(57)【要約】  本発明は、増加した治療有効性を有する治療用ＴＩＬ集団を調製するためにＴＩＬを再プログラミングするための改善及び／又は短縮されたプロセス及び方法を提供する。そのような再プログラミングされたＴＩＬは、治療用処置レジメンでの使用を見出す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ｉ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｉｉ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；
（ｉｉｉ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第３のＴＩＬ集団は、前記第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも１００倍多く、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である；及び
（ｉｖ）前記第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は前記治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する；
を含む方法。
【請求項２】
（ｖ）前記第３のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、追加のＯＫＴ−３及び追加のＡＰＣを補充することにより、追加の第２の拡大培養をステップ（ｉｖ）前又は後に実施することを更に含み、前記追加の第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉｉ）で得られたよりも大きい治療用ＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、前記より大きい治療用ＴＩＬ集団は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｄ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｅ）前記第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は前記治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する；
（ｆ）ステップ（ｄ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収すること、ここで、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；及び
（ｇ）ステップ（ｅ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
を含む方法。
【請求項４】
凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）における前記回収されたＴＩＬ集団を含む前記輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記凍結保存プロセスは、回収されたＴＩＬ集団と凍結保存培地との１：１の比率を使用して実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＢＭＣは、照射され、且つ同種異系である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＢＭＣは、ステップ（ｄ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｅ）における前記回収は、膜ベースの細胞処理系を使用して実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｅ）における前記回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の容積を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の断片は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０〜約６０個の断片を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の断片は、約１グラム〜約１．５グラムの総質量を有する約５０個の断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｄ）における前記細胞培養培地は、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
ＩＬ−２濃度は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ〜約５，０００ＩＵ／ｍＬである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＬ−１５濃度は、約５００ＩＵ／ｍＬ〜約１００ＩＵ／ｍＬである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＩＬ−２１濃度は、約２０ＩＵ／ｍＬ〜約０．５ＩＵ／ｍＬである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｆ）における前記輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２３】
前記凍結保存培地は、７％〜１０％のＤＭＳＯを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｃ）における第１の期間及びステップ（ｅ）における第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｃ）における第１の期間及びステップ（ｅ）における第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約２２日の期間内に実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約２０日〜約２２日の期間内に実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１５日〜約２０日の期間内に実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約２０日の期間内に実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約１５日の期間内に実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２２日以下で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２０日以下で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、１５日以下で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ａ）〜（ｆ）は、１０日以下で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ａ）〜（ｆ）及び凍結保存は、２２日以下で実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｅ）で回収された前記治療用ＴＩＬ集団は、治療有効投与量の前記ＴＩＬのために十分なＴＩＬを含む、請求項３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
治療有効投与量のために十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の容器内で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器内で実施することは、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を複数の容器内で実施することと比較して、切除された腫瘍毎のＴＩＬ収率の増加をもたらす、請求項３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗原提示細胞は、前記系を開放することなく、ステップ（ｄ）における第２の期間中に前記ＴＩＬに添加される、請求項３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｄ）における前記第３のＴＩＬ集団は、対象に投与されたときに少なくとも５倍以上のインターフェロンγ産生を提供する、請求項３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される、請求項３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｆ）又は（ｇ）からの前記ＴＩＬは、患者に注入される、請求項３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記複数の断片は、約４個の断片を含む、請求項３〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
癌を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｄ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｅ）前記第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び／又は前記治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供する；
（ｆ）ステップ（ｄ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収すること、ここで、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；及び
（ｇ）ステップ（ｅ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｈ）任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を含む前記輸注バッグを凍結保存すること；及び
（ｉ）ステップ（ｇ）における前記輸注バッグから治療有効投与量の前記第３のＴＩＬ集団を前記患者に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む方法。
【請求項４５】
癌を有する対象の処置に使用するための拡大培養ＴＩＬ集団であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｄ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、前記第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｅ）前記第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露すること、ここで、前記ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び／又は前記治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供する；
（ｆ）ステップ（ｄ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収すること、ここで、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；及び
（ｇ）ステップ（ｅ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；及び
（ｈ）任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を含む前記輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第３のＴＩＬ集団である、拡大培養ＴＩＬ集団。
【請求項４６】
前記方法は、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の特徴の１つ以上を更に含む、請求項４４又は４５に記載の癌を有する対象を処置するのに使用するためのＴＩＬ集団。
【請求項４７】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、治療用ＴＩＬ集団を生成するために、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にＴＩＬを曝露することを含み、前記ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び／又は前記治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供する、方法。
【請求項４８】
タンパク質発現の前記一過性の変化は、タンパク質発現の誘導をもたらす、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
タンパク質発現の前記一過性の変化は、タンパク質発現の低減をもたらす、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、前記一過性のタンパク質発現を低減するために利用される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子を評価する方法であって、治療用ＴＩＬ集団を生成するために、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にＴＩＬを曝露して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養することを含み、前記ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は前記治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する、方法。
【請求項５２】
タンパク質発現の前記一過性の変化は、ＰＤ−１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１及びｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）からなる群から選択される遺伝子を標的とする、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｅ）前記第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つの短鎖干渉ＲＮＡ又は１つのメッセンジャーＲＮＡの移動を媒介する；
（ｆ）前記第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｇ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｈ）ステップ（ｇ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供すること、ここで、ステップ（ｇ）からステップ（ｈ）への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である；
（ｉ）ステップ（ｈ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｈ）から（ｉ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；及び
（ｊ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含み、前記無菌エレクトロポレーションステップは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉ＲＮＡの送達を含む、方法。
【請求項５４】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、前記系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）前記第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップ又はＳＱＺマイクロ流体膜破壊ステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップ又はＳＱＺマイクロ流体膜破壊ステップは、少なくとも１つの短鎖干渉ＲＮＡ又は１つのメッセンジャーＲＮＡの移動を媒介する；
（ｆ）前記第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｇ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｈ）ステップ（ｇ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供すること、ここで、ステップ（ｇ）からステップ（ｈ）への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である；
（ｉ）ステップ（ｈ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｈ）から（ｉ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；及び
（ｊ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含み、前記エレクトロポレーションステップは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉ＲＮＡの送達を含み、更に、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、前記第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団又は回収されたＴＩＬ集団に挿入される、方法。
【請求項５５】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｅ）前記第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つの短鎖干渉ＲＮＡ又は１つのメッセンジャーＲＮＡの移動を媒介する；
（ｆ）前記第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｇ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｈ）ステップ（ｇ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供すること、ここで、ステップ（ｇ）からステップ（ｈ）への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である；
（ｉ）ステップ（ｈ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｈ）から（ｉ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；及び
（ｊ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含み、前記無菌エレクトロポレーションステップは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉ＲＮＡの送達を含む、方法。
【請求項５６】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）前記第１のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させること、ここで、前記ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で添加され、前記ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである；
（ｅ）任意選択により、前記第１のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する；
（ｆ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｇ）前記第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｈ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｈ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｉ）ステップ（ｈ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供すること、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む方法。
【請求項５７】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）前記第１のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させること、ここで、前記ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬの濃度で添加され、前記ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである；
（ｅ）任意選択により、前記第１のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する；
（ｆ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｇ）前記第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｈ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｇ）からステップ（ｈ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｉ）ステップ（ｈ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供すること、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む方法。
【請求項５８】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｅ）前記第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｆ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｇ）ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）のいずれかの間に前記第２のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させること、ここで、前記ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で添加され、前記ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである；
（ｈ）任意選択により、前記第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する；
（ｉ）ステップ（ｇ）又は（ｈ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供すること、ここで、ステップ（ｇ）からステップ（ｉ）への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む方法。
【請求項５９】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、前記患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）前記腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって前記第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、前記第１の拡大培養は、前記第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、前記第２のＴＩＬ集団は、前記第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｅ）前記第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｆ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること、ここで、前記第２の拡大培養は、前記第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、前記第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；
（ｇ）ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）のいずれかの間に前記第２のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させること、ここで、前記ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬの濃度で添加され、前記ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである；
（ｈ）任意選択により、前記第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施すること、ここで、前記無菌エレクトロポレーションステップは、前記少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する；
（ｉ）ステップ（ｇ）又は（ｈ）から得られた前記治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供すること、ここで、ステップ（ｅ）からステップ（ｈ）への移行は、前記系を開放することなく行われ、前記回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの前記回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと、ここで、ステップ（ｈ）から（ｉ）への移行は、前記系を開放することなく行われる；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、前記回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む方法。
【請求項６０】
前記ｓｄ−ＲＮＡは、第１の拡大培養期間中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎に前記第１の細胞集団に添加される、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ｓｄ−ＲＮＡは、第１の拡大培養期間中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎に前記第２の細胞集団に添加される、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
２つのｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢからなる群から選択される２つの分子の発現を阻害するために添加される、請求項５６〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
２つのｓｄ−ＲＮＡは、２つの分子の発現を阻害するために添加され、前記２つの分子は、
ｉ．ＰＤ−１及びＬＡＧ−３、
ｉｉ．ＰＤ−１及びＴＩＭ−３、
ｉｉｉ．ＰＤ−１及びＣＩＳＨ、
ｉｖ．ＰＤ−１及びＣＢＬＢ、
ｖ．ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３、
ｖｉ．ＬＡＧ−３及びＣＩＳＨ、
ｖｉｉ．ＬＡＧ−３及びＣＢＬＢ、
ｖｉｉｉ．ＴＩＭ−３及びＣＩＳＨ、
ｉｘ．ＴＩＭ−３及びＣＢＬＢ、及び
ｘ．ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ
からなる群から選択される、請求項５６〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
３つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢからなる群から選択される３つ以上の分子の発現を阻害するために添加される、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢからなる群から選択される少なくとも１つの分子の発現は、前記少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触された前記ＴＩＬにおいて少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％だけ低減される、請求項５６〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢからなる群から選択される少なくとも１つの分子の発現は、前記少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触された前記ＴＩＬにおいて少なくとも１２時間、少なくとも２４時間又は少なくとも４８時間にわたって少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％だけ低減される、請求項５６〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ｓｄ−ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られ、且つ前記ｓｄ−ＲＮＡのインビトロ転写に適した線状二本鎖ＤＮＡテンプレートであって、前記二本鎖ＤＮＡのコード鎖上のＲＮＡポリメラーゼプロモーター、３，０００ヌクレオチド長未満であり、且つ真核細胞へのトランスフェクション後にｍＲＮＡを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な５’非翻訳領域、前記ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームであって、前記ポリペプチドは、トランスフェクトされる前記細胞に対して異種であり、前記ポリペプチドは、免疫細胞のリガンド又は受容体、免疫系の機能を刺激又は阻害するポリペプチド及び発癌性ポリペプチドの機能を阻害するポリペプチドからなる群から選択される、オープンリーディングフレーム、真核細胞へのトランスフェクション後にｍＲＮＡを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な３’非翻訳領域及び前記二本鎖ＤＮＡの前記コード鎖上の５０〜５，０００ヌクレオチドのポリ（Ａ）ストレッチを５’から３’に含む線状二本鎖ＤＮＡテンプレートからのインビトロ転写を実施することを含む方法によって調製され、前記プロモーターは、前記オープンリーディングフレームに対して異種であり、前記ＤＮＡテンプレートは、ＤＮＡベクター内に含有されず、且つ前記ポリ（Ａ）ストレッチの３’末端で終了する、請求項５６〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼのためのコンセンサス結合配列を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記オープンリーディングフレームは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記線状二本鎖ＤＮＡテンプレートは、内部リボソーム侵入部位を更に含む、請求項６７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、２０１８年１月８日に提出された米国仮特許出願第６２／６１４，８８７号、２０１８年４月２７日に提出された米国仮特許出願第６２／６６４，０３４号、２０１８年５月９日に提出された米国仮特許出願第６２／６６９，３１９号、２０１８年７月１３日に提出された米国仮特許出願第６２／６９７，９２１号、２０１８年９月２１日に提出された米国仮特許出願第６２／７３４，８６８号及び２０１８年１１月３０日に提出された米国仮特許出願第６２／７７３，７１５号に対する優先権を主張し、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
[0002]  本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩの写しは、２０１９年１月７日に作成され、116983-5034-WO_ST25.txtという名称であり、１２２キロバイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
[0003]  腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移植を用いたかさ高い抵抗性の癌の処置は、予後不良の患者に対する治療への強力なアプローチとなる。Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。免疫療法の成功には多量のＴＩＬが必要であり、商業化に向けてロバストで信頼性のある方法が求められている。これは、細胞拡大培養に伴う技術上、物流上及び規制上の問題に起因して実現が課題となっている。ＩＬ−２ベースのＴＩＬ拡大培養、それに続く「急速拡大培養法」（ＲＥＰ）は、その速さ及び効率から、ＴＩＬ拡大培養に好ましい方法となりつつある。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39；Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。ＲＥＰは、１４日の期間でＴＩＬの１，０００倍の拡大をもたらすことができるが、それには、フィーダー細胞として、多くの場合に複数のドナーからの大過剰の（例えば、２００倍の）照射した同種異系末梢血単核球（ＰＢＭＣ、単核球（ＭＮＣ）としても知られる）並びに抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及び高用量のＩＬ−２が必要である。Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。ＲＥＰ手順を経たＴＩＬは、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功をもたらしている。現行の注入適合パラメータは、ＴＩＬの組成（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８又はＣＤ４陽性）の読み取り並びにＲＥＰ産物の拡大倍数及び生存率に依存するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[0004]  商業規模の製造及び複数の臨床センターのヒト患者に使用するための規制当局の承認に適している、より強力又は効果的なＴＩＬ製造プロセス及びかかるプロセスに基づく治療法を提供する緊急の必要性が存在する。本発明は、増加した治療有効性を有する治療用ＴＩＬ集団を調製するためにＴＩＬを再プログラミングするための一過性の遺伝子改変プロセスを提供することにより、この必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
[0005]  本発明は、ＴＩＬを拡大培養し、且つ治療用ＴＩＬ集団を生じさせるための改善及び／又は短縮された方法を提供する。
【０００６】
[0006]  本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、（ｉ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；（ｉｉ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせること
、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも１００倍多く、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、生じさせること；及び（ｉｖ）第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する、曝露することを含む。
【０００７】
[0007]  一部の実施形態において、方法は、第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することを更に含み、ここで、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する。
【０００８】
[0008]  本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する、曝露すること；
（ｆ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること；及び
（ｇ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む方法も提供する。
【０００９】
[0009]  一部の実施形態において、方法は、第３のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、追加のＯＫＴ−３及び追加のＡＰＣを補充することにより、追加の第２の拡大培養をステップ（ｉｖ）前又は後に実施することを更に含み、ここで、追加の第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉｉ）で得られたよりも大きい治療用ＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、より大きい治療用ＴＩＬ集団は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を示す。
【００１０】
[0010]  一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）における回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
【００１１】
[0011]  一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収されたＴＩＬ集団と凍結保存培地との１：１の比率を使用して実施される。
【００１２】
[0012]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、照射され、且つ同種異系である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、ステップ（ｄ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に加えられる。一部の実施形態において、抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である。
【００１３】
[0013]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）における回収は、膜ベースの細胞処理系を使用して実施される。
【００１４】
[0014]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）における回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
【００１５】
[0015]  一部の実施形態において、複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の容積を有する。
【００１６】
[0016]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０〜約６０個の断片を含む。
【００１７】
[0017]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。
【００１８】
[0018]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１グラム〜約１．５グラムの総質量を有する約５０個の断片を含む。
【００１９】
[0019]  一部の実施形態において、細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
【００２０】
[0020]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）における細胞培養培地は、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１を更に含む。
【００２１】
[0021]  一部の実施形態において、ＩＬ−２濃度は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ〜約５，０００ＩＵ／ｍＬである。
【００２２】
[0022]  一部の実施形態において、ＩＬ−１５濃度は、約５００ＩＵ／ｍＬ〜約１００ＩＵ／ｍＬである。
【００２３】
[0023]  一部の実施形態において、ＩＬ−２１濃度は、約２０ＩＵ／ｍＬ〜約０．５ＩＵ／ｍＬである。
【００２４】
[0024]  一部の実施形態において、ステップ（ｆ）における輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
【００２５】
[0025]  一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。一部の実施形態において、凍結保存培地は、７％〜１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
【００２６】
[0026]  一部の実施形態において、ステップ（ｃ）における第１の期間及びステップ（ｅ）における第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
【００２７】
[0027]  一部の実施形態において、ステップ（ｃ）における第１の期間及びステップ（ｅ）における第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
【００２８】
[0028]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約２２日の期間内に実施される。
【００２９】
[0029]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約２０日〜約２２日の期間内に実施される。
【００３０】
[0030]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１５日〜約２０日の期間内に実施される。
【００３１】
[0031]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約２０日の期間内に実施される。
【００３２】
[0032]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、約１０日〜約１５日の期間内に実施される。
【００３３】
[0033]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２２日以下で実施される。
【００３４】
[0034]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、２０日以下で実施される。
【００３５】
[0035]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、１５日以下で実施される。
【００３６】
[0036]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、１０日以下で実施される。
【００３７】
[0037]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）及び凍結保存は、２２日以下で実施される。
【００３８】
[0038]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）で回収された治療用ＴＩＬ集団は、治療有効投与量のＴＩＬのために十分なＴＩＬを含む。
【００３９】
[0039]  一部の実施形態において、治療有効投与量のために十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【００４０】
[0040]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の容器内で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器で実施することは、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を複数の容器内で実施することと比較して、切除された腫瘍毎のＴＩＬ収率の増加をもたらす。
【００４１】
[0041]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放することなく、ステップ（ｄ）における第２の期間中にＴＩＬに添加される。
【００４２】
[0042]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）における第３のＴＩＬ集団は、対象に投与されたときに少なくとも５倍以上のインターフェロンγ産生を提供する。
【００４３】
[0043]  一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
【００４４】
[0044]  一部の実施形態において、ステップ（ｆ）又は（ｇ）からのＴＩＬは、患者に注入される。
【００４５】
[0045]  一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
【００４６】
[0046]  本発明は、癌を有する対象を処置する方法であって、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供する、曝露すること；
（ｆ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること；及び
（ｇ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；
（ｈ）任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；及び
（ｉ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療有効投与量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む方法も提供する。
【００４７】
[0047]  一部の実施形態において、ステップ（ｆ）で回収された治療用ＴＩＬ集団は、ステップ（ｈ）の治療有効投与量のＴＩＬを投与するのに十分なＴＩＬを含む。
【００４８】
[0048]  一部の実施形態において、ステップ（ｈ）における治療有効投与量の投与に十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【００４９】
[0049]  一部の実施形態において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである。
【００５０】
[0050]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、ステップ（ｄ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に添加される。
【００５１】
[0051]  一部の実施形態において、ステップ（ｈ）で治療有効投与量のＴＩＬ細胞を投与する前に非破壊的リンパ球枯渇レジメンが患者に投与されている。
【００５２】
[0052]  一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。
【００５３】
[0053]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｈ）で患者にＴＩＬ細胞を投与した翌日に始まる高用量ＩＬ−２レジメンで患者を処置するステップを更に含む。
【００５４】
[0054]  一部の実施形態において、高用量ＩＬ−２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
【００５５】
[0055]  一部の実施形態において、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。
【００５６】
[0056]  一部の実施形態において、癌は、黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌及びＮＳＣＬＣからなる群から選択される。
【００５７】
[0057]  一部の実施形態において、癌は、黒色腫である。
【００５８】
[0058]  一部の実施形態において、癌は、ＨＮＳＣＣである。
【００５９】
[0059]  一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌である。
【００６０】
[0060]  一部の実施形態において、癌は、ＮＳＣＬＣである。
【００６１】
[0061]  本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ）第１のＴＩＬ集団を得るために、患者から切除された腫瘍から処理された腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｂ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｃ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること；及び
（ｅ）ステップ（ｄ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｄ）から（ｅ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む。
【００６２】
[0062]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）で回収された治療用ＴＩＬ集団は、治療有効投与量のＴＩＬのために十分なＴＩＬを含む。
【００６３】
[0063]  一部の実施形態において、治療有効投与量のために十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【００６４】
[0064]  一部の実施形態において、本方法は、凍結保存プロセスを使用して、回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存するステップを更に含む。
【００６５】
[0065]  一部の実施形態において、凍結保存プロセスは、回収されたＴＩＬ集団と凍結保存培地との１：１の比率を使用して実施される。
【００６６】
[0066]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
【００６７】
[0067]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、照射され、且つ同種異系である。
【００６８】
[0068]  ＰＢＭＣは、ステップ（ｃ）において９〜１４日目のいずれかに細胞培養物に添加される、請求項６８に記載の方法。
【００６９】
[0069]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、人工抗原提示細胞である。
【００７０】
[0070]  一部の実施形態において、ステップ（ｄ）における回収は、LOVO細胞処理系を使用して実施される。
【００７１】
[0071]  一部の実施形態において、複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の容積を有する。
【００７２】
[0072]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０〜約６０個の断片を含む。
【００７３】
[0073]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。
【００７４】
[0074]  一部の実施形態において、複数の断片は、約１グラム〜約１．５グラムの総質量を有する約５０個の断片を含む。
【００７５】
[0075]  一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
【００７６】
[0076]  一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、Ｇコンテナ及びXuri細胞培養バッグからなる群から選択される容器内に提供される。
【００７７】
[0077]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）における輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。
【００７８】
[0078]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）における第１の期間及びステップ（ｃ）における第２の期間は、１０日、１１日又は１２日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
【００７９】
[0079]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）における第１の期間及びステップ（ｃ）における第２の期間は、１１日の期間内にそれぞれ個別に実施される。
【００８０】
[0080]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は、約１０日〜約２２日の期間内に実施される。
【００８１】
[0081]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は、約１０日〜約２０日の期間内に実施される。
【００８２】
[0082]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は、約１０日〜約１５日の期間内に実施される。
【００８３】
[0083]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は、２２日以下で実施される。
【００８４】
[0084]  一部の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）及び凍結保存は、２２日以下で実施される。
【００８５】
[0085]  一部の実施形態において、ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、単一の容器内で実施され、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を単一の容器で実施することは、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を複数の容器内で実施することと比較して、切除された腫瘍毎のＴＩＬ収率の増加をもたらす。
【００８６】
[0086]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、系を開放することなく、ステップ（ｃ）における第２の期間中にＴＩＬに添加される。
【００８７】
[0087]  一部の実施形態において、微生物汚染のリスクは、開放系と比較して低減される。
【００８８】
[0088]  一部の実施形態において、ステップ（ｅ）からのＴＩＬは、患者に注入される。
【００８９】
[0089]  一部の実施形態において、閉鎖型容器は、単一のバイオリアクターを含む。
【００９０】
[0090]  一部の実施形態において、閉鎖型容器は、G-REX-10を含む。
【００９１】
[0091]  一部の実施形態において、閉鎖型容器は、G-REX-100を含む。
【００９２】
[0092]  一部の実施形態では、ステップ（ｄ）において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、２５：１〜１００：１のＡＰＣ：ＴＩＬ比で第２のＴＩＬ集団の細胞培養物に添加される。
【００９３】
[0093]  一部の実施形態において、細胞培養物は、２．５×１０９ＡＰＣ対１００×１０６ＴＩＬの比を有する。
【００９４】
[0094]  一部の実施形態では、ステップ（ｃ）において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、２５：１〜１００：１のＡＰＣ：ＴＩＬ比で第２のＴＩＬ集団の細胞培養物に添加される。
【００９５】
[0095]  一部の実施形態において、細胞培養物は、２．５×１０９ＡＰＣ対１００×１０６ＴＩＬの比を有する。
【００９６】
[0096]  本発明は、癌を有する対象の処置に使用するための拡大培養ＴＩＬ集団も提供し、拡大培養ＴＩＬ集団は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供する、曝露すること；
（ｆ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること；及び
（ｇ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｈ）任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第３のＴＩＬ集団である。
【００９７】
[0097]  一部の実施形態において、ＴＩＬの集団は、上記及び本明細書に記載の方法に従い、癌を有する対象を処置するために使用され、この方法は、上記及び本明細書に列挙される特徴の１つ以上を更に含む。
【００９８】
[0098]  本発明は、ＴＩＬ生存率を決定するためのアッセイ方法も提供する。本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をより大きいＴＩＬ集団に拡大培養することにより、ＴＩＬの生存率をアッセイする方法も提供し、この方法は、
（ｉ）予め拡大培養された第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｉｉ）ＩＬ−２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも１００倍多く、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、生存率について更にアッセイされる、生じさせること
を含む。
【００９９】
[0099]  一部の実施形態において、本方法は、
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、追加のＯＫＴ−３及び追加のＡＰＣを補充することにより、追加の第２の拡大培養を実施することであって、追加の第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉｉ）で得られたよりも大きいＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、第３の集団は、生存率について更にアッセイされる、実施すること
を更に含む。
【０１００】
[00100]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）前に、細胞は、凍結保存される。
【０１０１】
[00101]  一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ｉ）の実施前に解凍される。
【０１０２】
[00102]  一部の実施形態において、分析に十分なＴＩＬを得るため、ステップ（ｉｖ）は、１〜４回繰り返される。
【０１０３】
[00103]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は、約４０日〜約５０日の期間内に実施される。
【０１０４】
[00104]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は、約４２日〜約４８日の期間内に実施される。
【０１０５】
[00105]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は、約４２日〜約４５日の期間内に実施される。
【０１０６】
[00106]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は、約４４日以下で実施される。
【０１０７】
[00107]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）からの細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８及びＴＣＲαβを、新鮮に回収された細胞と同程度に発現する。
【０１０８】
[00108]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
【０１０９】
[00109]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、ステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに細胞培養物に添加される。
【０１１０】
[00110]  一部の実施形態において、ＡＰＣは、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
【０１１１】
[00111]  一部の実施形態において、本方法は、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【０１１２】
[00112]  一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ（ｉ）前に行われる。
【０１１３】
[00113]  一部の実施形態において、本方法は、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【０１１４】
[00114]  一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ（ｉ）前に行われる。
【０１１５】
[00115]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、生存率に関してアッセイされる。
【０１１６】
[00116]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、凍結保存後に生存率に関してアッセイされる。
【０１１７】
[00117]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、凍結保存後及びステップ（ｉｖ）後に生存率に関してアッセイされる。
【０１１８】
[00118]  本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法であって、治療用ＴＩＬ集団を生成するために、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にＴＩＬを曝露することを含む方法も提供し、ここで、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供する。
【０１１９】
[00119]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、タンパク質発現の誘導をもたらす。
【０１２０】
[00120]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、タンパク質発現の低減をもたらす。
【０１２１】
[00121]  一部の実施形態では、１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、一過性のタンパク質発現を低減するために利用される。
【０１２２】
[00122]  本発明は、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子を評価する方法も提供し、方法は、治療用ＴＩＬ集団を生成するために、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子にＴＩＬを曝露して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養することを含み、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する。
【０１２３】
[00123]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１及びｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）からなる群から選択される遺伝子を標的とする。
【０１２４】
[00124]  一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）第１のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｅ）任意選択により、第１のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｆ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｈ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｈ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｉ）ステップ（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む。
【０１２５】
[00125]  一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）第１のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬの濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｅ）任意選択により、第１のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｆ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｈ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｇ）からステップ（ｈ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｉ）ステップ（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む。
【０１２６】
[00126]  一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）のいずれかの間に第２のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｈ）任意選択により、第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｉ）ステップ（ｇ）又は（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む。
【０１２７】
[00127]  一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）のいずれかの間に第２のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬの濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｈ）任意選択により、第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｉ）ステップ（ｇ）又は（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｈ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｈ）から（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む。
【０１２８】
[00128]  一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、第１の拡大培養期間中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎に第１の細胞集団に添加される。
【０１２９】
[00129]  一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、第１の拡大培養期間中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎に第２の細胞集団に添加される。
【０１３０】
[00130]  一部の実施形態において、２つのｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢからなる群から選択される２つの分子の発現を阻害するために添加される。
【０１３１】
[00131]  一部の実施形態において、２つのｓｄ−ＲＮＡは、２つの分子の発現を阻害するために添加され、２つの分子は、
ｉ．ＰＤ−１及びＬＡＧ−３、
ｉｉ．ＰＤ−１及びＴＩＭ−３、
ｉｉｉ．ＰＤ−１及びＣＩＳＨ、
ｉｖ．ＰＤ−１及びＣＢＬＢ、
ｖ．ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３、
ｖｉ．ＬＡＧ−３及びＣＩＳＨ、
ｖｉｉ．ＬＡＧ−３及びＣＢＬＢ、
ｖｉｉｉ．ＴＩＭ−３及びＣＩＳＨ、
ｉｘ．ＴＩＭ−３及びＣＢＬＢ、及び
ｘ．ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ
からなる群から選択される。
【０１３２】
[00132]  一部の実施形態において、３つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢからなる群から選択される３つ以上の分子の発現を阻害するために添加される。
【０１３３】
[00133]  一部の実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢからなる群から選択される少なくとも１つの分子の発現は、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触されたＴＩＬにおいて少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％だけ低減される。
【０１３４】
[00134]  一部の実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢからなる群から選択される少なくとも１つの分子の発現は、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触されたＴＩＬにおいて少なくとも１２時間、少なくとも２４時間又は少なくとも４８時間にわたって少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％だけ低減される。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
図面の簡単な説明
【図１】[00135]プロセス２Ａ、ＴＩＬ製造の２２日間プロセスの実施形態の概略図を示す。
【図２】[00136]ＴＩＬ製造のための１Ｃプロセス及び２Ａプロセスの実施形態の比較を示す。
【図３】[00137]１Ｃプロセスのタイムラインを示す。
【図４】[00138]より高い細胞数のために、投与及び共療法ステップを含む、ＴＩＬ製造のためのプロセス２Ａを使用したＴＩＬ療法の実施形態のプロセスを示す。
【図５】[00139]より低い細胞数のために、投与及び共療法ステップを含む、ＴＩＬ製造のためのプロセス２Ａを使用したＴＩＬ療法の実施形態のプロセスを示す。
【図６】[00140]２Ａプロセスの実施形態の詳細な概略図を示す。
【図７Ａ】[00141]凍結保存ステップを含む２Ａプロセスの実施形態の主要なステップを示す。
【図７Ｂ】[00141]凍結保存ステップを含む２Ａプロセスの実施形態の主要なステップを示す。
【図７Ｃ】[00141]凍結保存ステップを含む２Ａプロセスの実施形態の主要なステップを示す。
【図８】[00142]ステップＡ〜Ｆの概要を提供する例示的なプロセス２Ａのチャートである。
【図９】[00143]プロセス２Ａデータ収集計画のプロセスフローチャートである。
【図１０】[00144]急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）の例示的な実施形態のスキームである。到着すると、腫瘍は、断片化され、１１日間、ＴＩＬ拡大培養（プレＲＥＰ拡大培養）を行うため、ＩＬ−２を含むG-Rexフラスコに入れられる。トリプルカクテル研究では、プレＲＥＰの開始時にＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１が追加される。急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）の場合、ＴＩＬは、１１日間のＲＥＰ拡大培養のためにフィーダー及びＯＫＴ３で更に培養される。
【図１１】[00145]凍結保存ＴＩＬの代表的な製造プロセス（約２２日間）である。
【図１２】[00146]プロセス２Ａ、ＴＩＬ製造の２２日間プロセスの実施形態の概略図を示す。
【図１３】[00147]プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの例示的な実施形態からのステップＡ〜Ｆの比較表である。
【図１４】[00148]プロセス１Ｃの実施形態とプロセス２Ａの実施形態との詳細な比較である。
【図１５】[00149]凍結保存ＴＩＬ製造プロセスの実施形態の説明（２２日間）である。
【図１６】[00150]Ｇｅｎ  １からＧｅｎ  ２へのプロセス改善の表である。
【図１７】[00151]Ｇｅｎ  ２凍結保存ＬＮー１４４製造プロセスのスキームである。
【図１８】[00152]プロセス２Ａ、ＴＩＬ製造の２２日間プロセスの実施形態の概略図を示す。
【図１９】[00153]重力血液フィルターの下部（単一ライン）へのＴＩＬ懸濁液移送パックの無菌溶接（実施例１６のプロセスノート５．１１を参照されたい）の概略図を示す。
【図２０】[00154]GRex100MCSから「上清」移送パックへの赤い培地の取り出しラインの無菌溶接（実施例１６のプロセスノート５．１１を参照されたい）の概略図を示す。
【図２１】[00155]セルコネクト装置の単一スパイク（Ｂ）を（Ｇ）で4S-4M60マニホールドの４スパイク端に置き換える、4S-4M60のCC2セルコネクトへの溶接（実施例１６のプロセスノート５．１１を参照されたい）の概略図を示す。
【図２２】[00156]4S-4M60のオスのルアーエンドの１つへのリピーター流体移送セットの溶接（実施例１６のプロセスノート５．１１を参照されたい）の概略図を示す。
【図２３】[00157]LOVO原料（source）バッグへの重力血液フィルターの長い終端の無菌溶接（実施例１６のプロセスノート５．１１を参照されたい）の概略図を示す。
【図２４】[00158]フィルターの２つの供給源ラインの１つの、「プールされたＴＩＬ懸濁液」収集バッグへの無菌溶接（実施例１６のプロセスノート５．１１を参照されたい）の概略図を示す。
【図２５】[00159]セルコネクト装置の単一スパイク（Ｂ）を（Ｇ）で4S-4M60マニホールドの４スパイク端に置き換える、4S-4M60のCC2セルコネクトへの滅菌溶接（実施例１６のプロセスノート５．１１を参照されたい）の概略図を示す。
【図２６】[00160]４つのオスルアーエンド（Ｅ）の１つを各バッグに交換する、ステップ８．１４．８で準備したハーネスへのＣＳ７５０クライオバッグの滅菌溶接（実施例１６のプロセスノート５．１１を参照されたい）の概略図を示す。
【図２７】[00161]4S-4M60のスパイクへのＣＳ−１０バッグの溶接（実施例１６のプロセスノート５．１１を参照されたい）の概略図を示す。
【図２８】[00162]ステップ８．１４．１０で準備した装置における残りのスパイク（Ａ）への「製剤化されたＴＩＬ」バッグの溶接（実施例１６のプロセスノート５．１１を参照されたい）の概略図を示す。
【図２９】[00163]空の未透過液バッグ及びＣＳ−１０バッグを取り外す、Ｆでのヒートシール（実施例１６のプロセスノート５．１２を参照されたい）の図を示す。
【図３０】[00164]一過性の遺伝子編集のためのＴＩＬプロセスの実施形態の概略図を示す。
【図３１】[00165]一過性の遺伝子編集のためのＴＩＬプロセスの実施形態の概略図を示す。
【図３２】[00166]一過性の遺伝子再プログラミングの目的で、ＲＮＡ移動ステップのＴＩＬプロセスへの組み込みに関する概略図を示す。
【図３３】[00167]ＴＩＬの遺伝子発現を一過性に変化させるために提案された遺伝子工学アプローチの概要を示す。
【図３４】[00168]腫瘍部位へのＴＩＬ輸送を改善するために一過性の遺伝子発現変化を利用できる、ケモカイン及びケモカイン受容体の概要を示す。
【図３５】[00169]腫瘍部位へのＴＩＬ輸送を改善するために一過性の遺伝子発現変化を利用できる、ケモカイン及びケモカイン受容体の第２の概要を示す。
【図３６】[00170]例示的な自己送達性リボ核酸（ｓｄ−ＲＮＡ）の実施形態の概略的な構造図を示す。Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018を参照されたい。
【図３７】[00171]例示的なｓｄ−ＲＮＡの実施形態の概略的な構造図を示す。米国特許出願公開第２０１６／０３０４８７３号を参照されたい。
【図３８】[00172]特別に設計されたプライマーを使用したＰＣＲによって得られるＤＮＡテンプレートを使用した、ｍＲＮＡ合成の例示的なスキームを示す。フォワードプライマーは、インビトロ転写に適したバクテリオファージプロモーターを含有し、リバースプライマーは、ポリＴストレッチを含有する。ＰＣＲ産物は、インビトロ転写に適した発現カセットである。新生ｍＲＮＡの３’末端にあるポリアデニル酸は、異常なＲＮＡランオフ合成及び二本鎖ＲＮＡ産物の生成を防止できる。転写の完了後、ポリＡテールは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼで更に伸長できる。（米国特許第８，８５９，２２９号を参照されたい。）
【図３９】[00173]ＰＤＣＤ１、ＴＩＭ３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及びＣＩＳＨのＳｄ−ｒｘＲＮＡ媒介サイレンシングを示すグラフである。
【図４０】[00174]ＴＩＬにおけるＳｄ−ｒｘＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング；例示的なプロトコルである。例示的な腫瘍は、黒色腫（新鮮又は凍結；ｎ＝６）、乳房腫瘍（新鮮又は凍結；ｎ＝５）、肺腫瘍（ｎ＝１）、肉腫（ｎ＝１）及び／又は卵巣（ｎ＝１）を含む。
【図４１】[00175]タンパク質発現の低減は、５つの標的の４つで検出された。ＰＤ１：ｎ＝９、ＴＩＭ３：ｎ＝８、ＬＡＧ３／ＣＩＳＨ：ｎ＝２、Ｃｂｌ−ｂ  ｎ＝２。プレＲＥＰ黒色腫及び新鮮乳癌ＴＩＬからの調製物、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。％ＫＤは、（１００−（１００×（目的の遺伝子／ＮＴＣ）））として計算される。
【図４２】[00176]Ｓｄ−ｒｘＲＮＡ誘発性ＫＤは、時間及び刺激と共に下降した。ｎ＝３、プレＲＥＰ黒色腫ＴＩＬからの調製物、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。
【図４３】[00177]ＴＩＬの生存率は、ＰＤＣＤ１  ｓｄ−ｒｘＲＮＡによってわずかに影響を受けた。ＰＤ１、ＴＩＭ３  ｎ＞６、プレＲＥＰ黒色腫／新鮮乳癌ＴＩＬからの調製物。ＬＡＧ３、ＣＩＳＨ  ｎ＝２、プレＲＥＰ黒色腫及び乳癌ＴＩＬ、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。
【図４４】[00178]ＰＤ１及びＴＩＭ３のＳｄ−ｒｘＲＮＡ媒介ＫＤは、ＴＩＬの活性化を示す表現型の変化と関連していた。ｎ＝３、プレＲＥＰ黒色腫ＴＩＬからの調製物、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。
【図４５Ａ】[00179]ｓｄ−ｒｘＲＮＡによるＰＤ１及びＴＩＭ３ノックダウンは、他の阻害／枯渇マーカーの発現に影響しない。Ａ）ｎ＝３、ＴＩＭ３：ｎ＝２、プレＲＥＰ黒色腫ＴＩＬからの調製物、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。
【図４５Ｂ】[00179]ｓｄ−ｒｘＲＮＡによるＰＤ１及びＴＩＭ３ノックダウンは、他の阻害／枯渇マーカーの発現に影響しない。Ｂ）ｎ＝３、ＴＩＭ３：ｎ＝２、プレＲＥＰ黒色腫ＴＩＬからの調製物、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。
【図４６】[00180]ＰＤ１及びＴＩＭ３  ＫＤは、ＩＦＮγの分泌を有意に改善しなかった。ｎ＝３、プレＲＥＰ黒色腫ＴＩＬからの調製物、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。
【図４７Ａ】[00181]ＣＤ１０７ａ動員は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのいずれにも影響されなかった。Ａ）ｎ＝６、プレＲＥＰ黒色腫ＴＩＬからの調製物、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。
【図４７Ｂ】[00181]ＣＤ１０７ａ動員は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのいずれにも影響されなかった。Ｂ）ｎ＝２、プレＲＥＰ黒色腫及び乳癌ＴＩＬからの調製物、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。
【図４７Ｃ】[00181]ＣＤ１０７ａ動員は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのいずれにも影響されなかった。Ｃ）ｎ＝３、凍結黒色腫及び新鮮乳癌ＴＩＬ。
【図４７Ｄ】[00181]ＣＤ１０７ａ動員は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのいずれにも影響されなかった。Ｄ）ｎ＝３、凍結黒色腫並びに新鮮乳癌及び肺癌ＴＩＬ。
【図４７Ｅ】[00181]ＣＤ１０７ａ動員は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのいずれにも影響されなかった。Ｅ）ｎ＝３、乳癌腫瘍からの新鮮調製物。
【図４７Ｆ】[00181]ＣＤ１０７ａ動員は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのいずれにも影響されなかった。Ｆ）ｎ＝３、乳癌腫瘍からの新鮮調製物。
【図４８】[00182]xCELLigenceリアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）。
【図４９Ａ】[00183]ＰＤ１  ＫＤ  ＴＩＬは、より優れた死滅効率を引き出した。Ａ）死滅効率の代表図。
【図４９Ｂ】[00183]ＰＤ１  ＫＤ  ＴＩＬは、より優れた死滅効率を引き出した。Ｂ）ｎ＝３、黒色腫ＴＩＬ、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡの代表図。
【図５０】[00184]ｓｄ−ｒｘＲＮＡ用量反応実験である。Ａ）ｎ＝３、乳癌腫瘍からの新鮮調製物。Ｂ）ｎ＝３、プレＲＥＰ黒色腫ＴＩＬからの調製物。
【図５１Ａ】[00185]ＣＢＬＢのＳｄ−ｒｘＲＮＡ媒介ノックダウンは、検出できなかった。Ａ）グラフ。
【図５１Ｂ】[00185]ＣＢＬＢのＳｄ−ｒｘＲＮＡ媒介ノックダウンは、検出できなかった。Ｂ）フローサイトメトリーアッセイプロット。ｎ＝２、プレＲＥＰ黒色腫及び新鮮乳癌ＴＩＬからの調製物。ＮＴＣと比較してＣＢＬＢのｍＲＮＡレベルに変化はなかった。フローサイトメトリーアッセイを使用したＣｂｌ−ｂのタンパク質レベルに変化はなかった。
【図５２Ａ】[00186]IovanceのＴＩＬ製造プロセスにおける、ＴＩＬ表現型を評価するｓｄ−ｒｘＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの試験を示す。ＰＤ−１のｓｄ−ｒｘＲＮＡ媒介ノックダウンは、ＴＩＬの活性化を示す表現型の変化と関連していた。ＰＤ−１、ｎ＞６、プレＲＥＰ黒色腫／新鮮乳癌ＴＩＬからの調製物、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。Ａ）ＣＤ２５、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＤ９５、４−１ＢＢ及びＯＸ４０。
【図５２Ｂ】[00186]IovanceのＴＩＬ製造プロセスにおける、ＴＩＬ表現型を評価するｓｄ−ｒｘＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの試験を示す。ＰＤ−１のｓｄ−ｒｘＲＮＡ媒介ノックダウンは、ＴＩＬの活性化を示す表現型の変化と関連していた。ＰＤ−１、ｎ＞６、プレＲＥＰ黒色腫／新鮮乳癌ＴＩＬからの調製物、２ｕＭ  ｓｄ−ｒｘＲＮＡ。Ｂ）ＣＤ２５、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、４−１ＢＢ及びＯＸ４０。Ｎ＝１２、新鮮及び凍結ＴＩＬ；乳房、黒色腫、卵巣及び肺。
【図５３】[00187]ＰＤ１  ｓｄ−ｒｘＲＮＡの添加により、ＴＩＬの細胞増殖が有意に低減したが、生存率は、低減しなかった。Ａ）拡大倍率。Ｂ）細胞生存率。ｎ＝７、乳房、肉腫及び肺のＴＩＬ。
【図５４】[00188]ＰＤ１  ＫＤは、非特異的刺激に反応してＣＤ１０７ａ動員及びＩＦＮγ分泌を改善しなかった。Ａ）刺激前後のＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８細胞のパーセンテージ。Ｂ）刺激前後のＩＦＮγ分泌。ｎ＝６、黒色腫ＴＩＬ。
【発明を実施するための形態】
【０１３６】
配列表の簡単な説明
[00189]  配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[00190]  配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[00191]  配列番号３は、組換えヒトＩＬ−２タンパク質のアミノ酸配列である。
[00192]  配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[00193]  配列番号５は、組換えヒトＩＬ−４タンパク質のアミノ酸配列である。
[00194]  配列番号６は、組換えヒトＩＬ−７タンパク質のアミノ酸配列である。
[00195]  配列番号７は、組換えヒトＩＬ−１５タンパク質のアミノ酸配列である。
[00196]  配列番号８は、組換えヒトＩＬ−２１タンパク質のアミノ酸配列である。
[00197]  配列番号９は、ヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列である。
[00198]  配列番号１０は、マウス４−１ＢＢのアミノ酸配列である。
[00199]  配列番号１１は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖である。
[00200]  配列番号１２は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖である。
[00201]  配列番号１３は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00202]  配列番号１４は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00203]  配列番号１５は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ１である。
[00204]  配列番号１６は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ２である。
[00205]  配列番号１７は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ３である。
[00206]  配列番号１８は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00207]  配列番号１９は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00208]  配列番号２０は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00209]  配列番号２１は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖である。
[00210]  配列番号２２は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖である。
[00211]  配列番号２３は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00212]  配列番号２４は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00213]  配列番号２５は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ１である。
[00214]  配列番号２６は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ２である。
[00215]  配列番号２７は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ３である。
[00216]  配列番号２８は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00217]  配列番号２９は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00218]  配列番号３０は、４−１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00219]  配列番号３１は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。
[00220]  配列番号３２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00221]  配列番号３３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00222]  配列番号３４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00223]  配列番号３５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00224]  配列番号３６は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00225]  配列番号３７は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00226]  配列番号３８は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00227]  配列番号３９は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00228]  配列番号４０は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00229]  配列番号４１は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00230]  配列番号４２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。
