(57)【要約】  本発明は、生物学的材料、特に食品の細菌汚染および分解（腐敗）の防止および改善のための製品および方法に関する。特に、本発明は、内腔を規定する材料のエンベロープを含む製品を提供し、該内腔は、表面に共有結合で付着したバクテリオファージを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内腔を規定する材料のエンベロープであって、該内腔が、表面に共有結合で付着したバクテリオファージを含む、エンベロープ。
【請求項２】
前記表面が前記エンベロープの内部である、請求項１に記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項３】
前記表面が前記内腔内にあるが、前記エンベロープから分離可能であるかまたは分離されている、請求項１に記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項４】
前記エンベロープが密封されている、前記請求項のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項５】
前記エンベロープが空にされていない、前記請求項のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項６】
前記内腔内の雰囲気が空気である、前記請求項のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項７】
前記製品が生物学的材料を含むためのものである、前記請求項のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項８】
前記生物学的材料が植物材料である、請求項７に記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項９】
前記製品が食品を含むためのものである、請求項１から８のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項１０】
前記食品がサラダである、請求項９に記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項１１】
前記食品が野菜である、請求項９に記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項１２】
前記食品が肉である、請求項９に記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項１３】
前記食品が鶏肉である、請求項９に記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項１４】
前記植物材料が食用ではない、請求項１から８のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項１５】
前記植物材料が１つまたはそれ以上の花である、請求項７、８、９または１４のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項１６】
前記バクテリオファージが、カンピロバクター、サルモネラ、シュードモナス、ペクトバクテリウムおよびシトロバクターの１つまたはそれ以上から選択される細菌に対して活性である、前記請求項のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項１７】
前記バクテリオファージがシュードモナス属、好ましくは緑膿菌の細菌に対して活性である、請求項１６に記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項１８】
前記バクテリオファージがシトロバクター属の細菌に対して活性である、請求項１６に記載の内腔を規定する材料のエンベロープ。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープを製造する方法であって、バクテリオファージを表面に共有結合で付着させる工程および該材料から該表面を囲む該内腔を形成する工程を含む、方法。
【請求項２０】
生物学的材料を包装する方法であって、請求項１から１８のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープの内腔内に該生物学的材料を密封する工程を含む、方法。
【請求項２１】
エンベロープの内腔内に密封された材料上の細菌の数を制御するための、請求項１から１８に記載の内腔を規定する材料のエンベロープの使用。
【請求項２２】
生物学的材料を保存するための、請求項２１に記載の請求項１から１８のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープの使用。
【請求項２３】
前記保存が一時的である、請求項２２に記載の請求項１から１８のいずれかに記載の内腔を規定する材料のエンベロープの使用。
【請求項２４】
請求項１から１８の内腔を規定する材料のエンベロープの内腔内に対象物を包装するためのシステムであって、該エンベロープの表面にバクテリオファージを共有結合で固定化するための装置および該エンベロープの該内腔内に該対象物を密封するための装置を含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的材料、特に食料品の細菌汚染および分解（腐敗）の予防および改善のための製品および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品は、保管中に細菌による汚染および腐敗の影響を特に受けやすい。食物サプライチェーンに見出される細菌叢は複雑であり、一部の菌株は高度に病原性であり、人間の健康に大きなリスクをもたらす。他のものは無害であるが、臭気、変色およびテクスチャの劣化のような二次的な問題を介して保存期間（shelf life）を大幅に短縮させ得る。新鮮な果物および野菜の包装方法は、デンマーク技術研究所の包装および輸送セクションによって２００８年に公開された「ガイド−新鮮な果物と野菜の包装」に集約されている。
【０００３】
食品包装材料は、伝統的に、内蔵の食品との所望でない相互作用を避けるように選択されてきた。既知の包装材料および方法は、通常、主に外部環境の影響に対する保護バリアとして機能する。食品の品質を維持し、および／または包装製品の安全性を高める目的で、食品と相互作用するように設計された包装材料（いわゆる「アクティブ」包装材料）が設計されている（「Bioactive Food Packaging: Strategies, Quality, Safety」（２０１６年）、Michael Kontominas著、DEStech Publications、ランカスター、ペンシルベニア、米国）。特に、抗菌特性を有する包装材料は、「Antimicrobial polymeric materials for packaging applications: A review」（スペイン、バダホスのFormatex発行のEun-Soo Park（2015））でレビューされている。
【０００４】
バクテリオファージ（「ファージ」）は、細菌内で感染および複製するウイルスである。「溶菌性」バクテリオファージは、細菌内でビリオンが複製された後、細菌細胞を壊し（溶解し）、破壊する。細胞が破壊されると、ファージの子孫は感染する新しい宿主を見つけることができる。バクテリオファージは、地球上で最も多くの生命体である。それらは、細菌が成長するあらゆる環境で見出され得る。バクテリオファージは、地下水と地表水、土壌、食物（例えばザウアークラウト、ワイン）、下水、およびスラッジで検出される。
【０００５】
バクテリオファージは、固体培地と液体培地の両方に分散可能である。国際特許出願ＷＯ０３／０９３４６２およびＷＯ２００７／０７２０４９は、バクテリオファージが基材への共有結合で固定化され、それらが自由に拡散することを不可能にするが、細胞に感染する能力を保持し、したがって細菌溶解および遊離バクテリオファージの放出を引き起こすことを開示している。
【０００６】
バクテリオファージは能動的に移動することができない−それらは受動的であり、外部プロセスによってのみ輸送される。したがって、細菌の第一の集団のバクテリオファージ感染は、空間的に分離された細菌の第二の集団には転移されないかもしれない。つまり、バクテリオファージ感染は、感受性細菌の供給の存在によって最も効果的に運ばれ、維持される。
【０００７】
例えば噴霧により、遊離バクテリオファージを製品に付与することが知られている。特定の例として、米国特許出願公開第２００９／０２４６３３６号は、食品を処理する任意の段階での食品へのバクテリオファージ処理の付与を含む、食品中の細菌汚染を低減または防止するシステムおよび方法を開示する。バクテリオファージ処理は、食品以外の表面や水系にも付与され得る。
【０００８】
しかし、そのような処理法が、包装された食料品の腐敗を防止するのに効果的であるとが見出されていない。最も注目すべきは、バクテリオファージは一般に液体製剤で提供される必要があるが、水分の添加は食品の細菌腐敗または汚染を促進する鍵となる重要な要因の１つである。
【０００９】
それゆえ、包装された材料の細菌汚染および／または包装された生物学的材料の分解（腐敗）を処理または低減する代替手段が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、生物学的材料、特に食料品の細菌汚染および分解（腐敗）の防止および改善のための製品および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、表面に共有結合で付着したバクテリオファージを含む内腔を規定する材料のエンベロープを提供する。
【００１２】
