(57)【要約】本発明は、7.0〜7.7、特に7.1〜7.6、より詳細には7.2〜7.5の範囲内のpH値を有するリン酸緩衝液を含む人工硝子体液組成物に関する。本発明はさらに、人工硝子体液組成物の製造方法、物質の挙動を分析するための方法、物質と接触させた際の該人工硝子体液組成物の変化を分析するための方法、およびキットオブパーツに関する。2021500310.tif 000014
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
7.0〜7.7、特に7.1〜7.6、より詳細には7.2〜7.5の範囲内のpH値を有するリン酸緩衝液を含む、人工硝子体液組成物。
【請求項２】
前記リン酸緩衝液が、特に0.001〜0.2M、より詳細には0.003〜0.05M、最も詳細には0.005〜0.02Mの範囲内のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）である、請求項1に記載の人工硝子体液組成物。
【請求項３】
最大578μMのクレアチニン、最大28.1mMのグルコース、最大58.5mMの尿素、200〜1630μMのキサンチン、100〜800μMのヒポキサンチン、0.1〜23mMの乳酸ナトリウム、50〜300μMのグルタチオンのうちの少なくとも1つを含む、請求項1または2に記載の人工硝子体液組成物。
【請求項４】
64.6μMのクレアチニン、2.2mMのグルコース、7.6mMの尿素、580μMのキサンチン、309μMのヒポキサンチン、10.5mMの乳酸ナトリウム、および200μMのグルタチオンを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の人工硝子体液組成物。
【請求項５】
20〜300mg/LのII型コラーゲン、特に40mg/LのII型コラーゲン、および/または0.03〜0.9％w/vのヒアルロン酸ナトリウム、特に0.6％w/vのヒアルロン酸ナトリウムを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の人工硝子体液組成物。
【請求項６】
アスコルビン酸を含まない、請求項1〜5のいずれか一項に記載の人工硝子体液組成物。
【請求項７】
以下の段階を含む、特に請求項3〜6のいずれか一項に記載の人工硝子体液組成物を製造するための方法：
（i）水中のグルコース、クレアチニン、乳酸ナトリウム、グルタチオン、および尿素のストック溶液、ギ酸：水 2：1比のヒポキサンチンのストック溶液、ならびに1M NaOH中のキサンチンナトリウムのストック溶液を供給する段階；
（ii）段階（i）のストック溶液を、7.0〜7.7、特に7.1〜7.6、より詳細には7.2〜7.5の範囲内のpH値、最も詳細には7.4のpH値を有するリン酸緩衝液中で混合して、該リン酸緩衝液のpH値にpH調整する段階；
（iii）ヒアルロン酸を段階（ii）で得られた混合物に添加して、2〜8℃で少なくとも4時間撹拌する段階；
（iv）II型コラーゲンを段階（iii）で得られた混合物に添加する段階；
（v）任意で、段階（iv）で得られた混合物を滅菌ろ過する段階。
【請求項８】
以下の段階を含む、物質の挙動を分析するための方法：
（i）請求項1〜6のいずれか一項に記載の人工硝子体液組成物をインビトロ環境において供給する段階；
（ii）該物質を人工硝子体液に適用する段階；および
（iii）適用された該物質の少なくとも1つの特性を測定する段階。
【請求項９】
適用される前記物質が、巨大分子、薬物製剤、賦形剤、タンパク質、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
適用される前記物質が、100Da〜1800kDaの範囲内、特に1kDa〜500kDa、より詳細には4kDa〜200kDaの範囲内のサイズを有する分子を含む、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
適用された前記物質の前記少なくとも1つの特性が、安定性、生物学的利用能、DDSシステムからの放出、およびDDSシステムの分解からなる群より選択される、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
段階（iii）の前に、適用された前記物質を、最大360日間、特に最大180日間、より詳細には最大90日間、前記人工硝子体液組成物中の状態にしておく、請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
以下の段階を含む、人工体液組成物の挙動を分析するための方法：
（i）請求項1〜6のいずれか一項に記載の人工硝子体液組成物をインビトロ環境において供給する段階；
（ii）物質を人工硝子体液に適用する段階；および
（iii）該人工体液組成物の少なくとも1つの特性を測定する段階。
【請求項１４】
請求項7に記載の方法により製造された、請求項1〜6のいずれか一項に記載の人工硝子体液組成物。
【請求項１５】
（A）7.0〜7.7、特に7.1〜7.6、より詳細には7.2〜7.5の範囲内のpH値、最も詳細には7.4のpH値を有する、リン酸緩衝液、特にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）；
（B）クレアチニン、グルコース、尿素、キサンチン、ヒポキサンチン、乳酸ナトリウム、グルタチオンからなる群より選択される少なくとも1つ；
（C）II型コラーゲンおよび/またはヒアルロン酸ナトリウム；ならびに任意で
（D）使用説明書
を含む、特に請求項1〜6のいずれか一項に記載の人工硝子体液組成物を製造するためのキットオブパーツ。
【請求項１６】
請求項8〜12のいずれか一項に記載の人工硝子体液組成物中の物質の挙動を分析するための方法における、および/または請求項13に記載の人工体液組成物の挙動を分析するための方法における、請求項1〜6のいずれか一項に記載の人工硝子体液組成物の使用。
【請求項１７】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の人工硝子体液組成物を製造するための、7.0〜7.7、特に7.1〜7.6、より詳細には7.2〜7.5の範囲内のpH値を有するリン酸緩衝生理食塩水の使用。
【請求項１８】
本明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、人工硝子体液組成物、人工体液の製造のための方法、物質の挙動を分析するための方法、およびキットオブパーツに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
黄斑変性症、または糖尿病性網膜症などの網膜疾患の治療において、薬物の硝子体内注射は成功している。硝子体内注射では、硝子体液（VH）中に、すなわち、例えばヒトの、眼球の水晶体と網膜の間の空間を満たしている透明なゲル中に、薬物製剤が直接注入される。網膜に到達する未変化薬物の投与量の割合が高いため、通常硝子体内注射は高い生物学的利用能を有する。
【０００３】
しかしながら、VH中の薬物製剤の安定性などを試験するためのインビトロ試験は、真のインビボ条件をシミュレートする場合にほとんど役に立たないことが分かっている。VHは、その天然環境にない場合、急速に変性し、VH中の変性産物の蓄積のためにVHのpH値が急激に上昇することがある。それゆえ、試験は、生きている対象者の眼の実際の状況を、特に長期間、例えば数日間にわたって、表していない可能性がある。より進歩した試験システムでは、緩衝系を適用することによってVHの生理学的pH値を安定化することができる。そこでは、変性産物をVHから半透膜を通って緩衝溶液へと向かわせることが可能である。
【０００４】
薬物製剤または薬物負荷長時間作用型送達（DDS）システム（E.P. Holowka, S.K. Bhatia, Controlled release systems, Drug Delivery: Materials Design and Clinical Perspective, Chapter-2, Springer Science Business Media, New York, 2014, ISBN: 978-1-4939-1997-0, 7-62（非特許文献1））の硝子体内（IVT）注射の後、治療薬はVHにとどまり、かなり長期間にわたって生理学的pHおよび温度にさらされる。したがって、生理学的条件でのVH中のこれらの薬剤の安定性を研究することは最も興味を引くことである。天然ヒトVHの物理的および化学的変動は病状および年齢が原因となり、それらは安定性の予測に直接的な影響を与える可能性がある。動物（例えば、ウサギ、ブタ、サル）由来のVHを使用する場合には、著しい生物学的種内および種間変動が、例えば粘度および/または密度の変動に関して、認められる。
【０００５】
