(57)【要約】  遺伝子編集のための組成物および方法。一部の実施形態では、編集効率の改善、免疫原性の低下、または他の利益のうちの1つまたは複数を提供し得る、Cas9をコードするポリヌクレオチドが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、その最小ウリジン含有量から、前記最小ウリジン含有量の150％の範囲のウリジン含有量を有する、mRNA。
【請求項２】
RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量から、前記最小ウリジンジヌクレオチド含有量の150％の範囲のウリジンジヌクレオチド含有量を有する、mRNA。
【請求項３】
RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、その最小ウリジン含有量から、最小アデニン含有量の150％の範囲のアデニン含有量を有する、mRNA。
【請求項４】
RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量から、前記最小アデニンジヌクレオチド含有量の150％の範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有する、mRNA。
【請求項５】
配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含むmRNAであって、前記mRNAは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む、mRNA。
【請求項６】
RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、少なくともその最初の30、50、70、100、150、200、250または300ヌクレオチドにわたり、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する、mRNA。
【請求項７】
前記オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75％は、（i）表1、表2または表3に列記されるコドン、または（ii）表4に列記されるコドンのセット、である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項８】
RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAであって、前記オープンリーディングフレームは、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75％は、表1、表2または表3に列記されるコドン、または（ii）表4に列記されるコドンのセットである、前記mRNA。
【請求項９】
前記オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75％は、表4の低U1セットのコドンである、請求項7または8に記載のmRNA。
【請求項１０】
前記オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75％は、表4の低Aセットのコドンである、請求項7または8に記載のmRNA。
【請求項１１】
前記オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75％は、表4の低A/Uセットのコドンである、請求項7または8に記載のmRNA。
【請求項１２】
前記オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、前記コドンの少なくとも75％は、表4の長半減期セットのコドンである、請求項7または8に記載のmRNA。
【請求項１３】
前記コドンの少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%が、（i）表1、表2または表3に列記されるコドン、または（ii）表4に列記されるコドンのセットである、請求項7〜12のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項１４】
前記オープンリーディングフレームが、少なくともその最初の30、50、70、100、150、200、250または300ヌクレオチドにわたり、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する、請求項1〜5または7〜13のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項１５】
前記オープンリーディングフレームが、その配列の少なくとも最初の10%、12%、15%、20%、25%、30%または35%にわたり、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項１６】
前記mRNAが、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65または66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項1〜4または6〜15のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項１７】
前記オープンリーディングフレームが、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量から、前記最小ウリジンジヌクレオチド含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のウリジンジヌクレオチド含有量を有する、請求項1〜16のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項１８】
前記オープンリーディングフレームが、その最小ウリジン含有量から、前記最小ウリジン含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のウリジン含有量を有する、請求項1〜17のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項１９】
前記オープンリーディングフレームが、その最小ウリジン含有量から、最小アデニン含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のアデニン含有量を有する、請求項1〜18のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項２０】
前記オープンリーディングフレームが、その最小アデニンジヌクレオチド含有量から、前記最小アデニンジヌクレオチド含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有する、請求項1〜19のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項２１】
配列番号32、34、36、38、41または75-77のいずれか1つに対し、少なくとも90％の同一性を有する5’UTRを含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項２２】
配列番号33、35、37、39または40のいずれか1つに対し、少なくとも90％の同一性を有する3’UTRを含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項２３】
前記mRNAが、同じ源に由来する5’UTRと3’UTRを含む、請求項21または22に記載のmRNA。
【請求項２４】
Cap0、Cap1およびCap2から選択される5’キャップを含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項２５】
前記オープンリーディングフレームが、哺乳動物におけるmRNAの翻訳を増加させるコドンを有する、請求項1〜24のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項２６】
前記オープンリーディングフレームが、哺乳動物の特定の器官におけるmRNAの翻訳を増加させるコドンを有する、請求項25に記載のmRNA。
【請求項２７】
前記器官が、肝臓である、請求項26に記載のmRNA。
【請求項２８】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項25〜27のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項２９】
前記コドンが、配列番号5からなる配列を有するORFを含むmRNAの翻訳と比較して、前記哺乳動物におけるmRNAの翻訳を増加させる、請求項25〜28のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項３０】
前記mRNAが、医薬組成物中で哺乳動物に投与されたときに、前記哺乳動物が、最小ウリジン含有量の150％よりも高い、Cas9ヌクレアーゼをコードするORFを含むmRNAを投与された哺乳動物よりも少なくとも5倍低いサイトカイン反応を呈する、請求項1〜29のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項３１】
最小ウリジン含有量の150％よりも高い、Cas9ヌクレアーゼをコードする前記ORFを含む前記mRNAが、配列番号5からなる配列を有する、請求項30に記載のmRNA。
【請求項３２】
前記RNA誘導型DNA結合剤が、二本鎖エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項1〜31のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項３３】
前記RNA誘導型DNA結合剤が、Casクリベースを含む、請求項32に記載のmRNA。
【請求項３４】
前記RNA誘導型DNA結合剤が、ニッカーゼ活性を有する、請求項1〜33のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項３５】
前記RNA誘導型DNA結合剤が、Casニッカーゼを含む、請求項34に記載のmRNA。
【請求項３６】
前記RNA誘導型DNA結合剤が、dCas DNA結合ドメインを含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項３７】
前記Casクリベース、CasニッカーゼまたはdCas DNA結合ドメインが、Cas9クリベース、Cas9ニッカーゼまたはdCas9 DNA結合ドメインである、請求項33または35〜36のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項３８】
前記コードされるRNA誘導型DNA結合剤が、核局在シグナル（NLS）を含む、請求項1〜37のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項３９】
前記NLSが、前記RNA誘導型DNA結合剤のC末端に結合されている、請求項38に記載のmRNA。
【請求項４０】
前記NLSが、前記RNA誘導型DNA結合剤のN末端に結合されている、請求項38に記載のmRNA。
【請求項４１】
前記NLSが、配列番号78〜91のいずれか1つに対し、少なくとも80%、85%、90%または95%の同一性を有する配列を含む、請求項38〜40のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項４２】
前記NLSが、配列番号78〜91のいずれか1つの配列を含む、請求項38〜40のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項４３】
前記NLSが、配列番号92〜104のいずれか1つの配列に対し、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または100%の同一性を有する配列によりコードされる、請求項38〜42のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項４４】
前記mRNAが、配列番号4、7または9に対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項４５】
前記mRNAが、配列番号4、7または9に対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項４６】
前記mRNAが、配列番号4、7または9に対し、少なくとも98%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項４７】
前記mRNAが、配列番号4、7または9に対し、100%同一の配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項４８】
前記mRNAが、配列番号111、114または117に対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項４９】
前記mRNAが、配列番号111、114または117に対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項５０】
前記mRNAが、配列番号111、114または117に対し、少なくとも98%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項５１】
前記mRNAが、配列番号112、122または125に対し、100%同一の配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項５２】
前記mRNAが、配列番号112、122または125に対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項５３】
前記mRNAが、配列番号112、122または125に対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項５４】
前記mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項５５】
前記mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175に対し少なくとも95％の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項５６】
前記mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175に対し少なくとも98％の同一性を有する配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項５７】
前記mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107-175に対し100％同一の配列を含む、請求項37〜43のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項５８】
前記mRNAが、配列番号3、6、8または186〜196のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項37〜57のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項５９】
前記RNA誘導型DNA結合剤が、異種機能性ドメインをさらに含む、請求項1〜58のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項６０】
前記異種機能性ドメインが、Foklヌクレアーゼである、請求項59に記載のmRNA。
【請求項６１】
前記異種機能性ドメインが、転写制御ドメインである、請求項59に記載のmRNA。
【請求項６２】
前記mRNAの有効量が、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに前記哺乳動物に投与されたときに、前記哺乳動物の肝細胞から取得されたゲノムDNAの少なくとも50％において、TTR座位中にindelが形成される、請求項1〜61のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項６３】
前記mRNAの有効量が、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに前記哺乳動物に投与されたときに、前記哺乳動物の血清中のTTR濃度が少なくとも50％減少する、請求項1〜62のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項６４】
ウリジンの少なくとも10％が、改変ウリジンで置換される、請求項1〜63のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項６５】
前記改変ウリジンが、N1-メチル-シュードウリジン、シュードウリジン、5-メトキシウリジン、または5-ヨードウリジンのうちの1つまたは複数である、請求項64に記載のmRNA。
【請求項６６】
前記改変ウリジンが、N1-メチル-シュードウリジンまたは5-メトキシウリジンのうちの1つまたは両方である、請求項64に記載のmRNA。
【請求項６７】
前記改変ウリジンが、N1-メチル-シュードウリジンである、請求項64に記載のmRNA。
【請求項６８】
前記改変ウリジンが、5-メトキシウリジンである、請求項64に記載のmRNA。
【請求項６９】
ウリジンの15％〜45％が、前記改変ウリジンで置換される、請求項64〜68のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項７０】
ウリジンの少なくとも20％または少なくとも30％が、前記改変ウリジンで置換される、請求項64〜68のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項７１】
ウリジンの少なくとも80％または少なくとも90％が、前記改変ウリジンで置換される、請求項70に記載のmRNA。
【請求項７２】
100％のウリジンが、前記改変ウリジンで置換される、請求項70に記載のmRNA。
【請求項７３】
前記mRNAの有効量が、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに前記哺乳動物に投与されたときに、前記哺乳動物の肝細胞から取得されたゲノムDNAの少なくとも70％または少なくとも90％において、TTR座位中にindelが形成される、請求項64〜72のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項７４】
前記mRNAが、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに前記哺乳動物に投与されたときに、前記哺乳動物の血清中のTTR濃度が少なくとも70％または少なくとも90％減少する、請求項64〜73のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項７５】
前記動物が、マウスであり、前記ガイドRNAが、配列番号42からなる配列を有する、請求項62、63、71または72に記載のmRNA。
【請求項７６】
前記動物が、ラットであり、前記ガイドRNAが、配列番号69からなる配列を有する、請求項62、63、71または72に記載のmRNA。
【請求項７７】
前記mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜76のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項７８】
前記mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜77のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項７９】
前記mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも98%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜78のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項８０】
前記mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜79のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項８１】
前記mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、100%の同一性を有する配列を含む、請求項1〜80のいずれか1項に記載のmRNA。
【請求項８２】
請求項1〜81のいずれか1項に記載のmRNAをコードする配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物。
【請求項８３】
請求項82に記載の発現構築物を含むプラスミド。
【請求項８４】
請求項82に記載の発現構築物または請求項83に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項８５】
請求項82に記載の発現構築物または請求項83に記載のプラスミドと、RNAポリメラーゼを、mRNAの転写が許容可能な条件下で接触させることを含む、前記mRNAを調製する方法。
【請求項８６】
前記接触工程が、インビトロで実施される、請求項85に記載の方法。
【請求項８７】
請求項1〜81のいずれか1項に記載のmRNAと、少なくとも1つのガイドRNAを含む組成物。
【請求項８８】
請求項1〜81のいずれか1項に記載のmRNAを含む脂質ナノ粒子。
【請求項８９】
請求項1〜81のいずれか1つに記載のmRNAと、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項９０】
少なくとも1つのガイドRNAをさらに含む、請求項88に記載の脂質ナノ粒子、または請求項89に記載の医薬組成物。
【請求項９１】
前記少なくとも1つのガイドRNAが、TTRを標的とする、請求項87〜90のいずれか1項に記載の組成物または脂質ナノ粒子。
【請求項９２】
請求項1〜83または87〜91のいずれか1項に記載のmRNA、発現構築物、組成物、または脂質ナノ粒子と、細胞を接触させることを含む、ゲノムを編集する方法または標的遺伝子を改変する方法。
【請求項９３】
ゲノム編集のため、または標的遺伝子の改変のための、請求項1〜83または87〜91のいずれか1項に記載のmRNA、発現構築物、組成物、または脂質ナノ粒子の使用。
【請求項９４】
ゲノム編集のため、または標的遺伝子の改変のための医薬品の製造のための、請求項1〜83または87〜91のいずれか1項に記載のmRNA、発現構築物、組成物、または脂質ナノ粒子の使用。
【請求項９５】
前記ゲノム編集または前記標的遺伝子の改変が、肝臓の細胞で発生する、請求項92〜94のいずれか1項に記載の方法または使用。
【請求項９６】
前記肝臓の細胞が、肝細胞である、請求項95に記載の方法または使用。
【請求項９７】
前記ゲノム編集または前記標的遺伝子の改変が、インビボである、請求項92〜96のいずれか1項に記載の方法または使用。
【請求項９８】
前記ゲノム編集または前記標的遺伝子の改変が、単離細胞中または培養細胞中である、請求項92〜97のいずれか1項に記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2017年9月29日に出願され、その全体が参照により本明細書に援用される米国仮特許出願第62/556,144号明細書の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる配列表を含む。当該ASCIIコピーは、2018年9月28日に作成され、2018-09-28_01155-0020-00PCT_ST25.txtという名称であり、963,200バイトのサイズである。
【０００３】
本開示は、RNA誘導型DNA結合剤（RNA-guided DNA binding agents）、例えばCRISPR-Casシステムおよびそのサブユニットを含むゲノム編集用のポリヌクレオチド、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
例えばCRISPR-CasシステムなどのRNA誘導型DNA結合剤を使用して、真核細胞およびインビボを含む、標的化ゲノム編集を行うことができる。そうした編集は、特定の有害性のあるアレルを不活化させることができる、または特定の有害性のある点変異を修正することができることが示されている。この剤は、剤をコードするmRNAを提供することにより、原位置（in situ）で発現させることができる。しかしながら既存の方法では所望するよりも低い編集効率であるか、または望ましくない免疫原性がある場合があり、例えば望ましくないサイトカインレベルの上昇を誘発させる場合がある。
【０００５】
ゆえにゲノム編集用のポリヌクレオチド、組成物および方法の改善が必要とされている。本開示は、例えば編集効率の改善または免疫原性の低下（例えば投与時のサイトカイン上昇の低下）のうちの少なくとも1つといった1つまたは複数の利益をもたらすゲノム編集用の組成物および方法を提供すること、または少なくとも公衆に有用な選択を与えることを目的としている。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするポリヌクレオチドが提供され、この場合においてそのコドン利用、非コード配列（例えばUTR）、異種ドメイン（例えばNLS）および／またはヌクレオチド含有量のうちの1つまたは複数は、本明細書に開示される方法において既存のポリヌクレオチドとは異なっている。そうした特性により、例えば上述の利益をもたらし得ることが見出された。一部の実施形態では、編集効率の改善は、哺乳動物の例えば肝臓もしくは肝細胞などの臓器または細胞型で発生するか、またはそれらに特異的である。
【発明の概要】
【０００６】
実施形態1は、RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであり、この場合において当該オープンリーディングフレームは、その最小ウリジン含有量から、最小ウリジン含有量の150％の範囲のウリジン含有量を有する。
【０００７】
実施形態2は、RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであり、この場合において当該オープンリーディングフレームは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量から、最小ウリジンジヌクレオチド含有量の150％の範囲のウリジンジヌクレオチド含有量を有する。
【０００８】
実施形態3は、RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであり、この場合において当該オープンリーディングフレームは、その最小ウリジン含有量から、最小アデニン含有量の150％の範囲のアデニン含有量を有する。
【０００９】
実施形態4は、RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであり、この場合において当該オープンリーディングフレームは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量から、最小アデニンジヌクレオチド含有量の150％の範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有する。
【００１０】
実施形態5は、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含むmRNAであり、この場合において当該mRNAは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００１１】
実施形態6は、RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含むmRNAであり、この場合において当該オープンリーディングフレームは、少なくともその最初の30、50、70、100、150、200、250または300ヌクレオチドにわたり、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する。
【００１２】
実施形態7は、当該オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、当該コドンの少なくとも75％は、（i）表1、表2または表3に列記されるコドン、または（ii）表4に列記されるコドンのセット、である、前述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００１３】
実施形態8は、RNA誘導型DNA結合剤をコードするオープンリーディングフレームを含む、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAであり、この場合において当該オープンリーディングフレームは、コドンのセットからなり、当該コドンの少なくとも75％は、表1、表2または表3に列記されるコドン、または（ii）表4に列記されるコドンのセットである。
【００１４】
実施形態9は、当該オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、当該コドンの少なくとも75％は、表4の低U1セットのコドンである、実施形態7または8に記載のmRNAである。
【００１５】
実施形態10は、当該オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、当該コドンの少なくとも75％は、表4の低Aセットのコドンである、実施形態7または8に記載のmRNAである。
【００１６】
実施形態11は、当該オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、当該コドンの少なくとも75％は、表4の低A/Uセットのコドンである、実施形態7または8に記載のmRNAである。
【００１７】
実施形態12は、当該オープンリーディングフレームが、コドンのセットからなり、当該コドンの少なくとも75％は、表4の長半減期セットのコドンである、実施形態7または8に記載のmRNAである。
【００１８】
実施形態13は、当該コドンの少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%が、（i）表1、表2または表3に列記されるコドン、または（ii）表4に列記されるコドンのセットである、実施形態7〜12のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００１９】
実施形態14は、当該オープンリーディングフレームが、少なくともその最初の30、50、70、100、150、200、250または300ヌクレオチドにわたり、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する、実施形態1〜5または7〜13のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００２０】
実施形態15は、当該オープンリーディングフレームが、その配列の少なくとも最初の10%、12%、15%、20%、25%、30%または35%にわたり、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する、前述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００２１】
実施形態16は、当該mRNAが、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65または66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、実施形態1〜4または6〜15のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００２２】
実施形態17は、当該オープンリーディングフレームが、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量から、最小ウリジンジヌクレオチド含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のウリジンジヌクレオチド含有量を有する、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００２３】
実施形態18は、当該オープンリーディングフレームが、その最小ウリジン含有量から、最小ウリジン含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のウリジン含有量を有する、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００２４】
実施形態19は、当該オープンリーディングフレームが、その最小ウリジン含有量から、最小アデニン含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のアデニン含有量を有する、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００２５】
実施形態20は、当該オープンリーディングフレームが、その最小アデニンジヌクレオチド含有量から、最小アデニンジヌクレオチド含有量の101%、102%、103%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%または150%の範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有する、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００２６】
実施形態21は、配列番号32、34、36、38、41または75〜77のいずれか1つに対し、少なくとも90％の同一性を有する5’UTRを含む、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００２７】
実施形態22は、配列番号33、35、37、39または40のいずれか1つに対し、少なくとも90％の同一性を有する3’UTRを含む、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００２８】
実施形態23は、当該mRNAが、同じ源に由来する5’UTRと3’UTRを含む、実施形態21または22に記載のmRNAである。
【００２９】
実施形態24は、Cap0、Cap1およびCap2から選択される5’キャップを含む、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００３０】
実施形態25は、当該オープンリーディングフレームが、哺乳動物におけるmRNAの翻訳を増加させるコドンを有する、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００３１】
実施形態26は、当該オープンリーディングフレームが、哺乳動物の特定の器官におけるmRNAの翻訳を増加させるコドンを有する、実施形態25に記載のmRNAである。
【００３２】
実施形態27は、当該器官が、肝臓である、実施形態26に記載のmRNAである。
【００３３】
実施形態28は、当該哺乳動物が、ヒトである、実施形態25〜27のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００３４】
実施形態29は、当該コドンが、配列番号5からなる配列を有するORFを含むmRNAの翻訳と比較して、哺乳動物におけるmRNAの翻訳を増加させる、実施形態25〜28のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００３５】
実施形態30は、当該mRNAが、医薬組成物中で哺乳動物に投与されたときに、当該哺乳動物が、最小ウリジン含有量の150％よりも高い、Cas9ヌクレアーゼをコードするORFを含むmRNAを投与された哺乳動物よりも少なくとも5倍低いサイトカイン反応を呈する、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００３６】
実施形態31は、最小ウリジン含有量の150％よりも高い、Cas9ヌクレアーゼをコードするORFを含むmRNAが、配列番号5からなる配列を有する、実施形態30に記載のmRNAである。
【００３７】
実施形態32は、当該RNA誘導型DNA結合剤が、二本鎖エンドヌクレアーゼ活性を有する、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００３８】
実施形態33は、当該RNA誘導型DNA結合剤が、Casクリベース（cleavase）を含む、実施形態32に記載のmRNAである。
【００３９】
実施形態34は、当該RNA誘導型DNA結合剤が、ニッカーゼ活性を有する、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００４０】
実施形態35は、当該RNA誘導型DNA結合剤が、Casニッカーゼを含む、実施形態34に記載のmRNAである。
【００４１】
実施形態36は、当該RNA誘導型DNA結合剤が、dCas DNA結合ドメインを含む、実施形態1〜31のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００４２】
実施形態37は、当該Casクリベース、CasニッカーゼまたはdCas DNA結合ドメインが、Cas9クリベース、Cas9ニッカーゼまたはdCas9 DNA結合ドメインである、実施形態33または35〜36のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００４３】
実施形態38は、当該コードされるRNA誘導型DNA結合剤が、核局在シグナル（NLS）を含む、上述の実施形態のいずれか1つに記載に記載のmRNAである。
【００４４】
実施形態39は、当該NLSが、当該RNA誘導型DNA結合剤のC末端に結合されている、実施形態38に記載のmRNAである。
【００４５】
実施形態40は、当該NLSが、当該RNA誘導型DNA結合剤のN末端に結合されている、実施形態38に記載のmRNAである。
【００４６】
実施形態41は、当該NLSが、配列番号78〜91のいずれか1つに対し、少なくとも80%、85%、90%または95%の同一性を有する配列を含む、実施形態38〜40のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００４７】
実施形態42は、当該NLSが、配列番号78〜91のいずれか1つの配列を含む、実施形態38〜40のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００４８】
実施形態43は、当該NLSが、配列番号92〜104のいずれか1つの配列に対し、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または100%の同一性を有する配列によりコードされる、実施形態38〜42のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００４９】
実施形態44は、当該mRNAが、配列番号4、7または9に対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００５０】
実施形態45は、当該mRNAが、配列番号4、7または9に対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００５１】
実施形態46は、当該mRNAが、配列番号4、7または9に対し、少なくとも98%の同一性を有する配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００５２】
実施形態47は、当該mRNAが、配列番号4、7または9に対し、100％同一の配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００５３】
実施形態48は、当該mRNAが、配列番号111、114または117に対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００５４】
実施形態49は、当該mRNAが、配列番号111、114または117に対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００５５】
実施形態50は、当該mRNAが、配列番号111、114または117に対し、少なくとも98%の同一性を有する配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００５６】
実施形態51は、当該mRNAが、配列番号112、122または125に対し、100％同一の配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００５７】
実施形態52は、当該mRNAが、配列番号112、122または125に対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００５８】
実施形態53は、当該mRNAが、配列番号112、122または125に対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００５９】
実施形態54は、当該mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００６０】
実施形態55は、当該mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175に対し少なくとも95％の同一性を有する配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００６１】
実施形態56は、当該mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175に対し少なくとも98％の同一性を有する配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００６２】
実施形態57は、当該mRNAが、配列番号10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175に対し100％同一の配列を含む、実施形態37〜43のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００６３】
実施形態58は、当該mRNAが、配列番号3、6、8または186〜196のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、実施形態37〜57のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００６４】
実施形態59は、当該RNA誘導型DNA結合剤が、異種機能性ドメインをさらに含む、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００６５】
実施形態60は、当該異種機能性ドメインが、Foklヌクレアーゼである、実施形態59に記載のmRNAである。
【００６６】
実施形態61は、当該異種機能性ドメインが、転写制御ドメインである、実施形態59に記載のmRNAである。
【００６７】
実施形態62は、当該mRNAの有効量が、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに哺乳動物に投与されたときに、当該哺乳動物の肝細胞から取得されたゲノムDNAの少なくとも50％において、TTR座位中にindelが形成される、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００６８】
実施形態63は、当該mRNAの有効量が、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに哺乳動物に投与されたときに、当該哺乳動物の血清中のTTR濃度が少なくとも50％減少する、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００６９】
実施形態64は、ウリジンの少なくとも10％が、改変ウリジンで置換される、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００７０】
