(57)【要約】  本発明は、敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための方法であって、１つ以上の微生物ムラミダーゼを含む組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤を動物に投与することを含む方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための方法であって、１つ以上の微生物ムラミダーゼを含む組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤を動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記単胃動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、家禽、シチメンチョウ、カモ、ウズラ、ホロホロチョウ、ガチョウ、ハト、ひなバト、鶏、ブロイラー、産卵鶏、若めんどり、及びヒヨコ、ネコ、イヌ、ウマ、甲殻類の動物、小エビ、中エビ、魚、アンバージャック、ピラルク、バーブ、バス、アミキリ、ボカチコ、ブリーム、カジカ、コロソマ、コイ、ナマズ、カトラ、サバヒー、チャー、カワスズメ、スギ、タラ、クラッピー、へダイ、ニベ科の魚、ウナギ、ハゼ、キンギョ、グラミー、ハタ、グァポテ、ハリバット、ジャワ、ラベオ、ライ、ドジョウ、サバ、ミルクフィッシュ、サギ、ボウフィン、ボラ、パコ、パールスポット、ペヘレイ、パーチ、カワカマス、コバンアジ、ローチ、サケ、サンパ、ソーガー、ハタ科の魚、タイ、シャイナー、カワアナゴ科の魚、タイワンドジョウ、フエダイ、アカメ、シタビラメ、スパインフット、チョウザメ、マンボウ、アユ、テンチ、テラー、テラピア、マス、マグロ、ターボット、シロマス、ウォールアイ、並びにホワイトフィッシュからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物ムラミダーゼは、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）又はチャワンタケ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）から得られる又は入手可能である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物ムラミダーゼは、ＧＨ２４及びＧＨ２５からなるリストから選択される１つ以上のドメインを含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物ムラミダーゼは：
（ａ）配列番号１に対して少なくとも５０％、たとえば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）ムラミダーゼ活性を有し且つ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０の位置に、１つ以上のアミノ酸置換及び／又は１つ以上のアミノ酸欠失及び／又は１つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組み合わせを有する、配列番号１の変異体；
（ｃ）少なくとも１７０のアミノ酸、たとえば少なくとも１７５のアミノ酸、少なくとも１７７のアミノ酸、少なくとも１８０のアミノ酸、少なくとも１８５のアミノ酸、少なくとも１９０のアミノ酸、少なくとも１９５のアミノ酸、又は少なくとも２００のアミノ酸などを含む、ムラミダーゼ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片；
（ｄ）配列番号４に対して少なくとも５０％、たとえば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｅ）ムラミダーゼ活性を有し且つ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０の位置に、１つ以上のアミノ酸置換及び／又は１つ以上のアミノ酸欠失及び／又は１つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組み合わせを有する、配列番号４の変異体；並びに
（ｆ）少なくとも２１０のアミノ酸、たとえば少なくとも２１５のアミノ酸、少なくとも２２０のアミノ酸、少なくとも２２５のアミノ酸、少なくとも２３０のアミノ酸、少なくとも２３５のアミノ酸、又は少なくとも２４０のアミノ酸などを含む、ムラミダーゼ活性を有する（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物ムラミダーゼは、配列番号１のアミノ酸１〜２１３、配列番号４のアミノ酸１〜２４５、及び配列番号１０のアミノ酸１〜２０８からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための方法であって、１つ以上の微生物ムラミダーゼを含む組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤を動物に投与することを含み、
（ａ）前記微生物ムラミダーゼは、ＧＨ２４及びＧＨ２５からなるリストから選択される１つ以上のドメインを含む微生物ムラミダーゼであり、動物用飼料１ｋｇ当たり３００〜５００ｍｇの酵素タンパク質のレベルで添加される；
（ｂ）前記単胃動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、鶏、ブロイラー、産卵鶏、若めんどり、及びヒヨコからなる群から選択される；
（ｃ）任意選択で、前記微生物ムラミダーゼは、前記動物の生存期間の間、少なくとも１０日間、毎日、前記動物に供給される、方法。
【請求項８】
敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための方法であって、１つ以上の微生物ムラミダーゼを含む組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤を動物に投与することを含み、
（ａ）前記微生物ムラミダーゼは、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）から得られる又は入手可能なＧＨ２４又はＧＨ２５ムラミダーゼであり、動物用飼料１ｋｇ当たり３００〜５００ｍｇの酵素タンパク質のレベルで添加される；
（ｂ）前記単胃動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、鶏、ブロイラー、産卵鶏、若めんどり、及びヒヨコからなる群から選択される；並びに
（ｃ）前記趾蹠皮膚炎は、ネガティブコントロールと比較して、少なくとも１％低下する、方法。
【請求項９】
敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤の使用であって、前記組成物、前記動物用飼料、又は前記動物用飼料添加剤は、１つ以上の微生物ムラミダーゼを含む、使用。
【請求項１０】
前記単胃動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、家禽、シチメンチョウ、カモ、ウズラ、ホロホロチョウ、ガチョウ、ハト、ひなバト、鶏、ブロイラー、産卵鶏、若めんどり、及びヒヨコ、ネコ、イヌ、ウマ、甲殻類の動物、小エビ、中エビ、魚、アンバージャック、ピラルク、バーブ、バス、アミキリ、ボカチコ、ブリーム、カジカ、コロソマ、コイ、ナマズ、カトラ、サバヒー、チャー、カワスズメ、スギ、タラ、クラッピー、へダイ、ニベ科の魚、ウナギ、ハゼ、キンギョ、グラミー、ハタ、グァポテ、ハリバット、ジャワ、ラベオ、ライ、ドジョウ、サバ、ミルクフィッシュ、サギ、ボウフィン、ボラ、パコ、パールスポット、ペヘレイ、パーチ、カワカマス、コバンアジ、ローチ、サケ、サンパ、ソーガー、ハタ科の魚、タイ、シャイナー、カワアナゴ科の魚、タイワンドジョウ、フエダイ、アカメ、シタビラメ、スパインフット、チョウザメ、マンボウ、アユ、テンチ、テラー、テラピア、マス、マグロ、ターボット、シロマス、ウォールアイ、並びにホワイトフィッシュからなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記微生物ムラミダーゼは、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）又はチャワンタケ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）から得られる又は入手可能である、請求項９〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記微生物ムラミダーゼは、ＧＨ２４及びＧＨ２５からなるリストから選択される１つ以上のドメインを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記微生物ムラミダーゼは：
（ａ）配列番号１に対して少なくとも５０％、たとえば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）ムラミダーゼ活性を有し且つ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０の位置に、１つ以上のアミノ酸置換及び／又は１つ以上のアミノ酸欠失及び／又は１つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組み合わせを有する、配列番号１の変異体；
（ｃ）少なくとも１７０のアミノ酸、たとえば少なくとも１７５のアミノ酸、少なくとも１７７のアミノ酸、少なくとも１８０のアミノ酸、少なくとも１８５のアミノ酸、少なくとも１９０のアミノ酸、少なくとも１９５のアミノ酸、又は少なくとも２００のアミノ酸などを含む、ムラミダーゼ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片；
（ｄ）配列番号４に対して少なくとも５０％、たとえば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｅ）ムラミダーゼ活性を有し且つ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０の位置に、１つ以上のアミノ酸置換及び／又は１つ以上のアミノ酸欠失及び／又は１つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組み合わせを有する、配列番号４の変異体；並びに
（ｆ）少なくとも２１０のアミノ酸、たとえば少なくとも２１５のアミノ酸、少なくとも２２０のアミノ酸、少なくとも２２５のアミノ酸、少なくとも２３０のアミノ酸、少なくとも２３５のアミノ酸、又は少なくとも２４０のアミノ酸などを含む、ムラミダーゼ活性を有する（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記微生物ムラミダーゼは、配列番号１のアミノ酸１〜２１３、配列番号４のアミノ酸１〜２４５、及び配列番号１０のアミノ酸１〜２０８からなる群から選択される、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［配列表の参照］
本出願は、コンピュータ可読形態をした配列表を含有し、これは、本明細書において援用される。
【０００２】
［発明の背景］
［発明の分野］
本発明は、１つ以上の微生物ムラミダーゼを使用して、敷料の品質を改善する及び／又は動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための方法に関する。
【０００３】
［関連技術の説明］
ムラミダーゼは、リゾチームとも称されるが、多くの生物によって、細菌に対する防御メカニズムとして産生されるＯ−グリコシルヒドロラーゼである。酵素は、細菌の重要な構造分子であるペプチドグリカンのグリコシド結合を切断することによって、細菌細胞壁の加水分解を引き起こす。細菌の細胞壁がムラミダーゼの作用によって弱められた後、細菌の細胞は、浸透圧不均衡の結果として溶解する。
【０００４】
ムラミダーゼは、ウイルス、植物、昆虫、鳥、爬虫類動物、及び哺乳動物などのような多くの生物において天然に存在する。ムラミダーゼは、５つの異なるグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリーに分類された（ＣＡＺｙ、ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ）：ニワトリ卵白ムラミダーゼ（ＧＨ２２）、ガチョウ卵白ムラミダーゼ（ＧＨ２３）、バクテリオファージＴ４ムラミダーゼ（ＧＨ２４）、スフィンゴモナスべん毛タンパク質（ＧＨ７３）、及びキャラロプシス（Ｃｈａｌａｒｏｐｓｉｓ）ムラミダーゼ（ＧＨ２５）。ＧＨ２３及びＧＨ２４ファミリー由来のムラミダーゼは、主としてバクテリオファージで知られており、菌類では最近同定されたばかりである。ムラミダーゼファミリーＧＨ２５は、他のムラミダーゼファミリーと構造的に関係しないことがわかった。
【０００５】
ムラミダーゼは、従来、それが天然に豊富に存在することから、ニワトリ卵白から抽出されており、かなり最近になるまで、ニワトリ卵白ムラミダーゼは、動物用飼料における使用について検討される唯一のムラミダーゼであった。ニワトリ卵白から抽出されるムラミダーゼは、市場で入手できる一次産品であるが、たとえば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁におけるＮ，６−Ｏ−ジアセチルムラミン酸を切断せず、したがって、とりわけこの重要なヒト病原体を溶解することができない（Ｍａｓｓｃｈａｌｃｋ  Ｂ，Ｄｅｃｋｅｒｓ  Ｄ，Ｍｉｃｈｉｅｌｓ  ＣＷ（２００２），“Ｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｙ  ｍｕｒａｍｉｄａｓｅ  ｕｎｄｅｒ  ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ”，Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔ．６５（１２）：１９１６−２３）。
【０００６】
国際公開第２０００／２１３８１号パンフレットは、少なくとも２つの殺菌酵素及び多価不飽和脂肪酸を含む組成物を開示し、殺菌酵素の１つは、鶏卵白由来のＧＨ２２ムラミダーゼであった。英国特許第２３７９１６６号明細書は、細菌のペプチドグリカン層を破壊する化合物及び細菌のリン脂質層を破壊する化合物を含む組成物を開示し、ペプチドグリカンを破壊する化合物は、鶏卵白由来のＧＨ２２ムラミダーゼであった。
【０００７】
国際公開第２００４／０２６３３４号パンフレットは、（ａ）細胞壁溶解物質又はその塩、（ｂ）殺菌物質、（ｃ）金属イオン遮閉剤、及び（ｄ）ランチビオティック（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）を含む、家畜の消化管中の腸内病原体の成長を抑制するための殺菌組成物を開示し、細胞壁溶解物質又はその塩は、ニワトリ卵白由来のＧＨ２２ムラミダーゼである。
【０００８】
驚くべきことに、本発明の発明者らは、ムラミダーゼが、敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるために飼料中に使用することができることを発見した。動物性タンパク質に対する需要が大きくなりつつあり、動物福祉を改善するそのような解決策は、常に農業者の関心の的となっている。
【０００９】
［発明の概要］
したがって、本発明は、敷料の品質を改善し且つ単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための方法であって、１つ以上の微生物ムラミダーゼを含む組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤を動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
［配列表の概要］
配列番号１は、国際公開第２０１３／０７６２５３号パンフレットにおいて記載される、Ｎ末端ＳＰＩＲＲを有するアクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）由来の野生型ＧＨ２５ムラミダーゼの成熟アミノ酸配列である。
【００１１】
配列番号２は、トリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）から単離されるＧＨ２４ムラミダーゼの遺伝子配列である。
【００１２】
配列番号３は、配列番号２から推定されるアミノ酸配列である。
【００１３】
配列番号４は、トリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）由来の野生型ＧＨ２４ムラミダーゼの成熟アミノ酸配列である。
【００１４】
配列番号５は、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）（ニワトリ卵白ムラミダーゼ）由来の野生型ＧＨ２２ムラミダーゼの成熟アミノ酸配列である。
【００１５】
配列番号６は、プライマーＦ−８０４７０である。
【００１６】
配列番号７は、プライマーＲ−８０４７０である。
【００１７】
配列番号８は、プライマー８６４３である。
【００１８】
配列番号９は、プライマー８６５４である。
【００１９】
配列番号１０は、国際公開第２０１３／０７６２５３号パンフレットにおいて記載される、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）由来の野生型ＧＨ２５ムラミダーゼの成熟アミノ酸配列である。
【００２０】
