(57)【要約】  本開示は、核酸の捕捉、濃縮、分析、および／または精製に使用するための改良された磁性ガラス粒子を提供する。開示した組成物、その使用方法、デバイス、およびキットに対する様々な修飾について記載する。
2021501107.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）安定化剤およびソルボサーマル条件下で製造された磁性コア、（b）液体ガラスコーティングを含む磁性ビーズの組成物であって、ここで、当該磁性ビーズが超常磁性体である、組成物。
【請求項２】
前記磁性ビーズが200〜400nmの粒子サイズを有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記磁性ビーズが50〜70Am2／kgの飽和磁化を有する、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
前記磁性ビーズが3Am2／kg未満の残留磁気を有する、請求項1〜3のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記液体ガラスコーティングがケイ酸塩を含む、請求項1〜4のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ケイ酸塩が、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸リチウム、およびケイ酸マグネシウムから成る群から選択される、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
前記安定化剤が、クエン酸塩、ヒスチジン、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、オレイン酸ナトリウム、ポリアクリル酸から成る群から選択される、請求項1〜6のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記液体ガラスコーティングが20nm以下の厚みを有する、請求項1〜7のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記磁性コアが、Fe3O4、α−Fe2O3、γ−Fe2O3、MnFexOy、CoFexOy、NiFexOy、CuFexOy、ZnFexOy、CdFexOy、BaFexOおよびSrFexO｛式中、xおよびyは合成の方法によって異なり、および式中、xは、好ましくは1〜3の整数であり、かつ、式中、yは3または4である｝である、請求項1〜8のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか１項に記載の組成物と、液体を含んでいる磁性ビーズの懸濁液であって、均質の状態まで混合される、懸濁液。
【請求項１１】
5〜200mg／mLの磁性ビーズを含んでいる請求項10に記載の懸濁液。
【請求項１２】
前記液体が水性バッファーを含む、請求項10または11に記載の懸濁液。
【請求項１３】
カオトロピック剤をさらに含む、請求項12に記載の懸濁液。
【請求項１４】
サンプルの核酸分析を実施するために構成されたデバイスであって、以下の：
（a）サンプルアリコートを受け入れるように構成されたサンプル導入口；
（b）請求項1〜9のいずれか１項に記載の組成物を含む区画；および
（c）試薬調製、標的濃縮、阻害剤除去、核酸抽出、増幅、およびリアルタイム検出を含めた前記PCR分析の1もしくは複数のステップを実施するためにそれぞれ構成された1もしくは複数の追加区画を含むPCR分析領域、
を含む、デバイス。
【請求項１５】
請求項1〜9のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。
【請求項１６】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の磁性ビーズの組成物の製造方法であって、以下のステップ：
（a）安定化剤と、少なくとも1つの遷移金属を含む金属、金属塩、金属炭化物、金属窒化物、金属硫化物、金属リン化物、金属酸化物、または金属キレートから成る群から選択されるいずれか1つの材料によるナノ粒子とを、ソルボサーマル条件下で接触させて、超常磁性体である磁性コアを形成するように100nm超の制御されたサイズの凝集体を形成させ；
（b）ステップ（a）で形成された磁性コアを液体ガラスでコートすること、
を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の分野
改良された磁性ガラス粒子が、核酸分析、捕捉、濃縮、および精製を実施するために構成されたサンプル処理細管で使用のために開示される。
【背景技術】
【０００２】
本開示の背景
多くの生物物質、特に核酸は、自然環境からのそれらの単離に関して特有の難題を示す。一方で、それらは非常に低濃度で存在していることが多く、そしてもう一方で、それらは、特に生物特異的アッセイにおいて、それらが単離または計測されるのを困難にする多くの他の固形物および溶解物の存在下で見出されることが多い。
【０００３】
核酸精製の分野において、磁性シリカ粒子が広く使用される。フェリ磁性ナノ粒子は、一般的に市販されていないので、学術的な刊行物により知られているだけである。斯かる刊行物としては、シリカコーティングを有するナノ粒子（Chen et al; J. of alloys and compounds 497 (2010) 221-227; Wang et al; Bioresource Technology 101 (2010) 8931-8935; Reza et al; Cent. Eu. J. Chem 5 (2010) 1041-1048）が挙げられる。しかしながら、多数の磁性シリカ粒子が市販されており、そして、その大部分が超常磁性挙動を示す。市販の粒子は、通常、Stober法（Stober et al., J. Colloid Interface Sci., 1968, 26, 62）によるシランコーティングを有する磁性コアでできている。ごくわずかな公知の例では、シリカ源は可溶性ケイ酸塩（液体ガラス）ベースである（Philipse et al., Langmuir, 1994, 10, 92 ? 99; Bolle et al., 2015, EP2916327B1）。磁性コアに関して、超常磁性挙動を有する3〜10nmに及ぶナノ粒子または強磁性挙動を有する60nm超のナノ粒子のいずれかが典型的には使用される。超常磁性挙動を有する60nm超のナノ粒子の例はLiuら（Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 5875-5879）によって示されているが、斯かる粒子は、核酸精製に使用されなかった。EP2110175は、PCR適用におけるコート磁性ビーズの使用を開示し、ここで、その磁性ビーズは、ポリマーまたはシリカコートでコートされた金属または合金から作り出された磁性コアを有する。しかしながら、EP2110175は、ビーズのいずれかの好ましい特性も（例えば、超常磁性特性）または斯かるビーズのソルボサーマル製造も開示していない。WO2014／090838は、その磁性シリカ粒子の25〜85％（重量による）を表し、かつ、30μm以下の粒子サイズを有する、SiO2含有表面を有する磁性粒子を開示する。その中で、磁性コア粒子は、沈降反応を使用して製造される。第二のステップでは、粒子はシリカによってコートされ、ここで、いくつかのコア粒子またはその凝集物がコートされて、磁性シリカ粒子が形成される。したがって、磁性シリカ粒子は厚いシリカコーティングを示す。そのうえ、WO2014／090838で開示された製造法は、超素粒子（すなわち、磁性ナノ粒子の輪郭が明確な凝集体）の製造を可能にしておらず、ここで、超素粒子だけが薄いシリカコーティングで覆われている。しかしながら、厚いコーティングを有する粒子は、困難かつ過酷な反応条件を有するシステムに好適ではないことが示された。
【０００４】
（サンプル処理細管内で見られるかのうせいがあるおよび／または短い所要時間を可能にすることが必要とされる）ある条件下での核酸精製における斯かる粒子の使用では、その粒子が強い磁化応答、低い残留磁気および核酸の素早い溶出特性と組み合わせた核酸について高くかつ迅速な結合能を示す必要があり、そしてそれは、斯かる市販の粒子向けの事例ではない。したがって、本記載の目的は、これらの特性に備える粒子の提供である。
【発明の概要】
【０００５】
本開示の概要
一態様において、本開示は、（a）安定化剤と、ソルボサーマル条件下で製造された磁性コア、（b）液体ガラスコーティングを含む磁性ビーズの組成物を提供し、ここで、その磁性ビーズは超常磁性体である。いくつかの実施形態において、磁性ビーズは、100nm超の粒子サイズを有する。いくつかの実施形態において、直径は、約80〜500nm、より具体的には約150〜450nm、より具体的には約200〜400nm、およびより一層具体的には約250〜400nmである。特定の実施形態において、磁性ビーズは、200〜400nmの粒子サイズを有する。いくつかの実施形態において、磁性コアの直径は、約50〜450nm、より具体的には約100〜400nm、より具体的には150〜350nm、より具体的には約200〜350nmである。特定の実施形態において、磁性コアは、約250〜320nm、より具体的には約260〜300nm、より具体的には約270〜290nmである。いくつかの実施形態において、磁性ビーズは、30〜80Am2／kg、より具体的には50〜70Am2／kgの飽和磁化を有する。いくつかの実施形態において、磁性ビーズは、5Am2／kg未満、より具体的には3Am2／kg未満、より一層具体的には2Am2／kg未満の残留磁気を有する。いくつかの実施形態において、磁性ビーズは、3Am2／kg未満の残留磁気を有する。いくつかの実施形態において、液体ガラスコーティングはケイ酸塩を含む。特定の実施形態において、ケイ酸塩は、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸リチウム、およびケイ酸マグネシウムから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、ケイ酸塩はケイ酸ナトリウムである。いくつかの実施形態において、液体ガラスコーティングは、20nm以下の厚みを有する。特定の実施形態において、液体ガラスコーティングは、10nm以下の厚みを有する。いくつかの実施形態において、磁性コアは、安定化剤を伴った磁性ナノ粒子の輪郭が明確な凝集体である。いくつかの実施形態において、安定化剤は、クエン酸塩、ヒスチジン、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、オレイン酸ナトリウム、ポリアクリル酸から成る群から選択される。特定の実施形態において、安定化剤はクエン酸ナトリウムである。いくつかの実施形態において、磁性コアは、少なくとも1つの安定化剤を伴った磁性ナノ粒子の輪郭が明確な凝集体である。いくつかの実施形態において、磁性コアは、磁性ナノ粒子の輪郭が明確な凝集体であり、ここで、磁性ナノ粒子は、＜30nmのサイズを有し、およびここで、磁性ナノ粒子の輪郭が明確な凝集体の直径は、50〜450nm、より具体的には約100〜400nm、より具体的には約150〜350nm、より具体的には約200〜350nmである。本明細書中、磁性コアは超常磁性特性を備える。一実施形態において、安定化剤は、存在しているか、または前記の磁性ナノ粒子の輪郭が明確な凝集体の形成中にその場で加えられる。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの安定化剤は、クエン酸塩、ヒスチジン、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、オレイン酸ナトリウム、ポリアクリル酸またはその2つ以上の混合物から成る群から選択される。特定の実施形態において、安定化剤の混合物はクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、磁性コアは、Fe3O4、α−Fe2O3、γ−Fe2O3、MnFexOy、CoFexOy、NiFexOy、CuFexOy、ZnFexOy、CdFexOy、BaFexOおよびSrFexO｛式中、xおよびyは合成の方法によって異なり、および式中、xは、好ましくは1〜3の整数、より好ましくは2であり、かつ、yは、好ましくは3または4であり、最も好ましくはFe3O4である｝である。特定の実施形態において、磁性コアは磁鉄鋼コアである。いくつかの実施形態において、ソルボサーマル条件は、190〜250℃および1〜20barの加圧を含む条件である。いくつかの実施形態において、磁性ビーズは実質的に球状である。
