーン（ＥｖａＧｒｅｅｎ）、ヨウプロ−１（ＹＯ−ＰＲＯ−１）、サイト（ＳＹＴＯ）、ＢＥＢＯ（ＢＥＢＯ）及びベクスト（ＢＥＸＴＯ）から構成された群から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項１６】
前記融合増幅産物に結合できるプローブは、オリゴヌクレオチド、ＬＮＡ、ＰＮＡ及びそれらの混合から構成された群から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項１７】
前記融合増幅産物に結合できるプローブは、代理標的の任意の配列に結合することを特徴とする、請求項１６に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項１８】
前記融合増幅産物に結合できるプローブは、両末端にレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）と消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が連結されていることを特徴とする、請求項１６に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項１９】
前記レポーターは、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フルオレセインクロロトリアジニル（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌ）、ロダミングリーン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ）、ロダミンレッド（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｒｅｄ）、テトラメチルロダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＦＩＴＣ、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ）、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ＴＥＴ、ＴＲＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）系染料及びチアジカルボシアニン（ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）染料から構成された群から選ばれる一つ以上の蛍光物質であることを特徴とする、請求項１８に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項２０】
前記消光子は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、タムラ（ＴＡＭＲＡ）、エクリプス（Ｅｃｌｉｐｓｅ）、ＤＤＱ、ＱＳＹ、ブラックベリークエンチャー（Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、Ｑｘｌ、アイオワブラック（Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ）ＦＱ、アイオワブラックＲＱ及びＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１から構成された群から選ばれる一つ以上であることを特徴とする、請求項１８に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項２１】
前記（ｂ）段階は、探索プライマーが混成化する標的核酸鎖の反対鎖と混成化する補助プライマーをさらに注入することを特徴とする、請求項１に記載の標的核酸増幅方法。
【請求項２２】
ｉ）標的核酸と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）できる１個以上の探索プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）；
ｉｉ）前記探索プライマーが結合しない標的核酸部位と結合する配列及び標的核酸に結合しない任意の配列を含む１個以上の代理標的（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ）；及び
ｉｉｉ）前記代理標的を増幅できる１個以上の増幅プライマー；
を含む標的核酸増幅用ＰＣＲ組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、探索プライマーが混成化する標的核酸鎖と反対側の鎖と混成化する補助プライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項２２に記載の標的核酸増幅用ＰＣＲ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸（ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）塩基配列に対する依存度を最小化できる標的核酸増幅方法、及び標的核酸検出敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を増加させる過程で標的核酸増幅効率の変化を最小化できる標的核酸増幅方法に関し、より詳細には、標的核酸が存在する場合、標的核酸と任意の代理標的（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ）間の融合増幅産物（ｆｕｓｉｏｎ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）が生成されるように誘導し、該融合増幅産物を増幅して標的核酸増幅の高効率及び高敏感度を具現する方法、前記標的核酸と任意の代理標的間の融合増幅産物生成過程で代理標的の注入量だけを調節して標的核酸検出敏感度を効果的に調整する方法及び前記方法具現のための重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球上のあらゆる生命体が持つ遺伝情報は各個体に固有な属性の根源となり、これは、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）という物質にアデニン（Ａ；ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（Ｇ；ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（Ｃ；ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、チミン（Ｔ；ｔｈｙｍｉｎｅ）、ウラシル（Ｕ；ｕｒａｃｉｌ）の塩基が配列された順序で記録される。したがって、このような塩基の順序（塩基配列）を明らかにしたり、確認することは、生命体の属性を確認し、内在された代謝機作を理解するための過程になり得る。
【０００３】
近年、生命体の特定塩基配列を検出又は確認する方法によって生命体の存在の有無又はその属性を確認する分子診断（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）法が広く活用されている。医学的に活用される分子診断の代表例に、人間の癌発生に関連している遺伝子突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を検出したり、人間に発生し得る感染疾患の原因病源体を検出したりすることがあり、その他、食品に存在する有害微生物を検出する検査もやはり分子診断に属する。
【０００４】
特定塩基配列を特異的に確認するための分子診断の様々な手法の大多数が核酸重合酵素（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いた重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用する。前記重合酵素連鎖反応は、特定塩基配列部位を含む標的核酸（ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に特異的に混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）し得る一対のプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、及び前記プライマーを始発体とし、標的核酸を鋳型として重合酵素連鎖反応を起こし得る耐熱性（ｔｈｅｒｍｏ−ｓｔａｂｌｅ）核酸重合酵素を含む組成物、並びに前記組成物に所定の温度を段階的で繰り返し与え得る装置（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）によってなされる。また、前記重合酵素連鎖反応を用いた分子診断は、大量で形成された（増幅された）標的核酸内の特定塩基配列を実時間で検出するために核酸結合染料（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｙｅ）又はプローブ（ｐｒｏｂｅ）を活用するが、これらを実時間重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）と呼ぶ（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９２．１０：４１３−４１７，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９３．１１：１０２６−１０３０）。
【０００５】
現在までの大多数の分子診断方法は、前記重合酵素連鎖反応を用いて標的核酸の存在有無又はその属性を確認しながら当該標的核酸を直接増幅する方式を用いてきた。標的核酸増幅には一対以上のプライマーが使用され、前記プライマーは必ず標的核酸と相補的でなければならないため、任意に塩基配列を調整できる機会は多くなかった。かかる理由で標的核酸の塩基配列特性が分子診断の性能に直接影響を与えているが、仮に標的核酸が高いグアニン／シトシンの割合（Ｇ／Ｃ  ｃｏｎｔｅｎｔ）を有すると、２次構造（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）形成及び高すぎる融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を示すことになるため、前記重合酵素連鎖反応時の増幅効率が大きく減少し、診断製品の開発において主な障害要素として指摘されてきた（ＭｃＤｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９８．２６：３３４０−３３４７）。
【０００６】
その上、現在までの多くの分子診断方法は、前記実時間重合酵素連鎖反応を用いて標的核酸の存在有無又はその属性を確認しながら蛍光信号を発生させ得るプローブを活用してきた。前記プローブも標的核酸を増幅するプライマーと同様に標的核酸に相補的な塩基配列を持っていなければならため、標的核酸を変更する場合、プローブも必ず変更しなければならないという非効率的な側面があった。仮に標的特異的なプローブではなく核酸結合染料を用いて重合酵素連鎖反応産物を検出する場合、標的核酸の変更に応じて核酸結合染料を変更する必要はないが、前記核酸結合染料が標的核酸の塩基配列を区別できず、標的特異的検出に限界がある実情である。
【０００７】
また、標的核酸の増幅効率は、実時間重合酵素連鎖反応において増幅曲線（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）の勾配で評価でき、標的核酸検出敏感度は、増幅曲線から算出されたＣｔ（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値で示すことができるが、今までの大多数の分子診断方法は、前記標的核酸の増幅効率又は検出敏感度を最適化しながら主にプライマーの塩基配列又は注入量だけを調節するしかできなかったため、前記増幅効率と検出敏感度を独立して調整することが困難であり、最適化に多い時間と費用がかかるという短所があった。すなわち、プライマーの塩基配列又は注入量が変わったとき、前記増幅効率と検出敏感度が同時に変わるので、検出敏感度を向上させる過程で増幅効率をコントロールし難く、多くの試行錯誤が必要であった。
【０００８】
そこで、本発明者らは、標的核酸の性質に制限されることなく標的核酸を増幅できる方法及び核酸増幅効率に及ぶ影響を最小化しながら標的核酸増幅の敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を効果的に増加させることができる方法を開発するために鋭意努力した結果、標的核酸と混成化する探索プライマー；標的核酸と結合する配列及び任意の配列を含む代理標的（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ）；及び代理標的を増幅できる増幅プライマーを用いて融合増幅産物（ｆｕｓｉｏｎ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）を生成する方法でＰＣＲを行う場合、標的核酸に対する依存度が最小化するだけでなく、高敏感度及び高効率で標的核酸を増幅でき、また前記代理標的の量を調節すれば標的核酸増幅敏感度だけを独立して容易に調整できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
