(57)【要約】  本発明は、乳脂肪から不純物を含まないコレステロールを抽出するための無溶媒方法を開示する。そのように分離されたコレステロールは、ビタミンＤ３の更なる調製に有用である。本発明は更に、高純度の乳脂肪から医薬品グレードのコレステロールを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ．ＣａＣｌ２−コレステロール付加物を得るために、約１：２〜約１：２０の範囲に及ぶモル比の非ケン化乳脂肪を無水塩化カルシウムと共に加熱すること、及び
ｉｉ．純粋なコレステロールを得るために、溶媒中での還流により付加物からコレステロールを分離し、続いて再結晶化すること、
を含む工程を特徴とする、  乳脂肪から医薬品グレードのコレステロールを抽出する無溶媒方法。
【請求項２】
前記加熱が４０〜９０℃の範囲の温度にて実施される、請求項１に記載の無溶媒方法。
【請求項３】
前記加熱が７５〜８５℃の範囲の温度で実施される、請求項２に記載の無溶媒方法。
【請求項４】
工程（ｉｉ）における前記溶媒が、低級アルコール又はケトンから選択される、請求項１に記載の無溶媒方法。
【請求項５】
前記低級アルコールがメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ＩＰＡ、ｎ−ブタノール、イソブタノール、又はｔｅｒｔ−ブタノールから選択され、前記ケトンがアセトン、２−ブタノン、又はメチルイソブチルケトンから選択される、請求項４に記載の無溶媒方法。
【請求項６】
前記コレステロールが９５〜９８％の範囲のＨＰＬＣ純度を特徴とする、請求項１に記載の無溶媒方法。
【請求項７】
ビタミンＤ３の合成のための請求項１の方法によって得られた、医薬品グレードのコレステロール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳脂肪から不純物を含まないコレステロールを抽出するための無溶媒方法に関する。このように単離されたコレステロールは、ビタミンＤ３の更なる調製に有用である。本発明は、高純度の乳脂肪からの医薬品グレードのコレステロールを更に提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＵＰＡＣ名（３β）−コレスタ−５−エン−３−オールを有し、体系名が２，１５−ジメチル−１４−（１，５−ジメチルヘキシル）テトラシクロ［８．７．０．０２’７．０１１’１５］ヘプタコサ−７−エン−５−オールであるコレステロールは、あらゆる高等動物の主要な脂質ステロールであり、生体組織、特に脳や脊髄に分布している。コレステロールは、肝臓、脊髄、及び脳に高濃度で見出される。コレステロールは細胞膜の重要な成分であり、安定性を提供し、ステロイドホルモン、胆汁及びビタミンＤを生合成するための主要な前駆体である。
【０００３】
【化１】
2021501737.tif 000002
【０００４】
コレステロールは、卵黄、内臓肉、エビ、イカ、牛肉、豚肉、鶏肉、魚、羊毛脂、全脂肪乳製品、バター、ハードマーガリン、ラード、ココナッツ油、ギー（澄ましバター）、植物性ギー、パーム油に見出すことができる。これらの供給源は通常、コレステロールをその遊離型及びエステル化型で含有している。
【０００５】
コレステロールの最も重要な供給源は、羊毛から得られるラノリンである。原料羊毛は、３つの主要な不純物、即ち羊毛脂、スイント、汚れを含有し、汚れは羊毛重量の３０〜４０％を構成する。交雑羊毛の脂含有量は約６％である。羊毛脂は、各種の長鎖脂肪酸と長鎖アルコール及びステロールとのエステルからなる、非常に複雑な混合物である。グリセロールエステルが存在しないため、羊毛脂は通常ワックスであり、脂肪ではない。羊毛脂中に存在する脂肪酸の大部分は、ステロール、例えばコレステロール、ラノステロール及びジヒドロラノステロールと少量の他のステロール誘導体からなる。存在する他の脂肪酸としては、Ｃ１０〜Ｃ２６ノルマルパラフィン系列、Ｃ１０〜Ｃ２８偶数炭素原子のイソ酸系列、末端イソブチル基を有し、Ｃ９〜Ｃ３１奇数炭素を有するアンテイソ酸系列、α−ヒドロキシノルマル及びイソ酸、例えば約Ｃ１２〜Ｃ３２の偶数炭素数を有する［Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯＯＨ］、Ｃ１８〜Ｃ３０のｎ−アルコール、Ｃ１８〜Ｃ２６のイソアルコール、Ｃ１７〜Ｃ２７のアンテイソアルコール及び１，２ジオールが挙げられる。羊毛脂の脂肪酸の組成は、さまざまなエステルを形成可能な各種の酸及びアルコールが存在すること考えると、複雑な性質である。
