(57)【要約】【課題】ｍｉＲＮＡの活性を変化させる薬剤を用いたＨＥＲ２依存性がんの処置の提供。【解決手段】本発明は、ＨＥＲ２依存性がんの処置で使用するための、マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）の活性を変化させる薬剤であって、上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ、ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ５４２−５ｐからなる群より選択される、薬剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ２依存性がんの処置で使用するための、マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）の活性を変化させる薬剤であって、上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ、ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ５４２−５ｐからなる群より選択される、薬剤。
【請求項２】
上記薬剤は、抗ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ模倣物である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
上記抗ｍｉＲＮＡは、抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ、抗ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ４５１ａ−５ｐ、抗ｍｉＲＮＡ５４２−５ｐ、抗ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、抗ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、及び抗ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐからなる群より選択される、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
上記抗ｍｉＲＮＡは、上記ｍｉＲＮＡを標的にするアンチセンス化合物である、請求項２又は３に記載の薬剤。
【請求項５】
上記アンチセンス化合物は、上記ｍｉＲＮＡの対応する配列に相補的な連続したヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
上記アンチセンス化合物は、上記ｍｉＲＮＡの全長に相補的な連続したヌクレオチド配列を含む、請求項４及び５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
上記アンチセンス化合物のヌクレオチドの少なくとも８０％はロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである、請求項４〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
上記ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドは、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ、又はＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐである、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
上記ｍｉＲＮＡ模倣物は、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ模倣物及びｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ模倣物からなる群より選択される、請求項２に記載の薬剤。
【請求項１０】
上記ＨＥＲ２依存性がんは、乳がん、子宮内膜がん、子宮がん、又は卵巣がん等の女性生殖器がん、膀胱がん、肛門がん、大腸がん、特に子宮体部漿液性腺がん（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）等の子宮漿液性がん、肺がん、特に非小細胞肺がん、肝臓がん、腎臓がん、胃食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓がん、及び胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の薬剤。
【請求項１１】
上記ＨＥＲ２依存性がんは、ＨＥＲ２＋乳がんである、請求項１〜１０のいずれかに記載の薬剤。
【請求項１２】
上記乳がんは、モエシン陰性である、請求項１０又は１１のいずれかに記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
乳がんは世界中で女性に最も一般的ながんであり、２０１２年にはおよそ１７０万件が新たに診断された（がん全体で二番目に多い）。これは新たながん件数全体の約１２％、女性におけるがん全体の２５％に当たる。乳がん件数の約半数及び死亡者数の６０％が経済的な発展途上国で発生すると推定されている。フランスでの罹患率はヨーロッパの中で最も激しく、一定の割合で増加している。
【０００２】
原発性ヒト乳がんの約２０％〜３０％がＨＥＲ２の脱制御された発現を原因としており、フランスの年間患者数約８０００人、世界の年間患者数４５００００人に当たる。ＨＥＲ２は、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ／ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ）ファミリーの１つとして周知である。処置を受けた患者のうち、実際の治療法に反応を示すのは２５％のみである。実際の戦略が狙う標的がＨＥＲ２の細胞外領域であるもの（ハーセプチン／トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社（米国）が近年開発したトラスツズマブエムタンシン等の抗ＨＥＲ２抗体療法）や、受容体のキナーゼ活性であるもの（ラパチニブ／タイケルブ（ＧＳＫ社、米国）等の小分子チロシンキナーゼ阻害薬）は、作用が限定的であることが判明している。
【０００３】
特に、これらの分子は、ＨＥＲ２の変異型又は切断型に対して強い作用を持たない。トラスツズマブについては、処置を受けた患者のうち６６％〜８８％は処置に全く反応せず（すなわち「一次抵抗性」を呈する）、この薬剤に反応する処置患者のうち１／３では、平均して１年未満で疾患の進行（すなわち「獲得抵抗性」が発生する）が広く見られる。主としてｐ９５ＨＥＲ−２の発現に起因する治療抵抗性の発生によって有効性は限定的となるが、これは、この高活性ＨＥＲ２切断型がトラスツズマブの認識部位を持たないからである。
【０００４】
小分子チロシンキナーゼ阻害薬（ラパチニブ）を用いた処置では、該薬剤が特異性が低い（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ＥｒｂＢ及び非ＥｒｂＢキナーゼを非特異的に阻害することで毒性が増すことが多く、安全に使用できる範囲が限定される。ラパチニブに対する反応期間の中央値は１年未満であり、トラスツズマブによる前処置を受けた患者の大半（約８０％）が反応を示さなかった。
【０００５】
したがって、ＨＥＲ２＋乳がん等のＨＥＲ２依存性がんを処置する新規な方法の開発が求められている。特に、毒性リスクの低いＨＥＲ２依存性がん処置の代替アプローチの開発が急務である。
【０００６】
本出願人は、ＨＥＲ２依存性がん処置の新しいアプローチとなる新たな標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）を明らかにした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本明細書において本発明者らは、ＨＥＲ２依存性がんを処置するために特異的なｍｉＲＮＡの活性を変化させることを提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＨＥＲ２の発現及び／又は活性化を制御するｍｉＲＮＡを明らかにした。具体的には、特定のｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ、ｍｉＲ２９ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ２００ｂ−３ｐ）は、ＨＥＲ２の活性化を低下させることができる。したがって、これらのｍｉＲＮＡは、ＨＥＲ２＋乳がん等のＨＥＲ２依存性がんにおけるＨＥＲ２の異常活性化を低下させる新しい治療アプローチとなる。このような化合物は、トラスツズマブ及びラパチニブ等の公知の治療法とは異なる機序でＨＥＲ２の活性化を阻害するため、トラスツズマブ耐性細胞株の活性化を効率的にブロックするのに用いることができる。
【０００９】
本発明は、ＨＥＲ２依存性がんの処置で使用するための、マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）の活性を変化させる薬剤であって、上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ、ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ５４２−５ｐからなる群より選択される、薬剤に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（定義）
本明細書中、「ＨＥＲ２」は、ヒト上皮成長因子受容体ファミリーを構成するタンパク質の１つである「ヒト上皮成長因子受容体２」を意味する。また、「ＨＥＲ２」は「ＥｒｂＢ２」と呼ばれることも多い。本発明において「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」は互換的に使用される。
【００１１】
本明細書中、「ＨＥＲ２依存性がん」、「ＨＥＲ２陽性がん」、又は「ＨＥＲ２＋がん」は、ＨＥＲ２活性化の悪化を伴うがんを意味する。特に、「ＨＥＲ２依存性がん」は、「ＨＥＲ２非依存性がん」、「ＨＥＲ２陰性がん」、又は「ＨＥＲ２−がん」とは対照的に、ＨＥＲ２遺伝子の脱制御を示すがん細胞が確認されたがん症例を意味する。より具体的には、上記脱制御は、ＨＥＲ２遺伝子の増幅に相当し得る。このような増幅は遺伝子レベル又はタンパク質レベルで検出できる。例えば、アメリカ臨床腫瘍学会／アメリカ病理学会（ＡＳＣＯ／ＣＡＰ）が乳がん向けに発行したガイドラインでは、乳がんのＥｒｂＢ２状態を決定するためのいくつかのカットオフ値が設定されている。これらのガイドラインでは、原発部位について、また可能であれば転移部位について、以下であれば、がんが「ＨＥＲ２依存性」であると考えるべきと規定されている。
・免疫化学的検査（ＩＨＣ）において、浸潤がん細胞の３０％超で均一且つ強い膜染色が見られる。あるいは、
・（ｉ）測定されるＣＥＰ１７（１７番染色体のセントロメア）に対するＨＥＲ２のＦＩＳＨ増幅比が２以上（デュアルプローブ試験）、若しくは（ｉｉ）ＣＥＰ１７（１７番染色体のセントロメア）に対するＨＥＲ２のＦＩＳＨ増幅比が２未満（デュアルプローブ試験）、且つ核１つあたりの平均ＨＥＲ２コピー数が少なくとも６（シングルプローブ試験）、又は（ｉｉｉ）細胞あたりのＨＥＲ２コピー数ではシングルプローブ平均が少なくとも６シグナル。
【００１２】
さらに、原発部位について、また可能であれば転移部位について、以下である場合、がんが「ＨＥＲ２非依存性」であると考えられる。
・ＩＨＣにおいて、細胞の１０％未満で染色が見られないか、又は弱く不完全な膜染色若しくは弱いが完全な膜染色が見られる。あるいは、
・ＦＩＳＨのＨＥＲ２／ＣＥＰ１７比が２未満、且つ細胞あたりの平均ＨＥＲ２コピー数が４シグナル未満であることが認められるか（デュアルプローブ試験）、又は細胞あたりの平均ＨＥＲ２コピー数が４シグナル未満であることが認められる（シングルプローブを使用する場合）。
【００１３】
原発部位について、また可能であれば転移部位について、以下である場合、ＨＥＲ２状態が不確かであると考えられる（そして、新しい試験を実施すべきである）。
・ＩＨＣにおいて、（ｉ）周辺膜の不完全な標識及び／又は弱い／中程度の標識が認められるが、浸潤がん細胞の１０％超においてであるか、又は（ｉｉ）周辺膜の完全且つ強い標識が認められるが、浸潤がん細胞の１０％以下である。あるいは、
・ＦＩＳＨのＨＥＲ２／ＣＥＰ１７比が２未満、且つ細胞あたりの平均ＨＥＲ２コピー数が４シグナル以上６シグナル未満であることが認められるか（デュアルプローブ試験）、又は細胞あたりの平均ＨＥＲ２コピー数が４シグナル以上６シグナル未満であることが認められる（シングルプローブを使用する場合）。
【００１４】
ＨＥＲ２遺伝子の脱制御は、そのコピー数に関わらず、ＨＥＲ２遺伝子の活性化変異にも相当し得るので、それによりＨＥＲ２のチロシンキナーゼ活性が増大する。例えば、上記活性化変異としては、Ｖ６５９Ｅ、Ｇ３０９Ａ、Ｄ７６９Ｈ、Ｄ７６９Ｙ、Ｖ７７７Ｌ、Ｐ７８０ｉｎｓ、Ｖ８４２Ｉ、Ｒ８９６Ｃ、Ｋ７５３Ｅ、又はＬ７５５Ｓが挙げられ、ポリメラーゼ連鎖反応法又は任意の配列決定法によって検出できる（Ｂｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．，２０１３，３（２），２２４−２３７；Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１６，２２（１９），４８５９−４８６９）。また、ＨＥＲ２遺伝子の増幅及び体細胞活性化変異はいずれも、同じがん症例で検出できる。
【００１５】
ＦｉｓｈやＩＨＣ以外に、確定したＨＥＲ２状態を有する陰性及び陽性コントロール細胞を使用する周知の分子生物学的試験方法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法、ウエスタンブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応法等を比較として採用して、がんのＨＥＲ２状態を決定できる。
【００１６】
本発明に係るＨＥＲ２依存性がんは、乳がん、子宮内膜がん、子宮がん、又は卵巣がん等の女性生殖器がん、膀胱がん、肛門がん、大腸がん、特に子宮体部漿液性腺がん（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）等の子宮漿液性がん、肺がん、特に非小細胞肺がん、肝臓がん、腎臓がん、胃食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓がん、及び胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）からなる群より選択されることが好ましい。好ましい実施形態において、上記ＨＥＲ２依存性がんは、ＨＥＲ２＋乳がん、ＨＥＲ２＋卵巣がん、ＨＥＲ２＋膀胱がん、ＨＥＲ２＋大腸がん、ＨＥＲ２＋子宮体部漿液性腺がん、及びＨＥＲ２＋胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）であってもよく、ＨＥＲ２＋乳がんが好ましい。
【００１７】