この背景技術の部分に記載された前記情報は単に本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、したがって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に既に知られた先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、標的核酸に対する依存度を最小化できる標的核酸の増幅方法及び核酸増幅効率に及ぶ影響を最小化しながら標的核酸増幅敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を効果的に調整することができる標的核酸増幅方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、標的核酸に対する依存度を最小化でき、標的核酸増幅敏感度を効果的に調整することができる標的核酸増幅用重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するために、本発明は、（ａ）検体試料から核酸を分離する段階；（ｂ）ｉ）標的核酸と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）できる１個以上の探索プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）；ｉｉ）前記探索プライマーが結合しない標的核酸部位と結合する配列及び標的核酸に結合しない任意の配列を含む１個以上の代理標的（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ）；及びｉｉｉ）前記代理標的を増幅できる１個以上の増幅プライマーを注入して重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行う段階；及び（ｃ）融合増幅産物（ｆｕｓｉｏｎ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）の存在有無を判別する段階を含む標的核酸増幅方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ｉ）標的核酸と混成化できる１個以上の探索プライマー；ｉｉ）前記探索プライマーが結合しない標的核酸部位と結合する配列及び標的核酸に結合しない任意の配列を含む１個以上の代理標的；及びｉｉｉ）前記代理標的を増幅できる１個以上の増幅プライマーを含む標的核酸増幅用重合酵素連鎖反応組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の具現に必要な構成物及び構成物間の混成化関係を示す図であり、（ａ）は探索プライマーと代理標的が同一の標的核酸鎖に結合する場合を、（ｂ）は探索プライマーと代理標的が異なる標的核酸鎖に結合する場合を示す。
【図２】本発明の具現に使用できる代理標的の構造を示す図である。
【図３】本発明の実施例から得られる融合増幅産物（ａ）と一般の重合酵素連鎖反応から得られる増幅産物（ｂ）とを比較して示す図である。
【図４】本発明の実施例において、融合増幅産物を形成するできる機序のうち一つを示す図であり、（ａ）は、標的核酸と探索プライマー、代理標的及び増幅プライマーとの混成化関係を示し、（ｂ）は、増幅プライマーによって代理標的の反対側の核酸鎖が合成されることを示し、（ｃ）及び（ｄ）は、（ｂ）で合成された前記代理標的の反対側の核酸鎖が標的核酸に結合後に伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）されることを示し、（ｅ）及び（ｆ）は、（ｄ）で合成された前記伸張された代理標的の反対側の鎖に探索プライマーが結合後に伸張されることを意味し、（ｇ）は、（ｄ）及び（ｆ）で合成された前記伸張された代理標的の反対側の鎖及び探索プライマー伸張鎖にさらに他の探索プライマー及び増幅プライマーが結合して合成が進行される過程を繰り返し行うことを示す。
【図５】本発明の実施例において、融合増幅産物を形成するできる機序のうち一つを示す図であり、（ａ）は、標的核酸と探索プライマー、代理標的及び増幅プライマーとの混成化関係を示し、（ｂ）は、標的核酸に結合した探索プライマー及び代理標的に結合した増幅プライマーが伸張されて新しい核酸鎖を合成することを示し、（ｃ）は、（ｂ）で合成した探索プライマーと増幅プライマーの伸張鎖が分離された後に互いに混成化が起きて融合増幅産物の生成が始まることを意味し、（ｄ）は、生成の完了した融合増幅産物を意味し、（ｅ）は、（ｄ）で生成された融合増幅産物にさらに他の探索プライマー及び増幅プライマーが結合して合成が進行される過程を繰り返し行うことを示す。
【図６】本発明の実施例において、融合増幅産物を形成するできる機序のうち一つを示す図であり、（ａ）は、標的核酸と探索プライマー、代理標的及び増幅プライマーとの混成化関係を示す図であり、（ｂ）は、標的核酸に結合した探索プライマー及び代理標的に結合した増幅プライマーが伸張されて新しい核酸鎖を合成することを示し、（ｃ）及び（ｄ）は、（ｂ）で合成された増幅プライマー伸張鎖がさらに他の標的核酸に結合した後にさらに追加伸張されることを意味し、（ｅ）及び（ｆ）は、（ｄ）で追加伸張された増幅プライマー伸張鎖に探索プライマーが結合後に伸張されることを意味し、（ｇ）は、（ｄ）及び（ｆ）で合成された前記増幅プライマー伸張鎖及び探索プライマー伸張鎖にさらに他の探索プライマー及び増幅プライマーが結合して合成が進行される過程を繰り返し行うことを示す。
【図７】本発明の実施例において、融合増幅産物を形成するできる機序のうち一つを示す図であり、（ａ）は、標的核酸と探索プライマー、代理標的及び増幅プライマーとの混成化関係を示す図であり、（ｂ）は、標的核酸に結合した探索プライマー及び代理標的が伸張されて新しい核酸鎖を合成することを示し、（ｃ）及び（ｄ）は、（ｂ）で合成された代理標的伸張鎖にさらに他の探索プライマーが結合後に伸張されることを示し、（ｅ）は、（ｂ）及び（ｄ）で合成された前記代理標的伸張鎖及び探索プライマー伸張鎖にさらに他の探索プライマー及び増幅プライマーが結合して合成が進行される過程を繰り返し行うことを示す。
【図８】本発明の具現に使用できる補助プライマー（ａｓｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｉｍｅｒ）の役割を示す図である。補助プライマーは、探索プライマーと対をなして標的核酸の標的部位の量を増加させることによって、微量の標的核酸が存在する条件で融合増幅産物の生成を促進することができる。
【図９】本発明の実施例において、ヒト遺伝体内上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ；Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子の増幅及び検出結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例において、補助プライマーを用いたヒト遺伝体内上皮細胞成長因子受容体遺伝子の増幅及び検出結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例において、様々な形態の代理標的を用いたヒト遺伝体内上皮細胞成長因子受容体遺伝子の増幅及び検出結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例において、グアニン／シトシンの割合が相対的に高いヒト遺伝体内ＨＲＡＳ遺伝子の増幅結果を示す図であり、本発明の標的核酸増幅方法（Ａ）と通常の標的核酸増幅方法（Ｂ）を比較したものである。
【図１３】本発明の実施例において、グアニン／シトシンの割合が相対的に高いヒト遺伝体内ＨＲＡＳ遺伝子の増幅及び検出結果を示す図であり、本発明の標的核酸増幅方法（Ａ）と通常の標的核酸増幅方法（Ｂ）を比較したものである。
【図１４】本発明の実施例において、ヒト遺伝体内上皮細胞成長因子受容体遺伝子検出の敏感度調整結果を示す図であり、本発明の敏感度調整方法（Ａ）及び通常の敏感度調整方法（Ｂ）を比較したものである。
【図１５】本発明の実施例において、ヒト遺伝体内ＥＧＦＲ遺伝子とＨＲＡＳ遺伝子の多重増幅及び検出結果を示す図であり、ＥＧＦＲ遺伝子標的の注入量がＨＲＡＳ遺伝子標的に比べて多い条件（Ａ）とＨＲＡＳ遺伝子標的の注入量がＥＧＦＲ遺伝子標的に比べて多い条件（Ｂ）において、本発明の標的核酸増幅方法と通常の標的核酸増幅方法を比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
特に定義されない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法は本技術分野によく知られており、通用されるものである。
【００１６】
本発明では、標的核酸の依存度を最小化した状態で標的核酸を増幅できるかどうかを確認しようとした。
【００１７】
すなわち、本発明の一実施例では、ヒトＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ  ２０、ｃｏｄｏｎ  ７９０の近隣部分に対して、標的核酸センス（ｓｅｎｓｅ）鎖（ｓｔｒａｎｄ）に結合し得る探索プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、探索プライマーのダウンストリーム（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に該当する標的核酸配列に相補的な配列及び任意の配列を含む代理標的（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ）、及び代理標的の任意の配列の一部に結合し得る増幅プライマーを注入して重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００１８】
その結果、ヒトＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ  ２０、ｃｏｄｏｎ  ７９０の近隣部位と代理標的の融合増幅産物（ｆｕｓｉｏｎ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）が正常に形成され、検出用プローブ（ｐｒｏｂｅ）によって前記融合増幅産物が検出でき（図９）、標的核酸アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）鎖に結合し得る補助プライマー（ａｓｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｉｍｅｒ）をさらに投入した結果、ヒトＥＧＦＲ遺伝子検出の敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が反応当たり１０ｃｏｐｉｅｓレベルであり、非常に高敏感度の検出が可能であることを確認した（図１０）。
【００１９】
本発明のさらに他の一実施例では、平均的なグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量が高いため通常の重合酵素連鎖反応方法では増幅し難いヒトＨＲＡＳ遺伝子のｅｘｏｎ  ２、ｃｏｄｏｎ  １２〜１３の近隣部分に対して、標的核酸のセンス鎖に結合する探索プライマー、探索プライマーのダウンストリームに該当する標的核酸配列のアンチセンス鎖に相補的な配列及び任意の配列を含む代理標的、代理標的の任意の配列の一部と同じ配列を有する増幅プライマー、及び標的核酸アンチセンス鎖に結合し得る補助プライマーを注入して重合酵素連鎖反応を行った。
【００２０】
その結果、代理標的及び増幅プライマーが含まれていない通常の方法に比べてより高い増幅効率及び正確度でＨＲＡＳ遺伝子  ｅｘｏｎ  ２、ｃｏｄｏｎ  １２〜１３部分が検出できた（図１３）。
【００２１】
また、本発明では標的核酸検出敏感度を任意に調整するとき、核酸増幅効率に対する影響を最小化できるどうかを確認しようとした。
【００２２】
すなわち、本発明の一実施例では、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ  ２０、ｃｏｄｏｎ  ７９０の近隣部分に対して、標的核酸センス鎖に結合し得る探索プライマー、探索プライマーのダウンストリームに該当する標的核酸配列に相補的な配列及び任意の配列を含む様々な量（０．０１ｆｍｏｌｅ、０．１ｆｍｏｌｅ、１ｆｍｏｌｅ、１０ｆｍｏｌｅ）の代理標的、代理標的の任意の配列の一部に結合し得る増幅プライマー、及び標的核酸アンチセンス鎖に結合し得る補助プライマーを注入して重合酵素連鎖反応を行った。
【００２３】
その結果、通常の方法ではプライマーの濃度の増減によって標的核酸検出敏感度を調整する場合、核酸増幅効率も共に変化するのに対して、代理標的の注入量の調節によって標的核酸検出敏感度を調整する場合には、核酸増幅効率が一定に維持されることが確認できた（図１４）。
【００２４】
