(57)【要約】  細胞に外来性物質を導入するために細胞にトランスフェクションを起こさせる方法とデバイスである。この方法は、電場の存在下で細胞を非定常フローの領域に暴露して、細胞を溶解させることなく細胞への外来性物質の導入を促進するステップを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に外来性物質を導入するためにトランスフェクションを起こさせる方法であって、
細胞と外来性物質を含む液体をマイクロ流体デバイスのフローチャネルに導入するステップであって、前記フローチャネルは少なくとも１つの分流器を含むステップと、
細胞を少なくとも１つの分流器の下流の非定常フローに曝露して、細胞が溶解することなく細胞の膜を一時的に透過性にするステップと、
細胞を電場に曝露して、膜が透過化されている間に外来性物質を細胞に導入するステップとを含む方法。
【請求項２】
外来性物質を細胞に導入する方法であって、
細胞を溶解させることなく一時的に細胞膜を透過性にするために、外来性物質を含む懸濁液中の細胞を非定常フローの条件下で圧力変化に曝露するステップと、
細胞を電場に曝露して、膜が透過性である間に外来性物質を細胞に導入するステップとを含む方法。
【請求項３】
電場が外来性物質の送達を促進する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記外来性物質に電荷を帯びさせるように構成することをさらに含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記外来性物質が負に帯電している、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記外来性物質が正に帯電している、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記外来性物質が中性に帯電している、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
電場への細胞の曝露が、細胞が非定常フローにある間に起こる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記電場は、直流を使用して生成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記電場が、交流を使用して生成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記電場が、外来性物質の送達を促進することができる電場強度で生成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
電場が、細胞状態に悪影響を与えるように摂動するには不十分な電場強度で生成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
前記電場が、外来性物質の送達を促進するのに十分な振動成分及びオフセットを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
前記電場が、振動成分と、前記細胞状態に悪影響を与えるように摂動するには不十分な振動成分及びオフセットを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
電場が、前記細胞状態に悪影響を与えるように摂動するには不十分な周波数で生成される、上記の請求項のいずれかに記載の方法、
【請求項１６】
前記圧力変化が負圧変化である、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記フローチャネルが少なくとも第２の分流器を含み、各分流器は最大幅を有し、各分流器の前記最大幅は、前記フローチャネルの幅に沿った配列内の各分流器間の間隔よりも大きいことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記フローチャネルが少なくとも第２の分流器を含み、各分流器は各分流器の間に間隔を有し、各分流器間の前記間隔は細胞の直径より大きい幅を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
外来性物質が、有機分子、生理学的に許容される有機分子誘導体、生体分子、生理学的に許容される生体分子誘導体、生理学的に許容される生体分子類似体、無機分子、生理学的に許容される無機分子誘導体、量子ドット、カーボンナノチューブ、ナノ粒子、及び金粒子からなる群から選択される、上記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記生体分子が、炭水化物、脂質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、及び核酸からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸が、デオキシリボ核酸及びリボ核酸からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸が発現ベクターに含まれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記発現ベクターがプラスミドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記発現ベクターが少なくとも１つの調節配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの調節配列が、エンハンサー領域及びプロモーター領域からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
外来性物質を細胞に導入するためのマイクロ流体デバイスであって、
少なくとも１つのフローチャネルを含む基板と、ここで前記フローチャネルは、対向する側壁、前記側壁の一方から前記側壁の他方までの幅、及び幅に垂直な長さを有しており、
フローチャネルの幅に沿って配列状に配向された複数の分流器と、ここで前記分流器は、前記フローチャネル内で配向され、フローチャネルの長さの下流部分に沿った非定常フローを引き起こして、細胞の膜を一時的に透過性にし、
前記分流器の下流に配置された少なくとも１つの電極とを含んでなり、ここで前記少なくとも１つの電極は、膜が透過性である間、細胞への外来性物質の導入を容易にするために電場を放出するように構成されるデバイス。
【請求項２７】
前記電極は、前記基板の一部として形成される、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記フローチャネルが閉鎖フローチャネルであり、前記電極が前記閉鎖フローチャネルの床及び／又は天井に配置される、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記電極が、前記フローチャネルを取り囲むように構成される、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３０】
少なくとも第２の電極をさらに含み、前記電極が直列構成で配向されている、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３１】
少なくとも第２の電極をさらに含み、前記電極が並列構成で配向される、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの電極に電圧を与えるように構成された電源をさらに備える、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記電源は、オフセット電流を調整するための手段を含む、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記電源がＤＣ発電機である、請求項３２又は３３に記載のデバイス。
【請求項３５】
前記電源がＡＣ発電機である、請求項３２又は３３に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記分流器が複数のポストである、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３７】
少なくとも１つの並列フローチャネルをさらに含み、前記電極の一部は、前記並列フローチャネルを分離する側壁に存在する、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３８】
前記電極が、前記分流器の下流の非定常フローのゾーンと重なる電場を放出するように構成される、請求項２６〜３７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３９】
前記分流器はそれぞれ、前記フローチャネルの幅に平行な最大幅を有し、各分流器の最大幅は、前記フローチャネルの幅に沿った配列内の各分流器間の間隔よりも大きい、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの電極の１つがアノードである、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの電極の１つがカソードである、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項４２】
分流器及び電極の複数の配列をさらに備え、前記配列及び電極は、フローチャネルの長さに沿って互いに交互する構成で配向される、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項４３】
次の方法より細胞に導入された外来性物質を含む改変された細胞であって、この方法は、
細胞を溶解させることなく一時的に細胞膜を透過性にするために、非定常フローの条件下で圧力変化を誘導するステップと、
電場を生成して、膜が透過性である間に外来性物質を細胞に導入するステップとを含む、改変された細胞。
【請求項４４】
医薬組成物であって、
細胞が電場内にあり、非定常フローによってパルス化されている間に、細胞膜を一時的に透過性とし、外来性物質を細胞に導入することによって改変された細胞と
薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、非定常フローに暴露された細胞に外来性物質を導入する方法に関し、外来性物質の存在下で細胞を電場に曝露することを含む。
【背景技術】
【０００２】
バイオマイクロフルイディクスは、細胞を分離又は富化し（Ｓｈｉｅｌｄｓｅｔａｌ。２０１５）、改変し、培養し、修正するために使用され得る。したがって、バイオマイクロフルイディクスは、細胞を分離又は富化、改変、培養、及び修正する必要がある遺伝子改変細胞療法（ＧＭＣＴ）の開発と製造に適している。改変Ｔ細胞に基づくＧＭＣＴは、何らかの血液悪性腫瘍を有する患者に実質的に改善された結果を提供できる。具体的には、ＣＤ１９をターゲットとするキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法は顕著な応答を示し、以前のすべての療法に反応しない進行した急性リンパ芽球性白血病の患者を治す可能性がある。遺伝子改変ＣＡＲ−Ｔ細胞は、急性リンパ芽球性白血病における８３％の寛解率の実証に続いて、がんの治療のためＦＤＡ（食品医薬品局）の承認を得た最初の細胞療法である。
【０００３】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞の遺伝子改変を介して生成されて改変されたヒトＴ細胞を生じさせ、改変されたヒトＴ細胞は、ヒンジ領域に連結された腫瘍標的に向けられた細胞外単鎖可変断片を、共刺激ドメイン上及び細胞内ＣＤ３ゼータ活性化ドメイン上に提示する。これらの治療法の製造においては、スループットが比較的低い割には費用と時間がかかり、改変される細胞の種類によって結果が変化し得る。さらに、ＧＭＣＴ製造で最も問題となるステップは、Ｔ細胞表面でのＣＡＲの発現のためのトランスフェクション又はトランスダクションを介した核酸の細胞内送達である。ウイルスのトランスダクション（レトロウイルスやレンチウイルスなどの）は、臨床試験用のＣＡＲ−Ｔ療法を生成するために現在使用されている主要な方法である。ただし、これらの方法は生産にかなりの時間と人手を必要とし、治療投与時に複製能を有するウイルスの導入を回避するために、生産中及び生産後の広範な安全テストが必要となる。
【０００４】
エレクトロポレーションなどの物理的トランスフェクション方法は、ＧＭＣＴ製造のための魅力的な代替方法である。エレクトロポレーションは、広範な安全性又は放出上の予防策を必要とせず、広範囲の外来性物質を細胞（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び／又はさまざまな複合体）に送達するために使用できるが、重大な細胞損失又は正常な細胞の機能の改変をもたらし得る。これらの問題に対処するために、多くの代替的な物理的送達方法が開発されている。一般に、マイクロ流体メソッドは、より均一な処理条件により、マクロスケールメソッドを改善することが示されている。細胞の直径とマイクロ流体チャネルの形状は同じオーダーである。物理的なマイクロ流体細胞内送達方法の例には、エレクトロポレーションによるフロー、マイクロニードル注入、細胞圧搾、流体剪断、及びエレクトロソニックジェット噴出が含まれる。これらの方法は現在のＧＭＣＴ生産に代わる有望で魅力的な代替方法を提供するが、スループット、処理速度、クロッギング、及び／又は研究プラットフォームから臨床用の生産への変換が煩わしいといった点により制限される。さらに、従来のメカノポレーションシステム及び方法は、通常、メカノポレーションの後に、層流条件又は静的なフロー条件を必要とすることに留意されたい。
【０００５】
ＣＡＲ−Ｔ療法のようなＧＭＣＴの生成のための理想的な細胞内送達プラットフォームは、異なる外来性物質（例えば、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び／又はさまざまな複合体）において柔軟であるべきであり、またさまざまな細胞型に適用可能であるべきで、その際細胞生存率、細胞回収、及び正常な細胞活動の摂動は最小限に留められるべきものである。現在、Ｔ細胞は、ＧＭＣＴの生成のために、プラスミド、ＲＮＡ、Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を含むさまざまな外来性物質で修飾されている。ＲＮＡは、Ｔ細胞への細胞内送達後に、さまざまな修飾モダリティーを有して重要な有用性を提供するため、特に興味深い。これには、さまざまなＴ細胞のゲノムを、永続する、長命な、一過性の方法で編集してキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる外来性物質が含まれる。
【０００６】
ＧＭＣＴの開発及び製造のためのマイクロ流体的及び物理的な細胞内送達を検討する場合、以下を含むいくつかの実際的な測定基準がある。（１）細胞回収率、（２）細胞生存率、（３）送達又は発現の効率性、（４）スループット、及び（５）正常又は望ましい細胞状態及び機能の維持。ＧＭＣＴでは大量の細胞が必要とされるため、細胞回収率が低いことは理想的ではない。細胞は修飾後に頻繁に増殖するため、高い細胞生存率も好ましい。観察によると、細胞生存率が低いか、死んだ細胞が存在すると、細胞の成長率が低下したり、成長が完全に停止したりすることがわかっている。さらに、非生存細胞は有害な免疫応答を誘発する可能性があり、注入毒性を誘発するかもしれないため、規制機関は、注入投与時に低い細胞生存率をともなう細胞療法を可能にするため、非生存細胞の存在の正当化を必要としている。送達効率は、細胞の状態を変化させないで治療効果を誘発するのに十分であるべきであり、細胞修飾の効率は、死んだ細胞の除去などの追加の処理ステップを必要としないよう十分高いものである必要がある。エレクトロポレーションは、未感作Ｔ細胞にＣＡＲｓでトランスフェクションを起こさせるために使用されており、２４時間後の回収率は２０％未満であることがわかった。細胞生存率を大幅に低下させることに加えて、エレクトロポレーションはＴ細胞表面活性化マーカーの発現を増加させましたが、これは治療効果を低下させる可能性があるため望ましくない。細胞を処理できる速度が重要であるのと同様に、総スループットは重要である。増殖前に１０８個の細胞を改変するのに少なくとも１０８秒又は約３年かかる場合、単一細胞マイクロニードル注入がＧＭＣＴ製造に役立つ可能性は低いこうしてみると、上記のマイクロ流体的及び物理的な細胞内送達方法のいずれも、ＧＭＣＴの開発及び製造のすべてのニーズを満たす、あるいは上回るものではない。
【０００７】
マイクロ流体トランスフェクションの分野における進歩は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／１０９８６４（発明者Ｐａｗｅｌｌ）に開示されており、その明細書全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、流体力及び電場の使用による細胞内送達のための方法及びデバイスを広く対象とする。本開示は、流体力及び電場の使用による細胞内送達の方法及びデバイスをさらに広く対象とする。本開示はまた、流体力によって透過性とされた細胞に電気泳動を介してペイロード、カーゴ、又は外来性物質を能動的に送達する方法及びデバイスにも広く関する。
【０００９】
広い形態において、本開示は、細胞を電場及び非定常フローに曝露することによって外来性物質を細胞に導入する方法に関する。別の広い形態において、本開示は、細胞を電場及び非定常フローに曝露することによって外来性物質の細胞への導入を改善する方法に関する。
【００１０】
第１の態様では、外来性物質を細胞に導入する方法が提供され、この方法は、細胞又はその一部を（ｉ）非定常フローの少なくとも１つの領域、（ｉｉ）電場、に曝露することを含み、これにより、外来性物質を細胞に導入する。
【００１１】
第２の態様では、外来性物質の細胞への導入を改善する方法が提供され、この方法は、細胞又はその一部を（ｉ）非定常フローの少なくとも１つの領域、（ｉｉ）電場、に曝露することを含み、これにより、外来性物質の細胞への導入を改善する。
【００１２】
第３の態様では、外来性物質を細胞、又はその一部に導入するデバイスが提供され、デバイスは以下を含む。細胞のフローと液体中に浮遊する外因性物質を通過可能にするように構成された寸法を有する少なくとも部分的に囲まれたチャネル。ここでチャネルは、非定常フローの少なくとも１つの領域と、電場のソース又はエミッタを含むように構成される。
【００１３】
好ましくは、デバイスは、マイクロ流体デバイスである。
【００１４】
好適には、電場の少なくとも一部は、電気泳動によって外来性物質を細胞に導入、送達、又は駆動させるように構成される。好適には、電場の一部は、外来性物質を細胞に導入し、駆動させ、送達するのに十分な強度を有する。好ましい実施形態では、電場は電気泳動場である。ある実施形態では、電場全体が、電気泳動によって外来性物質を細胞に導入又は送達するように構成される。
【００１５】
好適には、曝露とは、外来性物質の存在下での曝露を含む。
【００１６】
好ましい実施形態では、外来性物質は、細胞の外膜における摂動を介して駆動される。好適には、摂動は、実質的には非定常フローにより生成され得る。摂動は、細胞膜又は細胞壁における少なくとも１つの孔であってもよい。
【００１７】
好ましくは、電場は、交流又は直流、あるいはそれらの組み合わせを使用して生成される。好適には、ソース又はエミッタは、交流又は直流、あるいはそれらの組み合わせを使用して生成するよう構成される。
【００１８】
好適には、電場は、１つ以上の電極によって生成される。好ましくは、少なくとも１つの電極は、白金電極である。好ましくは、少なくとも１つの電極は、アノード又はカソードであり得る。
【００１９】
少なくとも１つ電極は、電場が印加されるとき、少なくとも１つの電極の劣化を最小限にすることに適合した材料を含み得る。好ましい実施形態では、その材料は導電性材料であり得る。好適には、伝導性材料は白金であり得る。
【００２０】
少なくとも１つ電極は、電場が印加されるとき、少なくとも１つの電極の劣化を最小限にすることに適合した材料の１つ以上の層を含み得る。
【００２１】
少なくとも１つ電極は、電場が印加されるとき、少なくとも１つの電極の劣化を最小限にすることに適合した材料を含む１つ以上の表面を含み得る。
【００２２】
好適には、少なくとも１つ電極は、基板への接着を増強するように適合されている。
【００２３】
好ましくは、電場は、相互嵌合された配列内の複数の電極によって生成され得る。
【００２４】
好適には、細胞は、外来性物質のフローを可能にするように構成された少なくとも部分的に囲まれたチャネル内で電場に曝露されてもよい。チャネルは、非定常フローの少なくとも１つの領域、より好ましくは、非定常フローの複数の領域を含むように構成され得る。
【００２５】
好ましくは、チャネルは、１つ以上の分流器を含む。好適には、非定常フローの少なくとも１つは、少なくとも１つの分流器の下流にある。
【００２６】
ある好ましい実施形態では、非定常フローの少なくとも１つの領域に曝露される細胞は、圧力の一時的な低下にも曝露され得る。好適には、細胞は、非定常フローの少なくとも１つの領域内での圧力の一時的な低下にさらされてもよい。好ましくは、圧力の一時的な低下は、少なくとも１つの分流器の下流である。
【００２７】
好適には、少なくとも１つ分流器は障害物であり、好ましくはポストである。
【００２８】
好ましくは、細胞は、原核細胞、真核細胞、古細菌、真菌細胞、植物細胞又は昆虫細胞、及びそれらの任意の組み合わせであるか、又はそれらを含む。好適には、真核細胞は、哺乳動物細胞又は酵母細胞であり得る。
【００２９】