【０００６】
別の態様において、本開示は、先に示した組成物と液体を含む磁性ビーズの懸濁液を提供し、ここで、懸濁液は均質の状態まで混合される。いくつかの実施形態において、懸濁液は5〜200mg／mLの磁性ビーズを含む。他の実施形態において、懸濁液は5〜100mg／mLの磁性ビーズを含む。他の実施形態において、懸濁液は5〜60mg／mLの磁性ビーズを含む。特定の実施形態において、懸濁液は25〜50mg／mLの磁性ビーズを含む。いくつかの実施形態において、液体は水性緩衝化溶液を含む。いくつかの実施形態において、水性緩衝化溶液は、Tris−ヒドロキシメチルアミン（TRIS）、ホスファート、N−（2−ヒドロキシエチル）ピペラジン−N’−（2−エタンスルホン酸）（HEPES）、およびその混合物を含む。いくつかの実施形態において、水性緩衝化溶液はカオトロピック剤をさらに含む。特定の実施形態において、カオトロピック剤は、中に2〜8mol／Lの濃度にて懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態において、カオトロピック剤は、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジニウム、グアニジニウムイソチオシアネート、および塩酸グアニジニウム（guanidinium hydrochlorite）から成る群から選択される。
【０００７】
別の態様において、本開示は、サンプルの核酸分析を実施するために構成されたデバイスであって、以下の：
a．サンプルアリコートを受け入れるように構成されたサンプル導入口；
b．本明細書中に記載した磁性ビーズを含んでいる組成物を含む区画；および
c．試薬調製、標的濃縮、阻害剤除去、核酸抽出、増幅、およびリアルタイム検出を含めた前記PCR分析の1もしくは複数のステップを実施するためにそれぞれ構成された1もしくは複数の追加区画を含むPCR分析領域、
を含む前記デバイスを提供する。
【０００８】
別の態様において、本開示は、本明細書中に開示されるデバイスを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書中に記載したように、標的核酸配列を特異的に増幅、捕捉、タグ付与／変換または検出するための少なくとも1つのデバイスを含む任意の製造物（例えば、パッケージまたはコンテナ）を含み、ここで、本明細書中に記載した組成物が、デバイスに含まれるか、または別個のキット構成要素、バイアルもしくはコンテナとして提供される。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書中に記載した増幅法またはそのステップに使用される、使用説明書、補助的試薬、対照物質、および／または構成要素もしくはモジュールのいずれか1つをさらに含む。
【０００９】
別の態様において、本開示は、先に開示の組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書中に記載したデバイスで提供されてもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、パッケージまたはコンテナの状態で提供される。いくつかの実施形態において、キットは、以下の構成要素：ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要なバッファー、のうちの少なくとも1つをさらに含む。いくつかの実施形態において、キット構成要素は、別個の構成要素として、別個のバイアルまたはコンテナ内のキットに含まれる。いくつかの実施形態において、1以上のキット構成要素が、同じバイアルまたはコンテナ内のキットに含まれる。いくつかの実施形態において、キットは、溶出液または溶出バッファーをさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは逆転写酵素活性を有する酵素を含む。いくつかの実施形態において、キットは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性および逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ酵素を含む。
【００１０】
さらに別の態様において、本開示は、本明細書中に記載した磁性ビーズの組成物の製造方法であって、以下のステップ：
a．安定化剤と、少なくとも1つの遷移金属を含む金属、金属塩、金属炭化物、金属窒化物、金属硫化物、金属リン化物、金属酸化物、または金属キレートから成る群から選択されるいずれか1つの材料によるナノ粒子とを、ソルボサーマル条件下で接触させて、超常磁性体である磁性コアを形成するように100nm超の制御されたサイズの凝集体を形成させ；
b．ステップ（a）で形成された磁性コアを液体ガラスでコートすること、
を含む製造方法を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、コート磁性ビーズの直径は、約80〜500nm、より具体的には約150〜450nm、より具体的には約200〜400nm、およびより一層具体的には約250〜400nmである。特定の実施形態において、磁性ビーズは、200〜400nmの粒子サイズを有する。いくつかの実施形態において、磁性コアの直径は、約50〜450nm、より具体的には約100〜400nm、より具体的には約150〜350nm、より具体的には約200〜350nmである。特定の実施形態において、磁性コアは、約250〜320nm、より具体的には約260〜300nm、より具体的には約270〜290nmである。いくつかの実施形態において、安定化剤は、クエン酸塩、ヒスチジン、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、オレイン酸ナトリウム、ポリアクリル酸から成る群から選択される。特定の実施形態において、安定化剤はクエン酸ナトリウムである。いくつかの実施形態において、磁性コアは、Fe3O4、α−Fe2O3、γ−Fe2O3、MnFexOy、CoFexOy、NiFexOy、CuFexOy、ZnFexOy、CdFexOy、BaFexOおよびSrFexO｛式中、xとyは、合成の方法によって異なり、および式中、xは、好ましくは1〜3の整数であり、より好ましくは2であり、かつ、式中、yは、好ましくは3または4であり、最も好ましくはFe3O4である｝である。特定の実施形態において、磁性コアは磁鉄鋼コアである。いくつかの実施形態において、ソルボサーマル条件は、190〜250℃および1〜20barの加圧を含む条件である。いくつかの実施形態において、磁性ビーズは実質的に球状である。いくつかの実施形態において、液体ガラスコーティングはケイ酸塩を含む。特定の実施形態において、ケイ酸塩は、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸リチウム、およびケイ酸マグネシウムから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、ケイ酸塩はケイ酸ナトリウムである。いくつかの実施形態において、液体ガラスコーティングは、20nm以下の厚みを有する。特定の実施形態において、液体ガラスコーティングは、10nm以下の厚みを有する。いくつかの実施形態において、ステップa．は、安定化剤の存在下で金属塩を還元することを含む。特定の実施形態において、金属塩はFeCl3であり、かつ、安定化剤はクエン酸ナトリウムであって、磁鉄鋼コアを形成する。特定の実施形態において、液体ガラスはケイ酸ナトリウムである。特定の実施形態において、その方法は、以下のステップ：
a．最長18時間、高温にて酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、およびエチレングリコールの存在下でFeCl3を還元することによって磁鉄鋼コアを形成し；
b．ステップ（a）で形成された磁鉄鋼コアを液体ガラス、好ましくはケイ酸ナトリウムによってコートすること、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、本明細書中に記載した粒子の磁鉄鋼コアを作製するのに使用され得るソルボサーマル反応を例示する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、磁鉄鋼コアへの安定化剤の添加をさらに例示する。典型的には、クエン酸塩が磁鉄鋼ナノ粒子の周りに配位結合して、超素粒子をもたらす。
【図２】図２は、本明細書中に記載した粒子の磁鉄鋼コアを作製するのに使用され得る化学反応の推定される機序を例示する。
【図３Ａ】図３Ａは、オルトケイ酸テトラエチル（TEOS）コーティング反応を例示する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、液体ガラスコーティング反応を例示する。
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、本明細書中に記載したMGPの形態に対する試薬濃度の影響を示す比較SEM分析を含む。図４Ａ：倍率1（MC13）；図４Ｂ：倍率2（MC15）；図４Ｃ：倍率4（MC06）。
【図５】図５は、本明細書中に記載するビーズと共に使用できるサンプル処理デバイスを例示する。
【図６】図６は、シリカコーティングの厚さに対する粒子（MC48サンプル）の等電点の依存関係を例示する。
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、それらの等電点に対するMC48サンプルの計測されたFluA CT値（図７Ａ）、FluB CT値（図７Ｂ）およびRSV CT値（図７Ｃ）の依存関係を例示する。
【図８】図８は、それらの等電点に対するMC47サンプルの計測されたFluA、FluB、RSV、および内部陽性対照（IPC）CT値の依存関係を例示する。
【図９】図９は、シリカコーティングの厚さに対するMC48サンプルの計測されたFluA CT値の依存関係を例示する。
【図１０Ａ−１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃは、コーティングなし（図１０Ａ）、当該開示による低コーティング厚の液体ガラスコーティング（図１０Ｂ）、およびオルトケイ酸テトラエチル（TEOS）コーティング手順を使用した高コーティング厚（図１０Ｃ）の磁性ガラス粒子MC14を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の詳細な説明
定義