本発明に係るＨＥＲ２＋乳がんは、モエシン陰性であってもよい。「モエシン陰性」は、健康な患者に比べてモエシンの発現量が減少していることを意味する。患者（生存分析サーバーからのデータ）におけるカットオフ値は２１７６である（遺伝子発現量からの相対値）。したがって、遺伝子発現量が３９０〜２１７６の患者は「ＭＳＮ陰性」（又はＭＳＮが低い）であり、遺伝子発現量が２１７６〜１２９６５の患者は「ＭＳＮ陽性」（又はＭＳＮが高い）である。例えば、ＨＥＲ２＋乳がん細胞におけるＭＳＮ発現量が、正常な上皮細胞（ＨＭＥＣ）におけるＭＳＮ発現量の１１％未満である場合、ＨＥＲ２＋乳がんは「ＭＳＮ陰性」であると考えられる。
【００１８】
本明細書中、「薬剤」は、最も広い意味で使用されており、オリゴヌクレオチド、化学物質、ポリペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。
【００１９】
本発明において、「オリゴヌクレオチド」とは、２つ以上のヌクレオチドの共有結合により形成される分子を意味する。オリゴヌクレオチドの配列について言及する場合、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵ等の塩基配列について言及していると理解される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも８個、例えば８個〜３０個、好ましくは２２±２個のヌクレオチドで構成される連続したヌクレオチド配列からなっていても、該配列を含んでいてもよい。
【００２０】
本明細書中、「マイクロリボ核酸」又は「ｍｉＲＮＡ」とは、植物、動物、及びいくつかのウイルスに存在する小さな非コードＲＮＡ分子（通常、約１８〜２５個のヌクレオチドを含む）であって、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節において機能する分子を意味する。本発明に係るｍｉＲＮＡは、細胞内又は細胞外環境に存在していてもよい。後者の場合、一般的に循環ｍｉＲＮＡ又は細胞外ｍｉＲＮＡとして知られている。
【００２１】
本明細書中、「抗ｍｉＲＮＡ」は、最も広い意味で使用されており、ｍｉＲＮＡを部分的に又は完全に抑制する、阻害する、又は無効にするあらゆる薬剤を含む。抗ｍｉＲＮＡを同定する方法は、ｍｉＲＮＡを抗ｍｉＲＮＡ候補に接触させることと、該ｍｉＲＮＡの特異的結合及び／又は阻害（ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を測定することとを含んでもよい。本発明の抗ｍｉＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のアンチセンス化合物であってもよい。また、本発明の抗ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡを隔離する能力を有することが当該技術分野においてよく知られているｍｉＲＮＡスポンジであってもよい。
【００２２】
本明細書中、「アンチセンス化合物」は、オリゴヌクレオシド、好ましくはオリゴヌクレオチドを含む又はそれからなる化合物を意味し、少なくともその一部は、ハイブリダイズ可能な標的核酸に相補的であり、その結果、少なくとも１つのアンチセンス活性が生じる。アンチセンス化合物は、本質的にヌクレオチドからなる場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼ばれる。
【００２３】
本明細書中、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、ｍｉＲＮＡ配列又はそれに対応するサブ配列に完全に相補的な又は本質的に相補的な（すなわち、１つ又は２つのミスマッチを含んでもよい）連続したヌクレオチド配列からなる又は該配列を含むオリゴヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態において、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、ｍｉＲＮＡと特異的に結合して該ｍｉＲＮＡを阻害し、該ｍｉＲＮＡ活性のｍｉＲＮＡダウンレギュレーションを可能にするよう設計された一本鎖ＲＮＡ分子を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは化学的に修飾されていてもよい（例えば、１つ以上のヌクレオチド類似体を含んでもよい）。
【００２４】
本発明において、「ヌクレオチド類似体」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチド等の天然ヌクレオチドの糖及び／又は塩基部分における修飾による変異体を意味する。類似体は、アンチセンス化合物又はｍｉＲＮＡ模倣物に関して言えば、原則的に、天然ヌクレオチドに対して単に「サイレント」又は「同等」であり、すなわち、オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡをハイブリダイズするよう作用する方法に対して機能的効果を示さない。それにも関わらず、このような「同等」の類似体は、例えば、それらの製造がより容易若しくはより安価である場合、保存若しくは製造条件に対してより安定している場合、又はタグ若しくは標識となる場合、有用であり得る。しかしながら、ヌクレオチド類似体は、ｍｉＲＮＡへの結合親和性の向上、ヌクレアーゼ耐性の向上、及び／又は細胞内への輸送し易さの向上等、アンチセンス化合物がｍｉＲＮＡをハイブリダイズするよう作用する方法に対して機能的効果を示すことが好ましい。また、ヌクレオチド類似体は、ｍｉＲＮＡ模倣物のヌクレアーゼ耐性の向上及び／又は細胞内への輸送し易さの向上の方法に対して機能的効果を示してもよい。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド類似体はロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである。
【００２５】
本明細書中、「相補性」及び「相同性」は互換的であり、アンチセンス化合物のヌクレオチド配列とｍｉＲＮＡ配列との同一性％（又は相同性％）を意味する。例えば、相補性（又は相同性）％は、アライメントされた塩基のうち、２配列間で同一である塩基数を数え、連続したヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることで算出できる。
【００２６】
本明細書中、「ｍｉＲＮＡ模倣物」は、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、又はヘアピンＲＮＡ等のＲＮＡであって、ｍｉＲＮＡを模倣し、該ｍｉＲＮＡ活性のアップレギュレーションを可能にするＲＮＡを意味する。ｍｉＲＮＡ模倣物は化学的に修飾されていてもよい（例えば、１つ以上のヌクレオチド類似体を含んでもよい）。
【００２７】
本明細書中、「活性を変化させる」は、最も広い意味で使用されており、「活性を低下させる」及び「活性を高める」を含む。本明細書中、「活性を低下させる」とは、ｍｉＲＮＡの活性を部分的に又は完全に抑制する、阻害する、又は無効にすることを意味する。本明細書中、「活性を高める」とは、ｍｉＲＮＡの活性を部分的に又は完全に高める、活性化する、模倣する、アップレギュレーションする、又は刺激することを意味する。
【００２８】
本明細書中、「患者」又は「個体」は、がんの影響を受けた又は影響を受けやすいヒト又はヒト以外の哺乳類（げっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌ、又は霊長類等）を意味する。上記対象は、ヒト、男性、又は女性であることが好ましい。
【００２９】
「処置する」又は「処置」とは、この用語が適用される障害若しくは異常、又は該障害若しくは異常の１つ以上の症状を元に戻す、軽減する、その進行を阻害する、又は予防することを意味する。具体的には、障害の処置は、がん細胞の破壊、枯渇、又は増殖阻害であってもよい。このような処置によってがん細胞を完全に枯渇させることが最も好ましい。
【００３０】
（変化させたｍｉＲＮＡ）
本発明は、ＨＥＲ２依存性がんの処置で使用するための、マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）の活性を変化させる薬剤であって、上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ、ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ５４２−５ｐからなる群より選択される、薬剤に関する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記ｍｉＲＮＡは、表１に詳細に示されるヒトｍｉＲＮＡである。
【００３２】
【表１】
2021501747.tif 000002
【００３３】
いくつかの実施形態において、上記薬剤は、抗ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ模倣物である。
【００３４】
（抗ｍｉＲＮＡ）
本発明に係る使用のための薬剤は、抗ｍｉＲＮＡであってもよい。上記薬剤は、抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ、抗ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ４５１ａ−５ｐ、抗ｍｉＲＮＡ５４２−５ｐ、抗ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、抗ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、及び抗ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐからなる群より選択される抗ｍｉＲＮＡであることが好ましい。
【００３５】
具体的には、上記抗ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡを標的にするアンチセンス化合物（アンタゴｍｉＲとも呼ばれる）であり、抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ、抗ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、抗ｍｉＲＮＡ４５１ａ、抗ｍｉＲＮＡ５４２−５ｐ、抗ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、抗ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、及び抗ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐからなる群より選択されることが好ましい。具体的には、上記アンチセンス化合物は、ｍｉＲＮＡの対応する配列（例えば、８〜３０個のヌクレオチドからなる配列）に相補的な連続したヌクレオチド配列（例えば、少なくとも８個の連続したヌクレオチド）を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、上記アンチセンス化合物は、少なくとも、ｍｉＲＮＡのシード配列に相補的な連続したヌクレオチド配列を含む。ｍｉＲＮＡのシード配列は、該ｍｉＲＮＡがその標的ｍＲＮＡに結合するために不可欠である。当業者であれば、ｍｉＲＮＡのシード配列を容易に決定できる。例えば、シード配列としては以下が挙げられる。
【００３７】
ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｃ、及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐのシード配列：ａａｕａｃｕ（配列番号１７）
ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ１４１−３ｐのシード配列：ａａｃａｃｕ（配列番号１８）
ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐのシード配列：ａｇｃａｃｃ（配列番号１９）
ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ４９７−５ｐのシード配列：ａｇｃａｇｃａ（配列番号２０）
ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐのシード配列：ｃｃｇａｇｃ（配列番号２１）
ｍｉＲＮＡ４５１ａ−５ｐのシード配列：ａａｃｃｇｕｕ（配列番号２２）
ｍｉＲＮＡ５４２−５ｐのシード配列：ｃｇｇｇｇａｕ（配列番号２３）
【００３８】
いくつかの実施形態において、上記アンチセンス化合物は、ｍｉＲＮＡの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％に相補的な連続したヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、上記アンチセンス化合物は、ｍｉＲＮＡの全長に相補的な（すなわち、ｍｉＲＮＡの１００％に相補的な）連続したヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡを標的にする上記アンチセンス化合物は、上記アンチセンス化合物の全長にわたってｍｉＲＮＡの対応する配列に相補的であり、いくつかの実施形態においては、上記アンチセンス化合物の３’末端ヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡの１、２、３、４番目の５’末端ヌクレオチドに対して相補的である（すなわち、アラインメントされる）。
【００４１】
表２に、市販されているアンチセンス化合物の例を示す。
【００４２】
【表２】
2021501747.tif 000003
【００４３】
好ましい実施形態において、上記抗ｍｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ等に対する安定性及び／又は細胞取り込みを向上させること等を目的として、化学的に修飾されたアンチセンス化合物である。
【００４４】
アンチセンス化合物の様々な化学修飾が提案されており、通常、治療用途のアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばその連続したヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチド類似体を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明は、ヌクレオチド類似体を含むアンチセンス化合物に関する。好ましい実施形態において、上記アンチセンス化合物のヌクレオチドの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％又は１００％はヌクレオチド類似体である。
【００４６】
好ましい実施形態において、上記ヌクレオチド類似体はロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである。好ましい実施形態において、上記アンチセンス化合物のヌクレオチドの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％又は１００％はＬＮＡヌクレオチドである。したがって、上記アンチセンス化合物は、上記アンチセンス化合物のヌクレオチドの１００％がＬＮＡヌクレオチドである場合、「ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼ばれることもある。いくつかの実施形態において、上記ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドは、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（例えば配列番号３０）、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ（例えば配列番号３１）、又はＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（例えば配列番号３２）である。