好適には、外来性物質は、有機小分子、核酸、プラスミド、微生物染色体、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボソーム、ヌクレオチドを含む群から選択される１つ又は複数の薬剤であるか、又はそれらを含む。一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、ウイルス様粒子、酵素、色素体、タンパク質、複数のタンパク質（ヘテロ又はホモオリゴマー／三次構造）を含むアセンブリ、アプタマー、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）、デンドリマー、線形合成ポリマー、分岐合成ポリマー、ペプチド、ペプトイド、アミノ酸、脂質、炭水化物、多糖類、荷電合成ポリマー、非荷電合成ポリマー、リポソーム、タンパク質が埋め込まれたリポソーム、単層単層ベシクル、多層単層ベシクル、ウイルス様粒子、ウイルス、量子ドット、カーボンナノチューブ、放射性核種、代謝産物、磁性ビーズ、無機ナノ粒子、有機ナノ粒子、磁気ナノ粒子、ウイルスキャプシド、金属粒子（金粒子など）、単糖、サイトカイン、ケモカイン、薬物分子、製薬関連分子、オルガネラ、ビタミン、及びステロイド、及びそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ又は複数の薬剤であるか、又はそれらを含む。オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、ウイルス様粒子、酵素、色素体、タンパク質、複数のタンパク質（ヘテロ又はホモオリゴマー／三次構造）を含むアセンブリ、アプタマー、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）、デンドリマー、線形合成ポリマー、分岐合成ポリマー、ペプチド、ペプトイド、アミノ酸、脂質、炭水化物、多糖類、荷電合成ポリマー、非荷電合成ポリマー、リポソーム、タンパク質が埋め込まれたリポソーム、単層単層ベシクル、多層単層ベシクル、ウイルス様粒子、ウイルス、量子ドット、カーボンナノチューブ、放射性核種、代謝産物、磁性ビーズ、無機ナノパーツｉｃｌｅ、有機ナノ粒子、磁気ナノ粒子、ウイルスキャプシド、金属粒子（金粒子など）、単糖、サイトカイン、ケモカイン、薬物分子、製薬関連分子、オルガネラ、ビタミン、及びステロイド、及びそれらの任意の組み合わせ。好ましくは、外来性物質は、核酸であるか、又はそれを含む。より好ましくは、核酸はＤＮＡ及び／又はＲＮＡである。さらにより好ましくは、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
【００３０】
第４の態様では、前述の態様のいずれか１つの方法に従って使用されるとき、第３の態様によるデバイスが提供される。
【００３１】
第５の態様では、前述の態様のいずれか１つの方法に従って産生された細胞が提供される。
【００３２】
第６の態様では、第５の態様の細胞を含む細胞懸濁液が提供される。
【００３３】
第７の態様では、第５の態様による細胞、又は第６の態様による細胞懸濁液、及び薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００３４】
第８の態様では、前述の態様のいずれか１つによるデバイスを含むキットが提供される。
【００３５】
さらなる態様では、細胞にトランスフェクションを起こさせて、外来性物質を細胞に導入する方法が提供される。この方法は、細胞と外来性物質を含む液体をマイクロ流体デバイスのフローチャネルに導入するステップと、ここでフローチャネルは少なくとも１つの分流器を含み、細胞が少なくとも１つの分流器を通過して流れるときに、細胞を少なくとも１つの分流器の下流の非定常フローに曝露して、細胞が溶解することなく細胞の膜を一時的に透過性にするステップと、細胞を電場に曝露して、膜が透過化されている間に外来性物質を細胞に導入するステップとを含む。
【００３６】
さらなる態様では、外来性物質を細胞に導入する方法が提供される。この方法は、細胞を溶解させることなく一時的に細胞膜を透過性にするために、外来性物質を含む懸濁液中の細胞を非定常フローの条件下で圧力変化に曝露するステップと、細胞を電場に曝露して、膜が透過性である間に外来性物質を細胞に導入するステップとを含む。
【００３７】
電場は、電気泳動場であり得る。この方法は、外来性物質を電荷を帯びさせるように構成することをさらに含み得る。外来性物質は、負に帯電していても、正に帯電していても、又は中性であってもよい。電場は、外来性物質の送達を容易にする電場強度であり、一方で、この電場強度は、細胞状態に害を与えるように摂動するには不十分である。
【００３８】
さらなる態様では、外来性物質を細胞に導入するマイクロ流体デバイスが提供される。デバイスは、少なくとも１つのフローチャネルを含む基板を含み、前記フローチャネルは、対向する側壁、前記側壁の一方から前記側壁の他方までの幅、及び幅に垂直な長さを有する。デバイスはまた、前記フローチャネルの幅に沿って配列状に配向された複数の分流器を含み、前記分流器は、前記フローチャネル内で配向され、フローチャネルの長さの下流部分に沿った非定常フローを引き起こして、細胞の膜を一時的に透過性にする。デバイスはまた、前記分流器の下流に配置された少なくとも１つの電極を含み、前記少なくとも１つの電極は、膜が透過性である間、細胞への外来性物質の導入を容易にするために電場を放出するように構成される。
【００３９】
さらに別の態様では、非定常フロー条件下で圧力変化を誘発して、細胞が溶解することなく細胞膜を一時的に透過性し、膜が透過性である間、外来性物質を細胞に導入するために電場を生成する方法によって細胞に導入された外来性物質を含む修飾細胞が提供される。
【００４０】
さらなる態様では、細胞が電場内にあり、非定常フローによってパルス化されている間に、細胞膜を一時的に透過性とし、外来性物質を細胞に導入することによって改変された細胞を含む医薬組成物、及び薬学的に許容される担体が提供される。
【００４１】
本明細書における「好ましい」又は「好ましくは」（”ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ”又は“ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ”）という言い方は、例示を目的としているだけであることが理解されるであろう。
【００４２】
本明細書全体を通して、文脈がそうでない限り、「含む」に該当する語（”ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、”ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”、”ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）は、述べられたステップ要素又はステップ又は要素のグループを包含することを意味するが、その他のステップ又は要素又はステップ又は要素のグループを除外することを意味しないと理解される。したがって、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）などの用語の使用は、記載された要素が必須又は必須であるが、他の要素は選択的であり、存在してもしなくてもよいことを示す。「〜からなる」（”ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ”）とは、「〜からなる」という語句に続くものを含み、含んだものに限定されることを意味する。したがって、「からなる」（”ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ”）という語句は、記載された要素が必須又は必須であり、他の要素が存在しないことを示す。「から本質的になる」（”ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ”）とは、句の後に記載された任意の要素を含むことを意味し、記載された要素の開示において特定された活動又は行為を妨害し又はこれに寄与しない他の要素に限定される。したがって、「から本質的になる」（”ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ”）という表現は、記載された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は選択的であり、記載された要素の活動又は行為に影響を与えるかどうかに応じて存在する場合としない場合がある。冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法上の対象が、１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）であることを指すために使用される。例として、「ａｎｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。本明細書で使用されるように、別段の記載がない限り、単数形の使用には複数形（及びその逆）も含まれる。
【００４３】
「約」とは、基準の量、水準、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さに対して、約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％程度、量、水準、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さが変化することを意味する。
【００４４】
意味が明らかに反対である場合を除き、本明細書に記載されているすべての範囲は、端点を含むと見なされる。範囲は、制限間のすべての値を完全に含むものとして解釈される。
【００４５】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本開示の実施又は試験において、本明細書に記載のものと同様又は同等の任意の方法及び材料は使用可能であるが、好ましい方法及び材料が記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本明細書に開示される外来性物質を細胞に導入するための方法の略図である。
【図２】図１に概略的に表された方法による、異なるｍＲＮＡトランスフェクション濃度を使用した、トランスフェクション後１９時間での初代Ｔ細胞ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現効率のグラフ表示である。
【図３】図１に概略的に表された方法による、異なるｍＲＮＡトランスフェクション濃度を使用した、１週間にわたるＴ細胞増殖、生存率及びＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現効率のグラフ表示である。
【図４】単一のドナーからの２つのタイプのＣＤ３＋細胞間で等しく分布しているＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現のグラフ表示である。
【図５】ＣＤ６９、ＣＤ１５４、ＣＤ４４、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２５のＴ細胞活性化プロファイルのグラフ表示である。
【図６】電気マイクロ流体渦放出（ｅμＶＳ）の概要の略図である。
【図７】本明細書に開示されるフローセルの略図である。
【図８】流体アクセスのためのスルーホールと共に相互嵌合された白金電極を含むｅμＶＳ蓋の略図である。
【図９】μＶＳのみを使用した、ヒトパンＴ細胞への５．７ｋｂプラスミド送達後のＥｍＧＦＰ（エメラルドグリーン蛍光タンパク質）プラスミド発現のグラフ表示である。
【図１０】２１時間でのμＶＳ及びｅμＶＳ処理後の静止ＰＢＭＣへのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ送達後のＥＧＦＰ発現、細胞生存率、収量及び回収のグラフ表示である。
【図１１】４２．５時間でのμＶＳ及びｅμＶＳ処理後の静止ＰＢＭＣへのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ送達後のＥＧＦＰ発現、細胞生存率、収量及び回収のグラフ表示である。
【図１２】２０時間でのｅμＶＳ処理後の静止ＰＢＭＣへのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ送達後のＥＧＦＰ発現、細胞生存率、収量及び回収のグラフ表示である。
【図１３】４３時間でのｅμＶＳ処理後の静止ＰＢＭＣへのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ送達後のＥＧＦＰ発現、細胞生存率、収量及びのグラフ表示である。
【図１４】処理後４８時間での静止ＰＢＭＣのμＶＳ及びｅμＶＳ処理サンプルの表面マーカー発現を示す代表的なヒストグラムのグラフ表示である。
【図１５】４８時間でのμＶＳ又はｅμＶＳを使用して処理された静止ＰＢＭＣにおいて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団に分割されたＣＤ３＋細胞におけるさまざまな活性化又はＴ細胞系統表面マーカーの発現プロファイルを表す。
【図１６】処理後２４時間での静止ＰＢＭＣのｅμＶＳ処理サンプルの表面マーカー発現を示す代表的なヒストグラムのグラフ表示である。
【図１７】処理後２４時間でのｅμＶＳを使用して処理された静止ＰＢＭＣにおいて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団に分割されたＣＤ３＋細胞におけるさまざまな活性化又はＴ細胞系統表面マーカーの発現プロファイルを表す。
【図１８】トランスフェクションの１９．５〜２０時間後に収集されたｅμＶＳを使用して一晩活性化されたＰＢＭＣにＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを送達した後のＥＧＦＰ発現、細胞生存率、収量、及び回収のグラフ表示である。
【図１９】トランスフェクションの４７．５時間後に収集されたｅμＶＳを使用して一晩活性化されたＰＢＭＣにＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを送達した後のＥＧＦＰ発現、細胞生存率、収量、及び回収のグラフ表示である。
【図２０】処理後２４時間での活性化ＰＢＭＣのｅμＶＳ処理サンプルの表面マーカー発現を示す代表的なヒストグラムのグラフ表示である。
【図２１】２４時間後にｅμＶＳを使用して処理された一晩活性化されたＰＢＭＣにおいて、ＣＤ４＋とＣＤ８＋の集団に分割されたＣＤ３＋細胞におけるさまざまな活性化又はＴ細胞系統表面マーカーの発現プロファイルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本明細書に記載の各実施形態は、特に明記しない限り、必要な変更を加えて、ありとあらゆる実施形態に適用される。
【００４８】
好ましい態様では、本開示は、細胞を（ｉ）非定常フローの少なくとも１つの領域、及び（ｉｉ）電場に暴露することによって外来性物質を細胞に導入するための方法及びデバイスに関する特定の理論に縛られることを望まないが、電場への細胞の曝露は、外来性物質を細胞内に促進し、駆動し、押し込み、送達し、増強し、あるいは輸送する。好適には、電場の力、特に駆動力は、細胞あるいは１つ以上の細胞内コンパートメント及び／又は細胞レベル下内コンパートメント（例えばこれらに限定されないが核又はミトコンドリアなど）への外来性物質の輸送又は転位を増強する。特定の好ましい実施形態では、電場は電気泳動場であり、より好ましくは、低強度の電気泳動場である。
【００４９】
適切には、低強度の電場は、非定常フローで流体力学的に孔を開けられた細胞への細胞外物質の取り込みを改善又は促進するのに十分であり得る。当業者は、細胞又は細胞の一部への外来性物質の細胞内送達のための電場強度が、好ましくは以下に限定されないが（１）荷電した細胞外物質の取り込みが増強又は促進されるようなものであり、（２）これが発現と共になされ、適切であれば（３）細胞状態の摂動が最小化されるものであることを理解されよう。
【００５０】
本開示の文脈において、エレクトロポレーションによる細胞などの標的実体への外来性物質の導入は、典型的には、標的実体を特定の閾値を超える電場に曝露することを含む。ほんの一例として、エレクトロポレーションの典型的な電場強度は、赤血球では約２ｋＶ／ｃｍ〜約４ｋＶ／ｃｍ、血小板では約５ｋＶ／ｃｍ〜約７ｋＶ／ｃｍ、そし細菌及び酵母については約７ｋＶ／ｃｍ〜１０ｋＶ／ｃｍである。（これらの非限定的な例はＣｒａｗｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｏｓ、Ｓｅｍｉｎ  Ｉｎｔｅｒｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ。１９９６Ｍａｒ；１（１）：９１−１０２に記載され、参照によりその全体が組み込まれる。）
【００５１】
さらに、効率的な又は改善されたエレクトロポレーションは、電場の変調、修正、調整、又はその他のチューニングを含み得る。ほんの一例として、イノシトール六リン酸（ＩＨＰ）を赤血球に導入することは、高電圧方形パルス（例えば、約２．１３ｋＶ／ｃｍ、約２ｍｓ）を使用し、続いて低電圧指数パルス（例えば、約１．５〜約１．７５ｋＶ／ｃｍ、約５ｍｓ））を使用して達成され得る。通常、これにより、通常の指数関数形パルスカプセル化と比較して、赤血球へのＩＨＰの送達が最大５０％増加する。（これらの非限定的な例は、米国特許第６，０９０，６１７号に記載されその全体が参照により組み込まれる。）指数パルスは、電気泳動送達とエレクトロポレーションの両方に使用できる。さらに、この場合、指数関数形パルスはエレクトロポレーションの閾値をはるかに下回る可能性がある。つまり、効率的な送達は、低電場強度の指数関数形パルスと細胞膜に起因する電気泳動の結果である可能性がある。
【００５２】
本開示は、広くは、非定常流体フローを介した膜孔形成が電気泳動送達に結合される、電気流体力学的孔形成及び送達のための方法及びデバイスに関する。本開示はまた、広くは、非定常フローを使用し細胞の流体力学的孔形成によって外来性物質が細胞に導入され、流体力学的に孔形成された細胞への外来性物質の細胞内送達が、電場の曝露により増強される電気流体力学的送達に関する。好適には、本開示の方法及び／又はデバイスで使用される電場は、流体力学的に孔形成された細胞への外来性物質の細胞内導入又は送達を改善するには十分であるが、細胞を不利に改変し、特に不可逆的に細胞を修正又は改変するには十分ではないよう企図される。
【００５３】
特定の実施形態では、本開示は、細胞を（ｉ）非定常フローの少なくとも１つの領域、及び（ｉｉ）電場に暴露することによって外来性物質を細胞に導入し、これによって外来性物質を細胞に導入する方法に関する。
【００５４】
他の特定の実施形態では、本開示は、細胞への外来性物質の導入を改善する方法に関し、本方法は細胞を（ｉ）非定常フローの少なくとも１つの領域と、（ｉｉ）電場と、に暴露するステップを含み、これにより、細胞への外来性物質の導入を改善する。
【００５５】
本明細書に記載される「細胞への外来性物質の導入する」の文脈において、「導入する」という用語は、外来性物質が少なくとも細胞の最も外側の障壁に、すなわち、細胞壁又は細胞膜の中に、送達される、動く、位置を変える、移動する、又は横断することを意味する。外来性物質は、細胞の最も外側の障壁を越えて移動し、細胞壁又は細胞膜を通過して、細胞の細胞質領域に入り得る。外来性物質は、細胞内の細胞小器官又は細胞成分に移動し得る。具体的には、外来性物質は、細胞の核又はミトコンドリアに移動し得る。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「外来性」という用語は、細胞が本明細書に記載される方法に暴露される前にその細胞の外部に存在する任意の物質を意味する。「外因性」という用語は、細胞の外で生産され、生成され、発達し、成長し、又は発生した物質に関連することが理解されよう。好適には、細胞を曝露するステップは、外来性物質の存在下で細胞を曝露することを含む。外来性物質は、天然に存在するものでも合成されたものでもよい。
【００５７】
本明細書で使用する場合、材料に関連する限り、「天然に存在する」（あるいは「野生型」）という用語は、天然に存在する任意の材料を意味し、生物活性物質を含み得る。天然に存在する材料は、自然的には生起しないが、自然から好適に分離される方法で改変されてもよい。
【００５８】
本開示の文脈において、「合成」という用語は、自然的には生起しないが、人間の技術的介入によって作成されることを意味する。合成タンパク質及び核酸との関連で、これには、組換え、化学合成、又はコンビナトリアル技術によって生成された分子が含まれる。合成材料は、天然に存在する材料の模倣である場合もあれば、自然界に存在する材料に類似していない場合もある。
【００５９】
外来性物質は、物質が導入される細胞において生物学的に活性であり得る。あるいは、外来性物質は、それが導入された後、細胞に対して検出可能な影響を及ぼさない場合がある。
【００６０】
好適には、外来性物質は、１つ以上の薬剤であるか、又は１つ以上の薬剤を含み得る。「薬剤」という用語は、有機分子、無機分子、ウイルスなどの生物学的粒子（これらに限定されないが）、小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質ならびにそれらを含む組成物などのタンパク質性分子、ＲＮＡ、ＤＮＡなどの核酸分子、及びその模倣物及び化学的類似体を含む。「薬剤」は、１つ又は複数の異なる薬剤又は異種の薬剤の組み合わせであってもよく、例として、これに限定されるものではないが、放射性核種で標識された抗体がある。外来性物質は、好適な担体、緩衝液又は賦形剤、又は適切な担体、緩衝液、及び賦形剤の組み合わせに加えて、１つ又は複数の薬剤を含む組成物であり得る。適切な担体、緩衝液、又は賦形剤の非限定的な例としては、水、リン酸緩衝生理食塩水、細胞増殖培地が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