実施形態65は、当該改変ウリジンが、N1-メチル-シュードウリジン、シュードウリジン、5-メトキシウリジン、または5-ヨードウリジンのうちの1つまたは複数である、実施形態64に記載のmRNAである。
【００７１】
実施形態66は、当該改変ウリジンが、N1-メチル-シュードウリジンまたは5-メトキシウリジンのうちの1つまたは両方である、実施形態64に記載のmRNAである。
【００７２】
実施形態67は、当該改変ウリジンが、N1-メチル-シュードウリジンである、実施形態64に記載のmRNAである。
【００７３】
実施形態68は、当該改変ウリジンが、5-メトキシウリジンである、実施形態64に記載のmRNAである。
【００７４】
実施形態69は、ウリジンの15％〜45％が、改変ウリジンで置換される、実施形態64〜68のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００７５】
実施形態70は、ウリジンの少なくとも20％または少なくとも30％が、改変ウリジンで置換される、実施形態64〜68のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００７６】
実施形態71は、ウリジンの少なくとも80％または少なくとも90％が、改変ウリジンで置換される、実施形態70つに記載のmRNAである。
【００７７】
実施形態72は、100％のウリジンが、改変ウリジンで置換される、実施形態70に記載のmRNAである。
【００７８】
実施形態73は、当該mRNAの有効量が、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに哺乳動物に投与されたときに、当該哺乳動物の肝細胞から取得されたゲノムDNAの少なくとも70％または少なくとも90％において、TTR座位中にindelが形成される、実施形態64〜72のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００７９】
実施形態74は、当該mRNAが、脂質ナノ粒子を含有する医薬組成物中で哺乳動物のTTR遺伝子を標的とするガイドRNAとともに哺乳動物に投与されたときに、当該哺乳動物の血清中のTTR濃度が少なくとも70％または少なくとも90％減少する、実施形態64〜73のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００８０】
実施形態75は、当該動物が、マウスであり、当該ガイドRNAが、配列番号42からなる配列を有する、実施形態62、63、71または72に記載のmRNAである。
【００８１】
実施形態76は、当該動物が、ラットであり、当該ガイドRNAが、配列番号69からなる配列を有する、実施形態62、63、71または72に記載のmRNAである。
【００８２】
実施形態77は、当該mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００８３】
実施形態78は、当該mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００８４】
実施形態79は、当該mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも98%の同一性を有する配列を含む、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００８５】
実施形態80は、当該mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００８６】
実施形態81は、当該mRNAが、配列番号43、44、51、53、55〜61または176〜185のいずれか1つに対し、100％の同一性を有する配列を含む、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAである。
【００８７】
実施形態82は、上述の実施形態のいずれか1つに記載のmRNAをコードする配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物である。
【００８８】
実施形態83は、実施形態82に記載の発現構築物を含むプラスミドである。
【００８９】
実施形態84は、実施形態82に記載の発現構築物または実施形態83に記載のプラスミドを含む宿主細胞である。
【００９０】
実施形態85は、実施形態82に記載の発現構築物または実施形態83に記載のプラスミドと、RNAポリメラーゼを、mRNAの転写が許容可能な条件下で接触させることを含む、mRNAを調製する方法である。
【００９１】
実施形態86は、当該接触工程が、インビトロで実施される、実施形態85に記載の方法である。
【００９２】
実施形態87は、実施形態1〜81のいずれか1つに記載のmRNAと、少なくとも1つのガイドRNAを含む組成物である。
【００９３】
実施形態88は、実施形態1〜81のいずれか1つに記載のmRNAを含む脂質ナノ粒子である。
【００９４】
実施形態89は、実施形態1〜81のいずれか1つに記載のmRNAと、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。
【００９５】
実施形態90は、少なくとも1つのガイドRNAをさらに含む、実施形態88に記載の脂質ナノ粒子または実施形態89に記載の医薬組成物である。
【００９６】
実施形態91は、当該少なくとも1つのガイドRNAが、TTRを標的とする、実施形態87〜90のいずれか1つに記載の組成物または脂質ナノ粒子である。
【００９７】
実施形態92は、請求項1〜83または87〜91のいずれか1項に記載のmRNA、発現構築物、組成物、または脂質ナノ粒子と、細胞を接触させることを含む、ゲノムを編集する方法または標的遺伝子を改変する方法である。
【００９８】
実施形態93は、ゲノム編集のため、または標的遺伝子の改変のための、請求項1〜83または87〜91のいずれか1項に記載のmRNA、発現構築物、組成物、または脂質ナノ粒子の使用である。
【００９９】
実施形態94は、ゲノム編集のため、または標的遺伝子の改変のための医薬品の製造のための、請求項1〜83または87〜91のいずれか1項に記載のmRNA、発現構築物、組成物、または脂質ナノ粒子の使用である。
【０１００】
実施形態95は、当該ゲノム編集または標的遺伝子の改変が、肝臓の細胞で発生する、請求項92〜94のいずれか1項に記載の方法または使用である。
【０１０１】
実施形態96は、当該肝臓の細胞（liver cell）が、肝細胞（hepatocyte）である、請求項95に記載の方法または使用である。
【０１０２】
実施形態97は、当該ゲノム編集または標的遺伝子の改変が、インビボである、請求項92〜96のいずれか1項に記載の方法または使用である。
【０１０３】
実施形態98は、当該ゲノム編集または標的遺伝子の改変が、単離細胞中または培養細胞中である、請求項92〜97のいずれか1項に記載の方法または使用である。
【表Ａ−１】
2021500863.tif 000002
【表Ａ−２】
2021500863.tif 000003
【表Ａ−３】
2021500863.tif 000004
【表Ａ−４】
2021500863.tif 000005
【表Ａ−５】
2021500863.tif 000006
【表Ａ−６】
2021500863.tif 000007
【表Ａ−７】
2021500863.tif 000008
【表Ａ−８】
2021500863.tif 000009
【表Ａ−９】
2021500863.tif 000010
【表Ａ−１０】
2021500863.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１Ａ】図1A〜1Dは、PBS、または0.5もしくは1mg/kg(mpk）の脂質ナノ粒子（LNP）製剤LNP417-LNP421の投与後のIFNアルファ、IL-6、TNFアルファおよびMCP-1のレベルを示す。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【０１０５】
【図２Ａ】図2A〜2Bは、PBS、または0.5もしくは1mpkのLNP製剤LNP417-LNP421の投与後の血清TTRレベルと、肝臓編集の百分率を示す。
【図２Ｂ】同上。
【０１０６】
【図３】図3は、Cas9 DNA構築物からの転写に関する、インビトロ転写（IVT）収率を示す。転写は、非改変のウリジン-5’-三リン酸塩（UTP）もしくはN1-メチル-シュード-UTPの単独（横軸上の0）、指定割合の5-メトキシUTPと混合されたもの（横軸上の20〜80）、または100％ 5-メトキシUTP（100）のいずれかを用いて実施された。3つのバーの各セットについて、左のバーは、N1-メチル-シュード-UTPおよび／または5-メトキシUTPならびに配列番号2を使用した。中心のバーは、非改変UTPおよび／または5-メトキシUTPならびに配列番号2を使用した。そして右のバーは、非改変UTPおよび／または5-メトキシUTPならびに配列番号1を使用した。
【０１０７】
【図４】図4は、Cas9（配列番号2）および最適化Cas9（配列番号1）のDNA構築物に対する、インビトロ転写（IVT）結果からのmRNAの純度を示す。非改変のウリジン-5’-三リン酸塩（UTP）（四角）またはN1-メチル-シュード-UTP（暗色の円）の単独（0）、または指定割合の5-メトキシUTPと混合されたもの（20〜80）、または100％ 5-メトキシUTP（100）を用いて、配列番号2のCas9配列から転写が行われた。非改変のUTP（0）、または指定割合の5-メトキシUTPと混合されたもの（20〜80）、または100％ 5-メトキシUTP（100）を用いて、配列番号1のCas9配列（明色の円）から転写が行われた。各コード配列には、核局在シグナルが含まれた。
【０１０８】
【図５】図5A〜5Dは、抗dsRNA抗体のドットブロットの結果を示す。二本鎖RNA対照（A）、UTPおよび／または5-メトキシUTPの存在下で転写されたCas9（B）、UTPおよび／または5-メトキシUTPの存在下で転写された配列番号4を含むCas9 mRNA配列（C）、およびN1-メチル-シュード-UTPおよび／または5-メトキシUTPの存在下で転写されたCas9（D）を用いた結果である。パネル（B）〜（D）は、0〜100％の5-メトキシUTP、および100〜0％のUTPまたはN1-メチルUTPを含有する転写物を用いて実施された。
【０１０９】
【図６】図6Aおよび6Bは、Cas9 mRNAで処置されたNeuro 2A細胞中のmRNAのインビトロ編集効率を示す。編集の百分率（A)または編集のEC50（B）として表されている。Cas9 mRNA中の5-メトキシUTPの濃度増加の効果を評価した。N1-メチル-シュード-UTP（Aの左側の系、Bの暗色の円）もしくは非改変のウリジン-5’-三リン酸塩（UTP）（Aの真ん中の系、Bの四角）の単独（0）、または指定割合の5-メトキシUTPと混合されたもの（20〜80）、または100％ 5-メトキシUTP（100）を用いて、配列番号2のCas9配列から転写が行われた。非改変のUTP（0）、または指定割合の5-メトキシUTPと混合されたもの（20〜80）、または100％ 5-メトキシUTP（100）を用いて、配列番号1のCas9配列（Aの右側の系、Bの明色の円）から転写が行われた。各コード配列には、核局在シグナルが含まれた。
【０１１０】
【図７】図7A〜7Dは、LNP製剤LNP720-LNP724の投与後4時間での血清サイトカインレベルを示す。図7Aのアスタリスクは、少なくとも1つの個別の測定結果が、検出限界を下回ったことを示す。
【０１１１】
【図８】図8Aおよび8Bは、LNP製剤LNP720-LNP724を用いた投与後7日での血清TTRレベル（A）と、肝臓中のTTR編集の百分率（B）を示す。図8Aのアスタリスクは、少なくとも1つの個別の測定結果が、検出限界を下回ったことを示す。
【０１１２】
【図９】図9は、1mpkのLNP製剤LNP720-LNP724を用いた投与後7日での脾臓中のTTR編集の百分率を示す。
【０１１３】
【図１０】図10は、LNP製剤のLNP720-LNP724およびLNP685を用いた、初代マウス肝細胞（PMH）におけるTTR編集の百分率を示す。
【０１１４】
【図１１Ａ】図11Aおよび11Bは、ORFが配列番号5または4の配列を有するCas9 mRNAを含む製剤の投与後の血清TTRレベルを示す。TTRデータは、TSS-処置動物中のTTRレベルと比較した、血清レベル（A)、または百分率（B)として表されている。
【図１１Ｂ】同上。
【０１１５】
【図１２】図12は、ORFが配列番号5または4の配列を有するCas9 mRNAを含む、5mpkまたは2mpkの製剤の投与後の肝臓におけるTTR編集の百分率を示す。
【０１１６】
【図１３Ａ】図13A〜Eは、指定されるLNP製剤の投与後の、血清TTRレベルと、肝臓中のTTR編集の百分率を示す。
【図１３Ｂ】同上。
【図１３Ｃ】同上。
【図１３Ｄ】同上。
【図１３Ｅ】同上。
【０１１７】
【図１４】図14は、0.3、1、3または10ngのLNP815-821、823、または824を用いて処置された初代マウス肝細胞（PMH）中のTTR編集の百分率を示す。
【０１１８】
【図１５Ａ】図15A〜Bは、ORFが配列番号5または4の配列を有するCas9 mRNAを、指定されるガイド：Cas9の比率および量で含有するLNP製剤の投与後の血清TTRレベルを示す。
【図１５Ｂ】同上。
【０１１９】
【図１６Ａ】図16A〜Bは、ORFが配列番号5または4の配列を有するCas9 mRNAを、指定されるガイド：Cas9の比率および量で含有するLNP製剤の投与後の肝臓中のTTR編集の百分率を示す。
【図１６Ｂ】同上。
【０１２０】
【図１７Ａ】図17A〜Bは、ORFが配列番号5または4の配列を有するCas9 mRNAを、指定されるガイド：Cas9の比率および量で含有するLNP製剤の投与後の脾臓中のTTR編集の百分率を示す。
【図１７Ｂ】同上。
【０１２１】
【図１８】図18は、ORFが配列番号5または4の配列を有するCas9 mRNAを、指定されるガイド：Cas9の比率で含有するLNP製剤の投与後の肝臓中のCas9発現に関するウェスタンブロットを示す。
【０１２２】
【図１９Ａ】図19A〜Bは、指定される量の指定されるLNP製剤を投与した後の血清TTRレベルを示す。
【図１９Ｂ】同上。
【０１２３】
【図２０】図20は、指定される量の指定されるLNP製剤を投与した後の肝臓中のTTR編集の百分率を示す。
【０１２４】
【図２１Ａ】図21A〜Cは、指定される量の指定されるLNP製剤を投与した後の肝臓の編集（A）および血清TTR（Bの単位はμg/ml、CはTSS対照の百分率として）のレベルを示す。
【図２１Ｂ】同上。
【図２１Ｃ】同上。
【０１２５】
【図２２Ａ】図22A〜Dは、指定される比率および量のLNP製剤の投与後の血清TTRおよび編集結果を示す。
【図２２Ｂ】同上。
【図２２Ｃ】同上。
【図２２Ｄ】同上。
【０１２６】
【図２３】図23は、ORFが指定される配列番号の配列を有するCas9 mRNAを用いた処置後のHep2G細胞中のCas9タンパク質発現を示す。
【０１２７】
【図２４】図24は、ORFが指定される配列番号の配列を有する、指定される濃度のCas9 mRNAを用いた処置後のHepG2細胞中の編集百分率を示す。
【０１２８】
【図２５】図25は、ORFが指定される配列番号の配列を有するCas9 mRNAを含むLNP製剤の投与後の肝臓中のCas9発現を示す。
【０１２９】
【図２６】図26は、ORFが指定される配列番号の配列を有するCas9 mRNAを含むLNP製剤の投与後のTTR座位でのインビボ編集の結果を示す。
【０１３０】
【図２７Ａ】図27A〜Bは、ORFが指定される配列番号の配列を有するCas9 mRNAを含むLNP製剤の投与後の血清TTR（A）および血清TTR（％TSS）（B）を示す。
【図２７Ｂ】同上。
【０１３１】
【図２８】図28は、ORFが指定される配列番号の配列を有するCas9 mRNAを指定される量で含むLNP製剤の投与後のインビボでの肝臓編集を示す。
【０１３２】
【図２９Ａ】図29A〜Bは、ORFが指定される配列番号の配列を有するCas9 mRNAを指定される量で含むLNP製剤の投与後の血清TTRレベル（A）および血清TTR（％TSS）（B）を示す。
【図２９Ｂ】同上。
【０１３３】
【図３０Ａ】図30A〜Bは、転写物が指定される配列番号の配列を有するCas9 mRNAを含むLNP製剤の投与後の血清TTRレベル（A）および肝臓中の編集％（B）を示す。
【０１３４】
【図３０Ｂ】同上。
【図３１】図31は、指定されるキャップおよび転写物配列を有するmRNAを含み、指定される投与量で製剤化されたLNPの投与後の肝臓中のTTR編集の百分率を示す。
【０１３５】
【図３２】図32は、指定されるキャップおよび転写物配列を有するmRNAを含み、指定される量で製剤化されたLNPの投与後の血清TTRレベルを示す。
【０１３６】
【図３３】図33は、ORFが、指定されるNLSを含み、指定される配列番号の配列を有するCas9をコードするmRNAで製剤化されたLNPの投与後の肝臓中のTTR編集の百分率を示す。
【０１３７】
【図３４Ａ】図34A〜Bは、ORFが、指定されるNLSを含み、指定される配列番号の配列を有するCas9をコードするmRNAで製剤化されたLNPの投与後の血清TTRレベル（A）および血清TTR（％TSS）（B）を示す。
【図３４Ｂ】同上。
【０１３８】
【図３５】図35は、Cas9をコードし、様々な種類および活性レベルのNLS配列を含むmRNAで製剤化されたLNPの投与後のNLS活性と編集効率の相関を示す。
【０１３９】
【図３６】図36は、指定される配列および指定される5’UTRを有するmRNA転写物からの、HepG2細胞におけるCas9タンパク質発現のレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４０】
参照は、本発明の特定の実施形態を詳細にするために作成されるものであり、その実施例は、添付の図面において図示されている。本発明は図示される実施形態と併せて解説されるが、本発明を当該実施形態に限定する意図はないことを理解されたい。むしろ本発明は、添付の請求の範囲により規定される本発明の範囲内に含まれ得るすべての代替物、改変および均等を包含することが意図される。
【０１４１】
詳細な教示を記載する前に、本開示は具体的な組成物または方法の工程に限定されず、それらは変化し得るものとして理解されたい。本明細書および添付の請求の範囲において使用される場合、文脈から別段であることが明白でない限り、単数形（a、anおよびthe）は複数の指示対象も含むことに注意されたい。ゆえに例えば「複合体（a conjugate）」という言及は、複数の複合体（a plurality of conjugates）を含み、「細胞（a cell）」という言及は複数の細胞（a plurality of cells）を含む。
【０１４２】
数値範囲は、その範囲を規定する数字を含む。測定された値および測定可能値は、有効桁と測定尺度に関する誤差を考慮した概算であることを理解されたい。また「含有する」、「包含する」、「含む」の使用は、限定であることは意図されない。前述の概要および詳細な説明の両方ともが例示であり、解説目的のみであること、および本教示の限定ではないことを理解されたい。
【０１４３】
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定されたときの特定の値に対する許容可能な誤差を意味し、その値がどのように測定されたか、もしくは決定されたかに、または記載される内容の特性に実質的な影響を与えない変動量の程度に依存し、例えば10％、5％、2％または1％以内である。したがって逆であることが示唆されない限り、以下の明細書および添付の請求の範囲に記載される数値パラメーターは、取得しようとされる望ましい特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、および請求の範囲に対する均等の原理の適用を限定する試みとしてではなく、各数値パラメーターは少なくとも、報告される有効桁の数値に照らし合わせて、および通常の四捨五入法を適用することで解釈されるものとする。
【０１４４】
上述で具体的に記載されない限り、明細書中の実施形態は、様々な「含む」構成要素を列挙し、そしてまた、列挙される構成要素「からなる」または「本質的にからなる」とも予期される。明細書中の実施形態は、様々な「からなる」構成要素を列挙し、そしてまた、列挙される構成要素を「含む」または「本質的にからなる」としても予期される。そして明細書中の実施形態は、「本質的にからなる」様々な構成要素を列挙し、そしてまた、列挙される構成要素「からなる」または「を含む」としても予期される（このことは、請求の範囲においては、これらの用語の使用に相互交換可能に適用されない）。
【０１４５】
本明細書において使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためのみであり、所望の内容の限定とは決してみなされない。参照により援用されるいずれか文献が、限定されないが本明細書の定義を含む表現内容と矛盾する場合、本明細書の表現内容が統制する。本教示は様々な実施形態と併せて解説されているが、本教示がかかる実施形態に対する限定であることは意図されない。むしろ本教示は様々な代替、改変および均等を包含することが当業者により認識されるであろう。
【０１４６】
Ａ.定義
別段の記載がない限り、本明細書において使用される場合、以下の用語および文言は、以下の意味を有することが意図される。
【０１４７】
「またはそれらの組み合わせ」という用語は、本明細書において使用される場合、当該用語に先行する列記される用語のすべての再配列および組み合わせを指す。例えば「A、B、Cまたはそれらの組み合わせ」は、以下のうちの少なくとも1つを含むことが意図される：A、B、C、AB、AC、BCまたはABC。もし特定の状況下で順序が重要である場合には、BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BACまたはCABも含むことが意図される。この例に続き、当該用語の1つまたは複数の項目または用語の反復を含む組み合わせも明示的に含まれる。例えば、BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなどである。当業者には、文脈から別段であることが明らかでない限り、通常、任意の組み合わせにおいて項目または用語の数に限定はないことが理解されるであろう。
【０１４８】
本明細書において使用される場合、「キット」という用語は、例えば1つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは組成物などの関連する構成要素と、例えば送達デバイス（例えばシリンジ）、溶媒、溶液、緩衝液、説明書もしくは乾燥剤などの1つまたは複数の関連する材料のパッケージされたセットを指す。
【０１４９】
「または」は、包括的な意味で使用される。すなわち、文脈から別段であることが要求されない限り、「および／または」と均等である。
【０１５０】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は本明細書において、主鎖に沿って共に結合される窒素を含む複素環塩基または塩基アナログを有する、従来的なRNA、DNA、RNA-DNA混合物およびそれらのアナログであるポリマーをはじめとするヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含む多重結合性化合物を指すために使用される。核酸の「主鎖」は、様々な結合から構成されていてもよく、糖-ホスホジエステル結合、ペプチド-核酸結合（「ペプチド核酸」またはPNA；PCT国際特許出願公開WO 95/32305）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホン酸結合またはそれらの組み合わせのうちの1つまたは複数を含む様々な結合から構成されてもよい。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または例えば2’メトキシ置換もしくは2’ハライド置換などの置換を含む類似化合物であってもよい。窒素を含む塩基は、従来的な塩基（A、G、C、T、U）、それらのアナログ（例えば5-メトキシウリジン、シュードウリジン、またはN1-メチルシュードウリジンまたはその他などの改変ウリジン）；イノシン；プリンまたはピリミジンの誘導体（例えばN4-メチルデオキシグアノシン、デアザ-またはアザ-プリン、デアザ-またはアザ-ピリミジン、5位または6位に置換基を含むピリミジン塩基（例えば5-メチルシトシン）、2位、6位または8位に置換基を含むプリン塩基、2-アミノ-6-メチルアミノプリン、O6-メチルグアニン、4-チオ-ピリミジン、4-アミノ-ピリミジン、4-ジメチルヒドラジン-ピリミジン、およびO4-アルキル-ピリミジン；米国特許第5,378,825号およびPCT国際特許出願公開WO 93/13121）であってもよい。全体的な検討については、The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11th ed., 1992)を参照のこと。核酸は、1つまたは複数の「脱塩基」残基を含んでもよく、この残基では主鎖がポリマーの位置に窒素を含む塩基を含まない（米国特許第5,585,481号）。核酸は、従来的なRNA糖またはDNA糖、塩基および結合のみを含んでもよく、または従来的な構成要素と置換基（例えば2’メトキシ結合を含む従来的な塩基、または従来的な塩基と1つまたは複数の塩基アナログの両方を含有するポリマー）の両方を含んでもよい。核酸としては、「ロックド核酸」（LNA）、1つまたは複数のLNAヌクレオチドモノマーをRNA模倣糖構造で固定された二環式フラノース単位とともに含有するアナログも挙げられ、これは相補的なRNA配列およびDNA配列に対するハイブリダイゼーションアフィニティを強化する（Vester and Wengel, 2004, Biochemistry 43(42):13233-41）。RNAおよびDNAは異なる糖部分を有しており、RNAではウラシルまたはそのアナログが存在し、DNAではチミンまたはそのアナログが存在することで異なり得る。
【０１５１】
「改変ウリジン」は本明細書において、ウリジンと同じ水素結合アクセプター、およびウリジンとは1つまたは複数の構造的差異を有する、チミジン以外のヌクレオシドを指すために使用される。一部の実施形態では、改変ウリジンは、置換ウリジン、すなわち1つまたは複数の非プロトン置換基（例えばアルコキシ、例えばメトキシ）がプロトンの代わりとなっているウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、シュードウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、置換シュードウリジン、すなわち1つまたは複数の非プロトン置換基（例えばアルキル、例えばメチル）がプロトンの代わりとなっているシュードウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、置換ウリジン、シュードウリジンまたは置換シュードウリジンのうちのいずれかである。
【０１５２】
本明細書において使用される場合、「ウリジン位置」とは、ウリジンまたは改変ウリジンにより占められているポリヌクレオチド中の位置を指す。ゆえに例えば、「ウリジン位置の100％が改変ウリジンである」ポリヌクレオチドは、同じ配列の従来的なRNA（すべての塩基が標準的なA、U、CまたはG塩基）中でウリジンであり得るすべての位置で改変ウリジンを含有する。別段の示唆がない限り、本開示中または本開示に添付される配列の表または配列表のポリヌクレオチド配列中のUは、ウリジンまたは改変ウリジンであってもよい。
【０１５３】
本明細書において使用される場合、第一の配列は、第一の配列と第二の配列のアライメントが、第二の配列のその全体のX％以上の位置が第一の配列との合致を示す場合、第二の配列に対して、「少なくともX％の同一性を有する配列を含む」とみなされる。例えば、AAGAという配列は、AAGという配列に対し、100％の同一性を有する配列を含む。その理由は、第二の配列の3つすべての位置で合致するという点でアライメントは100％の同一性を与えるためである。RNAとDNAの違い（一般的に、チミジンとウリジンの交換、その逆も然り）および例えば改変ウリジンなどのヌクレオシドアナログの存在は、その関連ヌクレオチド（例えばチミジン、ウリジンまたは改変ウリジン）が同じ相補性を有する限りにおいて、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性において差異を生じさせる原因とはならない（例えばチミジン、ウリジンまたは改変ウリジンのすべてに対してアデノシン。別の例は、シトシンと5-メチルシトシンであり、これらは両方とも相補物としてグアノシンを有する）。ゆえに例えば、式中、Xが任意の改変ウリジン、例えばシュードウリジン、N1-メチルシュードウリジン、または5-メトキシウリジンである5'-AXGという配列は、AUGに対して、両方とも同じ配列（5'-CAU）に対して完全に相補的であるという点で、100％同一であるとみなされる。アライメントアルゴリズムの例は、Smith-Waterman and Needleman-Wunschアルゴリズムであり、当分野に公知である。当業者であれば、アライメントされる所与の配列ペアに対し、どのアルゴリズムおよびパラメーター設定を選択するのが適切であるかを理解するであろう。全般的に似た長さ、そしてアミノ酸に関しては＞50％、ヌクレオチドに関しては＞75％の予測同一性の配列に関しては、www.ebi.ac.ukウェブサーバでEBIにより提供されるNeedleman-Wunschアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定のNeedleman-Wunschアルゴリズムが一般的に適している。
【０１５４】
「mRNA」は本明細書において、DNAではなく、ポリペプチドに翻訳され得るオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指すために使用される（すなわち、リボソームとアミノ-アシル化tRNAによる翻訳の基質として役立ち得る）。mRNAは、リボース残基またはそのアナログ、例えば2'-メトキシリボース残基を含むリン酸塩-糖主鎖を含んでもよい。一部の実施形態では、mRNAリン酸塩-糖主鎖の糖は、リボース残基、2’メトキシリボース残基またはそれらの組み合わせから本質的になる。概して、mRNAは、実質的な量のチミジン残基を含有しない（例えば0個のチミジン残基または30、20、10、5、4、3もしくは2個よりも少ないチミジン残基。または10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%もしくは0.1%よりも低いチミジン含有量）。mRNAは、そのウリジン位置の一部またはすべてに改変ウリジンを含有してもよい。
【０１５５】
本明細書において使用される場合、「RNA誘導型DNA結合剤」とは、RNAおよびDNAの結合活性を有するポリペプチドまたはポリペプチド複合体、またはそうした複合体のDNA結合サブユニットを意味する。ここで当該DNA結合活性は配列特異的なものであり、RNAの配列に依存する。RNA誘導型DNA結合剤の例としては、Casクリベース／ニッカーゼおよびその不活化型（dCas DNA結合剤）が挙げられる。「Casヌクレアーゼ」は「Casタンパク質」とも呼ばれており、本明細書において使用される場合、Casクリベース、CasニッカーゼおよびdCas DNA結合剤を包含する。Casクリベース／ニッカーゼおよびdCas DNA結合剤には、III型CRISPRシステムのCsmまたはCmr複合体、そのCas10、Csm1またはCmr2サブユニット、I型CRISPRシステムのCascade複合体、そのCas3サブユニット、そしてクラス2のCasヌクレアーゼが含まれる。本明細書において使用される場合、「クラス2のCasヌクレアーゼ」は、RNA誘導型DNA結合活性を有する一本鎖ポリペプチドであり、例えばCas9ヌクレアーゼまたはCpf1ヌクレアーゼなどがある。クラス2のCasヌクレアーゼには、クラス2のCasクリベースおよびクラス2のCasニッカーゼ（例えばH840A、D10AまたはN863Aバリアント）が含まれ、それらはRNA誘導型のDNAクリベース活性またはニッカーゼ活性をさらに有している。そしてクラス2のdCas DNA結合剤も含まれ、この結合剤ではクリベース／ニッカーゼ活性は不活化されている。クラス2のCasヌクレアーゼとしては例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例えばN497A、R661A、Q695A、Q926Aバリアント)、HypaCas9(例えば、N692A、M694A、Q695A、H698Aバリアント）、eSPCas9(1.0) (例えば、K810A、K1003A、R1060Aバリアント）およびeSPCas9(1.1)(例えば、K848A、K1003A、R1060Aバリアント）のタンパク質およびその改変物が挙げられる。Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015)のCpf1タンパク質は、Cas9のホモログであり、RuvC様ヌクレアーゼドメインを含有する。ZetscheのCpf1配列は、その全体で参照により組み込まれる。例えば、Zetscheの表S1およびS3を参照のこと。「Cas9」には、Spy Cas9、本明細書に列記されるCas9のバリアント、およびその均等物が包含される。例えば、Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015)を参照のこと。
【０１５６】
本明細書において使用される場合、所与のオープンリーディングフレーム（ORF）の「最小ウリジン含有量」は、（a）各位置で最少ウリジンコドンを使用し、そして（b）所与のORFと同じアミノ酸配列をコードする、ORFのウリジン含有量である。所与のアミノ酸に対する最小ウリジンコドンは、最も少ないウリジンを有するコドンである（フェニルアラニンのコドンを除き、通常0または1である。フェニルアラニンの最小ウリジンコドンは2個のウリジンを有する）。改変ウリジン残基は、最小ウリジン含有量の評価の目的に対して、ウリジンと均等であるとみなされる。
【０１５７】
本明細書において使用される場合、所与のオープンリーディングフレーム（ORF）の「最小ウリジンジヌクレオチド含有量」は、（a）各位置で最少ウリジンコドン（上記）を使用し、そして（b）所与のORFと同じアミノ酸配列をコードするORFの可能な限り最も少ないウリジンジヌクレオチド（UU)含有量である。ウリジンジヌクレオチド（UU)含有量は、ORF中のUUジヌクレオチドの計数として絶対値で表されてもよく、またはウリジンジヌクレオチドのウリジンにより占められる位置の百分率として比率ベースで表されてもよい（例えば、AUUAUは、5つのうち2つの位置がウリジンジヌクレオチドのウリジンで占められているため、40％のウリジンジヌクレオチド含有量を有する）。改変ウリジン残基は、最小ウリジンジヌクレオチド含有量の評価の目的に対して、ウリジンと均等であるとみなされる。
【０１５８】
本明細書において使用される場合、所与のオープンリーディングフレーム（ORF）の「最小アデニン含有量」は、（a）各位置で最少アデニンコドンを使用し、そして（b）所与のORFと同じアミノ酸配列をコードする、ORFのアデニン含有量である。所与のアミノ酸に対する最小アデニンコドンは、最も少ないアデニンを含むコドンである（リシンおよびアスパラギンのコドンを除き、通常、0または1である。リシンおよびアスパラギンの最小アデニンコドンは2個のアデニンを有する）。改変アデニン残基は、最小アデニン含有量の評価の目的に対して、アデニンと均等であるとみなされる。
【０１５９】
本明細書において使用される場合、所与のオープンリーディングフレーム（ORF）の「最小アデニンジヌクレオチド含有量」は、（a）各位置で最少アデニンコドン（上記）を使用し、そして（b）所与のORFと同じアミノ酸配列をコードするORFの可能な限り最も少ないアデニンジヌクレオチド（AA)含有量である。アデニンジヌクレオチド（AA)含有量は、ORF中のAAジヌクレオチドの計数として絶対値で表されてもよく、またはアデニンジヌクレオチドのアデニンにより占められる位置の百分率として比率ベースで表されてもよい（例えば、UAAUAは、5つのうち2つの位置がアデニンジヌクレオチドのアデニンで占められているため、40％のアデニンジヌクレオチド含有量を有する）。改変アデニン残基は、最小アデニンジヌクレオチド含有量の評価の目的に対して、アデニンと均等であるとみなされる。
【０１６０】
「ガイドRNA」、「gRNA」および「ガイド」は本明細書において相互交換可能に使用され、crRNA（CRISPR RNAとしても知られている）、またはcrRNAとtrRNA（tracrRNAとしても知られている）の組み合わせのいずれかを指す。crRNAとtrRNAは単一RNA分子として会合してもよく（シングルガイドRNA、sgRNA）、または2つの別個のRNA分子であってもよい（デュアルガイドRNA、dgRNA）。「ガイドRNA」または「gRNA」とは、それぞれの型を指す。trRNAは天然配列であってもよく、または天然配列と比較して改変または変動を伴うtrRNA配列であってもよい。
【０１６１】
本明細書において使用される場合、「ガイド配列」とは、標的配列に相補的で、ガイドRNAを標的配列へと向かわせ、RNA誘導型DNA結合剤による結合または改変（例えば開裂）が発生するよう機能するガイドRNA内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的化配列」または「スペーサー配列」と呼称される場合もある。例えば化膿連鎖球菌（すなわちSpy Cas9）および関連Cas9ホモログ／オルソログの場合、ガイド配列は20塩基対の長さであり得る。それより短い、または長い配列、例えば15-、16-、17-、18-、19-、21-、22-、23-、24-または25-ヌクレオチドの長さの配列も、ガイドとして使用することができる。一部の実施形態では、標的配列は、例えば遺伝子中または染色体上であり、そしてガイド配列に対して相補的である。一部の実施形態では、ガイド配列と、その対応する標的配列の間の相補性または同一性の程度は、約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%であってもよい。一部の実施形態では、ガイド配列と標的領域は、100％の相補性または同一であってもよい。他の実施形態では、ガイド配列と標的領域は、少なくとも1つのミスマッチを含有してもよい。例えばガイド配列と標的配列は、1、2、3または4個のミスマッチを含有してもよく、この場合の標的配列の全長は、少なくとも17、18、19、20塩基対またはそれ以上の塩基対である。一部の実施形態では、ガイド配列と標的領域は、1〜4個のミスマッチを含有してもよく、この場合のガイド配列は、少なくとも17、18、19、20またはそれ以上のヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、ガイド配列と標的領域は、1、2、3または4個のミスマッチを含有してもよく、この場合のガイド配列は、20ヌクレオチドを含有する。
【０１６２】
Casタンパク質の核酸基質は二本鎖核酸であるため、Casタンパク質の標的配列は、ゲノムDNAのプラス鎖およびマイナス鎖の両方を含む（すなわち、所与の配列と、その配列の逆相補）。ゆえにガイド配列は、「標的配列に対して相補的」であると言われており、ガイド配列は、ガイドRNAを標的配列の逆相補に結合させ得ると理解されている。したがって一部の実施形態では、ガイド配列は標的配列の逆相補に結合し、ガイド配列は、ガイド配列中のUがTに置換されることを除き、標的配列（例えばPAMを含まない標的配列）の特定のヌクレオチドと同一である。
【０１６３】
本明細書において使用される場合、「indels」とは、核酸中の二本鎖切断（DSB：double-stranded breaks）の部位での挿入または欠失のいずれかである、多くのヌクレオチドからなる挿入／欠失の変異を指す。
【０１６４】
本明細書において使用される場合、「ノックダウン」とは、特定の遺伝子産物の発現（例えばタンパク質、mRNAまたはその両方）における減少を指す。タンパク質のノックダウンは、組織または細胞群（例えば血清または細胞培養培地）から分泌されたタンパク質を検出する、または対象の組織もしくは細胞群からのタンパク質の総細胞量を検出することにより、測定されることができる。mRNAのノックダウンを測定する方法は公知であり、対象の組織または細胞群から単離されたmRNAの配列解析が含まれる。一部の実施形態では、「ノックダウン」とは、特定の遺伝子産物の発現の何らかの消失を指す場合があり、例えば転写されるmRNA量の減少、または細胞群（例えば組織中に存在する細胞群などのインビボ群を含む）により発現もしくは分泌されるタンパク質量における減少を指す場合がある。
【０１６５】
本明細書において使用される場合、「ノックアウト」とは、細胞中の特定のタンパク質の発現の消失を指す。ノックアウトは、組織または細胞群（例えば血清または細胞培養培地）から分泌されたタンパク質の量を検出する、または組織もしくは細胞群のタンパク質の総細胞量を検出することにより、測定されることができる。一部の実施形態では、本開示方法は、1つまたは複数の細胞（例えば組織中に存在する群などのインビボ群を含む細胞群）の標的タンパク質を「ノックアウト」する。一部の実施形態では、ノックアウトは、例えばindelsにより生成されるなどの標的タンパク質の変異体は形成せず、むしろ細胞の標的タンパク質の発現を完全に消失させる。
【０１６６】
本明細書において使用される場合、「リボ核タンパク質（RNP）」または「RNP複合体」とは、例えばCasクリベース、ニッカーゼまたはdCas DNA結合剤（例えばCas9）などのRNA誘導型DNA結合剤とともにあるガイドRNAを指す。一部の実施形態では、ガイドRNAは、例えばCas9などのRNA誘導型DNA結合剤を標的配列へと誘導し、そしてガイドRNAは標的配列にハイブリダイズし、当該剤は標的配列に結合する。当該剤がクリベースまたはニッカーゼである場合には、結合の後に開裂またはニック形成が続き得る。
【０１６７】
本明細書において使用される場合、「標的配列」とは、gRNAのガイド配列に相補的な標的遺伝子中の核酸配列を指す。標的配列とガイド配列の相互作用は、RNA誘導型DNA結合剤を標的配列内に結合させ、そして潜在的に（剤の活性に応じて）ニックを形成させ、または開裂させるよう誘導する。
【０１６８】
本明細書において使用される場合、「治療」とは、対象の疾患または障害のための任意の治療投与または治療適用を指し、疾患を阻害すること、その発現を止めること、疾患の1つもしくは複数の症状を緩和すること、疾患を治癒すること、または疾患の1つもしくは複数の症状の再発を予防することを含む。
【０１６９】
Ｂ．ポリヌクレオチドおよび組成物の例
１．低ウリジン含有量のmRNAおよびORF
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量から、最小ウリジン含有量の約150％の範囲のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、ORFのウリジン含有量は、その最小ウリジン含有量の約145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%または101%以下である。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量と等しいウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約150％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約145％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約140％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約135％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約130％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約125％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約120％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約115％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約110％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約105％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約104％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約103％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約102％以下のウリジン含有量を有するオープン��ーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量の約101％以下のウリジン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。
