(57)【要約】【課題】単離および精製された乳酸菌であるラクトバチルスパラカゼイＰＳ２３（ＰＳ２３）およびその応用を提供する。【解決手段】ＰＳ２３は、老化を遅延させる、免疫調節活性を向上させる、アレルギーを抑制、予防、または、治療する、炎症を抑制、予防、または、治療する、腸炎症に関連する慢性疾患を予防または治療する、および／または、気分障害もしくは神経症状を予防および／または治療する。
2021509811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離および精製された乳酸菌であるラクトバチルスパラカゼイＰＳ２３（ＰＳ２３）であって、ライプニッツ研究所ＤＳＭＺ・ドイツ微生物細胞培養コレクションにブダペスト条約に基づき寄託され、ＤＳＭＺ受託番号３２３２２が付与されているＰＳ２３。
【請求項２】
ＰＳ２３細胞、および、任意で食用担体または医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３】
前記ＰＳ２３細胞は、生存細胞または死細胞である細菌全体の形態で用いられ得る、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
経口投与に適した形態を成す、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
固体、半固体、液体、および、粉末の顆粒の形態を成す、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
（ｉ）老化を遅延させる（老化防止）、（ｉｉ）免疫調節活性を向上させる、（ｉｉｉ）アレルギーを抑制、予防、または、治療する、（ｉｖ）炎症を抑制、予防、または、治療する、（ｖ）腸炎症に関連する慢性疾患を予防または治療する、および／または、（ｖｉ）気分障害もしくは神経症状を予防および／または治療する、または、被検体のニューロンのアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患を治療もしくは予防するための製剤の製造における、請求項１に記載の乳酸菌の使用。
【請求項７】
前記老化防止は、免疫老化を予防もしくは遅延させる、サルコペニアを予防もしくは遅延させる、または、腸バリアもしくは腸管免疫を高めることを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ＰＳ２３は、免疫系の年齢に関係する劣化または免疫老化、および、炎症加齢に関連する慢性疾患を予防または治療できる、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記ＰＳ２３は、サルコペニアを予防または遅延させることができる、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
ニューロンのアポトーシスまたは神経変性に関連する疾患は、卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ＡＬＳ−痴呆複合症、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上性麻痺、神経障害性疼痛関連の双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、脳卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症、および、うつ病からなる群から選ばれる、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＰＳ２３は、学習能力、記憶力、および、自発運動活性を高めることができる、請求項６に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＰＳ２３は、ストレス関連の疾患を予防または治療できる、請求項６に記載の使用。
【請求項１３】
前記ストレス関連の疾患は、慢性的な脳の炎症、脳血管事故、老化、および、神経変性病を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記ＰＳ２３は、睡眠の質および効率を高めることができる、請求項６に記載の使用。
【請求項１５】
前記腸炎症に関連する慢性疾患は、炎症性腸疾患、および、炎症性腸症候群を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１に記載の乳酸菌は、約１×１０７〜約１×１０１３細胞／日の量の加熱殺菌したＰＳ２３細胞として、または、約１×１０７〜約１×１０１３ＣＦＵ／日の量の生きたＰＳ２３細胞として投与される、請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なプロバイオティクスおよびその応用に関する。
特に、本発明は、新規な乳酸菌、関連組成物、および、その使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機構（ＷＨＯ）は、プロバイオティクスを“生きた微生物であり、十分な量で投与すると、宿主に対して健康的な有益性をもたらす”と定義している。乳酸菌などのプロバイオティクスは、腸機能調節活性、免疫刺激活性、および、抗がん活性を有する。
【０００３】
牛乳、パン、野菜、および、他の食用植物材料を含む発酵食品の製造にはさまざまな株の乳酸菌（ＬＡＢ）が用いられている。乳酸菌（ＬＡＢ）は、グラム陽性菌の一種であり、一般的に発酵食品の生産に用いられる。食事、および、臨床用途における乳酸菌の利点は、広く研究されている。乳酸菌は、腐敗細菌の成長を阻害するため、発酵中に生成される発酵産物の低ｐＨおよび作用を生かして食品を保存するための発酵材料として利用されてきた。このため、乳酸菌は、チーズ、ヨーグルト、および、他の発酵乳製品などのさまざまな種類の食料品を調製するために用いられてきた。乳酸菌は、摂取するとすぐにヒトや動物に対して有益な性質を示すということが分かっているという点で、大いに注目されている。特に、ラクトバチルスまたはビフィドバクテリウムの特定の株は、腸粘膜にコロニーを形成し、ヒトおよび動物の健康維持に役立たせることができることがわかっている。抗炎症活性および免疫調節活性は、乳酸菌のよく知られた特性である。特許文献１は、ラクトバチルスジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）株のＤＮＡ配列の使用に関し、特に、微生物と、それらがコロニーを形成する宿主との相互作用を解明し、さらに、そのような株によって示されるプロバイオティック特性の原理を解明するためのゲノム配列に関する。特許文献２は、気分障害、または、神経症状を改善し、神経変性疾患を治療または予防するため、単離した乳酸菌であるラクトバチルスファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＰＳ１５０を提供している。
【０００４】
しかしながら、健康に良い新規のプロバイオティクスの開発が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７８７５４２１号