【００４７】
（ｍｉＲＮＡ模倣物）
本発明に係る使用のための薬剤は、ｍｉＲＮＡ模倣物であってもよい。上記ｍｉＲＮＡ模倣物はｍｉＲＮＡの細胞機能を有し、該ｍｉＲＮＡ活性のアップレギュレーションを可能にする。
【００４８】
好ましい実施形態において、上記ｍｉＲＮＡ模倣物は、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ模倣物及びｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ模倣物からなる群より選択される。つまり、上記ｍｉＲＮＡ模倣物は、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ又はｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐの細胞機能を有することになり、例えば、上記ｍｉＲＮＡ模倣物の配列は、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐのヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相同性を有する。
【００４９】
好ましい実施形態において、上記ｍｉＲＮＡ模倣物は、ヌクレアーゼ等に対する安定性及び／又は細胞取り込みを向上させること等を目的として、化学的に修飾されている。
【００５０】
したがって、好ましい実施形態において、上記ｍｉＲＮＡ模倣物はヌクレオチド類似体を含む。上記ｍｉＲＮＡ模倣物のヌクレオチドの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％又は１００％はヌクレオチド類似体であることが好ましい。
【００５１】
いくつかの実施形態において、上記ヌクレオチド類似体はロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである。好ましい実施形態において、上記ｍｉＲＮＡ模倣物のヌクレオチドの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％又は１００％はＬＮＡヌクレオチドである。
【００５２】
好ましい実施形態において、上記ヌクレオチド類似体は２’−Ｆ／ＭＯＥヌクレオチドである。好ましい実施形態において、上記ｍｉＲＮＡ模倣物のヌクレオチドの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％又は１００％は２’−Ｆ／ＭＯＥヌクレオチドである。
【００５３】
２’−Ｆ／ＭＯＥヌクレオチド等の上記ヌクレオチド類似体は、ｍｉＲＮＡ模倣物がヌクレアーゼ耐性の向上及び／又は細胞内への輸送し易さの向上を示す方法に対して機能的効果を発揮する場合に特に有利である。
【００５４】
（ＨＥＲ２依存性がん）
いくつかの実施形態において、ＨＥＲ２依存性がんは、乳がん、子宮内膜がん、子宮がん、又は卵巣がん等の女性生殖器がん、膀胱がん、肛門がん、大腸がん、特に子宮体部漿液性腺がん（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）等の子宮漿液性がん、肺がん、特に非小細胞肺がん、肝臓がん、腎臓がん、胃食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓がん、及び胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）からなる群より選択される。好ましい実施形態において、上記ＨＥＲ２依存性がんは、ＨＥＲ２＋乳がん、ＨＥＲ２＋卵巣がん、ＨＥＲ２＋膀胱がん、ＨＥＲ２＋大腸がん、ＨＥＲ２＋子宮体部漿液性腺がん、及びＨＥＲ２＋胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）であってもよく、ＨＥＲ２＋乳がんが好ましい。上記乳がんは、モエシン陰性であってもよい。
【００５５】
（医薬組成物）
本発明の薬剤は、医薬組成物において使用することができる。上記組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、又はアジュバントを含むことが好適である。上記医薬組成物において有用な担体又は希釈剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。上記薬剤を医薬組成物とした場合、治療効果を示すのに効果的な有効且つ簡便な方法で投与することができ、なかでも、例えば経口、静脈内、筋肉内、皮内、鼻腔内、又は局所経路による投与が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記薬剤を腫瘍に直接投与してもよく、全身投与により腫瘍に対して標的化してもよい。
【００５６】
（併用処置）
いくつかの実施形態において、本発明の薬剤は、他の治療薬との併用処置で使用される。いくつかの実施形態において、他の治療薬は、ＨＥＲ２＋乳がんの処置において公知の治療薬である。例えば、該抗腫瘍処置は、抗ＨＥＲ２抗体療法（例えば、ハーセプチン／トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブエムタンシン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、米国））等、ＨＥＲ２の細胞外領域を標的にすることを狙ったものでもよいし、あるいは該抗腫瘍処置は、小分子チロシンキナーゼ阻害薬（例えば、ラパチニブ／タイケルブ（ＧＳＫ社、米国））等、ＨＥＲ２のキナーゼ活性を標的にすることを狙ったものでもよい。また、該抗腫瘍処置は、パクリタキセル等のタキサン系化学療法であってもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明の薬剤を第一選択療法で使用して、トラスツズマブの臨床的有用性を最大限にする（その結果、トラスツズマブの必要量及びその関連する毒性を減らす）代替処置の組み合わせを提供し、且つ／又は、第二選択療法で使用して、トラスツズマブ耐性を防止する又は遅延させる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】異なるＨＥＲ２／ＭＳＮ状態を有するいくつかの乳がん細胞株のｍｉＲｎｏｍｅ分析を表す。上パネルには、異なるＨＥＲ２／ＭＳＮ状態（ＣＤＳ  ＨＥＲ２＋ＭＳＮｌｏ及びＣＤＳ  ＨＥＲ２−ＭＳＮｈｉ）を有する乳がん細胞株におけるＨＥＲ２及びモエシン（ＭＳＮ）ｍＲＮＡ発現量を示すトランスクリプトーム解析を示す。下パネルには、ｍｉＲＮＡ候補の発現を表したものを示す。ＭＳＮｈｉは、ＭＳＮの発現が高いことを意味する。ＭＳＮｌｏは、ＭＳＮの発現が低いことを意味する。
【図２−１】ｍｉＲＮＡ２９ファミリー（ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ）の発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図２−２】ｍｉＲＮＡ２９ファミリー（ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ）の発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図３−１】ｍｉＲＮＡ２００ファミリー（ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ）の発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図３−２】ｍｉＲＮＡ２００ファミリー（ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ）の発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図３−３】ｍｉＲＮＡ２００ファミリー（ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ）の発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図３−４】ｍｉＲＮＡ２００ファミリー（ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ）の発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図４−１】ｍｉＲＮＡ１５ファミリー（ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１９５−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ）の発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図４−２】ｍｉＲＮＡ１５ファミリー（ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１９５−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ）の発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図４−３】ｍｉＲＮＡ１５ファミリー（ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１９５−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ）の発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図４−４】ｍｉＲＮＡ１５ファミリー（ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１９５−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ）の発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図５−１】ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ５４２−５ｐの発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図５−２】ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ５４２−５ｐの発現量に応じて、ＨＥＲ２＋乳がん（ＨＥＲ２＋ＢＣ）又はＨＥＲ２−乳がん（ＨＥＲ２−ＢＣ）患者の生存分析を表す。ＢＣは「乳がん」を意味する。
【図６】ウエスタンブロットで解析したＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）並びにモエシン（ＭＳＮ）及びクラスリンの発現量に対する、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において４８時間トランスフェクトした２０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（アンタゴｍｉＲ）の影響を表す。
【図７】ウエスタンブロットで解析したＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）並びにモエシン（ＭＳＮ）及びクラスリンの発現量に対する、ＭＤＡＭＢ２３１（ＨＥＲ２−乳がん細胞株）において４８時間トランスフェクトした２０ｎＭのｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ模倣物の影響を表す。
【図８】ウエスタンブロットで解析したＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２／クラスリン）に対する、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間又は９６時間トランスフェクトした２０ｎＭ及び４０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（アンタゴｍｉＲ）の影響を定量化したものを表す。
【図９】ｑＲＴ−ＰＣＲで分析したＨＥＲ２のｍＲＮＡ発現量に対する、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間トランスフェクトした２０ｎＭ及び４０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（アンタゴｍｉＲ）の影響を表す。
【図１０】ウエスタンブロットで解析したＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）、Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）及びＥＲＫ（ｐＥＲＫ）の活性化、並びにクラスリンの発現量に対する、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間トランスフェクトした２０ｎＭ及び４０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（アンタゴｍｉＲ）の影響を表す。
【図１１】ｑＲＴ−ＰＣＲで分析したＨＥＲ２のｍＲＮＡ発現量に対する、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間トランスフェクトした２０ｎＭ及び４０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（ｉｎｈ  ２９ｃ）の影響を表す。ＣＴは「コントロール」を意味する。ｉｎｈ．２９ｃは「抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ」を意味する。
【図１２】ウエスタンブロットで解析したＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）、モエシン（ＭＳＮ）発現、ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）の活性化、並びにクラスリンの発現量に対する、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間トランスフェクトした２０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ、及び８０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ（アンタゴｍｉＲ）の影響を表す。
【図１３】ウエスタンブロットで解析したＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）、モエシン（ＭＳＮ）発現、ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）の活性化、並びにエズリンの発現量に対する、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間トランスフェクトした２０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ、８０ｎＭ、及び１００ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（アンタゴｍｉＲ）の影響を表す。
