(57)【要約】  抗−ＶＩＳＴＡ抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、これを含む自己免疫疾患の予防又は治療用組成物、及びＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体との併用投与用組成物に関する。【選択図】  図１
2021500068.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、７、１３及び１９から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、８、１４及び２０から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３、９、１５及び２１から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号４、１０、１６及び２２から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１１、１７及び２３から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１２、１８、２４、３４〜４０から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＶＩＳＴＡ（Ｖ−ｄｏｍａｉｎ  Ｉｇ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号２５、２７、２９、３１及び４９から構成される群から選ばれる重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号２６、２８、３０、３２、４１〜４８及び５０から構成される群から選ばれる軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項６】
請求項５の核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項８】
次の段階を含むＶＩＳＴＡに結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
（ａ）請求項７の細胞を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む腫瘍又は自己免疫疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項の抗体又はその抗原結合断片を含む、ＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体との併用投与用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗−ＶＩＳＴＡ抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、これを含む自己免疫疾患の予防又は治療用組成物、及びＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体との併用投与用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫システムは、外部から侵入する病原菌などに対抗するために細胞と組織が関与するネットワークシステムである。反復的に露出される非自己抗原（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ  ａｎｔｉｇｅｎ）に対応するための兔疫体系には、大きく、抗体を用いたＢ−細胞反応（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、細胞を媒介に作動するＴ−細胞反応（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）がある。それらの他に、病源体に対して即時反応できる体系もあるが、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、ＮＫ細胞（ＮＫ  ｃｅｌｌ）及び好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）などの細胞が抗原を除去することに直接関与する。免疫システムは、自己抗原（ｓｅｌｆ  ａｎｔｉｇｅｎ）に対しては免疫システムが作動しないようにクローン選別（ｃｌｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）などが個体発達の初期に作動する。しかし、免疫システムが自己抗原に対して作動することもあるが、これは疾患の原因になる。
【０００３】
リウマチ関節炎はこのような自己免疫疾患の代表疾患である。腫瘍においてもこのような免疫回避機序が作動するということが、様々な研究から明らかになった。これらは免疫細胞の活性を抑制又は増加させることによって抗原に対する免疫を抑制又は増加させることがある。これらの因子に関与する物質を免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）と呼ぶ。最近ではこのような腫瘍に対する免疫抑制機能を妨害したり免疫活性に関与する因子などをより強化したりすることによって腫瘍を治療しようとする様々な試みがなされている。
【０００４】
２０１０年に免疫チェックポイントであるＣＴＬＡ−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４）に対する遮断抗体が悪性黒色腫患者に初めて適用されて約２０％の患者で明確な治療効果が立証され、陰性的免疫調節（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）機能を有する免疫チェックポイントを標的する治療抗体を用いてその作用を抑制させることによって抗癌免疫反応を亢進させ、癌を治療する新しい治療概念が台頭してきた。
【０００５】
次に開発された抗−ＰＤ−１又は抗−ＰＤ−Ｌ１抗体は、抗−ＣＴＬＡ−４抗体に比べてより優れた効果を示し、特にＣＴＬＡ−４抗体治療中に患者に現れる深刻な副作用が著しく減り、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、膀胱癌において非常に積極的に用いられている。
【０００６】
特に、今までの抗癌免疫療法は、従来の癌治療法、すなわち、手術、抗癌剤、放射線治療などに失敗した患者に対して間欠的に選択されたが、副作用の減った抗―ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体の開発によって一次治療様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）として選択されており、既存の治療法に反応しない、様々な癌腫、例えば胃癌、肝癌などへも治療の範囲を広げ、積極的に臨床試験を進めている。
【０００７】
ＰＤ−１標的治療剤は、Ｔ−細胞の免疫調節を活性化させる機序を有しており、ＰＤ−Ｌ１はＰＤ−１のリガンドであり、腫瘍細胞で発現するＰＤ−Ｌ１に結合してＴ−細胞による免疫抑制を妨害することによって抗癌活性を示す。このような活性をより極大化するためには、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１とは重複しない免疫抑制機序の組成物が必要である。それらの物質と既存治療剤との併用治療は腫瘍患者の治療効能を改善する上で非常に有用な手段になるだろう。
【０００８】
ＶＩＳＴＡ（Ｖ−ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｉｇ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、最近に明らかになった免疫チェックポイント物質であり、Ｔ−細胞の活性を直接抑制するものと知られている。ＶＩＳＴＡの発現は、造血母細胞（ｈｅｍｏｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）で発現し続くが、中でも、骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）系列細胞で最も発現し、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋調節Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）では相対的に発現量が低いと知られている。Ｔ細胞を含む大部分の免疫細胞で発現するが、骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）細胞で最も発現すると知られている。したがって、ＶＩＳＴＡを抑制する分子はＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１と異なる標的点を有しており、このことから、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１治療剤との併用治療における効能拡大が期待できる。
【０００９】
