(57)【要約】  ヒト母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生成及び精製する方法が提供される。この方法は、遺伝子組換え微生物、好ましくは遺伝子組換え酵母株の発酵と、酵素処理、濾過及び疑似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィー工程の１つ又は複数を用いた発酵生成物の下流処理とを含む。食品又は飼料用途、好ましくは乳児用食品及び／又は人工栄養乳における、得られたＨＭＯの使用も提供される。【選択図】なし
2021524238.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種又は複数のヒト母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生成する方法であって、
ａ）１種又は複数のＨＭＯを生成するために遺伝子組換えされた微生物を適切な発酵培地において発酵させて、発酵生成物を形成すること；
ｂ）前記発酵生成物の酵素処理；
ｃ）前記発酵生成物からのバイオマスの除去；
ｄ）限外濾過；
ｅ）ナノ濾過；及び
ｆ）カラムクロマトグラフィー工程
を含む方法。
【請求項２】
前記１種又は複数のＨＭＯは、２’−フコシルラクトースである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物は、酵母である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵母は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シュワンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）及びチゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、カンジダ・ボイディニー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、シュワンニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、トルラスポラ・デルブルッキー（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、チゴサッカロミセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）及びチゴサッカロミセス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）からなる群から選択される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素処理は、ラクターゼ、β−ガラクトシダーゼ、トレハラーゼ及びインベルターゼからなる群から選択される１種又は複数の酵素と共に前記発酵生成物をインキュベートすることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素処理は、乳糖及び／又はショ糖を単糖に転化させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発酵生成物からの前記バイオマスの前記除去は、遠心分離、濾過又はその組み合わせを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記クロマトグラフィー工程は、単層カラム又は多層カラムである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記カラムクロマトグラフィー工程は、疑似移動床クロマトグラフィーである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ナノ濾過工程は、複数回行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ濾過は、２回行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ナノ濾過工程は、連続的に行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）脱色；
ｂ）濾過；及び／又は
ｃ）乾燥
の１つ又は複数を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記乾燥は、蒸発を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記疑似移動床クロマトグラフィーは、
ｉ）少なくとも１つのカラムが弱又は強陽イオン交換樹脂を含む、少なくとも４つのカラム；及び／又は