［定義］
微生物ムラミダーゼ：「微生物ムラミダーゼ」という用語は、微生物源から得られる又は入手可能である、ムラミダーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。微生物源の例は、菌類である；すなわち、ムラミダーゼは、菌界から得られ又は入手可能であり、ここで、界という用語は、分類階級のことである。特に、微生物ムラミダーゼは、チャワンタケ亜門（ｓｕｂ−ｐｈｙｌｕｍ  Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）などのような子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）から得られ又は入手可能であり、ここで、門及び亜門という用語は、分類階級のことである。
【００２１】
ポリペプチドの分類階級が知られていない場合、それは、ポリペプチドのＢＬＡＳＴＰ検索を実行し（たとえばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＩＢ）ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を使用して）、それを最も近いホモログと比較することによって、当業者によって容易に決定することができる。知られているポリペプチドの断片である未知のポリペプチドは、同じ分類上の種のものであるとみなされる。置換、欠失、及び／又は挿入を１０以下の位置に含む未知の天然ポリペプチド又は人工変異体は、知られているポリペプチドと同じ分類上の種に由来するとみなされる。
【００２２】
ムラミダーゼ活性：「ムラミダーゼ活性」という用語は、浸透圧による溶菌をもたらす、ペプチドグリカンにおけるＮ−アセチルムラミン酸残基及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の間の又はキトデキストリン（ｃｈｉｔｏｄｅｘｔｒｉｎ）におけるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基同士の間の１，４−ベータ−結合の酵素加水分解を意味する。ムラミダーゼは、酵素分類ＥＣ  ３．２．１．１７に属する。ムラミダーゼ活性は、通常、比濁法によって測定される。この方法は、ムラミダーゼの溶解作用によって誘発される、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ４６９８の懸濁液の濁り度の変化に基づく。適切な実験条件では、これらの変化は、培地のムラミダーゼの量と比例する（ＩＮＳ  １１０５  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＮ（ｗｗｗ．ｆａｏ．ｏｒｇ）を参照）。本発明の目的上、ムラミダーゼ活性は、実施例５（「ムラミダーゼ活性の決定」）において記載される濁り度アッセイに従って決定される。一態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号１のムラミダーゼ活性の少なくとも２０％、たとえば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％を有する。一態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号４のムラミダーゼ活性の少なくとも２０％、たとえば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％を有する。一態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号１０のムラミダーゼ活性の少なくとも２０％、たとえば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％を有する。
【００２３】
断片：「断片」という用語は、成熟ポリペプチド又はドメインのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端が欠けている、１つ以上の（たとえばいくつかの）アミノ酸を有するポリペプチド又は触媒ドメインを意味し；断片は、ムラミダーゼ活性を有する。一態様では、断片は、配列番号１の少なくとも１７０のアミノ酸、たとえば少なくとも１７５のアミノ酸、少なくとも１７７のアミノ酸、少なくとも１８０のアミノ酸、少なくとも１８５のアミノ酸、少なくとも１９０のアミノ酸、少なくとも１９５のアミノ酸、又は少なくとも２００のアミノ酸などを含み、ムラミダーゼ活性を有する。
【００２４】
別の態様では、断片は、配列番号４の少なくとも２１０のアミノ酸、たとえば少なくとも２１５のアミノ酸、少なくとも２２０のアミノ酸、少なくとも２２５のアミノ酸、少なくとも２３０のアミノ酸、少なくとも２３５のアミノ酸、又は少なくとも２４０のアミノ酸などを含み、ムラミダーゼ活性を有する。
【００２５】
一態様では、断片は、配列番号１０の少なくとも１７０のアミノ酸、たとえば少なくとも１７５のアミノ酸、少なくとも１７７のアミノ酸、少なくとも１８０のアミノ酸、少なくとも１８５のアミノ酸、少なくとも１９０のアミノ酸、少なくとも１９５のアミノ酸、又は少なくとも２００のアミノ酸などを含み、ムラミダーゼ活性を有する。
【００２６】
単離された：「単離された」という用語は、環境が自然界において生み出すことのない形態をした物質を意味する。単離された物質の非限定的な例は、（１）任意の天然に存在しない物質、（２）自然界において関連する天然に存在する構成要素の１つ以上又はすべてから少なくとも部分的に取り出された任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド、又は補助因子を含むがこれらに限定されない任意の物質；（３）自然界において見つけられる物質と比較して、人の手によって修飾された任意の物質；又は（４）自然に関連している他の構成成分と比較して、物質の量を増加させることによって修飾された任意の物質（たとえば、物質をコードする遺伝子の多数のコピー；物質をコードする遺伝子と自然に関連しているプロモーターよりも強力なプロモーターの使用）を含む。単離された物質は、発酵ブロスサンプル中に存在してもよい。
【００２７】
成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」という用語は、翻訳及びＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などのような任意の翻訳後修飾後のその最終形態をしたポリペプチドを意味する。
【００２８】
配列同一性：２つのアミノ酸配列の間の又は２つのヌクレオチド配列の間の関係性は、パラメーターである「配列同一性」によって説明される。
【００２９】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）、好ましくは５．０．０又はそれ以降のバージョンのＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用して決定される。使用されるパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティー、０．５のギャップエクステンションペナルティー、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅが表示する「最長の同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）の出力は、同一性パーセントとして使用され、以下のように算出される：
（同一残基×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数）
【００３０】
変異体：「変異体」という用語は、１つ以上の（たとえばいくつかの）位置に、１つ以上の（いくつかの）アミノ酸残基の改変、すなわち置換、挿入、及び／又は欠失を含む、ムラミダーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換は、ある位置を占めているアミノ酸を異なるアミノ酸と置き換えることを意味する；欠失は、ある位置を占めているアミノ酸の除去を意味する；挿入は、その位置を占めているアミノ酸のすぐ後に隣接させて１、２、又は３つのアミノ酸を追加することを意味する。
【００３１】
一態様では、本発明によるムラミダーゼ変異体は、１〜５の；１〜１０の；１〜１５の；１〜２０の；１〜２５の；１〜３０の；１〜３５の；１〜４０の；１〜４５の；又は１〜５０の、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０の改変を含んでいてもよく、親ムラミダーゼ、たとえば配列番号１、配列番号４、又は配列番号１０などのムラミダーゼ活性の少なくとも２０％、たとえば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％を有する。
【００３２】
単胃動物：「単胃動物」という用語は、ヒトを除く、単純な一室の胃を有する任意の動物を指す。単胃動物の例は、豚又はブタ（子ブタ、育成ブタ、及び雌ブタを含むがこれらに限定されない）；シチメンチョウ、カモ、ウズラ、ホロホロチョウ、ガチョウ、ハト（ひなバトを含む）、及び鶏（ブロイラー鶏（本明細書においてブロイル（ｂｒｏｉｌｅ）と呼ばれる）、ヒヨコ、産卵鶏、雌鶏（本明細書において産卵鶏と呼ばれる）を含むが、これらに限定されない）などのような家禽；ネコ及びイヌなどのような愛玩動物；ウマ（サラブレッド種、冷血種、及び温血種を含むが、これらに限定されない）、甲殻類の動物（小エビ及び中エビを含むが、これらに限定されない）、並びに魚（アンバージャック、ピラルク、バーブ、バス、アミキリ、ボカチコ、ブリーム、カジカ、コロソマ、コイ、ナマズ、カトラ、サバヒー（ｃｈａｎｏｓ）、チャー、カワスズメ、スギ、タラ、クラッピー、へダイ、ニベ科の魚、ウナギ、ハゼ、キンギョ、グラミー、ハタ、グァポテ、ハリバット、ジャワ、ラベオ（ｌａｂｅｏ）、ライ（ｌａｉ）、ドジョウ、サバ、ミルクフィッシュ、サギ、ボウフィン、ボラ、パコ（ｐａｃｏ）、パールスポット（ｐｅａｒｌｓｐｏｔ）、ペヘレイ、パーチ、カワカマス、コバンアジ、ローチ、サケ、サンパ（ｓａｍｐａ）、ソーガー、ハタ科の魚、タイ、シャイナー、カワアナゴ科の魚、タイワンドジョウ、フエダイ、アカメ、シタビラメ、スパインフット（ｓｐｉｎｅｆｏｏｔ）、チョウザメ、マンボウ、アユ、テンチ、テラー（ｔｅｒｒｏｒ）、テラピア、マス、マグロ、ターボット、シロマス、ウォールアイ、及びホワイトフィッシュを含むが、これらに限定されない）を含む。
【００３３】
動物用飼料：「動物用飼料」という用語は、動物による摂取に適した又はそれが意図される任意の化合物、調製物、又は混合物を指す。単胃動物のための動物用飼料は、通常、濃縮物並びにビタミン、ミネラル、酵素、直接給与生菌（ｄｉｒｅｃｔ  ｆｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）、アミノ酸、及び／又は他の飼料成分（プレミックス中になど）を含むのに対して、反芻動物のための動物用飼料は、一般に、まぐさ（粗飼料及びサイレージを含む）を含み、濃縮物並びにビタミン、ミネラル、酵素、直接給与生菌、アミノ酸、及び／又は他の飼料成分（プレミックス中になど）をさらに含んでいてもよい。
【００３４】
濃縮物：「濃縮物」という用語は、タンパク質及びエネルギーの濃度が高い飼料、たとえば魚粉、糖蜜、オリゴ糖、ソルガム、種子、及び穀粒（全部又はたとえばトウモロコシ、カラスムギ、ライムギ、オオムギ、コムギから粉砕、製粉などによって調製された）、油料種子の油かす（たとえば綿実、ベニバナ、ヒマワリ、ダイズ（ダイズ粉など）、菜種／キャノーラ、ピーナッツ、又は落花生由来の）、パーム核粕、酵母由来の原材料、並びにジスチラーズグレイン（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｇｒａｉｎｓ）（ウェットジスチラーズグレイン（ｗｅｔ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｇｒａｉｎｓ）（ＷＤＳ）及びドライドジスチラーズグレインソリュブル（ｄｒｉｅｄ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｇｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｕｂｌｅｓ）（ＤＤＧＳ）など）などを意味する。
【００３５】
まぐさ：本明細書において定義される「まぐさ」という用語はまた、粗飼料をも含む。まぐさは、飼料植物、牧草、及び他の飼料植物由来の干し草及びサイレージ、海草、発芽させた穀粒及びマメ科植物、又はその任意の組み合わせなどのような新鮮な植物原材料である。飼料植物の例は、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）、ミヤコグサ、アブラナ（たとえばケール、菜種（キャノーラ）、カブハボタン（スウェーデンカブ）、カブラ）、クローバー（たとえばタチクローバー、アカツメクサ、サブタレニアンクローバー、シロツメクサ）、牧草（たとえばバミューダグラス、スズメノチャヒキ、偽エンバク（ｆａｌｓｅ  ｏａｔ  ｇｒａｓｓ）、ウシノケグサ、ヒースグラス（ｈｅａｔｈ  ｇｒａｓｓ）、イチゴツナギ、カモガヤ、ドクムギ、オオアワガエリ）、トウモロコシ（メイズ）、キビ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、ソルガム、ダイズ、及びコムギ、並びにビートなどのような野菜である。まぐさは、子実生産由来の作物残渣（トウモロコシのわら；コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、及び他の穀粒由来の麦わらなど）；ビートトップのような野菜由来の残渣；大豆、菜種、及び他のマメ科植物由来の茎及び葉のような油料種子生産由来の残渣；並びに動物若しくはヒトの消費のための穀粒の精製由来の又は燃料生産若しくは他の産業由来の画分をさらに含む。
【００３６】
粗飼料：「粗飼料」という用語は、繊維、ふすま、種及び穀粒由来の殻、並びに作物残渣（わら、コプラ、麦わら、もみ殻、テンサイの廃棄物など）などのような、繊維のレベルが高い乾燥植物原材料を意味する。
【００３７】
敷料の品質：「敷料の品質」という用語は、動物が排出する敷料の状態を意味する。敷料は、寝わらの原材料、排出物、羽毛、無駄になった飼料、及び無駄になった水の混合物である。品質は、水分、ｐＨ値、アンモニア態窒素含有量などによって特徴付けることができる。
【００３８】
［発明の詳細な説明］
［敷料の品質を改善する及び／又は趾蹠皮膚炎を低下させるための方法］
驚くべきことに、微生物ムラミダーゼを有する動物用飼料を補足することが、微生物ムラミダーゼを有していない動物用飼料と比較して、単胃動物の敷料の品質を改善するといったかなりの利益をもたらすことがわかった。インビボにおけるブロイラー試験において、驚くべきことに、次のことが発見された：
（ａ）ムラミダーゼによる処置は、より低い敷料の水分に結びつく；
（ｂ）ムラミダーゼによる処置は、より低い敷料アンモニア態窒素に結びつく；及び／又は
（ｄ）ムラミダーゼによる処置は、より低い敷料ｐＨ値に結びつく。
【００３９】
さらに驚くべきことに、微生物ムラミダーゼを有する動物用飼料を補足することが、微生物ムラミダーゼを有していない動物用飼料と比較して、単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させることがわかった。インビボにおけるブロイラー試験において、驚くべきことに、次のことが発見された：
（ａ）ムラミダーゼによる処置は、趾蹠皮膚炎スコアの低下に結びつく。
【００４０】
したがって、本発明は、敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための方法であって、１つ以上の微生物ムラミダーゼを含む組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤を動物に投与することを含む方法に関する。
【００４１】
本発明において、改善は、微生物ムラミダーゼが存在しない（本明細書においてネガティブコントロールと呼ばれる）動物用飼料又は動物用飼料添加剤と比較される。
【００４２】
好ましくは、敷料の水分は、ネガティブコントロールと比較して、少なくとも１％、たとえば少なくとも１．５％、少なくとも２．０％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、又は少なくとも５％低い。
【００４３】
好ましくは、敷料のアンモニア態窒素は、ネガティブコントロールと比較して、少なくとも１０％、たとえば少なくとも１５％、少なくとも２５％、又は少なくとも３０％低い。
【００４４】
好ましくは、敷料のｐＨ値は、ネガティブコントロールと比較して、０．０５〜０．２、たとえば０．０７５〜０．１７５、０．１〜０．１５低い。
【００４５】
好ましくは、趾蹠皮膚炎は、ネガティブコントロールと比較して、５％〜３０％、たとえば１０％〜２５％、１５％〜２０％低下する。
【００４６】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、動物用飼料１ｋｇ当たり１００〜１０００ｍｇの酵素タンパク質、たとえば動物用飼料１ｋｇ当たり２００〜９００ｍｇ、３００〜８００ｍｇ、４００〜７００ｍｇ、５００〜６００ｍｇの酵素タンパク質などのレベル又はこれらの区間の任意の組み合わせで添加されてもよい。
【００４７】
