(57)【要約】  本発明は、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む製剤およびその使用に関し、特にプロタンパク質転換酵素枯草菌プロテアーゼ／ｋｅｘｉｎ型９（ＰＣＳＫ９）と特異的に結合する抗体および／または抗体断片、緩衝剤、粘度低下剤および界面活性剤を含む医薬製剤に関する。本発明はまた、抗ＰＣＳＫ９抗体に関する。また、本発明は、これらの製剤または抗体の治療・診断のための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体抗体製剤であって、
（ｉ）抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその抗原結合断片と、
（ｉｉ）緩衝剤と、
（ｉｉｉ）粘度低下剤と、
（ｉｖ）界面活性剤とを含む、前記液体抗体製剤。
【請求項２】
前記液体抗体製剤における抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片の濃度が約５０〜約２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の液体抗体製剤。
【請求項３】
前記液体抗体製剤における前記緩衝剤の濃度が約０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．１〜５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項４】
前記緩衝剤がヒスチジン、グルタミン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから選択され、好ましくはヒスチジン緩衝液である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項５】
前記粘度低下剤の濃度が約１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば約２０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項６】
前記粘度低下剤がソルビトール等の糖アルコール、アルギニン、アルギニン塩酸塩、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、酢酸ナトリウム、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項７】
前記粘度低下剤が、濃度が約１％〜６％（ｗ／ｖ）のソルビトールである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項８】
前記粘度低下剤がソルビトールとアルギニンまたはアルギニン塩との組み合わせであり、前記アルギニン塩が好ましくはアルギニン塩酸塩である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項９】
前記ソルビトールの濃度が約１％〜６％（ｗ／ｖ）、好ましくは約２％〜４％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約３％（ｗ／ｖ）であり、前記アルギニンまたはアルギニン塩の濃度が約５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは約７０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約９０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項８に記載の液体抗体製剤。
【請求項１０】
前記界面活性剤の濃度が約０．０１〜５ｍｇ／ｍｌ、例えば約０．０５〜１ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項１１】
前記界面活性剤がプルロニクス、ポリソルベート−８０、ポリソルベート−６０、ポリソルベート−４０またはポリソルベート−２０等の非イオン性界面活性剤である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項１２】
前記液体製剤のｐＨ値が約５．０〜６．０、例えば約５．２〜５．８である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項１３】
前記液体製剤の２５℃における粘度が約１．０〜２０センチポアズ、例えば約１．０〜１０センチポアズである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項１４】
前記液体製剤が医薬製剤であり、好ましくは注射剤であり、より好ましくは皮下注射剤である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項１５】
前記抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片が重鎖可変領域ＶＨおよび／または軽鎖可変領域ＶＬを含み、
（ａ）前記ＶＨが、
（ｉ）配列番号２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２または３３に示される重鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ、
（ｉｉ）表Ｉに示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の組み合わせ、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）の配列に対して、前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を含む配列、または
（ｉｖ）相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３であって、配列番号１、７、８、９、１０、１１、１２、１３および２０から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１、または配列番号１、７、８、９、１０、１１、１２、１３および２０から選択されるアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２、１４、１５、１６、１７および２１から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２、または配列番号２、１４、１５、１６、１７および２１から選択されるアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、ならびに配列番号３、１８、１９および２２から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３、または配列番号３、１８、１９および２２から選択されるアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含み、
および／または、
（ｂ）前記ＶＬが、
（ｉ）配列番号２４に示されるＶＬに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、
（ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６に示されるアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の組み合わせ、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）の配列に対して、前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を含む配列、または
（ｉｖ）相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３であって、配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＬＣＤＲ１、または配列番号４のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＬＣＤＲ２、または配列番号５のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、ならびに配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＬＣＤＲ３、または配列番号６のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、
を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項１６】
前記抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片が重鎖可変領域ＶＨおよび／または軽鎖可変領域ＶＬを含み、
（ａ）前記重鎖可変領域ＶＨが、
（ｉ）配列番号２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２および３３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
（ｉｉ）配列番号２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２および３３から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２および３３から選択されるアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記アミノ酸変異はＣＤＲ領域に生じず、
および／または、
（ｂ）前記軽鎖可変領域ＶＬが、
（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記アミノ酸変異はＣＤＲ領域に生じない、
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項１７】
前記抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片が重鎖および／または軽鎖を含み、
（ａ）前記重鎖が、
（ｉ）配列番号３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３および４４から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
（ｉｉ）配列番号３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３および４４から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３および４４から選択されるアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは２０個以下または１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記アミノ酸変異は重鎖のＣＤＲ領域に生じず、より好ましくは、前記アミノ酸変異は重鎖可変領域に生じず、
および／または、
（ｂ）前記軽鎖が、
（ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
（ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは２０個以下または１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記アミノ酸変異は軽鎖のＣＤＲ領域に生じず、より好ましくは、前記アミノ酸変異は軽鎖可変領域に生じない、
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項１８】
前記抗ＰＣＳＫ９抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれらの組み合わせであり、好ましくは前記抗ＰＣＳＫ９抗体はモノクローナル抗体であり、より好ましくは前記抗ＰＣＳＫ９抗体は、下記の特性、
（１）ＰＣＳＫ９（好ましくはヒトＰＣＳＫ９タンパク質）と結合し、好ましくは、平衡解離定数（ＫＤ）が約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下、約０．０１ｎＭ以下または約０．００１ｎＭ以下（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）であること、
（２）ＰＣＳＫ９（例えば、ヒトＰＣＳＫ９）とＬＤＬＲ（例えば、ヒトＬＤＬＲ）との結合を阻害すること、
（３）ＬＤＬＲの回復能力を増加させ、および／またはＰＣＳＫ９により誘導されるＬＤＬ−Ｃ取り込み減少を抑制し、それにより細胞（例えば、肝細胞）によるＬＤＬ−Ｃ取り込みを増加させることであって、好ましくは、前記抗体濃度は、約１０、１５、２０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎＭ以上、例えば約１０〜１００ｎＭ、１５〜７０ｎＭであり、好ましくは、前記抗体の細胞によるＬＤＬＣ取り込み増加能力が、対照抗体よりも少なくとも２倍高く、好ましくは、対照抗体はＩｇＧ、またはアリロクマブ（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）またはロデルシズマブ（Ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）等の本分野で既知の抗体であること、
（４）細胞のＬＤＬＲ内在化を効果的に阻止すること、
（５）血清中のＬＤＬ−Ｃレベルおよび／または総コレステロール（ＴＣ）レベルを（投与量依存的に）低下させること、
（６）血清中のＬＤＬ−Ｃレベルを長い期間、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日数超の持続期間に有意に低下させること、
（７）表Ｃに示されるいずれか１つの抗体とＰＣＳＫ９（例えばヒトＰＣＳＫ９、好ましくは配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する）に対して同じまたは類似の結合親和力および／または特異性を示すこと、
（８）表Ｃに示されるいずれか１つの抗体とＰＣＳＫ９（例えばヒトＰＣＳＫ９、好ましくは配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する）との結合を抑制（例えば、競合的に抑制）すること、
（９）表Ｃに示されるいずれか１つの抗体と同じまたは重複するエピトープと結合すること、
（１０）表Ｃに示されるいずれか１つの抗体とＰＣＳＫ９（例えばヒトＰＣＳＫ９、好ましくは配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する）と競合的結合すること、
（１１）表Ｃに示されるいずれか１つの抗体の１つ以上の生物学的特性を有すること、
の１つ以上を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の液体抗体製剤。
【請求項１９】
抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤における粘度低下剤としての糖アルコールの使用であって、好ましくは前記糖アルコールはソルビトールであり、好ましくは前記抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤は請求項１〜１８のいずれか一項に記載の液体製剤である、前記使用。
【請求項２０】
抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤の製造における粘度低下剤としての糖アルコールの使用であって、好ましくは前記糖アルコールはソルビトールであり、好ましくは前記抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤は請求項１〜１８のいずれか一項に記載の液体製剤である、前記使用。
【請求項２１】
抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤における粘度低下剤としての、糖アルコールとアルギニンまたはアルギニン塩好ましくはアルギニン塩酸塩との組み合わせの使用であって、好ましくは前記糖アルコールはソルビトールであり、好ましくは前記抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤は請求項１〜１８のいずれか一項に記載の液体製剤である、前記使用。
【請求項２２】
抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤の製造における粘度低下剤としての糖アルコールとアルギニンまたはアルギニン塩好ましくはアルギニン塩酸塩との組み合わせの使用であって、好ましくは前記糖アルコールはソルビトールであり、好ましくは前記抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤は請求項１〜１８のいずれか一項に記載の液体製剤である、前記使用。
【請求項２３】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の液体抗体製剤を凍結乾燥することによって得られる、固体製剤。
【請求項２４】
対象におけるコレステロールレベルを低下させるための薬物の製造における、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の液体抗体製剤の使用。
【請求項２５】
コレステロール関連疾患を治療するための薬物の製造における、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の液体抗体製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体製剤の分野に関し、特にプロタンパク質転換酵素枯草菌プロテアーゼ／ｋｅｘｉｎ型９（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  ｔｙｐｅ９）（ＰＣＳＫ９）と特異的に結合する抗体（以下、抗ＰＣＳＫ９抗体と呼ばれる）および／またはその抗体断片を含む医薬製剤に関する。また、本発明は、これらの製剤の治療・診断のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清コレステロールレベルの上昇は心血管イベントを招く重要な危険因子であり、現在、多種の作用機序を持つコレステロールを低下させる薬物が発売されたり、研究されたりしている。中でも抗ＰＣＳＫ−９モノクローナル抗体は、良好な安全性と治療効果を備えていることから、広く注目されている（趙水平ら、中国成人血中脂質異常予防治療ガイドライン（２０１６年改訂版）。中国循環雑誌３１（１０）：９３７−９５３，２０１６）。
【０００３】
モノクローナル抗体薬物は作用特異性が強く、副作用が小さいなどの利点によりすでに多くの疾患分野の薬物の発展主流になっており、ＬＤＬＲのエンドサイトーシスを減少させることでＬＤＬ−Ｃを低下させる抗ＰＣＳＫ−９モノクローナル抗体薬物は現在の研究の焦点である。抗ＰＣＳＫ−９モノクローナル抗体はＬＤＬ−Ｃを低下させる効果が顕著で、安全性が良好で、投与しやすく、脂質降下治療分野の重大な画期的薬物である。
【０００４】
現在も代替ＰＣＳＫ９抗体が求められている。具体的には、ＰＣＳＫ９との親和力が高く、細胞株由来が確実で、安定性に優れ、ＬＤＬ−Ｃを高効率で低下できる代替ＰＣＳＫ９抗体が求められている。さらに具体的には、ＬＤＬ−Ｃを高効率で低下させ、持続的な有効化期間（例えば、持続的なＬＤＬ−Ｃレベルの抑制）を提供する代替ＰＣＳＫ９抗体が求められている。かかる抗体はまた、好ましくは、開発、製造または製剤化を容易にする良好な物理化学的特性を有するであろう。
【０００５】
現在市販されている多くのモノクローナル抗体薬物は静脈注射であるが、一部の慢性疾患では患者が自宅で自ら投与できることが望ましいため、皮下注射が最も好ましい注射方式となっている。皮下注射の体積は一般に１．０〜１．５ｍｌに制限されるため、抗体製剤は高濃度（≧１００ｍｇ／ｍｌ）に達して臨床投与量の要求を満たす必要がある。しかし、高粘度は高濃度抗体製剤の大きな挑戦でもある。なぜならば、高粘度製剤は、下流のプロセスと注射器による薬物の皮下投与に大きな困難をもたらすからである。タンパク質は、高濃度では常に安定性が低く、凝集体および粒子を生じやすく、タンパク質コンフォメーションの不安定性はまた、電荷不均一性などの化学的安定性の著しい変化を引き起こす。
