(57)【要約】  本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を作製する方法及びそうした方法によって生成される組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、
（ｉ）細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたＴ細胞）の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は前記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触（例えば、結合）させるステップ；
（ｉｉ）前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、前記ＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）と接触させ、それにより前記核酸分子を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を提供するステップ、及び
（ｉｉｉ）保存（例えば、凍結保存培地中の前記細胞の集団を再製剤化すること）又は投与のために前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を採取するステップ
を含み、
（ａ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に又はステップ（ｉ）の開始後の２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１８時間以内に実施され、及び
ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後の３０（例えば、２６）時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の２４時間以内に実施されるか、
（ｂ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に又はステップ（ｉ）の開始後の２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１８時間以内に実施され、及び
ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）の開始後の３０時間以内、例えばステップ（ｉｉ）の開始後の２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内に実施されるか、又は
（ｃ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、例えば、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖され、
任意選択で、ステップ（ｉｉ）における前記核酸分子は、ウイルスベクター上にあり、任意選択で、ステップ（ｉｉ）における前記核酸分子は、ウイルスベクター上のＲＮＡ分子であり、任意選択で、ステップ（ｉｉ）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、前記ＣＡＲをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む、方法。
【請求項２】
ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する前記薬剤は、ＣＤ３を刺激する薬剤（例えば、抗ＣＤ３抗体）であり、共刺激分子を刺激する前記薬剤は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＣＤ２、ＣＤ２２６又はそれらの任意の組み合わせを刺激する薬剤であり、任意選択で、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する前記薬剤又は共刺激分子を刺激する前記薬剤は、抗体（例えば、単一ドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン抗体）、ペプチボディ、Ｆａｂフラグメント若しくはｓｃＦｖ）、小分子又はリガンド（例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド）から選択され、任意選択で、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する前記薬剤又は共刺激分子を刺激する前記薬剤は、ビーズを含まず、任意選択で、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する前記薬剤は、抗ＣＤ３抗体を含み、且つ共刺激分子を刺激する前記薬剤は、抗ＣＤ２８抗体を含み、任意選択で、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する前記薬剤は、コロイドポリマーナノマトリックスに共有結合された抗ＣＤ３抗体を含み、且つ共刺激分子を刺激する前記薬剤は、コロイドポリマーナノマトリックスに共有結合された抗ＣＤ２８抗体を含み、任意選択で、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する前記薬剤及び共刺激分子を刺激する前記薬剤は、Ｔ  Ｃｅｌｌ  ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉ）は、ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のＣＡＲ発現細胞のパーセンテージを増加させ、例えば、ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、ステップ（ｉ）なしである以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ＣＡＲ発現細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０又は６０％高い）を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと同じであるか又は５若しくは１０％以下だけ異なるか；
（ｂ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、例えば、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて少なくとも１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８又は３倍だけ増加されるか；
（ｃ）前記細胞の集団中のＣＡＲ発現ナイーブＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉ）の期間中に増加し、例えばステップ（ｉｉ）の開始後の１８〜２４時間で少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０％だけ増加するか；又は
（ｄ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて減少しないか又は５若しくは１０％以下だけ減少する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、２０、３０又は４０％高い）を示すか；
（ｂ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージより高い（例えば、少なくとも１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８又は３倍高い）か；
（ｃ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のＣＡＲ発現ナイーブＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のＣＡＲ発現ナイーブＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージより高い（例えば、少なくとも４、６、８、１０又は１２倍高い）か；
（ｄ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、２０、３０又は４０％高い）を示すか；
（ｅ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージより高い（例えば、少なくとも１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８又は３倍高い）か；又は
（ｆ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のＣＡＲ発現ナイーブＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のＣＡＲ発現ナイーブＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージより高い（例えば、少なくとも４、６、８、１０又は１２倍高い）、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと同じであるか又は５若しくは１０％以下だけ異なるか；
（ｂ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０％だけ低下されるか；
（ｃ）ＣＡＲ発現セントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉ）の期間中に減少し、例えばステップ（ｉｉ）の開始後の１８〜２４時間で少なくとも８、１０、１２、１４、１６又は２０％だけ減少するか；又は
（ｄ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて増加しないか又は５若しくは１０％以下だけ増加する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のより低いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、２０、３０又は４０％低い）を示すか；
（ｂ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージより低い（例えば、少なくとも２０、３０、４０又は５０％低い）か；
（ｃ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のＣＡＲ発現セントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のＣＡＲ発現セントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージより低い（例えば、少なくとも１０、２０、３０又は４０％低い）か；
（ｄ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のより低いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、２０、３０又は４０％低い）を示すか；
（ｅ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージより低い（例えば、少なくとも２０、３０、４０又は５０％低い）か；又は
（ｆ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のＣＡＲ発現セントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のＣＡＲ発現セントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージより低い（例えば、少なくとも１０、２０、３０又は４０％低い）、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて増加されるか；
（ｂ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて増加されるか；
（ｃ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージより高いか；又は
（ｄ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージより高いか；
（ｅ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージより高いか；又は
（ｆ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージより高い、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、７５、１００若しくは１２５％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；
（ｂ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、
ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）より低い（例えば、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０又は３００％低い）か；
（ｃ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、１００、１５０若しくは２００％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；
（ｄ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、
ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）より低い（例えば、少なくとも約５０、１００、１２５、１５０又は１７５％低い）か；
（ｅ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）は、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、１００、１５０、２００若しくは２５０％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；
（ｆ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）は、
ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）より低い（例えば、少なくとも約５０、１００又は１２５％低い）か；
（ｇ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）は、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）とほぼ同じであるか又は約１２５、１５０、１７５若しくは２００％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；
（ｈ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）は、
ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）より低い（例えば、少なくとも約４０、５０、６０、７０又は８０％低い）か；
（ｊ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）とほぼ同じであるか又は約１８０、１９０、２００若しくは２１０％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；又は
（ｋ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、
ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）より低い（例えば、少なくとも約２０、３０又は４０％低い）、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、前記ＣＡＲによって認識される抗原を発現する細胞と一緒にインキュベートされた後、例えば図２９Ｃ〜２９Ｄに関して実施例８に記載される方法を用いて評価されるように、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞又はステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８若しくは９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞よりも高いレベル（例えば、少なくとも２、４、６、８、１０、１２又は１４倍高い）でＩＬ−２を分泌する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、又はステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８若しくは９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べてより長く持続するか又はより高いレベルで増殖する（例えば、図４Ｃに関して実施例１に記載される方法を用いて評価されるように）、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞又はステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８若しくは９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞よりも強力な抗腫瘍活性（例えば、低用量、例えば０．１５×１０６、０．２×１０６、０．２５×１０６又は０．３×１０６個の生存ＣＡＲ発現細胞でより強力な抗腫瘍活性）を示す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下だけ増殖され、任意選択で、ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団中の生存細胞の数は、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団中の生存細胞の数から減少する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、ステップ（ｉ）の開始時の前記細胞の集団と比べて増殖されないか又は２時間未満、例えば１若しくは１．５時間未満だけ増殖される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｉ）及び／又は（ｉｉ）は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）、ＬＳＤ１阻害剤、ＭＡＬＴ１阻害剤又はそれらの組み合わせを含む細胞培地（例えば、無血清培地）中で実施される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｉ）及び／又は（ｉｉ）は、血清代替品を含む無血清細胞培地中で実施される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記血清代替品は、ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＩＣＳＲ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｉ）前に、
（ｉｖ）（任意選択で）実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から新鮮な白血球アフェレーシス産物（或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの新鮮な産物）などの造血組織の代替供給源）を受け取るステップ、及び
（ｖ）新鮮な白血球アフェレーシス産物（或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの新鮮な産物）などの造血組織の代替供給源）から、ステップ（ｉ）で接触された前記細胞（例えば、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞）の集団を単離するステップ
をさらに含み、任意選択で、
ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｖ）の開始後の３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の３０時間以内に実施されるか、又は
ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、ステップ（ｖ）の終了時の前記細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｉ）前に、実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から、白血球アフェレーシス産物（或いは全血液、骨髄又は腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去）から単離された凍結保存Ｔ細胞などの造血組織の代替供給源）から単離された凍結保存Ｔ細胞を受け取るステップをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｉ）前に、
（ｉｖ）（任意選択で）実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から凍結保存白血球アフェレーシス産物（或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの凍結保存産物）などの造血組織の代替供給源）を受け取るステップ、及び
（ｖ）凍結保存白血球アフェレーシス産物（或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの凍結保存産物）などの造血組織の代替供給源）から、ステップ（ｉ）で接触された前記細胞（例えば、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞）の集団を単離するステップ
をさらに含み、任意選択で、
ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｖ）の開始後の３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の３０時間以内に実施されるか、又は
ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、ステップ（ｖ）の終了時の前記細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｖｉ）：ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団の一部を少なくとも２、２．５、３、３．５、４、４．５、５．５．６、６．５又は７日、例えば少なくとも２日且つ７日以下にわたって培養し、及び前記一部中のＣＡＲ発現レベルを測定する（例えば、前記一部中の生存ＣＡＲ発現細胞のパーセンテージを測定する）ステップ
をさらに含み、任意選択で、
ステップ（ｉｉｉ）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を採取及び凍結することを含み、且つステップ（ｖｉ）は、ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団の一部を解凍し、前記部分を少なくとも２、２．５、３、３．５、４、４．５、５．５、６、６．５又は７日、例えば少なくとも２日且つ７日以下にわたって培養し、及び前記一部中のＣＡＲ発現レベルを測定する（例えば、前記一部中の生存ＣＡＲ発現細胞のパーセンテージを測定する）ことを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、
（１）細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば凍結白血球アフェレーシス産物から単離されたＴ細胞）の集団を、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−６又はそれらの組み合わせから選択されるサイトカインと接触させるステップ、
（２）前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、前記ＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）と接触させ、それにより前記核酸分子を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を提供するステップ、及び
（３）保存（例えば、凍結保存培地中の前記細胞の集団を再製剤化すること）又は投与のために前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を採取するステップ
を含み、
（ａ）ステップ（２）は、ステップ（１）と一緒に又はステップ（１）の開始後の５時間以内、例えばステップ（１）の開始後の１、２、３、４又は５時間以内に実施され、及び
ステップ（３）は、ステップ（１）の開始後の２６時間以内、例えばステップ（１）の開始後の２２、２３又は２４時間以内、例えばステップ（１）の開始後の２４時間以内に実施されるか、又は
（ｂ）ステップ（３）からの前記細胞の集団は、例えば、ステップ（１）の開始時の前記細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖され、
任意選択で、ステップ（２）における前記核酸分子は、ウイルスベクター上にあり、任意選択で、ステップ（ｉｉ）における前記核酸分子は、ウイルスベクター上のＲＮＡ分子であり、任意選択で、ステップ（ｉｉ）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、前記ＣＡＲをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む、方法。
【請求項２３】
ステップ（１）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−２と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（１）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−７と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（１）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（１）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−２１と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（１）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（１）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−７及びＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（１）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−７及びＩＬ−２１と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（１）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））及びＩＬ−２１と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（１）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−７、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））及びＩＬ−２１と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（１）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）及びＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（１）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−２及びＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（３）からの前記細胞の集団は、前記細胞の集団を例えば抗ＣＤ３抗体と接触させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ＣＡＲ発現細胞の中でナイーブ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０％高い）を示す、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（３）からの前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、
（ａ）ステップ（１）の開始時の前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと同じであるか又は５若しくは１０％以下だけ異なるか、又は
（ｂ）ステップ（１）の開始時の前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて増加される、例えば少なくとも１０又は２０％だけ増加される、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（３）からの前記細胞の集団は、ステップ（３）が、ステップ（１）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（１）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、２０、３０又は４０％高い）を示す、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（３）からの前記細胞の集団は、ステップ（２）後且つステップ（３）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、２０、３０又は４０％高い）を示す、請求項２２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（３）からの前記細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ（３）が、ステップ（１）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（１）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、より長く持続するか又はより高いレベルで増殖する（例えば、図４Ｃに関して実施例１に記載される方法を用いて評価されるように）、請求項２２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（３）からの前記細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ（２）後且つステップ（３）前に前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、より長く持続するか又はより高いレベルで増殖する（例えば、図４Ｃに関して実施例１に記載される方法を用いて評価されるように）、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（３）からの前記細胞の集団は、ステップ（１）の開始時の前記細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖され、任意選択で、ステップ（３）からの前記細胞の集団中の生存細胞の数は、ステップ（１）の開始時の前記細胞の集団中の生存細胞の数から減少する、請求項２２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（３）からの前記細胞の集団は、ステップ（１）の開始時の前記細胞の集団と比べて増殖されないか又は２時間未満、例えば１若しくは１．５時間未満だけ増殖される、請求項２２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は前記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤とインビトロで接触されないか、又は接触される場合、前記接触させるステップは、２時間未満、例えば１若しくは１．５時間以下である、請求項２２〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する前記薬剤は、ＣＤ３（例えば、抗ＣＤ３抗体）を刺激する薬剤であり、共刺激分子を刺激する前記薬剤は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＣＤ２、ＣＤ２２６又はそれらの任意の組み合わせを刺激する薬剤であり、任意選択で、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する前記薬剤又は共刺激分子を刺激する前記薬剤は、抗体（例えば、単一ドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン抗体）、ペプチボディ、Ｆａｂフラグメント若しくはｓｃＦｖ）、小分子又はリガンド（例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド）から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（１）及び／又は（２）は、
５、４、３、２、１又は０％以下の血清であって、任意選択で、ステップ（１）及び／又は（２）は、約２％の血清を含む細胞培地中で実施される、血清、又は
ＬＳＤ１阻害剤又はＭＡＬＴ１阻害剤
を含む細胞培地中で実施される、請求項２２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から凍結保存白血球アフェレーシス産物（或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの凍結保存産物）などの造血組織の代替供給源）を受け取るステップをさらに含む、請求項２２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ｉ）又はステップ（１）の開始時の前記細胞の集団は、ＩＬ６Ｒ発現細胞（例えば、ＩＬ６Ｒα及び／又はＩＬ６Ｒβについて陽性の細胞）について濃縮されている、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ｉ）又はステップ（１）の開始時の前記細胞の集団は、５０、６０又は７０％以上のＩＬ６Ｒ発現細胞（例えば、ＩＬ６Ｒα及び／又はＩＬ６Ｒβについて陽性の細胞）を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）又はステップ（１）及び（２）は、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））を含む細胞培地中で実施される、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ＩＬ−１５は、前記細胞の集団が例えば１０、１５、２０又は２５日後に増殖する能力を増加させる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＩＬ−１５は、前記細胞の集団中のＩＬ６Ｒβ発現細胞のパーセンテージを増加させる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、メソテリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、Ｔｎ−Ｏ−グリコペプチド、ｓＴｎ−Ｏ−グリコペプチド、ＰＳＭＡ、ＣＤ９７、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、レグマン、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−β、ＳＳＥＡ−４、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ（例えば、ＥＲＢＢ２）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、エフリンＢ２、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｓＬｅ、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＦＡＰ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６若しくはＥ７、ＭＬ−ＩＡＰ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、Ｆｏｓ関連抗原、好中球エラスターゼ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、精子タンパク質１７、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、チログロブリン、ＰＬＡＣ１、グロボＨ、ＲＡＧＥ１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ  ７０−２、ＮＡ−１７、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＰＲ２０、Ｌｙ６ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＧＦＲα４又はＭＨＣに提示される前記抗原のいずれかのペプチドから選択される抗原に結合する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗原結合ドメインは、本明細書に開示されるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ又はＣＡＲ配列を含み、任意選択で、
（ａ）前記抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡに結合し、且つ表３〜１５に開示されるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ若しくはＣＡＲ配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むか；
（ｂ）前記抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、且つ表２に開示されるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ若しくはＣＡＲ配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むか；
（ｃ）前記抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合し、且つ本明細書に開示されるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ若しくはＣＡＲ配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むか；又は
（ｄ）前記抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し、且つ本明細書に開示されるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ若しくはＣＡＲ配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、請求項５１又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、前記ＶＨ及びＶＬは、リンカーによって連結され、任意選択で、前記リンカーは、配列番号６３又は１０４のアミノ酸配列を含む、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
（ａ）前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含むか、
（ｂ）前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメインを含むか、
（ｃ）前記膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
（ｄ）前記核酸分子は、前記膜貫通ドメインをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号１７の核酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗原結合ドメインは、ヒンジ領域によって前記膜貫通ドメインに連結され、任意選択で、
（ａ）前記ヒンジ領域は、配列番号２、３若しくは４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
（ｂ）前記核酸分子は、前記ヒンジ領域をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号１３、１４若しくは１５の核酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含み、任意選択で、前記一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２又はＣＤ６６ｄに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含み、任意選択で、
（ａ）前記一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含むか、
（ｂ）前記一次シグナル伝達ドメインは、配列番号９若しくは１０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
（ｃ）前記核酸分子は、前記一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号２０若しくは２１の核酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含み、任意選択で、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２８−ＯＸ４０、ＣＤ２８−４−１ＢＢ又はＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含み、任意選択で、
（ａ）前記共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含むか、
（ｂ）前記共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
（ｃ）前記核酸分子は、前記共刺激シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号１８の核酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来する機能性シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζに由来する機能性シグナル伝達ドメインとを含み、任意選択で、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列（又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列）と、配列番号９若しくは１０のアミノ酸配列（又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列）とを含み、任意選択で、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列と、配列番号９又は１０のアミノ酸配列とを含む、請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＣＡＲは、配列番号１のアミノ酸配列を含むリーダー配列をさらに含む、請求項５１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法によって作製されるＣＡＲ発現細胞（例えば、自家又は同種異系ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の集団。
【請求項６２】
ＣＡＲを発現するように操作された細胞の集団（「ＣＡＲ発現細胞の集団」）であって、
（ａ）前記ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞；
（ｂ）前記ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞の約５％〜約１０％以内の変化；
（ｃ）前記ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて、増加された、例えば少なくとも１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８又は３倍増加されたパーセンテージのナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞；
（ｄ）前記ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞；
（ｅ）前記ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の約５％〜約１０％以内の変化；
（ｆ）前記ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、減少された、例えば少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０％減少されたパーセンテージのセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞；
（ｇ）前記ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞；
（ｈ）前記ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の約５％〜約１０％以内の変化；又は
（ｉ）前記ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、増加されたパーセンテージのステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞
を含む細胞の集団。
【請求項６３】
ＣＡＲを発現するように操作された細胞の集団（「ＣＡＲ発現細胞の集団」）であって、
（ａ）前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、前記ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、７５、１００若しくは１２５％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；
（ｂ）前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、前記ＣＡＲを発現するように操作される前の前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、１００、１５０若しくは２００％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；
（ｃ）前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）は、前記ＣＡＲを発現するように操作される前の前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、１００、１５０、２００若しくは２５０％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；
（ｄ）前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）は、前記ＣＡＲを発現するように操作される前の前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）とほぼ同じであるか又は約１２５、１５０、１７５若しくは２００％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；又は
（ｅ）前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、前記ＣＡＲを発現するように操作される前の前記細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）とほぼ同じであるか又は約１８０、１９０、２００若しくは２１０％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）、細胞の集団。
【請求項６４】
請求項６１〜６３のいずれか一項に記載のＣＡＲ発現細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項６５】
対象の免疫応答を増加させる方法であって、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載のＣＡＲ発現細胞の集団又は請求項６４に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより前記対象の免疫応答を増加させるステップを含む方法。
【請求項６６】
対象の癌を処置する方法であって、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載のＣＡＲ発現細胞の集団又は請求項６４に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより前記対象の前記癌を処置するステップを含む方法。
【請求項６７】
前記癌は、例えば、中皮腫、悪性胸膜中皮腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮癌、大細胞肺癌、膵臓癌、膵管腺癌、食道腺癌、乳癌、膠芽腫、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、皮膚癌、黒色腫、腎癌、肝臓癌、脳腫瘍、胸腺腫、肉腫、癌腫、子宮癌、腎臓癌、消化管癌、尿路上皮癌、咽頭癌、頭部及び頸部癌、直腸癌、食道癌若しくは膀胱癌の１つ以上から選択される固形癌又はその転移である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記癌は、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性炎症を伴うＤＬＢＣＬ、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、濾胞性リンパ腫、小児性濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型若しくは大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫（粘膜関連リンパ組織型節外性濾胞辺縁帯リンパ腫）、辺縁帯リンパ腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫／白血病、脾臓びまん性赤脾髄小細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病−変異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、Ｈ鎖病、プラズマ細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児性節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ＋大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に発生する大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は分類不能なリンパ腫から選択される液性癌である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
第２の治療薬を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記第２の治療薬は、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記第２の治療薬は、イブルチニブである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
イブルチニブは、約６００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約１９０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１２０ｍｇ又は１００ｍｇの用量で毎日１回投与される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
イブルチニブは、４２０ｍｇ、２８０ｍｇ又は１４０ｍｇの用量で毎日１回投与される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
イブルチニブは、前記ＣＡＲ発現細胞の集団の前記投与前、それと同時又はその後に投与される、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＣＡＲ発現細胞の集団は、請求項２１において測定されるＣＡＲ発現細胞のパーセンテージに基づいて決定された用量で投与される、請求項６５〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）の集団は、約０．５×１０６〜５０×１０６個の生存ＣＡＲ発現細胞、例えば約５×１０６個の生存ＣＡＲ発現細胞の用量で投与され、任意選択で、前記ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）の集団は、５×１０６個の生存ＣＡＲ発現細胞の用量で投与される、請求項６５〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）の集団は、約２．５×１０６〜２．５×１０８個の生存ＣＡＲ発現細胞、例えば約２．５×１０７個の生存ＣＡＲ発現細胞の用量で投与され、任意選択で、前記ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）の集団は、２．５×１０７個の生存ＣＡＲ発現細胞の用量で投与される、請求項６５〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）の集団は、約１．２５×１０７〜１．２５×１０９個の生存ＣＡＲ発現細胞、例えば約１．２５×１０８個の生存ＣＡＲ発現細胞の用量で投与され、任意選択で、前記ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）の集団は、１．２５×１０８個の生存ＣＡＲ発現細胞の用量で投与される、請求項６５〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現細胞）の集団は、約２．５×１０６〜２．５×１０８個の生存ＣＡＲ発現細胞、例えば約１×１０７又は５×１０７個の生存ＣＡＲ発現細胞の用量で投与される、請求項６５〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記対象は、ＣＬＬ又はＳＬＬを有する、請求項６６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記対象は、ＤＬＢＣＬ、例えば再発性及び／又は難治性ＤＬＢＣＬを有する、請求項６６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記対象は、例えば、少なくとも２、２．５、３、３．５又は４日、例えば約３日にわたってサイトカイン放出症候群の兆候についてモニターされる、請求項６５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
対象の免疫応答を増加させる方法に使用するためのものであり、前記方法は、有効量の前記ＣＡＲ発現細胞の集団又は有効量の前記医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載のＣＡＲ発現細胞の集団又は請求項６４に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
対象の癌を処置する方法に使用するためのものであり、前記方法は、有効量の前記ＣＡＲ発現細胞の集団又は有効量の前記医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載のＣＡＲ発現細胞の集団又は請求項６４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１８年８月３１日に提出された米国仮特許出願第６２／７２６，１５５号明細書、２０１８年１１月３０日に提出された米国仮特許出願第６２／７７３，６７９号明細書及び２０１９年６月７日に提出された米国仮特許出願第６２／８５８，４８２号明細書（これらの各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子出願されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年８月１６日に作成され、名称がＮ２０６７−７１５３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが２６０，５３２バイトである。
【０００３】
本発明は、概して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を作製する方法及びそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｔ細胞、特にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形質導入したＴ細胞での養子細胞移入（ＡＣＴ）療法は、いくつかの血液癌の試験で有望性が示されている。遺伝子改変Ｔ細胞の製造は、現在、複雑なプロセスである。ＣＡＲ発現細胞療法製品の生産を改善し、製品の品質を高めると共に製品の治療効果を最大化する方法及びプロセスが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を作製する方法及びそうした方法を使用して生成される組成物に関する。また、対象の疾患、例えば癌を処置するためにそのような組成物を使用する方法も開示される。
【０００６】
一部の実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法を特徴とし、本方法は、（ｉ）細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたＴ細胞）の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触（例えば、結合）させるステップ；（ｉｉ）細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を提供するステップ、及び（ｉｉｉ）保存（例えば、凍結保存培地中の細胞の集団を再製剤化すること）又は投与のために細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を採取するステップを含み、（ａ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に又はステップ（ｉ）の開始後の２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１８時間以内に実施され、及びステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後の２６時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の２２、２３、２４又は２５時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の２４時間以内に実施されるか；（ｂ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に又はステップ（ｉ）の開始後の２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１８時間以内に実施され、及びステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）の開始後の３０時間以内、例えばステップ（ｉｉ）の開始後の２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内に実施されるか；又は（ｃ）ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、例えば、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、ＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、プラスミド上にある。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、いずれのベクター上にもない。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後の２０時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後の１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後の１８時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後の２６時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後の２２、２３、２４又は２５時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後の２４時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）の開始後の３０時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）の開始後の２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内に実施される。
【０００７】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、増殖されない。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、例えば、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、例えば、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて１０％以下だけ増殖される。
【０００８】
一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、ＣＤ３を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＣＤ２、ＣＤ２２６又はそれらの任意の組み合わせを刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、ＣＤ２８を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、抗体（例えば、単一ドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン抗体）、ペプチボディ、Ｆａｂフラグメント若しくはｓｃＦｖ）、小分子又はリガンド（例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド）から選択される。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、抗体（例えば、単一ドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン抗体）、ペプチボディ、Ｆａｂフラグメント若しくはｓｃＦｖ）、小分子又はリガンド（例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド）から選択される。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、ビーズを含まない。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、ビーズを含まない。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、抗ＣＤ３抗体を含む。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、コロイドポリマーナノマトリックスに共有結合された抗ＣＤ３抗体を含む。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、コロイドポリマーナノマトリックスに共有結合された抗ＣＤ２８抗体を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び共刺激分子を刺激する薬剤は、Ｔ  Ｃｅｌｌ  ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、ハイドロゲルを含まない。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、ハイドロゲルを含まない。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、アルギン酸塩を含まない。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、アルギン酸塩を含まない。
【００１０】
一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、ハイドロゲルを含む。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、ハイドロゲルを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、アルギン酸塩を含む。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、アルギン酸塩を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤又は共刺激分子を刺激する薬剤は、Ｑｕａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＭａｇＣｌｏｕｄｚ（商標）を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）は、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のＣＡＲ発現細胞のパーセンテージを増加させ、例えば、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｉ）なしである以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ＣＡＲ発現細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０又は６０％高い）を示す。
【００１２】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと同じである。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２％以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと５又は１０％以下だけ異なる。
【００１３】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％高い）を示す。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％高い）を示す。
【００１４】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと同じである。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２％以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと５又は１０％以下だけ異なる。
【００１５】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のより低いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％低い）を示す。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のより低いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％低い）を示す。
【００１６】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて増加される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて増加される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージより高い。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージより高い。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージより高い。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団中のＣＡＲ発現ステムメモリーＴ細胞、例��ばＣＡＲ発現ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージより高い。
【００１７】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、７５、１００若しくは１２５％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）より低い（例えば、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０又は３００％低い）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）より低い（例えば、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０又は３００％低い）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、１００、１５０若しくは２００％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）より低い（例えば、少なくとも約５０、１００、１２５、１５０又は１７５％低い）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）より低い（例えば、少なくとも約５０、１００、１５０又は１７５％低い）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）は、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、１００、１５０、２００若しくは２５０％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）は、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）より低い（例えば、少なくとも約５０、１００又は１２５％低い）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）は、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）より低い（例えば、少なくとも約５０、１００又は１２５％低い）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）は、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）とほぼ同じであるか又は約１２５、１５０、１７５若しくは２００％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）は、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）より低い（例えば、少なくとも約４０、５０、６０、７０又は８０％低い）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）は、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）より低い（例えば、少なくとも約４０、５０、６０、７０又は８０％低い）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）とほぼ同じであるか又は約１８０、１９０、２００若しくは２１０％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の��団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）より低い（例えば、少なくとも約２０、３０又は４０％低い）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）より低い（例えば、少なくとも約２０、３０又は４０％低い）。
【００１８】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ＣＡＲによって認識される抗原を発現する細胞と一緒にインキュベートされた後、例えば図２９Ｃ〜２９Ｄに関して実施例８に記載される方法を用いて評価されるように、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞又はステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８若しくは９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞よりも高いレベル（例えば、少なくとも２、４、６、８、１０、１２又は１４倍高い）でＩＬ−２を分泌する。
【００１９】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べてより長く持続するか又はより高い（例えば、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５若しくは９０％高い）レベルで増殖する（例えば、図４Ｃを参照にして実施例１に記載される方法を用いて評価されるように）。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べてより長く持続するか又はより高い（例えば、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５若しくは９０％高い）レベルで増殖する（例えば、図４Ｃを参照にして実施例１に記載される方法を用いて評価されるように）。
【００２０】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉ）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（ｉ）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞又はステップ（ｉｉ）後且つステップ（ｉｉｉ）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８若しくは９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞よりも強力な抗腫瘍活性（例えば、低用量、例えば０．１５×１０６、０．２×１０６、０．２５×１０６又は０．３×１０６個の生存ＣＡＲ発現細胞でより強力な抗腫瘍活性）を示す。
【００２１】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて増殖されない。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、例えば、生存細胞の数によって評価されて、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中の生存細胞の数から減少する。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団と比べて増殖されないか又は０．５、１、１．５若しくは２時間未満、例えば１若しくは１．５時間未満だけ増殖される。
【００２２】
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））、ＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ））、ＬＳＤ１阻害剤又はＭＡＬＴ１阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、ＩＬ−７、ＩＬ−２１又はそれらの組み合わせを含む細胞培地（例えば、無血清培地）中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））、ＩＬ−２１、ＩＬ−７、ＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）、ＬＳＤ１阻害剤、ＭＡＬＴ１阻害剤又はそれらの組み合わせを含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））、ＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）、ＬＳＤ１阻害剤又はＭＡＬＴ１阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））、ＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）、ＬＳＤ１阻害剤又はＭＡＬＴ１阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）は、ＩＬ−７、ＩＬ−２１又はそれらの組み合わせを含む細胞培地（例えば、無血清培地）中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ＩＬ−７、ＩＬ−２１又はそれらの組み合わせを含む細胞培地（例えば、無血清培地）中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））、ＩＬ−２１、ＩＬ−７、ＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）、ＬＳＤ１阻害剤、ＭＡＬＴ１阻害剤又はそれらの組み合わせを含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））、ＩＬ−２１、ＩＬ−７、ＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）、ＬＳＤ１阻害剤、ＭＡＬＴ１阻害剤又はそれらの組み合わせを含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、細胞培地は、血清代替品を含む無血清培地である。一部の実施形態では、血清代替品は、ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＩＣＳＲ）である。
【００２３】
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ（ｉ）前に、（ｉｖ）実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から新鮮な白血球アフェレーシス産物（或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの新鮮な産物）などの造血組織の代替供給源）を受け取るステップをさらに含む。
【００２４】
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ（ｉ）前に、（ｖ）新鮮な白血球アフェレーシス産物（或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの新鮮な産物）などの代替供給源）から、ステップ（ｉ）で接触された細胞（例えば、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞）の集団を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｖ）の開始後の３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の３０時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｖ）の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖される。
【００２５】
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ（ｉ）前に、実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から、白血球アフェレーシス産物（或いは全血液、骨髄又は腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去）から単離された凍結保存Ｔ細胞などの造血組織の代替供給源）から単離された凍結保存Ｔ細胞を受け取るステップをさらに含む。
【００２６】
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ（ｉ）前に、（ｉｖ）実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から凍結保存白血球アフェレーシス産物（或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの凍結保存産物）などの造血組織の代替供給源）を受け取るステップをさらに含む。
【００２７】
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ（ｉ）前に、（ｖ）凍結保存白血球アフェレーシス産物（或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの凍結保存産物）などの造血組織の代替供給源）から、ステップ（ｉ）で接触された細胞（例えば、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞）の集団を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｖ）の開始後の３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の３０時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｖ）の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖される。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法を特徴とし、本方法は、（１）細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば凍結白血球アフェレーシス産物から単離されたＴ細胞）の集団を、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−６又はそれらの組み合わせから選択されるサイトカインと接触させるステップ、（２）細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を提供するステップ、及び（３）保存（例えば、凍結保存培地中の細胞の集団を再製剤化すること）又は投与のために細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を採取するステップを含み、（ａ）ステップ（２）は、ステップ（１）と一緒に又はステップ（１）の開始後の５時間以内、例えばステップ（１）の開始後の１、２、３、４又は５時間以内に実施され；及びステップ（３）は、ステップ（１）の開始後の２６時間以内、例えばステップ（１）の開始後の２２、２３、２４又は２５時間以内、例えばステップ（１）の開始後の２４時間以内に実施されるか；又は（ｂ）ステップ（３）からの細胞の集団は、例えば、ステップ（１）の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、ＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、プラスミド上にある。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、いずれのベクター上にもない。一部の実施形態では、ステップ（２）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む。
【００２９】
一部の実施形態では、ステップ（２）は、ステップ（１）と一緒に実施される。一部の実施形態では、ステップ（２）は、ステップ（１）の開始後の５時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（２）は、ステップ（１）の開始後の１、２、３、４又は５時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（３）は、ステップ（１）の開始後の２６時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（３）は、ステップ（１）の開始後の２２、２３、２４又は２５時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（３）は、ステップ（１）の開始後の２４時間以内に実施される。
【００３０】
一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、例えば、ステップ（１）の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されない。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、例えば、ステップ（１）の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、例えば、ステップ（１）の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて１０％以下だけ増殖される。
【００３１】
一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−２と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−７と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−２１と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−２及びＩＬ−７と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−２及びＩＬ１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−２及びＩＬ−２１と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−２及びＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−７及びＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−７及びＩＬ−２１と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−７及びＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））及びＩＬ−２１と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））及びＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−２１及びＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ（１）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をＩＬ−７、ＩＬ１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））及びＩＬ−２１と接触させることを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、細胞の集団を例えば抗ＣＤ３抗体と接触させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ＣＡＲ発現細胞の中でナイーブ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％高い）を示す。
【００３３】
一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（１）の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと同じである。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（１）の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２％以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（１）の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと５又は１０％以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（１）の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて増加される。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（１）の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０％だけ増加される。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ステップ（１）の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて少なくとも１０又は２０％だけ増加される。
【００３４】
一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、ステップ（３）が、ステップ（１）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（１）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％高い）を示す。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、ステップ（２）後且つステップ（３）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％高い）を示す。
【００３５】
一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと同じである。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２％以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと５又は１０％以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、ステップ（１）の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと比べて減少される。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、ステップ（１）の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと比べて少なくとも１０又は２０％だけ減少される。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、ステップ（１）の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと比べて少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０％だけ減少される。
【００３６】
一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、ステップ（３）が、ステップ（１）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（１）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のより低いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％低い）を示す。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、ステップ（２）後且つステップ（３）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のより低いパーセンテージ（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％低い）を示す。
【００３７】
一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ（３）が、ステップ（１）の開始後、２６時間を超えて、例えばステップ（１）の開始後、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、より長く持続するか又はより高い（例えば、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５若しくは９０％高い）レベルで増殖する（例えば、図４Ｃに関して実施例１に記載される方法を用いて評価されるように）。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ（２）後且つステップ（３）前に細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をインビトロで３日超、例えば５、６、７、８又は９日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、より長く持続するか又はより高い（例えば、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５若しくは９０％高い）レベルで増殖する（例えば、図４Ｃに関して実施例１に記載される方法を用いて評価されるように）。
【００３８】
一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、ステップ（１）の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて増殖されない。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、ステップ（１）の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５又は４０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、ステップ（１）の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて１０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団中の生存細胞の数は、例えば、生存細胞の数によって評価されて、ステップ（１）の開始時の細胞中の生存細胞の数から減少する。
【００３９】
一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、ステップ（１）の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて増殖されない。一部の実施形態では、ステップ（３）からの細胞の集団は、ステップ（１）の開始時の細胞の集団と比べて、０．５、１、１．５又は２時間未満、例えば１又は１．５時間未満だけ増殖される。
【００４０】
一部の実施形態では、細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又はそれらの細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤とインビトロで接触されないか、又は接触される場合、接触させるステップは、２時間未満、例えば１若しくは１．５時間以下である。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、ＣＤ３（例えば、抗ＣＤ３抗体）を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＣＤ２、ＣＤ２２６又はそれらの任意の組み合わせを刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、ＣＤ２８を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、抗体（例えば、単一ドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン抗体）、ペプチボディ、Ｆａｂフラグメント若しくはｓｃＦｖ）、小分子又はリガンド（例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド）から選択される。
【００４１】
一部の実施形態では、ステップ（１）及び／又は（２）は、５、４、３、２、１又は０％以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（１）及び／又は（２）は、２％以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（１）及び／又は（２）は、約２％の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（１）及び／又は（２）は、ＬＳＤ１阻害剤又はＭＡＬＴ１阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（１）は、５、４、３、２、１又は０％以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（１）は、２％以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（１）は、約２％の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（２）は、５、４、３、２、１又は０％以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（２）は、２％以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（２）は、約２％の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（１）は、ＬＳＤ１阻害剤又はＭＡＬＴ１阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ（２）は、ＬＳＤ１阻害剤又はＭＡＬＴ１阻害剤を含む細胞培地中で実施される。
【００４２】
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ（ｉ）前に、（ｉｖ）実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から新鮮な白血球アフェレーシス産物（或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの新鮮な産物）などの造血組織の代替供給源）を受け取るステップをさらに含む。
【００４３】
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ（ｉ）前に、（ｖ）新鮮な白血球アフェレーシス産物（或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの新鮮な産物）などの造血組織の代替供給源）から、ステップ（ｉ）で接触された細胞（例えば、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞）の集団を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｖ）の開始後の３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の３０時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｖ）の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖される。
【００４４】
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ（ｉ）前に、実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から、白血球アフェレーシス産物（或いは全血液、骨髄又は腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去）から単離された凍結保存Ｔ細胞などの代替供給源）から単離された凍結保存Ｔ細胞を受け取るステップをさらに含む。
【００４５】
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ（ｉ）前に、（ｉｖ）実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から凍結保存白血球アフェレーシス産物（或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの凍結保存産物）などの造血組織の代替供給源）を受け取るステップをさらに含む。
【００４６】
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ（ｉ）前に、（ｖ）凍結保存白血球アフェレーシス産物（或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除（例えば、胸腺除去からの凍結保存産物）などの造血組織の代替供給源）から、ステップ（ｉ）で接触された細胞（例えば、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞）の集団を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｖ）の開始後の３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５時間以内、例えばステップ（ｖ）の開始後の３０時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、ステップ（ｖ）の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖される。
【００４７】
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）又はステップ（１）の開始時の細胞の集団は、ＩＬ６Ｒ発現細胞（例えば、ＩＬ６Ｒα及び／又はＩＬ６Ｒβについて陽性の細胞）について濃縮されている。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）又はステップ（１）の開始時の細胞の集団は、４０、４５、５０、５５、６０、６５若しくは７０％以上のＩＬ６Ｒ発現細胞（例えば、ＩＬ６Ｒα及び／又はＩＬ６Ｒβについて陽性の細胞）を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）又はステップ（１）及び（２）は、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ＩＬ−１５は、細胞の集団が例えば１０、１５、２０又は２５日後に増殖する能力を増加させる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５は、細胞の集団中のＩＬ６Ｒβ発現細胞のパーセンテージを増加させる。