[00231]  配列番号４３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00232]  配列番号４４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00233]  配列番号４５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。
[00234]  配列番号４６は、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）アミノ酸配列である。
[00235]  配列番号４７は、４−１ＢＢＬポリペプチドの可溶性部分である。
[00236]  配列番号４８は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00237]  配列番号４９は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00238]  配列番号５０は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00239]  配列番号５１は、４−１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４−１−１バージョン２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00240]  配列番号５２は、４−１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３−２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00241]  配列番号５３は、４−１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３−２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00242]  配列番号５４は、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列である。
[00243]  配列番号５５は、マウスＯＸ４０のアミノ酸配列である。
[00244]  配列番号５６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の重鎖である。
[00245]  配列番号５７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の軽鎖である。
[00246]  配列番号５８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00247]  配列番号５９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00248]  配列番号６０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の重鎖ＣＤＲ１である。
[00249]  配列番号６１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の重鎖ＣＤＲ２である。
[00250]  配列番号６２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の重鎖ＣＤＲ３である。
[00251]  配列番号６３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00252]  配列番号６４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00253]  配列番号６５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ−０５６２）の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00254]  配列番号６６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖である。
[00255]  配列番号６７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖である。
[00256]  配列番号６８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00257]  配列番号６９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00258]  配列番号７０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ１である。
[00259]  配列番号７１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ２である。
[00260]  配列番号７２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ３である。
[00261]  配列番号７３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00262]  配列番号７４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00263]  配列番号７５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00264]  配列番号７６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖である。
[00265]  配列番号７７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖である。
[00266]  配列番号７８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00267]  配列番号７９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00268]  配列番号８０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ１である。
[00269]  配列番号８１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ２である。
[00270]  配列番号８２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ３である。
[00271]  配列番号８３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00272]  配列番号８４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00273]  配列番号８５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00274]  配列番号８６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00275]  配列番号８７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00276]  配列番号８８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の重鎖ＣＤＲ１である。
[00277]  配列番号８９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の重鎖ＣＤＲ２である。
[00278]  配列番号９０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の重鎖ＣＤＲ３である。
[00279]  配列番号９１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00280]  配列番号９２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00281]  配列番号９３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９−１２２の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00282]  配列番号９４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00283]  配列番号９５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00284]  配列番号９６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の重鎖ＣＤＲ１である。
[00285]  配列番号９７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の重鎖ＣＤＲ２である。
[00286]  配列番号９８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の重鎖ＣＤＲ３である。
[00287]  配列番号９９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の軽鎖ＣＤＲ１である。
[00288]  配列番号１００は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の軽鎖ＣＤＲ２である。
[00289]  配列番号１０１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６−２２２の軽鎖ＣＤＲ３である。
[00290]  配列番号１０２は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）アミノ酸配列である。
[00291]  配列番号１０３は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの可溶性部分である。
[00292]  配列番号１０４は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの代替的可溶性部分である。
[00293]  配列番号１０５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00294]  配列番号１０６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00295]  配列番号１０７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00296]  配列番号１０８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00297]  配列番号１０９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00298]  配列番号１１０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00299]  配列番号１１１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00300]  配列番号１１２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00301]  配列番号１１３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00302]  配列番号１１４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00303]  配列番号１１５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00304]  配列番号１１６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00305]  配列番号１１７は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00306]  配列番号１１８は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00307]  配列番号１１９は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00308]  配列番号１２０は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00309]  配列番号１２１は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00310]  配列番号１２２は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00311]  配列番号１２３は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00312]  配列番号１２４は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
[00313]  配列番号１２５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）である。
[00314]  配列番号１２６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。
【０１３７】
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
[00315]  急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）によってエキソビボで培養したＴＩＬを利用する養子細胞療法は、黒色腫患者において宿主免疫抑制後に養子細胞療法の成功をもたらしている。現行の注入適合パラメータは、ＴＩＬの組成（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８又はＣＤ４陽性）の読み取り並びにＲＥＰ産物の拡大倍数及び生存率の数値に依存している。
【０１３８】
[00316]  現行のＲＥＰプロトコルは、患者に注入されることになるＴＩＬの健康に関して見識をほとんど与えない。Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞からエフェクターＴ細胞へのその成熟の過程で顕著な代謝シフトを起こす（Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364（本明細書によって全体として明示的に組み込まれる）及び特に嫌気的及び好気的代謝の考察及びマーカーについて参照されたい）。例えば、ナイーブＴ細胞はＡＴＰの産生をミトコンドリア呼吸に依存する一方、ＴＩＬなどの成熟した健康なエフェクターＴ細胞は、高度に解糖性であり、それは、増殖、遊走、活性化及び抗腫瘍有効性に必要とするバイオエナジェティクス基質の供給を好気的解糖に依存する。
【０１３９】
[00317]  現在のＴＩＬ製造プロセスは、長さ、経費、無菌性の懸念及び本明細書中に記載される他の要因によって制限されるため、かかるプロセスを商業化する可能性は、大幅に制限されており、これら及び他の理由により、現時点で利用できる商業プロセスはない。本発明は、一過性のタンパク質発現変化の方法論並びに商業規模の製造及び複数の臨床センターでヒト患者に使用するための規制当局の承認に適している、かかるプロセスに基づく治療法を利用したＴＩＬ製造プロセスを提供する。本発明は、治療有効性が増大した治療用ＴＩＬ集団を調製するためにＴＩＬを再プログラミングするための一過性の遺伝子改変プロセスを提供する。
【０１４０】
ＩＩ．定義
[00319]  他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
[00320]  用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。
【０１４２】
[00321]  用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。
【０１４３】
[00322]  用語「エキソビボ」は、対象の身体から摘出された細胞、組織及び／又は臓器の処置又は処置の実施を含む事象を指す。適切には、細胞、組織及び／又は臓器は、手術又は処置の方法で対象の身体に戻される。
【０１４４】
[00323]  用語「急速拡大培養」は、１週間の期間にわたって少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍又は９倍）、より好ましくは、１週間の期間にわたって少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍又は９０倍）又は最も好ましくは、１週間の期間にわたって少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。複数の急速拡大培養プロトコルを以下に概説する。
【０１４５】
[00324]  本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７  ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬは、初代及び二次ＴＩＬの両方を含む。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり（「新鮮に回収された」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ及び拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ  ＴＩＬ」又は「ポストＲＥＰ  ＴＩＬ」）を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のＴＩＬ細胞集団である。ＴＩＬ細胞集団は、遺伝子修飾ＴＩＬを含み得る。
【０１４６】
[00325]  本明細書において「細胞集団」（ＴＩＬを含む）は、共通の形質を共有する多数の細胞を意味する。一般に、集団は、概して数が１×１０６〜１×１０１０個の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は異なる数を含む。例えば、ＩＬ−２の存在下での初代ＴＩＬの初期成長は、およそ１×１０８個の細胞のバルクＴＩＬ集団をもたらす。ＲＥＰ拡大培養は、概して１．５×１０９〜１．５×１０１０個の注入のための細胞集団が提供されるように行われる。
【０１４７】
[00326]  本明細書において「凍結保存ＴＩＬ」とは、初代、バルク又は拡大培養（ＲＥＰ  ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが約−１５０℃〜−６０℃の範囲で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法は、実施例を含め、本明細書の他の部分にも記載される。明確にするために言えば、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの供給源として用いられ得る凍結組織サンプルと区別可能なものである。
【０１４８】
[00327]  本明細書において「解凍した凍結保存ＴＩＬ」とは、かつて凍結保存されていたが、次に処理により、限定はされないが細胞培養温度又はＴＩＬを患者に投与し得る温度を含め、室温以上に戻されたＴＩＬ集団を意味する。
【０１４９】
[00328]  ＴＩＬは、一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーの１つ以上を発現することによって分類することができる：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ  αβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ−１及びＣＤ２５。加えて及び代わりに、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。
【０１５０】
[00329]  用語「凍結保存培地（cryopreservation media）」又は「凍結保存培地（cryopreservation medium）」は、細胞の凍結保存に使用できる任意の培地を指す。かかる培地には、７％〜１０％のＤＭＳＯを含む培地が含まれ得る。例示的培地には、CryoStor CS10、Hyperthermasol及びそれらの組み合わせが含まれる。用語「ＣＳ１０」は、Stemcell Technologies又はBiolife Solutionsから入手した凍結保存培地を指す。ＣＳ１０倍地は、商品名「CryoStor（登録商標）CS10」と称される場合がある。ＣＳ１０培地は、ＤＭＳＯを含む無血清、無動物成分培地である。
【０１５１】
[00330]  用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトではＣＤ４５Ｒ０＋であり、且つＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）及びＩＬ−１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ−６、ＢＣＬ−６Ｂ、ＭＢＤ２及びＢＭＩ１が含まれる。セントラルメモリーＴ細胞はＴＣＲ惹起後にエフェクター分子としてＩＬ−２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ４区画において優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺において比例的に濃縮されている。
【０１５２】
[00331]  用語「エフェクターメモリーＴ細胞」は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現が欠損しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、且つＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるか又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）及びＩＬ−１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は、抗原刺激後、インターフェロン−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−５を含む、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ８区画において優勢であり、ヒトでは肺、肝臓及び腸において比例的に濃縮されている。ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は多量のパーフォリンを有する。用語「閉鎖系」は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。本発明の方法では、細胞培養方法に適切な任意の閉鎖系を用いることができる。閉鎖系としては、例えば、限定はされないが、閉鎖型Ｇコンテナが挙げられる。閉鎖系に腫瘍セグメントが加えられた後は、ＴＩＬの患者への投与直前までこの系は外部環境に対して開放されない。
【０１５３】
[00332]  腫瘍を破砕するプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化」、「断片」及び「断片化された」という用語には、腫瘍組織の破砕、スライス、分割及び細切並びに腫瘍組織の物理的構造を破砕する任意の他の方法などの機械的断片化方法が含まれる。
【０１５４】
[00333]  用語「末梢血単核球」及び「ＰＢＭＣ」は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。抗原提示細胞（ＰＢＭＣは、抗原提示細胞の一種である）として使用される場合、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。
【０１５５】
[00334]  用語「末梢血単核球」及び「ＰＢＭＣ」は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含めた、円形の核を有する末梢血細胞を指す。好ましくは、末梢血単核球は、照射された同種異系末梢血単核球である。ＰＢＭＣは、抗原提示細胞の一種である。
【０１５６】
[00335]  用語「抗ＣＤ３抗体」は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体であって、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ−３が含まれる。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビジリズマブが含まれる。
【０１５７】
[00336]  用語「ＯＫＴ−３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体中のＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含む、モノクローナル抗体若しくはバイオシミラー又はその変異体を指し、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA）及びムロモナブ又はそれらの変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム若しくはバイオシミラーなどの市販の形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に示す（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ−３を産生することができるハイブリドーマは、American Type Culture Collectionに寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ−３を産生することができるハイブリドーマもEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。
【０１５８】
【表１】
2021509586.tif 000002
【０１５９】
[00337]  用語「ＩＬ−２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）は、インターロイキン−２として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ−２を含む。ＩＬ−２は、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号３）。例えば、ＩＬ−２という用語は、アルデスロイキン（PROLEUKIN、１単回使用バイアルあたり２２００万ＩＵで複数の供給元から市販されている）並びにCellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２０９−ｂ）から市販で供給される組換えＩＬ−２の形態及び他の販売業者からの他の市販の同等物などのＩＬ−２のヒト組換え型を包含する。アルデスロイキン（デス−アラニル−１、セリン−１２５ヒトＩＬ−２）は、分子量およそ１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え型ＩＬ−２である。本発明における使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に示す（配列番号４）。ＩＬ−２という用語は、本明細書に記載されているように、Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ−２１４も含む、ペグ化形態のＩＬ−２も包含する。本発明での使用に好適なＮＫＴＲ−２１４及びペグ化ＩＬ−２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１  Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６  Ａ１号（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明での使用に適したコンジュゲートＩＬ−２の代替形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号及び同第４９０２，５０２号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適したＩＬ−２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
【表２】
2021509586.tif 000003
【０１６１】
[00338]  用語「ＩＬ−４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これは、Ｔｈ２  Ｔ細胞により、且つ好酸球、好塩基球及び肥満細胞により産生される。ＩＬ−４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）からＴｈ２  Ｔ細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。ＩＬ−４によって活性化されると、Ｔｈ２  Ｔ細胞は続いてポジティブフィードバックループにおいて、更なるＩＬ−４を産生する。ＩＬ−４はまた、Ｂ細胞拡大培養及びクラスＩＩ  ＭＨＣ発現を刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−４は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２１１）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ  ＣＴＰ００４３）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−４のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号５）。
【０１６２】
[00339]  用語「ＩＬ−７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。ＩＬ−７は、Ｔ細胞の発生を刺激することができる。ＩＬ−７は、胸腺内のＴ細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルにおいて、ＩＬ−７受容体α及び一般的なγ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ−７受容体に結合する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−７は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２５４）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ  ＰＨＣ００７１）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−７のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号６）。
【０１６３】
[00340]  用語「ＩＬ−１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）は、インターロイキン−１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ−２を含む。ＩＬ−１５は、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ−２と共有する。組換えヒトＩＬ−１５は、分子量１２．８ｋＤａの１１４個のアミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−２３０−ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号３４−８１５９−８２）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号７）。
【０１６４】
[00341]  用語「ＩＬ−２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）は、インターロイキン−２１として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びそれらの変異体を含む全ての形態のＩＬ−２１を含む。ＩＬ−２１は、例えば、Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２１は、主にナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ−２１は、分子量１５．４ｋＤａの１３２個のアミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−２１は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号ＣＹＴ−４０８−ｂ）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA （ヒトＩＬ−２１組換えタンパク質、カタログ番号１４−８２１９−８０）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号８）。
【０１６５】
[00342]  「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」又は「治療量」が指示されるとき、本発明の組成物の正確な投与量は、医師が年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して決定することができる。概して、本明細書に記載される腫瘍浸潤リンパ球（例えば、二次ＴＩＬ又は遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球）を含む医薬組成物は、１０４〜１０１１細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５〜１０６、１０５〜１０１０、１０５〜１０１１、１０６〜１０１０、１０６〜１０１１、１０７〜１０１１、１０７〜１０１０、１０８〜１０１１、１０８〜１０１０、１０９〜１０１１又は１０９〜１０１０細胞／ｋｇ体重）（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投薬量で投与され得ると言うことができる。腫瘍浸潤リンパ球（場合により遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球を含む）組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。腫瘍浸潤リンパ球（ある場合には遺伝子的なものを含む）は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与され得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投与量及び処置レジメンは、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて処置を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。
【０１６６】
[00343]  「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織を含むが、これらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
【０１６７】
[00344]  用語「固形腫瘍」は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。用語「固形腫瘍癌」は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌などの肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
【０１６８】
[00345]  「液性腫瘍」という用語は、本来流動性である異常な細胞塊を指す。液性腫瘍癌としては、白血病、骨髄腫及びリンパ腫並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。液性腫瘍から得られたＴＩＬは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称される。
【０１６９】
[00346]  本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形若しくは血液腫瘍微小環境又は微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されているように、「新生物性形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤をサポートし、腫瘍を宿主の免疫から保護し、治療抵抗性を培い、優勢な転移を成功させるニッチを提供する、細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス及び機械的手がかり」の複合的な混合物を指す。腫瘍はＴ細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、免疫系による腫瘍の排除は、微小環境による免疫抑制のため、希少である。
【０１７０】
[00347]  一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を治療する方法を含み、ここで、患者は、本発明に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一部の実施形態において、ＴＩＬ集団が提供され得、ここで、患者は、本発明に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入の２７〜２３日前）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本発明に係るＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ−２の静脈内注入を受ける。
【０１７１】
[00348]  実験的知見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のｒＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
【０１７２】
[00349]  本明細書で使用される「共投与」、「共投与すること」、「〜と組み合わせて投与される」、「〜と組み合わせて投与すること」、「同時（simultaneous）」及び「同時（concurrent）」という用語は、両方の活性医薬成分及び／又はそれらの代謝産物が同時に対象内に存在するための、２つ以上の活性医薬成分（本発明の好ましい実施形態において、例えば複数のＴＩＬと組み合わせた少なくとも１つのカリウムチャネルアゴニスト）の対象への投与を包含する。共投与には、別々の組成物中での同時投与、別々の組成物中での異なる時点における投与又は２つ以上の活性医薬成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
【０１７３】
[00350]  用語「有効量」又は「治療有効量」は、疾患処置を含むが、これに限定されない、意図された用途を達成するのに十分な、本明細書に記載の化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロ又はインビボ）又は処置されている対象及び疾患状態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患状態の重症度又は投与方法によって変動し得る。この用語は、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板接着及び／又は細胞遊走の減少）を誘発する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織及び化合物が運ばれる物理的送達システムによって変動する。
【０１７４】
[00351]  用語「処置」、「処置している」、「処置する」などは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという意味で予防的であり得、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的に又は完全に治癒するという意味で治療的であり得る。「処置」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、依然としてそれを有するとは診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、即ちその発症又は進行を止めること；及び（ｃ）疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を生じさせること及び／又は１つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「処置」は、疾患又は病態がない場合でも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「処置」は、例えば、ワクチンの場合、疾患状態がない中で免疫応答を誘発し又は免疫を付与することができる組成物の送達を包含する。
【０１７５】
[00352]  核酸又はタンパク質の部分に関して使用される場合の「異種」という用語は、その核酸又はタンパク質が、天然には互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え的に産生され、新しい機能性核酸を作成するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列、例えば１つの供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコーディング領域又は異なる供給源からのコーディング領域を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然には互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【０１７６】
[00353]  ２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈における「配列同一性」、「パーセント同一性」及び「配列パーセント同一性」（又はそれらの同義語、例えば「９９％同一」）という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限の対応について比較し、整合させた場合に（必要であればギャップを導入する）、同じであるか、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用するか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを入手するために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当技術分野において公知である。パーセント配列同一性を決定するための適切なプログラムには、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式が含まれる。２つの配列間の比較は、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech, South San Francisco, California）又はDNASTARから入手可能なMegAlignは、配列を整合するために使用することができる、公に入手可能な更なるソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
【０１７７】
[00354]  本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照抗体のアミノ酸配列内又はそれに隣接する特定の位置での１つ以上の置換、欠失及び／又は付加により、参照抗体のアミノ酸配列と異なる、アミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含するが、これに限定されるものではない。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列中に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電又は非荷電であるアミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。変異体という用語は、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
【０１７８】
[00355]  本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７  ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬは、初代及び二次ＴＩＬの両方を含む。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから得られるものであり（「新鮮に回収された」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ、拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ  ＴＩＬ」）並びに本明細書で考察する通りの「ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬ」を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は成長した任意のＴＩＬ細胞集団である。ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬは、例えば、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む、図８のステップＤに記載されたものなど）を含み得る。
【０１７９】
[00356]  ＴＩＬは、一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、一般的に、次のバイオマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ  αβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ−１及びＣＤ２５の１つ以上を発現することによって分類することができる。加えて及び代わりに、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、更に効力によって特徴付けられ得  −  例えば、ＴＩＬは、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）遊離が約５０ｐｇ／ｍＬより高い、約１００ｐｇ／ｍＬより高い、約１５０ｐｇ／ｍＬより高い又は約２００ｐｇ／ｍＬより高い場合に効力があると見なすことができる。
【０１８０】
[00357]  「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成の非修飾及び修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチドの糖部分、塩基部分及び／又はデオキシリボヌクレオチド間の結合への変化が含まれる。
【０１８１】
[00358]  「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を定義する。「リボヌクレオチド」という用語は、ｂ−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを定義する。ＲＮＡという用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えにより産生されたＲＮＡ並びに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる改変されたＲＮＡが含まれる。本明細書に記載されるＲＮＡ分子のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたＲＮＡは、類似体又は天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。
【０１８２】
[00359]  「修飾ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環又はリン酸基に対して１つ以上の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸及びシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸及びデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを除外する。修飾には、メチルトランスフェラーゼなどのヌクレオチドを修飾する酵素による修飾の結果として天然に存在するものが含まれる。
【０１８３】
[00360]  修飾ヌクレオチドには、合成又は非天然ヌクレオチドも含まれる。ヌクレオチドの合成又は非天然の修飾には、２’修飾を有する修飾、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）又は塩基類似体を含むものが含まれる。本開示について記載されるような２’修飾ヌクレオチドに関して、「アミノ」とは、２’−ＮＨ２又は２’−Ｏ−ＮＨ２を意味し、これらは、修飾されていても修飾されていなくてもよい。そのような修飾されたグループは、例えば、米国特許第５，６７２，６９５号及び同第６，２４８，８７８号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
[00361]  「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」という用語は、一本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指し、その一本鎖ＲＮＡは、遺伝子又は標的遺伝子と同じ細胞でｍｉＲＮＡが発現される場合、遺伝子又は標的遺伝子の発現を変化させる（発現を低減又は阻害する；発現を調節する；直接的又は間接的に発現を増強する）能力を有する。一実施形態において、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子に対して実質的又は完全な同一性を有し、一本鎖ｍｉＲＮＡを形成する核酸を指す。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、プレｍｉＲＮＡの形態であり得、ここで、プレｍｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡの配列は、完全長の標的遺伝子又はその部分配列に対応し得る。通常、ｍｉＲＮＡは、少なくとも約１５〜５０ヌクレオチド長である（例えば、一本鎖ｍｉＲＮＡの各配列は、１５〜５０ヌクレオチド長であり、二本鎖プレｍｉＲＮＡは、約１５〜５０塩基対の長さである）。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、２０〜３０塩基のヌクレオチドである。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、２０〜２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長である。
【０１８５】
[00362]  「標的遺伝子」という用語は、免疫耐性機構に関与する遺伝子の発現を調節することが知られているか又は同定されている遺伝子を含み、サプレッサー受容体、例えばＣＴＬＡ４及びＰＤ１；免疫細胞を不活性化するサイトカイン受容体、例えばＴＧＦ−β受容体、ＬＡＧ３及び／又はＴＩＭ３並びにそれらの組み合わせなどの遺伝子のいくつかのグループの１つであり得る。一部の実施形態において、標的遺伝子は、ＰＤ−１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＮＯＴＣＨ  １／２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）、ＮＯＴＣＨリガンドｍＤＬＬ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１及び／又はｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の１つ以上を含む。
【０１８６】
[00363]  「低分子干渉ＲＮＡ」、又は「ｓｉＲＮＡ」、又は「短鎖干渉ＲＮＡ」、又は「サイレンシングＲＮＡ」という語句は、それぞれ一般的に約１０２２ヌクレオチド長のセンス及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、任意選択により１〜３ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む二本鎖ＲＮＡ分子のグループを定義する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路で活性であり、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の標的遺伝子の発現に干渉する。
【０１８７】
[00364]  ｓｄ−ＲＮＡという用語は、非対称の二本鎖ＲＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッドとして形成される「自己送達可能な」ＲＮＡｉ剤を指す。二本鎖ＲＮＡは、約１９〜２５ヌクレオチドのガイド（センス）鎖及び約１０〜１９ヌクレオチドのパッセンジャー（アンチセンス）鎖を含み、約５〜９ヌクレオチドの一本鎖ホスホロチオール化テールを結果として生じる二重鎖形成を伴う。一部の実施形態において、ＲＮＡ配列は、ステロール、例えばコレステロール、ビタミンＤ、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン及びフェニルなどの安定化及び疎水性修飾で修飾され得、トランスフェクション試薬又は製剤の不存在下で安定性及び効率的な細胞取り込みをもたらす。一部の実施形態において、ＩＦＮ誘発性タンパク質について試験する免疫応答アッセイは、ｓｄ−ＲＮＡが他のＲＮＡｉ剤と比較して低減した免疫刺激プロファイルを生成することを示す。例えば、参照により組み込まれるByrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864を参照されたい。一部の実施形態において、本明細書に記載されているｓｄ−ＲＮＡは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。
【０１８８】
[00365]  用語「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、あらゆる溶媒、分散剤、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤並びに不活性成分を含むものとする。活性医薬成分のためのかかる薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬成分も記載の組成物及び方法に組み込むことができる。
【０１８９】
[00366]  用語「約」及び「およそ」は、統計的に意味のある値の範囲内を指す。かかる範囲は、所定の値又は範囲の一桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、更により好ましくは１０％以内、更により好ましくは５％以内であり得る。用語「約」又は「およそ」に含まれる許容変動は、研究中の特定の系に依存し、当業者に容易に理解できる。更に、本明細書で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状及び他の量及び特性が正確ではなく、且つ正確である必要がないことを意味するが、近似及び／又はより大きい又はより小さい場合があり、必要に応じて、公差、変換係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に公知の他の因子を反映する。一般に、寸法、サイズ、製剤、パラメータ、形状又は他の量若しくは特性は、明示的にそうであると明記されているか否かにかかわらず、「約」又は「およそ」である。大きく異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態が、記載された用語を引用する場合があることに留意されたい。
【０１９０】
[00367]  添付の特許請求の範囲で使用される場合、「を含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行用語は、記載されていない追加の請求要素又はステップがある場合、それらが特許請求の範囲から除外されることに関して、元の形式及び修正された形式で、特許請求の範囲を定義する。用語「を含む」は、包括的又は無制限であることを意図しており、追加の、引用されていない要素、方法、ステップ又は材料を除外するものではない。用語「からなる」は、特許請求の範囲で指定されたもの以外の任意の要素、ステップ又は材料を除外し、後者の場合、指定された材料に関連する通常の不純物を除外する。用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を特定の要素、ステップ又は材料及び請求された発明の基本的及び新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載の全ての組成物、方法及びキットは、代替実施形態において、「を含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行用語のいずれかによってより具体的に定義され得る。
【０１９１】
ＩＩＩ．ＴＩＬにおける一過性に変化したタンパク質発現の方法
[00368]  一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬは、タンパク質発現を変化させるために、それぞれ本明細書で提供されるように、閉鎖無菌製造プロセス中を含む、拡大培養ステップ前、その間又はその後に更に操作される。一部の実施形態において、一過性に変化したタンパク質発現は、一過性の遺伝子編集によるものである。一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬは、転写因子（ＴＦ）及び／又はＴＩＬにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子で処置される。一部の実施形態において、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又はＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する。
【０１９２】
[00369]  一部の実施形態において、本発明は、１つ以上のタンパク質の発現の促進又は１つ以上のタンパク質の発現の阻害及びタンパク質の組の促進と、別のセットのタンパク質の阻害との両方の同時の組み合わせのための、ＴＩＬ集団へのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又は小分子（短鎖）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の挿入を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）挿入などのヌクレオチド挿入による遺伝子編集を含む。
【０１９３】
[00370]  一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬは、タンパク質発現の一過性の変化を受ける。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、第１の拡大培養前に、例えば、例えば図８に示されるステップＡから得られる、ＴＩＬ集団におけるものを含むバルクＴＩＬ集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図８に示されるステップＢにおいて、拡大培養されるＴＩＬ集団におけるものを含む第１の拡大培養中に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、第１及び第２の拡大培養間の移行中のＴＩＬ集団、図８に示される、例えばステップＢから取得され、ステップＣに含まれるＴＩＬ集団におけるものを含む第１の拡大培養後に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えばステップＣから得られる、ＴＩＬ集団におけるものを含む第２の拡大培養前及び図８に示されるステップＤにおけるその拡大培養前にバルクＴＩＬ集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図８に示されるステップＤにおいて、拡大培養されるＴＩＬ集団におけるものを含む第２の拡大培養中に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、例えば図８に示されるステップＤにおける、拡大培養から得られるＴＩＬ集団におけるものを含む第２の拡大培養後に発生する。
【０１９４】
[00371]  一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、エレクトロポレーションのステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、図３０及び図３１に示される方法に従って実施される。エレクトロポレーション法は、当技術分野で公知であり、例えばTsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７  Ａ１号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションのステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング及びエンドサイトーシス）は、当技術分野で公知であり、例えばGraham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467；Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376；及びChen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752；並びに米国特許第５，５９３，８７５号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リポソームトランスフェクションのステップを含む。ろ過水中のカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスフォチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を使用する方法などのリポソームトランスフェクション法は、当技術分野で公知であり、例えばRose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525及びFelgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417並びに米国特許第５，２７９，８３３号；同第５，９０８，６３５号；同第６，０５６，９３８号；同第６，１１０，４９０号；同第６，５３４，４８４号；及び同第７，６８７，０７０号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、米国特許第５，７６６，９０２号；同第６，０２５，３３７号；同第６，４１０，５１７号；同第６，４７５，９９４号；及び同第７，１８９，７０５号（そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法を使用したトランスフェクションのステップを含む。
【０１９５】
[00372]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増加をもたらす。ＴＳＣＭは、抗原経験のあるセントラルメモリーＴ細胞の初期の前駆細胞である。ＴＳＣＭは、一般に、幹細胞を定義する長期生存、自己再生及び多能性能力を示し、効果的なＴＩＬ産物の生成に一般的に望ましい。ＴＳＣＭは、養子細胞移入のマウスモデルで他のＴ細胞サブセットと比較して強化された抗腫瘍活性を示している（Gattinoni et al. Nat Med 2009, 2011；Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012；Cieri et al. Blood 2013）。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、高い割合のＴＳＣＭを含む組成物を伴うＴＩＬ集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭパーセンテージの増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＬ集団における、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍又は１０倍のＴＳＣＭの増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭを伴うＴＩＬ集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭを伴う治療用ＴＩＬ集団をもたらす。
【０１９６】
[00373]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、抗原経験のあるＴ細胞の若返りをもたらす。一部の実施形態において、若返りには、例えば、増殖の増加、Ｔ細胞活性化の増加及び／又は抗原認識の増加が含まれる。
【０１９７】
[00374]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを保存するために、Ｔ細胞の大部分における発現を変化させる。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを変化させない。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを維持する。
【０１９８】
[00375]  一部の実施形態において、タンパク質の一過性の変化は、特定の遺伝子の変化した発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１（ＰＤＣＤ１又はＣＤ２７９とも称される）、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１及び／又はｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を含むが、これらに限定されない遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１及び／又はｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）からなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦＢＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４／５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−７を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−１０を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−１２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−１５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−２１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤを標的とする。
【０１９９】
[00376]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤを介するもの及び／又はｍＤＬＬ１などの他のＮＯＴＣＨリガンドを介するものなど、ＮＯＴＣＨシグナル伝達経路を標的とする（例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるKondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)を参照されたい）。
【０２００】
[00377]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＧＩＴを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦβを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＳＣＲ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ８を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ１７を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＶＨＬを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を標的とする。
【０２０１】
[00378]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、一過性のタンパク質発現によって過剰発現されるケモカイン受容体は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２及び／又はＣＣＬ１７を含むが、これらに限定されないリガンドを有する受容体を含む。一部の実施形態において、一過性のタンパク質発現によって過剰発現されるケモカイン受容体は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１並びにＮＯＴＣＨ  １／２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を含むが、これらに限定されないリガンドを有する受容体を含む。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤを介するもの及び／又はｍＤＬＬ１などの他のＮＯＴＣＨリガンドを介するものなど、ＮＯＴＣＨシグナル伝達経路を標的とする（例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるKondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)を参照されたい）。
【０２０２】
[00379]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲ２及び／又はＴＧＦβの減少及び／又は発現の低減をもたらす（例えば、ＴＧＦβ経路の遮断をもたらすことを含む）。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）の減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨの減少及び／又は発現の低減をもたらす。
【０２０３】
[00380]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、腫瘍部位へのＴＩＬ輸送又は移動を改善するために、ケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２及び／又はＣＳＣＲ３からなる群から選択されるケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。
【０２０４】
[00381]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、インターロイキンの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１からなる群から選択されるインターロイキンの増加及び／又は過剰発現をもたらす。
【０２０５】
[00382]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤを介するもの及び／又はｍＤＬＬ１などの他のＮＯＴＣＨリガンドを介するものなど、ＮＯＴＣＨシグナル伝達経路を標的とする（例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるKondo, T. et al., NOTCH-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy, Nature Communications, Vol. 8, Article number: 15338 (2017)を参照されたい）。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ｍＤＬＬ１などのＮＯＴＣＨリガンドの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＶＨＬの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１の増加及び／又は過剰発現をもたらす。
【０２０６】
[00383]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰプロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の減少及び／又は発現の低減をもたらす。
【０２０７】
[00384]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つの分子の減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される２つの分子の減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１と、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つの分子との減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせの減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１と、ＬＡＧ−３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせの１つとの減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１及びＬＡＧ３の減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＰＤ−１の減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３の減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現の低減をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現の低減をもたらす。
【０２０８】
[00385]  一部の実施形態において、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団又は回収されたＴＩＬ集団に挿入される（例えば、接着分子の発現が増加する）。
【０２０９】
[00386]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つの分子の減少及び／又は発現の低減並びにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びそれらの組み合わせの増加及び／又は発現の増強をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つの分子の減少及び／又は発現の低減並びにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びそれらの組み合わせの増加及び／又は発現の増強をもたらす。
【０２１０】
[00387]  一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の低減が存在する。
【０２１１】
[00388]  一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の増加が存在する。
【０２１２】
[00389]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、転写因子（ＴＦ）及び／又はＴＩＬにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子でのＴＩＬの処置によって誘導される。一部の実施形態において、ＳＱＺベクターを含まないマイクロ流体プラットフォームは、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子の細胞内送達のために使用される。転写因子を含むタンパク質を、Ｔ細胞を含む様々な初代ヒト細胞に送達する能力を実証するそのような方法（Sharei et al. PNAS 2013並びにSharei et al., PLOS ONE 2015及びGreisbeck et al., J. Immunology vol. 195, 2015）が説明されており、これは、ＴＦ又は他の分子が細胞に侵入するようにマイクロ流体狭窄を使用して細胞を変形させる迅速な方法を含む。例えば、国際公開第２０１３／０５９３４３Ａ１号、国際公開第２０１７／００８０６３Ａ１号若しくは国際公開第２０１７／１２３６６３Ａ１号又は米国特許出願公開第２０１４／０２８７５０９Ａ１号、同第２０１８／０２０１８８９Ａ１号若しくは同第２０１８／０２４５０８９Ａ１号（これらは、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。国際公開第２０１３／０５９３４３Ａ１号、国際公開第２０１７／００８０６３Ａ１号若しくは国際公開第２０１７／１２３６６３Ａ１号又は米国特許出願公開第２０１４／０２８７５０９Ａ１号、同第２０１８／０２０１８８９Ａ１号若しくは同第２０１８／０２４５０８９Ａ１号に記載されるそのような方法は、転写因子（ＴＦ）及び／又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子にＴＩＬ集団を曝露するために本発明と共に使用することができ、ここで、ＴＦ及び／又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び／又はＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供し、したがってＴＩＬ集団の再プログラミング及び再プログラミングされたＴＩＬ集団の治療効果の再プログラミングされていないＴＩＬ集団と比較した増加をもたらす。一部の実施形態において、再プログラミングは、本明細書に記載されるように、ＴＩＬの開始集団又は前の（即ち再プログラミング前の）集団と比較して、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞の増加したサブ集団をもたらす。
【０２１３】
[00390]  一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ＴＣＦ−１、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ及び／又はＭＹＢを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ＴＣＦ−１である。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤである。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ＭＹＢである。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、市販のKNOCKOUT血清代替物（Gibco/ThermoFisher）などの人工多能性幹細胞培養物（ｉＰＳＣ）と共に投与されて、追加のＴＩＬ再プログラミングを誘導する。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、追加のＴＩＬ再プログラミングを誘導するために、ｉＰＳＣカクテルと共に投与される。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ｉＰＳＣカクテルなしで投与される。一部の実施形態において、再プログラミングは、ＴＳＣＭのパーセンテージの増加をもたらす。一部の実施形態において、再プログラミングは、ＴＳＣＭのパーセンテージの約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％ＴＳＣＭの増加をもたらす。
【０２１４】
[00391]  一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法は、
（ｉ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得るステップ；
（ｉｉ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも１００倍多く、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、生じさせること；及び
（ｉｖ）第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する、曝露すること
を含む。
【０２１５】
[00392]  一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つの短鎖干渉ＲＮＡ又は１つのメッセンジャーＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｇ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｈ）ステップ（ｇ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｉ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｊ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含み、滅菌エレクトロポレーションステップは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉ＲＮＡの送達を含む。
【０２１６】
[00393]  一実施形態によれば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団に対してＳＱＺマイクロ流体膜破壊ステップを実施することであって、ＳＱＺマイクロ流体膜破壊ステップは、少なくとも１つの短鎖干渉ＲＮＡ又は１つのメッセンジャーＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｇ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｈ）ステップ（ｇ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｉ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｊ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含み、ＳＱＺマイクロ流体膜破壊ステップは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するための短鎖干渉ＲＮＡの送達を含む。
【０２１７】
[00394]  一部の実施形態において、上記のように一過性に変化するタンパク質発現の方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子改変する方法と組み合わされ得、１つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定した組み込みのステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レトロウイルス形質導入のステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レンチウイルス形質導入のステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えばLevine, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77；Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75；Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71及び米国特許第６，６２７，４４２号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入のステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入システムは、当技術分野で公知であり、例えばCepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入のステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入システムは、当技術分野で公知であり、トランスポサーゼの長期発現がトランスジェニック細胞では発生しないように、トランスポサーゼがＤＮＡ発現ベクターとして又は発現可能なＲＮＡ若しくはタンパク質として提供されるシステム、例えばｍＲＮＡ（例えば、キャップ及びポリＡテールを含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポサーゼを含む。ＳＢ１０、ＳＢ１１、ＳＢ１００ｘなどのサケ科のＴｅｌ様トランスポサーゼ（ＳＢ又はSleeping Beautyトランスポサーゼ）を含む適切なトランスポゾン媒介遺伝子導入システム及び酵素活性が向上した人工酵素は、例えば、Hackett, et al., Mol. Therapy 2010, 18, 674-83及び米国特許第６，４８９，４５８号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
[00395]  一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップ又はＳＱＺマイクロ流体膜破壊ステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップ又はＳＱＺマイクロ流体膜破壊ステップは、少なくとも１つの短鎖干渉ＲＮＡ又は１つのメッセンジャーＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｇ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｈ）ステップ（ｇ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｉ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｊ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含み、エレクトロポレーションステップは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害するための短鎖干渉ＲＮＡの送達を含み、更に、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団又は回収されたＴＩＬ集団に挿入される。
【０２１９】
[00396]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、自己送達ＲＮＡ干渉（ｓｄ−ＲＮＡ）によって誘導される発現の低減であり、これは、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを使用してその３’末端でコレステロールにコンジュゲートした２０ヌクレオチドのアンチセンス（ガイド）鎖及び１３〜１５塩基のセンス（パッセンジャー）鎖を含む、２’−ＯＨ置換（典型的にはフッ素又は−ＯＣＨ３）の高いパーセンテージを有する化学合成された非対称ｓｉＲＮＡ二重鎖である。ｓｄ−ＲＮＡの使用方法は、Khvorova and Watts, Nat. Biotechnol. 2017, 35, 238-248；Byrne, et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2013, 29, 855-864；及びLigtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018（近刊）に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄ−ＲＮＡの送達は、エレクトロポレーション、ＳＱＺ又は他の方法を使用せずに達成され、代わりにＴＩＬ集団が培地中１μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄ−ＲＮＡに曝露される１〜３日の期間を使用する。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄ−ＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中１０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄ−ＲＮＡに曝露される１〜３日の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄ−ＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄ−ＲＮＡに曝露される１〜３日の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄ−ＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中において０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ〜５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄ−ＲＮＡに曝露される１〜３日の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄ−ＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中において０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ〜５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄ−ＲＮＡに曝露される１〜３日の期間を使用して達成され、ここで、ｓｄ−ＲＮＡへの曝露は、培地に新鮮なｓｄ−ＲＮＡを添加することにより、２、３、４又は５回行われる。他の適切なプロセスは、例えば、米国特許出願公開第２０１１／００３９９１４  Ａ１号、同第２０１３／０１３１１４１  Ａ１号及び同第２０１３／０１３１１４２  Ａ１号並びに米国特許第９，０８０，１７１号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２０】
[00397]  一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、図３２によるプロセスを使用して、製造中にＴＩＬの集団に挿入される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ、ＮＯＴＣＨリガンドｍＤＬＬ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４  ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＴＧＦＢＲ２、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ＢＡＦＦ  ＢＲ３、ＣＩＳＨ及び／又はＣＢＬＢに干渉するＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、発現の低減は、例えば、フローサイトメトリー及び／又はｑＰＣＲによって評価されるような遺伝子サイレンシングのパーセンテージに基づいて決定される。一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の低減が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の低減が存在する。