天然VHは、緩衝系、低分子量成分（例えば、塩およびイオン）、ならびにマトリックス形成ポリマー（例えば、コラーゲンおよびヒアルロン酸）に大きく分類することができる、様々な大小の無機および有機分子で構成されることが公知である。詳しくは、天然VHは主に水で構成されている（98〜99％）。残りの成分（1〜2％）は、主にコラーゲン、ヒアルロン酸、タンパク質、および低分子量成分、例えば、アスコルビン酸、グルタチオン、グルコース、乳酸、キサンチン、ヒポキサンチン、クレアチニン、尿素などであり、Kleinberg et al. (Vitreous substitutes: a comprehensive review, Surv Ophthalmol. 2011 Jul-Aug;56(4): 300-23)（非特許文献2）およびAmith Mulla (Role of vitreous humor biochemistry in forensic pathology, University of Saskatchewan, Thesis, 2005)（非特許文献3）に開示されている。
【０００６】
人工硝子体液（aVH）を開発することによって前述の課題を解決することが必要であり、このaVHは、物理的および化学的パラメータに対してより良い制御を提供することができ、かつ調査のロバスト性を向上させる。これは独立請求項の特徴によって実現される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】E.P. Holowka, S.K. Bhatia, Controlled release systems, Drug Delivery: Materials Design and Clinical Perspective, Chapter-2, Springer Science Business Media, New York, 2014, ISBN: 978-1-4939-1997-0, 7-62
【非特許文献２】Kleinberg et al., Vitreous substitutes: a comprehensive review, Surv Ophthalmol. 2011 Jul-Aug;56(4): 300-23
【非特許文献３】Amith Mulla, Role of vitreous humor biochemistry in forensic pathology, University of Saskatchewan, Thesis, 2005
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、緩衝系、低分子量（SMW）成分、および高分子量（LMW）成分、例えばマトリックス形成ポリマーを含む、aVHの新規組成物を評価した。これはその後、薬物または薬物製剤の安定性、およびIVT送達後のDDSシステムからの薬物放出挙動を予測するためのインビトロモデルとして使用することができる。この新規aVHは、安定性および放出予測のための、最もシンプルでありながら非常に効率のよいリアルタイムのインビトロ実験媒体であると分かるだろう。それゆえ、本明細書に記載の新規aVH組成物は、研究ツールとしてだけでなく、品質管理ツールとしても役に立つ可能性がある。
【０００９】
本発明の第1の局面によれば、リン酸緩衝液を含む人工硝子体液組成物が提供される。リン酸緩衝液は、7.0〜7.7、特に7.1〜7.6、より詳細には7.2〜7.5の範囲内のpH値を有する。最も詳細には、リン酸緩衝液のpH値は7.4である。リン酸緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、Tweenを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBST）、Tweenとアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBSTN）、およびアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBSN）からなる群より選択することができる。
【００１０】
リン酸緩衝液はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）であり得る。リン酸緩衝生理食塩水は、特に0.001〜0.2M、より詳細には0.003〜0.05M、最も詳細には0.005〜0.02Mの範囲内であり得る。リン酸緩衝生理食塩水は、好ましくは7.4のpH値を有する。本発明による好ましい緩衝液は、8g/LのNaCl、0.2g/LのKCl、1.44g/LのNa2HPO4、および0.24g/LのKH2PO4を含む0.01M PBS、pH7.4である。
【００１１】
人工硝子体液組成物は少なくとも1つの低分子量成分を含むことができる。低分子量成分は、クレアチニン、グルコース、尿素、キサンチン、ヒポキサンチン、乳酸ナトリウム、およびグルタチオンからなる群より選択され得る。人工硝子体液組成物は、最大578μMのクレアチニン、最大28.1mMのグルコース、最大58.5mMの尿素、200〜1630μMのキサンチン、100〜800μMのヒポキサンチン、0.1〜23mMの乳酸ナトリウム、50〜300μMのグルタチオンを含むことができる。好ましい態様では、人工硝子体液組成物は、64.6μMのクレアチニン、2.2mMのグルコース、7.6mMの尿素、580μMのキサンチン、309μMのヒポキサンチン、10.5mMの乳酸ナトリウム、および200μMのグルタチオンを含む。
【００１２】
さらに、人工硝子体液組成物は、20〜300mg/LのII型コラーゲンおよび/または0.03〜0.9％w/vのヒアルロン酸ナトリウムを含み得る。コラーゲンおよび/またはヒアルロン酸ナトリウムは、人工硝子体液中でマトリックス形成成分としての役割を果たす。本発明の好ましい態様では、人工硝子体液組成物は40mg/LのII型コラーゲンおよび/または0.6％w/vのヒアルロン酸ナトリウムを含む。
【００１３】
人工硝子体液組成物はアスコルビン酸を含まなくてもよい。
【００１４】
本発明のさらなる局面は、好ましくは本明細書に記載される、人工硝子体液組成物の製造のための方法に関する。この方法は、水中のグルコース、クレアチニン、乳酸ナトリウム、グルタチオン、および尿素のストック溶液、ギ酸：水 2：1比のヒポキサンチンのストック溶液、ならびに1M NaOH中のキサンチンナトリウムのストック溶液を供給する段階（i）を含む。この方法はさらに、段階（i）のストック溶液を、7.0〜7.7、特に7.1〜7.6、より詳細には7.2〜7.5の範囲内のpH値、最も詳細には7.4のpH値を有するリン酸緩衝液中で混合して、該リン酸緩衝液のpH値にpH調整する段階（ii）を含む。好ましくは、混合は、該混合物を絶えず撹拌しながら行う。段階（iii）では、ヒアルロン酸を段階（iii）で得られた混合物に添加して、該混合物を2〜8℃で少なくとも4時間撹拌する。特に、ヒアルロン酸が完全に溶解するまで該混合物を撹拌する。この方法はさらに、II型コラーゲンを、好ましくは絶えず撹拌しながら、段階（iii）で得られた混合物に添加する段階（iv）を含む。任意で、段階（iv）で得られた混合物を滅菌ろ過する。
【００１５】
リン酸緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、Tweenを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBST）、Tweenとアジ化ナトリウムとを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBSTN）、およびアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBSN）からなる群より選択することができる。リン酸緩衝液はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）であり得る。リン酸緩衝生理食塩水は、特に0.001〜0.2M、より詳細には0.003〜0.05M、最も詳細には0.005〜0.02Mの範囲内であり得る。リン酸緩衝生理食塩水は、好ましくは7.4のpH値を有する。本発明による好ましい緩衝液は、8g/LのNaCl、0.2g/LのKCl、1.44g/LのNa2HPO4、および0.24g/LのKH2PO4を含む0.01M PBS、pH7.4である。
【００１６】
人工硝子体液組成物は少なくとも1つの低分子量成分を含むことができる。低分子量成分は、クレアチニン、グルコース、尿素、キサンチン、ヒポキサンチン、乳酸ナトリウム、およびグルタチオンからなる群より選択され得る。好ましい態様では、aVH組成物は、64.6μMのクレアチニン、2.2mMのグルコース、7.6mMの尿素、580μMのキサンチン、309μMのヒポキサンチン、10.5mMの乳酸ナトリウム、および200μMのグルタチオンを含む。さらに、人工硝子体液組成物は、20〜300mg/LのII型コラーゲンおよび/または0.03〜0.9％w/vのヒアルロン酸ナトリウムを含み得る。コラーゲンおよび/またはヒアルロン酸ナトリウムは、人工硝子体液中でマトリックス形成成分としての役割を果たす。本発明の好ましい態様では、人工硝子体液組成物は40mg/LのII型コラーゲンおよび/または0.6％w/vのヒアルロン酸ナトリウムを含む。本発明の好ましい態様では、人工硝子体液組成物は40mg/LのII型コラーゲンと0.6％w/vのヒアルロン酸ナトリウムを含む。人工硝子体液組成物はアスコルビン酸を含まなくてもよい。