【０００６】
また、モノクローナル抗体は生体高分子であり、その構造は非常に複雑である。製造中、発現された抗体分子は、Ｎ末端環化、グリコシル化、脱アミド化、異性化、酸化、断片化、ジスルフィド結合ミスマッチなどの様々な翻訳後修飾および分解反応を受ける。これらの品質属性は最終製品の安全性や有効性に影響を及ぼす可能性があるため、製品の品質の正確性や一貫性を制御することも重要である。
【０００７】
本分野では低粘度、安定、高濃度の抗ＰＣＳＫ−９抗体液体製剤を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
ＰＣＳＫ９は、重要で有利な治療標的として提示される。本発明はまた、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片（例えば、本明細書で定義される抗ＰＣＳＫ９抗体）を含む液体抗体製剤を提供する。本発明はまた、ＰＣＳＫ９に対する抗体を提供する。
【０００９】
Ｉ．本発明の抗体製剤
１つの態様において、本発明は、
（ｉ）抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片（例えば、抗原結合断片）と、
（ｉｉ）緩衝剤と、
（ｉｉｉ）粘度低下剤と、
（ｉｖ）界面活性剤とを含む、液体抗体製剤を提供する。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片の濃度は、約５０〜約２００ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片の濃度は、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片の濃度は、約１００ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片の濃度は、約１２５ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片の濃度は、約１５０ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片の濃度は、約１７５ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片の濃度は、約２００ｍｇ／ｍＬである。
【００１１】
１つの実施形態において、前記抗ＰＣＳＫ９抗体は、ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、ヒトＰＣＳＫ９）と結合する任意の抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれらの組み合わせである。好ましくは、１つの実施形態において、前記抗ＰＣＳＫ９抗体は、モノクローナル抗体である。１つの実施形態において、前記抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片は、本明細書で定義される抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片である。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の緩衝剤の濃度は、約０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌである。１つの実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の緩衝剤の濃度は、約０．１〜５０ｍｇ／ｍｌである。１つの実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の緩衝剤の濃度は、約０．２〜１０ｍｇ／ｍｌである。１つの実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の緩衝剤の濃度は、約０．５〜２．５ｍｇ／ｍｌである。１つの実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の緩衝剤の濃度は、約１．０〜２．０ｍｇ／ｍｌである。１つの実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の緩衝剤の濃度は、約１．５ｍｇ／ｍｌである。
【００１３】
１つの実施形態において、前記緩衝剤は、ヒスチジン、グルタミン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから選択される。１つの実施形態において、前記緩衝剤は、ヒスチジン。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の粘度低下剤の濃度は、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。１つの実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の粘度低下剤の濃度は、約２０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｍｏｌ／Ｌである。１つの実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の粘度低下剤の濃度は、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌである。１つの実施形態において、本発明の液体抗体製剤中の粘度低下剤の濃度は、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１５】
１つの実施形態において、前記粘度低下剤は、糖アルコール（例えば、ソルビトール）、アルギニン、アルギニン塩酸塩、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、酢酸ナトリウム、およびこれらの組み合わせから選択される。１つの実施形態において、前記粘度低下剤は、ソルビトールである。１つの実施形態において、前記粘度低下剤は、約１％〜６％（ｗ／ｖ）の濃度のソルビトールである。１つの実施形態において、前記粘度低下剤は、約１％〜６％（ｗ／ｖ）の濃度のソルビトールであり、前記液体製剤は、他の粘度低下剤を含まない。１つの実施形態において、前記粘度低下剤は、ソルビトールとアルギニンまたはアルギニン塩（好ましくはアルギニン塩酸塩）との組み合わせである。１つの実施形態において、前記粘度低下剤は、ソルビトールとアルギニンまたはアルギニン塩（好ましくはアルギニン塩酸塩）との組み合わせであり、ここで、ソルビトールの濃度は約１％〜６％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは約２％〜４％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは約３％（ｗ／ｖ）であり、ここで、アルギニンまたはアルギニン塩（好ましくはアルギニン塩酸塩）の濃度は約５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは約７０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは約９０ｍｍｏｌ／Ｌである。１つの実施形態において、前記粘度低下剤は、ソルビトールとアルギニンまたはアルギニン塩（好ましくはアルギニン塩酸塩）との組み合わせであり、ここで、ソルビトールの濃度は約１％〜６％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは約２％〜４％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは約３％（ｗ／ｖ）であり、ここで、アルギニンまたはアルギニン塩の濃度は約５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは約７０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは約９０ｍｍｏｌ／Ｌであり、かつ前記液体製剤は、他の粘度低下剤を含まない。
【００１６】
１つの実施形態において、前記界面活性剤の濃度は、約０．０１〜５ｍｇ／ｍｌである。１つの実施形態において、前記界面活性剤の濃度は、約０．０５〜１ｍｇ／ｍｌである。１つの実施形態において、前記界面活性剤の濃度は、約０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌである。１つの実施形態において、前記界面活性剤の濃度は、約０．３ｍｇ／ｍｌである。
【００１７】
１つの実施形態において、前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。１つの実施形態において、前記界面活性剤は、例えばプルロニクス（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ポリソルベート−８０、ポリソルベート−６０、ポリソルベート−４０、またはポリソルベート−２０などである。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明の液体製剤は、好ましくは注射用水、注射用有機溶媒（注射用油、エタノール、プロピレングリコールなどを含むがこれらに限定されない）、またはこれらの組み合わせから選択される溶媒を含む。
【００１９】
１つの実施形態において、前記液体製剤のｐＨ値は、約５．０〜６．０である。１つの実施形態において、前記液体製剤のｐＨ値は、約５．２〜５．８である。１つの実施形態において、前記液体製剤のｐＨ値は、約５．４〜５．６である。１つの実施形態において、前記液体製剤のｐＨ値は、約５．５である。
【００２０】
１つの実施形態において、前記液体製剤は、２５℃で約１．０〜２０センチポアズの粘度を有する。１つの実施形態において、前記液体製剤は、２５℃で約１．０〜１０センチポアズの粘度を有する。１つの実施形態において、前記液体製剤は、２５℃で約１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０または１０．０センチポアズの粘度を有する。１つの実施形態において、前記液体製剤は、２５℃で約５．０〜７．０センチポアズの粘度を有する。１つの実施形態において、前記液体製剤は、２５℃で約５．２センチポアズの粘度を有する。１つの実施形態において、前記液体製剤は、２５℃で約６．０センチポアズの粘度を有する。
【００２１】
１つの実施形態において、前記液体製剤は、医薬製剤であり、好ましくは注射剤であり、より好ましくは皮下注射剤である。
【００２２】
１つの好ましい実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、
（ｉ）約１００ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片と、
（ｉｉ）約０．２〜１０ｍｇ／ｍｌのヒスチジンと、
（ｉｉｉ）約１％〜６％（ｗ／ｖ）のソルビトールと、
（ｉｖ）約０．０５〜１ｍｇ／ｍｌのポリソルベート−８０またはポリソルベート−２０とを含み、
ここで、前記液体製剤のｐＨは約５．０〜６．０である。
【００２３】
１つのより好ましい実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、注射用水をさらに含む。
【００２４】
１つの好ましい実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、
（ｉ）約１００ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片と、
（ｉｉ）約０．２〜１０ｍｇ／ｍｌのヒスチジンと、
（ｉｉｉ）約１％〜６％のソルビトールおよび約５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニンまたはアルギニン塩と、
（ｉｖ）約０．０５〜１ｍｇ／ｍｌのポリソルベート−８０またはポリソルベート−２０とを含み、
ここで、前記液体製剤のｐＨは約５．０〜６．０である。
【００２５】
１つのより好ましい実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、注射用水をさらに含む。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤は、約−８０℃〜約４５℃、例えば−８０℃、約−３０℃、約−２０℃、約０℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３７℃、約４２℃または約４５℃の条件下で少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月、少なくとも７か月、少なくとも８か月、少なくとも９か月、少なくとも１０か月、少なくとも１１か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月、少なくとも２４か月、少なくとも３６か月、またはそれ以上の期間保存した後、抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片の純度低下は１０％以下であり、例えば５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％以下であるとＳＥＣ−ＨＰＬＣ法で測定される。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤は、約−８０℃〜約４５℃、例えば−８０℃、約−３０℃、約−２０℃、約０℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３７℃、約４２℃または約４５℃の条件下で少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月、少なくとも７か月、少なくとも８か月、少なくとも９か月、少なくとも１０か月、少なくとも１１か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月、少なくとも２４か月、少なくとも３６か月、またはそれ以上の期間保存した後、抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片の純度低下は１０％以下であり、例えば５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％以下であると非還元型ＣＥ−ＳＤＳ法で測定される。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤は、約−８０℃〜約４５℃、例えば−８０℃、約−３０℃、約−２０℃、約０℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３７℃、約４２℃または約４５℃の条件下で少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月、少なくとも７か月、少なくとも８か月、少なくとも９か月、少なくとも１０か月、少なくとも１１か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月、少なくとも２４か月、少なくとも３６か月、またはそれ以上の期間保存した後、抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片の電荷不均一性の変化は１０％以下であり、例えば５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％以下であるとＣＥＸ−ＨＰＬＣ法で測定される。
【００２９】
本発明の製剤は、高い抗体濃度を有する一方で、投与、特に皮下投与に適する低い粘度を有し、高い物理的および化学的安定性を有し、保存時に凝集体および粒子が発生しにくく、電荷不均一性の変化が生じにくい。これらの利点は、完全で、効率的で、一貫性の高い臨床薬剤を製造するために非常に有益である。
【００３０】
本発明者らは、驚くべきことに、ソルビトールを抗ＰＣＳＫ９抗体の液体製剤における粘度低下剤として用いることができ、他の粘度低下剤を添加することなく、低粘度、高濃度の抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片の液体製剤が得られ、前記液体製剤が高い安定性を有することを見出した。また、本発明者らは、驚くべきことに、ソルビトールとアルギニンとの組み合わせが、粘度低下剤として、抗ＰＣＳＫ９抗体の液体製剤の粘度をより低くすることができ、高濃度の抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片の液体製剤の皮下注射を容易にする粘度をより低くすることができ、前記ＰＣＳＫ−９抗体の液体製剤の安定性を向上させることができることを見出した（実施例１０〜１２参照）。
【００３１】
したがって、別の態様において、本発明は、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤における粘度低下剤としての糖アルコールの使用を提供する。
【００３２】
１つの実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤中の前記糖アルコールの濃度は、約１％〜６％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは約２％〜４％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは約３％（ｗ／ｖ）である。１つの実施形態において、前記糖アルコールは、好ましくはソルビトールである。
【００３３】
別の態様において、本発明は、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤の製造における粘度低下剤としての糖アルコールの使用を提供する。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明は、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤の製造における唯一の粘度低下剤としての糖アルコールの使用を提供する。
【００３５】
１つの実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤中の前記糖アルコールの濃度は、約１％〜６％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは約２％〜４％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは約３％（ｗ／ｖ）である。１つの実施形態において、前記糖アルコールは、好ましくはソルビトールである。
【００３６】
別の態様において、本発明は、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤における粘度低下剤としての糖アルコールとアルギニン（またはアルギニン塩、好ましくはアルギニン塩酸塩）との組み合わせの使用を提供する。
【００３７】
１つの実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体の液体製剤中の前記糖アルコールの濃度は、約１％〜６％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは約２％〜４％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは約３％（ｗ／ｖ）であり、アルギニンまたはアルギニン塩（好ましくはアルギニン塩酸塩）の濃度は、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは約７０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは約９０ｍｍｏｌ／Ｌである。１つの実施形態において、前記糖アルコールは、好ましくはソルビトールである。
【００３８】