本明細書で特に定義しない限り、本明細書で使用される科学的用語および技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、かつ複数形の用語は単数形を含む。冠詞「a」および「an」が本明細書にて使用される場合、冠詞の文法的目的の1もしくは複数の（すなわち、少なくとも1つ）を指す。例として、「要素（an element）」とは、1つの要素または複数の要素を意味する。
【００１４】
「検出する（detect）」、「検出すること（detecting）」、「検出（detection）」、および同様の用語は、本出願において、プロセス、またはある物の存在もしくは非存在、および程度、量、またはレベル、または発生確率を発見もしくは決定することを広範に指すために使用される。例えば、用語「検出すること（detecting）」とは、標的核酸配列に関して使用される場合、その配列の存在、存在、レベル、もしくは量、および確率もしくは尤度の発見または決定を示すことがある。「存在または非存在を検出すること（detecting presence or absence）」、「存在または非存在の検出（detection of presence or absence）」、および関連する表現は、定性的かつ定量的検出を含むことを理解されたい。
【００１５】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）のポリマーを指し、天然に存在する（アデノシン、グアニジン、シトシン、ウラシル、およびチミジン）、天然に存在しない、並びに修飾された核酸を含む。この用語は、ポリマーの長さ（例えば、モノマーの数）によって制限されない。核酸は一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよく、概して5’−3’ホスホジエステル結合を含有し得るが、いくつかの場合において、ヌクレオチド類似体は他の結合を有してもよい。モノマーは、典型的にはヌクレオチドと呼ばれる。用語「非天然ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」とは、修飾された窒素塩基、糖、もしくはリン酸基を含有するヌクレオチド、またはその構造中に非天然部分を組み込むヌクレオチドを指す。非天然ヌクレオチドの例には、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、アミノ化ヌクレオチド、脱アミノ化ヌクレオチド、アルキル化ヌクレオチド、ベンジル化ヌクレオチド、および蛍光体標識ヌクレオチドが含まれる。
【００１６】
「サンプル」または「生体サンプル」という用語は、個体由来の核酸を含むか、または含むと推定される任意の組成物を指す。この用語は、細胞、組織または血液の精製成分または分離成分、例えばDNA、RNA、タンパク質、無細胞部分、または細胞溶解物を含む。一実施形態において、サンプルは全血サンプルである。本明細書で使用される「全血サンプル」は、身体から採取され、かつ血漿や血小板のような構成成分が除去されていない血液を含む。一般に、このサンプルは、抗凝血剤の添加以外は修飾されていない。このサンプルはまた、他の種類の生体サンプル、例えば、血漿、血清、血液成分（白血球膜）、および乾燥血液滴を指すこともできる。サンプルはまた、細胞株を含む個体から得られた細胞のインビトロ培養物の成分および成分を含み得る。サンプルの特定のさらなる例は、糞便、粘膜スワブ、組織吸引物、組織ホモジネート、細胞培養物および細胞培養上清（真核細胞および原核細胞の培養を含む）、尿、唾液、痰、および脳脊髄サンプルを含む。
【００１７】
「ソルボサーマル」条件は、化学物質を作製するソルボサーマル合成方法で適用される。本明細書中では、ソルボサーマル合成は、金属酸化物ナノ粒子またはナノ構造のサイズ、形状分布、および結晶度に関する精密制御を可能にする。これらの特徴は、反応温度、反応時間、溶媒タイプ、界面活性剤タイプ、および前駆体タイプを含めた特定の実験パラメータを変えることによって変更できる（R. Xu et al., Modern Inorganic Synthetic Chemistry, Elsevier, 2011, Amsterdam, pp. 63）。
【００１８】
「フェリ磁性」という用語は、本明細書中で使用される場合、反対方向であるが、不平等に配分された磁性モーメントを有し、これにより、外部磁場が印加された時点で磁性の飽和および残留をもたらす原子の集団から成る物質を指す。
【００１９】
「常磁性」という用語は、それによって、特定の材料が外部印加磁場によって弱々しく引き付けられる磁性の形態、および印加磁場の向きの内部、誘発磁場の形態を指す。常磁性は、完全に充填されていない原子軌道を有する全原子が常磁性体であるような、物質内の不対電子の存在に起因して起こる。それらのスピンのため、不対電子は、磁性双極子モーメントを有するので、小さい磁石のように振る舞う。外部磁場は、電子のスピンをその場に対して並列に整列させ、正味の引力を引き起こす。常磁性物質としては、アルミニウム、酸素、チタニウム、および酸化鉄（FeO）が挙げられる。特に、常磁性体は、熱運動がスピン配向をランダム化するので、外部印加磁場の不存在下でいずれの磁化も保有しない。その結果、印加された場が取り除かれたとき、全磁化はゼロまで減少する。
【００２０】
「超常磁性」という用語は、小さな強磁性またはフェリ磁性ナノ粒子の状態で現れる磁性の形態を指す。外部磁場の不存在下、ナノ粒子の磁化は平均してゼロの状態にあるように見える。この状況は超常磁性状況にあることが理解される。この状況では、外部磁場は、常磁性粒子のものよりはるかに大きい超常磁性粒子の磁化率によりナノ粒子を磁化させることができる。
【００２１】
磁性粒子
本開示によって解決すべき課題は、サンプル調製および生物学的アッセイに関して、特にサンプル処理細管の中で実施される自動処理法に関して、改良された特性を有する磁性粒子に提供することと見なすことができる。サンプル処理細管を使用するシステム、例えば、cobas（登録商標）Liat（登録商標）Systemに記載されるものなどには、磁性粒子に関して非常に困難な要件がある。斯かるシステムでは、洗浄、インキュベーションおよび溶出ステップは、数分以内に起こるのではなく、むしろ数秒以内に起こり、その結果、粒子に対する要求が増大する。特に、粒子は、強い磁化応答に備える必要があり、小さな粒子サイズを有する必要があり、かつ、低い残留磁化を示す必要がある。いくつかの態様において、粒子が超常磁性的であり、かつ、さもなければ、粒子がばらけるのがあまりに遅い場合に、＞200nmのサイズを有することが有益であることが示された。この問題の解決策は、低い残留磁気および速い磁気分離時間の所望の特性、核酸の素早い溶出性を伴った核酸の高度かつ迅速な結合能を示す本開示による粒子によって提供される。特に、本開示による粒子は、（高度かつ迅速な結合能のための）比較的高い有効表面積、（磁性飽和のための）低コーティング厚、（短い磁気分離時間のための）約100 nm超である粒子サイズ、および（低い残留磁気のための）超常磁性体である磁性コアを備える。
【００２２】
一態様において、本開示は、ソルボサーマル条件下で作製される磁性コアを含む磁性粒子または磁性ビーズおよび液体ガラスベースのコーティングを提供し、ここで、磁性粒子または磁性ビーズは超常磁性のものである。より具体的には、本開示は、磁性粒子の組成物を提供する。本明細書中に使用される場合、「粒子」（または「ビーズ」）とは、比較的小さい直径を有する固体材料を指す。本明細書中に企図される粒子は、液体ガラスベースのコーティングを有する小さい磁性コアの固体分散系である。粒子は、比較的小さく、かつ、実質的に球状である。「粒子」および「ビーズ」、ならびに「磁性粒子」および「磁性ビーズ」という用語が互換的に使用され得ることは留意されるべきである。斯かる粒子またはビーズの利点としては、これだけに限定されるものではないが、以下の点：
・例えば、短い磁気分離時間、短い沈降時間および増大した外部表面積の間の良好なバランスを提供する、例えば、100nm超、例えば、100〜500nmなど、より具体的には200〜400nmの大きな粒子サイズ；
・均質性および再現性のよい結果をもたらす、狭い粒子サイズ分布；
・低い残留磁気をもたらし、かつ、磁力導入後に凝集傾向を与えない、超常磁性粒子の使用；
・高い飽和磁化につながる、比較的薄い液体ガラスコーティングの使用；
・製造可能性およびプロセス拡張可能性の容易さ；および
・廃棄物の低減を伴って、製造時間および物品コストを削減した、磁鉄鋼コアおよびコーティングの最適化された合成、
が挙げられる。
【００２３】
本明細書中、サイズが、粒子の磁気特性に関する唯一の決定要因でないことに留意されるべきである。例えば、鉄酸化物、例えばFe3O4などは、様々な特性を有する様々な修飾状態で存在し得る。特に、微結晶のサイズは粒子の磁気特性に関連する可能性がある。例えば、小さな結晶は、有意に低い残留磁気を示し、これにより、超常磁性特性を備え得るが、その一方で、200nm以上のサイズを有する微結晶は、超常磁性特性を示さない可能性がある。具体的な一実施形態において、本開示による粒子の磁性コアは、小さな結晶で構成される（例えば、安定化剤をさらに含んでいる磁性ナノ粒子の輪郭が明確な凝集体）。よって、本開示による粒子は、100〜500nm、より具体的には200〜400nmのサイズに達するが、依然として超常磁性特性を示す。そのうえ、超常磁性特性は、それらが何度か磁石と接触する場合に、粒子が凝集物になる可能性がないので、工業的使用に関して決定的であり得る。
【００２４】
本開示の一態様は、実質的に球状であり、かつ、小さな直径を有する、および100nm超の直径を有する少なくとも1つの磁性物体を含む磁性粒子の組成物である。特定の態様において、直径は、約80〜500nm、より具体的には約150〜450nm、より具体的には約200〜400nm、およびより一層具体的には約250〜400nmである。特定の態様において、磁性コアの直径は、約50〜450nm、より具体的には約100〜400nm、より具体的には約150〜350nm、より具体的には約200〜350nmである。特定の態様において、磁性コアは、約250〜320nm、より具体的には約260〜300nm、より具体的には約270〜290nmである。本開示による磁性粒子は、その中に非常に小さい非凝集磁性物体を分散させたガラス液滴である。したがって、本明細書中に記載した磁性粒子はまた、「磁性ガラス粒子」（「MGP」）とも呼ばれる。磁性体と呼ばれる物体は、磁石、すなわち、強磁性または超常磁性材料に引きつけられる。強磁性材料としては、まだ前磁化されていない材料を挙げることもできる。前磁化は、これに関連して、磁石と接触させることを意味すると理解され、そしてそれが、残留磁性を増強する。より具体的には、本開示による磁性粒子の磁性コアは超常磁性体である。超常磁性ビーズを作製するために好適な材料は、少なくとも1つの遷移金属を含む、金属、金属塩、金属炭化物、金属窒化物、金属硫化物、金属リン化物、金属酸化物、または金属キレートである。本開示による好ましい遷移金属としては、これだけに限定されるものではないが、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、亜鉛、カドミウム、ニッケル、ガドリニウム、銅、およびモリブデンが挙げられる。より好ましくは、金属、金属炭化物、金属窒化物、金属硫化物、金属リン化物、金属酸化物、または金属キレートは少なくとも鉄を含む。より好ましくは、磁性コアは、酸化鉄、特に、Fe3O4、α−Fe2O3、γ−Fe2O3、MnFexOy、CoFexOy、NiFexOy、CuFexOy、ZnFexOy、CdFexOy、BaFexO、およびSrFexO｛式中、xおよびyは合成方法によって異なり、および式中、ｘは好ましくは1〜3の整数であり、より好ましくは2であり、かつ、式中、yは好ましくは3または4である｝から成る群から選択される酸化鉄を含む。最も好ましくは、磁性コアはFe3O4を含む。より具体的には、好ましい磁性体は、鉄または酸化鉄、例えば、磁鉄鋼（Fe3O4）、またはFe2O3である。