その表面は、バクテリオファージが共有結合し得る任意の基材上にあり得る。したがって、表面のこの定義には、剛性または柔軟性のある、または実質的にそうである基材が含まれる。さらに、この定義には、特定の形状または構成（例えば、平面、曲面または球形）の基材が含まれる。したがって、表面のこの定義には、粒子の表面も含まれ、粒子の表面は、球形または不規則な寸法であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】３０℃で４８時間培養した後のホウレンソウの葉のペクトバクテリウム・アトロセプティカム(Pectobacterium atrosepticum)（Ｐｂａ）４９０７５によって誘発された腐敗の結果。画像Ａは、細菌とファージの両方で処理されたバジルの葉を示す。画像ＢはＰｂａ  ４９０７５のみで処理されたバジルの葉を示す。画像Ｃは対照（葉は未処理のまま）である。
【図２】Ｐｂａ  ４９０７５およびバクテリオファージΦ４９０７５を用いる移動研究に利用されたホウレンソウの葉。
【図３】遊離ファージおよび共有結合で固定化されたファージの両方の移動の程度を示す棒グラフ。
【図４】５０ｇのホウレンソウの葉を含む再構成サラダ袋。
【図５】袋セクション内のホウレンソウの葉のスクリーニング：サンプリングされたバクテリオファージを一晩富化した後の開始（Beginning）（ａ）、中間（Middle）（ｂ）、および最終（End）（ｃ）。Ｐｂａ  ４９０７５頂部寒天菌叢を示す対照を（ｄ）に示す。
【図６】さまざまなサラダ袋セクションでのΦ４９０７５  １ｇ当たりのファージ濃度。
【図７】保存期間の観察評価：（１＝非常に新鮮，５＝非常に腐敗）。ラインは「使用期限日（use by date）」を示す；（Ａ）鮮度の外観；（Ｂ）各サラダの葉の色の均一性；（Ｃ）サラダの光沢／外観；（Ｄ）サラダの葉の萎れと硬さ(rigour)の欠如；（Ｅ）サラダの葉の褐変（ｉ）葉の縁の褐変および（ｉｉ）葉の表面の褐変。
【図８】汚染および３つの異なる条件での保管後に鶏肉片から単離されたカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)の数：ａ）３７℃で７２時間保管；ｂ）４℃で１２０時間保管；ｃ）室温で１６時間保管。
【図９】汚染および３つの異なる条件での保管後に鶏肉片から単離されたネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)の数：ａ）３７℃で７２時間保管；ｂ）４℃で１２０時間保存；ｃ）室温で１６時間保管。
【図１０】汚染および３つの異なる条件での保管後に鶏肉片から単離された緑膿菌の数：ａ）３７℃で７２時間保管；ｂ）４℃で１２０時間保管；ｃ）室温で１６時間保管。
【図１１】これらの細菌の組み合わせによる汚染と３つの異なる条件での保管後に鶏肉から単離されたカンピロバクター・ジェジュニ(C. jejuni)とネズミチフス菌(S. typhimurium)の数：ａ）３７℃で７２時間保管；ｂ）４℃で１２０時間保管；ｃ）室温で１６時間保管。
【図１２】元の接種のポイントからの距離の関数としての鶏皮上のバクテリオファージの数。
【図１３】実施例６Ａに記載された実験の写真であって、バクテリオファージカクテルがその上に共有結合で固定化されたプラスチックシート片をホウレンソウの葉の上に配置した。葉の暗い領域は、腐敗の度合いが高いことを示す。右側に試験サンプルを示し、左側に対照サンプルを示す。
【図１４】室温で２日後の対照の葉と試験用の葉との品質を示す棒グラフ。以下の表５に記載されている４点評価系を使用して、葉の等級付けを行った。
【図１５】実施例６に記載された実験の第１日の間の対照の葉および試験用の葉の写真。試験サンプルを右側に示し、対照のサンプルを左側に示す。
【図１６】実施例６に記載の葉の腐敗実験の結果。評価は、「食べられる」葉を葉の総数で除して表す。０．５をそれぞれの保存期間を比較するためのカットオフポイントとして使用した。
【図１７】実施例７に記載のように共有結合で固定化されたバクテリオファージのカクテルに曝露したホウレンソウのベビーリーフの平均鮮度スコアのグラフ。ホウレンソウの袋を毎日サンプリングして、盲検試験での平均鮮度スコアを決定した。３を上回る鮮度スコアを合格とみなした。共有結合で固定化されたバクテリオファージに晒されたホウレンソウの保存期間が大幅に延長された。
【図１８】単一のバクテリオファージ（ＰＭＡ）および２つのバクテリオファージカクテルを用いる袋詰めホウレンソウの保存期間の延長を示すグラフ。
【図１９】サラダ単独を対照にして、包装に共有結合で固定化されたバクテリオファージ（「固定ファージ」）またはホウレンソウに噴霧したバクテリオファージ（「吸着ファージ」）のいずれかを使用した、袋詰めホウレンソウの保存期間の延長を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の製品、方法、および使用は、エンベロープの外の環境から分離され、したがって実質的に独立しているエンベロープの内腔内の環境を提供するという利点を有する。このようにして、本発明は、細菌の集団がよりよく制御され得る製品を生じる。
【００１５】
遊離バクテリオファージは、感受性細菌に感染して溶菌することができる。したがって、遊離バクテリオファージは、細菌集団を制御する目的で、細菌で汚染された材料上に噴霧される。しかし、この処理は、実験室条件下での遊離バクテリオファージの毒性を考えると予想されるほど効果的ではない。本発明者らは、遊離バクテリオファージが環境条件による不活性化に対して感受性であることを観察した。乾燥（脱水）による不活性化が顕著な要因であるが、他の要因（紫外線、フリーラジカルへの曝露など）も重要である。したがって、食品材料上に噴霧された遊離バクテリオファージは、比較的迅速に不活性化される。したがって、遊離バクテリオファージは標的細菌に感染すると予想され得るが、本発明者らは、それらは標的細菌に感染する機会を得る前にしばしば不活性化され、その結果、遊離バクテリオファージによる処理の効果が低下または無効になるという予期せぬ発見を行った。
【００１６】
さらに、遊離、つまり非固定化バクテリオファージは比較的迅速に不活性化されるため、感受性細菌の濃度が低い場合、バクテリオファージと細菌との相互作用が発生する機会はさらに低下する。それゆえ、遊離バクテリオファージを使用して細菌集団を制御することの有効性は限られる。
【００１７】
しかし、たとえ感受性のある標的細菌が複製せず、かつ／または低濃度であるような条件であっても、それらは（能動的または拡散を介して）移動し、内腔内に広がる。
【００１８】
遊離バクテリオファージとは対照的に、本発明で使用される共有結合で固定化されたバクテリオファージは、特に拘束されているが、遊離バクテリオファージよりも実質的に安定している。バクテリオファージは、基材に共有結合で付着させることにより固定化され得る。このような共有結合で付着したバクテリオファージは、自由に拡散することが不可能であるが、それらは、細胞に感染し、その後細菌の溶解と遊離バクテリオファージの放出とを引き起こす能力を保持する。これらの特性は、感受性細菌のバクテリオファージ感染の成功の全体的な確率を高め、したがって、細菌集団のより良い制御をもたらすという予想外の利点を生じる。
【００１９】
したがって、理論に束縛されることを望まないが、本発明は、汚染細菌の集団が、包装された製品の損傷または腐敗を引き起こし得るレベルに達することなく、理想的には、感受性細菌が共有結合で固定化されたバクテリオファージに接触する前に、本発明の製品の内腔全体に実質的に広がることを可能にするというさらなる利点を有する。このようにして、バクテリオファージ感染のタイミングが制御される。したがって、対象物が内腔内に包装された後、内腔内で、バクテリオファージ感染の効果が汚染細菌の空間的に隔離されたポケットを残すことなく内腔空間全体に広がることができるような、感受性細菌の重要な集団分布またはサイズに達し得る。
【００２０】
他の形跡がなければ、表面上に共有結合で固定化されたバクテリオファージは、細菌の臨界濃度に達する前、拡散してそれらの標的と相互作用することができるほどに実質的に自由ではないことが予想される。したがって、食品が包装と接触していないポイントで食品を処理できるように、食品包装上に共有結合で固定化されたバクテリオファージを使用する場合、宿主細菌のこの移動の程度の測定および評価が重要である。
【００２１】
細菌集団のこの広がりは、共有結合で固定化されたバクテリオファージによる感受性細菌の感染の前に達成することができる。このような感染は遊離バクテリオファージを生成し、これが汚染細菌の感受性集団に感染し、実質的に破壊する。細菌の集団全体に影響を与えることは、細菌が内腔全体に広がるようになり、その集団がバクテリオファージ感染のより広い伝播を可能にする連続した範囲を持つという直感に反するステップによって可能になる。したがって、バクテリオファージと感受性細菌との間の「捕食者−被食者」関係を「捕食者」バクテリオファージに有利に傾けることにより、汚染バクテリオファージ感受性細菌の集団がより効果的に制御され得る。
【００２２】
さらに、エンベロープ内に共有結合で固定化されたバクテリオファージは、遊離バクテリオファージよりも劣化を受けにくい。したがって、汚染細菌が内腔を再コロニー化する場合、汚染細菌の集団の制御を再確立するために、それらは一層利用可能である。
【００２３】
表面は、エンベロープの内部であってもよい。エンベロープの内面上にバクテリオファージを共有結合で固定化することは、内腔の壁を構成する材料の製造が、それへのバクテリオファージの共有結合での付着を含むことができ、そしてこの材料をエンベロープ内に直接形成できるという利点がある。したがって、バクテリオファージの共有結合での付着は平面材料上で実施することができ、これは、次いでエンベロープに形成され、好ましくは包装業界で標準的な手段（例えばフロー包装）による。したがって、本発明の製品の製造プロセスは、既存の技術と有利に互換性がある。さらに、本発明の製品に形成するのに適した包装材料は、公知かつ標準的な包装技術の状況で輸送かつ使用する前に、バクテリオファージを材料に共有結合で付着させることにより、事前におよび／または別の場所で調製してもよい。これは大きな利点であり、４℃で保存し、使用近くまたは使用時に付与の必要がある液体中よりも、バクテリオファージを保存するはるかに便利な方法である。