したがって、本発明は一観点において、（ａ）検体試料から核酸を分離する段階；（ｂ）ｉ）標的核酸と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）できる１個以上の探索プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）；ｉｉ）前記探索プライマーが結合しない標的核酸部位と結合する配列及び標的核酸に結合しない任意の配列を含む１個以上の代理標的（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ）；及びｉｉｉ）前記代理標的を増幅させ得る１個以上の増幅プライマーを注入して重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行う段階；及び（ｃ）融合増幅産物（ｆｕｓｉｏｎ  ａｍｐｌｉｃｏｎ）の存在有無を判別する段階を含む標的核酸の増幅方法に関する。
【００２５】
本発明において用語“標的核酸”は、検出しようとする全種類の核酸を意味し、各々の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）、亜種（ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ）、又は変種（ｖａｒｉａｎｔ）由来の遺伝子塩基配列又は同一種内遺伝子突然変異を含む。これは、ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡとｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ、ｖｉｒａｌ  ＤＮＡを含む全種類のＤＮＡ、又はｍＲＮＡ、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｖｉｒａｌ  ＲＮＡなどを含む全種類のＲＮＡを特徴とし得るが、これに限定されない。標的核酸は、重合酵素連鎖反応のための条件下で探索プライマー、補助プライマー、代理標的と混成化し、プローブ（ｐｒｏｂｅ）も標的核酸の一部又は全部と混成化し得る。
【００２６】
本発明において用語“混成化”は、相補的塩基配列を持つ一本鎖核酸間の水素結合によって二本鎖核酸が形成されることを意味し、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）と類似の意味で使われる。ただし、より広義には、混成化は、２つの一本鎖間の塩基配列が完全に相補的な場合（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）の他、例外として一部の塩基配列が相補的でない場合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）も含む。
【００２７】
本発明において用語“探索プライマー”とは、標的核酸と混成化して重合酵素連鎖反応によって前記融合増幅産物を形成及び増幅できるプライマーを意味する。
【００２８】
本発明において用語“増幅プライマー”とは、前記代理標的が、探索プライマーが混成化する標的核酸鎖と同じ鎖に混成化する場合、代理標的の任意の配列の一部と混成化して重合酵素連鎖反応によって前記融合増幅産物を形成及び増幅できるプライマーを意味し、前記代理標的が、探索プライマーが混成化する標的核酸鎖の反対鎖に混成化する場合、代理標的の任意の配列の一部と同じ配列であり、前記融合増幅産物を形成及び増幅できるプライマーを意味する。
【００２９】
本発明において前記増幅プライマーは、増幅しようとする標的核酸が複数の種類である場合、一つの増幅プライマーで複数の種類の標的を一度に増幅させることができるユニバーサルプライマーとしての機能を果たすことができる。すなわち、一般多重ＰＣＲは、検出しようとするターゲット（ｔａｒｇｅｔ）数字分だけ正方向及び逆方向プライマーを対にさせて同時に使用しなければならないが、本発明の方法は、複数の多重標的ＤＮＡを同時に検出する実時間ＰＣＲ過程において正方向プライマー（探索プライマー）のみを検出しようとするターゲット数字分だけ使用し、逆方向プライマー（増幅プライマー）はユニバーサルプライマーとして１個のみを使用してもよいので、複数のターゲットを同時に検出しようとするとき、少ない数のプライマーを使用して済み、ＰＣＲの複雑性及びＰＣＲ効率の偏差が減少する。
【００３０】
本発明において用語“融合増幅産物”は、探索プライマーと代理標的、増幅プライマーによって形成及び増幅され、標的核酸の一部と代理標的の全部又は一部の塩基配列が融合された形態の産物を意味する。好ましい実施例において融合増幅産物の形成は、核酸重合酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）又はフラップエンドヌクレアーゼ（ｆｌａｐ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性によって誘導され得るが、これに限定されるものではない。
【００３１】
本発明において、前記探索プライマーが結合しない標的核酸部位は探索プライマーのダウンストリーム（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に存在し、前記探索プライマーのダウンストリームは、探索プライマーが標的核酸と結合した後、ＰＣＲによって伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）される方向であることを特徴とし得る。
【００３２】
本発明において、代理標的は前記探索プライマーと対を成すことが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３３】
本発明において、前記代理標的は、必要な場合、プライマーとしての機能をしないように当業者に公知のいかなる方法を用いてもよいが、好ましくは、前記標的核酸に結合しない任意の配列が代理標的の３’末端又は５’末端に位置したり、或いは代理標的の３’末端に核酸重合が抑制される官能基又は塩基をさらに含むことを特徴とし得る。
【００３４】
本発明において、前記核酸重合が抑制される官能基又は塩基は、アミン基（ａｍｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）、リン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）、アルキル基（ａｌｋｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、アルカンジオール（ａｌｋａｎｅ−ｄｉｏｌ）、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、非塩基性リンカー（ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｎｋｅｒ）、Ｃ３〜１８スぺーサー（Ｃ３−１８  ｓｐａｃｅｒ）、ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｉ−ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｄｄＮＴＰ）、逆方向デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＮＴＰ）及び逆方向ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｉ−ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｄＮＴＰ）から構成された群から選ばれる１種以上であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
【００３５】
本発明において、前記探索プライマー、代理標的及び増幅プライマーは、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）及びＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）のいずれか一つ又はそれらの混合からなることを特徴とし得る。
【００３６】
本発明において、前記代理標的は、標的核酸と混成化し得るとともに、探索プライマーと増幅プライマーによって融合増幅産物の形成を誘導する核酸であればいずれも使用可能であるが、好ましくは、１０〜５００個の塩基配列長に作製されたオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）でよく、より好ましくは、２０〜１５０個の塩基配列長に作製された一本鎖オリゴヌクレオチドであることを特徴とし得る。
【００３７】
本発明において前記代理標的の標的核酸と結合する部分と任意の配列の長さ比率は６：４〜２：８であることを特徴とし得るが、これに限定されない。
【００３８】
本発明において前記代理標的の標的核酸と結合する部分は、４０〜８０℃の融解温度（Ｔｍ；ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有する１０〜５０個の長さの塩基配列を含むことを特徴とし得るが、これに限定されない。
【００３９】
本発明において前記代理標的の任意の配列は、１０〜１００個の長さの塩基配列であり得、標的核酸との相補性がないように任意に決められたり、標的核酸の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）とは異なる種由来の遺伝体塩基配列から決められることを特徴とし得るが、これに限定されない。
【００４０】
本発明において、前記代理標的は、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であるスぺーサー（ｓｐａｃｅｒ）をさらに含むことを特徴とし、前記スぺーサーの長さは１〜１００個の塩基配列であり得、より好ましくは２〜２０個の塩基配列であることを特徴とし得る。
【００４１】
本発明において、前記スぺーサーのＧＣ割合は３０％以下であり得、より好ましくは５〜３０％であり、最も好ましくは１〜１０％であることを特徴とし得る。
【００４２】
本発明において前記スぺーサーは、代理標的に含まれている任意の配列の中から、増幅プライマーが混成化したり増幅プライマーが含む配列を除いた配列を意味し、代理標的の標的核酸との混成化部位及び増幅プライマーが混成化したり或いは増幅プライマーが含む配列部位間の過度な隣接又は重なり（ｏｖｅｒｌａｐ）を防止する機能を果たし、必要な場合、融合増幅産物のＧＣ割合を調節する機能を有し、また、必要な場合、前記スぺーサーに結合できるプローブを用いて、標的核酸塩基配列が変更されても同じプローブで検出を行うようにする機能を果たすことができる。
【００４３】
本発明の一実施例では、スぺーサーが存在しない代理標的の場合、増幅効率が減少することを確認した。
【００４４】
本発明において、前記代理標的は、探索プライマーが混成化する標的核酸鎖と同一の鎖又は反対の鎖に混成化することを特徴とし得る。
【００４５】
本発明において、前記融合増幅産物の長さは５０ｂｐ〜１ｋｂｐであることを特徴とし、ＧＣ割合は３５〜６５％であり、より好ましくは４０〜６０％であることを特徴とし得る。
【００４６】
本発明において、前記探索プライマーは、前記代理標的に対する相補性がなく、代理標的と混成化しないか、一部が混成化されても核酸合成伸張が起きないことを特徴とし、前記増幅プライマーは標的核酸に対する相補性がなく、標的核酸と混成化しないか、一部が混成化されても核酸合成伸張が起きないことを特徴とし得る。
【００４７】
本発明において、前記（ｃ）段階の融合増幅産物の存在有無を判別する段階は、前記融合増幅産物に結合できる核酸結合染料（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｙｅ）又はプローブ（ｐｒｏｂｅ）を使用することを特徴とし得る。
【００４８】
本発明において、前記核酸結合染料は、インターカレーティング（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）物質又はＤＮＡマイナーグルーブ（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）結合物質であればいずれも使用可能であるが、好ましくは、臭化エチジウム（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、サイバーグリーン１（ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）、サイバーグリーンゴールド（ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｏｌｄ）、エバーグリーン（ＥｖａＧｒｅｅｎ）、ヨウプロ−１（ＹＯ−ＰＲＯ−１）、サイト（ＳＹＴＯ）、ベボ（ＢＥＢＯ）及びベクスト（ＢＥＸＴＯ）から構成された群から選ばれることを特徴とし得る。
【００４９】
本発明において、前記融合増幅産物に結合できるプローブは、オリゴヌクレオチド、ＬＮＡ、ＰＮＡ及びそれらの混合から構成される群から選ばれることを特徴とし得る。
【００５０】
ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ペプチド核酸）は、核酸塩基が糖−リン酸骨格以外のペプチド骨格に連結された類似ＤＮＡであり、１９９１年にＮｉｅｌｓｅｎ等によって初めて合成された。ＰＮＡは、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）又はＭＮＡ（Ｍｏｐｈｏｌｉｎｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）と同様に、遺伝子認識物質の一つとして人工的に合成し、基本骨格がポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）で構成されている。
【００５１】
ＰＮＡは、親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）と選択性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）に非常に優れ、核酸分解酵素に対する安定性が高いため、現存する制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）で分解されない。また、熱／化学的に物性及び安定性が高いため、長期保管しやすいという長所がある。
【００５２】
ＰＮＡは、相補的な塩基配列の天然核酸と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応によって二重鎖を形成する。長さが同一の場合、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖はＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも、ＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖はＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖よりも安定である。また、ＰＮＡは単一塩基不整合（ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｓｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）によって二本鎖が不安定になる程度が大きいので、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出する能力が天然核酸に比べて高い。
【００５３】
すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合力よりもＰＮＡ−ＤＮＡ結合力が非常に高く、１個のヌクレオチド不整合（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）に対しても融解温度（Ｔｍ）値が普通１５〜２０℃程度の差異を示す。このような結合力の差異を用いてＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及びＩｎ／Ｄｅｌ（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ）などの塩基配列変化を検出することが可能になる。
【００５４】
本発明において、融合増幅産物に結合できるプローブは、融合増幅産物内の任意の塩基配列及び標的核酸の塩基配列と部分的に又は全体的に相補的な塩基配列を有することを特徴とし、好ましくは、両末端にレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）と消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が連結されていることを特徴とし得る。
【００５５】
本発明において前記プローブは、レポーターと消光子間の距離が近い時には信号発生が抑制されるが、レポーターと消光子間の距離が遠ざかるにつれて信号強度が増加する。一般に、前記プローブが相補的塩基配列と混成化した時にレポーターと消光子間の距離が最も遠ざかるので、信号発生又は信号強度の増加によって特定塩基配列を検出することができる。
【００５６】
本発明において、前記レポーターは、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フルオレセインクロロトリアジニル（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌ）、ロダミングリーン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ）、ロダミンレッド（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｒｅｄ）、テトラメチルロダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＦＩＴＣ、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ）、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ＴＥＴ、ＴＲＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）系染料及びチアジカルボシアニン（ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）染料から構成された群から選ばれる一つ以上の蛍光物質であることを特徴とし得る。
【００５７】
本発明において、前記消光子は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、タムラ（ＴＡＭＲＡ）、エクリプス（Ｅｃｌｉｐｓｅ）、ＤＤＱ、ＱＳＹ、ブラックベリークエンチャー（Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、Ｑｘｌ、アイオワブラック（Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ）ＦＱ、アイオワブラックＲＱ及びＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１から構成された群から選ばれる一つ以上であることを特徴とし得る。
【００５８】
本発明の好ましい実施例において、前記融合増幅産物の検出は、実時間重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）によってなり、この時、融合増幅産物の増幅による増幅曲線（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）だけを得てＣｔ（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を測定したり、重合酵素連鎖反応後に融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）だけを得てプローブによる融解ピーク（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｅａｋ）を測定したり、或いは増幅曲線及び融解曲線をともに得て両結果をまとめてなり得るが、これに限定されない。
【００５９】
試料内に標的核酸が存在して融合増幅産物が早く増幅されるほど、検出プローブによる信号発生量が早く増加するので、スレショルドに到達するサイクル数が減ってＣｔ値が少なく測定され、これを用いて標的核酸の有無を確認することができる。また、融解曲線分析は一般に、実時間重合酵素連鎖反応の核酸増幅過程後に進行され、試料の温度を低温（２５〜５５℃レベル）に下げた後に高温（７５〜９５℃レベル）まで１〜１０秒当たり０．３〜１℃ずつ増加させたり、或いは試料の温度を高温に上げた後に低温まで１〜１０秒当たり０．３〜１℃ずつ減少させながら信号パターンを測定する。融合増幅産物が増幅された場合、前記融解曲線分析から、融合増幅産物と結合したプローブの融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｍ）付近で信号パターン変化が見られ、これを融解ピーク（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｅａｋ）と分析し、融合増幅産物を確認することができる。
【００６０】
本発明において、前記（ｂ）段階は、探索プライマーが混成化する標的核酸鎖の反対側の鎖に混成化する補助プライマーをさらに注入することを特徴とし得る。すなわち、探索プライマーが標的核酸のセンス（ｓｅｎｓｅ）鎖と混成化する場合、補助プライマーはアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）鎖と混成化することを意味する。
【００６１】
本発明において補助プライマーは前記探索プライマーと対をなして一定の標的核酸部位の量を増加させる効果を奏する。補助プライマーは前記代理標的に対する相補性がなく、代理標的に混成化しないか、一部が混成化しても核酸合成伸張が起きないことを特徴とし得る。本発明において前記補助プライマーの主な役割は、標的核酸が極微量存在する条件下で標的核酸の量（ｃｏｐｙ数）を増加させることによって融合増幅産物の生成率を増大させることである。
【００６２】
本発明において前記補助プライマーを使用する場合、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）は次の２段階によって行われることを特徴とし得る：
１）‘標的核酸増幅段階’であり、前記探索プライマーと補助プライマーが対をなして主な合成反応を導く段階；及び
２）‘融合増幅産物増幅段階’であり、前記探索プライマー及び代理標的、増幅プライマーが作用して融合増幅産物が主に増幅されるように誘導する段階。
【００６３】
本発明において前記段階の細分化は主に重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）のための段階的で反復的な温度変化（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ）のうち、各要素間の混成化を誘導する段階（ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｓｔｅｐ）の温度を特に調整することによって具現される。好ましくは、前記標的核酸増幅段階でアニーリング段階の温度を高く設定し、且つ前記探索プライマーと補助プライマーの融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｍ）も高く設定して、探索プライマーと補助プライマーによる標的核酸増幅が優先して現れるようにし、前記融合増幅産物増幅段階でアニーリング段階の温度を下げ、前記増幅プライマーと代理標的内の標的核酸結合部位の融解温度を低く設定することによって、融合増幅産物の増幅が起きるように誘導することができる。この時、前記補助プライマーの量を制限すれば前記標的核酸増幅段階で補助プライマーが殆ど消尽されるので、結果的に各段階別に必要な構成要素だけが反応に参加する方式の２段階重合酵素連鎖反応を完成することができる。
【００６４】
本発明は他の観点において、ｉ）標的核酸と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）できる１個以上の探索プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）；ｉｉ）前記探索プライマーが結合しない標的核酸部位と結合する配列及び標的核酸に結合しない任意の配列を含む１個以上の代理標的（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ）；及びｉｉｉ）前記代理標的を増幅させ得る１個以上の増幅プライマーを含む標的核酸増幅用重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）組成物に関する。
【００６５】
本発明において、前記組成物は、探索プライマーが混成化する標的核酸鎖（ｓｔｒａｎｄ）の反対側の鎖に混成化する補助プライマーをさらに含むことを特徴とし得る。すなわち、探索プライマーが標的核酸のセンス（ｓｅｎｓｅ）鎖と混成化する場合、補助プライマーはアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）鎖と混成化することを意味する。
【００６６】
本発明において“試料”は様々な試料を含み、好ましくは、本発明の方法を用いて生物試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅ）を分析する。より好ましくは、ウイルス種（ｓｐｅｃｉｅｓ）と混合された試料であるか、前記ウイルスに感染された個体（例えば、ヒト、哺乳類及び魚類など）の試料であり得、植物、動物、ヒト、菌類、バクテリア及びウイルス起源の生物試料が分析され得る。哺乳類又はヒト起源の試料を分析する場合、前記試料は、特定組織又は器官から由来し得る。組織の代表例には、結合、皮膚、筋肉又は神経組織が含まれる。器官の代表例には、目、脳、肺、肝、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、小腸、睾丸、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺及び内部血管が含まれる。分析される生物試料は、生物学的根源から出たいかなる細胞、組織、流体液（ｆｌｕｉｄ）、又は本発明によってよく分析され得るいかなる他の媒質（ｍｅｄｉｕｍ）も含み、これは、ヒト、動物、ヒト又は動物の消費のために製造された飲食物から得た試料が含まれる。また、分析される生物試料は体液試料を含み、これは、血液、血清、血漿、リンパ、母乳、小便、糞便、眼球流液、唾液、精液、脳抽出物（例えば、脳粉砕物）、脊髄液、虫垂、脾臓及び扁桃腺組織抽出物が含まれるが、これに限定されない。