【００１７】
本発明のさらなる局面は、好ましくは本明細書に記載される、人工硝子体液組成物に適用された物質の挙動を分析するための方法に関する。この方法は、好ましくは本明細書に記載される人工硝子体液組成物をインビトロ環境において供給する段階（i）を含む。本発明によるインビトロ環境は、バイアル、好ましくはガラスバイアルまたはプラスチックバイアル、ウェル、容器、くぼみのある皿、エクスビボ硝子体内（ExVit）モデル（Patel et al., Evaluation of protein drug stability with vitreous humor in a novel ex-vivo intraocular model, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2017; 112:117-186に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、および特別に設計されたガラスまたはプラスチックデバイスであり得る。この方法はさらに、分析される物質を該人工硝子体液に適用する段階（ii）を含む。この物質は人工硝子体液組成物に投与され得る。特に、該物質は、人工硝子体液組成物に注射されても、または人工硝子体液組成物の中に拡散されても、または長時間作用型の徐放性送達（DDS）システムから人工硝子体液組成物に放出されてもよい。さらに、この方法は、適用された物質の少なくとも1つの特性を測定する段階（iii）を含む。適用される物質の特性は硝子体液に適用する前に既知であるので、人工硝子体液への適用前と適用後の該物質の特性の比較が可能であり；例えば、aVH中に存在するときの適用された物質の安定性、生物学的利用能、DDSシステムからの放出、およびaVH内のDDSシステムの分解（Blanco et al., Protein encapsulation and release from poly(lactide-co-glycolide) microspheres: effect of the protein and polymer properties and of the co-encapsulation of surfactants, European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics. 1998 May;45(3): 285-94）を分析するために、そのような比較が可能である。該物質の特性は、直ちにおよび/または特性の経時的変化を追跡するために間隔をおいて、測定することができる。
【００１８】
適用される物質は、巨大分子、タンパク質、例えば抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、薬物製剤、賦形剤、小分子、薬物送達システム（生分解性および非生分解性）、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つであり得る。しかしながら、物質という用語は、前述の例に限定されると理解されるべきではない。
【００１９】
適用される物質は、100Da〜1800kDaの範囲内、特に1kDa〜500kDa、より詳細には4kDa〜200kDa、最も詳細には10kDa〜175kDaの範囲内のサイズを有する分子を含み得る。
【００２０】
適用された物質の少なくとも1つの特性は、安定性、生物学的利用能、DDSシステムからの放出、およびDDSシステムの分解からなる群より選択される。
【００２１】
段階（iii）の前に、適用された物質を、最大360日間、特に最大180日間、よりに詳細には最大90日間、人工硝子体液組成物中の状態にしておいてもよい。ただし、先に述べたように、該物質の特性の経時的変化を追跡するために間隔をおいて、その特性を測定することができる。その後、段階（iii）により、少なくとも1つの特性の最後の測定時間が定められる。人工硝子体液は、段階（iii）の前に一定の温度に維持され、特に32〜38℃、より詳細には35〜37℃、最も詳細には36〜37℃の範囲内の温度に維持され得る。
【００２２】
本発明のさらなる局面は、本明細書に記載される人工体液組成物の挙動を分析するための方法に関し、その場合には、ある物質が該人工体液組成物に適用される。この方法は、好ましくは本明細書に記載される人工硝子体液組成物をインビトロ環境において供給する段階（i）を含む。本発明によるインビトロ環境は、バイアル、好ましくはガラスバイアルまたはプラスチックバイアル、ウェル、容器、くぼみのある皿、エクスビボ硝子体内（ExVit）モデル（Patel et al., Evaluation of protein drug stability with vitreous humor in a novel ex-vivo intraocular model, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2017; 112:117-186に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、および特別に設計されたガラスまたはプラスチックデバイスであり得る。この方法はさらに、ある物質を人工硝子体液に適用する段階（ii）を含む。この物質は人工硝子体液組成物に投与され得る。特に、該物質は、人工硝子体液組成物に注射されても、または人工硝子体液組成物の中に拡散されても、または長時間作用型の徐放性送達（DDS）システムから人工硝子体液組成物に放出されてもよい。さらに、この方法は、該人工体液組成物の少なくとも1つの特性を測定する段階（iii）を含む。人工体液組成物の特性は該物質を適用する前に既知であるので、該物質の適用前と適用後の人工体液組成物の特性の比較が可能であり；例えば、該物質が存在するときの人工体液組成物の安定性および/または粘度を分析するために、そのような比較が可能である。一般に、この方法は、適用された物質を考慮して人工体液組成物の耐容性を評価することを、特に粘度、濁度、浸透圧からなる群の少なくとも1つの変化を測定することによって、可能にする。人工体液組成物の特性は、直ちにおよび/または特性の経時的変化を追跡するために間隔をおいて、測定することができる。適用される物質は、巨大分子、タンパク質、例えば抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、薬物製剤、賦形剤、小分子、薬物送達システム（生分解性および非生分解性）、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つであり得る。しかしながら、物質という用語は、前述の例に限定されると理解されるべきではない。適用される物質は、100Da〜1800kDaの範囲内、特に1kDa〜500kDa、より詳細には4kDa〜200kDa、最も詳細には10kDa〜175kDaの範囲内のサイズを有する分子を含み得る。段階（iii）の前に、適用された物質を、最大360日間、特に最大180日間、より詳細には最大90日間、人工硝子体液組成物中の状態にしておいてもよい。ただし、先に述べたように、人工体液組成物の特性の経時的変化を追跡するために間隔をおいて、その特性を測定することができる。その後、段階（iii）により、少なくとも1つの特性の最後の測定時間が定められる。人工硝子体液は、段階（iii）の前に一定の温度に維持され、特に32〜38℃、より詳細には35〜37℃、最も詳細には36〜37℃の範囲内の温度に維持され得る。
【００２３】
本発明のさらなる局面は、本明細書に記載される人工体液中の物質の挙動および/または本明細書に記載される人工体液組成物の挙動を分析するための方法に関する。
【００２４】
本発明のさらなる局面は、本明細書に記載される製造方法により製造された、本明細書に記載される人工硝子体液組成物に関する。
【００２５】
本発明のさらなる局面は、特に本明細書に記載される、人工硝子体液組成物を製造するためのキットオブパーツに関する。キットオブパーツはいくつかの成分で構成される。成分（A）は、リン酸緩衝液、特にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、より詳細には0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）であり、そのpH値が7.0〜7.7、特に7.1〜7.6、より詳細には7.2〜7.5の範囲内、最も詳細には7.4のpH値である。成分（B）は、クレアチニン、グルコース、尿素、キサンチン、ヒポキサンチン、乳酸ナトリウム、グルタチオンからなる群より選択される少なくとも1つを含む。好ましくは、成分（B）は、クレアチニン、グルコース、尿素、キサンチン、ヒポキサンチン、乳酸ナトリウム、グルタチオンの混合物を含むか、または成分（B）は、（B1）クレアチニン、（B2）グルコース、（B3）尿素、（B4）キサンチン、（B5）ヒポキサンチン、（B6）乳酸ナトリウム、および（B7）グルタチオンと呼ばれる成分の選択物である。成分（C）は、II型コラーゲンおよび/またはヒアルロン酸ナトリウムを含む。好ましくは、成分（C）は、（C1）II型コラーゲンおよび（C2）ヒアルロン酸ナトリウムと呼ばれる成分の選択物である。任意の成分（D）は使用説明書である。