構造的には細胞外免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｖ（ＩｇＶ）ｄｏｍａｉｎ）を有している点でＴＩＭファミリーに類似しているといえ、ヒトとマウスのＶＩＳＴＡアミノ酸配列は約９０％の相同性があることが明らかになった。実験によれば、ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインが抗体重鎖のＦｃ部位と結合した形態のＶＩＳＴＡ−ＦｃやＶＩＳＴＡ全アミノ酸配列を発現しているＡＰＣｓ（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）がリガンドとして作用し、ＶＩＳＴＡによってＴ細胞増殖（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）とサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の発現を抑制すると知られている。また、ＶＩＳＴＡ特異的な抗体の場合、自己免疫脳脊髓炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）モデルにおいて疾患の重症度を増加させることもあれば、抗腫瘍免疫活性を高めることもあると知られている（Ｌｅ  Ｍｅｒｃｉｅｒ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００１０】
このようなＶＩＳＴＡの免疫抑制活性を用いて腫瘍抑制治療剤としての開発も可能であるが、ＶＩＳＴＡが有する本来の免疫抑制活性をさらに高めることによってＧｖＨＤ（Ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ）及び自己免疫疾患の治療剤として使用することもできる。マウスＶＩＳＴＡに対する抗体が、野生型Ｔ−細胞（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ）によって誘導されるＧｖＨＤを抑制できることが究明されたのがその例に当たるといえよう（Ｆｉｌｅｓ，ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。これは、エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）によって抗体の活性がアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）又はアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）として働き得るということを示す。したがって、ＶＩＳＴＡに対する抗体を選別するとき、２つの機能を有する抗体を選別できることが期待できる。
【００１１】
このような技術的背景下で、本出願の発明者らは抗−ＶＩＳＴＡ抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者らは、ＶＩＳＴＡに目的の結合力を示す抗−ＶＩＳＴＡ抗体を開発し、このような抗−ＶＩＳＴＡ抗体が目的の免疫抗癌剤又は自己免疫疾患治療剤の役割を果たし得ることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、ＶＩＳＴＡに対する新規抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞及びその製造方法を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む腫瘍又は自己免疫疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む、ＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体と併用投与するための組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号１、７、１３及び１９から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、８、１４及び２０から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３、９、１５及び２１から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号４、１０、１６及び２２から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１１、１７及び２３から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１２、１８、２４、３４〜４０から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＶＩＳＴＡ（Ｖ−ｄｏｍａｉｎ  Ｉｇ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。
【００１９】
本発明はまた、前記核酸を含むベクターを提供する。
【００２０】
本発明はまた、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００２１】
本発明はまた、次の段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階である。
【００２２】
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、腫瘍又は自己免疫疾患の予防又は治療用組成物を提供する。本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片を腫瘍又は自己免疫疾患の患者に投与する段階を含む、腫瘍又は自己免疫疾患の予防又は治療方法を提供する。本発明はさらに、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＩＳＴＡの免疫抑制機序妨害用途及びこれを用いた腫瘍の予防又は治療用途、若しくは前記抗体又はその抗原結合断片のＶＩＳＴＡの免疫抑制能を増加させる用途及びこれによる自己免疫疾患の予防又は治療用途を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、前記抗体又はその抗原結合断片を含む、ＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体との併用投与用組成物を提供する。本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片をＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体と共に患者に投与する段階を含む腫瘍の予防又は治療方法を提供する。本発明はさらに、腫瘍治療において前記抗体又はその抗原結合断片をＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体と併用投与するための用途を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る抗−ＶＩＳＴＡ抗体又はその抗原結合断片は、ＶＩＳＴＡに目的する結合力を示し、目的する癌／腫瘍又は自己免疫疾患の予防又は治療に有用である。本発明によれば、既存の免疫チェックポイントを標的とする治療剤と異なる標的ポイントを有する治療剤を開発することによって、腫瘍の治療において既存治療剤との併用治療及び単独治療法を提供することができ、免疫活性を抑制するチェックポイントの活性を強化することによって新しい免疫抑制治療法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＶＩＳＴＡを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞に単クローンｓｃＦｖファージを反応させてＶＩＳＴＡ発現細胞と単クローンｓｃＦｖファージが結合するか否かを確認した結果である。
【図２】選別された抗−ＶＩＳＴＡ抗体とヒト及びマウスＶＩＳＴＡ抗原の交差反応性（ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）が存在するか否かを確認するためのＥＬＩＳＡ測定結果である。
【図３】ヒト及びマウスＶＩＳＴＡを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞への選別された抗−ＶＩＳＴＡ抗体の結合力を確認した結果である。
【図４】ヒト末梢血液ａｌｌｏ−ＭＬＲ反応で生産されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ方法で測定した結果である。
【図５】抗−ＶＩＳＴＡ抗体投与群で有意の体重減少があることを示す結果である。
【図６】抗−ＶＩＳＴＡ抗体投与群で有意の腫瘍重さの減少があることを示す結果である。
【図７】最適化抗−ＶＩＳＴＡ抗体の機能を評価するために、混合リンパ球反応試験法（ｍｉｘｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＭＬＲ）によって有効に細胞が増殖することを示す結果である。
【図８】最適化抗−ＶＩＳＴＡ抗体の機能を評価するために、混合リンパ球反応試験法（ｍｉｘｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＭＬＲ）によってサイトカイン分泌が増加することを確認した結果である。
【図９】最適化抗−ＶＩＳＴＡ抗体投与群で有意の体重減少があることを示す結果である。