特に好ましい実施形態において、外来性物質は、以下に記載のものを含む群から選択される１つ以上の薬剤であるか、又は１つ以上の薬剤を含み得る。有機小分子、核酸、プラスミド、微生物染色体、リボザイム、ＤＮＡザイム、リボソーム、ヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、ウイルス様粒子、酵素、色素体、タンパク質、複数のタンパク質（ヘテロ又はホモオリゴマー／三次構造）を含むアセンブリ、アプタマー、ダーピン（ＤＡＲＰｉｎ）、デンドリマー、線状合成ポリマー、分岐合成ポリマー、ペプチド、ペプトイド、アミノ酸、脂質、炭水化物、多糖類、荷電合成ポリマー、非荷電合成ポリマー、リポソーム、タンパク質が埋め込まれたリポソーム、単層単層ベシクル、多層単層ベシクル、ウイルス様粒子、ウイルス、量子ドット、カーボンナノチューブ、放射性核種、代謝産物、磁気ビーズ、無機ナノ粒子、有機ナノ粒子、磁気ナノ粒子、ウイルスキャプシド、金属粒子（例えば、金粒子）、単糖、サイトカイン、ケモカイン、薬物分子、薬学的に関連する分子、オルガネラ、ビタミン、ステロイド、及びそれらの任意の組み合わせ。
【００６２】
少なくとも１つの薬剤又は外来性物質は帯電していても帯電していなくてもよい。本開示の方法を使用して送達を改善するために、帯電が導入され得る。特定の好ましい実施形態において、外来性物質又は少なくとも１つの外来性物質はその電荷を増加させるために改変され得る。改変により、正味の電荷又は相対的な電荷が変更され得る。ほんの一例として、タンパク質性分子は、タンパク質性分子の正味の又は相対的な電荷を増加させるために、末端又はアミノ酸側鎖で荷電化合物に結合されてもよい。特定の実施形態では、緩衝液又は溶液のｐＨは、外来性物質の電荷を改変するように調整される。別の例では、これに限定されないが、ポリ酢酸ビニルなどのポリマーの電荷は変更されてもよい。電荷の変更は、当業者によって理解されるであろう。外来性物質は正に帯電していてもよい。あるいは、外来性物質は負に帯電していてもよい。外来性物質が正及び負の両方に帯電していることも考えられる。外来性物質は、好ましくは、デバイスへの導入前に帯電される。外来性物質の予備帯電は、例えば、負に帯電した分子、正に帯電した分子、又は電場を使用してプロトンを増強することによってのみ実行することができる。
【００６３】
外来性物質又は薬剤は、単離又は精製され得る。「単離された」とは、物質がその天然の状態で通常付随する成分を、又は物質が精製又は合成手段により生成中に存在する成分を、実質的又は本質的に含まないことを意味する。したがって、「単離された」という用語は、その範囲内に精製された又は合成された材料をも含む。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「精製された」という用語は、物質が由来する細胞又は組織源からの細胞成分又は他の汚染材料を実質的に含まない物質（例えば、核酸、ペプチド、又はポリペプチド）、あるいは物質が化学的に合成された場合、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない物質を指す。「実質的に含まない」とは、物質（例えば、核酸、ペプチド又はポリペプチド）の製剤が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、，８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％純粋であることを意味する。好ましい実施形態では、物質の製剤において、非物質的成分、又は化学的前駆物質、又は非物質的化学物質（本明細書では「汚染成分」とも呼ばれる）が、約４０％、３０％、２０％、１０％未満、より好適には５％、４％、３％、２％、１％（乾燥重量による）未満である。物質（例えば、ペプチド又はポリペプチド）が組換えにより産生される場合はまた、物質は好適には実質的に培地を含まず、すなわち、培地は、物質製剤の体積の約２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％２％、１％未満を表す。本開示は、乾燥重量で少なくとも約０．００１、０．０１、０．１、１．０、及び１０ミリグラムの単離された又は精製された製剤を含み得る。
【００６５】
特定の好ましい実施形態において、外来性物質は、核酸であるか、又は核酸を含み得る。好適には、核酸は単離された核酸である。核酸は合成であってもよい。核酸は、複数の異なる核酸から組み立てられ、形成され、又は他の方法で合成されたキメラ分子であり得る。核酸は、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）分子、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）分子、ロックド核酸、アンロックド核酸、ホスホロチオエート核酸、リボ核酸（「ＲＮＡ」）分子、及びそれらの任意の組み合わせであり得る。ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）分子、リボザイム、又は阻害性ＲＮＡ分子であり得る。阻害剤ＲＮＡ分子を企図する特定の実施形態では、阻害剤ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）又は小さい（又は短い）干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）であり得る。
【００６６】
ＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、天然に存在する染色体又はその一部、遺伝子、プラスミド、メチル化ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、又は薬剤であり得る。
【００６７】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、細胞のゲノムのあらゆる別個のコード領域、ならびに関連する非コード領域及び調節領域を指す。この用語は、特定のポリペプチド、イントロン、及び発現の調節に関与する隣接する５’及び３’非コードヌクレオチド配列をコードするオープンリーディングフレームを意味することを意図する。この点に関して、遺伝子はさらに、プロモーター、エンハンサー、終結及び／又はポリアデニル化シグナルなどの、所与の遺伝子と自然に関連する制御シグナル、又は異種制御シグナルを含み得る。ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ又はそれらのフラグメントであり得る。遺伝子は、染色体外維持又は宿主への組み込みのために適切なベクターに導入されてもよい。
【００６８】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合（又は関連する構造変異体又はその合成類似体）を介して連結された多数のヌクレオチド残基（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又は関連する構造変異体又はその合成類似体）から構成されるポリマーを指す。したがって、「オリゴヌクレオチド」という用語は通常、ヌクレオチド残基及びそれらの間の結合が天然に存在するヌクレオチドポリマーを指すが、この用語は、その範囲内に、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボ核酸、リボザイム、ロックド核酸、アンロックド核酸などを含むがこれに限定されない様々な類似体も含むと理解される。分子の正確なサイズ及び／又は鎖は、特定の用途に応じて異なる。オリゴヌクレオチドは典型的には長さがかなり短く、一般に約１０〜約３０ヌクレオチド残基であるが、、この用語は任意の長さの分子を指すことができる。とはいえ用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は典型的はに大きなオリゴヌクレオチドに使用される。
【００６９】
薬剤は、核酸分子を発現するための薬剤であり得る。これらの外来性物質は、一般に、好適には目的のタンパク質又はポリペプチドの発現のために、調節配列に作動可能に接続された核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、タンパク質を細胞表面又は細胞外環境に輸送するための配列をさらに含む。核剤は、ウイルス又は非ウイルスベクターなどのベクター、発現ベクター、及び一連の細胞における発現及び分泌のためのプラスミドを含む。
【００７０】
特定の実施形態では、薬剤はベクターであり、より好ましくは発現ベクターである。発現ベクターは、プラスミドなどの自己複製染色体外ベクター、又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、細胞内での核酸の送達又は発現を補助するためのビヒクルとして使用される任意の分子を指す。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はタンパク質を発現する。「ベクター」とは、ポリヌクレオチド分子、好適には、プラスミド由来（例示であるが）のＤＮＡ分子、バクテリオファージ、原核生物、真菌、ウイルス、酵母又は植物、脊椎動物又は無脊椎動物を含む高等真核生物を意味し、ベクターにはポリヌクレオチドを挿入又はクローニングすることができる。ベクターは、好ましくは１つ又は複数の固有の制限部位を含み、標的細胞又は組織又はその前駆細胞又は組織を含む定義された宿主細胞において自律複製することができ、又はクローン化さたシーケンスが再現可能であるように定義された宿主のゲノムと統合され得る。したがって、ベクターは自律複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在するベクターであり得、その複製は線状又は閉環状プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体などの染色体複製から独立している。ベクターには、自己複製を保証するための任意の手段を含めることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。ベクターシステムは、単一のベクター又はプラスミド、２つ以上のベクター又はプラスミドを含み得、これらは一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡ、又はトランスポゾンを含む。ベクターの選択は、通常は、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依拠するであろう。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルス又はウイルス由来のベクターであり、これらは脊椎動物又は無脊椎動物において、そして好適には哺乳動物細胞において作動的に機能する。このようなベクターは、ポックスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス又は酵母に由来し得る。ベクターは、適切な形質転換体の選択に使用できる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含むこともできる。そのような耐性遺伝子の例は当業者に知られており、抗生物質カナマイシン及びＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））に対する耐性を与えるｎｐｔｌｌ遺伝子、及び抗生物質ハイグロマイシンＢに対する耐性を与えるｈｐｈ遺伝子を含む。
【００７１】
特定の好適な実施形態において、本開示は、好ましくは、本開示の方法及びシステムを使用してＴ細胞に導入又は送達され得る、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする薬剤を企図する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外認識ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの融合である。
【００７２】
本開示は、ゲノム編集用途のための外来性物質の導入を企図する。これらの実施形態によれば、本開示の方法及びデバイスは、１つ以上のヌクレアーゼ、特に、操作されたヌクレアーゼを導入する。好適なヌクレアーゼの非限定的な例には、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムが含まれる。
【００７３】
本開示の他の実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである。ベクターはまた、人工染色体であり、好ましくは、細菌人工染色体又は酵母人工染色体であってもよい。あるいは、ベクターは原核生物の染色体であってもよく、好ましくは天然に存在する原核生物の染色体であってもよい。天然に存在する原核生物の染色体は、単離された天然に存在する原核生物の染色体であってもよい。
【００７４】
「ポリペプチド」、「タンパク性分子」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーならびにその変異体及び合成類似体を指す。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成非天然アミノ酸（例えば対応する天然アミノ酸の化学的類似体）であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。これらの用語は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの修飾を除外しない。対象とするタンパク質性分子の可溶型が特に有用である。定義内に含まれるのは、例えば、非天然アミノ酸又は置換結合を有するポリペプチドを含む、アミノ酸の１つ以上の類似体を含むポリペプチドである。異なる起源に由来する複数のアミノ酸配列を含むキメラ分子も含まれる。
【００７５】
本開示は、電場の少なくとも一部が、電気泳動によって外来性物質を細胞内に送達するように構成されている実施形態を含む。当業者によって理解されるように、電気泳動は、電場における分子、特に荷電分子の運動又は動きである。
【００７６】
好適には、電場の少なくとも一部、好ましくは電場が電気泳動場である電場の少なくとも一部が、外来性物質を細胞内に駆動するのに十分な強度を有する。好ましくは、外来性物質は、実質的に細胞の摂動を介して、より好ましくは、非定常フローの少なくとも１つの領域によって引き起こされる細胞の摂動を介して駆動される。さらにより好ましくは、摂動は、非定常フローの少なくとも１つの領域によって及び圧力の一時的な低下によって、引き起こされる。特定の理論に縛られるつもりはないが、細胞を流体力、特に非定常フローにさらすことにより、細胞は外因性物質の取り込みが可能となり、それは、おそらく、細胞の外部障壁での細孔の形成又は摂動によるものと思われる。好ましくは、これは細胞を溶解することなく行われる。流体力、特に非定常フローは、圧力の一時的な低下を生じさせるか、引き起こすか、そうでなければ生成する可能性がある。圧力の一時的な低下は、細胞を溶解することなく細胞膜の透過性を促進する可能性がある。細胞膜全体の比較的に突然の一時的な圧力低下によって、細胞内の圧力が細胞外の圧力よりも高くなり、膜に一時的に細孔が形成され得る。特定の好ましい実施形態において、細胞透過性は、細胞を変形させる圧縮により細胞を通過させ、孔又は摂動（いわゆる「細胞圧搾」）を引き起こすやりかたで生じさせるものではない。
【００７７】
本開示は、特定の好ましい実施形態において、電場が交流（「ＡＣ」）を使用して生成されることを企図する。代替的な実施形態では、電場は、直流（「ＤＣ」）を使用して生成される。ＡＣは、均一に振動する場合があり、又は電場の力に対して正味の直接性があるような振動を有する場合がある。非対称振動は、交流を印加して非ゼロのバイアスを有することによって達成することができるが、これに限定されない。他の特定の実施形態では、電場は、ＡＣ及びＤＣの組み合わせによって生成されてもよい。ＡＣ及びＤＣの組み合わせを企図するこれらの実施形態では、電場は、ＤＣ電流の有無にかかわらず、増分ＤＣオフセットでのＡＣ電流によって生成され得る。
【００７８】
本開示は、細胞が電場に暴露されると、同時に非定常フローの少なくとも１つの領域に暴露されるという実施形態を企図する。代替的な実施形態においては、これらのステップ又は処理は、順次的に、又は段階的に起こり得る。順次的又は段階的な曝露又は処理を企図する代替的実施形態によれば、細胞は、電場への曝露の前に非定常フローの少なくとも１つの領域に曝露され得る。あるいは、細胞は、非定常フローの少なくとも１つの領域に暴露される前に電場に暴露されてもよい。
【００７９】
本開示では、非定常フローの少なくとも１つの領域にさらされた細胞を、電場に暴露することを含む方法を対象とする実施形態を含むことが企図される。
【００８０】
本開示は、電場への曝露が、同じ又は別のコンパートメント、フローセル、又はデバイス内で起こり、細胞を非定常フロー、好ましくは非定常フロー及び一時的な圧力低下にさらすことを、さらに企図する。
【００８１】
特定の好ましい実施形態では、細胞は、細胞がチャネル又はデバイスを通過するときに電場に曝露される。細胞及び外来性物質は、電場への曝露の前に接触又は混合され得る。あるいは、細胞は、電場への曝露の時点で外来性物質と接触し得る。代替的な実施形態では、細胞及び／又は外来性物質が流れていない（すなわち、静止しているか、又は一時的に静止している）ときに、電場への曝露が生じ得ることも企図される。
【００８２】
本開示の特定の実施形態では、細胞は、原核細胞、真核細胞、真菌細胞、配偶子細胞（例えば、精子細胞又は卵子細胞）、接合体、原生生物細胞、古細菌、植物細胞又は昆虫細胞である。真核細胞は、哺乳動物細胞又は酵母細胞であり得る。本開示はまた、前駆細胞、特に幹細胞、より好ましくは造血幹細胞又は間葉系幹細胞を企図していることが理解されよう。細胞は、免疫原性細胞であり、例えばこれらに限定されないがＴ細胞又はＢ細胞などである。細胞は培養中であるか、組織サンプルから抽出されているか、及び／又は不死化されている。植物細胞を企図するこれらの実施形態では、本開示の方法による処理の前に、細胞壁を完全又は部分的に除去してプロトプラストを形成することができることが理解されよう。細胞は、初代培養由来であっても、連続（二次）培養由来であってもよい。細胞は、任意の組織型に由来し得る。細胞は、最終分化していても、していなくてもよい。好適には、細胞は単離された細胞であってよい。
【００８３】
細胞は宿主細胞であり得ることが企図されてる。「宿主細胞」という用語は、本発明の任意の組換えベクター又は単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るか、又はレシピエントであった個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞には単一の宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、自然の、偶発的、又は意図的な突然変異や変化により、元の親細胞と（形態又は全体のＤＮＡ補体において）必ずしも完全に同一ではない。宿主細胞は、本発明の組換えベクター又はポリヌクレオチドで、インビボ又はインビトロでトランスフェクションを起こさせられたかあるいは感染された細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞である。
【００８４】
当業者によって理解されるように、好ましい開始細胞密度は、細胞型及び／又は外来性物質に依存し得る。本開示の好ましい実施形態、及び哺乳動物細胞に関する特定の好ましい実施形態において、開始細胞密度は、約１００００細胞／ｍＬ〜約１億細胞／ｍＬ、及びその間のすべての整数値である。
【００８５】
本明細書に記載される方法は、細胞への外来性物質の導入を改善し得る。「改善する」、「改善する」、又は「改善」（”ｉｍｐｒｏｖｅ”又は”ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ”又は”ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ”）とは、１つ又は複数のパラメータ又は測定の増強、豊富化、増加、又はその他の増大を意味する。これは、外来物質を細胞に導入するための１つ又は複数の他の物理的、化学的又は生物学的方法を使用する方法と比較され得る。特定の好ましい実施形態では、本開示の方法の改善は、細胞を非定常フローの少なくとも１つの領域に曝露することによって、この場合選択的には圧力の一時的な低下を伴って、外来性物質を細胞に導入する方法と比較され得る。例として、改善というのは、コントロール又は比較法（例えば、標準的なエレクトロポレーション条件、リポソーム媒介トランスフェクション、又は非定常フローのみの少なくとも１つの領域に細胞をさらす方法）によって処理される対応する細胞の母集団と比較して、実質的に又は約１〜約８０％、約１〜約５０％、約１〜約１０％、又は約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％又は約８０％又はそれ以上の少なくとも１つの、パラメータ又は測定の増加であり得る。１つ以上のパラメータ又は測定は、定性的又は定量的であり得る。本開示は、外来性物質を有する、又は含む細胞の数によって測定される効率の増加を企図する。あるいは、細胞に導入された分子の数が測定されてもよい。細胞の生存又は生存率は、本明細書に記載されている方法を使用することにより改善され得る。細胞又は細胞集団に導入される細孔の速度又は数は、本開示の方法によって改善され得る。本開示は、改善が異なるパラメータ又は測定の組み合わせによって測定され得ることを企図していることが理解されよう。改善は、当業者に知られているような、任意の適切な技術又はアッセイによって測定され得る。例として、緑色蛍光タンパク質（これに限定されないが）などのマーカーを使用して、改善を測定又は定量化することができる。あるいは、内因性細胞マーカーを使用して、これに限定されないが１つ以上のＣＤ（分化のクラスター）タンパク質などで効率をモニターすることができる。
