(57)【要約】【課題】ＰＤ−Ｌ１を標的とすることができ、癌治療における用途が見出されるさらなる分子が当技術分野で依然として必要とされている。【解決手段】ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することができる抗体分子又はその抗原結合フラグメント。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列（アミノ酸３１から３５）が、ＳＹＧＩＳ（配列番号１）であり；ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＷＩＳＡＹＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列番号２）であり；ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号３）であり；Ｘ1が、Ｓ又はＮ又はＧであり；Ｘ2が、Ｇ又はＳであり；Ｘ3が、又はＧ、Ｎ又はＳであり；Ｘ4が、Ｔ又はＡであり、配列が、Kabatの命名法によって定義されることを特徴とする、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＲＤ２及びＨＣＤＲ３を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列（アミノ酸３１から３５）が、ＳＹＧＩＳ（配列番号１）であり；ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＷＩＳＡＹＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列番号２）であり；ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号３）であり；ここで、Ｘ1が、Ｓ又はＮであり；Ｘ2が、Ｇ又はＳであり；Ｘ3が、Ｇ又はＮであり；Ｘ4が、Ｔであり、前記配列が、Kabatの命名法によって定義されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ＨＣＤＲ１に先行する２８位のアミノ酸がＰ又はＴである、請求項１又は請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ＨＣＤＲ２の配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4（配列番号４）（残基５４〜５７）が、ＳＧＧＴ（配列番号５）、ＮＳＮＴ（配列番号６）、ＧＧＳＴ（配列番号７）及びＳＧＮＡ（配列番号８）から選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ＨＣＤＲ１の２８位（Kabatの命名法）の残基がＰであり、ＨＣＤＲ２の配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4（配列番号４（残基５４〜５７）がＳＧＧＴ（配列番号５）である、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
（ａ）可変軽鎖（ＶＬ）がカッパＶＬであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＲＡＳＱＳＩＸ5Ｘ6ＲＬＡ（配列番号９）であり；ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＥＡＳＸ7Ｘ8ＥＸ9（配列番号１０）であり；ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＱＱＸ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13ＰＸ14Ｘ15Ｘ16（配列番号１１）であり；ここで、Ｘ5は、Ｇ又はＳであり；Ｘ6は、Ｎ又はＧであり；Ｘ7は、Ｔ又はＮであり；Ｘ8は、Ｓ又はＬであり；Ｘ9は、Ｔ又はＳであり；Ｘ10は、Ｓ又はＡであり；Ｘ11は、Ｙ又はＮであり；Ｘ12は、Ｓ又はＴであり；Ｘ13は、Ｔ、Ｗ又はＦであり；Ｘ14は、不在又はＲであり；Ｘ15は、Ｙ、Ｒ又はＶであり；Ｘ16は、Ｔ又はＳであること、又は
（ｂ）ＶＬがラムダＶＬであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＸ17ＶＳ（配列番号１２）であり；ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＥＶＴＮＲＰＳ（配列番号１３）であり；ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＳＦＫＲＧＳＴＬＶＶ（配列番号１４）であり；ここで、Ｘ17は、Ｙ又はＳであり；配列は、Kabatの命名法によって定義されること
を特徴とする、軽鎖相補性決定領域：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記ＶＬドメインがカッパＶＬであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＲＡＳＱＳＩＧＮＲＬＡ（配列番号１５）であり；ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＥＡＳＴＳＥＴ（配列番号１６）であり；ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＱＱＳＹＳＴＰＹＴ（配列番号１７）である、請求項６に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
抗体：
（ａ）配列番号１、１８、３、１５、１６及び１７のG1AA/E12v2；
（ｂ）配列番号１、１８、３、１９、２０及び２１のG1AA/G12v2；
（ｃ）配列番号１、１８、３、１９、２０及び２２のG1AA/E05v2；
（ｄ）配列番号１、２３、３、１５、１６及び１７のG1/887_04_E12；
（ｅ）配列番号１、２３、３、１９、２０及び２１のG1/887_04_G12；
（ｆ）配列番号１、２３、３、１９、２０及び２２のG1/894_08_E05；
（ｇ）配列番号１、２３、３、１９、２０及び２４のG1/894_08_A05；
（ｈ）配列番号１、１８、３、２５、１３及び１４のG1AA/lambdav3；
（ｉ）配列番号１、２３、３、２６、１３及び１４のG1/280_02_G02_NS又は
（ｊ）配列番号１、７８、３、２６、１３及び１４のG1/280_02_G02；
のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＲＤ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む抗原結合部位を含み、ここで配列はKabatの命名法に従って定義される、請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗原結合部位が、抗体：
（ａ）配列番号２７及び２８それぞれのG1AA/E12v2；
（ｂ）配列番号２９及び３０それぞれのG1AA/G12v2；
（ｃ）配列番号３１及び３２それぞれのG1AA/E05v2；
（ｄ）配列番号３３及び３４それぞれのG1/887_04_E12；
（ｅ）配列番号３５及び３６それぞれのG1/887_04_G12；
（ｆ）配列番号３７及び３８それぞれのG1/894_08_E05；
（ｇ）配列番号３９及び４０それぞれのG1/894_08_A05；
（ｈ）配列番号４１及び４２それぞれのG1AA/lambdav3；
（ｉ）配列番号４３及び４４それぞれのG1/280_02_G02_NS；又は
（ｊ）配列番号４５及び４６それぞれのG1/280_02_G02；
のＶＨ及び／又はＶＬドメインを含み、ここで配列はKabatの命名法に従って定義される、請求項１から８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体分子が、抗体：
（ａ）配列番号４７及び４８それぞれのG1AA/E12v2；
（ｂ）配列番号４９及び５０それぞれのG1AA/G12v2；
（ｃ）配列番号５１及び５２それぞれのG1AA/E05v2；
（ｄ）配列番号５３及び５４それぞれのG1/887_04_E12；
（ｅ）配列番号５５及び５６それぞれのG1/887_04_G12；
（ｆ）配列番号５７及び５８それぞれのG1/894_08_E05；
（ｇ）配列番号５９及び６０それぞれのG1/894_08_A05；
（ｈ）配列番号６１及び６２それぞれのG1AA/lambdav3；
（ｉ）配列番号６３及び６４それぞれのG1/280_02_G02_NS；又は
（ｊ）配列番号６５及び６６それぞれのG1/280_02_G02；
の重鎖及び／又は軽鎖を含み、ここで配列はKabatの命名法に従って定義される、請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１１】
ＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び／又はＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）；ＶＨ及び／又はＶＬ；Ｆａｂ；抗体G1AA/E12v2、G1AA/G12v2又はG1AA/E05v2の軽鎖及び／又は重鎖を含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
ＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び／又はＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）；ＶＨ及び／又はＶＬ；Ｆａｂ；抗体G1AA/E12v2又はG1/E12v2の軽鎖及び／又は重鎖を含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記ＶＨが、配列番号２７のG1AA/E12v2、配列番号２９のG1AA/G12v2、配列番号３１のG1AA/E05v2、配列番号３３のG1/887_04_E12、配列番号３５のG1/887_04_G12、配列番号３７のG1/894_08_E05、配列番号３９のG1/894_08_A05、配列番号４１のG1AA/lambdav3、配列番号４３のG1/280_02_G02_NS及び配列番号４５のG1/280_02_G02から選択される抗体の前記ＶＨに対して少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
前記抗体分子又は抗原結合フラグメントがヒトＰＤ−Ｌ１に結合する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
前記抗体分子又は抗原結合フラグメントがカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合する、請求項１から１４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
前記抗体又は抗原結合フラグメントがマウスＰＤ−Ｌ１に結合する、請求項１から１５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
前記抗体又は抗原結合フラグメントが、組換えヒトＰＤ−Ｌ１及び組換えカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対して、ＳＰＲ（例えば、Biacore）によって測定した場合、２ｎＭ未満、好ましくは１ｎＭ未満、より好ましくは０．７５ｎＭ未満、さらにより好ましくは０．５ｎＭ未満の親和性（ＫＤ）を有する、請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで評価した場合、Ｔ細胞活性化を刺激する、請求項１から１７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
前記抗体又は抗原結合フラグメントが、少なくとも第２の抗原結合部位を含む、多重特異性、好ましくは二重特異性の分子である、請求項１から１８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、前記抗体又は抗原結合フラグメントの定常ドメインに位置する第２の抗原結合部位を含む、請求項１から１９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
前記第２の抗原結合部位が
（ａ）定常重鎖ドメインのＡＢ構造ループにおける第１の配列及び／又はＥＦ構造ループにおける第２の配列、
（ｂ）定常重鎖ドメインのＡＢ構造ループにおける第１の配列及びＥＦ構造ループにおける第２の配列、
（ｃ）定常重鎖ドメインのＡＢ構造ループにおける第１の配列及び／又はＥＦ構造ループにおける第２の配列及び／又はＣＤ構造ループにおける第３の配列
（ｄ）定常重鎖ドメインのＡＢ構造ループにおける第１の配列、ＥＦ構造ループにおける第２の配列、及びＣＤ構造ループにおける第３の配列
を含む、請求項２０に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
前記定常重鎖ドメインがＣＨ３ドメインである、請求項２０又は２１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
前記抗体が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、又はその抗原結合フラグメントである、請求項１から２２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
前記抗体が、ＩｇＧ１若しくはそのフラグメント、又はＩｇＧ４若しくはそのフラグメントである、請求項２３に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
前記抗体が、修飾Ｆｃ領域を有するＩｇＧ１又はそのフラグメントである、請求項２３又は請求項２４に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
前記抗体が、免疫エフェクター機能が低下した修飾Ｆｃ領域を有するＩｇＧ１又はそのフラグメントである、請求項２４又は請求項２５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
前記修飾Ｆｃが、ＩｇＧ１と比較して低下したＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを有する、請求項２５又は２６に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
前記修飾Ｆｃ領域が、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ−ＰＡ又はＬＡＬＡ−ＰＧ修飾を含む、請求項２５から２７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
前記抗体が、前記Ｆｃ領域にＬＡＬＡ修飾を含むＩｇＧ１又はその抗原結合フラグメントである、請求項２５から２８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
前記第２の抗原結合部位が、阻害性チェックポイント分子、共刺激分子、又は腫瘍関連抗原に結合する、請求項１９から２９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３１】
前記第２の抗原結合部位が、ＯＸ４０、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）又はＣＤ１３７に結合しない、請求項１９から３０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
前記第２の抗原結合部位が、ＣＤ２７又は糖質コルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）に結合しない、請求項１９から３０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
前記第２の抗原結合部位が、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）に結合しない、請求項１９から３０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び免疫系モジュレーター（アゴニスト又はアンタゴニスト）、細胞傷害性分子、又は放射性同位体を含む、コンジュゲート又は融合物。
【請求項３５】
検出可能な標識を有する、請求項１から３４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート又は融合物。
【請求項３６】
請求項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート又は融合物をコードする、核酸分子又は核酸分子のセット。
【請求項３７】
前記核酸分子又は核酸分子のセットが、
（ａ）G1AA/E12v2又はG1/E12v2；
（ｂ）G1AA/E05v2又はG1/E05v2；
（ｃ）G1AA/G12v2又はG1/G12v2；
（ｄ）G1/887_04_E12；
（ｅ）G1/894_08_E05；
（ｆ）G1/887_04_G12；
（ｇ）G1/894_08_A05；
（ｈ）G1AA/lambdav3；
（ｉ）G1/280_02_G02_NS；又は
（ｊ）G1/280_02_G02。
のＶＨ及び／又はＶＬ、Ｆａｂ、重鎖及び／又は軽鎖の１つ以上をコードするｃＤＮＡ配列を含む、請求項３６に記載の核酸分子又は核酸分子のセット。
【請求項３８】
第１の核酸配列及び第２の核酸配列を含み、
（ａ）前記第１の核酸配列が、配列番号２７の抗体G1AA/E12v2のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、前記第２の核酸配列が、配列番号２８の抗体G1AA/E12v2のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｂ）前記第１の核酸配列が、配列番号２９の抗体G1AA/G12v2のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、前記第２の核酸配列が、配列番号３０の抗体G1AA/G12v2のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｃ）前記第１の核酸配列が、配列番号３１の抗体G1AA/E05v2のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、前記第２の核酸配列が、配列番号３２の抗体G1AA/E05v2のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｄ）前記第１の核酸配列が、配列番号３３の抗体G1/887_04_E12のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、前記第２の核酸配列が、配列番号３４の抗体G1/887_04_E12のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｅ）前記第１の核酸配列が、配列番号３５の抗体G1/887_04_G12のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、前記第２の核酸配列が、配列番号３６の抗体G1/887_04_G12のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｆ）前記第１の核酸配列が、配列番号３７の抗体G1/894_08_E05のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、前記第２の核酸配列が、配列番号３８の抗体G1/894_08_E05のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｇ）前記第１の核酸配列が、配列番号３９の抗体G1/894_08_A05のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、前記第２の核酸配列が、配列番号４０の抗体G1/894_08_A05のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｈ）前記第１の核酸配列が、配列番号４１の抗体G1AA/lambdav3のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、前記第２の核酸配列が、配列番号４２の抗体G1AA/lambdav3のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｉ）第１の核酸配列が、配列番号４３の抗体G1/280_02_G02_NSのＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号４４の抗体G1/280_02_G02_NSのＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、又は
（ｉ）前記第１の核酸配列が、配列番号４５の抗体G1/280_02_G02のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、前記第２の核酸配列が、配列番号４６の抗体G1/280_02_G02のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含む、
請求項３７に記載の核酸分子又は核酸分子のセット。
【請求項３９】
請求項３６から３８のいずれかの核酸分子又は核酸分子のセットを含む、ベクター又はベクターのセット。
【請求項４０】
請求項３６から３８のいずれかの核酸分子若しくは核酸分子のセット、又は請求項３９のベクター若しくはベクターのセットを含む、組換え宿主細胞。
【請求項４１】
前記抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート又は融合物の産生に適した条件下で請求項４０の組換え宿主細胞を培養することを含む、請求項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、融合物のコンジュゲートを産生する方法。
【請求項４２】
前記抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート又は融合物を単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１から４２のいずれか１項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート又は融合物と、賦形剤（例えば、薬学的に許容される賦形剤）とを含む、組成物（例えば、医薬組成物）。
【請求項４４】
治療によるヒト又は動物の体の処置方法における使用のための、請求項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物、又は請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
請求項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物、又は請求項４３に記載の組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、患者の疾患又は障害を処置する方法。
【請求項４６】
前記ヒト又は動物の体の前記処置のための医薬の製造における、請求項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物、又は請求項４３に記載の組成物の使用。
【請求項４７】
前記抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート、融合物又は組成物を、第２の治療と組み合わせて前記ヒト又は動物の体に投与することを含む処置方法における請求項４４に記載の使用のための、請求項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物、又は請求項４３に記載の組成物。
【請求項４８】
前記方法が、治療有効量の第２の治療を前記患者に投与することをさらに含む、請求項４５の方法、又は請求項４６の使用。
【請求項４９】
前記第２の治療が、放射線療法、好ましくは標的放射線療法である、請求項４７に記載の使用のための、又は請求項４８に記載の方法における、抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート、融合物又は組成物。
【請求項５０】
前記ヒト若しくは動物の体で実施される、又は前記ヒト若しくは動物の体からのサンプルでインビトロで実施される、診断方法における使用のための、請求項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物、又は請求項４３に記載の組成物。
【請求項５１】
請求項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物の使用、又は請求項４３に記載の組成物の使用を含む、患者の疾患又は障害を検出する方法。
【請求項５２】
診断薬の製造における、請求項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物の使用、又は請求項４３に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、癌治療における用途が見出され得る。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プログラム細胞死１（ＰＤ−１）は、細胞表面受容体であり、そのリガンドＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４、Ｂ７−Ｈ１）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）は、Ｔ細胞の活性化、耐性、及び免疫病理学のバランスを調節する阻害シグナルを伝達する。ＰＤ−Ｌ１は、全ての免疫細胞及び一部の腫瘍細胞で一過性に発現する。
【０００３】
ＰＤ−Ｌ１は、細胞外領域内の２つのＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン及び短い細胞質ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質である。完全ヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１）配列は、GENBANK（登録商標）受託番号Q9NZQ7下で見出すことができる。細胞質ドメインには既知のシグナル伝達モチーフがなく、リガンドとその受容体との相互作用に関しＰＤ−Ｌ１によるシグナル伝達がないことを示唆している。ＰＤ−Ｌ１の分子量は４０ｋＤａ（２９０アミノ酸）で、ヒト９番染色体及びマウス１９番染色体のＣＤ２７４遺伝子によってコードされている。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ７タンパク質ファミリーのメンバーであり、Ｂ７．１及びＢ７．２とおよそ２０％のアミノ酸配列同一性を共有している。ヒトＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−Ｌ１のマウス及びカニクイザルのオルソログとそれぞれ７０％及び９３％のアミノ酸同一性を共有している。
【０００４】
ヒトＰＤ−Ｌ１は、その受容体ＰＤ−１に７７０ｎＭの親和性（ＫＤ）で結合する。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄細胞に発現しており、細胞性免疫応答の活性化又は阻害を調節する。ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合すると、阻害性シグナルが伝達され、サイトカイン産生が減少し、Ｔ細胞の増殖が抑制される。その結果、細胞によるＰＤ−Ｌ１発現は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の死滅に対する保護を媒介することができ、これは、ウイルス感染時の慢性免疫応答を弱める調節メカニズムである。癌は、慢性及び炎症誘発性疾患として、ＰＤ−Ｌ１発現のアップレギュレーションを通じてこの免疫保護経路を破壊し、宿主の免疫応答を回避する。能動免疫応答では、ＩＦＮγは、ＰＤ−Ｌ１の発現もアップレギュレートする。ＰＤ−Ｌ１はまた、別のタンパク質であるＢ７．１（ＣＤ８０としても知られる）との相互作用を通じて免疫抑制を媒介し、ＣＤ２８を通じてＴ細胞の活性化の二次シグナルの１つを送達する能力を遮断する。腫瘍細胞でのＰＤ−Ｌ１発現とそのＢ７．１との関与に関して、腫瘍免疫抵抗性におけるこの特定の相互作用の関連性はまだ不明である。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１の発現は、多種多様な固形腫瘍で示されている。ある研究で調べられた６５４のサンプルのうち、異なる部位からの１９の腫瘍に及ぶ、８９（１４％）がＰＤ−Ｌ１陽性（５％以上の頻度）であった。最も高いＰＤ−Ｌ１陽性頻度は、頭頸部（１７／５４；３１％）、子宮頸部（１０／３４；２９％）、原発不明の癌（ＣＵＰ；８／２９；２８％）、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ；５／２０；２５％）、膀胱（８／３７；２１％）、食道（１６／８０；２０％）、トリプルネガティブ（ＴＮ）乳房（６／３３；１８％）、及び肝細胞癌（６／４１；１５％）で見られた（Grosso et al., 2013）。ＰＤ−Ｌ１の腫瘍関連発現は、免疫抵抗性を付与し、Ｔ細胞媒介性アポトーシスから腫瘍細胞を保護する可能性があることが示されている。
【０００６】