【図１０】最適化抗−ＶＩＳＴＡ抗体投与群で有意の腫瘍重さの減少があることを示す結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
特に定義しない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家にとって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法は、当該技術分野でよく知られており、通常使われるものである。
【００２７】
本発明は一観点において、配列番号１、７、１３及び１９から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、８、１４及び２０から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３、９、１５及び２１から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号４、１０、１６及び２２から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１１、１７及び２３から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１２、１８、２４、３４〜４０から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＶＩＳＴＡ（Ｖ−ｄｏｍａｉｎ  Ｉｇ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００２８】
本明細書で使われる用語、“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗−ＶＩＳＴＡ抗体を意味する。本発明の範囲にはＶＩＳＴＡに特異的に結合する完全な抗体の形態だけでなく、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。
【００２９】
完全な抗体は、２本の全長軽鎖及び２本の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖の定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。
【００３０】
抗体の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうちＦａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の定常領域及び重鎖の最初の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを有する最小の抗体断片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ，ｓｃＦｖ）は一般にペプチドリンカーによって重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されるか、或いはＣ−末端で直接連結されて二本鎖Ｆｖと同様にダイマーのような構造をなし得る。このような抗体断片はタンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペブシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、遺伝子組換え技術によって作製することもできる。
【００３１】
一実施例において、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であるか、完全な抗体形態である。また、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はエプシロン（ε）のいずれか一イソタイプから選ばれ得る。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域はカッパ又はラムダ型であり得る。
【００３２】
本明細書で使われる用語、“重鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片のいずれをも意味する。また、本明細書で使われる用語、“軽鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片のいずれをも意味する。
【００３３】
本発明の抗体は、単クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖ（ｓｄＦＶ）及び抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、又はこれらの抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。
【００３４】
前記単クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から得た抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が、微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異以外は同一であるものを指す。単クローン抗体は高度に特異的であるため、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に、個別の決定因子（エピトープ）に対して指示された個別の抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体製剤とは違い、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一決定因子に対して指示される。
【００３５】
“エピトープ”は、抗体が特異的に結合できるタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは通常、化学的に活性である表面分子群、例えばアミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般に、特定の３次元の構造的特徴だけでなく、特定の電荷特性も有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失するが、後者に対しては消失しないという点で区別される。
【００３６】
前記“ヒト化”形態の非−ヒト（例：ネズミ科（ｍｕｒｉｎｅ））抗体は、非−ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基を、目的する特異性、親和性及び能力を保有している非−ヒト種（供与者抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ又は非−ヒト霊長類の超可変領域からの残基に置き換えたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。
【００３７】
前記“ヒト抗体”は、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であり、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンで構成されているものを意味する。
【００３８】
前記ヒト抗体には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来するか、特別な抗体分類又は亜分類に属する抗体内の相応する配列と同一又は相同性である反面、残りの鎖は他の種から由来するか、他の抗体分類又は亜分類に属する抗体内の相応する配列と同一又は相同性である、“キメラ”抗体（免疫グロブリン）の他に、目的する生物学的活性を示す前記抗体の断片も含まれる。
【００３９】
本願におけるような“抗体可変ドメイン”とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分のことを指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。
【００４０】
“相補性決定領域”（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）とは、抗原結合のために必要な、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。
【００４１】
本発明において、前記ＶＩＳＴＡに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【００４２】
“骨格領域”（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。
【００４３】
“Ｆｖ”断片は、完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインが、例えばｓｃＦｖで堅固に事実上共有的に連合した二量体からなる。
【００４４】
“Ｆａｂ”断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと、重鎖の可変及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は一般に、それらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端近傍に共有的に連結される一対のＦａｂ断片を含む。