【００６７】
本発明はさらに他の観点において、前記組成物を含む標的核酸検出用キットに関する。
【００６８】
本発明において、前記キットは、バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）、ＤＮＡ重合酵素（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＤＮＡ重合酵素助因子（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ）及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）のような標的核酸増幅反応（例えば、重合酵素連鎖反応）を実施する上で必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、本発明のキットはまた、様々なオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）分子、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、様々なバッファー及び試薬、及びＤＮＡ重合酵素活性を抑制する抗体を含むことができる。また、前記キットの特定反応において使用される試薬の最適量は、本明細書に開示の事項を習得した当業者によって容易に決定され得る。典型的に、本発明の装置は、先に言及された構成成分を含む別途の包装又はコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）で作製され得る。
【００６９】
一実施例において、前記キットは、サンプルを入れる区切られたキャリア手段、試薬を含む容器、代理標的とプライマーを含む容器、及び前記増幅産物を検出するためのプローブを含む容器を含むことができる。
【００７０】
前記キャリア手段は、瓶、チューブのような一つ以上の容器を収容するのに適し、各容器は、本発明の方法に用いられる独立的構成要素を含有する。本発明の明細書において、当該分野における通常の知識を有する者は容器中の必要な製剤を容易に分配できる。
【００７１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００７２】
実施例１．  ヒト上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ；Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子の増幅及び検出
１．１  プライマー、代理標的及びプローブの作製
ヒトＥＧＦＲ遺伝子は体内信号伝達体系において機能する膜タンパク質及び受容体タンパク質を暗号化しており、ＥＧＦＲ遺伝子に突然変異が起きると癌につながることがあると知られている（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００７．１１７：２０５１−２０５８）。
【００７３】
上述したヒトＥＧＦＲ遺伝子を本発明の新規な標的核酸増幅方法を用いて効果的に増幅し検出するために、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ  ２０、ｃｏｄｏｎ  ７９０の近隣部位に特異的に混成化し得る探索プライマー１、代理標的１を設計し、また前記代理標的１に混成化し得る増幅プライマー１を設計して製造した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）。また、設計されたプライマー及び代理標的を用いて生成及び増幅される融合増幅産物を検出できるようにプローブ１を設計して製造した（ＰＡＮＡＧＥＮＥ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を表１及び表２に開示する。
【００７４】
【表１】
2021509821.tif 000003
【００７５】
【表２】
2021509821.tif 000004
【００７６】
前記代理標的１は、５６塩基配列長の一本鎖オリゴヌクレオチドとして作製したが、５’末端及び３’末端にはそれぞれ６塩基配列長のチミン（Ｔ）及び６塩基配列長のアデニン（Ａ）が存在して、代理標的がプライマーとして直接機能することを防止した。前記代理標的１の塩基配列のうち、下線で表示された塩基配列はヒトＥＧＦＲ遺伝子の標的塩基配列と相補的であり、イタリックで表示された塩基配列は前記増幅プライマー１と相補的な特性を有する。
【００７７】
前記プローブ１は１０塩基配列長のＰＮＡとして作製したが、Ｎ末端には消光子の［Ｄａｂｃｙｌ］が、Ｃ末端にはレポーターである［ＲＯＸ］がそれぞれ付着しており、ＰＮＡと［ＲＯＸ］との間には［Ｏ  ｌｉｎｋｅｒ］及び［Ｋ（ｌｙｓｉｎｅ）］を連結して作製した。前記プローブ１は相補的塩基配列を持つ前記融合増幅産物に混成化する時に前記消光子とレポーターとが最大の距離で離れることになり、この時にレポーターからの信号（蛍光）値が最大となり、前記信号を測定することによって融合増幅産物を検出することができる。
【００７８】
前記プローブ１は前記代理標的１の一部と同じ塩基配列を有するが、これによって、プローブ１は代理標的１に直接混成化せず、単に代理標的１に前記増幅プライマー１が混成化して生成された核酸重合産物に混成化し得る。しかし、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）内の前記代理標的１の注入量が非常に少ないため、単に代理標的１に前記増幅プライマー１が混成化して生成された核酸重合産物に前記プローブ１が混成化するだけでは増幅曲線上の検出できるレベルの信号が放出されない。前記プローブ１によって増幅曲線上の検出できるレベルの信号放出が起きるためには、前記代理標的１の塩基配列の一部を含めた前記融合増幅産物が生成されなければならず、また融合増幅産物に前記探索プライマー１と前記増幅プライマー１が混成化して融合増幅産物を増幅させることによって、プローブ１が混成化する核酸重合産物の量が大きく増加する必要がある。
【００７９】
１．２  融合増幅産物の生成及び確認
約１０，０００個（ｃｏｐｙ）の標的核酸が存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するように、１．５ｐｍｏｌｅの探索プライマー１と３０ｐｍｏｌｅの増幅プライマー１、１０ｆｍｏｌｅの代理標的１、２ｐｍｏｌｅのプローブ１を含む重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）用組成物を製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に用いられる核酸重合酵素（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）に加えて、バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）、デオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）、ポタシウムクロリド（ＫＣｌ）、マグネシウムクロリド（ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などの要素が含まれた。
【００８０】
重合酵素連鎖反応のための温度調節は一般のサーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）で行われ、サイクル前の熱変性（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１５分］後に、４５サイクルの熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６０℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］で行った。前記毎サイクルごとにＲＯＸチャネルの蛍光値を測定して増幅曲線を導出した。
【００８１】
重合酵素連鎖反応後には、反応産物に対する融解曲線を導出するために、熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、５分］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［３５℃、５分］−溶融（ｍｅｌｔｉｎｇ）［３５℃−−＞７５℃、０．５℃間隔］過程を行い、この時、溶融段階で測定された蛍光値を分析して融解ピーク結果を導出した。
【００８２】
その結果、約１０，０００個（ｃｏｐｙ）の標的核酸が存在する条件で増幅曲線上の蛍光信号の上昇が観察され、標的核酸が存在しない条件では蛍光信号の上昇が見られなかったため、両条件を明確に区別することができた。また、標的核酸が存在する条件では５６℃前後で非常に高い融解ピークが見られるのに対し、標的核酸が存在しない条件では５６℃前後で融解ピークが観察されたもののその高さが顕著に低いので、融解曲線上の融解ピークの高さの差異によっても両条件を区別することができた（図９）。
【００８３】
実施例２．  補助プライマーを含むヒト上皮細胞成長因子受容体遺伝子の増幅及び検出
２．１  補助プライマー合成
上述したヒトＥＧＦＲ遺伝子を本発明の標的核酸増幅方法によって高敏感度で検出するために、前記探索プライマー１、代理標的１、増幅プライマー１、プローブ１に加えて、ＥＧＦＲ遺伝子に特異的に混成化し得る補助プライマー１を設計及び製造した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を表３及び表４に開示する。
【００８４】
【表３】
2021509821.tif 000005
【００８５】
【表４】
2021509821.tif 000006
【００８６】
２．２  補助プライマーを含む融合増幅産物の生成及び確認
約１０〜１０，０００個（ｃｏｐｙ）の標的核酸が存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するように、１．５ｐｍｏｌｅの探索プライマー１と３０ｐｍｏｌｅの増幅プライマー１、０．５ｐｍｏｌｅの補助プライマー１、１０ｆｍｏｌｅの代理標的１、２ｐｍｏｌｅのプローブ１を含む重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）用組成物を製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素に加えて、バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）、デオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）、ポタシウムクロリド（ＫＣｌ）、マグネシウムクロリド（ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などの要素が含まれた。
【００８７】
重合酵素連鎖反応のための温度調節は一般のサーマルサイクラーで行われ、サイクル前の熱変性（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１５分］後に、１５サイクルの最初の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６４℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］を経て、３０サイクルの二番目の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６０℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］で行った。前記二番目の段階において毎サイクルごとにＲＯＸチャネルの蛍光値を測定して増幅曲線を導出した。
【００８８】
重合酵素連鎖反応後には、反応産物に対する融解曲線を導出するために、熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、５分］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［３５℃、５分］−溶融（ｍｅｌｔｉｎｇ）［３５−−＞７５℃、０．５℃間隔］過程を行い、この時、溶融段階で測定された蛍光値を分析して融解ピーク結果を導出した。
【００８９】
その結果、約１０〜１０，０００個（ｃｏｐｙ）の標的核酸が存在する全ての条件で増幅曲線上の蛍光信号の上昇が観察され、標的核酸が存在しない条件では蛍光信号の上昇が見られなかったため、両条件を明確に区別することができた。また、標的核酸が存在する条件では５６℃前後で非常に高い融解ピークが見られるのに対し、標的核酸が存在しない条件では５６℃前後で融解ピークが観察されるもののその高さが顕著に低いので、融解曲線上の融解ピークの高さの差異によっても両条件を区別することができた（図１０）。