【特許文献２】国際公開公報第２０１８／１２９７２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、単離および精製された乳酸菌であるラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＰＳ２３を提供する。ＰＳ２３は、ライプニッツ研究所ＤＳＭＺ・ドイツ微生物細胞培養コレクションにブダペスト条約に基づき寄託され、ＤＳＭＺ受託番号３２３２２が付与されている。
【０００７】
また、本開示は、本発明のＰＳ２３細胞を含む組成物、および、任意で、食用担体、または、医薬的に許容される担体も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態では、ＰＳ２３細胞は、生存または死細胞である細菌全体の形態で用いられ得る。一実施形態では、組成物は、経口投与に適した形態を成す。さらなる実施形態では、組成物は、固体、半固体、液体、および、粉末の顆粒の形態を成す。
【０００９】
本開示は、また、（ｉ）老化を遅延させる（老化防止）、（ｉｉ）免疫調節活性を向上させる、（ｉｉｉ）アレルギーを抑制、予防、または、治療する、（ｉｖ）炎症を抑制、予防、または、治療する、（ｖ）腸炎症に関連する慢性疾患を予防または治療する、および／または、（ｖｉ）気分障害もしくは神経症状を予防および／または治療する、または、被検体のニューロンのアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患を治療もしくは予防するための製剤の製造における、請求項１に記載の乳酸菌の使用に関する。
【００１０】
一実施形態では、老化防止は、免疫老化を予防もしくは遅延させる、サルコペニアを予防もしくは遅延させる、または、腸バリアもしくは腸管免疫を高めることである。
【００１１】
一実施形態では、ＰＳ２３は、免疫系における年齢に関係する劣化（すなわち免疫老化）および炎症加齢に関連する慢性疾患を予防または治療できる。
【００１２】
一実施形態では、ＰＳ２３は、サルコペニアを予防または遅延させることができる。
【００１３】
一実施形態では、ニューロンのアポトーシスまたは神経変性に関連する疾患は、卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ＡＬＳ−痴呆複合症、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上性麻痺、神経障害性疼痛関連の双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、脳卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症、および、うつ病からなる群から選ばれる。
【００１４】
一実施形態では、ＰＳ２３は、ストレス関連の疾患を予防または治療できる。一実施形態では、ＰＳ２３は、睡眠の質および効率を向上させることができる。
【００１５】
一実施形態では、腸炎症に関連する慢性疾患は、炎症性腸疾患、または、炎症性腸症候群である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ラクトバチルスパラカゼイ亜種パラカゼイＰ２３、および、他のラクトバチルスカゼイおよびラクトバチルスパラカゼイ株を示す。Ｍは、マーカー（２５０〜１０，０００ｂｐ）；第１列は、ラクトバチルスパラカゼイ亜種トレランスＡＴＣＣ  ２５５９９；第２列は、ラクトバチルスパラカゼイ亜種パラカゼイＡＴＣＣ  ２５３０２；第３列は、ラクトバチルスカゼイ亜種カゼイＡＴＣＣ３９３；第４列は、ラクトバチルスパラカゼイ亜種パラカゼイＰＳ２３である。
【図２】加熱殺菌したまたは生きたＰＳ２３による糞便の潜血スコアの減少を示す。
【図３Ａ】ＰＳ２３によるＤＳＳ誘発性結腸短縮の抑制を示す。ＤＳＳ処置した群の平均長は、対照群より著しく短い。
【図３Ｂ】ＰＳ２３によるＤＳＳ誘発性結腸短縮の抑制を示す。ＰＳ２３は、結腸におけるＤＳＳ誘発性組織損傷を回復させる。
【図４】ＰＳ２３は、結腸の炎症性サイトカイン濃度およびＭＰＯ活性を低下させることを示す。
【図５】ＰＳ２３は、若年期のストレスによって誘発される異常な表現型を正常化できることを示す；（Ａ）および（Ｂ）は、ＭＳマウスがオープンフィールド領域の中心区画の滞在時間および進入回数が少ないことを示す；（Ｃ）は、ＭＳマウスがＥＰＭオープンアームで過ごす時間のパーセンテージが少ないことを示す；（Ｄ）は、立ち上がり回数が少なく、ＭＳマウスの探索的行動が抑制されたことを示す；（Ｅ）は、ＭＳは、マウスの不安様行動を引き起こすだけでなく、うつ様行動も引き起こすことを示す。
【図６】ＰＳ２３は、ＭＳ誘発性炎症を正常化することを示す。
【図７】ＰＳ２３は、ＭＳ誘発性ＨＰＡ軸機能不全を正常化することを示す。
【図８】ＰＳ２３は、海馬におけるＧＲおよびＢＤＮＦタンパク質の発現を増加させることを示す。
【図９】母子分離マウスの海馬におけるドーパミン代謝率を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＊＊＊ｐ＜０．００１対対照群；＃＃＃ｐ＜０．００１対ＭＳ群。
【図１０】モーリスの水迷路試験によるＳＡＭＰ８マウスにおける学習能力および記憶力の行動評価を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図１１】オープンフィールド試験で評価したＳＡＭＰ８マウスの自発運動活性を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図１２Ａ】ＳＡＭＰ８マウスの脳組織におけるセロトニン量を示す。
【図１２Ｂ】ＳＡＭＰ８マウスの脳組織におけるドーパミン量を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図１３】ＳＡＭＰ８マウスにおける血清ＢＤＮＦ濃度を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図１４Ａ】ＳＡＭＰ８マウスの前頭前皮質および海馬におけるＳＯＤの量を示す。
【図１４Ｂ】ＳＡＭＰ８マウスの前頭前皮質および海馬におけるＧＰｘの量を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図１５】ＳＡＭＰ８マウスの老化度の評価を示す。評価カテゴリは、（Ａ）行動、（Ｂ）肌および毛、（Ｃ）眼および脊椎を含む。データは平均値±標準偏差として示されている。老化度判定基準は、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１７（２）：１８３−９４  （１９８１）に従った。
【図１６】ＳＡＭＰ８マウスの貪食活性を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図１７Ａ】ＳＡＭＰ８マウスの血清中のＩＬ−１０の濃度を示す。
【図１７Ｂ】ＳＡＭＰ８マウスの血清中のＴＮＦ−αの濃度を示す。