【００４５】
“一本鎖Ｆｖ”又は“ｓｃＦｖ”抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的の構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。
【００４６】
ＶＩＳＴＡ抗体は一本鎖又は二本鎖を含むことができる。機能的に、ＶＩＳＴＡ抗体の結合親和性は１０−５Ｍ〜１０−１２Ｍ範囲内にある。例えば、ＶＩＳＴＡ抗体の結合親和性は、１０−６Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−７Ｍ又は１０−５Ｍ〜１０−６Ｍである。
【００４７】
前記ＶＩＳＴＡに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２５、２７、２９、３１及び４９から構成される群から選ばれる重鎖可変領域を含むことができる。また、前記ＶＩＳＴＡに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２６、２８、３０、３２、４１〜４８、及び５０から構成される群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことができる。
【００４８】
本発明に係る具体的実施例において、配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号２６の軽鎖可変領域；
配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号４１の軽鎖可変領域；
配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号４２の軽鎖可変領域；
配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号４３の軽鎖可変領域；
配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号４４の軽鎖可変領域；
配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号４５の軽鎖可変領域；
配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号４６の軽鎖可変領域；
配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号４７の軽鎖可変領域；
配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号４８の軽鎖可変領域；
配列番号２５の重鎖可変領域及び配列番号５０の軽鎖可変領域；
配列番号４９の重鎖可変領域及び配列番号４８の軽鎖可変領域；
配列番号４９の重鎖可変領域及び配列番号５０の軽鎖可変領域；
配列番号２７の重鎖可変領域及び配列番号２８の軽鎖可変領域；
配列番号２９の重鎖可変領域及び配列番号３０の軽鎖可変領域；又は
配列番号３１の重鎖可変領域及び配列番号３２の軽鎖可変領域を含むことができる。
【００４９】
“ファージディスプレイ”は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージ粒子の表面上に外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速且つ効率よく分類できるという事実にある。ペプチド及びタンパク質ライブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を有するポリペプチドを探るために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに用いられてきた。
【００５０】
ファージディスプレイ技術は、特定リガンド（例：抗原）と結合する新規タンパク質を生成及び選別するための強力な道具を提供した。ファージディスプレイ技術を用いて、タンパク質変異体の大きなライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外皮タンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を暗号化する核酸配列と融合させる。タンパク質又はポリペプチドを暗号化する核酸配列を遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた一価ファージディスプレイシステムが開発された。一価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現するので、粒子感染性が維持される。
【００５１】
繊維状ファージ表面上におけるペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉの周辺細胞質における機能性抗体断片の発現を立証することが、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発する上で重要である。抗体又は抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、数多くの方式、例えば、無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法又は関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象にして、目的する特徴を伴う抗体又は抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングすることができる。
【００５２】
ファージディスプレイ技術は、目的する特徴を持つ抗体を製造するための通常のハイブリドーマ及び組換え方法に比べていくつかの利点を有する。このような技術は、動物を使用しなくとも短時間で様々な配列を持つ大きい抗体ライブラリーを生成可能にする。ハイブリドーマの製造やヒト化抗体の製造は数ヵ月の期間を要することがある。また、免疫が一切要求されないため、ファージ抗体ライブラリーは、毒性又は低抗原性の抗原に対しても抗体を生成させることができる。また、ファージ抗体ライブラリーを用いて新規の治療的抗体を生成及び確認することができる。
【００５３】
ファージディスプレイライブラリーを用いて免疫させた、非−免疫させたヒト、生殖細胞系配列、又は未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗体を生成させる技術を用いることができる。各種リンパ系組織を使用して、未感作又は非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認及び分離し得る技術は、治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーの大きさ、細菌性細胞中における生産効率及びライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーの大きさは抗体又は抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディングと停止コドンの存在による非効率的生産によって減少する。細菌性細胞における発現は抗体又は抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制され得る。発現は可変／定常界面の表面又は選別されたＣＤＲ残基における残基を交互に突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞において抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一つの要素である。
【００５４】
高親和性抗体分離において抗体又は抗原結合性タンパク質の様々なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域はそれらがしばしば抗原結合に参加することが明らかになった。重鎖上のＣＤＲ３領域は大きさ、配列及び構造的立体形態面において非常に多様であり、これを用いて様々なライブラリーを製造することができる。
本発明に係る具体的実施例において、抗−ＶＩＳＴＡ抗体クローン１Ｂ８の親和度増進のために抗体最適化を行い、また、１Ｂ８の軽鎖ＣＤＲ３と重鎖ＣＤＲ３に無作為変異を導入し、変異体ｓｃＦｖファージライブラリーを用いてバイオパンニングした結果、配列番号３３〜４０で構成された群から選ばれる一つ以上の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む８種の最適化クローンが得られた。
【００５５】
また、各位置において２０個のアミノ酸を全て用いて可変重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって多様性を発生させることができる。２０個のアミノ酸を全て使用すれば、多様性の大きい変異体抗体配列が生成され、新規の抗体を確認する機会が増加し得る。
【００５６】