ＰＤ−Ｌ１を標的とする治療は、マウスのインビボ研究で優れた結果を示している。黒色腫のＢ１６マウスモデルにおいて、ＧＶＡＸ又はＦＶＡＸいずれかのワクチン接種戦略と組み合わせた抗ＰＤ−Ｌ１治療による処置は、生存率（対照群で３０日間対ＰＤ−Ｌ１処置群で５２日間）及び研究終了時の腫瘍のない（５％）動物の割合の両方で有意な効果をもたらした（Curran et al., 2010）。抗ＰＤ−Ｌ１療法は、Ｐ８１５マウスマストーマ（mastoma）モデルにおける免疫抑制のメカニズムを研究するためにも使用されている。マウスに注入されたＰ８１５細胞は、通常、強い免疫応答を誘発し、その拒絶を引き起こす。ＰＤ−Ｌ１がＰ８１５細胞で発現すると、これらの細胞は免疫攻撃を免れ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与によって免疫攻撃を無効にすることができる（Iwai et al., 2002）。免疫原性ヒト癌においてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を標的とすること（Herbst et al, 2014）が、抗癌免疫応答の刺激を通じて生存率における利点をもたらすことは明らかである（Wolchok et al., 2013; Larkin et al., 2015）。
【０００７】
アテゾリズマブ（MPDL3280A、RG7466、TECENTRIQ（商標））は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒト化ＩｇＧ１抗体である。これは、単剤療法として、また結腸直腸癌、乳癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び腎細胞癌を含む固形癌の処置のための他の生物学的及び／又は小分子療法と組み合わせて、臨床試験中である。アテゾリズマブによる処置は、ＮＳＣＬＣで２３％、黒色腫で３６％、膀胱で３３％、ＲＣＣで１４％、頭頸部癌で１３％の客観的応答率（ＯＲＲ）をもたらした（Herbst et al., 2014; Powles et al., 2014）。
【０００８】
２０１６年５月、ＦＤＡは、シスプラチンベースの化学療法が失敗した後の局所進行性又は転移性尿路上皮癌処置に対するアテゾリズマブを迅速承認したが、検証的試験は、全生存期間の主要評価項目を達成できなかった。２０１６年１０月、ＦＤＡは、プラチナ含有化学療法中又はその後に疾患が進行した転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者の処置に対するアテゾリズマブを承認した。ＥＧＦＲ又はＡＬＫゲノム腫瘍異常のある患者は、アテゾリズマブ投与前のこれらの異常に対するＦＤＡ承認の療法で、疾患が進行している必要がある。一部の肺癌患者に対するアバスチン及び標準化学療法と組み合わせたアテゾリズマブは、ＦＤＡの優先審査中であり、２０１８年９月５日までに決定が見込まれている。アテゾリズマブの臨床試験で報告された最も一般的な有害反応は、倦怠感、食欲不振、悪心、及び感染症であり、尿路感染症が最も一般的な重篤な有害反応であった。
【０００９】
アベルマブ（MSB0010718C、BAVENCIO（商標））は、ＰＤ−Ｌ１に結合する完全ヒトＩｇＧ１抗体であり、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、中皮腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、腎癌及びメルケル細胞癌を含む多くの癌で臨床試験が行われている。アベルマブは、２０１７年１月に、胃癌の処置につき欧州医薬品庁（ＥＭＡ）（European Medicines Agency）から希少疾病用医薬品の指定を受けた。２０１７年に、ＦＤＡ及びＥＭＡは、成人及び１２歳以上の小児患者のメルケル細胞癌（侵攻性皮膚癌）について、アベルマブを承認した。承認は、非盲検、シングルアーム、多施設の臨床試験（JAVELIN Merkel 200試験）のデータに基づいている。全ての患者は、転移性疾患に対して投与された化学療法中又はその後に、疾患の進行を伴う組織学的に確認された転移性ＭＣＣを有していた。全体的な応答率（ＯＲＲ）は、固形腫瘍の応答評価基準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors）（ＲＥＣＩＳＴ）１．１に従って、独立した審査委員会によって評価された。ＯＲＲは、１１％の完全応答率及び２２％の部分応答率で３３％であった（９５％信頼区間［ＣＩ］：２３．３、４３．８）。２９人の応答患者の中で、応答期間は２．８から２３．３ヶ月＋の範囲であり、応答の８６％は６ヶ月以上持続した。ＰＤ−Ｌ１腫瘍の発現又はメルケル細胞ポリオーマウイルスの存在にかかわらず、患者における応答が観察された。安全性データは１７３８人の患者で評価された。アベルマブに対する最も一般的な重篤な有害反応は、免疫介在性有害反応（肺炎、肝炎、大腸炎、副腎不全、甲状腺機能低下及び甲状腺機能亢進、糖尿病、及び腎炎）及び生命にかかわる注入反応であった。JAVELIN Merkel 200試験に登録された８８人の患者の中で、最も一般的な有害反応は、倦怠感、筋骨格痛、下痢、悪心、注入関連反応、発疹、食欲減退、及び末梢性浮腫であった。試験で１人以上の患者に発生した重篤な有害反応は、急性腎障害、貧血、腹痛、腸閉塞、無力症、及び蜂巣炎であった。
【００１０】
デュルバルマブ（MEDI4736、IMFINZI（商標））は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＩｇＧ１抗体であり、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、膀胱癌、膵臓癌において、単剤又はトレメリムマブとの組み合わせで、臨床試験において試験され、胃癌、黒色腫、及び切除不能な肝細胞癌などの追加の固形癌の試験において、他の生物学的及び小分子とともに試験されている。
【００１１】
デュルバルマブは、プラチナ含有化学療法中若しくはその後に疾患が進行したか、又はプラチナ含有化学療法によるネオアジュバント若しくはアジュバント処置から１２ヶ月以内に疾患が進行した、局所進行性又は転移性尿路上皮癌を有する患者の処置につき、ＦＤＡに承認された。
【００１２】
デュルバルマブ及びトレメリムマブの第１Ｂ相臨床試験では、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において、ある程度の活性が示された。しかし、２０１７年７月、AstraZenecaは、非小細胞肺癌の第一選択処置としてのトレメリムマブを併用したデュルバルマブの第ＩＩＩ相試験が、無増悪生存期間の主要評価項目を満たすことができなかったと発表した。
【００１３】
肺癌患者におけるデュルバルマブ及びゲフィチニブを組み合わせた第Ｉ相試験の初期の結果は、「有望である」と報告された。固形腫瘍に対してデュルバルマブ及びＴＬＲ７／８アゴニスト（MEDI 9197）を使用した第１相臨床試験が進行中である。ＨＰＶ関連の再発性／転移性頭頸部癌を有する患者において、デュルバルマブをＨＰＶ  ＤＮＡワクチン（MEDI 0457）と組み合わせた第１ｂ／２ａ相試験が進行中である。
【００１４】
２０１７年１１月、二重盲検第３相AstraZeneca PACIFIC臨床試験では、ステージＩＩＩの非小細胞肺癌の処置におけるデュルバルマブの有効性が報告された。２サイクル以上のプラチナベースの化学療法後に疾患が進行しなかったステージＩＩＩのＮＳＣＬＣを有する７０９人の患者のコホートは、肺癌の地固め療法としてデュルバルマブ又はプラセボの投与を受けるように無作為に割り当てられた。デュルバルマブは、無増悪生存期間の中央値を５．６ヶ月（プラセボ）から１６．８ヶ月（デュルバルマブ）に増加させた。１２ヶ月の無増悪生存率は３５．３％（プラセボ）から５５．９％（デュルバルマブ）に増加し、１８ヶ月の無増悪生存率は２７．０％（プラセボ）から４４．２％（デュルバルマブ）に増加した。死亡又は遠隔転移までの期間の中央値は、１４．６ヶ月（プラセボ）から２３．２ヶ月（デュルバルマブ）に増加した。しかし、極端な副作用も患者の２６．１％（プラセボ）から患者の２９．９％（デュルバルマブ）に増加した。
【００１５】
１つの標準的なプラチナベースのレジメン中又はその後に疾患が進行した局所進行性又は転移性尿路上皮癌を有する１８２人の患者において、デュルバルマブへの曝露後に有害反応が報告された。患者は、２週間ごとに静脈内注入により１０ｍｇ／ｋｇのデュルバルマブを投与された。曝露期間の中央値は１０．２週間であった（範囲：０．１４、５２．４）。患者の３１％は、有害反応のために薬の遅延又は中断があった。最も一般的な有害反応（＞２％）は、肝損傷（４．９％）、尿路感染症（３．３％）、急性腎障害損傷（３．３％）、及び筋骨格痛（２．７％）であった。最も一般的な有害反応（１５％以上）は、倦怠感（３９％）、筋骨格痛（２４％）、便秘（２１％）、食欲不振（１９％）、悪心（１６％）、末梢性浮腫（１５％）及び尿路感染症（１５％）であった。最も一般的なグレード３又は４の有害反応（３％以上）は、倦怠感、尿路感染症、筋骨格痛、腹痛、脱水症、及び一般的な身体的健康の悪化であった。デュルバルマブで処置された８人の患者（４．４％）は、心肺停止、全般的な身体的健康の悪化、敗血症、腸閉塞、肺炎、又は免疫介在性肝炎のグレード５の有害事象を経験した。さらなる３人の患者が死亡時に感染及び疾患の進行を経験していた。デュルバルマブは、３．３％の患者で有害反応のために中止された。重篤な有害反応は、患者の４６％で発生した。最も頻度の高い重篤な有害反応（＞２％）は、急性腎障害（４．９％）、尿路感染症（４．４％）、筋骨格痛（４．４％）、肝障害（３．３％）、全般的な健康状態の悪化（３．３％）、敗血症、腹痛、発熱／腫瘍関連発熱（各２．７％）であった。全身性コルチコステロイド又はホルモン補充療法を必要とする免疫介在性有害反応は、全身性コルチコステロイド療法を必要とする５．５％（１０／１８２）の患者、及びホルモン補充療法のみを必要とする２．７％（５／１８２）の患者を含む、８．２％（１５／１８２）の患者で発生した。７人の患者（３．８％）は、免疫介在性の有害反応のために、１日４０ｍｇ超相当のプレドニゾンの経口投与を受けた。
【００１６】
BMS-936559を含むさらなる抗ＰＤ−Ｌ１抗体は臨床試験で試験されており、他の抗体は前臨床試験中である。
【００１７】
国際公開第２０１３／１８１６３４号（Sorrento Therapeutics）は、ＰＤ−Ｌ１抗体について説明している。開示された唯一の抗体、「SH1E2」（当該出願の配列番号１４７／１４８）は、当技術分野で開示されているＰＤ−Ｌ１抗体10A5及びYW234.55S70と比較した場合、ＣＤ２５陽性細胞のパーセンテージによって測定される、改善されたＴ細胞活性化を示すと言われている。
【００１８】
感染症は、腫瘍学と多くの類似点を示す。免疫調節におけるＰＤ−Ｌ１の役割は、病原体に対する免疫応答を最大化するために利用され得ると考えられている。感染症における免疫調節は医学の新たな分野であり、初期のレビューでは、ＰＤ−Ｌ１遮断が、特にＴ細胞の枯渇への対抗を助けることにより、感染に対する生物学的反応を改善し、免疫介在性クリアランスを管理し、長期免疫を生成し得ることが示唆されている（Wykes and Lewin, 2017）。したがって、ＰＤ−Ｌ１を標的とすることができ、感染症の処置における用途が見出されるさらなる分子も当技術分野で依然として必要とされている。
【００１９】
ＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体は、血管炎症及び脳卒中などの炎症に関連する状態の処置にも有用であり得る。
【００２０】
開発中の様々な抗ＰＤ−Ｌ１治療剤があるが、現在のデータは、既存の抗ＰＤ−Ｌ１単剤療法による全体的な処置が癌患者の５０％未満で反応をもたらすことを示している。報告された有害反応の範囲及び重症度は、臨床試験における抗体間で異なる。客観的応答率（ＯＲＲ）を高めるため、及び／又は有害効果を減らすために、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、他のチェックポイントレギュレーターに対する抗体などの他の生物学的製剤、並びに小分子療法、及び腫瘍ワクチンなどの他の免疫系活性化アプローチと組み合わせられ得る。
【００２１】
したがって、ＰＤ−Ｌ１を標的とすることができ、癌治療における用途が見出されるさらなる分子が当技術分野で依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の記載
本発明者らは、ファージライブラリーのスクリーニング、続いて変異誘発、スクリーニング、選択、及び軽鎖シャッフリングによって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を調製して、ＰＤ−Ｌ１に対する親和性及びＴ細胞活性化アッセイにおける活性を有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体を単離した。
【００２３】
翻訳後修飾の可能性のある部位を除去し、選択された抗体の生物物理学的特性を改善するために、変異誘発、スクリーニング及び選択のさらなるラウンドが実行された。
【００２４】
上記のアプローチにより、ＰＤ−Ｌ１への優れた結合とＴ細胞活性化アッセイにおける活性とを示す、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の同定が可能となった。これらの特徴に基づいて、本発明の抗体は、ＰＤ−Ｌ１の阻害を介して、ヒトの癌、並びに感染性及び炎症性疾患の処置における用途を見出すことが期待される。
【００２５】
本発明の抗体はまた、ヒトＰＤ−Ｌ１に対するそれらの親和性と同等の、カニクイザルＰＤ−Ｌ１に対する高い親和性を有することが示された。本発明の抗体はまた、マウスＰＤ−Ｌ１に対して測定可能な親和性を示した。
【００２６】
さらに、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体は、比較的高い融解温度を有することが確認され、これは、抗体の製造及び保管に有益な、安定性の向上が期待できる。
【００２７】
本発明は以下を提供する：
１．ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列（アミノ酸３１から３５）が、ＳＹＧＩＳ（配列番号１）であり；ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＷＩＳＡＹＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列番号２）であり；ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号３）であり；ここで、Ｘ1は、Ｓ又はＮ又はＧであり；Ｘ2は、Ｇ又はＳであり；Ｘ3は、又はＧ、Ｎ又はＳであり；Ｘ4は、Ｔ又はＡであり、配列は、Kabatの命名法によって定義されることを特徴とする、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＲＤ２及びＨＣＤＲ３を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００２８】
２．ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列（アミノ酸３１から３５）が、ＳＹＧＩＳ（配列番号１）であり；ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＷＩＳＡＹＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列番号２）であり；ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号３）であり；ここで、Ｘ1は、Ｓ又はＮであり；Ｘ2は、Ｇ又はＳであり；Ｘ3は、Ｇ又はＮであり；Ｘ4は、Ｔであり、配列は、Kabatの命名法によって定義されることを特徴とする、項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００２９】
３．ＨＣＤＲ１に先行する２８位のアミノ酸がＰ又はＴである、項１又は項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３０】
４．ＨＣＤＲ２の配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4（配列番号４）（残基５４〜５７）が、ＳＧＧＴ（配列番号５）、ＮＳＮＴ（配列番号６）、ＧＧＳＴ（配列番号７）及びＳＧＮＡ（配列番号８）から選択される、項１から３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３１】
５．ＨＣＤＲ１の２８位（Kabatの命名法）の残基がＰであり、ＨＣＤＲ２の配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4（配列番号４（残基５４〜５７）がＳＧＧＴ（配列番号５）である、項１から４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３２】
６．
（ａ）可変軽鎖（ＶＬ）がカッパＶＬであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＲＡＳＱＳＩＸ5Ｘ6ＲＬＡ（配列番号９）であり；ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＥＡＳＸ7Ｘ8ＥＸ9（配列番号１０）であり；ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＱＱＸ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13ＰＸ14Ｘ15Ｘ16（配列番号１１）であり；ここで、Ｘ5は、Ｇ又はＳであり；Ｘ6は、Ｎ又はＧであり；Ｘ7は、Ｔ又はＮであり；Ｘ8は、Ｓ又はＬであり；Ｘ9は、Ｔ又はＳであり；Ｘ10は、Ｓ又はＡであり；Ｘ11は、Ｙ又はＮであり；Ｘ12は、Ｓ又はＴであり；Ｘ13は、Ｔ、Ｗ又はＦであり；Ｘ14は、不在又はＲであり；Ｘ15は、Ｙ、Ｒ又はＶであり；Ｘ16は、Ｔ又はＳであること、又は
（ｂ）ＶＬがラムダＶＬであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＸ17ＶＳ（配列番号１２）であり；ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＥＶＴＮＲＰＳ（配列番号１３）であり；ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＳＦＫＲＧＳＴＬＶＶ（配列番号１４）であり；ここで、Ｘ17は、Ｙ又はＳであり；配列は、Kabatの命名法によって定義されること
を特徴とする、軽鎖相補性決定領域：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む、項１から５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３３】
７．ＶＬドメインがカッパＶＬであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＲＡＳＱＳＩＧＮＲＬＡ（配列番号１５）であり；ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＥＡＳＴＳＥＴ（配列番号１６）であり；ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＱＱＳＹＳＴＰＹＴ（配列番号１７）である、項６に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３４】
８．抗体：
（ａ）配列番号１、１８、３、１５、１６及び１７のG1AA/E12v2；
（ｂ）配列番号１、１８、３、１９、２０及び２１のG1AA/G12v2；
（ｃ）配列番号１、１８、３、１９、２０及び２２のG1AA/E05v2；
（ｄ）配列番号１、２３、３、１５、１６及び１７のG1/887_04_E12；
（ｅ）配列番号１、２３、３、１９、２０及び２１のG1/887_04_G12；
（ｆ）配列番号１、２３、３、１９、２０及び２２のG1/894_08_E05；
（ｇ）配列番号１、２３、３、１９、２０及び２４のG1/894_08_A05；
（ｈ）配列番号１、１８、３、２５、１３及び１４のG1AA/lambdav3；
（ｉ）配列番号１、２３、３、２６、１３及び１４のG1/280_02_G02_NS又は
（ｊ）配列番号１、７８、３、２６、１３及び１４のG1/280_02_G02；
のＣＤＲ（それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＲＤ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む抗原結合部位を含み、ここで配列はKabatの命名法に従って定義される、項１から７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３５】
９．抗原結合部位が、抗体：
（ａ）配列番号２７及び２８それぞれのG1AA/E12v2；
（ｂ）配列番号２９及び３０それぞれのG1AA/G12v2；
（ｃ）配列番号３１及び３２それぞれのG1AA/E05v2；
（ｄ）配列番号３３及び３４それぞれのG1/887_04_E12；
（ｅ）配列番号３５及び３６それぞれのG1/887_04_G12；
（ｆ）配列番号３７及び３８それぞれのG1/894_08_E05；
（ｇ）配列番号３９及び４０それぞれのG1/894_08_A05；
（ｈ）配列番号４１及び４２それぞれのG1AA/lambdav3；
（ｉ）配列番号４３及び４４それぞれのG1/280_02_G02_NS；又は
（ｊ）配列番号４５及び４６それぞれのG1/280_02_G02；
のＶＨ及び／又はＶＬドメインを含み、ここで配列はKabatの命名法に従って定義される、項１から８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【００３６】
１０．抗体分子が、抗体：
（ａ）配列番号４７及び４８それぞれのG1AA/E12v2；
（ｂ）配列番号４９及び５０それぞれのG1AA/G12v2；
（ｃ）配列番号５１及び５２それぞれのG1AA/E05v2；
（ｄ）配列番号５３及び５４それぞれのG1/887_04_E12；
（ｅ）配列番号５５及び５６それぞれのG1/887_04_G12；
（ｆ）配列番号５７及び５８それぞれのG1/894_08_E05；
（ｇ）配列番号５９及び６０それぞれのG1/894_08_A05；
（ｈ）配列番号６１及び６２それぞれのG1AA/lambdav3；
（ｉ）配列番号６３及び６４それぞれのG1/280_02_G02_NS；又は
（ｊ）配列番号６５及び６６それぞれのG1/280_02_G02；
の重鎖及び／又は軽鎖を含み、ここで配列はKabatの命名法に従って定義される、項１から９のいずれか１項に記載の抗体分子。
【００３７】
１１．ＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び／又はＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）；ＶＨ及び／又はＶＬ；Ｆａｂ；抗体G1AA/E12v2、G1AA/G12v2又はG1AA/E05v2の軽鎖及び／又は重鎖を含む、項１から１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３８】
１２．ＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び／又はＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）；ＶＨ及び／又はＶＬ；Ｆａｂ；抗体G1AA/E12v2又はG1/E12v2の軽鎖及び／又は重鎖を含む、項１から１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３９】
１３．ＶＨが、配列番号２７のG1AA/E12v2、配列番号２９のG1AA/G12v2、配列番号３１のG1AA/E05v2、配列番号３３のG1/887_04_E12、配列番号３５のG1/887_04_G12、配列番号３７のG1/894_08_E05、配列番号３９のG1/894_08_A05、配列番号４１のG1AA/lambdav3、配列番号４３のG1/280_02_G02_NS及び配列番号４５のG1/280_02_G02から選択される抗体のＶＨに対して少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する、項１から１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４０】
１４．抗体分子又は抗原結合フラグメントがヒトＰＤ−Ｌ１に結合する、項１から１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４１】
１５．抗体分子又は抗原結合フラグメントがカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合する、項１から１４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４２】
１６．抗体又は抗原結合フラグメントがマウスＰＤ−Ｌ１に結合する、項１から１５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４３】
１７．抗体又は抗原結合フラグメントが、組換えヒトＰＤ−Ｌ１及び組換えカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対して、ＳＰＲ（例えば、Biacore）によって測定した場合、２ｎＭ未満、好ましくは１ｎＭ未満、より好ましくは０．７５ｎＭ未満、さらにより好ましくは０．５ｎＭ未満の親和性（ＫＤ）を有する、項１から１６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４４】
１８．抗体又はその抗原結合フラグメントが、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで評価した場合、Ｔ細胞活性化を増強する、項１から１７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４５】
１９．抗体又は抗原結合フラグメントが、少なくとも第２の抗原結合部位を含む、多重特異性、好ましくは二重特異性の分子である、項１から１８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４６】
２０．抗体又はその抗原結合フラグメントが、抗体又は抗原結合フラグメントの定常ドメインに位置する第２の抗原結合部位を含む、項１から１９のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【００４７】
２１．第２の抗原結合部位が、
（ａ）定常重鎖ドメインのＡＢ構造ループにおける第１の配列及び／又はＥＦ構造ループにおける第２の配列、
（ｂ）定常重鎖ドメインのＡＢ構造ループにおける第１の配列及びＥＦ構造ループにおける第２の配列、
（ｃ）定常重鎖ドメインのＡＢ構造ループにおける第１の配列及び／又はＥＦ構造ループにおける第２の配列及び／又はＣＤ構造ループにおける第３の配列
（ｄ）定常重鎖ドメインのＡＢ構造ループにおける第１の配列、ＥＦ構造ループにおける第２の配列、及びＣＤ構造ループにおける第３の配列
を含む、項２０に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４８】
２２．定常重鎖ドメインがＣＨ３ドメインである、項２０又は２１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４９】
２３．抗体が免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、又はその抗原結合フラグメントである、項１から２２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００５０】
２４．抗体が、ＩｇＧ１若しくはそのフラグメント、又はＩｇＧ４若しくはそのフラグメントである、項２３に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００５１】
２５．抗体が、修飾Ｆｃ領域を有するＩｇＧ１又はそのフラグメントである、項２３又は項２４に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００５２】
２６．抗体が、免疫エフェクター機能が低下した修飾Ｆｃ領域を有するＩｇＧ１又はそのフラグメントである、項２４又は項２５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００５３】
２７．修飾Ｆｃが、ＩｇＧ１と比較して低下したＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを有する、項２５又は２６に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００５４】
２８．修飾Ｆｃ領域が、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ−ＰＡ又はＬＡＬＡ−ＰＧ修飾を含む、項２５から２７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００５５】
２９．抗体が、Ｆｃ領域にＬＡＬＡ修飾を含むＩｇＧ１又はその抗原結合フラグメントである、項２５から２８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００５６】
３０．第２の抗原結合部位が、阻害性チェックポイント分子、共刺激分子、又は腫瘍関連抗原に結合する、項１９から２９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００５７】
本発明によると、抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、第２の抗原結合部位は、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ７３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＲ．Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＳＩＲＰａ、ＢＴＬＡ、ＣＣＲ４、ＣＤ２００Ｒ、又はＴＧＦベータなどの阻害性チェックポイント分子に結合し得る。