【００９０】
実施例３．  様々な形態の代理標的を用いたヒト上皮細胞成長因子受容体遺伝子の増幅及び検出
３．１  プライマー、代理標的及びプローブの作製
上述したヒトＥＧＦＲ遺伝子を様々な形態の代理標的を用いて効果的に増幅し検出するために、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ  ２０、ｃｏｄｏｎ  ７９０の近隣部位に特異的に混成化し得る探索プライマー２、代理標的１、代理標的２、代理標的３、補助プライマー１を設計し、また、前記代理標的１又は２に混成化可能であり、前記代理標的３の一部の塩基配列と同じ塩基配列の増幅プライマー１を設計して製造した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）。また、設計されたプライマー及び代理標的を用いて生成及び増幅される融合増幅産物を検出できるようにプローブ２を設計して製造した（ＰＡＮＡＧＥＮＥ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を表５及び表６に開示する。
【００９１】
【表５】
2021509821.tif 000007
【００９２】
【表６】
2021509821.tif 000008
【００９３】
前記代理標的２は、５０塩基配列長の一本鎖オリゴヌクレオチドとして作製したが、３’末端に６塩基配列長のアデニン（Ａ）が存在して、代理標的がプライマーとして直接機能することを防止した。前記代理標的２の塩基配列のうち、下線で表示された塩基配列はヒトＥＧＦＲ遺伝子の標的塩基配列と相補的であり、イタリックで表示された塩基配列は前記増幅プライマー１と相補的な特性を有する。
【００９４】
前記代理標的３は４４塩基配列長の一本鎖オリゴヌクレオチドとして作製したが、下線で表示された塩基配列はヒトＥＧＦＲ遺伝子の標的塩基配列と相補的であり、イタリックで表示された塩基配列は前記増幅プライマー１と同じ塩基配列である特性を有する。
【００９５】
前記プローブ２は１２塩基配列長のＰＮＡとして作製したが、Ｎ末端には消光子である［Ｄａｂｃｙｌ］が、Ｃ末端にはレポーターである［ＦＡＭ］がそれぞれ付着しており、ＰＮＡと［ＦＡＭ］との間には［Ｋ］を連結して作製した。前記プローブ２は相補的塩基配列を持つ前記融合増幅産物に混成化される時に前記消光子とレポーターとが最大の距離で離れることになり、この時にレポーターからの信号（蛍光）値が最大となり、前記信号を測定することによって融合増幅産物が検出できる。
【００９６】
３．２  融合増幅産物の生成及び確認
約１００個（ｃｏｐｙ）の標的核酸が存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するように、１．５ｐｍｏｌｅの探索プライマー２と３０ｐｍｏｌｅの増幅プライマー１、４ｐｍｏｌｅのプローブ２を含む重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）用組成物を製造し、追加として代理標的１、代理標的２、代理標的３の中から一つを選択して１０ｆｍｏｌｅを注入するか、或いは代理標的２と３を１０ｆｍｏｌｅずつ共に注入した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）に加えて、バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）、デオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）、ポタシウムクロリド（ＫＣｌ）、マグネシウムクロリド（ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などの要素が含まれた。
【００９７】
代理標的１の場合、図５及び図６に示すメカニズムを含む過程を経て融合増幅産物を形成でき、代理標的２の場合、図４に示すメカニズムを含む過程を経て融合増幅産物が形成され、代理標的３の場合、図７に示すメカニズムを含む過程を経て融合増幅産物の生成が可能である。
【００９８】
重合酵素連鎖反応のための温度調節は一般のサーマルサイクラーで行われ、サイクル前の熱変性（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１５分］後に、１５サイクルの最初の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６４℃、３０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］を経て、３５サイクルの二番目の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６０℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］で行った。前記二番目の段階において毎サイクルごとにＦＡＭチャネルの蛍光値を測定して増幅曲線を導出した。
【００９９】
重合酵素連鎖反応後には、反応産物に対する融解曲線を導出するために、熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、５分］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［３５℃、５分］−溶融（ｍｅｌｔｉｎｇ）［３５℃−−＞７５℃、０．５℃間隔］過程を行い、この時、溶融段階で測定された蛍光値を分析して融解ピーク結果を導出した。
【０１００】
その結果、約１００個（ｃｏｐｙ）の標的核酸が存在する全ての増幅条件で増幅曲線上の蛍光信号の上昇が観察され、標的核酸が存在しない条件では蛍光信号の上昇が見られなかったため、両条件を明確に区別することができた。また、標的核酸が存在する条件では５２℃前後で非常に高い融解ピークが見られるのに対し、標的核酸が存在しない条件では融解ピークが観察されず、これによっても両条件を区別することができた（図１１）。
【０１０１】
実施例４．  ヒトＨＲＡＳ遺伝子内のグアニン／シトシン高割合（ｈｉｇｈ  ＧＣ  ｃｏｎｔｅｎｔ）領域の増幅
４．１  プライマー、代理標的及びプローブの作製
ヒトＨＲＡＳ遺伝子は細胞内信号伝達体系に関与するタンパク質を暗号化し、ＨＲＡＳ遺伝子のコドン（ｃｏｄｏｎ）１２、１３、６１に該当する部位の突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）は様々な癌発生と関連していると知られている（Ｒａｊａｓｅｋｈａｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ａｎｄ  Ｒａｍａｎ，Ｔ．Ｃｅｎｔ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．２０１３．８：６０９−６２４）。
【０１０２】
上述したヒトＨＲＡＳ遺伝子のｅｘｏｎ  ２のｃｏｄｏｎ１２、１３部位は、平均してグアニン／シトシンの割合（Ｇ／Ｃ  ｃｏｎｔｅｎｔ）がほぼ７０％程度と高いため、通常の重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）方法では高効率で増幅し難いが、これを、本発明の新規な標的核酸増幅方法で効果的に増幅し検出するために、ＨＲＡＳ遺伝子に特異的に混成化し得る探索プライマー３、代理標的４、補助プライマー２を設計し、また前記代理標的４に混成化し得る増幅プライマー２を設計し製造した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）。また、設計されたプライマー及び代理標的を用いて生成及び増幅される融合増幅産物を検出できるようにプローブ３を設計して製造した（ＰＡＮＡＧＥＮＥ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を表７及び表８に開示する。
【０１０３】
【表７】
2021509821.tif 000009
【０１０４】
【表８】
2021509821.tif 000010
【０１０５】
前記代理標的４は、５６塩基配列長の一本鎖オリゴヌクレオチドとして作製したが、５’末端及び３’末端にはそれぞれ６塩基配列長のチミン（Ｔ）及び６塩基配列長のアデニン（Ａ）が存在して、代理標的がプライマーとして直接機能することを防止した。前記代理標的４の塩基配列のうち、下線で表示された塩基配列はヒトＨＲＡＳ遺伝子の標的塩基配列と相補的であり、イタリックで表示された塩基配列は前記増幅プライマー２と相補的な特性を有する。
【０１０６】
前記プローブ３は９塩基配列長のＰＮＡとして作製したが、Ｎ末端には消光子である［Ｄａｂｃｙｌ］２個が［Ｋ（ｌｙｓｉｎｅ）］にて連結された形態が、Ｃ末端にはレポーターである［ＲＯＸ］がそれぞれ付着しており、ＰＮＡと［ＲＯＸ］との間には［Ｏ  ｌｉｎｋｅｒ］及び［Ｋ］を連結して作製した。また、前記プローブ３の塩基配列のうち［＾］で表示された部分には、正の電荷を帯びる官能基（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）をＰＮＡ骨格（ＰＮＡ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）に連結することによって、本来には電荷を帯びないＰＮＡ骨格に電荷を導入して作製した。前記プローブ３は、相補的塩基配列を持つ前記融合増幅産物に混成化する時に前記消光子とレポーターとが最大の距離で離れることになり、この時にレポーターからの信号（蛍光）値が最大となり、前記信号を測定することによって融合増幅産物が検出できる。
【０１０７】
前記プローブ３の塩基配列は、前記探索プライマー３、増幅プライマー２、代理標的４、及び補助プライマー２のいずれとも相補的でなく、ただし、前記補助プライマー２による標的核酸の増幅産物鎖、及び前記代理標的４の塩基配列の一部を含む融合増幅産物のうち増幅プライマー２による増幅産物鎖に相補的な特徴を有する。しかし、前記補助プライマー２の注入量が非常に少なく、補助プライマーと対をなす探索プライマー３の注入量が相対的に多いため、前記補助プライマー２による標的核酸の増幅産物鎖に前記プローブ３が混成化することだけでは検出できるレベルの信号を放出することができない。これに対し、前記融合増幅産物を増幅する増幅プライマー２は注入量が非常に多く、対をなす探索プライマー３の注入量が相対的に少ないので、融合増幅産物のうち増幅プライマー２による増幅産物鎖に前記プローブ３が混成化すると効果的に信号を放出することができ、これによって融合増幅産物だけを選択的に検出することができる。
【０１０８】
４．２  融合増幅産物の生成及び確認
約２５ｎｇの抽出されたヒト遺伝体ＤＮＡが存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するように、１．５ｐｍｏｌｅの探索プライマー３と３０ｐｍｏｌｅの増幅プライマー２、０．５ｐｍｏｌｅの補助プライマー２、１０ｆｍｏｌｅの代理標的４、４ｐｍｏｌｅのプローブ３を含む重合酵素連鎖反応用組成物を製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素に加えて、バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）、デオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）、ポタシウムクロリド（ＫＣｌ）、マグネシウムクロリド（ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などの要素が含まれた。
【０１０９】
重合酵素連鎖反応のための温度調節は一般のサーマルサイクラーで行われ、サイクル前の熱変性（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１５分］後に、１５サイクルの最初の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６４℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］を経て、３５サイクルの二番目の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６０℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］で行った。前記二番目の段階において毎サイクルごとにＲＯＸチャネルの蛍光値を測定して増幅曲線を導出した。
【０１１０】
また、本発明の標的核酸増幅方法を用いたＨＲＡＳ  ｅｘｏｎ  ２、ｃｏｄｏｎ  １２、１３部位の検出との性能を比較するために、対照群である通常の重合酵素連鎖反応を用いた同一部位の検出を共に行った。前記重合酵素連鎖反応用組成物から代理標的４及び増幅プライマー２を排除し、補助プライマー２の注入量を３０ｐｍｏｌｅに増加させた対照群用重合酵素連鎖反応用組成物を製造した。
【０１１１】