【００２６】
本発明のさらなる局面は、本明細書に記載される人工体液組成物中の物質の挙動を分析するための方法における、本明細書に記載の人工硝子体液組成物の使用に関する。本発明のさらなる局面は、ある物質が人工硝子体液組成物に適用される場合の、人工硝子体液組成物の挙動を分析するための方法における、本明細書に記載の人工硝子体液組成物の使用に関する。本発明のさらなる局面は、本明細書に記載される人工組成物中の物質の挙動を分析するための方法における、および/またはある物質が本明細書に記載される人工体液組成物に適用される場合の人工体液組成物の挙動を分析するための方法における、本明細書に記載の人工体液組成物の使用に関する。
【００２７】
本発明のさらなる局面は、本明細書に記載の人工硝子体液組成物を製造するための、7.0〜7.7、特に7.1〜7.6、より詳細には7.2〜7.5の範囲内のpH値、最も詳細には7.4のpH値を有するリン酸緩衝生理食塩水の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】37℃で1週間インキュベートした後の、異なる緩衝強度で調製された3種類の模擬緩衝媒体（simulated buffer medium：SBM）中の還元型アスコルビン酸の量に相関する吸光度分析。
【図２】分離されたブタ硝子体液の粘度の測定。
【図３】図3aおよび3b：天然VHと人工VH中のタンパク質の安定性を比較するために用いられるExVitモデル（図3a）、および人工VH中のタンパク質の安定性を調べるために使用されるバイアルベースのモデル（図3b）の図形表示。
【図４】図4aおよび4b：37℃でインキュベートした後のモノクローナル抗体（mAb）を含むまたは含まないExVitモデルまたはバイアルモデルにおけるPBSおよび硝子体液（aVHおよびpVH）のpH（図4a）と浸透圧（図4b）の分析（実験を3つ組で実施し、結果を平均値±標準偏差で報告する）。
【図５】37℃でインキュベートした後のmAbを含むまたは含まないExVitモデルまたはバイアルモデルにおけるPBSおよび硝子体液（aVHおよびpVH）の濁度の分析（実験を3つ組で実施し、結果を平均値±標準偏差で報告する）。
【図６】図6aおよび6b：aVH（ExVitまたはバイアルモデル）、pVH、およびPBS中のmAbの物理的安定性をSECで調べた。図6aはメインピークを表す。図6bは高分子量種（HMWS、％）を表す（実験を3つ組で実施し、結果を平均値±標準偏差で報告する）。
【図７】図7aおよび7b：aVH（ExVitまたはバイアルモデル）、pVH、およびPBS中のmAbの物理的安定性をCE-SDS-NGSで調べた。図7aはメインピークを表す。図7bは脱グリコシル化された変種を表す（面積％）。
【図８】図8aおよび8b：mAbの結合親和性。図8aは抗原-1に対する結合親和性を表す。図8bは、aVH（ExVitまたはバイアルモデル）中およびpVH中でインキュベートした後の安定性サンプルから回収された抗原-2に対する結合親和性を表す。
【図９】様々なPLGAベースのLAD硝子体内インプラントからの小分子（SM）医薬有効成分（API）の累積放出（％）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の態様の詳細な説明
I. 定義
本出願で使用する「硝子体液」は、天然または人工の供給源に由来し得る。天然の硝子体液は、様々な動物種、例えば、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ウサギ、および非ヒト霊長類に由来しても、またはヒトのものでもよい。ブタの硝子体液は、本明細書ではpVHと略記される。天然の硝子体液は、例えば、あらかじめ摘出された眼から得ることができる。
【００３０】
人工硝子体液は、ヒトの硝子体液を模倣することが好ましい。人工硝子体液は、高分子量（LMW）成分またはマトリックス形成成分とも呼ばれる様々なポリマー材料から調製することができ、例えば、ヒアルロン酸、アルギン酸、寒天、キトサン、ゼラチン、キサンタンガム、ペクチン、コラーゲンなどであるがこれらに限定されない天然ポリマー、またはプルロニックゲル、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、PEG、PCL、PLA、PGA、PLGAから構成される二量体、三量体、または多量体のゲル化ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸などであるがこれらに限定されない合成ポリマー、ならびに異なる濃度でのこれらのポリマーの組み合わせから調製される。LMW成分、特にヒアルロン酸の量は、最終的なaVH組成物の規定の粘度を達成するように選択され得る。人工硝子体液は低分子量（SMW）成分をさらに含んでもよい。こうした低分子量成分は、窒素含有有機酸、糖、尿素などの還元剤、プリン塩基またはその誘導体、乳酸の塩、およびグルタチオンなどの酸化防止剤を含む群から選択することができる。
【００３１】
硝子体液はまた、人工および天然硝子体液または異なる組み合わせでのそれらの成分の混合物であり得る。
【００３２】
「緩衝溶液」は、好ましくは前記システムのpH値を有するかまたは該pH値を、例えばpH5.5〜pH8.5、好ましくは約pH7.0〜約pH7.6、より好ましくはpH7.4に維持することができる溶液である。「生理学的に適切な緩衝溶液」は、好ましくは該システムのpH値を有するか、または該pH値を約pH7.0〜約pH7.6、より好ましくはpH7.2〜7.4に維持することができる溶液である。緩衝溶液は塩類を含むことが好ましい。緩衝溶液は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、重炭酸塩緩衝液、リンゲル重炭酸塩緩衝液、リンゲル乳酸緩衝液、模擬体液、他の等張溶液、細胞培養培地、および他の生理学的に代表的な緩衝液であり得る。
【００３３】
本発明によるPBSは、8g/LのNaCl、0.2g/LのKCl、1.44g/LのNa2HPO4、および0.24g/LのKH2PO4を含み得る。PBSのpH値は7.4であることが好ましい。
【００３４】
「物質の挙動」という用語は、本発明による人工硝子体液または人工体液組成物に適用された場合の物質の特性の変化に関連する。物質の特性の変化は、（a）化学的または物理的変化、（b）標的へのその結合の変化、（c）ある多形体から別の多形体への変換、（d）物理的状態の変化、例えば液体からゲルへの変化、であり得る。物質は、2つまたはそれ以上の治療薬、賦形剤、製剤（単純もしくは徐放性）、またはプラセボ（単純、もしくは徐放性製剤のプラセボ）であり得る。人工VH（aVH）の組成は、天然VHのインビボ生理学的状態をシミュレートすることを可能にする。例えば、薬物製剤を硝子体液の中に注射すると、ヒトだけでなく動物の眼についても、該製剤の安定性およびDDSからの放出をシミュレートすることができる。例えば、後方の眼組織の様々な眼の状態（加齢によりまたは疾患により、多かれ少なかれ変性した眼に対応する）において、各種タンパク質の異なる拡散および沈殿挙動を試験することができる。これらの状態は、本発明によるaVHおよび物質の挙動を分析するための方法を用いて、aVHの特性、例えば組成および/または密度および/または粘度を変えることによってシミュレートし、試験することができる。さらに、注入位置に存在する物理的および化学的環境を考慮することによって、特にタンパク質または薬物製剤などの物質の安定性とDDSからの放出に関して、より現実的な試験結果を得ることができる。したがって、本発明による人工硝子体液および前記方法は、天然の環境、好ましくは眼の環境のジオメトリーをより現実的にシミュレートすることを可能にする。
【００３５】
「人工体液組成物の挙動」という用語は、本発明による人工硝子体液に物質が適用される場合の、人工体液組成物の特性の変化に関連する。人工体液組成物の特性の変化は、特に化学的または物理的変化、および/または物理的状態の変化、例えばゲルから液体への変化であり得る。
【実施例】
【００３６】
II. 実施例
材料