【０２２１】
[00398]  一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、１つ以上の自己送達ＲＮＡ（ｓｄ−ＲＮＡ）、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｈ）ステップ（ｇ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｉ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｊ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含み、１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害する。
【０２２２】
[00399]  一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、１つ以上の自己送達ＲＮＡ（ｓｄ−ＲＮＡ）、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｈ）ステップ（ｇ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｇ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｉ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｊ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含み、１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を一過性に阻害し、更に、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法により、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団又は回収されたＴＩＬ集団に挿入される。
【０２２３】
Ａ．ｓｄ−ＲＮＡ法
[00400]  本明細書に記載されるように、ｓｉＲＮＡの化学修飾に基づく自己送達可能なＲＮＡｉ技術を本発明の方法と共に使用して、ｓｄ−ＲＮＡを問題なくＴＩＬに送達することができる。骨格修飾と非対称ｓｉＲＮＡ構造及び疎水性リガンドとの組み合わせ（例えば、Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018及び米国特許出願公開第20160304873号並びに本明細書の図３６及び図３７を参照されたい）は、ｓｄ−ＲＮＡのヌクレアーゼ安定性を利用して、培養培地に単純に添加することにより、追加の製剤及び及び方法なしで、ｓｄ−ＲＮＡを培養した哺乳動物細胞に浸透させることを可能にする。この安定性は、単に培地中のｓｄ−ＲＮＡの活性濃度を維持することで、ＲＮＡｉを介した標的遺伝子活性の一定レベルの低減のサポートを可能にする。理論に拘束されるものではないが、ｓｄ−ＲＮＡの骨格安定化は、非分裂細胞において数ヶ月間続き得る、遺伝子発現効果の長期低減を提供する。
【０２２４】
[00401]  一実施形態において、本明細書で開示される遺伝子を標的とするために本明細書で使用されるｓｄ−ＲＮＡは、図３６又は図３７に示される構造を有する。
【０２２５】
[00402]  一部の実施形態において、９５％を超えるＴＩＬのトランスフェクション効率及び様々な特定のｓｄ−ＲＮＡによる標的の発現の低減が生じる。一部の実施形態において、いくつかの未修飾リボース残基を含有するｓｄ−ＲＮＡを、完全に修飾された配列で置換して、ＲＮＡｉ効果の効力及び／又は寿命を増加させた。一部の実施形態において、発現効果の低減は、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、５日間、６日間、７日間又は８日間以上維持される。一部の実施形態において、発現効果の低減は、ＴＩＬのｓｄ−ＲＮＡ処置後、１０日以上で減少する。一部の実施形態において、標的発現の発現において７０％を超える低減が維持される。一部の実施形態において、標的発現の発現において７０％を超える低減は、維持されたＴＩＬである。一部の実施形態において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路における発現の減少により、ＴＩＬがより強力なインビボ効果を示すことが可能となり、これは、一部の実施形態において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の抑制効果の回避による。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡによるＰＤ−１の発現の低減は、ＴＩＬ増殖の増加をもたらす。
【０２２６】
１．ｓｄ−ＲＮＡの選択及び特徴
ａ．ｓｄ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造
[00403]  低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、短鎖干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとして知られる場合もあり、一般に長さが１９〜２５塩基対の二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現に干渉するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）で使用される。
【０２２７】
[00404]  二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、一般にセンス（パッセンジャー）及びアンチセンス（ガイド）鎖であり、一本鎖オーバーハング領域を含み得る、ＲＮＡの相補鎖の対を含む任意の分子を定義するために一般的に使用できる。ｓｉＲＮＡと対比されるｄｓＲＮＡという用語は、ダイサーを含む切断酵素システムの作用により、より大きいｄｓＲＮＡ分子から放出されるｓｉＲＮＡ分子の配列を含む前駆体分子を一般的に指す。
【０２２８】
[00405]  ｓｄ−ＲＮＡ（自己送達可能なＲＮＡ）は、細胞に侵入するのに送達ビヒクルを必要とせず、従来のｓｉＲＮＡと比較して向上した薬理を有する、共有結合修飾されたＲＮＡｉ化合物の新しいクラスである。「自己送達可能なＲＮＡ」又は「ｓｄ−ＲＮＡ」は、疎水性修飾されたＲＮＡ干渉アンチセンスハイブリッドであり、初代細胞ではインビトロで、局所投与ではインビボで非常に効果的であることが実証されている。毒性のない強力な取り込み及び／又はサイレンシングが実証されている。ｓｄ−ＲＮＡは、一般に、最小の二本鎖領域を有する、化学的に修飾された非対称の核酸分子である。ｓｄ−ＲＮＡ分子は、典型的には、一本鎖領域及び二本鎖領域を含み、分子の一本鎖領域及び二本鎖領域の両方に様々な化学修飾を含み得る。更に、ｓｄ−ＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、従来の及び先端的なステロール型分子などの疎水性コンジュゲートに結合させることができる。ｓｄ−ＲＮＡ（及び／又はｓｄ−ＲＮＡと同様の方法で利用することができるＲＮＡ）及びそのようなｓｄ−ＲＮＡを作製するための関連する方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０３０４８７３号、国際公開第２０１０／０３３２４６号、国際公開第２０１７／０７０１５１号、国際公開第２００９／１０２４２７号、国際公開第２０１／１１１９８８７号、国際公開第２０１０／０３３２４７号、国際公開第２００９０４５４５７号、国際公開第２０１１／１１９８５２号、国際公開第２０１１／１１９８７１号、米国特許出願公開第２０１１／０２６３６８０号、国際公開第２０１０／０３３２４８号、国際公開第２０１０／０７８５３６号、国際公開第２０１０／０９０７６２号、米国特許出願公開第２０１１００３９９１４号、国際公開第２０１１／１０９６９８号、国際公開第２０１０／０９０７６２号、米国特許第８，８１５，８１８号、国際公開第２０１６／０９４８４５号、国際公開第２０１７／１９３０５３号、米国特許出願公開第２００６／０２７６６３５号、国際公開第２００１／００９３１２号、米国特許出願公開第２０１７／００４３０２４号、米国特許出願公開第２０１７／０３１２３６７号、米国特許出願公開第２０１６／０３１９２７８号、米国特許出願公開第２０１７／０３６９８８２号、米国特許第８，５０１，７０６号、米国特許出願公開第２００４／０２２４４０５号、米国特許第８，２５２，７５５号、米国特許出願公開第２００７／００３１８４４号、米国特許出願公開第２００７／００３９０７２号、米国特許出願公開第２００７／０２０７９７４号、米国特許出願公開第２００７／０２１３５２０号、米国特許出願公開第２００７／０２１３５２１号、米国特許出願公開第２００７／０２１９３６２号、米国特許出願公開第２００７／０２３８８６８号、米国特許出願公開第２０１４／０１４８３６２号、米国特許出願公開第２０１６／０１９３２４２号、米国特許出願公開第２０１６／０１９４６４６１号、米国特許出願公開第２０１６／０２０１０５８号、米国特許出願公開第２０１６／０２０１０６５号、米国特許出願公開第２０１７／０３４９９０４号、米国特許出願公開第２０１８／０１１９１４４号、米国特許第７，８３４，１７０号、米国特許第８，０９０，５４２号及び米国特許出願公開第２０１２／００５２４８７号にも広範に記載され、これらの全ては、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ｓｄ−ＲＮＡは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAからも市販されている。ｓｄ−ＲＮＡの構造、化学、標的位置、配列の優先傾向などを最適化するために独自のアルゴリズムが開発され、ｓｄ−ＲＮＡの効力予測に利用されている（例えば、米国特許出願公開第２０１６０３０４８７３号を参照されたい）。これらの分析に基づいて、機能的ｓｄ−ＲＮＡ配列は、一般に、４０％を超える確率において、１μＭの濃度で７０％を超える発現の低減を有すると定義されている。
【０２２９】
ｂ．ｓｄ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造
[00406]  一部の実施形態において、本発明で使用するための１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、線状二本鎖ＤＮＡテンプレートから生成することができる。一部の実施形態において、１つ以上のｓｄ−ＲＮＡを生成するための線状二本鎖ＤＮＡテンプレートは、米国特許第８，８５９，２２９号及び以下で説明されているものである。
【０２３０】
[00407]  一部の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られ、且つｍＲＮＡのインビトロ転写に適した線状二本鎖ＤＮＡテンプレートは、二本鎖ＤＮＡのコード鎖上のＲＮＡポリメラーゼプロモーター、３，０００ヌクレオチド長未満であり、且つ真核細胞へのトランスフェクション後にｍＲＮＡを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効なの５’非翻訳領域、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームであって、ポリペプチドは、トランスフェクトされる細胞に対して異種であり、ポリペプチドは、免疫細胞のリガンド又は受容体、免疫系の機能を刺激又は阻害するポリペプチド及び発癌性ポリペプチドの機能を阻害するポリペプチドからなる群から選択される、オープンリーディングフレーム、真核細胞へのトランスフェクション後にｍＲＮＡを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な３’非翻訳領域及び二本鎖ＤＮＡのコード鎖上の５０〜５，０００ヌクレオチドのポリ（Ａ）ストレッチを５’から３’に含み、ここで、プロモーターは、オープンリーディングフレームに対して異種であり、ＤＮＡテンプレートは、ＤＮＡベクター内に含有されず、且つポリ（Ａ）ストレッチの３’末端で終了する。一部の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼのためのコンセンサス結合配列を含む。一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、融合ポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、ＰＤ−１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）からなる群から選択されるポリペプチド及びそれらの組み合わせをコードする。一部の実施形態において、線状二本鎖は、内部リボソーム侵入部位を更に含む。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）ストレッチは、３００〜４００ヌクレオチド長である。
【０２３１】
[00408]  一部の実施形態において、請求項１の線状二本鎖ＤＮＡテンプレートは、５’から３’に、二本鎖ＤＮＡのコード鎖上のＲＮＡポリメラーゼプロモーター、３，０００ヌクレオチド長未満であり、且つ真核細胞へのトランスフェクション後にｍＲＮＡを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な５’非翻訳領域、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームであって、ポリペプチドは、トランスフェクトされる細胞に対して異種であり、ポリペプチドは、免疫細胞のリガンド又は受容体、免疫系の機能を刺激又は阻害するポリペプチド及び発癌性ポリペプチドの機能を阻害するポリペプチドからなる群から選択される、オープンリーディングフレーム、真核細胞へのトランスフェクション後にｍＲＮＡを検出可能なポリペプチドに翻訳するのに有効な３’非翻訳領域及び二本鎖ＤＮＡのコード鎖上の５０〜５，０００ヌクレオチドのポリ（Ａ）ストレッチからなり、ここで、プロモーターは、オープンリーディングフレームに対して異種であり、ＤＮＡテンプレートは、ＤＮＡベクター内に含有されず、且つポリ（Ａ）ストレッチの３’末端で終了する。一部の実施形態において、３’非翻訳領域は、少なくとも１００ヌクレオチド長である。
【０２３２】
[00409]  一部の実施形態において、本発明は、上記の線状二本鎖ＤＮＡテンプレートを生成する方法を提供し、ここで、方法は、フォワード及びリバースプライマーを生成することを含み、フォワードプライマーは、目的の標的二本鎖ＤＮＡの非コード鎖に実質的に相補的な複数のヌクレオチド及びＲＮＡポリメラーゼの結合部位として機能する複数のヌクレオチドを含み、リバースプライマーは、目的の標的二本鎖ＤＮＡのコード鎖に実質的に相補的な複数のヌクレオチド及び複数のデオキシチミジンヌクレオチドを含み、線状二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成するために、フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、標的ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施する。一部の実施形態において、本発明は、上記の線状二本鎖ＤＮＡテンプレートを生成する方法を提供し、ここで、方法は、フォワード及びリバースプライマーを生成することを含み、フォワードプライマーは、目的の標的二本鎖ＤＮＡの直接上流のヌクレオチドの領域に実質的に相補的な複数のヌクレオチドを含み、リバースプライマーは、目的の標的二本鎖ＤＮＡの直接下流のヌクレオチドの領域に実質的に相補的な複数のヌクレオチドを含み、線状二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成するために、フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、標的ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施する。一部の実施形態において、プライマーは、目的の二本鎖ＤＮＡの５’及び３’非翻訳領域のヌクレオチドのストレッチに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、プライマーは、目的の二本鎖ＤＮＡのオープンリーディングフレーム内のヌクレオチドのストレッチに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、プライマーは、目的の二本鎖ＤＮＡのオープンリーディングフレーム内のヌクレオチドのストレッチに実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、ここで、プライマーは、５’及び３’非翻訳領域を含むヌクレオチドのストレッチを更に含み、５’非翻訳領域を含むフォワードプライマーにおけるヌクレオチドのストレッチは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むヌクレオチドと、目的の標的二本鎖ＤＮＡの非コード鎖に実質的に相補的であるヌクレオチドとの間にあり、３’非翻訳領域を含むリバースプライマーにおけるヌクレオチドのストレッチは、複数のデオキシチミジンヌクレオチドと、目的の標的二本鎖ＤＮＡのコード鎖に実質的に相補的なヌクレオチドとの間にある。一部の実施形態において、フォワードプライマー及びオープンリーディングフレームは、コンセンサスコザック配列を含む。
【０２３３】
[00410]  一部の実施形態において、本発明は、線状二本鎖ＤＮＡテンプレートからのインビトロ転写を実施することを含む、細胞のトランスフェクションのための１つ以上のＲＮＡを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、１つ以上のアデニンヌクレオチド又はその類似体でＲＮＡのポリ（Ａ）テールを伸長することを更に含む。一部の実施形態において、方法は、転写されたＲＮＡの５’キャップとして機能するヌクレオチドを転写中に付加することを更に含む。一部の実施形態において、ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。一部の実施形態において、ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。
【０２３４】
[00411]  一部の実施形態において、本発明は、線状二本鎖ＤＮＡテンプレートから産生される、１つ以上のオープンリーディングフレームを含む１つ以上の単離されたＲＮＡの使用を利用する。一部の実施形態において、本発明は、細胞を線状二本鎖ＤＮＡテンプレートから産生された１つ以上のＲＮＡと接触させることを含む、細胞において１つ以上のＲＮＡを発現する方法を提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡは、細胞内でのＲＮＡの別個の発現レベルを提供するために等しくないモル量で存在する。一部の実施形態において、１つ以上のＲＮＡは、ＰＤ−１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。一部の実施形態において、１つ以上のＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを標的とする。
【０２３５】
（ｉ）非翻訳領域
[00412]  安定性及び／又は翻訳効率を促進する能力を備えた化学構造も使用され得る。ＲＮＡは、好ましくは、５’及び３’ＵＴＲを有する。以下の例は、４４塩基対の５’ＵＴＲをＰＣＲテンプレートに含めることで、６塩基対の５’ＵＴＲのみを含むＰＣＲテンプレートと比較して、転写されたＣＦＰ  ＲＮＡの翻訳効率が向上したことを示す。例は、１１３塩基対の３’ＵＴＲを付加することで、１１塩基対の３’ＵＴＲのみを含むＰＣＲテンプレートと比較して、転写されたＧＦＰ  ＲＮＡの翻訳効率が向上することも示す。一般に、３’ＵＴＲの長さは、１００ヌクレオチドを超えるため、１００ヌクレオチドより長い３’ＵＴＲが好ましい。一実施形態において、３’ＵＴＲ配列は、１００〜５０００ヌクレオチドである。５’ＵＴＲの長さは、３’ＵＴＲの長さほど重要ではなく、より短いことができる。一実施形態において、５’ＵＴＲは、０〜３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加される５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域にアニーリングするＰＣＲのためのプライマーの設計を含むが、これに限定されない異なる方法で変更することができる。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な５’及び３’ＵＴＲの長さを変更することができる。
【０２３６】
[00413]  ５’及び３’ＵＴＲは、天然に存在する、目的の遺伝子に対して内因性の５’及び３’ＵＴＲであり得る。代わりに、目的の遺伝子に対して内因性でないＵＴＲ配列は、ＵＴＲ配列をフォワード及びリバースプライマーに組み込むことにより又はテンプレートの他の変更により付加することができる。目的の遺伝子に対して内因性でないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を変更するのに有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列におけるＡＵが豊富な要素は、ｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られている。したがって、当技術分野で周知のＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を高めるように３’ＵＴＲを選択又は設計することができる。
【０２３７】
[00414]  一実施形態において、５’ＵＴＲは、内因性遺伝子のコザック配列を含有し得る。代わりに、目的の遺伝子に対して内因性でない５’ＵＴＲが上記のようにＰＣＲによって付加される場合、５’ＵＴＲ配列を付加することでコンセンサスコザック配列を再設計できる。コザック配列は、一部のＲＮＡ転写産物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのＲＮＡに必要であるとは限らないようである。多くのｍＲＮＡに対するコザック配列の要件は、当技術分野で公知である。他の実施形態において、５’ＵＴＲは、そのＲＮＡゲノムが細胞内で安定しているＲＮＡウイルスに由来し得る。他の実施形態において、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、３’又は５’ＵＴＲで様々なヌクレオチド類似体を使用することができる。
【０２３８】
（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼプロモーター
[00415]  遺伝子クローニングを必要とせずにＤＮＡテンプレートからＲＮＡを合成できるようにするには、転写される配列の上流のＤＮＡテンプレートに転写のプロモーターが付加されるべきである。バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、ＤＮＡライゲーションなどの異なる遺伝子工学的方法によってＳｔ  ＵＴＲに付加され得るか、又は標的ＤＮＡに実質的に相補的な配列のフォワードプライマー（５’）に付加され得る。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加されると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に組み込まれる。好ましい一実施形態において、プロモーターは、上記のように、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、Ｔ３及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。
【０２３９】
（ｉｉｉ）ポリ（Ａ）テール及び５’キャップ
[00416]  好ましい実施形態において、ｍＲＮＡは、５’末端のキャップと、細胞内のリボソーム結合、翻訳開始及び安定性ｍＲＮＡを決定する３’ポリ（Ａ）テールとの両方を有する。環状ＤＮＡテンプレート、例えばプラスミドＤＮＡでは、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で線状化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後にポリアデニル化されたとしても真核生物のトランスフェクションに効果的でない通常サイズのｍＲＮＡをもたらす。
【０２４０】
[00417]  直鎖状ＤＮＡテンプレートでは、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、テンプレートの最後の塩基を超えて転写産物の３’末端を伸長できる（Schenborn及びMierendorf, Nuc. Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva及びBerzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。これは、ランオフ転写産物が曲がり、続いて第２のＤＮＡ鎖とテンプレートが交換されるか、又はＲＮＡ自体が転写され（Triana-Alonso et al., J. Biol. Chem., 270:6298-307 (1995)；Dunn及びStudier, J. Mol. Biol., 166:477-535 (1983)；Arnaud-Barbe et al., Nuc. Acids Res., 26:3550-54 (1998)；Macdonald et al., 1993）、次いで逆方向の異常な転写及び二本鎖ＲＮＡの蓄積につながり得、これは、遺伝子発現を阻害し得る。ＤＮＡ線形化自体は、正しい転写に十分でない（Triana-Alonso et al., J. Biol. Chem., 270:6298-307 (1995)；Dunn及びStudier, J. Mol. Biol., 166:477-535 (1983)；Arnaud-Barbe et al., 1998 Nuc. Acids Res., 26:3550-54 (1998)；Macdonald et al., J. Mol. Biol., 232:1030-47 (1993)；Nakano et al., Biotechnol. Bioeng., 64:194-99 (1999), plasmid DNA linearized downstream of a poly (A/T) stretch of 64-100 nucleotides results in good templates (Saeboe-Larssen et al., J. Immunol. Meth., 259:191-203 (2002)；Boczkowski et al., Cancer Res., 60:1028-34 (2000)；Elango et al., Biochem Riophys Res Commun., 330:958-966 2005）。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの内因性終結シグナルは、ステムループ構造に折り畳まれ、続いてウリジン残基の追跡が行われ得る、ＲＮＡをコードする（Dunn及びStudier, J. Mol. Biol., 166:477-535 (1983)；Arnaud-Barbe et al., 1998 Nuc. Acids Res., 26:3550-54 (1998)）。ヘアピンなしでも、合成されたウリジンの追跡は、転写を減弱し得る（Kiyama及びOishi, Nuc. Acids Res., 24:4577-4583 (1996)。ポリ（Ａ／Ｔ）ストレッチの下流のプラスミドＤＮＡの線状化は、おそらく潜在的な異常な転写を防ぐ一種の「ダイナミック」ターミネーターを形成すると仮定された：ポリ（Ａ／Ｔ）ストレッチ上のＲＮＡ転写物の３’伸長及び逆方向の転写は、成長の終結のようなシグナル（伸長されたポリ（Ｕ）ストレッチ及びポリ（Ａ／Ｕ）ヘアピン）を生成する。その結果、ＧＦＰ遺伝子の３’アンカー配列及び５’１００塩基ストレッチのポリ（Ｔ）を使用してリバースＰＣＲプライマーが設計された（図３８）。
【０２４１】
[00418]  ＤＮＡテンプレートにポリＡ／Ｔストレッチを組み込む従来法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミドの不安定性を引き起こし得、そのため、細菌細胞から得られたプラスミドＤＮＡテンプレートは、多くの場合、欠失及び他の異常で重度に汚染されている。このため、クローニング手順は面倒で時間がかかるだけでなく、多くの場合、信頼できるものではない。そのため、クローニングせずにポリＡ／Ｔ  ３’ストレッチでＤＮＡテンプレートを構築できる方法が非常に望ましい。
【０２４２】
[00419]  転写ＤＮＡテンプレートのポリＡ／Ｔセグメントは、ＰＣＲ中、１００ＴテールなどのｐｏｌｙＴテール（サイズは、５０〜５０００Ｔであり得る）を含有するリバースプライマーを使用して、又はＰＣＲ後、ＤＮＡライゲーション若しくはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない他の任意の方法によって産生することができる。ポリ（Ａ）テールは、ＲＮＡに安定性も提供し、その分解を減少させる。一般に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正の相関がある。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１００〜５０００アデノシンである。以下の例は、１００塩基対のポリ（Ａ）のストレッチが、ＲＮＡ転写物の効率的な翻訳を可能にするのに十分であることを示す。
【０２４３】
[00420]  ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、大腸菌（E. coli）ポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）などのポリ（Ａ）ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後に更に伸長できる。以下の例は、ｐｏｌｙ（Ａ）テールの長さを１００ヌクレオチドから３００ヌクレオチドから４００ヌクレオチドに増加させると、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍になることを示す。更に、３’末端への異なる化学基の結合により、ｍＲＮＡの安定性が向上させることができる。そのような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰ類似体は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールに組み込むことができる。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性を更に高めることができる。適切なＡＴＰ類似体には、コルジオシピン及び８−アザアデノシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４４】
[00421]  ５’キャップは、ＲＮＡ分子に安定性を提供することもできる。好ましい実施形態において、本明細書に開示される方法によって産生されるＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは、例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ又はＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａキャップ類似体であり得、これらは、全て市販されている。５’キャップは、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）（Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)を参照されたい）又は任意の他の適切な類似体でもあり得る。５’キャップは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される技術を使用して提供される（Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)）。
【０２４５】
[00422]  本明細書に開示される方法によって産生されるＲＮＡは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、キャップに依存しないリボソームのｍＲＮＡへの結合を開始し、翻訳の開始を促進するウイルス、染色体又は人工的に設計された任意の配列である。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤及び界面活性剤などの細胞透過性及び生存率を促進する因子を含み得る、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質が含まれ得る。
【０２４６】
[00423]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭ／１０，０００ＴＩＬ又は約０．２５μＭ〜約４μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す���一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ媒体の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、���的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示
す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。
【０２４７】
ｃ．ｓｄ−ＲＮＡ修飾
[00424]  一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、治療剤の安定性及び／又は有効性を増加させ、処置される細胞又は組織へのオリゴヌクレオチドの効率的な送達をもたらすための１つ以上の修飾を含む。そのような修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾、２’−Ｏ−フルオロ修飾、ジホスホロチオエート修飾、２’Ｆ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾及び／又は２’デオキシヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、ステロール、コレステロール、ビタミンＤ、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン及び／又はフェニルを含む１つ以上の疎水性修飾を含むように修飾される。更なる特定の実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル、２’デオキシ、疎水性修飾及びホスホロチオエートの組み合わせである。一部の実施形態において、糖は、修飾され得、修飾された糖は、Ｄ−リボース、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチル及び２’−Ｏ−エチルを含む）、即ち２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロ（２’−フルオロを含む）、Ｔ−メトキシエトキシ、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル及びシアノなどを含み得るが、これらに限定されない。一実施形態において、糖部分は、ヘキソースであり得、記載されるようにオリゴヌクレオチドに組み込まれる（Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res., 18:4711 (1992)）。
【０２４８】
[00425]  一部の実施液体において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖である、即ち分子のいずれかの末端にオーバーハングする一本鎖配列を有しない、即ち平滑末端である。一部の実施形態において、個々の核酸分子は、異なる長さであり得る。換言すれば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖ではない。例えば、２つの別個の核酸分子が使用される場合、分子の１つ、例えばアンチセンス配列を含む第１の分子は、それにハイブリダイズする第２の分子より長いものであり得る（分子の一部が一本鎖のまま残る）。一部の実施形態において、単一の核酸分子が使用される場合、いずれかの末端の分子の一部は、一本鎖のままであり得る。
【０２４９】
[00426]  一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスマッチ及び／又はループ又はバルジを含有するが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたって二本鎖である。別の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０〜９５％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９６〜９８％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも又は最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のミスマッチを含有する。
【０２５０】
[00427]  一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、３’又は５’結合を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護され得る（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号及び国際公開第９８／１３５２６号）。例えば、オリゴヌクレオチドは、「ブロッキング基」を含めることによって耐性とすることができる。本明細書で使用される「ブロッキング基」という用語は、合成のための保護基又はカップリング基のいずれかとして、オリゴヌクレオチド又はヌクレオモノマーに結合することができる置換基（例えば、ＯＨ基以外）を指す（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）、グリコール（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）リン酸（ＰＯ３２＋）、ホスホン酸水素又はホスホルアミダイト）。「ブロッキング基」は、修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造を含む、オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端を保護する「末端ブロッキング基」又は「エキソヌクレアーゼブロッキング基」も含み得る。
【０２５１】
[00428]  一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡ内の隣接するポリヌクレオチドの少なくとも一部は、置換結合、例えばホスホロチオエート結合によって結合される。
【０２５２】
[00429]  一部の実施形態において、化学修飾は、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００の細胞取り込みの強化を導く。一部の実施形態において、Ｃ又はＵ残基の少なくとも１つは、疎水性修飾を含む。一部の実施形態において、複数のＣ及びＵが疎水性修飾を含む。一部の実施形態において、Ｃ及びＵの少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は少なくとも９５％が疎水性修飾を含み得る。一部の実施形態において、Ｃ及びＵの全てが疎水性修飾を含む。
【０２５３】
[00430]  一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡ又はｓｄ−ｒｘＲＮＡは、プロトン化可能なアミンの組み込みにより、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子のエンドソーム放出の増強を示す。一部の実施形態において、プロトン化可能なアミンは、センス鎖に組み込まれる（ＲＩＳＣ充填後に廃棄される分子の部分において）。一部の実施形態において、本発明のｓｄ−ＲＮＡ化合物は、二重鎖領域（長さが１０〜１５塩基の効率的なＲＩＳＣエントリーに必要）及び４〜１２ヌクレオチド長の一本鎖領域と、１３ヌクレオチドの二重鎖とを含む非対称化合物を含む。一部の実施形態において、６ヌクレオチドの一本鎖領域が使用される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡの一本鎖領域は、２〜１２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート修飾と称される）を含む。一部の実施形態において、６〜８個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合が使用される。一部の実施形態において、本発明のｓｄ−ＲＮＡ化合物は、ユニークな化学修飾パターンも含み、これは、安定性を提供し、ＲＩＳＣエントリーと適合性である。
【０２５４】
[00431]  例えば、ガイド鎖は、ＲＩＳＣエントリーに干渉することなく安定性を確認する任意の化学修飾によっても修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖における化学修飾パターンは、２’Ｆ修飾されているＣ及びＵヌクレオチドの大部分と、リン酸化されている５’末端とを含む。
【０２５５】
[00432]  一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡ又はｓｄ−ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％が修飾されている。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡ又はｓｄ−ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が修飾されている。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡ又はｓｄ−ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの１００％が修飾されている。
【０２５６】
[00433]  一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡ分子は、最小の二本鎖領域を有する。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、８〜１５ヌクレオチド長の範囲である。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、二本鎖領域は、１３ヌクレオチド長である。ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に１００％の相補性があり得、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に１つ以上のミスマッチがあり得る。一部の実施形態において、二本鎖分子の１つの末端において、分子は、平滑末端であるか、又は１ヌクレオチドのオーバーハングを有する。分子の一本鎖領域は、一部の実施形態において、４〜１２ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、一本鎖領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、一本鎖領域は、４ヌクレオチド長未満又は１２ヌクレオチド長超でもあり得る。特定の実施形態において、一本鎖領域は、６又は７ヌクレオチド長である。
【０２５７】
[00434]  一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡ分子は、増加した安定性を有する。一部の場合、化学修飾されたｓｄ−ＲＮＡ又はｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は、任意の中間値を含む、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間又は２４時間を超える培地中での半減期を有する。一部の実施形態において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、１２時間より長い培地中での半減期を有する。
【０２５８】
[00435]  一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、効力の増加及び／又は毒性の低下のために最適化される。一部の実施形態において、ガイド及び／又はパッセンジャー鎖のヌクレオチド長及び／又はガイド及び／又はパッセンジャー鎖におけるホスホロチオエート修飾の数は、一部の態様において、ＲＮＡ分子の効力に影響を与えることができる一方、２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾の２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾による置換は、一部の態様において、分子の毒性に影響を与えることができる。一部の実施形態において、分子の２’Ｆ含有量の低減は、分子の毒性を低減すると予測される。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子におけるホスホロチオエート修飾の数は、細胞への分子の取り込み、例えば細胞への分子の受動的取り込みの効率に影響を及ぼし得る。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは２’Ｆ修飾を有しないが、細胞取り込み及び組織浸透において同等の効力を特徴とする。
【０２５９】
[00436]  一部の実施形態において、ガイド鎖は、長さがおよそ１８〜１９ヌクレオチドであり、およそ２〜１４個のリン酸修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、リン酸修飾された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１４を超えるヌクレオチドを含み得る。ガイド鎖は、ＲＩＳＣエントリーに干渉することなく安定性の向上を付与する１つ以上の修飾を含み得る。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドなどのリン酸修飾ヌクレオチドは、３’末端、５’末端にあるか、又はガイド鎖全体に広がっている。一部の実施形態において、ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含む。ガイド鎖は、２’Ｆ及び／又は２’ＯＭｅ修飾も含むことができ、これは、分子全体に位置し得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の１位のヌクレオチド（ガイド鎖の最も５’位のヌクレオチド）は、２’ＯＭｅ修飾及び／又はリン酸化されている。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾され得る。例えば、１９ｎｔガイド鎖の２〜１０位（又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾され得る。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドも２’ＯＭｅ修飾することができる。例えば、１９ｎｔガイド鎖の１１〜１８位（又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の最も３’末端のヌクレオチドは、修飾されていない。特定の実施形態において、ガイド鎖内のＣ及びＵの大部分は、２’Ｆ修飾されており、ガイド鎖の５’末端は、リン酸化されている。他の実施形態において、１位及び１１〜１８位のＣ又はＵは、２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端は、リン酸化されている。他の実施形態において、１位及び１１〜１８位のＣ又はＵは、２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端は、リン酸化されており、２〜１０位のＣ又はＵ、は２’Ｆ修飾されている。
【０２６０】
ｄ．ｓｄ−ＲＮＡの送達
[00437]  自己送達可能なＲＮＡｉ技術は、追加の製剤又は技術を必要とすることなく、ＲＮＡｉ剤で細胞を直接トランスフェクションする方法を提供する。トランスフェクションが困難な細胞株をトランスフェクトする能力、高いインビボ活性及び使用の単純さは、従来のｓｉＲＮＡベースの手法に比べて有意な機能的利点を提供する組成物及び方法の特徴であり、したがって、ｓｄ−ＲＮＡ法は、本発明のＴＩＬにおける標的遺伝子の発現を低減する方法に関するいくつかの実施形態において使用される。ｓｄ−ＲＮＡｉ法により、化学合成された化合物をエクスビボ及びインビボの両方で広範な初代細胞及び組織に直接送達することが可能となる。本明細書の本発明の一部の実施形態に記載されているｓｄ−ＲＮＡは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。
【０２６１】
[00438]  ｓｄ−ＲＮＡの一般的な構造は、図３６に示される。ｓｄ−ＲＮＡは、疎水的に修飾されたｓｉＲＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド構造として形成され、例えば全体として参照により本明細書に組み込まれるByrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10):855-864に開示される。
【０２６２】
[00439]  一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、無菌エレクトロポレーションを使用して、本明細書に記載されるＴＩＬに送達することができる。
【０２６３】
[00440]  一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、膜貫通送達システムと組み合わせて細胞に送達することができる。一部の実施形態において、この膜貫通送達システムは、脂質、ウイルスベクターなどを含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、いかなる送達剤も必要としない自己送達ＲＮＡｉ剤である。
【０２６４】
[00441]  実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡ又はｓｄ−ＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドは、異なる方法、例えばエレクトロポレーション（Amaxa Nucleofector-II （Amaxa Biosystems、Cologne、ドイツ）、（ECM 830（BTX）（Harvard Instruments、Boston、MA）、Neon（商標）トランスフェクションシステム（ThermoFisher Scientific、Waltham、MAから市販）及び／又はGene Pulser II（BioRad、Denver、CO）、Multiporator（Eppendort、Hamburg、ドイツ）、リポフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクションを使用したカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション又は「遺伝子銃」などの微粒子銃粒子送達システム（例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれるNishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照されたい）を含むが、これらに限定されない市販の方法を使用して標的細胞に導入することができる。米国特許第８，８５９，２２９号、米国特許出願公開第２０１６／０２３０１８８号及びAmaxa Nucleofector（登録商標）ＩＩマニュアル（ウェブサイトhttp://icob.sinica.edu.tw/pubweb/bio-chem/Core%20Facilities/Data/R401-core/Nucleofector_Manual_II_Apr06.pdfで入手可能）も参照されたい。
【０２６５】
[00442]  一部の実施形態において、エレクトロポレーションは、製造業者の推奨に従い、Amaxa NUCLEOFECTOR（商標）−ＩＩを使用して実施することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、NUCLEOFECTOR（商標）−ＩＩ溶液Ｖ及びエレクトロポレーションのための推奨される形態のセットを使用してトランスフェクトすることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、溶液Ｖ、Ｔ及びＲ並びにエレクトロポレーションの異なる形態を使用してトランスフェクトすることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、Ｔ細胞NUCLEOFECTOR（商標）−ＩＩ溶液及びエレクトロポレーションの異なる形態を使用してトランスフェクトすることができる。核酸送達の代替方法も、本明細書に記載の使用されるオリゴヌクレオチドをトランスフェクトするために利用することができる：カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションは、LIPOFECTIN又はLIPOFECTAMIN（Invitrogen）を使用して実施された。エレクトロポレーションは、ECM 830（BTX）（Harvard Instruments、Boston、MA）、Gene Pulser II（BioRad、Denver、CO）、Multiporator（Eppendorf、Hamburg、ドイツ）及び／又はNeon（商標）トランスフェクションシステム（ThermoFisher Scientific、Waltham、MAから市販）でも実施される。一部の実施形態において、pmaxGFPプラスミドＤＮＡ（Amaxa Biosystems）をＤＮＡ対照として利用することができる。いくつかの実施形態では、トランスフェクション効率（ＥＴ）は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるトランスフェクションの約３、６、９、１２、１５及び／又は１８時間後に決定することができる。一部の実験では、ＧＦＰコントロールでＧＦＰがもはや検出できなくなるまでトランスフェクタントを１２時間〜２４時間毎に更に分析できる。一部の実施形態では、細胞生存率は、トリパンブルー染色排除により決定することができる。
【０２６６】
[00443]  オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド組成物は、本明細書に記載のＴＩＬと接触し（例えば、接触させ、本明細書では投与又は送達とも称される）、ＴＩＬにより取り込まれる（ＴＩＬによる受動的取り込みを含む）。ｓｄ−ＲＮＡは、第１の拡大培養中、例えばステップＢ、第１の拡大培養後、例えばステップＣ中、第２の拡大培養前又はその間、例えばステップＤ前又はその間、ステップＤ後且つステップＥにおける回収前、ステップＦの回収中又はその後、ステップＦの最終的な製剤化及び／又は輸注バッグへの移動前又はその間及びステップＦのいずれかの任意選択による凍結保存ステップ前に、本明細書に記載されるようにＴＩＬに添加することができる。更に、ｓｄ−ＲＮＡは、ステップＦの任意の凍結保存ステップから解凍した後に添加することができる。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、１００ｎＭ〜２０ｍＭ、２００ｎＭ〜１０ｍＭ、５００ｎｍ〜１ｍＭ、１μＭ〜１００μＭ、１μＭ〜１００μＭからなる群から選択される濃度において、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地からなる群から選択される量において、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、プレＲＥＰ又はＲＥＰ段階中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬからなる群から選択される量において、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、���ＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、第１、第２及び／又は追加の拡大培養段階中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る。
【０２６７】
[00444]  ｓｄ−ＲＮＡを含む本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、例えば、細胞培養培地中に高濃度でｓｄ−ＲＮＡを溶解し、受動的取り込みが発生するのに十分な時間を与えることにより、拡大培養プロセス中に本明細書に記載されるようにＴＩＬと接触させることができる。一部の実施形態において、高濃度は、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬを含む。一部の実施形態において、高濃度は、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬを含む。一部の実施形態において、高濃度は、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は最大１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬを含む。
【０２６８】
[00445]  一部の実施形態において、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達は、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ、グリセロール若しくはデキストラン、エレクトロポレーションを含む、当技術分野で認められた適切な方法により、又は例えばカチオン性、アニオン性若しくは中性脂質組成物若しくはリポソームを使用するトランスフェクションにより、当技術分野で公知の方法を使用して増強され得る（例えば、国際公開第９０／１４０７４号；国際公開第９１／１６０２４号；国際公開第９１／１７４２４号；米国特許第４，８９７，３５５号；Bergan et a 1993. Nucleic Acids Research. 21:3567）。
【０２６９】
ｅ．ｓｄ−ＲＮＡの組み合わせ
[00446]  一部の実施形態において、標的遺伝子の発現を低減するために２つ以上のｓｄ−ＲＮＡが使用される。一部の実施形態において、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨを標的とするｓｄ−ＲＮＡの１つ以上が一緒に使用される。一部の実施形態において、ＰＤ−１  ｓｄ−ＲＮＡは、２つ以上の遺伝子標的の発現を低減するためにＴＩＭ−３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨの１つ以上と共に使用される。一部の実施形態において、ＬＡＧ３  ｓｄ−ＲＮＡは、ＣＩＳＨ標的とするｓｄ−ＲＮＡと組み合わせて使用されて、両方の標的の遺伝子発現を低減する。一部の実施形態において、本明細書のＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨの１つ以上を標的とするｓｄ−ＲＮＡは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。一部の実施形態において、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨの１つ以上を標的とするｓｄ−ＲＮＡは、図３６又は図３７に示される構造を有する。
【０２７０】
[00447]  一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とし、別のｓｄ−ＲＮＡは、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１と、ＬＡＧ−３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子のいずれか１つとを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とし、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とし、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とし、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とし、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄ−ＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とする。
【０２７１】
ｆ．共刺激受容体又は接着分子の過剰発現
[00448]  追加の実施形態によると、ＴＩＬ拡大培養方法中のＴＩＬのタンパク質発現の変化は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を治療用ＴＩＬ集団の少なくとも一部において増強することも可能にすることができる。例えば、タンパク質発現を変化させると、刺激受容体の発現が増強され得、これは、遺伝子改変されていない刺激受容体の発現と比較して、それが過剰発現されることを意味する。本発明のＴＩＬにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることにより発現の増強を示し得る免疫チェックポイント遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＮＯＴＣＨ  １／２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）及び／又はＮＯＴＣＨリガンドｍＤＬＬ１などの特定のケモカイン受容体及びインターロイキンが含まれる。
【０２７２】
（ｉ）ＣＣＲ及びＣＣＬ
[00449]  養子Ｔ細胞免疫療法を有効にするには、Ｔ細胞をケモカインによって腫瘍に適切に輸送する必要がある。腫瘍細胞によって分泌されるケモカイン、末梢に存在するケモカイン及びＴ細胞によって発現されるケモカイン受容体間の一致は、Ｔ細胞の腫瘍床への輸送の成功に重要である。
【０２７３】
[00450]  特定の実施形態によれば、本発明のタンパク質発現方法の変更は、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３及び／又はＣＸ３ＣＲ１の１つ以上などのＴＩＬにおける特定のケモカイン受容体の発現を増加させるために使用され得る。ＣＣＲの過剰発現は、養子移入後のエフェクター機能及びＴＩＬの増殖を促進するのに役立つ。一部の実施形態において、本発明のタンパク質発現方法の変更は、ＴＩＬ中のＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２及び／又はＣＣＬ１７の発現の増加に使用され得る。
【０２７４】
[00451]  特定の実施形態によれば、ＴＩＬにおけるＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３及び／又はＣＸ３ＣＲ１の１つ以上の発現は、本発明の組成物及び方法に従って増強される。例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養するための方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、プロセス２Ａ又は図２０及び２１に示される方法）に従って実施され得、ここで、方法は、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３及び／又はＣＸ３ＣＲ１の１つ以上の発現を増強させることによってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することを含む。以下でより詳細に説明されるように、遺伝子編集プロセスは、ケモカイン受容体遺伝子における二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能なヌクレアーゼの使用を含み得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法又はジンクフィンガー法は、ＴＩＬにおける特定のケモカイン受容体の発現を増強するために使用され得る。
【０２７５】
[00452]  一実施形態において、ＣＣＲ４及び／又はＣＣＲ５接着分子は、本明細書に記載のガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法を使用してＴＩＬ集団に挿入される。一実施形態において、ＣＸＣＲ２接着分子は、Forget, et al., Frontiers Immunology 2017, 8, 908又はPeng, et al., Clin. Cancer Res. 2010, 16, 5458に記載のガンマレトロウイルス又はレンチウイルス方法を使用してＴＩＬ集団に挿入され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７６】
[00453]  一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ｉ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得るステップ；
（ｉｉ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも１００倍多く、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、生じさせること；及び
（ｉｖ）第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供し、発現の変化は、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８及び／又はＣＣＬ２２の１つ以上の発現の増加である、曝露すること
を含む。
【０２７７】
（ｉｉ）インターロイキン及びその他
[00454]  追加の実施形態によれば、本発明の遺伝子編集方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の１つ以上などの特定のインターロイキン並びにＮＯＴＣＨ  １／２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の発現を増加させるために使用され得る。特定のインターロイキンは、Ｔ細胞のエフェクター機能を増強し、腫瘍制御を媒介することが示されている。
【０２７８】
[00455]  特定の実施形態によれば、ＴＩＬにおけるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の１つ以上などの特定のインターロイキン並びにＮＯＴＣＨ  １／２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の発現は、本発明の組成物及び方法に従って増強される。一部の実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法も提供し、この方法は、
（ｉ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得るステップ；
（ｉｉ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも１００倍多く、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、生じさせること；及び
（ｉｖ）第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に曝露することであって、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供し、発現の変化は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１並びにＮＯＴＣＨ  １／２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の１つ以上の発現の増加である、曝露すること
を含む。
【０２７９】
ＩＶ．ＴＩＬの製造方法
[00456]  これらの特徴のいくつかを含むプロセス２Ａとして知られるＴＩＬプロセスの例を図１に示し、プロセス１Ｃに対する本発明の本実施形態の利点のいくつかを図１３及び１４と同様に図２に示す。プロセス１Ｃを図３に比較のために示す。プロセス２Ａに基づくＴＩＬ治療の２つの代替タイムラインを図４（細胞数が多い）及び図５（細胞数が少ない）に示す。プロセス２Ａの実施形態を図６並びに図８に示す。図１３及び図１４は、例示的なプロセス１Ｃと比較した例示的なプロセス２Ａを更に提供する。
【０２８０】
[00457]  本明細書において考察される通り、本発明は、患者への移植前に凍結保存ＴＩＬを再刺激することによりその代謝活性、従って相対的健康を増加させること及び代謝的健康の試験方法に関するステップを含み得る。一般的に本明細書に概説される通り、ＴＩＬは、一般的に、患者サンプルから採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、任意選択により、以下に考察する通り、遺伝的に操作され得る。
【０２８１】
[00458]  一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存され得る。解凍後、ＴＩＬは、患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激され得る。
【０２８２】
[00459]  一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の拡大培養（プレＲＥＰと称されるプロセス及び図８にステップＡとして示されるプロセスを含む）は、３〜１４日に短縮され、第２の拡大培養（ＲＥＰと称されるプロセス及び図８にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、例で考察され、図４、５、６及び７に示す通り、第１の拡大培養（例えば、図８のステップＢとして記載される拡拡大培養）は、１１日間に短縮され、第２の拡大培養（例えば、図８のステップＤに記載される拡大培養）は、１１日間に短縮される。一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察するように、第１の拡大培養及び第２の拡大培養（例えば、図８のステップＢ及びステップＤとして記載される拡大培養）の組み合わせは、２２日間に短縮される。
【０２８３】
[00460]  以下の「ステップ」の名称Ａ、Ｂ、Ｃ等は、図８を参照し、本明細書に記載の特定の実施形態を参照している。以下及び図８におけるステップの順序は、例示であり、ステップの任意の組み合わせ又は順序並びに追加のステップ、ステップの繰り返し及び／又はステップの省略は、本出願及び本明細書に開示される方法によって企図される。
【０２８４】
Ａ．ステップＡ：患者の腫瘍サンプルを入手
[00461]  一般に、ＴＩＬは、最初に患者腫瘍サンプルから得られ（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためにより大きい集団に拡大培養され、任意選択により凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、且つ任意選択によりＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
【０２８５】
[00462]  患者腫瘍サンプルは、当技術分野において公知の方法を用いて、概して外科的切除又は針生検など、腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含むサンプルを得るための手段によって入手され得る。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からのものであり得る。腫瘍サンプルは、血液悪性腫瘍から得られた腫瘍など、液性腫瘍でもあり得る。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌（限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む）を含めた任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴って悪性黒色腫腫瘍から得られる。
【０２８６】
[00463]  「固形腫瘍」という用語は、嚢胞又は液体領域を通常含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、新生物性又は癌性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌としては、限定はされないが、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌及び膀胱癌など、肉腫、癌腫及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、癌は、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、膠芽腫、卵巣癌、肉腫、膵癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、柔組織（癌細胞）を含む相互依存的組織コンパートメント及び癌細胞が分散し支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含む。
【０２８７】
[00464]  「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織を含むが、これらに限定されない哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」とも称される。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
【０２８８】
[00465]  入手後、腫瘍サンプルは、一般的に鋭的な切離を用いて１〜約８ｍｍ３の小片に断片化され、約２〜３ｍｍ３が特に有用である。ＴＩＬは、酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。そのような腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Roswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）1640緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて機械的分離（例えば、組織分離剤を使用）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約１分間機械的に分離した後、続いて５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片のみが存在するまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。このプロセスの終わりに細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号に記載されているものなど、当技術分野で公知の代替的方法を使用し得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、ＴＩＬを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
【０２８９】
[00466]  一般に、回収された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に回収された」細胞集団と呼ばれる。
【０２９０】
[00467]  一部の実施形態において、断片化は、例えば、切離及び消化を含めた物理的断片化を含む。一部の実施形態において、断片化は、物理的断片化である。一部の実施形態において、断片化は、切離である。一部の実施形態において、断片化は、消化による。一部の実施形態において、ＴＩＬは、初めに、患者から得られた酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。一実施形態において、ＴＩＬは、初めに、患者から得られた酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
【０２９１】
[00468]  一部の実施形態において、腫瘍が固形腫瘍である場合、例えばステップＡ（図８に提供される）における腫瘍サンプルの入手後、腫瘍は、物理的断片化を受ける。一部の実施形態において、断片化は、凍結保存前に行われる。一部の実施形態において、断片化は、凍結保存後に行われる。一部の実施形態において、断片化は、腫瘍の入手後、いかなる凍結保存もなしに行われる。一部の実施形態において、腫瘍は、断片化され、第１の拡大培養のための各容器に１０、２０、３０、４０個又はそれを超える数の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は、断片化され、第１の拡大培養のための各容器に３０又は４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、腫瘍は、断片化され、第１の拡大培養のための各容器に４０個の断片又は小片が置かれる。一部の実施形態において、複数の断片は、約４〜約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ３の容積を有する。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３００ｍｍ３〜約１５００ｍｍ３の総容積を有する約３０〜約６０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１３５０ｍｍ３の総容積を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約１グラム〜約１．５グラムの総質量を有する約５０個の断片を含む。一部の実施形態において、複数の断片は、約４個の断片を含む。
【０２９２】
[00469]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、腫瘍断片から得られる。一部の実施形態において、腫瘍断片は、鋭的な切離によって得られる。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１ｍｍ３〜８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約２ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約３ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約４ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約６ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約７ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約９ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍は、１〜４ｍｍ×１〜４ｍｍ×１〜４ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は、１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は、３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍである。一部の実施形態において、腫瘍は、４ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍである。
【０２９３】
[00470]  一部の実施形態において、各断片上の出血、壊死及び／又は脂肪組織の量を最小限にするために腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の出血組織の量を最小限にするために腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の壊死組織の量を最小限にするために腫瘍が切除される。一部の実施形態において、各断片上の脂肪組織の量を最小限にするために腫瘍が切除される。
【０２９４】
[00471]  一部の実施形態において、腫瘍の内部構造を維持するために腫瘍の断片化が実施される。一部の実施形態において、腫瘍の断片化は、メスでの鋸引き運動を実施することなく実施される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、腫瘍消化物から得られる。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば、限定はされないが、ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ  GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ  ＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的解離（GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA）によって作成した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍を約１分間機械的に分離し得る。次に溶液を５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再び約１分間機械的に破壊し得る。再び５％ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目に約１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％ＣＯ２下３７℃での更に３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
【０２９５】
[00472]  一部の実施形態において、第１の拡大培養ステップ前の回収された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に回収された」細胞集団と呼ばれる。
【０２９６】
[00473]  一部の実施形態において、細胞は、以下に更に詳細に記載し、図８に例示する、ステップＢに記載の拡大培養に進む前に、任意選択によりサンプル回収後に凍結され、凍結貯蔵され得る。
【０２９７】
Ｂ．ステップＢ：第１の拡大培養
[00474]  一部の実施形態において、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクルを増加させることができる幼若ＴＩＬを得ることを提供し、従って成熟ＴＩＬ（即ち被験者／患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたＴＩＬ）を超える追加の治療上の利点を提供し得る。幼若ＴＩＬの特徴が、文献に記載されている。例えば、Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)；Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)、Huang et al., J Immunother, 28（3）:258-267 (2005)、Besser et al., Clin Cancer Res, 19（17）:OF1-OF9 (2013)、Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)、Robbins, et al., J Immunol 2004；173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらは、全て全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９８】
[00475]  Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）及びＣ（定数）の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、本方法によって得られたＴＩＬは、新たに回収されたＴＩＬ及び／又は例えば図８に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、図１３に例示されているように、本方法によって得られたＴＩＬは、新たに回収されたＴＩＬ及び／又はプロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第１の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、α、β、γ及びδ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α及び／又はβの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）βの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ちＴＣＲα／β）の発現が増加する。
【０２９９】
[00476]  腫瘍断片の解剖又は消化（例えば、図８のステップＡに記載されるように）後、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ−２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して３〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、７〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１０〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約１１日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。
【０３００】
[00477]  好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、初期バルクＴＩＬ拡大培養ステップ（例えば、プレＲＥＰと称されるプロセスを含み得る図８のステップＢで説明したものなど）、その後の、以下ステップＤの下及び本明細書に記載されているように、第２の拡大培養（ステップＤ、急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、その後の、任意選択による凍結保存及びその後の第２ステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用してＴＩＬの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって得られたＴＩＬは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。
【０３０１】
[00478]  実施形態において、ＴＩＬ培養が２４ウェルプレートで例えばCostar２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始される場合、各ウェルには、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp.、Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の腫瘍消化物細胞又は１個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。
【０３０２】
[00479]  一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ１６４０からなる。培養が４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態において（図１）、各フラスコに１０〜４０ｍＬのＩＬ−２含有ＣＭ中の１０〜４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５〜３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ−２を補充し、５日目以降には２〜３日毎に培地の半分を交換した。
【０３０３】
[00480]  腫瘍断片の調製後、得られた細胞（即ち断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ−２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と共に含む培地中で（又はある場合には本明細書に概説される通りａＡＰＣ細胞集団の存在下で）インキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、概して１０〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、概して約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、第１の拡大培養中の成長培地は、ＩＬ−２又はその変異体を含む。一部の実施形態において、ＩＬは、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）である。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は、１ｍｇバイアルについて２０〜３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は、１ｍｇバイアルについて２０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は、１ｍｇバイアルについて２５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は、１ｍｇバイアルについて３０×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は、４〜８×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は、５〜７×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は、６×１０６ＩＵ／ｍｇのＩＬ−２の最終濃度を有する。一部の実施形態において、ＩＬ−２ストック溶液は、実施例４に記載される通り調製される。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２又は約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２〜約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２〜約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２〜約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ−２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ−２を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０��０ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
【０３０４】
[00481]  一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ−１５を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。