【００２４】
本発明の１つの実施形態では、容器またはエンベロープ内に密封された生物学的材料を含む製品が提供され、バクテリオファージは、材料に曝露された容器またはエンベロープの内面の少なくとも一部に共有結合で付着している。
【００２５】
あるいは、またはさらに、表面は、内腔内にあるが、エンベロープから分離可能であるかまたは分離されている。すなわち、バクテリオファージが共有結合で付着しているエンベロープの内腔に別個の対象物または材料が挿入されていてもよい。これは、材料のエンベロープを標準的な方法を用いて形成することができ、別個の対象物、材料、またはインサートをその内腔内に配置してもよいという利点を有する。したがって、バクテリオファージの特異性は、インサートに所望のバクテリオファージを付着させることによって好都合に変更され得る。したがって、包装システムに大きな変更を加えることなく、最終製品のバクテリオファージの特異性を確立および変更できる。これは、それ以外は標準の機械で構成でき、既知の方法および技術を使用することができる。
【００２６】
したがって、包装された対象物に遊離バクテリオファージを付与することに対するさらなる利点は、本発明の製品および方法を利用する包装が、包装プロセス中に追加の工程を必要としないことである。さらに、本発明とは対照的に、包装前に対象物に遊離バクテリオファージを付与するためにはかなりの追加の労力と時間が必要とされる。
【００２７】
本発明の１つの実施形態では、容器またはエンベロープに密封された生物学的材料用のインサートが提供され、このインサートは、本体と、本体に共有結合で付着され、容器またはエンベロープ内で保管中に生物学的材料の腐敗を引き起こすことが知られている細菌に対して活性を示すバクテリオファージとを含む。
【００２８】
インサートは、プラスチック材料、カードおよびボール紙のリストから選択される材料を含み得る。インサートは、実質的に平坦かつ平面であってもよい。これらの材料および構成は、材料を所定のサイズに切断し、形成されたインサートをエンベロープまたは容器に挿入することによって、インサートを形成する前にその上にバクテリオファージを共有結合で固定する材料のストックシートを処理するため、公知の技術および機械と互換性があるという利点をもたらす。
【００２９】
内腔に挿入された別個の材料はまた、上記で定義された１つまたはそれ以上の粒子の粉末を含むか、またはそれからなってもよい。したがって、粉末粒子の表面は、バクテリオファージがそこに共有結合で付着するための基材を提供する。そのような粉末は、食用材料を含むか、またはそれから作られ得る。この食用材料は、デンプン、ゼラチン、セルロース、ペクチン、コラーゲンおよびタンパク質、好ましくはデンプンまたはゼラチンのうちの１つまたは複数から選択され得る。好ましくは、食用材料は乾燥しているか、実質的に乾燥している。
【００３０】
エンベロープは密封され得る。本開示において、密封とは、実質的に気密であることを意味し得る。あるいは、「密封された」とは、上述した内腔内のバクテリオファージおよび感受性細菌の有利な捕食者−被食者関係を生じさせ、かつ／または維持され得るように、本発明の製品が十分に閉じられて内腔の内容物を隔離させることを意味する。したがって、密封という用語は、有利な捕食者−被食者の環境を対象物の一部の微小環境として確立し、そして製品の別の部分を露出したままにするか、異なる微小環境に置く一方で、対象物の特定部分を汚染する細菌を制御するために、本発明の包装材料内の対象物の一部を取り囲むか、または囲むことも含み得る。エンベロープの密封は、エンベロープの材料に熱、圧力もしくは接着剤、またはこれらの組み合わせを使用することにより好都合に実施され得る。
【００３１】
エンベロープは必ずしも排気下でなくともよく、保護的な（例えば酸素欠乏の）雰囲気下にあることを含む。内腔内の感受性細菌の数をバクテリオファージが制御できるようにするために、内腔の壁に共有結合で固定化されたバクテリオファージを内腔内の材料と接触させることは必須ではない。したがって、本発明の利点からの利益のために、エンベロープの真空密封および／または内腔の排気は必要とされない。
【００３２】
さらに、遊離バクテリオファージは、通常、液体キャリア中の材料に噴霧することにより材料に付与される。これに対して、（例えば、包装材料上、インサート上、または乾燥粉末上の）表面に共有結合で固定化されたバクテリオファージの使用では、エンベロープに存在する水分（液体）の量は増加しない。さらに、液体噴霧は細菌による汚染の影響を受け易く、したがって、処理された製品の細菌汚染のさらなるリスクがある。
【００３３】
上記にもかかわらず、内腔は、液体、好ましくは水溶液または水を含んでもよい。これは、内腔内の遊離バクテリオファージの伝染性を増大させるという利点を有する。理論に縛られることを望まないが、液体の存在により、バクテリオファージがエンベロープ内をより容易に、したがってより完全に移動することが可能になる。
【００３４】
内腔内の雰囲気は空気であってもよい。これは、改変されたまたは保護的な雰囲気（例えば、窒素、二酸化炭素、一酸化炭素またはアルゴン）を用いる必要なく、本発明の製品の内腔内の細菌の数を制御する利点を有する。あるいは、内腔は、保護雰囲気、好ましくは低酸素レベルの雰囲気を含み得る。
【００３５】
バクテリオファージは、エンベロープまたは容器に保管されている材料を腐敗するかまたは汚染することが知られている細菌に対して活性であり得る。
【００３６】
製品は生物学的材料を含むためのものであってもよい。生物学的材料は、特に細菌汚染を受けやすく、本発明は、本発明の製品内に包装された生物学的材料を汚染する細菌の数を制御する手段を提供する。さらに、本発明の製品は、汚染細菌の数が制御されるべき非生物学的材料を保護するのに適している。
【００３７】
本発明の１つの実施形態では、容器またはエンベロープ内に密封された生物学的材料を含む製品が提供され、生物学的材料は、保管中に細菌による腐敗の影響を受けやすく、そして、細菌に対して活性なバクテリオファージは、容器またはエンベロープの内面、または容器またはエンベロープ内のインサートの表面に共有結合される。容器またはエンベロープ内のインサートはまた、上記で定義されたような１つまたはそれ以上の粒子の粉末を含むかまたはそれからなってもよい。好ましくは、粉末は、乾燥した食用粉末であり、最も好ましくは、生物学的材料に付与される。
【００３８】
生物学的材料は植物材料であってもよい。
【００３９】
製品は、食品、すなわち食用材料を含むためのものであってよい。製品はサラダを含むものであってよい。食品材料は果物および／または野菜であり得る。野菜材料は、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、スイートコーン、キュウリ、レタス、マッシュルーム、タマネギ、ジャガイモ、ルッコラ、ホウレンソウ、またはトマトを含むか、またはそれらからなるものであってよい。果物材料は、リンゴ、バナナ、ベリー、柑橘類、ブドウ、メロン、桃、梨またはパイナップルを含むものであってもよい。食品材料は、１つまたはそれ以上の花（切り花であってもよい）、苗木、低木および木またはそれらの苗木であり得る。食品材料は、肉、好ましくは鶏肉、牛肉、魚肉、豚肉または子羊肉であり得る。
【００４０】
生肉に見られる細菌叢は複雑で、一部の細菌株は非常に病原性がある。無害な他のものもあるが、臭気などの二次的な問題によって保存期間が短くなることがある。本発明の製品および方法は、これらの細菌株を管理して、胃腸炎などの食中毒の発生率を有意に低減し、および／または保存期間を延ばすことができるという点で有利である。
【００４１】
この製品は、食用でない生物学的植物材料を含むためであってもよい。このような非食用材料には、１つまたはそれ以上の花（切り花であってもよい）、苗、低木および木またはそれらの苗木のような植物材料が含まれ得る。
【００４２】
バクテリオファージは、カンピロバクター属(Campylobacter)、サルモネラ属(Salmonella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ペクトバクテリウム属(Pectobacterium)、キサントモナス属(Xanthomonas)、エルウィニア属(Erwinia)、ブレネリア属(Brenneria)、ディッケヤ属(Dickeya)、大腸菌(Escherichia coli)、赤痢菌(Shigella)、ビブリオ属(Vibrio)、リステリア属(Listeria)、クロストリジウム属(Clostridium)、バチルス属(Bacillus)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、エルシニア(Yersinia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、乳酸菌およびシトロバクター属(Citrobacter)の１つまたはそれ以上から選択される細菌に対して活性を有し得る。細菌は食中毒や腐敗を引き起こすことが知られている。本発明の製品は、＞４℃で、すなわち理想的でない貯蔵条件下でインキュベートされた食品を汚染する細菌の数をよりよく制御するという利点を有する。
【００４３】
好ましくは、バクテリオファージは緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)に対して活性を有する。この細菌は、それ自体が病原性ではないが、この細菌は鶏肉に強い臭気を与え、腐敗をもたらし、売り上げの損失を引き起こす。非固定化バクテリオファージは、４℃を超える温度で保存された食品の緑膿菌の抑制にはあまり効果がない。したがって、本発明の製品は、緑膿菌の汚染をよりよく制御できるという利点を有する。