本発明において、単胃動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、家禽、シチメンチョウ、カモ、ウズラ、ホロホロチョウ、ガチョウ、ハト、ひなバト、鶏、ブロイラー、産卵鶏、若めんどり、及びヒヨコ、ネコ、イヌ、ウマ、甲殻類の動物、小エビ、中エビ、魚、アンバージャック、ピラルク、バーブ、バス、アミキリ、ボカチコ、ブリーム、カジカ、コロソマ、コイ、ナマズ、カトラ、サバヒー、チャー、カワスズメ、スギ、タラ、クラッピー、へダイ、ニベ科の魚、ウナギ、ハゼ、キンギョ、グラミー、ハタ、グァポテ、ハリバット、ジャワ、ラベオ、ライ、ドジョウ、サバ、ミルクフィッシュ、サギ、ボウフィン、ボラ、パコ、パールスポット、ペヘレイ、パーチ、カワカマス、コバンアジ、ローチ、サケ、サンパ、ソーガー、ハタ科の魚、タイ、シャイナー、カワアナゴ科の魚、タイワンドジョウ、フエダイ、アカメ、シタビラメ、スパインフット、チョウザメ、マンボウ、アユ、テンチ、テラー、テラピア、マス、マグロ、ターボット、シロマス、ウォールアイ、並びにホワイトフィッシュからなる群から選択されてもよい。好ましくは、単胃動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、家禽、シチメンチョウ、カモ、ウズラ、ホロホロチョウ、ガチョウ、ハト、ひなバト、鶏、ブロイラー、産卵鶏、若めんどり、及びヒヨコからなる群から選択される。より好ましくは、単胃動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、鶏、ブロイラー、産卵鶏、及びヒヨコからなる群から選択される。
【００４８】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、誕生から屠殺まで動物に供給されてもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、誕生から屠殺まで、毎日、動物に供給される。より好ましくは、微生物ムラミダーゼは、動物の生存期間の間、少なくとも１０日、たとえば少なくとも１５日又は少なくとも２０日（日は連続的又は非連続的とすることができる）間、毎日、動物に供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、１０〜２０日間、動物に供給され、その後、５〜１０日の非処置期間が続き、このサイクルは、動物の生存期間の間、繰り返される。
【００４９】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、ふ化後最初の４９日間、ブロイラーに供給されてもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ふ化後最初の３６日間、ブロイラーに供給される。より好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ふ化後２２〜３６日目にブロイラーに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、プレスターター（１〜７日目）期の間、ブロイラーに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、スターター（８〜２２日目）期の間、ブロイラーに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、プレスターター（１〜７日目）及びスターター（８〜２２日目）期の間、ブロイラーに供給される。
【００５０】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、動物の生存期間の間、産卵鶏に供給されてもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ふ化から７６週間、産卵鶏に供給される。より好ましくは、微生物ムラミダーゼは、産卵期の間（およそ１８週目から）、産卵鶏に供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、産卵期の間、産卵鶏に供給されるが、強制換羽期の間は与えられない。
【００５１】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、動物の生存期間の間、シチメンチョウに供給されてもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ふ化から２４週間、シチメンチョウに供給される。より好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ふ化から最初の１６週間（雌鶏について）及びふ化の最初の２０週間（雄シチメンチョウについて）、シチメンチョウに供給される。
【００５２】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、動物の生存期間の間、ブタに供給されてもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、誕生から２７週間、ブタに供給される。より好ましくは、微生物ムラミダーゼは、誕生から離乳（４週間で）まで、子ブタに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、誕生から最初の６週間（４週間の授乳期及び離乳後の２週間）、子ブタに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、プレスターター（離乳後１〜１４日目）の間、離乳した子ブタに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、スターター（離乳後１５〜４２日目）期の間、離乳した子ブタに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、プレスターター（離乳後１〜１４日目）及びスターター（離乳後１５〜４２日目）期の間、離乳した子ブタに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、育成／肥育期（誕生後１０週目〜およそ２７週目）の間、ブタに供給される。
【００５３】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、菌類起源のものであってもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、たとえばチャワンタケ亜門（ｓｕｂ−ｐｈｙｌｕｍ  Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）などから得られる又は入手可能である。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ＧＨ２４及びＧＨ２５からなるリストから選択される１つ以上のドメインを含む。
【００５４】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、配列番号１、４、又は１０に対して、少なくとも５０％、たとえば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有していてもよい。
【００５５】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、配列番号１のアミノ酸配列若しくはその対立遺伝子変異体を含んでいてもよく若しくはそれからなってもよく；又はムラミダーゼ活性を有する断片であり、断片は、少なくとも１７０のアミノ酸、たとえば少なくとも１７５のアミノ酸、少なくとも１７７のアミノ酸、少なくとも１８０のアミノ酸、少なくとも１８５のアミノ酸、少なくとも１９０のアミノ酸、少なくとも１９５のアミノ酸、又は少なくとも２００のアミノ酸などを含む。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、配列番号１のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体並びにＮ末端及び／又はＣ末端Ｈｉｓ−タグ及び／又はＨＱ−タグを含む又はそれからなる。より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜２１３を含む又はそれからなる。
【００５６】
その代わりに、微生物ムラミダーゼは、配列番号４のアミノ酸配列若しくはその対立遺伝子変異体を含んでいてもよく若しくはそれからなってもよく；又はムラミダーゼ活性を有するその断片であり、断片は、少なくとも２１０のアミノ酸、たとえば少なくとも２１５のアミノ酸、少なくとも２２０のアミノ酸、少なくとも２２５のアミノ酸、少なくとも２３０のアミノ酸、少なくとも２３５のアミノ酸、又は少なくとも２４０のアミノ酸などを含む。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、配列番号４のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体並びにＮ末端及び／又はＣ末端Ｈｉｓ−タグ及び／又はＨＱ−タグを含む又はそれからなる。より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜２４５を含む又はそれからなる。
【００５７】
さらにその代わりに、微生物ムラミダーゼは、配列番号１０のアミノ酸配列若しくはその対立遺伝子変異体を含んでいてもよく若しくはそれからなってもよく；又はムラミダーゼ活性を有するその断片であり、断片は、少なくとも２１０のアミノ酸、たとえば少なくとも２１５のアミノ酸、少なくとも２２０のアミノ酸、少なくとも２２５のアミノ酸、少なくとも２３０のアミノ酸、少なくとも２３５のアミノ酸、又は少なくとも２４０のアミノ酸などを含む。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、配列番号１０のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体並びにＮ末端及び／又はＣ末端Ｈｉｓ−タグ及び／又はＨＱ−タグを含む又はそれからなる。より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸１〜２０８を含む又はそれからなる。
【００５８】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、配列番号１、４、又は１０の変異体であってもよく、変異体は、ムラミダーゼ活性を有し且つ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０の位置に、１つ以上の置換及び／又は１つ以上の欠失及び／又は１つ以上の挿入又はその任意の組み合わせを有する。好ましくは、配列番号１、４、又は１０における１つ以上のアミノ酸置換及び／又は１つ以上のアミノ酸欠失及び／又は１つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組み合わせを含む位置の数は、１〜４５、たとえば１〜４０、１〜３５、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、又は１〜５の位置などである。より好ましくは、配列番号１、４、又は１０における１つ以上のアミノ酸置換及び／又は１つ以上のアミノ酸欠失及び／又は１つ以上のアミノ酸挿入又はその任意の組み合わせを含む位置の数は、１０以下、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。さらに好ましくは、配列番号１、４、又は１０における置換、欠失、及び／又は挿入の数は、１０以下、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。さらに好ましくは、配列番号１、４、又は１０における置換、好ましくは保存的置換の数は、１０以下、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。さらに好ましくは、配列番号１、４、又は１０における保存的置換の数は、１０以下、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。
【００５９】
当業者は誰でも、微生物ムラミダーゼのポリペプチドが、アミノ酸の変化を有していてもよいことを理解することができる。アミノ酸の変化は、小さなもの、すなわち、タンパク質のフォールディング及び／若しくは活性に著しく影響を与えない保存的アミノ酸置換若しくは挿入；通常１〜３０のアミノ酸のわずかな欠失；アミノ末端メチオニン残基などのようなわずかなアミノ若しくはカルボキシ末端の伸張；２０〜２５残基以下の小さなリンカーペプチド；又はポリヒスチジン域、抗原エピトープ、若しくは結合ドメインなどのように、実効電荷若しくは別の機能を変化させることによって精製を容易にするわずかな伸張であってもよい。
【００６０】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）、並びに小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、及びメチオニン）の群内のものである。一般に比活性を改変しないアミノ酸置換は、当技術分野において知られており、たとえばＨ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋによって記載される。一般によくある置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／ｌｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／ｌｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００６１】
ポリペプチドにおける必須のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング変異導入法（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などのような、当技術分野において知られている手順に従って同定することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。後者の技術では、単一のアラニン突然変異が、分子のすべての残基に導入され、結果として生じる突然変異分子は、分子の活性に不可欠であるアミノ酸残基を同定するために、ムラミダーゼ活性についてテストされる。Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８もまた、参照されたい。酵素又は他の生物学的相互作用の活性部位はまた、推定上のアミノ酸接触位置の突然変異と併せて、核磁気共鳴、結晶構造解析、電子回折、又は光アフィニティー標識法のような技術によって決定されるように、構造の物理的解析によって決定することもできる。たとえばｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照されたい。必須のアミノ酸の同一性はまた、関係するポリペプチドとのアライメントから推測することもできる。
【００６２】
アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２ムラミダーゼの結晶構造は、国際公開第２０１３／０７６２５３号パンフレットにおいて開示されるように、１．３Åの分解能で解析された。これらの原子座標は、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２ムラミダーゼの構造又は相同な構造（本発明の変異体など）を描く３次元モデルを生成するために使用することができる。ｘ線構造を使用して、アミノ酸残基Ｄ９５及びＥ９７（番号付けについては配列番号１を使用）は、触媒残基として同定された。
【００６３】
一実施形態では、本発明は、敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための方法であって、１つ以上の微生物ムラミダーゼを含む組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤を動物に投与することを含み、
（ａ）微生物ムラミダーゼは、ＧＨ２４及びＧＨ２５からなるリストから選択される１つ以上のドメインを含む微生物ムラミダーゼであり、動物用飼料１ｋｇ当たり３００〜５００ｍｇの酵素タンパク質のレベルで添加される；
（ｂ）動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、鶏、ブロイラー、産卵鶏、若めんどり、及びヒヨコからなる群から選択される；
（ｃ）任意選択で、微生物ムラミダーゼは、動物の生存期間の間、少なくとも１０日間、毎日、動物に供給される、方法に関する。
【００６４】
別の実施形態では、本発明は、敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための方法であって、１つ以上の微生物ムラミダーゼを含む組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤を動物に投与することを含み、
（ａ）微生物ムラミダーゼは、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）から得られる又は入手可能なＧＨ２４又はＧＨ２５ムラミダーゼであり、動物１ｋｇ当たり３００〜５００ｍｇの酵素タンパク質のレベルで添加される；
（ｂ）動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、鶏、ブロイラー、産卵鶏、若めんどり、及びヒヨコからなる群から選択される；並びに
（ｃ）敷料の品質のパラメーターの１つは、ネガティブコントロールと比較して、少なくとも１％改善される、方法に関する。