別の態様において、本発明は、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤の製造における粘度低下剤としての糖アルコールとアルギニン（またはアルギニン塩、好ましくはアルギニン塩酸塩）との組み合わせの使用を提供する。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明は、抗ＰＣＳＫ９抗体を含む液体製剤の製造における唯一の粘度低下剤としての糖アルコールとアルギニン（またはアルギニン塩、好ましくはアルギニン塩酸塩）との組み合わせの使用を提供する。
【００４０】
１つの実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体の液体製剤中の前記糖アルコールの濃度は、約１％〜６％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは約２％〜４％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは約３％（ｗ／ｖ）であり、アルギニンまたはアルギニン塩（好ましくはアルギニン塩酸塩）の濃度は、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは約７０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは約９０ｍｍｏｌ／Ｌである。１つの実施形態において、前記糖アルコールは、好ましくはソルビトールである。
【００４１】
別の態様において、本発明は、上記の液体製剤を凍結乾燥することによって得られる固体製剤を提供する。使用前に、該固体製剤を適切な溶媒に再構成し、本発明の液体製剤を形成することができる。
【００４２】
別の態様において、本発明は、
ａ．抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片を用意するステップと、
ｂ．緩衝剤および粘度低下剤を添加するステップと、
ｃ．界面活性剤を添加するステップと、
ｄ．場合により無菌濾過して、本発明の液体製剤を得るステップとを含む、本発明による液体製剤の製造方法を提供する。
【００４３】
１つの実施形態において、ステップａ．における抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片は、単離精製された抗ＰＣＳＫ９抗体である。
【００４４】
１つの実施形態において、ステップａ．における抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片は、溶液、好ましくは水溶液の形態で提供される。
【００４５】
１つの実施形態において、ステップｂ．の前に限外濾過遠心分離管（例えば、約３０ＫＤのカットオフ分子量）を用いて抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片を遠心分離により濃縮する。
【００４６】
１つの実施形態において、ステップｂ．の緩衝剤および粘度低下剤は、溶液、好ましくは水溶液の形態で提供される。
【００４７】
１つの実施形態において、ステップｂ．の後に、限外濾過遠心分離により濃縮し、緩衝剤および粘度低下剤溶液、好ましくは水溶液で希釈し、置換が完了するまでこのように繰り返す。
【００４８】
１つの実施形態において、ステップｃ．の前に、ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片の濃度を調整する。
【００４９】
前記抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片、緩衝剤、粘度低下剤、および界面活性剤は、本明細書に記載のとおり、その投与量および／または濃度が本発明の液体製剤について記載のとおりであり、またはそれによって適切に決定され得る。
【００５０】
１つの実施形態において、本発明の液体製剤の製造方法は、
ｉ．単離精製された抗ＰＣＳＫ９抗体を用意し、場合によりカットオフ分子量が約３０ＫＤの限外濾過遠心分離管に添加し、遠心分離により濃縮するステップと、
ｉｉ．緩衝剤および粘度低下剤溶液、好ましくは水溶液（好ましくは、緩衝剤および粘度低下剤の種類、濃度および溶液のｐＨは、上記および定義部分で本発明の液体製剤について定義したとおりであり、より好ましくは、緩衝剤はヒスチジンであり、粘度低下剤はアルギニンおよび／またはソルビトールである）を添加して希釈した後に濃縮を継続し、置換が完了するまでこのように繰り返すステップと、
ｉｉｉ．置換後のタンパク質の濃度を、本発明の液体製剤について定義した濃度に調整するステップと、
ｉｖ．界面活性剤の最終濃度が本発明の液体製剤について定義した濃度となるように、界面活性剤またはその溶液、好ましくは水溶液を添加するステップと、
ｖ．場合によりステップｉｖの溶液を無菌濾過するステップと、
ｖｉ．場合によりバイアル瓶に分注し、ゴム栓およびアルミニウム製プラスチック蓋をして完成品を得るステップとを含む。
【００５１】
実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体は、本明細書で定義される抗ＰＣＳＫ９抗体である。
【００５２】
ＩＩ．本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９またはその断片（好ましくはヒトＰＣＳＫ９タンパク質）と結合する抗ＰＣＳＫ９抗体または抗体断片（好ましくは抗原結合断片）を提供する。
【００５３】
本発明の１つの態様において、本明細書は、抗ＰＣＳＫ９抗体、およびその断片（例えば、抗原結合断片）を提供する。いくつかの実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体は、ＰＣＳＫ９活性を抑制または阻害する。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、以下の１つ以上の特性を有する：
（１）ＰＣＳＫ９（好ましくはヒトＰＣＳＫ９タンパク質）と結合し、好ましくは、平衡解離定数（ＫＤ）が約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下、約０．０１ｎＭ以下、または約０．００１ｎＭ以下（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）であること、
（２）ＰＣＳＫ９（例えば、ヒトＰＣＳＫ９）とＬＤＬＲ（例えば、ヒトＬＤＬＲ）との結合を阻害すること、
（３）ＬＤＬＲの回復能力を増加させ、および／またはＰＣＳＫ９により誘導されるＬＤＬ−Ｃ取り込み減少を抑制し、それにより細胞（例えば、肝細胞）によるＬＤＬ−Ｃ取り込みを増加させることであって、好ましくは、前記抗体濃度は、約１０、１５、２０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎＭ以上、例えば約１０〜１００ｎＭ、１５〜７０ｎＭであり、好ましくは、前記抗体の細胞によるＬＤＬＣ取り込み増加能力が、対照抗体よりも少なくとも２倍高く、好ましくは、対照抗体はＩｇＧ、またはアリロクマブ（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）またはロデルシズマブ（Ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）等の本分野で既知の抗体であること、
（４）細胞のＬＤＬＲ内在化を効果的に阻止すること、
（５）血清中のＬＤＬ−Ｃレベルおよび／または総コレステロール（ＴＣ）レベルを（投与量依存的に）低下させること、
（６）血清中のＬＤＬ−Ｃレベルを長い期間、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日数超の持続期間にわたって有意に低下させること。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記ＶＨは、
（ｉ）表ＩＩに示されるいずれかの抗体のＶＨに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、または
（ｉｉ）、（ｉ）の配列に対して、前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）が含まれる配列を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＬは、
（ｉ）配列番号２４に示されるＶＬに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、または
（ｉｉ）、（ｉ）の配列に対して、前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）が含まれる配列を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域ＶＨおよび軽鎖可変領域ＶＬを含み、
（ａ）前記ＶＨが、
（ｉ）表ＩＩに示されるいずれかの抗体のＶＨに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、または
（ｉｉ）、（ｉ）の配列に対して、前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）が含まれる配列を含み、および／または
（ｂ）前記ＶＬが、
（ｉ）配列番号２４に示されるＶＬに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、または
（ｉｉ）、（ｉ）の配列に対して、前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）が含まれる配列を含む。
【００５７】
好ましい実施形態において、ＶＨは、配列番号２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２または３３に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含み、または前記アミノ酸配列からなる。
【００５８】
好ましい実施形態において、ＶＬは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含み、または前記アミノ酸配列からなる。
【００５９】
好ましい実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２または３３に示される重鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ、および／または
（ｂ）配列番号２４に示される軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲを含む。
【００６０】
好ましい実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２または３３に示される重鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ、および
（ｂ）配列番号２４に示される軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲを含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
（ｉ）前記ＶＨは、相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３であって、配列番号１、７、８、９、１０、１１、１２、１３および２０から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１、または配列番号１、７、８、９、１０、１１、１２、１３および２０から選択されるアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２、１４、１５、１６、１７および２１から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２、または配列番号２、１４、１５、１６、１７および２１から選択されるアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、ならびに配列番号３、１８、１９および２２から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３、または配列番号３、１８、１９および２２から選択されるアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、を含み
および／または、
（ｉｉ）前記ＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３であって、配列番号４のアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＬＣＤＲ１、または配列番号４のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＬＣＤＲ２、または配列番号５のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、ならびに配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列よりからなるＬＣＤＲ３、または配列番号６のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【００６２】
好ましい実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
（ａ）前記ＶＨが、
（ｉ）表Ｉに示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３の組み合わせ、または
（ｉｉ）前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）が含まれる（ｉ）のＨＣＤＲの組み合わせの変異体を含む。
および／または、
（ｂ）前記ＶＬが、
（ｉ）それぞれ配列番号４、５および６に示されるアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の組み合わせ、または
（ｉｉ）前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）が含まれる（ｉ）のＬＣＤＲの組み合わせの変異体を含む。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨは相補性決定領域（ＣＤＲ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、前記抗体またはその抗原結合断片に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３の組み合わせは下表（表Ｉ）に示されるとおりである。
【００６４】
【表１】
2021524839.tif 000002
【００６５】
好ましい実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、表Ｉに示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３の組み合わせを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域ＶＨおよび／または軽鎖可変領域ＶＬを含み、
（ａ）重鎖可変領域ＶＨが、
（ｉ）配列番号２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２および３３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、または
（ｉｉ）配列番号２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２および３３から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２および３３から選択されるアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記アミノ酸変異はＣＤＲ領域に生じず、
および／または、
（ｂ）軽鎖可変領域ＶＬが、
（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記アミノ酸変異はＣＤＲ領域に生じない。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記抗体またはその抗原結合断片に含まれる重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬの組み合わせは、下表（表ＩＩ）に示されるとおりである。
【００６８】
【表２】
2021524839.tif 000003
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、重鎖および／または軽鎖を含み、
（ａ）重鎖が、
（ｉ）配列番号３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３および４４から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
（ｉｉ）配列番号３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３および４４から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号３４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３および４４から選択されるアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは２０個以下または１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記アミノ酸変異は重鎖のＣＤＲ領域に生じず、より好ましくは、前記アミノ酸変異は重鎖可変領域に生じず、
および／または、
（ｂ）軽鎖が、
（ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
（ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、または
（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは２０個以下または１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記アミノ酸変異は軽鎖のＣＤＲ領域に生じず、より好ましくは、前記アミノ酸変異は軽鎖可変領域に生じない。
【００７０】
好ましい実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、重鎖と、軽鎖とを含み、前記抗体またはその抗原結合断片に含まれる重鎖と軽鎖の組み合わせは下表（表ＩＩＩ）に示されるとおりである。
【００７１】
【表３】
2021524839.tif 000004
【００７２】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、抗ＰＣＳＫ９抗体のアミノ酸配列の変異体、および、上記の任意の抗体と同じエピトープを結合する抗体をさらに含む。
【００７３】
一部の実施形態において、ＰＣＳＫ９またはその断片と結合する抗体または抗体断片（好ましくは、抗原結合断片）を提供し、前記抗体はＰＣＳＫ９の断片内のエピトープと結合する。一部の実施形態において、ＰＣＳＫ９またはその断片と結合する抗体または抗体断片を提供し、前記抗体はヒトＰＣＳＫ９アミノ酸配列配列番号５３を含むアミノ酸断片内のエピトープと結合する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片の重鎖および／または軽鎖は、シグナルペプチド配列、例えば、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧをさらに含む。
【００７５】
本発明の１つの実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸変異は、アミノ酸の置換、挿入または欠失を含む。好ましくは、本発明において前記アミノ酸変異はアミノ酸置換であり、保存的な置換であることが好ましい。
【００７６】