【図１４】ＭＴＴアッセイで解析したＨＥＲ２依存性増殖に対する、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において９６時間トランスフェクトした４０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ（アンタゴｍｉＲ）の影響を表す。
【図１５】ＭＴＴアッセイで解析したＨＥＲ２依存性増殖に対する、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において９６時間トランスフェクトした４０ｎＭ及び８０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（アンタゴｍｉＲ）の影響を表す。
【図１６】ウエスタンブロットで解析したＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）並びにクラスリンの発現量に対する、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間トランスフェクトした４０ｎＭ及び６０ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（ＬＮＡ２９ｃ）又は６０ｎＭのコントロール抗ｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ）の影響を表す。
【図１７】ウエスタンブロットで解析したＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）、Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）及びＥＲＫ（ｐＥＲＫ）の活性化、並びにクラスリンの発現量に対する、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間トランスフェクトした３０ｎＭ及び６０ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（ＬＮＡ４２９）又は６０ｎＭのコントロール抗ｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ）の影響を表す。
【図１８】インピーダンスベースの細胞増殖アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）によりリアルタイムで測定したＨＥＲ２依存性増殖に対する、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）においてトランスフェクトした１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（ＬＮＡ２９ｃ）又は１００ｎＭのコントロール抗ｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ）の影響を表す。
【図１９】インピーダンスベースの細胞増殖アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）によりリアルタイムで測定したＨＥＲ２依存性増殖に対する、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）においてトランスフェクトした６０ｎＭ及び１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（ＬＮＡ２９ｃ）又は１００ｎＭのコントロール抗ｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ）の影響を表す。
【図２０】インピーダンスベースの細胞増殖アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）によりリアルタイムで測定したＨＥＲ２依存性増殖に対する、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）においてトランスフェクトした６０ｎＭ及び１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ（ＬＮＡ２００ｂ）又は１００ｎＭのコントロール抗ｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ）の影響を表す。
【図２１】インピーダンスベースの細胞増殖アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）によりリアルタイムで測定したＨＥＲ２依存性増殖に対する、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）においてトランスフェクトした６０ｎＭ及び１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ（ＬＮＡ２００ｂ）又はコントロール抗ｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ）の影響を表す。
【図２２】インピーダンスベースの細胞増殖アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）によりリアルタイムで測定したＨＥＲ２依存性増殖に対する、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）においてトランスフェクトした６０ｎＭ及び１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（ＬＮＡ４２９）又はコントロール抗ｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ）の影響を表す。
【図２３】インピーダンスベースの細胞増殖アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）によりリアルタイムで測定したＨＥＲ２依存性増殖に対する、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）においてトランスフェクトした６０ｎＭ及び１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（ＬＮＡ４２９）又はコントロール抗ｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ）の影響を表す。
【図２４】インピーダンスベースの細胞増殖アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）によりリアルタイムで測定したＨＥＲ２依存性増殖に対する、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）においてジムノシス（ｇｙｍｎｏｓｉｓ）により送達した０．１μＭ及び１μＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ（ＬＮＡ２００ｂ）又はコントロール抗ｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ）の影響を表す。
【図２５】インピーダンスベースの細胞増殖アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）によりリアルタイムで測定したＨＥＲ２依存性増殖に対する、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）においてジムノシス（ｇｙｍｎｏｓｉｓ）により送達した０．１μＭ及び１μＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（ＬＮＡ４２９）又はコントロール抗ｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ）の影響を表す。
【図２６】インピーダンスベースの細胞増殖アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）によりリアルタイムで測定した細胞増殖に対する、ＭＤＡＭＢ−２３１（ＨＥＲ２陰性乳がん細胞株）においてトランスフェクトした１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（ＬＮＡ２９ｃ）、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ（ＬＮＡ２００ｂ）、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（ＬＮＡ４２９）、又はコントロール抗ｍｉＲＮＡ  ＬＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ）の影響を表す。
【図２７】健常人（ｎ＝２２）、ＨＥＲ２＋乳がん患者（ｎ＝１４）、又はＨＥＲ２−乳がん患者（ｎ＝１８）から得られた術前血清試料におけるｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−２００ｃ−３ｐの発現量を表す。左パネルには、個々のｍｉＲＮＡ発現量を示す。右パネルには、ｍｉＲＮＡ発現量の合計を示す。
【００５９】
図面及び実施例において、「ｍｉＲ」及び「ｍｉＲＮＡ」は互換的に使用され、例えば、「ｍｉＲ４２９−３ｐ」は「ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ」を意味する。
【実施例】
【００６０】
実施例１：実施例で用いた方法
方法
データセット及び生存分析
ＭＥＴＡＢＲＩＣ（乳腺腫瘍：１２６２件）にてｍｉＲｐｏｗｅｒ［Ｂｒｅａｓｔ］（ｈｔｔｐ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐ＝ｓｅｒｖｉｃｅ＆ｃａｎｃｅｒ＝ｂｒｅａｓｔ＿ｍｉＲｎａ）を用いて、乳がん患者の全生存期間に対するｍｉＲＮＡの影響を測定した。ＨＥＲ２陽性状態（分子サブタイプＨＥＲ２＋ＥＲに対する免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によりＨＥＲ２＋）又はＨＥＲ２−（トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）分子サブタイプ）乳がん患者のいずれかを分析した。
【００６１】
細胞株及び培養条件
ＨＥＲ２＋乳がん細胞株であるＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３０）及びＢＴ４７４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２０）並びにＨＥＲ２−乳がん細胞株であるＭＤＡＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ  ＣＲＭ−ＨＴＢ−２６）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ社）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（４．５ｇ／ｌグルコース；Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。５％ＣＯ２を補充した加湿インキュベーターを用いて、３７℃で１０ｍＬの完全培地の入った１００ｍｍシャーレ中で細胞を培養した。
【００６２】
試薬
一次抗体としては、抗ｐＹ１２４８  ＨＥＲ２（＃０６−２２９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社；１：１０００）、抗ＨＥＲ２（ａｂ２４２８、Ａｂｃａｍ社、１：１０００）、抗ｐＡＫＴ及び抗ｐＥＲＫ１／２（それぞれ、＃９２７１；１：１００及び＃９１０６Ｌ；１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、並びに抗クラスリン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、＃６１０５００；１：１０００）を使用した。二次抗体としては、ＨＲＰ（１：５０００）と結合させた抗ウサギＩｇＧ（＃ＮＡ９３４０−１ＭＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）又は抗マウスＩｇＧ（＃ＮＡ９３１０−１ＭＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用した。抗ＭＳＮ及び抗エズリンは、Ｐａｕｌ  Ｍａｎｇｅａｔ博士（モンペリエ大学）から贈呈されたものであり、１：１０００希釈で使用した。ｍｉＲＮＡ模倣物及び抗ｍｉＲＮＡ（アンタゴｍｉＲ）をＡｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ（登録商標）社から購入したが、それらは以下の通りである：ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ模倣物（ＭＩＭ００８０）、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ阻害剤（ＩＮＨ００８０）、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ阻害剤（ＩＮＨ０２５２）、及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ阻害剤（ＩＮＨ０３８８）。
【００６３】
ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡｍｉＲＮＡ阻害剤（ＬＮＡ）をＥｘｉｑｏｎ／Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）社から購入したが、それらは以下の通りである：ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ阻害剤（ＣＣＧＡＴＴＴＣＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴ（配列番号３０）、ＹＩ０４１０５４６０）、ｍｉＲＮＡ２００ｂ阻害剤（ＣＡＴＣＡＴＴＡＣＣＡＧＧＣＡＧＴＡＴＴ（配列番号３１）、ＹＩ０４１０４０４２）、ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ阻害剤（ＣＧＧＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴ（配列番号３２）、ＹＩ０４１０１２９０）、及びコントロールｍｉＲＮＡ阻害剤（ＴＡＡＣＡＣＧＴＣＴＡＴＡＣＧＣＣＣＡ（配列番号３３）、ＹＩ００１９９００６）。
【００６４】
ｍｉＲＮＡ模倣物及び抗ｍｉＲＮＡトランスフェクション
