(57)【要約】本開示は、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−カルボキシルシトシンおよび５−ホルミルシトシンの位置の、核酸配列における、亜硫酸水素塩非含有特定のための方法を提供する。本明細書に記述した方法は、非修飾シトシンに影響を及ぼすことなく、塩基分解能で定量的に修飾シトシンを検出する軽度の反応を伴うＤＮＡまたはＲＮＡメチル化およびヒドロキシメチル化分析を提供する。本明細書ではＴＡＰＳ（ＴＥＴ補助ピリジンボラン配列決定（ＴＥＴ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｂｏｒａｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））と呼ばれる、ボラン誘導体（例えば、ピリジンボランおよび２−ピコリンボラン（ｐｉｃ−ＢＨ３））によるＴＥＴ酸化および還元を組み合わせることにより、５ｍＣおよび５ｈｍＣを特定する新しい方法が本明細書に提供される（表１）。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸中の５−メチルシトシン（５ｍＣ）を特定するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
ｉ．  核酸試料中の５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）にブロッキング基を添加する工程と、
ii．  前記核酸試料中の前記５ｍＣを５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）および／または５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換する工程と、
iii．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣおよび／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
ｃ．  前記配列におけるＤＨＵの存在を検出すること、または前記ＤＨＵをチミン（Ｔ）に変換して前記配列における前記チミン（Ｔ）の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のＤＨＵへの移行またはシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｍＣの位置を提供する、方法。
【請求項２】
各移行位置でのＤＨＵまたはＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置での５ｍＣの定量レベルを提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定する方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
ｉ．  前記核酸試料中の前記５ｍＣおよび５ｈｍＣを５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）および／または５ｆＣに変換する工程と、
ii．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣおよび／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
ｃ．  前記配列におけるＤＨＵの存在を検出すること、または前記ＤＨＵをチミン（Ｔ）に変換して前記配列における前記チミン（Ｔ）の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のＤＨＵへの移行またはシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣのいずれかの位置を提供する、方法。
【請求項４】
各移行位置でのＤＨＵまたはＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置での５ｍＣまたは５ｈｍＣの定量レベルを提供する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標的核酸中の５ｍＣを特定するための、および５ｈｍＣを特定するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸中の５−メチルシトシン（５ｍＣ）を特定する工程であって、前記特定する工程が、
ｉ．  前記標的核酸を含む第一核酸試料を提供する工程、
ii．  前記第一試料中の前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
（１）．  前記第一核酸試料中の、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）にブロッキング基を添加することと、
（２）．  前記第一核酸試料中の前記５ｍＣを、５ｃａＣおよび／または５ｆＣに変換することと、
（３）．  修飾標的核酸を含む修飾第一核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣおよび／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換することと、を含む、修飾する工程、
iii．  前記配列におけるＤＨＵの存在を検出すること、または前記ＤＨＵをチミン（Ｔ）に変換して前記配列における前記チミン（Ｔ）の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のＤＨＵへの移行またはシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｍＣの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、
ｂ．  前記標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定する工程であって、前記特定する工程が、
ｉ．  前記標的核酸を含む第二核酸試料を提供する工程、
ii．  前記第二試料中の前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
（１）．  前記第二核酸試料中の５ｍＣおよび５ｈｍＣを、５ｃａＣおよび／または５ｆＣに変換することと、
（２）．  修飾標的核酸を含む修飾第二核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣおよび／または５ｆＣをジヒドロラシル（ＤＨＵ）に変換することと、を含む、修飾する工程、および
iii．  前記配列におけるＤＨＵの存在を検出すること、または前記ＤＨＵをチミン（Ｔ）に変換して前記配列における前記チミン（Ｔ）の存在を検出することを含む、前記第二試料から前記修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のＤＨＵへの移行またはシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣのいずれかの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、ならびに、
ｃ．  工程（ａ）および（ｂ）の結果を比較する工程であって、工程（ｂ）で存在するが工程（ａ）では存在しないＣからＤＨＵまたはＣからＴへの移行が、前記標的核酸中の５ｈｍＣの位置を提供する、比較する工程、を含む、方法。
【請求項６】
工程（ａ）において、各移行位置でのＤＨＵまたはＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で５ｍＣの定量レベルを提供し、工程（ｂ）において、各移行位置でのＤＨＵまたはＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で５ｍＣ、または５ｈｍＣの定量レベルを提供し、および工程（ｃ）において、工程（ｂ）で、工程（ａ）ではなく、特定されたＣからＤＨＵまたはＴへの移行についてのパーセンテージの差異が、前記標的核酸中の各位置で５ｈｍＣの定量レベルを提供する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記５ｈｍＣに添加される前記ブロッキング基が糖である、請求項１〜２または請求項５〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記糖がグルコースまたは修飾グルコースである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ブロッキング基が、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の存在下で、糖に連結されたウリジン二リン酸（ＵＤＰ）に前記核酸試料を接触させることにより、前記５ｈｍＣに添加される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、Ｔ４バクテリオファージβ−グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）、Ｔ４バクテリオファージα−グルコシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸試料中の前記５ｍＣを、５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程、ならびに前記核酸試料中の前記５ｍＣ及び５ｈｍＣを、５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程は、テンイレブントランスロケーション（ＴＥＴ）酵素と前記核酸試料を接触させることを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＥＴ酵素が、ヒトＴＥＴ１、ＴＥＴ２、及びＴＥＴ３、マウスＴｅｔ１、Ｔｅｔ２、及びＴｅｔ３、ネグレリアＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、ウシグソヒトヨタケ（ＣｃＴＥＴ）、ならびにその誘導体または類似体からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＥＴ酵素がＮｇＴＥＴまたはマウスＴＥＴである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
標的核酸中の５ｃａＣ、または５ｆＣを特定するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣおよび５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程、
ｃ．  前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する工程、および
ｄ．  前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｃａＣ、または５ｆＣのいずれかの位置を提供する、方法。
【請求項１５】
各移行位置でのＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で、５ｃａＣ、または５ｆＣの定量レベルを提供する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的核酸中の５ｃａＣを特定するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  前記核酸試料中の５ｆＣにブロッキング基を添加する工程、
ｃ．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程、および
ｄ．  前記配列におけるＤＨＵの存在を検出すること、または前記ＤＨＵをチミン（Ｔ）に変換して前記配列における前記チミン（Ｔ）の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のＤＨＵへの移行またはシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｃａＣの位置を提供する、方法。
【請求項１７】
各移行位置でのＤＨＵまたはＴのパーセンテージが、前記標的核酸の各位置で５ｃａＣの定量レベルを提供する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記５ｆＣにブロッキング基を添加する工程が、ヒドロキシルアミン誘導体、ヒドラジン誘導体、およびヒドラジド誘導体から選択されるアルデヒド反応性化合物と、前記核酸試料を接触させることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒドロキシルアミン誘導体が、Ｏ−エチルヒドロキシルアミンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
標的核酸中の５ｆＣを特定するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  前記核酸試料中の５ｃａＣにブロッキング基を添加する工程、
ｃ．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程、および
ｄ．  前記配列におけるＤＨＵの存在を検出すること、または前記ＤＨＵをチミン（Ｔ）に変換して前記配列における前記チミン（Ｔ）の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のＤＨＵへの移行またはシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｆＣの位置を提供する、方法。
【請求項２１】
各移行位置でのＤＨＵまたはＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で５ｆＣの定量レベルを提供する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
５ｃａＣにブロッキング基を添加する前記工程が、前記核酸試料をカルボン酸誘導体化試薬、及びアミン、ヒドラジン又はヒドロキシルアミン化合物と接触させることを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
５ｃａＣにブロッキング基を添加する前記工程が、前記核酸試料を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と接触させることと、エチルアミンと接触させることと、を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
標的核酸中の５ｈｍＣを特定するための方法であって、前記方法が、
ａ.  前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ.  前記試料中の前記核酸を修飾する工程であって、
ｉ  前記核酸試料中の前記５ｈｍＣを５ｃａＣおよび／または５ｆＣに変換する工程と
ii  前記５ｃａＣおよび／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換して修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供する工程と、を含む、修飾する工程、および
ｃ.  前記配列におけるＤＨＵの存在を検出すること、または前記ＤＨＵをチミン（Ｔ）に変換して前記配列におけるチミン（Ｔ）の存在を検出することを含む、前記修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のＤＨＵへの移行またはシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｈｍＣの位置を提供する、検出する工程、を含む、方法。
【請求項２５】
各移行位置でのＤＨＵまたはＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で５ｈｍＣの定量レベルを提供する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記５ｈｍＣを５ｃａＣおよび／または５ｆＣに変換する工程が、前記核酸試料を酸化剤と接触させることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記酸化剤が、過ルテニウム酸カリウムまたはＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する前記工程をさらに含む、請求項１〜６、および１４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する前記工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはプライマー伸長を行うことを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記５ｃａＣおよび／または５ｆＣをＤＨＵへ変換する前記工程が、前記核酸試料を還元剤に接触させることを含む、請求項１〜６、および１４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記還元剤が、ピリジンボラン、２−ピコリンボラン（ｐｉｃ−ＢＨ３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリドからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記還元剤が、ピリジンボラン、または２−ピコリンボランである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾標的核酸の配列を特定する前記工程が、鎖終結配列決定、マイクロアレイ、高処理量配列決定、および制限酵素分析のうちの一つ以上を含む、請求項１〜６、および１４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６１４，７９８号、２０１８年４月２０日出願の６２／６６０，５２３号、２０１８年１１月２６日に出願された６２／７７１，４０９号（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、核酸配列における、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−カルボキシルシトシンおよび／または５−ホルミルシトシンの位置を特定するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
５−メチルシトシン（５ｍＣ）および５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）は、哺乳類ゲノム中に見られる二つの主なエピジェネティックマークであり、５ｈｍＣはテンイレブントランスロケーション（ＴＥＴ）ファミリージオキシゲナーゼによって、５ｍＣから生成される。Ｔｅｔはさらに５ｈｍＣを５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）と５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）とに酸化することができ、これは５ｍＣおよび５ｈｍＣと比較して、哺乳類ゲノム中では非常に低い存在量で存在する（５ｈｍＣの１０分の１〜１００分の１の存在量）。５ｍＣと５ｈｍＣとは、遺伝子制御から正常な発現まで幅広い生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。異常なＤＮＡメチル化およびヒドロキシメチル化は、様々な疾患と関連付けられてきており、また癌の広く認められた特徴である。したがって、ＤＮＡ配列における５ｍＣと５ｈｍＣの決定は、基本的な研究にとって重要なだけではなく、診断および治療を含む臨床用途にとっても有益である。
【０００４】
５ｆＣおよび５ｃａＣは、５ｍＣの二つの最終酸化誘導体であり、塩基除去修復経路のチミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）によって非修飾シトシンに変換されうる。したがって、５ｆＣおよび５ｃａＣは、活性な脱メチル化プロセスにおける二つの重要な主要中間体であり、胚発生において重要な役割を果たしている。５ｆＣおよび５ｃａＣは、これらのコンテクストにおいて見出され、５ｍＣの完全に近い脱メチル化の指標としての役割を果たす。５ｆＣおよび５ｃａＣはまた、特異的なタンパク質を結合したり、またＲＮＡポリメラーゼＩＩの割合および特異性に影響を及ぼすなどの、さらなる機能も果たしうる。
【０００５】
５ｍＣはまた、安定し、かつ極めて豊富なｔＲＮＡおよびｒＲＮＡの両方で、およびｍＲＮＡで特定されている転写後のＲＮＡ修飾でもある。さらに、５ｍＣは、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）およびｅＲＮＡ（エンハンサーＲＮＡ）で検出されている。しかしながら、異なる生物体における特異的なＲＮＡタイプにおける５ｍＣの発生には差異があると思われる。例えば、５ｍＣは、細菌からのｔＲＮＡおよびｍＲＮＡには存在しないと思われるが、真核細胞および古細菌中のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡでは見出されている。
【０００６】
５ｈｍＣもＲＮＡで検出されている。例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びマウスに由来するｍＲＮＡは、５ｈｍＣを含有することが見いだされている。ＤＮＡ中の５ｍＣを酸化する同一の酵素群は、哺乳類の総ＲＮＡにおける５ｈｍＣの形成に触媒作用を及ぼすと報告された。ハエでは、５ｈｍＣ抗体を用いたメチル化ＲＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＲＩＰ‐配列）を使用したトランスクリプトームワイドな研究は、多数のｍＲＮＡコード配列で５ｈｍＣの存在を検出し、特に脳内で高レベルであった。また、活性翻訳は、ＲＮＡ中の高５ｈｍＣレベルと関連付けられており、ＲＮＡにおける５ｈｍＣ堆積に関与するＴＥＴ酵素が欠損しているハエは脳の発達が損なわれていることも報告された。
【０００７】
ＤＮＡメチル化およびヒドロキシメチル化分析に対する現在の究極の基準であり最も広く使用されている方法は、亜硫酸水素塩配列決定（ＢＳ）、ならびに、Ｔｅｔ−補助亜硫酸水素塩配列決定（ＴＡＢ−配列）および酸化的亜硫酸水素塩配列決定（ｏｘＢＳ）などのその誘導方法である。これらの方法のすべては、５ｍＣおよび／または５ｈｍＣを完全なままに残しながら非メチル化シトシンをウラシルに変換するための亜硫酸水素塩処理を用いる。ウラシルをチミンとして読み取る亜硫酸水素塩処理ＤＮＡのＰＣＲ増幅により、各シトシンの修飾情報を単一塩基分解能で推測することができる（ＣからＴへの移行が非メチル化シトシンの位置を提供する）。しかしながら、亜硫酸水素塩配列決定に対する少なくとも二つの主な欠点がある。第一に、亜硫酸水素塩処理は厳しい化学反応であり、これは必要な酸性および熱的条件下での脱プリンによりＤＮＡの９０％以上を分解する。この分解は、循環細胞遊離ＤＮＡおよび単一細胞配列決定を含む臨床試料など、その適用を低入力試料に厳しく制限する。第二に、亜硫酸水素塩配列決定は、非修飾シトシンのチミンへの完全変換に依存する。非修飾シトシンは、ヒトゲノム中の合計シトシンの約９５％を占める。全てのこれらの位置をチミンに変換することで、配列の複雑さが大幅に低減され、配列決定の品質の低下、低いマッピング率、不均一なゲノムカバレッジ、および配列決定コストの増加につながる。亜硫酸水素塩配列決定方法はまた、非修飾シトシンのチミンへの変換が不完全なことにより、５ｍＣおよび５ｈｍＣの誤検出しやすい。
【０００８】
亜硫酸水素塩配列決定を使用して、ＲＮＡ中のシトシンのメチル化もまた検出してきた。メチル化ＲＮＡ−免疫沈降法などの、ＲＮＡ中の５ｍＣ検出の他の方法とは異なり、ＲＮＡ−亜硫酸水素塩配列決定（ＲＮＡ−ＢＳ−配列）は、ＲＮＡにおける特定のＣ位置のメチル化の程度を決定することができるという利点がある。ただし、ＲＮＡ−ＢＳ−配列は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩配列決定に関して上述した同じ欠点を持っている。特に、反応条件は、ＲＮＡの実質的な分解を生じさせ得る。
【０００９】