ｉｉ）異なる流量を有する４つの領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ；及び／又は
ｉｉｉ）水を含む溶離液；及び／又は
ｉｖ）１５℃〜６０℃の動作温度
を含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶離液は、エタノール及び／又は硫酸を更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
領域Ｉにおける前記流量は、２８〜３２ｍｌ／分であり、領域ＩＩにおける前記流量は、１９〜２３ｍｌ／分であり、領域ＩＩＩにおける前記流量は、２１〜２５ｍｌ／分であり、及び／又は領域ＩＶにおける前記流量は、１６〜２０ｍｌ／分である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記動作温度は、２５℃〜５０℃である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
２〜４ｍｌ／分の供給速度を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
１０〜１３ｍｌ／分の溶離液流量を含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
１６〜２０分のスイッチング時間を含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのカラムは、０．１〜５０００ｋｇの陽イオン交換樹脂を含む、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記陽イオン交換樹脂は、スルホン酸樹脂である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）〜ｆ）は、任意の順序で行われる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ａ）〜ｆ）は、請求項１に記載の順序で行われる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法に従って得られるＨＭＯ。
【請求項２８】
食品又は飼料調製物における、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法に従って得られるＨＭＯの使用。
【請求項２９】
前記食品は、ヒト用食品である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記食品は、乳児用食品である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記食品は、人工栄養乳又は乳児用サプリメントである、請求項２９又は３０に記載の使用。
【請求項３２】
栄養補助食品における、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法に従って得られるＨＭＯの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月２３日出願の米国仮特許出願第６２／６７５，３９３号明細書の出願日の利益を主張する。
【０００２】
［背景］
[0002]本開示は、ヒト母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生成及び精製するプロセスに関する。このプロセスは、遺伝子組換え微生物、好ましくは遺伝子組換え酵母株の発酵と、酵素処理、濾過及び特に疑似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィー形式の単層カラム又は多層カラムクロマトグラフィーの１つ又は複数を用いた発酵生成物の下流処理とを含む。
【０００３】
[0003]ヒト母乳は、構造的に多様な非抱合型グリカンである固有のオリゴ糖、ＨＭＯのファミリーを含有する。ヒト母乳の３番目（乳糖及び脂肪に続く）に豊富な固形成分であるにもかかわらず、ヒト乳児は、実際にはＨＭＯを消化することができない。代わりに、ＨＭＯは、プレバイオティクスとして機能して、共生細菌を確立することを促進する。ＨＭＯは、粘膜表面への微生物病原体の付着の防止を促進する付着防止剤としても機能する。これらの複合オリゴ糖の出現及び集中は、ヒトに特異的であり、酪農家畜などの他の哺乳動物のミルク中に大量には見られない。
【０００４】
[0004]ヒト母乳オリゴ糖の化学的合成に伴う課題のため、主に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌株におけるいくつかの酵素的方法及び発酵的アプローチが開発されている。しかしながら、これらの方法では、オリゴ糖の複合混合物が形成され、すなわち目的の生成物に乳糖などの出発原料、生合成中間体及び個々の単糖、ポリペプチドなどの基質等が混入している。