ブタの眼は、スイスのチューリッヒ近くにある地元の食肉処理場から入手した。特注の水平拡散チャンバー（side-by-side diffusion chamber）は、SES GmbH-Analytical Systems（Bechenheim、ドイツ）から購入した。50kDaの分子量カットオフ（MWCO）の拡散制御膜（カタログ番号131384）は、Spectrum lab（カリフォルニア州、米国）から調達した。コラーゲン（II型）（カタログ番号804001-sol）およびヒアルロン酸ナトリウム（カタログ番号HA15M）は、それぞれmdbioproductsおよびLifecore Biomedical社から購入した。L-アスコルビン酸（カタログ番号A5960）、キサンチンナトリウム塩（カタログ番号X3627）、ヒポキサンチン（カタログ番号H9636）、クレアチニン（カタログ番号C4255）、尿素（カタログ番号51457）、グルコース（カタログ番号G8270）、L-グルタチオン（カタログ番号G4251）および乳酸ナトリウム（カタログ番号71718）は、米国Sigma Aldrich社から調達した。二重特異性モノクローナル抗体（mAb）はCHO細胞株で作製されて、バーゼルのF.Hoffmann-La Roche AGにより提供された。そのmAbは、IgG-1フォーマットに基づく完全長のヒト化mAbであり、約150kDaの分子量を有する。mAbは、それぞれ等張性および安定性をもたらすように、糖と界面活性剤を含むヒスチジン緩衝液（20mM、pH6.0）中に製剤化した。分子量＜600ダルトンおよびLogP 3.24の小分子は、バーゼルのF. Hoffmann-La Roche AGにより提供された。PLGAポリマーは、米国ParsippanyのEvonik社から調達した（RG756S PL(DL)GA 75：25およびRG753H PL(DL)GA 75：25）。ExVitモデルに関連する全ての実験では、リン酸緩衝生理食塩水（0.01M PBS、pH7.4）を緩衝液区画で使用した。これらの研究で使用した他の全ての試薬は分析グレードのものであった。
【００３７】
実施例1
模擬緩衝媒体（SBM）の開発
天然のVHは、マトリックス形成ポリマーなどの、少量の有機および無機成分を含む、主に水から構成された液体組織である。VHの組成は文献に報告されている。人工VH（aVH）を調製するには、第一に、aVHの物理化学的安定性をサポートし得る基本の緩衝系を同定することが重要であった。第二に、文献に報告された既定の濃度で天然VHの全ての低分子量成分を含む模擬緩衝媒体（SBM）を調製することが重要であった。最後に、天然VHの固有の成分であるマトリックス形成ポリマー、すなわちヒアルロン酸とコラーゲンの存在下でSBMを調製した。その後、aVHを37℃で3ヶ月間貯蔵することによりaVHの安定性を評価した。
【００３８】
適切な緩衝系を同定するために、生理学的pHをサポートする2つの生物学的に適切な緩衝系、例えばクレブス-リンゲル重炭酸塩緩衝液およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を調べた。緩衝系の組成を表1および表2に示す。
【００３９】
（表１）重炭酸塩緩衝液の組成（改変クレブス-リンゲル緩衝液、pH7.4）
2021500310.tif 000003
【００４０】
（表２）リン酸緩衝生理食塩水の組成（PBS、0.01M、pH7.4）
2021500310.tif 000004
【００４１】
低分子量（SMW）成分のヒポキサンチン（309μM）、クレアチニン（64.6μM）、キサンチン（580μM）、アスコルビン酸（350μg/mL）、グルコース（2.2mM）、尿素（7.6mM）、乳酸ナトリウム（10.5mM）、およびグルタチオン（200μM）は、VHの重要な成分として文献に報告されている。それゆえ、SBMの調製にそれらを用いた。表3および表4に記載するように、重炭酸塩またはPBSベースの緩衝系に溶解した特定のSMW成分を含むまたは含まない、様々なSBMの組成物（組成物1〜17）を調製した。
【００４２】
（表３）クレブス-リンゲル重炭酸塩ベースの緩衝系を含む模擬緩衝媒体（SBM）の37℃での貯蔵安定性に対するSMW成分の影響
2021500310.tif 000005
【００４３】
（表４）リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4、0.01M）ベースの緩衝系を含む模擬緩衝媒体（SBM）の37℃での貯蔵安定性に対するSMW成分の影響
2021500310.tif 000006
【００４４】
これらのSBMを空気層流の下に0.22μフィルターで滅菌ろ過した。次に、37℃で7日間インキュベートすることにより、SBMの貯蔵安定性を調べた。pHと透明性を測定することにより、緩衝液の適合性を評価した。pHの評価のために、サンプル（100μL）を無菌的にエッペンドルフチューブに移し、校正したpHメーター（827 pH Lab、Metrohm社、スイス）で分析した。SBMの透明性は、肉眼で観察して、サンプルを透明または混濁として分類した。
【００４５】
表3では、クレブス-リンゲル重炭酸塩緩衝液を含む全ての試験組成物（1〜9）は、1週間のインキュベーション後に混濁およびpHに関する不安定性を示した。pHに関する不安定性は酸性へのシフトに関係している。これは、重炭酸塩ベースの緩衝系の弱い緩衝能力および/または緩衝系と低分子量成分との不適合性が原因であり得る。要約すると、主に混濁とpHシフトが原因で、クレブス-リンゲル重炭酸塩緩衝液を用いてSBMを開発することはできそうもない。
【００４６】
一方、PBSベースのSBM組成物10〜17は、37℃で7日間インキュベートした後でも透明のままであった（表4）。しかし、これらの組成物もまた、全てが7日後に酸性pHへのシフトを示した。
【００４７】
実施例2
SBMの安定性に対する、より高い緩衝強度、乳酸ナトリウム、ヒポキサンチン、およびアスコルビン酸の影響
安定した組成を見つけるために、乳酸ナトリウム、ヒポキサンチンおよびアスコルビン酸を含むまたは含まないSBM、ならびに緩衝強度がより高いSBMを調べた。表5に報告されるSBMを調製した。
【００４８】
（表５）模擬緩衝媒体（SBM）の37℃での貯蔵安定性に対する、緩衝強度ならびに乳酸ナトリウム、ヒポキサンチン、およびアスコルビン酸の存在/非存在の影響
2021500310.tif 000007
【００４９】
SBMを滅菌ろ過し、37℃で1週間インキュベートして、pHと透明性を分析した。サンプルを回収して、上記のように分析を行った。また、1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル（α,α-ジフェニル-β-ピクリルヒドラジル）（DPPH）アッセイを使用して、サンプル中の還元型アスコルビン酸の量を分析した。簡単に説明すると、100μLのアスコルビン酸標準品または試験サンプルを1900μLのDPPH溶液の存在下に37℃で30分間、暗所にてインキュベートした。次に、ブランクとしてのメタノールに対して、517nmでの光学密度（OD）の変化についてサンプルを分析した。アスコルビン酸の存在により、溶液の色が紫色から茶色がかった淡黄色に変化する。
【００５０】
表5に示したpHの結果は、より高い緩衝強度（組成物18〜20）がpHを維持するのに十分でなかったことを明確に示している。また、乳酸ナトリウムもしくはヒポキサンチンまたはその両方の非存在もまた、酸性pHへのシフトを防ぐことができなかった（組成物21〜27）。アスコルビン酸を含まないSBM組成物28〜30のみが、7日後に安定したpHを示した。さらに、図1のDPPHに示すように、アスコルビン酸を含むまたは含まないSBMは、517nmで同様のレベルの吸光度を示し、37℃で7日間インキュベートした後に還元型アスコルビン酸が存在しないことを示唆している。アスコルビン酸は7日未満で酸化されて、酸性側へのpHシフトをもたらす可能性がある。したがって、最終的なSBM組成物にはアスコルビン酸を含めなかった。
【００５１】
実施例3
SBMの長期安定性
SBMの組成物28がpHまたは透明性を変化させずに7日間安定であることが判明した時点で、それを37℃での長期貯蔵安定性についてさらに特徴付けた。簡単に説明すると、組成物28を調製して、LAFの下で無菌的にろ過した。次に、無菌SBMを6mL滅菌ガラスバイアル中に無菌的に移した。そのガラスバイアルを密封し、37℃で3ヶ月間インキュベートした。サンプルを、様々な時点で、例えば、初期、1週目、2週目、5週目、8週目、12週目などに回収して、pH、透明性、密度、粘度、および浸透圧について分析した。pHの評価のために、サンプル（100μL）を無菌的にエッペンドルフチューブに移し、校正したpHメーター（827 pH Lab、Metrohm社、スイス）で分析した。SBMの透明性は、肉眼で観察して、サンプルを透明または混濁として分類した。SBMの密度は、DMA 38（Anton Paar社）密度計を用いて20℃で評価した。サンプルの浸透圧は、0〜0.5オスモル/kgの範囲内で校正した浸透圧計（Osmomat 030 3P Cryoscopic Osmometer）を用いて、欧州薬局方（European Pharmacopoeia），浸透圧（Osmolality）、セクション2.2.35，欧州医薬品品質管理局（European Directorate for the Quality of Medicine）、ストラスブール、フランス、2017、pp. 59に従って評価した。校正後、50μLのサンプルを浸透圧計に入れて、浸透圧を評価した。粘度は、SV-1A振動式粘度計を用いて分析した。簡単に説明すると、2mLのサンプルをサンプルホルダーに移し、振動プレートがサンプルホルダーの底部または側壁に確実に触れないようにして、該プレートをサンプルに挿入した。粘度を測定し、ミリパスカル秒（mPa.S）で報告した。