非修飾シトシンに影響を与えずに定量的に塩基分解能で修飾シトシン（５ｍＣおよび５ｈｍＣ）を検出できる軽度の反応であるＤＮＡメチル化およびヒドロキシメチル化分析のための方法に対するニーズがある。同様に、軽度の反応条件を用いた、かつ非修飾シトシンに影響を与えずに定量的に塩基分解能で修飾シトシンを検出できる、ＲＮＡメチル化およびヒドロキシメチル化分析のための方法に対するニーズがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、核酸における、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−カルボキシルシトシンおよび／または５−ホルミルシトシンのうちの一つ以上の位置を特定するための方法を提供する。本明細書に記述した方法は、非修飾シトシンに影響を及ぼすことなく、塩基分解能で定量的に修飾シトシンを検出する軽度の反応を伴うＤＮＡまたはＲＮＡメチル化およびヒドロキシメチル化分析を提供する。本明細書ではＴＡＰＳ（ＴＥＴ補助ピリジンボラン配列決定（ＴＥＴ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｂｏｒａｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））と呼ばれる、ボラン誘導体（例えば、ピリジンボランおよび２−ピコリンボラン（ｐｉｃ−ＢＨ３））によるＴＥＴ酸化および還元を組み合わせることにより、５ｍＣおよび５ｈｍＣを特定する新しい方法が本明細書に提供される（表１）。ＴＡＰＳは、非修飾シトシンに影響を与えることなく、高感度および特異性で直接修飾を検出し、またその他のシトシン修飾を検出するために採用することができる。これは非破壊的であり、ＲＮＡおよびＤＮＡを１０ｋｂｓの長さまで保存する。亜硫酸水素塩配列決定と比較すると、ＴＡＰＳはより高いマッピング率、より均一なカバレッジおよびより低い配列決定コストをもたらし、より高品質、より包括的かつ安価なメチローム解析を可能にする。酸化工程を用いないこの方法の変型は、本明細書に記載される５ｆＣおよび／または５ｃａＣを特定するために使用される。
【００１１】
一態様では、本発明は、標的核酸中の５−メチルシトシン（５ｍＣ）を特定するための方法を提供し、この方法は、
ａ．  標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  核酸を修飾する工程であって、
ｉ．  核酸試料中の５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）にブロッキング基を添加する工程と、
ii．  核酸試料中の５ｍＣを５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）および／または５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換する工程と、
iii．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、５ｃａＣおよび／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
ｃ．  修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的核酸中の５ｍＣの位置を提供する、検出する工程を含む。
【００１２】
標的核酸中の５ｍＣを特定する方法の実施形態では、各移行位置でのＴのパーセンテージは、標的核酸の各位置で５ｍＣの定量レベルを提供する。実施形態では、核酸はＤＮＡである。他の実施形態では、核酸はＲＮＡである。
【００１３】
別の態様では、本発明は、標的核酸中の５ｍＣ、または５ｈｍＣを特定するための方法を提供し、この方法は、
ａ．  標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  核酸を修飾する工程であって、
ｉ．  核酸試料中の５ｍＣおよび５ｈｍＣを５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）および／または５ｆＣに変換する工程と、
ii．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、５ｃａＣおよび／または５ｆＣをＤＨＵに変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
ｃ．  修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣのいずれかの位置を提供する、検出する工程を含む。
【００１４】
５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定する方法の実施形態では、各移行位置でのＴのパーセンテージは、標的核酸の各位置で５ｍＣまたは５ｈｍＣの定量レベルを提供する。実施形態では、核酸はＤＮＡである。他の実施形態では、核酸はＲＮＡである。
【００１５】
別の態様では、本発明は、標的核酸中の５ｍＣを特定するための、および５ｈｍＣを特定するための方法を提供し、この方法が、
ａ．  標的核酸中の５ｍＣを特定する工程であって、この特定する工程が、
ｉ．  標的核酸を含む第一核酸試料を提供する工程、
ii．  第一試料中の核酸を修飾する工程であって、
１．  第一核酸試料内の、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）にブロッキング基を添加することと、
２．  第一核酸試料中の５ｍＣを、５ｃａＣおよび／または５ｆＣに変換することと、
３．  修飾標的核酸を含む修飾第一ＤＮＡ試料を提供するために、５ｃａＣおよび／または５ｆＣをＤＨＵに変換することと、を含む、修飾する工程、
iii．  修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
iv．  修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的核酸中の５ｍＣの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、
ｂ．  標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定する工程であって、この特定する工程が、
ｉ．  標的核酸を含む第二核酸試料を提供する工程、
ii．  第二核酸試料中の核酸を修飾する工程であって、
１．  第二核酸試料中の５ｍＣおよび５ｈｍＣを、５ｃａＣおよび／または５ｆＣに変換することと、
２．  修飾標的核酸を含む修飾第二核酸試料を提供するために、５ｃａＣおよび／または５ｆＣをＤＨＵに変換することと、を含む、修飾する工程、
iii．  修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、
iv．  第二試料から修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較して修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣのいずれかの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、ならびに、
ｃ．  工程（ａ）および（ｂ）の結果を比較する工程であって、工程（ｂ）で存在するが工程（ａ）では存在しないＣからＴへの移行が、標的核酸中の５ｈｍＣの位置を提供する、比較する工程、を含む。
【００１６】
標的核酸中の５ｍＣを特定し、５ｈｍＣを特定するための実施形態では、工程（ａ）においては、各移行位置でのＴのパーセンテージは、標的核酸中の５ｍＣの定量レベルを提供し、工程（ｂ）においては、各移行位置でのＴのパーセンテージは、標的核酸中の５ｍＣ、または５ｈｍＣの定量レベルを提供し、および工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で、しかし工程（ａ）ではなく、特定されたＣからＴへの移行についてのパーセンテージの差異が標的核酸中の各位置での５ｈｍＣの定量レベルを提供する。実施形態では、核酸はＤＮＡである。他の実施形態では、核酸はＲＮＡである。
【００１７】
本発明の実施形態では、核酸試料中の５ｈｍＣに添加されたブロッキング基は糖である。実施形態では、糖は天然起源の糖または修飾糖、例えばグルコースまたは修飾グルコースである。本発明の実施形態では、ブロッキング基は、例えば、Ｔ４バクテリオファージβ−グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）、およびＴ４バクテリオファージα−グルコシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）ならびにその誘導体および類似体のような、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の存在下での、例えば、修飾グルコースに連結するＵＤＰ−グルコース、またはＵＤＰなどの、糖に連結するＵＤＰに核酸試料を接触させることで５ｈｍＣに添加される。
【００１８】
本発明の実施形態では、核酸試料中の５ｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程、ならびに核酸試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程はそれぞれ、テンイレブントランスロケーション（ＴＥＴ）酵素と核酸試料を接触させることを含む。さらなる実施形態では、ＴＥＴ酵素は、ヒトＴＥＴ１、ＴＥＴ２、およびＴＥＴ３；マウスＴｅｔ１、Ｔｅｔ２、およびＴｅｔ３；ネグレリアＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）；ウシグソヒトヨタケ（ＣｃＴＥＴ）、ならびにその誘導体または類似体のうちの一つ以上である。実施形態において、ＴＥＴ酵素はＮｇＴＥＴである。
【００１９】
別の態様では、本発明は、標的核酸中の５ｃａＣ、または５ｆＣを特定するための方法を提供し、この方法は、
ａ．  標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、５ｃａＣおよび５ｆＣをＤＨＵに変換する工程、
ｃ．  修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
ｄ．  修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的核酸中の５ｃａＣまたは５ｆＣのいずれかの位置を提供する、検出する工程を含む。
【００２０】
標的核酸中の５ｃａＣまたは５ｆＣを特定する方法の実施形態では、各移行位置でのＴのパーセンテージは、標的核酸の各位置で５ｃａＣまたは５ｆＣの定量レベルを提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、標的核酸中の５ｃａＣを特定するための方法を提供し、この方法は、
ａ．  標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  核酸試料中の５ｆＣにブロッキング基を添加する工程、
ｃ．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、５ｃａＣをＤＨＵに変換する工程、
ｄ．  修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
ｅ．  修飾標的核酸の配列を決定する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的核酸中の５ｃａＣの位置を提供する、決定する工程、を含む。
【００２２】
標的核酸中の５ｃａＣを特定する方法の実施形態では、各移行位置でのＴのパーセンテージは、標的核酸の各位置で５ｃａＣの定量レベルを提供する。実施形態では、核酸はＤＮＡである。他の実施形態では、核酸はＲＮＡである。
【００２３】
本発明の実施形態では、核酸試料の５ｆＣにブロッキング基を添加することは、例えば、ヒドロキシルアミン誘導体（Ｏ−エチルヒドロキシルアミン）、ヒドラジン誘導体、およびヒドラジド誘導体を含むアルデヒド反応性化合物と核酸を接触させることを含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は、標的核酸中の５ｆＣを特定するための方法を提供し、この方法は、
ａ．  標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  核酸試料中の５ｃａＣにブロッキング基を添加する工程、
ｃ．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、５ｆＣをＤＨＵに変換する工程、
ｄ．  修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、
ｅ．  修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、標的核酸と比較した修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的核酸中の５ｆＣの位置を提供する、検出する工程、を含む。
【００２５】
標的核酸中の５ｆＣを特定する方法の実施形態では、各移行位置でのＴのパーセンテージは、標的核酸の各位置で５ｆＣの定量レベルを提供する。実施形態では、核酸（試料および標的）はＤＮＡである。他の実施形態では、核酸（試料および標的）はＲＮＡである。
【００２６】
実施形態において、核酸試料中の５ｃａＣにブロッキング基を添加する工程は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および（ｉｉ）アミン（エチルアミンなど）、ヒドラジン、またはヒドロキシルアミン化合物を含む、カルボン酸誘導体化試薬に核酸試料を接触させることを含む。
【００２７】
本発明の実施形態では、上記方法は修飾標的核酸のコピー数を増幅する工程をさらに含む。実施形態では、この増幅工程は、修飾標的核酸の配列を検出する工程の前に実施される。修飾標的核酸がＤＮＡであるときにコピー数を増幅する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、プライマー伸長および／またはクローニングを行うことによって達成されうる。修飾標的核酸がＲＮＡである場合、コピー数を増幅する工程は、オリゴ（ｄＴ）プライマー（ｍＲＮＡに対する）、ランダムプライマー、及び／または遺伝子特異的プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって達成され得る。
【００２８】
本発明の実施形態では、ＤＮＡ試料はＤＮＡのピコグラム量を含む。本発明の実施形態では、ＤＮＡ試料は、約１ｐｇ〜約９００ｐｇ  ＤＮＡ、約１ｐｇ〜約５００ｐｇ  ＤＮＡ、約１ｐｇ〜約１００ｐｇ  ＤＮＡ、約１ｐｇ〜約５０ｐｇ  ＤＮＡ、約１〜約１０ｐｇ  ＤＮＡ、約２００ｐｇ未満、約１００ｐｇ未満ＤＮＡ、約５０ｐｇ未満ＤＮＡ、約２０ｐｇ未満ＤＮＡ、および約５ｐｇ未満ＤＮＡを含む。本発明の他の実施形態では、ＤＮＡ試料はＤＮＡのナノグラム量を含む。本発明の実施形態では、ＤＮＡ試料は、約１〜約５００ｎｇのＤＮＡ、約１〜約２００ｎｇのＤＮＡ、約１〜約１００ｎｇのＤＮＡ、約１〜約５０ｎｇのＤＮＡ、約１ｎｇ〜約１０ｎｇのＤＮＡ、約１ｎｇ〜約５ｎｇのＤＮＡ、約１００ｎｇ未満のＤＮＡ、約５０ｎｇ未満のＤＮＡ、約５ｎｇ未満のＤＮＡ、または約２ｎｇ未満のＤＮＡを含有する。本発明の実施形態では、ＤＮＡ試料は循環細胞遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む。本発明の実施形態では、ＤＮＡ試料はＤＮＡのマイクログラム量を含む。
【００２９】
本発明の実施形態では、５ｃａＣおよび／または５ｆＣをＤＨＵに変換する工程は、例えば、ピリジンボラン、２−ピコリンボラン（ｐｉｃ−ＢＨ３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリドを含む還元剤に核酸試料を接触させることを含む。好ましい実施形態では、還元剤はｐｉｃ−ＢＨ３および／またはピリジンボランである。
【００３０】
本発明の実施形態では、修飾標的核酸の配列を決定する工程は、鎖終結配列決定、マイクロアレイ、高処理量配列決定、および制限酵素分析を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１。ボラン含有化合物スクリーニング。１１ｍｅｒオリゴヌクレオチド（オリゴ）における５ｃａＣのＤＨＵへの変換についてボラン含有化合物をスクリーニングし、変換率をＭＡＬＤＩで評価した。エチレンジアミンボランおよびジメチルアミンボランは３０％の変換率を与えた一方で、２−ピコリンボラン（ピコボラン）、ボランピリジン、およびｔｅｒｔ−ブチルアミンボランが５ｃａＣを完全にＤＨＵに変換し得た。ジシクロヘキシルアミンボラン、モルホリンボラン、４−メチルモルホリンボラン、およびトリメチルアミンボランで測定された検出可能な生成物はなかった（未検出（ｎ．ｄ．））。水素化ホウ素ナトリウムおよび水素化トリアセトキシホウ素ナトリウムなどのその他の還元剤は、酸性媒体で急速に分解し、不完全な変換につながる。酸性状態下でシアン化水素形成の可能性があるため、シアノホウ水素化ナトリウムは使用されなかった。完全な変換、低毒性、及び高安定性の理由により、ピコボラン及びピリジンボランを選択した。
【００３２】
【図２】図２Ａ〜Ｂ。ＤＮＡオリゴに対するピコボラン反応。（Ａ）ピコボランで処理された５ｃａＣ含有１１ｍｅｒモデルＤＮＡのＭＡＬＤＩ特性解析。計算された質量（ｍ／ｚ）が各グラフの上に表示され、観測された質量がピークの左側に表示される。（Ｂ）ｄＣの変換率および様々なシトシン誘導体は、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量された。三つの複製の平均±ＳＤとして示されるデータ。
【００３３】
【図３−１】図３Ａ〜Ｂ。単一ヌクレオシドピコボラン反応。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ結果は、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロウリジン（Ｉ．Ａｐａｒｉｃｉ−Ｅｓｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．８１，４０３１−４０３８（２０１６））に従った。（Ａ）単一ヌクレオシドピコボラン反応生成物の１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４，４００ＭＨｚ）チャート。δ  ｐｐｍ：６．２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），４．３０（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），２．６５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），２．２０（ｍ，１Ｈ），２．０３（ｍ，１Ｈ）。（Ｂ）単一ヌクレオシドピコボラン反応生成物の１３Ｃ  ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４，４００ＭＨｚ）チャート。δ  ｐｐｍ：１７１．５６（ＣＯ），１５３．５４（ＣＯ），８５．９７（ＣＨ），８３．８６（ＣＨ），７０．９９（ＣＨ），６１．９２（ＣＨ２），３６．０４（ＣＨ２），３５．４６（ＣＨ２），３０．４９（ＣＨ２）。
【図３−２】同上。
【００３４】
【図４−１】図４Ａ〜Ｂ。（Ａ）５ｃａＣのＤＨＵへのボラン変換、および５ｃａＣのＤＨＵへのボラン反応のための提案メカニズム、ならびに（Ｂ）５ｆＣのＤＨＵへのボラン変換、および５ｆＣのＤＨＵへのボラン反応のための提案メカニズム、を示す図表。
【図４−２】同上。
【００３５】
【図５】図５Ａ〜Ｂ。（Ａ）図は、ＴＡＰＳ方法が５ｍＣと５ｈｍＣの両方をＤＨＵに変換し、これは、複製時にチミンとして機能することを示す。（Ｂ）ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳβ、およびＣＡＰＳ方法の概要。
【００３６】
【図６−１】図６。５ｆＣおよび５ｃａＣをブロックすることを伴う、またはブロックしない、ピコボランで処理された５ｆＣおよび５ｃａＣ含有モデルＤＮＡオリゴのＭＡＬＤＩ特性解析。５ｆＣおよび５ｃａＣは、ｐｉｃ−ＢＨ３を用いてジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換される。５ｆＣは、オキシムになり、ピコボラン変換に抵抗するであろうＯ−エチルヒドロキシルアミン（ＥｔＯＮＨ２）などのヒドロキシルアミン誘導体によってブロックされた。５ｃａＣは、ＥＤＣコンジュゲーションを介してエチルアミンによってブロックされ、ピコボランによる変換をブロックするアミドに変換された。計算されたＭＳ（ｍ／ｚ）が各グラフの上に表示され、観測されたＭＳがピークの左側に表示される。
【図６−２】同上。
【００３７】
【図７−１】図７。５ｈｍＣをブロックすることを伴う、またはブロックしない、ＫＲｕＯ４およびピコボランで処理されたモデルＤＮＡオリゴを含有する５ｍＣおよび５ｈｍＣのＭＡＬＤＩ特性解析。５ｈｍＣは、グルコースを用いてβＧＴによってブロックされることができ、５ｇｍＣに変換されることができる。５ｍＣ、５ｈｍＣ、および５ｇｍＣは、ピコボランによって変換されることはできなかった。５ｈｍＣはＫＲｕＯ４によって５ｆＣへと酸化されることができ、次にピコボランによってＤＨＵに変換されることができた。計算されたＭＳ（ｍ／ｚ）が各グラフの上に表示され、観測されたＭＳがピークの左側に表示される。
【図７−２】同上。
【００３８】
【図８】図８Ａ〜Ｂ。制限酵素消化は、ＴＡＰＳが５ｍＣを効果的にＴに変換できることを示した。（Ａ）ＴＡＰＳによって引き起こされる配列変化を確認するための制限酵素消化アッセイの概略図。（Ｂ）ＴＡＰＳによって引き起こされたＣからＴへの移行を確認するためのＴａｑαＩ−消化試験。ＴａｑαＩ制限部位を有する、ならびに五つの完全にメチル化されたＣｐＧ部位（５ｍＣ）およびその非メチル化対照（Ｃ）を含む２２２ｂｐモデルＤＮＡ上で、ＴＡＰＳを行った。ＰＣＲ増幅された２２２ｂｐモデルＤＮＡは、５ｍＣ、ＣおよびＣ  ＴＡＰＳに示すように、ＴａｑαＩで、約１６０ｂｐおよび約６０ｂｐ断片に切断されうる。メチル化ＤＮＡ上のＴＡＰＳの後、Ｔ（ｍＣ）ＧＡ配列はＴＴＧＡに変換され、５ｍＣ−ＴＡＰＳレーンに示されるようにＴａｑαＩ消化により切断されなくなる。
【００３９】
【図９】図９Ａ〜Ｂ。２２２ｂｐモデルＤＮＡおよびｍＥＳＣ  ｇＤＮＡ上のＴＡＰＳ。（Ａ）ＴＡＰＳの前（５ｍＣ、Ｃ）、および後（５ｍＣ  ＴＡＰＳ、Ｃ  ＴＡＰＳ）の、五つの完全にメチル化されたＣｐＧ部位およびその非メチル化対照を含有する２２２ｂｐモデルＤＮＡに対するサンガー配列決定の結果。ＴＡＰＳ法でＴに変換されるのは５ｍＣだけである。（Ｂ）ＮｇＴＥＴ１酸化後およびピコボラン還元後のｍＥＳＣｓ  ｇＤＮＡ対照における相対的修飾レベルのＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量化。三つの複製の平均±ＳＤとして示されるデータ。
【００４０】
【図１０−１】図１０Ａ〜Ｄ。ＴＡＰＳは、亜硫酸水素塩と比較して有意なＤＮＡ分解を引き起こさなかった。氷浴で冷却する前（Ａ）、および後（Ｂ）の、２２２ｂｐの非メチル化ＤＮＡ、２２２ｂｐメチル化ＤＮＡ、およびｍＥＳＣ  ｇＤＮＡのアガロースゲル画像。ＴＡＰＳ後で検出可能なＤＮＡ分解は観察されなかった、およびＤＮＡは二本鎖のままであり、冷却なし視覚化することができた。亜硫酸水素塩変換が分解を作り出し、ＤＮＡは一本鎖になり、氷で冷却された後のみ視覚化され得た。（Ｃ）氷上での冷却前（左パネル）および後（右パネル）のＴＡＰＳおよび亜硫酸水素塩で処理された様々な断片長のｍＥＳＣ  ｇＤＮＡのアガロースゲル画像。ＴＡＰＳの後のＤＮＡは二本鎖のままであり、ゲル上で直接視覚化され得た。亜硫酸水素塩処理により、試料により多くの損傷および断片化が起こり、およびＤＮＡは一本鎖になり、氷で冷却された後のみ視覚化され得た。図１５に示されるように、断片長に関わらず、すべてのｇＤＮＡに対してＴＡＰＳ変換が完了した。（Ｄ）ＴＡＰＳ（３個の独立したリピート）の前後の２２２ｂｐモデルＤＮＡのアガロースゲル画像は、反応後に検出可能な分解を示していなかった。
【図１０−２】同上。
【００４１】
