(57)【要約】  本開示は、本明細書でミトフラボスチンと呼ばれる、フラビン含有酵素に結合し、ミトコンドリア機能を阻害する化合物に関する。ミトコンドリア阻害特性および抗癌特性に関して化合物をスクリーニングする方法が開示される。また、癌、細菌感染症、および病原性酵母、を予防または治療するためにミトフラボスチンを使用する方法、ならびに抗加齢利益を提供するためにミトフラボスチンを使用する方法が提供される。特定のミトフラボスチン化合物もまた開示される。【選択図】図４Ｂ
2021500374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトフラボスチン。
【請求項２】
ジフェニレンヨードニウム、ジフェニレンヨードニウムの薬学上許容される塩、およびジフェニルヨードニウムまたはジフェニルヨードニウムの薬学上許容される塩のうち少なくとも１つを含む、請求項１に記載のミトフラボスチン。
【請求項３】
抗癌活性、抗加齢活性、放射線増感活性、光増感活性のうち少なくとも１つを有する、請求項１に記載のミトフラボスチン。
【請求項４】
抗癌活性、抗加齢活性、放射線増感活性、光増感活性のうち少なくとも１つを有する、請求項２に記載のミトフラボスチン。
【請求項５】
化学療法薬、天然物質、およびカロリー制限のうち少なくとも１つに対して癌細胞を増感させる、請求項１に記載のミトフラボスチン。
【請求項６】
化学療法薬、天然物質、およびカロリー制限のうち少なくとも１つに対して癌細胞を増感させる、請求項２に記載のミトフラボスチン。
【請求項７】
フラビン含有酵素に結合する、請求項１に記載のミトフラボスチン。
【請求項８】
フラビン含有酵素に結合する、請求項２に記載のミトフラボスチン。
【請求項９】
前記フラビン含有酵素がフラビンアデニンジヌクレオチドおよびフラビンモノヌクレオチドのうち少なくとも１つから選択される、請求項７に記載のミトフラボスチン。
【請求項１０】
前記フラビン含有酵素がフラビンアデニンジヌクレオチドおよびフラビンモノヌクレオチドのうち少なくとも１つから選択される、請求項８に記載のミトフラボスチン。
【請求項１１】
ミトコンドリア標的化合物を含む、請求項１に記載のミトフラボスチン。
【請求項１２】
前記ミトコンドリア標的化合物が膜標的シグナルおよびミトコンドリアリボソーム標的シグナルを含む群から選択される少なくとも１つの化合物である、請求項１１に記載のミトフラボスチン。
【請求項１３】
前記膜標的シグナルがパルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、およびオレイン酸を含む群から選択される化合物である、請求項１２に記載のミトフラボスチン。
【請求項１４】
前記ミトコンドリア標的シグナルがトリフェニルホスホニウムおよびグアニジニウムを含む群から選択される化合物である、請求項１２に記載のミトフラボスチン。
【請求項１５】
癌を治療する方法であって、必要とする患者に、薬学上有効な量のミトフラボスチンおよび薬学上許容される担体を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記ミトフラボスチンがジフェニレンヨードニウム、ジフェニレンヨードニウムの薬学上許容される塩、およびジフェニルヨードニウム、またはジフェニルヨードニウムの薬学上許容される塩のうち少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
微生物感染症を治療する方法であって、必要とする患者に、薬学上有効な量のミトフラボスチンおよび薬学上許容される担体を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記ミトフラボスチンがジフェニレンヨードニウム、ジフェニレンヨードニウムの薬学上許容される塩、およびジフェニルヨードニウム、またはジフェニルヨードニウムの薬学上許容される塩のうち少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
加齢に伴う病態または感染症を治療する方法であって、必要とする患者に、薬学上有効な量のミトフラボスチンおよび薬学上許容される担体を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記ミトフラボスチンがジフェニレンヨードニウム、ジフェニレンヨードニウムの薬学上許容される塩、およびジフェニルヨードニウム、またはジフェニルヨードニウムの薬学上許容される塩のうち少なくとも１つを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
有効成分として少なくとも１種類のミトフラボスチンを含む医薬組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１種類のミトフラボスチンが、ジフェニレンヨードニウム、ジフェニレンヨードニウムの薬学上許容される塩、およびジフェニルヨードニウム、またはジフェニルヨードニウムの薬学上許容される塩のうち少なくとも１つを含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
癌の治療、細菌感染症の治療、病原性酵母感染症の治療、加齢に伴う病態の治療、および加齢の影響の軽減のうち少なくとも１つの表示がされる、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ミトフラボスチンを同定する方法であって、表現型薬物スクリーニングおよびミトコンドリア阻害スクリーニングのうち少なくとも１つを実施することを含む、方法。
【請求項２５】
前記表現型薬物スクリーニングがＡＴＰ枯渇アッセイを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記表現型薬物スクリーニングが細胞外酸性化速度アッセイおよび酸素消費速度アッセイのうち少なくとも１つを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ミトフラボスチンを抗癌活性および抗微生物活性のうち少なくとも１つに関して試験することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記の試験される抗癌活性がマンモスフィアの形成である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ミトフラビン。
【請求項３０】
膜標的シグナルおよびミトコンドリア標的シグナルのうち少なくとも１つをさらに含む、請求項３２に記載のミトフラビン。
【請求項３１】
癌幹細胞においてリボフラビン欠乏を誘導するための方法であって、少なくとも１種類のミトフラビンを送達投与することを含む、方法。
【請求項３２】
前記ミトフラビンが膜標的シグナルおよびミトコンドリア標的シグナルのうち少なくとも１つを含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、フラビン含有酵素と結合し、ミトコンドリア機能を阻害する化合物である「ミトフラボスチン(mitoflavoscins)」に関し、ミトフラボスチンを合成するための方法、癌幹細胞を標的化するためにミトフラボスチンを使用する方法、ならびに癌を治療するためおよび癌細胞において薬物耐性を軽減するための両目的のための医薬化合物、有効成分として１種類以上のミトフラボスチンを含有する医薬組成物を含む。また、ミトコンドリア機能を阻害するリボフラビンの誘導体である化合物「ミトフラビン」も開示される。
【背景技術】
【０００２】