本発明の抗体又は抗体断片は、ＶＩＳＴＡを特異的に認識し得る範囲内で、本明細書に記載された本発明の抗−ＶＩＳＴＡ抗体の配列だけでなく、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他生物学的特性をより一層改善させるために抗体のアミノ酸配列に更なる変化を与えることができる。このような変形は例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、模様及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシン及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは類似の大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似の模様を有することがわかる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは生物学的に機能均等物であるといえる。
【００５７】
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すれば、本発明の抗体又はこれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前述した本発明の配列と任意の他の配列をできるだけ対応するようにアラインし、当業界において通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小で９０％の相同性、最も好ましくは最小で９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は当業界に公知である。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）はＮＢＣＩなどから接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用することができる。ＢＬＡＳＴはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／から接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿  ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。
【００５８】
これに基づいて、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載の明示された配列又は全体に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有し得る。このような相同性は、当業界に公知である方法による配列比較及び／又は整列によって決定され得る。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ  ２．０）、手動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。
【００５９】
本発明は他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸に関する。
【００６０】
本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を分離して抗体又はその抗原結合断片を組換え的に生産することができる。核酸を分離し、それを複製可能なベクター内に挿入してさらにクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）又はさらに発現させる。これに基づいて、本発明はさらに他の観点において前記核酸を含むベクターに関する。
【００６１】
“核酸”はＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは自然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は修飾され得る。前記修飾はヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。
【００６２】
前記抗体を暗号化するＤＮＡは通常の過程を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いて）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には一般に、次の一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終結配列。
【００６３】
本明細書で使われる用語、“ベクター”は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターにおいて抗体をコードする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。
“作動的に連結”は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これによって前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボゾーム結合座及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）を利用することができ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
場合によって、ベクターはそれから発現する抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ  Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。
前記ベクターは選択標識として当業界において通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
本発明はさらに他の観点において、前記言及されたベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために使われた細胞は原核生物、酵母又は高等真核生物細胞であり得るが、これに制限されるものではない。
エスケリチアコライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルスサブチリス及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を利用することができる。
ただし、動物細胞への関心が最も高く、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ  ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０であり得るが、これに制限されるものではない。
本発明はさらに他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。
前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用の培地はいずれも制限なく培養培地として使用することができる。当業者に公知であるその他全ての必須補充物が適度の濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞と共に既に使用されており、これは当業者にとって明らかであろう。
前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば遠心分離又は限外ろ過によって不純物を除去し、その結果を例えば親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。更なるその他精製技術、例えば陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどを用いることができる。
【００６４】
本発明はさらに他の観点において、前記抗体を有効成分として含む腫瘍の予防又は治療用組成物に関する。前記抗体は、ＩｇＧ又は可変領域を含む断片、すなわちＳｃＦｖ、Ｆａｂであり得る。また、重鎖の可変領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４であり得る。
【００６５】
本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＶＩＳＴＡに対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む腫瘍の予防又は治療用薬剤学的組成物であり得る。また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を腫瘍患者に投与する段階を含む腫瘍の予防又は治療方法であり得る。さらに、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＩＳＴＡの免疫抑制機序妨害用途及びこれを用いた腫瘍の予防又は治療用途であり得る。
【００６６】
前記組成物に適用される疾患である腫瘍は、典型的に免疫治療療法に反応する腫瘍又は癌、及び今まで免疫療法に関連していない腫瘍又は癌を含む。治療用に好ましい腫瘍又は癌の非制限的例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、透明細胞癌腫）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応前立腺癌腫）、膵臓腺癌腫、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平細胞癌腫、肝癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、及びその他新生物癌腫を含む。さらに、本発明は、本発明の抗体を用いて治療できる不応又は再発癌を含む。