【図１１】図１１。ＴＡＰＳの前後のモデルＤＮＡ間の増幅曲線と溶融曲線との比較。ｑＰＣＲアッセイでは、増幅曲線のＴＡＰＳの前後にモデルＤＮＡの軽微な差異が示された。ＴＡＰＳ後により低温にシフトされたメチル化ＤＮＡ（５ｍＣ）の溶融曲線は、非メチル化ＤＮＡ（Ｃ）に対するシフトがない一方で、可能なＴｍが低減させたＣからＴへの移行を示唆した。
【００４２】
【図１２】図１２。サンガー配列決定によって実証されるように、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳβおよびＣＡＰＳの後に誘導された完全なＣからＴへの移行。単一メチル化および単一ヒドロキシメチル化されたＣｐＧ部位を含有するモデルＤＮＡを本明細書に記述したように調製した。本明細書に記載されるＮｇＴＥＴ１酸化およびピリジンボラン還元プロトコルの後にＴＡＰＳ変換を行った。５ｈｍＣブロッキング、ＮｇＴＥＴ１酸化、およびピリジンボラン還元プロトコルの後にＴＡＰＳ変換を行った。５ｈｍＣ酸化、およびピリジンボラン還元プロトコルの後にＣＡＰＳ変換を行った。変換後、１ｎｇの変換されたＤＮＡ試料は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲ増幅され、サンガー配列決定のために処理された。ＴＡＰＳが、５ｍＣと５ｈｍＣの両方をＴに選択的に変換した。ＴＡＰＳβは選択的に５ｍＣを変換したが、ＣＡＰＳは選択的に５ｈｍＣを変換した。三つの方法のいずれも、非修飾シトシンおよびその他の塩基に対して変換を引き起こさなかった。
【００４３】
【図１３−１】図１３Ａ〜Ｂ。（Ａ）ＴＡＰＳは、様々なＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼと適合性があり、サンガー配列決定により示されるように、完全なＣからＴへの移行を誘導する。ポリメラーゼ試験のためのメチル化ＣｐＧ部位を含有するモデルＤＮＡおよびプライマー配列が本明細書に記載されている。ＴＡＰＳ処理後、５ｍＣをＤＨＵに変換した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉウラシルプラスポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、およびベントエキソポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）は、ＤＨＵをＴとして読み取り、したがって、ＰＣＲ後に完全なＣからＴへの移行を誘発する。あるいは、プライマー伸長をビオチン標識プライマー、ならびにクレノウフラグメント、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを含む等温ポリメラーゼで行った。新たに合成されたＤＮＡ鎖を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１により分離し、次いでＴａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲにより増幅し、サンガー配列決定用に処理した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＨＵを効率的にバイパスし、ＤＨＵ部位に対向してアデニンを挿入することができ、これはＲＴ−ＰＣＲおよびサンガー配列決定によって証明されている。（Ｂ）特定のその他の商品化ポリメラーゼによってＤＮＡを含有するＤＨＵは効率的に増幅されなかった。ＴＡＰＳ処理後、５ｍＣをＤＨＵに変換した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉウラシルプラスポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼは、ＤＨＵをＴとして読み取り、したがって、完全なＣからＴへの移行を誘発する。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、フュージョンポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、およびＮＥＢ  Ｑ５ポリメラーゼ（非表示）を含む特定の他の商品化ポリメラーゼでは、低いＣからＴへの移行が観察されたか、または全く観察されなかった。
【図１３−２】同上。
【００４４】
【図１４】図１４。ＤＨＵは、ＴおよびＣと比較してＰＣＲバイアスを示していない。一つのＤＨＵ／Ｕ／Ｔ／Ｃ修飾を含有するモデルＤＮＡを、本明細書に記載される対応するＤＮＡオリゴで合成した。ＤＨＵ／Ｕ／Ｔ／Ｃ修飾を用いた各モデルＤＮＡに対する標準曲線を、モデルＤＮＡ入力の１：１０段階希釈でのｑＰＣＲ反応に基づいてプロットした（０．１ｐｇ〜１ｎｇ、各ｑＰＣＲ実験を三組で実行した）。ログ濃度（ｎｇ）値と平均Ｃｔ値との間の退行の勾配は、ＥｘｃｅｌのＳＬＯＰＥ機能によって算出された。ＰＣＲ効率は、以下の等式を使用して計算された：効率％＝（１０＾（−１／勾配）−１）＊１００％。増幅因子は、以下の等式を使用して計算された：増幅因子＝１０＾（−１／勾配）。ＤＨＵまたはＴまたはＣ修飾を有するモデルＤＮＡに対するＰＣＲ効率はほぼ同じであり、これはＤＨＵが正規塩基として読み取ることができ、ＰＣＲバイアスを引き起こさないことを示した。
【００４５】
【図１５】図１５Ａ〜Ｂ。ＴＡＰＳは、ＤＮＡ断片長に関わらず、５ｍＣを完全にＴに変換した。（Ａ）ＴａｑαＩ消化アッセイのアガロースゲル画像は、ＤＮＡ断片長に関わらず、全ての試料における完全な５ｍＣのＴへの変換が確認された。ラムダゲノムからの１９４ｂｐモデル配列は、ＴＡＰＳの後でＰＣＲ増幅され、ＴａｑαＩ酵素で消化された。変換されていない試料から増幅されたＰＣＲ生成物を切断することができ、一方でＴＡＰＳ処理試料上で増幅された生成物はインタクトであり、制限部位の損失を示唆し、そしてそのため完全な５ｍＣからＴへの移行を示唆した。（Ｂ）ＣからＴへの変換パーセンテージは、ゲルバンド定量によって推定され、試験された全てのＤＮＡ断片長に対して１００％示されている。
【００４６】
【図１６】図１６。異なるＴＡＰＳ条件についての変換および偽陽性。ｍＴｅｔ１とピリジンボランの組み合わせは、ＮｇＴＥＴ１またはピコボランとの他の条件と比較して、メチル化Ｃの最高変換率（９６．５％、完全ＣｐＧメチル化ラムダＤＮＡで計算された）および非修飾Ｃの最低変換率（０．２３％、２ｋｂ非修飾スパイクインで計算された）を達成した。バーの上に、すべての試験されたシトシン部位の変換率＋／−ＳＥが示される。
【００４７】
【図１７】図１７Ａ〜Ｂ。短いスパイクインの変換率。５ｍＣおよび５ｈｍＣを含む、（Ａ）１２０ｍｅｒ−１および（Ｂ）１２０ｍｅｒ−２。両方の鎖からの５ｍＣおよび５ｈｍＣ部位で完全に近い変換が達成された。修飾状況を持つ実際の配列が上部および下部に表示される。
【００４８】
【図１８−１】図１８Ａ〜Ｅ。全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定（ＷＧＢＳ）に対するＴＡＰＳの配列決定の品質の改善。（Ａ）ＴＡＰＳ処理ＤＮＡ中の５ｍＣおよび５ｈｍＣの変換率。左：既知の位置でメチル化またはヒドロキシメチル化された合成スパイクイン（ＣｐＮ）。（Ｂ）非修飾２ｋｂスパイクインからのＴＡＰＳの偽陽性率。（Ｃ）１００万回のシミュレートされた読み取りを一つのＩｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ  ＣＰＵの１コアで処理するときの、ＴＡＰＳおよびＷＧＢＳの総実行時間。（Ｄ）ゲノムにマッピングされたすべての配列決定された読み取りペア（トリミング後）の画分。（Ｅ）イルミナベーススペース（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢａｓｅＳｐａｃｅ）によって報告されるように、すべての配列決定された読み取りペアの第一および第二の読み取りに対する１塩基当たりの配列決定品質スコア。上部：ＴＡＰＳ。下部：ＷＧＢＳ。
【図１８−２】同上。
【００４９】
【図１９】図１９Ａ〜Ｂ。ＷＧＢＳよりもさらに均一なカバレッジをもたらし、より少ないカバーされていない位置をもたらしたＴＡＰＳ。両方の鎖で計算された、ＷＧＢＳとＴＡＰＳとの間の（Ａ）すべての塩基およびＢ）のＣｐＧ部位にわたるカバレッジの深さの比較。「ＴＡＰＳ（ダウンサンプリング）」の場合、すべてのマッピングされたＴＡＰＳ読み取りからのランダム読み取りが、カバレッジの中央値がＷＧＢＳのカバレッジの中央値と一致するように選択された。５０×を超えるカバレッジを持つ位置を最後の区間に示す。
【００５０】
【図２０】図２０。全染色体にわたる修飾レベルの分布。ＣｐＧのカバレッジによって重み付けされ、ウィンドウサイズ１０でガウス加重移動平均フィルターを使用して平滑化された、マウス染色体に沿った１００ｋｂウィンドウにおける平均修飾レベル。
【００５１】
【図２１−１】図２１Ａ〜Ｅ。ＴＡＰＳおよびＷＧＢＳによるゲノム全体でのメチローム測定の比較。（Ａ）全てのマウスＣｐＧ島（２０ウィンドウの区間に入れられた）、および４ｋｂｐの近接領域（５０の同等のサイズのウィンドウの区間に入れられた）における平均配列決定カバレッジの深さ。配列決定の深さの差異を考慮するために、すべてのマッピングされたＴＡＰＳ読み取りは、ゲノム全体にわたってマッピングされたＷＧＢＳ読み取りの中央値と一致するようにダウンサンプリングされた。（Ｂ）ＴＡＰＳのみ、ＴＡＰＳとＷＧＢＳの両方、またはＷＧＢＳのみによる、少なくとも三つの読み取りによってカバーされたＣｐＧ部位。（Ｃ）ＴＡＰＳのみ、ＴＡＰＳとＷＧＢＳの両方、またはＷＧＢＳのみで検出した、少なくとも三つの読み取りおよび修飾レベル＞０．１によってカバーされたＣｐＧ部位の数。（Ｄ）ＴＡＰＳおよびＷＧＢＳに対する修飾レベル（パーセントで）の染色体分布の例。ウィンドウサイズ１０でガウス加重移動平均フィルターを使用して平滑化された、マウス染色体４に沿った１００ｋｂウィンドウ当たりの修飾ＣｐＧの平均画分。（Ｅ）各方法によって測定されるように修飾レベルによって分類された、ＴＡＰＳおよびＷＧＢＳの両方における少なくとも三つの読み取りでカバーされた、ＣｐＧ部位の数を表すヒートマップ。コントラストを改善するために、両方の方法で修飾されていないＣｐＧを含む第一の区間は、色スケールから除外され、星印で示されている。
【図２１−２】同上。
【００５２】
【図２２】図２２。ＣｐＧ島の周辺の修飾レベル。ＣｐＧ島（２０ウィンドウの区間に入れられた）、および４ｋｂｐの近接領域（５０の同等のサイズのウィンドウの区間に入れられた）における平均修飾レベル。三つの読み取り未満のカバレッジを持つ区間は無視された。
【００５３】
【図２３】図２３Ａ〜Ｂ。ＴＡＰＳは、ＷＧＢＳよりも小さなカバレッジ修飾バイアスを示す。すべてのＣｐＧ部位はそれらのカバレッジに従った区間に入れられた、また、平均（円）および中央値（三角）の修飾値がＷＧＢＳ（Ａ）およびＴＡＰＳ（Ｂ）の各区間に示されている。１００超の読み取りをカバーするＣｐＧ部位が最後の区間に表示される。線は、データ点を通る線形適合を表す。
【００５４】
【図２４】図２４Ａ〜Ｃ。ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡライブラリ調製キットで調製された低入力ｇＤＮＡおよび細胞遊離ＤＮＡ  ＴＡＰＳ。（Ａ）配列決定ライブラリは、ｄｓＤＮＡライブラリキットＮＥＢＮｅｘｔＵｌｔｒａ  ＩＩまたはＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒｐｌｕｓキットで、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の１ｎｇまで下げ、成功裏に構築された。ｓｓＤＮＡライブラリキットＡｃｃｅｌ−ＮＧＳメチル−配列キットを用いて、（Ｂ）０．０１ｎｇのｍＥＳＣ  ｇＤＮＡまたは（Ｃ）１ｎｇの細胞遊離ＤＮＡにまで、入力ＤＮＡ量をさらに下げた。
【００５５】
【図２５】図２５Ａ〜Ｂ。ｄｓＤＮＡ  ＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒｐｌｕｓライブラリ調製キットで調製された低入力ｇＤＮＡおよび細胞遊離ＤＮＡ  ＴＡＰＳライブラリ。配列決定ライブラリは、ＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒｐｌｕｓキットで、わずか１ｎｇの（Ａ）ｍＥＳＣ  ｇＤＮＡ、および（Ｂ）細胞遊離ＤＮＡで構築された。細胞遊離ＤＮＡは、血漿ヌクレアーゼ分解により、１６０ｂｐ（ヌクレオソームサイズ）の周辺に鋭利な長さ分布を有する。ライブラリ構築の後、約３００ｂｐになり、これは、Ｂ）の鋭利なでバンドある。
【００５６】
【図２６】図２６Ａ〜Ｄ。高品質の細胞遊離ＤＮＡ  ＴＡＰＳ。（Ａ）ＴＡＰＳ処理ｃｆＤＮＡ中の５ｍＣの変換率。（Ｂ）ＴＡＰＳ処理ｃｆＤＮＡにおける偽陽性率。（Ｃ）ゲノムに一意にマッピングされたすべての配列決定された読み取りペアの画分。（Ｄ）ゲノムに一意にマッピングされた、およびＰＣＲ重複読み取りの除去後の、すべての配列決定された読み取りペアの画分。ＣＨＧとＣＨＨとは、非ＣｐＧコンテクストである。
【００５７】
【図２７】図２７。ＴＡＰＳは遺伝的バリアントを検出できる。メチル化（ＭＯＤ、上行）およびＣからＴへのＳＮＰ（下行）は、元の上の鎖（ＯＴ）／元の下の鎖（ＯＢ）、左側のカラム、に、ならびにＯＴ（ＣＴＯＴ）およびＯＢ（ＣＴＯＢ）に相補的な鎖、右側のカラム、に、明確な塩基分布パターンを示した。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明は、本明細書において、ＴＡＰＳという名称の配列で５ｍＣおよび５ｈｍＣを検出するための亜硫酸水素塩非含有の塩基分解能方法を提供する。ＴＡＰＳは、非修飾シトシンに影響を与えずに塩基分解能で直接的および定量的に５ｍＣおよび５ｈｍＣを検出するための軽度の酵素反応および化学反応から成る。本発明はまた、非修飾シトシンに影響を与えずに、塩基分解能で５ｆＣおよび５ｃａＣを検出する方法を提供する。したがって、本明細書に提供される方法は、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ、および５ｃａＣのマッピングを提供し、亜硫酸水素塩配列決定などの以前の方法の欠点を克服する。
表１。５ｍＣおよび５ｈｍＣ配列決定用のＢＳおよび関連する方法と、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳβおよびＣＡＰＳとの比較。
【表１】
2021509587.tif 000003
【００５９】
５ｍＣを特定する方法
【００６０】
一態様では、本発明は、標的ＤＮＡ中の５−メチルシトシン（５ｍＣ）を特定するための方法を提供し、この方法は、
ａ．  標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を提供する工程、
ｂ．  ＤＮＡを修飾する工程であって、
ｉ．  ＤＮＡ試料中の５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）にブロッキング基を添加する工程と、
ii．  ＤＮＡ試料中の５ｍＣを５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）および／または５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換する工程と、
iii．  修飾標的ＤＮＡを含む修飾ＤＮＡ試料を提供するために、５ｃａＣおよび／または５ｆＣをＤＨＵに変換する工程と、を含む、修飾する工程、
ｃ．  修飾標的ＤＮＡの配列を検出する工程であって、修飾標的ＤＮＡの配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が比較した、検出する工程を含む。
【００６１】
標的ＤＮＡ中の５ｍＣを特定する方法の実施形態では、方法は、標的ＤＮＡ内で修飾が特定された各位置で５ｍＣの修飾の頻度の定量的尺度を提供する。実施形態では、各移行位置でのＴのパーセンテージは、標的ＤＮＡの各位置での５ｍＣの定量レベルを提供する。
【００６２】
５ｈｍＣを含まない標的ＤＮＡで５ｍＣを特定するために、５ｃａＣおよび／または５ｆＣへの変換を受けないように、試料中の５ｈｍＣがブロックされる。本発明の方法では、試料ＤＮＡ中の５ｈｍＣは、５ｈｍＣにブロッキング基を添加することによって後続する工程に対して非反応性にされる。一実施形態では、ブロッキング基は、修飾糖、例えば、グルコースまたは６−アジド−グルコース（６−アジド−６−デオキシ−Ｄ−グルコース）を含む糖である。一つ以上のグルコシルトランスフェラーゼ酵素の存在下で、ＤＮＡ試料をウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−糖と接触させることにより、糖ブロッキング基を５ｈｍＣのヒドロキシメチル基に加える。
【００６３】
実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼは、Ｔ４バクテリオファージβ−グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）、Ｔ４バクテリオファージα−グルコシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）、ならびにその誘導体および類似体である。βＧＴは、核酸中で、β‐Ｄ‐グルコシル（グルコース）残基が、ＵＤＰ−グルコースから５−ヒドロキシメチルシトシン残基へと移送される化学反応を触媒する酵素である。
【００６４】
ブロッキング基は、例えばグルコースであるということを記述することによって、これは、５ｈｍＣに加えられてグルコシル５−ヒドロキシメチルシトシンを得るグルコース部分（例えば、β−Ｄ−グルコシル残基）を指す。糖ブロッキング基は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の基質である任意の糖または修飾糖とすることができ、５ｈｍＣから５ｃａＣおよび／または５ｆＣへのその後の変換をブロックする。次に、ＤＮＡ試料中の５ｍＣを５ｃａＣおよび／または５ｆＣに変換する工程は、ＴＥＴ酵素を使用する酸化によるなどの本明細書に提供される方法によって達成される。そして５ｃａＣおよび／または５ｆＣをＤＨＵに変換することは、ボラン酸化によるなどの本明細書に提供される方法によって達成される。
【００６５】
５−メチルシトシン（５ｍＣ）を特定するための方法をＲＮＡ試料上で実施して、標的ＲＮＡの５ｍＣの位置を特定し、定量的尺度を提供することができる。
【００６６】
５ｍＣまたは５ｈｍＣを（一緒に）特定する方法
【００６７】
別の態様では、本発明は、標的ＤＮＡ中の５ｍＣ、または５ｈｍＣを特定するための方法を提供し、この方法は、
ａ．  標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を提供する工程、
ｂ．  ＤＮＡを修飾する工程であって、
ｉ．  ＤＮＡ試料中の５ｍＣおよび５ｈｍＣを５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）および／または５ｆＣに変換する工程と、
ii．  修飾標的ＤＮＡを含む修飾ＤＮＡ試料を提供するために、５ｃａＣおよび／または５ｆＣをＤＨＵに変換する工程と、を含む、修飾する工程、
ｃ．  修飾標的ＤＮＡの配列を検出する工程であって、標的ＤＮＡと比較した修飾標的ＤＮＡの配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的ＤＮＡ中の５ｍＣまたは５ｈｍＣのいずれかの位置を提供する、検出する工程を含む。
【００６８】
標的ＤＮＡ中の５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定する方法の実施形態では、方法は、標的ＤＮＡ内で修飾が特定された各位置で５ｍＣまたは５ｈｍＣの修飾の頻度の定量的尺度を提供する。実施形態では、各移行位置でのＴのパーセンテージは、標的ＤＮＡの各位置での５ｍＣまたは５ｈｍＣの定量レベルを提供する。
【００６９】
５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定するためのこの方法は、５ｍＣおよび５ｈｍＣの位置を提供するが、二つのシトシン修飾を区別しない。むしろ、５ｍＣと５ｈｍＣの両方がＤＨＵに変換される。ＤＨＵの存在を直接検出することができ、または修飾ＤＮＡを、ＤＨＵがＴに変換される既知の方法によって複製することができる。
【００７０】
５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定するための方法をＲＮＡ試料上で実施して、標的ＲＮＡの５ｍＣまたは５ｈｍＣの位置を特定し、定量的尺度を提供することができる。
【００７１】
５ｍＣを特定する、および５ｈｍＣを特定する方法
【００７２】
本発明は、本明細書に記載される第一のＤＮＡ試料について５ｍＣを特定する方法を実施することと、（ｉｉ）本明細書に記載される第二のＤＮＡ試料について５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定する方法を実施することによって、標的ＤＮＡ中の５ｍＣを特定し、および５ｈｍＣを特定する方法を提供する。５ｍＣの位置は、（ｉ）によって提供される。（ｉ）および（ｉｉ）の結果、ここにおいてＣのＴへの移行が（ｉｉ）では検出されるが（ｉ）では検出されない、を比較することによって、標的ＤＮＡ中の５ｈｍＣの位置を提供する。実施形態において、第一及び第二のＤＮＡ試料は、同じＤＮＡ試料に由来する。例えば、第一および第二の試料は、分析されるＤＮＡを含む試料から取られた別個のアリコートであってもよい。
【００７３】
ＤＨＵへの変換前に５ｍＣ、および５ｈｍＣ（ブロックされていない）が５ｆＣおよび５ｃａＣに変換されるため、ＤＮＡ試料中の任意の既存の５ｆＣおよび５ｃａＣは、５ｍＣおよび／または５ｈｍＣとして検出される。しかしながら、通常の条件下でゲノムＤＮＡ中の５ｆＣおよび５ｃａＣの極度の低レベルが考えられる場合、ＤＮＡ試料中のメチル化およびヒドロキシメチル化を分析する時にこれは多くの場合許容される。５ｆＣおよび５ｃａＣの信号は、例えば、それぞれヒドロキシルアミンコンジュゲーションおよびＥＤＣカップリングにより、５ｆＣおよび５ｃａＣをＤＨＵへの変換から保護することによって除去することができる。
【００７４】
上記の方法は、５ｍＣの位置およびパーセンテージを、５ｍＣまたは５ｈｍＣ（一緒に）の位置およびパーセンテージと比較することを通して、標的ＤＮＡの５ｈｍＣの位置およびパーセンテージを特定する。あるいは、標的ＤＮＡの５ｈｍＣの修飾の位置および頻度を直接測定することができる。従って、一態様では、本発明は、標的ＤＮＡ中の５ｈｍＣを特定するための方法を提供し、この方法は、
ａ．  標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を提供する工程、
ｂ．  ＤＮＡを修飾する工程であって、
ｉ．  ＤＮＡ試料中の５ｈｍＣを５ｆＣに変換する工程と、
ii．  修飾標的ＤＮＡを含む修飾ＤＮＡ試料を提供するために、５ｆＣをＤＨＵに変換する工程と、を含む、修飾する工程、
ｃ．  修飾標的ＤＮＡの配列を検出する工程であって、標的ＤＮＡと比較した修飾標的ＤＮＡの配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的ＤＮＡ中の５ｈｍＣの位置を提供する、検出する工程を含む。
【００７５】
実施形態では、５ｈｍＣを５ｆＣへと変換する工程は、例えば、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）（本明細書に参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２、３３、９３４−９３７及びＷＯ２０１３０１７８５３に記載されるように）、またはＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ（銅（ＩＩ）過塩素酸塩、および２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ））（本明細書に参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１７，５３，５７５６−５７５９及びＷＯ２０１７０３９００２に記載されるように）にＤＮＡを接触させることにより、５ｈｍＣを５ｆＣへと酸化することを含む。次いで、ＤＮＡ試料の５ｆＣを、例えばボラン反応によってなどの、本明細書に開示される方法によってＤＨＵに変換する。
【００７６】
５ｍＣを特定し、および５ｈｍＣを特定するための方法をＲＮＡ試料上で実施して、標的ＲＮＡの５ｍＣおよび５ｈｍＣの位置を特定し、定量的尺度を提供することができる。
【００７７】
５ｃａＣまたは５ｆＣを特定する方法
【００７８】