研究者は新たな抗癌治療を開発するために奮闘してきた。従来の癌療法（例えば、放射線、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、および５−フルオロウラシルなどの代謝拮抗剤）では、細胞増殖およびＤＮＡ複製に関与する細胞機構に干渉することによって増殖の速い癌細胞を選択的に検出し根絶することが試みられてきた。他の癌療法では、増殖の速い癌細胞上の変異した腫瘍抗原に選択的に結合する免疫療法（例えば、モノクローナル抗体）が使用されてきた。残念なことに、これらの療法の後に同じ部位または異なる部位に腫瘍がしばしば再発し、全ての癌細胞が根絶されていたわけではないことを示す。再発は不十分な化学療法薬の用量および／または療法に耐性のある癌クローンの出現のためであり得る。ゆえに、新規な癌治療戦略が必要である。
【０００３】
突然変異分析の進展は、癌発症中に起こる遺伝子突然変異の徹底的な研究を可能とした。ゲノムの知識をもってしても、最近の腫瘍学では癌のサブタイプで主要なドライバー突然変異を同定するのが困難であった。厳しい現実として、各患者の腫瘍がユニークであり、単一の腫瘍が複数の異なるクローン細胞を含有することがあると思われる。従って、必要とされるものは、癌の異なるタイプ間で共通性を強調する新たなアプローチである。腫瘍細胞と正常細胞の間の代謝の違いを標的とすることは、新規な癌治療戦略として期待されている。ヒト乳癌サンプルからの転写プロファイリングデータの解析は、ミトコンドリア生合成および／またはミトコンドリア翻訳に関連する９５を超えるｍＲＮＡ転写産物の上昇を明らかにした。Ｓｏｔｇｉａら，  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ，  １１（２３）：４３９０−４４０１  （２０１２）。加えて、９５の上方調節されたｍＲＮＡのうち３５を超えるものが、ミトコンドリアリボゾームタンパク質（ＭＲＰ）をコードしている。ヒト乳癌幹細胞のプロテオミクス分析も同様に、いくつかのミトリボゾームタンパク質ならびにミトコンドリア生合成に関連するその他のタンパク質の有意な過剰発現を明らかにした。Ｌａｍｂら，  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，  ５（２２）：１１０２９−１１０３７  （２０１４）。
【０００４】
ある種の静菌性抗生物質またはＯＸＰＨＯＳ阻害剤の標的外効果を用いたミトコンドリア生合成の機能的阻害は、癌幹細胞の増殖に機能的ミトコンドリアが必要とされるというさらなる証拠を提供する。本発明者らは最近、生細胞のヘテロな集団から癌幹様細胞（ＣＳＣ）を濃縮および精製するために、ミトコンドリア蛍光色素（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）が効果的に使用され得ることを示した。Ｆａｒｎｉｅら，  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，  ６：３０２７２−３０４８６  （２０１５）。最大のミトコンドリア質量を有する癌細胞は、転移能に通常関連する特徴である足場非依存性増殖を受ける機能的能力が最も高かった。この「ミト−ハイ(Mito-high)」細胞亜集団はまた、前臨床モデルを用いて示されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏでも最高の腫瘍誘導活性を有していた。
【発明の概要】
【０００５】
以上の背景に鑑みて、本発明者らは、ＦＤＡ承認薬およびその他の関連試験化合物の大きなライブラリーを既知の標的を用いてスクリーニングすることによるミトコンドリアの新規な代謝阻害剤の検索に焦点を当て、作用機序を確定した。発明者らは、検索を、ミトコンドリアＡＴＰ生産を有意に低減するが細胞死を誘導しない（急性毒性副作用を有する薬物を避けるため）化合物に限定した。本開示の目的は、フラビン含有酵素に結合し、ミトコンドリアのＡＴＰ生産を阻害する化合物であるミトフラボスチンを同定する本方法を特定することである。本開示の目的はまた、抗癌特性および抗生物特性を有するミトフラボスチンを同定することである。本開示の目的はまた、抗加齢特性を有するミトフラボスチンを同定することである。本開示の目的はまた、放射線増感剤および光増感剤として機能するミトフラボスチンを同定することである。「ミトフラボスチン」という用語は、フラビン含有酵素に結合し、ミトコンドリア機能を阻害する化合物を広く指す。よって、これらの化合物は、ＦＭＮ、ＦＡＤ、および／またはリボフラビンを標的とし、それらを枯渇させるように設計することができる。本開示はさらに、ミトフラボスチンを同定する方法、そのようなミトフラボスチンを作製する方法、およびミトフラボスチンを治療目的で使用する方法に関する。
【０００６】
加えて、従前に出されたデータは、「ミトリボスチン(mitoriboscins)」と呼ばれるミトコンドリアリボソームを標的とするミトコンドリア機能の阻害剤が、細菌および病原性酵母を標的とするため、抗加齢利益を提供するため、放射線増感剤および／または光増感剤として機能させるため、癌細胞塊および癌幹細胞を化学療法薬、医薬、および／または他の天然物質、例えば栄養補助食品およびカロリー制限に対して増感させるために使用可能であることを示唆する。それらのミトコンドリア阻害特性を考えれば、ミトフラボスチンも同様に、細菌および病原性酵母を標的とするため、抗加齢利益を提供するため、放射線増感剤および／または光増感剤として機能させるため、癌細胞塊および癌幹細胞を化学療法薬、医薬、および／またはその他の天然物質に対して増感させるために使用可能である。
【０００７】
ミトフラボスチンは、ハイスループットスクリーニングとその後のミトコンドリア阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏバリデーションの集束アプローチによって同定することができる。ミトフラボスチンは、コンピューターによる薬物設計と表現型薬物スクリーニングを組み合わせることによって迅速に開発することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本アプローチの実施形態に従う創薬戦略の概略を示す模式図を示す。
【図２】図２は、ＡＴＰレベルに対する塩化ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）の効果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＭＣＦ７細胞の細胞生存率に対するＤＰＩの効果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞の細胞生存率に対するＤＰＩの効果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、酸素消費速度（ＯＣＲ）に対するＤＰＩでの２４時間処理の効果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、基礎呼吸、プロトンリーク、ＡＴＰ関連呼吸、最大呼吸、および予備呼吸能に対するＤＰＩの効果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）に対するＤＰＩでの２４時間処理の効果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、解糖、解糖予備、非グルコース誘導性ＥＣＡＲ、および解糖予備能に対するＤＰＩの効果を示す。
【図６】図６は、Ｌ−乳酸生産に対するＤＰＩの効果を示す。
【図７】図７は、マンモスフィア形成に対するＤＰＩの効果を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、癌幹細胞マーカーＣＤ４４＋／ＣＤ２４−に対するＤＰＩの効果を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、癌幹細胞マーカーＣＤ４４＋／ＣＤ２４−に対するＤＰＩの効果を示す。