【００６７】
本発明はさらに他の観点において、前記抗体を有効成分として含む腫瘍の予防又は治療用組成物に関する。前記抗体は、ＩｇＧ又は可変領域を含む断片、すなわちＳｃＦｖ、Ｆａｂであり得る。また、重鎖の可変領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４であり得る。
【００６８】
本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＶＩＳＴＡに対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物であり得る。また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を自己免疫疾患患者に投与する段階を含む自己免疫疾患の予防又は治療方法であり得る。さらに、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＩＳＴＡの免疫抑制能を増加させる用途及びこれによる自己免疫疾患の予防又は治療用途であり得る。
【００６９】
前記自己免疫疾患は、例えば、白血病；慢性疲労症候群；移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＶＨＤ）；痛覚過敏；炎症性腸疾患；神経炎症性疾患；大脳虚血を含む虚血／再灌流損傷、それぞれ神経変性を招くこともある外傷、てんかん、出血又は発作の結果としての脳損傷；糖尿病、例えば、１型若年性糖尿病；多発性硬化症；眼疾患；疼痛；膵臓炎；肺線維症；リウマチ性疾患、例えば、リウマチ様関節炎、骨関節炎、若年性（リウマチ様）関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群及び反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎、大脳脈管炎、シェーグレン症候群、リウマチ性発熱、多軟骨炎及び多発性筋肉痛、リウマチ性及び巨大細胞動脈炎；敗血症性ショック；放射線療法による副作用；全身性紅斑性ループス；側頭下顎骨関節疾患；甲状腺炎などであり得る。
【００７０】
”予防”は、本発明に係る組成物の投与によって癌又は自己免疫疾患を抑制させたり進行を遅延させる全ての行為を意味し、”治療”は、癌の発展の抑制、癌の軽減又は癌の除去、又は自己免疫疾患の抑制、自己免疫疾患の軽減又は自己免疫疾患の除去を意味する。
【００７１】
場合によって、前記抗体以外の他の抗癌治療剤を併用することによって腫瘍細胞を効果的に標的化し、抗−腫瘍Ｔ細胞活性を増加させて、腫瘍細胞を標的化する免疫反応を増大させることができる。その他、抗−新生物剤又は免疫原性製剤［（例えば、弱化した癌細胞、腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド及び炭水化物分子を含む）、抗原伝達細胞、例えば、腫瘍由来抗原又は核酸でパルスされた樹状細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮα２、ＧＭ−ＣＳＦ）、及び免疫刺激サイトカインを暗号化する遺伝子で形質感染された細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦを含むが、これに制限されない。）］；標準癌治療療法（例えば、化学治療療法、放射線治療療法又は手術）；又はその他抗体（ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、その他成長因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−ＩＢＢ、及びＩＣＯＳを含むが、これに制限されない。）と共に使用可能である。
【００７２】
具体的に、前記抗体又はその抗原結合断片を含む、ＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体との併用投与用組成物である。また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片をＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体と共に患者に投与する段階を含む腫瘍の予防又は治療方法に関する。さらに、本発明は、腫瘍の予防又は治療において前記抗体又はその抗原結合断片の、ＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体と併用投与するための用途に関する。
【００７３】
前記抗体又はその抗原結合断片とＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体は、同時に投与することができる。また、前記抗体又はその抗原結合断片とＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体は一定の時間間隔をおいて個別に投与することもできる。前記抗体又はその抗原結合断片投与の前又は後にＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体を別途に投与することができる。
【００７４】
前記組成物は、上述した本発明の抗−ＶＩＳＴＡ抗体又はその抗原結合断片を有効成分として用いるので、この両者に共通する内容は記載を省略する。
【００７５】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常使用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合には静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。
経口投与時に、タンパク質又はペプチドが消化されることから、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化する必要がある。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動し得る任意の装置によって投与することができる。
【００７６】
本発明に係る組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、通常の熟練し医師は所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。例えば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書で使う用語“薬剤学的有効量”は、癌又は自己免疫疾患を予防又は治療するに十分な量を意味する。
【００７７】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造したり、又は多用量容器内に内入させて製造することができる。このとき、剤形はオイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であってもよく、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、また、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００７９】
実施例１．ＶＩＳＴＡに結合する抗体の選別
ＶＩＳＴＡに結合する抗体を選別するための抗体ライブラリー及びライブラリーの準備は、韓国公開特許第１０−２００８−０１０９４１７号のような自体のヒト未感作ｓｃＦｖ（ｈｕｍａｎ  ｎａｉｖｅ  ＳｃＦｖ）ライブラリーを用いた。９６ウェル免疫プレートに抗原（ｈＶＩＳＴＡ−Ｆｃ，ＲＮＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃａｔ．Ｎｏ  ７１２６−Ｂ７）を２μｌ／ｍｌで１００μｌずつウェルに入れ、４℃で一晩置く。翌日、抗原コーティングプレート（ｃｏａｔｉｎｇ  ｐｌａｔｅ）はＰＢＳで３回洗浄した後、２％ＢＳＡ遮断バッファ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）２００μｌを入れて室温で２時間反応させる。２ｘＹＴ−ＴＥＴ（テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ）成長培地（ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ）２ｍｌにＸＬ１−Ｂｌｕｅストック（ｓｔｏｃｋ）５０μｌを入れて３７℃、２００ｒｐｍで２時間程度育てた後に１３ｍｌをさらに添加し、ＯＤ６００が０．５になるまで育てる。遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）し、２時間が経つと１ＸＰＢＳで３回洗浄する。洗浄した各ウェルにファージライブラリーグループ（ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｇｒｏｕｐ）を合わせてファージライブラリー量と４％ＢＳＡ量を同一に混ぜた後に２００μｌずつ添加し、室温で３０分間ロッキング（ｒｏｃｋｉｎｇ）した後、２時間反応させる。