【図１７Ｃ】ＳＡＭＰ８マウスの血清中のＭＰＣ−１の濃度を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図１８】ＳＡＭＰ８マウスの脾臓細胞におけるトータルＴ細胞およびＣＤ４+細胞のパーセンテージを示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図１９】ＣｏＡによって刺激されたＳＡＭＰ８マウスの脾細胞のＩＦＮガンマおよびＩＬ−５の産生量を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図２０】ＳＡＭＰ８マウスの血清中のＳＯＤおよびＧＰｘ量に及ぼすＰＳ２３の影響を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図２１Ａ】ＳＡＭＰ８マウスの身体組成を示す。
【図２１Ｂ】ＳＡＭＰ８マウスの前肢握力を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図２２】ＳＡＭＰ８マウスのヒラメ筋の酸素消費速度を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図２３】ＳＡＭＰ８マウスの前脛骨筋における筋肉ミトコンドリアの合成に関連する遺伝子発現を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図２４】ＳＡＭＰ８マウスの前脛骨筋における炎症性サイトカインＩＬ−６の遺伝子発現を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図２５Ａ】ＳＡＭＰ８マウスの腸透過性を示す。
【図２５Ｂ】ＳＡＭＰ８マウスの腸長を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図２６Ａ】ＳＡＭＰ８マウスの腸液におけるＭＣＰ−１の量を示す。
【図２６Ｂ】ＳＡＭＰ８マウスの腸液におけるＩｇＡの量を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対非老化群；＊ｐ＜０．０５対老化群。
【図２７Ａ】オープンフィールド試験により評価した、繰り返しＣＯＲＴ注射を受けたマウスの総移動距離を示す。
【図２７Ｂ】オープンフィールド試験により評価した、繰り返しＣＯＲＴ注射を受けたマウスの中央区画滞在時間を示す。
【図２７Ｃ】オープンフィールド試験により評価した、繰り返しＣＯＲＴ注射を受けたマウスの中央区画進入回数を示す。
【図２７Ｄ】オープンフィールド試験により評価した、繰り返しＣＯＲＴ注射を受けたマウスの中央区画までの距離を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１対対照群；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対ＣＯＲＴ群。
【図２８Ａ】繰り返しＣＯＲＴ注射を受けたマウスの、強制水泳試験により評価した不動時間を示す。
【図２８Ｂ】繰り返しＣＯＲＴ注射を受けたマウスのショ糖嗜好性を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５対対照群；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対ＣＯＲＴ群。
【図２９Ａ】繰り返しＣＯＲＴ注射を受けたマウスの海馬におけるミネラルコルチコイド受容体の相対発現量を示す。
【図２９Ｂ】繰り返しＣＯＲＴ注射を受けたマウスの海馬におけるグルココルチコイド受容体の相対発現量を示す。
【図２９Ｃ】繰り返しＣＯＲＴ注射を受けたマウスの海馬におけるＢＤＮＦの相対発現量を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１対対照群；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１対ＣＯＲＴ群。
【図３０】繰り返しＣＯＲＴ注射を受けたマウスの糞便におけるビフィドバクテリウム種、ラクトバチルス種、および、クロストリジウムコッコイデス群の相対存在量を示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１対対照群；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対ＣＯＲＴ群。
【図３１】繰り返しＣＯＲＴ注射を受けたマウスの脳組織におけるセロトニンレベルを示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０５対対照群；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対ＣＯＲＴ群。
【図３２Ａ】ＰＳ２３を１週間経口投与することによってＰＳＱＩスコアが向上したことを示す。
【図３２Ｂ】ＰＳ２３を１週間経口投与することによって睡眠効率が向上したことを示す。データは平均値±標準偏差として示されている。＊ｐ＜０．０５。
【図３３】実験計画を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
接続詞“および”によってつなげられた単語の群は、それらの単語のそれぞれおよびすべてがその群の中に存在することを要求していると見なされるべきではなく、むしろ、特に記載のない限り、“および／または”として読まれるべきである。同様に、接続詞“または”によってつなげられた単語の群は、その群の中で相互に排他的であることを要求していると見なされるべきではなく、むしろ、特に記載のない限り、“および／または”として読まれるべきである。さらに、本発明の要素または構成要素は、単数で記載されるかもしれないが、単数であると明確に記載していない限り、複数も本発明の範囲内に含まれる。
【００１８】
本願明細書中で使用される単数を表す冠詞は、特に明記しない限り単数および複数のどちらも意味する。したがって、単数形を表す冠詞（必要に応じて文法上変化する）は、１つ以上を意味する。
【００１９】
用語“プロバイオティクス”とは、適切な量で投与されたとき宿主に健康的効果をもたらす微生物として当技術では認識されている。プロバイオティクス微生物は、毒性のないこと、生存度、付着性、および、有益な効果に関していくつかの要件を満たさなくてはならない。これらのプロバイオティクスの特徴は、同種の細菌においてさえも株に依存する。
【００２０】
本願明細書中で用いられる用語“医薬的に許容される”とは、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または、妥当な利益／危険比に比例する他の問題もしくは合併症なしで被検体（ヒトまたはヒトでない動物）の組織と接触して用いるのに適した、健全な医学的判断の範囲内での化合物、材料、組成物、および／または、剤形のことを指す。担体、賦形剤などは、それぞれが製剤の他の成分と共存できるという意味において“許容される”ものでなければならない。適切な担体、賦形剤などは、標準的な製薬の教科書で確認することができる。
【００２１】
用語“食用担体”とは、被検体の組織と接触して用いるのに適した化合物、材料、組成物、および／または、剤形のことを指す。各担体もまた、製剤の他の成分と共存できるという意味において“許容される”ものでなければならない。本願明細書中で用いられる用語“有効量”とは、健全な医学的判断の範囲内において、治療される症状が著しく快方に向かうために十分多く、深刻な副作用を避けるために十分少ない（妥当な利益／危険比での）組成物における各株のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の量を指す。
