(57)【要約】  本発明は、ヒトＴ細胞受容体のＴＲＢＶ９ファミリーに特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、発現ベクター、該抗体を産生するための方法、およびヒトＴ細胞受容体のファミリーと関連する疾患または障害を治療するための前記抗体の使用にも関する。本発明は、ＴＲＢＶ９ファミリーのＴ細胞受容体を所持するＴ細胞を除去するために、特に、その病因形成においてＴＲＢＶ９ファミリーのＴ細胞が関与する、強直性脊椎炎、セリアック病、および血液の癌を治療するために、用いてもよい抗体の産生にも向けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴ細胞受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって：
１）ＨＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインであって、ここで
ＨＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を含み、
ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を含み、
ＨＣＤＲ３は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６の群より選択されるアミノ酸配列を含む
前記重鎖可変ドメイン；
２）ＬＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインであって、ここで
ＬＣＤＲ１は配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ＬＣＤＲ２は配列番号８のアミノ酸配列を含み、
ＬＣＤＲ３は配列番号９のアミノ酸配列を含む
前記軽鎖可変ドメイン
を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
重鎖可変ドメインが、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９の群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
重鎖可変ドメインが、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９の群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
軽鎖可変ドメインが、配列番号１１に示すアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
軽鎖可変ドメインが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項４記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
１）配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７の群より選択される配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖；
２）配列番号２９の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
１）配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７の群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖；
２）配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項６のモノクローナル抗体。
【請求項８】
抗体が全長ＩｇＧ抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の群より選択されるヒトアイソタイプに関する、請求項８記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ヒトＴ細胞受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域に特異的に結合する、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかの抗体またはその抗原結合断片を産生する宿主細胞を得る方法であって、請求項１０記載の核酸を含む、請求項１記載のベクターで細胞を形質転換する工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１０記載の核酸を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を得るための宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を得る方法であって、請求項１３記載の宿主細胞を、明記される抗体の産生を確実にする条件下で、培地中で培養し、その後、得た抗体を単離し、そして精製する工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
ヒトＴ細胞受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域によって仲介される疾患または障害の防止または治療のための薬学的組成物であって、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の有効量を、１つまたはいくつかの薬学的に許容されうる賦形剤と組み合わせて含む、前記薬学的組成物。
【請求項１６】
明記される疾患または障害が、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群より選択される、請求項１５記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を所持するヒトＴ細胞受容体によって仲介される疾患または障害の防止または治療のための薬学的組成物であって、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の有効量、および有効量の少なくとも１つの他の療法的活性化合物を含む、前記薬学的組成物。
【請求項１８】
明記される疾患または障害が、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群より選択される、請求項１７記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
他の療法的活性化合物が、小分子、抗体またはステロイドホルモンより選択される、請求項１７〜１８のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
そのベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに関連するＴ細胞受容体の生物学的活性を、こうした阻害を必要とする被験体において阻害する方法であって、被験体に、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の有効量を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を所持するヒトＴ細胞受容体によって仲介される疾患または障害を治療する方法であって、こうした治療の必要がある被験体に、療法的に有効な量で、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項１５記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の疾患または障害を治療する方法であって、疾患または障害が、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群より選択される、前記方法。
【請求項２３】
ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を所持するヒトＴ細胞受容体によって仲介される疾患または障害に対する、こうした治療を必要とする被験体の治療のための、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項１５記載の薬学的組成物の使用。
【請求項２４】
疾患が、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群より選択される、請求項２３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーおよび生体臨床医学の分野、特に抗体またはその抗原結合断片、ならびにその使用に関する。より具体的には、本発明は、ヒトＴ細胞受容体ファミリーに特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、発現ベクター、前記抗体を調製するための方法、およびヒトＴ細胞受容体ファミリーに関連する疾患または障害の治療における前記抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト自己免疫疾患の治療において、主要な炎症プロセス仲介因子、例えばＴＮＦアルファ、ＩＬ１、ＩＬ６、ＩＬ１７、ＩＬ２３に対する抗体に基づく薬剤の使用が記載されてきている（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅ  Ｄら，  Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．  ２０１１  Ｊｕｎ；７０（６）：９０５−８、Ｂａｅｔｅｎ  Ｄら，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１５  Ｄｅｃ  ２４；３７３（２６）：２５３４−４８）。免疫調節特性を有するＣＤ３およびＣＤ４受容体複合体に対するモノクローナル抗体は、自己免疫疾患の治療のための臨床試験中である（Ｋｕｈｎ  Ｃ．およびＷｅｉｎｅｒ  Ｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１６  Ｊｕｌ；８（８）：８８９−９０６；  Ｈｅｌｌｉｎｇ  Ｂ．ら，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５  Ａｐｒ；９３（４）：３９６−４０５；  Ｋｏｎｉｇ  Ｍ．ら，  Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１６  Ｊａｎ  ２５；７：１１）。しかし、こうした薬剤の使用は、炎症の減少にはつながるが、疾患の発展をとめることはなく、そして疾患の原因、すなわち自己反応性Ｔリンパ球には直接作用しないことが示されてきている（Ｈａｒｏｏｎ  Ｎら，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２０１３  Ｏｃｔ；６５（１０）：２６４５−５４．、Ｄｕａｒｔｅ  Ｊ．ら，  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１０  Ｍａｙ  １０；５（５）：ｅ１０５５８；  Ｋｏｎｉｇ  Ｍ．ら，  Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１６  Ｊａｎ  ２５；７：１１）。
【０００３】
モノクローナル抗体を用いて強直性脊椎炎（ＡＳ、ベフテレフ病）の症候性治療が成功したにもかかわらず、自己免疫反応の選択的でそして長期の抑制を可能にし、そしてＡＳの進行を止める有効な薬剤は、いまだに生成されてきていない。したがって、ＡＳ患者生物から、その出現が疾患の発展に関連する自己反応性Ｔリンパ球クローンを除くことを可能にすることが緊急の課題である。
【０００４】
抗原認識Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および細胞内タンパク質または病原性生物の表面上のタンパク質のプロセシングされたペプチドである、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ、ＨＬＡ）タンパク質の間の相互作用は、自己反応性Ｔリンパ球クローンの出現に重要な役割を果たすことが知られる。多くの自己免疫疾患は、ヒトにおける特定のＨＬＡ遺伝子変異体の存在と関連する。例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７アレルは、ＡＳ、反応性関節炎、およびクローン病と関連する。特定のＨＬＡアレル変異体のキャリアーにおいて自己免疫疾患が発展するリスクは、自己抗原である特定のペプチドのこれらのアレルによる優先的な提示によって説明されることも可能であり、こうした自己抗原に対する免疫反応が自己免疫疾患の発展を誘発する。自己免疫反応を開始するありうる機構の１つは、生物自身のペプチドに相同である、細菌またはウイルス起源のタンパク質由来のペプチドの組織適合遺伝子複合体分子による提示であり、この事実は、交差反応性によって、自己抗原に対する免疫反応を導きうる。
【０００５】
先行技術から知られるように、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列は、自己免疫疾患の病因形成に関与するＴリンパ球クローンの同定を可能にするマーカーである。構造的に、Ｔ細胞受容体のサブユニットは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、そしていくつかの遺伝子セグメントから形成される。ＴＣＲ可変領域は、ＴＣＲ抗原結合部位を形成する。これは、これらがクローン特異的である、すなわち別個の抗原に反応するＴリンパ球において異なることを意味する。
【０００６】
ＴＣＲ可変ドメイン内の可変（Ｖ）遺伝子セグメントのアミノ酸相同性に関して、Ｔ細胞受容体は、異なるファミリーに分けられる。ＩＭＧＴ命名法にしたがって、ベータ鎖は２６の別個のファミリーに区別され、そしてアルファ鎖は４１のファミリーに区別される（Ｔｕｒｎｅｒ  ＳＪら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００６，  Ｖ．６，  ８８３−８９４）。ＴＣＲ鎖ファミリーを決定するため、試験アミノ酸配列、およびその情報が、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで、インターネット上で入手可能であるＩＭＧＴデータベース（”Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ”，  Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐ．，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００１；  ２９：２０７−２０９）中に要約される、既知のＴＣＲ鎖配列の多数の整列を用いる。ＩｇＢｌａｓｔソフトウェアパッケージを用いて、多数の整列およびＴＣＲ鎖ファミリーの決定を行ってもよい。
【０００７】
ＡＳ患者における自己免疫ＴＣＲのコンセンサス変異体が記載されてきており、これは、そのＨＬＡ＊Ｂ２７アレル状態に関わらず、ＡＳ患者において滑液および末梢血中に存在し、そして健康なドナーにおいて同じ分析深度では存在しないことが示されてきている（Ｆａｈａｍ  Ｍ．ら，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  ２０１７；６９（４）：７７４−７８４；  Ｋｏｍｅｃｈ  Еら．  １２ｔｈ  ＥＪＩ−ＥＦＩＳ  Ｔａｔｒａ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ；  ２０１６  Ｓｅｐ  ３−７；  Ｓｔｒｂｓｋｅ  Ｐｌｅｓｏ，  Ｓｌｏｖａｋｉａ．  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｂｏｏｋ  ｐ．  ３９）。これらのＴＣＲは、ＴＲＢＶ９ファミリーのメンバーである（ＩＭＧＴ命名法による）。
【０００８】
ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を所持するＴ細胞受容体はまた、セリアック病のような自己免疫疾患の発展にも関連している（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｊら，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１５；  １９４（１２）：  ６１１２−２２）。また、これらは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）によって引き起こされるＴ細胞リンパ腫を含む、Ｔ細胞リンパ腫およびＴ細胞白血病において、悪性化にさらされているＴ細胞の表面に見られる（Ｔｏｙａｂｅ  Ｓら，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００３；  １３４（１）：  ９２−９７）。