好ましい実施形態において、本発明において前記アミノ酸変異はＣＤＲ外の領域（例えば、ＦＲ）に生じる。より好ましくは、本発明において前記アミノ酸変異は重鎖可変領域外および／または軽鎖可変領域外の領域に生じる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、置換は保存的な置換である。前記保存的な置換とは、１つのアミノ酸が同種の別のアミノ酸によって置換されたことを指す。例えば、１つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸によって置換されたこと、１つの塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸によって置換されたこと、または１つの中性アミノ酸が別の中性アミノ酸によって置換されたことを指す。例示的な置換は下表ＩＶに示されるとおりである。
【００７８】
【表４】
2021524839.tif 000005
【００７９】
一部の実施形態において、置換は抗体のＣＤＲ領域に生じる。通常、得られる変異体は、親抗体に対して特定の生物学的特性（例えば、増加した親和力）において修飾（例えば、改善）を有し、および／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換変異体は、親和力成熟抗体である。
【００８０】
一部の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体のグリコシル化の程度が増大または低減するように改変される。抗体のグリコシル化部位の追加または欠失は、アミノ酸配列を改変させて１つ以上のグリコシル化部位を生成または除去することによって容易に実現できる。抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着する糖類を改変させることができる。いくつかの使用では、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）機能を改善するためにフコースモジュールを除去するなど、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ２７７：２６７３３参照）。他の使用では、ガラクトシド化修飾を行って補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を修飾することができる。
【００８１】
一部の実施形態において、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域変異体を生成することによって、疾患の治療における抗体の有効性などを増強させることができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。Ｆｃ変異体の例については、米国特許第７，３３２，５８１号、米国特許第６，７３７，０５６号、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ  ２００４／０５６３１２およびＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ９（２）：６５９１−６６０４（２００１）、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ  ９９／５１６４２およびＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：４１７８−４１８４（２０００）、米国特許第７，３７１，８２６号、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、およびＷＯ  ９４／２９３５１を参照されたい。
【００８２】
一部の実施形態において、システイン操作された抗体、例えば、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換された「チオＭＡｂ」の産生が望ましい場合がある。例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように、システイン操作された抗体を生成することができる。
【００８３】
一部の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、本分野で既知の事項として容易に得られる他の非タンパク質の部分を含有するようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導作用に適する部分の非限定的な例は、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキサン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、デキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセリン）、ポリビニルアルコール、これらの混合物を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、以下の１つ以上の特性を有する。
（ｉ）表Ｃに示されるいずれか１つの抗体とＰＣＳＫ９（例えばヒトＰＣＳＫ９、好ましくは配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する）に対して同じまたは類似の結合親和力および／または特異性を示すこと、
（ｉｉ）表Ｃに示されるいずれか１つの抗体とＰＣＳＫ９（例えばヒトＰＣＳＫ９、好ましくは配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する）との結合を抑制（例えば、競合的に抑制）すること、
（ｉｉｉ）表Ｃに示されるいずれか１つの抗体と同じまたは重複するエピトープと結合すること、
（ｉｖ）表Ｃに示されるいずれか１つの抗体とＰＣＳＫ９（例えばヒトＰＣＳＫ９、好ましくは配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する）と競合的結合すること、
（ｖ）表Ｃに示されるいずれか１つの抗体の１つ以上の生物学的特性を有すること。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、ＩｇＧ１形態の抗体、ＩｇＧ２形態の抗体またはＩｇＧ４形態の抗体である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体はヒト化された抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体のフレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトに共有するフレームワーク配列である。１つの実施形態において、本明細書に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体はその抗体断片をさらに含む。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、および抗体断片より形成された多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【００８７】
パパイン消化抗体は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、結晶化しやすいその能力を反映する名称の残りの「Ｆｃ」断片とを生成する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片を生成する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体はヒト化抗体である。抗体のヒト化のための各種の方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ＆Ｆｒａｎｓｓｏｎに記載の当該方法の概要は当業者が知っている内容であり、当該内容の全体が引用によって本明細書に組み込まれる（Ａｌｍａｇｒｏ  ＪＣ＆Ｆｒａｎｓｓｏｎ  Ｊ（２００８）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ１３：１６１９−１６３３）。Ａｌｍａｇｒｏ＆Ｆｒａｎｓｓｏｎでは、定量的アプローチと経験的アプローチに区別されている。定量的アプローチは、少量の人工抗体の変異体を生成しその結合または任意の他の対象特性を評価することを特徴とする。設計された変異体に所望の効果が得られない場合は、再度の設計と結合評価を行う。定量的アプローチは、ＣＤＲグラフト、リサーフェイシング（Ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）、超ヒト化（Ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）、ヒト文字列内容の最適化（Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｒｉｎｇ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を含む。これに対して、経験的アプローチは、大量のヒト化変異体ライブラリーを生成し富化技術またはハイスループットスクリーニングを利用して最適なクローンを選択することに基づく。したがって、経験的アプローチは、大量の抗体変異体に対する検索が可能な、確実な選択および／またはスクリーニングシステムに基づく。例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイなどのインビトロディスプレイ技術は、上記の要件を満たしており、当業者が知っている内容でもある。経験的アプローチは、ＦＲライブラリー、案内選択（Ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、フレームワークシャッフリング（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、およびＨｕｍａｎｅｅｒｉｎｇを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体はヒト抗体である。本分野で既知の様々な技術を利用してヒト抗体を製造できる。ヒト抗体に関しては、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ＆ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５  ：３６８−７４（２００１）、およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０  ：４５０−４５９（２００８）の説明が参照される。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体はキメラ抗体である。
【００９１】
組み合わせライブラリーにおいて、所望の活性を有する抗体をスクリーニングすることによって本発明の抗体を単離することができる。例えば、本分野において、ファージディスプレイライブラリーを生成しこれらのライブラリーにおいて所望の結合特性を有する抗体をスクリーニングする方法として、いくつかが知られている。これらの方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｏ’  Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に記載の内容が参照され、その更なる説明として、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ＆Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｏ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）が参照される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本発明は、例えば、検出可能なマーカー（例えば、蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質および化学発光部分）、細胞傷害剤または免疫抑制剤などの他の物質と複合された抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体（「複合体または免疫複合体」）をさらに含む。細胞傷害剤は、細胞に対して傷害性を有する任意の薬剤を含む。免疫複合体の生成に適する細胞傷害剤（例えば、化学療法剤）としては、例えばＷＯ０５／１０３０８１が参照され、本分野で既知の内容である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体であり得る。多重特異性モノクローナル抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよいし、１つを超える標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含んでいてもよい。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９を参照する。抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体は、別の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）と連結または共発現することができる。例えば、抗体またはその断片は、二次以上の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を生成するために、別の抗体または抗体断片などの１つ以上の他の分子に（例えば、化学的結合、遺伝的融合、非共有結合、または他の方法で）機能的に連結されてもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＰＣＳＫ９タンパク質、例えば配列番号５３に示されるヒトＰＣＳＫ９タンパク質と結合する。
【００９５】
ＩＩＩ．本発明の抗体またはその製剤の治療方法および使用
別の態様において、本発明は、対象におけるＰＣＳＫ９とＬＤＬ−受容体（ＬＤＬＲ）の結合を抑制する方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を前記対象に投与することを含む。本発明はまた、対象におけるＰＣＳＫ９とＬＤＬ−受容体（ＬＤＬＲ）の結合を抑制するための薬物の製造における、本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の使用に関する。
【００９６】
別の態様において、本発明は、対象のコレステロールレベルを低下させる方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を前記対象に投与することを含む。１つの実施形態において、コレステロールはＬＤＬ−コレステロール、好ましくは血清コレステロールである。別の態様において、本発明は、対象のＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させる方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、対象の血清ＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させる方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を前記対象に投与することを含む。別の態様において、本発明はまた、対象における対象のコレステロールレベル（１つの実施形態において、ＬＤＬ−コレステロールレベルまたは血清ＬＤＬ−コレステロールレベルである）を低下させるための薬物の製造における、本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の使用に関する。
【００９７】
別の態様において、本発明は、ＬＤＬ−コレステロールレベルの上昇に関連する対象の病的状態を予防または治療する方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を前記対象に投与することを含む。本発明はまた、対象におけるＬＤＬ−コレステロールレベルの上昇に関連する対象の病的状態を治療するための薬物の製造における、本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の使用に関する。
【００９８】
１つの態様において、本発明は、コレステロール関連疾患を予防または治療する方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を前記対象に投与することを含む。本発明はまた、コレステロール関連疾患を治療するための薬物の製造における、本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の使用に関する。コレステロール関連疾患の例示的かつ非限定的な例は、以下に提供される。いくつかの実施形態において、コレステロール関連疾患は、高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）または高脂血症である。いくつかの実施形態において、本発明は、高コレステロール血症および／または高脂血症を治療する方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本発明はまた、高コレステロール血症および／または高脂血症を治療するための薬物の製造における、本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の使用に関する。
【００９９】
１つの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９活性を除去、抑制または低下させることによって改善、緩和、抑制または予防され得る任意の疾患または病的状態を予防または治療する方法に関する。いくつかの実施形態において、スタチン（ｓｔａｔｉｎｓ）を用いて治療または予防することができる疾患または病的状態は、本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を用いて治療または予防することもできる。いくつかの実施形態において、コレステロール合成の防止またはＬＤＬＲ発現の増加から利益を得ることができる疾患または病的状態は、本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体を用いて治療することもできる。
【０１００】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、前記対象に有効量の他の治療剤を組み合わせて適用することをさらに含む。１つの実施形態において、本発明はまた、本明細書に記載の抗体製剤または抗体および他の治療剤を含む組み合わせ製品に関する。１つの実施形態において、他の治療剤は、ＬＤＬＲタンパク質のレベルを上昇させる。別の実施形態において、他の治療剤は、ＬＤＬ−コレステロールのレベルを低下させる。別の実施形態において、他の治療剤は、スタチンを含む。別の実施形態において、他の治療剤は、スタチンである。いくつかの実施形態において、スタチンは、アトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）、フルバスタチン（ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、メバスタチン（ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）、ピタバスタチン（ｐｉｔａｖａｓｔａｔｉｎ）、プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）、ロスバスタチン（ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ）、シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、およびこれらの任意の組み合わせから選択される。一部の実施形態において、前記他の治療剤は、アテローム性動脈硬化症および／または心血管疾患を予防および／または治療するために使用される。一部の実施形態において、前記他の治療剤は、再発する心血管イベントのリスクを低減するための方法である。一部の実施形態において、前記他の治療剤は、対象のＨＤＬ−コレステロールレベルを上昇させるために使用される。いくつかの実施形態において、対象または個体は、哺乳類であり、好ましくは、ヒトである。