ｍｉＲＮＡ−２００ｂ−３ｐ（ＵＡＡＵＡＣＵＧＣＣＵＧＧＵＡＡＵＧＡＵＧＡ（配列番号６））、ｍｉＲＮＡ−４２９−３ｐ（ＵＡＡＵＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＡＣＣＧＵ（配列番号１））、及びｍｉＲＮＡ−２９ｃ−３ｐ（ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ（配列番号２））模倣物又は阻害剤（すなわち「抗」）を、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社又はＥｘｉｑｏｎ／Ｑｉａｇｅｎ社から購入した。６ウェルプレートを用いて、抗生物質を含まないＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、Ｇｉｂｃｏ社）中で２５０×１０３個のＳＫＢＲ３細胞、ＢＴ４７４細胞、又はＭＤＡＭＢ−２３１細胞を培養した。２４時間後、製造業者の指示書に従いＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）にリポフェクタミン（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸを用いて、２０〜１００ｎＭｍｉＲＮＡ模倣物又は阻害剤で細胞をトランスフェクトし、ウエスタンブロット又はＭＴＴアッセイ（４８〜９６時間後）又はインピーダンスベースの細胞増殖アッセイを行うために処理した。トランスフェクションの６時間後に、培地を１％抗生物質含有ＤＭＥＭと交換した。
【００６５】
ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの調製、及びリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析
Ｔｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ社、Ｔ９４２４）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、デラウェア州ウィルミントン）を用いて、全ＲＮＡの濃度及び完全性を測定した。ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）処理（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、デラウェア州ウィルミントン）後にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ  ＲＴを用いて、全ＲＮＡ２００ｎｇで逆転写反応を実施した。製造業者の指示書に従いＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＩＩでリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を１０μｌで実施した。
【００６６】
ＰＣＲプライマーは次の通りである。
フォワードＭＳＮ  ５’−ＧＧＡＡＴＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＴＡＧＧＡＴＡＴＣＴＴ−３’（配列番号２４）
リバースＭＳＮ  ５’−ＧＧＡＡＴＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＴＡＧＧＡＴＡＴＣＴＴ−３’（配列番号２５）
フォワードＨＥＲ２  ５’−ＧＣＣＧＣＡＧＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴ−３（配列番号２６）
リバースＨＥＲ２  ５’−ＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号２７）
フォワードＧＡＰＤＨ  ５’−ＧＡＴＣＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧ−３’（配列番号２８）
リバースＧＡＰＤＨ  ５’−ＧＣＡＡＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＴＣ−３’（配列番号２９）
【００６７】
ＰＣＲの条件は、９５℃１０秒；６０℃１０秒；７２℃１５秒であった。各ｒｕｎの終わりに融解曲線分析を実施して、単一の生成物が合成されたことを確認した。２−ΔΔＣｔ法を用いて、ＧＡＰＤＨで標準化したＨＥＲ２及びＭＳＮの相対的発現量を算出した。以下に示す各種のＨＥＲ２状態を有する２５種類の乳がん細胞株について、ＨＥＲ２及びＭＳＮのｍＲＮＡ量の分析を行った：ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２７）、ＢＴ−４８３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２１）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３１）、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２８）、ＺＲ−７５−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５００）、ＨＣＣ２０２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３１６）、ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２０）、ＭＣＦ  １０Ａ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０３１７）、ＭＣＦ−１２Ａ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０７８２）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３０）、ｈＴＥＲＴ−ＨＭＥ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−４０１０）、ＭＣＦ−１０−２Ａ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０７８１）、１８４Ｂ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８７９９）、ＢＴ−５４９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２２）、ＨＣＣ１９３７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３３６）、Ｈｓ  ５７８Ｔ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２６）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）、ＭＣＦ−１２Ｆ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０７８３）、ＰＭＣ４２（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿５２１５）、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２４）、ＢＴ−２０（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１９）、ＨＣＣ７０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３１５）、ＨＣＣ１５９９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３３１）、ＨＣＣ１１４３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３２１）、及びＨＣＣ１１８７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３２２）。
【００６８】
ウエスタンブロット
ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、及びＭＤＡＭＢ−２３１細胞を４℃で１０分間溶菌した（ロイペプチン、アプロチニン、及びペプスタチンプロテアーゼ阻害剤と、オルトバナジン酸塩及びＡＥＢＳＦホスファターゼ阻害剤とを含有する５０ｍＭトリス、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％トリトン、１０％グリセロール、ｐＨ８．８）。標準プロトコルに従い、ライセートをＬａｅｍｍｌｉバッファにより９５℃１０分で変性させ、勾配バッファ（１００ｍＭトリス、１００ｍＭトリシン、０．１％ＳＤＳ）中、１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル（ＰｒｏＳｉｅｖｅ、Ｌｏｎｚａ社）でタンパク質を分離し、転写バッファ（２０％ＥｔＯＨ、２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ８．５）を用いてニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標））に転写した。３％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴバッファ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭトリス、０．１％Ｔｗｅｅｎ）を用いて膜を室温で３０分間ブロッキングし、適切な一次抗体（試薬を参照）を用いて４℃で一晩インキュベートした。二次抗体として、西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗ウサギ又は抗マウス抗体（試薬を参照）を使用した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて、ＦＵＳＩＯＮ−ＦＸ７−ＳＰＥＣＴＲＡ撮影システム（Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ社）で検出した。
【００６９】
ｍｉＲｎｏｍｅ分析
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ）でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキットを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりｍｉＲＮＡ発現量を定量化した。８０４種類のヒトｍｉＲＮＡプローブを検出するよう設計されたＨｕｍａｎ  ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙのバージョン９．０及び１１．０（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造業者のガイドラインに従って使用した。小さな核小体ＲＮＡ  ＲＮＵ４４（Ｑｉａｇｅｎ社）を内在性コントロールとして用いて、ｍｉＲＮＡ発現量を標準化した。
【００７０】
ＭＴＴアッセイ
５×１０３個のＳＫＢＲ３細胞又はＢＴ４７４細胞を９６ウェルプレートで培養した。７２時間目に培地を除去し、１００μＬの新鮮な培地と交換した。１０μＬの１２ｍＭ  ＭＴＴ原液を各ウェルに添加した。該原液は、１００μＬの培地のみにも添加し、ネガティブコントロールとした。３７℃で２〜４時間インキュベートした後、ウェルから２５μＬを残して培地を除去し、５０μＬのＤＭＳＯを添加した。５４０ｎｍの吸光度を読み取り、細胞増殖を定量化する。
【００７１】
インピーダンスベースの細胞増殖アッセイ
９６Ｘマイクロプレート（Ｅ−Ｐｌａｔｅ）を用いて、７〜９×１０３細胞／ウェルを２００μＬの培地に播種した。ＲＴＣＡ−ＭＰ  ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）システムを用いて、細胞の付着、拡散、及び増殖を１５分毎にモニタリングした。細胞／センサーインピーダンスを細胞指数（ｃｅｌｌ  ｉｎｄｅｘ）と呼ばれる任意の単位として表した。
【００７２】
【表Ａ】
2021501747.tif 000004
【００７３】
健常人又は乳がん患者の血清試料におけるデータセット及びｍｉＲＮＡ発現量分析
Ａｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ／）で実験ＧＳＥ４２１２８（遺伝子発現オムニバスアクセッション番号）から健常人（ｎ＝２２）、ＨＥＲ２＋乳がん患者（ｎ＝１４）、又はＨＥＲ２−乳がん患者（ｎ＝１８）から得られた術前血清試料におけるｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐの発現量を入手した。ｍｉＲＮＡ発現量は、対応する健常コントロールの平均値で標準化した。また、それらの発現量の合計の平均値も求めた。
【００７４】
実施例２：異なるＨＥＲ２状態及びモエシン状態を有する乳がん細胞株のｍｉＲｎｏｍｅ分析
材料及び方法
実施例１で詳述した通り、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍでＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキットを用いて、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により試料におけるｍｉＲＮＡ発現量を定量化した。簡単に説明すると、８０４種類のヒトｍｉＲＮＡプローブを検出するよう設計されたＨｕｍａｎ  ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙのバージョン９．０及び１１．０（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造業者のガイドラインに従って使用した。各ｍｉＲＮＡの相対的発現量を、ＲＮＵ４４に対する標的ｍｉＲＮＡの発現量のＮ倍の差として表す。この分析は、異なるＨＥＲ２状態（７種類のＨＥＲ２＋及び１８種類のＨＥＲ２−）を有する２５種類の乳がん細胞株において実施して、数種類のｍｉＲＮＡの量、具体的には、ｍｉＲＮＡ２９、ｍｉＲＮＡ２００、及びｍｉＲＮＡ１５ファミリー、並びにｍｉＲＮＡ−４５１ａ、ｍｉＲＮＡ−５４２−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ６１５−３ｐの量をモニタリングした。
【００７５】
結果
２５種類の乳がん細胞株のｍｉＲｎｏｍｅ分析により、ＨＥＲ２＋乳がん細胞株において、ＨＥＲ２−乳がん細胞株と比較して発現が異なるいくつかのｍｉＲＮＡを同定した。それらには、ｍｉＲＮＡ２９ファミリー（ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ）、ｍｉＲ２００ファミリーの５種類（ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ）、ｍｉＲ１５ファミリーの６種類（ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１９５−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ）、並びにｍｉＲＮＡ４５１ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ５４２−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ６１５−３ｐが含まれる（図１）。表３に結果の詳細を示す。
【００７６】
【表３】
2021501747.tif 000005
【００７７】
結論
鍵となるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１９５−５ｐ、ｍｉＲＮＡ４９７、ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ５４２−５ｐ）の量は、ＨＥＲ２−乳がん細胞株と比較して、ＨＥＲ２＋乳がん細胞株において特異的に増加した。