【図９】図９は、ミトコンドリア反応性酸素種（ＲＯＳ）生産に対するＤＰＩの効果を示す。
【図１０】図１０は、ＯＣＲに対するＤＰＩでの１時間処理の効果を示す。
【図１１】図１１は、ＥＣＡＲに対するＤＰＩでの１時間処理の効果を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＯＣＲに対するＤＰＩ処理、「ウォッシュアウト」、および再開の効果を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＯＣＲに対するＤＰＩ処理、「ウォッシュアウト」、および再開の効果を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＯＣＲに対するＤＰＩ処理、「ウォッシュアウト」、および再開の効果を示す。
【図１３】図１３は、基礎呼吸、プロトンリーク、ＡＴＰ関連呼吸、最大呼吸、および予備呼吸能に対するＤＰＩ処理、「ウォッシュアウト」、および再開の効果を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＯＣＲに対するＤＰＩでの長期処理の効果を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＭＣＦ７細胞の形態および密度に対するＤＰＩでの長期処理の効果を示す。
【図１５】図１５は、化合物ＡとしてのＤＰＩおよび化合物Ｂとしてのフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の構造の比較を示す。
【図１６】図１６は、化合物ＡとしてのＤＰＩおよび関連化合物Ｂとしての塩化ジフェニルヨードニウムの構造を比較するものである。
【図１７】図１７は、ミトコンドリアを標的化するためにＤＰＩまたはＤＰＩ関連化合物に付加され得るＲ官能基の結合のための潜在的位置を示す。
【図１８】図１８は、ミトコンドリア機能を阻害するリボフラビンの誘導体であるミトフラビン化合物の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下の記載は、本アプローチの実施形態を、本アプローチの実施を可能とするために十分に詳細に説明する。本アプローチはこれらの特定の実施形態に関して記載されるが、当然のことではあるが、本アプローチは異なる形態で具体化されてもよく、本明細書は、添付の特許請求の範囲を本明細書に示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が詳細かつ完全となるように、また、本アプローチの範囲を当業者に十分に伝えるように示される。
【００１０】
ミトコンドリア代謝は、癌から細菌および真菌感染症、加齢に及ぶ範囲の多くの苦痛を治療するための未利用の入り口である。癌幹細胞の増殖には機能的ミトコンドリアが必要とされる。癌細胞においてミトコンドリア代謝を阻害することで、それらの細胞の増殖が妨げられる。本アプローチは、ＦＤＡ承認薬およびその他の関連試験化合物の大きなライブラリーを既知の標的を用いてスクリーニングすることによってこの入り口を探索し、作用機序を確定し、さらに検索を、ＡＴＰ生産を有意に低減したが、急性毒性副作用を有する薬物を避けるために、細胞死を誘導しなかった化合物に限定した。
【００１１】
フラビン含有酵素ミトフラボスチンに結合するミトコンドリアＡＴＰ生産の新規な阻害剤は、表現型薬物スクリーニングと機能的バリデーションを合わせたアプローチによって同定され得る。図１は、本明細書に開示される表現型薬物スクリーニングおよび機能的バリデーションを使用することによりミトフラボスチンを同定するための方法の概観である。この方法の実施形態は、表現型薬物スクリーニングＳ１０１、機能的バリデーションＳ１０２、およびそれらの結果から１以上の候補薬を選択することＳ１０３を含み得る。表現型薬物スクリーニングＳ１０１は、ＡＴＰ枯渇アッセイを用いて行うことができる。ＡＴＰ枯渇アッセイは、細胞死を誘導せずに、それにより、毒性副作用を避けて、ＡＴＰ枯渇を機能的に誘導し得る化合物を同定することができる。このスクリーニングアッセイは、分子のライブラリーで行うことができる。例えば、本発明者らの初期の検討では、ＭＣＦ７細胞（６，０００細胞／ウェル）を黒色透明底の９６ウェルプレートに播種し、処理前に一晩インキュベートした。次に、Ｔｏｃｒｉｓｃｒｅｅｎ（商標）化合物ライブラリー（５６０の化合物）のサブセットに２０μＭの濃度で表現型薬物スクリーニングを行った（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ  Ｃｏｒｐ、ＭＮ、ＵＳＡ）。７２時間のインキュベーション後に化合物を試験し、実験は３反復で行った。処理後、培地をウェルから吸引し、プレートを温ＰＢＳ（ｗ／Ｃａ2+およびＭｇ2+を添加）で洗浄した。次に、細胞をヘキスト３３３４２（Ｓｉｇｍａ）染色溶液（１０μｇ／ｍｌ）とともに３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。蛍光をプレートリーダーで３５５／４６０ｎｍの励起／発光波長を用いて読み取った。次に、所与の化合物で処理したまさに同じウェルで代謝活性（ＡＴＰ含量）を測定するためにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行った。アッセイは生産者のプロトコールに従って行った。蛍光（ヘキスト染色）強度および発光強度（ＡＴＰ含量）を、ビヒクル単独で処理した対照に対して正規化し、パーセンテージとして示した。ＡＴＰ枯渇を強く誘導した化合物を同定するために、陽性ヒットをより低濃度（１０μＭ）で再スクリーニングした。当業者は、同じまたは類似のＡＴＰ枯渇アッセイを用いることにしてもよいし、このようなアッセイを修飾してもよいし、またはＡＴＰ枯渇アッセイを、選択された化合物をミトコンドリア阻害に関してスクリーニングするための別の方法論（例えば、酸素消費アッセイ）に置き換えてもよいと認識されるべきである。
【００１２】
ＤＰＩ（塩化ジフェニレンヨードニウム）は、ＡＴＰ枯渇の強力な誘導剤として同定された。本発明者らは、ＤＰＩがより低い濃度でもＡＴＰ枯渇を誘導すると仮定した。発明者らは、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７）を様々な濃度のＤＰＩで７２時間処理した。次に、細胞数に対して正規化するために、これらの細胞に蛍光ヘキストＤＮＡ染色を施した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏをプローブとして使用することにより、本発明者らは、同じウェル内のＡＴＰ含量を測定するために発光を使用することができた。７２時間の処理で、５００ｎＭのＤＰＩはＡＴＰレベルを＞８０％低下させたが、プレートに結合している細胞の数は不変であった（ＤＮＡ含量によって検出した場合）ことから、細胞死を有意に誘導しなかった。図２は、これらの結果をまとめたものであり、ＤＰＩは多量の細胞死を誘導することなくＡＴＰレベルを選択的に低下させることを示す。
【００１３】