【０００５】
[0005]これらの混合物から個々のオリゴ糖生成物を精製するための従来技術におけるプロセスは、技術的に複雑である。乳清又は糖蜜などの複合混合物から乳糖又はショ糖などの二糖を分離するために、複数の結晶化作業が糖産業で用いられている。これらの方法の欠点は、複雑であり、且つ生成収量が低いことである。特定のＨＭＯなど、複合オリゴ糖の精製には、サイズ排除クロマトグラフィーが最も広く使用されている。しかしながら、サイズ排除クロマトグラフィーは、食品用途にとって経済的ではなく、特定のＨＭＯ、例えば２’−フコシルラクトース（２’ＦＬ）を適切な量で生成することができない。
【０００６】
[0006]したがって、低コスト且つ高効率及び／又は高純度でＨＭＯ、特に２’ＦＬを生成及び精製するための向上したプロセスを提供する必要が依然としてある。
【０００７】
[0007]技術的問題の解決策は、以下に特徴付ける実施形態によって提供される。
【０００８】
［簡単な概要］
[0008]本出願は、ヒト母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生成及び精製する方法を提供する。特に、本発明の方法は、目的のＨＭＯを生成するために遺伝子組換えされた微生物を適切な発酵培地において発酵させることと、得られた発酵生成物を精製して、副生成物を除去し、且つ目的のＨＭＯを得ることとを含む。
【０００９】
[0009]一部の実施形態において、微生物は、目的のＨＭＯを生成するために遺伝子組換えされている酵母である。
【００１０】
[0010]２’−フコシルラクトース（２’ＦＬ）などの目的のＨＭＯは、疑似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーによって発酵培地から精製される。発酵後、目的のＨＭＯを含有する発酵培地は、ＳＭＢクロマトグラフィーに適用される。好ましくは、ＳＭＢクロマトグラフィーに発酵培地を適用する前に、発酵培地を、以下：
[0011]ｉ）発酵生成物の酵素処理；
[0012]ｉｉ）バイオマスの除去；
[0013]ｉｉｉ）発酵生成物の限外濾過；及び／又は
[0014]ｉｖ）発酵生成物のナノ濾過
の１つ又は複数にかける。
【００１１】
[0015]一部の実施形態において、発酵生成物の酵素処理を用いて、乳糖及び／又はショ糖を単糖に転化させる。
【００１２】
[0016]一部の実施形態において、酵素処理は、１種又は複数の酵素と共に発酵生成物をインキュベートすることを含む。一部の実施形態において、酵素は、ラクターゼ、β−ガラクトシダーゼ、トレハラーゼ及び／又はインベルターゼである。
【００１３】
[0017]一部の実施形態において、バイオマスの除去は、遠心分離、濾過、限外濾過、ナノ濾過又はその組み合わせによって行われる。
【００１４】
[0018]一部の実施形態において、バイオマスの除去は、遠心分離によって行われる。
【００１５】
[0019]一部の実施形態において、バイオマスの除去は、濾過によって行われる。
【００１６】
[0020]一部の実施形態において、発酵生成物の限外濾過を用いて、タンパク質及び／又は他の高分子量分子、例えばＤＮＡが除去される。
【００１７】
[0021]一部の実施形態において、発酵生成物のナノ濾過を用いて、低分子量分子、例えば標的化合物よりも大きいオリゴ糖及び／又はそれより小さい糖成分並びにペプチドが除去される。
【００１８】
[0022]一部の実施形態において、複数のナノ濾過工程に発酵生成物がかけられる。例えば、第１のナノ濾過工程は、目的のＨＭＯよりもわずかに大きいか又は大きい分子、例えばＨＭＯより大きいオリゴ糖などを除去するために実施され得る。第２のナノ濾過は、目的のＨＭＯよりも小さい分子、例えば単糖、アミノ酸及びイオンなどを除去するために実施され得る。一部の実施形態において、ナノ濾過工程は、連続的に行われる。
【００１９】
[0023]一部の実施形態において、本発明の方法は、以下：
[0024]ａ）脱色；
[0025]ｂ）更なる濾過；及び／又は
[0026]ｃ）得られたＨＭＯ溶液の濃縮及び／又は乾燥
の１つ又は複数を更に含む。
【００２０】
[0027]好ましい実施形態において、脱色、更なる濾過及び／又は乾燥は、ＳＭＢクロマトグラフィー工程後に実施される。
【００２１】
[0028]乾燥工程を除いて、本発明の方法の工程は、任意の順序で行われ得ることが理解されるであろう。一部の実施形態において、本発明の方法の１つ又は複数の工程は、複数回行われ得る。好ましい実施形態において、本発明の方法の工程は、上記の順序で行われる。
【００２２】
[0029]本発明の方法に従って得られるＨＭＯも提供される。
【００２３】