【００５２】
（表６）37℃での模擬緩衝媒体（SBM）の長期貯蔵安定性
2021500310.tif 000008
【００５３】
表6に示したデータは、3ヶ月の研究期間中、SBMが安定したままであったことを示している。この調査の過程で、pH、透明性、密度、浸透圧、または粘度の変化は観察されなかった。したがって、より低いPBS強度の、アスコルビン酸を含まないSBM組成物（組成物28）が、aVHの開発に適したSBMとして選択された。
【００５４】
実施例4
天然硝子体液の粘度評価
研究/放出媒体（この場合はaVH）の粘度は、DDSシステムからの治療薬の放出速度に大きな影響を与えるであろう。したがって、aVHの粘度は天然VHに類似している必要がある。先に述べたように、VHは、それが眼の中にあるときには、加圧下でゲルのようにふるまう液体組織である。VHは、眼から分離されるとすぐに、主にコラーゲン線維の方位喪失（disorientation）のために液化する。VHの流動学的性質は、コラーゲン原線維の濃度と方位によって大きく影響される。通常、コラーゲン線維は、硝子体基底部から眼底（the back of the eye）に向かって特定の順序で配置されている（Le Goff et al., Adult vitreous structure and postnatal changes., Eye. 2008 Oct;22(10): 1214-22）。それゆえ、VHマトリックスの構造を損なうことなく、その場でVHの粘度を評価することが非常に重要である。分析手順が複雑であるため、天然VHの実際のインビボ粘度に関する具体的情報は用いることができない。ここでは、本発明者らは振動式粘度計を用いてその場で天然VHの粘度を評価した。そのため、この情報を使用して、適切な粘度を有するaVHを調製することができる。
【００５５】
摘出したばかりのブタの眼を、熱処理などのさらなる加工をせずに食肉処理場から調達した。輸送中、氷浴で保持された等張液中に眼を保存した。粘度測定の前に、眼を37℃で2時間維持した。インキュベーションの後、VHに接近するために眼を強膜（1×1cm）から切り開いた。振動プレートが底部または側壁に確実に触れないようにして、該プレートを眼の中に挿入した。また、コラーゲン線維の方位が全体的な粘度に与える影響を理解するために、振動プレートをコラーゲン線維に対して垂直または平行に配置して粘度を測定した。
【００５６】
図2に記載されるように、天然の、ここではブタの、VHは、プレートをコラーゲン線維に対して平行に配置したとき、71±43mPa.Sの粘度を示した。興味深いことに、プレートをコラーゲン線維に対して垂直に配置した場合、粘度は有意に異ならなかった（78±42mPa.S）。天然VHの粘度には（特定の方位の）コラーゲンと共にヒアルロン酸が主に関与しているため、これらの同じ成分をaVHにおける粘度増強剤と見なした。ヒアルロン酸溶液の濃度対粘度の結果（表7）に基づいて、aVHを調製するために0.6％w/vのHAを使用した。ここでは、異なる分子量のヒアルロン酸を異なる濃度で使用して、同様のaVH粘度を達成し得ることに留意することが重要である。
【００５７】
（表７）異なる濃度での平均分子量1.01〜1.8MDaのヒアルロン酸水溶液の粘度
2021500310.tif 000009
【００５８】
実施例5
SBMを用いた好ましい人工VHの調製
SBMの長期安定性が確保されたら、それを用いてaVHを調製した。簡単に説明すると、最適化されたSBMを前のセクションに記載したように調製し、その後、一定量のヒアルロン酸（HA）を添加して0.6％のHA-SBM溶液を調製した。2〜8℃で一晩撹拌することにより、SBM中にHAを可溶化した。翌日、II型コラーゲンをHA-SBM溶液に添加して、40mg/Lの最終コラーゲン濃度とした。得られたaVHを0.22μフィルターで無菌的にろ過した。aVHはさらなる使用まで2〜8℃で保存した。好ましいaVHの最終組成を表8に報告する。
【００５９】
（表８）好ましい人工硝子体液の組成
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【００６０】
実施例6
人工硝子体液（aVH）の貯蔵安定性
37℃での貯蔵安定性についてaVHを調べた。この研究では、3mLのaVHを6mL滅菌ガラス（タイプI）バイアル中に無菌的に移し、37℃で3ヶ月間インキュベートした。サンプルを、所定の時間間隔で、すなわち、初期、1週目、2週目、5週目、8週目および12週目に回収して、pH、浸透圧、密度、および粘度について分析した。本明細書に記載のプロトコールを用いて分析を行った。
【００６１】
（表９）37℃での人工VHの長期貯蔵安定性
2021500310.tif 000011
【００６２】
表9に記載されるように、全ての物理化学的パラメータは研究期間を通じて安定したままであった。3ヶ月の時点でほんのわずかな粘度の変化が観察されたが、これはHAポリマーの部分的分解による可能性がある。したがって、次の段階では、タンパク質の安定性を評価するためにaVHを天然VHと比較した。
【００６３】
aVHが37℃で3ヶ月間安定であることが判明したら、分子量が約150kDaの120mg/ml二重特異性モノクローナル抗体（mAb）50μlをaVHおよび天然VHに注射し、その安定性を調べた。天然VHとaVH中のmAbの安定性が同等であると判明した場合には、インビトロ/エクスビボ安定性および/または（DDS製剤からの）放出の調査のために、aVHを天然VHの代わりに使用し得ることが確認できるという仮説を立てた。
【００６４】
実施例7
aVH中および天然VH中のmAbの安定性（実験セットアップ）
Patel et al. (Evaluation of protein drug stability with vitreous humor in a novel ex-vivo intraocular model. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2015; 95(Pt B):407-17)およびPatel et al. (Evaluation of protein drug stability with vitreous humor in a novel ex-vivo intraocular model. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2017; 112:117-186)において、VHが眼から分離されるとすぐに、VHのpHが急速に（約pH8.5まで）上昇することが報告された。このアルカリ性pHへのシフトの理論的根拠は十分には理解されていないが、この文献は、分離時のVHの微小環境の急速な変化および/またはVHの変性産物の蓄積を指摘している。分離されたVHの高いpH値（約pH8.5）および高濃度の変性産物は、タンパク質の安定性に有害な影響を与える可能性があり、また、インビボ状況では起こらないmAbの分解を刺激して、この研究をアーチファクトに陥りやすくする可能性がある。現在、分離されたpVH中のタンパク質薬物または薬物送達システムの安定性を研究するために、開発された信頼できるツールは1つのみが利用可能であるにすぎない。前述のExVitモデルは、アルカリ性pHへのシフトとVH変性産物の生成に関連する問題をうまく解決している。aVHを安定性予測ツールとして確立するには、（ExVitおよびバイアルでの）aVHおよび（ExVitでの）分離された天然VHの比較研究を行うことが非常に重要である。それゆえ、3つの試験グループ、すなわち、（1）ExVitモデルを用いてaVH中でインキュベートしたタンパク質、（2）ExVitモデルを用いて分離されたブタVH（pVH）中でインキュベートしたタンパク質、および（3）閉鎖バイアルモデルにおいてaVH中でインキュベートしたタンパク質を研究した。
【００６５】
ブタ硝子体液（pVH）の分離
解剖用のナイフを用いて結膜の近くに切り込みを入れてブタの眼を開き、針なしの使い捨て注射器で透明なVHを収集した。次に、VHを0.22μmフィルターで滅菌ろ過して、微生物汚染および細胞破片を確実に除去した。VHで起こり得る代謝活動および変性または変化を避けるために、VHを-70℃以下で（分注して）保存した。VH分離の過程の間ずっと、眼球を氷浴内に保持した。全ての実験は、眼および視覚の研究での動物の使用に関する「視覚と眼科学研究協会会議」（Association of Research in Vision and Ophthalmology：ARVO）の声明に従って行った。
【００６６】
実験セットアップ