【０１７０】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量から、最小ウリジンジヌクレオチド含有量の200％の範囲のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、ORFのウリジンジヌクレオチド含有量は、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約195%、190%、185%、180%、175%、170%、165%、160%、155%、150%、145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%または101%以下である。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量と等しいウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約200％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約195％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約190％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約185％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約180％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約175％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約170％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約165％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約160％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約155％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量と等しいウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約150％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約145％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約140％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約135％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約130％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約125％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約120％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約115％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約110％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約105％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約104％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約103％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約102％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量の約101％以下のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。
【０１７１】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジンジヌクレオチド含有量から、対象のmRNAと同じタンパク質をコードする参照配列の最大ウリジンジヌクレオチド含有量の90％以下のウリジンジヌクレオチド含有量の範囲のウリジンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、ORFのウリジンジヌクレオチド含有量は、対象のmRNAと同じタンパク質をコードする参照配列の最大ウリジンジヌクレオチド含有量の約85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%または5%以下である。
【０１７２】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、0個のウリジントリヌクレオチドから、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40または50個のウリジントリヌクレオチドの範囲のウリジントリヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む（より長いウリジンの連続は、その中の固有の3-ウリジンセグメントの数として計数される。例えばウリジンテトラヌクレオチドは2個のウリジントリヌクレオチドを含有する。ウリジンペンタヌクレオチドは3個のウリジントリヌクレオチドを含有する、など）。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、0%ウリジントリヌクレオチドから、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%または2%ウリジントリヌクレオチドの範囲のウリジントリヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含み、当該ウリジントリヌクレオチドの含有量の百分率は、ウリジントリヌクレオチド（またはより長いウリジン連続）部分を形成するウリジンにより占められる配列中の位置の百分率として算出される。配列UUUAAAおよびUUUUAAAAは各々、50%のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。例えば一部の実施形態では、ORFは、2%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。例えば一部の実施形態では、ORFは、1.5%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、1%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.9%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.8%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.7%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.6%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.5%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.4%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.3%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.2%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.1%以下のウリジントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、ウリジントリヌクレオチドを含有しないオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。
【０１７３】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小ウリジントリヌクレオチド含有量から、対象のmRNAと同じタンパク質をコードする参照配列の最大ウリジントリヌクレオチド含有量の90％以下のウリジントリヌクレオチドの範囲のウリジントリヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、ORFのウリジントリヌクレオチド含有量は、対象のmRNAと同じタンパク質をコードする参照配列の最大ウリジントリヌクレオチド含有量の約85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%または5%以下である。
【０１７４】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、例えば同じヌクレオチドの反復連続などの最小ヌクレオチドホモポリマーを有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。例えば一部の実施形態では、表1に列記されるコドンから最小ウリジンコドンを選択するときに、mRNAは、ヌクレオチドホモポリマーの数と長さを減少させる最小ウリジンコドンを選択する工程、例えばアラニンに関してGCCの代わりにGCAを選択する工程、またはグリシンに関してGGGの代わりにGGAを選択する工程、またはリシンに関してAAAの代わりにAAGを選択する工程により、構築される。
【０１７５】
所与のORFは、例えばORFの充分な画分において最小ウリジンコドンを使用する工程により、ウリジン含有量またはウリジンジヌクレオチド含有量またはウリジントリヌクレオチド含有量を低下させることができる。例えばRNA誘導型DNA結合剤のアミノ酸配列は、アミノ酸をコドンへと転換させる工程によりORF配列へと戻し翻訳させることができ、この場合において当該ORFの一部またはすべては、以下に示される最小ウリジンコドン例を使用する。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%が、表1に列記されるコドンである。
【表１】
2021500863.tif 000012
【０１７６】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、コドンの少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%が表1に列記されるコドンであるコドンセットからなるオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。
【０１７７】
２．低アデニン含有量のmRNAおよびORF
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量から、最小アデニン含有量の約150％の範囲のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、ORFのアデニン含有量は、その最小アデニン含有量の約145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%または101%以下である。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量と等しいアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約150%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約145%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約140%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約135%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約130%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約125%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約120%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約115%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約110%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約105%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約104%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約103%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約102%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレー���（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニン含有量の約101%以下のアデニン含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量から、最小アデニンジヌクレオチド含有量の200％の範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、ORFのアデニンジヌクレオチド含有量は、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約195%、190%、185%、180%、175%、170%、165%、160%、155%、150%、145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%または101%以下である。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量と等しいアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約200％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約195％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約190％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約185％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約180％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約175％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約170％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約165％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約160％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約155％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量と等しいアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約150％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約145％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約140％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約135％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約130％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約125％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約120％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約115％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約110％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約105％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約104％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約103％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約102％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約101％以下のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量から、対象のmRNAと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニンジヌクレオチド含有量の90％以下のアデニンジヌクレオチド含有量の範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、ORFのアデニンジヌクレオチド含有量は、対象のmRNAと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニンジヌクレオチド含有量の約85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%または5%以下である。
【０１８０】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、0個のアデニントリヌクレオチドから、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40または50個のアデニントリヌクレオチドの範囲のアデニントリヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む（より長いアデニンの連続は、その中の固有の3-アデニンセグメントの数として計数される。例えばアデニンテトラヌクレオチドは2個のアデニントリヌクレオチドを含有する。アデニンペンタヌクレオチドは3個のアデニントリヌクレオチドを含有する、など）。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、0%アデニントリヌクレオチドから、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%または2%アデニントリヌクレオチドの範囲のアデニントリヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含み、当該アデニントリヌクレオチドの含有量の百分率は、アデニントリヌクレオチド（またはより長いアデニン連続）部分を形成するアデニンにより占められる配列中の位置の百分率として算出される。配列UUUAAAおよびUUUUAAAAは各々、50%のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。例えば一部の実施形態では、ORFは、2%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。例えば一部の実施形態では、ORFは、1.5%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、1%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.9%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.8%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.7%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.6%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.5%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.4%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.3%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.2%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、ORFは、0.1%以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、アデニントリヌクレオチドを含有しないオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、例えば同じヌクレオチドの反復連続などの最小ヌクレオチドホモポリマーを有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。例えば一部の実施形態では、表1に列記されるコドンから最小アデニンコドンを選択するときに、mRNAは、ヌクレオチドホモポリマーの数と長さを減少させる最小アデニンコドンを選択する工程、例えばアラニンに関してGCCの代わりにGCAを選択する工程、またはグリシンに関してGGGの代わりにGGAを選択する工程、またはリシンに関してAAAの代わりにAAGを選択する工程により、構築される。
【０１８２】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、その最小アデニントリヌクレオチド含有量から、対象のmRNAと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニントリヌクレオチド含有量の90％以下のアデニントリヌクレオチドの範囲のアデニントリヌクレオチド含有量を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。一部の実施形態では、ORFのアデニントリヌクレオチド含有量は、対象のmRNAと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニントリヌクレオチド含有量の約85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%または5%以下である。
【０１８３】
所与のORFは、例えばORFの充分な画分において最小アデニンコドンを使用する工程により、アデニン含有量またはアデニンジヌクレオチド含有量またはアデニントリヌクレオチド含有量を低下させることができる。例えばRNA誘導型DNA結合剤のアミノ酸配列は、アミノ酸をコドンへと転換させる工程によりORF配列へと戻し翻訳させることができ、この場合において当該ORFの一部またはすべては、以下に示される最小アデニンコドン例を使用する。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%が、表2に列記されるコドンである。
【表２】
2021500863.tif 000013
【０１８４】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、コドンの少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%が表2に列記されるコドンであるコドンセットからなるオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。
【０１８５】
３．低アデニン含有量および低ウリジン含有量のmRNAならびにORF
実現可能な程度に、低アデニン含有量に関する上述の特性のいずれかを、低ウリジン含有量に関する上述の特性のいずれかと組み合わせることができる。例えばRNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供されてもよく、当該mRNAは、その最小ウリジン含有量から、最小ウリジン含有量の約150%の範囲のウリジン含有量（例えば、ORFのウリジン含有量は、その最小ウリジン含有量の約145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%または101%以下である）、およびその最小アデニン含有量から、最小アデニン含有量の約150％の範囲のアデニン含有量（例えば、その最小アデニン含有量の約145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%または101%以下）、を有するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。ウリジンジヌクレオチドおよびアデニンジヌクレオチドに関しても同じである。同様に、ORF中のウリジンヌクレオチドおよびアデニンジヌクレオチドの含有量も、上述のとおりであってもよい。同様に、ORF中のウリジンジヌクレオチドおよびアデニンヌクレオチドの含有量も、上述のとおりであってもよい。
【０１８６】
所与のORFは、例えばORFの充分な画分において最小ウリジンコドンおよびアデニンコドンを使用する工程により、ウリジンおよびアデニンのヌクレオチドならびに／またはジヌクレオチドの含有量を低下させることができる。例えばRNA誘導型DNA結合剤のアミノ酸配列は、アミノ酸をコドンへと転換させる工程によりORF配列へと戻し翻訳させることができ、この場合において当該ORFの一部またはすべては、以下に示される最小ウリジンおよび最小アデニンのコドン例を使用する。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%が、表3に列記されるコドンである。
【表３】
2021500863.tif 000014
【０１８７】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAが提供され、当該mRNAは、コドンの少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%が表3に列記されるコドンであるコドンセットからなるオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。表3に示されるように、3種の列記されるセリンの各コドンは、1個のAまたは1個のUのいずれかを含有する。一部の実施形態では、ウリジン最小化は、セリンにAGCコドンを使用することを優先する。一部の実施形態では、アデニン最小化は、セリンにUCCおよび／またはUCGコドンを使用することを優先する。
【０１８８】
４．翻訳を増加させる、および／または高度に発現されるtRNAに相当するコドン；コドンセットの例
一部の実施形態では、mRNAは、例えばヒトなどの哺乳動物において翻訳を増加させるコドンを有するORFを含む。さらなる実施形態では、mRNAは、例えばヒトなどの哺乳動物の例えば肝臓などの器官において翻訳を増加させるコドンを有するORFを含む。さらなる実施形態では、mRNAは、例えばヒトなどの哺乳動物の例えば肝細胞などの細胞型において翻訳を増加させるコドンを有するORFを含む。哺乳動物、細胞型、哺乳動物の器官、ヒト、ヒトの器官などにおける翻訳の増加は、当該ORFの野生型配列の翻訳の程度との比較で決定されることができ、または当該ORFが由来する生物体のコドン分布またはアミノ酸レベルで最も類似したORFを含有する生物体、例えば化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、または原核細胞由来のCasヌクレアーゼ、例えば以下に記載される他の原核細胞由来のCasヌクレアーゼなどの場合に対しては別の原核細胞などのコドン分布に合致するコドン分布を有するORFとの比較で決定されることができる。あるいは一部の実施形態では、哺乳動物、細胞型、哺乳動物の器官、ヒト、ヒトの器官などのCas9配列に対する翻訳の増加は、任意の適用可能な点変異、異種ドメインなどを含む、その他の条件が同じである、配列番号5の配列を有するORFの配列と比較して決定される。ヒトの肝臓およびヒトの肝細胞を含む、ヒトにおける発現の増加に有用なコドンは、ヒトの肝臓／肝細胞において高度に発現されるtRNAに相当するコドンであってもよく、Dittmar KA, PLos Genetics 2(12): e221 (2006)に検討されている。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、例えばヒトなどの哺乳動物において高度に発現されるtRNAに相当するコドンである（例えば各アミノ酸に関し最も高く発現されるtRNA）。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、例えばヒトの器官などの哺乳動物の器官において高度に発現されるtRNAに相当するコドンである（例えば各アミノ酸に関し最も高く発現されるtRNA）。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、例えばヒトの肝臓などの哺乳動物の肝臓において高度に発現されるtRNAに相当するコドンである（例えば各アミノ酸に関し最も高く発現されるtRNA）。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、例えばヒトの肝細胞などの哺乳動物の肝細胞において高度に発現されるtRNAに相当するコドンである（例えば各アミノ酸に関し最も高く発現されるtRNA）。
【０１８９】
あるいは生物体（例えばヒト）において概して高度に発現されるtRNAに相当するコドンが使用されてもよい。
【０１９０】
コドン選択に関する前述の方法のいずれかを、例えば表1、2または3のコドンで開始し、そして複数の選択が可能であれば、概して生物体（例えばヒト）において、または肝臓もしくは肝細胞などの対象の器官または細胞型（例えばヒトの肝臓またはヒトの肝細胞）において、より高度に発現されるtRNAに相当するコドンを使用することにより、上記に示される最小ウリジンおよび／または最小アデニンコドンと組み合わせ得る。
【０１９１】
一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、表4に示されるコドンセットからのコドンである（例えば低U1、低Aまたは低A/Uコドンのセット）。低U1、低G、低C、低Aおよび低A/Uのセット中のコドンは、指定されるヌクレオチドを最小化するコドンを使用し、さらに複数の選択が可能であれば高度に発現されるtRNAに相当するコドンも使用する。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、表4に示される低U1コドンセットからのコドンである。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、表4に示される低Aコドンセットからのコドンである。一部の実施形態では、ORF中のコドンの少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%が、表4に示される低A/Uコドンセットからのコドンである。
【表４】
2021500863.tif 000015
【０１９２】
５．コードされるRNA誘導型DNA結合剤
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、クラス2のCasヌクレアーゼである。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、クリベース活性を有しており、この活性は二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも呼称され得る。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、例えばクラス2のCasヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼを含む（例えばII型、V型またはVI型のCasヌクレアーゼであってもよい）。クラス2のCasヌクレアーゼとしては例えば、Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2およびC2c3タンパク質ならびにそれらの改変型が挙げられる。Cas9ヌクレアーゼの例としては、化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌および他の原核細胞（例えば次のパラグラフのリストを参照）およびそれらの改変型（例えば遺伝子操作型または変異体）のII型CRISPRシステムのものが挙げられる。例えば、US2016/0312198 A1；US 2016/0312199 A1を参照のこと。Casヌクレアーゼの他の例としては、III型CRISPRシステムのCsmもしくはCmr複合体、またはそのCas10、Csm1もしくはCmr2サブユニット、およびI型CRISPRシステムのCascade複合体、またはそのCas3サブユニットが挙げられる。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、IIA型、IIB型またはIIC型のシステム由来であってもよい。様々なCRISPRシステムおよびCasヌクレアーゼの検討に関しては、例えばMakarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 9:467-477 (2011); Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol, 13: 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell,60:385-397 (2015)を参照のこと。
【０１９３】
Casヌクレアーゼが由来し得る種の非限定的な例としては、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、連鎖球菌属（Streptococcus sp.）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）、ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、ステレラ・ワズワースエンシス（Sutterella wadsworthensis）、ガンマプロテオバクテリア綱（Gammaproteobacterium）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、フィブロバクター・サクシノゲネス（Fibrobacter succinogene）、ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）、バチルス・シュードマイコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス・セレニティレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エクシグオバクテリウム ・シビリカム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバチルス・デルブレッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ミクロシラ・マリナ（Microscilla marina）、バークホルデリア・バクテリウム（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス属（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ・ワトソニイ（Crocosphaera watsonii）、シアノセイス属（Cyanothece sp.）、アオコ（Microcystis aeruginosa）、シネココッカス属（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム・アラビティカム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェツクス・デゲンシイ（Ammonifex degensii）、カルディセルロシルプター・ベシー（Caldicelulosiruptor becscii）、暫定的候補名デスルフォルディス（Candidatus Desulforudis）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、ナトロアナエロビウス・サーモフィルス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）、アシディチオバチルス・カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム・ビノスム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター属（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス・ワトソニイ（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテドノバクター・ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Methanohalobium evestigatum）、アナベナ・バリア��リス（Anabaena variabilis）、ノジュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストック属（Nostoc sp.）、アルスロスピラ ・マキシマ（Arthrospira maxima）、アルスロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アルスロスピラ属（Arthrospira sp.）、リングビア属（Lyngbya sp.）、ミクロコレウス・クトノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オスキラトリア属（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ・モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、ストレプトコッカス・パスツーリアヌス（Streptococcus pasteurianus）、ナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）、カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheria）、アシダミノコッカス属（Acidaminococcus sp.）、ラクノスピラ・バクテリウムND2006（Lachnospiraceae bacterium ND2006）、およびアカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）が挙げられる。
【０１９４】
一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、化膿連鎖球菌由来のCas9ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来のCas9ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、髄膜炎菌由来のCas9ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌由来のCas9ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、フランシセラ・ノビシダ由来のCpf1ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、アシダミノコッカス属由来のCpf1ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、ラクノスピラ・バクテリウムND2006由来のCpf1ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、Casヌクレアーゼは、野兎病菌（Francisella tularensis）、ラクノスピラ・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）、ブチリビブリオ・プロテオクラスティカス（Butyrivibrio proteoclasticus）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（Peregrinibacteria bacterium）、パルクバクテリア・バクテリウム（Parcubacteria bacterium）、スミセラ属（Smithella）、アシダミノコッカス属（Acidaminococcus）、暫定的候補名メタノプラズマ・テルミツム（Candidatus Methanoplasma termitum）、ユウバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、モラクセラ・ボボキュリ（Moraxella bovoculi）、レプトスピラ・イナダイ（Leptospira inadai）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Porphyromonas crevioricanis）、プレボテーラ・ディシエンス（Prevotella disiens）、またはポルフィロモナス・マカカエ（Porphyromonas macacae）由来のCpf1ヌクレアーゼである。ある実施形態では、Casヌクレアーゼは、アシダミノコッカス属またはラクノスピラ科由来のCpf1ヌクレアーゼである。
【０１９５】
野生型Cas9は、以下の2つのヌクレアーゼドメインを有する：RuvCおよびHNH。RuvCドメインは、非標的DNA鎖を開裂し、HNHドメインは標的DNA鎖を開裂する。一部の実施形態では、Cas9ヌクレアーゼは、複数のRuvCドメインおよび／または複数のHNHドメインを含む。一部の実施形態では、Cas9ヌクレアーゼは、野生型Cas9である。一部の実施形態では、Cas9は、標的DNAにおいて二本鎖切断を誘導することができる。ある実施形態では、Casヌクレアーゼは、dsDNAを開裂してもよく、dsDNAの1つの鎖を開裂してもよく、またはDNAクリベース活性もしくはニッカーゼ活性を有さなくてもよい。Cas9アミノ酸配列の例は、配列番号3として提示される。Cas9 mRNA ORF配列の例は、配列番号4として提示され、開始コドンと停止コドンが含まれている。融合タンパク質中での含有に適したCas9 mRNAコード配列の例は、配列番号10として提示される。
【０１９６】