[0030]一部の実施形態において、本発明の方法に従って得られるＨＭＯは、食品、サプリメント又は医薬組成物中にある。医薬組成物は、薬剤として許容される担体を含有し得る。
【００２４】
[0031]一部の実施形態において、本発明の方法に従って得られるＨＭＯは、食品において使用することができる。食品は、非ヒト動物又はヒトが摂取するいずれかの食料であり、固体及び液体組成物の両方を含む。食品は、動物又はヒト用食料の添加物であり得る。食料としては、限定されないが、一般的な食料；液体食品、例えばミルク、飲料、治療用飲料及び栄養飲料；機能性食品；サプリメント；栄養補助剤；未熟児用調合乳などの人工栄養乳；妊婦又は母乳で育てている母親のための食品；成人のための食品；老人用食品；及び動物用食品が挙げられる。
【００２５】
[0032]本開示の性質、目的及び利点を更に理解するために、以下の図面と併せて以下の詳細な説明を参照されたい。同様の参照数字は、同様の要素を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】[0033]本発明の例示的な工程を示す。
【００２７】
［詳細な説明］
[0034]本開示を更に説明する前に、特定の実施形態に対する変更形態がなされ得るため、本開示は、以下に記載の本開示の特定の実施形態に限定されず、且つ依然として添付の特許請求の範囲内にあることを理解されたい。用いられる専門用語は、記載の特定の実施形態の目的のためであり、それに限定することを意図するものではないことも理解されたい。代わりに、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって確立される。
【００２８】
[0035]本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈に明確に指定がない限り複数形を包含する。別段の指定がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００２９】
[0036]本明細書で使用される「発酵生成物」という用語は、微生物の発酵から得られる生成物を意味する。したがって、発酵生成物は、細胞、発酵培地、残留基質材料及び発酵中に生成されるいずれかの分子／副生成物、例えば目的のＨＭＯなどを含む。精製方法の各工程後、発酵生成物の１種又は複数の成分が除去され、その結果、より精製されたＨＭＯが得られる。
【００３０】
[0037]本開示は、一態様において、ヒト母乳オリゴ糖を生成及び精製する方法であって、遺伝子組換え微生物の発酵；乳糖及びショ糖を単糖に転化させる酵素処理；バイオマス（例えば、細胞、高分子量分子）を除去するための遠心分離及び／又は濾過；タンパク質及び／又はＤＮＡなどの他の高分子量分子を除去するための限外濾過；目的のＨＭＯよりもわずかに大きい且つ／又は小さい分子を除去するための１つ又は複数のナノ濾過工程；並びに疑似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーの１つ又は複数を含む方法を特徴とする。
【００３１】
[0038]本発明の方法に従って生成及び精製される目的のＨＭＯは、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩＩ、６’−ガラクトシル乳糖、３’−ガラクトシル乳糖、ラクト−Ｎ−ヘキサオース及びラクト−Ｎ−ネオヘキサオースからなる群から選択される。
【００３２】
[0039]好ましい実施形態において、本発明の方法に従って生成及び精製される目的のＨＭＯは、２’−フコシルラクトース（２’ＦＬ）である。
【００３３】
[0040]２’ＦＬなどの目的のＨＭＯは、遺伝子組換え微生物の発酵によって生成される。発酵は、例えば、化学的に定義される発酵培地など、いずれかの適切な発酵培地において行われ得る。発酵培地は、使用される微生物に応じて異なり得る。
【００３４】
[0041]好ましい実施形態において、微生物は、遺伝子組換え酵母である。酵母は、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）株、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）株、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）株、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株、シュワンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）株、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）株、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株又はチゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株であり得る。