ExVitは、VH区画と緩衝液区画の2区画モデルである。図3aに示すように、2つの区画は、MWCOが50kDaの拡散制御膜によって分離されていた。緩衝液区画には常に滅菌PBS（0.01M、pH7.4）が満たされたのに対して、VH区画には無菌pVHまたは無菌aVHが満たされた。このデバイスを滅菌テフロンキャップで密閉し、37℃で一晩インキュベートした（MaxQ-4000インキュベーター、Thermo Scientific社）。インキュベーション後、緩衝液区画からのPBSを新鮮な滅菌PBS（37℃でプレインキュベートした）で置き換えた。同時に、50μL（120mg/mL）のmAbをVH区画に注射した。デバイスを密閉し、所定の時間間隔、すなわち、初期、2週目、4週目および8週目の間、37℃でインキュベートした。mAbを含まない、pVHまたはaVHを含有するVH区画を陰性対照と見なした。また、mAbの安定性に対するpH、温度およびPBSの影響を調べるために、50μLのmAbを含む、PBSで満たしたVH区画を対照として使用した。所定の時間間隔で、サンプルをVH区画から滅菌ガラスバイアルの中に無菌的に移した。このモデルの性能を、サンプルのpH、浸透圧、および総タンパク質濃度を測定することによって評価した。mAbの物理的安定性と結合親和性を調べるために、サンプルをさらに評価した。
【００６７】
バイアル内のaVHの実験セットアップ
2mLの滅菌ろ過したaVHを、滅菌した6mLガラスバイアルに無菌的に移した（図3b）。120mg/mLのmAb製剤25μLを試験サンプルに注射した一方で、mAbを含まないaVHを対照と見なした。バイアルを37℃でインキュベートし、サンプルを所定の時間間隔で、すなわち、初期、2週目、4週目、および8週目に回収した。mAbの安定性を評価するために、サンプルを様々な分析手法で分析した。
【００６８】
（表１０）2つの異なるモデル、すなわちExVitおよびバイアルにおいて天然VH中および人工VH中のmAbの安定性を調べるための研究設計
2021500310.tif 000012
【００６９】
実施例8
aVH中および天然VH中のmAbの安定性（モデル性能の評価）
ExVitモデルおよびバイアルモデルでmAbの存在下にaVHを調べることができることを確認することが重要であった。それを確認するために、試験グループA、B、およびC、ならびに対照グループA、B、C、およびD（表10による）を、37℃での長期インキュベーション後にpH、浸透圧および透明性の変化について調べた。pHを各時間間隔で調べた。簡単に説明すると、100μLのサンプルをExVitおよびバイアルモデルから、対照（pVHのみ、aVHのみ、および緩衝液＋mAb）および試験物（pVH＋mAb、aVH＋mAb）から回収した。前述のように、pHと浸透圧を分析した。pHおよび浸透圧の結果を、それぞれ、時間間隔に対するpH単位またはオスモル/kgとしてプロットした。
【００７０】
インビボでは、VHは常に生理学的pHに緩衝化されている。したがって、mAbの長期安定性を模倣するためには、aVHまたは天然VHのpHを生理学的値に維持することが非常に重要である。図4aに示したデータから、mAb製剤の添加後の全ての試験および対照サンプル（ExVitまたはバイアルモデル）のpH値は、2ヶ月の研究期間を通して安定したままであったことが明確に示される。さらに、研究期間全体を通して、aVHおよびpVHの浸透圧は0.31〜0.33オスモル/kgに維持された（図4b）。それは、mAb製剤がaVH/pVH内にそれらの浸透圧を変えることなく常に均一に分布していたことを示している。この研究では、aVHはバイアルだけでなくExVitモデルでも安定していることが判明した。そのため、aVH中で調べられたタンパク質の安定性を、分離されたpVHと比較することが可能である。
【００７１】
実施例9
aVH中および天然VH中のmAbの物理的安定性の評価
以下に示すように、様々な分析手法、例えば、顕微鏡法、比濁法、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）、およびキャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム-非ゲルふるい分け（capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate-non gel sieving：CE-SDS-NGS）によってmAbの物理的安定性についてサンプルを評価した。
【００７２】
不溶性粒子の顕微鏡評価
タンパク質は一般に、物理的、化学的、環境的ストレスに対して非常に感受性であり、可溶性および不溶性の粒子（大きな凝集体）を容易に生成することがある。不溶性粒子を評価するために、各時間間隔で、2mLのサンプルを滅菌FTUチューブに無菌的に移した。目に見える粒子の存在について顕微鏡（Keyence VHX-600デジタル顕微鏡）でサンプルを評価した。
【００７３】
比濁法
タンパク質の物理的安定性は比濁分析によっても予測することができる。2100AN濁度計（HACH）を用いて、所定の時点での対照および試験サンプルの濁度を測定した。機器を0.1〜150NTUの間で校正した。濁度を評価するために、各時間間隔で2mLのサンプルを滅菌FTUチューブに無菌的に移した。結果をFTU単位対時間としてプロットした（図5）。
【００７４】
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）
mAbの断片および可溶性凝集体のレベルは、UV-可視光検出器に連結されたサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を使用して評価した。このSEC法はmAbの評価のために社内で開発された。簡単に説明すると、50μLのサンプル（対照および試験サンプル）をTosch Bioscience社から入手した分離カラム（TSKゲル、G3000SWXL、7.8-300mm、5μ）に注入した。凝集体と断片の分離は、移動相として0.2Mリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて流速0.5mL/minで実施した。UV-可視光検出は、Waters-2489検出器（Water Corp. MA、米国）を用いて280nmで行った。Waters 2695 HPLC（Waters Corp. MA、米国）で分析を行い、Empower-2ソフトウェアを用いてデータを処理した。
【００７５】
キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム-非ゲルふるい分け（CE-SDS-NGS）
安定性サンプル中の可溶性凝集体および断片のレベルを、CE-SDS-NGSによってさらに確認した。CE-SDS-NGS分析は、Beckman Coulterキャピラリー電気泳動システム（Proteome Lab PA800）を用いて非還元条件下に実施した。キャピラリーを70psiで0.1mM NaOH（5分間）、0.1mM HCl（1分間）および脱イオン水（1分間）により洗浄した。SDS MWゲル緩衝液を50psiでキャピラリーにロードした。次に、非還元性のサンプルを動電学的に10kVで注入し、分析を15kVで実施した。32-Karatソフトウェアを用いてデータを処理した。メインピーク、凝集体、断片、軽鎖および重鎖の面積を計算し、結果をピーク面積（％）対時間としてプロットした。
【００７６】
試験サンプル中および対照サンプル中の粒子および不溶性凝集体の形成は、顕微鏡分析を使用して目に見える粒子の存在（顕微鏡評価および濁度）を観察することにより評価した。結果は、37℃で2ヶ月のインキュベーション後、試験または対照のいずれのグループにおいても目に見える粒子を示さなかった。また、50μLのmAb製剤を試験または対照サンプルに注入した場合、即時の沈殿または粒子形成は観察されなかった。それらの結果を濁度分析でさらに確認した（図5）ところ、試験グループの濁度の読み取り値は10 FTU未満のままであり、それらも対照と同程度であった。これは、aVH中でのmAbのインキュベーションの間に、目に見えるまたは肉眼不可視の凝集体が生成されなかったことを示唆している。
【００７７】
可溶性凝集体の形成は、実験的には証明されていないが、タンパク質薬物の安全性および/または有効性に影響を及ぼす可能性がある。図6aおよび6bのSECの結果は、試験BおよびCでの2ヶ月間のインキュベーション後、mAbのモノマー含有量に変化がないことを示している。これは、pVH中で（試験B）、さらにはバイアルでインキュベートしたときのaVH中でも（試験C）、mAbが高分子量種（HMWS、可溶性凝集体）および低分子量種（LMWS、断片）を生成しないことを示唆する興味深い知見である。他方、mAbをPBS中37℃で同じ時間インキュベートした場合（対照A）には、メインピークのかなりの損失（2.3％）が観察された。驚くべきことに、試験Aは、試験Cと比較したとき、2ヶ月の時点でメインピークのわずかな損失を示した。試験C（バイアルモデル）では、mAbは緩衝系としてaVH中に存在するPBSにのみさらされるが、試験A（ExVitモデル）では、mAbがさらに緩衝液区画に存在するPBSにもさらされる。このことは、試験Aで観察されたメインピークの損失が、試験Cと比較して、わずかに高いことを説明し得る。
【００７８】