【００４９】
前述した方法の一部の実施形態では、本方法は、閉鎖系において実施される。一部の実施形態では、Ｔ細胞分離、活性化、形質導入、インキュベーション及び洗浄は、全て閉鎖系において実施される。前述した方法の一部の実施形態では、本方法は、個別の装置内で実施される。一部の実施形態では、Ｔ細胞分離、活性化及び形質導入、インキュベーション及び洗浄は、個別の装置内で実施される。
【００５０】
前述した方法の一部の実施形態では、本方法は、形質導入効率を高めるためにアジュバント又は形質導入促進試薬を細胞培地に添加するステップをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバント又は形質導入試薬は、カチオン性ポリマーを含む。一部の実施形態では、アジュバント又は形質導入促進試薬は、ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）（Ｓｉｒｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ベクトフシン（ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ）−１、Ｆ１０８、臭化ヘキサジメトリン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）、ＰＥＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ又はＬｅｎｔｉＴｒａｎｓ（商標）から選択される。一部の実施形態では、アジュバントは、ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）（Ｓｉｒｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）である。
【００５１】
前述した方法の一部の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団をウイルスベクターで形質導入するステップは、形質導入効率が高められるような条件下で細胞の集団及びウイルスベクターを遠心力に付すことを含む。一実施形態では、細胞は、スピノキュレーションによって形質導入される。
【００５２】
前述した方法の一部の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、底部にガス透過膜を含む細胞培養フラスコ内で活性化され、形質導入され、このガス透過膜は、ガス交換を実質的に損なうことなく大きい培地量を支持する。一部の実施形態では、細胞増殖は、対流による栄養素へのアクセス、例えば中断しないアクセスによって達成される。
【００５３】
前述した方法の一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００５４】
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、メソテリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、Ｔｎ−Ｏ−グリコペプチド、ｓＴｎ−Ｏ−グリコペプチド、ＰＳＭＡ、ＣＤ９７、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、レグマン、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−β、ＳＳＥＡ−４、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ（例えば、ＥＲＢＢ２）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、エフリンＢ２、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｓＬｅ、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＦＡＰ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６若しくはＥ７、ＭＬ−ＩＡＰ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、Ｆｏｓ関連抗原、好中球エラスターゼ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、精子タンパク質１７、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、チログロブリン、ＰＬＡＣ１、グロボＨ、ＲＡＧＥ１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ  ７０−２、ＮＡ−１７、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＰＲ２０、Ｌｙ６ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＧＦＲα４又はＭＨＣに提示されるこれらの抗原のいずれかのペプチドから選択される抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に開示されるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ又はＣＡＲ配列を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨ及びＶＬは、リンカーによって連結され、任意選択で、リンカーは、配列番号６３又は１０４のアミノ酸配列を含む。
【００５５】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、膜貫通ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１７の核酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５６】
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに連結される。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号２、３若しくは４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、ヒンジ領域をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１３、１４若しくは１５の核酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５７】
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２又はＣＤ６６ｄに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、配列番号９又は１０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号２０若しくは２１の核酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５８】
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２８−ＯＸ４０、ＣＤ２８−４−１ＢＢ又はＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号１８の核酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５９】
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来する機能性シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζに由来する機能性シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列（又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列）と、配列番号９若しくは１０のアミノ酸配列（又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列）とを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列と、配列番号９又は１０のアミノ酸配列とを含む。
【００６０】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１のアミノ酸配列を含むリーダー配列をさらに含む。
【００６１】
一部の実施形態では、本発明は、前述した方法のいずれか又は本明細書に開示されるいずれか他の方法によって作製されるＣＡＲ発現細胞（例えば、自家又は同種異系ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の集団を特徴とする。一部の実施形態では、本明細書に開示のＣＡＲ発現細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が本明細書において提供される。
【００６２】
一部の実施形態では、本明細書記載の方法を用いて製造される最終ＣＡＲ細胞産物において、ビーズ（例えば、ＣＤ４ビーズ、ＣＤ８ビーズ及び／又はＴｒａｎｓＡＣＴビーズ）の総量は、製造プロセス中に添加されるビーズの総量の０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４又は０．５％以下である。
【００６３】
一部の実施形態では、本発明は、以下の特徴の１つ以上を含むＣＡＲ発現細胞（例えば、自家又は同種異系ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の集団を特徴とする：（ａ）ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞；（ｂ）ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞の約５％〜約１０％以内の変化；（ｃ）ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージと比べて、増加された、例えば少なくとも１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８又は３倍増加されたパーセンテージのナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞；（ｄ）ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞；（ｅ）ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の約５％〜約１０％以内の変化；（ｆ）ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、減少された、例えば少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０％減少されたパーセンテージのセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞；（ｇ）ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞；（ｈ）ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、ステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の約５％〜約１０％以内の変化；又は（ｉ）ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β��ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、増加されたパーセンテージのステムメモリーＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＩＬ−２受容体β＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞。
【００６４】
一部の実施形態では、本発明は、ＣＡＲ発現細胞（例えば、自家又は同種異系ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の集団を特徴とし、ここで、（ａ）細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、ＣＡＲを発現するように操作される前の同じ細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、７５、１００若しくは１２５％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；（ｂ）細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、ＣＡＲを発現するように操作される前の細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、１００、１５０若しくは２００％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；（ｃ）細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）は、ＣＡＲを発現するように操作される前の細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）とほぼ同じであるか又は約２５、５０、１００、１５０、２００若しくは２５０％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；（ｄ）細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）は、ＣＡＲを発現するように操作される前の細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）とほぼ同じであるか又は約１２５、１５０、１７５若しくは２００％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）か；又は（ｅ）細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、ＣＡＲを発現するように操作される前の細胞の集団のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）とほぼ同じであるか又は約１８０、１９０、２００若しくは２１０％以下だけ異なる（例えば、それ以下だけ増加される）。
【００６５】
一部の実施形態では、本発明は、対象の免疫応答を増加させる方法を特徴とし、これは、本明細書に開示されるＣＡＲ発現細胞の集団又は本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与し、それにより対象の免疫応答を増加させるステップを含む。
【００６６】
一部の実施形態では、対象の癌を処置する方法が開示され、これは、本明細書に開示されるＣＡＲ発現細胞の集団又は本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与し、それにより対象の癌を処置するステップを含む。一部の実施形態では、癌は、例えば、中皮腫、悪性胸膜中皮腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮癌、大細胞肺癌、膵臓癌、膵管腺癌、食道腺癌、乳癌、膠芽腫、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、皮膚癌、黒色腫、腎癌、肝臓癌、脳腫瘍、胸腺腫、肉腫、癌腫、子宮癌、腎臓癌、消化管癌、尿路上皮癌、咽頭癌、頭部及び頸部癌、直腸癌、食道癌若しくは膀胱癌の１つ以上から選択される固形癌又はその転移である。一部の実施形態では、癌は、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性炎症を伴うＤＬＢＣＬ、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、濾胞性リンパ腫、小児性濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型若しくは大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫（粘膜関連リンパ組織型節外性濾胞辺縁帯リンパ腫）、辺縁帯リンパ腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫／白血病、脾臓びまん性赤脾髄小細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病−変異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、Ｈ鎖病、プラズマ細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児性節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ＋大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に発生する大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は分類不能なリンパ腫から選択される液性癌である。
【００６７】
一部の実施形態では、本方法は、第２の治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の治療薬は、抗癌治療薬、例えば化学療法薬、放射線療法又は免疫調節療法である。一部の実施形態では、第２の治療薬は、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））である。
【００６８】
本明細書に記載のものと同様の又は均等な方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献（例えば、配列データベース参照番号）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書で（例えば、本明細書の任意の表において）言及される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ及びＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれる。１つの遺伝子又はタンパク質が複数の配列受託番号を参照する場合、全ての配列変異体が包含される。
【００６９】
さらに、材料、方法及び例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。見出し、副見出し又は番号若しくは文字が振られた要素、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｉ）等は、単に読み易いように提供される。本明細書で見出し又は番号若しくは文字が振られた要素を使用しても、ステップ若しくは要素がアルファベット順に実施される必要はないか、又はステップ若しくは要素が必ず互いに別個のものである必要はない。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面並びに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１−１】図１：精製Ｔ細胞をサイトカインと一緒にインキュベートしたとき、ナイーブ細胞は、形質導入された主要な集団であった。図１Ａは、例示的なサイトカインプロセスを示すグラフである。図１Ｂは、形質導入後の各表示時点でＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを示すグラフの組である。図１Ｃは、２つの独立したドナーにおけるサイトカインのみの集団（右）と比較して、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激集団（左）におけるＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ−集団内の形質導入を示す一連のグラフである。図１Ｃの「Ｓｈｏｒｔ  ｓｔｉｍ  ＩＬ７＋ＩＬ１５」と称するサンプルの場合、細胞をビーズで２日間刺激した後、これらをＩＬ７及びＩＬ１５の存在下で除去した。図１Ｄ、１Ｅ及び１Ｆは、３日間にわたって毎日ＩＬ２（図１Ｄ）、ＩＬ１５（図１Ｅ）及びＩＬ７＋ＩＬ１５（図１Ｆ）と一緒に培養したＴ細胞サブセットの形質導入を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。図１Ｇは、ＩＬ２（右上パネル）又はＩＬ−１５（右下パネル）での刺激後のＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯについて第０日（左）及び第１日（右）にＴ細胞分化を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。図１Ｈ及び１Ｉは、第０日又は表示のサイトカインとの２４時間のインキュベーション後のＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＲＯ−、ＣＤ３＋ＣＣＲ７＋ＲＯ＋、ＣＤ３＋ＣＣＲ７−ＲＯ＋及びＣＤ３＋ＣＣＲ７−ＲＯ−細胞のパーセンテージを示す一連のグラフである。
【図１−２】（上記の通り。）
【図１−３】（上記の通り。）
【図１−４】（上記の通り。）
【図１−５】（上記の通り。）
【図１−６】（上記の通り。）
【図１−７】（上記の通り。）
【図１−８】（上記の通り。）
【図１−９】（上記の通り。）
【図１−１０】（上記の通り。）
【図１−１１】（上記の通り。）
【図１−１２】（上記の通り。）
【図２−１】図２：１日のサイトカイン刺激で産生されたＣＡＲＴは、機能性であった。図２Ａ：精製されたＴ細胞を１のＭＯＩで、且つ試験した全サイトカイン条件において形質導入し、第１日及び第１０日に観察されたＣＡＲ発現細胞のパーセンテージは、同等であった。１日以内にＣＡＲＴを生成し、採取後、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより９日間増殖させて、インビボセッティングを模倣した。図２Ａは、第１日ＣＡＲＴ（左）及び第１０日ＣＡＲＴ（右）の各条件下でＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞の平均パーセンテージを示すグラフの組である。図２Ｂ：増殖後の第１日ＣＡＲＴの細胞毒性能力を、標的細胞としてＮａｌｍ６を用いて測定した。図２Ｂは、各条件からのＣＡＲＴによるＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞の殺傷％を示すグラフである。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて増殖した第１０日ＣＡＲＴは、「第１０日」と記した。他の全てのサンプルは、第１日ＣＡＲＴであった。図２Ｃ：Ｎａｌｍ６標的細胞に応答する増殖第１日ＣＡＲＴのＩＦＮｇの分泌を検定した。図２Ｃは、ＣＤ１９陽性又はＣＤ１９陰性標的細胞の存在下で各条件からのＣＡＲＴによるＩＦＮ−γ分泌の量を示すグラフである。図２Ｄ：第１日ＣＡＲＴの増殖能力をＥＤＵの取り込みの測定により検定した。図２Ｄは、各条件についてのＥＤＵ陽性細胞の平均パーセンテージを示すグラフである。図２Ｂと同様に、第１０日ＣＡＲＴは、「第１０日」と記し、他の全てのサンプルは、第１日ＣＡＲＴであった。
【図２−２】（上記の通り。）
【図２−３】（上記の通り。）
【図２−４】（上記の通り。）
【図３−１】図３：第０日の形質導入時のＭＯＩの影響及び培地組成。図３Ａ：精製されたＴ細胞をＩＬ１５、ＩＬ２＋ＩＬ１５、ＩＬ２＋ＩＬ７又はＩＬ７＋ＩＬ１５の存在下において１〜１０の範囲のＭＯＩで形質導入した。使用したサイトカインとは関係なく、形質導入の線形増加が観察された。図３Ａは、ＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを、試験した各条件のＭＯＩに対してプロットした一連のグラフである。図３Ｂ：培地の組成は、サイトカインプロセスでの形質導入に影響を与えた。図３Ｂは、試験した各条件について第１日（左）及び第８日（右）のＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージを示すグラフの組である。「２．５０」は、２．５０のＭＯＩを示す。「５．００」は、５．００のＭＯＩを示す。
【図３−２】（上記の通り。）
【図３−３】（上記の通り。）
【図４−１】図４：２４時間以内に産生されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍を除去することができる。図４Ａ：精製されたＴ細胞をＣＡＲ１９で形質導入し、２４時間後に採取した。図４Ａは、ＩＬ２、ＩＬ１５及びＩＬ７＋ＩＬ１５と一緒に培養したＣＡＲ１９によるＴ細胞の形質導入を示す一連のフローサイトメトリープロットであり、各サイトカイン条件による形質導入を示す。図４Ｂ：試験した全ての条件において、８０％を超える平均生存率を示すグラフ。図４Ｃ：末梢血中の第１日ＣＡＲＴの増殖は、それらの第１０日対応物と比較してインビボで増加する。試験した各条件について注入後の表示時点での生存ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ−ＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージ。第１０日ＣＡＲＴは、「Ｄ１０  １ｅ６」又は「Ｄ１０  ５ｅ６」と表示され、他のサンプル、全て第１日ＣＡＲＴであった。図４Ｄ：第１日ＣＡＲＴは、第１０日ＣＡＲＴと比較して、動態の遅延はあるものの、インビボで腫瘍を排除することができた。図４Ｄは、試験した各条件での腫瘍接種後の表示時点での総フラックスを示すグラフである。腫瘍接種から４日後にＣＡＲＴを投与した。第１０日ＣＡＲＴは、「５ｅ６  ｄ．１０」として表示され、他のサンプルは、全て第１日ＣＡＲＴであった。
【図４−２】（上記の通り。）
【図４−３】（上記の通り。）
【図４−４】（上記の通り。）
【図４−５】（上記の通り。）
【図４−６】（上記の通り。）
【図４−７】（上記の通り。）
【図４−８】（上記の通り。）
【図５−１】図５：サイトカインプロセスは、スケーラブルであった。図５Ａ：Ｔ細胞をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で濃縮し、Ｂ細胞コンパートメントを１％未満まで減少させた。図５Ａは、ロイコパック細胞（上）又はＣＤ４＋ＣＤ８＋濃縮後細胞（下）の抗ＣＤ３抗体（左）又は抗ＣＤ１９抗体及び抗ＣＤ１４抗体（右）による細胞の染色を示す一連のフローサイトメトリープロットである。図５Ｂ：２４ウェルプレート又は濃縮後ＰＬ３０バッグのいずれかにおいて、凍結アフェレーシスからの精製Ｔ細胞をＣＡＲ１９で形質導入した。２４時間後にＣＡＲＴを採取した。図５Ｂは、ＩＬ２又はｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ）のいずれかの存在下で製造された細胞のＣＤ３の染色及びＣＡＲを示す一連のフローサイトメトリープロットである。
【図５−２】（上記の通り。）
【図６−１】図６：活性化プロセスにより製造されたＣＡＲＴは、インビボで優れた抗腫瘍有効性を示した。図６Ａ及び６Ｂは、腫瘍移植後の表示時点に対して腫瘍負荷をプロットしたグラフである。「ｄ．１」は、活性化プロセスを用いて製造されるＣＡＲＴを示す。「ｄ．９」は、この試験で陽性対照として使用される伝統的９日増殖プロトコルで製造されたＣＡＲＴを示す。図６Ｃは、マウスからの生物発光を示す一連の代表的画像である。
【図６−２】（上記の通り。）
【図６−３】（上記の通り。）
【図７−１】図７：ＩＬ６Ｒα及びＩＬ６Ｒβ発現細胞は、低分化Ｔ細胞集団中で濃縮された。新鮮なＴ細胞を表示の表面抗原について染色し、ＣＤ４（図７Ａ）及びＣＤ８（図７Ｂ）Ｔ細胞サブセット上のＩＬ６Ｒα及びＩＬ６Ｒβの発現レベルを検定した。
【図７−２】（上記の通り。）
【図８−１】図８：ＩＬ６Ｒα及びＩＬ６Ｒβ発現細胞の両方は、低分化Ｔ細胞集団中で濃縮された。新鮮なＴ細胞を表示の表面抗原について染色し、ＣＤ４（図８Ａ）及びＣＤ８（図８Ｂ）Ｔ細胞サブセット上の表示の表面抗原の発現レベルを検定した。
【図８−２】（上記の通り。）
【図９】ＩＬ６Ｒα発現細胞は、低分化Ｔ細胞の表面マーカーを発現した。新鮮なＴ細胞を表示の表面抗原について染色し、ＩＬ６Ｒα高、中及び低発現細胞サブセットにおける各種の表面抗原の発現レベルを検定した。
【図１０】ＩＬ６Ｒβ発現細胞は、低分化Ｔ細胞の表面マーカーを発現した。新鮮なＴ細胞を表示の表面抗原について染色し、ＩＬ６Ｒβ高、中及び低発現細胞サブセットにおける各種の表面抗原の発現レベルを検定した。
【図１１】ＩＬ６Ｒα発現は、ＴＣＲエンゲージメント後に下方制御されたが、ＩＬ６Ｒβ発現はそうではなかった。第０日にＴ細胞をαＣＤ３αＣＤ２８ビーズで活性化した後、表示の時点でＩＬ６Ｒα及びＩＬ６Ｒβの発現レベルについて検定した。
【図１２】ＴＣＲエンゲージメント後のサイトカイン処理Ｔ細胞の増殖倍率。第０日に、表示のサイトカインの存在下、Ｔ細胞をαＣＤ３αＣＤ２８ビーズで活性化した後、表示の時点で細胞数をモニターした。
【図１３−１】図１３：ＩＬ２、ＩＬ７及びＩＬ１５処理は、ＴＣＲエンゲージメント後の細胞サイズ及び生存率に影響を与えなかった。第０日に、表示のサイトカインの存在下、Ｔ細胞をαＣＤ３αＣＤ２８ビーズで活性化した後、表示の時点で細胞サイズ（図１３Ａ）及び生存率（図１３Ｂ）をモニターした。
【図１３−２】（上記の通り。）
【図１４−１】図１４：サイトカイン処理後のＣＤ４Ｔ細胞での様々な表面分子の発現動態。第０日に、表示のサイトカインの存在下、Ｔ細胞をαＣＤ３αＣＤ２８ビーズで活性化した後、表示の時点で、フローサイトメトリーにより様々な表面分子の発現を検定した。
【図１４−２】（上記の通り。）
【図１４−３】（上記の通り。）
【図１４−４】（上記の通り。）
【図１５−１】図１５：サイトカイン処理後のＣＤ８Ｔ細胞での様々な表面分子の発現動態。第０日に、表示のサイトカインの存在下、Ｔ細胞をαＣＤ３αＣＤ２８ビーズで活性化した後、表示の時点で、フローサイトメトリーにより様々な表面分子の発現を検定した。
【図１５−２】（上記の通り。）
【図１５−３】（上記の通り。）
【図１５−４】（上記の通り。）
【図１６】ＴＣＲエンゲージメント後、ＩＬ６Ｒβ発現は、主としてＣＤ２７発現Ｔ細胞サブセットで制限された。第０日に、表示のサイトカインの存在下、Ｔ細胞をαＣＤ３αＣＤ２８ビーズで活性化した後、第１５日に、フローサイトメトリーによりＩＬ６Ｒβ発現を検定した。
【図１７】ＴＣＲエンゲージメント後、ＩＬ６Ｒβ発現は、主としてＣＤ５７非発現Ｔ細胞サブセットで抑制された。第０日に、表示のサイトカインの存在下、Ｔ細胞をαＣＤ３αＣＤ２８ビーズで活性化した後、第２５日に、フローサイトメトリーによりＩＬ６Ｒβ発現を検定した。
【図１８】共通γ鎖サイトカイン処理Ｔ細胞は、第２５日に機能性サイトカインを産生した。第０日に、表示のサイトカインの存在下、Ｔ細胞をαＣＤ３αＣＤ２８ビーズで活性化した後、第２５日に、フローサイトメトリーによりＩＬ２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦα産生Ｔ細胞のパーセンテージについて検定した。
【図１９−１】図１９：２つの健常なドナーからのＴ細胞におけるＭＯＩ＝２．５のＡＲＭを用いた１日目のＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現。図１９Ａは、フローサイトメトリーにより測定される通り、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現を示すヒストグラムのパネルである。図１９Ｂは、フローサイトメトリー解析に使用される試薬／条件を列記する表である。
【図１９−２】（上記の通り。）
【図２０−１】図２０：ＡＲＭプロセスを用いて製造された細胞の第１日から第４日までのインビトロＣＡＲ発現動態。ＣＡＲは、第３日に安定して発現された。図２０Ａは、フローサイトメトリーにより測定される表示時点でのＣＡＲ発現を示すヒストグラムのパネルである。図２０Ｂ及び２０Ｃは、それぞれＣＡＲ＋％及びＭＦＩ値を経時的に示すグラフである。
【図２０−２】（上記の通り。）
【図２０−３】（上記の通り。）
【図２１−１】図２１：ＫＭＳ−１１−ｌｕｃ多発性骨髄腫異種移植マウスモデルにおけるインビボトリアージ。各マウスは、１．５Ｅ６の第１日ＣＡＲＴ産物を受けた。図２１Ａは、ＣＡＲＴ細胞における第１日及び第７日ＣＡＲ発現を示すヒストグラムのパネルである。図２１Ｂは、ＣＡＲＴ処置後の腫瘍動態（ＢＬＩレベル）を示すグラフである。
【図２１−２】（上記の通り。）
【図２２−１】図２２：ＫＭＳ−１１−ｌｕｃ多発性骨髄腫異種移植マウスモデルにおける、用量滴定を用いたＢＣＭＡ  ＣＡＲのインビボトリアージ。図２２Ａは、第１日及び第３日にＣＡＲ発現を示すヒストグラムのパネルである。図２２Ｂは、２つの異なる用量：１用量の１．５ｅ５ＣＡＲ＋Ｔ細胞及び１用量の５ｅ４ＣＡＲ＋Ｔ細胞を用いるＣＡＲＴ処置後の腫瘍取込み動態を示すグラフである。ＣＡＲ＋細胞の用量は、第３日ＣＡＲ発現に基づいて正規化した。図２２Ｃは、本試験中の体重動態を経時的に示すグラフである。
【図２２−２】（上記の通り。）
【図２２−３】（上記の通り。）
【図２３−１】図２３：図２３Ａ及び２３Ｂは、細胞表面上にＣＡＲを発現するＴ細胞のパーセンテージ（図２３Ａ）及び経時的に観察されたＣＤ３＋ＣＡＲ＋細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（図２３Ｂ）を示すグラフである（反復効率は、図２３Ｃに示す２つのフローパネルから平均される）。図２３Ｃは、ＵＴＤサンプルに基づいて、生存ＣＤ３＋細胞上の表面ＣＡＲ発現のゲーティング戦略を示すフローサイトメトリープロットのパネルである。プロット内の数値は、ＣＡＲ陽性率（％）を示す。
【図２３−２】（上記の通り。）
【図２３−３】（上記の通り。）
【図２３−４】（上記の通り。）
【図２４−１】図２４：図２４Ａは、出発材料（Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）産物）及び培養開始から様々な時点での採取時のエンドツーエンド（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）組成を示すグラフである。ネイティブ（ｎ）、セントラルメモリー（ｃｍ）、エフェクターメモリー（ｅｍ）及びエフェクター（ｅｆｆ）サブセットは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯ表面発現又はそれらの欠如によって確定された。ＣＤ４組成が示される。各時点で、左側のバーは、ＣＤ３＋集団（バルク）全体の細胞組成を示し、右側のバーは、ＣＡＲ＋画分の細胞組成を示す。図２４Ｂは、ＣＤ３＋集団（バルク）全体及びＣＡＲ＋画分内の形質導入効率全体（上の列）、ＣＤ４／ＣＤ８組成（中央列）及びメモリーサブセット（下の列）を決定するための生存ＣＤ３＋事象に適用されるゲーティング戦略を示すフローサイトメトリープロットのパネルである。
【図２４−２】（上記の通り。）
【図２４−３】（上記の通り。）
【図２４−４】（上記の通り。）
【図２４−５】（上記の通り。）
【図２４−６】（上記の通り。）
【図２４−７】（上記の通り。）
【図２５】それぞれのサブセットにおける生存細胞数として表される、表面ＣＡＲを経時的に発現するＴ細胞サブセットの動態。
【図２６】洗浄前カウントから決定される通り、培養開始から１２〜２４時間後の生存細胞回収（接種された生存細胞数に対して採取時に回収された生存細胞数）。
【図２７】採取時点の洗浄前及び洗浄後に決定される通り、培養開始から１２〜２４時間後に採取された高速ＣＡＲＴの生存率。
【図２８−１】図２８：図２８Ａは、フローサイトメトリーにより解析される、出発材料（健常なドナーロイコパック：ＬＫＰＫ）及びＴ細胞濃縮産物の組成を示すグラフである。数値は、親（生存、単一細胞）の％を示す。Ｔ：Ｔ細胞；ｍｏｎｏ：単球；Ｂ：Ｂ細胞；ＣＤ５６（ＮＫ）：ＮＫ細胞。図２８Ｂは、形質導入率（前方散乱光ＦＳＣ対ＣＡＲ）及びＴ細胞サブセット（ＣＤ４対ＣＤ８及びＣＣＲ７対ＣＤ４５ＲＯ）を決定するために用いられる生存ＣＤ３＋事象に関するゲーティング戦略を示すフローサイトメトリープロットのパネルである。ＡＲＭ  ＣＤ１９ＣＡＲ（活性化高速製造（ＡＲＭ）プロセスを用いて製造されたＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞）及びＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ（伝統的製造（ＴＭ）プロセスを用いて製造されたＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞）について、左下のパネルは、バルク培養物を表し、右のパネルは、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を表す。「ＡＲＭ−ＵＴＤ」及び「ＴＭ−ＵＴＤ」は、ＡＲＭ及びＴＭプロセスそれぞれに従って製造された非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を指す。四部円内の数値は、親集団の％を示す。ＴＭ−ＵＴＤ及びＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲプロット内のボックスは、ＴＭプロセスのＴＣＭ表現型への傾斜を示す。ＡＲＭ−ＵＴＤ及びＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲプロット内のボックスは、ＡＲＭプロセスによるナイーブ様細胞の維持を示す。ＮＡ：該当なし。図２８Ｃは、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ及びＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲのエンドツーエンド（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）Ｔ細胞組成を示すグラフである。組成は、適用可能な場合、「バルク」及び「ＣＡＲ＋」集団について示される。それぞれの集団のパーセンテージは、親、場合に応じてＣＤ３＋又はＣＡＲ＋ＣＤ３＋のいずれかの％を指す。代表的なバルク又はＣＡＲ＋集団のＣＤ４細胞の％が表示される。ＬＫＰＫ：ロイコパック出発材料；４及び８：それぞれＣＤ４＋及びＣＤ８＋；ｅｆｆ：エフェクター；ｅｍ：エフェクターメモリー；ｃｍ：セントラルメモリー；ｎ：ネイティブ様。データは、３つの異なる健常なドナー（ｎ＝３）を用いた３つのフルスケール試験及びプロセスを最適化するために使用されるいくつかのスモールスケール試験の代表的なものである。図２８Ｄは、図２８Ｃに示されるパーセンテージを示す表である。
【図２８−２】（上記の通り。）
【図２８−３】（上記の通り。）
【図２８−４】（上記の通り。）
【図２８−５】（上記の通り。）
【図２８−６】（上記の通り。）
【図２８−７】（上記の通り。）
【図２９−１】図２９：細胞培養上清中のサイトカイン濃度。ＩＦＮ−γ（図２９Ａ及び２９Ｂ）並びにＩＬ−２（図２９Ｃ及び図２９Ｄ）。図２９Ａ及び２９Ｃ：ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ及び代表的なＵＴＤを、ＮＡＬＭ６−ＷＴ（ＡＬＬ）、ＴＭＤ−８（ＤＬＢＣＬ）と一緒に共培養するか又は癌細胞なしで（Ｔ細胞単独で）培養した。４８ｈ後、上清を収集した。図２９Ｂ及び２９Ｄ：ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲを、ＮＡＬＭ６−ＷＴ、ＮＡＬＭ６−１９ＫＯ（ＣＤ１９陰性）と一緒に共培養するか又は単独で培養した。２４ｈ又は４８ｈ後、上清を収集した。抗原特異的サイトカイン分泌をさらに評価するために、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲを単独で２４ｈ培養し、洗浄した後、標的細胞と一緒に２４ｈ共培養した。示されるデータは、２つの健常なドナーＴ細胞から得られ、計３つのドナーによる２回の実験の代表的なものである。
【図２９−２】（上記の通り。）
【図２９−３】（上記の通り。）
【図２９−４】（上記の通り。）
【図３０−１】図３０：図３０Ａは、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの抗腫瘍活性を試験するための異種移植マウスモデルの概略を示すグラフである。図３０Ｂは、センチネルバイアルからのＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ細胞でのＣＡＲ発現の決定を示すフローサイトメトリープロットのパネルである。フローサイトメトリー解析前に、図に記載する期間にわたってＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ細胞を培養した。ＣＡＲ発現のゲーティングは、アイソタイプ対照（Ｉｓｏ）染色に基づいて行った。図３０Ｃは、異種移植マウスモデルにおけるＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲのインビボ有効性を示すグラフである。ルシフェラーゼリポーター遺伝子を発現するプレＢ  ＡＬＬ株ＮＡＬＭ６をＮＧＳマウスに注射し；腫瘍負荷は、総身体発光（ｐ／ｓ）として表され、９５％信頼区間の平均腫瘍負荷として示される。腫瘍接種後の第７日に各用量（生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞の数）のＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ又はＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲでマウスを処置した。Ｘ−ＧＶＨＤの発症により、高い用量のＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ群は、第３３日に停止した。ビヒクル（ＰＢＳ）及び非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）は、陰性対照として使用した。ＡＲＭ−ＵＴＤ  １×１０６用量及び全てのＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ用量群の場合のｎ＝４を除き、全ての群についてｎ＝５マウスであった。５つの異なる健常なドナーから生成されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を用いて５つの異種移植試験を実施したが、そのうちの３つは、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲとの比較を含んだ。
【図３０−２】（上記の通り。）
【図３０−３】（上記の通り。）
【図３０−４】（上記の通り。）
【図３０−５】（上記の通り。）
【図３０−６】（上記の通り。）
【図３０−７】（上記の通り。）
【図３１】それぞれのＣＡＲ−Ｔ細胞用量のＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ又はＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲで処置されたＮＡＬＭ６腫瘍担持マウスの血漿サイトカインレベル。マウスを採血し、血漿サイトカインをＭＳＤアッセイにより測定した。ＣＡＲ−Ｔ（図３１Ａ及び３１Ｃ）又はＡＲＭ−及びＴＭ−ＵＴＤ細胞（図３１Ｂ及び３１Ｄ）で処置したマウスについて、ＩＦＮ−γ（図３１Ａ及び３１Ｂ）並びにＩＬ−２（図３１Ｃ及び３１Ｄ）を示す。各用量内のバーは、様々な時点（左から第４、７、１０、１２、１６、１９、２３、２６日）での群内の平均サイトカインレベルを表す。水平バー及び数値は、文字で表されるＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ（１×１０６用量群）とＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ（０．５×１０６用量群）との間の倍率変化比較：ＩＦＮ−γが３倍；及びＩＬ−２が１０倍を示す。腫瘍負荷又は体重減少により取り下げた群は、最後の時点を表示してない。血漿サイトカインレベルは、２回の試験について測定した。ｎｏ  ｔｕｍ：腫瘍なし。
【図３２−１】図３２：ＰＢＳビヒクル、ＵＴＤ、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ又はＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲで処置したＮＡＬＭ６腫瘍担持マウスにおける総及びＣＡＲ＋Ｔ細胞濃度の経時的変化。血液サンプルは、ＣＡＲ−Ｔ細胞注射から４、７、１４、２１及び２８日後に採取した。総Ｔ細胞（ＣＤ３＋、上）及びＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＡＲ＋、下）濃度を、計画された時点でフローサイトメトリーにより解析し、９５％信頼区間の平均細胞として示す。
【図３２−２】（上記の通り。）
【図３２−３】（上記の通り。）
【図３２−４】（上記の通り。）
【図３３−１】図３３：三者（ｔｈｒｅｅ−ｐａｒｔｙ）共培養上清中のＩＬ−６レベル（ｐｇ／ｍＬ）。続いて、異なる比（１：１及び１：２．５）で６又は２４時間インキュベートした、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ／Ｋ５６２共培養細胞（図３３Ａ）又はＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ／Ｋ５６２共培養細胞（図３３Ｂ）をＰＭＡ−分化ＴＨＰ−１細胞にさらに２４時間かけて添加した。Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞と共培養したＣＡＲ−Ｔ細胞、Ｋ５６２−メソテリン細胞と共培養したＣＡＲ−Ｔ細胞及び単独のＣＡＲ−Ｔ細胞からの結果を示す。明瞭化のために、１：５比は、示さなかった。ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲのみ及びＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲのみと称されるバーは、標的細胞を含まないＣＡＲ−Ｔ細胞培養物（６ｈ、２４ｈ）を表す。平均＋ＳＥＭ、ｎ＝１（ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ）及びｎ＝３（ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ）の２回反復。
【図３３−２】（上記の通り。）
【図３４】ＡＲＭプロセスは、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞幹細胞性を保存する。ＡＲＭプロセスを用いて製造されたＲＩ６１、Ｒ１Ｇ５及びＢＣＭＡ１０  ＣＡＲＴ細胞を解凍時（図３４Ａ）及び解凍後４８ｈ（図３４Ｂ）にＣＡＲ発現について評価した。解凍後４８ｈ産物についてＣＣＲ７／ＣＤ４５ＲＯマーカーも評価した（図３４Ｃ）。示されるデータは、２つのドナーＴ細胞を用いて実施された２つの実験からの代表的なものである。
【図３５】ＴＭプロセスは、主に、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）（ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７＋）をもたらしたが、ネイティブ様Ｔ細胞集団は、ＴＭプロセスによるＣＡＲ＋Ｔ細胞においてほとんど消失される。ＴＭプロセスを用いて製造されたＰＩ６１、Ｒ１Ｇ５及びＢＣＭＡ１０  ＣＡＲＴ細胞を第９日のＣＡＲ発現について評価した（図３５Ａ）。ＣＣＲ７／ＣＤ４５ＲＯマーカーも解凍後第９日産物で評価した（図３５Ｂ）。示されるデータは、２つのドナーＴ細胞を用いて実施された２つの実験からの代表的なものである。
【図３６】ＡＲＭ処理ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ特異的活性化を示し、より高いレベルのＩＬ２及びＩＦＮ−γを分泌する。細胞上清中のＩＬ２及びＩＦＮ−γ濃度。ＡＲＭ若しくはＴＭプロセスを用いて製造されたＲＩ６１、Ｒ１Ｇ５及びＢＣＭＡ１０  ＣＡＲＴ細胞並びにそれぞれのＵＴＤをＫＭＳ−１１と２．５：１比で共培養した。２０ｈ後に上清を収集した。ＡＲＭ産物について、ＩＦＮ−γ濃度を図３６Ａに示し、ＩＬ−２濃度を図３６Ｂに示す。ＴＭ産物について、ＩＦＮ−γ濃度を図３６Ｃに示し、ＩＬ−２濃度を図３６Ｄに示す。示されるデータは、２つのドナーＴ細胞を用いて実施された２つの実験からの代表的なものである。
【図３７−１】図３７：インプット細胞（図３７Ａ）、第１日細胞（図３７Ｂ）及び第９日細胞（図３７Ｃ）についての単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータ。「ｎＧｅｎｅ」グラフは、１細胞当たりの発現細胞の数を示す。「ｎＵＭＩ」グラフは、１細胞当たりのユニークな分子識別子（ＵＭＩ）の数を示す。
【図３７−２】（上記の通り。）
【図３７−３】（上記の通り。）
【図３８−１】図３８：インプット細胞（図３８Ａ）、第１日細胞（図３８Ｂ）及び第９日細胞（図３８Ｃ）を増殖シグネチャーについて比較するＴ−分布型確率的近傍埋め込み法（ＴＳＮＥ）プロットであり、増殖シグネチャーは、遺伝子ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＰＬＫ１及びＭＫＩ６７の発現に基づいて決定した。各点は、そのサンプル中の細胞を表す。薄いグレーとして示される細胞は、増殖遺伝子を発現しないが、濃い影付きの細胞は、１つ以上の増殖遺伝子を発現する。図３８Ｄは、第１日細胞、第９日細胞及びインプット細胞についての活性化Ｔ細胞状態に対する休止Ｔ細胞状態を特徴とする遺伝子を含む遺伝子セットの遺伝子セットスコアの分布を示すバイオリンプロットである。図３８Ｄでは、遺伝子セットスコア（Ｕｐ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）が高いほど、休止Ｔ細胞表現型の増加を示すのに対し、遺伝子セットスコア（Ｕｐ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）が低いほど、活性化Ｔ細胞表現型の増加を示す。インプット細胞は、第９日及び第１日細胞と比べて、全体的に休止状態の方が多かった。第１日細胞は、最も高い活性化遺伝子セットスコアを示す。
【図３８−２】（上記の通り。）
【図３８−３】（上記の通り。）
【図３８−４】（上記の通り。）
【図３９−１】図３９：インプット細胞、第１日細胞及び第９日細胞についての遺伝子セット解析。図３９Ａにおいて、遺伝子セットの遺伝子セットスコア「Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ」が高いほど、そのサンプル中の細胞のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）表現型の増加を示し、遺伝子セットスコアが低いほど、幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）表現型の増加を示す。図３９Ｂでは、遺伝子セットの遺伝子セットスコア「Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ」が高いほど、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）表現型の増加を示し、遺伝子セットスコアが低いほど、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）表現型の増加を示す。図３９Ｃでは、遺伝子セットの遺伝子セットスコア「Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ」が低いほど、幹細胞性表現型の増加を示す。図３９Ｄでは、遺伝子セットの遺伝子セットスコＥア「Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ」が高いほど、低酸素表現型の増加を示す。図３９Ｅでは、遺伝子セットの遺伝子セットスコア「Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ」が高いほど、オートファジー表現型の増加を示す。第１日細胞は、メモリー、ステム様及び分化シグネチャーに関してインプット細胞と同様と思われた。これに対し、第９日細胞は、代謝ストレスについて高い濃縮を示す。
【図３９−２】（上記の通り。）
【図３９−３】（上記の通り。）
【図３９−４】（上記の通り。）
【図３９−５】（上記の通り。）
【図４０−１】図４０：インプット細胞についての遺伝子クラスター解析。図４０Ａ〜４０Ｃは、インプット細胞の４つのクラスターの遺伝子セット解析からの遺伝子セットスコアを示すバイオリンプロットである。図４０Ａ〜４０Ｃ中でバイオリンプロットに重なる各ドットは、細胞の遺伝子セットスコアを表す。図４０Ａでは、遺伝子セットの遺伝子セットスコア「Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ」が高いほど、Ｔｒｅｇ細胞表現型の増加を示し、遺伝子セットの遺伝子セットスコア「Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ」が低いほど、Ｔｅｆｆ細胞表現型の増加を示す。図４０Ｂでは、遺伝子セットの遺伝子セットスコア「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ  ｕｐ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」が高いほど、後期メモリーＴ細胞表現型の増加を示し、遺伝子セットの遺伝子セットスコア「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ  ｕｐ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」が低いほど、早期メモリーＴ細胞表現型の増加を示す。図４０Ｃでは、遺伝子セットの遺伝子セットスコア「Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＮ」が高いほど、エフェクターメモリーＴ細胞表現型の増加を示し、遺伝子セットの遺伝子セットスコア「Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＮ」が低いほど、ナイーブＴ細胞表現型の増加を示す。早期メモリー、低分化Ｔ細胞状態にあるクラスター１及びクラスター２の細胞と比べて、クラスター３の細胞は、後期メモリー、より分化したＴ細胞状態にあることがわかる。クラスター０は、中間Ｔ細胞状態にあると考えられる。総合すると、このデータは、インプット細胞に相当レベルの不均質性があることを示している。
【図４０−２】（上記の通り。）
【図４０−３】（上記の通り。）
【図４１−１】図４１：ＴＣＲシーケンシング及びクロノタイプ多様性の測定。第９日細胞は、クロノタイプ頻度のより平坦な分布（高い多様性）を有する。
【図４１−２】（上記の通り。）
【図４１−３】（上記の通り。）
【図４２】再発性及び／又は難治性多発性骨髄腫を有する成人患者でのＡＲＭプロセスを用いて製造されたＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞を試験する第Ｉ相臨床試験の計画を示すフローチャートである。
【図４３】２つの異なる濃度（３０μＭ及び１００μＭ）のＡＺＴの存在又は非存在下において、ウイルス添加後の様々な収集時点でのＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現についてのＦＡＣＳ解析を示すグラフである。レンチウイルスベクターは、活性化及び細胞接種時のＡＺＴ処理前に１時間遅く添加した。
【図４４−１】図４４：解凍時（図４４Ａ）及び解凍後４８ｈのＣＡＲ発現についてのＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの評価並びに解凍後４８ｈ産物のＣＣＲ７／ＣＤ４５ＲＯマーカー、さらにＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの第９日の評価を示すグラフである（図４４Ｂ）。示されるデータは、２つのドナー由来のＴ細胞を用いて実施された２つの実験からの代表的なものである。
【図４４−２】（上記の通り。）
【図４４−３】（上記の通り。）
【図４５】細胞培養上清中のサイトカイン濃度を示すグラフである。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ及びＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ並びに代表的なＵＴＤをＫＭＳ−１１と共培養した。２４ｈ後に上清を収集した。示されるデータは、２つのドナー由来のＴ細胞を用いて実施された２つの実験からの代表的なものである。
【図４６】ＡＲＭ−ＢＣＭＡを検定するための異種移植有効性試験の概略を示すグラフである。
【図４７】異種移植モデルにおけるＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの有効性をＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲのそれと比較するグラフである。ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を発現するＭＭ細胞株ＫＭＳ１１を注射した。腫瘍負荷は、総身体発光（ｐ／ｓ）として表され、平均腫瘍負荷＋ＳＥＭとして示される。腫瘍接種後第８日にそれぞれの用量（生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞の数）のＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ又はＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲでマウスを処置した。ビヒクル（ＰＢＳ）及びＵＴＤ  Ｔ細胞は、陰性対照として使用した。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（１ｅ４  細胞）、ＰＢＳ及びＵＴＤ群の場合のＮ＝４を除き、全ての群についてＮ＝５マウスであった。
【図４８−１】図４８：ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ又はＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲで処置したマウスの血漿ＩＦＮ−γ動態を示すグラフである。それぞれのＣＡＲ−Ｔ用量のＵＴＤ、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ又はＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲで処置した、ＫＭＳ１１−ｌｕｃ腫瘍担持マウスの血漿ＩＦＮ−γレベル。ＩＦＮ−γレベル、全て平均±ＳＥＭとして示される。マウスを採血し、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイにより血漿サイトカインを測定した。
【図４８−２】（上記の通り。）
【図４８−３】（上記の通り。）
【図４９】インビボでのＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ及びＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの細胞動態を示すグラフである。異なる用量においてＴＭ  ＵＴＤ、ＡＲＭ  ＵＴＤ、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ及びＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲで処置したＫＭＳ１１腫瘍担持マウスの末梢血の細胞動態。細胞数は平均細胞数＋ＳＤとして表す。腫瘍接種後第８日にそれぞれの用量（生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞の数）のＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ又はＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲでマウスを処置した。ビヒクル（ＰＢＳ）及びＵＴＤ  Ｔ細胞は、陰性対照として使用した。ＣＡＲ−Ｔ注射から７、１４及び２１日後に血液サンプルを採取し、計画された時点でフローサイトメトリーにより解析した。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（１ｅ４  細胞）、ＰＢＳ及びＵＴＤ群の場合のＮ＝４を除き、全ての群についてＮ＝５マウスであった。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
【００７２】
用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１つ又は１つより多い（すなわち少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味する。
【００７３】
用語「約」は、量、時間的な継続期間などの計測可能な値を参照するとき、指定される値から±２０％又は一部の例では±１０％、又は一部の例では±５％、又は一部の例では±１％、又は一部の例では±０．１％の変動が、かかる変動が本開示の方法の実施に適切であるものとして包含されることを意味する。
【００７４】
本発明の組成物及び方法は、指定された配列を有するポリペプチド及び核酸又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも８５％、９０％若しくは９５％以上同一の配列を包含する。アミノ酸配列に関連して、用語「実質的に同一の」は、本明細書において、第１及び第２アミノ酸配列が共通の構造ドメイン及び／若しくは共通の機能活性を有し得るように、第２アミノ酸配列内のアラインメントされたアミノ酸残基とｉ）同一であるか、又はｉｉ）その保存的置換である十分な若しくは最小数のアミノ酸残基を含有する第１アミノ酸配列、例えば参照配列、例えば本明細書に記載の配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含有するアミノ酸配列を指すために使用される。
【００７５】
ヌクレオチド配列に関連して、用語「実質的に同一の」は、本明細書において、第１及び第２ヌクレオチド配列が共通の機能活性を有するポリペプチドをコードするか、又は共通の構造ポリペプチドドメイン若しくは共通の機能性ポリペプチド活性をコードするように、第２核酸配列内のアラインメントされたヌクレオチドと同一である十分な若しくは最小数のヌクレオチドを含有する第１核酸配列、例えば参照配列、例えば本明細書に記載の配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を指すために使用される。
【００７６】
用語「変異体」は、参照アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、又は実質的に同一のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを指す。一部の実施形態では、変異体は、機能性変異体である。
【００７７】
用語「機能性変異体」は、参照アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、又は実質的に同一のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドで、参照アミノ酸配列の１つ以上の活性を有し得るポリペプチドを指す。
【００７８】
用語サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１又はＩＬ−６）は、完全長の天然に存在するサイトカイン、断片又は変異体、例えば機能性変異体（天然に存在するサイトカインの活性、例えば免疫調節活性の少なくとも１０％、３０％、５０％若しくは８０％を有するその断片及び機能性変異体を含む）を包含する。一部の実施形態では、サイトカインは、天然に存在するサイトカインと実質的に同一（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性）であるか、又はサイトカインをコードする天然に存在するヌクレオチド配列と実質的に同一（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性）であるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、文脈から理解される通り、サイトカインは、受容体ドメイン、例えばサイトカイン受容体ドメイン（例えば、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ）をさらに含む。
【００７９】
用語「キメラ抗原受容体」又は代替的に「ＣＡＲ」は、下に定義されるような、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称する）を含む組換えポリペプチド構築物を指す。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチド構築物中のドメインは、同じポリペプチド鎖内に例えばキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチド構築物内のドメインは、互いに隣接しておらず、例えば異なるポリペプチド鎖内、例えば本明細書に記載される通りＲＣＡＲ内に提供される。
【００８０】
一部の実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。一部の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、下に定義するような少なくとも１つの共刺激分子由来の１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、共刺激分子は、４１ＢＢ（すなわちＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ及び／又はＣＤ２８から選択される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン及び刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン並びに共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン並びに１つ以上の共刺激分子由来の２つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン並びに１つ以上の共刺激分子由来の少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意選択のリーダー配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインのＮ末端のリーダー配列をさらに含み、このリーダー配列は、細胞プロセシング及びＣＡＲの細胞膜への局在化中に抗原認識ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から任意選択により切断される。
【００８１】
本明細書に記載のものなどの特定の腫瘍抗原Ｘ（Ｘは、本明細書に記載されるような腫瘍マーカーであり得る）を標的とする抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体又はＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα結合ドメイン若しくはＴＣＲβ結合ドメイン））を含むＣＡＲは、ＸＣＡＲとも称される。例えば、ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、ＢＣＭＡ  ＣＡＲと称される。ＣＡＲは、任意の細胞、例えば本明細書に記載される免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞）に発現され得る。
【００８２】
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、セカンドメッセンジャーを生成することにより、又はそのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、特定されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために細胞内で情報を伝達することにより作用するタンパク質の機能的部分を指す。
【００８３】
用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質又はポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル、多重鎖又は単鎖又はインタクトな免疫グロブリンであり得、及び天然の供給源又は組換え供給源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
【００８４】
用語「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の少なくとも一部又はその組換え変異体を指し、また標的、例えば抗原に対し、抗体フラグメントの認識及び特異的結合を付与する上で十分な抗原結合ドメイン、例えばインタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、線形抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（ＶＬ又はＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン並びにヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つ以上、例えば２つのＦａｂフラグメント又は連結された抗体の２つ以上、例えば２つの単離ＣＤＲ若しくは他のエピトープフラグメントを含む二価フラグメントなどの抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含むが、これらに限定されない。抗体フラグメントは、シングルドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖにも取り込まれ得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６，２００５を参照されたい）。抗体フラグメントは、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドをベースとする足場にもグラフトされ得る（フィブロネクチンポリペプチドミニボディについて記載している米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントと、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントとを含む融合タンパク質を指し、軽鎖及び重鎖可変領域は、短い可動性ポリペプチドリンカーによって近接して連結されており、単鎖ポリペプチドとして発現することが可能であり、及びｓｃＦｖは、その由来であるインタクトな抗体の特異性を保持している。指定されない限り、本明細書で使用されるとき、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域を例えばポリペプチドのＮ端側及びＣ端側末端に対していずれの順序でも有し得、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含み得るか又はＶＨ−リンカー−ＶＬを含み得る。
【００８５】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨ又はＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨの構造を含み得る。
【００８６】
本明細書で使用される「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性及び結合親和性を与える抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。例えば、一般に、各重鎖可変領域（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）には３つのＣＤＲがあり、各軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）には３つのＣＤＲがある。ある所与のＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）により記載のもの又はその組み合わせを含む、多くの周知のスキームのいずれかを使用して決定できる。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａを組み合わせた番号付けスキームでは、一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの一部、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの一部又はその両方であるアミノ酸残基に対応する。
【００８７】
抗体又はその抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲ組成物の部分は、種々の形態で存在し得、例えば、ここで、抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）又は例えばヒト型若しくはヒト化抗体を含め、ポリペプチド鎖の一部として発現する（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、用語「結合ドメイン」又は「抗体分子」（本明細書では「抗標的結合ドメイン」とも称される）は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン鎖又はそのフラグメントを指す。用語「結合ドメイン」又は「抗体分子」は、抗体及び抗体フラグメントを包含する。一部の実施形態では、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、これは、複数個の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、複数のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対して特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。
【００８９】
用語「二重特異性抗体」及び「複数の二重特異性抗体」は、単一分子内の２つの抗体の抗原結合部位を結合させる分子を指す。従って、二重特異性抗体は、同時又は順次２つの異なる抗体に結合することができる。二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。２つの抗体を結合させる様々なフォーマットも当技術分野で公知である。本発明の二重特異性抗体の形態としては、当業者には周知のように、ダイアボディ、単鎖抗体、Ｆａｂ二量体化（Ｆａｂ−Ｆａｂ）、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ及びタンデム抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
用語「抗体重鎖」は、その天然に存在するコンホメーションで抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の大きい方を指し、通常、これが抗体の属するクラスを決定する。
【００９１】
用語「抗体軽鎖」は、その天然に存在するコンホメーションで抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の小さい方を指す。カッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖が２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【００９２】
用語「組換え抗体」は、例えば、バクテリオファージ又は酵母発現システムによって発現される抗体など、組換えＤＮＡ技術を用いて作成される抗体を指す。この用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子であって、抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子又はその抗体を指定するアミノ酸配列の合成によって作成された抗体を意味するとも解釈されるべきであり、ＤＮＡ又はアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能な周知の組換えＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を用いて得られたものである。
【００９３】
用語「抗原」又は「Ａｇ」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答には、抗体産生又は特異的免疫適格細胞の活性化のいずれか又は両方が含まれ得る。当業者は、任意の巨大分子が、事実上あらゆるタンパク質又はペプチドを含め、抗原となり得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、従って、免疫応答を生じさせるタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、その用語が本明細書において使用される通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原がある遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明には、限定されないが、２つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用が含まれること、及びそれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を生じさせるポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配列されることが容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、合成して作成され得るか、又は生体試料から得られ得るか、又はポリペプチド以外の巨大分子である可能性もあることが容易に明らかである。かかる生体試料には、限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞又は体液が他の生物学的成分と共に含まれ得る。
【００９４】
用語「抗腫瘍効果」及び「抗癌効果」は、互換的に使用され、限定されないが、例えば腫瘍体積若しくは癌体積の減少、腫瘍細胞若しくは癌細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の増加、腫瘍細胞増殖若しくは癌細胞増殖の低減、腫瘍細胞生存若しくは癌細胞生存の低減又は癌性病態に関連する多様な生理学的症状の改善を含む様々な手段によって現れ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」又は「抗癌効果」は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体が腫瘍又は癌の発生を予防する能力によってもまず現れ得る。
【００９５】
用語「自己」は、同じ個体に由来する任意の材料であって、後にその個体に再導入されることになる材料を指す。
【００９６】
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系であると言われる。一部の実施形態において、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。
【００９７】
用語「異種」は、異なる種の動物に由来するグラフトを指す。
【００９８】
本明細書で使用される用語「アフェレーシス」は、ドナー又は患者の血液をドナー又は患者から採取して、選択した特定の成分を分離する装置に通過させた後、例えば再輸血によって残りをドナー又は患者に戻すという、当技術分野で承認されている体外処置を指す。従って、「アフェレーシスサンプル」に関連して、アフェレーシスを用いて得られたサンプルを指す。
【００９９】
用語「癌」は、異常細胞の急速且つ無制御の成長によって特徴付けられる疾患を指す。癌細胞は、局所的に又は血流及びリンパ系を通じて体の他の部位に広がり得る。様々な癌の例が本明細書に記載され、限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法で処置される癌は、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫を含む。
【０１００】
用語「腫瘍」及び「癌」は、本明細書では同義的に使用され、例えば、両方の用語とも固形及び液性、例えばびまん性又は循環性腫瘍を包含する。本明細書で使用されるとき、用語「癌」又は「腫瘍」は、前癌性並びに悪性の癌及び腫瘍を含む。
【０１０１】
「由来する」は、この用語が本明細書で使用される場合、第１の分子と第２の分子との間の関係を指す。これは、概して、第１の分子と第２の分子との間の構造的類似性に言及するものであり、第２の分子に由来する第１の分子に関する方法又は供給源を限定することを含意又は包含しない。例えば、ＣＤ３ζ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、求められる機能、すなわち適切な条件下でシグナルを生成する能力を有するような十分なＣＤ３ζ構造を保持している。これは、細胞内シグナル伝達ドメインの特定の作製方法に限定することを含意又は包含せず、例えば細胞内シグナル伝達ドメインを提供するためにＣＤ３ζ配列で開始して不要な配列を欠失させるか、又は変異を付与して細胞内シグナル伝達ドメインに至らせなければならないことを意味しない。
【０１０２】
用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含む抗体又は抗体フラグメントの結合特性が大きい影響又は変化を被ることのないアミノ酸改変を指す。かかる保存的改変には、アミノ酸置換、付加及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発など、当技術分野において公知の標準技法によって本発明の抗体又は抗体フラグメントに導入することができる。保存的置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、本発明のＣＡＲ内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に置き換えることができ、及び変化したＣＡＲは、本明細書に記載される機能アッセイを用いて試験することができる。
【０１０３】
刺激及び／又は共刺激分子による刺激に関連して、用語「刺激」は、刺激性分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）及び／又は共刺激分子（例えば、Ｃ２８若しくは４−１ＢＢ）とその同族のリガンドとの結合によって誘導される応答、例えば一次若しくは二次応答を指し、それにより、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介する。刺激は、特定の分子の発現変化及び／又は細胞骨格構造の再組織化などを媒介することができる。
【０１０４】
用語「刺激性分子」は、Ｔ細胞によって発現され、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様について、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を提供する分子を指す。一部の実施形態では、ＣＡＲ内のＩＴＡＭ含有ドメインは、内因性ＴＣＲ複合体とは独立に一次ＴＣＲのシグナル伝達を反復する。一部の実施形態では、一次シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、ペプチドを載せたＭＨＣ分子との結合により開始される一次シグナルであり、これは、限定されないが、増殖、活性化、分化などを含むＴ細胞応答の媒介をもたらす。刺激性様式で作用する初代細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有初代細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても知られる）、ＦｃεＲＩ及びＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２由来のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。本発明の具体的なＣＡＲにおいて、本発明の任意の１つ以上のＣＡＲＳの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えばＣＤ３−ζの一次シグナル伝達配列を含む。用語「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」は、その表面上に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を提示するアクセサリー細胞などの免疫系細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）を指す。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこうした複合体を認識し得る。ＡＰＣは、抗原をプロセシングしてそれをＴ細胞に提示する。
【０１０５】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、分子の細胞内部分を指す。実施形態において、細胞内シグナルドメインは、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に特殊な機能を果たすよう指示する。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された一部を使用する範囲内で、このような切断された一部を、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全鎖の代わりに使用し得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、そのため、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断された一部を含むことを意図する。
【０１０６】
細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えばＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、ＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能の例として、細胞溶解活性及びサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性が挙げられる。
【０１０７】
一部の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激又は抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。一部の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナル又は抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインがＴ細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、及び共刺激細胞内シグナル伝達ドメインが共受容体又は共刺激分子からの細胞質配列を含むことができる。
【０１０８】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例には、限定されないが、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても知られる）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれる。
【０１０９】
用語「ζ」若しくは代替的に「ζ鎖」、「ＣＤ３−ζ」又は「ＴＣＲ−ζ」は、ＣＤ２４７を指す。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２０９６３は、例示的なヒトＣＤ３ζアミノ酸配列を提供する。「ζ刺激ドメイン」若しくは代替的に「ＣＤ３−ζ刺激ドメイン」又は「ＴＣＲ−ζ刺激ドメイン」は、ＣＤ３ζ又はその変異体（例えば、突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入若しくは欠失を有する分子）の刺激ドメインを指す。一部の実施形態では、ζの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２〜１６４又はその変異体（例えば、突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入若しくは欠失を有する分子）を含む。一部の実施形態では、「ζ刺激ドメイン」又は「ＣＤ３−ζ刺激ドメイン」は、配列番号９若しくは１０として提供される配列又はその変異体（例えば、突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入若しくは欠失を有する分子）である。
【０１１０】
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、Ｔ細胞の、限定されないが、増殖などによる共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２８−ＯＸ４０、ＣＤ２８−４−１ＢＢ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分を指す。
【０１１２】
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体若しくは天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体又はその機能的フラグメントを含み得る。
【０１１３】
用語「４−１ＢＢ」は、ＣＤＲ１３７又は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９を指す。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２０９６３は、例示的なヒト４−１ＢＢアミノ酸配列を提供する。「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、４−１ＢＢの共刺激ドメイン又はその変異体（例えば、突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入若しくは欠失を有する分子）を指す。一部の実施形態では、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号７として提供される配列又はその変異体（例えば、突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入若しくは欠失を有する分子）である。
【０１１４】
「免疫エフェクター細胞」は、その用語が本明細書で使用される場合、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例には、Ｔ細胞、例えばα／βＴ細胞及びγ／δＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞及び骨髄球由来食細胞が含まれる。
【０１１５】
「免疫エフェクター機能又は免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書で使用されるとき、標的細胞の免疫攻撃を亢進させる又は促進する例えば免疫エフェクター細胞の機能又は応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能又は応答は、標的細胞の死滅又は成長若しくは増殖阻害を促進するＴ細胞又はＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞の場合、一次刺激及び共刺激が免疫エフェクター機能又は応答の例である。
【０１１６】
用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
【０１１７】
用語「コードする」は、定義付けられたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は定義付けられたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的過程における他のポリマー及び巨大分子の合成の鋳型としての役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチド内の特異的ヌクレオチド配列の固有の特性及びそれによってもたらされる生物学的特性を指す。従って、遺伝子、ｃＤＮＡ又はＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞又は他の生体系のタンパク質が産生される場合にタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一の且つ通常配列表に提供されるものであるコード鎖及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写鋳型として使用される非コード鎖の両方は、その遺伝子のｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると称することができる。
【０１１８】
特記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の全てを含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句には、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかのバージョンで１つ又は複数のイントロンを含み得る限りにおいて、イントロンも含まれ得る。
【０１１９】
用語「有効量」又は「治療有効量」は、本明細書において互換的に使用され、特定の生物学的結果を達成する上で有効である、本明細書に記載の化合物、製剤、材料若しくは組成物の量を指す。
【０１２０】
「内因性」という用語は、生物体、細胞、組織若しくは系からの又はその内部で生成された任意の物質を指す。
【０１２１】
用語「外因性」は、生物、細胞、組織又は系の外側から導入されるか又はその外側で産生される任意の材料を指す。
【０１２２】
用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を指す。一部の実施形態では、発現は、細胞に導入されたｍＲＮＡの翻訳を含む。
【０１２３】
用語「トランスファーベクター」は、単離核酸を含む組成物であって、細胞内部への単離核酸の送達に使用し得る組成物を指す。当技術分野では、限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含め、多くのベクターが公知である。従って、用語「トランスファーベクター」には自己複製プラスミド又はウイルスが含まれる。この用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸のトランスファーを促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物もさらに含むものと解釈されなければならない。ウイルストランスファーベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
【０１２４】
用語「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、他の発現用エレメントは、宿主細胞によって供給されるか、又はインビトロ発現系に供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド又はリポソームに含まれる）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含め、当技術分野において公知のもの全てが含まれる。
【０１２５】
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させることができる点でレトロウイルスの中でユニークであり、レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡに多量の遺伝情報を送達することができ、そのため、遺伝子デリバリーベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
【０１２６】
用語「レンチウイルスベクター」は、特に、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に提供される通りの自己不活性化レンチウイルスベクターを含め、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。臨床で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例としては、限定されないが、例えばＯｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子デリバリー技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどが挙げられる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に公知であろう。
【０１２７】
用語「相同」又は「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子など、２つの核酸分子間又は２つのポリペプチド分子間におけるサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占有されるとき、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占有される場合、それらは、その位置で相同又は同一である。２つの配列間の相同性は、一致する位置又は相同な位置の数の直接の関数である。例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５個の位置）が相同である場合、それらの２つの配列は、５０％相同である。位置の９０％（例えば、１０個中９個）が一致するか又は相同である場合、それらの２つの配列は、９０％相同である。
【０１２８】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は他の抗原結合部分配列など）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体及びその抗体フラグメントは、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体又は抗体フラグメント）においてレシピエントの相補決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基に置き換えられているものである。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも、移入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。これらの改変は抗体又は抗体フラグメントの性能をさらに精緻化及び最適化し得る。一般に、ヒト化抗体又はその抗体フラグメントは、少なくとも１つ及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、及びＦＲ領域の全て又は大部分がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体又は抗体フラグメントは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含むことができる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２を参照されたい。
【０１２９】
「完全にヒト」は、分子全体がヒト起源であるか、又はヒト形態の抗体又は免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなる抗体又は抗体フラグメントなどの免疫グロブリンを指す。
【０１３０】
用語「単離されている」は、自然状態から改変されているか又は取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸又はペプチドは、「単離されている」のではないが、その自然状態の共存する材料から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは、「単離されている」。単離核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができるか、又は例えば宿主細胞など、非天然環境中に存在することができる。
【０１３１】
本発明との関連において、一般的に存在する核酸塩基に関して以下の略称が使用される。「Ａ」は、アデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、及び「Ｕ」は、ウリジンを指す。
【０１３２】
用語「作動可能に連結された」又は「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列との間における後者の発現をもたらす機能的な連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関係した状態に置かれているとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、互いに連続し得、例えば２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。
【０１３３】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、又は胸骨内注射、腫瘍内、又は輸注技法を含む。
【０１３４】
用語「核酸」、「核酸分子」、「ポリペプチド」又は「ポリヌクレオチド分子」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、且つ天然に存在するヌクレオチドと同じように代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸が包含される。一部の実施形態では、「核酸」、「核酸分子」、「ポリペプチド」又は「ポリヌクレオチド分子」は、ヌクレオチド／ヌクレオシド誘導体又は類似体を含む。別に指示のない限り、特定の核酸配列は、黙示的に、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換、例えば保存的置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ及び相補配列並びに明示的に指示される配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換、例えば保存的置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成し得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０１３５】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列又はペプチドの配列を含むことのできるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合によってつなぎ合わされた２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、この用語は、当技術分野では一般に例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短鎖と、当技術分野では概してタンパク質と称される、多数の種類があるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド又はこれらの組み合わせが含まれる。
【０１３６】
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要である、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
【０１３７】
用語「プロモーター／調節配列」は、そのプロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の例では、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の例では、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントも含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであり得る。
【０１３８】
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、細胞のほとんど又は全ての生理条件下で細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
【０１３９】
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的にプロモーターに対応する誘発物質が細胞に存在する場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
【０１４０】