ファージライブラリー反応が終わると、上澄液を捨て、０．０５％ＰＢＳＴで５回洗浄し、ＰＢＳで５回洗浄した後、各ウェルに１００ｍＭ  ＴＥＡ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１００μｌを入れて室温で１０分間振り動かす。１０分経過すると、各ウェルに１Ｍトリス（ｐＨ７．５）５０μｌを入れて混ぜる。上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）はＯＤ６０００．５になったＸＬ１−ｂｌｕｅ  １０ｍｌに入れて３７℃で３０分間感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させる。感染が終わると、１００μｌはアウトプットタイター（ｏｕｔｐｕｔ  ｔｉｔｅｒ）として使用し、残りは７，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離する。上澄液を捨て、沈殿物はラージスクエアプレート（ｌａｒｇｅ  ｓｑｕａｒｅ  ｐｌａｔｅ：ＣＭ  ３４μｇ／ｍｌ＋１％グルコース）にスプレッド（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）して３０℃で一晩インキュベーション（ｏｖｅｒｎｉｎｇｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する。アウトプットタイターとして残した１００μｌは、１／１０、１／１００、１／１０００に希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）し、ＣＭプレートにスプレッドして３７℃で一晩置く。翌日、スクエアプレートに育ったコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）は２ｘＹＴ培地５０ｍｌを入れた後、ループ（ｌｏｏｐ）を用いてかき集めた後に７０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上澄液を捨て、沈殿液（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）に対して１次パンニングストック（ｐａｎｎｉｎｇ  ｓｔｏｃｋ）を作り、２ｘＹＴ培養培地（ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉａ：ＣＭ  ３４μｇ／ｍｌ＋１％グルコース）１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに入れた後、ＯＤ６０００．２となるように細胞を入れ、２００ｒｐｍ、３７℃でＯＤ６０００．５になるまで育てる。ＯＤ６００値が０．５になるまで細胞を培養した後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ：Ｍ１３ＫＯ７ミュータント）を細胞の２０倍になるように入れる。ヘルパー��ァージを入れて３７℃、３０分感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた後、７０００ｒｐｍ、１０分遠心分離する。上澄液を捨て、細胞は２ｘＹＴ培地（ＣＭ  ３４μｇ／ｍｌ＋Ｋａｎ．  ７０μｇ／ｍｌ＋１ｍＭ  ＩＰＴＧ＋５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１００ｍｌに入れ替えた後、２００ｒｐｍ、３０℃で一晩置く。翌日、育った細胞は７０００ｒｐｍ、１０分、遠心分離し、同一方法でもう１回遠心分離する。集めた上澄液は、上澄液の１／５（ｖ／ｖ）２０％  ＰＥＧ／２．５ｍ  ＮａＣｌを入れてアイス（ｉｃｅ）で１時間沈殿させる。沈殿させた後、７０００ｒｐｍ、１時間遠心分離する。上澄液を捨て、ＰＢＳ  ３ｍｌで沈殿液（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）を溶かした後、０．４５μｍフィルター（ｆｉｌｔｅｒ）に濾過した後に４℃で保管し、これを次のパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）過程で使用する。この過程を３〜４回反復し、抗原に結合する抗体をＥＬＩＳＡを行って確認した。
【００８０】
実施例２．単クローンＳｃＦｖファージＥＬＩＳＡ
パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）過程が終わると、最後のラウンド細胞ストック（ｒｏｕｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔｏｃｋ）をＣＭ寒天プレート（ａｇａｒ  ｐｌａｔｅ）に２００〜５００個のコロニーが形成され得るように希釈して敷いた後、３７℃で一晩置く。翌日、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）が育つと、９６ウェルディーププレート（９６  ｗｅｌｌ  ｄｅｅｐ  ｐｌａｔｅ）に２ｘＹＴ培地（ＣＭ  ３４μｇ／ｍｌ＋１％グルコース）２００μｌを入れ、各ウェルにコロニーを一つずつ入れた後３７℃、３０００ｒｐｍで一晩置く。翌日、新しい９６ウェルディーププレートに２ｘＹＴ培地（ＣＭ  ３４μｇ／ｍｌ＋１％グルコース）２００μｌを入れ、各ウェルに、前日に育てた細胞を２０ｍｌずつ入れた後、３７℃、３０００ｒｐｍ、１時間１０分育てる。残りの細胞は、５０％グリセロールを１００μｌずつ添加して−７０℃で保管する。細胞が育つと、ヘルパーファージ１μｌと２ｘＹＴ培地１９μｌを混ぜた後、各ウェルに２０μｌずつ添加後に３７℃で３０分インキュベーションする。インキュベーションが終わると、３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離する。上澄液を捨て、２ｘＹＴ培地（ＣＭ  ３４μｇ／ｍｌ＋Ｋａｎ．  ７０μｇ／ｍｌ＋１ｍＭ  ＩＰＴＧ＋５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２００μｌを入れてメガグロー（ｍｅｇａｇｒｏｗ）で３０℃、３０００ｒｐｍで一晩置く。
【００８１】
９６ウェル免疫プレートに、Ａｇ（ｈＶＩＳＴＡ−Ｆｃ，ｍＶＩＳＴＡ−Ｆｃ）を１μｇ／ｍｌ作って１００μｌ／ｗｅｌｌずつ入れて４℃で一晩置く。翌日、前日に育てた細胞は３０００ｒｐｍ、１０分遠心分離して４℃で保管する。敷いておいたＡｇは０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄し、２％ＢＳＡ遮断バッファ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）２００μｌずつ入れた後、２５℃、２時間インキュベーションする。遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）が終わると、０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄する。各ウェルに、４％  ＢＳＡ  ５０μｌとダウン（ｄｏｗｎ）して４℃で保管したファージ５０μｌとを混ぜた後、室温で１時間振り動かして反応させる。ファージ結合（ｐｈａｇｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）が終わると、０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ−接合マウス抗−Ｍ１３抗体１：３０００（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｍ１３  Ａｂ）（＃ＧＥ２７−９４２１−０１）を１００μｌずつ入れた後、２５℃で１時間反応させる。反応が終わると、０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＢＤ  ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｅｔ  ５５５２１４）を１００μｌずつ入れて３〜５分間発色させた後、停止溶液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５０μｌずつ入れてＥＬＩＳＡリーダ（ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ）で分析する。
【００８２】
【表１】
2021500068.tif 000003
【００８３】
選別された抗体は、次の表２の通りである。
【００８４】
【表２Ａ】
2021500068.tif 000004
【表２Ｂ】
2021500068.tif 000005
【００８５】
【表３】
2021500068.tif 000006
【００８６】
実施例３．ＶＩＳＴＡ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞への抗−ＶＩＳＴＡ  ＳｃＦＶファージ結合