【０００９】
本発明に最も類似しているのは、ＴＲＢＶ５−３  ＴＲＢＶ８−１ファミリーに属するヒトＴ細胞受容体可変ドメインのベータ鎖領域に対するモノクローナル抗体Ｗ１１２および２Ｄ１であり、これらは、関節リウマチの診断および治療のためのツールとして、特許出願（ＷＯ９００６７５８）に記載された。これらのモノクローナル抗体は、それぞれ、０．３〜５％の間のＴＲＢＶ５−３を所持する末梢Ｔリンパ球、および０．５〜１３％のＴＲＢＶ８−１を所持する末梢Ｔリンパ球を認識する。関節リウマチの病因形成におけるＴリンパ球の関与を示す多くの研究の結果によって、Ｔ受容体のベータ鎖領域に特異的なモノクローナル抗体の使用が生じた。特に、Ｂｒｅｎｎａｎら，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８８  Ｓｅｐ；  ７３（３）：  ４１７−４２３のデータは、健康なドナーと比較した際、関節リウマチを患う患者の滑液試料において、ＴＲＢＶ５およびＴＲＢＶ８を所持するＴリンパ球の割合が上昇していることを立証している。
【００１０】
また、ＷＯ９４０５８０１は、ＴＣＲ  Ｖ（ベータ）３．１サブファミリーと相互作用する、ヒトＴ細胞受容体のＶＢ３．１可変領域のエピトープと相互作用する、関節リウマチの診断および療法のためのモノクローナル抗体を開示する。
【００１１】
ＷＯ９４０５８０１およびＷＯ９００６７５８に記載される、関節リウマチを治療するためのアプローチの主な欠点は、病因形成およびベータ鎖可変セグメントの特定のファミリーの間の関連に、説得力がある証拠が欠如していることである。
【００１２】
ラットＴＲＣの第１３ファミリーベータ鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体もまた記載されてきている。動物モデルによって、これらの抗体の補助により、そのＴ受容体がＶＢ１３ベータ鎖を含むＴ細胞の小集団（ＶＢ１３＋  Ｔ細胞）を予防的に除去することが可能であることが立証されてきており、そしてこうした方法は、Ｉ型糖尿病になりやすい系統のラットにおいて、Ｉ型糖尿病の発展に対して防御し、そしてまた、ウイルス誘導性糖尿病発展のリスクも有意に減少させることが示されてきている（Ｚｈｉｊｕｎ  Ｌｉｕら，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ２０１２  Ｍａｙ；  ６１（５）：  １１６０−１１６８．）。同時に、そのＴ受容体が別個のベータ鎖ファミリー（ＶＢ１６）を含むＴ細胞を枯渇させても、結果は対照群とは異ならない。ＶＢ１３に対するモノクローナル抗体の最初の投与であっても、ラット脾臓において、ＶＢ１３＋  Ｔ細胞数の６０％減少を生じることに注目することが重要である。
【００１３】
記載される類似体はすべて、ＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲには結合せず、そしてＡＳおよびＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲと関連する他の疾患を治療するために適していない。
【００１４】
ＡＳおよびセリアック病を治療する際に使用してもよい抗体である、ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを所持するＴ細胞の除去に適したモノクローナル抗体は、記載されてきていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ９００６７５８
【特許文献２】ＷＯ９４０５８０１
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅ  Ｄら，  Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．  ２０１１  Ｊｕｎ；７０（６）：９０５−８
【非特許文献２】Ｂａｅｔｅｎ  Ｄら，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１５  Ｄｅｃ  ２４；３７３（２６）：２５３４−４８
【非特許文献３】Ｋｕｈｎ  Ｃ．およびＷｅｉｎｅｒ  Ｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１６  Ｊｕｌ；８（８）：８８９−９０６
【非特許文献４】Ｈｅｌｌｉｎｇ  Ｂ．ら，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５  Ａｐｒ；９３（４）：３９６−４０５
【非特許文献５】Ｋｏｎｉｇ  Ｍ．ら，  Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１６  Ｊａｎ  ２５；７：１１
【非特許文献６】Ｈａｒｏｏｎ  Ｎら，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２０１３  Ｏｃｔ；６５（１０）：２６４５−５４．
【非特許文献７】Ｄｕａｒｔｅ  Ｊ．ら，  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１０  Ｍａｙ  １０；５（５）：ｅ１０５５８
【非特許文献８】Ｔｕｒｎｅｒ  ＳＪら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００６，  Ｖ．６，  ８８３−８９４
【非特許文献９】Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐ．，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００１；  ２９：２０７−２０９
【非特許文献１０】Ｆａｈａｍ  Ｍ．ら，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  ２０１７；６９（４）：７７４−７８４
【非特許文献１１】Ｋｏｍｅｃｈ  Еら．  １２ｔｈ  ＥＪＩ−ＥＦＩＳ  Ｔａｔｒａ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ；  ２０１６  Ｓｅｐ  ３−７
【非特許文献１２】Ｓｔｒｂｓｋｅ  Ｐｌｅｓｏ，  Ｓｌｏｖａｋｉａ．  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｂｏｏｋ  ｐ．  ３９
【非特許文献１３】Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｊら，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１５；  １９４（１２）：  ６１１２−２２
【非特許文献１４】Ｔｏｙａｂｅ  Ｓら，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００３；  １３４（１）：  ９２−９７
【非特許文献１５】Ｂｒｅｎｎａｎら，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８８  Ｓｅｐ；  ７３（３）：  ４１７−４２３
【非特許文献１６】Ｚｈｉｊｕｎ  Ｌｉｕら，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ２０１２  Ｍａｙ；  ６１（５）：  １１６０−１１６８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、特に、その病因形成にＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲが関与する、ＡＳ、セリアック病および悪性血液疾患の療法のための、ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを所持するＴ細胞を除去するために使用可能な抗体の生成に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ヒトＴ受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域に特異的に結合する能力を有するモノクローナル抗体およびその抗原結合断片に関する。本発明の抗体を、その病因形成にＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲが関与する自己免疫および腫瘍性疾患、例えばＡＳ、セリアック病ならびにいくつかのＴ細胞リンパ腫およびＴ細胞白血病を治療するための薬剤として用いてもよい。
【００１９】
本発明の抗体および抗原結合断片は、
１）その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、３つの超可変領域、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ここで
ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔの番号付けスキームによる）は配列番号１のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ３は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
２）その軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、３つの超可変領域、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、ここで
ＬＣＤＲ１は配列番号７のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ２は配列番号８のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ３は配列番号９のアミノ酸配列を有する
点で特徴づけられる。
【００２０】
別に特に言及しない限り、以後、抗体のＣＤＲを決定するために、周知のＫａｂａｔ番号付けスキームを用いる。
本発明の抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体であってもよい。いくつかの態様において、本発明の抗体は、ヒト様定常領域および構造構成要素を含有するが、ラット様可変ドメインを有する。
【００２１】
いくつかの態様において、抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、そして対象抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２２】
やはり提供するのは、その軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１１に示す配列に実質的に類似である（例えば少なくとも９０％同一である）抗体である。
やはり提供するのは、その重鎖可変ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９からなる群より選択される配列に実質的に類似である（例えば少なくとも９０％同一である）抗体である。
【００２３】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、そのアミノ酸配列が配列番号２９に実質的に類似である軽鎖、およびそのアミノ酸配列が、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７からなる群より選択されるものに実質的に類似である重鎖を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、本発明のモノクローナル抗体は、全長ヒトＩｇＧ抗体、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ２またはＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。
やはり提供するのは、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードする核酸、本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸、ならびにその機能的断片である。
【００２５】
やはり提供するのは、本発明の核酸および選択した宿主細胞における該核酸の発現に必要な制御要素を含む発現カセットおよび発現ベクターである。ベクターまたは発現カセットは、染色体外要素として宿主細胞中に存在してもよいし、または前記発現カセットまたはベクターの細胞内への導入（トランスフェクションによる）の結果として、細胞ゲノム内に組み込まれていてもよい。
【００２６】
さらに提供するのは、本発明の核酸、ベクターまたは発現カセットを含む細胞および安定細胞株、ならびにその調製のための方法である。
やはり提供するのは、上記抗体またはその抗原結合断片を産生するための方法であって、上述の宿主細胞を、前記抗体の産生を確実にする条件下で、培地中で培養する工程を含む、前記方法である。いくつかの態様において、方法には、生じた抗体の続く単離および精製が含まれる。
【００２７】
やはり提供するのは、ヒトＴ受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域によって仲介される疾患または障害を防止するかまたは治療するための薬学的組成物であって、上記抗体またはその抗原結合断片を、１つまたはそれより多い薬学的に許容されうる賦形剤と組み合わせて含む、前記薬学的組成物である。
【００２８】
１つの態様において、薬学的組成物は：強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群より選択される疾患または障害を防止するかまたは治療することを意図される。
【００２９】
やはり提供するのは、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を所持するヒトＴ細胞受容体によって仲介される疾患または障害を防止するかまたは治療するための薬学的組み合わせであって、上記抗体またはその抗原結合断片および少なくとも１つの他の療法的活性化合物を含む、前記薬学的組み合わせである。
【００３０】
１つの態様において、薬学的組み合わせは：強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群より選択される疾患または障害を防止するかまたは治療することを意図される。
【００３１】
１つの態様において、薬学的組み合わせは、小分子、抗体またはステロイドホルモンより選択される、別の療法的活性化合物、例えばコルチコステロイドを含む。
やはり提供するのは、そのベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴ細胞受容体の生物学的活性を、こうした阻害を必要とする被験体において阻害する方法であって、被験体に、上述の抗体またはその抗原結合断片の有効量を投与する工程を含む、前記方法である。
【００３２】
やはり提供するのは、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を所持するヒトＴ細胞受容体によって仲介される疾患または障害を治療するための方法であって、こうした治療の必要がある被験体に、療法的に有効な量で、上記抗体またはその抗原結合断片、あるいは前記薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法である。
【００３３】
疾患または障害を治療するための方法の態様の１つにおいて、疾患または障害は：強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群より選択される。
やはり提供するのは、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を所持するヒトＴ細胞受容体によって仲介される疾患または障害の、こうした治療を必要とする被験体における治療のための、上述の抗体またはその抗原結合断片、あるいは上述の薬学的組成物の使用である。
【００３４】
使用の態様の１つにおいて、疾患は：強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群より選択される。
本発明の技術的結果は、そのベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲに特異的に結合する新規抗体を生成することであり、そしてこれを用いて、その病因形成に、そのベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲが関与する、自己免疫および腫瘍性疾患を治療してもよい。さらに、技術的結果は、ＡＳおよび／またはセリアック病の治療の有効性を増加させることであり、この増加は、自己免疫Ｔリンパ球に直接作用可能であり、そしてＡＳにおける長期の寛解を達成可能な抗体を産生することによって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ｅＦｌｕｏｒ  ４０５で標識された抗ＣＤ３モノクローナル抗体（縦軸）、およびＦＩＴＣで標識された、ＴＲＢＶ９に対するモノクローナル抗体（横軸）を用いた、単核血液分画細胞の分布の２パラメータヒストグラムを示す：抗ＴＲＢＶ９−１（図１）。抗ＴＲＢＶ９モノクローナル抗体の各変異体を、２つの濃度：試験あたり２７０ｎｇ（上部グラフ）または２７ｎｇ（下部グラフ）で用いた。小さい四角形は、ＣＤ３＋ＴＲＢＶ９＋の特異的集団を示す。