【００５８】
本発明によると、抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、第２の抗原結合部位は、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、ＮＫＧ２Ｄ、又はＴＮＦＲ２などのＴ細胞によって発現される共刺激分子に結合し、その共刺激分子のアゴニストであり得る。
【００５９】
本発明によると、抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、第２の抗原結合部位は、ｃ−Ｍｅｔ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＥＰＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ、ＦＡＰ、ＶＥＧＦ、ＭＳＬＮ、ＧＰＣ３、ＣＤ３８、ＣＤ１９、又はＣＤ２０などの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合し得る。
【００６０】
３１．第２の抗原結合部位が、ＯＸ４０、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）又はＣＤ１３７に結合しない、項１９から３０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００６１】
３２．第２の抗原結合部位が、ＣＤ２７又は糖質コルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）に結合しない、項１９から３０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００６２】
３３．第２の抗原結合部位が、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）に結合しない、項１９から３０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００６３】
３４．項１から３３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び免疫系モジュレーター（アゴニスト又はアンタゴニスト）、細胞傷害性分子、又は放射性同位体を含む、コンジュゲート又は融合物。
【００６４】
３５．検出可能な標識を有する、項１から３４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート又は融合物。
【００６５】
３６．項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート又は融合物をコードする、核酸分子又は核酸分子のセット。
【００６６】
３７．核酸分子又は核酸分子のセットが、
（ａ）G1AA/E12v2又はG1/E12v2；
（ｂ）G1AA/E05v2又はG1/E05v2；
（ｃ）G1AA/G12v2又はG1/G12v2；
（ｄ）G1/887_04_E12；
（ｅ）G1/894_08_E05；
（ｆ）G1/887_04_G12；
（ｇ）G1/894_08_A05；
（ｈ）G1AA/lambdav3；
（ｉ）G1/280_02_G02_NS；又は
（ｊ）G1/280_02_G02。
のＶＨ及び／又はＶＬ、Ｆａｂ、重鎖及び／又は軽鎖の１つ以上をコードするｃＤＮＡ配列を含む、項３６に記載の核酸分子又は核酸分子のセット。
【００６７】
３８．第１の核酸配列及び第２の核酸配列を含み、
（ａ）第１の核酸配列が、配列番号２７の抗体G1AA/E12v2のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号２８の抗体G1AA/E12v2のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｂ）第１の核酸配列が、配列番号２９の抗体G1AA/G12v2のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号３０の抗体G1AA/G12v2のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｃ）第１の核酸配列が、配列番号３１の抗体G1AA/E05v2のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号３２の抗体G1AA/E05v2のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｄ）第１の核酸配列が、配列番号３３の抗体G1/887_04_E12のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号３４の抗体G1/887_04_E12のＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｅ）第１の核酸配列が、配列番号３５の抗体G1/887_04_G12のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号３６の抗体G1/887_04_G12のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｆ）第１の核酸配列が、配列番号３７の抗体G1/894_08_E05のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号３８の抗体G1/894_08_E05のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｇ）第１の核酸配列が、配列番号３９の抗体G1/894_08_A05のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号４０の抗体G1/894_08_A05のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｈ）第１の核酸配列が、配列番号４１の抗体G1AA/lambdav3のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号４２の抗体G1AA/lambdav3のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、
（ｉ）第１の核酸配列が、配列番号４３の抗体G1/280_02_G02_NSのＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号４４の抗体G1/280_02_G02_NSのＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含むか、又は
（ｉ）第１の核酸配列が、配列番号４５の抗体G1/280_02_G02のＶＨをコードするＶＨ  ｃＤＮＡ配列を含み、第２の核酸配列が、配列番号４６の抗体G1/280_02_G02のＶＬをコードするＶＬ  ｃＤＮＡ配列を含む、
項３７に記載の核酸分子又は核酸分子のセット。
【００６８】
３９．項３６から項３８のいずれかの核酸分子又は核酸分子のセットを含む、ベクター又はベクターのセット。
【００６９】
４０．項３６から項３８のいずれかの核酸分子若しくは核酸分子のセット、又は項３９のベクター若しくはベクターのセットを含む、組換え宿主細胞。
【００７０】
４１．抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート又は融合物の産生に適した条件下で項４０の組換え宿主細胞を培養することを含む、項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート又は融合物を産生する方法。
【００７１】
４２．抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート又は融合物を単離及び／又は精製することをさらに含む、項４１に記載の方法。
【００７２】
４３．項１から４２のいずれか１項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート又は融合物と、賦形剤（例えば、薬学的に許容される賦形剤）とを含む、組成物（例えば、医薬組成物）。
【００７３】
４４．治療によるヒト又は動物の体の処置方法における使用のための、項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物、又は項４３に記載の組成物。
【００７４】
４５．項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物、又は項４３に記載の組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、患者の疾患又は障害を処置する方法。
【００７５】
４６．ヒト又は動物の体の処置のための医薬の製造における、項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物、又は項４３に記載の組成物の使用。
【００７６】
４７．抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート、融合物又は組成物を、第２の治療と組み合わせてヒト又は動物の体に投与することを含む処置方法における項４４に記載の使用のための、項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物、又は項４３に記載の組成物。
【００７７】
４８．方法が、治療有効量の第２の治療を患者に投与することをさらに含む、項４５の方法、又は項４６の使用。
【００７８】
４９．第２の治療が、放射線療法、好ましくは標的放射線療法である、項４７に記載の使用のための、又は項４８に記載の方法における、抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート、融合物又は組成物。
【００７９】
５０．ヒト若しくは動物の体で実施される、又はヒト若しくは動物の体からのサンプルでインビトロで実施される診断方法における使用のための、項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物、又は項４３に記載の組成物。
【００８０】
５１．項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物の、又は項４３に記載の組成物の使用を含む、患者の疾患又は障害を検出する方法。
【００８１】
５２．診断薬の製造における、項１から３５のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、コンジュゲート若しくは融合物の使用、又は項４３に記載の組成物の使用。
【００８２】
抗ＰＤ−Ｌ１又は抗ＰＤ−１抗体を用いた様々な種類の癌の処置が臨床試験で調査され、有望な結果が示されている。これらには、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、線維肉腫、腎細胞癌、黒色腫（進行性及び転移性黒色腫）、膵臓癌、乳癌、多形神経膠芽腫、肺癌（非小細胞肺癌及び小細胞肺癌など）、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮細胞癌など）、胃癌（stomach cancer）（胃癌（gastric cancer））、膀胱癌、頸癌、子宮癌（子宮内膜癌、子宮頸癌）、外陰癌、精巣癌、陰茎癌、食道癌、肝細胞癌、上咽頭癌、メルケル細胞癌、中皮腫、ＤＮＡミスマッチ修復欠損結腸直腸癌、ＤＮＡミスマッチ修復欠損子宮内膜癌、甲状腺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、無痛性非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫など）、白血病（慢性リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病など）、多発性骨髄腫、及び末梢Ｔ細胞リンパ腫などの固形腫瘍が含まれる。したがって、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、これらの癌の処置における用途が見出され得る。これらの癌の腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１を発現するＴＩＬなどの免疫細胞を含有することが知られているか、又はそれが期待される。
【００８３】
特に、ＰＤ−Ｌ１抗体を使用した、黒色腫、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、腎細胞癌、胃癌、頭頸部癌（頭頸部の扁平上皮細胞癌など）、中皮腫、肺癌（非小細胞肺癌など）、卵巣癌、メルケル細胞癌、膵臓癌、黒色腫及び肝細胞癌の処置が臨床試験で調査され、有望な結果が示されている。したがって、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを使用して処置される癌は、黒色腫、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、腎細胞癌、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌（頭頸部の扁平上皮細胞癌など）、中皮腫、肺癌（非小細胞肺癌など）、卵巣癌、メルケル細胞癌、膵臓癌、黒色腫、又は肝細胞癌であり得る。
【００８４】
癌は、悪性癌細胞の異常な増殖を特徴とし得る。用途が乳癌などの特定の種類の癌に言及している場合、これは、関連する組織、この場合は乳房組織の悪性形質転換を指す。異なる組織、例えば、卵巣組織の悪性形質転換に起因する癌は、乳房などの身体の別の位置に転移性病変をもたらし得るが、これは、本明細書で言及される乳癌ではなく、卵巣癌である。
【００８５】
癌は、原発癌又は二次癌であり得る。したがって、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、癌が原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である、患者の癌を処置する方法における使用のためのものであり得る。
【００８６】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントはまた、ウイルス、細菌、真菌及び／又は寄生虫感染症などの感染症の処置における用途を見出すことが期待され得る。好ましくは、感染症は、ウイルス性、細菌性又は真菌性疾患、より好ましくはウイルス性又は細菌性疾患、最も好ましくはウイルス性疾患である。感染症は、慢性又は急性であり得るが、好ましくは慢性である。
【００８７】
本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントで処置され得るウイルス性疾患の例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、エンテロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヘルペスウイルス（エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）など）、及びパピローマウイルス感染症が含まれる。
【００８８】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントで処置され得る細菌性疾患の例には、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、グラム陰性菌（アシネトバクター（Acinetobacter）、クレビセラ（Klebisella）、エンテロバクター（Enterobacter）など）、グラム陽性菌（クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）など）、及びリステリア（Listeria）（リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）など）感染症が含まれる。
【００８９】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントで処置され得る真菌性疾患の例には、アスペルギルス（Aspergillus）及びカンジダ（Candida）感染症が含まれる。
【００９０】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントで処置され得る寄生虫性疾患の例には、マラリア、トキソプラズマ、及びリーシュマニア感染症が含まれる。
【００９１】
本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントは、患者、好ましくはヒト患者の処置方法において使用されるように設計される。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、通常、医薬組成物の形態で投与され、これは、薬学的に許容される賦形剤などの少なくとも１つの追加の成分を含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、抗体又はその抗原結合フラグメントに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。このような材料は非毒性でなければならず、抗体又はその抗原結合フラグメントの有効性に干渉してはならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、これは、注射（例えば、静脈内又は皮下）によるものであり得る。抗体又はその抗原結合フラグメントは、静脈内又は皮下で投与され得る。
【００９２】
液体医薬組成物は、一般的に、水又は生理食塩水などの液体担体を含む。皮下若しくは静脈内注射、又は罹患部位での注射の場合、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は抗体若しくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物は、好ましくは、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を備えた、非経口的に許容される水溶液の形態である。
【００９３】
本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物は、単独で若しくは他の処置と組み合わせて、同時に若しくは連続して、又は処置される状態に応じて別の治療剤との組み合わせ製剤として、投与され得る。例えば、本発明の抗体又はそのフラグメントは、処置される疾患、例えば、上記のような癌のための既存の治療剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の抗体又はそのフラグメントは、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種（癌ワクチン接種とも呼ばれる）、放射線療法、免疫療法、腫瘍溶解性ウイルス、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、又はホルモン療法などの第２の抗癌療法と組み合わせて患者に投与され得る。
【００９４】
本発明の抗体又はそのフラグメントは、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線療法などの抗癌療法においてアジュバントとして作用し得ることが期待される。理論に拘束されることを望むものではないが、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線療法の一部としての患者への抗体又はそのフラグメントの投与は、癌関連抗原ＰＤ−Ｌ１に対して、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線療法のみで達成されるよりも大きな免疫応答を誘発すると考えられている。
【００９５】
したがって、患者の癌を処置する方法は、本発明による治療有効量の抗体又はそのフラグメントを、化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射性核種、免疫療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン療法剤と組み合わせて、患者に投与することを含み得る。化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射性核種、免疫療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン療法剤は、好ましくは、問題の癌のための化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射性核種、免疫療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン療法剤、すなわち、問題の癌の処置に効果的であることが示されている、化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射性核種、免疫療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン療法剤である。適切な、問題の癌に対して効果的であることが示されている、化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射性核種、免疫療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン療法剤の選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００９６】
例えば、方法が本発明による治療有効量の抗体又はそのフラグメントを、化学療法剤と組み合わせて患者に投与することを含む場合、化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ＿ＲＡＦ酵素阻害剤、アルキル化剤、プラチナ類似体、ヌクレオシド類似体、サリドマイド誘導体、抗悪性腫瘍化学療法剤などからなる群から選択され得る。タキサンは、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ−パクリタキセルを含み；細胞傷害性抗生物質は、アクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラサイクリン、ドキソルビシン及びバルルビシンを含み；チロシンキナーゼ阻害剤は、スニチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コベミチニブ及びトラメチニブを含み；ＰＡＲＰ阻害剤は、ピラパリブを含み；Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤は、ベムラフェニブ及びダブラフェニブを含み；アルキル化剤は、ダカルバジン、シクロホスファミド、テモゾロミドを含み；プラチナ類似体は、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンを含み；ヌクレオシド類似体は、ゲムシタビン及びアザシチジンを含み；抗悪性腫瘍剤は、フルダラビンを含む。本発明における使用に適した他の化学療法剤には、メトトレキサート、デファクチニブ、エンチノスタット、ペメトレキセド、カペシタビン、エリブリン、イリノテカン、フルオロウラシル、及びビンブラスチンが含まれる。
【００９７】
癌の処置のためのワクチン接種戦略は、クリニックで実施され、科学文献で詳細に議論されている（Rosenberg S. Development of Cancer Vaccines.ASCO Educational Book Spring:60-62(2000)など）。これは主に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を伴う場合と伴わない場合の両方で、ワクチン接種方法としてこれらの細胞を使用することにより、自己又は同種異系の癌細胞によって発現される様々な細胞マーカーに応答するように免疫系を刺激する戦略を含む。ＧＭ−ＣＳＦは、抗原提示において強い反応を引き起こし、前記戦略で使用される場合、特によく機能する。
【００９８】
本発明の方法が本発明による治療有効量の抗体又はそのフラグメントを、免疫療法剤と組み合わせて患者に投与することを含む場合、免疫療法剤は、チェックポイント阻害剤、共刺激分子、又は可溶性因子に結合する抗体（ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ７３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＨＥＶＭ、ＴＧＦＢ、ＩＬ−１０、ＣＳＦ−１に結合する抗体など）からなる群から選択され得る。或いは、免疫療法剤は、１つ以上のＩＬ−２、コンジュゲートＩＬ−２のプロドラッグ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、及びＩ型インターフェロンからなる群から選択される、サイトカイン又はサイトカインベースの治療であり得る。
【００９９】
投与は「治療有効量」であり得、これは患者への利点を示すのに十分な量である。そのような利益は、少なくとも１つの症状の、少なくとも改善であり得る。したがって、特定の疾患の「処置」とは、少なくとも１つの症状の改善を指す。実際に投与される量、並びに投与の速度及び時間経過は、処置される対象の性質及び重症度、処置される特定の患者、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、抗体又はそのフラグメントのタイプ、投与方法、投与のスケジュール、並びに医師に知られている他の要因に依存する。処置の処方、例えば、投与量の決定などは、一般医及び他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度及び／又は処置されている疾患の進行に依存し得る。抗体又はそのフラグメントの適切な用量は、当技術分野で周知である（Ledermann et al.(1991) Int.J. Cancer 47:659-664；及びBagshawe et al.(1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922）。投与される抗体又はそのフラグメントに対して適切な、本明細書又はPhysician’s Desk Reference(2003)に示されている特定の投与量が使用され得る。抗体又はそのフラグメントの治療有効量又は適切な用量は、動物モデルにおけるそのインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿するための方法は公知である。正確な用量は、処置される領域のサイズ及び位置、並びに特定の結合メンバーの正確な性質を含む、多数の要因に依存する。処置は、医師の裁量により、毎日、週に２回、週に１回、又は月に１回繰り返され得る。処置は、手術の前及び／又は後に行われ得、外科的処置の解剖学的部位に直接投与又は適用され得る。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
詳細な説明
本発明は、ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位を含む抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、組換え手段によって産生され得る。「組換え抗体」は、組換え操作された宿主細胞によって産生された抗体である。本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントは、任意選択により単離又は精製される。
【０１０１】
「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、文脈上別段の必要がない限り、ヒトＰＤ−Ｌ１、マウス（murine）、特にマウス（mouse）ＰＤ−Ｌ１、及び／又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１を指し得る。好ましくは、「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、文脈上別段の必要がない限り、ヒトＰＤ−Ｌ１を指す。
【０１０２】
「抗体分子」という用語は、天然であるか、又は部分的若しくは全体的に合成的に産生されるかを問わず、免疫グロブリンを説明する。抗体分子は、ヒト又はヒト化され得る。抗体分子は、好ましくはモノクローナル抗体分子である。抗体の例は、免疫グロブリンＧなどの免疫グロブリンアイソタイプ、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などのそれらのアイソタイプサブクラス、並びにそれらのフラグメントである。４つのヒトサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）には、それぞれ異なる重鎖が含有されるが、それらは相同性が高く、主にヒンジ領域及びそれらが宿主の免疫系を活性化する程度が異なる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４は、ヒンジ領域に２つの鎖間ジスルフィド結合を含有し、ＩｇＧ２は４つ、ＩｇＧ３は１１個の鎖間ジスルフィド結合を有する。
【０１０３】
本明細書で使用される「抗体」及び「抗体分子」という用語は、Ｆａｂ及びｓｃＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントを含み、ただし、前記フラグメントは、ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。したがって、文脈上別段の必要がない限り、本明細書で使用される「抗体」又は「抗体分子」という用語は、「抗体又はその抗原結合フラグメント」と同等である。
【０１０４】