【００２２】
本願明細書中で用いられる用語“障害”は、“疾病”または“疾患”と置き換えられる。
【００２３】
本願明細書中で用いられる用語“気分障害”とは、気分がひどく変化することを言い表す病気のカテゴリである。気分障害による病気は、大うつ病性障害、双極性障害（躁病−多幸性、活動過多、いい気になり過ぎる、非現実的な楽観主義）、持続性抑うつ障害（慢性低悪性度うつ）、循環気質（双極性障害の軽症型）、および、季節性感情障害（ＳＡＤ）を含む。本願明細書中で用いられる用語“神経症状”とは、行動、記憶、または、認知の観点から、神経障害および疾患が脳機能に影響を及ぼす病気のカテゴリである。神経症状における病気は、これらに限定されないが、ストレス（慢性的な軽度のストレス）、認知低下、認知障害（軽度認知障害（ＭＣＩ）を含む）、記憶力の衰え、一般的な記憶力の問題、認知障害、または、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、卒中、および、統合失調症などの神経変性疾患を含む。
【００２４】
“治療”とは、特定の疾病または疾患の少なくとも１つの兆候、症状、徴候、または、影響を低下または減少させることを意味するものと理解される。本願明細書中で用いられる“予防”とは、発病率もしくは発病度を制限、低下させるか、または、疾病もしくは疾患の少なくとも１つの兆候もしくは徴候の進行を阻害することであると理解される。本願明細書中で用いられる用語“被検体”とは、本開示の化合物または組成物の投与から恩恵を受けることができる動物である。いくつかの実施形態では、被検体は、例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、および、ラットやマウスなどの齧歯類を含む哺乳類である。典型的には、哺乳類は、ヒトである。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、単離および精製された乳酸菌であるラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＰＳ２３を提供する。ＰＳ２３は、ライプニッツ研究所ＤＳＭＺ・ドイツ微生物細胞培養コレクションにブダペスト条約に基づき寄託され、ＤＳＭＺ受託番号３２３２２が付与されている。
【００２６】
一実施形態では、単離および精製されたラクトバチルスパラカゼイ群は、健康なヒトの糞便から単離される。
【００２７】
一実施形態では、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列およびｐｈｅＳ遺伝子配列は、ＰＳ２３がラクトバチルスパラカゼイ亜種パラカゼイに最も類似していることを示す。
【００２８】
他の側面では、本発明は、本発明のＰＳ２３細胞を含む組成物、および、任意で、食用担体、または、医薬的に許容される担体を提供する。本発明の組成物において、ＰＳ２３細胞は、生存していているかまたは生存していない可能性のある細菌全体の形態で用いられ得る。好ましくは、細菌細胞は、生きているまたは生存細胞として存在する。
【００２９】
本発明の組成物は、投与に適したいかなる形態、特に、経口投与に適した形態であってよい。形態は、例えば、固体、半固体、液体、および、粉末の顆粒を含む。
【００３０】
本発明の組成物の例としては、食品、特に、乳製品を含む栄養組成物が挙げられる。
【００３１】
組成物は、例えば、カプセル、錠剤、飲料、粉末、または、乳製品であり得る。任意で、プロバイオティクス（乳酸菌など）の他の株が存在してもよい。好ましくは、本願の栄養組成物は、ベビーフード、乳児用調合乳、または、乳児用フォローオン調合乳である。好ましくは、本願の組成物は、栄養補助食品、医薬品、栄養強化食品、または、病人向けの特別食（医療用食品）である。本発明の栄養組成物は、補助食品、および、機能性食品も含む。“補助食品”とは、通常食品に用いられる化合物から生成される製品であって、錠剤、粉末、カプセル、ポーション、または、食物とは通常関係のない他の形状をなし、被検体の健康に有益な効果をもたらす。“機能性食品”とは、被検体の健康に有益な効果をもたらす食物である。特に、補助食品、および、機能性食品は、疾病に効く、または、疾病から守ってくれる生理学的効果を有し得る。本発明による組成物が栄養補助食品である場合、水、ヨーグルト、牛乳、または、果汁などの適切な飲料液と混ぜるか、または、固体もしくは流動食と混ぜるなどして投与し得る。
【００３２】
その場合、栄養補助食品は、錠剤、丸薬、カプセル、トローチ剤、顆粒、粉末、懸濁液、小袋、トローチ、菓子、バー、シロップ、および、通常は単位用量形態である対応する剤形であり得る。好ましくは、栄養補助食品は、栄養補助食品を調製する従来の工程で製造される錠剤、トローチ剤、カプセル、または、粉末の形態で投与される、本発明の組成物を含む。
【００３３】
本願明細書中に記載される組成物は、１つ以上の医薬的に許容される担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などを含み得る医薬的に許容される組成物であってよい。本発明の組成物は、例えば、経口投与など、さまざまな経路の投与のために調製され得る。また、組成物は、カプセル化技術などにおける送達ビヒクルと組み合わせて提供され得る。
【００３４】
経口投与のためには、粉末、懸濁液、顆粒、錠剤、丸剤、カプセル、ジェルキャップ、および、カプレットが固形の剤形として好ましい。これらは、例えば、本開示の１つ以上の化合物と、デンプンなどの少なくとも１つの添加剤、または、他の添加剤とを混合することによって調製され得る。適切な添加剤は、スクロース、ラクトース、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成ポリマー、または、グリセリドである。任意で、経口投与形態は、不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、パラベンまたはソルビン酸などの保存剤、アスコルビン酸、トコフェロール、または、システインなどの抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝液、甘味料、または、香料などの、投与しやすくするための他の材料を含み得る。錠剤および丸剤は、当技術分野で知られた適切なコーティング材料でさらに処理されてよい。
【００３５】
経口投与のための液体剤形は、医薬的に許容されるエマルジョン、シロップ、エリキシル、懸濁液、および、溶液の形態をなし、水などの不活性希釈剤を含んでよい。医薬製剤および組成物は、これらに限定されないが、油、水、アルコール、および、それらの組み合わせなどの滅菌液を用いて、液体懸濁液、または、溶液として調製され得る。医薬的に適切な界面活性剤、懸濁剤、および、乳化剤が経口または非経口投与のために添加されてよい。
【００３６】
さらなる側面では、本発明は、（ｉ）老化を遅延させる（老化防止）、（ｉｉ）免疫調節活性を向上させる、（ｉｉｉ）アレルギーを抑制、予防、または、治療する、（ｉｖ）炎症を抑制、予防、または、治療する、（ｖ）腸炎症に関連する慢性疾患を予防または治療する、および／または、（ｖｉ）気分障害もしくは神経症状を予防および／または治療する、または、被検体のニューロンのアポトーシスもしくは神経変性に関連する疾患を治療もしくは予防するための方法を提供する。方法は、本発明のＰＳ２３細胞、または、本発明のＰＳ２３細胞を含む組成物を、被検体に有効量投与することを含む。