一部の実施形態では、キメラCasヌクレアーゼが使用され、この場合、当該タンパク質の1つのドメインまたは領域は、別のタンパク質部分により置き換えられている。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼドメインは、例えばFok1などの別のヌクレアーゼ由来のドメインと置き換えられてもよい。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、改変ヌクレアーゼであってもよい。
【０１９７】
他の実施形態では、Casヌクレアーゼは、I型CRISPR／Casシステム由来であってもよい。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、I型CRISPR／CasシステムのCascade複合体の構成要素であってもよい。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、Cas3タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、III型CRISPR／Casシステム由来であってもよい。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、RNA開裂活性を有してもよい。
【０１９８】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、一本鎖ニッカーゼ活性を有する。すなわち、1つのDNA鎖を切断して、「ニック」としても知られている一本鎖切断を生成することができる。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、Casニッカーゼを含む。ニッカーゼは、dsDNA中にニックを生成する酵素である。すなわちDNAの二重らせんの1つの鎖を切断するが、他方は切断しない。一部の実施形態では、Casニッカーゼは、エンドヌクレアーゼ活性部位が例えば触媒ドメイン中の1つまたは複数の変化（例えば点変異）によって不活化されているCasヌクレアーゼ（例えば上述のCasヌクレアーゼ）の型である。Casニッカーゼと触媒ドメイン変化例に関する検討については例えば米国特許第 8,889,356号を参照のこと。一部の実施形態では、例えばCas9ニッカーゼなどのCasニッカーゼは、不活化されたRuvCドメインまたはHNHドメインを有する。Cas9ニッカーゼのアミノ酸配列の例は、配列番号6として提示される。開始コドンと停止コドンを含む、Cas9ニッカーゼのmRNA ORF配列の例は、配列番号7として提示される。融合タンパク質中での含有に適したCas9ニッカーゼmRNAコード配列の例は、配列番号11として提示される。
【０１９９】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、ただ1つの機能性ヌクレアーゼドメインのみを含むように改変される。例えば剤タンパク質は、ヌクレアーゼドメインの1つを変異させ、または完全もしくは部分的に欠失させて、その核酸開裂活性を減少するように改変されてもよい。一部の実施形態では、活性が低下したRuvCドメインを有するニッカーゼが使用される。一部の実施形態では、不活性なRuvCドメインを有するニッカーゼが使用される。一部の実施形態では、活性が低下したHNHドメインを有するニッカーゼが使用される。一部の実施形態では、不活性なHNHドメインを有するニッカーゼが使用される。
【０２００】
一部の実施形態では、Casタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸が置換されて、ヌクレアーゼ活性が減少または変化する。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、RuvCまたはRuvC様ヌクレアーゼドメイン中にアミノ酸置換を含有してもよい。RuvCまたはRuvC様ヌクレアーゼドメイン中のアミノ酸置換の例としてはD10A（化膿連鎖球菌のCas9タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Zetsche et al. (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771を参照のこと。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、HNHまたはHNH様ヌクレアーゼドメイン中にアミノ酸置換を含有してもよい。HNHまたはHNH様ヌクレアーゼドメイン中のアミノ酸置換の例としてはE762A、H840A、N863A、H983AおよびD986A（化膿連鎖球菌のCas9タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Zetsche et al. (2015)を参照のこと。アミノ酸置換のさらなる例としては、D917A、E1006AおよびD1255A（フランシセラ・ノビシダのU112 Cpf1 (FnCpf1)配列(UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN)に基づく）が挙げられる。
【０２０１】
一部の実施形態では、ニッカーゼをコードするmRNAは、標的配列のセンス鎖とアンチセンス鎖にそれぞれ相補的なガイドRNAのペアと組み合わせて提供される。一部の実施形態では、ガイドRNAは、ニッカーゼを標的配列へと誘導し、標的配列の逆鎖上にニックを形成させることによりDSBを導入する（すなわち二重ニック形成）。一部の実施形態では、二重ニック形成の使用により、特異性が改善され、オフターゲット効果が減少され得る。一部の実施形態では、ニッカーゼは、DNAの逆鎖を標的とする2つの別個のガイドRNAとともに使用され、標的DNA中に二重ニックを形成させる。一部の実施形態では、ニッカーゼは、近接するよう選択される2つの別個のガイドRNAとともに使用され、標的DNA中に二重ニックを形成させる。
【０２０２】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、クリベース活性およびニッカーゼ活性を欠く。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、dCas DNA結合ポリペプチドを含む。dCasポリペプチドは、DNA結合活性を有するが、本質的に触媒（クリベース／ニッカーゼ）活性は欠く。一部の実施形態では、dCasポリペプチドは、dCas9ポリペプチドである。一部の実施形態では、クリベース活性およびニッカーゼ活性を欠くRNA誘導型DNA結合剤、またはdCas DNA結合ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ活性部位が例えばその触媒ドメイン中の1つまたは複数の変化（例えば点変異）によって不活化されているCasヌクレアーゼ（例えば上述のCasヌクレアーゼ）の型である。例えば、US 2014/0186958 A1; US 2015/0166980 A1を参照のこと。dCas9アミノ酸配列の例は、配列番号8として提示される。dCas9 mRNA ORF配列の例は、配列番号9として提示され、開始コドンと停止コドンが含まれている。融合タンパク質中での含有に適したdCas9 mRNAコード配列の例は、配列番号12として提示される。
【０２０３】
６．異種機能性ドメイン；核局在シグナル
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、1つまたは複数の異種機能性ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドであるか、または融合ポリペプチドを含む）。
【０２０４】
一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、細胞の核内へのRNA誘導型DNA結合剤の移送を促進し得る。例えば、異種機能性ドメインは、核局在シグナル（NLS)であってもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、1〜10個のNLSと融合されてもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、1〜5個のNLSと融合されてもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、1個のNLSと融合されてもよい。1個のNLSが使用される場合、そのNLSは、RNA誘導型DNA結合剤の配列のN末端またはC末端に結合されてもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、少なくとも1個のNLSにC末端融合されてもよい。NLSは、RNA誘導型DNA結合剤の配列内に挿入されてもよい。他の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、複数のNLSと融合されてもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、2、3、4または5個のNLSと融合されてもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、2個のNLSと融合されてもよい。ある実施形態では、当該2個のNLSは、同じであっても（例えば2個のSV40 NLS）、異なっていてもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、カルボキシ末端で結合された2個のSV40 NLS配列に融合される。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、2個のNLSと融合されてもよく、1つはN末端で、もう1つはC末端で結合される。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、3個のNLSと融合されてもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、NLSと融合されなくてもよい。一部の実施形態では、NLSは、一分割配列（monopartite sequence）であってもよく、例えばSV40 NLSのPKKKRKV (配列番号78)またはPKKKRRV（配列番号90）であってもよい。一部の実施形態では、NLSは、二分割配列（bipartite sequence）であってもよく、例えば核質のNLSのKRPAATKKAGQAKKKK（配列番号91）であってもよい。一部の実施形態では、NLS配列は、LAAKRSRTT (配列番号79)、QAAKRSRTT (配列番号80)、PAPAKRERTT (配列番号81)、QAAKRPRTT (配列番号82)、RAAKRPRTT (配列番号83)、AAAKRSWSMAA (配列番号84)、AAAKRVWSMAF (配列番号85)、AAAKRSWSMAF (配列番号86)、AAAKRKYFAA (配列番号87)、RAAKRKAFAA (配列番号88)またはRAAKRKYFAV (配列番号89)を含んでもよい。特定の実施形態では、1つのPKKKRKV（配列番号78）NLSが、RNA誘導型DNA結合剤のC末端に結合されてもよい。1つまたは複数のリンカーが任意で融合部位に含まれる。一部の実施形態では、上述の実施形態のいずれかによる1つまたは複数のNLSは、例えば以下に記載される異種機能性ドメインのうちのいずれかなどの1つまたは複数の追加の異種機能性ドメインと組み合わされて、RNA誘導型DNA結合剤中に存在する。
【０２０５】
一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、RNA誘導型DNA結合剤の細胞内半減期を改変することができてもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤の半減期は、延長されてもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤の半減期は、短縮されてもよい。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、RNA誘導型DNA結合剤の安定性を増加させることができてもよい。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、RNA誘導型DNA結合剤の安定性を減少させることができてもよい。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、タンパク質分解のシグナルペプチドとして作用してもよい。一部の実施形態では、タンパク質分解は、例えばプロテアソーム、リソソームプロテアーゼまたはカルパインプロテアーゼなどのタンパク質分解酵素により介在されてもよい。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、PEST配列を含んでもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤は、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖の付加により改変されてもよい。一部の実施形態では、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（UBL）であってもよい。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、低分子ユビキチン様修飾因子（SUMO：ubiquitin-like proteins include small ubiquitin-like modifier）、ubiquitin cross-reactive protein（UCRP、interferon-stimulated gene-15（ISG15）としても知られる）、small ubiquitin-like modifier（URM1）、neuronal-precursor-cell-expressed developmentally downregulated protein-8（NEDD8、出芽酵母においてRub1とも呼ばれる）、human leukocyte antigen F-associated（FAT10)、autophagy-8 (ATG8)および-12 (ATG12)、Fau ubiquitin-like protein (FUB1)、membrane-anchored UBL (MUB)、ubiquitin fold-modifier-1 (UFM1)、ならびにubiquitin-like protein-5 (UBL5)が挙げられる。
【０２０６】
一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、マーカードメインであってもよい。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグおよびレポーター遺伝子配列が挙げられる。一部の実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質であってもよい。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色蛍光タンパク質（例えば、YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、青色蛍光タンパク質（例えば、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、シアン蛍光タンパク質（例えば、ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、赤色蛍光タンパク質（例えば、mKate、mKate2、mPlum、DsRed単量体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-単量体、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)、およびオレンジ色蛍光タンパク質（例えば、mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato）または任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、マーカードメインは、精製タグおよび／またはエピトープタグであってもよい。タグの非限定的な例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、キチン結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（TRX）、ポリ（NANP）、タンデムアフィニティ精製（TAP）タグ、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（BCCP）、ポリ-Hisおよびカルモジュリンが挙げられる。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT)、ベータ-ガラクトシダーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質が挙げられる。
【０２０７】
追加の実施形態では、異種機能性ドメインは、特定の細胞小器官、細胞型、組織または器官にRNA誘導型DNA結合剤を標的化させ得る。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、ミトコンドリアにRNA誘導型DNA結合剤を標的化させ得る。
【０２０８】
さらなる実施形態では、異種機能性ドメインは、エフェクタードメインであってもよい。RNA誘導型DNA結合剤が、その標的配列に誘導されるとき、例えばCasヌクレアーゼが、gRNAにより標的配列へと誘導されるとき、エフェクタードメインは、標的配列を改変し、または標的配列に影響を与えてもよい。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば非Casヌクレアーゼドメイン）、エピジェネティック改変ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインから選択されてもよい。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、例えばFoklヌクレアーゼなどのヌクレアーゼである。例えば米国特許第9,023,649号を参照のこと。一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、転写活性化因子または抑制因子である。例えば、Qi et al., “Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression,” Cell 152:1173-83 (2013); Perez-Pinera et al., “RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors,” Nat. Methods 10:973-6 (2013); Mali et al., “CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,” Nat. Biotechnol. 31:833-8 (2013); Gilbert et al., “CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes,” Cell 154:442-51 (2013)を参照のこと。ゆえに、RNA誘導型DNA結合剤は本質的に、ガイドRNAを使用して所望の標的配列に結合するよう誘導され得る転写因子となる。ある実施形態では、DNA改変ドメインは、例えば脱メチル化ドメインまたはメチルトランスフェラーゼドメインなどのメチル化ドメインである。ある実施形態では、エフェクタードメインは、例えば塩基編集ドメインなどのDNA改変ドメインである。特定の実施形態では、DNA改変ドメインは、特定の改変をDNAに導入する核酸編集ドメイン、例えばデアミナーゼドメインである。例えば、WO 2015/089406;US 2016/0304846を参照のこと。WO 2015/089406およびUS 2016/0304846に記載される核酸編集ドメイン、デアミナーゼドメイン、およびCas9バリアントは、参照により本明細書に援用される。
７．UTR；コザック配列
【０２０９】
一部の実施形態では、mRNAは、ヒドロキシステロイド17-ベータデヒドロゲナーゼ4（HSD17B4またはHSD）由来のUTR、例えばHSD由来の5’UTRを少なくとも1個含む。一部の実施形態では、mRNAは、グロビンmRNA、例えばヒトアルファグロビン（HBA）mRNA、ヒトベータグロビン（HBB）mRNA、またはアフリカツメガエルベータグロビン（XBG）mRNA由来のUTRを少なくとも1個含む。一部の実施形態では、mRNAは、例えばHBA、HBBまたはXBGなどのグロビンmRNA由来の5’UTR、3’UTR、または5’および3’UTRを含む。一部の実施形態では、mRNAは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス（CMV)、マウスHba-a1、HSD、アルブミン遺伝子、HBA、HBBまたはXBG由来の5’UTRを含む。一部の実施形態では、mRNAは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスHba-a1、HSD、アルブミン遺伝子、HBA、HBBまたはXBG由来の3’UTRを含む。一部の実施形態では、mRNAは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスHba-a1、HSD、アルブミン遺伝子、HBA、HBB、XBG、ヒートショックプロテイン90（Hsp90）、グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、ベータ-アクチン、アルファ-チューブリン、腫瘍タンパク質（p53）、または表皮増殖因子受容体（EGFR）由来の5’および3’UTRを含む。
【０２１０】
一部の実施形態では、mRNAは、例えばアクチン、アルブミン、または例えばHBA、HBBもしくはXBGなどのグロビンなど、構造的に発現されるmRNAなどの同じ源に由来する5’および3’UTRを含む。
【０２１１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAは、配列番号32、34、36、38または41のいずれか1つに対し、少なくとも90％の同一性を有する5’UTRを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAは、配列番号33、35、37、39または40のいずれか1つに対し、少なくとも90％の同一性を有する3’UTRを含む。一部の実施形態では、前述の同一性レベルのいずれかは、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAは、配列番号32、34、36、38または41のいずれか1つの配列を有する5’UTRを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAは、配列番号33、35、37、39または40のいずれか1つの配列を有する3’UTRを含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、mRNAは、5’UTRを含まず、例えば5’キャップと開始コドンの間に追加のヌクレオチドが存在しない。一部の実施形態では、mRNAは、5’キャップと開始コドンの間にコザック配列（以下に記載される）を含むが、追加の5’UTRは何も有さない。一部の実施形態では、mRNAは、3’UTRを含まず、例えば停止コドンとポリA尾部の間に追加のヌクレオチドが存在しない。
【０２１３】
一部の実施形態では、mRNAは、コザック配列を含む。コザック配列は、翻訳開始、およびmRNAから翻訳されるポリペプチドの総生産量に影響を与えることができる。コザック配列は、開始コドンとして機能し得るメチオニンコドンを含む。最小コザック配列はNNNRUGNであり、式中、以下のうちの少なくとも1つが当てはまる：最初のNは、AまたはGであり、2番目のNは、Gである。ヌクレオチド配列の場合では、Rはプリン（AまたはG）を意味する。一部の実施形態では、コザック配列は、RNNRUGN、NNNRUGG、RNNRUGG、RNNAUGN、NNNAUGGまたはRNNAUGGである。一部の実施形態では、コザック配列は、rccRUGgであり、小文字の位置に対し、ミスマッチはゼロ、またはミスマッチは最大で1個または2個である。一部の実施形態では、コザック配列は、rccAUGgであり、小文字の位置に対し、ミスマッチはゼロ、またはミスマッチは最大で1個または2個である。一部の実施形態では、コザック配列は、gccRccAUGG（配列番号105のヌクレオチド4〜13）であり、小文字の位置に対し、ミスマッチはゼロ、またはミスマッチは最大で1個、2個または3個である。一部の実施形態では、コザック配列は、gccAccAUGであり、小文字の位置に対し、ミスマッチはゼロ、またはミスマッチは最大で1個、2個、3個または4個である。一部の実施形態では、コザック配列は、GCCACCAUGである。一部の実施形態では、コザック配列は、gccgccRccAUGG（配列番号105）であり、小文字の位置に対し、ミスマッチはゼロ、またはミスマッチは最大で1個、2個、3個または4個である。
【０２１４】
８．例示的配列
一部の実施形態では、mRNAは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含み、当該ORFは、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、mRNAは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含み、当該RNA誘導型DNA結合剤は、配列番号3、6、8、13、16、19、22、25、28、68または186〜196のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ORFは、その最小ウリジン含有量から、最小ウリジン含有量の150％の範囲のウリジン含有量を有し、および／またはその最小ウリジンジヌクレオチド含有量から、最少ウリジンジヌクレオチド含有量の150％の範囲のウリジンジヌクレオチド含有量を有する。一部の実施形態では、mRNAは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含み、当該RNA誘導型DNA結合剤は、配列番号3、6、8、13、16、19、22、25、28、68または186〜196のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ORFは、その最小アデニン含有量から、最小アデニン含有量の150％の範囲のアデニン含有量を有し、および／またはその最小アデニンジヌクレオチド含有量から、最少アデニンジヌクレオチド含有量の150％の範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有する。一部のそうした実施形態では、アデニンヌクレオチド含有量とウリジンヌクレオチド含有量の両方が、その各最小量の150％以下である。一部の実施形態では、アデニンジヌクレオチド含有量とウリジンジヌクレオチド含有量の両方が、その各最小量の150％以下である。一部の実施形態では、mRNAは、配列番号43、44、51、53、55〜61または67のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列は、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含む。一部の実施形態では、mRNAは、配列番号43、44、51、53、55〜61または67のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列は、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含み、当該配列番号43、44、51、53、55〜61または67の最初の3ヌクレオチドは、削除される。一部の実施形態では、前述の同一性レベルのいずれかは、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％である。
【０２１５】
一部の実施形態では、mRNAは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含み、当該ORFは、少なくともその最初の30、50、70、100、150、200、250または300ヌクレオチドにわたり、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する。当該最初の30、50、70、100、150、200、250または300ヌクレオチドは、開始コドン（典型的にはATG）の最初のヌクレオチドから測定され、Aがヌクレオチド1であり、Tがヌクレオチド2となる。一部の実施形態では、当該オープンリーディングフレームは、その配列の少なくとも最初の10%、12%、15%、20%、25%、30%または35%にわたり、配列番号1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つに対し少なくとも90％の同一性を有する。当該ORFの配列の長さは、開始コドンの始まりから、停止コドンの終わりまでのヌクレオチドの数であり、その配列の最初の10%、12%、15%、20%、25%、30%または35%は、総配列長の指定される百分率を構成する、開始コドンの最初のヌクレオチドから始まるヌクレオチド数に相当する。
【０２１６】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号43に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号43のORF（すなわち配列番号4）は、配列番号7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２１７】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号44に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号44のORF（すなわち配列番号4）は、配列番号7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２１８】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号56に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号56のORF（すなわち配列番号4）は、配列番号7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２１９】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号57に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号57のORF（すなわち配列番号4）は、配列番号7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２２０】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号58に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号58のORF（すなわち配列番号4）は、配列番号7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２２１】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号59に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号59のORF（すなわち配列番号4）は、配列番号7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２２２】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号60に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号60のORF（すなわち配列番号4）は、配列番号7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２２３】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号61に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号61のORF（すなわち配列番号4）は、配列番号7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２２４】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号176に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号176のORFは、配列番号4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２２５】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号177に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号177のORFは、配列番号4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２２６】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号178に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号178のORFは、配列番号4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２２７】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号179に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号179のORFは、配列番号4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２２８】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号180に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号180のORFは、配列番号4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２２９】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号181に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号181のORFは、配列番号4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２３０】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号182に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号182のORFは、配列番号4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２３１】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号183に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号183のORFは、配列番号4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２３２】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号184に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号184のORFは、配列番号4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２３３】
一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするORFを含むmRNAは、配列番号185に対し少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、当該配列番号185のORFは、配列番号4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65、66または107〜175のいずれか1つの別のORFと置換される。
【０２３４】
一部の実施形態では、配列番号43、44、56〜61または176〜185の任意で置換される配列に対する同一性の程度は、少なくとも95％である。一部の実施形態では、配列番号43、44、56〜61または176〜185の任意で置換される配列に対する同一性の程度は、少なくとも98％である。一部の実施形態では、配列番号43、44、56〜61または176〜185の任意で置換される配列に対する同一性の程度は、少なくとも99％である。一部の実施形態では、配列番号43、44、56〜61または176〜185の任意で置換される配列に対する同一性の程度は、100％である。
【０２３５】
９．ポリ-A尾部
一部の実施形態では、mRNAは、ポリ-アデニル化（ポリA）尾部をさらに含む。一部の例では、ポリ-A尾部は、当該ポリ-A尾部内の1つまたは複数の場所で、1つまたは複数の非アデニンヌクレオチド「アンカー」で「中断」される。ポリ-A尾部は、少なくとも8個の連続したアデニンヌクレオチドを含み得るが、1つまたは複数の非アデニンヌクレオチドも含み得る。本明細書において使用される場合、「非アデニンヌクレオチド」とは、アデニンを含まない任意の天然または非天然のヌクレオチドを指す。グアニン、チミンおよびシトシンヌクレオチドが、非アデニンヌクレオチドの例である。したがって本明細書に記載されるmRNA上のポリ-A尾部は、RNA誘導型DNA結合剤または対象配列をコードするヌクレオチドに対し3’に位置する連続的アデニンヌクレオチドを含み得る。一部の例では、mRNA上のポリ-A尾部は、RNA誘導型DNA結合剤または対象配列をコードするヌクレオチドに対し3’に位置する非連続的アデニンヌクレオチドを含み、この場合において当該非アデニンヌクレオチドは、均一、または不均一な間隔でアデニンヌクレオチドを中断する。
【０２３６】
一部の実施形態では、ポリ-A尾部は、mRNAのインビトロ転写に使用されるプラスミド中にコードされ、転写物の一部となる。プラスミド中にコードされるポリ-A配列、すなわちポリ-A配列中の連続的なアデニンヌクレオチドの数は、厳密ではない場合があり、例えばプラスミド中の100個のポリ-A配列は、転写されるmRNAにおいて厳密には100個のポリ-A配列をもたらさない場合がある。一部の実施形態では、ポリ-A尾部は、プラスミド中にコードされず、PCRテーリングまたは例えば大腸菌のポリ（A）ポリメラーゼを使用した酵素的テーリングにより付加される。
【０２３７】
一部の実施形態では、ポリ（A)結合タンパク質が連続的アデニンヌクレオチド部分に結合することができるように、1つまたは複数の非アデニンヌクレオチドが配置され、連続的アデニンヌクレオチドを中断する。一部の実施形態では、少なくとも8、9、10、11または12個の連続的アデニンヌクレオチドの後に、1つまたは複数の非アデニンヌクレオチドが配置される。一部の実施形態では、少なくとも8〜50個の連続的アデニンヌクレオチドの後に、1つまたは複数の非アデニンヌクレオチドが配置される。一部の実施形態では、少なくとも8〜100個の連続的アデニンヌクレオチドの後に、1つまたは複数の非アデニンヌクレオチドが配置される。一部の実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6または7個のアデニンヌクレオチドの後にあり、その後に少なくとも8個の連続的アデニンヌクレオチドが続く。
【０２３８】
本開示のポリ-A尾部は、連続的アデニンヌクレオチドを1配列含み、その後に1つまたは複数の非アデニンヌクレオチドを含み、任意でその後に追加のアデニンヌクレオチドを含んでもよい。
【０２３９】
一部の実施形態では、ポリ-A尾部は、1つの非アデニンヌクレオチド、または2〜10個の非アデニンヌクレオチドの1つの連続的部分を含み、または含有する。一部の実施形態では、少なくとも8、9、10、11または12個の連続的アデニンヌクレオチドの後に、非アデニンヌクレオチドが配置される。一部の例では、少なくとも8〜50個の連続的アデニンヌクレオチドの後に、1つまたは複数の非アデニンヌクレオチドが配置される。一部の実施形態では、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50個の連続的アデニンヌクレオチドの後に、1つまたは複数の非アデニンヌクレオチドが配置される。
【０２４０】
一部の実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシンまたはチミンである。一部の例では、非アデニンヌクレオチドは、グアニンヌクレオチドである。一部の実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、シトシンヌクレオチドである。一部の実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、チミンヌクレオチドである。一部の例では、1つまたは複数の非アデニンヌクレオチドが存在する場合、当該非アデニンヌクレオチドは、a)グアニンおよびチミンヌクレオチド、b)グアニンおよびシトシンヌクレオチド、c)チミンおよびシトシンヌクレオチド、またはd)グアニン、チミンおよびシトシンヌクレオチド、から選択され得る。非アデニンヌクレオチドを含みポリ-A尾部の例は、配列番号62に提示される。
【０２４１】
１０．改変ヌクレオチド
一部の実施形態では、mRNAは、一部またはすべてのウリジン位置で改変ウリジンを含む。一部の実施形態では、改変ウリジンは、5位で改変されたウリジンであり、例えばハロゲンまたはC1-C3アルコキシで改変されたウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、1位で改変されたシュードウリジンであり、例えばC1-C3アルキルで改変されたシュードウリジンである。改変ウリジンは、例えばシュードウリジン、N1-メチル-シュードウリジン、5-メトキシウリジン、5-ヨードウリジンまたはそれらの組み合わせであってもよい。一部の実施形態では、改変ウリジンは、5-メトキシウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、5-ヨードウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、シュードウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、N1-メチル-シュードウリジンである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、シュードウリジンとN1-メチル-シュードウリジンの組み合わせである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、シュードウリジンと5-メトキシウリジンの組み合わせである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、N1-メチルシュードウリジンと5-メトキシウリジンの組み合わせである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、5-ヨードウリジンとN1-メチル-シュードウリジンの組み合わせである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、シュードウリジンと5-ヨードウリジンの組み合わせである。一部の実施形態では、改変ウリジンは、5-ヨードウリジンと5-メトキシウリジンの組み合わせである。