抗体は免疫グロブリンであり、これは、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる同じ基本構造を有し、２つのＦａｂアームを形成する。このアームは、柔軟なヒンジ領域によって抗体のステムであるＦｃドメインに接続され、古典的な「Ｙ」形状を与える、同一のドメインを含有する。Ｆａｂドメインは、２つの可変ドメイン及び２つの定常ドメインからなり、重鎖には可変重鎖（ＶＨ）及び定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインがあり、軽鎖には可変軽鎖（ＶＬ）及び定常軽鎖（ＣＬ）ドメインがある。２つの可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）は、可変フラグメント（Ｆｖ）を形成する。これは、抗体のＣＤＲベースの抗原特異性を提供し、定常ドメイン（ＣＨ１及びＶＬ）は、構造フレームワークとして機能する。各可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる３つの超可変ループを含有する。ＶＨ及びＶＬのそれぞれで、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）に４つの可変性の低いフレームワーク（ＦＲ）領域（ＦＲ１、ＦＷ２、ＦＷ３、及びＦＷ４）が隣接し、構造ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＣＤＲ２−ＦＷ３−ＣＤＲ３−ＦＷ４が得られる。ＣＤＲは、抗体の表面に特定の抗原認識部位を提供する。
【０１０５】
本明細書において、Kabat及びImMunoGeneTics（IMGT）の両方の番号付け命名法が使用される。一般的に、特に示されない限り（明示的に、又は文脈によって）、アミノ酸残基は、本明細書において、Kabat番号付けスキーム（Kabat et al., 1991）に従って番号付けされる。ＩＭＧＴ番号付けが使用される場合の例において、アミノ酸残基は、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従って本明細書において番号付けされる。ＩＭＧＴ番号付けスキームは、Lefranc et al., 2005に記載されている。
【０１０６】
配列がＩＭＧＴ命名法によって定義される場合、本発明は以下を提供する：
１Ａ．ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＧＹＸ1ＦＴＳＹＧ（配列番号６７）であり；ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＩＳＡＹＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5（配列番号６８）であり；ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＡＲＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ（配列番号６９）であり；ここで、Ｘ1は、Ｐ又はＴであり；Ｘ2は、Ｓ、Ｎ又はＧ、好ましくは、Ｓ又はＮであり；Ｘ3は、Ｇ又はＳであり；Ｘ4は、Ｇ、Ｎ又はＳ、好ましくは、Ｇ又はＮであり；Ｘ5は、Ｔ又はＡ、好ましくは、Ｔであり、配列は、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）の命名法によって定義されることを特徴とする、それぞれがフレームワーク（ＦＷ）領域に隣接する、ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＲＤ２及びＨＣＤＲ３を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメント。
【０１０７】
２Ａ．ＨＣＤＲ２の配列Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5（配列番号４）（残基６２〜６５）が、ＳＧＧＴ（配列番号５）、ＮＳＮＴ（配列番号６）、ＧＧＳＴ（配列番号７）及びＳＧＮＡ（配列番号８）（ＩＭＧＴ命名法）から選択される、項１Ａに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【０１０８】
３Ａ．ＨＣＤＲ２のＸ1がＰであり、Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5がＳＧＧＴ（配列番号５）（ＩＭＧＴ命名法）である、項１Ａ又は２Ａに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【０１０９】
４Ａ．
（ａ）可変軽鎖（ＶＬ）がカッパＶＬであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＱＳＩＸ6Ｘ7Ｒ（配列番号７０）であり；ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＥＡＳ（配列番号７１）であり；ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＱＱＸ8Ｘ9Ｘ10ＴＰＹＴ（配列番号７２）、ＱＱＸ8Ｘ9Ｘ10ＴＰＲＶＴ（配列番号７３）、ＱＱＸ8Ｘ9Ｘ10ＦＰＲＶＳ（配列番号７４）、又はＱＱＸ8Ｘ9Ｘ10ＷＰＲＴ（配列番号７５）であり；ここで、Ｘ6は、Ｇ又はＳであり；Ｘ7は、Ｎ又はＧであり；Ｘ8は、Ｓ又はＡであり；Ｘ9は、Ｙ又はＮであり；Ｘ10は、Ｓ又はＴであること；又は
（ｂ）ＶＬがラムダＶＬであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、ＳＳＤＶＧＧＹＮＸ11（配列番号７６）であり；ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、ＥＶＴ（配列番号７７）であり；ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＳＳＦＫＲＧＳＴＬＶＶ（配列番号１４）であり；ここで、Ｘ11は、Ｙ又はＳであり；配列は、ＩＭＧＴの命名法によって定義されること
を特徴とする、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む、項１Ａから３Ａのいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【０１１０】
５Ａ．
（ａ）抗体G1AA/E12v2のＣＤＲ；
（ｂ）抗体G1AA/G12v2のＣＤＲ；
（ｃ）抗体G1AA/E05v2のＣＤＲ；
（ｄ）抗体G1/887_04_E12のＣＤＲ；
（ｅ）抗体G1/887_04_G12のＣＤＲ；
（ｆ）抗体G1/894_08_E05のＣＤＲ；
（ｇ）抗体G1/894_08_A05のＣＤＲ；
（ｈ）抗体G1AA/lambdav3のＣＤＲ；又は
（ｉ）抗体G1/280_02_G02_NSのＣＤＲ；
（ｊ）抗体G1/280_02_G02のＣＤＲ；
を含む抗原結合部位を含み、ここで配列は、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）の番号付けスキームに従って定義される、項１Ａから４Ａのいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合フラグメント。
【０１１１】
モノクローナル抗体及び他の抗体で、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を一般的に保持する他の抗体又はキメラ分子を産生することができる。そのような技術は、ＣＤＲを異なる免疫グロブリンフレームワークに導入すること、又は可変領域を異なる免疫グロブリン定常領域に移植することを含み得る。ある免疫グロブリンのＣＤＲの別の免疫グロブリンへの導入は、例えば、欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号、又は欧州特許出願公開第Ａ−２３９４００号に記載されている。或いは、抗体分子を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は、遺伝子変異又は他の変化を受け得、これは、産生される抗体の結合特異性を変化させる場合も、変化させない場合もある。
【０１１２】
抗体は多くの方法で修飾できるため、「抗体」という用語は、抗体フラグメント、誘導体、機能的同等物、及び抗体の相同体をカバーすると解釈されるべきであり、これは、天然であるか、又は全体的若しくは部分的に合成であるかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。したがって、別のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメイン又は同等物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第Ａ−０１２０６９４号及び欧州特許出願公開第Ａ−０１２５０２３号に記載されている。
【０１１３】
ＣＤＲ配列及びＣＨ３ドメインの両方を含む抗体フラグメントの例は、ＣＨ３ドメインに連結されたｓｃＦｖを含むミニボディである（Hu et al., 1996）。
【０１１４】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ＰＤ−Ｌ１、特にヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。この文脈での結合は、特定の結合を指し得る。「特異的」という用語は、抗体分子がその特異的結合パートナー（ここではＰＤ−Ｌ１）以外の分子への有意な結合を示さない状況を指し得る。「特異的」という用語は、抗体分子が、ＰＤ−Ｌ１上のエピトープなどの、いくつかの抗原によって運ばれる特定のエピトープに特異的である場合にも適用でき、この場合、抗体分子は、エピトープを運ぶ様々な抗原に結合できる。
【０１１５】
アミノ酸は、１文字若しくは３文字のコード、又はフルネームで呼ばれ得る。２０個の標準アミノ酸のそれぞれの１文字と３文字のコード、及びフルネームを以下に示す。
【０１１６】
【表１−１】
2021524478.tif 000003
【０１１７】
好ましい実施形態において、本発明のＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｅ１２ｖ２のＨＣＤＲ３配列（配列番号３）を含み；抗体がＥ１２ｖ２のＨＣＤＲ２配列（配列番号１８）をさらに含むことが好ましく；本発明のＰＤ−Ｌ１抗体がＥ１２ｖ２のＨＣＤＲ１配列（配列番号１）をさらに含むことが好ましい。好ましい実施形態において、ＨＣＤＲ２配列は、Ｅ１２ｖ２のＨＣＤＲ２配列（配列番号１８）であり、ＶＨ（Kabat）における２８位のアミノ酸は、プロリンである。特に好ましい実施形態において、本発明のＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３のＨＣＤＲ３配列、配列番号１８のＨＣＤＲ２配列を含み、ＶＨ（Kabat）における２８位のアミノ酸は、プロリンである。より特に好ましい実施形態において、本発明のＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３のＨＣＤＲ３配列、配列番号１８のＨＣＤＲ２配列、及び配列番号１のＨＣＤＲ１配列を含み、ＶＨ（Kabat）における２８位のアミノ酸は、プロリンである。
【０１１８】
本発明の抗体は、抗体の機能的特性が保持されるという条件で、ＶＨ及び／又はＶＬ配列における１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のさらなるアミノ酸修飾を含み得る。
【０１１９】
修飾は、アミノ酸の置換、欠失又は挿入であり得る。好ましくは、修飾は置換である。
【０１２０】
１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている好ましい実施形態において、置換は、例えば以下のチャートに従う、保存的置換であり得る。いくつかの実施形態において、中央の列の同じカテゴリーのアミノ酸は、互いに置換されており、すなわち、非極性アミノ酸は、例えば、別の非極性アミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態において、右端の列の同じ行のアミノ酸が互いに置換されている。
【０１２１】
【表１−２】
2021524478.tif 000004
【０１２２】
いくつかの実施形態において、置換は、機能的に保存的であり得る。すなわち、いくつかの実施形態において、置換は、同等の非置換抗体分子と比較して、置換を含む抗体分子の１つ以上の機能的特性（例えば、結合親和性）に影響を与えない（又は実質的に影響を与えない）可能性がある。
【０１２３】
好ましい実施形態において、本発明のＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載の本発明のＶＨ及び／又はＶＬ配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変更（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０個以下の変更、１５個以下の変更、１０個以下の変更、５つ以下の変更、４つ以下の変更、３つ以下の変更、２つ以下の変更、又は１つの変更を伴う、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン配列を含み得る。
【０１２４】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号３に記載のＥ１２ｖ２のＨＣＤＲ３ドメインを含む。
【０１２５】
別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２７に記載のＥ１２ｖ２のＶＨドメイン、又は配列番号２７に記載の配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む。
【０１２６】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号２７に記載の配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２７】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号３に記載のＥ１２ｖ２のＨＣＤＲ３、及び配列番号１８、２３又は２４に記載のものから選択されるＨＣＤＲ２を含むＶＨドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号２７に記載の配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２８】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号３に記載のＥ１２ｖ２のＨＣＤＲ３、配列番号１８、２３又は２４に記載のものから選択されるＨＣＤＲ２ドメイン、２８位のプロリン、を含むＶＨドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号２７に記載の配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２９】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２８に記載のＥ１２ｖ２のＶＬドメイン、又は配列番号２８に記載の配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１３０】
配列同一性は、一般的に、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCGパッケージ、Accelerys Inc、米国サンディエゴ（San Diego USA））を参照して定義される。ＧＡＰは、NeedlemanとWunschのアルゴリズムを使用して、２つの完全配列を整列させ、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般的に、ギャップ生成ペナルティが１２に等しく、ギャップ拡張ペナルティが４に等しいデフォルトのパラメーターが使用される。ＧＡＰの使用が好ましい場合もあるが、他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al.(1990) J. MoI.Biol.215:405-410の方法を使用）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85:2444-2448の方法を使用）、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman(1981) J. MoI Biol.147:195-197）、又は上掲Altschul et al.(1990)のＴＢＬＡＳＴＮプログラムも、一般的にデフォルトパラメーターを使用して用いられ得る。特に、psi-Blastアルゴリズム（Nucl.Acids Res.(1997) 25 3389-3402）が使用され得る。配列同一性は、Bioedit、ClustalWアルゴリズムを使用して定義され得る。
【０１３１】
抗体はＣＨ２ドメインを含み得る。ＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＧ分子の場合のように、好ましくはＣＨ３ドメインのＮ末端に位置する。抗体のＣＨ２ドメインは、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインである。ヒトＩｇＧドメインの配列は当技術分野で公知である。
【０１３２】
抗体は、ＣＨ２ドメインのＮ末端に免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を含み得る。免疫グロブリンヒンジ領域は、２つのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン配列が会合して二量体を形成することを可能にする。好ましくは、ヒンジ領域又はその一部は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４ヒンジ領域、又はその一部である。より好ましくは、ヒンジ領域又はその一部は、ＩｇＧ１ヒンジ領域又はその一部である。
【０１３３】
ＣＨ３ドメインの配列は特に限定されない。好ましくは、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインなどのヒト免疫グロブリンＧドメイン、最も好ましくは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインである。
【０１３４】
本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４定常領域を含み得る。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインの配列は、当技術分野で公知である。
【０１３５】
抗体分子の重鎖は、任意選択により、重鎖ＣＨ３ドメイン配列のＣ末端に追加のリジン残基（Ｋ）を含み得る。
【０１３６】
免疫グロブリンは、個別のドメインを含むモジュラーアーキテクチャを有することが知られており、これを多数の異なる方法で組み合わせて、多重特異性、例えば、二重特異性、三重特異性、又は四重特異性抗体形式を作製することができる。例示的な多重特異性抗体形式は、例えば、Spiess et al., 2015及びKontermann, 2012に記載されている。本発明の抗体は、そのような多重特異性形式で使用され得る。
【０１３７】
例えば、本発明の抗体は、ヘテロ二量体完全免疫グロブリン分子などのヘテロ二量体抗体分子、又はそのフラグメントであり得る。この場合、抗体の一部は、本明細書に記載されるような配列を有するであろう。例えば、本発明の抗体が二重特異性ヘテロ二量体抗体分子である場合、抗体は、ＰＤ−Ｌ１以外の抗原を結合するＶＨドメイン及びＶＬドメインをそれぞれ含む重鎖及び軽鎖と対になっている、本明細書に記載の重鎖及び軽鎖を含み得る。ヘテロ二量体抗体を調製するための技術は、当技術分野で知られており、抗体分子のＣＨ３ドメインを操作して「ノブ」又は「ホール」のいずれかを作製して鎖ヘテロ二量体化を促進することを含むノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）技術を含む。或いは、静電反発力によるＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避し、静電引力によるヘテロ二量体化に向けるために、抗体分子に電荷対を導入することによってヘテロ二量体抗体を調製することができる。ヘテロ二量体抗体形式の例には、CrossMab、mAb-Fv、SEED-body、及びKIH IgGが含まれる。
【０１３８】
或いは、多重特異性抗体分子は、完全免疫グロブリン分子又はそのフラグメント、及び１つ又は複数の追加の抗原結合部位を含み得る。抗原結合部位は、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体であり得、完全免疫グロブリン分子又はそのフラグメントに融合され得る。完全免疫グロブリン分子に融合した追加の抗原結合部位を含む多重特異性抗体分子の例には、ＤＶＤ−ＩｇＧ、ＤＶＩ−ＩｇＧ、ｓｃＦｖ４−ＩｇＧ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、及びｓｃＦｖ−ＩｇＧ分子が含まれる（Spiess et al., 2015；図１）。免疫グロブリンフラグメントに融合した追加の抗原結合部位を含む多重特異性抗体分子の例には、例えば、ＢｉＴＥ分子、ダイアボディ、及びＤＡＲＴ分子が含まれる（Spiess et al., 2015；図１）。他の適切な形式は、当業者には容易に明らかであろう。
【０１３９】
ＣＤＲベースのＰＤ−Ｌ１結合部位に加えて、例えば、抗体のＶＨにおいて、抗体は、二重又は多重特異性分子を作製するために、１つ以上の追加の抗原結合部位をさらに含み得る。抗体は、ＣＨ３ベース又はＣＨ２ベースの抗原結合部位を含み得る。ＣＤＲベースの抗原結合部位は、天然に存在する免疫グロブリン分子に見出され、それらの構造は当技術分野で周知である。抗体又はその抗原結合フラグメントがＣＤＲベースの抗原結合部位を含む場合、抗体又はその抗原結合フラグメントは、好ましくは抗体分子である。二重特異性又は多重特異性抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１のＣＤＲベースの抗原結合部位、及び第２の標的のＣＨ３ベース又はＣＨ２ベースの結合部位を含み得る。好ましい実施形態において、抗体分子は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子などのヒト免疫グロブリンＧ分子、より好ましくはヒトＩｇＧ１分子である。
【０１４０】
任意選択により、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体の定常ドメイン、好ましくはＣＨ３又はＣＨ２に位置する、第２の抗原結合部位を有し得る。
【０１４１】
或いは、又はさらに、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２又は第３の標的抗原のためのさらなるＣＤＲベースの抗原結合部位（例えば、ＶＨ及びＶＬによって形成される）を含み得る。したがって、本発明による抗体分子又はその抗原結合フラグメントは、第２の抗原結合部位を含む多重特異性、好ましくは二重特異性の分子であり得る。
【０１４２】
第２の抗原結合部位は、存在する場合、ＣＨ３ベース若しくはＣＨ２ベースの抗原結合部位又はＣＤＲベースの抗原結合部位であり得、前記抗原の結合が癌の処置において有益であると予想されるように抗原に結合し得る。
【０１４３】
抗体分子は、ｍＡｂ2（ＴＭ）二重特異性抗体であり得る。本明細書で言及されるｍＡｂ2二重特異性抗体は、その可変領域のそれぞれにＣＤＲベースの抗原結合部位、及び抗体分子の定常ドメインに少なくとも１つの抗原結合部位を含む、ＩｇＧ免疫グロブリンである。
【０１４４】
一実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントが第２の抗原結合部位、例えば、ＣＨ３ベース、ＣＨ２ベース、又はＣＤＲベースの抗原結合部位を含む場合、第２の抗原結合部位は、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ７３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、２Ｂ４、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ４７、ＳＩＲＰａ、ＢＴＬＡ、ＣＣＲ４、ＣＤ２００Ｒ、又はＴＧＦベータなどの、非冗長且つ相補的な阻害チェックポイント分子に結合し得る。
【０１４５】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の阻害及び共刺激分子の刺激は、ヒト患者の免疫応答を増強するための補完的な戦略を表す。チェックポイント遮断を通じたＴ細胞枯渇の逆転により、これらの細胞がより強力に活性化され、完全な抗腫瘍活性を発現し得る。したがって、別の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２の抗原結合部位、例えば、ＣＨ３ベース、ＣＨ２ベース、又はＣＤＲベースの抗原結合部位を含み得、第２の抗原結合部位は、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、ＮＫＧ２Ｄ、又はＴＮＦＲ２などのＴ細胞によって発現される共刺激分子に結合し、その共刺激分子のアゴニストであり得る。
【０１４６】
さらなる実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２の抗原結合部位、例えば、ＣＨ３ベース、ＣＨ２ベース、又はＣＤＲベースの抗原結合部位を含み得、第２の抗原結合部位は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合し得る。このような抗体又はその抗原結合フラグメントは、局所的な免疫活性化を通じて腫瘍特異的Ｔ細胞応答をもたらすと期待される。ＴＡＡの例は、ｃ−Ｍｅｔ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＥＰＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ、ＦＡＰ、ＶＥＧＦ、ＭＳＬＮ、ＧＰＣ３、ＣＤ３８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０である。
【０１４７】
上で詳述したように、感染症は、腫瘍学と多くの類似点を示す。免疫調節におけるＰＤ−Ｌ１の役割は、病原体に対する免疫応答を最大化するために利用され得る。感染症の処置における免疫調節は医学の新たな分野であり、初期のレビューでは、ＰＤ−Ｌ１遮断が、感染に対する生物学的反応を改善し、特に、Ｔ細胞の枯渇への対抗を助け、免疫介在性クリアランスを管理し、長期免疫を生成し得ることが示唆されている（Wykes and Lewin, 2017）。
【０１４８】
いくつかの感染症において、過剰な炎症誘発性反応及び最適以下の抗原特異的Ｔ細胞活性が、重度の組織損傷の原因である（Rao et al., 2017）。理論に拘束されることを望むものではないが、第２の抗原結合部位を含む本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの使用は、病原体環境に有益な免疫調節活性を局在化することによってこれらの疾患の処置における用途が見出され得ると考えられる。
【０１４９】
或いは、アゴニスト作用又はアンタゴニスト作用のいずれかのために免疫細胞標的に結合する第２の抗原結合部位を含む本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの使用は、Ｔ細胞特異性及び活性の増加をもたらし得る。
【０１５０】
したがって、一実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントが第２の抗原結合部位を含む場合、第２の抗原結合部位は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、又はＣＤ８０などの免疫細胞標的に結合し得る。
【０１５１】
或いは、抗体又はその抗原結合フラグメントが第２の抗原結合部位を含む場合、第２の抗原結合部位は、病原性標的、すなわち、ヒト病原体によって発現される抗原に結合し得る。病原体は、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫であり得る。好ましくは、病原体は、ウイルス、細菌又は真菌である。より好ましくは、病原体はウイルス又は細菌である。最も好ましくは、病原体はウイルスである。ウイルス抗原の例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって発現されるタンパク質ｐ２４、ｇｐ１２０、及びｇｐ４１、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって発現されるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、並びにインフルエンザウイルスによって発現される血球凝集素及びノイラミニダーゼが含まれる。細菌性抗原の例には、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）によって発現されるRv1733、Rv2389及びRv2435nが含まれる。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体の第２の抗原結合部位は、ＯＸ４０に結合しない可能性がある。さらに、又は或いは、本発明の抗体の第２の抗原結合部位は、ＣＤ１３７に結合しない可能性がある。さらに、又は或いは、本発明の抗体の第２の抗原結合部位は、ＣＤ２７に結合しない可能性がある。さらに、又は或いは、本発明の抗体の第２の抗原結合部位は、糖質コルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）に結合しない可能性がある。さらに、又は或いは、本発明の抗体の第２の抗原結合部位は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）に結合しない可能性がある。さらに、又は或いは、本発明の抗体の第２の抗原結合部位は、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）に結合しない可能性がある。