【００８６】
本開示は、電場の強度が変化し得ることを企図する。例として、電場の強さは、異なる細胞型及び細胞への導入のための外来性物質によって異なり得る。特定の好ましい実施形態において、曝露時間は、約１マイクロ秒〜約１秒、及びそれらの間のすべての整数値である。
【００８７】
好適には、電場によって生成される強度は、外来性物質を細胞に導入するのに十分である。電圧は、電場の強度又はパルス強度が約０．００１ボルト／センチメートルから約１００キロボルト／センチメートル（「ｋＶ／ｃｍ」）の範囲になるように印加することができる。電場の強度又はパルス強度は、約０．０１ｋＶ／ｃｍ〜約１ｋＶ／ｃｍ、約０．０５ｋＶ／ｃｍ〜約０．５ｋＶ／ｃｍ、約０．１ｋＶ／ｃｍ〜約０．３ｋＶ／ｃｍ、及びそれらの間のすべての整数値の範囲であり得る。
【００８８】
任意の１つの細胞型が電場に曝露され得る時間は、有能な当業者により決定可能である。暴露が長すぎると非効率になる可能性があるが、暴露が短かすぎると、外来性物質を細胞に導入できない場合がある。最適な曝露時間は、本出願の例を参照することにより、特定の細胞について決定することができる。
【００８９】
好ましくは、細胞は、外来性物質の存在下で、少なくとも約１ナノ秒、少なくとも約１０ナノ秒、少なくとも約１００ナノ秒、少なくとも約１マイクロ秒又は少なくとも約１ミリ秒の間、圧力の一時的な低下に暴露される。本開示の特定の実施形態において、細胞は、少なくとも約１５ナノ秒、少なくとも約２０ナノ秒、少なくとも約２５ナノ秒、少なくとも約３０ナノ秒、少なくとも約３５ナノ秒の間、圧力の一時的な低下に曝される。少なくとも約４０ナノ秒、少なくとも約４５ナノ秒、少なくとも約５０ナノ秒、少なくとも約６０ナノ秒、少なくとも約７０ナノ秒、少なくとも約８０ナノ秒、少なくとも約９０ナノ秒、少なくとも約１００ナノ秒、少なくとも約１５０ナノ秒、少なくとも約２００ナノ秒、少なくとも約２５０ナノ秒、少なくとも約３００ナノ秒、少なくとも約３５０ナノ秒、少なくとも約４００ナノ秒、少なくとも約４５０ナノ秒、少なくとも約５００ナノ秒、少なくとも約５５０ナノ秒、少なくとも約６００ナノ秒、少なくとも約６５０ナノ秒、少なくとも約７００ナノ秒、少なくとも約７５０ナノ秒、少なくとも約８００ナノ秒、少なくとも約８５０ナノ秒、少なくとも約９００ナノ秒、少なくとも約９５０ナノ秒、少なくとも約１マイクロ秒、少なくとも約１０マイクロ秒、少なくとも約５０マイクロ秒、少なくとも約１００マイクロ秒、少なくとも約２００マイクロ秒、少なくとも約３００マイクロ秒、少なくとも約４００マイクロ秒、少なくとも約５００マイクロ秒、少なくとも約６００マイクロ秒、少なくとも約７００マイクロ秒、少なくとも約８００マイクロ秒、又は少なくとも約９００マイクロ秒、又はそれ以上の間、圧力の一時的な低下に暴露される。
【００９０】
特定の実施形態では、電場の強度又はパルス強度は、細胞をエレクトロポレーションするために必要とされるよりも小さい。理解されるように、エレクトロポレーションは、細胞膜を破壊して細胞膜透過性を一時的に増加させるのに十分な強度を必要とする（例えば、閾値膜貫通電圧を超えることにより）。例として、電場の強度又はパルス強度は、細胞に悪影響を与える、又は著しく摂動させるのに必要な強度よりも、約５０％、約１％〜約５０％、約５０％〜約９９％、又は約１％〜約９９％低くてもよい。
【００９１】
特定の好ましい実施形態では、本明細書で使用される電場は、従来のエレクトロポレーション技術の強度以下であり得る。他の好ましい実施形態では、電場は電気泳動場である。電気泳動場の文脈では、電場が帯電した外来性物質に作用し、これにより帯電した外来性物質を移動させることを意味する。好適には、電場は、帯電した外来性物質に作用する電気泳動場の強さであり、これにより帯電した外来性物質を移動させる。好ましくは、電気泳動場の強度は、電気穿孔場の強度よりも低いか、又は細胞状態を著しく摂動させるのに必要な強度よりも低い。好ましくは、電気泳動場の強度は、電気泳動範囲がエレクトロポレーションよりも少なく細胞を摂動させるか、又はカップリングなしでエレクトロポレーションと比較して薬剤の送達の増強をもたらす細胞型に基づいて最適化される。
【００９２】
好適には、電場は、１つ以上の電極によって生成される。好適には、少なくとも１つの電極は、導電性媒体を含む。少なくとも１つの電極は、金属材料、又は導電性ポリマー、又はそれらの組み合わせから形成され得る。本開示は、少なくとも１つの電極が、同じ又は異なる材料から形成され得ることを企図する。金属材料は、アルミニウム、金、白金、又は任意の他の適切な金属であってよい。特に、動作中に著しく劣化しない金属が好ましいと言える。好ましくは、電極の表面層として使用される金属は白金である。他の金属又は材料が表面金属と基板の間の接着層として他の金属又は材料が有益であり、その例はこれらに限られないがチタン、クロム、銅、銀、ニッケル、金及びインジウムなどである。複数の金属の組み合わせも考えられる。接着促進層はまた、窒化ケイ素などの複合材料、又はこれらに限定されないが、グラフェン、四面体アモルファスカーボン、アモルファスシリコン、又は他の複合材料などの元素構造であってもよい。適切な導電性ポリマーの非限定的な例として、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）、ナフタレンテトラカルボン酸二無水物などのポリナフタレン、ポリアニリン、又は硫化物を含む誘導体を含むポリフェニレンが挙げられる。導電性ポリマーの非限定的な例は、次の文献、Ｂａｌｉｎｔｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，  ２０１４．１０（６）、２３４１−２３５３に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
本開示は、任意の適切な電極のパターン又は構成を企図する。特定の実施形態では、電極パターンは、第１の電極配列及び第２の電極配列に構成される複数の電極対であり得る。したがって、第１の電極の配列は、第２の電極の配列からずれていてもよい。本開示はまた、相互嵌合された（又は櫛のような）パターンに構成された電極パターンを企図する。
【００９４】
当業者によって理解されるように、このパターン化は、任意の好適な手段によって達成され得る。好適な実施形態では、電極は、（１）ＤＲＩＥ石英基板への１００ｎｍアモルファスシリコン堆積（２）スパッタコーティングによる１００ｎｍ白金電極の堆積とレーザー加工された入口／出口基板へのリフトオフ又は電子ビーム蒸着、及び（３）蓋とフローセル基板の陽極接合によって、石英基板上に又は中に統合されてもよい。堆積の他の手段には、化学蒸着及びプラズマ増強化学蒸着などの蒸着法が含まれる。電極をパターン化する他の手段には、化学エッチング、レーザーアブレーション、反応性イオンエッチング、及び集束イオンビームパターン化が含まれる。電極パターンはまた、所望のパターンで又はその逆で基板を前処理することによって達成することができ、その場合、導電性材料の選択的親和性が堆積中に所望のパターンを生成するのに十分であるようにする。
【００９５】
好適には、少なくとも１つの電極は、電極間に均一な電場が生成されるように配置される。１つの好ましい実施形態では、電極間隔とフローセル高さとの間の比率が、均一な電場を生成する。有利には比率は、約０．５と約５との間であり、より好ましくは約３であり、より好ましくは約３．１である。好ましい実施形態では、相互嵌合された白金電極は、約２５μｍの幅（フロー方向）及び約１５０μｍのピッチでマイクロ流体フローセル（フローに垂直）に広がり、約１２５μｍの電極間間隔をもたらすことができる。一部の状況では均一性が低下してフロープロファイルの改善などの利点が得られる場合があることを考慮して、約０．０１から約１００までの比率など、より広い範囲の比率を使用することもできる。より詳細には、当業者は、電場均一性と細胞曝露時間及びフロープロファイルとのバランスをとるフローセル高さに対する電極間隔の最適な比を決定し、送達効率、細胞生存率及び細胞回収率を最大化できる。
【００９６】
電極は、デバイスの一部として形成されてもよく、例えば、基板内、フローチャネルの床部分及び／又は天井部分に、又はフローチャネルを囲むように形成され得る。電極は、平行なフローチャネルを分離する側壁内に存在し得る。あるいは、電極は、システムの別個の構成要素であり得、そして所望に応じて、フローチャネルの長さに沿って可変的に配置され得る。第２の電極がある場合、電極は、直列及び／又は並列の関係で配置されてもよい。電極は、好ましくは、分流器の下流の非定常フローのゾーンと重なる電場を放出するように構成される。
【００９７】
電圧発生器、ＤＣ発生器、又はＡＣ発生器などの電源は、電極を付勢するように構成され得る。電源は、オフセット電流を調整するための手段で構成され得る。そのような手段は、ユーザーインターフェースを含み得る。
【００９８】
好ましくは、細胞は、非定常フローの少なくとも１つの領域に、又は代替的には非定常フローの複数の領域に、曝露され、又はさらされる。非定常フローの領域の数は、特定のニーズに適合するように当業者が適切に決定することができ、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の数とすることができる。細胞は、チャネル通過中の動きによって、非定常フローの複数の領域にさらされ得る。非定常フローの局所領域などの非定常フローの領域は、任意の適切な幅を有することができる。例として、適切な幅は、約２０μｍであり得る。
【００９９】
本開示は、非定常フローの少なくとも１つの領域にさらされた細胞が圧力の一時的な変化、好ましくは圧力の一時的な減少にさらされる実施形態を企図する。特定の理論に縛られることを望まないが、分流器の実質的にすぐ下流に非定常フローの局所領域が存在する本開示の実施形態では、細胞は、以下のように２倍の圧力変化にさらされ得る。（１）非定常フローによって引き起こされる圧力の局所的な増加、及び（２）圧力の一時的な低下に続く圧力の増加。これは、細胞外圧が細胞内圧よりも高い透過性細胞膜全体に圧力差を生じさせる可能性があり、これにより細胞膜近くの外来性物質の能動的送達が促進され、及び／又は外来性物質は、例えば局所細胞外環境からサイトゾルへの拡散又はフローによって、細胞に導入され得る。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「圧力の低下」という用語は、その用語が細胞がそのような圧力低下にさらされることに関連する限り、細胞がさらされる圧力ゾーンが、そのゾーンのすぐ周囲の圧力よりも比較して低いことを意味する。ゾーン内の圧力は均一であっても、変動する圧力の局部的な領域があってもかまわない。ただしこれは、これらの局部的な領域が、ゾーンの周囲の圧力に比べてなお低い圧力を保っている場合に限られる。ゾーン内の圧力は均一であっても、変動する圧力の局部的な領域があってもかまわない。ただしこれは、これらの局部的な領域が、ゾーンの周囲の圧力に比べてなお低い圧力を保っている場合に限られる。「圧力」とは、当技術分野で知られているように、物質がその周囲に及ぼす単位面積あたりの力を意味する。圧力のＳＩ単位はパスカル（Ｐａ）である。圧力の測定に一般的に使用されるその他の単位には、キロパスカル（ｋＰａ）、ポンド力／平方インチ（ＰＳＩ）、水銀柱ミリメートル（ｍｍＨｇ）、ミリバール（ｍｂａｒ）、及び大気（ａｔｍ）の空気圧が含まれます。特に真空に関連する圧力は、トル（Ｔｏｒｒ）で測定できる。本出願では、用語「ｋＰａ」が使用される場合、それはゲージ圧を指し、０ｋＰａのゲージ圧が１０１．３２５ｋＰａの絶対圧を指す絶対圧力ではない。
【０１０１】
圧力の一時的な減少は、周囲のゾーンの圧力とそれより低い圧力のゾーンとの間の圧力差の文脈で定義されてもよい。圧力の一時的な低下は、より低い圧力のゾーンの最小圧力とその周囲のゾーンの最大圧力の文脈で定義することもできる。例えば、低圧ゾーンの最小圧力が約−１０ｋＰａで、その周囲のゾーンの最大圧力が約１００ｋＰａの場合、圧力差は約１１０ｋＰａになる。別の例では、低圧のゾーンの最小圧力が約２０ｋＰａで、その周囲のゾーンの最大圧力が約５００ｋＰａの場合、圧力差は約４８０ｋＰａになります。さらなる例では、より低い圧力のゾーンとその周囲のゾーンとの間の圧力差は、約２００ｋＰａである場合、これは、より低い圧力のゾーンにおける最小圧力が約−１００ｋＰａから約１０００ｋＰａの範囲にあり、周囲ゾーンの最大圧力が、約１００ｋＰａから約１２００ｋＰａの範囲にある結果であり得る。さらに別の例では、より低い圧力のゾーンと周囲のゾーンとの間の圧力差は、約５０ｋＰａであり得、これは、より低い圧力のゾーンにおける最小圧力が約０ｋＰａから約１５０ｋＰの範囲にあり、その周囲ゾーンの最大圧力が約５０ｋＰａから約２００ｋＰａの範囲にある結果であり得る。
【０１０２】
いずれか１つの細胞型に加えることができる最大及び最小圧力は、有能な当業者には明らかであろう。圧力が低すぎるとメソッドの効率が低下する可能性があり、圧力が高すぎると細胞が破裂する可能性がある。最適な圧力差は、本出願の実施例を参照することによって、及び日常的な実験を通じて、特定のセルについて特定され得る。
【０１０３】
好ましくは、外因性物質の存在下で細胞が曝露される圧力の一時的な低下は、少なくとも約１０ｋＰａ、少なくとも約１００ｋＰａ、少なくとも約５００ｋＰａ又は少なくとも約１０００ｋＰａの低下である。。特定の実施形態では、圧力の一時的な減少（以下単位はｋＰａ）は、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくと約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約８５０、少なくとも約９００、少なくとも約９５０又は少なくとも約１０００、又はそれ以上の圧力（ｋＰａ）の減少である。
【０１０４】
圧力の減少の文脈における用語「一時的」は、圧力の減少が一時的に生じることを意味し、ここで細胞が減少した圧力に曝露された後、そのあとに細胞が曝露される圧力はより高いものとなる。本開示のいくつかの実施形態では、圧力の一時的な減少は、細胞が少なくとも約１０ナノ秒の間、しかし約１ミリ秒以下の間で、特定の曝露中に到達した最小圧力を意味する。この時間は、セルが周囲のゾーンの最大圧力に曝露されるときから、セルがその周囲のゾーンの圧力に比較してより低い圧力のゾーンの最小圧力に曝露される瞬間までの時間を含まないことが理解されよう。この時間はまた、セルがより低い圧力のゾーンで最小圧力に曝露されるときから、セルが周囲のゾーンで最大圧力に曝露される瞬間までの時間を含まない。
【０１０５】
本開示の好ましい実施形態では、非定常フローの少なくとも１つの領域にさらされる細胞は、チャネル、好ましくは閉鎖チャネル内の電場に曝され、この場合チャネルはその寸法を、外来性物質とそのチャネルを通る細胞を含む液体が、流れることができるように構成される。本開示の文脈において、「チャネル」とは、長さ及び２つ以上の端部を有し、液体のフローを可能にする構成要素の長さにわたって延びる中空空間と、２つ以上の端部における貫通開口部を有する、任意の構成要素を意味する。チャネルの寸法は、液体中を、関連のある細胞型のフローが可能になるように構成されていればよい。チャネルの断面は任意の形状を有することができる。チャネルは、少なくともいくつかの囲まれたセクションを含むことが好ましいが、必要な圧力変化が起こり得るチャネル内の領域がある限り、その長さ全体に沿って必ずしも密閉されているわけではない。液体のフローは本質的にチャネルの一端から他端へのフローであり、フローの方向が「上流」と「下流」の方向を決定することが理解されよう。
【０１０６】
チャネルを通るフローは、これらに限定されないが、静水圧、流体力学的圧力及び／又は電気浸透流などの様々な手段によって引き起こされ得る。液体のフローは、これらに限定されないが、圧力ポンプ、ガスシリンダー、コンプレッサーポンプ、真空ポンプ、シリンジ、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、ピストン、毛細血管ポンプ、心臓、筋肉又は重力などの圧力源によって駆動されてもよい。
【０１０７】
チャネルを通る液体のフローは速度を有し、この速度は、これらに限定されないが、チャネルの構成、圧力源の強度及び性質、圧力の粘度液体、細胞型及び液体中の細胞密度及び／又は外来性物質の性質及び量などの要因によって影響を受ける可能性がある。液体のフローは、好ましくは、液体中の細胞速度であり得る。特定の好ましい実施形態では、液体中の細胞速度は、毎秒約１５メートルであると推定される。
【０１０８】
本開示の好ましい実施形態では、液体がチャネルを通って流れるときに液体の速度が変動し、変動する速度は、液体がチャネルを通って流れるときの液体の最大速度及び最小速度に関して定義することができる。液体がチャネルを流れるときに、液体の速度は特定の最大速度と最小速度の間で変動し得る。好ましくは、チャネルを通って流れる液体の変動速度は、毎秒約１メートル、より好ましくは毎秒約５メートルの最小ピーク速度を有する。本開示の他の好ましい実施形態では、チャネルを通って流れる液体の変動速度は、毎秒約１０メートルの最大速度、毎秒約２０メートルの最大速度、毎秒約３０メートルの最大速度、毎秒約４０メートルの最大速度、毎秒約５０メートルの最大速度、毎秒約６０メートルの最大速度、毎秒約７０メートルの最大速度、毎秒約８０メートルの最大速度、毎秒約９０メートルの最大速度、又は毎秒約１００メートルの最大速度を有する。したがって、チャネルを流れる液体のピーク速度は、毎秒約１メートルから毎秒約１００メートルの範囲で変動し得ることがあることが理解されよう。
【０１０９】
本開示はまた、液体中の外来性物質を細胞内に導入するためのデバイスに関し、本デバイスは細胞及び液体中に懸濁された外来性物質のフローを通過させるように構成されたチャネルを含む。ここで１つ以上のフローはチャネル内で分流し、分流器は、分流器のすぐ下流で少なくとも１つの減圧領域をもたらす。本開示の特定の実施形態では、デバイスは、マイクロ流体デバイスである。特定の好ましい実施形態において、デバイスは、図７及び／又は図８に実質的に示されるデバイスであり得る。
【０１１０】
非定常フローの少なくとも１つの領域に曝された細胞は、非定常フローに加えて流体力にも曝され得ることが理解されよう。当業者は、非定常フローが層流渦列、遷移渦列、乱流渦列、遷移流又は乱流を指すことを理解するであろう。細胞は、ほふく流や層流などの定常流にさらされることがある。当業者は、ほふく流が、液体の慣性力が液体の粘性力よりも著しく低い液体のフローを意味することを理解されるであろう。当業者は、ほふく流が、液体の慣性力が液体の粘性力よりも著しく低い液体のフローを意味することを理解されるであろう。細胞は、チャネルに入るとき、チャネルから出るとき、又はその両方において、定常フローにさらされる可能性がある。本開示の特定の実施形態では、チャネルは、液体のフローが層流であるチャネル内に１つ以上の領域があり、液体のフローがほふく状態であるチャネル内に１つ以上の領域があり、そして液体のフローが非定常であるチャネル内に１つ以上の領域があるように、液体のフローに影響を与えるよう構成される。
【０１１１】
理解されるように、フローのタイプは、２つの異なるレイノルズ数を計算することによって推定することができる：１つは閉鎖チャネル（Ｒｅｃ）及び／又は分流器間の領域を通る特定のフローについて、そして１つは物体の周りのフローについて（Ｒｅｏ）。例えば、ほふく流の場合、Ｒｅｃは１よりもかなり小さく（Ｒｅｃ＜＜１）、層流の場合、Ｒｅｃは１から約２，３００の間（１＜Ｒｅｃ＜２３００）である。遷移流はＲｅｃ＞２３００で開始する。例えば、物体の周りの非定常フローの場合、Ｒｅｏは約４０より大きい（Ｒｅｏ＞４０）か、又は非定常フローを引き起こすのに十分である。Ｒｅｃは、平均液体速度（ν）と水力直径（Ｄｈ）の、液体の動粘度（ｖ）に対する比率として定義でき、この方程式はＲｅｃ＝νＤｈ／ｖとして定義される。幅が高さよりも大幅に大きい広いチャネル（又はその逆）の場合、Ｄｈを短い距離の２倍の長さに置き換えることがでる。ポスト間のフローのチャネルレイノルズ数（Ｒｅｃ）を計算する場合、この方程式が使用され、チャネルの水力直径（Ｄｈ）はポスト間のチャネルの水力直径を指し、平均液体速度（Ｄ）はポスト間の平均速度を指す。
【０１１２】
本開示の好ましい実施形態では、液体のフローは、チャネル内の１つ以上の分流器によって影響を受ける。少なくとも１つの分流器を通過する外来性物質のフローが渦又は非定常フローを生成することが理解されるであろう。特定の実施形態では、分流器は、チャネル内に配置された障害物である。「障害物」という用語は、液体のフローが物体の周りに方向転換される結果を生じる、チャネル内に配置された物体に関係し、実質的に障害物のすぐ下流に、圧力の減少した局所化領域、又は非定常フローと結合した圧力の減少を生じさせる。障害物は、細胞がその障害物を越えてチャネルを通過できるようなものでなければならない。好ましい実施形態では、障害物は、チャネルの長さにほぼ垂直な方向にチャネルの内面から外向きに延びることができる。障害物は、チャネルの長さの一方の側からもう一方の側に伸びることがある。あるいは、障害物は、チャネルの長さの片側から部分的にのみ延びることができる。特定の実施形態では、障害物はポストである。本開示の文脈において、「ポスト」である障害物は、その最大幅以上の高さを有するプリズムである障害物であり得る。ポストは、円筒形、三角形、正方形、多角形、翼形、又はその他の形状で、特定の形状を選択して、所与のチャネルのレイノルズ数（Ｒｅｃ）のために圧力の一時的な低下及び／又は所与の物体のレイノルズ数（Ｒｅｏ）のために非定常フローを調整できる。特に好ましい実施形態では、ポストは円筒形である。