【００７８】
鍵となるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ）の量は、ＨＥＲ２−乳がん細胞株と比較して、ＨＥＲ２＋乳がん細胞株において特異的に低下した。
【００７９】
実施例３：ｍｉＲＮＡ２９ファミリーの発現量に応じた乳がん患者の生存分析
材料及び方法
ＭＥＴＡＢＲＩＣ（乳腺腫瘍：１２６２件）にてオンラインのｍｉＲｐｏｗｅｒカプラン・マイヤープロッター（ｈｔｔｐ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐ＝ｓｅｒｖｉｃｅ＆ｃａｎｃｅｒ＝ｂｒｅａｓｔ＿ｍｉＲｎａ）を用いて、乳がん患者の全生存期間に対するｍｉＲＮＡ２９ファミリーの発現量の影響を測定した。標的ｍｉＲＮＡの発現に基づいて、患者を２群に分けた。ＨＥＲ２陽性状態（分子サブタイプＨＥＲ２＋ＥＲに対する免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によりＨＥＲ２＋）又はＨＥＲ２−（トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）分子サブタイプ）乳がん患者のいずれかを分析した。
【００８０】
結果
ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐ（ＨＥＲ２＋／ＭＳＮｌｏ乳がん細胞株においてダウンレギュレーションされたもの、実施例２を参照）の発現量の低さは、これらのｍｉＲＮＡの発現量が高い患者に比べて全生存期間が短くなる傾向と関連していた（図２Ａ、Ｂ）。
【００８１】
ＭｉＲ２９ａ−３ｐ
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐの発現量が低い場合、６１ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐの発現量が高い場合、２００ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐの発現量が低い場合、死亡率は７０％超であるのに対して、ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐの発現量が高い場合、死亡率は４０％未満（Ｐ＝０．１１）。
【００８２】
ＭｉＲ２９ｂ−３ｐ
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐの発現量が低い場合、７３ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐの発現量が高い場合、２００ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐの発現量が低い場合、死亡率は６０％超であるのに対して、ｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐの発現量が高い場合、死亡率は４０％未満（Ｐ＝０．５９）。
【００８３】
ＨＥＲ２−乳がん患者においても同様の傾向が見られた（Ｐ＝０．３８及び０．１７）（図２Ｄ、Ｅ）。
【００８４】
一方、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株においてアップレギュレーションされたもの、実施例１を参照）の発現量の高さは、このｍｉＲＮＡの発現量が低い患者に比べて全生存期間が短くなる傾向と関連していた（図２Ｃ）。
【００８５】
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐの発現量が高い場合、７１ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐの発現量が低い場合、２００ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐの発現量が高い場合、死亡率は５５％超であるのに対して、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐの発現量が低い場合、死亡率は４０％未満（Ｐ＝０．３７）。
【００８６】
これらのｍｉＲＮＡの発現量はＨＥＲ２−乳がん患者の生存プロファイルを変化させなかったため（Ｐ＝０．９６）、上記傾向はＨＥＲ２＋乳がんに特異的であった（図２Ｆ）。
【００８７】
結論
生存分析から、ｍｉＲＮＡ２９ａ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ２９ｂ−３ｐとは対照的に、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ量の増加は、特にＨＥＲ２＋乳がんと診断された患者において、全生存期間が短くなることと関連していることが明らかとなった。
【００８８】
実施例４：ｍｉＲＮＡ２００ファミリー：ＨＥＲ２状態に応じた血清発現量、及び乳がん患者の生存分析
材料及び方法
全生存期間：ＭＥＴＡＢＲＩＣ（乳腺腫瘍：１２６２件）にてオンラインのｍｉＲｐｏｗｅｒカプラン・マイヤープロッター（ｈｔｔｐ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐ＝ｓｅｒｖｉｃｅ＆ｃａｎｃｅｒ＝ｂｒｅａｓｔ＿ｍｉＲｎａ）を用いて、乳がん患者の全生存期間に対するｍｉＲＮＡ２００ファミリーの発現量の影響を測定した。標的ｍｉＲＮＡの発現に基づいて、患者を２群に分けた。ＨＥＲ２陽性状態（分子サブタイプＨＥＲ２＋ＥＲに対する免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によりＨＥＲ２＋）又はＨＥＲ２−（トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）分子サブタイプ）乳がん患者のいずれかを分析した。
【００８９】
循環ｍｉＲＮＡ２００ファミリーの血清中量
Ａｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ／）で実験ＧＳＥ４２１２８（遺伝子発現オムニバスアクセッション番号）から入手した健常人（ｎ＝２２）、ＨＥＲ２＋乳がん患者（ｎ＝１４）、又はＨＥＲ２−乳がん患者（ｎ＝１８）から得られた術前血清試料におけるｍｉＲＮＡ発現量をｑＲＴ−ＰＣＲで定量化したものを分析した。それらの発現量の複合プロファイルは、それらの個々の発現量の平均である。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて実施したクラスカル・ウォリス検定の一元配置分散分析（Ｐ＝０．０１７４；ダン多重比較検定：健常人対ＨＥＲ２＋、調整済みＰ＝０．０２５５＊；健常人対ＨＥＲ２−、調整済みＰ＞０．９９９９ｎｓ；ＨＥＲ２＋対ＨＥＲ２−、調整済みＰ＝０．０４６３°）である。
【００９０】
結果
予測生存分析：ｍｉＲ２００ファミリーの５種類のうち、ｍｉＲ２００ａ−３ｐ（図３Ａ、Ｆ）、ｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ（図３Ｃ、Ｈ）、及びｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ（図３Ｄ、Ｉ）の発現量は、患者の生存率に顕著には影響しなかった。一方、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐの発現量の高さは、これら２種類のｍｉＲＮＡの発現量が低い患者に比べて全生存期間が顕著に短くなることと関連していた（図３Ｂ、Ｅ）。
【００９１】
ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐの発現量が高い場合、６２ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐの発現量が低い場合、１２０ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐの発現量が高い場合、死亡率は６０％であるのに対して、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐの発現量が低い場合、死亡率は２０％（Ｐ＝０．０７８）。
【００９２】
ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐの発現量が高い場合、６２ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐの発現量が低い場合、１２０ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐの発現量が高い場合、死亡率は６０％であるのに対して、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐの発現量が低い場合、死亡率は２０％（Ｐ＝０．０９）。
【００９３】
これらのｍｉＲＮＡの発現量はＨＥＲ２−乳がん患者の生存プロファイルを顕著には変化させなかったため（ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ：Ｐ＝０．３８；ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ：Ｐ＝０．１３）、上記傾向はＨＥＲ２＋乳がんに特異的であった（図３Ｇ、Ｊ）。
【００９４】
したがって、生存分析から、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐの量の増加は、特にＨＥＲ２＋乳がんと診断された患者において、全生存期間が短くなることと関連していることが明らかとなる。
【００９５】
ＨＥＲ２＋乳がん患者と非疾患対象との血清中量の比較
ＨＥＲ２＋乳がん患者（ｎ＝１４）の術前血清試料におけるｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−２００ｃ−３ｐの各発現量は、ＨＥＲ２−乳がん患者（ｎ＝１８）又は健常コントロール（ｎ＝２２）と比べて高いことが分かった（図２７Ａ）。ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−２００ｃ−３ｐの発現量の合計は、ＨＥＲ２−乳がん患者（Ｐ＝０２５５）又は健常コントロール（Ｐ＝０．０４６３）よりも、ＨＥＲ２＋乳がん患者の血清試料において顕著に高い（図２７Ｂ）。
【００９６】
鍵となるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ１４１−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ａ−３ｐ、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ２００ｃ−３ｐ）の合計量は、ＨＥＲ２−乳がん患者及び健常人と比べて、ＨＥＲ２＋乳がん患者の血清において顕著に増加していることが分かる。したがって、これらのｍｉＲＮＡは、乳がんの非侵襲的な診断のための非常に興味深いバイオマーカーとなる。
【００９７】
結論
これらの結果全体から、対象におけるＨＥＲ２依存性がんを診断及び／又は予後予測する方法におけるバイオマーカーとして、及び、ＨＥＲ２＋がん治療戦略における有用な標的として、ｍｉＲＮＡ２００ファミリーのｍｉＲＮＡの妥当性が指摘される。
【００９８】
実施例５：ｍｉＲＮＡ１５ファミリーの発現量に応じた乳がん患者の生存分析
材料及び方法
ＭＥＴＡＢＲＩＣ（乳腺腫瘍：１２６２件）にてオンラインのｍｉＲｐｏｗｅｒカプラン・マイヤープロッター（ｈｔｔｐ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐ＝ｓｅｒｖｉｃｅ＆ｃａｎｃｅｒ＝ｂｒｅａｓｔ＿ｍｉＲｎａ）を用いて、乳がん患者の全生存期間に対するｍｉＲＮＡ１５ファミリーの発現量の影響を測定した。標的ｍｉＲＮＡの発現に基づいて、患者を２群に分けた。ＨＥＲ２陽性状態（分子サブタイプＨＥＲ２＋ＥＲに対する免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によりＨＥＲ２＋）又はＨＥＲ２−（トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）分子サブタイプ）乳がん患者のいずれかを分析した。
【００９９】
結果
ｍｉＲＮＡ１５ファミリーの６種類のうち、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ（図４Ａ）、ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ（図４Ｂ）、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ（図４Ｅ）、及びｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ（図４Ｆ）の発現量の高さは、これらのｍｉＲＮＡの発現量が低い患者に比べて全生存期間が短くなる傾向と関連していた。
【０１００】
ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ１６−５ｐの発現量が高い場合、１０７ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐの発現量が低い場合、２００ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ１６−５ｐの発現量が高い場合、死亡率は５０％超であるのに対して、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐの発現量が低い場合、死亡率は４０％未満（Ｐ＝０．３２）。
【０１０１】
ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐの発現量が高い場合、１０７ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐの発現量が低い場合、２００ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐの発現量が高い場合、死亡率は５０％超であるのに対して、ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐの発現量が低い場合、死亡率は４０％未満（Ｐ＝０．３７）。
【０１０２】
ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐの発現量が高い場合、１０８ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐの発現量が低い場合、２００ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐの発現量が高い場合、死亡率は５０％超であるのに対して、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐの発現量が低い場合、３０％未満（Ｐ＝０．４２）。
【０１０３】
ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐの発現量が高い場合、１０８ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐの発現量が低い場合、２００ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐの発現量が高い場合、死亡率は５０％超であるのに対して、ｍｉＲＮＡ４９７−５ｐの発現量が低い場合、死亡率は３０％未満（Ｐ＝０．４２）。