【０１５３】
本発明の抗体は、免疫系モジュレーター、細胞傷害性分子、放射性同位体又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。免疫系モジュレーターは、サイトカインなどの細胞傷害性分子であり得る。
【０１５４】
抗体分子は、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。この場合、抗体分子はコンジュゲートと呼ばれ得る。そのようなコンジュゲートにより、本明細書に記載されるような疾患の処置及び／又は診断における用途が見出される。
【０１５５】
例えば、生物活性分子は、サイトカイン、好ましくはヒトサイトカインなどの免疫系モジュレーターであり得る。例えば、サイトカインは、Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖を刺激するサイトカインであり得る。抗体分子にコンジュゲートするためのサイトカインの例には、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−ガンマが含まれる。
【０１５６】
或いは、生物活性分子は、サイトカイン、例えば、ＴＧＦ−ベータ又はＩＬ−６のリガンドトラップなどの、リガンドトラップであり得る。
【０１５７】
抗体分子にコンジュゲートされ得る適切な検出可能な標識は当技術分野で公知であり、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、イットリウム９０、インジウム１１１、テクネチウム９９などの放射性同位体；フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、テキサスレッド（Texas Red）並びにシアニン色素誘導体（例えば、Cy7及びAlexa750）などの、蛍光色素；ジアミノベンジジンなどの発色色素；ラテックスビーズ；西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識；スペクトル的に分離された吸収又は発光特性を備えた蛍光体又はレーザー色素；並びに特定の同族の検出可能部分（例えば、標識されたアビジン）への結合を介して検出され得る、ビオチンなどの化学部分を含む。
【０１５８】
本発明の抗体は、ジスルフィド又はペプチド結合などの任意の適切な共有結合又は非共有結合によって、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。生物活性分子がサイトカインである場合、サイトカインは、ペプチドリンカーによって抗体分子に結合され得る。適切なペプチドリンカーは当技術分野で公知であり、長さは５から２５アミノ酸、５から２０アミノ酸、５から１５アミノ酸、１０から２５アミノ酸、１０から２０アミノ酸、又は１０から１５アミノ酸であり得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、生物活性分子は、切断可能なリンカーによって抗体にコンジュゲートされ得る。リンカーは、治療部位での抗体からの生物活性分子の放出を可能にし得る。リンカーには、アミド結合（例えば、ペプチドリンカー）、ジスルフィド結合、又はヒドラゾンが含まれ得る。例えば、ペプチドリンカーは部位特異的プロテアーゼによって切断され得、ジスルフィド結合は細胞質ゾルの還元環境によって切断され得、ヒドラゾンは酸媒介性加水分解によって切断され得る。
【０１６０】
コンジュゲートは、本発明の抗体と、生物活性分子とを含む融合タンパク質であり得る。この場合、生物活性分子は、ペプチドリンカー又はペプチド結合によって抗体にコンジュゲートされ得る。抗体が多鎖分子である場合、例えば、抗体分子がＦｃａｂであるか、若しくはＦｃａｂを含む場合、又はｍＡｂ2である場合、生物活性分子は、抗体分子の１つ以上の鎖にコンジュゲートされ得る。例えば、生物活性分子は、ｍＡｂ2分子の重鎖の一方又は両方にコンジュゲートされ得る。融合タンパク質には、産生及び精製が容易であるという利点があり、臨床グレードの材料の産生が容易になる。
【０１６１】
本発明はまた、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸又は核酸のセット、及びそのような核酸又は核酸のセットを含むベクターを提供する。
【０１６２】
核酸が本発明の抗体分子のＶＨ及びＶＬドメイン、又は重鎖及び軽鎖をコードする場合、２つのドメイン又は鎖は、２つの別個の核酸分子上にコードされ得る。
【０１６３】
単離された核酸分子を使用して、本発明の抗体分子を発現させ得る。核酸は、一般的に、発現のための組換えベクターの形態で提供される。したがって、本発明の別の態様は、上記のような核酸を含むベクターを提供する。プロモーター配列、転写終結フラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含有する適切なベクターを選択又は構築することができる。好ましくは、ベクターは、宿主細胞における核酸の発現を駆動するための適切な調節配列を含む。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス性、例えば、ファージ、又はファージミドであり得る。
【０１６４】
本明細書に記載の核酸分子又はベクターは、宿主細胞に導入され得る。核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための技術は、当技術分野で十分に確立されており、任意の適切な技術が使用され得る。組換え抗体分子の産生に適した様々な宿主細胞が当技術分野で公知であり、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の宿主細胞が含まれる。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ、ＮＳ０、又はＨＥＫ細胞などの哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である。
【０１６５】
本発明の核酸又はベクターを含む組換え宿主細胞も提供される。本発明の抗体を産生するために、そのような組換え宿主細胞が使用され得る。したがって、本発明の抗体を産生する方法も提供され、この方法は、抗体の産生に適した条件下で組換え宿主細胞を培養することを含む。この方法は、抗体分子を単離及び／又は精製するステップをさらに含み得る。
【０１６６】
したがって、本発明は、宿主細胞において抗体分子をコードする核酸を発現すること、及び任意選択により、そのように産生された抗体分子を単離及び／又は精製することを含む、本発明の抗体分子を産生する方法を提供する。宿主細胞を培養するための方法は、当技術分野で周知である。組換え抗体分子を精製するための技術は当技術分野で周知であり、例えば、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又はアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＬを使用するもの）が含まれる。いくつかの実施形態において、精製は、抗体分子上のアフィニティータグを使用して実施され得る。方法はまた、抗体分子を、任意選択により、薬学的に許容される賦形剤又は以下に記載される他の物質とともに、医薬組成物へと製剤化することを含み得る。
【０１６７】
本発明の抗体は、処置用途、特に、癌の処置及び感染症の処置などのヒトにおける処置用途で用途を見出すことが期待される。したがって、本発明による抗体分子を含む医薬組成物などの組成物、及び薬学的に許容される賦形剤などの賦形剤も提供される。
【０１６８】
本発明はさらに、処置方法における使用のための本発明の抗体分子を提供する。患者を処置する方法も提供され、この方法は、治療有効量の本発明による抗体分子を患者に投与することを含む。さらに、医薬の製造における使用のための本発明による抗体分子の使用が提供される。本明細書で言及される場合、患者は、好ましくはヒト患者である。
【０１６９】
本発明はまた、患者の癌を処置する方法における使用のための本発明の抗体分子を提供する。患者の癌を処置する方法も提供され、この方法は、治療有効量の本発明による抗体分子を患者に投与することを含む。さらに、患者の癌を処置するための医薬の製造における使用のための本発明による抗体分子の使用が提供される。処置は、第２の抗癌剤及び／又は処置（抗腫瘍ワクチン及び／又は化学療法剤など）を患者に投与することをさらに含み得る。第２の抗癌剤及び／又は治療は、本発明の抗体分子と同時に、別々に、又は連続して、患者に投与され得る。
【０１７０】
別の態様において、本発明は、
ａ）癌の処置、ｂ）癌の進行の遅延、ｃ）癌に罹患している患者の生存期間の延長、又はｄ）細胞媒介性免疫応答の刺激
における使用のための、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体に関する。
【０１７１】
本発明はまた、患者の感染症を処置する方法における使用のための本発明の抗体を提供する。患者の感染症を処置する方法も提供され、この方法は、治療有効量の本発明による抗体を患者に投与することを含む。さらに、患者の感染症を処置するための医薬の製造における使用のための本発明による抗体の使用が提供される。処置は、感染症の処置のための第２の薬剤及び／又は治療を患者に投与することをさらに含み得る。第２の薬剤及び／又は治療法は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント又は抗体分子と同時に、別々に、又は連続して、患者に投与され得る。
【０１７２】
したがって、本明細書に記載の抗体分子は、治療用途、特に癌の処置に有用であり得る。さらに、抗体分子は、持続性感染症などの感染症の処置に有用であることが期待される。
本明細書に記載の抗体分子は、ヒト又は動物の体の処置方法において使用され得る。本発明の関連する態様は、
（ｉ）医薬としての使用のための本明細書に記載の抗体分子、
（ｉｉ）疾患又は障害の処置方法における使用のための本明細書に記載の抗体分子、
（ｉｉｉ）疾患又は障害の処置における使用のための医薬品の製造における本明細書に記載の抗体分子の使用；及び
（ｉｖ）個体の疾患又は障害の処置方法であって、本明細書に記載の治療有効量の抗体分子を個体に投与することを含む方法
を提供する。
【０１７３】
個体は、患者、好ましくはヒト患者であり得る。
【０１７４】
処置は、何らかの所望の治療効果、例えば、状態の進行の阻害又は遅延など、が達成される任意の処置又は治療であり得、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の改善、状態の治癒又は寛解（部分的又は全体的）、１つ以上の症状及び／又は状態の兆候を予防、改善、遅延、軽減、若しくは阻止すること、又は個体若しくは患者の生存期間を処置の不存在時に予想される期間を超えて延長することを含む。
【０１７５】
予防的手段（すなわち、予防法）としての処置も含まれる。例えば、癌などの疾患の発生又は再発の影響を受けやすい、又はそのリスクがある個体は、本明細書に記載されるように処置され得る。そのような処置は、個体における疾患の発生又は再発を予防又は遅延させ得る。
【０１７６】
記載されているような処置方法は、抗体分子に加えて、少なくとも１つのさらなる処置を個体に投与することを含み得る。したがって、本明細書に記載の抗体分子は、単独で、又は１つ以上の他の処置と組み合わせて、個体に投与され得る。抗体分子が別の処置と組み合わせて個体に投与される場合、追加の処置は、抗体分子の投与と同時に、連続的に、又は別個に個体に投与され得る。追加の処置が抗体分子と同時に投与される場合、抗体分子及び追加の処置は、組み合わせた調製物として個体に投与され得る。例えば、追加の治療は、処置される疾患に対する既知の治療又は治療剤であり得る。
【０１７７】
抗体分子は単独で投与され得るが、抗体分子は通常、抗体分子に加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗体分子を含む医薬組成物を提供する。抗体分子を医薬組成物に製剤化することを含む方法も提供される。
【０１７８】
医薬組成物は、抗体分子に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、又は当業者に周知の他の材料を含み得る。本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症のない、対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに適した、化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。各担体、賦形剤などもまた、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容可能」でなければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、これは、以下で論じられるように、注入、注射、又は他の適切な経路によるものであり得る。
【０１７９】
非経口、例えば皮下又は静脈内投与（例えば、注射による）の場合、抗体分子を含む医薬組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を備えた、非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。関連技術を有する当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、乳酸リンガー注射などの等張性ビヒクルを使用して、適切な溶液を調製することが十分に可能である。リン酸、クエン酸及びその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３'−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、デキストリを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を必要に応じて使用してもよい。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、抗体分子は、投与前に再構成するために凍結乾燥形態で提供され得る。例えば、凍結乾燥された抗体分子は、個体に投与する前に、滅菌水又は生理食塩水で再構成され得る。
【０１８１】
投与は「治療有効量」であり得、これは個体への利点を示すのに十分である。実際に投与される量、並びに投与の速度及び時間経過は、処置される対象の性質及び重症度、処置される特定の個体、個体の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、抗体分子のタイプ、投与方法、投与のスケジュール、並びに医師に知られている他の要因に依存する。処置の処方、例えば、投与量の決定などは、一般医及び他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度及び／又は処置されている疾患の進行に依存し得る。抗体分子の適切な用量は当技術分野で周知である（Ledermann et al., 1991; Bagshawe et al., 1991）。投与される抗体分子に対して適切な、本明細書又はPhysician’s Desk Reference (2003)に示されている特定の投与量が使用され得る。抗体分子の治療有効量又は適切な用量は、動物モデルにおけるインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿するための方法は公知である。正確な用量は、処置される領域のサイズ及び位置、並びに抗体分子の正確な性質を含む、多数の要因に依存する。
【０１８２】
典型的な抗体用量は、全身投与の場合は１００μｇから１ｇの範囲であり、局所投与の場合は１μｇから１ｍｇの範囲である。最初により高い負荷用量、続いて１つ以上のより低い用量が投与され得る。これは、成人個体の単回処置用の用量であり、比例的に小児及び乳児用に調整され得、分子量に比例して他の抗体形式にも調整できる。
【０１８３】
処置は、医師の裁量により、毎日、週に２回、週に１回、又は月に１回繰り返され得る。個体の処置スケジュールは、抗体組成物の薬物動態学的及び薬力学的特性、投与経路、並びに処置される状態の性質に依存し得る。
【０１８４】
処置は定期的であり得、投与間の期間は、約２週間以上、例えば、約３週間以上、約４週間以上、約月１回以上、約５週間以上、又は約６週間以上であってもよい。例えば、処置は２から４週間ごと、又は４から８週間ごとであり得る。適切な製剤及び投与経路は上に記載されている。
【０１８５】
好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子は、癌の処置方法における使用のためのものであり得る。
【０１８６】
癌は、悪性癌細胞の異常な増殖を特徴とし得る。乳癌などの特定の種類の癌に言及される場合、これは、乳房組織などの関連組織の悪性細胞の異常な増殖を指す。乳房に位置するが、卵巣組織などの別の組織の悪性細胞の異常増殖の結果である二次癌は、本明細書で言及されるような乳癌ではなく、卵巣癌である。
【０１８７】
癌は、原発癌又は二次癌であり得る。したがって、本明細書に記載の抗体分子は、癌が原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である、個体の癌を処置する方法における使用のためのものであり得る。
【０１８８】
本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌の腫瘍は、例えばその細胞表面上に、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を含み得る。一実施形態において、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を含むと決定されたものであってもよい。細胞表面上の抗原の発現を決定するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、フローサイトメトリーを含む。
【０１８９】
例えば、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などの白血病；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫などのリンパ腫；並びに肉腫（例えば、軟部肉腫）、皮膚癌（例えば、メルケル細胞癌）、黒色腫、膀胱癌（例えば、尿路上皮癌）脳腫瘍（多形神経膠芽腫）、乳癌、子宮／子宮内膜癌、卵巣癌（例えば、卵巣漿液性嚢胞腺腫）、前立腺癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ））、結腸直腸癌（例えば、結腸直腸腺癌）、子宮頸癌（例えば、子宮頸扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌）、肝癌（例えば、肝細胞癌）、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌）、食道癌、膵臓癌、腎癌（例えば、腎細胞癌）、副腎癌、胃癌（例えば、胃腺癌）、精巣癌、胆嚢及び胆道の癌（例えば、胆管細胞癌）、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌、及び脳癌などの固形癌からなる群から選択され得る。
【０１９０】
好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、固形癌である。より好ましくは、本明細書に記載の抗体分子を使用して処置される癌は、肉腫、黒色腫、膀胱癌、脳癌、乳癌、卵巣癌、子宮／子宮内膜癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎癌、胃癌からなる群から選択される固形癌である。
【０１９１】
癌において、処置は、完全な癌の寛解を含む癌の成長の阻害、及び／又は癌の転移の阻害、及び癌の再発の阻害を含み得る。癌の増殖は、一般的に、癌内のより発達した形態への変化を示す多数の指標のいずれかを指す。したがって、癌増殖の阻害を測定するための指標には、癌細胞の生存の低下、腫瘍の体積又は形態の減少（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、又は他の画像化方法を使用して決定される）、腫瘍増殖の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏性皮膚検査のパフォーマンスの改善、抗癌免疫細胞又は他の抗癌免疫応答の活性の増加、及び腫瘍特異的抗原のレベルの減少が含まれる。個体の癌性腫瘍に対する免疫応答を活性化又は増強することにより、癌の増殖、特に対象にすでに存在する癌の増殖に抵抗する個体の能力を改善し、及び／又は個体の癌増殖の傾向を低下させ得る。
【０１９２】
癌処置において、本明細書に記載の抗体分子は、問題の癌の処置に適切であることが示されているか、適切であると期待される抗癌療法又は治療剤などの、別の抗癌療法又は治療剤と組み合わせて、個体に投与され得る。例えば、抗体分子は、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法（養子ＮＫ細胞療法など）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、若しくはガンマ／デルタＴ細胞による治療、又はホルモン療法のための薬剤と組み合わせて個体に投与され得る。
【０１９３】
理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載の抗体分子は、抗癌治療におけるアジュバントとして作用し得ると考えられる。具体的には、例えば、化学療法及び／又は放射線療法と組み合わせた、又は抗腫瘍ワクチンと組み合わせた、抗体分子の個体への投与は、化学療法及び／又は放射線療法、又は抗腫瘍ワクチン単独で達成されるよりも、癌に対してより大きな免疫応答を誘発すると考えられる。
【０１９４】
本明細書に記載されるような本発明の抗体と組み合わせた投与のための１つ以上の化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、アルキル化剤、プラチナ類似体、ヌクレオシド類似体、葉酸代謝拮抗剤、サリドマイド誘導体、抗悪性腫瘍化学療法剤などからなる群から選択され得る。タキサンは、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ−パクリタキセルを含み；細胞傷害性抗生物質は、アクチノマイシン、ブレオマイシン、並びにドキソルビシン、ミトキサントロン及びバルルビシンなどのアントラサイクリンを含み；チロシンキナーゼ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コベミチニブ及びトラメチニブを含み；ＰＡＲＰ阻害剤は、ピラパリブを含み；Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤は、ベムラフェニブ及びダブラフェニブを含み；アルキル化剤は、ダカルバジン、シクロホスファミド及びテモゾロミドを含み；プラチナ類似体は、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンを含み；ヌクレオシド類似体は、アザシチジン、カペシタビン、フルダラビン、フルオロウラシル及びゲムシタビンを含み；葉酸代謝拮抗剤は、メトトレキサート及びペメトレキセドを含む。本発明における使用に適した他の化学療法剤には、デファクチニブ、エンチノスタット、エリブリン、イリノテカン、及びビンブラスチンが含まれる。
【０１９５】
本明細書に記載の抗体分子とともに投与するための好ましい治療剤は、ドキソルビシン、ミトキサントロン、シクロホスファミド、シスプラチン、及びオキサリプラチンである。
【０１９６】
本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための放射線療法は、外照射療法又は近接照射療法であり得る。
【０１９７】
本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子、核酸、サイトカイン、又はサイトカインベースの治療剤であり得る。例えば、治療用抗体分子は、免疫調節分子、例えば、阻害性チェックポイント分子又は免疫共刺激分子、自然免疫系の受容体、又は腫瘍抗原、例えば、細胞表面腫瘍抗原又は可溶性腫瘍抗原に結合し得る。治療用抗体分子が結合し得る免疫調節分子の例には、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−１、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、ＩＬ−１０及びＣＳＦ−１が含まれる。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（例えば、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ−５）、及びＳＴＩＮＧが含まれる。治療用抗体分子が結合し得る腫瘍抗原の例には、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０及びＴＧＦ−ベータが含まれる。
【０１９８】
本明細書に記載されるような抗体分子と組み合わせた投与のための核酸は、ｓｉＲＮＡであり得る。
【０１９９】
サイトカイン又はサイトカインベースの治療は、ＩＬ−２、コンジュゲートＩＬ−２のプロドラッグ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、及びＩ型インターフェロンからなる群から選択され得る。
【０２００】
癌の処置のための抗腫瘍ワクチンは、クリニックで実施され、且つ科学文献で詳細に議論されている（Rosenberg S. Development of Cancer Vaccines.ASCO Educational Book Spring:60-62(2000)など）。これは主に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を伴う場合と伴わない場合の両方で、ワクチン接種方法としてこれらの細胞を使用することにより、自己又は同種異系の癌細胞によって発現される様々な細胞マーカーに応答するように免疫系を刺激する戦略を含む。ＧＭ−ＣＳＦは、抗原提示において強い反応を引き起こし、前記戦略で使用される場合、特によく機能する。
【０２０１】
化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法剤は、好ましくは、問題の癌のための化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法剤、すなわち、問題の癌の処置に効果的であることが示されている、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法剤である。問題の癌に効果的であることが示されている、適切な化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法剤の選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２０２】
潜在的な治療的使用のためのいくつかの実施形態において、エフェクター機能を活性化しない抗体が好ましい。
【０２０３】
ＩｇＧ４が使用されているが、このサブクラスはＦａｂアーム交換を受け、インビボでＩｇＧ４間で重鎖を交換できる。エフェクター機能を欠いているため、ＩｇＧ４抗体は、細胞を枯渇させることなく受容体を遮断するための好ましいＩｇＧサブクラスを表す。ＩｇＧ４分子は、Ｆａｂアーム交換と呼ばれる動的プロセスで半分子を交換できる。この現象は、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４の間で発生し得る。S228P変異は、この組換えプロセスを防ぎ、より予測不可能でない治療用ＩｇＧ４抗体の設計を可能にすることが示されている。
【０２０４】
ＣＨ２ドメインは、Ｆｃγ受容体及び補体に結合することが知られている。ＣＨ２ドメインのＦｃγ受容体への結合には抗体依存性細胞媒介性傷害性（ＡＤＣＣ）が必要である一方、補体への結合には補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）が必要である。抗体分子のＣＨ２ドメインは、好ましくは、ＣＨ２ドメインの１つ以上のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃγ受容体、及び／又は補体への結合を低減又は抑制する１つ以上の変異を含む。本発明者らは、Ｆｃγ受容体への結合を減少させる、又は抑制することにより、抗体分子によって媒介されるＡＤＣＣが減少する、又は排除されると仮定する。同様に、補体への結合を減少させる、又は抑制することは、抗体分子によって媒介されるＣＤＣを減少又は排除することが期待される。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、抗体分子が患者に投与される場合に、肝臓の炎症を軽減又は回避することが期待される。さらに、Ｆｃγ受容体への結合を低減又は抑制することは、抗体分子が本明細書に記載されるような免疫細胞抗原の第２の抗原結合部位を含む場合に有用であることが期待され、ここで、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを介した、抗体分子が結合した免疫細胞の死滅は避けるべきである。１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を減少させる、又は抑制する変異は、当技術分野で公知である（Wang et al., 2018）。これらの変異には、Bruhns et al., 2009及びHezareh et al., 2001に記載される「ＬＡＬＡ変異」が含まれ、これは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ１．３位及び１．２位のロイシン残基をアラニン（Ｌ１．３Ａ及びＬ１．２Ａ）で置換することを含む。或いは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ８４．４位のアスパラギン（Ｎ）をアラニン、グリシン、又はグルタミン（Ｎ８４．４Ａ、Ｎ８４．４Ｇ、又はＮ８４．４Ｑ）に変異させることによる、保存されたＮ結合型グリコシル化部位の変異を通じたα−グリコシル抗体の生成は、ＩｇＧ１エフェクター機能を低下させることも知られている（Wang et al., 2018）。さらなる代替として、補体活性化（Ｃ１ｑ結合）及びＡＤＣＣは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ１１４位のプロリンをアラニン又はグリシン（Ｐ１１４Ａ又はＰ１１４Ｇ）に変異させることによって低減することが知られている（Idusogie et al., 2000；Klein et al., 2016）。これらの変異は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性がさらに低下した、又は全くない抗体分子を生成するために組み合わせることもできる。