一態様では、本発明は、標的ＤＮＡ中の５ｃａＣまたは５ｆＣを特定するための方法を提供し、この方法は、
ａ．  標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を提供する工程、
ｂ．  修飾標的ＤＮＡを含む修飾ＤＮＡ試料を提供するために、５ｃａＣおよび／または５ｆＣをＤＨＵに変換する工程、
ｃ．  修飾標的ＤＮＡのコピー数を随意に増幅する工程、
ｄ．  修飾標的ＤＮＡの配列を検出する工程であって、標的ＤＮＡと比較した修飾標的ＤＮＡの配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的ＤＮＡ中の５ｃａＣまたは５ｆＣの位置を提供する、検出する工程を含む。
【００７９】
５ｆＣまたは５ｃａＣを特定するためのこの方法は、５ｆＣまたは５ｃａＣの位置を提供するが、これらの二つのシトシン修飾を区別しない。むしろ、５ｆＣおよび５ｃａＣの両方がＤＨＵに変換され、これは本明細書に記載の方法によって検出される。
【００８０】
５ｃａＣを特定する方法
【００８１】
別の態様では、本発明は、標的ＤＮＡ中の５ｃａＣを特定するための方法を提供し、この方法は、
ａ．  標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を提供する工程、
ｂ．  ＤＮＡ試料中の５ｆＣにブロッキング基を添加する工程、
ｃ．  修飾標的ＤＮＡを含む修飾ＤＮＡ試料を提供するために、５ｃａＣをＤＨＵに変換する工程、
ｄ．  修飾標的ＤＮＡのコピー数を随意に増幅する工程、
ｅ．  修飾標的ＤＮＡの配列を決定する工程であって、標的ＤＮＡと比較した修飾標的ＤＮＡの配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的ＤＮＡ中の５ｃａＣの位置を提供する、決定する工程を含む。
【００８２】
標的ＤＮＡ中の５ｃａＣを特定する方法の実施形態では、方法は、標的ＤＮＡ内で修飾が特定された各位置で５ｃａＣの修飾の頻度の定量的尺度を提供する。実施形態では、各移行位置でのＴのパーセンテージは、標的ＤＮＡの各位置での５ｃａＣの定量レベルを提供する。
【００８３】
この方法では、５ｆＣがブロックされ（そして５ｍＣおよび５ｈｍＣはＤＨＵに変換されない）、標的ＤＮＡ内の５ｃａＣの特定を可能にする。本発明の実施形態では、ＤＮＡ試料の５ｆＣにブロッキング基を添加することは、例えば、ヒドロキシルアミン誘導体、ヒドラジン誘導体、およびヒラジド（ｈｙｒａｚｉｄｅ）誘導体を含むアルデヒド反応性化合物とＤＮＡを接触させることを含む。ヒドロキシルアミン誘導体には、アスヒドロキシルアミン（ａｓｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ）、ヒドロキシルアミン塩酸塩、ヒドロキシルアンモニウム硫酸塩、ヒドロキシルアミンホスファート、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、Ｏ−ヘキシルヒドロキシルアミン、Ｏ−ペンチルヒドロキシルアミン、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミン、およびとりわけ、Ｏ−エチルヒドロキシルアミン（ＥｔＯＮＨ２）、Ｏ−アルキル化、またはＯ−アリール化ヒドロキシルアミン、酸またはその塩が含まれる。ヒドラジン誘導体としては、Ｎ−アルキルヒドラジン、Ｎ−アリールヒドラジン、Ｎ−ベンジルヒドラジン、Ν，Ν−ジアルキルヒドラジン、Ｎ，Ｎ−ジアリールヒドラジン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルヒドラジン、Ｎ，Ｎ−アルキルベンジルヒドラジン、Ｎ，Ｎ−アリールベンジルヒドラジン、およびΝ，Ν−アルキルアリールヒドラジンが挙げられる。ヒドラジド誘導体としては、−トルエンスルホニルヒドラジド、Ｎ−アシルヒドラジド、Ν，Ν−アルキルアシルヒドラジド、Ｎ，Ｎ−ベンジルアシルヒドラジド、Ｎ−Ｎ−アリールアシルヒドラジド、Ｎ−スルホニルヒドラジド、Ｎ，Ｎ−アルキルスルホニルヒドラジド、Ｎ，Ｎ−ベンジルスルホニルヒドラジド、及びＮ，Ｎ−アリールスルホニルヒドラジドが挙げられる。
【００８４】
５ｃａＣを特定するための方法をＲＮＡ試料上で実施して、標的ＲＮＡの５ｃａＣの位置を特定し、定量的尺度を提供することができる。
【００８５】
５ｆＣを特定する方法
【００８６】
別の態様では、本発明は、標的ＤＮＡ中の５ｆＣを特定するための方法を提供し、この方法は、
ａ．  標的ＤＮＡを含むＤＮＡ試料を提供する工程、
ｂ．  ＤＮＡ試料中の５ｃａＣにブロッキング基を添加する工程、
ｃ．  修飾標的ＤＮＡを含む修飾ＤＮＡ試料を提供するために、５ｆＣをＤＨＵに変換する工程、
ｄ．  修飾標的ＤＮＡのコピー数を随意に増幅する工程、
ｅ．  修飾標的ＤＮＡの配列を検出する工程であって、標的ＤＮＡと比較した修飾標的ＤＮＡの配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、標的ＤＮＡ中の５ｆＣの位置を提供する、検出する工程を含む。
【００８７】
標的ＤＮＡ中の５ｆＣを特定する方法の実施形態では、方法は、標的ＤＮＡ内で修飾が特定された各位置で５ｆＣの修飾の頻度の定量的尺度を提供する。実施形態では、各移行位置でのＴのパーセンテージは、標的ＤＮＡの各位置での５ｆＣの定量レベルを提供する。
【００８８】
ＤＮＡ試料の５ｃａＣにブロッキング基を添加することは、（ｉ）ＤＮＡ試料を、例えば、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、またはΝ，Ν’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などのカルボジイミド誘導体のようなカルボン酸誘導体化試薬のようなカップリング剤と接触させること、および（ｉｉ）ＤＮＡ試料を、アミン、ヒドラジン、またはヒドロキシルアミン化合物と接触させることによって達成することができる。したがって、例えば５ｃａＣは、ＤＮＡ試料をＥＤＣで、次にベンジルアミン、エチルアミンまたはその他のアミンで処理することにより、ブロックされ、例えばｐｉｃ−ＢＨ３によって、ＤＨＵへの変換から５ｃａＣをブロックするアミドを形成することができる。ＥＤＣ触媒された５ｃａＣカップリングの方法は、ＷＯ２０１４１６５７７０号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
５ｆＣを特定するための方法をＲＮＡ試料上で実施して、標的ＲＮＡの５ｆＣの位置を特定し、定量的尺度を提供することができる。
【００９０】
核酸試料／標的核酸
【００９１】
本発明は、標的核酸における、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−カルボキシルシトシンおよび／または５−ホルミルシトシンのうちの一つ以上の位置を、非修飾シトシンに影響を及ぼすことなく、塩基分解能で定量的に特定するための方法を提供する。実施形態では、標的核酸はＤＮＡである。他の実施形態では、標的核酸はＲＮＡである。同様に、標的核酸を含む核酸試料は、ＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料であってもよい。
【００９２】
標的核酸は、シトシン修飾（すなわち、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ、および／または５ｃａＣ）を有する任意の核酸であってもよい。標的核酸は、試料中の単一核酸分子とすることができ、または試料（またはそのサブセット）中の核酸分子の集団全体であってもよい。標的核酸は、供給源（例えば、細胞、組織試料など）由来の天然核酸であってもよく、または例えば、配列決定のためのアダプターを用いた断片化、修復およびライゲーションによって、高処理量配列決定準備フォームに予め変換されてもよい。したがって、標的核酸は、個別において（例えば、個別標的の配列を決定することにより）、または群において（例えば、高処理量または次世代配列決定方法により）分析できる標的核酸配列のライブラリを生成するために本明細書に記載される方法を使用することができるように、複数の核酸配列を含むことができる。
【００９３】
核酸試料は、モネラ（細菌）、原生生物、真菌類、植物界、および動物界からの生物体から得ることができる。核酸試料は、患者または対象から、環境試料から、または対象の生物体から取得されうる。実施形態において、核酸試料は、細胞または細胞の集合、体液、組織試料、器官および細胞小器官から抽出されるか、または由来する。
【００９４】
ＲＮＡ試料／標的ＲＮＡ
【００９５】
本発明は、標的ＲＮＡにおける、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−カルボキシルシトシンおよび／または５−ホルミルシトシンのうちの一つ以上の位置を、非修飾シトシンに影響を及ぼすことなく、塩基分解能で定量的に特定するための方法を提供する。実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（移転ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）およびｅＲＮＡ（エンハンサーＲＮＡ）のうち一つ以上である。標的ＲＮＡは、試料中の単一ＲＮＡ分子とすることができ、または試料（またはそのサブセット）中のＲＮＡ分子の集団全体であってもよい。したがって、標的ＲＮＡは、個別において（例えば、個別標的の配列を決定することにより）、または群において（例えば、高処理量または次世代配列決定方法により）分析できる標的ＲＮＡ配列のライブラリを生成するために本明細書に記載される方法を使用することができるように、複数のＲＮＡ配列を含むことができる。
【００９６】
ＤＮＡ試料／標的ＤＮＡ
【００９７】
本発明の方法は、亜硫酸水素塩配列決定などの方法に関連する実質的な分解を回避する軽度の酵素反応および化学反応を利用する。したがって、本発明の方法は、循環細胞遊離ＤＮＡなどの低入力試料の分析、および単一細胞分析に有用である。
【００９８】
本発明の実施形態では、ＤＮＡ試料はＤＮＡのピコグラム量を含む。本発明の実施形態では、ＤＮＡ試料は、約１ｐｇ〜約９００ｐｇ  ＤＮＡ、約１ｐｇ〜約５００ｐｇ  ＤＮＡ、約１ｐｇ〜約１００ｐｇ  ＤＮＡ、約１ｐｇ〜約５０ｐｇ  ＤＮＡ、約１〜約１０ｐｇ  ＤＮＡ、約２００ｐｇ未満、約１００ｐｇ未満ＤＮＡ、約５０ｐｇ未満  ＤＮＡ、約２０ｐｇ未満ＤＮＡ、および約５ｐｇ未満ＤＮＡを含む。本発明の他の実施形態では、ＤＮＡ試料はＤＮＡのナノグラム量を含む。本発明の方法で使用するための試料ＤＮＡは、単一細胞またはバルクＤＮＡ試料からのＤＮＡを含む任意の量でありうる。実施形態において、本発明の方法は、約１〜約５００ｎｇのＤＮＡ、約１〜約２００ｎｇのＤＮＡ、約１〜約１００ｎｇのＤＮＡ、約１〜約５０ｎｇのＤＮＡ、約１〜約１０ｎｇのＤＮＡ、約２〜約５ｎｇのＤＮＡ、約１００ｎｇ未満のＤＮＡ、約５０ｎｇ未満のＤＮＡ約５ｎｇ未満、および約２ｎｇ未満のＤＮＡを含む、ＤＮＡ試料で行うことができる。本発明の実施形態では、ＤＮＡ試料はＤＮＡのマイクログラム量を含む。
【００９９】
本明細書に記載される方法で使用されるＤＮＡ試料は、例えば、体液、組織試料、器官、細胞小器官、または単一細胞を含む任意の供給源からとなりうる。実施形態において、ＤＮＡ試料は循環細胞遊離ＤＮＡ（細胞遊離ＤＮＡまたはｃｆＤＮＡ）であり、これは血液中に存在し、細胞内に存在しないＤＮＡである。ｃｆＤＮＡは、当技術分野で公知の方法を使用して血液または血漿から分離されうる。市販キットは、例えば、循環核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ）を含み、ｃｆＤＮＡの単離に利用できる。ＤＮＡ試料は、抗体免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法、制限酵素消化ベースの濃縮、ハイブリダイゼーションベースの濃縮、または化学的ラベリングベースの濃縮を含むがこれらに限定されない濃縮工程から生じ得る。
【０１００】
標的ＤＮＡは、これに限定されないが、組織、器官、細胞、および細胞小器官から精製されたＤＮＡ断片またはゲノムＤＮＡを含むシトシン修飾（すなわち、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ、および／または５ｃａＣ）を有する任意のＤＮＡであってもよい。標的ＤＮＡは、試料中の単一ＤＮＡ分子とすることができ、または試料（またはそのサブセット）中のＤＮＡ分子の集団全体であってもよい。標的ＤＮＡは、供給源由来の天然ＤＮＡであってもよく、または例えば、配列決定のためのアダプターを用いた断片化、修復およびライゲーションによって、高処理量配列決定準備フォームに予め変換されてもよい。したがって、標的ＤＮＡは、個別において（例えば、個別標的の配列を決定することにより）、または群において（例えば、高処理量または次世代配列決定方法により）分析できる標的ＤＮＡ配列のライブラリを生成するために本明細書に記載される方法を使用することができるように、複数のＤＮＡ配列を含むことができる。
【０１０１】
５ｍＣおよび５ｈｍＣの、５ｃａＣおよび／または５ｆＣへの変換
【０１０２】
本明細書に記載されるＴＡＰＳ方法などの本発明の実施形態には、５ｍＣと５ｈｍＣとを（または５ｈｍＣがブロックされている場合は５ｍＣのみ）、５ｃａＣおよび／または５ｆＣに変換する工程が含まれる。本発明の実施形態では、この工程は、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料をテンイレブントランスロケーション（ＴＥＴ）酵素と接触させることを含む。ＴＥＴ酵素は、５ｍＣ上の酸素分子のＮ５メチル基への移送を触媒する酵素のファミリーであり、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）の形成をもたらす。ＴＥＴはさらに５ｈｍＣの５ｆＣへの酸化、および５ｆＣの酸化を触媒して５ｃａＣを形成する（図５Ａを参照）。ＴＥＴ酵素は、ヒトＴＥＴ１、ＴＥＴ２、およびＴＥＴ３；マウスＴｅｔ１、Ｔｅｔ２、およびＴｅｔ３；ネグレリアＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）；ウシグソヒトヨタケ（ＣｃＴＥＴ）、ならびにその誘導体または類似体のうちの一つ以上を含む本発明の方法において有用である。実施形態において、ＴＥＴ酵素はＮｇＴＥＴである。他の実施形態では、ＴＥＴ酵素はヒトＴＥＴ１（ｈＴＥＴ１）である。
【０１０３】
５ｃａＣおよび／または５ｆＣの、ＤＨＵへの変換
【０１０４】
本発明の方法には、核酸試料中の５ｃａＣおよび／または５ｆＣをＤＨＵに変換する工程が含まれる。本発明の実施形態では、この工程は、例えば、ピリジンボラン、２−ピコリンボラン（ｐｉｃ−ＢＨ３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリドなどのボラン還元剤を含む還元剤にＤＮＡまたはＲＮＡ試料を接触させることを含む。好ましい実施形態では、還元剤はピリジンボランおよび／またはｐｉｃ−ＢＨ３である。
【０１０５】
修飾標的核酸のコピー数を増幅する
【０１０６】
本発明の方法は、当技術分野で公知の方法によって、修飾標的核酸のコピー数を増幅する（増加する）工程を随意に含み得る。修飾標的核酸がＤＮＡである場合、コピー数は、例えば、ＰＣＲ、クローニング、及びプライマー伸長によって増加することができる。個々の標的ＤＮＡのコピー数は、特定の標的ＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅することができる。あるいは、標準的な技術によるＤＮＡベクターへのクローニングによって、複数の異なる修飾標的ＤＮＡ配列を増幅することができる。本発明の実施形態では、複数の異なる修飾標的ＤＮＡ配列のコピー数は、例えば、二本鎖アダプターＤＮＡが試料ＤＮＡ（または修飾試料ＤＮＡ）に過去にライゲーションされており、アダプターＤＮＡに対して相補的なプライマーを使用してＰＣＲが実施されるような、次世代配列決定のためのライブラリを生成するため、ＰＣＲによって増加される。
【０１０７】
修飾標的核酸の配列の検出
【０１０８】
本発明の実施形態では、方法は修飾標的核酸の配列を検出する工程を含む。修飾標的ＤＮＡまたはＲＮＡは、５ｍＣ、５ｈｍＣ、５ｆＣ、および５ｃａＣのうちの一つ以上が非修飾標的ＤＮＡまたはＲＮＡに存在した位置にＤＨＵを含有する。ＤＨＵは、ＤＮＡ複製および配列決定方法におけるＴとしての役目を果たす。したがって、シトシン修飾は、当技術分野で既知のＣのＴへの移行を特定する任意の直接的または間接的な方法によって検出されうる。このような方法には、サンガー配列決定、マイクロアレイおよび次世代配列決定方法などの配列決定方法が含まれる。ＣのＴへの移行はまた、制限酵素分析によって検出することもでき、ここでＣのＴへの移行が制限エンドヌクレアーゼ認識配列を無効にするか、または導入する。
【０１０９】
キット
【０１１０】
本発明はさらに、標的ＤＮＡ中の５ｍＣおよび５ｈｍＣの特定用キットを提供する。このようなキットは、本明細書に記載される方法による５ｍＣおよび５ｈｍＣの特定用の試薬を含む。キットはまた、本明細書に記載の方法による、５ｃａＣの特定のためのおよび５ｆＣの特定のための試薬を含有してもよい。実施形態において、キットは、ＴＥＴ酵素、ボラン還元剤および方法を実施するための指示を含む。さらなる実施形態では、ＴＥＴ酵素はＴＥＴ１であり、ボラン還元剤は、ピリジンボラン、２−ピコリンボラン（ｐｉｃ−ＢＨ３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリドからなる群のうちの一つ以上から選択される。さらなる実施形態では、ＴＥＴ１酵素はＮｇＴｅｔ１またはマウスＴｅｔ１であり、ボラン還元剤はピリジンボランおよび／またはｐｉｃ−ＢＨ３である。
【０１１１】
実施形態において、キットは、５ｈｍＣのブロッキング基およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素をさらに含む。さらなる実施形態では、５ｈｍＣのブロッキング基は、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−糖であり、ここでこの糖はグルコースまたはグルコース誘導体であり、またグルコシルトランスフェラーゼ酵素はＴ４バクテリオファージβ−グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）、Ｔ４バクテリオファージα−グルコシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）、ならびにその誘導体および類似体である。
【０１１２】
実施形態では、キットは、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）および／またはＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ（銅（ＩＩ）過塩素酸塩、および２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ））から選択される酸化剤をさらに含む。
【０１１３】
実施形態において、キットは、核酸試料中の５ｆＣをブロックするための試薬を含む。実施形態では、キットは、本明細書に記載されるように、例えば、ヒドロキシルアミン誘導体、ヒドラジン誘導体、およびヒラジド（ｈｙｒａｚｉｄｅ）誘導体を含むアルデヒド反応性化合物を含む。実施形態において、キットは、本明細書に記載されるような５ｃａＣをブロックするための試薬を含む。
【０１１４】
実施形態において、キットは、ＤＮＡまたはＲＮＡを単離するための試薬を含む。実施形態では、キットは、例えば、血液、血漿、または血清からのｃｆＤＮＡなどの試料から低入力ＤＮＡを単離するための試薬を含む。
【実施例】
【０１１５】
方法
【０１１６】
モデルＤＮＡの調製。
【０１１７】
ＭＡＬＤＩおよびＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ試験用のＤＮＡオリゴ。Ｃ、５ｍＣおよび５ｈｍＣを有するＤＮＡオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＩＤＴ）から購入した。すべての配列および修飾が図６および７に見出され得た。５ｆＣを有するＤＮＡオリゴをＣテーリング方法により合成した：ＤＮＡオリゴ５’−ＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴＣ−３’、および５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＴ−３’をアニールし、次にＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２中で、５−ホルミル−２’−ｄＣＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびクレノウフラグメント３’→５’エキソ−（ニューイングランドバイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））と、２時間３７℃でインキュベートした。生成物をバイオスピンＰ−６ゲルカラム（Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  Ｐ−６  Ｇｅｌ  Ｃｏｌｕｍｎ）（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））で精製した。
【０１１８】
５ｃａＣを有するＤＮＡオリゴを、標準的なホスホラミダイト（シグマ（Ｓｉｇｍａ））５−カルボキシ−ｄＣ−ＣＥホスホラミダイト（グレンリサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を用いたＥｘｐｅｄｉｔｅ  ８９００核酸合成システムを使用して合成した。その後の脱保護および精製は、製造業者の指示に従ってＧｌｅｎ−Ｐａｋカートリッジ（グレンリサーチ）で実施された。精製オリゴヌクレオチドは、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間）Ｂｉｏｓｃｒｉｐｔｍｅｔｒｙワークステーションにより特徴付けられた。
【０１１９】
変換試験用の２２２ｂｐモデルＤＮＡ。五つのＣｐＧ部位を含む２２２ｂｐモデルＤＮＡを生成するために、バクテリオファージラムダＤＮＡ（サーモフィッシャー）は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブス）を使用してＰＣＲ増幅され、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））によって精製された。プライマー配列は以下の通りである：ＦＷ−５’−ＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＧＣＡＴＧＴＣ−３’、ＲＶ−５’−ＣＡＵＴＡＣＴＣＡＣＵＴＣＣＣＣＡＣＵＴ−３’。ＰＣＲ生成物の逆鎖におけるウラシル塩基を、ＵＳＥＲ酵素（ニューイングランドバイオラブス）により除去した。精製されたＰＣＲ生成物１００ｎｇを次に、１ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２、０．６４ｍＭ  Ｓ−アデノシルメチオニンおよび２０  Ｕ  Ｍ．ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（ニューイングランドバイオラブス）を含有する２０μｌ溶液中で、２時間３７℃でメチル化し、次に２０分間６５℃で、熱失活した。メチル化された２２２ｂｐモデルＤＮＡを、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズによって精製した。
【０１２０】
サンガー配列決定を用いたＴＡＰＳ、ＴＡＰＳβ、およびＣＡＰＳの検証のためのモデルＤＮＡ。単一の５ｍＣおよび単一の５ｈｍＣ部位を含有する３４ｂｐのＤＮＡオリゴを、５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、および５０ｍＭのＮａＣｌを含むアニーリング緩衝液中でその他のＤＮＡオリゴでアニールし、次いで４００ＵのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ）を含む反応において、２５℃で１時間ライゲーションし、１．８Ｘ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズで精製した。
【表２】
2021509587.tif 000004
【０１２１】
