(57)【要約】本開示は、微生物宿主中で組換え発現されたタンパク質の翻訳後修飾を修飾して、組換えタンパク質の１つまたは複数の特性を改善するための方法を企図している。微生物宿主において有利なＰＴＭを取込み、ＰＴＭのその他の望ましくない影響を回避しながら動物タンパク質を生産するための方法、タンパク質配列、および製品が本明細書で提供される。一部の実施形態では、本明細書の方法、成分、および得られる製品は、微生物宿主で産生される組換え動物タンパク質の栄養含量および／または栄養価を改善するためにＰＴＭの修飾を利用する。一部の実施形態では、栄養含量および／または栄養価は、微生物宿主によって産生された組換えタンパク質のグリコシル化を変更することによって改善される。
2021534763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
消費可能な組成物を生産する方法であって、
ａ．宿主細胞中で栄養タンパク質を組換え発現するステップであって、前記栄養タンパク質が、前記宿主細胞の外に分泌される、ステップ、
ｂ．前記宿主細胞中でα−１，２−マンノシダーゼを組換え発現するステップであって、前記α−１，２−マンノシダーゼが、前記宿主細胞から分泌された前記栄養タンパク質のグリコシル化を、５０％を上回って低減し、前記栄養タンパク質が、少なくとももう1つの成分と混合されて前記消費可能な組成物を形成する、ステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記α−１，２−マンノシダーゼが、配列番号７の配列、その機能的等価物、または配列番号７と８５％もしくはそれより高度に同一な配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記α−１，２−マンノシダーゼが、配列番号１５０の配列、その機能的等価物、または配列番号１５０と８５％もしくはそれより高度に同一な配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記消費可能な組成物の栄養含量が、対照組成物の栄養含量と同等またはそれより多く、前記対照組成物が、天然源から単離された同じタンパク質または前記α−１，２−マンノシダーゼによって修飾されていない組換え栄養タンパク質を使用して生産される、請求項１から３に記載の方法。
【請求項５】
前記栄養含量が、前記組成物のタンパク質含量である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記消費可能な組成物の前記タンパク質含量が、前記対照組成物より少なくとも５％高い、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記消費可能な組成物の前記タンパク質含量が、前記対照組成物より少なくとも１０％高い、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記消費可能な組成物の前記タンパク質含量が、前記対照組成物より少なくとも２０％高い、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞から分泌された前記栄養タンパク質の少なくとも７５％が、修飾されたグリコシル化パターンを有する、請求項１から５に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞から分泌された前記栄養タンパク質の少なくとも８０％が、修飾されたグリコシル化パターンを有する、請求項１から５に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞から分泌された前記栄養タンパク質の少なくとも９０％が、修飾されたグリコシル化パターンを有する、請求項１から５に記載の方法。
【請求項１２】
前記栄養タンパク質の熱安定性が、対照組成物と比較して増加し、前記対照組成物が、天然源から単離された同じタンパク質または前記α−１，２−マンノシダーゼによって修飾されていない前記組換え栄養タンパク質を使用して生産される、請求項１から１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項１から１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記栄養タンパク質の窒素の炭素に対する比が、その天然源から単離された栄養タンパク質の比と同等またはそれより大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記栄養タンパク質が動物タンパク質である、請求項１から１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記栄養タンパク質が鳥類のタンパク質である、請求項１から１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記栄養タンパク質が卵白タンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載の方法を使用して生産される、消費可能な組成物。
【請求項１９】
飲料である、請求項１８に記載の消費可能な組成物。
【請求項２０】
食料品である、請求項１８に記載の消費可能な組成物。
【請求項２１】
組換え栄養タンパク質の発現のために使用される宿主細胞であって、
ａ．栄養タンパク質の発現を駆動する第１のプロモーター、
ｂ．配列番号７もしくは１５０の配列、その機能的等価物、または配列番号７もしくは１５０と８５％もしくはそれより高度に同一な配列を有するα−１，２−マンノシダーゼの発現を駆動する第２のプロモーターを含み、
前記栄養タンパク質のマンノシル化が、前記α−１，２−マンノシダーゼの発現の結果として低減される、宿主細胞。
【請求項２２】
真菌または酵母である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記栄養タンパク質および前記α−１，２−マンノシダーゼが、１つまたは複数の発現カセットを使用して発現される、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記栄養タンパク質および前記α−１，２−マンノシダーゼが、別個の発現構築物で発現される、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記栄養タンパク質が、前記宿主細胞の外に分泌される、請求項２１から２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記分泌された栄養タンパク質が、対照組成物と比較して同等のまたはそれより多い栄養含量を有し、前記対照組成物が、天然源から単離された同じタンパク質または前記α−１，２−マンノシダーゼによって修飾されていない組換え栄養タンパク質を使用して生産される、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記栄養含量が、前記タンパク質含量である、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記分泌された栄養タンパク質が、様々な程度のグリコシル化を有する、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記分泌された栄養タンパク質の少なくとも５０％が、修飾されたグリコシル化パターンを有する、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
異種宿主細胞中で産生された組換え動物タンパク質および１つまたは複数の追加の成分を含む消費可能な組成物であって、
前記動物タンパク質が、消費可能な組成物における使用に適したレベルのグリコシル化を含み、前記動物タンパク質が、前記消費可能な組成物に１つまたは複数の食料機能的特徴を提供する、消費可能な組成物。
【請求項３２】
栄養タンパク質をコードする第１の核酸およびα−１，２−マンノシダーゼをコードする第２の核酸を含む微生物であって、
前記α−１，２−マンノシダーゼが、前記微生物に対して異種であり、前記α−１，２−マンノシダーゼが、前記栄養タンパク質のグリコシル化構造を修飾することが可能である、微生物。
【請求項３３】
前記栄養タンパク質が、食料成分として、または食品として使用される、請求項３２に記載の微生物。
【請求項３４】
前記α−１，２−マンノシダーゼが、配列番号１５０、配列番号７、またはそれらに対して８０％より高い相同性を有する配列のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の微生物。
【請求項３５】
前記第１および第２の核酸配列が、１つまたは複数の発現カセットに含有される、請求項３２に記載の微生物。
【請求項３６】
Ｐｉｃｈｉａ種である、請求項３２に記載の微生物。
【請求項３７】
前記α−１，２−マンノシダーゼがＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓのα−１，２−マンノシダーゼである、請求項３２に記載の微生物。
【請求項３８】
前記α−１，２−マンノシダーゼがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのα−１，２−マンノシダーゼであり、前記微生物がＰｉｃｈｉａ種である、請求項３２に記載の微生物。
【請求項３９】
前記栄養タンパク質が卵白タンパク質である、請求項３２から３８のいずれかに記載の微生物。
【請求項４０】
前記卵白タンパク質が、配列番号１１〜２６のいずれか１つのアミノ酸配列またはそれに対して８０％を上回る相同性を有する任意の配列を含む、請求項３９に記載の微生物。
【請求項４１】
前記核酸配列の少なくとも１つが前記微生物中における発現のためにコドン最適化されている、請求項３２から４０のいずれかに記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年８月２１日出願の米国仮特許出願第６２／７２０，７８５号（代理人整理番号４９１６０−７１２．１０１）の利益を主張する。その開示全体は参照により本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
特にヒトおよび動物による消費のためのタンパク質を創製して、安全性、有効性、および栄養価の向上をもたらすための方法を特定することが必要とされている。微生物宿主におけるタンパク質の産生はタンパク質の生産の価値あるツールであり得る。しかし、組換えタンパク質のペプチド骨格の翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、タンパク質の酵素としての有効性、安全性、精製の容易さ、分泌、および／または発現レベルに影響することがある。
【０００３】
例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが産生した異種タンパク質は、「超マンノシル化」されていること、即ちそのペプチド骨格のグリコシル化部位が延長されたマンノシル基の分枝（時には１００マンノース基を上回る）を保有し得ることが知られている（Ser  Huy  Teh,1  Mun  Yik  Fong,2  and  Zulqarnain  Mohamed,1,3  Genet  Mol  Biol.  2011  Jul-Sep;  34(3):  464-470）。そのような異常なグリコシル化は、異種タンパク質が治療用途を意図している場合には、免疫源となる危険を生じることがある。
【０００４】
一部の例では、ＰＴＭは組換えタンパク質の意図された用途に有益であることもあるが、宿主のＰＴＭが望ましくない有害な共有結合を生じる場合がある。所望のＰＴＭプロファイルを発現し、有害な特徴を避けながらＰＴＭの有益な態様を利用する改善された方法で、特にヒトおよび動物による消費のためのタンパク質を創製するための方法を特定することが必要とされている。
参照による組み込み
本明細書中で言及された全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個々に参照によって取り込まれると示されるのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ser  Huy  Teh,1  Mun  Yik  Fong,2  and  Zulqarnain  Mohamed,1,3  Genet  Mol  Biol.  2011  Jul-Sep;  34(3):  464-470
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微生物宿主において有利なＰＴＭを取込み、ＰＴＭのその他の望ましくない影響を回避しながら動物タンパク質を生産するための方法、タンパク質配列、および製品が本明細書で提供される。一部の実施形態では、本明細書の方法、成分、および得られる製品は、微生物宿主で産生される組換え動物タンパク質の栄養含量および／または栄養価を改善するためにＰＴＭの修飾を利用する。一部の実施形態では、栄養含量および／または栄養価は、微生物宿主によって産生された組換えタンパク質のグリコシル化を変更することによって改善される。
【０００７】
一部の実施形態では、組換えタンパク質はヒトまたは動物による消費のための食料、栄養、またはその他の製品に使用が見出される。一部の実施形態では、組換えタンパク質は１つまたは複数の工業プロセスにおける使用のための酵素であってよい。
【０００８】
消費可能な組成物を生産する方法が本明細書で提供される。本方法は、宿主細胞中で栄養タンパク質を組換え発現するステップを含み、栄養タンパク質は宿主細胞の外に分泌され得る。本方法は、宿主細胞中でα−１，２−マンノシダーゼを組換え発現するステップも含み得る。α−１，２−マンノシダーゼは、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、５０％を上回って低減し得る。栄養タンパク質は、少なくとももう1つの成分と混合されて消費可能な組成物を形成し得る。
【０００９】
α−１，２−マンノシダーゼは、配列番号７の配列、その機能的等価物、または配列番号７と８５％もしくはそれより高度に同一な配列相同性を有し得る。α−１，２−マンノシダーゼは、配列番号１５０の配列、その機能的等価物、または配列番号１５０と８５％もしくはそれより高度に同一な配列相同性を有し得る。
【００１０】
消費可能な組成物の栄養含量は、対照組成物の栄養含量と同等またはそれより多くてよく、対照組成物は、天然源から単離された同じタンパク質またはα−１，２−マンノシダーゼによって修飾されていない組換え栄養タンパク質を使用して生産される。