【００４４】
好ましくは、バクテリオファージは、シュードモナス属の他の細菌に対しても活性を有する。特にバクテリオファージは、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・フラギ(Pseudomonas fragi)などの蛍光シュードモナスに対して活性である。これらの菌は、サラダの腐敗の原因であると判断され、保存期間を短縮し、大幅な商業的損失を引き起こす。
【００４５】
好ましくは、バクテリオファージは乳酸菌に対しても活性を有する。
【００４６】
好ましくは、バクテリオファージは、シトロバクター属の細菌に対して活性を有する。本発明者らは、予期せぬことに、シトロバクター属の細菌が保管中のサラダの腐敗の原因であることを見出した。以前は、これはシュードモナス属の細菌と乳酸菌によるものと排他的に考えられていた。したがって、本発明者らは、とりわけ、サラダの保存において、シトロバクター属の細菌の数を制御することの予想外の利点を開示する。
【００４７】
さらに、本発明は、バクテリオファージの感染および作用の特異性により、特定の種の細菌を標的とすることができるという利点を有する。例えば、シトロバクター属の細菌を特異的に標的とすることができる。
【００４８】
本発明はまた、内腔を規定する材料のエンベロープを含む製品を製造する方法を提供し、この内腔は、表面に共有結合で付着したバクテリオファージを含み、方法は、バクテリオファージを表面に共有結合で付着させる工程、および材料から表面を囲む内腔を形成する工程を含む。
【００４９】
本発明はさらに、生物学的または非生物学的材料を包装する方法を提供し、この方法は、表面に共有結合で付着したバクテリオファージを含む内腔を規定する材料のエンベロープを含む製品の内腔内に生物学的材料を密封する工程を含む。
【００５０】
本発明の１つの実施形態では、以下：
生物学的材料を提供する工程
生物学的材料のための容器またはエンベロープを提供する工程
容器またはエンベロープの表面の少なくとも一部にバクテリオファージを共有結合で付着させる工程、
生物学的材料を容器またはエンベロープの内側に配置し、容器またはエンベロープを密封して、容器またはエンベロープの内面上のバクテリオファージを生物学的材料に曝露させる工程、
を含む、生物学的製品を調製する方法が提供される。
【００５１】
本発明はまた、内腔を規定する材料のエンベロープを含む製品の使用を提供し、この内腔は、表面に共有結合で付着したバクテリオファージを含み、製品の内腔内に密封された材料上の細菌の数を制御する。
【００５２】
好ましくは、この使用は生物学的材料の保存のためであり、より好ましくは保存は一時的である。保存という用語は、生物学的製品の食用または使用可能な寿命を延ばすこと、および／または保存期間を延ばすことを意味するために使用される。これは、本発明の製品を使用して保護された材料を、本発明に従って保存されていない生物学的材料よりも長く貯蔵、展示および／または販売できるという利点を有する。生物学的製品の食用または使用可能な寿命および／または保存期間の延長は、好ましくは少なくとも１日であり、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間または少なくとも４週間であり得る。
【００５３】
本発明はまた、本発明の請求項の製品の内腔内に対象物を包装するためのシステムを提供し、このシステムは、エンベロープの表面にバクテリオファージを共有結合で固定化するための装置；および製品の内腔内の対象物を密封するための装置；を備える。
【００５４】
本発明はさらに、植物材料の腐敗の制御または防止におけるシトロバクター属の細菌に対して活性なバクテリオファージの使用を提供し、好ましくは植物材料は食品であり、より好ましくは食品はサラダである。
【００５５】
本発明はまた、基材上に共有結合で固定化されたシトロバクター属の細菌に対して活性なバクテリオファージを含む製品を提供する。適切な基材は、ＷＯ０３／０９３４６２およびＷＯ２００７／０７２０４９の出願に開示されている。
【００５６】
バクテリオファージは、ポリエチレン、ポリアミド、およびセルロースフィルムから選択される材料で作られるものを含むか、またはそれらから選択される材料を含む、多くの異なるタイプの一般的な食品包装材料に共有結合で固定され得る。
【００５７】
本発明はさらに、基材上にシトロバクター属の細菌に対して活性なバクテリオファージを共有結合で固定化する工程を含む方法を提供する。
【実施例】
【００５８】
次に、本発明を、添付の図面を参照して以下の特定の実施形態で説明する。
【００５９】
（実施例１）
（ホウレンソウの葉上のバクテリオファージΦ４９０７５の移動）
ホウレンソウの葉の表面でのバクテリオファージの移動の観察により、遊離バクテリオファージおよび共有結合で固定化されたバクテリオファージに由来するバクテリオファージがそれら自体分散することが示された。
【００６０】
バクテリオファージΦ４９０７５とその対応する宿主であるペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Pectobacterium atrosepticum）（Ｐｂａ）４９０７５（一般的な植物病原菌）を、ファージの移動を実証するモデルとして使用した。固定されたバクテリオファージを、Ｐｂａ  ４９０７５で処理された葉の表面に共有結合で付着させ、遊離バクテリオファージの対照を並行した。これらのバクテリオファージが葉を横切って移動した程度を測定した。
【００６１】
細菌に付与するために、Ｐｂａ  ４９０７５一晩培養物の１／１０希釈液１ｍＬを、ピペットを用いて葉の特定のポイントに滴下した。バクテリオファージを付与するために、１００μｌのライセートを、宿主を添加したのと同じポイントにスポットした。
【００６２】
これらの実験の結果（図１に示す）は、Ｐｂａ  ４９０７５がバジルの葉に腐敗を引き起こし、Φ４９０７５がこのプロセスの遅延に効果的であることを示す。
【００６３】
図１に示す視覚試験に加えて、細胞数も測定し、ファージ処理により細菌数が減少することがわかった。これらの実験では、最初に葉を３００μｌのＰｂａ  ４９０７５（一晩培養物）で処理し、葉の表面に加えて均一に広げた。次いで、１０μｌのファージを葉の表面にスポットした。葉を乾燥から保護するために２ｍＬの水を含むペトリ皿に吊り下げた。それらを３０℃で一晩インキュベートした。これに続いて、葉を取り除き、秤量し、１０ｍＬのＰＢＳに２時間浸漬した。ＰＢＳ溶液の細菌含有量を測定し、葉の切片の単位質量あたりの濃度を計算した（結果を表１に示す）。
【００６４】
【表１】
2021501098.tif 000002
【００６５】
このバクテリオファージおよび宿主のペアを、バクテリオファージの移動をさらに調査するためのモデルとして使用した。
【００６６】
（移動の研究）
Φ４９０７５は、表面にＰｂａ  ４９０７５を含むホウレンソウの葉を横切って移動することが示された。ファージは、それが付与された領域でその量が最も多く、このポイントから離れるにつれて数が徐々に減少した（図２および３を参照）。
【００６７】
図２で示した葉を、ペトリ皿に吊り下げたままにして、（乾燥から葉を保護するために）底面に少量の水を存在させた。３００μｌの一晩のＰｂａ  ４９０７５を葉の表面に加え、均一に広げた。上記のように１０μｌのΦ４９０７５ライセートをスポットした（共有結合で固定化されたファージの場合、バクテリオファージを共有結合で固定化した１ｃｍ２のプラスチックシートを葉の上に配置した）。３０℃で２４時間インキュベートした後、図示したように葉を３分の１に切り、各３分の１のバクテリオファージ含有量を測定した。
【００６８】
図３に示す葉のセクションのバクテリオファージ含有量を、１０ｍＬのＰＢＳに２時間浸漬したままにする前に、葉のセクションの重さを量ることによって決定した。ＰＢＳ溶液のファージ濃度を、プラークアッセイを使用して測定し、所定の葉のセクションの単位質量あたりの元のファージ濃度を計算した。
【００６９】
図３からわかるように、共有結合で固定化されたバクテリオファージの場合、領域全体のファージ数の減少は、開始領域から最終領域まで１ｌｏｇを超える減少が観察された遊離ファージで観察されたものほど急激ではない。対照として、細菌で処理せずにおいた葉を、試験葉と同じ方法でファージで処理した。バクテリオファージを、それを付与した「開始」セクションでのみ検出した。
【００７０】
（実施例２）
（サラダ袋を用いる移動の研究）
この研究については、バクテリオファージがより多くの障害物を伴ってより長い距離にわたって分散することができるかどうかを確認するために、サラダ袋内で移動の研究を行った。
【００７１】
（図４に示す）２４．５×１０ｃｍの寸法のサラダ袋を、ヒートシーラーを用いて大型のＴｅｓｃｏ３００ｇホウレンソウ袋から構成した。５０ｇのホウレンソウの葉を各袋に配置した。１０ｍＬのＰｂａ  ４９０７５を袋に付与し、袋を密封して穏やかに反転させて、その中に細菌を分散させた。Φ４９０７５が共有結合で固定化された８×４ｃｍのプラスチックシートを袋の遠端に配置し、再度密封した。袋を室温で３６時間放置した後、「開始、中間、および最終」というラベルの付いた３等分した３つに分けた（「開始」とは、共有結合で固定化されたバクテリオファージを保持するプラスチックのシートが存在していたセクションをいう）。
【００７２】
最初の試験を、バクテリオファージの移動が発生したかどうかを判断するために行った。各セクション（「最初、中間、および最終」）について袋の側面に小さな切り込みを入れた。綿棒を使用して、切り口からサンプリングを行った。各綿棒を、対数増殖期のＰｂａ  ４９０７５を含む栄養ブロスに加え、一晩富化させた。翌日、各富化後のサンプルを宿主に対してスクリーニングした。
【００７３】