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするか又はそれによって指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
【０１４１】
用語「癌関連抗原」、「腫瘍抗原」、「過剰増殖性障害抗原」及び「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、互換的に、特定の過剰増殖性障害に共通の抗原を指す。一部の実施形態では、これらの用語は、癌細胞の表面上に、完全に又はフラグメント（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として、発現する分子（典型的にはタンパク質、炭水化物若しくは脂質）であって、癌細胞に対する薬理学的薬剤の優先的な標的化に有用な分子を指す。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、正常細胞及び癌細胞の両方が発現するマーカー、例えば系列マーカー、例えばＢ細胞上のＣＤ１９である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞と比べて癌細胞で過剰発現（例えば、正常細胞と比べて１倍の過剰発現、２倍の過剰発現、３倍以上の過剰発現）する細胞表面分子である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、癌細胞で不適切に合成される細胞表面分子、例えば正常細胞に発現する分子と比べて欠失、付加又は変異を含む分子である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、癌細胞の細胞表面にのみ、完全に又はフラグメント（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現することになり、正常細胞の表面には合成されないか又は発現しない。一部の実施形態では、本発明の過剰増殖性障害抗原は、原発性若しくは転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌並びに乳癌、前立腺癌（例えば、去勢抵抗性若しくは治療抵抗性前立腺癌又は転移性前立腺癌）、卵巣癌、膵臓癌など、又は形質細胞増殖性障害、例えば無症候性骨髄腫（くすぶり型多発性骨髄腫若しくは無症候性骨髄腫）、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、形質細胞腫（例えば、プラズマ細胞増殖症、孤立性骨髄腫、孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫及び多発性形質細胞腫）、全身性軽鎖アミロイドーシス及びＰＯＥＭＳ症候群（また、クロウ・深瀬症候群、高月病（Ｔａｋａｔｓｕｋｉ  ｄｉｓｅａｓｅ）及びＰＥＰ症候群としても知られる）に由来する。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体フラグメント）を含むＣＡＲを含む。通常、内因性タンパク質に由来するペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のポケットに嵌まり、ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、あらゆる有核細胞によって構成的に発現される。癌では、ウイルス特異的及び／又は腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体が免疫療法用のユニークなクラスの細胞表面標的となる。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ１又はＨＬＡ−Ａ２のコンテクストでウイルス又は腫瘍抗原由来のペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体が記載されている（例えば、Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１１  ８５（５）：１９３５−１９４２；Ｓｅｒｇｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１１  １１７（１６）：４２６２−４２７２；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０  １８４（４）：２１５６−２１６５；Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００１  ８（２１）：１６０１−１６０８；Ｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１３  ５（１７６）：１７６ｒａ３３；Ｔａｓｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１２  １９（２）：８４−１００を参照されたい）。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリなど、ライブラリーのスクリーニングによって同定することができる。
【０１４２】
用語「腫瘍支持抗原」又は「癌支持抗原」は、互換的に、それ自体癌性ではない細胞の表面に発現するが、例えばそれらの増殖若しくは生存、例えば免疫細胞に対する抵抗性を促進することによって癌細胞を支持する分子（典型的にはタンパク質、炭水化物若しくは脂質）を指す。このタイプの例示的な細胞として、間質細胞及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）が挙げられる。腫瘍支持抗原自体は、癌細胞を支持する細胞に抗原が存在する限り、腫瘍細胞を支持する役割を果たす必要はない。
【０１４３】
用語「可動性ポリペプチドリンカー」又は「リンカー」は、ｓｃＦｖとの関連で使用されるとき、可変重鎖領域と可変軽鎖領域とを共に連結するために単独又は組み合わせで使用されるグリシン及び／又はセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一部の実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、１以上の正の整数、例えばｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５及びｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０である）（配列番号４１）を含む。一部の実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーには、限定されないが、（Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ）４（配列番号２７）又は（Ｇｌｙ４  Ｓｅｒ）３（配列番号２８）が含まれる。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）又は（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）（配列番号２５）の複数の繰り返しを含む。また、国際公開第２０１２／１３８４７５号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるリンカーも本発明の範囲内に含まれる。
【０１４４】
本明細書で使用されるとき、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップ又はＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも称される）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「前」又は５’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、１番目の転写ヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びＲＮアーゼからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結び付いており、それぞれが他方に影響を与えるようにして同時転写的に起こる。転写開始直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端に、ＲＮＡポリメラーゼに関連するキャップ合成複合体が結合する。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡのその安定性又は翻訳効率などの機能を調整するために改変することができる。
【０１４５】
本明細書で使用されるとき、「インビトロ転写ＲＮＡ」は、インビトロ合成されたＲＮＡを指す。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。概して、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから作成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの作成に使用される鋳型を含む。
【０１４６】
本明細書で使用されるとき、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに結合される一連のアデノシンである。一過性発現用の構築物の一部の実施形態において、ポリ（Ａ）は、５０〜５０００である。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）は、６４より多い。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）は、１００より多い。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）は、３００より多い。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）は、４００より多い。ポリ（Ａ）配列は、局在性、安定性又は翻訳効率などのｍＲＮＡ機能を調整するために化学的又は酵素的に改変することができる。
【０１４７】
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポリアデニリル部分又はその改変変異体の共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってｍＲＮＡ前駆体に付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列（多くの場合に数百個）である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ（Ａ）テール及びそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するのに役立つ。ポリアデニル化は、転写終結、ｍＲＮＡの核外移行及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写直後に核内で起こるが、さらに後に細胞質でも起こり得る。転写が終結した後、ＲＮＡポリメラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用によってｍＲＮＡ鎖が切断される。切断部位は、通常、切断部位近傍の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位の遊離３’末端にアデノシン残基が付加される。
【０１４８】
本明細書で使用されるとき、「一過性」は、数時間、数日間又は数週間の期間にわたる組み込まれないトランス遺伝子の発現を指し、この発現期間は、宿主細胞においてゲノムに組み込まれた場合又は安定プラスミドレプリコン中に含まれている場合の遺伝子の発現期間よりも短い。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、１つ以上の療法（例えば、本発明のＣＡＲなどの１つ以上の療法剤）の投与によってもたらされる増殖性障害の進行、重症度及び／若しくは持続期間の低減若しくは改善又は増殖性障害の１つ以上の症状（好ましくは１つ以上の認識し得る症状）の改善を指す。具体的な実施形態において、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、患者には必ずしも認識できない、腫瘍の増殖などの増殖性障害の少なくとも１つの計測可能な理学的パラメーターの改善を指す。他の実施形態において、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、増殖性障害の進行の物理的な、例えば認識し得る症状の安定化による阻害、生理学的な、例えば理学的パラメーターの安定化による阻害のいずれか又は両方を指す。他の実施形態において、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、腫瘍サイズ又は癌性細胞数の低減又は安定化を指す。
【０１５０】
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。語句「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、且つ細胞の膜を越えてシグナルを伝える能力を有する分子及び分子複合体を含む。
【０１５１】
用語「対象」は、免疫応答を生じさせることのできる生きている生物（例えば、哺乳類、例えばヒト）を含むことが意図される。
【０１５２】
用語の「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞とは、その天然に存在する状態でそれが通常結び付いている他の細胞型と分離されている細胞も指す。一部の例では、実質的に精製された細胞集団とは、均質な細胞集団を指す。他の例では、この用語は、単に、その自然状態でそれが天然に結び付いている細胞から分離されている細胞を指す。一部の実施形態において、これらの細胞は、インビトロで培養される。一部の実施形態において、これら細胞は、インビトロで培養されない。
【０１５３】
本明細書で使用される用語「治療的」とは、処置を意味する。治療効果は、病態の低減、抑制、寛解又は根絶によって達成される。
【０１５４】
本明細書で使用される用語「予防」とは、疾患若しくは病態の予防又は予防的処置を意味する。
【０１５５】
用語「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」は、外因性核酸を宿主細胞に移入させるか又は導入するプロセスを指す。「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換又は形質導入されたものである。細胞には初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
【０１５６】
用語「特異的に結合する」は、試料中に存在するコグネイト結合パートナー（例えば、Ｔ細胞に存在する刺激及び／若しくは共刺激分子）タンパク質を認識して、それと結合するが、試料中の他の分子は実質的に認識しないか又はそれらに結合しない抗体又はリガンドを指す。
【０１５７】
本明細書で使用される「調節可能なキメラ抗原受容体（ＲＣＡＲ）」という用語は、免疫エフェクター細胞中にあるとき、標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性及び細胞内シグナル生成を細胞に賦与する一連のポリペプチド、典型的には最も単純な実施形態では２つのポリペプチドを指す。一部の実施形態では、ＲＣＡＲは、少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン並びにＣＡＲ分子に関連して本明細書で定義されるような刺激分子及び／又は共刺激分子由来の機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞腫シグナル伝達ドメイン（また、本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）を含む。一部の実施形態では、ＲＣＡＲ中のこれら一連のポリペプチドは、互いに隣接しておらず、例えば異なるポリペプチド鎖内にある。一部の実施形態では、ＲＣＡＲは、二量体化スイッチを含み、これは、二量体化分子が存在すると、ポリペプチドを互いに結合させることができ、例えば細胞内シグナル伝達ドメインに抗原結合ドメインを結合させることができる。一部の実施形態では、ＲＣＡＲは、本明細書に記載される細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）、例えばＲＣＡＲ発現細胞（また、「ＲＣＡＲＸ細胞」とも称される）に発現される。一部の実施形態では、ＲＣＡＲＸ細胞は、Ｔ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称される。一部の実施形態では、ＲＣＡＲＸは、ＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称される。ＲＣＡＲは、ＲＣＡＲ発現細胞に、標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性及び調節可能な細胞内シグナル生成若しくは増殖を賦与することができ、これらは、ＲＣＡＲ発現細胞の免疫エフェクター特性を最適化し得る。複数の実施形態では、ＲＣＡＲ細胞は、抗原結合ドメインに結合した抗原を含む標的細胞に対する特異性を取得するために、少なくとも部分的に、抗原結合ドメインに依存する。
【０１５８】
「膜アンカー」又は「膜テザリングドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、細胞外若しくは細胞内ドメインを原形質膜に結合させる上で十分なポリペプチド若しくは部分、例えばミリストイル基を指す。
【０１５９】
「スイッチドメイン」は、この用語が本明細書で例えばＲＣＡＲを指す場合に使用されるとき、二量体化分子の存在下で別のスイッチドメインと結合する実体、典型的には、ポリペプチドベースの実体を指す。この結合により、第１のスイッチドメインに連結、例えば融合した第１の実体と、第２のスイッチドメインに連結、例えば融合した第２の実体との機能性カップリングが起こる。第１及び第２のスイッチドメインは、集合的に二量体化スイッチと呼ばれる。複数の実施形態において、第１及び第２のスイッチドメインは、互いに同じであり、例えば、両者は、同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと呼ばれる。複数の実施形態において、第１及び第２のスイッチドメインは、互いに異なり、例えば、それらは、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと呼ばれる。複数の実施形態において、スイッチは、細胞内である。複数の実施形態では、スイッチは、細胞外である。複数の実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばＦＫＢＰ又はＦＲＢベースであり、二量体化分子は、小分子、例えばラパログである。複数の実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばｍｙｃペプチドに結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子は、ポリペプチド、その断片又はポリペプチドの多量体、例えばｍｙｃリガンド若しくは１つ以上のｍｙｃ  ｓｃＦｖに結合するｍｙｃリガンドの多量体である。複数の実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は、抗体又はその断片、例えばｍｙｃ抗体である。
【０１６０】
「二量体化分子」という用語は、この用語が本明細書で例えばＲＣＡＲを指す場合に使用されるとき、第１のスイッチドメインと第２のスイッチドメインの結合を促進する分子を指す。複数の実施形態において、二量体化分子は、対象に天然に存在しないか、又は有意な二量体化を起こす濃度では存在しない。複数の実施形態では、二量体化分子は、小分子、例えばラパマイシン若しくはラパログ、例えばＲＡＤ００１である。
【０１６１】
用量「低い免疫増強用量」は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えばＲＡＤ００１若しくはラパマイシン又は触媒ｍＴＯＲ阻害剤と一緒に使用されるとき、例えばＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性の阻害により測定される通り、ｍＴＯＲ活性を部分的に、しかし完全にではなく、阻害するｍＴＯＲ阻害剤の用量を指す。例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の阻害によりｍＴＯＲ活性を評価する方法は、本明細書に詳述される。この用量は、完全な免疫抑制をもたらすのに不十分であるが、免疫応答を増強するには十分である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の数の減少及び／若しくはＰＤ−１陰性Ｔ細胞の数の増加又はＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比の増加をもたらす。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、ナイーブＴ細胞の数の増加をもたらす。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、
例えば、メモリーＴ細胞、例えばメモリーＴ細胞前駆体での下記マーカー：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋及びＢＣＬ２の１つ以上の発現の増大；
例えば、メモリーＴ細胞、例えばメモリーＴ細胞前駆体でのＫＬＲＧ１の発現の減少；並びに
例えば、下記の特徴：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増加、ＣＤ１２７ｈｉｇｈの増加、ＣＤ２７＋の増加、ＫＬＲＧ１の減少及びＢＣＬ２の増加のいずれか１つ又はそれらの組み合わせを備えるメモリーＴ細胞前駆体の数の増加
の１つ以上をもたらし、ここで、前述した変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、少なくとも一時的に起こる。
【０１６２】
「難治性」は、本明細書で使用される場合、処置に応答しない疾患、例えば癌を指す。複数の実施形態において、難治性癌は、処置の開始前又は開始時点で処置に抵抗性であり得る。他の実施形態において、難治性癌は、処置中に抵抗性になり得る。難治性癌は、抵抗性癌とも称される。
【０１６３】
本明細書で使用される「再発した」又は「再発」は、改善若しくは応答性期間後、例えばある治療（例えば、癌治療）による以前の処置後の疾患（例えば、癌）の又は癌などの疾患の兆候及び症状の再発又は再出現を指す。初期の応答性期間は、癌細胞のレベルの、ある閾値未満、例えば２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％又は１％未満への低下を含み得る。再出現は、癌細胞のレベルの、ある閾値を越える、例えば２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％又は１％を超える増加を含み得る。例えば、再出現は、例えば、Ｂ−ＡＬＬに関連して、完全応答後の、例えば血液、骨髄（＞５％）又は任意の髄外部位における芽球の再出現を含み得る。これに関連して、完全応答は、＜５％のＢＭ芽球を含み得る。より一般的には、一部の実施形態において、応答（例えば、完全応答又は部分応答）は、検出可能なＭＲＤ（微小残存病変）の非存在を含み得る。一実施形態において、応答性の初期期間は、少なくとも１、２、３、４、５又は６日間；少なくとも１、２、３又は４週間；少なくとも１、２、３、４、６、８、１０又は１２ヶ月間；又は少なくとも１、２、３、４又は５年間続く。
【０１６４】
範囲：本開示全体を通じて、本発明の様々な実施形態が範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での記載は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する確固たる限定と解釈されてはならないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値を有すると考えられなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示される部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６を有すると考えられなければならない。別の例として、９５〜９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するものを含み、及び９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％及び９８〜９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅に関わらず適用される。
【０１６５】
「遺伝子編集システム」は、この用語が本明細書で使用されるとき、前記システムにより標的化されるゲノムＤＮＡの部位若しくはその付近の１つ以上の核酸の改変、例えば欠失を指令し、実行するシステム、例えば１つ以上の分子を指す。遺伝子編集システムは、当技術分野では公知であり、以下により詳しく記載する。
【０１６６】
「組み合わせて」投与されるは、本明細書で使用される場合、疾患による対象の苦痛が継続する過程において２種（以上の）異なる処置が対象に送達されることを意味し、例えば対象が疾患を有すると診断された後且つ疾患が治癒若しくは排除されるか、又は処置が他の理由で中止される前に、２種以上の処置が送達される。一部の実施形態では、１つの処置の送達は、第２の処置の送達が開始するとき依然として続いており、これにより、投与に関して重複が存在する。これは、本明細書において、「同時」又は「同時送達」と呼ばれる場合がある。他の実施形態では、１つの処置の送達は、他の処置の送達が開始する前に終了する。いずれかの場合の一部の実施形態において、処置は、併用投与によってより有効である。例えば、第２の処置の方が有効であり、例えばより少ない第２の処置で同等の効果がみられるか、又は第２の処置は、第１の処置を行わずに第２の処置が投与される場合にみられるものより優れた程度まで症状を軽減するか若しくは第１の処置と類似の状況がみられる。一部の実施形態では、送達は、症状の軽減又は障害に関する他のパラメーターが、一方が他方なしで送達された場合に認められるものより高くなるようにする。２つの処置の効果は、部分的に相加的、完全に相加的であるか又は相加的を上回り得る。送達は、送達される第１の処置の効果が、第２の処置が送達されるときにも依然として検出可能であるようにすることができる。
【０１６７】
本明細書で互換的に使用される「枯渇（欠失）」又は「枯渇する（欠失させる）こと」という用語は、プロセス、例えば選択ステップ、例えばネガティブ選択が実施された後の、サンプル中の細胞、タンパク質若しくは高分子のレベル又は量の減少又は低下を指す。枯渇は、細胞、タンパク質若しくは高分子の完全又は部分的な枯渇であり得る。一部の実施形態において、枯渇は、プロセスが実施される前のサンプル中の細胞、タンパク質若しくは高分子のレベル又は量と比べて、細胞、タンパク質若しくは高分子のレベル又は量の少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の減少又は低下である。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「ナイーブＴ細胞」は、抗原未経験のＴ細胞を指す。一部の実施形態では、抗原未経験Ｔ細胞は、胸腺中でそのコグネイト抗原に遭遇しているが、末梢では遭遇していない。一部の実施形態では、ナイーブＴ細胞は、メモリーＴ細胞の前駆体である。一部の実施形態では、ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の両方を発現するが、ＣＤ４５ＲＯを発現しない。一部の実施形態では、ナイーブＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８及びＣＤ１２７の発現並びにＣＤ９５又はＣＤ４５ＲＯアイソフォームの非存在を特徴とし得る。一部の実施形態では、ナイーブＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＩＬ−７受容体α、ＩＬ−６受容体及びＣＤ１３２を発現するが、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ６９又はＣＤ４５ＲＯを発現しない。一部の実施形態では、ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＤ９５又はＩＬ−２受容体βを発現しない。一部の実施形態では、マーカーの表面発現レベルは、フローサイトメトリーを用いて評価される。
【０１６９】
用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトにおいてＣＤ４５ＲＯ陽性であり、ＣＣＲ７を発現するＴ細胞のサブセットを指す。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ９５を発現する。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及び／又はＩＬ−１５Ｒを発現する。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２受容体β、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌを発現する。一部の実施形態では、マーカーの表面発現レベルは、フローサイトメトリーを用いて評価される。
【０１７０】
用語「ステムメモリーＴ細胞」、「幹細胞メモリーＴ細胞」、「幹細胞様メモリーＴ細胞」、「メモリーステムＴ細胞」、「Ｔメモリー幹細胞」、「Ｔステムセルメモリー細胞」又は「ＴＳＣＭ細胞」は、幹細胞様能力、例えば自己再生する能力並びに／又はメモリー及び／若しくはエフェクターＴ細胞サブセットを再構成する多分化能を備えたメモリーＴ細胞のサブセットを指す。一部の実施形態では、ステムメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２受容体β、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌを発現する。一部の実施形態では、マーカーの表面発現レベルは、フローサイトメトリーを用いて評価される。一部の実施形態では、例示的なステムメモリーＴ細胞は、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１７  Ｊａｎｕａｒｙ  ０６；２３（１）：１８−２７に開示されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
明瞭化の目的で、別に注記されない限り、特定のマーカーを「発現しない」又は「それが存在しない」又は「それについて陰性である」ものとして細胞若しくは細胞の集団を分類するのは、必ずしもマーカーの非存在を意味するわけではない。当業者は、容易に、陽性及び／若しくは陰性対照に対して細胞を比較し、及び／又は所定の閾値を設定し、且つ従来の検出方法を用いて、例えばフローサイトメトリーを用いて、例えば本明細書の実施例に記載されるように、細胞が、所定の閾値に満たない発現レベルを有するか、又は細胞の集団が、所定の閾値に満たない過剰発現レベルを有するとき、マーカーを発現しないか、若しくはマーカーについて陰性であるものとして細胞若しくは細胞の集団を分類することができる。例えば、代表的なゲーティング戦略を図１に示す。例えば、ＣＣＲ７陽性、ＣＤ４５ＲＯ陰性細胞は、図１Ｇの左上象限に示される。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、細胞の「ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）」という用語は、細胞が、幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）表現型に対してエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）表現型を示す程度を表すスコアを指す。より高いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、ＴＥＭ表現型の増加を示すのに対し、より低いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、ＴＳＣＭ表現型の増加を示す。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、ＴＥＭ細胞で上方制御される及び／又はＴＳＣＭで下方制御される１つ以上の遺伝子、例えばＭＸＲＡ７、ＣＬＩＣ１、ＮＡＴ１３、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＧＬＣＣＩ１、ＤＵＳＰ１０、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＣＡＣＮＢ３、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＴＰＲＧ１、ＥＯＭＥＳ、ＭＡＴＫ、ＡＲＨＧＡＰ１０、ＡＤＡＭ８、ＭＡＮ１Ａ１、ＳＬＦＮ１２Ｌ、ＳＨ２Ｄ２Ａ、ＥＩＦ２Ｃ４、ＣＤ５８、ＭＹＯ１Ｆ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＥＲＮ１、ＮＰＣ１、ＮＢＥＡＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＳＹＴＬ２、ＳＬＣ４Ａ４、ＰＩＫ３ＡＰ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＦ、ＰＬＥＫＨＡ５、ＡＤＲＢ２、ＰＬＸＮＤ１、ＧＮＡＯ１、ＴＨＢＳ１、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＣＹＴＨ３、ＫＬＲＦ１、ＦＬＪ１６６８６、ＡＵＴＳ２、ＰＴＰＲＭ、ＧＮＬＹ及びＧＦＰＴ２からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を測定することによって決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、例えば、図３９Ａを参照にして実施例１０に例示される通り、ＲＮＡ−ｓｅｑ、例えば単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を用いて、各細胞について決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均ｌｏｇ正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
【０１７３】
本明細書で使用されるとき、細胞の「ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）」という用語は、細胞が、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）表現型に対して調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を示す程度を表すスコアを指す。より高いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、Ｔｒｅｇ表現型の増加を示すのに対し、より低いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、Ｔｅｆｆ表現型の増加を示す。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、Ｔｒｅｇ細胞で上方制御される及び／又はＴｅｆｆ細胞で下方制御される１つ以上の遺伝子、例えばＣ１２ｏｒｆ７５、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＷＡＰ７０、ＲＧＳ１、ＰＲＲ１１、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＳＨＲ、Ｃ１４ｏｒｆ１４５、ＣＡＳＰ８、ＳＹＴ１１、ＡＣＴＮ４、ＡＮＸＡ５、ＧＬＲＸ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＰＭＣＨ、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１、ＩＬ３２、ＦＡＭ１６０Ｂ１、ＳＨＭＴ２、ＦＲＭＤ４Ｂ、ＣＣＲ３、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＮＴＮＧ２、ＣＬＤＮＤ１、ＢＡＲＤ１、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＴＹＭＳ、ＡＴＰ１Ｂ１、ＧＪＢ６、ＦＧＬ２、ＴＫ１、ＳＬＣ２Ａ８、ＣＤＫＮ２Ａ、ＳＫＡＰ２、ＧＰＲ５５、ＣＤＣＡ７、Ｓ１００Ａ４、ＧＤＰＤ５、ＰＭＡＩＰ１、ＡＣＯＴ９、ＣＥＰ５５、ＳＧＭＳ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＫＡＰ２、ＨＤＡＣ９、ＩＫＺＦ４、ＣＡＲＤ１７、ＶＡＶ３、ＯＢＦＣ２Ａ、ＩＴＧＢ１、ＣＩＩＴＡ、ＳＥＴＤ７、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＣＣＲ１０、ＫＩＡＡ０１０１、ＳＬＣ１４Ａ１、ＰＴＴＧ３Ｐ、ＤＵＳＰ１０、ＦＡＭ１６４Ａ、ＰＹＨＩＮ１、ＭＹＯ１Ｆ、ＳＬＣ１Ａ４、ＭＹＢＬ２、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＣＣＲ５、ＳＴ８ＳＩＡ６、ＴＯＸ、ＢＦＳＰ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、ＮＣＡＰＨ、ＨＬＡ−ＤＰＢ２、ＳＹＴ４、ＮＩＮＪ２、ＦＡＭ４６Ｃ、ＣＣＲ４、ＧＢＰ５、Ｃ１５ｏｒｆ５３、ＬＭＣＤ１、ＭＫＩ６７、ＮＵＳＡＰ１、ＰＤＥ４Ａ、Ｅ２Ｆ２、ＣＤ５８、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＬＯＣ１００１８８９４９、ＦＡＳ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＳＥＬＰ、ＷＥＥ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＦＣＲＬ１、ＩＣＡ１、ＣＮＴＮＡＰ１、ＯＡＳ１、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＣＣＲ６、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＡＮＸＡ２Ｐ３、ＳＴＡＭ、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＡＮＸＡ２、ＰＩ１６、ＤＵＳＰ４、ＬＡＹＮ、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＰＴＰＬＡ、ＡＮＸＡ２Ｐ１、ＺＮＦ３６５、ＬＡＩＲ２、ＬＯＣ５４１４７１、ＲＡＳＧＲＰ４、ＢＣＡＳ１、ＵＴＳ２、ＭＩＡＴ、ＰＲＤＭ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＦＡＭ１２９Ａ、ＨＰＧＤ、ＮＣＦ４、ＬＧＡＬＳ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＪＡＫＭＩＰ１、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＩＫＺＦ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＦＡＮＫ１、ＲＴＫＮ２、ＴＲＩＢ１、ＦＣＲＬ３及びＦＯＸＰ３からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を測定することによって決定される。一部の実施形態において、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、例えば、図３９Ｂを参照にして実施例１０に例示される通り、ＲＮＡ−ｓｅｑ、例えば単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を用いて決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ）は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均ｌｏｇ正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
【０１７４】
本明細書で使用されるとき、細胞の「ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」という用語は、細胞が、幹細胞性表現型を示す程度を表すスコアを指す。より低いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）は、幹細胞性表現型の増加を示す。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）は、造血幹細胞中で下方制御されるのに対して、分化幹細胞中で上方制御される１つ以上の遺伝子、例えばＡＣＥ、ＢＡＴＦ、ＣＤＫ６、ＣＨＤ２、ＥＲＣＣ２、ＨＯＸＢ４、ＭＥＯＸ１、ＳＦＲＰ１、ＳＰ７、ＳＲＦ、ＴＡＬ１及びＸＲＣＣ５からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を測定することにより測定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）は、例えば、図３９Ｃを参照にして実施例１０に例示される通り、ＲＮＡ−ｓｅｑ、例えば単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を用いて決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ）は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均ｌｏｇ正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
【０１７５】
本明細書で使用されるとき、細胞の「ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（ＵＰ  ｈｙｐｏｘｉａ）」という用語は、細胞が低酸素表現型を示す程度を表すスコアを示す。より高いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（ＵＰ  ｈｙｐｏｘｉａ）は、低酸素表現型の増加を示す。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（ＵＰ  ｈｙｐｏｘｉａ）は、低酸素を被っている細胞において上方制御される１つ以上の遺伝子、例えばＡＢＣＢ１、ＡＣＡＴ１、ＡＤＭ、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＡＫ２、ＡＫ３、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＡＬＤＯＡ、ＡＬＤＯＣ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＸＡ１、ＡＮＸＡ２、ＡＮＸＡ５、ＡＲＨＧＡＰ５、ＡＲＳＥ、ＡＲＴ１、ＢＡＣＥ２、ＢＡＴＦ３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＨＬＨＥ４０、ＢＨＬＨＥ４１、ＢＩＫ、ＢＩＲＣ２、ＢＮＩＰ３、ＢＮＩＰ３Ｌ、ＢＰＩ、ＢＴＧ１、Ｃ１１ｏｒｆ２、Ｃ７ｏｒｆ６８、ＣＡ１２、ＣＡ９、ＣＡＬＤ１、ＣＣＮＧ２、ＣＣＴ６Ａ、ＣＤ９９、ＣＤＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＬＫ１、ＣＮＯＴ７、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ５Ａ３、ＣＰ、ＣＴＳＤ、ＣＸＣＲ４、Ｄ４Ｓ２３４Ｅ、ＤＤＩＴ３、ＤＤＩＴ４、１−Ｄｅｃ、ＤＫＣ１、ＤＲ１、ＥＤＮ１、ＥＤＮ２、ＥＦＮＡ１、ＥＧＦ、ＥＧＲ１、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＬＦ３、ＥＬＬ２、ＥＮＧ、ＥＮＯ１、ＥＮＯ３、ＥＮＰＥＰ、ＥＰＯ、ＥＲＲＦＩ１、ＥＴＳ１、Ｆ３、ＦＡＢＰ５、ＦＧＦ３、ＦＫＢＰ４、ＦＬＴ１、ＦＮ１、ＦＯＳ、ＦＴＬ、ＧＡＰＤＨ、ＧＢＥ１、ＧＬＲＸ、ＧＰＩ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＡＰ１、ＨＢＰ１、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ９、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＰＵＤ１、ＨＧＦ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＫ１、ＨＫ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＭＯＸ１、ＨＭＯＸ２、ＨＳＰＡ５、ＨＳＰＤ１、ＨＳＰＨ１、ＨＹＯＵ１、ＩＣＡＭ１、ＩＤ２、ＩＦＩ２７、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＮＳＩＧ１、ＩＲＦ６、ＩＴＧＡ５、ＪＵＮ、ＫＤＲ、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ１９、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＬＥＰ、ＬＧＡＬＳ１、ＬＯＮＰ１、ＬＯＸ、ＬＲＰ１、ＭＡＰ４、ＭＥＴ、ＭＩＦ、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＰＩ、ＭＴ１Ｌ、ＭＴＬ３Ｐ、ＭＵＣ１、ＭＸＩ１、ＮＤＲＧ１、ＮＦＩＬ３、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＯＳ１、ＮＯＳ２、ＮＯＳ２Ｐ１、ＮＯＳ２Ｐ２、ＮＯＳ３、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ４Ａ１、ＮＴ５Ｅ、ＯＤＣ１、Ｐ４ＨＡ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＩＣＳ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＫ３、ＰＦＫＦＢ１、ＰＦＫＦＢ３、ＰＦＫＦＢ４、ＰＦＫＬ、ＰＧＡＭ１、ＰＧＦ、ＰＧＫ１、ＰＧＫ２、ＰＧＭ１、ＰＩＭ１、ＰＩＭ２、ＰＫＭ２、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＩＮ２、ＰＬＯＤ２、ＰＮＮ、ＰＮＰ、ＰＯＬＭ、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＴ、ＰＲＯＫ１、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＤ９、ＰＴＧＳ１、ＰＴＧＳ２、ＱＳＯＸ１、ＲＢＰＪ、ＲＥＬＡ、ＲＩＯＫ３、ＲＮＡＳＥＬ、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＲＰ９、ＳＡＴ１、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＳＭ２、ＳＩＡＨ２、ＳＩＮ３Ａ、ＳＩＲＰＡ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＬＣ６Ａ１０Ｐ、ＳＬＣ６Ａ１６、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＯＲＬ１、ＳＰＰ１、ＳＲＳＦ６、ＳＳＳＣＡ１、ＳＴＣ２、ＳＴＲＡ１３、ＳＹＴ７、ＴＢＰＬ１、ＴＣＥＡＬ１、ＴＥＫ、ＴＦ、ＴＦＦ３、ＴＦＲＣ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＭ２、ＴＨ、ＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＭ１７Ａ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＰ５３、ＴＰＢＧ、ＴＰＤ５２、ＴＰＩ１、ＴＸＮ、ＴＸＮＩＰ、ＵＭＰＳ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＩＭ、ＶＰＳ１１及びＸＲＣＣ６からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を測定することにより決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（ＵＰ  ｈｙｐｏｘｉａ）は、例えば、図３９Ｄを参照にして実施例１０に例示される通り、ＲＮＡ−ｓｅｑ、例えば単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を用いて決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（ＵＰ  ｈｙｐｏｘｉａ）は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均ｌｏｇ正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
【０１７６】
本明細書で使用されるとき、細胞の「ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（ＵＰ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）」という用語は、細胞がオートファジー表現型を示す程度を表すスコアを示す。より高いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（ＵＰ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、オートファジー表現型の増加を示す。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（ＵＰ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、オートファジーを被っている細胞において上方制御される１つ以上の遺伝子、例えばＡＢＬ１、ＡＣＢＤ５、ＡＣＩＮ１、ＡＣＴＲＴ１、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＫＲ１Ｅ２、ＡＬＫＢＨ５、ＡＬＰＫ１、ＡＭＢＲＡ１、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ７、ＡＲＳＢ、ＡＳＢ２、ＡＴＧ１０、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１３、ＡＴＧ１４、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＡＴＧ１６Ｌ２、ＡＴＧ２Ａ、ＡＴＧ２Ｂ、ＡＴＧ３、ＡＴＧ４Ａ、ＡＴＧ４Ｂ、ＡＴＧ４Ｃ、ＡＴＧ４Ｄ、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ａ、ＡＴＧ９Ｂ、ＡＴＰ１３Ａ２、ＡＴＰ１Ｂ１、ＡＴＰＡＦ１−ＡＳ１、ＡＴＰＩＦ１、ＢＥＣＮ１、ＢＥＣＮ１Ｐ１、ＢＬＯＣ１Ｓ１、ＢＭＰ２ＫＬ、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、ＢＯＣ、Ｃ１１ｏｒｆ２、Ｃ１１ｏｒｆ４１、Ｃ１２ｏｒｆ４４、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｃ１４ｏｒｆ１３３、Ｃ１ｏｒｆ２１０、Ｃ５、Ｃ６ｏｒｆ１０６、Ｃ７ｏｒｆ５９、Ｃ７ｏｒｆ６８、Ｃ８ｏｒｆ５９、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＣＡ７、ＣＡＬＣＢ、ＣＡＬＣＯＣＯ２、ＣＡＰＳ、ＣＣＤＣ３６、ＣＤ１６３Ｌ１、ＣＤ９３、ＣＤＣ３７、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＡＦ１Ｂ、ＣＨＭＰ２Ａ、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＣＨＭＰ３、ＣＨＭＰ４Ａ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ４Ｃ、ＣＨＭＰ６、ＣＨＳＴ３、ＣＩＳＤ２、ＣＬＤＮ７、ＣＬＥＣ１６Ａ、ＣＬＮ３、ＣＬＶＳ１、ＣＯＸ８Ａ、ＣＰＡ３、ＣＲＮＫＬ１、ＣＳＰＧ５、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＤ、ＣＸＣＲ７、ＤＡＰ、ＤＫＫＬ１、ＤＮＡＡＦ２、ＤＰＦ３、ＤＲＡＭ１、ＤＲＡＭ２、ＤＹＮＬＬ１、ＤＹＮＬＬ２、ＤＺＡＮＫ１、ＥＩ２４、ＥＩＦ２Ｓ１、ＥＰＧ５、ＥＰＭ２Ａ、ＦＡＢＰ１、ＦＡＭ１２５Ａ、ＦＡＭ１３１Ｂ、ＦＡＭ１３４Ｂ、ＦＡＭ１３Ｂ、ＦＡＭ１７６Ａ、ＦＡＭ１７６Ｂ、ＦＡＭ４８Ａ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＬ、ＦＢＸＯ７、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ７、ＦＧＦＢＰ１、ＦＩＳ１、ＦＮＢＰ１Ｌ、ＦＯＸＯ１、ＦＵＮＤＣ１、ＦＵＮＤＣ２、ＦＸＲ２、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＧＡＢＡＲＡＰＬ３、ＧＡＢＲＡ５、ＧＤＦ５、ＧＭＩＰ、ＨＡＰ１、ＨＡＰＬＮ１、ＨＢＸＩＰ、ＨＣＡＲ１、ＨＤＡＣ６、ＨＧＳ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊ、ＨＫ２、ＨＭＧＢ１、ＨＰＲ、ＨＳＦ２ＢＰ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰＡ８、ＩＦＩ１６、ＩＰＰＫ、ＩＲＧＭ、ＩＳＴ１、ＩＴＧＢ４、ＩＴＰＫＣ、ＫＣＮＫ３、ＫＣＮＱ１、ＫＩＡＡ０２２６、ＫＩＡＡ１３２４、ＫＲＣＣ１、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ７３、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＴＯＲ１、ＬＡＭＴＯＲ２、ＬＡＭＴＯＲ３、ＬＡＲＰ１Ｂ、ＬＥＮＧ９、ＬＧＡＬＳ８、ＬＩＸ１、ＬＩＸ１Ｌ、ＬＭＣＤ１、ＬＲＲＫ２、ＬＲＳＡＭ１、ＬＳＭ４、ＭＡＰ１Ａ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｃ、ＭＡＰ１Ｓ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１２、ＭＡＲＫ２、ＭＢＤ５、ＭＤＨ１、ＭＥＸ３Ｃ、ＭＦＮ１、ＭＦＮ２、ＭＬＳＴ８、ＭＲＰＳ１０、ＭＲＰＳ２、ＭＳＴＮ、ＭＴＥＲＦＤ１、ＭＴＭＲ１４、ＭＴＭＲ３、ＭＴＯＲ、ＭＴＳＳ１、ＭＹＨ１１、ＭＹＬＫ、ＭＹＯＭ１、ＮＢＲ１、ＮＤＵＦＢ９、ＮＥＦＭ、ＮＨＬＲＣ１、ＮＭＥ２、ＮＰＣ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲＢＦ２、ＮＴＨＬ１、ＮＵＰ９３、ＯＢＳＣＮ、ＯＰＴＮ、Ｐ２ＲＸ５、ＰＡＣＳ２、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ７、ＰＤＫ１、ＰＤＫ４、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ３、ＰＦＫＰ、ＰＧＫ２、ＰＨＦ２３、ＰＨＹＨＩＰ、ＰＩ４Ｋ２Ａ、ＰＩＫ３Ｃ３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＮＫ１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＰＬＯＤ２、ＰＮＰＯ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＰＹ、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、ＰＲＫＡＢ１、ＰＲＫＡＢ２、ＰＲＫＡＧ１、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＡＧ３、ＰＲＫＤ２、ＰＲＫＧ１、ＰＳＥＮ１、ＰＴＰＮ２２、ＲＡＢ１２、ＲＡＢ１Ａ、ＲＡＢ１Ｂ、ＲＡＢ２３、ＲＡＢ２４、ＲＡＢ３３Ｂ、ＲＡＢ３９、ＲＡＢ７Ａ、ＲＢ１ＣＣ１、ＲＢＭ１８、ＲＥＥＰ２、ＲＥＰ１５、ＲＦＷＤ３、ＲＧＳ１９、ＲＨＥＢ、ＲＩＭＳ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ４１、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＴＯＲ、ＲＲＡＧＡ、ＲＲＡＧＢ、ＲＲＡＧＣ、ＲＲＡＧＤ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＳＣＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ１０、ＳＥＳＮ２、ＳＦＲＰ４、ＳＨ３ＧＬＢ１、ＳＩＲＴ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ１Ａ４、ＳＬＣ２２Ａ３、ＳＬＣ２５Ａ１９、ＳＬＣ３５Ｂ３、ＳＬＣ３５Ｃ１、ＳＬＣ３７Ａ４、ＳＬＣ６Ａ１、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＭＵＲＦ１、ＳＮＡＰ２９、ＳＮＡＰＩＮ、ＳＮＦ８、ＳＮＲＰＢ、ＳＮＲＰＢ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＮＲＰＦ、ＳＮＴＧ１、ＳＮＸ１４、ＳＰＡＴＡ１８、ＳＱＳＴＭ１、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＭ、ＳＴＡＭ２、ＳＴＡＴ２、ＳＴＢＤ１、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３２Ａ、ＳＴＯＭ、ＳＴＸ１２、ＳＴＸ１７、ＳＵＰＴ３Ｈ、ＴＢＣ１Ｄ１７、ＴＢＣ１Ｄ２５、ＴＢＣ１Ｄ５、ＴＣＩＲＧ１、ＴＥＡＤ４、ＴＥＣＰＲ１、ＴＥＣＰＲ２、ＴＦＥＢ、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＭＢＩＭ６、ＴＭＥＭ２０３、ＴＭＥＭ２０８、ＴＭＥＭ３９Ａ、ＴＭＥＭ３９Ｂ、ＴＭＥＭ５９、ＴＭＥＭ７４、ＴＭＥＭ９３、ＴＮＩＫ、ＴＯＬＬＩＰ、ＴＯＭＭ２０、ＴＯＭＭ２２、ＴＯＭＭ４０、ＴＯＭＭ５、ＴＯＭＭ６、ＴＯＭＭ７、ＴＯＭＭ７０Ａ、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＴＰ５３ＩＮＰ２、ＴＲＡＰＰＣ８、ＴＲＥＭ１、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ５、ＴＳＧ１０１、ＴＸＬＮＡ、ＵＢＡ５２、ＵＢＢ、ＵＢＣ、ＵＢＱＬＮ１、ＵＢＱＬＮ２、ＵＢＱＬＮ４、ＵＬＫ１、ＵＬＫ２、ＵＬＫ３、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ３０、ＵＶＲＡＧ、ＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＶＤＡＣ１、ＶＭＰ１、ＶＰＳ１１、ＶＰＳ１６、ＶＰＳ１８、ＶＰＳ２５、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ３３Ａ、ＶＰＳ３３Ｂ、ＶＰＳ３６、ＶＰＳ３７Ａ、ＶＰＳ３７Ｂ、ＶＰＳ３７Ｃ、ＶＰＳ３７Ｄ、ＶＰＳ３９、ＶＰＳ４１、ＶＰＳ４Ａ、ＶＰＳ４Ｂ、ＶＴＡ１、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、ＷＤＦＹ３、ＷＤＲ４５、ＷＤＲ４５Ｌ、ＷＩＰＩ１、ＷＩＰＩ２、ＸＢＰ１、ＹＩＰＦ１、ＺＣＣＨＣ１７、ＺＦＹＶＥ１、ＺＫＳＣＡＮ３、ＺＮＦ１８９、ＺＮＦ５９３及びＺＮＦ６８１からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を測定することにより決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（ＵＰ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、例えば、図３９Ｅを参照にして実施例１０に例示される通り、ＲＮＡ−ｓｅｑ、例えば単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を用いて決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（ＵＰ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均ｌｏｇ正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
【０１７７】
本明細書で使用されるとき、細胞の「ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」という用語は、細胞が、活性化Ｔ細胞表現型に対して休止Ｔ細胞表現型を示す程度を表すスコアを指す。より高いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）は、休止Ｔ細胞表現型の増加を示すのに対し、より低いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）は、活性化Ｔ細胞表現型の増加を示す。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）は、休止Ｔ細胞で上方制御され、且つ／又は活性化Ｔ細胞で下方制御される１つ以上の遺伝子、例えばＡＢＣＡ７、ＡＢＣＦ３、ＡＣＡＰ２、ＡＭＴ、ＡＮＫＨ、ＡＴＦ７ＩＰ２、ＡＴＧ１４、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＸＮ７、ＡＴＸＮ７Ｌ３Ｂ、ＢＣＬ７Ａ、ＢＥＸ４、ＢＳＤＣ１、ＢＴＧ１、ＢＴＧ２、ＢＴＮ３Ａ１、Ｃ１１ｏｒｆ２１、Ｃ１９ｏｒｆ２２、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＣＡＭＫ２Ｇ、ＣＡＲＳ２、ＣＣＮＬ２、ＣＤ２４８、ＣＤ５、ＣＤ５５、ＣＥＰ１６４、ＣＨＫＢ、ＣＬＫ１、ＣＬＫ４、ＣＴＳＬ１、ＤＢＰ、ＤＣＵＮ１Ｄ２、ＤＥＮＮＤ１Ｃ、ＤＧＫＤ、ＤＬＧ１、ＤＵＳＰ１、ＥＡＰＰ、ＥＣＥ１、ＥＣＨＤＣ２、ＥＲＢＢ２ＩＰ、ＦＡＭ１１７Ａ、ＦＡＭ１３４Ｂ、ＦＡＭ１３４Ｃ、ＦＡＭ１６９Ａ、ＦＡＭ１９０Ｂ、ＦＡＵ、ＦＬＪ１００３８、ＦＯＸＪ２、ＦＯＸＪ３、ＦＯＸＬ１、ＦＯＸＯ１、ＦＸＹＤ５、ＦＹＢ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＹＡＬ２、ＩＣＡＭ２、ＩＦＩＴ５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＫＢＫＢ、ＩＱＳＥＣ１、ＩＲＳ４、ＫＩＡＡ０６６４Ｌ３、ＫＩＡＡ０７４８、ＫＬＦ３、ＫＬＦ９、ＫＲＴ１８、ＬＥＦ１、ＬＩＮＣ００３４２、ＬＩＰＡ、ＬＩＰＴ１、ＬＬＧＬ２、ＬＭＢＲ１Ｌ、ＬＰＡＲ２、ＬＴＢＰ３、ＬＹＰＤ３、ＬＺＴＦＬ１、ＭＡＮＢＡ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＵ２、ＭＧＥＡ５、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＭＳＬ１、ＭＳＬ３、ＭＹＨ３、ＭＹＬＩＰ、ＮＡＧＰＡ、ＮＤＳＴ２、ＮＩＳＣＨ、ＮＫＴＲ、ＮＬＲＰ１、ＮＯＳＩＰ、ＮＰＩＰ、ＮＵＭＡ１、ＰＡＩＰ２Ｂ、ＰＡＰＤ７、ＰＢＸＩＰ１、ＰＣＩＦ１、ＰＩ４ＫＡ、ＰＬＣＬ２、ＰＬＥＫＨＡ１、ＰＬＥＫＨＦ２、ＰＮＩＳＲ、ＰＰＦＩＢＰ２、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＺ、ＰＲＫＤ３、ＰＲＭＴ２、ＰＴＰ４Ａ３、ＰＸＮ、ＲＡＳＡ２、ＲＡＳＡ３、ＲＡＳＧＲＰ２、ＲＢＭ３８、ＲＥＰＩＮ１、ＲＮＦ３８、ＲＮＦ４４、ＲＯＲ１、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３２、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ６、ＲＰＳ９、ＲＸＲＡ、ＲＹＫ、ＳＣＡＮＤ２、ＳＥＭＡ４Ｃ、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ６、ＳＥＴＸ、ＳＦ３Ｂ１、ＳＨ２Ｂ１、ＳＬＣ２Ａ４ＲＧ、ＳＬＣ３５Ｅ２Ｂ、ＳＬＣ４６Ａ３、ＳＭＡＧＰ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＰＤ１、ＳＮＰＨ、ＳＰ１４０Ｌ、ＳＰＡＴＡ６、ＳＰＧ７、ＳＲＥＫ１ＩＰ１、ＳＲＳＦ５、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＶＩＬ、ＳＹＦ２、ＳＹＮＪ２ＢＰ、ＴＡＦ１Ｃ、ＴＢＣ１Ｄ４、ＴＣＦ２０、ＴＥＣＴＡ、ＴＥＳ、ＴＭＥＭ１２７、ＴＭＥＭ１５９、ＴＭＥＭ３０Ｂ、ＴＭＥＭ６６、ＴＭＥＭ８Ｂ、ＴＰ５３ＴＧ１、ＴＰＣＮ１、ＴＲＩＭ２２、ＴＲＩＭ４４、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＳＰＹＬ２、ＴＴＣ９、ＴＴＮ、ＵＢＥ２Ｇ２、ＵＳＰ３３、ＵＳＰ３４、ＶＡＭＰ１、ＶＩＬＬ、ＶＩＰＲ１、ＶＰＳ１３Ｃ、ＺＢＥＤ５、ＺＢＴＢ２５、ＺＢＴＢ４０、ＺＣ３Ｈ３、ＺＦＰ１６１、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＺＨＸ２、ＺＭＹＭ５、ＺＮＦ１３６、ＺＮＦ１４８、ＺＮＦ３１８、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ５１２Ｂ、ＺＮＦ６０９、ＺＮＦ６５２、ＺＮＦ８３、ＺＮＦ８６２及びＺＮＦ９１からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を測定することにより決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）は、例えば、図３８Ｄを参照にして実施例１０に例示される通り、ＲＮＡ−ｓｅｑ、例えば単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を用いて決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均ｌｏｇ正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
【０１７８】
本明細書で使用されるとき、細胞の「ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ  ｕｐ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」は、メモリー分化における細胞の段階を表すスコアを指す。より高いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ  ｕｐ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）は、後期メモリーＴ細胞表現型の増加を示すのに対し、より低いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ  ｕｐ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）は、早期メモリーＴ細胞表現型の増加を示す。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（ＵＰ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、メモリー分化中に上方制御される１つ以上の遺伝子、例えばＭＴＣＨ２、ＲＡＢ６Ｃ、ＫＩＡＡ０１９５、ＳＥＴＤ２、Ｃ２ｏｒｆ２４、ＮＲＤ１、ＧＮＡ１３、ＣＯＰＡ、ＳＥＬＴ、ＴＮＩＰ１、ＣＢＦＡ２Ｔ２、ＬＲＰ１０、ＰＲＫＣＩ、ＢＲＥ、ＡＮＫＳ１Ａ、ＰＮＰＬＡ６、ＡＲＬ６ＩＰ１、ＷＤＦＹ１、ＭＡＰＫ１、ＧＰＲ１５３、ＳＨＫＢＰ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ２、ＰＩＰ４Ｋ２Ａ、ＨＣＮ３、ＧＴＰＢＰ１、ＴＬＮ１、Ｃ４ｏｒｆ３４、ＫＩＦ３Ｂ、ＴＣＩＲＧ１、ＰＰＰ３ＣＡ、ＡＴＧ４Ｄ、ＴＹＭＰ、ＴＲＡＦ６、Ｃ１７ｏｒｆ７６、ＷＩＰＦ１、ＦＡＭ１０８Ａ１、ＭＹＬ６、ＮＲＭ、ＳＰＣＳ２、ＧＧＴ３Ｐ、ＧＡＬＫ１、ＣＬＩＰ４、ＡＲＬ４Ｃ、ＹＷＨＡＱ、ＬＰＣＡＴ４、ＡＴＧ２Ａ、ＩＤＳ、ＴＢＣ１Ｄ５、ＤＭＰＫ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ６、ＲＥＥＰ５、ＡＢＨＤ６、ＫＩＡＡ０２４７、ＥＭＢ、ＴＳＥＮ５４、ＳＰＩＲＥ２、ＰＩＷＩＬ４、ＺＳＣＡＮ２２、ＩＣＡＭ１、ＣＨＤ９、ＬＰＩＮ２、ＳＥＴＤ８、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＵＬＢＰ３、ＩＬ１５ＲＡ、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＬＣＰ１、ＣＨＰ、ＲＵＮＸ３、ＴＭＥＭ４３、ＲＥＥＰ４、ＭＥＦ２Ｄ、ＡＢＬ１、ＴＭＥＭ３９Ａ、ＰＣＢＰ４、ＰＬＣＤ１、ＣＨＳＴ１２、ＲＡＳＧＲＰ１、Ｃ１ｏｒｆ５８、Ｃ１１ｏｒｆ６３、Ｃ６ｏｒｆ１２９、ＦＨＯＤ１、ＤＫＦＺｐ４３４Ｆ１４２、ＰＩＫ３ＣＧ、ＩＴＰＲ３、ＢＴＧ３、Ｃ４ｏｒｆ５０、ＣＮＮＭ３、ＩＦＩ１６、ＡＫ１、ＣＤＫ２ＡＰ１、ＲＥＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＭＶＤ、ＴＴＣ３９Ｃ、ＰＬＥＫＨＡ２、ＦＫＢＰ１１、ＥＭＬ４、ＦＡＮＣＡ、ＣＤＣＡ４、ＦＵＣＡ２、ＭＦＳＤ１０、ＴＢＣＤ、ＣＡＰＮ２、ＩＱＧＡＰ１、ＣＨＳＴ１１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＭＹＯ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＤＬＧ３、ＭＸＤ４、ＲＡＬＧＤＳ、Ｓ１ＰＲ５、ＷＳＢ２、ＣＣＲ３、ＴＩＰＡＲＰ、ＳＰ１４０、ＣＤ１５１、ＳＯＸ１３、ＫＲＴＡＰ５−２、ＮＦ１、ＰＥＡ１５、ＰＡＲＰ８、ＲＮＦ１６６、ＵＥＶＬＤ、ＬＩＭＫ１、ＣＡＣＮＢ１、ＴＭＸ４、ＳＬＣ６Ａ６、ＬＢＡ１、ＳＶ２Ａ、ＬＬＧＬ２、ＩＲＦ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＣＤ９９、ＲＡＰＧＥＦ１、ＰＰＰ４Ｒ１、ＯＳＢＰＬ７、ＦＯＸＰ４、ＳＬＡ２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＳＴ７、ＪＡＺＦ１、ＧＧＡ２、ＰＩ４Ｋ２Ａ、ＣＤ６８、ＬＰＧＡＴ１、ＳＴＸ１１、ＺＡＫ、ＦＡＭ１６０Ｂ１、ＲＯＲＡ、Ｃ８ｏｒｆ８０、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＴＧＦＢＩ、ＤＮＡＪＣ１、ＧＰＲ１１４、ＬＲＰ８、ＣＤ６９、ＣＭＩＰ、ＮＡＴ１３、ＴＧＦＢ１、ＦＬＪ０００４���、ＡＮＴＸＲ２、ＮＲ４Ａ３、ＩＬ１２ＲＢ１、ＮＴＮＧ２、ＲＤＸ、ＭＬＬＴ４、ＧＰＲＩＮ３、ＡＤＣＹ９、ＣＤ３００Ａ、ＳＣＤ５、ＡＢＩ３、ＰＴＰＮ２２、ＬＧＡＬＳ１、ＳＹＴＬ３、ＢＭＰＲ１Ａ、ＴＢＫ１、ＰＭＡＩＰ１、ＲＡＳＧＥＦ１Ａ、ＧＣＮＴ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＳＴＯＭ、ＣＡＬＨＭ２、ＡＢＣＡ２、ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ、ＳＹＮＥ２、ＰＡＭ、Ｃ１２ｏｒｆ７５、ＣＬＣＦ１、ＭＸＲＡ７、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＣＬＳＴＮ３、ＡＣＯＴ９、ＨＩＰ１、ＬＡＧ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＣＢＬＤ１、ＫＬＦ６、ＣＡＣＮＢ３、ＲＮＦ１９Ａ、ＲＡＢ２７Ａ、ＦＡＤＳ３、ＤＬＧ５、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＡＣＴＮ４、ＴＢＫＢＰ１、ＡＴＸＮ１、ＡＲＡＰ２、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＦＡＭ５３Ｂ、ＭＡＮ１Ａ１、ＦＡＭ３８Ａ、ＰＬＸＮＣ１、ＧＲＬＦ１、ＳＲＧＮ、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、Ｂ４ＧＡＬＴ５、ＷＩＰＩ１、ＰＴＰＲＪ、ＳＬＦＮ１１、ＤＵＳＰ２、ＡＮＸＡ５、ＡＨＮＡＫ、ＮＥＯ１、ＣＬＩＣ１、ＥＩＦ２Ｃ４、ＭＡＰ３Ｋ５、ＩＬ２ＲＢ、ＰＬＥＫＨＧ１、ＭＹＯ６、ＧＴＤＣ１、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＧＡＬＭ、ＴＡＲＰ、ＡＤＡＭ８、ＭＳＣ、ＨＮＲＰＬＬ、ＳＹＴ１１、ＡＴＰ２Ｂ４、ＮＨＳＬ２、ＭＡＴＫ、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＳＬＦＮ１２Ｌ、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＰＩＫ３Ｒ３、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＭＢＯＡＴ１、ＧＹＧ１、ＫＡＴＮＡＬ１、ＦＡＭ４６Ｃ、ＺＣ３ＨＡＶ１Ｌ、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＣＴＮＮＡ１、ＮＰＣ１、Ｃ３ＡＲ１、ＣＲＩＭ１、ＳＨ２Ｄ２Ａ、ＥＲＮ１、ＹＰＥＬ１、ＴＢＸ２１、ＳＬＣ１Ａ４、ＦＡＳＬＧ、ＰＨＡＣＴＲ２、ＧＡＬＮＴ３、ＡＤＲＢ２、ＰＩＫ３ＡＰ１、ＴＬＲ３、ＰＬＥＫＨＡ５、ＤＵＳＰ１０、ＧＮＡＯ１、ＰＴＧＤＲ、ＦＲＭＤ４Ｂ、ＡＮＸＡ２、ＥＯＭＥＳ、ＣＡＤＭ１、ＭＡＦ、ＴＰＲＧ１、ＮＢＥＡＬ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＰＥＬＯ、ＳＬＣ４Ａ４、ＫＬＲＦ１、ＦＯＳＬ２、ＲＧＳ２、ＴＧＦＢＲ３、ＰＲＦ１、ＭＹＯ１Ｆ、ＧＡＢ３、Ｃ１７ｏｒｆ６６、ＭＩＣＡＬ２、ＣＹＴＨ３、ＴＯＸ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＳＹＮＥ１、ＷＥＥ１、ＰＹＨＩＮ１、Ｆ２Ｒ、ＰＬＤ１、ＴＨＢＳ１、ＣＤ５８、ＦＡＳ、ＮＥＴＯ２、ＣＸＣＲ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ２、ＤＵＳＰ４、ＡＵＴＳ２、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＫＬＲＧ１、ＴＮＩＰ３、ＧＺＭＡ、ＰＲＲ５Ｌ、ＰＲＤＭ１、ＳＴ８ＳＩＡ６、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＰＲＭ、ＧＦＰＴ２、ＭＹＢＬ１、ＳＬＡＭＦ７、ＦＬＪ１６６８６、ＧＮＬＹ、ＺＥＢ２、ＣＳＴ７、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＣＣＬ５、ＫＬＲＤ１及びＫＬＲＢ１からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を測定することにより決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ  ｕｐ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）は、例えば、図４０Ｂを参照にして実施例１０に例示される通り、ＲＮＡ−ｓｅｑ、例えば単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を用いて決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ  ｕｐ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均ｌｏｇ正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
【０１７９】
本明細書で使用されるとき、細胞の「ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＮ）」という用語は、細胞が、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）表現型に対してエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）表現型を示す程度を表すスコアを指す。より高いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＮ）は、ＴＥＭ表現型の増加を示すのに対し、より低いＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＮ）は、ＴＮ表現型の増加を示す。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＮ）は、ＴＥＭ細胞で上方制御され、且つ／又はＴＮ細胞で下方制御される１つ以上の遺伝子、例えばＭＹＯ５Ａ、ＭＸＤ４、ＳＴＫ３、Ｓ１ＰＲ５、ＧＬＣＣＩ１、ＣＣＲ３、ＳＯＸ１３、ＫＲＴＡＰ５−２、ＰＥＡ１５、ＰＡＲＰ８、ＲＮＦ１６６、ＵＥＶＬＤ、ＬＩＭＫ１、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＶ２Ａ、ＫＰＮＡ２、ＯＳＢＰＬ７、ＳＴ７、ＧＧＡ２、ＰＩ４Ｋ２Ａ、ＣＤ６８、ＺＡＫ、ＲＯＲＡ、ＴＧＦＢＩ、ＤＮＡＪＣ１、ＪＯＳＤ１、ＺＦＹＶＥ２８、ＬＲＰ８、ＯＳＢＰＬ３、ＣＭＩＰ、ＮＡＴ１３、ＴＧＦＢ１、ＡＮＴＸＲ２、ＮＲ４Ａ３、ＲＤＸ、ＡＤＣＹ９、ＣＨＮ１、ＣＤ３００Ａ、ＳＣＤ５、ＰＴＰＮ２２、ＬＧＡＬＳ１、ＲＡＳＧＥＦ１Ａ、ＧＣＮＴ１、ＧＬＵＬ、ＡＢＣＡ２、ＣＬＤＮＤ１、ＰＡＭ、ＣＬＣＦ１、ＭＸＲＡ７、ＣＬＳＴＮ３、ＡＣＯＴ９、ＭＥＴＲＮＬ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＬＲＩＧ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＣＡＣＮＢ３、ＲＮＦ１９Ａ、ＲＡＢ２７Ａ、ＦＡＤＳ３、ＡＣＴＮ４、ＴＢＫＢＰ１、ＦＡＭ５３Ｂ、ＭＡＮ１Ａ１、ＦＡＭ３８Ａ、ＧＲＬＦ１、Ｂ４ＧＡＬＴ５、ＷＩＰＩ１、ＤＵＳＰ２、ＡＮＸＡ５、ＡＨＮＡＫ、ＣＬＩＣ１、ＭＡＰ３Ｋ５、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＴＡＲＰ、ＡＤＡＭ８、ＭＡＴＫ、ＳＬＦＮ１２Ｌ、ＰＩＫ３Ｒ３、ＦＡＭ４６Ｃ、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＣＴＮＮＡ１、ＮＰＣ１、ＳＨ２Ｄ２Ａ、ＥＲＮ１、ＹＰＥＬ１、ＴＢＸ２１、ＳＴＯＭ、ＰＨＡＣＴＲ２、ＧＢＰ５、ＡＤＲＢ２、ＰＩＫ３ＡＰ１、ＤＵＳＰ１０、ＰＴＧＤＲ、ＥＯＭＥＳ、ＭＡＦ、ＴＰＲＧ１、ＮＢＥＡＬ２、ＮＣＡＰＨ、ＳＬＣ４Ａ４、ＦＯＳＬ２、ＲＧＳ２、ＴＧＦＢＲ３、ＭＹＯ１Ｆ、Ｃ１７ｏｒｆ６６、ＣＹＴＨ３、ＷＥＥ１、ＰＹＨＩＮ１、Ｆ２Ｒ、ＴＨＢＳ１、ＣＤ５８、ＡＵＴＳ２、ＦＡＭ１２９Ａ、ＴＮＩＰ３、ＧＺＭＡ、ＰＲＲ５Ｌ、ＰＲＤＭ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＰＲＭ、ＧＦＰＴ２、ＭＹＢＬ１、ＳＬＡＭＦ７、ＺＥＢ２、ＣＳＴ７、ＣＣＬ５、ＧＺＭＫ及びＫＬＲＢ１からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現を測定することにより決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＮ）は、例えば、図４０Ｃを参照にして実施例１０に例示される通り、ＲＮＡ−ｓｅｑ、例えば単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）を用いて決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＮ）は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均ｌｏｇ正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
【０１８０】
ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ値（例えば、ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値）に関連して、正のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅが１００％減少するとき、この値は０になる。負のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅが１００％増加するとき、この値は０になる。例えば、図３９Ａにおいて、第１日サンプルのＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値は、−０．０８４であり；第９日サンプルのＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値は、０．０３５であり；入力サンプルのＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値は、−０．１である。図３９Ａにおいて、入力サンプルのＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値の１００％の増加により、０のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ値が得られ；入力サンプルのＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値の２００％の増加により、０．１のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ値が得られる。図３９Ａにおいて、第９日サンプルのＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値の１００％の減少により、０のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ値が得られ；第９日サンプルのＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ中央値の２００％の減少により、−０．０３５のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ値が得られる。
【０１８１】
本明細書で使用されるとき、用語「ビーズ」は、直径約０．１μｍ〜数ミリメートルのサイズの固体表面を備える個別の粒子を指す。ビーズは、球形（例えば、ミクロスフィア）であり得るか、又は不規則な形状を有し得る。ビーズは、限定されないが、常磁性材料、セラミック、プラスチック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、セルロース、ナイロンなどを含め、多様な材料を含み得る。一部の実施形態では、ビーズは、比較的均一で、直径約４．５μｍの、球形、超常磁性ポリスチレンビーズであり、例えばＣＤ３（例えば、ＣＤ３ε）及びＣＤ２８に対する抗体の混合物でコーティングされている、例えばそれと結合している。一部の実施形態では、ビーズは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）である。一部の実施形態では、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体の双方が同じビーズに結合されて、抗原提示細胞によるＴ細胞の刺激を模倣する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の特性並びに細胞単離及び増殖のためのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の使用は当技術分野で公知であり、例えばＮｅｕｒａｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００７；１０６：４１−７３を参照されたく、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
本明細書で使用されるとき、用語「ナノマトリックス」は、可動性ポリマー鎖のマトリックスを含むナノ構造を指す。ナノマトリックスは、１〜５００ｎｍ、例えば１０〜２００ｎｍのサイズである。一部の実施形態では、可動性ポリマー鎖のマトリックスは、Ｔ細胞に活性化シグナルを提供する１つ以上のアゴニスト、例えばアゴニスト抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体に結合される。一部の実施形態では、ナノマトリックスは、１つ以上の刺激分子のアゴニスト及び／又は１つ以上の共刺激分子のアゴニストに結合、例えば共有結合したコロイドポリマーナノマトリックスを含む。一部の実施形態では、１つ以上の刺激分子のアゴニストは、ＣＤ３アゴニスト（例えば、抗ＣＤ３アゴニスト抗体）である。一部の実施形態では、１つ以上の刺激分子のアゴニストは、ＣＤ２８アゴニスト（例えば、抗ＣＤ２８アゴニスト抗体）である。一部の実施形態では、ナノマトリックスは、例えば、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体などのアゴニストの結合点として、固体表面の非存在を特徴とする。一部の実施形態では、ナノマトリックスは、国際公開第２０１４／０４８９２０Ａ１号パンフレットに開示されるナノマトリックス又はＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｃｃ  ＧｍｂＨ製のＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）キットに提供されるようなナノマトリックスであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）は、ヒトＣＤ３及びＣＤ２８に対するヒト化組換えアゴニスト抗体に共有結合されたコロイドポリマーナノマトリックスから構成される。
【０１８３】
本明細書に記載の組成物及び方法の様々な実施形態について以下でさらに詳細に説明する。追加的定義は、本明細書全体を通して記載される。
【０１８４】
本明細書には、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞）を製造する方法、そうした細胞を含む組成物及び対象の疾患、例えば癌を処置するためのそうした細胞の使用方法が提供される。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、２４時間未満でＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞を製造することができる。理論に縛られることを意図しないが、本明細書に記載の方法は、製造プロセス中、ナイーブＴ細胞などのＴ細胞の未分化表現型を保存する。未分化表現型を有するこれらのＣＡＲ発現細胞は、注入後にインビボで、より長く持続し、且つ／又はより良く増殖し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の製造方法により生産されるＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑを用いて測定される通り（例えば、図３９Ａを参照にして実施例１０に記載される方法を用いて測定される通り）、伝統的な製造プロセスにより生産されるＣＡＲＴ細胞と比べて、より高いパーセンテージの幹細胞メモリーＴ細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の製造方法により生産されるＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑを用いて測定される通り（例えば、図３９Ｂを参照にして実施例１０に記載される方法を用いて測定される通り）、伝統的な製造プロセスにより生産されるＣＡＲＴ細胞と比べて、より高いパーセンテージのエフェクターＴ細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の製造方法により生産されるＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑを用いて測定される通り（例えば、図３９Ｃを参照にして実施例１０に記載される方法を用いて測定される通り）、伝統的な製造プロセスにより生産されるＣＡＲＴ細胞と比べて、Ｔ細胞の幹細胞性をより良く保存する。一部の実施形態では、本明細書に記載の製造方法により生産されるＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑを用いて測定される通り（例えば、図３９Ｄを参照にして実施例１０に記載される方法を用いて測定される通り）、伝統的な製造プロセスにより生産されるＣＡＲＴ細胞と比べて、低いレベルの低酸素を示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の製造方法により生産されるＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑを用いて測定される通り（例えば、図３９Ｅを参照にして実施例１０に記載される方法を用いて測定される通り）、伝統的な製造プロセスにより生産されるＣＡＲＴ細胞と比べて、低いレベルのオートファジーを示す。
【０１８５】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））などのビーズの使用を含まず、脱ビーズステップも含まない。一部の実施形態では、本明細書に開示の方法により製造されるＣＡＲＴ細胞は、最小エクスビボ拡大、例えば１日未満、１２時間未満、８時間未満、６時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満又はエクスビボ拡大なしで対象に投与することができる。従って、本明細書に記載の方法は、対象の疾患の処置に使用するための改善されたＣＡＲ発現細胞産物を作製する高速製造プロセスを提供する。
【０１８６】
サイトカインプロセス
一部の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法を提供し、これは、（１）細胞の集団を、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−６又はそれらの組み合わせから選択されるサイトカインと接触させるステップ、（２）細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を取得するステップ、及び（３）保存（例えば、凍結保存媒体中で細胞の集団の再製剤化すること）又は投与のために細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を採取するステップを含み、（ａ）ステップ（２）は、ステップ（１）と一緒に又はステップ（１）の開始後の５時間以内、例えばステップ（１）の開始後の１、２、３、４又は５時間以内に実施し、ステップ（３）は、ステップ（１）の開始後の２６時間以内、例えばステップ（１）の開始後の２２、２３又は２４時間以内、例えばステップ（１）の開始後の２４時間以内に実施するか、又は（ｂ）ステップ（３）からの細胞の集団は、増殖されないか、又は例えばステップ（１）の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、ＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、プラスミド上にある。一部の実施形態では、ステップ（２）における核酸分子は、いずれのベクター上にもない。一部の実施形態では、ステップ（２）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む。
【０１８７】
一部の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団は、対象からのアフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）から収集される。
【０１８８】
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）を対象から採取し、凍結サンプル（例えば、凍結保存サンプル）として細胞製造施設に輸送する。次に、凍結アフェレーシスサンプルを解凍した後、例えばセルソーティング機（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を用いて、アフェレーシスサンプルからＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を選択する。続いて、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を、本明細書に記載のサイトカインプロセスを用いるＣＡＲＴ製造のために接種する。一部の実施形態では、サイトカインプロセスの終了時、ＣＡＲＴ細胞を凍結保存し、後に解凍して、対象に投与する。一部の実施形態では、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ製造のために接種する前に、１ラウンド以上の凍結−解凍工程に付す。
【０１８９】
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）を対象から採取し、新鮮な産物（例えば、凍結していない産物）として細胞製造施設に輸送する。例えば、セルソーティング機（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を用いて、アフェレーシスサンプルからＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を選択する。続いて、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を、本明細書に記載のサイトカインプロセスを用いるＣＡＲＴ製造のために接種する。一部の実施形態では、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ製造のために接種する前に、１ラウンド以上の凍結−解凍工程に付す。
【０１９０】
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）を対象から採取する。例えば、セルソーティング機（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を用いて、アフェレーシスサンプルからＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を選択する。続いて、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を凍結サンプル（例えば、凍結保存サンプル）として細胞製造施設に輸送する。選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を後に解凍し、本明細書に記載のサイトカインプロセスを用いるＣＡＲＴ製造のために接種する。
【０１９１】
一部の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）を接種し、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））、ＩＬ−２１若しくはＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ）から選択される１つ以上のサイトカイン）並びにＣＡＲをコードするベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を細胞に添加する。２０〜２４時間のインキュベーション後、細胞を洗浄してから、保存又は投与のために製剤化する。
【０１９２】
伝統的なＣＡＲＴ製造アプローチと異なり、本明細書に提供されるサイトカインプロセスは、ＣＤ３及び／又はＣＤ２８刺激又はエクスビボＴ細胞拡大を伴わない。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体と接触させて、エクスビボで広範囲に増殖するＴ細胞は、セントラルメモリー表現型に向かう分化を示す傾向がある。理論に縛られることを意図しないが、本明細書に提供されるサイトカインプロセスは、ＣＡＲＴ製造中、Ｔ細胞の未分化表現型を保存するか又は増加させて、対象に注入された後長期に持続し得るＣＡＲＴ産物を生成する。
【０１９３】
一部の実施形態では、細胞の集団を１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））、ＩＬ−２１又はＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）から選択される１つ以上のサイトカイン）と接触させる。
【０１９４】
一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−２と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−７と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−２１と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−２及びＩＬ−７と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−２及びＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−２及びＩＬ−２１と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−２及びＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−７及びＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−７及びＩＬ−２１と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−７及びＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））及びＩＬ−２１と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））及びＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−２１及びＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＩＬ−７、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））及びＩＬ−２１と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＬＳＤ１阻害剤とさらに接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をＭＡＬＴ１阻害剤とさらに接触させる。
【０１９５】
一部の実施形態では、細胞の集団を２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０又は３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５と接触させる。
【０１９６】
一部の実施形態では、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団を、ＣＡＲをコードするＤＮＡ分子で形質導入する。
【０１９７】
一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップと同時に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０時間以内に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の５時間以内に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の４時間以内に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の３時間以内に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の２時間以内に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の１時間以内に行う。
【０１９８】
一部の実施形態では、細胞の集団を保存又は投与のために採取する。
【０１９９】
一部の実施形態では、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の７２、６０、４８、３６、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９又は１８時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。一部の実施形態では、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の２６時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。一部の実施形態では、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の２５時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。一部の実施形態では、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の２４時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。一部の実施形態では、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の２３時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。一部の実施形態では、細胞の集団を前述した１つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の２２時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。
【０２００】
一部の実施形態では、細胞の集団は、エクスビボで増殖されない。
【０２０１】
一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した１つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した１つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて５％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した１つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて１０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した１つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて１５％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した１つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて２０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した１つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて２５％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した１つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて３０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した１つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて３５％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した１つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて４０％以下だけ増殖される。
【０２０２】
一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、前述した１つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２０、２４、３６又は４８時間以下だけ増殖される。
【０２０３】
一部の実施形態において、細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体（例えば、抗ＣＤ３抗体）を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子（例えば、抗ＣＤ２８抗体）を刺激する薬剤とインビトロで接触されないか、又は接触される場合、接触させるステップは、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５若しくは５時間未満である。
【０２０４】
一部の実施形態において、細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体（例えば、抗ＣＤ３抗体）を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子（例えば、抗ＣＤ２８抗体）を刺激する薬剤と２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８時間インビトロで接触される。
【０２０５】