【００１１】
栄養含量は、組成物のタンパク質含量であってよい。消費可能な組成物のタンパク質含量は、対照組成物より少なくとも５％多くてよい。消費可能な組成物のタンパク質含量は、対照組成物より少なくとも１０％多くてよい。消費可能な組成物のタンパク質含量は、対照組成物より少なくとも２０％多くてよい。
【００１２】
宿主細胞から分泌された栄養タンパク質の少なくとも５０％は、修飾されたグリコシル化パターンを有し得る。宿主細胞から分泌された栄養タンパク質の少なくとも７５％は、修飾されたグリコシル化パターンを有し得る。宿主細胞から分泌された栄養タンパク質の少なくとも８０％は、修飾されたグリコシル化パターンを有し得る。宿主細胞から分泌された栄養タンパク質の少なくとも９０％は、修飾されたグリコシル化パターンを有し得る。
【００１３】
修飾されたグリコシル化パターンを有する栄養タンパク質の熱安定性は、対照組成物と比較して増加し得、対照組成物は、天然源から単離された同じタンパク質またはα−１，２−マンノシダーゼによって修飾されていない組換え栄養タンパク質を使用して生産される。
【００１４】
宿主細胞はＰｉｃｈｉａ種、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓであってよい。
【００１５】
栄養タンパク質の窒素の炭素に対する比は、その天然源から単離された栄養タンパク質の比と同等またはそれより大きくてよい。
【００１６】
栄養タンパク質は動物タンパク質であってよい。栄養タンパク質は鳥類のタンパク質であってよい。栄養タンパク質は卵白タンパク質であってよい。
【００１７】
一部の実施形態では、消費可能な組成物は、本明細書に記載した方法を使用して生産され得る。消費可能な組成物は飲料であってよい。消費可能な組成物は食料品であってよい。
【００１８】
一部の実施形態では、組換え栄養タンパク質の発現のために使用される宿主細胞が本明細書で提供される。宿主細胞は、栄養タンパク質の発現を駆動する第１のプロモーター（promoter）および配列番号７もしくは１５０の配列、その機能的等価物、または配列番号７もしくは１５０と８５％もしくはそれより高度に同一な配列を有するα−１，２−マンノシダーゼの発現を駆動する第２のプロモーターを含み得る。栄養タンパク質のマンノシル化は、α−１，２−マンノシダーゼの発現の結果として低減され得る。宿主細胞は真菌または酵母であってよい。宿主細胞はＰｉｃｈｉａ種、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓであってよい。
【００１９】
栄養タンパク質およびα−１，２−マンノシダーゼは、１つまたは複数の発現カセットを使用して発現され得る。栄養タンパク質およびα−１，２−マンノシダーゼは、別個の発現構築物で発現され得る。
【００２０】
栄養タンパク質は宿主細胞の外に分泌され得る。分泌された栄養タンパク質は、対照組成物と比較して同等またはそれより多い栄養含量を有してよく、対照組成物は、天然源から単離された同じタンパク質またはα−１，２−マンノシダーゼによって修飾されていない組換え栄養タンパク質を使用して生産される。
【００２１】
栄養含量は、タンパク質含量であってよい。分泌された栄養タンパク質は、様々な程度のグリコシル化を有し得る。分泌された栄養タンパク質の少なくとも５０％は、修飾されたグリコシル化パターンを有し得る。
【００２２】
消費可能な組成物が本明細書で提供される。消費可能な組成物は、異種宿主細胞中で産生された組換え動物タンパク質および１つまたは複数の追加の成分を含み得る。動物タンパク質は、消費可能な組成物における使用に適したレベルのグリコシル化を含み得る。動物タンパク質は、消費可能な組成物に１つまたは複数の食料機能的特徴を提供し得る。
【００２３】
一部の実施形態では、栄養タンパク質をコードする第１の核酸およびα−１，２−マンノシダーゼをコードする第２の核酸を含む微生物が本明細書で提供される。α−１，２−マンノシダーゼは、微生物に対して異種であってよく、α−１，２−マンノシダーゼは、栄養タンパク質のグリコシル化構造を修飾することが可能であり得る。
【００２４】
栄養タンパク質は、食料成分として、または食品として使用し得る。α−１，２−マンノシダーゼは、配列番号１５０、配列番号７、またはそれらに対して８０％もしくは８５％より高い相同性を有する配列のアミノ酸配列を含み得る。
【００２５】
第１および第２の核酸配列は、１つまたは複数の発現カセットに含有され得る。微生物はＰｉｃｈｉａ種であってよい。α−１，２−マンノシダーゼはＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓのα−１，２−マンノシダーゼであってよい。α−１，２−マンノシダーゼはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのα−１，２−マンノシダーゼであってよく、微生物はＰｉｃｈｉａ種であってよい。
【００２６】
栄養タンパク質は卵白タンパク質であってよい。卵白タンパク質は、配列番号１１〜２６のいずれか１つのアミノ酸配列またはそれに対して８０％の相同性を有する任意の配列を含み得る。核酸配列の少なくとも１つは微生物中における発現のためにコドン最適化され得る。
【００２７】
一部の実施形態では、微生物宿主中で発現された組換え動物タンパク質は、栄養価を有し、それ自体で使用してもよいし、または栄養源として組成物において使用してもよい。一部の実施形態では、異種発現されたタンパク質は動物またはヒトのタンパク質の栄養源である。本明細書における一部の実施形態では、組換え動物タンパク質のグリコシル化の修飾によって、そのグリコシル化構造の修飾を伴わずに微生物宿主細胞で発現された同じ組換えタンパク質と比較して、タンパク質中の窒素の炭素に対する比が変更される。一部の実施形態では、グリコシル化の修飾によって、その天然に存在する源からのタンパク質と比較して、組換え動物タンパク質の栄養価が変更されるかまたは増加する。
【００２８】
一部の実施形態では、組換え動物タンパク質は酵素活性を有する。一部の実施形態では、組換え動物タンパク質は工業プロセスにおける使用のための機能性を有する。一部の実施形態では、組換え動物タンパク質のグリコシル化の修飾によって、そのグリコシル化構造の修飾を伴わずに発現された同じタンパク質と比較して、組換えタンパク質の１つまたは複数の機能的特性は、強化される、低減される、またはそれ以外の方法で変更される。
【００２９】
本明細書の方法の一部の実施形態では、ステップは、１つまたは複数のグリコシル化酵素を変更する、欠失させる、または追加することによって微生物宿主のグリコシル化機構を変更するステップを含む。一部の実施形態では、微生物宿主のグリコシル化機構の変更は、改善された栄養含量または改善された栄養価を有する組換えタンパク質の産生をもたらす。一部の実施形態では、本方法における使用のための微生物宿主は糸状菌である。一部の実施形態では、微生物宿主はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（現在Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉとして知られている）である。
【００３０】
本明細書における一部の実施形態では、組換え発現された動物タンパク質の栄養含量または栄養価は、微生物宿主中でアルファ−１，２−マンノシダーゼ（α−１，２−マンノシダーゼ）を発現させることによっても改善される。本方法の一部の実施形態では、ステップは、糸状菌宿主細胞中で動物タンパク質を組換え発現するステップ、同じ宿主細胞中でアルファ−１，２−マンノシダーゼ（α−１，２−マンノシダーゼ）を組換え発現するステップ、および宿主から組換え動物タンパク質を単離するステップを含む。本発明の一部の実施形態では、組換え発現のための微生物は、グリコシル化機構の２つまたはそれより多くの成分において変更される。そのような変更には、例えば酵母宿主におけるＯＣＨ１の欠失またはノックアウトが含まれ得る。
【００３１】
本方法の一部の実施形態では、組換え動物タンパク質は宿主細胞から分泌され、α−１，２−マンノシダーゼは宿主細胞から分泌されない。本方法の一部の実施形態では、α−１，２−マンノシダーゼはいずれの異種分泌シグナルまたは異種細胞内標的配列も伴わずに発現され、組換え動物タンパク質は分泌シグナル配列またはその他のアミノ酸配列を伴って発現され、それにより動物タンパク質の分泌がもたらされる。この場合には宿主が非天然局在化シグナルを認識するので、α−１，２−マンノシダーゼは細胞内部に保持される。α−１，２−マンノシダーゼは細胞内部で組換え発現された動物タンパク質に作用し、変更されたグリコシル化修飾を有する組換え動物タンパク質が分泌される。本方法の一部の実施形態では、分泌された動物タンパク質はマンノシダーゼおよびその他の微生物関連タンパク質とは別に単離され得る。本方法の一部の実施形態では、組換え動物タンパク質は宿主細胞の外部の成長培地から単離される。
【００３２】
本方法の一部の実施形態では、α−１，２−マンノシダーゼは微生物宿主細胞に対して異種である。α−１，２−マンノシダーゼは真菌源、鳥類源、または哺乳動物源からのものであり得る。一部の実施形態では、α−１，２−マンノシダーゼはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉに由来する。他の実施形態では、α−１，２−マンノシダーゼは種Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ等の鳥類の種に由来する。一部の実施形態では、２種またはそれより多くの種のα−１，２−マンノシダーゼタンパク質が本方法において組換え発現される。２種またはそれより多くの種のα−１，２−マンノシダーゼタンパク質は同じ種、同様の種、または異なる種に由来し得る。一部の実施形態では、発現のための１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼタンパク質は、配列番号１〜１０、もしくは１４５〜１５１、配列番号１５２〜１５３によってコードされるアミノ酸配列、またはそれらに対して少なくとも８０％もしくは８５％の相同性を有する配列のいずれか１つもしくは複数である。
【００３３】
一部の実施形態では、１つまたは複数のα−１，２−マンノシダーゼは、組換え動物タンパク質もまた組換え発現した宿主細胞中で発現される。一部の実施形態では、微生物は、１つまたは複数の発現カセットに含有される第１および第２の核酸配列を含有する。これらのカセットは、宿主ゲノムの中の１種または複数の部位において相同のまたは非相同の組換えによって組み込まれ得る。一部の実施形態では、第１および第２の核酸配列は同じ発現カセットに含有される。他の実施形態では、第１および第２の核酸配列は別個の発現カセットに含有され、これらの別個のカセットは宿主ゲノム中にともに、個別に、共存して、または連続的に、組み込まれ得る。
【００３４】
一部の実施形態では、第１の核酸は異種プロモーターをさらに含有する。一部の実施形態では、第２の核酸は異種プロモーターを含有する。一部の実施形態では、第１および第２の核酸はそれぞれ異種プロモーターを含有し、そのようなプロモーターは互いに同じであるかまたは異なってよい。
【００３５】
α−１，２−マンノシダーゼおよび組換え動物タンパク質を発現するための本明細書の方法には、酵母を含む種々の宿主微生物が含まれる。本方法の一部の実施形態では、微生物はメチロトローフ酵母である。一部の実施形態では、酵母はＰｉｃｈｉａ  ｓｐ．またはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｓｐ．である。一部の実施形態では、酵母はＰｉｃｈｉａ  ＰａｓｔｏｒｉｓまたはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉである。
【００３６】
本明細書で提供する方法は、改善された栄養含量または改善された栄養価を有する組換え動物タンパク質の生産に適している。一部の実施形態では、改善された栄養含量または改善された栄養価によって、組換え動物タンパク質の窒素の炭素に対する比が変更される。一部の実施形態では、組換え動物タンパク質の窒素の炭素に対する比は約０．２５、約０．３、約０．３５、および／または約０．４より大きい。一部の実施形態では、組換え動物タンパク質は、その天然に存在する源から単離されたときの動物タンパク質と比較して、同等のまたは低減したグリコシル化度を有している。
【００３７】
一部の実施形態では、組換え動物タンパク質は、その天然に存在する源から単離されたときのタンパク質と比較して、マンノシル化において同等であるかまたは低減している。一部の実施形態では、組換え産生された動物タンパク質は、１つまたは複数のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２残基を含有する。一部の実施形態では、組換え動物タンパク質は、タンパク質に付随するＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の割合より大きい割合のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有している。一部の実施形態では、組換え動物タンパク質はＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎｙＧｌｃＮＡｃ２に対する比が１より大きく、ＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２のＸは１、２、３、４、および５から選択される整数、ならびに、ＭａｎｙＧｌｃＮＡｃ２のＹは６より大きくまたはこれと同等の整数である。一部の実施形態では、Ｙは６、７、８、９、および１０から選択される整数である。１つまたは複数のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２残基を有する１種または複数種の組換え動物タンパク質を含有する組成物が本明細書で提供され、組換えタンパク質は改善された栄養含量または改善された栄養価を有する。一部の実施形態では、改善された栄養含量または改善された栄養価は、約０．２５、約０．３０、約０．３５、または約０．４より大きいかこれと同等の窒素の炭素に対する比の組換え動物タンパク質を有することを含む。
【００３８】
本明細書に記載した組成物は、食料品、栄養補給剤、栄養粉末、または消費できるドリンクとして調合することができる。本明細書に記載した組成物は動物用飼料または飼料サプリメントとしても調合することができる。