【０２４２】
一部の実施形態では、本開示によるmRNA中のウリジン位置の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%が、改変ウリジンである。一部の実施形態では、本開示によるmRNA中のウリジン位置の10%〜25%、15〜25%、25〜35%、35〜45%、45〜55%、55〜65%、65〜75%、75〜85%、85〜95%または90〜100%が、改変ウリジンであり、例えば5-メトキシウリジン、5-ヨードウリジン、N1-メチル-シュードウリジン、シュードウリジンまたはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、本開示によるmRNA中のウリジン位置の10%〜25%、15〜25%、25〜35%、35〜45%、45〜55%、55〜65%、65〜75%、75〜85%、85〜95%または90〜100%が、5-メトキシウリジンである。一部の実施形態では、本開示によるmRNA中のウリジン位置の10%〜25%、15〜25%、25〜35%、35〜45%、45〜55%、55〜65%、65〜75%、75〜85%、85〜95%または90〜100%が、シュードウリジンである。一部の実施形態では、本開示によるmRNA中のウリジン位置の10%〜25%、15〜25%、25〜35%、35〜45%、45〜55%、55〜65%、65〜75%、75〜85%、85〜95%または90〜100%が、N1-メチルシュードウリジンである。一部の実施形態では、本開示によるmRNA中のウリジン位置の10%〜25%、15〜25%、25〜35%、35〜45%、45〜55%、55〜65%、65〜75%、75〜85%、85〜95%または90〜100%が、5-ヨードウリジンである。一部の実施形態では、本開示によるmRNA中のウリジン位置の10%〜25%、15〜25%、25〜35%、35〜45%、45〜55%、55〜65%、65〜75%、75〜85%、85〜95%または90〜100%が、5-メトキシウリジンであり、残りが、N1-メチルシュードウリジンである。一部の実施形態では、本開示によるmRNA中のウリジン位置の10%〜25%、15〜25%、25〜35%、35〜45%、45〜55%、55〜65%、65〜75%、75〜85%、85〜95%または90〜100%が、5-ヨードウリジンであり、残りが、N1-メチルシュードウリジンである。
【０２４３】
１１．5’キャップ
一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAは、例えばCap0、Cap1またはCap2などの5’キャップを含む。5’キャップは通常、7-メチルグアニンリボヌクレオチド（以下に検討されるように例えばARCAに関してさらに改変され得る）であり、5’三リン酸を介して、mRNAの5’-3’方向の鎖の最初のヌクレオチド、すなわち最初のキャップ近接ヌクレオチドの5’位に結合される。Cap0では、mRNAの最初と2番目のキャップ近接ヌクレオチドのリボースは両方とも2’-ヒドロキシルを含む。Cap1では、mRNAの最初と2番目の転写されるヌクレオチドのリボースはそれぞれ2'-メトキシおよび2'-ヒドロキシルを含む。Cap2では、mRNAの最初と2番目のキャップ近接ヌクレオチドのリボースは両方とも2’-メトキシを含む。例えば、Katibah et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30; Abbas et al. (2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115を参照のこと。例えばヒトmRNAなどの哺乳動物mRNAをはじめとする高度な真核細胞生物の内因性mRNAの大部分は、Cap1またはCap2を含む。Cap0と他のキャップの構造はCap1およびCap2とは異なっており、そのために例えばIFIT-1およびIFIT-5などの自然免疫系の構成要素により「非自己」として認識され、I型インターフェロンを含むサイトカインのレベル上昇が生じる可能性があるため、例えばヒトなどの哺乳動物において免疫原性があり得る。例えばIFIT-1およびIFIT-5などの自然免疫系の構成要素は、Cap1またはCap2以外のキャップを有するmRNAの結合に関してeIF4Eと競合し、mRNAの翻訳を阻害する可能性もある。
【０２４４】
キャップは、共に転写することで含有され得る。例えば、ARCA（抗リバースキャップアナログ（anti-reverse cap analog）、Thermo Fisher Scientific社、カタログ番号AM8045）は、開始時に転写物内にインビトロで組み込まれ得る、グアニンリボヌクレオチドの5’位に結合された7-メチルグアニン3’-メトキシ-5’-酸リン酸塩を含むキャップアナログである。ARCAは、Cap0キャップを生じさせ、最初のキャップ近接ヌクレオチドの2’位はヒドロキシルである。例えば、Stepinski et al., (2001) “Synthesis and properties of mRNAs containing the novel ‘anti-reverse’ cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG,” RNA 7: 1486-1495を参照のこと。ARCA構造を以下に示す。
【化１】
2021500863.tif 000016
【０２４５】
CleanCap（商標）AG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies社、カタログ番号N-7113)またはCleanCap（商標）GG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies社、カタログ番号N-7133)を使用して、Cap1構造を共転写により提供することができる。CleanCap（商標）AGおよびCleanCap（商標）GGの3'-O-メチル化型も、TriLink Biotechnologies社から、カタログ番号N-7413およびN-7433でそれぞれ販売されている。CleanCap（商標）AG構造を以下に示す。CleanCap（商標）構造は本明細書において、上記のカタログ番号の下3桁を使用して呼称される場合もある（例えば、TriLink Biotechnologies社のカタログ番号N-7113では、「CleanCap（商標）113」）。
【化２】
2021500863.tif 000017
【０２４６】
あるいはキャップは転写後にRNAに付加されてもよい。例えばワクシニアキャッピング酵素は市販されており（New England Biolabs社、カタログ番号M2080S)、そのD1サブユニットによりもたらされるRNAトリホスファターゼとグアニリルトランスフェラーゼの活性、およびそのD12サブユニットによりもたらされるグアニンメチルトランスフェラーゼを有している。ゆえに、この酵素はS-アデノシルメチオニンおよびGTPの存在下で7-メチルグアニンをRNAに付加し、Cap0をもたらすことができる。例えば、Guo, P. and Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.  USA 87, 4023-4027; Mao, X. and Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24472-24479を参照のこと。キャップとキャップ化方法に関するさらなる検討については、例えばWO2017/053297およびIshikawa et al., Nucl. Acids. Symp. Ser. (2009) No. 53, 129-130を参照のこと。
【０２４７】
１２．ガイドRNA
一部の実施形態では、少なくとも1つのガイドRNAは、本明細書に開示されるmRNAと組み合わされて提供される。一部の実施形態では、ガイドRNAは、mRNAとは別個の分子として提供される。一部の実施形態では、ガイドRNAは、本明細書に開示されるmRNAの一部として、例えばUTRの一部として提供される。一部の実施形態では、少なくとも1つのガイドRNAがTTRを標的とする。
【０２４８】
一部の実施形態では、ガイドRNAは、改変sgRNAを含む。一部の実施形態では、sgRNAは、配列番号74に示される改変パターンを含み、式中、Nは任意の天然ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドであり、N全体でガイド配列を構成する。例えば本明細書において、式中、Nが、本明細書に開示されるガイド配列のいずれかと置換される配列番号74が包含される。ガイドヌクレオチドとNの置換にかかわらず、改変は、配列番号74に示されるとおりである。すなわち、ガイドヌクレオチドが「N」を置換するが、最初の3個のヌクレオチドは、2’OMe改変されており、最初と2番目のヌクレオチドの間、2番目と3番目のヌクレオチドの間、そして3番目と4番目のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合が存在する。
１３．脂質；製剤；送達
【０２４９】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるmRNAは、単独で、または1つもしくは複数のガイドRNAを伴い、脂質ナノ粒子中で製剤化され、または脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、2016年3月30日に出願されたU.S.S.N. 62/315,602の優先権を主張する2017年3月30日に出願されたPCT/US2017/024973の「LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS」を参照のこと。当該出願は、その全体で参照により本明細書にその内容が組み込まれる。ヌクレオチドを対象に送達できることが当業者に公知の任意の脂質ナノ粒子（LNP）を利用して、本明細書に記載のRNAを投与してもよく、一部の実施形態では、1つまたは複数のガイドRNAが付随してもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載のmRNAは、単独で、または1つもしくは複数のガイドRNAを伴い、リポソーム、ナノ粒子、エキソームもしくは微小胞中で製剤化され、またはそれらを介して投与される。エマルション、ミセルおよび懸濁液は、部分的送達および／または局所送達に適した組成物であり得る。
【０２５０】
本明細書において、CRISPR／Casカーゴを含む、RNA用の様々なLNP製剤の実施形態が開示される。そうしたLNP製剤は、（i）例えばアミン脂質などのCCD脂質、（ii）中性脂質、（iii）ヘルパー脂質、および（iv）例えばPEG脂質などのステルス脂質を含んでもよい。LNP製剤の一部の実施形態は、ヘルパー脂質、中性脂質、および例えばPEG脂質などのステルス脂質とともに「アミン脂質」を含む。「脂質ナノ粒子」とは、分子間力により互いに物理的に関連づけられた複数の（すなわち１超の）脂質分子を含む粒子を意味する。
【０２５１】
CCD脂質
CRISPR／Cas mRNAおよびガイドRNA構成要素の肝臓の細胞への送達用の脂質組成物は、CCD脂質を含む。
【０２５２】
一部の実施形態では、CCD脂質はLipid Aであり、これは(9Z,12Z)-3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピル オクタデカ-9,12-ジエノアートであり、3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピル (9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノアートとも呼ばれている。Lipid Aは、以下のように図示されることができる：
【化３】
2021500863.tif 000018
【０２５３】
Lipid Aは、WO2015/095340（例えば84〜86ページ）に従い合成されてもよい。
【０２５４】
一部の実施形態では、CCD脂質は、Lipid Bであり、これは((5-((ジメチルアミノ)メチル)-1,3-フェニレン)ビス(オキシ))ビス(オクタン-8,1-ジイル)ビス(デカノアート)であり、((5-((ジメチルアミノ)メチル)-1,3-フェニレン)ビス(オキシ))ビス(オクタン-8,1-ジイル)ビス(デカノアート)とも呼ばれている。Lipid Bは、以下のように図示されることができる：
【化４】
2021500863.tif 000019
【０２５５】
Lipid Bは、WO2014/136086（例えば107〜09ページ）に従い合成されてもよい。
【０２５６】
一部の実施形態では、CCD脂質は、Lipid Cである。これは2-((4-(((3-(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-ビス(オクタデカ-9,12-ジエノアート)である。
【０２５７】
Lipid Cは、以下のように図示されることができる：
【化５】
2021500863.tif 000020
【０２５８】
一部の実施形態では、CCD脂質は、Lipid Dであり、これは、3-(((3-(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)-13-(オクタノイルオキシ)トリデシル 3-オクチルウンデカノアートである。
【０２５９】
Lipid Dは、以下のように図示されることができる：
【化６】
2021500863.tif 000021
【０２６０】
Lipid CおよびLipid Dは、WO2015/095340に従い合成されてもよい。
【０２６１】
CCD脂質は、Lipid A、Lipid B、Lipid CまたはLipid Dと均等であり得る。ある実施形態では、CCD脂質は、Lipid Aと均等であり、Lipid Bと均等であり、Lipid Cと均等であり、またはLipid Dと均等である。
【０２６２】
アミン脂質
【０２６３】
一部の実施形態では、生物活性剤送達用のLNP組成物は、「アミン脂質」を含む。これは、Lipid Aのアセタールアナログを含む、Lipid Aまたはその均等物と規定される。
【０２６４】
一部の実施形態では、アミン脂質はLipid Aであり、これは(9Z,12Z)-3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピル オクタデカ-9,12-ジエノアートであり、3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピル (9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノアートとも呼ばれている。Lipid Aは、以下のように図示されることができる：
【化７】
2021500863.tif 000022
【０２６５】
Lipid Aは、WO2015/095340（例えば84〜86ページ）に従い合成されてもよい。ある実施形態では、アミン脂質は、Lipid Aと均等である。
【０２６６】
ある実施形態では、アミン脂質は、Lipid Aのアナログである。ある実施形態では、Lipid Aアナログは、Lipid Aのアセタールアナログである。特定のLNP組成物において、アセタールアナログは、C4-C12アセタールアナログである。一部の実施形態では、アセタールアナログは、C5-C12アセタールアナログである。追加の実施形態では、アセタールアナログは、C5-C10アセタールアナログである。さらなる実施形態では、アセタールアナログは、C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11およびC12のアセタールアナログから選択される。
【０２６７】
本明細書に記載されるLNPにおける使用に適したアミン脂質は、インビボで生分解性である。アミン脂質は、低毒性である（例えば10mg/kg以上の量で、有害作用なく動物モデルにおいて忍容される）。ある実施形態では、アミン脂質を含有するLNPとしては、アミン脂質の少なくとも75％が、8、10、12、24もしくは48時間以内、または3、4、5、6、7もしくは10日以内に血漿から除去されるLNPが挙げられる。ある実施形態では、アミン脂質を含有するLNPとしては、mRNAまたはgRNAの少なくとも50％が、8、10、12、24もしくは48時間以内、または3、4、5、6、7もしくは10日以内に血漿から除去されるLNPが挙げられる。ある実施形態では、アミン脂質を含有するLNPとしては、LNPの少なくとも50％が、例えば脂質（例えばアミン脂質）、RNA(例えばmRNA）または他の構成要素を測定することにより、8、10、12、24もしくは48時間以内、または3、4、5、6、7もしくは10日以内に血漿から除去されるLNPが挙げられる。ある実施形態では、LNPの脂質封入されたものに対する、遊離脂質、RNAまたは核酸構成要素が測定される。
【０２６８】
脂質クリアランスは、文献に記載されるように測定されてもよい。Maier, M.A., et al. Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 (「Maier」)を参照のこと。例えばMaierでは、ルシフェラーゼ標的化siRNAを含有するLNP-siRNAシステムが、0.3mg/Kgで6〜8週齢のオスC57Bl/6マウスに、外側尾静脈を介した静脈内ボーラス注射により投与された。血液、肝臓および脾臓のサンプルが、投与後、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96および168時間で採取された。組織採取の前に生理食塩水を用いてマウスをかん流し、血液サンプルを処理して血漿を得た。すべてのサンプルを処理して、LC-MSにより分析された。さらにMaierは、LNP-siRNA製剤投与後の毒性評価に関する方法も報告している。例えばルシフェラーゼ標的化siRNAは、0、1、3、5および10mg/kg（5匹／群）で、単回静脈内ボーラス注射を介して、オスSprague-Dawleyラットに5mL/kgの投与量で投与された。24時間後、約1mLの血液を意識のある動物の頸静脈から採取し、血清を単離した。投与後72時間ですべての動物を安楽死させ、解剖した。臨床兆候、体重、血清化学検査、器官重量および病理組織検査の評価を実施した。MaierはsiRNA-LNP製剤を評価する方法を記載しており、これらの方法を、本開示のLNP組成物投与のクリアランス、薬物動態および毒性の評価に適用してもよい。
【０２６９】
アミン脂質によって、クリアランス率が増加する。一部の実施形態では、クリアランス率は、脂質クリアランス率であり、例えばアミン脂質が血液、血清または血漿から除去される率である。一部の実施形態では、クリアランス率は、RNAクリアランス率であり、例えばmRNAまたはgRNAが血液、血清または血漿から除去される率である。一部の実施形態では、クリアランス率は、LNPが血液、血清または血漿から除去される率である。一部の実施形態では、クリアランス率は、LNPが例えば肝臓組織または脾臓組織などの組織から除去される率である。ある実施形態では、高率のクリアランス率によって、実質的な有害作用を伴わない安全性プロファイルがもたらされる。アミン脂質は循環および組織中のLNP蓄積を減少させる。一部の実施形態では、循環および組織中のLNP蓄積の減少によって、実質的な有害作用を伴わない安全性プロファイルがもたらされる。
【０２７０】
本開示のアミン脂質は、それが存在する培地のpHに応じてイオン化され得る。例えばやや酸性の培地中では、アミン脂質はプロトン化され、それにより正電荷を帯びる。逆にやや塩基性の培地中、例えばpHがおよそ7.35の血液中では、アミン脂質はプロトン化せず、電荷を帯びないであろう。一部の実施形態では、本開示のアミン脂質は、少なくとも約9のpHでプロトン化され得る。一部の実施形態では、本開示のアミン脂質は、少なくとも約9のpHでプロトン化され得る。一部の実施形態では、本開示のアミン脂質は、少なくとも約10のpHでプロトン化され得る。
【０２７１】
アミン脂質が電荷を帯びる能力は、その固有のpKaに関連する。例えば本開示のアミン脂質はそれぞれ独立して、約5.8〜約6.2の範囲のpKaを有してもよい。例えば本開示のアミン脂質はそれぞれ独立して、約5.8〜約6.5の範囲のpKaを有してもよい。これは有益であり得、例えば肝臓などへのインビボカーゴの送達には、約5.1〜約7.4の範囲のpKaを有するカチオン性脂質が有効であることが判明している。さらに、例えば腫瘍などへのインビボ送達には、約5.3〜約6.4の範囲のpKaを有するカチオン性脂質が有効であることが判明している。たとえば、WO2014/136086を参照のこと。
【０２７２】
追加脂質
本開示の脂質組成物における使用に適した「中性脂質」としては、様々な中性脂質、非荷電脂質または両性イオン脂質が挙げられる。本開示での使用に適した中性リン脂質の例としては限定されないが、5-ヘプタデシルベンゼン-1,3-ジオール(レソルシノール)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ホスホコリン(DOPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ホスファチジルコリン(PLPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DAPC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジラウリロイルホスファチジルコリン(DLPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、1-パルミトイル-2-ミリストイル ホスファチジルコリン(PMPC)、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン(PSPC)、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DBPC)、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(SPPC)、1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DEPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)が挙げられる。1つの実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)からなる群から選択されてもよい。別の実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)であってもよい。
【０２７３】
「ヘルパー脂質」には、ステロイド、ステロール、およびアルキルレソルシノールが含まれる。本開示における使用に適したヘルパー脂質としては限定されないが、コレステロール、5-ヘプタデシルレソルシノールおよびコレステロールヘミコハク酸塩が挙げられる。1つの実施形態では、ヘルパー脂質は、コレステロールであってもよい。1つの実施形態では、ヘルパー脂質は、コレステロールヘミコハク酸塩であってもよい。
【０２７４】
「ステルス脂質」は、ナノ粒子がインビボ（例えば血中）で存在できる時間の長さを変える脂質である。ステルス脂質は、例えば粒子の凝集を低下させ、粒子サイズを制御することにより製剤プロセスにおいて役に立ち得る。本明細書において使用されるステルス脂質は、LNPの薬物動態特性を調節し得る。本開示の脂質組成物における使用に適したステルス脂質としては限定されないが、脂質部分に結合された親水性の頭部基を有するステルス脂質が挙げられる。本開示の脂質組成物における使用に適したステルス脂質、およびそうした脂質の生化学に関する情報は、Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol. 25, No. 1, 2008, pg. 55-71、およびHoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52に見出すことができる。追加の適切なPEG脂質は、例えばWO 2006/007712に開示されている。
【０２７５】
1つの実施形態では、ステルス脂質の親水性頭部基は、PEGを基にしたポリマーから選択されるポリマー部分を含む。ステルス脂質は、脂質部分を含んでもよい。一部の実施形態では、ステルス脂質は、PEG脂質である。
【０２７６】
1つの実施形態では、ステルス脂質は、PEG(ポリ（エチレンオキシド）と呼称される場合もある）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（N-ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸およびポリ[N-(2-ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド]に基づいたポリマーから選択されるポリマー部分を含む。
【０２７７】
1つの実施形態では、PEG脂質は、PEG（ポリ（エチレンオキシド）と呼称される場合もある）に基づくポリマー部分を含む。
【０２７８】
PEG脂質はさらに脂質部分を含む。一部の実施形態では、脂質部分は、ジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから誘導されてもよく、約C4〜約C40の飽和または不飽和の炭素原子を独立して含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロール基またはジアルキルグリカミド基を含むものが挙げられ、この場合において当該鎖は、例えばアミドまたはエステルなどの官能基を1つまたは複数含み得る。一部の実施形態では、アルキル鎖長は、約C10〜C20を含む。ジアルキルグリセロール基またはジアルキルグリカミド基はさらに1つまたは複数の置換アルキル基を含んでもよい。当該鎖長は、対称性または非対称性であってもよい。
【０２７９】
別段の示唆がない限り、本明細書において使用される「PEG」という用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。1つの実施形態では、PEGは、任意で置換されるエチレングリコールもしくはエチレンオキシドの直鎖または分枝鎖のポリマーである。1つの実施形態では、PEGは、非置換である。1つの実施形態では、PEGは、例えば1つもしくは複数のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシまたはアリール基により置換される。1つの実施形態では、当該用語は、例えばPEG-ポリウレタンまたはPEG-ポリプロピレンなどのPEGコポリマーを含む（例えば、J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)を参照のこと）。別の実施形態では、当該用語は、PEGコポリマーを含まない。1つの実施形態では、PEGは、約130〜約50,000の分子量を有し、一部の従属実施形態では、約150〜約30,000、一部の従属実施形態では、約150〜約20,000、一部の従属実施形態では、約150〜約15,000、一部の従属実施形態では、約150〜約10,000、一部の従属実施形態では、約150〜約6,000、一部の従属実施形態では、約150〜約5,000、一部の従属実施形態では、約150〜約4,000、一部の従属実施形態では、約150〜約3,000、一部の従属実施形態では、約300〜約3,000、一部の従属実施形態では、約1,000〜約3,000、そして一部の従属実施形態では、約1,500〜約2,500の分子量を有する。
【０２８０】
ある実施形態では、PEG（例えばステルス脂質などの脂質部分または脂質に複合体化されている）は、「PEG-2K」であり、「PEG 2000」とも呼ばれる。これは約2,000ダルトンの平均分子量を有する。PEG-2Kは、本明細書において、以下の式（I）により表される。式中、nは45であり、これは多量体化の数平均の程度が、約45サブ単位を含むことを意味する。しかし当分野に公知の他のPEG実施形態を使用してもよく、例えば多量体化の数平均の程度が約23サブ単位(n=23）および／または68サブ単位（n=68）を含むものが挙げられる。一部の実施形態では、nは、約30〜約60の範囲であってもよい。一部の実施形態では、nは、約35〜約55の範囲であってもよい。一部の実施形態では、nは、約40〜約50の範囲であってもよい。一部の実施形態では、nは、約42〜約48の範囲であってもよい。一部の実施形態では、nは、45であってもよい。一部の実施形態では、Rは、H、置換アルキルおよび非置換アルキルから選択されてもよい。一部の実施形態では、Rは、非置換アルキルであってもよい。一部の実施形態では、Rは、メチルであってもよい。
【０２８１】
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、PEG脂質は、PEG-ジラウロイルグリセロール、PEG-ジミリストイルグリセロール(PEG-DMG)(カタログ番号# GM-020、NOF社、日本、東京）、PEG-ジパルミトイルグリセロール、PEG-ジステアロイルグリセロール(PEG-DSPE)(カタログ番号 # DSPE-020CN、NOF社、日本、東京）、PEG-ジラウリルグリカミド、PEG-ジミリスチルグリカミド、PEG-ジパルミトイルグリカミド、およびPEG-ジステアロイルグリカミド、PEG-コレステロール(1-[8'-(コレスト-5-en-3[ベータ]-オキシ)カルボキサミド-3',6'-ジオキサオクタニル]カルバモイル-[オメガ]-メチル-ポリ(エチレングリコール)、PEG-DMB (3,4-ジテトラデコキシベンジル-[オメガ]-メチル-ポリ(エチレングリコール)エーテル)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (PEG2k-DMG) (カタログ番号#880150P、Avanti Polar Lipids社、アラバマ州アラバスター、米国)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (PEG2k-DSPE) (カタログ番号#880120C、Avanti Polar Lipids社、アラバマ州アラバスター、米国)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロール、メトキシポリエチレングリコール (PEG2k-DSG; GS-020、NOF社、東京、日本）、ポリ(エチレングリコール)-2000-ジメタクリレート (PEG2k-DMA)、および1,2-ジステアリルオキシプロピル-3-アミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (PEG2k-DSA)から選択されてもよい。1つの実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DMGである。一部の実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DSGである。1つの実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DSPEである。1つの実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DMAである。1つの実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-C-DMAである。1つの実施形態では、PEG脂質は、WO2016/010840(パラグラフ[00240]〜[00244])に記載される化合物S027であってもよい。1つの実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DSAである。1つの実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-C11である。一部の実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-C14である。一部の実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-C16である。一部の実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-C18である。
【０２８２】
LNPは、（i）封入およびエンドソーム脱出のためのアミン脂質、（ii）安定化のための中性脂質、（iii）さらに安定化のためのヘルパー脂質、および（iv）例えばPEG脂質などのステルス脂質、を含有してもよい。
【０２８３】
一部の実施形態では、LNP組成物は、RNA誘導型DNA結合剤、Casヌクレアーゼ mRNA、クラス2のCasヌクレアーゼ mRNA、Cas9 mRNAおよびgRNAのうちの1つまたは複数を含むRNA構成要素を含んでもよい。一部の実施形態では、LNP組成物は、RNA構成要素としてクラス2 CasヌクレアーゼおよびgRNAを含んでもよい。ある実施形態では、LNP組成物は、RNA構成要素、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、およびステルス脂質を含んでもよい。あるLNP組成物では、ヘルパー脂質は、コレステロールである。他の組成物では、中性脂質は、DSPCである。追加の実施形態では、ステルス脂質は、PEG2k-DMGまたはPEG2k-C11である。ある実施形態では、LNP組成物は、Lipid AまたはLipid Aの均等物、ヘルパー脂質、中性脂質、ステルス脂質、およびガイドRNAを含む。ある組成物では、アミン脂質は、Lipid Aである。ある組成物では、アミン脂質は、Lipid Aまたはそのアセタールアナログであり、ヘルパー脂質は、コレステロールであり、中性脂質は、DSPCであり、およびステルス脂質は、PEG2k-DMGである。
【０２８４】
ある実施形態では、脂質組成物は、製剤中の脂質構成要素の各モル比に従って記載される。本開示の実施形態は、製剤中の脂質構成要素の各モル比に従って記載される脂質組成物を提供する。1つの実施形態では、アミン脂質のモル％は、約30モル％〜約60モル％であってもよい。1つの実施形態では、アミン脂質のモル％は、約40モル％〜約60モル％であってもよい。1つの実施形態では、アミン脂質のモル％は、約45モル％〜約60モル％であってもよい。1つの実施形態では、アミン脂質のモル％は、約50モル％〜約60モル％であってもよい。1つの実施形態では、アミン脂質のモル％は、約55モル％〜約60モル％であってもよい。1つの実施形態では、アミン脂質のモル％は、約50モル％〜約55モル％であってもよい。1つの実施形態では、アミン脂質のモル％は、約50モル％であってもよい。1つの実施形態では、アミン脂質のモル％は、約55モル％であってもよい。一部の実施形態では、LNPバッチのアミン脂質のモル％は、標的モル％の±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%または±2.5%となる。一部の実施形態では、LNPバッチのアミン脂質のモル％は、標的モル％の±4モル%、±3モル%、±2モル%、±1.5モル%、±1モル%、±0.5モル%または±0.25モル%となる。すべてのモル％の数値は、LNP組成物の脂質構成要素の割合として与えられる。ある実施形態では、アミン脂質モル％のLNPロット間変動は、15％未満、10％未満または5％未満となる。
【０２８５】
1つの実施形態では、中性脂質のモル％は、約5モル％〜約15モル％であってもよい。1つの実施形態では、中性脂質のモル％は、約7モル％〜約12モル％であってもよい。1つの実施形態では、中性脂質のモル％は、約9モル％であってもよい。一部の実施形態では、LNPバッチの中性脂質のモル％は、標的中性脂質モル％の±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%または±2.5%となる。ある実施形態では、LNPロット間変動は、15％未満、10％未満または5％未満となる。
【０２８６】
1つの実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約20モル％〜約60モル％であってもよい。1つの実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約25モル％〜約55モル％であってもよい。1つの実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約25モル％〜約50モル％であってもよい。1つの実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約25モル％〜約40モル％であってもよい。1つの実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約30モル％〜約50モル％であってもよい。1つの実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約30モル％〜約40モル％であってもよい。1つの実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、アミン脂質、中性脂質およびPEG脂質濃度に基づき、100モル％の脂質構成要素となるよう調整される。一部の実施形態では、LNPバッチのヘルパー脂質のモル％は、標的モル％の±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%または±2.5%となる。ある実施形態では、LNPロット間変動は、15％未満、10％未満または5％未満となる。
【０２８７】
1つの実施形態では、PEG脂質のモル％は、約1モル％〜約10モル％であってもよい。1つの実施形態では、PEG脂質のモル％は、約2モル％〜約10モル％であってもよい。1つの実施形態では、PEG脂質のモル％は、約2モル％〜約8モル％であってもよい。1つの実施形態では、PEG脂質のモル％は、約2モル％〜約4モル％であってもよい。1つの実施形態では、PEG脂質のモル％は、約2.5モル％〜約4モル％であってもよい。1つの実施形態では、PEG脂質のモル％は、約3モル％であってもよい。1つの実施形態では、PEG脂質のモル％は、約2.5モル％であってもよい。一部の実施形態では、LNPバッチのPEG脂質のモル％は、標的PEG脂質モル％の±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%または±2.5%となる。ある実施形態では、LNPロット間変動は、15％未満、10％未満または5％未満となる。
【０２８８】
ある実施形態では、カーゴには、RNA誘導型DNA結合剤（例えばCasヌクレアーゼ、クラス2Casヌクレアーゼ、またはCas9）をコードするmRNA、およびgRNAもしくはgRNAをコードする核酸、またはmRNAとgRNAの組み合わせが含まれる。1つの実施形態では、LNP組成物は、Lipid Aまたはその均等物を含んでもよい。一部の態様では、アミン脂質は、Lipid Aである。一部の態様では、アミン脂質は、Lipid A均等物、例えばLipid Aのアナログである。ある実施形態では、アミン脂質は、Lipid Aのアセタールアナログである。様々な実施形態では、LNP組成物は、アミン脂質、中性脂質、ヘルパー脂質およびPEG脂質を含む。ある実施形態では、ヘルパー脂質は、コレステロールである。ある実施形態では、中性脂質は、DSPCである。特定の実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DMGである。一部の実施形態では、LNP組成物は、Lipid A、ヘルパー脂質、中性脂質およびPEG脂質を含んでもよい。一部の実施形態では、LNP組成物は、アミン脂質、DSPC、コレステロールおよびPEG脂質を含む。一部の実施形態では、LNP組成物は、DMGを含むPEG脂質を含む。ある実施形態では、アミン脂質は、Lipid A、およびLipid AのアセタールアナログをはじめとするLipid Aの均等物から選択される。追加の実施形態では、LNP組成物は、Lipid A、コレステロール、DSPCおよびPEG2k-DMGを含む。
【０２８９】
本開示の実施形態はさらに、封入されるアミン脂質の正電荷アミン基（N）と、核酸の負電荷リン酸基（P）の間のモル比に従い記載される脂質組成物を提供する。これはN/Pという方程式により数学的に表され得る。一部の実施形態では、LNP組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質およびヘルパー脂質を含む脂質構成要素、ならびに核酸構成要素を含んでもよく、この場合においてN/P比は約3〜10である。一部の実施形態では、LNP組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質およびヘルパー脂質を含む脂質構成要素、ならびにRNA構成要素を含んでもよく、この場合においてN/P比は約3〜10である。1つの実施形態では、N/P比は、約5〜7であってもよい。1つの実施形態では、N/P比は、約4.5〜8であってもよい。1つの実施形態では、N/P比は、約6であってもよい。1つの実施形態では、N/P比は、6±1であってもよい。1つの実施形態では、N/P比は、約6±0.5であってもよい。一部の実施形態では、N/P比は、標的N/P比の±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%または±2.5%となる。ある実施形態では、LNPロット間変動は、15％未満、10％未満または5％未満となる。
【０２９０】
一部の実施形態では、RNA構成要素は、例えば本明細書に記載される、CasヌクレアーゼをコードするmRNAなどのmRNAを含んでもよい。1つの実施形態では、RNA構成要素は、Cas9 mRNAを含んでもよい。CasヌクレアーゼをコードするmRNAを含む一部の組成物では、LNPは、例えばgRNAなどのgRNA核酸をさらに含む。一部の実施形態では、RNA構成要素は、CasヌクレアーゼmRNAおよびgRNAを含む。一部の実施形態では、RNA構成要素は、クラス2CasヌクレアーゼmRNAおよびgRNAを含む。
【０２９１】
ある実施形態では、LNP組成物は、例えばクラス2CasヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼをコードするmRNA、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質およびPEG脂質を含んでもよい。例えばクラス2CasヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、あるLNP組成物では、ヘルパー脂質は、コレステロールである。例えばクラス2CasヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、他の組成物では、中性脂質は、DSPCである。例えばクラス2CasヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、追加の実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DMGまたはPEG2k-C11である。例えばクラス2CasヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼをコードするmRNAを含む、特定の組成物では、アミン脂質は、Lipid A、および例えばLipid Aのアセタールアナログなどのその均等物から選択される。
【０２９２】
一部の実施形態では、LNP組成物は、gRNAを含んでもよい。ある実施形態では、LNP組成物は、アミン脂質、gRNA、ヘルパー脂質、中性脂質およびPEG脂質を含んでもよい。gRNAを含む、あるLNP組成物では、ヘルパー脂質は、コレステロールである。gRNAを含む、いくつかの組成物では、中性脂質は、DSPCである。gRNAを含む、追加の実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DMGまたはPEG2k-C11である。ある実施形態では、アミン脂質は、Lipid A、および例えばLipid Aのアセタールアナログなどのその均等物から選択される。
【０２９３】
1つの実施形態では、LNP組成物は、sgRNAを含んでもよい。1つの実施形態では、LNP組成物は、Cas9 sgRNAを含んでもよい。1つの実施形態では、LNP組成物は、Cpf1 sgRNAを含んでもよい。sgRNAを含む、一部の組成物では、LNPは、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質およびPEG脂質を含む。sgRNAを含む、ある組成物では、ヘルパー脂質は、コレステロールである。sgRNAを含む、他の組成物では、中性脂質は、DSPCである。sgRNAを含む、追加の実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DMGまたはPEG2k-C11である。ある実施形態では、アミン脂質は、Lipid A、および例えばLipid Aのアセタールアナログなどのその均等物から選択される。