移動の程度を調査するために、既知量の葉を袋から取り出し、ファージ含有量について試験した。これを２０ｍＬのＰＢＳに２時間懸濁させ、プラークアッセイによって葉から抽出されたファージの濃度を測定することによって行った。各袋セクションを３回サンプリングした。
【００７４】
指標としてファージの存在を用いて、最初の綿棒テストで最も遠い袋セクション（「最終」）への移動を確認した（図５を参照）。
【００７５】
バクテリオファージのカウント結果は、Φ４９０７５が「開始」セクションで最高レベルであったことを示す。このセクションには、共有結合で固定化されたバクテリオファージを保持するプラスチックのシートが含まれていた。中間セクションに移動して、Φ４９０７５の濃度は少し低下し（０．５〜１ｌｏｇの間）、最終セクションでそのレベルを維持した。結果を図６に棒グラフで示す（図６の袋１および袋２を参照）。袋１および２は同じように試験した。対照１は、ＰＢＳに懸濁したＰｂａ  ４９０７５細胞の代わりにＰＢＳのみで処理したサラダ袋を表す。対照２については、「開始」セクションでは共有結合で固定化された材料に加えて、液体を袋に添加しなかった。
【００７６】
２つの対照の各袋セクションの濃度は、袋１および２の濃度よりもかなり低かった（図６の対照１および２を参照）。これは、対応するＰｂａ宿主が存在しないためであり、これがないと、Φ４９０７５は生育できない。Ｐｂａ  ４９０７５が存在しないにもかかわらず、対照１の移動をまだ観察した。袋１および２と同様のパターンで、ファージ含有量は開始セクションで最も高く、その後中間セクションと最終セクションでほぼ２ｌｏｇ減少した。この移動はおそらく、固定化されていないファージ（吸着された）がノックオフされたかまたはシートから洗い流され、袋全体に分散したためと考えられる。対照２では、中間および最終セクションにはファージは検出されなかった。これらの結果は、液体媒体の存在下でファージの分散が大幅に促進され、その不在が検出できないレベルの移動を引き起こすことを示唆している（対照２）。対応する宿主株の存在により、袋のすべてのセクションでファージがかなり高いレベルまで生育することが可能になる。
【００７７】
これらの結果から、流動性媒体の存在により、移動が発生する範囲が大幅に増加することがわかる。時間が経つにつれ、サラダ袋内に水分が発生し、これがバクテリオファージの移動に寄与する可能性があることに留意すべきである。宿主株を比較的多く使用し、この実験で使用するためにサラダ袋全体に分配した。実際には、分布していない細菌の濃度がはるかに低くなり、これはバクテリオファージの移動に影響を及ぼす。
【００７８】
（実施例３）
（袋詰めサラダの保存期間）
本研究の目的は、フレッシュカットサラダの葉におけるペクトバクテリウム・カロトボラム（Pectobacterium carotovorum）に対するバクテリオファージの抗菌性能を示し、そして細菌の負荷を減らすことが製品の保存期間に及ぼす影響を示すことであった。ペクトバクテリウム・カロトボラムは多様な宿主範囲を持つ植物病原体であり、サプライチェーン内の食品の崩壊に広く関連している。
【００７９】
（方法）
公式の「使用期限日」の６日前に、１５０ｇのフロレットスイートクリスピーサラダを６袋購入した。以下の群を試験した：
１．対照群。袋内の葉に滅菌水を噴霧し、元の袋内にヒートシールした。
２．細菌群。袋内の葉には、２００ｃｆｕ／ｇのペクトバクテリウム・カロトボラムを接種した。
３．細菌＋包装に共有結合で固定化されたファージ。袋内の葉には、２００ｃｆｕ／ｇのペクトバクテリウム・カロトボラムを接種した。さらに、国際特許出願ＷＯ０３／０９３４６２およびＷＯ２００７０７２０４９に記載されている方法を使用して、バクテリオファージを包装に共有結合で固定化した。
【００８０】
包装材料は元のフロレットサラダ袋であった。包装材料は、１×１０４ｐｆｕ／ｃｍ２のライセートを使用して固定化に供した。実験中、４℃で保存する前に、各袋をヒートシールして「上下にゆすった」。
【００８１】
サラダの葉を、物理的特性については毎日、微生物学的分析のために２日ごとに評価した（可能な場合）。袋から１ｇのサンプルを取り、細菌を抽出した。常に、食品の目視評価は、Kang, KimおよびChoiによって指定されたさまざまな鍵となる重要な基準に基づいた（Kang, S. C., et al. (2007). 「Shelf-life extension of fresh-cut iceberg lettuce (Lactuca sativa L) by different antimicrobial films.」 J Microbiol Biotechnol vol. 17(8) pages 1284-1290)。１（非常に新鮮）から５（非常に腐敗）までの特性のスコアを毎日記録した。記録した特性は以下であった：褐変、萎れ、鮮度、色および光沢。
【００８２】
（結果−保存期間の観察的評価）
（全体鮮度）
KangおよびKim（2007）にしたがって、すべての試験グループについて、鍵となる重要な製品特性の観察分析があった。KangおよびKimによって定義された鍵となる重要なパラメータである全体的な鮮度は、時間の経過に伴うサンプルの一般的な物理的変化を示している。すべてのサンプルが試験期間中に腐敗したことが観察されたが、腐敗の速度と程度はサンプル間で異なった。
【００８３】
鮮度の外観の結果を図７Ａに示す（１＝非常に新鮮、５＝非常に腐敗。ラインは「使用期限日」を示す）。図７Ａは、サラダの葉に細菌のみを加えた群が、速い腐敗率と最も広範囲な腐敗を示したことを示している。これに続いて、未処理の対照群があり、この腐敗を引き起こす細菌がサラダにすでに存在していたことを示す。ただし、腐敗が最も少ないのは、包装にバクテリオファージが共有結合で固定化されている群であり、３日目から８日目まで腐敗の増加が観察されなかった。
【００８４】
（色の均一性）
色の均一性は、消費者にサラダの視覚的な魅力を示すために使用される。これは、ペクトバクテリウム・カロトボラムおよびバクテリオファージの存在による変動もまた示した。結果を図７Ｂに示す。細菌のみの群は、他のサンプル群よりも速い速度で色の均一性を失った。細菌を添加していない対照の袋は、より遅い速度で色の均一性を失った。共有結合で固定化されたバクテリオファージを有する群は最もよい性能を示し、４日目から試験終了まで、他の群との間に有意差があった。
【００８５】
（光沢）
色の均一性と同様に、光沢はサラダの視覚的な魅力の指標を与える。結果を図７Ｃに示す。対照のサラダの葉および意図的に汚染したサラダの葉の両方とも同様に挙動し、８日間の試験で光沢が減少した。共有結合で固定化されたバクテリオファージを含む群の葉は、１日目以降、対照よりも著しく高い光沢を維持した。
【００８６】
（萎れ）
褐変後、萎れはサラダの強い指標である。結果を図７Ｄに示す。すべてのサンプル群において萎れは急速であった。繰り返しになるが、細菌のみの群が最も広範な萎れ率を示したのに対し、共有結合で固定化されたバクテリオファージの群は、「使用期限日」を超えて著しい改善を示した。
【００８７】
（褐変）
褐変に関して、次の２つの尺度を評価した。それらは、サラダの葉の縁周りの褐変の程度および表面の褐変であった。結果を図７Ｅ（ｉ）および（ｉｉ）に示す。ペクトバクテリウム・カロトボラム細菌を添加したサンプルにおいて、褐変率が非常に高かった。褐変がこの細菌の最も一般的な影響であるため、これは予想された。繰り返しになるが、「保存期間ポイント」では、共有結合で固定化されたバクテリオファージを有する袋の褐変が最小であった。
【００８８】
（視覚的結果に関する結論）
サラダの視覚的局面に関して行った観察は、その表面に共有結合で固定化されたバクテリオファージを有する袋が、他のサンプルよりも一貫して優れた性能を示したことを示している。しかしながら、共有結合で固定化されたバクテリオファージを含む袋中でさえ、なおいくらかの腐敗が観察されている。
【００８９】
したがって、これらの実験は、サラダ袋の内側に共有結合で固定化されたバクテリオファージの存在による、袋詰めされた新鮮なカットサラダにおけるペクトバクテリウム・カロトボラム細菌の細菌負荷の効果的な減少を示している。バクテリオファージは直接細菌数を減らすだけでなく、褐変や萎れを減らすことでサラダの葉の腐敗の目に見える兆候を防ぐ。６日目（元の保存期間）から８日目まで、サラダの５つの鍵となる重要なパラメータすべてのさらなる劣化はなかった。これは、サラダ袋の表面へのバクテリオファージの固定化により、袋の内容物に対して劣化が著しく改善され得ることを示している。
【００９０】
（実施例４）
（生の鶏肉における病原菌の減少）
本試験は、標的細菌株に対して活性なバクテリオファージを使用することにより、生の鶏肉の細菌数が減少することを示す。遊離バクテリオファージと食品包装に共有結合で固定化されたバクテリオファージとの両方を使用した。
【００９１】
（実験設計）
生の鶏肉を標的細菌で汚染し、次いで、包装に包んだ。以下の３つの実験群があった：
１．対照群。鶏肉を標的細菌で汚染し、そして標準的な食品包装に包んだ。
２．遊離バクテリオファージ群。鶏肉を標的細菌で汚染し、非固定化バクテリオファージを鶏肉の表面に付与し、次いで標準的な食品包装に包んだ。
３．共有結合で固定化されたバクテリオファージ群。鶏肉を標的細菌で汚染し、Fixed Phageテクノロジーを使用して付着された共有結合で固定化されたバクテリオファージでコーティングした食品包装に包んだ。
【００９２】
上記３つの群をカンピロバクター・ジェジュニ、ネズミチフス菌および緑膿菌で汚染し、そして以下の保存条件にて保存した：
ａ．３７℃にて７２時間保存
ｂ．４℃にて１２０時間保存
ｃ．室温にて１６時間保存。
【００９３】
規定の保存条件の最後に、各群のサンプルを採取して、サンプル上に存在する細菌の数を決定した。
【００９４】
（方法）
（培地）
本実施例で使用したすべての培地を、表２に詳述する。すべての培地を、購入したか、事前に製造したか、または当技術分野で既知の方法に従って製造した。
【００９５】
【表２】
2021501098.tif 000003
【００９６】