【０１０４】
さらに、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ（図４Ｋ）及びｍｉＲＮＡ４９７−５ｐ（図４Ｌ）は、ＨＥＲ２−乳がん患者の生存プロファイルを変化させなかった（Ｐ＝０．７９及び０．９１）。ＨＥＲ２−乳がん患者において、ｍｉＲＮＡ１５ａ−５ｐ（図４Ｈ）の発現量の高さは、このｍｉＲＮＡの発現量が低い患者に比べて全生存期間が長くなる傾向と関連していた（Ｐ＝０．３８）。
【０１０５】
ｍｉＲＮＡ１９５−５ｐ（図４Ｄ）の発現量は、ＨＥＲ２＋乳がん患者の生存プロファイルを変化させなかった。また、図１のｍｉＲｎｏｍｅ分析でアップレギュレーションが見られないｍｉＲＮＡ１５ｂ−５ｐ（図４Ｃ）の発現量の低さは、このｍｉＲＮＡの発現量の高い患者に比べて全生存期間が短くなる傾向と関連していた（Ｐ＝０．１７）。
【０１０６】
結論
生存分析から、ｍｉＲＮＡ１６−５ｐ、ｍｉＲＮＡ１５ａ、ｍｉＲＮＡ４２４−５ｐ、及びｍｉＲＮＡ４９７−５ｐの量の増加は、特にＨＥＲ２＋乳がんと診断された患者において、全生存期間が短くなることと関連していることが明らかとなった。
【０１０７】
実施例６：ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ５４２−５ｐの発現量に応じた乳がん患者の生存分析
材料及び方法
ＭＥＴＡＢＲＩＣ（乳腺腫瘍：１２６２件）にてオンラインのｍｉＲｐｏｗｅｒカプラン・マイヤープロッター（ｈｔｔｐ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐ＝ｓｅｒｖｉｃｅ＆ｃａｎｃｅｒ＝ｂｒｅａｓｔ＿ｍｉＲｎａ）を用いて、乳がん患者の全生存期間に対するｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ５４２−５ｐの影響を測定した。標的ｍｉＲＮＡの発現に基づいて、患者を２群に分けた。ＨＥＲ２陽性状態（分子サブタイプＨＥＲ２＋ＥＲに対する免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によりＨＥＲ２＋）又はＨＥＲ２−（トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）分子サブタイプ）乳がん患者のいずれかを分析した。
【０１０８】
結果
ｍｉＲＮＡ４５１ａ−３ｐ（図５Ｂ）、ｍｉＲＮＡ５４２−５ｐ（図５Ｃ）、及びｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ（図５Ａ）の量の高さは、これら３種類のｍｉＲＮＡの発現量が低い患者に比べて全生存期間が顕著に短くなることと関連していた。
【０１０９】
ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐの発現量が高い場合、１０８ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐの発現量が低い場合、２００ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ−６１５−３ｐの発現量が高い場合、死亡率は５０％超であるのに対して、ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐの発現量が低い場合、死亡率は３０％未満（Ｐ＝０．５４）。
【０１１０】
ｍｉＲＮＡ４５１ａ−３ｐ
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ４５１ａ−３ｐの発現量が高い場合、１０８ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−３ｐの発現量が低い場合、２００ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ４５１ａ−３ｐの発現量が高い場合、死亡率は５０％超であるのに対して、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−３ｐの発現量が低い場合、死亡率は４０％未満（Ｐ＝０．２６）。
【０１１１】
ｍｉＲＮＡ５４２−５ｐ
・生存期間中央値：ｍｉＲＮＡ５４２−５ｐの発現量が高い場合、１０８ヶ月であるのに対して、ｍｉＲＮＡ５４２−５ｐの発現量が低い場合、２００ヶ月超。
・全生存率：ｍｉＲＮＡ５４２−５ｐの発現量が高い場合、死亡率は５０％超であるのに対して、ｍｉＲＮＡ５４２−５ｐの発現量が低い場合、死亡率は３０％未満（Ｐ＝０．３１）。
【０１１２】
これらのｍｉＲＮＡの発現量は、ＨＥＲ２−乳がん患者の生存プロファイルを必ずしも変化させなかったため、上記傾向はＨＥＲ２＋乳がんに特異的であった（図５Ｄ〜Ｆ）。
【０１１３】
結論
生存分析から、ｍｉＲＮＡ６１５−３ｐ、ｍｉＲＮＡ４５１ａ−３ｐ、及びｍｉＲＮＡ５４２−５ｐの量の増加は、特にＨＥＲ２＋乳がんと診断された患者において、全生存期間が短くなることと関連していることが明らかとなった。
【０１１４】
実施例７：ＳＫＢＲ３細胞株及びＭＤＡＭＢ２３１細胞株におけるＨＥＲ２の発現及び活性化に対するｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐの役割
材料及び方法
実施例１に詳述した方法に従って、２０ｎＭ又は４０ｎＭの抗ｍｉＲ２９ｃ−３ｐ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、ＩＮＨ００８０）（アンタゴｍｉＲ）をＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において４８時間、７２時間、又は９６時間トランスフェクトし、ＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）並びにクラスリンの発現量をウエスタンブロットで解析し（図６Ａ）、定量化した（図６Ｂ及び図８）。７２時間目に、ＨＥＲ２ｍＲＮＡの発現量もｑＲＴ−ＰＣＲで分析した（図９）。
【０１１５】
実施例１に詳述した方法に従って、ＭＤＡＭＢ２３１（ＨＥＲ２−乳がん細胞株）において４８時間トランスフェクトし、ＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）並びにクラスリンの発現量をウエスタンブロットで解析し（図７Ａ）、定量化した（図７Ｂ）。
【０１１６】
結果
ＨＥＲ２に対するｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐの役割を調べるために、先ず、ＳＫＢＲ３及びＭＤＡＭＢ２３１において機能喪失及び機能獲得実験を行った。トランスフェクションの４８時間後、抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（２０ｎＭ）によりＨＥＲ２活性化が７０％低下し、それに付随してＨＥＲ２発現が５０％低下したことを認めた（図６）。一方、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ模倣物は、ＨＥＲ２活性化の６５％増加を誘導し、それに付随してＭＤＡＭＢ２３１におけるＨＥＲ２発現が１３０％増加した（図７）。両条件において、ＭＳＮ発現に対する影響はなかった（図６、図７）。また、トランスフェクションの７２時間及び９６時間後、経時的な影響により、ＨＥＲ２阻害率が７５％に達したことを報告した（図８）。さらに、抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐでトランスフェクトしたＳＫＢＲ３において、ＨＥＲ２発現の５０％低下がｑＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベル（ＨＥＲ２のｍＲＮＡ）で確認された（図９）。
【０１１７】
結論
抗ｍｉＲ２９ｃ−３ｐは、ＳＫＢＲ３細胞におけるＭＳＮ発現とは無関係に、ＨＥＲ２の発現及び活性化を強力に阻害した。反対に、ＭＤＡＭＢ２３１におけるｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ模倣物の異所性発現は、ＭＳＮ発現とは無関係に、ＨＥＲ２の発現及び活性化を増加させた。
【０１１８】
これらの結果から、ＨＥＲ２＋乳がん等のＨＥＲ２依存性がんの処置において、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐの活性を変化させる薬剤（抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ等）を使用できることが確認された。
【０１１９】
実施例８：ＢＴ４７４細胞株におけるＨＥＲ２の発現及び活性化に対するｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐの役割
材料及び方法
実施例１に詳述した方法に従って、２０ｎＭ又は４０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、ＩＮＨ００８０）（アンタゴｍｉＲ）をＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間トランスフェクトし、ＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）、Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）及びＥＲＫ（ｐＥＲＫ）の活性化、並びにクラスリンの発現量をウエスタンブロットで解析し（図１０Ａ）、定量化した（図１０Ｂ）。ＨＥＲ２のｍＲＮＡの発現量もｑＲＴ−ＰＣＲで解析した（図１１）。
【０１２０】
また、４０ｎＭ又は６０ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（Ｑｉａｇｅｎ社、ＹＩ０４１０５４６０、配列番号３０）（ＬＮＡ２９ｃ）又は６０ｎＭのコントロールＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、ＹＩ００１９９００６、配列番号３３）（ＬＮＡ  ＣＴＡ）をＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間トランスフェクトし、ＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）並びにクラスリンの発現量をウエスタンブロットで解析した（図１６）。
【０１２１】
結果
ＢＴ４７４において抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐにより誘導されたＨＥＲ２阻害を確認するために、活性化されたＨＥＲ２及びエストロゲン受容体量が多いＢＴ４７４細胞を用いた。トランスフェクションの７２時間後に、抗ｍｉＲ２９ｃ−３ｐ（４０ｎＭ）によりＨＥＲ２活性化が５０％低下し、それに付随してＨＥＲ２発現が２０％低下、Ａｋｔ活性化が６０％低下、ＥＲＫ活性化が３０％低下したことを確認した（図１０）。さらに、抗ｍｉＲ２９ｃ−３ｐでトランスフェクトしたＢＴ４７４において、ＨＥＲ２発現の２０％低下がｑＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベル（ＨＥＲ２のｍＲＮＡ）で確認された（図１１）。
【０１２２】
抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐにより誘導されたＨＥＲ２阻害についても、ＢＴ４７４細胞においてＬＮＡに基づく抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ及びネガティブコントロールの抗ｍｉＲＮＡを用いて試験を行った。ネガティブコントロールと比較すると、ＬＮＡに基づく抗ｍｉＲ２９ｃ−３ｐ（４０ｎＭ及び６０ｎＭ）により、トランスフェクションの７２時間後に、ＨＥＲ２活性化が３０％低下し、それに付随して４０ｎＭではＨＥＲ２発現が３５％低下した（図１６）。
【０１２３】
結論
ＭｉＲ２９ｃ−３ｐ阻害剤は、ＢＴ４７４細胞におけるＨＥＲ２の発現及び活性化を阻害した。
【０１２４】
これらの結果から、ＨＥＲ２＋乳がん等のＨＥＲ２依存性がんの処置において、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐの活性を変化させる薬剤（抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ等）を使用できることが確認された。
【０１２５】
実施例９：ＨＥＲ２の活性化に対するｍｉＲＮＡ２００ファミリーの役割
材料及び方法
実施例１に詳述した方法に従って、２０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ、及び８０ｎＭの抗ｍｉＲ２００ｂ−３ｐ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、ＩＮＨ０２５２）（図１２）、又は２０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ、８０ｎＭ、及び１００ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、ＩＮＨ０３８８）（図１３）（アンタゴｍｉＲ）をＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間トランスフェクトし、ＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）、ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）の活性化、並びにクラスリン又はエズリンの発現量をウエスタンブロットで解析し（図１２Ａ及び図１３Ａ）、定量化した（図１２Ｂ、１３Ｂ）。
【０１２６】
また、６０ｎＭのコントロールＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社、ＹＩ００１９９００６、配列番号３３）（ＬＮＡ  ＣＴＡ）又は３０ｎＭ若しくは６０ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（Ｑｉａｇｅｎ社、ＹＩ０４１０１２９０、配列番号３２）（ＬＮＡ４２９）をＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）において７２時間トランスフェクトし、ＨＥＲ２の活性化（ｐＹＨＥＲ２）及び発現（ＨＥＲ２）、Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）及びＥＲＫ（ｐＥＲＫ）の活性化、並びにクラスリンの発現量をウエスタンブロットで解析した（図１７）。
【０１２７】
結果
ＨＥＲ２に対するｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐの役割を調べるために、ＳＫＢＲ３において機能喪失及び機能獲得実験も行った。トランスフェクションの７２時間後、抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐにより、ＨＥＲ２活性化の用量依存的阻害が誘導され、８０ｎＭでは阻害率は４０％に達したが、ＨＥＲ２発現量に対する影響はないことを認めた（図１２）。また、ＳＫＢＲ３における抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐのトランスフェクションにより、ＨＥＲ２活性化の劇的な用量依存的阻害が誘導されたことが分かった。１００ｎＭでは阻害率が１００％に達し、それに付随してＨＥＲ２発現量が同様に低下した。また、抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐは用量依存的なｐＥＲＫ阻害も誘導し、阻害率は５０％に達した（図１３）。