ライゲーションの反応後にウラシルリンカーをＵＳＥＲ酵素により除去し、最終生成物配列（５’〜３’）を得た：
【化１】
2021509587.tif 000005
モデルＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマーは以下の通りであった：Ｐ５：５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧ−３’およびＰ７：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ−３’。
【０１２２】
ポリメラーゼ試験およびサンガー配列決定のためのモデルＤＮＡ。ポリメラーゼ試験およびサンガー配列決定のモデルＤＮＡを、異なるＤＮＡオリゴを使用したことを除き、上記と同一のライゲーション方法で調製した：
【表３】
2021509587.tif 000006
【０１２３】
最終生成物配列（５’〜３’）は以下のとおりであった：
【化２】
2021509587.tif 000007
モデルＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマーは、上記のＰ５プライマー及びＰ７プライマーである。プライマー伸長のためのビオチン標識プライマー配列は、Ｐ７プライマーの５’末端にビオチン連結されている。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ転写後のＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲプライマーは、Ｐ５プライマーとＲＴ：５’−ＴＧＣＴＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＡＧ−３’であった。
【０１２４】
ＰＣＲバイアス試験のモデルＤＮＡ。ＰＣＲバイアス試験のモデルＤＮＡを、異なるＤＮＡオリゴを使用したことを除き、上記と同一のライゲーション方法で調製した：
【表４】
2021509587.tif 000008
【０１２５】
最終生成物配列（５’〜３’）：
【化３】
2021509587.tif 000009
モデルＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマーは、上記のＰ５およびＰ７プライマーである。
【０１２６】
メチル化バクテリオファージラムダゲノムＤＮＡの調製
【０１２７】
１μｇの非メチル化バクテリオファージラムダＤＮＡ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を、Ｍｇ２＋非含有緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、０．６４ｍＭのＳＡＭ、及び０．８Ｕ／μｌのＭ．ＳｓｓＩ酵素を含有する５０μＬ反応で、３７℃で２時間メチル化した。次いで０．５μＬのＭ．ＳｓｓＩ酵素および１μｌのＳＡＭを加え、その反応を、さらに２時間３７℃でインキュベートした。その後メチル化ＤＮＡを１倍のＡｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズで精製した。完全なメチル化を確保するために、全手順をＮＥＢ緩衝液２で繰り返した。次いで、ＤＮＡメチル化をＨｐａＩＩ消化アッセイで検証した。５０ｎｇのメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを、カットスマート緩衝液（ＣｕｔＳｍａｒｔ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＮＥＢ）中、２ＵのＨｐａＩＩ酵素（ＮＥＢ）で１０μＬ反応において、１時間３７℃で消化した。消化生成物は、消化されていないラムダＤＮＡ対照と共に１％アガロースゲル上で実行した。非メチル化ラムダＤＮＡはアッセイ後に消化された、一方で、メチル化ラムダＤＮＡはインタクトのままであり、成功裡にＣｐＧメチル化を完了したことを確認した。ラムダＤＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋに見出すことができる−ＥＭＢＬ受託番号：Ｊ０２４５９。
【０１２８】
２ｋｂ非修飾スパイクイン対照の調製
【０１２９】
２ｋｂのスパイクイン対照（２ｋｂ−１、２、３）を、１ｎｇのＤＮＡ鋳型、０．５μＭのプライマー、１  Ｕのフュージョン  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（サーモフィッシャー）を含有する反応において、ｐＮＩＣ２８−Ｂｓａ４プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号２６１０３）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲプライマー配列を表２に列挙する。
表２。スパイクイン用のＰＣＲプライマーの配列。
【表５】
2021509587.tif 000010
【０１３０】
ＰＣＲ生成物をＺｙｍｏ−Ｓｐｉｎカラムで精製した。２ｋｂの非修飾対照配列（５’〜３’）：ＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＧＴＴＧＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＡＡＧＣＧＴＴＡＡＴＧＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＧＣＣＡＴＧＴＴＡＡＧＧＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＡＡＧＧＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＧＡＡＡＣＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＴＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴＧＣＣＣＧＧＴＴＡＣＴＧＧＡＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＣＧＧＣＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＴＴＡＡＴＡＣＡＧＡＴＧＴＡＧＧＴＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＧＣＴＧＡＣＴＴＣＣＧＣＧＴＴＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣＧＡＡＡＣＡＣＧＧＡＡＡＣＣＧＡＡＧＡＣＣＡＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧＣＡＧＡＣＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＣＧＣＴＴＣＡＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧＣＧＴＡＴＣＧＧＴＧＡＴＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＧＴＡＡＧＧＣＡＡＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＣＣＧＧＧＴＣＣＴＣＡＡＣＧＡＣＡＧＧＡＧＣＡＣＧＡＴＣＡＴＧＣＧＣＡＣＣＣＧＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＧＣＣＧＡＡＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＣＧＧＧＡＣＣＡＧＴＧＡＣＧＡＡＧＧＣＴＴＧＡＧＣＧＡＧＧＧＣＧＴＧＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＧＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＣＧＣＴＣＣＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＧＴＣＣＴＣＧＣＣＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣＴＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＡＣＧＡＧＴＴＧＣＡＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＡＴＡＧＴＣＡＴＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＡＣＣＧＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＧＧＴＴＧＡＡＧＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＴＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＴＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＴＣＣＡＣＧＣＴＧＧＴＴＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＡＣＧＧＣＧＧＧＡＴＡＴＡＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＴＣＧＧＴＡＴＣＧＴＣＧＴＡＴＣＣＣＡＣＴＡＣＣＧＡＧＡＴＡＴＣＣＧＣＡＣＣＡＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＣＴＣＧＧＴＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＡＴＴＧＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＧＡＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＣＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡＴＧＧＣＡＣＴＣＣＡＧＴＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＣＧＣＴＡＴＣＧＧＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＴＧＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧＧＣＣＣＧＣＴＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＡＴＧＣＧＡＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＧＴＡＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＴＧＴＣＴＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＡＴＡＡＣＧＣＣＧＧＡＡＣＡＴＴＡＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＧＣＧＴＴＧＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＡＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＴＴＣＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＡＧＡＴＴＴＡＡＴＣＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＴＧＣＧＡＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＴＴＧＴＴＧＴＧＣＣＡＣＧＣＧＧＴＴＧＧＧＡＡＴＧＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＡＧＡＡＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＧＧＧＡＡＡＣＧＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＡＣＴＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＡＴＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＣＣＴ
【０１３１】
１２０ｍｅｒスパイクイン対照の調製
【０１３２】
１２０ｍｅｒのスパイクイン対照をプライマー伸長によって生成した。オリゴ配列およびプライマーを表３に列挙する。
表３。１２０ｍｅｒ対照スパイクインの調製に使用されるＤＮＡオリゴおよびプライマーの配列。
【表６】
2021509587.tif 000011
簡潔に述べると、１２０ｍｅｒ−１スパイクインについて、５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌを含有したアニール緩衝液中、１０μＭのプライマーで３μＭのオリゴをアニールした。１２０ｍｅｒ−２スパイクインについては、５μＭのオリゴを７．５μＭのプライマーでアニールした。プライマー伸長は、０．４μＭのｄＮＴＰｓ（１２０ｍｅｒ−１：ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄｈｍＣＴＰ、１２０ｍｅｒ−２：ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ）および５Ｕのクレノウポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブス）を用いて、ＮＥＢ緩衝液２において、１時間３７℃で実施された。反応後、スパイクイン対照は、Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎカラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上で精製された。次いで１２０ｍｅｒスパイクイン対照が、ＮＥＢ緩衝液２中、０．６４ｍＭのＳＡＭおよび０．８Ｕ／μｌのＭ．ＳｓｓＩ酵素を含有する５０μＬ反応において、３７℃で２時間メチル化され、およびＺｙｍｏ−Ｓｐｉｎカラムで精製された。使用されるすべてのスパイクイン配列は、ｈｔｔｐｓ：／／ｆｉｇｓｈａｒｅ．ｃｏｍ／ｓ／８０ｃ３ａｂ７１３ｃ２６１２６２４９４ｂからダウンロードされ得る。
【０１３３】
Ｎ５ｍＣＮＮおよびＮ５ｈｍＣＮＮでの合成スパイクインの生成
【０１３４】
Ｎ５ｍＣＮＮおよびＮ５ｈｍＣＮＮ配列を用いた合成オリゴは、アニーリングおよび伸長方法によって生成された。オリゴ配列を以下の表４に示す。
表４。
【表７】
2021509587.tif 000012
【０１３５】
簡潔に述べると、１０μＭのＮ５ｍＣＮＮおよびＮ５ｈｍＣＮＮオリゴ（ＩＤＴ）は、５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、および５０ｍＭのＮａＣｌを含有するアニール緩衝液中で一緒にアニールされた。伸長は、０．４ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ）および５Ｕのクレノウポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて、ＮＥＢ緩衝液２において、１時間３７℃で実施された。反応後、スパイクイン対照は、Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎカラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上で精製された。Ｎ５ｍＣＮＮおよびＮ５ｈｍＣＮＮを用いた合成スパイクイン（５’〜３’）：ＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＡＣＧＣＴＧＧＣＡＴＮｍＣＮＮＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＣＴＡＧＴＧＡＧＡＡＴＧＡＡＧＧＧＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＡＡＧＡＴＧＧＴＣＮＮＧＮＡＴＣＴＴＧＧＧＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＴＧＧＣＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＧＡＧＴＴＧＧ。相補鎖（５’〜３’）：ＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＡＣＣＣＡＡＧＡＴＮｈｍＣＮＮＧＡＣＣＡＴＣＴＴＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＣＴＡＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＮＮＧＮＡＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣ。
【０１３６】
ＤＮＡ消化およびＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
【０１３７】
ＤＮＡ試料は、２ＵのヌクレアーゼＰ１（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））と１０ｎＭのデアミナーゼ阻害剤エリスロ−９−アミノ−β−ヘキシル−α−メチル−９Ｈ−プリン−９−エタノール塩酸塩（シグマアルドリッチ）で消化された。３７℃で一晩インキュベートした後、試料を、６Ｕのアルカリホスファターゼ（シグマアルドリッチ）と、０．５ＵのホスホジエステラーゼＩ（シグマアルドリッチ）とで３７℃で３時間にわたってさらに処理した。消化したＤＮＡ溶液は、タンパク質を除去するためにアミコンウルトラ−０．５ｍＬ  １０Ｋ遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０  Ｋ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ）（メルクミリポア（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で濾過され、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を受けた。
【０１３８】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、６４９５Ｂ三連四重極型質量分析計（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ））と結合した１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（アジレント）を用いて実施された。ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、１．８−ミクロン、アジレント）を使用した。カラム温度は４０℃で維持され、溶媒系は１０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．０、溶媒Ａ）および水−アセトニトリル（６０／４０、ｖ／ｖ、溶媒Ｂ）を０．４ｍＬ／分の流量で含有する水であった。勾配は、０〜５分；０溶媒Ｂ；５〜８分；０〜５．６３％溶媒Ｂ；８〜９分；５．６３％溶媒Ｂ；９〜１６分；５．６３〜１３．６６％溶媒Ｂ；１６〜１７分；１３．６６〜１００％溶媒Ｂ；１７〜２１分；１００％溶媒Ｂ；２１〜２４．３分；１００〜０％溶媒Ｂ；２４．３〜２５分；０％溶媒Ｂであった。ＭＳの動的複数反応モニタリングモード（ｄｙｎａｍｉｃ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｍｏｄｅ）（ｄＭＲＭ）が定量化に使用された。供給源依存性パラメータは、以下の通りであった：ガス温度２３０℃、ガス流１４Ｌ／分、ネブライザー４０ｐｓｉ、シースガス温度４００℃、シースガス流１１Ｌ／分、陽イオンモードにおいてキャピラリー電圧１５００Ｖ、ノズル電圧０Ｖ、陽イオンモードにおいて高圧ＲＦ  １１０Ｖおよび陽イオンモードにおいて低圧ＲＦ  ８０Ｖ。全ての化合物についてフラグメンター電圧は３８０Ｖであり、その他の化合物依存性パラメータは表５に要約されている。
表５。ヌクレオシド定量化に使用される化合物依存性ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳパラメータ。ＲＴ：保持時間、ＣＥ：衝突エネルギー、ＣＡＥ：細胞促進電圧（ｃｅｌｌ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ  ｖｏｌｔａｇｅ）。すべてのヌクレオシドが陽性モードで分析された。
【表８】
2021509587.tif 000013
【０１３９】
ＮｇＴＥＴ１の発現及び精製
【０１４０】
Ｈｉｓタグ付きＮｇＴＥＴ１タンパク質（ＧＧ７３９５５２．１）をコードするｐＲＳＥＴ−Ａプラスミドは、インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から設計され、購入された。タンパク質は、一部の修飾と共に前述したように、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌に発現され、および精製された（Ｊ．Ｅ．Ｐａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ＴＥＴ−ｌｉｋｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１２，４３１６−４３２１（２０１５）、参照により本明細書に組み込まれる）。簡潔に述べると、タンパク質発現については、一晩小規模培養物からの細菌をＬＢ培地中で３７℃および２００ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．７〜０．８であるまで増殖させた。その後、培養物を室温まで冷却し、標的タンパク質発現を０．２ｍＭのイソプロピル−β−ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発した。細胞はさらに１８時間、１８℃および１８０ｒｐｍで維持された。その後、細胞を採取し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのイミダゾール、１μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのペプスタチンＡおよび１ｍＭのＰＭＳＦを含有する緩衝液中で再懸濁した。細胞をＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５高圧ホモジナイザーで破壊し、溶解物を３０，０００  ｘ  ｇおよび４℃で１時間遠心分離することにより清澄した。収集した上清をＮｉ−ＮＴＡ樹脂に装填し、およびＮｇＴＥＴ１タンパク質を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのイミダゾール、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液で溶出した。次いで、収集した画分をＨｉｌｏａｄ  １６／６０  Ｓｄｘ  ７５（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）で精製した。次いで、ＮｇＴＥＴ１を含む画分を収集し、緩衝液を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液に交換し、ＨｉＴｒａｐ  ＨＰ  ＳＰカラムに装填した。純粋なタンパク質を塩勾配で溶出し、収集し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＤＴＴを含有する最終緩衝液に緩衝液交換した。次いで、タンパク質を最大１３０μＭまで濃縮し、グリセロール（３０％  ｖ／ｖ）と混合し、アリコートを−８０℃で保存した。
【０１４１】
ｍＴＥＴ１ＣＤの発現および精製
【０１４２】