【００３５】
[0042]一部の実施形態において、酵母は、例えば、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、カンジダ・ボイディニー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、シュワンニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、トルラスポラ・デルブルッキー（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、チゴサッカロミセス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）又はチゴサッカロミセス・バイリー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）である。
【００３６】
[0043]発酵生成物からのバイオマスの分離は、いずれかの適切な手段によって行うことができる。一実施形態において、発酵生成物を遠心分離し、バイオマスを分離して除去する。他の実施形態において、発酵生成物を濾過して、バイオマスを分離して除去する。一部の実施形態において、遠心分離と濾過とを併用して、発酵生成物からバイオマスを分離して除去する。一部の実施形態において、膜ろ過を用いて、発酵培地を濾過する。好ましい実施形態において、膜濾過は、精密濾過、限外濾過又はその組み合わせである。
【００３７】
[0044]好ましい実施形態において、好ましくはカットオフ１０ミクロン、好ましくはカットオフ５ミクロン、好ましくはカットオフ０．２ミクロンのクロスフロー精密濾過によって発酵生成物を濾過して、バイオマスを分離して除去する。
【００３８】
[0045]一部の実施形態において、限外濾過を行い、タンパク質及びＤＮＡなどの他の高分子量化合物を発酵生成物から除去する。一部の実施形態において、限外濾過膜の孔径は、１００ｋＤ以下の分画分子量（「ＭＷＣＯ」）、９０ｋＤのＭＷＣＯ、８０ｋＤのＭＷＣＯ、７０ｋＤのＭＷＣＯ、６０ｋＤのＭＷＣＯ、５０ｋＤのＭＷＣＯ、４０ｋＤのＭＷＣＯ、３５ｋＤのＭＷＣＯ、３０ｋＤのＭＷＣＯ、２５ｋＤのＭＷＣＯ、２０ｋＤのＭＷＣＯ、１５ｋＤのＭＷＣＯ、１０ｋＤのＭＷＣＯ、９ｋＤのＭＷＣＯ、８ｋＤのＭＷＣＯ、７ｋＤのＭＷＣＯ、６ｋＤのＭＷＣＯ若しくは５ｋＤのＭＷＣＯ又はそれ未満である。
【００３９】
[0046]一部の実施形態において、最初のナノ濾過工程を実施して、目的のＨＭＯよりもわずかに高い分子量を有する分子を発酵生成物から除去する。一部の実施形態において、ナノ濾過膜の孔径は、０．５ｋＤのＭＷＣＯ、０．６ｋＤのＭＷＣＯ、０．７ｋＤのＭＷＣＯ、０．８ｋＤのＭＷＣＯ、０．９ｋＤのＭＷＣＯ、１ｋＤのＭＷＣＯ、１．２ｋＤのＭＷＣＯ、１．４ｋＤのＭＷＣＯ、１．６ｋＤのＭＷＣＯ、１．８ｋＤのＭＷＣＯ、２ｋＤのＭＷＣＯ若しくはそれを超えるか、又は対象の標的分子よりも高いＭＤＷＣＯを有する。
【００４０】
[0047]一部の実施形態において、第２のナノ濾過工程を実施して、単糖及びイオンなどの低分子量分子を除去する。一部の実施形態において、第２のナノ濾過膜の孔径は、５００ダルトン（Ｄａ）以下の分画分子量（「ＭＷＣＯ」）、４５０ＤａのＭＷＣＯ、４００ＤａのＭＷＣＯ、３５０ＤａのＭＷＣＯ、３００ＤａのＭＷＣＯ、２５０ＤａのＭＷＣＯ若しくは２００ＤａのＭＷＣＯ又はそれ未満である。
【００４１】
[0048]本明細書に記載の限外濾過及びナノ濾過技術を用いて、それぞれの濾過後に２つの別々のストリームが形成され、１つのストリームは、濃縮水として知られ、第２のストリームは、透過水として知られる。
【００４２】
[0049]一部の実施形態において、限外濾過工程後の透過水中の目的のＨＭＯの収率は、５０％を超え、６０％を超え、７０％を超え、８０％を超え、９０％を超え、９１％を超え、９２％を超え、９３％を超え、９４％を超え、９５％を超え、９６％を超え、９７％を超え、９８％を超え、又は９９％を超える。
【００４３】
[0050]一部の実施形態において、ナノ濾過工程後の透過水中の目的のＨＭＯの収率は、５０％を超え、６０％を超え、７０％を超え、８０％を超え、９０％を超え、９１％を超え、９２％を超え、９３％を超え、９４％を超え、９５％を超え、９６％を超え、９７％を超え、９８％を超え、又は９９％を超える。
【００４４】
[0051]一部の実施形態において、ナノ濾過工程後の濃縮水中の目的のＨＭＯの収率は、５０％を超え、６０％を超え、７０％を超え、８０％を超え、９０％を超え、９１％を超え、９２％を超え、９３％を超え、９４％を超え、９５％を超え、９６％を超え、９７％を超え、９８％を超え、又は９９％を超える。