【００２５】
本開示によると、先に規定した磁性コア材料は、安定化剤を伴った磁性ナノ粒子の輪郭が明確な凝集体を含む。好適な安定化剤は、言及された化合物の塩および誘導体、例えば、エステルや重合体などを含めた、ジカルボン酸、トリカルボン酸、ポリアクリル酸、アミノ酸、界面活性剤および脂肪酸から成る群のうちの少なくとも1つのメンバーから選択される。これにより、前述の群としては、言及された化合物の塩および誘導体、例えば、エステルや重合体などが挙げられると理解されている。よって、安定化剤は、好ましくは、ジカルボン酸、ジカルボン酸塩、ジカルボン酸誘導体、トリカルボン酸、トリカルボン酸塩、トリカルボン酸誘導体、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸誘導体、アミノ酸、アミノ酸塩、アミノ酸誘導体、界面活性剤、界面活性剤の塩、脂肪酸、脂肪酸塩、および脂肪酸誘導体から成る群のうちの少なくとも1つのメンバーから選択される。一態様において、安定化剤、例えばクエン酸塩などは、超常磁性特性を示す、本開示による粒子の磁性コアを形成する粒子凝集体（いわゆる、超素粒子）の形成中にその場で加えられる。本明細書中、粒子凝集体生成後の安定化剤のその後の添加は、同じ結果をもたらさない。好ましくは、脂肪酸、脂肪酸塩または脂肪酸誘導体として、超素粒子の表面に結合することができ、その結果、超素粒子を安定させる斯かる化合物が選ばれる。安定化剤として利用させる脂肪酸は、好ましくは、端末のカルボキシル基（−COOH）、および磁性粒子の表面に対して高い親和性吸着（例えば、化学吸着または物理吸着）を有する、8〜22個の炭素原子を含むアルキル基の単一鎖である。脂肪酸は、水の存在下での酸化および／または加水分解から磁性粒子コアを保護することを含めた複数の機能を有し、そしてそれは、ナノ粒子の磁化を有意に低減し（Hutten, et al. (2004) J. Bio-tech. 112:47-63）；ナノ粒子コアを安定させる、などの可能性がある。「脂肪酸」という用語としては、飽和または不飽和、および特に不飽和脂肪酸が挙げられる。例示的な飽和脂肪酸としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、トリデシル酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、ノナデシル酸、ヘンエイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、メリッシン酸、ヘナトリアコンチル酸、ラッセロ酸、プシルル酸、ゲダ酸、セロプラスチン酸、ヘキサトリアコンチル酸、ヘプタトリアコンタン酸およびオクタトリアコンタン酸などが挙げられる。例示的な不飽和脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ヘキサデカトリエン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘンエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、イワシ酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサヘキサエン酸、カレンド酸、エイコサジエン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、5−ドデセン酸、7−��トラデセン酸、パルミトレイン酸、バクセン酸、パウリン酸、15−ドコセン酸、17−テトラコセン酸、エライジン酸、ゴンド酸、メアド酸、エルカ酸、ネルボン酸、ルメン酸、カレンド酸、ジャカル酸、エレオステアリン酸、カタルプ酸、プニカ酸、ルメレン酸、パリナル酸、ボッセオペンタエン酸、ピノレン酸、ポドカルプ酸などが挙げられる。脂肪酸は、合成され得るか、または確立された方法を使用して天然源から単離され得る。そのうえ、脂肪酸は、誘導体、例えば、脂肪酸エノールエステル（すなわち、アセトンのエノール形と反応させた脂肪酸）、脂肪酸エステル（すなわち、一価アルコールのアルキル基によって置換された活性水素を有する脂肪酸）、脂肪族アミンもしくは脂肪アミドなど、または特定の実施形態において、先に記載した脂肪アルコールである。特に好ましい脂肪酸はオレイン酸である。当該開示との関連において使用される界面活性剤は、両親媒性である、すなわち、疎水基と親水基の両方を含む有機化合物である。好ましくは、超素粒子の表面に結合することができ、それによって、さまざまな鎖長、親水性−親油性バランス（HLB）値および表面荷電を有する超素粒子の好ましい安定化が、適用によって利用できる、界面活性剤が選択される。好ましくは、開示による界面活性剤は、クアテラナリアンモニウム塩、アルキルベンゼンスルホナート、リグニン スルホナート、ポリオキシレトキシラート、または硫酸エステルである。界面活性剤の制限されることのない例は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、ノニフェノルポリエトキシラート（すなわち、NP−4、NP−40およびNP−7）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウム、ドクセート、ペルフルオロオクタンスルホナート、ペルフルオロブタンスルホナート、アルキルアリールリン酸エーテル、アルキルエーテルホスファート、ステアリン酸ナトリウム、2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸、ペルフルオロノナン酸アンモニウム、ラウレス硫酸マグネシウム、ペルフルオロノナン酸、ペルフルオロオクタン酸、リン脂質、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウム、パレス硫酸ナトリウム、塩化ベヘントリモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ブロニドキス、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、ラウリルメチルグルセス−10塩化ヒドロキシプロピルジモニウム、二塩酸オクテニジン、オラフルル、N−オレイル−1,3−プロパンジアミン、塩化ステアラルコニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、臭化トンゾニウム、セトマクロゴール1000、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コクアミドDEA、コクアミドMEA、デシルポリグルコース、ココアンホ二酢酸二ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリエチレングリコールイソセチルエーテル、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ラウリルグルコシド、マルトシデス、モノラウリン、ミコスブチリン、ノノキシノール、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、N−オクチルβ−D−チオグルコピラノシド、オクチルグルコシド、オレイルアルコール、ペンタエチレングリコールモノ−ドデシルエーテル、ポリドカノール、ポロキサマー、ポリエトキシル化タロウアミン、ポリリシノール酸ポリグリセリン、ポリソルビン酸、ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、ステアリルアルコール、スルファクチン、トリトンX-100、Tween80、コクアミドプロピルベタイン、コクアミドプロピルヒドロキシスルタイン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ヒドロキシスルタイン、ラウリルジメチルアミンオキシド、レシチン、ミリスタミンオキシド、ペプチテルゲントス、ラウロアンホ酢酸ナトリウムおよびbis（2−エチルヘキシル）スルホコハク酸エステルである。
【００２６】
「アミノ酸」という用語は、本開示の意味の範囲内で使用される場合、天然または非天然のアミノ酸またはアミノ酸誘導体、ならびにアミノ酸の塩を指す。好ましくは、その結果、好ましくは、超素粒子を安定化させる、超素粒子の表面への結合が可能であるアミノ酸が選ばれる。例示的なアミノ酸としては、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、セレノシステイン、ピロリシン、システイン、デヒドロアラニン、エンデュラシジジン（enduracididine）、ランチオニン、ノルバリン、およびその誘導体が挙げられる。
【００２７】
本開示の意味の範囲内の「ジカルボン酸」という用語は、2つのカルボン酸官能基を含有する炭化水素または置換炭化水素（すなわち、R1−（C（O）OH）2）を指し、ここで、R1は（a）0〜18個の炭素ユニットを含有する線状炭化水素であるか、または（b）芳香族または非芳香族として、3〜8個の炭素ユニットを含有する環状炭化水素である。その用語は、脂肪酸の塩および誘導体、例えば、脂肪酸のエステルなどを含む。代表的なジカルボン酸は、例えば、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸、オクタン二酸、ノナン二酸、デカンニ酸、ウンデカン二酸、ドデカンジオン酸、ヘキサデカン二酸、マレイン酸、フマル酸、グルタコン酸、トラウマチン酸、ムコン酸、グルチン酸、シトラコン酸、メサコン酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、タルトロン酸、酒石酸、ジアミノピメリン酸、サッカリン酸、メソシュウ酸、オキサロ酢酸、アセトンジカルボン酸、アラビナル酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ジフェン酸、2,6−ナフタレンジカルボン酸である。
【００２８】
本開示の意味の範囲内の「トリカルボン酸」という用語は、3つのカルボン酸官能基を含有する炭化水素または置換炭化水素、すなわち、（R1−（C（O）OH）3）を指し、ここで、R1は（a）3〜18個の炭素ユニットを含有する線状炭化水素であるか、または（b）芳香族または非芳香族として3〜8個の炭素ユニットを含有する環状炭化水素である。その用語は、脂肪酸の塩および誘導体、例えば、脂肪酸のエステルなどを含む。代表的なトリカルボン酸は、例えば、クエン酸（2−ヒドロキシプロパン−1,2,3トリ−カルボン酸）、イソクエン酸（ｌ−ヒドロキシプロパン−1,2,3トリカルボン酸）、アコニット酸（プロパ−ｌ−エン−1,2,3トリカルボン酸）、プロパン−1,2,3−トリカルボン酸、トリメリト酸（ベンゼン−1,2,4−トリカルボン酸）、トリメシン酸（ベンゼン−ｌ,3,5−トリカルボン酸）、オキサロコハク酸（1−オキソプロパン−1,2,3−トリカルボン酸）またはヘミメリト酸（ベンゼン−ｌ,2,3−トリカルボン酸）である。好ましくは、トリカルボン酸は、シトラート、すなわち、クエン酸の塩および誘導体を含めたクエン酸である。
【００２９】