【０２０５】
したがって、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み得、ここで、ＣＨ２ドメインは、好ましくは、
（ｉ）１．３位及び１．２位のアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位のアラニン又はグリシン；及び／又は
（ｉｉｉ）８４．４位のアラニン、グルタミン又はグリシン；
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０２０６】
好ましい実施形態において、抗体分子はＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位のアラニン残基；及び
（ｉｉ）１．２位のアラニン残基；
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０２０７】
代替的な好ましい実施形態において、抗体分子はＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位のアラニン残基；
（ｉｉ）１．２位のアラニン残基；及び
（ｉｉｉ）１１４位のアラニン；
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０２０８】
ＩｇＧは、ＦｃＲｎ媒介性リサイクルにより、血清中に自然に長期間持続し、典型的な半減期はおよそ２１日である。半減期を延長するために、ＦｃドメインとＦｃＲｎとのｐＨ依存性相互作用は、ｐＨ７．４で最小限の結合を維持しながらｐＨ６．０での親和性を高めるように設計されている。変異T250Q/M428Lは、アカゲザルのＩｇＧ半減期をおよそ２倍増加させた。M252Y/S254T/T256E変異体（ＹＴＥと呼ばれる）は、カニクイザルのＩｇＧ半減期をおよそ４倍増加させた。投与された抗体の効力を維持又は改善する一方で、投与の頻度を減らすために、いくつかの状況ではより長い半減期が望ましい。本発明の抗体は、投与後のインビボ血清の半減期を延長するように操作された半減期延長変異体として提供され得、したがって、本発明の抗体は、T250Q/M428L又はM252Y/S254T/T256E変異体として提供され得る。
【０２０９】
本発明の抗体分子は、ＰＤ−Ｌ１の検出、特にその細胞表面にＰＤ−Ｌ１を含む細胞、すなわち細胞表面に結合したＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の検出に有用であり得る。細胞は、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、又はＴＩＬなどの免疫細胞であってもよいが、好ましくは、ＣＤ８+Ｔ細胞又はＴＩＬである。
【０２１０】
したがって、本発明は、サンプル中のＰＤ−Ｌ１の存在、好ましくはその細胞表面にＰＤ−Ｌ１を含む細胞の存在、を検出するための抗体分子の使用に関する。抗体分子は、本明細書の他の箇所に記載されているように、検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。
【０２１１】
ＰＤ−Ｌ１を検出するインビトロでの方法も提供され、この方法は、抗体分子を目的のサンプルとインキュベートすること、及び抗体分子のサンプルへの結合を検出することを含み、ここで、抗体のサンプルへの結合は、ＰＤ−Ｌ１の存在を示す。サンプルへの抗体分子の結合は、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して検出され得る。
【０２１２】
好ましい実施形態において、本発明は、その細胞表面にＰＤ−Ｌ１を含む細胞を検出するインビトロでの方法に関し、この方法は、抗体分子を目的の細胞サンプルとインキュベートすること、及びサンプル中に存在する細胞への抗体分子の結合を決定することを含み、ここで、サンプル中に存在する細胞への抗体の結合は、その細胞表面にＰＤ−Ｌ１を含む細胞の存在を示す。細胞への抗体分子の結合を検出するための方法は当技術分野で公知であり、ＥＬＩＳＡ、及びフローサイトメトリーを含む。
【０２１３】
目的の細胞サンプルは、個体から得られた腫瘍サンプルであり得る。
【０２１４】
したがって、本発明の抗体分子は、疾患又は障害の検出又は診断、特に癌の検出又は診断に有用であり得る。癌は、本明細書に記載されるような本発明の抗体分子で処置することができる癌であり得る。
【０２１５】
したがって、本発明の関連する態様は、
（ｉ）診断薬としての使用のための本明細書に記載の抗体分子、
（ｉｉ）癌などの疾患又は障害を検出又は診断する方法における使用のための本明細書に記載の抗体分子、
（ｉｉｉ）疾患又は障害の検出又は診断における使用のための診断薬の製造における本明細書に記載の抗体分子の使用；
（ｉｖ）個体の疾患又は障害を検出又は診断する方法；及び
（ｖ）個体における疾患又は障害を検出又は診断する方法における使用のためのキットであって、本明細書に記載の抗体分子を含む、キット
を提供する。
【０２１６】
本発明のさらなる態様及び実施形態は、以下の実験的例示を含む本開示を与えられた当業者には明らかであろう。
【０２１７】
本明細書で言及されている全ての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれの特定の開示として、他方の有無にかかわらず解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、ちょうどそれぞれが本明細書に個別に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢ、のそれぞれの特定の開示として解釈されるべきである。
【０２１９】
文脈上が別段の指示がない限り、上記の特徴の説明及び定義は、本発明のいずれの特定の態様又は実施形態にも限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
【０２２０】
ここで、本発明の特定の態様及び実施形態を、例として、本明細書で提供される図を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
図面の一覧
【図１】混合白血球反応アッセイ。抗ＰＤ−Ｌ１カッパクローン、G1/894_8_E05、G1/887_4_E12、及びG1/887_4_G12の機能的活性は、混合白血球反応アッセイで試験された。全ての抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂは、０．０３０ｎＭ未満のＥＣ50値を有する強力な活性を示した。陰性対照G1AA/4420の活性は観察されなかった。
【図２】ＤＯ１１．１０マウスＴ細胞活性化アッセイ。マウスＰＤ−Ｌ１に対する抗ＰＤ−Ｌ１カッパクローン、G1/894_8_E05、G1/887_4_E12、及びG1/887_4_G12の機能的活性は、ＬＫ３５．２を過剰発現するマウスＰＤ−Ｌ１及びＤＯ１１．１０Ｔ細胞を用いたＴ細胞アッセイで試験した。全ての抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂは、低ナノモル濃度のＥＣ50値を有する強力な活性を示した。陰性対照G1AA/4420の活性は観察されなかった。
【図３】非腫瘍性マウスにおける抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの薬物動態。
【図４】混合白血球反応アッセイ。抗ＰＤ−Ｌ１カッパクローン、G1AA/E05v2、G1AA/E12v2及びG1AA/G12v2の機能的活性は、混合白血球反応アッセイで試験された。全ての抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂは、０．０５５ｎＭ未満のＥＣ50値を有する強力な活性を示した。陰性対照G1AA/4420の活性は観察されなかった。
【実施例】
【０２２２】
実施例
これらの実験の目的は、マウス及び／又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１と交差反応性であり、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１活性の強力な阻害剤（遮断剤）である抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂを生成することであった。
【０２２３】
実施例１：ナイーブ抗ＰＤ−Ｌ１結合ｍＡｂ：280_02_G02の分離
１．１  抗原：ＣＤ４及びＦｃタグ付きヒト及びマウスＰＤ−Ｌ１
融合タンパク質を含むヒト及びマウスのＰＤ−Ｌ１抗原は、抗体の選択及びスクリーニングに使用するために生成された。抗原は、単量体Ｃ末端ラットＣＤ４、ドメイン３及び４（ｒＣｄ４）タグ（Brown and Barclay, 1994）、又は二量体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（ｈＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ（配列番号７９）、ｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓ（配列番号８０）、ｍＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ（配列番号８１）及びｍＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓ（配列番号８２）のいずれかとともに発現させた。２つの異なる形式での抗原の産生により、逐次抗体ファージディスプレイのパニング中にタグバインダーの除去が可能となった。抗原をコードする発現プラスミドは、Chapple et al., 2006に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクションの５日後に上清を回収し、分泌抗原をNi-NTAセファロースアフィニティークロマトグラフィーで精製した（Schofield et al., 2007）。ビオチン化抗原は、EZ-link Sulfo-NHS-Biotin試薬（Thermo Fisher Scientific、製品コード21326）を使用して、製造元の推奨に従って調製した。ビオチン化反応生成物をゲル濾過し、単量体画分を回収した。単量体画分は、全ての液相ファージディスプレイの選択のために使用された。蛍光ビオチン定量キット（Thermo Fisher Scientific、製品コード46610）を使用して決定した分子あたりの平均ビオチン数は、ＰＤ−Ｌ１単量体あたり１から３ビオチンであった。
【０２２４】
１．２  選択
１．２．１  ライブラリーの設計
「IONTAS 1」ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー（IONTAS Ltd.）を使用して、抗ＰＤ−Ｌ１クローンを選択した。IONTAS 1ライブラリーの構築のために使用された抗体遺伝子は、ヒトリンパ球（４２のバフィーコートの提供）及び１つの扁桃腺組織サンプルに由来した。バフィーコート及び扁桃腺組織の両方が、地域研究倫理委員会（Local Research Ethical Committee）の承認の下で入手された。
【０２２５】
１．２．２  ナイーブ固相選択
Schofield et al., 2007に記載されたように、ポリスチレンNuncチューブに直接コーティングされた抗原を使用して、IONTAS1抗体ファージディスプレイライブラリーで３ラウンドの固相選択を実行した。第１、第２、及び第３の選択ラウンドは、それぞれヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓ（配列番号８０）、マウスＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ（配列番号８１）及びヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓ（配列番号８０）が使用された。第１のラウンドでは、直接選択のために、Nunc Maxisorpイムノチューブ（Immunotube）（Thermo Scientific、444202）を１０μｇ／ｍｌのヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓで一晩コーティングした。翌日、チューブをＰＢＳで２回すすぎ、その後ＰＢＳ２％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）を上部に充填してブロックし、１時間インキュベートした後、チューブをＰＢＳで３回洗浄した。また、IONTAS 1抗体ファージディスプレイライブラリー（５００μｌ）を１時間、４％ＭＰＢＳ（５００μｌ）でブロックした。各抗原でコーティングされたイムノチューブに２％ＭＰＢＳ（１７９．２５μｌ）、Ｆｃ−Ｈｉｓ（１０．７５μｌ、２．８ｍｇ／ｍｌ）及びブロックされたIONTAS 1抗体ファージディスプレイライブラリー（１１０μｌ、２×１０12コロニー形成単位、２％ＭＰＢＳ）を追加した。Ｆｃ−Ｈｉｓを選択に追加して、固相固定化Ｆｃタグ付き抗原に結合する抗Ｆｃバインダーを除去した。抗体ファージディスプレイライブラリーを室温で１．５時間、直接固定化された抗原に結合させた。この後、イムノチューブをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％Tween（商標）-20）で６回洗浄し、次にＰＢＳで６回洗浄した。結合したファージを、標準ファージ回収手順を使用して溶出及び増殖した。抗体ファージディスプレイ選択の第２のラウンドは、Nuncイムノソーブチューブ（immunosorb tube）をコーティングするためにマウスＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（配列番号８１）を使用し、選択解除のためにＦｃ−Ｈｉｓの代わりにｒＣｄ４−Ｈｉｓを使用し、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓに対して選択された第１のラウンドのアウトプットファージをインプットファージ集団として使用したことを除いて、上記のように実行した。ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓによる第３のラウンドは、第１のラウンドと全く同じように実行された。
【０２２６】
１．２．３  チェーンシャッフリングと溶液相の選択
選択された可変重（ＶＨ）抗ＰＤ−Ｌ１抗体集団は、Dyson et al., 2011に記載されるように、ナイーブ可変軽（ＶＬ）抗体集団とシャッフルされ、このシャッフルされ、レスキューされた抗体ファージディスプレイ集団が溶液相の選択において使用された。簡単に説明すると、パニングは、第１、第２、及び第３のラウンドで、それぞれヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（配列番号７９）（１０ｎＭ）、ヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（配列番号７９）（２００ｐＭ）及びマウスＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（配列番号８１）（１０ｎＭ）で実行され、これにより、「選択２８０」と呼ばれるアウトプット抗ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖ集団が得られた。このｓｃＦｖ集団は、Dyson et al., 2011に記載されるように、実行されたファージポリクローナルＥＬＩＳＡによって決定されたように、ヒト及びマウスの抗ＰＤ−Ｌ１結合ｓｃＦｖを含み、ヒトＰＤ１若しくはｒＣｄ４又はＦｃタグとの最小の交差反応性を示した。
【０２２７】
１．３  スクリーニング：ＥＬＩＳＡ、組換えブロッキングアッセイ、細胞ベースのブロッキングアッセイ
１．３．１  モノクローナルｓｃＦｖＥＬＩＳＡ
実施例１．２．３からの選択２８０ｓｃＦｖ集団をＥＬＩＳＡによってスクリーニングして、ヒトＰＤ−Ｌ１に最もよく結合するクローンを同定した。ｓｃＦｖ集団を可溶性ｓｃＦｖベクターｐＳＡＮＧ１０にサブクローニングし、（Martin et al., 2006; Studier, 2005）に記載されているように、可溶性ｓｃＦｖを含有する大腸菌（E.coli）培養物を調製した。次に、可溶性ｓｃＦｖを、固定化されたヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（配列番号７９）を用いたモノクローナルＥＬＩＳＡで使用した。簡単に説明すると、Nunc Maxisorpプレート（Thermo Fisher Scientific、437111）をヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（配列番号７９）（５μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ）で一晩コーティングし、２％ＭＰＢＳで１時間ブロックし、大腸菌（E.coli）培養上清（２ｘ２％ＭＰＢＳで１：２に希釈）を添加し、ｓｃＦｖを室温で１時間結合させた。結合したｓｃＦｖは、ユーロピウムで標識された抗FLAG M2抗体（Sigma、F1804）で検出された。合計４７０のクローンがスクリーニングされ、これにより、抗原を含有しない「空の」ブロックされたウェルと比較して、バックグラウンドより少なくとも１０倍高いＰＤ−Ｌ１の結合シグナルを持つ３４６の抗ＰＤ−Ｌ１クローンが同定された。一次ＥＬＩＳＡシグナルによって評価された１９２の最良の抗ヒトＰＤ−Ｌ１クローンが、さらなる分析のために選択された。
【０２２８】
１．３．２  ＥＬＩＳＡベースのＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１ブロッキングアッセイにおけるｓｃＦｖのスクリーニング
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ１の間の相互作用を遮断したクローンを特定するために、ＥＬＩＳＡを実行してブロッキングｓｃＦｖのためのスクリーニングを実行した。簡単に説明すると、Nunc Maxisorpプレート（437111、Thermo Fisher Scientific）を抗ｒＣｄ４（ドメイン３及び４）抗体（MCA1022、OX-68、Bio-Rad）で一晩コーティングし、３％ＭＰＢＳでブロックし、室温で１時間、ヒトＰＤ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ（配列番号７９）（３％ＭＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。ビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓ（配列番号７９）（５０μｌ、０．２ｎＭ）を、ｓｃＦｖを含有する大腸菌（E.coli）培養上清と事前に混合した。Nunc９６ウェルプレートを、ＰＢＳ、０．１％Tween（商標）-20（ＰＢＳ−Ｔ）で３回、ＰＢＳで３回洗浄した後、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓ／ｓｃＦｖ混合を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合したヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｈｉｓをヤギ抗Ｆｃ−ビオチン（Jackson ImmunoResearch、109-065-098、Laboratories、０．１μｇ／ｍｌ、３％ＭＰＢＳ）及びストレプトアビジン・ユーロピウム（Streptavidin-Europium）（Perkin Elmer、1244-360）、その後にDELFIAエンハンスメントソリューション（Perkin Elmer、4001-0010）を使用して検出した。スクリーニングされた１９２個のクローンのうち、培地対照と比較して、１８３個は少なくとも９０％のブロッキング活性を示した。同定された１８３個の抗ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖクローンを、実施例１．３．１に記載されているように、一次ＥＬＩＳＡでマウスＰＤ−Ｌ１交差反応性についてさらにスクリーニングしたが、ヒトＰＤ−Ｌ１の代わりに固定化マウスＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓを使用した。これにより、５０のマウス交差反応性抗ＰＤ−Ｌ１クローンが特定され、これは、ＩｇＧ１形式への変換の候補であった。
【０２２９】
１．３．３  ブロッキング抗ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖクローンのＩｇＧ１形式への変換
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ１の間の相互作用を遮断した抗ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖクローンは、ＶＬ及びＶＨ遺伝子をＩｇＧ１発現プラスミドｐＩＮＴ３−ＩｇＧ１にサブクローニングすることにより、ＩｇＧ１形式に変換され、Chapple et al., 2006に記載されるように、ＨＥＫ２９３で、４ｍｌスケールで発現された。抗体は、製造元の指示に従って、プロテインＡセファロースビーズ（ＰＣ−Ａ１００）及びProteus「１ステップバッチ」ミディスピンカラム（Generon、GEN-1SB08）を使用して、バッチアフィニティー精製された。精製された抗体の透析は、８ｋＤａカットオフのGeBAflexマキシチューブ（Generon、D045）を使用して実行された。必要に応じて、抗体を限外濾過により２μＭに濃縮した。
【０２３０】
１．３．４  ジャーカットＮＦＡＴレポーター共培養アッセイにおけるＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１ブロッキング活性のためのスクリーニング
次に、精製された抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの機能的活性を、共培養レポーターアッセイスクリーニングで評価した。このスクリーニングは、GloResponse NFAT-luc2／PD-1安定ジャーカット細胞株（Promega、CS187102）及び、解凍及び使用ＰＤ−Ｌ１細胞（Promega、CS178103）を使用して製造元の指示に従って実行された。ＰＤ−Ｌ１細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＨＡＭ’Ｓ−Ｆ１２培地に播種した。翌日、ＰＤ−１ジャーカットレポーター細胞（Promega、CS187102）をアッセイ培地（９０％ＲＰＭＩ１６４０、１％ＦＢＳ）に再懸濁した。付着したＰＤ−Ｌ１細胞を含有するプレートから培地を除去し、２倍濃度（２００ｎＭ）で異なる抗体を含む４０μｌのアッセイ培地、その後に４０μｌのＰＤ−１細胞混合物を付着細胞に加えた。プレートは、５％ＣＯ2、３７℃で６時間インキュベートした。BioGlo試薬（Promega、G7940、８０μｌ）を各ウェルに添加し、BMG pherastarプレートリーダーを使用してルシフェラーゼアウトプットを読み取った。これにより、抗体を含有しない対照と比較してルシフェラーゼ活性が増加するために共培養アッセイでＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断することができる抗体G1/280_02_G02が特定された。この活性は、用量反応共培養アッセイ（濃度範囲を２倍にする：２００から１．５６ｎＭ）で確認され、計算された半数効果濃度（ＥＣ50）は４．２ｎＭになった。
【０２３１】
１．４  配列の最適化
G1/280_02_G02抗体の配列の予備分析により、ＶＨ−ＣＤＲ２の潜在的な脱アミド化部位、具体的にはKabat位５４から５５のＮＧモチーフが同定された。この部位での脱アミド化は、潜在的に結合に影響を与える可能性があるため、ＮＧモチーフがＮＡ、ＮＳ、ＳＧ、又はＧＧのいずれかに変更された変異体クローンが作成された。これらの修飾は、組換えＰＤ−Ｌ１に対する親和性又はＰＤ−Ｌ１ブロッキング活性の効力の顕著な低下をもたらさず、軽鎖シャッフルで使用するために、G1/280_02_G02_NSと指定されたＮＳ修飾を含有する変異体クローンを選択した。
【０２３２】
１．５  ナイーブ選択の概要
使用されたファージ選択戦略により、強力なインビトロＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ブロッキング活性とマウスＰＤ−Ｌ１交差反応性を備えた５０を超える抗ヒトＰＤ−Ｌ１結合クローンが同定された。特に、G1/280_02_G02は、細胞ベースのＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイで強力な活性化を示し、そのためにさらなる最適化のために選択された。
【０２３３】
実施例２：カッパ軽鎖を含有する抗ＰＤ−Ｌ１クローンを生成するためのチェーンシャッフリング
G1/280_02_G02_NS抗体はラムダ軽鎖を有する。これまで臨床状況で使用されてきたほとんどのモノクローナル抗体はカッパ軽鎖を持っているため（Jain et al., 2017）、チェーンシャッフリングキャンペーンを使用して、G1/280_02_G02_NS抗体の重鎖を含むが、ヒトＰＤ−Ｌ１及びマウスの交差反応性に対する親和性を保持したカッパ軽鎖と対となる、クローンを生成することが求められた。ファージディスプレイプラスミドpIONTAS-1（カッパライブラリー）のIONTAS（商標）カッパ軽鎖ライブラリーを使用して、軽鎖変異体と結合したG1/280_02_G02_NS抗体の重鎖を含むｓｃＦｖクローンの軽鎖シャッフルライブラリーを調製した。
【０２３４】
２．１  ファージの選択及びスクリーニング戦略
ビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ（配列番号７９）及びマウスＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ抗原（配列番号８１）を使用して、３ラウンドで多数のファージディスプレイ溶液の選択を行った。選択は、全てのラウンドで抗原濃度を減少させることによって実行され（１００から０．０２ｎＭまで変化）、選択の各ラウンドにおいて「非抗原」対照が使用された。選択の詳細を表２に示す。
【０２３５】
【表２】
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【０２３６】
セクション１．３．１に記載されているように、可溶性ｓｃＦｖ発現システムを使用して、ラウンド２から２つ（ｎｏ．８７１及び８７２）及びラウンド３から４つ（ｎｏ．８８７、８９０、８９１及び８９４）の６つの選択アウトプットがスクリーニングのために選択された。ＤＥＬＦＩＡ増強溶液を使用した上記の実施例１．３．１に記載されたアッセイを使用して、合計１６９２個の可溶性ｓｃＦｖクローンを、ＥＬＩＳＡ（ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ（配列番号７９）抗原を、ダルベッコ（Dulbecco）ＰＢＳ５０μｌ中、３μｇ／ｍＬでMaxisorbプレート上にコーティングした）で固定化抗原に結合させるためにスクリーニングした。
【０２３７】
スクリーニングされた１６９２クローンのうち、１０２９クローンがＤＥＬＦＩＡアッセイで２０００ＲＦＵを超えるシグナルを生じ、成功率は約６１％であった。次に、上位７３６クローンを選択し、ｈＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ抗原の３つの濃度（１．０ｎＭ、０．２ｎＭ、及び０．０４ｎＭ）を使った二次アッセイ（親和性ランキング）を使用して分析した。スクリーニングされた７３６クローンから、最大のシグナルを示した４８クローンが、ＩｇＧ１形式でのクローニング及び発現のために選択された。クローンをExpi293F（商標）（Fisher Scientificカタログ番号13479756）細胞を８００μｌスケールで発現させ、培養上清をＩｇＧ１形式でさらにスクリーニングするためにトランスフェクション後５日目に回収した。
【０２３８】
２．２  ＳＰＲスクリーニング
４８の抗体は全て、ＳＰＲ（Biacore T200機器）を使用して親和性によってランク付けされた。ランク付けのために、希釈した上清（１ＸＰＢＳ及び０．００２％Tween（商標）-20で作製されたランニングバッファー中１：１０）をプロテインＡチップ（GE healthcare、製品コード：29127556）上に固定化し、ヒトＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓ（配列番号７９）を５０ｎＭの濃度で調製した表面上に流した。この１回の注入を使用して生成された結合（ｋa）及び解離（ｋd）速度定数を使用して、推定解離定数（ＫD）を決定した。クローンのＫD値は、Ｉｇ１形式（G1/280_02_G02_NS）にクローン280_02_G02_NSのそれと比較した。クローンG1/280_02_G02_NSよりもヒトＰＤ−Ｌ１に対して高い親和性を示し、そのためクローンG1/280_02_G02_NSとともに完全な速度論的分析が行われたユニークな配列の１０個のクローンが同定された。