【０２９４】
ある実施形態では、LNP組成物は、本明細書に開示されるmRNA、例えばCasヌクレアーゼをコードするmRNA、およびsgRNAであり得るgRNAを含む。1つの実施形態では、LNP組成物は、アミン脂質、CasヌクレアーゼをコードするmRNA、gRNA、ヘルパー脂質、中性脂質およびPEG脂質を含んでもよい。CasヌクレアーゼをコードするmRNA、およびgRNAを含む、ある組成物では、ヘルパー脂質は、コレステロールである。CasヌクレアーゼをコードするmRNA、およびgRNAを含む、一部の組成物では、中性脂質は、DSPCである。CasヌクレアーゼをコードするmRNA、およびgRNAを含む、追加の実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DMGまたはPEG2k-C11である。ある実施形態では、アミン脂質は、Lipid A、および例えばLipid Aのアセタールアナログなどのその均等物から選択される。
【０２９５】
ある実施形態では、LNP組成物は、例えばクラス2Cas mRNAなどのCasヌクレアーゼmRNA、および少なくとも1つのgRNAを含む。ある実施形態では、LNP組成物は、gRNAとCasヌクレアーゼmRNA、例えばクラス2CasヌクレアーゼmRNAを、約25：1〜約1：25の比率で含む。ある実施形態では、LNP製剤は、gRNAとCasヌクレアーゼmRNA、例えばクラス2CasヌクレアーゼmRNAを、約10：1〜約1：10の比率で含む。ある実施形態では、LNP製剤は、gRNAとCasヌクレアーゼmRNA、例えばクラス2CasヌクレアーゼmRNAを、約8：1〜約1：8の比率で含む。本明細書において測定される場合、比率は、重量による。一部の実施形態では、LNP製剤は、gRNAとCasヌクレアーゼmRNA、例えばクラス2Cas mRNAを、約5：1〜約1：5の比率で含む。一部の実施形態では、比率の範囲は、約3:1〜1:3、約2:1〜1:2、約5:1〜1:2、約5:1〜1:1、約3:1〜1:2、約3:1〜1:1、約3:1、約2:1〜1:1である。一部の実施形態では、gRNAとmRNAの比率は、約3：1または約2：1である。一部の実施形態では、gRNAとCasヌクレアーゼ mRNA、例えばクラス2Casヌクレアーゼの比率は、約1：1である。比率は、約25:1、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:10または1:25であってもよい。
【０２９６】
本明細書に開示されるLNP組成物は、鋳型核酸を含んでもよい。鋳型核酸は、例えばクラス2CasヌクレアーゼmRNAなどのCasヌクレアーゼをコードするmRNAとともに製剤化されてもよい。一部の実施形態では、鋳型核酸は、ガイドRNAとともに製剤化されてもよい。一部の実施形態では、鋳型核酸は、CasヌクレアーゼをコードするmRNAおよびガイドRNAの両方とともに製剤化されてもよい。一部の実施形態では、鋳型核酸は、CasヌクレアーゼをコードするmRNAまたはガイドRNAとは別個に製剤化されてもよい。鋳型核酸は、LNP組成物とともに送達されてもよく、またはLNP組成物とは別個に送達されてもよい。一部の実施形態では、鋳型核酸は、所望の修復機序に応じて、一本鎖または二本鎖であってもよい。鋳型は、標的DNAに相同な領域、または標的DNAに隣接した配列に相同な領域を有してもよい。
【０２９７】
本明細書に記載されるLNP製剤のいずれかは、例えばCasヌクレアーゼなどのRNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAの単独送達、または1つもしくは複数のガイドRNAと一緒の送達に適している。一部の実施形態では、LNP組成物は、RNA構成要素および脂質構成要素を含んで包含され、この場合において当該脂質構成要素は、アミン脂質、中性脂質、ヘルパー脂質およびステルス脂質を含み、N/P比は、約1〜10である。
【０２９８】
一部の例では、脂質構成要素は、Lipid A、またはそのアセタールアナログ、コレステロール、DSPCおよびPEG-DMGを含み、この場合においてN/P比は、約1〜10である。一部の実施形態では、脂質構成要素は、約40〜60モル％のアミン脂質、約5〜15モル％の中性脂質、および約1.5〜10モル％のPEG脂質を含み、この場合において脂質構成要素の残りはヘルパー脂質であり、LNP組成物のN/P比は、約3〜10である。一部の実施形態では、脂質構成要素は、約50〜60モル％のアミン脂質、約8〜10モル％の中性脂質、および約2.5〜4モル％のPEG脂質を含み、この場合において脂質構成要素の残りはヘルパー脂質であり、LNP組成物のN/P比は、約3〜8である。一部の例では、脂質構成要素は、約50〜60モル％のアミン脂質、約5〜15モル％のDSPC、および約2.5〜4モル％のPEG脂質を含み、この場合において脂質構成要素の残りはコレステロールであり、LNP組成物のN/P比は、約3〜8である。一部の例では、脂質構成要素は、43〜53モル％のLipid A、約8〜10モル％のDSPC、および1.5〜10モル％のPEG脂質を含み、この場合において脂質構成要素の残りはコレステロールであり、LNP組成物のN/P比は、3〜8±0.2である。
【０２９９】
一部の実施形態では、LNPは、RNA水溶液と、例えば100％エタノールなどの有機溶媒系の脂質溶液を混合することにより形成される。適切な溶液または溶媒としては、水、PBS、Tris緩衝液、NaCl、クエン酸緩衝液、エタノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、イソプロパノールが挙げられ、またはそれらを含んでもよい。例えばLNPのインビボ投与に関して薬学的に許容可能な緩衝液を使用してもよい。ある実施形態では、緩衝液を使用して、LNPを含む組成物のpHを、pH6.5以上に維持する。ある実施形態では、緩衝液を使用して、LNPを含む組成物のpHを、pH7.0以上に維持する。ある実施形態では、組成物は、約7.2〜約7.7の範囲のpHを有する。追加的な実施形態では、組成物は、約7.3〜約7.7の範囲のpH、または約7.4〜約7.6の範囲のpHを有する。さらなる実施形態では、組成物は、約7.2、7.3、7.4、7.5、7.6または7.7のpHを有する。組成物のpHは、マイクロpHプローブを用いて測定されてもよい。ある実施形態では、抗凍結剤が組成物に含まれる。抗凍結剤の非限定的な例としては、スクロース、トレハロース、グリセロール、DMSO、およびエチレングリコールが挙げられる。例示的な組成物は、10％以下の例えばスクロースなどの抗凍結剤を含んでもよい。ある実施形態では、LNP組成物は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10%の抗凍結剤を含んでもよい。ある実施形態では、LNP組成物は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10%のスクロースを含んでもよい。一部の実施形態では、LNP組成物は、緩衝液を含んでもよい。一部の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液（PBS）、Tris緩衝液、クエン酸緩衝液およびそれらの混合物を含んでもよい。ある例示的な実施形態では、緩衝液は、NaClを含む。ある実施形態では、NaClは、除外される。NaCl量の例は、約20mM〜約45mMの範囲であってもよい。NaCl量の例は、約40mM〜約50mMの範囲であってもよい。一部の実施形態では、NaCl量は、約45mMである。一部の実施形態では、緩衝液は、Tris緩衝液である。Tris量の例は、約20mM〜約60mMの範囲であってもよい。Tris量の例は、約40mM〜約60mMの範囲であってもよい。一部の実施形態では、Tris量は、約50mMである。一部の実施形態では、緩衝液は、NaClおよびTrisを含む。LNP組成物のある例示的な実施形態は、Tris緩衝液中で5％スクロースおよび45mM NaClを含有する。他の例示的な実施形態では、組成物は、約5％w/vの量のスクロース、約45mM NaCl、およびpH7.5の約50mM Trisを含有する。塩、緩衝液および抗凍結剤の量は、製剤全体の浸透圧が維持されるように変化させてもよい。例えば最終浸透圧は、450mOsm/L未満で維持されてもよい。さらなる実施形態では、浸透圧は、350〜250mOsm/Lである。ある実施形態では、300±20mOsm/Lの最終浸透圧を有する。
【０３００】
一部の実施形態では、マイクロ流体混合法、T-混合法または交差混合（cross-mixing）法が使用される。ある態様では、流速、ジャンクションサイズ、ジャンクションの配置、ジャンクションの形状、管の直径、溶液、ならびに／またはRNAおよび脂質の濃度を変化させてもよい。LNPまたはLNP組成物は、例えば透析、接線流ろ過またはクロマトグラフィーなどを介して濃縮または精製されてもよい。LNPは、例えば懸濁液として、エマルションとして、または凍結乾燥粉末として保存されてもよい。一部の実施形態では、LNP組成物は、2〜8℃で保存され、ある態様では、LNP組成物は室温で保存される。追加的な実施形態では、LNP組成物は、例えば−20℃または−80℃で凍結保存される。他の実施形態では、LNP組成物は、約0℃〜約−80℃の範囲の温度で保存される。凍結されたLNP組成物は使用前に例えば氷上、4℃、室温または25℃で融解されてもよい。凍結されたLNP組成物は例えば氷上、4℃、室温、25℃または37℃などの様々な温度で維持されてもよい。
【０３０１】
一部の実施形態では、LNP組成物は、約80％を超えるカプセル封入を有する。一部の実施形態では、LNP組成物は、約120nm未満の粒子サイズを有する。一部の実施形態では、LNP組成物は、約0.2未満のpdiを有する。一部の実施形態では、これら特性のうち少なくとも2つが存在する。一部の実施形態では、これら3つの特性のそれぞれが存在する。これらパラメーターを決定するための解析方法は、以下の一般的試薬および方法のセクションにおいて検討する。
【０３０２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAと関連づけられたLNPは、医薬品の調製における使用のためである。
【０３０３】
また、エレクトロポレーション法もカーゴ送達の公知の手段であり、任意のエレクトロポレーション法が、本明細書に開示されるgRNAのいずれか1つの送達に使用されてもよい。一部の実施形態では、エレクトロポレーション法を使用して、本明細書に開示されるmRNAおよび1つまたは複数のガイドRNAを送達してもよい。
【０３０４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAを、生体外の細胞に送達する方法が提供され、この場合において当該mRNAは、LNPと関連づけられ、またはLNPと関連づけられない。一部の実施形態では、mRNA／LNPまたはmRNAは、1つまたは複数のガイドRNAとも関連づけられる。
【０３０５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAが、医薬組成物中で哺乳動物に投与される場合、当該哺乳動物は、最小ウリジン含有量の150％を超えるCas9ヌクレアーゼをコードするmRNAを投与された哺乳動物よりも、少なくとも1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、7.5、8、8.5、9、9.5または10倍低いサイトカイン反応を呈する。サイトカイン反応は、実施例に記載されるように決定されてもよい。サイトカイン反応間の違いは、例えば以下のサイトカインのうちの少なくとも1つ、2つ、3つまたは4つなど、サイトカインパネル中の平均変化として測定され得る：IFNアルファ、IL-6、TNFアルファおよびMCP-1。一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAが、医薬組成物中で哺乳動物に投与される場合、当該哺乳動物は、Cas9ヌクレアーゼをコードするORFを有するmRNAを投与された哺乳動物よりも、少なくとも1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、7.5、8、8.5、9、9.5または10倍低いサイトカイン反応を呈し、この場合において当該ORFの配列は、配列番号5からなる。一部の実施形態では、配列番号5からなる配列を有するORF中のウリジンは、改変されていない。一般的に、投与量を含む、mRNA以外の比較組成の特性は一定に保たれなければならず、投与量は適切な範囲、例えば0.1〜5mpkなどの範囲、または本明細書に記載される他の範囲（例えばmRNAセクションの効率の決定に検討されている）でなければならないと理解されている。
【０３０６】
一部の実施形態では、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、RNA誘導型DNA結合剤をコードするヌクレオチド配列を含む同じベクター、転写物またはmRNA上に位置付けられてもよい。一部の実施形態では、ガイドRNAおよびRNA誘導型DNA結合剤の発現は、それら自体の対応するプロモーターにより誘導されてもよい。一部の実施形態では、ガイドRNAの発現は、RNA誘導型DNA結合剤の発現を誘導するものと同じプロモーターにより誘導されてもよい。一部の実施形態では、ガイドRNA、およびRNA誘導型DNA結合剤をコードするORFは、単一の転写物内に含有されてもよい。例えばガイドRNAは、RNA誘導型DNA結合剤の転写物の非翻訳領域（UTR）内であってもよい。一部の実施形態では、ガイドRNAは、RNA誘導型DNA結合剤の転写物の5’UTR内であってもよい。他の実施形態では、ガイドRNAは、RNA誘導型DNA結合剤の転写物の3’UTR内であってもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤の転写物の細胞内半減期は、その3’UTR内にガイドRNAを含有させ、それによりその3’UTRの長さを短縮させることで減少させ得る。追加の実施形態では、ガイドRNAは、RNA誘導型DNA結合剤の転写物のイントロン内であってもよい。一部の実施形態では、イントロンで適切なスプライス部位が加えられてもよく、それによりそのイントロン内にガイドRNAが配置され、ガイドRNAが転写物から適切にスプライスアウトされる。一部の実施形態では、同じベクター上で近接しているRNA誘導型DNA結合剤とガイドRNAを発現させることで、RNA誘導型DNA結合剤とガイドRNAのリボ核タンパク質複合体の形成が、より効率的に促進されてもよい。
【０３０７】
一部の実施形態では、本開示によるmRNAを含む医薬製剤が提供される。一部の実施形態では、例えば本開示によるmRNAを含む、少なくとも1つの脂質、例えばLNPを含む医薬製剤が提供される。例えば上述のものなど、RNAの送達に適した任意のLNPを使用することができる。LNPの追加例は、3017年3月30日に出願されたPCT/US2017/024973に記載されている。医薬製剤は、例えば水または緩衝液などの薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。医薬製剤は、例えば安定剤、保存剤、増量剤などの薬学的に許容可能な賦形剤を1つまたは複数、さらに含むことができる。医薬製剤は、例えば塩化ナトリウムなどの薬学的に許容可能な塩を1つまたは複数、さらに含むことができる。一部の実施形態では、医薬製剤は、静脈内投与用に製剤化される。一部の実施形態では、医薬製剤は、肝循環内への送達用に製剤化される。
Ｃ．mRNAの有効性の決定
【０３０８】
一部の実施形態では、mRNAの有効性は、RNPの他の構成要素、例えばTTRを標的とするgRNAなど、少なくとも1つのgRNAとともに発現されたときに決定される。
【０３０９】
開裂活性を有するRNA誘導型DNA結合剤により、DNA中で二本鎖切断がもたらされ得る。非相同末端結合（NHEJ：nonhomologous end joining）は、DNA中の二本鎖切断（DSB）が、切断末端の再結合を介して修復されるプロセスであり、挿入／欠失（indel）変異の形態でエラーを生じさせ得る。DSBのDNA末端はしばしば酵素処理を受けて、一端または両端のヌクレオチドの付加または除去を生じさせ、その後、その末端が再結合される。再結合前のこれらの付加または除去によって、DNA配列中にNHEJ修復部位で挿入または欠失（indel）変異が存在するようになる。indelによる変異の多くがリーディングフレームを変化させ、または未成熟停止コドンを生じさせ、そして非機能性タンパク質を生成させる。
【０３１０】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするmRNAの有効性は、インビトロモデルに基づいて決定される。一部の実施形態では、インビトロモデルは、HEK293細胞である。一部の実施形態では、インビトロモデルは、HUH7ヒト肝癌細胞である。一部の実施形態では、インビトロモデルは、例えば初代ヒト肝細胞または初代マウス肝細胞などの初代肝細胞である。
【０３１１】
一部の実施形態では、RNAの有効性は、TTR編集割合により測定される。編集割合の決定方法の例は、以下の実施例に提示される。一部の実施形態では、TTR編集割合は、mRNAが非改変のウリジンを含み、その他の条件はすべて同じである配列番号5のORFを含むときに得られる編集割合と比較われる。
【０３１２】
一部の実施形態では、mRNAの有効性は、mRNAと、TTRを標的とする例えば配列番号42などのgRNAを含むLNPの投与後のマウスの血清TTR濃度を使用して決定される。一部の実施形態では、mRNAの有効性は、mRNAと、TTRを標的とする例えば配列番号69などのgRNAを含むLNPの投与後のラットの血清TTR濃度を使用して決定される。血清TTR濃度は、絶対項または偽処置された対照との相対的なノックダウン％で表され得る。一部の実施形態では、mRNAの有効性は、mRNAと、TTRを標的とする例えば配列番号42などのgRNAを含むLNPの投与後のマウスの肝臓中の編集割合を使用して決定される。一部の実施形態では、有効量は、血清TTRの少なくとも50％の編集または50％のノックダウンを実現することができる。有効量の例は、0.1〜10mg/kg（mpk）の範囲、例えば0.1〜0.3mpk、0.3〜0.5mpk、0.5〜1mpk、1〜2mpk、2〜3mpk、3〜5mpk、5〜10mpk、または0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3、5もしくは10mpkである。
【０３１３】
一部の実施形態では、例えば標的DNA中の挿入／欠失（indel）変異の形成、および相同組み換え修復（HDR：homology directed repair）事象などの遺伝子編集事象の検出は、タグ化プライマーを用いた線形増幅、およびタグ化増幅産物の単離を利用する（本明細書において以降、「LAM-PCR」または「線形増幅（LA：Linear Amplification）」法と呼称される）。
【０３１４】
一部の実施形態では、当該方法は、二本鎖切断（DSB）を有するように誘導された、および任意でDSBを修復するためのHDR鋳型が与えられた細胞から細胞DNAを単離する工程；タグ化プライマーを用いて、DNAの線形増幅を少なくとも1サイクル実施する工程；タグを含む線形増幅産物を単離し、それにより非タグ化プライマーで増幅した増幅産物をすべて除外する工程；任意で、単離産物をさらに増幅する工程；および線形増幅産物またはさらに増幅された産物を分析し、例えば標的DNA中の二本鎖切断、挿入、欠失またはHDR鋳型配列などの編集事象の存在または非存在を決定する工程、を含む。一部の例では、編集事象は、定量されることができる。本明細書において使用される場合、定量（HDR、および例えばindelなどの非HDR編集事象の状況下を含む）は、集団における編集事象の頻度および／または型を検出する工程を含む。
【０３１５】
一部の実施形態では、線形増幅は1サイクルのみ実施される。
【０３１６】
一部の例では、タグ化プライマーは、分子バーコードを含む。一部の実施形態では、タグ化プライマーは、分子バーコードを含み、線形増幅は1サイクルのみ実施される。
【０３１７】
一部の実施形態では、分析工程は、線形増幅産物またはさらに増幅された産物の配列解析工程を含む。配列解析工程は、次世代シーケンスをはじめとする当業者に公知の任意の方法を含み、ならびに線形増幅産物またはさらに増幅された産物を、プラスミド内にクローニングする工程、およびプラスミドまたはプラスミドの一部を配列解析する工程を含む。他の態様では、分析工程は、線形増幅産物またはさらに増幅された産物に、デジタルPCR(dPCR）またはドロップレットデジタルPCR（ddPCR）を実施する工程を含む。他の例では、分析工程は、線形増幅産物またはさらに増幅された産物と、HDR鋳型配列を含むDNAを特定するよう設計された核酸プローブを接触させる工程、および線形増幅産物またはさらに増幅された産物に結合したプローブを検出する工程、を含む。一部の実施形態では、当該方法はさらに、標的DNA中のHDR鋳型の位置を決定する工程を含む。
【０３１８】
ある実施形態では、当該方法はさらに、標的DNA中の挿入部位の配列を決定する工程を含み、この場合において当該挿入部位は、HDR鋳型が標的DNAに組み込まれる位置であり、当該挿入部位は、標的DNA配列の一部およびHDR鋳型配列の一部を含み得る。
【０３１９】
一部の実施形態では、タグ化プライマーを用いた標的DNAの線形増幅は、1〜50サイクル、1〜60サイクル、1〜70サイクル、1〜80サイクル、1〜90サイクル、または1〜100サイクルの間、実施される。
【０３２０】
一部の実施形態では、タグ化プライマーを用いた標的DNAの線形増幅は、DNA二本鎖を分離させるための変性工程、およびプライマーを結合させるためのアニーリング工程、および伸長工程を含む。一部の実施形態では、線形増幅は、等温である（温度変化を必要としない）。一部の実施形態では、等温線形増幅は、ループ介在等温増幅法（LAMP：loop-mediated isothermal amplification）、鎖置換型増幅法（SDA:strand displacement amplification）、ヘリカーゼ依存性増幅法、またはニッキング酵素増幅反応法である。
【０３２１】
一部の実施形態では、タグ化プライマーは、例えば挿入部位、欠失部位または鋳型挿入部位などの予測される編集事象の位置から、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、少なくとも230、少なくとも240、少なくとも250、少なくとも260、少なくとも270、少なくとも280、少なくとも290、少なくとも300、少なくとも1,000、少なくとも5,000または少なくとも10,000ヌクレオチド離れて標的DNAにアニーリングする。
【０３２２】
一部の実施形態では、タグ化プライマーは、分子バーコードを含む。一部の実施形態では、分子バーコードは、標的DNAに相補的ではない配列を含む。一部の実施形態では、分子バーコードは、6、8、10または12個のヌクレオチドを含む。
【０３２３】
一部の実施形態では、プライマー上のタグは、ビオチン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、DNA配列、またはフルオレセインイソチオシアネート（FITC)である。
【０３２４】
一部の実施形態では、線形増幅産物は、プライマー上のタグに特異的な捕捉試薬を使用して単離される。一部の実施形態では、捕捉試薬は、ビーズ、固形支持体、マトリクスまたはカラム上にある。一部の実施形態では、単離工程は、線形増幅産物と、プライマー上のタグに特異的な捕捉試薬を接触させる工程を含む。一部の実施形態では、捕捉試薬は、ビオチン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、DNA配列、またはフルオレセインイソチオシアネート（FITC)である。
【０３２５】
一部の実施形態では、タグは、ビオチンであり、捕捉試薬は、ストレプトアビジンである。一部の実施形態では、タグは、ストレプトアビジンであり、捕捉試薬は、ビオチンである。一部の実施形態では、タグは、プライマーの5’末端、プライマーの3’末端、またはプライマーの内部にある。一部の実施形態では、タグおよび／または捕捉試薬は、単離工程の後に除去される。一部の実施形態では、タグおよび／または捕捉試薬は除去されず、さらなる増幅工程および分析工程は、タグおよび／または捕捉試薬の存在下で実施される。
【０３２６】
一部の実施形態では、さらなる増幅は、非線形である。一部の実施形態では、さらなる増幅は、デジタルPCR、qPCRまたはRT-PCRである。一部の実施形態では、配列解析は、次世代シーケンス（NGS）である。
【０３２７】
一部の実施形態では、標的DNAは、ゲノムまたはミトコンドリアのDNAである。一部の実施形態では、標的DNAは、原核細胞または真核細胞のゲノムDNAである。一部の実施形態では、標的DNAは、哺乳動物のDNAである。標的DNAは、非分裂細胞または分裂細胞に由来してもよい。一部の実施形態では、標的DNAは、初代細胞に由来してもよい。一部の実施形態では、標的DNAは、複製細胞に由来してもよい。
【０３２８】
一部の例では、細胞DNAは、せん断された後に、線形増幅される。一部の実施形態では、せん断されたDNAは、0.5kb〜20kbの平均サイズである。一部の例では、細胞DNAは、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.5、9.75、10.0、10.25、10.5、10.75、11.0、11.25、11.5、11.75、12.0、12.25、12.5、12.75、13.0、13.25、13.5、13.75、14.0、14.25、14.5、14.75、15.0、15.25、15.5、15.75、16.0、16.25、16.5、16.75、17.0、17.25、17.5、17.75、18.0、18.25、18.5、18.75、19.0、19.25、19.5、19.75、または20.0kbの平均サイズにせん断される。一部の例では、細胞DNAは、約1.5kbの平均サイズにせん断される。
【０３２９】
Ｄ．用途、方法および治療の例
一部の実施形態では、mRNA、LNPまたは医薬組成物は、例えば標的遺伝子の編集などのゲノム編集における使用のためである。一部の実施形態では、mRNA、LNPまたは医薬組成物は、例えばその配列またはエピジェネティックの状態を変えるなど、標的遺伝子の改変における使用のためである。一部の実施形態では、mRNA、LNPまたは医薬組成物は、標的遺伝子内への二本鎖切断（DSB）の導入における使用のためである。一部の実施形態では、mRNA、LNPまたは医薬組成物は、標的遺伝子内へのindelの導入における使用のためである。一部の実施形態では、例えば標的遺伝子の編集などのゲノム編集のための医薬の調製のための、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物の使用が提供される。一部の実施形態では、例えばその配列またはエピジェネティックの状態を変えるなど、標的遺伝子の改変のための医薬の調製のための、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物の使用が提供される。一部の実施形態では、標的遺伝子内への二本鎖切断（DSB）の導入のための医薬の調製のための、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物の使用が提供される。一部の実施形態では、標的遺伝子内へのindelの導入のための医薬の調製のための、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物の使用が提供される。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えばヒトなどの哺乳動物といった対象中にある。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えばヒトの肝臓など、哺乳動物の肝臓などの器官中にある。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えばヒトの肝臓の細胞など、哺乳動物の肝臓の細胞などの肝臓の細胞中にある。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えばヒト肝細胞など、哺乳動物肝細胞などの肝細胞中にある。一部の実施形態では、肝臓の細胞または肝細胞は、原位置（in situ）にある。一部の実施形態では、肝臓の細胞または肝細胞は、例えば初代培養中など、培養中に単離される。本明細書に開示される用途に対応する方法も提供され、当該方法は、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物を対象に投与する工程、または上述の細胞などの細胞と、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物を接触させる工程を含む。
【０３３０】
一部の実施形態では、mRNA、LNPまたは医薬組成物は、TTRと関連したアミロイドーシス（ATTR）などの疾患の治療または療法における使用のためである。一部の実施形態では、例えばTTRと関連したアミロイドーシス（ATTR）を有する対象の治療のための医薬の調製のための、本明細書に開示されるmRNA（例えば本明細書に開示される組成物における）の使用が提供される。
【０３３１】
一部の実施形態では、mRNA、LNPまたは医薬組成物は、生物体、器官または原位置の細胞に関し上記に検討される使用のいずれかのために、静脈内投与される。一部の実施形態では、mRNA、LNPまたは医薬組成物は、0.01〜10mg/kg（mpk）の範囲、例えば0.01〜0.1mpk、0.1〜0.3mpk、0.3〜0.5mpk、0.5〜1mpk、1〜2mpk、2〜3mpk、3〜5mpk、5〜10mpk、または0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3、5、もしくは10mpkの投与量で投与される。
【０３３２】
対象を含む上述の実施形態のいずれかにおいて、対象は、哺乳動物であってもよい。対象を含む上述の実施形態のいずれかにおいて、対象は、ヒトであってもよい。対象を含む上述の実施形態のいずれかにおいて、対象は、ウシ、ブタ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚類または家禽であってもよい。
【０３３３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物は、静脈内投与され、または静脈内投与用である。一部の実施形態では、ガイドRNA、組成物および製剤は、肝循環内に投与され、または肝循環内への投与用である。
【０３３４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物の単回投与で、標的遺伝産物の発現をノックダウンするには充分である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物の単回投与で、標的遺伝産物の発現をノックアウトするには充分である。他の実施形態では、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物の複数回投与が、累積的な効果を介して、編集、改変、indel形成、DSB形成などの最大化に有益である場合もある。
【０３３５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNA、LNPまたは医薬組成物を用いた治療の有効性は、送達後、1年、2年、3年、4年、5年または10年で認められる。
【０３３６】
一部の実施形態では、治療により、疾患の進行が減速または停止する。
【０３３７】
一部の実施形態では、治療により、例えば肝臓などの器官の機能の変化、もしくは器官疾患の症状が改善、安定化または減速する。
【０３３８】
一部の実施形態では、治療の有効性は、対象の生存期間の増加により測定される。
【０３３９】
Ｅ．DNA分子、ベクター、発現構築物、宿主細胞および作製方法の例
ある実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるRNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAのいずれかをコードする配列を含むDNA分子を提供する。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤の配列に加えて、DNA分子は、RNA誘導型DNA結合剤をコードしない核酸分子もさらに含む。RNA誘導型DNA結合剤をコードしない核酸としては限定されないが、プロモーター、エンハンサー、制御配列、およびガイドRNAをコードする核酸が挙げられる。
【０３４０】
一部の実施形態では、DNA分子は、crRNA、trRNA、またはcrRNAとtrRNAをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、crRNA、trRNA、またはcrRNAとtrRNAをコードするヌクレオチド配列は、天然型CRISPR／Casシステム由来のリピート配列のすべて、または一部に隣接するガイド配列を含む、またはそれからなる。crRNA、trRNA、またはcrRNAとtrRNAを含む、またはそれらからなる核酸は、ベクター配列をさらに含んでもよく、この場合において当該ベクターの配列は、crRNA、trRNA、またはcrRNAとtrRNAと共に自然界で存在しない核酸を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、crRNAおよびtrRNAは、1つのベクター内の非連続的な核酸によりコードされる。他の実施形態では、crRNAおよびtrRNAは、連続的な核酸によりコードされてもよい。一部の実施形態では、crRNAおよびtrRNAは、単一核酸の逆鎖にコードされる。他の実施形態では、crRNAおよびtrRNAは、単一核酸の同じ鎖にコードされる。
【０３４１】
一部の実施形態では、DNA分子は、本明細書に記載されるRNA誘導型DNA結合剤をコードするmRNAのいずれかをコードする配列に操作可能に連結されたプロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、DNA分子は、例えばヒト肝細胞もしくはげっ歯類（例えばマウス）肝細胞などのヒトの細胞またはマウスの細胞といった哺乳動物細胞中での発現に適した発現構築物である。一部の実施形態では、DNA分子は、例えばヒトの肝臓またはげっ歯類（例えばマウス）の肝臓といった哺乳動物の肝臓の細胞中での発現に適した発現構築物である。一部の実施形態では、DNA分子は、プラスミドまたはエピソームである。一部の実施形態では、DNA分子は、例えば細菌、または培養真核細胞などの宿主細胞中に含有される。細菌の例としては、例えば大腸菌などのプロテオバクテリアが挙げられる。培養真核細胞の例としては、げっ歯類（例えばマウス）またはヒト起源の肝細胞を含む初代肝細胞、げっ歯類（例えばマウス）またはヒト起源の肝細胞を含む肝細胞株、ヒト細胞株、げっ歯類（例えばマウス）細胞株、CHO細胞、例えば分裂酵母または出芽酵母などの微生物の真菌、例えばS. cerevisiaeなどのサッカロミセス属、および昆虫細胞が挙げられる。
【０３４２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAの作製方法が提供される。一部の実施形態では、当該方法は、本明細書に記載されるDNA分子と、RNAポリメラーゼを、転写が可能な条件下で接触させる工程を含む。一部の実施形態では、接触させる工程は、例えばセルフリー系などのインビトロで実施される。一部の実施形態では、RNAポリメラーゼは、例えばT7RNAポリメラーゼなどのバクテリオファージを起源とするRNAポリメラーゼである。一部の実施形態では、上述の改変ヌクレオチドを少なくとも1つ含むNTPが提供される。一部の実施形態では、NTPは、上述の改変ヌクレオチドを少なくとも1つ含み、UTPを含まない。
【０３４３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるmRNAは、単独、または1つもしくは複数のガイドRNAとともに、1つまたは複数のベクターのベクター系の内に含まれてもよく、またはベクター系により送達されてもよい。一部の実施形態では、ベクターのうちの1つまたは複数は、DNAベクターであってもよい。一部の実施形態では、ベクターのうちの1つまたは複数は、RNAベクターであってもよい。一部の実施形態では、ベクターのうちの1つまたは複数は、環状であってもよい。他の実施形態では、ベクターのうちの1つまたは複数は、線状であってもよい。一部の実施形態では、ベクターのうちの1つもしくは複数、またはベクターのすべてが、脂質ナノ粒子、リポソーム、非脂質ナノ粒子またはウイルスカプシド中に封入されてもよい。ベクターの非限定的な例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、トランスポゾン、ウイルスベクター、および発現ベクターが挙げられる。
【０３４４】
ウイルスベクターの非限定的な例としては、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（HDAd）、単純ヘルペスウイルス（HSV-1）ベクター、バクテリオファージT4、バキュロウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、AAVベクターであってもよい。他の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってもよい。一部の実施形態では、レンチウイルスは、非統合型であってもよい。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであってもよい。一部の実施形態では、アデノウイルスは、高クローニングキャパシティ型、または「弱い（gutless）」アデノウイルスであってもよく、この場合、すべてのコードウイルス領域は、5’および3’の末端逆位配列（ITR：inverted terminal repeats）から離れ、パッケージングシグナル（I）がウイルスから除去されて、パッケージングキャパシティが増加している。さらに他の実施形態では、ウイルスベクターは、HSV-1ベクターであってもよい。一部の実施形態では、HSV-1系のベクターは、ヘルパー依存性であり、他の実施形態では、ヘルパー非依存性である。例えばパッケージング配列のみを保持しているアンプリコンベクターは、パッケージ用の構造要素を有するヘルパーウイルスを必要とする。一方で非必須のウイルス機能を省いた30kb欠失型HSV-1ベクターは、ヘルパーウイルスを必要としない。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、バクテリオファージT4であってもよい。一部の実施形態では、バクテリオファージT4は、ウイルス頭部が空であるとき、線状もしくは環状のDNA分子またはRNA分子のいずれかをパッケージすることができる。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクターであってもよい。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであってもよい。クローニングキャパシティが小さいAAVベクターまたはレンチウイルスベクターを使用する実施形態では、本明細書に開示されるベクターシステムの構成要素のすべてを送達するためには複数のベクターを使用する必要があり得る。例えば1つのAAVベクターがCasタンパク質をコードする配列を含みながら、第二のAAVベクターが、1つまたは複数のガイド配列を含んでもよい。
【０３４５】
一部の実施形態では、ベクターは、例えば本明細書に開示されるmRNAのコード配列などの1つまたは複数のコード配列の細胞中での発現を誘導できてもよい。一部の実施形態では、細胞は、例えば細菌細胞などの原核細胞であってもよい。一部の実施形態では、細胞は、例えば酵母、植物、昆虫または哺乳動物の細胞などの真核細胞であってもよい。一部の実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。一部の実施形態では、真核細胞は、げっ歯類の細胞であってもよい。一部の実施形態では、真核細胞は、ヒトの細胞であってもよい。異なる細胞型で発現を誘導するための適切なプロモーターは当分野に公知である。一部の実施形態では、プロモーターは、野生型であってもよい。他の実施形態では、プロモーターは、より効率的で有効な発現のために改変されてもよい。さらに他の実施形態では、プロモーターは、切断されても、その機能を保持し得る。例えばプロモーターは、通常のサイズを有してもよく、またはベクターがウイルス内に適切にパッケージングされるために適した小さなサイズを有してもよい。
【０３４６】
一部の実施形態では、ベクターシステムは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするヌクレオチド配列を1コピー含んでもよい。他の実施形態では、ベクターシステムは、RNA誘導型DNA結合剤をコードするヌクレオチド配列を複数コピー含んでもよい。一部の実施形態では、RNA誘導型DNA結合剤をコードするヌクレオチド配列は、少なくとも1つの転写制御配列または翻訳制御配列に操作可能に連結されてもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも1つのプロモーターに操作可能に連結されてもよい。
【０３４７】
一部の実施形態では、プロモーターは、構造的、誘導性または組織特異的であってもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、構造プロモーターであってもよい。構造プロモーターの非限定的な例としては、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（CMV）、シミアンウイルス（SV40）プロモーター、アデノウイルス主要後期（MLP）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（MMTV）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター、伸長因子-アルファ（EF1a）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、イムノグロブリンプロモーター、その機能性断片、または前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、プロモーターは、CMVプロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、断片化CMVプロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、EF1aプロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、ヒートショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質またはアルコールにより誘導されるプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、例えばTet-On（登録商標）プロモーター（Clontech社）などの低い基礎（非誘導時）発現レベルを有するプロモーターであってもよい。
【０３４８】
一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば肝臓での発現に特異的なプロモーターであってもよい。
【０３４９】