【０１０１】
上記併用療法には、併用投与（２種以上の治療剤が同一または別の製剤に含まれる）と、別の投与とが含まれ、任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の投与は、他の治療剤および／またはアジュバントの投与の前、同時および／または後に行うことができる。
【０１０２】
疾患を予防または治療するために、本発明の製剤または抗体の適切な投与量（単独で投与される場合または１種以上の他の治療剤と組み合わせて投与される場合）が、治療対象疾患の種類、抗体のタイプ、疾患の重症度とその経過、前記抗体の投与が予防目的であるか治療目的であるか、これまでの治療歴、患者の臨床病歴、前記製剤または抗体に対する応答、主治医の判断によって決定される。前記抗体は、単回の治療として、または一連の治療において患者に適切に投与される。前記抗体の例示的な投与量の範囲は、３〜３０ｍｇ／ｋｇを含む。
【０１０３】
他の態様において、本発明は、薬物を生産または製造するための、任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の使用を提供し、前記薬物は、上記の関連の疾患または病的状態の治療に用いられる。
【０１０４】
一部の実施形態において、本発明の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、高コレステロール血症、高脂血症、心血管疾患および／または任意のコレステロール関連疾患の出現を予防または緩和するために、予防的に投与され得る。一部の実施形態において、本発明の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、既存の高コレステロール血症および／または高脂血症および／または心血管疾患および／または任意のコレステロール関連疾患を治療するために投与することができる。いくつかの実施形態において、本発明の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、病的状態および／または病的状態に関連する症状の出現を遅延することができる。
【０１０５】
ＩＶ．その他
１つの態様において、本発明は、上記の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片をコードする核酸を提供する。１つの実施形態において、前記核酸を含むベクターを提供する。１つの実施形態において、ベクターは発現ベクターである。１つの実施形態において、前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。１つの実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞または抗体もしくはその抗原結合断片の製造に適する他の細胞から選択される。別の実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。
【０１０６】
１つの実施形態において、本発明は、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片（好ましくは、抗原結合断片）の製造方法を提供し、前記方法は、前記抗体またはその断片（好ましくは、抗原結合断片）をコードする核酸の発現に適する条件において前記宿主細胞を培養することと、場合により前記抗体またはその断片（好ましくは、抗原結合断片）を単離することとを含む。ある実施形態において、前記方法は、宿主細胞から抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片（好ましくは、抗原結合断片）を回収することをさらに含む。
【０１０７】
１つの態様において、本発明は、試料中のＰＣＳＫ９タンパク質の検出方法に関し、前記方法は、（ａ）試料を本明細書に記載の任意の抗ＰＣＳＫ９抗体製剤または本発明の抗体と接触させることと、（ｂ）抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片とＰＣＳＫ９タンパク質における複合物の形成を検出することとを含む。１つの実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体は、検出可能に標識される。
【０１０８】
本発明は、本明細書に記載の任意の実施形態の任意の組み合わせをさらに含む。本明細書に記載の任意の実施形態またはその任意の組み合わせは、本明細書に記載の本発明の任意のおよび全ての製剤または抗ＰＣＳＫ９抗体またはその断片、方法および使用に適用する。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、異なる濃度の各抗ＰＣＳＫ９抗体がＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合を阻害する能力を示す。
【図２】図２は、異なる濃度の各抗ＰＣＳＫ９抗体がＨｅｐＧ２細胞のＬＤＬＲ回復を増加させる能力を示す。
【図３】図３は、異なる濃度の各抗ＰＣＳＫ９抗体が細胞のＬＤＬＲ内在化を低下させる能力を示す。
【図４】図４Ａは、本発明の例示的な抗体の重鎖のＦＲおよびＣＤＲの配列情報を示し、図４Ｂは、本発明の例示的な抗体の軽鎖のＦＲおよびＣＤＲの配列情報を示す。
【図５】図５Ａは、本発明の例示的な抗体の重鎖可変領域を示す配列情報を示し、図５Ｂは、本発明の例示的な抗体の軽鎖可変領域を示す配列情報を示す。
【図６】図６は、ラットにおける抗ＰＣＳＫ−９抗体またはＥｖｏｌｏｃｕｍａｂの皮下または静脈内投与後の血清中のＬＤＬ−Ｃの、投与前レベル（Ｄ１投与前、基線）に対する％変化率（平均）ｖｓ時間のプロットを示す。
【図７】図７は、ラットにおける抗ＰＣＳＫ−９抗体またはＥｖｏｌｏｃｕｍａｂの皮下または静脈内投与後の血清中の％ＨＤＬ−Ｃの、投与前レベル（Ｄ１投与前、基線）に対する％変化率（平均）ｖｓ時間のプロットを示す。
【図８】図８は、カニクイザルにおける抗ＰＣＳＫ−９抗体またはＥｖｏｌｏｃｕｍａｂの投与後の血清ＬＤＬ−Ｃの、投与前レベル（Ｄ１投与前、基線）に対する％変化率（平均）ｖｓ時間のプロットを示す。
【図９】図９は、カニクイザルにおける抗ＰＣＳＫ−９抗体またはＥｖｏｌｏｃｕｍａｂの投与後の血清ＨＤＬ−Ｃの、投与前レベル（Ｄ１投与前、基線）に対する％変化率（平均）ｖｓ時間のプロットを示す。
【図１０】図１０は、カニクイザルにおける抗ＰＣＳＫ−９抗体またはＥｖｏｌｏｃｕｍａｂの投与後の血清ＴＣの、投与前レベル（Ｄ１投与前、基線）に対する％変化率（平均）ｖｓ時間のプロットを示す。
【０１１０】
定義
本発明において使用されている用語は、以下に列挙される定義を有する。定義が本明細書に記載されていない場合、本発明において使用されている用語は、本分野において一般的に理解される意味を有する。
【０１１１】
本明細書で解釈のために以下の定義を使用し、しかも矛盾がなければ、単数形で使用される用語は複数の場合をも含み、逆の場合については同様である。なお、本明細書で使用されている用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定を加えるものではない。
【０１１２】
本明細書で使用される用語「および／または」は選択可能オプションのうちのいずれか一項または選択可能オプションのうちの２項または複数項を指すと理解すべきである。
【０１１３】
本明細書で使用される用語「包含する」または「含む」とは、前記要素、整数またはステップを含むが、他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本明細書において、用語「包含する」または「含む」を用いる場合、特記しない限り、述べられた要素、整数またはステップからなる場合を含む必要がある。例えば、ある具体的な配列の抗体可変領域を「包含する」ことを言及する場合、当該配列からなる抗体可変領域を含むことを指す。
【０１１４】
特記しない限り、用語「プロタンパク質転換酵素枯草菌プロテアーゼ／ｋｅｘｉｎ型９（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  ｔｙｐｅ９）（ＰＣＳＫ９）」、「ＰＣＳＫ９」または「ＮＡＲＣ−１」は、本明細書で使用される場合、任意の天然ＰＣＳＫ９、任意の脊椎動物源（霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳類を含む）からの任意の天然ＰＣＳＫ９が好ましい。当該用語は、「完全長」の未処理ＰＣＳＫ９、ならびに細胞内処理によって生成される任意の形態のＰＣＳＫ９またはその任意の断片を包含する。当該用語はまた、天然に存在するＰＣＳＫ９の変異体、例えばスプライシング変異体または対立遺伝子変異体を含む。
【０１１５】
用語「ＰＣＳＫ９活性」またはＰＣＳＫ９の「生物学的活性」は、本明細書で使用される場合、ＰＣＳＫ９の任意の生物学的作用を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、ＰＣＳＫ９が基質または受容体と相互作用または結合する能力を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の生物学的活性は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬ−受容体（ＬＤＬＲ）と結合する能力である。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９は、結合し、ＬＤＬＲに関連する反応を触媒する。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲの利用を低下または減少させる能力を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の生物学的活性は、ＰＣＳＫ９が対象のＬＤＬの量を増加させる能力を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の生物学的活性は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬと結合するために使用され得る対象のＬＤＬＲの量を減少させる能力を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の生物学的活性は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬと結合するために使用され得るＬＤＬＲの量を減少させる能力を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の生物学的活性は、ＰＣＳＫ９シグナル伝達に起因する任意の生物学的活性を含む。
【０１１６】
語「抗ＰＣＳＫ９抗体」、「抗ＰＣＳＫ９」、「ＰＣＳＫ９抗体」または「ＰＣＳＫ９と結合する抗体」とは、標的ＰＣＳＫ９中の診断剤および／または治療剤として使用できるように、十分な親和性でＰＣＳＫ９タンパク質またはその断片と結合する抗体を指す。１つの実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体は、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）によって測定して、ＰＣＳＫ９と結合する抗体の約１０％未満の程度で、非関連の非ＰＣＳＫ９タンパク質と結合する。いくつかの実施形態において、抗ＰＣＳＫ９の抗体の平衡解離定数（ＫＤ）が１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）である。
【０１１７】
「抗体断片」とは、完全抗体の一部を含みかつ完全抗体によって結合された抗原と結合する、完全抗体とは異なる分子を指す。抗体断片の非限定的な例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、二価抗体もしくは二重特異性抗体もしくはその断片、ラクダ科由来の抗体、抗体断片により形成された二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体を含む。
【０１１８】
本明細書で使用される用語「エピトープ」とは、抗原（例えば、ＰＣＳＫ９）における抗体分子と特異的に相互作用する部分を指す。
【０１１９】
参照抗体と「同一のまたは重複するエピトープと結合する抗体」とは、競合測定において５０％以上の前記参照抗体とその抗原の結合を阻害する抗体を指し、言い換えれば、参照抗体が競合測定において５０％以上の当該抗体とその抗原の結合を阻害する。
【０１２０】
参照抗体に対してその抗原と競合的に結合する抗体とは、競合測定において５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の前記参照抗体とその抗原の結合を阻害する抗体を指す。言い換えれば、参照抗体が競合測定において５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の当該抗体とその抗原の結合を阻害する。１種の抗体が別の抗体と競合関係にあるかどうかを決定するためには様々な競合的結合測定を用いることができる。これらの測定の例としては、固相直接放射免疫測定または間接放射免疫測定（ＲＩＡ）、固相直接酵素免疫測定または間接酵素免疫測定（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合測定（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３）が挙げられる。
【０１２１】
参照抗体とその抗原の結合を抑制（例えば、競合的抑制）する抗体とは、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の前記参照抗体とその抗原の結合を抑制する抗体を指す。言い換えれば、参照抗体が５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の当該抗体とその抗原の結合を抑制する。抗体とその抗原の結合は親和力（例えば、平衡解離定数）として計測できる。親和力の測定方法は、本分野で既知の内容である。
【０１２２】
参照抗体と同じまたは類似の結合親和力および／または特異性を示す抗体とは、参照抗体の少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の結合親和力および／または特異性を有する抗体を指す。これに関しては、本分野の既知の任意の結合親和力および／または特異性の測定方法で測定できる。
【０１２３】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、抗体可変ドメインでは、配列において超可変でありかつ構造上に形成された所定のループ（「超可変ループ」）および／または抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープに結合する役割を果たす。重鎖と軽鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ−末端から順に番号付ける。抗体の重鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と呼ばれる。１つの特定の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のアミノ酸配列において、各ＣＤＲにおけるアミノ酸配列の境界は、公知の各種の抗体ＣＤＲ割り当てシステムのいずれか１種またはその組み合わせにより正確に決定できる。前記割り当てシステムの例は、抗体の三次元的構造とＣＤＲリングのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３，Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７−９４８（１９９７））、抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂａｔｈ）、Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ）、国際的ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／にて利用可能）、大量の結晶構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づくＮｏｒｔｈ  ＣＤＲ定義を含む。
【０１２４】
ただし、異なる割り当てシステムから得られた同一抗体の可変領域のＣＤＲの境界には、差異がある可能性があることを認識すべきである。即ち、異なる割り当てシステムで定義された同一抗体の可変領域のＣＤＲ配列には違いがある。したがって、本発明で定義された具体的なＣＤＲ配列により抗体が限定される場合、前記抗体の範囲には、可変領域配列が前記した具体的なＣＤＲ配列を含むが、異なる手段（例えば、異なる割り当てシステムのルールまたは組み合わせ）が使用されることにより、かかるＣＤＲ境界が本発明で定義された具体的なＣＤＲ境界と異なるような抗体も含まれる。
【０１２５】
異なる特異性（即ち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。しかし、抗体と抗体との間にあるＣＤＲが異なるにもかかわらず、ＣＤＲには限られた数のアミノ酸位置のみを抗原との結合に直接参与する。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ＣｏｎｔａｃｔおよびＮｏｒｔｈ方法のうちの少なくとも２種を用いて、最小重複領域を決定し、それによって抗原結合用の「最小結合単位」を提供することができる。最小結合単位は、ＣＤＲの１つのサブ部分であることができる。当業者が明らかにしたように、抗体の構造とタンパク質のフォールディングによって、ＣＤＲ配列の残り部分の残基を確定することができる。従って、本発明は、本出願に提供される如何なるＣＤＲの変異体も考慮する。例えば、１つのＣＤＲの変異体において、最小結合単位のアミノ酸残基はそのまま保持することができ、KａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａに基づいて定義された残りのＣＤＲ残基は保守的なアミノ酸残基で置換されることができる。
【０１２６】
「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方調節などを含む。かかるエフェクター機能には一般に、Ｆｃ領域と結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）の関連が求められ、それに例えば、本発明に開示されている複数種の測定手法を用いて評価できる。
【０１２７】
本明細書で使用される用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義しており、前記領域は少なくとも一部の定常領域を含む。該用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域がＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボニル基末端に延長している。一方、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよいし、または存在しなくてもよい。別途説明が行われる場合を除き、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号が、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号付けシステム（別称ＥＵインデックス）に準じる。
【０１２８】