Ｎ末端フラグタグを有する、ｍＴＥＴ１ＣＤ触媒ドメイン（ＮＭ＿００１２５３８５７．２、４３７１−６３９２）は、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨ１制限部位の間のｐｃＤＮＡ３−フラグにクローニングした。タンパク質発現のために、１ｍｇプラスミドを、１×１０６細胞／ｍＬの密度でＥｘｐｉ２９３Ｆ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））細胞培養物の１Ｌへとトランスフェクトし、および細胞を３７℃、１７０ｒｐｍおよび５％のＣＯ２で４８時間増殖させた。続いて、細胞を遠心分離によって採取し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ＝７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１Ｘ完全（ｃＯｍｐｌｅｔｅ）プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する溶解緩衝液中で再懸濁し、２０分間氷上でインキュベートした。細胞溶解物を次に３００００  ×ｇおよび４℃で、３０分間遠心分離によって清澄した。収集された上清は、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティゲル（シグマ）で精製し、純粋なタンパク質は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ３Ｘフラグペプチド（シグマ）、１Ｘ完全（ｃＯｍｐｌｅｔｅ）プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ）、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する緩衝液で溶出した。収集した画分を濃縮し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＤＴＴを含む最終緩衝液に緩衝液交換した。濃縮されたタンパク質をグリセロール（３０％  ｖ／ｖ）と混合し、液体窒素中で凍結させ、アリコートを−８０℃で保存した。組み換え型ｍＴＥＴ１ＣＤの活性および品質をＭＡＬＤＩ質量分光分析によりチェックした。このアッセイに基づき、組換え型ｍＴＥＴ１ＣＤは完全に活性であり、５ｍＣの５ｃａＣへの酸化を触媒することができる。タンパク質がヌクレアーゼを含まないことを確認するＭＡＬＤＩによって、試験されたモデルオリゴの任意の有意な消化が検出された。
【０１４３】
ＴＥＴ酸化
【０１４４】
ＮｇＴＥＴ１酸化。２２２ｂｐモデルＤＮＡオリゴのＴｅｔ酸化については、１００ｎｇの２２２ｂｐ  ＤＮＡを、５０ｍＭ  ＭＯＰ緩衝液（ｐＨ６．９）、１００ｍＭアンモニウム鉄（ＩＩ）硫酸、１ｍＭ  ａ−ケトグルタル酸、２ｍＭアスコルビン酸、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および５μＭ  ＮｇＴＥＴを含有する２０μｌ溶液中で、３７℃で１時間インキュベートした。その後、０．４  ＵのプロテイナーゼＫ（ニューイングランドバイオラブス）を反応混合物に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。生成物は、製造業者の指示に従ってＺｙｍｏ−Ｓｐｉｎカラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により精製された。
【０１４５】
ゲノムＤＮＡのＮｇＴＥＴ１酸化については、５００ｎｇのゲノムＤＮＡを、５０ｍＭ  ＭＯＰ緩衝液（ｐＨ６．９）、１００ｍＭアンモニウム鉄（ＩＩ）硫酸、１ｍＭ  ａ−ケトグルタル酸、２ｍＭアスコルビン酸、１ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および５μＭ  ＮｇＴＥＴ１を含有する５０μｌ溶液中で、３７℃で１時間インキュベートした。その後、４ＵのプロテイナーゼＫ（ニューイングランドバイオラブス）を反応混合物に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。生成物は、製造業者の指示に従って１．８Ｘ  Ａｍｐｕｒｅビーズ上で洗浄された。
【０１４６】
ｍＴＥＴ１酸化。１００ｎｇのゲノムＤＮＡは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００μＭアンモニウム鉄（ＩＩ）硫酸、１ｍＭ  ａ−ケトグルタル酸、２ｍＭアスコルビン酸、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、および４μＭ  ｍＴＥＴ１ＣＤを含有する５０μｌ反応において、３７℃で８０分間インキュベートした。その後、０．８ＵのプロテイナーゼＫ（ニューイングランドバイオラブス）を反応混合物に加え、５０℃で１時間インキュベートした。生成物は、製造業者の指示に従って、バイオスピンＰ−３０ゲルカラム（バイオラド）、および１．８Ｘ  Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ上で洗浄された。
【０１４７】
ボラン還元
【０１４８】
Ｐｉｃ−ＢＨ３還元。ＭｅＯＨおよび５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２、サーモフィッシャー）中の、２５μＬの５Ｍ  α−ピコリン−ボラン（ｐｉｃ−ＢＨ３、シグマアルドリッチ）を、２０μＬのＤＮＡ試料に加え、６０ｏＣで１時間インキュベートした。生成物は、２２２ｂｐの製造業者の指示に従って、Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎカラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって、またはオリゴの製造業者の指示に従って、マイクロバイオスピン（Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ）６カラム（バイオラド）によって精製された。
【０１４９】
あるいは、１００ｍｇの２−ピコリン−ボラン（ピコボラン、シグマアルドリッチ）を１８７μＬのＤＭＳＯ中に溶解して、およそ３．２６Ｍの溶液を得た。各反応について、２５μＬのピコボラン溶液と５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２、サーモフィッシャー）を２０μＬのＤＮＡ試料に加え、７０℃で３時間インキュベートした。生成物は、製造業者の指示に従って、ゲノムＤＮＡのためのＺｙｍｏ−Ｓｐｉｎカラムによって、または、ＤＮＡオリゴのためのマイクロバイオスピン６カラム（バイオラド）によって精製した。
【０１５０】
ピリジンボラン還元。３５μＬの水中の５０〜１００ｎｇの酸化ＤＮＡを、６００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ＝４．３）と、１Ｍピリジンボランとを含有する５０μＬ反応において、３７℃および８５０ｒｐｍのエッペンドルフサーモミキサーで１６時間、還元した。生成物をＺｙｍｏ−Ｓｐｉｎカラムによって精製した。
【０１５１】
単一ヌクレオシドピコボラン反応。ＭｅＯＨおよび５００μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２、サーモフィッシャー）中、５００μＬの３．２６Ｍ  ２−ピコリン−ボラン（ピコボラン、シグマアルドリッチ）を１０ｍｇの２’−デオキシシチジン−５−カルボン酸ナトリウム塩（ベリー・アンド・アソシエイツ（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ））に加えた。混合物を６０℃で１時間攪拌した。生成物をＨＰＬＣによって精製して、白色発泡体として純粋な化合物を得た。Ｃ９Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｎａに対して計算された高分解能ＭＳ（Ｑ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋：２５３．０８００；が以下を見出した：２５３．０７８９。
【０１５２】
５ｈｍＣブロッキング
【０１５３】
５ｈｍＣブロッキングを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭウリジンジホスホグルコース（ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ニューイングランドバイオラブス）、および１０Ｕ  βＧＴ（サーモフィッシャー）、ならびに１０μＭ  ５ｈｍＣ  ＤＮＡオリゴを含有した２０μｌ溶液中で、３７℃で１時間実施した。製造業者の指示に従って、生成物をマイクロバイオスピン６カラム（バイオラド）により精製した。
【０１５４】
５ｆＣブロッキング
【０１５５】
５ｆＣブロッキングを、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）、１０ｍＭ  Ｏ−エチルヒドロキシルアミン（シグマアルドリッチ）、および１０μＭ  ５ｆＣ  ＤＮＡオリゴ中で、３７℃で２時間実施した。製造業者の指示に従って、生成物をマイクロバイオスピン６カラム（バイオラド）によって精製した。
【０１５６】
５ｃａＣブロッキング
【０１５７】
５ｃａＣブロッキングを、７５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）、２０ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、シグマアルドリッチ）、２０ｍＭ  １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、フルオロケム（Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ））、および１０μＭ  ５ｃａＣ  ＤＮＡオリゴ中で、３７℃で０．５時間実施した。次いで緩衝液を、製造業者の説明書に従って、マイクロバイオスピン６カラム（バイオラド）を使用して、１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに交換した。１０ｍＭのエチルアミン（シグマアルドリッチ）をオリゴに加え、３７℃で１時間インキュベートした。製造業者の指示に従って、生成物をマイクロバイオスピン６カラム（バイオラド）によって精製した。
【０１５８】
５ｈｍＣ酸化
【０１５９】
４６μＬの５ｈｍＣ  ＤＮＡオリゴを、２．５μＬの１Ｍ  ＮａＯＨで３０分間３７℃で、振盪インキュベーター中で変性させ、次いで５０ｍＭ  ＮａＯＨおよび１５ｍＭ過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４、シグマアルドリッチ）を含有する溶液１．５μＬで、氷上で１時間酸化した。生成物は、製造業者の指示に従って、マイクロバイオスピン６カラムによって精製された。
【０１６０】
ＴａｑαＩアッセイでのＴＡＰＳ変換の検証
【０１６１】
ＴＡＰＳ後の５ｍＣ変換は、ＴａｑαＩ制限部位（ＴＣＧＡ）および後続のＴａｑαＩ消化を含む標的領域のＰＣＲ増幅によって試験された。例えば、我々のＴＡＰＳライブラリの５ｍＣ変換は、ＣｐＧメチル化ラムダＤＮＡスパイクイン対照から増幅される単一のＴａｑαＩ制限部位を含む１９４ｂｐのアンプリコンに基づいて試験することができる。１９４ｂｐのアンプリコンから増幅されたＰＣＲ生成物は、ＴａｑαＩ制限酵素と消化生成物で消化され、２％アガロースゲルでチェックされる。非変換対照ＤＮＡで増幅されたＰＣＲ生成物は、ＴａｑαＩによって消化され、ゲル上に二つのバンドを示す。ＴＡＰＳで変換された試料では、制限部位はＣからＴへの移行によって失われるため、１９４ｂｐのアンプリコンはインタクトのままである。全体的な変換レベルは、消化されたおよび消化されていないゲルバンド定量に基づいて評価されることができ、またＴＡＰＳ試料を成功させるためには９５％よりも高くするべきである。
【０１６２】
簡潔に述べると、変換されたＤＮＡ試料は、対応するプライマーを用いたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブス）によってＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ生成物を、１Ｘカットスマート緩衝液（ニューイングランドバイオラブス）中の４単位のＴｑａαＩ制限酵素（ニューイングランドバイオラブス）を用いて、６５℃で３０分間インキュベートし、２％アガロースゲル電気泳動によりチェックした。
【０１６３】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
【０１６４】
ＴＡＰＳ（図１１）の前後のモデルＤＮＡ間の増幅曲線および溶融曲線の比較については、１×ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０高分解能溶融マスターミックス（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、２５０ｎＭのプライマーＦＷ−ＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＧＣＡＴＧＴＣおよびＲＶ−ＣＡＴＴＡＣＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＴＴ、ならびに３ｍＭのＭｇＳＯ４を含有する、１９μＬのＰＣＲマスターミックス中に、ＤＮＡ試料１ｎｇを加えた。ＰＣＲ増幅については、９５℃で１０分間、初期変性工程を実施し、次に９５℃で５秒間の変性を４０サイクル行い、カスタマイズされたアニーリング温度で５秒間のアニーリング、および７２℃で５秒間伸長を実施した。最終工程は、９５℃で１分間、７０℃で１分間、および６５℃〜９５℃の溶融曲線（０．０２℃の工程増分、各獲得前に５秒保持）を含んだ。
【０１６５】
その他のアッセイについては、ｑＰＣＲを、１×  Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（１×  Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（サーモフィッシャー）、２００ｎＭの前方プライマー、および逆方向プライマーを含む、１９μＬのＰＣＲマスターミックスに必要量のＤＮＡ試料を添加することにより実施した。ＰＣＲ増幅については、初期変性工程を９５℃で２０秒間実施し、次いで９５℃で３秒間の変性を４０サイクル、２０秒のアニーリングおよび伸長を６０℃で行った。
【０１６６】
ＨｐａＩＩ−ｑＰＣＲアッセイでのｍＥＳＣ  ｇＤＮＡ中のＣｍＣＧＧメチル化レベルの検証。
【０１６７】
１μｇのｍＥＳＣ  ｇＤＮＡを、５０μＬ反応において３７℃で１６時間、５０単位のＨｐａＩＩ（ＮＥＢ、５０単位／μＬ）および１Ｘカットスマート緩衝液でインキュベートした。対照反応については、ＨｐａＩＩを添加しなかった。反応に、１μＬのプロテイナーゼＫを加え、４０℃で３０分間インキュベートし、その後９５℃で１０分間プロテイナーゼＫで失活した。ＨｐａＩＩ消化試料、または対照試料のＣｔ値は、特定のＣＣＧＧ位置（表９に記載）に対する対応するプライマーセットで、上記のｑＰＣＲアッセイによって測定された。
【０１６８】
サンガー配列決定
【０１６９】
ＰＣＲ生成物を、エキソヌクレアーゼＩおよびエビアルカリホスファターゼ（Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ニューイングランドバイオラブス）またはＺｙｍｏ−Ｓｐｉｎカラムにより精製し、サンガー配列決定用に処理した。
【０１７０】
異なる長さの断片に対するＤＮＡ損傷試験。
【０１７１】
ｍＥＳＣゲノムＤＮＡを０．５％ＣｐＧメチル化ラムダＤＮＡでスパイクインし、断片化しないままにしておき、またはＣｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０機器で超音波分解し、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ  ビーズで５００〜１ｋｂ、または１ｋｂ〜３ｋｂにサイズ選択した。２００ｎｇのＤＮＡはｍＴＥＴ１ＣＤで単回酸化（ｓｉｎｇｌｅ−ｏｘｉｄｉｓｅｄ）させ、上述の、または製造業者のプロトコルに従ってＥｐｉＴｅｃｔ亜硫酸水素塩キット（Ｑｉａｇｅｎ）で変換された、ピリジンボラン複合体を使用して還元した。ＴＡＰＳ前後のＤＮＡの１０ｎｇおよび亜硫酸水素塩変換が１％アガロースゲルで実行された。可視化するために、亜硫酸水素塩変換されたゲルを氷浴中の試料１０分間冷却した。ＴＡＰＳ試料中の５ｍＣ変換は、上述の通り、ＴａｑαＩ消化アッセイによって試験された。
【０１７２】
ｍＥＳＣ培養およびゲノムＤＮＡの単離
【０１７３】
マウスＥＳＣ（ｍＥＳＣ）Ｅ１４は、１５％のＦＢＳ（ギブコ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ギブコ）、１％の非必須アミノ酸（ギブコ）、１％のペニシリン／ストレプトアビジン（ギブコ）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（シグマ）、１０００単位／ｍＬ  ＬＩＦ（ミリポア）、１μＭ  ＰＤ０３２５９０１（ステムジェント（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ））、および３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（ステムジェント）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のゼラチンで被覆されたプレート（ｇｅｌａｔｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｐｌａｔｅｓ）上で培養した。培養物を３７℃および５％ＣＯ２で維持し、２日ごとに継代した。
【０１７４】
ゲノムＤＮＡの単離については、１０００  ｘ  ｇ及び室温で５分間遠心分離により細胞を採取した。ＤＮＡを製造業者のプロトコルに従い、Ｑｕｉｃｋ−ＤＮＡ  Ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で抽出した。
【０１７５】
ＴＡＰＳおよびＷＧＢＳに対するｍＥＳＣ  ｇＤＮＡの調製。
【０１７６】
全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定（ＷＧＢＳ）について、ｍＥＳＣ  ｇＤＮＡを、０．５％の非メチル化ラムダＤＮＡでスパイクインした。全ゲノムＴＡＰＳについては、ｍＥＳＣ  ｇＤＮＡを０．５％のメチル化ラムダＤＮＡおよび０．０２５％の非修飾２ｋｂスパイクイン対照でスパイクインした。ＤＮＡ試料をＣｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０機器によって断片化し、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ上で２００〜４００ｂｐにサイズ選択した。ＴＡＰＳ用ＤＮＡを、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ  ビーズを用いたサイズ選択後にＮ５ｍＣＮＮおよびＮ５ｈｍＣＮＮ対照オリゴの０．２５％で追加的にスパイクインした。
【０１７７】
全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定
【０１７８】
全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定（ＷＧＢＳ）について、０．５％の非メチル化バクテリオファージラムダＤＮＡを伴う２００  ｎｇの断片化されたｍＥＳＣ  ｇＤＮＡスパイクインが使用された。メチル化アダプター（ＮｅｘｔＦｌｅｘ）の末端修復およびＡテーリング反応、ならびにライゲーションは、製造業者のプロトコルに従ってＫＡＰＡ  ＨｙｐｅｒＰｌｕｓキット（カパ・バイオシステムズ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で調製された。続いて、ＤＮＡは、イルミナのプロトコルに従い、ＥｐｉＴｅｃｔ亜硫酸水素塩キット（Ｑｉａｇｅｎ）で亜硫酸水素塩変換を受けた。最終ライブラリを、ＫＡＰＡ  Ｈｉｆｉウラシルプラスポリメラーゼ（カパ・バイオシステムズ）で、６サイクルの間増幅し、１ＸＡｍｐｕｒｅビーズで洗浄した。ＷＧＢＳ配列決定ライブラリは、１５％のＰｈｉＸ対照ライブラリスパイクインを有するＮｅｘｔＳｅｑ高出力キットを使用して、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００配列決定装置（ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（イルミナ）上で配列決定されたペア末端８０ｂｐであった。
【０１７９】
全ゲノムＴＡＰＳ
【０１８０】
全ゲノムＴＡＰＳについては、０．５％のメチル化ラムダＤＮＡを伴う、１００ｎｇの断片化されたｍＥＳＣ  ｇＤＮＡスパイクイン、および０．０２５％の非修飾２ｋｂスパイクイン対照が使用された。イルミナ多重化アダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  ａｄａｐｔｅｒ）の末端修復およびＡテーリング反応、ならびにライゲーションは、製造業者のプロトコルに従ってＫＡＰＡ  ＨｙｐｅｒＰｌｕｓキットで調製された。ライゲーションされたＤＮＡをｍＴＥＴ１ＣＤで２回酸化し、次いで上述のプロトコルに従ってピリジンボランで還元した。最終配列決定ライブラリを、ＫＡＰＡ  Ｈｉｆｉウラシルプラスポリメラーゼで、５サイクルの間増幅し、１ＸＡｍｐｕｒｅビーズで洗浄した。全ゲノムＴＡＰＳ配列決定ライブラリは、１％のＰｈｉＸ対照ライブラリスパイクインを有する一つのＮｅｘｔＳｅｑ高出力キットを使用して、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００配列決定装置（イルミナ）上で配列決定されたペア末端８０ｂｐであった。
【０１８１】
ｄｓＤＮＡライブラリ調製キットを用いた低入力全ゲノムＴＡＰＳ
【０１８２】
全ゲノムＴＡＰＳについて上述したように調製されたｍＥＳＣ  ｇＤＮＡを、低入力全ゲノムＴＡＰＳに使用した。簡潔に述べると、１００ｎｇ、１０ｎｇ、および１ｎｇのｍＥＳＣ  ｇＤＮＡを含む試料を、上述のプロトコルに従ってＮｇＴＥＴ１で酸化した。製造業者のプロトコルに従い、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ（ニューイングランドバイオラブス）またはＫＡＰＡ  ＨｙｐｅｒＰｌｕｓキットを用いて、末端修復およびＡテーリング反応、ならびにライゲーションを行った。続いて、ＤＮＡは上述のようにピコボラン反応を受けた。変換されたライブラリを、ＫＡＰＡ  Ｈｉｆｉウラシルプラスポリメラーゼで増幅し、１Ｘ  Ａｍｐｕｒｅビーズで洗浄した。
【０１８３】
ｓｓＤＮＡライブラリ調製キットを用いた低入力全ゲノムＴＡＰＳ
【０１８４】
全ゲノムＴＡＰＳについて上述したように調製されたｍＥＳＣ  ｇＤＮＡを、低入力全ゲノムＴＡＰＳに使用した。簡潔に述べると、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、および１０ｐｇのｍＥＳＣ  ｇＤＮＡを含む試料を、上述のように、ＮｇＴＥＴ１で１回酸化し、ピコボランで還元した。配列決定ライブラリは、製造業者のプロトコルに従って、Ａｃｃｅｌ−ＮＧＳメチル−配列ＤＮＡライブラリキット（Ａｃｃｅｌ−ＮＧＳ  Ｍｅｔｈｙｌ−Ｓｅｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ）（スウィフト・バイオサイエンシズ（Ｓｗｉｆｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて調製した。最終ライブラリを、６サイクル（１００ｎｇ）、９サイクル（１０ｎｇ）、１３サイクル（１ｎｇ）、１６サイクル（１００ｐｇ）、および２１サイクル（１０ｐｇ）の間、ＫＡＰＡ  Ｈｉｆｉウラシルプラスポリメラーゼで増幅し、０．８５Ｘ  Ａｍｐｕｒｅビーズで洗浄した。
【０１８５】
他の実験では、全ゲノムＴＡＰＳについて上述したように調製されたｍＥＳＣ  ｇＤＮＡを、低入力全ゲノムＴＡＰＳに使用した。簡潔に述べると、１００ｎｇ、１０ｎｇ、および１ｎｇのｍＥＳＣ  ｇＤＮＡを含む試料を、末端修復およびＡテーリング反応に使用し、製造業者のプロトコルに従ってＫＡＰＡ  ＨｙｐｅｒＰｌｕｓキットを用いてイルミナ多重化アダプターにライゲーションした。次に、ライゲーションされた試料をｍＴＥＴ１ＣＤで１回酸化し、次いで上述のプロトコルに従ってピリジンボランで還元した。変換されたライブラリを、５サイクル（１００ｎｇ）、８サイクル（１０ｎｇ）、１３サイクル（１ｎｇ）の間、ＫＡＰＡ  Ｈｉｆｉウラシルプラスポリメラーゼで増幅し、１Ｘ  Ａｍｐｕｒｅビーズで洗浄した。