【図２】図２は、ｅＦｌｕｏｒ  ４０５で標識された抗ＣＤ３モノクローナル抗体（縦軸）、およびＦＩＴＣで標識された、ＴＲＢＶ９に対するモノクローナル抗体（横軸）を用いた、単核血液分画細胞の分布の２パラメータヒストグラムを示す：抗ＴＲＢＶ９−２（図２）。抗ＴＲＢＶ９モノクローナル抗体の各変異体を、２つの濃度：試験あたり２７０ｎｇ（上部グラフ）または２７ｎｇ（下部グラフ）で用いた。小さい四角形は、ＣＤ３＋ＴＲＢＶ９＋の特異的集団を示す。
【図３】図３は、ｅＦｌｕｏｒ  ４０５で標識された抗ＣＤ３モノクローナル抗体（縦軸）、およびＦＩＴＣで標識された、ＴＲＢＶ９に対するモノクローナル抗体（横軸）を用いた、単核血液分画細胞の分布の２パラメータヒストグラムを示す：抗ＴＲＢＶ９−３（図３）。抗ＴＲＢＶ９モノクローナル抗体の各変異体を、２つの濃度：試験あたり２７０ｎｇ（上部グラフ）または２７ｎｇ（下部グラフ）で用いた。小さい四角形は、ＣＤ３＋ＴＲＢＶ９＋の特異的集団を示す。
【図４】図４は、ｅＦｌｕｏｒ  ４０５で標識された抗ＣＤ３モノクローナル抗体（縦軸）、およびＦＩＴＣで標識された、ＴＲＢＶ９に対するモノクローナル抗体（横軸）を用いた、単核血液分画細胞の分布の２パラメータヒストグラムを示す：抗ＴＲＢＶ９−４（図４）。抗ＴＲＢＶ９モノクローナル抗体の各変異体を、２つの濃度：試験あたり２７０ｎｇ（上部グラフ）または２７ｎｇ（下部グラフ）で用いた。小さい四角形は、ＣＤ３＋ＴＲＢＶ９＋の特異的集団を示す。
【図５】図５は、細胞傷害性試験：抗ＴＲＢＶ９−２（試験）およびレミケード（対照）とインキュベーションした後の、ｅＦｌｕｏｒ  ４０５で標識された抗ＣＤ３モノクローナル抗体（縦軸）、およびＦＩＴＣで標識された、ＴＲＢＶ９に対するモノクローナル抗体（横軸）を用いた、単核血液分画細胞の分布の２パラメータヒストグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、ヒトＴ受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域に特異的に結合する能力を有する、単離モノクローナル抗体およびその機能的断片に関する。やはり提供するのは、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、本発明の核酸および選択した宿主細胞における該核酸の発現に必要な制御要素を含む発現カセットおよび発現ベクターである。さらに提供するのは、本発明の核酸、ベクターまたは発現カセットを含む細胞および安定細胞株である。やはり提供するのは、モノクローナル抗体またはその機能的断片を産生するための方法、１つまたはそれより多い薬学的に許容されうる賦形剤、希釈剤またはキャリアーと組み合わせて、本発明の抗体を有効量で含む薬学的組成物および薬学的組み合わせ、ならびに本発明の抗体を用いたＡＳおよび他の疾患の診断および療法のための方法である。
【００３７】
定義
本発明は、いくつかの用語を最初に定義すると、より容易に理解されるであろう。
本明細書に提供する材料および方法は多様でありうるため、特定の組成物および方法工程に限定されないことが理解される。本明細書において、そして付随する請求項において、背景が明らかに別に指示しない限り、単数形には対応する複数の参照対象が含まれることに注意しなければならない。
【００３８】
ヒト「Ｔ細胞受容体」はまた、「ＴＣＲ」、「Ｔ受容体」とも称され、Ｔリンパ球表面上に見られるヘテロ二量体タンパク質複合体である。この受容体は、Ｔリンパ球上にのみ存在する。ＴＣＲの主な機能は、主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）の分子に結合した、プロセシングされた抗原を特異的に認識することである。
【００３９】
ヒトＴＣＲは、２つのサブユニット、αおよびベータ鎖、またはγおよびδ鎖からなり、これらの鎖はジスルフィド結合を通じて連結され、そして細胞膜上にドッキングされる。ＴＣＲ鎖は各々、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン、連結ドメイン、およびＴリンパ球形質膜中に受容体を係留する膜貫通ドメインに連結された定常（Ｃ）ドメインを有する。アルファおよびベータ鎖の定常ドメインの長さは、それぞれ、９１および１２９アミノ酸残基である。アルファ鎖の連結および膜貫通ドメインの長さは３０および１７アミノ酸残基（ＡＡＲ）であり、そしてベータ鎖の長さは２１および２２  ＡＡＲである。Ｔ受容体可変ドメインの長さは、１０４〜１２５  ＡＡＲで多様である。
【００４０】
少ない割合のＴリンパ球はγ／δ型受容体を有する。これらはα／β受容体と類似に配置されるが、一次構造が異なり、そしていくつかの機能特徴を有する。これらははるかにより低い可変性（限定されたクローン特異性）を示し、「非古典的」（非ＭＨＣ）抗原提示分子を含む複合体中の抗原またはさらに遊離抗原を認識する。
【００４１】
Ｔ受容体は、その相補性を決定する６つの領域（ＣＤＲ）：３つのアルファ鎖領域および３つのベータ鎖領域を通じて、ＭＨＣ／抗原複合体と反応する。これらのＣＤＲは、超可変領域、Ｔ細胞受容体の可変ドメインのループ、ＶアルファおよびＶベータである。
【００４２】
用語「ＴＲＢＶ９」または「ＴＲＢＶ９ファミリー」は、ＩＭＧＴ命名法にしたがって区別されるように、Ｔ細胞受容体のベータ鎖の９番目のファミリーを指し、その可変ドメインのアミノ酸配列が、ＣＤＲ１（アミノ酸配列はＳ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｓである）およびＣＤＲ２（アミノ酸配列はＹ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｅ−Ｅである）のユニークなモチーフを含むことで特徴づけられる。用語「ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲ」は、そのベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴ細胞受容体を指す。
【００４３】
Ｔリンパ球またはＴＣＲと関連した用語「病理学的」は、こうしたＴＣＲまたはＴＣＲ所持Ｔリンパ球が、疾患または病理と関連し、そして／または疾患を引き起こし、そして／または疾患の発展に寄与することを意味する。
【００４４】
ＴＣＲと関連した用語「自己免疫」は、こうしたＴＣＲが自己免疫疾患の発展に関与することを意味する。
用語「抗体」は、本明細書において、ジスルフィド結合によって連結された４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）からなる免疫グロブリン分子を指すよう意図される。軽鎖は、カッパまたはラムダと分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンと分類され；これらは、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような抗体アイソタイプを決定し、そしてこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けられうる。各重鎖タイプは、特定の定常領域によって特徴づけられる。
【００４５】
各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域によって囲まれる、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域にさらに分けられうる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１，ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される。
【００４６】
本出願において、３つの重鎖ＣＤＲは「ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３」と称される一方、３つの軽鎖ＣＤＲは、「ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３」と称される。ＣＤＲは、抗原と特異的に相互作用する残基の大部分を含有する。本発明の抗体のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ内のＣＤＲアミノ残基は、別に言及しない限り、周知のＫａｂａｔ番号付けスキームにしたがって番号付けられ、そして配置される。本出願には、別に言及しない限り、アミノ酸の慣用的な文字コードが含まれる。
【００４７】
用語「抗ＴＲＢＶ９抗体」、「ＴＲＢＶ９に対する抗体」、「ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖に特異的に結合する抗体」および「ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖に対する抗体」は、本出願の背景において交換可能であり、そしてヒトＴ細胞受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖のエピトープに特異的に結合する抗体に関する。
【００４８】
本出願の目的のための用語「抗体」および「モノクローナル抗体」は、ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲに対するモノクローナル抗体を指す。本明細書において、「モノクローナル抗体」は、別に言及しない限り、齧歯類、霊長類またはラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）の抗体、好ましくはマウス、マカク、ラクダまたはラマ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体に関する。
【００４９】
各対の軽／重鎖の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。本出願において用いる際、「抗原結合部分」、または「抗原結合領域」、または「抗原結合ドメイン」または「抗原結合部位」は、交換可能であり、抗原と相互作用して、そして抗原に関する抗体特異性およびアフィニティを与えるアミノ酸残基を含む、抗体分子のこうした部分に関する。抗体のこの部分には、抗原結合残基の適切なコンホメーションを維持するために必要な、「フレームワーク」アミノ酸残基が含まれる。
【００５０】
用語「ヒト抗体」は、本明細書において、可変および定常ドメインの配列がヒト配列に由来する抗体を指す。本発明のヒト抗体には、例えばＣＤＲにおける、そして特にＣＤＲ３における、ヒトには典型的でないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ非定方向性（ｕｎｄｉｒｅｃｔｅｄ）または部位特異的突然変異誘発によって導入される突然変異、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異）が含まれてもよい。
【００５１】
用語「ヒト化」は、抗体に関して用いた際、ヒト様定常領域および構造構成要素の存在によって特徴づけられるが、他の起源の免疫グロブリン、または修飾された抗体の対応する断片に典型的である相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体を指すよう用いられる。
【００５２】
本発明の抗体に関する用語「キメラ」は、ヒト様定常領域によって特徴づけられるが、他の起源の可変領域を有する抗体を指すよう用いられる。こうした抗体において、非ヒト起源の（例えばラット起源の）軽鎖および／または重鎖の可変ドメインは、ヒト起源の対応する鎖の定常ドメインに機能可能であるように連結される。
【００５３】
用語「機能可能であるように連結される」等は、抗体を記載するために用いられる際、互いに対して物理的に（別に言及しない限り、共有結合的に）そして機能的な関係にある、ポリペプチド配列を指す。最も好ましい態様において、キメラ分子のポリペプチド構成要素の機能は、単離ポリペプチド構成要素の機能特性に比較した際、不変である。用語「機能可能であるように連結される」等は、核酸を記載するために用いられる際、これらが連結される点で、リーディングフレームシフトも、そして停止コドンも存在しないように、核酸が共有結合していることを意味する。当業者には明らかであるように、「機能可能であるように連結された」構成要素（タンパク質、ポリペプチド、リンカー配列、タンパク質ドメイン等）を含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、前記構成要素をコードする断片からなり、前記断片は、全長キメラタンパク質、例えば本発明のキメラ抗体が、ヌクレオチド配列の翻訳および転写中に産生されるように、共有結合している。
【００５４】
本明細書において、用語「単離された」または「得られた」は、分子または細胞が天然に存在するもの以外の環境にある分子または細胞を意味する。
好ましい態様において、本発明の抗体は、組換えであり、すなわち組換えＤＮＡ技術を用いて生成される。用語「組換え抗体」には、本明細書において、組換え手段によって調製され、発現され、生成され、または単離されているすべての抗体、例えば宿主細胞内に導入されている組換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物から単離された抗体（例えばＴａｙｌｏｒ  Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：６２８７−６２９５を参照されたい）が含まれる。いくつかの態様において、組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックである動物を用いる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）に供され、そしてしたがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、そしてこれに関連する一方、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しない可能性もある配列である。
【００５５】
用語「特異的に結合する」は、本明細書において、特定の結合対の１つのメンバーが、その特異的結合パートナー（単数または複数）以外の分子には有意には結合しない状況を指すよう意図される。該用語はまた、例えば本発明の抗体の抗原結合ドメインが、いくつかの抗原によって所持される特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり；この場合、抗原結合ドメインを含む特異的抗体は、エピトープを所持する多様な抗原に特異的に結合可能であろう。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＴ細胞受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖のエピトープに特異的に結合する一方、他のファミリーのＴＣＲベータ鎖およびＴＣＲアルファ鎖には特異的に結合しない。
【００５６】
用語「エピトープ」は、抗体の１つまたはそれより多くの抗原結合領域で、抗体によって認識され、そして結合されることが可能である分子の部分を指す。エピトープは、しばしば、分子の化学的活性表面グループ、例えばアミノ酸または糖側鎖からなり、そして特定の三次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。
【００５７】
本出願において用いる際、用語「エピトープ」は、とりわけ、動物において、好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラットまたはヒトにおいて、抗原性および／または免疫原性活性を有するポリペプチド断片を指す。用語「抗原性エピトープ」は、本明細書において、抗体に特異的に結合可能であり、そして例えば標準的イムノアッセイによって、先行技術から周知の任意の技術によって検出可能であるポリペプチド断片である。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性ではないが、免疫原性であってもよい。「免疫原性エピトープ」は、本明細書において、先行技術から知られる任意の方法によって決定されるような、動物において抗体反応を誘発するポリペプチド断片と定義される。「非線形エピトープ」または「コンホメーションエピトープ」は、エピトープ特異的抗体に結合する抗原タンパク質内に、非隣接ポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。
【００５８】