【０３０５】
[00482]  一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ−２１を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。
【０３０６】
[00483]  一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ−３抗体を含まない。
【０３０７】
[00484]  一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４−１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４−１ＢＢアゴニストであり、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ−１０１、融合タンパク質並びにそれらの断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
【０３０８】
[00485]  一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を更に含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０３０９】
[00486]  一部の実施形態において、第１の拡大培養培地は、培養培地の略称である「ＣＭ」と称される。一部の実施形態において、これはＣＭ１（培養培地１）と称される。一部の実施形態において、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ１６４０からなる。培養が４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN）内で開始される実施形態において（図１）、各フラスコに１０〜４０ｍＬのＩＬ−２含有ＣＭ中の１０〜４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５〜３０個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ−２を補充し、５日目以降には２〜３日毎に培地の半分を交換した。一部の実施形態において、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１であり、実施例５を参照されたい。一部の実施形態において、第１の拡大培養は、初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地中で行われる。一部の実施形態において、初期細胞培養培地又は第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む。
【０３１０】
[00487]  一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもあるものを含み得る、図８のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは、３〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、例えば図４及び５並びに例えば図８のステップＢに記載されている実施例を含む実施例で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称されることもある図８のステップＢに記載されるプロセスなどを含み得る）プロセスは、７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は、１０〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５並びに例えば図８のステップＢに記載されている拡大培養を含む第１の拡大培養は、１１日間に短縮される。
【０３１１】
[00488]  一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、１日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、２日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、３日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、４日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、５日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、６日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、７日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、８日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、９日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、１０日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、１１日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、１２日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、１３日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、１日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、２日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、３日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、４日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、５日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、６日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、７日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、８日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、９日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、１０日〜１１日間続行され得る。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は、１１日間続行され得る。
【０３１２】
[00489]  一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１の組み合わせは、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図８による並びに本明細書に記載されている通り、ステップＢプロセス中を含む第１の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の組み合わせが、第１の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１並びにそれらの任意選択の組み合わせは、例えば、図８による及び本明細書に記載されている通りステップＢプロセス中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１は、１日目に添加される。一部の実施形態において、コア生検が膵臓腫瘍からのもの（例えば、膵臓起源のもの）である場合、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１は、１日目に添加される。一部の実施形態において、ＩＬ−１５は含まれない。一部の実施形態において、ＩＬ−２１は含まれない。一部の実施形態において、ＩＬ−１５もＩＬ−２１も含まれない。
【０３１３】
[00490]  一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（例えば、プレＲＥＰと称される図８のステップＢに記載されるプロセスなどを含む）プロセスは、３〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は、７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４、５、６及び７に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は、１０〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４、５、６及び７に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は、１１日間に短縮される。
【０３１４】
[00491]  一部の実施形態において、第１の拡大培養、例えば図８によるステップＢは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
【０３１５】
[00492]  一部の実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地からなる群から選択される量において、第１の拡大培養、例えば図８のステップＢ中、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一部の実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、第１の拡大培養、例えば図８のステップＢ中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬからなる群から選択される量において、第１の拡大培養、例えば図８のステップＢ中、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、第１の拡大培養、例えば図８のステップＢ中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る。
【０３１６】
Ｃ．ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行
[00493]  ある場合には、例えば図８に示されるように、例えばステップＢから得られるＴＩＬ集団を含む、第１の拡大培養から得られるバルクＴＩＬ集団は、以下本明細書で考察されるプロトコルを使用して直ちに凍結保存され得る。代わりに、第２のＴＩＬ集団と称される第１の拡大培養から得られたＴＩＬ集団は、第２の拡大培養（ＲＥＰと呼ばれることがある拡大培養を含み得る）に供し、その後、以下で考察するように凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが治療に使用される場合、第１のＴＩＬ集団（バルクＴＩＬ集団と称されることもある）又は第２のＴＩＬ集団（一部の実施形態において、ＲＥＰ  ＴＩＬ集団と称される集団を含み得る）は、拡大培養前又は第１の拡大培養後で第２の拡大培養前に適切な処置のために遺伝子修飾に供することができる。
【０３１７】
[00494]  一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図８に示される通りのステップＢから）得られたＴＩＬは、選択のためのフェノタイピングまで貯蔵される。一部の実施形態において、第１の拡大培養から（例えば、図８に示される通りのステップＢから）得られたＴＩＬは、貯蔵されず第２の拡大培養に直接進む。一部の実施形態において、第１の拡大培養から得られたＴＩＬは、第１の拡大培養後、第２の拡大培養前に凍結保存されない。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約３日〜１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約４日〜１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約４日〜１０日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約７日〜１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから約１４日の時点で行われる。
【０３１８】
[00495]  一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日の時点で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１のＴＩＬ拡大培養は２日〜１４日間続行され得る。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから３日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから４日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから５日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから６日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから７日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから８日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから９日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１０日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１１日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１２日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１３日〜１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１４日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから２日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから３日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから４日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから５日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから６日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから７日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから８日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから９日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１０日〜１１日で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、断片化が行われたときから１１日で行われる。
【０３１９】
[00496]  一部の実施形態において、ＴＩＬは第１の拡大培養後、第２の拡大培養前に貯蔵されず、ＴＩＬは第２の拡大培養に直接進む（例えば、一部の実施形態において、図８に示すように、ステップＢからステップＤへの移行中に貯蔵は行われない）。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、移行は閉鎖系で行われる。一部の実施形態において、第１の拡大培養からのＴＩＬは、第２のＴＩＬ集団からのＴＩＬであり、移行期間を伴わず第２の拡大培養に直接進む。
【０３２０】
[00497]  一部の実施形態において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行は、例えば、図８によるステップＣは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
【０３２１】
[00498]  一部の実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地からなる群から選択される量において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行、例えば図８のステップＣ中、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一部の実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行、例えば図８のステップＣ中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬからなる群から選択される量において、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行、例えば図８のステップＣ中、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行、例えば図８のステップＣ中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る。
【０３２２】
１．サイトカイン
[00499]  本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ−２を含む培養培地を使用する。
【０３２３】
[00500]  代わりに、ＴＩＬの急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（参照により全体として明示的に本明細書に組み込まれる）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ−２とＩＬ−１５、ＩＬ−２とＩＬ−２１、ＩＬ−１５とＩＬ−２１とＩＬ−２、ＩＬ−１５とＩＬ−２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
【０３２４】
Ｄ．ステップＤ：第２の拡大培養
[00501]  一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は、例えば、図８に記載の通り、ステップＡ及びステップＢ並びにステップＣと称される移行後、回収及び初期バルク処理後、数が増加する。この更なる増加は、本明細書では第２の拡大培養と称され、これは、当技術分野で一般に急速拡大培養法と称される拡大培養プロセス（ＲＥＰ並びに図８のステップＤに示されるプロセス）を含み得る。第２の拡大培養は、概して、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗ＣＤ３抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。
【０３２５】
[00502]  一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養又は第２のＴＩＬ拡大培養（これは、ＲＥＰと称されることもある拡大培養；並びに図８のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に公知の任意のＴＩＬフラスコ又は容器を使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、約７日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、約８日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、約９日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、約１０日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、約１１日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、約１２日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、約１３日〜約１４日間続行し得る。一部の実施形態において、第２のＴＩＬ拡大培養は、約１４日間続行し得る。
【０３２６】
[00503]  一実施形態において、第２の拡大培養は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと称される膨張並びに図８のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）又はＵＨＣＴ−１（BioLegend、San Diego, CA, USAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択により３００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２又はＩＬ−１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下において、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチド、例えば０．３μΜ  ＭＡＲＴ−１：２６−３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ  ００：２０９−２１７（２１０Ｍ）など、任意選択によりベクターから発現させることができる、１つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１つ以上の抗原を、第２の拡大培養中に誘導することにより、インビトロでのＴＩＬの更なる刺激を誘発するように拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＳＳＸ−２及びＶＥＧＦＲ２又はその抗原性部分を挙げることができる。ＴＩＬは、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、ＴＩＬは、例えば、照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ−２によって更に再刺激することができる。一部の実施形態において、再刺激は、第２の拡大培養の一部として生じる。一部の実施形態において、照射された自己リンパ球の存在下において、又は照射されたＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ−２と共に第２の拡大培養が発生する。
【０３２７】
[00504]  一実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ−２を更に含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
【０３２８】
[00505]  一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ−３抗体を含まない。
【０３２９】
[00506]  一部の実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢアゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢアゴニストであり、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ−１０１、融合タンパク質並びにその断片、誘導体、変異体、バイオシミラー及び組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、細胞培養培地中、２０μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬの濃度を達成するのに十分な濃度で添加される。
【０３３０】
[00507]  一部の実施形態において、１つ以上のＴＮＦＲＳＦに加えて、細胞培養培地は、初期濃度約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び初期濃度約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を更に含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０３３１】
[00508]  一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図８による並びに本明細書に記載されている通り、ステップＤプロセス中を含む第２の拡大培養中に含められ得る。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の組み合わせが、第２の拡大培養中の組み合わせとして用いられる。一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１並びにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図８による及び本明細書に記載されている通りステップＤプロセス中に含められ得る。
【０３３２】
[00509]  一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３、抗原提示フィーダー細胞及び任意選択によりＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む補充細胞培養培地で実施され得る。一部の実施形態において、第２の拡大培養は補充細胞培養培地で行われる。一部の実施形態において、補充細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示フィーダー細胞を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ；抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示フィーダー細胞で生じる（即ち抗原提示細胞）。
【０３３３】
[00510]  一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５又は約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５〜約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ−１５を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−１５を含む。
【０３３４】
[00511]  一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１又は約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１〜約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、第２の拡大培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。一部の実施形態において、細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ−２１を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２１を含む。
【０３３５】
[00512]  一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞との比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００又は約１：５００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：５０〜１：３００である。一実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：１００〜１：２００である。
【０３３６】
[00513]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、バルクＴＩＬを１５０ｍＬ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバーに移すまで培地補充が行われる（一般的に新鮮培地による呼吸を介した３分の２の培地補充）。別の成長チャンバーには、以下に更に十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
【０３３７】
[00514]  一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で考察されるように、７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、１１日間に短縮される。
【０３３８】
[00515]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、前述のように（Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51；Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42）T-175フラスコ及び気体透過性バッグ又はガス透過性培養器具（G-Rexフラスコ）を使用して実施され得る。一部の実施形態において、第２の拡大培養（急速拡大培養と称される拡大培養を含む）は、T-175フラスコで実施され、１５０ｍＬの培地に懸濁した約１×１０６個のＴＩＬを各T-175フラスコに加え得る。ＴＩＬは、ＩＬ−２の１ｍＬあたり３０００ＩＵ及び抗ＣＤ３の１ｍＬあたり３０ｎｇを補充したＣＭ及びAIM-V培地の１：１の混合物で培養され得る。T-175フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、５日目に、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む５０／５０培地を使用して交換され得る。一部の実施形態において、７日目に、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせることができ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む３００ｍＬのAIM Vを加えた。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数を計数し、新鮮培地を加えて細胞数を０．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬに保った。
【０３３９】
[00516]  一実施形態において、第２の拡大培養（これはＲＥＰと称される拡大培養；並びに図８のステップＤに参照されるものを含み得る）は、１００ｃｍガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている）において実施され得、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を補充した４００ｍＬの５０／５０培地中で５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬをＰＢＭＣと培養し得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し加え得る。G-Rex 100フラスコ内でＴＩＬを連続的に拡大培養するときは、７日目に各G-Rex 100のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し得、且つ細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割し得、それらを３つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加え得る。細胞は培養１４日目に回収し得る。
【０３４０】
[00517]  一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２と混合してフラスコ内で実施される。一部の実施形態において、細胞が別の成長チャンバーに移されるまで培地交換が行われる。一部の実施形態において、培地の２／３が新鮮培地による呼吸に置き換えられる。一部の実施形態において、別の成長チャンバーには、以下に更に十分に考察する通りのG-REXフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
【０３４１】
[00518]  一実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。当技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号に記載されている方法は、優れた腫瘍反応性に関するＴＩＬの選択に使用され得る。
【０３４２】
[00519]  任意選択により、第２の拡大培養（ＲＥＰ拡大培養と称される拡大培養を含む）後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは、死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。一部の実施形態では、Cellometer K2自動セルカウンター（Nexcelom Bioscience、Lawrence, MA）を使用してＴＩＬサンプルをカウントし、生存率を決定することができる。一部の実施形態では、生存率は、例えば、実施例１５に記載されるCellometer K2 Image Cytometer自動セルカウンタープロトコルに従って決定される。
【０３４３】
[00520]  一部の実施形態において、ＴＩＬの第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、先述の通りT-175フラスコ及びガス透過性バッグ（Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342）又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施することができる。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、フラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、T-175フラスコで実施される第２の拡大培養及び約１×１０６個のＴＩＬを約１５０ｍＬの培地中に懸濁し、これを各T-175フラスコに加える。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞としての照射（５０Ｇｙ）された同種異系ＰＢＭＣと１：１００の比で培養し、及び細胞は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充したＣＭとAIM-V培地との１：１混合物（５０／５０培地）で培養した。T-175フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートする。一部の実施形態において、培地は、５日目に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０／５０培地を使用して交換される。一部の実施形態において、７日目、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む３００ｍＬのAIM-Vを加える。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数を計数し得、新鮮培地を加えて細胞数を約０．５〜約２．０×１０６細胞／ｍＬに保ち得る。
【０３４４】
[00521]  一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、１００ｃｍ２ガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf）において実施され（図１）、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充した４００ｍＬの５０／５０培地中で約５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬを照射同種異系ＰＢＭＣと１：１００の比で培養する。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされる。一部の実施形態において、５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心する。次に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮５０／５０培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex100フラスコに加え戻し得る。ＴＩＬがG-Rex100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態において、７日目に各G-Rex100内のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し、且つ細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割しており、それらを３つのG-Rex100フラスコの播種に使用する。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加える。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのAIM-Vを加える。細胞は培養１４日目に回収される。
【０３４５】
[00522]  Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）及びＣ（定数）の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第２の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、α、β、γ及びδ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α及び／又はβの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）βの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ちＴＣＲα／β）の発現が増加する。
【０３４６】
[00523]  一部の実施形態において、第２の拡大培養培地（例えば、ＣＭ２又は第２の細胞培養培地と称されることもある）は、以下で更に詳細に考察する通り、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３並びに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。
【０３４７】
[00524]  一部の実施形態において、第２の拡大培養、例えば図８によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
【０３４８】
[00525]  一部の実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地からなる群から選択される量において、第２の拡大培養、例えば図８のステップＤ中、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一部の実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、第２の拡大培養、例えば図８のステップＤ中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬからなる群から選択される量において、第２の拡大培養、例えば図８のステップＤ中、ＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡは、第２の拡大培養、例えば図８のステップＤ中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る。
【０３４９】
１．フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00526]  一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順（例えば、図８のステップＤに記載された拡大培養並びにＲＥＰと称される拡大培養を含む）は、ＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養中及び／又は第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて得られる。
【０３５０】
[00527]  一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、同種異系ＰＢＭＣの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
【０３５１】
[00528]  一部の実施形態において、１４日目の生細胞の総数がＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目に培養（即ち第２の拡大培養の開始日）に移行した初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。
【０３５２】
[00529]  一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ−２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。
【０３５３】
[00530]  一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ−２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、５〜６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び１０００〜６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００〜５０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２０〜４０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００〜４０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２５〜３５ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２５００〜３５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。
【０３５４】
[00531]  一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は、ＰＢＭＣである。一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００又は約１：５００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、１：５０〜１：３００である。一実施形態において、第２の拡大培養におけるＴＩＬと抗原提示フィーダー細胞との比は、１：１００〜１：２００である。
【０３５５】
[00532]  ある実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約１００×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約５０×１０６個のＴＩＬの比を必要とする。更に別の実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞と約２５×１０６個のＴＩＬを必要とする。
【０３５６】
[00533]  一実施形態において、本明細書に記載の第２の拡大培養手順は、第２の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて得られる。一実施形態において、ＰＢＭＣの代わりに人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞が使用される。
【０３５７】
[00534]  一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかによって不活性化され、図４、５、６及び７に記載された例示的な手順を含む、本明細書に記載されたＴＩＬ拡大培養手順で使用される。
【０３５８】
[00535]  一実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせて、第２の拡大培養で使用される。
【０３５９】
２．サイトカイン
[00536]  本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ−２を含む培養培地を使用する。
【０３６０】
[00537]  代わりに、ＴＩＬの急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の２つ以上の組み合わせについては、概して国際公開第２０１５／１８９３５６号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（参照により全体として明示的に本明細書に組み込まれる）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ−２とＩＬ−１５、ＩＬ−２とＩＬ−２１、ＩＬ−１５とＩＬ−２１とＩＬ−２、ＩＬ−１５とＩＬ−２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
【０３６１】
Ｅ．ステップＥ：ＴＩＬの回収
[00538]  第２の拡大培養ステップ後、細胞は回収することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図８に提供される通り、１、２、３、４回又はそれ以上の拡大培養ステップ後に回収される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図８に提供される通り、２つの拡大培養ステップ後に回収される。
【０３６２】
[00539]  ＴＩＬは、例えば、遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で回収することができる。ＴＩＬ回収方法は、当技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは自動化系を使用して回収される。
【０３６３】
[00540]  細胞回収機及び／又は細胞処理系は、例えば、Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及びInotech Biosystems International, Inc.を含む様々な供給源から市販されている。任意選択による細胞ベースのハーベスターを本方法で使用することができる。一部の実施形態において、細胞回収機及び／又は細胞処理系は、膜ベースの細胞ハーベスターである。一部の実施形態において、細胞回収は、LOVO系（Fresenius Kabi製）などの細胞処理系を介して行われる。用語「LOVO細胞処理系」は、滅菌及び／又は閉鎖系環境で回転膜又は回転フィルターなどの膜又はフィルターを通して、細胞を含む溶液を送り出すことができ、ペレット化せずに上清又は細胞培養培地を除去する連続フロー及び細胞処理を可能にする、あらゆる販売業者によって製造された機器又は装置も指す。一部の実施形態において、細胞回収機及び／又は細胞処理系は、閉鎖、無菌系で細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮及び／又は他の細胞処理ステップを実施することができる。
【０３６４】
[00541]  一部の実施形態において、回収、例えば図８によるステップＥは、閉鎖系バイオリアクターから実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。一部の実施形態において、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。
【０３６５】
[00542]  一部の実施形態において、図８によるステップＥは、実施例１６に記載のプロセスに従って実施される。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例１６に記載されるような閉鎖系が使用される。
【０３６６】
[00543]  一部の実施形態において、実施例１６に記載された方法に従ってＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、セクション８．５（実施例１６では、１１日目のＴＩＬ回収と称される）に記載されるような方法を使用して、１日目〜１１日目にＴＩＬが回収される。一部の実施形態において、セクション８．１２（実施例１６では、２２日目のＴＩＬ回収と称される）に記載されるような方法を使用して、１２日目〜２２日目にＴＩＬが回収される。
【０３６７】
Ｆ．ステップＦ：最終的な製剤化／輸注バッグへの移動
[00544]  図８に例示的順序で提供される通りの、且つ上記及び本明細書に詳細に概説される通りのステップＡ〜Ｅが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。一部の実施形態において、上記に記載される拡大培養方法を用いて治療上十分な数のＴＩＬが得られると、ＴＩＬは患者への投与における使用のため容器に移される。
【０３６８】
[00545]  一実施形態において、本開示のＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０〜６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内が挙げられる。
【０３６９】
１．医薬組成物、投薬量及び投与レジメン
[00546]  一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養したＴＩＬは医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは好ましくは約３０〜６０分間継続される。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。
【０３７０】
[00547]  任意の適切な用量のＴＩＬを投与することができる。一部の実施形態において、特に癌が黒色腫である場合、平均が約７．８×１０１０ＴＩＬである約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０ＴＩＬが投与される。一実施形態において、約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約３×１０１０〜約１２×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約４×１０１０〜約１０×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約５×１０１０〜約８×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約６×１０１０〜約８×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、約７×１０１０〜約８×１０１０のＴＩＬが投与される。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。一部の実施形態において、特に癌が黒色腫である場合、治療有効投与量は約７．８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約３×１０１０〜約１２×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約４×１０１０〜約１０×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約５×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約６×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。一部の実施形態において、治療有効投与量は、約７×１０１０〜約８×１０１０個のＴＩＬである。
【０３７１】
[00548]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２及び５×１０１２〜１×１０１３の範囲内である。
【０３７２】
[00549]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより低い。
【０３７３】
[00550]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより高い。
【０３７４】
[00551]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％〜約５０％、約０．００１％〜約４０％、約０．０１％〜約３０％、約０．０２％〜約２９％、約０．０３％〜約２８％、約０．０４％〜約２７％、約０．０５％〜約２６％、約０．０６％〜約２５％、約０．０７％〜約２４％、約０．０８％〜約２３％、約０．０９％〜約２２％、約０．１％〜約２１％、約０．２％〜約２０％、約０．３％〜約１９％、約０．４％〜約１８％、約０．５％〜約１７％、約０．６％〜約１６％、約０．７％〜約１５％、約０．８％〜約１４％、約０．９％〜約１２％又は約１％〜約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
【０３７５】
[00552]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、約０．０２％〜約４．５％、約０．０３％〜約４％、約０．０４％〜約３．５％、約０．０５％〜約３％、約０．０６％〜約２．５％、約０．０７％〜約２％、約０．０８％〜約１．５％、約０．０９％〜約１％、約０．１％〜約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
【０３７６】
[00553]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ又は０．０００１ｇ以下である。
【０３７７】
[00554]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ又は１０ｇ超である。
【０３７８】
[00555]  本発明の医薬組成物において提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されるべき対象の性別及び年齢、処置されるべき対象の体重並びに担当医の選好及び経験に依存するであろう。臨床的に確立されたＴＩＬの投与量も適切な場合に使用され得る。ＴＩＬの投与量など、本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、処置されるヒト又は哺乳動物、疾患又は状態の重症度、投与速度、活性医薬成分の性質及び処方医の裁量に依存するであろう。
【０３７９】
[00556]  一部の実施形態において、ＴＩＬは単回投与で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは複数回投与で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回を超え得る。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は必要な限り継続し得る。
【０３８０】
[00557]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２及び５×１０１２〜１×１０１３の範囲内である。
【０３８１】
[00558]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇｍｇ〜約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ〜約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ〜約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【０３８２】
[00559]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約４５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約３５ｍｇ、約２０ｍｇ〜約３０ｍｇ、約２３ｍｇ〜約２８ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ〜約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ〜約１１０ｍｇ又は約９５ｍｇ〜約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ〜約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ〜約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ〜約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ〜約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ〜約２０５ｍｇ又は約１９８〜約２０７ｍｇの範囲内である。
【０３８３】
[00560]  有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれでも投与され得る。
【０３８４】
Ｇ．任意選択による細胞培養培地成分
１．抗ＣＤ３抗体
[00561]  一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養培地（ＲＥＰと称されるものを含み、例えば図Ａを参照されたい）は、抗ＣＤ３抗体も含む。抗ＣＤ３抗体をＩＬ−２と併用すると、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は、完全長抗体並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が概して好ましく；例えばTsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719（参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０３８５】
[00562]  当業者が理解し得る通り、本発明において使用が見出される好適な抗ヒトＣＤ３抗体は、限定はされないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、幾つも存在する。詳細な実施形態において、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている）。
【０３８６】
２．４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト
[00563]  一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストである。４−１ＢＢアゴニストは、当技術分野で公知の任意の４−１ＢＢ結合分子であり得る。４−１ＢＢ結合分子は、ヒト又は哺乳類４−１ＢＢに結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。４−１ＢＢアゴニスト又は４−１ＢＢ結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。４−１ＢＢアゴニスト又は４−１ＢＢ結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えばＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及び４−１ＢＢに結合する抗体の操作された形態、例えばｓｃＦｖ分子も含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のための４−１ＢＢアゴニストは、抗４−１ＢＢ抗体、ヒト抗４−１ＢＢ抗体、マウス抗４−１ＢＢ抗体、哺乳動物抗４−１ＢＢ抗体、モノクローナル抗４−１ＢＢ抗体、ポリクローナル抗４−１ＢＢ抗体、キメラ抗４−１ＢＢ抗体、抗４−１ＢＢアドネクチン、抗４−１ＢＢドメイン抗体、単鎖抗４−１ＢＢ断片、重鎖抗４−１ＢＢ断片、軽鎖抗４−１ＢＢ断片、抗４−１ＢＢ融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーを含む。アゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体は、強い免疫応答を誘導することが知られている。Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677。好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、アゴニスト性、抗４−１ＢＢヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体（即ち単一細胞株に由来する抗体）である。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ＥＵ−１０１（Eutilex Co. Ltd.）、ウトミルマブ若しくはウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。好ましい一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブ又はウレルマブ又はそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。
【０３８７】
[00564]  好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニスト又は４−１ＢＢ結合分子は、融合タンパク質でもあり得る。好ましい実施形態において、三量体又は六量体４−１ＢＢアゴニスト（３つ又は６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体４−１ＢＢアゴニストは、典型的には２つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（４−１ＢＢＬ）のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１−Ｆｃを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の２つ以上を更に連結する、三量体（三価）又は六量体（又は六価）又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
【０３８８】
[00565]  アゴニスト性４−１ＢＢ抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘導することが知られている。好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法で４−１ＢＢ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、例えばＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制する、アゴニスト性４−１ＢＢモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
【０３８９】
[00566]  一部の実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒト４−１ＢＢ（配列番号９）に結合することを特徴とする。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ヒト４−１ＢＢ（配列番号９）に結合する結合分子である。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、マウス４−１ＢＢ（配列番号１０）に結合する結合分子である。４−１ＢＢアゴニスト又は結合分子が結合する４−１ＢＢ抗原のアミノ酸配列を表３に概括する。
【０３９０】
【表３】
2021509586.tif 000004
【０３９１】
[00567]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約７０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約６０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約５０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約４０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０３９２】
[00568]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約７．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約７．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約１×１０６  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０３９３】
[00569]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約２×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．１×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．２×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．３×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．４×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．５×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．６×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約２．７×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．８×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２．９×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約３×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０３９４】
[00570]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウス４−１ＢＢに結合する、４−１ＢＢアゴニストを含む。
【０３９５】
[00571]  好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ＰＦ−０５０８２５６６又はＭＯＲ−７４８０としても知られるウトミルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウトミルマブはPfizer, Inc.から入手できる。ウトミルマブは、免疫グロブリンＧ２−ラムダ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー９、４−１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウトミルマブのアミノ酸配列を表４に示す。ウトミルマブは、Ａｓｎ５９及びＡｓｎ２９２のグリコシル化部位；位置２２−９６（ＶＨ−ＶＬ）、１４３−１９９（ＣＨ１−ＣＬ）、２５６−３１６（ＣＨ２）及び３６２−４２０（ＣＨ３）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２２’−８７’（ＶＨ−ＶＬ）及び１３６’−１９５’（ＣＨ１−ＣＬ）の軽鎖内ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置２１８−２１８、２１９−２１９、２２２−２２２及び２２５−２２５、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８−１３０、２１９−２１９、２２２−２２２及び２２５−２２５並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１９−１３０（２）、２２２−２２２及び２２５−２２５の鎖内重鎖−重鎖ジスルフィド架橋；ＩｇＧ２Ａアイソフォーム位置１３０−２１３’（２）、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム位置２１８−２１３’及び１３０−２１３’並びにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム位置２１８−２１３’（２）の鎖内重鎖−軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウトミルマブ並びにその変異体及び断片の調製並びに特性は、米国特許第８，８２１，８６７号；第８，３３７，８５０号；及び第９，４６８，６７８号並びに国際公開第２０１２／０３２４３３  Ａ１号に記載され、これらのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ウトミルマブの前臨床的特徴は、Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother.2012, 61, 1721-33に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウトミルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０２４４４７９３、ＮＣＴ０１３０７２６７、ＮＣＴ０２３１５０６６及びＮＣＴ０２５５４８１２が含まれる。
【０３９６】
[00572]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号１１で示される重鎖及び配列番号１２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
【０３９７】
[00573]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号１３に示される配列を含み、４−１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号１４に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
【０３９８】
[00574]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにそれらの保存的アミノ酸置換を含む。
【０３９９】
[00575]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブに関して薬物規制当局によって承認された４−１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４−１ＢＢ抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された４−１ＢＢアゴニスト抗体であり、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。４−１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウトミルマブである。
【０４００】
【表４】
2021509586.tif 000005
【０４０１】
[00576]  好ましい実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ＢＭＳ−６６３５１３及び２０Ｈ４．９．ｈ４ａとしても知られるモノクローナル抗体ウレルマブ又はその断片、誘導体、変異体若しくはバイオシミラーである。ウレルマブは、Bristol-Myers Squibb, Inc.及びCreative Biolabs, Inc.から入手できる。ウレルマブは、免疫グロブリンＧ４−カッパ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９、４−１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ヒト（Homo sapiens）（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウレルマブのアミノ酸配列を表５に示す。ウレルマブは、位置２９８（及び２９８’’）のＮ−グリコシル化部位；位置２２−９５（ＶＨ−ＶＬ）、１４８−２０４（ＣＨ１−ＣＬ）、２６２−３２２（ＣＨ２）及び３６８−４２６（ＣＨ３）（並びに位置２２’’−９５’’、１４８’’−２０４’’、２６２’’−３２２’’及び３６８’’−４２６’’）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２３’−８８’（ＶＨ−ＶＬ）及び１３６’−１９６’（ＣＨ１−ＣＬ）（並びに位置２３’’’−８８’’’及び１３６’’’−１９６’’’）の軽鎖内ジスルフィド架橋；位置２２７−２２７’’及び２３０−２３０’’の鎖内重鎖−重鎖ジスルフィド架橋；並びに位置１３５−２１６’及び１３５’’−２１６’’’の鎖内重鎖−軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウレルマブ並びにその変異体及び断片の調製及び特性は、米国特許第７，２８８，６３８号及び第８，９６２，８０４号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ウレルマブの前臨床的及び臨床的特徴は、http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272で入手可能なSegal, et al., Clin.Cancer Res.2016に記載される。様々な血液学的及び固形腫瘍の適応症におけるウレルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０１７７５６３１、ＮＣＴ０２１１００８２、ＮＣＴ０２２５３９９２及びＮＣＴ０１４７１２１０が含まれる。
【０４０２】
[00577]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号２１で示される重鎖及び配列番号２２で示される軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
【０４０３】
[00578]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号２３に示される配列を含み、４−１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号２４に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
【０４０４】
[00579]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、それぞれ配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
【０４０５】
[00580]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、ウレルマブに関して薬物規制当局によって承認された４−１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含む４−１ＢＢ抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出された４−１ＢＢアゴニスト抗体であり、４−１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。４−１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はウレルマブである。
【０４０６】
【表５】
2021509586.tif 000006
【０４０７】
[00581]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、１Ｄ８、３Ｅｌｏｒ、４Ｂ４（BioLegend 309809）、Ｈ４−１ＢＢ−Ｍ１２７（BD Pharmingen 552532）、ＢＢＫ２（Thermo Fisher MS621PABX）、１４５５０１（Leinco Technologies B591）、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１１２４８として寄託され、米国特許第６，９７４，８６３号に開示されている細胞株によって産生される抗体、５Ｆ４（BioLegend 31 1503）、Ｃ６５−４８５（BD Pharmingen 559446）、米国特許出願公開第２００５／００９５２４４号に開示されている抗体、米国特許第７，２８８，６３８号に開示されている抗体（２０Ｈ４．９−ＩｇＧｌ（ＢＭＳ−６６３０３１）など）、同第６，８８７，６７３号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ−５５４２７１など）、同第７，２１４，４９３号に開示されている抗体、同第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、同第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、同第６，９０５，６８５号に開示されている抗体（４Ｅ９又はＢＭＳ−５５４２７１など）、同第６，３６２，３２５号に開示されている抗体（１Ｄ８又はＢＭＳ−４６９４９２；３Ｈ３又はＢＭＳ−４６９４９７；又は３Ｅｌなど）、同第６，９７４，８６３号に開示されている抗体（５３Ａ２など）；同第６，２１０，６６９号に開示されている抗体（１Ｄ８、３Ｂ８又は３Ｅ１など）、同第５，９２８，８９３号に記載されている抗体、同第６，３０３，１２１号に開示されている抗体、同第６，５６９，９９７号に開示されている抗体、国際公開第２０１２／１７７７８８号、同第２０１５／１１９９２３号及び同第２０１０／０４２４３３号に開示されている抗体並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体又はバイオシミラー、からなる群から選択され、ここで、前述の特許又は特許出願公開のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０８】
[00582]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、国際公開第２００８／０２５５１６  Ａ１号、同第２００９／００７１２０  Ａ１号、同第２０１０／００３７６６  Ａ１号、同第２０１０／０１００５１  Ａ１号及び同第２０１０／０７８９６６  Ａ１号；米国特許出願公開第２０１１／００２７２１８  Ａ１号、同第２０１５／０１２６７０９  Ａ１号、同第２０１１／０１１１４９４  Ａ１号、同第２０１５／０１１０７３４  Ａ１号及び同第２０１５／０１２６７１０  Ａ１号；並びに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号及び同第８，４５０，４６０号に記載されている４−１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０９】
[00583]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、構造Ｉ−Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）又は構造Ｉ−Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示される４−１ＢＢアゴニスト性融合タンパク質又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。
【化１】
2021509586.tif 000007
構造Ｉ−Ａ及びＩ−Ｂにおいて、円柱は個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ−Ａ及びＩ−Ｂは、例えば、４−１ＢＢＬ又は４−１ＢＢに結合する抗体、に由来する、３つの直鎖状に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これは折り畳まれて三価タンパク質を形成し、次いで、ＩｇＧ１−Ｆｃ（ＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む）を介して第２の三価（triavelent）タンパク質に連結され、次いで、これはジスルフィド結合（小さい細長い楕円形）を介して２つの三価タンパク質を連結するために使用され、構造を安定化し、６つの受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン及びシグナル伝達タンパク質をあわせてシグナル伝達複合体を形成できるアゴニストを提供する。円柱として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基並びに柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列並びに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーにより接続されたＶＨ及びＶＬ鎖を含む、ｓｃＦｖドメインであり得る。de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44；Ahmad, et al., Clin. & Dev.Immunol.2012, 980250；Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208；又は本明細書の別の箇所に組み込まれた参考文献に記載されているものなどの任意のｓｃＦｖドメイン設計が使用され得る。この形態の融合タンパク質構造は、米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号及び同第８，４５０，４６０号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１０】
[00584]  構造Ｉ−Ａの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表６に示す。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン（配列番号３１のアミノ酸１７〜２３０）、完全ヒンジドメイン（配列番号３１のアミノ酸１〜１６）又はヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４〜１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号３２〜配列番号４１に示される実施形態から選択され得る。
【０４１１】
【表６】
2021509586.tif 000008
【０４１２】
[00585]  構造Ｉ−Ｂの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表７に示す。構造Ｉ−ＢのようにＦｃ抗体断片がＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は好ましくは配列番号４２に示されるものであり、リンカー配列は好ましくは配列番号４３〜配列番号４５に示される実施形態から選択される。
【０４１３】
【表７】
2021509586.tif 000009
【０４１４】
[00586]  一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウレルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、表８に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。
【０４１５】
[00587]  一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、４−１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４６による配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、可溶性４−１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号４７による配列を含む１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含む。
【０４１６】
[00588]  一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−Ｂによる４−１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、表８に示されるＶＨ及びＶＬ配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４−１ＢＢ結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。
【０４１７】
【表８】
2021509586.tif 000010
【０４１８】
[00589]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４−１ＢＢ結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインである。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４−１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４−１ＢＢ結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインであり、可溶性４−１ＢＢドメインのそれぞれは、ストーク領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、４−１ＢＢ結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３〜８アミノ酸長を有する。
【０４１９】
[00590]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３〜８アミノ酸長を有し、各ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは４−１ＢＢ結合ドメインである。
【０４２０】
[00591]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、前述のＶＬドメインのいずれかに連結された前述のＶＨドメインのいずれかを含む４−１ＢＢアゴニスト性ｓｃＦｖ抗体である。
【０４２１】
[00592]  一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、BPS Bioscience４−１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号７９０９７−２であり、これはBPS Bioscience, San Diego, CA, USAから市販されている。一実施形態において、４−１ＢＢアゴニストは、Creative Biolabs４−１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号ＭＯＭ−１８１７９であり、これはCreative Biolabs, Shirley, NY, USAから市販されている。
【０４２２】
３．ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニスト
[00593]  一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニストである。ＯＸ４０アゴニストは、当技術分野で公知の任意のＯＸ４０結合分子であり得る。ＯＸ４０結合分子は、ヒト又は哺乳類ＯＸ４０に結合できるモノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、免疫グロブリン分子の任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン重鎖を含み得る。ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体並びに抗体断片、例えばＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、上記のいずれかのエピトープ結合断片及びＯＸ４０に結合する抗体の操作された形態、例えばｓｃＦｖ分子も含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物における使用のためのＯＸ４０アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体、ヒト抗ＯＸ４０抗体、マウス抗ＯＸ４０抗体、哺乳動物抗ＯＸ４０抗体、モノクローナル抗ＯＸ４０抗体、ポリクローナル抗ＯＸ４０抗体、キメラ抗ＯＸ４０抗体、抗ＯＸ４０アドネクチン、抗ＯＸ４０ドメイン抗体、単鎖抗ＯＸ４０断片、重鎖抗ＯＸ４０断片、軽鎖抗ＯＸ４０断片、抗ＯＸ４０融合タンパク質及びそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーを含む。好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、アゴニスト性、抗ＯＸ４０ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体（即ち単一細胞株に由来する抗体）である。
【０４２３】
[00594]  好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト又はＯＸ４０結合分子は、融合タンパク質でもあり得る。ＯＸ４０Ｌに融合したＦｃドメインを含むＯＸ４０融合タンパク質は、例えば、Sadun, et al., J. Immunother.2009, 182, 1481-89に記載されている。好ましい実施形態において、三量体又は六量体ＯＸ４０アゴニスト（３つ又は６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体ＯＸ４０アゴニストは、典型的には２つのリガンド結合ドメインを保有するアゴニスト性モノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（ＯＸ４０Ｌ）のクラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１−Ｆｃを含み、任意選択によりこれらの融合タンパク質の２つ以上を更に連結する、三量体（三価）又は六量体（又は六価）又はそれより大きい融合タンパク質は、例えば、Gieffers, et al., Mol.Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47に記載される。
【０４２４】
[00595]  アゴニスト性ＯＸ４０抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘発することが知られている。Curti, et al., Cancer Res.2013, 73, 7189-98。好ましい実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、毒性を低減するのに十分な方法でＯＸ４０抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、例えばＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制する、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体又は融合タンパク質である。