【００３９】
本明細書の方法および組成物の一部の実施形態では、組換え動物タンパク質は組換え卵白タンパク質である。一部の実施形態では、卵白タンパク質はオボムコイド（ＯＶＤ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、オボグロブリン、β−オボムチン、α−オボムチン、およびリゾチームのうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、組換え動物タンパク質は組換え卵白タンパク質であり、タンパク質産生のための宿主細胞はＰｉｃｈｉａである。一部の実施形態では、組換え動物タンパク質は組換え卵白タンパク質であり、Ｐｉｃｈｉａ中の発現タンパク質のグリコシル化構造は、組換え卵白タンパク質の窒素の炭素に対する比が天然に存在する鶏卵から単離されたときの卵白タンパク質と同等かこれより大きくなるように修飾される。一部の実施形態では、組換え動物タンパク質は組換え卵白タンパク質であり、Ｐｉｃｈｉａ中の発現タンパク質のグリコシル化構造は、タンパク質の栄養価がその天然源からのタンパク質と実質的に同じかそれより良いように修飾される。
【００４０】
一部の実施形態では、組換え卵白タンパク質は、天然に存在する鶏卵から単離されたときの卵白タンパク質と比較して同等のまたはそれより低減したグリコシル化度を有している。一部の実施形態では、組換え卵白タンパク質は、天然に存在する鶏卵から単離されたときの卵白タンパク質と比較してマンノシル化において同等のまたはそれより低減している。一部の実施形態では、組換え卵白タンパク質は１つまたは複数のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２残基を含有する。一部の実施形態では、組換え卵白タンパク質は、卵白タンパク質に付随するＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２の割合より大きい割合のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有している。一部の実施形態では、組換え卵白タンパク質は、ＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎｙＧｌｃＮＡｃ２に対する比が１より大きく、ＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２のＸは１、２、３、４、および５から選択される整数、ならびに、ＭａｎｙＧｌｃＮＡｃ２のＹは６より大きくまたはこれと同等の整数である。一部の実施形態では、Ｙは６、７、８、９、および１０から選択される整数である。
【００４１】
本明細書で提供する方法は、組換え卵白タンパク質の窒素の炭素に対する比が約０．２５、約０．３、約０．３５および／または約０．４より大きい組換え卵白タンパク質の生産に適している。一部の実施形態では、組成物は第２の卵白タンパク質を含有し、第２の卵白タンパク質は天然卵白タンパク質、組換え卵白タンパク質、または第２のタンパク質のグリコシル化構造および／または窒素の炭素に対する比を変更するように修飾された卵白タンパク質（天然または組換え）であってよい。本明細書に記載された方法によって生産された組成物は、食料品、栄養補給剤、栄養粉末、または消費できるドリンクとして調合することができる。
【００４２】
一部の実施形態では、変更された窒素の炭素に対する比を有する組換え卵白タンパク質は、オボムコイド、オボアルブミン、オボグロブリン、β−オボムチン、α−オボムチン、シスタチン、オボインヒビター、およびリゾチームである。一部の実施形態では、変更された窒素の炭素に対する比による組換え卵白タンパク質は、配列番号１１〜２６で示されるタンパク質またはそれに対して少なくとも８０％の相同性を有する配列のいずれか１つまたは複数である。
【００４３】
本発明の新規な特徴を、特に添付した特許請求の範囲において説明する。本発明の原理を利用した実例的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および付随する図面（本明細書においてまた「図」および「ＦＩＧ．」）を参照することにより、本発明の特徴および利点がより良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１Ａ〜図１Ｄは、ＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２の部分構造を示す。
【００４５】
【図２】図２は、トランスジーンに作動可能に連結したプロモーターを含む例示的ベクターを示す。
【００４６】
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、試料中に存在するそれぞれのグリコフォームの相対量を示す試料の質量分析の結果を示す。
【００４７】
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、親株であるＳＦ１７（ａ）およびＳＦ２２（ｂ）における株１と比較した株２（ＴｒＭＤＳ２発現株）のＳＤＳ−Ｐａｇｅバンドパターンを示す。２つの株は同様の量のＯＶＤを産生する。株１は、これまでのところＫ．ｐｈａｆｆｉｉで見られる（ａ）で標識された７つの主バンドを有する特徴的なＯＶＤパターンを産生する。バンド６および７を例外として全ての主バンドはシフトしているようである。
【００４８】
【図５】図５は、Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉの共通のＮ−グリコシル化パターンを示す。四角はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を示し、円はマンノース（Ｍａｎ）を示す。
【００４９】
【図６】図６は、ＴｒＭＤＳ２とＧｇＭＡＮ１Ａ１の脱グリコシル化機能の比較を示す。
【００５０】
【図７】図７は、ＴｒＭＤＳ２とＧｇＭＡＮ１Ａ１の共発現の結果を示す。
【００５１】
【図８】図８は、ＨｓＯＲＭ１を発現する個別の形質転換体の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【００５２】
【図９】図９Ａ〜図９Ｃは、ＨｓＯＲＭ１のＴｒＭＤＳ２誘導脱グリコシル化のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果および形質転換に使用したベクターの概略図を示す。
【００５３】
【図１０】図１０は、オボアルブミン（ＯＶＡ）の脱グリコシル化のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【００５４】
【図１１】図１１は、天然ＯＶＡおよび変性ＯＶＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【００５５】
【図１２】図１２は、ＴｒＭＤＳ２によるＯＶＡの脱グリコシル化のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【００５６】
【図１３】図１３は、ＧｇＯＶＤ上のＭＤＳ１の脱グリコシル化活性の欠損の結果を示す。
【００５７】
【図１４】図１４は、ＧｇＯＶＤ上のＴｒＭＤＳ２の脱グリコシル化活性の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本明細書で提供する方法、核酸、発現構築物、微生物、組成物、および方法は、宿主中で組換え動物タンパク質を発現し、発現されたタンパク質のグリコシル化を修飾するためのツール、方法、および組成物を提供する。本明細書で企図する１つのそのような宿主は、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．（現在Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｓｐ．と再分類されている）である。本開示は、本明細書に記載した方法のいずれか１つまたは複数におけるＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等のＰｉｃｈｉａ種のグリコシル化機構を修飾することを企図している。
【００５９】
本開示は、組換えタンパク質のグリコシル化を修飾して、タンパク質の１つもしくは複数の機能的特徴および／またはその産生を変更または強化することを企図している。
【００６０】
そのような修飾によって、グリコシル化機構の修飾が存在しない宿主微生物中で産生された組換えタンパク質と比較して高い栄養価を有する組換えタンパク質を作製することができる。組換え動物タンパク質は、グリコシル化機構の修飾が存在しない宿主微生物中で産生された組換えタンパク質と比較して、および／またはその天然源もしくは別の異種宿主から産生された同じタンパク質と比較して、より高い窒素の炭素に対する比を有し得る。そのような修飾により、１種または複数種のタンパク質の組換え発現に呼応して、グリコシル化機構の修飾が存在しない宿主中で産生された組換えタンパク質と比較して、改善された発現、分泌、精製を有する組換えタンパク質を作製することができる。そのような修飾により、１種または複数種のタンパク質の組換え発現に呼応して、グリコシル化機構の修飾が存在しない宿主微生物中で産生された組換えタンパク質と比較して、改善された酵素の機能性または活性を有する組換えタンパク質を作製することができる。
【００６１】
酵母宿主中におけるグリコシル化をもたらす１つのアプローチは、「外部鎖伸長」とみなされるものにおけるグリカン構造のマンノシル化をさらに延長するために必要なステップとしてのコアＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２基質（図１Ｃ）に対するゴルジにおける必要なＯＣＨ１タンパク質のアルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を利用する。ＯＣＨ１機能が破壊されたノックアウトまたは変異体では、マンノシル化はゴルジにおけるこの土台の基質を超えて進行することができず、超マンノシル化は排除される。
【００６２】
一部の実施形態では、酵母宿主はＯＣＨ１機能をノックアウトするように修飾され得る。一部の実施形態では、酵母宿主はＯＣＨ１機能の部分的破壊またはノックダウンを有するように修飾され得る。
【００６３】
あるいは、またはさらに、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのアルファ−１，２−マンノシダーゼ等のＥＲに存在する異種マンノシダーゼ、またはその他の同様に機能性の酵素をノックインして、新生ポリペプチドがゴルジに移行する前にグリカンをＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造に切断し、それによりＯＣＨ１の効率的なアルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性に必要なＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２基質を効率的に排除することもできる。ＯＣＨ１のアルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性はＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２基質に特異的で、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造には特異的でないことが示唆されてきた。したがって、ゴルジに移行した、ペプチド結合ＥＲ処理グリカン構造の大部分がＥＲに存在する異種アルファ−１，２−マンノシダーゼの活性によってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造に切断されれば、ＯＣＨ１活性が効率的に排除される可能性がある。この論理に従い、野生型に対して変更されたグリコシル化を有する微生物を作製する単純化された方法が本明細書で開示され、微生物は１種または複数種の異種アルファ−１，２−マンノシダーゼを含むのみであり、一部の実施形態では、完全に機能的な野生型ＯＣＨ１も保持している。
【００６４】
種々の実施形態では、グリコシル化の均質性（即ち、そのペプチド骨格上にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造のみを保有するタンパク質の割合）は、異種マンノシダーゼの発現を制御することによって調整することができる。一部の実施形態では、宿主微生物は１種または複数種の異種アルファ−１，２−マンノシダーゼを発現する。異種アルファ−１，２−マンノシダーゼは真菌起源、鳥類起源、および／または哺乳動物起源であってよい。異種アルファ−１，２−マンノシダーゼは、配列番号７のＭＤＳ２酵素等のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉからのものである。一部の実施形態では、異種アルファ−１，２−マンノシダーゼは、配列番号１５０等のＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ等のニワトリからのものである。他の実施形態では、ある種のアルファ−１，２−マンノシダーゼは、配列番号１〜１０および配列番号１４５〜１５０に対応するタンパク質、配列番号１５１〜１５２によってコードされるアミノ酸配列から選択されるが、これらに限定されない。
【００６５】
一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号１〜１０または配列番号１４５〜１５１のいずれかと８０％、８５％、またはそれを上回る配列同一性を有する配列を有し得る。一部の例では、配列同一性は９０％、９５％、９８％を上回り得る。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号１５２〜１５３のいずれかと８０％、８５％、またはそれを上回る配列同一性を有する配列を有する核酸配列によってコードされ得る。いくつかの例では、ヌクレオチド配列同一性は９０％、９５％、９８％を上回り得る。異種マンノシダーゼは、配列番号７と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％を上回る配列同一性を有するマンノシダーゼであってよい。異種マンノシダーゼは、配列番号１５０と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％を上回る配列同一性を有するマンノシダーゼであってよい。