本アプローチは、細胞生存率を確定する方法を含む。当業者ならば、特定の実施形態に好適な細胞生存率を確定するための１以上の方法を選択することができる。本発明者らは、細胞タンパク質含量の測定に基づくスルホローダミン（ＳＲＢ）アッセイを使用した。９６ウェルプレートで５日間処理した後、細胞を、低温室にて１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で１時間固定し、室温で一晩乾燥させた。次に、細胞をＳＲＢとともに１５分間インキュベートし、１％酢酸で２回洗浄し、少なくとも１時間風乾した。最後に、タンパク質に結合した色素を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．８溶液中に溶解させ、プレートリーダーを用い５４０ｎｍで読み取った。図３Ａは、ＭＣＦ７細胞の細胞生存率に対するＤＰＩの効果を示す。特に、このデータは、ＤＰＩは５日間の処理の後であっても細胞生存率に有意に影響しないことを示す。ＤＰＩは、３３ｎＭといった高い濃度でＭＣＦ７細胞に毒性をほとんどまたは全く示さなかった。図３Ｂは、ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１細胞の細胞生存率に対するＤＰＩの効果を示す。実質的に同じ結果が正常線維芽細胞（ｈＴＥＲＴ−ＢＪ１）でも見られ、５日のインキュベーション後に１００ｎＭまで毒性作用をほとんどまたは全く示さなかった（図３Ｂ）。
【００１４】
本アプローチは、ミトコンドリア阻害剤としての化合物の機能が確定され得る機能的バリデーションＳ１０２の方法をさらに含む。例えば、代謝フラックス解析、マンモスフィアアッセイ、生存率アッセイ、および抗生物（抗細菌および／または抗真菌）活性を含む、いくつかの方法が機能的バリデーションに使用され得る。本発明者らは、シーホース細胞外フラックス（ＸＦ９６）分析装置（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用い、ＭＣＦ７細胞で、リアルタイム酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を決定した。簡単に述べれば、ＭＣＦ７細胞を１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、および１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを添加したＤＭＥＭ中で維持した。ウェル当たり８，０００細胞をＸＦ９６ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2加湿雰囲気で一晩インキュベートした。翌日、細胞を予温したＸＦアッセイ培地（ＯＣＲ測定用、ＸＦアッセイ培地には１０ｍＭグルコース、１ｍＭピルビン酸を添加し、ｐＨ７．４に調整した）で洗浄した。次に、細胞を無ＣＯ２インキュベーター内、３７℃にて、１７５μＬ／ウェルのＸＦアッセイ培地中で１時間維持した。インキュベーションの間に、ＸＦアッセイ培地中、２５μＬの８０ｍＭグルコース、９μＭオリゴマイシン、１Ｍ  ２−デオキシグルコース（ＥＣＡＲ測定用）および２５μＬの１０μＭオリゴマイシン、９μＭ  ＦＣＣＰ、１０μＭロテノン、１０μＭアンチマイシンＡ（ＯＣＲ測定用）をＸＦｅ−９６センサーカートリッジのインジェクションポートにロードした。試験中、この装置はこれらの阻害剤を所与の時点でウェルに注入し、同時にＥＣＡＲ／ＯＣＲを絶えず測定した。ＥＣＡＲおよびＯＣＲの測定値は、タンパク質含量によって正規化した（スルホローダミンＢアッセイ）。データセットを、ＸＦｅ−９６ソフトウエアにより、一元配置ＡＮＯＶＡとスチューデントのｔ検定計算を用いて分析した。試験は全て３反復で行った。
【００１５】
ＯＣＲ結果は、ＤＰＩが２．５ｎＭの濃度でほとんどまたは全く効果がなかったことを示す。しかしながら、５ｎＭでは、基礎呼吸が約５０％低下した。最後に、１０ｎＭでは、基礎呼吸数が約８５％低下し、ＡＴＰ生産に＞９０％の低下をもたらした。図４Ａ〜Ｂは、これらの結果をまとめたものであり、ＤＰＩがミトコンドリア呼吸を強力に阻害することを示す。図４Ａは、ＯＣＲに対するＤＰＩ処理の効果を経時的に示し、図４Ｂは、基礎呼吸、プロトンリーク、ＡＴＰ関連呼吸、最大呼吸、および予備呼吸能に対するＤＰＩ処理の効果を示す。機能的バリデーションには多くの方法が知られていること、および当業者ならばバリデーション要件（例えば、ミトコンドリア機能を測定するまたは近似値を求める他のアッセイ）に応じて１以上を選択できると認識されるべきである。
【００１６】
記載のように、ＤＰＩの抗ミトコンドリア効果が反応性解糖応答を誘導するかどうかを判定するために、本発明者らは、ＤＰＩ処理乳癌細胞に対して、ＥＣＡＲを測定することによる「解糖ストレス試験」を行った。ＭＣＦ７細胞にシーホースＸＦｅ９６で代謝フラックス解析を行い、これもまた、Ｌ−乳酸生産のサロゲートマーカーとしてのＥＣＡＲを測定する。ＤＰＩ（２．５ｎＭ）で２４時間処理した後、効果はほとんどまたは全く見られなかった。しかしながら、１０ｎＭのＤＰＩでは、解糖が約２倍増加した。図５Ａ〜Ｂは、ＤＰＩが解糖表現型を強く誘導したことを強調する。図５Ａは、ＥＣＡＲに対するＤＰＩの効果を経時的に示す。図５Ｂは、解糖、解糖予備能(glycolytic reserve)、および解糖予備能(glycolytic reserve capacity)に対するＤＰＩの効果を示す。
【００１７】
ＥＣＡＲにおいて見られた上昇がＬ−乳酸生産に対応していたことを確認するために、Ｌ−乳酸レベルを、ＩＳＣＵＳflex  Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｍ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｉｎｃ．、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて直接測定した。培養培地を回収し、遠心分離し、ＭＣＦ７細胞を種々の濃度のＤＰＩで１、３または５日間処理した後にＩＳＣＵＳflex  Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて分析した。装置の較正は、生産者が提供しているサンプルによって行った。次に、Ｌ−乳酸レベルを測定し、ビヒクル単独で処理したＭＣＦ７細胞から採取したサンプルに対して正規化した。図６は、ＤＰＩは有意なＬ−乳酸生産を誘導したことを示し、乳酸の生産量をほぼ２倍にし、これは解糖の２倍の増加に一致する。
【００１８】
本アプローチは、いくつかの実施形態では、化合物を抗癌特性に関して試験する方法を含み得る。例えば、本発明者らは、ＭＣＦ７細胞においてマンモスフィア形成を阻害するＤＰＩの能力を検討した。ＭＣＦ７細胞の単細胞懸濁液は、酵素的解離（１×トリプシン−ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および手動解離（２５ゲージの針）を用いて調製した。次に、細胞を、（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ、Ｓｉｇｍａ）でコーティングした培養皿に、非接着条件にて、マンモスフィア培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２／Ｂ２７／２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ／ＰｅｎＳｔｒｅｐ）中、５００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。細胞を５日間増殖させ、加湿インキュベーターにて３７℃、５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素／空気中、大気圧で維持した。培養５日後、＞５０μｍのスフィアを、アイピースグラティキュールを用いて計数し、スフィアを形成した播種細胞のパーセンテージを計算し、ビヒクル単独処理対照に対して正規化したマンモスフィア形成パーセントとして表す。マンモスフィアアッセイは３反復で行い、独立に３回繰り返した。図７は、ＤＰＩはマンモスフィアアッセイにおいてＣＳＣの増殖を用量依存的に阻害したことを強調する。ＤＰＩ処理は、ＩＣ−５０  ３．２３ｎＭでＣＳＣの増殖を濃度依存的に有意に低下させた。当業者ならば、本アプローチから逸脱することなく、特定の細胞株に対する候補ミトフラボスチンの効果を評価するために当技術分野で知られる他の方法を使用し得ると認識されるべきである。また、当業者ならば他の癌種に対する候補ミトフラボスチンの効果を、癌幹細胞（ＣＳＣ）を標的とする阻害剤として評価し得ることも認識されるべきである。ＣＳＣは、ほとんどの癌腫で保存されたまたは類似の特徴を示す。