本発明に適用される「抗体およびその抗原結合断片」の非限定的な例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、ヘテロ複合体抗体、多重特異性抗体、組換え抗体、ヘテロ抗体、ヘテロ接合抗体、キメラ抗体、ヒト化（特にＣＤＲがグラフトされている）抗体、脱免疫抗体、またはヒト由来の抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片、Ｆｄ、Ｆｖ、二硫化物によって連結されているＦｖ（ｄｓＦｖ）、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ダイアボディまたはトラボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（１４），６４４４−６４４８）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）（単一ドメイン抗体とも呼ばれる）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、上記のいずれか１種のエピトープ結合断片を含む。
【０１２９】
「ヒトに共有するフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンのＶＬまたはＶＨフレームワーク配列を選択するに当たり最も頻繁に出現するアミノ酸残基を示すフレームワークを指す。一般に、ヒト免疫グロブリンのＶＬまたはＶＨ配列に対する選択は、可変ドメイン配列のサブタイプに対する選択である。
【０１３０】
「ＩｇＧ形態の抗体」とは、抗体の重鎖定常領域がＩｇＧ形態を有することを指す。全ての同一のアイソタイプの抗体はその重鎖定常領域が同じであり、異なるアイソタイプの抗体において、その重鎖定常領域が異なる。例えば、ＩｇＧ１形態の抗体とは、その重鎖定常領域のＩｇドメインがＩｇＧ１のＩｇドメインであることを指す。
【０１３１】
本明細書に記載の用語「治療剤」は、細胞傷害剤、他の抗体、小分子薬物または免疫調節剤などを含むコレステロール関連疾患の予防または治療に有効な任意の物質を含む。
【０１３２】
「ヒト抗体」とは、ヒトまたはヒト細胞より生成されたまたはヒト以外に由来するものであって、ヒト抗体ライブラリーまたはヒト抗体をコードする他の配列を利用する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものを指す。ヒト抗体に対する当該定義において、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が明確に除外されている。
【０１３３】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ほぼ全ての可変ドメインの少なくとも１つ、一般に２つを含む。なお、全てのまたはほぼ全てのＣＤＲが非ヒト抗体に由来する部分に対応し、全てのまたはほぼ全てのＦＲがヒト抗体に由来する部分に対応する。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含むことが好ましい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形態」とは、ヒト化が行われている抗体を指す。
【０１３４】
「個体」または「対象」は、哺乳類を含む。哺乳類の非限定的な例は、家畜（例えば、ウシ、ヤギ（ヒツジ）、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）を含む。いくつかの実施形態において、前記個体または前記対象はヒトである。
【０１３５】
「単離された」抗体とは、その存在する自然環境の成分と単離している抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される純度が９５％以上または９９％以上であるように精製される。抗体純度の評価方法の概要は、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９−８７（２００７）が参照される。
【０１３６】
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、前記配列を照合し（必要に応じてギャップを導入し）、配列同一性の最大パーセントを得て、いかなる保存的置換を配列同一性の一部とみなさない場合、候補配列中のアミノ酸残基と参照ポリペプチド配列中の同じアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性のパーセントを決定するために、本分野での様々な方法を使用して、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公衆利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、配列照合を行うことができる。当業者は、比較している全長配列範囲内の最大の照合に必要とするいかなるアルゴリズムを含む、照合を測定するための適切なパラメータを確定することができる。
【０１３７】
より好ましくは、さらに例えば、本発明に記載の核酸配列とタンパク質配列を「参照配列」としてパブリックデータベースにおいて検索を実行することによって、他のメンバー配列または関連の配列を同定することもできる。
【０１３８】
用語「組み合わせ製品」は、２つ以上の治療剤が、特に、組み合わせパートナーが相乗効果などの相乗効果を示すことを可能にする時間間隔内で、独立して同じ時間または時間間隔内で別々に投与され得る、投与量単位形態の固定組み合わせまたは非固定組み合わせ、または組み合わせて投与される部分のためのキットを指す。用語「固定組み合わせ」は、本発明の抗体および組み合わせパートナー（例えば、スタチンなどの他の治療剤）が、単一の実体または投与量として患者に同時に投与されることを意味する。用語「非固定組み合わせ」は、本発明の抗体および組み合わせパートナー（例えば、スタチンなどの他の治療剤）が、特定の時間的制限なしに、別個の実体として患者に同時に、並行して、または連続して投与されることを意味し、そのような投与は、患者における２つの化合物の治療上有効なレベルを提供する。後者はまた、カクテル療法、例えば３つ以上の治療剤の投与にも適している。好ましい実施形態において、薬物の組み合わせは、非固定組み合わせである。
【０１３９】
用語「併用療法」は、本開示に記載のコレステロール関連疾患を治療するための２つ以上の治療剤の投与を意味する。そのような投与は、活性成分の一定の割合を有する単一のカプセルのような、実質的に同時にこれらの治療剤を同時投与することを含む。あるいは、そのような投与は、複数のまたは別個の容器中での各活性成分（例えば、錠剤、カプセル、粉末および液体）の同時投与を含む。粉末および／または液体は、投与前に所望の投与量に再構成または希釈することができる。さらに、そのような投与は、各タイプの治療剤を実質的に同じ時間または異なる時間に連続的に使用することを含む。いずれの場合においても、治療案は、本明細書に記載の病的状態または病状の治療における医薬の組み合わせの有益な効果を提供するであろう。
【０１４０】
本明細書で使用される用語「治療」とは、出現している症状、病的状態、病状または疾患の進行または重症度に対する軽減、中断、遅延、寛解、停止、低減、または逆転を指す。
【０１４１】
本明細書で使用される用語「予防」は、疾患、病的状態、特定の疾患もしくは病的状態に係る症状の発生または進行に対する抑制を含む。いくつかの実施形態において、家族歴がある対象は、予防性計画の候補である。一般に、用語「予防」は病的状態または症状が生じる前に、特に、リスクのある対象に生じる前の薬物投与を指す。
【０１４２】
用語「コレステロール関連疾患」は、高コレステロール血症、高脂血症、心臓病、メタボリックシンドローム（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、糖尿病、冠動脈心疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ）、卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、心血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、および一般的な異常脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）（例えば、総血清コレステロールの上昇、ＬＤＬの上昇、トリグリセリドの増加、ＶＬＤＬの増加および／またはＨＤＬの低下を示す）のいずれか１つ以上を含む。抗ＰＣＳＫ９抗体を（単独でまたは１つ以上の他の薬物と組み合わせて）用いて治療できる原発性および二次性異脂血症のいくつかの非限定的な例は、メタボリックシンドローム、糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、家族性混合性高脂血症（ｆａｍｉｌｉａｌ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、家族性高トリグリセリド血症（ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、家族性高コレステロール血症（ｆａｍｉｌｉａｌ   ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｓ）、ヘテロ接合性高コレステロール血症（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ   ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）、ホモ接合性高コレステロール血症（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ   ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）、家族性欠陥性アポリポタンパク質（ｆａｍｉｌｉａｌ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ   ａｐｏｐｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｂ−１００、多遺伝子性高コレステロール血症（ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ   ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）、残粒除去障害症（ｒｅｍｎａｎｔ ｒｅｍｏｖａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、肝リパーゼ欠損（ｈｅｐａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、食事不注意（ｄｉｅｔａｒｙ ｉｎｄｉｓｃｒｅｔｉｏｎ）、甲状腺機能障害（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ）、薬物（エストロゲンとプロゲステロン療法、β阻害剤とチアジン系利尿剤（ｔｈｉａｚｉｄｅ ｄｉｕｒｅｔｉｃｓ）を含む）、ネフローゼ症候群（ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、慢性腎不全（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）、クッシング症候群（Ｃｕｓｈｉｎｇ′ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、原発性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、グリコーゲン沈着症（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、肝細胞腫瘍（ｈｅｐａｔｏｍａ）、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ）、肢端肥大症（ａｃｒｏｍｅｇａｌｙ）、インスリノーマ（ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ）、単純性オーキシン欠乏症（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）とアルコールによる高トリグリセリド血症（ａｌｃｏｈｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）のいずれかに続発する異常脂血症を含む。
【０１４３】
用語「高コレステロール血症」は、本明細書で使用される場合、コレステロールレベルがあるレベル以上に上昇する病的状態を指す。いくつかの実施形態において、ＬＤＬ−コレステロールレベルは、あるレベルを超えて上昇する。いくつかの実施形態において、血清ＬＤＬ−コレステロールレベルは、あるレベルを超えて上昇する。
【０１４４】
本明細書で使用される用語「ベクター」とは、それに連結された別の核酸を増殖させる核酸分子を指す。当該用語は、核酸の自己複製が可能な構造としてのベクター、それを導入していた宿主細胞のゲノムに結合されたベクターを含む。一部のベクターは、それに操作可能に連結された核酸の発現をガイドすることができる。本明細書で、かかるベクターは「発現ベクター」と呼ばれる。
【０１４５】
「対象／患者試料」とは、患者または対象より得た細胞または液体の集まりである。組織または細胞試料の由来としては、新鮮な、冷凍されたおよび／または保存された器官、組織試料、生検試料もしくは穿刺試料などの固形組織、血液もしくは任意の血液成分、脳脊髄液、羊膜液（羊水）、腹腔内液（腹水）もしくは間質液などの体液、対象における妊娠もしくは発育の任意の段階に由来する細胞が挙げられる。組織試料は、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質などの自然界に存在する組織に溶けない化合物を含んでもよい。
【０１４６】
用語「有効量」とは、本発明の製剤、抗体または断片の１回分または複数回分の量を患者に投与した後、治療される患者に所望の効果が得られるという量または投与量を指す。有効量は、当業者である主治医が、例えば、哺乳類の生物種、投与対象の大きさ、年齢、健康状態と、適用される疾患、疾患の程度または重症度、個体患者における応答、投与される抗体、投与方式、投与製剤の生物学的利用能の特徴、選択される投与計画、併用療法の適用の複数種の要因を考慮して容易に決定することができる。
【０１４７】
「治療的有効量」とは、所定の期間に亘って所定の用量で所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。本発明の製剤、抗体または抗体断片またはその複合体または組成物の治療有効量は、例えば、疾患の状態、個体の年齢、性別、重量、抗体または抗体の部分が個体に所望の反応を起こす能力の複数種の要因によって変化する可能性がある。また治療有効量は、製剤、抗体または抗体断片またはその複合体または組成物の任意の毒性または有害作用が有益な治療効果に及ばないという量である。
【０１４８】
「予防的有効量」は、所定の期間に亘って所定の用量で所望の予防結果を達成するために有効な量を指す。一般に、予防目的の投与量は対象における疾患の早期段階よりも前にまたは疾患の早期段階に適用されるため、予防有効量が治療有効量を下回る。
【０１４９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、「宿主細胞培養物」は、外因性核酸が導入された細胞、かかる細胞の子孫を指すように入れ替えて使用される。宿主細胞は、「形質転換体」、「形質転換細胞」を含み、初代形質転換細胞、および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む。子孫は、突然変異が含まれる可能性があるため、核酸の内容において親細胞と同じではない。本発明では、初代の形質転換細胞からスクリーニングまたは選択された同じ機能または生理活性を有する突然変異体子孫が含まれる。
【０１５０】
本明細書で使用される用語「製剤」は、少なくとも１つの活性成分および少なくとも１つの不活性成分を含む、動物、好ましくは哺乳類（ヒトを含む）への投与に適した組成物を指す。「液体製剤」は液体形態の製剤を指す。本発明の液体製剤は、（ｉ）抗ＰＣＳＫ−９抗体またはその断片と、（ｉｉ）緩衝剤と、（ｉｉｉ）粘度低下剤と、（ｉｖ）界面活性剤と、（ｖ）溶媒とを含む。本発明の製剤の組成は、上記の液体製剤の実施形態に示されるようにすることができる。本発明の液体製剤は、好ましくは注射剤であり、より好ましくは皮下注射剤である。
【０１５１】
本明細書で使用される「緩衝剤」は、ｐＨ緩衝剤を指す。好ましくは、前記緩衝剤は、本発明の液体製剤のｐＨを約５．０〜６．０、好ましくは約５．２〜５．８、より好ましくは約５．４〜５．６、最も好ましくは約５．５に保持することができる。液体製剤中の緩衝剤の濃度は、例えば、約０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、約０．２〜１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５〜２．５ｍｇ／ｍｌ、約１．０〜２．０ｍｇ／ｍｌまたは約１．５ｍｇ／ｍｌである。好ましくは、緩衝剤は、ヒスチジン、グルタミン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから選択される。
【０１５２】
本明細書で使用される「粘度低下剤」は、抗ＰＣＳＫ−９抗体液体製剤の粘度を低下させることができる物質を指す。液体製剤中の粘度低下剤の濃度は、例えば、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、約２０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌまたは約５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである。好ましくは、粘度低下剤は、糖アルコール、アルギニン、アルギニン塩酸塩、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、酢酸ナトリウム、およびこれらの組み合わせから選択される。より好ましくは、粘度低下剤は、ソルビトールであり、あるいは粘度低下剤は、ソルビトールとアルギニンまたはアルギニン塩（好ましくはアルギニン塩酸塩）の組み合わせである。好ましくは、液体製剤中のソルビトールの濃度は、約１％〜６％（ｗ／ｖ）であり、液体製剤中のアルギニンまたはアルギニン塩（好ましくはアルギニン塩酸塩）の濃度は、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは約７０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは約９０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１５３】
本明細書に記載されるように、「界面活性剤」は、少量の添加によって溶液系の界面状態を著しく変化させることができる物質を指す。液体製剤中の界面活性剤の濃度は、例えば、約０．０１〜５ｍｇ／ｍｌ、約０．０５〜１ｍｇ／ｍｌまたは約０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは約０．３ｍｇ／ｍｌである。好ましくは、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、例えばプルロニクス（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ポリソルベート−８０、ポリソルベート−６０、ポリソルベート−４０またはポリソルベート−２０などである。
【０１５４】
本明細書で使用される用語「溶媒」は、活性成分および不活性成分を溶解または懸濁させて液体製剤を形成するために使用される液体を指す。本発明において有用な溶媒は、注射用水、注射用有機溶媒（注射用油、エタノール、プロピレングリコールなどを含むがこれらに限定されない）、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【０１５５】
本明細書で使用される用語「糖アルコール」糖アルコールは、接触水素化などの還元反応によって単糖を得られる対応するポリオールである。糖アルコールは、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールなどを含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
用語「約」は数値と共に使用されるとき、下限として記載数値より１０％小さく上限として記載数値より１０％大きい範囲における数値を含むことを意味する。
【０１５７】