【００６６】
使用するマンノシダーゼは、配列番号１〜１０または配列番号１４５〜１５１のいずれかを有する酵素の機能的等価物または機能的断片であってよい。本明細書で使用する場合、「機能的断片」は、全長のタンパク質の酵素活性を実質的に保持している酵素のポリペプチド断片を意味する。マンノシダーゼは、配列番号７の実質的に等価な機能的断片であってよい。マンノシダーゼは、配列番号１５０の実質的に等価な機能的断片であってよい。「実質的に」は全長のα−１，２−マンノシダーゼの少なくとも約４０％、または好ましくは少なくとも約５０％もしくはそれを上回る酵素活性を意味する。
【００６７】
ある種のアルファ−１，２−マンノシダーゼは、標的タンパク質に対して他よりも効率的な活性を有し得る。一部の実施形態では、２種もしくはそれより多くの種の異種アルファ−１，２−マンノシダーゼが組換え発現される。２種もしくはそれより多くの種のアルファ−１，２−マンノシダーゼは同じ起源、同様の起源、または異なる起源からであってよい。
【００６８】
本明細書に記載した２つまたはそれより多くの介入の組合せをさらに使用して、組換えタンパク質の超マンノシル化を低減させることができる。例えば、ＯＣＨ１の変異、欠失、またはその他の低減したもしくは排除された発現を含有する株において組換えタンパク質とともに宿主中で組換えアルファ−１，２−マンノシダーゼを発現させることができる。
【００６９】
他の実施形態では、１種または複数種の異種アルファ−１，２−マンノシダーゼを発現する結果として生じる微生物は、同じ微生物においてこれも異種タンパク質として発現される（配列番号１１〜２６に対応するタンパク質またはペプチド部分配列から選択されるがこれらに限定されない）１つまたは複数の標的タンパク質の所望の均質性および／またはグリコシル化度の低減をもたらすように設計される。
【００７０】
本明細書の一部の実施形態では、組換えアルファ−１，２−マンノシダーゼは、宿主中で１種または複数種の組換えタンパク質の発現とともに発現される。本明細書の一部の実施形態では、１種または複数種の組換えタンパク質の発現とともに組換えアルファ−１，２−マンノシダーゼを発現させることは、改善された栄養価または改善された栄養含量を有する組換えタンパク質をもたらす。本明細書の一部の実施形態では、１種または複数種の組換えタンパク質の発現とともに組換えアルファ−１，２−マンノシダーゼを発現させることは、その天然に存在する源から、および／または異なる異種宿主から単離されたときのタンパク質と同等のまたはそれより大きい窒素の炭素に対する比を有する組換えタンパク質を提供する。組換えタンパク質は宿主細胞の外に分泌され得る。
【００７１】
組換えタンパク質は栄養タンパク質であり得る。栄養タンパク質は、所望の量の必須アミノ酸を含有するタンパク質であり得る。栄養タンパク質は重量で少なくとも３０％の必須アミノ酸を含み得る。栄養タンパク質は重量で少なくとも４０％の必須アミノ酸を含み得る。栄養タンパク質は重量で少なくとも５０％の必須アミノ酸を含み得る。栄養タンパク質は食用形態で天然に存在するタンパク質またはタンパク質の断片を含むか、またはこれらからなってよい。栄養タンパク質は動物タンパク質であり得る。栄養タンパク質は鳥類のタンパク質であり得る。栄養タンパク質は卵白タンパク質であり得る。
【００７２】
本明細書の一部の実施形態では、組換えアルファ−１，２−マンノシダーゼは１種または複数種の卵白タンパク質の発現とともに宿主で発現される。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、配列番号１１〜２６のいずれかと８０％またはそれを上回る配列同一性を有する配列を有し得る。一部の例では、配列同一性は９０％、９２％、９５％、９８％を上回り得る。
【００７３】
本明細書の一部の実施形態では、１種または複数種の卵白タンパク質の発現とともに組換えアルファ−１，２−マンノシダーゼを発現させることは、改善された栄養価を有する卵白タンパク質を提供する。本明細書の一部の実施形態では、１種または複数種の卵白タンパク質の発現とともに組換えアルファ−１，２−マンノシダーゼを発現させることは、天然に存在する鶏卵から単離されたときの卵白タンパク質と同等のまたはそれより大きい窒素の炭素に対する比を有する卵白タンパク質を提供する。
【００７４】
栄養タンパク質は、栄養タンパク質に加えて異種マンノシダーゼ酵素を発現する宿主細胞中で組換えによって産生され得る。あるいは、組換え栄養タンパク質を、本明細書に記載したマンノシダーゼで処理してもよい。結果として生じる組換えタンパク質は、グリコシル化が低減されたタンパク質または脱グリコシル化されたタンパク質であり得る。
【００７５】
低減されたグリコシル化または脱グリコシル化は、組換え糖タンパク質が本明細書に記載したように修飾された微生物中で発現されたとき、野生型の微生物の非修飾株と比較して、組換え糖タンパク質上の炭水化物部分の大きさが低減し、特にマンノース残基が少ないことを指し得る。「脱グリコシル化された」タンパク質は、マンノシダーゼの存在下に生成されず、別段マンノシダーゼに曝露されない同じタンパク質のＮ連結グリコシル化のレベルと比較して、少なくとも約１０パーセント（例えば、１０パーセント、２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、または１００パーセント）低減したＮ連結グリコシル化のレベルを有し得る。
【００７６】
１種またはそれより多くの種のタンパク質のグリコシル化を低減するために使用される酵素は、マンノシダーゼ、より好ましくはアルファ−１，２−マンノシダーゼを含み得る。酵素は、宿主細胞から分泌された組換えタンパク質のグリコシル化を低減し得る。例えば、組換えタンパク質の画分は酵素によって脱グリコシル化され得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、１％を上回って低減し得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、５％を上回って低減し得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、１０％を上回って低減し得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、２０％を上回って低減し得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、３０％を上回って低減し得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、４０％を上回って低減し得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、５０％を上回って低減し得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、６０％を上回って低減し得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、７５％を上回って低減し得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、８０％を上回って低減し得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、９０％を上回って低減し得る。酵素は、宿主細胞から分泌された栄養タンパク質のグリコシル化を、９５％を上回って低減し得る。
【００７７】
グリコシル化度または単一のタンパク質におけるグリカン単位の数は、宿主細胞中で修飾され得る。組換えタンパク質のグリコシル化度は、対照タンパク質のグリコシル化度の９０％未満であってよい。組換えタンパク質のグリコシル化度は、対照タンパク質のグリコシル化度の８０％未満であってよい。組換えタンパク質のグリコシル化度は、対照タンパク質のグリコシル化度の７５％未満であってよい。組換えタンパク質のグリコシル化度は、対照タンパク質のグリコシル化度の５０％未満であってよい。組換えタンパク質のグリコシル化度は、対照タンパク質のグリコシル化度の３０％未満であってよい。組換えタンパク質のグリコシル化度は、対照タンパク質のグリコシル化度の２０％未満であってよい。組換えタンパク質のグリコシル化度は、対照タンパク質のグリコシル化度の１５％未満であってよい。組換えタンパク質のグリコシル化度は、対照タンパク質のグリコシル化度の１０％未満であってよい。組換えタンパク質のグリコシル化度は、対照タンパク質のグリコシル化度の５％未満であってよい。組換えタンパク質のグリコシル化度は、対照タンパク質のグリコシル化度の１％未満であってよい。
組換えタンパク質を含む組成物
【００７８】
消費可能な組成物は１種または複数種の組換えタンパク質を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「消費可能な組成物」は、単離された組換えタンパク質を含み、ヒトおよびその他の哺乳動物を含むが、これに限定されない動物によって消費され得る組成物を指す。消費可能な食料組成物は、非限定的な例として食品、飲料製品、栄養補助食品、食品添加物、および機能性食品を含む。消費可能な組成物は組換えタンパク質に加えて１つまたは複数の成分を含み得る。１つまたは複数の成分（component）は、食料品、飲料などを形成するのに使用する成分（ingredient）、溶媒を含み得る。例えば、組換えタンパク質は、溶媒と混合して飲料を生産し、または他の添加物と混合して食品を形成することができる粉末の形態であってよい。
【００７９】
脱グリコシル化組換えタンパク質の栄養含量は、同一量の対照タンパク質の栄養含量より高くてよい。対照タンパク質は組換えによって産生されるがマンノシダーゼで処理されていない同じタンパク質であってよい。対照タンパク質は異種マンノシダーゼを発現しない宿主細胞中で組換え産生された同じタンパク質であってよい。対照タンパク質は天然に存在する源から単離された同じタンパク質であってよい。例えば、対照タンパク質はＯＶＤ、ＯＶＡ、または天然卵白から単離することができる他のタンパク質等の単離された卵白タンパク質であってよい。
【００８０】
組換え栄養タンパク質を含む組成物の栄養含量は、対照タンパク質を含む組成物の栄養含量より多くてよい。栄養含量は、タンパク質のタンパク質含量であってよい。組成物のタンパク質含量は、対照タンパク質を含む組成物のタンパク質含量より約１％〜８０％多くてよい。組成物のタンパク質含量は、対照タンパク質を含む組成物のタンパク質含量より約１％〜５％多くてよい。組成物のタンパク質含量は、対照タンパク質を含む組成物のタンパク質含量より約１％〜１０％多くてよい。組成物のタンパク質含量は、対照タンパク質を含む組成物のタンパク質含量より約１％〜２０％多くてよい。組成物のタンパク質含量は、対照タンパク質を含む組成物のタンパク質含量より約１％〜５０％多くてよい。組成物のタンパク質含量は、対照タンパク質を含む組成物のタンパク質含量より約１％〜８０％多くてよい。組成物のタンパク質含量は、対照タンパク質を含む組成物のタンパク質含量より約５％〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜３０％、５〜５０％、５〜８０％多くてよい。組成物のタンパク質含量は、対照タンパク質を含む組成物のタンパク質含量より約１０％〜８０％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜５０％、１０〜７０％、１０〜８０％多くてよい。組成物のタンパク質含量は、対照タンパク質を含む組成物のタンパク質含量より約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％多くてよい。
【００８１】
組成物のタンパク質含量は従来の方法を使用して測定し得る。例えば、タンパク質含量は、燃焼による窒素の定量を使用し、次いで変換係数を使用して試料中のタンパク質の量を推定し、続いて乾燥物質のパーセンテージ（ｗ／ｗ）を計算することによって測定し得る。
【００８２】
脱グリコシル化タンパク質の窒素の炭素に対する比は、対照タンパク質の窒素の炭素に対する比より高くてよい。組換えタンパク質の窒素の炭素に対する比は約０．１より大きいかまたはこれと同等であってよい。脱グリコシル化タンパク質の窒素の炭素に対する比は対照タンパク質の窒素の炭素に対する比より大きくてよい。組換えタンパク質の窒素の炭素に対する比は約０．２５より大きいかまたはこれと同等であってよい。組換えタンパク質の窒素の炭素に対する比は約０．３より大きいかまたはこれと同等であってよい。組換えタンパク質の窒素の炭素に対する比は約０．３５より大きいかまたはこれと同等であってよい。組換えタンパク質の窒素の炭素に対する比は約０．４より大きいかまたはこれと同等であってよい。組換えタンパク質の窒素の炭素に対する比は約０．５より大きいかまたはこれと同等であってよい。
【００８３】
脱グリコシル化タンパク質の溶解度は対照タンパク質の溶解度より大きくてよい。脱グリコシル化タンパク質を含む組成物の溶解度は対照タンパク質を含む組成物の溶解度より大きくてよい。脱グリコシル化タンパク質の熱安定性は対照タンパク質の熱安定性より高くてよい。
【００８４】
組換えタンパク質のグリコシル化度は生産される消費可能な組成物に依存し得る。例えば、消費可能な組成物は、組成物のタンパク質含量を増加させるために低いグリコシル化度を含み得る。あるいは、組成物中のタンパク質の溶解度を増加させるために、グリコシル化度は高くてよい。
異種発現したアルファ−１，２−マンノシダーゼを保有する微生物
【００８５】
以下は、異種アルファ−１，２−マンノシダーゼを発現する微生物の構築の概略を示す。
【００８６】
本明細書において「アルファ−１，２−マンノシダーゼ」は、（図１に示す結合に関する）部分構造としてＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２（式中、ｘ≧６）を含有するグリカン構造におけるマンノース基の間のアルファ−１，２−グリコシド結合の切断を触媒すると認識される任意のタンパク質を指す。リスト中に表されるポリヌクレオチド配列またはその部分配列のいずれかによってコードされるこれらのタンパク質に対するアルファ−１，２−マンノシダーゼの例には、配列番号１〜１０および配列番号１４５〜１５１または配列番号１５２〜１５３によってコードされるものが含まれる。
【００８７】