【００１９】
これらの所見をさらにバリデートするために、本発明者らは、癌細胞における「幹細胞性(stemness)」を定量するために第２の別のアプローチを使用した。発明者らは、特異的細胞表面マーカー、すなわち、ＣＤ４４およびＣＤ２４に対する蛍光抗体プローブを検討した。ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞集団は、ＣＳＣ濃縮画分に相当する。１×１０5個のＭＣＦ７細胞を６ウェルプレートの、１０％熱失活ＦＢＳを添加した完全培地中に播種した。翌日、細胞をＤＰＩ（５、１０、５０ｎＭ）で５日間処理した。ビヒクル単独（ＤＭＳＯ）対照細胞を並行して処理した。簡単に述べれば、７−ＡＡＤ色素染色により同定されるような３０，０００〜５０，０００個の生細胞を、ＣＤ２４／ＣＤ４４発現に関して分析した。発明者らは、ＣＤ２４（ＩＯＴｅｓｔ  ＣＤ２４−ＰＥ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＣＤ４４（ＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ４４、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体を、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析に使用した。結果は３回の生物学的反復（繰り返し）の平均値であり、対照に対して正規化した平均蛍光強度のパーセンテージとして表される。一元配置ＡＮＯＶＡをボンフェローニの多重比較検定とともに使用した。図８Ａおよび８Ｂは、ＤＰＩは全細胞集団からこれらのＣＳＣを選択的に排除することを示す。ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−細胞集団は、ＤＰＩ処理によって、ＩＣ−５０  １０ｎＭで、用量依存的に低減された。癌細胞の幹細胞性を定量するための他の方法も知られ、当業者ならばバリデーション要件に応じて１つ以上を選択し得ると認識されるべきである。
【００２０】
発明者らは、ＤＰＩがＣＳＣの増殖を阻害する潜在的機構はミトコンドリア反応性酸素種（ＲＯＳ）生産を誘導することによるものであると仮定した。この仮定を検定するために、発明者らは、ミトコンドリアＲＯＳ生産に対するＤＰＩの効果を５〜５０ｎＭの範囲で決定した。簡単に述べれば、ミトコンドリアによる超酸化物の生産を、ＭｉｔｏＳＯＸ（商標）Ｒｅｄミトコンドリア超酸化物インジケーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ．、Ｍ３６００８）によって測定した。３×１０5  ＭＣＦ７細胞／ウェルを６ウェルプレートの、１０％熱失活ＦＢＳを添加した完全培地中に播種した。翌日、細胞をＤＰＩ（５、５０ｎＭ）またはロテノン（０．５μＭ）で２４時間処理した。対照細胞用のビヒクル単独（ＤＭＳＯ）も並行して処理した。Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたＦＡＣＳにより、少なくとも３０，０００イベントを記録した。３回の生物学的反復（繰り返し）を独立した実験で分析した。結果は各実験の平均の平均値であり、対照に対して正規化した平均蛍光強度のパーセンテージとして表される。図９は、５ｎＭの濃度(concentrati7n)で、ＤＰＩは、ビヒクル単独で処理した対照細胞に比べて、検出可能なミトコンドリアＲＯＳ生産を誘導することができなかったことを示す。しかしながら、５０ｎＭ  ＤＰＩは、陽性対照として用いた５００ｎＭのロテノンと同じ量のミトコンドリアＲＯＳを誘導した。よって、マンモスフィア形成を＞５０％阻害した同濃度のＤＰＩ（５ｎＭ）は、ミトコンドリアＲＯＳ生産を増すことができなかった。従って、癌細胞の「幹細胞性」に対する低用量ＤＰＩの効果は、ＲＯＳ生産だけで説明することはできない。
【００２１】
ＤＰＩの高い効力を考えて、発明者らは、細胞代謝に迅速に影響を与えるその能力を評価した。図１０は、ミトコンドリア呼吸に対するＤＰＩの迅速作用を示す。１０〜１００ｎＭの濃度範囲で、わずか１時間のＤＰＩ処理後に、ミトコンドリアＯＣＲは段階的に低下した。基礎呼吸は、ＩＣ−５０  ５０ｎＭで阻害された。同様に、ＤＰＩは、反応性解糖表現型を迅速に誘導した。解糖は、５〜１００ｎＭの濃度範囲で段階的に増大した。図１１は、解糖が効果的に倍増したことを示す。
【００２２】
ＤＰＩの効果はまた、極めて可逆的であり得る。ＤＰＩの効果の可逆性を評価するために、ＭＣＦ７細胞にまず、２４時間、ＤＰＩ処理を行った。次に、ＤＰＩを除去し（「ウォッシュアウト）、細胞をさらに２４時間培養し、回復させた。図１２は、１０ｎＭ  ＤＰＩで、わずか２４時間後に１００％に近いほぼ完全な基礎呼吸の回復が見られたことを示す（図１２Ｃ）。より高い濃度では、回復は完全ではなかったものの有意な回復を示した。同様に、図１３は、１０ｎＭ  ＤＰＩ集団および「ウォッシュアウト」後１０ｎＭの集団に関して、基礎呼吸、プロトンリーク、ＡＴＰ関連呼吸、および最大呼吸の完全に近いまたは完全な回復を示す。
【００２３】
本発明者らはまた、細胞に対するＤＰＩでの長期処理の効果も検討した。ＭＣＦ７細胞を、様々な濃度のＤＰＩ（１０、２５、および５０ｎＭの存在下で１か月培養した。次に、ミトコンドリア呼吸を評価した。図１４Ａは、これらの濃度は全て呼吸のほぼ完全な阻害を示すことを表す。１０ｎＭのＤＰＩ濃度で、細胞の形態および密度はそのままである（図１４Ｂ）。
【００２４】
本発明者らは、ＤＰＩは、フラビン含有酵素（フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、およびリボフラビン）を阻害することによりミトコンドリア呼吸を遮断すると仮定している。（Ａ）ＤＰＩと（Ｂ）ＦＭＮの構造比較を図１５に示す。フラビン含有酵素は、ミトコンドリア複合体Ｉ−ＮＤＵＦＶ１（５１ｋＤ）、ＮＤＵＦＶ２（２４ｋＤ）およびＮＤＵＦＶ３（１０ｋＤ）の３つのタンパク質成分を含む。ＳＤＨＡも、ミトコンドリア複合体ＩＩおよびクレブス回路の両方の一部であるフラボタンパク質である。バイオインフォマティクスリファレンスツールとしてＧｅｎｅＣａｒｄｓ（登録商標）を用い、発明者らは、全てのフラビン含有遺伝子産物の約７０％がミトコンドリアに局在していると見積もっている（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、レホヴォト、ＩＬ）。従って、発明者らは、ＤＰＩは複合体ＩおよびＩＩにおいてミトコンドリアを阻害することにより働くと仮定している。ＤＰＩの作用は、ＦＭＮおよび／またはＦＡＤにおけるミトコンドリア欠損の誘導を介すもの、および／またはＣＳＣにおけるフラビン含有酵素の不活化によるものであり得る。よって、本発明者らは、ＤＰＩ、ＤＰＩの類似体、およびＤＰＩ関連化合物（例えば、塩化ジフェニルヨードニウム）がＣＳＣを処置するために使用可能であると予想している（例えば、図１７参照）。本明細書で開示される方法は、このような化合物を、例えば、抗癌活性、抗加齢活性、放射線増感活性、光増感活性を含む薬学的有効性に関してスクリーニングおよびバリデートするために使用可能であると認識されるべきである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ミトフラボスチンは、少なくとも１つの膜標的シグナルおよび／または少なくとも１つのミトコンドリア標的シグナルの結合によってミトコンドリアを標的とするように設計され得る。