一部の実施形態において、本明細書に記載のサイトカインプロセスを用いて製造される細胞の集団は、細胞の集団を、例えばＣＤ３／ＴＣＲ複合体（例えば、抗ＣＤ３抗体）と結合する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子（例えば、抗ＣＤ２８抗体）と結合する薬剤と接触させるステップをさらに含む以外には類似の方法によって作製された細胞と比べて、ＣＡＲ発現細胞の中でナイーブ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０％高い）を示す。
【０２０６】
一部の実施形態において、本明細書に記載のサイトカインプロセスは、０、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５又は８％以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載のサイトカインプロセスは、ＬＳＤ１阻害剤、ＭＡＬＴ１阻害剤又はそれらの組み合わせを含む細胞培地中で実施される。
【０２０７】
活性化プロセス
一部の実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法を提供し、これは、（ｉ）細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたＴ細胞）の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップ；（ｉｉ）細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を提供するステップ、及び（ｉｉｉ）保存（例えば、凍結保存培地中の細胞の集団を再製剤化すること）又は投与のために細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を採取するステップを含み、（ａ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に又はステップ（ｉ）の開始後の２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１８時間以内に実施され、及びステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後の２６時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の２２、２３又は２４時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の２４時間以内に実施されるか；（ｂ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に又はステップ（ｉ）の開始後の２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後の１８時間後に実施され、及びステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）の開始後の３０時間以内、例えばステップ（ｉｉ）の開始後の２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内に実施されるか；又は（ｃ）ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は、例えば、ステップ（ｉ）の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、ＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、プラスミド上にある。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）における核酸分子は、いずれのベクター上にもない。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む。
【０２０８】
一部の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団は、対象からのアフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）から収集される。
【０２０９】
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）を対象から採取し、凍結サンプル（例えば、凍結保存サンプル）として細胞製造施設に輸送する。次に、凍結アフェレーシスサンプルを解凍した後、例えばセルソーティング機（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を用いて、アフェレーシスサンプルからＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を選択する。続いて、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を、本明細書に記載の活性化プロセスを用いるＣＡＲＴ製造のために接種する。一部の実施形態では、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ製造のために接種する前に、１ラウンド以上の凍結−解凍工程に付す。
【０２１０】
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）を対象から採取し、新鮮な産物（例えば、凍結していない産物）として細胞製造施設に輸送する。例えば、セルソーティング機（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を用いて、アフェレーシスサンプルからＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を選択する。続いて、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を、本明細書に記載の活性化プロセスを用いるＣＡＲＴ製造のために接種する。一部の実施形態では、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ製造のために接種する前に、１ラウンド以上の凍結−解凍工程に付す。
【０２１１】
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）を対象から採取する。例えば、セルソーティング機（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を用いて、アフェレーシスサンプルからＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を選択する。続いて、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を凍結サンプル（例えば、凍結保存サンプル）として細胞製造施設に輸送する。選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を後に解凍し、本明細書に記載の活性化プロセスを用いるＣＡＲＴ製造のために接種する。
【０２１２】
一部の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体と例えば１２時間接触させた後、ＣＡＲをコードするベクター（例えば、レンチウイルスベクター）による形質導入を実施する。培養開始から２４時間後、細胞を洗浄し、保存又は投与のために製剤化する。
【０２１３】
理論に縛られることを意図しないが、短時間のＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激によって自己再生Ｔ細胞の効率的な形質導入が促進され得る。伝統的なＣＡＲＴ製造アプローチと比較して、本明細書に提供される活性化プロセスは、長時間のエクスビボ増殖を伴わない。サイトカインプロセスと同様に、本明細書に提供される活性化プロセスも、ＣＡＲＴ製造中、未分化Ｔ細胞を保存する。
【０２１４】
一部の実施形態では、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる。
【０２１５】
一部の実施形態において、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、ＣＤ３を刺激する薬剤である。一部の実施形態において、共刺激分子を刺激する薬剤は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＣＤ２、ＣＤ２２６又はそれらの任意の組み合わせを刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、ＣＤ２８を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、抗体（例えば、単一ドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン抗体）、ペプチボディ、Ｆａｂフラグメント若しくはｓｃＦｖ）、小分子又はリガンド（例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド）から選択される。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、抗体である。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、抗ＣＤ３抗体である。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、抗体（例えば、単一ドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン抗体）、ペプチボディ、Ｆａｂフラグメント若しくはｓｃＦｖ）、小分子又はリガンド（例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド）から選択される。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、抗体である。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体である。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤又は共刺激分子を刺激する薬剤は、ビーズを含まない。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、コロイドポリマーナノマトリックスに共有結合された抗ＣＤ３抗体を含む。一部の実施形態では、共刺激分子を刺激する薬剤は、コロイドポリマーナノマトリックスに共有結合された抗ＣＤ２８抗体を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び共刺激分子を刺激する薬剤は、Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を含む。
【０２１６】
一部の実施形態において、マトリックスは、例えば、細胞に対して非毒性であるポリマー、例えば生分解性若しくは生体適合性の不活性材料を含むか又はそれから構成される。一部の実施形態では、マトリックスは、親水性ポリマー鎖から構成され、これは、鎖の水和によって水溶液中で最大可動性を取得する。一部の実施形態において、可動性マトリックスは、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖、グリコサミノグリカン又は細胞外マトリックス組成物からなるものであり得る。多糖としては、例えば、セルロースエーテル、デンプン、アラビアガム、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、キサンタン、グアーガム又はアルギン酸塩を挙げることができる。他のポリマーとしては、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリクオタニウムポリマー、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ブロックコポリマー又はポリウレタンが挙げられる。一部の実施形態において、可動性マトリックスは、デキストランのポリマーである。
【０２１７】
一部の実施形態では、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団を、ＣＡＲをコードするＤＮＡで形質導入する。
【０２１８】
一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップと同時に行う。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０．５時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の２０時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１９時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１８時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１７時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１６時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１５時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１４時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１４時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１３時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１２時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１１時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１０時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の９時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の８時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の７時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の６時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の５時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の４時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の３時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の２時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の１時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の３０分以内に実施する。
【０２１９】
一部の実施形態では、保存又は投与のために細胞の集団を採取する。
【０２２０】
一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の７２、６０、４８、３６、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９又は１８時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の２６時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の２５時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の２４時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の２３時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。一部の実施形態において、細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の２２時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。
【０２２１】
一部の実施形態において、細胞の集団はエクスビボで増殖されない。
【０２２２】
一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて５％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて１０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて１５％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて２０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて２５％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて３０％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて３５％以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は上記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて４０％以下だけ増殖される。
【０２２３】
一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、前述した１つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２０、２４、３６又は４８時間以下だけ増殖される。
【０２２４】
一部の実施形態において、活性化プロセスは、無血清細胞培地中で実施される。一部の実施形態において、活性化プロセスは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））又はＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ））から選択される１つ以上のサイトカインを含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態において、ｈｅｔＩＬ−１５は、
【化１】
2021534783.tif 000002
のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ｈｅｔＩＬ−１５は、配列番号３０９と少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、活性化プロセスは、ＬＳＤ１阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態において、活性化プロセスは、ＭＡＬＴ１阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態において、無血清細胞培地は、血性代替品を含む。一部の実施形態において、血清代替品は、ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＩＣＳＲ）である。一部の実施形態において、ＩＣＳＲのレベルは、例えば、最大５％、例えば約１％、２％、３％、４％又は５％であり得る。理論に縛られることを意図しないが、ＩＣＳＲ、例えば２％ＩＣＳＲを含有する細胞培地、例えば表２１若しくは表２５に示すラピッドメディア（Ｒａｐｉｄ  Ｍｅｄｉａ）を使用すれば、本明細書に記載の製造プロセス中の細胞生存能力を向上させることができる。
【０２２５】
一部の実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法を提供し、これは、（ａ）対象から採取したアフェレーシスサンプル（例えば、新鮮な又は凍結保存された白血球アフェレーシスサンプル）を用意するステップ；（ｂ）アフェレーシスサンプルからＴ細胞を選択する（例えば、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はビーズなしの選択を用いて）ステップ；（ｃ）単離したＴ細胞を例えば１×１０６〜１×１０７細胞／ｍＬで接種するステップ；（ｄ）Ｔ細胞を、Ｔ細胞を刺激する薬剤、例えばＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる（例えば、Ｔ細胞を抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体と接触させる、例えばＴ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔと接触させる）ステップ；（ｅ）Ｔ細胞を、ＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）と例えば６〜４８時間、例えば２０〜２８時間接触させる（例えば、Ｔ細胞を、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むウイルスと接触させる）ステップ；及び（ｆ）保存（例えば、凍結保存培地中でＴ細胞を製剤化すること）又は投与のためにＴ細胞を洗浄及び採取するステップを含む。一部の実施形態において、ステップ（ｆ）は、ステップ（ｄ）又は（ｅ）の開始後の３０時間以内、例えばステップ（ｄ）又は（ｅ）の開始後の２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内に実施される。
【０２２６】
本明細書に開示されるプロセスにより製造されるＣＡＲ発現細胞の集団
一部の実施形態において、本開示は、例えば、本明細書に記載の製造方法のいずれかにより作製され、ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を特徴とし、ここで、操作された免疫エフェクター細胞は、抗腫瘍特性を呈示する。一部の実施形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な抗原は、本明細書に記載の癌関連抗原である。一部の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、ＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲは、細胞表面に発現される。一部の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、細胞は、ＣＡＲを安定して発現することができる。一部の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、ＣＡＲをコードする核酸、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡでトランスフェクトされる。一部のこうした実施形態において、細胞は、ＣＡＲを一過性発現し得る。
【０２２７】
一部の実施形態では、本明細書に記載される製造方法（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセス）のいずれかにより作製され、ＣＡＲを発現するように操作された細胞（例えば、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞）の集団が提供される。
【０２２８】
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、製造プロセスの開始時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時）の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージと比べて、（１）同じであるか、（２）例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５％以下だけ異なるか、又は（３）少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５％だけ増加される。一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団は、２６時間超継続する（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日超継続する）か、又は３日超（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５日にわたりインビトロで細胞の集団を増殖させるステップを含む以外には類似の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のより高いパーセンテージ（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０％高い）を示す。
【０２２９】
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５若しくは６０％以上である。
【０２３０】
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、製造プロセスの開始時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時）の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージと比べて、（１）同じであるか、（２）例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５％以下だけ異なるか、又は（３）少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４若しくは２５％だけ減少される。一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団は、例えば２６時間超持続する（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日超持続する）か、又は例えば３日超にわたりインビトロで細胞の集団を増殖させる（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５日にわたりインビトロで細胞の集団を増殖させる）ステップを含む以外には類似の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のより低いパーセンテージ（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０％低い）を示す。
【０２３１】
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージは、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％以下である。
【０２３２】
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団は、インビボで投与された後、例えば２６時間超持続する（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２日超持続する）か、又は例えば３日超にわたりインビトロで細胞の集団を増殖させる（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５日にわたりインビトロで細胞の集団を増殖させる）ステップを含む以外には類似の方法によって作製された細胞と比べて、長時間持続するか又は高い（例えば、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５若しくは９０％高い）レベルで増殖する（例えば、図４Ｃを参照にして実施例１に記載される方法を用いて評価されるように）。
【０２３３】
一部の実施形態において、細胞の集団は、製造プロセスの開始前（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始前）にＩＬ６Ｒ発現細胞（例えば、ＩＬ６Ｒα及び／又はＩＬ６Ｒβ）について濃縮されている。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、製造プロセスの開始時（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時）に、例えば３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％以下のＩＬ６Ｒ発現細胞（例えば、ＩＬ６Ｒα及び／又はＩＬ６Ｒβについて陽性の細胞）を含む。
【０２３４】
医薬組成物
さらに、本開示は、ＣＡＲ発現細胞組成物並びに疾患の中でも、とりわけ癌又は本明細書に記載の腫瘍抗原を発現する細胞若しくは組織を含むあらゆる悪性若しくは自己免疫疾患を処置するための薬剤又は方法でのそれらの使用を提供する。一部の実施形態では、１種以上の薬学的に又は生理的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載の製造プロセス（例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセス）により作製される、ＣＡＲ発現細胞、例えば複数のＣＡＲ発現細胞を含む医薬組成物が提供される。
【０２３５】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、免疫エフェクター細胞を、癌に指向させる、１つ以上のＣＡＲを含有するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を提供する。これは、癌関連抗原に対して特異的であるＣＡＲ上の抗原結合ドメインを通して達成される。本明細書に記載のＣＡＲにより標的化され得る２つのクラスの癌関連抗原（腫瘍抗原）が存在する：（１）癌細胞の表面に発現される癌関連抗原；及び（２）それ自体は細胞内であるが、そのような抗原のフラグメント（ペプチド）がＭＨＣ（主要組織適合複合体）により癌細胞の表面に提示される、癌関連抗原。
【０２３６】
従って、免疫エフェクター細胞（例えば、本明細書に記載の方法によって得られるもの）は、以下の癌関連抗原（腫瘍抗原）の１つを標的とするＣＡＲを含有するように操作することができる：ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−β、ＰＲＳＳ２１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ及びｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２。
【０２３７】
本明細書に記載されるＣＡＲ分子の一部となり得る様々な成分の非限定的な例の配列を表１に列挙し、ここで、「ａａ」は、アミノ酸を表し、「ｎａ」は、対応するペプチドをコードする核酸を表す。
【０２３８】
【表１】
2021534783.tif 000003
【０２３９】
【表２】
2021534783.tif 000004
【０２４０】
【表３】
2021534783.tif 000005
【０２４１】
【表４】
2021534783.tif 000006
【０２４２】
【表５】
2021534783.tif 000007
【０２４３】
二特異性ＣＡＲ
一部の実施形態において、多特異性抗体分子は二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、２以下の抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列及び第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。一部の実施形態において、第１及び第２のエピトープは同じ抗原、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）である。一部の実施形態において、第１及び第２のエピトープは重複する。一部の実施形態において、第１及び第２のエピトープは重複しない。一部の実施形態において、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）にある。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第１のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列並びに第２のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第１のエピトープに結合特異性を有する半抗体及び第２のエピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第１のエピトープに結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメント及び第２のエピトープに結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメントを含む。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第１のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメント及び第２のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントを含む。
【０２４４】
特定の実施形態において、抗体分子は、多特異性（例えば、二特異性又は三特異性）抗体分子である。二重特異性又はヘテロ二量体性抗体分子を産生するためのプロトコル及び二重特異性抗体分子の様々な構成は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落４５５〜４５８に記載されており、その全体が参照により組み込まれる。
【０２４５】
一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えば、ｓｃＦｖにより特徴付けられ、これは、ＣＤ１９に結合特異性を有し、例えば、本明細書に記載されるようなｓｃＦｖを含むか、又は本明細書に記載のｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲ及び／又は重鎖ＣＤＲ及び第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を異なる抗原に含む。
【０２４６】
キメラＴＣＲ
一部の実施形態において、本発明の抗原及び抗原フラグメント（例えば、ＣＤ１９抗体及びフラグメント）を、キメラＴＣＲを作るために、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）鎖の１つ以上の定常ドメイン、例えば、ＴＣＲα又はＴＣＲβ鎖に移植できる。理論に縛られないが、キメラＴＣＲは、抗原結合によりＴＣＲ複合体を経てシグナル伝達すると考えられる。例えば、本明細書に記載するようなｓｃＦｖを、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖の定常ドメイン、例えば、少なくとも細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの部分に移植できる。別の例として、抗体フラグメント、例えば本明細書に記載されるようなＶＬドメインを、ＴＣＲα鎖の定常ドメインに移植でき、抗体フラグメント、例えば本明細書に記載されるようなＶＨドメインを、ＴＣＲβ鎖の定常ドメインに移植できる（又は代わりにＶＬドメインをＴＣＲβ鎖の定常ドメインに移植し得、ＶＨドメインを、ＴＣＲα鎖に移植し得る）。別の例として、抗体又は抗体フラグメントのＣＤＲは、キメラＴＣＲを作るために、ＴＣＲα鎖及び／又はβ鎖に移植され得る。例えば、本明細書に記載のＬＣＤＲをＴＣＲα鎖の可変ドメインに移植し得、本明細書に記載のＨＣＤＲをＴＣＲβ鎖の可変ドメインに移植し得るか又はその逆も可能である。このようなキメラＴＣＲは、例えば、当技術分野で公知の方法により産生し得る（例えば、Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０００；７：１３６９−１３７７；Ｚｈａｎｇ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００４；１１：４８７−４９６；Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ａｐｒ；１９（４）：３６５−７４）。
【０２４７】
非抗体足場
実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小モジュラー免疫医薬品、マキシボディ、プロテインＡ又はアフィリンを含む。非抗体足場は、細胞上の標的抗原に結合する能力を有する。実施形態において、抗原結合ドメインは、細胞上で発現される天然に存在するタンパク質のポリペプチド又はそのフラグメントである。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場を含む。得られるポリペプチドが標的細胞上の標的抗原に特異的に結合する少なくとも１つの結合領域を含む限り、多様な非抗体足場を使用することができる。
【０２４８】
非抗体足場は、フィブロネクチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ及びＡｂｌｙｎｘ  ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、ベルギー）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、ドイツ）、小モジュラー免疫医薬品（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ、スウェーデン）及びアフィリン（γクリスタリン又はユビキチン）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、ドイツ）を含む。
【０２４９】
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、標的細胞の表面上の対リガンドに結合する分子の細胞外ドメイン又はその対リガンド結合フラグメントを含む。
【０２５０】
免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする配列を含む組換えＤＮＡ構築物を含むことができ、ＣＡＲは、腫瘍抗原、例えば本明細書に記載の腫瘍抗原及び細胞内シグナル伝達ドメインに特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体フラグメント、ＴＣＲ又はＴＣＲフラグメント）を含む。細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ζ鎖を含み得る。他の箇所に記載されるように、本明細書に記載される方法は、細胞（例えば、Ｔ制御性枯渇細胞の集団からのもの）を、ＣＡＲ、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸で形質導入することを含み得る。
【０２５１】
一部の実施形態において、ＣＡＲはｓｃＦｖドメインを含み、ｓｃＦｖの前には、配列番号１に提供されるような任意選択のリーダー配列があり得、後ろには、配列番号２又は配列番号３６又は配列番号３８に提供されるような任意選択のヒンジ配列、配列番号６に提供されるような膜貫通領域、配列番号７又は配列番号１６を含む細胞内シグナル伝達ドメイン及び配列番号９又は配列番号１０を含むＣＤ３ζ配列があり得、例えば、これらのドメインは、連続しており、同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。
【０２５２】
一部の実施形態において、例示的ＣＡＲ構築物は、任意選択のリーダー配列（例えば、本明細書に記載されるリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載される抗原結合ドメイン）、ヒンジ（例えば、本明細書に記載されるヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載される膜貫通ドメイン）及び細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載される細胞内刺激ドメイン）を含む。一部の実施形態において、例示的ＣＡＲ構築物は、任意選択のリーダー配列（例えば、本明細書に記載されるリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載される抗原結合ドメイン）、ヒンジ（例えば、本明細書に記載されるヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載される膜貫通ドメイン）、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載される共刺激シグナル伝達ドメイン）及び／又は細胞内一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載される一次シグナル伝達ドメイン）を含む。
【０２５３】
例示的なリーダー配列は、配列番号１として提供される。ヒンジ／スペーサー配列の例は、配列番号２又は配列番号３６又は配列番号３８として提供される。例示的な膜貫通ドメイン配列は、配列番号６として提供される。例示的な４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの配列は、配列番号７として提供される。例示的なＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの配列の例は、配列番号１６として提供される。例示的なＣＤ３ζドメイン配列は、配列番号９又は配列番号１０として提供される。
【０２５４】
一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸構築物を含み、核酸分子は、抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、この配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に連続しており、それと同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲに使用し得る例示的細胞内シグナル伝達ドメインには、限定されないが、例えばＣＤ３−ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。一部の例では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含み得る。
【０２５５】
所望の分子をコードする核酸配列は、標準的な技法を用いて、例えば核酸分子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによるか、それを含むことが知られるベクターから核酸分子を誘導することによるか、又はそれを含む細胞及び組織から直接単離することによるなど、当技術分野において公知の組換え方法を用いて得ることができる。代わりに、目的の核酸はクローニングでなく、むしろ合成的に作製することができる。
【０２５６】
ＣＡＲをコードする核酸は、例えばレトロウイルス又はレンチウイルスベクター構築物を使用して、免疫エフェクター細胞に導入することができる。
【０２５７】
ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、細胞に直接トランスフェクトされ得るＲＮＡ構築物を使用しても免疫エフェクター細胞に導入され得る。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡの作成方法には、特別に設計したプライマーによるテンプレートのインビトロ転写（ＩＶＴ）と、続くポリ（Ａ）付加が含まれ、それにより、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）（例えば、本明細書に記載の３’及び／又は５’ＵＴＲ）、５’キャップ（例えば、本明細書に記載の５’キャップ）及び／又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、本明細書に記載のＩＲＥＳ）、発現させようとする核酸及びポリ（Ａ）テールを含む構築物、典型的には５０〜２０００塩基長（例えば、実施例に記載されるもの、例えば、配列番号３５）が産生される。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞において効率的にトランスフェクトされ得る。一部の実施形態において、テンプレートは、ＣＡＲの配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターは、電気穿孔によって細胞、例えばＴ細胞に、形質導入される。
【０２５８】
抗原結合ドメイン
一部の実施形態において、複数の免疫エフェクター細胞、例えばＴ制御性枯渇細胞の集団は、抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合要素を含むＣＡＲをコードする核酸を含む。結合要素の選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドのタイプ及び数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。従って、本明細書に記載のＣＡＲにおいて抗原結合ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌及び寄生虫感染、自己免疫疾患並びに癌細胞に関連するものが含まれる。
【０２５９】
一部の実施形態において、抗原結合ドメインを含むＣＡＲの一部分は、腫瘍抗原、例えば本明細書に記載される腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。
【０２６０】
抗原結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びその機能性フラグメント、例えば、限定されないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ科動物由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）などのシングルドメイン抗体及び組換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はそのフラグメント、例えば、単鎖ＴＣＲなど、抗原結合ドメインとして機能することが当技術分野において公知の代替的足場を含め、抗原に結合する任意のドメインであり得る。一部の例において、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが最終的に使用されることになる同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトでの使用には、ＣＡＲの抗原結合ドメインが抗体又は抗体フラグメントの抗原結合ドメインにヒト又はヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【０２６１】
ＣＤ１９ＣＡＲ
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞（例えば、ヒトＣＤ１９に結合するＣＡＲを発現する細胞）である。
【０２６２】
一部の実施形態において、ＣＤ１９ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６−１７）：１１５７−１１６５（１９９７）に記載されるＦＭＣ６３ｓｃＦｖフラグメントと同じであるか又は類似の結合特異性を有する。一部の実施形態において、ＣＤ１９ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６−１７）：１１５７−１１６５（１９９７）に記載されるｓｃＦｖフラグメントを含む。
【０２６３】
一部の実施形態において、ＣＤ１９ＣＡＲは、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表３に従う抗原結合ドメイン（例えば、ヒト化抗原結合ドメイン）を含む。国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットは、様々なＣＡＲ構築物の結合及び有効性をアッセイする方法も記載する。
【０２６４】
一部の実施形態において、親マウスｓｃＦｖ配列は、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＣＡＲ１９構築物である。一部の実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットに記載されるｓｃＦｖである。
【０２６５】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットの配列番号１２に記載される融合ポリペプチド配列を含み、これは、ヒトＣＤ１９に特異的に結合するマウス由来のｓｃＦｖフラグメントを提供する。
【０２６６】
一部の実施形態において、ＣＤ１９ＣＡＲは、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットの配列番号１２に記載されるアミノ酸配列を含む。
【０２６７】
一部の実施形態において、アミノ酸配列は、
【化２】
2021534783.tif 000008
又はそれに対して実質的に相動性の配列である。
【０２６８】
一部の実施形態において、ＣＤ１９ＣＡＲは、ＵＳＡＮ名ＴＩＳＡＧＥＮＬＥＣＬＥＵＣＥＬ−Ｔを有する。実施形態において、ＣＴＬ０１９は、Ｔ細胞の遺伝子改変によって作製され、この改変は、ＥＦ−１αプロモーターの制御下のＣＴＬ０１９導入遺伝子を含有する自己不活性化、複製欠損レンチウイルス（ＬＶ）ベクターでの形質導入による安定的挿入によって媒介される。ＣＴＬ０１９は、パーセント導入遺伝子陽性Ｔ細胞に基づいて対象に送達される導入遺伝子陽性Ｔ細胞と導入遺伝子陰性Ｔ細胞の混合物であり得る。
【０２６９】
他の実施形態において、ＣＤ１９ＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットの表３に記載の抗原結合ドメイン（例えば、ヒト化抗原結合ドメイン）を含む。
【０２７０】
マウスＣＤ１９抗体のヒト化は、マウス特異的残基が、ＣＡＲＴ１９処置、すなわちＣＡＲ１９構築物で形質導入されたＴ細胞による処置を受ける患者にヒト−抗−マウス抗原（ＨＡＭＡ）応答を誘導し得る臨床現場において望ましい。ヒト化ＣＤ１９ＣＡＲ配列の生成、特性決定及び有効性について、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に、実施例１〜５（ｐ．１１５〜１５９）を含め、記載されている。
【０２７１】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、
【化３】
2021534783.tif 000009
のアミノ酸配列を含むヒト化ＣＤ１９ＣＡＲである。
【０２７２】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、
【化４】
2021534783.tif 000010
のアミノ酸配列を含むヒト化ＣＤ１９ＣＡＲである。
【０２７３】
いずれか既知のＣＤ１９ＣＡＲ、例えばいずれか既知のＣＤ１９ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合ドメインを当技術分野において本開示に従って使用することができる。例えば、ＬＧ−７４０；米国特許第８，３９９，６４５号明細書；米国特許第７，４４６，１９０号明細書；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２０１３  ５４（２）：２５５−２６０（２０１２）；Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２２（１７）：２９６５−２９７３（２０１３）；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８（１８）：４８１７−４８２８（２０１１）；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１６（２０）：４０９９−１０２（２０１０）；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２２（２５）：４１２９−３９（２０１３）；及び１６ｔｈ  Ａｎｎｕ  Ｍｅｅｔ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｇｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒ（ＡＳＧＣＴ）（Ｍａｙ  １５−１８，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ）２０１３，Ａｂｓｔ  １０に記載のＣＤ１９ＣＡＲである。
【０２７４】
例示的なＣＤ１９ＣＡＲは、本明細書に記載されるＣＤ１９ＣＡＲ又はＸｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２３．２４（２０１４）：３７５０−９；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２２．２５（２０１３）：４１２９−３９，Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２２．１７（２０１３）：２９６５−７３、ＮＣＴ００５８６３９１、ＮＣＴ０１０８７２９４、ＮＣＴ０２４５６３５０、ＮＣＴ００８４０８５３、ＮＣＴ０２６５９９４３、ＮＣＴ０２６５０９９９、ＮＣＴ０２６４０２０９、ＮＣＴ０１７４７４８６、ＮＣＴ０２５４６７３９、ＮＣＴ０２６５６１４７、ＮＣＴ０２７７２１９８、ＮＣＴ００７０９０３３、ＮＣＴ０２０８１９３７、ＮＣＴ００９２４３２６、ＮＣＴ０２７３５０８３、ＮＣＴ０２７９４２４６、ＮＣＴ０２７４６９５２、ＮＣＴ０１５９３６９６、ＮＣＴ０２１３４２６２、ＮＣＴ０１８５３６３１、ＮＣＴ０２４４３８３１、ＮＣＴ０２２７７５２２、ＮＣＴ０２３４８２１６、ＮＣＴ０２６１４０６６、ＮＣＴ０２０３０８３４、ＮＣＴ０２６２４２５８、ＮＣＴ０２６２５４８０、ＮＣＴ０２０３０８４７、ＮＣＴ０２６４４６５５、ＮＣＴ０２３４９６９８、ＮＣＴ０２８１３８３７、ＮＣＴ０２０５０３４７、ＮＣＴ０１６８３２７９、ＮＣＴ０２５２９８１３、ＮＣＴ０２５３７９７７、ＮＣＴ０２７９９５５０、ＮＣＴ０２６７２５０１、ＮＣＴ０２８１９５８３、ＮＣＴ０２０２８４５５、ＮＣＴ０１８４０５６６、ＮＣＴ０１３１８３１７、ＮＣＴ０１８６４８８９、ＮＣＴ０２７０６４０５、ＮＣＴ０１４７５０５８、ＮＣＴ０１４３０３９０、ＮＣＴ０２１４６９２４、ＮＣＴ０２０５１２５７、ＮＣＴ０２４３１９８８、ＮＣＴ０１８１５７４９、ＮＣＴ０２１５３５８０、ＮＣＴ０１８６５６１７、ＮＣＴ０２２０８３６２、ＮＣＴ０２６８５６７０、ＮＣＴ０２５３５３６４、ＮＣＴ０２６３１０４４、ＮＣＴ０２７２８８８２、ＮＣＴ０２７３５２９１、ＮＣＴ０１８６０９３７、ＮＣＴ０２８２２３２６、ＮＣＴ０２７３７０８５、ＮＣＴ０２４６５９８３、ＮＣＴ０２１３２６２４、ＮＣＴ０２７８２３５１、ＮＣＴ０１４９３４５３、ＮＣＴ０２６５２９１０、ＮＣＴ０２２４７６０９、ＮＣＴ０１０２９３６６、ＮＣＴ０１６２６４９５、ＮＣＴ０２７２１４０７、ＮＣＴ０１０４４０６９、ＮＣＴ００４２２３８３、ＮＣＴ０１６８０９９１、ＮＣＴ０２７９４９６１又はＮＣＴ０２４５６２０７に記載される抗ＣＤ１９ＣＡＲを含み、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７５】
一部の実施形態において、ＣＤ１９ＣＡＲは、例えば、表２に開示されるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ若しくは完全ＣＡＲ配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
【０２７６】
【表６】
2021534783.tif 000011
【０２７７】
【表７】
2021534783.tif 000012
【０２７８】
【表８】
2021534783.tif 000013
【０２７９】
【表９】
2021534783.tif 000014
【０２８０】
ＢＣＭＡ  ＣＡＲ
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現細胞（例えば、ヒトＢＣＭＡに結合するＣＡＲを発現する細胞）である。例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲは、国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表１又は１６に開示される配列を含み得る。ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物は、任意選択のリーダー配列；任意選択ヒンジドメイン、例えばＣＤ８ヒンジドメイン；膜貫通ドメイン、例えばＣＤ８膜貫通ドメイン；細胞内ドメイン、例えば４−１ＢＢ細胞内ドメイン；並びに機能的シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζドメインを含み得る。特定の実施形態において、ドメインは、隣接しており、同じリーディングフレーム内で単一の融合タンパク質を形成する。他の実施形態において、ドメインは、例えば、本明細書に記載されるＲＣＡＲ分子と同様に、個別のポリペプチド内に存在する。
【０２８１】
一部の実施形態において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ分子は、１つ以上のＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ又は国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレットに開示されるＢＣＭＡ−１、ＢＣＭＡ−２、ＢＣＭＡ−３、ＢＣＭＡ−４、ＢＣＭＡ−５、ＢＣＭＡ−６、ＢＣＭＡ−７、ＢＣＭＡ−８、ＢＣＭＡ−９、ＢＣＭＡ−１０、ＢＣＭＡ−１１、ＢＣＭＡ−１２、ＢＣＭＡ−１３、ＢＣＭＡ−１４、ＢＣＭＡ−１５、１４９３６２、１４９３６３、１４９３６４、１４９３６５、１４９３６６、１４９３６７、１４９３６８、１４９３６９、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９７８−Ａ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９７８−Ｇ１、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９７９−Ｃ１、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９７８−Ｃ７、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９７８−Ｄ１０、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９７９−Ｃ１２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９８０−Ｇ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９８０−Ｄ２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９７８−Ａ１０、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９７８−Ｄ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９８０−Ａ２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９８１−Ｃ３、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ−Ｃ１９７８−Ｇ４、Ａ７Ｄ１２．２、Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１２Ａ３．２若しくはＣ１３Ｆ１２．１の完全長配列又はそれと実質的に（例えば、９５〜９９％）同一の配列を含む。
【０２８２】
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物に使用することができる別の例示的なＢＣＭＡ標的化配列は、国際公開第２０１７／０２１４５０号、同第２０１７／０１１８０４号、同第２０１７／０２５０３８号、同第２０１６／０９０３２７号、同第２０１６／１３０５９８号、同第２０１６／２１０２９３号、同第２０１６／０９０３２０号、同第２０１６／０１４７８９号、同第２０１６／０９４３０４号、同第２０１６／１５４０５５号、同第２０１５／１６６０７３号、同第２０１５／１８８１１９号、同第２０１５／１５８６７１号パンフレット、米国特許第９，２４３，０５８号、同第８，９２０，７７６号、同第９，２７３，１４１号、同第７，０８３，７８５号、同第９，０３４，３２４号明細書、米国特許出願第２００７／００４９７３５号、同第２０１５／０２８４４６７号、同第２０１５／００５１２６６号、同第２０１５／０３４４８４４号、同第２０１６／０１３１６５５号、同第２０１６／０２９７８８４号、同第２０１６／０２９７８８５号、同第２０１７／００５１３０８号、同第２０１７／００５１２５２号、同第２０１７／００５１２５２号、同第２０１６／０２０３３２号、同第２０１６／０８７５３１号明細書、国際公開第２０１６／０７９１７７号、同第２０１５／１７２８００号、同第２０１７／００８１６９号パンフレット、米国特許第９，３４０，６２１号、米国特許出願第２０１３／０２７３０５５号、同第２０１６／０１７６９７３号、同第２０１５／０３６８３５１号、同第２０１７／００５１０６８号、同第２０１６／０３６８９８８号及び同第２０１５／０２３２５５７号明細書に開示されており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、別の例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物は、国際公開第２０１２／０１６３８０５号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）からのＶＨ及びＶＬ配列を用いて作製される。
【０２８３】
一部の実施形態において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、配列、例えば表３〜１５に開示されるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ若しくは完全ＣＡＲ配列又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト抗体又はヒト抗体フラグメントを含む。一部の実施形態において、ヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に（例えば、表３〜１０及び１２〜１５に）記載されるヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインの１つ以上（例えば、全３つ）のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ、ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３並びに／又は本明細書に（例えば、表３〜１０及び１２〜１５に）記載されるヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインの１つ以上（例えば、全３つ）のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ、ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、ヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に（例えば、表３、７及び１２）に記載のヒトＶＬ並びに／又は本明細書に（例えば、表３、７及び１２）に記載のヒトＶＨを含む。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、表３、７及び１２のアミノ酸配列のＶＬ及びＶＨを含むｓｃＦｖである。一部の実施形態において、抗ＢＣＭＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、以下を含む：表３、７及び１２に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ若しくは３つの修飾（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０若しくは１０以下の修飾（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列又は表３、７及び１２のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含むＶＬ並びに／或いは表３、７及び１２に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ若しくは３つの修飾（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０若しくは１０以下の修飾（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列又は表３、７及び１２のアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含むＶＨ。
【０２８４】
【表１０】
2021534783.tif 000015
【０２８５】
【表１１】
2021534783.tif 000016
【０２８６】
【表１２】
2021534783.tif 000017
【０２８７】
【表１３】
2021534783.tif 000018
【０２８８】
【表１４】
2021534783.tif 000019
【０２８９】
【表１５】
2021534783.tif 000020
【０２９０】
【表１６】
2021534783.tif 000021
【０２９１】
【表１７】
2021534783.tif 000022
【０２９２】
【表１８】
2021534783.tif 000023
【０２９３】
【表１９】
2021534783.tif 000024
【０２９４】
【表２０】
2021534783.tif 000025
【０２９５】
【表２１】
2021534783.tif 000026
【０２９６】
【表２２】
2021534783.tif 000027
【０２９７】
【表２３】
2021534783.tif 000028
【０２９８】
【表２４】
2021534783.tif 000029
【０２９９】
【表２５】
2021534783.tif 000030
【０３００】
【表２６】
2021534783.tif 000031
【０３０１】
【表２７】
2021534783.tif 000032
【０３０２】
【表２８】
2021534783.tif 000033
【０３０３】
【表２９】
2021534783.tif 000034
【０３０４】
【表３０】
2021534783.tif 000035
【０３０５】
【表３１】
2021534783.tif 000036
【０３０６】
【表３２】
2021534783.tif 000037
【０３０７】
【表３３】
2021534783.tif 000038
【０３０８】
【表３４】
2021534783.tif 000039
【０３０９】
【表３５】
2021534783.tif 000040
【０３１０】
【表３６】
2021534783.tif 000041
【０３１１】
【表３７】
2021534783.tif 000042
【０３１２】
【表３８】
2021534783.tif 000043
【０３１３】
【表３９】
2021534783.tif 000044
【０３１４】
【表４０】
2021534783.tif 000045
【０３１５】
【表４１】
2021534783.tif 000046
【０３１６】
【表４２】
2021534783.tif 000047
【０３１７】
【表４３】
2021534783.tif 000048
【０３１８】
一部の実施形態において、ヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３を含む。
【０３１９】
特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ分子又は本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、以下を含む：
（１）以下から選択される１つ、２つ若しくは３つの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号５４のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号５５のＬＣ  ＣＤＲ２及び配列番号５６のＬＣ  ＣＤＲ３；及び／又は
（２）以下の１つからの１つ、２つ若しくは３つの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号４４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣ  ＣＤＲ２及び配列番号８４のＨＣ  ＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号４４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣ  ＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣ  ＣＤＲ３；（ｉｉｉ）配列番号４４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣ  ＣＤＲ２及び配列番号６８のＨＣ  ＣＤＲ３；又は（ｉｖ）配列番号４４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣ  ＣＤＲ２及び配列番号７６のＨＣ  ＣＤＲ３。
【０３２０】
特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ分子又は本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、以下を含む：
（１）以下の１つからの１つ、２つ若しくは３つの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号９５のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３１のＬＣ  ＣＤＲ２及び配列番号１３２のＬＣ  ＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号９５のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号９６のＬＣ  ＣＤＲ２及び配列番号９７のＬＣ  ＣＤＲ３；（ｉｉｉ）配列番号９５のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１１４のＬＣ  ＣＤＲ２及び配列番号１１５のＬＣ  ＣＤＲ３；又は（ｉｖ）配列番号９５のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１１４のＬＣ  ＣＤＲ２及び配列番号９７のＬＣ  ＣＤＲ３；並びに／又は
（２）以下の１つからの１つ、２つ若しくは３つの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号８６のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３０のＨＣ  ＣＤＲ２及び配列番号８８のＨＣ  ＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号８６のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号８７のＨＣ  ＣＤＲ２及び配列番号８８のＨＣ  ＣＤＲ３；又は（ｉｉｉ）配列番号８６のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１０９のＨＣ  ＣＤＲ２及び配列番号８８のＨＣ  ＣＤＲ３。
【０３２１】
特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ分子又は本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、以下を含む：
（１）以下の１つからの１つ、２つ若しくは３つの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号１４７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１８２のＬＣ  ＣＤＲ２及び配列番号１８３のＬＣ  ＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号１４７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１４８のＬＣ  ＣＤＲ２及び配列番号１４９のＬＣ  ＣＤＲ３；又は（ｉｉｉ）配列番号１４７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７０のＬＣ  ＣＤＲ２及び配列番号１７１のＬＣ  ＣＤＲ３；並びに／又は
（２）以下の１つからの１つ、２つ若しくは３つの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ：
（ｉ）配列番号１７９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１８０のＨＣ  ＣＤＲ２及び配列番号１８１のＨＣ  ＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号１３７のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３８のＨＣ  ＣＤＲ２及び配列番号１３９のＨＣ  ＣＤＲ３；又は（ｉｉｉ）配列番号１６０のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１６１のＨＣ  ＣＤＲ２及び配列番号１６２のＨＣ  ＣＤＲ３。
【０３２２】
一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４４、４５、８４、５４、５５及び５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４４、４５、４６、５４、５５及び５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４４、４５、６８、５４、５５及び５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４４、４５、７６、５４、５５及び５６のアミノ酸配列を含む。
【０３２３】
一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４７、４８、８４、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４７、４８、４６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４７、４８、６８、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４７、４８、７６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含む。
【０３２４】
一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４９、５０、８５、６０、５８及び５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４９、５０、５１、６０、５８及び５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４９、５０、６９、６０、５８及び５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４９、５０、７７、６０、５８及び５６のアミノ酸配列を含む。
【０３２５】
一部の実施形態において、ヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、ＶＨ（例えば、本明細書に記載のＶＨ）及びＶＬ（例えば、本明細書に記載のＶＬ）を含むｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、ＶＨは、リンカー、例えば本明細書に記載されるリンカー、例えば表１に記載のリンカーを介してＶＬに結合される。一部の実施形態において、ヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカーを含み、ここで、ｎは、１、２、３、４、５若しくは６、好ましくは３又は４である（配列番号２６）。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の配向：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域又は重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれでもあり得る。
【０３２６】
一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、断片、例えば単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２又は二機能性（例えば、二重特異性）ハイブリッドである（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））。一部の実施形態では、本発明の抗体及びその断片は、野生型又は増大した親和性でＢＣＭＡタンパク質と結合する。
【０３２７】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、当技術分野で公知の方法に従って調製することができる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）。ｓｃＦｖ分子は、柔軟なポリペプチドリンカーを用いてＶＨ及びＶＬ領域を互いに連結することによって生成することができる。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さ及び／又はアミノ酸組成物を備えるリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカー長さは、どのようにｓｃＦｖ分子の可変領域がフォールドし、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短いポリペプチドリンカー（例えば、５〜１０アミノ酸）を使用すると、鎖内フォールディングが妨げられる。また、鎖間フォールディングも、２つの可変領域を一緒にして、機能性エピトープ結合部位を形成するために必要である。例えば、リンカー配向及びサイズについて、例えばＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８、米国特許出願第２００５／０１００５４３号、同第２００５／０１７５６０６号、同第２００７／００１４７９４号明細書並びに国際公開第２００６／０２０２５８号パンフレット及び同第２００７／０２４７１５号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０３２８】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ及びＶＨ領域間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０若しくはそれを超えるアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、いずれの天然に存在するアミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸グリシン及びセリンを含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、一連のグリシン及びセリン反復、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ここで、ｎは、１以上の正の整数である）（配列番号２５）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２７）又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号２８）であり得る。リンカー長さの変化は、活性を保持又は増大して、活性試験で優れた有効性をもたらし得る。
【０３２９】
ＣＤ２０  ＣＡＲ
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞（例えば、ヒトＣＤ２０に結合するＣＡＲを発現する細胞）である。一部の実施形態では、ＣＤ２０  ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１６１６４７３１号パンフレット及び同第２０１８０６７９９２号パンフレットに従う抗原結合ドメインを含む。例示的なＣＤ２０結合配列又はＣＤ２０  ＣＡＲ配列は、例えば、国際公開第２０１８０６７９９２号パンフレットの表１〜５に開示されている。一部の実施形態では、ＣＤ２０  ＣＡＲは、国際公開第２０１８０６７９９２号パンフレット又は同第２０１６１６４７３１号パンフレットに開示されるＣＤＲ、可変領域、ｓｃＦｖ又は完全長配列を含む。
【０３３０】
ＣＤ２２  ＣＡＲ
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞（例えば、ヒトＣＤ２０に結合するＣＡＲを発現する細胞）である。一部の実施形態では、ＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１６１６４７３１号パンフレット及び同第２０１８０６７９９２号パンフレットに従う抗原結合ドメインを含む。例示的なＣＤ２２結合配列又はＣＤ２２  ＣＡＲ配列は、例えば、国際公開第２０１６１６４７３１号パンフレットの表６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０Ａ及び１０Ｂ並びに国際公開第２０１８０６７９９２号パンフレットの表６〜１０に開示されている。一部の実施形態では、国際公開第２０１８０６７９９２号パンフレット又は同第２０１６１６４７３１号パンフレットに開示されるＣＤ２２  ＣＡＲは、ＣＤＲ、可変領域、ｓｃＦｖ又は完全長配列を含む。
【０３３１】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２２に結合する抗原を含む（ＣＤ２２  ＣＡＲ）。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ２２を標的にする。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の単鎖Ｆｖ配列を含む。
【０３３２】
ヒトＣＤ  ＣＡＲの配列を以下に記載する。一部の実施形態では、ヒトＣＤ２２  ＣＡＲは、ＣＡＲ２２−６５である。
【０３３３】
ヒトＣＤ２２  ＣＡＲｓｃＦｖ配列
【化５】
2021534783.tif 000049
【０３３４】
ヒトＣＤ２２  ＣＡＲ重鎖可変領域
【化６】
2021534783.tif 000050
【０３３５】
ヒトＣＤ２２  ＣＡＲ軽鎖可変領域
【化７】
2021534783.tif 000051
【０３３６】
【表４４】
2021534783.tif 000052
【０３３７】
【表４５】
2021534783.tif 000053
【０３３８】
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１６に挙げる任意の重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む。複数の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３をさらに含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１７に挙げるＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０３３９】
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１７に挙げる任意の重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３の１つ、２つ若しくは全部と、表１６に挙げる任意の重鎖結合ドメインアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３の１つ、２つ若しくは全部を含む。
【０３４０】
一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバーリングスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａナンバーリングスキーム又はそれらの組み合わせに従って定義される。
【０３４１】
ＶＬ及びＶＨドメインがｓｃＦｖ内に出現する順序は変動する可能性があり（すなわちＶＬ−ＶＨ若しくはＶＨ−ＶＬ配向）、また各サブユニットが配列ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）（例えば、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２８）又は（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２７）を含む「Ｇ４Ｓ」サブユニット（配列番号２５）の１つ、２つ、３つ若しくは４つのコピーのいずれかは、可変ドメインを連結して、完全なｓｃＦｖドメインを形成することができる。代わりに、ＣＡＲ構築物は、例えば、配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４３）を含むリンカーを含み得る。代わりに、ＣＡＲ構築物は、例えば、配列ＬＡＥＡＡＡＫ（配列番号３０８）を含むリンカーを含み得る。一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物は、ＶＬ及びＶＨドメイン間にリンカーを含まない。
【０３４２】
これらのクローン、全てＣＤ３ζ鎖由来の共刺激ドメインのシグナルドメインにＱ／Ｋ残基変化を含んだ。
【０３４３】
ＥＧＦＲ  ＣＡＲ
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ発現細胞（例えば、ヒトＥＧＦＲに結合するＣＡＲを発現する細胞）である。一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ発現細胞（例えば、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するＣＡＲを発現する細胞）である。例示的なＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲは、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレット、例えば国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットの表２に開示される配列を含む。
【０３４４】
例示的なＥＧＦＲｖＩＩＩ結合配列又はＥＧＦＲ  ＣＡＲ配列は、国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットに開示されるＥＧＦＲ  ＣＡＲのＣＤＲ、可変領域、ｓｃＦｖ又は完全長ＣＡＲ配列を含み得る。
【０３４５】
メソテリンＣＡＲ
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、メソテリンＣＡＲ発現細胞（例えば、ヒトメソテリンに結合するＣＡＲを発現する細胞）である。例示的なメソテリンＣＡＲは、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１５０９０２３０号パンフレット及び同第２０１７１１２７４１号パンフレット、例えば国際公開第２０１７１１２７４１号パンフレットの表２、３、４及び５に開示される配列を含み得る。
【０３４６】
他の例示的なＣＡＲ
他の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３に特異的に結合することができ、例えば本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレットの表１〜２のＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲ１〜ＣＡＲ８）又は抗原結合ドメインを含み得る。ＣＤ１２３  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメイン（例えば、Ｋａｂａｔ若しくはＣｈｏｔｈｉａに従う１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ；及び１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲ）をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレットに明示されている。他の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３に特異的に結合することができ、例えば本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレットの表２、６及び９に従うＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲ１２３−１〜ＣＡＲ１２３−４及びｈｚＣＡＲ１２３−１〜ｈｚＣＡＲ１２３−３２のいずれか）又は抗原結合ドメインを含み得る。ＣＤ１２３  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメイン（例えば、Ｋａｂａｔ若しくはＣｈｏｔｈｉａに従う１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ；及び１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲ）をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレットに明示されている。
【０３４７】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のＣＬＬ１  ＣＡＲ、例えば本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書に記載されるＣＬＬ１  ＣＡＲを含む。複数の実施形態では、ＣＬＬ１  ＣＡＲは、アミノ酸を含むか、又は本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書に表示されるヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＬＬ−１に特異的に結合し、例えば本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１６／０１４５３５号パンフレットの表２に従うＣＡＲ分子又は抗原結合ドメインを含み得る。ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメイン（例えば、Ｋａｂａｔ若しくはＣｈｏｔｈｉａに従う１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ；及び１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲ）をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第２０１６／０１４５３５号パンフレットに明示されている。
【０３４８】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書に記載のＣＤ３３  ＣＡＲ、例えば本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書に記載されるＣＤ３３  ＣＡＲを含む。複数の実施形態では、ＣＤ３３  ＣＡＲは、アミノ酸を含むか、又は本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書に表示されるヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ３３に特異的に結合し、例えば本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレットの表２若しくは９に従うＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲ３３−１〜ＣＤ３３−９のいずれか）又は抗原結合ドメインを含み得る。ＣＤ３３  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメイン（例えば、Ｋａｂａｔ若しくはＣｈｏｔｈｉａに従う１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ；及び１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲ）をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレットに明示されている。
【０３４９】
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５−０２８３１７８−Ａ１号明細書、２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５Ａ１号明細書又は国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載の抗体）及び／又は本明細書に記載の抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５−０２８３１７８−Ａ１号明細書、２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５Ａ１号明細書又は国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載の抗体）を含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。
【０３５０】
実施形態において、抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５−０２８３１７８−Ａ１号明細書、２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５Ａ１号明細書又は国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットに記載の抗原結合ドメインである。
【０３５１】
実施形態において、抗原結合ドメインはＢＣＭＡを標的とし、米国特許出願公開第２０１６−００４６７２４−Ａ１号明細書に記載されている。実施形態において、抗原結合ドメインはＣＤ１９を標的とし、米国特許出願公開第２０１５−０２８３１７８−Ａ１号明細書に記載されている。実施形態において、抗原結合ドメインはＣＤ１２３を標的とし、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１Ａ１号明細書に記載されている。実施形態において、抗原結合ドメインはＣＬＬ１を標的とし、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１Ａ１号明細書に記載されている。実施形態において、抗原結合ドメインはＣＤ３３を標的とし、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２Ａ１号明細書に記載されている。
【０３５２】
ＣＡＲ発現細胞を使用して標的とすることができる例示的な標的抗原には、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット、国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレット、国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレット、国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレット、国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４５３５号パンフレット及び国際公開第２０１６／０２５８８０号パンフレットに記載されるように、とりわけ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ３３、メソテリン、ＢＣＭＡ及びＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０３５３】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４に特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０２５８８０号パンフレットの表２に記載のＣＡＲ分子又は抗原結合ドメインを含み得る。ＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４  ＣＡＲ分子及び抗原結合ドメインをコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列（例えば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲ及びＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによる１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）は、国際公開第２０１６／０２５８８０号パンフレットで特定されている。
【０３５４】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ分子のいずれかの抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ３３、メソテリン、ＢＣＭＡ及びＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４）は、上に挙げた抗体由来の１つ、２つ、３つ（例えば、全３つの）重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３及び／又は上に挙げた抗原結合ドメイン由来の１つ、２つ、３つ（例えば、全３つの）軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、上に列挙若しくは記載した抗体の重鎖可変領域及び／又は可変軽鎖領域を含む。
【０３５５】
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、上に挙げた抗体由来の１つ、２つ、３つ（例えば、全３つの）重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３及び／又は上に挙げた抗原結合ドメイン由来の１つ、２つ、３つ（例えば、全３つの）軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、上に列挙若しくは記載した抗体の重鎖可変領域及び／又は可変軽鎖領域を含む。
【０３５６】
一部の実施形態において、腫瘍抗原は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日出願の国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットに記載の腫瘍抗原である。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、１９Ａ２４とも称される）；Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ−１又はＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ  Ａｇ）又は（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットα２（ＩＬ−１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体α（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テスティシン又はＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ−β）；ステージ特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体α；受容体チロシンタンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロテアーゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異体（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、βタイプ、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ���；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲγ代替オープンリーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；染色体１２ｐ上に位置するＥＴＳ転座変異体遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫癌精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫癌精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）；生存；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１又はガレクチン８）、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫由来アポトーシス阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型プロテーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロムＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ、すなわちＢｒｏｔｈｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｓｉｔｅｓ）；Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘ染色体切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎ユビキタス１（ＲＵ１）；腎ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ  Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ  Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２変異体（ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ又はＣＤ８９）；白血球関連免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メン���ーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；並びに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）の１つ以上から選択される。
【０３５７】
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２及びＨＣ  ＣＤＲ３並びに／又は上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２及びＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙又は記載した抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。
【０３５８】
一部の実施形態において、抗腫瘍抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような抗癌関連抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２又は二機能性（例えば、二特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））である。一部の実施形態において、本発明の抗体及びそのフラグメントは、野生型又は増強した親和性で本明細書に記載されるような癌関連抗原に結合する。
【０３５９】