【０１１３】
適切なチャネル構成の非限定的な例は、図１、図７及び実施例１で示される。５ｍｍｘ１０ｍｍｘ１０．４ｍｍ好ましいチャネル又はデバイス構成には、単一の入口及び単一の出口を有する、７．５ｍｍｘ１．５ｍｍｘ０．０４ｍｍの深さの、反応性イオンによりエッチングされたマイクロ流体フローセルを含む、約５ｍｍｘ１０ｍｍｘ１．４ｍｍ（長さｘ幅ｘ高さ又は厚さ）のチップが含まれる。入口と出口は、レーザー加工がなされ約７００μｍの内径を有する。好ましい実施形態では、フローセルは、５行（フロー方向）及び２５列（フロー垂直）のポストを有するポスト配列を含み、ここで、ポストは、２０μｍの直径、及びフローセル深度に等しい４０μｍの高さを有する。ポストの行は５００μｍ（フロー方向）ピッチを有し、ポストの列は６０μｍ（フロー垂直）ピッチを有する。
【０１１４】
チャネルを通りかつ分流器の直接上流のフローの平均速度は、圧力の一時的な減少が分流器のすぐ下流で誘導されるか、又は圧力の一時的な減少と非定常フローの局所領域が分流器のすぐ下流で誘導される場合のものである。分流器がポストである本開示の実施形態では、適切な誘導を起こす平均上流速度は、ポストの周りの液体のフローのためのレイノルズ数（Ｒｅｏ）を使用して計算することができる。円筒形ポストの周りの液体のフローの場合、ポストの下流で非定常フローを誘導するには、少なくとも４０のＲｅｏ（Ｒｅｏ≧４０）が必要となる可能性がある。他のポスト形状の場合、非定常フローを生成するために必要なＲｅｏはポストの特定の形状に依存する可能性があり、平均上流液体速度を調整して、（１）十分な大きさの圧力の一時的な低下、又は（２）非定常フローと十分な大きさの圧力の一時的な低下を作り出す必要がある。Ｒｅｏは、平均上流速度（ν）とポストの特徴的な長さ（Ｉ）との流体の動粘度（ｖ）に対する比として定義される。Ｒｅｏ＝νＩ／ｖ。
【０１１５】
特定の好ましい実施形態では、液体のフローが非定常であるチャネル内の少なくとも１つの領域における液体のフローの物体のレイノルズ数（Ｒｅｏ）は、少なくとも約４０であるが、層流渦放出を形成する約１５０以下である。あるいは、物体のレイノルズ数は、少なくとも約１５０であってもよいが、過渡的な渦放出では約３００以下である。物体のレイノルズ数は、乱流渦放出の場合は少なくとも約３００から約３００，０００以下、又は乱流境界層のある乱流渦放出の場合は少なくとも約３００，０００から約３，５００，０００以下、又は再構築された乱流渦放出の場合は少なくとも約３，５００，０００である。
【０１１６】
特定の理論に束縛されることを望まないが、本開示の実施形態では、分流器の実質的にすぐ下流に非定常フローの局所領域があり得、細胞は、次のように２方向の圧力増加に曝露され得る。（１）非定常フローによって引き起こされる圧力の局所的な増加、及び（２）圧力の一時的な低下に続く圧力の増加。これは、細胞外圧が細胞内圧よりも高い透過性細胞膜全体に圧力低下を生じさせる可能性があり、これにより細胞膜近くの外来性物質の能動的送達が促進され、及び／又は外来性物質は、例えば局所細胞外環境からサイトゾルへの拡散又はフローによって、細胞に導入され得る。
【０１１７】
他の好ましい実施形態では、非定常フローが、流体慣性によって生成又は誘導される。これらの実施形態によれば、チャネルは、流体慣性によって乱流を誘発するように構成されてもよい。この実施形態では、チャネルのレイノルズ数は、遷移流の場合は約２，０００より大きく、乱流の場合は約４，０００より大きい。代替的な好ましい実施形態では、表面の粗さ、形状の変化、又は物理的な「トリップ」を使用して、囲まれたチャネル内に非定常フローを誘導することができる。
【０１１８】
本開示の方法は、外来性物質を細胞の集団に導入するために使用され得、そしてこの細胞の集団内で、いくつかの細胞は溶解され（したがって生存不能）、いくつかの細胞は溶解されないかもしれないが生存不能であり、またその他の細胞は生存可能である。好ましくは、実質的にすべての細胞は、本開示の方法での処理後に生存可能である。
【０１１９】
本開示の方法及びデバイスは、温度の変化を監視することをさらに含むことを企図する。デバイスは、流路に動作可能に接続されて温度の変化を監視する熱電対を含み得る。
【０１２０】
本開示の実施形態では、細胞は、細胞と外来性物質の両方が液体中にあるとき、外来性物質の存在下で電場に曝露される。液体は、通常、ｅμＶＳプロセスの期間にわたって細胞の溶解をもたらさない任意の液体であり、本開示のいくつかの実施形態では、本方法の期間中に細胞の生存率を維持することができる任意の液体である。好ましくは、外来性物質は、液体に可溶であるか、液体に懸濁することができるか、又は液体に分散可能である。例として、液体は、細胞増殖培地、又はリン酸緩衝生理食塩水、又はトリス緩衝生理食塩水などの緩衝生理食塩水であってもよい。液体は、血液、血漿又は血清、又は全血、臍帯骨髄、骨髄又は脂肪由来の液体などの別の体液であってもよい。血液又は体液は、処理の改善のために、分画、分離、及び／又は希釈することができる。流体は、細胞への外来性物質の導入を促進する薬剤又は化学物質を含み得るが、液体は、細胞への外来性物質の導入を容易にするための任意の追加の薬剤又は化学物質を、必ずしも含む必要はない。例えば、本開示の特定の実施形態では、液体は、任意の追加的な、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、カルシウムイオン（例えば、塩化カルシウム又はリン酸カルシウムの形で）、マグネシウムイオン（例えば、塩化マグネシウムの形で）、荷電ポリマー、又はデンドリマーを含まない。これらの化学物質及び薬剤の多くは細胞に有毒であり、本開示の方法で使用される液体中にこれらの化学物質又は薬剤の添加量が存在しないか、又は実質的に存在しないことによって、本開示の方法を実行する場合に、望ましくない細胞溶解又は細胞死を防止できると理解される。
【０１２１】
細胞懸濁液を企図する実施形態では、懸濁液の液体は、追加の成分を用いて、又は用いずに実施された本開示の方法における液体であり得ることが理解されよう。細胞懸濁液は、当技術分野で理解されているように、乾燥した、又は代替的には、凍結乾燥製剤を指すこともある。
【０１２２】
「追加の」とは、液体中に通常及び／又は自然に存在し得るものに加えた、化学物質又は薬剤の任意の追加量を意味する。ほんの一例として、血液などの体液は、天然にカルシウムイオンを含み得るが、本開示の特定の実施形態では、リン酸カルシウムは、本開示の方法において液体として使用される前に、血液に添加されない。。別の例では、細胞増殖培地は通常マグネシウムイオンを含み得るが、本開示の特定の実施形態では、塩化マグネシウムは、本開示の方法において液体として使用される前に、増殖培地に添加されない。
【０１２３】
本開示は、医薬組成物を企図する。好適には、本開示の医薬組成物は、適切な医薬的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤は、哺乳動物、より好ましくはヒトへの投与に好適である。「薬学的に許容される担体」とは、生物学的又はその他の点で望ましくない物質からなる薬学的ビヒクルを意味し、すなわち、その物質は、いかなる又は実質的な副作用も引き起こさない選択された活性剤と共に対象に投与され得る。
【０１２４】
本開示はまた、凍結保護物質を含む医薬組成物を企図する。担体は、賦形剤及び他の添加剤、例えば希釈剤、洗剤、着色剤、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ｐＨ指示試薬、保存剤などを含み得る。薬学的に許容される担体、希釈剤及び賦形剤を記載する有用な参考文献は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  Ｎ．Ｊ．  ＵＳＡ、１９９１）及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ、２０１２）で、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
本開示の方法は、追加の処理又はステップを企図する。一例として、細胞選択（例えば、蛍光活性化細胞分類又はＦＡＣＳ）は、高純度の遺伝子改変された細胞集団を得るために含まれ得る。さらに、細胞が非定常フローの少なくとも１つの領域に曝露されている場合と電場に曝露されている場合との間に挿入される、追加の処理又はステップが存在し得る。
【０１２６】
本開示が容易に理解され、実用的な効果をもたらすことができるように、特定の好ましい実施形態が、以下の非限定的な実施例によってこれから説明される。
【実施例】
【０１２７】
〔実施例１〕
マイクロフルイディクスは、伝統的な細胞内送達方法を積極的に改善するために使用されている。しかしながら、特にＧＭＣＴの開発と製造の範囲内において、実用的なマイクロ流体細胞内送達方法に対する実質的ニーズは存在する。ここで、発明者らは、μＶＳに基づく流体力学的細胞内送達方法（図１ａ〜ｆに示される）を、ヒト汎Ｔ細胞への強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ｍＲＮＡ送達のためのその最適化と共に詳述する。以下は、μＶＳを介した細胞内送達後、μＶＳが高い細胞回収率（例９６．３±１．１％、平均±ｓｔｄｅｖ）、高い細胞生存率（例８３．７±０．７％）、及び高いＥＧＦＰ発現効率（例５７．４±６．８％）を生じさせ、４６．３±５．６％の収量で回収され、生存し、ＥＧＦＰを発現する、汎Ｔ細胞の収率をしょうじさせることを示している。実際、次のことも実証されている。
（１）μＶＳはＴ細胞の増殖に悪影響を与えまない。
（２）μＶＳは、Ｔ細胞型の間で同等なＥＧＦＰ発現プロファイルを生じさせる。そして
（３）μＶＳはＴ細胞活性化プロファイルを変更しない。
【０１２８】
この小規模プロトタイプはまた、２００万細胞ｓ−１を超える処理速度を可能にする。最後に、このプロトタイプは業界標準の半導体プロセスで製造されており、高い歩留まり（９５％を超えるなど）と厳しい許容誤差（５％未満など）のスケーラブルなデバイス製造を実現する。
【０１２９】
方法。デバイスの設計と製造：デバイスは４．８ｍｍｘ９．８ｍｍの実装面積で設計されており、幅９６０ｐｍ、深さ４０μｍのフローセルを含んでいた。このフローセルは、直径が４０μｍのポストのポスト列を含んでいて、ポスト配列はバルクフロー方向に対して直行する６０μｍのピッチ、及びバルク流の方向に５００μｍのピッチを有していた。デバイスの概要は図１（ｇ）及び（ｈ）に示される。
【０１３０】
デバイス製造は、業界標準の半導体プロセス及び溶融シリカウエハを使用して達成された。フローセルと配列の形状は、異方性深堀り反応性イオンエッチングによって構築された（図１（ｈ）を参照）。深堀り反応性イオンエッチングされたフローセルは、入口と出口のために直径が約７００μｍのレーザー加工された貫通孔を含む溶融シリカの蓋に熱的に結合された。製造後、デバイスと形体の幾何特性は、走査型電子顕微鏡（図１（ｈ）を参照）、白色光干渉法（図示せず）、及びデジタル顕微鏡（図示せず）を使用して検証された。
【０１３１】
試験リグの開発：専用の試験リグは、０〜１５０ｐｓｉｇのマイクロ流体デバイスを操作するために開発され、１ｍＬｍｉｎ−１から１ｍＬｓ−１の範囲の流量も測定できた。これを達成するために、圧縮された窒素タンクは、校正された２段階レギュレーターを使用して１５０ｐｓｉｇ未満に調整され、圧縮空気フィルター（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｃａｒｒ、４４１４Ｋ７１）を使用して５μｍまでろ過された。次に、圧縮窒素流量を手動のオン／オフバルブ（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｃａｒｒ、４３７９Ｋ６１）で制御し、体積流量を校正済み質量流量計（Ａｌｉｃａｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍ−１ＳＬＰＭ−Ｄ）で測定した。次に、圧縮された窒素を使用して、浮遊している細胞や薬剤のサンプルをマイクロ流体チップ中に空気圧で送り込んだ。図１ｆに示すように、サンプルは１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに収容され、サンプル収集用のアウトレットチューブを備えた内部固定具に連結されたチューブアダプター（Ｅｌｖｅｆｌｏｗ、ＫＲＸＳ）に配置された。
【０１３２】
流体力学特性評価及びシミュレーション無次元方程式を使用して、チャネル内のレイノルズ数（Ｒｅ）を計算し、円筒形ポストの周りのフローを計算した。方程式は、体積流量（Ｑ）、流体の動粘性率（ｖ）、及び特定のデバイスの形状に基づいている。無次元解析を使用して、物体が円筒形のポストの場合、次のレイノルズ数がみいだされた：フローセル（Ｒｅｆｃ）、入口チャネル（Ｒｅｃ）、ポスト間の間隔（Ｒｅｇ）、物体の周りのフロー（Ｒｅｏ）。（Ｒｅｆｃ）、（Ｒｅｃ）、及び（Ｒｅｇ）は次のように計算された。
【数１】
2021501608.tif 000003
ここで、Ｑはデバイスの体積流量、ｈｆｃはフローセルの高さ、ｖは流体の動粘性率である。フローセル、チャネル、間隔のそれぞれの幅は、ｗｆｃ、ｗｃ、ｗｇである。ｎは間隔又はチャネルの数で、次のように計算される。
【数２】
2021501608.tif 000004
ここで、ｐｒは行ピッチである。Ｒｅ０は次のように計算できる。
【数３】
2021501608.tif 000005
ここで、ｖ∞は自由流の速度、ｄはポストの直径である。ｖ∞は次のように計算できる。
【数４】
2021501608.tif 000006
次に、次の方程式を使用して、滑らかな円柱のストルーハル数（Ｓｔ）を計算する（Ｇｅｒｈａｒｄｔｅｔａｌ．２０１６）ためにＲｅ０を使用する。
【数５】
2021501608.tif 000007
次にＳｔを使用し、次の方程式を使用して、渦放出の頻度（ｆ）を概算する。
【数６】
2021501608.tif 000008
【０１３３】
本発明者らはまた、二次元計算流体力学技術及びＡＮＳＹＳ  Ｆｌｕｅｎｔを使用して、入口速度としてｖ∞を使用し、ユニット配列形状における流体力学的条件をシミュレートした。これは、代表的な流体力学的条件でのμＶＳフローの発達時間を評価するために行われた。μＶＳフローの発達時間は、速度輪郭線を見ながらポストに作用する一時的抗力係数（図示せず）を調べることによってシミュレートされた（図１（ｉ）を参照）。
【０１３４】
汎Ｔ細胞培養：Ｅｕｒｅｋａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからギフトとして提供された、単一のドナーＰＢＭＣｓから、標準的な手法を使用して、凍結保存され、精製された初代ＣＤ３＋Ｔ細胞が、ネガティブに選択された（汎Ｔ細胞又はＴ細胞と呼ばれる）た。再生及び培養のために、５００万個の汎Ｔ細胞を解凍し、ゲンタマイシン及びフェノールレッド（ロンザ）を含むＸ−ＶＩＶＯ１０に播種した。細胞は、解凍日にＣＤ３／２８／２Ｔ細胞活性化溶液（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１００ＩＵｍＬ−１組換えヒトＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）を使用して活性化し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。汎Ｔ細胞は、培地とＩＬ−２（最終濃度１００ＩＵｍＬ−１）を２〜３日ごとに加えて１６日間増殖させ、細胞濃度を１００万細胞ｍＬ−１以下に維持した。すべてのデータは、解凍後、活性化された１７日から２４日までの間に収集された。
【０１３５】
異なる濃度での汎Ｔ細胞へのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ送達：チップ上で使用される溶液は、目詰まりの原因となる可能性のある微粒子を除去するために使用する前に、０．２２μｍのろ過を使用してろ過された。オンチップ細胞処理では、Ｔ細胞を培養液から取り出し、遠心分離（３００ｘｇで５分間）によりペレット化した。上清を吸引により除去し、細胞ペレットを１×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、再度遠心分離によりペレット化し、上清を吸引により除去した。すすいだ細胞を、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ−ＸＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２５ｍＭトレハロース二水和物ＮＦ（ＪＴＢａｋｅｒ、ＶＷＲ）、及び５％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からなるフィルター処理培地に、細胞濃度が約２０００万細胞ｍＬ−１で懸濁した。細胞の濃度は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動ベンチトップセルカウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びトリパンブルー色素排除を使用して数え上げ、生存率を評価した。テストする８つの条件のそれぞれについて、細胞溶液の３つの複製サンプルを作成した。サンプルを作成するために、処理培地の列挙されたストックから６４０万個の細胞を取り出し、エッペンドルフバイオプール１．５ｍＬチューブに入れ、処理培地で希釈して、ｍＲＮＡ容量を差し引いた最終容量４００μＬとし、これを処理の直前に追加し、１６００万細胞ｍＬ−１の最終細胞濃度を求めた。これらのサンプルは、チップの目詰まりにつながる可能性がある細胞の凝集とクラスター形成を減少させるため、２つの個別のバッチでろ過された（最初のサンプルセットとして、１６０μｇｍＬ−１ｍＲＮＡコントロール、１０μｇｍＬ−１、４０μｇｍＬ−１、及び８０μｇｍＬ−１、ハンドリングコントロール、１２０μｇｍＬ−１、１６０μｇｍＬ−１、及びｍＲＮＡデバイスはコントロールとして処理されず、を２番目のサンプルセットとして）。
【０１３６】
サンプルリグ及びチュービングは、使用前に７０％エタノールによるふき取りにより滅菌され、チュービングは、実行の間にエタノールフラッシュで洗浄された。処理の直前に、各サンプルを適切な量のＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ（１μｇｍＬ−ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンディエゴＣＡ、Ｌ−７６０１）と混合し、１０μｇｍＬ−１からμｇｍＬ−１（３０ｎＭ〜４７３ｎＭ）の範囲の最終濃度とした。ピペッティングを使用して細胞を均一に懸濁してサンプルを完全に混合し、サンプルチューブをエッペンドルフチューブフィッティングに取り付け、フィッティングをしっかりと締めた。次に、細胞とｍＲＮＡの入ったエッペンドルフチューブを１２０ｐｓｉｇの窒素圧に曝露して、サンプルをチップに通し、μＶＳを介して細胞内ｍＲＮＡの取り込みを誘導した（図１ａ−ｅを参照）。処理したサンプルを１５ｍＬの円錐チューブに収集し、実験が完了するまで氷上で保持して、異なるサンプル間で発現時点を同期させた。各実行後、リグとチュービングを７０％エタノールで洗い流し、リグにおいては新しいマイクロ流体チップに交換された。すべてのサンプルが処理され、氷から取り出され、培地に戻されたときにｍＲＮＡ発現が開始され、時間差はゼロとなる。セット内のすべてのサンプルは３０分以内に処理され、サンプルの氷上での合計時間は３０分から３時間の範囲で、これは、１０μｇｍＬ−１のサンプルが氷上に保持されていた時間の長さである。コントロールサンプルは３組設定され、実験サンプルが処理されている間、室温に置かれた。デバイス処理されなかったコントロールサンプルは、純粋な処理培地において１６００万細胞ｍＬ−１からなり（ハンドリングコントロール）、これは実験サンプルのため細胞生存率と回収率を正規化するために使用され、処理培地で１６０μｇｍＬ−１ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡコントロール）を含む。追加のデバイスコントロールサンプルは、純粋な処理培地で１６００万細胞ｍＬ−１に設定され、デバイスを通過させ、追加的な外部要因なしに、細胞生存に対するμＶＳの影響を決定した。２つの３組のハンドリングコントロールサンプル（ｍＲＮＡを含む最初の）は、以前に説明したフィルター処理されたセルの２つのバッチに対して作成された。
【０１３７】
最後のサンプルを処理し、氷上で５分間インキュベートした後、すべてのサンプルを氷から取り出し、再懸濁し、カウンテス及びトリパンブルー色素を使用した、処理後細胞生存率及び濃度定量のために、１サンプルを取り出した。処理培地中の残りの細胞を、１００ＩＵｍＬ−１ＩＬ−２を有する、約８ｘ１０５細胞ｍＬ−１の濃度のＸ−ＶＩＶＯ１０で１〜２０に希釈した。培養物を６ウェルの非ＴＣ処理ウェルプレートに加え、後程の増殖、活性化マーカー、及びＥＧＦＰ発現分析のために５％ＣＯ２中で３７℃で培養した。ＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩセルカウンターを使用して定量化された、トリパンブルー色素排除を使用して、細胞増殖を監視した。トランスフェクション後２日目と４日目に追加のＩＬ−２を加え、解凍活性化後２４日の培養年齢で、７日目に細胞は廃棄された。
【０１３８】