（細菌およびバクテリオファージ）
細菌とバクテリオファージをFixed-Phageストアから入手した。本研究で使用したすべての細菌およびバクテリオファージを表２に詳述する。すべての細菌は、当技術分野で知られている標準的な方法に従って培養した。
【００９７】
【表３】
2021501098.tif 000004
【００９８】
（鶏肉ブロイラーの準備および接種）
厚さ５０ｍｍの鶏肉ブロイラーを、無菌のかみそりの刃を使用して無菌的に５０ｇのスライスに切断した。ブロイラーを、ＰＢＳ溶液中に１×１０６ＣＦＵ／ｍＬの適切な細菌の濃度を含む２ｍＬ溶液を用いて接種した。試験した細菌は、カンピロバクター・ジェジュニのみ、ネズミチフス菌のみ、緑膿菌のみ、およびカンピロバクター・ジェジュニとネズミチフス菌を含む共培養であった。陰性対照に使用したスライスには、２ｍＬの滅菌ＰＢＳを接種した。次いで、各ブロイラーを室温で３０分間インキュベートした。
【００９９】
（包装材料の準備）
厚さ０．２ｍｍのポリアミド／ポリエチレン（ＰＡ／ＰＥ）複合真空ラップ（Ａｎｄｒｅｗ  Ｊａｍｅｓ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ）を１５×２８ｃｍの袋に切り分けた。コロナ放電で処理されるすべての袋を、内表面の処理を可能にするために無菌的に切断した。
【０１００】
（バクテリオファージの包装材料への固定）
各包装表面をコロナ放電で処理した。１×１０７ＰＦＵ／ｍＬの濃度のバクテリオファージ溶液を固定化のために調製した。各包装表面を、ＷＯ０３／０９３４６２およびＷＯ２００７０７２０４９に開示されているように、７．５ｋＶでの２回のコロナ放電処理によって処理し、１０ｍＬのバクテリオファージ溶液を表面に無菌的に付与した。次に、各表面を滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、層流キャビネット下で３０分間乾燥させた。当技術分野で標準的である寒天オーバーレイ法を使用する抗菌試験のために、包装材料の少量のサンプルを保持した。
【０１０１】
（バクテリオファージによる鶏肉表面の処理）
濃度０．５×１０８ＰＦＵ／ｍＬのバクテリオファージのサンプルを、各鶏肉片の処理用に準備した。各鶏肉片にバクテリオファージ溶液２ｍＬを接種し、室温で３０分間インキュベートした。
【０１０２】
（鶏肉サンプルの保存）
１片の鶏肉片をそれぞれの適切な袋に入れ、各袋を真空シーラー（Andrew James）を使用して好気性条件下で真空シールした。合計３片を共有結合で固定化されたバクテリオファージに曝露し、３片を非固定化バクテリオファージに曝露した。対照については、１つの非接種片を共有結合で固定化したバクテリオファージに曝露し、１つの非接種片を非固定化バクテリオファージに曝露し、１つの非接種片を無処理で食品包装に包み、そして細菌を接種した３片を処理なしで食品包装に包装した。鶏肉片は、加速試験では３７℃で７２時間、冷蔵試験では４℃で１２０時間、室温試験では室温で１６時間保存した。
【０１０３】
（鶏肉ブロイラーのサンプリング）
各鶏肉片を無菌的に３つの別々の１０ｇ片に切り、各片を１５ｍＬの滅菌ＰＢＳに加えた。次に、各チューブを、室温で３０分間、４００ＲＰＭでロータリーミキサーに追加した。次に、各サンプルに滅菌ＰＢＳで７×１／１０の段階希釈を行い、各希釈のサンプル３×１０μｌを適切な選択寒天に加えた。２０μｌのサンプルをＫａｒｍａｌｉ寒天プレートに加えた。Ｘ．Ｌ．Ｄおよびシュードモナス寒天プレートを３７℃で７２時間好気的にインキュベートし、Ｋａｒｍａｌｉ寒天プレートを３７℃で７２時間嫌気的にインキュベートした。
【０１０４】
（包装材料のサンプリング）
共有結合で固定化されたバクテリオファージ、非固定化バクテリオファージ、および未処理の対照を含む包装材料のサンプルを、抗菌活性についてサンプリングした。合計３つのサンプルを寒天オーバーレイに添加し、３７℃の好気性条件下でインキュベートした。抗菌活性を、材料の周囲の阻害ゾーンの存在によって確認した。
【０１０５】
（データ入力と統計分析）
各鶏肉ブロイラーから単離された細菌のデータをプロットして頻度分布を決定し、９５％信頼区間でクラスカル・ウォリス検定を使用して比較した。すべての統計解析を、GraphPad Prism 4ソフトウェアを使用して行った。
【０１０６】
（結果）
（処理した鶏肉ブロイラーからのカンピロバクター・ジェジュニの単離）
汚染および上記条件下での保存後に鶏肉片から単離したカンピロバクター・ジェジュニの数を図８に示す。未処理の材料では抗菌活性は認められなかった。カンピロバクター・ジェジュニ細菌は、どの試験の陰性対照鶏肉片からも単離されなかった。
【０１０７】
加速試験では、陽性対照（中央値３．３×１０５ＣＦＵ、範囲３×１０４〜３．３×１０６ＣＦＵ）よりも、有意に（ｐ＜０．００１）少ないカンピロバクター・ジェジュニを、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値６×１０３ＣＦＵ、範囲０〜１．３×１０５ＣＦＵ）および非固定化バクテリオファージで処理したバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値１．２×１０５ＣＦＵ、範囲３×１０３〜１×１０５ＣＦＵ）から回収した（図８ａ）。非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片から、有意に（ｐ＜０．０１）少ない細菌を単離した（図８ａ）。
【０１０８】
室温試験では、陽性対照（中央値１×１０４ＣＦＵ、範囲５００〜１．１×１０６ＣＦＵ））よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値５×１０３ＣＦＵ、範囲５００〜２×１０４ＣＦＵ）から、有意に（ｐ＜０．０１）少ないカンピロバクター・ジェジュニを回収した。陽性対照と非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値１．１×１０４ＣＦＵ、範囲５×１０３〜６×１０４ＣＦＵ）の間では有意差は観察されなかった（図８ｂ）。非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片よりも共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片から、有意に（ｐ＜０．０１）少ない細菌を単離した（図８ｂ）。
【０１０９】
冷蔵試験では、陽性対照（中央値１×１０６ＣＦＵ、範囲１．１６〜２×１０６ＣＦＵ）よりも、有意に（ｐ＜０．００１）少ないカンピロバクター・ジェジュニを、非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値１．４×１０５ＣＦＵ、範囲５００〜１．８×１０６ＣＦＵ）および共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値３．５×１０５ＣＦＵ、範囲５×１０３〜６．５×１０４ＣＦＵ）で回収した（図８ｃ）。非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片よりも共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片から、有意に（ｐ＜０．００１）少ない細菌を単離した（図８ｃ）。
【０１１０】
（処理された鶏肉ブロイラーからのネズミチフス菌の単離）
汚染および上記条件下での保存後に鶏肉片から単離したネズミチフス菌の数を図９に示す。未処理の材料では抗菌活性は認められなかった。ネズミチフス菌は、どの試験の陰性対照片からも単離されなかった。
【０１１１】
加速試験では、陽性対照（中央値２×１０７ＣＦＵ、範囲１×１０６〜３×１０８ＣＦＵ）よりも、有意に（ｐ＜０．００１）少ないネズミチフス菌を、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値３×１０３ＣＦＵ、範囲５００〜４×１０４ＣＦＵ）から回収した。陽性対照と非固定化で処理された鶏肉片（中央値１×１０７ＣＦＵ、範囲１×１０６〜３×１０８ＣＦＵ）との間で有意差は観察されなかった（図９ａ）。共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片から単離された細菌は、非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片よりも有意に（ｐ＜０．００１）少なかった（図９ａ）。
【０１１２】
室温試験では、陽性対照（中央値６×１０４ＣＦＵ、範囲１×１０４〜４×１０５ＣＦＵ）よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片（中央値２．８×１０３ＣＦＵ、範囲４００〜２．８×１０４ＣＦＵ）と非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片（中央値５×１０３ＣＦＵ、範囲１×１０３〜１．２×１０５ＣＦＵ）から有意に（ｐ＜０．００１）少ないネズミチフス菌を回収した（図９ｂ）。非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片から単離された細菌と共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片から単離された細菌との間に有意差は認めらなかった（図９ｂ）。
【０１１３】
冷蔵試験では、陽性対照（中央値２．２×１０５ＣＦＵ、範囲５００〜９×１０５ＣＦＵ）よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片（中央値１×１０３ＣＦＵ、範囲０〜２．３×１０４ＣＦＵ）と非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片（中央値１×１０４ＣＦＵ、範囲２００〜８×１０５ＣＦＵ）から、有意に（ｐ＜０．００１）少ないネズミチフス菌を回収した（図９ｃ）。非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片から、有意に（ｐ＜０．０５）少ない細菌を単離した。