【０２３９】
簡単に説明すると、ＳＰＲ実験はBIAcoreT200機器を使用して実行された。希釈した培養上清からの抗体を、ＦＣ２上のプロテインＡチップ（GE Healthcare、29127556）に１０μｌ／分の流速で、６０秒の接触時間で捕捉した。典型的には、これにより５００〜８００ＲＵの抗体が捕捉される。５０から０．０５ｎＭの範囲のＰＤ−Ｌ１−ｒＣｄ４−Ｈｉｓの２倍希釈液を、ＦＣ１及びＦＣ２上で５０ｎＭから３０μｌ／分の流速で注入した（濃度範囲：５０ｎＭ〜０．０５ｎＭ）。結合は１８０秒にわたって測定され、解離は３００秒にわたって測定された。全ての測定は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Tween（商標）-20で、２５℃で実施した。速度論的パラメーターは、参照細胞の減算及びBIAevaluationソフトウェア（GE、BR-1005-97）を使用した１：１の相互作用を想定したセンソグラム実験データのフィッティングによって決定された。得られたデータは、BIAevaluationソフトウェアを使用してフィッティングされ、対応するｋa、ｋd、及びＫD値を算出した。試験された１０個のクローンのうち、「G1/887_04_E12」、「894_08_A05」、「G1/894_08_E05」及び「G1/887_04_G12」と指定された４つの抗体は、ナノモル濃度以下のＫD値を示し、これは、G1/280_02_G02_NSにつきＫDよりも低かった。記載のスクリーニング条件下で得られた親和性データは、実施例２に記載のカッパ軽鎖シャッフルにより、G1/280_02_G02_NS抗体の重鎖がラムダ軽鎖だけでなくカッパ軽鎖とも対になって、組換えヒトＰＤ−Ｌ１に対する良好な、そして実際に改善された、親和性を有する抗体を産生することを示した。低レベルの捕捉ｍＡｂで生成された正確な親和性は、表３セクション３．２に報告されている。
【０２４０】
実施例３：ＩｇＧ１形式のカッパクローンの特性評価
３．１  細胞ベースのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ブロッキングアッセイ
カッパ軽鎖、G1/887_04_E12、G1/894_08_E05及びG1/887_04_G12を含有する抗ＰＤ−Ｌ１クローンが、ＰＤ１及びＰＤ−Ｌ１の間の相互作用を遮断する能力を、PD1/PD-L1 Blockade Bioassay製品（Promega、J1250/J1255）を製造元の推奨に従って使用した生体発光細胞ベースのアッセイで評価した。ブロッキング活性をG1/280_02_G02_NSクローンと比較した。
【０２４１】
簡単に説明すると、全ての抗体はセクション１．３．３に記載されているように発現及び精製され、１００ｎＭから３５ｐＭまで（８つの濃度）の３倍希釈で２回試験された。計算されたＩＣ50値を表３に示す。試験された全てのクローンは、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の強力な阻害剤であることが示され、３つのカッパ軽鎖を含有するクローンG1/887_04_E12、G1/894_08_E05、及びG1/884_04_G12は、ラムダ軽鎖を含有するクローンG1/280_02_G02_NSよりもさらに優れたＩＣ50値を示した。
【０２４２】
【表３】
2021524478.tif 000006
【０２４３】
３．２  親和性
抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  G1/887_04_E12、G1/887_04_G12及びG1/894_08_E05の組換えヒトビオチン化ヒトPD-L1-Avi-His（Acro Biosystems、PD1-H82E5）、カニクイザルPD-L1-His(Acro Biosystems、PD1-C52H4）及びマウスPD-L1-His（Acro Biosystems、PD1-M5220）との結合を、Biacore T200機器（GE Healthcare）を使用してＳＰＲで測定した。親和性をＩｇＧ１形式の280_02_G02_NSクローンと比較した（G1AA/280_02_G02_NS；このクローン名の「ＡＡ」は、このクローンがＣＨ２ドメインに「ＬＡＬＡ」変異も含んでいたことを示す）。
【０２４４】
簡単に説明すると、HBS-EP緩衝液（GE Healthcare、BR100188）で２μｇ／ｍｌに希釈した抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂを、３０μｌ／分で、プロテインＡチップ（GE Healthcare、29127556）のフローセル２、３、及び４に個別に注入し、約１１０ＲＵの最終応答を達成した。HBS-EP緩衝液で希釈した組換えヒト、カニクイザル及びマウスＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ抗原を、必要に応じてフローセル１、２、３、又は４に、８１ｎＭから０．０３７ｎＭの濃度範囲で３倍希釈して、７５μｌ／分で４分間注入し、その後緩衝液中で１０分間解離させた。再生は、１０ｍＭグリシン−ＨＣＬ  ｐＨ１．５（GE Healthcare、Human Antibody Capture Kit、ＢＲ００３５６）を３０μｌ／分の速度で３０秒間注入することによって達成された。差し引かれたデータ（フローセル２−フローセル１、フローセル３−フローセル１、又はフローセル４−フローセル１）は、BIAevaluation 3.2ソフトウェア（GE Healthcare）を使用して分析して、屈折率（ＲＩ）定数０で、質量移動を伴うモデル１：１結合を使用して結合を同定した。マウスＰＤ−Ｌ１結合曲線の親和性を決定するために、対応するヒト結合プロファイルのＲｍａｘを使用した。
【０２４５】
結合データは、G1AA/280_02_G02_NSクローン及びG1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12クローンが、１桁台前半のナノモル濃度又はナノモル濃度以下の親和性でヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合し、完全にヒト／カニクイザルの交差反応性であることを示した。（表４）。G1AA/280_02_G02_NSクローンと比較して、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12、及びG1/887_04_G12クローンの結合親和性は、ヒトＰＤ−Ｌ１で約１．８から４．８倍、カニクイザルＰＤ−Ｌ１で２．７から４．７倍高かった。組換えマウスＰＤ−Ｌ１に対するクローンの親和性は低く、ＫD値は３８から２２５ｎＭの範囲であり、最も高い親和性がG1/887_04_E12クローンで観察された。これらのデータは、G1AA/280_02_G02_NS抗体の重鎖が、組換えヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１についての良好な（及びカッパ軽鎖ペアリングの場合はナノモル濃度以下の）親和性、並びに組換えマウスＰＤ−Ｌ１についての低くともいくらかの親和性を有する抗体を産生するために、ラムダ軽鎖及びカッパ軽鎖の両方と対となることができることを示す。
【０２４６】
【表４】
2021524478.tif 000007
【０２４７】
３．３  細胞発現ＰＤ−Ｌ１への抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの結合
３．３．１  ヒトＰＤ−Ｌ１を過剰発現する細胞の生成
抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12の細胞表面ＰＤ−Ｌ１への結合を評価するために、ヒトＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を生成した。
【０２４８】
ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して、ヒトＰＤ−Ｌ１配列（配列番号８３）をpcDNA（商標）5/FRTベクター（ThermoFisher Scientific、カタログ番号V601020）にサブクローンし、その後、Lipofectamine 2000（Life Technologies、11668-019）を使用してベクターをFlp-In T-REx 293細胞株（Life Technologies、R780-07）に形質転換した。細胞を、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）及び１５μｇ／ｍｌブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）を含有するＤＭＥＭで、安定的に形質転換された細胞のコロニーが形成されるまで３〜４週間増殖させた。これらのコロニーを１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Sigma Aldrich、D9891）の存在下で増幅し、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＰＤ−Ｌ１（ＭＩＨ１）抗体（BD Biosciences、557924）を使用してＰＤ−Ｌ１の発現について試験した。細胞解離緩衝液を使用して細胞を剥離し、ＰＢＳで１回洗浄し、９６ウェルプレートのウェルに２×１０5細胞でプレーティングし、ＰＢＳで１：２０に希釈した抗体と４℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで再度洗浄し、Accur iC6サイトメーター（BD Biosciences）を使用して測定した。FlowJoXソフトウェアを使用してデータを分析した。ヒトＰＤ−Ｌ１の発現が細胞株で検出された。
【０２４９】
３．３．２  細胞結合アッセイ：ＨＥＫ２９３−ｈＰＤ−Ｌ１及び対照ＨＥＫ−ＦＲＴへの細胞結合は特異的結合を示す。
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12を、次に、フローサイトメトリーを使用して、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＨＥＫ２９３細胞への結合を試験した。非特異的結合は、ヒトＰＤ−Ｌ１を欠くＨＥＫ２９３親細胞（Flp-In T-Rex 293細胞株、Life Technologies、R780-07）への結合を試験することによっても評価された。
【０２５０】
ＨＥＫ２９３及びＨＥＫ２９３．ｈＰＤ−Ｌ１懸濁液は、０．５％ＢＳＡ（Sigma、A7906）を含有するＰＢＳ中で調製し、１００μｌの丸底９６ウェルプレート(VWR、734-1797)に１×１０5細胞／ウェルで播種した。細胞を１００μｌの１×ＤＰＢＳで１回洗浄し、ｍＡｂ G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12を１００μｌの１ｘＤＰＢＳ（Gibco、14190-094）で希釈した（１．１０-6〜０．０１３ｎＭで、５倍希釈）。洗浄した細胞を希釈した抗体混合物に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄した。次に、ＰＢＳで１：１０００に希釈した１００μｌ／ウェルの二次抗体（Alexa Fluor 647-AffiniPure Goat Anti-Human IgG、F（ab’）2 Fragment Specific、Stratech Scientific、109-605-006-JIR）を添加し、細胞／抗体混合物を４℃で２０分間インキュベートした後、細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、７ＡＡＤ（１：１０００、Biotium、40043）を含有する１００μｌのＰＢＳに再懸濁してから、CantoIIフローサイトメーター（BD Bioscience）を使用して分析した。死細胞を除外し、ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍ／５３０／３０）の蛍光を測定した。幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）値を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０２５１】
G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12クローンは、ＥＣ50値が０．２６〜０．２９ｎＭの範囲で細胞表面ヒトＰＤ−Ｌ１に結合することが見出された（表５参照）。親ＨＥＫ２９３細胞への結合は観察されず、結合の特異性を示した。したがって、試験した全てのｍＡｂクローンは、非特異的な結合は観察されず、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合した。
【０２５２】
【表５】
2021524478.tif 000008
【０２５３】
３．４  混合リンパ球反応アッセイにおける抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの活性
抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの活性は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで試験された。ＭＬＲアッセイは、２つの同種異系リンパ球集団（同じ種であるが、遺伝的に異なる）間で発生する細胞性免疫応答を測定する。このアッセイでは、あるドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞及び別のドナーからの単球由来樹状細胞（ｉＤＣ）を使用する。免疫細胞には生理学的レベルの免疫チェックポイント調節因子が含まれているため、ＭＬＲアッセイを使用して、Ｔ細胞活性化がヒトシステムのｍＡｂによって増強されることを確認することができる。
【０２５４】
３．４．１  拡大培養ＣＤ４＋Ｔ細胞の生成
ＰＢＭＣは、フィコール勾配分離によって白血球錐体から分離された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Human CD4+T Cell Isolation Kit（Miltenyi Biotec Ltd、130-096-533）を使用して、製造元の指示に従って分離した。ヒトＴ−アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８ Dynabeads（Life Technologies、11131D）をボルテックスで再懸濁した。ビーズを滅菌１５ｍｌチューブに移し、１０％ＦＢＳ（Life Technologies、10270106）を含む１０ｍｌ  ＲＰＭＩ（Life Technologies、61870044）及び１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies、15140122）を加えてダイナビーズを洗浄した。上澄みを廃棄した。１０％ＦＢＳ及び１×ペニシリンストレプトマイシン溶液を添加したＲＰＭＩ中の１．０×１０6細胞／ｍｌのＣＤ４＋Ｔ細胞、及び３：１のビーズ対細胞比を有する５０ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ２（Peprotech、200-02-50μg）をＴ７５フラスコ（Greiner Bio-one、690195）に移し、３７℃＋５％ＣＯ2でインキュベートした。３日後、細胞を穏やかに再懸濁し、計数した。細胞密度は、必要に応じて新鮮な培地（ＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ＋ペニシリンストレプトマイシン溶液１Ｘ＋５０ＩＵ／ｍｌのｒｈｕＩＬ２）を添加することにより、０．８〜１×１０6細胞／ｍｌの範囲に維持した。７日目又は８日目に、ＣＤ３／２８ビーズを除去し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、減量した１０ＩＵ／ｍｌのｒｈｕＩＬ２を有する新鮮培地ＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ＋ペニシリンストレプトマイシン溶液１Ｘの１×１０6細胞／ｍｌで一晩静置した。細胞は必要になるまで凍結保存した。
【０２５５】
３．４．２  ｉＤＣの生成
未処理の単球は、Human Pan Monocyte Isolation Kit（Miltenyi Biotec Ltd、130-096-537）を使用して、製造元の指示に従ってヒトＰＢＭＣから分離した。単球は、ヒトMo-DC分化培地（Miltenyi Biotec Ltd、130-094-812）を使用して、製造元の指示に従ってｉＤＣに分化させた。
【０２５６】
３．４．３  ＭＬＲアッセイ
拡大培養されたＴ細胞は、実験の１日前に解凍し、ＡＩＭ  Ｖ培地（GIBCO、12055-091）で洗浄し、ＡＩＭ  Ｖ培地中、３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12を、９６ウェル丸底プレート（VWR、734-1797）中、５０μｌのＡＩＭ  Ｖ培地で、最終濃度の４倍で３回希釈した。ＬＡＬＡ変異を含有する４４２０と指定される抗ＦＩＴＣ抗体（Bedzyk et al., 1989；Bedzyk et al., 1990）が陰性対照として含まれていた。３０ｎＭから０．００２ｎＭまでの３倍希釈系列を試験した。５０μｌのＡＩＭ  Ｖ培地に懸濁した１×１０4ｉＤＣ細胞、及び１００μｌのＡＩＭ  Ｖ培地に懸濁した１×１０5拡大培養したＣＤ４＋Ｔ細胞の両方を、抗体希釈液に添加し、３７℃＋５％ＣＯ2で５日間インキュベートした。以下の対照が含まれていた：ＣＤ４＋Ｔ細胞単独、ｉＤＣ単独、ＣＤ４＋Ｔ細胞＋ｉＤＣ、及びＡＩＭＶ培地単独。上清を回収し、サンプルを希釈し（１：２５）、ヒトＩＦＮガンマＥＬＩＳＡ  Ready-SET-Go!キット（Life Technologies、88-7316-77）を使用して、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）濃度を測定した。Ｇｅｎ５ソフトウェア、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４パラメーターロジスティック曲線適合（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。ヒトＩＦＮ−γの濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０２５７】
抗ヒトＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ  G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12は、ＥＣ50値が０．０３０ｎＭ未満、及びＩＦＮ−γ（Ｅmax）の最大レベルが１００００ｐｇ／ｍｌを超えるＭＬＲアッセイにおいて強力な活性を示した（表６、代表図１）。ＥＣ50は、応答の半分が達成されるｍＡｂの濃度を示し、他方で、Ｅmaxは、アッセイで達成されるＩＦＮ−γの最大濃度を示す絶対値である。予想通り、陰性対照G1AA/4420 mAbでは活性は観察されなかった。
【０２５８】
【表６】
2021524478.tif 000009
【０２５９】
３．５  マウスＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの活性
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  G1/887_04_E12、G1/887_4_G12及びG1/894_08_E05はマウスＰＤ−Ｌ１に対して弱い交差反応性を示すことが示されたため（実施例３．２、表４を参照）、マウスＰＤ−Ｌ１に対するそれらの機能的活性を、ＤＯ１１．１０  ＯＶＡ  Ｔ−リンパ球及びＬＫ３５．２Ｂ−リンパ球ハイブリドーマ細胞株に基づく、インターロイキン２（ＩＬ−２）放出アッセイで調査した。ＩＬ−２放出はＴ細胞活性化のマーカーである。内因性マウスＰＤ−１を発現するＴ細胞に空のベクター（ｐＬＶＸ）をトランスフェクトした。Ｂ−細胞にマウスＰＤ−Ｌ１構築物をトランスフェクトした。
【０２６０】
３．５．１  空のベクターを用いたＴ細胞株の産生
レンチウイルス形質導入法を使用したLenti-X HTXパッケージングシステム（Clontech、631249）を使用して、空のレンチウイルスベクターｐＬＶＸを含有するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）を生成した。Lenti-X発現ベクター（pLVX）（Clontech、631253）をLenti-X HTXパッケージングミックスとともにLenti-X293T細胞株（Clontech、632180）に同時トランスフェクトして、ウイルスを生成した。ＤＯ１１．１０細胞株は、Lenti-XHTXパッケージングシステムで産生されたレンチウイルス粒子を使用して形質導入された。
【０２６１】
３．５．２  ＰＤ−Ｌ１を過剰発現する抗原提示細胞の産生
レンチウイルス形質導入法を使用したLenti-X HTXパッケージングシステム（Clontech、631249）を使用してマウスＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＬＫ３５．２  Ｂ細胞リンパ腫細胞（ATCC、HB-98）を生成した。マウスＰＤ−Ｌ１ｃＤＮＡ（配列番号８４のマウスＰＤ−Ｌ１をコードする）を含有するLenti-X発現ベクター（pLVX）（Clontech、631253）は、Lenti-XHTXパッケージングミックスとともにLenti-X293T細胞株（Clontech、632180）に同時トランスフェクトして、ウイルスを生成した。ＬＫ３５．２細胞株は、Lenti-X HTXパッケージングシステムで生成したレンチウイルスベクターを使用して形質導入された。
【０２６２】
３．５．３  マウスＤＯ１１．１０Ｔ細胞活性化アッセイ
抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  G1/887_04_E12、G1/887_04_G12及びG1/894_08_E05又は抗ＦＩＴＣ陰性対照ｍＡｂ（G1AA/4420）の希釈液は、実験培地（ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）、１０％  ＦＢＳ（Gibco、10270-106）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070））で調製された。２．４６μＭ  ＯＶＡペプチド（Ｈ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ−ＯＨ、Pepscan）（１００μＬ  ＬＫ３５．２ｍＰＤ−Ｌ１細胞（マウスＰＤ−Ｌ１を過剰発現させるためにｍＰＤ−Ｌ１を含むレンチウイルスベクターで形質導入されたＢ細胞ハイブリドーマ）／ｍＡｂ混合物が９６丸底プレートの１ウェルあたり）の存在下、ｍＡｂは、４×１０5／ｍｌ  ＬＫ３５．２ｍＰＤ−Ｌ１細胞と１：１で、実験培地中で混合し、３７℃、５％  ＣＯ2で１時間インキュベートした。１００μｌ容量の実験培地中のｍｌあたり２×１０5  ＤＯ１１．１０  ｐＬＶＸ細胞（空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＤＯ１１．１０  Ｔ細胞ハイブリドーマ）を、１００μｌのＬＫ３５．２ｍＰＤ−Ｌ１／（ｍＡｂｓ）混合物に添加した。次いで、細胞を混合し、３７℃、５％ＣＯ2で、２４時間インキュベートした。上清を収集し、製造元の指示に従ってマウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、88-7024-88又はR＆Dシステム、SM2000）でアッセイした。Gen5ソフトウェア、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍ（補正）の吸光度値から５７０ｎｍの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、４パラメーターロジスティック曲線適合（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。マウスＩＬ−２の濃度をｍＡｂの対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数（アゴニスト）対応答式を使用して適合させた。
【０２６３】
結果を図２及び表７に示す。抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂは、マウスＴ細胞活性化アッセイで顕著な活性を示し、効力（ＥＣ50）は１〜４．４ｎＭの範囲であった。予想通り、陰性対照ｍＡｂでは活性は観察されなかった。試験した３つのクローンのうち、組換えマウスＰＤ−Ｌ１に対して最も高い親和性を示した（表４参照）G1/887_04_E12も、Ｔ細胞活性化アッセイで最も強力なクローンであった。効力の差は、測定された親和性よりも低く、これは、このアッセイにおけるＬＫ３５．２細胞でのマウスＰＤ−Ｌ１の過剰発現によるためである可能性が高い。
【０２６４】
【表７】
2021524478.tif 000010
【０２６５】
３．６  ナイーブマウスの薬物動態
インビボ薬物動態（ＰＫ）を調査するために、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂG1/894_08_E05、G1/887_04_E12、及びG1/887_04_G12を、ｍＡｂを非腫瘍性マウスに投与した研究用グレードのＰＫ試験で試験し、血清中の濃度を経時的に測定した。
【０２６６】
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（９〜１０週齢の雌）を３匹の動物からなる４つのグループに分け、静脈内投与された試験抗体の単回投与を受けた。動物に８ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂを１回投与した。抗体を静脈内投与（１００μｌ、尾静脈）し、血液サンプル（２０μｌ、尾静脈）を７つの異なる時点で、１時点あたり３匹のマウスから収集した。時点は、投与後０．５、１、６、２４、４８、９６、及び１４４時間であった。血液を室温で２時間凝固させ、遠心分離機で２０分間、２０００ｇで回転させた後、血清を回収して−８０℃で保存した。分析のために、全ての血清サンプルを解凍し、同時に、200-3W-002-Aプログラムを使用してGyrolab xPlore機器（Gyrolab Technologies）で実行した。ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ−重鎖及び軽鎖サル吸着（Cambridge Bioscience、A80-319B）を捕捉試薬として使用し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＦ６４７（Cambridge Bioscience、2040-31）を検出試薬として使用した。ヒトＩｇＧの濃度を各血清サンプルで測定し、各化合物の滴定曲線に基づいて実際の薬物濃度を計算して、検出における潜在的な差異を排除した。捕捉又は検出抗ヒトＩｇＧｍＡｂへの結合がｍＡｂによって変化しなかったことを検証するために、追加の標準曲線を実行した。
【０２６７】
抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂは初期の急速なクリアランスを示さず、曝露レベルは６日間で２４μｇ／ｍｌ超に維持された（図３）。このデータは、ｍＡｂで予想されたとおりであり、公開されている抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂデータと一致している（Deng et al., 2016）。
【０２６８】
３．７  ＩｇＧ１形式のカッパクローンの特性評価の概要
選択されたカッパ軽鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  G1/894_08_E05、G1/887_04_E12、及びG1/887_04_G12は、カニクイザル及びマウスＰＤ−Ｌ１の交差反応性を示し、細胞表面に発現したＰＤ−Ｌ１への特異的結合を示し、ラムダ軽鎖を含むクローンG1/280_02_G02よりも、組換えヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対してさらに高い親和性を示した。抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  G1/894_08_E05、G1/887_04_E12、及びG1/887_04_G12は、インビトロでヒトＴ細胞の強力な活性化因子であり、機能的なマウス交差反応性を保持し、非腫瘍性マウスで満足なＰＫプロファイルを保持することを示した。
【０２６９】
実施例４：配列の最適化
４．１  潜在的なタンパク質脱アミド化部位の特定及び除去