ある例において、ｓｃＦｖｓは、当技術分野で公知の方法により製造できる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。ＳｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域とＶＬ領域を一緒に連結することにより産生できる。ｓｃＦｖ分子は、最適長及び／又はアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカーを用いる場合、（例えば、５〜１０アミノ酸）、鎖内折りたたみは阻止される。鎖内折りたたみは、２可変領域が一体となって機能的エピトープ結合部位を形成させるためにも必要である。リンカー方向及びサイズの例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、同第２００５／０１７５６０６号、同第２００７／００１４７９４号明細書及び国際公開第２００６／０２０２５８号パンフレット及び国際公開第２００７／０２４７１５号パンフレットを参照されたい。
【０３６０】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域との間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれを超えるアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。一実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸グリシン及びセリンを含む。一部の実施形態において、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ここで、ｎは１つ以上の正の整数である）など、一連のグリシン及びセリン反復を含む（配列番号２５）。一部の実施形態において、リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２７）又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号２８）であり得る。リンカー長の変動は、活性を維持又は増強し、活性試験において優れた有効性を生じ得る。
【０３６１】
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）又はそのフラグメント、例えば単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。そのようなＴＣＲを作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、ｉｌｌｅｍｓｅｎ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１３６９−１３７７（２０００）；Ｚｈａｎｇ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：４８７−４９６（２００４）；Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９（４）：３６５−７４（２０１２）（参考文献はその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。例えば、リンカー（例えば、柔軟なペプチド）によって連結されたＴ細胞クローン由来のＶα及びＶβ遺伝子を含むｓｃＴＣＲを操作することができる。このアプローチは、それ自体が細胞内にある癌関連標的にとって非常に有用であるが、そのような抗原（ペプチド）のフラグメントは、ＭＨＣによって癌細胞の表面に提示される。
【０３６２】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１つ以上のさらなるアミノ酸、例えば膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域と関係する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜最大で１５のアミノ酸）及び／又は膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と関係する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜最大で１５のアミノ酸）を含み得る。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインの１つに関連して使用されるものである。ある例において、膜貫通ドメインは、このようなドメインが、同一又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合するのを避けるように、例えば受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように選択され又はアミノ酸置換による改変ができる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞表面上の別のＣＡＲとホモ二量体化できる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴに存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように改変又は置換され得る。
【０３６３】
膜貫通ドメインは、天然由来又は組換え源由来であり得る。源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合又は膜貫通タンパク質由来であり得る。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合したときは常に細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α、ＣＤ８β）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、少なくとも、共刺激分子、例えばＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１  （ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドの膜貫通領域を含み得る。
【０３６４】
一部の事例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに結合することができる。例えば、一部の実施形態において、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジ又はＣＤ８ａヒンジであり得る。一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号２のアミノ酸配列を含む（例えば、これから構成される）。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６の膜貫通ドメインを含む（例えば、これから構成される）。
【０３６５】
一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号３のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされるヒンジを含む。
【０３６６】
一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号４のアミノ酸配列のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号１５のヌクレオチド配列によってコードされるヒンジを含む。
【０３６７】
一部の実施形態において、膜貫通ドメインは組換えであり得、その場合、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。一部の実施形態において、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットを、組換え膜貫通ドメインの各末端に見ることができる。
【０３６８】
任意選択により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴ又はポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域との間に結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは特に適当なリンカーを提供する。例えば、一部の実施形態において、リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、リンカーは、配列番号１６のヌクレオチド配列によりコードされる。
【０３６９】
一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【０３７０】
細胞質ドメイン
本発明のＣＡＲの細胞質ドメイン又は領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般的に、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。
【０３７１】
本発明のＣＡＲにおいて使用する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して機能する共受容体の細胞質配列並びにこれらのあらゆる誘導体又はバリアント及び同じ機能的能力を有するあらゆる組換え配列を含む。
【０３７２】
ＴＣＲ単独により産生されたシグナルはＴ細胞の完全活性化には不十分であり、二次及び／又は共刺激シグナルも必要であることが知られている。そのため、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列が介在するということができる：ＴＣＲ（初代細胞内シグナル伝達ドメイン）を介して抗原依存性一次活性化を開始するもの及び二次又は共刺激シグナル（二次細胞質ドメイン、例えば共刺激ドメイン）を提供するように抗原非依存的方法で作用するもの。
【０３７３】
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性方向又は阻害性方向のいずれかで制御する。刺激性方向で作用する初代細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
【０３７４】
本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても知られる）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及びＣＤ６６ｄのものを含む。一部の実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０３７５】
一部の実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭドメインと比較して改変された（例えば、増加又は減少した）活性を有する、修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば変異ＩＴＡＭドメインを含む。一部の実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば最適化及び／又は切断されたＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれを超えるＩＴＡＭモチーフを含む。
【０３７６】
本発明で特に有用な一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む分子のさらに別の例としては、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及びＣＤ３２の分子が挙げられる。
【０３７７】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインをそれ自体で含み得るか、又は本発明のＣＡＲに関連して有用ないずれか他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わされ得る。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζ鎖部分並びに共刺激分子伝達ドメインを含み得る。共刺激分子シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。こうした分子の例として、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の拡大、エフェクター機能及び生存を増大し、ヒトＴ細胞持続性及び抗腫瘍活性をインビボで高めることが実証されている（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（３）：６９６−７０６）。本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列を、ランダムに又は指定された順序で互いに連結させることもできる。任意選択で、２〜１０アミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０アミノ酸）長の短いオリゴ又はポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列同士の連結を形成し得る。一部の実施形態では、グリシン−セリンダブレットを好適なリンカーとして使用することができる。一部の実施形態では、単一アミノ酸、例えばアラニン、グリシンを好適なリンカーとして使用することができる。
【０３７８】
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上、例えば２、３、４、５つ又はそれを超える共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、２つ以上、例えば２、３、４、５つ又はそれを超える共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば本明細書に記載のリンカー分子によって隔てられている。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、リンカー分子は、グリシン残基である。一部の実施形態では、リンカーは、アラニン残基である。
【０３７９】
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインとＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインと４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号７のシグナル伝達ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインは、配列番号９（突然変異型ＣＤ３ζ）又は配列番号１０（野生型ヒトＣＤ３ζ）のシグナル伝達ドメインである。
【０３８０】
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインとＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号１９の核酸配列によってコードされる。
【０３８１】
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインとＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号３７の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインとＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、ＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインは、配列番号３９の核酸配列によってコードされる。
【０３８２】
ＣＡＲと他の分子又は薬剤との共発現
第２のＣＡＲの共発現
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＡＲ、例えば同じ標的（例えば、ＣＤ１９）又は異なる標的（例えば、ＣＤ１９以外の標的、例えば、本明細書に記載の標的）に対する、例えば第２のＣＡＲの異なる抗原結合ドメインをさらに含み得る。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、第１の抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ及び第２の、異なる、抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。第１のＣＡＲへの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０又はＩＣＯＳ及び一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζの第２のＣＡＲへの配置は、両標的が発現される細胞に対してＣＡＲ活性を制限する。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含む第１のＣＡＲ及び他の抗原を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ及び他の抗原を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲを含む。
【０３８３】
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書に記載のＸＣＡＲ及び阻害性ＣＡＲを含む。一部の実施形態において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えばＸも発現する正常細胞で見られるが、癌細胞で見られない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦ（例えば、ＴＧＦβ）の細胞内ドメインであり得る。
【０３８４】
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞が２以上の異なるＣＡＲを含むとき、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものである。例えば、第１及び第２のＣＡＲを発現する細胞は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えばＶＨＨである第２のＣＡＲの抗原結合ドメインと結合を形成しない、例えばフラグメント、例えばｓｃＦｖとしての第１のＣＡＲの抗原結合ドメインを有し得る。
【０３８５】
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子を含み、相補的決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の４鎖抗体由来の単一ドメイン、操作されたドメイン及び抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当技術分野の又は将来的な単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ及びウシを含むが、これらに限定されない任意の種由来であり得る。この用語は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）及びサメ以外の種由来の天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
【０３８６】
一部の実施形態において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来であるような、魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲ（「ＩｇＮＡＲ」）の可変領域由来の単一ドメイン分子を製造する方法は、国際公開第０３／０１４１６１号パンフレット及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２９０１−２９０９に記載されている。
【０３８７】
一部の実施形態において、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、国際公開第９４０４６７８号パンフレット及びＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８に記載されている。明確化するために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来のこの可変ドメインは、ここでは、４鎖免疫グロブリンの慣用のＶＨと区別するためにＶＨＨ又はナノボディとして知られている。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコ由来であり得る。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）以外の他の種は、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生し得、このようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
【０３８８】
ＳＤＡＢ分子は、組換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化及び／又はインビトロ産生され得る（例えば、ファージディスプレイにより選択）。
【０３８９】
受容体の抗原結合ドメイン間を相互作用する抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞は、例えば、抗原結合ドメインの１つ以上がその同族抗原に結合することを阻止するため、望ましくない可能性があることも判明した。従って、本明細書に開示されるのは、このような相互作用を最小化する、抗原結合ドメインを含む第１及び第２の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞である。また、本明細書に開示されるのは、このような相互作用を最小化する抗原結合ドメインを含む第１及び第２の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸並びにこのような細胞及び核酸を製造及び使用する方法である。一部の実施形態において、第１及び第２の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の抗原結合ドメインの一方は、ｓｃＦｖを含み、他方は、単一ＶＨドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。
【０３９０】
一部の実施形態において、本明細書における組成物は、第１及び第２のＣＡＲを含み、ここで、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメイン及び可変重ドメインを含まない。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、他方は、ｓｃＦｖではない。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
【０３９１】
一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、単一ＶＨドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、ナノボディを含む。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
【０３９２】
一実施形態において、細胞の表面上に存在するとき、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第２のＣＡＲの存在により実質的に低減されない。一実施形態において、第２のＣＡＲの存在下の第１のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第２のＣＡＲの非存在下の第１のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。
【０３９３】
一実施形態において、細胞の表面上に存在するとき、第１及び第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より少なく互いに結合する。一実施形態において、第１及び第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％少なく、例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％少なく互いに結合する。
【０３９４】
ＣＡＲ活性を強化する薬剤の共発現
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、別の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性又は適応度を増強する薬剤をさらに発現できる。
【０３９５】
例えば、一部の実施形態において、薬剤は、Ｔ細胞機能を調節又は制御する、例えば、阻害する分子を阻害する薬剤であり得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞機能を調節又は制御する分子は、阻害分子である。阻害分子、例えば、ＰＤ１は、一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン又はＴＧＦβを含む。
【０３９６】
一部の実施形態において、例えば、本明細書に記載されるような、薬剤、例えば阻害性核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ；又は例えば阻害性タンパク質若しくはシステム、例えば群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）、転写−アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、ＣＡＲ発現細胞においてＴ細胞の機能を調節又は制御する、例えば阻害する、分子の発現を阻害することができる。一部の実施形態において、薬剤は、ｓｈＲＮＡ、例えば本明細書に記載のｓｈＲＮＡである。一部の実施形態において、Ｔ細胞機能を調節又は制御する、例えば阻害する薬剤は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。例えば、Ｔ細胞機能を調節又は制御する、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの成分、例えば全ての成分をコードする核酸に連結される。
【０３９７】
一部の実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン若しくはＴＧＦβ又はこれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの少なくとも細胞外ドメインの部分）などの阻害分子の第１のポリペプチド及び本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインである第２のポリペプチド（例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載のような例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む）である第２のポリペプチドを含む。一部の実施形態において、薬剤は、ＰＤ１又はそのフラグメント（例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメインの部分）の第１のポリペプチド並びに本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び／又は本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）の第２のポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞に発現される（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７５）。ＰＤ１に対する２リガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３）。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌において豊富である（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８１：２８１−７；Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５４：３０７−３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５０９４）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との局所相互作用の阻害により逆転できる。
【０３９８】
一部の実施形態において、薬剤は、阻害分子、例えばプログラム細胞死１（ＰＤ１）（本明細書ではＰＤ１  ＣＡＲと称する）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、膜貫通ドメイン及び４１ＢＢ及びＣＤ３ζなどの細胞内シグナル伝達ドメインに融合され得る。一部の実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、本明細書に記載のＸＣＡＲと組み合わせで使用したとき、Ｔ細胞の残留性を改善する。一部の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２４において下線で示すＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＣＡＲである。一部の実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
【０３９９】
一部の実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
【０４００】
一部の実施形態において、薬剤は、ＰＤ１  ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＰＤ１  ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲの核酸配列は、ＰＤ１  ＥＣＤに下線を施した配列番号２３として提示される。
【０４０１】
別の例において、一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、共刺激分子又は共刺激分子リガンドであり得る。共刺激分子の例には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体並びにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が含まれる。そのような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、例えば本明細書に記載されるようなものを含む。共刺激分子リガンドの例には、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ及びＬＩＧＨＴが含まれる。実施形態において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインと異なる共刺激分子のリガンドである。実施形態において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインと同一の共刺激分子のリガンドである。一部の実施形態において、共刺激分子リガンドは４−１ＢＢＬである。一部の実施形態において、共刺激リガンドは、ＣＤ８０又はＣＤ８６である。一部の実施形態において、共刺激分子リガンドはＣＤ７０である。実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、１つ以上の追加の共刺激分子又は共刺激分子リガンドを発現するようにさらに操作され得る。
【０４０２】
ＣＡＲとケモカイン受容体の共発現
実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞は、さらに、ケモカイン受容体分子を含む。Ｔ細胞におけるケモカイン受容体ＣＣＲ２ｂ又はＣＸＣＲ２のトランスジェニック発現は、黒色腫及び神経芽腫を含むＣＣＬ２−又はＣＸＣＬ１分泌固形腫瘍への輸送を促進する（Ｃｒａｄｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１０  Ｏｃｔ；３３（８）：７８０−８及びＫｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００２  Ｎｏｖ  １；１３（１６）：１９７１−８０）。そのため、理論に拘束されることを望むものではないが、腫瘍、例えば、固形腫瘍により分泌されるケモカインを認識するＣＡＲ発現細胞で発現されるケモカイン受容体は、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍への帰巣を改善し、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍への浸潤を促進し、及びＣＡＲ発現細胞の抗腫瘍効果を増強すると考えられる。ケモカイン受容体分子は、天然に存在する又は組換えケモカイン受容体又はそのケモカイン結合フラグメントを含み得る。本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔｘ）における発現に適するケモカイン受容体分子は、ＣＸＣケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６又はＣＸＣＲ７）、ＣＣケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０又はＣＣＲ１１）、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体（例えば、ＣＸ３ＣＲ１）、ＸＣケモカイン受容体（例えば、ＸＣＲ１）又はそのケモカイン結合フラグメントを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲと共に発現するケモカイン受容体分子は、腫瘍により分泌されるケモカインに基づき選択する。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、さらに、ＣＣＲ２ｂ受容体又はＣＸＣＲ２受容体を含む、例えば、発現する。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ及びケモカイン受容体分子は、同じベクターにある又は２つの異なるベクターにある。本明細書に記載のＣＡＲ及びケモカイン受容体分子が同じベクターに実施形態において、ＣＡＲ及びケモカイン受容体分子は、各々、２つの異なるプロモーターの制御下にあるか又は同じプロモーターの制御下にある。
【０４０３】
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明は、本明細書に記載される１つ以上のＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を含む免疫エフェクター細胞、例えば本明細書に記載の方法によって作製されたものも提供する。一部の実施形態において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一部の実施形態において、核酸分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。
【０４０４】
本明細書に記載される核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子又はそれらの組み合わせであり得る。一部の実施形態において、核酸分子は、本明細書に記載されるようなＣＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。他の実施形態において、核酸分子は、前述の核酸分子のいずれかを含むベクターである。
【０４０５】
一部の実施形態において、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、その配列が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。一部の実施形態において、本発明のＣＡＲ構築物全体は、その配列全体が哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。コドン最適化とは、コーディングＤＮＡにおける同義コドン（すなわち同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が異なる種に偏っているという発見を指す。そのようなコドン縮重は、同一のポリペプチドが様々なヌクレオチド配列によってコードされることを可能にする。様々なコドン最適化方法が当技術分野で知られており、例えば、少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号明細書及び同第６，１１４，１４８号明細書に開示される方法が含まれる。
【０４０６】
従って、一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞、例えば本発明の方法により作製されたものは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含み、ＣＡＲは、本明細書に記載の腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）並びに刺激ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメイン）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載の一次シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載のζ鎖）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。
【０４０７】
本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子、例えば、本明細書に記載の核酸分子が挿入されているベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組み込み及び娘細胞への伝播を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコ−レトロウイルス由来のベクターを超えるさらなる利点を有する。さらに、それらは、低免疫原性であるという付加的利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、γレトロウイルスベクターでもあり得る。γレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル（ψ）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、１つ以上の（例えば、２）末端反復配列（ＬＴＲ）及び目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含み得る。γレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖなどのウイルス構造的遺伝子を欠き得る。例示的なγレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）及び骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）及びそれら由来のベクターを含む。他のγレトロウイルスベクターは、例えば、Ｔｏｂｉａｓ  Ｍａｅｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１１  Ｊｕｎ；３（６）：６７７−７１３に記載される。
【０４０８】
一部の実施形態において、所望のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。一部の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成できる。参照により本明細書に包含される下記のＪｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９．１０：７０４−７１６を参照されたい。
【０４０９】
概説すると、ＣＡＲをコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸又はその一部をプロモーターに操作可能に連結させ、その構築物を発現ベクターに取り込むことにより達成される。ベクターは、真核生物での複製及び組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列及びプロモーターを含む。
【０４１０】
核酸は、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクター及びシークエンシングベクターを含む。
【０４１１】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供され得る。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １  −４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ及び他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ以上の選択可能マーカーを含む（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット；国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；及び米国特許第６，３２６，１９３号明細書）。
【０４１２】
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当分野で知られる技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装できる。次いで、組換えウイルスが単離され、対象の細胞にインビボ又はエクスビボで送達され得る。多数のレトロウイルス系が当分野で知られる。一実施形態において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当分野で知られる。一部の実施形態において、レンチウイルスベクターを使用する。
【０４１３】
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらは、開始部位の上流３０〜１１０ｂｐの領域に位置するが、多数のプロモーターが、同様に開始部位の下流に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の空間はしばしば可動性であり、そのため、要素が互いに逆になったとき又は移動したときにプロモーター機能が保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素間の空間は、活性が落ち始める前、５０ｂｐ離れるまで増加し得る。プロモーターにより、個々の要素は、転写を活性化するために協調的又は独立的に機能できるように見える。代表的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ又はホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。
【０４１４】
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲコード核酸分子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う伸長因子−１複合体のαサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された核酸分子からＣＡＲ発現を駆動するのに有効であることが示されている。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。一部の実施形態において、ＥＦ１ａプロモーターは、実施例で提供される配列を含む。
【０４１５】
プロモーターの別の例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる、強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列並びにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターなど、しかし、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターも使用し得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部であるとして意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、発現が望まれるときに発現を活性化し、発現が望まれないときに発現を遮断することができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０４１６】
プロモーターの別の例は、ホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。実施形態において、切断ＰＧＫプロモーター（例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較したとき、１つ以上の、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００又は４００ヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター）が望ましいことがある。
【０４１７】
ＰＧＫプロモーター例のヌクレオチド配列を下に提供する。
ＷＴ  ＰＧＫプロモーター：
【化８】
2021534783.tif 000054
例示的な切断型ＰＧＫプロモーター：
ＰＧＫ１００：
【化９】
2021534783.tif 000055
ＰＧＫ２００：
【化１０】
2021534783.tif 000056
ＰＧＫ３００：
【化１１】
2021534783.tif 000057
ＰＧＫ４００：
【化１２】
2021534783.tif 000058
【０４１８】
ベクターは、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子から）、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にする要素（例えばＳＶ４０起源及びＣｏｌＥ１又は当分野で知られるその他）及び／又は選択を可能にする要素（例えば、アンピシリン耐性遺伝子及び／又はゼオシンマーカー）も含み得る。
【０４１９】
ＣＡＲポリペプチド又はその一部の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクター遺伝子導入又はウイルスベクターによる感染が探求される細胞の集団から発現細胞から発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又は両者も含み得る。一部の実施形態において、選択可能マーカーは、ＤＮＡの別の断面に担持され、共トランスフェクション法において使用される。選択可能マーカー及びレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞における発現が可能であるように、適切な制御配列が隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子を含む。
【０４２０】
レポーター遺伝子は、恐らく遺伝子導入されている細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物又は組織に存在又は発現されず、発現がある容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてから適当な時間後にアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。適当な発現系は周知であり、既知技術により製造でき又は商業的に入手できる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物をプロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するのに使用し得る。
【０４２１】
実施形態において、ベクターは、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲ、例えばＣＤ１９ＣＡＲ及び第２のＣＡＲ、例えば阻害性ＣＡＲ又はＣＤ１９以外の抗原に特異的に結合するＣＡＲをコードする２つ以上の核酸配列を含み得る。このような実施形態において、２以上のＣＡＲをコードする核酸配列は、同じフレームにおいて単一核分子により且つ単一ポリペプチド鎖としてコード化される。一部の実施形態において、２以上のＣＡＲは、例えば、１つ以上のペプチド開裂部位により分けられ得る（例えば、自己開裂部位又は細胞内プロテアーゼのための基質）。ペプチド切断部位の例には、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａ部位が含まれる。
【０４２２】
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は当分野で知られる。発現ベクターに関連して、ベクターは、任意の方法、例えば当技術分野で知られたものにより、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫細胞に容易に導入できる。例えば、例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的手段により、宿主細胞に移入される。
【０４２３】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクター及び／又は外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １  −４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照されたい）。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入するための適切な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０４２４】
宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書及び同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
【０４２５】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散体系を含む。インビトロ及びインビボで送達媒体として使用するための代表的コロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。標的化ナノ粒子又は他の適当なサブミクロンサイズの送達系を用いるポリヌクレオチドの送達など、最新式の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能である。
【０４２６】
非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入のために意図される（インビトロ、エクスビボ又はインビボ）。一部の実施形態において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含又は複合体化又は他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとして又は「崩壊」構造を有して存在し得る。それらはまた、単に溶液に分散され、恐らくサイズ又は形が均一ではない凝集体を形成し得る。脂質は、天然に存在する又は合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴並びに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群及びその誘導体を含む。
【０４２７】
使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得ることができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）はＫ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から得ることができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ．）から得ることができる。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質の原液を、約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に揮発するために、唯一の溶媒として使用する。「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集体の産生により形成される多様な単及び多層状脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体を伴う小胞構造を有することにより特徴付けられる。多層状リポソームは、水性媒体により分離された、複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに自然に形成される。脂質要素は、閉構造形成前に自己凝集し、水及び溶解した溶質を脂質二重層間に封入する（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。しかしながら、通常の小胞構造と異なる構造を溶液で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であるか又は単に脂質分子の不均一凝集体として存在すると考えられ得る。リポフェクタミン−核酸複合体も考慮される。
【０４２８】
外来性核酸を宿主細胞に導入する又はそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝す方法に関係なく、宿主細胞における組換え核酸配列の存在を確認するために、多様なアッセイを行い得る。このようなアッセイは、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、薬剤の同定に使用するための、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）により、特定のペプチドの存在又は不在を検出するような「生化学的」アッセイ又は本発明の範囲内に入る本明細書に記載のアッセイを含む。
【０４２９】
ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）ＣＡＲ
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ分子はナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）の１つ以上の成分を含み、それによりＮＫＲ−ＣＡＲを形成する。ＮＫＲ成分は、次のナチュラルキラー細胞受容体のいずれか由来の膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン又は細胞質ドメインであり得る：キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１及びＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー、例えばＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ及びＣＤ２Ｆ−１０；Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、例えばＣＤ１６及びＣＤ６４；及びＬｙ４９受容体、例えばＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃ。本明細書に記載のＮＫＲ−ＣＡＲ分子は、アダプター分子又は細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＤＡＰ１２と相互作用し得る。ＮＫＲ要素を含むＣＡＲ分子の例示的な配置及び配列は、国際公開第２０１４／１４５２５２号パンフレットに記載され、その内容が参照により本明細書に援用される。
【０４３０】
スプリットＣＡＲ
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、国際公開第２０１４／０５５４４２号パンフレット及び国際公開第２０１４／０５５６５７号パンフレットにより詳細に記載されている。簡潔には、スプリットＣＡＲ系は、第１の抗原結合ドメイン及び共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ）を有する第１のＣＡＲを発現する細胞を含み、細胞は、第２の抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を有する第２のＣＡＲも発現する。細胞が第１の抗原に遭遇したとき、共刺激ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第２の抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、殺細胞活性が開始される。そのため、ＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原の存在下でのみ完全活性化される。
【０４３１】
キメラ抗原受容体を制御するための戦略
一部の実施形態において、ＣＡＲ活性が制御できる制御可能ＣＡＲ（ＲＣＡＲ）は、ＣＡＲ治療の安全性及び有効性を最適化するために望ましい。ＣＡＲ活性が制御され得る多くの方法がある。例えば、誘導性アポトーシス（例えば二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用するもの）（例えば、Ｄｉ  Ｓｔａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１１  Ｎｏｖ．３；３６５（１８）：１６７３−１６８３を参照されたい）を本発明のＣＡＲ治療における安全スイッチとして使用できる。一部の実施形態において、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、誘導性アポトーシススイッチをさらに含み、ヒトカスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）又は改変バージョンは、条件付き二量体化を可能にするヒトＦＫＢタンパク質の改変に融合される。ラパログ（例えば、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７）などの小分子の存在下では、誘導性カスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）が活性化され、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の急速なアポトーシス及び死をもたらす。カスパーゼベースの誘導性アポトーシススイッチ（又はそのようなスイッチの１つ以上の態様）の例は、例えば、米国特許出願公開第２００４０４００４７号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２８６９８０号明細書；米国特許出願公開第２０１４０２５５３６０号明細書；国際公開第１９９７０３１８９９号パンフレット；国際公開第２０１４１５１９６０号パンフレット；国際公開第２０１４１６４３４８号パンフレット；国際公開第２０１４１９７６３８号パンフレット；国際公開第２０１４１９７６３８号パンフレットに記載され、参照により全て本明細書に組み込まれる。
【０４３２】
別の例において、ＣＡＲ発現細胞は、誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐａｓｅ−９）分子も発現でき、これは、二量体化因子薬物（例えば、ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ（ＡＰ１９０３（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）又はＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ）とも呼ばれる）の投与により、細胞のカスパーゼ−９活性化及びアポトーシスに至る。ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、二量体化（ＣＩＤ）結合ドメインの化学誘導因子を含み、これは、ＣＩＤの存在下で二量体化に介在する。これは、ＣＡＲ発現細胞の誘導的及び選択的枯渇に至る。ある場合、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲコードベクターと別の核酸分子によりコードされる。ある場合、ｉＣａｓｐａｓｅ−９分子は、ＣＡＲコードベクターと同じ核酸分子によりコードされる。ｉＣａｓｐａｓｅ−９は、ＣＡＲ発現細胞の何らかの毒性を避けるための安全スイッチを提供できる。例えば、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８；１５（１０）：６６７−７５；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｄ．Ｎｏ．ＮＣＴ０２１０７９６３；及びＤｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１１；３６５：１６７３−８３を参照されたい。
【０４３３】
本発明のＣＡＲ治療を制御するための代替的戦略は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘発により、例えばＣＡＲ発現細胞を消失させることにより、ＣＡＲ活性の脱活性化又は遮断する小分子又は抗体の利用を含む。例えば、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、細胞死、例えばＡＤＣＣ又は補体誘導性細胞死を誘発できる分子により認識される抗原も発現し得る。例えば、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、抗体又は抗体フラグメントにより標的化され得る受容体も発現し得る。このような受容体の例は、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７及びＥＧＦＲ並びにその切断バージョン（例えば、１つ以上の細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の１つ以上の領域を欠くバージョン）を含む。
【０４３４】
例えば、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、シグナル伝達能力を欠くが、ＡＤＣＣを誘発できる分子、例えばセツキシマブ（アービタックス（登録商標））により認識されるエピトープを保持する切断型上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）も発現し、その結果、セツキシマブの投与がＡＤＣＣ及び続くＣＡＲ発現細胞の枯渇を誘発する（例えば、国際公開第２０１１／０５６８９４号パンフレット及びＪｏｎｎａｌａｇａｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１３；２０（８）８５３−８６０を参照されたい）。別の戦略は、例えば、ＡＤＣＣによりＣＡＲ発現細胞の選択的枯渇をもたらす、リツキシマブに結合する、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞におけるＣＤ３２及びＣＤ２０抗原の両方からの標的エピトープをあわせる、高度に小型のマーカー／自殺遺伝子の発現を含む（例えば、Ｐｈｉｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４（８）１２７７−１２８７を参照されたい）。本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を枯渇させる他の方法は、例えば、ＡＤＣＣ誘発により、破壊するために成熟リンパ球、例えばＣＡＲ発現細胞に選択的に結合し、標的とするモノクローナル抗ＣＤ５２抗体であるＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）の投与を含む。他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体を使用して選択的に標的化され得る。一実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えばＡＤＣＣ又はＡＤＣ活性を引き起こし、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことができる。他の実施形態において、ＣＡＲリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体は、細胞致死を誘発する薬剤、例えばトキシンに結合させ、それによりＣＡＲ発現細胞数を減らすことができる。代わりに、ＣＡＲ分子自体、下記のように、活性が制御され得る、例えば活性化又は遮断され得るように配置できる。
【０４３５】
他の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞除去剤により認識される標的タンパク質も発現し得る。一部の実施形態において、標的タンパク質は、ＣＤ２０であり、Ｔ細胞除去剤は、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブである。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞を減少又は除去する、例えばＣＡＲ誘発毒性を軽減することが望まれるときにＴ細胞除去剤を投与する。他の実施形態において、Ｔ細胞除去剤は、本明細書の実施例に記載されるように、抗ＣＤ５２抗体、例えばアレムツズマブである。
【０４３６】
他の実施形態において、ＲＣＡＲは、本明細書に記載の標準的ＣＡＲの要素、例えば抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインが個別のポリペプチド又はメンバーに配置された、一連の典型的には最も単純な実施形態において２つのポリペプチドを含む。一部の実施形態において、一連のポリペプチドは、二量体化分子の存在下で互いにポリペプチドを結合できる、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる二量体化スイッチを含む。一部の実施形態において、本発明のＣＡＲは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４１２７２６１号パンフレットに記載されるような二量体化スイッチを利用する。このような制御可能ＣＡＲのさらなる記載及び例示定期配置は、本明細書及び２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／０９０２２９号パンフレット（例えば、段落５２７〜５５１）に提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、ＲＣＡＲは、スイッチドメイン、例えば、配列番号２７５に記載されるようなＦＫＢＰスイッチドメインを含むか、又は例えば配列番号２７６に示されるような、ＦＲＢと結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメントを含む。一部の実施形態において、ＲＣＡＲは、例えば配列番号２７７に示されるような、ＦＲＢ配列を含むスイッチドメイン又は例えば配列番号２７８〜２８３のいずれかに記載されるような、変異型ＦＲＢ配列を含む。
【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【０４３７】
【表４６】
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【０４３８】
ＲＮＡトランスフェクション
インビトロで転写されたＲＮＡ  ＣＡＲを産生する方法が本明細書に開示される。ＲＮＡ  ＣＡＲ及びそれを使用する方法は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落５５３〜５７０に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４３９】
免疫エフェクター細胞は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされたＣＡＲを含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＣＡＲ発現細胞の産生のために、例えば本明細書に記載される方法により作製される、免疫エフェクター細胞に導入される。
【０４４０】
一部の実施形態において、インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲを一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入できる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産生鋳型を使用するインビトロ転写により産生される。任意の供給源からの目的のＤＮＡを、適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型にＰＣＲにより直接変換できる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列又はＤＮＡのあらゆる他の適切な供給源であり得る。インビトロ転写のための所望の鋳型は本明細書中に記載されるＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ  ＣＡＲの鋳型は、本明細書に記載の腫瘍関連抗原に対する抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域（例えば、本明細書に記載のヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメインなどの本明細書に記載の膜貫通ドメイン）；及び細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むものを含む細胞質領域を含む。
【０４４１】
一部の実施形態において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であり得る。一部の実施形態において、核酸は、５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のいくらか又は全てを含み得る。核酸は、エクソン及びイントロンを含み得る。一部の実施形態において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、ヒト核酸配列である。一部の実施形態において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、代わりに、天然に存在する生物で通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。例示的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するようにライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。ライゲートされたＤＮＡの部分は、単一生物由来又は１つを超える生物由来であり得る。
【０４４２】
ＰＣＲを使用して、トランスフェクションに使用するｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型を産生する。ＰＣＲを実施する方法は、当技術分野で周知である。ＰＣＲにおいて使用するプライマーは、ＰＣＲのための鋳型として使用するＤＮＡの領域に実質的に相補的である領域を有するように設計する。本明細書で使用する「実質的に相補的」は、プライマー配列の残基の大部分又は全てが相補的であるか又は１つ以上の塩基が非相補的又はミスマッチである、ヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用するアニーリング条件下においてＤＮＡ標的とアニール又はハイブリダイズできる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される（オープンリーディングフレーム）核酸の部分を増幅するように設計できる。プライマーは、目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計できる。一部の実施形態において、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲの全て又は一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコーディング領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当技術分野で周知の合成法により産生できる。「順方向プライマー」は、増幅するＤＮＡ配列の上流であるＤＮＡ鋳型上にヌクレオチドに対して実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配列に対する５位を指すために本明細書で使用する。「逆方向プライマー」は、増幅するＤＮＡ配列の下流である、二本鎖ＤＮＡ鋳型に対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」は、コード鎖に対して、増幅するＤＮＡ配列に対する３’位を指すために本明細書で使用する。
【０４４３】
ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼを本明細書に開示する方法で使用できる。試薬及びポリメラーゼは、多数の供給元から市販されている。
【０４４４】
安定性及び／又は翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用し得る。実施形態において、ＲＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを有する。一部の実施形態において、５’ＵＴＲは、１〜３０００ヌクレオチド長である。コーディング領域に付加する５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域をアニールするＰＣＲのためのプライマーの設計を含むが、これに限定されない異なる方法により変わり得る。このアプローチを使用して、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクション後、最適翻訳効率を達成するのに必要な５’及び３’ＵＴＲ長を修飾できる。
【０４４５】
５’及び３’ＵＴＲは、目的の核酸のための天然に存在する内在性５’及び３’ＵＴＲであり得る。代わりに、目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列を順方向及び逆方向プライマーへのＵＴＲ配列の取り込みにより又は鋳型の任意の他の修飾により付加できる。目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率の修飾のために有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列のＡＵリッチ要素は、ｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られる。従って、３’ＵＴＲを、当技術分野で周知であるＵＴＲの特性に基づき、転写されたＲＮＡの安定性を増加するように選択及び設計できる。
【０４４６】
一部の実施形態において、５’ＵＴＲは、内在性核酸のＫｏｚａｋ配列を含み得る。代わりに、目的の核酸に対して内在性ではない５’ＵＴＲを上記のようにＰＣＲにより付加するとき、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を５’ＵＴＲ配列の付加により再設計できる。Ｋｏｚａｋ配列は、あるＲＮＡ転写物の翻訳効率を上げることができるが、効率的翻訳を可能とするために全ＲＮＡで必要であるように見えない。多くのｍＲＮＡについてのＫｏｚａｋ配列に対する必要性は、当技術分野で公知である。他の実施形態において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の実施形態において、種々のヌクレオチドアナログを、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために３’又は５’ＵＴＲにおいて使用できる。
【０４４７】
遺伝子クローニングの必要性なしにＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするために、転写のプロモーターは、転写する配列の上流のＤＮＡ鋳型に結合すべきである。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列が順方向プライマーの５’末端に追加されるとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に取り込まれる。一部の実施形態において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載するような、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列が当技術分野で公知である。
【０４４８】
一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、リボソーム結合、翻訳開始及び細胞におけるｍＲＮＡの安定性を決定する、５’末端及び３’ポリ（Ａ）テールの両者にキャップを有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えばプラスミドＤＮＡ上において、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞における発現に適しない長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直線化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後ポリアデニル化されても、真核トランスフェクションに有効ではない正常サイズのｍＲＮＡを生じる。
【０４４９】
直鎖状ＤＮＡ鋳型で、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を越えて転写物の３’末端を伸長できる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：６２２３−３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５−６５（２００３））。
【０４５０】
ＤＮＡ鋳型に伸びるポリ（Ａ）／Ｔの組込みの慣用法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに統合されたポリ（Ａ）／Ｔ配列は、プラスミド不安定性を生じ得、これは、細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型が多くの場合に欠失及び他の異常で高度に汚染されている理由である。これにより、クローニング工程は、困難で時間がかかるだけでなく、多くの場合に信頼できないものとなる。これが、クローニングを伴わないポリ（Ａ）／Ｔ  ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の産生を可能にする方法が非常に望ましい理由である。
【０４５１】
転写ＤＮＡ鋳型のポリ（Ａ）／Ｔセグメントは、１００ＴテールなどのポリＴテールを含む逆方向プライマーを使用するＰＣＲ中（サイズは、５０〜５０００Ｔであり得る（配列番号３２））又はＤＮＡライゲーション若しくはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない任意の他の方法によりＰＣＲ後に産生できる。ポリ（Ａ）テールはまた、ＲＮＡに安定性を提供し、その分解を減らす。一般に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正に相関する。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１００〜５０００アデノシンである（例えば、配列番号３３）。
【０４５２】
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）のなどのポリ（Ａ）ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後にさらに伸長できる。一部の実施形態において、ポリ（Ａ）テールの１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチドへの長さの延長（配列番号３４）は、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍増加を生じる。さらに、３’末端への異なる化学基の付加は、ｍＲＮＡ安定性を増加させ得る。このような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰアナログは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールに取り込まれ得る。ＡＴＰアナログは、ＲＮＡの安定性をさらに高め得る。
【０４５３】
５’キャップもＲＮＡ分子に安定性を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法により産生されたＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載の技術を使用して提供される（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６−４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８−９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８−９６６（２００５））。
【０４５４】
本明細書に開示する方法により産生されたＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始し、翻訳開始を促進するあらゆるイルス、染色体又は人工設計配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤及び界面活性剤などの細胞透過性及び生存能を促進する因子を含有し得る、細胞電気穿孔に適した任意の溶質が含まれ得る。
【０４５５】
ＲＮＡを、多数の異なる方法、例えば商業的に利用可能な方法のいずれかを使用して標的細胞に導入でき、これは、電気穿孔（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、（ＥＣＭ  ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）又はＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ，Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマー封入、ペプチド介在トランスフェクション又は「遺伝子銃」などの微粒子銃粒子送達系（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１−７０（２００１）を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。
【０４５６】
非ウイルス送達方法
一部の実施形態において、非ウイルス方法を使用して、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を細胞又は組織又は対象に送達できる。
【０４５７】
一部の実施形態において、非ウイルス方法は、トランスポゾン（転位因子とも呼ばれる）の使用を含む。一部の実施形態において、トランスポゾンは、ゲノムの位置にそれ自体挿入できるＤＮＡのフラグメント、例えば自己複製性であり、そのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡのフラグメント又は長い核酸の外にスプライシングされ、ゲノムの別の場所に挿入されることができるＤＮＡのフラグメントである。例えば、トランスポゾンは、転位のための逆位反復フランキング遺伝子からなるＤＮＡ配列を含む。
【０４５８】
例示的なトランスポゾンを使用する核酸送達法は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系（ＳＢＴＳ）及びｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポゾン系を含む。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０．Ｒ１（２０１１）：Ｒ１４−２０；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５（２００８）：２９６１−２９７１；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２００８）：５８０−５８９；Ｇｒａｂｕｎｄｚｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８（２０１０）：１２００−１２０９；Ｋｅｂｒｉａｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．１２２．２１（２０１３）：１６６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６．９（２００８）：１５１５−１６；Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２．１２（２００７）：３１５３−６５；及びＤｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．１２２．３（２００５）：４７３−８３（これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０４５９】
ＳＢＴＳは２つの成分：１）導入遺伝子を含むトランスポゾン、及び２）トランスポサーゼ酵素の供給源を含む。トランスポサーゼは、担体プラスミド（又は他のドナーＤＮＡ）から、宿主細胞染色体／ゲノムなどの標的ＤＮＡにトランスポゾンを転位できる。例えば、トランスポサーゼは、担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、トランスポゾン（導入遺伝子含有）をプラスミドの外に切り出し、宿主細胞のゲノムに入れる。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．上掲を参照されたい。
【０４６０】
例示的なトランスポゾンは、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、全て参照により本明細書に組み込まれるＧｒａｂｕｎｄｚｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１．３（２０１３）：１８２９−４７；及びＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８．８（２００８）：２９６１−２９７１を参照されたい。例示的なトランスポサーゼは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポサーゼ、例えばＳＢ１０トランスポサーゼ又はＳＢ１１トランスポサーゼを含む（例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現できる機能亢進トランスポサーゼ）。例えば、全て参照により本明細書に組み込まれるＡｒｏｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．；Ｋｅｂｒｉａｅｉ  ｅｔ  ａｌ．；及びＧｒａｂｕｎｄｚｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０４６１】
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸の効率的組込み及び発現を可能にする。例えば、ＳＢＴＳなどのトランスポゾン系を使用する、本明細書に記載のＣＡＲを安定に発現する細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を産生する方法が本明細書に提供される。
【０４６２】
本明細書に記載の方法により、一部の実施形態において、ＳＢＴＳ成分を含む１つ以上の核酸、例えばプラスミドが細胞に送達される（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）。例えば、核酸は、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）送達の標準法、例えば本明細書に記載の方法、例えば電気穿孔、トランスフェクション又はリポフェクションにより送達される。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子、例えば本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸）を含むトランスポゾン並びにトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の実施形態において、例えば、デュアルプラスミド系、例えば第１のプラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第２のプラスミドがトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、２核酸の系が提供される。例えば、第１及び第２の核酸は、宿主細胞に共送達される。
【０４６３】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞は、ヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系又は操作されたメガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ）を使用するＳＢＴＳ及び遺伝子編集の遺伝子挿入の組み合わせを使用して産生される。
【０４６４】
一部の実施形態において、非ウイルス送達方法の使用は、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の再プログラミング及び対照への細胞の直接注入を可能にする。非ウイルスベクターの利点は、患者集団に見合うために必要な十分量の産生が容易且つ比較的安価であること、保存中の安定性及び免疫原性の欠如を含むが、これらに限定されない。
【０４６５】
製造／生産の方法
一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、細胞（例えば、本明細書に記載されるような免疫エフェクター細胞）での処置後にＴ細胞枯渇剤を投与すること、それにより、ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）を減少させる（例えば、枯渇させる）ことをさらに含む。そのようなＴ細胞枯渇剤は、ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）を効果的に枯渇させて、毒性を緩和するために使用することができる。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書の方法に従って製造され、例えば、本明細書の方法に従ってアッセイされた（例えば、トランスフェクション又は形質導入前又は後）。
【０４６６】
一部の実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、本明細書に記載の細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団の投与の１、２、３、４又は５週間後に投与される。
【０４６７】
一部の実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体誘導性細胞死を誘導することにより、ＣＡＲ発現細胞を枯渇させる薬剤である。例えば、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、細胞死、例えば、ＡＤＣＣ又は補体誘導性細胞死を誘発できる分子により認識される抗原（例えば、標的抗原）も発現し得る。例えば、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、抗体又は抗体フラグメントにより標的化され得る標的タンパク質（例えば、受容体）も発現し得る。このような標的タンパク質の例は、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７及びＥＧＦＲ及びその切断バージョン（例えば、１つ以上の細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の１つ以上の領域を欠くバージョン）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０４６８】
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲ及び標的タンパク質を共発現し、例えば、天然で標的タンパク質を発現するか、又は標的タンパク質を発現するように操作される。例えば、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＡＲ核酸（例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＲ核酸）及び標的タンパク質をコードする核酸を含む核酸（例えば、ベクター）を含み得る。
【０４６９】
一部の実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、ＣＤ５２阻害剤、例えば、抗ＣＤ５２抗体分子、例えば、アレムツズマブである。
【０４７０】
他の実施形態において、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載されるようなＣＡＲ分子（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ）及びＴ細胞枯渇剤によって認識される標的タンパク質を発現する。一部の実施形態において、標的タンパク質はＣＤ２０である。標的タンパク質がＣＤ２０である実施形態において、Ｔ細胞除去剤は抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブである。
【０４７１】
前述の方法のいずれかのさらなる実施形態において、方法は、細胞、例えば造血幹細胞又は骨髄を、哺乳動物に移植することをさらに含む。
【０４７２】
一部の実施形態において、本発明は、細胞移植前に哺乳動物をコンディショニングする方法を特徴とする。方法は、哺乳動物に、ＣＡＲ核酸又はポリペプチド、例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ核酸又はポリペプチドを含む、有効量の細胞を投与することを含む。一部の実施形態において、細胞移植は、幹細胞移植、例えば、造血幹細胞移植又は骨髄移植である。他の実施形態において、細胞移植前に対象をコンディショニングすることは、対象における標的発現細胞、例えば、ＣＤ１９発現正常細胞又はＣＤ１９発現癌細胞の数を減少させることを含む。
【０４７３】
水簸
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法は、不要な細胞、例えば単球及び芽細胞を除去し、これにより、ＣＡＲ発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮改善を達成する水簸法を特徴とする。一部の実施形態では、本明細書に記載の水簸法は、事前に凍結したサンプル、例えば解凍サンプルからのＣＡＲ発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮のために最適化される。一部の実施形態では、本明細書に記載の水簸法は、当技術分野で公知の水簸プロトコルから収集される細胞の調製物と比較して、純度が向上した細胞の調製物を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の水簸法は、特定の等張液（例えば、ＰＢＳ）を用いた希釈による出発サンプル、例えば細胞サンプル、例えば解凍した細胞サンプルの最適化された粘度の使用並びに水簸装置により収集される各画分の流量及び収集量の最適化された組み合わせの使用を含む。本発明に適用することができる例示的な水簸法は、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレット（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）の４８〜５１ページに記載されている。
【０４７４】
密度勾配遠心分離
養子細胞治療製品の製造は、末梢血アフェレーシス出発材料中に存在する血液細胞及び血液成分の複合混合物から離れて、所望の細胞、例えば免疫エフェクター細胞をプロセシングすることを必要とする。末梢血由来のリンパ球サンプルは、フィコール溶液による密度勾配遠心分離を用いた分離に成功している。しかし、フィコールは、臨床使用に適格ではないため、フィコールは、治療用途で細胞を分離するのに好ましい試薬ではない。さらに、フィコールは、グリコールを含有し、これは、細胞に対して毒性を有する可能性がある。さらに、凍結保存後の解凍アフェレーシス産物のフィコール密度勾配遠心分離は、例えば、本明細書の実施例に記載されるように、準最適なＴ細胞産物をもたらす。例えば、フィコール溶液による密度勾配遠心分離によって分離された細胞調製物では、非Ｔ細胞、特に望ましくないＢ細胞、芽細胞及び単球の相対的な増加と共に、最終産物でのＴ細胞の喪失が観察された。
【０４７５】
理論に縛られることを意図しないが、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、凍結保存中に脱水して、新鮮な細胞よりも密度が高くなると考えられる。理論に縛られることを意図しないが、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、他の血液細胞よりも長い間密度が高いままであるため、他の細胞よりも容易にフィコール密度勾配分離中に失われることも考えられる。従って、理論に縛られることを意図しないが、フィコールより大きい密度の培地は、フィコール又はフィコールと同じ密度、例えば１．０７７ｇ／ｍＬを有する他の培地と比較して、所望の免疫エフェクター細胞の分離の改善を提供すると考えられる。
【０４７６】
一部の実施形態において、本明細書に記載の密度勾配遠心分離法は、イオジキサノールを含む密度勾配媒体の使用を含む。一部の実施形態において、密度勾配媒体は、水中に約６０％のイオジキサノールを含む。
【０４７７】
一部の実施形態において、本明細書に記載の密度勾配遠心分離法は、フィコールより大きい密度を有する密度勾配媒体の使用を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載の密度勾配遠心分離法は、１．０７７ｇ／ｍＬ超、例えば１．０７７ｇ／ｍＬ超、１．１ｇ／ｍＬ超、１．１５ｇ／ｍＬ超、１．２ｇ／ｍＬ超、１．２５ｇ／ｍＬ超、１．３ｇ／ｍＬ超、１．３１ｇ／ｍＬ超の密度を有する密度勾配媒体の使用を含む。一部の実施形態では、密度勾配媒体は、約１．３２ｇ／ｍＬの密度を有する。
【０４７８】
密度勾配遠心分離の別の実施形態は、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の５１〜５３ページに記載されている。
【０４７９】
選択による濃縮
ＣＡＲ発現に適した所望の免疫エフェクター細胞の濃縮を改善するための特定の細胞の選択方法が本明細書に提供される。一部の実施形態において、選択は、ポジティブ選択、例えば所望の免疫エフェクター細胞の選択を含む。一部の実施形態では、選択は、ネガティブ選択、例えば望ましくない細胞の選択、例えば望ましくない細胞の除去を含む。複数の実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ又はネガティブ選択方法は、例えば、フロースルー装置、例えば本明細書に記載のフロースルー装置の使用により、流動条件下で実施される。例示的なポジティブ及びネガティブ選択は、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の５３〜５７ページに記載されている。選択方法は、細胞プロセシングシステムとも呼ばれるフロースルー装置を使用することにより流動条件下で実施して、ＣＡＲ発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の細胞調製物をさらに濃縮することができる。例示的なフロースルー装置は、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の５７〜７０ページに記載されている。例示的な細胞分離及び脱ビーズ（ｄｅｂｅａｄｉｎｇ）方法は、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の７０〜７８ページに記載されている。
【０４８０】
選択手順は、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレットの５７〜７０ページに記載されているものに限定されない。カラム技術（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｌｕｓ又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標））と組み合わせてＣＤ１９、ＣＤ１４及びＣＤ２６  Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズを用いる不要な細胞の除去によるネガティブＴ細胞選択又はＣＤ４及びＣＤ８  Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ及びカラム技術（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｌｕｓ又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標））の組み合わせを用いたポジティブＴ細胞選択を使用することができる。代わりに、放出可能なＣＤ３ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたカラムフリー技術を使用することもできる。
【０４８１】
加えて、ＴｈｅｒｍｏＧｅｎｅｓｉｓ  Ｘ−シリーズ装置などのビーズフリー技術も使用することができる。
【０４８２】
臨床用途
本明細書に記載のプロセス、全て臨床医薬品製造（ｃＧＭＰ）基準に従って実施することができる。
【０４８３】
これらのプロセスは、特に製造プロセス開始時の未処理の出発材料（特に細胞）の収集並びに細胞療法用の細胞の選択若しくは拡大のための製造プロセス中の細胞精製、富化、採取、洗浄、濃縮又は細胞培地交換のために使用され得る。
【０４８４】
細胞は、任意の複数の細胞を含み得る。細胞は、同じ細胞型又は混合された細胞型のものであり得る。加えて、細胞は、一人のドナー、例えば細胞療法のための自己ドナー又は単一同種異系ドナーに由来するものであり得る。細胞は、患者から、例えば白血球アフェレーシス又はアフェレーシスから取得され得る。細胞は、Ｔ細胞を含み得、例えば５０％超のＴ細胞、６０％超のＴ細胞、７０％超のＴ細胞、８０％超のＴ細胞又は９０％超のＴ細胞を有する集団を含み得る。
【０４８５】
選択プロセスは、培養及び拡大前に、細胞を選択する上で特に有用となり得る。例えば、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８でコーティングされた常磁性粒子を使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）若しくは他のタンパク質をコードする核酸の伸長又は導入のためにＴ細胞を選択することができる。こうしたプロセスを使用して、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の治療のためにＣＴＬ０１９  Ｔ細胞を生産する。
【０４８６】
本明細書に開示される脱ビーズプロセス及びモジュールは、特に、細胞療法用の細胞の製造、例えば培養及び増殖前又は後の細胞の精製に有用であり得る。例えば、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた常磁性粒子を使用して、Ｔ細胞、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は他のタンパク質をコードする核酸の導入によって修飾された若しくは修飾されるであろうＴ細胞を、ＣＡＲがＴ細胞により発現されるように、選択的に増殖させることができる。こうしたＴ細胞の製造中、脱ビーズプロセス又はモジュールを用いて、Ｔ細胞を常磁性粒子から分離することができる。このような脱ビーズプロセス又はモジュールを用いて、例えば急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置のためのＣＴＬ０１９  Ｔ細胞を生産する。
【０４８７】