真核生物においては、小胞体（ＥＲ）で合成される前駆体オリゴ糖構造（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）は、Ｎ−グリコシル化として知られているものの最初のステップでポリペプチドのアスパラギン残基に（コンセンサスＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−ＴｈｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ部位において。式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）付加することができる。ＥＲの管腔において、前駆体オリゴ糖が切断されてそれぞれ結合したＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖のグルコース残基が除去される（図１Ａ）。さらにマンノース基が除去されてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２コア構造が生じる（図１Ｂ）。このコア構造は、糖タンパク質のゴルジへの移行に際してさらに処理される。酵母のゴルジにおいては、この処理には、最終的には完全に処理されたタンパク質に超マンノシル化グリカン基を生じ得るマンノシル基のさらなる付加を開始するために必要なステップにおいてＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２コア構造に作用するＯＣＨ１、即ちアルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの活性が関与している。図１Ｄは、アルファ−１，２−マンノシダーゼによるアルファ−１，２−グリコシド結合におけるＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２が切断されるときに生じ得る産物であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を示す。Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２と異なり、ＯＣＨ１は基質としてのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に対して効率的なアルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を保有しない。三角：グルコース、四角：Ｎ−アセチルグルコサミン、円：マンノース。
【００８８】
本明細書において微生物の「形質転換」は、微生物へのポリヌクレオチドの導入を指す。
【００８９】
本明細書において「形質転換体」は、形質転換された微生物を指す。
【００９０】
本明細書において「トランスジーン」は、微生物中に含有されれば遺伝子産物を形成することができるポリヌクレオチドを指す。
【００９１】
本明細書において「発現カセット」は、トランスジーンをコードする部分配列を含有し、微生物中に含有されたときにその部分配列を発現させることができ、その微生物に対して異種である任意のポリヌクレオチドである。
【００９２】
本明細書において「プロモーター」は、トランスジーンの上流または５’に位置し、発現カセットが微生物中に含有されたときにそのトランスジーンからの転写の開始に関与する発現カセットのポリヌクレオチド部分配列を指す。
【００９３】
本明細書において「糖タンパク質」は、そのペプチド骨格に共有結合した炭水化物を保有するタンパク質を指す。
【００９４】
本明細書において「グリコフォーム」は、ペプチド結合した多糖の異なる構造によってそれぞれが他から区別される糖タンパク質のいくつかの異なる形態のいずれかを指す。
【００９５】
一部の実施形態では、宿主微生物は、宿主中のタンパク質として発現されるときにそのグリカン基の異種アルファ−１，２−マンノシダーゼによる変更の意図された標的である１つまたは複数の安定に組み込まれた異種トランスジーンを保有する。本明細書においてそのようなトランスジーンを「標的タンパク質」と称する。
【００９６】
Ａ．発現カセットを含有するベクターの合成
【００９７】
形質転換されるアルファ−１，２−マンノシダーゼを含有する発現カセットを保有するベクターを最初に作製する。一部の実施形態では、多数の発現カセットを保有するベクターの上で、または別個のベクターの上で、多数の異なるアルファ−１，２−マンノシダーゼを形質転換することができる。本明細書に記載される発現カセットは、化学合成、分子クローニングもしくは組換え方法、ＤＮＡもしくは遺伝子アセンブリ方法、人工遺伝子合成、ＰＣＲ、またはそれらの任意の組合せを使用して取得され得る。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当該分野で周知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を産生するために、本明細書で提供される配列、および市販のＤＮＡ合成機を使用できる。組換え方法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドが、適切なクローニングベクターまたは発現ベクター中に挿入され得、クローニングベクターまたは発現ベクターは、次に、複製および増幅のために適切な宿主細胞中に導入され得る。適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築され得るか、または当該分野で入手可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは、使用が意図される宿主細胞に従って変動し得るが、有用なクローニングベクターは、自己複製する能力を一般に有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を有し得、および／または発現ベクターを含有するクローンを選択する際に使用され得るマーカーについての遺伝子を運搬し得る。クローニングおよび発現ベクターを得るための方法は周知である（例えば、Green  and  Sambrook,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  4th  edition,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  New  York  (2012)を参照）。
【００９８】
図２に、これらの手段によって創製されたベクターの例を提供する。図２は、トランスジーン（図２のＴ．ｒｅｅｓｅｉ  アルファ−１，６−マンノシダーゼ  １−Ｔ．Ｒ．  ＭＤＳ１）に作動可能に連結したプロモーター（図２のＦＢＡ１プロモーター）を含有するベクター（Ａ）を記載している。ベクターは、インフレームでトランスジーンと融合したＨＤＥＬ  ＥＲ保持シグナルをコードするＣ末端配列（図２のＨＤＥＬ）をさらに含む。ベクターは、ターミネーターエレメント（図２のＡＯＸ１ターミネーター）をさらに含む。これらのエレメントを本明細書でまとめて「発現カセット」と称するが、一部の実施形態では、シグナルペプチドを設計に含めることもできる。一部の実施形態では、ＥＲ保持シグナルは存在しても存在しなくてもよい。宿主微生物中に形質転換する前に、ベクターの増幅を補助するために当業者はベクター中に含有される複製起点（Ｅ）に依拠してもよい（図２のＯＲＩ）。発現ベクターを含有しない微生物からの発現ベクターで安定的に形質転換された微生物の選択を補助するために、当業者はプロモーターエレメントの下流のベクター中に含有される選択マーカー（Ｆ）に依拠してもよい（図２のゼオシン耐性遺伝子）。発現ベクターは、宿主ゲノムへの発現ベクターの安定な組込みを容易にするために、宿主微生物への形質転換の前に発現ベクターの直線化を可能にする制限酵素部位（Ｇ）（図２のＳｗａI）を含有することもできる。図２において、エレメントＥ、Ｆは、ＣＲＥ／ｌｏｘ組換えによって介在する領域の切除を触媒することができる隣接するＬｏｘＰ部位の存在のために、当業者によって形質転換後にその遺伝子上の位置から除去してもよい（https://en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_recombination）。一般には、発現カセットは、同族宿主微生物のゲノムに組み込まれたときにトランスジーンの転写を媒介するように設計される。図２の発現ベクターを含むエレメントについてはこの宿主微生物はＰｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓであるが、他の実施形態では、この宿主生物は任意の微生物であってよく、当業者は発現ベクターをそのゲノムに導入することができ、それにより発現ベクター中のエレメントは細胞に認識され、転写およびそれに続く転写物の意図した全長のタンパク質へのプロセシングが十分に誘導される。一部の実施形態では、トランスジーンは宿主生物中における最適の発現のためにコドン最適化してよい。
【００９９】
発現ベクターの遺伝子エレメントは、意図された微生物宿主における当業者による発現に適するように設計することができる。一部の実施形態では、追加的なベクターおよび／または追加的なエレメントが、（当業者によって必要と認められれば）形質転換の特定の方法を補助するために設計し得る（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９に基づく方法のためのＣＡＳ９およびｇＲＮＡベクター）。
【０１００】
プロモーターエレメント（Ａ）は、これらに限定されないが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含み得る。プロモーターには、これらに限定されないが、ａｃｕ−５、ａｄｈ１＋、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ４）、ＡＨＳＢ４ｍ、ＡＩＮＶ、ａｌｃＡ、α−アミラーゼ、代替オキシダーゼ（ＡＯＤ）、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）、アルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）、ＡＸＤＨ、Ｂ２、ＣａＭＶ、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）、ｃｃｇ−１、ｃＤＮＡ１、細胞フィラメントポリペプチド（ｃｆｐ）、ｃｐｃ−２、ｃｔｒ４＋、ＣＵＰ１、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）、エノラーゼ（ＥＮＯ、ＥＮＯ１）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）、ＦＭＤ、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤＨ）、Ｇ１、Ｇ６、ＧＡＡ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ＧＡＬ４、ＧＡＬ５、ＧＡＬ６、ＧＡＬ７、ＧＡＬ８、ＧＡＬ９、ＧＡＬ１０、ＧＣＷ１４、ｇｄｈＡ、ｇｌａ−１、α−グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ、ＧＡＰ、ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ１）、グリセロールキナーゼ（ＧＵＴ１）、ＨＳＰ８２、ｉｎｖｌ＋、イソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ１）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＩＬＶ５）、ＫＡＲ２、ＫＥＸ２、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ４）、ＬＥＵ２、ｍｅｌＯ、ＭＥＴ３、メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）、ｎｍｔ１、ＮＳＰ、ｐｃｂＣ、ＰＥＴ９、ペルオキシン８（ＰＥＸ８）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ、ＰＧＫ１）、ｐｈｏ１、ＰＨＯ５、ＰＨＯ８９、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＩＳ１）、ＰＹＫ１、ピルビン酸キナーゼ（ｐｋｉ１）、ＲＰＳ７、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）、３−ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳＥＲ１）、ＳＳＡ４、ＳＶ４０、ＴＥＦ、翻訳伸長因子１アルファ−（ＴＥＦ１）、ＴＨＩ１１、ホモセリンキナーゼ（ＴＨＲ１）、ｔｐｉ、ＴＰＳ１、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、ＸＲＰ２、ＹＰＴ１、ＧＣＷ１４、ＧＡＰ、配列番号３１〜４７から選択される配列または部分配列、およびそれらの任意の組合せが含まれる。一部の実施形態では、使用されるヌクレオチドは、配列番号３１〜４７のいずれかと８０％またはそれを上回る配列同一性を有する配列を有し得る。一部の例では、配列同一性は９０％、９５％、９８％を上回り得る。
【０１０１】
本明細書に記載したマンノシダーゼを発現するために使用されるプロモーターは、宿主細胞に異種であってよい。本明細書に記載したマンノシダーゼを発現するために使用されるプロモーターは、宿主細胞由来であってよい。本明細書に記載したマンノシダーゼを発現するために使用されるプロモーターは、構成的または誘導性であってよい。α−１，２−マンノシダーゼの発現を駆動するために強力なプロモーターを使用してよい。例えば、高いタンパク質含量が望まれる場合には、ベクターは、組換えタンパク質の脱グリコシル化度を増加させるために強力なプロモーターを含んでよい。あるいは、α−１，２−マンノシダーゼの発現を駆動するために、弱いプロモーターを使用してもよい。例えば、低い脱グリコシル化度が必要な場合には、マンノシダーゼの発現を駆動するために弱いプロモーターを使用してもよい。
【０１０２】
宿主細胞は、組換え栄養タンパク質の発現を駆動する第１のプロモーターおよびα−１，２−マンノシダーゼの発現を駆動する第２のプロモーターを含み得る。第１および第２のプロモーターは、本明細書で提供するプロモーターのリストから選択してよい。一部の例では、α−１，２−マンノシダーゼおよび組換え栄養タンパク質の発現は、同じプロモーターに由来し得る。あるいは、第１および第２のプロモーターは異なってよい。