【００４５】
[0052]濃縮水中の収率（Ｙ）は、Ｙｒ＝ＣｒＶｒ／ＣｆＶｆによって算出され、式中、Ｃｒは、濃縮水中のその溶質の濃度であり、Ｃｆは、初期供給物中のその溶質の濃度であり、Ｖｒは、濃縮水の体積であり、且つＶｆは、初期供給物の体積である。
【００４６】
[0053]透過水中の収率（Ｙ）は、Ｙｐ＝ＣｐＶｐ／ＣｆＶｆによって算出され、式中、Ｃｐは、透過水中のその溶質の濃度であり、Ｃｆは、初期供給物中のその溶質の濃度であり、Ｖｐは、透過水の体積であり、且つＶｆは、初期供給物の体積である。
【００４７】
[0054]一部の実施形態において、脱塩工程が行われる。この工程では、膜及び／又は電気透析工程が用いられ得る。脱塩工程は、第２のナノ濾過工程と同じであり得る。
【００４８】
[0055]本発明のプロセスは、発酵生成物を疑似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーにかけて、不純物、他の同様の分子、不要な分子及び他の荷電分子から２’ＦＬなどの目的のＨＭＯを精製することを含む。ＳＭＢクロマトグラフィーは、好ましくは、１つ又は複数の濾過工程後に行われる。好ましい実施形態において、発酵生成物は、ＳＭＢクロマトグラフィーを実施する前に遠心分離、精密濾過、限外濾過及び１つ又は複数のナノ濾過工程にかけられる。
【００４９】
[0056]ＳＭＢクロマトグラフィー工程は、
[0057]ｉ）少なくとも４つのカラム、好ましくは少なくとも８つのカラム、より好ましくは少なくとも１２のカラム（少なくとも１つのカラムは、弱又は強陽イオン交換樹脂、好ましくはＨ＋型又はＣａ２＋型の陽イオン交換樹脂を含む）；及び／又は
[0058]ｉｉ）異なる流量を有する４つの領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ；及び／又は
[0059]ｉｉｉ）水、好ましくはエタノール及び水、より好ましくは５〜１５体積％のエタノール及び８５〜９５体積％の水、最も好ましくは９〜１１体積％のエタノール及び８９〜９１体積％の水を含むか又はそれからなる溶離液であって、任意選択的に硫酸、好ましくは≦１０ｍＭの硫酸、より好ましくは≦２〜５ｍＭの硫酸を更に含む溶離液；及び／又は
[0060]ｉｖ）１５〜６０℃、好ましくは２０〜５５℃、より好ましくは２５〜５０℃の動作温度
を含み得る。
【００５０】
[0061]精製されるＨＭＯが２’ＦＬである場合、ＳＭＢクロマトグラフィー工程は、
[0062]ｉ）異なる流量を有する４つの領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶであって、流量は、好ましくは、領域Ｉにおいて２８〜３２ｍｌ／分、領域ＩＩにおいて１９〜２３ｍｌ／分、領域ＩＩＩにおいて２１〜２５ｍｌ／分及び／又は領域ＩＶにおいて１６〜２０ｍｌ／分である、４つの領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ；及び／又は
[0063]ｉｉ）２〜４ｍｌ／分、好ましくは３ｍｌ／分の供給速度；及び／又は
[0064]ｉｉｉ）１０〜１３ｍｌ／分、好ましくは１１．５ｍｌ／分の溶離液流量；及び／又は
[0065]ｉｖ）１６〜２０分、好ましくは１７〜１９分、より好ましくは１８分のスイッチング時間
を含み得る。
【００５１】
[0066]好ましくは、カラムの少なくとも１つは、０．１〜５０００ｋｇの陽イオン交換樹脂、好ましくは０．２〜５００ｋｇの陽イオン交換樹脂、より好ましくは０．５〜５０ｋｇの陽イオン交換樹脂、最も好ましくは１．０〜２０ｋｇの陽イオン交換樹脂を含む。
【００５２】
[0067]陽イオン交換材料の量、異なる領域における流量、供給速度、溶離液流量及び／又はスイッチング時間は、必要に応じてスケールアップされ得る。スケールアップは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００倍又は前記値間のすべての可能な拡大倍率であり得る。
【００５３】
[0068]カラムにおいて、強陽イオン交換樹脂が固定相として使用され得る。好ましくは、陽イオン交換樹脂は、スルホン酸樹脂、より好ましくはＰｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）ＰＣＲ８３３Ｈ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ，ラーティンゲン（Ｒａｔｉｎｇｅｎ），独国）、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＭＤＳ２３６８及び／又はＬｅｗａｔｉｔ  ＭＤＳ１３６８樹脂である。陽イオンイオン交換樹脂がカラムにおいて用いられる場合、それは、硫酸で再生され得る。硫酸は、溶離液中において、好ましくは１０ｍＭ以下の硫酸の濃度で用いることができる。（強）陽イオン交換樹脂は、Ｈ＋型又はＣａ２＋型で存在し得る。