【００３７】
一実施形態では、有効量は、１日当たり約１×１０７〜１×１０１３個の加熱殺菌したＰＳ２３細胞、または、１日当たり約１×１０７〜１×１０１３コロニー形成単位（ＣＦＵ）の生きたＰＳ２３細胞である。いくつかの実施形態では、有効量は、１日当たり約１×１０７〜約１×１０１２、約１×１０７〜約１×１０１１、約１×１０７〜１×１０１０、約１×１０８〜約１×１０１３、約１×１０８〜約１×１０１２、もしくは、約１×１０８〜約１×１０１１個の加熱殺菌したＰＳ２３細胞、または、１日当たり１×１０７〜約１×１０１２、約１×１０７〜約１×１０１１、約１×１０７〜１×１０１０、約１×１０８〜約１×１０１３、約１×１０８〜約１×１０１２、もしくは、約１×１０８〜約１×１０１１ＣＦＵの生きたＰＳ２３細胞である。さらなる実施形態では、有効量は、１日当たり約１×１０１０個の加熱殺菌したＰＳ２３細胞、または、１日当たり約１×１０１０ＣＦＵの生きたＰＳ２３細胞である。
【００３８】
一実施形態では、老化防止は、これらに限定されないが、免疫老化を予防もしくは遅延させる、サルコペニアを予防もしくは遅延させる、または、腸バリアもしくは腸管免疫を高めることを含む。
【００３９】
ＰＳ２３は、貪食活性を高め、全身性炎症を回復させ、Ｔ細胞集団およびＣＤ４+細胞集団の総数を増加させ、脾細胞におけるＴｈ１／Ｔｈ２応答のバランスをとる。したがって、ＰＳ２３は、免疫系における年齢に関係する劣化（すなわち免疫老化）、および、心血管疾患、がん、および、２型糖尿病などの炎症加齢に関連する慢性疾患を予防または治療できる。
【００４０】
また、ＰＳ２３は、サルコペニアを予防または遅延させることができる。サルコペニアとは、加齢に伴って生じる筋肉量および筋力の低下のことであり、身体障害、生活の質の低下、および、フレイルと強い関連性がある。
【００４１】
一実施形態では、ニューロンのアポトーシスまたは神経変性に関連する疾患は、卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ＡＬＳ−痴呆複合症、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上性麻痺、神経障害性疼痛関連の双極性障害、大脳皮質基底核変性症、総合失調症、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、脳卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症、および、うつ病からなる群から選ばれ得る。
【００４２】
ＰＳ２３は、学習能力、記憶力、および、自発運動活性を高めることができる。したがって、ＰＳ２３は、神経変性を予防および遅延させることができる。これらの効果は、脳の酸化ストレスを低下させ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現を高めることによって達成される。したがって、ＰＳ２３は、慢性的な脳の炎症、脳血管事故、老化、および、神経変性病などの中枢神経系（ＣＮＳ）における老化および酸化ストレスに関連する疾患を予防、または、治療できる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＰＳ２３は、ストレス関連の疾患を予防または治療できる。ＰＳ２３は、不安様行動、探索的行動、および、うつ様行動を回復させ、ＨＰＡ軸の機能不全を正常化し、海馬におけるＧＲ（グルココルチコイドレセプター）およびＢＤＮＦタンパク質の発現を増加させ、ニューロンをストレスから守り、海馬におけるドーパミン代謝率を向上させる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＰＳ２３は、ストレス関連の疾患を予防および治療する。
ＰＳ２３は、コルチコステロン（ＣＯＲＴ）誘発性うつ様行動を回復させ、海馬におけるグルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）、および、ＢＤＮＦタンパク質の発現を増加させ、ニューロンをストレスから守り、脳内のセロトニンレベルを上昇させることができる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＰＳ２３は、睡眠の質および効率を向上させる。
【００４６】
一実施形態では、ＰＳ２３は、腸透過性を高め、腸炎症を抑制するか、または、粘膜免疫を高めることができる。一実施形態では、腸炎症に関連する慢性疾患は、これらに限定されないが、炎症性腸疾患、および、炎症性腸症候群を含む。
【００４７】
図面の簡単な説明に続く発明を実施するための形態は、以下の実施例でより詳細に説明される。言うまでもなく、これらの実施形態は、例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４８】
材料および方法
【００４９】
１．１  ＰＳ２３の調製
【００５０】
ＰＳ２３（ＤＳＭ３２３２２）を健康なヒトの糞便から単離し、その１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の系統発生的分類によって新規な株として識別した。単離したＰＳ２３を、マンロゴサシャープブロス（ＭＲＳ；ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ（商標）、ベクトンディッキンソン、米国メリーランド州スパークス）に接種し、３７℃で１８時間培養し、６０００×ｇの遠心分離に１０分間かけて収穫した。ペレットをＭＲＳ＋１２．５％グリセロール中に再懸濁して１ミリリットル当たり５×１０９コロニー形成単位の最終濃度にした。その後、再懸濁溶液をフリーザーチューブにアリコートし、使用するまで−２０℃で保存した。使用に当たり、アリコートを１時間予熱して３７℃にし、マウスに投与する前に生理食塩水に再懸濁した。
【００５１】
１．２  動物および飼育
【００５２】
本研究に使用されるすべてのマウスは、国立実験動物センター（台北、台湾）から購入され、国立陽明大学の動物センターに収容された。部屋は、温度２２±２度、湿度５０〜６０％、１２時間の明暗サイクルに保たれた。特に明記しない限り、マウスには、水および食事を適宜与えた（Lab Diet Autoclavable Rodent Diet 5010;PMI Nutrition International、米国ミズーリ州ブレントウッド）。すべての動物実験手順は、国立陽明大学の動物使用管理委員会によって検討され、承認されている。実験開始前に、マウスを１週間順化させた。
【００５３】
１．３  実験計画およびサンプル採取