対照群用重合酵素連鎖反応のための温度調節は一般のサーマルサイクラーで行われ、サイクル前の熱変性（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１５分］後に、５０サイクルの熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６０℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］で行い、毎サイクルごとにＲＯＸチャネルの蛍光値を測定して増幅曲線を導出した。
【０１１２】
その結果、約２５ｎｇの抽出されたヒト遺伝体ＤＮＡが存在する条件でグアニン／シトシン含量が高いＨＲＡＳ  ｅｘｏｎ  ２、ｃｏｄｏｎ  １２、１３部位の増幅効率が、本発明の標的核酸増幅方法を用いた時に画然に高くなることを確認した。すなわち、前記代理標的４及び増幅プライマー２を含めて前記融合増幅産物を形成する方法によって標的核酸を検出する方法は、標的核酸を直接増幅して検出する通常の方法に比べて、グアニン／シトシン含量が高い核酸を検出するとき、増幅曲線の勾配が約１．５倍程度とより急に増加し、増幅曲線の高さもより高く示された（図１２）。前記増幅曲線の勾配は、異なる２個の蛍光値スレショルドによる２個のＣｔ値間の差から計算した。その結果を表９に開示する。
【０１１３】
【表９】
2021509821.tif 000011
【０１１４】
実施例５．  ヒトＨＲＡＳ遺伝子内のグアニン／シトシン高割合（ｈｉｇｈ  ＧＣ  ｃｏｎｔｅｎｔ）領域の増幅及び検出
５．１  プライマー、代理標的及びプローブの作製
グアニン／シトシンの割合（Ｇ／Ｃ  ｃｏｎｔｅｎｔ）が高いため通常の重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）方法では増幅及び検出がし難いヒトＨＲＡＳ遺伝子のｅｘｏｎ  ２のｃｏｄｏｎ１２、１３部位を、本発明の新規な標的核酸増幅方法を用いて効果的に増幅し検出するために、ＨＲＡＳ遺伝子に特異的に混成化し得る探索プライマー３、代理標的５、代理標的６、補助プライマー２を設計し、また前記代理標的５及び代理標的６に混成化し得る増幅プライマー１を設計して製造した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）。また、設計されたプライマー及び代理標的を用いて生成及び増幅される融合増幅産物を検出できるようにプローブ３を設計して製造した（ＰＡＮＡＧＥＮＥ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を、表１０及び表１１に開示する。
【０１１５】
【表１０】
2021509821.tif 000012
【０１１６】
【表１１】
2021509821.tif 000013
【０１１７】
前記代理標的５は５０塩基配列長の一本鎖オリゴヌクレオチドとして作製したが、塩基配列のうち、下線で表示された塩基配列はヒトＨＲＡＳ遺伝子の標的塩基配列と相補的であり、イタリックで表示された塩基配列は前記増幅プライマー１の塩基配列と同じ特性を有する。
【０１１８】
前記代理標的６は６０塩基配列長の一本鎖オリゴヌクレオチドとして作製したが、塩基配列のうち、下線で表示された塩基配列はヒトＨＲＡＳ遺伝子の標的塩基配列と相補的であり、イタリックで表示された塩基配列は前記増幅プライマー１の塩基配列と同じ特性を有する。
【０１１９】
前記プローブ３は９塩基配列長のＰＮＡとして作製したが、Ｎ末端には消光子である［Ｄａｂｃｙｌ］２個が［Ｋ（ｌｙｓｉｎｅ）］にて連結された形態が、Ｃ末端にはレポーターである［ＲＯＸ］がそれぞれ付着しており、ＰＮＡと［ＲＯＸ］間には［Ｏ  ｌｉｎｋｅｒ］及び［Ｋ］を連結して作製した。また、前記プローブ３の塩基配列のうち［＾］で表示された部分には正の電荷を帯びる官能基（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）をＰＮＡ骨格に連結することによって、本来には電荷を帯びないＰＮＡ骨格に電荷を導入して作製した。前記プローブ３は、相補的塩基配列を持つ前記融合増幅産物に混成化する時に前記消光子とレポーターとが最大の距離で離れることになり、この時にレポーターからの信号（蛍光）値が最大となり、前記信号を測定することによって融合増幅産物が検出できる。
【０１２０】
前記プローブ３の塩基配列は前記探索プライマー３、増幅プライマー１、代理標的５、代理標的６、及び補助プライマー２のいずれとも相補的でなく、ただし、前記補助プライマー２による標的核酸の増幅産物鎖及び前記代理標的５又は代理標的６の塩基配列の一部を含む融合増幅産物のうち、増幅プライマー１による増幅産物鎖に相補的な特徴を有する。しかし、前記補助プライマー２の注入量が非常に少なく、補助プライマーと対をなす探索プライマー３の注入量が相対的に多いため、前記補助プライマー２による標的核酸の増幅産物鎖に前記プローブ３が混成化することだけでは検出できるレベルの信号を放出することができない。これに対し、前記融合増幅産物を増幅する増幅プライマー１は注入量が非常に大きく、対をなす探索プライマー３の注入量が相対的に少ないので、融合増幅産物のうち、増幅プライマー１による増幅産物鎖に前記プローブ３が混成化すると効果的に信号を放出することができ、これによって融合増幅産物だけを選択的に検出することができる。
【０１２１】
５．２  融合増幅産物の生成及び確認
約２５ｎｇの抽出されたヒト遺伝体ＤＮＡが存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するように、１．５ｐｍｏｌｅの探索プライマー３と３０ｐｍｏｌｅの増幅プライマー１、０．５ｐｍｏｌｅの補助プライマー２、５０ｆｍｏｌｅの代理標的５又は代理標的６、４ｐｍｏｌｅのプローブ３を含む重合酵素連鎖反応用組成物を製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素に加えて、バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）、デオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）、ポタシウムクロリド（ＫＣｌ）、マグネシウムクロリド（ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などの要素が含まれた。
【０１２２】
重合酵素連鎖反応のための温度調節は一般のサーマルサイクラーで行われ、サイクル前の熱変性（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、５分］後に、１５サイクルの最初の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、２０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６４℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］を経て、３５サイクルの二番目の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、２０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６０℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］で行った。
【０１２３】
重合酵素連鎖反応後には、反応産物に対する融解曲線を導出するために、熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、５分］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［２５℃、５分］−溶融（ｍｅｌｔｉｎｇ）［２５℃−−＞７５℃、０．５℃間隔］過程を行い、この時、溶融段階で測定されたＲＯＸチャネルの蛍光値を分析して融解ピーク結果を導出した。
【０１２４】
また、本発明の標的核酸増幅方法を用いたＨＲＡＳ  ｅｘｏｎ  ２、ｃｏｄｏｎ  １２、１３部位の検出との性能を比較するために、対照群である通常の重合酵素連鎖反応を用いた同一部位の検出を共に行った。前記重合酵素連鎖反応用組成物から代理標的５、代理標的６及び増幅プライマー１を排除し、補助プライマー２を含む対照群用プライマーの注入量を３０ｐｍｏｌｅに増加させた対照群用重合酵素連鎖反応用組成物を製造した。使用された対照群用プライマーの塩基配列を表１２に開示する。
【０１２５】
【表１２】
2021509821.tif 000014
【０１２６】
対照群用重合酵素連鎖反応のための温度調節は一般のサーマルサイクラーで行われ、サイクル前の熱変性（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、５分］後に、１５サイクルの最初の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、２０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６４℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］を経て、３５サイクルの二番目の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、２０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６０℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］で行った。
【０１２７】
重合酵素連鎖反応後には、反応産物に対する融解曲線を導出するために、熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、５分］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［２５℃、５分］−溶融（ｍｅｌｔｉｎｇ）［２５℃−−＞７５℃、０．５℃間隔］過程を行い、この時、溶融段階で測定されたＲＯＸチャネルの蛍光値を分析して融解ピーク結果を導出した。
【０１２８】
また、本発明の標的核酸増幅方法及び対照群用重合酵素連鎖反応を用いたＨＲＡＳ  ｅｘｏｎ  ２、ｃｏｄｏｎ  １２、１３部位検出の偽陽性（ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）発生の有無を調べるために、約２５ｎｇの抽出されたヒト遺伝体ＤＮＡが存在する条件の他、標的核酸が注入されていない条件（Ｎｏ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＴＣ））も共にテストした。
【０１２９】
その結果、本発明の標的核酸増幅方法を用いた場合、ヒト遺伝体ＤＮＡが注入された条件でグアニン／シトシン含量が高いＨＲＡＳ  ｅｘｏｎ  ２、ｃｏｄｏｎ  １２、１３部位の増幅及び検出が正常になされ、また標的核酸が注入されていない条件では融解曲線上の融解ピークが形成されず、偽陽性がないことを確認した。この時、融合増幅産物内の標的核酸塩基配列部位のグアニン／シトシン含量は６３．１％と高かったが、代理標的５及び代理標的６の任意の塩基配列によって融合増幅産物全体のグアニン／シトシン含量がそれぞれ５５．８％、５２．４％と低くなることを確認した。これに対し、対照群である通常の重合酵素連鎖反応を用いた場合、それぞれ６３．１％、６８．４％、６９．８％のグアニン／シトシン含量を示す３種の増幅産物を生成して標的核酸検出を試みたが、相当数の偽陽性がみられて検出結果を信頼し難く（増幅産物１、増幅産物２を用いた標的核酸の検出時）、融解ピークが見られる融解温度が正常範囲を外れたり（増幅産物２を用いた標的核酸の検出時）、或いは融解ピークが異常に形成され（増幅産物３を用いた標的核酸の検出時）、結果的に目標の標的核酸増幅及び検出が困難であることを確認した（図１３）。
【０１３０】
実施例６．  ヒト上皮細胞成長因子受容体遺伝子検出の敏感度調整
６．１  プライマー、代理標的及びプローブの作製
上述したヒトＥＧＦＲ遺伝子を本発明の標的核酸増幅方法を用いて検出するものの、増幅効率への影響を最小化しながら敏感度を任意に調整するために、ＥＧＦＲ遺伝子に特異的に混成化し得る探索プライマー４、代理標的７、補助プライマー１に加えて、前記代理標的７に特異的に混成化し得る増幅プライマー３、及び前記代理標的７の塩基配列の一部を含んで生成される融合増幅産物に特異的に混成化し得るプローブ２を設計及び製造した（プライマー及び代理標的メーカー：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ、プローブメーカー：ＰＡＮＡＧＥＮＥ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を表１３及び表１４に開示する。
【０１３１】
【表１３】
2021509821.tif 000015
【０１３２】
【表１４】
2021509821.tif 000016
【０１３３】
前記代理標的７は５２塩基配列長の一本鎖オリゴヌクレオチドとして作製したが、５’末端及び３’末端にはそれぞれ６塩基配列長のチミン（Ｔ）及び６塩基配列長のアデニン（Ａ）が存在して、代理標的がプライマーとして直接機能することを防止した。前記代理標的７の塩基配列のうち、下線で表示された塩基配列はヒトＥＧＦＲ遺伝子の標的塩基配列と相補的であり、イタリックで表示された塩基配列は前記増幅プライマー３と相補的な特性を有する。