好ましくは、安定化剤は、クエン酸、ヒスチジン、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、オレイン酸ナトリウム、ポリアクリル酸またはそれぞれのその塩または誘導体を含めた、そのうちの2つ以上の混合物から成る群から選択される。よって、本開示はまた、先に記載した磁性粒子にも関し、ここで、磁性コアは、好ましくは、少なくとも1つの安定化剤を伴った凝集磁性ナノ粒子から成る超素粒子から成り、ここで、少なくとも1つの安定化剤は、クエン酸塩、ヒスチジン、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、オレイン酸ナトリウム、ポリアクリル酸またはそのうちの2つ以上の混合物から成る群から選択される。特定の実施形態において、安定化剤はクエン酸ナトリウムである。好ましくは、安定化剤の量は、安定化剤と超素粒子の合計の全重量に基づいて1〜80重量％の範囲より好ましくは5〜70重量％の範囲、より好ましくは10〜50重量％の範囲、最も好ましくは20〜40％にある。
【００３０】
特定の態様において、MGPの磁性コアはソルボサーマル条件下で製造される。ソルボサーマル条件は、約190〜250℃および約1〜20barの加圧を含むことは理解されている。
【００３１】
例えば、MGPの組成物に液体を加え、そして、その懸濁液を均質状態まで混合することによって製造できる磁性ビーズの懸濁液もまた提供される。懸濁液に使用される液体は、磁性粒子の安定性に影響しない、そして均質な懸濁液の作製のために利用されうるところのあらゆる液体を含みうる。分子生物学における工程、特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の精製工程であって、特定の条件下、それらの物質のガラス粒子への結合を利用する上記工程に好適である液体が使用される。あるいは、液体は、アルコール又はそれらと水とのあらゆる混合物あるいはケトンを含む。一実施形態において、懸濁液は5〜200mg／mLのMGPを含むことができる。他の実施形態において、懸濁液は5〜100mg／mLのMGPを含むことができる。他の実施形態において、懸濁液は5〜60mg／mLのMGPを含むことができる。特定の実施形態において、懸濁液は25〜50mg／mLのMGPを含むことができる。
【００３２】
これに代えて、またはこれに加えて、MGPは、カオトロピック物質を任意選択で含み得る水性緩衝溶液中に懸濁される。本明細書中、その濃度は、2〜8 mol／l、例えば、4〜6 mol／lであり得る。カオトロピック塩は、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウムまたは塩酸グアニジニウム（guanidinium hydrochlorite）である。本明細書中に使用される「カオトロピック物質」としては、液状の水の構造を乱し、そしてDNAまたはRNAを含む溶液中にこの作用物質が存在した場合、DNAまたはRNAがMGPに結合することに対して効果を有するあらゆる化学物質が挙げられる。分子生物学の目的において、好適な緩衝液系は、例えばSambrook et al. (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press, New York, N.Y., USA中に見出され得る。好ましい緩衝物質は、トリス−ヒドロキシメチルアミン（TRIS）、リン酸、N−（2−ヒドロキシエチル）ピペラジン−N’−（2−エタンスルホン酸）（HEPES）、それらの塩または他の好適な物質である。加えて、例えばNaCl，KClまたはCaCl2のような溶液のイオン強度を変える物質または、例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）若しくはそれらの塩のような金属陽イオン錯化剤である物質が提供され得る。他の実施形態において、前記MGP懸濁液は、DNAまたはRNAを場合によりタンパク質、脂肪酸、炭水化物、および生物起源の他の材料との混合物の形でさらに含み得る。他の実施形態において、前記液体は、アルコール、ケトン、水性緩衝溶液、カオトロピック物質、溶液のイオン強度を変更する物質、錯化剤、生物材料、前記の特徴を有する全てのDNAまたはRNAの混合物を含み得る。
【００３３】
MGPで使用できる磁性体は、当該技術分野で知られているいずれか1つの好適な方法によって特徴づけることができる。例えば、磁性飽和とは、適用された外部磁場の増大がさらに材料の磁化を増強できないときに至る状況であり、そのようにして、総磁束密度をおおまかに平均する。同様に、残留磁性、残留磁化または残留磁束密度は、外部磁場を取り除いた後に強磁性材料（鉄など）において後に残る磁化である。一実施形態において、本明細書中に企図されたMGPは、30〜80Am2／kg、より具体的には50〜70Am2／kgの飽和磁化および5Am2／kg未満、より具体的には3未満より一層具体的には2未満の残留磁気を有する。
【００３４】
本明細書中に記載したMGPで使用される磁性コア材料としては、液体ガラスコーティング、例えば液体ガラスナトリウムコーティングを含めたアモルファス物質で構成されたコーティングが挙げられる。未コーティング磁性コア粒子は、約250〜320nm、より具体的には260〜300nm、より具体的には270〜290nmの直径を有する。液体ガラスコーティングが適用された後に、コートビーズは約270〜340nm、より具体的には280〜320nmの直径を有し、それぞれ50〜70Am2／kgで磁化させる。
【００３５】
磁性粒子の製造方法
先に開示した磁性ビーズの組成物を製造する方法が、さらに本明細書中に開示される。本明細書中、第一のステップでは、ソルボサーマル条件下、安定化剤を、少なくとも1つの遷移金属を含む金属、金属塩、金属炭化物、金属窒化物、金属硫化物、金属リン化物、金属酸化物、または金属キレートから成る群から選択されるいずれか1つの材料によるナノ粒子と接触させる。その結果、超常磁性体である磁性コアを形成する、100nmを超える制御されたサイズの凝集体が生じる。第二のステップでは、磁性コアを液体ガラスでコートして、本開示による磁性ビーズを形成する。
【００３６】
反応は、高温、好ましくは190〜250℃、および高圧、好ましくは1〜20barの下で実施される。斯かるソルボサーマル条件下では、安定化剤は、磁性ナノ粒子の周りの表面に配位結合して、超素粒子をもたらす。したがって、磁性コアは、互いに集合した凝集、安定化剤−コートナノ粒子から成る超素粒子を含む。本明細書中、コーティングは、それぞれのナノ粒子の少なくとも一部、好ましくは全表面を覆う安定化剤である。好ましくは、この場合もまた、各ナノ粒子は、金属、金属塩、金属炭化物、金属窒化物、金属硫化物、金属リン化物、金属酸化物、金属キレート、およびそのうちの2つ以上の混合物から成る群から選択される化合物を含む。超素粒子に存在するそれぞれのナノ粒子は、上記の群の2つ以上の混合物、すなわち、金属、金属塩、金属炭化物、金属窒化物、金属硫化物、金属リン化物、金属酸化物、金属キレート、およびそのうちの2つ以上の混合物のうちの2つ以上を含み得ることは理解されている。さらに、2つ以上の異なった金属、2つ以上の異なった金属塩、2つ以上の異なった金属酸化物、2つ以上の異なった金属炭化物、2つ以上の異なった金属窒化物、2つ以上の異なった金属硫化物、2つ以上の異なった金属キレートまたは2つ以上の異なった金属リン化物の混合物が想定できる。より好ましくは、超素粒子の各ナノ粒子は、金属酸化物または金属炭化物を含む。好ましい実施形態において、金属は遷移金属である。本開示による好ましい遷移金属としては、これだけに限定されるものではないが、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、亜鉛、カドミウム、ニッケル、ガドリニウム、銅、およびモリブデンが挙げられる。最も好ましくは、金属は鉄である。特定の実施形態によると、超素粒子に含まれる各ナノ粒子は、金属酸化物ナノ粒子であり、最も好ましくは酸化鉄ナノ粒子、特にFe3O4ナノ粒子である。
【００３７】
よって、本開示はまた、上記の磁性粒子、ならびに先に記載した方法によって得られたまたは入手可能な磁性粒子に関し、ここで、磁性コアは、凝集ナノ粒子から成る超素粒子を含むか、または好ましくはそれらから成り、ここで、そのナノ粒子は少なくとも1つの安定化剤で好ましくはコートされている。好ましくは、磁性コアは、80〜500nm、より具体的には約150〜450nm、より具体的には約200〜400nm、より一層具体的には約250〜400nmの範囲の直径を有する。特定の実施形態において、磁性ビーズは、200〜400nmの粒子サイズを有する。いくつかの実施形態において、磁性コアの直径は、約50〜450nm、より具体的には約100〜400nm、より具体的には約150〜350nm、より具体的には約200〜350nmである。特定の実施形態において、磁性コアは、約250〜320nm、より具体的には約260〜300nm、より具体的には約270〜290nmである。
【００３８】
好ましくは、安定化剤は、ジカルボン酸、トリカルボン酸、ポリアクリル酸、アミノ酸、界面活性剤および脂肪酸から成る群のうちの少なくとも1つのメンバーから選択される。これにより、前述の群には、言及された化合物の塩および誘導体、例えば、エステルや重合体などが含まれると理解されている。よって、安定化剤は、好ましくは、ジカルボン酸、ジカルボン酸塩、ジカルボン酸誘導体、トリカルボン酸、トリカルボン酸塩、トリカルボン酸誘導体、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸誘導体、アミノ酸、アミノ酸塩、アミノ酸誘導体、界面活性剤、界面活性剤の塩、脂肪酸、脂肪酸塩および脂肪酸誘導体から成る群のうちの少なくとも1つのメンバーから選択される。
【００３９】
本明細書中に使用される「コート」または「コーティング」という用語は、磁性ナノ粒子と安定化剤との吸着、ファンデルワールスおよび／または無極性基相互作用（例えば、化学吸着または物理吸着）、または共有結合のプロセスを指すのに使用される。
【００４０】
図1Aに示されている特定の実施形態において、鉄（III）の塩がソルボサーマル条件下でFe3O4に低減されて、磁性ナノ粒子を形成する。還元剤は、アルコール、好ましくはポリアルコール、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールなどの群から選択され得る。そのうえ、安定化剤は反応混合物中に存在する。図1Bに示されているとおり、安定化剤、例えば、クエン酸ナトリウムなどは、磁性ナノ粒子周囲の表面に配位結合して、制御されたサイズでのナノ粒子の凝集体、いわゆる、超素粒子のその場での形成をもたらす。
【００４１】
第二のステップでは、超素粒子は、シリカ、ケイ酸塩、シラン、およびそのうちの2つ以上の混合物から成る群から選択されるコーティングでコートされる。当該技術分野で知られている方法は、Stober法によるオルトケイ酸テトラエチル（TEOS）の使用である（Stober et al., J. Colloid Interface Sci., 1968, 26, 62）。図3Aに示されているとおり、超素粒子は、TEOSが加えられる前にエタノールおよびH2Oと混合される。その混合物を15〜35℃の温度にて8〜24時間撹拌すると、TEOSで覆われた磁性ビーズがもたらされる。
【００４２】