本明細書で使用される「ｗ／ｖ」は、「重量／体積」を指し、例えば、「１％ｗ／ｖ」は１ｇ／１００ｍｌ＝０．０１ｇ／ｍｌ＝１０ｍｇ／ｍｌである。
【実施例】
【０１５８】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
略語の意味：
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
ＣＥ−ＳＤＳ：ラウリル硫酸ナトリウムキャピラリーゲル電気泳動法
ＣＺＥ：毛管ゾーン電気泳動法
【０１５９】
実施例１．抗ＰＣＳＫ９の抗体スクリーニングによる親抗体の決定
抗原ビオチン標識
メーカーの説明に従い、Ｐｉｅｒｃｅ社のスクシンイミドスルホン酸基ビオチン標識キットを用いてＰＣＳＫ９抗原（配列番号５３）をビオチン標識した。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）ｋａｐｐａ鎖抗体（ＬＣ−ＦＩＴＣ）は（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ポリエチレンアビジン（ＳＡ−ＰＥ）は（Ｓｉｇｍａ）、ストレプトアビジン−６３３（ＳＡ−６３３）は（Ｍｏｌｅｃ  ｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）から購入した。ストレプトマイシンマイクロビーズおよび細胞免疫磁気ビーズ分離カラムは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＬＳから購入した。
【０１６０】
予備スクリーニング
従来の方法（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３；ＷＯ２００９０３６３７９；ＷＯ  ２０１０１０５２５６；Ｗ０２０１２００９５６８）を用いて、８つの酵母ベースの抗体ディスプレイ（ｙｅａｓｔ−ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）ライブラリー（Ａｄｉｍａｂから）に対して、各ライブラリーの多様性が１×１０９になるよう増幅させる。簡単に説明すると、最初の２回のスクリーニングにおいて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のＭＡＣＳシステムを利用して磁気活性化による細胞選別を行う。最初に、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（リン酸塩緩衝液、０．１％ウシ血清アルブミン含有）において、各ライブラリーの酵母細胞（最大１×１０１０個の細胞／ライブラリー）をそれぞれ室温で１５ｍｉｎインキュベートし、緩衝液が上記のように製造した１００ｎＭのビオチンで標識されたＰＣＳＫ９抗原を含有する。予め冷却されたＦＡＣＳ洗浄緩衝液５０ｍｌで洗浄し、次に同洗浄緩衝液４０ｍｌで細胞を再懸濁し、ストレプトマイシンビーズ５００μｌを加えて４℃で１５ｍｉｎインキュベートする。１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して上清を捨て、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液５ｍｌで細胞を再懸濁し、細胞溶液をＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＬＳカラムに加えた。試料をロードした後、カラムを３回洗浄し、各回にＦＡＣＳ洗浄緩衝液３ｍｌを使用した。磁気領域からＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＬＳカラムを取り外し、成長培地５ｍｌで溶出し、溶出された酵母細胞を回収し、３７℃で一晩成長させた。
【０１６１】
フローサイトメーターを利用して、次回の選別を行い、ＭＡＣＳシステムによってスクリーニングされた約１×１０８の酵母細胞に対してＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、室温で低濃度のビオチン（１００−１ｎＭ）標識を含有するＰＣＳＫ９抗原またはＰＣＳＫ９−Ｆｃ融合抗原において培養した。培養液を捨て、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液で細胞を２回洗浄した後、細胞をＬＣ−ＦＩＴＣ（１：１００希釈）と混合し、ＳＡ−６３３（１：５００希釈）またはＥＡ−ＰＥ（１：５０希釈）試薬と混合し、４℃で１５ｍｉｎ培養した。予め冷却されたＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回溶出し、緩衝液０．４ｍｌに再懸濁し、フィルターを備える分離管に細胞を移した。ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を選別した。
【０１６２】
次に、競合的リガンドを得て、非特異的結合体（例えば、ＣＨＯ細胞の膜タンパク質）を除去するためにさらに数回のスクリーニングを行う。最後の数回の選別の後、収集した酵母細胞をプレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、標的モノクローナルを選別した。ｓａｎｇｅｒ法を用いて得られた抗体の可変領域を配列決定した。約３１０個の可変領域配列に対して特異的な抗体を合計で得て、１つずつ同定した。
【０１６３】
酵母が発現しＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和クロマトグラフィーの方法を用いて精製してこれらの抗ＰＣＳＫ９抗体タンパク質を得る。
【０１６４】
抗体の製造および精製
３０℃で、スクリーニングして得られた抗ＰＣＳＫ９抗体を発現する酵母細胞を振とうし４８時間誘導することによって、抗ＰＣＳＫ９抗体を発現させた。誘導完了後、１３００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して酵母細胞を除去し、上清液を得た。上清液における抗ＰＣＳＫ９抗体に対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを用いて精製し、ｐＨ２．０の酢酸溶液で溶出して、抗ＰＣＳＫ９抗体を得た。パパイン消化およびＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ生命医療集団）による精製を用いて対応するＦａｂ断片を得ることができる。
【０１６５】
上記抗ＰＣＳＫ９抗体を発現する酵母細胞から抗ＰＣＳＫ９抗体をコードする遺伝子ＤＮＡを本分野の常法に従って取得し、常法に従ってこの遺伝子ＤＮＡを新たな発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３．１）にクローニングした。
【０１６６】
メーカーが提供する方法に従って、目的抗体遺伝子を含有する上記発現ベクターとトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を培養されたヒト胎児腎２９３細胞に一過性トランスフェクションし、培地を捨て、新鮮な培地で細胞を４×１０６／ｍｌに希釈する。３７℃、５％ＣＯ２の条件において、細胞を７日間培養し、４８時間ごとに新鮮な培地を流加する。７日後に、１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離する。上清液を採取し、抗体の純度が９５％を上回るように、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａで上清液を精製した。
【０１６７】
ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＫＤ測定（バイオレイヤー干渉法）
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和力測定は従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂａｓｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ．２７０−８）で行った。簡単に説明すると、分析緩衝液においてオフラインでセンサを３０ｍｉｎ平衡化し、次にオンラインで６０秒間検出して基線を作成し、オンラインで上述したように精製された抗体をＡＨＱセンサにロードする。センサを１００ｎＭのＰＣＳＫ９抗原に曝露させて５ｍｉｎ作用させた後、センサを分析緩衝液に移して５ｍｉｎ解離させる。１：１結合モデルを利用して動力学的分析を行った。
【０１６８】
ＭＳＤ−ＳＥＴ動力学測定
平衡親和力の測定は前述のとおりである（Ｅｓｔｅｐ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。ＩｇＧフリーのＢＳＡを０．１％含有するリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳＦ）に、終濃度が１０〜１００ｐＭである前述のようにして得られたビオチンで標識されるＰＣＳＫ９抗原（ｂ−ＰＣＳＫ９）を添加し、上記のようにして得られた抗ＰＣＳＫ９  ＦａｂまたはｍＡｂを３〜５倍連続希釈して、濃度が５〜１００ｎＭのＦａｂまたはｍＡｂ溶液を得た。抗体（２０ｎＭリン酸塩緩衝生理食塩水で希釈）４℃を、ＭＳＤ−ＥＣＬプレート上に一晩または室温で３０ｍｉｎコーティングした。３％ＢＳＡを加え、７００ｒｐｍで３０ｍｉｎ室温で密閉した後、洗浄緩衝液（ＰＢＳＦ＋０．０５％トゥイーン２０）で３回洗浄した。試料をプレートに添加し、振盪器に入れて７００ｒｐｍ、室温で１５０ｓインキュベートした後、１回洗浄した。ｓｕｌｆｏｔａｇで標識されるストレプトアビジン（ＰＢＳＦで希釈）２５０ｎｇ／ｍｌを加え、室温で３ｍｉｎインキュベートした。緩衝液を３回洗浄した後、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００装置を用いて読み取り、プレートに結合する抗原を決定した。結合しない抗原のパーセントは、抗体滴定法によって得られ、その結果、抗ＰＣＳＫ９  ＦａｂまたはｍＡｂと抗原の結合は、代謝動態の二次方程式に一致することが見出された。
【０１６９】
Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４  結合エピトープ同定
結合エピトープ同定に関連して、標準的なサンドイッチ式の相互阻害解析法を使用した。標的特異的対照ＩｇＧをＡＨＱセンサに固定し、センサの上空のＦｃ結合部位を無関係なヒトＩｇＧ１抗体でブロックした。センサを１００ｎＭの目的抗原ＰＣＳＫ９溶液に１２０ｓ入れ、上記のように製造した第２種の１００ｎＭの抗ＰＣＳＫ９の抗体またはリガンド溶液に入れた。データを読み取り、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析ソフトウェア７．０（ＦｏｒｔｅＢｉｏから）で処理した。抗原が抗体と結合した後、第２種の抗体またはリガンドと結合することができることは、１つの未結合エピトープ（非競合的）を示唆し、結合しないことはエピトープ阻害（競合的またはリガンド阻害）を意味する。
【０１７０】
上記のスクリーニングおよび同定によって、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合を阻害し、ヒトマウスＰＣＳＫ９の両方と結合することができるいくつかの抗体を得た。親和力がより高い抗ＰＣＳＫ９抗体を得るために、次の方法により抗体ＡＤＩ−０２３９６に対し最適化を行った。
【０１７１】
実施例２．抗ＰＣＳＫ９抗体の親和力の最適化
ＶＨｍｕｔスクリーニング
当該方法は、通常のミスマッチＰＣＲ方法により抗体重鎖領域に突然変異を導入することである。ＰＣＲを行った過程で、１μＭの高頻度突然変異の塩基類似体ｄＰＴＰと８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰを利用して、塩基ミスマッチの概率を約０．０１ｂｐに上げた。
【０１７２】
得られたミスマッチＰＣＲ生成物に対し、相同組換えの方法により重鎖定常領域を含有するベクターに導入した。当該方法により、ＰＣＳＫ９抗原価を含み、非標識抗原による競合と親抗体競合を用いるスクリーニング条件において、ライブラリーの容量が１×１０７の二次ライブラリーを得た。ＦＡＣＳ方法により３回のスクリーニングに成功している。
【０１７３】
ＣＤＲＨ１／ＣＤＲＨ２スクリーニング
ＶＨｍｕｔ方法により得られた子孫抗体のＣＤＲＨ３遺伝子を、多様性が１×１０８のＣＤＲＨ１／ＣＤＲＨ２遺伝子ライブラリーに導入し、それに対し３回のスクリーニングを行った。１回目でＭＡＣＳ方法を用い、２回目、３回目でＦＡＣＳ方法を用いて、抗体抗原結合物に対して親和力加圧を行って、親和力が最大の抗体をスクリーニングした。
【０１７４】
１回目の最適化：第１のステップは、ヒトマウス交差活性、リガンド競合性を有する抗ＰＣＳＫ９抗体  ＡＤＩ−０２３９６（「親」抗体と命名）の親和力を向上させることである。簡単に言えば、親抗体に突然変異（「ミスマッチＰＣＲ」を利用する方法）を導入し、二次の酵母ベースの抗体ディスプレイ（ｙｅａｓｔ−ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）ライブラリーを構築することである。最終的に、約１×１０７サイズの二次プールが生成され、より高い親和力抗体の濃縮に使用される。スクリーニング条件には、ＰＣＳＫ９抗原価、未標識抗原競合、および親抗体の使用競合が含まれる。ＦＡＣＳ技術は目的集団のスクリーニングにも用いられる（具体的な操作方法はＣｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６を参照）。２〜３回の濃縮を経て、得られた酵母をプレートにコーティングしてモノクローナルを得ることができる。この操作の結果、ＡＤＩ−０９１１１、ＡＤＩ−０９１１２とＡＤＩ−０９１１３の合計３つの親和力改善子孫が得られた。ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔにより測定した３つの抗体のＫＤ範囲は１〜１０ｎＭである。２つの子孫抗体ＡＤＩ−０９１１２とＡＤＩ−０９１１３を、２回目の親和力最適化に使用した。
【０１７５】
２回目の親和力最適化：第２のステップは、２つのヒトマウス交差活性、リガンド競合性を有する抗ＰＣＳＫ９モノクローナルＡＤＩ−０９１１２とＡＤＩ−０９１１３（「親」抗体と命名）の親和力を向上させることである。簡単に言えば、各親抗体について、二次の酵母ベースの抗体ディスプレイ（ｙｅａｓｔ−ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）ライブラリーを構築することである。親抗体のＣＤＲ−Ｈ３および軽鎖（ＬＣ）を、既存の酵母ライブラリー中の遺伝子のＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ２と組み合わせた（「Ｈ１／Ｈ２」最適化と命名）。これにより、最終的に、後のより高い親和力抗体の濃縮のために、約１×１０８サイズの５つのライブラリーを生成した。スクリーニング方法は１回目のスクリーニングと同じである。２〜３回の濃縮を経て、酵母をプレート上にコーティングしてモノクローナルを得た。この作業の後、ＡＤＩ−１００８５、ＡＤＩ−１００８６およびＡＤＩ−１００８７がＡＤＩ−０９９１２のＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ２領域の変異体であり、ＡＤＩ−１００８８、ＡＤＩ−１００８９およびＡＤＩ−１００９０がＡＤＩ−０９１１３のＶＨ領域変異体である、親和性が改善された子孫抗体が得られた。前記抗体に関する配列情報は、表Ａ〜Ｃを参照されたい。これらの抗体のヒトＰＣＳＫ９に対する親和力は１０倍向上し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ法およびＭＳＤ−ＳＥＴ測定によって、ＫＤ範囲が４−１７ｐＭ〜２００ｐＭの範囲にあることが示された（表１、表２）。一部の抗体の親和力は対照抗体より１０倍程度高かった。他の抗体機能の同定は、前臨床開発を容易にするために抗体の数をさらに減らすことができる。
【０１７６】
本出願に係る各抗ＰＣＳＫ−９抗体の配列情報および番号は下表Ａ〜Ｃに示されるとおりである。
【０１７７】
【表５】
2021524839.tif 000006
【０１７８】
【表６】
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【０１７９】
【表７】
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【０１８０】
【表８】
2021524839.tif 000009
【０１８１】
【表９】
2021524839.tif 000010
【０１８２】
実施例３．抗ＰＣＳＫ−９抗体によるＰＣＳＫ−９とＬＤＬＲの結合抑制実験
実施例１に記載のＰＣＳＫ９タンパク質（ビオチンで標識されるＰＣＳＫ９タンパク質）を、作動液としてＰＢＳ溶液（リン酸塩緩衝溶液）で４００ｎｍｏｌ／Ｌに希釈した。それぞれＰＢＳ溶液で実施例２で得られた抗ＰＣＳＫ９抗体（ＡＤＩ−１００８５、ＡＤＩ−１００８６、ＡＤＩ−１００８７、ＡＤＩ−１００８８、ＡＤＩ−１００８９およびＡＤＩ−１００９０）を１０００ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ／Ｌ、１ｎｍｏｌ／Ｌ、０．１ｎｍｏｌ／Ｌの濃度に希釈し、同様の方法で対照抗体（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ、Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ、ＢｏｃｏｃｉｚｕｍａｂおよびＬｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）の各濃度の溶液を製造した。ＰＣＳＫ９作動液を、勾配希釈された各抗ＰＣＳＫ９抗体試料または対照試料と等体積混合した。ＰＢＳ溶液でヒトＬＤＬＲを過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＬＤＬＲ）を再懸濁して計数し、その細胞濃度をＰＢＳ溶液で４×１０６個／ｍｌに調整し、９６ウェルＵ型細胞培養プレートに接種して１ウェル当たり５０μｌの細胞培養液を加え、５０μｌのＰＣＳＫ９と抗ＰＣＳＫ９抗体の混合液を加え、１ウェル当たりの細胞数が２．０×１０５個であり、２００ｇを室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てる。ＰＢＳ溶液で１：２００の割合で抗−Ｈｉｓ−ＦＩＴＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を終濃度が２．５μｇ／ｍｌになるまで希釈し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで３０ｍｉｎ氷浴した。２００ｇを室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清液を軽く捨て、各ウェルに１５０μｌのＰＢＳ溶液を加え、２００ｇを室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清液を軽く捨て、３回繰り返した。各実験ウェルに８０μｌ／ウェルのＰＢＳ溶液を加え、ピペットで数回かけて細胞を再懸濁した。フローサイトメーターで細胞蛍光シグナルの強度値を検出した。
【０１８３】
実験で検出された蛍光シグナルは、下記の表３を参照されたい。
【０１８４】
【表１０】
2021524839.tif 000011
【０１８５】
表３のオリジナルデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアで解析してプロットし、図１を得た。
【０１８６】
実験の結果、抗ＰＣＳＫ９抗体は、対照抗体と比較して、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合を阻害する同等の能力を有することが示された。
【０１８７】
実施例４．細胞ＬＤＬ−ｃ取り込み解析実験