【０１０３】
シグナルペプチド（Ｂ）  本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをさらにコードし得る。シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、シグナルペプチド、輸送ペプチド、リーダー配列またはリーダーペプチドとしても公知のシグナルペプチドは、タンパク質またはポリヌクレオチドの分泌を支持し得る。宿主細胞からの、組換えタンパク質または異種的に発現されたタンパク質の細胞外分泌は、タンパク質の精製を促進し得る。シグナルペプチドは、タンパク質の前駆体（例えば、プレプロペプチド、プレタンパク質）に由来し得る。シグナルペプチドは、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＨＯ１）、アルブミン（例えば、ニワトリ）、細胞外アルカリプロテアーゼ（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＸＲＰ２）、α−接合因子（α−ＭＦ、ＭＡＴα）（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アミラーゼ（例えば、α−アミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ推定アミラーゼＳＰＣＣ６３．０２ｃ（Ａｍｙ１））、β−カゼイン（例えば、ウシ）、炭水化物結合モジュールファミリー２１（ＣＢＭ２１）−デンプン結合ドメイン、カルボキシペプチダーゼＹ（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  Ｃｐｙ１）、セロビオヒドロラーゼＩ（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＣＢＨ１）、ジペプチジルプロテアーゼ（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ推定ジペプチジルプロテアーゼＳＰＢＣ１７１１．１２（Ｄｐｐ１））、グルコアミラーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、ヒートショックタンパク質（例えば、細菌Ｈｓｐ７０）、ヒドロホビン（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＨＢＦＩ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＨＢＦＩＩ）、イヌラーゼ、インベルターゼ（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２）、キラータンパク質またはキラー毒素（例えば、１２８ｋＤａ  ｐＧＫＬキラータンパク質、Ｋ１キラー毒素のα−サブユニット（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ１毒素ＫＩＬＭ１、Ｋ２８プレプロ毒素、Ｐｉｃｈｉａ  ａｃａｃｉａｅ）、ロイシン−リッチ人工シグナルペプチドＣＬＹ−Ｌ８、リゾチーム（例えば、ニワトリＣＬＹ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｅ）（例えば、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｐ因子（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  Ｐ３）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｄｓｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｅｘｇ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｐｉｒ１、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｓｃｗおよび細胞壁タンパク質Ｐｉｒ４（内部リピートを有するタンパク質）が含まれるがこれらに限定されないタンパク質の前駆体に由来し得る。シグナルペプチドの例は、配列番号４８〜１４４から選択される配列または部分配列、およびそれらの任意の組合せを含むこともできる。一部の��施形態では、シグナルペプチドは存在しない。一部の実施形態では、シグナルタンパク質またはシグナルペプチドは、配列番号４８〜１４４のいずれかと８０％またはそれを上回る配列同一性を有する配列を有し得る。一部の例では、配列同一性は９０％、９５％、９８％を上回り得る。
ＥＲ標的化／保持シグナル
【０１０４】
このモチーフは、結果として生じるタンパク質のＥＲへの保持のシグナルを示す。ＥＲ保持シグナルはタンパク質の前駆体（例えば、プレプロペプチド、プレタンパク質）に由来し得る。ＥＲ保持シグナルは、これらに限定されないが、アミノ酸配列ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、または配列番号１〜１０もしくは１４５〜１４９に含有される部分配列によってコードされ得る膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むタンパク質の前駆体に由来し得る。ＥＲ保持シグナルは典型的にはトランスジーンＯＲＦのＣ末端にインフレームで融合しているが、一部の実施形態では、それが存在する場合にはシグナルペプチドの切断部位のすぐ下流にあるトランスジーンのＮ末端にインフレームで融合し得る。一部の実施形態では、ＥＲ保持シグナルは存在しない。一部の実施形態では、アルファ−１，２−マンノシダーゼ等の発現されたタンパク質はＥＲの中に保持されているか、または異種タンパク質の分子内脱グリコシル化を提供するためにＥＲ保持シグナルを必要としない。
【０１０５】
トランスジーン（Ｃ）は、これらに限定されないが、配列番号１〜３０または１４５〜１５０からなるリストから選択されるポリヌクレオチド等の、ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。これらの配列は、同じタンパク質をコードするように変更され、選択された宿主における発現のために最適化（即ちコドン最適化）されるように設計することができ、例えばアルファ−１，２−マンノシダーゼをコードし、コドン最適化された形態の配列番号１５１〜１５２の核酸配列であり得る。
【０１０６】
本例におけるターミネーターエレメント（Ｄ）はＡＯＸ１ターミネーターであるが、トランスジーンに対応するｍＲＮＡを含有する新生転写物の伸長の継続を中止させるように働く任意の好適な配列であるように選択され得る。
【０１０７】
選択可能なマーカー（Ｆ）は、これらに限定されないが、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ゼオシン、アンピシリン、ブラスチシジン、カナマイシン、ノーセオスリシン、クロラムフェニコール（chloroamphenicol）、テトラサイクリン、トリクロサン、ガンシクロビル、およびそれらの任意の組合せ）、栄養素要求性マーカー（例えば、ｆ  ａｄｅ１、ａｒｇ４、ｈｉｓ４、ｕｒａ３、ｍｅｔ２、およびそれらの任意の組合せ）を含み得る。
ベクターによる微生物宿主の形質転換
【０１０８】
次に、発現ベクターに由来する発現カセットをコードする遺伝情報を含有する発現ベクターまたはポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が宿主細胞に挿入され、成功した形質転換体のクローン集団が当技術分野で公知の任意の手段によって単離され得る。
【０１０９】
アルファ−１，２−マンノシダーゼをコードする部分配列を含有する発現カセットを保有するポリヌクレオチドによる、当業者による形質転換に適した微生物。これらには、Ａｒｘｕｌａ  ｓｐｐ．、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、Ｅｎｄｏｔｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｄｏｔｈｉａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ、Ｍｕｃｏｒ  ｓｐｐ．、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｌｔｒｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉおよびＫｏｍａｇａｔｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
細胞は、例えば、直接的取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ接合、ＰＥＧ媒介性プロトプラスト融合、ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性形質転換、微粒子銃形質転換、化学的形質転換またはエレクトロポレーションによって外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、形質転換され得る。一旦導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非組込み発現ベクター（例えば、プラスミド）として細胞内に維持され、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。（発現ベクターに保有される耐性遺伝子によって）ある種の薬剤（例えば、抗生物質ゼオシン）に対する耐性を付与する遺伝子を保有しない細胞を陰性選択する、その薬剤を含有する寒天プレートに播種することによって、外因性発現ベクターを取り込む細胞について細胞集団を選択することができる。
【０１１１】
あるいは、必須代謝物（例えば、ウラシル）の合成に必要な遺伝子（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＵＲＡ３遺伝子）をノックアウトすることによって栄養素要求性株を創製し、選択マーカーとしてノックアウト（即ちＵＲＡ３遺伝子）を補う遺伝子を含有する発現ベクターを使用してこの株を形質転換し、この必須代謝物を欠く培地上で成長する能力によって形質転換された細胞を選択することができる。
【０１１２】
（当業者には公知のように）手作業で選択することができるコロニーの成長に適した時間および温度で推定される形質転換体を含有する細胞の集団をひろげたプレートをインキュベートした後、いずれかのアプローチで個別のコロニーを採取し、当分野における熟練者には公知の標準的な分子生物学的方法（即ちコロニーＰＣＲ、ゲノムシーケンシング）によって、宿主細胞ゲノム中への発現ベクターの組込みを検証することができる。次いでこれらのプレートからの個別のコロニーを使用して、形質転換された発現ベクター中に含有される選択マーカー（複数可）に適切なものとして選択される選択剤を含有する細胞系に適した成長培地を含有する個別の培養容器に接種することができる。適切な時間（例えば、振盪フラスコ中３０℃で一夜、別段、当分野における熟練者に公知）の後、組換えベクターによる細胞系の成功した形質転換は、形質転換された発現カセットのトランスジーンによってコードされるタンパク質（以後、「組換えタンパク質」と称する）の存在によってそれぞれの培養容器中で決定することができる。この発現は、標準的な分子生物学的方法（例えば、ウェスタンブロット、公知の標準タンパク質を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決定することができる。次いで組換えタンパク質の発現を示す培養容器に対応するプレートからのコロニーを使用して、細胞系の成長および組換えタンパク質の発現を促進する形質転換された細胞系に適した選択培地を含有する容器に接種することができる。あるいは、組換えタンパク質の発現を示した培養容器に対応するプレートからのコロニーを後日の使用のために（例えば、グリセロールストック中、−８０℃で）保存することができる。
形質転換された株の有効性の決定
【０１１３】
アルファ−１，２−マンノシダーゼをコードする組み込まれたトランスジーンで安定に形質転換されたことが確認された結果として生じた株は、内因性のまたは異種発現した標的タンパク質のグリコシル化に対するその発現の影響について試験される。
【０１１４】
親の野生型株または異種アルファ−１，２−マンノシダーゼを含有する親株で発現したタンパク質の発現および精製は、当業者には公知である。例えば、（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ等の）メチロトローフ酵母株において、これが強い過発現のためにメタノール誘導性プロモーター（即ちＡＯＸ１）に作動可能に連結されれば、標的タンパク質を誘導することができる。この標的タンパク質がシグナルペプチドも含有していれば、これを培地から回収し、当業者には公知の技術を使用して分析のために十分に精製することができる。一般には、アルファ−１，２−マンノシダーゼを用いてまたは用いずに（本明細書で「対照タンパク質」と称する）細胞から精製したタンパク質試料の間で、または天然源から単離した同じタンパク質と比較して、目的のタンパク質（例えば、標的タンパク質）に存在するグリカン基を比較することができる。試料調製および比較のそのような尺度は、これらに限定されないが、目的のタンパク質の大きさの比較のためのキャピラリー電気泳動またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、グリカン特異的抗体を使用する免疫染色技術（例えば、ウェスタンブロット）、および試料中のグリカン基を同定する定量的質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ）によるＮ連結グリカンのプロファイリング）等の方法を含む技術を使用して実施することができる。例えばZiv  Roth,  Galit  Yehezkel,  and  Isam  Khalaila  International  Journal  of  Carbohydrate  Chemistry  Volume  2012  (2012)を参照されたい。
【０１１５】