初期Ｔ細胞生存率及び処理後濃度は、カウンテス及びトリパンブルー染色を使用して、各サンプル複製からの最低２つのユニークサンプルをカウントすることにより定量化された。これらのカウントは、図２ａに示す回収率と収率を決定するために使用された。増殖培地中の各サンプルの細胞増殖と生存率を、トリパンブルー色素を排除したカウンテスを使用して７日間監視した（図３）。トランスフェクション後のさまざまな時点でのＥＧＦＰの発現と持続性（図３）をフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーター）とヨウ化プロピジウム（最終濃度１μΜ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してモニターし、死んだ細胞を除外した。図２は、図１に概略的に表された方法による、異なるｍＲＮＡトランスフェクション濃度を使用した、トランスフェクション後１９時間での初代Ｔ細胞ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現効率のグラフ表示である。トランスフェクション後１９時間での初代Ｔ細胞ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現効率、処理後の、細胞生存率、細胞回収率、及び異なるｍＲＮＡトランスフェクション濃度（ｎ＝３）を使用したトランスフェクションを起こさせられた細胞の総収量を測定した（図２（ａ））。すべての条件で、μＶＳトランスフェクション後に高い回収率（８８％以上など）と生存率（７７％以上など）が達成された。トランスフェクション及び培養への復帰後１９時間でのｍＲＮＡ濃度の関数として、フローサイトメトリーを介して生きた単一Ｔ細胞からのＥＧＦＰ蛍光強度を分析した（図２（ｂ））。トランスフェクション効率は、１０μｇｍＬ−１（３０ｎＭ）〜１６０μｇｍＬ−１（４７３ｎＭ）、で約２４％〜６４％の範囲だった。ＥＧＦＰ蛍光（相対蛍光単位）とｍＲＮＡ濃度の母集団中央値の間にも線形関係があった。
【０１３９】
細胞回収及び細胞生存率と共に発現効率が、回収され、生存可能でかつトランスフェクションを起こさせられた細胞の最高収量をもたらすｍＲＮＡ濃度を決定するためのｍＲＮＡ濃度の関数として列挙された。ここで収量はｙ＝ｒｖｅとして定義される。ここで、ｙは回収され、生存可能なトランスフェクションを起こさせられた細胞の収率又は割合、又はデバイスのトランスフェクション後に生存していてＥＧＦＰを発現したインプット細胞の割合である。ｒは回収された細胞の割合、ｖは回収された細胞の生存率、ｅはトランスフェクション効率又はＥＧＦＰを発現する生存細胞の割合である。
【０１４０】
ＥＧＦＰ発現の収量及び効率（図２ｂ）は、培養物についての最高のＥＧＦＰ発現値を使用して計算され、この値は、処理の約１９時間後、細胞の培養培地への復帰時に生じた、
【０１４１】
単一のドナー由来のＴ細胞サブタイプにおける均一な発現プロファイル：蛍光モノクローナル抗体標識及びフローサイトメトリー分析を使用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブタイプ間で発現効率を調べた。これらの培養物は、培地に戻された後２７時間で分析された。サンプルはそれぞれ、１０、８０、及び１６０μｇｍＬ−１の培養液から取り出し、ｖ底の９６ウェルプレートに入れ、ＤＰＢＳで希釈し、遠心分離によってペレット化し、上清を吸引した。細胞を、１％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭＥＤＴＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）を含むＤＰＢＳ中において、マウス抗ヒトＣＤ３−アレキサンダー７００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＰＮ５６−００３７−４２）、マウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＰＮ  ２５−００４８−４２）、マウス抗ヒトＣＤ８ａ−ＳｕｐｅｒＢｒｉｇｈｔ６００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＰＮ  ６３−００８８−４２）それぞれが２５μｇｍＬ−１の１００μＬ−１に再懸濁した。以前の抗体は、ＥＧＦＰを発現するＣＤ４ＣＤ＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブタイプの割合を定量化するために使用された。細胞を抗体混合物中で氷上で３０分間インキュベートし、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、遠心分離によりペレット化し、上清を吸引した。サンプルを２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、遠心分離によりペレット化し、上清を２回目のすすぎ段階として吸引した後、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。実験は、抗体で標識したＡｂＣ補正ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とＥＧＦＰ発現細胞（ＢＬ１チャネル）の組み合わせを使用して補正された。
【０１４２】
Ｔ細胞活性化での無変化：Ｔ細胞の活性化に対するμＶＳベースのｍＲＮＡ送達の影響を評価するために、ハンドリングコントロールとデバイス処理コントロール（ｍＲＮＡなし）細胞を、培養に戻してから２４時間後、にさまざまな活性化マーカーに対する蛍光標識抗体で標識した。コントロール及びデバイス処理グループの各複製からの活性化マーカーごとに１つのサンプルを培養物から取り出し、ＤＰＢＳにより９６ウェルプレートで希釈した。遠心分離（１．５分８００ｘｇ）により細胞をペレット化し、上清を吸引除去し、サンプルあたり次のいずれかのＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒモノクローナル抗体を２５μＬｍＬ−１含むＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４−ＦＩＴＣ（ＰＮ１１−１５４８−４２）、ＣＤ２５−ＰＥ（ＰＮ１２０２５７−４１）、ＣＣＲ７−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０（ＰＮ４７−１９７９−４２）、ＣＤ４４−ＡＰＣｅＦｌｕｏｒ７８０（ＰＮ４７−０４４１−８０）、ＣＤ６９−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＰＮ４８−０６９９−４２），ＣＤ４５ＲＡ−ＳｕｐｅｒＢｒｉｇｈｔ７０２（ＰＮ６７−０４５８−４２）。サンプルを氷上で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回すすぎ、フローサイトメトリーで分析した。
【０１４３】
結果及び考察：デバイスの設計と製作深堀り反応性イオンエッチングされた溶融シリカの機能により、垂直の側壁が形成され（図１ｈを参照）、熱結合によりバルクの材料結合が生じた。本方法中に生成されたマイクロ流体チップは、本研究に必要な圧力をはるかに超える動作圧力に耐えることができた。さらに、光学的に透明な溶融石英基板（図１ｇを参照）を使用することで、処理の前後にデバイスを検査することができた。
【表１】
2021501608.tif 000009
【０１４４】
半導体プロセスの使用は、設計されたデバイス形状と製作されたデバイス形状との間に最小限の変動（表１を参照）があったことを意味した。さらに、デバイスの歩留まり又は正常に製作されたデバイスの割合は通常９５％だった。これは、比較的単純なデバイス形状に起因する。例えば、製作された機能の最大アスペクト比は約６．６だった。深堀り反応性イオンエッチングは、かなり高いアスペクト比の機能を生成するために頻繁に使用されます。
【０１４５】
装置は、改善された細胞回収と共に、より均一なフロー条件のための入口及び出口チャネルを含むように設計された。予備実験では、オープン又はチャネルフリーのインレットとアウトレットを含むデバイス設計でも、細胞内送達又はトランスフェクションは可能であった。しかし、細胞回収率は著しく低く、細胞片やポストの上流側での堆積が観察された。これらの予備的なデバイス設計では、大量の細胞を処理する場合や細胞密度が高い場合、目詰まりする傾向があった。この目詰まりは、ポストに激突した後の細胞の機械的溶解によるものだった。
【０１４６】
入口及び出口チャネルの導入は、この形態の細胞溶解の機会を、関連するデバイスの目詰まりとともに、実質的に減少させる。この研究で使用された特定の設計では、製作されたポストはフローセル幅の約６８．２％を占めているが、製作された入口及び出口チャネル構造は同じフローセル幅の約１０．３％を占めている。処理後も細胞の破片はチャネルの入口で観察されるが、細胞の回収率は高く維持され（汎Ｔ細胞培養に関するセクションを参照）、本デバイスでは特に、この研究で使用される細胞密度では、目詰まりする傾向が低下する。
【０１４７】
試験リグの開発：マイクロフルイディクス機器には、通常、低流量、少量のサンプル量、及び低い動作圧力という制約がある。したがって、マイクロ流体チップ内でμＶＳを生成するために必要な高圧を生成するには、カスタムなテストリグの開発が必要だった。マイクロ流体の流量の直接測定は、以下の点で、利用可能な市販の機器では不可能だった。（１）有意な流量、（２）初代Ｔ細胞の敏感な性質、及び（３）短いフロー時間。例えば、１２０ｐｓｉｇ（８．２ＡＴＭ）の操作圧力を使用して、１６００万細胞ｍＬ−１の密度で細胞を含む４００μＬのサンプルを処理する場合、測定された流量は通常８ｍＬｍｉｎ−１で、これにより約３秒の合計サンプルフロー時間を生じさせる。さらに、質量流量計とチップフィッティングの間の限られたチュービングの長さと相まって、短いサンプルフロー時間は、拡散によって引き起こされるアーチファクトを意味し、チュービングとチップを介してサンプルを駆動する窒素のフローに比べて、チュービング壁を通る圧縮窒素の透過は無視できると考えられた。
【０１４８】
この専用システムにより、発明者は、（１）チップ内の流体力学的条件、又は（２）チュービングを通るサンプルのフロー、を妨げることなく、流量を定量化することができた。予備実験中に、チュービングの大きな曲がりやねじれが細胞の生存率と回復率の両方に悪影響を与えることが観察されました。これは、変形したチュービング内に作成された高剪断再循環領域に起因していた。さらに、理想的なフロー条件を生成するには、チュービングを注意深く選択する必要があった。チュービングの内径の小さな変化は、チップ内の体積流量と流体力学の状態に大きな変化をもたらすが、必要以上にチュービングが長いと、サンプルの総損失が増加する。これは、定量的な流量測定を可能にしながら初期の流路を維持できる試験リグを設計するときに、十分な注意が必要であることを意味した。このように、この専用の試験リグは、細胞がマイクロ流体チップ内で正確に制御された流体力学的条件にのみさらされることを意味した。
【０１４９】
流体力学特性評価及びシミュレーション無次元解析を、（１）デバイスフロー細胞、（２）入口チャネル、（３）ポスト間、及び（４）ポストの周囲のフロー条件の特徴づけに使用した。細胞培地は主に水で構成されており、トランスフェクションは室温（約２０°Ｃ）で行われたため、流体力学条件は、１．００４ｘ１０−６ｍ２ｓ−１の動粘度すなわち２０°Ｃの水の動粘度を使用して特徴付け及びシミュレーションがなされた。異なるトランスフェクション培地組成は、高い剪断速度の２０℃の水に対して同じ動的粘度を示すことが示された（図示せず）。さらに、流体力学的特性評価とシミュレーションの目的は、流体力学的条件の合理的な分析を提供することである。この目的のために、無次元解析の要約を以下の表（表２）に示す。
【表２】
2021501608.tif 000010
【０１５０】
上記の表は、フロー細胞内（Ｒｅｔｃ）、チャネル内（Ｒｅｃ）、及びポスト間の間隔（Ｒｅｇ）のフロー条件が、それぞれ２７１、１８０、及び２９１であることを示している。これらの値は、遷移流及び乱流の開始のためのレイノルズ数よりもかなり低くなっている。したがって、ポスト配列の上流のフロー条件は層流であり、マイクロ流体デバイス内の流体力学的条件は渦の発生のみに起因する可能性がある、というのはＲｅ０＝１４６であり、Ｒｅ０＞４０のときに渦放出が発生することがわかっているためである。マイクロ流体の流体力学は、複雑なフロー条件で同じ特性を持つレイノルズ数が一致するミクロ及びマクロスケールのフローでよく研究される。さらに、渦放出は、マイクロ流体ポスト配列で発生することが以前に示されている。渦放出は、ポストの背後の伴流で発生し、フローが不安定になるため、フロー場が変動し、その結果、抗力と揚力が発生する。したがって、渦放出がこれらの特定のマイクロ流体ポスト配列で発生していると結論付けることは合理的である。
【０１５１】
計算流体力学によるシミュレーションを使用して、流体力学的フロー条件を確認し、これにより伴流内の渦の発達が示され、これによって、渦放出頻度を調査し、μＶＳのフロー発達時間を決定することができた。フロー発達時間を使用して、各サンプルのどれくらいのパーセント又は割合が完全に発達したμＶＳに曝露されているかを評価し、理論上の最小サンプルサイズを概算した。図１ｉに示すように、フロー条件は約１０−４秒後に完全に発達する。さらに、抗力係数分析は、μＶＳフロー発達時間が８ｍＬｍｉｎ−１のデバイスの流量で、３ｘ１０−４ｓであることを示唆する。つまり、４００μＬのサンプルが処理されるとき、フロー発達時間は、合計サンプルフロー時間の０．０１％を占めると推定される。少量サンプルが研究用に必要とされるとき、この場合最小限の試薬消費が理想的であってサンプル内の細胞が貴重であるが、この点は特に重要である。このフローの状態では、互いに影響を受けた円筒状ポストの下流に渦が発生し、ほぼ逆位相の同期領域が主要なフローパターンである。
【０１５２】
この実施例で説明されている流体力学的特徴付け及びシミュレーション方法は、単相流体力学を想定している。製作されたポストの間のすぐそばの領域には約４．６ｐＬの体積が含まれるが、個々の細胞は、１６００万細胞ｍＬ−１の細胞濃度で約６２．５ｐＬの懸濁液体積を占める。懸濁液体積とは、培地中の浮遊細胞間に培地が均等に分布していると仮定した場合の、単一細胞及び周囲の懸濁培地の総体積を指す。これは、細胞あたりの総懸濁液体積が、ポスト間の直近の量よりも１３．６倍大きいことを意味する。ポスト配列を通過する際、細胞は個々に処理されて細胞間相互作用はごくわずかで、単相流体力学は、フロー状態を特徴付けてシミュレーションする場合の合理的な仮定である、と想定された。さらに、このドナーからの汎Ｔ細胞は、通常、直径が８〜１０μｍである。直径９μｍの球の体積は０．３８ｐＬであり、このドナーからの通常の汎Ｔ細胞は、ポスト間の直近の体積よりも１２．１倍小さい体積を占めます。細胞とポストの相互作用は、各チャネルの中央付近に配置された細胞では最小限である。チャネルの幅と高さは、このドナーの通常の汎Ｔ細胞よりもおよそ６．６倍と４．４倍ほど大きく、これはほとんどの細胞がポスト間の直近を流れることを示唆する。これらの相対的な容量と形状は、相互作用の主なものが流体と細胞又は流体とポストとの相互作用であることを意味し、そのためより高度な３次元及び多相シミュレーションは正当化されなかった。
【０１５３】
汎Ｔ細胞培養：凍結保存された汎Ｔ細胞は、１６日間で５００万の個々のサンプルから、実験ワークフローに十分な細胞数に増殖された。開発実験では、増殖された細胞を最初の活性化から２週間で又はその後にトランスフェクションを起こさせられ、活性化及び消耗マーカーの発現に基づいて、Ｔ細胞を静止状態に戻した。
【０１５４】
異なる濃度での汎Ｔ細胞へのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ送達：エレクトロポレーションのような高効率で短時間のトランスフェクション法は、多くの場合、ｍＲＮＡをともなうＴ細胞トランスフェクションにおいて、細胞生存率と回復率の低下をもたらす。これと比較して、μＶＳベースの分子送達は、処理時間とＴ細胞の健康への影響を大幅に減少させる。３０ｎＭから４７３ｎＭのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを汎ＣＤ３＋細胞に送達することにより、１９時間で、生きた処理細胞集団のうち約２０％から６５％の範囲で最大のＥＧＦＰ発現を生じた（図２ａ−ｂ）。興味深いことに、ＥＧＦＰ蛍光強度の中央値は、ｍＲＮＡ濃度と直線的に相関している（図２（ｃ））。短い処理時間（例えば、４００μＬのサンプルでは約３秒）により、処理後すぐに細胞を細胞培養液に戻すことができる。これにより迅速な回復が促進され、低又は無血清培地で、例えば化学的トランスフェクションに必要な条件であるが、長期間にわたって細胞に生じるストレスやダメージが軽減される。さらに、μＶＳは、エレクトロポレーションと比較すると、穏やかな細胞内送達方法であると思われ、試験した条件で高い回収率（８８％以上など）と生存率（７７％以上など）をもたらすが、エレクトロポレーションでは、特に初代免疫細胞の場合、生存率と回収率が低下する可能性がある。
【０１５５】
培地組成は、細胞の回収率及び生存率、ならびにμＶＳｍＲＮＡ送達の全体的な効率に直接的な影響を与えることが見出された。さまざまな無血清培地の選択肢がスクリーニングされ、Ｔ細胞の増殖に使用されるＸ−ＶＩＶＯ１０培地を含む他の無血清培地の選択肢と比較して、Ｉｍｍｕｎｃｕｌｔ−ＸＦにおいて全収量（ｙ）が最も高いと認められた。トレハロースを培地に添加して、細胞の生存率と回収率を高めた。トレハロースは一般的に賦形剤として使用され、エレクトロポレーション中の細胞損失を減らすことが実証されている。最後に、５％ｖ／ｖＤＭＳＯを共溶媒として処理媒体に追加しましたが、これによりμＶＳへの暴露時に、細胞膜の孔の生成を容易になる、又はおそらく孔の大きさが増大するというアイデアに基づいていた。ＤＭＳＯは、カチオン性脂質化学トランスフェクション効率を高めるため、そしてポリブレンをともなう細胞内ＤＮＡ送達のため哺乳類細胞に孔を生成するために使用されている。共溶媒の添加は、孔生成に対する膜の抵抗を低下させると考えられている。
【０１５６】
中程度のイオン強度又は伝導率はまた、孔生成の全体的な容易さ及びμＶＳによる細胞回収に影響を及ぼし得る。ｍＲＮＡ濃度の増加に伴い生存率が低下する傾向が観察されたが、この低下はわずかだった。これは、サンプルに追加されたｍＲＮＡ溶液の高いパーセンテージが、ｍＲＮＡの高い濃度を含むためと考えられる。例えば、１０μｇｍＬ−１のサンプルには、処理媒体において、１％ｖ／ｖｍＲＮＡ緩衝液が含まれ、１６０μｇｍＬ−１のサンプルには１６％ｖ／ｖｍＲＮＡ緩衝液が含まれていた。ｍＲＮＡ溶液は、Ｉｍｍｕｎｃｕｌｔ−ＸＦと比較して、低イオン強度の緩衝液（例えば１ｍＭクエン酸ナトリウム）である。これは、ｍＲＮＡ濃度の増加に伴う総処理培地のイオン強度の低下が、生存率の低下傾向の原因である可能性が高いことを意味する。ｍＲＮＡ溶液が存在すると、トレハロースの濃度も低下し、これはまたｍＲＮＡ濃度の増加に伴う、細胞生存率の低下をもたらし得る。
【０１５７】
さらに、他の濃度と比較した１０μｇｍＬ−１サンプルの生存率の低下と比較的低い成長率（図３（ｃ）を参照）は、処理後の氷上での長時間（合計約３時間）の結果であると仮定され，これは，処理される最初のグループであって、氷上での最長のインキュベーション期間と、処理してから培地に戻すまでの時間が最長だったためと思われる。ハンドリングコントロールと比較したすべてのグループの生存率の低下は、培養に戻ったときの細胞死の増加が原因である可能性があり、これは膜修復の試みの失敗、熱衝撃に伴う大量の機械的溶解、及び培地ストレスに起因すると思われる。
【０１５８】
μＶＳによる総細胞回収率は、例外的かつ驚くほど高かった。従来のＴ細胞の回収率は、エレクトロポレーション後、通常２０％であり、これはμＶＳが、従来のエレクトロポレーションと比較して５倍近く改善されたＴ細胞回収率を提供することを意味する。回収率が低いことに加えて、エレクトロポレーションはＴ細胞の生存率に悪影響を与えることも知られている。エレクトロポレーション後のＴ細胞の生存率を、１５％から４０％にするという課題が報告されている。特に高濃度のプラスミドを使用した場合、２〜３日間でのさらなる細胞死が観察される。一方、μＶＳは、ハンドリングコントロール及びｍＲＮＡコントロールと比べて、細胞の生存率にも細胞の増殖率にも影響を与えない（図３）。ｍＲＮＡコントロール（図３ｂ）を１６０μｇｍＬ−１（図３ｇ）と比較すると、Ｔ細胞の生存率と成長率のわずかな減少が観察されるが、これは小さいものである。デバイスで処理されたコントロール細胞（図３ｈ）とハンドリングコントロール（図３ａ）とを比較すると、成長率と生存率は７日間の培養期間全体でほぼ同じであり、これはｍＲＮＡ処理細胞の生存率と成長率のわずかな低下は、ｍＲＮＡ溶液の存在によるものであり、μＶＳを使用した処理細胞の影響によるものではないことを示している。こうしてみると、これはμＶＳがエレクトロポレーションに比べてＴ細胞の細胞内送達のためのより穏やかな方法でありながら、有意なＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現効率を可能にすることを示唆しており、これはり、回収され、生存能力があり、ＥＧＦＰを発現するＴ細胞の実質的な収量をもたらした。図３は、（ａ）ハンドリングコントロール、（ｂ）ｍＲＮＡコントロール、（ｃ）１０μｇｍＬ−１、（ｄ）４０μｇｍＬ−１、（ｅ）８０μｇｍＬ−１、（ｆ）１２０μｇｍＬ−１、（ｇ）１６０μｇｍＬ−１、及び（ｈ）デバイス処理された対照サンプルの、１週間のＴ細胞の成長率、生存率、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現効率を示している。トランスフェクション後、培地に戻した後、トリパンブルー色素排除と３組の自動セルカウンターを使用して、各グループの細胞生存率（青色の線）と濃度（倍濃度の増加としてプロット、黒色の線）をモニターした。トランスフェクション後の異なる時点でフローサイトメトリーを使用して、ＥＧＦＰの発現と持続性を定量化した。結果のプロットは、細胞増殖率と生存率が、μＶＳを使用したオンチップｍＲＮＡトランスフェクションから悪影響を受けなかったことを示す。１０μｇｍＬ−１グループを除いて、すべてのグループは、処理後の成長から２倍の濃度の増加を示した。１０μｇｍＬ−１グループは、処理から回収までの間に氷上で過ごす時間が最も長かったため、余分なストレスがかかった可能性がある。さらに、ＥＧＦＰタンパク質の持続性が監視され（緑色の線）、細胞の成長とタンパク質の分解により信号が減少するように見えた。