本発明の抗体またはその機能的断片に関する用語「生物学的特性」または「生物学的特徴」、あるいは用語「活性」または「生物活性」は、本出願において交換可能に用いられ、そしてこれには、限定されるわけではないが、エピトープ／抗原アフィニティおよび特異性、ＴＲＢＶ９ファミリーに属するベータ鎖を含むＴＣＲの活性を中和するかまたはこれに拮抗する能力が含まれる。
【００５９】
抗体の他の同定可能な生物学的特性または特徴には、例えば、交差反応性（すなわちターゲットペプチドの非ヒト相同体との、あるいは一般に他のタンパク質または組織との）、および哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を保持する能力が含まれる。限定されるわけではないが、ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、ＫＩＮＥＸＡ表面プラズモン共鳴分析、限定を伴わないｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ阻害アッセイ、受容体結合アッセイ、サイトカインまたは増殖因子産生および／または分泌アッセイ、ならびにシグナル伝達、およびヒト、霊長類または任意の他の供給源を含む多様な供給源から得た組織切片の免疫組織化学を含む、当該技術分野に認識される技術を用いて、前述の特性または特徴を観察し、測定し、そして／または評価してもよい。
【００６０】
本発明の抗体の活性に関する用語「阻害する」または「中和する」は、本明細書において、例えば、限定されるわけではないが、抗体の生物学的活性、または特性、疾患または状態を含む、阻害しようとするものの進行または重症度に実質的に拮抗するか、これを禁じるか、防止するか、抑制するか、遅延させるか、中断するか、除去するか、停止するか、減少させる能力を指す。
【００６１】
本明細書において、用語「突然変異体」または「変異体」は、１つまたはそれより多いアミノ酸が、本発明の抗体またはその断片の天然アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端および／または該配列の内部で、付加され、そして／または置換され、そして／または欠失され、そして／または挿入されている、本発明に開示する抗体を指す。本明細書において、用語「突然変異体」はまた、突然変異体タンパク質をコードする核酸分子も指す。さらに、用語「突然変異体」は、タンパク質または核酸よりもより短いかまたはより長い任意の変異体を指す。
【００６２】
用語「相同性」は、比較しているヌクレオチドまたはアミノ酸配列と他のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性および／または類似性の度合いによって決定される、前記配列の関係を記載するために用いられる。
【００６３】
本明細書において、アミノ酸またはヌクレオチド配列は、アミノ酸またはヌクレオチド配列が、比較のために選択した領域内で、特定される配列と少なくとも７０％の同一性を有するならば、参照配列と「実質的に類似である」かまたは「実質的に同じである」。したがって、実質的に類似の配列には、例えば、少なくとも７５％同一性、例えば少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性）を有するものが含まれる。互いに同一である２つの配列はまた、実質的に類似である。
【００６４】
参照配列に基づいて、配列同一性を決定する。配列分析のためのアルゴリズムは、当該技術分野に知られ、例えば、Ｙｅら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０１３，  Ｗ３４−４０に記載されるＩｇＢＬＡＳＴがある。本発明の目的のため、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の間の同一性および類似性のレベルを決定するため、標準的パラメータを伴うギャップ化整列を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）によって提供されるＩｇＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージの補助で、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を比較してもよい。パーセント同一性を計算するため、参照配列、例えば可変領域の全長を用いる。
【００６５】
ポリペプチドを「コードする」ヌクレオチド配列に対する言及は、ポリペプチドが、ｍＲＮＡの翻訳および転写中にヌクレオチド配列から産生されることを意味する。それによって、ｍＲＮＡに同一であり、そして典型的には配列リストに用いられるコード鎖、および転写のためのテンプレートとして働く相補鎖の両方が示されてもよい。当業者に明らかであるように、該用語にはまた、同じアミノ酸配列をコードする任意の縮重ヌクレオチド配列もまた含まれる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列には、イントロンを含む配列が含まれる。
【００６６】
抗体
上述のように、本発明は、ヒトＴ受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域に特異的に結合する能力を有する単離モノクローナル抗体およびその機能的断片に関する。
【００６７】
本発明の抗体は
ａ）その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、３つの超可変領域、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ここで
ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔの番号付けスキームによる）はアミノ酸配列ＤＹＬＶＨ（配列番号１）を有し；
ＨＣＤＲ２はアミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＴＰＴＹＡＤＤＦＥＧ（配列番号２）を有し；
ＨＣＤＲ３はＳＷＲＲＧＬＲＧＬＧＦＤＹ（配列番号３）、ＳＷＲＲＧＬＲＧＩＧＦＤＹ（配列番号４）、ＳＷＲＲＧＩＲＧＬＧＦＤＹ（配列番号５）、ＳＷＲＲＧＩＲＧＩＧＦＤＹ（配列番号６）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）その軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、３つの超可変領域、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、ここで：
ＬＣＤＲ１はアミノ酸配列ＫＡＳＫＳＩＮＫＹＬＡ（配列番号７）を有し；
ＬＣＤＲ２はアミノ酸配列ＤＧＳＴＬＱＳ（配列番号８）を有し；
ＬＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＨＮＥＹＰＰＴ（配列番号９）を有する
点で特徴づけられる。
【００６８】
本発明の抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体、あるいはその抗原結合断片であってもよく、そしてベフテレフ病、およびその病因形成にＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲが関与する他の疾患、例えばセリアック病またはＴ細胞リンパ腫を治療するための医薬品として用いてもよい。
【００６９】
例えば、当該技術分野に周知のハイブリドーマ技術、ならびに組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、あるいはこうした技術または当該技術分野に周知の他の技術の組み合わせを用いて、本発明のモノクローナル抗体を得てもよい。用語「モノクローナル抗体」は、本出願で用いた際、その産生法というよりも、例えば任意の真核、原核またはファージクローンを含む、単一のコピーまたはクローンから得られる抗体を指す。
【００７０】
ペプチド合成によって、または以下の「核酸」セクションに記載するような組換えＤＮＡ技術を用いて、ヒト化およびキメラ抗体を得てもよい。
いくつかの態様において、本発明の抗体はキメラであり、そしてこれらが非ヒト起源の（例えばラットまたはマウスの）軽鎖および重鎖の可変ドメイン、ならびにヒト起源の定常ドメインを有する点で特徴づけられる。いくつかの態様において、本発明の抗体は、これらが、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９の群より選択される重鎖可変ドメインのアミノ酸配列、ならびに配列番号１１に示す軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を有する点で特徴づけられる。それによって、好ましい態様において、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤの定常領域などの重鎖定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。さらに、抗体は、軽鎖定常領域または軽鎖カッパ定常領域または軽鎖ラムダ定常領域のいずれかを含んでもよい。好ましくは、抗体は軽鎖カッパ定常領域を含む。
【００７１】
本発明の抗ＴＲＢＶ９−１、抗ＴＲＢＶ９−２、抗ＴＲＢＶ９−３または抗ＴＲＢＶ９−４抗体の重鎖アミノ酸配列の例を、それぞれ、配列番号２１、２３、２５および２７に示す。抗体軽鎖の例示的なアミノ酸配列を配列番号２９に示す。
【００７２】
いくつかの態様において、抗体の可変ドメインのフレームワーク領域のアミノ酸配列、またはその部分は、一般的にヒト起源のものであり、そしてしたがって、「ヒト化抗体」である。この「ヒト化」は、患者における療法的使用のため、前記抗体の免疫原性を減少する際に有用であると見なされる。フレームワーク領域中の特定の選択されるアミノ酸残基は、ヒトではなく、ラットのままである。
【００７３】
いくつかの態様において、本発明の抗体およびその抗原結合断片には、そのアミノ酸配列が配列番号１１のものに実質的に類似である、例えば少なくとも９０％同一、よりしばしば少なくとも９３％同一、典型的には９４％またはそれより高く同一である（好ましくは９５％またはそれより高く同一、９６％またはそれより高く同一；９７％またはそれより高く同一、９８％またはそれより高く同一、９９％またはそれより高く同一、あるいは９９．５％またはそれより高く同一である）軽鎖可変ドメインが含まれる。
【００７４】
いくつかの態様において、本発明の抗体およびその抗原結合断片には、その可変ドメインのアミノ酸配列が配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９の群より選択されるものに実質的に類似である重鎖可変ドメインが含まれる。例えば、これらは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９の群より選択されるものに、少なくとも９０％同一、よりしばしば少なくとも９３％同一、典型的には９４％またはそれより高く同一である（好ましくは９５％またはそれより高く同一、９６％またはそれより高く同一；９７％またはそれより高く同一、９８％またはそれより高く同一、９９％またはそれより高く同一、あるいは９９．５％またはそれより高く同一である）アミノ酸配列を有する。
【００７５】
いくつかの態様において、本発明の抗体には、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７からなる群より選択されるものに、少なくとも９０％同一（例えば、９３％またはそれより高く同一、９４％またはそれより高く同一、９５％またはそれより高く同一、９６％またはそれより高く同一；９７％またはそれより高く同一、９８％またはそれより高く同一、９９％またはそれより高く同一、あるいは９９．５％またはそれより高く同一である）アミノ酸配列を有する重鎖、ならびに配列番号２９のものに、少なくとも９０％同一（例えば、９３％またはそれより高く同一、９４％またはそれより高く同一、９５％またはそれより高く同一、９６％またはそれより高く同一；９７％またはそれより高く同一、９８％またはそれより高く同一、９９％またはそれより高く同一、あるいは９９．５％またはそれより高く同一である）アミノ酸配列を有する軽鎖が含まれる。
【００７６】
先行技術から知られるように、可変ドメインを含む抗体配列に、抗体が抗原に結合する能力を実質的に改変しない突然変異を導入してもよい。本発明の抗体はまた、抗体がＴＣＲのＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖に結合する能力の喪失を導かないが、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性の減少、あるいは抗体のアフィニティまたは他の生物学的特性の増加を導きうる、さらなる突然変異もまた含んでもよい。特に、先行技術から周知であるように、抗体配列において、保存的アミノ酸置換を作製してもよい。「保存的置換」は、本出願において用いた際、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基によって置換される置換を意味する。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野に周知であり、これには、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。好ましくは、ＶＬおよび／またはＶＨドメイン中のＣＤＲ３領域には、５を超えない保存的アミノ酸置換、よりしばしば３を超えない保存的置換が含まれる。典型的には、保存的置換は、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖のエピトープに結合するために必須であるアミノ酸位では作製されない。
【００７７】
本発明の抗体の上記変異体（突然変異体）を、ペプチド合成によって、または以下の「核酸」セクションに記載するような組換えＤＮＡ技術を用いて生成してもよい。
やはり提供するのは、本発明の抗体の抗原結合断片である。用語、抗体の「抗原結合断片」（または「抗体の機能的断片」または「抗体の活性断片」）は、本明細書において、抗原に特異的に結合する能力を保持する１つまたはそれより多い抗体断片を指す。全長抗体の断片によって、抗体の抗原結合機能を実行可能であることが示されてきている。用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれる結合断片の例には、（ａ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｂ）ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ）２断片；（ｃ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｄ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｅ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、および（ｆ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子を形成するように、これらが単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いてこれらのドメインを連結してもよい（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；  Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。こうした一本鎖抗体もまた、用語、抗体の「抗原結合断片」内に含まれると意図される。これらにはまた、一本鎖抗体の他の型、例えばディアボディも含まれる。ディアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用い、それによって、ドメインが、別の鎖の相補ドメインと対形成することを強制し、そして２つの抗原結合部位を生成する、二価二重特異性抗体である（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ  Р．ら（１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；  Ｐｏｌｊａｋ  Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。
【００７８】
慣用的な技術、例えば、それぞれ、パパインまたはペプシン消化を用いて、完全抗体から、抗体断片、例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２を得てもよい。さらに、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、抗体、抗体断片および免疫接着分子を得てもよい。
【００７９】
抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体断片と１つまたはそれより多いタンパク質またはペプチドの共有または非共有会合によって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってもよい。こうした免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）、ならびに二価でそしてサイズが減少したｓｃＦｖ生体分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３１：１０４７−１０５８）が含まれる。抗体断片間の他の化学的結合もまた、当該技術分野の最先端から周知である。
【００８０】
本発明の抗体およびその機能的断片は、単離型で存在し、これはすなわち、こうしたタンパク質が、他のタンパク質または他の天然存在生物学的分子、例えばオリゴ糖、核酸、およびその断片等の存在を実質的に含まないことを意味し、この場合の用語「実質的に含まない」は、単離タンパク質を含む前記組成物の７０％未満、典型的には６０％未満、そしてよりしばしば５０％未満が他の天然存在生物学的分子であることを意味する。いくつかの態様において、前記タンパク質は、実質的に精製された型で存在し、用語「実質的に精製された型」は、少なくとも９５％に等しい、典型的には少なくとも９７％に等しい、そしてよりしばしば少なくとも９９％に等しい純度を意味する。
【００８１】
組換えまたはハイブリドーマ技術によって得た抗体を精製するための方法は当該技術分野に周知であり、例えばクロマトグラフィ（例えばイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、特に特異抗原プロテインＡまたはプロテインＧに関するアフィニティ、およびサイズ分離カラムクロマトグラフィ）、遠心分離、溶解性差異（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準技術によって、精製を実行してもよい。さらに、本発明の技術によって生成される抗体またはその断片を、精製を容易にするために異種ポリペプチド配列（例えばヒスチジンタグ）に融合させてもよい。
【００８２】
解離定数（ＫＤ）を決定することによる標準分析を用いて、抗体アフィニティを決定してもよい。等式ＫＤ＝ｋｄ／ｋоｎ、式中、ｋｄは実験的に計算される抗体−抗原複合体の解離速度定数であり、そしてｋоｎは実験的に計算される会合速度定数である、を用いて、ＫＤを計算する。
【００８３】
好ましい抗体は、約１ｘ１０−７Ｍを超えない；好ましくは約１ｘ１０−８Ｍを超えない；よりしばしば約１ｘ１０−９Ｍを超えない；より好ましくは約１ｘ１０−１０Ｍを超えない、そして最も好ましくは約１ｘ１０−１１Ｍを超えない、例えば約１ｘ１０−１２Ｍを超えないＫＤ値でヒト抗原に結合するものである。
【００８４】
好ましい抗体には、ＣＤＲ３配列によって特徴づけられる抗ＴＲＢＶ９−１、抗ＴＲＢＶ９−２、抗ＴＲＢＶ９−３または抗ＴＲＢＶ９−４が含まれ、そしてこれらは以下の実験セクションに詳細に記載される。
【００８５】
本発明の組成物および方法で用いてもよい抗体およびその断片は、生物学的に活性である抗体および断片であり、すなわち、これらは望ましい抗原エピトープに結合し、そして直接または間接的に生物学的効果を示すことが可能である。
【００８６】
本発明の抗体およびその機能的断片は、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖のエピトープ（領域）に特異的に結合可能である。好ましい態様において、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖に対するその特異的結合は、前記ベータ鎖を含むＴＣＲの活性阻害を生じる。典型的には、阻害は好ましくは、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０，７０、８０、９０、９５％またはそれより多い。
【００８７】
いくつかの態様において、本発明のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖に対する抗体またはその断片は、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を含むＴＣＲを所持するＴ細胞を除去しうる。いくつかの態様において、本発明の抗体またはその断片は、Ｔリンパ球の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の除去を提供しうる。
【００８８】
核酸
本発明は、ヒト抗体の既知の定常ドメインに機能可能であるように融合した、本発明の可変ドメインを含む、キメラ抗体を産生するために用いてもよい、本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸分子、その機能的断片および可変ドメインを提供する。
【００８９】
好ましい態様において、本発明の核酸は、その可変ドメインが、３つの超可変領域、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ここで
ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔの番号付けスキームによる）は配列番号１のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し；
ＨＣＤＲ３は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する
抗体重鎖をコードする。
【００９０】
好ましい態様において、本発明の核酸は、その可変ドメインが、３つの超可変領域、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、ここで
ＬＣＤＲ１は配列番号７のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ２は配列番号８のアミノ酸配列を有し；
ＬＣＤＲ３は配列番号９のアミノ酸配列を有する
抗体軽鎖をコードする。
【００９１】
前記抗体鎖の相同体および突然変異体をコードする核酸分子、その機能的断片およびドメインもまた、本発明の範囲内にある。
いくつかの態様において、核酸は、その可変ドメインが、配列番号１１のものに実質的に類似であるアミノ酸配列を含む、抗体軽鎖をコードし；例えば、これらは、少なくとも９０％同一、よりしばしば少なくとも９３％同一、典型的には９４％またはそれより高く同一である（好ましくは９５％またはそれより高く同一、９６％またはそれより高く同一；９７％またはそれより高く同一、９８％またはそれより高く同一、９９％またはそれより高く同一、あるいは９９．５％またはそれより高く同一である）。
【００９２】
いくつかの態様において、核酸は、その可変ドメインが、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９からなる群より選択されるものに実質的に類似であるアミノ酸配列を含む、抗体重鎖をコードし；例えば、これらは、こうした配列に、少なくとも９０％同一、よりしばしば少なくとも９３％同一、典型的には９４％またはそれより高く同一である（好ましくは９５％またはそれより高く同一、９６％またはそれより高く同一；９７％またはそれより高く同一、９８％またはそれより高く同一、９９％またはそれより高く同一、あるいは９９．５％またはそれより高く同一である）。
【００９３】
いくつかの態様において、核酸は、そのアミノ酸配列が配列番号１１に示される可変ドメインを含む抗体軽鎖、およびそのアミノ酸配列が、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９からなる群より選択される可変ドメインを含む抗体重鎖をコードする。
【００９４】
いくつかの態様において、核酸は、抗体の対応する定常ドメインをコードする核酸との機能可能である融合に用いてもよい、そのアミノ酸配列が、配列番号１１、１３、１５、１９に提示される可変ドメインをコードする。
【００９５】
関心対象の核酸分子の例示的な特定の型は、以下の実験セクションにより詳細に開示される。
本明細書において、核酸分子は、ＤＮＡ分子、例えばゲノムＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子、あるいはＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ分子である。いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、本発明の抗体または抗体断片をコードするオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）分子であり、そして適切な条件（例えば生理学的細胞内条件）下で、異種発現系における発現に用いられることが可能である。
【００９６】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、遺伝子操作法によって産生される。核酸を産生するための方法は、当該技術分野に周知である。例えば、アミノ酸配列情報またはヌクレオチド配列情報が入手可能であれば、オリゴヌクレオチド合成によって、本発明の単離核酸分子の調製が可能になる。アミノ酸配列情報の場合、縮重コードのため、互いに異なるいくつかの核酸を合成してもよい。所望の宿主のためのコドン変異体を選択する方法が、当該技術分野に周知である。
【００９７】
ホスホラミダイト法によって合成オリゴヌクレオチドを調製してもよく、そして生じた構築物を、当該技術分野に周知の方法、例えば高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）または例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹに記載されるような他の方法にしたがって、そして例えば、米国保健福祉省国立衛生研究所（ＮＩＨ）の組換えＤＮＡ研究指針に記載される指針の下に、精製してもよい。本発明の長い二本鎖ＤＮＡ分子を以下の方式で：隣接する断片と粘着可能な適切な末端を含む、適切な相補性のいくつかのより小さい断片を合成することによって合成してもよい。ＤＮＡリガーゼまたはＰＣＲに基づく方法を用いて、隣接断片を連結してもよい。
【００９８】
また、本発明の核酸分子を生物学的供給源からクローニングしてもよい。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸と相同であるか、実質的に同じであるか、同一であるか、または該核酸から得られた核酸も含む。
【００９９】
本発明の核酸は、天然に存在する環境以外の環境に存在し、例えばこれらは単離され、増加した量で存在し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系、あるいは天然状態で存在するもの以外の細胞または生物に存在するかまたはこれらにおいて発現される。
【０１００】
緊密に関連する核酸配列間のヌクレオチド配列における変化または相違は、通常の複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎまたはｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の過程で生じる、配列中のヌクレオチド変化に相当してもよい。特定の目的のために、例えば制御領域中の特定のアミノ酸またはヌクレオチド配列のコドンを変化させるために、他の変化を特異的に設計し、そして配列内に導入してもよい。多様な突然変異誘発技術を用いて、こうした特異的変化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ってもよいし、あるいは変化を誘導するかまたは変化に関して選択する特定の選択条件下に置かれた宿主生物において得てもよい。こうした特異的に生成される配列変異体を、元来の配列の「突然変異体」または「誘導体」と称してもよい。
【０１０１】
上記核酸から選択されるテンプレート核酸上で、テンプレート配列中の１つまたはそれより多いヌクレオチドの修飾、欠失または付加、あるいはその組み合わせによって、突然変異体または誘導体核酸を得て、テンプレート核酸の変異体を産生してもよい。修飾、付加または欠失を、当該技術分野に知られる任意の方法（例えば、Ｇｕｓｔｉｎら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （１９９３）  １４：  ２２；  Ｂａｒａｎｙ，  Ｇｅｎｅ  （１９８５）  ３７：  １１１−１２３；およびＣｏｌｉｃｅｌｌｉら，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  （１９８５）  １９９：５３７−５３９，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （１９８９），  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．  １５．３−１５．１０８を参照されたい）によって実行してもよく、これらには、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発、アセンブリーＰＣＲ、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発、ｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰性集合（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ）突然変異誘発、指数関数的集合突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、遺伝子再集合、遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成連結再集合（ＳＬＲ）、またはその組み合わせが含まれる。また、組換え、再帰性配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ウラシル含有テンプレート突然変異誘発、ギャップ化二重鎖突然変異誘発、ポイントミスマッチ修復突然変異誘発、修復不全宿主株突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射線原性突然変異誘発、欠失突然変異誘発、制限選択突然変異誘発、制限精製突然変異誘発、人工遺伝子合成、集合突然変異誘発、キメラ核酸多量体生成、およびその組み合わせを含む方法によって、修飾、付加または欠失を行ってもよい。
【０１０２】
やはり提供するのは、本発明のタンパク質をコードする核酸の縮重変異体である。核酸の縮重変異体には、同じアミノ酸をコードする他のコドンでの、核酸のコドンの置換が含まれる。特に、核酸の縮重変異体を生成して、宿主細胞における発現を増加させる。この態様において、宿主細胞中の遺伝子において、好ましくないかまたはより好ましくない核酸のコドンを、宿主細胞中の遺伝子において、コード配列中で過剰に存在するコドンで置換し、ここで、前記の置換されたコドンは同じアミノ酸をコードする。遺伝子コード最適化は先行技術から周知である。
【０１０３】
上述の修飾は、抗体またはその機能的断片の特性を実質的に改変しないが、宿主細胞におけるタンパク質フォールディングを促進するか、凝集能を減少させるか、またはタンパク質の他の生化学的特性、例えば半減期を調節してもよい。いくつかの態様において、これらの修飾は、タンパク質の生化学的特性を修飾しない。上記に特定されるすべてのタイプの修飾および突然変異は、核酸レベルで実行される。
【０１０４】
請求する核酸を、実質的に精製された型で単離し、そして調製してもよい。実質的に精製された型は、核酸が、少なくとも５０％純粋、典型的には少なくとも約９０％純粋であり、そして典型的には「組換え体」である、すなわち典型的にはその天然宿主生物中に天然に存在する染色体上で関連していない、１つまたはそれより多いヌクレオチドが隣接することを意味する。
【０１０５】
やはり提供するのは、以下により詳細に論じる、本発明のタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質をコードする核酸である。本発明の可変ドメインをコードする核酸を、抗体の軽鎖および重鎖の対応する定常ドメインをコードする核酸に機能可能であるように連結してもよい。抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸を、宿主細胞からの発現産物の輸送を促進するリーダーペプチドをコードする核酸に機能可能であるように連結してもよい。リーダーペプチドは、続いて、ポリペプチドの成熟中に除去される。
【０１０６】