例として示される１つのこうしたプロセスでは、細胞、例えばＴ細胞をドナー（例えば、自己キメラ抗原受容体Ｔ細胞産物で処置しようとする患者）からアフェレーシス（例えば、白血球アフェレーシス）により収集する。続いて、収集した細胞を任意選択で例えば水簸ステップ又は標的細胞（例えば、Ｔ細胞）のポジティブ若しくはネガティブ選択によって精製し得る。次に、常磁性粒子、例えば抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティング常磁性粒子を細胞集団に添加して、Ｔ細胞を増殖させることができる。このプロセスは、形質導入ステップも含み得、このステップにおいて、１つ以上の所望のタンパク質、例えばＣＡＲ、例えばＣＤ１９を標的化するＣＡＲをコードする核酸が細胞に導入される。核酸は、レンチウイルスベクター中に導入され得る。細胞、例えばレンチウイルスにより形質導入された細胞を例えば好適な培地の存在下で例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれを超える日数の期間にわたって増殖することができる。増殖の後、本明細書に開示される脱ビーズプロセス／モジュールを用いて、常磁性粒子から所望のＴ細胞を分離することができる。このプロセスは、本開示のプロセスに従う１つ以上の脱ビーズステップを含み得る。次に、脱ビーズした細胞を、患者への投与のために製剤化することができる。ＣＡＲ  Ｔ細胞及びそれらの製造の例は、例えば、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。本開示のシステム及び方法は、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットに記載されるか又はそれに関連する任意の細胞分離／精製／脱ビーズプロセスに使用され得る。別のＣＡＲ  Ｔ製造プロセスは、例えば、国際公開第２０１６１０９４１０号パンフレット及び同第２０１７１１７１１２号パンフレット（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０４８８】
本明細書に記載のシステム及び方法は、従来のシステム及び方法と比較して、化学物質との曝露が少ないか又は曝露せずに、望ましい細胞の無駄を少なくし、細胞外傷を低減すると共に、細胞からの磁気及びあらゆる非常磁性粒子をより確実に除去することにより、他の細胞療法製品にも同様に利益をもたらし得る。
【０４８９】
上には本開示の例示的な実施形態のみが具体的に記載されているが、これらの例の修正及び変更は、本開示の趣旨及び意図される範囲から逸脱することなく、可能であることは理解されよう。例えば、磁気モジュール及びそれらを含むシステムは、記載されるものに加えて様々な配置に構成及び使用され得る。それ以外にも、非磁気モジュールを同様に使用することができる。加えて、システム及び方法は、本明細書に具体的に記載されていない別の成分及びステップを含み得る。例えば、方法は、プライミングを含み得、この場合、流体をまず１成分に導入して、気泡を除去し、細胞懸濁液又はバッファー運動に対する抵抗を低減する。さらに、複数の実施形態は、本明細書に記載の方法で使用するための本明細書に記載のシステムの一部のみを含む場合もある。例えば、複数の実施形態は、細胞を分離若しくは脱ビーズして細胞産物を生産することができる完全なシステムを形成するために、非使い捨て装置内で使用可能な使い捨てモジュール、ホースなどに関連し得る。
【０４９０】
本発明と組み合わせることができる追加の製造方法及びプロセスは、当技術分野で記載されている。例えば、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレットの８６〜９１ページには、改善された洗浄ステップ及び改善された製造プロセスが記載されている。
【０４９１】
免疫エフェクター細胞の供給源
この項では、所望の免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを取得し、所望の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を分離及びプロセシングし、且つ不要な物質、例えば不要な細胞を除去するための追加の方法又はステップを提供する。この項に記載される追加の方法又はステップは、先行項に記載される水簸、密度勾配遠心分離、流動条件下での選択又は改善された洗浄ステップのいずれかと組み合わせて使用することができる。
【０４９２】
細胞の供給源、例えばＴ細胞若しくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、対象から取得することができる。対象の例として、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。
【０４９３】
本開示の一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、当業者に周知の任意の数の技術及び本明細書に開示される方法のいずれかを使用して、それらのステップの任意の組み合わせで、対象から収集した血液の単位から得ることができる。一部の実施形態では、個体の循環血液からの細胞をアフェレーシスにより取得する。アフェレーシス産物は、典型的にはＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含めたリンパ球、赤血球及び血小板を含む。一部の実施形態では、アフェレーシスにより収集された細胞は、血漿画分を除去するために洗浄し、任意選択で、続くプロセシングステップのために細胞を適切なバッファー又は培地に入れ得る。一部の実施形態では、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。一部の実施形態では、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るか、又は全てではないとしても多くの二価カチオンを欠き得る。一部の実施形態において、細胞は、本明細書に記載の改善された洗浄ステップを使用して洗浄される。
【０４９４】
カルシウム非存在下での初期活性化ステップは、活性化の増強をもたらすことができる。当業者には容易に認識されるように、洗浄ステップは、当業者に公知の方法により、例えば製造業者の指示に従う半自動化「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ（商標）又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  Ｅｌｉｔｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｅｐａｘ若しくはＳｅｆｉａ）又はスピニングメンブレンろ過技術を利用する装置（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ  ＬＯＶＯ）を使用することにより達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば無Ｃａ、無Ｍｇ  ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充したＰＢＳ−ＥＤＴＡ又はバッファーを含む又は含まない他の食塩水溶液など、多様な生体適合性バッファーに再懸濁し得る。代わりに、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去した後、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
【０４９５】
一部の実施形態において、所望の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離又は向流遠心水簸により単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。
【０４９６】
本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の、例えばネガティブ選択技術を使用する、例えばＴ制御性細胞枯渇集団、例えばＣＤ２５＋枯渇細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈ枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の、例えば特定の亜集団の選択を含み得る。一部の実施形態において、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞を含む。
【０４９７】
一部の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈＴ細胞を、抗ＣＤ２５抗体若しくはそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド、例えばＩＬ−２を使用して集団から除去する。一部の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体若しくはそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンドを基質、例えばビーズにコンジュゲートするか、或いはそうでなければ基質、例えばビーズ上に被覆する。一部の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメントを、本明細書に記載されるような基質にコンジュゲートさせる。
【０４９８】
一部の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈＴ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）からのＣＤ２５枯渇剤を使用して集団から除去する。一部の実施形態では、細胞対ＣＤ２５枯渇剤の比は１ｅ７細胞対２０μＬ、又は１ｅ７細胞対１５μＬ、又は１ｅ７細胞対１０μＬ、又は１ｅ７細胞対５μＬ、又は１ｅ７細胞対２．５μＬ、又は１ｅ７細胞対１．２５μＬである。一部の実施形態では、例えばＴ制御性細胞の場合、５億細胞／ｍｌ超を使用する。一部の実施形態では、６億、７億、８億又は９億細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。
【０４９９】
一部の実施形態において、枯渇させようとする免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９のＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、枯渇させようとする免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９〜１×１０１０（及びその間の任意の整数値）のＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、得られるＴ制御性枯渇細胞集団は、２×１０９のＴ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞若しくはＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞以下（例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７以下のＴ制御性細胞）を有する。
【０５００】
一部の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞を、例えばチュービング１６２−０１など、枯渇チュービングセットと共にＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して集団から除去する。一部の実施形態では、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系を例えばＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２．１などの枯渇設定で作動させる。
【０５０１】
特定の理論に縛られることを意図しないが、アフェレーシス前又はＣＡＲ発現細胞産物の製造工程中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少（例えば、不要な免疫細胞、例えばＴｒｅｇ細胞の数の減少）は、対象の再発リスクを有意に低下させる。例えば、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させる方法は当技術分野で知られている。Ｔｒｅｇ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体（本明細書に記載の抗ＧＩＴＲ抗体）、ＣＤ２５枯渇及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０５０２】
一部の実施形態において、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞の製造前のＴｒｅｇ細胞の数の減少（例えば、枯渇）を含む。例えば、製造方法は、例えば、サンプル、例えばアフェレーシスサンプルと、抗ＧＩＴＲ抗体及び／又は抗ＣＤ２５抗体（若しくはそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド）を接触させ、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物の製造前にＴｒｅｇ細胞を枯渇させることを含む。
【０５０３】
理論に縛られることを意図しないが、アフェレーシス前又はＣＡＲ発現細胞産物の製造工程中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少（例えば、不要な免疫細胞、例えばＴｒｅｇ細胞の数の減少）は、対象の再発リスクを低下させることができる。一部の実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞採取前にＴｒｅｇ細胞を減らす１つ以上の治療で前処置されており、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再び必要とするリスクを低減する。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇又はそれらの組み合わせの１つ以上の対象への投与を含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇又はそれらの組み合わせの１つ以上の対象への投与を含むが、これに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇又はそれらの組み合わせの１つ以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物注入前、注入中又は注入後に行うことができる。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇又はそれらの組み合わせの１つ以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物注入前、注入中又は注入後に行うことができる。
【０５０４】
一部の実施形態において、製造方法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴｒｅｇ細胞の数の減少（例えば、枯渇）を含む。例えば、製造方法は、例えば、サンプル、例えばアフェレーシスサンプルと抗ＧＩＴＲ抗体及び／又は抗ＣＤ２５抗体（若しくはそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド）を接触させ、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物の製造前にＴｒｅｇ細胞を枯渇させることを含む。
【０５０５】
一部の実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置（例えば、ＣＴＬ０１９処置）を再び必要とするリスクを低減する。一部の実施形態では、対象は、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）産物製造のための細胞の採取前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再び必要とするリスクを低減する。
【０５０６】
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）製造プロセスは、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物（例えば、ＣＴＬ０１９産物）の製造前にＴｒｅｇ細胞を枯渇させるように修飾される。一部の実施形態では、ＣＤ２５枯渇を使用して、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物（例えば、ＣＴＬ０１９産物）の製造前に、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させる。
【０５０７】
一部の実施形態において、除去すべき細胞の集団は、制御性Ｔ細胞又は腫瘍細胞ではなく、ＣＡＲＴ細胞の増殖及び／又は機能に他にマイナスに影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５又は潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。一部の実施形態では、このような細胞は、制御性Ｔ細胞及び／若しくは腫瘍細胞と同時に、又は前記枯渇後、又は別の順番で除去することが意図される。
【０５０８】
本明細書に記載の方法は、２つ以上の選択ステップ、例えば２つ以上の枯渇ステップを含み得る。ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、例えば、ネガティブ選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成することができる。１つの方法は、ネガティブ選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫粘着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は選択である。例えば、ネガティブ選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含み得る。
【０５０９】
本明細書に記載の方法は、腫瘍抗原、例えばＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４又はＣＤ１１ｂを発現する細胞の集団からの除去をさらに含み、それによりＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲの発現に好適なＴ制御性枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇又はＣＤ２５ｈｉｇｈ枯渇及び腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供する。一部の実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性、例えばＣＤ２５＋細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗腫瘍抗原抗体又はそのフラグメントを同じ基質、例えばビーズに結合することができ、これを細胞の除去に使用することができるか、或いは抗ＣＤ２５抗体若しくはそのフラグメント又は抗腫瘍抗原抗体若しくはそのフラグメントを別のビーズに結合することができ、その混合物を細胞の除去に使用することができる。他の実施形態では、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞の除去及び腫瘍抗原発現細胞の除去は逐次的であり、例えばいずれの順番でも起こり得る。
【０５１０】
チェックポイント阻害剤、例えば本明細書に記載のチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えばＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞及びＴＩＭ３＋細胞の１つ以上の集団からの除去を含み、それによりＴ制御性枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇細胞及びチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えばＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋及び／又はＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦ（例えば、ＴＧＦβ）、例えば本明細書に記載されるようなものが挙げられる。一実施形態において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御性、例えばＣＤ２５＋細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はそのフラグメントを同じビーズに結合することができ、それを細胞の除去に使用することができるか、又は抗ＣＤ２５抗体若しくはそのフラグメント及び抗チェックポイント阻害剤抗体若しくはそのフラグメントを別のビーズに結合することができ、その混合物を細胞の除去に使用することができる。他の実施形態では、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞の除去及びチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は逐次的であり、例えばいずれの順番でも起こり得る。
【０５１１】
本明細書に記載の方法は、ポジティブ選択ステップを含み得る。例えば、Ｔ細胞を、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３ｘ２８）コンジュゲートビーズと一緒にインキュベーションすることにより単離することができる。一部の実施形態では、時間は、約３０分である。一部の実施形態では、時間は、３０分〜３６時間又はそれより長い範囲及びその間の全部の整数値である。一部の実施形態では、時間は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間又は６時間である。一部の実施形態では、時間は、１０〜２４時間、例えば２４時間である。腫瘍組織又は免疫不全状態の個体から腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合のように、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況において、Ｔ細胞を単離するために長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕獲効率を高め得る。そのため、単にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと結合させる時間を短縮若しくは延長し、且つ／又はビーズ対Ｔ細胞比を増加又は減少させる（本明細書に詳しく記載される通り）ことにより、培養開始時又はプロセス中の他の時点でＴ細胞の亜集団を優先的に又はその反対に選択することができる。加えて、ビーズ若しくは他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体比を増加又は減少させることにより、培養開始時又は他の所望の時点でＴ細胞の亜集団を優先的に又はその反対に選択することができる。
【０５１２】
一実施形態において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ及びパーフォリン又は他の適切な分子、例えば他のサイトカインの１つ以上を発現するＴ細胞集団を選択することができる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、国際公開第２０１３／１２６７１２号パンフレットに記載される方法により決定することができる。
【０５１３】
ポジティブ又はネガティブ選択により所望の細胞の集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は変わり得る。一部の実施形態において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞を一緒に混合する体積を有意に低下させる（例えば、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合もある。例えば、一部の実施形態では、１００億細胞／ｍｌ、９０億／ｍｌ、８０億／ｍｌ、７０億／ｍｌ、６０億／ｍｌ又は５０億／ｍｌの濃度が使用される。一部の実施形態では、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。一部の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。一部の実施形態では、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。
【０５１４】
高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加することができる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞の又は多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（例えば、白血病性血液、腫瘍組織など）からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療価値を有し得るため、取得することが望ましい。例えば、高濃度細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０５１５】
一部の実施形態において、低濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を有意に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量で発現する細胞について選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕獲される。一部の実施形態では、使用する細胞の濃度は、５×１０６／ｍｌである。一部の実施形態では、使用する濃度は、約１×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌ及びその間の任意の整数値であり得る。
【０５１６】
一部の実施形態において、２〜１０℃又は室温のいずれかにおいて様々な長さの時間にわたり様々な速度のローテータ上で細胞をインキュベートし得る。
【０５１７】
一部の実施形態において、集団の複数の免疫エフェクター細胞は、ジアグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）を発現せず、例えばＤＧＫ欠損性である。一部の実施形態では、集団の複数の免疫エフェクター細胞は、Ｉｋａｒｏｓを発現せず、例えばＩｋａｒｏｓ欠損性である。一部の実施形態では、集団の複数の免疫エフェクター細胞は、ＤＧＫ及びＩｋａｒｏｓを発現せず、例えばＤＧＫ及びＩｋａｒｏｓ両方の欠損性である。
【０５１８】
刺激のためのＴ細胞は、洗浄ステップ後に凍結させることもできる。理論に縛られることを意図しないが、凍結及びそれに続く解凍ステップは、細胞集団から顆粒球を、またある程度まで単球を除去することにより、より均一な産物を取得する。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップ後、細胞を凍結溶液に懸濁することができる。多くの凍結溶液及びパラメーターが当技術分野で知られ、これに関連して有用であり、ある方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ又は１０％Ｄｅｘｔｒａｎ  ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ又は３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ  ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯを含む培養培地又は例えばＨｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用することを伴い、次いで細胞を１°／分の速度で−８０℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相に保存する。制御凍結の他の方法も、直ちに−２０℃又は液体窒素の非制御凍結と同様に使用することができる。
【０５１９】
一部の実施形態において、凍結保存細胞を本明細書に記載されるように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化前に室温で１時間休息させる。
【０５２０】
本発明に関連して、本明細書に記載されるような増殖細胞が必要となり得る時点前の期間における、対象からの血液サンプル又はアフェレーシス産物の採取も企図されている。従って、増殖させようとする細胞の供給源は、必要な任意の時点で採取することができ、Ｔ細胞などの所望の細胞は、本明細書に記載のものなど、免疫エフェクター細胞治療からの利益があるであろう任意の数の疾患又は状態について、免疫エフェクター細胞治療におけるその後の使用のために単離及び凍結することができる。一部の実施形態では、血液サンプル又はアフェレーシスは、概して健常な対象から採取する。一部の実施形態では、血液サンプル又はアフェレーシスは、疾患を発症するリスクにあるが、依然として疾患を発症していない、概して健常な対象から採取し、目的の細胞をその後の使用のために単離及び凍結する。一部の実施形態では、Ｔ細胞を増殖、凍結し、後の時点で使用することができる。一部の実施形態では、サンプルは、本明細書に記載されるような特定の疾患の診断の直後且つ何らかの処置前に患者から採取する。一部の実施形態では、任意の数の関連する処置モダリティー前に対象からの血液サンプル又はアフェレーシスから細胞を単離し、こうした処置モダリティーとして、限定されないが、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体又は他の免疫除去剤、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８及び照射などの薬剤による処置が挙げられる。
【０５２１】
本発明の一部の実施形態において、Ｔ細胞は、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後、患者から直接取得する。この点について、特定の癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置後間もなく、患者が通常その処置から回復するまでの間、得られるＴ細胞の品質がエクスビボで増殖する能力について最適であるか又は改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着及びインビボ増殖増強について好ましい状態であり得る。このように、本発明に関連して、Ｔ細胞、樹状細胞又は造血細胞系統の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが企図される。さらに、一部の実施形態では、可動化（例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動化）及びコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生及び／又は増殖に好都合である条件を、特に、治療後の定められた時間枠中に対象において形成することができる。細胞型の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
【０５２２】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書に記載のＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から取得する。一部の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作しようとする免疫エフェクター細胞の集団、例えばＴ細胞は、対象中の又は対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベル又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比が少なくとも一過性に増加するように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投薬から十分な時間後又は十分な投薬後に採取する。
【０５２３】
他の実施形態では、ＣＡＲを発現するように操作されているか又は操作される免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の数を増加させるか、又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比を増大する量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理することができる。
【０５２４】
本願の方法は、５％以下、例えば２％の、ヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用することができ、既知培養培地条件及び組成物、例えばＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ”Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１５）４，ｅ３１；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．３１に記載のものを用いることができることは認識される。
【０５２５】
一部の実施形態において、本願の方法は、少なくとも約０．１％、０．５％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％の血清を含む培地条件を利用することができる。一部の実施形態では、培地は、約０．５％〜５％、約０．５％〜４．５％、約０．５％〜４％、約０．５％〜３．５％、約０．５％〜３％、約０．５％〜２．５％、約０．５％〜２％、約０．５％〜１．５％、約０．５％〜１．０％、約１．０％〜５％、約１．５％〜５％、約２％〜５％、約２．５％〜５％、約３％〜５％、約３．５％〜５％、約４％〜５％又は約４．５％〜５％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約０．５％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約０．５％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約１％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約１．５％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約２％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約２．５％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約３％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約３．５％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約４％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約４．５％の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約５％の血清を含む。一部の実施形態では、血清は、ヒト血清、例えばヒトＡＢ血清を含む。一部の実施形態では、血清は、採取後に自然凝固させたヒト血清、例えばｏｆｆ−ｔｈｅ−ｃｌｏｔ（ＯＴＣ）血清である。一部の実施形態では、血清は、血漿由来血清ヒト血清である。血漿由来血清は、抗凝固剤、例えばクエン酸ナトリウムの存在下で採取されて、プールされたヒト血漿の脱線維によって生成することができる。
【０５２６】
一部の実施形態において、本願の方法は、無血清培地を含む培地条件を利用することができる。一部の実施形態において、無血清培地は、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ（商標）ＸＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣｅｌｌＧｒｏ（商標）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、ＴｅｘＭａｃｓ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（商標）（Ｓｉｇｍａ）、Ｘｖｉｖｏ１５（商標）（Ｌｏｎｚａ）、ＰｒｉｍｅＸＶ（商標登録）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＳｔｅｍＸＶｉｖｏ（商標登録）（ＲａｎｄＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）である。無血清培地には、ＬｉｆｅＴｅｃｈのＩＣＳＲ（免疫細胞血清代替品）などの血清代替品を添加することができる。血清代替品（例えば、ＩＣＳＲ）のレベルは、例えば、最大５％、例えば約１％、２％、３％、４％又は５％であり得る。一部の実施形態において、無血清培地は、血清、例えばヒト血清、例えばヒトＡＢ血清を添加し得る。一部の実施形態では、血清は、採取後に自然凝固させたヒト血清、例えばｏｆｆ−ｔｈｅ−ｃｌｏｔ（ＯＴＣ）血清である。一部の実施形態では、血清は、血漿由来ヒト血清である。血漿由来血清は、抗凝固剤、例えばクエン酸ナトリウムの存在下で採取されて、プールされたヒト血漿の脱線維によって生成することができる。
【０５２７】
一部の実施形態において、Ｔ細胞集団は、ジアグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ  ＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか、又はＤＧＫ活性が低減若しくは阻害された細胞を含む。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ発現を低減又は阻止するための遺伝的手法、例えばＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により作製することができる。代わりに、ＤＧＫ欠損細胞は、本明細書に記載のＤＧＫ阻害剤での処理により作製することもできる。
【０５２８】
一部の実施形態において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか、又はイカロス活性が低下した又は阻害された細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減又は阻止するための遺伝的手法、例えばＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により作製することができる。代わりに、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えばレナリドマイドでの処理により作製することができる。
【０５２９】
複数の実施形態において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損及びイカロス欠損であり、例えばＤＧＫ及びイカロスを発現しないか、又はＤＧＫ及びイカロス活性が低減若しくは阻害されている。このようなＤＧＫ及びイカロス欠損細胞は、本明細書に記載の方法のいずれかにより作製することができる。
【０５３０】
一部の実施形態では、ＮＫ細胞を対象から取得する。一部の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えばＮＫ−９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
【０５３１】
同種ＣＡＲ発現細胞
本明細書に記載の複数の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えばＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩの発現を欠く同種Ｔ細胞であり得る。
【０５３２】
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に何ら機能的ＴＣＲを発現しないように操作され、機能的ＴＣＲを含む１つ以上のサブユニットを発現しないように操作される（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＴＣＲε及び／又はＴＣＲζの発現がない（又は発現の減少を示す）ように操作される）か、又はその表面にごくわずかな機能的ＴＣＲを産生するように操作され得る。代わりに、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１つ以上の変異型又は切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現し得る。用語「実質的に障害されたＴＣＲ」とは、このＴＣＲが、宿主で有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。
【０５３３】
本明細書に記載のＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作され得る。例えば、本明細書に記載のＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラス１及び／又はＨＬＡクラスＩＩが下方制御されるように操作され得る。一部の実施形態において、ＨＬＡの下方制御は、β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現の減少又は排除を伴い得る。
【０５３４】
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲ及び機能的ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩを欠き得る。
【０５３５】
機能的ＴＣＲ及び／又はＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲ又はＨＬＡの１つ以上のサブユニットのノックアウト又はノックダウンを含む、任意の適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡのノックダウンを含み得る。
【０５３６】
一部の実施形態において、同種細胞は、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにより、阻害性分子を発現しないか、又は低レベルで発現する細胞であり得る。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下し得る、阻害分子を発現しないか、又は低レベルで発現する細胞であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦ（例えば、ＴＧＦβ）を含む。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質レベルでの阻害による、阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。複数の実施形態において、例えば本明細書に記載されるような、阻害性核酸、例えば阻害性核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用することができる。
【０５３７】
ＴＣＲ又はＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ
一部の実施形態において、ＴＣＲ発現及び／又はＨＬＡ発現を、細胞、例えばＴ細胞における、ＴＣＲ及び／若しくはＨＬＡ並びに／又は本明細書に記載の阻害分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦβ）をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用して、阻害することができる。
【０５３８】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの発現系及び例示的なｓｈＲＮＡのための発現系は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６４９及び６５０に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０５３９】
ＴＣＲ又はＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
本明細書で使用する「ＣＲＩＳＰＲ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ」は、一連の群生性等間隔短回文反復配列又はこのような一連の反復を含む系を指す。本明細書で使用する「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系は、細胞、例えばＴ細胞における、ＴＣＲ及び／若しくはＨＬＡ遺伝子並びに／又は本明細書に記載の阻害分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦβ）の発現抑制又は変異に使用することができる、ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓ由来の系を指す。
【０５４０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びその使用は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６５１〜６５８に記載され、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０５４１】
ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ」又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ」は、細胞、例えばＴ細胞における、ＨＬＡ及び／若しくはＴＣＲ遺伝子並びに／又は本明細書に記載の阻害分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦβ）の編集に使用することができる人工ヌクレアーゼである、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼを指す。
【０５４２】
ＴＡＬＥＮ及びその使用は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６５９〜６６５に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０５４３】
ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
「ＺＦＮ」又は「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲに対するＺＦＮ」又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ」は、細胞、例えばＴ細胞における、ＨＬＡ及び／若しくはＴＣＲ遺伝子並びに／又は本明細書に記載の阻害分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦβ）の編集に使用することができる人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを指す。
【０５４４】
ＺＦＮ及びその使用は、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６６６〜６７１に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０５４５】
テロメラーゼ発現
テロメアは、体細胞の持続に重要な役割を果たし、その長さはテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）によって維持される。ＣＬＬ細胞のテロメア長は非常に短い可能性があり（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｓｈｏｒｔｅｒ  ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ  ｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＺＡＰ−７０＋／ＣＤ３８  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ”Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１４３，３８３−３８６．，Ａｕｇｕｓｔ  ２８  ２００８）、製造されたＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ１９細胞ではさらに短くなる可能性があるため、患者への養子移入後にそれが増殖する可能性が制限される。テロメラーゼの発現は、ＣＡＲ発現細胞を複製疲弊から救済することができる。
【０５４６】
いずれか特定の理論に縛られることを意図しないが、一部の実施形態において、治療用Ｔ細胞は、Ｔ細胞中の短縮されたテロメアのために、患者における持続性が短期であり；従って、テロメラーゼ遺伝子を用いたトランスフェクションにより、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の持続性を改善することができる。Ｃａｒｌ  Ｊｕｎｅ，“Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１７：１４６６−１４７６（２００７）を参照されたい。そのため、一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、異所性にテロメラーゼサブユニットを、例えばテロメラーゼの触媒的サブユニット、例えばＴＥＲＴ、例えばｈＴＥＲＴを発現する。一部の実施形態では、本開示は、細胞と、テロメラーゼサブユニット、例えばテロメラーゼの触媒的サブユニット、例えばＴＥＲＴ、例えばｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む、ＣＡＲ発現細胞を生産する方法を提供する。細胞は、ＣＡＲをコードする構築物と接触させる前、それと同時又はその後に核酸と接触させることができる。
【０５４７】
テロメラーゼの発現は安定しているか（例えば、核酸が細胞のゲノムに組み込まれ得る）又は一過性である（例えば、核酸が組み込まれず、一定の時間、例えば数日後に発現が低下する）可能性がある。安定した発現は、テロメラーゼサブユニット及び選択可能なマーカーをコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクト又は形質導入し、安定な組み込み体を選択することによって達成され得る。これに代わり又はこれと組み合わせて、安定した発現は、例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ又はＦＬＰ／ＦＲＴシステムを使用した、部位特異的組換えによって達成され得る。
【０５４８】
一過性の発現は、核酸、例えばＤＮＡ又はｍＲＮＡなどのＲＮＡによるトランスフェクション又は形質導入を含み得る。一部の実施形態において、一過性のｍＲＮＡトランスフェクションは、ＴＥＲＴによる安定したトランスフェクションに関連する場合のある遺伝的不安定性を回避する。外因性テロメラーゼ活性の一過性発現は、例えば、国際公開第２０１４／１３０９０９号パンフレットに記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。複数の実施形態において、テロメラーゼサブユニットのｍＲＮＡベースのトランスフェクションは、Ｍｏｄｅｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって商品化されたメッセンジャーＲＮＡ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（商標）プラットフォームに従って実施される。例えば、この方法は、米国特許第８７１０２００号明細書、同第８８２２６６３号明細書、同第８６８００６９号明細書、同第８７５４０６２号明細書、同第８６６４１９４号明細書又は同第８６８００６９号明細書に記載の方法であり得る。
【０５４９】
一部の実施形態において、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質ＩＤ  ＡＡＣ５１７２４．１のアミノ酸配列を有する（Ｍｅｙｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ｈＥＳＴ２，ｔｈｅ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｇｅｎｅ，Ｉｓ  Ｕｐ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ”Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ９０，Ｉｓｓｕｅ  ４，２２  Ａｕｇｕｓｔ  １９９７，Ｐａｇｅｓ  ７８５−７９５）。
【化１６】
2021534783.tif 000063
【０５５０】
一部の実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２８４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列を有する。一部の実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２８４の配列を有する。一実施形態において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端又は両方に欠失（例えば、５、１０、１５、２０又は３０アミノ酸以下）を含む。一部の実施形態において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端又は両方にトランスジェニックアミノ酸配列（例えば、５、１０、１５、２０又は３０アミノ酸以下）を含む。
【０５５１】
一部の実施形態において、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１８１６７の核酸配列によりコードされる（Ｍｅｙｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ｈＥＳＴ２，ｔｈｅ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｇｅｎｅ，Ｉｓ  Ｕｐ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ”Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ９０，Ｉｓｓｕｅ  ４，２２  Ａｕｇｕｓｔ  １９９７，Ｐａｇｅｓ  ７８５−７９５）。
【０５５２】
免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）の活性化及び増殖
本明細書に記載の方法により生成又は濃縮されたＴ細胞などの免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に記載する方法を使用して、一般的に活性化及び増殖され得る。
【０５５３】
一般に、免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体結合シグナルを刺激する薬剤が結合したその表面と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを接触させることにより増殖できる。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は抗ＣＤ２抗体との接触又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触により、本明細書に記載のように刺激し得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドである。例えば、Ｔ細胞集団を、Ｔ細胞の増殖刺激に適する条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用できる。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８を含み（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、当技術分野で一般に知られる他の方法のように使用できる（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０５５４】
一部の実施形態において、Ｔ細胞のための一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中でも表面と結合し得る。表面に結合しているとき、薬剤は、同じ表面（すなわち「シス」形態）又は別の表面（すなわち「トランス」形態）に結合し得る。代わりに、一方の薬剤が表面に結合し、他方が溶液にあり得る。一部の実施形態において、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中であるか又は表面と結合する。一部の実施形態において、両剤は、溶液中にあり得る。一部の実施形態において、薬剤は、不溶性形態であり、Ｆｃ受容体又は抗体又は薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面に架橋され得る。この点に関して、例えば本発明におけるＴ細胞の活性化及び増殖のために意図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書及び同第２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
【０５５５】
一部の実施形態において、２剤は、ビーズに、同じビーズ、すなわち「シス」又は別のビーズ、すなわち「トランス」で固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合フラグメントであり、両剤は、均等な分子量で同じビーズに共固定化される。一部の実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及びＴ細胞増殖のためのビーズに結合した１：１比の各抗体を使用する。本発明の一部の実施形態において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、Ｔ細胞増殖の増殖が観察されるように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を使用する。一部の実施形態において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して約１〜約３倍増加が観察される。一部の実施形態において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体比は、１００：１〜１：１００及びその間の全ての整数値の範囲である。一部の実施形態において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合しており、すなわちＣＤ３：ＣＤ２８比が１未満である。一部の実施形態において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体比は、２：１より大きい。一部の実施形態において、ビーズに結合した１：１００  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した１：７５  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した１：５０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した１：３０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した１：１０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した１：３  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した３：１  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。
【０５５６】
１：５００〜５００：１及びその間の任意の整数値の粒子対細胞比をＴ細胞又は他の標的細胞の刺激のために使用し得る。当業者に容易に認識され得るように、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは、少ない細胞にのみ結合でき、大きいビーズは、多く結合できる。一部の実施形態において、細胞対粒子比は、１：１００〜１００：１及びその間の任意の整数値の範囲であり、一部の実施形態において１：９〜９：１及びその間の任意の整数値からなる比をＴ細胞刺激に使用し得る。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は、上記のように変わり得るが、しかしながら、ある好適な値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１及び１５：１を含み、１つの好適な比は少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。一部の実施形態において、１：１以下の粒子対細胞比を使用する。一部の実施形態において、好適な粒子：細胞比は、１：５である。一部の実施形態において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、一部の実施形態において、粒子対細胞比は、１日目は１：１〜１０：１であり、さらなる粒子をその後１０日目まで連日又は隔日で細胞に添加し、最終比１：１〜１：１０である（添加の比の細胞数に基づく）。一部の実施形態において、粒子対細胞比は、刺激１日目に１：１であり、刺激３日目及び５日目に１：５に調節する。一部の実施形態において、粒子を、１日目の１：１及び刺激３日目及び５日目の１：５の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。一部の実施形態において、粒子対細胞比は、刺激１日目は２：１であり、刺激３日目及び５日目に１：１０に調節する。一部の実施形態において、粒子を、１日目の１：１及び３日目及び５日目の１：１０の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が本発明における使用に適し得ることを認識する。特に、比は、粒子径並びに細胞サイズ及びタイプによる。一部の実施形態において、使用するための最も典型的な比は、１日目の１：１、２：１及び３：１付近である。
【０５５７】
一部の実施形態において、Ｔ細胞などの細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズ及び細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。一部の実施形態において、培養前に薬剤被覆ビーズ及び細胞を分離するが、一緒に培養する。一部の実施形態において、ビーズ及び細胞を磁気力などの力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。
【０５５８】
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ（３ｘ２８ビーズ）とＴ細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。一部の実施形態において、細胞（例えば、１０４〜１０９Ｔ細胞）及びビーズ（例えば、ＤｙｎａビーズＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズを１：１比）を緩衝液、例えばＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなどの二価カチオンなし）中で合わせる。再び、任意の細胞濃度を使用し得ることが当業者に容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、試料中で極めて稀であり、試料の０．０１％のみが含まれるか又は試料全体（すなわち１００％）が目的の標的細胞で構成され得る。従って、あらゆる細胞数が本発明に関連して一体となる。一部の実施形態において、細胞と粒子との最大接触を確実にするために、粒子及び細胞を混合する体積を有意に減少させる（すなわち細胞の濃度を高める）ことが望ましいことがある。例えば、一部の実施形態において、約１００億細胞／ｍｌ、９０億細胞／ｍｌ、８０億細胞／ｍｌ、７０億細胞／ｍｌ、６０億細胞／ｍｌ、５０億細胞／ｍｌ又は２０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。一部の実施形態において、１億細胞／ｍｌ超を使用する。一部の実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万又は５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。一部の実施形態において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの濃度を使用する。一部の実施形態において、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有し得、及び特定の態様では得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度細胞の使用は、通常、ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０５５９】
一部の実施形態において、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＤ１９ＣＡＲをコードする核酸が形質導入された細胞を例えば本明細書に記載の方法により増殖する。一部の実施形態において、細胞を数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間）〜約１４日（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日）の期間の培養により増殖する。一部の実施形態において、細胞は、４〜９日の期間増殖される。一部の実施形態において、細胞は、８日以下、例えば７日、６日又は５日の期間増殖される。一部の実施形態において、細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件において９日間培養で増殖された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、多様なＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死、サイトカイン産生、活性化、遊走、表面ＣＡＲ発現、ＣＡＲ定量的ＰＣＲ又はそれらの組み合わせにより規定され得る。一部の実施形態において、５日増殖された細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１９ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍又は４倍増加を示す。一部の実施形態において、細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞を発現する細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えばＩＦＮ−γ及び／又はＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。一部の実施形態において、５日増殖された細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１９ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生、例えばＩＦＮ−γ及び／又はＧＭ−ＣＳＦレベルのｐｇ／ｍｌで少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれを超えて増加する。
【０５６０】
Ｔ細胞の培養期間が６０日以上となり得るような数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清（例えば、胎児ウシ又はヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ−α又は当業者に知られる細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地（例えば、最小必須培地、α−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ培地１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２又はＸ−ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ）、Ｘ−Ｖｉｖｏ２０、ＯｐＴｍｉｚｅｒ及びＩＭＤＭ）を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート、及びＮ−アセチル−システイン、及び２−メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、限定されないが、無血清又は適切な量の血清（又は血漿）が添加されたか、又は規定されたセットのホルモン及び／又はＴ細胞の増殖及び拡大に十分な量のサイトカインが添加されたＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、Ｘ−Ｖｉｖｏ２０、ＯｐＴｍｉｚｅｒ及びＩＭＤＭを含み得る。抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシンは、実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養に含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。
【０５６１】
一部の実施形態において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーなどの本明細書に記載の方法により測定して、１４日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）増加をもたらす１つ以上のインターロイキンを含む適切な培地（例えば、本明細書に記載の培地）で増殖させる。一部の実施形態において、細胞は、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−７（例えば、ＩＬ−１５及びＩＬ−７）の存在下で増殖させる。
【０５６２】
実施形態において、本明細書に記載の方法、例えばＣＡＲ発現細胞製造法は、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈＴ細胞を、例えば抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して細胞集団から除去することを含む。細胞集団からＴ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈＴ細胞を除去する方法は、本明細書に記載される。実施形態において、方法、例えば製造法は、細胞集団（例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞又はＣＤ２５ｈｉｇｈＴ細胞などのＴ制御性細胞が枯渇されている細胞集団；又は抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンドと前に接触された細胞集団）とＩＬ−１５及び／又はＩＬ−７との接触をさらに含む。例えば、細胞集団（例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンドと先に接触されている）をＩＬ−１５及び／又はＩＬ−７の存在下で増殖させる。
【０５６３】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチド又はＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの組み合わせ、例えばｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物とＣＡＲ発現細胞の製造中に例えばエクスビボで接触させることを含む。実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞をＣＡＲ発現細胞の製造中に例えばエクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞をＣＡＲ発現細胞の製造中に例えばエクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチド及びＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組み合わせを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞をＣＡＲ発現細胞の製造中に例えばエクスビボで、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
【０５６４】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチド及びＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。一部の実施形態において、接触は、リンパ球亜集団、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞の生存及び増殖をもたらす。
【０５６５】
種々の刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液又はアフェレーシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性又はサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体での刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８〜９日目前まで主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を産生するが、約８〜９日目後、Ｔ細胞集団は、徐々に大きくなるＴＣ細胞集団を含む。従って、処置の目的により、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することは有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットを大きい程度まで増殖させることが有利であり得る。
【０５６６】
さらに、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中、有意に、しかし、主に再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物をもたらす能力を可能とする。
【０５６７】
本明細書に記載のＣＡＲが構築されると、適切なインビトロ及び動物モデルにおける抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのＴ細胞増殖の持続及び抗癌活性など、しかし、これらに限定されない分子の活性を評価するために種々のアッセイが使用され得る。本発明のＣＡＲの効果を評価するためのアッセイは、以下にさらに詳細に記載される。
【０５６８】
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６９５に記載されるように、単量体及び二量体の存在を検出するために使用できる。
【０５６９】
抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビトロ増殖をフローサイトメトリーにより測定できる。例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８  ａＡＰＣで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下において、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。代表的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ又はホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの培養６日目にフローサイトメトリーにより評価する。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。代わりに、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用するＣＡＲとｅＧＦＰを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、１日目にＣＡＲを形質導入する。培養物を本明細書に記載されるような癌関連抗原＋Ｋ５６２細胞（本明細書に記載されるような癌関連抗原を発現するＫ５６２）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体存在下でｈＣＤ３２及び４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）でのいずれかで再刺激する。外来性ＩＬ−２を、１００ＩＵ／ｍｌを隔日で培養物に添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。
【０５７０】
再刺激非存在下の持続するＣＡＲ＋Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい。簡潔には、平均Ｔ細胞体積（ｆｌ）を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激及び１日目の記載するＣＡＲの形質導入後、培養８日目にＣｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ粒子カウンター若しくはより高いバージョン、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｃｅｐｔｅｒ又は他の細胞カウンターを使用して測定する。
【０５７１】
動物モデルも、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６９８に記載されるように、ＣＡＲ発現細胞活性の測定に使用できる。
【０５７２】
用量依存的ＣＡＲ処置応答は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落６９９に記載されるように、評価できる。
【０５７３】
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落７００に記載されるように、以前に説明されている。
【０５７４】
細胞毒性は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落７０１に記載されるように、標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。代替的な非放射性方法も利用することができる。
【０５７５】
細胞毒性は、例えば、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞アナライザー（ＲＴＣＡ）を使用して、付着細胞の電気インピーダンスの変化を測定することによっても評価できる。一部の実施形態において、細胞毒性は複数の時点で測定される。
【０５７６】
造影テクノロジーは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落７０２に記載されるように、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送及び増殖を評価するために使用することができる。
【０５７７】
本明細書の実施例部分に記載のもの並びに当分野で知られるものを含む、他のアッセイも、本明細書に記載のＣＡＲの評価に使用できる。
【０５７８】
ここに開示する方法の代わりに又はこれと組み合わせて、ＣＡＲリガンドの使用を含む、ＣＡＲ発現細胞（例えば、インビトロ又はインビボ（例えば、臨床モニタリング））、免疫細胞増殖及び／又は活性化及び／又はＣＡＲ特異的選択の１つ以上の検出及び／又は定量のための方法及び組成物が開示される。一部の実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ分子に結合する、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに結合する抗体である（例えば、抗原結合ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体；又は細胞外結合ドメインの定常領域に結合する抗体）。他の実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ抗原分子である（例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＲ抗原分子）。
【０５７９】
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞を検出及び／又は定量する方法が開示される。例えば、ＣＡＲリガンドは、インビトロ又はインビボでＣＡＲ発現細胞の検出及び／又は定量に使用できる（例えば、患者におけるＣＡＲ発現細胞の臨床モニタリング又は患者への投薬）。方法は、
ＣＡＲリガンド（任意選択により、標識ＣＡＲリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射活性又は蛍光標識を含むＣＡＲリガンド）を提供し；
ＣＡＲ発現細胞を獲得し（例えば、製造サンプル又は臨床サンプルなどのＣＡＲ発現細胞含有サンプルの獲得）；
ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドを、結合が生じる条件下で接触させ、それにより、存在するＣＡＲ発現細胞のレベル（例えば、量）を検出することを含む。ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンドの結合は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなどのような標準技術を使用して検出できる。
【０５８０】
一部の実施形態において、増殖及び／又は活性化細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）を増殖する方法が開示される。方法は、
ＣＡＲ発現細胞（例えば、第１のＣＡＲ発現細胞又は一過性に発現されるＣＡＲ細胞）を提供し）；
前記ＣＡＲ発現細胞とＣＡＲリガンド、例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＲリガンドを、免疫細胞増殖及び／又は増殖が生じる条件下で接触させ、それにより、活性化及び／又は増殖集団を産生することを含む。
【０５８１】
特定の実施形態において、ＣＡＲリガンドは基質上に存在する（例えば、基質、例えば、天然に存在しない基質に固定化又は結合される）。一部の実施形態において、基質は、非細胞基質である。非細胞基質は、例えば、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、膜（例えば、ニトロセルロース膜）、マトリックス、チップ又はビーズから選択される固体支持体であり得る。実施形態において、ＣＡＲリガンドは、基質に存在する（例えば、基質表面上）。ＣＡＲリガンドを、基質に共有又は非共有（例えば、架橋）により固定、結合又は会合させ得る。一部の実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ビーズに結合（例えば、共有結合）する。前記実施形態において、免疫細胞集団をインビトロ又はエクスビボで増殖できる。方法は、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ分子のリガンド存在下、免疫細胞の集団を培養することをさらに含む。
【０５８２】
他の実施形態において、細胞を増殖及び／又は活性化する方法は、さらに第２の刺激性分子、例えば、ＣＤ２８の添加を含む。例えば、ＣＡＲリガンド及び第２の刺激性分子を基質、例えば、１つ以上のビーズに固定し、それにより細胞増殖及び／又は活性化を増加させ得る。
【０５８３】
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞を選択又は富化する方法を提供する。方法は、ＣＡＲ発現細胞と本明細書に記載されるようなＣＡＲリガンドを接触させ、ＣＡＲリガンドの結合に基づき細胞を選択することを含む。
【０５８４】
さらに他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞を枯渇、減少及び／又は死滅する方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞と本明細書に記載されるようなＣＡＲリガンドを接触させ；及び細胞を、ＣＡＲリガンドの結合に基づき標的化し、それによりＣＡＲ発現細胞の数を減らす及び／又は殺傷することを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲリガンドは、毒性剤と結合する（例えば、トキシン又は細胞除去剤）。一部の実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣ又はＡＤＣ活性を生じ得る。
【０５８５】
本明細書に開示する方法において使用できる例示的な抗ＣＡＲ抗体は、例えば、国際公開第２０１４／１９０２７３号パンフレット及びＪｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔ  ＣＤ１９−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ”，ＰＬＯＳ  Ｍａｒｃｈ  ２０１３  ８：３  ｅ５７８３８に記載され、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０５８６】
一部の実施形態において、本明細書における組成物及び方法は、例えば、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年７月３１日出願の米国特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０４３２１９号明細書に記載のような、Ｔ細胞の特定のサブセットのために最適化される。一部の実施形態において、Ｔ細胞の最適化サブセットは、対照Ｔ細胞、例えば、同じ構築物を発現する異なるタイプ（例えば、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋）のＴ細胞と比較して、残留性の増強を示す。
【０５８７】
一部の実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲを含み、そのＣＡＲは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に適する（例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る）細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインを含む。一部の実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲを含み、そのＣＡＲは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に適する（例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る）細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン又はＩＣＯＳドメイン以外の共刺激ドメインを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲは、本明細書に記載の抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインを含むＣＡＲを含む。
【０５８８】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるのは、対象、例えば、癌を有する対象を処置する方法である。方法は、前記対象に、有効量の：
１）抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；及び
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば第１の共刺激ドメイン、例えばＩＣＯＳドメイン
を含む、ＣＡＲを含むＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＡＲＣＤ４＋）；並びに
２）ＣＡＲを含むＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＡＲＣＤ８＋）であって、
抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；及び
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば第２の共刺激ドメイン、例えば４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン又はＩＣＯＳドメイン以外の別の共刺激ドメイン
を含むもの
を投与することを含み、ここで、ＣＡＲＣＤ４＋とＣＡＲＣＤ８＋は互いに異なる。任意選択により、方法は、さらに、
３）ＣＡＲを含む第２のＣＤ８＋Ｔ細胞（第２のＣＡＲＣＤ８＋）であって、
抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；及び
第２のＣＡＲＣＤ８＋が、ＣＡＲＣＤ８＋上に存在しない細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインを含み、任意選択により、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインを含まない、細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む。
【０５８９】
バイオポリマー送達方法
一部の実施形態において、本明細書に開示する１つ以上のＣＡＲ発現細胞を、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与又は送達し得る。バイオポリマー足場は、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞の送達、増殖及び／分散を支持又は強化することができる。バイオポリマー足場は、生体適合性（例えば、炎症性又は免疫応答を実質的に誘発しない）及び／又は天然に存在し得るか又は合成である生分解性ポリマーを含む。例示的なバイオポリマーは、例えば、２０１５年３月１３日に出願された国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットの段落１００４〜１００６に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０５９０】
医薬組成物及び処置
一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるように産生されたＣＡＲ発現細胞を、任意選択により１つ以上の他の治療と組み合わせて、投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるようなＣＡＲ発現細胞を含む反応混合物を、任意選択により１つ以上の他の治療と組み合わせて、投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるようなＣＡＲ発現細胞を含む反応混合物を発送又は受領する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるように産生されたＣＡＲ発現細胞を受領することを含み、ＣＡＲ発現細胞を、任意選択により１つ以上の他の治療と組み合わせて、患者に投与することをさらに含む、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるようなＣＡＲ発現細胞を産生することを含み、ＣＡＲ発現細胞を、任意選択により１つ以上の他の治療と組み合わせて、患者に投与することをさらに含む、患者を処置する方法を提供する。他の療法は、例えば、化学療法などの癌療法であり得る。
【０５９１】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞を、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて対象に投与する。Ｔｒｅｇ細胞数を減らす（例えば、枯渇させる）方法は当分野で知られ、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与、ＧＩＴＲ機能修飾を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、アフェレーシス前又は本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞投与前に対象におけるＴｒｅｇ細胞数を減らすことは、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）の数を減らし、対象の再発のリスクを減らすと考えられる。
【０５９２】
一部の実施形態において、本明細書に記載の治療、例えば、ＣＡＲ発現細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させるＧＩＴＲアゴニスト及び／又はＧＩＴＲ抗体などのＧＩＴＲを標的とする及び／又はＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて対象に投与される。実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞を、対象にシクロホスファミドと組み合わせて投与する。一部の実施形態において、ＧＩＴＲ結合分子及び／又はＧＩＴＲ機能を調節する分子（例えば、ＧＩＴＲアゴニスト及び／又はＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体）を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一部の実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストを細胞のアフェレーシス前に投与できる。実施形態において、シクロホスファミドを、対象にＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入又は再注入）前又は細胞のアフェレーシス前に投与する。実施形態において、シクロホスファミド及び抗ＧＩＴＲ抗体を、対象にＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入又は再注入）前又は細胞のアフェレーシス前に投与する。一部の実施形態において、対象は癌（例えば、固形癌又はＡＬＬ又はＣＬＬなどの血液癌）を有する。一部の実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。実施形態において、対象はＡＬＬを有する。実施形態において、対象は固形癌、例えば、本明細書に記載の固形癌を有する。例示的なＧＩＴＲアゴニストは、例えば、米国特許第６，１１１，０９０号明細書、欧州特許第０９０５０５Ｂ１号明細書、米国特許第８，５８６，０２３号明細書、国際公開第２０１０／００３１１８号パンフレット及び同２０１１／０９０７５４号パンフレットに記載のＧＩＴＲ融合タンパク質又は例えば米国特許第７，０２５，９６２号明細書、欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号明細書、米国特許第７，８１２，１３５号明細書、米国特許第８，３８８，９６７号明細書、米国特許第８，５９１，８８６号明細書、欧州特許出願公開第ＥＰ１８６６３３９号明細書、国際公開第２０１１／０２８６８３号パンフレット、国際公開第２０１３／０３９９５４号パンフレット、国際公開第２００５／００７１９０号パンフレット、国際公開第２００７／１３３８２２号パンフレット、国際公開第２００５／０５５８０８号パンフレット、国際公開第９９／４０１９６号パンフレット、国際公開第２００１／０３７２０号パンフレット、国際公開第９９／２０７５８号パンフレット、国際公開第２００６／０８３２８９号パンフレット、国際公開第２００５／１１５４５１号パンフレット、米国特許第７，６１８，６３２号明細書及び国際公開第２０１１／０５１７２６号パンフレットに記載される抗ＧＩＴＲ抗体など、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質及び抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）を含む。
【０５９３】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、本明細書に記載のＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて対象に投与する。一部の実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストを、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一部の実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストを細胞のアフェレーシス前に投与できる。一部の実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。
【０５９４】
本明細書に記載の方法は、医薬組成物中にＣＡＲ発現細胞を製剤化することをさらに含み得る。医薬組成物は、本明細書に記載のように、ＣＡＲ発現細胞、例えば複数のＣＡＲ発現細胞を１つ以上の薬学的に又は生理学的に許容される担体、希釈剤又は添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチド又はアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。組成物は、例えば静脈内投与のために、製剤化することができる。
【０５９５】
一部の実施形態において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞又はプラスミド成分、細菌及び真菌からなる群から選択される汚染物が実質的になく、例えば検出可能なレベルで存在しない。一部の実施形態において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ａ群からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０５９６】
「免疫学的に有効量」、「抗癌有効量」、「癌阻害有効量」又は「治療量」が示されるとき、組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染の程度又は転移及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して医師が決定できる。本明細書に記載の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を含む医薬組成物を、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、いくつかの例において１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の範囲の用量（これらの範囲内の全整数値を含む）で投与し得ると一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物をまたこの用量で複数回投与し得る。細胞を、免疫療法において一般に知られる注入技術を使用して投与できる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。
【０５９７】
一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞）の用量は、約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８又は５×１０８細胞／ｋｇを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞）の用量は、少なくとも約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８又は５×１０８細胞／ｋｇを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞）の用量は、最大約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８又は５×１０８細胞／ｋｇを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞）の用量は、約１．１×１０６〜１．８×１０７細胞／ｋｇを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞）の用量は、約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９又は５×１０９細胞を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞）の用量は、少なくとも約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９又は５×１０９細胞を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞）の用量は、最大約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９又は５×１０９細胞を含む。
【０５９８】
一部の実施形態において、活性化された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を対象に投与し、その後、血液を再採取し（又はアフェレーシスを実施し）、そこから免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化し、これらの活性化及び増殖した免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を患者に再注入することが望ましい場合がある。この過程を数週間毎に複数回実施できる。一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血した血液から活性化することができる。一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ又は１００ｃｃの採血した血液から活性化される。
【０５９９】
対象組成物の投与は、任意の簡便な方法により実施し得る。本明細書に記載の組成物は、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により又は腹腔内に、例えば、皮内又は皮下注射により患者に投与し得る。免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の組成物を、腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注射し得る。
【０６００】
投薬レジメン
一部の実施形態では、１用量の生存ＣＡＲ発現細胞（例えば、生存ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０又はＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞）は、約０．５×１０６個の生存ＣＡＲ発現細胞〜約１．２５×１０９個の生存ＣＡＲ発現細胞（例えば、０．５×１０６個の生存ＣＡＲ発現細胞〜１．２５×１０９個の生存ＣＡＲ発現細胞）を含む。一部の実施形態では、１用量の生存ＣＡＲ発現細胞（例えば、生存ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０又はＣＤ２２  ＣＡＲ発現細胞）は、約１×１０６、約２．５×１０６、約５×１０６、約１．２５×１０７、約２．５×１０７、約５×１０７、約５．７５×１０７又は約８×１０７個の生存ＣＡＲ発現細胞を含む。
【０６０１】
患者の選択