【０１５９】
単一のドナーからのＴ細胞サブタイプ間の均一な発現μＶＳｍＲＮＡ送達に集団バイアスがあったかどうかを評価するために、３つのｍＲＮＡ濃度（１０、８０、及び１６０μｇｍＬ−１）からのＴ細胞のサンプルをＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８ａ蛍光抗体で標識した。仮説は、活性化状態、細胞の年齢、又は細胞周期の段階が、μＶＳによって誘発される穿孔に対する細胞の感受性に影響を与える可能性があるというものだった。サンプルは、フローサイトメトリー及びＥＧＦＰ蛍光により分析されたＴ細胞タイプの分布を介して分析された。図４に示す結果は、ＥＧＦＰ発現細胞のパーセンテージが、すべての実験条件を通じて、すべてのＣＤ４＋又はＣＤ８＋集団間で同じであることを示している。さらに、ｍＲＮＡ濃度依存の蛍光強度プロファイルもほぼ同じで、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブタイプとＣＤ８＋Ｔ細胞サブタイプとの間の再現性を示す。
【０１６０】
この等しい分布は、Ｔ細胞の純粋な集団を単離する代わりに、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を使用することに焦点を合わせたＧＭＣＴにとって有利である。また、遺伝子操作や再注入の前にＰＢＭＣの前処理を少なくすることが望ましいポイントオブケアＧＭＣＴ製造にも有利である。これらの均一な分布プロファイルもμＶＳに固有のものであり得る。レンチウイルスのトランスダクション効率は、ドナー間の一貫した傾向なしにＴ細胞サブタイプ間で異なることが知られているが、一方、エレクトロポレーションは、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団に悪影響を及ぼし、４０％のＣＤ８＋Ｔ細胞の生存率を生じさせることが示されている。さらに、発現プロファイルは、プラスミドエレクトロポレーション後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の間で異なることが知られている。こうしてみると、図４に示すデータは、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡのサイトゾル送達後のＣＤ４＋Ｔ細胞サブタイプとＣＤ８＋Ｔ細胞サブタイプとの間での均一な発現プロファイルを示しており、μＶＳは、少なくともサイトゾル細胞内送達を考慮した場合、エレクトロポレーション及びレンチウイルストランスダクションに比べて追加的な利点を提供することを示唆する。図４は、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現が、単一のドナーからの２種類のＣＤ３＋細胞に等しく分布していることを示す。μＶＳベースのｍＲＮＡ送達により、ＣＤ８細胞とＣＤ４Ｔ細胞との間での発現の均一な分布がもたらされ、この発現は、ＣＤ３＋集団全体のＥＧＦＰ発現と等しい。ＥＧＦＰを発現するＣＤ３＋細胞の割合（左上のヒストグラム）は、特定のＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞グループ（それぞれ左下と右下のヒストグラム）に変換され、これらは、蛍光標識抗体を使用して区別され（右上の散布図）、ヘルパーＴ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞のｍＲＮＡ送達にバイアスがないことを示す。ＥＧＦＰ陽性率は、（ａ）１０μｇｍＬ−１、（ｂ）８０μｇｍＬ−１、及び（ｃ）１６０μｇｍＬ−１について表示される。
【０１６１】
Ｔ細胞活性化での無変化：初代ヒト免疫細胞のエレクトロポレーションは、Ｔ細胞の活性化マーカーを増加させることが観察されている。エレクトロポレーションと培養に戻ってから２４時間後に、Ｔ細胞活性化の初期マーカーであるＣＤ６９と、抗原提示細胞の共刺激に役立つ活性化マーカーであるＣＤ１５４の発現が増加したという観察結果があり、これはエレクトロポレーションがＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化をもたらすことを示す。この実施例で、我々は、μＶＳを使用して処理した細胞は、培養中の細胞と比較して細胞の活性化状態が変化するかどうかを調べた（図５を参照）。ハンドリングコントロール、及びデバイス処理されたコントロールグループからの各複製は、さまざまな活性化マーカーに対する異なる抗体で個別にラベル付けされた。ＣＤ６９とＣＤ１５４、並びにＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４４の活性化の追加マーカーである。ＣＣＲ７は、ナイーブＴ細胞に見られるリンパ系ホーミングサイトカイン受容体で、活性化すると失われる。ＣＤ２５は、ＣＤ６９に比べて活性化が遅いマーカーであり、細胞の活性化時に増加し、ＣＤ６９よりも長く活性化されて細胞表面に持続する。ＣＤ４５ＲＡはナイーブＴ細胞に見られ、活性化と記憶の形成により失われる。ＣＤ４４は特定の細胞外マトリックス成分の受容体であり、Ｔ細胞の活性化により上方制御される。デバイス処理された細胞のヒストグラム形状、集団分布、又は蛍光強度の変化と、ハンドリングコントロールの変化との比較は、μＶＳ曝露がμＶＳ処理細胞のＴ細胞活性化状態に影響を与えることを示す。実験後、細胞をＩＬ−２を含む培養液に戻し、２４時間かけて回復させ、活性化マーカーの発現又は活性化状態の変化のための時間を与えた。マウスＩｇＧ１カッパのアイソタイプコントロールは、Ｔ細胞とはオフターゲットである又は非特異的結合相互作用がないことが事前に測定されていた（図示せず）。したがって、様々なマーカーの蛍光強度の変化は、特定の相互作用によるものであった。
【０１６２】
デバイス処理細胞及びコントロール細胞は、すべてのマーカーについて同じ発現を示した（図５は、各グループの複製からの代表的なデータを示す）。両方のグループのヒストグラムデータはほぼ同じようにマッピングされ、これはμＶＳが処理の２４時間後にＴ細胞の活性化状態を変更しないことを示す。μＶＳによる細胞内送達は高い生存率と回収率をもたらすため、これは有利ではあるが、エレクトロポレーションを使用して見られる結果とは対照的に、Ｔ細胞活性化の状態を摂動することはない。図５は、Ｔ細胞活性化プロファイルの概要を示す。処理後及び２４時間の細胞培養後、ハンドリングコントロール及び処理コントロールからの各複製は、μＶＳ曝露がＴ細胞活性化状態において変化を引き起こすかどうかを評価するため、活性化のマーカー（ＣＤ６９、ＣＤ１５４、ＣＤ４４、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２５）に対する蛍光抗体で個別に標識された。処理されたコントロール細胞とハンドリングコントロール細胞グループのそれぞれからの複製がＦｌｏｗＪｏを使用してプロットされ、ヒストグラムデータがオーバーレイされた。すべてのグループについて、活性化マーカーの発現は、コントロールグループとデバイス処理グループの間で同じままであった。フローサイトメトリーデータの代表的なオーバーレイが上にプロットされ、処理されたコントロールが赤の破線で示され、ハンドリングコントロールが青で示されている。オーバーレイされたデータに基づくと、μＶＳを介した処理を理由としての、汎Ｔ細胞の活性化状態と活性化／ナイーブ性マーカーの発現は変化していない。
【０１６３】
結論：この実施例は、ヒト汎Ｔ細胞へのｍＲＮＡの細胞内送達を可能にする、渦放出又はμＶＳに基づいて、流体力学的条件を生成するために使用されるマイクロ流体ポスト配列の使用について説明した。この方法とデバイスは、ｍＲＮＡの汎Ｔ細胞への効率的な送達を可能とし、ｍＲＮＡを８０μｇｍＬ−１の濃度で、２００万細胞Ｓ−１を超える処理速度で送達する場合、高い細胞回収率（例えば、９６．３±１．１％、平均±ｓｔｄｅｖ）、高い細胞生存率（例えば、８３．７±０．７％）、有意なＥＧＦＰ発現（例えば、５７．４±６．８％）を生じさせ、回収され、生存し、ＥＧＦＰを発現する、汎Ｔ細胞の、４６．３±５．６％の収率をもたらした。μＶＳは、Ｔ細胞の活性化状態を変化させることなく、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団においても均等なＥＧＦＰ発現プロファイルをもたらすことが示される。好都合なことに、マイクロ流体デバイスは、業界標準のプロセスで製造することができ、比較的単純な機能形状であり、そのため（１）デバイスの歩留まりが高く（２）スケールの変更が容易である。
【０１６４】
〔実施例２：流体力学的プラスミド送達〕
ｍＲＮＡだけでなく、流体力学的孔形成を介した細胞内送達の有用性を評価するため、２５ｍトレハロースと７．５％ＤＭＳＯが補充されたＸ−ＶＩＶＯＴＭ２０培地を使用した５．７ｋｂＤＮＡプラスミド（ｐＪＴＩＴＭＲ４ＥｘｐＣＭＶＥｍＧＦＰｐＡＶｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ１４１４６）の送達は、この実施例において特に明記されていない限り、実施例１と同じプロトコルを使用して検討された。汎Ｔ細胞は、１６ｘ１０６細胞ｍｌ−１の濃度で再懸濁される前に、１回又は２回活性化され、１２０ｐｓｉｇの操作圧力で、実施例１に記載されたのと同じデバイスで処理される前に、１．５μｇｍｌ−１の濃度でＥＧＦＰプラスミドと混合された。シングル活性化及びダブル活性化細胞集団のＥＧＦＰ発現は、業界標準のフローサイトメトリー技術を使用して、処理後４３時間の間に評価された。図９ａに示すように、活性化され、少なくとも７日間培養され、その後の２番目の再活性化ステップを経た処理された細胞の４．１４％がＥＧＦＰ＋で、単一活性化汎Ｔ細胞の０．７５％がＥＧＦＰ＋だった（図９（ｂ）を参照）。実際には、μＶＳのみを使用して５．７ｋｂのプラスミドをヒトパンＴ細胞に送達した後のＥｍＧＦＰ（エメラルドグリーン蛍光タンパク質）プラスミド発現。活性化後、μＶＳを使用してＥｍＧＦＰプラスミドでヒト汎Ｔ細胞を処理し、その後処理後活性化ステップを実行すると、４．１４％のＥｍＧＦＰ発現が達成され、一方、単一活性化に続いてμＶＳをにより汎Ｔ細胞を処理して、０．７５％のＥＧＦＰ発現が達成される。
【０１６５】
こうしてみると、また実施例１で考察したｍＲＮＡデータと比較してみると、このデータは、プラスミド取り込みがμＶＳで可能であることを示しているが、発現レベルは、ｍＲＮＡ送達後のＥＧＦＰ発現よりも大幅に低くなる。これは、電気流体力学的細胞内送達の必要性を示しており、ここでは、電場と流体力学的孔形成を組み合わせることで、取り込みが強化され、エレクトロソニックマイクロジェットの放出を電場と組み合わせたときの、電場による細胞圧搾などを組み合わせるときに見られる後続する発現がある。
【０１６６】
〔実施例３：細胞内送達の最適化〕
μＶＳを介した遺伝子改変は、ＧＭＣＴの生産のための臨床的及び商業的製造の進歩及び改善をサポートするための最適なプラットフォームである。上記の実施例に記載されている送達効率は、本明細書に記載されているような、異なる荷電外来性物質を使用した電気マイクロ流体渦放出（ｅμＶＳ）で改善することができる。
【０１６７】
上述の送達効率は、図６に示すように、相互嵌合された白金電極の統合により次の処理を同時又は逐次に行って、最適化することができる。（１）μＶＳを介した膜透過処理、及び（２）電気マイクロ流体渦放出（ｅμＶＳβ）を介したインシトゥで活性な電気泳動送達又は細胞内送達。白金電極の統合では、活性化された（電気泳動などの）移転が、細胞生存率や細胞状態の摂動に悪影響を与えることなく、μＶＳの送達効率を高めることができるかどうかを判断しようとする場合がある。ｅμＶＳは、±ＤＣ電流とともに、増分ＤＣオフセットでのＡＣ電流に基づいて評価することもできる。ＦＡＣＳさらに、ｅμＶＳは、細胞選択（例えば、蛍光活性化細胞分類又はＦＡＣＳ）と組み合わせて、高純度の遺伝子改変された細胞集団を取得できる。図６は、電気マイクロ流体渦放出（ｅμＶＳ）の概要を示しており、ここで示されるのは（ａ）細胞とｍＲＮＡ又はその他の外来性物質が懸濁液中で混合されている、（ｂ）ポストを通過する懸濁液のフローが渦又は不安定なフローを生み出している、（ｃ）渦が細胞膜を破壊している、（ｄ）相互嵌合された電極からの電場が活性化してｍＲＮＡ又は他の外来性物質をサイトゾルに送達する（ｅ）細胞膜が回復する。
【０１６８】
μＶＳの流体力学的側面は、次のように開発された。設計形状には、約４．８ｍｍｘ９．８ｍｍｘ１．４ｍｍ（長さｘ幅ｘ高さ又は厚さ）のチップが含まれ、これには約７．５ｍｍｘ１ｍｍｘ０．０４ｍｍの深さの反応性イオンエッチングされたマイクロ流体フローセルが含まれ、単一の入口と単一の出口を有する。入口と出口は、レーザー加工がなされ約７００μｍの内径を有する。フローセル内には、６行（フロー方向）及び１７列（フロー垂直）のポストからなるポスト配列を含み、ここで、ポストは、４０μｍの直径、及びフローセル深度に等しい４０μｍの高さを有する。ポストの行は４００μｍ（フロー方向）ピッチを有し、ポストの列は６０μｍ（フロー垂直）ピッチを有する。典型的なμＶＳ設計形状の概略図を図７に示す。具体的には、図７は、１つのμＶＳ設計のフローセルの概略図を示しており、これは次の形状からなる。約４．８ｍｍｘ９．８ｍｍｘ１．４ｍｍ（長さｘ幅ｘ高さ又は厚さ）のチップが含まれ、これには約７．５ｍｍｘ１ｍｍｘ０．０４ｍｍの深さの反応性イオンエッチングされたマイクロ流体フローセルが含まれ、単一の入口と単一の出口を有する。入口と出口は、レーザー加工がなされ約７００μｍの内径を有する。フローセル内には、６行（フロー方向）及び１７列（フロー垂直）のポストからなるポスト配列を含み、ここで、ポストは、４０μｍの直径、及びフローセル深度に等しい４０μｍの高さを有する。ポストの行は４００μｍ（フロー方向）ピッチを有し、ポストの列は６０μｍ（フロー垂直）ピッチを有する。基板には、ｅμＶＳの蓋に接着した後の電気的アクセス用の８つの貫通孔も含まれている。
【０１６９】
送達効率をさらに最適化するために、相互嵌合された白金電極は、インシトゥで活性な電気泳動送達又はｅμＶＳのためのクオーツ設計に統合されてもよい。これは、スパッタコーティングによる白金電極の堆積によって達成され、レーザー加工された入口と出口の穴があるボロフロート基板にリフトオフし、（３）蓋（図８を参照）とフローセル基板（図７を参照）の陽極接合を行う。相互嵌合された白金電極は、２５μｍの幅（フロー方向）及び１５０μｍのピッチでフローセル全体（フロー垂直）に広がり、１５０μｍのピッチで１２５μｍの電極間間隔をもたらすことができる。このため、電極間隔とフローセル高さとの間の比率が〜３．１となり、電極間に均一な電場を生成するために役立つ。隔離された配列及び出口電極列が提供され得、各電極列は、約２ｍｍ（フロー方向）の領域を占める電極配列は、マイクロピンプローブ又は代替の導電性媒体を使用して、反対側にある基板のレーザー加工穴からアクセスできる。さらに、熱電対をフローパスに組み込んで、温度の変化を監視することもできる。特に、図８は、流体アクセスのための貫通孔と共に相互嵌合された白金電極を含むｅμＶＳ蓋の略図である。この設計は、スパッタコーティングによる白金電極の堆積によって達成され、レーザー加工された入口と出口の穴があるボロフロート基板にリフトオフした。相互嵌合された白金電極は、２５μｍの幅（フロー方向）及び１５０μｍのピッチで１２５μｍの電極間間隔をもたらし、フローセル全体（フロー垂直）に広がる。ポスト配列領域と出口領域に隔離された配列が存在し、各電極列は、約２ｍｍ（フロー方向）の領域を占める。電極配列は、マイクロピンプローブ又は代替の導電性媒体を使用して、反対側にある基板のレーザー加工穴からアクセスでき、蓋は、陽極接合、真空接合又は同様の接合技術を使用してフローセル基板に接合されてもよい。
【０１７０】
作製後、電極は、トランスフェクション培地（実施例１を参照）で洗い流しながら、室温（例：２０°Ｃ）及び代表的な体積流量（例：１ｍｌｓ−）で特性評価でき、電極間のインピーダンスを測定し（４端子）、適用されたさまざまなピーク間電圧（例えば、１〜１Ｖｐｐ）の電場強度（例えば、ｋＶｍ−１）を測定する。これはまた、培地組成又は温度の変化で補われてもよい。最大印加電圧は、電極の劣化寿命によって決定でき、交流電流を使用して、電極での気泡形成を最小限に抑えることができる。上記の設計内での推定ピークセル速度は１５〜５０ｍｓ−１に達し、最小２．５〜８．３−μｓの電極間セル滞留時間を生じる。５ＭＨｚＡＣ正弦波を使用して、正弦波の周期を確保でき、これはより低い周波数がより低いピーク細胞速度のために使用される、最小及び推定電極間セル滞留時間よりも大幅に短い（例えば、１２．５倍）。特定の細胞型ごとに異なる最適なμＶＳフローセル設計及び電極設計と、特定の外来性物質又は薬剤ごとに最適なｅμＶＳプロトコルが必要になると想定される。
【０１７１】
〔実施例４：静止時ＰＢＭＣに対するｍＲＮＡのｅμＶ−電圧スクリーン〕
電気泳動力と組み合わせた流体力学的孔形成を介した細胞内送達の有用性を評価するために、我々は、ＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎＢｕｆｆｅｒＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＣａｔｎｏ。ＭＰＫ１００９６）を使用した静止ＰＢＭＣへのｍＲＮＡの送達を調べた。この実施例で別段の特定がない限り、実施例１と同じプロトコルを使用して細胞を前処理した。ろ過とカウントの後、すべての細胞を適切なチューブに等量で分配し、所定の実験のための数量のサンプルを作成した。
【０１７２】
所与の電圧、周波数、ＤＣオフセット、及び信号形状での外部電場力は、ベンチトップ関数発生器（テクトロニクス、ＡＦＧ３０１１Ｃ）及び線形電源（ペボノ、ＰＳ３０５Ｈ０〜３０Ｖ）に構成された。ｅμＶＳチップは２２００オームの電流制限抵抗に直列に接続され、電場のシステムによる監視のための分圧器回路を作成した。
【０１７３】
ｅμＶＳ試験リグの開発：試験リグは、マイクロ流体デバイスを操作するために開発された。流体がデバイスを流れている間、０〜１５０ｐｓｉｇの間の、低電圧から高電圧をチップに供給できる。チップ上の白金電極パッドは、８電気ピン接続（ＭｃＭａｓｔｅｒＣａｒｒ、５９４９Ｔ６２）を備えた外部アダプターにはんだ付けされたスプリングプローブに曝露された。圧縮された窒素タンクは、校正された２段階レギュレータを使用して、１４０ＰＳＩを供給するように調整された。体積流量は、校正済み質量流量計（ＡｌｉｃａｔＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍ−１ＳＬＰＭ−Ｄ）で測定された。図１（ｆ）に示すように、サンプルは１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに収容され、サンプル収集用のアウトレットチューブを備えた内部固定具に連結されたチューブアダプター（Ｅｌｖｅｆｌｏｗ、ＫＲＸＳ）に配置された。２チャネルのデジタルストレージオシロスコープ（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ、ＴＢＳ１０５２Ｂ）を接続して、ファンクションジェネレーターからの入力信号とｅμＶＳチップの出力信号を監視する。印加された信号は、２５μｍの幅（フロー方向）と、１２５μｍの電極間間隔ｅμＶＳを生じさせる１５０μｍのピッチとを有するフローセル全体（フロー垂直）に広がる相互嵌合された白金電極に送られる。
【０１７４】
電場の校正及び特性評価：細胞は、ｅμＶＳデバイス内を特定の速度、ｖａｖｇ、で移動する。細胞は、電極板の総距離によって定義される設定された時間、ｌｅｆｌｅｌｄ、の間、電場を通過する。細胞が電場で費やす合計時間は、次のように表すことができる。
【数７】
2021501608.tif 000011
細胞のバルクグループに適用される信号のパルス持続時間は、関数発生器から生成される入力周波数に関連する。
【数８】
2021501608.tif 000012
ここで、ｆはヘルツ単位の入力信号周波数であり、Ｔｐｕｌｓｓはセルに送達される単一パルスの持続時間である。細胞が経験するパルス数は、細胞が電場を移動するのに費やす合計時間に関連する。それは次のように表すことができる。
【数９】
2021501608.tif 000013
細胞と外来性物質がｅμＶＳチップを通過すると、それらは次によって近似される電場力を経験する。
【数１０】
2021501608.tif 000014
【０１７５】
印加電圧が関数発生器によって設定されたピークツーピーク電圧である場合、白金電極間の間隔は、試験が行われる前に設計及び製造される。電気的送達の成功は、細胞が電場を通過する速度、（ｉｉ）この電場の大きさ、及び（ｉｉｉ）細胞膜が経験するパルスの数、に依存する。細胞が最初に非定常フローによって引き起こされる物理的変形を経験するので、細胞膜はわずかに開いており、伝統的に、外来性物質が細胞に拡散する。代わりに、ｅμＶＳを使用して、低電圧の電気泳動力が外来性物質の細胞への送達を支援する。
【０１７６】