やはり提供するのは、請求する核酸を含むベクターおよび他の核酸構築物である。用語「ベクター」は、機能可能であるように連結されている別の核酸を輸送することが可能である核酸分子を指す。特定のベクターは、導入された宿主細胞において、自律的に複製可能である一方、他のベクターは、宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、そして宿主ゲノムとともに複製されることが可能である。さらに、いくつかのベクターは、機能可能であるように連結されている遺伝子の発現を指示することが可能である。こうしたベクターは、本出願において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称され；例示的なベクターが先行技術から周知である。適切なベクターには、ウイルスおよび非ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージ等が含まれ、好ましくはプラスミドであり、そして本発明の核酸配列のクローニング、増幅、発現、適切な宿主へのトランスファーなどに用いられる。適切なベクターの選択は、当業者には明らかである。全長核酸またはその部分をベクター内に挿入し、典型的にはＤＮＡリガーゼによって、ベクター中の切断された制限酵素部位に付着させる。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏで相同組換えによって、典型的には所望のヌクレオチド配列に隣接して、ベクターに相同な領域を付着させることによって、所望のヌクレオチド配列を挿入してもよい。オリゴヌクレオチドの連結によって、または例えば相同性領域および所望のヌクレオチド配列の部分の両方を含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、相同性領域を付加する。典型的には、ベクターは、染色体外要素として、細胞内に導入された結果、宿主細胞において、その増殖を確実にする複製起点を有する。ベクターは原則として、宿主細胞における核酸の発現およびターゲットポリペプチドの生成を確実にする制御要素もまた含んでもよい。発現ベクターにおいて、前記核酸は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサーおよびインデューサー、ならびにポリペプチドの開始コドンを含んでもよい制御配列に、機能可能であるように連結される。いくつかの態様において、本発明の核酸はさらに、宿主細胞から細胞外空間内への発現産物の単離を確実にするリーダーペプチドに、機能可能であるように連結される。
【０１０７】
やはり提供するのは、とりわけ、発現カセットまたは系に基づく対象ポリペプチド（例えば、本発明の抗体の軽鎖および重鎖）の産生のために、または対象核酸の複製のために用いられる発現カセットまたは系である。発現カセットは染色体外要素として存在してもよいし、または前記発現カセットの細胞内への導入の結果として細胞ゲノム内に組み込まれてもよい。発現のため、本発明の核酸によってコードされるタンパク質産物は、例えば細菌系、酵母、昆虫、両生類、または哺乳動物細胞を含む、任意の好適な発現系において発現される。発現カセットにおいて、ターゲット核酸は、プロモーター、エンハンサー、終結配列、オペレーター、リプレッサーおよびインデューサー、ならびにポリペプチドの開始コドンを含んでもよい制御配列に機能可能であるように連結される。いくつかの態様において、本発明の核酸はさらに、宿主細胞から細胞外空間内への発現産物の単離を確実にするリーダーペプチドに機能可能であるように連結される。所望の産物を発現可能である発現カセットまたは系を調製するための方法は、当該技術分野に知られる。
【０１０８】
上記発現系を原核または真核宿主において用いてもよい。宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バキュロウイルスベクターと組み合わされた昆虫細胞、またはヒト胚性細胞ではないより高次の生物の細胞、例えば酵母、植物、脊椎動物の細胞、例えばＣＨＯ細胞（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０、ＣＲＬ−１６５１）およびＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）を、タンパク質の産生に用いてもよい。
【０１０９】
本発明の抗体を産生するため、宿主細胞を、抗体軽鎖をコードする核酸を含む発現ベクター、および抗体重鎖をコードする核酸を含む発現ベクターで、同時形質転換する。いくつかの態様において、抗体の軽鎖および重鎖の両方をコードする核酸が導入されている単一の発現ベクターを用いる。
【０１１０】
軽鎖および重鎖の発現のため、軽鎖および重鎖が宿主細胞において発現され、そして好ましくは宿主細胞が培養されている培地内に分泌され、そしてその培地から、抗体が単離可能であるように、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（単数または複数）を、宿主細胞内に形質転換（同時形質転換）する。用語「形質転換」の多様な解釈は、外因性ＤＮＡを原核または真核宿主細胞に導入するために一般的に用いられる広範囲の方法を含むように意図され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（監修）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら（監修）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （１９８９）に記載されるような、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等が含まれる。
【０１１１】
抗体の核酸を含む組換え発現ベクターを宿主細胞内に導入すると、宿主細胞中で抗体を発現するか、または（より好ましくは）宿主細胞を増殖させている培地内に抗体を分泌するために十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体が産生される。標準的タンパク質精製技術を用いて、培地から抗体を単離してもよい。細胞培養条件は当業者に周知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  Ｊ．Ｓ．，  Ｄａｓｓｏ  Ｍ．，  Ｈａｒｆｏｒｄ  Ｊ．В．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｊ．およびＹａｍａｄａ  Ｋ．Ｍ．（監修）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．刊行，  ２０００に記載される。
【０１１２】
本発明の核酸の複製および／または発現に適した、上記宿主細胞あるいは他の宿主細胞または生物のいずれかを用いる場合、生じる複製核酸、発現タンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞または生物の産物として、本発明の範囲内にある。当該技術分野に知られる適切な技術によって、産物を単離してもよい。
【０１１３】
本発明のタンパク質を安定発現する細胞株を、当該技術分野に知られる方法（例えば、ゲノム内に組み込まれた遺伝子を含有するトランスフェクション細胞の同定および単離を可能にする、選択可能マーカー、例えばｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンの同時トランスフェクション）によって選択してもよい。
【０１１４】
また、本発明の核酸分子を用いて、生物学的試料における遺伝子発現を決定してもよい。特定のヌクレオチド配列、例えばゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの存在に関して細胞を調べる方法は、当該技術分野においてよく確立されている。簡潔には、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを細胞試料から単離する。相補ＤＮＡ鎖を形成する逆転写酵素を用い、その後、対象ＤＮＡ配列に特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を行うＲＴ−ＰＣＲによって、ｍＲＮＡを増幅してもよい。あるいは、ゲル電気泳動によって、ｍＲＮＡ試料を分離し、適切なキャリアー、例えばニトロセルロース、ナイロン等にトランスファーし、そして次いで、プローブとしての対象ＤＮＡの断片で探査する。他の技術、例えばオリゴヌクレオチド連結アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および固相チップ上に固定されたＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーションもまた使用を見出しうる。対象配列にハイブリダイズしているｍＲＮＡの検出は、試料における遺伝子発現の指標となる。
【０１１５】
本発明の抗体の療法的使用
１つの側面において、本発明の抗体またはその活性断片を、表面ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを所持する、例えばＡＳ、セリアック病、Ｔ細胞リンパ腫において、自己免疫Ｔリンパ球の活性を示す、病原性Ｔリンパ球の活性と関連する、障害の治療に用いる。
【０１１６】
用語「患者」は、本出願で用いた際、限定されるわけではないが、マウス、サル、ヒト、家畜哺乳動物、スポーツ哺乳動物およびペット哺乳動物を含む哺乳動物を指し；好ましくは、該用語はヒトに適用される。特定の態様において、患者は、そのベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲの体内の存在によって仲介される疾患または障害、あるいは状態によってさらに特徴づけられる。先行技術から知られるように、そのベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲは、ＡＳおよびセリアック病と関連する。さらに、そのベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲは、いくつかの血液疾患、例えばエプスタイン−バーウイルスによって引き起こされるＴ細胞リンパ腫の発展にも関連しうる。
【０１１７】
本明細書において、１つまたはそれより多い他の療法剤と抗体に言及する用語「同時投与」、「同時投与された」および「組み合わせられた」は、以下を意味するよう意図され、以下を指し、そして以下を含む：
１）本発明の抗体および療法剤のこうした組み合わせの、治療が必要な患者への同時投与であって、こうした構成要素が、前記構成要素を実質的に同時に前記患者に放出する、単一の投薬型内でともに配合されている、前記投与、
２）本発明の抗体および療法剤のこうした組み合わせの、治療を必要とする患者への同時投与であって、こうした構成要素を互いに分けて別個の投薬型に配合し、該投薬型が前記患者によって実質的に同時に摂取された際、前記構成要素が、前記患者に実質的に同時に放出される、前記同時投与；
３）本発明の抗体および療法剤のこうした組み合わせの、治療を必要とする患者への連続投与であって、こうした構成要素が、互いに別々に、別個の投薬型に配合され、この投薬型が、前記患者によって、各投与の間の十分な時間間隔で連続して摂取された際、前記構成要素が、前記患者に実質的に異なる時点で放出される、前記連続投与；および
４）本発明の抗体および療法剤のこうした組み合わせの、治療を必要とする患者への連続投与であって、こうした構成要素が、単一の投薬型に一緒に配合され、ここから、前記構成要素が、制御された方式で放出された際、これらが、前記患者に、同じ時点および／または異なる時点で、同時に、連続しておよび／または重複して放出され、各部分が、同じ経路によってまたは異なる経路によってのいずれかで投与されうる、前記連続投与。
【０１１８】
本発明の抗体（例えば抗ＴＲＢＶ９−１、抗ＴＲＢＶ９−２、抗ＴＲＢＶ９−３または抗ＴＲＢＶ９−４）を、さらなる療法的治療を伴わずに、すなわち独立療法として投与してもよい。さらに、本発明の抗体による治療は、少なくとも１つのさらなる療法的治療（併用療法）を含んでもよい。本発明のいくつかの態様において、抗体を、その病因形成にＴＲＢＶ９ベータ鎖を含むＴＣＲが関与する自己免疫または腫瘍性疾患、例えばＡＣ、セリアック病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病のために、別の薬物／薬物療法と同時投与してもよいし、またはこれらとともに配合してもよい。
【０１１９】
投与用量および経路
本発明の抗体を、問題の状態を治療するために有効な量で、すなわち、所望の結果を達成するために必要な用量および期間、投与する。療法的有効量は、治療しようとする特定の状態、患者の年齢、性別および体重、ならびに抗体が単独で投与されるか、あるいは１つまたはそれより多くのさらなる免疫抑制または抗炎症治療技術と組み合わせて実行されるかなどの要因に応じて多様でありうる。
【０１２０】
投薬措置を調節して、最適な反応を提供してもよい。例えば、単一のボーラスを投与してもよいし、ある期間に渡って、いくつかの別個の用量を投与してもよいし、あるいは療法的状況の緊急の要件によって示されるように、用量を比例的に減少させるかまたは増加させてもよい。投与および投薬の均一性を単純にするため、単位投薬型で非経口組成物を配合することが特に好適である。本明細書において、単位投薬型は、治療しようとする患者／被験体のための単位投薬型として適切な、物理的に別個の単位を指すよう意図され：各単位は、望ましい薬学的キャリアーと組み合わせて、望ましい療法効果を得るように計算された、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有する。典型的には、本発明の単位投薬型の明細は、（ａ）化学療法剤のユニークな特性、および達成しようとする特定の療法的または予防的効果、ならびに（ｂ）被験体における感受性を治療するためのこうした活性化合物の配合技術に本質的な限界によって決定され、そしてこれらに直接依存する。
【０１２１】
したがって、当業者は、本明細書の開示から、投薬量および投薬措置が、療法分野において周知の方法にしたがって調節されることを認識するであろう。これは、最大許容用量は、容易に確立可能であり、そして患者に対して検出可能な療法的効果を提供する有効量もまた決定可能であり、患者に対する検出可能な療法的効果を達成するための各剤の投与に関する時間的な必要性も同様であることを意味する。したがって、いくつかの用量および投薬措置を、例として本文書に提供するが、これらの例は、いかなる意味でも、本発明を実施する際に、患者に関して必要とされうる投薬量および投薬措置を限定しない。
【０１２２】
投薬の価値は、軽減しようとする状態のタイプおよび重症度に応じて多様である可能性もあり、そしてこれには、１つまたは多数の用量が含まれてもよいことが注目される。さらに、任意の特定の患者に関して、個々の必要性にしたがった時間に渡って、そして組成物の投与を実行するかまたは管理する医師の裁量で、特定の投薬措置を調節すべきであり、そして本明細書に示す濃度範囲は例としてのみであり、そして具現化された組成物の範囲または実施を制限するようには意図されないことが理解されるものとする。さらに、本発明の組成物での投薬措置は、疾患のタイプ、年齢、体重、性別、患者の健康状態、状態の重症度、投与経路、および使用する特定の抗体を含む、多様な要因に基づいてもよい。したがって、投薬措置は、非常に多様であってもよいが、標準法を用いて、ルーチンに決定してもよい。例えば、臨床効果、例えば毒性効果および／または実験室の値を含んでもよい、薬物動態学的または薬力学的パラメータに基づいて、用量を決定してもよい。したがって、本発明は、当業者によって決定されるような、患者内用量増大を含む。必要な用量および様式の決定は、関連する技術分野に周知であり、そして本文書に開示する着想を知った後、当業者には明らかであろう。
【０１２３】
適切な投与法の例を上に提供する。
本発明の抗体の適切な用量は、０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１〜２０ｍｇ／ｋｇを含むことが意図される。例えば少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで、少なくとも１ｍｇ／ｋｇを含めて、例えば少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇで、例えば少なくとも２ｍｇ／ｋｇで、例えば少なくとも３ｍｇ／ｋｇで、少なくとも４ｍｇ／ｋｇを含めて、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇで；そして例えば最大で５０ｍｇ／ｋｇまでで、最大で３０ｍｇ／ｋｇまでを含めて、例えば最大で２０ｍｇ／ｋｇまでで、最大で１５ｍｇ／ｋｇまでを含めて、抗体を投与してもよい。投与は典型的には、適切な時間間隔で、例えば週1回、２週に１回、３週ごとに１回または４週ごとに１回、そして担当医が適切であると判断する限り長く反復され、いくつかの場合、担当医は、必要であれば、用量を増加するかまたは減少してもよい。
【０１２４】
薬学的組成物