さらに、コーティングは、シリカ（例えば、オルトケイ酸テトラエチル、3−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、アリルトリメトキシシラン、アリルトリエトキシシラン、トリエトキシビニルシラン、3−（トリメトキシシリル）プロピルアクリラート、トリメトキシ（7−オクテン−1−イル）シラン、トリメトキシメチルシラン、トリエトキシメチルシラン、エチルトリメトキシシラン、トリエトキシ（エチル）シラン、トリメトキシフェニルシラン、トリメトキシ（2−フェニルエチル）シラントリメトキシ（プロピル）シラン、n−プロピルトリエトキシシラン、イソブチル（トリメトキシ）シラン、イソブチルトリエトキシシラン）の群またはケイ酸塩（例えば、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸リチウム、およびケイ酸マグネシウム）の群から選択され得る。図3Bに示されているとおり、超粒子は、HClを加える前に、超粒子をH2Oおよび液体ガラスナトリウム（例えば、液体ガラス）と混合することによって液体ガラス（「LG」）コーティングに供され得る。混合物を15〜35℃の温度にて2〜12時間撹拌すると、液体ガラスコーティングを有する磁性ビーズがもたらされる。コーティングの効果によって、液体ガラスコーティングステップは、少なくとももう一回繰り返されてもよい。溶液にHClをゆっくり滴下および適用することによって、厳密にコーティング厚を調整することが可能である。よって、非常に薄いコーティングは、HClを溶液に追加する際に、明確に制御された条件を使用することによって得られてもよい。以下の実施例の項で示されているとおり、厚過ぎるコーティングは、例えば、cobas（登録商標）Liat（登録商標）アッセイにおいて欠陥のある結果につながる。
【００４３】
アッセイシステムとサンプル処理デバイス
本明細書中に記載のMGPは、あらゆる手動の増幅アッセイ法または自動化された核酸増幅システム、あるいはサンプル調製システムに使用できる。一実施形態において、MGPは、これだけに限定されるものではないが、cobas（登録商標）6800／8800 System、cobas（登録商標）4800 System、cobas（登録商標）AmpliPrep Instrument、cobas（登録商標）Liat（登録商標）System、cobas（登録商標）p630 Instrument、cobas（登録商標）s201 System、cobas（登録商標）TaqMan（登録商標）48 Analyzer、cobas（登録商標）TaqMan（登録商標）Analyzer、LightCycler（登録商標）1536 System、LightCycler（登録商標）2.0 System、LightCycler（登録商標）480 System、LightCycler（登録商標）96 System、MagNA Pure 96 System、MagNA Pure Compact System、MagNA Pure LC 2.0 System、またはFLOW Solution（例えば、www.molecular.roche.com/systemを参照のこと）を含めた、あらゆる好適な市販のPCR装置および／またはサンプル調製システムに使用できる。
【００４４】
具体的な実施形態において、本明細書中に記載したMGPは、核酸増幅技術を実施するサンプル処理デバイスで使用される。生体サンプルから抽出された核酸は、本明細書中で先に記載した方法のうちのいずれかを使用する核酸の増幅によって、さらに処理されてもよい。具体的な実施形態において、生物から抽出された核酸は、RNAであり、それらの処理は、TthポリメラーゼとTaqポリメラーゼまたは逆転写酵素とTaqポリメラーゼなどの酵素の組み合わせを用いる結合型逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）を含む。いくつかの実施形態において、ニックの入った環状核酸プローブは、T4DNAリガーゼまたはAmpligase（商標）を用いて環状化でき、核酸を誘導でき、続いて体外での選択工程後に閉環状プローブの生成を検出する。この検出は、当業者に周知の酵素を用いてPCR、TMA、RCA、LCR、NASBAまたはSDARを介して実施できる。例示的な実施形態において、核酸の増幅は、核酸増幅中の蛍光の増大を検出する蛍光標識核酸プローブまたはDNA挿入色素、ならびに分子分析器内の光度計または電荷結合デバイスを使用してリアルタイムに検出することができる。これらの蛍光標識されたプローブは、当業者に周知の検出方式（すなわち、TaqMan（商標）、molecular beacons（商標）、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）プローブ、scorpion（商標）プローブ）を使用し、蛍光の消光ならびに消光時の放出、または一方のレポーターから他方のレポーターへの蛍光エネルギー移動を通常は使用して、特定の核酸の合成または存在を検出する。
【００４５】
一実施形態において、本明細書で開示されるMGPは、ミクロ寸法からマクロ寸法のチャンネル、チャンバー、貯蔵部、検出領域および処理領域を含むデバイスで使用される。このデバイスは、例えば、米国特許第6,440,725号、6,783,934号、6,818,185号、6,979,424号、8,580,559号、および8,940,526号（その開示を全体として参照により本明細書中に援用する）に記載されるカートリッジ、デバイス、容器、またはパウチであってもよく、ならびにCepheid Corp.、Idaho Technology, Inc.、および／またはBiofire Diagnostics, Incから入手できるようなデバイスであってもよい。
【００４６】
例えば、デバイスは、米国出願公開特許第20100056383号（その開示を全体として参照により本明細書中に援用する）の図1に示されるように、細胞溶解領域、核酸調製領域、第1段階増幅領域、第2段階増幅領域を含む内蔵型核酸分析パウチ内であり得る。このパウチは、様々なサイズの種々の経路およびブリスターを含み、かつサンプルがシステムおよび種々の領域を通って流れ、それに応じて処理されるようには配置されている。サンプル処理は、パウチ内に配置された種々のブリスターで実施される。処理領域内および処理領域間でサンプルを移動させるように多数の経路が設けられ、流体および試薬をサンプルに送達し、あるいはサンプルからその流体および試薬を除去するようにその他の経路が設けられる。パウチ内の液体は、圧力、例えば空気圧によってブリスター間を移動する。この特定の実施形態において、本明細書中に記載したMGPは、MGPを収納するように構成された区画内に、かつ、そのMGPがサンプル処理ワークフローに組み入れられ、適切に処理されるように、一方のもしくは他方のチャンネルまたはブリスターとの流体連結の状態で提供される。
【００４７】
別の例において、デバイスは、米国特許第9,322,052号（その開示を参照により本明細書中に援用する）の図3〜5および図9に示されるような内蔵型核酸分析カートリッジで実行できる。このカートリッジは、特に、入口ポートを通して導入された流体サンプルを保持するサンプルチャンバー、洗浄液を保持する洗浄チャンバー、溶解試薬を保持する試薬チャンバー、溶解チャンバー、使用済みのサンプルと洗浄液を受け入れる廃物チャンバー、中和剤を保持する中和剤チャンバー、および主要混合物（例えば、増幅試薬および蛍光プローブ）を保持し、その試薬とプローブを液体サンプルから分離された検体と混合する主要混合物チャンバー、反応容器、および検出チャンバーを含む。この実施形態において、本明細書中に記載したMGPは、MGPを収納するように構成された区画内に、かつ、そのMGPがサンプル処理ワークフローに組み入れられ、適切に処理されるように、一方のもしくは他方のチャンネルまたはブリスターとの流体連結の状態で提供される。
【００４８】
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、米国特許第7,718,421号（その開示を全体として参照により本明細書中に援用する）に記載されるようなサンプル処理デバイスで実施される。米国特許第7,718,421号に記載されるような区画化デバイスは、生体サンプルを受取り、保存し、処理し、および／または分析するのに好都合な容器を提供する。特定の実施形態において、区画化措置は、複数の処理工程を含むサンプル処理手順を容易にする。特定の実施形態において、サンプルデバイス内にサンプルを収集し、次いでそのデバイスをデバイスおよびその内容物を操作する分析器内に配置してサンプルを処理する。
【００４９】
特定の実施形態は、破断可能なシールによって区画に分割された可撓性デバイスを含む。個々の区画は、サンプルを処理する様々な試薬および緩衝剤を含んでもよい。締め具およびアクチュエータは、様々な組み合わせで、かつ様々なタイミングで適用されて、流体の移動を導き破断可能なシールを破裂させることができる。この破断可能なシールの破裂では、流体流れに対する障害物を実質的に含まない内部デバイス表面を残していてもよい。一実施形態において、生体サンプルの流れは、処理が進行するにつれてデバイスの遠位端に向かって導かれ、一方で廃物の流れは、サンプルが最初に注入されたデバイスの開口部に向かって反対方向に移動することができる。このサンプル注入口は、係止機構を備えたキャップによって、場合によっては恒久的に密封されてもよく、廃物チャンバーはキャップ内に配置されて、保管するように廃物を受け入れてもよい。この手段の顕著な利点は、処理サンプルが未処理サンプルに接した表面と接触しないことにある。その結果、未処理サンプル中にあり、かつデバイスの壁を覆う可能性がある微量の反応阻害物質が、処理サンプルを汚染しにくいことになる。
【００５０】
サンプル処理デバイスは、図5に示され、16、110、120、130、140、150、160、170、180および／または190などの複数の区画を形成でき、圧縮によって実質的に平坦にできる透明な可撓性デバイス10を含んでもよい。一実施形態において、デバイスには少なくとも2つの区画があってもよい。一実施形態において、デバイスには少なくとも3つの区画があってもよい。この可撓性デバイスは、約2〜105℃での動作機能性、サンプル、標的および試薬との適合性、低いガス透過性、最小限の蛍光特性、および／または反復の圧縮および屈曲サイクル中の弾力性を提供できる。このデバイスは、様々な材料で作製でき、その材料の例として、限定はされないが、ポリプロピレンまたはポリエチレンなどのポリオレフィン、ポリウレタン、ポリオレフィンコポリマーおよび／または適切な特性を提供する他の材料が挙げられる。
【００５１】
例示的な実施形態において、1つ以上の試薬は、デバイス区画内で、乾燥物質としておよび／または溶液として保存することができる。試薬が乾燥形状で保存される場合の実施形態において、溶液を隣接する区画に保存して、試薬溶液の再構成を容易に行える。典型的な試薬の例として、溶解試薬、溶出緩衝液、洗浄緩衝液、DNA分解酵素阻害剤、RNA分解酵素阻害剤、タンパク質分解酵素阻害剤、キレート剤、中和試薬、カオトロピック塩溶液、洗浄剤、界面活性剤、抗凝固剤、発芽溶液、イソプロパノール、エタノール溶液、抗体、核酸プローブ、ペプチド核酸プローブ、およびホスホロチオ酸核酸プローブが挙げられる。試薬のうちの1つがカオトロピック塩溶液である実施形態において、好ましい成分は、イソシアン酸グアニジニウムまたは塩酸グアニジニウムまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、サンプルが注入される開口部に関連して試薬をデバイス内に保存する順序は、チューブを活用する方法において試薬の使用可能な順序に反映される。好ましい実施形態において、試薬は、サンプル中の所定の成分に特異的に結合可能な物質を含む。例えば、その物質は核酸に特異的に結合してもよく、または核酸プローブは特定の塩基配列を備える核酸に特異的に結合してもよい。
【００５２】
デバイスセグメントからのシグナルのリアルタイム検出は、ブロックに接続された光度計、分光計、CCDなどのセンサを使用して達成できる。例示的な実施形態において、デバイスセグメントのアクチュエータによって圧力を加えて、デバイスセグメントの形状を適切に規定することができる。シグナルの方式は、蛍光、スペクトルのような特定の波長の光の強度、および／または細胞の画像などの画像、または量子ドットのような人工要素であってもよい。蛍光の検出のために、光学システムからの光の励起を用いて反応系を照射することができ、その発光は光度計によって検出することができる。特定の波長を持つ複数のシグナルを検出するように、専用の検出チャネルまたはスペクトロメーターによって異なる波長シグナルを直列または並列で検出できる。