【００６５】
別の実施形態では、本発明は、敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための方法であって、１つ以上の微生物ムラミダーゼを含む組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤を動物に投与することを含み、
（ａ）微生物ムラミダーゼは、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）から得られる又は入手可能なＧＨ２４又はＧＨ２５ムラミダーゼであり、動物用飼料１ｋｇ当たり３００〜５００ｍｇの酵素タンパク質のレベルで添加される；
（ｂ）動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、鶏、ブロイラー、産卵鶏、若めんどり、及びヒヨコからなる群から選択される；並びに
（ｃ）趾蹠皮膚炎は、ネガティブコントロールと比較して、少なくとも１０％低下する、方法に関する。
【００６６】
［配合物］
本発明の微生物ムラミダーゼは、敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための組成物として配合されてもよく、本発明は、これもまた包含することを意図する。本発明の微生物ムラミダーゼは、液体又は固体として配合されてもよい。
【００６７】
液体配合物については、配合剤は、ポリオール（たとえばグリセロール、エチレングリコール、若しくはプロピレングリコールなど）、塩（たとえば塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムなど）、又は糖若しくは糖誘導体（たとえばデキストリン、グルコース、スクロース、及びソルビトールなど）を含んでいてもよい。したがって、本発明の組成物は、本発明の微生物ムラミダーゼ並びにグリセロール、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、及びソルビトールからなるリストから選択される１つ以上の配合剤を含む液体組成物であってもよい。液体配合物は、飼料をペレットにした後で、飼料に噴霧されてもよい又は動物に与えられる飲料水に追加されてもよい。
【００６８】
固体配合物については、本発明の組成物は、たとえば顆粒、噴霧乾燥粉末、又は凝集体であってもよい。配合剤は、塩（有機又は無機亜鉛、ナトリウム、カリウム、又はカルシウム塩、たとえば酢酸カルシウム、安息香酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カリウム、安息香酸カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸亜鉛、安息香酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛、ソルビン酸亜鉛、硫酸亜鉛など）、デンプン又は糖又は糖誘導体（たとえばスクロース、デキストリン、グルコース、ラクトース、ソルビトールなど）を含んでいてもよい。
【００６９】
たとえば、固体組成物は、粒状の形態をしている。顆粒は、構成成分が均一に混合されたマトリックス構造を有していてもよい。しかしながら、顆粒は、通常、コア粒子及び１つ以上のコーティングを含み、コーティングは、通常、塩及び／又はワックスコーティングである。ワックスの例は、ポリエチレングリコール；ポリプロピレン；カルナウバろう；カンデリラろう；蜜ろう；硬化ウシ獣脂、硬化パーム油、硬化綿実油、及び／又は硬化大豆油などのような硬化植物油又は動物獣脂；脂肪酸アルコール；ステアリン酸はステアリン酸及びパルミチン酸の混合物であるステアリン酸グリセリルなどのようなモノグリセリド及び／又はジグリセリド；微晶ろう；パラフィン；並びに硬化直鎖長鎖脂肪酸などのような脂肪酸及びその誘導体である。好ましいワックスは、パーム油又は硬化パーム油である。コア粒子は、任意選択で１つ以上の塩と一緒に任意選択で１つ以上の追加の酵素と組み合わせた本発明のムラミダーゼの均一のブレンド又は１つ以上の追加の酵素と任意選択で組み合わせた本発明のムラミダーゼを塗布した不活性粒子とすることができる。
【００７０】
上記の顆粒において、コア粒子の原材料は、無機塩（たとえば酢酸カルシウム、安息香酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カリウム、安息香酸カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸亜鉛、安息香酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、クエン酸亜鉛、ソルビン酸亜鉛、硫酸亜鉛など）、デンプン又は糖又は糖誘導体（たとえばスクロース、デキストリン、グルコース、ラクトース、ソルビトールなど）、糖又は糖誘導体（たとえばスクロース、デキストリン、グルコース、ラクトース、ソルビトールなど）、小有機分子、デンプン、フラワー、セルロース、及びミネラル並びに粘土鉱物（含水アルミニウム層状ケイ酸塩（ｈｙｄｒｏｕｓ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｐｈｙｌｌｏｓｉｌｉｃａｔｅ）としても知られている）からなる群から選択されてもよい。好ましくは、コアは、カオリナイト又はカオリンなどのような粘土鉱物を含む。
【００７１】
塩コーティングは、通常、厚さが少なくとも１μｍであり、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、及び／又はクエン酸ナトリウムなどのような、１つの特定の塩又は塩の混合物とすることができる。他の例は、たとえば国際公開第２００８／０１７６５９号パンフレット、国際公開第２００６／０３４７１０号パンフレット、国際公開第１９９７／０５２４５号パンフレット、国際公開第１９９８／５４９８０号パンフレット、国際公開第１９９８／５５５９９号パンフレット、国際公開第２０００／７００３４号パンフレットにおいて記載されるもの又は国際公開第２００１／０００４２号パンフレットにおいて記載されるなどのポリマーコーティングである。
【００７２】
好ましくは、本発明の組成物は、本発明のムラミダーゼ並びに塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプン、及びセルロースからなるリストから選択される１つ以上の配合剤を含む固体組成物である。より好ましくは、配合剤は、１つ以上の以下の化合物から選択される：硫酸ナトリウム、デキストリン、セルロース、チオ硫酸ナトリウム、及び炭酸カルシウム。さらに好ましくは、固体組成物は、粒状の形態をしている。よりさらに好ましくは、固体組成物は、粒状の形態をしており、コア粒子、本発明のムラミダーゼを含む酵素層、及び塩コーティングを含む。
【００７３】
好ましくは、配合剤は、１つ以上の以下の化合物から選択される：グリセロール、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコール又は１，３−プロピレングリコール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプン、カオリン、及びセルロース。より好ましくは、配合剤は、１つ以上の以下の化合物から選択される：１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール、硫酸ナトリウム、デキストリン、セルロース、チオ硫酸ナトリウム、カオリン、及び炭酸カルシウム。
【００７４】
［動物用飼料及び動物用飼料添加剤］
本発明の微生物ムラミダーゼは、敷料の品質を改善する及び／又は動物の趾蹠皮膚炎を低下させるために動物用飼料又は動物用飼料添加剤として配合されてもよく、本発明は、これもまた包含することを意図する。
【００７５】
動物用飼料組成物又は動物用の餌は、タンパク質の含有量が比較的高い。家禽及びブタの餌は、国際公開第２００１／０５８２７５号パンフレットの表Ｂ、２〜３列目に示されるような特徴をなすことができる。魚の餌は、この表Ｂの４列目に示されるような特徴をなすことができる。さらに、そのような魚の餌は、普通、２００〜３１０ｇ／ｋｇの粗脂肪含有量を有する。
【００７６】
本発明による動物用飼料組成物は、５０〜８００ｇ／ｋｇの粗タンパク質含有量を有していてもよく、本明細書において記載される１つ以上の微生物ムラミダーゼをさらに含む。
【００７７】
さらに又は代わりに（上記に示される粗タンパク質含有量の）、本発明の動物用飼料組成物は、１０〜３０ＭＪ／ｋｇの代謝エネルギー含有量；及び／又は０．１〜２００ｇ／ｋｇのカルシウム含有量；及び／又は０．１〜２００ｇ／ｋｇの有効リン含有量；及び／又は０．１〜１００ｇ／ｋｇのメチオニン含有量；及び／又は０．１〜１５０ｇ／ｋｇのメチオニンプラスシステインの含有量；及び／又は０．５〜５０ｇ／ｋｇのリシン含有量を有していてもよい。
【００７８】
特に、代謝エネルギー、粗タンパク質、カルシウム、リン、メチオニン、メチオニンプラスシステイン、及び／又はリシンの含有量は、国際公開第２００１／０５８２７５号パンフレットの表Ｂの範囲２、３、４、又は５（Ｒ．２〜５）のいずれか１つの範囲内にあってもよい。
【００７９】
窒素含有量は、ケルダール法によって決定され（Ａ．Ｏ．Ａ．Ｃ．，１９８４，Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １４ｔｈ  ｅｄ．，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ）、粗タンパク質は、窒素（Ｎ）に係数６．２５を掛けて算出される（すなわち粗タンパク質（ｇ／ｋｇ）＝Ｎ（ｇ／ｋｇ）×６．２５）。
【００８０】
代謝エネルギーは、ＮＲＣ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｗｉｎｅ，ｎｉｎｔｈ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９８８，ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｓｗｉｎｅ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ａｎｉｍａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｕｎｃｉｌ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．２−６及びｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｖａｌｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｆｅｅｄ−ｓｔｕｆｆｓ，Ｓｐｅｌｄｅｒｈｏｌｔ  ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  ｐｏｕｌｔｒｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，７３６１  ＤＡ  Ｂｅｅｋｂｅｒｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．Ｇｒａｆｉｓｃｈ  ｂｅｄｒｉｊｆ  Ｐｏｎｓｅｎ＆ｌｏｏｉｊｅｎ  ｂｖ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ．ＩＳＢＮ  ９０−７１４６３−１２−５に基づいて算出することができる。
【００８１】
バランスの取れた動物用の餌のカルシウム、有効リン、及びアミノ酸の食事含有量は、Ｖｅｅｖｏｅｄｅｒｔａｂｅｌ  １９９７，ｇｅｇｅｖｅｎｓ  ｏｖｅｒ  ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  ｓａｍｅｎｓｔｅｌｌｉｎｇ，ｖｅｒｔｅｅｒｂａａｒｈｅｉｄ  ｅｎ  ｖｏｅｄｅｒｗａａｒｄｅ  ｖａｎ  ｖｏｅｄｅｒｍｉｄｄｅｌｅｎ，Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｖｅｅｖｏｅｄｅｒｂｕｒｅａｕ，Ｒｕｎｄｅｒｗｅｇ  ６，８２１９  ｐｋ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ．ＩＳＢＮ  ９０−７２８３９−１３−７などのような飼料表に基づいて算出される。
【００８２】
本発明の動物用飼料組成物は、上記に定義される少なくとも１つの植物性タンパク質を含有してもよい。
【００８３】
本発明の動物用飼料組成物は、通常０〜２５％の量で、肉骨粉、羽毛粉、及び／又は魚粉などのような動物性タンパク質を含有してもよい。本発明の動物用飼料組成物は、通常０〜３０％の量で、ドライドジスチラーズグレインソリュブル（ＤＤＧＳ）を含んでいてもよい。
【００８４】
好ましくは、本発明の動物用飼料組成物は、０〜８０％のメイズ；及び／又は０〜８０％のソルガム；及び／又は０〜７０％のコムギ；及び／又は０〜７０％のオオムギ；及び／又は０〜３０％のカラスムギ；及び／又は０〜４０％のダイズ粉；及び／又は０〜２５％の魚粉；及び／又は０〜２５％の肉骨粉；及び／又は０〜２０％のホエーを含有する。
【００８５】
好ましくは、本発明の動物用飼料は、植物性タンパク質を含む。植物性タンパク質のタンパク質含有量は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％（ｗ／ｗ）である。
【００８６】
本発明において、植物性タンパク質は、植物性タンパク質源、たとえばマメ科植物及び穀物など、たとえばマメ科（レグミノサエ）（Ｆａｂａｃｅａｅ（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ））、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、及びイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の植物由来の原材料、たとえば大豆粕、ハウチワマメ粕、菜種粕、及びその組み合わせなどに由来してもよい。
【００８７】
植物性タンパク質源は、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）の１つ以上の植物、たとえばダイズ、ハウチワマメ、エンドウマメ、又はインゲン由来の原材料であってもよい。植物性タンパク質源はまた、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）の１つ以上の植物、たとえばビート、テンサイ、ホウレンソウ、又はキノア由来の原材料であってもよい。植物性タンパク質源の他の例は、菜種及びキャベツである。ダイズは、好ましい植物性タンパク質源である。植物性タンパク質源の他の例は、オオムギ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、メイズ（トウモロコシ）、イネ、及びソルガムなどのような穀物である。
【００８８】
動物用の餌は、たとえば、マッシュされた飼料（ペレットにされない）又はペレットにされた飼料として製造することができる。通常、製粉された飼料原料は、混合され、十分な量の必須のビタミン及びミネラルは、当該の種についての規格に従って追加される。酵素は、固体又は液体酵素配合物として追加することができる。たとえば、マッシュ飼料については、固体又は液体酵素配合物は、成分混合ステップの前又はその間に追加されてもよい。ペレットにされた飼料については、（液体又は固体）ムラミダーゼ／酵素調製物は、飼料成分ステップの前又はその間に追加されてもよい。通常、液体酵素調製物は、任意選択でグリセロール、エチレングリコール、又はプロピレングリコールなどのようなポリオールと共に、本発明の微生物ムラミダーゼを含み、ペレットに液体配合物を噴霧することによってなどのように、ペレット成形ステップの後に追加される。ムラミダーゼはまた、飼料添加剤又はプレミックス中に組み込まれてもよい。
【００８９】
その代わりに、本発明の微生物ムラミダーゼは、挽いたダイズ粉などのような増量剤と液体酵素溶液の混合物を凍結させ、次いで、混合物を凍結乾燥することによって、調製されてもよい。
【００９０】
本発明において、動物用飼料組成物は、１つ以上の追加の酵素、微生物、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、及び／又は他の飼料成分をさらに含んでいてもよい。
【００９１】
好ましくは、組成物は、本発明の１つ以上の微生物ムラミダーゼ、１つ以上の配合剤、並びに次のものからなるリストから選択される１つ以上の構成成分を含む：１つ以上の追加の酵素；１つ以上の微生物；１つ以上のビタミン；１つ以上のミネラル；１つ以上のアミノ酸；及び１つ以上の他の飼料成分。
【００９２】
本発明の動物用飼料組成物の最終的なムラミダーゼ濃度は、動物用飼料１ｋｇ当たり０．０１〜２００ｍｇの酵素タンパク質、たとえば動物用飼料１ｋｇ当たり０．１〜１５０ｍｇ、０．５〜１００ｍｇ、１〜７５ｍｇ、２〜５０ｍｇ、３〜２５ｍｇ、２〜８０ｍｇ、５〜６０ｍｇ、８〜４０ｍｇ、若しくは１０〜３０ｍｇの酵素タンパク質又はこれらの区間の任意の組み合わせなどの範囲内にあってもよい。
【００９３】
微生物ムラミダーゼは、１つ以上の以下の量（投薬範囲）で投与されることが、今のところ想定される：０．０１〜２００；０．０１〜１００；０．５〜１００；１〜５０；５〜１００；５〜５０；１０〜１００；０．０５〜５０；５〜２５；又は０．１０〜１０−これらの範囲はすべて、飼料１ｋｇ当たりのムラミダーゼをｍｇで表している（ｐｐｍ）。
【００９４】