本発明の抗体を、患者への投与に適した薬学的組成物内に取り込んでもよい。本発明の抗体を単独で、あるいは薬学的に許容されうるキャリアー、希釈剤、および／または賦形剤と組み合わせて、単一または多数用量で投与してもよい。投与のための薬学的組成物は、投与の選択した様式に適切であるように設計され、そして薬学的に許容されうる希釈剤、キャリアー、および／または賦形剤、例えば分散剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤等を適切であるように用いてもよい。前記組成物は、例えば、実施者に一般的に知られるように、組成物を得るための多様な技術を提供する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  第１９版，  Ｇｅｎｎａｒｏ監修，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  １９９５におけるような慣用的方法にしたがって、設計される。
【０１２５】
「医薬品（薬剤）」は、ヒトおよび動物において、生理学的機能の回復、改善または修飾のために、そして疾患の治療および防止のために、診断、麻酔、避妊、美容術等のために意図される、錠剤、カプセル、粉末、凍結乾燥物、注射剤、注入剤、軟膏および他の既製品型の薬学的組成物としての化合物または化合物の混合物である。当該技術分野において許容される、ペプチド、タンパク質または抗体を投与するための任意の方法を、本発明の抗体に関して、適切に使用してもよい。
【０１２６】
用語「薬学的に許容されうる」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける投与に適した１つまたはそれより多い適合する液体または固体構成要素を指す。
用語「賦形剤」は、本明細書において、本発明の上記成分以外の任意の成分を記載する。これらは、薬剤産物に、必要な物理化学特性を与えるため、薬剤製造において用いられる無機または有機性の物質である。
【０１２７】
用語「緩衝液」、「緩衝剤組成物」、「緩衝剤」は、その酸−塩基コンジュゲート構成要素の作用によって、ｐＨの変化に抵抗することが可能であり、そして抗体薬剤が、ｐＨの変化に抵抗することを可能にする、溶液を指す。一般的に、薬学的組成物は、好ましくは、４．０〜８．０の範囲のｐＨを有する。用いる緩衝剤の例には、限定されるわけではないが、酢酸、リン酸、クエン酸、ヒスチジン、コハク酸等の緩衝溶液が含まれる。
【０１２８】
用語「等張剤」、「浸透圧調節物質」または「浸透圧調節剤」は、本明細書において、液体抗体配合物の浸透圧を増加させうる賦形剤を指す。「等張」薬剤は、ヒト血液のものと等しい浸透圧を有する薬剤である。等張薬剤は、典型的には、約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。用いられる等張剤には、限定されるわけではないが、ポリオール、糖類およびスクロース、アミノ酸、金属塩、例えば塩化ナトリウム等が含まれる。
【０１２９】
「安定化剤」は、活性剤の物理的および／または化学的安定性を提供する、賦形剤、あるいは２つまたはそれより多い賦形剤の混合物を指す。安定化剤には、アミノ酸、例えば限定されるわけではないが、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、リジン、グルタミン、プロリン；界面活性剤、例えば限定されるわけではないが、ポリソルベート２０（商品名：Ｔｗｅｅｎ  ２０）、ポリソルベート８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ  ８０）、ポリエチレン−ポリプロピレングリコールおよびそのコポリマー（商品名：ポロキサマー）、プルロニック（登録商標）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；酸化防止剤、例えば限定されるわけではないが、メチオニン、アセチルシステイン、アスコルビン酸、モノチオグリセロール、硫酸塩等；キレート剤、例えば限定されるわけではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸ナトリウム等が含まれる。
【０１３０】
特定される保存可能期間中に、保存温度、例えば２〜８℃で、活性剤が、その物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を保持するならば、薬学的組成物は「安定」である。好ましくは、活性剤は、物理的および化学的安定性、ならびに生物学的活性の両方を保持する。加速されたまたは天然の経年変化（ａｇｉｎｇ）状態において、安定性試験の結果に基づいて、保存期間を調節する。
【０１３１】
本発明のモノクローナル抗体を含む薬学的組成物を、本出願に記載するような病理を示す患者に、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋内、鼻内、頬側、舌下、または座薬投与を含む、標準的投与法を用いて投与してもよい。
【０１３２】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、本発明の抗体の「療法的有効量」を含むかまたは「療法的有効量」である。用語「療法的有効量」は、所望の療法的結果を達成するために必要な投薬量および期間で有効である量を指すよう意図される。抗体の療法的有効量は、被験体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに抗体またはその部分が被験体において望ましい反応を誘発する能力などの要因にしたがって多様であってもよい。療法的有効量はまた、抗体の療法的に有益な効果がいかなる毒性のまたは有害な効果にも勝るものである。「予防的に有効な量」は、望ましい予防的結果を達成するために必要な投薬量および期間で有効な量を指す。典型的には、予防的用量は、疾患前または疾患の早期に個体に処方されるため、予防的に有効な量は、療法的に有効な量より少ない可能性もある。
【０１３３】
療法的に有効なまたは予防的に有効な量は、患者に療法的利点を提供するために必要である活性剤の毒性用量より低い、少なくとも最小限に療法的に有益な用量である。一方、本発明の抗体の療法的に有効な量は、自己免疫クローンの存在が、望ましくない病的な影響を引き起こすかまたはそれに貢献する場合、あるいはそのベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲの減少が、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、有益な療法的効果を引き起こす場合、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、自己免疫クローンの生物学的活性を、例えば、そのベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲへの結合を通じて減少させる量である。
【０１３４】
本発明の抗体の投与経路は、経口、非経口、吸入または局所であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、非経口投与に許容されうる薬学的組成物中に含まれてもよい。用語「非経口」には、本明細書において、静脈内、筋内、皮下、直腸、膣または腹腔内投与が含まれる。静脈内、腹腔内または皮下注射が好ましい投与経路である。こうした注射に許容されうる薬学的キャリアーは、先行技術から周知である。
【０１３５】
適切な指針に記載されるように、薬学的組成物は、産生、および例えば気密性のバイアル（アンプル）またはシリンジによって提供される、コンテナ中の保存条件下で、無菌であり、そして安定であるべきである。したがって、組成物を調製した後、薬学的組成物を濾過滅菌に供してもよいし、または任意の他の技術によって微生物学的に適切に作製してもよい。静脈内注入のための典型的な組成物には、例えば無菌リンゲル溶液、生理食塩水、デキストロース溶液またはハンクス塩溶液などの液体２５０〜１０００ｍｌ、および療法的有効用量（例えば１〜１００ｍｇ／ｍｌまたはそれより多い）の抗体濃度が含まれてもよい。用量は、疾患タイプおよび重症度に応じて多様であってもよい。任意の患者の用量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与しようとする特定の化合物、性別、投与期間および経路、全身健康状態、ならびに他の同時に投与される薬剤を含む多くの要因に応じることが、医学の最先端から周知である。典型的な用量は、例えば０．００１〜１０００μｇの範囲であってもよい；が、特に、上述のパラメータを考慮すると、この例示的範囲より低い、そして高い用量が予期される。毎日の非経口投薬措置は、１日あたり、０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ総体重、好ましくは０．３μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ、そしてより好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは０．５μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇである。患者の健康状態の定期的な評価によって、治療プロセスを監視してもよい。数日またはより長い反復投与のため、患者の状態に応じて、疾患症状の望ましい反応または抑制が生じるまで、治療を反復する。しかし、本明細書に記載されない別の投薬措置もまた適用してもよい。実施者が達成しようと望む試料の薬物動態学的崩壊に応じて、単一ポール（ｐｏｌｅ）投与、多数ボーラス投与によって、あるいは抗体の連続注入によって、所望の投薬量を投与してもよい。
【０１３６】
抗体の前記の仮定される特性は、大部分、医師の決定に応じる。適切な用量および措置を選択する際に重要な要因は、望ましい結果である。本明細書で考慮される要因には、治療しようとする特定の疾患、治療を受ける特定の哺乳動物、特定の患者の臨床状態、障害の原因、抗体投与部位、特定の抗体タイプ、投与経路、投与措置および医学業に周知の他の要因が含まれる。
【０１３７】
本発明の療法剤は、凍結または凍結乾燥され、そして投与前に適切な無菌キャリアー中で再構成されてもよい。凍結乾燥および再構成は、抗体活性のある程度の喪失を生じうる。用量を調節して、この喪失を補償してもよい。一般的に６〜８の間のｐＨが薬学的組成物には好ましい。
【０１３８】
製造物品（製品）およびキット
本発明のさらなる態様は、その病因形成にＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を所持するＴＣＲを伴う自己免疫疾患および関連状態ならびに悪性血液疾患を治療するために用いる製品を含む、製造物品である。こうした疾患には、例えば、ＡＳ、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫およびその他が含まれる。
【０１３９】
製品は、ブリスターおよび／またはパッケージ中にあってもよい、ラベルおよびパッケージ挿入物を含むコンテナである。適切なコンテナには、例えば、バイアル、アンプル、シリンジ等が含まれる。コンテナは、多様な材料、例えばガラスまたはポリマー素材から作製されてもよい。コンテナは、特定の状態の治療に有効な組成物を含み、そして無菌アクセスポートを有してもよい。組成物中の少なくとも１つの活性成分は、本発明の抗体である。ラベルおよびパッケージ挿入物は、薬剤が特定の状態を治療するために用いられるよう意図されることを示す。ラベルおよび／またはパッケージ挿入物は、さらに、患者において抗体組成物を投与するための指示を含有し、これには、こうした療法製品に関する、適応症、投与頻度、用量、経路、禁忌および／または注意が含まれる。１つの態様において、パッケージ挿入物は、組成物が治療のために用いられるよう意図されることを示す。
【０１４０】
さらに製造物品は、限定なしに、商業的目的のために必要な、または消費者に必要な他の製品、例えば溶媒、希釈剤、フィルター、注射針、およびシリンジも含んでもよい。
本発明はまた、多様な目的のため、例えばＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを所持するＴ細胞を殺す能力の評価のため、細胞からのＴＲＢＶ９受容体の精製または免疫沈降のために用いてもよいキットにも関する。単離および精製のため、キットは顆粒（例えばセファロース顆粒）にカップリングした抗体を含んでもよい。キットは、コンテナ、ラベルおよびパッケージ挿入物を含む。
【０１４１】
診断使用
また、本発明の抗体を診断目的で用いてもよい（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ）。例えば、患者から得た試料（例えば組織試料または体液試料、例えば炎症性滲出物、血液、腸液、唾液または尿）中のＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを含むＴリンパ球を検出するかまたはそのレベルを測定するために、抗体を用いてもよい。適切な検出および測定法には、イムノアッセイ、例えばフローサイトメトリー、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および免疫組織学が含まれる。本発明にはさらに、本明細書に記載する抗体を含むキット、例えば診断キットが含まれる。
【０１４２】
本発明をよりよく理解可能とするため、以下の実施例を示す。以下の実施例は例示目的のみのためであり、そしていかなる意味でも、本発明の範囲を限定するとは見なされないものとする。
【０１４３】
本明細書に引用するすべての刊行物、特許および特許出願は、本明細書に援用される。前述の発明は、多義性の解釈を排除するため、例示および例によってある程度詳細に記載されてきているが、当業者には、本発明に開示する着想に基づいて、付随する態様の本質または範囲から逸脱することなく、特定の改変および修飾を行ってもよいことが非常に明らかであろう。
【実施例】
【０１４４】
実施例１．  抗体の産生および精製
重複プライマーおよび高忠実度Ｑ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ、米国）を用いて、ＤＮＡ断片を増幅することによって、抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードする核酸（配列番号１０、１２、１４、１６、１８）を得た。試薬キット（＃２８１０４）を用いてＱｉａｇｅｎ（ドイツ）のカラム上で、得た核酸を精製し、そしてヒト重鎖（ＩｇＧ１）および軽鎖（カッパ）遺伝子の定常領域を含む、商業的に入手可能なｐＦｕｓｅベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、米国）内に指向性クローニングした。サンガー法を用いた配列決定によって、クローニングされた断片の配列を確認した。
【０１４５】
その結果、４つの抗体重鎖変異体のコード配列を含むプラスミドを得た：
ＨＶ抗ＴＲＢＶ９−１、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号２０および２１に示す；
ＨＶ抗ＴＲＢＶ９−２、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号２２および２３に示す；
ＨＶ抗ＴＲＢＶ９−３、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号２４および２５に示す；
ＨＶ抗ＴＲＢＶ９−３、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号２６および２７に示す；
および、１つの抗体軽鎖変異体に関する、ＬＶ抗ＴＲＢＶ９（配列番号２８および２９）。
【０１４６】
抗体重鎖のヒト化の度合いは７２％であり、そして軽鎖の度合いは６９％である。
抗体を得るため、プラスミドをＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞株にトランスフェクションした。２９３ｆｅｃｔｉｎｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国  ＃１２３４７０１）をトランスフェクションに用いた。３０００万の細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地、各３０ｍｌに入れ、抗体重鎖変異体の１つをコードするｐＦｕｓｅプラスミド３０μｇ、および抗体軽鎖をコードするｐＦｕｓｅプラスミド３０μｇ、ならびに２３９ｆｅｃｔｉｎｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国  ＃１２３４７０１９）６０μｌをこれに添加した。免疫グロブリン重鎖および軽鎖を含むプラスミドを、内毒素含量に関して試験した水（Ｑｉａｇｅｎ、米国）中に溶解した。
【０１４７】
生じた反応混合物を、振盪装置上、３７℃で１週間インキュベーションした。１週間後、細胞上清を採取し、これを用いて抗体を単離した。この目的のため、上清を１０，０００ｒｐｍで１０回遠心分離し、そして１ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ＰｒＧカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いて、液体分画を精製した。溶出のため、ＨＣｌ中の０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ２．５を用いた。変性条件下で１２％ＰＡＧＥを用いて、単離品質を評価した。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００微量分光光度計上、２８０Ａでの測定によって、定量化を行った。生じた産物を＋４℃で保存した。