【００５４】
[0069]一部の実施形態において、生成されるＨＭＯの純度は、８８％以上である。一部の実施形態において、生成されるＨＭＯの純度は、９０％以上、９１％を超え、９２％を超え、９３％を超え、９４％を超え、９５％を超え、９６％を超え、９７％を超え、９８％を超え、９９％を超える。以下の式が用いられる：
[0070]純度パーセント＝（ＣＨＭＯ／ＣＤＭ）×１００（式中、ＣＨＭＯは、目的のＨＭＯの濃度であり、且つＣＤＭは、全乾燥物質の濃度である）。
【００５５】
[0071]一部の実施形態において、本発明のプロセスは、１種又は複数の脱色工程を含む。脱色は、いずれかの適切な手段によって行うことができる。例えば、脱色は、活性炭での発酵生成物の処理によって行うことができる。１種又は複数の脱色工程は、本発明のプロセス中のいずれかの箇所で行われ得る。好ましい実施形態において、脱色は、ＳＭＢクロマトグラフィー後に行われる。
【００５６】
[0072]目的のＨＭＯを含有する得られた溶液は、濃縮及び／又は乾燥され得る。一部の実施形態において、得られた溶液は、蒸発されるか、凍結乾燥されるか、又はそのいずれかの組み合わせが行われる。
【００５７】
[0073]本発明のプロセスを用いて得られたＨＭＯは、食品及び飼料用途での使用に適している。一部の実施形態において、得られたＨＭＯは、乳児用食品、人工栄養乳及び／又は乳児用サプリメントにおいて使用される。好ましい実施形態において、得られたＨＭＯは、ヒト乳児用食品、ヒト人工栄養乳及び／又はヒト乳児用サプリメントにおいて使用される。
【００５８】
[0074]他の実施形態において、本発明のプロセスを用いて得られたＨＭＯは、例えば、胃腸疾患の治療として薬品において及び／又はプレバイオティクスとして使用される。
【００５９】
[0075]以下の実施例は、例証のために提供されるが、特許請求される本発明を限定するものではない。
【００６０】
［実施例］
［実施例１］
[0076]１種又は複数のヒト母乳オリゴ糖を発現させるために遺伝子組換えされた微生物細胞を適切な発酵培地で培養し、その結果、ヒト母乳オリゴ糖を含有する発酵生成物が得られる。次いで、この発酵生成物をラクターゼ、β−ガラクトシダーゼ、トレハラーゼ及び／又はインベルターゼなどの１種又は複数の酵素で処理する。遠心分離に続いて濾過又はその組み合わせなど、いずれかの適切な手段を用いて、細胞などのバイオマスを発酵生成物から除去する。次いで、発酵生成物を限外濾過にかけて、タンパク質及びＤＮＡなどの他の高分子量化合物を除去する。次いで、ナノ濾過工程を行い、目的のＨＭＯよりもわずかに高い分子量を有する分子を発酵生成物から除去する。第２のナノ濾過工程を行い、単糖及びイオンなどの低分子量分子を除去する。
【００６１】
[0077]次に、発酵生成物を疑似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィー工程にかけて、目的のＨＭＯを更に精製する。ＳＭＢクロマトグラフィーに使用されるシステムは、陽イオン交換樹脂を含有する少なくとも４つのカラムを含む。異なる領域で使用される流量は、領域Ｉにおいて２８〜３２ｍｌ／分、領域ＩＩにおいて１９〜２３ｍｌ／分、領域ＩＩＩにおいて２１〜２５ｍｌ／分及び／又は領域ＩＶにおいて１６〜２０ｍｌ／分である。使用される溶離液は、水中にエタノール１０％であり得る。精製ＨＭＯを含有する得られた溶液を任意選択的に脱色、濾過及び／又は乾燥にかけることができる。
【００６２】
[0078]本明細書に記載のすべての参考文献は、あたかも参考文献のそれぞれが具体的且つ個々に参照により組み込まれることが示されるように、参照により本明細書に組み込まれる。いずれの参考文献の引用も、出願日前のその開示に対するものであり、本開示が、先行発明により、かかる参考文献に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。
【００６３】
[0079]上記の要素のそれぞれ又は２つ以上は、共に上述のタイプと異なる他のタイプの方法でも有用な用途を見出し得ることを理解されたい。更に分析することなく、前述のことから本開示の趣旨が完全に明らかとなるため、他者は、現在の知識を適用することにより、先行技術の観点から、添付の特許請求の範囲に記載の本開示の一般的又は具体的な態様の本質的な特徴を公正に構成する特徴を省略することなく、様々な用途にそれを容易に適用することができる。前述の実施形態は、単なる一例として示されており、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
2021524238.tif 000003
【国際調査報告】
2021524238.tif 000004
2021524238.tif 000005