【０４２５】
[00596]  一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒトＯＸ４０（配列番号５４）に結合することを特徴とする。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ヒトＯＸ４０（配列番号５４）に結合する結合分子である。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、マウスＯＸ４０（配列番号５５）に結合する結合分子である。ＯＸ４０アゴニスト又は結合分子が結合するＯＸ４０抗原のアミノ酸配列を表９に概括する。
【０４２６】
【表９】
2021509586.tif 000011
【０４２７】
[00597]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１００ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約６０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約５０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約４０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約３０ｐＭ以下のＫＤでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
【０４２８】
[00598]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約７．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９．５×１０５  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約１×１０６  １／Ｍ・ｓ以上のｋａｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
【０４２９】
[00599]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約２×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．１×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．２×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．３×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．４×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．５×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．６×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約２．７×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．８×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２．９×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約３×１０−５  １／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃでヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
【０４３０】
[00600]  一部の実施形態において、記載される組成物、プロセス及び方法は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合するか、又は約１ｎＭ以下のＩＣ５０でヒト又はマウスＯＸ４０に結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。
【０４３１】
[00601]  一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、ＭＥＤＩ０５６２又はＭＥＤＩ−０５６２としても知られるタボリキシズマブである。タボリキシズマブは、AstraZeneca, Incの子会社MedImmuneから入手できる。タボリキシズマブは、免疫グロブリンＧ１−カッパ、抗［ヒト（Homo sapiens）ＴＮＦＲＳＦ４（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー４、ＯＸ４０、ＣＤ１３４）］、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体である。タボリキシズマブのアミノ酸配列を表１０に示す。タボリキシズマブは、フコシル化複合二分岐ＣＨＯ型グリカンを伴い位置３０１及び３０１’’のＮ−グリコシル化部位；位置２２−９５（ＶＨ−ＶＬ）、１４８−２０４（ＣＨ１−ＣＬ）、２６５−３２５（ＣＨ２）及び３７１−４２９（ＣＨ３）（並びに位置２２’’−９５’’、１４８’’−２０４’’、２６５’’−３２５’’及び３７１’’−４２９’’）の重鎖内ジスルフィド架橋；位置２３’−８８’（ＶＨ−ＶＬ）及び１３４’−１９４’（ＣＨ１−ＣＬ）（並びに位置２３’’’−８８’’’及び１３４’’’−１９４’’’）の軽鎖内ジスルフィド架橋；位置２３０−２３０’’及び２３３−２３３’’の鎖内重鎖−重鎖ジスルフィド架橋；並びに位置２２４−２１４’及び２２４’’−２１４’’’の鎖内重鎖−軽鎖ジスルフィド架橋を含む。様々な固形腫瘍の適応症におけるタボリキシズマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所Clinicaltrials.gov識別子ＮＣＴ０２３１８３９４及びＮＣＴ０２７０５４８２が含まれる。
【０４３２】
[00602]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号５６で示される重鎖及び配列番号５７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
【０４３３】
[00603]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号５８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号５９に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。
【０４３４】
[00604]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６０、配列番号６１及び配列番号６２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
【０４３５】
[00605]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブに関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はタボリキシズマブである。
【０４３６】
【表１０】
2021509586.tif 000012
【０４３７】
[00606]  一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは１１Ｄ４であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。１１Ｄ４の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号；同第８，２３６，９３０号；及び同第９，０２８，８２４号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。１１Ｄ４のアミノ酸配列を表１１に示す。
【０４３８】
[00607]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号６６で示される重鎖及び配列番号６７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
【０４３９】
[00608]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号６８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号６９に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
【０４４０】
[00609]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号７３、配列番号７４及び配列番号７５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
【０４４１】
[00610]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１１Ｄ４である。
【０４４２】
【表１１】
2021509586.tif 000013
【０４４３】
[00611]  一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは１８Ｄ８であり、これはPfizer, Inc.から入手可能な完全ヒト抗体である。１８Ｄ８の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号；同第８，２３６，９３０号；及び同第９，０２８，８２４号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。１８Ｄ８のアミノ酸配列を表１２に示す。
【０４４４】
[00612]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号７６で示される重鎖及び配列番号７７で示される軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列を有する重鎖及び軽鎖又は抗原結合断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、それらの変異体若しくはコンジュゲートを含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。
【０４４５】
[00613]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号７８に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号７９に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
【０４４６】
[00614]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８２に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号８３、配列番号８４及び配列番号８５に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
【０４４７】
[00615]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤は１８Ｄ８である。
【０４４８】
【表１２】
2021509586.tif 000014
【０４４９】
[00616]  一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＨｕ１１９−１２２であり、これはGlaxoSmithKline plc.から入手可能なヒト化抗体である。Ｈｕ１１９−１２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号並びに国際公開第２０１２／０２７３２８号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１１９−１２２のアミノ酸配列を表１３に示す。
【０４５０】
[00617]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９−１２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号８６に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号８７に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
【０４５１】
[00618]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号９１、配列番号９２及び配列番号９３に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
【０４５２】
[00619]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９−１２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９−１２２である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９−１２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９−１２２である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１１９−１２２である。
【０４５３】
【表１３】
2021509586.tif 000015
【０４５４】
[00620]  一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＨｕ１０６−２２２であり、これはGlaxoSmithKline PLC.から入手可能なヒト化抗体である。Ｈｕ１０６−２２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号並びに国際公開第２０１２／０２７３２８号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１０６−２２２のアミノ酸配列を表１４に示す。
【０４５５】
[00621]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６−２２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域（ＶＲ）を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（ＶＨ）は配列番号９４に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（ＶＬ）は配列番号９５に示される配列及びその保存的アミノ酸置換を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９９％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９８％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９７％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９６％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含む。
【０４５６】
[00622]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ配列番号９６、配列番号９７及び配列番号９８に記載の配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換並びにそれぞれ配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１に記載の配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン並びにその保存的アミノ酸置換を含む。
【０４５７】
[00623]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６−２２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。一実施形態において、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、参照医薬品又は参照生物学的製剤と比較して１つ以上の翻訳後改変を含む、アミノ酸配列を含むＯＸ４０抗体を含み、ここで、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６−２２２である。一部の実施形態において、１つ以上の翻訳後改変は、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び切断の１つ以上から選択される。一部の実施形態において、バイオシミラーは、認可された又は認可のために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品又は参照生物学的製剤の製剤と異なる製剤で提供され、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６−２２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／又は欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されていることがあり得る。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６−２２２である。一部の実施形態において、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤を更に含む組成物として提供され、ここで、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品又は参照生物学的製剤に含まれる賦形剤と同一又は異なっており、参照医薬品又は参照生物学的製剤はＨｕ１０６−２２２である。
【０４５８】
【表１４】
2021509586.tif 000016
【０４５９】
[00624]  一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニスト抗体はＭＥＤＩ６４６９（９Ｂ１２とも称される）である。ＭＥＤＩ６４６９はマウスモノクローナル抗体である。Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Weinberg, et al., J. Immunother.2006, 29, 575-585に記載されているように、Biovest Inc.（Malvern, MA, USA）に寄託された、９Ｂ１２ハイブリドーマによって産生される抗体であり、その開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９のＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態において、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。
【０４６０】
[00625]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Ｌ１０６ ＢＤ（Pharmingen Product #340420）である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（BD Pharmingen Product #340420）のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（BD Pharmingen Product #340420）の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）である。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）のＣＤＲを含む。一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号２００７３）の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、マウスモノクローナル抗体抗ｍＣＤ１３４／ｍＯＸ４０（クローンＯＸ８６）であり、InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NHから市販されている。
【０４６１】
[00626]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、国際公開第９５／１２６７３号、同第９５／２１９２５号、同第２００６／１２１８１０号、同第２０１２／０２７３２８号、同第２０１３／０２８２３１号、同第２０１３／０３８１９１号及び同第２０１４／１４８８９５号；欧州特許第０６７２１４１号；米国特許出願公開第２０１０／１３６０３０号、同第２０１４／３７７２８４号、同第２０１５／１９０５０６号及び同第２０１５／１３２２８８号；並びに米国特許第７，５０４，１０１号、同第７，５５０，１４０号、同第７，６２２，４４４号、同第７，６９６，１７５号、同第７，９６０，５１５号、同第７，９６１，５１５号、同第８，１３３，９８３号、同第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号（２０Ｅ５及び１２Ｈ３を含む）に記載されるＯＸ４０アゴニストから選択され、それぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４６２】
[00627]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、構造Ｉ−Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）又は構造Ｉ−Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示されるＯＸ４０アゴニスト性融合タンパク質又はその断片、誘導体、コンジュゲート、変異体若しくはバイオシミラーである。構造Ｉ−Ａ及びＩ−Ｂの特性は、上記並びに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号及び同第８，４５０，４６０号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。構造Ｉ−Ａのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表６に示す。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全定常ドメイン（配列番号３１のアミノ酸１７〜２３０）、完全ヒンジドメイン（配列番号３１のアミノ酸１〜１６）又はヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４〜１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を接続するための好ましいリンカーは、追加的ポリペプチドの融合に適したリンカーを含む、配列番号３２〜配列番号４１に示される実施形態から選択され得る。同様に、構造Ｉ−Ｂのポリペプチドドメインのアミノ酸配列を表７に示す。構造Ｉ−ＢのようにＦｃ抗体断片がＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は好ましくは配列番号４２に示されるものであり、リンカー配列は好ましくは配列番号４３〜配列番号４５に示される実施形態から選択される。
【０４６３】
[00628]  一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、タボリキシズマブの可変重鎖及び可変軽鎖、１１Ｄ４の可変重鎖及び可変軽鎖、１８Ｄ８の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１１９−１２２の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１０６−２２２の可変重鎖及び可変軽鎖、表１５に記載されている可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、上記の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ並びにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、変異体及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。
【０４６４】
[00629]  一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０２による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、可溶性ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０３による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１０４による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。
【０４６５】
[00630]  一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号８６及び配列番号８７に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、それぞれ配列番号９４及び配列番号９５に示される配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。一実施形態において、構造Ｉ−Ａ又はＩ−ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、表１５に示されるＶＨ及びＶＬ配列とそれぞれ少なくとも９５％同一であるＶＨ及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインはリンカーによって接続されている。
【０４６６】
【表１５】
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【０４６７】
【表１６】
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【０４６８】
【表１７】
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【０４６９】
[00631]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインである。一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加のドメインを更に含み、ここで、追加のドメインは、Ｆａｂ又はＦｃ断片ドメインであり、可溶性ＯＸ４０結合ドメインのそれぞれは、ストーク領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで一定の距離を提供するが、ＯＸ４０結合ドメインの一部ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３〜８アミノ酸長を有する。
【０４７０】
[00632]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインを含むＯＸ４０アゴニスト性単鎖融合ポリペプチドであり、ここで、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインのそれぞれは、ストーク領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは、独立して３〜８アミノ酸長を有し、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインはＯＸ４０結合ドメインである。
【０４７１】
[00633]  一部の実施形態において、ＯＸ４０アゴニストはＭＥＤＩ６３８３である。ＭＥＤＩ６３８３はＯＸ４０アゴニスト性融合タンパク質であり、米国特許第６，３１２，７００号に記載されているように調製することができ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４７２】
[00634]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、前述のＶＬドメインのいずれかに連結された前述のＶＨドメインのいずれかを含むＯＸ４０アゴニスト性ｓｃＦｖ抗体である。
【０４７３】
[00635]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、Creative BiolabsＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体ＭＯＭ−１８４５５であり、これはCreative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USAから市販されている。
【０４７４】
[00636]  一実施形態において、ＯＸ４０アゴニストは、BioLegend, Inc., San Diego, CA, USAから市販されているＯＸ４０アゴニスト性抗体クローンＢｅｒ−ＡＣＴ３５である。
【０４７５】
Ｈ．任意選択による細胞生存率分析
[00637]  任意選択により、ステップＢの第１の拡大培養後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。任意選択により、第１の拡大培養（初めのバルク拡大培養と称されることがある）後、当技術分野において公知の標準アッセイを用いて細胞生存率アッセイを実施することができる。例えば、バルクＴＩＬのサンプルに対してトリパンブルー色素排除アッセイを行うことができ、これは、死細胞を選択的に標識して生存率の評価を可能にするものである。生存率の試験に用いられる他のアッセイとしては、限定はされないが、アラマーブルーアッセイ；及びＭＴＴアッセイを挙げることができる。
【０４７６】
１．細胞数、生存率、フローサイトメトリー
[00638]  一部の実施形態において、細胞数及び／又は生存率が測定される。限定はされないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ５６などのマーカー並びに本明細書に開示又は記載される任意の他のものの発現を抗体によるフローサイトメトリー、例えば、限定はされないが、FACSCanto（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences）を使用してBD Bio-sciences（BD Biosciences、San Jose, CA）から市販されているものによって測定することができる。細胞は、ディスポーザブルc-chip血球計算盤（VWR、Batavia, IL）を使用して手動でカウントすることができ、及び生存率は、限定はされないがトリパンブルー染色を含め、当技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。
【０４７７】
[00639]  ある場合には、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察する通り、ＲＥＰに供し、次に凍結保存することができる。同様に、療法において遺伝子修飾ＴＩＬが使用されることになる場合、バルク又はＲＥＰ  ＴＩＬ集団を好適な処置のための遺伝子修飾に供することができる。
【０４７８】
２．細胞培養
[00640]  一実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、約５，０００ｍＬ〜約２５，０００ｍＬの細胞培養培地、約５，０００ｍＬ〜約１０，０００ｍＬの細胞培養培地又は約５，８００ｍＬ〜約８，７００ｍＬの細胞培養培地を使用することを含み得る。一実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地は、例えば、AIM-V細胞培養培地（Ｌ−グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、ＴＩＬ数の拡大は、２日又は３日おき以下の頻度で細胞に新鮮細胞培養培地を加える（細胞をフィードするとも称される）ことを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
【０４７９】
[00641]  一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培養培地は、ろ過されていない。ろ過されていない細胞培養培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培養培地は、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を欠いている。
【０４８０】
[00642]  ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織サンプルを得ること；細胞培養培地が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織サンプルを培養すること；腫瘍組織サンプルからＴＩＬを得ること；ａＡＰＣを使用して、細胞培養培地が中に入った第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約１４〜約４２日間、例えば約２８日間拡大することを含む本方法の所要期間である。
【０４８１】
[00643]  一実施形態において、ＴＩＬは、ガス透過性容器内で拡大培養する。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７  Ａ１号（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含め、当技術分野において公知の方法、組成物及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、ＴＩＬは、ガス透過性バッグ内で拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）などのガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
【０４８２】
[00644]  一実施形態において、ＴＩＬは、G-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。かかる実施形態は、細胞集団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｃｍ２に拡大培養することを可能にする。一実施形態において、この拡大培養は、細胞に新鮮な細胞培養培地を加える（細胞をフィードするとも称される）ことなく行われる。ある実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィーディングなしである。ある実施形態において、これにフィーディングはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置及び方法は、当技術分野において公知であり、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７  Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８  Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０  Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８  Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３  Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５  Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０  Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６  Ａ１号（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスは、Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.にも記載されている。
【０４８３】
Ｉ．任意選択によるＴＩＬ遺伝子改変
[00645]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、任意選択により、限定はされないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えばＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ−ＥＳＯ−１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えば、ＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。
【０４８４】
Ｊ．任意選択によるＴＩＬ凍結保存
[00646]  上記で考察し、且つ図８に提供されるステップＡ〜Ｅにおいて例示した通り、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、（例えば、図８のステップＤに従って提供される）第２の拡大培養後の拡大培養されたＴＩＬ集団は、凍結保存することができる。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中にＴＩＬ集団を置くことにより達成され得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。一部の実施形態において、ＴＩＬは、５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、細胞培養培地＋５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、実施例８及び９に提供される方法に従って凍結保存される。
【０４８５】
[00647]  適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は、概して完全培地中に再懸濁され、任意選択により１回以上洗浄される。一部の実施形態において、当技術分野において公知の通りに解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
【０４８６】
Ｋ．拡大培養されたＴＩＬの表現型特徴付けの方法
[00648]  グランザイムＢ産生：グランザイムＢは、ＴＩＬが標的細胞を死滅させる能力の別の尺度である。ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する抗体を使用して上記に記載した通り再刺激した培地上清について、そのグランザイムＢレベルも、Human Granzyme B DuoSet ELISA Kit（R & D Systems、Minneapolis, MN）を製造者の指示に従って使用して評価した。一部の実施形態において、第２の拡大培養ＴＩＬ又は第２の追加の拡大培養ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬと称されるＴＩＬを含め、図８のステップＤに記載されるものなど）は、グランザイムＢ産生が増加する。
【０４８７】
[00649]  一部の実施形態において、テロメア長は、細胞生存率及び／又は細胞機能の尺度として使用することができる。一部の実施形態において、テロメアは、図８に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、驚くべきことに、本発明によって作製されたＴＩＬと同一の長さであった。テロメア長の測定：ゲノムＤＮＡ及び細胞学的調製物中のテロメア長を測定するために、様々な方法が使用されてきた。テロメア制限断片（ＴＲＦ）分析は、テロメア長を測定するための究極の判断基準である（de Lange et al., 1990）。ただし、ＴＲＦの主な制限は、大量のＤＮＡ（１．５＾ｇ）を必要とすることである。テロメア長の測定に広く使用されている２つの技術、即ち蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；Agilent Technologies、Santa Clara、CA）及び定量的ＰＣＲを本発明で用い得る。
【０４８８】
[00650]  一部の実施形態において、ＴＩＬの健康は、ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌によって測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ−γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ−γ産生は、ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する抗体で刺激されたＴＩＬの培地中のサイトカインＩＦＮ−γのレベルを決定することで測定できる。これらの刺激したＴＩＬからの培地中のＩＦＮ−γレベルは、ＩＦＮ−γ遊離を測定することにより決定できる。
【０４８９】
[00651]  一部の実施形態において、標的細胞を溶解するＴＩＬの細胞傷害能は、高感度の用量依存的方法でＴＩＬの細胞傷害能を測定するＴＩＬアッセイのための生物発光リダイレクト溶解アッセイ（効力アッセイ）に従い、生物発光細胞株Ｐ８１５（クローンＧ６）とのＴＩＬの共培養アッセイを使用して評価された。
【０４９０】
[00652]  一部の実施形態において、本方法は、上記に記載した通りの方法を用いた、ＴＩＬ生存率を評価するためのアッセイを提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図８に提供される通りのものを含め、上記で考察した通りに拡大培養される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、生存率の評価前に凍結保存される。一部の実施形態において、生存率評価は、第１の拡大培養、第２の拡大培養及び追加の第２の拡大培養の実施前にＴＩＬを解凍することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＴＩＬ集団の細胞増殖、細胞毒性、細胞死及び／又は他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。生存率は、上記に記載されるＴＩＬ代謝アッセイのいずれか並びに当技術分野において公知の細胞生存率の評価について公知の任意の方法によって測定することができる。一部の実施形態において、本方法は、図８に例示されるものを含め、本明細書に記載される方法を用いて拡大培養されたＴＩＬの細胞増殖、細胞毒性、細胞死及び／又は他の生存率に関連する事項を評価するためのアッセイを提供する。
【０４９１】
[00653]  本発明は、ＴＩＬ生存率を決定するためのアッセイ方法も提供する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、新鮮に回収されたＴＩＬ及び／又は例えば図８に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して同等の生存率を有する。一部の実施形態において、ＴＩＬは、新鮮に回収されたＴＩＬ及び／又は例えば図８に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して生存率が増加した。本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をより大きいＴＩＬ集団に拡大培養することにより、ＴＩＬの生存率をアッセイする方法も提供し、この方法は、
（ｉ）予め拡大培養された第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｉｉ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも１００倍多く、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、生存率について更にアッセイされる、生じさせること
を含む。
【０４９２】
[00654]  一部の実施形態において、本方法は、
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、追加のＯＫＴ−３及び追加のＡＰＣを補充することにより、追加の第２の拡大培養を実施することであって、追加の第２の拡大培養は、ステップ（ｉｉｉ）で得られたよりも大きいＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、第３の集団は、生存率について更にアッセイされる、実施すること
を更に含む。
【０４９３】
[00655]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）前に、細胞は、凍結保存される。
【０４９４】
[00656]  一部の実施形態において、細胞は、ステップ（ｉ）の実施前に解凍される。
【０４９５】
[00657]  一部の実施形態において、分析に十分なＴＩＬを得るため、ステップ（ｉｖ）が１〜４回繰り返される。
【０４９６】
[00658]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は、約４０日〜約５０日の期間内に実施される。
【０４９７】
[00659]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は、約４２日〜約４８日の期間内に実施される。
【０４９８】
[00660]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は、約４２日〜約４５日の期間内に実施される。
【０４９９】
[00661]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）は、約４４日以下で実施される。
【０５００】
[00662]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）からの細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８及びＴＣＲαβを、新鮮に回収された細胞と同程度に発現する。
【０５０１】
[00663]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。
【０５０２】
[00664]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、ステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに細胞培養物に添加される。
【０５０３】
[00665]  一部の実施形態において、ＡＰＣは、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
【０５０４】
[00666]  一部の実施形態において、本方法は、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【０５０５】
[00667]  一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ（ｉ）前に行われる。
【０５０６】
[00668]  一部の実施形態において、本方法は、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップを更に含む。
【０５０７】
[00669]  一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ（ｉ）前に行われる。
【０５０８】
[00670]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、生存率に関してアッセイされる。
【０５０９】
[00671]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、凍結保存後に生存率に関してアッセイされる。
【０５１０】
[00672]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、凍結保存後及びステップ（ｉｖ）後に生存率に関してアッセイされる。
【０５１１】
[00673]  Ｔ及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られているが多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（結合）及びＣ（定数）の遺伝子セグメントは、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流側での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を示し、増加させるＴＩＬを生成する方法を提供する（ポリクローナル性と称されることがある）。一部の実施形態において、Ｔ細胞レパートリーの多様性の増加は、新鮮に回収されたＴＩＬ及び／又は例えば図８に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して生存率が増加した。一部の実施形態において、本方法により得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、第１の拡大培養で得られたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。一部の実施形態において、多様性の増加は、免疫グロブリンの多様性及び／又はＴ細胞受容体の多様性の増加である。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン重鎖にある。一部の実施形態において、免疫グロブリンの多様性は、免疫グロブリン軽鎖にある。一部の実施形態において、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。一部の実施形態において、多様性は、α、β、γ及びδ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体の１つにある。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α及び／又はβの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αの発現が増加する。一部の実施形態において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）βの発現が増加する。一部の実施形態において、ＴＣＲａｂ（即ちＴＣＲα／β）の発現が増加する。
【０５１２】
[00674]  本開示によれば、ＴＩＬの生存率をアッセイする方法及び／又は対象への投与における更なる使用である。一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をアッセイする方法は、
（ｉ）第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｉｉ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；及び
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多い、生じさせること；
（ｉｖ）第３のＴＩＬ集団を回収し、洗浄し、且つ凍結保存すること；
（ｖ）凍結保存ＴＩＬを極低温で貯蔵すること；
（ｖｉ）第３のＴＩＬ集団を解凍して、解凍された第３のＴＩＬ集団を提供すること；及び
（ｖｉｉ）第３の集団の細胞培養培地にＩＬ−２、ＯＫＴ−３及びＡＰＣを添加することにより、解凍された第３のＴＩＬ集団の一部の追加の第２の拡大培養を少なくとも３日の追加的拡大培養期間（ｒｅＲＥＰ期間と称される場合もある）にわたって実施することであって、この第３の拡大培養は、第４のＴＩＬ集団を得るために実施され、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数は、比を求めるために第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と比較される、実施すること；
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の比に基づき、解凍されたＴＩＬ集団が患者への投与に好適であるかどうかを決定すること；
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）において、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、治療有効投与量の解凍された第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む。
【０５１３】
[00675]  一部の実施形態において、追加の拡大培養期間（ｒｅＲＥＰ期間と称される場合もある）は、第４のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第３のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５０：１より大きくなるまで実施される。
【０５１４】
[00676]  一部の実施形態において、治療有効投与量のために十分なＴＩＬの数は、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０個である。
【０５１５】
[00677]  一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は、約４０日〜約５０日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は、約４２日〜約４８日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は、約４２日〜約４５日の期間内に実施される。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）〜（ｖｉｉ）は、約４４日以下で実施される。
【０５１６】
[00678]  一部の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）又は（ｖｉｉ）からの細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８及びＴＣＲαβを、新鮮に回収された細胞と同程度に発現する。一部の実施形態において、細胞は、ＴＩＬである。
【０５１７】
[00679]  一部の実施形態において、抗原提示細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、ステップ（ｉｉｉ）において９〜１７日目のいずれかに細胞培養物に添加される。
【０５１８】
[00680]  一部の実施形態において、ＡＰＣは、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。
【０５１９】
[00681]  一部の実施形態において、高親和性Ｔ細胞受容体をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップである。
【０５２０】
[00682]  一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ（ｉ）前に行われる。
【０５２１】
[00683]  一部の実施形態において、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合した単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで第１のＴＩＬ集団を形質導入するステップである。
【０５２２】
[00684]  一部の実施形態において、形質導入ステップは、ステップ（ｉ）前に行われる。
【０５２３】
[00685]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、ステップ（ｖｉｉ）後に生存率に関してアッセイされる。
【０５２４】
[00686]  本開示は、ＴＩＬをアッセイする更なる方法も提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＴＩＬをアッセイする方法を提供し、この方法は、
（ｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を得ること；
（ｉｉ）第１の凍結保存ＴＩＬ集団の一部を解凍すること；
（ｉｉｉ）ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の一部を少なくとも３日の追加的拡大培養期間（ｒｅＲＥＰ期間と称される場合もある）にわたって培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１のＴＩＬ集団からの一部は、比を求めるために第２のＴＩＬ集団と比較され、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比は、５：１より大きいこと、生じさせること；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の比に基づき、第１のＴＩＬ集団が患者への治療的投与における使用に好適であるかどうかを決定すること；
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数との比が５：１より大きいと決定されるとき、第１のＴＩＬ集団が治療的投与における使用に好適であると決定すること
を含む。
【０５２５】
[00687]  一部の実施形態において、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬ数と第１のＴＩＬ集団の一部のＴＩＬ数との比は、５０：１より大きい。
【０５２６】
[00688]  一部の実施形態において、本方法は、本明細書に提供される任意の実施形態に記載される通りの方法により、ステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体の拡大培養を実施することを更に含む。
【０５２７】
[00689]  一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉ）からの第１の凍結保存ＴＩＬ集団全体を患者に投与することを更に含む。
【０５２８】
Ｌ．ＴＩＬ製造用閉鎖系
[00690]  本発明は、ＴＩＬ培養プロセス中の閉鎖系の使用を提供する。かかる閉鎖系は、微生物汚染の防止及び／又は削減を可能にし、使用するフラスコの数が少なくなり、コスト削減が可能となる。一部の実施形態において、閉鎖系は、２つの容器を使用する。
【０５２９】
[00691]  かかる閉鎖系は、当技術分野で公知であり、例えばhttp://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及びhttps://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm.に記載されている。
【０５３０】
[00692]  一部の実施形態において、閉鎖系は、例えば、実施例１６に記載されるようなルアーロック及びヒートシール系を含む。一部の実施形態において、系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、閉鎖系は、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。一部の実施形態において、実施例１６に記載されるような閉鎖系が使用される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、セクション８．１４「最終製剤及び充填」の実施例１６に記載される方法に従って最終製品製剤容器中に製剤化される。
【０５３１】
[00693]  ＦＤＡのウェブサイトで提供されているように、滅菌方法を備えた閉鎖系は、公知であり、詳細に記載されている。https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htmを参照されたい。上記で参照され、以下の関連箇所において提供されている。
【０５３２】
序論
[00694]  滅菌接続装置（ＳＴＣＤ）は、互換性のある２つの配管間に滅菌溶接を産生する。この手順により、様々な直径の容器及びチューブを滅菌接続できる。このガイダンスでは、これらの装置の使用に関する推奨管理基準及び手順について記載する。このガイダンスは、滅菌接続装置の製造業者がマーケティングの承認又は認可を得るためにＦＤＡに提出しなければならないデータ又は情報は取り扱っていない。また、表示方法において許可されていない目的で承認又は認可された滅菌接続装置を使用すると、米連邦食品医薬品化粧品法下で装置が粗悪品及び不正表示品と見なされる可能性があることに注意することも重要である。
【０５３３】
[00695]  一部の実施形態において、閉鎖系は、腫瘍断片が得られた時点から、ＴＩＬが、患者への投与又は凍結保存の準備が整うまで１つの容器を使用する。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、第１の容器は、閉鎖型Ｇコンテナであり、ＴＩＬ集団は、遠心され、第１の閉鎖型Ｇコンテナを開かずに輸注バッグに移される。一部の実施形態において、２つの容器が使用される場合、輸注バッグは、HypoThermosol含有輸注バッグである。閉鎖系又は閉鎖ＴＩＬ細胞培養系は、腫瘍サンプル及び／又は腫瘍断片が追加されると、系が外側から確実に密閉され、細菌、真菌及び／又は他の微生物汚染がない閉鎖環境を形成する。
【０５３４】
[00696]  一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約５％〜約１００％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約５％〜約９５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約５％〜約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約１０％〜約９０％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約１５％〜約８５％である。一部の実施形態において、微生物汚染の減少は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％である。
【０５３５】
[00697]  閉鎖系は、微生物汚染の不在下及び／又は大幅に減少させ、ＴＩＬを成長させる。
【０５３６】
[00698]  更に、ＴＩＬ細胞培養環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧は、細胞が培養されるにつれてそれぞれ変化する。したがって、細胞培養に適した培地が流通していても、ＴＩＬ成長に最適な環境として閉鎖環境を常に維持する必要がある。このため、閉鎖環境の培地内のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧の物理的要因は、センサーによって監視され、そのセンサーの信号は、培養環境の入口に設置されたガス交換器の制御に使用され、閉鎖環境のガス分圧は、細胞培養環境を最適化するため、培地の変化に従ってリアルタイムで調整されることが望ましい。一部の実施形態において、本発明は、閉鎖環境への入口に、閉鎖環境のｐＨ、二酸化炭素分圧及び酸素分圧を測定し、監視装置からの信号に基づいてガス濃度を自動的に調整することにより、細胞培養環境を最適化する監視装置を備えたガス交換器を一体化した閉鎖細胞培養系を提供する。
【０５３７】
[00699]  一部の実施形態において、閉鎖環境内の圧力は、連続的又は断続的に制御される。即ち、閉鎖環境内の圧力は、例えば、圧力維持装置によって変化させることができ、即ち空間が陽圧状態のＴＩＬの成長に適していることを保証するか、又は陰圧状態の流体の滲出を促進し、したがって細胞成長を促進することを確実にする。更に、断続的に負圧を加えることにより、閉鎖環境の容積の一時的な収縮によって閉鎖環境内の循環液を均一且つ効率的に交換することが可能である。
【０５３８】
[00700]  一部の実施形態において、ＴＩＬの成長に最適な培養成分を置換又は追加することができ、ＩＬ−２及び／又はＯＫＴ３などの要因並びに組み合わせを追加し得る。
【０５３９】
Ｃ．細胞培養
[00701]  ある実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、上記で考察され図８で例示されているものを含み、約５，０００ｍＬ〜約２５，０００ｍＬの細胞培養培地、約５，０００ｍＬ〜約１０，０００ｍＬの細胞培養培地又は約５，８００ｍＬ〜約８，７００ｍＬの細胞培養培地を使用することを含み得る。一部の実施形態において、培地は、例えば、実施例２１に記載されるように、無血清培地である。一部の実施形態において、第１の拡大培養の培地は、無血清である。一部の実施形態において、第２の拡大培養の培地は、無血清である。一部の実施形態において、第１及び第２の拡大培養の培地は、両方とも無血清である。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えばAIM-V細胞培養培地（Ｌ−グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad CA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では、有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。一実施形態において、ＴＩＬの数を拡大することは、３日又は４日に１回以下の頻度で細胞にフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
【０５４０】
[00702]  一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培養培地は、ろ過されていない。ろ過されていない細胞培養培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培養培地は、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を欠いている。
【０５４１】
[00703]  ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織サンプルを得ること；細胞培養培地が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織サンプルを培養すること；腫瘍組織サンプルからＴＩＬを得ること；細胞培養培地を含有する第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約７〜１４日間、例えば約１１日間拡大することを含む本方法の所要期間である。一部の実施形態において、プレＲＥＰは、約７〜１４日間、例えば約１１日間である。一部の実施形態において、ＲＥＰは、約７〜１４日間、例えば約１１日間である。
【０５４２】
[00704]  一実施形態において、ＴＩＬは、ガス透過性容器内で拡大培養する。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７  Ａ１号（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含め、当技術分野において公知の方法、組成物及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。一実施形態において、ＴＩＬは、ガス透過性バッグ内で拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ及び約１０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。
【０５４３】
[00705]  一実施形態において、ＴＩＬは、G-Rexフラスコ（Wilson Wolf Manufacturingから市販されている）において拡大培養することができる。そのような実施形態は、細胞集団が約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｃｍ２に拡大培養することを可能にする。一実施形態において、これは、フィードなしである。一実施形態において、これは、G-Rexフラスコ内に約１０ｃｍの高さの培地がある限りフィードなしである。一実施形態において、これにフィードはないが、１つ以上のサイトカインが加えられる。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置及び方法は、当技術分野において公知であり、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７  Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８  Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０  Ｂ２号、国際公開第２０１１／０７２０８８  Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３  Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５  Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０  Ｂ２号、国際公開第２０１３／１７３８３５  Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６  Ａ１号（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスは、Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292にも記載されている。
【０５４４】
Ｄ．任意選択のＴＩＬ遺伝子改変
[00706]  一部の実施形態において、ＴＩＬは、任意選択により、限定はされないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えばＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ−ＥＳＯ−１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えば、ＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加の機能性を含むように遺伝子改変される。
【０５４５】
[00707]  Ｅ．任意選択のＴＩＬ凍結保存
[00708]  バルクＴＩＬ集団又は拡大培養されたＴＩＬ集団は、任意選択により凍結保存できる。一部の実施形態において、治療用ＴＩＬ集団で凍結保存が行われる。一部の実施形態において、凍結保存は、第２の拡大培養後に回収されたＴＩＬで生じる。一部の実施形態において、図８の例示的ステップＦのＴＩＬで凍結保存が行われる。一部の実施形態において、ＴＩＬは輸注バッグ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、輸注バッグでの置換前に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、凍結保存されるが輸注バッグ中には置かれない。一部の実施形態において、凍結保存は凍結保存培地を使用して実施される。一部の実施形態において、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する。これは、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中にＴＩＬ集団を入れることにより達成される。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。
【０５４６】
[00709]  適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は、概して完全培地中に再懸濁され、任意選択により１回以上洗浄される。一部の実施形態において、当技術分野において公知の通り解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
【０５４７】
[00710]  好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団はＣＳ１０凍結保存培地（CryoStor 10、BioLife Solutions）を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は凍結保存培地（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する）を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、１：１（容積：容積）の比のＣＳ１０及び細胞培養培地を用いて凍結保存される。好ましい実施形態において、ＴＩＬの集団は、約１：１（容積：容積）の比のＣＳ１０及び細胞培養培地を使用し、更に追加のＩＬ−２を含んで凍結保存される。
【０５４８】
[00711]  ステップＡ〜Ｅにおいて上記で考察した通り、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。
【０５４９】
[00712]  上記で考察し、且つ図８に提供されるステップＡ〜Ｅにおいて例示した通り、ＴＩＬ拡大培養プロセス全体を通じて数々の時点で凍結保存を行うことができる。一部の実施形態において、（例えば、図ＡのステップＤに従って提供される）第２の拡大培養後の拡大培養されたＴＩＬ集団は、凍結保存することができる。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中にＴＩＬ集団を置くことにより達成され得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。一部の実施形態において、ＴＩＬは、５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、細胞培養培地＋５％ＤＭＳＯ中に凍結保存される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、実施例１６に提供される方法に従って凍結保存される。
【０５５０】
[00713]  一部の実施形態において、ステップＢに係る第１の拡大培養後のバルクＴＩＬ集団又はステップＤに係る１回以上の第２の拡大培養後の拡大培養ＴＩＬ集団が凍結保存され得る。凍結保存は、概して、凍結溶液、例えば８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中にＴＩＬ集団を置くことにより達成され得る。この溶液中の細胞を極低温バイアルに入れ、−８０℃で２４時間貯蔵し、任意選択により凍結保存のため気体窒素フリーザーに移す。Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986を参照されたい。
【０５５１】
[00714]  適切な場合、細胞をフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で溶液の約５分の４が解凍されるまで解凍する。細胞は、概して完全培地中に再懸濁され、任意選択により１回以上洗浄される。一部の実施形態において、当技術分野において公知の通り解凍ＴＩＬをカウントし、生存率に関して評価することができる。
【０５５２】
[00715]  ある場合には、ステップＢのＴＩＬ集団は、以下で考察するプロトコルを用いて直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクＴＩＬ集団にステップＣ及びステップＤを施し、ステップＤ後に凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬを治療に使用する場合、ステップＢ又はステップＤのＴＩＬ集団は、適切な処置のため遺伝子修飾の対象となり得る。
【０５５３】
Ｖ．患者の処置方法
[00716]  処置方法は、最初のＴＩＬ収集及びＴＩＬの培養から始まる。かかる方法については、両方とも当技術分野において例えばJin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292（全体として参照により本明細書に組み込まれる）により記載されている。処置方法の実施形態は、実施例を含む以下のセクション全体で説明される。
【０５５４】
[00717]  本明細書に記載の方法、例えば上記のステップＡ〜Ｆに記載の方法を含むか、又は上記のステップＡ〜Ｆに記載の方法（例えば、図８にも示される）に従って作製された拡大培養ＴＩＬは、癌患者の処置における特定の使用（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGoff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239並びに補足内容）が見出される。一部の実施形態において、ＴＩＬは、先述の通り転移性黒色腫の寄託切除物から成長させた（Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342を参照されたい；全体として参照により本明細書に組み込まれる）。新鮮腫瘍は無菌条件下で剥離し得る。正式な病理解析のため、代表サンプルを収集し得る。２ｍｍ３〜３ｍｍ３の単一の断片が使用され得る。一部の実施形態において、患者１人あたり５、１０、１５、２０、２５又は３０のサンプルを得る。一部の実施形態において、患者１人あたり２０、２５又は３０のサンプルを得る。一部の実施形態において、患者１人あたり２０、２２、２４、２６又は２８のサンプルを得る。一部の実施形態において、患者１人あたり２４のサンプルを得る。サンプルを２４ウェルプレートの個々のウェルに置き、高用量ＩＬ−２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む成長培地中に維持し、腫瘍の破壊及び／又はＴＩＬの増殖に関してモニターし得る。処理後に生細胞が残っている任意の腫瘍を酵素消化して単一細胞懸濁液にし、本明細書に記載される通り凍結保存し得る。
【０５５５】
[00718]  一部の実施形態において、表現型分析（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ５６）のため、増殖に成功したＴＩＬをサンプリングし、利用可能な場合には自己腫瘍に対して試験し得る。ＴＩＬは、一晩の共培養によりインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）レベル＞２００ｐｇ／ｍＬ及びバックグラウンドの２倍となった場合に応答性であると見なすことができる。（Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847；全体として参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態において、自己応答性又は十分な成長パターンのエビデンスを有する培養物が、急速拡大培養（ＲＥＰ）と称されることもある第２の拡大培養を含め、第２の拡大培養（例えば、図８のステップＤにおいて提供される通りの第２の拡大培養）に選択され得る。一部の実施形態において、高い自己応答性（例えば、第２の拡大培養中の高い増殖）を有する拡大培養ＴＩＬが、追加の第２の拡大培養に選択される。一部の実施形態において、自己応答性（例えば、図８のステップＤに提供される通りの第２の拡大培養中の高い増殖）を有するＴＩＬが、図８のステップＤに係る追加の第２の拡大培養に選択される。
【０５５６】
[00719]  一部の実施形態において、患者はＡＣＴ（養子細胞移入）に直接移されず、例えば一部の実施形態において、腫瘍回収後及び／又は第１の拡大培養後、細胞は、直ちには利用されない。そのような実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の２日前に解凍することができる。そのような実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の１日前に解凍することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存し、患者への投与の直前に解凍することができる。
【０５５７】
[00720]  輸注バッグＴＩＬの凍結保存サンプルの細胞表現型は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡ（BD BioSciences）に関するフローサイトメトリー（例えば、FlowJo）並びに本明細書に記載される方法のいずれかによって分析することができる。血清サイトカインは標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ法を用いることにより測定した。血清ＩＦＮ−ｇの上昇は、＞１００ｐｇ／ｍＬ及び４、３ベースラインレベル超と定義した。
【０５５８】
[00721]  一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図８に例示される方法により作製されるＴＩＬは、ＴＩＬの臨床有効性の驚くべき改善を提供する。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図８に例示される方法により作製されるＴＩＬは、例えば図８に例示される方法以外の方法を含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるＴＩＬと比べて臨床有効性が増加する。一部の実施形態において、本明細書に記載されているもの以外の方法は、プロセス１Ｃ及び／又はジェネレーション１（Ｇｅｎ１）と称される方法を含む。一部の実施形態において、有効性の増加は、ＤＣＲ、ＯＲＲ及び／又は他の臨床応答によって測定される。一部の実施形態において、本明細書で提供される方法、例えば図８に例示される方法により作製されるＴＩＬは、例えば図８に例示される方法以外の、例えばＧｅｎ１プロセスを含む、本明細書に記載されるもの以外の方法により作製されるＴＩＬと比べて同様の応答時間及び安全プロファイルを示す。
【０５５９】
[00722]  一部の実施形態において、ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）は、処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された対象の血液中のＩＦＮ−γは、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ−γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ−γ産生は、本発明の方法、例えば図８に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液、血清又はＴＩＬエキソビボ中のサイトカインＩＦＮ−γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γの増加は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、Quantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、例えば、図８に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬエキソビボで測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、例えば、図８に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液で測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、例えば、図８に記載されるものを含む、本発明の方法により調製されたＴＩＬで処置された対象のＴＩＬ血清で測定される。
【０５６０】
[00723]  一部の実施形態において、例えば図８に記載されるものを含む本発明の方法により調製されたＴＩＬは、例えば、図８に例示されない、例えばプロセス１Ｃメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるＴＩＬと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び／又は増加したポリクローナル性は、処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法に作製されたＴＩＬを投与された患者に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図８に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍又は１０００倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０００倍増加する。
【０５６１】
[00724]  有効性の尺度には、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されるように、疾患制御率（ＤＣＲ）並びに全奏効率（ＯＲＲ）が含まれ得る。
【０５６２】
１．癌及び他の疾患の処置方法
[00725]  本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患の処置方法で使用することができる。一実施形態において、それらは過剰成長性障害の処置に使用するためのものである。それらは、本明細書及び以下の段落に記載されている通り他の障害の処置にも使用され得る。
【０５６３】
[00726]  一部の実施形態において、過剰成長性障害は癌である。一部の実施形態において、過剰成長性障害は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、過剰成長性障害は血液学的悪性腫瘍である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
【０５６４】
[00727]  一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、ここで患者は本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入の２７〜２３日前）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。一実施形態において、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は生理学的許容量まで８時間毎に７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ−２の静脈内注入を受ける。
【０５６５】
[00728]  示された疾患又は障害の処置、予防及び／又は管理における本明細書に記載の化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の処置のためのガイダンスを提供する当技術分野でにおいて公知の様々なモデルを使用して試験することができる。例えば、卵巣癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92；及びFong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12に記載がある。膵臓癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294に記載がある。乳癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212に記載がある。黒色腫の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859に記載がある。肺癌の処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664に記載がある。肺癌処置の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60；及びSano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32に記載がある。
【０５６６】
[00729]  一部の実施形態において、ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）は、過剰成長性傷害の処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＴＩＬで処置された対象の血液中のＩＦＮ−γは、活性ＴＩＬの指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ−γ産生は、細胞傷害能のもう１つの尺度である。ＩＦＮ−γ産生は、本発明の方法、例えば図８に例示されるものを含む方法により調製されたＴＩＬで処置された対象の血液中のサイトカインＩＦＮ−γのレベルを決定することにより測定できる。一部の実施形態において、本方法で得られたＴＩＬは、図１３及び本出願全体に例示されるように、プロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された対象と比較して、本方法のＴＩＬで処置された対象の血液中のＩＦＮ−γの増加をもたらす。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γの増加は、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者における処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以上増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、３倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、４倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γ分泌は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５倍増加する。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、Quantikine ELISA kitを使用して測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者からのＴＩＬエキソビボにおいて測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者の血液において測定される。一部の実施形態において、ＩＦＮ−γは、本発明の方法により作製されたＴＩＬで処置された患者の血清において測定される。
【０５６７】
[00730]  一部の実施形態において、例えば図８に記載されるものを含む本発明の方法により調製されたＴＩＬは、例えば、図８に例示されない、例えばプロセス１Ｃメソッドと称されるものを含む他の方法により作製されるＴＩＬと比較してポリクローナル性の増加を示す。一部の実施形態において、有意に改善されたポリクローナル性及び／又は増加したポリクローナル性は、癌処置の処置有効性及び／又は臨床有効性の増加の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性とは、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。一部の実施形態において、ポリクローナル性の増加は、本発明の方法によって作製されたＴＩＬの投与に関する処置有効性の指標である。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、例えば、図８に具体化された方法以外の方法を含む、本明細書で提供する以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍又は１０００倍が増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、２倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、５００倍増加する。一部の実施形態において、ポリクローナル性は、未処置患者と比較して、及び／又は本明細書で提供するもの以外の方法、例えば図８で具体化された方法以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで処置された患者と比較して、１０００倍増加する。