液体窒素保存タンクからＨｅｐＧ２細胞凍結保存管を取り出し、３７℃で快速水浴で融解し、細胞懸濁液を１５ｍｌの遠心分離管に移し、４ｍｌの室温成長培地（９０％ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、そのうちＤＭＥＭとＦＢＳはすべてＧｉｂｃｏ社から購入）、１０００ｒ／ｍｉｎ、室温で５ｍｉｎ遠心分離した後、新鮮な成長培地で沈殿細胞を再懸濁し、培養瓶に移して３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。対数増殖期のＨｅｐＧ２細胞を、ＰＢＳ溶液で２回洗浄した後、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏから購入）１ｍｌを加えて３ｍｉｎ消化し、６ｍｌの増殖培地を加えて細胞を再懸濁して反応を停止した。成長培地を用いてＨｅｐＧ２細胞を０．８×１０６個／ｍｌに調整し、黒色で底部が透明なポリ−Ｄ−リジンコーティング９６ウェル細胞培養プレート（Ｎｕｎｃから購入）に接種し、１ウェル当たり１００μＬ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６〜７ｈインキュベートした。成長培地を捨て、解析培地（ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ）に置き換え、１ウェル当たり１００μＬ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。抗体試料（ＡＤＩ−１００８５、ＡＤＩ−１００８７、ＡＤＩ−１００８８、ＡＤＩ−１００８９）をそれぞれ解析培地で６６．７ｎｍｏｌ／Ｌに希釈した。さらに６６．７ｎｍｏｌ／Ｌの試料を開始濃度として４倍勾配希釈を行い、陽性対照抗体（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ、ＥｖｏｌｏｃｕｍａｂおよびＬｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）および陰性対照（ＬＤＬ、ＰＣＳＫ９＋ＬＤＬおよびＩｇＧ）は同じ操作を行った。得られた各濃度勾配試料のそれぞれ６０μｌを６６．７ｎｍｏｌ／ＬのＰＣＳＫ９６０μｌと等体積混合して各混合液を得た。ブランク対照は１２０μｌの解析培地である。９６ウェルプレート内の液体を吸引廃棄し、１ウェル当たり５０μｌの上記混合液とブランク対照試料を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１ｈインキュベートした。培養プレートを取り出し、１ウェル当たり５０μｌを加え、解析培地で希釈した６μｇ／ｍｌのＢＯＤＩＰＹ標識ＬＤＬ溶液（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）を加え、培養プレートを３７℃に置き、５％ＣＯ２条件下で４ｈ培養した。培地を捨て、各ウェルに１００μｌのＰＢＳ溶液を加えてプレートを洗浄した後、捨てた。２回洗浄し、各ウェルに１００μｌのＰＢＳ溶液を加えた。Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｉ３酵素マーカーを用いて、蛍光値を読み取った。 
【０１８８】
得られた蛍光値のオリジナルデータを下表４に示し、表４に開示したデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアで解析してプロットし、図２を得た。実験結果から、抗ＰＣＳＫ９抗体（ＡＤＩ−１００８５、ＡＤＩ−１００８７、ＡＤＩ−１００８８、ＡＤＩ−１００８９）は、抗ＰＣＳＫ９抗体を加えない蛍光値と比較して、ＨｅｐＧ２細胞に作用した場合、蛍光値が約２倍増強することがわかった。これらのデータは、本出願に開示される各抗ＰＣＳＫ９抗体がＨｅｐＧ２細胞においてＬＤＬＲの回復能力を増加させ、ＰＣＳＫ９により誘導されるＬＤＬ−ｃ取り込みの低下を抑制し、それによりＨｅｐＧ２細胞がＬＤＬ−ｃ取り込みを増加させ、そして１６．８ｎＭと６６．７ｎＭの勾配では、その効果はいずれも陽性対照抗体よりも優れていた。
【０１８９】
【表１１】
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【０１９０】
実施例５．細胞ＬＤＬＲ内在化解析実験
ＰＣＳＫ９はＬＤＬＲと直接結合してＬＤＬＲ内在化を促進でき、肝細胞に入ってからリソソーム分解に運ばれ、それによって細胞表面発現のＬＤＬＲを減少させ、血清中のＬＤＬ−ｃのレベルを増加させる。抗ＰＣＳＫ９抗体はＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合を阻害し、それによってＰＣＳＫ９がＬＤＬＲを消費する能力を低下させ、本実験はＣＨＯ−ＬＤＬＲ細胞を抗ＰＣＳＫ９抗体およびＰＣＳＫ９タンパク質溶液と共同でインキュベートすることにより、上述のフローサイトメトリーを用いてＬＤＬＲの蛍光値を測定し、抗ＰＣＳＫ９抗体と陽性対照抗体（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）の蛍光値を比較し、細胞ＬＤＬＲ内在化に対する抗ＰＣＳＫ９抗体の生物活性を判断した。
【０１９１】
実施例１に記載のＰＣＳＫ９タンパク質を、ＲＰＭＩ  １６４０細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて５０μｇ／ｍｌの濃度で構成し、６０μｌ、１０００ｎｍの抗ＰＣＳＫ９抗体（ＡＤＩ−１００８５およびＡＤＩ−１００８７）をＰＣＳＫ９（５０μｇ／ｍｌ）溶液と混合し、均質化した後に３０ｍｉｎインキュベートし、陽性抗体対照を同じように処理した。ＣＨＯ細胞とＣＨＯ−ＬＤＬＲ細胞をそれぞれ遠心分離し、５００ｇを室温で３ｍｉｎ遠心分離し、ＰＢＳ溶液で細胞を再懸濁し、細胞密度を２×１０６個／ｍｌに調整し、９６ウェルＵプレートに、１００μｌ／ウェルで加え、上記の混合した試料１００μｌ／ウェルを培養プレートに添加し、４つのバッチに分け、均一に吹き込み、４℃で４ｈインキュベートした。その後、２００μｌのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、５００ｇを室温で３ｍｉｎ遠心分離した。抗−ＬＤＬＲ−ＰＥ（北京義翹公司、品番２０１３１−Ｒ３０１−Ｐ）５μｌを１００μｌのＰＢＳ溶液に加えて希釈し、その後１００μｌずつ９６ウェルＵプレートに加え、光を避けて３０ｍｉｎインキュベートした。さらに２００μｌのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、５００ｇを３ｍｉｎ遠心分離し、得られた細胞を細胞培地で再懸濁し、ＣＨＯ−ＬＤＬＲ細胞表面にＰＥ蛍光を標識したＬＤＬＲタンパク質の蛍光シグナルを、フローサイトメトリーを用いて検出し、実験結果は表５を参照されたい。表５のオリジナルデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアで解析してプロットし、図３を得た。
【０１９２】
表５の結果から、本出願で得られた抗体は、細胞のＬＤＬＲ内在化を阻害するのに有効であることが分かる。
【０１９３】
【表１２】
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【０１９４】
実施例６．健康なＳＤラットに対する抗ＰＣＳＫ９抗体の血中脂質低下効果
試験抗体（抗ＰＣＳＫ９抗体ＡＤＩ−１００８７）を本分野の常法に従ってＳＰＦ級ＳＤラット（北京維通利華実験動物技術有限公司）に投与し、雌ラットは体重が約２５４〜２９４ｇで、約９〜１２週齢であり、雄ラットは体重が約３６９〜４２０ｇで、約９〜１２週齢である。各群とも単回投与であり、投与計画の詳細は表６を参照されたい。
【表１３】
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【０１９５】
各群の動物は、投与前０ｈ（Ｄ１）、投与後７２ｈ（Ｄ４）、１６８ｈ（Ｄ８）、３３６ｈ（Ｄ１５）、５０４ｈ（Ｄ２２）、６７２ｈ（Ｄ２９）、８４０ｈ（Ｄ３６）の時点で常法に従って頸静脈採血を行った。抗凝固剤のない試験管に採取し、氷上に放置して凝固させた後、２〜８℃、５０００ｒｐｍ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、血清を採取し、Ｈｉｔａｃｈｉ  ７０６０型自動生化学分析器を用いてＬＤＬ−ＣおよびＨＤＬ−Ｃの測定を行った。血中脂質分析データに基づいて、各時点におけるＬＤＬ−ＣおよびＨＤＬ−Ｃの投与前（基線）に対する変化率（％ＬＤＬ−Ｃおよび％ＨＤＬ−Ｃ）を計算した。実験結果によれば、ラットに本願の抗ＰＣＳＫ９抗体３〜３０ｍｇ／ｋｇを単回皮下投与すると、血清ＬＤＬ−ＣおよびＨＤＬ−Ｃレベルを投与量依存的に低下させることができることがわかった（図６および図７）。例えば投与後３日目、７日目、１４日目、２１日目のそれぞれにおいて、基線レベルより有意に低下した。さらに、出願人は、ラットに１０ｍｇ／ｋｇのＥｖｏｌｏｃｕｍａｂを単回皮下投与した後、血清ＬＤＬ−ＣおよびＨＤＬ−Ｃレベルが有意に低下しないことを同時に発見した。
【０１９６】
本発明の他の抗体についても、同様の方法を適用して上記測定を行うことができる。
【０１９７】
実施例７．健康なカニクイザルに対する抗ＰＣＳＫ９抗体の血中脂質低下効果
試験抗体（抗ＰＣＳＫ９抗体ＡＤＩ−１００８７）を本分野の常法に従ってカニクイザル（広東春盛生物科技発展有限公司）に投与し、雌動物は体重が約２〜４ｋｇで、年齢が約３〜５歳であり、雄動物は体重が約３〜５ｋｇで、年齢が約３〜５歳である。投与案は表７を参照されたく、ここで、群１〜５は単回投与であり、群６は週１回投与であり、合計４回投与した。
【０１９８】
【表１４】
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【０１９９】
群１〜５の場合、投与前０ｈおよび投与後２４ｈ（Ｄ２）、７２ｈ（Ｄ４）、１２０ｈ（Ｄ６）、１６８ｈ（Ｄ８）、３３６ｈ（Ｄ１５）、５０４ｈ（Ｄ２２）、６７２ｈ（Ｄ２９）、８４０ｈ（Ｄ３６）、１００８ｈ（Ｄ４３）、１１７６ｈ（Ｄ５０）および１３４４ｈ（Ｄ５７）の時点で、常法に従って動物の投与肢の反対側前肢または後肢から、皮下静脈または鼠径動脈／鼠径静脈採血を行った。群６については、初回投与前０ｈおよび投与後２４ｈ（Ｄ２）、７２ｈ（Ｄ４）、１２０ｈ（Ｄ６）、１６８ｈ（Ｄ８、２回目の投与前）、３３６ｈ（Ｄ１５、３回の投与前）の時点で上記のように採血した。最終投与は、投与前０ｈ、投与開始後２４ｈ（Ｄ２）、７２ｈ（Ｄ４）、１２０ｈ（Ｄ６）、１６８ｈ（Ｄ８）、３３６ｈ（Ｄ１５）、５０４ｈ（Ｄ２２）、６７２ｈ（Ｄ２９）、８４０ｈ（Ｄ３６）、１００８ｈ（Ｄ４３）、１１７６ｈ（Ｄ５０）および１３４４ｈ（Ｄ５７）で採血した。
【０２００】
凝固促進剤および分離ゲルを含有する試験管に全血を収集し、氷上に放置して凝固させた後、２〜８℃で遠心分離し、５０００ｒｐｍ／ｍｉｎで、１０ｍｉｎ遠心分離し、血清を収集した。全血液試料採取終了後、総コレステロール（ＴＣ）、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃの測定を行った。血中脂質分析データから、各時点におけるＬＤＬ−ＣおよびＨＤＬ−Ｃの投与前（基線）に対する変化率（％ＬＤＬ−Ｃおよび％ＨＤＬ−Ｃ）を算出した。実験結果によると、カニクイザルは３、１０、３０ｍｇ／ｋｇの本出願の抗ＰＣＳＫ９抗体（ＡＤＩ−１００８７）を単回皮下投与した後、血清ＬＤＬ−Ｃ（図８）とＴＣ（図１０）のレベルがいずれも著しく低下し、そして比較的明らかな量的効果の関係を示し、投与後３〜２８日で基線レベルより著しく低下した。本出願に開示される抗体は、ＬＤＬ−ＣおよびＴＣに関連する状況および／または病的状態、例えば血中脂質を低下させるのに有用であり得ることが示される。
【０２０１】
抗ＰＣＳＫ９抗体投与後のカニクイザル血清ＨＤＬ−Ｃレベルには全体的に明らかな影響はなかった（図９）。
【０２０２】
しかし、本出願人は驚くべきことに、カニクイザルが本出願の抗ＰＣＳＫ９抗体とＥｖｏｌｏｃｕｍａｂをそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇずつ単回皮下投与した後、Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ投与後にＬＤＬ−Ｃが基線レベルより著しく低下する期間が１４日しかないことを発見し、同一投与量の本出願の抗体投与後２１日未満、すなわち、本出願の抗ＰＣＳＫ９抗体が、ＥｖｏｌｏｃｕｍａｂよりもＬＤＬ−Ｃを有意に低下させる時間が長い。
【０２０３】
本発明の他の抗体についても、同様の方法を適用して上記測定を行うことができる。
【０２０４】
実施例８：本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体液体製剤（製剤Ａ）の製造
抗ＰＣＳＫ９液体製剤を処方Ａに従って１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。
処方Ａ
抗ＰＣＳＫ９抗体        １５０ｍｇ／ｍｌ
（ＡＤＩ−１００８７）
ヒスチジン              １．５ｇ／Ｌ
アルギニン              ９０ｍｍｏｌ／Ｌ
ソルビトール            ３％
ポリソルベート８０      ０．３ｇ／Ｌ
ｐＨ                    ５．５
【０２０５】
実施例２で得られた抗ＰＣＳＫ９抗体（ＡＤＩ−１００８７）を限外濾過遠心分離管（カットオフ分子量３０ＫＤ）に加え、遠心分離により濃縮した後、ポリソルベート８０および抗ＰＣＳＫ９抗体を含まない処方Ａ水溶液（１．５ｇ／Ｌヒスチジン、９０ｍｍｏｌ／Ｌアルギニン、３％ソルビトール、ｐＨ５．５）を加えて希釈した後に濃縮を継続し、置換が完了するまでこのように繰り返した。置換後のタンパク質を１５０ｍｇ／ｍｌに調整した後、１／１００体積のポリソルベート８０水溶液（３０ｇ／Ｌ）を加え、ポリソルベート８０の終濃度を０．３ｇ／Ｌとした。この半製品を無菌濾過した後、バイアル瓶に分注し、ゴム栓とアルミニウム製プラスチック蓋をして完成品を得た。
【０２０６】
実施例９：本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体液体製剤の比較例（製剤Ｂ）の製造
比較例：抗ＰＣＳＫ９液体製剤を処方Ｂに従って１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。
処方Ｂ
抗ＰＣＳＫ９抗体        １５０ｍｇ／ｍｌ
（ＡＤＩ−１００８７）
ヒスチジン              １．５ｇ／Ｌ
アルギニン              １８０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリソルベート８０      ０．３ｇ／Ｌ
ｐＨ                    ５．５
【０２０７】
実施例２で得られた抗ＰＣＳＫ９抗体（ＡＤＩ−１００８７）を限外濾過遠心分離管（カットオフ分子量３０ＫＤ）に加え、遠心分離により濃縮した後、ポリソルベート８０および抗ＰＣＳＫ９抗体を含まない処方Ｂ水溶液（１．５ｇ／Ｌヒスチジン、１８０ｍｍｏｌ／Ｌアルギニン、ｐＨ５．５）を加えて希釈した後に濃縮を継続し、置換が完了するまでこのように繰り返した。置換後のタンパク質を１５０ｍｇ／ｍｌに調整した後、１／１００体積のポリソルベート８０水溶液（３０ｇ／Ｌ）を加え、ポリソルベート８０の終濃度を０．３ｇ／Ｌとした。この半製品を無菌濾過した後、バイアル瓶に分注し、ゴム栓とアルミニウム製プラスチック蓋をして完成品を得た。
【０２０８】
実施例１０：抗ＰＣＳＫ９抗体液体製剤の粘度測定
コーンプレート粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ、ＣＡＰ１０００＋／２０００＋、詳細はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｎｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｄｅｔａｉｌｓ−４−８３−４０１−６０．ｈｔｍｌを参照）を用いて室温２０〜２５℃で粘度測定を行った。ローターおよび速度を選択した（ローター：ｃｐ−４０、回転数：２５ｒｐｍ）。ローターを連結ナットに取り付け、位置を調節し、試料を添加した。Ｒｕｎボタンを押し、試料粘度測定を行った。上記の実験に従って製剤Ａの粘度が５．２センチポアズであり、製剤Ｂの粘度が６．０センチポアズであると測定した。驚くべきことに、製剤Ａの粘度は製剤Ｂの粘度よりも著しく低く、アルギニンとソルビトールの組み合わせが高濃度抗体製剤の粘度を低下させるのにより有利であることを示している。
【０２０９】
実施例１１：抗ＰＣＳＫ９抗体液体製剤のタンパク質純度変化
製剤Ａと製剤Ｂの安定性を調べるために加速安定性実験を行った。バイアル瓶に分注し、プラグで蓋をした製剤Ａと製剤Ｂの完成品を４０℃±２℃／６０％ＲＨ±５％ＲＨの条件下で加速安定性の考察を行い、考察期間は２か月間継続した。この間、タンパク質純度の変化を下記のＳＥＣ−ＨＰＬＣ法、非還元型ＣＥ−ＳＤＳ法により測定した。
【０２１０】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法：
試料濃度を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、親水性シリカゲル体積排除カラムＴＳＫＧ  ３０００ＳＷｘｌ、タンパク質注入量１００μｇ、移動相２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、２００ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン、ｐＨ６．８、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２８０ｎｍ、カラム温度２５℃で面積正規化法により算出した。
【０２１１】
ＣＥ−ＳＤＳ法：
試料約１００μｇに、ｐＨ７．０試料緩衝液を加えて総体積を９５μｌとし、還元試料に５μｌのβ−メルカプトエタノールを加え、非還元試料に５μｌの２５０ｍｍｏｌ／ＬのＮＥＭを加え、混合した後に７０℃で１０ｍｉｎ加熱し、測定を行った。
【０２１２】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法において、タンパク質純度の変化は、ＳＥＣ主ピークの減少パーセントに基づいて測定され、製剤Ａのタンパク質純度は、１か月で２．６％、２か月で３．７％低下した。製剤Ｂのタンパク質純度は、１か月で４．１％、２か月で７．０％低下した。タンパク質純度の変化は、非還元ＣＥ−ＳＤＳの減少パーセントに基づいて測定され、製剤Ａのタンパク質純度は、２週間で０．４％低下し、１か月で２．０％低下した。製剤Ｂのタンパク質純度は、２週間で２．５％低下し、１か月で７．３％低下した。製剤Ａの純度変化速度は、製剤Ｂに比べて著しく遅いことがわかる。製剤Ｂと比較して、製剤Ａは、より高い安定性を有する。
【０２１３】
実施例１２：抗ＰＣＳＫ９抗体液体製剤の電荷不均一性測定
実施例１１において加速安定性試験を行った製剤Ａおよび製剤Ｂから異なる時点で試料を採取し、電荷不均一性の測定を行った。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｕｎｃｏａｔｅｄ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙキャピラリー、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＰＡ８００  ｐｌｕｓキャピラリー電気泳動器を用い、サンプリング電圧は０．５ｐｓｉ、サンプリング時間は１０．０ｓ、単離電圧は３０ｋＶ、解析時間は３０ｍｉｎであった。面積正規化法を用いて、総ピーク面積に対する酸性成分、塩基性成分および主ピークのピーク面積のパーセントを算出した。製剤Ａは２週間でＣＺＥの主ピークが０％低下し、１か月で２．９％低下した。一方、製剤Ｂは２週間でＣＺＥの主ピークが２．０％低下し、１か月で７．６％低下した。
【０２１４】
製剤Ａの電荷不均一性の変化速度は、製剤Ｂよりも著しく遅く、アルギニンとソルビトールの組み合わせは、製剤の電荷不均一性の変化をより少なくすることがわかる。
【０２１５】
以上、本発明の例示的な実施形態について説明したが、これらの開示は例示に過ぎず、本発明の範囲内で様々な他の代替、適応、および修正が可能であることを当業者は理解するであろう。したがって、本発明は、本明細書に列挙した特定の実施形態に限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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