【０１１４】
（処理した鶏肉ブロイラーからの緑膿菌の単離）
汚染および上記条件下での保存後に鶏肉片から単離された緑膿菌の数を図１０に示す。未処理の材料では抗菌活性は認められなかった。緑膿菌は、いかなる試験の陰性対照からも単離されなかった。
【０１１５】
加速試験では、陽性対照（中央値１×１０５ＣＦＵ、範囲５×１０４〜３×１０５ＣＦＵ）よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値２×１０３ＣＦＵ、範囲５００〜５×１０３ＣＦＵ）から有意に（ｐ＜０．００１）少ない緑膿菌を回収し、非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値１．５×１０５ＣＦＵ、範囲５×１０３〜２×１０５ＣＦＵ）から有意に（ｐ＜０．０１）少ない緑膿菌を回収した。非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片よりも共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片から、有意に少ない細菌を単離した（図１０ａ）。
【０１１６】
室温試験では、陽性対照（中央値５．５×１０３ＣＦＵ、範囲５×１０３〜３×１０４ＣＦＵ）よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片（中央値１０５０ＣＦＵ、範囲５００〜４×１０３ＣＦＵ）と非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片（中央値１×１０３ＣＦＵ、範囲５００〜１×１０４ＣＦＵ）から有意に（ｐ＜０．００１）少ない緑膿菌を回収した（図１０ｂ）。非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片から単離された細菌と共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片から単離された細菌の間に有意差は認めらなかった（図１０ｂ）。
【０１１７】
冷蔵試験では、陽性対照（中央値５×１０３ＣＦＵ、範囲５×１０３〜２．５×１０４ＣＦＵ）よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片（中央値１×１０３ＣＦＵ、範囲５００〜２×１０３ＣＦＵ）と非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片（中央値５×１０３ＣＦＵ、範囲５００〜１×１０４ＣＦＵ）から有意に（ｐ＜０．００１）少ない緑膿菌を回収した（図１０ｃ）。非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片よりも共有固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片から、有意に（ｐ＜０．０５）少ない細菌を単離した。
【０１１８】
（処理した鶏肉ブロイラーからのカンピロバクター・ジェジュニおよびネズミチフス菌の共培養物の単離）
単一の細菌種の試験を、細菌の組み合わせ、すなわちカンピロバクター・ジェジュニおよびネズミチフス菌で繰り返した。汚染および上記条件下での保存後に鶏肉片から単離した各タイプの菌数を図１１に示す。
【０１１９】
カンピロバクター・ジェジュニおよびネズミチフス菌は、どの試験の陰性対照からも単離されなかった。加速試験では、陽性対照（中央値１×１０６ＣＦＵ、範囲５×１０３〜３×１０６ＣＦＵ）よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値２．５×１０３ＣＦＵ、範囲５００〜１×１０４ＣＦＵ）および非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値５×１０４ＣＦＵ、範囲５×１０３〜１．５×１０５ＣＦＵ）から、有意に少ないカンピロバクター・ジェジュニを回収した（図１１ａ）。陽性対照（中央値３×１０６、範囲１×１０６〜８×１０６ＣＦＵ）よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値１×１０４ＣＦＵ、範囲１×１０３〜８×１０４ＣＦＵ）および非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値２．２×１０５、範囲１．９×１０３〜５×１０６ＣＦＵ）から、有意に（ｐ＜０．００１）少ないネズミチフス菌を回収した（図１１ａ）。非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片から、有意に（ｐ＜０．０１）少ないカンピロバクター・ジェジュニおよびネズミチフス菌を単離した。
【０１２０】
室温試験では、陽性対照（中央値１．５×１０４ＣＦＵ、範囲１．５×１０３〜６×１０４ＣＦＵ）よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値３００ＣＦＵ、範囲５０〜４×１０３ＣＦＵ）および非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値５×１０３ＣＦＵ、範囲５００〜２×１０４ＣＦＵ）から、有意に少ないカンピロバクター・ジェジュニを回収した（図１１ａ）。陽性対照（中央値１×１０４、範囲１×１０３〜８×１０４ＣＦＵ）よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値８００ＣＦＵ、範囲１００〜２×１０４ＣＦＵ）および非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値１×１０３、範囲１００〜１×１０４ＣＦＵ）から、有意に少ないネズミチフス菌を回収した（図１１ａ）。両鶏肉処理物から単離されたカンピロバクター・ジェジュニ間には有意な差は見られず、そして非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片よりも共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片から、有意に（ｐ＜０．０５）少ないネズミチフス菌を単離した（図１１ａ）。
【０１２１】
冷蔵試験では、陽性対照（中央値１．５×１０４ＣＦＵ、範囲５×１０３〜５×１０４ＣＦＵ）よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値１×１０３ＣＦＵ、範囲４５０〜４．５×１０３ＣＦＵ）および非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値２．５×１０４ＣＦＵ、範囲１×１０３〜２．５×１０４ＣＦＵ）から、有意に少ないカンピロバクター・ジェジュニを回収した（図１１ａ）。陽性対照（中央値６×１０４ＣＦＵ、範囲１×１０４〜１．６×１０５ＣＦＵ）よりも、共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値３×１０３ＣＦＵ、範囲２×１０３〜８×１０３ＣＦＵ）および非固定化バクテリオファージで処理した鶏肉片（中央値１×１０４、範囲１×１０３〜５×１０４ＣＦＵ）から、有意に少ないネズミチフス菌を回収した（図１１ｃ）。両鶏肉処理物から単離されたカンピロバクター・ジェジュニ間には有意な差は見られず、そして非固定化バクテリオファージで処理された鶏肉片よりも共有結合で固定化されたバクテリオファージで処理された鶏肉片から、有意に（ｐ＜０．０５）少ないネズミチフス菌を単離した（図１１ｃ）。
【０１２２】
（結論）
したがって、食品包装に共有結合で固定化されたバクテリオファージは、生の鶏肉片からの細菌の病原性株を有意に減らすことができることが示されている。場合によっては、細菌数は５ｌｏｇ減少した。遊離バクテリオファージは、包装に共有結合で固定化されたバクテリオファージよりも細菌数の減少が少ないことを示した。
【０１２３】
（実施例５）
（鶏肉を横切るバクテリオファージの移動）
バクテリオファージの食品包装への固定化の有効性を決定する鍵となる重要な要素は、包装表面から離れている食品を処理することにある。これを調べるために、バクテリオファージが開始ポイントから鶏皮を横切って移動する程度を決定する実験を行った。
【０１２４】
（実験方法）
実験モデルは鶏皮を使用した。このモデルでは、以下の２つの実験群を使用した：
１．バクテリオファージのみを添加した鶏皮。
２．細菌（カンピロバクター・ジェジュニ）とバクテリオファージとの両方を添加した鶏皮。
【０１２５】
細菌を含む群では、カンピロバクター・ジェジュニのサンプル３０μｌ（１×１０７ｃｆｕ／ｍＬ）を鶏皮６×５ｃｍ２に均等に広げた。これにより、皮１ｃｍ２当たり３×１０５ｃｆｕが均一に分布した。両群において、１０μｌのバクテリオファージ溶解物（１×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）を鶏皮上のあるポイントに添加した。次に皮をポリエチレンフィルムで覆い、４℃でインキュベートした。１６時間後、鶏皮に沿ったさまざまなポイント（元のバクテリオファージ接種のポイントから０．５、１、１．５、２ｃｍ離れたポイント）で鶏皮からサンプルを採取した。これらのサンプルをバクテリオファージについてアッセイした。
【０１２６】
（結果）
両群、すなわち細菌を含む場合と含まない場合の両方で、バクテリオファージを鶏皮から単離した。細菌を含まない群では、元の接種のポイントから１ｃｍの距離までの皮から、いくつかのバクテリオファージを単離した。
【０１２７】
カンピロバクター・ジェジュニ細菌を添加した群では、高い移動率があり、元の接種ポイントから２ｃｍを超える距離で有意なレベルのバクテリオファージを検出した。これらの結果を図１２に示す（このグラフには対数スケールがあり、よって、１ｐｆｕ＝０ｐｆｕである）。