【０５６８】
２．共投与方法
[00731]  一部の実施形態において、本明細書に記載されるように作製されるＴＩＬ（例えば、図８のステップＡ〜Ｆに記載される方法から得られたＴＩＬを含む）は、以下に記載する抗体など、１つ以上の免疫チェックポイント調節因子と併用して投与することができる。例えば、ＰＤ−１を標的とする、且つ本発明のＴＩＬと共投与し得る抗体としては、例えば、限定はされないが、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Bristol-Myers Squibb；Opdivo（登録商標））、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５又はＭＫ−３４７５、Merck；Keytruda（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ＪＳ００１（ShangHai JunShi）、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体ＴＳＲ−０４２（Tesaro, Inc.）、ピジリズマブ（抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  ＣＴ−０１１、Medivation）、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＢＧＢ−Ａ３１７（BeiGene）及び／又は抗ＰＤ−１抗体ＳＨＲ−１２１０（ShangHai HengRui）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Regeneron）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ−１１０６（Bristol-Myers Squibb）及び／又はヒト化抗ＰＤ１  ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Novartis）が挙げられる。一部の実施形態において、ＰＤ−１抗体は、クローン：ＲＭＰ１−１４（ラットＩｇＧ）−BioXcellカタログ番号BP0146からのものである。本明細書に記載される通りのステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、米国特許第８，００８，４４９号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される抗ＰＤ−１抗体である。一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分はＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−１とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ−Ｌ１に結合してＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する当技術分野において公知の任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適である。例えば、ＰＤ−Ｌ１を標的とする臨床試験中の抗体としては、ＢＭＳ−９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Genentech）が挙げられる。ＰＤ−Ｌ１を標的とする他の好適な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される。当業者は、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を破壊し、且つ抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に記載される通りのステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬとの共投与方法における使用に好適であることを理解するであろう。一部の実施形態において、ステップＡ〜Ｆにより作製されるＴＩＬの組み合わせを投与される対象は、患者が抗ＰＤ−１抗体単独の投与に不応性の癌型を有するとき抗ＰＤ−１抗体と共投与される。一部の実施形態において、患者が難治性黒色腫を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ−１と併用して投与される。一部の実施形態において、患者が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有するとき、患者はＴＩＬを抗ＰＤ−１と併用して投与される。
【０５６９】
３．任意選択による患者のリンパ球枯渇プレコンディショニング
[00732]  一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を含み、ここで患者は本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、本発明は、骨髄非破壊的化学療法で前処置された患者の癌処置に使用するためのＴＩＬの集団を含む。一実施形態において、ＴＩＬの集団は注入による投与用である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入の２７〜２３日前）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るＴＩＬ注入（０日目）後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ−２（アルデスロイキン、PROLEUKINとして市販）の静脈内注入を受ける。特定の実施形態において、ＴＩＬの集団は、ＩＬ−２と組み合わせて癌を処置するのに使用され、ＩＬ−２はＴＩＬの集団後に投与される。
【０５７０】
[00733]  実験的知見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
【０５７１】
[00734]  一般的に、リンパ球枯渇はフルダラビン又はシクロホスファミド（活性型はマホスファミドと称される）及びその組み合わせの投与を使用して達成される。かかる方法については、Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239及びDudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357（これらは、全て参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０５７２】
[00735]  一部の実施形態において、フルダラビンは、０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間にわたって実施される。
【０５７３】
[00736]  一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度で得られる。一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により１μｇ／ｍＬの濃度で得られる。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日又は３００ｍｇ／ｍ２／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内（即ちｉ．ｖ．）投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で、４〜５日間にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で、４日間にわたって実施される。
【０５７４】
[00737]  一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスファミドを共に患者に投与することによって行われる。一部の実施形態において、４日間にわたって、フルダラビンは２５ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与され、シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与される。
【０５７５】
[00738]  一実施形態において、リンパ球枯渇は、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与により実施される。
４．ＩＬ−２レジメン
【０５７６】
[00739]  一実施形態において、ＩＬ−２レジメンは、治療有効部分の投与の翌日から静脈内投与される高用量ＩＬ−２レジメンを含み、治療用ＴＩＬ集団の治療有効部分を投与した１日後から静脈に内投与され始め、高用量ＩＬ−２レジメンはアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくはそれらの変異体を含み、アルデロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体が８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入を使用して、最大１４用量において０．０３７ｍｇ／ｋｇ又は０．０４４ｍｇ／ｋｇ  ＩＵ／ｋｇ（患者の体重）の用量で投与される。９日間の静置後、このスケジュールを更に１４回、合計で最大２８回まで繰り返し得る。
【０５７７】
[00740]  一実施形態において、ＩＬ−２レジメンは、漸減性ＩＬ−２レジメンを含む。漸減性ＩＬ−２レジメンは、O’Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61及びEton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、漸減性ＩＬ−２レジメンは、１８×１０６ＩＵ／ｍ２の６時間にわたる静脈内投、それに続く１８×１０６ＩＵ／ｍ２の１２時間にわたる静脈内投与、その後、１８×１０６ＩＵ／ｍ２の２４時間にわたる静脈内投与、その後、４．５×１０６ＩＵ／ｍ２の７２時間にわたる静脈内投与を含む。この処置サイクルは、最大４サイクル、２８日毎に繰り返し得る。一実施形態において、漸減性ＩＬ−２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ２、３日目及び４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ２を含む。
【０５７８】
[00741]  一実施形態において、ＩＬ−２レジメンは、０．１０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日の用量において１、２、４、６、７、１４又は２１日毎にペグ化ＩＬ−２を投与することを含む。
【０５７９】
５．養子細胞移入
[00742]  養子細胞移入（ＡＣＴ）は、非常に有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を癌患者に移入することを含む。ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロ同定、それらの細胞の数を増やすインビトロ拡大培養及び癌担持宿主へのその注入を伴う治療手法である。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍の間質に由来し得る（腫瘍浸潤リンパ球又はＴＩＬ）。ＡＣＴのためのＴＩＬは、本明細書に記載される通り調製することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、例えば、図８に記載される通りの方法により調製される。ＴＩＬは、抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている場合に血液からも誘導され得るか、混合リンパ球腫瘍細胞培養物（ＭＬＴＣ）でエンリッチされ得るか、又は自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされ得る。注入される癌担持宿主にリンパ球が由来するＡＣＴは、自己ＡＣＴと称される。米国特許出願公開第２０１１／００５２５３０号は、主に転移性黒色腫に罹患している患者の治療に向けた、癌退縮を促進するため養子細胞療法を実施する方法に関する（これらの方法に関して全体として参照により組み込まれる）。一部の実施形態において、ＴＩＬは、本明細書に記載される通り投与することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは単回用量で投与することができる。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球は複数回用量で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回を超え得る。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬ及び／又は細胞傷害性リンパ球の投与は必要な限り継続され得る。
【０５８０】
６．例示的処置の実施形態
[00743]  一部の実施形態において、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を処置する方法を提供し、この方法は、（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得るステップ；（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を実施することにより、第２のＴＩＬ集団を得るステップであって、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の急速拡大培養を実施することにより、第３のＴＩＬ集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く；第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含む、ステップ；（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップを含む。一部の実施形態において、本開示は、癌の処置における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であり、ＴＩＬ集団は、（ｂ）第１の細胞培養培地中において、患者から切除された腫瘍から得られた第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を実施することにより、第２のＴＩＬ集団を得るステップであって、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の急速拡大培養を実施することにより、第３のＴＩＬ集団を得るステップであって、急速拡大培養の開始から７日後、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く；第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含む、ステップ；（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップを含む方法によって得ることができる。一部の実施形態において、本方法は、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得る第１のステップ（ａ）を含む。一部の実施形態において、第２の細胞培養培地中において、ＩＬ−２は、約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、及びＯＫＴ−３抗体は、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する。一部の実施形態において、第１の拡大培養は、１４日以下の期間にわたって実施される。一部の実施形態において、第１の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して実施される。一部の実施形態において、急速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は、１：８０〜１：４００である。一部の実施形態において、急速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は、約１対３００である。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌及び腎細胞癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫、卵巣癌及び子宮頸癌からなる群から選択される。一部の実施形態において、処置される癌は、黒色腫である。一部の実施形態において、処置される癌は、卵巣癌である。一部の実施形態において、処置される癌は、子宮頸癌である。一部の実施形態において、癌の処置方法は、患者に第３のＴＩＬ集団を投与する前に骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンによって患者を処置するステップを更に含む。一部の実施形態において、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む。一部の実施形態において、高用量ＩＬ−２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む。一部の実施形態において、処置に使用されるＴＩＬは、第１及び／又は第２の拡大培養、例えば図８のステップＢ、Ｃ及び／又はＤ中に細胞培養培地に添加され得るＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡと接触しており、ここで、ＴＩＬ及び他の薬剤は、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地からなる群から選択される量で添加され得る。一部の実施形態において、処置に使用されるＴＩＬは、第１及び／又は第２の拡大培養、例えば図８のステップＢ、Ｃ及び／又はＤ中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡと接触している。一実施形態において、処置に使用されるＴＩＬは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡと接触しており、ここで、ＴＩＬ及び他の薬剤は、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬからなる群から選択される量において、第１及び／又は第２の拡大培養、例えば図８のステップＢ、Ｃ及び／又はＤ中に添加され得る。一実施形態において、処置に使用されるＴＩＬは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の遺伝子を標的とする１つ以上のｓｄ−ＲＮＡと接触しており、ここで、ＴＩＬ及び他の薬剤は、第１及び／又は第２の拡大培養、例えば図８のステップＢ、Ｃ及び／又はＤ中、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎又は７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る。
【実施例】
【０５８１】
実施例
[00744]  ここで、本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形形態を包含すると解釈されるべきである。
【０５８２】
実施例１：閉鎖系アッセイ
[00745]  本明細書で考察されるように、閉鎖系で患者の腫瘍からＴＩＬを開発するためのプロトコル及びアッセイが開発された。
【０５８３】
[00746]  この実施例では、G-REX装置で患者の切除腫瘍組織から臨床的に重要な数のＴＩＬを産生し、最終細胞製品を凍結保存するための新規簡略手順について説明する。この手順の追加の側面については、実施例２〜８で説明する。
【０５８４】
手順
[00747]  高度な調製：０日目（最大３６時間前に実施）、５００ｍＬのハンクス平衡塩類溶液に５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを添加して、ＴＩＬ分離洗浄バッファー（ＴＩＷＢ）を調製した。１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンストック溶液には、２．５ｍＬをＨＢＳＳに移した。５０ｍｇ／ｍＬのストック溶液には、０．５ｍＬをＨＢＳＳに移した。
【０５８５】
[00748]  ＣＭ２の手順については、ＬＡＢ−００５「プレＲＥＰ及びＲＥＰの培地の調製」に従ってGlutaMax（商標）でＣＭ１培地を調製した。４℃で最大２４時間貯蔵。使用前に少なくとも１時間、３７℃で温めた。
【０５８６】
[00749]  ＩＬ−２アリコートを−２０℃の冷凍庫から取り出し、２〜８℃の冷蔵庫に入れた。腫瘍標本を取り出し、処理の準備ができるまで４℃で貯蔵した。
【０５８７】
[00750]  HypoThermasol又はCryoStor CS10（いずれもBioLife Solutions,Inc.から市販されている）で凍結断片として未使用腫瘍を出荷した。
【０５８８】
ＴＩＬの腫瘍処理
[00751]  必要に応じて、以下の材料を無菌的にＢＳＣに移し、以下の表１６に従って表示を付した。
【０５８９】
【表１８】
2021509586.tif 000020
【０５９０】
[00752]  ５ｍＬのゲンタマイシンをＨＢＳＳボトルに移した。ＴＩＷＢと表示を付した。混ざるように撹拌した。５０ｍＬのＴＩＷＢを各皿にピペットした。長鉗子を使用し、標本ボトルから腫瘍を取り出し、洗浄１皿に移した。洗浄皿で、周囲温度で３分間腫瘍をインキュベートした。腫瘍を洗浄皿に移し、洗浄皿で周囲温度において３分間腫瘍をインキュベートした。新しい洗浄皿で洗浄を繰り返す。
【０５９１】
[00753]  腫瘍の長さを測定及び記録した。腫瘍断片を初めに１０の中間片に剥離し、各中間片の腫瘍構造を保存した。一度に１つの中間腫瘍断片を使用して、腫瘍を最大３×３×３ｍｍの断片に慎重に薄切りにした。残りの中間腫瘍断片について繰り返した。
【０５９２】
[00754]  利用可能な腫瘍断片が４つ未満である場合、４０の断片の目標を達成するために利用可能な他の断片を使用した。４０個未満の断片の場合、１０〜４０個を単一のG-Rex 100Mフラスコに入れた。
【０５９３】
G-Rex 100Mフラスコに播種する
[00755]  必要に応じて、以下の材料を無菌的にＢＳＣに移し、以下の表４に従って表示を付した。
【０５９４】
【表１９】
2021509586.tif 000021
【０５９５】
[00756]  ＣＭ１にリットル毎に１ｍＬのＩＬ−２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を添加した。
【０５９６】
[00757]  以下の表５で決定されるように、必要な各G-REX 100Mバイオリアクターに、６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１０００ｍＬの予め温めたＣＭ１を入れた。ホールピペットを使用して、適切な数の腫瘍断片を各G-Rex 100Mフラスコに移し、表５に従って断片を分配した。G-Rex 100Mフラスコに移した１つ以上の入手可能な腫瘍断片が浮かんでいる場合、追加の腫瘍断片を１つ取得し、G-Rex 100Mフラスコに移した。各フラスコに加えられた断片の総数を記録した。各G-REX 100Mバイオリアクターを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。
【０５９７】
[00758]  ＞４１の断片が得られた場合、１０００ｍＬの予め温めた完全なＣＭ１を第２のG-REX 100Mバイオリアクターに入れた。
【０５９８】
【表２０】
2021509586.tif 000022
【０５９９】
高度な調製：１１日目（最大２４時間前に調製）
[00759]  GlutaMaxで６ＬのＣＭ２を調製した。ＣＭ２の手順については、「プレＲＥＰ及びＲＥＰの培地の調製」の参考検査手順を使用した。使用の１時間前に３７℃で加温した。ＩＬ−２アリコートを解凍した：冷凍庫からＩＬ−２アリコートを取り出し、４℃に置いた。
【０６００】
ＴＩＬを回収する（１１日目）
[00760]  インキュベーターからG-REX-100Mフラスコを取り外し、ＢＳＣ２に入れた。フラスコの底にある細胞を乱さなかった。GatherRex又は蠕動式ポンプを使用して、フラスコから約９００ｍＬの細胞培養上清を吸引した。フラスコを静かに旋回させてＴＩＬを再懸濁した。全ての細胞が膜から遊離していることが観察された。残留細胞懸濁液を適切なサイズの血液移送パック（３００〜１０００ｍＬ）に移した。断片が血液移送パックに移らないように注意した。移送パックに４インチ血漿移送セットを固定した。細胞懸濁液を混合し、３ｍＬシリンジを使用して、細胞カウントのために１ｍＬのＴＩＬ懸濁液を取り出した。使用する準備ができるまで移送パックをインキュベーターに入れた。
【０６０１】
培地の調製
[00761]  培地を３７℃で＞１時間温めた。３ｍＬの６×１０６ＩＵ／ｍＬストックｒｈＩＬ−２を６ＬのＣＭ２に加え、最終濃度３，０００ＩＵ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２にした（「完全ＣＭ２」）。メスルアー付きの４インチ血漿移送セットを１Ｌ移送パックに滅菌溶接した。５００ｍＬの完全ＣＭ２を１Ｌ移送パックに移した。針付きの１．０ｍＬシリンジを使用して、１５０μＬの１ｍｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）を吸い上げ、５００ｍＬの「完全ＣＭ２」に移した。使用するまで３７℃で貯蔵した。
【０６０２】
フラスコの調製
[00762]  ４．５Ｌの「完全ＣＭ２」をG-REX-500Mフラスコに移し、準備ができるまでフラスコを３７℃のインキュベーターに入れた。
【０６０３】
照射フィーダーを解凍する
[00763]  ２人以上のドナーからの５．０×１０９の同種異系照射フィーダーを使用した。ＬＮ２冷凍庫からフィーダーを取り外した。フィーダーを３７℃のインキュベーター又はビーズバスで解凍した。ほぼ完全に解凍されたが、依然として冷えているときにフィーダーを浴から取り出した。十分な数の照射細胞（５×１０９個の細胞、＋／−２０％）を確保するため、各フィーダーバッグをオープンG-Rex 500Mに直接加えた。５００ｍＬの「完全ＣＭ２」＋ＯＫＴ３を含む１Ｌ移送パックを取り外し、ＢＳＣに移した。フィーダーバッグの内容物全体をシリンジに引き込み、容積を記録し、５．０×１０９個の同種異系照射フィーダーを移送パックに分配した。
【０６０４】
[00764]  標的細胞数の＋／−１０％（５．０×１０９）に＞７０％の生存率で到達した場合に続行した。標的細胞数の９０％未満（５．０×１０９）に＞７０％の生存率で到達した場合、別のバッグを解凍し、上記を繰り返した。標的細胞数の１１０％以上が達成された場合、所望の細胞用量に必要な適切容積を計算して進めた。
【０６０５】
G-REX 500MフラスコでのＴＩＬ及びフィーダーの共培養
[00765]  インキュベーターから調製済み培地を含むG-REX 500Mフラスコを取り外した。フィーダー移送パックをG-REX-500Mに取り付け、バッグの内容物を500Mに排出できるようにした。合計２００×１０６の生細胞を達成するために追加するＴＩＬ懸濁液の量を計算した。
（ＴＶＣ／ｍＬ）／２００×１０６＝ｍＬ
【０６０６】
[00766]  ＴＩＬが５〜２００×１０６の合計生細胞である場合、全てのＴＩＬ（全量）をG-REX-500Mに加えた。ＴＩＬカウントが生細胞総数２００×１０６を超えた場合、２００×１０６個のＴＩＬを個々のG-REX-500Mに分配するのに必要な量計算して加えた。残りのＴＩＬをスピンダウンし、ＣＳ１０で最大１０８／ｍＬの少なくとも２つのクライオバイアルで凍結し、ＴＩＬ識別表示及び凍結日付の表示を付した。
【０６０７】
[00767]  G-REX-500Mを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに５日間入れた。
【０６０８】
高度な調製：１６〜１８日目
[00768]  ５０×１０６個未満のＴＩＬで開始した培養のためのAIM Vの１０Ｌバッグ１つ、５０×１０６個を超えるＴＩＬで開始したバッグ２つを３７℃で少なくとも１時間又は使用する準備が整うまで温めた。
【０６０９】
ＴＩＬ細胞カウントを実施：１６〜１８日目
[00769]  インキュベーターからG-REX 500Mフラスコを取り外し、フラスコの底にある細胞培養物を乱さないように注意した。G-REX-500Mフラスコから４Ｌの細胞培養培地を取り出し、滅菌容器に入れた。全てのＴＩＬが膜から再懸濁されるまでG-REX-500Mを旋回させた。細胞懸濁液を２Ｌ移送パックに移した。後で使用するために500Mフラスコを保持した。以下の式に従い、継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。端数は切り上げた。
総生細胞／１．０×１０９＝フラスコ数
【０６１０】
ＣＭ４を調製する
[00770]  必要な500Mフラスコ２本毎に１０ＬのAIM-Vバッグを準備した。必要に応じて追加の培地を温めた。AIM-Vが１０Ｌ必要になる毎に１００ｍＬのGlutaMAXを加えてＣＭ４を作成した。３，０００ＩＵ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２の最終濃度のためにＣＭ４培地にｒｈＩＬ−２を添加した。細胞培養を分割する。各G-REX-500Mを５Ｌまで充填した。計算した数のG-REX-500MでＴＩＬ量を均等に分配した。ＲＥＰの２２日目に回収するまでフラスコを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。
【０６１１】
高度な調製：２２〜２４日目
[00771]  PlasmaLyte A 7.4の２つの１Ｌバッグのそれぞれに４０ｍＬの２５％ＨＳＡを加え、２Ｌの１％ＨＳＡ洗浄バッファーを調製した。LOVO補助バッグにプールする。６００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２で２００ｍＬのＣＳ１０を添加した。４つの７５０ｍＬアルミニウム冷凍庫キャニスターを４℃で予め冷却した。
【０６１２】
ＴＩＬを回収する：２２〜２４日目
[00772]  ３７℃のインキュベーターからG-REX 500Mフラスコを取り外し、フラスコの底にある細胞培養物を乱さないように注意した。各フラスコから細胞培養上清４．５Ｌを吸引して廃棄した。G-REX-500Mフラスコを旋回させて、ＴＩＬを完全に再懸濁した。ＴＩＬをバイオプロセスバッグに回収した。バッグをよく混合し、３ｍＬシリンジを使用して、細胞カウントのために２×２ｍＬのサンプルを採取した。バッグの重量を量り、初期重量と最終重量に差を発見した。以下の計算を使用して、細胞懸濁液の量を決定した。
細胞懸濁液の正味重量（ｍＬ）／１．０３＝容積（ｍＬ）
【０６１３】
[00773]  ＴＩＬをろ過してLOVO原料バッグを準備する。全細胞がLOVO原料バッグに移されると、全てのクランプを閉じ、LOVOソースバッグのチューブを密閉してフィルターを取り外し、秤量した。体積を計算した。
【０６１４】
[00774]  ６００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を添加した冷温のＣＳ１０でＴＩＬ１：１を処方する。
【０６１５】
[00775]  必要なクライオバッグの必要数を計算した。
（細胞製品の容積×２）／１００＝必要バッグ数（切り捨て）
【０６１６】
[00776]  各バッグに分注する容積を計算した。
（細胞製品の容積×２）／必要バッグ数＝各バッグに加える容積
【０６１７】
[00777]  表６の以下の材料をＢＳＣに無菌的に移した。
【０６１８】
【表２１】
2021509586.tif 000023
【０６１９】
ＴＩＬの製剤
[00778]  LOVO最終物、ＣＳ１０バッグルアーロック及び適切な数のクライオバッグが取り付けられた。必要なＣＳ１０容積は、LOVO最終物バッグの容積と同等であった。反転によりLOVO最終物バッグを混合した。
【０６２０】
[00779]  製剤化された産物１００ｍＬを各クライオバッグに移した。クライオバッグから全ての気泡を取り除き、密封した。密封したバッグを４℃にし、予め冷却したアルミニウム製冷凍キャニスターに置いた。
【０６２１】
コントロールレートフリーザー（ＣＲＦ）を使用したＴＩＬの凍結保存。
[00780]  速度を制御された冷凍庫の標準手順に従った。ＣＲＦを使用した後、液体窒素（ＬＮ２）にクライオバッグを貯蔵した。
【０６２２】
実施例２：リンパ球枯渇
[00781]  細胞は、７日目及びリンパ球減少前にカウントできる。最終細胞製品には、Plasma-Lyte A（商標）の最小５０％のHypoThermosol（商標）（容積／容積）及び３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を含む最大０．５％ＨＳＡ（ヒト注入に適合）で製剤化された最大約１５０×１０９個の生細胞が含まれる。最終産物は、注入のための２つの容積のいずれかで投与に使用できた。
１）回収された総ＴＩＬが≦７５×１０９個である場合、２５０ｍＬ（容量３００ｍＬの輸注バッグ内）、又は
２）回収された総ＴＩＬが＜１５０×１０９個である場合、５００ｍＬ（容量６００ｍＬの輸注バッグ内）
【０６２３】
[00782]  ＲＥＰステップ中のＴ細胞拡大培養率に患者間で差があるため、各患者の最終ＴＩＬ注入産物のために産生される可能性のある細胞の総数は予測できない。３〜１４日間のＲＥＰの３、４、５、６、７日目の細胞の下限は、シクロホスファミド及びフルダラビンの化学療法レジメンを使用して患者をリンパ球枯渇させる判断を下すために必要な最小細胞数に基づいて設定される。この最小到達細胞数に基づいてリンパ球枯渇を開始すると、３日目から１４日目のいずれか及び多くの場合には７日目までに、ＲＥＰで生成されるＴＩＬの利用可能な数で患者を処置することが約束される。注入の範囲の上限（１５０×１０９個の生細胞）は、臨床応答が達成された場合に安全に注入された公知の公開上限に基づいている。Radvanyi, et al., Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770。
【０６２４】
実施例３：プロセス２Ａ  −  ０日目
[00783]  この実施例では、実施例３〜６で説明した２Ａプロセスの詳細な０日目のプロトコルについて説明する。
【０６２５】
調製。
[00785]  腫瘍洗浄培地ＣＭ１及びＩＬ−２は、有効期限内であることを確認した。インキュベーターにＣＭ１（細胞培養培地１）を入れた。
【０６２６】
方法。
[00786]  ６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＴＩＬ培地ＣＭ１を調整した：１ＬのＣＭ１及び１ｍｌのＩＬ−２（６，０００，０００ＩＵ／ｍＬ）。G-REXに加えるときに断片に使用するため、２５ｍｌのＣＭ１＋ＩＬ２を５０ｍｌのコニカルに入れ、予温のため３７℃のインキュベーターに入れた。
【０６２７】
[00787]  各G-REX 100MCSバイオリアクターに、６，０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む予め温めた９７５ｍｌのＣＭ１を注入した。必要になるまでインキュベーターにG-REX 100MCSを入れた。
【０６２８】
組織剥離
[00788]  腫瘍処理の開始時間を記録した。過剰な腫瘍断片のために、３〜５ｍＬの腫瘍洗浄培地を１つの６ウェルプレートの各ウェルにピペットで入れた。５０ｍＬの腫瘍洗浄液をピペットで移し、皿１〜３と保持皿を洗浄した。２つの１５０ｍｍ剥離皿をバイオセーフティキャビネットに入れた。３本の滅菌５０ｍＬコニカルチューブをＢＳＣに入れた。５〜２０ｍＬの腫瘍洗浄培地を各コニカルに追加した。腫瘍の洗浄及び剥離プロセス中、必要に応じて、鉗子及びメスを腫瘍洗浄媒体に浸した。
【０６２９】
[00789]  標本ボトルから腫瘍を取り出し、洗浄１皿に移した。洗浄１皿で、周囲温度で≧３分間腫瘍をインキュベートした。腫瘍を洗浄２皿に移した。洗浄２皿で、周囲温度で≧３分間腫瘍をインキュベートした。腫瘍を洗浄３皿に移した。洗浄３皿で、周囲温度で≧３分間腫瘍をインキュベートした。剥離皿に腫瘍を移し、腫瘍の長さを測定及び記録した。
【０６３０】
[00790]  各中間片の腫瘍構造を保つように注意を払いながら、剥離皿の腫瘍断片を初めに中間片に剥離した。全剥離手順中に組織が水和したままにあるように皿を保持しながら、積極的に断片に剥離されていない中間腫瘍断片を組織に移した。
【０６３１】
[00791]  一度に１つの中間腫瘍断片を使用して、剥離皿で腫瘍をおよそ３×３×３ｍｍの断片に慎重に薄切りにした。中間片の全ての組織が判定されるまで中間腫瘍断片から断片を剥離し続けた。好ましい断片を選択し、トランスファーピペットを使用して、腫瘍断片皿の１つの円で洗浄培地の滴に最大４つの好ましい断片を移した。ホールピペット、メス又は鉗子を使用して、好ましくない組織及び廃棄物をできる限り多く好ましくない組織に移した。残りの全ての組織は、６ウェルプレートのウェルの１つに入れた。（黄色の脂肪組織又は壊死組織により、好ましくない組織が示された。）残りの中間腫瘍断片に対して処理を継続し、全ての腫瘍が処理されるまで一度に１つの中間片を処理した。
【０６３２】
[00792]  最高５０個の最良の腫瘍断片を、ＣＭ１を含む腫瘍断片と表示が付された５０ｍＬコニカルチューブに移した。５０ｍＬコニカルから浮遊物を取り除いた。断片及び浮遊物の数を記録した。腫瘍断片の入ったコニカルを旋回させ、５０ｍｌコニカルの内容物をG-Rex 100MCSフラスコに注いだ。G-Rex 100Mフラスコに移した１つ以上の腫瘍断片が浮かんでいる場合、好ましい組織の皿から入手可能な場合には追加の腫瘍断片を１つ取得し、G-Rex 100Mフラスコに移した。
【０６３３】
[00793]  インキュベーター数及び各フラスコに加えられた断片の総数を記録した。G-REX 100Mバイオリアクターを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。
【０６３４】
実施例４：プロセス２Ａ  −  １１日目
[00794]  この実施例では、実施例３〜６で説明した２Ａプロセスの詳細な１１日目のプロトコルについて説明する。
【０６３５】
前回の調製
処理の前日：
[00795]  ＣＭ２は、処理が行われる前日に準備できた。４℃に置いた。
【０６３６】
処理日。
[00797]  フィーダーセルハーネスを準備した。CTF-FORM-318毎に５ｍＬの凍結保存培地を準備し、必要になるまで４℃に置く。
【０６３７】
[00798]  G-Rex 500MCSフラスコを準備する。１０ｍＬシリンジを使用して、ＣＭ２（細胞培養培地２）１リットルあたり０．５ｍＬのＩＬ−２（ストックは６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を、未使用の滅菌メスルアーコネクタを通してバイオプロセスバッグに無菌的に移した。全てのＩＬ−２が培地と混合されたことを確認した。４．５リットルのＣＭ２培地をG-Rex 500MCSに送り込んだ。G-Rex 500MCSをインキュベーターに入れた。
【０６３８】
照射フィーダー細胞を準備する
[00799]  １Ｌ移送パック（ＴＰ）の乾燥重量を記録した。重量で５００ｍＬのＣＭ２をＴＰに注入した。３７℃（＋／−１℃）の水浴中でフィーダー細胞を解凍した。最終フィーダー配合物をよく混合した。５ｍＬシリンジ及び不要なポートを使用して、１ｍｌの細胞を確実にサンプリング及び除去できるようにポートを細胞溶液ですすぎ、カウントのための表示が付されたチューブに入れた。フィーダー細胞サンプル及び記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。細胞数が＜５×１０９である場合、より多くの細胞を解凍してカウントし、フィーダー細胞に加えた。フィーダーバッグの容積を再秤量し容積を計算した。取り除く細胞の容積を計算した。
【０６３９】
G-REXへのフィーダーの追加
[00801]  細胞をよく混合し、上記で計算した容積を取り除き、５．０×１０９個の細胞を達成した。不要な細胞を廃棄した。１ｍＬシリンジと１８Ｇ針を使用して、０．１５０ｍＬのＯＫＴ３を吸引し、針を取り外し、メスルアーを介してフィーダーＴＰに移した。フィーダーバッグをG-Rex 500MCSの赤ラインに滅菌溶接した。ラインのクランプを外し、重力によりフィーダー細胞がフラスコに流れ込むようにした。G-Rex 500MCSをインキュベーターに戻し、時間を記録した。
【０６４０】
ＴＩＬを調整する：ＴＩＬ回収の開始時間を記録する
[00803]  インキュベーターからG-Rex 100MCSを慎重に取り出した。GatheRexを使用して、約９００ｍＬの培養上清を１Ｌ移送パックに移した。全ての細胞が膜から剥離するまでフラスコを旋回した。膜を確認し、全ての細胞が剥離していることを確認した。収集チューブから離してフラスコを傾け、腫瘍断片を縁に沿って沈降させた。断片がフラスコの反対側に残るように、収集チューブに向かってゆっくりとフラスコを傾けた。GatheRexを使用して、残留細胞懸濁液を、腫瘍断片を避けて３００ｍＬの移動パックに移した。全ての細胞が膜から離れたことを再確認した。必要に応じて、GatheRexのクランプを開放して逆洗し、重力によって一部の培地をG-Rex 100MCSフラスコに流入させた。フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させ、３００ｍｌ  ＴＰに注入した。収集が完了した後、赤ラインとヒートシールを閉じた。細胞懸濁液を含む３００ｍｌ  ＴＰの記録質量（乾燥質量を含む）及び細胞懸濁液の容積を計算した。細胞をよく混合した。５ｍＬシリンジドロー１ｍＬを無菌的に取り付け、冷凍保存バイアルに入れた。第２のシリンジで繰り返した。これらは、細胞、生存率のカウントに使用された。インキュベーターに入れ、インキュベーターで時間及び場所を記録した。各サンプルに対して一度の細胞カウントを実施し、記録した。必要に応じて、総生細胞ＴＩＬ密度を２×１０８個以下の生細胞に調整した。削除する容積を計算又は不要な調整を記録した。
【０６４１】
[00804]  過剰な細胞を適切なサイズのコニカルチューブに移し、後に凍結保存するためにキャップを緩めてインキュベーターに入れた。
【０６４２】
[00805]  インキュベーターからG-Rex 500MCSを取り出し、細胞をフラスコへ汲み出した。G-Rex 500MCSをインキュベーターに戻し、G-Rexインキュベーターに置かれた時間を記録した。
【０６４３】
過剰の凍結保存
[00806]  細胞に加える凍結培地の計算量：
【０６４４】
【表２２】
2021509586.tif 000024
【０６４５】
[00807]  ＴＩＬを４００×ｇにおいて２０℃で５分間、最大減速及び最大加速で沈下させた。無菌的に上清を吸引した。残った液体に細胞を再懸濁し、再懸濁中、準備した凍結培地をゆっくりと添加した。分注し、−８０℃に置いた。
【０６４６】
実施例５：プロセス２Ａ  −  １６日目
[00808]  この実施例では、実施例３〜６で説明した２Ａプロセスの詳細な１６日目のプロトコルについて説明する。
【０６４７】
ＴＩＬの回収及びカウント。
[00809]  ５０×１０６個未満のＴＩＬで開始した培養物のＣＭ４の１０Ｌバッグ１つを３７℃のインキュベーターで少なくとも３０分又は使用準備が整うまで温めた。インキュベーターからG-Rex 500MCSフラスコを取り出し、GatheRexを使用して、約４Ｌの培養上清を１０ＬのLabtainerに移した。適切なGatheRex回収指示に従って回収した。
【０６４８】
[00810]  上清を除去した後、全ての細胞が膜から剥離するまでフラスコを旋回した。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。GatheRexを使用して、残留細胞懸濁液を２Ｌ  ＴＰに移し、全ての細胞が収集されるまで端を傾斜したまま維持した。付着した細胞について膜を検査した。フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させた。２Ｌ  ＴＰに細胞を加えた。２Ｌ移送パックをヒートシールした。細胞懸濁液を含む移送パックの質量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。乾燥質量を含む、細胞懸濁液量を決定した。
【０６４９】
[00811]  細胞を静かに混合し、１１ｍｌを吸い上げ、表２１に示すように分注した。
【０６５０】
【表２３】
2021509586.tif 000025
【０６５１】
[00812]  細胞懸濁液量及びＱＣのために除去された量に基づいた２Ｌ移送パック内の新しい量を計算し、記録した（１１ｍＬ）。
【０６５２】
[00813]  植菌及び指示された無菌試験。マイコプラズマ試験のため、保留中のラックに４℃でマイコプラズマサンプルを貯蔵した。ＴＩＬが播種されるまで取っておいた。
【０６５３】
細胞カウント：
[00814]  記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。文書化された希釈。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。継代培養に必要なフラスコの総数を計算した。
【０６５４】
ＣＭへのＩＬ−２の追加
[00815]  Aim Vの１０ＬバッグをGlutamaxと共に配置した。５ｍＬのＩＬ−２をシリンジに吸い上げ（最終濃度は３０００ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−２をバッグに分配した。Aim Vの残りのバッグについても繰り返した。
【０６５５】
G-Rex 500MCSフラスコを調製する
フラスコに加えるＣＭ４の量を決定した。フラスコ毎に加えられた細胞の容積及びＣＭ４の５０００ｍＬ−Ａの容積を記録した。フラスコを３７℃、５％ＣＯ２に入れた。
【０６５６】
ＴＩＬの入ったフラスコに播種
[00816]  細胞産物バッグを化学天秤に置き、G-REXフラスコにＴＩＬを加えた時間を記録した。細胞をよく混合した。全てのフラスコで細胞の移動を繰り返した。フラスコを３７℃、５％ＣＯ２に置き、ＴＩＬをG-REXフラスコに加えた時間を記録した。微生物学研究室へ沈降プレートの試験及び好気的及び嫌気的無菌性の試験の指示をした。
【０６５７】
流動性又は過剰細胞の凍結保存：
[00818]  必要な凍結培地の計算量：標的細胞濃度は、１×１０８／ｍｌであった。除去されたセルの総量を記録した。標的細胞濃度は、１×１０８細胞／ｍＬであった。加える凍結培地の総量を計算した。
【０６５８】
[00819]  凍結保存培地を調製し、必要になるまで４０℃に置いた。ＴＩＬを４００×ｇにおいて２０℃で５分間、最大減速及び最大加速で沈下させた。上清を吸引した。チューブの底を穏やかに叩いて、残った液体に細胞を再懸濁し、チューブを穏やかに叩きながら、準備した凍結培地をゆっくりと添加した。適切なサイズの表示が付されたクライオチューブに分注した。−８０℃の冷凍庫に入れた。７２時間以内に恒久的な貯蔵場所に移し、−８０℃の冷凍庫に入れた日時を文書化して記録した。
【０６５９】
実施例６：プロセス２Ａ  −  ２２日目
[00820]  この実施例では、実施例３〜６で説明した２Ａプロセスの詳細な２２日目のプロトコルについて説明する。
【０６６０】
高度な調製
[00821]  PlasmaLyte Aの３つの１ＬバッグをＢＳＣに入れた。プールを準備し、PlasmaLyte Aバッグに１％ＨＳＡの表示を付した。２５％の１２０ｍＬを移送のために充填した。HSAを３ＬのPlasmaLyteバッグに移した。よく混合した。３リットルバッグの無針ポートから５ｍＬの１％ＨＳＡのPlasmaLyteを取り出した。LOVO洗浄バッファーと表示し、日付を付した。
【０６６１】
ＩＬ−２調製
[00823]  ５ｍＬシリンジから表示が付された５０ｍｌの滅菌コニカルチューブにPlasmalyte／１％ＨＳＡを分配した。PlasmaLyteを含むチューブに０．０５ｍＬのＩＬ−２ストックを加え、ＩＬ−２  ６×１０４個と表示を付した。２〜８℃で保管した。
【０６６２】
細胞の調製
[00824]  ３７℃からG-REX 500Mフラスコを取り外した。GatheRexポンプを使用して、第１のフラスコの容積を減少させた。飛散又は泡立ちを避けながらＴＩＬが完全に再懸濁されるまで、G-REX 500Mフラスコを旋回させた。全ての細胞が膜から乖離していることを確認した。G-Rexフラスコを傾けて、細胞懸濁液が収集ストローのあるフラスコの側面に溜まるようにした。細胞懸濁液を収集するためにGatherRexを開始し、全ての細胞がフラスコから取り除かれるようにした。細胞がフラスコに残っている場合、１００ｍＬの上清をフラスコに戻し、旋回させて、細胞懸濁液バッグに集めた。追加のフラスコに対して繰り返した。ヒートシールし、LOVO原料バッグと表示を付した。乾燥重量を記録した。
【０６６３】
[00825]  ＴＩＬが細胞懸濁液バッグからフィルターを通ってLOVO原料バッグに排出されるようにした。全細胞がLOVO原料バッグに移されると、全てのクランプを閉じ、印の直上をヒートシールし、取り外した。バッグをよく混合し、２つの３ｍＬシリンジを使用して、細胞及び生存率のカウントのためにシリンジサンプルポートから２つの独立した２ｍＬのサンプルを採取した。バッグの重量を量り、初期重量と最終重量との間の差を判定した。乾燥質量を含むデータを記録しインキュベーターに入れた。
【０６６４】
細胞カウント。
[00826]  各サンプル及び記録データに対して一度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。有核細胞の総数を決定した。除去するＴＮＣの数を決定し、LOVO処理のために＝１．５×１０１１個の細胞を保持した。取り出した細胞を適切なサイズの容器に入れて廃棄した。
【０６６５】
LOVOの回収
[00827]  事前準備で設定されたBaxter延長セットを備えた１０ＬLabtainerは、LOVOキットに溶接された交換用ろ液バッグであった。LOVOディスプレイに従った。手順を開始するため、ドロップダウンメニューから「ＴＩＬ  G-Rex回収」プロトコルを選択し、指示に従った。
【０６６６】
[00828]  最終産物量（保持量）画面が表示されると、表１５の総有核細胞（ＴＮＣ）値を使用して、以下の表（表１６）で最終産物の標的容積を決定した。LOVO手順の設定中、その細胞範囲に関連付けられた最終産物容積（ｍＬ）を入力した。
【０６６７】
【表２４】
2021509586.tif 000026
【０６６８】
【表２５】
2021509586.tif 000027
【０６６９】
[00829]  表１６から指定された容積を標的にするため、最終産物容積（ｍＬ）入力欄に触れた。テンキーが表示された。ｍＬ単位で所望の最終産物量を入力した。
【０６７０】
[00830]  ろ液及び溶液１に表示される容積を書き留めた（PlasmaLyteを読まれたい）。ろ液及び溶液１に表示される容積を書き留めた（PlasmaLyteを読まれたい）。
【０６７１】
[00831]  ＩＰバッグを前塗布した。原料バッグを混合した。LOVO手順中、系は自動的に一時停止して、作業者が異なるバッグを取り扱うことができるようにした。一時停止中に異なる画面が表示された。各画面に対応する指示に従った。
【０６７２】
原料すすぎ一時停止
[00832]  原料バッグを排出させた後、LOVOが原料バッグに洗浄バッファーを加えバッグをすすいだ。設定量の洗浄バッファーが原料バッグに加えられた後、LOVOは自動的に一時停止し、原料すすぎ一時停止画面を表示した。
【０６７３】
[00833]  LOVOは原料バッグからのすすぎ液を処理し、自動化手順を続けた。
【０６７４】
ＩＰバッグの混合の一時停止
[00834]  スピナを通過させる別の細胞を準備するため、ＩＰバッグを洗浄バッファーで希釈した。ＩＰバッグに洗浄バッファーを追加すると、LOVOは自動的に一時停止し、「ＩＰバッグ混合」一時停止画面が表示された。
【０６７５】
[00835]  「ＩＰバッグ混合」一時停止画面が表示されると、作業者は、細胞懸濁液を完全に混合するため、ＩＰバッグを数回反転させた。指示に従い、LOVOのＩＰバッグからの液体の処理を再開した。
【０６７６】
ＩＰの角を揉むことの一時停止
[00836]  LOVO手順の最終洗浄サイクル中、細胞をＩＰバッグからスピナを介して保持液（最終産物）バッグに注入した。ＩＰバッグが空になったら、１０ｍＬの洗浄バッファーをＩＰバッグの底部ポートに加え、バッグをすすいだ。すすぎ液を追加した後、LOVOは自動的に一時停止し、「ＩＰの角を揉む」一時停止画面が表示された。
【０６７７】
[00837]  「ＩＰの角を揉む」一時停止画面が表示されると、作業者は、バッグの角を揉んで、いかなる残っている細胞も浮遊させた。LOVOを再開して、ＩＰバッグからすすぎ液をポンプで排出した。
【０６７８】
[00838]  LOVO手順の最後に、産物除去画面が表示された。
【０６７９】
[00839]  表１７のフォーマットに従い、結果からデータを記録した。
【０６８０】
【表２６】
2021509586.tif 000028
【０６８１】
シャットダウンLOVOシャットダウン手順
[00841]  最終的な製剤化された産物量を記録した。最終産物表から必要なＩＬ−２の量を計算した。
【０６８２】
【表２７】
2021509586.tif 000029
【０６８３】
クライオバッグの数及び保持量を判定した
[00843]  標的容積に印を付け、凍結保存バッグの数と産物の保持サンプルの容積の下の表を保持した。
【０６８４】
[00844]  標的容積／バッグ計算：（最終製剤量−１００％回収率が得られないための量調整＝１０ｍＬ）／バッグの数。
【０６８５】
[00845]  １：１（容積：容積）のＣＳ１０（CryoStor 10、BioLife Solutions）及びＩＬ−２で細胞を調製した。
【０６８６】
[00846]  ＩＬ−２及び接続装置で細胞を調整した。細胞及び装置を移送バッグに入れ、２〜８℃で≦１５分間置いた。
【０６８７】
ＣＳ１０の添加
[00847]  「最終製剤産物量」表で決定された冷ＣＳ１０の量を汲み上げた。ゆっくりと穏やかに混合しながら、ＣＳ１０（１：１、容積：容積）を細胞に加えた。
【０６８８】
製剤細胞産物のクライオバッグへの添加
[00849]  各凍結バッグに入れる細胞の量に合わせて、シリンジを適切なサイズのシリンジに交換した。細胞産物を混合した。細胞産物バッグに通じるクランプを開放し、適切な量を引き出した。
【０６８９】
最終産物の量を記録した
[00850]  不要なポート及び適切なサイズのシリンジを使用して、事前に決定した保持量を調製した。「保持」と表示を付した５０ｍＬコニカルチューブに保持した。ハーネスに取り付けられたシリンジを使用して、細胞を約１インチまでチューブに吸い上げながらバッグから全ての空気を取り除いた。２〜８℃に置いた。細胞産物バッグ内の細胞を混合し、活栓上の新しいシリンジを使用して残りのＣＳ７５０バッグに対してステップ３〜８を繰り返して、細胞を保持した。産物がＣＲＦに入ったら、処理のために取っておいた。
【０６９０】
制御速度フリーザー（ＣＲＦ）手順（実施例１６も参照されたい）
[00851]  冷凍庫は、サンプルを追加する準備ができるまで４℃で保持された。ＣＲＦにサンプルを加えた。
【０６９１】
[00852]  ＣＲＦが４℃に戻るまで待った。温度が達すると、ＣＲＦプログラムに従って凍結保存した。容器の完全性、ポートの完全性、シールの完全性、細胞集塊の存在及び粒子の存在について、クライオバッグの目視検査を実施した（注：過剰又は不足検査は実施しなかった）。
【０６９２】
[00853]  クライオバッグを予め調整したカセットに入れ、ＣＲＦに移した。カセットをＣＲＦの棚に均等に並べた。リボン熱電対を中央カセットに使用するか、又はダミーバッグを中央位置に置いた。
【０６９３】
[00854]  ＣＲＦの扉を閉じた。チャンバーの温度が４℃＋／−１．５℃に達すると、産物をＣＲＦに移した時間及びチャンバー温度を記録した。
【０６９４】
[00855]  品質管理サンプルの処理
必要に応じて、以下の材料を無菌的に移し、表２５のＱＣ及び保持に従って表示を付した。１−細胞カウントチューブ、１−エンドトキシンチューブ、１−マイコプラズマチューブ、１−グラム染色チューブ、１チューブ再刺激チューブ及び１−迅速な試験のためのＱＣへのフローチューブ。残りの複製チューブを制御速度フリーザーに入れた。
【０６９５】
【表２８】
2021509586.tif 000030
【０６９６】
細胞カウント
[00857]  各サンプル及び記録データに対し１度の細胞カウントを実施し、バッチ記録に生データのカウントを添付した。Cellometerカウントプログラムを文書化した。正しい希釈がCellometerに入力されたことを確認した。
【０６９７】
[00858]  製剤後の保持細胞の凍結保存：バイアルをＣＲＦに入れた。凍結完了後に貯蔵場所に移し、ＣＦＲに入れた日時を記録した。ＬＮ２に移した日時を記録した。
【０６９８】
[00859]  微生物検査：好気的及び嫌気的無菌性の試験の指示をした。
【０６９９】
細胞産物バッグの凍結保存後
[00860]  実施完了後にフリーザーを停止した。カセットからクライオバッグを取り外した。カセットを気相ＬＮ２に移した。
【０７００】
実施例７：ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１サイトカインカクテルの使用
[00861]  この実施例では、追加のＴ細胞成長因子として機能するＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１サイトカインの使用を、実施例１〜１０のＴＩＬプロセスと組み合わせて説明する。
【０７０１】
[00862]  実施例１〜１０のプロセスを使用して、実験の片腕で、ＩＬ−２の存在下において、結腸直腸、黒色腫、子宮頸、三種陰性乳房、肺及び腎臓の腫瘍から、他方では培養の開始時にＩＬ−２の代わりにＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の組み合わせで、ＴＩＬを成長させた。プレＲＥＰの完了時に、培養物の拡大率、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ−γ）及びＴＣＲ  Ｖβレパートリーを評価した。ＩＬ−１５及びＩＬ−２１は、本明細書の他の箇所及びGruijl, et al.,に記載されている通り、ＩＬ−２１は、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋腫瘍浸潤リンパ球の成長を促進し、細胞傷害能が高く、制御性Ｔ細胞の副次的成長が少ない。Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/）。
【０７０２】
[00863]  結果は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１で処理した条件のＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方で、ＩＬ−２のみの条件と比較して複数の組織でＴＩＬ拡大培養の増強（＞２０％）が観察されたことを示した。ＩＬ−２のみの培養物に比べて、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１で処理した培養物から得られたＴＩＬには、偏ったＴＣＲ  Ｖβレパートリーを含むＣＤ８＋集団が主に偏っていた。ＩＦＮ−γ及びＣＤ１０７ａは、ＩＬ−２のみで処理したＴＩＬと比較して、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１で処理したＴＩＬで上昇した。
【０７０３】
実施例８：第２段階、多施設、黒色腫における３コホート研究
[00864]  この第２段階の多施設３コホート研究は、転移性黒色腫患者のプロセス１Ｃ（本明細書に記載される通り）に従って製造されたＴＩＬ療法の安全性及び有効性を評価するよう設計されている。コホート１及び２は、それぞれ最大３０人の患者を登録し、コホート３は最大１０人の患者への第２のＴＩＬ注入のための再処置コホートである。第１の２つのコホートは、２つの異なる製造プロセス：プロセス１Ｃ及びプロセス２Ａの実施形態（それぞれ実施例１〜１０で説明）を評価している。コホート１の患者は新鮮な非凍結保存ＴＩＬを受け取り、コホート２の患者は実施例１〜１０で説明したプロセスで製造された産物を受け取り、凍結保存製品を産生する。研究設計を図２６に示す。この研究は、転移性黒色腫患者のサブ集団の処置のための自己ＴＩＬの安全性及び有効性を評価する第２段階、多施設、３コホート研究である。主要な選択基準には、測定可能な転移性黒色腫及びＴＩＬ生成のために切除可能な病変が≧１；全身療法の少なくとも１つの前の段階；年齢≧１８歳；０〜１のＥＣＯＧパフォーマンスステータス、が含まれる。処置コホートには、非凍結保存ＴＩＬ産物（プロセス１Ｃを使用して調製）、凍結保存ＴＩＬ産物（プロセス２Ａの実施形態を使用して調製）及び無応答又は初期応答後に進行する患者に対するＴＩＬ産物による再処置が含まれる。プライマリエンドポイントは安全性であり、セカンダリエンドポイントは有効性であり、客観的奏効率（ＯＲＲ）、完全寛解率（ＣＲＲ）、無増悪生存率（ＰＦＳ）、奏効期間（ＤＯＲ）及び全生存期間（ＯＳ）で定義される。
【０７０４】
実施例９：γ線照射末梢単核球の個々のロットの適格性
[00865]  本実施例は、γ線照射した末梢単核球（ＰＢＭＣ、別名ＭＮＣ）の個々のロットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について説明する。
【０７０５】
[00866]  各照射ＭＮＣフィーダーロットは個別のドナーから調製した。精製抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下におけるＲＥＰでＴＩＬを拡大培養するその能力に関して各ロット又はドナーを個別にスクリーニングした。加えて、フィーダー細胞の各ロットを、ＴＩＬを加えずに試験して、受けたγ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認した。
【０７０６】
背景
[00867]  ＴＩＬのＲＥＰには、γ線照射した拡大培養が止まったＭＮＣフィーダー細胞が必要であった。ＲＥＰフラスコ内でフィーダーＭＮＣ上の膜受容体が抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＴＩＬに架橋することにより、ＴＩＬが拡大培養されるように刺激される。フィーダーロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、且つＧＭＰ条件下で凍結保存した。
【０７０７】
[00868]  移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得るため、ＴＩＬ療法を受ける患者が生細胞のフィーダー細胞を注入されないことが重要である。従って、フィーダー細胞は、γ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖ＤＮＡ切断が生じて再培養時にＭＮＣ細胞が細胞生存能力を失うことにより、拡大培養が止められる。
【０７０８】
判定基準及び実験セットアップ
[00869]  フィーダーロットは２つの基準で判定された。１）共培養においてＴＩＬを１００倍超に拡大培養するその能力、及び２）その複製不能性。
【０７０９】
[00870]  直立Ｔ２５組織培養フラスコ内で成長させた２つの初代プレＲＥＰ  ＴＩＬ株を利用するミニＲＥＰフォーマットでフィーダーロットを試験した。各ＴＩＬ株がＲＥＰにおいて活性化に応答して拡大培養するその能力はユニークであるため、フィーダーロットは２つの異なるＴＩＬ株に対して試験した。制御として、後ろ向き的に上記の基準に適合することが示されている照射ＭＮＣフィーダー細胞の１ロットを、実験ロットと並行して実施した。
【０７１０】
[00871]  単一の実験で試験した全てのロットが等価な試験を受けることを確実にするため、全ての条件及び全てのフィーダーロットの試験に同じプレＲＥＰ  ＴＩＬ株の十分なストックが利用可能であった。
【０７１１】
[00872]  試験したフィーダー細胞の各ロットについて、合計６つのＴ２５フラスコがあった：プレ−ＲＥＰ  ＴＩＬライン＃１（２フラスコ）；プレ−ＲＥＰ  ＴＩＬライン＃２（２フラスコ）；及びフィーダー制御（２フラスコ）。ＴＩＬ株＃１及び＃２が入ったフラスコは、フィーダーロットがＴＩＬを拡大培養させる能力を判定した。フィーダー対照フラスコは、フィーダーロットの複製不能性を判定した。
【０７１２】
実験プロトコル
−２／３日目、ＴＩＬ株の解凍
[00873]  ＣＭ２培地を調整した。３７℃の水浴中でＣＭ２を加温した。３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した４０ｍｌのＣＭ２を調製した。使用時まで保温する。使用したＴＩＬ株の名前の表示を付した２つの５０ｍｌコニカルチューブの各々に、ＩＬ−２を含まない２０ｍｌの予め加温したＣＭ２を入れた。ＬＮ２貯蔵庫から２つの指定のプレＲＥＰ  ＴＩＬ株を取り出し、バイアルを組織培養室に移した。残りの氷が少量になるまでバイアルを３７℃の水浴中の密封されたジッパー式貯蔵用バッグの内部に置くことにより、バイアルを解凍した。
【０７１３】
[00874]  滅菌ホールピペットを使用してバイアルの内容物を直ちに表示を付した調製済み５０ｍｌコニカルチューブ内の２０ｍｌのＣＭ２中に移した。ＩＬ−２を含まないＣＭ２を使用して４０ｍｌまでＱＳして細胞を洗浄した。４００×ＣＦで５分間遠心した。上清を吸引し、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した５ｍｌの温ＣＭ２に再懸濁した。
【０７１４】
[00875]  少量のアリコート（２０μｌ）をデュプリケートで取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。カウントする一方、ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置いた。細胞濃度を決定し、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＣＭ２でＴＩＬを１×１０６細胞／ｍｌに希釈した。
【０７１５】
[00876]  加湿した３７℃インキュベーター内で必要に応じた数のウェルにおいて２４ウェル組織培養プレートの１ウェルあたり２ｍｌでミニＲＥＰの０日目まで培養した。混同及び潜在的な交差汚染を避けるため、異なるＴＩＬ株は別個の２４ウェル組織培養プレートにおいて培養した。
【０７１６】
０日目、ミニＲＥＰを開始する
[00877]  試験するフィーダーロットの数に十分なＣＭ２培地を調製した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、８００ｍｌのＣＭ２培地を調製した）。上記で調製したＣＭ２の一部をアリコートに分け、細胞の培養のため、それに３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、５００ｍｌの３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２含有ＣＭ２培地を調製する）。
【０７１７】
[00878]  各ＴＩＬ株を別々に作業して交差汚染を防ぎながら、ＴＩＬ培養物が入った２４ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、ＢＳＣに移した。
【０７１８】
[00879]  滅菌ホールピペット又は１００〜１０００μｌピペッター及びチップを使用して、使用するＴＩＬの各ウェルから約１ｍｌの培地を取り出し、２４ウェル組織培養プレートの使用されていないウェルに入れた。
【０７１９】
[00880]  新鮮な滅菌ホールピペット又は１００〜１０００μｌピペッター及びチップを使用して、ウェル内で残りの培地をＴＩＬと混合して細胞を再懸濁し、次にＴＩＬ名が表示された５０ｍｌコニカルチューブに細胞懸濁液を移し、容積を記録した。
【０７２０】
[00881]  確保しておいた培地でウェルを洗浄し、その容積を同じ５０ｍｌコニカルチューブに移した。細胞を４００×ＣＦでスピンして細胞ペレットを収集した。培地上清を吸引して取り除き、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含有する２〜５ｍｌのＣＭ２培地中に細胞ペレットを再懸濁する。使用される容積は、回収されるウェルの数及びペレットのサイズに基づく（容積は＞１．３×１０６細胞／ｍｌの濃度を確保するのに十分であろう）。
【０７２１】
[00882]  血清用ピペットを使用して、細胞懸濁液を完全に混合し、容積を記録した。２００μｌを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントする一方、ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブは、キャップを緩めてガス交換を可能にして、加湿した、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに置いた。カウントを記録した。
【０７２２】
[00883]  ＴＩＬ細胞が入った５０ｍｌコニカルチューブをインキュベーターから取り出し、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した温ＣＭ２中にそれらの細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。キャップを緩めたまま、５０ｍｌコニカルチューブをインキュベーターに戻した。
【０７２３】
[00884]  第２のＴＩＬ株について上記のステップを繰り返した。
【０７２４】
[00885]  実験のためのＴ２５フラスコにＴＩＬをプレーティングする直前に、ＴＩＬは以下に従って１．３×１０５細胞／ｍｌの最終濃度に１：１０希釈した。
【０７２５】
MACS GMP CD3純粋（ＯＫＴ３）作業溶液を調製する
[00886]  ４℃の冷蔵庫からＯＫＴ３のストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を取り出し、ＢＳＣに置いた。ミニＲＥＰの培地中には３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３の最終濃度を使用した。
【０７２６】
[00887]  実験の各Ｔ２５フラスコ内の２０ｍｌについて６００ｎｇのＯＫＴ３が必要であった；これは各２０ｍｌについて６０μｌの１０μｇ／ｍｌ溶液又は各フィーダーロットについて試験する６つ全てのフラスコについて３６０μｌの相当量であった。
【０７２７】
[00888]  試験する各フィーダーロットについて、１０μｇ／ｍｌの作業濃度に対して４００μｌの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３を作成した（例えば、１回に４つのフィーダーロットを試験するために、１６００μｌの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３：１６μｌの１ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３＋１．５８４ｍｌの３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２含有ＣＭ２培地を作成した）。
【０７２８】
Ｔ２５フラスコを調製する
[00889]  各フラスコに表示を付し、フィーダー細胞を調製する前にフラスコにＣＭ２培地を充填した。フラスコを３７℃の加湿された５％ＣＯ２インキュベーターに置くことにより、残りの構成成分を加えるまでの間、培地を保温した。フィーダー細胞を調製し終えたら、各フラスコ内のＣＭ２に構成成分を加える。
【０７２９】
【表２９】
2021509586.tif 000031
【０７３０】
フィーダー細胞を調製する
[00890]  本プロトコルについては、試験した１ロットあたり最低７８×１０６個のフィーダー細胞が必要であった。ＳＤＢＢによって凍結された各１ｍｌバイアルは、凍結時に１００×１０６個の生細胞を有した。ＬＮ２貯蔵庫からの解凍時に５０％回収率と仮定すると、各ＲＥＰについて推定１００×１０６個の生細胞を所与として、１ロットあたりフィーダー細胞の１ｍｌバイアルを少なくとも２本解凍することが推奨された。代わりに、１．８ｍｌバイアルで供給される場合、１本のバイアルのみで十分なフィーダー細胞が提供された。
【０７３１】
[00891]  フィーダー細胞の解凍前に、試験される各フィーダーロットについて約５０ｍｌのＩＬ−２不含ＣＭ２を予め加温した。ＬＮ２貯蔵庫から指定のフィーダーロットバイアルを取り出し、ジッパー式貯蔵用バッグに入れ、氷上に置いた。３７℃の水浴に浸すことにより、閉じたジッパー式貯蔵用バッグ内でバイアルを解凍した。ジッパー式バッグからバイアルを取り出し、７０％ＥｔＯＨを噴霧するか又はそれで拭き取り、バイアルをＢＳＣに移した。
【０７３２】
[00892]  ホールピペットを使用して、フィーダーバイアルの内容物を５０ｍｌコニカルチューブ内の３０ｍｌの温ＣＭ２中に直ちに移した。バイアルを少量のＣＭ２で洗浄してバイアル内に残った細胞を全て取り出した。４００×ＣＦで５分間遠心した。上清を吸引し、４ｍｌ温ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２に再懸濁した。２００μｌを取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントを記録した。
【０７３３】
[00893]  細胞を温ＣＭ２＋３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２中に１．３×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。ＴＩＬ細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌ〜１．３×１０５細胞／ｍｌに希釈した。
【０７３４】
共培養をセットアップする
[00894]  ＴＩＬ細胞を１．３×１０６細胞／ｍｌ〜１．３×１０５細胞／ｍｌに希釈した。１５ｍｌコニカルチューブに４．５ｍｌのＣＭ２培地を加えた。インキュベーターからＴＩＬ細胞を取り出し、１０ｍｌ血清用ピペットを使用して十分に再懸濁した。１．３×１０６細胞／ｍｌ  ＴＩＬ懸濁液から０．５ｍｌの細胞を取り出し、１５ｍｌコニカルチューブ内の４．５ｍｌの培地に加えた。ＴＩＬストックバイアルをインキュベーターに戻した。十分に混合した。第２のＴＩＬ株について繰り返した。単一のフィーダーロットについての予め加温した培地が入ったフラスコをインキュベーターからＢＳＣに移した。１ｍｌピペットチップで上下に数回ピペッティングすることによりフィーダー細胞を混合し、１ｍｌ（１．３×１０７細胞）をそのフィーダーロットの各フラスコに移した。各フラスコに６０μｌのＯＫＴ３作業ストック（１０μｇ／ｍｌ）を加えた。２つの対照フラスコをインキュベーターに戻した。
【０７３５】
[00895]  １ｍｌ（１．３×１０５）の各ＴＩＬロットを対応する表示のＴ２５フラスコに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、直立でインキュベートした。５日目まで手を加えなかった。
【０７３６】
[00896]  試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
【０７３７】
５日目、培地交換
３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２でＣＭ２を調製した。各フラスコに１０ｍｌ必要である。１０ｍｌピペットで、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含む１０ｍｌ温ＣＭ２を各フラスコに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、７日目まで直立でインキュベートした。試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
【０７３８】
７日目、回収
[00897]  インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、且つフラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各試験フラスコから１０ｍｌの培地及び対照フラスコの各々から１５ｍｌの培地を取り出した。
【０７３９】
[00898]  １０ｍｌ血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、２００μｌを取り出して細胞をカウントした。適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてＴＩＬをカウントした。７日目のカウントを記録した。
【０７４０】
[00899]  試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
【０７４１】
[00900]  以下の表ＴＴに従い、フィーダー対照フラスコについて複製不能性を判定し、且つＴＩＬが入ったフラスコについて０日目からの拡大倍率を判定した。
【０７４２】
７日目、１４日目までのフィーダー対照フラスコの継続
[00901]  ７日目にフィーダー対照フラスコをカウントし終えた後、対照フラスコの各々に、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含有する新鮮ＣＭ２培地１５ｍｌを加えた。対照フラスコをインキュベーターに戻し、１４日目まで直立位置でインキュベートした。
【０７４３】
１４日目、フィーダー対照フラスコの非拡大培養の延長
[00902]  インキュベーターからフラスコを取り出してＢＳＣに移し、且つフラスコの底にある細胞層を乱さないよう注意を払った。フラスコの底に成長する細胞を乱すことなく、各対照フラスコから約１７ｍｌの培地を取り出した。５ｍｌ血清用ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、十分に混合して細胞集塊を全て壊した。各フラスコの容積を記録した。
【０７４４】
[00903]  ピペッティングにより細胞懸濁液を完全に混合した後、２００μｌを取り出して細胞をカウントした。適切な標準実施要領を自動セルカウンター装置と併せて用いてＴＩＬをカウントした。カウントを記録した。
【０７４５】
[00904]  試験した全てのフィーダーロットについて繰り返した。
【０７４６】
結果及び適合基準
結果
[00905]  γ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であった。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、また、０日目と比較してＲＥＰ培養の７日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少も実証された。
【０７４７】
[00906]  全てのフィーダーロットが、ＲＥＰ培養の７日目までにＴＩＬ増殖の１００倍の拡大という判定基準に適合するものと予想された。
【０７４８】
[00907]  フィーダー対照フラスコの１４日目のカウントは、７日目に見られた非拡大培養傾向が続くものと予想された。
【０７４９】
適合基準
[00908]  フィーダー細胞の各ロットについて試験した各複製ＴＩＬ株は、以下の適合基準を満たしていた。
【０７５０】
[00909]  以下の通り（以下の表２７に概説する）、適合は２倍であった。
【０７５１】
【表３０】
2021509586.tif 000032
【０７５２】
[00910]  ３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で培養したとき放射線量がＭＮＣフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であったかどうかを判定した。複製不能かどうかは、ＲＥＰの７日目及び１４日目に自動細胞カウントによって決定したときの総生細胞数（ＴＶＣ）によって判定した。
【０７５３】
[00911]  適合基準は「成長なし」であったが、これは、ＲＥＰの０日目に培養を開始した初期生細胞数から７日目及び１４日目に総生細胞数が増加しなかったことを意味した。
【０７５４】
[00912]  フィーダー細胞がＴＩＬ拡大培養を支持する能力を判定した。ＲＥＰの０日目の培養開始からＲＥＰの７日目までの生細胞の拡大倍率の点でＴＩＬ成長を測定した。７日目、自動細胞カウントによって判定したとき、ＴＩＬ培養物は最低でも１００倍の拡大（即ちＲＥＰ  ０日目に培養を開始した総ＴＩＬ生細胞数の１００倍より多い）を実現した。
【０７５５】
適合基準を満たさないＭＮＣフィーダーロットのコンティンジェンシーテスト
[00913]  ＭＮＣフィーダーロットが上記に概説される適合基準のいずれかを満たさなかった場合、その原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験する。
【０７５６】
[00914]  ロットのサテライトの試験バイアルが２つ以上残っている場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトの試験バイアルが１つ残っているか又は残っていなかった場合、上記に挙げる適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
【０７５７】
[00915]  適格とされるには、問題のロット及び対照ロットが適合基準を達成しなければならなかった。これらの基準に適合すると、そのロットは、使用のためにリリースされた。
【０７５８】
実施例１０：γ線照射末梢血単核球の個々のロットの適格性
[00916]  本実施例は、γ線照射末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の個々のロットが本明細書に記載される例示的方法における同種異系フィーダー細胞としての使用に適格か判定するための新規簡略手順について記載する。本例は、臨床用ＴＩＬロットの産生における使用に関する照射ＰＢＭＣ細胞ロットの判定プロトコルを提供する。個別のドナーから各照射ＰＢＭＣロットを調製した。１００を超える適格性判定プロトコルを通して、いずれの場合にも、ＳＤＢＢ（サンディエゴ血液バンク）からの照射ＰＢＭＣロットはＲＥＰの７日目にＴＩＬを＞１００倍に拡大することが示された。この改良された適格性判定プロトコルは、受けたγ線線量がそれらを複製不能にするのに十分であったことを確認するため更に試験されたＳＤＢＢからの照射ドナーＰＢＭＣロットに適用することが意図された。それが１４日間にわたって複製不能を維持することが実証されると、ドナーＰＢＭＣロットは、臨床用ＴＩＬロットの産生への使用に「適格である」と見なした。
【０７５９】
背景
[00917]  ＴＩＬの現行の標準ＲＥＰには、γ線照射した拡大培養が止まったＰＢＭＣが必要であった。培養下でＰＢＭＣ上の膜受容体が抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＴＩＬに架橋することにより、ＴＩＬが拡大するように刺激される。ＰＢＭＣロットは、個別のドナーから採取された全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物をFicoll-Hypaqueで遠心に供し、洗浄し、照射し、且つＧＭＰ条件下で凍結保存した。
【０７６０】
[00918]  移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こし得るため、ＴＩＬ療法を受けた患者が生細胞ＰＢＭＣを注入されないことが重要である。従ってドナーＰＢＭＣは、γ線照射を細胞に与え、その結果二本鎖ＤＮＡ切断が生じて再培養時にＰＢＭＣが細胞生存能力を失うことにより、拡大培養が止められる。
【０７６１】
判定基準
[00919]  照射ＰＢＭＣロットの判定基準はその複製不能性であった。
【０７６２】
実験セットアップ
[00920]  直立Ｔ２５組織培養フラスコを使用して、フィーダーロットをＴＩＬと共培養したかのようにミニＲＥＰフォーマットで試験した。対照ロット：歴史的に上記の基準に適合することが示されている照射ＰＢＭＣの１つのロットを、対照として実験ロットと並行して実行した。試験する照射ドナーＰＢＭＣの各ロットについて、デュプリケートのフラスコを実行した。
【０７６３】
実験プロトコル
０日目
[00921]  試験されるドナーＰＢＭＣの各ロットについて約９０ｍｌのＣＭ２培地を調製した。ＣＭ２は３７℃の水浴中に保温した。６×１０６ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２のアリコートを解凍した。ＣＭ２培地をＢＳＣに戻し、７０％ＥｔＯＨで拭き取った後、フードに置いた。試験するＰＢＭＣの各ロットについて、約６０ｍｌのＣＭ２を別個の滅菌ボトルに取り出した。解凍した６×１０６ＩＵ／ｍｌストック溶液からのＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌの最終濃度でこの培地に加えた。このボトルに「ＣＭ２／ＩＬ２」（又は類似）の表示を付して、それを無添加のＣＭ２と区別した。
【０７６４】
ＯＫＴ３を調製する
[00922]  ４℃の冷蔵庫から抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）のストック溶液を取り出し、ＢＳＣに置いた。ミニＲＥＰの培地中には３０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３の最終濃度を使用した。１ｍｇ／ｍｌストック溶液からの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）の１０μｇ／ｍｌ作業溶液を調製した。必要になるまで冷蔵庫に置いた。
【０７６５】
[00923]  試験した各ＰＢＭＣロットについて、１５０μｌの１：１００希釈の抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）ストックを調製する。例えば、１回に４つのＰＢＭＣロットを試験するために、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した５９４μｌのＣＭ２に６μｌの１ｍｇ／ｍｌストック溶液を加えることにより、６００μｌの１０μ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を調製する。
【０７６６】
フラスコを調製する
[00924]  表示を付したＴ２５フラスコに、１フラスコあたり１９ｍｌのＣＭ２／ＩＬ−２を加え、細胞を調製する間、フラスコを３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベーターに置いた。
【０７６７】
照射ＰＢＭＣを調製する
[00925]  試験されるＰＢＭＣロットのバイアルをＬＮ２貯蔵庫から取り出した。それらのバイアルは解凍時まで−８０℃に置くか、又はドライアイス上に保った。解凍される各ロットについて３０ｍｌのＣＭ２（ＩＬ−２の添加なし）を５０ｍｌコニカルチューブに入れた。各チューブに解凍されるＰＢＭＣの異なるロット番号の表示を付した。使用時まで、チューブのキャップを確実に閉めて３７℃の水浴中に置いた。必要に応じて、５０ｍｌコニカルチューブをＢＳＣに戻し、７０％ＥｔＯＨで拭き取った後、フードに置いた。
【０７６８】
[00926]  低温貯蔵庫からバイアルＰＢＭＣを取り出し、３７℃の水浴中のフローティングチューブラックに置いて解凍した。解凍は、バイアル内に少量の氷が残るまで進行させた。滅菌ホールピペットを使用して、バイアルの内容物を５０ｍｌコニカルチューブ内の３０ｍｌのＣＭ２中に直ちに移した。チューブから約１ｍｌの培地を取り出してバイアルをすすいだ；すすぎ液を５０ｍｌコニカルチューブに戻した。キャップを確実に閉め、静かに回して細胞を洗浄した。
【０７６９】
[00927]  室温において４００×ｇで５分間遠心した。上清を吸引し、１０００μｌピペットチップを使用して１ｍｌの温ＣＭ２／ＩＬ−２中に細胞ペレットを再懸濁した。代わりに、培地を加える前に、キャップを閉めたチューブを空のチューブラックに沿って引きずることにより細胞ペレットを再懸濁した。細胞ペレットの再懸濁後、ＣＭ２／ＩＬ−２培地を使用して容積を４ｍｌにした。容積を記録した。
【０７７０】
[00928]  少量のアリコート（例えば、１００μｌ）を取り出し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。カウントは、詳細な自動セルカウンターＳＯＰに基づきデュプリケートで実施した。細胞カウントの実施前にＰＢＭＣの希釈を実施する必要がある可能性が最も高かった。推奨される出発希釈は１：１０であったが、これは使用するセルカウンターのタイプに応じて異なっていた。カウントを記録した。
【０７７１】
[00929]  ＣＭ２／ＩＬ−２培地を使用してＰＢＭＣの濃度を１．３×１０７細胞／ｍｌに調整した。静かに回すことによるか、又は血清用ピペットを使用して静かに上下に吸引することにより十分に混合した。
【０７７２】
培養フラスコをセットアップ
[00930]  ２つの表示を付したＴ２５フラスコを組織培養インキュベーターからＢＳＣに戻した。抗ＣＤ３／ＯＫＴ３の１０μｇ／ｍｌバイアルをＢＳＣに戻した。フラスコに１ｍｌの１．３×１０７ＰＢＭＣ細胞懸濁液を加えた。各フラスコに６０μｌの１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３／ＯＫＴ３を加えた。キャップを閉めたフラスコを組織培養インキュベーターに戻し、手を加えることなく１４日間成長させた。次のロットに必要になるまで抗ＣＤ３／ＯＫＴ３バイアルを冷蔵庫に入れ戻した。判定されるＰＢＭＣのロット毎に繰り返した。
【０７７３】
１４日目、ＰＢＭＣの非拡大培養性の測定
[00931]  複製したＴ２５フラスコをＢＳＣに戻した。各フラスコについて、新鮮な１０ｍｌ血清用ピペットを使用してフラスコの各々から約１７ｍｌを取り出し、次に残りの培地を慎重に抜き取って、フラスコ内に残る容積を測定した。容積を記録した。
【０７７４】
[00932]  同じ血清用ピペットを使用して上下にピペッティングすることによりサンプルを十分に混合した。
【０７７５】
[00933]  カウントのため各フラスコから２００μｌサンプルを取り出した。自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした。判定されるＰＢＭＣのロット毎にステップ７．４．２６〜７．４．３１を繰り返した。
【０７７６】
結果及び適合基準
結果
[00934]  γ線照射の線量はフィーダー細胞を複製不能にするのに十分であると予想された。全てのロットが判定基準に適合するものと予想され、０日目と比較してＲＥＰ培養の１４日目に残る生存フィーダー細胞総数の減少が実証された。
【０７７７】
適合基準
[00935]  試験した各照射ドナーＰＢＭＣロットについて、以下の適合基準が満たされた：「成長なし」  −  １４日目の総生細胞数が、ＲＥＰの０日目に培養を開始した初期生細胞数より少なかったことを意味した。
【０７７８】
適合基準を満たさないＰＢＭＣロットのコンティンジェンシーテスト
[00936]  照射ドナーＰＢＭＣロットが上記の適合基準を満たさなかった場合、その不適合の原因として単純な実験者エラーを排除するため以下のステップを行ってロットを再試験した。ロットのサテライトのバイアルが２つ以上残っていた場合、そのロットは再試験した。ロットのサテライトのバイアルが１つ残っているか又は残っていない場合、上記の適合基準に基づきそのロットは不適合とした。
【０７７９】
[00937]  適格とされるには、コンティンジェンシーテストを受けるＰＢＭＣロットが、適合基準を達成する対照ロットと問題のロットの両方の複製との両方を有していた。これらの基準に適合すると、そのロットは、使用のためにリリースされた。
【０７８０】
実施例１１：ＩＬ−２ストック溶液の調製
[00938]  この実施例は、精製され凍結乾燥された組換えヒトインターロイキン−２を、ｒｈＩＬ−２の使用を含むものを含む本出願及び実施例に記載されたものを全て含む更なる組織培養プロトコルでの使用に適したストックサンプルに溶解するプロセスを説明する。
【０７８１】
手順
[00939]  ０．２％酢酸溶液（ＨＡｃ）を調製した。２９ｍＬ滅菌水を５０ｍＬコニカルチューブに移した。１ｍＬの１Ｎ酢酸を５０ｍＬのコニカルチューブに加えた。チューブを２〜３回反転させることにより十分に混合した。Steriflipフィルターを使用してろ過することによりＨＡｃ溶液を滅菌した。
【０７８２】
[00940]  ＰＢＳ中で１％ＨＳＡを調製した。１５０ｍＬ滅菌フィルターユニット内の９６ｍＬ  ＰＢＳに４ｍＬの２５％ＨＳＡストック溶液を加えた。溶液をろ過した。４℃で貯蔵した。調製したｒｈＩＬ−２の各バイアルについて、書式に記入した。
【０７８３】
[00941]  ｒｈＩＬ−２ストック溶液（６×１０６ＩＵ／ｍＬ最終濃度）を調製した。ｒｈＩＬ−２はロット毎に異なり、製造者の分析証明書（ＣＯＡ）に掲載されている以下のような情報が必要であった：１）１バイアルあたりのｒｈＩＬ−２の質量（ｍｇ）、２）ｒｈＩＬ−２の比活性（ＩＵ／ｍｇ）及び３）推奨０．２％ＨＡｃ再構成容量（ｍＬ）。
【０７８４】
[00942]  ｒｈＩＬ−２ロットに必要な１％ＨＳＡの容積は、以下の式を用いて計算した。
【数１】
2021509586.tif 000033
【０７８５】
[00943]  例えば、CellGenixのｒｈＩＬ−２ロット１０２００１２１  ＣＯＡによれば、１ｍｇバイアルの比活性は２５×１０６ｌＵ／ｍｇである。２ｍＬの０．２％ＨＡｃ中にｒｈＩＬ−２を再構成することが推奨されている。
【数２】
2021509586.tif 000034
【０７８６】