一部の実施形態では、組換え発現された卵白タンパク質について、ＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２のＭａｎｙＧｌｃＮＡｃ２に対する比の値が計算され得る。一部の例では、ｘの値は１、２、３、４、もしくは５より小さいかまたはこれと同等であってよい。一部の例では、ｙの値は６、７、８、９、もしくは１０より大きくまたはこれと同等であってよい。一部の例では、ＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２：ＭａｎｙＧｌｃＮＡｃ２の比は１より大きくてよい。一部の実施形態では、組換え発現された卵白タンパク質は９より小さいかまたはこれと同等である重合度を有し得る。一部の例では、重合度は９、８、７、または６より小さくてよい。
【０１１６】
以下の例は、標的タンパク質（即ち配列番号１２に相当するタンパク質）に存在するグリカン基を決定するための試料の調製および分析の概略を示す。一部の実施形態では、標的タンパク質またはペプチドは、配列番号１２のいずれかと８０％またはそれを上回る配列同一性を有する配列を有し得る。一部の例では、配列同一性は９０％、９５％、または９８％を上回り得る。
【０１１７】
一部の実施形態では、組換え卵白タンパク質は、０．２５を上回る窒素の炭素に対する（ＮのＣに対する）比を有し得る。一部の例では、組換え発現されたタンパク質のＮのＣに対する比は約０．２５、約０．３、約０．３５、または約０．４を上回り得る。
【０１１８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳによるＮ連結グリカンのプロファイリング
【０１１９】
３００μｇに対応するそれぞれの試料のアリコートを分析に使用することができる。糖タンパク質を還元し、アルキル化し、次いでＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中のトリプシンで一夜消化する。プロテアーゼ消化の後、試料をＣ１８セップパックカートリッジに通し、低重量パーセンテージの酢酸で洗浄して、糖ペプチドを低濃度酢酸中のイソプロパノールのブレンドで溶出し、ＳｐｅｅｄＶａｃにて乾燥する。乾燥した糖ペプチド溶出物をＰＮＧアーゼＦで処理してＮ連結グリカンを放出させ、消化物をＣ１８セップパックカートリッジに通してＮグリカンを回収する。
【０１２０】
Ｎ連結グリカンの過Ｏ−メチル化
【０１２１】
質量分析による構造解析のために、Ｎ連結グリカンを過メチル化する（Anumula  and  Taylor,  1992）。簡潔に述べると、乾燥した溶出物をジメチルスルホキシドに溶解し、ＮａＯＨおよびヨウ化メチルでメチル化する。反応を水で停止し、過Ｏ−メチル化された炭水化物を塩化メチレンで抽出し、Ｎ２下に乾燥する。
【０１２２】
マトリックス支援レーザー脱離飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ）によるプロファイリング
【０１２３】
過メチル化されたグリカンをメタノールに溶解し、α−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）マトリックスとともに結晶化する。試料中に存在するグリカンの分析は、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  ５８００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳによって実施する。
【０１２４】
図３Ａおよび図３Ｂに、異種アルファ−１，２−マンノシダーゼを発現する細胞系から得られた試料（図３Ｂ）に対する対照試料（図３Ａ）中に存在するそれぞれのグリコフォームの相対量を従事者に通知することを意図した上記の手順からの試料の質量分析の結果を示す。それぞれの同定されたグリコフォームの相対量を、それぞれ対照試料とアルファ−１，２−マンノシダーゼ試料に対応する表１および表２に提示する。この図に提示したデータは、マンノシダーゼの活性が対照試料に対して試料中の他のグリカン構造に対するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２型構造の相対的存在の増加に影響するという予言的な結果を表している。試料２においてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は同定されたグリコフォームの７７．１％を占める（表１）一方、試料１ではＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は同定されたグリコフォームの中に現れていない（表２）。四角：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、緑色の円：マンノース（Ｍａｎ）、白色の円：ヘキソース（Ｈｅｘ）。
【表１】
2021534763.tif 000003
【表２】
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【実施例】
【０１２５】
（実施例１）
アルファ−１，２−マンノシダーゼの同定
ＢｌａｓｔＰを使用して、Ｐｉｃｈａ  ｓｐ．（現在Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ種として再分類されている）中で異種発現されたタンパク質上のグリカン構造の修飾を付与することができる公知のアルファ−１，２−マンノシダーゼとの同一性を有するタンパク質配列を検索した。同定された例示的真菌のアルファ−１，２−マンノシダーゼタンパク質配列は、配列番号１〜１０を含む。Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ中の配列についてさらなる検索を実施した。例示的Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓのアルファ−１，２−マンノシダーゼタンパク質配列は、配列番号１４５〜１５０を含む。
（実施例２）
Ｐｉｃｈｉａ中のアルファ−１，２−マンノシダーゼの発現のための発現ベクターの構築
【０１２６】
真菌のアルファ−１，２−マンノシダーゼタンパク質配列、配列番号７（ＴｒＭＤＳ２と称する）を、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓのアルファ−１，２−マンノシダーゼタンパク質配列、配列番号１５０（ＧｇＭＡＮ１Ａ１と称する）とともに、発現のために選択した。ＧｇＭＡＮ１Ａ１については、Ｐｉｃｈｉａ中の発現を増加させるために、ｃＤＮＡ（配列番号１５２）をコドン最適化した（配列番号１５３、ＧｇＭＡＮ１Ａ１Ｃと称する）。
【０１２７】
それぞれのｃＤＮＡ、ＴｒＭＤＳ２、およびＧｇＭＡＮ１Ａ１Ｃを、メタノール誘導性プロモーターの下流のＰｉｃｈｉａ発現ベクター、ゼオシン耐性のための選択可能なマーカーを含有するベクターにクローニングした。アルファ−１，２−マンノシダーゼの発現ベクターを、ＯＶＤを分泌していることを以前に確認したＫ．ｐｈａｆｆｉｉ株（株１）にエレクトロポレーションによって形質転換した。２つのアルファ−１，２−マンノシダーゼ酵素のための発現カセットを、いずれも個別におよびともに、ＯＶＤ発現株に形質転換した。形質転換された細胞をゼオシン含有寒天プレート上で選択し、個別のコロニーをマイクロタイター９６ウェルプレートフォーマットで成長させて、分泌されたＯＶＤの品質を評価した。
（実施例３）
Ｐｉｃｈｉａ中のアルファ−１，２−マンノシダーゼの発現
【０１２８】
成長培地中における分泌されたタンパク質の存在を確認するため、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを高スループットフォーマットで行った。次いで選択したウェルからの上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってスクリーニングした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから所望のタンパク質パターンを示すクローンを４０ｍＬの振盪フラスコフォーマットおよび／または最大４０Ｌのバイオリアクターにスケールアップして、形質転換されたデグリコシダーゼ（deglycosidase）の活性を確認した。振盪フラスコフォーマットで生成された材料を使用して、ＴｒＭＤＳ２を発現する１つの株（株２）について、ＬＣ／ＭＳによる外部グリカンの分析を行った。ＴｒＭＤＳ２発現ＰｉｃｈｉａからのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の点検により、この異種タンパク質は試験した条件下では分泌されないことが示された。これは、天然ＴｒＭＤＳ２タンパク質配列がＰｉｃｈｉａによって認識される細胞内局在化シグナルを含有することを意味している。ＴｒＭＤＳ２タンパク質は十分大きいので、これはＯＶＤの上によく泳動し、タンパク質ゲル上で視認できるはずである。
（実施例４）
Ｐｉｃｈｉａ中のＴｒＭＤＳ２の異種発現の活性解析
【０１２９】
株２におけるＴｒＭＤＳ２の異種発現は、振盪フラスコでの実験においてその親株である株１と比較してＯＶＤの発現を有意に低減しなかった。その初期の振盪フラスコでの実施（run）において、ＳＦ１７、即ち株２は、株１の二連の平均分泌レベルと比較して９５％の分泌されたＯＶＤを生じた（図４Ａ）。しかし、この相違は振盪フラスコでの実験の誤差範囲内である。引き続く実施において、ＳＦ２２、即ち株２の二連は、株１の二連と比較して１０９％の分泌されたＯＶＤを生じた（図４Ｂ）。
【０１３０】
全ての実験において、株２はＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で見られるように分泌されたＯＶＤにおいて視認できるバンドパターンの下方シフトを生じた（図４Ａ〜図４Ｂ）。このバンドシフトは、株１から株２へのＯＶＤの見かけの分子量の低下を示し、タンパク質上のグリカンの存在の低減の結果であることが理論付けられた。
【０１３１】
株２の株におけるＯＶＤのグリコシル化の低減を、外部ＬＣ／ＭＳによって確認した（表３）。ＯＶＤを産生した株１において見出されるほとんど全てのグリカンはマンノース９個またはそれよりも多くの分枝パターンを有する。対照的に、ＯＶＤを産生した株２において見出されるグリカンの大多数はマンノース８個またはそれ未満の分枝を含有する。Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉマンノシル化の公知の分枝パターンを図５に示す。
【表３】
2021534763.tif 000005
（実施例５）
Ｐｉｃｈｉａ中のＧｇＭＡＮ１Ａ１の異種発現
【０１３２】
株１におけるＧｇＭＡＮ１Ａ１の異種発現は一連の脱グリコシル化効果を生じ、その最も強いものは株２のバンドパターンに近く、その最も弱いものは極めて僅かな下方シフトを伴って株１のバンドパターンに近似している。
【０１３３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行って、ＧｇＭＡＮ１Ａ１の機能性の２つの極端例をＴｒＭＤＳ２ならびに株１のパターンと比較した（図６）。解析において、より多くのＯＶＤを生じるが同じグリコシル化パターンを維持する株１の誘導株である株３を、標準ＯＶＤバンドパターンとして使用した。ＴｒＭＤＳ２の発現は形質転換体の間で変動したが、弱い方のＴｒＭＤＳ２クローンも株２のバンドパターンに極めて近似したバンドパターンを示した。「弱い」ＭＤＳ２クローンも、図６における比較に含めた。ＴｒＭＤＳ２とＧｇＭＡＮ１Ａ１のバンドパターンには僅かな相違があった。
（実施例６）
Ｐｉｃｈｉａ中のＧｇＭＡＮ１Ａ１の局在化
【０１３４】
試料ＧｇＭＡＮ１Ａ１．ａはスクリーニングの間に見出された最強の脱グリコシル化効果を表し、ＧｇＭＡＮ１Ａ１．ｂは最弱を表す。ゲルの左側においてＭＤＳ２からＧｇＭＡＮ１Ａ１．ｂへの進行性の上向きのバンドシフトがあり、一連の脱グリコシル化機能を示している。次いでそれぞれの試料をゲルの右側において株３と個別に比較し、脱グリコシル化を確認する。ＧｇＭＡＮ１Ａ１発現ＰｉｃｈｉａからのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の点検により、この異種タンパク質は試験した条件下では分泌されないことが示された。ＧｇＭＡＮ１Ａ１タンパク質は十分大きいので、これはＯＶＤの上によく泳動し、タンパク質ゲル上で視認できるはずである。これは、天然ＧｇＭＡＮ１Ａ１タンパク質配列がＰｉｃｈｉａによって認識される細胞内局在化シグナルを含有することを意味している。
【０１３５】
強いＴｒＭＤＳ２脱グリコシル化と弱いＴｒＭＤＳ２脱グリコシル化との間の主な相違は、アスタリスクでマークしたバンドにおいて見られる。このバンドは近接したダブレットのようである。強いＴｒＭＤＳ２パターンではダブレットは下部のバンドに出現しやすく、弱いＴｒＭＤＳ２パターンは上部のバンドに出現しやすい。ＧｇＭＡＮ１Ａ１．ａはアスタリスクでマークしたバンドを例外としてＭＤＳ２のバンドパターンに類似したバンドパターンを示す。ＧｇＭＡＮ１Ａ１．ａにおけるこのバンドはダブレットの間の大きさであるようである。ＧｇＭＡＮ１Ａ１．ｂは全てのバンドの中でさらに上向きのシフトを示す。ゲルの右側の標準ＯＶＤパターンのすぐ隣と比較すると、これは極めて僅かに下方シフトしており、ＴｒＭＤＳ２の脱グリコシル化パターンで見られる最上部のバンドの特徴的な消失を示している。
【０１３６】
株１でＴｒＭＤＳ２とＧｇＭＡＮ１Ａ１とを共発現し、グリコシル化パターンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって調査した。ＴｒＭＤＳ２単独のパターンを含めて一連の脱グリコシル化パターンが見られた（図７）。
（実施例７）
ＨｓＯＲＭ１の脱グリコシル化
【０１３７】
ヒト血清糖タンパク質「オロソムコイド１」（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＯＲＭ１、ＨｓＯＲＭ１、ユニポートＰ０２７６３）は、アスパラギン残基３３、５６、７２、９３、および１０３に５つの予想されるＮ−グリコシル化コンセンサスモチーフを有する。ＨｓＯＲＭ１コーディング配列をメタノール誘導性プロモーターの下流に配置した。アルファ接合因子シグナル配列をＨｓＯＲＭ１コーディング配列のＮ末端に融合させた。翻訳された融合物はポリペプチド配列、配列番号１５４を提供した（太字はＨｓＯＲＭ１配列を示し、非太字はシグナル配列のアミノ酸を示す）。
【０１３８】