【０００６】
従って、羊毛脂から医薬品グレードのコレステロールを得ることは制限され、費用効果が高く、工業的に拡張可能なコレステロール抽出のための代替供給源が求められている。
【０００７】
当分野において好ましい、そのような供給源の１つは、より高濃度のコレステロールを有する生乳、低温殺菌牛乳、生クリーム、低温殺菌クリーム、バターオイル、又は無水脂肪等から選択される乳製品である。乳脂肪中のコレステロールの含有量は変動することがあり、通例、１００グラムあたり２〜５グラムの総コレステロールが含有されている。更に本質的には、乳脂肪中のコレステロールは全て、遊離コレステロールとして存在し、ごく微量のコレステロールはエステルとして存在する。
【０００８】
水蒸気ストリッピング、二酸化炭素を使用する超臨界流体抽出（ＳＦＥ）、特定の酵素コレステロール還元酵素又はシクロデキストリンを使用する吸着等、乳脂肪からコレステロールを抽出するために多くの技法が採用されている。これらの方法は長期であり、煩雑であり、費用がかかる。
【０００９】
特許文献１は、３５〜８０℃の範囲の温度で吸着剤としてサポニンを使用し、濾過又は遠心分離により不溶性コレステロール：サポニン／珪藻土を分離する、加工乳製品又は未加工乳製品からコレステロールを除去する方法を開示している。しかし、乳脂肪中に存在する３−β−コレステロールエステルはサポニンと複合体を形成しないことが判明している。特許文献１に記載された方法は、コレステロールをエステル化型で分離しない。
【００１０】
特許文献２は、液体無水動物脂肪から遊離脂肪酸（ＦＦＡ）及び好ましくはコレステロールを除去する方法を開示している。この方法では、アルカリ金属塩基の希釈溶液を使用してＦＦＡの塩を形成し、次にアルカリ金属塩を使用して動物脂肪からＦＦＡを析出させる。好ましくは、コレステロールを除去する方法でシクロデキストリンが使用される。特許文献２に記載されている方法には、最初のけん化と、後続のベータ−シクロデキストリンを使用するＦＦＡ（コレステロール）の分離が含まれる。特許文献２に記載されている方法は、低温での比較的長い反応時間方法に基づき、けん化による中性脂肪の損失による、さもなければ収量に有害であるけん化のために、塩基量を制御して使用することが必要である。
【００１１】
特許文献３は、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、塩化亜鉛、塩化カルシウム、硝酸マンガン、硫酸マンガン、塩化マンガンを含む金属塩を含浸させた炭素；アミド及びヌクレオチドから選択される水溶性又はアルコール可溶性有機化合物を含浸させた炭素；多孔質ガラス、セラミック又はプラスチック；無機塩及び／又は選択されたアミド及びヌクレオチドを含浸させたアルミナ、シリカ、ゼオライト及びマグネシアから選択される吸着剤を充填した固定及び脈動炭素カラムを使用して、食用脂肪、特に乳脂肪からステロールを除去する方法に関する。
【００１２】
特許文献４は、好ましくは溶媒又は溶媒混合物（例えばアルコール／水混合物）中で行われるケン化と、これに続く、高温で少なくとも１つの非水混和性溶媒による抽出を含む、乳脂肪からのコレステロールの抽出方法について記載している。特許文献４の方法は、高温におけるコレステロールの液体抽出であり、収量及び純度は低い。
【００１３】
ビタミンＤ３の生産の前駆体としても作用する、医薬品グレードのコレステロールの商業的価値に照らして、乳脂肪からコレステロールを高収量及び高純度で抽出するための、費用効果の高い改良された方法を提供する技術が必要である。これは依然として本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５３２６５７９号明細書
【特許文献２】米国特許第６１２９９４５号明細書