末梢血単核細胞（ＰＢＣ）培養：５，０００万個までの凍結保存されたＰＢＭＣを含む個々のサンプルバイアル瓶を解凍し、１日間（１６〜３２時間）静止した。実験では、静止期のＰＢＭＣを、最初の培養時間から１日（１６〜３２時間）でトランスフェクションを起こさせられた。
【０１７７】
ＰＢＭＣサンプルの調製及び処理：トランスフェクションの直前に、８０μＬのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ（１μｇ／μＬＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈＰＮＬ−６３０１−１０００）を、２００μｇ／ｍＬのｍＲＮＡ濃度でトランスフェクションを起こさせられる各サンプルに加えた（１対５の比率）。ｍＲＮＡと５．０〜７．０ｘ１０６細胞／ｍＬの範囲の濃度の細胞サンプルをピペッティングで混合した。次に、窒素ガスを使用してさまざまな圧力でさまざまな電気的条件で細胞を実験治具で処理し、３７℃に予熱されたＸＶＩＶＯ１０又は１５を含む１５ｍＬファルコンチューブに捕獲した。ｍＲＮＡをＰＢＭＣに送達する前に、流量及びその他の実験の詳細が記録される。
【０１７８】
異なる濃度及び電気的条件での静止ＰＢＭＣへのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ送達：ｅμＶＳは、動いているバルク細胞に電場を加え、これは処理時間とＴ細胞の健康への影響を減少させる。複数の実験にわたって、２００μｇ／ｍＬｍＲＮＡをＰＢＭＣに送達すると、２１時間で、処理された生きた細胞集団の約２８．９％から９１．１％の範囲で、ＥＧＦＰ発現が得られた（図１０）。この発現範囲は、２．７３％〜１６．３１％の送達収量範囲に対応し、これは、μＶＳと比較してて０％〜３４．３５％の向上を表す。ｅμＶＳは、特定の電気的条件で、通常より高い送達効率とわずかに低い又は同等の細胞生存率（例えば、７５％を超える）を有する。潜在的なストレスや損傷は、細胞が低血清から無血清の培地、又は高電圧環境に長期間置かれると、発生する可能性がある。μＶＳと同様に、ｅμＶＳは処理時間は短いため、処理後すぐに細胞を細胞培養液に戻すことができる。したがって、低電圧の電気泳動力は、標準のμＶＳと比較して、細胞への過剰なストレスや損傷を引き起こすことなく、効率を向上させる。
【０１７９】
ｅμＶＳを最適化するための考慮事項には、適切な電気的特性（例えば、電圧、周波数、ＤＣオフセット、信号タイプ）及び生物学的条件（例えば、とりわけ、培養培地、処理培地、細胞の濃度、外来性物質、及び細胞型）の選択が含まれる。考慮事項にはまた、ポスト配列の設計の最適化や、相互嵌合された白金電極の構成も含まれる。これらの変数は一緒になって、ｅμＶＳによる孔形成及び細胞回復の全体的な容易さに影響を与える可能性もある。エレクトロポレーションを使用してｍＲＮＡをＰＢＭＣに送達する場合に一般的に見られる生存率と同様に、生存率が低下する傾向は、ｅμＶＳチップデザインの最初のバージョンにおいて、０ＶＤＣオフセットの、１ＭＨｚの周波数で、６０Ｖ後に発生する。これは、細胞に適用される３．２ｋＶ／ｃｍを超える推定電場力に相当し、印加された電場が流体のフローの中の細胞を殺すように思われる閾値電圧を示す。上記の機器を使用して、さまざまな電気条件を設定しました。４０ＶでＤＣオフセットが１０Ｖの１ＭＨｚの正弦波では、静止状態のＰＢＭＣに対するｍＲＮＡの回収率、生存率、及び送達効率がそれぞれ５２％、７９．４％、及び３８．１％であることがわかった。これらの結果は、電場を追加すると、標準的なμＶＳの収量が約３０％向上することを示している。異なる処理培地の組成、例えば、より伝導性のあるもの、又はｅμＶＳの組み合わせ効果に補完性のあるものは、これらの結果を改善する可能性がある。
【０１８０】
ハンドリングコントロールと比較しての、ｅμＶＳを使用して処理されたすべてのグループの生存率の低下は、膜修復の不成功、バルクの機械的溶解、印加された電場により生じたオーム加熱、及び培地ストレスにより、培養に戻ったときに細胞死が増加したためと思われる。
【０１８１】
こうしてみると、また実施例１で考察したｍＲＮＡデータと比較してみると、このデータは、ｅμＶＳを用いてｍＲＮＡの送達向上が可能であることを示している。細胞生存率は維持され、外来性物質の送達はμＶＳに比べて向上する（図１０及び１１）。図１０及び１１は、μＶＳ及びｅμＶＳ処理後の、（１）２１時間後及び（２）４２．５時間後の、静止ＰＢＭＣへのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ送達後の、ＥＧＦＰ発現、細胞生存率、収量、及び回復を示す。ＥＧＦＰ発現（ｅ）と生存率（ｖ）を測定し、処理後に回収された細胞数（ｒ）を計算した。次に、これらの３つの測定値を使用して、式ｙ＝ｅｖｒを使用して、生きたＥＧＦＰ発現細胞の収量（ｙ）を計算した。ｅμＶＳを使用した静止ＰＢＭＣへのｍＲＮＡの送達の向上は、μＶＳと比較した場合に、異なる電気的条件で観察された。さらに、０ＶＤＣオフセットで１ＭＨｚの周波数で６０Ｖを超える増加した電圧レベルでは、細胞生存率の低下が観察され、収量の低下につながった。
【０１８２】
図１２及び１３は、変動する電気的条件で、０Ｖ〜３０Ｖの範囲のＤＣオフセットで、２０時間（図１２）及び４３時間（図１２）でのｅμＶＳ処理後の静止ＰＢＭＣへのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ送達後のＥＧＦＰ発現、細胞生存率、収量及び回収のグラフ表示を示す。ＥＧＦＰ発現（ｅ）と生存率（ｖ）を測定し、処理後に回収された細胞数（ｒ）を計算した。次に、これらの３つの測定値を使用して、式ｙ＝ｅｖｒを使用して、生きたＥＧＦＰ発現細胞の収量（ｙ）を計算した。ｅμＶＳを使用した静止ＰＢＭＣへのｍＲＮＡの送達の向上は、μＶＳと比較して異なる電気的条件で観察されたが、３０ＶＤＣオフセットで１ＭＨｚの周波数で４０Ｖを超える増加した電圧レベルでは、細胞生存率の低下が観察され、これは収量の減少をもたらした。低周波数のＤＣオフセット。
【０１８３】
Ｔ細胞活性化での無変化：上述したように、初代ヒト免疫細胞のエレクトロポレーションは、Ｔ細胞の活性化マーカーを増加させる。したがって、Ｔ細胞活性化に対するｅμＶＳの影響を調べることが重要である（図１４〜１７）。Ｔ細胞活性化に対するｐＶＳベースのｍＲＮＡ送達の影響を評価するために、ハンドリングコントロール細胞、ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓで一晩活性化されたハンドリングコントロール細胞、ｍＲＮＡコントロール細胞、及びデバイス処理された細胞が、培養に戻った後、２４時間から４８時間（示されているように）、さまざまな活性化マーカーに対する蛍光標識抗体で標識された。コントロール及びデバイス処理グループの各複製からのに１つのサンプルを培養物から取り出し、ＤＰＢＳにより９６ウェルプレートで希釈した。遠心分離（２分８００ｘｇ）により細胞をペレット化し、上清を吸引除去し、サンプルあたり次のいずれかのＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒモノクローナル抗体を２５μＬｍＬ−１含むＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＣＤ８ａ−ＰＥ（１２−００８８−４２），ＣＤ４５ＲＡ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（４５−０４５８−４２），ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ−Ｃｙ７（２５−０４５７−４２），ＣＤ１３７−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（Ａ５１０１９），ＣＤ３−ＡＦ７００（５６−００３７−４２），ＣＤ４−ＡＰＣ−ｅＦ７８０（５６−００３７−４２），ＣＤ６９−ｅＦｌｕｏｒ４５０（４８−０６９９−４２），ＬｉｖｅＤｅａｄＡｑｕａＳｔａｉｎ（＃），ＣＤ６２Ｌ−ＳｕｐｅｒＢｒｉｇｈｔ６００（６３−０６２９−４２），ＣＤ２５−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７１１（３０２６３６）．サンプルを氷上で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回すすぎ、フローサイトメトリーで分析した。活性化のマーカーＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１３７、及び活性化時に下方制御される他のマーカーＣＤ４５ＲＡとＣＤ６２Ｌの発現を調べた。ＣＤ２５は、ＣＤ６９に比べて活性化が遅いマーカーであり、細胞の活性化時に増加し、ＣＤ６９よりも長く活性化されて細胞表面に持続する。ＣＤ４５ＲＡはナイーブＴ細胞（Ｔｎ）に見られ、活性化と記憶の形成時に失われる（Ｔｎ＝ＣＤ４５＋、ＣＤ６２Ｌ＋）。ＣＤ４５ＲＯは、記憶細胞Ｔｅｒｎ（Ｔｃｍ＝ＣＤ４５−、ＣＤ６２Ｌ＋）に一般的に見られるマーカーである。ＣＤ６２Ｌは、活性化すると一般的に下方制御される。デバイス処理された細胞のヒストグラム形状、集団分布、又は蛍光強度の変化と、ハンドリングコントロールの変化との比較は、ｅμＶＳ曝露がｅμＶＳ処理細胞のＴ細胞活性化状態に影響を与えることを示す。実験後、細胞をＩＬ−２を含む培養液に戻し、２４時間〜４８時間かけて回復させ、活性化マーカーの発現又は活性化状態の変化のための時間を与えた。マウスＩｇＧ１カッパのアイソタイプコントロールは、Ｔ細胞とはオフターゲットである又は非特異的結合相互作用がないことが事前に測定されていた（図示せず）。したがって、様々なマーカーの蛍光強度の変化は、特定の相互作用によるものであった。
【０１８４】
デバイス処理された細胞とコントロール細胞は、μＶＳ又はｅμＶＳ処理サンプルのいずれにおいても、ハンドリングコントロール又はｍＲＮＡコントロールと比較して、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及びＣＤ１３７の活性化マーカーの発現における変化を示さなかった（図１４〜１７は、各グループの複製からの代表的なデータを示す）。Ｔ細胞サブタイプ集団には、大きな変化は見られなかった。両方のグループからのヒストグラムは、ｅμＶＳが、処理後２４時間から４８時間のＴ細胞の活性化状態を変更しないことを示す。このことは有利である、というのはｅμＶＳによる細胞内送達はμＶＳよりも高い効率をもたらすが、Ｔ細胞活性化の状態を摂動させないからである。特に、図１４は、処理後４８時間での静止ＰＢＭＣｓのμＶＳ及びｅμＶＳ処理サンプルの表面マーカー発現を示す代表的なヒストグラムのグラフ表示である。ＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞で通常見られるマーカーだが、ＣＤ６２Ｌは活性化すると下方制御される。ＣＤ４５ＲＯマーカーとＣＤ４５ＲＡマーカーはそれぞれ、記憶細胞とナイーブ細胞のＴ細胞サブタイプを表す。ＥＧＦＰ発現もプロットされた。徐々に濃い灰色の線は、ｍＲＮＡハンドリングコントロール（最も明るいグレー）とハンドリングコントロール（中程度のグレー）を表し、これらは陰性コントロールとして機能する。μＶＳサンプルは最も濃い灰色で、黒い実線はｅμＶＳ（４０Ｖ１ＭＨｚ）サンプルを表す。黒い点線は、活性化されたハンドリングコントロールサンプルに対応しており、このサンプルはＣＤ３／２８ダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）によって一晩活性化され、Ｔ細胞活性化プロファイルの陽性コントロールとして機能する。活性化マーカー発現の発現増加又はＴ細胞サブセット表現型の変化は、μＶＳ及びｅμＶＳ処理細胞のいずれにおいても観察されなかった。図１５は、処理後４８時間でのμＶＳ又はｅμＶＳを使用して処理された静止ＰＢＭＣｓにおいて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団に分割されたＣＤ３＋細胞におけるさまざまな活性化又はＴ細胞系統表面マーカーの発現プロファイルを表す。図１６は、処理後２４時間での静止ＰＢＭＣｓのｅμＶＳ処理サンプルの表面マーカー発現を示す代表的なヒストグラムのグラフ表示である。ＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞で通常見られるマーカーだが、ＣＤ６２Ｌは活性化すると下方制御される。ＣＤ４５ＲＯマーカーとＣＤ４５ＲＡマーカーはそれぞれ、記憶細胞とナイーブ細胞のＴ細胞サブタイプを表す。ＥＧＦＰ発現もプロットされた。ｍＲＮＡハンドリングコントロール（明るい灰色）とハンドリングコントロール（暗い灰色）は、陰性コントロールとして機能する。黒い実線はｅμＶＳ（４０Ｖ、１ＭＨＺ１０Ｖオフセット）サンプルを表す。黒い点線は、活性化されたハンドリングコントロールサンプルに対応しており、このサンプルはＣＤ３／２８ダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）によって一晩活性化され、Ｔ細胞活性化プロファイルの陽性コントロールとして機能する。活性化マーカー発現の発現増加又はＴ細胞サブセット表現型の変化は、ｅμＶＳ処理細胞において観察されなかった。図１７は、処理後２４時間でのｅμＶＳを使用して処理��れた静止ＰＢＭＣｓにおいて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団に分割されたＣＤ３＋細胞におけるさまざまな活性化又はＴ細胞系統表面マーカーの発現プロファイルを表す。図１８と図１９は、トランスフェクションの１９．５〜２０時間後（図１８）と４７．５時間後（図１９）に収集されたｅμＶＳを使用して一晩活性化されたＰＢＭＣｓにＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを送達した後のＥＧＦＰ発現、細胞生存率、収量、及び回復を示す。これらのグラフはさまざまな電気的条件でのサンプルの結果を示しており、細胞を傷つけず、細胞全体の生存率を低下させることなく、送達の効果的な向上を示す。
【０１８５】
上記の例は、マイクロ流体ポスト配列を組み合わせて使用し、これによりμＶＳとしても知られる非定常流体力学的条件を作成し、低電圧電気泳動力により静止状態及び活性化ＰＢＭＣｓへのｍＲＮＡの細胞内送達を可能する（ｅμＶＳ）ことを記載する。この例で説明する方法とデバイスにより、静止ＰＢＭＣへのｍＲＮＡの効率的な送達が可能となり、ｍＲＮＡ濃度２００μｇｍＬ−１で、高回収率（５２％）、高生存率（８２．４％）、効率の向上（３８．１％）がもたらされた。ｅμＶＳは、静止状態のＰＢＭＣｓと活性化されたＰＢＭＣｓの両方での表面マーカーの発現に見られるように、Ｔ細胞の活性化状態の変化をほとんど又はまったく生じない。本デバイスは、業界標準のプロセスで製造することができ、比較的単純な機能形状であり、そのため（１）デバイスの歩留まりが高く（２）生産のためのスケールの変更が容易なデバイスである。
【０１８６】
〔実施例５：活性化されたＰＢＭＣｓ〕
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養：５，０００万個までの凍結保存されたＰＢＭＣｓを含む個々のサンプルバイアル瓶を解凍し、回復させるため１時間未満培養液に静置した。その後、ＰＢＭＣは、培養下に置かれてから１時間以内にＤｙｎａｂｅａｄｓＨｕｍａｎＴ−ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＣａｔＮｏ．１１１．３１Ｄ）を使用して活性化された。開発実験では、活性化されたＰＢＭＣｓは、活性化時間から１日（１６−３２時間）でトランスフェクションを起こさせられた。
【０１８７】
一晩活性化されたＰＢＭＣの調製及び処理：ＰＢＭＣｓは１８．５時間活性化され、Ｄｙｎａｂｅａｄｓは細胞が３．４ｘ１０６細胞ｍｌ−１の濃度で再懸濁される前に除去された。トランスフェクションの直前に、サンプルを８０μＬのｍＲＮＡ（１μｇ／μＬＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈＰＮＬ−６３０１−１０００）と１μｇ／μＬの濃度で混合した。全サンプルのｍＲＮＡ濃度は２００μｇ／ｍＬで、１対５の比率である。次に、細胞は、実施例４のセクションで詳細に説明されている静止ＰＢＭＣｓと同様に取り扱われ、トランスフェクションを起こさせられ、処理され、培養された。事前に活性化されたハンドリングコントロールは、処理後細胞培養の間に、２つのグループに分割された。グループの１つは、ＤｙｎａｂｅａｄｓＨｕｍａｎＴ−ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／２８で追加の活性化を受けた。
【０１８８】
ｅｕＶＳ法でトランスフェクションを起こさせられた活性化ＰＢＭＣｓの発現及び表現型：ｅμＶＳ技術を使用した、処理され一晩活性化されたＴ細胞の、１９．５時間で取得された、ＥＧＦＰ発現時点では、それぞれ４８．８％、７６．２％、６５．８％、及び２４．５１％の最適なＥＧＦＰ送達、生存率、回収率、及び収量をもたらした（図１８）。最適な電気的構成は、４０Ｖで、０ＶＤＣオフセット、１ＭＨｚ入力周波数だった。活性化表現型の方法は、異なる活性化パネルを使用したことを除いて、静止ＰＢＭＣｓについて上記で説明したものと同じだった。ＣＤ８ａ−ＰＥ（１２−００８８−４２），ＣＤ４５ＲＡ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（４５−０４５８−４２），ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ−Ｃｙ７（２５−０４５７−４２），ＣＤ１３７−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（Ａ５１０１９），ＣＤ３−ＡＦ７００（５６−００３７−４２），ＣＤ４−ＡＰＣ−ｅＦ７８０（５６−００３７−４２），ＣＤ６９−ｅＦｌｕｏｒ４５０（４８−０６９９−４２），ＬｉｖｅＤｅａｄＡｑｕａＳｔａｉｎ（＃），ＣＤ６２Ｌ−ＳｕｐｅｒＢｒｉｇｈｔ６００（６３−０６２９−４２），ＣＤ２５−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７１１（３０２６３６）．μＶＳでトランスフェクションを起こさせられた静止ＰＢＭＣＳのＴ細胞活性化プロファイルと同様に、ｍＲＮＡを活性化ＰＢＭＣに送達するｅμＶＳ法でも、活性化実験後ハンドリングコントロール細胞と比較した場合、活性化表現型プロファイルに大きな変化は見らなかった（図２０及び２１）。図２０は、処理後２４時間での活性化されたＰＢＭＣｓのｅμＶＳ処理サンプルの表面マーカー発現を示す代表的なヒストグラムのグラフ表示である。ＣＤ２５、ＣＤ６９及びＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞で通常見られるマーカーだが、ＣＤ６２Ｌは活性化すると下方制御される。ＣＤ４５ＲＯマーカーとＣＤ４５ＲＡマーカーはそれぞれ、記憶細胞とナイーブ細胞のＴ細胞サブタイプを表す。ＥＧＦＰ発現もプロットされた。ｍＲＮＡハンドリングコントロール（明るい灰色）とハンドリングコントロール（暗い灰色）は、陰性コントロールとして機能する。黒い実線はｅμＶＳ（４０Ｖ、１ＭＨＺオフセットなし）サンプルを表す。黒い点線は、活性化されたハンドリングコントロールサンプルに対応しており、このサンプルはＣＤ３／２８ダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）によって一晩活性化され、Ｔ細胞活性化プロファイルの陽性コントロールとして機能する。活性化マーカー発現の発現増加又はＴ細胞サブセット表現型の変化は、ｅμＶＳ処理細胞において観察されなかった。一方、図２１は、２４時間後にｅμＶＳを使用して処理された一晩活性化されたＰＢＭＣｓにおいて、ＣＤ４＋とＣＤ８＋の集団に分割されたＣＤ３＋細胞におけるさまざまな活性化又はＴ細胞系統表面マーカーの発現プロファイルを表す。
【０１８９】
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、コンピュータープログラム、アルゴリズム、及び刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９０】
本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願の「先行技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
【０１９１】
本明細書を通して、本開示を任意の１つの実施形態又は特徴の特定の収集に限定することなく、本開示の好ましい実施形態を説明することを目的とする。したがって、当業者は、本開示に照らして、本開示の範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態において様々な修正及び変更を行うことができることを理解するであろう。そのような修正及び変更はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【図１】
2021501608.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021501608.tif 000021
【図８】
2021501608.tif 000022
【図９】
2021501608.tif 000023
【図１０】
2021501608.tif 000024
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2021501608.tif 000035
【国際調査報告】
2021501608.tif 000036
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