対象を処置する方法又は本明細書に開示される使用のための組成物のいずれかの一部の実施形態では、対象は、癌、例えば血液癌を有する。一部の実施形態では、癌は、リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性炎症を伴うＤＬＢＣＬ、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、濾胞性リンパ腫、小児性濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫（粘膜関連リンパ組織型節外性濾胞辺縁帯リンパ腫）、辺縁帯リンパ腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫／白血病、脾臓びまん性赤脾髄小細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病−変異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、Ｈ鎖病、プラズマ細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児性節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ＋大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に発生する大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は分類不能なリンパ腫から選択される。一部の実施形態では、癌は、再発及び／又は難治性癌である。
【０６０２】
対象を処置する方法又は本明細書に開示される使用のための組成物のいずれかの一部の実施形態では、対象は、ＣＬＬ又はＳＬＬを有する。一部の実施形態では、ＣＬＬ又はＳＬＬを有する対象は、以前、ＢＴＫ阻害剤療法、例えばイブルチニブを少なくとも１〜１２ヶ月、例えば６カ月にわたって投与されている。一部の実施形態では、ＢＴＫ阻害剤療法、例えばイブルチニブ療法は、第二選択療法である。一部の実施形態では、対象は、部分的応答を有したか、又はＢＴＫ阻害剤療法に対する応答が安定した疾患を有した。一部の実施形態では、対象は、ＢＴＫ阻害剤療法に対して応答しなかった。一部の実施形態では、対象は、耐性を発生し、例えばイブルチニブ耐性突然変異を発生した。一部の実施形態では、イブルチニブ耐性突然変異は、ＢＴＫをコードする遺伝子及び／又はＰＬＣｇ２をコードする遺伝子の突然変異を含む。一部の実施形態では、対象は、成人、例えば少なくとも１８歳である。
【０６０３】
対象を処置する方法又は本明細書に開示される使用のための組成物のいずれかの一部の実施形態では、対象は、ＤＬＢＣＬ、例えば再発及び／又は難治性ＤＬＢＣＬを有する。一部の実施形態では、ＤＬＢＣＬ、例えば再発及び／又は難治性ＤＬＢＣＬを有する対象は、以前、少なくとも２つの選択化学療法、例えば抗ＣＤ２０療法及び／又はアントラリンに基づく化学療法を実施されている。一部の実施形態では、対象は、以前、幹細胞療法、例えば自己幹細胞療法を受けており、前記幹細胞療法に対して応答しなかった。一部の実施形態では、対象は、幹細胞療法、例えば自己幹細胞療法に適格ではない。一部の実施形態では、対象は、成人、例えば少なくとも１８歳である。
【０６０４】
ＣＡＲ有効性を評価するためのバイオマーカー
一部の実施形態では、対象（例えば、癌、例えば血液癌を有する対象）において、ＣＡＲ発現細胞療法（例えば、ＣＤ１９若しくはＢＣＭＡ  ＣＡＲ療法）の有効性を評価又はモニターする方法が本明細書に開示される。この方法は、ＣＡＲ療法に対する有効性の値を取得することを含み、ここで、前記値は、ＣＡＲ発現細胞療法の有効性又は適合性を示す。
【０６０５】
複数の実施形態では、ＣＬＬ若しくはＳＬＬを有する対象におけるＣＡＲ療法に対する有効性の値は、下記パラメーターの１つ、２つ、３つ若しくは全部の尺度を含む：
（ｉ）サンプル（例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたＣＡＲ発現細胞産物サンプル）中のＢＴＫをコードする遺伝子の突然変異；
（ｉｉ）サンプル（例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたＣＡＲ発現細胞産物サンプル）中のＰＬＣｇ２をコードする遺伝子の突然変異；
（ｉｉｉ）サンプル（例えば、対象からのアフェレーシスサンプル若しくは腫瘍サンプル）中の；例えばＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ９５、Ｌａｇ３、ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３及び／若しくはＣＤ８１のレベル及び／若しくは活性により評価される；又は免疫グロブリンディープシーケンシングにより評価されるような微小残存病変；又は
（ｉｖ）サンプル、例えば対象からのアフェレーシスサンプル中の、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−ａ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ１，ＭＩＰ１ａから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくは全部のレベル又は活性。
【０６０６】
複数の実施形態では、ＤＬＢＣＬ、例えば再発及び／又は難治性ＤＬＢＣＬを有する対象のＣＡＲ療法に対する有効性の値は、下記パラメーターの１つ又は両方の尺度を含む：
（ｉ）サンプル（例えば、対象からのアフェレーシスサンプル若しくは腫瘍サンプル）中の；例えばＣＤ８、ＣＤ４、ＣＡＲ１９、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、ＣＤ９５、Ｌａｇ３、ＰＤ−１及び／若しくはＴｉｍ−３のレベル及び／若しくは活性により評価される；又は免疫グロブリンディープシーケンシングにより評価されるような微小残存病変；又は
（ｉｉ）サンプル（例えば、対象からアフェレーシスサンプル）中の、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−ａ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ１，ＭＩＰ１ａから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくは全部のレベル又は活性。
【０６０７】
他の実施形態では、ＣＡＲ療法に対する有効性の値は、下記パラメーターの１、２、３、４、５、６つ若しくはそれを超える（全部）の尺度をさらに含む：
（ｉ）サンプル（例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたＣＡＲ発現細胞産物サンプル）中の、休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、より若いＴ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞（例えば、ナイーブＣＤ４若しくはＣＤ８  Ｔ細胞、ナイーブγ／δ  Ｔ細胞）、若しくはステムメモリーＴ細胞（例えば、ステムメモリーＣＤ４若しくはＣＤ８Ｔ細胞若しくはステムメモリーγ／δ  Ｔ細胞）、若しくは早期メモリーＴ細胞又はそれらの組み合わせの１、２、３つ若しくはそれを超えるもの（例えば、全部）のレベル又は活性；
（ｉｉ）サンプル（例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたＣＡＲ発現細胞産物サンプル）中の、活性化ＴＥＦＦ細胞、活性化ＴＲＥＧ細胞、より経時的なＴ細胞（例えば、より経時的なＣＤ４若しくはＣＤ８細胞）若しくは後期メモリーＴ細胞又はそれらの組み合わせの１、２、３つ若しくはそれを超えるもの（例えば、全部）のレベル又は活性；
（ｉｉｉ）サンプル（例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたＣＡＲ発現細胞産物サンプル）中の、免疫細胞疲弊マーカー、例えば１、２つ若しくはそれを超えるものの免疫チェックポイント阻害因子（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ及び／又はＬＡＧ−３）のレベル又は活性。一部の実施形態において、免疫細胞は、疲弊表現型を有し、例えば少なくとも２つの疲弊マーカー、例えばＰＤ−１及びＴＩＭ−３を同時発現する。他の実施形態では、免疫細胞は、疲弊表現型を有し、例えば少なくとも２つの疲弊マーカー、例えばＰＤ−１及びＬＡＧ−３を同時発現する；
（ｉｖ）サンプル（例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたＣＡＲ発現細胞産物サンプル）中の、例えばＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞集団における、ＣＤ２７及び／又はＣＤ４５ＲＯ−（例えば、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ−）免疫エフェクター細胞のレベル又は活性；
（ｖ）ＣＣＬ２０、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−６、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ５７、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１から選択されるバイオマーカーの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは全部のレベル又は活性；
（ｖｉ）ＣＡＲ発現細胞産物サンプル、例えばＣＬＬ−１発現細胞産物サンプル中のサイトカインレベル又は活性（例えば、サイトカインレパトアの品質）；又は
（ｖｉｉ）製造されたＣＡＲ発現細胞産物サンプル中のＣＡＲ発現細胞の形質導入効率。
【０６０８】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞療法は、複数のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞（例えば、その集団）、例えば複数のＴ細胞若しくはＮＫ細胞（例えば、その集団）又はそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞療法は、ＣＤ１９ＣＡＲ療法である。
【０６０９】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、本明細書に開示される１つ以上のパラメーターの尺度は、対象から得たアフェレーシスサンプルから取得される。アフェレーシスサンプルは、注入又は再注入前に評価することができる。
【０６１０】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、本明細書に開示される１つ以上のパラメーターの尺度は、対象から得た腫瘍サンプルから取得される。
【０６１１】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、本明細書に開示される１つ以上のパラメーターの尺度は、製造されたＣＡＲ発現細胞産物サンプル、例えばＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞産物サンプルから取得される。製造されたＣＡＲ発現細胞産物は、注入又は再注入前に評価することができる。
【０６１２】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞療法を受ける前、療法の過程で又はそれを受けた後に評価される。
【０６１３】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、本明細書に開示される１つ以上のパラメーターの尺度により、１つ以上の遺伝子発現、フローサイトメトリー又はタンパク質発現についてのプロフィールを評価する。
【０６１４】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、本方法は、本明細書に開示される１つ以上のパラメーターの尺度に基づいて、対象を応答者、非応答者、再発者又は非再発者として識別することをさらに含む。
【０６１５】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、応答者、例えば完全応答者は、参照値、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞の非応答者パーセンテージと比べて、高い、例えば統計的に有意に高いパーセンテージのＣＤ８＋Ｔ細胞を有するか又は有する者として識別される。
【０６１６】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、応答者、例えば完全応答者は、参照値、例えばＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ−免疫エフェクター細胞の非応答者数と比べて、例えばＣＤ８＋集団において、高いパーセンテージのＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ−免疫エフェクター細胞を有するか又は有する者として識別される。
【０６１７】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、応答者、例えば完全応答者若しくは部分応答者は、参照値、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞の非応答者パーセンテージと比べて、高い、例えば統計的に有意に高いパーセンテージのＣＤ４＋Ｔ細胞を有するか又は有する者として識別される。
【０６１８】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、応答者、例えば完全応答者は、参照値、例えば休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、より若いＴ細胞若しくは早期メモリーＴ細胞の非応答者数と比べて、高いパーセンテージで休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、より若いＴ細胞若しくは早期メモリーＴ細胞又はそれらの組み合わせの１、２、３つ若しくはそれを超えるもの（例えば、全部）を有するか又は有する者として識別される。
【０６１９】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、非応答者は、参照値、例えば活性化ＴＥＦＦ細胞、活性化ＴＲＥＧ細胞、より経時的なＴ細胞（例えば、より経時的なＣＤ４若しくはＣＤ８細胞）又は後期メモリーＴ細胞の応答者数と比べて、高いパーセンテージで、活性化ＴＥＦＦ細胞、活性化ＴＲＥＧ細胞、より経時的なＴ細胞（例えば、より経時的なＣＤ４若しくはＣＤ８細胞）若しくは後期メモリーＴ細胞又はそれらの組み合わせの１、２、３つ若しくはそれを超えるもの（例えば、全部）を有するか又は有する者として識別される。
【０６２０】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、非応答者は、より高いパーセンテージの免疫細胞疲弊マーカー、例えば１、２つ又はそれを超える免疫チェックポイント阻害因子（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ及び／若しくはＬＡＧ−３）を有するか又は有する者として識別される。一部の実施形態では、非応答者は、応答者からのＰＤ−１若しくはＬＡＧ−３発現免疫エフェクター細胞パーセンテージと比べて、高いパーセンテージのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１若しくはＬＡＧ−３発現免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞）（例えば、ＣＡＲ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞）を有するか又は有する者として識別される。
【０６２１】
一部の実施形態では、非応答者は、より高いパーセンテージで、疲弊表現型を有する免疫細胞、例えば少なくとも２つの疲弊マーカーを同時発現する、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及び／若しくはＴＩＭ−３を同時発現する免疫細胞を有するか又は有する者として識別される。他の実施形態では、非応答者は、より高いパーセンテージで、疲弊表現型を有する免疫細胞、例えば少なくとも２つの疲弊マーカーを同時発現する、例えばＰＤ−１及びＬＡＧ−３を同時発現する免疫細胞を有するか又は有する者として識別される。
【０６２２】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、非応答者は、ＣＡＲ発現細胞療法に対する応答者（例えば、完全応答者）と比べて、高いパーセンテージで、ＣＡＲ発現細胞集団（例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ＋細胞集団）中にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＬＡＧ−３＋細胞を有するか又は有する者として識別される。
【０６２３】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、応答者（例えば、完全又は部分応答者）は、下記プロフィールの１、２、３つ若しくはそれを超えるもの（又は全部）を有する：
（ｉ）参照値、例えばＣＤ２７＋免疫エフェクター細胞の非応答者数と比べて、高い数のＣＤ２７＋免疫エフェクター細胞を有する；
（ｉｉ）参照値、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞の非応答者数と比べて、高い数のＣＤ８＋Ｔ細胞を有する；
（ｉｉｉ）参照値、例えば１つ以上のチェックポイント阻害因子を発現する細胞の非応答者数と比べて、少数の、１つ以上のチェックポイント阻害因子、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３若しくはＫＬＲＧ−１又はそれらの組み合わせから選択されるチェックポイント阻害因子を発現する免疫細胞を有する；又は
（ｉｖ）参照値、例えば休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、ナイーブＣＤ４細胞、非刺激メモリーＴ細胞若しくは早期メモリーＴ細胞の非応答者数と比べて、高い数で、休止ＴＥＦＦ細胞、休止ＴＲＥＧ細胞、ナイーブＣＤ４細胞、非刺激メモリーＴ細胞若しくは早期メモリーＴ細胞又はそれらの組み合わせの１つ、２つ、３つ、４つ若しくはそれを超えるもの（全部）を有する。
【０６２４】
複数の実施形態では、本明細書の方法によって特定された応答者、非応答者、再発者又は非再発者である対象は、臨床基準に従ってさらに評価することができる。例えば、完全応答者は、疾患、例えば癌を有するか又は有する者で、処置に対して完全応答、例えば完全寛解を呈示する対象として識別される。完全応答は、例えば、ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（登録商標）又はその全体が参照により本明細書に組み込まれるＨａｌｌｅｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１８）１３１：２７４５−２７６０“ｉｗＣＬＬ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，ａｎｄ  ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＬＬ，”に開示される通りのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（ｉｗＣＬＬ）２０１８を用いて識別され得る。部分応答者は、疾患、例えば癌を有するか又は有する者で、処置に対して部分応答、例えば部分寛解を呈示する対象として識別される。部分応答は、例えば、ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（登録商標）又は本明細書に記載される通りのｉｗＣＬＬ  ２０１８基準を用いて識別され得る。非応答者は、疾患、例えば癌を有するか又は有する者として識別され、その対象は、処置に対して応答を呈示せず、例えば、患者は、安定又は進行性疾患を有する。非応答者は、例えば、ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（登録商標）又は本明細書に記載される通りのｉｗＣＬＬ  ２０１８基準を用いて識別され得る。
【０６２５】
上記に代わり又は本明細書に開示の方法と組み合わせて、前記の値に応答して、以下のステップの１つ、２つ、３つ、４つ若しくはそれを超えるものを実施する：
例えば、応答者又は非応答者に、ＣＡＲ発現細胞療法を投与する；
変更された用量設定のＣＡＲ発現細胞療法を投与する；
ＣＡＲ発現細胞療法のスケジュール又はタイムコースを変更する；
例えば、非応答者又は部分応答者に、ＣＡＲ発現細胞療法と組み合わせて、追加薬剤、例えばチェックポイント阻害因子、例えば本明細書に記載のチェックポイント阻害因子を投与する；
非応答者又は部分応答者に、ＣＡＲ発現細胞療法による処置前に対象中の若いＴ細胞の数を増加させる療法を実施する；
例えば、非応答者又は部分応答者として識別された対象の場合、ＣＡＲ発現細胞療法の製造プロセスを改変する、例えばＣＡＲをコードする核酸の導入前に若いＴ細胞を濃縮するか又は形質導入効率を高める；
例えば、非応答者若しくは部分応答者又は再発者の場合、代替療法を実施する；又は
対象が、非応答者又は再発者であるか又はそれとして識別される場合、例えばＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体の投与の１つ以上又はそれらの組み合わせにより、ＴＲＥＧ細胞集団及び／又はＴＲＥＧ遺伝子シグネチャーを低減する。
【実施例】
【０６２６】
本発明を、次の実験的実施例を参照してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみを目的として提供し、特に断らない限り限定を意図しない。従って、本発明は、決して次の実施例に限定されると解釈してはならず、むしろ本明細書に提供する教示の結果として明らかとなる任意且つ全ての変形形態を含むと解釈すべきである。
【０６２７】
実施例１：サイトカイン刺激によるＣＡＲＴの産生
概要
この実施例では、「サイトカインプロセス」と呼ばれるＣＡＲＴ製造プロセスを説明する。一部の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）を培地（例えば、血清含有培地、例えば２％血清を含有する培地）に接種する。例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５（例えば、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ））、ＩＬ−２１又はＩＬ−６（例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａ）から選択される１つ以上のサイトカイン並びにＣＡＲをコードするベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を細胞に添加する。２０〜２４時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、製剤化した後、凍結保存する。例示的なサイトカインプロセスを図１Ａに示す。
【０６２８】
伝統的なＣＡＲＴ製造プロセスと比較して、この修正プロセスは、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激並びにエクスビボＴ細胞増殖を排除する。理論に縛られることを意図しないが、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズは、セントラルメモリーＴ細胞への分化を駆動し；これと対照的に、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びＩＬ−７などのサイトカインは、形質導入されたＣＤ３＋Ｔ細胞の未分化表現型の保存を助け得る。結論として、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化を伴わないサイトカインプロセスは、伝統的な手法を用いて作製されるＣＡＲＴ細胞と比べて、高いパーセンテージのナイーブ／ステムＴ細胞を含むＣＡＲＴ細胞を作製することができる。
【０６２９】
方法
採取から２４時間以内にアフェレーシスを取得した後、Ｔ細胞を精製し、得られたＴ細胞の純度をフローサイトメトリーで評価する。Ｔ細胞を凍結した後、使用の必要があるまで液体窒素中に配置する。
【０６３０】
代わりに、凍結保存アフェレーシスサンプルを調製した後、Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）機を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮する。
【０６３１】
必要な最終濃度の１，０００倍で、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を調製した。ＩＬ−２は、培地中での１０倍希釈により調製した。
【０６３２】
【表４７】
2021534783.tif 000064
【０６３３】
エキスパンダービーズ刺激条件では、計算を実施して、ビーズ対細胞比が３：１の最終濃度で細胞を平板培養した。Ｄｙｎａｍａｇ（登録商標）を用いて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）磁気ビーズを洗浄し、実験に必要な量の培地中に再懸濁させた。洗浄したビーズを、特定のサイトカイン及び細胞の入ったチューブに添加した。
【０６３４】
平板培養時、１の多重感染度（ＭＯＩ）で、レンチウイルスベクターにより細胞を形質導入した。形質導入しようとするベクターの具体的な量は、使用中のベクターロットの多重感染度（ＭＯＩ）及び濃度（力価）に基づいて計算した。力価及びＭＯＩは、初代Ｔ細胞株に基づいて測定した。
【０６３５】
刺激のためにサイトカインのみを使用する条件では、細胞を洗浄後１Ｅ７／ｍｌの濃度で再懸濁させ、条件（表１９）に応じてサイトカインを既に含有するコニカルチューブに添加した。細胞及びサイトカインを添加した後、レンチウイルスベクター、次いで培地を添加した。
【０６３６】
全ての条件において、細胞を混合し、２４ウェルプレートの１４ウェルに１ｍｌを平板培養した。細胞をインキュベーター内に配置したが、これは３７℃及び５％ＣＯ２であった。
【０６３７】
翌日、細胞を採取し、細胞の濃度及び生存性を記録した。それらの機能は、細胞毒性及び増殖（ＥＤＵ）合同アッセイを用いて測定した。これらの細胞は、「第１日ＣＡＲＴ」と称される。
【０６３８】
Ｔ細胞分化状態について細胞の免疫表現型を決定した後、フローサイトメトリーを用いてＣＡＲの形質導入を評価した。細胞を洗浄し、生死判定試薬、続いて抗体カクテルを添加し（表２０）、プレートを室温で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、固定した後、ＢＤ  ｆｏｒｔｅｓｓａで解析した。
【０６３９】
【表４８】
2021534783.tif 000065
【０６４０】
第１日ＣＡＲＴが、採取後に増殖する能力を依然として維持しているか否かを決定するために、Ｔ２５フラスコにおいて、３：１（ビーズ対細胞）の比でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて、５ｅ６細胞／条件を増殖させた。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）磁気ビーズを前述のように洗浄した。培地は、サイトカインを含まなかった。３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーター内に細胞を配置した。
【０６４１】
２日毎にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて増殖させるＴ細胞の場合、最大１０日の培養で細胞をカウントし、溢流（ｓｐｉｌｔ）させた。第１０日に、細胞を回収し、カウントしてから、分化パネル（表２０）を用いて免疫表現型を決定した後、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  １０（商標）を用いて凍結した。機能性アッセイのために細胞を解凍したが、これらのアッセイは、細胞毒性アッセイ、増殖アッセイ及びサイトカイン分泌アッセイを含んだ。
【０６４２】
ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下、インビトロで１０日間増殖させた細胞は、「第１０日ＣＡＲＴ」と称される。
【０６４３】
精製Ｔ細胞を他の活性化刺激の非存在下でサイトカインと一緒にインキュベートしたとき、第１日から第４日まで形質導入の増加があった（図１Ｂ）。時点及びサイトカイン条件とは独立に、ＣＡＲ陽性集団内で優勢な集団は、ナイーブであった（図１Ｄ、１Ｅ及び１Ｆ）。活性化因子の排除により、初期集団による形質導入の増強が起こった。特に、ＩＬ−２又はＩＬ−１５に対する曝露は、インビトロでの自己再生Ｔ細胞を維持した（図１Ｇ）。試験した他のサイトカイン処理（ＩＬ−７；ＩＬ２＋ＩＬ７；ＩＬ−７＋ＩＬ−１５；及びＩＬ２＋ＩＬ−１５）でも、同様の現象が観察された（データは示していない）。サイトカインプロセス（この具体的な実施例では、ＩＬ２又はＩＬ−１５を用いた）は、ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋細胞のパーセンテージを維持するか又はやや増加した（図１Ｇ）。ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−７とＩＬ−１５の組み合わせについて、類似のデータを図１Ｈ及び１Ｉに示す。表示のサイトカインと一緒にＴ細胞を２４時間培養すると、ＣＤ３＋Ｔ細胞のナイーブ表現型が維持されると共に、セントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージが低下した（図１Ｈ及び１Ｉ）。
【０６４４】
２４時間以内に観察された形質導入が安定していることを確実にするために、２４時間以内に産生されたＣＡＲＴを洗浄して、残留ウイルスを全て除去してから、ＣＤ３／Ｄ２８増殖ビーズを用いて１０日にわたって増殖させた。増殖した細胞は、第１日ＣＡＲＴとほぼ同等の形質導入を示し、これは、形質導入が安定していることを示した（図２Ａ）。
【０６４５】
細胞毒性、サイトカイン放出及び増殖アッセイを用いて、第１日ＣＡＲＴ及び第１０日ＣＡＲＴの機能性を検定した。標的細胞は、Ｎａｌｍ６細胞、すなわちＣＤ１９を発現するＢ細胞ＡＬＬ細胞であった。細胞毒性アッセイから、増殖後第１日ＣＡＲＴは、第１日ＣＡＲＴがはるかに少ない形質導入細胞を含有したとしても、第１０日ＣＡＲＴ（図２Ｂ）と比較して、殺傷では同等であることが証明された。増殖させた同じ第１日ＣＡＲＴをＩＦＮ−γの分泌について比較すると、第１０日ＣＡＲＴ（図２Ｃ）と比較して、低いＩＦＮ−γ分泌を有することが判明し、これは、恐らく形質導入細胞の数の差によるものであろう。第１日ＣＡＲＴが、より高レベルの形質導入を有する別の試験では、それらは、より高レベルのＩＦＮ−γを分泌した（データは示していない）。さらに、ＩＬ７単独の条件を除く全ての処理条件からの第１日ＣＡＲＴは、第１０日ＣＡＲＴと同等であるか又はそれより高い増殖を示した（図２Ｄ）。図２Ｄに示すデータは、形質導入レベルについて正規化していない。
【０６４６】
第１０日ＣＡＲＴには安定な形質導入が観察されたが、効率は一貫して低かった。レンチウイルスベクターの多重感染度（ＭＯＩ）増加の力価測定を４つのサイトカイン条件で検定したところ、試験した全ての条件で、形質導入との線形関係が観察された（図３Ａ）。
【０６４７】
さらに、様々な培地組成物（主として、５％から２％、２％から無血清までの血清濃度の低減）を比較して、それらが形質導入効率に影響を及ぼすか否かを決定した。２％ヒト血清までの血清の低減は、最も高い形質導入効率をもたらした（図３Ｂ）。グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）のみの添加も、形質導入効率に有意な影響を及ぼすと考えられた。
【０６４８】
次に、第１日ＣＡＲＴ及び第１０日ＣＡＲＴを、インビボでのそれらの抗腫瘍活性について、マウスＡＬＬモデルを用いて検定した。手短には、８０％を超える生存率で、前述のように第１日ＣＡＲＴ及び第１０日ＣＡＲＴを製造した（図４Ａ及び４Ｂ）。ＣＡＲＴを腫瘍担持マウスに投与し、インビボでの増殖についてモニターした。図４Ｃに示す通り、第１日ＣＡＲＴは、それらの第１０日ＣＡＲＴ対応物よりも高いレベルのインビボ増殖を示した。特に、ＩＬ−２の存在下で製造されたＣＡＲＴが、最も高いレベルのインビボ増殖を示した（図４Ｃ）。試験したＣＡＲＴ、全てインビボで腫瘍増殖を阻害したが、第１日ＣＡＲＴは、第１０日ＣＡＲＴと比較して動態の遅れを示した（図４Ｄ）。この特定のドナーにおいて、ＩＬ２条件は、インビボで腫瘍を排除する最も高い能力を明らかにした（図４Ｄ）。
【０６４９】
さらに、この製造プロセスがスケーラブルであるかどうかも調べた。ＩＬ２又はｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ）いずれかの存在下、２４ウェルプレート又は濃縮後のＰＬ３０バッグのいずれかにおいて、凍結アフェレーシスサンプルからの精製Ｔ細胞をＣＡＲ１９で形質導入した。ｈｅｔＩＬ−１５は、国際公開第２０１４／０６６５２７号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、これは、ヒトＩＬ−１５Ｒａの可溶性形態と複合体化したヒトＩＬ−１５を含む。細胞を２４時間後に回収し、ＣＡＲの発現について検定した。図５Ｂに示すように、プロセスを、ＩＬ２又はｈｅｔＩＬ−１５の存在下において、２４ウェルプレートからＰＬ３０バッグにスケーリングしたとき、観察される形質導入に影響はなかった。
【０６５０】
実施例２：ＴＣＲ刺激によるＣＡＲＴの産生
概要
この実施例では、「活性化プロセス」と呼ばれるＣＡＲＴ製造プロセスを説明する。一部の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）を、ＩＬ−２を含有する培地（例えば、無血清培地、例えばＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地）（例えば、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）サプリメント、Ｇｌｕｔａｍａｘ及び１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地）に接種し、細胞培養装置内に配置して、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、ＴｒａｎｓＡｃｔ）と接触させる。１２時間後、ＣＡＲをコードするベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を細胞に添加し、細胞をインキュベーターに戻す。細胞培養の開始から２４ｈで、細胞を採取し、サンプリングした後、製剤化した。理論に縛られることを意図しないが、例えば抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、ＴｒａｎｓＡｃｔ）を用いた短時間のＣＤ３及びＣＤ２８活性化により、自己再生Ｔ細胞の効率的な形質導入を促進する。
【０６５１】
この実施例及び他の実施例では、「伝統的製造（ＴＭ）」プロセスと呼ばれるＣＡＲＴ製造プロセスを対照として使用した。一部の実施形態では、Ｔ細胞を新鮮な又は凍結保存された白血球アフェレーシスサンプルから選択し（例えば、ポジティブ又はネガティブ選択を用いて）、活性化し（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いて）、ＣＡＲ分子をコードする核酸分子と接触させて（例えば、ＣＡＲ分子をコードする核酸分子を含むレンチウイルスベクターで形質導入する）、例えば７、８、９、１０又は１１日間インビトロで増殖させた。例示的なＴＭプロセスは、ｄ９対照アームからのＣＡＲ細胞を製造するために使用される方法としてこの実施例に提供される。
【０６５２】
方法
一部の実施形態では、本明細書に提供される活性化プロセスは、凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物で開始する。カウント及びＱＣのためのサンプルを取得した後、産物を細胞分別機（例えば、取り付けたＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）デバイスキット）に付着させると、プログラムが開始する。細胞を洗浄し、１つ又は複数の所望の表面マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ９５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２及び／又はＣＤ５６）に結合するマイクロビーズと一緒にインキュベートする。ビーズ標識細胞は、細胞を磁気カラムに通過させることによって選択する。所望であれば、第２セットの表面マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ９５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２及び／又はＣＤ５６）に結合するビーズと一緒に陰性画分をインキュベートした後、細胞を磁気分離カラムに再度通過させることにより、細胞をさらに分離することもできる。単離した細胞を再度洗浄してから、分離バッファーを細胞培地と交換する。次に、精製した細胞を培養に進めるか又は後の使用のために凍結保存する。凍結保存した細胞は、解凍し、予め温めた細胞培地で洗浄した後、細胞培地に再懸濁させることができる。新鮮な細胞を培養物に直接添加することができる。細胞を０．４〜１．２ｅ６細胞／ｃｍ２膜で膜分離バイオリアクターに接種し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ／ポリマー、ナノ粒子又はナノコロイド（及び／又は下記共活性化因子の単独若しくは組み合わせのいずれか：ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＣＤ２若しくはＣＤ２２６を刺激する試薬）などの活性化試薬を添加した後、細胞培地を０．２５〜２ｍｌ／ｃｍ２膜の最終量まで添加する。ＣＡＲをコードするベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を培養開始直後又は１８時間以内に添加する。培養開始から計２４時間にわたって、ベクター及び前述の活性化試薬と一緒に細胞をインキュベートする。培養を２４時間進行させたら、回転若しくはピペット操作又は他の攪拌によって機械的に細胞を再懸濁させてから、刺激試薬スカホールドを適切なバッファーと一緒に溶解させる。細胞を洗浄して、不必要な試薬を除去し、凍結保存培地中に再配合する。細胞は、投与のために必要になるまで凍結保存する。
【０６５３】
図６Ａ〜６Ｃに関連する試験のために、以下のプロトコルを使用した。
【０６５４】
自動フィコール（Ｓｅｐａｘ  ２、ＢｉｏＳａｆｅ）を用いて、新鮮な１／４ロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）から細胞を精製して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を作製した。これらのＰＢＭＣを、免疫磁気ネガティブ選択（ＰａｎＴ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いてさらに精製することにより、高純度（９８〜１００％）のＣＤ３  Ｔ細胞を生成した。これらの細胞を、膜分離バイオリアクター内の、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ）完全培地（添付文書に従って配合され、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ）が添加されている）及び推奨用量の抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化試薬（ＴｒａｎｓＡｃｔ，Ｍｉｌｅｎｙｉ）と一緒に培養させた。次に、細胞を活性化のために３７℃、５％ＣＯ２で１２時間インキュベートした。細胞をインキュベーターから取り出し、新しく解凍したレンチウイルスベクターを２．５ｔｕ／細胞の多重感染度（ＭＯＩ）で培養物に添加した。細胞を形質導入のためにさらに１２時間インキュベーターに戻した。細胞を回収し、培地で２回洗浄してから、滅菌ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接配合した後、ＮＳＧマウスに尾静脈から注射した。ｄ９対照アームからの細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｅｒａｄｉｇｍ）（完全培地、別名「Ｒ１０」）及びＴ細胞当たり３ビーズの抗ＣＤ３／２８Ｅｘｐａｎｄｅｒ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加したＲＰＭＩ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、フラスコ内（Ｔ２５−Ｔ２２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ）で増殖させた。次に、活性化のために、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。細胞をインキュベーターから取り出し、新しく解凍したレンチウイルスベクターを２．５ｔｕ／細胞のＭＯＩで培養物に添加した。細胞をさらに７日間インキュベーターに戻すが、５ｅ５細胞／ｍｌの濃度を維持するために２日毎に分割した。増殖した細胞を５０ｍｌ遠心分離管（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、自立型磁石（Ｄｙｎａｍａｇ−５０、Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、２ラウンドのビーズ除去に付した。次に、脱ビーズした細胞を培地で２回洗浄し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ１０  ｃｒｙｏｍｅｄｉａ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に配合し、ＣｏｏｌＣｅｌｌ  ｄｅｖｉｃｅ（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ）を用いて凍結保存した後、少なくとも４８時間にわたって気相液体窒素中で維持した。細胞を予め温めたＲ１０培地中で解凍し、培地で２回洗浄してから、滅菌ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に配合した後、ＮＳＧマウスに尾静脈から注射した。
【０６５５】
６〜８週齢のＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に、前準備なしでＣＡＲＴ注射の４日前に、１ｅ６細胞／マウスでルシフェラーゼ処理ＮＡＬＭ６腫瘍細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−３２７３，ＡＴＣＣ）を注射した。ＰＢＳ配合ＣＡＲＴ細胞を、ＮＳＧ一匹当たり２ｅ６、５ｅ５若しくは２ｅ５ＣＡＲ＋細胞又は対応用量の非形質導入増殖Ｔ細胞若しくはＰＢＳビヒクル対照を注射した。マウスは、毎週の採血、２週間毎のルシフェラーゼイメージング（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）及び２週間毎の体重測定によりモニターした。動物、全て毒性の兆候（体重減少、瀕死）についてモニターし、症候が現れたら安楽死させた。全ての生存マウスを試験終了時（第５週）に安楽死させて、終末血液、骨髄及び脾臓サンプルを取得した。試験は、ＩＡＣＵＣ及びその他全ての適用可能なガイドラインに従って実施した。
【０６５６】
結果
前述の活性化プロセスを用いて、ＣＡＲＴ細胞を作製し、マウスＡＬＬモデルにおけるそれらのインビボ抗腫瘍活性について特性決定した。図６Ａ〜６Ｃに示す通り、活性化プロセスを用いて製造したＣＡＲＴ細胞は、インビボで強力な抗腫瘍活性を示した。
【０６５７】
実施例３：Ｔ細胞でのＩＬ６Ｒ発現及びＴ細胞増殖に対するサイトカインの作用
材料及び方法
Ｔ細胞培養
以前凍結したＴ細胞を解凍し、第０日に、表示のサイトカインの存在下でαＣＤ３／αＣＤ２８  ｄｙｎａｌビーズ（１：３の細胞：ビーズ比）と接触させた。第３日から、第３、５、６、９、１２、１５及び１８日に、２倍のＴ細胞増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５５μＭβ−メルカプトエタノール、１０％ＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン）を、表示のサイトカイン（サイトカインなし、ｒｈＩＬ２（５０ＩＵ／ｍｌ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＩＬ６（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ７（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＩＬ１５（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びＩＬ２１（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））を含むプレートに添加した。サイトカイン、ＩＬ６又はＩＬ２１なしで処理した細胞は、第１８日まで培養し、ＩＬ２、ＩＬ７又はＩＬ１５で処理した細胞は、第２５日まで培養した。
【０６５８】
細胞表面染色
細胞を表示時点で回収してから、生死判定試薬（ｅＦｌｕｒｏ７８０，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン♯：ＯＫＴ３）、ＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン♯：ＯＫＴ４）、ＣＤ８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン♯：ＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ４５ＲＯ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン♯：ＵＣＨＬ１）、ＣＣＲ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン♯：Ｇ０４３Ｈ７）、ＣＤ２７（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ、クローン♯：Ｌ１２８）、ＣＤ１２７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン♯：Ａ０１９Ｄ５）、ＣＤ５７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン♯：ＨＣＤ５７）、ＣＤ１２６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン♯：ＵＶ４）及びＣＤ１３０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、クローン♯：２８１２６）抗体で染色した。細胞をＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａにより取得した後、ＦｌｏｗＪｏプログラムを使用して、データ解析を実施した。
【０６５９】
細胞内サイトカイン染色
第２５日に、サイトカイン産生細胞の割合（％）を調べるために、Ｔ細胞を採取し、３７℃のインキュベーターにおいてＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在下、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びイオノマイシン（１μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で４時間簡単に活性化させた。次に、Ｔ細胞を生死判定試薬（ｅＦｌｕｒｏ７８０，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン♯：ＯＫＴ３）、ＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン♯：ＯＫＴ４）、ＣＤ８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン♯：ＲＰＡ−Ｔ８）抗体で染色した後、固定及び透過処理した。続いて、Ｔ細胞をＩＦＮ−γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン♯：４Ｓ．Ｂ３）、ＩＬ−２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＭＱ１−１７Ｈ１２）及びＴＮＦ−ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｍａｂ１１）に対する抗体でさらに染色した。細胞をＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａにより取得した後、ＦｌｏｗＪｏプログラムを使用して、データ解析を実施した。
【０６６０】
結果
ＩＬ６Ｒα及び／又はＩＬ６Ｒβ発現細胞を、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の双方で、より低い分化Ｔ細胞サブセット中で濃縮した。図７Ａ及び７Ｂに示す通り、ナイーブＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞は、対応するメモリーＴ細胞よりも高いレベルのＩＬ６Ｒα及びＩＬ６Ｒβを発現した。ＩＬ６Ｒα及びＩＬ６Ｒβを発現したＴ細胞は、主としてＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋細胞であった（図８Ａ及び８Ｂ）。ＴＣＲ刺激時、ＩＬ６Ｒα発現が下方制御されたが、ＩＬ６Ｒβ発現はそうではなかった（図１１）。
【０６６１】
次に、様々なサイトカインを、Ｔ細胞増殖に対するそれらの影響について比較した。試験したサイトカインのうち、ＩＬ１５、ＩＬ２及びＩＬ７は、Ｔ細胞増殖を増大し、ＩＬ１５が最大の増大を示した（図１２）。サイトカイン処置は、細胞のサイズ（図１３Ａ）又は生存率（図１３Ｂ）に影響しなかった。ＩＬ１５処理は、ＩＬ６Ｒβ発現細胞の増殖も増大した（図１４）。ＩＬ６Ｒβ発現細胞は、主に、ＴＣＲ結合後１５日のＣＤ４及びＣＤ８の双方で、ＣＤ２７＋（図１６）又はＣＤ５７−（図１７）Ｔ細胞サブセットに存在し、ＴＣＲ活性化後２５日で、ＩＬ２、ＩＦＮγ及びＴＮＦαサイトカインを産生した（図１８）。
【０６６２】
実施例４：前臨床試験のためのＴＣＲ刺激によるＣＡＲＴの産生
前臨床試験のためのエンジニアリングランの第０日単位操作は、第０日に使用する培地ラピッドバッファー（Ｒａｐｉｄ  Ｂｕｆｆｅｒ）及びラピッドメディア（表２１）の製造から開始した。ラピッドバッファー（ＲＢ）は、０．５％ＨＳＡと共にＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）バッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含有した。ラビットメディア（表２１）は、製造第０日に調製され、基本培地は、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）と呼ばれる既製品培地を含むが、この培地は、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＩＬ−２、ＣＴＳ（商標）サプリメント及びＩＣＳＲを含有する。Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）機を第０日での使用のためにプライミングした。
【０６６３】
【表４９】
2021534783.tif 000066
【０６６４】
Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）機は、第０日にプライミングし、健常なドナー白血球アフェレーシス材料を解凍し、アフェレーシス材料を合わせて６００ｍＬトランスファーバッグに導入したが、これは後にＰｒｏｄｉｇｙ（登録商標）に密着させることができる。ＩＰＣサンプルを６００ｍＬトランスファーバッグから抽出し、ＮＣ２００により測定して、出発アフェレーシス材料について生存細胞数及び生存率パーセンテージを取得した。Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）のプライミングを終了した後、アフェレーシス材料をアプリケーションバッグに移した。ＴＣＴプログラムの開始後にアフェレーシスがＰｒｏｄｉｇｙ（登録商標）機に進入すると、それがどの程度多くのポジティブ選択分離を実施したかに応じて、プログラムは３時間４５分から４時間１５分まで作動した。第０日のＴＣＴプログラムは、ラピッドバッファーによりＣｅｎｔｒｉｃｕｌｔ中のＤＭＳＯを洗い流し、血小板洗浄、減容、Ｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔ中でのＣＤ４及びＣＤ８マイクロビーズとアフェレーシスのインキュベーションに続いて、Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）上の磁石を用いたポジティブ選択により、マイクロビーズでのＴ細胞の選択を実施する。ＣＤ４及びＣＤ８試薬で選択されたＴ細胞を、ラピッドメディアを含むリアプリケーションバッグ中に溶出した。インプロセスコントロール（ＩＰＣ）サンプルをリアプリケーションバッグから取得して、培養容器（Ｇ−Ｒｅｘ５００ＭＣＳ）中の接種に利用可能な総生存細胞数を決定した。
【０６６５】
Ｇ−Ｒｅｘ培養装置をまず、ラピッドメディアでプライミングした後、リアプリケーションバッグからの標的細胞容量を培養容器に添加した。次に、活性化試薬（ＴｒａｎｓＡＣＴ）を培養容器に添加した。続いて、ＴｒａｎｓＡＣＴの導入後にレンチウイルスベクターを培養容器に添加し、１．０のＭＯＩを用いてベクター添加を実施した。次に、Ｇ−Ｒｅｘ５００ＭＣＳ培養容器を、２５０ｍＬの最終培地容量までのラピッドメディア、さらにそのベクター添加容量でフラッシングした。続いて、Ｇ−Ｒｅｘ培養容器をインキュベーター中に配置して、２０〜２８時間の範囲の目標２４ｈにわたって培養物をインキュベートした。
【０６６６】
標的２４ｈインキュベーション後、ＣＡＲＴ培養物をインキュベーターから取り出し、サンプルを抽出して、ハーベストウォッシュ（Ｈａｒｖｅｓｔ  Ｗａｓｈ）前の細胞培養物の生存細胞数及び生存率を取得した。プレハーベスト（Ｐｒｅ−Ｈａｒｖｅｓｔ）に取得したサンプルはＩＰＣであり、ＬＯＶＯ洗浄装置へのインプットとして使用することにより、回転濾過膜への細胞の流量を決定した。ＬＯＶＯは、ＩＰＣとして生存ＷＢＣ濃度を使用した。ＣＡＲＴ製造プロセスのために使用されるプログラムは、１溶液による４回の洗浄（Ｗａｓｈ）として記載され、ハーベストバッファー（ＰＢＳ＋２．０％ＨＳＡ）を使用した。ＬＯＶＯ洗浄中、減容及びハーベストバッファーによる細胞の洗浄の双方にＩＰＣバッグを使用した後、それを最終的にアウトプットバッグ中に溶出した。次に、ＬＯＶＯ洗浄からのアウトプットバッグをサンプリングして、ｓａｎｉｓｕｒｅボトルを用いた手動の遠心分離の実施と共に、凍結培地を用いた最終製剤化の最終ステップを実施するために、生存細胞数及び生存率を取得した。
【０６６７】
実施例５：活性化高速製造（ＡＲＭ）プロセスを用いたＢＣＭＡ  ＣＡＲＴの産生
概要
この実施例では、「活性化高速製造（ＡＲＭ）」と呼ばれるＣＡＲＴ製造プロセスを説明する。一部の実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）を、培地（例えば、無血清培地、例えばＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地）、組換えヒトＩＬ−２培地（例えば、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）サプリメント、Ｇｌｕｔａｍａｘ及び１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、ＴｒａｎｓＡＣＴ）及びＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を含有する細胞培養装置中で培養する。２４時間後、「第１日ＣＡＲＴ産物」と称される細胞を採取し、サンプリングした後、製剤化した。理論に縛られることを意図しないが、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、ＴｒａｎｓＡＣＴ）を用いた簡単なＣＤ３及びＣＤ２８の活性化は、自己再生Ｔ細胞の効率的な形質導入を促進する。一部の事例では、培養から４８ｈ、７２ｈ及び９６ｈ又は７日後にいくつかの細胞を採取して、インビトロでのＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現動態を測定する。第１日ＣＡＲＴ応答は、限定されないが、インビボ細胞溶解活性及び増殖を含む。
【０６６８】
ＡＲＭプロセスを用いた第１日ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴの産生
一部の実施形態では、本明細書に提供される活性化プロセスは、凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物で開始する。カウント及びＱＣのためのサンプルを取得した後、産物を細胞分別機（例えば、取り付けたＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）デバイスキット）に付着させると、プログラムが開始する。細胞を洗浄し、所望の表面マーカー、例えばＣＤ４及びＣＤ８などに結合するマイクロビーズと一緒にインキュベートする。ビーズ標識細胞は、細胞を磁気カラムに通過させることによって選択する。単離した細胞を再度洗浄してから、分離バッファーを細胞培地と交換する。次に、精製したＴ細胞を培養に進めるか又は後の使用のために凍結保存する。単離したＴ細胞の純度は、フローサイトメトリー評価によるＱＣステップを通過することになる。凍結保存した細胞は、解凍し、予め温めた細胞培地で洗浄し、細胞培地に再懸濁させることができる。新鮮な細胞を培養物に直接添加することができる。細胞を０．４〜１．２ｅ６細胞／ｃｍ２膜で膜分離バイオリアクターに接種し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ／ポリマー、ナノ粒子又はナノコロイドなどの活性化試薬を添加した後、細胞培地を０．２５〜２ｍｌ／ｃｍ２膜の最終量まで添加する。平板培養時、様々な多重感染度（ＭＯＩ）の、ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで細胞を形質導入する。ＳｕｐＴ１などの細胞株に基づいて力価及びＭＯＩを測定する。２４時間の時点で、細胞を洗浄して不要な試薬を除去した後、染色して、フローサイトメトリーによりＣＡＲ発現を測定し、インビボ試験のための「第１日ＣＡＲＴ産物」として凍結保存培地に再製剤化する。
【０６６９】
この実施例には、ＡＲＭプロセスを用いて製造される、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｒ１Ｂ６、Ｒ１Ｆ２、Ｒ１Ｇ５、ＰＩ６１、Ｂ６１−０２、Ｂ６１−１０又はＨｙ０３を発現するＴ細胞の産生及び特性決定が記載される。Ｒ１Ｂ６、Ｒ１Ｆ２及びＲ１Ｇ５の配列は表３〜６に開示する。ＰＩ６１、Ｂ６１−０２及びＢ６１−１０の配列は、表７〜１１に開示する。Ｈｙ０３の配列は、表１２〜１５に開示する。
【０６７０】
２．５のＭＯＩでＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いて、Ｔ細胞を形質導入してから２４時間後、ｒＢＣＭＡ＿Ｆｃを用いたフローサイトメトリーによりＣＡＲの発現を測定した。図１９Ａに示すように、生存ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団全体が異なる度合いで右にシフトしたことが認められた。Ｒ１Ｇ５、Ｒ１Ｂ６又はＰＩ６１を発現するように形質導入された細胞が、最も高いＣＡＲ発現を示した（図１９Ａ）。フローサイトメトリーにより測定されるこの発現のパターンは、ＣＡＲを発現するように形質導入された細胞の典型的なフローサイトメトリーヒストグラム（この場合、ＣＡＲ陽性集団は、陰性集団から明瞭に分離される）と異なっていた。図１９Ａは、ｒＢＣＭＡ＿Ｆｃにより検出される「偽形質導入又は一過性発現」が存在し得ることを示しており、これは、必ずしも実際の遺伝子発現を示すわけではない。レンチウイルス偽形質導入が観察され、これはベクターの添加時点から開始し、ＣＤ３４＋細胞では最大２４時間及び２９３細胞では最大７２時間持続することがこれまでに報告されている（Ｈａａｓ  ＤＬ，ｅｔ  Ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０００．２９１：７１−８０）。インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターは、ＣＤ３４＋細胞において最大１０日及び２９３細胞では、最大１４日にわたって一過性ｅＧＦＰ発現を引き起こした。レンチウイルス偽形質導入はＴ細胞において広範に研究されていないが、こうした短時間での一過性発現の可能性は、無視することができない。そのため、インビトロ動態試験を実施して、以下に示すようにＡＲＭを用いて製造した細胞のＣＡＲ発現を測定した。
【０６７１】
ＡＲＭプロセスを用いて製造した細胞のインビトロＣＡＲ発現動態試験
本明細書に記載の試験により、ＡＲＭプロセスを用いて製造した細胞が、どのようにしてＣＡＲ分子を経時的に発現するかを調べる。手短には、健常なドナーからのＴ細胞を、１のＭＯＩのＡＲＭプロセスを用いてＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように製造し、様々な時間にわたって培養を維持し、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ及び７日に採取して、ＡＦ６４７標識ｒＢＣＭＡ＿Ｆｃを用いたフローサイトメトリーによりＣＡＲ発現動態を評価した。ＣＡＲ発現動態を理解することは、インビボでトリアージ又は臨床用量設定戦略のためのリアル且つ安定な発現のための代替時点を見出す上で役立つ。
【０６７２】
第１日に、１のＭＯＩで形質導入された細胞のＣＡＲ発現パターン（図２０Ａ）は、２．５のＭＯＩで形質導入された細胞のそれと類似している（図１９Ａ）。いずれのＭＯＩ条件も、第１日に偽又は一過性発現パターンを示した（図１９Ａ及び２０Ａ）。しかし、第２日に、ｒＢＣＭＡ＿Ｆｃ陽性集団は、ＵＴＤ陰性対照群から分離し始めた（図２０Ａ）。第３及び第４日に、ｒＢＣＭＡ＿Ｆｃ陽性集団（ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現細胞を呈示し、ＵＴＤ群には存在しない）が、細胞がＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように形質導入された全ての群に明確に現れた。第３日から第４日まで、ＣＡＲ＋％は、各ＣＡＲ構築物について比較的安定しており（図２０Ｂ）、最も高いＭＦＩは第３日に観察された（図２０Ｃ）（細胞は、この時点で最大であった）。図１９Ａに示すデータと一致して、ＰＩ６１、Ｒ１Ｇ５及びＲ１Ｂ６を発現するように形質導入された細胞は、最も高いＣＡＲ発現細胞であった（図２０Ａ）。特に、Ｒ１Ｆ２又はＨｙ０３をコードするベクターで形質導入された細胞は、第１日に一過性ＣＡＲ発現を示さなかったが、第３日及び第４日後にＢＣＭＡ  ＣＡＲ分子を明らかに発現した（図２０Ａ）。結論として、様々なＣＡＲをコードするベクターは、経時的に様々なＣＡＲ発現動態を有すると考えられ、ＣＡＲ発現の代替時点として、第３日が選択された。
【０６７３】
インビボでの第１日のＡＲＭで処理したＢＣＭＡ  ＣＡＲＴの機能性の評価
播種性ＫＭＳ−１１−ｌｕｃ多発性骨髄腫異種移植マウスモデルを用いて、第１日ＣＡＲＴをそれらのインビボでの抗腫瘍活性について調べた。ルシフェラーゼリポーターは、定量的生物発光イメージング（ＢＬＩ）により疾患負荷のモニタリングを可能にする。手短には、前述のように製造した第１日ＣＡＲＴを腫瘍担持マウスに投与した。最初のインビボ試験（図２１Ａ及び２１Ｂ）において、各マウスは、１．５Ｅ６細胞の用量で最終ＣＡＲＴ産物を受けた。ＣＡＲ発現を第１日及び第７日に分析した（図２１Ａ）。インビボ有効性試験では、ＰＩ６１、Ｒ１Ｇ５又はＲ１Ｂ６を発現する細胞は、強力な抗腫瘍活性を示した（図２１Ｂ）。Ｒ１Ｆ２を発現する細胞は、有効性の遅延を示した（図２１Ｂ）。ＵＴＤ群も、ＣＡＲＴ注射から１４日後に部分的抗腫瘍活性を示したが、これはアロ反応によるものと考えられる（図２１Ｂ）。２回目のインビボ試験では、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量漸増法を試験した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量は、第３日のＣＡＲ＋％に基づいて決定した（図２２Ａ）。腫瘍取込み動態をＢＬＩ測定により週２回モニターした。図２２Ａは、第１日及び第３日に検出されたＣＡＲ発現を示す。インビボ結果は、図２２Ｂに示すように、１．５ｅ５  ＣＡＲ＋Ｔ細胞及び５ｅ４  ＣＡＲ＋Ｔ細胞の両用量で３つのクローンＰＩ６１、Ｒ１Ｂ６及びＲ１Ｇ５の全てが、腫瘍を拒絶し、排除できたことを示す。図２２Ｃは、この試験の過程での体重変化を示すが、ＧＶＨＤの前兆を呈示していない。
【０６７４】
実施例６：１２〜２４時間で採取される高速ＣＡＲＴの動態
概論
高速ＣＡＲＴ産物を２４時間未満で産生できるか否かを決定するために、培養物で１２〜２４時間後に生成された高速ＣＡＲＴの採取についての動態を特性決定した。この評価は、凍結保存した健常なドナーフェレーシスから濃縮したＴ細胞と、接種時のＴｒａｎｓＡＣＴ活性化試薬及び技術グレードＣＴＬ０１９ベクターの同時添加とを使用して、スモールスケールで実施した。一次読出しは、新しく採取したＣＡＲＴ産物についての生存率、増殖後の生存細胞回収、白血球及びＴ細胞サブセット組成並びに形質導入効率（表面免疫表現型決定により決定される通り）であった。
【０６７５】
方法
レンチウイルス産生及び力価決定：４．７×１０７ＴＵ／ｍＬのＨＥＫ２９３ＴベースｑＰＣＲ力価及び１．８８×１０７ＴＵ／ｍＬの概算Ｔ細胞ベース力価を用いて、ＣＴＬ０１９をコードするレンチウイルスベクターを調製した。
【０６７６】
Ｔ細胞単離：健常なドナーフェレーシスの凍結保存ロイコパック（ＬＫＰＫ）をＨｅｍａｃａｒｅから取得し、必要になるまで液体窒素中で保存した。第０日に、アフェレーシスを小さい氷の結晶が残るまで解凍した後、Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）プロセスバッファーで希釈した。次に、ＴＳ  ５２０チュービングセット及びＴ細胞形質導入（ＴＣＴ）プログラムソフトウエアバージョン１．０を備えるＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で、自動化ＣＤ４／ＣＤ８ポジティブ選択を実施した。最終的Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）産物をＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）完全Ｔ細胞培地中に溶出し、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）により列挙されるように、ＡＯ／ＰＩ染色により細胞濃度及び生存率を決定した。
【０６７７】
培養開始及び形質導入：Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）産物からの細胞を計７つの容器（形質導入培養物用の５つの容器と、非形質導入（ＵＴＤ）培養物用の２つの容器）に直ちに接種した。時点０で、各容器に膜１ｃｍ２当たり０．６×１０６生存細胞の密度で、ＧＭＰグレードＴｒａｎｓＡｃｔと共に接種してから、ＩＬ−２を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）完全Ｔ細胞培地で１．２×１０６生存細胞／ｍＬの最終濃度に到達させた。ベクターを室温で解凍し、概算Ｔ細胞力価に基づく０．４５のＭＯＩで各形質導入培養物に添加した。ＵＴＤ対照にはウイルスを添加しなかった。一旦接種したら、採取の準備ができるまで、培養物を３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０６７８】
採取：培養開始から１２〜２４時間の各時点で、採取のために１つの形質導入培養物を選択した。容器を回転させて、膜から離して細胞を穏やかに再懸濁させることにより細胞を採取し、次に、全培養容量を再懸濁させた後、セロロジカルピペットによりコニカルチューブに移した。洗浄前カウント、生存率決定及びフロー染色のために、小さいアリコートを取り出した。各培養物の残りを５０ｍＬで２回（ＵＴＤ容器の場合、１００ｍＬで２回）洗浄し、再懸濁させてから、洗浄後アリコートを取り出して、カウント及び生存率を検定した。
【０６７９】
ＣＡＲＴ製造中の白血球組成及びＣＤ１９−ＣＡＲ発現のフローサイトメトリー：白血球組成、Ｔ細胞表現型及び必要に応じてＣＡＲ発現について、培養前後のインプロセスサンプルを染色した。特別注文の蛍光色素標識抗イディオタイプ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、形質導入細胞でのＣＴＬ０１９−ＣＡＲ発現を評価した。各採取時点で、培養物のアリコートを生死判定試薬（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で直ちに染色し、洗浄した後、いずれもＣＤ３染色及び抗イディオタイプ抗体を含有する２つのフローパネルで染色し、獲得のためにパラホルムアルデヒド中に固定した。サンプルをフローサイトメーター（ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ；補正のために単一色の対照を使用した）で測定し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウエアで解析した。解析のために、白血球組成について染色したサンプル、全て生存ＣＤ４５＋一重項事象に基づいてプリゲートし、Ｔ細胞サブセットについて染色したサンプル、全て生存ＣＤ３＋一重項事象に基づいてプリゲートした。ＣＤ４５ＲＯ及びＣＣＲ７についてのゲートは、蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照を用いて設定した。
【０６８０】
結果
ＬＫＰＫの白血球組成、培養前のＰｒｏｄｉｇｙ（登録商標）産物及び培養後のＣＡＲＴ産物を第０日及び各採取時点でフローサイトメトリーにより特性決定した。同定された細胞型は、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、単球（ＣＤ１４＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＣＤ３−５６＋）及び他の細胞であった（表２２）。Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）濃縮により、生存率が高く（９２．９％）且つＴ細胞について濃縮された（４８％から９２％に）第０日出発材料が産生されたのに対し、混入Ｂ細胞（６％から０．１０％に）並びに単球及びＮＫ細胞は各々４％未満まで減少した。１２〜２４時間の培養後、生存細胞の純度はさらに３〜４．４％増加し、これは、１２時間時点までの単球及びＢ細胞の即時減少並びに１２から２４時間時点までのＮＫ細胞の漸減と対応する。フローサイトメトリーにより細胞外ＣＡＲを発現する白血球のうち、３％未満が混入細胞（すなわちＴ細胞ではない）であり、接種後１５時間〜１９時間でＣＡＲ純度の最大の上昇（９６．６％から９９．２％に）がみられた。
【０６８１】
【表５０】
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【０６８２】
培養して１８時間後のＣＡＲ発現細胞の純度の上昇（表２２）は、ＣＡＲ表面発現を有するＴ細胞のパーセンテージの増加と一致する（図２２Ａ及び２３Ｃ）。２４時間の培養後にフローサイトメトリーにより評価した高速ＣＡＲＴ産物で上に観察された通り（実施例５を参照）、ＣＡＲ表面発現は、明確な陽性及び陰性集団をもたらさなかった。従って、ＣＡＲ陽性についてのゲーティングは、下限としてのＵＴＤサンプルを用いて設定した。細胞外ＣＡＲを発現するＣＤ３＋細胞の割合は、接種から１５時間後まで１％未満のままであり；その後、ＣＡＲ発現は、３時間毎に３〜４％ずつ増加し、飽和することなく最大１１．８％に達した（図２３Ａ）。ＭＦＩにより測定されるＣＡＲ発現の強度も、＞１８時間の培養後やや増加したが、２４時間を通して弱いままであった（図２３Ｂ）。
【０６８３】
さらに、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＣＲ７の組み合わせを用いて各時点（表２４Ａ及び２４Ｂ）でＴ細胞サブセット（ＣＤ４：ＣＤ８比及びメモリーサブセット組成）も評価し；ここで、非分化ネイティブ様Ｔ細胞はＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ−として、セントラルメモリー細胞はＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋として、エフェクターメモリー細胞はＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＯ＋として、且つ高度分化エフェクターＴ細胞はＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＯ−として定義された。ＵＴＤを含め、評価した全ての時点で、培養物は、初期出発材料（それぞれ２３％及び５２％）よりも、高い割合のナイーブ細胞（４０〜４７％）及び低い割合のセントラルメモリー細胞（３３〜３９％）を含有した。興味深いことに、バルク組成物中のナイーブ又はセントラルメモリーＴ細胞の頻度は、１２〜２４時間で変化しなかったが、その後の採取物は、より高い頻度の細胞外ＣＡＲ発現細胞（ナイーブであった）及びより低い頻度の細胞外ＣＡＲ発現細胞（セントラルメモリー細胞であった）と相関した（１８時間時点でのＣＡＲ発現細胞中１６％ナイーブ／６３％セントラルメモリー細胞及び２４時間時点でのＣＡＲ発現細胞中２４％ナイーブ／５４％セントラルメモリー細胞）。同様に、バルクＣＤ４：ＣＤ８比は有意に変化しなかったが、ＣＡＲ＋細胞のＣＤ４画分は、１８〜２４時間で１０％減少した（６６％から５６％）。総細胞数へのこれらの頻度の変換（図２５）から、ＣＡＲを最も早期に発現するとみられたＴ細胞のサブセットは、培養の１５〜１８時間にわたり、大部分がナイーブＣＤ４細胞であり；その後、ナイーブＣＤ８  ＣＡＲ及びセントラルメモリー細胞ＣＤ８  ＣＡＲの頻度が急速に増加することが明らかである。
【０６８４】
生存細胞回復（又は増殖倍率）並びに洗浄前及び洗浄後生存率を各採取時点で決定した（図２６及び２７）。生存細胞の回復は、接種から１８時間後（最低４６％、細胞外ＣＡＲ発現の速度増加と一致）まで１３％低下し、その後の時点で採取した培養物について５２％までやや増加した（図２６）。産物生存率は、洗浄後７１〜７７％まで増加し、採取について、生存率は、５〜２４時間で低下した（図２７）。
【０６８５】
結論
１２〜２４時間に試験した時点のうち、ＴｒａｎｓＡｃｔ及び技術グレードＣＴＬ０１９ベクターで同時に接種した高速ＣＡＲＴは、２４時間の時点で最も高いＣＡＲ表面発現を示す。非常に少数の細胞は、接種後１５時間までＣＡＲ＋（採取の時間に測定）であり、その後、％ＣＡＲはより急速に増加する。ＣＡＲ発現の強度は弱いが、接種から１８時間後にゆっくりと増加する。
【０６８６】
高速ＣＡＲＴ産物は、接種後１２〜２４時間の全ての時点で、最初の１２時間での単球減少のために出発材料より純度が高くなり（より高い％Ｔ細胞）、続いてＮＫ細胞がわずかに減少し、残留Ｂ細胞はＰｒｏｄｉｇｙ（登録商標）濃縮により全く除去されなかった。
【０６８７】
接種後１８時間で採取したとき、全体的な細胞回復は最も低かった（２４時間までにやや改善する）が、全体的なＴ細胞組成は、接種後１２〜２４時間で変化しない。細胞外ＣＡＲを最初に発現するＴ細胞は、接種後１５〜１８時間にわたり、大部分がセントラルメモリーＣＤ４であり、その後、ナイーブ及びセントラルメモリーＣＤ８がＣＡＲ発現を示す。
【０６８８】
実施例７：活性化高速製造（ＡＲＭ）プロセスの説明
一部の実施形態では、連続的活性化高速製造（ＡＲＭ）プロセスを用いて、約２日かけてＣＡＲＴ細胞を製造するが、これにより恐らくより多数の低分化Ｔ細胞（Ｔナイーブ及びＴＳＣＭ（ステムセントラルメモリーＴ）細胞）をインビボ細胞増殖のために患者に戻すことが可能になるであろう。短い製造期間により、早期分化Ｔ細胞プロフィールは、その所望の最終分化状態に向けて、エクスビボ培養容器内ではなく、体内で増殖することが可能になる。
【０６８９】
一部の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、凍結保存白血球アフェレーシス源材料、例えば非動員自己末梢血白血球アフェレーシス（ＬＫＰＫ）材料を用いて製造される。凍結保存材料は、抗ＣＤ４／抗ＣＤ８免疫磁気システムを用いて、生産の１日目（第０日）にＴ細胞濃縮のためのプロセシングステップに付す。次に、陽性画分をＧ−ｒｅｘ培養容器に接種し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８系（ＴｒａｎｓＡＣＴ）で活性化し、同じ日に、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）で形質導入する。翌日、形質導入の２０〜２８時間後、Ｔ細胞を採取し、４回洗浄し、凍結培地に製剤化した後、コントロールレートフリーザー（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒａｔｅ  Ｆｒｅｅｚｅｒ）（ＣＲＦ）により凍結する。第０日のプロセスの開始から翌日の採取の開始まで、第０日の接種後２４時間を目標にして、細胞を２０〜２８時間培養する。
【０６９０】
第０日の培地を表２１に従って調製した。凍結白血球アフェレーシス材料を解凍する。解凍した細胞をラピッドバッファー（表２１）で希釈し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置で洗浄する。Ｔ細胞をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ４及びＣＤ８マイクロビーズにより選択する。Ｔ細胞選択（約３時間４０分〜４時間４０分）のためのプログラムが終了したら、ラピッドメディア（表２１）に懸濁させた細胞を含むリアプリケーションバッグをトランスファーパックに移す。生存率及び細胞カウントのためにサンプルを取得した。培養容器を活性化及びベクター形質導入に接種する際、陽性画分バッグからの細胞数及び生存率データを用いて、細胞濃度を決定する。
【０６９１】
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ（ＣＤ４及びＣＤ８）を用いたＴ細胞のポジティブ選択後、細胞を培養容器、Ｇ−Ｒｅｘに接種する。細胞を接種したら、活性化試薬（ＴｒａｎｓＡＣＴ）を培養容器に添加する。次に、１．０（０．８〜１．２）の目標ＭＯＩで、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターにより細胞を形質導入する。ベクター添加後、培養容器をインキュベーターに移し、そこで、公称５％ＣＯ２（作動範囲４．５〜５．５％）、３７℃の公称温度（作動範囲３６〜３８℃）で目標の２４時間にわたり（作動範囲２０〜２８時間）それをインキュベートする。インキュベーション後、細胞をハーベスト洗浄液（Ｈａｒｖｅｓｔ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（表２１）で４回洗浄して、非組込みベクター及び残留ウイルス粒子並びに他のプロセス関連不純物を全て除去する。次に、細胞を溶出し、細胞数及び生存率のためのサンプルを取得して試験し、それらの結果を用いて、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０を用いた最終製剤化のために、細胞を再懸濁させるのに必要な量を決定する。続いて、細胞を遠心分離して、ハーベスト洗浄液を除去し、凍結保存を実施する。
【０６９２】
一部の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞中に発現したＣＡＲがＣＤ１９に結合する。一部の実施形態では、ラピッドメディア（ＲＭ）（表２１）に使用したＩＬ−２の代わりに、ＩＬ−１５、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ−１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ）、ＩＬ−６又はＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａを使用することができる。
【０６９３】
一部の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞中に発現したＣＡＲはＢＣＭＡに結合する。一部の実施形態では、ラピッドメディア（ＲＭ）（表２１）に使用したＩＬ−２の代わりに、ＩＬ−１５、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ−１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ）、ＩＬ−６又はＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａを使用することができる。
【０６９４】
実施例８：活性化高速製造（ＡＲＭ）プロセスを用いて製造されるＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の特性決定
本明細書には、活性化高速製造（ＡＲＭ）プロセスを用いて製造される抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞産物が開示される。ＡＲＭプロセスは、伝統的製造（ＴＭ）プロセスと比較して、ターンアラウンドタイムを短縮し、先を見越して、患者に対する抗ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞産物の適時注入を可能にする。さらに、ＡＲＭプロセスは、改善した抗腫瘍効果に関連する細胞サブセットである推定ステムメモリーＴ（Ｔｓｔｅｍ）細胞も保存する。製造の主な違いは、ＴＭプロセスが、抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を、製剤化前にインターロイキン（ＩＬ−）２と一緒に９日間インビトロで培養する増殖期を含むのに対し、ＡＲＭプロセスは、わずか２４時間の培養後に製剤化を可能にする点である。これは、ＣＤ３及びＣＤ２８に対するアゴニスト活性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と結合した完全に生体適合性のナノマトリックスの使用により可能になるものであり、こうしたビーズは、ＴＭプロセスで使用されるＣＤ３／ＣＤ２８常磁性ビーズと異なり、形質導入の直後に残留レンチウイルスベクターと一緒に洗い流すことができる。異種移植マウスモデルからの結果並びにＴｓｔｅｍ細胞の最終産物濃縮、持続性が増加し、且つ長期抗腫瘍効果に関連する亜集団は、ＴＭプロセスを用いて製造される抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞と比較して、ＡＲＭプロセスを用いて製造される抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の治療可能性の全体的向上を示唆している。異種移植マウスモデルにより明らかにされた別の重要な相違は、ＴＭプロセスを用いて製造される対応物と比較して、ＡＲＭプロセスを用いて製造される抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞増殖の細胞動態の約１週間の遅延の可能性である。この遅延は、約１週間であると推定され、これにより、ＴＭプロセスで製造される抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を用いた場合の３週間という潜在的毒性の慎重なモニタリング枠から４週間への相応延期がもたらされる。これに対し、インビトロサイトカイン放出モデルからの非臨床安全性データは、ＡＲＭプロセスを用いて製造される抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞とＴＭプロセスを用いて製造されるものが、ＩＬ−６産生をインビボで誘導する同様の可能性を有し、従って、同様のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）リスクを保有し得ることを示している。このエビデンスに基づき、ＡＲＭプロセスを用いて製造される抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞は、進行性小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）／慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有する患者の第Ｉ相、オープンラベル臨床試験で、この適用で既に承認された薬剤であるブルトン型キナーゼ阻害剤（ＢＴＫｉ）イブルチニブ（Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ）と併用して且つＤＬＢＣＬでの単剤として調査されることになる。
【０６９５】
作製及びインビトロ分析
臨床スケールでの抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞製造を目的とするＡＲＭプロセスを試験するために、代表的な例として、図２８Ａに記載する出発材料として、凍結した健常なドナー白血球アフェレーシス産物（Ｌｅｕｋｏｐａｋ，ＬＫＰＫ）を使用した。ＬＫＰＫは、３７％Ｔ細胞、４％ＮＫ細胞、３７％単球及び１５％Ｂ細胞を含有した（図２８Ａ）。解凍後、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８マイクロビーズを用いて、Ｔ細胞をポジティブ選択した。陽性Ｔ細胞選択後の産物の組成は、９５．４％Ｔ細胞、１．９％ＮＫ細胞、１．７％単球及び０．１％Ｂ細胞であった（図２８Ａ）。
【０６９６】
ポジティブ選択されたＴ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８アゴニストモノクローナル抗体に共役したポリマーナノマトリックスを用いて活性化してから、抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。２４時間の培養後、細胞を採取し、凍結保存した（こうした細胞をこの実施例では「ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ」と称する）。並行して、同じドナーＴ細胞及びレンチウイルスベクターを使用し、伝統的製造（ＴＭ）プロセスを用いてＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した（こうした細胞をこの実施例では「ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ」と称する）。ＴＭプロセスは、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体に結合させた常磁性ビーズを使用し、組織培養フラスコ内の９日培養期間の後、同じ採取及び凍結手順を行った。各プロセスにより作製したＣＡＲ−Ｔ細胞をフローサイトメトリーにより分析して、解凍後のＣＡＲ発現並びにＴ細胞表現型を評価した（図２８Ｂ〜２８Ｄ）。Ｔ細胞表現型の分析から、ＡＲＭプロセスは、ＣＤ８及びＣＤ４コンパートメントの両方でナイーブ様Ｔ細胞を保持した（４５．１％ＣＤ４５ＲＯ−／ＣＣＲ７＋）のに対し、ＴＭプロセスは、主としてセントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞をもたらした（ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの４３．６％に対して６８．６％ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７＋）ことが明らかとなった（図２８Ｃ及び図２８Ｄ）。重要なことには、ＡＲＭプロセスは、ＴＭプロセスと比較して、ＣＡＲ＋集団でも、初期ナイーブ様ＣＤ４５ＲＯ−／ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団を良好に維持した（出発材料中２８．６％、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲで３７．５％及びＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲで４．５％）（図２８Ｃ及び図２８Ｄ）。このＴ細胞集団は、Ｆｒａｉｅｔｔａ，ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２４（５）；５６３−５７１により記載され、且つＣＬＬ第Ｉ相臨床試験で持続的寛解を伴うＣＤ４５ＲＯ−／ＣＤ２７＋Ｔｓｔｅｍ細胞と大きく重なっている。
【０６９７】
その表現型以外に、最終ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ細胞産物をインビトロでのその機能についても評価した。ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ及びＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲを解凍し、ＣＤ１９発現細胞株：ＮＡＬＭ６（ＡＬＬ）又はＴＭＤ−８（ＤＬＢＣＬ）と一緒に共培養した。共培養から４８時間後の上清中のサイトカインレベルの比較から、刺激癌細胞（ＮＡＬＭ６又はＴＭＤ−８、図２９Ａ及び２９Ｃ）に応じて、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲと比較して、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲにより分泌されるＩＦＮ−γの１１〜１７倍の増加及びＩＬ−２のレベルの３．５〜１０倍の増加が明らかにされた。ＡＲＭ若しくはＴＭプロセスを経た非形質導入（ＵＴＤ）細胞（図２９Ｃ）又はＣＤ１９陰性ＮＡＬＭ６（ＮＡＬＭ６−１９ＫＯ）標的細胞（図２９Ｄ）を用いた実験により、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ及びＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲによるＣＤ１９特異的認識を確認した。ＣＤ１９特異刺激の非存在下でのＡＲＭ−ＵＴＤ及びＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ（それぞれ、図２９Ａ及び２９Ｂ）によるＩＦＮ−γ分泌のより高いバックグラウンドは、これらの産物の活性化された性質に起因する可能性がある。このバックグラウンド分泌は、４８時間の共培養によち減少した（図２８Ｂ及び２９Ｄ）。標的細胞との最初の２４時間の共培養後の細胞の中間洗浄後、さらに２４時間（２４ｈ＋２４ｈ）共培養すると、バックグラウンドとＣＤ１９特異的サイトカイン分泌の差はさらに増大した。２４ｈ＋２４ｈ条件は、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲによるバックグラウンドＩＦＮ−γ分泌が最初の２４時間後に衰えることを明示している。
【０６９８】
要約すると、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲを作製するために用いたＡＲＭプロセスは、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲのそれと同等若しくはそれより高いＣＡＲ発現を有するＴ細胞をもたらす。重要なことには、ＡＲＭプロセスは、インプット材料と同様のＴ細胞表現型を維持する。ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲは、インビトロでのＣＤ１９特異的活性化を証明し、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲと比較して、より高いレベルのＩＬ−２を分泌し、これは、そのＴｓｔｅｍ表現型と相関する。
【０６９９】
インビボ有効性
インビボでの有効性試験を用いて、ＡＲＭプロセスの開発の指針とし、最終的に、臨床抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞製造に使用されるプロセスが得られた。本明細書に記載の実験のために、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲを臨床スケールで作製した。並行して、同じレンチウイルスベクター及び同じドナーからのＴ細胞を用いて、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲを作製した。異なるプロセスを用いて作製されたＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を、プレＢ  ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６と一緒に接種した免疫欠損型ＮＳＧマウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒｇ−ヌル）で評価した。この腫瘍細胞株は骨髄中に生着するが、高い腫瘍負荷の場合、循環中でも検出され得る。白血病接種から７日後、マウスのコホートは、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の１回の注入を受けた（図３０Ａ）。第０日にＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ及びＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの解凍後フローアッセイに基づいて、０．２×１０６、０．５×１０６及び２×１０６生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞という計画用量を決定した。
【０７００】
解凍後０日に、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの偽形質導入の懸念の理由で、センチネルバイアルを解凍し、最大５日間培養した後、様々な時点でフローサイトメトリーによりＣＡＲ発現（パーセンテージ及び平均蛍光強度）を分析した（図３０Ｂ）。その後の時点での陽性細胞のパーセンテージは、解凍後０日サンプルと比較して低かった。同時に、ＣＡＲ平均蛍光強度は、各細胞で高く、これは、安定に形質導入されたＣＡＲ−Ｔ細胞を表している。第３日の測定を用いて、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの実際用量を決定したところ、０．１×１０６、０．２５×１０６及び１×１０６生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞であることが判明した。休止させ、完全に組み込まれたＣＡＲＴ細胞に対して解凍後サンプルのフロー分析を実施したため、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ用量は不変のままであった（０．２×１０６、０．５×１０６及び２×１０６生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞）。
【０７０１】
ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ及びＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲは、用量依存的に腫瘍退縮を誘導した（図３０Ｃ）。０．５×１０６若しくは２×１０６ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ細胞又は０．２５×１０６及び１×１０６ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ細胞で処置したマウスは、持続的な腫瘍退縮を経験した。興味深いことに、試験した各々の最低用量（２×１０６ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ細胞又は０．１×１０６ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ細胞）で、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲに対する応答は持続せず、初期の部分的白血病制御後、全てのマウスが最終的に再発した。対照的に、最低用量（０．１×１０６）ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ処置マウスは、腫瘍負荷の安定的減少を示し、これは試験終了まで持続した。腫瘍退縮の動態は、約１週間のＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの活性化遅延を示し、これは、Ｔｓｔｅｍ細胞が、その抗腫瘍活性を及ぼすために、増殖して、エフェクターメモリー細胞に分化する必要があることを示唆している。
【０７０２】
２つの製造プロセスにより作製されたＣＡＲ−Ｔ細胞及びＵＴＤ細胞で処置したマウスは、週２回採血して、サイトカインレベルを測定した（図３１Ａ〜３１Ｄ）。ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ又はＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲいずれかのＣＡＲ−Ｔ細胞を注入したマウスの循環ＩＦＮ−γレベルは、二相パターンを示した（図３１Ａ）。ＣＡＲ−Ｔ細胞注入から４〜７日後に早期ＩＦＮ−γピークが観察され、これは、ＴＭ−ＵＴＤ又はＡＲＭ−ＵＴＤを注入したマウスでは明瞭でなかったことから、腫瘍認識後のＣＤ１９特異的活性化に関連する可能性がある。早期ＣＤ１９媒介活性化は、インビボＩＬ−２レベルの同時上昇（図３１Ｃ）により確認されたが、これは、後の時点で衰えた。
【０７０３】
インビボ細胞動態
ＮＳＧマウスにおけるＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの有効性を評価するための薬理学試験の一環として、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の増殖をインビボで評価した（図３２）。注入から最大４週間後、ＣＤ３＋／ＣＡＲ＋Ｔ細胞の血中濃度をフローサイトメトリーにより解析した。ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖は推定することができる。しかし、Ｘ−ＧＶＨＤの発症に影響される試験時間の制限のために、長期持続性は評価することができない。０．２×１０６細胞の最低用量のＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲを除いて、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ及びＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの両方について細胞増殖を全ての用量で観察した。曝露（細胞注射後２１日以内のＣｍａｘ及びＡＵＣ）は、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ及びＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲのいずれについても用量の増加と共に増大した。同じ用量レベルのＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲに対してＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ及びの増殖を比較するために、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの曝露を、同等用量のＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ（０．２５×１０６及び１×１０６細胞）に対して内挿した。０．２５×１０６及び１×１０６細胞の用量のＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲと比較して、Ｃｍａｘは、２４〜４６倍高く、ＡＵＶ０−２１ｄは、１８〜３３倍高かった。ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲピーク増殖までの時間（Ｔｍａｘ）は、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲと比較して、少なくとも１週間遅れた。
【０７０４】
要約すると、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲをインビトロで評価する薬理学試験は、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲが、早期分化表現型を有し、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２をより分泌する可能性を有することを示す。インビボで、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲは、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲと比較して、遅れるが、より高い細胞増殖を示し、より多くのＩＬ−２分泌を誘導すると共に、より低用量で腫瘍増殖を制御した。記述されるＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの他の特徴、例えばより遅い時点での高レベルの血漿ＩＦＮ−γ及びより早期のＸ−ＧＶＨＤの発生が、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ並びにＡＲＭ−ＵＴＤの両方で認められ、これらは、ここで使用される異種移植マウスモデルの制限について根拠を示している。総合すると、これらの結果は、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲが、より多くの幹細胞性特徴を備えるＴ細胞を含有し、それによりＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲが効果的に生着し、増殖して、腫瘍を拒絶することができるという仮定を支持するものである。
【０７０５】
インビトロＩＬ−６放出アッセイ
ＣＡＲＴ細胞によるＩＬ−６誘導可能性のインビトロ検証のための三者（ｔｈｒｅｅ  ｐａｒｔｙ）共培養モデルは、Ｎｏｒｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，Ｊｕｎ；２４（６）；７３９−７４８により最初に公開されており、一部を改変して本明細書において適用した。このモデルは、最大化ＩＬ−６産生のための骨髄細胞供給源として、ＣＡＲ−Ｔ細胞、白血病標的細胞及びバイスタンダーＴＨＰ−１単球細胞から構成される。このインビトロ細胞モデルでは、ＣＤ１９発現標的及びＴＨＰ−１細胞との共培養により、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ又はＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲのいずれか単独によるＩＬ−６分泌が増加された（図３３Ａ及び３３Ｂ）。重要なことには、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲにより誘導された時間依存性ＣＤ１９特異的ＩＬ−６分泌は、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲにより誘導されたものと重ね合わせることができた。同じインビトロ細胞モデルにおいて、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ条件でのＣＤ１９特異的ＩＦＮ−γ分泌は、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ条件よりも１０倍高かった（データは示していない）。
【０７０６】
まとめ
これらの結果は、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲが、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲと比較して、優れた抗腫瘍能力と、類似の安全性プロフィールを有し得ることを示唆するものである。最も低い試験用量での優れた腫瘍制御と、高いインビボ細胞増殖とによって優れた抗腫瘍能力が推測される。しかしながら、こうした計算は、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲが初めに検証されることになる２つの疾患適用（ＣＬＬ及びＤＬＢＣＬ）よりも攻撃的なＡＬＬモデル（ＮＡＬＭ６）でそれが検定されたことから、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの全体的治療能力の過小評価である可能性がある。ＣＬＬでは、とりわけ、インビボＣＡＲ−Ｔ細胞増殖が、腫瘍退縮と頑健に相関する場合（Ｍｕｅｌｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ｂｌｏｏｄ．１３０（２１）；２３１７−２３２５；Ｆｒａｉｅｔｔａ，ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２４（５）；５６３−５７１）、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲの有意に高い増殖能（最大２０倍）により、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲに比べ有意義に優れた有効性をもたらし得る。
【０７０７】