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発潰瘍性大腸炎（ＵＣ）マウスモデルでは、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を健康（対照）、ＵＣ対照（ＤＳＳ）、ＤＳＳ＋加熱殺菌したＰ２３（加熱殺菌）、および、ＤＳＳ＋生きたＰＳ２３（生）群に無作為に割り当てた。１日目から７日目まで、対照群およびＤＳＳ群のいずれにも生理食塩水を経口投与し、加熱殺菌群および生群には加熱殺菌したＰＳ２３（１×１０９細胞／マウス／日）、または、生きたＰＳ２３（１×１０９ＣＦＵ／マウス／日）をそれぞれ経口投与した。８日目、すべてのＤＳＳ群の飲み水を５％のＤＳＳ水（ｇ／ｍＬ）と交換した。１４日目、糞便潜血値を測定するためにマウスの糞便を収集した。糞便収集後、マウスを二酸化炭素窒息により死亡させた。結腸を注意深く切除して盲腸から肛門までの長さを測定した。測定の直後に、遠位結腸の小さな部分を切り取り、組織学用の１０％リン酸緩衝ホルマリンで固定した。結腸タンパク質の抽出まで、結腸の残りの部分を−８０℃で保存した。
【００５４】
ＭＳ（母子分離）マウスモデルでは、雌の時限妊娠したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いた。ＰＳ２３の精神作用効果を評価すべく、ＭＳ実験群にＰＳ２３を投与した。ＭＳ群には生理食塩水に再懸濁して加熱殺菌したＰＳ２３（１×１０９細胞／マウス／日）または生きたＰ２３（（１×１０９ＣＦＵ／マウス／日）をＰＤ２９から４週間、強制飼養により投与し、その一方で、ＭＳおよびナイーブ対照群には、同じ期間生理食塩水を与えた。ＰＳ２３による治療期間の終わりに、マウスに一連の行動試験を行った。試験は、オープンフィールド試験（ＯＦＴ）、高架式十字迷路試験（ＥＰＭ）、強制水泳試験（ＦＳＴ）の順に、最もストレスの小さいものから大きいものへと行っていった。
すべての試験は、明るい状態の時に行われた。
【００５５】
１．４  結腸組織の均質上清の調製
【００５６】
プロテアーゼ阻害剤（シグマアルドリッチ、米国ミズーリ州セントルイス）の存在下で、結腸組織をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のＮＰ−４０、および、０．１％のＳＤＳ）に均質化した。結腸タンパク質ホモジネートを氷上で１５分間インキュベートし、４℃で、１２，０００ｇの遠心分離に１０分間かけた。上清を収集して分析するまで−８０℃で保存した。ブラッドフォードアッセイによりタンパク質含有量を決定した。
【００５７】
１．５  サイトカイン産生の決定
【００５８】
血清、または、結腸組織の均質上清におけるサイトカイン濃度を市販のキットで測定した（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄのＥＬＩＳＡキットで用いられるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０、および、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＥＬＩＳＡキットで用いられるＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、および、ＩＬ−６）。
【００５９】
１．６  ミエロペルオキシダーゼ活性アッセイ
結腸組織の均質上清におけるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性のレベルを、市販のキットであるＣａｙｍａｎ  ＭＰＯ過酸化アッセイキットで測定した。
【００６０】
１．７  オープンフィールド試験
【００６１】
マウスの自発運動活性をオープンフィールド試験（ＯＦＴ）により検査した。この試験では、マウスをオープンフィールド活動チャンバに１０分間置いた（ツルースキャンアクティビティシステム（Tru Scan Activity System）;Coulbourn Instruments、米国ペンシルベニア州ホワイトホール）。四角い活動チャンバ（２５．４×２５．４×３８ｃｍ）は、両側に光ビームセンサバーを付けたプレキシガラス壁で形成されている。各試験後にボックスを７０％エタノールで清浄した。活動は自動的に記録され、ツルースキャン２．２ソフトウェア（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により定量化された。総移動距離、移動時間、および、中心区画からの距離および中心区画滞在時間をツルースキャンアクティビティシステムにより測定した。中心部の１２．５×１２．５ｃｍの領域を中心区画として定義した。
【００６２】
１．８  高架式十字迷路試験
高架式十字迷路は、２つのクローズドアームと２つのオープンアームとからなる（高さ４５ｃｍ、アームの全長６６ｃｍ、アームの幅１０ｃｍ、クローズドアームの壁の高さ３０ｃｍ）。この試験は、マウスの不安様行動を評価するために行われた。交差するアーム（１０×１０ｃｍ）の中心にマウスを置き、迷路の中を１０分間自由に探索させた。各試験後に迷路を７０％エタノールで清浄した。マウスの活動を迷路中央の天井に取り付けたビデオカメラで記録した。記録された行動を後にＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎビデオトラッキングソフトウェア（Noldus Information Technology、オランダ、ヴァーヘニンゲン）によって分析した。オープンアームおよびクローズドアームにおける総移動距離および滞在期間を定量化した。
【００６３】
１．９  強制水泳試験
【００６４】
マウスのうつ様行動を評価するために強制水泳試験（ＦＴＳ）を用いた。簡単に説明すると、マウスを透明なアクリルシリンダ（高さ３０ｃｍ、内径１０ｃｍ、水（２３〜２５℃）を１５ｃｍ入れる）に入れ、初日は６分間泳がせた。泳いだ後のマウスをティッシュペーパーで拭き、ホームケージに戻した。翌日、マウスに２回目の水泳セッションを５分間受けさせた。水泳セッションをビデオカメラで記録し、行動をＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎビデオトラッキングソフトウェアで分析した。２回目のセッション中の不動時間を定量化した。
【００６５】
１．１０  血清コルチコステロン
【００６６】
血清をまず希釈し、市販のＣＯＲＴ  ＥＩＡキット（ケイマンケミカルカンパニー、米国ミシガン州）を用いてコルチコステロン濃度を分析した。製造業者の説明書に従い、キットに設けられた基準を用いてコルチコステロン濃度を補間した。
【００６７】
１．１１  統計分析
すべてのデータを平均値±標準誤差、または、平均値±標準偏差として示した。
【００６８】
一元配置または二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、および、適切な場合、ボンフェローニの事後検定またはスチューデントの両側ｔ検定も用いて群間の差を分析した。
【００６９】
実施例１
ラクトバチルスパラカゼイＰ２３の遺伝子型決定
【００７０】
ＰＳ２３の１６Ｓ  ｒＲＮＡおよびｐｈｅＳ  ＤＮＡ配列と最も類似する１６Ｓ  ｒＲＮＡおよびｐｈｅＳ  ＤＮＡ配列を有する生物を以下の表に示す。
【表１】
2021509811.tif 000003
【００７１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子およびｐｈｅＳ遺伝子の比較は、ＰＳ２３がラクトバチルスパラカゼイ亜種パラカゼイに属することを示している。
【００７２】