本発明アプローチの下で、化合物は、ミトコンドリアに対する化合物の特異性を高める標的シグナルで修飾され得る。例えば、図１８は、ミトコンドリアを標的とするためにＤＰＩまたはＤＰＩ関連化合物に付加され得るＲ官能基の結合のための場所を示す。いくつかの実施形態では、膜標的シグナルは、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、およびオレイン酸などの脂肪酸を含む。これは膜標的シグナルを網羅する一覧ではなく、列挙されてない膜標的シグナルも本アプローチから逸脱することなく使用可能であると認識されるべきである。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア標的シグナルとしては、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）、グアニジニウムに基づく部分、およびコリンエステルを含む。これはミトコンドリア標的シグナルを網羅する一覧ではなく、列挙されてないミトコンドリア標的シグナルも本アプローチから逸脱することなく使用可能であると認識されるべきである。
【００２６】
図１８に示されるＲ官能基は同じであっても異なっていてもよく、後に同定された他の官能基の中でも、水素、炭素、窒素、硫黄、酸素、フッ素(flourine)、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルカン、環式アルカン、アルカンに基づく誘導体、アルケン、環式アルケン、アルケンに基づく誘導体、アルキン、アルキンに基づく誘導体、ケトン、ケトンに基づく誘導体、アルデヒド、アルデヒドに基づく誘導体、カルボン酸、カルボン酸に基づく誘導体、エーテル、エーテルに基づく誘導体、エステルおよびエステルに基づく誘導体、アミン、アミノに基づく誘導体、アミド、アミドに基づく誘導体、単環式または多環式アレン、ヘテロアレン、アレンに基づく誘導体、ヘテロアレンに基づく誘導体、フェノール、フェノールに基づく誘導体、安息香酸、安息香酸に基づく誘導体、および１以上のミトコンドリア標的シグナルのいずれかから選択され得ると認識されるべきである。明瞭にするために、ミトコンドリア標的シグナルは、結合された分子をミトコンドリアに標的化する効率を高める任意の化学実体またはペプチド実体と定義される。このような修飾は、化合物の効力および有効性を高めると予想される。よって、Ｒは、とりわけ、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）、グアニジニウムに基づく部分および／またはコリンエステルなどの陽イオン化合物を含む、いずれのミトコンドリア標的シグナル（ペプチド実体または化学実体）であってもよい。
【００２７】
ＤＰＩはフラビン含有酵素を標的とすることから、ミトコンドリア機能に対するその効果は、急性リボフラビン（ビタミンＢ２）欠乏の薬理学的誘導によって説明可能である。リボフラビンは、ＦＡＤおよびＦＭＮの生化学的前駆体である。従前の研究では、哺乳動物ＨｅｐＧ２細胞がリボフラビン不含培地で培養された場合、ミトコンドリア複合体Ｉ（ＮＤＵＦＳ１；ＮＤＵＦＶ２）および複合体ＩＩ（ＳＤＨＡ）の重要成分が、ＡＩＦＭ１、ＤＬＤ、ＭＣＡＤおよびＮＱＯ１などの多くの他のミトコンドリア関連タンパク質と同様に、有意に減少した（最大５分の１）ことが示された。従前のデータはまた、フラビンがミトコンドリア活力の増大およびＣＳＣ活性の上昇の自家蛍光マーカーであることも示している。よって、ＤＰＩ、ＤＰＩの類似体、およびＤＰＩ関連化合物は、フラビンを標的とすることによりＣＳＣを処理するために使用可能である。
【００２８】
ＤＰＩはフラビン欠乏の急性および可逆的誘導を介したミトコンドリア呼吸の阻害によってＣＳＣを根絶し得ることから（ＦＭＮと同様）、発明者らは、リボフラビン欠乏を早急に誘導するための機構がまたＣＳＣを治療的に根絶するためにも用であり得ると仮定している。急性リボフラビン欠乏を誘導するための他の方法は、リボフラビンの「ドミナントネガティブ」誘導体を使用することであり得る。これらのリボフラビン誘導体は、それらの効力を高めるために化学基の付加によっても増強され得る。例えば、ロゼオフラビン［８−デメチル−８−（ジメチルアミノ）−リボフラビンまたは８−ジメチルアミノリボフラビン］は、リボフラビンの誘導体である天然抗菌化合物であり、これはＣＳＣを標的とするためにその潜在能力を最適化するように化学修飾することができる。ルミクロム（７，８−ジメチルアロキサジン）は、リボフラビン分解の蛍光光産物であり、これもＣＳＣを標的とするためにその潜在能力を最適化するように化学修飾することができる。リボフラビンの他の一般的な誘導体としては、アロキサジン、ルミフラビン、１，５−ジヒドロリボフラビンおよび１，５−ジヒドロフラビンが含まれる。リボフラビンのこれらの誘導体は、ｉ）脂肪酸部分またはｉｉ）ＴＰＰ（トリフェニルホスホニウム）部分などの膜標的シグナルまたはミトコンドリア標的シグナルの付加により、それらのミトコンドリアへの標的化効率を高めるよう修飾することができる。これらのミトコンドリア標的実体は、ミトコンドリア機能を阻害するリボフラビン誘導体である化合物として、「ミトフラビン」と呼ばれ得る。ミトフラビンの例を図１８に示し、ここで、ＦＡは脂肪酸部分を表し、ＴＰＰはトリフェニルホスホニウム部分を表す。
【００２９】
本発明者らは、ミトコンドリアに対するＤＰＩの効果のさらなる機構が、ミトコンドリア複合体Ｉにおける、順方向への電子伝達には影響を及ぼさずにコハク酸からの逆の電子伝達を妨げることによるＲＯＳ生産（すなわち、超酸化物陰イオン）の阻害であると仮定している。ＤＰＩは、ミトコンドリア呼吸の際の、不要なＲＯＳ生産および細胞損傷に寄与する望ましくない副反応の生成を妨げる。
【００３０】
さらなる証拠が、他のビタミンの代謝の標的化も癌治療戦略として使用可能であることを示している。葉酸拮抗剤は、葉酸の作用を遮断または妨害する代謝拮抗剤である。ほとんどの葉酸拮抗剤は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を標的とすることによりそれらの効果を発揮する。葉酸は、メチオニン、セリン、プリンおよびチミジン生合成を駆動する多くの生合成酵素（すなわち、メチルトランスフェラーゼ）の補因子として働く。ＦＤＡ承認葉酸拮抗剤の例としては、メトトレキサート；  ペメトレキセド；プログアニル；ピリメタミン；およびトリメトプリムが含まれる。葉酸拮抗剤の作用は、特にＤＮＡ合成（細胞周期のＳ期）中に、急速に分裂している細胞を優先的に標的とする。現在、メトトレキサートおよびペメトレキセドが骨肉腫、非小細胞肺癌、中皮腫および血液系悪性腫瘍などの様々な癌種の治療に慣用されている。よって、葉酸拮抗剤療法は癌ならびにマラリア、トキソプラスマ症およびニューモシスチス肺炎などの種々の感染性寄生虫疾患を治療するための有望な戦略と考えられる。しかしながら、葉酸拮抗剤はまた、正常細胞の増殖にも影響を及ぼし、悪心、嘔吐、腹痛、無顆粒球症および再生不良性貧血（骨髄抑制）をもたらすので、重大な副作用も持つ。ＤＰＩ、ＤＰＩの類似体、およびＤＰＩ関連化合物（例えば、塩化ジフェニルヨードニウム）によるフラビンの標的化は、これらの現行治療よりも改善された転帰をもたらし得る。
【００３１】
ミトコンドリアは、加齢のプロセスに直接関連付けられている。しかしながら、それらの厳密な役割は依然として活発に議論されている。発明者らは、ＤＰＩが正常細胞を冬眠に似た代謝休止または「一時的活動停止」の状態で維持するために使用され得ると仮定し、これは加齢のプロセスを緩慢にするまたは逆転させるのに極めて有用であり得る。この主張を裏づける上で、線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）での従前の研究が、ＤＰＩは酸化ストレス応答中のリポフスチン（加齢関連副生成物またはマーカー）の蓄積を防ぐことを示している。