[00944]  ＩＬ−２バイアルのゴム栓をアルコールワイプで拭き取った。３ｍＬシリンジに取り付けた１６Ｇ針を使用して、推奨容積の０．２％ＨＡｃをバイアルに注入した。針を引き抜くときに栓が外れないよう注意を払った。バイアルを３回反転させて、粉末が全て溶解するまで回した。栓を慎重に取り外し、アルコールワイプ上に置いておいた。計算した容積の１％ＨＳＡをバイアルに加えた。
【０７８７】
[00945]  ｒｈＩＬ−２溶液の貯蔵。短期貯蔵（＜７２時間）の場合、バイアルを４℃で貯蔵した。長期貯蔵（＞７２時間）については、バイアルを少量のアリコートに分け、使用直前まで−２０℃でクライオバイアルに貯蔵した。凍結／解凍サイクルを避けた。調製日から６ヵ月後に期限切れとした。ｒｈ−ＩＬ−２表示には、販売業者及びカタログ番号、ロット番号、有効期限、作業者イニシャル、アリコートの濃度及び容積が含まれた。
【０７８８】
実施例１２：プレＲＥＰ及びＲＥＰプロセスのための培地調製
[00946]  本例は、限定はされないが、転移性黒色腫、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌及び肺腺癌を含めた様々な腫瘍型に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の培養が関わるプロトコルに用いられる組織培養培地の調製手順について説明する。本出願及び実施例に記載される任意のＴＩＬの調製にこの培地を使用することができる。
【０７８９】
ＣＭ１の調製
[00947]  低温貯蔵庫から以下の試薬を取り出し、３７℃の水浴中で加温した：（ＲＰＭＩ１６４０、ヒトＡＢ血清、２００ｍＭＬ−グルタミン）。以下の表２８に従い、ろ過される容積に適切な０．２μｍフィルターユニットの上部に成分の各々を加えることによりＣＭ１培地を調製した。４℃で保管する。
【０７９０】
【表３１】
2021509586.tif 000035
【０７９１】
[00948]  使用当日、所要量のＣＭ１を３７℃の水浴中で予め加温し、６０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した。
【０７９２】
[00949]  追加の補充  −  必要があれば表２９に準じる。
【０７９３】
【表３２】
2021509586.tif 000036
【０７９４】
ＣＭ２の調製
[00950]  冷蔵庫から調製済みのＣＭ１を取り出したか、又は上記セクション７．３に従って新鮮ＣＭ１を調製する。AIM-V（登録商標）を冷蔵庫から取り出し、滅菌培地ボトル内に調製済みＣＭ１を等容積のAIM-V（登録商標）と混合することにより、必要な量のＣＭ２を調製した。使用当日、ＣＭ２培地に３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を加えた。使用当日、十分な量の３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２含有ＣＭ２を作成した。ＣＭ２培地ボトルに、その名前、調製者のイニシャル、それがろ過／調製された日付、２週間の有効期限の表示を付し、組織培養に必要になるまで４℃で貯蔵した。
【０７９５】
ＣＭ３の調製
[00951]  使用が必要になった当日に、ＣＭ３を調製した。ＣＭ３はAIM-V（登録商標）培地と同じであり、使用当日に３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を添加した。AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ−２ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ３を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた直後に、ボトルに「３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２」の表示を付す。過剰なＣＭ３がある場合、これを培地名、調製者のイニシャル、培地の調製日及びその有効期限（調製後７日）を表示したボトルに４℃で貯蔵した。ＩＬ−２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
【０７９６】
ＣＭ４の調製
[00952]  ＣＭ４はＣＭ３と同じであり、加えて２ｍＭのGlutaMAX（商標）（最終濃度）を添加した。１ＬのＣＭ３について１０ｍｌの２００ｍＭ  GlutaMAX（商標）を加えた。AIM-Vのボトル又はバッグにＩＬ−２ストック溶液及びGlutaMAX（商標）ストック溶液を直接加えることにより、実験の必要上十分な量のＣＭ４を調製した。軽く振盪することにより十分に混合した。AIM-Vに加えた直後に、ボトルに「３０００ＩＬ／ｎｉｌ  ＩＬ−２及びGlutaMAX」の表示を付した。過剰なＣＭ４がある場合、これを培地名「G1utaMAX」及び有効期限（調整後７日）とボトルにラベル付けし、４℃で貯蔵した。ＩＬ−２を添加した培地は４℃で７日間の貯蔵後に廃棄した。
【０７９７】
実施例１３：２Ａプロセスで使用する無血清培地の評価
[00954]  この実施例では、２Ａプロセスで現在使用されている標準ＣＭ１、ＣＭ２及びＣＭ４培地の代替としての無血清培地の有効性の評価を示すデータを提供する。この研究では、３つの段階の代替として利用可能な無血清培地（ＳＦＭ）及び無血清代替品の有効性を試験した。
【０７９８】
[00955]  段階  −  １：標準対CTS Optimizer又はPrime T CDM又はXvivo-20無血清培地と、血清代替物又は血小板溶解物の有無を使用して、ＴＩＬ拡大培養（ｎ＝３）の有効性を比較した。
【０７９９】
[00956]  段階  −  ２：G-Rex 5M（ｎ＝３）を使用して、ミニスケール２Ａプロセスで無血清培地条件の候補を試験した。
【０８００】
背景情報
[00957]  プレ及びポストＲＥＰ培養で使用されている現在の培地の組み合わせは効果的であることが証明されているが、AIM-VではＲＥＰ障害が発生する可能性がある。効果的な無血清代替物が特定された場合、使用する培地の種類の数を３から１に減らすことで、ＣＭＯで実施するプロセスをより容易且つ単純にすることができる。更に、ＳＦＭは、ヒト血清の使用を排除することにより、外因性疾患の可能性を減らす。この実施例は、２Ａプロセスでの無血清培地の使用を裏付けるデータを提供する。
【０８０１】
【表３３】
2021509586.tif 000037
【０８０２】
実験設計
[00958]  プレＲＥＰ及びＲＥＰは、LAB-008で述べた通りに開始された。この３つの段階の実験概要を以下のチャートに示す。
【０８０３】
【表３４】
2021509586.tif 000038
【０８０４】
[00959]  上記のチャートで提供されている通り、このプロジェクトは、２つのステップで無血清培地及び添加物を試験するために入念に実施された。
【０８０５】
[00960]  ステップ１：無血清培地提供者の選択。プレＲＥＰ及びポストＲＥＰは、G-Rex２４ウェルプレートで２Ａプロセスを模倣するよう設定された。プレＲＥＰは、G-Rex２４ウェルプレートの各断片／ウェルを条件毎に３回又は４回培養することにより開始された。ＲＥＰは、１１日目にG-Rex２４ウェルの４×１０ｅ５ＴＩＬ／ウェルを培養して開始し、１６日目に分割し、２２日目に回収した。CTS OpTimizer、X-Vivo 20及びPrime T-CDMは、プレＲＥＰ及びＲＥＰで使用できる無血清培地の代替候補として使用された。CTS Immune SR血清代替品（Life Technologies）又は血小板溶解物血清（ＳＤＢＢ）をＳＦＭに３％加えた。各条件は、プレＲＥＰ及びポストＲＥＰの両方で少なくとも３つの腫瘍で試験し、２Ａプロセスを模倣するように計画された。
【０８０６】
[00961]  ステップ２：特定された候補者を、プロトコル（ＴＰ−１７−００７）毎にミニスケール２Ａプロセスで更に試験した。簡潔に言えば、プレＲＥＰは、条件毎に２断片／G-Rex 5Mフラスコを３回培養することによって開始された。ＲＥＰは、１１日目に２×１０ｅ６／G-Rex 5Mフラスコを使用して開始され、１６日目に分割され、２２日目に回収された。
【０８０７】
[00962]  注記：いくつかの腫瘍は処理され、１実験で複数のパラメータを測定するためにセットアップされた。
【０８０８】
観察
[00963]  無血清培地を２Ａプロセスで使用される標準と比較した場合、同等又は統計的に優れた細胞成長の結果が観察された。
【０８０９】
[00964]  ２Ａプロセスで使用される標準培地で成長したＴＩＬと比較した場合、無血清培地で成長したＴＩＬから同様の表現型、ＩＦＮ−ｙ産生及び代謝物分析が観察された。
【０８１０】
結果
プレ及びポストＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養の無血清培地の有効性を試験する。
[00965]  CTS Optimizer＋ＳＲ（血清交換）は、増強したプレＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養と同等のＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養とを示した。CTS OpTimizer、X-Vivo 20及びPrime T-CDMは、３％ＣＴＳ免疫ＣＴＳ  ＳＲの有無にかかわらず追加され、標準条件に対して試験された。Ｍ１０７９及びＬ４０２６では、CTS OpTimizer＋ＣＳＲ条件は、標準条件（ＣＭ１、ＣＭ２、ＣＭ４）と比較した場合、プレＲＥＰ  ＴＩＬの有意な増強（ｐ＜０．０５）を示した。一方、ＣＳＲを使用しないCTS OptimizerはプレＲＥＰ  ＴＩＬの拡大培養に役立たなかった（付録−１、２、３）。CTS Optimizer＋ＣＳＲは、試験された３つの腫瘍の２つでポストＲＥＰに匹敵するＴＩＬ拡大培養を示した（図２Ｂ）。X-Vivo 20及びPrime T-CDM条件では、プレ及びポストＲＥＰで大きいばらつきが発生したが、CTS Optimizerは４組間で比較的一貫性があった。更に、血小板溶解物を加えたＳＦＭは、標準と比較した場合、プレＲＥＰ及びポストＲＥＰ  ＴＩＬの拡大培養を促進しなかった。この調査結果は、当社の標準に匹敵する成長を提供するために血清置換が確かに必要であることを示唆しており、CTS optimizer＋ＣＳＲが候補となり得る。
【０８１１】
[00966]  G-Rex 5Mミニで候補条件を試験する。
【０８１２】
[00967]  ポストＲＥＰ  ＴＩＬの表現型分析。以下の表３１を参照されたい。
【０８１３】
【表３５】
2021509586.tif 000039
【０８１４】
インターフェロンγの比較可能性
[00969]  インターフェロンγＥＬＩＳＡ（Quantikine）。ＩＦＮ−ｙの産生は、R&D SystemsのQuantikine ELISAキットを使用して測定した。ＣＴＳ＋ＳＲは、標準条件と比較した場合、同量のＩＦＮーｙを産生した。
【０８１５】
実施例１４：Ｔ細胞成長因子カクテルＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１は、腫瘍浸潤Ｔ細胞の拡大培養とエフェクター機能を増強する
[00970]  自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた養子Ｔ細胞療法は、転移性黒色腫及び子宮頸癌の患者で臨床的有効性を実証している。いくつかの研究では、より良い臨床結果では、注入された細胞の総数及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と正の相関を示している。現在のほとんどの産生レジメンでは、ＴＩＬの成長を促進するためにＩＬ−２のみを使用している。ＩＬ−１５及びＩＬ−２１を含むレジメンを使用すると、リンパ球の成長が促進されることが報告されている。この研究では、最近診療所で実施された第２のジェネレーションＩＬ−２  ＴＩＬプロトコルにＩＬ−１５及びＩＬ−２１を加えることの前向きな効果について説明する。
【０８１６】
材料及び方法
[00971]  ＴＩＬを生成するプロセスには、１〜３ｍｍ３サイズの腫瘍断片を、ＩＬ−２を含む培地に配置する、プレ急速拡大培養プロトコル（プレＲＥＰ）が含まれる。プレＲＥＰ中、ＴＩＬは腫瘍断片から移り、ＩＬ−２刺激に応じて拡大培養する。
【０８１７】
[00972]  ＴＩＬの成長を更に促進するために、ＴＩＬは、照射ＰＢＭＣフィーダー、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３を含む急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）と呼ばれる二次培養期間を通して拡大培養される。この研究では、最終的なＴＩＬ産物の表現型と機能の属性を維持しながらＴＩＬを拡大培養するために、短縮プレＲＥＰ及びＲＥＰ拡大培養プロトコルが開発された。
【０８１８】
[00973]  この短縮ＴＩＬ産生プロトコルを使用し、ＩＬ−２単独とＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の組み合わせの影響を評価した。これらの２つの培養レジメンは、結腸直腸癌、黒色腫、子宮頸癌、トリプルネガティブ乳癌、肺癌及び腎癌から成長したＴＩＬの産生について比較された。プレＲＥＰの完了時に、培養ＴＩＬの拡大率、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮγ）及びＴＣＲ  Ｖβレパートリーを評価した。
【０８１９】
[00974]  プレＲＥＰ培養は、標準ＩＬ−２（６００ＩＵ／ｍＬ）プロトコルを使用して、又はＩＬ−２に加えてＩＬ−１５（１８０ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ−２１（ＩＵ／ｍＬ）で開始した。プレＲＥＰの完了時に細胞の拡大を評価した。全体の成長が少なくとも２０％向上した場合、培養はＩＬ−２に比べて拡大が増加していると分類された。黒色腫及び肺癌の表現型及び機能についての研究をここに示す。以下の表３２を参照されたい。
【０８２０】
【表３６】
2021509586.tif 000040
【０８２１】
[00975]  これらのデータは、肺癌の表現型及び機能の違いに加え、ＩＬ−２単独と比較してＴＩＬをＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１と共に培養した場合のＴＩＬ産物収量の増加を実証する。
【０８２２】
[00976]  ＴＩＬの拡大に対するトリプルカクテルの効果は適応症に特異的であり、ほとんどの低収量腫瘍に利益をもたらした。
【０８２３】
[00977]  ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比は、ＮＳＣＬＣ  ＴＩＬ産物での処理により増加した。
【０８２４】
[00978]  Ｔ細胞活性は、黒色腫及びＮＳＣＬＣの両方でのＣＤ１０７ａ発現レベルによって評価されるように、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１をＩＬ−２に加えることにより増強されるようであった。
【０８２５】
[00979]  ここで、提供されるデータは、本出願において本明細書及び他の実施例で説明している２Ａプロセスなど、より短く、より堅牢なプロセスを使用したＴＩＬ拡大培養を、ＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１サイトカインカクテルの包含に適応できることを示しており、これにより、特に特定の適応症においてＴＩＬ拡大培養を更に促進する手段を提供する。
【０８２６】
[00980]  進行中の実験は、ＴＩＬ機能に対するＩＬ−２／ＩＬ−１５／ＩＬ−２１の効果を更に評価している。
【０８２７】
[00981]  追加の実験では、ＲＥＰ（第１の拡大培養）中のトリプルカクテルの効果を判定する。
【０８２８】
[00982]  これらの観察結果は、主流の抗癌療法に必要な幅広い適用性及び可用性を備えたＴＩＬの大規模な製造に必要なＴＩＬ培養レジメンの最適化及び標準化に特に関連する。
【０８２９】
実施例１５：同種異系フィーダー細胞の範囲を評価する：ＴＩＬ比率１００：１から２５：１まで
[00983]  この研究では、プロセス１Ｃで現在利用されているＴＩＬに対する１００：１の同種異系フィーダー細胞のコントロールに対して、２５：１及び５０：１でＴＩＬの成長を試験した。
【０８３０】
[00984]  国立癌研究所の外科部門が発表した研究では、ＲＥＰ（１）の開始時に１ｃｍ２あたり５×１０６個の同種異系フィーダー細胞でG-Rex 100フラスコのＴＩＬの最適な活性化の閾値が示された。これは数学的モデリングを通じて検証されており、同モデルで、単位面積あたりの細胞：細胞接触に最適化されたフィーダー層を使用すると、ＴＩＬの活性化及び拡大への影響は最小限で、ＴＩＬに対する同種異系フィーダー細胞の割合は２５：１に減少し得ることが予測された。
【０８３１】
[00985]  この研究では、ＲＥＰ開始時に単位面積あたりのフィーダー細胞の最適密度を確立し、１臨床ロットあたりの使用フィーダー細胞の量を減らして正規化するために必要なＲＥＰ開始時の同種異系フィーダー比の有効範囲を検証した。本研究では、固定数のフィーダー細胞で２００×１０６個未満の共培養されたＴＩＬを伴うＲＥＰの開始も実証された。
Ａ．Ｔ細胞の容積（直径１０μｍ）：Ｖ＝（４／３）πｒ３＝５２３．６μｍ３
Ｂ．高さ４０μｍ（４細胞）のG-Rex 100（Ｍ）の円柱フラスコ：Ｖ＝（４／３）πｒ３＝４×１０１２μｍ３
Ｃ．円柱フラスコＢを満たすために必要な細胞数：４×１０１２μｍ３／５２３．６μｍ３＝７．６×１０８μｍ３＊０．６４＝４．８６×１０８
Ｄ．４Ｄ空間で最適に活性化できる細胞数：４．８６×１０８／２４＝２０．２５×１０６
Ｅ．G-Rex 500に外挿されたフィーダー及びＴＩＬの数：ＴＩＬ：１００×１０６及びフィーダー：２．５×１０９
【０８３２】
[00991]  式１．１００ｃｍ２ベースのシリンダー内でＴＩＬを活性化するための正二十面体ジオメトリを提供するために必要な単核細胞の数の概算。この計算は、ＮＣＩの実験データを厳密に反映したＴ細胞の閾値活性化の約５×１０８の実験結果を導き出す。（１）（Ｃ）乗数（０．６４）は、１９９２年にJaeger及びNagelによって計算された等価球のランダムデータ密度である（２）。（Ｄ）除数２４は、４次元空間の「ニュートン数」（３）で同様のオブジェクトに接触する可能性のある等価球の数である。
【０８３３】
参照資料
(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3):283-292。
(2) Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20; 255(5051):1523-31。
(3) O. R. Musin (2003). “The problem of the twenty-five spheres”. Russ. Math. Surv. 58 (4):794-795。
【０８３４】
実施例１６：閉鎖系を使用した凍結保存ＴＩＬ細胞療法の産生
[00995]  この実施例では、Iovance Biotherapeutics,IncのｃＧＭＰ製造について説明する。現行のヒト細胞・組織医薬品の製造・品質管理基準並びに現行の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準に従ったG-RexフラスコでのＴＩＬ細胞療法プロセス。この資料は、米国ＦＤＡ医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理に関する基準（２１  ＣＦＲ  Ｐａｒｔ  ２１０、２１１、１２７０及び１２７１）並びにフェーズＩから商用資料まで適用されるＩＣＨ  Ｑ７基準に基づいて製造される。
【０８３５】
[00996]  プロセスの概要を以下の表３３に示す。
【０８３６】
【表３７】
2021509586.tif 000041
【０８３７】
[00997]  指定がない限り、この実施例全般的に１．０ｍＬ／Ｌ＝１．０ｇ／ｋｇを前提としている。開封後、２℃〜８℃で次の期限が適用される。ヒト血清、タイプＡＢ（ＨＩ）ジェミニ、１ヶ月；２−メルカプトエタノール、１か月。硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍｌ原料は、室温で１か月間保管し得る。１０ＬのAIM-V培地を含む袋は、使用前に最大２４時間、１度のみ室温で温め得る。２２日目の回収中、G-Rex500MCSフラスコからＴＩＬを回収するために２つのGatherex（商標）を使用し得る。
【０８３８】
０日目ＣＭ１培地の調整
[00998]  ＲＰＭＩ１６４０培地を調整した。ＢＳＣにおいて、適切なサイズのピペットを使用して、１０００ｍＬ  ＲＰＭＩ１６４０培地から１００．０ｍＬを取り出し、「廃棄物」とラベル付けされた適切なサイズの容器に入れた。
【０８３９】
[00999]  ＢＳＣにおいて、ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルに試薬を追加した。表に示すように、ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルに次の試薬を追加した。追加された容積が記録された。ボトル毎の追加量：熱不活性化ヒトＡＢ血清（１００．０ｍＬ）；GlutaMax（１０．０ｍＬ）；硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬ（１．０ｍＬ）；２−メルカプトエタノール（１．０ｍＬ）
【０８４０】
[001000]  試薬が完全に混合されるように、ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルにキャップを付け、ボトルを回転させた。ステップ８．１．６から１Ｌ  ０．２２−ミクロンフィルターユニットを通してＲＰＭＩ１６４０培地をろ過した。ろ過された培地とラベル付けした。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、以下の情報をラベル付けした。
【０８４１】
[001001]  全ての氷が溶けるまで、１つの１．１ｍＬ  ＩＬ−２アリコート（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍した。ＩＬ−２を記録した。ロット番号と有効期限。ＩＬ−２原料溶液を培地に移した。ＢＳＣにおいて、１．０ｍＬのＩＬ−２原料溶液を、ステップ８．１．８で調整したＣＭ１  ０日目培地ボトルに移した。ＣＭ１  ０日目培地１ボトル及びＩＬ−２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）１．０ｍＬを追加した。ＩＬ−２を含む培地を混合するために、ボトルに蓋をして回転させた。「完了ＣＭ１  ０日目培地」というラベルが付けられた。
【０８４２】
[001002]  適切なサイズのピペットを使用して２０．０ｍＬの培地を取り出し、５０ｍＬのコニカルチューブに分注した。ＢＳＣにおいて、「完了ＣＭ１  ０日目培地」と表示された２５．０ｍＬ（ステップ８．１．１３で調整済）を５０ｍＬのコニカルチューブに移した。チューブに「組織片」とラベル付けした。G-Rex100MCS（Ｗ３０１３１３０）を無菌的にＢＳＣに入れた。ＢＳＣにおいて、ベントフィルタークランプを開いたままにし、G-Rex100MCSの全てのクランプを閉じた。ルアー接続を介して、G-Rex100MCSフラスコの赤い線をリピーターポンプ流体移送セット（Ｗ３００９４９７）の長径端に接続した。ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行した。ＢＳＣからリピーターポンプ流体移送セットのポンプチューブセクションを取り外し、リピーターポンプに取り付けた。ＢＳＣ内で、ポンプ式溶液分注システム（ＰＬＤＳ）（Ｗ３０１２７２０）からシリンジを取り外し、廃棄した。
【０８４３】
[001003]  ＰＬＤＳピペットを、ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のために「完了ＣＭ１  ０日目培地」にピペットチップを取り付けた。培地とG-Rex100MCSとの間の全てのクランプを開けた。完了ＣＭ１培地をG-Rex100MCSフラスコに送り込んだ。ポンプ速度を「高」及び「９」に設定し、全ての完了ＣＭ１  ０日目培地をG-Rex100MCSフラスコに送り込んだ。全ての培地が送り込まれた時点で、ラインをクリアにし、ポンプを停止した。
【０８４４】
[001004]  フラスコからポンプを取り外した。ベントフィルターを除き、フラスコの全てのクランプが閉じていることを確認した。赤い培地ラインからリピーターポンプ流体移送セットを取り外し、赤い培地ラインに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。ＢＳＣからG-Rex100MCSフラスコを取り除きターミナルルアー近くの赤いラインから赤いキャップをヒートシールした。ＱＡが用意したG-Rex100MCSフラスコにin-process「０日目」ラベルを付けた。下記に「０日目」ラベルのサンプルを添付した。インキュベーターパラメーター：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％ＣＯ２。
【０８４５】
[001005]  ３０分以上の加温のために、インキュベーターに５０ｍＬコニカルチューブを設置した。
【０８４６】
０日目腫瘍洗浄培地の調整
[001006]  ゲンタマイシンをＨＢＳＳに追加した。ＢＳＣにおいて、５．０ｍＬのゲンタマイシン（Ｗ３００９８３２又はＷ３０１２７３５）を１×５００ｍＬ  ＨＢＳＳ培地（Ｗ３０１３１２８）ボトルに追加した。容積を記録した。ボトル毎の追加量：ＨＢＳＳ（５００．０ｍＬ）；硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍｌ（５．０ｍＬ）。試薬を完全に混合した。ステップ８．２．１で調整したゲンタマイシンを含むＨＢＳＳを１Ｌ  ０．２２ミクロンフィルターユニット（Ｗ１２１８８１０）でろ過した。ろ過された培地に無菌的に蓋をし、以下の情報をラベル付けした。
【０８４７】
０日目の腫瘍処置
[001007]  腫瘍標本を入手し、腫瘍情報を処理及び記録するために直ちに２℃〜８℃の部屋に移した。３本の５０ｍｌコニカルチューブにラベルを付けた。１つ目は「鉗子」、２つ目は「メス」、３つ目は「新鮮な腫瘍洗浄培地」。５×１００ｍｍのペトリ皿に「洗浄１」、「洗浄２」、「洗浄３」、「保持」及び「良好でない」というラベルを付けた。１つの６ウェルプレートに「好ましい中間断片」というラベルを付けた。
【０８４８】
[001008]  適切なサイズのピペットを使用して、５．０ｍＬの「腫瘍洗浄培地」を１つの６ウェルプレートの各ウェルの良好な中間腫瘍断片を（合計３０．０ｍＬ）に移した。適切なサイズのピペットを使用して、ステップ８．２．４で調整した５０．０ｍＬの「腫瘍洗浄培地」を「洗浄１」、「洗浄２」、「洗浄３」、「保持」の各１００ｍｍペトリ皿に移した（合計２００．０ｍＬ）。適切なサイズのピペットを使用して、ステップ８．２．４で準備した２０．０ｍＬの「腫瘍洗浄培地」を各５０ｍＬコニカル（合計６０．０ｍＬ）に移した。２つの６ウェルプレートから蓋を無菌的に取り外した。蓋は、選択された腫瘍断片に利用された。無菌的に腫瘍はＢＳＣに移された。処理開始時間が記録された。
【０８４９】
[001009]  腫瘍洗浄１：鉗子を使用し、標本ボトルから腫瘍を取り出し、「洗浄１」に移した。鉗子を使用して、腫瘍を優しくそっと洗浄し、時間を記録した。サンプル計画毎に腫瘍検体ボトルから２０．０ｍＬ（又は利用可能な容積）の溶液を５０ｍＬのコニカルに移した。テストのために提出するまで収集したバイオバーデンサンプルを２〜８℃でラベル付けし保存した。
【０８５０】
[001010]  腫瘍洗浄２：新しい鉗子セットを使用し、「洗浄１」皿から腫瘍を取り出し、洗浄２皿に移した。鉗子を使用し、３分以上静かに攪拌して腫瘍標本を洗浄し、その後、静置した。時間を記録した。
【０８５１】
[001011]  移送ピペットを使用して、コニカルから腫瘍洗浄培地を４滴ずつ、６ウェルプレートの裏返した蓋のそれぞれの６つの円に入れた（２つの蓋）。２つの円に追加で滴下し、合計で５０滴入れた。
【０８５２】
[001012]  腫瘍洗浄３：鉗子を使用し、「洗浄２」皿から腫瘍を取り出し、「洗浄３」皿に移した。鉗子を使用し、静かに攪拌して腫瘍標本を洗浄し、その後、３分以上静置した。時間を記録した。
【０８５３】
[001013]  １５０ｍｍ皿の蓋の下に定規を置いた。鉗子を使用し、無菌的に腫瘍標本を１５０ｍｍ解剖皿の蓋に移した。腫瘍標本の全ての断片を端から端まで配置し、おおよその全長と断片の数を記録した。壊死／脂肪組織の腫瘍を評価した。腫瘍領域全体の３０％以上が壊死組織及び／又は脂肪組織であると観察されたかどうかを評価した。はいの場合、腫瘍全体が適切な大きさであることを確認し、その場合、続行した。腫瘍領域全体の３０％未満が壊死組織又は脂肪組織であることが観察されたかどうかを評価した。はいの場合、続行した。
【０８５４】
[001014]  切離の処理。腫瘍が大きく、組織外部の３０％超が壊死／脂肪質が観察された場合、メス及び／又は鉗子の組み合わせを用いて、腫瘍の内部構造を維持しつつ、壊死／脂肪組織を取り除くことにより「切離の処理」が行われた。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用した。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。
【０８５５】
[001015]  メス及び／又は鉗子の組み合わせを使用して、腫瘍標本を均一で適切なサイズの断片（最大６個の中間断片）に切断する。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用する。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。解剖されていない中間断片を「腫瘍洗浄培地」に完全に浸したままにすること。各中間断片を「保持」皿に移した。
【０８５６】
[001016]  一度に１つの中間断片を操作し、解剖皿の腫瘍中間断片を約３×３×３ｍｍのサイズの断片に切離し、各断片の出血、壊死及び／又は脂肪組織の量を最小限にした。腫瘍の内部構造を維持するために、垂直切断圧のみを使用した。メスによる鋸引き運動での切断はしなかった。
【０８５７】
[001017]  出血、壊死及び／又は脂肪組織のない最大８個の腫瘍断片を選択した。参考として、定規を使用した。８個の良好な断片を得られるまで又は中間断片全体が切離されるまで解剖を続けた。選択した各断片を「腫瘍洗浄培地」の１滴に移した。
【０８５８】
[001018]  中間断片から最大８個を選択した後、中間断片のレムナントを「好ましい中間断片」の６ウェルプレートの新しいシングルウェルに入れた。
【０８５９】
[001019]  望ましい組織が残っている場合、最大５０断片を滴下で充填するために、「好ましい中間断片」の６ウェルプレートから追加の好ましい腫瘍断片を選択した。作成された切離断片の総数を記録した。
【０８６０】
[001020]  インキュベーターから「組織片」５０ｍＬコニカルチューブを取り出した。コニカルチューブを３０分以上温めること。「組織片」５０ｍＬコニカルをＢＳＣに入れ、オープン処理表面の無菌性を損なわないようにする。
【０８６１】
[001021]  移送ピペット、メス、鉗子又は組み合わせを使用して、良好な皿のふたから選択された５０個の最良の腫瘍断片を「組織片」５０ｍＬコニカルチューブに移した。移動中に腫瘍断片を落とし、望ましい組織が残っている場合、好ましい腫瘍中間断片ウェルから追加の断片が加えられた。断片数を記録した。
【０８６２】
[001022]  インキュベーターから培地を含むG-Rex100MCSを取り出した。G-Rex100MCSを無菌的にＢＳＣに入れた。フラスコを移す時、蓋又は容器の底から手に持たない。両サイドから手に持ち容器を移動した。ＢＳＣでは、G-Rex100MCSフラスコキャップを持ち上げて、チューブ内部の無菌性が維持されるようにした。懸濁するために腫瘍断片の入ったコニカルチューブを攪拌し、内容物を素早くG-Rex100MCSフラスコに注いだ。腫瘍断片がフラスコの膜全体に均一に分布するように確認した。必要に応じてフラスコを前後に静かに傾けて、腫瘍断片を均等に分散させた。容器の底膜の腫瘍断片の数及び容器内で確認できる浮遊物の数を記録した。注記：播種された断片の数が収集された数と同等でない場合、エリア管理に連絡し、セクション１０．０の文書を作成すること。
【０８６３】
[001023]  以下のパラメータでG-Rex100MCSをインキュベートした：G-Rexフラスコをインキュベートした。温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％  ＣＯ２。インキュベーション１１日目にG-Rex100MCSを取り出す適切な時間を決定するための計算を実行した。計算：インキュベーション時間；下限＝インキュベーション時間＋２５２時間；上限＝インキュベーション時間＋２７６時間。
【０８６４】
１１日目  −  培地の調製
[001024]  インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％  ＣＯ２。１０００ｍＬ  ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｗ３０１３１１２）ボトル３本及び１０００ｍＬAIM-V（Ｗ３００９５０１）ボトル３本を、インキュベーターで３０分以上温めた。時間を記録した。培地：ＲＰＭＩ１６４０及びAIM-V。後で使用するために、AIM-V培地（Ｗ３００９５０１）の追加の１×１０００ｍｌボトルを室温で配置した。
【０８６５】
[001025]  時間に達した時にＲＰＭＩ１６４０培地を取り出した。ステップ８．４．４でインキュベーション終了時間を記録した。培地が３０分以上温められていることを確認する。ＢＳＣで、３本の予め温めておいた１０００ｍＬ  ＲＰＭＩ１６４０培地ボトルのそれぞれから１００．０ｍＬを取り出し、「廃棄物」というラベルが付いた適切なサイズの容器に入れた。ＢＳＣで、３本のＲＰＭＩ１６４０培地ボトルそれぞれに以下の試薬を加え、各ボトルに加えた容積を記録した。GemCell Human serum, Heat Inactivated Type AB（１００．０ｍＬ）、GlutaMax（１０．０ｍＬ）、硫酸ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍＬ（１．０ｍＬ）、２−メルカプトエタノール（１．０ｍＬ）。
【０８６６】
[001026]  試薬が完全に混合されるように、ボトルに蓋をし、回転した。培地の各ボトルを個別の１Ｌ  ０．２２ミクロンフィルターユニットでろ過した。ろ過した培地を無菌的に蓋し、各ボトルにＣＭ１  １１日目培地ラベル付けした。全ての氷が溶けるまでＩＬ−２の３×１．１ｍＬアリコート（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍し、ＩＬ２ロット番号と有効期限を記録した。
【０８６７】
[001027]  インキュベーターから３本のAIM-V培地を取り出した。インキュベーション終了時間を記録した。３０分以上培地を温めたか確認した。マイクロピペットを使用して、解凍したＩＬ−２  ３．０ｍＬを事前に温めたAIM-V培地の１Ｌボトル１本に加えた。ＩＬ−２を分注した後、マイクロピペットチップを培地ですすぐ。各アリコートに新しい滅菌マイクロピペットチップを使用する。追加された総量を記録した。「ＩＬ−２を含むAIM-V」とボトルにラベルを付けた。１０ＬのLabtainerバッグとリピーターポンプ移送セットをＢＳＣに無菌的に移した。１０ＬのLabtainerバッグの全てのラインを閉じた。ルアーロック接続を介して、リピーターポンプ移送セットの長径のチューブの端を１０ＬのLabtainerバッグの中央メスポートに取り付けた。
【０８６８】
[001028]  ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行した。移送セットチュービングをBaxaポンプに通した。Baxaポンプを「高」及び「９」に設定する。Pumpmatic Liquid-Dispensing System（ＰＬＤＳ）からシリンジを取り外し、廃棄した。ＰＬＤＳピペットの無菌性を損なわないようにすること。
【０８６９】
[001029]  ルアー接続を介してＰＬＤＳピペットをリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のためＩＬ−２ボトル（ステップ８．４．１３で調整済）を含むAIM-V培地にピペットの先端を入れた。培地ボトルと１０ＬのLabtainer間の全てのクランプを開いた。
【０８７０】
[001030]  ＰＬＤＳを使用して、調整したＩＬ−２を含む予め温めておいたAIM-V培地を２本の追加のAIM-Vボトルと同様に１０ＬのLabtainerバッグに移す。ろ過されたＣＭ１  １１日目培地の３本のボトルを追加した。最終ボトルの追加後、バッグのラインをクリアにした。注記：培地の各ボトルの追加中にポンプを停止した。移送セットからＰＬＤＳを取り出し、ＢＳＣのラインのルアーに赤いキャップを取り付けた。バッグを優しく揉み混合した。次に記載する情報で培地バックにラベル付けした。有効期限は調整日から２４時間であった。
【０８７１】
[001031]  「完全ＣＭ２  １１日目培地」バッグの利用可能なメスポートに６０ｍＬシリンジを取り付けた。２０．０ｍＬの培地を取り出し、５０ｍＬのコニカルチューブに入れた。「完全ＣＭ２  １１日目培地」バッグのメスポートに赤いキャップを取り付けた。テストのために提出するまで、培地参考サンプルを２〜８℃でラベル付けし保存した。移送セットラインの赤いキャップを、赤いキャップの近くでヒートシールした。移送セットをバッグに接続したままにした。
【０８７２】
[001032]  ＢＳＣで、「細胞数希釈用」とロット番号でラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地を４本の１５ｍＬコニカルチューブに追加した。ロット番号とチューブ番号（１〜４）をチューブにラベル付けした。４つのクライオバイアル「フィーダー」とバイアル番号（１〜４）とラベル付けした。残りの２−メルカプトエタノール、GlutaMax及びヒト血清をＢＳＣから２〜８℃に移した。
【０８７３】
[001033]  ＢＳＣの外側で、調整した「完全ＣＭ２  １１日目培地」バッグに取り付けられた移送セットに１Ｌ移送パックを溶接した。「フィーダー細胞ＣＭ２」及びロット番号を移送パックにラベル付けした。バッグから数インチ離れた場所に１Ｌの移送パックチューブのチューブに、マークを付けた。チューブがマークの位置までスケール上にあるように、空の移送パックをスケールの上に置いた。スケールを風袋引きし、スケールに空の移送パックを置いた。
【０８７４】
[001034]  Baxaポンプを「中」及び「４」に設定する。ステップ８．４．２２で調整した「完全ＣＭ２  １１日目」培地５００．０±５．０ｍＬを細胞ＣＭ２培地移送パックに注入した。重量で測定し、移送パックに追加された完全ＣＭ２培地の容積を記録した。
【０８７５】
[001035]  充填したら、ラインをヒートシールした。フィーダーセル培地移送パックから移送セット付きのＣＭ２  １１日目の培地バッグを離し、１Ｌ移送パックに溶接したままにした。調整した「完全ＣＭ２  １１日目培地」を使用するまでインキュベーターに入れた。
【０８７６】
１１日目  −  ＴＩＬ回収
[001036]  インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％  ＣＯ２。G-Rex100MCSをインキュベーターから取り外す前に、インキュベーションパラメーターが満たされていることを確認するためのチェックを実行した。下限は上記と同じである。
【０８７７】
[001037]  インキュベーターからの取り出し時間を記録した。インキュベーターからG-Rex 100MCSを慎重に取り外し、大きいフィルターラインを除く全てのクランプが閉じられていることを確実にした。処理開始時間が記録された。
【０８７８】
[001038]  ３００ｍＬ移送パックに「ＴＩＬ懸濁液」のラベルを付けた。重力血液フィルターのＴＩＬ懸濁液移送（単線）を滅菌溶接した。３００ｍＬ移送パックをはかりに置き、乾燥重量を記録した。１Ｌ移送パックに「上清」とラベル付けした。
【０８７９】
[001039]  G-Rex100MCSからの赤い培地除去ラインを「上清」移送パックに滅菌溶接した。「ＴＩＬ懸濁液」移送パックに接続された血液フィルターの上部の２つのスパイクラインの１つにG-Rex100MCSからの透明細胞除去ラインを滅菌溶接した。G-Rex100MCSをGatheRexの左側に配置し、「上清」及び「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを右側に配置した。
【０８８０】
[001040]  G Rex100MCSから赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部（赤い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex100MCSからのクリアハーベストラインをGatheRexのクランプ底部（青い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。GatheRexからG-Rex100MCSフラスコの滅菌フィルターにガスラインを取り付けた。G-Rex100MCSフラスコから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。G-Rex100MCSから１Ｌ移送パックに約９００ｍＬの培地上清を移した。フラスコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex100MCSフラスコを目視で検査した。
【０８８１】
[001041]  上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
【０８８２】
[001042]  フラスコを激しく叩いて細胞を遊離させるために培地を攪拌した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。注記：細胞が離れなかった場合、エリア管理に連絡すること。収集チューブから離してフラスコを傾け、腫瘍断片を縁に沿って沈降させた。断片がフラスコの反対側に残るように、収集チューブに向かってゆっくりとフラスコを傾けた。細胞収集ストローが壁面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、４５０の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くのみで十分である。
【０８８３】
[001043]  ＴＩＬサスペンション移送パックにつながる全てのクランプを解放した。GatheRexを使用して、血液フィルターから細胞懸濁液を３００ｍＬ移送パックに移した。全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けた。付着した細胞について膜を検査した。G-Rex100MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約１／４をすすぎ培地で覆う。全てのクランプが閉じていることを確認した。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでＴＩＬサスペンション移送パックをヒートシールした（プロセスノート５．１２に従う）。「上清」トランスファパックをヒートシールした。溶接のための十分なラインを維持した。ＴＩＬ懸濁液移送パックの重量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。
【０８８４】
[001044]  ４インチプラズマ移送セットを「上清」移送パックに溶接し、４インチプラズマ移送セットのルアー接続を保持し、ＢＳＣに移した。４インチプラズマ移送セットを３００ｍＬ「ＴＩＬ懸濁」移送パックに溶接し、４インチプラズマ移送セットのルアー接続を保持し、ＢＳＣに移した。
【０８８５】
[001045]  １Ｌの「上清」移送パックから約２０．０ｍＬの上清を吸い上げ、「Bac-T」とラベル付けした滅菌５０ｍＬコニカルチューブに分注した。適切なサイズのシリンジを使用して、BacTとラベル付けされた５０ｍＬのコニカルから１．０ｍＬのサンプルを取り出し、嫌気性ボトルに播種した。
【０８８６】
[001046]  バイアル番号（１〜４）と４つのクライオバイアルにラベル付けした。別の３ｍＬシリンジを使用して、ルアー接続を使用してＴＩＬ懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞カウントサンプルを引き出し、それぞれのクライオバイアルに入れた。ラインに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。必要になるまで、ＴＩＬ移送パックをインキュベーターに入れた。細胞計数及び計算を実行した。希釈していない初期細胞計数を実行した。希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０。
【０８８７】
[001047]  細胞計数とＴＩＬ数を記録した。総生存ＴＩＬ細胞が５×１０６未満である場合、「１１日目のG-Rexの充填及び播種」に進めた。総生存ＴＩＬ細胞が５×１０６を超える場合、「フローサイトメトリーで計算」に進む。
【０８８８】
フローサイトメトリーで計算。
[001048]  総生存ＴＩＬセル数が４．０×１０７以上の場合、フローサイトメトリーのサンプルのために１．０×１０７個の細胞を得るために容積を計算した。フローサイトメトリーに必要な総生存細胞：１．０×１０７細胞。フローサイトメトリーに必要な細胞の容積：生存細胞濃度を１．０×１０７細胞で割った値。
【０８８９】
[001049]  該当する場合：総生細胞及び容積のフローを再計算した。以下のサイトメトリーのサンプルを除去した後の残りの総生存細胞と残りの容積を計算した。
【０８９０】
サンプルのＴＩＬ凍結保存
[001050]  該当する場合：凍結保存のための容積を計算した。凍結保存のために１×１０７個の細胞を得るために必要な細胞の体積を計算した。
【０８９１】
【表３８】
2021509586.tif 000042
【０８９２】
[001051]  該当する場合：凍結保存のためのサンプルを取り除いた。ＴＩＬ懸濁液移送パックから計算された容積を取り出した。適切なサイズのコニカルチューブに入れ、「凍結保存サンプル１×１０７細胞」、日付及びロット番号をラベル付けした。ＴＩＬ懸濁液移送パックに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。
【０８９３】
[001052]  次のパラメータに従って「凍結保存サンプル１×１０７細胞」を遠心分離した。速度：３５０×ｇ、時間：１０：００分、温度：外気温度、ブレーキ：フル（９）；加速：フル（９）。
【０８９４】
[001053]  ＣＳ−１０を追加した。ＢＳＣにおいて、無菌的に上清を吸引した。チューブの底を軽く叩き、残った液体に細胞を再懸濁した。ＣＳ−１０を追加した。０．５ｍＬのＣＳ１０をゆっくりと添加した。容積を記録した。凍結保存サンプルバイアルは、約０．５ｍＬで満たされた。
【０８９５】
１１日目  −  フィーダー細胞
[001054]  ＬＮ２フリーザーから少なくとも２つの異なるロット番号を持つフィーダー細胞のバッグを３つ入手した。解凍の準備ができるまで、ドライアイス上に細胞を置いた。フィーダー細胞情報を記録した。少なくとも２つの異なるロット番号のフィーダー細胞が得られたことを確認した。フィーダー細胞バッグをロット番号に基づいて個々のジップトップバッグに入れ、３７．０±２．０℃の水浴若しくはサイトサーモを約３〜５分又は氷が消えるまで解凍した。
【０８９６】
[001055]  フィーダー細胞ハーネスの準備。4S-4M60をCC2セルコネクト（Ｗ３０１２８２０）に溶接し、セルコネクト装置の単一スパイクを4S-4M60マニホールドの４スパイク端に置き換えた。必要に応じて溶接した。
【０８９７】
[001056]  「フィーダー細胞ＣＭ２  １１培地」移送パックに溶接された培地移送パックをCC2ルアーに接続した。バッグは、ニードレスインジェクションポートでハーネスの側面に取り付けられる。完全ＣＭ２  １１日目培地を含む部品をＢＳＣに移した。
【０８９８】
[001057]  解凍したフィーダー細胞を貯める。ＢＳＣ内で、１００ｍＬシリンジに１０ｍＬの空気を引き込んだ。これを使用して、CC2の６０ｍＬシリンジを交換した。カバーを取り外す前に、アルコールパッドでフィーダー細胞バックのポートを拭いた。CC2の３つのスパイクを使用して、３つのフィーダーバッグをスパイクする。スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持した。ポートの側面に穴を開けないようにすること。フィーダー細胞バッグからのラインが開き、ニードレスインジェクションポートへのラインが閉じるように、活栓を開いた。フィーダー細胞バッグの内容物をシリンジに入れた。３つのバッグは全て一度に排水された。シリンジの圧力を維持しながら、フィーダー細胞バッグから排水した時点で、フィーダー細胞バッグのラインを遮断した。下のシリンジからハーネスを取り外さなかった。シリンジ内のフィーダー細胞の総量を記録した。
【０８９９】
[001058]  移送パックにフィーダー細胞が追加された。活栓を回し、フィーダー細胞バッグのラインを閉じ、培地移送パックのラインを開けた。培地移送パックへのラインがクランプ解除されていることを確認した。フィーダー細胞をシリンジから「フィーダー細胞ＣＭ２培地」移送パックに分注した。フィーダー細胞を含む移送パックのラインのクランプを開放し、シリンジはハーネスに取り付けたままにした。移送パックの貯められたフィーダー細胞を混合するためにバッグを揉んだ。「フィーダー細胞懸濁液」とバッグにラベル付けした。
【０９００】
[001059]  フィーダー細胞懸濁液の総量を計算した。細胞計数サンプルを取り除いた。各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用し、ニードレスインジェクションポートを使用してフィーダー細胞懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞数サンプルを引き出した。各サンプルをラベル付きクライオバイアルに分注した。
【０９０１】
[001060]  NC-200及びプロセスノート５．１４を使用して、細胞数及び計算を実行した。０．５ｍＬの細胞懸濁液を、ロット番号及び「細胞数希釈用」でラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地に加えることにより、細胞数サンプルを希釈した。これにより１：１０希釈となる。
【０９０２】
[001061]  細胞数及びサンプル量を記録した。総生細胞が５×１０９未満である場合に続行する。総生細胞が５×１０９以上の場合、細胞数を増やすために上記のように進めた。必要に応じて追加のフィーダーセルを得て、先に述べたように移送パックに追加した。生存可能な５×１０９のフィーダー細胞を得るために必要なフィーダー細胞懸濁液の容積を計算した。除去する過剰分のフィーダー細胞の容積を計算した。最も近い整数に切り捨てる。
【０９０３】
[001062]  余分なフィーダー細胞を除去した。新しい１００ｍＬシリンジで、１０ｍＬの空気を吸い上げ、シリンジをハーネスに取り付けた。「フィーダー細胞懸濁液」移送パックへのラインを開いた。シリンジを使用して、計算されたフィーダー細胞の容積と移送パックからの追加の１０．０ｍＬを１００ｍＬシリンジに入れた。フィーダー細胞の容積を取り除いたら、フィーダー細胞懸濁液移送パックのラインを閉じた。最終シリンジは取り外さなかった。シリンジが満たされたら、新しいシリンジと交換した。複数のシリンジを使用して、総量を取り除いた。新しいシリンジ毎に１０ｍＬの空気を引き込んだ。除去されたフィーダー細胞の総量（追加の１０ｍＬを含む）を記録した。
【０９０４】
[001063]  ＯＫＴ３を加えた。ＢＳＣで、１．０ｍＬシリンジと１６Ｇ針を使用して、０．１５ｍＬのＯＫＴ３を吸い上げた。シリンジから針を無菌的に取り外し、シリンジをニードルレスインジェクションポートに取り付ける。ＯＫＴ３を注入した「フィーダー細胞懸濁液」移送パックの活栓を開き、先に取り出したフィーダー細胞１０ｍＬを追加して、ラインを通してＯＫＴ３を洗い流した。シリンジを逆さまにして、空気を押し通してフィーダー細胞懸濁液移送パックへのラインをクリアにした。残りのフィーダー細胞懸濁液をシリンジに残した。全てのクランプを閉じ、ハーネスをＢＳＣから取り外した。溶接に十分なチューブを残し、フィーダー細胞懸濁液移送パックをヒートシールした。
【０９０５】
１１日目のG-Rexの充填及び播種
[001064]  G-Rex500MCSのセットアップ。梱包からG-Rex500MCSを取り出し、フラスコに亀裂又はチューブにねじれがないか検査した。全てのルアー接続と閉鎖が確実であることを確認した。ベントフィルターラインを除くG-Rex500MCSラインの全てのクランプを閉じた。マーカーを使用して、４．５Ｌグラデーションで線を引いた。インキュベーターから「完全ＣＭ２  １１日目培地」を取り出した。
【０９０６】
[001065]  培地を汲み上げる準備。G-Rex500MCSの赤い線を、完全ＣＭ２  １１日目培地に接続されたリピーターポンプ移送セットに溶接した。「完全ＣＭ２  １１日目培地」バッグをＩＶポールに掛けた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。G-Rex500MCSに培地を注入した。Baxaポンプを「高」及び「９」に設定する。G-Rex500MCSに４．５Ｌの培地を注入し、４．５Ｌグラデーションでフラスコに印を付けた線まで満たした。溶接部の近くでG-Rex500MCSの赤い線をヒートシールした。フラスコに「１１日目」とラベル付けをした。フィーダーセルの溶接：懸濁液移送パックをフラスコへ。G-Rex500MCSの赤い線を「フィーダー細胞懸濁液」移送パックに滅菌溶接した。
【０９０７】
[001066]  フィーダー細胞をG-Rex500MCSに加えた。フィーダー細胞懸濁液とG-Rex500MCSとの間の全てのクランプを開き、重力供給方式によりフラスコにフィーダー細胞懸濁液を追加した。溶接部近くの赤い線をヒートシールした。ＴＩＬ懸濁液移送パックをフラスコに溶接した。G-Rex500MCSの赤い線を「ＴＩＬ懸濁液」移送パックに滅菌溶接した。
【０９０８】
[001067]  ＴＩＬをG-Rex500MCSに追加した。ＴＩＬ懸濁液とG-Rex500MCSとの間の全てのクランプを開き、重力供給方式によりフラスコにＴＩＬ懸濁液を追加した。ＴＩＬ懸濁液バッグを取り外すために、溶接部近くの赤い線をヒートシールした。
【０９０９】
[001068]  G-Rex500MCSをインキュベートした。大きいフィルターラインを除き、G-Rex 500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認し、インキュベーターに置いた。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセント：５．０±１．５％  ＣＯ２。
【０９１０】
[001069]  インキュベーションウィンドウを計算した。インキュベーション１６日目にG-Rex500MCSを取り出す適切な時間を決定するための計算を実行した。下限：インキュベーション時間＋１０８時間。上限：インキュベーション時間＋１３２時間。
【０９１１】
１１日目、過剰ＴＩＬ凍結保存
[001070]  過剰なＴＩＬバイアルを冷凍した。制御速度冷凍庫（ＣＲＦ）に入れられたバイアルの総数を記録及び検証した。冷却が完了したら、バイアルをＣＲＦから適切な保管容器に移す。
【０９１２】
１６日目  培地の調製
[001071]  事前に温められたAIM-V培地。使用の少なくとも１２時間前までに２〜８℃から３つのCTS AIM V  １０Ｌ培地バッグを取り外し、遮光して室温に置いた。各バッグにラベルを付けた。温め開始時刻と日付の記録。全てのバッグが１２〜２４時間温められていることを確認した。
【０９１３】
[001072]  ルアー接続を使用して、１０ＬのLabtainerバッグのメスポートの１つに、流体移送セットの長径端を接続した。「上清」として上清のラベルを１０ＬのLabtainerに準備した。上清のために１０ＬのLabtainerを準備した。ＢＳＣから取り外す前に、全てのクランプが閉じられていることを確認すること。
【０９１４】
[001073]  全ての氷が溶けるまで、CTS AIM V培地の１袋あたりＩＬ−２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）の５×１．１ｍＬアリコートを解凍した。Glutamax１００．０ｍＬを適切なサイズのレシーバーに分注した。各レシーバーに追加された容積を記録し、各レシーバーに「GlutaMax」とラベル付けした。
【０９１５】
[001074]  ＩＬ−２をGlutaMaxに追加した。マイクロピペットを使用して、各GlutaMaxレシーバーに５．０ｍＬのＩＬ−２を追加した。プロセスノート５．１８毎にチップをすすぐことを確認し、追加した各ｍＬに新しいピペットチップを使用した。各レシーバーに追加された容積を記録し、各レシーバーに「GlutaMax＋ＩＬ−２」とラベル付けした。
【０９１６】
[001075]  製剤のためにCTS AIM V培地バッグを準備した。CTS AIM V １０Ｌ培地バッグ（Ｗ３０１２７１７）が室温で温められ、使用前に１２〜２４時間遮光されていることを確認した。インキュベーション終了時間を記録した。ＢＳＣで、４インチプラズマ移送セットのクランプを閉じ、スパイクポートを使用しバッグと接続した。スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持した。ポートの側面に穴を開けないようにすること。ルアーを通じて、リピーターポンプ流体移送セットの長径端を４インチプラズマ移送セットに接続した。
【０９１７】
[001076]  ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行した。ＢＳＣからリピーターポンプ流体移送セットのポンプチューブセクションを取り外し、リピーターポンプに取り付けた。
【０９１８】
[001077]  製剤用培地を準備した。ＢＳＣ内で、ポンプ式溶液分注システム（ＰＬＤＳ）からシリンジを取り外し、廃棄した。ＰＬＤＳピペットの無菌性を損なわないようにすること。ＰＬＤＳピペットを、ルアー接続を介してリピーターポンプ流体移送セットの小径端に接続し、吸引のために「GlutaMax＋ＩＬ−２」にピペットチップを取り付けた。レシーバー及び１０Ｌバッグ間の全てのクランプを開く。
【０９１９】
[001078]  GlutaMax＋ＩＬ−２をバッグに注入した。ポンプ速度を「中」と「３」に設定し、全ての「GlutaMax＋ＩＬ−２」を１０Ｌ  CTS AIM V培地バッグに送った。溶液が残っていない場合、ラインをクリアにし、ポンプを停止する。以下の各Aim Vバッグに追加されたＩＬ−２を含むGlutaMaxの容積を記録した。
【０９２０】
[001079]  ＰＬＤＳを取り外した。全てのクランプが閉じていることを確認し、リピーターポンプ流体移送セットからＰＬＤＳピペットを取り外した。リピーターポンプ流体移送セットを取り外し、４インチのプラズマ移送セットに赤いキャップを付けた。
【０９２１】
[001080]  調整済み「完全ＣＭ４  １６日目培地」と各バッグにラベル付けした。
【０９２２】
[001081]  サンプルプラン毎の培地参考品を除去した。３０ｍＬシリンジを使用して、シリンジを４インチプラズマ移送セットに取り付けて２０．０ｍＬの「完全ＣＭ４  １６日目培地」取り出し、５０ｍＬコニカルチューブにサンプルを分注した。シリンジを取り外した後、４インチプラズマ移送セットが固定されているか又は赤いキャップが付いているか確認する。
【０９２３】
[001082]  新しいリピーターポンプ流体移送セットを取り付けた。「完全ＣＭ４  １６日目培地」バッグに接続された４インチプラズマ移送セットに新しいリ流体ポンプ移送セットの長径端を取り付けた。サンプルプラン在庫ラベルとラベル付けし、テストのために提出するまで、培地参考品サンプルを２〜８℃で保存した。
【０９２４】
[001083]  インキュベーターをモニターした。該当する場合、準備された追加のバッグを監視する。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ２パーセント：５．０±１．５％  ＣＯ２。
【０９２５】
[001084]  完全ＣＭ４  １６日目培地を温めた。インキュベーター内の完全ＣＭ４  １６日目培地の最初のバッグを、使用準備が整うまで３０分以上温めた。該当する場合、追加のバッグを温めた。
【０９２６】
[001085]  希釈の準備をした。ＢＳＣで、「細胞数希釈用」とラベル付けされたAIM-V培地の４．５ｍＬを各４×１５ｍＬコニカルチューブに加えた。コニカルチューブにラベルを付けた。４つのクライオバイアルにラベルを付けた。
【０９２７】
１６日目  ＲＥＰ流出
[001086]  インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５％  ＣＯ２。
【０９２８】
[001087]  インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出した。G-Rex500MCSをインキュベーターから取り外す前に、インキュベーションパラメーター上限、下限、除去時間が満たされていることを確認するためのチェックを実行した。インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出した。
【０９２９】
[001088]  約１２インチのラインを残し、１Ｌの移送パック（Ｗ３００６６４５）をヒートシールした。１Ｌ移送パックに「ＴＩＬ懸濁液」のラベルを付けた。ライン全体を含む１Ｌの移送パックをはかりの上に置き、乾燥重量を記録した。
【０９３０】
[001089]  GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからの赤色の培地除去ラインを、上記で調整した１０ＬのLabtainerバッグ「上清」のリピーターポンプ移送セットに滅菌溶接した。G-Rex500MCSからクリア細胞除去ラインを、上記で準備したＴＩＬ懸濁液移送パックに滅菌溶接した。G-Rex500MCSフラスコをGatheRexの左側に配置した。上清Labtainerバッグを置き、その右側に及びＴＩＬ懸濁液移送パックを配置した。G-Rex500MCSからの赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部（赤い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex500MCSからのクリアハーベストラインをクランプ底部（青い線でマーク）及びGatheRexのチューブガイドに取り付けた。GatheRexからガスラインをG-Rex500MCSの滅菌フィルターに取り付けた。注記：G-Rex500MCSから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。
【０９３１】
[001090]  G-Rex500MCSの容積削減。ＳＯＰ−０１７７７に従い、G-Rex500MCSから１０ＬのLabtainerに約４．５Ｌの培養上清を移した。フラスコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex500MCSフラスコを目視で検査した。
【０９３２】
[001091]  ＴＩＬ回収のためにフラスコを準備した。上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
【０９３３】
[001092]  ＴＩＬ回収の開始。ＴＩＬ回収開始時間を記録した。フラスコを激しく叩き細胞を遊離させるために培地を攪拌した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。細胞収集ストローが壁面及び底膜の接合部にない場合、ストローを適切に配置するには、通常、４５０の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くのみで十分である。
【０９３４】
[001093]  ＴＩＬの回収。ＴＩＬ懸濁液移送パックにつながる全てのクランプを解放した。GatheRexを使用して、細胞懸濁液をＴＩＬ懸濁液移送パックに移した。注記：全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けることを確認する。付着した細胞について膜を検査した。
【０９３５】
[001094]  フラスコ膜をすすいだ。G-Rex500MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約１／４をすすぎ培地で覆う。G-Rex500MCSのクランプを閉じた。G-Rex500MCSの全てのクランプが閉じていることを確認した。
【０９３６】
[001095]  ヒートシールした。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでＴＩＬ含有移送パックをヒートシールした。上清を含む１０ＬのLabtainerをヒートシールし、サンプル収集のためにBSCに通した。
【０９３７】
[001096]  細胞懸濁液を含む移送パックの重量を記録し、細胞懸濁液の容積を計算した。サンプル除去のための移送パックを準備した。４インチプラズマ移送セットを上からＴＩＬ懸濁液移送パックに溶接し、できるだけバッグの近くにメスルアーの端に取り付けたままにした。
【０９３８】
[001097]  細胞上清からテストサンプルを取り除いた。ＢＳＣで、メスのルアーポートと適切なサイズのシリンジを使用して、１０ＬのLabtainerから１０．０ｍＬの上清を取り除く。１５ｍＬのコニカルチューブに入れて「BacT」とラベルを付け、BacTサンプルのためにチューブを保持した。別のシリンジを使用して、１０．０ｍＬの上清を取り出し、１５ｍＬコニカルチューブに入れた。テストのためにマイコプラズマサンプルのためのチューブを保持した。「マイコプラズマ希釈剤」としてチューブにラベル付けした。上清バッグを閉じた。ルアーポートに赤いキャップを付けてバッグを閉じ、ＢＳＣから外した。
【０９３９】
[001098]  細胞カウントサンプルを取り出した。ＢＳＣで、各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用して、ルアー接続を使用し「ＴＩＬ懸濁液」移送パックから４×１．０ｍＬ細胞カウントサンプルを取り出した。上記で準備したクリオバイアルにサンプルを入れた。
【０９４０】
[001099]  マイコプラズマサンプルを取り出した。３ｍＬシリンジを使用し、ＴＩＬ懸濁液移送パックから１．０ｍＬ取り出し、上記で調整した「マイコプラズマ希釈液」とラベル付けした１５ｍＬコニカルに入れた。テストのために提出するまで、マイコプラズマサンプルを２〜８℃でラベル付けし保存した。
【０９４１】
[001100]  播種のための移送パックを準備した。ＢＳＣで、リピーターポンプ流体移送セットの長径チューブ端を、ＴＩＬを含む移送パックのルアーアダプターに取り付けた。止血鉗子を使用して、移送パックの近くのラインを遮断した。移送セットの端に赤いキャップをした。
【０９４２】
[001101]  ＴＩＬをインキュベーターに入れた。ＢＳＣから細胞懸濁液を取り除き、必要になるまでインキュベーターに入れた。時間を記録した。
【０９４３】
[001102]  セルカウントを実行した。NC-200使用して、細胞カウント及び計算を実行した。０．５ｍＬの細胞懸濁液を上記で調製した４．５ｍＬのAIM-V培地に加えて、最初に細胞カウントサンプルを希釈した。これにより、１：１０希釈になった。
【０９４４】
[001103]  継代培養のためのフラスコを計算した。播種に必要なフラスコの総数を計算した。注記：G-Rex500MCSフラスコの数を四捨五入して、近い整数に表示した。
【０９４５】
【表３９】
2021509586.tif 000043
【０９４６】
[001104]  播種のためのG-Rex500MCSフラスコの最大数は５であった。播種するフラスコの計算数が５個を超えた場合、利用可能な全量の細胞懸濁液を使用して、５個のみを播種した。
【０９４７】
[001105]  必要とする追加の培地バッグの数を決定した。上記で準備したバッグに加えて必要とする培地バッグの数を計算した。必要な培地バッグの数を次の整数に切り上げた。
【０９４８】
【表４０】
2021509586.tif 000044
【０９４９】
[001106]  必要に応じて追加の培地を調整した。上記で計算したG-Rex-500Mフラスコが２つ必要なたびに、「ＣＭ４  １６日目培地」の１０Ｌバッグを１つ準備した。追加の培地を準備し温めながら、最初のGREX-500Mフラスコに進み、播種した。
【０９５０】
[001107]  必要に応じて追加の培地バッグを調整した。上記で決定した追加の培地バッグの計算された数を準備し、温めた。
【０９５１】
[001108]  G-Rex500MCSを満たした。ベンチトップでG-Rex500MCSを開き、容器の亀裂又はチューブのねじれを検査した。全てのルアー接続と閉鎖が確実であることを確認した。フラスコの外側の４５００ｍＬラインにマーカーでマークを付けた。大きいフィルターラインを除いて、G-Rex 500MCSの全てのクランプを閉じた。G-Rex500MCSの赤い培地ラインを、上記で準備した培地バッグの液体移送セットに滅菌溶接した。
【０９５２】
[001109]  培地を汲み上げる準備。ＩＶポールに「ＣＭ４  １６日目培地」を掛けた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。
【０９５３】
[001110]  G-Rex500MCSに培地を注入した。Baxaポンプを「高」及び「９」に設定し、４５００ｍＬの培地をフラスコに注入する。４．５Ｌの「ＣＭ４  １６日目培地」をG-Rex500MCSに注入し、上記のようにフラスコにマークされた線まで満たした。４．５Ｌの培地が移されたら直ちにポンプを停止した。
【０９５４】
[001111]  ヒートシールした。G-Rex500MCSの赤い培地ラインを、作成された溶接部の近くでヒートシールし、培地バッグを取り外した。
【０９５５】
[001112]  充填の繰り返し。培地が温められ、使用の準備ができたら、上記で計算された各フラスコについて、充填とシーリングの手順を繰り返す。重力充填又は複数のポンプを使用して、複数のフラスコに同時に充填し得る。培地１バッグについて２つのフラスコのみを充填する。
【０９５６】
[001113]  満たされたフラスコを記録しラベル付けした。各フラスコにアルファベット順に「１６日目」のラベル付けした。
【０９５７】
[001114]  必要に応じてフラスコをインキュベートした。ＴＩＬを播種するのを待つ間、フラスコをインキュベーターで保存した。充填されたフラスコの総数を記録した。
【０９５８】
[001115]  追加する細胞懸濁液の容量を計算した。新しいG-Rex500MCSフラスコに追加するＴＩＬ懸濁液の目標量を計算した。
【０９５９】
【表４１】
2021509586.tif 000045
【０９６０】
[001116]  フラスコの数が５個を超える場合、５個のみが播種され、細胞懸濁液の全量が使用される。
【０９６１】
[001117]  播種のためにフラスコを準備した。インキュベーターからステップ８．１０．７０よりG-Rex500MCSを取り出した。
【０９６２】
[001118]  ポンピングの準備。大きいフィルターライン以外のG-Rex 500MCSの全てのクランプを閉じた。ポンプチュービングをBaxaポンプに通した。
【０９６３】
[001119]  インキュベーターからＴＩＬを取り出した。インキュベーターから「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを取り出し、インキュベーション終了時間を記録した。
【０９６４】
[001120]  播種のために細胞懸濁液を調整した。「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを上からポンプインレットラインまで滅菌溶接した。
【０９６５】
[001121]  スケール上にＴＩＬ懸濁液バッグを置いた。「低」及び「２」に設定されたBaxaポンプを使用して、ＴＩＬ懸濁液バッグから溶接までのラインをプライミングした。スケールを風袋引きした。
【０９６６】
[001122]  ＴＩＬ懸濁液をフラスコに播種した。Baxaポンプを“中”及び“５”と設定する。上記で計算したＴＩＬ懸濁液の容量をフラスコに注入する。各フラスコに加えたＴＩＬ懸濁液の容量を記録する。
【０９６７】
[001123]  ヒートシールした。次のフラスコを溶接するのに十分なチューブを残し、「ＴＩＬ懸濁液」移送パックをヒートシールした。
【０９６８】
[001124]  残りのフラスコを充填した。播種した各フラスコ間で「ＴＩＬ懸濁液」移送パックを混合したことを確認し、残りの全てのフラスコに播種するために充填とシーリングのステップを繰り返した。
【０９６９】
[001125]  インキュベーターをモニターした。フラスコが２つのインキュベーターに分けて入れる必要がある場合、両方をモニターすること。インキュベーターのパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃；ＣＯ２パーセント：５．０±１．５％  ＣＯ２。各フラスコがインキュベーターに置かれた時間を記録した。
【０９７０】
[001126]  インキュベーションウィンドウを計算した。インキュベーション２２日目にG-Rex500MCSを取り出す時間範囲を決定するために以下の計算を実行した。下限：時間＋１３２時間；上限：時間＋１５６時間。
【０９７１】
２２日目  洗浄バッファーの調製
[001127]  １０ＬのLabtainerバッグを準備した。ＢＳＣで、ルアー接続を介して４インチプラズマ移送セットを１０ＬのLabtainerバッグに取り付ける。「上清」、ロット番号及び初期／日付として１０ＬのLabtainerバッグラベルを調整した。ＢＳＣから取り出し移す前に、全てのクランプを閉じた。注記：回収するG-Rex500MCSフラスコ２本毎に１つの１０ＬのLabtainerバッグを準備した。
【０９７２】
[001128]  液体移送セットを溶接した。BSCの外側で、4S-4M60の全てのクランプを閉じた。4S-4M60のオスルアーの端の１つにセットされたリピーター液体移送セットを溶接した。
【０９７３】
[001129]  Plasmalyte-A及びヒトアルブミンを２５％ＢＳＣに移した。4S-4M60及びリピーター移送セットの部品をＢＳＣに移した。
【０９７４】
【表４２】
2021509586.tif 000046
【０９７５】
【表４３】
2021509586.tif 000047
【０９７６】
【表４４】
2021509586.tif 000048
【０９７７】
[001130]  Plasmalyteを３０００ｍＬバッグに注入した。Plasmalyte-Aの３袋を4S-4M60コネクタセットにスパイクした。注記：取り外す前にアルコール綿棒（Ｗ３００９４８８）でポートカバーを拭いた。注記：スパイクを一方向に回しながら一定の圧力を維持する。ポートの側面に穴を開けないようにすること。Origen３０００ｍＬ収集バッグを、ルアー接続を介して、リピーターポンプ移送セットの長径端に接続した。３０００ｍＬのOrigenバッグの未使用ラインのクランプを閉じた。ＢＳＣに隣接しているBaxaポンプを実行した。ＢＳＣの外側に位置するBaxaポンプに移送セットチュービングを通した。ポンプを「高」及び「９」に設定した。Plasmalyte-Aから３０００ｍＬ  Origenバッグまでの全てのクランプを開いた。Plasmalyte-Aから３０００ｍＬ  Origenバッグまでの全てのクランプを開いた。全てのPlasmalyte-Aが移されたら直ちにポンプを停止した。必要に応じて、ポンプを逆転させてバッグの位置を操作することにより、３０００ｍＬ  Origenバッグから空気を取り除いた。全てのクランプを閉じた。
【０９７８】
[001131]  ルアー接続を介してリピーターポンプ液体移送セットから３０００ｍＬバッグを取り外し、バッグへのラインに赤いキャップ（Ｗ３０１２８４５）を取り付けた。
【０９７９】
[001132]  ３０００ｍＬバッグにヒトアルブミン２５％を追加した。ベント付きミニスパイクを開いた。スパイクの無菌性を損なうことなく、青いキャップを確実に締めた。ベント付きのミニスパイクで、ヒトアルブミン２５％ボトルのセプタムをスパイクした。注記：スパイクの無菌性を損なわないようにすること。合計３回スパイクされたヒトアルブミン２５％ボトルで２回繰り返された。１つのベント付きミニスパイクから青いキャップを取り外し、６０ｍＬシリンジをヒト血清アルブミン２５％ボトルに取り付けた。２５％のヒト血清アルブミン６０ｍＬを吸い上げる。２５％ヒト血清アルブミンの複数のボトルを使用する必要があり得る。必要に応じて、ベント付きミニスパイクからシリンジを外し、ヒト血清アルブミン２５％ボトルの次のベント付きミニスパイクに接続する。６０ｍＬが得られたら直ちにベント付きミニスパイクからシリンジを取り外す。Plasmalyte-Aで満たされた３０００ｍＬ  Origenバッグのニードルレスインジェクションポートにシリンジを取り付ける。全ての２５％ヒトアルブミンを分注した。最終容量の２５％ヒトアルブミン１２０．０ｍＬを取得するために繰り返した。全ての２５％ヒトアルブミンを追加した後、バッグを静かに混合した。「LOVO洗浄バッファー」とラベル付けされ、２４時間の有効期限を割り当てた。
【０９８０】
[001133]  ＩＬ−２希釈液を調製した。１０ｍＬシリンジを使用し、LOVO洗浄緩衝液バッグのニードルレスインジェクションポートを使用して、５．０ｍＬのLOVO洗浄バッファーを除去した。LOVO洗浄バッファーを５０ｍＬコニカルチューブに分注し、「ＩＬ−２希釈液」とラベル付けした。
【０９８１】
[001134]  ＣＲＦブランクバッグLOVO洗浄バッファーを分注した。１００ｍＬシリンジを使用して、ニードレスインジェクションポートから７０．０ｍＬのLOVO洗浄バッファーを吸い上げた。注記：使用する前に、毎回アルコールパッドでニードレスインジェクションポートを拭いた。シリンジに赤いキャップをし、「ブランククライオバッグ」及びロット番号とラベル付けした。注記：ステップ８．１４．３で必要になるまで、シリンジを室温で保持した。
【０９８２】
[001135]  洗浄バッファーの準備完了。LOVO洗浄バッファーバッグの全てのクランプを閉じた。
【０９８３】
[001136]  ＩＬ−２の解凍。全ての氷が溶けるまで、１つの１．１ｍＬのＩＬ−２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を解凍した。ＩＬ−２のロット番号と有効期限を記録した。注記：ＩＬ−２ラベルが添付されていることを確認した。
【０９８４】
[001137]  ＩＬ−２調製。「ＩＬ−２希釈液」とラベル付けされた５０ｍＬコニカルチューブに５０μＬ  ＩＬ−２ストック（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）を追加した。
【０９８５】
[001138]  ＩＬ−２調製。「ＩＬ−２  ６×１０４」、日付、ロット番号及び２４時間の有効期限としてコニカルのラベルを変更した。２℃〜８℃で蓋をして保管する。
【０９８６】
[001139]  凍結保存の準備。最終産物の凍結保存のために、２℃〜８℃で５個の凍結カセットを置き、事前調整した。
【０９８７】
[001140]  細胞カウント希釈を準備した。ＢＳＣで、ロット番号及び「細胞カウント希釈用」とラベル付けされた４．５ｍＬのAIM-V培地を４本の個別の１５ｍＬコニカルチューブに追加し、チューブにラベル付けした。
【０９８８】
[001141]  細胞カウントの準備。バイアル番号（１〜４）と４つのクライオバイアルにラベル付けした。
【０９８９】
２２日目  ＴＩＬ回収
[001142]  インキュベーターをモニターした。インキュベーターのパラメータ温度ＬＥＤディスプレイ：３７±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５％±１．５％。
【０９９０】
[001143]  インキュベーターからG-Rex500MCSを取り出した。G-Rex500MCSをインキュベーターから取り外す前に、フラスコをチェックし、インキュベーションパラメーターが満たされていることを確認した（インキュベーション時間）。
【０９９１】
[001144]  ３０００ｍＬ収集バッグに「ＴＩＬ懸濁液」、ロット番号及び初期／日付のラベル付けされたＴＩＬ収集バッグを準備した。
【０９９２】
[001145]  余分な接続を封鎖した。各接続の端近くにある収集バッグの２つのルアー接続をヒートシールした。
【０９９３】
[001146]  GatheRexのセットアップ。G-Rex500MCSからの赤い培地除去ラインを上記で準備した１０ＬのLabtainerバッグに滅菌溶接した（プロセスノート５．１１に従う）。注記：複数のGatheRexデバイスの使用についてはプロセスノート５．１６を参照されたい。G-Rex500MCSからのクリア細胞除去ラインを、上記で準備したＴＩＬ懸濁液収集バッグに滅菌溶接した（プロセスノート５．１１に従う）。G-Rex500MCSフラスコをGatheRexの左側に配置した。上清Labtainerバッグ及びその右側にプールされたＴＩＬ懸濁液収集バッグを配置した。G-Rex500MCSからの赤い培地除去ラインをGatheRexのクランプ上部（赤い線でマーク）及びチューブガイドに取り付けた。G-Rex500MCSからのクリアハーベストラインをクランプ底部（青い線でマーク）及びGatheRexのチューブガイドに取り付けた。GatheRexからのガスラインとG-Rex500MCSの滅菌フィルターを接続した。G-Rex500MCSから上清を除去する前に、細胞除去ラインの全てのクランプが閉じていることを確認した。
【０９９４】
[001147]  容量削減。G-Rex500MCSから約４．５Ｌの上清を上清バッグに移した。フラスコが水平であり、吸引ディップチューブの端まで培地が減少していることを確認するためにG-Rex500MCSを目視で検査した。必要に応じて手順を繰り返す。
【０９９５】
[001148]  ＴＩＬ回収のためにフラスコを準備した。上清を取り除いた後、赤いラインへのクランプを全て閉じた。
【０９９６】
[001149]  ＴＩＬの収集を開始した。ＴＩＬ回収開始時間を記録した。フラスコを激しく叩き細胞を遊離させるために培地を攪拌した。全ての細胞が離れたことを確認するためにフラスコの検査を実施した。「ＴＩＬ懸濁液」３０００ｍＬ収集バッグを平らな表面の乾いたワイプの上に置いた。フラスコを傾けて、ホースがフラスコの端にくるようにした。注記：細胞収集ホースが壁面及び底膜の接合部にない場合、ホースを適切に配置するには、通常、４５°の角度でフラスコを傾けたまま軽く叩くのみで十分であった。
【０９９７】
[001150]  ＴＩＬの回収。ＴＩＬ懸濁液収集バッグにつながる全てのクランプを解放した。GatheRexを使用して、ＴＩＬ懸濁液を３０００ｍＬ収集バッグに移した。注記：全ての細胞と培地が収集されるまで、エッジを傾斜し続けた。付着した細胞について膜を検査した。
【０９９８】
[001151]  フラスコ膜をすすいだ。G-Rex500MCSの底をすすいだ。ガス交換膜の約１／４をすすぎ培地で覆った。
【０９９９】
[001152]  G-Rex500MCSのクランプを閉じた。全てのクランプが閉じていることを確認する。
【１０００】
[001153]  ヒートシールした。チューブ全体の長さがほぼ同じになるように、できる限り溶接部の近くでＴＩＬを含む収集バッグをヒートシールする。上清バッグをヒートシールした。
【１００１】
[001154]  残りのG-Rex 500 MCSフラスコの収穫が完了した。上記の手順を繰り返し、全てのＴＩＬを同じ収集バッグにプールする。２番目のフラスコ毎に１０Ｌの上清バッグを交換する必要があった。
【１００２】
[001155]  LOVO原料バッグを準備した。新しい３０００ｍＬ収集バッグを入手した。「LOVO原料バッグ」、ロット番号及び初期／日付としてラベル付けされた。「LOVO原料バッグ」のチューブをヒートシールし、メスルアーを取り外して、溶接に十分なラインを残した。
【１００３】
[001156]  LOVO原料バッグの重量を測定した。適切なサイズのプラスチック容器をスケールの上に置き風袋引きした。ポートとラインを含むLOVO原料バッグをビンに入れ、乾燥重量を記録する。
【１００４】
[001157]  細胞懸濁液をLOVO原料バッグに移した。１７０μｍの重量血液フィルターの全てのクランプを閉じた。
【１００５】
[001158]  細胞懸濁液をLOVO原料バッグに移した。重量血液フィルターの長い終端をLOVO原料バッグに滅菌溶接した。「プールされたＴＩＬ懸濁液」収集バッグにフィルターの２つの供給源ラインの１つを滅菌溶接した。溶接が完了したら直ちに、取り去るためにフィルターの未使用ラインをヒートシールした。必要なクランプを全て開き、ＩＶポールに収集バッグをぶら下げてＴＩＬ懸濁液を引き上げ、血液フィルターを介してLOVO原料バッグにＴＩＬの重力フロー移行を開始する。排出中、ＴＩＬを均一なサスペンションに保つために、ＴＩＬ懸濁液バッグを優しく回転又はこねた。
【１００６】
[001159]  全てのクランプを閉じた。全てのＴＩＬがLOVO原料バッグに移されたら、全てのクランプを閉じた。
【１００７】
[001160]  ヒートシールした。重力血液フィルターを取り除くために、できる限り溶接の近くでヒートシールした（プロセスノート５．１２に従って）。
【１００８】
[001161]  細胞カウントサンプルを取り出した。ＢＳＣで、各サンプルに個別の３ｍＬシリンジを使用して、ニードルレスインジェクトンポートを使用しLOVO原料バッグから４×１．０ｍＬ細胞カウントサンプルを取り出した。ステップ８．１１．３６で準備したクライオバイアルにサンプルを入れた。
【１００９】
[001162]  セルカウントを実行した。NC-200使用して、細胞カウント及び計算を実行した。０．５ｍＬの細胞懸濁液を上記で調製した４．５ｍＬのAIM-V培地に加えて、最初に細胞カウントサンプルを希釈した。これにより、１：１０希釈になった。
【１０１０】
[001163]  細胞カウント及びサンプル量を記録した。総生存ＴＩＬ細胞を計算した。総生細胞が１．５×１０９以上の場合に続行した。総有核細胞の計算。
【１０１１】
[001164]  マイコプラズマ希釈剤を準備した。ＢＳＣでは、ルアーサンプルポートを介して１つの上清バッグから１０．０ｍＬを取り出し、１５ｍＬコニカルに入れた。１５ｍＬのコニカル「マイコプラズマ希釈液」にラベルを付ける。
【１０１２】
LOVO
[001165]  LOVOをオンにして、「ＴＩＬ  G-Rex回収」プロトコルを開始し、画面のプロンプトに従った。バッファータイプはPlasmaLyteであった。LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
【１０１３】
[001166]  最終産物目標量の決定。総有核細胞（ＴＮＣ）値及び以下の表を使用して、最終産物の標的容量（ｍＬ）を決定し記録した。
【１０１４】
【表４５】
2021509586.tif 000049
【１０１５】
[001167]  LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
【１０１６】
[001168]  使い捨てキットをロードした。使い捨てキットをロードする前に、アルコールワイプ、その後、糸くずの出ないワイプで圧力センサーポートを拭く。使い捨てキットをロードする。使い捨てキットのロードに関する画面の指示に従う。
【１０１７】
[001169]  ろ過バッグを取り外した。標準のLOVO使い捨てキットがロードされたら、次へボタンに触れた。容器情報及び場所情報画面が表示された。スケールからろ液バッグを取り外した。
【１０１８】
ろ液容器は新しいこと及び測定限界であることの確認をした。
[001171]  ろ液容量を入力した。既存のろ液バッグのオスルアーにLOVO補助バッグを溶接接続した。全てのクランプが開いており、流路が開いていることを確認した。ろ液容器容量入力欄に触れる。テンキーが表示される。新規合計ろ液容量（５，０００ｍＬ）を入力する。ボタンに触れ、入力を受諾する。注記：推定ろ過量は５０００ｍＬを超えてはならない。
【１０１９】
[001172]  ベンチトップにろ液容器を置いた。注記：溶接中にチューブがＦクランプから外れた場合、チューブをクランプに戻した。ベンチトップに新規ろ液容器を置いた。重量計＃３にろ液バッグを掛けなかった。手順中に秤量計＃３は空になる。
【１０２０】
[001173]  ろ液容器の変更後、LOVOタッチスクリーンのプロンプトに従った。
【１０２１】
[001174]  キットが正しくロードされたことを確認した。使い捨てキットドライチェックオーバーレイが表示された。キットが適切にロードされ、全てのクランプが開いていることを確認した。全てのチューブにねじれ又は他の障害物がないか確認し、可能であれば直す。キットが正しく取り付けられていることを確認し、全てのロバートクランプを確認した。はいボタンを押した。全てのLOVO臨床クランプが自動的に閉じ、使い捨てキット取り付け確認画面が表示される。LOVOには、キットを確認するために一連の加圧手順が実施された。
【１０２２】
[001175]  キットチェック結果。キットチェックに合格した場合、次の手順に進んだ。＊いいえの場合、チェック完了後に２回目のキットチェックを実行し得た。＊いいえの場合、全てのチューブのねじれ又は他の障害物をチェックして直した。＊いいえの場合、キットが適切に取り付けられていることを確認し、全てのロバートクランプを確認した。２回目のキットチェックに失敗した場合：エリア管理に連絡し、セクション１０．０の新しいキットのインストールの準備をする。必要なステップ８．１３．２３〜ステップ８．１３．３０を繰り返す。
【１０２３】
[001176]  Plasmalyteの接続解決画面が表示された。洗浄値は常に３０００ｍＬであるはずである。画面にこの値を入力した。
【１０２４】
[001177]  Plasmalyteの３０００ｍＬバッグを、クランプ１を通過するチューブに滅菌溶接した。ＩＶポールにPlasmalyteのバッグをぶら下げ、バッグの両角のループをフックに取り付けた。
【１０２５】
[001178]  PlasmaLyteが接続されていることを確認した。全てのプラスチック製クランプを開けた。溶液量の入力が３０００ｍＬであったことを確認した。次へボタンに触れた。使い捨てキット準備オーバーレイが表示された。PlasmaLyteが取り付けられ、PlasmaLyteバッグにつながるチューブの全ての溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認し、その後、はいボタンに触れた。
【１０２６】
[001179]  Plasmalyteが動いていることが観察された。使い捨てキット準備が開始され、使い捨てキット準備中画面が表示される。PlasmaLyteのバッグに接続されたチューブを介して、PlasmaLyteが移動することを視覚的に観察した。流体が動いていない場合、画面上の一時停止ボタンを押して、クランプ又は溶接が依然として閉じているか否かを確認した。問題が解決したら、画面の再開ボタンを押し、使い捨てキット準備を再開した。LOVOタッチスクリーンプロンプトに従った。
【１０２７】
[001180]  チューブに原料容器を接続した。ステップ８．１２．３１で準備したLOVO原料バッグを、プロセスノート５．１１に従ってクランプＳを通過するチューブに滅菌溶接する。クランプからチューブを取り外す必要がある場合があり得た。注記：取り外す場合、原料チューブをＳクランプに取り変えることを確認する。
【１０２８】
[001181]  原料容器をぶら下げた。原料容器をＩＶポールにぶら下げ、バッグの両角のループをフックに取り付けた。原料を重量計＃１にぶら下げなかった。原料バッグへの全てのクランプを開いた。
【１０２９】
[001182]  原料容器が取り付けられていることを検証した。次へボタンに触れた。原料準備オーバーレイが表示された。原料が使い捨てキットに取り付けられ、原料につながるチューブの全ての溶接部及びプラスチック製のクランプが開いていることを確認した。はいボタンに触れた。
【１０３０】
[001183]  Plasmalyteが動いていたことを確認する。原料準備が開始され、原料準備中画面が表示された。原料バッグに取り付けられたチューブを介して、PlasmaLyteが移動しているのを視覚的に観察した。流体が動いていない場合、画面上の一時停止ボタンを押して、クランプ又は溶接部が依然として閉じているか否かを確認する。問題が解決したら、画面上の再開ボタンを押し、原料準備を再開した。
【１０３１】
[001184]  手順画面を開始した。原料の準備が正常に終了すると、手順開始画面が表示される。スタートを押した。スタートを押すと直ちに「前洗浄サイクル１」一時停止画面が表示された。
【１０３２】
[001185]  インプロセスバッグ内で反転した。重量計＃２からインプロセスバッグを取り外し（インプロセストップポートチューブガイドからチューブを取り外すこともできる）、それを手動で反転させ、使い捨てキットの準備ステップ中に加えた洗浄バッファーがバッグの全内部表面に塗布されるようにした。重量計＃２のインプロセスバッグを再びぶら下げた（バックのラベルは左側を向いていた）。チューブガイドのトップポートチューブが外れた場合には交換する。
【１０３３】
[001186]  原料バッグを反転した。スタートボタンを押す前に、バッグの角を揉み、細胞を静かに撹拌して均質な細胞懸濁液を作成することにより、ＩＶポールからそれを取り外すことなく原料バッグを混合した。再開ボタンを押した。LOVOは原料バッグからの流動を開始し、洗浄サイクル１画面が表示される。
【１０３４】
[001187]  原料すすぎ一時停止。原料容器が空になり、LOVOが原料バッグに洗浄バッファーを追加すると、原料すすぎ一時停止画面が表示された。原料バッグをＩＶポールから取り外すことなく、角を揉んでよく混ぜた。再開を押した。
【１０３５】