【特許文献３】欧州特許第０３１８３２６号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１６０９６９８８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、得られたコレステロールが実質的に不純物を含まず、ビタミンＤ３の調製に使用できる、乳脂肪からコレステロールを抽出するための、費用効果の高い無溶媒方法を提供することによって満足される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、乳脂肪から高純度コレステロールを抽出する無溶媒方法は、
ｉ．ＣａＣｌ２−コレステロール付加物を得るために、１：１〜１：１２の範囲に及ぶモル比で未けん化乳脂肪を無水塩化カルシウムと共に加熱すること、及び
ｉｉ．純粋なコレステロールを得るために、溶媒中での還流により付加物からコレステロールを分離し、続いて再結晶化すること
を含む。
【００１７】
一態様において、本発明は、９５〜９８％の範囲のＨＰＬＣ純度を特徴とする、乳脂肪の医薬品グレードのコレステロールを提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、本発明により得られた乳脂肪の純粋なコレステロールからビタミンＤ３を製造する方法を提供する。従って、コレステロールは、本出願人により出願された国際出願ＩＮ２０１５／０００１９８号明細書に従って、７−デヒドロコレステロール（７−ＤＨＣ；プロビタミンＤ３）に変換され、７−ＤＨＣは照射によってビタミンＤ３に変換される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】標準（ＳＴＤ）コレステロールのクロマトグラムを示す。
【図２】本方法で得られたコレステロールのクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、乳脂肪から高純度のコレステロールを抽出するための無溶媒方法に関する。本方法は、乳脂肪の機能性、風味又は他の特性に影響し得る初期段階において、潜在的に有害な溶媒と乳脂肪の接触を回避する。更にケン化がないため、中性脂肪の損失につながり、所望の生成物の低い収量がもたらされ得る、塩基の使用が妨げられる。コレステロールを含まない単離された乳脂肪を水で洗浄して、微量の無機不純物を除去する。コレステロールを含まない残留乳脂肪は、乳業においてその独自の用途に使用できる。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、乳脂肪から高純度コレステロールを抽出するための費用効果の高い無溶媒方法であって、
ｉ．ＣａＣｌ２−コレステロール付加物を得るために、約１：２〜約１：２０の範囲に及ぶ比率で未けん化乳脂肪を無水塩化カルシウムと共に加熱すること、及び
ｉｉ．純粋なコレステロールを得るために、溶媒中での還流により付加物からコレステロールを分離し、続いて再結晶化すること、
を含む工程を特徴とする方法に関する。
【００２２】
本発明の乳脂肪としては、液体スキムミルク、限外ろ過スキムミルク、濃縮スキムミルク、及びスキムミルクの各種誘導体等のスキムミルク、還元液体乳清、乳清粉末、乳清タンパク質単離物等の乳清製品、全乳、低脂肪、還元脱脂粉乳、並びにこれらの食品中の相当量のコレステロールを与えるもの等が挙げられる。コレステロールの含有量は、通常、乳脂肪１グラムあたり２〜５グラムの範囲に及ぶ。
【００２３】
したがって、この方法は、遊離コレステロールの付加生成物を得るために、約１：２〜約１：２０の範囲に及ぶモル比でステロール含有非けん化乳脂肪を無水塩化カルシウムと共に無溶媒媒体中で加熱することを含む。加熱は、４０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃、最も好ましくは７５〜８５℃の範囲の温度にて２〜１０時間行う。
【００２４】
次いで、反応塊を４０〜５０℃まで冷却し、１０〜３６時間同温度に維持し、濾過する。コレステロール付加物を有機溶媒に懸濁させて、１〜１０時間、好ましくは１〜５時間、より好ましくは２〜４時間還流させる。反応塊を０〜５０℃、好ましくは１５〜４５℃、より好ましくは２０〜３０℃まで冷却し、同温度で約２〜３時間撹拌し、濾過して、有機溶媒で更に洗浄し、真空下で乾燥させてコレステロールを得る。