ベクターは、少なくとも1つのガイドRNAをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、ベクターは、1コピーのガイドRNAを含む。他の実施形態では、ベクターは、複数コピーのガイドRNAを含む。複数のガイドRNAを含む実施形態では、ガイドRNAは、同一でなくてもよく、それによりそれらガイドRNAは別々の標的配列を標的とする。またはガイドRNAは、同じ標的配列を標的とするという点で、同一であってもよい。ベクターが複数のガイドRNAを含む一部の実施形態では、各ガイドRNAは、例えばRNA誘導型DNA結合剤とのリボ核タンパク質複合体内での活性または安定性といった他の様々な特性を有してもよい。一部の実施形態では、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、例えばプロモーター、3’UTRまたは5’UTRといった少なくとも1つの転写制御配列または翻訳制御配列に操作可能に連結されてもよい。1つの実施形態では、プロモーターは、例えばtRNALys3またはtRNAキメラなどのtRNAプロモーターであってもよい。Mefferd et al., RNA. 2015 21:1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628を参照のこと。一部の実施形態では、プロモーターは、RNAポリメラーゼIII（Pol III）により認識されてもよい。Pol IIIの非限定的な例としては、U6プロモーターおよびH1プロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのU6プロモーターに操作可能に連結されてもよい。他の実施形態では、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのH1プロモーターに操作可能に連結されてもよい。複数のガイドRNAを含む実施形態では、発現誘導に使用されるプロモーターは、同じであっても、異なってもよい。一部の実施形態では、ガイドRNAのcrRNAをコードするヌクレオチド、およびガイドRNAのtrRNAをコードするヌクレオチドは、同じベクター上で提供されてもよい。一部の実施形態では、crRNAをコードするヌクレオチド、およびtrRNAをコードするヌクレオチドは、同じプロモーターにより誘導されてもよい。一部の実施形態では、crRNAおよびtrRNAは、単一の転写物に転写されてもよい。例えばcrRNAおよびtrRNAは、単一の転写物から処理されて、二重分子のガイドRNAを形成してもよい。あるいはcrRNAおよびtrRNAは、単一分子のガイドRNAへと転写されてもよい。他の実施形態では、crRNAおよびtrRNAは、同じベクター上の、それぞれの対応するプロモーターにより誘導されてもよい。さらに他の実施形態では、crRNAおよびtrRNAは、異なるベクターによりコードされてもよい。
【０３５０】
一部の実施形態では、組成物は、ベクターシステムを含み、この場合において当該システムは、複数のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターシステムは、1つの単一ベクターを含んでもよい。他の実施形態では、ベクターシステムは、2つのベクターを含んでもよい。追加の実施形態では、ベクターシステムは、3つのベクターを含んでもよい。様々なガイドRNAがマルチプレックス化に使用される場合、または複数コピーのガイドRNAが使用される場合、ベクターシステムは、4個以上のベクターを含んでもよい。
【０３５１】
一部の実施形態では、ベクターシステムは、標的細胞に送達された後でのみ発現を開始させるために、誘導性プロモーターを含んでもよい。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、ヒートショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質またはアルコールにより誘導されるプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、例えばTet-On（登録商標）プロモーター（Clontech社）などの低い基礎（非誘導時）発現レベルを有するプロモーターであってもよい。
【０３５２】
追加の実施形態では、ベクターシステムは、特定の組織内に送達された後でのみ発現を開始させる組織特異的プロモーターを含んでもよい。
【実施例】
【０３５３】
以下の実施例は、ある開示される実施形態を解説するために提供され、本開示の範囲を限定するとは決してみなされないものとする。
【０３５４】
一般試薬および方法。別段の示唆がない限り、mRNAは、直線化プラスミドDNA鋳型およびT7 RNAポリメラーゼを使用したインビトロ転写（IVT)により合成された。転写は概して、プラスミド中にコードされる、T7プロモーター、例えば配列番号43（配列番号1を含み、配列番号4のRNA ORFをコードする）、または配列番号48（配列番号2を含み、配列番号5のRNA ORFをコードする）などの本明細書に開示される転写配列、およびポリA尾部（配列番号63）を含む構築物から実施された。複数のUTRを検証した実験では、例えば配列番号58および59などの転写配列が使用されたという点を除き、類似した構築物が使用された。T7プロモーターおよび100nt ポリ（A/T）領域を含有するプラスミドDNAを、Xbalとともに37℃で2時間、以下の条件を用いてインキュベートすることにより直線化した：200ng/μL プラスミド、2U/μL XbaI (NEB社)、および1x反応緩衝液。Xbalは、反応物を65℃で20分間加熱することにより不活化した。直線化されたプラスミドは、silica maxi spin column（Epoch Life Sciences社）を使用して酵素および緩衝塩から精製され、アガロースゲルで分析され、直線化を確認された。Cas9改変mRNAを生成するためのIVT反応物は、以下の条件下で4時間、37℃でインキュベートされた：50ng/μLの直線化プラスミド；GTP、ATP、CTP、およびUTP、または指定される場合にはCTPもしくはUTPの代わりに改変ヌクレオチド三リン酸塩（例えばN1-メチルシュード-UTP）（Trilink社）を各々2mM；10mM ARCA(Trilink社);5U/μL T7 RNAポリメラーゼ(NEB社);1U/μL マウスRNase阻害剤(NEB社);0.004U/μL 大腸菌無機ピロホスファターゼ（NEB社)；および1x反応緩衝液。4時間のインキュベーションの後、TURBO DNase（ThermoFisher社）を加えて最終濃度を0.01U/μLとし、反応物をさらに30分間インキュベートしてDNA鋳型を除去した。Cas9 mRNAは、メーカーのプロトコールに従いMegaClear Transcription Clean-upキット（ThermoFisher社）を使用して酵素およびヌクレオチドから精製した。あるいはmRNAは、沈殿プロトコールで精製し、一部の例ではその後にHPLC系の精製を行った。簡潔に述べると、DNase消化の後、0.21x体積の7.5M LiCl溶液を加えて混合することによりmRNAを沈殿させ、沈殿したmRNAを遠心分離でペレット形成させた。上清を除去し、mRNAを水中で再構成させた。酢酸アンモニウムとエタノールを使用して再度、mRNAを沈殿させた。2x体積の100％EtOHとともに、5Mの酢酸アンモニウムをmRNA溶液に加えて最終濃度を2Mとした。溶液を混合し、-20℃で15分間インキュベートした。沈殿したmRNAを再度、遠心分離でペレット形成させ、上清を除去して、mRNAを水中で再構成させた。最終工程として、酢酸ナトリウムとエタノールを使用してmRNAを沈殿させた。1/10体積の3M 酢酸ナトリウム（pH5.5）を、2x体積の100％EtOHとともに溶液に加えた。溶液を混合し、-20℃で15分間インキュベートした。沈殿したmRNAを再度、遠心分離でペレット形成させ、上清を除去して、ペレットを70％の冷エタノールで洗浄し、空気乾燥させた。mRNAを水中で再構成させた。HPLC精製したmRNAに対しては、LiCl沈殿と再構成の後、RP-IP HPLC（例えば、Kariko, et al. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 21 e142を参照のこと)によりmRNAを精製した。プーリングに選択した分画を1つにまとめ、上述の酢酸ナトリウム／エタノール沈殿により脱塩した。
【０３５５】
すべての方法に関し、転写物の濃度は、260nmでの吸光度を測定することにより決定され（Nanodrop社）、転写物は、Bioanalyzer（Agilent社）によるキャピラリー電気泳動により分析された。
【０３５６】
別段の示唆がない限り、インビボ編集実験は、Charles River LaboratoriesのメスのCD-1マウスとSprague-Dawleyラットを用いて実施された。別段の示唆がない限り、マウスの血清TTRレベルの分析は、以下のように実施された。指定されるように血液を採取し、血清を単離させた。
【０３５７】
適用例で指定される場合、処置マウスにおいてサイトカイン誘導も測定された。この分析のために、およそ50〜100μLの血液を尾静脈の切り傷から採取して、血清サイトカイン測定を行った。室温でおよそ2時間、血液を凝固させ、その後、1000xgで10分間遠心分離して、血清を採取した。Luminex based magnetic bead multiplex assay (Affymetrix ProcartaPlus社、カタログ番号Exp040-00000-801)を使用してIL-6、TNFアルファ、IFNアルファ、およびMCP-1を測定し、採取されたサンプル中のサイトカイン分析を行った。キットの試薬と標準物は、メーカーのプロトコールに指示されるように調製された。提供されるサンプル希釈液を使用してマウス血清を4倍希釈し、希釈抗体でコートされた磁気ビーズを50μL含むウェルに、50μLを加えた。室温で2時間、プレートをインキュベートし、その後洗浄した。希釈されたビオチン抗体（50μL）をビーズに加え、室温で1時間インキュベートした。再度ビーズを洗浄し、その後、各ウェルに50μLの希釈ストレプトアビジン-PEを加え、次いで30分間インキュベートした。ビーズをもう一度洗浄し、その後100μLの洗浄緩衝液中に懸濁させ、Bio-Plex 200装置(Bio-Rad社)上で読み取った。5パラメーターのロジスティック曲線適合を使用した標準曲線から算出されたサイトカイン濃度を用いて、Bioplex Manager ver.6.1の分析パッケージを使用し、データを分析した。
【０３５８】
別段の示唆がない限り、非改変のATP、GTP、CTPおよびUTPを使用した。別段の示唆がない限り、すべてのmRNAが、1つの核局在シグナルをコードした。
【０３５９】
メーカーのプロトコールに従い、Precision Nanosystems NanoAssemblr（商標）Benchtop Instrumentを使用し、脂質とRNA溶液をマイクロ流体混合するか、または以下に記載されるように直交流混合により、LNPを形成させた。別段の示唆がない限り、LNPは、45％ Lipid A、9％ DSPC、44％コレステロール、および2％ PEG2k-DMGを含有し、N:P比は4.5であった。
【０３６０】
LNP製剤-NanoAssemblr
概して、脂質ナノ粒子の構成要素は、様々なモル比の脂質構成要素で100％エタノール中に溶解された。RNAカーゴを、25mMクエン酸塩、100mM NaCl、pH5.0中に溶解させ、およそ0.45mg/mLの濃度のRNAカーゴを得た。脂質アミンとRNAリン酸塩（N：P）のモル比が約4.5または6、mRNAとgRNAが1：1の重量比で、LNPを製剤化した。
【０３６１】
メーカーのプロトコールに従い、Precision Nanosystems NanoAssemblr（商標）Benchtop Instrumentを使用し、脂質とRNA溶液をマイクロ流体混合することにより、LNPを形成させた。様々な流速を使用して混合する間、水性溶媒と有機溶媒の比率は2：1に維持された。混合した後、LNPを集め、水中で希釈し（およそ1：1のv/v）、室温で1時間保持して、さらに水で希釈して（およそ1：1のv/v）、その後、最後の緩衝液交換を行った。50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)スクロース、pH7.5 (TSS)への最終緩衝液交換は、PD-10脱塩カラム（GE社）を用いて完了させた。必要な場合には、Amicon 100 kDa centrifugal filters（Millipore社）を用いた遠心分離により製剤を濃縮した。次いで得られた混合液を、0.2μmの滅菌フィルターを使用してろ過した。最終LNPは、次に使用するまで-80℃で保存した。
【０３６２】
LNP製剤−直交流
直交流法を使用して調製されたLNPに関しては、LNPは、2体積のRNA溶液と、1体積の水を用いて、エタノール中、脂質を衝突噴流混合することにより形成させた。脂質のエタノール溶液は、直交混合を介して2体積のRNA溶液と混合させた。4番目の水流は、インラインティー（inline tee）を介して、出口の直交流と混合される。（WO2016010840の図2を参照）。LNPは1時間室温で保持され、水でさらに希釈された（およそ1：1のv/v）。希釈されたLNPは、flat sheet cartridge (Sartorius社、100kD MWCO)上の接線流ろ過を使用して濃縮され、次いで50mM Tris、45mM NaCl、5%(w/v)スクロース、pH7.5(TSS)へと透析ろ過を行うことにより緩衝液交換された。あるいはTSSへの最終緩衝液交換は、PD-10脱塩カラム（GE社）を用いて完了された。必要な場合には、Amicon 100 kDa centrifugal filters（Millipore社）を用いた遠心分離により製剤を濃縮した。次いで得られた混合液を、0.2μmの滅菌フィルターを使用してろ過した。最終LNPは、次に使用するまで4℃または-80℃で保存した。
製剤分析
【０３６３】
動的光散乱法（DLS：Dynamic Light Scattering）を使用して、本開示のLNPの多分散指数（polydispersity index:pdi）およびサイズを特徴解析する。DLSは、サンプルを光源に当てることから生じる光の散乱を測定する。DLS測定から決定される場合のPDIは、集団の粒子サイズ（およその平均粒子サイズ）の分布を表し、完全に均一な集団は、PDIがゼロとなる。平均粒子サイズと多分散は、Malvern Zetasizer DLS装置を使用した動的光散乱法（DLS）により測定される。LNPサンプルは、PBS中で30倍に希釈され、その後にDLSにより測定された。Z-平均直径は、強度に基づいた平均粒子サイズの測定尺度であり、平均直径数およびpdiとともに報告された。Malvern Zetasizer装置も使用して、LNPのゼータポテンシャルが測定される。サンプルは、0.1X PBS、pH7.4中で1：17に希釈され（800μLに50μL）、その後に測定される。
【０３６４】
蛍光を基にしたアッセイ（Ribogreen（登録商標）、ThermoFisher Scientific社）を使用して、総RNA濃度と遊離RNAを決定する。封入効率は、（総RNA−遊離RNA）／総RNAとして算出される。LNPサンプルは、0.2％ Triton-X 100を含有する1X TE緩衝液で適切に希釈されて総RNAが決定され、または1xTE緩衝液で適切に希釈されて遊離RNAが決定される。製剤を作製するために使用され、1xTE緩衝液±0.2％Triton-X 100で希釈された開始RNA溶液を利用して標準曲線が作製される。次いで希釈されたRiboGreen（登録商標）色素（メーカーの指示書に従う）を各標準物とサンプルに加え、暗室、室温でおよそ10分間インキュベートする。SpectraMax M5 Microplate Reader (Molecular Devices社)を使用して、サンプルを読み取る。励起、自動カットオフ、および発光の波長は、それぞれ488nm、515nmおよび525nmに設定される。総RNAおよび遊離RNAは、適切な標準曲線から決定される。
【０３６５】
封入効率は、（総RNA−遊離RNA）／総RNAとして算出される。DNA系カーゴ成分の封入効率の決定にも同じ手順を使用してもよい。一本鎖DNAに関しては、Oligreen Dyeを使用してもよく、二本鎖DNAに関しては、Picogreen Dyeを使用してもよい。
【０３６６】
典型的には、LNPを調製したとき、封入効率は、＞80％であった。粒子サイズは、＜120nmであった。pdiは、＜0.2であった。
【０３６７】
インビボでのLNP送達
別段の記載がない限り、6〜10週齢のメスのCD-1マウスを各試験で使用した。動物の体重を測定し、体重に従って集団を分け、集団の平均体重に基づいて投与溶液を調製した。動物1匹当たり0.2mLの体積で、外側尾静脈からLNPを投与した（体重1キログラム当たり、およそ10mL）。有害作用に関し、投与後およそ6時間で動物を観察した。投与後24時間で体重を計測した。様々な時点で、イソフルラン麻酔下での心穿刺による放血で動物を安楽死させた。本明細書に記載されるように、血清分離チューブまたは血漿用の緩衝クエン酸ナトリウムを含有するチューブに、血液を採取した。インビボ編集を含む試験に関しては、各動物の中葉または3つの独立した葉（例えば右中葉、左中葉および左側葉）から肝臓組織を採取し、DNA抽出と分析を行った。
【０３６８】
次世代シーケンス（NGS）および血清TTRレベル（データ示さず）により、肝臓編集に関し、マウスコホートを測定した。
【０３６９】
トランスサイレチン（TTR）ELISA分析
指定されるように血液を採取し、血清を単離させた。Mouse Prealbumin (Transthyretin) ELISA Kit (Aviva Systems Biology社、カタログ番号OKIA00111)を使用して総マウスTTR血清レベルを決定した。ラットTTR血清レベルは、ラット特異的なELISAキット(Aviva Systems Biology社、カタログ番号OKIA00159)をメーカーのプロトコールに従い使用して測定した。簡潔に述べると、キットのサンプル希釈液を用いてサンプルを連続希釈して10,000倍の最終希釈とした。次いでこの希釈サンプルをELISAプレートに添加し、その後、指示書に従いアッセイを実施した。
【０３７０】
NGS配列解析
簡潔に述べると、ゲノムの標的位置での編集効率を定量的に決定するために、ゲノムDNAを単離し、ディープシーケンシングを利用して遺伝子編集により導入された挿入と欠失の存在を特定した。
【０３７１】
PCRプライマーを標的部位（例えばTTR)周辺に設計し、対象ゲノム領域を増幅させた。プライマー配列を以下に提示する。追加のPCRをメーカーのプロトコールに従い実施し（Illumina社）、シーケンシングに必要な化学特性を付加した。Illumina MiSeq装置上でアンプリコンをシーケンシングした。低クオリティスコアのリードを取り除いた後、リードをヒト参照ゲノム（例えばhg38）に対してアライメントした。得られたリードを含むファイルを参照ゲノムに対してマッピングし（BAMファイル）、対象標的領域と重複したリードを選択して、挿入、置換または欠失を含むリード数と野生型リード数を算出した。
【０３７２】
編集割合（例えば「編集効率」または「編集百分率」）は、野生型を含むシーケンスリード総数に対する、挿入または欠失を含むシーケンスリードの総数として規定される。
【０３７３】
１．改変ヌクレオチドを有するCas9 mRNAのインビボ特徴解析
配列番号5に記載されるORFを含むmRNAは、以下の表5に示されるように様々な改変ヌクレオチド含有量で調製された。mRNAは、トランスサイレチン遺伝子（TTR）を標的とするガイドRNA（G282、配列番号42）と混合され、LNP内に組み込まれた。LNP420を除くすべてのLNPで、非改変のシチジンが使用された。
【表５】
2021500863.tif 000023
【０３７４】
LNP417-LNP421は、0.5mg/kg（mpk）または1mpkの投与量でマウスに投与された。サイトカイン（IFNアルファ、IL-6、TNFアルファおよびMCP-1）誘導は、投与後（hpd）4時間で測定された。結果を図1A〜Dに示す。
【０３７５】
投与後7日で、血清および肝臓を、それぞれ血清TTR測定と編集効率分析用に採取した。結果を図2A〜2Bに示す。
【０３７６】
シュードウリジンおよび5-メチルCTPを使用することで、ほぼ完全にサイトカイン誘導を無効化させたことが観察された。60%（LNP421）または100%（LNP417）のN1-メチルシュードウリジンを使用することでも、非改変Cas9 mRNAよりもサイトカイン誘導が低くなり、60%のN1-メチルシュードウリジンでの低下の度合いは、ほぼ100%であった。
【０３７７】
すべての改変Cas9構築物が、血清TTRの低下において効果が類似しており、非改変構築物よりも効果が高かった。これはおそらく安定性の増加によるものであろう。肝臓編集データによると、シュードウリジンおよびN1-メチルシュードウリジンを使用した構築物は等しく効果的であった。シュードウリジンおよび5-メチルシチジンを用いた構築物は、シュードウリジン単独で用いた構築物よりも著しく効果が低かった。60％N1-メチルシュードウリジンを用いた構築物は、100％N1-メチルシュードウリジンを用いた構築物よりもやや効果が低い場合があった。
【０３７８】
２．Cas9をコードする改変mRNAの開発およびインビトロ特徴解析
Cas9配列（配列番号1）を設計し、肝臓発現を改善し、ウリジンを最小化した。最小可能性ウリジン含有量を有すること、および肝臓で対応するtRNAの最大発現を有することに基づきコドンを選択した。肝臓tRNA発現に関しては、Dittmar KA, PLos Genetics 2(12): e221 (2006)を参照のこと。Cas9 mRNAのウリジン含有量の低下は、当該mRNAに対する自然免疫反応を減少させること、および／または他の利益をもたらすことが目的であった。表6は、tRNAレベルに基づく最適肝臓コドン、および最小可能性ウリジン数を有するコドンを示す。最小ウリジンコドンが、最適肝臓コドンと異なっている例は、太字の斜体となっている。表は、化膿連鎖球菌Cas9のアミノ酸配列（配列番号3）中の各アミノ酸数も示している。
【表６】
2021500863.tif 000024
【０３７９】
アスパラギン酸およびセリンの場合には、最も高く発現されるtRNAに相当する肝臓コドンは、チミジンを含有した。これは対応するmRNAにおいてウリジンとして転写される。アスパラギン酸およびセリンに対しては、最小ウリジンコドンが選択された（それぞれ、GACおよびAGC）。Cas9 ORF配列は、4140ntの長さであり、528個のU（12.8％のウリジン含有量）を含有し、そしてORF中、3個以上の連続的なウリジンの何らかの連なりを回避した。配列中には、63例のUUジヌクレオチドが存在した（126/4140＝3％ウリジンジヌクレオチド含有量）。配列番号2は、RNA ORFとして19.6％のウリジンを含有する代替的なCas9配列を提示する。
【０３８０】
配列番号3は、配列番号1および2の両方によりコードされるCas9のアミノ酸配列を提示しており、Cas9 ORFのこの新たな設計によって、コードされるアミノ酸配列は変わらなかった。配列番号4は、配列番号1のORFのRNA型である。配列番号5は、配列番号2のORFのRNA型である。
【０３８１】
改変ヌクレオチドの効果も評価された。Cas9を転写するために使用される改変UTPには、N1-メチル-シュード-UTPおよび5-メトキシ-UTPが含まれた。
【０３８２】
N1-メチル-シュード-UTPの構造は、以下である：
【化８】
2021500863.tif 000025
【０３８３】
5-メトキシ-UTPの構造は、以下である：
【化９】
2021500863.tif 000026
【０３８４】
配列番号4および5のORFを含むmRNAに関して、インビトロ転写（IVT）産生量が決定された。両方とも核局在シグナル（NLS）をコードした。配列番号5を含む配列は、非改変UTPまたはN1-メチル-シュード-UTPのいずれか存在下で転写された。配列番号4を含む配列は、非改変UTPの存在下で転写された。さらに、5-メトキシ-UTPの割合を増加させたIVTも実施された。図3のX軸に示される。分光光度法により決定される、これらの構築物のそれぞれに対する産生量が示されている。
【０３８５】
これらの結果から、mRNAの5-メトキシウリジン含有量が増加するにつれ、産生量がやや減少するが、mRNA産生量は、すべての条件下で許容可能であったことが示される。ゆえに両方のCas9配列に関し、Cas9 mRNAは、試験された条件全体で許容可能な産生量で作製され得た。
【０３８６】
インビトロ転写されたmRNAの純度は、Agilent Bioanalyzer 2100を使用して取得されたmRNAキャピラリー電気泳動（CE）トレースに対する曲線下面積（AUC）分析法を使用して算出された（図4）。非改変UTPで作製された配列番号5のCas9 mRNAは概して、5-メトキシ-UTP置換が増加すると、純度が増加した。一方で、N1-メチル-シュード-UTPを用いて作製された同じ構築物は、5-メトキシ-UTP置換の増加による影響は殆どなかった。
【０３８７】
非改変UTPで作製された配列番号4のCas9は、5-メトキシ-UTP置換による影響は比較的受けていないと思われた。0〜20％の5-メトキシ-UTP置換で、純度が若干増加した。
【０３８８】
様々なmRNAの免疫原性は、二本鎖（ds）ｍRNA特性の測定手段、免疫原性の可能性の指標として抗dsRNA抗体を用いたドットブロット分析により評価された（図5A〜5D）。図5Bおよび5Dは、配列番号5を含むCas9 mRNA配列を使用し、図5Cは、配列番号4を含むCas9 mRNA配列を使用した。非改変UTP（図5B〜C）を用いて作製された構築物に関しては、5-メトキシ-UTP含有量が増加するに伴い、見掛け上の二本鎖性が全体的に減少した。N1-メチル-シュード-UTPを用いて作製されたmRNA（図5D）は、抗dsRNA抗体に対する結合低下を示したが、5-メトキシ-UTP含有量の増加でも、当該抗体への結合が低下すると見受けられた。
【０３８９】
次に、トランスサイレチン（TTR）を標的とするガイド（G209；配列番号64）とともにmRNAをNeuro 2A細胞内へとトランスフェクトし、編集割合を測定することにより編集効率をインビトロ評価した。
【０３９０】
図6Aに示されるように、2個の核局在配列およびHAタグとともにN1-メチル-シュード-UTPを有する、配列番号2を含む構築物から転写されたCas9 mRNA（左端の中括弧で示される群）、2個の核局在配列およびHAタグとともにUTPを有して転写される配列番号2を含む構築物から転写されたCas9 mRNA（真ん中の中括弧により示される群）、そしてUTPを有する、配列番号1を含む構築物から転写されたCas9 mRNA（右端の中括弧により示される群）が評価された。各群に対し、0.1ng〜100ngの様々な濃度のmRNAを、X軸に示されるように、5-メトキシ-UTPの量を0％から100％に増加させて転写させ、評価した。未処置細胞は、測定可能な編集を示さなかった。図6Bは、EC50値（ng）として表される編集効率データを示す。
【０３９１】
転写中に5-メトキシ-UTP含有量を増加させることで、両方の配列番号5の条件下において、編集効率に対して負の影響が出ると見受けられた。N1-メチル-シュード-UTPも含む転写物は、UTP含有転写物よりも安定性が高い（例えば60％および80％の5-メトキシ-UTP）。対照的に、配列番号4を含むCas9 mRNA配列を用いた編集効率は、5-メトキシ-UTP含有量の増加による何らかの影響を受けるとしても、ほんの少しであった。ゆえに、このシステムによれば、配列番号4のmRNAを含むCas9 mRNA配列は、100％の5-メトキシ-ウリジンに至るまで、非改変ウリジンを含む型と類似した編集効率を提供することができる。
【０３９２】
３．Cas9をコードするmRNAのインビボ特徴解析
配列番号5を含むCas9 mRNA配列と比較した、配列番号4を含むCas9 mRNA配列のインビボ有効性、および非改変UTP、N1-メチル-シュード-UTP、40％ 5-メトキシ-UTP＋60％非改変UTP、または100％ 5-メトキシ-UTPの存在下での配列番号4を含むCas9 mRNA配列の転写物の効果を評価した。表7は、これらインビボ試験群に関する情報を提示する。各mRNAは、脂質ナノ粒子（LNP）製剤として投与された。
【表７】
2021500863.tif 000027
【０３９３】
インビボ試験デザインは以下のとおりであった。CD-1メスマウスは、Charles River社からであった（1群当たりn=5）。1キログラム当たり1mg（mpk）または0.5mpkで、トランスサイレチン（TTR）を対象とする単一ガイドRNA（配列番号42）とともに動物に静脈内投与した（i.v.）。1mpk投与量を与えられた動物は、MCP-1、IL-6、IFNアルファ、およびTNFアルファのサイトカイン分析を行うために、投与後（hpd：hours post-dose）4時間で採血された。全体的な健康状態に関し、24hpdで動物を評価した。投与後7日で解剖を実施し、血清TTR分析のために血清を採取し、次世代シーケンス（NGS）編集分析のために肝臓を採取した。
【０３９４】
1mpkで投与された動物の血清が4hpdで採取され、メーカーの指示書に従い血清を調製してProcartaPlex（登録商標）Mouse 4-plex assay (Thermo Fisher社)で検証した。MCP-1、IL-6、IFNアルファ、およびTNFアルファの血清レベルに関する結果を、図7A〜7Dに示す。これらの結果は、改変UTPで調製された配列番号4を含むCas9 mRNA配列（LNP721、LNP723またはLNP724）が、比較的低レベルのサイトカイン産生を示したことを示唆している。
【０３９５】
血清中のTTRレベルも、投与後7日で評価された。図8Aと表8に示す。TSS（すなわち5％スクロース、45mM NaCl、50mM Tris、pH7.5）サンプルは、LNP処置無しのTTRレベルを示している。すべてのLNP製剤を、表7に記載する。
【表８】
2021500863.tif 000028
【０３９６】
表9および図8Bは、次世代シーケンス（NGS）により測定された肝臓中のTTRの編集割合に関する結果を提示する。
【０３９７】
【表９】
2021500863.tif 000029
【０３９８】
TSS対照サンプルと比較して、Cas9を含むすべてのLNPが、血清TTRレベルの低下と、基準を超える編集を示した。標準Cas9 mRNA配列（配列番号5、LNP720）と、配列番号4のmRNAを含むCas9 mRNA配列（配列番号4、LNP721）は、両方ともN1-メチル-シュード-UTPを有して転写されており、これらを比較すると、配列番号4を含むCas9 mRNA配列は、活性の改善を示した（TTRが低く、編集％が高い）。配列番号4を含むCas9 mRNA配列に関し、N1-メチル-シュード-UTPで活性は最も高く、40％ 5-メトキシ-UTP＋60％非改変UTP（LNP723）を含む転写物は、100％ 5-メトキシ-UTP（LNP724）よりも活性が高かった。
【０３９９】
オフターゲット効果の測定として、上述のLNP製剤を1mpkで投与された動物の脾臓中の編集も測定した。結果は、図7および表10に示す。すべてのLNP製剤に関し、Cas9または最適化Cas9のいずれも、肝臓において20倍超高い編集が認められた（図6A）。
【表１０】
2021500863.tif 000030
【０４００】
４．初代マウス肝細胞における、Cas9をコードするmRNAの有効性に関する特徴解析
様々なLNPの有効性が、初代マウス肝細胞（PMH：primary mouse hepatocyte）においてインビトロで評価された。
【０４０１】
100ngでは、表5に記載されるすべてのLNPが、TTR編集をサポートした。図10に示す。予測されたように、未処置細胞は測定可能なTTR編集を示さなかった。
【０４０２】
表11は、図10に提示されるデータに基づき各LNPに対して算出されたEC50値を示す。
【表１１】
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【０４０３】
５．ラットにおけるCas9 mRNA含有LNPのインビボ特徴解析
配列番号4を含むCas9 mRNA配列のインビボ有効性を、配列番号5を含むCas9 mRNA配列と対比させて、ラットにおいて評価した。表12は、これらインビボ試験群に関する情報を提示する。標準Cas9 mRNAとは配列番号5のことを指し、一方でU削減（U-dep）mRNAとは配列番号4を指す。各mRNAは、脂質ナノ粒子（LNP）製剤として投与された。
【０４０４】
LNP716（標準Cas9）LNP製剤とLNP738（U削減）LNP製剤に関する詳細を、表12に示す。
【表１２】
2021500863.tif 000032
【０４０５】
血清TTRは、上述のように測定された。
【０４０６】
配列番号5のORFを有するCas9 mRNAを、配列番号4のORFを有するCas9 mRNAと、図9Aおよび表13に示されるように2mpkおよび5mpkの投与量でラットにおいて比較した（図11A〜B）。これらのデータから、配列番号4のCas9 ORFは、配列番号5のCas9 ORFと比較して、2mpkおよび5mpkの両方で血清TTRのより大きな低下を誘導したことが示唆される。図9Bおよび表13は、TSS処置対照の値と比較した、百分率としてのこれらの結果を表す。U-dep Cas9 LNPの5mpkの投与は、血清TTRレベルにおいて、90％を超える低下を誘導した。
【表１３】
2021500863.tif 000033
【０４０７】
図10および表14は、2mpkおよび5mpkでのLNP716製剤（標準）ならびにLNP738製剤（U削減）を用いた投与後のTTRの肝臓編集を示す。TSSはごくわずかな編集を示した。一方で、LNP716製剤およびLNP738製剤の両方ともが、TTRの肝臓編集を誘導した。製剤の比較において、U削減を含むLNP738製剤は、標準Cas9を含むLNP716製剤の編集よりも2倍超高く誘導した。
【表１４】
2021500863.tif 000034
【０４０８】
これらのデータから、U削減Cas9 mRNAは、肝臓において、TTR編集の程度を大幅に改善したことが示唆される。
【０４０９】
６．様々なUTRを有するmRNAの特徴解析
表15に示されるように、UTRおよび±ヘマグルチニン（HA）タグを伴うCas9をコードするmRNAを、TTRを標的とするガイドRNA（G282；配列番号42）とともにLNPとして製剤化した。LNPは、Nano Assemblr（商標）を使用して組み立てられ、45％Lipid A、9％ DSPC、44％コレステロール、および2％PEG2k-DMGを含有した。これをAmicon PD10フィルターを使用して精製し、0.5mg/mlの濃度で使用した（LNP濃度）。CD-1メスマウス（1群当たりn=5）に、0.5または1.0mpkで静脈内投与した。投与後7日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。
【表１５】
2021500863.tif 000035
【０４１０】
図13A〜Eは以下を示す。血清TTR（図13Aにおいてμg/mlとして。および図13Bにおいて、TSSの％として）；LNP662〜669のすべてに関する肝臓編集（図13C）；UTRのみが変化しているLNP663〜LNP666に関する肝臓編集（図13D）；そしてmRNA配列とUTP改変のみが変化しているLNP662およびLNP667〜LNP669に関する肝臓編集（図13E）。
【０４１１】
ヒトアルブミン、ヒトアルファグロビン、ヒトベータグロビン、およびアフリカツメガエルベータグロビンのUTRはおおよそ等しく効果的であった。ヒトアルファグロビンを用いた値は若干低い場合があったが、その差異が有意であったかは不明瞭であった。
【０４１２】
配列番号4のORFは、より少ないウリジンを含有しており、肝臓における編集量を増加させた。N1-メチルシュードウリジンで作製されたCas9 mRNAは、非改変ウリジンで作製されたCas9 mRNAよりもさらに効果的であった。
【０４１３】
７．様々なガイド：Cas9比率でのインビトロおよびインビボでの編集
配列番号4または配列番号5のORFを含むmRNAは、TTRを標的とするガイドRNAを含むLNPとして、図16に示されるようにガイド：Cas9 mRNAの重量比を変えて製剤化された。Cas9 mRNAは、上述のようにIVT合成により、ウリジン三リン酸塩の代わりにN1-メチルシュードウリジン三リン酸塩、そしてHSD 5’UTR、ヒトアルブミン3’UTR、およびポリA尾部を用いて作製された。
【表１６】
2021500863.tif 000036
【０４１４】
初代マウス肝細胞（PMH）を、3％カニクイザル血清を補充した培養培地中に24時間播種し、次いで表16に示されるように0.3、1、3、または10ngのLNPを用いて処理した。48時間後に細胞を溶解させ、編集％をNGSにより決定した。図14および表17に結果を示す。
【表１７】
2021500863.tif 000037
【０４１５】
インビボ特徴解析のために、0.2、0.5または1mpkでマウスにLNPを投与した（1群当たりn=5）。投与後8日目に動物を殺処分し、血液ならびに肝臓および脾臓を採取して、血清TTR、肝臓編集および脾臓編集を測定した。血清TTRの結果を図 15A〜Bおよび表18に示す。肝臓編集の結果は、図 16A〜Bおよび表19に示す。脾臓編集の結果は、図 17A〜Bおよび表20に示す。陰性対照マウスには、ビヒクルを投与した（形質転換および保存溶液；「TSS」）。LNP815-LNP819を用いた実験、LNP820-LNP824を用いた実験に対して別個の対照を使用した。
【表１８】
2021500863.tif 000038
【表１９】
2021500863.tif 000039
【０４１６】
LNP820-LNP824は概して、同じ比率のLNP815-LNP819カウンターパートとほぼ同じか、それ以上の肝臓編集結果をもたらした。LNP820-LNP824は、0.5mpkおよび1mpkで、検証された比率範囲にわたり、および0.2mpkで2：1〜1：4の比率にわたり、一貫した性能を示した。
【表２０】
2021500863.tif 000040
【０４１７】
追加のマウス群（n=2）は、各製剤を用いて3mpkで投与され、6hpdで殺処分され、肝臓におけるタンパク質発現が決定された。1：1および1：4の比率の製剤（LNP816、LNP818、LNP821、およびLNP823）を3mpkで処置されたマウスからの肝臓タンパク質のウェスタンブロットを図18に示す。ウェスタン用の一次抗体は、1：5,000のImmunoprecise（商標）ウサギ抗Cas9抗体であり、二次抗体は、1：12,500のDylight（商標）ヤギ抗ウサギ抗体であった。Cas9タンパク質発現は、配列番号4のORFを有するmRNAを使用したLNPにおいて、著しく高かった。
【０４１８】
８．改変ヌクレオチドの効果の特徴解析
表21に示されるように、Cas9をコードし、改変ヌクレオチドを含有するmRNAを、TTRを標的とするガイドRNA（G282；配列番号42）とともにLNPとして製剤化した。LNP1034は、Trilink Biotechnologies, LLCから市販されているCas9 mRNAを含有し、CleanCap（商標）（7-メチルグアニンキャップ後の最初のヌクレオチドが2’-O-メチル化されているCap1構造）を含んだ。LNP1027-LNP1033は、配列番号4のORFと、ARCA（抗リバースキャップアナログ）Cap0を含むmRNAを含有した。LNPは、Nano Assemblr（商標）を使用して組み立てられ、45％ Lipid A、9％ DSPC、44％コレステロール、および2％PEG2k-DMGを含有した。これをAmicon PD10フィルターを使用して精製し、TSS緩衝液中に懸濁させた。LNP中のN:P（窒素とリン酸塩）の比率は、4.5であり、製剤のRNA濃度は、0.4mg/mlであった。メスのCD-1マウス（1群当たりn=5）に、0.1または0.3mpkで静脈内投与した。投与後7日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。
【表２１】
2021500863.tif 000041
【０４１９】
血清TTRの結果を、図19A〜B（血清TTRの結果はそれぞれ、μg/mL、およびTSS対照の％で表される）、図20（肝臓編集）および表22に示される。
【表２２】
2021500863.tif 000042
【０４２０】
LNP1027のN1-メチルシュードウリジン含有mRNAは、LNP1032のシュードウリジン含有mRNAと比較して若干、編集効率が高かった。シュードウリジンと5-メチルシチジンの両方を含有するmRNA（LNP1033）の効力は、大きく低下した。25％ 5-ヨードウリジンを含有するmRNAは、N1-メチルシュードウリジン含有mRNAと同等の編集効率を示した。50％ 5-ヨードウリジンで、効能の低下があった。Trilinkの5-メトキシウリジンmRNAは、低い活性を示した。
【０４２１】
９．ラットにおける、様々なUTRを有するmRNAの効果に関する特徴解析
本試験は、ラットにおける、HBB（ヒトベータグロビン）5’および3’-UTR；XBG（アフリカツメガエルベータグロビン）5’および3’-UTR；またはヒトHSD17B4（HSD)5’UTRおよびアルブミン（ALB）3’UTRを有する、ARCAキャップ化Cas9 mRNAのインビボ有効性を評価した。
【０４２２】
ラットTTR遺伝子を標的とするガイドRNA（G534、配列番号72）およびCas9 mRNAを1：1のモル比でLNP中に含有する製剤は、上述の直交流プロセスを使用して調製し、VivaFlow（商標）50膜上でろ過された。LNPは、カチオン性脂質（Lipid A）、コレステロール、DSPC、およびPEG2k-DMGを、45：9：43：3のモル比で含有し、6.0のN:P比を有した。製剤は、1mpkおよび0.3mpkで投与された。すべてのラットが、Charled River社からのメスのSprague Dawleyであった。1群当たりn=5。（投与後7日の）解剖でTTR分析のために血液を採取し、編集分析のために肝臓を採取した。LNP1058において、mRNAは、HBB UTRを含有した。LNP1059において、mRNAは、XBG UTRを含有した。LNP1060において、mRNAは、HSDおよびALBのそれぞれ5’UTRおよび3’UTRを含有した。すべてのケースで、mRNAコード配列は、配列番号4に従った。
【０４２３】
肝臓編集および血清TTRの結果を、図21A〜Cおよび表23に示す。
【表２３】
2021500863.tif 000043
【０４２４】
結果は、LNP1058-LNP1060において検証されたすべてのmRNAは、編集をサポートできたことを示している。最も高いレベルの編集および、最も大きな血清TTRの減少は、LNP1059においてXBG UTRを含有するmRNAで認められた。
【０４２５】
１０．RNAカーゴ：mRNAおよびgRNAの共製剤
本試験は、マウスにおける、様々な比率のgRNAとmRNAのインビボ有効性を評価した。CleanCap（商標）でキャップ化された、配列番号 4のORF、HSD 5’UTR、ヒトアルブミン3’UTR、コザック配列、およびポリA尾部を有するCas9 mRNAは、実施例1に示されるように、ウリジン三リン酸塩の代わりにN1-メチルシュードウリジン三リン酸塩を用いてIVT合成により作製された。
【０４２６】
LNP製剤は、55：33：9：3のモル比のLipid A、コレステロール、DSPCおよびPEG2k-DMG、および6のN:P比を有して、実施例2に記載されるように、mRNAおよびsg282（配列番号42、G282）から調製された。製剤のgRNA：Cas9 mRNAの重量比は、表24に示されるとおりであった。
【表２４】
2021500863.tif 000044
【０４２７】
インビボ特徴解析のために、上述のLNPを、1キログラム当たり0.1mgの総RNA（mg ガイドRNA＋mg mRNA）で、マウスに投与された（1群当たりn=5）。投与後7〜9日。上述のように動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。肝臓編集および血清TTRの結果を、図22Aおよび図22Bに示す。陰性対照マウスは、TSSビヒクルを投与された。
【０４２８】
さらに上述のLNPを、1キログラム当たり0.05mg mRNAの一定のmRNA投与量でマウスに投与した（1群当たりn=5）。一方でgRNAの投与量は、1キログラム当たり0.06mg〜0.4mgに変化させた。投与後7-9日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。肝臓編集および血清TTRの結果を、図22Cおよび図22Dに示す。陰性対照マウスは、TSSビヒクルを投与された。
【０４２９】
１１．コドンスキームの特徴解析