【００５３】
キット
いくつかの実施形態において、MGP、ならびに本明細書中に記載したその組成物および懸濁液が、キットまたはその構成要素に含まれる。本明細書中に企図されたキットは、本明細書中に記載した標的核酸配列を特異的に増幅、捕捉、タグ付与／変換または検出するための少なくとも1つのデバイスを含めた、任意の製品（例えば、パッケージまたはコンテナ）を含むことができ、ここで、本明細書中に記載した組成物は、そのデバイス内に含まれるか、または別個のキット構成要素、バイアルまたはコンテナとして提供される。キットは、本明細書中に記載した増幅法またはそのステップに使用される、使用説明書、補助的試薬、対照物質、および／または構成要素もしくはモジュールをさらに含み得る。キットはまた、以下の構成要素：ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要なバッファー、のうちの少なくとも1つも含み得る。1もしくは複数のキット構成要素が、例えば、別個のバイアルまたはコンテナ内の、別個の構成要素としてキットに含まれても、または1もしくは複数のキット構成要素が、同じバイアルまたはコンテナ内のキットに含まれてもよい。
【００５４】
斯かるキットは、サンプル調製手順中に使用される構成要素、例えば、96または384ウェル形式のマイクロタイタープレートまたは、例えばEppendorf, Hamburg, Germanyによって製造された普通反応チューブ、および本明細書中に記載した対照物質を使用した核酸増幅を実施するための他のすべての試薬を含んでもよい。キットは、本明細書中に記載したMGPを含み得る。キットは、さらにまたは加えて、プロテアーゼ試薬と、例えば、細胞溶解を可能にするカオトロピック試薬、洗浄剤、アルコールまたはその混合物を含む溶解バッファーとを含む。キットのこれらの構成要素は、チューブまたは貯蔵コンテナ内に別個に提供されてもよい。構成要素の性質によって、これらは単一のチューブまたは貯蔵コンテナ内に提供されてもよい。キットはさらにまたは加えて、核酸がそれに結合したとき磁性ガラス粒子の洗浄ステップに好適な洗浄液を含んでもよい。この洗浄液は、緩衝液中にエタノールおよび／またはカオトロピック試薬を含有しても、または先に記載したように、エタノールおよび／またはカオトロピック試薬なしに酸性pHを有する溶液であってもよい。多くの場合、洗浄液または他の溶液は、使用前に希釈されるべき原液として提供される。
【００５５】
キットは、溶出液または溶出バッファー、すなわち、磁性ガラス粒子に結合した核酸を溶出するための溶液もしくはバッファー（例えば、10mMのTris、1mMのEDTA、pH8.0）または純水をさらに含んでもよい。さらに、核酸の精製に使用できる、追加試薬または緩衝液が提示されてもよい。
【００５６】
具体的な実施形態において、キットは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を含む。キットはまた、逆転写酵素活性を有する酵素も含む。別の実施形態において、キットは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性および逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ酵素を含む。
【００５７】
磁性粒子の方法と使用
本明細書中に記載したMGP（およびその組成物と懸濁液）は、細菌病原体（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、c．ディフィシル（c. difficile,）、ツベルクロシス（tuberculosis）、グループB連鎖球菌、敗血症、クラミジア、および淋病）、ウイルス病原体（例えば、インフルエンザ、HIV、HCV、およびHBV）、腫瘍細胞（例えば、膀胱癌、肺癌、乳癌、結腸癌、および白血病）、染色体変化、例えば、遺伝子重複、遺伝子欠損または遺伝子転座など、特定の細胞表面マーカーを発現する細胞、例えば、CD4＋細胞など、遺伝子の突然変異／改変、例えば、一塩基多型（SNP）や遺伝子のメチル化状況など、に関連する核酸を含めた、任意の標的核酸の解析に使用できる。
【００５８】
一実施形態において、MGPは、核酸の捕捉、濃縮、分析、および／または精製を含むアッセイに使用できる。例えば、本明細書中に記載したMGPは、標的核酸を捕捉するのに使用できる。捕捉することは、標的核酸を濃縮する、およびサンプルから反応阻害因子を取り除く助けとなる。MGPは、定義された化学的および温度条件下、捕捉、濃縮、および／または精製に使用でき、かつ、異なった化学的および温度条件下で構成要素を放出し得る。
【００５９】
具体的な実施形態において、MGPは、核酸増幅法によってサンプル中の核酸を分析するために使用される。核酸増幅方法としては、これだけに限定されるものではないが、リガーゼ連鎖反応（LCR; Wu D. Y. and Wallace R. B., Genomics 4 (1989) 560-69; and Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991)189-193）；ポリメラーゼ・リガーゼ連鎖反応（Barany F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16）；ギャップ−LCR（WO 90/01069）；修復連鎖反応（EP 0439182 A2）、3SR（Kwoh D.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; WO 92/08808）、およびNASBA（US 5,130,238）が挙げられる。さらに、本明細書中に記載したMGPはまた、以下の方法：鎖置換増幅（SDA）、転写媒介増幅（TMA）、およびQb増幅（総説に関して、例えばWhelen A. C. and Persing D. H., Annu. Rev. Microbiol. 50(1996) 349-373; Abramson R. D. and Myers T. W., Curr Opin Biotechnol 4 (1993) 41-47を参照のこと）で使用できる。
【００６０】
核酸増幅の1つの方法はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）であり、その方法は米国特許第4,683,202号、第4,683,195号、第4,800,159号、および第4,965,188号に開示されている。一般的に、PCRは選択した核酸鋳型（例えばDNAまたはRNA）に結合する2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。核酸分析に有用なプライマーは、標的核酸の核酸配列内の核酸合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは制限酵素分解物から通常の方法で精製、または合成的に製造できる。プライマーは増幅効率を最大化するために一本鎖であることが好ましいが、プライマーは二本鎖でもよい。二本鎖プライマーは最初に変性させる、つまり鎖を分離処理する。二本鎖核酸を変性する1つの方法は加熱である。「熱安定性ポリメラーゼ」は熱的に安定であるポリメラーゼ酵素であり、つまり、それは鋳型に相補的なプライマー伸長物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸を変性させるのに必要な時間高温にさらされる際不可逆的に変性しない酵素である。一般に、合成は各プライマーの3’末端で開始し、鋳型鎖に沿って5’から3’方向に進む。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、サーマス・フラブス（Thermus flavus）、T.ルーバー（T. ruber）、T.サーモフィラス（T. thermophilus）、T.アクアティクス（T. aquaticus）、T.ラクテウス（T. lacteus）、T.ルーベンス（T. rubens）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、またはメタノサーマス・フェルビドゥス（Methanothermus fervidus）から単離される。とはいえ、酵素を補充する条件であれば熱的に安定ではないポリメラーゼもPCR分析に使用できる。
【００６１】
鋳型核酸が二本鎖の場合、それをPCRで鋳型として使用する前に二本の鎖の分離が必要である。鎖の分離は、物理的、化学的または酵素的手段を含む任意の適切な変性方法で達成できる。核酸の鎖を分離する1つの方法は、核酸がほぼ変性するまで（例えば、50％、60％、70％、80％、90％または95％を超える変性）核酸を加熱することを含む。鋳型核酸の変性に必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩の濃度、変性させる核酸長およびヌクレオチド組成に依存すると考えられるが、一般的には約90℃〜約105℃の範囲で、温度および核酸長などの反応の特徴に応じた時間で実施する。一般的に、変性は約5秒から9分間実施される。各ポリメラーゼをそのような高温に長時間さらして機能的な酵素を失う危険性を除くため、変性工程は短いことが好ましい。特定の実施形態では、変性工程は最大30秒、例えば最大20秒、最大10秒、最大5秒、または、特に約5秒である。
【００６２】
二本鎖鋳型核酸が熱で変性されると、反応混合物を標的核酸の標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却することができる。アニーリング温度は好ましくは約35℃〜約70℃、さらに好ましくは約45℃〜約65℃、さらに好ましくは約50℃〜約60℃、さらに好ましくは約55℃〜約58℃である。アニーリングの時間は、約10秒〜約1分（例えば、約20秒〜約50秒、約30秒〜約40秒）でよい。これに関連し、それぞれの分析の包括性を高めるために異なるアニーリング温度の使用が有利となる場合がある。つまり、これは比較的低いアニーリング温度でプライマーが一塩基だけ適合しない配列を有する標的にも結合する可能性があることを意味し、従ってある配列の変異体も増幅することができる。これは、例えば特定の有機体が検出すべき既知または未知の遺伝的変異を持つ場合などに望ましい。一方、比較的高いアニーリング温度は、より特異性が高くなるという利点がある。何故なら、より高い温度では、正確に一致しない標的配列に対してプライマーが結合する確率が連続的に減少するからである。両者の現象から利益を得るため、本開示の実施形態によっては、上述の工程は異なる温度でアニールすることを含み、好ましくは最初に低い温度、次に高い温度でアニールすることを含むことが好ましい。例えば、最初の培養が55℃にて約5サイクル実施される場合、正確に一致しない標的配列を（予備的に）増幅できる。次いで、実験の大部分で高い特異性を提供するような、例えば58℃にて約45サイクル実施することができる。このように、特異性は比較的高いままで、潜在的に重要な遺伝的変異体は見逃されない。
【００６３】