【００３２】
本明細書において本発明の説明に使用される技術用語は、単に特定の実施形態を記述するためのものであって、本発明の限定を意図しない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲に使用する場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数形も含むものとする。本発明は、下記の詳細な説明の考慮から明らかとなるような多くの代替、改変、および等価物を含む。
【００３３】
本発明の様々な要素を記述するために「第１」、「第２」、「第３」、「ａ）」、「ｂ）」、および「ｃ）」などの用語が本明細書で使用され得るが、これらの用語により限定されるものではないと理解される。これらの用語は、本発明のある要素を別の要素から区別するために使用されるにすぎない。よって、以下に述べられる第１の要素は、本発明の教示から逸脱することなく、要素態様と呼ぶことができ、同様に第３もそうである。よって、「第１」、「第２」、「第３」、「ａ）」、「ｂ）」、および「ｃ）」などの用語は、関連の要素に順序またはその他の階層を必ずしも与えることを意図せず、単に識別のために使用される。操作（または工程）の順序は、特許請求の範囲に示されている順序に限定されない。
【００３４】
そうではないことが定義されない限り、本明細書に使用される全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の熟練者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。慣用される辞書に定義されているものなどの用語は、本願の文脈および関連の技術分野でのそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであること、および本明細書に明示的にそのように定義されない限り、理想化されたまたは過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。本発明の説明に使用される技術用語は、単に特定の実施形態を記述するためのものであって、本発明の限定を意図しない。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の参照文献は、それらの全内容が本明細書の一部として援用される。技術用語に矛盾がある場合は、本明細書が優先する。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「および／または」は、関連する列挙項目の可能性のある１以上のいずれかのおよびあらゆる組合せ、ならびに択一（「または」）で解釈される場合には組合せがないことを指し、それらを包含する。
【００３６】
文脈がそうではないことを示さない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴はいずれの組合せで使用してもよいことが特に意図される。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に示されるいずれの特徴もまたは特徴の組合せも除外または省略可能であることを企図する。説明のために、本明細書が、複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むことを述べる場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれも、またはそれらの組合せを省略および排除可能であることが特に意図される。
【００３７】
本明細書で使用する場合、移行句「から本質的になる」（および文法的変形）は、列挙された材料または工程「および特許請求される発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないもの」を包含すると解釈されるべきである。よって、「から本質的になる」という用語は、本明細書で使用する場合、「を含む」と等価と解釈されるべきでない。
【００３８】
「約」という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、量または濃度などの測定可能な値に関する場合、明示された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％の変動を包含することを意味する。測定可能な値に関して本明細書に示される範囲には、他のいずれかの範囲および／またはその中の個々の値を含み得る。
【００３９】
このように本発明のある特定の実施形態を記載してきたが、添付の特許請求の範囲により定義される本発明は、以下に特許請求されるようなその趣旨または範囲から逸脱することなくそれらの多くの明らかな変形が可能であるので、上記に示される特定の詳細によって限定されないと理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するミトフラボスチン。
【請求項２】
少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニレンヨードニウム、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニレンヨードニウムの薬学上許容される塩、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルジフェニルヨードニウム、および少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニルヨードニウムの薬学上許容される塩のうち少なくとも１つを含む、請求項１に記載のミトフラボスチン。
【請求項３】
抗癌活性、抗加齢活性、放射線増感活性、光増感活性のうち少なくとも１つを有する、請求項１に記載のミトフラボスチン。
【請求項４】
抗癌活性、抗加齢活性、放射線増感活性、光増感活性のうち少なくとも１つを有する、請求項２に記載のミトフラボスチン。
【請求項５】
化学療法薬、天然物質、およびカロリー制限のうち少なくとも１つに対して癌細胞を増感させる、請求項１に記載のミトフラボスチン。
【請求項６】
化学療法薬、天然物質、およびカロリー制限のうち少なくとも１つに対して癌細胞を増感させる、請求項２に記載のミトフラボスチン。
【請求項７】
前記少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルがパルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、およびオレイン酸から選択される、請求項１に記載のミトフラボスチン。
【請求項８】
前記少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルがパルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、およびオレイン酸から選択される、請求項２に記載のミトフラボスチン。
【請求項９】
フラビンアデニンジヌクレオチドおよびフラビンモノヌクレオチドのうち少なくとも１つに結合する、請求項１に記載のミトフラボスチン。
【請求項１０】
フラビンアデニンジヌクレオチドおよびフラビンモノヌクレオチドのうち少なくとも１つに結合する、請求項８に記載のミトフラボスチン。
【請求項１１】
ミトコンドリア標的化合物をさらに含む、請求項１に記載のミトフラボスチン。
【請求項１２】