様々なコドンスキームを使用したCas9配列を設計して、タンパク質発現の改善に関して検証した。各配列は、配列番号3のCas9アミノ酸を異なるコドンセットを使用してコードするよう設計された。各オープンリーディングフレーム配列においては、単一コドンを使用して、各アミノ酸をコードした。配列は、NCBI-GenBank Flat File Release 160.0 (Nakamura et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28, 292; Benson et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34(データベース公表）、D16-20)に基づく、ホモサピエンスでの完全タンパク質コード遺伝子においてコドンが存在する頻度、およびコドン間の特定のヌクレオチドの存在度に基づいて変化する。表4に示されるコドンスキームに基づき、Cas9に対する7つの異なるオープンリーディングフレーム（配列番号52、54および108〜112）が構築され、配列番号3のCas9タンパク質をコードした。これらを、HSD 5’UTR、（配列番号41）、アルブミン3’UTR、T7プロモーターおよびポリA尾部をさらに含有する構築物内に組み込んだ。アルブミン3’UTR、およびポリA尾部を含有する配列例は、配列番号53であり、HSD 5’UTR、および配列番号52のORFの後に、3’UTRとポリA尾部が続く。さらにこれらの評価には、Presnyakら（2015）が報告しているmRNA半減期を改善する最適コドンに基づいたコドンスキームを使用して配列番号3のCas9タンパク質をコードした、同様の構成の構築物が含まれた（配列番号107、表4の長半減期コドンセットを使用）。
【０４３０】
ウリジンの代わりに100％ N1-メチルシュードウリジンを使用したIVTにより、メッセンジャーRNAを各構築物に対して作製した。Lipofectamine（商標）MessengerMAX（商標）Transfection Reagent (ThermoFisher社)を使用して、HepG2細胞に800ngの各Cas9 mRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの6時間後、細胞を凍結融解で溶解させ、遠心分離で清浄化させた。Cas9タンパク質レベルは、ELISAアッセイにより決定した。簡潔に述べると、総タンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイにより決定した。捕捉抗体としてCas9マウス抗体(Origene社、カタログ番号 CF811179)、および検出抗体としてCas9(7A9-3A3)マウスモノクローナル抗体(Cell Signaling Technology社、カタログ番号14697)を使用して、メーカーのプロトコールに従い、MSD GOLD 96-well Streptavidin SECTOR Plate (Meso Scale Diagnostics社、カタログ番号L15SA-1)を調製した。組み換えCas9タンパク質を、Diluent 39(Meso Scale Diagnostics社)中、1X Halt（商標）Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-Free (ThermoFisher社、カタログ番号78437)とともに較正標準として使用した。Meso Quickplex SQ120装置(Meso Scale Discovery社)を使用してELISAプレートを読み取り、データは、Discovery Workbench 4.0ソフトウェアパッケージ(Meso Scale Discovery社)を使用して分析された。
【０４３１】
編集効率は、トランスサイレチン（TTR）を標的とするガイド（G502；配列番号70）とともにmRNAをHepG2細胞内へとトランスフェクトし、編集割合を測定することによりインビトロ評価した。表25に示される配列番号を含むCas9 mRNAは、3ng〜100ngのmRNA濃度で評価された。未処置細胞は、測定可能な編集を示さなかった。図23〜24および表25は、インビトロでのCas9タンパク質発現および編集に対する、様々なコドンセットの効果を示す。
【表２５】
2021500863.tif 000045
【０４３２】
インビボでのコドンスキームの効果を決定するために、表4に記載されるコドンスキームを使用してCas9をコードするmRNAからインビボで発現されたときのCas9タンパク質発現が測定された。表26に示されるように、メッセンジャーRNAは、TTRを標的とするガイドRNA（G282、配列番号42）とともにLNPとして製剤化された。直交流法を使用してLNPは組み立てられ、50％ Lipid A、9％ DSPC、38％コレステロール、および3％PEG2k-DMGをそれぞれ50：38：9：3のモル比で含有し、6.0のN:P比を有した。LNPは、Amicon PD10フィルター（GE Healthcare社）を使用して精製され、0.32mg/mlの濃度で使用された（LNP濃度）。メスのCD-1マウス（1群当たりn=5）に、1mpkで静脈内投与した。投与後3時間で動物を殺処分し、肝臓を採取して、肝臓中のCas9発現を測定した。Cas9タンパク質発現は、上述のMeso Scale Discovery ELISAアッセイを使用して肝臓中で測定された。およそ40〜50mgの肝臓組織が、1x Complete Protease Inhibitor Tablet (Roche社、カタログ番号11836170001)を含むRIPA Buffer (Boston Bioproducts社、BP-115)中、ビーズミルによりホモジナイズされた。図25および表26は、肝臓におけるCas9発現の結果を示す。低Aおよび低A/UのコドンスキームのmRNA（配列番号111および112のORF）は、検証されたORFの中で最も高いCas9発現を示した。陰性対照のCas9タンパク質発現、および配列番号54のORFは、定量下限（LLOQ）を下回った。
【表２６】
2021500863.tif 000046
【０４３３】
インビボでのコドンスキームの効果を決定するために、様々なコドンスキームを使用してCas9をコードするmRNAからのインビボでのゲノム編集を測定した。表27に示されるように、メッセンジャーRNAは、TTRを標的とするガイドRNA（G282、配列番号42）とともにLNPとして製剤化された。直交流法を使用してLNPは組み立てられ、50％ Lipid A、9％ DSPC、38％コレステロール、および3％PEG2k-DMGをそれぞれ50：38：9：3のモル比で含有し、6.0のN:P比を有した。LNPは、Amicon PD-10フィルター（GE Healthcare社）を使用して精製され、0.05mg/mlの濃度で使用された（LNP濃度）。メスのCD-1マウス（1群当たりn=5、ただし配列番号52で処理された群はn=4）に、0.1mpkで静脈内投与した。投与後6日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。表27および図26は、インビボでの編集結果を示す。表27および図27A〜Bは、血清TTRレベルを示す。
【表２７】
2021500863.tif 000047
【０４３４】
様々なmRNA濃度でのコドンスキームの有効性を決定するために、インビボ投与反応実験を実施した。表28に示されるように、メッセンジャーRNAは、TTRを標的とするガイドRNA（G282、配列番号42）とともにLNPとして製剤化された。直交流法を使用してLNPは組み立てられ、50％ Lipid A、9％ DSPC、38％コレステロール、および3％PEG2k-DMGを含有した。LNPは、Amicon PD10フィルター（GE Healthcare社）を使用して精製され、0.7mg/mlの濃度で使用された（LNP濃度）。メスのCD-1マウス（1群当たりn=5）に、0.03、0.1または0.3mpkで静脈内投与した。投与後7日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。表28および図28は、インビボでの編集結果を示す。表28および図29A〜Bは、血清TTRレベルを示す。
【表２８】
2021500863.tif 000048
【０４３５】
様々なUTRを用いたコドンスキームの効果を決定するために、Cas9をコードするmRNAの投与後のインビボでのゲノム編集を測定した。表29に示されるように、メッセンジャーRNAは、TTRを標的とするガイドRNA（G282、配列番号42）とともにLNPとして製剤化された。直交流法を使用してLNPは組み立てられ、50％ Lipid A、9％ DSPC、38％コレステロール、および3％PEG2k-DMGをそれぞれ50：38：9：3のモル比で含有し、6.0のN:P比を有した。LNPは、Amicon PD-10フィルター（GE Healthcare社）を使用して精製され、0.05mg/mlの濃度で使用された（LNP濃度）。メスのCD-1マウス（1群当たりn=5；配列番号43の編集に関してはn=4）に、0.1mpkで静脈内投与した。投与後6日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。表29および図30A〜Bは、インビボ編集結果（B）および血清TTR結果（A)を示す。
【表２９】
2021500863.tif 000049
【０４３６】
１２．キャッピング構造の効果の特徴解析
表30に示されるように、Cas9をコードし、キャップ、UTRおよびポリA尾部を含有するmRNAを、TTRを標的とするガイドRNA（G282；配列番号42）とともにLNPとして製剤化した。直交流法を使用してLNPは組み立てられ、50％ Lipid A、9％ DSPC、38％コレステロール、および3％ PEG2k-DMGをそれぞれ50：38：9：3のモル比で含有し、6.0のN:P比を有した。LNPは、Amicon PD-10フィルター（GE Healthcare社）を使用して精製され、0.06mg/mlの濃度で使用された（LNP濃度）。メスのCD-1マウス（1群当たりn=5）に、0.1または0.3mpkで静脈内投与した。投与後7日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。
図31および表30は、Cap1を有するmRNAが、Cap0のmRNAよりも、0.1mpkの投与量で約10％高い平均編集を有することを示す。0.3mpkの投与量では、XBG UTRを有するmRNAが、酵素的Cap0の場合を除き、HSD UTRを有するmRNAよりも若干高い平均編集を有している。血清TTRの結果を、図32（血清TTRの結果はそれぞれ、μg/mL、およびTSS対照の％で表される）、図31（肝臓編集）および表30に示す。
【表３０】
2021500863.tif 000050
【０４３７】
１３．核局在シグナルの特徴解析
いくつかの核局在シグナル（NLS)を使用したCas9配列を設計し、検証して、有効性を決定した。様々な強度の11個の非標準NLSを、Kosugi et al. (2009) Journal of Biological Chemistry, 284(1), 478-485により特定されたNLSから、表31に示されるように選択した。これらのアミノ酸配列は、Cas9アミノ酸配列（配列番号13）のカルボキシ末端に付加された。対照配列は、配列番号4をコードする。
【表３１】
2021500863.tif 000051
【０４３８】
表31に示されるように、NLSとともにCas9をコードするmRNAを、TTRを標的とするガイドRNA（G282；配列番号42）とともにLNPとして製剤化した。直交流法を使用してLNPは組み立てられ、50％ Lipid A、9％ DSPC、38％コレステロール、および3％PEG2k-DMGをそれぞれ50：38：9：3のモル比で含有し、6.0のN:P比を有した。LNPは、Amicon PD-10フィルター（GE Healthcare社）を使用して精製され、約0.07mg/mlの濃度で使用された（LNP濃度）。メスのCD-1マウス（1群当たりn=5）に、0.1mpkで静脈内投与した。投与後7日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を測定した。表32および図33に結果を示す。表32に列記されるNLSに対応する配列番号については、表31を参照のこと。
【表３２】
2021500863.tif 000052
【０４３９】
NLS5は、SV40 NLSを超える統計的に有意な増加を示した（一元配置分散分析、p=0.006）。NLS4およびNLS8はそれぞれ、SV40 NLSと比較して編集の増加傾向の見込みを呈したが、この実験において差異は統計的に有意ではなかった。図34A〜Bは、核局在シグナルバリアントの投与後の血清TTRレベルを示す。上記のKosugiら（2009）は、核局在の程度に対してNLSの活性を等級分けしており（表32の「NLS強度」）、10は核に排他的に局在、1は細胞中に拡散している。この論文中で等級付けられたNLS活性は、図35に示されるように編集効率と正に相関している。
【０４４０】
１４．インビトロにおけるUTRの効果に関する特徴解析
表33および図36は、様々な5’UTRを有する転写物からのCas9発現を示す。すべての構築物が、3’ヒトアルブミンUTRを使用した。IVTにより各構築物に対するメッセンジャーRNAが作製された。配列番号179のメッセンジャーRNAは、直線化プラスミドを使用して作製された。その他すべては、PCR産物を鋳型として使用して作製された。HepG2細胞に、100ngの各Cas9 mRNAとトランスサイレチン（TTR）を標的とするガイド（G502、配列番号70）25nM最終濃度を用いて、Lipofectamine（商標）MessengerMAX（商標）Transfection Reagent (ThermoFisher社)を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの6時間後、細胞は、Nano-Glo（登録商標）HiBiT Lytic Assay (Promega社)により溶解された。Cas9タンパク質レベルは、Nano-Glo（登録商標）Nano-Glo HiBiT Extracellular Detection System (Promega社、カタログ番号N2420)を使用することにより決定された。表33および図36は、様々な5’UTRを有する転写物からのCas9発現を示す。
【表３３】
2021500863.tif 000053
【０４４１】
１５．非ヒト霊長類へのLNP送達
X-フロー／TFFプロセスを使用して上述のように調製されたLNP製剤を用いた3回の実験が実施された。個別のモル量およびカーゴは、表34〜36に提示されている。Cas9 mRNAおよびガイドRNA（gRNA）を含有する各製剤は、1:1の重量比のmRNA：gRNAを有した。LNPの投与量（mg/kg単位、総RNA含有量）、投与経路、および動物がデキサメタゾン前処置を受けたかどうかを、表に示す。デキサメタゾン（Dex）前処置を受けた動物について、Dexは、LNPまたはビヒクルの投与の1時間前に、IVボーラス注射により2mg/kgで投与された。
【０４４２】
血液化学分析について、測定される各因子に対して表に指定される時点で、動物から血液が採取された。サイトカイン誘導は、NHP処置の前後に測定された。最小で0.5mLの全血が、拘束された意識のある動物の末梢静脈から採取され、4mlの血清分離管に移された。最短で30分間、室温で血液を凝固させ、次いで2000xgで15分間、遠心分離させた。それぞれ120uLの血清が2本のポリプロピレンマイクロチューブに分注され、分析されるまで-60℃〜-86℃に保存された。Meso Scale Discovery社 (MSD)からの非ヒト霊長類用U-Plex Cytokineカスタムキットを分析に使用した。分析には以下のパラメーターが含まれた：INF-g、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MCP-1およびTNF-a。IL-6およびMCP-1に重点が置かれた。キットの試薬と標準物は、メーカーのプロトコールに指示されるように調製された。NHP血清は、そのまま使用された。MSD Sector Imager 6000上でプレートが検証され、MSD Discovery work bench software Version 4012により分析が実施された。
【０４４３】
補体レベルは、酵素イムノアッセイにより、処置前後の動物において測定された。0.5mL量の全血が、拘束された意識のある動物の末梢静脈から採取され、0.5mlのk2EDTA管に移された。2000xgで15分間、血液を遠心分離した。それぞれ120uLの血漿が2本のポリプロピレンマイクロチューブに分注され、分析されるまで-60℃〜-86℃に保存された。分析には、Quidel MicroVue Complement Plus EIA kit (C3a -カタログ番号A031)または(Bb-カタログ番号A027)を使用した。キットの試薬と標準物は、メーカーのプロトコールに指示されるように調製された。450nmの光学密度で、MSD Sector Imager 6000上でプレートが検証された。結果は、4-パラメーターの曲線適合を使用して分析された。
【０４４４】
サイトカイン誘導および補体活性化のデータを以下の表に示す。「BLQ」とは、定量限界未満を意味する。ガイドRNAの配列番号は以下の通りである。G502、配列番号 70；G506、配列番号 197；G509、配列番号 71；G510、配列番号 198。
【表３４】
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【表３５−１】
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【表３５−２】
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【表３６−１】
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【表３６−２】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【０４４５】
１６．マウス肝臓における様々なmRNAのCas9発現の比較
Cas9発現は、Cas9をコードする様々なmRNAの投与後にインビボで測定された。表49に指定されるメッセンジャーRNAは、マウスTTR遺伝子を標的とするマウスsgRNAとともにLNPとして製剤化された（sgRNA：mRNAの重量比は1:2）。直交流法を使用してLNPは組み立てられ、50％ Lipid A、9％ DSPC、38％コレステロール、および3％ PEG2k-DMGを含み、6.0のN:P比を有した。LNPは、Sartocon Slice 200 (Sartorius社)を使用して精製され、1.53mg/mlの濃度で使用された（RNA濃度）。LNP製剤は、上述のように平均粒子サイズ、多分散指数（pdi）、総RNA含有量およびRNAの封入効率に対して分析された（データ示さず）。
【０４４６】
メスのCD-1マウス（1群当たりn=5）に、0.3mpkで静脈内投与した。投与後1時間、3時間、および6時間で動物を殺処分し、肝臓組織を採取して、Cas9タンパク質レベルを、実施例11に記載されるようにMSD ELISAにより測定した。表49は、Cas9タンパク質レベルを示す。各時点で、配列番号43で処理された動物よりも、配列番号177で処理された動物において、より多くのCas9タンパク質が検出されている。
【表４９】
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【０４４７】
１７．様々なmRNAの投与反応の比較
Cas9をコードする様々なmRNAの投与反応曲線をインビボで比較した。LNP製剤は、配列番号43および配列番号177のmRNA、ならびにsg502（配列番号70、G502）とともに調製され、実施例16に記載されるように製剤化された。脂質ナノ粒子成分は、脂質成分のモル比が50/9/38/3(LP01/DSPC/コレステロール/PEG-DMG)で、100％エタノール中に溶解された。脂質アミンとRNAリン酸塩（N：P）のモル比が約6、gRNAとmRNAが1：2の重量比で、LNPを製剤化した。LNP製剤は、上述のように平均粒子サイズ、多分散指数（pdi）、総RNA含有量およびRNAの封入効率に対して分析された（データは示さず）。
【０４４８】
インビボ特徴解析のために、メスのCD-1マウス（1群当たりn=5）に、1キログラム当たり0.03、0.1または0.3mgの総RNA（mg ガイドRNA＋mg mRNA）で静脈内投与した（1群当たりn=5）。投与後7日目に動物を殺処分し、血液と肝臓を採取して、血清TTRと肝臓編集を実施例1に記載されるように測定した。陰性対照動物は、TSSビヒクルを投与された。編集データは、以下の表50に示す。配列番号43については、各々5匹の動物を用いた、8回のインビボ実験の平均が提供される。配列番号177については、各投与量で5匹の動物を用いた、インビボ実験からの平均が提供される。各投与量で、配列番号43で処理された動物よりも、配列番号177で処理された動物において、編集％が高い。
【表５０】
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【０４４９】
配列表
以下の配列表は、本明細書に開示される配列のリストを提供する。DNA配列（Tを含む）が、RNAに関して参照される場合、Tは、U（状況に応じて、改変または非改変であり得る）と置き換えられるものとし、逆もまた然りであることを理解されたい。
【０４５０】
【表５１−１】
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【表５１−２】
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【表５１−３】
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【表５１−４】
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【表５１−５】
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【表５１−６】
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【表５１−７】
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【表５１−８】
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【表５１−９】
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【表５１−１０】
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【表５１−１１】
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【表５１−１２】
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【表５１−１３】
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【表５１−１４】
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【表５１−１５】
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【表５１−１６】
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【表５１−１７】
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【表５１−１８】
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【表５１−１９】
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【表５１−２０】
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【表５１−２１】
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【表５１−２２】
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【表５１−２３】
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【表５１−２４】
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【表５１−２５】
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【表５１−２７】
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【表５１−２８】
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【表５１−２９】
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【表５１−３０】
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【表５１−３１】
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【表５１−３３】
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【表５１−３４】
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【表５１−３５】
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【表５１−３６】
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【表５１−３８】
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【表５１−３９】
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【表５１−４０】
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【表５１−４１】
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【表５１−４２】
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【表５１−４３】
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【表５１−４４】
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【表５１−４５】
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【表５１−４６】
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【表５１−４７】
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【表５１−４８】
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【表５１−４９】
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【表５１−５０】
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【表５１−５３】
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【表５１−５４】
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【表５１−５５】
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【表５１−５６】
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【表５１−５７】
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【表５１−５８】
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【表５１−５９】
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【表５１−６０】
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【表５１−６１】
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【表５１−６２】
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【表５１−６３】
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【表５１−６４】
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【表５１−６５】
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【表５１−６８】
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【表５１−６９】
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【表５１−７０】
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【表５１−７１】
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【表５１−７８】
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【表５１−７９】
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【表５１−８０】
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【表５１−８８】
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【表５１−９０】
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【表５１−９１】
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【表５１−９３】
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【表５１−９４】
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【表５１−９５】
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【表５１−９６】
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【表５１−９７】
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【表５１−９８】
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【表５１−９９】
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【表５１−１００】
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【表５１−１０４】
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【表５１−１０５】
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【表５１−１０６】
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【表５１−１０８】
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【表５１−１０９】
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【表５１−１１０】
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【表５１−１１１】
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【表５１−１１２】
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【表５１−１１３】
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【表５１−１１４】
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【表５１−１１５】
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【表５１−１１６】
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【表５１−１１７】
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【表５１−１１８】
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【表５１−１１９】
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【表５１−１２０】
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【表５１−１２２】
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【表５１−１２３】
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【表５１−１２４】
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【表５１−１２７】
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【表５１−１２８】
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【表５１−１２９】
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【表５１−１３０】
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【表５１−１５７】
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【表５１−１５８】
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【表５１−１５９】
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【表５１−１６０】
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【表５１−１６１】
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【表５１−１６２】
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【表５１−１６３】
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【表５１−１６４】
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【表５１−１６５】
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【表５１−１６６】
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【表５１−１６７】
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【表５１−１６８】
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【表５１−１６９】
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【表５１−１７０】
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【表５１−１７１】
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【表５１−１７４】
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【表５１−１７５】
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【表５１−１７７】
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【表５１−１８０】
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【表５１−１８１】
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【表５１−１８７】
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【表５１−１８８】
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【表５１−１８９】
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【表５１−１９０】
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【表５１−１９１】
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【表５１−１９２】
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【表５１−１９３】
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【表５１−１９４】
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【表５１−１９５】
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【表５１−１９６】
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【表５１−１９７】
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【表５１−１９８】
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【表５１−１９９】
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【表５１−２００】
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【表５１−２０１】
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【表５１−２０２】
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【表５１−２０３】
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【表５１−２０４】
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【表５１−２０５】
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【表５１−２０６】
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【表５１−２０７】
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【表５１−２０８】
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【表５１−２０９】
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【表５１−２１０】
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【表５１−２１１】
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【表５１−２１２】
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【表５１−２１３】
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【表５１−２１４】
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【表５１−２１５】
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【表５１−２１６】
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【表５１−２１７】
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【表５１−２１８】
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【表５１−２１９】
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【表５１−２２０】
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【表５１−２２１】
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【表５１−２２２】
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【表５１−２２３】
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【表５１−２２４】
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【表５１−２２５】
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【表５１−２２６】
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【表５１−２２７】
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【表５１−２２８】
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【表５１−２２９】
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【表５１−２３０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３】
2021500863.tif 000343
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
2021500863000001.app
【国際調査報告】
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2021500863.tif 000362
2021500863.tif 000363
2021500863.tif 000364
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