次いで、ポリメラーゼ活性を促進または最適化する温度に反応混合物を調整する、つまり、アニールしたプライマーから伸長反応が起こり、分析する核酸に相補的な生成物が生成するのに十分な温度に調整する。前記温度は、核酸鋳型にアニールした各プライマーから伸長産物を合成するのに十分な温度にすべきだが、伸長産物が相補的鋳型から変性するほど高くすべきでない（例えば、伸長反応の温度は一般に約40℃〜80℃の範囲である（例えば、約50℃〜約70℃、約60℃））。伸長反応の時間は、約10秒〜約5分、好ましくは約15秒〜2分、さらに好ましくは約20秒〜約1分、さらに好ましくは約25秒〜約35秒でよい。新たに合成した鎖は、反応の次の工程で使用できる二本鎖分子を形成する。鎖の分離、アニーリング、および伸長反応の工程は、標的核酸に対応する増幅産物を必要量合成するまで、必要に応じて何度も繰り返すことができる。反応における制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシド三リン酸エステルの量である。繰り返し工程（すなわち、変性、アニーリング、および伸長反応）は、好ましくは少なくとも1回繰り返される。検出に利用する場合、繰り返し工程の数は例えば試料の性質に依存すると考えられる。試料が核酸の複雑な混合物である場合、検出に十分な標的配列を増幅するためにはさらに繰り返し工程が必要になると考えられる。一般に、繰り返し工程は少なくとも約20回繰り返されるが、40、60、さらには100回繰り返してもよい。
【実施例】
【００６４】
磁性コアの合成
磁性コアを、文書［3］すなわちLiuら（Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 5875-5879）に記載のソルボサーマル条件下、塩化鉄（III）を酸化鉄（II、III）（Fe3O4）に還元することによって合成した。簡単に言えば、磁性コア（「MCビーズ」）を、800mLのエチレングリコールをアルゴンで1時間脱気することによって作製した。FeCl3（44g）を加え、溶解し、そして、その溶液を圧力反応器に移した。クエン酸ナトリウム（9.7g）および酢酸ナトリウム（51.9g）を加え、混合物を160℃まで1時間加熱し、次に、温度を200℃まで上げて18時間維持した。混合物を、エタノールおよび水（3×エタノール、3×水）を使用した磁気洗浄に供した。入手したMCビーズは超常磁性体であった。反応スキームを図1Aおよび1Bに示す。本明細書中、酢酸ナトリウムを陽子受容体として使用したが、それに対して、図1Bに示すように、輪郭が明確なナノ粒子凝集体の形成を促進するために、クエン酸ナトリウムを加えた。考えられる還元機構を図2に示す。
【００６５】
磁性コアのコーティング
一部のMCビーズを、以下のとおり、Stober方法（Stober et al., J. Colloid Interface Sci., 1968, 26, 62）に従ってオルトケイ酸テトラエチル（TEOS）でコートした：上記の方法によって製造した0.4gのMCビーズを、1280mLのエタノール、312mLのH2O、および16mLのNH4OHと混合した。混合物を、30分間活性化したフロースルーUSセルに加えた。TEOS（2mL）を加え、そして、混合物を25℃にて16時間撹拌した。混合物を、エタノールと水（3×エタノール、3×水）を使用した磁気洗浄に供した。
【００６６】
別の一部のMCビーズを、フロースルーUSセルを備えた250mLのガラス反応器内で、0.5gのビーズを160mLのH2Oおよび40mLの液体ガラスナトリウムと混合（および10分間の予混合）することによって液体ガラス（「LG」）コーティングに供した。HCl（1M、66mL）を加え、そして、混合物を継続的に撹拌しながら、2時間フロースルーUSセルに供した。次に、混合物を磁気洗浄に供し（3×水）、そして、上記の液体ガラスコーティングステップを少なくとももう一回繰り返した。例示的なビーズはMC13−LG〜MC17−LGである。
【００６７】
別の一部のMCビーズを、フロースルーUSセルを備えたガラス反応器内で、MCビーズ（2〜15g／L）を、最大250mLの全容積以内の様々な量の液体ガラスナトリウム（38〜100mL）と混合（および10分間の予混合）することによって液体ガラス（「LG」）コーティングに供した。HCl（1〜3M、45〜110mL）を滴下して加え、そして、混合物を継続的に撹拌しながら、4〜6時間フロースルーUSセルに供した。次に、混合物を磁気洗浄に供した（3×水）。例示的なビーズは、MC47−LGおよびMC48−LGである。
【００６８】
結果
未コートMCビーズは約270nmの直径を有し、TEOSコート粒子は約400nmの直径を有し、および液体ガラスコート粒子は約280nmの直径を有し、それぞれ46.7（TEOS）および54（LG）A＊m2／kgで磁化させた。
【００６９】
文書［3］、すなわち、Liuら、で説明されている方法に従って合成したビーズと比較した未コートMCビーズを使用した実験の概要を表1に示す。
【００７０】
【表１】
2021501107.tif 000003
【００７１】
高濃縮反応の収量は直線的に増加した。さらに、飽和磁化（「Magn.」）の増大を観察した。残留磁気（「Rem.」）もまた同様に増大した。SEM分析は、図4A〜Cに図示しとおり、ナノMGPの形態に対する試薬濃度の影響を示した。
【００７２】
先に概説したとおり、コーティング方法は、EP2916327B1から構成した。反応時間を2日間から4時間に短縮し、およびバイパスプローブを使用することによって、超音波処理手順を最適化し、そしてそれが、コーティング手順の簡単なスケールアップを可能にし、そして、10グラムを首尾よくコーティングすることによって示されたが、それに対して、EP2916327B1では、500mgのバッチが使用されている。比較のために、磁性コアを同様にStober法によってコートし、そこでは、TEOSを試薬として使用した。表2は異なる合成条件を示す。
【００７３】
【表２】
2021501107.tif 000004
【００７４】
第三のステップでは、MGPの機能性をcobas（登録商標）Liat（登録商標）により実証した。cobas（登録商標）Liat（登録商標）Systemは、cobas（登録商標）Liat（登録商標）Analyzerによる標的DNA／RNA配列のサンプル調製、PCR増幅およびリアルタイム検出を完全に自動化する診療現場用のシステムである。所要時間（TAT）は非常に短時間であり、10〜20分間の範囲である。ナノMGPの核酸結合、濃縮および精製に関する合計時間は5分以下くらい短い。これらの試験では、25mg／mLの濃度にて10μLのそれぞれのナノMGPをcobas（登録商標）Liat（登録商標）チューブ内に充填した。クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）（C.diff）、A型インフルエンザ（Influenza typeA）（FluA）、B型インフルエンザ（Influenza typeB）（FluB）、およびヒト呼吸器合胞体ウイルス（human Respiratory Syncytial Virus）（RSV）を標的核酸として使用した。低サイクル閾値（Ct）および高増幅（Amp）値が好まれる。MC−LGビーズは、細菌またはウイルス生物体からのDNAまたはRNA標的の検出に関して一貫した性能を示したが、MC−TEOSは遅いCt値および低Amp値を示した。MGPの機能性能に関する結果を表3にまとめる。
【００７５】
【表３】
2021501107.tif 000005
【００７６】
コート粒子の物理特性
MC47およびMC48ビーズを、フロースルーUSセルを備えたガラス反応器内で、MCビーズ（2〜15g／L）を、最大250mLの全容積以内の様々な量の液体ガラスナトリウム（38〜100mL）と混合（および10分間の予混合）することによって液体ガラス（「LG」）コーティングに供した。所望のコーティング厚によって、HCl（1〜3M、45〜110mL）を滴下して加え、そして、混合物を、継続的に撹拌しながら、4〜6時間フロースルーUSセルに供した。次に、混合物を磁気洗浄に供した（3×水）。
【００７７】
【表４】
2021501107.tif 000006
【００７８】
図6および表4は、粒子のコーティング厚（すなわち、シリカ含有量）に対する粒子の等電点の依存関係を示す。本明細書中、シリカコートが増大すると共に、等電点の値が低下することが明確に示された。
【００７９】
それに続いて、cobas（登録商標）Liat（登録商標）アッセイにおける粒子性能に対する粒子の等電点の影響を分析した。本明細書中、先に記載したシリカコートMC47およびMC48ビーズを、標準的な条件下、cobas（登録商標）Liat（登録商標）FluA／B RSV試験の試薬を使用したPCR増幅／検出反応に供した。等電点の依存関係におけるFluA（図7A）、FluB（図7B）およびRSV（図7C）に対するMC48ビーズについて計測したサイクル閾値（CT）の結果を図7に提供する。図8では、それらの等電点に対するMC47サンプルの計測したFluA、FluB、RSVおよび内部陽性対照（IPC）CT値の依存関係を解説する。MC47およびMC48コートビーズを使用して生じたCT値の概要および等電点値に対するそれらの相関関係を表5に提供する。
【００８０】
【表５】
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【００８１】
これらのデータから、cobas（登録商標）Liat（登録商標）アッセイにおける粒子の性能が粒子の等電点に依存していると推論され得る。そのうえ、高過ぎる等電点値と同様に低過ぎる等電点値もまた、粒子の欠陥のある性能につながることが明らかになった。よって、粒子の等電点が粒子のコーティング厚と直接的に相関する場合、当該開示に従って、粒子／ケイ酸塩懸濁液へのHClの添加によって実施される、粒子のコーティング厚を制御することは非常に重要である。PCR分析において厚過ぎるコーティングが粒子の欠陥のある性能につながるという更なる徴候が図9に提供され、コーティング厚と高いCT値との直接的な相関関数を示している。有益なコーティングの構造は、図10に示されたSEM顕微鏡写真を検討することによって直接見られる。未コートMC14ビーズ（図10A）、当該開示による方法を使用してコートしたMC14（図10B）および上記のTEOS法でコートしたMC14ビーズ（図10C）を比較して、ケイ酸ナトリウムを用いた液体ガラスコーティングのコーティング厚が非常に薄い一方で、TEOSを用いたコーティングが実質的により厚いコーティングを備えることが明らかになる。本明細書中、先に記載したTEOSコートビーズの遅延したCT値もまた、厚いコーティングがPCR分析における欠陥のある性能につながることを示すデータとも合致した。
【００８２】
要約すると、上記データは、当該開示によるコートビーズが従来技術の方法を使用して製造およびコートされた磁性ビーズを超える有利な特性を示すことを明確に示している。本明細書中、磁性コア粒子は、磁鉄鋼ナノ粒子の制御された凝集体によって構築される。これにより、粒子は、80〜500nmの範囲内の粒子サイズと相まって、非常に低い残留磁気を示す。制御された凝集体は、ソルボサーマル反応においてその場で安定化剤を加えることによってのみ形成される。そのうえ、粒子のガラスコートの厚さは、具体的には、コート粒子の厚過ぎるコーティングと同様に、高過ぎるおよび低過ぎる等電点値が回避されるように、制御されなければならない。
【００８３】
本願は、本明細書中に記載した特定の実施形態によって範囲を制限されることはない。実際には、本明細書中に記載したものに加えて、様々な修飾が上記の説明および添付図面から当業者には明らかになる。斯かる修飾は、請求項の範囲内にあることが意図される。様々な刊行物が本明細書中に引用され、その開示を全体として参照により援用する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【国際調査報告】
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