【０１３４】
６．２  代理標的注入量の調節による融合増幅産物の生成及び増幅の確認
約１，０００，０００個（ｃｏｐｙ）の標的核酸が存在する条件で前記意図した融合増幅産物を形成するものの、Ｃｔ値に代表される標的核酸検出敏感度が調整されるように、１．５ｐｍｏｌｅの探索プライマー４と３０ｐｍｏｌｅの増幅プライマー３、０．５ｐｍｏｌｅの補助プライマー１、４ｐｍｏｌｅのプローブ２を含む重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）用組成物に０．０１〜１０ｆｍｏｌｅのそれぞれ異なる量の代理標的７が注入されるように製造した。すなわち、本来には１０ｆｍｏｌｅの量で注入された前記代理標的７を、１倍、０．１倍、０．０１倍、０．００１倍に希釈してそれぞれ１０ｆｍｏｌｅ、１ｆｍｏｌｅ、０．１ｆｍｏｌｅ、０．０１ｆｍｏｌｅが注入されるように製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素に加えて、バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）、デオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）、ポタシウムクロリド（ＫＣｌ）、マグネシウムクロリド（ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などの要素が含まれた。
【０１３５】
重合酵素連鎖反応のための温度調節は一般のサーマルサイクラーで行われ、サイクル前の熱変性（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１５分］後に、１５サイクルの最初の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６４℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］を経て、３５サイクルの二番目の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［５８℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］で行った。前記二番目の段階において毎サイクルごとにＦＡＭチャネルの蛍光値を測定して増幅曲線を導出した。
【０１３６】
また、本発明の標的核酸増幅方法を用いた前記ＥＧＦＲ遺伝子の検出敏感度調整性能を比較するために、対照群である通常の重合酵素連鎖反応を用いた同一部位検出及び敏感度調整を共に行った。また、前記重合酵素連鎖反応用組成物から代理標的７及び増幅プライマー３を排除し、１．５ｐｍｏｌｅの探索プライマーと３０ｐｍｏｌｅの補助プライマーを１倍、０．５倍、０．２５倍、０．１倍、０．０１倍に希釈後に注入して対照群用重合酵素連鎖反応用組成物を製造した。
【０１３７】
対照群用重合酵素連鎖反応のための温度調節は一般のサーマルサイクラーで行われ、サイクル前の熱変性（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１５分］後に、５０サイクルの熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［５８℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］で行い、毎サイクルごとにＦＡＭチャネルの蛍光値を測定して増幅曲線を導出した。
【０１３８】
その結果、本発明の標的核酸増幅方法を用いた場合、前記代理標的７の注入量減少にしたがって増幅曲線の上昇が一定に遅延されることによってＣｔ値が漸次増加する形で敏感度が調整されることを観察し、また増幅曲線の上昇が遅延されるにもかかわらず増幅曲線の勾配はほぼ一定に維持され、増幅効率に及ぶ影響が最小化することを確認した。これに対し、探索プライマーと補助プライマーの注入量を調節した対照群である通常の方法では、増幅曲線の上昇が遅延される現象は類似に現れるが、増幅曲線の上昇が遅延されることによって増幅曲線の勾配が大幅に低くなることが観察され、このことから、通常の方法では敏感度調整が増幅効率に大きな影響を与えるだけでなく、プライマーの注入量を大きく減少させる場合、標的核酸増幅が全く起きないこともあることを確認した（図１４）。
【０１３９】
実施例７．  ヒト上皮細胞成長因子受容体遺伝子とＨＲＡＳ遺伝子の多重増幅及び検出
７．１プライマー、代理標的及びプローブの作製
上述したヒトＥＧＦＲ遺伝子とＨＲＡＳ遺伝子を効果的に同時増幅及び検出するために、ＥＧＦＲ遺伝子のｅｘｏｎ  ２０、ｃｏｄｏｎ  ７９０の近隣部位に特異的に混成化し得る探索プライマー２、代理標的２、代理標的３、補助プライマー１を設計し、また前記代理標的２に混成化可能であり、代理標的３の一部の塩基配列と同じ塩基配列の増幅プライマー１を設計して製造した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）。また、設計されたプライマー及び代理標的によって生成及び増幅される融合増幅産物を検出できるようにプローブ２を設計して製造した（ＰＡＮＡＧＥＮＥ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）。そして、ＨＲＡＳ遺伝子のｅｘｏｎ  ２のｃｏｄｏｎ  １２、１３部位に特異的に混成化し得る探索プライマー５、代理標的８、代理標的９、補助プライマー２を設計し、また前記代理標的８に混成化可能であり、代理標的９の一部の塩基配列と同じ塩基配列の増幅プライマー１を設計して製造した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）。また、設計されたプライマー及び代理標的によって生成及び増幅される融合増幅産物を検出できるようにプローブ３を設計して製造した（ＰＡＮＡＧＥＮＥ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）。各プライマー、代理標的及びプローブの塩基配列を表１５及び表１６に開示する。
【０１４０】
【表１５】
2021509821.tif 000017
【０１４１】
【表１６】
2021509821.tif 000018
【０１４２】
前記代理標的８は４８塩基配列長の一本鎖オリゴヌクレオチドとして作製したが、３’末端に６塩基配列長のアデニン（Ａ）が存在して、代理標的がプライマーとして直接機能することを防止した。前記代理標的８の塩基配列のうち、下線で表示された塩基配列はヒトＨＲＡＳ遺伝子の標的塩基配列と相補的であり、イタリックで表示された塩基配列は前記増幅プライマー１と相補的な特性を有する。
【０１４３】
前記代理標的９は４２塩基配列長の一本鎖オリゴヌクレオチドとして作製したが、下線で表示された塩基配列はヒトＨＲＡＳ遺伝子の標的塩基配列と相補的であり、イタリックで表示された塩基配列は前記増幅プライマー１と同じ塩基配列である特性を有する。
【０１４４】
７．２  融合増幅産物の生成を用いた多重検出
約１，０００，０００個（ｃｏｐｙ）のヒトＥＧＦＲ遺伝子標的と１０個、１００個、１，０００個、１０，０００個、又は１００，０００個のヒトＨＲＡＳ遺伝子標的を混合したり、或いは約１，０００，０００個のヒトＨＲＡＳ遺伝子標的と１０個、１００個、１，０００個、１０，０００個、又は１００，０００個のヒトＨＲＡＳ標的を混合した条件で前記意図した融合増幅産物の形成を用いてＥＧＦＲ遺伝子標的とＨＲＡＳ遺伝子標的を同時検出できるように、１．５ｐｍｏｌｅの探索プライマー２、１．５ｐｍｏｌｅの探索プライマー５、３０ｐｍｏｌｅの増幅プライマー１、０．５ｐｍｏｌｅの補助プライマー１、０．５ｐｍｏｌｅの補助プライマー２、１０ｆｍｏｌｅの代理標的２、１０ｆｍｏｌｅの代理標的３、１０ｆｍｏｌｅの代理標的８、１０ｆｍｏｌｅの代理標的９、４ｐｍｏｌｅのプローブ２、４ｐｍｏｌｅのプローブ３を含む重合酵素連鎖反応用組成物を製造した。前記重合酵素連鎖反応用組成物には、一般に重合酵素連鎖反応に使用される核酸重合酵素に加えて、バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）、デオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）、ポタシウムクロリド（ＫＣｌ）、マグネシウムクロリド（ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などの要素が含まれた。
【０１４５】
重合酵素連鎖反応のための温度調節は一般のサーマルサイクラーで行われ、サイクル前の熱変性（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１５分］後に、１５サイクルの最初の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６４℃、３０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］を経て、３５サイクルの二番目の段階である熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、１０秒］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［６０℃、２０秒］−伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）［７２℃、２０秒］で行った。
【０１４６】
重合酵素連鎖反応後には、反応産物に対する融解曲線を導出するために、熱変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）［９５℃、５分］−アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）［３５℃、５分］−溶融（ｍｅｌｔｉｎｇ）［３５℃−−＞７５℃、０．５℃間隔］過程を行い、この時、溶融段階で測定されたＦＡＭチャネルとＲＯＸチャネルの蛍光値を分析して融解ピーク結果を導出した。
【０１４７】
その結果、本発明の標的核酸増幅方法を用いた場合、複数の標的核酸が不均等に混合された条件、すなわち、ＨＲＡＳ遺伝子標的の量がＥＧＦＲ遺伝子標的の量に比べて１／１０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００のレベルと非常に少ない条件又はＥＧＦＲ遺伝子標的の量がＨＲＡＳ遺伝子標的の量に比べて１／１０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００のレベルと非常に少ない条件でも両標的を完全に同時検出できることを観察した。これに対し、対照群である通常の方法では、多量に注入された遺伝子標的の検出は容易であったが、前記多量に注入された遺伝子標的と混合された少量の遺伝子標的の同時検出は不安定な様子を示した（図１５）。
【０１４８】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は好適な実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明に係る標的核酸増幅方法は、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）産物の塩基配列の一部を任意に調整することができ、結果的に標的核酸塩基配列に対する依存度が最小化するので、仮にグアニン／シトシンの割合（Ｇ／Ｃ  ｃｏｎｔｅｎｔ）が過度に高くて当該部位の増幅が難しい標的核酸であってもそれに対する増幅を効果的に行うことができ、前記代理標的（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ）の標的核酸相補的塩基配列部位と増幅プライマー相補的塩基配列部位との間に任意の塩基配列を挿入できるので、このような任意の塩基配列部位と混成化する汎用（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）プローブ（ｐｒｏｂｅ）を作製することによって、標的核酸の塩基配列が変更されても前記汎用プローブは使用し続けることができ、よって、分子診断、産前診断、早期診断、癌診断、遺伝関連診断、遺伝形質診断、感染菌の診断、薬剤耐性菌の判別、法医学、生物体の種判別などに有用である。
【０１５０】
なお、本発明に係る標的核酸増幅方法は、前記代理標的の注入量を調節して標的核酸増幅の敏感度を容易に調整しながらもこの調整が増幅効率に及ぶ影響を最小化できるので、診断製品開発時に最適化過程をより効率的に行うことができる。
【図１】
2021509821.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2021509821.tif 000027
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2021509821.tif 000030
【図１３】
2021509821.tif 000031
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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