【０１２８】
（結論）
本研究は、バクテリオファージが所定のポイントから生の鶏皮の上を移動できる程度を示している。また、それらが移動できる距離は、ほんの数時間で数センチメートルになり得ることも示している。この移動は、いくつかの理由から生じ得る。まず、各細菌細胞が感染すると、新しいバクテリオファージのバーストおよび放出前にある程度移動して続き、さらなる細菌宿主に感染し得る。第２に、各バクテリオファージは、半径０．１ｃｍの細菌を含む領域をクリアにする（かつ通り抜ける）ことができる可能性がある。これらの両方の要因により、バクテリオファージは、開始ポイントから比較的長い距離で鶏皮上に広がることができる。
【０１２９】
（実験方法）
（増殖培地の調製）
ここで使用するすべての実験用微生物培地およびバクテリオファージ培地を、Oxoidから得た。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、Fisher Scientificから入手し、希釈剤として使用した。すべての微生物培地を、製造元の指示に従って蒸留水を使用して調製した。調製した培地を、使用前に１２１℃で１５分間蒸気滅菌して滅菌した。直ちに使用しない場合は、微生物培地を室温で最大２週間保存した。使用前に、固形寒天をマイクロ波により８００Ｗで５分間溶融させた。寒天プレートを無菌状態で微生物ドラフトチャンバーに無菌的に注いで無菌状態を維持し、プレートあたり２０ｍＬの溶融寒天を３０分間風乾した。無菌技術を用いて液体培地を調製し、滅菌チューブに分注した。
【０１３０】
（供試細菌およびバクテリオファージの検証）
適切な微生物培地での細菌の増殖は、生存可能な株を示した。１×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬの力価を持つバクテリオファージの溶液を、スターター力価として使用した。溶液中のバクテリオファージの濃度を決定するために、溶液を滅菌ＰＢＳで８×１／１０の段階希釈にかけた。各希釈のサンプルを、寒天オーバーレイ法を使用して試験した。増殖培地中の透明なプラークは生存可能なバクテリオファージを示し、バクテリオファージ濃度は、最低希釈のプラークの数を数えることにより決定した。
【０１３１】
したがって、本発明は、食料品を含む対象物を保存するための包装材料、包装材料の使用、ならびにこれらの包装材料の製造のための方法およびシステムを提供する。
【０１３２】
（実施例６）
（ホウレンソウの葉に関する研究）
２枚のプラスチックシートの間に挟んだ葉を用いるモデルシステムを開発した。これらのプラスチックシートは、共有結合で固定化されたバクテリオファージでコーティングされることにより、食品包装に関するパラメータを試験することができる。
【０１３３】
（実験Ａ）
本実験は、ホウレンソウの葉に腐敗を引き起こすと以前に決定された細菌株であるL. amingenを標的とする２つのバクテリオファージのカクテルを使用して行った。このカクテルをプラスチックシート（１面）に共有結合で固定化させた。これに続いて、共有結合で固定化されたバクテリオファージを有するプラスチックのシートをより小さな断片に切断した。モリソンズ（イギリスのスーパーマーケットチェーン）からの５枚のホウレンソウ葉を、正方形の培養皿内に入れた。共有結合で固定化されたバクテリオファージを保有するプラスチックシートの単一片を各葉の上に配置した（バクテリオファージ側を下に向けて）。５枚の未処理の葉の対照も別の正方形の培養皿内に設置した。室温で２日間放置した後、葉を観察し、表５に示す４点評価システムを使用して評価付けした。これらの実験の結果を図１３および１４に示す。
【０１３４】
共有結合で固定化されたバクテリオファージを保有するプラスチックシートと接触している葉は、未処理の対照群よりも良好な状態にあるように見えた。したがって、共有結合で固定化されたファージカクテルは、表面に存在する腐敗細菌から葉を保護するのに有効である。
【０１３５】
（実験Ｂ）
実験Ａとは対照的に、本実験では、１６種類のバクテリオファージ（このプロジェクト用に単離）の異なるカクテルを使用した。小さなプラスチックシートの切り抜きの代わりに、シート全体を使用して葉を「挟み込み」、袋の環境をシミュレートした。バクテリオファージカクテルをプラスチックシートに共有結合で固定化し、実験を正方形の培養皿内に設定し、シートあたり９枚の葉を使用した。対照実験は、共有結合で固定化されたバクテリオファージを使用せずに、２つのプレーンなプラスチックシートの間に葉を挟みこんだ。
【０１３６】
４点等級付けシステム（表５を参照）の代わりに、「食用」スケールを使用して葉を等級付けした。これは、実験を行っている葉が毎日「食べられるか食べられないか」を等級付けすることを含んだ。全体的な食用スコアは、食べられる葉の数を全体（９）で割ることにより決定した。これらの実験の結果を図１６に示す。
【０１３７】
（実施例７）
（サラダ袋腐敗研究）
（セットアップ）
ベビーリーフホウレンソウを、試験の日にモリソンズスーパーマーケットから購入した。各袋には１６０グラムが入っており、２１ｃｍ×２１ｃｍの大きさであった。袋を検査して、腐敗が発生していないこと、および広告された保存期間が３日間であることを確認した。次の各試験条件で合計３つの袋を使用した。
【０１３８】
（バクテリオファージカクテル）
最初の研究で使用したプロトタイプのバクテリオファージカクテルは、３つのバクテリオファージで構成されていた（表４）。試験の前に、各個々のバクテリオファージ溶液を透析を使用して精製した。各バクテリオファージの１０ｍＬ溶液を透析膜に加え、ＰＢＳ内で４℃にて２４時間インキュベートした。
【０１３９】
【表４】
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【０１４０】
（処理の付与）
共有結合で固定化されたバクテリオファージおよび水について、２０ｃｍ×２０ｃｍのポリプロピレンフィルムに７．５ｋＶで２回のコロナ放電処理を施し、２ｍＬのバクテリオファージ溶液を表面に付与した。すべてのシートを層流キャビネットで３０分間乾燥させ、２枚のシートを適切なホウレンソウ袋の上部と底部に追加して、すべての葉を覆った。水の対照のために、滅菌蒸留水をＰＡ／ＰＥフィルムに噴霧し、７．５ｋＶで２回のコロナ放電処理を行った。吸着バクテリオファージ処理では、２ｍＬのバクテリオファージ溶液を葉に噴霧し、袋を振ってバクテリオファージ溶液を分配した。
【０１４１】
（サラダのインキュベーションおよびサンプリング）
各研究は無作為化かつ盲検化し、各サラダ袋を１４４時間インキュベートし、サンプリングを２４時間ごとに行った。
【０１４２】
（サラダの腐敗分析）
各サラダ袋の腐敗を、訓練を受けた３人のスタッフによって評価した。腐敗を、Garcia-GimenoおよびG. Zurera-Cosanoで以前に記載しそして表５にまとめた方法を使用して評価した(Determination of ready-to-eat vegetable salad shelf-life (1997). Int. J. Food Microbiol. 36: 31-38)。褐変、色、およびテクスチャを評価して、各袋の平均鮮度スコアを作成した。
【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
結果−腐敗研究
ホウレンソウの各袋を鮮度スコアについて毎日評価した。鮮度スコア３以上を許容範囲であると判断した。
【０１４５】
すべてのホウレンソウサンプルが、時間の経過とともに鮮度スコアが低下することが分かった（図１７）。結果は、包装材料に共有結合で固定化されたバクテリオファージが、カットオフ３で１日を超えて、カットオフ２で２日を超えて、袋入りサラダの保存期間を延長できることを示している。この結果は、スペイン（例として図６を参照）およびイタリア（結果は示されていない）で生産されたサラダでも再現され、バクテリオファージカクテルがヨーロッパ全体（およびおそらくそれを超えて）での使用に適しており、サラダの腐敗を効果的に減らすことができることを示している。共有結合で固定化されたバクテリオファージが製造プロセスのより早い段階で導入された場合（つまり、サラダが最初に袋詰めされたとき）は、さらに長い保存期間の延長をもたらすと予想される。
【０１４６】
単一ファージおよび上記カクテルのバリエーションの両使用の場合に同様の結果が得られた（図１８）。ＰＭＡ（単一ファージ）は、元のカクテル（カクテル１）中のバクテリオファージの１つを置き換えて、同様の効力を持つが液体培養でより高い収量をもたらす改善されたカクテル（カクテル２）を提供し、これは、工業化がより容易になりかつより大量に生産し得ることを示している。
【０１４７】
共有結合で固定化されたバクテリオファージが保存期間を延長する能力もまた、非固定化バクテリオファージと比較した。共有結合で固定化されたバクテリオファージの現実の利点は、４℃で保存する必要のある液体としてではなく、既存の製造プロセスと適合性のある標準のプラスチックシートに展開できることであるが、共有結合で固定化／付着したバクテリオファージは驚くべきことにまた、遊離バクテリオファージよりも保存期間の延長に効果的であることが示された（図１７）。共有結合で固定化されたバクテリオファージは、以前の実験と一致してサラダの保存期間を延長したが、共有結合で固定化されていない場合（「吸着バクテリオファージ」）の同じカクテルは、いくらかの保存期間の延長をもたらしたが、共有結合で固定化されたバクテリオファージよりも明らかに劣っていた。
【０１４８】
したがって、本発明は、抗細菌包装、その製造および使用を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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