【００２５】
単離した粗コレステロールを、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ＩＰＡ、ｎ−ブタノール、イソブタノール、又はｔｅｒｔ−ブタノール等の低級アルコール、好ましくはメタノール、あるいはアセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトンから選択されるケトン、好ましくはアセトンから選択される溶媒中での結晶化によって更に精製する。
【００２６】
コレステロール−塩化カルシウム付加物の濾過後に得られるコレステロールを含まない残留乳脂肪は、乳業が要求する品質基準を満足し、乳業においてその独自の用途に使用できる。
【００２７】
一実施形態において、本方法により得られたコレステロールは、不純物を実質的に含まず、以下の比較表１及び２に示すように、９５〜９９％の範囲のＨＰＬＣ純度を特徴とする。医薬品グレードのコレステロールは、ビタミンＤ３を更に調製するための前駆体として使用することができる。
【００２８】
表１：標準コレステロールのＨＰＬＣデータ（図１参照）
【表１】
2021501737.tif 000003
【００２９】
表２：本方法で得られたコレステロールのＨＰＬＣデータ（図１参照）
【表２】
2021501737.tif 000004
【００３０】
別の実施形態において、本発明の乳脂肪から得られた医薬品グレードのコレステロールからのビタミンＤ３の調製方法は、（ａ）本出願人により出願された国際出願ＩＮ２０１５／０００１９８号明細書に従って、コレステロールを７−デヒドロコレステロール（７−ＤＨＣ；プロビタミンＤ３）に変換すること、及び（ｉｉ）照射により７−ＤＨＣをビタミンＤ３に変換することを含む。
【００３１】
本発明の有利な実施形態において、コレステロールの抽出に使用される乳脂肪は、初期段階で溶媒に暴露されないので、乳脂肪の機能性、風味又は他の特性がそれにより妨げられない。ケン化がないため、中性脂肪の損失につながり得て、所望の生成物の収量低下が生じる、塩基の使用が妨げられる。高品質のコレステロールを含まない残留乳脂肪は、その要件に従って、乳業で更なる用途にできる。本方法により得られたコレステロールは医薬品グレードであり、ビタミンＤ３を更に調製するための前駆体として使用することができる。本方法は簡単であり、最小限のワークアップステップで工業的に実行可能である。
【実施例】
【００３２】
本明細書の例は、本開示の特定の態様を例示するために提供されて、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
実施例１：乳脂肪からのコレステロール
乳脂肪（１００グラム）と無水塩化カルシウム（８．５グラム）を８０℃にて２〜４時間加熱した。反応塊を４５℃まで冷却し、同温度にて１５時間維持した。反応塊を４５℃にて濾過し、コレステロール付加物の固体残渣をメタノール（１００ｍｌ）に懸濁させた。反応塊を４〜６時間還流させ、２５〜３０℃まで冷却し、同温度にて２〜３時間撹拌し、濾過して、メタノール（１０ｍｌ）で洗浄して粗コレステロールを得た。粗コレステロールをメタノール（１００ｍｌ）に溶解して再結晶させ、濾過し、２０〜５０ｍｌの冷メタノールで洗浄して、４５℃にて真空乾燥して純粋なコレステロールを得た。
【００３４】
収量：３５グラム
ＨＰＬＣ純度：９６〜９９％。
【００３５】
上記の説明は例示的であり、限定的ではないことを理解されたい。説明を検討すれば、多くの実施形態が当業者には明らかとなる。従って、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるべきではなく、代わりに、添付の特許請求の範囲並びにそのような特許請求の範囲が権利を付与する均等物の全範囲を参照して決定されるべきである。
【図１】
2021501737.tif 000005
【図２】
2021501737.tif 000006
【国際調査報告】
2021501737.tif 000007
2021501737.tif 000008