37℃でPBSおよびVH中でインキュベートした後に、mAbの物理的安定性を評価し、かつ主にmAbの断片化を評価するために、CE-SDS-NGS分析を行った。図7に示した結果は、メインピーク面積の損失（図7a）と、同時に起こるより低分子量の脱グリコシル化変種の増加（図7b）を示している。メインピークの損失は対照Aグループで約25％であった。これは、試験Bで観察された損失（約7％）よりも約400％高かった。さらに、対照サンプルについてのLMWSの面積は、試験Bと比較して300％超増加した。SECで観察されたのと同様に、ExVitセットアップ（試験A）を用いてaVH中でインキュベートされたmAbは、バイアルセットアップ（試験C）を用いてaVH中でインキュベートされたmAbと比較して、メインピークのより高い損失とLMWSの増加を示した。さらに、試験AでのmAbの物理的安定性は対照Aにより類似しており、試験CでのmAbの物理的安定性は試験Bにより整合している。これは、SEC分析において観察された結果をさらに確認する。試験A、試験B、および試験Cで観察されたLMWSは同じような種類のものであり、これはインビボでのタンパク質安定性を予測するために天然VHの代わりにaVHを使用するという論拠をさらに支持することに留意することが重要である。
【００７９】
実施例10
aVH中および天然VH中のmAbの結合親和性の評価
mAb安定性サンプルとその標的抗原との特異的相互作用は、SPR-Biacore T100/T200機器（GE Healthcare社）を使用して評価した。mAbとその標的抗原との相互作用を評価するにあたって、デュアルバインディングSPRアッセイを実施した。このSPRアッセイは、全体が参照により本明細書に組み入れられる欧州薬局方（European Pharmacopoeia）、浸透圧（Osmolality）、セクション2.2.35、欧州医薬品品質管理局（European Directorate for the Quality of Medicine）、ストラスブール、フランス、2017、pp. 59に従って行った。捕捉用抗ヒトFab抗体（Human Fab Capture Kit、GE Healthcare社）を標準アミンカップリングによりBiacore CM5バイオセンサーチップ上に固定し、＞5000RUのカップリング密度を達成した。分析は、ランニングおよび希釈緩衝液としてPBS-T（0.05％ポリソルベート20を含むリン酸緩衝生理食塩水、pH7.4）を使用して、25℃、流速10μL/minで実施した。mAb安定性サンプル（aVH/pVH/PBSから抽出した）を様々な濃度（13.85/19.04/26.18/36.00μg/mL）で90秒間測定セルに注入した。抗原1を0.5μg/mLの濃度で60秒間注入し、続いて両方の（測定および参照）フローセルに2.5μg/mLの抗原2を60秒間注入し、両方の抗原の複合体安定性を30秒間モニタリングした。その後、10mMグリシン溶液pH2.1を30μg/mLの流量で60秒間注入することにより、チップ表面を再生した。捕捉されたmAbサンプルへの抗原の相対的結合レベルは、100％の活性を有すると定義された参照物質に対してmAbサンプルの捕捉レベルを正規化することによって調整した。それぞれの抗原に対する個々の結合ドメインの得られた相対活性を、インキュベーション時間に対してプロットした。
【００８０】
図8aおよび8bに示すように、mAbのそれぞれ抗原1（20％低下）および抗原2（10％低下）への結合親和性の有意な低下が、試験グループA、B、およびCで観察された。試験グループA、B、およびCではmAbの物理的安定性に差異が認められたが、結合親和性の低下はこれらのグループ間で有意な差がなかった。これは、抗体のCDRの化学的変化が抗原に対するその結合親和性に直接的な影響を及ぼすという事実による可能性がある。このmAbの化学的安定性は、pH、温度などの環境要因によって大きく影響される。安定性研究では、その研究期間を通じて全てのグループでpHと温度が一定していた。したがって、全てのグループにおけるmAbの化学的安定性は等しく影響を受ける可能性があり、結果としてmAbの結合親和性も同様に影響された。
【００８１】
実施例11
小分子（SM）医薬有効成分（API）を負荷したPLGAインプラントの調製およびaVH中の長時間作用型送達（LAD）インプラントからのAPIのインビトロ放出
これらのLADインプラントは、SM APIとしてのデキサメタゾンとマトリックス形成ポリマーとしてのPLGAで構成される市販品Ozurdexと同じように、ホットメルト押し出し法で製造される。SMを負荷した乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）インプラントは、社内ですでに確立されたホットメルト押し出しプロトコールを用いて調製した。簡単に説明すると、ホットメルト押し出しを用いて4つの異なるインプラント（F-1、F-2、F-3、およびF-4）を調製した。これらのインプラントは、ポリマーの種類（疎水性および末端キャップ）、ポリマーの分子量、および押し出し温度が異なっていた。インプラントの詳細な組成とプロセスパラメータを表11に示す。インプラントを調製するために、ポリマーとAPIを均一に混合して、2つの異なる温度（F-1とF-2では90℃、F-3では110℃）で押し出した。さらに、インプラントの品質に対する滅菌の影響を理解するために、電子線（E-beam）滅菌法を使用してF-3バッチの一部を滅菌した（F-4）。電子線滅菌は、25kGyの標準目標線量で、同時ビーム処理10MeV、20KW線形加速器Mevex（オタワ、カナダ）を使用して室温で実施した。その後、使用するまで全てのインプラントをすぐに2〜8℃で保存した。
【００８２】
（表１１）SMを負荷したPLGA LADインプラントの組成およびプロセスパラメータ
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【００８３】
これらのインプラントは、押し出し後のAPIの量、均一性、安定性などの種々の重要なパラメータについて、および重要なAPIの放出について特徴付けた。LADインプラントからのAPIのインビトロおよびインビボ放出は、複雑で相互依存的な製剤化およびプロセス変数によって影響を受けやすい。こうしたパラメータは、マトリックス形成ポリマー（ポリマーのMW、ポリマーの疎水性など）、および/またはAPI（疎水性、APIの物理的状態、例えば多形または塩形態）、および/またはプロセス（滅菌、押し出し温度など）に関連している可能性がある。APIの放出に対するこれらの変数の影響を把握するには、的確な放出媒体を選択することが非常に重要である。そのために、硝子体内投与を目的としたLADインプラントのための放出媒体として使用されるaVHの可能性が評価された。簡単に説明すると、5mgの上記の異なるインプラント（F-1〜F-4）を2mLのaVH中で37℃にて4週間インキュベートした。1、7、14、21、および28日間のインキュベーション後にサンプルを回収して、SMの定性的および定量的評価のためにHPLC法（自社開発）で分析した。図9に示すように、全てのインプラントは4週間後に異なるレベルのSM放出を示した。インプラントF-2は最速の分解性ポリマーで構成されていたため、他の全てのインプラントと比較して最も速い放出を示した。インプラントF-1およびF-3は、組成は同じであったが、異なる温度で押し出された。F-3はF-1と比較して大幅に高い放出を示した。この放出の違いは、F-3がAPIのTg（96℃）を超える温度で押し出されたという事実に起因し得る。より高い押し出し温度は、疎水性薬物とポリマーとの均一な混合を生じさせて、これが最終的にAPIのより速い放出につながった可能性がある。F-2はAPIのTgより低い温度で押し出されたため、APIは元の粒子の形態のままで存在し、ポリマーとの不均一な混合につながった可能性がある。APIは疎水性であるので、これらのAPI粒子はaVH中で非常に低い溶解と拡散に基づいた放出を示した可能性がある。興味深いことに、F-4はF-3と比較してかなり遅い放出を示した。電子線滅菌のプロセスにより、生分解性PLGAポリマーの構造が変化して、APIの放出が遅くなった可能性がある。
【００８４】
放出媒体としてのaVHが、その重要な品質特徴、すなわちAPIの放出、に基づいてインプラントを区別化することができたことに留意することは重要である。このaVHの実験により、様々な種類のポリマーの違いを見分けることが可能であり、さらに温度、滅菌などの処理プロセスによってもたらされる違いを把握することも明らかに可能である。言い換えれば、放出媒体としてのaVHは、異なって機能することが既知であるまたは少なくとも期待される、製剤を区別することができる。したがって、aVHは、（前の実施例で強調したように）製剤の安定性を調べるために使用できるだけでなく、LAD製剤からのAPIの放出を調べるためにも使用できる。さらに、本明細書で開示されるaVHは、LADインプラントからのAPI放出および/または薬物放出に関してインビボ条件をより良好に模倣することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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