G1/280_02_G02_NSクローン配列の解析により、Ｈ−ＣＤＲ２ループ（Kabat位５４〜５７）内の配列ＮＳＮＴ（配列番号６）が、脱アミド化された場合、結合に影響を与える可能性がある潜在的な脱アミド化部位として同定された。このクローンの重鎖は、実施例２に記載のチェーンシャッフリングキャンペーンによって得られた全てのカッパ軽鎖含有クローンに保持されていたため、この潜在的な脱アミド化部位は、クローンG1/887_04_E12、G1/894_08_A05、G1/894_08_E05、及びG1/887_4_G12にも存在した。生殖細胞系列配列に最も近い特定のプライマーを使用して、４つのカッパ軽鎖含有クローンにおいて、ＮＳＮＴ（配列番号６）配列は、部位特異的変異導入法により、ＧＧＳＴ（配列番号７）、ＳＧＧＴ（配列番号５）又はＳＧＮＡ（配列番号８）のいずれかに変化して、表８で特定される変異体クローンを産生した。この潜在的な脱アミド化部位を除去すると同時に、カッパ軽鎖シャッフル中にこの抗体の配列に意図せず導入された、G1/887_04_E12クローンのＶＨ領域内のKabat位２８のプロリン残基の役割は、G1/280_02_G02_NSクローンに含まれるスレオニン残基に戻すことによっても調査された。親及び得られた変異体クローン（全てＩｇＧ１形式）を０．８ｍｌスケールでトランスフェクトし、トランスフェクションの５日後に回収した培養上清を使用して、ＳＰＲによるヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓに対するクローンの親和性を決定した。Ｃｙｎｏ  ＰＤ−Ｌ１−ｒＣＤ４−Ｈｉｓを実施例１．１で記載されているように生成した。G1/887_04_E12クローンに由来する変異体クローンを除いて、全ての変異体クローンは、それぞれの親クローンと比較して、ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対するナノモル濃度以下の親和性を保持していた（表８参照）。
【０２７０】
【表８】
2021524478.tif 000011
【０２７１】
親（G1/887_04_E12）と比較してG1/929_01_A01、G1/929_01_A02、及びG1/929_01_A03クローンの親和性が大幅に低下したのは、Ｈ−ＣＤＲ２におけるＧＧＳＴ（配列番号７）、ＳＧＧＴ（配列番号５）及びＳＧＮＡ（配列番号８）の置換の存在よりも、Kabat位２８におけるＶＨ領域のプロリンが除去に起因する可能性が高いと考えられた。G1/887_04_E12クローン内のこのプロリン残基がＰＤ−Ｌ１に対する親和性について重要であるように見えたことは驚くべきことであった。Ｈ−ＣＤＲ２（５４〜５７位）におけるＳＧＧＴ（配列番号５）置換を含む３つの親クローンG1/887_04_E12、G1/894_08_E05及びG1/887_04_G12に由来する変異体、すなわちクローンG1/929_01_A02、G1/929_01_A08及びG1/929_01_A11は、このＳＧＧＴ（配列番号５）置換が生殖細胞系列配列に最も近いことに基づいて、さらなる特性評価のために選択された。
【０２７２】
部位特異的変異導入を使用して、G1/280_02_G02_NSクローンのＨ−ＣＤＲ２ループ内の潜在的な脱アミド化部位（Kabat位５４から５７のＮＳＮＴ（配列番号６））もＳＧＧＴ（配列番号５）へと修飾された。さらに、このクローンのラムダ軽鎖のＣＤＲ１におけるKabat位３１から３２で特定される、さらなる潜在的な脱アミド化部位（ＮＳモチーフ）は、ＩＧＬＶ２−８−０１、ＩＧＬＶ２−８−０２、ＩＧＬＶ２−８−０３、ＩＧＬＶ２−１１−０１、ＩＧＬＶ２−１１−０２、ＩＧＬＶ２−１１−０３及びＩＧＬＶ２−１４−０１、ＩＧＬＶ２−１４−０２、ＩＧＬＶ２−１４−０３、ＩＧＬＶ２−１４−０４などのいくつかの生殖細胞系列配列におけるこの位置にチロシンが見られるように、セリン３２（Kabat番号付け）をチロシンに変異させることによってＮＹへと修飾された。これらの修飾の組み合わせにより、ラムダ軽鎖含有クローンG1/lambdav3が得られ、これもさらなる特性評価のために選択された。
【０２７３】
実施例５：ｍＡｂ／ｍＡｂ2の特性評価
５．１  ｍＡｂ及びｍＡｂ2形式のクローニング及びクローンの産生
実施例４で同定されたG1/929_01_A02「ＳＧＧＴ」変異体クローンのＶＨ領域のKabat位２８のスレオニン残基を、ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対する親和性を改善する目的で、親クローンG1/887_04_E12の同じ位置に存在するようにプロリンに変異させた。ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞における一過性発現及びmAb Select SuReタンパク質Ａカラムを使用した精製を使用して、この修飾された変異体クローン、及び実施例４においてＩｇＧ１形式及びＬＡＬＡ変異で同定された他の３つの「ＳＧＧＴ」変異体クローン（G1/929_01_A08、G1/929_01_A11、及びG1/lambdav3）を産生し、エフェクター機能が非存在下の場合の機能的活性の試験を可能にした。得られたｍＡｂは、G1AA/E12v2、G1AA/E05v2、G1AA/G12v2及びG1AA/lambdav3と指定された。重鎖及び軽鎖配列は、それぞれG1AA/E12v2につき配列番号４７及び配列番号４８、G1AA/G12v2につき配列番号４９及び配列番号５０、G1AA/E05v2につき配列番号５１及び配列番号５２、及びG1AA/lambdav3につき配列番号６１及び配列番号６２に示されている。
【０２７４】
ｍＡｂのＣＤＲに基づく抗原結合部位は、ｍＡｂ2と呼ばれる二重特異性抗体を提供するために、定常ドメインで生成されたＦｃａｂ（フラグメント結晶化抗原結合）部分と組み合わせることができる。
【０２７５】
本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１につきそれらの特異性を試験するために、抗ＣＤ１３７／抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ2形式で産生した。ｍＡｂ2は、重鎖を持つＩｇＧ１  ＬＡＬＡ形式で産生され、重鎖は、Ｆｃａｂ部分のＣＨ３ドメインに抗ヒトＣＤ１３７結合部位を有し、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂクローンのG1AA/E12v2、G1AA/E05v2、G1AA/G12v2又はG1AA/lambdav3からのＶＨドメインを有する。ｍＡｂ2を生成するために、重鎖を抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの対応する軽鎖と同時トランスフェクトした。ｍＡｂ2は、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞において一過性発現により産生され、mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製されて、クローンFS22-172-003AA/E12v2、FS22-172-003AA/G12v2、FS22-172-003AA/E05v2及びFS22-172-003AA/lambdav3が得られた。重鎖及び軽鎖配列は、それぞれFS22-172-003AA/E12v2につき配列番号８５及び配列番号８６、FS22-172-003AA/G12v2につき配列番号８７及び配列番号８８、FS22-172-003AA/E05v2につき配列番号８９及び配列番号９０、及びFS22-172-003AA/lambdav3につき配列番号９１及び配列番号９２に示されている。
【０２７６】
５．２  ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対するｍＡｂの親和性
G1AA/lambdav3（すなわち、ＶＨ−ＣＤＲ２におけるＮＳＮＴ（配列番号６）からＳＧＧＴ（配列番号５）、ＶＬ−ＣＤＲ１におけるＮＳからＮＹ、及びＬＡＬＡ変異）及びカッパ軽鎖含有ｍＡｂのG1AA/E12v2、G1AA/E05v2及びG1AA/G12v2（すなわち、ＬＡＬＡ変異、及びG1AA/E12v2単独、ＶＨ領域におけるKabat位２８のスレオニンからプロリン）に存在するさらなる配列修飾が結合動力学に影響を及ぼすかどうかを決定するために、実施例３．２に記載のように、ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１についてのこれらの抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂの親和性が決定された。ｍＡｂのG1AA/lamdav3、G1AA/E05v2、G1AA/E12v2、及びG1AA/G12v2は、ｍＡｂ  G1AA/280_02_G02_NS、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12について実施例３．２（表４）で観察されたそれらと同様のヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１についての親和性を示し、試験されたｍＡｂ及びｍＡｂ2の結合親和性は、潜在的な脱アミノ化部位の修飾又はＬＡＬＡ変異の導入により影響を受けなかったことが実証された。G1AA/E12v2  ｍＡｂは、試験した４つのｍＡｂ全ての中で最低のＫD値を示した（ヒトＰＤ−Ｌ１では０．２１ｎＭ、カニクイザルＰＤ−Ｌ１では０．３７ｎＭ）。
【０２７７】
G1AA/E12v2のＶＨは、G1/929_01_A02（実施例４、表８）のＶＨと１残基異なり、G1AA/E12v2はKabat位２８にプロリンを保持するが、G1/929_01_A02はこの位置にスレオニンを保持する。G1/929_01_A02は、G1AA/E12v2と比較した場合、ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１の両方に対して１０倍を超える低い親和性を示した。このデータは、クローンG1AA/E12v2のＶＨにおける２８位（Kabat命名法）のプロリン残基が、ヒト及びカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対する親和性に重要であることを示す。
【０２７８】
【表９】
2021524478.tif 000012
【０２７９】
５．３  ＰＤ−Ｌ１ファミリーメンバーの特異性
ＰＤ−Ｌ１は、免疫チェックポイント調節因子のＢ７相同性ファミリーに属する（Ni and Dong, 2017）。ｍＡｂ2クローンFS22-172-003AA/lambdav3、FS22-172-003AA/E05v2、FS22-172-003AA/E12v2及びFS22-172-003AA G12v2の抗ＰＤ−Ｌ１のＦａｂアームの特異性を分析するために、密接に関連するファミリーメンバーへそれらが結合する能力を、ＳＰＲを使用して試験した。この目的は、１μＭの濃度で密接に関連する抗原へのｍＡｂ2の結合を示さないが、１ｎＭの濃度でＰＤ−Ｌ１受容体への結合を示すことによって特異性を示すことであった。
【０２８０】
ＣＭ５チップ上のフローセルは、およそ１０００ＲＵのヒトＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ（R&D Biosystems、1224-PL）、ＣＤ８０−Ｆｃ（R&D Biosystems、140-B1）、ＰＤ−１−Ｈｉｓ（R&D Biosystems、8986-PD）、Ｂ７−Ｈ３−Ｈｉｓ（F-star自社生産）、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（R&D Biosystems、156-B7）又はＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（Acrobiosystems、PD1-H83F3）のいずれかで固定された。フローセル１はブランク固定として実行された。ｍＡｂ2は、１×ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で１μＭ及び１ｎＭ（GE Healthcare、製品コードBR100188）に希釈し、３分間チップ上に流動させ、次いで４分間解離させた。再生のために、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の３０秒注入を使用した。各抗原のコーティングを実証するために、陽性対照ｍＡｂを５０〜１００ｎＭで注入した。結合レベルは、会合フェーズの終わりに決定され、比較された。
【０２８１】
試験した全てのｍＡｂ2クローンは、高レベルの特異性を示し、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ又はＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓのいずれかに結合するために、１ｎＭで検出された結合応答の１０５ＲＵから５７０ＲＵの範囲に対し、１μＭで検出された４つの抗原に結合するｍＡｂ2は１０ＲＵ未満であった。これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１に対するＦａｂアームの特異性が、潜在的な脱アミノ化部位を除去するためにＣＤＲに加えられた修飾にかかわらず保持され、ＬＡＬＡ変異の導入及びｍＡｂ2形式におけるＦａｂの産生はＰＤ−Ｌ１へのそれらの結合に影響されないことを示した。
【０２８２】
５．４  ＭＬＲにおける抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの活性
抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂのG1AA/E05v2、G1AA/E12v2、及びG1AA/G05v2は、実施例３．４に記載されているように混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで試験された。G1AA/4420を陰性対照として使用した。データを表１０及び図４に示す。ｍＡｂのG1AA/E05v2、G1AA/E12v2及びG1AA/G12v2は、０．０５４ｎＭ未満のＥＣ50及び６００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮ−γの最大レベル（Ｅｍａｘ）のＭＬＲアッセイにおいて強力な活性を示した（表１０、図４。ＥＣ50、特にＥｍａｘ値は、例３．４で記載した値とは顕著に異なっていた。応答は、あるドナーからのＴ細胞及び別のドナーからの単球由来樹状細胞との間の同種反応に依存するため、この違いはドナーのばらつきによるものと考えられている。抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの効力は、クローンの効力の順序にランク付けしたのと同様に、実施例３．４に記載されたデータと一致していた。予想通り、陰性対照G1AA/4420 mAbの活性は観察されなかった。
【０２８３】
【表１０】
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【０２８４】
５．５  抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの発現、精製及び分析特性
ｍＡｂのG1AA/E05v2、G1AA/E12v2、及びG1AA/G12v2はラボスケールで産生され、ＳＥＣ及び示差走査熱量測定（ＤＳＣ）の標準的な分析方法によって特徴付けられた。
【０２８５】
５．５．１  ラボスケールでの抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの発現及び精製
ｍＡｂのG1AA/E05v2、G1AA/E12v2、及びG1AA/G12v2をコードするＤＮＡ配列を、PEIpro（Polyplus、フランス）を使用してＨＥＫ２９３  ６Ｅ（カナダ国立研究評議会（National Research Council Canada））細胞にトランスフェクトした。５日後、細胞培養液を回収し、AKTAxpress機器を使用してMabSelectプロテイン−Ａプレパックカラム（両方GE Healthcare、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）で精製した。カラムの平衡化は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０の２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、で行い、その後、回収した細胞培養液をロードした。樹脂を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０の２５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用して洗浄し、続いてｐＨ３．５未満の緩衝液を使用してｍＡｂを溶出した。
【０２８６】
５．５．２  ＳＥ−ＵＰＬＣによる分析
精製後のＳＥ−ＵＰＬＣは、Acquity H-Class Bio UPLC（Waters Corp、UK）を使用して、単量体の割合を測定するために精製から２４時間以内に実施した（材料は４℃で保存した）。Acquity UPLC BEH200 SEC  １．７ｍｍカラム（４．６×１５０ｍｍ）を使用し、移動相は、２５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、ｐＨ６．８で構成されていた。単量体、低分子量及び高分子量種の定量化は、Empowerソフトウェア（Waters Corp、UK）を使用して実行された。
【０２８７】
５．５．３  熱安定性
G1AA/E05v2、G1AA/E12v2、及びG1AA/G12v2の融解温度（Ｔm）は、Microcal VPキャピラリー示差走査熱量計（ＤＳＣ）を使用して測定した。G1AA/lambdav3は、カッパ軽鎖含有ｍＡｂ及びラムダ軽鎖含有ｍＡｂの違いを評価するために含まれていた。サンプルは、サンプル緩衝液中、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で測定された。スキャン速度は６０℃／時間に設定され、データは３５℃から１００℃の間で収集された。データ分析は、Origin7.0ソフトウェアを使用して実行された。Ｆａｂ及びＣＨ３のＤＳＣピークが重複していたため、１つの値が報告された。
【０２８８】
【表１１】
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【０２８９】
結果の概要を表１１に示す。３つのｍＡｂ：G1AA/E05v2、G1AA/E12v2、及びG1AA/G12v2は、良好な分析特性パラメーターを示した。タンパク質Ａ後の単量体純度は９８％を超え、Ｆａｂ遷移の熱安定性（Ｔｍ）は、ＩｇＧ１について典型的に報告される遷移の上端で確認され、G1AA/E12v2が最も熱的に安定しているように見えた（Ｆａｂ／ＣＨ３  ＴM＝８１．４〜８４．１℃）。ラムダ軽鎖ｍＡｂのG1AA/lambdav3は、３つのカッパ軽鎖含有ｍＡｂよりもＴｍが低かった。
【０２９０】
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【０２９１】
配列表情報
抗体配列
注記：
ｉ．  完全重鎖、可変ドメインはイタリック体で示され、Kabatスキームに従うＣＤＲはイタリック体且つ下線で示され、ＩＭＧＴスキームに従うＣＤＲは太字のイタリック体で示され、したがって、重複するＩＭＧＴ及びKabat  ＣＤＲ配列は太字、イタリック体、且つ下線で示され、該当する場合、ＬＡＬＡ変異の位置は太字且つ下線で示される。
ｉｉ．  完全重鎖のアミノ酸及びｃＤＮＡ配列は、任意選択によるＣ末端のリジンなしで提供される。
ｉｉｉ．  完全軽鎖、可変ドメインはイタリック体で示され、Kabatスキームに従うＣＤＲはイタリック体且つ下線で示され、ＩＭＧＴスキームに従うＣＤＲは太字のイタリック体で示され、したがって、重複するＩＭＧＴ及びKabat  ＣＤＲ配列は太字、イタリック体、且つ下線で示される。
ｉｖ．  可変ドメインのアミノ酸配列において、Kabatスキームに従うＣＤＲはイタリック体且つ下線で示され、ＩＭＧＴスキームに従うＣＤＲは太字のイタリック体で示され、したがって、重複するＩＭＧＴ及びKabat  ＣＤＲ配列は太字、イタリック体、且つ下線で示される。
ｖ．  Kabatスキーム及びＩＭＧＴスキームの両方に従うＣＤＲアミノ酸配列が提供される。
【０２９２】
【表１２】
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【０２９３】
【表１３】
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【０２９４】
【表１４】
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【０２９５】
【表１５】
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【０２９６】
【表１６】
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【０２９７】
【表１７】
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【０２９８】
【表１８】
2021524478.tif 000021
【０２９９】
【表１９】
2021524478.tif 000022
【０３００】
【表２０】
2021524478.tif 000023
【０３０１】
【表２１】
2021524478.tif 000024
【０３０２】
【表２２】
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【０３０３】
【表２３】
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【０３０４】
【表２４】
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【０３０５】
【表２５】
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【０３０６】
【表２６】
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【０３０７】
【表２７】
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【０３０８】
【表２８】
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【０３０９】
【表２９】
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【０３１０】
【表３０】
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【０３１１】
【表３１】
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【０３１２】
【表３２】
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【０３１３】
【表３３】
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【０３１４】
【表３４】
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【０３１５】
【表３５】
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【０３１６】
【表３６】
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【０３１７】
【表３７】
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【０３１８】
【表３８】
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【０３１９】
【表３９】
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【０３２０】
【表４０】
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【０３２１】
【表４１】
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【０３２２】
【表４２】
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【０３２３】
【表４３】
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【０３２４】
【表４４】
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【０３２５】
【表４５】
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【０３２６】
【表４６】
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【０３２７】
【表４７】
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【０３２８】
【表４８】
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【０３２９】
【表４９】
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【０３３０】
【表５０】
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【０３３１】
【表５１】
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【０３３２】
【表５２】
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【０３３３】
【表５３】
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【０３３４】
【表５４】
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【０３３５】
【表５５】
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【０３３６】
【表５６】
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【０３３７】
【表５７】
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【０３３８】
【表５８】
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【０３３９】
【表５９】
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【０３４０】
【表６０】
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【０３４１】
【表６１】
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【０３４２】
【表６２】
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【０３４３】
【表６３】
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【０３４４】
【表６４】
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【０３４５】
【表６５】
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【０３４６】
【表６６】
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【０３４７】
【表６７】
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【０３４８】
【表６８】
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【０３４９】
【表６９】
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【０３５０】
【表７０】
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【０３５１】
【表７１】
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【０３５２】
【表７２】
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【０３５３】
【表７３】
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【０３５４】
【表７４】
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【０３５５】
【表７５】
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【０３５６】
ｍＡｂ2形式で試験したｍＡｂ
注記：
ｉ．  重鎖配列において、可変ドメインはイタリック体、該当する場合、ＬＡＬＡ変異の位置は太字且つ下線。
ｉｉ．  軽鎖配列において、可変ドメインはイタリック体。
【０３５７】
【表７６】
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【０３５８】
【表７７】
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【０３５９】
【表７８】
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【０３６０】
【表７９】
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【０３６１】
【表８０】
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【０３６２】
【表８１】
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【０３６３】
【表８２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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