【０１４８】
表１は、単離されたタンパク質の特性を示す。
表１  抗体の特性
【０１４９】
【表１】
2021509274.tif 000002
【０１５０】
ＯｃｔｅｔＲｅｄ  ９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ製）を用いて、抗ＴＲＢＶ９抗体のアフィニティを測定した。ＡＲ２Ｇセンサーの調製および固定に関して、製造者のマニュアルに記載される標準プロトコルにしたがって、アミン反応性第二世代センサー（ＡＲ２Ｇ）の表面上に、抗原（表１）を非特異的に固定した。作業緩衝液として、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１％  ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて、３０℃で分析を行った。２の増分で、１２６ｎＭ〜２ｎＭの濃度で、作業緩衝液を用いて、抗ＴＲＢＶ９抗体の結合アフィニティを分析した。標準法にしたがい、そして１：１相互作用モデルを用いて、Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェア（バージョン７．０）を用いて、参照シグナルを減じた後の結合曲線を分析した。結果を表２に要約する。
【０１５１】
表２．  抗体アフィニティの評価
【０１５２】
【表２】
2021509274.tif 000003
【０１５３】
ＴＲＢＶ７＋ＴＲＡＶ３８抗原を用いた際には、抗体との相互作用は観察されなかった。ＴＲＢＶ９−２およびＴＲＢＶ９−４抗体は、最適の特性を示した。
実施例２．  ＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲベータ鎖を発現しているＴリンパ球を標識するための抗ＴＲＢＶ９モノクローナル抗体の使用。
【０１５４】
実施例１に記載するように、モノクローナル抗体（重鎖ＣＤＲ３配列で特徴づけられる、抗ＴＲＢＶ９−１、抗ＴＲＢＶ９−２、抗ＴＲＢＶ９−３、抗ＴＲＢＶ９−４）を産生した。抗体を視覚化するため、製造者のプロトコルにしたがって、フルオレセインイソチオシアネート試薬（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いて、これらをフルオレセインで標識した。４９５／２８０ｎｍの波長での吸収スペクトル比によって、抗体分子と反応するフルオロフォアの量を調節した。標識抗体を用いて、ヒト血液の単核分画において、ＴＲＢＶ９ファミリーのＴＣＲベータ鎖を発現しているＴリンパ球を検出した。
【０１５５】
５人の健康なドナーの末梢血を用いて、この分画を得た。ＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｅｔｔｅ試験管中に血液を収集し（各２ｘ９ｍｌ）、（Ｋｏｖａｌｃｈｕｋ  Ｌ．  Ｖ．ら  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  −  ２０１０．  −  １７６  ｐ．）に記載される標準法にしたがって、単核分画を単離した。単離後、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に細胞を移した。Ｌａｎｇ  Ｎ．Ｒ．（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  Ｍ．：  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １９７６．−２８８  ｐ．）に記載されるようなトリパンブルー染色法によって、細胞総数およびその生存度を決定した。
【０１５６】
Ｔリンパ球を標識するため、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭ  ＥＤＴＡを補充したＰＢＳ緩衝液中に、最終濃度５ｎｇ／μｌおよび０．５ｎｇ／μｌの抗ＴＲＢＶ９−１、抗ＴＲＢＶ９−２、抗ＴＲＢＶ９−３、抗ＴＲＢＶ９−４抗体、ならびに製造者によって推奨される濃度のＣＤ３に対するモノクローナル抗体−ｅＦｌｕｏｒ４０５（ＯＫＴ３クローン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、各試験において、各々、５００，０００細胞（試験あたり）を含む単核分画のアリコットに添加した。
【０１５７】
０．５％  ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡを補充したＰＢＳ  ５０μｌの体積を有する、生じた反応混合物を、室温で３０分間インキュベーションし、その後、細胞を、０．５％  ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡを補充したＰＢＳ緩衝剤で洗浄し、そして染色結果をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＡＲＩＡ  ＩＩＩ、米国、図１〜４）によって分析した。モノクローナル抗体の生じた変異体はすべて、ＣＤ３＋陽性細胞の分画を特異的に認識することが示された。しかし、ＴＲＢＶ９−２変異体が最も安定した染色を示し、５ｎｇ／μｌおよび０．５ｎｇ／μｌの抗体濃度両方でＣＤ３陽性分画の２．９％であった。他の抗体変異体（抗ＴＲＢＶ９−２、抗ＴＲＢＶ９−３、抗ＴＲＢＶ９−４）は、同じ濃度で、ＴＲＢＶ９＋リンパ球の異なる比率の染色を示した。また、他の変異体を用いた際に存在する、弱く染色される非特異的ＣＤ３陰性細胞が存在しないことによって、そしてＴＲＢＶ９に関して陰性である他のＣＤ３陽性リンパ球から、特異的細胞集団が有意に分離されることによって、抗ＴＲＢＶ９−２の特異性を決定した。
【０１５８】
したがって、第二の変異体（抗ＴＲＢＶ９−２）は、ＴＲＢＶ９＋  Ｔリンパ球の最も有効でそして非常に特異的な染色を示すことが見出された。この抗体を、０．６ｎｇ／μｌの濃度で、ＴＲＢＶ９＋  Ｔリンパ球の検出のための診断目的に用いてもよい。
【０１５９】
抗ＴＲＢＶ９−１、抗ＴＲＢＶ９−２、抗ＴＲＢＶ９−３、抗ＴＲＢＶ９−４抗体の特異性を評価するため、５つの末梢血試料から、上述のように得た単核血液分画を、以下の比を用いて、上述のように抗ＴＲＢＶ９−ＦＩＴＣ抗体および抗ＣＤ３−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）で染色した：
５μｌ（１μｇ）の抗ＣＤ３−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）および３０ｎｇ（０．５ｎｇ／ｍｌ）の抗ＴＲＢＶ９−２  ＦＩＴＣを、単核血液分画の３００万の細胞に添加した。反応混合物を室温で３０分間インキュベーションし、０．５％  ＢＳＡを補充したＰＢＳ緩衝剤で細胞を洗浄し、そしてＣＤ３＋ＴＲＢＶ９＋細胞、ならびにＣＤ３＋ＴＲＢＶ９−細胞の集団を単離するため、セルソーター（ＦＡＣＳＡＲＩＡ  ＩＩＩ、米国）上でソーティングした。ＣＤ３＋ＴＲＢＶ９＋集団の再ソーティングによって、ソーティング品質を管理し、この再ソーティングは、ターゲット細胞集団の９５％の濃縮を示した。
【０１６０】
得た細胞分画をＲＬＴ緩衝剤（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）中に入れ、製造者のプロトコルにしたがって、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙミニキット＃２１７００４試薬キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを単離した。Ｂｒｉｔａｎｏｖａら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２０１６，  １９６（１２）  ５００５−５０１３）に記載されるプロトコルにしたがって、Ｍｉｎｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｅｕｒｏｇｅｎ、ロシア）を用いて、単離ＲＮＡテンプレート上でｃＤＮＡを合成し、Ｔ受容体ベータ鎖の断片を増幅した。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター（米国）を、産生された単位複製配列に連結し、配列決定装置の製造者のプロトコルにしたがって、ＭｉＳｅｑ  Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で、配列決定を行った。インターネット上、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｉｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．ｃｏｍで入手可能であるＭｉＧＥＣ、ＭｉＸＣＲおよびＶＤＪツールソフトウェアを用いて、配列決定データを分析した。データ分析は、ＣＤ３＋ＴＲＢＶ９＋分画の９０％の配列が、ＴＲＢＶ９ベータ鎖可変セグメント遺伝子ファミリーに属することを示した。同時に、ＴＲＢＶ９可変セグメント配列を含有する断片は、ＣＤ３＋ＴＲＢＶ９−分画にはまったく見られなかった。したがって、抗ＴＲＢＶ９−１、抗ＴＲＢＶ９−２、抗ＴＲＢＶ９−３、抗ＴＲＢＶ９−４は、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖に特異的に結合する。
【０１６１】
実施例３．  抗体の機能的活性
実施例１に記載するように、モノクローナル抗体（重鎖ＣＤＲ３配列で特徴づけられる、抗ＴＲＢＶ９−１、抗ＴＲＢＶ９−２、抗ＴＲＢＶ９−３、抗ＴＲＢＶ９−４）を得た。実施例２に記載するように、ヒト血液の単核分画を得た。
【０１６２】
さらに、ヒトＮＫ細胞単離試薬キット＃１３０−０９２−６５７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃ、米国）を用いて、単核分画の部分から、ナチュラルキラー細胞を単離した。製造者のプロトコルを用いた。標識抗体ＣＤ１６−ＦＩＴＣ、ＣＤ５６−ＰＥ、ＣＤ３−ＶｉｏＢｌｕｅを用いたサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩＩ、米国）によって、ＮＫ細胞単離の品質を評価した。ＮＫ細胞の濃縮は８５〜９５％であった。
【０１６３】
細胞傷害性を評価するため、１ｘ１０６細胞を含む単核分画アリコットに、最終濃度５μｇ／ｍｌで、抗体（抗ＴＲＢＶ９−１、抗ＴＲＢＶ９−２、抗ＴＲＢＶ９−３、または抗ＴＲＢＶ９−４）を添加した。抗ＴＲＢＶ９抗体と同じ濃度の抗体レミケードを陰性対照として用いた。対照細胞アリコットには抗体を添加しなかった（陽性対照）。また、１０５  ＮＫ細胞をすべての反応混合物に添加した。最終反応体積は１００μｌだった。
【０１６４】
反応混合物を室温で１時間インキュベーションし、次いで細胞を数回洗浄して、抗体を除去し、そしてテーブル上、９６ウェル丸底プレートのウェルに分配した。
６日後、細胞をウェルから採取し、そしてフローサイトメトリーを用いた免疫表現型分析に用いた。以下の抗体を用いて、Ｔリンパ球を検出した：抗ＣＤ３−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ＯＫＴ３クローン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；抗ＣＤ８−ＰＣ７（ＳＦＣＩ２１Ｔｈｙ２Ｄ３クローン、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、米国）；生じる抗体はＦｉｔｃで標識された抗ＴＲＢＶ９−１、２、３、４である。染色後、細胞を洗浄し、そしてＢＤ  ＦＡＣＳＡＲＩＡ  ＩＩＩ装置上で分析した。ＣＤ３＋ＴＲＢＶ９＋  Ｔリンパ球は、本発明の抗ＴＲＢＶ９抗体とインキュベーションした試料中ではまったく検出されなかった。対照的に、ＣＤ３＋ＴＲＢＶ９＋二重陽性Ｔリンパ球は、抗ＴＲＢＶ９抗体を含まない対照試料（「ゼロ対照」）、ならびに療法抗体レミケードを含む対照試料においてなお検出され、この事実は、ＴＲＢＶ９に対する抗体の添加後、ＴＲＢＶ９＋  Ｔ細胞が特異的に除去されたことを確認した。図５は、フローサイトメトリーの典型的な結果を示す。本発明の抗ＴＲＢＶ９抗体の代わりに、非細胞傷害性抗ＣＤ６抗体を用いたさらなる陰性対照においては、「ゼロ対照」に比較した際、ターゲットＣＤ３＋ＣＤ６＋集団には変化は観察されなかった。これは、第６日の非標識抗体によるエピトープのスクリーニングがまったく観察されないことを示し、そして抗ＴＲＢＶ９抗体が、ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを所持する細胞を除去する能力を確認する。
【０１６５】
実施例４．  安定細胞株の操作
軽鎖および重鎖抗体鎖の最適比を含むベクター構築物で、懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞株をトランスフェクションすることによって、抗ＴＲＢＶ９−２モノクローナル抗体を産生する安定細胞株を得た。ＣｌｏｎｅＰｉｘロボットプラットフォーム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、高レベル（１００ｍｇ／Ｌ）を維持するクローン株を得た。Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸロボット自動化系（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、およびＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６分析系（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、選択したクローンの生産性を分析した。動物由来タンパク質を含有しない血清不含培地を用いて、産生細胞を培養した。ＨｙＣｌｏｎｅ単回使用バイオリアクター（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２００Ｌ発酵装置中で、前臨床研究のためのＢＣＤ０８５産物を産生した。
【０１６６】
実施例５．  本発明の抗体を含む薬学的組成物を得る
薬学的組成物の構成要素を表３に示す。
表３．  薬学的組成物の構成要素の濃度
【０１６７】
【表３】
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【０１６８】
実施例６．  抗体を含む薬学的組成物を含むキット
抗ＴＲＢＶ９−２抗体組成物を含む投薬型を含むキットを産生するため、実施例５にしたがって調製した薬学的組成物を、無菌条件下で、１ｍｌアンプルまたはシリンジ中に密封し、ラベルを付け、そしてプラスチックまたはボール紙コンテナ内にパッケージングした。
【０１６９】
また、アンプルコンテナに挿入物も含めた。
実施例７．  本発明の抗体の変異体
Ｗｕｒｃｈら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  １２  （９），  ６５３−６５７（２００４）に記載されるように、ＰＣＲ産物の「重複伸長」を用いた部位特異的突然変異誘発によって、突然変異体ＨＶ抗ＴＲＢＶ９−１配列を得た。ＰＣＲには、製造者の指針にしたがって、Ｑ５高忠実度ポリメラーゼ（ＮＥＢ、米国）を用いた。増幅後、１％アガロースゲル電気泳動およびさらなる抽出によって、得た断片を精製した。重複伸長ＰＣＲ（９５℃１２秒間の変性；５５℃２分間のアニーリング；７２℃１分間の伸長、８回のＰＣＲサイクル）によって、突然変異を含むゲル単離ＤＮＡ断片を完全な構築物に組み合わせた。この方法は、互いに相補的な領域を有する反応混合物中に存在する断片を、テンプレートおよびプライマーとして用いることを仮定する。増幅された断片の末端に相補的なプライマーを付加した標準ＰＣＲによって、全構築物を増幅した。実施例１に記載するように、試薬キット（＃２８１０４）を用いて、Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ）カラム上で、得た核酸を精製し、そしてｐＦｕｓｅベクター内にクローニングした。サンガー法による配列決定によって、突然変異体ＤＮＡ配列をチェックした。生じた可変ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下のように示す：変異体１−配列番号３０および配列番号３１中；変異体２−配列番号３２および配列番号３３中。突然変異体抗体が、ＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲベータ鎖を発現しているＴリンパ球に結合する能力を、実施例２に記載するように検証した。導入された置換は、結合特異性に影響を及ぼさないことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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