ＥＲＩＣ−ＰＣＲ法および（ＧＴＧ）５−ＰＣＲ法によりゲノムフィンガープリンティングを分析し、Ｐ２３は、ラクトバチルスパラカゼイの新規株であることが示された（図１参照）。
【００７３】
ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬキット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）を用いてＰＳ２３の糖利用を調べた。発酵試験は、ＰＳ２３がラクトバチルスパラカゼイ亜種パラカゼイに類似した生化学的性質を有することを示している。
【表２】
2021509811.tif 000004
実施例２
ＰＳ２３は腸出血を抑制する
【００７４】
毎日５％のＤＳＳを７日間投与すると組織をひどく損傷させ、腸から出血したので、ＤＳＳ群の糞便には血が混じっている可能性がある。腸炎症の重症度を測定すべく、１３日目に潜血分析のために各マウスの糞便を収集した。暗い色のサンプルほどスコアが高かった。図２に示すように、ＤＳＳ群の糞便の潜血スコアは、対照群より著しく高く（ｐ＜０．０００１）、ＤＳＳ処置後に腸出血が増加したことを示している。このことは、糞便およびマウスらの肛門が血まみれであるという我々の観察によって裏付けられ、ＤＳＳで処置したすべてのマウスが、軽度から重度の腸炎症を患っていることを示している。糞便の潜血スコアが低いことから、加熱殺菌ＰＳ２３または生きたＰＳ２３の長期投与は、出血を抑制することができるとわかった（図２）。スコアがＤＳＳ群より著しく低いことからわかるように、特に、生きたＰＳ２３は、加熱殺菌したものより効果的に出血を抑制した（図２；ｐ＜０．０５）。
実施例３
ＰＳ２３は、ＤＳＳ誘発性結腸短縮を抑制する
【００７５】
ＤＳＳマウスモデルでは、短縮された結腸の長さに着目する。ＤＳＳ処置群における平均長は、対照群より著しく短いことがわかった（図３Ａ；ｐ＜０．０００１）。しかしながら、ＰＳ２３群、特に、生きたＰＳ２３群における長さは、ＤＳＳ群より著しく長かった（図３Ａ；ｐ＜０．０１）。また、生きたＰＳ２３群におけるマウスの結腸にはより固い便が存在し、投与によって下痢が緩和したことがわかった。さらに、組織像は、腸細胞の損失、陰窩の炎症、好中球、粘膜固有層、上皮過形成、および、単核細胞の観察によって評価されるように、ＰＳ２３が結腸におけるＤＳＳ誘発性組織損傷を回復させたことを示した（図３Ｂ）。
実施例４
ＰＳ２３は、結腸の炎症性サイトカイン濃度およびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を低下させる
【００７６】
ＤＳＳ−結腸炎モデルでは、ＤＳＳ誘発性腸炎症、および、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＭＰＯ活性の増大が報告されている。ＤＳＳ処置したマウスの結腸組織でＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＭＰＯ活性が増大したという同様な結果を見出した（図４）。一方で、加熱殺菌したＰＳ２３および生きたＰＳ２３の投与はどちらも結腸組織におけるサイトカイン濃度およびＭＰＯ活性を低下させたが、どちらの群におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、および、ＭＰＯ活性の低下もＤＳＳ群に対する統計的有意差を達成した。（図４；ｐ＜０．０５）。
実施例５
ＰＳ２３は、ＭＳ誘発性不安様行動および探索的行動を抑制する
【００７７】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに母子分離（ＭＳ）を行い、オープンフィールド試験（ＯＦＴ）、高架式十字迷路試験（ＥＰＭ）、および、強制水泳試験（ＦＳＴ）を用いてＭＳマウスの行動を評価した。オープンフィールド領域の中心区画での滞在時間が少なく（図５（Ａ）および（Ｂ））、ＥＰＭのオープンアームで過ごす時間のパーセンテージが少ない（図５（Ｃ））。これは、ＭＳがマウスをより不安にさせていることを示している。また、立ち上がり回数も少ないことがわかった（図５（Ｄ））。これは、ＭＳマウスの探索的行動が抑制されたことを示している。さらに、ＦＳＴでの不動時間が長くなっているように（図５（Ｅ））、ＭＳは、マウスの不安様行動を引き起こすだけでなく、うつ様行動も引き起こすことがわかった。興味深いことに、加熱殺菌したＰＳ２３および生きたＰＳ２３を両方とも４週間投与することにより、それらは緩和した（図５）。これは、ＰＳ２３が若年期のストレスによって誘発される異常な表現型を正常化できることを示している。
実施例６
ＰＳ２３は、ＭＳ誘発性炎症を正常化する
【００７８】
ＭＳ群では、血清のＴＮＦ−α、および、ＩＬ−６は、対照より高いが、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０は低いというように、ＭＳは、亢進した炎症に対するマウスの免疫をシフトさせることがわかった（図６）。その一方で、ＰＳ２３の長期投与は、低下した血清ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、および、上昇したＩＬ−１０濃度によって示されるように、炎症を抑制した。過度に活性化した免疫反応は、物理的および心理的障害のリスクを高めるので、ＭＳマウスにおける我々の発見は、前のＤＳＳ実験で示されたＰＳ２３の抗炎症作用を反映し、また、ＰＳ２３がどのようにしてＭＳマウスの不安様行動およびうつ様行動を改善するのかということの部分的な根拠となるかもしれない。
実施例７
ＰＳ２３は、ＭＳ誘発性ＨＰＡ軸機能不全を正常化する
【００７９】
ＭＳがＨＰＡ軸を破壊することを示す過去の研究とほぼ一致し、ＭＳマウスのＣＯＲＴ濃度は、基礎的状態およびストレス状態のいずれにおいても非ＭＳ対照マウスとは異なり、基礎的状態においてＨＰＡ軸活動が過剰になることがわかった（図７；ｐ＜０．０１）。にもかかわらず、ＦＳＴの３０分後にＣＯＲＴ濃度は低下し、ＣＯＲＴ濃度の基礎的状態とストレス状態との比は、対照より著しく低いことがわかった（図７；ｐ＜０．０００１）。これは、ＨＰＡ軸がＭＳによって損なわれ、刺激直後の十分なＣＯＲＴ濃度を維持できなくなったことを示唆している。これに対し、加熱殺菌したＰＳ２３および生きたＰＳ２３のいずれのＣＯＲＴ濃度も、ＭＳ群からほぼ対照群の濃度まで改善した（図７）。これは、ＰＳ２３が調節不全のＨＰＡ軸を正常化することを示している。
実施例８
ＰＳ２３は、海馬におけるＧＲおよびＢＤＮＦタンパク質発現を増加させる
【００８０】
ＧＲは、ＨＰＡ軸のフィードバック阻害の原因となる主要な受容体である。ＨＰＡへの、ＭＳおよびＰＳ２３の影響をより詳しく調べるべく、海馬のＧＲタンパク質レベルを検査した。ＭＳマウスではＧＲ発現が減少することがわかった（図８）。これは、ＭＳが、ＨＰＡ軸のフィードバックループを損ない、ＭＳ群における血清ＣＯＲＴ濃度の上昇の原因となり得ることを示している。また、この領域ではＢＤＮＦタンパク質レベルが低下することもわかった（図８）。海馬におけるＢＤＮＦ濃度の変化は、うつと関係がある。若年期には、ＭＳがマウスの海馬の発達を阻害し、その結果ＢＤＮＦ濃度が不十分となり、ストレス反応を弱める。これに対し、加熱殺菌したＰＳ２３および生きたＰＳ２３の両方を長期投与することによって、低下したＧＲおよびＢＤＮＦのタンパク質レベルをＭＳ群よりも著しく高くなるように回復させ（図８；ｐ＜０．０５）、海馬のニューロンをストレスから守ることができる。生きたＰＳ２３または加熱殺菌したＰＳ２３の経口投与は、海馬におけるドーパミン代謝率を向上させた（図９）。