飼料１ｋｇ当たりのムラミダーゼタンパク質のｍｇを決定するために、ムラミダーゼは、飼料組成物から精製され、精製されたムラミダーゼの比活性は、適切なアッセイ（下記のムラミダーゼ活性を参照）を使用して決定される。飼料組成物のムラミダーゼ活性それ自体もまた、同じアッセイを使用して決定され、これら２つの決定に基づいて、飼料１ｋｇ当たりのムラミダーゼタンパク質ｍｇの投薬量が、算出される。
【００９５】
本発明の動物用飼料添加剤は、０．０１〜１０．０％；より詳細には０．０５〜５．０％；又は０．２〜１．０％（％は飼料１００ｇ当たりの添加剤のｇを意味する）のレベルで動物用の餌又は飼料に含まれる（又は含まれなければならないように定められる）ことが意図される。これは、特にプレミックスについてそうである。
【００９６】
同じ原則が、飼料添加剤中のムラミダーゼタンパク質のｍｇの決定にも適用される。当然、サンプルが、飼料添加剤又は飼料を調製するために使用されるムラミダーゼから入手できる場合、比活性は、このサンプルから決定される（飼料組成物又は添加剤からムラミダーゼを精製する必要はない）。
【００９７】
［追加の酵素］
本発明において、本明細書において記載される組成物又は動物用飼料又は動物用飼料添加剤は、１つ以上の酵素を任意選択で含む。酵素は、ハンドブックＥｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ＮＣ−ＩＵＢＭＢ，１９９２）に基づいて分類することができ、インターネットのＥＮＺＹＭＥのサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｅｎｚｙｍｅ／もまた参照されたい。ＥＮＺＹＭＥは、酵素の命名法に関する情報の宝庫である。ＥＮＺＹＭＥは、主として、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＵＢ−ＭＢ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９２の提言に基づくものであり、ＥＮＺＹＭＥは、ＥＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）番号が提供された、特徴付けられた酵素のそれぞれのタイプについて説明している（Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ．Ｔｈｅ  ＥＮＺＹＭＥ  ｄａｔａｂａｓｅ，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：３０４−３０５）。このＩＵＢ−ＭＢ  Ｅｎｚｙｍｅ命名法は、それらの基質特異性及び場合によってはそれらの分子機構に基づき；そのような分類は、これらの酵素の構造的な特徴を反映するものではない。
【００９８】
あるグリコシドヒドロラーゼ酵素、たとえばエンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ（ｇａｌａｃｔａｎａｓｅ）、マンナナーゼ、デキストラナーゼ、ムラミダーゼ、及びガラクトシダーゼなどの別の分類は、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  ｅｔ  ａｌ，“Ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ）ｉｎ  ２０１３”，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１４）４２（Ｄ１）：Ｄ４９０−Ｄ４９５において記載される；ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇもまた、参照されたい。
【００９９】
したがって、本発明の組成物又は動物用飼料又は動物用飼料添加剤はまた、フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８若しくは３．１．３．２６）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）；ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）；アルファ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）；プロテアーゼ（ＥＣ３．４）；ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）；ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）；リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５）；ホスホリパーゼＣ（３．１．４．３）；ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）；たとえばアルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）などのようなアミラーゼ；アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）；ベータ−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）；アセチルキシランエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７２）；フェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）；セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）；セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）；ベータ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）；プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、アルファ−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２４）、マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．２５）、及びベータ−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４若しくはＥＣ３．２．１．６）又はその任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの他の酵素を含んでいてもよい。
【０１００】
市販で入手可能なフィターゼの例は、Ｂｉｏ−Ｆｅｅｄ（商標）フィターゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｐ、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＮＰ、及びＲｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＨｉＰｈｏｓ（ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｎａｔｕｐｈｏｓ（商標）（ＢＡＳＦ）、Ｆｉｎａｓｅ（登録商標）、及びＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）Ｂｌｕｅ（ＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）、ＯｐｔｉＰｈｏｓ（登録商標）（Ｈｕｖｅｐｈａｒｍａ）、Ｐｈｙｚｙｍｅ（登録商標）ＸＰ（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ／ＤｕＰｏｎｔ）、及びＡｘｔｒａ（登録商標）ＰＨＹ（ＤｕＰｏｎｔ）を含む。他の好ましいフィターゼは、たとえば国際公開第９８／２８４０８号パンフレット、国際公開第００／４３５０３号パンフレット、及び国際公開第０３／０６６８４７号パンフレットにおいて記載されるものを含む。
【０１０１】
市販で入手可能なキシラナーゼの例は、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＷＸ及びＲｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ２（ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｅｃｏｎａｓｅ（登録商標）ＸＴ及びＢａｒｌｅｙ（ＡＢ  Ｖｉｓｔａ）、Ｘｙｌａｔｈｉｎ（登録商標）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ）、Ｈｏｓｔａｚｙｍ（登録商標）Ｘ（Ｈｕｖｅｐｈａｒｍａ）、並びにＡｘｔｒａ（登録商標）ＸＢ（キシラナーゼ／ベータ−グルカナーゼ、ＤｕＰｏｎｔ）を含む。
【０１０２】
市販で入手可能なプロテアーゼの例は、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔ（ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含む。
【０１０３】
［微生物］
本発明において、組成物又は動物用飼料又は動物用飼料添加剤は、１つ以上の追加の微生物をさらに含んでいてもよい。たとえば、組成物又は動物用飼料は、１つ以上の以下の属由来の細菌をさらに含む：乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペジオコックス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオン酸菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、及びメガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）又はその任意の組み合わせ。
【０１０４】
好ましくは、本発明の組成物又は動物用飼料又は動物用飼料添加剤は、１つ以上の以下の株由来の細菌をさらに含む：バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、腸球菌種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、及びペジオコックス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、乳酸桿菌種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、ビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ペジオコックス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、プロピオニバクテリウム・ソエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｏｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマーリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）亜種アニマーリス（ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｉｉｖａｒｉｕｓ）亜種サリバリウス（ｓａｉｉｖａｒｉｕｓ）、メガスフェラ・エルスデニイ．（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、プロピオン酸菌種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐ）。
【０１０５】
より好ましくは、本発明の組成物又は動物用飼料又は動物用飼料添加剤は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の１つ以上の以下の株由来の細菌をさらに含む：３Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０６）、１５Ａ−Ｐ４（ＰＴＡ−６５０７）、２２Ｃ−Ｐ１（ＰＴＡ−６５０８）、２０８４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３０）、ＬＳＳＡ０１（ＮＲＲＬ−Ｂ−５０１０４）、ＢＳ２７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１  ０５）、ＢＳ  １８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３３）、ＢＳ  ２７８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６３４）、ＤＳＭ  ２９８７０、ＤＳＭ  ２９８７１、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１３６、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６０５、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６０６、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６２２、及びＰＴＡ−７５４７。
【０１０６】
より好ましくは、本発明の組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤は、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）の１つ以上の以下の株由来の細菌をさらに含む：ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１６、ＡＴＣＣ  ７００３８５、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８８５、又はＮＲＲＬ  Ｂ−５０８８６。
【０１０７】
より好ましくは、組成物、動物用飼料添加剤、又は動物用飼料は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の１つ以上の以下の株由来の細菌をさらに含む：ＮＲＲＬ  Ｂ  ５００１５、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６２１、又はＮＲＲＬ  Ｂ−５０６２３。
【０１０８】
より好ましくは、本発明の組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の１つ以上の以下の株由来の細菌をさらに含む：ＤＳＭ  ２９８６９、ＤＳＭ  ２９８７２、ＮＲＲＬ  Ｂ  ５０６０７、ＰＴＡ−７５４３、ＰＴＡ−７５４９、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０３４９、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０６０６、ＮＲＲＬ  Ｂ−５００１３、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１５１、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１４１、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１４７、又はＮＲＲＬ  Ｂ−５０８８８。
【０１０９】
本発明の組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤中の細菌株のそれぞれの細菌数は、１×１０４〜１×１０１４ＣＦＵ／乾燥材料ｋｇ、好ましくは１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／乾燥材料ｋｇ、より好ましくは１×１０７〜１×１０１１、最も好ましくは１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／乾燥材料ｋｇである。
【０１１０】
本発明の組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤中の細菌株のそれぞれの細菌数は、１×１０５〜１×１０１５ＣＦＵ／動物／日、好ましくは１×１０７〜１×１０１３ＣＦＵ／動物／日、より好ましくは１×１０８〜１×１０１２ＣＦＵ／動物／日、最も好ましくは１×１０９〜１×１０１１ＣＦＵ／動物／日である。
【０１１１】
本発明において、１つ以上の菌株は、安定した胞子の形態で存在してもよい。
【０１１２】
［プレミックス］
本発明において、組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤は、たとえば、混合して動物用飼料にされるビタミン、ミネラル、酵素、アミノ酸、防腐剤、抗生物質、他の飼料成分、又はその任意の組み合わせを含むプレミックスを含んでいてもよい。
【０１１３】
［アミノ酸］
本発明の組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤は、１つ以上のアミノ酸をさらに含んでいてもよい。アミノ酸の例は、リシン、アラニン、ベータ−アラニン、スレオニン、メチオニン、及びトリプトファンを含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
［ビタミン及びミネラル］