前記ミトコンドリア標的化合物が第２の膜標的シグナルおよびミトコンドリアリボソーム標的シグナルを含む群から選択される少なくとも１つの化合物である、請求項１１に記載のミトフラボスチン。
【請求項１３】
前記第２の膜標的シグナルがパルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、およびオレイン酸から選択される、請求項１２に記載のミトフラボスチン。
【請求項１４】
前記ミトコンドリア標的シグナルがトリフェニルホスホニウムおよびグアニジニウムを含む群から選択される化合物である、請求項１２に記載のミトフラボスチン。
【請求項１５】
癌を治療する方法であって、必要とする患者に、薬学上有効な量の、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するミトフラボスチンおよび薬学上許容される担体を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記ミトフラボスチンが少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニレンヨードニウム、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニレンヨードニウムの薬学上許容される塩、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニルヨードニウム、および少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニルヨードニウムの薬学上許容される塩のうち少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
微生物感染症を治療する方法であって、必要とする患者に、薬学上有効な量の、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するミトフラボスチンおよび薬学上許容される担体を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記ミトフラボスチンが少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニレンヨードニウム、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニレンヨードニウムの薬学上許容される塩、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニルヨードニウム、および少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニルヨードニウムの薬学上許容される塩のうち少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
加齢に伴う病態または感染症を治療する方法であって、必要とする患者に、薬学上有効な量のミトフラボスチンおよび薬学上許容される担体を投与することを含み、前記ミトフラボスチンが少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有する、方法。
【請求項２０】
前記ミトフラボスチンが少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニレンヨードニウム、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニレンヨードニウムの薬学上許容される塩、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニルヨードニウム、および少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニルヨードニウムの薬学上許容される塩のうち少なくとも１つを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ミトフラボスチンが少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有する、少なくとも１種類のミトフラボスチンを含む医薬組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１種類のミトフラボスチンが、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニレンヨードニウム、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニレンヨードニウムの薬学上許容される塩、少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニルヨードニウム、および少なくとも１つの脂肪酸膜標的シグナルを有するジフェニルヨードニウムの薬学上許容される塩のうち少なくとも１つを含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
癌の治療、細菌感染症の治療、病原性酵母感染症の治療、加齢に伴う病態の治療、および加齢の影響の軽減のうち少なくとも１つの表示がされる、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ミトフラボスチンを同定する方法であって、
フラビン含有酵素に結合することが知られる候補化合物に対して、表現型薬物スクリーニングおよびミトコンドリア阻害スクリーニングのうち少なくとも１つを実施すること、および
ミトコンドリア阻害剤としての候補化合物の機能をバリデートすること
を含む、方法。
【請求項２５】
前記表現型薬物スクリーニングがＡＴＰ枯渇アッセイを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記表現型薬物スクリーニングが細胞外酸性化速度アッセイおよび酸素消費速度アッセイのうち少なくとも１つを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記の同定されたミトフラボスチンを抗癌活性および抗微生物活性のうち少なくとも１つに関して試験することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記の試験される抗癌活性がマンモスフィアの形成である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ミトフラビン。
【請求項３０】
膜標的シグナルおよびミトコンドリア標的シグナルのうち少なくとも１つをさらに含む、請求項３２に記載のミトフラビン。
【請求項３１】
癌幹細胞においてリボフラビン欠乏を誘導するための方法であって、少なくとも１種類のミトフラビンを送達投与することを含む、方法。
【請求項３２】
前記ミトフラビンが膜標的シグナルおよびミトコンドリア標的シグナルのうち少なくとも１つを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＦＡが脂肪酸である一般式
【化１】
2021500374.tif 000028
を含む、請求項２９に記載のミトフラビン。
【請求項３４】
ＴＰＰがトリフェニルホスホニウム部分である一般式
【化２】
2021500374.tif 000029
を含む、請求項２９に記載のミトフラビン。
【請求項３５】
ミトコンドリア阻害剤としての候補化合物の機能をバリデートすることが、候補化合物に対して、代謝フラックス解析、マンモスフィア形成アッセイ、生存率アッセイ、抗菌アッセイ、および抗真菌活性アッセイのうち少なくとも１つを実施することを含む、請求項２４に記載の方法。
【国際調査報告】
2021500374.tif 000030
2021500374.tif 000031