マウスでは、ＣＡＲ媒介性腫瘍退縮と関連するＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲによるＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の早期全身放出は、伝統的に製造されたＣＡＲ−Ｔ細胞により誘導される放出のそれぞれ３倍及び１０倍であった。この株では、機能性骨髄細胞の欠如によって炎症性サイトカインを産生することができないため、ＩＬ−６レベルはインビボで検定されなかった（Ｎｏｒｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，Ｊｕｎ；２４（６）；７３９−７４８；Ｇｉａｖｒｉｄｉｓ，ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，Ｊｕｎ；２４（６）；７３１−７３８）。これを回避し、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲにより誘導されるインビボＩＬ−６放出の可能性を評価するために、インビトロ三者共培養系を使用したが、この場合、バイスタンダー単球細胞を炎症性サイトカインの供給源として添加した（Ｎｏｒｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，Ｊｕｎ；２４（６）；７３９−７４８）。この系では、ＩＬ−６産生は、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲと、伝統的に製造されたＣＡＲ−Ｔ細胞との間で類似しており、これは、ＣＲＳに対する同様のリスクを示唆している。反対に、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ細胞増殖の動態遅延により、ＴＭ−ＣＤ１９ＣＡＲに典型的な３週間から、４週間へのＣＲＳモニタリング期間の延長が必要となる。ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲを用いたインビトロ実験から、解凍後最初の３日間の培養中のＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲによる一過性、非ＣＡＲ媒介性ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２分泌の可能性も明らかにされた。組換えヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）及び組換えヒトＩＦＮ−γ（ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ）を受ける患者からのデータに基づく包括的リスク評価により、さらにＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲ注入後に予測される曝露を考慮に入れて、これらの患者に、記載されるような全身症状（熱、悪寒、紅斑）のリスクが非常に低くなることを示す。このリスクをさらに軽減するために、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲを受ける患者は、細胞産物の注入から少なくとも７２時間にわたって入院することになる。
【０７０８】
最終的に、非ＧＬＰ準拠毒性試験では、ＡＲＭ−ＣＤ１９ＣＡＲを移植したＮＳＧマウスは、血液又はリンパ器官免疫表現型決定並びに関連する一連の器官の組織学的評価により評価したところ、伝統的に製造されたＣＡＲ−Ｔ細胞及びＡＲＭプロセスを経た非形質導入細胞と比較して予想外の挙動を示さなかった。
【０７０９】
実施例９：ＡＲＭプロセスを用いて製造されるＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞
方法
Ｔ細胞単離
健常なドナーアフェレーシスの新鮮なロイコパックをＨｅｍａｃａｒｅから取得し、必要になるまで気相液体窒素（ＬＮ２）中で保存した。第０日に、２／４ロイコパックをＬＮ２から取り出し、Ｐｌａｓｍａｔｈｅｒｍ（Ｂａｒｋｅｙ，Ｌｅｏｐｏｌｄｓｈｏｅｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で小さい氷の結晶が残るまで解凍した後、Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）プロセスバッファーで希釈した。次に、ＴＳ  ５２０チュービングセット及びＴ細胞形質導入（ＴＣＴ）プログラムソフトウエアバージョン１．０を備えるＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）で、自動化ＣＤ４／ＣＤ８ポジティブ選択を実施した。各Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）アウトプット（産物、廃棄物及び非標的細胞）の細胞数及び生存率を、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）により列挙されるように、ＡＯ／ＰＩ染色により決定して、総細胞回復及びＴ細胞回復を評価した。ＣＤ４／ＣＤ８濃縮産物をＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）完全Ｔ細胞培地中に溶出し、２４ｈ又は伝統的９日プロセス（ＴＭ）のいずれかを用いたさらなる培養のために分割した。残ったＴ細胞はＬＮタンク内で凍結した。Ｔ細胞純度はフローサイトメトリー解析により評価した。
【０７１０】
ＡＲＭプロセスを用いたＣＡＲ−Ｔ細胞産生
Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）により精製したＴ細胞をプレート、フラスコ、Ｇ−ＲＥＸ容器などの様々なスケールの容器又は本格的な臨床スケールのｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔに接種した。接種時、臨床グレードレンチウイルスベクターに加えて、ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８アゴニストと共役したポリマーナノマトリックスを添加した。１００ＩＵ／ｍＬのヒト組換えＩＬ−２（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、２％ＩＣＲＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）完全Ｔ細胞培地中で細胞を２４時間インキュベートして、採取及び凍結保存した。
【０７１１】
凍結保存ＣＡＲ−Ｔ細胞のアリコートを予め温めたＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）完全培地中で解凍し、２０×容量の予め温めた培地で２回洗浄した後、培養し、フローサイトメトリー解析に付して、解凍後の様々な時点でＢＣＭＡ−ＣＡＲ発現及び幹細胞性特徴を評価した。細胞産物のアリコートを標的細胞株と共培養して、特定の抗原刺激に応答するサイトカイン放出を評価した。
【０７１２】
ＴＭプロセスを用いたＣＡＲ−Ｔ細胞産生
Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）処理Ｔ細胞を温かいＲＰＭＩ完全Ｔ細胞培地に再懸濁させてから、２４ウェルプレート内で平板培養した。３：１のビーズ：細胞比で、ヒトＴ−エキスパンダーＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと一緒にＴ細胞を３７℃で一晩インキュベートした。
【０７１３】
第１日に、ＳＵＰ−Ｔ１力価に基づき、２のＭＯＩでレンチウイルスを添加した。非形質導入対照（ＵＴＤ）にはウイルスを添加しなかった。Ｔ細胞を３７℃で一晩インキュベートした後、１ウェル当たり１ｍＬの完全Ｔ細胞培地をさらに添加してから、３７℃で一晩インキュベートした。残る７日間の培養物増殖のために、Ｔ細胞を組織培養フラスコに移し、２日毎に完全Ｔ細胞培地で希釈した。
【０７１４】
第８日〜９日において、Ｔ細胞を脱ビーズし、採取した後、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０凍結保存溶液中に凍結保存し、ＣｏｏｌＣｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ（Ｂｉｏｃｉｓｉｏｎ）内に−８０℃で凍結し、翌日ＬＮ２に移した。Ｔ細胞の小アリコートをＣＡＲ発現について染色した。補正のために単色対照を加えた。サンプルをフローサイトメーター（ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ）で測定し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウエアで解析した。
【０７１５】
標的細胞株及び培養
Ｎａｌｍ６細胞をレンチウイルスホタルルシフェラーゼリポーター構築物でトランスフェクトして、Ｎａｌｍ６−ｌｕｃ細胞株を作製した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で増殖させた。使用前の腫瘍抗原ＢＣＭＡ発現の検出のために、細胞のアリコートを使用した。
【０７１６】
インビトロサイトカイン分泌アッセイ
ＢＣＭＡ発現標的細胞に応答する抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ（エフェクター細胞と称する）のサイトカイン分泌を、９６ウェル平底プレート内でＣＡＲ−Ｔ細胞を標的細胞と２．５倍Ｅ：Ｔ比で２０ｈインキュベートすることにより評価した。エフェクター細胞は、ＡＲＭ又はＴＭプロセスのいずれかを用いて作製されるＰＩ６１、Ｒ１Ｇ５及びＢＣＭＡ１０ＣＡＲＴ細胞であった。ＡＲＭプロセスを用いて製造されたＣＡＲＴ細胞を、細胞の休止及び非特異的活性の最小化を可能にする２４ｈウォッシュアウト条件で平板培養した。標的細胞は、ＢＣＭＡ陽性ＫＭＳ１１−ｌｕｃ又はＢＣＭＡ陰性ＮＡＬＭ６−ｌｕｃを含む。これらの標的細胞は、新しく平板培養したＴ細胞又は２４ｈウォッシュアウト条件（ＡＲＭ細胞のみ）からのＴ細胞に添加した。このアッセイのために、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−ＴへのＵＴＤの添加によりＣＡＲ−Ｔ細胞の％形質導入を正規化した。これにより、各サンプル中の同じ数のＣＡＲ−Ｔ細胞と同じ総Ｔ細胞数の比較が可能になった。標的に対するエフェクターの２０時間共培養時点からの上清を各ウェルから回収し、ＭＳＤサイトカイン分析に使用するために−２０℃で凍結した。カスタムＭＳＤ  Ｖ−ＰＬＥＸ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２Ｋｉｔ（♯Ｋ１５１Ａ０Ｈ−４Ａ）を使用して、各々の上清サンプル中の分泌サイトカインを定量した。
【０７１７】
結果
ＡＲＭプロセスは、Ｔ細胞の幹細胞性を保存する
ＡＲＭプロセスを用いて製造されるＣＡＲ−Ｔ細胞をフローサイトメトリーにより分析して、解凍時及び解凍後４８ｈ時点のそれらのＣＡＲ発現並びにＴ細胞表現型を評価した（図３４Ａ、３４Ｂ及び３４Ｃ）。ＴＭプロセスを用いて製造されるＣＡＲ−Ｔ細胞の場合、ＣＡＲ発現を採取の９日前に評価した（図３５Ａ）。ＢＣＭＡ−ＣＡＲは、図３４Ａに示す解凍時にほとんど検出不能であった。しかし、解凍後４８ｈの時点で、ＢＣＭＡ−ＣＡＲは、ＰＩ６１で３２．９％、Ｒ１Ｇ５で３５．９％及びＢＣＭＡ１０で１７．４％のように明確に発現された。ＴＭプロセスを用いて作製された第９日細胞は、ＰＩ６１で３６％、Ｒ１Ｇ５で４０％及びＢＣＭＡ１０で７％のＢＣＭＡ−ＣＡＲ発現を示す（図３５Ａ）。ＣＡＲ＋Ｔ細胞表現型の解析から、ＡＲＭプロセスは、ナイーブ様Ｔ細胞（ＰＩ６１及びＲ１Ｇ５について約６０％のＣＤ４５ＲＯ−／ＣＣＲ７＋、ＢＣＭＡ１０について３２％のＣＤ４５ＲＯ−／ＣＣＲ７＋）を保持したことが明らかとなった（図３４Ｃ）。ＴＭプロセスは、主としてセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）（全３つのＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔについて７２〜８１％のＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７＋）をもたらしたが、ＴＭプロセスを用いて製造されたＣＡＲ＋Ｔ細胞ではナイーブ様Ｔ細胞集団がほぼ消失した（図３５Ｂ）。全体として、ナイーブＴ細胞集団は、以前の報告（Ｃｏｈｅｎ  ＡＤ，ｅｔ  ａｌ（２０１９）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１３０．ｐｉｉ：１２６３９７．ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ１２６３９７；Ｆｒａｉｅｔｔａ，ＪＡ，ｅｔ  ａｌ（２０１８）．Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２４（５）；５６３−５７１）に記載されているＣＤ４５ＲＯ−／ＣＤ２７＋Ｔｓｔｅｍ細胞と大きく重なり、応答及びＣＡＲ−Ｔ発現と関連する。
【０７１８】
その表現型に加えて、最終的ＰＩ６１、Ｒ１Ｇ５及びＢＣＭＡ１０ＣＡＲＴ細胞産物をそれらの機能についてもインビトロで評価した。ＰＩ６１、Ｒ１Ｇ５及びＢＣＭＡ１０細胞産物を解凍し、１：１比でＢＣＭＡ発現細胞株ＫＭＳ−１１と一緒に共培養した。解凍後のＡＲＭ処理細胞は、共培養を確立する前に２４ｈ休止させた。共培養後２４時間の上清中のサイトカインレベルを比較すると、図３６Ａ〜３６Ｄに示す通り、ＴＭ産物と比較して、ＡＲＭ産物により分泌されるＩＬ−２の約５〜２５倍の増加及びＩＦＮ−γの約３〜７倍のレベル増加が明らかにされた。ＡＲＭ又はＴＭプロセスを経た非形質導入（ＵＴＤ）細胞による実験で、ＰＩ６１、Ｒ１Ｇ５及びＢＣＭＡ１０によるＢＣＭＡ特異的認識が確認された。
【０７１９】
要約すると、ＡＲＭプロセスを用いて産生されたＰＩ６１、Ｒ１Ｇ５及びＢＣＭＡ１０ＣＡＲＴ細胞は、インビトロでのＢＣＭＡ特異的活性化を示し、ＴＭ処理産物と比較して、高いレベルのＩＬ−２及びＩＦＮ−γを分泌するが、これは、ＡＲＭプロセスを用いて産生されるＣＡＲＴ細胞のＴｓｔｅｍ表現型と相関する。
【０７２０】
実施例１０：ＡＲＭプロセスを用いて製造されるＣＡＲＴ細胞の遺伝子シグネチャー分析
方法
単一細胞ＲＮＡｓｅｑ
１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ及び支持ライブラリー構築キットを用いて、単一細胞ＲＮＡｓｅｑライブラリーを作製した。
【０７２１】
凍結保存細胞を解凍し、カウント及びフロー分別（試験課題の必要に応じて）した後、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔにロードした。個別の細胞を液滴にロードし、ＧｅｍＣｏｄｅビーズによって個別の液滴中のＲＮＡにバーコードを付けた。バーコード付きＲＮＡを液滴から放出させ、全トランスクリプトームＩｌｌｕｍｉｎａ適合性シーケンシングライブラリーに変換した。
【０７２２】
作製したライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで配列決定し、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ解析パイプライン及びＬｏｕｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒソフトウエアを用いて解析した。
【０７２３】
単一細胞免疫細胞プロファイリング
全トランスクリプトーム１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ単一細胞ライブラリーを鋳型材料として使用して、免疫細胞プロファイリング及びレパトア解析を作成した。Ｔ細胞受容体配列をＣｈｒｏｍｉｕｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  ５‘ＬｉｂｒａｒｉｅｓからＰＣＲ増幅した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング装置で解析した。
【０７２４】
解析パイプライン
単一細胞ＲＮＡｓｅｑデータを、ＦＡＳＴＱファイルで開始するＣｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒ解析パイプラインで処理した。Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒ解析パイプラインの詳細な説明は、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｕｐｐｏｒｔ．１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ−ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ／ｌａｔｅｓｔ／ｗｈａｔ−ｉｓ−ｃｅｌｌ−ｒａｎｇｅｒに見出すことができる。一般的パイプラインは、アラインメント、フィルタリング、バーコードカウント及びＵＭＩカウントを含んだ。細胞バーコードを用いて、遺伝子バーコードマトリックスを作成し、クラスターを決定して、遺伝子発現解析を実施した。遺伝子発現カウントデータは、Ｓｅｕｒａｔ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを用いて正規化した。２００未満の発現遺伝子を有する細胞を解析から廃棄した。２つ以下の細胞にのみ発現された遺伝子を解析から廃棄した。残ったデータを、１０，０００のスケール因子を用いてＳｅｕｒａｔ  ｌｏｇ正規化法により正規化した。１細胞当たりの検出分子の数に対する回帰によりデータをスケーリングした。遺伝子セット内の全遺伝子の平均ｌｏｇ正規化遺伝子発現値を取得することにより、遺伝子セットスコア（ＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ）を算出した。各遺伝子は、サンプル全体の遺伝子の平均発現が０であり、標準偏差が１であるように正規化されたｚ−スコアである。次に、遺伝子セットスコアを、遺伝子セット内の遺伝子の正規化値の平均として計算する。遺伝子セットスコア計算例を以下に説明する。
【０７２５】
本実施例の遺伝子セットスコア計算の場合、６つの遺伝子についての２つのサンプルの正規化遺伝子発現を表２３に記載する。この計算例を目的として、遺伝子セットは、遺伝子１〜４から構成される。従って、サンプル１及び２の両方が、０の遺伝子セットスコアを有する。
【０７２６】
【表５１】
2021534783.tif 000068
【０７２７】
遺伝子セット「Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ」は、以下の遺伝子：ＭＸＲＡ７、ＣＬＩＣ１、ＮＡＴ１３、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＧＬＣＣＩ１、ＤＵＳＰ１０、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＣＡＣＮＢ３、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＴＰＲＧ１、ＥＯＭＥＳ、ＭＡＴＫ、ＡＲＨＧＡＰ１０、ＡＤＡＭ８、ＭＡＮ１Ａ１、ＳＬＦＮ１２Ｌ、ＳＨ２Ｄ２Ａ、ＥＩＦ２Ｃ４、ＣＤ５８、ＭＹＯ１Ｆ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＥＲＮ１、ＮＰＣ１、ＮＢＥＡＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＳＹＴＬ２、ＳＬＣ４Ａ４、ＰＩＫ３ＡＰ１、ＰＴＧＤＲ、ＭＡＦ、ＰＬＥＫＨＡ５、ＡＤＲＢ２、ＰＬＸＮＤ１、ＧＮＡＯ１、ＴＨＢＳ１、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＣＹＴＨ３、ＫＬＲＦ１、ＦＬＪ１６６８６、ＡＵＴＳ２、ＰＴＰＲＭ、ＧＮＬＹ及びＧＦＰＴ２を含む。
【０７２８】
遺伝子セット「Ｕｐ  Ｔｒｅｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  Ｔｅｆｆ」は、以下の遺伝子：Ｃ１２ｏｒｆ７５、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＷＡＰ７０、ＲＧＳ１、ＰＲＲ１１、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＴＳＨＲ、Ｃ１４ｏｒｆ１４５、ＣＡＳＰ８、ＳＹＴ１１、ＡＣＴＮ４、ＡＮＸＡ５、ＧＬＲＸ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＰＭＣＨ、ＲＡＢ１１ＦＩＰ１、ＩＬ３２、ＦＡＭ１６０Ｂ１、ＳＨＭＴ２、ＦＲＭＤ４Ｂ、ＣＣＲ３、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＮＴＮＧ２、ＣＬＤＮＤ１、ＢＡＲＤ１、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＴＹＭＳ、ＡＴＰ１Ｂ１、ＧＪＢ６、ＦＧＬ２、ＴＫ１、ＳＬＣ２Ａ８、ＣＤＫＮ２Ａ、ＳＫＡＰ２、ＧＰＲ５５、ＣＤＣＡ７、Ｓ１００Ａ４、ＧＤＰＤ５、ＰＭＡＩＰ１、ＡＣＯＴ９、ＣＥＰ５５、ＳＧＭＳ１、ＡＤＰＲＨ、ＡＫＡＰ２、ＨＤＡＣ９、ＩＫＺＦ４、ＣＡＲＤ１７、ＶＡＶ３、ＯＢＦＣ２Ａ、ＩＴＧＢ１、ＣＩＩＴＡ、ＳＥＴＤ７、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＣＣＲ１０、ＫＩＡＡ０１０１、ＳＬＣ１４Ａ１、ＰＴＴＧ３Ｐ、ＤＵＳＰ１０、ＦＡＭ１６４Ａ、ＰＹＨＩＮ１、ＭＹＯ１Ｆ、ＳＬＣ１Ａ４、ＭＹＢＬ２、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＣＣＲ５、ＳＴ８ＳＩＡ６、ＴＯＸ、ＢＦＳＰ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、ＮＣＡＰＨ、ＨＬＡ−ＤＰＢ２、ＳＹＴ４、ＮＩＮＪ２、ＦＡＭ４６Ｃ、ＣＣＲ４、ＧＢＰ５、Ｃ１５ｏｒｆ５３、ＬＭＣＤ１、ＭＫＩ６７、ＮＵＳＡＰ１、ＰＤＥ４Ａ、Ｅ２Ｆ２、ＣＤ５８、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＬＯＣ１００１８８９４９、ＦＡＳ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＳＥＬＰ、ＷＥＥ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＦＣＲＬ１、ＩＣＡ１、ＣＮＴＮＡＰ１、ＯＡＳ１、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＣＣＲ６、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＡＮＸＡ２Ｐ３、ＳＴＡＭ、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＡＮＸＡ２、ＰＩ１６、ＤＵＳＰ４、ＬＡＹＮ、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＰＴＰＬＡ、ＡＮＸＡ２Ｐ１、ＺＮＦ３６５、ＬＡＩＲ２、ＬＯＣ５４１４７１、ＲＡＳＧＲＰ４、ＢＣＡＳ１、ＵＴＳ２、ＭＩＡＴ、ＰＲＤＭ１、ＳＥＭＡ３Ｇ、ＦＡＭ１２９Ａ、ＨＰＧＤ、ＮＣＦ４、ＬＧＡＬＳ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＪＡＫＭＩＰ１、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＩＫＺＦ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＦＡＮＫ１、ＲＴＫＮ２、ＴＲＩＢ１、ＦＣＲＬ３及びＦＯＸＰ３を含む。
【０７２９】
遺伝子セット「Ｄｏｗｎ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ」は、以下の遺伝子：ＡＣＥ、ＢＡＴＦ、ＣＤＫ６、ＣＨＤ２、ＥＲＣＣ２、ＨＯＸＢ４、ＭＥＯＸ１、ＳＦＲＰ１、ＳＰ７、ＳＲＦ、ＴＡＬ１及びＸＲＣＣ５を含む。
【０７３０】
遺伝子セット「Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ」は、以下の遺伝子：ＡＢＣＢ１、ＡＣＡＴ１、ＡＤＭ、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＡＫ２、ＡＫ３、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＡＬＤＯＡ、ＡＬＤＯＣ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＸＡ１、ＡＮＸＡ２、ＡＮＸＡ５、ＡＲＨＧＡＰ５、ＡＲＳＥ、ＡＲＴ１、ＢＡＣＥ２、ＢＡＴＦ３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＨＬＨＥ４０、ＢＨＬＨＥ４１、ＢＩＫ、ＢＩＲＣ２、ＢＮＩＰ３、ＢＮＩＰ３Ｌ、ＢＰＩ、ＢＴＧ１、Ｃ１１ｏｒｆ２、Ｃ７ｏｒｆ６８、ＣＡ１２、ＣＡ９、ＣＡＬＤ１、ＣＣＮＧ２、ＣＣＴ６Ａ、ＣＤ９９、ＣＤＫ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＬＫ１、ＣＮＯＴ７、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ５Ａ３、ＣＰ、ＣＴＳＤ、ＣＸＣＲ４、Ｄ４Ｓ２３４Ｅ、ＤＤＩＴ３、ＤＤＩＴ４、１−Ｄｅｃ、ＤＫＣ１、ＤＲ１、ＥＤＮ１、ＥＤＮ２、ＥＦＮＡ１、ＥＧＦ、ＥＧＲ１、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＬＦ３、ＥＬＬ２、ＥＮＧ、ＥＮＯ１、ＥＮＯ３、ＥＮＰＥＰ、ＥＰＯ、ＥＲＲＦＩ１、ＥＴＳ１、Ｆ３、ＦＡＢＰ５、ＦＧＦ３、ＦＫＢＰ４、ＦＬＴ１、ＦＮ１、ＦＯＳ、ＦＴＬ、ＧＡＰＤＨ、ＧＢＥ１、ＧＬＲＸ、ＧＰＩ、ＧＰＲＣ５Ａ、ＨＡＰ１、ＨＢＰ１、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ９、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＰＵＤ１、ＨＧＦ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＫ１、ＨＫ２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＭＯＸ１、ＨＭＯＸ２、ＨＳＰＡ５、ＨＳＰＤ１、ＨＳＰＨ１、ＨＹＯＵ１、ＩＣＡＭ１、ＩＤ２、ＩＦＩ２７、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＮＳＩＧ１、ＩＲＦ６、ＩＴＧＡ５、ＪＵＮ、ＫＤＲ、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ１９、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＬＥＰ、ＬＧＡＬＳ１、ＬＯＮＰ１、ＬＯＸ、ＬＲＰ１、ＭＡＰ４、ＭＥＴ、ＭＩＦ、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＰＩ、ＭＴ１Ｌ、ＭＴＬ３Ｐ、ＭＵＣ１、ＭＸＩ１、ＮＤＲＧ１、ＮＦＩＬ３、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＯＳ１、ＮＯＳ２、ＮＯＳ２Ｐ１、ＮＯＳ２Ｐ２、ＮＯＳ３、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ４Ａ１、ＮＴ５Ｅ、ＯＤＣ１、Ｐ４ＨＡ１、Ｐ４ＨＡ２、ＰＡＩＣＳ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＫ３、ＰＦＫＦＢ１、ＰＦＫＦＢ３、ＰＦＫＦＢ４、ＰＦＫＬ、ＰＧＡＭ１、ＰＧＦ、ＰＧＫ１、ＰＧＫ２、ＰＧＭ１、ＰＩＭ１、ＰＩＭ２、ＰＫＭ２、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＬＩＮ２、ＰＬＯＤ２、ＰＮＮ、ＰＮＰ、ＰＯＬＭ、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＴ、ＰＲＯＫ１、ＰＳＭＡ３、ＰＳＭＤ９、ＰＴＧＳ１、ＰＴＧＳ２、ＱＳＯＸ１、ＲＢＰＪ、ＲＥＬＡ、ＲＩＯＫ３、ＲＮＡＳＥＬ、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＲＰ９、ＳＡＴ１、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＧＳＭ２、ＳＩＡＨ２、ＳＩＮ３Ａ、ＳＩＲＰＡ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＬＣ６Ａ１０Ｐ、ＳＬＣ６Ａ１６、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＯＲＬ１、ＳＰＰ１、ＳＲＳＦ６、ＳＳＳＣＡ１、ＳＴＣ２、ＳＴＲＡ１３、ＳＹＴ７、ＴＢＰＬ１、ＴＣＥＡＬ１、ＴＥＫ、ＴＦ、ＴＦＦ３、ＴＦＲＣ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＭ２、ＴＨ、ＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＭ１７Ａ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＰ５３、ＴＰＢＧ、ＴＰＤ５２、ＴＰ���１、ＴＸＮ、ＴＸＮＩＰ、ＵＭＰＳ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＩＭ、ＶＰＳ１１及びＸＲＣＣ６を含む。
【０７３１】
遺伝子セット「Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ」は、以下の遺伝子：ＡＢＬ１、ＡＣＢＤ５、ＡＣＩＮ１、ＡＣＴＲＴ１、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＫＲ１Ｅ２、ＡＬＫＢＨ５、ＡＬＰＫ１、ＡＭＢＲＡ１、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ７、ＡＲＳＢ、ＡＳＢ２、ＡＴＧ１０、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１３、ＡＴＧ１４、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＡＴＧ１６Ｌ２、ＡＴＧ２Ａ、ＡＴＧ２Ｂ、ＡＴＧ３、ＡＴＧ４Ａ、ＡＴＧ４Ｂ、ＡＴＧ４Ｃ、ＡＴＧ４Ｄ、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７、ＡＴＧ９Ａ、ＡＴＧ９Ｂ、ＡＴＰ１３Ａ２、ＡＴＰ１Ｂ１、ＡＴＰＡＦ１−ＡＳ１、ＡＴＰＩＦ１、ＢＥＣＮ１、ＢＥＣＮ１Ｐ１、ＢＬＯＣ１Ｓ１、ＢＭＰ２ＫＬ、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、ＢＯＣ、Ｃ１１ｏｒｆ２、Ｃ１１ｏｒｆ４１、Ｃ１２ｏｒｆ４４、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｃ１４ｏｒｆ１３３、Ｃ１ｏｒｆ２１０、Ｃ５、Ｃ６ｏｒｆ１０６、Ｃ７ｏｒｆ５９、Ｃ７ｏｒｆ６８、Ｃ８ｏｒｆ５９、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＣＡ７、ＣＡＬＣＢ、ＣＡＬＣＯＣＯ２、ＣＡＰＳ、ＣＣＤＣ３６、ＣＤ１６３Ｌ１、ＣＤ９３、ＣＤＣ３７、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＡＦ１Ｂ、ＣＨＭＰ２Ａ、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＣＨＭＰ３、ＣＨＭＰ４Ａ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ４Ｃ、ＣＨＭＰ６、ＣＨＳＴ３、ＣＩＳＤ２、ＣＬＤＮ７、ＣＬＥＣ１６Ａ、ＣＬＮ３、ＣＬＶＳ１、ＣＯＸ８Ａ、ＣＰＡ３、ＣＲＮＫＬ１、ＣＳＰＧ５、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＤ、ＣＸＣＲ７、ＤＡＰ、ＤＫＫＬ１、ＤＮＡＡＦ２、ＤＰＦ３、ＤＲＡＭ１、ＤＲＡＭ２、ＤＹＮＬＬ１、ＤＹＮＬＬ２、ＤＺＡＮＫ１、ＥＩ２４、ＥＩＦ２Ｓ１、ＥＰＧ５、ＥＰＭ２Ａ、ＦＡＢＰ１、ＦＡＭ１２５Ａ、ＦＡＭ１３１Ｂ、ＦＡＭ１３４Ｂ、ＦＡＭ１３Ｂ、ＦＡＭ１７６Ａ、ＦＡＭ１７６Ｂ、ＦＡＭ４８Ａ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＬ、ＦＢＸＯ７、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ７、ＦＧＦＢＰ１、ＦＩＳ１、ＦＮＢＰ１Ｌ、ＦＯＸＯ１、ＦＵＮＤＣ１、ＦＵＮＤＣ２、ＦＸＲ２、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＧＡＢＡＲＡＰＬ３、ＧＡＢＲＡ５、ＧＤＦ５、ＧＭＩＰ、ＨＡＰ１、ＨＡＰＬＮ１、ＨＢＸＩＰ、ＨＣＡＲ１、ＨＤＡＣ６、ＨＧＳ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊ、ＨＫ２、ＨＭＧＢ１、ＨＰＲ、ＨＳＦ２ＢＰ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰＡ８、ＩＦＩ１６、ＩＰＰＫ、ＩＲＧＭ、ＩＳＴ１、ＩＴＧＢ４、ＩＴＰＫＣ、ＫＣＮＫ３、ＫＣＮＱ１、ＫＩＡＡ０２２６、ＫＩＡＡ１３２４、ＫＲＣＣ１、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ７３、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＴＯＲ１、ＬＡＭＴＯＲ２、ＬＡＭＴＯＲ３、ＬＡＲＰ１Ｂ、ＬＥＮＧ９、ＬＧＡＬＳ８、ＬＩＸ１、ＬＩＸ１Ｌ、ＬＭＣＤ１、ＬＲＲＫ２、ＬＲＳＡＭ１、ＬＳＭ４、ＭＡＰ１Ａ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ａ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ２、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｃ、ＭＡＰ１Ｓ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１２、ＭＡＲＫ２、ＭＢＤ５、ＭＤＨ１、ＭＥＸ３Ｃ、ＭＦＮ１、ＭＦＮ２、ＭＬＳＴ８、ＭＲＰＳ１０、ＭＲＰＳ２、ＭＳＴＮ、ＭＴＥＲＦＤ１、ＭＴＭＲ１４、ＭＴＭＲ３、ＭＴＯＲ、ＭＴＳＳ１、ＭＹＨ１１、ＭＹＬＫ、ＭＹＯＭ１、ＮＢＲ１���ＮＤＵＦＢ９、ＮＥＦＭ、ＮＨＬＲＣ１、ＮＭＥ２、ＮＰＣ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲＢＦ２、ＮＴＨＬ１、ＮＵＰ９３、ＯＢＳＣＮ、ＯＰＴＮ、Ｐ２ＲＸ５、ＰＡＣＳ２、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ７、ＰＤＫ１、ＰＤＫ４、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ３、ＰＦＫＰ、ＰＧＫ２、ＰＨＦ２３、ＰＨＹＨＩＰ、ＰＩ４Ｋ２Ａ、ＰＩＫ３Ｃ３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＮＫ１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＰＬＯＤ２、ＰＮＰＯ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＰＹ、ＰＲＫＡＡ１、ＰＲＫＡＡ２、ＰＲＫＡＢ１、ＰＲＫＡＢ２、ＰＲＫＡＧ１、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＡＧ３、ＰＲＫＤ２、ＰＲＫＧ１、ＰＳＥＮ１、ＰＴＰＮ２２、ＲＡＢ１２、ＲＡＢ１Ａ、ＲＡＢ１Ｂ、ＲＡＢ２３、ＲＡＢ２４、ＲＡＢ３３Ｂ、ＲＡＢ３９、ＲＡＢ７Ａ、ＲＢ１ＣＣ１、ＲＢＭ１８、ＲＥＥＰ２、ＲＥＰ１５、ＲＦＷＤ３、ＲＧＳ１９、ＲＨＥＢ、ＲＩＭＳ３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ４１、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＴＯＲ、ＲＲＡＧＡ、ＲＲＡＧＢ、ＲＲＡＧＣ、ＲＲＡＧＤ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＳＣＮ１Ａ、ＳＥＲＰＩＮＢ１０、ＳＥＳＮ２、ＳＦＲＰ４、ＳＨ３ＧＬＢ１、ＳＩＲＴ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ１Ａ４、ＳＬＣ２２Ａ３、ＳＬＣ２５Ａ１９、ＳＬＣ３５Ｂ３、ＳＬＣ３５Ｃ１、ＳＬＣ３７Ａ４、ＳＬＣ６Ａ１、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＭＵＲＦ１、ＳＮＡＰ２９、ＳＮＡＰＩＮ、ＳＮＦ８、ＳＮＲＰＢ、ＳＮＲＰＢ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＮＲＰＦ、ＳＮＴＧ１、ＳＮＸ１４、ＳＰＡＴＡ１８、ＳＱＳＴＭ１、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＭ、ＳＴＡＭ２、ＳＴＡＴ２、ＳＴＢＤ１、ＳＴＫ１１、ＳＴＫ３２Ａ、ＳＴＯＭ、ＳＴＸ１２、ＳＴＸ１７、ＳＵＰＴ３Ｈ、ＴＢＣ１Ｄ１７、ＴＢＣ１Ｄ２５、ＴＢＣ１Ｄ５、ＴＣＩＲＧ１、ＴＥＡＤ４、ＴＥＣＰＲ１、ＴＥＣＰＲ２、ＴＦＥＢ、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＭＢＩＭ６、ＴＭＥＭ２０３、ＴＭＥＭ２０８、ＴＭＥＭ３９Ａ、ＴＭＥＭ３９Ｂ、ＴＭＥＭ５９、ＴＭＥＭ７４、ＴＭＥＭ９３、ＴＮＩＫ、ＴＯＬＬＩＰ、ＴＯＭＭ２０、ＴＯＭＭ２２、ＴＯＭＭ４０、ＴＯＭＭ５、ＴＯＭＭ６、ＴＯＭＭ７、ＴＯＭＭ７０Ａ、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＴＰ５３ＩＮＰ２、ＴＲＡＰＰＣ８、ＴＲＥＭ１、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ５、ＴＳＧ１０１、ＴＸＬＮＡ、ＵＢＡ５２、ＵＢＢ、ＵＢＣ、ＵＢＱＬＮ１、ＵＢＱＬＮ２、ＵＢＱＬＮ４、ＵＬＫ１、ＵＬＫ２、ＵＬＫ３、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ３０、ＵＶＲＡＧ、ＶＡＭＰ７、ＶＡＭＰ８、ＶＤＡＣ１、ＶＭＰ１、ＶＰＳ１１、ＶＰＳ１６、ＶＰＳ１８、ＶＰＳ２５、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ３３Ａ、ＶＰＳ３３Ｂ、ＶＰＳ３６、ＶＰＳ３７Ａ、ＶＰＳ３７Ｂ、ＶＰＳ３７Ｃ、ＶＰＳ３７Ｄ、ＶＰＳ３９、ＶＰＳ４１、ＶＰＳ４Ａ、ＶＰＳ４Ｂ、ＶＴＡ１、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、ＷＤＦＹ３、ＷＤＲ４５、ＷＤＲ４５Ｌ、ＷＩＰＩ１、ＷＩＰＩ２、ＸＢＰ１、ＹＩＰＦ１、ＺＣＣＨＣ１７、ＺＦＹＶＥ１、ＺＫＳＣＡＮ３、ＺＮＦ１８９、ＺＮＦ５９３及びＺＮＦ６８１を含む。
【０７３２】
遺伝子セット「Ｕｐ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ」は、以下の遺伝子：ＡＢＣＡ７、ＡＢＣＦ３、ＡＣＡＰ２、ＡＭＴ、ＡＮＫＨ、ＡＴＦ７ＩＰ２、ＡＴＧ１４、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＸＮ７、ＡＴＸＮ７Ｌ３Ｂ、ＢＣＬ７Ａ、ＢＥＸ４、ＢＳＤＣ１、ＢＴＧ１、ＢＴＧ２、ＢＴＮ３Ａ１、Ｃ１１ｏｒｆ２１、Ｃ１９ｏｒｆ２２、Ｃ２１ｏｒｆ２、ＣＡＭＫ２Ｇ、ＣＡＲＳ２、ＣＣＮＬ２、ＣＤ２４８、ＣＤ５、ＣＤ５５、ＣＥＰ１６４、ＣＨＫＢ、ＣＬＫ１、ＣＬＫ４、ＣＴＳＬ１、ＤＢＰ、ＤＣＵＮ１Ｄ２、ＤＥＮＮＤ１Ｃ、ＤＧＫＤ、ＤＬＧ１、ＤＵＳＰ１、ＥＡＰＰ、ＥＣＥ１、ＥＣＨＤＣ２、ＥＲＢＢ２ＩＰ、ＦＡＭ１１７Ａ、ＦＡＭ１３４Ｂ、ＦＡＭ１３４Ｃ、ＦＡＭ１６９Ａ、ＦＡＭ１９０Ｂ、ＦＡＵ、ＦＬＪ１００３８、ＦＯＸＪ２、ＦＯＸＪ３、ＦＯＸＬ１、ＦＯＸＯ１、ＦＸＹＤ５、ＦＹＢ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＹＡＬ２、ＩＣＡＭ２、ＩＦＩＴ５、ＩＦＩＴＭ１、ＩＫＢＫＢ、ＩＱＳＥＣ１、ＩＲＳ４、ＫＩＡＡ０６６４Ｌ３、ＫＩＡＡ０７４８、ＫＬＦ３、ＫＬＦ９、ＫＲＴ１８、ＬＥＦ１、ＬＩＮＣ００３４２、ＬＩＰＡ、ＬＩＰＴ１、ＬＬＧＬ２、ＬＭＢＲ１Ｌ、ＬＰＡＲ２、ＬＴＢＰ３、ＬＹＰＤ３、ＬＺＴＦＬ１、ＭＡＮＢＡ、ＭＡＰ２Ｋ６、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＵ２、ＭＧＥＡ５、ＭＭＰ８、ＭＰＯ、ＭＳＬ１、ＭＳＬ３、ＭＹＨ３、ＭＹＬＩＰ、ＮＡＧＰＡ、ＮＤＳＴ２、ＮＩＳＣＨ、ＮＫＴＲ、ＮＬＲＰ１、ＮＯＳＩＰ、ＮＰＩＰ、ＮＵＭＡ１、ＰＡＩＰ２Ｂ、ＰＡＰＤ７、ＰＢＸＩＰ１、ＰＣＩＦ１、ＰＩ４ＫＡ、ＰＬＣＬ２、ＰＬＥＫＨＡ１、ＰＬＥＫＨＦ２、ＰＮＩＳＲ、ＰＰＦＩＢＰ２、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＺ、ＰＲＫＤ３、ＰＲＭＴ２、ＰＴＰ４Ａ３、ＰＸＮ、ＲＡＳＡ２、ＲＡＳＡ３、ＲＡＳＧＲＰ２、ＲＢＭ３８、ＲＥＰＩＮ１、ＲＮＦ３８、ＲＮＦ４４、ＲＯＲ１、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３２、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ６、ＲＰＳ９、ＲＸＲＡ、ＲＹＫ、ＳＣＡＮＤ２、ＳＥＭＡ４Ｃ、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ６、ＳＥＴＸ、ＳＦ３Ｂ１、ＳＨ２Ｂ１、ＳＬＣ２Ａ４ＲＧ、ＳＬＣ３５Ｅ２Ｂ、ＳＬＣ４６Ａ３、ＳＭＡＧＰ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＰＤ１、ＳＮＰＨ、ＳＰ１４０Ｌ、ＳＰＡＴＡ６、ＳＰＧ７、ＳＲＥＫ１ＩＰ１、ＳＲＳＦ５、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＶＩＬ、ＳＹＦ２、ＳＹＮＪ２ＢＰ、ＴＡＦ１Ｃ、ＴＢＣ１Ｄ４、ＴＣＦ２０、ＴＥＣＴＡ、ＴＥＳ、ＴＭＥＭ１２７、ＴＭＥＭ１５９、ＴＭＥＭ３０Ｂ、ＴＭＥＭ６６、ＴＭＥＭ８Ｂ、ＴＰ５３ＴＧ１、ＴＰＣＮ１、ＴＲＩＭ２２、ＴＲＩＭ４４、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＴＳＰＹＬ２、ＴＴＣ９、ＴＴＮ、ＵＢＥ２Ｇ２、ＵＳＰ３３、ＵＳＰ３４、ＶＡＭＰ１、ＶＩＬＬ、ＶＩＰＲ１、ＶＰＳ１３Ｃ、ＺＢＥＤ５、ＺＢＴＢ２５、ＺＢＴＢ４０、ＺＣ３Ｈ３、ＺＦＰ１６１、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＺＦＰ３６Ｌ２、ＺＨＸ２、ＺＭＹＭ５、ＺＮＦ１３６、ＺＮＦ１４８、ＺＮＦ３１８、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ５１２Ｂ、ＺＮＦ６０９、ＺＮＦ６５２、ＺＮＦ８３、ＺＮＦ８６２及びＺＮＦ９１を含む。
【０７３３】
遺伝子セット「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ  ｕｐ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」は、以下の遺伝子：ＭＴＣＨ２、ＲＡＢ６Ｃ、ＫＩＡＡ０１９５、ＳＥＴＤ２、Ｃ２ｏｒｆ２４、ＮＲＤ１、ＧＮＡ１３、ＣＯＰＡ、ＳＥＬＴ、ＴＮＩＰ１、ＣＢＦＡ２Ｔ２、ＬＲＰ１０、ＰＲＫＣＩ、ＢＲＥ、ＡＮＫＳ１Ａ、ＰＮＰＬＡ６、ＡＲＬ６ＩＰ１、ＷＤＦＹ１、ＭＡＰＫ１、ＧＰＲ１５３、ＳＨＫＢＰ１、ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ２、ＰＩＰ４Ｋ２Ａ、ＨＣＮ３、ＧＴＰＢＰ１、ＴＬＮ１、Ｃ４ｏｒｆ３４、ＫＩＦ３Ｂ、ＴＣＩＲＧ１、ＰＰＰ３ＣＡ、ＡＴＧ４Ｄ、ＴＹＭＰ、ＴＲＡＦ６、Ｃ１７ｏｒｆ７６、ＷＩＰＦ１、ＦＡＭ１０８Ａ１、ＭＹＬ６、ＮＲＭ、ＳＰＣＳ２、ＧＧＴ３Ｐ、ＧＡＬＫ１、ＣＬＩＰ４、ＡＲＬ４Ｃ、ＹＷＨＡＱ、ＬＰＣＡＴ４、ＡＴＧ２Ａ、ＩＤＳ、ＴＢＣ１Ｄ５、ＤＭＰＫ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ６、ＲＥＥＰ５、ＡＢＨＤ６、ＫＩＡＡ０２４７、ＥＭＢ、ＴＳＥＮ５４、ＳＰＩＲＥ２、ＰＩＷＩＬ４、ＺＳＣＡＮ２２、ＩＣＡＭ１、ＣＨＤ９、ＬＰＩＮ２、ＳＥＴＤ８、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＵＬＢＰ３、ＩＬ１５ＲＡ、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＬＣＰ１、ＣＨＰ、ＲＵＮＸ３、ＴＭＥＭ４３、ＲＥＥＰ４、ＭＥＦ２Ｄ、ＡＢＬ１、ＴＭＥＭ３９Ａ、ＰＣＢＰ４、ＰＬＣＤ１、ＣＨＳＴ１２、ＲＡＳＧＲＰ１、Ｃ１ｏｒｆ５８、Ｃ１１ｏｒｆ６３、Ｃ６ｏｒｆ１２９、ＦＨＯＤ１、ＤＫＦＺｐ４３４Ｆ１４２、ＰＩＫ３ＣＧ、ＩＴＰＲ３、ＢＴＧ３、Ｃ４ｏｒｆ５０、ＣＮＮＭ３、ＩＦＩ１６、ＡＫ１、ＣＤＫ２ＡＰ１、ＲＥＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＭＶＤ、ＴＴＣ３９Ｃ、ＰＬＥＫＨＡ２、ＦＫＢＰ１１、ＥＭＬ４、ＦＡＮＣＡ、ＣＤＣＡ４、ＦＵＣＡ２、ＭＦＳＤ１０、ＴＢＣＤ、ＣＡＰＮ２、ＩＱＧＡＰ１、ＣＨＳＴ１１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＭＹＯ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＤＬＧ３、ＭＸＤ４、ＲＡＬＧＤＳ、Ｓ１ＰＲ５、ＷＳＢ２、ＣＣＲ３、ＴＩＰＡＲＰ、ＳＰ１４０、ＣＤ１５１、ＳＯＸ１３、ＫＲＴＡＰ５−２、ＮＦ１、ＰＥＡ１５、ＰＡＲＰ８、ＲＮＦ１６６、ＵＥＶＬＤ、ＬＩＭＫ１、ＣＡＣＮＢ１、ＴＭＸ４、ＳＬＣ６Ａ６、ＬＢＡ１、ＳＶ２Ａ、ＬＬＧＬ２、ＩＲＦ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＣＤ９９、ＲＡＰＧＥＦ１、ＰＰＰ４Ｒ１、ＯＳＢＰＬ７、ＦＯＸＰ４、ＳＬＡ２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＳＴ７、ＪＡＺＦ１、ＧＧＡ２、ＰＩ４Ｋ２Ａ、ＣＤ６８、ＬＰＧＡＴ１、ＳＴＸ１１、ＺＡＫ、ＦＡＭ１６０Ｂ１、ＲＯＲＡ、Ｃ８ｏｒｆ８０、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＴＧＦＢＩ、ＤＮＡＪＣ１、ＧＰＲ１１４、ＬＲＰ８、ＣＤ６９、ＣＭＩＰ、ＮＡＴ１３、ＴＧＦＢ１、ＦＬＪ０００４９、ＡＮＴＸＲ２、ＮＲ４Ａ３、ＩＬ１２ＲＢ１、ＮＴＮＧ２、ＲＤＸ、ＭＬＬＴ４、ＧＰＲＩＮ３、ＡＤＣＹ９、ＣＤ３００Ａ、ＳＣＤ５、ＡＢＩ３、ＰＴＰＮ２２、ＬＧＡＬＳ１、ＳＹＴＬ３、ＢＭＰＲ１Ａ、ＴＢＫ１、ＰＭＡＩＰ１、ＲＡＳＧＥＦ１Ａ、ＧＣＮＴ１、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＳＴＯＭ、ＣＡＬＨＭ２、ＡＢＣＡ２、ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ、ＳＹＮＥ２、ＰＡＭ、Ｃ１２ｏｒｆ７５、ＣＬＣＦ１、ＭＸＲＡ７、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＣＬＳＴＮ３、ＡＣＯＴ９、ＨＩＰ１、ＬＡＧ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＤＣＢＬＤ１、ＫＬＦ６、ＣＡＣＮＢ３、ＲＮＦ１９Ａ、ＲＡＢ２７Ａ、ＦＡＤＳ３、���ＬＧ５、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＡＣＴＮ４、ＴＢＫＢＰ１、ＡＴＸＮ１、ＡＲＡＰ２、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＦＡＭ５３Ｂ、ＭＡＮ１Ａ１、ＦＡＭ３８Ａ、ＰＬＸＮＣ１、ＧＲＬＦ１、ＳＲＧＮ、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、Ｂ４ＧＡＬＴ５、ＷＩＰＩ１、ＰＴＰＲＪ、ＳＬＦＮ１１、ＤＵＳＰ２、ＡＮＸＡ５、ＡＨＮＡＫ、ＮＥＯ１、ＣＬＩＣ１、ＥＩＦ２Ｃ４、ＭＡＰ３Ｋ５、ＩＬ２ＲＢ、ＰＬＥＫＨＧ１、ＭＹＯ６、ＧＴＤＣ１、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＧＡＬＭ、ＴＡＲＰ、ＡＤＡＭ８、ＭＳＣ、ＨＮＲＰＬＬ、ＳＹＴ１１、ＡＴＰ２Ｂ４、ＮＨＳＬ２、ＭＡＴＫ、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＳＬＦＮ１２Ｌ、ＳＰＡＴＳ２Ｌ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＰＩＫ３Ｒ３、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＭＢＯＡＴ１、ＧＹＧ１、ＫＡＴＮＡＬ１、ＦＡＭ４６Ｃ、ＺＣ３ＨＡＶ１Ｌ、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＣＴＮＮＡ１、ＮＰＣ１、Ｃ３ＡＲ１、ＣＲＩＭ１、ＳＨ２Ｄ２Ａ、ＥＲＮ１、ＹＰＥＬ１、ＴＢＸ２１、ＳＬＣ１Ａ４、ＦＡＳＬＧ、ＰＨＡＣＴＲ２、ＧＡＬＮＴ３、ＡＤＲＢ２、ＰＩＫ３ＡＰ１、ＴＬＲ３、ＰＬＥＫＨＡ５、ＤＵＳＰ１０、ＧＮＡＯ１、ＰＴＧＤＲ、ＦＲＭＤ４Ｂ、ＡＮＸＡ２、ＥＯＭＥＳ、ＣＡＤＭ１、ＭＡＦ、ＴＰＲＧ１、ＮＢＥＡＬ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＰＥＬＯ、ＳＬＣ４Ａ４、ＫＬＲＦ１、ＦＯＳＬ２、ＲＧＳ２、ＴＧＦＢＲ３、ＰＲＦ１、ＭＹＯ１Ｆ、ＧＡＢ３、Ｃ１７ｏｒｆ６６、ＭＩＣＡＬ２、ＣＹＴＨ３、ＴＯＸ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＳＹＮＥ１、ＷＥＥ１、ＰＹＨＩＮ１、Ｆ２Ｒ、ＰＬＤ１、ＴＨＢＳ１、ＣＤ５８、ＦＡＳ、ＮＥＴＯ２、ＣＸＣＲ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ２、ＤＵＳＰ４、ＡＵＴＳ２、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＫＬＲＧ１、ＴＮＩＰ３、ＧＺＭＡ、ＰＲＲ５Ｌ、ＰＲＤＭ１、ＳＴ８ＳＩＡ６、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＰＲＭ、ＧＦＰＴ２、ＭＹＢＬ１、ＳＬＡＭＦ７、ＦＬＪ１６６８６、ＧＮＬＹ、ＺＥＢ２、ＣＳＴ７、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＣＣＬ５、ＫＬＲＤ１及びＫＬＲＢ１を含む。
【０７３４】
遺伝子セット「Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＮ」は、以下の遺伝子：ＭＹＯ５Ａ、ＭＸＤ４、ＳＴＫ３、Ｓ１ＰＲ５、ＧＬＣＣＩ１、ＣＣＲ３、ＳＯＸ１３、ＫＲＴＡＰ５−２、ＰＥＡ１５、ＰＡＲＰ８、ＲＮＦ１６６、ＵＥＶＬＤ、ＬＩＭＫ１、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＶ２Ａ、ＫＰＮＡ２、ＯＳＢＰＬ７、ＳＴ７、ＧＧＡ２、ＰＩ４Ｋ２Ａ、ＣＤ６８、ＺＡＫ、ＲＯＲＡ、ＴＧＦＢＩ、ＤＮＡＪＣ１、ＪＯＳＤ１、ＺＦＹＶＥ２８、ＬＲＰ８、ＯＳＢＰＬ３、ＣＭＩＰ、ＮＡＴ１３、ＴＧＦＢ１、ＡＮＴＸＲ２、ＮＲ４Ａ３、ＲＤＸ、ＡＤＣＹ９、ＣＨＮ１、ＣＤ３００Ａ、ＳＣＤ５、ＰＴＰＮ２２、ＬＧＡＬＳ１、ＲＡＳＧＥＦ１Ａ、ＧＣＮＴ１、ＧＬＵＬ、ＡＢＣＡ２、ＣＬＤＮＤ１、ＰＡＭ、ＣＬＣＦ１、ＭＸＲＡ７、ＣＬＳＴＮ３、ＡＣＯＴ９、ＭＥＴＲＮＬ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＬＲＩＧ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＣＡＣＮＢ３、ＲＮＦ１９Ａ、ＲＡＢ２７Ａ、ＦＡＤＳ３、ＡＣＴＮ４、ＴＢＫＢＰ１、ＦＡＭ５３Ｂ、ＭＡＮ１Ａ１、ＦＡＭ３８Ａ、ＧＲＬＦ１、Ｂ４ＧＡＬＴ５、ＷＩＰＩ１、ＤＵＳＰ２、ＡＮＸＡ５、ＡＨＮＡＫ、ＣＬＩＣ１、ＭＡＰ３Ｋ５、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＴＡＲＰ、ＡＤＡＭ８、ＭＡＴＫ、ＳＬＦＮ１２Ｌ、ＰＩＫ３Ｒ３、ＦＡＭ４６Ｃ、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＣＴＮＮＡ１、ＮＰＣ１、ＳＨ２Ｄ２Ａ、ＥＲＮ１、ＹＰＥＬ１、ＴＢＸ２１、ＳＴＯＭ、ＰＨＡＣＴＲ２、ＧＢＰ５、ＡＤＲＢ２、ＰＩＫ３ＡＰ１、ＤＵＳＰ１０、ＰＴＧＤＲ、ＥＯＭＥＳ、ＭＡＦ、ＴＰＲＧ１、ＮＢＥＡＬ２、ＮＣＡＰＨ、ＳＬＣ４Ａ４、ＦＯＳＬ２、ＲＧＳ２、ＴＧＦＢＲ３、ＭＹＯ１Ｆ、Ｃ１７ｏｒｆ６６、ＣＹＴＨ３、ＷＥＥ１、ＰＹＨＩＮ１、Ｆ２Ｒ、ＴＨＢＳ１、ＣＤ５８、ＡＵＴＳ２、ＦＡＭ１２９Ａ、ＴＮＩＰ３、ＧＺＭＡ、ＰＲＲ５Ｌ、ＰＲＤＭ１、ＰＬＸＮＤ１、ＰＴＰＲＭ、ＧＦＰＴ２、ＭＹＢＬ１、ＳＬＡＭＦ７、ＺＥＢ２、ＣＳＴ７、ＣＣＬ５、ＧＺＭＫ及びＫＬＲＢ１を含む。
【０７３５】
また、類似のプロセス及び／又は特徴を記述する他の遺伝子セットを用いて、前述した細胞表現型を特性決定することもできる。
【０７３６】
Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒ  ＶＤＪを使用して、単一細胞ＶＤＪ配列及び各単一細胞５‘ライブラリーのアノテーションを作成した。データ解析及び視覚化のために、Ｌｏｕｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒソフトウエア及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを用いた。
【０７３７】
結果
この実施例は、インプット細胞として使用される精製Ｔ細胞、ＡＲＭプロセスを用いて製造されるＣＡＲＴ細胞（「第１日」細胞と標識される）及びＴＭプロセスを用いて製造されるＣＡＲＴ細胞（「第９日」細胞と標識される）間のＴ細胞状態を単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）により比較することを目標とする。加えて、単一細胞ＴＣＲ−ｓｅｑ（ｓｃＴＣＲ−ｓｅｑ）を実施して、クローン性を調べ、インプットから製造後材料への細胞分化を追跡する。
【０７３８】
図３７Ａ〜３７Ｃに示すように、インプット細胞は、最も少ない発現遺伝子及びＵＭＩを有したが、これは、これらの細胞が、転写的に活性ではなく、休止状態であることを示唆している。第１日及び第９日細胞は、より多くの遺伝子を発現し、第９日細胞が転写的に最も活性であった。同様の結果を図３８Ａ〜３８Ｄに示す。インプット細胞は、増殖遺伝子を発現していない（図３８Ａ及び３８Ｄ）。
【０７３９】
追加の遺伝子セット解析を図３９Ａ〜３９Ｅに示す。メディアン遺伝子セットスコア中央値を用いて、様々な細胞集団を比較した。第１日細胞及びインプット細胞は、より若く、よりステム様メモリー状態であった（図３９Ａ〜３９Ｃ）。図３９Ａでは、第１日細胞、第９日細胞及びインプット細胞のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）中央値は、それぞれ−０．０８４、０．０３５及び−０．１である。図３９Ｂでは、第１日細胞、第９日細胞及びインプット細胞のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ＴＥＭ  ｖｓ．Ｄｏｗｎ  ＴＳＣＭ）中央値は、それぞれ−０．０８２、０．０８７及び−０．０７１である。図３９Ｃでは、第１日細胞、第９日細胞及びインプット細胞のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｄｏｗｎ  Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）中央値は、それぞれ−０．０６２、０．１４及び−０．０８１である。
【０７４０】
加えて、第１日細胞は、第９日細胞と比較して、より理想的代謝状態にあった（図３９Ｄ及び３９Ｅ）。図３９Ｄでは、第１日細胞、第９日細胞及びインプット細胞のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ｈｙｐｏｘｉａ）中央値は、それぞれ０．０１９、０．１１及び−０．０９６である。図３９Ｅでは、第１日細胞、第９日細胞及びインプット細胞のＧｅｎｅＳｅｔＳｃｏｒｅ（Ｕｐ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ）中央値は、それぞれ０．０６６、０．１１及び−０．０９である。
【０７４１】
遺伝子発現に基づいて、インプット細胞は、４つのクラスターを含有する。クラスター０は、ＬＭＮＡ、Ｓ１００Ａ４などの高度発現を特徴とする。クラスター１は、ＲＰ９１３、ＰＲＫＣＱ−ＡＳ１などの高度発現を特徴とする。クラスター２は、ＰＲ１１−２９１Ｂ２１．２、ＣＤ８Ｂなどの高度発現を特徴とする。クラスター３は、ＮＫＧ７、ＧＺＭＨ、ＣＣＬ５、ＣＳＴ７、ＧＮＬＹ、ＦＧＦＢＰ２、ＧＺＭＡ、ＣＣＬ４、ＣＴＳＷ、ＣＤ８Ａなどの高度発現を特徴とする。インプット細胞のＴ分布型確率的近傍埋め込み法（Ｔ−Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）（ＴＳＮＥ）プロットにおいて、クラスター３は他の細胞から突出しており、クラスター１及び２は、識別するのが難しい。
【０７４２】
図４０Ａ〜４０Ｃに示す遺伝子セット解析によれば、クラスター０及びクラスター３は、Ｔエフェクター表現型が濃縮されたクラスター１及びクラスター２と比較して、Ｔ調節表現型が濃縮されていた。クラスター３は、後期メモリー／エフェクターメモリー（ＴＥＭ）細胞により占められ、クラスター１及びクラスター２は、早期メモリー及びナイーブ細胞であり、クラスター０は、中間にある。インプット細胞の大部分は、早期メモリー、ナイーブ状態にあった。理論に縛られることを意図しないが、これらの細胞が、製造工程中、最良に機能し得る。
【０７４３】
第１日細胞及び第９日細胞に、より低い転写不均一性が認められた（データは示していない）。
【０７４４】
インプット集団と同様に、第１日細胞は、インプット細胞のクラスター３にみられるものと類似して、ＴＳＮＥプロットにおいて早期メモリー細胞の大きいクラスターと、後期メモリー細胞のより小さいクラスターを示した。対照的に、第９日細胞は、ＴＳＮＥプロットに早期メモリー細胞の明確なクラスターは示さなかった。これは、第９日までに、細胞がより均質になったことを意味する。
【０７４５】
ＴＣＲを配列決定し、クロノタイプ多様性を測定した。全体として、３つのクロノタイププロフィールは、非常に平坦であった（ほとんどのクローンは、１回のみ選び出された）（図４１Ａ〜４１Ｃ及び表２４）。表２４のシャノンエントロピーは、分布の平坦性を測定する。インプット細胞中の優勢なクローンは、後期メモリー細胞であった。第１日細胞は、インプット細胞と類似しているようにみえたが、均一になり始めた。９日までに、優勢なクローンは実質的に均一になり、分布がはるかに平坦になった。多様性測定は、インプット細胞又は第１日細胞よりも第９日にはるかに均一且つ平坦な分布が存在したため、第９日で最も高かった。
【０７４６】
【表５２】
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【０７４７】
まとめ
第１日及び第９日産物間に有意なＴ細胞状態の差があった。第１日細胞は、インプット細胞とはるかによく類似し、幹細胞性シグネチャーが豊富であったが、これは、より有効な産物を示す。
【０７４８】
実施例１１：再発性及び／又は難治性多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する成人患者におけるＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）指向性ＣＡＲ−Ｔ細胞の第Ｉ相、オープンラベル試験。
この試験では、利用可能であれば、ＩＭｉＤ（例えば、レナリドミド若しくはポマリドミド）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ）及び承認された抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブ）を含め、少なくとも２種の過去の治療レジメンに対して再発性及び／又は難治性であり、且つ疾患進行のエビデンス（ＩＭＷＧ基準）が記録されている成人ＭＭ対象における抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の安全性及び耐容性を評価する。
【０７４９】
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ＰＩ６１抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通領域、４−１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。この試験では、活性化高速製造（ＡＲＭ）プロセスを用いて、抗ＢＣＭＡ  
ＣＡＲ−Ｔ細胞産物を製造する。こうした細胞は、「ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ」と呼ばれる。具体的に、Ｔ細胞表面上のＣＤ４及びＣＤ８共受容体を捕獲する市販の磁気ビーズを用いて、被験者の白血球アフェレーシス単位からＴ細胞を濃縮する。次に、濃縮したＴ細胞を、ヒトＣＤ３及びＣＤ８に対するヒト化組換えアゴニスト抗体に共有結合したコロイドポリマーナノマトリックスで刺激する。接種、活性化及び形質導入から２４時間後、ＣＡＲ−Ｔ細胞を採取し、洗浄して、残留する非組込みベクター及び非結合活性化マトリックスを除去する。洗浄後、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞療法薬を濃縮及び凍結保存する。投与用の産物の放出前に放出試験手順の結果が必要となる。
【０７５０】
レンチウイルスベクターによる形質導入後７〜８日持続するエクスビボＴ細胞増殖に依存するＣＡＲ−Ｔ細胞のＴＭプロセスと比較して、ＡＲＭプロセスは、エクスビボＴ細胞増殖を含まない。対照的に、ＡＲＭで生産されたＴ細胞は、遺伝子移入から２４時間後に採取されるため、それらを患者内でインビボ増殖させることができる。ＡＲＭプロセスで達成される優れたインビボＴ細胞増殖は、低分化Ｔ細胞表現型をもたらし、最終細胞産物中により大きい画分のメモリーステムＴ細胞を保存することが予測される。低分化のメモリーＣＡＲ−Ｔ細胞の存在は、臨床試験で改善された抗腫瘍効果に関連している（Ｆｒａｉｅｔｔａ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２４（５）；５６３−７１）。理論に縛られることを意図しないが、より大きい画分のメモリーＴ細胞を含むＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞は、患者内でＣＡＲ−Ｔ細胞増殖の増大をもたらし、これによりエフェクターＴ細胞枯渇を克服して、伝統的な製造プロセスにより生産されたＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞と比較して、ＭＭ患者により持続的な有効性を達成する。
【０７５１】
ＡＲＭプロセスは、伝統的製造（ＴＭ）プロセスを用いて製造されるＣＡＲＴ細胞と比較して、産物全体及びＣＡＲ−陽性画分の両方において、有意に高い割合のナイーブ様メモリーＴ細胞（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＯ−）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞を生産する。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ細胞は、用量応答性様式で、前臨床ＭＭモデルにおける腫瘍根絶を証明している。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ＴＭプロセスによって産生されたＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、少なくとも５倍強力であり、より高レベルの全身性サイトカインと共に、インビボで持続的なＣＡＲ−Ｔ細胞増殖をもたらす。総合すると、これらの結果は、ＡＲＭプロセスを用いて製造される抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞産物が、顕著なメモリー幹細胞表現型を有するＴ細胞を含み、その結果、増強された生着、増殖及び抗ＭＭ特性を備えたＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞産物が達成されるという仮定を支持する。
【０７５２】
この第Ｉ相試験では、まず、スクリーニング中に各対象を臨床適格性について評価する。本試験への参加に適格である対象は、以下の基準を満たさなければならない：（１）ＩＣＦ署名時の年齢≧１８歳；（２）スクリーニング時のＥＣＯＧパフォーマンスステータスが０又は１いずれかである；（３）ＭＭを有する対象であって、ＩＭｉＤ（例えば、レナリドミド若しくはポマリドミド）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ）及び承認済抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）（利用可能であれば）を含め、少なくとも２種の過去の治療レジメンに対して再発性及び／又は難治性であり、且つ疾患進行のエビデンス（ＩＭＷＧ基準）が記録されている者；（４）対象は、次の３つの測定値の少なくとも１つにより確定される測定可能な疾患を有していなければならない：血清Ｍ−タンパク質≧１．０ｇ／ｄＬ、尿Ｍ−タンパク質≧２００ｍｇ／２４時間又は血清遊離軽鎖（ｓＦＬＣ）＞１００ｍｇ／Ｌ関連ＦＬＣ；（５）全ての患者は、施設のガイドラインに従い連続的骨髄生検及び／又は吸引採取について適性であり、且つ本試験について記載の通り、反復手順を受ける意思がなければならない；（６）対象は、スクリーニング時に次の血液学的値を満たさなければならない：試験の７日以内に増殖因子支持なしで、絶対好中球数（ＡＮＣ）≧１，０００／ｍｍ３（≧１×１０９／Ｌ）、７日以内の輸血サポートなしのＣＤ３＋Ｔ細胞の絶対数＞１５０／ｍｍ３（＞０．１５×１０９／Ｌ）、血小板≧５０，０００／ｍｍ３（≧５０×１０９／Ｌ）及びヘモグロビン≧８．０ｇ／ｄｌ（≧４．９ｍｍｏｌ／Ｌ）；（７）患者は、臨床責任医師により、フルダラビン／シクロホスファミドＬＤレジメンを受けるのに適性であるとみなされなければならない；及び（８）製造が承認される非動員細胞の白血球アフェレーシス材料を有していなければならない。適合性であれば、対象は、白血球アフェレーシス産物を採取され、ＣＡＲ−Ｔ製造に付される。対象は、それらの白血球アフェレーシス産物の製造開始の承認と共に登録される。
【０７５３】
対象は、最終産物が利用可能であることが確認されて初めて、リンパ球枯渇（ＬＤ）化学療法を受ける。ＬＤ化学療法の後、解凍から９０分以内に、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞産物を静脈内（ｉ．ｖ．）注射により患者に投与する（図４２）。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの出発用量は、１×１０７生存ＣＡＲ陽性Ｔ細胞である。また、５×１０７生存ＣＡＲ陽性Ｔ細胞も試験する。各対象は各々、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞投与から最初の７２時間入院する。
【０７５４】
薬物動態分析のために、異なる時点で、連続的血液サンプルを採取して、フローサイトメトリー及びｑＰＣＲにより末梢血中の、またフローサイトメトリー及びｑＰＣＲにより骨髄中のＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ細胞動態を測定し、ＥＬＩＳＡにより末梢血中のｓＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬといった潜在的薬力学マーカーを測定する。特に、対象は、末梢血、骨髄又は他の関連組織中のＣＡＲトランスジーンの量；末梢血又は骨髄中のＣＡＲ陽性Ｔ細胞の表面発現；血清中の抗ｍＣＡＲ抗体；ＰＢＭＣ中のＩＦＮ−γ陽性ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージ；免疫細胞活性化のマーカー；可溶性免疫因子及びサイトカイン（例えば、ｓＢＣＭＡ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α）、ＣＡＲ−Ｔクローナリティ；並びに血清中の可溶性ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦについて分析される。
【０７５５】
実施例１２：活性化高速製造（ＡＲＭ）プロセスを用いるＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞の製造
ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞のＡＲＭプロセスは、表２５に概略を示すように、培地の調製から開始する。
【０７５６】
凍結保存した白血球アフェレーシス産物を出発材料として使用し、これをＴ細胞濃縮のために処理する。利用可能であれば、アフェレーシスペーパーワークを利用して、Ｔ細胞パーセンテージを決定する。アフェレーシスペーパーワークに基づくＴ細胞パーセンテージデータがない場合、到着した凍結保存白血球アフェレーシス産物にセンチネルバイアル試験を実施して、アフェレーシスのＴ細胞パーセンテージ目標を取得する。Ｔ細胞パーセンテージについての結果により、ＡＲＭプロセスの第０日にどの程度の個数のバッグを解凍するかを決定する。
【０７５７】
【表５３】
2021534783.tif 000070
【０７５８】
凍結保存白血球アフェレーシスを解凍、洗浄した後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ技術を用いて、Ｔ細胞選択及び濃縮を実施する。生存核細胞（ＶＮＣ）をＴｒａｎｓＡＣＴ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で活性化し、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。Ｍｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズで選択された生存細胞を、非加湿インキュベーションチャンバーであるＰｒｏｄｉｇｙ（登録商標）上のｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔ中に接種する。培養中、ＣＴＳ（商標）サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ＩＬ−２及び２％免疫細胞血清代替品をその成分として含むＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）基材の培地であるラピッドメディアに細胞を懸濁させて、Ｔ細胞活性化及び形質導入を促進する。レンチウイルス形質導入は、ＴｒａｎｓＡＣＴを培地中の希釈された細胞に添加した後、接種の日に１回実施する。レンチウイルスベクターは、接種日の使用直前に、室温で最大３０分かけて解凍する。
【０７５９】
第０日のプロセス開始から、培養物洗浄及び採取の開始まで、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞を接種から２０〜２８時間培養する。培養後、細胞懸濁液をｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔチャンバー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で２回の培地洗浄及び１回の採取物洗浄に付す。
【０７６０】
第１日のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）での採取物洗浄後、細胞懸濁液をサンプリングして、生存細胞数及び生存率を決定する。次に、細胞懸濁液を遠心分離機に移し、手動でペレット化する。上清を除去し、細胞ペレットをＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に再懸濁させることにより、約１０．０％の最終ＤＭＳＯ濃度を有する産物製剤が得られる。生存細胞数は、用量設定のために採取後に公式化する。次に、用量を個別のクライオバッグに分配し、クライオバイアル中での分析サンプリングを行う。
【０７６１】
凍結保存産物は、安全な進入制限エリア内のモニター付きＬＮ２保存タンク内に最終出荷及び発送まで保存する。
【０７６２】
実施例１３：活性化高速製造（ＡＲＭ）プロセスを用いて製造されたＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞の特性決定
まとめ
この実施例では、ＡＲＭプロセスを用いて製造されるＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞の特性決定を説明する。ＡＲＭプロセスは、伝統的製造（ＴＭ）産物と比較して、有意に高い割合のナイーブ様メモリーＴ細胞（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＯ−）から構成されるＣＡＲ−Ｔ細胞を生産する。多発性骨髄腫（ＭＭ）の前臨床モデルにおいて、ＡＲＭプロセスを用いて製造されたＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞は、用量依存的に腫瘍退縮を誘導し、これは、ＴＭプロセスを用いて製造されるＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞と比較して、腫瘍殺傷が最大５倍有効であった。さらに、ＡＲＭ製造細胞は、ＴＭ製造細胞と比較して、インビボで長期のＣＡＲＴ増殖（最大３倍高いＣｍａｘ及びＡＵＣ０−２１ｄ）を示し、より高い全身性サイトカイン（ＩＦＮ−γ、約３．５倍）を誘導した。総合すると、これらの結果は、ＡＲＭプロセスを用いて製造されるＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞が、顕著なメモリー幹細胞表現型及びインビボで増大した増殖能力を備えたＴ細胞を有するという仮定を支持するものである。
【０７６３】
ＡＲＭプロセスを用いて、ＣＡＲは、ウイルス添加後９６ｈ（また、産物の解凍後７２ｈとも称される）で、安定して発現させることができた。従って、ウイルス添加後９６ｈ又は解凍後７２ｈは、インビトロ及びインビボ活性のためのＣＡＲ発現の代替時点と考えられる。ＡＲＭプロセスを用いて製造されたＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞は、ＴＭプロセスで製造されたＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞と比較して、低分化細胞集団を保存し、インビトロでより高い標的特異的サイトカイン産生を示す。
【０７６４】
ＡＲＭプロセスを用いて製造されたＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞は、市販のヒト血漿膜タンパク質アレイを用いてＢＣＭＡに対する高い特異性を示した。このアッセイでは、ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）との結合は検出されたが、他の強度、中度若しくは弱い結合は検出されなかった。スクリーンは、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ産物に発現される抗ヒトＢＣＭＡ単鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（ＰＩ６１）の交差反応タンパク質の存在を高い信頼性で見出さなかった。標的分布試験を実施して、潜在的なオフ腫瘍オンターゲット（ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ  ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）毒性を決定した。免疫組織化学（ＩＨＣ）、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを使用して、正常ヒト組織中のＢＣＭＡの分布を調べた。これらの分析から、二次リンパ器官、骨髄及び粘膜関連リンパ組織などの正常形質細胞（ＰＣ）を含有する部位に限定されたことが示された。中枢神経系（ＣＮＳ）神経毒性は、他の細胞療法に関して懸念事項であったため、脳での発現を調べた。ＢＣＭＡに特異的であることが証明された市販の抗体を用いる免疫組織化学によっても、またＢＣＭＡターゲティングｓｃＦｖを含有するヒト−ウサギキメラツール抗体を用いた結合アッセイによっても、ＣＮＳ中に染色は、観察されなかった。これらの知見は、インサイチュハイブリダイゼーション及びＰＣＲに基づくスプライス変異体解析によって測定されるように、上記の組織中にＢＣＭＡ  ｍＲＮＡが存在しないことにより確認された。正常ＰＣ及びＢＣＭＡ発現形質細胞容樹状細胞のＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ標的化は、それらの枯渇を起こすと考えられるが；他の細胞型の標的化は、予想されない。
【０７６５】
結果
以下に記載する試験では、ＡＲＭプロセスを用いて製造されたＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞（「ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ」と称される）を、ＴＭプロセスを用いて製造されたＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞（「ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ」又は「ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ＊」と称される）と比較した。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲに発現されたＣＡＲ及びＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ＊に発現されたＣＡＲは、ＰＩ６１  ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通領域、４−１ＢＢ共刺激ドメイン並びにＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む同じ配列を有する。ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲに発現されたＣＡＲは、ＢＣＭＡ１０  ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通領域、４−１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【０７６６】
インビトロでのＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現動態
８〜９日後にＣＡＲトランスジーンのレンチウイルス組込みを測定するＴＭとは対照的に、ＡＲＭプロセスでは、レンチウイルス偽形質導入が起こり得ることから、レンチウイルス添加後２４ｈ以内にレンチウイルストランスジーンが完全に組み込まれ、真に発現されてはいない可能性がある（Ｈａａｓ  ＤＬ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ；２（１）：７１−８０；Ｇａｌｌａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ；１６（２）：３０９−１５）。そのため、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）の存在又は非存在下において、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの長期培養により、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ発現パターンを経時的に評価して、ＣＡＲトランスジーンの安定した組込み及び発現に対して偽形質導入の可能性を評価した。流量サイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析を実施して、Ｔ細胞活性化及びレンチウイルスによる形質導入後２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ及び１６８ｈでのＣＡＲ表面発現を検出した。一部の事例では、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ及びこの産物のアリコートを、他のアッセイでのさらに別の特性決定のために、採取後直接凍結した。
【０７６７】
図４３に示すように、ＦＡＣＳ解析は、レンチウイルスベクターの添加後２４ｈで、ＢＣＭＡ−ＣＡＲが、実際に発現を明らかにしなかったことを示している。しかし、ＣＡＲ＋集団は、初め、４８ｈで出現した。ＣＡＲ＋集団は、ウイルス添加後４８ｈ〜１６８ｈの各時点でやや増加した。ＣＡＲは、９６ｈから安定して発現されるとみられた。これは、非形質導入（ＵＴＤ）及びＡＺＴ処理サンプルとは対照的であり、これらは、４８ｈからのいずれの時点でもＣＡＲ＋集団を示さなかった（図４３）。ＡＺＴは、３０μＭ及び１００μＭ用量の双方でＣＡＲ＋集団を有効に阻害することができ、これは、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現が宿主細胞ゲノムへのウイルス遺伝子組込みによるものであり、レンチウイルス偽形質導入に起因するものではないようであることを示唆している。
【０７６８】
ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、Ｔ細胞幹細胞性を保存する
ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ及びＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲをＦＡＣＳにより解析して、解凍時のＣＡＲ発現並びに解凍後４８ｈのＴ細胞表現型を評価した（図４４Ａ及び４４Ｂ）。ＢＣＭＡ−ＣＡＲは、二人のドナーにみられる解凍時にほとんど検出不能であった（図４４Ａ）が、これは、図４３に示されるＣＡＲ発現動態試験の観察と一致する。しかし、解凍後４８ｈで、ＢＣＭＡ−ＣＡＲ発現は、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲについて３２．９％であった。対照的に、ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、７％のＢＣＭＡ−ＣＡＲ発現を明らかにした（図４４Ｂ）。ＣＡＲ＋Ｔ細胞表現型の解析から、ＡＲＭプロセスは、ナイーブ様Ｔ細胞（６０％ＣＤ４５ＲＯ−／ＣＣＲ７＋）を保持することが明らかにされ、ナイーブ様Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞集団（ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７−）の２６倍であることが判明した。ＴＭプロセスは、主として、ＣＡＲ＋Ｔ細胞内にセントラルメモリーＴ細胞（８１％ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７＋）もたらした。ＴＭプロセスでは、ナイーブ様Ｔ細胞集団は、ほとんど存在しなかった。このナイーブＴ細胞集団は、ＣＤ４５ＲＯ−／ＣＣＲ７＋Ｔｓｔｅｍ細胞（Ｃｏｈｅｎ  ＡＤ，ｅｔ  ａｌ（２０１９）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ；１２９（６）：２２１０−２１；及びＦｒａｉｅｔｔａ，ｅｔ  ａｌ（２０１８）．Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２４（５）；５６３−５７１により記載）と大きく重なり、増大したＣＡＲ−Ｔ発現及び臨床応答と関連する。
【０７６９】
その表現型に加えて、最終的ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ細胞産物をインビトロでのその活性化についても評価した。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ及びＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲを解凍し、ＢＣＭＡ発現細胞株ＫＭＳ−１１と一緒に共培養した。解凍後のＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ細胞は、共培養を確立する前に２４ｈ休ませた。共培養から２４時間後の上清中のサイトカインレベルを比較すると、図４５Ａ及び４５Ｂに示す通り、ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲと比較して、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲにより分泌されるＩＬ−２の５倍の増加及びＩＦＮ−γの２倍のレベル増加が明らかにされた。ＡＲＭ又はＴＭプロセスを経たＵＴＤ細胞による実験で、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ及びＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲによるＢＣＭＡ特異的認識が確認された。しかし、ＢＣＭＡ特異的刺激（図４５Ｂ）の非存在下でのＡＲＭ−ＵＴＤによるＩＦＮ−γ分泌のバッググランドが高いのは、ＡＲＭ産物の活性化された性質に起因する可能性がある。
【０７７０】
要約すると、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞を作製するために用いられるＡＲＭプロセスは、ＴＭプロセスのそれよりも高いＣＡＲ発現を伴うＴ細胞をもたらす。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、インビトロでＢＣＭＡ特異的活性化を示し、ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲと比較して、高いレベルのＩＬ−２を分泌するが、これは、そのＴｓｔｅｍ表現型と相関する。
【０７７１】
異種移植モデルにおけるＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ及びＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの有効性
インビボでの薬理学試験をＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの開発の指針として使用した。図４６に記載する実験では、ＧＭＰ材料を用いてＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲを作製した。並行して、ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、同じバッチのＴ細胞を用いるが、ＴＭにより作製した。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲを用いる用量計算には、産物の解凍後７２ｈのＣＡＲ＋（％）の測定を用いて、用量を計算し；ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの場合、第９日ＴＭ産物のＣＡＲ＋（％）の測定を用いて、用量を計算した。異なるプロセスを用いて製造されたＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を、ＭＭ細胞株ＫＭＳ−１１−Ｌｕｃを接種した免疫欠損型ＮＳＧマウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒｇ−ヌル）で評価した。この腫瘍細胞株は、骨髄に生着する。ＭＭ接種から８日後、マウスのコホートは、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の単回注入を受けた。対応用量群の総ＣＡＲ＋Ｔ細胞に対して用量を正規化した。ＵＴＤ  Ｔ細胞を同様に調製し、これは、腫瘍に対する同種免疫反応について照合するための独立した群として提供された。ＵＴＤ用量は、ＴＭ及びＡＲＭの両方について達成することができたそれぞれのプロセスの最も高い総Ｔ細胞用量を表すものであった。
【０７７２】
【表５４】
2021534783.tif 000071
【０７７３】
図４７は、全ての群の腫瘍退縮曲線である。両ＢＣＭＡ  ＣＡＲ＋Ｔ産物（ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ及びＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ）共に、試験した用量レベルで、最も低い用量群でも、腫瘍を排除することができた。腫瘍退縮は、用量依存的に誘導された。腫瘍殺傷効果の開始は、高い用量群に比べて低い用量群で約１週間遅れた。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの３〜５倍の用量で同様の退縮を誘導し、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲが、ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲに比べて３〜５倍強力であることを示している。
【０７７４】
さらに、この試験では、ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ＊の有効性も評価した。ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ＊及びＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、同じ抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現したが、これらは、異なるプロセス：それぞれＴＭプロセス及びＡＲＭプロセスを用いて製造された。これらの結果から、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲが、ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ＊より１〜５倍低い用量で類似の腫瘍退縮を誘導することが実証された。
【０７７５】
マウス、全てＣＡＲ＋Ｔ療法後２、７、１４及び２１日に採血して、血漿ＩＦＮ−γを測定した（図４８Ａ〜４８Ｃ）。早期ピークは観察されず、全ての群が、２日時点で非常に低レベルの循環ＩＦＮ−γ（＜１０ｐｇ／ｍｌ）を示した。全ての群についてピークは、ＣＡＲ＋Ｔ用量後１４日以内に観察された。しかし、ＩＦＮ−γレベルは、ＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲと比較して、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの方が３．５倍高かった。ＡＲＭ−ＵＴＤ群は、試験終了の２日前及び７日前ＩＦＮ−γをほとんど又は全く産生していない。ＩＦＮ−γは、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  １ｅ４及びＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  ５ｅ４群と比較すると、これら２つの群ではＣＡＲ＋Ｔ細胞が依然として増殖し、腫瘍阻害が遅れるため、第２１日に、より高い用量群で下降した。
【０７７６】
インビトロＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ細胞動態
ＮＳＧマウスにおける有効性を評価するためのこの薬理学試験の一環として、注入後最大３週間まで末梢血ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖をＦＡＣＳにより解析した。ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＡＲ＋Ｔ細胞増殖のいずれも、全ＣＡＲ−Ｔ細胞処理群に観察された。Ｃｍａｘ及びＡＵＣ−２１ｄに関して、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ又はＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの明らかな用量依存性増殖はなかった。ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ又はＭＴＶ２７３の細胞増殖のピークは、２１日以内に達成されなかった。しかし、５ｅ５の用量群のＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲ及び０．５ｅ５の用量群のＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、第１４日に明らかなピーク増殖を達成した（図４９）。２１日でのＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲの発現とＴＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲのそれとを比較すると、ＡＲＭ−ＢＣＭＡ  ＣＡＲのＣｍａｘ及びＡＵＣ０−２１ｄはいずれも２〜３倍高かった。
【０７７７】
実施例１４：ＩＬ−１５又はｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ−１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ）を使用する活性化高速製造（ＡＲＭ）プロセスを用いたＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞の製造
ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞のＡＲＭプロセスは、表２５に概略を示すような培地の調製で開始する。
【０７７８】
凍結保存した白血球アフェレーシス産物を出発材料として使用し、これをＴ細胞濃縮のために処理する。利用可能であれば、アフェレーシスペーパーワークを利用して、Ｔ細胞パーセンテージを決定する。アフェレーシスペーパーワークに基づくＴ細胞パーセンテージデータがない場合、到着した凍結保存白血球アフェレーシス産物にセンチネルバイアル試験を実施して、アフェレーシスのＴ細胞パーセンテージ目標を取得する。Ｔ細胞パーセンテージについての結果により、ＡＲＭプロセスの第０日にどの程度の個数のバッグを解凍するかを決定する。
【０７７９】
凍結保存白血球アフェレーシスを解凍、洗浄した後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ技術を用いて、Ｔ細胞選択及び濃縮を実施する。生存核細胞（ＶＮＣ）をＴｒａｎｓＡＣＴ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で活性化し、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。Ｍｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズで選択された生存細胞を、非加湿インキュベーションチャンバーであるＰｒｏｄｉｇｙ（登録商標）上のｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔ中に接種する。培養中、ＣＴＳ（商標）サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ＩＬ−１５又はｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ−１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ）及び２％免疫細胞血清代替品をその成分として含むＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）基材の培地であるラピッドメディアに細胞を懸濁させて、Ｔ細胞活性化及び形質導入を促進する。レンチウイルス形質導入は、ＴｒａｎｓＡＣＴを培地中の希釈された細胞に添加した後、接種の日に１回実施する。レンチウイルスベクターは、接種日の使用直前に、室温で最大３０分かけて解凍する。
【０７８０】
第０日のプロセス開始から、培養物洗浄及び採取の開始まで、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞を接種から２０〜２８時間培養する。培養後、細胞懸濁液をｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔチャンバー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で２回の培養物洗浄及び１回の採取物洗浄に付す。
【０７８１】
第１日のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）での採取物洗浄後、細胞懸濁液をサンプリングして、生存細胞数及び生存率を決定する。次に、細胞懸濁液を遠心分離機に移し、手動でペレット化する。上清を除去し、細胞ペレットをＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に再懸濁させることにより、約１０．０％の最終ＤＭＳＯ濃度を有する産物製剤が得られる。生存細胞数は、用量設定のために採取後に公式化する。次に、用量を個別のクライオバッグに分配し、クライオバイアル中での分析サンプリングを行う。
【０７８２】
凍結保存産物は、安全な進入制限エリア内のモニター付きＬＮ２保存タンク中に最終出荷及び発送まで保存する。
【０７８３】
一部の実施形態では、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）基材の培地に使用したＩＬ−１５又はｈｅｔＩＬ−１５の代わりにＩＬ−６又はＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａを使用することができる。
【０７８４】
実施例１５：活性化高速製造（ＡＲＭ）プロセスを用いたＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の製造
ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞のＡＲＭプロセスは、表２５に概略を示すような培地の調製で開始する。
【０７８５】
凍結保存した白血球アフェレーシス産物を出発材料として使用し、これをＴ細胞濃縮のために処理する。利用可能であれば、アフェレーシスペーパーワークを利用して、Ｔ細胞パーセンテージを決定する。アフェレーシスペーパーワークに基づくＴ細胞パーセンテージデータがない場合、到着した凍結保存白血球アフェレーシス産物にセンチネルバイアル試験を実施して、アフェレーシスのＴ細胞パーセンテージ目標を取得する。Ｔ細胞パーセンテージについての結果により、ＡＲＭプロセスの第０日にどの程度の個数のバッグを解凍するかを決定する。
【０７８６】
凍結保存白血球アフェレーシスを解凍、洗浄した後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ技術を用いて、Ｔ細胞選択及び濃縮を実施する。生存核細胞（ＶＮＣ）をＴｒａｎｓＡＣＴ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で活性化し、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。Ｍｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズで選択された生存細胞を、非加湿インキュベーションチャンバーであるＰｒｏｄｉｇｙ（登録商標）上のｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔ中に接種する。培養中、ＣＴＳ（商標）サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ＩＬ−２及び２％免疫細胞血清代替品をその成分として含むＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）基材の培地であるラピッドメディアに細胞を懸濁させて、Ｔ細胞活性化及び形質導入を促進する。レンチウイルス形質導入は、ＴｒａｎｓＡＣＴを培地中の希釈された細胞に添加した後、接種の日に１回実施する。レンチウイルスベクターは、接種日の使用直前に、室温で最大３０分かけて解凍する。
【０７８７】
第０日のプロセス開始から、培養物洗浄及び採取の開始まで、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を接種から２０〜２８時間培養する。培養後、細胞懸濁液をｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔチャンバー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で２回の培養物洗浄及び１回の採取物洗浄に付す。
【０７８８】
第１日のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）での採取物洗浄後、細胞懸濁液をサンプリングして、生存細胞数及び生存率を決定する。次に、細胞懸濁液を遠心分離機に移し、手動でペレット化する。上清を除去し、細胞ペレットをＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に再懸濁させることにより、約１０．０％の最終ＤＭＳＯ濃度を有する産物製剤が得られる。生存細胞数は、用量設定のために採取後に公式化する。次に、用量を個別のクライオバッグに分配し、クライオバイアルへの分析サンプリングを行う。
【０７８９】
凍結保存産物は、安全な進入制限エリア内のモニター付きＬＮ２保存タンク中に最終出荷及び発送まで保存する。
【０７９０】
一部の実施形態では、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）基材の培地に使用したＬ−２の代わりに、ＩＬ−１５、ｈｅｔＩＬ−１５（ＩＬ−１５／ｓＩＬ−１５Ｒａ）、ＩＬ−６又はＩＬ−６／ｓＩＬ−１６Ｒａを使用することができる。
【０７９１】
均等物
本明細書に引用するそれぞれの及び全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して開示しているが、本発明のさらなる実施形態及び変形形態は、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の当業者によって考案され得ることが明らかである。下記の特許請求の範囲は、全てのこのような実施形態及び均等な変形形態を含むと解釈されることを意図する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２４−５】
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【図２４−６】
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【図２４−７】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２８−４】
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【図２８−５】
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【図２８−６】
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【図２８−７】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図２９−４】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３０−４】
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【図３０−５】
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【図３０−６】
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【図３０−７】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３２−４】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３８−３】
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【図３８−４】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図３９−３】
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【図３９−４】
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【図３９−５】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４０−３】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４４−３】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４８−３】
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【図４９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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