本発明において、組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤は、１つ以上のビタミン、たとえば１つ以上の脂溶性ビタミン及び／又は１つ以上の水溶性ビタミンなどを含んでいてもよい。任意選択で、本発明の組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤は、１つ以上のミネラル、たとえば１つ以上の微量ミネラル及び／又は１つ以上のマクロミネラルなどを含んでいてもよい。
【０１１５】
通常、脂溶性及び水溶性ビタミン並びに微量ミネラルは、飼料への追加が意図されるいわゆるプレミックスの一部を形成するのに対して、マクロミネラルは、普通、別々に飼料に追加される。
【０１１６】
脂溶性ビタミンの非限定的な例は、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、及びビタミンＫ、たとえばビタミンＫ３を含む。
【０１１７】
水溶性ビタミンの非限定的な例は、ビタミンＢ１２、ビオチン及びコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸、並びにパントテン酸塩、たとえばＤ−パントテン酸Ｃａを含む。
【０１１８】
微量ミネラルの非限定的な例は、ホウ素、コバルト、塩化物、クロム、銅、フッ化物、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、セレン、及び亜鉛を含む。
【０１１９】
マクロミネラルの非限定的な例は、カルシウム、マグネシウム、カリウム、及びナトリウムを含む。
【０１２０】
これらの構成成分の栄養必要量（家禽及び子ブタ／ブタにより例示される）は、国際公開第２００１／０５８２７５号パンフレットの表Ａに掲載される。栄養必要量は、これらの構成成分が、餌において、示される濃度で提供されなければならないことを意味する。
【０１２１】
代わりに、本発明の組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤は、国際公開第０１／５８２７５号パンフレットの表Ａにおいて指定される個々の構成成分の少なくとも１つを含む。少なくとも１つは、いずれか、１つ以上、１つ若しくは２つ若しくは３つ若しくは４つなど、最大１３すべて、又は最大１５すべての個々の構成成分を意味する。より詳細には、この少なくとも１つの個々の構成成分は、表Ａの４列目又は５列目又は６列目に示される範囲内の投入濃度（ｉｎ−ｆｅｅｄ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を提供するような量で、本発明の組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤中に含まれる。
【０１２２】
好ましくは、本発明の動物用飼料添加剤は、下記表１において指定される範囲内の投入濃度を提供するように、下記のビタミンの少なくとも１つを含む（それぞれ、子ブタ及びブロイラーの餌について）。
【０１２３】
【表１】
2021534739.tif 000002
【０１２４】
［他の飼料成分］
本発明の組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤は、着色剤、安定剤、成長を改善する添加剤、及び芳香化合物／香味料、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）；活性酸素生成種、殺菌性ペプチド、及び抗菌性ポリペプチドをさらに含んでいてもよい。
【０１２５】
着色剤の例は、ベータ−カロテン、アスタキサンチン、及びルテインなどのようなカロテノイドである。
【０１２６】
安定化剤（たとえば酸性化するもの）の例は、有機酸である。これらの例は、安息香酸（ＶｅｖｏＶｉｔａｌｌ（登録商標）、ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、蟻酸、酪酸、フマル酸、及びプロピオン酸である。
【０１２７】
芳香化合物／香味料の例は、クレオゾール、アネトール、デカ−、ウンデカ−、及び／又はドデカ−ラクトン、イオノン、イロン、ギンゲロール、ピペリジン、プロピリデンファタリド（ｐｈａｔａｌｉｄｅ）、ブチリデンファタリド、カプサイシン、及びタンニンである。
【０１２８】
多価不飽和脂肪酸の例は、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、及びガンマ−リノール酸などのようなＣ１８、Ｃ２０、及びＣ２２多価不飽和脂肪酸である。
【０１２９】
活性酸素生成種の例は、過ホウ酸塩、過硫酸塩、又は過炭酸塩などのような化学物質；及びオキシダーゼ、オキシゲナーゼ、又はシンテターゼなどのような酵素である。
【０１３０】
殺菌ペプチド（ＡＭＰ）の例は、国際公開第０３／０４４０４９号パンフレット及び国際公開第０３／０４８１４８号パンフレットにおいて開示される化合物及びポリペプチドを含め、ＣＡＰ１８、ロイコシンＡ（Ｌｅｕｃｏｃｉｎ  Ａ）、トリトルプチシン、プロテグリン−１、タナチン、デフェンシン、ラクトフェリン、ラクトフェリシン、及びノビスピリン（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌｅｈｒｅｒ，２０００）などのようなオビスピリン、プレクタシン、並びにスタチン並びに殺菌活性を保持する上記の変異体又は断片である。
【０１３１】
抗菌性ポリペプチド（ＡＦＰ）の例は、国際公開第９４／０１４５９号パンフレット及び国際公開第０２／０９０３８４号パンフレットにおいて開示されるように、アスペルギルス・ギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ペプチド並びに抗菌性の活性を保持するその変異体及び断片である。
【０１３２】
［微生物リゾチームの使用］
別の態様では、本発明は、敷料の品質を改善する及び／又は単胃動物の趾蹠皮膚炎を低下させるための組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤の使用であって、組成物、動物用飼料、又は動物用飼料添加剤は、１つ以上の微生物ムラミダーゼを含む、使用に関する。
【０１３３】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、動物用飼料１ｋｇ当たり１００〜１０００ｍｇの酵素タンパク質、たとえば動物用飼料１ｋｇ当たり２００〜９００ｍｇ、３００〜８００ｍｇ、４００〜７００ｍｇ、５００〜６００ｍｇの酵素タンパク質又はこれらの区間の任意の組み合わせなどのレベルで添加されてもよい。
【０１３４】
本発明において、単胃動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、家禽、シチメンチョウ、カモ、ウズラ、ホロホロチョウ、ガチョウ、ハト、ひなバト、鶏、ブロイラー、産卵鶏、若めんどり、及びヒヨコ、ネコ、イヌ、ウマ、甲殻類の動物、小エビ、中エビ、魚、アンバージャック、ピラルク、バーブ、バス、アミキリ、ボカチコ、ブリーム、カジカ、コロソマ、コイ、ナマズ、カトラ、サバヒー、チャー、カワスズメ、スギ、タラ、クラッピー、へダイ、ニベ科の魚、ウナギ、ハゼ、キンギョ、グラミー、ハタ、グァポテ、ハリバット、ジャワ、ラベオ、ライ、ドジョウ、サバ、ミルクフィッシュ、サギ、ボウフィン、ボラ、パコ、パールスポット、ペヘレイ、パーチ、カワカマス、コバンアジ、ローチ、サケ、サンパ、ソーガー、ハタ科の魚、タイ、シャイナー、カワアナゴ科の魚、タイワンドジョウ、フエダイ、アカメ、シタビラメ、スパインフット、チョウザメ、マンボウ、アユ、テンチ、テラー、テラピア、マス、マグロ、ターボット、シロマス、ウォールアイ、並びにホワイトフィッシュからなる群から選択されてもよい。好ましくは、単胃動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、家禽、シチメンチョウ、カモ、ウズラ、ホロホロチョウ、ガチョウ、ハト、ひなバト、鶏、ブロイラー、産卵鶏、若めんどり、及びヒヨコからなる群から選択される。より好ましくは、単胃動物は、ブタ、子ブタ、育成ブタ、雌ブタ、鶏、ブロイラー、産卵鶏、及びヒヨコからなる群から選択される。
【０１３５】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、誕生から屠殺まで動物に供給されてもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、誕生から屠殺まで、毎日、動物に供給される。より好ましくは、微生物ムラミダーゼは、動物の生存期間の間、少なくとも１０日、たとえば、少なくとも１５日又は少なくとも２０日（日は連続的又は非連続的とすることができる）間、毎日、動物に供給される。一実施形態では、微生物ムラミダーゼは、１０〜２０日間、動物に供給され、その後、５〜１０日の非処置期間が続き、このサイクルは、動物の生存期間の間、繰り返される。
【０１３６】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、ふ化後最初の４９日間、ブロイラーに供給されてもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ふ化後最初の３６日間、ブロイラーに供給される。より好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ふ化後２２〜３６日目にブロイラーに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、プレスターター（１〜７日目）期の間、ブロイラーに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、スターター（８〜２２日目）期の間、ブロイラーに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、プレスターター（１〜７日目）及びスターター（８〜２２日目）期の間、ブロイラーに供給される。
【０１３７】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、動物の生存期間の間、産卵鶏に供給されてもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ふ化から７６週間、産卵鶏に供給される。より好ましくは、微生物ムラミダーゼは、産卵期の間（およそ１８週目から）、産卵鶏に供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、産卵期の間、産卵鶏に供給されるが、強制換羽期の間、与えられない。
【０１３８】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、動物の生存期間の間、シチメンチョウに供給されてもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ふ化から２４週間、シチメンチョウに供給される。より好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ふ化から最初の１６週間（雌鶏について）及びふ化の最初の２０週間（雄シチメンチョウについて）、シチメンチョウに供給される。
【０１３９】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、動物の生存期間の間、ブタに供給されてもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、誕生から２７週間、ブタに供給される。より好ましくは、微生物ムラミダーゼは、誕生から離乳（４週間で）まで、子ブタに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、誕生から最初の６週間（４週間の授乳期及び離乳後の２週間）、子ブタに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、プレスターター（離乳後１〜１４日目）の間、離乳した子ブタに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、スターター（離乳後１５〜４２日目）期の間、離乳した子ブタに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、プレスターター（離乳後１〜１４日目）及びスターター（離乳後１５〜４２日目）期の間、離乳した子ブタに供給される。さらに好ましくは、微生物ムラミダーゼは、育成／肥育期（誕生後１０週目〜およそ２７週目）の間、ブタに供給される。
【０１４０】
本発明において、微生物ムラミダーゼは、菌類起源のものであってもよい。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、たとえばチャワンタケ亜門（ｓｕｂ−ｐｈｙｌｕｍ  Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）などから得られる又は入手可能である。好ましくは、微生物ムラミダーゼは、ＧＨ２４及びＧＨ２５からなるリストから選択される１つ以上のドメインを含む。
【０１４１】
［実施例］
［株］
トリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）ＣＢＳ８０４．７０は、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。
Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｖｏｒ  Ｓｃｈｎｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅによれば、トリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）ＣＢＳ８０４．７０は、１９６８年５月にスタッフォードシャー（Ｓｔａｆｆｏｒｄｓｈｉｒｅ）、イングランド（Ｅｎｇｌａｎｄ）の石炭のボタ山の土壌から単離された。Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｖｏｒ  Ｓｃｈｎｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｅによれば、アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ  １１４．９２は、津久井湖（Ｔｓｕｋｕｉ  Ｌａｋｅ）、日本（Ｊａｐａｎ）近くのブタ糞便堆肥の汚泥から、１９８４年にＡ．Ｙｏｎｅｄａによって単離された。
【０１４２】
［培地及び溶液］
ＹＰ＋２％グルコース培地は、１％酵母抽出物、２％ペプトン、及び２％グルコースから構成された。
【０１４３】
ＹＰ＋２％マルトデキストリン培地は、１％酵母抽出物、２％ペプトン、及び２％マルトデキストリンから構成された。
【０１４４】
ＰＤＡ寒天平板は、ポテトエキス（ポテトエキスは、３０分間、水で３００ｇのスライスした（洗浄したが、皮はむいてない）ジャガイモをゆで、次いで、チーズクロスを通してブロスを移す又はこすことによって作製した）から構成された。次いで、蒸留水を、懸濁液の総体積が１リットルになるまで追加し、その後、２０ｇのデキストロース及び２０ｇの寒天末を追加した。培地は、１５分間、１５ｐｓｉでオートクレーブすることによって滅菌した（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ａ，１９９８）。
【０１４５】
ＬＢプレートは、１０ｇのＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇの酵母抽出物、１０ｇの塩化ナトリウム、１５ｇのＢａｃｔｏ−ａｇａｒ、及び１リットルになるまでの脱イオン水から構成された。
【０１４６】
ＬＢ培地は、１０ｇのＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇの酵母抽出物、１０ｇの塩化ナトリウム、及び１リットルになるまでの脱イオン水から構成された。
【０１４７】
ＣＯＶＥスクロースプレートは、３４２ｇのスクロース、２０ｇの寒天末、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、及び１リットルになるまでの脱イオン水から構成された。培地は、１５分間、１５ｐｓｉでオートクレーブすることによって滅菌した（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ａ，１９９８）。培地を６０℃まで冷却し、１０ｍＭアセトアミド、１５ｍＭ  ＣｓＣｌ、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（５０μｌ／５００ｍｌ）を追加した。
【０１４８】
ＣＯＶＥ塩溶液は、２６ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２６ｇのＫＣＬ、２６ｇのＫＨ２ＰＯ４、５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液、及び１リットルになるまでの脱イオン水から構成された。
【０１４９】
ＣＯＶＥ微量金属溶液は、０．０４ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１０ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び１リットルになるまでの脱イオン水から構成された。
【０１５０】
［実施例１：アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ  １１４．９２由来のＧＨ２５ムラミダーゼのクローニング、発現、及び精製］
アクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ  １１４．９２（配列番号１）由来のＧＨ２５ムラミダーゼを、国際公開第２０１３／０７６２５３号パンフレットの実施例８において記載されるようにクローニングし、発現させ、実施例５において記載されるように精製した。その代わりに、配列番号１０は、国際公開第２０１３／０７６２５３号パンフレットの実施例２において記載されるようにクローニングし、発現させることができる。
【０１５１】
［実施例２：トリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）由来のＧＨ２４ムラミダーゼの発現］
菌株を、２０℃で５日間、１０００ｍｌ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振とうフラスコ中１００ｍｌのＹＰ＋２％グルコース培地において培養した。菌糸を、ＭＩＲＡＣＬＯＴＨＲ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ，ＵＳＡ）を敷いたＢｕｃｈｎｅｒ減圧漏斗を通して培地を濾過することによってフラスコから回収した。菌糸は、液体窒素で凍結させ、さらなる使用まで−８０℃で保存した。ゲノムＤＮＡは、メーカーの指示に従ってＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧＭＢＨ、Ｈｉｌｄｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離した。
【０１５２】
ゲノム配列情報は、ｌｌｌｕｍｉｎａ  ＭｙＳｅｑ（ｌｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、ＣＡ）によって生成した。単離されたトリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）ゲノムＤＮＡの５μｇを、メーカーの指示に従って、ライブラリーの調製及び解析のために使用した。１００ｂｐのペアエンド法（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を用い、ライブラリーインサートサイズは２００〜５００ｂｐとした。ＨｉＳｅｑの２分の１回のランを、合計９５，７４４，２９８の得られた１００ｂｐの未加工のリードに使用した。リードを続いて２５％まで分画し、その後、トリミングした（１０又はそれ以上のＰｈｒｅｄスコアを有する最長のサブ配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を抽出）。これらのリードを、Ｉｄｂａバージョン０．１９を使用してアセンブルした。４００ｂｐよりも短いコンティグを除き、８，９５４，７９１，０３０ｂｐがもたらされ、Ｎ−５０は１０，０３５であった。遺伝子は、ＧｅｎｅＭａｒｋ．ｈｍｍ  ＥＳバージョン２．３ｃを使用してコールし、触媒ドメインの同定は、Ｐｆａｍによって提供される「Ｐｈａｇｅ  ｍｕｒａｍｉｄａｓｅ  ＰＦ００９５９」Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌを使用して行った。コード領域全体についてのポリペプチドコード配列は、下記に記載されるプライマーＦ−８０４７０及びＲ−８０４７０（それぞれ配列番号６及び配列番号７）を使用し、ＰＣＲによってトリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）ＣＢＳ８０４．７０ゲノムＤＮＡからクローニングした。
【化１】
2021534739.tif 000003
【０１５３】
太字は、トリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）酵素コード配列を表す。制限部位に下線を引く。制限部位の左側の配列は、ｐＤａｕ１０９の挿入部位に対して相同である（国際公開第２００５／０４２７３５号パンフレット）。
【０１５４】
Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ＨＩＦＩ  ＰＣＲ  ｍｉｘ，２ｘ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃａｔ  ｎｏ  ＡＢ−０７９５）を、実験に使用した。
【０１５５】
増幅反応（２５μｌ）は、以下の最終濃度で、メーカーの指示（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃａｔ  ｎｏ  ＡＢ−０７９５）に従って実行した：
ＰＣＲミックス：
０．５μＭプライマーＦ−８０４７０
０．５μＭプライマーＲ−８０４７０
１２．５  μＭ  Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ＨＩＦＩ  ＰＣＲ  ｍｉｘ，２ｘ  ｃｏｎｃ．
１１．０μｌ  Ｈ２Ｏ
１０ｎｇのトリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）ＣＢＳ８０４．７０ゲノムＤＮＡ。
【０１５６】
ＰＣＲ反応は、３０秒間９４℃で１サイクル；各３０秒間９４℃、３０秒間５２℃、及び６０秒間６８℃で３０サイクル、その後、６分間６８℃で１サイクルでプログラムしたＤＹＡＤ（登録商標）Ｄｕａｌ−Ｂｌｏｃｋ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）でインキュベートした。サンプルは、取り出してさらにプロセシングする前に、１０℃まで冷却した。
【０１５７】
３μｌのＰＣＲ反応液を、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＡＥ）バッファーを使用して１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。約９４６ｂｐの大きなバンドが、観察された。残りのＰＣＲ反応液を、メーカーの指示に従って、ＩＬＬＵＳＴＲＡ（商標）ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｆｌｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）により直接精製した。
【０１５８】
２μｇのプラスミドｐＤａｕ１０９を、Ｂａｍ  ＨＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩにより消化し、消化したプラスミドを、制限プラスミドからスタッファー断片（ｓｔｕｆｆｅｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を除去するために、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基−５０ｍＭホウ酸−１ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用して、１％アガロースゲル上に流した。バンドは、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）の追加及び４７０ｎｍの波長のトランスイルミネーターの使用によって視覚化した。制限プラスミドに対応するバンドは、ＩＬＬＵＳＴＲＡ（商標）ＧＦＸ（商標）ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して切り取り、精製した。プラスミドを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０の中に溶出させ、その濃度を、１μｌ当たり２０ｎｇに調整した。ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）、ＣＡ、ＵＳＡ）を、Ｂａｍ  ＨＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩにより消化したｐＤａｕ１０９（２０ｎｇ）の中に９８３ｂｐ  ＰＣＲ断片をクローニングするために使用した。ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）総反応体積は、１０μｌであった。ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）総反応体積は、１０μｌであった。ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）反応液を、メーカーのプロトコールに従って、ＦＵＳＩＯＮ−ＢＬＵＥ（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、マウンテンビュー、ＣＡ、ＵＳＡ）の中に形質転換し、１ｍｌ当たり５０μｇのアンピシリンを補足したＬＢ寒天プレート上で平板培養した。３７℃での一晩のインキュベーションの後、１ｍｌ当たり５０μｇのアンピシリンを補足したＬＢプレート上での選択下で成長している形質転換体コロニーを、観察した。
【０１５９】
いくつかのコロニーは、下記に記載されるｐＤａｕ１０９ベクタープライマーを使用するコロニーＰＣＲによる解析のために選択した。４つのコロニーを、黄色の接種ピン（Ｎｕｎｃ  Ａ／Ｓ、デンマーク（Ｄｅｎｍａｒｋ））により、１ｍｌ当たり５０μｇのアンピシリンを補足したＬＢプレートから１ｍｌ当たり５０μｇのアンピシリンを補足した新しいＬＢプレートに移動させ、３７℃で一晩インキュベートした。
プライマー８６５３：５’−ＧＣＡＡＧＧＧＡＴＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧ−３’（配列番号８）
プライマー８６５４：５’−ＣＡＴＡＴＡＡＣＣＡＡＴＴＧＣＣＣＴＣ−３’（配列番号９）
【０１６０】
３つのコロニーのそれぞれを、５μｌの２Ｘ  Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ＨＩＦＩ  ＰＣＲ  ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、ＩＬ、ＵＳＡ）、０．５μｌのプライマー８６５３（１０ｐｍ／μｌ）、０．５μｌのプライマー８６５４（１０ｐｍ／μｌ）、及び４μｌの脱イオン水から構成される２００μｌ  ＰＣＲチューブの中に直接移動させた。それぞれのコロニーＰＣＲは、６０秒間９４℃で１サイクル；各３０秒間９５℃、４５秒間６０℃、６０秒間７２℃、１０分間６８℃、及び１０分間１０℃で３０サイクルでプログラムしたＤＹＡＤ（登録商標）Ｄｕａｌ−Ｂｌｏｃｋ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒでインキュベートした。
【０１６１】
３μｌのそれぞれの終了したＰＣＲ反応液を、ＴＡＥバッファーを使用して１％アガロースゲル電気泳動にかけた。４つすべての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体が、約９８０ｂｐのＰＣＲバンドを示した。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧＭＢＨ、Ｈｉｌｄｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、４つのコロニーのそれぞれから単離した。結果として生じるプラスミドＤＮＡを、バージョン３．１  ＢＩＧ−ＤＹＥ（商標）ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３０  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して、プライマー８６５３及び８６５４（配列番号８及び９）により配列決定した。ｐＫＫＳＣ０３１２−２と命名された１つのプラスミドを、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８を形質転換するために選択した。Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８は、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳ遺伝子を不活性化することによってｐｙｒＧ栄養要求性を取り戻した、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＪａＬ３５５のａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）が破壊された遺伝子誘導体である（国際公開第２００２／４０６９４号パンフレット）。Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８のプロトプラストは、欧州特許第０２３８０２３号明細書、１４〜１５頁に記載される方法に従って調製した。
【０１６２】
ｐＫＫＳＣ０３１２−２を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３７０１を、メーカーの指示（Ｇｅｎｏｍｅｄ）に従って一晩成長させ、ｐＫＫＳＣ０３１２−２のプラスミドＤＮＡを、メーカーの指示に従って、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ  ＪＥＴｑｕｉｃｋ  ｋｉｔ、ｃａｔ．ｎｒ．４００２５０、ＧＥＮＯＭＥＤ  ＧｍｂＨ、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して単離した。精製したプラスミドＤＮＡを、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８の中に形質転換した。Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＭＴ３５６８プロトプラストは、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１４１９−１４２２の方法に従って調製した。選択プレートは、＋１０ｍＭアセトアミド＋１５  ｍＭ  ＣｓＣｌ＋ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（５０μｌ／５００ｍｌ）を有するＣＯＶＥスクロースからなった。プレートを、３７℃でインキュベートした。簡単に述べると、３ｕｇのＤＮＡに相当する８μｌのプラスミドＤＮＡを、１００μｌ  ＭＴ３５６８プロトプラストに追加した。２５０μｌの６０％  ＰＥＧ溶液を追加し、チューブを静かに混合し、３０分間３７℃でインキュベートした。ミックスを、１０ｍｌのあらかじめ融解させたＣｏｖｅトップアガロースに追加した（プロトプラスト混合物に追加する前に、トップアガロースを融解させ、温度を温かいウォーターバス中で４０℃に保った）。組み合わせた混合物を、次いで、１０ｍＭアセトアミドを有する２つのＣｏｖｅ−スクロース選択ペトリ皿上で平板培養した。プレートを、４日間３７℃でインキュベートした。１つのアスペルギルス形質転換コロニーを、炭素源として選択アセチミドを使用してプレート上での成長によって同定した。４つのＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）形質転換体のそれぞれを、９６ウェルディーププレート中２％グルコース及びさらに７５０μｌの２％マルトデキストリン及びさらにＤＡＰ４Ｃを補足した７５０μｌのＹＰ培地に接種し、４日間静置させて３７℃でインキュベートした。同時に、４つの形質転換体を、ＣＯＶＥ−２スクロース寒天培地上にさらに画線した。
【０１６３】
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）形質転換体由来の培養ブロスを、次いで、メーカーの推奨に従って、ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＧＨ２４ポリペプチドの産生について分析した。およそ２７ｋＤａのタンパク質バンドが、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）形質転換体のそれぞれについて観察された。１つのＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）形質転換体を、８５ｒｐｍで撹拌しながら、４日間２６℃で１００ｍｌのＤＡＰ４Ｃ培地を含有する１０００ｍｌ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振とうフラスコ中で培養した。
【０１６４】
［実施例３：トリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）由来のＧＨ２４ムラミダーゼの精製］
実施例２のＧＨ２４ムラミダーゼを有する発酵上清を、０．２２μｍのカットオフを有するＦａｓｔ  ＰＥＳ  Ｂｏｔｔｌｅトップフィルターを通して濾過した。結果として生じる溶液を、５ｍＭ  酢酸Ｎａ、ｐＨ４．５によりダイアフィルトレーションし、１０ｋＤａカットオフ膜によりＵｌｔｒａ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濃縮した（体積を１０分の１まで低下させた）。
【０１６５】
前処理の後、２７５ｍＬのムラミダーゼ含有溶液を、１０カラム体積で、バッファーＡ（５０ｍＭ酢酸Ｎａ  ｐＨ４．５）及びバッファーＢ（５０ｍＭ酢酸Ｎａ＋１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ４．５）の０〜１００％の勾配により、結合したムラミダーゼを溶出するＸＫ２６カラム中のＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（およそ６０ｍＬ）でのクロマトグラフィーによって精製した。カラムからの画分は、クロマトグラム（２８０及び２５４ｎｍでの吸収）並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に基づいてプールした。