[001188]  インプロセスバッグ混合の一時停止。スピナを通過させる別の細胞を準備するため、インプロセスバッグを洗浄バッファーで希釈した。インプロセスバッグに洗浄バッファーを加えた後、LOVOを自動的に一時停止し、「インプロセスバッグ混合」一時停止画面が表示された。重量計からバッグを取り出さずに、バッグを優しく絞って産物をよく混ぜた。再開を押した。
【１０３６】
[001189]  インプロセスの角を揉むことの一時停止。インプロセスバッグが空になったら、洗浄バッファーをインプロセスバッグの底部ポートに加え、バッグをすすいだ。すすぎ液を追加した後、LOVOは自動的に一時停止し、「ＩＰの角を揉む」一時停止画面が表示された。「ＩＰの角を揉む」一時停止画面が表示されたら、重量計＃２からバッグを取り外さないこと。インプロセスバッグを重量計＃２に掛けたまま、バッグの角を揉み、残っている細胞を懸濁液にした。バッグが重量計の上で揺れていないことを確認し、再開ボタンを押した。
【１０３７】
[001190]  製品除去画面を待った。LOVO手順の最後に、産物除去画面が表示された。この画面が表示されると、LOVOキットの全てのバッグが操作でき得た。注記：産物除去が表示されるまで、バッグに触れないこと。
【１０３８】
[001191]  保持液バッグを取り外した。未透過液バッグのポートに非常に近いチューブに止血剤を入れ、細胞懸濁液がチューブに落ちないようにした。ステップ８．１３．４８で溶接するのに十分なラインを維持するように、止血剤の下にヒートシールした（プロセスノート５．１２に従う）。未透過液バッグを取り外した。
【１０３９】
[001192]  製剤のための未透過液バッグを準備した。４インチプラズマ移送セットのメスルアーロックエンドを未透過液バッグに溶接した。未透過液バッグを移した。
【１０４０】
[001193]  産物を取り出した。産物除去画面の指示に従った。液体の移動を防ぐため、LOVOキットの全てのクランプを閉じた。
【１０４１】
[001194]  産物を取り出した。次へボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが開放され、キット取外画面が表示された。
【１０４２】
[001195]  データを記録した。キット除去画面の指示に従った。次へボタンに触れた。全てのLOVO臨床クランプが閉鎖され、結果概要画面が表示される。結果概要画面のデータを記録した。全てのポンプを閉じ、支持剤をろ過した。LOVOから要求されたときにキットを取り外した。記録された時間は全て、LOVOから直接記録された。
【１０４３】
最終製剤及び充填
[001196]  標的容積／バッグ計算。下の表ＤＤＤから、充填するＣＳ７５０バッグの数、バッグ毎の目標充填量、バッグ毎に参考品として取り除く量及び上記のLOVO保持液の量に対応するバッグ毎の最終目標量を選択した。
【１０４４】
【表４６】
2021509586.tif 000050
【１０４５】
[001197]  ＣＲＦブランクの準備。空のバッグを作成するためＣＳ−１０及びLOVO洗浄バッファーの量を計算した。
【１０４６】
【表４７】
2021509586.tif 000051
【１０４７】
[001198]  ＣＲＦブランクの準備。ＢＳＣの外側で、上記で準備したLOVO洗浄バッファーのシリンジを使用して、計算された容積を、ルアー接続を介して空のＣＳ７５０バッグに追加した。注記：ブランクＣＳ７５０バッグ製剤は、無菌で行う必要はない。適切なサイズのシリンジを使用して、計算したＣＳ−１０の容積を上記で準備した同じＣＳ７５０バッグに追加した。ＣＳ７５０バッグに赤いキャップを付けた。ＣＳ−７５０バッグから可能な限り多くの空気を取り除いた。ＣＳ７５０バッグをできる限りバッグに近づけてヒートシールし、チューブを取り外した。ＣＳ７５０バッグに「ＣＲＦブランク」、ロット番号及び初期／日付のラベルを付ける。ＣＲＦに置くまで、ＣＲＦブランクをコールドパックの上に置いた。
【１０４８】
[001199]  ＩＬ−２の必要量を計算した。最終産物に追加するＩＬ−２の量を計算した。
【１０４９】
【表４８】
2021509586.tif 000052
【１０５０】
[001200]  接続装置を組み立てた。4S-4M60をCC2セルコネクトに滅菌溶接し、セルコネクト装置の単一スパイクを4S-4M60マニホールドの４スパイク端に置き換えた。
【１０５１】
[001201]  接続された装置を組み立てた。ＣＳ７５０クライオバッグを上記で準備したハーネスに滅菌溶接し、４つのオスルアーエンド（Ｅ）の１つを各バッグに交換した。4S-4M60のスパイクにＣＳ−１０バッグを溶接した（プロセスノート５．１１に従う）。２〜８℃に調整された２つのコールドパック間にバッグを置くことによりＣＳ−１０を低温に保った。
【１０５２】
[001202]  ＩＬ−２を保持するＴＩＬを準備した。適切なサイズのシリンジを使用して、「ＩＬ−２  ６×１０４」アリコートから上記で決定した量のＩＬ−２を取り除いた。ルアー接続を介して上記で準備した未透過液バッグにシリンジを接続し、ＩＬ−２を注入する。シリンジからラインを通して空気を押してラインをクリアする。
【１０５３】
[001203]  製剤化されたＴＩＬバッグをラベル付けした。移送セットのクランプを閉じ、「製剤化ＴＩＬ」としてバッグにラベルを付け、バッグをＢＳＣから取り出した。
【１０５４】
[001204]  製剤化されたＴＩＬバッグを装置に追加した。ＩＬ−２を追加したら直ちに「製剤化ＴＩＬ」バッグを装置の残りのスパイクに溶接した。
【１０５５】
[001205]  ＣＳ１０を追加した。組み立てられた装置を、付属の製剤化ＴＩＬ、ＣＳ−７５０バッグ及びＣＳ−１０と共にＢＳＣに移した。注記：ＣＳ−１０バッグ及び全てのＣＳ−７５０バッグは、２℃〜８℃で事前調整された２つのコールドパック間に置かれた。製剤化ＴＩＬバッグをコールドパック上に置かなかった。装置の全てのクランプが閉じていることを確認した。活栓を回し、シリンジを閉じた。
【１０５６】
[001206]  シリンジの交換。約１０ｍＬの空気を１００ｍＬシリンジに引き込み、装置の６０ｍＬシリンジと交換した。
【１０５７】
[001207]  ＣＳ１０を追加した。ＣＳ７５０バッグへのラインが閉じるように活栓を回した。ＣＳ−１０バッグのクランプを開き、上記で計算した容積をシリンジに引いた。注記：適切な容量のＣＳ−１０を追加するには、複数のシリンジが使用される。ＣＳ−１０のクランプを閉じ、製剤化ＴＩＬバッグのクランプを開いて、ＣＳ−１０を追加する。およそ１０．０ｍＬ／分で最初の１０．０ｍＬのＣＳ１０を追加する。残りのＣＳ−１０をおよそ１．０ｍＬ／秒の速度で追加する。注記：複数のシリンジを使用して、ＣＳ−１０の適切な量を追加した。時間を記録した。注記：ＣＳ−１０の最初の追加から凍結の開始までの目標時間は３０分である。各ＣＳ１０追加の容量と追加された合計容量を記録した。ＣＳ１０バッグの全てのクランプを閉じた。
【１０５８】
[001208]  ＣＳ−７５０バッグを準備した。活栓を回し、シリンジを開けた。製剤化ＴＩＬバッグのクランプを開き、懸濁液が活栓に達する直前に懸濁液を引いた。製剤化ＴＩＬバッグのクランプを閉じた。空のＣＳ７５０最終産物バッグが開くように活栓を回した。新しいシリンジを使用して、空気を抜いてＣＳ７５０最終産物バッグから可能な限り多くの空気を取り除いた。シリンジのプランジャーに圧力をかけながら、バッグを締めて閉じた。約２０ｍＬの空気を新しい１００ｍＬシリンジに引き込み、装置に接続する。注記：製剤化ＴＩＬ懸濁液を低温に保つために、各ＣＳ７５０最終産物バッグは２つのコールドパック間にある必要がある。
【１０５９】
[001209]  細胞を分注した。最終産物バッグへのラインが閉じられるように活栓を回した。上記で計算された量を、製剤化ＴＩＬバッグからシリンジに引き込んだ。注記：複数のシリンジを使用して、正しい量を得ることができた。製剤化されたＴＩＬバッグへのラインが閉じられるように活栓を回した。一度に１つの最終産物バッグで作業し、細胞を最終産物バッグに分注した。上記の各ＣＳ７５０バッグに追加された細胞の量を記録した。細胞がスパイクポートの上部に均一であるようにシリンジから空気でラインをクリアした。満たされたバッグのクランプを閉じた。最終産物バッグ毎に手順を繰り返し、それぞれの間に製剤化ＴＩＬバッグを静かに混合した。以下の各最終産物バッグに入れられたＴＩＬの量を記録した。
【１０６０】
[001210]  最終産物バッグから空気を取り除き、参考品を保持した。最後の最終産物バッグが満たされたら、全てのクランプを閉じた。１０ｍＬの空気を新しい１００ｍＬシリンジに引き込み、装置のシリンジと交換する。一度に１つのバッグを操作し、各産物バッグから全ての空気と、上記で決定した参考のための製品の容積を引き出した。注記：サンプル量を取り除いたら、シリンジを逆さにし空気を利用して、産物バッグの上部ポートのラインをクリアにした。保持容量と空気が除去されたら、ラインをバッグにクランプした。
【１０６１】
[001211]  各バッグからの参考品の容積を記録した。
【１０６２】
[001212]  分配された参考品。５０ｍＬのコニカルチューブに参考品を分配し、チューブに「参考品」及びロット番号を表示した。バッグ毎に繰り返す。
【１０６３】
[001213]  凍結保存のための最終産物を準備した。止血剤を使用して、バッグの近くでラインをクランプした。シリンジ及びシリンジが装着されていた装置の赤いキャップのルアー接続を取り除いた。ＢＳＣから装置を移した。Ｆでヒートシール（プロセスノート５．１２に従って）し、空の未透過液バッグ及びＣＳ−１０バッグを取り外した。注記：装置上のシリンジのルアー接続を保持した。空の未透過液及びＣＳ−１０バッグを廃棄した。
【１０６４】
[001214]  最終産物バッグをレベル付けした。以下の最終産物ラベルのサンプルを添付した。
【１０６５】
[001215]  凍結保存のための最終産物を準備した。凍結保存するまで、コールドパック又は２〜８℃でクライオバッグを保持した。
【１０６６】
[001216]  細胞カウントサンプルを取り出した。適切なサイズのピペットを使用して、上記で取り出された参考品２．０ｍＬを取り出し、１５ｍＬコニカルチューブに入れて細胞数を測定した。
【１０６７】
[001217]  セルカウントを実行した。NC-200使用して、細胞カウント及び計算を実行した。注記：１つのサンプルのみを適切な希釈に希釈して、希釈が十分であることを確認する。追加のサンプルを適切な希釈係数に希釈し、カウントを続行する。細胞カウントサンプル体積を記録した。注記：希釈が不要な場合、「サンプル［μＬ］」＝２００、「希釈［μＬ］」＝０。生存細胞濃度の平均と実行された細胞カウントの生存率とを決定した。
【１０６８】
[001218]  フローサイトメトリーのサンプルを計算した。フローサイトメトリーのサンプリングに十分な細胞濃度を確保するために計算を実行した。
【１０６９】
【表４９】
2021509586.tif 000053
【１０７０】
[001219]  ＩＦＮ−γを計算した。ＩＦＮ−γサンプリングに十分な細胞濃度を確保するためにサンプルの計算を実行した。
【１０７１】
[001220]  ヒートシールした。サンプル量が決定されたら、最終産物バッグを可能な限りバッグの近くにヒートシールして、装置から取り出す。
【１０７２】
【表５０】
2021509586.tif 000054
【１０７３】
[001221]  マイコプラズマサンプルについては、上記の無菌及びBacTのテストサンプリングからの「マイコプラズマ希釈液」とラベル付けされた１５ｍＬのコニカルに製剤化細胞懸濁液量を追加する。ＢＳＣでは、適切なサイズのシリンジを使用して上記で参考品として収集した細胞懸濁液から１．０ｍＬのサンプルを取り出し、嫌気性ボトルに播種する。好気性ボトルについて上記を繰り返す。
【１０７４】
[001222]  サンプルのラベルを付け及び保存した。サンプルプラン在庫ラベルと全てのサンプルにラベルを付け、移すまで適切に保管する。最終産物及びサンプルの凍結保存の次のステップに進んだ。
【１０７５】
最終産物の凍結保存
[001223]  制御速度冷凍庫を準備した。凍結する前にＣＲＦがセットアップされたことを確認した。ＣＲＦ機器を記録した。凍結保存が実行される。
【１０７６】
[001224]  ＣＲＦプローブをセットアップする。ＣＲＦブランクバッグのセプタムに穴を開けた。６ｍＬバイアル温度プローブを挿入した。
【１０７７】
[001225]  最終産物とサンプルをＣＲＦに入れた。ブランクバッグを事前調整済みカセットに入れ、ＣＲＦラックのおよそ中央に移した。最終産物カセットをＣＲＦラックに移し、バイアルをＣＲＦバイアルラックに移した。製品ラック及びバイアルラックをＣＲＦに移した。産物がＣＲＦに移された時間及びチャンバー温度を記録した。
【１０７８】
[001226]  ４℃±１．５℃に達し、ＣＲＦの実行を続行するのに必要な時間を決定した。チャンバーの温度が４℃±１．５℃に達したら実行を開始した。時間を記録した。
【１０７９】
[001227]  完了し、保存した。実施完了後にＣＲＦを停止した。ＣＲＦからカセット及びバイアルを取り出す。カセット及びバイアルを保管のために気相ＬＮ２に移した。
【１０８０】
実施例１７：治療活性が強化された腫瘍抗原特異的Ｔ細胞について濃縮されたＴＩＬ産物の生成
[001228]  目標：治療活性が強化された腫瘍抗原特異的Ｔ細胞について濃縮されたＴＩＬ産物を生成すること。
【１０８１】
背景：
[001229]  悪性病変に関連するＴ細胞は通常、機能不全であり、腫瘍の成長を制御／防止することができない（Schietinger et al.Immunity 2016）。この実施例における全ての参考文献は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【１０８２】
[001230]  腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、エクスビボで抽出、活性化及び増殖させることができ、インビボ再注入時に効率的な抗腫瘍応答を誘発する（Rosenberg et al.Clin Cancer Res 2011）。転移性黒色腫に罹患した患者で最初に実証された養子細胞移入アプローチは、追加の固形腫瘍組織で試験されている。黒色腫及び頭頸部並びに子宮頸がんにおけるＴＩＬ療法の臨床的活性化が報告されている（ＳＩＴＣ、２０１７）。したがって、腫瘍特異的ＴＩＬは、抑制性腫瘍微小環境から救出され、腫瘍を効率的に標的化するために十分な数まで再調整及び／又は増幅することができる。
【１０８３】
[001231]  ＴＩＬ臨床試験のレトロスペクティブ分析は、頑強な増殖能力及び生存能力を備えた低分化型腫瘍反応性Ｔ細胞が、エフェクター及びエフェクターメモリーＴ細胞と比較して優れた抗腫瘍効果をもたらし、次世代のＴＩＬ産物は、低分化型Ｔ細胞が一貫して高いレベルで構成されるべきであることを示唆する（Klebanoff et al.J Immunother 2012）。
【１０８４】
[001232]  ステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、抗原経験のあるセントラルメモリーＴ細胞の初期の前駆細胞であり、幹細胞を定義する長期生存、自己再生及び多能性能力を示し、したがって、効果的なＴＩＬ産物の生成に最も望ましいと考えられている。ＴＳＣＭは、養子細胞移入のマウスモデルで他のＴ細胞サブセットと比較して強化された抗腫瘍活性を示している（Gattinoni et al. Nat Med 2009, 2011；Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012；Cieri et al. Blood 2013）。
【１０８５】
[001233]  最適な抗腫瘍活性を確実にするために、ＴＩＬ組成をＴＳＣＭの高い割合に偏らせる戦略が必要である。
【１０８６】
[001234]  抗原経験のあるＴ細胞の若返りは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術を用いて開発された再プログラミングツールを使用して達成された（Nishimura et al. Cell Stem Cell 2012; Vizcardo et al. Cell Stem Cell 2012）。このアプローチでは、腫瘍を治癒するために最も適したＴ細胞集団へのｉＰＳＣのエクスビボでの更なる分化が必要であり、これは、元のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーを制限する傾向のある長い２ステップのプロセスになる。材料の細胞内送達のためのインビトロ及びインビボ送達の戦略に関するStewart, et al. 538:183-192 (2016)も参照されたい。
【１０８７】
[001235]  Ｗｎｔ、ＮＯＴＣＨ及びＭｙｂを含むシグナル伝達経路は、ナイーブＴ細胞及び／又は抗原経験のあるＴ細胞から直接ＴＳＣＭ様細胞の生成をサポートすることが示されている（Gattinoni et al. Nat Med 2009、Kondo et al. Nat Comm 2017、Gautam et al. SITC 2017）。
【１０８８】
[001236]  細胞運命の再プログラミングは、適切な転写因子（ＴＦｓ）への一過性の曝露を必要とする。ＴＩＬの場合、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを保存するために、この曝露はＴ細胞の大部分を標的にする必要がある。
【１０８９】
[001237]  ＳＱＺベクターを含まないマイクロ流体プラットフォームは、高度な細胞内送達戦略を表している。それは、Ｔ細胞を含む様々な初代ヒト細胞に転写因子を含むタンパク質を送達する能力を実証している（Sharei et al. PNAS 2013並びにSharei et al. PLOS ONE 2015及びGreisbeck et al. The J of Immunology vol.195, 2015）。国際公開第２０１３／０５９３４３Ａ１号、国際公開第２０１７／００８０６３Ａ１号及び国際公開第２０１７／１２３６６３Ａ１号（これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。国際公開第２０１３／０５９３４３Ａ１号、国際公開第２０１７／００８０６３Ａ１号及び国際公開第２０１７／１２３６６３Ａ１号に記載されるそのような方法は、転写因子（ＴＦ）及び／又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子にＴＩＬ集団を曝露するために、本発明と共に使用することができ、ここで、ＴＦ及び／又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び／又はＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供し、したがって、ＴＩＬ集団の再プログラミング及び再プログラミングされたＴＩＬ集団の治療効果の再プログラミングされていないＴＩＬ集団と比較した増加をもたらす。
【１０９０】
戦略：
[001238]  ＳＱＺ細胞内ＴＦタンパク質送達技術を使用して、治療活性を強化された腫瘍抗原特異的Ｔ細胞について濃縮されたＴＩＬ産物を生成するための様々な再プログラミング戦略の能力を比較することが提案されている。
【１０９１】
[001239]  以下のポイント／質問を含む作業計画：
１．腫瘍の種類
・黒色腫
２．最適な送達条件
・ＳＱＺヒトＴ細胞最適化プロトコル＋追加条件
・送達効率のモニター
３．ＴＦの選択
・ＴＣＦ−１
・ＮＯＴＣＨ１／２  ＩＣＤ
・ＭＹＢ
・＋／−以前のｉＰＳＣカクテルで「完全な」再プログラミング？
４．ＴＩＬを標的とする活性化／拡大培養ステージ
・ＲＥＰ０日目
・その他？
５．再プログラミングの速度論
・７日目、１１日目、１４日目、１８日目…
６．標的とするＴＩＬサブセット
・最初のバルク
・後で比較するために分類分けした個々のサブセット（ＴＣＭ、ＴＥＭ、ＴＥＦＦ、ＴＥＭＲＡ）。
７．培養培地への追加因子の必要性
・ＩＬ７
・ＲＳＰＯ３／ＷＮＴ３Ａ
・その他？
８．読み出し
・プレ及びポストＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養表現型解析（修飾された？）パネル１、２及び３
・ポストＲＥＰ  ＴＩＬエフェクター機能評価（サイトカイン及び／又は活性化マーカー産生アッセイ）
・ポストＲＥＰ  ＴＩＬ腫瘍応答性評価（自己腫瘍細胞共培養アッセイ）
・ＴＣＲレパートリー分析（フローサイトメトリー及び／又はＲＮＡ−ｓｅｑ）
・タツノオトシゴなどの生細胞代謝アッセイ
・他の考慮事項
１．タンパク質ＴＦ産生
２．腫瘍の入手
３．物流管理（細胞の出荷）
【１０９２】
【表５１】
2021509586.tif 000055
【１０９３】
実施例１８：凍結保存プロセス
[001240]  この実施例では、CryoMed Controlled Rate Freezer、Model 7454（Thermo Scientific）を使用して、実施例１６で説明した短縮閉鎖手順で調製したＴＩＬの凍結保存プロセス方法について説明する。
【１０９４】
[001241]  使用した機器は、アルミニウム製カセットホルダーラック（ＣＳ７５０冷凍バッグと互換性あり）、７５０ｍＬバッグのための低温保存カセット、低圧（２２ｐｓｉ）液体窒素タンク、冷蔵庫、熱電対センサー（バッグのためのリボンタイプ）及びCryoStore CS750凍結バッグ（OriGen Scientific）であった。
【１０９５】
[001242]  凍結プロセスは、核形成から−２０℃まで０．５℃の速度及び最終温度−８０℃まで１分間に１℃の冷却速度を提供する。プログラムパラメーターは、以下の通りである：ステップ１−４℃で待機；ステップ２：１．０℃／分（サンプル温度）から−４℃；ステップ３：２０．０℃／分（チャンバー温度）から−４５℃；ステップ４：１０．０℃／分（チャンバー温度）から−１０．０℃；ステップ５：０．５℃／分（チャンバー温度）から−２０℃；及びステップ６：１．０℃／分（サンプル温度）から−８０℃。
【１０９６】
[001243]  この実施例の手順の描写を、実施例１６のプロセスと組み合わせて提供される。
【１０９７】
実施例１９：治療活性が強化された腫瘍抗原特異的Ｔ細胞について濃縮されたＴＩＬ産物の生成手順
段階１ａ：効率的及び特異的サイレンシングのための１つの検証済みｓｄ−ＲＮＡｆｍの調達
[001244]  最初の段階では、以下の３つの遺伝子：ＰＤ−１（ＰＤＣＤ１とも呼ばれる）、ＴＩＭ３及びＣＢＬＢを効率的且つ特異的サイレンシングのために、１つの検証済みｓｄ−ＲＮＡｆｍを調達する。
段階１ｂ：ＬＡＧ３及びＣＩＳＨの強力なサイレンシングのための配列の同定
【１０９８】
[001245]  新しい標的のために最大２０のｓｄ−ＲＮＡが設計される。遺伝子サイレンシングは、外因性標的のヒーラ細胞及び内因性標的の活性化された初代Ｔ細胞で評価される。ＰＤ−１及びＬＡＧ−３を含めた発現レベルを８０％より多く低減する対象の遺伝子毎に１つから２つのリードが選択される。選択されたｓｄ−ＲＮＡの完全に修飾されたバージョンが生成される。
【１０９９】
[001246]  １つから２つのＬＡＧ３及びＣＩＳＨ特異的ｓｄ−ＲＮＡｆｍが生成されることが予想される。標的遺伝子毎に２つの標的ＲＮＡが好ましい。
【１１００】
段階２：プレＲＥＰ  ＴＩＬにおけるｓｄ−ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの検証。
[001247]  ｓｄ−ＲＮＡ標的（ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及びＣＩＳＨを含む）を検証するために、最大６つの凍結黒色腫／他のプレＲＥＰラインが使用される。条件は、ｓｄ−ＲＮＡ濃度、解凍後のタイミング、反復／逐次送達及び培養条件を試験する。読み出しは、フロー及び／又はｑＰＣＲにより評価された遺伝子サイレンシングの割合である。ＴＩＬの成長及び経時的なサイレンシングの持続性についてのＲＮＡ送達の影響は、ＴＩＬの拡大培養することにより評価される。
【１１０１】
[001248]  ＲＥＰ回収後２４時間で８０％のサイレンシングがリードで得られることが予想される。総細胞数は未処置対照の１０％以内である。
【１１０２】
段階３：プロセス２Ａへのｓｄ−ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの実施。
[001249]  遺伝子サイレンシングは、３〜６の研究スケールの新鮮なＴＩＬ調製物で最適化される。条件は、ｓｄ−ＲＮＡ濃度、タイミング、反復／逐次送達及び培養条件を試験する。読み出しは、フロー及び／又はｑＰＣＲにより評価されたポストＲＥＰ  ＴＩＬにおける遺伝子サイレンシングの割合である。ＴＩＬ表現型及び機能に対する遺伝子サイレンシングの影響は、フローサイトメトリーアッセイを使用して評価される。効果の特異性（例えば、潜在的なオフターゲットサイレンシングの範囲と影響）を検証するために、任意選択によるレスキュー実験及び／又は遺伝子発現分析が行われた。今後の作業のために、少なくとも２つの標的／ｓｄ−ＲＮＡペアが選択される。その後、ＴＩＬ表現型が特徴付けられる。対照ＴＩＬ活性と同等以上の非特異的及び特異的なＴＩＬ活性を評価し、最適な標的／ｓｄ−ＲＮＡを決定する。
【１１０３】
段階４：フルスケールのＴＩＬ調製への最適化されたサイレンシングプロトコルの実施。
標的遺伝子毎に１つのフルスケールのＴＩＬ調製を行う。発売に必要な製品に加えて、段階３で定義された新しい特徴を持つＴＩＬ産物が開発される。
【１１０４】
実施例２０：例示的なＳＤ−ＲＮＡの調製及び使用
ｓｄ−ＲＮＡの設計
[001250]  およそ２〜２０のｓｄ−ＲＮＡ配列が所定の標的に対して生成される。場合により、ｓｄ−ＲＮＡ配列は、５００を超えるｓｄ−ＲＮＡ配列の機能的スクリーニングに基づいて設計された選択アルゴリズム（Ａｄｖｉｒｎａ  ＬＬＣから市販される、マサチューセッツ州ウースター、米国）に基づいて選択される。回帰分析を使用して、特定のヌクレオチドの出現頻度と、ｓｄ−ＲＮＡ二重鎖の任意の特定の位置における修飾及び遺伝子抑制アッセイにおけるその機能性との間の相関関係を確立する。選択された配列は、０．２μｍｏｌｅスケールで、商業的に合成され（例えば、TriLink Biotechnologiesによって）、注射のための滅菌ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリーの水に溶解される（CalBiochemから市販される、４．８６５０５）。二重鎖は、９５℃で５分間加熱し、室温まで徐々に冷却することでアニールできる。
【１１０５】
ｓｄ−ＲＮＡ直接送達（受動的取り込み）
[001251]  本明細書に記載されているｓｄ−ＲＮＡ標的遺伝子を含むオリゴヌクレオチドは、無血清培地で希釈し、３回、９６ウェル培養プレートに分注することができる。細胞は、指示された時間にわたり、予め希釈された化合物を含むプレートに還元型ＦＢＳを含む適切な培養培地に播種することができる。ヒーラ細胞は、１０，０００細胞／ウェルの３％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地でトランスフェクトできる。初代ヒトＴ細胞（AllCells、カリフォルニア州）は、５００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ２（ProSpec）を含むAIM-V（Gibco）完全培地で培養できる。細胞は、トランスフェクション前の少なくとも４日間、製造元の取扱説明書に従って抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Gibco、11131）で活性化することができる。Ｔ細胞は、特に明記されていない限り、ダイナビーズを取り出さずに１００，０００細胞／ウェルの５％ＦＢＳでトランスフェクトできる。トランスフェクション効率を確認するために、オリンパスＢＸ−６０顕微鏡を使用して、Ｃｙ３結合ｓｄ−ＲＮＡをトランスフェクトした生細胞から蛍光画像を入手できる。核染色は、トランスフェクトした細胞に添加したHoechst 33342(Molecular Probes、H1398)を３０分間使用し、画像処理することにより入手できる。
【１１０６】
リードｓｄ−ＲＮＡ化合物の同定
[001252]  実施例１８に記載のリードは、このプロトコルを使用して識別できる。ルシフェラーゼレポータープラスミドは、ＰＤＣＤ１標的領域をｐｓｉＣｈｅｃｋ２プラスミド（Promega、C8021）下流ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ配列に挿入することにより構築することができる。比較のために、以前に検証されたＭＡＰ４Ｋ４  ｓｄ−ＲＮＡ配列をポジティブコントロールとして挿入できる。
【１１０７】
[001253]  スクリーニングのために、ヒーラ細胞を製造元の取扱説明書に従い、Fugene HD（Promega、Ｅ２３１１）を使用しクローン化されたプラスミドでトランスフェクトすることができる。簡単に言えば、抗生物質を含まないＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ、３０−２００３）培地に２．５×１０６細胞／１０ｃｍ２３９０ディッシュで細胞を播種することができ、６時間後に２．５：１のFuGENE：ＤＮＡ比率でプラスミドをトランスフェクトする。細胞を１６〜１８時間インキュベートすることができ、ＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン処理し、３％ＦＢＳを含む最終濃度１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００細胞／１００μｌＥＭＥＭで希釈したｓｄ−ＲＮＡ化合物を９６ウェルプレートに播種する。細胞を４８時間ｓｄ−ＲＮＡで処置することができ、化合物の受動的な細胞取り込みを促進し、Ｇｌｏ溶解バッファー（Promega、Ｅ２６６Ａ）で溶解し、ウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla）及びホタルルシフェラーゼ（Firefly luciferase）発現をアッセイできる。そのために、各溶解物の２０μｌアリコートを二重の不透明９６ウェルプレートに加え、Ｍａｔｔｈｅｗｓ（ウミシイタケ（Renilla））アッセイバッファー５９  ３９７又はホタルルシフェラーゼ３９８アッセイバッファー（２５ｍＭグリシルグリシン、１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、４ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＡＴＰ、１５  ｍＭ  ３９９  Ｋ２ＰＯ４、ｐＨ７．８及び１  ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン）と混合した。使用直前に、基質Ｄ−ルシフェリン（Promega、Ｅ１６０５）及びｈ−セレンテラジン（NanoLight、３０１）を加えた。発光はSpectraMax i3（Molecular Devices）で測定し、正規化（ウミシイタケ（Renilla）／ホタル（Firefly））し、未処置対照のパーセントとして表すことができる。
【１１０８】
ｑＰＣＲによるｍＲＮＡの定量
[001254]  メーカーの推奨に従い、PureLinkTM Pro96精製キット（Invitrogen、１２１７３−０１１Ａ）を使用して、トランスフェクトされた細胞から総ＲＮＡを分離することができる。１：５及び１：２５のトランスフェクトされていない（ＮＴ）細胞の希釈液を標準曲線作成について調製できる。２０〜４０ｎｇの精製ＲＮＡをQuanta qScript RT-qPCR ToughMix（VWR、８９２３６６７２）及びTaqmanプローブ−PDCD1-FAM（Taqman、Ｈｓ０１５５００８８＿ｍ１）並びにGAPDH-VIC（Applied Biosystems、４３２６３１７Ｅ）と同じ反応で混合して、ワンステップマルチプレックスqPCR 407で遺伝子発現を分析した。サンプルは、StepOnePlus qPCR機器（Applied Biosystems）でQuantaの推奨設定を使用して増幅することができる。ＰＤＣＤ１の発現は、ＧＡＰＤＨに正規化し、標準曲線に合わせて調整し、非標的対照（ＮＴＣ）トランスフェクト細胞のパーセントとして表すことができる。
【１１０９】
細胞生存率アッセイ
[001255]  本発明による拡大培養されたＴＩＬは、様々な用量のｓｄ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドで７２時間トランスフェクトされ得る。細胞を洗浄し、１：１０に希釈したCellTiter-Blue試薬（Promega、Ｇ８０８Ａ）と３７℃で１時間インキュベートした。プレートを室温に戻し、蛍光を５３０ｎｍ  ｅｘ／５９０ｎｍ  ｅｍで記録した。同一条件で２倍細胞希釈液を４系列プレーティングし、蛍光測定値をプロットすることで、直線範囲を確認できる。
【１１１０】
腫瘍浸潤リンパ球の分離
[001256]  本明細書に記載されるように、腫瘍浸潤リンパ球は、例えば、図８及び図１４に概説されるように調製することができる。
【１１１１】
ＴＩＬ拡大培養
[001257]  本明細書に記載されるように、ＴＩＬをフラスコに播種し、第１及び／又は第２の拡大培養ステップを行うことができる。第１の拡大培養中、例えばステップｂ、第１の拡大培養後、例えばステップＣ中、第２の拡大培養前又はその間、例えばステップＤ前又はその間、ステップＤ後且つステップＥにおける回収前、ステップＦの回収中又はその後、ステップＦの最終的な製剤化及び／又は輸注バッグへの移動前又はその間及びステップＦのいずれかの任意選択による凍結保存ステップ前にｓｄ−ＲＮＡを添加することができる。更に、ｓｄ−ＲＮＡは、ステップＦの任意の凍結保存ステップから解凍した後に添加することができる。
【１１１２】
チミジン組み込みアッセイ
[001258]  ＴＩＬサンプルは、拡大培養ステップのいずれかで回収でき、２％ヒトＡＢ血清を補充したCellGro培地の９６ウェルプレート（１０４  ４４３細胞／ウェル）に３回播種できる。１時間後、１μＣｉ／ウェルの［メチル−３４４４  Ｈ］チミジン（PerkinElmer、ウォルサム、マサチューセッツ州）を各ウェルに添加し、４時間インキュベートすることができる。次に、細胞を回収し、Trilux1450microBeta液体シンチレーションカウンター（Wallac）で３Ｈ−チミジンの組み込みを測定して、ＴＩＬの成長を調べることができる。
【１１１３】
ｓｄ−ＲＮＡ処置細胞のＩＦＮ−γ分泌
[001259]  刺激されたＴ細胞によるＩＦＮ−γの産生は、製造元の取扱説明書に従い、ヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ開発キット（Mabtech）を使用して上清中で測定できる。ＴＩＬは、本明細書で提供されるように調製され、例えば２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡで数日間、場合により４日間処置することができる。この期間後、上清をＥＬＩＳＡ分析のために採取して、ＩＦＮ−γ産生レベルを決定することができる。
【１１１４】
ＴＩＬ処置
[001260]  ｓｄ−ＲＮＡで処置されたＴＩＬは、癌患者を治療する方法において本明細書に記載されているように使用することができる。
【１１１５】
実施例２１：例示的なエレクトロポレーション法
[001261]  本明細書に記載のいずれかの方法に従ってＴＩＬを調製した。次のトランスフェクション法がテストされる：リポフェクチン及びリポフェクタミンリポフェクション、短径波BTX ECM 830装置又はBio-Rad Gene Pulser IIを使用したエレクトロポレーション、エッペンドルフマルチポレーターを使用した指数関数的逓減波エレクトロポレーション及びAmaxaヌクレオフェクター。全ての方法は、最初は、必要に応じて変更される可能性がある製造元の推奨に基づいている。Amaxaヌクレオフェクターのプロトコルは、最大のトランスフェクション効率を与え得る。Amaxaの手順は、３つの溶液（Ｖ、Ｒ及びＴ）の１つ及びエレクトロポレーションの８つのプログラムの異なる組み合わせを使用して最適化される。また、米国特許出願公開第２０１６／０２３０１８８号及び米国特許第８，８５９，２２９号に記載された方法を参照されたい。これら両方が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションは、Menger et al., Cancer Res., 2016 Apr 15; 76(8):2087-93によって記載された方法に従って実行され得、Agile Pulse BTXシステム（ハーバード装置（Harvard Apparatus））を使用し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。エレクトロポレーションされた細胞は、本明細書の他の場所に記載されたプレＲＥＰ及びＲＥＰ法により拡大培養され得る。米国特許第６，０１０，６１３号及び同第６，０７８，４９０号（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものなど、当技術分野で公知のエレクトロポレーション法を使用し得る。パルスエレクトロポレーションの最適化は、以下のプログラム又はその変更を使用して記述されている方法を使用して実行され得る。
【１１１６】
【表５２】
2021509586.tif 000056
【１１１７】
[001262]  ＴＩＬは、異なるエレクトロポレーションプログラム又は方法を使用して、ＧＦＰをコード化するプラスミド約２０μｇ及び対照プラスミドｐＵＣを含む０．４ｃｍギャップキュベット（約１０６細胞／ｍＬ程度）でエレクトロポレーションされ得る。エレクトロポレーションの約２４時間後、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによってエレクトロポレーションした細胞で分析し、トランスフェクション効率を決定した。ＴＩＬにおけるプラスミドエレクトロポレーションに必要な最小電圧は、国際特許出願公開国際公開第２０１４／１８４７４４号及び米国特許出願公開第２０１３／０３１５８８４  Ａ１号で以前に報告されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【１１１８】
実施例２２：治療活性が強化された腫瘍抗原特異的Ｔ細胞について濃縮されたＴＩＬ産物の調製のための一過性トランスフェクションプロトコル
[001263]  この実施例の実験では、ＴＩＬ改善戦略の２つの異なる効果を調べる。戦略１：ＩＬ−２又は膜結合型ＩＬ−１５（ｍｂ−ＩＬ１５）の一過性発現。戦略２：ＮＯＴＣＨ媒介性ＴＩＬの再プログラミング。いくつかの実施形態では、ＮＯＴＣＨ媒介性再プログラミングは、ＮＯＴＣＨ１又はＮＯＴＣＨ２の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）のｍＲＮＡ発現を含む。いくつかの実施形態では、ＮＯＴＣＨ媒介性再プログラミングは、ＮＯＴＣＨリガンドＤＬＬ１のｍＲＮＡ発現を含む。
【１１１９】
[001264]  研究対象の腫瘍の種類は、黒色腫、肺、肉腫などである。
【１１２０】
[001265]  ＴＩＬは、例えば、実施例１６に記載されているプロセスを含む、本明細書で上記に記載されるようなプロセスを使用して生成される。
【１１２１】
[001266]  ＲＮＡ分子は、例えば、実施例２１に記載される方法を使用し送達される（また、米国特許出願公開第２０１６／０２３０１８８号及び米国特許第８，８５９，２２９号に記載された方法を参照されたい。これら両方が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【１１２２】
[001267]  例えば、ｍＲＮＡ試薬の検証、一過性トランスフェクション及び再プログラミングのタイミング、エレクトロポレーションのタイミングと使用するＴＩＬプロセスとの互換性、効率（トランスフェクション効率を含む）及び拡張性などを含み、送達条件が決定される。
【１１２３】
[001268]  実験の読み出しは、ＴＩＬ表現型（フローサイトメトリー）、ＴＩＬエフェクター機能（サイトカイン産生アッセイ）、ＴＩＬ腫瘍応答性（自己腫瘍細胞共培養アッセイ）、ＴＣＲレパートリーアッセイ（フローサイトメトリー及び／又はＲＮＡ−ｓｅｑ）及びＴＩＬ代謝状態（タツノオトシゴなどの生細胞代謝アッセイ）又は本明細書の上記の他のパラメータのいずれかを含む。
【１１２４】
予想される結果：
[001269]  送達条件は、ポストＲＥＰ  ＴＩＬで対象のたんぱく質を高発現させるために必要に応じて設計される。凍結黒色腫プレＲＥＰサンプルをスクリーニング条件に使用する。最適化実験のために提供される試薬はＧＦＰ  ｍＲＮＡである。条件は、いくつかのＴＩＬ活性化方法及びエレクトロポレーションプロトコルを試験する。読み出しは、フローサイトメトリーで評価された、エレクトロポレーションされていない対照に対する細胞生存率及びＧＦＰ陽性細胞の割合である。選択条件は、利用可能な組織の新鮮なＴＩＬ調製物２〜３個で確認される。いくつかの実施形態では、トランスフェクション効率（ＥＴ）は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるトランスフェクションの約３時間、６時間、９時間、１２時間、１５時間及び／又は１８時間後に決定することができる。一部の実験では、ＧＦＰがもはや検出できなくなるまで、トランスフェクタントを１２時間〜２４時間毎に更に分析できる。一部の実施形態では、細胞生存率は、トリパンブルー染色排除により決定することができる。このプロトコルは、８０％を超える生存率及び７０を超えるトランスフェクション効率をもたらすと予想される。
【１１２５】
[001270]  ヒトＩＬ−２及びｍｂ結合ＩＬ−１５  ｍＲＮＡが生成され、機能的に試験される。検証済みの条件を使用して、様々な組織から最大６つのＴＩＬ培養物をトランスフェクトする。読み出しは、トランスフェクション効率、ＴＩＬ表現型及びＴＩＬエフェクター機能である。このプロトコルは、８０％を超える生存率、７０％を超えるトランスフェクション効率、対照と比較して同等又は改善されたＴＩＬ表現型及びＴＩＬエフェクター機能の顕著な増加をもたらすと予想される。
【１１２６】
[001271]  送達条件は、Ｔ細胞再プログラミングをもたらすために必要に応じて設計される。Iovanceに保存された凍結黒色腫プレＲＥＰサンプルをスクリーニング条件に使用する。提供される試薬は、ＮＯＴＣＨ１又は２  ＩＣＤ  ｍＲＮＡである。条件は、いくつかのＴＩＬ活性化方法及びエレクトロポレーションのタイミングを試験する。読み出しは、フローサイトメトリーで評価された、エレクトロポレーションされていない対照に対する細胞生存率、トランスフェクション効率及びステムメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の割合である。選択条件は、利用可能な組織の新鮮なＴＩＬ調製物２〜３個で確認される。このプロトコルにより、８０％を超える生存率、７０％を超えるトランスフェクション効率及びＴＳＣＭ頻度の顕著な増加をもたらすと予想される。
【１１２７】
[001272]  再プログラミング実験は、上記で決定されたトランスフェクション条件を使用して、様々な組織からの最大６つのＴＩＬ調製物で実行される。読み出しは、トランスフェクション効率、ＴＩＬ表現型、ＴＣＲレパートリー及びＴＩＬエフェクター機能である。このプロトコルは、ＴＳＣＭ頻度が顕著に増加し、ＴＩＬ全体に対するＴＳＣＭサブセットのＴＣＲレパートリーの維持を可能にし、対照に対するエフェクター機能の維持を可能にすると予想する。
【１１２８】
実施例２３：SD-RXRNAの入手及び検証
[001273]  この実施例の実験は、５つの対象となる標的：ＰＤＣＤ１、ＴＩＭ３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及びＣＩＳＨについてｓｄ−ｒｘＲＮＡ構築物に関するデータを提供する。
【１１２９】
[001274]  段階１：対象となる５つの標的のためのｓｄ−ｒｘＲＮＡの入手。
【１１３０】
[001275]  段階２：プレＲＥＰ  ＴＩＬにおけるｓｄ−ｒｘＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの検証（８週間）。
【１１３１】
[001276]  最大６つの凍結黒色腫／他のプレＲＥＰライン。実験条件の決定。
【１１３２】
[001277]  読み出し：
・％サイレンシング：８０％以上が予想される
・サイレンシングの持続
・ＴＩＬの成長：対照の１０％以内が予想される
・ＴＩＬ機能：サイトカイン産生の増加が予想される。
【１１３３】
[001278]  段階３：Ｇｅｎ２及び／又は３プロセスへのｓｄ−ｒｘＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの実施（３か月）。
・３〜６の研究スケールの新鮮ＴＩＬ調製物
・上記と同じ読み出し
・ＴＩＬ表現型
・ＴＩＬ腫瘍応答性
・今後の作業のために、少なくとも２つの標的／ｓｄ−ｒｘＲＮＡペアが選択される。
【１１３４】
[001279]  段階４：フルスケールのＴＩＬ調製への最適化されたサイレンシングプロトコルの実施（８週間）。
標的遺伝子毎に１つのフルスケール調製。
【１１３５】
根拠：
[001280]  ＴＭＥでは、ＴＩＬは、エフェクター機能を負に調節するいくつかの阻害分子を発現する。
【１１３６】
[001281]  ＴＩＬをエクスビボで培養すると機能は回復できるが、再注入後に免疫抑制は再び引き起こされる。
【１１３７】
[001282]  再注入後のＴ細胞阻害経路が少なくとも数日間サイレンス化していることを確実にすることで、ＡＣＴに対するＴＩＬの効力が向上する可能性がある。
【１１３８】
[001283]  自己送達ｓｉＲＮＡ（ｓｄ−ｒｘＲＮＡ）は、Ｔ細胞遺伝子をノックダウンする効率的な方法を提供する。例えば、Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 26(6):1482-1493 (2018)を参照されたい。
【１１３９】
目標：
[001284]  阻害経路をサイレンシングすることにより、ＴＩＬエフェクター機能を再確立する。
【１１４０】
戦略：
[001285]  急速拡大培養プロトコル中のｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用した１）ＰＤＣＤ１、２）ＴＩＭ３、３）ＣＢＬＢ、４）ＬＡＧ３及び５）ＣＩＳＨの一過性のノックダウン。急速拡大培養プロトコル中のｓｄ−ｒｘＲＮＡを使用したＰＤ１の一過性のノックダウンに特に焦点を当てる。
【１１４１】
手順：
[001286]  ＲＥＰ’ｅｄ  ＴＩＬにおけるｓｄ−ｒｘＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの検証（ＫＤの効率及び持続性、Ｔ細胞の生存率）。
【１１４２】
[001287]  ＴＩＬ表現型及び機能（腫瘍応答性）に対する遺伝子サイレンシングの影響。
【１１４３】
結果要約
[001288]  ＲＥＰ中の標的ｓｄ−ｒｘＲＮＡの追加は、５つの標的の３つで遺伝子ＫＤが成功し、８０％超え（＞８０％）のＰＤ１ノックダウンが含まれた。
・ＰＤ１：＞８０％
・ＴＩＭ３：約７０％
・ＬＡＧ３：約７０％
・ＣＩＳＨ：約４０％
・ＣＢＬＢ：検出不可。
【１１４４】
[001289]  ＰＤ１  ＫＤ（ノックダウン）は、生存率の低減と関連していた。ＰＤ１  ＫＤはＴＩＬの拡大培養の低減と関連していた。
【１１４５】
[001290]  表現型の顕著な変化は、ＰＤ１及びＴＩＭ３  ＫＤと関連しており、より高いレベルの活性化を示唆する（増強されたＣＤ２５、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、４−１ＢＢ及びＯＸ４０の発現）。特に、表現型の顕著な変化は、ＰＤ１  ＫＤと関連しており、高レベルの活性化を示唆する（ＮＴＣ対照と比較して、増強されたＣＤ２５、ＣＣＲ７、４−１ＢＢ及びＯＸ４０の発現）。
【１１４６】
[001291]  これらの実験では、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのいずれも、再刺激（ＩＮＦ  ｇ／ＩＬ−２／ＴＮＦ−ａ）に応答してサイトカイン分泌の増加をもたらさなかった。特に、ＰＤＣＤ１  ｓｄ−ｒｘＲＮＡへのＴＩＬの曝露は、再刺激に応答してＣＤ１０７ａ動員又はサイトカイン分泌（ＩＮＦγ／ＩＬ−２／ＴＮＦ−α）を増加させなかった。例えば、図５４を参照されたい。
【１１４７】
[001292]  ＰＤ１  ＫＤ（ノックダウン）は、ＴＩＬのインビトロで殺傷能力を増加させた（例えば、図４９を参照されたい）。
【１１４８】
方法：
・０日目：プレＲＥＰが開始された。培地にＩＬ−２を追加。
・１１日目：ＲＥＰは、ＩＬ−２とＰＢＭＣを含む培地を使用して、解凍／新鮮プレＲＥＰ＋ｓｄ−ｒｘＲＮＡ（即ち第２の拡大培養開始）を開始した。
・１４日目：培地交換＋ＩＬ−２を含むｓｄ−ｒｘＲＮＡ（任意選択によりＯＫＴ３及びフィーダー（ＰＢＭＣ））；ただし、ＩＬ−２のみを使用して実行した（例えば、ＩＬ−２培地を含むｓｄ−ｒｘＲＮＡ）。
・１７日目：培地交換＋ｓｄ−ｒｘＲＮＡ（追加でｓｄ−ｒｘＲＮＡの追加）（例えば、ＩＬ−２培地を含むｓｄ−ｒｘＲＮＡ）。
・２１日目：培地交換＋ｓｄ−ｒｘＲＮＡ（追加でｓｄ−ｒｘＲＮＡの追加）（例えば、ＩＬ−２培地を含むｓｄ−ｒｘＲＮＡ）。
・２２日目：上記のように回収されたＴＩＬ。
・細胞数をカウントし、生存率を決定した。
・決定されたＫＤ（ノックダウン）効率（Ｑ−ＰＣＲ、フロー）
・上記のように、ＴＩＬを特徴付ける表現型アッセイを実施した。
・調査された活性化マーカー（ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ）（例えば、図４５、阻害／疲弊マーカー及び図４６、ＩＦＮγを参照されたい）。
【１１４９】
[001293]  この実験は、図４０に示すように、黒色腫、乳房、肺、肉腫及び卵巣の５種類の腫瘍タイプで行われた。
【１１５０】
実施例２４：実施例２３の変形実施形態
[001294]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１１５１】
[001295]  上記の方法の一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法は、
（ｉ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｉｉ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせること；
（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第３のＴＩＬ集団は、第２のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも１００倍多く、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために少なくとも１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、生じさせること；及び
（ｉｖ）第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に１１日目〜２１日目に曝露することであって、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する、曝露すること；及び
（ｖ）２２日目以降にステップ（ｉｖ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収すること；及び
（ｖｉ）任意選択により、ステップ（ｖ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すこと
を含み得る。
【１１５２】
[001296]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。
【１１５３】
[001297]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１１５４】
[001298]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、��発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１１５５】
[001299]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１５６】
[001300]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１５７】
[001301]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１５８】
[001302]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１５９】
[001303]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１６０】
実施例２５：実施例２３の変形実施形態
[001304]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１１６１】
[001305]  上記の方法の一部の実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に１１日目〜２１日目に曝露することであって、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の変化した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する、曝露すること；
（ｆ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を２２日目以降に回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること；及び
（ｇ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含み得る。
【１１６２】
[001306]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１６３】
[001307]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子��発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１１６４】
[001308]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、��発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１１６５】
[001309]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１６６】
[001310]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１６７】
[001311]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１６８】
[001312]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１６９】
[001313]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１７０】
実施例２６：実施例２３の変形実施形態
[001314]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１１７１】
[001315]  上記の方法の一部の実施形態において、癌を有する対象の処置方法が提供され、そのような方法は、
（ａ）患者象から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に１１日目〜２１日目に曝露することであって、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供する、曝露すること；
（ｆ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること；及び
（ｇ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；
（ｈ）任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること；及び
（ｉ）ステップ（ｇ）における輸注バッグから治療有効投与量の第３のＴＩＬ集団を患者に投与すること
を含む、拡大培養された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む。
【１１７２】
[001316]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１７３】
[001317]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子��発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１１７４】
[001318]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、��発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１１７５】
[001319]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１７６】
[001320]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１７７】
[001321]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１７８】
[001322]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１７９】
[001323]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１８０】
実施例２７：実施例２３の変形実施形態
[001324]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１１８１】
[001325]  上記の方法の一部の実施形態において、癌を有する対象の処置に使用するための拡大培養されたＴＩＬ集団が提供され得、拡大培養されたＴＩＬ集団は、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２及び任意選択によりＯＫＴ−３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約３〜１４日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｄ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１４日間にわたって実施され、第３のＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団であり、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２及び／又は第３のＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子に１１日目〜２１日目に曝露することであって、ＴＦ及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現及び／又は治療用ＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供する、曝露すること；
（ｆ）ステップ（ｄ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、回収すること；及び
（ｇ）ステップ（ｅ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｆ）から（ｇ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｈ）任意選択により、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの回収されたＴＩＬ集団を含む輸注バッグを凍結保存すること
を含む方法によって得ることができる第３のＴＩＬ集団である。
【１１８２】
[001326]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１８３】
[001327]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子��発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１１８４】
[001328]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、��発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１１８５】
[001329]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１８６】
[001330]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１８７】
[001331]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１８８】
[001332]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１８９】
[001333]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１９０】
実施例２８：実施例２３の変形実施形態
[001334]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１１９１】
[001335]  上記の方法の一部の実施形態において、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）１１〜２１日目を含む、ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）のいずれかの間に第２のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡの濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｈ）任意選択により、第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｉ）ステップ（ｇ）又は（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法が提供される。
【１１９２】
[001336]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１９３】
[001337]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子��発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１１９４】
[001338]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、��発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１１９５】
[001339]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１９６】
[001340]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１９７】
[001341]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１９８】
[001342]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１１９９】
[001343]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２００】
実施例２９：実施例２３の変形実施形態
[001344]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１２０１】
[001345]  上記の方法の一部の実施形態において、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）１１〜２１日目を含む、ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）のいずれかの間に第２のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡの濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｈ）任意選択により、第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｉ）ステップ（ｇ）又は（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；及び
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと
を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法が提供される。
【１２０２】
[001346]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２０３】
[001347]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２０４】
[001348]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２０５】
[001349]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２０６】
[001350]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２０７】
[001351]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．７５μＭ〜約２．２５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２０８】
[001352]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２０９】
[001353]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加され、ここで、少なくとも１日、ｓｄ−ＲＮＡの濃度は約２μＭで添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２１０】
実施例３０：実施例２３の変形実施形態
[001354]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１２１１】
[001355]  上記の方法の一部の実施形態において、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）１１〜２１日目を含む、ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）のいずれかの間に第２のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡの濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｈ）任意選択により、第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｉ）ステップ（ｇ）又は（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法が提供される。
【１２１２】
[001356]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２１３】
[001357]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子��発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２１４】
[001358]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、��発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２１５】
[001359]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２１６】
[001360]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２１７】
[001361]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２１８】
[001362]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２１９】
[001363]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２２０】
実施例３１：実施例２３の変形実施形態
[001364]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１２２１】
[001365]  上記の方法の一部の実施形態において、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）１１〜２１日目に第１のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｅ）任意選択により、第１のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｆ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｈ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｈ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｉ）ステップ（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法が提供される。
【１２２２】
[001366]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２２３】
[001367]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子��発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２２４】
[001368]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、��発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２２５】
[001369]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２２６】
[001370]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２２７】
[001371]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２２８】
[001372]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２２９】
[001373]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２３０】
実施例３２：実施例２３の変形実施形態
[001374]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１２３１】
[001375]  上記の方法の一部の実施形態において、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）１１〜２１日目に第１のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬの濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｅ）任意選択により、第１のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｆ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｈ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｇ）からステップ（ｈ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｉ）ステップ（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法が提供される。
【１２３２】
[001376]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２３３】
[001377]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子��発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２３４】
[001378]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、��発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２３５】
[001379]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２３６】
[001380]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２３７】
[001381]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２３８】
[001382]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２３９】
[001383]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２４０】
実施例３３：実施例２３の変形実施形態
[001384]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１２４１】
[001385]  上記の方法の一部の実施形態において、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）１１〜２１日目を含む、ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）のいずれかの間に第２のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｈ）任意選択により、第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｉ）ステップ（ｇ）又は（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法が提供される。
【１２４２】
[001386]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２４３】
[001387]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子��発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２４４】
[001388]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、��発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２４５】
[001389]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２４６】
[001390]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２４７】
[001391]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２４８】
[001392]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２４９】
[001393]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２５０】
実施例３４：実施例２３の変形実施形態
[001394]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１２５１】
[001395]  上記の方法の一部の実施形態において、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）１１〜２１日目を含む、ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）のいずれかの間に第２のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地の濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｈ）任意選択により、第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｉ）ステップ（ｇ）又は（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｇ）からステップ（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｉ）から（ｊ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法が提供される。
【１２５２】
[001396]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２５３】
[001397]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子��発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２５４】
[001398]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、��発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２５５】
[001399]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２５６】
[001400]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２５７】
[001401]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２５８】
[001402]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２５９】
[001403]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２６０】
実施例３５：実施例２３の変形実施形態
[001404]  実施例２３で考察される方法に従い、一過性に変化するタンパク質発現と組み合わせてＴＩＬを拡大培養する方法が記載される。この実施例は、実施例２３に記載された方法に沿って更に変化した実施形態を提供する。
【１２６１】
[001405]  上記の方法の一部の実施形態において、
（ａ）患者から得られた腫瘍サンプルを複数の腫瘍断片に処理することにより、患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得ること；
（ｂ）腫瘍断片を閉鎖系に添加すること；
（ｃ）ＩＬ−２を含み、且つ任意選択により４−１ＢＢアゴニスト抗体を含む細胞培養培地中で約２〜５日間にわたって第１のＴＩＬ集団を培養することにより、第１の拡大培養を実施すること；
（ｄ）ＯＫＴ−３を添加して第２のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第１の拡大培養は、第１のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、第１の拡大培養は、第２のＴＩＬ集団を得るために約１〜３日間にわたって実施され、第２のＴＩＬ集団は、第１のＴＩＬ集団よりも数において少なくとも５０倍多く、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｅ）第２のＴＩＬ集団を約１日間にわたって静置すること；
（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ−２、任意選択によりＯＫＴ−３抗体、任意選択によりＯＸ４０抗体及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することにより、第２の拡大培養を実施して第３のＴＩＬ集団を生じさせることであって、第２の拡大培養は、第３のＴＩＬ集団を得るために約７〜１１日間にわたって実施され、第２の拡大培養は、第２のガス透過性表面積を提供する閉鎖型容器内で実施され、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、系を開放することなく行われる、生じさせること；
（ｇ）１１〜２１日目を含む、ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）のいずれかの間に第２のＴＩＬ集団を少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡと接触させることであって、ｓｄ−ＲＮＡは、０．１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、０．７５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．２５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、１．５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、２μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、５μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ又は１０μＭ  ｓｄ−ＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬの濃度で添加され、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現を阻害するためのものである、接触させること；
（ｈ）任意選択により、第２のＴＩＬ集団に対して無菌エレクトロポレーションステップを実施することであって、無菌エレクトロポレーションステップは、少なくとも１つのｓｄ−ＲＮＡの移動を媒介する、実施すること；
（ｉ）ステップ（ｇ）又は（ｈ）から得られた治療用ＴＩＬ集団を回収して、回収されたＴＩＬ集団を提供することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｈ）への移行は、系を開放することなく行われ、回収されたＴＩＬ集団は、治療用ＴＩＬ集団である、提供すること；
（ｊ）ステップ（ｉ）からの回収されたＴＩＬ集団を輸注バッグに移すことであって、ステップ（ｈ）から（ｉ）への移行は、系を開放することなく行われる、移すこと；及び
（ｋ）ジメチルスルホキシドベースの凍結保存培地を使用して、回収されたＴＩＬ集団を凍結保存すること
を含む、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療用ＴＩＬ集団に拡大培養する方法が提供される。
【１２６２】
[001406]  一部の変形実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子は、例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを含むが、これに限定されないｓｄ−ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目にｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２６３】
[001407]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子��発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２６４】
[001408]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、７５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、８５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９０％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９５％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、ＰＤ−１の発現において、９９％の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約１０μＭの濃度、一部の実施形態では約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、��発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約５．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約６．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約７．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約８．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約９．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄ−ＲＮＡ配列は、約１０．０μＭの濃度で送達された場合、ＰＤ−１の発現の低減を示す。前述の実施形態のいずれかにおいて、指定された濃度は、培地交換前又は後にＴＩＬ培養培地に関して決定され得る。
【１２６５】
[001409]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約０．７５μＭ〜約３μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２６６】
[001410]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．０μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２６７】
[001411]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約１．５μＭ〜約２．５μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２６８】
[001412]  一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも２日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目の少なくとも３日、ｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ＴＩＬは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度において１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目の全てでｓｄ−ＲＮＡに曝露される。一部の変形実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、約２μＭのｓｄ−ＲＮＡ濃度で培地交換と共に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２６９】
[001413]  一部の実施形態において、１１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ、ＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡを含み、任意選択によりＩＬ−２、ＯＫＴ３及びＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の１つ以上を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１４日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、１７日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、２１日目に添加されるｓｄ−ＲＮＡは、ｓｄ−ＲＮＡ及びＩＬ−２を含む培地に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１４日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが１７日目に添加される。一部の実施形態において、更なるｓｄ−ＲＮＡが２１日目に添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び２１日目に同じ濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、１１日目、１４日目、１７日目及び／又は２１日目に異なる濃度で添加される。一部の実施形態において、ｓｄ−ＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とする。
【１２７０】
[001414]  上述の実施例は、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態を作製及び使用する方法の全面開示及び説明を当業者に与えるために提供され、本発明者らが、その発明と見なす範囲を限定することを意図するものではない。当業者に明らかである本発明を実施するための上述の態様の修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本発明に属する当業者の技能のレベルを示す。
【１２７１】
[001415]  全ての見出し及びセクションの指定は、明確化と参照の目的でのみ使用されており、決して限定と見なされるものではない。例えば、当業者は、本明細書に記載される本発明の趣旨及び範囲に従い、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を適切に組み合わせることが有用であることを理解するであろう。
【１２７２】
[001416]  本明細書に引用されている全ての参考文献は、個々の出版物若しくは特許又は特許出願が全ての目的についてその全体が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されている場合と同程度に、その全体があらゆる目的について参照により本明細書に組み込まれる。
【１２７３】
[001417]  当業者に明らかであるように、本出願の多くの修正形態及び変形形態は、その趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載される特定の実施形態及び実施例は、ごく一実施例としてのみ提供され、本出願は、特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲と共に添付の特許請求の範囲の条項よってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ】
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【図４７Ｅ】
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【図４７Ｆ】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３】
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【図５４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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