【０１８６】
細胞遊離ＤＮＡ  ＴＡＰＳ
【０１８７】
細胞遊離ＤＮＡ  ＴＡＰＳ試料は、１０ｎｇ、および１ｎｇの細胞遊離ＤＮＡ試料から調製された。簡潔に述べると、試料をＮｇＴＥＴ１で１回酸化し、上述のようにピコボランで還元した。配列決定ライブラリは、製造業者のプロトコルに従って、Ａｃｃｅｌ−ＮＧＳメチル−配列ＤＮＡライブラリキット（スウィフト・バイオサイエンシズ）を用いて調製した。最終ライブラリを、９サイクル（１０ｎｇ）、および１３サイクル（１ｎｇ）の間、ＫＡＰＡ  Ｈｉｆｉウラシルプラスポリメラーゼで増幅し、０．８５Ｘ  Ａｍｐｕｒｅビーズで洗浄した。
【０１８８】
他の実験では、細胞遊離ＤＮＡ  ＴＡＰＳ試料を、全ゲノムＴＡＰＳについて上述したように１０ｎｇ、および１ｎｇの細胞遊離ＤＮＡ試料から調製した。簡潔に述べると、細胞遊離ＤＮＡ試料を、末端修復およびＡテーリング反応に使用し、製造業者のプロトコルに従ってＫＡＰＡ  ＨｙｐｅｒＰｌｕｓキットを用いてイルミナ多重化アダプターにライゲーションした。次に、ライゲーションされた試料をｍＴＥＴ１ＣＤで１回酸化し、次いで上述のプロトコルに従ってピリジンボランで還元した。変換されたライブラリを、７サイクル（１０ｎｇ）、および１３サイクル（１ｎｇ）の間、ＫＡＰＡ  Ｈｉｆｉウラシルプラスポリメラーゼで増幅し、１Ｘ  Ａｍｐｕｒｅビーズで洗浄した。
【０１８９】
ＷＧＢＳデータ処理
【０１９０】
ペア末端の読み取りは、イルミナベーススペースからＦＡＳＴＱとしてダウンロードし、その後Ｔｒｉｍ  Ｇａｌｏｒｅ！  ｖ０．４．４で、品質トリミングされた（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ／）。トリミング後の少なくとも一つの読み取りが３５ｂｐより短い読み取りペアが、取り除かれた。トリミングされた読み取りは、−−オーバーラップオプション無し（−−ｎｏ＿ｏｖｅｒｌａｐ  ｏｐｔｉｏｎ）を使用したＢｉｓｍａｒｋ  ｖ０．１９を使用して、マウスゲノムのｍｍ９バージョン、ラムダファージおよびＰｈｉＸ（イルミナｉＧＥＮＯＭＥＳからの配列）を組み合わせたゲノムにマッピングされた（Ｆ．Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｂｉｓｍａｒｋ：ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ａｌｉｇｎｅｒ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃａｌｌｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−Ｓｅｑ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，１５７１−１５７２（２０１１）、参照により本明細書に組み込まれる）。「３−Ｃ」フィルターを使用して、過剰な非変換率で読み取りを取り除いた。Ｐｉｃａｒｄ  ｖ１．１１９（ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ／）ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓを使用してＰＣＲ重複を呼び出した。アーティファクトをマッピングする傾向が知られている領域が、ダウンロードされ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ａｎｓｈｕｌｋｕｎｄａｊｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｌａｃｋｌｉｓｔｓ）、さらなる分析から除外された（Ｅ．Ｐ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８９，５７−７４（２０１２）、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１９１】
ＴＡＰＳデータ前処理
【０１９２】
ペア末端読み取りは、イルミナベーススペースからダウンロードされ、その後Ｔｒｉｍ  Ｇａｌｏｒｅ！  ｖ０．４．４で品質トリミングされた。トリミング後の少なくとも一つの読み取りが３５ｂｐより短い読み取りペアが、取り除かれた。トリミングされた読み取りは、デフォルトのパラメータで、ＢＷＡ  ｍｅｍ  ｖ．０．７．１５を使用して、スパイクイン配列、ラムダファージ、およびマウスゲノムのｍｍ９バージョンを組み合わせるゲノムにマッピングされた（Ｈ．Ｌｉ，Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１７５４−１７６０（２００９）、参照により本明細書に組み込まれる）。アーティファクトをマッピングする傾向が知られている領域が、ダウンロードされ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ａｎｓｈｕｌｋｕｎｄａｊｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｌａｃｋｌｉｓｔｓ）、さらなる分析から除外された（Ｅ．Ｐ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ４８９，５７−７４（２０１２））。
【０１９３】
ＴＡＰＳ中の変換された塩基の検出
【０１９４】
整列された読み取りは、個別仕様のパイソン３スクリプト（ｐｙｔｈｏｎ３  ｓｃｒｉｐｔ）（ＭＦ−ｆｉｌｔｅｒ．ｐｙ）を使用して、元の上（ＯＴ）の、および元の下（ＯＢ）の鎖に分割した。次いで、別個にＯＴ上とＯＢ上とでＰｉｃａｒｄ  ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅを使用して、ＰＣＲ重複が取り除かれた。読み取りペア中のオーバーラップしているセグメントは、重複されたマッピングされたＯＴおよびＯＢ読み取り上で別個に、ＢａｍＵｔｉｌ  ｃｌｉｐＯｖｅｒｌａｐ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｔａｔｇｅｎ／ｂａｍＵｔｉｌ）を使用して取り除かれた。次いで、修飾された塩基を、サムツールｍｐｉｌｅｕｐ（ｓａｍｔｏｏｌｓ  ｍｐｉｌｅｕｐ）および個別仕様のパイソン３スクリプト（ＭＦ−ｃａｌｌｅｒ＿ＭＯＤ．ｐｙ）を使用して検出した。
【０１９５】
ＴＡＰＳおよびＷＧＢＳの配列決定品質分析
【０１９６】
ヌクレオチドタイプごとの品質スコア統計を、パイソン３スクリプト（ＭＦ−ｐｈｒｅｄｄｅｒ．ｐｙ）を用いてイルミナベーススペースからダウンロードしたときに、元のＦＡＳＴＱファイルから抽出した。
【０１９７】
ＴＡＰＳおよびＷＧＢＳのカバレッジ分析
【０１９８】
塩基ごとのゲノムカバレッジファイルはＢｅｄｔｏｏｌｓ  ｖ２．２５  ｇｅｎｏｍｅｃｏｖで生成された（Ａ．Ｒ．Ｑｕｉｎｌａｎ，Ｉ．Ｍ．Ｈａｌｌ，ＢＥＤＴｏｏｌｓ：ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６，８４１−８４２（２０１０）、参照により本明細書に組み込まれる）。ＴＡＰＳとＷＧＢＳの間の相対的カバレッジ分布を比較するために、ＴＡＰＳ読み取りは、ｓａｍｔｏｏｌｓビュー（ｓａｍｔｏｏｌｓ  ｖｉｅｗ）の−ｓオプションを使用して、ＷＧＢＳの対応するカバレッジ中央値にサブサンプリングされた。ＷＧＢＳ  およびサブサンプリングＴＡＰＳのカバレッジを比較する分析では、ＴＡＰＳおよびＷＧＢＳバムファイル（ｂａｍ  ｆｉｌｅ）の両方で、クリップオーバーラップ（ｃｌｉｐＯｖｅｒｌａｐ）を使用した。
【０１９９】
ＴＡＰＳ及びＷＧＢＳによって測定されたシトシン修飾の分析
【０２００】
塩基ごとの修飾された読み取りの画分はそれぞれ、Ｂｉｓｍａｒｋ出力、およびＭＦ−ｃａｌｌｅｒ＿ＭＯＤ．ｐｙの出力から算出された。Ｂｅｄｔｏｏｌｓの交差（Ｂｅｄｔｏｏｌｓ  ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ）を使用して交差を行い、統計解析及び図をＲ及びＭａｔｌａｂで生成した。ゲノム領域は、ＩＧＶ  ｖ２．４．６を使用して視覚化された（Ｊ．Ｔ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｖｉｅｗｅｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９，２４−２６（２０１１）、参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＧＩの周りのカバレッジおよび修飾レベルをプロットするために、ｍｍ９のすべてのＣＧＩ座標は、ＵＣＳＣゲノムブラウザからダウンロードされ、２０ウィンドウの区間に入れられ、両側に最大８０ｂｐのサイズの５０ウィンドウまで伸長させた（次のＣＧＩまでの距離の半分に達さない限り）。Ｂｅｄｔｏｏｌｓマップを使用して、各区間における平均修飾レベル（ＣｐＧにおける）およびカバレッジ（すべての塩基、両方の鎖における）を計算した。各区間の値を再度平均し、その後Ｍａｔｌａｂにプロットした。
【０２０１】
データ処理時間のシミュレーション
【０２０２】
合成ペア末端配列決定読み取りは、ラムダファージゲノムに基づいてＡＲＴ４２を使用してシミュレーションされた（−ｐ−ｓｓ  ＮＳ５０−−ｅｒｒｆｒｅｅ−−ｍｉｎＱ  １５−ｋ  ０−ｎｆ  ０−ｌ  ７５−ｃ  １００００００−ｍ  ２４０−ｓ  ０−ｉｒ  ０−ｉｒ２  ０−ｄｒ  ０−ｄｒ２  ０−ｓａｍ−ｒｓ  １０のパラメータで）。次に、全てのＣｐＧ位置の５０％が修飾されたものとしてマークされ、個別仕様のパイソン３スクリプトを使用して、ＴＡＰＳ（変換修飾塩基）として、またはＷＧＢＳ（変換非修飾塩基）としてのいずれかで、二つのライブラリが作成された。その後、本論の各方法に使用されるパイプラインに従って読み取りを処理した。処理時間はＬｉｎｕｘ（登録商標）コマンド時間で測定された。分析のすべての工程を、２５０ＧＢのメモリを備えた一つのＩｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ  ＣＰＵ上でシングルスレッドモードで実行した。
【０２０３】
結果と考察
【０２０４】
ｐｉｃ−ＢＨ３は、以前に知られていない還元脱カルボキシル化／脱アミノ化反応によって、５ｆＣおよび５ｃａＣをＤＨＵに簡単に変換することができるということを発見した（図４）。反応は、ＭＡＬＤＩを使用した単一ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドの両方で定量的であることが示された（図２〜３、および６〜７）。
【０２０５】
マトリクス支援レーザー脱離法／イオン化質量分光法（ＭＡＬＤＩ）によってモニターされるとき、５ｃａＣと反応する可能性のある化学物質をスクリーンするためのモデルとして１１ｍｅｒ  ５ｃａＣ含有ＤＮＡオリゴを使用した。ある特定のボラン含有化合物は、５ｃａＣオリゴと効率的に反応することが見出され、結果として４１Ｄａの分子量減少が得られた（図１および２）。ピリジンボランおよびその誘導体２−ピコリンボラン（ピコボラン）を、市販されており、環境に良好な還元剤であるため、さらなる研究のために選択した。
【０２０６】
単一の５ｃａＣヌクレオシド上の反応が繰り返され、ピリジンボランおよびピコボランが５ｃａＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換することを確認した（図３、４Ｂ）。興味深いことに、ピリジンボラン及びピコボランは、明らかな還元脱カルボキシル化／脱アミノ化機構を介して、５ｆＣをＤＨＵに変換することも見いだされた（図４Ｃおよび６）。両方の反応の詳細な機構がまだ定義されないままである。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＤＮＡオリゴでのボラン反応の定量的解析は、ピコボランが５ｃａＣおよび５ｆＣをＤＨＵに、およそ９８％の効率で変換し、非メチル化シトシン、５ｍＣまたは５ｈｍＣに対する活性を有しないことを確認する（図２Ｂ）。
【０２０７】
ウラシル誘導体として、ＤＨＵは、チミンとしてのＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの両方によって認識され得る。したがって、ボラン還元は、５ｃａＣからＴへ、および５ｆＣからＴへの両方の移行を誘発するために使用することができ、また、５ｆＣおよび５ｃａＣの塩基分解能配列決定に使用することができ、これを我々はピリジンボラン配列決定（「ＰＳ」）と称する（表６）。５ｆＣおよび５ｃａＣのＴへのボラン還元はそれぞれ、ヒドロキシルアミンコンジュゲーション（Ｃ．Ｘ．Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ５−ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １５３，６７８−６９１（２０１３）、参照により本明細書に組み込まれる）、およびＥＤＣカップリング（Ｘ．Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＣＡＢ−Ｓｅｑ）ｆｏｒ  ５−ｃａｒｂｏｘｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＤＮＡ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５，９３１５−９３１７（２０１３）、参照により本明細書に組み込まれる）を介してブロックすることができる（図６）。このブロッキングにより、ＰＳを、配列５ｆＣまたは５ｃａＣに特異的に使用することができる（表６）。
表６。ＢＳおよび関連する方法と、５ｆＣおよび５ｃａＣ配列決定のためのＰＳとの比較。
【表９】
2021509587.tif 000014
【０２０８】
さらに、ＴＥＴ酵素は、５ｍＣと５ｈｍＣとを５ｃａＣに酸化し、次いで、５ｃａＣをＴＥＴ−補助ピリジンボラン配列決定（「ＴＡＰＳ」）と呼ばれる本明細書のプロセスにおけるボラン還元にかけることに使用することができる（図５Ａ〜Ｂ、表１）。ＴＡＰＳは５ｍＣおよび５ｈｍＣのＣからＴへの移行を誘発することができ、したがって５ｍＣおよび５ｈｍＣの塩基分解能検出に使用できる。
【０２０９】
加えて、β−グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）は５ｈｍＣをグルコースで標識することができ、それによって、本明細書においてＴＡＰＳβと呼称されるプロセスで、５ｍＣのみの選択的配列決定を可能にしつつ（図５Ｂ、表１）、ＴＥＴ酸（Ｍ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｅ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  １４９，１３６８−１３８０（２０１２））およびボラン還元からそれを保護することができる（図７）。その後、ＴＡＰＳ測定からのＴＡＰＳβの減算によって、５ｈｍＣ部位を推定することができる。あるいは、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）、酸化亜硫酸水素塩配列決定（ｏｘＢＳ）で以前に使用された試薬（Ｍ．Ｊ．Ｂｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ５−Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ５−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｔ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｂａｓｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３６，９３４−９３７（２０１２））は、５ｈｍＣを５ｆＣに特異的に酸化させるための化学酸化剤としてＴＥＴを置き換えることに使用することができる（図７）。本明細書において、化学補助ピリジンボラン配列決定（「ＣＡＰＳ」）と呼称されるこのアプローチを、５ｈｍＣを特異的に配列するために使用することができる（図５Ｂ、表１）。したがって、ＴＡＰＳおよび関連する方法は、原則的に四つのシトシンのエピジェネティックな修飾すべてを配列するための包括的なスイートを提供することができる（図５Ｂ、表１、表６）。
【０２１０】
ＴＡＰＳ単独が、ゲノム内の既存の５ｆＣおよび５ｃａＣも検出する。しかしながら、通常の条件下でゲノムＤＮＡ中の５ｆＣおよび５ｃａＣの極度の低レベルが考えられる場合、これは許容される。特定の条件下、５ｆＣおよび５ｃａＣの信号を完全に除去することが望まれる場合では、それは、ヒドロキシルアミンコンジュゲーションおよびＥＤＣカップリングによってそれぞれ、５ｆＣおよび５ｃａＣを保護することによって容易に達成でき、それによってＤＨＵへの変換が防止される。
【０２１１】
ＴＡＰＳの性能は、亜硫酸水素塩配列決定と比較して、５ｍＣおよび５ｈｍＣの塩基分解能マッピングに対する現在の標準および最も広く使用されている方法であると評価された。ネグレリアＴＥＴ様オキシゲナーゼ（ＮｇＴＥＴ１）およびマウスＴｅｔ１（ｍＴｅｔ１）は両方とも、インビトロで効率的に５ｍＣを５ｃａＣに酸化することができるため、使用された。５ｍＣからＴへの移行を確認するために、完全にメチル化されたＣｐＧ部位を含有するモデルＤＮＡにＴＡＰＳを適用し、制限酵素消化（図８Ａ〜Ｂ）、およびサンガー配列決定（図９Ａ）によって実証されるように、それが５ｍＣをＴへ効果的に変換できることを示した。ＴＡＰＳβおよびＣＡＰＳも、サンガー配列決定によって検証された（図１２）。
【０２１２】
ＴＡＰＳをマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に適用した。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量化では、予想されるように、５ｍＣが、ｍＥＳＣｓ  ｇＤＮＡ中のシトシン修飾の９８．５％を占めることが示され、残りの部分は５ｈｍＣ（１．５％）、および微量の５ｆＣおよび５ｃａＣからなり、ＤＨＵはなかった（図９Ｂ）。ＴＥＴ酸化後、シトシン修飾の約９６％を５ｃａＣへと酸化し、および３％を５ｆＣへと酸化した（図９Ｂ）。ボラン還元後、９９％を超のシトシン修飾はＤＨＵに変換された（図９Ｂ）。これらの結果は、ゲノムＤＮＡ上で、ＴＥＴ酸化およびボラン還元の両方が効率的に働いていることを実証する。
【０２１３】
ＴＥＴ酸化およびボラン還元の両方は軽度の反応で、亜硫酸水素塩と比較しても顕著なＤＮＡ分解はなく（図１０Ａ〜Ｄ）、またそれによって高いＤＮＡ回収を提供する。亜硫酸水素塩配列決定に関する別の顕著な利点は、ＴＡＰＳが非破壊的であり、１０ｋｂｓの長さまでＤＮＡを保持できることである（図１０Ｃ）。さらに、ＤＮＡはＴＡＰＳ後に二本鎖を維持し（図１０Ａ〜Ｃ）、変換はＤＮＡ長さとは独立している（図１５Ａ〜Ｂ）。
【０２１４】
さらに、ＤＨＵは天然塩基に近接しているため、様々なＤＮＡポリメラーゼおよび等温ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼと適合性があり（図１３Ａ〜Ｂ）、ＰＣＲ中のＴ／Ｃと比較してバイアスは示されない（図１４）。
【０２１５】
全ゲノム配列決定を、ｍＥＳＣ  ｇＤＮＡの二つの試料で行った。一つの試料を、ＴＡＰＳを用いて変換し、比較するために、もう一方の試料には標準全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定（ＷＧＢＳ）を用いた。
【０２１６】
ＴＡＰＳの正確性を評価するために、ＣｐＧメチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＳｓｓＩ）またはＧｐＣメチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＣｖｉＰＩ）を使用して、完全に非修飾された、インビトロでメチル化された、のいずれかであった異なる長さのスパイクインを加えた（上記の方法を使用）。５ｍＣおよび５ｈｍＣを含む短いスパイクイン（１２０ｍｅｒ−１、および１２０ｍｅｒ−２）については、ＣｐＧおよび非ＣｐＧ両コンテクストにおける、両方の鎖での両方の修飾に対して完全に近い変換が観察された（図１７Ａ〜Ｂ）。
【０２１７】
ＴＡＰＳのために１００ｎｇのｇＤＮＡを使用し、ＷＧＢＳの２００ｎｇのｇＤＮＡと比較した。ＴＡＰＳの正確性を評価するために、我々は三つの異なるタイプのスパイクイン対照を加えた。全てのＣｐＧが完全にメチル化されたラムダＤＮＡを使用して、偽陰性率（５ｍＣの非変換率）を推定し、２ｋｂの非修飾アンプリコンを使用して偽陽性率（非修飾Ｃの変換率）を推定し、その他の任意の塩基によって取り囲まれたメチル化された、およびヒドロキシメチル化されたＣ（それぞれ、Ｎ５ｍＣＮＮおよびＮ５ｈｍＣＮＮ）の両方を含有する合成オリゴスパイクインを使用して、異なる配列コンテクストで５ｍＣおよび５ｈｍＣの変換率を比較した。ｍＴｅｔ１とピリジンボランとの組み合わせは、最も高い５ｍＣ変換率（ラムダおよび合成スパイクインではそれぞれ、９６．５％、および９７．３％）および非修飾Ｃの最も低い変換率（０．２３％）を達成した（図１８Ａ〜Ｂ、および図１６）。わずか０．２３％の偽陽性率を伴う、２．７％〜３．５％の偽陰性率は、亜硫酸水素塩配列決定に匹敵している。最近の試験では、９つの市販の亜硫酸水素塩キットが、それぞれ１．７％および０．６％の平均偽陰性率および平均偽陽性率を示した（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｔｉｓｓｕｅｓ，ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，ＦＦＰＥ  ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｓｐｉｒａｔｅｓ，ｌａｖａｇｅｓ，ｅｆｆｕｓｉｏｎｓ，ｐｌａｓｍａ，ｓｅｒｕｍ，ａｎｄ  ｕｒｉｎｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ９３９３３（２０１４））。合成スパイクインが、ＴＡＰＳが５ｍＣと５ｈｍＣの両方で十分に機能し、またＴＡＰＳが非ＣｐＧコンテクストで機能がわずかに悪化することを示唆する。５ｈｍＣの変換は５ｍＣよりも８．２％低く、非ＣｐＧコンテクストの変換は、ＣｐＧコンテクストの変換よりも１１．４％低い（図１８Ａ）。
【０２１８】
ＷＧＢＳデータは、アライメントおよび修飾呼び出し（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｃａｌｌｉｎｇ）の工程の両方に特別なソフトウェアを必要とする。対照的に、我々の処理パイプラインは、標準的なゲノムアライナー（ｂｗａ）を使用し、その後に、我々が「ａｓＴａｉｒ」と呼ぶ個別仕様の修飾呼び出しツールを使用する。シミュレートされたＷＧＢＳおよびＴＡＰＳ読み取り（同じ半メチル化供給源配列に由来する）を処理するとき、ＴＡＰＳ／ａｓＴａｉｒは、ＷＧＢＳ／Ｂｉｓｍａｒｋよりも３倍速くなった（図１８Ｃ）。
【０２１９】
ほぼすべてのシトシンのチミンへの変換により、ＷＧＢＳライブラリは、イルミナ配列決定にマイナスの影響を及ぼす可能性がある極めて歪みのあるヌクレオチド組成物を特徴とする。結果として、ＷＧＢＳ読み取りはＴＡＰＳと比較して、シトシン／グアニン塩基ペアで実質的により低い配列決定品質スコアを示した（図１８Ｅ）。ヌクレオチド組成物のバイアスを補正するために、少なくとも１０〜２０％のＰｈｉＸ  ＤＮＡ（塩基バランス対照ライブラリ）を、一般的にＷＧＢＳライブラリに添加する（例えば、ＨｉＳｅｑ  ３０００／ＨｉＳｅｑ  ４０００システムのイルミナ・全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ’ｓ  Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を参照のこと）。したがって、我々はＷＧＢＳライブラリに１５％のＰｈｉＸを補充した。これにより、ＢＳ変換された読み取りの低減された情報含有量と、亜硫酸水素塩処理の結果としてのＤＮＡ分解との組み合わせでは、ＴＡＰＳと比較してＷＧＢＳのマッピング率が有意に低下した（図１８Ｄおよび表７）。
表７。ＷＧＢＳおよびＴＡＰＳの、マッピングおよび配列決定の品質統計。
【表１０】
2021509587.tif 000015
【０２２０】