発現構築物をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉとも称する）のｍｕｔＳ株に形質転換し、一次形質転換体を選択して、ＨｓＯＲＭ１転写の誘導剤としてメタノールを使用する９６時間の経過に供した。培養上清のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって発現を解析した。Ｐｉｃｈｉａ発現ＨｓＯｒｍ１は別個の６個のポリペプチド種として移動した（下の図８を参照）。最小の分子量の種（２１．５ｋＤａ）は非グリコシル化形態であると予想され、他の形態はおそらくモノグリコシル化形態からペンタグリコシル化形態に対応している。Ｐｉｃｈｉａによって発現されたＨｓＯＲＭ１が高マンノースのグリカンを有していることを実証するため、株４からのＨｓＯｒｍ１含有上清をｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０００単位のエンドグルカナーゼＨ（ＥＨ）を用いて３７℃で１時間処理した。ＥＨ処理に続いて試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析すると、完全に脱グリコシル化された２１．５ｋＤａのポリペプチド種のみが残存し、これが完全に脱グリコシル化形態であるという観察がさらに支持された。
【０１３９】
図８：左のパネル−ＭＷは分子量タンパク質参照ラダーであり、ＭＷの右側のレーンはＨｓＯＲＭ１を発現する個別の形質転換体である。右のパネル−レーン１は分子量タンパク質参照ラダー、レーン２はＨｓＯｒｍ１を発現する形質転換体の抽出物、レーン３はエンドグリコシダーゼＨで処理した同じ形質転換体の抽出物である。黒色矢印は外から添加したＥｎｄｏ  Ｈ酵素を示し、灰色矢印はｉｎ  ｖｉｔｒｏで脱グリコシル化された２１．５ｋＤａのＨｓＯｒｍ１タンパク質種を示す。
【０１４０】
株の精製に続いて、株４（ウェルＣ１１の上清に対応、上の赤色矢印）をＤＮＡエレクトロポレーションに対して適格性にし、続いてメタノール誘導性プロモーター（配列番号３８）およびメタノール誘導転写ターミネーターの制御下にＴｒＭＤＳ２  ｃＤＮＡ発現構築物で形質転換した。メタノール含有誘導培地中における９６時間の経過の実験に続いて、ＨｓＯＲＭ１バンドシフトパターンによって、ＨｓＯＲＭ１＋／Ｐｅｘ１１−ＴｒＭＤＳ２共発現剤（co-expressor）を選択した。図９Ａおよび図９Ｂに、推定されるＴｒＭＤＳ２形質転換体のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＨｓＯＲＭ１のバンドパターンを示す。
【０１４１】
上で試験した形質転換体のサブセットについて、図９Ｃに示すように、オープンリーディングフレームにおける内部の１０６６ｂｐのＰＣＲ産物を増幅するプライマーを使用するＰＣＲによって、ＴｒＭＤＳ２の存在を検証した。
【０１４２】
ＰＣＲで生成した１０６６ｂｐの産物は試験した形質転換体、Ａ２、Ａ８、Ｂ３、Ｃ３、Ｃ７、Ｄ３、Ｅ４、Ｆ４、Ｇ８の全てである。一方、形質転換していない対照では、ＰＣＲ産物は見出されなかった。
最初の誘導実験に続いて、ＨｓＯＲＭ１＋／ＴｒＭＤＳ２共発現剤のサブセットを、ＨｓＯＲＭ１の脱グリコシル化度について比較した（下の図１０）。左から右へ、ＰＣＲで遺伝子型を決定した株（ＴｒＭＤＳ２構築物について陽性）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでより小さなＨｓＯＲＭ１ポリペプチド種における増加によって観察されるように、極めて僅かから顕著な脱グリコシル化まで変動するＨｓＯｒｍ１の脱グリコシル化のレベルを呈した。これらの株の比較により、発現した動物タンパク質（ＨｓＯｒｍ１等）の脱グリコシル化の程度は、ＴｒＭＤＳ２の異なるレベルの発現によって創製されるような種々のレベルの脱グリコシル化パターンを選択することによって微調整できることが示された。
（実施例８）
オボアルブミン（ＯＶＡ）の脱グリコシル化
【０１４３】
天然Ｇ．ｇａｌｌｕｓオボアルブミン（ＯＶＡ）は、アミノ酸残基２９２におけるアスパラギン連結（Ｎ連結）グリコシル化によって翻訳後修飾され（太字の配列番号２６）、ときにはアミノ酸残基３１１がグリコシル化されることも文献で注目されている（太字／下線の配列番号２６）。
【０１４４】
メタノール誘導性プロモーターおよびメタノール誘導ターミネーターの転写制御の下にＰｉｃｈｉａコドンをバイアスしたオボアルブミンのｃＤＮＡを含有するＯＶＡ発現構築物を作製した。続いてこのマルチコピー発現構築物をｍｕｔＳ  Ｐｉｃｈｉａ株である株５に形質転換して株６を創製した。次いでＰｉｃｈｉａ株である株６を抗生物質耐性マーカー（ＡＲＭ）の除去に供して株７を創製し、続いてこの株をＴｒＭＤＳ２形質転換に対して適格性にした。
【０１４５】
Ｐｉｃｈｉａ  ＤＮＡの形質転換に続いて、発現した組換えＯＶＡ（ｒＯＶＡ）は、メタノール含有培地中の９６時間の経過の後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでトリプレットとしてともに移動する非グリコシル化ならびにモノ−およびジ−グリコシル化された３種の別個の種として、形質転換体の培養上清中に出現した（図１１の「インプット」を参照）。Ｐｉｃｈｉａによって発現されたＯＶＡをさらに特徴解析するため、市販のエンドグリコシダーゼであるＥｎｄｏＨ（ＥＨ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＰＮＧアーゼ（ＰＦ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、製造者によって記載（https://www.neb.com/protocols/2012/10/18/endo-hf-protocol;https://www.neb.com/protocols/2014/07/31/pngase-f-protocol）されているようにそれぞれについて「天然」（Ｎ）および「変性」（Ｄ）のプロトコールを使用して、上清をｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理した。エンドグリコシダーゼのいずれかを使用する処理によって、非グリコシル化ＯＶＡのバンドシフトしたパターンが生じる。黒色矢印は反応物に加えたＰＮＧアーゼＦを示し、ゲル上の灰色矢印は反応物に加えたＥｎｄｏＨを示す。灰色および黒色矢印の上に現れるバンドは、脱グリコシル化されたＯＶＡタンパク質である。
【０１４６】
ＯＶＡ発現Ｐｉｃｈｉａ株（株７、上記）を、メタノール誘導ＴｒＭＤＳ２構築物で形質転換した（実施例７を参照）。ＯＶＡ＋／ＴｒＭＤＳ２＋形質転換体を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、バンドシフトパターンを可視化した。分子量（ＭＷ）ラダーを下の図１２に示す（左端のレーン１）。「Ｃ」と標識したレーンは親のＯＶＡ発現株によって産生されたｒＯＶＡを含有する（ＴｒＭＤＳ２なし）。レーンＡ９、Ｄ１０、Ｆ５、Ｇ５、Ｇ７、Ｇ１０、Ｈ１、およびＨ２は、メタノール誘導ＴｒＭＤＳ２構築物で形質転換したＯＶＡ株からのものである。これらの結果は、ＴｒＭＤＳ２がＰｉｃｈｉａによって発現されたｒＯＶＡのそれぞれのグリカン鎖の炭水化物のほぼ１．５〜２．５ｋＤａを除去できることを示唆している。
【０１４７】
形質転換体をＰＣＲによってＴｒＭＤＳ２の存在について検証した（実施例７を参照）。形質転換体Ａ９、Ｄ１０、Ｆ５、Ｇ５、Ｇ７、Ｇ１０、Ｈ１、およびＨ２（全て、上のバンドシフトゲル中に示される）は、ＴｒＭＤＳ２陽性の形質転換体であった。
（実施例９）
ＴｒＭＤＳ１の試験
【０１４８】
２つの異なるコドンバイアスしたＴｒＭＤＳ１構築物を、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＯＶＤ（ＧｇＯＶＤ）を発現する株に形質転換した。発現のため、いくつかの誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの後ろにＴｒＭＤＳ１を配置した。構築物１を構成的プロモーターの後ろの非Ｐｉｃｈｉａコドンバイアス（ＮＣＯ）ＴｒＭＤＳ１  ｃＤＮＡの発現のために操作し、構築物２を構成的ＧＡＰ１プロモーターの後ろのＰｉｃｈｉａコドン最適化（ＣＯ）ＴｒＭＤＳ１  ｃＤＮＡの発現のために操作し、構築物３をメタノール誘導性プロモーターの後ろのＰｉｃｈｉａコドン最適化ＴｒＭＤＳ１  ｃＤＮＡの発現のために操作し、構築物４をメタノール誘導性プロモーターの後ろのＰｉｃｈｉａコドン最適化ＴｒＭＤＳ１  ｃＤＮＡの発現のために操作し、構築物５をメタノール誘導性プロモーターの後ろの非Ｐｉｃｈｉａコドン最適化ＴｒＭＤＳ１  ｃＤＮＡの発現のために操作し、構築物６をメタノール誘導性プロモーターの後ろの非Ｐｉｃｈｉａコドン最適化ＴｒＭＤＳ１  ｃＤＮＡの発現のために操作した。
【０１４９】
メタノール誘導の下の時間経過に続いて、上清をＧｇＯＶＤバンドシフトについて解析した。これらのＭＤＳ１の多くのバージョンを発現する努力にも関わらず、バンドシフトの解析はＭＤＳ１がＧｇＯＶＤを脱グリコシル化できないことを示した。これは、上に例示した新たなマンノシダーゼ、即ちＭＤＳ２およびＧａｌｌｕｓマンノシダーゼとは対照的であった。
【０１５０】
ＧｇＯＶＤ上のＭＤＳ１の脱グリコシル化活性の欠損を示すバンドシフトゲルを図１３に示す。ゲル１（左から右へ）：分子量ラダー、構築物２  ＧＡＰ−ＣＯ＿ＴｒＭＤＳ１形質転換体１〜８、ＧｇＯＶＤ株のみ（マンノシダーゼの発現なし）、構築物１  構成的ＮＣＯ＿ＴｒＭＤＳ１形質転換体１、構築物３  メタノール誘導ＴｒＭＤＳ１形質転換体１および２、ＧｇＯＶＤ株のみ（マンノシダーゼの発現なし）、構築物３  形質転換体３。
【０１５１】
図１４：ゲル２（左から右へ）：ＧｇＯＶＤ株のみ（マンノシダーゼの発現なし）、分子量ラダー、構築物４  メタノール誘導ＣＯ＿ＴｒＭＤＳ１形質転換体１〜８、ＧｇＯＶＤ株のみ（マンノシダーゼの発現なし）、構築物５  メタノール誘導ＣＯ＿ＴｒＭＤＳ１形質転換体１〜４。
【０１５２】
全体として、ＭＤＳ１構築物の別個の２４０種の形質転換体を、ＧｇＯＶＤを脱グリコシル化する能力についてスクリーニングしたが、いずれも活性を有しなかった。
（実施例１０）
ＯＶＤのグリコシル化パターンの比較
【０１５３】
Ｐｉｃｈｉａ発酵からおよび天然ニワトリオボムコイドの市販の供給源からのタンパク質試料からなる乾燥粉末を、標準的な燃焼法を使用して全粗タンパク質について分析した。この方法においては、供給材料の窒素含量から試料の種類に基づいて全粗タンパク質を計算し、粉末についてのタンパク質のパーセントとして表４に提示する。窒素の結果に適用したタンパク質係数は６．２５である。この方法は０．１％タンパク質（乾燥基準）の検出限界を有する。ＭＤＳ２（配列番号７）をＰｉｃｈｉａ細胞中でニワトリＯＶＤとともに共発現し、得られた組換えＯＶＤ（ｒＯＶＤ）を、標準的なタンパク質クロマトグラフィー法を使用して発酵上清から精製した。得られたタンパク質溶液から膜濾過を使用して非タンパク質夾雑物を除去した。精製したタンパク質溶液を、凍結乾燥を使用して乾燥して粉末とした。次いでタンパク質粉末を全粗タンパク質の分析に送付した。ＭＤＳ２機能を何ら有さずに生成したｒＯＶＤ粉末は平均で７４％のタンパク質を有していたが、ＭＤＳ２を共発現すると、これは最大で８５％のタンパク質に増加した。８５％のＭＤＳ２処理材料は、タンパク質上の炭水化物を除去するＭＤＳ２の機能により、天然ニワトリＯＶＤ試料ＯＶＤに対しても高いタンパク質のパーセントであった。
【表４】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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【表５−１２】
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【表５−１３】
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【表５−１４】
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【表５−１５】
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【表５−１６】
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【表５−１７】
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【表５−１８】
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【表５−１９】
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【０１５４】
本明細書において本発明の好ましい実施形態を示し、説明したが、これらの実施形態は例示のみのために提供していることは当業者には明らかである。今や当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多くの変形、変化および置換に気づくことができる。本発明を実施するにあたって、本明細書で説明した本発明の実施形態に種々の選択肢を利用し得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲およびその等価物の範囲内の方法および構造がそれによって網羅されていることが意図されている。
【図１Ａ】
2021534763.tif 000026
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
2021534763.tif 000030
【図３】
2021534763.tif 000031
【図４Ａ】
2021534763.tif 000032
【図４Ｂ】
2021534763.tif 000033
【図５】
2021534763.tif 000034
【図６】
2021534763.tif 000035
【図７】
2021534763.tif 000036
【図８】
2021534763.tif 000037
【図９】
2021534763.tif 000038
【図１０】
2021534763.tif 000039
【図１１】
2021534763.tif 000040
【図１２】
2021534763.tif 000041
【図１３】
2021534763.tif 000042
【図１４】
2021534763.tif 000043
【配列表】
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【国際調査報告】
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