【０１６６】
分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから推測されるように、およそ２７ｋＤａで、純度は＞９０％であった。
【０１６７】
［実施例４：トリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）由来のＧＨ２４ムラミダーゼについての他の特徴］
Ｎ末端配列は、以下のとおり決定された：ＹＰＶＫＴＤＬ。
【０１６８】
この成熟配列から算出された分子量は、２６２０５．５Ｄａ（Ｍ＋Ｈ）＋である。
【０１６９】
インタクト分子量解析（ｉｎｔａｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって決定した分子量は、２６２０５．３Ｄａ（Ｍ＋Ｈ）＋であった。
【０１７０】
成熟配列（ＥＤＭＡＮ  Ｎ末端配列決定データ、インタクト分子量解析、及びプロテオミクス解析から）：
【化２】
2021534739.tif 000004
【０１７１】
［実施例５：ムラミダーゼ活性の決定］
ムラミダーゼ活性は、５４０ｎｍで分光光度計において測定される、再懸濁したミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）ＡＴＴＣ  Ｎｏ．４６９８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍ３７７０）又はエキシグオバクテリウム・ウンデア（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｎｄｅａ）（ＤＳＭ１４４８１）の溶液の吸光度／光学濃度の減少（降下）を測定することによって決定した。
【０１７２】
［ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）ベースの調製］
使用の前に、細胞を、０．５ｍｇ細胞／ｍＬの濃度まで、クエン酸−リン酸バッファーｐＨ６．５中で再懸濁し、５４０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を、測定した。細胞懸濁液は、次いで、細胞濃度がＯＤ５４０＝１．０に等しくなるように調整した。調整した細胞懸濁液は、次いで、使用の前に低温で保存した。再懸濁した細胞は、４時間以内に使用した。
【０１７３】
［エキシグオバクテリウム・ウンダエ（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｎｄａｅ）ベースの乾燥細胞の調製］
Ｅ．ウンダエ（Ｅ．ｕｎｄａｅ）（ＤＳＭ１４４８１）の培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで、一晩、５００ｍＬ振とうフラスコにおいて、１００ｍＬ  ＬＢ培地（Ｆｌｕｋａ  ５１２０８、２５ｇ／Ｌ）中で成長させた。一晩の培養物を、次いで、１０分間、２０℃及び５０００ｇで遠心分離し、ペレットは、次いで、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水により２回洗浄し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で再懸濁した。洗浄した細胞を、１３０００ｒｐｍで１分間、遠心分離し、できるだけ多くの上清を移した。洗浄した細胞を、１時間、減圧遠心機で乾燥させた。細胞ペレットを、光学濃度（ＯＤ）が５４０ｎｍ＝１になるように、クエン酸−リン酸バッファーｐＨ４、５、又は６中で再懸濁した。
【０１７４】
［濁り度アッセイにおけるムラミダーゼ殺菌活性の測定］
測定されることになるムラミダーゼサンプルを、クエン酸−リン酸バッファーｐＨ４、５、又は６において、１００〜２００ｍｇ酵素タンパク質／Ｌの濃度まで希釈し、使用まで氷上で保った。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）において、２００μＬのベースを各ウェルに追加し、プレートを、ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において５分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、各ウェルの吸光度を、５４０ｎｍ（開始値）で測定した。活性測定を開始するために、２０μＬの希釈ムラミダーゼサンプルを、各ベース（２００μｌ）に追加し、５４０ｎｍでの吸光度の反応速度測定を始め、３７℃で最低３０分間、最大２４時間行った。５４０ｎｍでの吸光度の測定を、各ウェルについてモニターし、ムラミダーゼがムラミダーゼ活性を有する場合、次第に吸光度の降下が見られるようになる。結果を、下記の表２に示す。
【０１７５】
【表２】
2021534739.tif 000005
【０１７６】
データから、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）由来のＧＨ２２ムラミダーゼ、トリコファエア・サッカタ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ  ｓａｃｃａｔａ）由来のＧＨ２４ムラミダーゼ、及びＡ．アルカロフィラム（Ａ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）由来のＧＨ２５ムラミダーゼのすべてが、ムラミダーゼ活性を有することが確認される。
【０１７７】
［実施例６：インビボにおけるブロイラー試験１］
［材料及び方法］
試験は、ＶＩＣＨ  ＧＬ９（ＧＣＰ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、２０００年６月、２００１年７月施行に従って、Ｐｏｕｌｐｈａｒｍ動物施設（Ｐｏｎｔｓｔｒａａｔ  ９３、８５５１  Ｈｅｅｓｔｅｒｔ、ベルギー（Ｂｅｌｇｉｕｍ））で実行した。生まれて１日の雄ブロイラー鶏（「ＲＯＳＳ  ３０８」）は、民間ふ化場（Ｂｒｏｅｉｅｒｉｊ  Ｖｅｒｖａｅｋｅ−Ｂｅｌａｖｉ、Ｏｕｄｅ  ｋａｐｅｌｌｅｓｔｒａａｔ  ６５、８７００  Ｔｉｅｌｔ  Ｂｅｌｇｉｍ）によって提供された。
【０１７８】
［動物及び収容場］
到着の日（１日目）に、鶏を、３０匹の群に無作為に分けた。各群を、チップが散りばめられた平飼い飼育室に入れ、異なる処置のうちの１つに割り当てた。
【０１７９】
各処置を、１２群で反復した。鶏は、環境制御室に収容した。収容施設は、天井に一定の間隔で置いたＴＬ電球による人工照明によって明るくした。室温及び相対湿度は、鳥の年齢に合わせた。
【０１８０】
［給餌及び処置］
実験用の餌（スターター及び育成）は、主な成分として、メイズ、コムギ、及びダイズ粉を主成分とした（表３）。餌は、スターター期については２０９．８ｇ粗タンパク質及び１２．２ＭＪ／ｋｇ  ＭＥＮ並びに育成期については１９０．９ｇ粗タンパク質及び１２．５３ＭＪ／ｋｇ  ＭＥＮを含有するように配合した。基本の餌は、いかなる抗コクシジウム剤も含有しなかった。
【０１８１】
【表３】
2021534739.tif 000006
【０１８２】
餌は、以下のように補足なしで又はＧＨ２５ムラミダーゼ（配列番号１）（活性６５，５０００ＬＳＵ（Ｆ）／ｇ）を補足して供給した：
【０１８３】
【表４】
2021534739.tif 000007
【０１８４】
［実験パラメーター及び解析］
Ｄ１（１日目）からＤ３６（３６日目）の研究の終わりまで、健康状態の観察は、少なくとも１日１回、熟練の家畜作業員が行い、記録した。
【０１８５】
敷料の相対湿度は、Ｄ１６（１６日目）、Ｄ２３（２３日目）、及びＤ３６に水分計を使用して３つの場所で測定した。
【０１８６】
趾蹠皮膚炎は、ｔｈｅ  ｗｅｌｆａｒｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｐｏｕｌｔｒｙ（２００９）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｌｆａｒｅｑｕａｌｉｔｙ．ｎｅｔ／ｎｅｔｗｏｒｋ／４５８４８／７／０／４０）に基づいて０〜２の以下のスコアリングシステムを使用し、すべての鳥について研究の最後の週の間にすべての鳥において決定した。
０：あらゆる小さな表層の病変がない
１：足蹠の実質的な退色、表層の病変、黒みがかった乳頭（ｐａｐｉｌｌａｅ）
２：かなりの大きさの潰瘍若しくはひっかき傷（ｓｃｒａｂ）、出血（ｈａｅｍｏｒｒａｇｈｅｓ）の徴候、又は重度の足蹠の腫脹。
【０１８７】
足蹠病変の重症度は、飼育室当たりの足蹠スコア（ＦＰＳ）として表した。このスコアは、以下のとおり算出する：１００％＊（（０．５＊スコア１を有する鳥の総数）＋（２＊スコア２を有する鳥の総数））／スコアをつけた鳥の総数。群れのＦＰＳは、０（すべての鳥が病変を有していない）〜２００（すべての鳥がスコア２を有する）の範囲にわたる。飼育室のＦＰＳは、線形回帰モデル（Ｒのコアパッケージの手順ｌｍ）を使用して解析した。
【０１８８】
［結果及び考察］
研究日及び処置ごとの敷料の平均相対湿度を、表５に示す。
【０１８９】
【表５】
2021534739.tif 000008
【０１９０】
Ｄ３６に、敷料の相対湿度は、ムラミダーゼ処置群において有意に低く、ムラミダーゼｌｏｗ及びムラミダーゼｈｉｇｈの群において、ネガティブコントロールと比較して、低い傾向があった。結果は、ムラミダーゼが敷料の湿りに対して効果を有することを示す。
【０１９１】
処置ごとの平均飼育室足蹠病変スコアを表６に示す。
【０１９２】
【表６】
2021534739.tif 000009
【０１９３】
ムラミダーゼ処置群は、ネガティブコントロールと比較して、低いペン足蹠病変スコアを示した。とりわけムラミダーゼｈｉｇｈ群は、最も低い飼育室足蹠病変スコアを示した。
【０１９４】
［結論］
研究において得られた結果は、微生物ムラミダーゼの含有が、敷料の水分及びブロイラー鶏の趾蹠皮膚炎を低下させるのに有効であることを示した。
【０１９５】
［実施例７：インビボにおけるブロイラー試験２］
［材料及び方法］
試験は、メキシコシティー（Ｍｅｘｉｃｏ  Ｃｉｔｙ）に位置するＮａｔｉｏｎａｌ  Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｘｉｃｏ（ＵＮＡＭ）のＰｏｕｌｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＥＩＥＰＡｖ）で実行した。年間平均温度は、１６℃であり、ＲＨは６０％である。
【０１９６】
合計９６０匹の１日齢雄ブロイラー鶏（Ｒｏｓｓ  ３０８）を完全無作為化法において使用し、処置は４つ、処置ごとの反復実験８回、及び飼育室ごとの鳥は３０匹とした。ブロイラーは、研究の最初から最後まで飼料及び水を自由に摂った。
【０１９７】
各飼育室に、敷料として新しい消毒した木屑（ｗｏｏｄ  ｓｈａｐｅ）を使用し、ひよこ用の給餌器及び給水器は、初期段階（５日間）で使用し；育成期間の終わりまでは自動給餌器（ｍａｎｕａｌ  ｆｅｅｄｅｒ）及びベル型給水器を使用した。初めの暖房は、飼育室ごとに１台の一般的なガス暖房器によって行い、鶏舎の温度及び相対湿度は、デジタルサーモハイドロメーター（ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｍｅｔｅｒ）によって毎日記録した。鶏舎は、石造りで、外側に手動式のカーテンを有する。設備の全般的な管理及び鳥の飼育は、この地域の一貫生産型飼育場（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｆａｒｍ）において使用されているものと同じとした。処置は、以下のとおり確立した：
【０１９８】
【表７】
2021534739.tif 000010
【０１９９】
酵素：ＲＯＮＯＺＹＭＥ（登録商標）ＨｉＰｈｏｓ  ＧＴ  ａ  １００ｐｐｍ（商品名、先買の日に製造されたロット（ｌｏｔ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ  ｐｒｅｅｍｐｔｉｏｎ  ｄａｔｅ））を餌組成物の一部とし、１０００ＦＹＴ／ｋｇで含んだ。実験用の餌のリンレベルは、成分中のフィチン酸塩の濃度に従って調整した。Ｃａ：Ｐ比はほぼ１．５：１．０であった。
【０２００】
抗コクシジアプログラム：１〜２１日はナイカルバジン１２５ｐｐｍ、２２〜４９日はサリノマイシン６０ｐｐｍとした。
【０２０１】
ワクチン接種プログラム：１０日齢時に、ニューカッスルワクチン及びニューカッスル／インフルエンザを、点眼及び皮下注入によって同時に投与した。２８日齢時の別のニューカッスルワクチンは、水摂取によって投与した。
【０２０２】
［実験用の餌］
実験用の餌（プレスターター、スターター、育成、及び仕上げ期）は、ソルガム、ダイズ粉、及びＤＤＧＳを主成分とした。餌は、下記の表に示される組成に従って調製した：
【０２０３】
【表８】
2021534739.tif 000011
【０２０４】
【表９】
2021534739.tif 000012
【０２０５】
【表１０】
2021534739.tif 000013
【０２０６】
【表１１】
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【０２０７】
【表１２】
2021534739.tif 000015
【０２０８】
飼料貯蔵条件：各フェーズの飼料は、使用の１週間前に仕上げ、室温で保管した。全保存期間の温度をモニターした（摂氏１８度）。
【０２０９】
テスト産物の追加：適切な量のムラミダーゼ（ＬＯＷ  ３０９ｇ／トン及び４３３ｇ／トン）を、各処置のプレミックスに追加し、飼料製造を完了した；このプレミックスを表８に従って残りの成分に追加した。
【０２１０】
［実験の測定及び手順］
趾蹠皮膚炎：判定は、３５及び４９日齢時に行った（これらの２つの年齢はメキシコ（Ｍｅｘｉｃｏ）において市場での販売にとって重要である）。各飼育室のすべての鳥は、Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ（登録商標），２００９に基づき、Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＤＳＭ  ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って判定した。評価は０〜４まで。Ａ−趾蹠皮膚炎の証拠なし（スコア０）；Ｂ−趾蹠皮膚炎のわずかな証拠（スコア１及び２）；Ｃ−趾蹠皮膚炎の証拠（スコア３及び４）。
【０２１１】
排出物の解析：サンプルは、給水及び給餌エリアを避けて、４つの異なる地点で（プールを得るために）、４９日の時点で各飼育室から採取した。Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＦＭＶＺ−ＵＮＡＭで両方の判定を行った。
１．乾燥材料、全窒素、及び水分−サンプルは、実験室への発送に向けて、それらを収集した直後に凍結させてしまっておいた。
２．アンモニア窒素−サンプルは、実験室への発送に向けて、それらを収集した直後に冷蔵してしまっておいた
【０２１２】
［結果及び考察］
趾蹠皮膚炎は、ブロイラーの足裏表面に壊死病変を引き起こす状態である（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ，２０１０）。その上、趾蹠皮膚炎は、足の市場価値を低下させる状態であり、湿った敷料及び高い家畜密度とのその関係により、福祉指標ともみなされる。趾蹠皮膚炎スコアを、表９に示すが、ここで、ネガティブコントロール処置は、３５及び４９日の判定の時点で有意な（Ｐ＜０．００１）最も高い足蹠スコアを示し、加工処理後、そういうわけで、使用した処置は、趾蹠皮膚炎の発生を低下させるのに有効であった。
【０２１３】
【表１３】
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【０２１４】
さらに、糞便中のアンモニア及び全窒素の解析で得られた結果（表１０）は、ムラミダーゼ高レベル処置において、有意な最も低いレベルの全窒素を示した。この研究結果は、同じ処置において観察された最も低い足蹠スコアと関係し、敷料の窒素の低下によって説明することができた（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ，２０１０）。
【０２１５】
【表１４】
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【０２１６】
［結論］
研究において得られた結果は、微生物ムラミダーゼの含有が、ブロイラー鶏の趾蹠皮膚炎を低下させる並びに敷料のアンモニア態窒素及びｐＨ値を低下させるのに有効であることを示した。
【０２１７】
本明細書において記載され、主張される本発明は、本明細書において開示される特定の態様によって範囲が限定されることはなく、それは、これらの態様がいくつかの本発明の態様の例証として意図されるからである。任意の等価な態様は、本発明の範囲内にあることが意図される。実際に、本発明の様々な修飾は、本明細書において示され且つ説明されるもの意外にも、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾もまた、添付の請求項の範囲内にあることが意図される。矛盾する場合、定義を含め、本開示に従うものとする。
【配列表】
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【国際調査報告】
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