【０１２８】
抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐにより誘導されたＨＥＲ２阻害についても、ＢＴ４７４細胞においてＬＮＡに基づく抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ及びネガティブコントロールの抗ｍｉＲＮＡを用いて試験を行った。ネガティブコントロールと比較すると、ＬＮＡに基づく抗ｍｉＲ４２９−３ｐ（３０ｎＭ及び６０ｎＭ）により、トランスフェクションの７２時間後に、ＨＥＲ２活性化が用量依存的に１６％及び６０％低下し、それに付随して６０ｎＭではＨＥＲ２発現が３０％低下し、Ａｋｔ活性化が４５％及び８５％阻害され、ＥＲＫ活性化が４０％及び６５％阻害された（図１７）。
【０１２９】
結論
ｍｉＲＮＡ２００ファミリーのうち、ｍｉＲＮＡ−２００ｂ−３ｐがＨＥＲ２の活性化を低下させることが明らかとなった。その一方で、ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐがＨＥＲ２の発現及び活性化を強力に阻害することが示された。
【０１３０】
これらの結果から、ＨＥＲ２＋乳がん等のＨＥＲ２依存性がんの処置において、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐの活性を変化させる薬剤（抗ｍｉＲＮＡ２００−３ｐ及び抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ等）を使用できることが確認された。
【０１３１】
実施例１０：ＨＥＲ２依存性細胞分裂に対するｍｉＲＮＡ２００ファミリーの役割
材料及び方法
実施例１に詳述した方法に従って、ＨＥＲ２を過剰発現するＢＴ４７４又はＳＫＢＲ３がん細胞株を、４０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ又は４０ｎＭ若しくは８０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐでトランスフェクトし、９６時間後にＭＴＴアッセイにより細胞増殖を測定した。未処置細胞をネガティブコントロールとして用いた。
【０１３２】
結果
図１４及び図１５に結果を示す。図から、４０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐは、トランスフェクションの９６時間後に、ＢＴ４７４細胞増殖の顕著な低下（２５％）を誘導したことが分かった。同様に、４０ｎＭ及び８０ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐは、トランスフェクションの９６時間後に、ＳＫＢＲ３細胞増殖の顕著な低下（４５％）を誘導した。
【０１３３】
結論
これらの結果から、抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ及び抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐは、ＨＥＲ２＋乳がん細胞株においてＨＥＲ２依存性細胞増殖を積極的にブロックできることが分かった。ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ阻害効果は、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ阻害よりも強かったが、これは、それによりＨＥＲ２のリン酸化がより強力に阻害されたことと一致している（実施例８）。
【０１３４】
これらの結果から、ＨＥＲ２＋乳がん等のＨＥＲ２依存性がんの処置において、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐの活性を変化させる薬剤（抗ｍｉＲＮＡ２００−３ｐ及び抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ等）を使用できることが確認された。
【０１３５】
実施例１１：インピーダンスベースの細胞増殖アッセイによるＨＥＲ２依存性細胞分裂に対するｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐの役割
材料及び方法
実施例１に詳述した方法に従って、ＨＥＲ２を過剰発現するＳＫＢＲ３（図１８）又はＢＴ４７４（図２０）がん細胞株を、６０ｎＭ若しくは１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（配列番号３０）又は１００ｎＭのコントロールＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ（配列番号３３）でトランスフェクトし、インピーダンスベースの細胞増殖アッセイによって細胞増殖を１４０時間又は１６８時間リアルタイムで測定した。
【０１３６】
結果
図１８及び図２０に結果を示す。図から、１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐが、播種の１４０時間後に、ＳＫＢＲ３細胞増殖の顕著な低下（３２％）を誘導したことが分かる。より大きく、６０ｎＭ及び１００ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐは、播種の１６８時間後に、ＢＴ４７４細胞増殖の顕著な低下（それぞれ、５２％及び７０％）を誘導した。
【０１３７】
結論
これらの結果から、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐは、ＨＥＲ２＋乳がん細胞株においてＨＥＲ２依存性細胞増殖を積極的にブロックできることが分かる。
【０１３８】
したがって、これらの結果から、ＨＥＲ２＋乳がん等のＨＥＲ２依存性がんの処置において、ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐの活性を変化させる薬剤（ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ等）を使用できることが分かる。
【０１３９】
実施例１２：インピーダンスベースの細胞アッセイによるＨＥＲ２依存性細胞分裂に対するｍｉＲＮＡ２００ファミリーの役割
材料及び方法
６０ｎＭ若しくは１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ（ＬＮＡ２００ｂ、配列番号３１）（図２０及び図２１）、コントロールＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ、配列番号３３）、又はＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（ＬＮＡ４２９、配列番号３２）（図２２及び図２３）をＢＴ４７４（図２０及び図２３）又はＳＫＢＲ３（図２１及び図２２）細胞（共に、ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）においてトランスフェクトし、インピーダンスベースの細胞増殖アッセイによって細胞増殖を１１３時間、１６０時間、又は１６８時間リアルタイムで測定した。
【０１４０】
さらに、０．１μＭ及び１μＭのホスホロチオエート修飾されたＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ（ＬＮＡ２００ｂ、配列番号３１）（図２４）、コントロールＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ（ＬＮＡ  ＣＴＡ、配列番号３３）、又はＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（ＬＮＡ４２９、配列番号３２）（図２５）をトランスフェクション試薬の非存在下、ＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳がん細胞株）に送達し、インピーダンスベースの細胞増殖アッセイによって細胞増殖を１９２時間リアルタイムで測定した。
【０１４１】
結果
結果から、４０ｎＭ及び６０ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐは、トランスフェクションの９６時間後及び播種の１６８時間後に、ＢＴ４７４細胞増殖の顕著な低下（２５％）を誘導したことが分かる。また、１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐは、ＢＴ４７４増殖の顕著な低下（５２％）を誘導した。ＳＫＢＲ３細胞において、６０ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐは、播種の１１３時間後に、増殖の顕著な低下（２５％）を誘導した。同様に、４０ｎＭ及び８０ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐは、トランスフェクションの９６時間後に、ＳＫＢＲ３細胞増殖の顕著な低下（４５％）を誘導し、６０ｎＭ及び１００ｎＭは、播種の１６０時間後に、ＳＫＢＲ３細胞増殖の顕著な低下（７５％）を誘導した。ＢＴ４７４細胞において、６０ｎＭ及び１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐは、播種の１６８時間後に、増殖の顕著な低下（それぞれ、８７％及び９２％）を誘導した。
【０１４２】
さらに、０．１μＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ（図２４）又はＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（図２５）をジムノシス送達（ｇｙｍｎｏｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）しても、ＢＴ４７４細胞増殖に影響はなかったが、それに対して、１μＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐは、処置の１４６時間後に、ＢＴ４７４細胞増殖の顕著な低下（３２％）を誘導した。同様に、１μＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐは、処置の１４６時間後に、ＢＴ４７４細胞増殖の顕著な低下（５８％）を誘導した。
【０１４３】
結論
これらの結果から、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ及びＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐは、２つの異なる阻害剤により、ＨＥＲ２＋乳がん細胞株においてＨＥＲ２依存性細胞増殖を積極的にブロックできることが分かった。さらに、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ及びＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐは、トランスフェクション剤の非存在下、ジムノシス送達（ｇｙｍｎｏｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）によって、ＨＥＲ２＋乳がん細胞株におけるＨＥＲ２依存性細胞増殖をブロックすることができる。ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ阻害効果は、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ阻害よりも強かったが、これは、それによりＨＥＲ２のリン酸化がより強力に阻害されたことと一致している（実施例８）。
【０１４４】
これらの結果から、ＨＥＲ２＋乳がん等のＨＥＲ２依存性がんの処置において、ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ４２９−３ｐの活性を変化させる薬剤（ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００−３ｐ及びＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ等）を使用できることが確認された。
【０１４５】
実施例１３：ＨＥＲ２非依存性細胞分裂に対するｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ２００ファミリーの無影響
材料及び方法
実施例１に詳述した方法に従って、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡＭＢ２３１乳がん細胞株を１００ｎＭのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ（配列番号３０）、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ（配列番号３１）、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐ（配列番号３２）又はコントロールＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ（配列番号３３）でトランスフェクトし、インピーダンスベースの細胞増殖アッセイによって細胞増殖を１６０時間リアルタイムで測定した（図２５）。
【０１４６】
結果
１００ｎＭの抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ、ＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ２００ｂ−３ｐ、又はＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡ４２９−３ｐは、播種の１６０時間後に、ＭＤＡＭＢ２３１細胞増殖の顕著な変化を全く誘導しなかった。
【０１４７】
結論
これらの結果から、抗ｍｉＲＮＡ２９ｃ−３ｐ又はｍｉＲＮＡ２００ファミリーのＬＮＡ抗ｍｉＲＮＡは、ＨＥＲ２陰性乳がん細胞株において細胞増殖に対して毒作用がないことが分かった。したがって、本発明の抗ｍｉＲＮＡは、ＨＥＲ２依存性がんに対して特異的な治療手段となる。
【図１】
2021501747.tif 000006
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
2021501747.tif 000010
【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2021501747.tif 000035
【図２３】
2021501747.tif 000036
【図２４】
2021501747.tif 000037
【図２５】
2021501747.tif 000038
【図２６】
2021501747.tif 000039
【図２７】
2021501747.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月26日(2020.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021501747000001.app
【国際調査報告】
2021501747.tif 000041
2021501747.tif 000042
2021501747.tif 000043
2021501747.tif 000044