したがって、同じ配列決定コスト（ＮｅｘｔＳｅｑ  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ１回実施）については、ＴＡＰＳの平均深さはＷＧＢＳのそれを超えた（それぞれ、２１×、および１３．１×、表８）。さらに、ＴＡＰＳはカバーされていない領域をより少なくし、全体的に、ＷＧＢＳと同じ配列決定の深さへのダウンサンプリングの後でも、より均一なカバレッジ分布を示した（四分位範囲：それぞれ９および１１、図１９Ａおよび表８）。
表８。ＴＡＰＳ、ＷＧＢＳ、およびＷＧＢＳとほぼ同じ平均カバレッジを持つようにダウンサンプリングされたＴＡＰＳのカバレッジ統計。ここでは、ゲノム内のすべての位置における両方の鎖に対してカバレッジが計算された。
【表１１】
2021509587.tif 000016
例えば、特にＣｐＧ島（ＣＧＩ）は一般的に、ＷＧＢＳとＴＡＰＳ間の配列決定深さの差異を制御するときであっても、ＴＡＰＳによってより良好にカバーされた（図２１Ａ）、一方、この両方はＣＧＩ内部で同等の脱メチル化を示した（図２２）。さらに、ＷＧＢＳは、高度にカバーされたＣｐＧ部位での修飾レベルの減少のわずかなバイアスを示した（図２３Ａ）。一方で、我々の結果は、ＴＡＰＳが修飾カバレッジのバイアスを非常に少なくすることを示唆している（図２３Ｂ）。これらの結果は、ＴＡＰＳが、配列決定コストを効果的に半減させながら、ＷＧＢＳと比較して配列決定品質を劇的に改善することを実証する。
【０２２１】
ＴＡＰＳのより高い、かつより均一のゲノムカバレッジにより、より多数のＣｐＧ部位が少なくとも三つの読み取りによってカバーされた。ＷＧＢＳでの７７．５％のみと比較して、このレベルでは、ＴＡＰＳを用いると、マウスゲノム内のすべての４３，２０５，３１６  ＣｐＧ部位の８８．３％がカバーされた（図２１Ｂおよび１９Ｂ）。ＴＡＰＳおよびＷＧＢＳは、染色体領域にわたって高度に相関したメチル化測定をもたらした（図２１Ｄおよび図２０）。ヌクレオチドあたりの基準では、３２，７５５，２７１  ＣｐＧの位置は、両方の方法で少なくとも三つの読み取りによってカバーされた（図２１Ｂ）。これらの部位内では、我々は、少なくとも１０％の修飾レベルを持つすべてのＣｐＧ位置として、「修飾ＣｐＧ」を定義した（Ｌ．Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｔ  ｂａｓｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，Ｒ４９（２０１４））。この閾値を使用すると、ＣｐＧの９５．８％は、ＴＡＰＳとＷＧＢＳとの間の一致する修飾状態を示した。ＷＧＢＳで、少なくとも三つの読み取りでカバーされ、修飾されたと見出された全てのＣｐＧの９８．５％は、ＴＡＰＳによって修飾されるように再び呼び出され、ＷＧＢＳとＴＡＰＳ間の良好な合意を示した（図２１Ｃ）。ＷＧＢＳおよびＴＡＰＳの両方で少なくとも三つの読み取りによってカバーされた各ＣｐＧ当たりの修飾レベルを比較するとき、ＴＡＰＳとＷＧＢＳとの間の良好な相関が観察された（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｒ＝０．６３，ｐ＜２ｅ−１６、図２１Ｅ）。特に、ＴＡＰＳは、ＷＧＢＳによって見逃された高度に修飾されたＣｐＧ位置のサブセットを特定した（図２１Ｅ、右下隅）。我々は、直交制限消化（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）およびリアルタイムＰＣＲアッセイを使用して、これらのＣｐＧの７つをさらに検証し、それらのすべてが完全にメチル化、および／またはヒドロキシメチル化されることを確認した（表９）。
表９。ＴＡＰＳ、ＷＧＢＳ、およびＨｐａＩＩ−ｑＰＣＲアッセイにより定量化されたｍＥＳＣ  ｇＤＮＡにおけるＣｍＣＧＧメチル化レベルの比較。ＴＡＰＳ、およびＷＧＢＳによる、カバレッジおよびメチル化レベル（ｍＣ％）を鎖当たりに対して計算した。ＨｐａＩＩ−ｑＰＣＲアッセイにおける、ＨｐａＩＩ消化試料のＣｔ値（ＣｔＨｐａＩＩ）、または対照試料（ＣｔＣｔｒｌ）は、３組の平均であった。ｍＣ％は以下の等式を用いて計算される：ｍＣ％＝２＾（ＣｔＣｔｒｌ−ＣｔＨｐａＩＩ）＊１００％。
【表１２】
2021509587.tif 000017
合わせて、これらの結果は、ＴＡＰＳが、ＷＧＢＳを直接置き換えることができること、および実際には、ＷＧＢＳよりもメチロームに対するより包括的な視点を提供することを示している。
【０２２２】
最後に、低入力ＤＮＡを用いてＴＡＰＳを試験し、ＴＡＰＳは、わずか１ｎｇのｇＤＮＡで働くことが示され、一部の例では、１０ｐｇのｇＤＮＡまで下げ、単一細胞レベル近くまでであった。ＴＡＰＳはまた、循環細胞遊離ＤＮＡを１ｎｇまで下げても、効果的に機能する。これらの結果は、低入力ＤＮＡおよび臨床用途のためのＴＡＰＳの可能性を示す（図２４Ａ〜Ｃ、図２５Ａ〜Ｂ）。
【０２２３】
ＴＡＰＳは、一つの健常試料、一つのバレット食道の（バレット）試料、及び１〜２ｍｌの血漿から得られた一つの膵臓ガン試料由来の、三つの循環細胞遊離ＤＮＡ試料（ｃｆＤＮＡ）で試験された。標準ＴＡＰＳプロトコルに従い、各試料を約１０ｘのカバレッジに配列決定した。ｃｆＤＮＡ  ＴＡＰＳの結果解析により、ＴＡＰＳが、高い５ｍＣ変換率（図２６Ａ）、低偽陽性率（非修飾シトシンの変換、図２６Ｂ）、高マッピング率（図２６Ｃ）、および低ＰＣＲ重複率（図２６Ｄ）を含む、バルクゲノムＤＮＡ由来と同等の、低入力ｃｆＤＮＡ由来の高品質メチローム配列決定を提供することが示された。これらの結果は、ｃｆＤＮＡからの疾患診断のためのＴＡＰＳの力を示す。
【０２２４】
またＴＡＰＳは、ＣからＴへの遺伝的バリアントまたは単一ヌクレオチド遺伝子多型（ＳＮＰ）からのメチル化を区別することもでき、したがって遺伝的バリアントを検出することができる。メチル化およびＣからＴへのＳＮＰは、ＴＡＰＳにおいて異なるパターンをもたらす：メチル化は、元の上の鎖（ＯＴ）／元の下の鎖（ＯＢ）におけるＴ／Ｇ読み取り、ならびにＯＴ（ＣＴＯＴ）およびＯＢ（ＣＴＯＢ）に相補的な鎖におけるＡ／Ｃ読み取りをもたらし、一方で、ＣからＴへのＳＮＰは、ＯＴ／ＯＢ、および（ＣＴＯＢ／ＣＴＯＴ）におけるＴ／Ａ読み取りをもたらす（図２７）。これにより、一つの実験および配列決定の実行において、メチル化情報および遺伝的バリアントの両方を提供し、またそれゆえに突然変異を提供することにおける、ＴＡＰＳの有用性がさらに増加する。本明細書に開示されるＴＡＰＳ方法のこの能力により、ゲノム解析のエピジェネティクス解析との統合が提供され、標準的な全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）を実施するニーズを除去することによって、配列決定コストの著しい減少がもたらされる。
【０２２５】
まとめると、我々は、シトシンの上皮遺伝子修飾のための一連のＰＳ由来の亜硫酸水素塩非含有、塩基分解能配列決定方法を開発し、全メチローム配列決定のためのＴＡＰＳの有用性を実証した。非修飾のシトシンに影響を及ぼすことなく、高い感度と特異性で、５ｍＣおよび５ｈｍＣを塩基分解能で直接的に検出するための軽度の酵素反応および化学反応を使用することにより、ＴＡＰＳは、高品質でより完全なメチロームを配列決定コストの半分で提供することにおいて、亜硫酸水素塩配列決定に優れている。このようにＴＡＰＳは、ＤＮＡメチルシトシンおよびヒドロキシメチルシトシン分析の新しい標準として亜硫酸水素塩配列決定を置き換えることができる。最近報告された亜硫酸水素塩非含有５ｆＣ配列決定方法にバルキーな修飾を導入するよりむしろ（Ｂ．Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｆｒｅｅ，ｂａｓｅ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ５−ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃａｌｅ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，１０４７−１０５０（２０１５）；Ｃ．Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  ５−Ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｍｂｒｙｏｓ  ａｎｄ  ＥＳＣｓ  ａｔ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｂａｓｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２０，７２０−７３１（２０１７））、ＴＡＰＳは、修飾シトシンをＤＨＵ、天然に近い塩基、へ変換し、これは共通のポリメラーゼによってＴと「読み取り」されることができ、また潜在的にＰＣＲフリーＤＮＡ配列決定と適合性がある。ＴＡＰＳは、ピロシーケンシング、メチル化感受性ＰＣＲ、制限消化、ＭＡＬＤＩ質量分光分析、マイクロアレイおよび全ゲノム配列決定を含むがこれに限定されない、様々な下流分析と適合性がある。ＴＡＰＳは長いＤＮＡを保持することができるため、ＳＭＲＴ配列決定およびナノ細孔配列決定などの長い読み取り配列決定技術と組み合わせると非常に貴重なものとなり、マップ領域に対する特定の困難を調査することができる。また、プルダウン方法をＴＡＰＳと組み合わせて、配列決定コストをさらに減少させ、塩基分解能情報を低分解能アフィニティベースのマップに追加することも可能である。本明細書では、コスト、複雑さ、および分析に必要な時間を減少させながら、ＴＡＰＳは、日常的に使用することで、ＷＧＢＳを直接的に置き換えることができると実証された。これにより、学術的研究および臨床診断におけるエピジェネティクス分析の採用がより広くなりうる。
例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
標的核酸中の５−メチルシトシン（５ｍＣ）を特定するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
ｉ．  ＤＮＡ試料中の５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）にブロッキング基を添加する工程と、
ii．  前記核酸試料中の前記５ｍＣを５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）および／または５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換する工程と、
iii．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣおよび／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
ｃ．  前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｍＣの位置を提供する、方法。
（項目２）
各移行位置でのＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置での５ｍＣの定量レベルを提供する、項目１に記載の方法。
（項目３）
標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定する方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
ｉ．  前記核酸試料中の前記５ｍＣおよび５ｈｍＣを５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）および／または５ｆＣに変換する工程と、
ii．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣおよび／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程と、を含む、修飾する工程、および
ｃ．  前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣのいずれかの位置を提供する、方法。
（項目４）
各移行位置でのＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置での５ｍＣまたは５ｈｍＣの定量レベルを提供する、項目３に記載の方法。
（項目５）
標的核酸中の５ｍＣを特定するための、および５ｈｍＣを特定するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸中の５−メチルシトシン（５ｍＣ）を特定する工程であって、前記特定する工程が、
ｉ．  前記標的核酸を含む第一核酸試料を提供する工程、
ii．  前記第一試料中の前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
１．  前記第一核酸試料中の、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）にブロッキング基を添加することと、
２．  前記第一核酸試料中の前記５ｍＣを、５ｃａＣおよび／または５ｆＣに変換することと、
３．  修飾標的核酸を含む修飾第一核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣおよび／または５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換することと、を含む、修飾する工程、
iii．  前記修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
iv．  前記修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｍＣの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、
ｂ．  前記標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣを特定する工程であって、前記特定する工程が、
ｉ．  前記標的核酸を含む第二核酸試料を提供する工程、
ii．  前記第二試料中の前記核酸を修飾する工程であって、前記修飾する工程が、
１．  前記第二核酸試料中の５ｍＣおよび５ｈｍＣを、５ｃａＣおよび／または５ｆＣに変換することと、
２．  修飾標的核酸を含む修飾第二核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣおよび／または５ｆＣをジヒドロラシル（ＤＨＵ）に変換することと、を含む、修飾する工程、
iii．  前記修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
iv．  前記第二試料から前記修飾標的核酸の配列を検出する工程であって、前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｍＣまたは５ｈｍＣのいずれかの位置を提供する、検出する工程、を含む、特定する工程、ならびに、
ｃ．  工程（ａ）および（ｂ）の結果を比較する工程であって、工程（ｂ）で存在するが工程（ａ）では存在しないＣからＴへの移行が、前記標的核酸中の５ｈｍＣの位置を提供する、比較する工程、を含む、方法。
（項目６）
工程（ａ）において、各移行位置でのＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で５ｍＣの定量レベルを提供し、工程（ｂ）において、各移行位置でのＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で５ｍＣ、または５ｈｍＣの定量レベルを提供し、および工程（ｃ）において、工程（ｂ）で、工程（ａ）ではなく、特定されたＣからＴへの移行についてのパーセンテージの差異が、前記標的核酸中の各位置で５ｈｍＣの定量レベルを提供する、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記５ｈｍＣに添加される前記ブロッキング基が糖である、項目１〜２または項目５〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記糖がグルコースまたは修飾グルコースである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ブロッキング基が、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の存在下で、糖に連結されたＵＤＰに前記核酸試料を接触させることにより、前記５ｈｍＣに添加される、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、Ｔ４バクテリオファージβ−グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）、Ｔ４バクテリオファージα−グルコシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）、ならびにその誘導体および類似体からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記核酸試料中の前記５ｍＣを、５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程、ならびに前記核酸試料中の前記５ｍＣ及び５ｈｍＣを、５ｃａＣ及び／または５ｆＣに変換する工程は、テンイレブントランスロケーション（ＴＥＴ）酵素と前記核酸試料を接触させることを含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ＴＥＴ酵素が、ヒトＴＥＴ１、ＴＥＴ２、及びＴＥＴ３、マウスＴｅｔ１、Ｔｅｔ２、及びＴｅｔ３、ネグレリアＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、ウシグソヒトヨタケ（ＣｃＴＥＴ）、ならびにその誘導体または類似体からなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＴＥＴ酵素がＮｇＴＥＴまたはマウスＴＥＴである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
標的核酸中の５ｃａＣ、または５ｆＣを特定するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣおよび５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程、
ｃ．  前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する工程、および
ｄ．  前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｃａＣ、または５ｆＣのいずれかの位置を提供する、方法。
（項目１５）
各移行位置でのＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で、５ｃａＣ、または５ｆＣの定量レベルを提供する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
標的核酸中の５ｃａＣを特定するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  前記核酸試料中の５ｆＣにブロッキング基を添加する工程、
ｃ．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記５ｃａＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程、
ｄ．  前記修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
ｅ．  前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｃａＣの位置を提供する、方法。
（項目１７）
各移行位置でのＴのパーセンテージが、前記標的核酸の各位置で５ｃａＣの定量レベルを提供する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記５ｆＣにブロッキング基を添加する工程が、ヒドロキシルアミン誘導体、ヒドラジン誘導体、およびヒドラジド誘導体から選択されるアルデヒド反応性化合物と、前記核酸試料を接触させることを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記ヒドロキシルアミン誘導体が、Ｏ−エチルヒドロキシルアミンである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
標的核酸中の５ｆＣを特定するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記標的核酸を含む核酸試料を提供する工程、
ｂ．  前記核酸試料中の５ｃａＣにブロッキング基を添加する工程、
ｃ．  修飾標的核酸を含む修飾核酸試料を提供するために、前記５ｆＣをジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換する工程、
ｄ．  前記修飾標的核酸のコピー数を随意に増幅する工程、および
ｅ．  前記修飾標的核酸の配列を検出する工程、を含み、
前記標的核酸と比較した前記修飾標的核酸の配列におけるシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への移行が、前記標的核酸中の５ｆＣの位置を提供する、方法。
（項目２１）
各移行位置でのＴのパーセンテージが、前記標的核酸中の各位置で５ｆＣの定量レベルを提供する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
５ｃａＣにブロッキング基を添加する前記工程が、前記核酸試料をカルボン酸誘導体化試薬、及びアミン、ヒドラジン又はヒドロキシルアミン化合物と接触させることを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
５ｃａＣにブロッキング基を添加する前記工程が、前記核酸試料を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と接触させることと、エチルアミンと接触させることと、を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記方法が、前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する前記工程をさらに含む、項目１〜６、および１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記修飾標的核酸のコピー数を増幅する前記工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはプライマー伸長を行うことを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記５ｃａＣおよび／または５ｆＣをＤＨＵへ変換する前記工程が、前記核酸試料を還元剤に接触させることを含む、項目１〜６、および１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記還元剤が、ピリジンボラン、２−ピコリンボラン（ｐｉｃ−ＢＨ３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリドからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記還元剤が、ピリジンボラン、または２−ピコリンボランである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記修飾標的核酸の配列を特定する前記工程が、鎖終結配列決定、マイクロアレイ、高処理量配列決定、および制限酵素分析のうちの一つ以上を含む、項目１〜６、および１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記核酸がＤＮＡである、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記核酸がＲＮＡである、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
2021509587.tif 000026
【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021509587.tif 000054
2021509587.tif 000055
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