実施例９
老化促進マウス（Anti-aging Study in Senescence Accelerated Mouse-Prone 8）（ＳＡＭＰ８）モデル
【００８１】
実験計画を図３３に示す。
【００８２】
ＰＳ２３は、神経変性を予防および遅延させた。ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの学習および記憶力を向上させた（図１０）。
【００８３】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの自発運動活性を向上させた（図１１）。
【００８４】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスのセロトニンやドーパミンなどの神経伝達物質の濃度を高めた（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。
【００８５】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの血清ＢＤＮＦ濃度を高めた（図１３）。
【００８６】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの前頭前皮質および海馬におけるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、および、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）などの抗酸化酵素量を増加させた（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。
【００８７】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの老化に伴う生理的変化を遅延および予防した（図１５（Ａ）〜（Ｃ））。
【００８８】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの老化によって低下した貪食活性を高めた（図１６）。
【００８９】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を増加させ、炎症性サイトカインＴＮＦ−αを減少させ、炎症性ケモカインＭＣＰ−１を減少させることによって全身性炎症を回復させた（図１７Ａ〜図１７Ｃ）。
【００９０】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの脾臓細胞におけるトータルＴ細胞およびＣＤ４+細胞集団の総数を増加させた（図１８）。
【００９１】
ＰＳ２３の経口投与は、ＩＦＮガンマの産生を増大させ、補酵素Ａ（ＣｏＡ）によって刺激された老いたＳＡＭＰ８マウスの脾細胞におけるＩＬ−５を減少させた（図１９）。
【００９２】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの血清中のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、および、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）などの抗酸化酵素量を増加させた（図２０）。
【００９３】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの筋肉量、および、握力を増大させた（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。
【００９４】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスのヒラメ筋の酸素消費速度を向上させた（図２２）。
【００９５】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの筋肉ミトコンドリアの合成に関連する遺伝子発現を高めた（図２３）。
【００９６】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの前脛骨筋における炎症性サイトカインＩＬ−６の遺伝子発現を減少させた（図２４）。
【００９７】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの老化現象により損なわれた腸透過性および腸長を向上させた（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。
【００９８】
ＰＳ２３の経口投与は、老いたＳＡＭＰ８マウスの腸液における炎症性サイトカインＭＣＰ−１を減少させ、分泌型免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）を増加させた（図２６Ａ及び図２６Ｂ）。
実施例１０
ＰＳ２３は、ストレス関連の疾患を予防および治療する
【００９９】
ＰＳ２３は、ストレス関連の疾患を予防および治療する。コルチコステロンを繰り返し注射することによって誘発されたうつモデルの実験計画を以下に示す。
【表３】
2021509811.tif 000005
【０１００】
生きたＰＳ２３または加熱殺菌したＰＳ２３の経口投与は、ＣＯＲＴ誘発性不安様行動、および、探索的行動を回復させた（図２７Ａ〜図２７Ｄ）。生きたＰＳ２３または加熱殺菌したＰＳ２３の経口投与は、ＣＯＲＴ誘発性うつ様行動を回復させた（図２８Ａおよび図２８Ｂ）。生きたＰＳ２３または加熱殺菌したＰＳ２３の経口投与は、海馬におけるグルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）、および、ＢＤＮＦタンパク質発現を増やし、ニューロンをストレスから守る（図２９Ａ〜図２９Ｃ）。
【０１０１】
生きたＰＳ２３または加熱殺菌したＰＳ２３の経口投与は、ＣＯＲＴ誘発性うつマウスにおけるラクトバチルス種、および、ビフィドバクテリウム種などの「良い」細菌の相対存在量を増加させ、クロストリジウム属などの「悪い」細菌の相対存在量を減少させた。結果は、ＰＳ２３の経口投与が、腸内微生物叢を変調し得ることを示した（図３０）。
【０１０２】
ＰＳ２３の経口投与は、ＣＯＲＴ誘発性うつマウスの脳におけるセロトニンレベルを上昇させた（図３１）。ＰＳ２３は、睡眠の質と効率を向上させる。６人の健康な人々にＰＳ２３（３×１０１０ＣＦＵ／日）を１週間毎日投与した。睡眠の質と効率をピッツバーグ睡眠質問票（ＰＳＱＩ）によって初日および７日目に評価した。結果は、ＰＳ２３の経口投与が睡眠の質および効率を高めることを示した（図３２Ａおよび図３２Ｂ）。
【図１】
2021509811.tif 000006
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【国際調査報告】
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