選別された抗体がＶＩＳＴＡを発現している細胞に結合するか否かを確認するために、ヒトＶＩＳＴＡ及びマウスＶＩＳＴＡを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を作製した。作製された細胞をＦＡＣＳバッファ（２％  ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ）に４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌにして９６ウェルディーププレートに５０μｌずつ入れた後、ファージインキュベーション（ｐｈａｇｅ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）したファージ上澄液を５０μｌずつ入れて室温で１時間インキュベーションする。インキュベーションが終わると、各ウェルにＦＡＣＳバッファを４００μｌずつ添加した後、２０００ｒｐｍ、５分間遠心分離する。上澄液を捨て、ａｎｔｉ−Ｍ１３抗体（１：１０００）を１００μｌずつ入れた後、４℃で１時間反応させる。反応が終わると、各ウェルにＦＡＣＳバッファを４００μｌずつ添加した後、２０００ｒｐｍ、５分間遠心分離する。上澄液を捨て、抗−マウスＩｇＧ−ＰＥ抗体（１：５００）を１００μｌずつ入れた後、４℃で１時間反応させる。反応が終わると、各ウェルにＦＡＣＳバッファを４００μｌずつ添加した後、２０００ｒｐｍ、５分間遠心分離する。上澄液を捨て、ＦＡＣＳバッファを２００μｌずつ入れた後、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を用いて分析した。その結果を図１に示した。
【００８７】
図１に見られるように、選別された抗体はいずれも、ヒトＶＩＳＴＡを過発現させるように製造されたＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合することが確認された。陰性対照群として使用された６Ａ６は結合しなく、陽性対照群として使用されたＶＩＳＴＡ抗体（ｒｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＦＡＢ７１２６１Ａ）は予想通り細胞によく結合した。
【００８８】
実施例４．抗ＶＩＳＴＡ  ＩｇＧ発現
選別したｓｃＦｖファージのＩｇＧ形態への転換は、分子生物学的手法を用いて行った。選別したＥ．Ｃｏｌｉクローンからファージミド（Ｐｈａｇｅｍｉｄ）を抽出し、制限酵素Ｓｆｉ  Ｉ（Ｒ０１２３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳ）で二重切断して重鎖可変領域ＤＮＡ断片を確保し、重鎖定常領域を含むベクターｐＩｇＧＨＤ−６Ａ６ＨｖｙをＳｆｉ  Ｉ処理後に可変領域ＤＮＡ断片を挿入した。同一の方法でファージミドを制限酵素ＢｓｔＸ  Ｉ（Ｒ０１１３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で二重切断して軽鎖可変領域ＤＮＡ断片を確保し、軽鎖定常領域を含むｐＩｇＧＬＤ−６Ａ６ＬｇｔベクターをＢｓｔＸ  Ｉで二重切断後に可変領域ＤＮＡ断片を挿入してＩｇＧ形態のＤＮＡクローニングを完了した。
【００８９】
ＩｇＧの一時発現は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現システムキット（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｋｉｔ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）を使用した。キットに含まれたＥｘｐｉ２９３細胞を専用培地を用いて、３７℃、５％  ＣＯ２環境下で１２５ｒｐｍオービタルシェーカー上に浮遊培養した。３日ごとに３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように継代培養し、発現ベクター導入時には３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように細胞数を調整して使用した。遺伝子導入は、専用試薬であるＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用し、細胞懸濁液１ｍｌ当たり発現ベクターＤＮＡ  １μｇとＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２．７μｌを含有するＬｉｐｉｄ−ＤＮＡ複合体を作製、細胞懸濁液に添加し、導入１６〜１８時間後にエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）１／２を添加して発現を誘導した。その後、同一条件で３〜４日間培養後、援心分離してＩｇＧ含有上澄液を取った。
【００９０】
実施例５．抗−ＰＤ−Ｌ１抗体の精製
取得した上澄液をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入し、親和力クロマトグラフィーを用いてＩｇＧを精製した。カラムを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に平衡化した後、上澄液を注入し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０（ｐＨ７．０）溶液で洗浄した後、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）で溶出後に１Ｍトリスで中和した。溶出したタンパク質は、ＭＷＣＯ  １０，０００  ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ，ＵＳ）を用いた透析過程によってＰＢＳに溶媒を入れ替えた。その後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，ＤＥ）を用いて必要濃度に濃縮し、分注後に−８０℃で保管した。
【００９１】
精製後、各抗体は非還元及び還元ＬＤＳサンプルバッファ（Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ及びＲｅｄｕｃｉｎｇ  ＬＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に処理し、ＮｕＰＡＧＥ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて電気泳動した。その結果、５０ｋＤａの重鎖及び２５ｋＤａの軽鎖を含む合計分子量約１５０ｋＤａのＩｇＧを得た。
【００９２】
実施例６．抗−ＶＩＳＴＡ抗体の抗原への結合力
選別された抗体の抗原に対する結合力をＯｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて測定した。そのために抗体をバイオセンサー（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）に固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ）した後、様々な濃度の抗原を９６ウェルに入れて測定した。
【００９３】
【表４】
2021500068.tif 000007
【００９４】
実施例７．抗−ＶＩＳＴＡ抗体のヒト及びマウスＶＩＳＴＡに対する交差反応性（ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）
ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ：９６ウェルプレートに、Ａｇ（ヒトＶＩＳＴＡ−Ｆｃ、マウスＶＩＳＴＡ−Ｆｃ）をそれぞれ１μｇ／ｍｌ作って１００μｌ／ｗｅｌｌずつ入れ、４℃で一晩置く。翌日、敷いておいたＡｇは、０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄し、２％  ＢＳＡ遮断バッファ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）２００μｌずつ入れた後、２５℃で２時間インキュベーションする。遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）が終わると、０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄する。各抗体を１μｇ／ｍｌ作って１００μｌ／ｗｅｌｌずつ入れて２５℃で１時間インキュベーションする。インキュベーションが終わると、０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄し、ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（ｋａｐｐａ）ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  １：２０００（ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂ  ＃Ａ８０−１１５Ｐ）を１００μｌずつ入れた後、２５℃で３０分インキュベーションした。インキュベーションが終わると、０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢ（ＢＤ  ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｅｔ  ＃５５５２１４）を１００μｌずつ入れて３〜５分発色させた後、停止溶液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）５０μｌずつ入れ、ＥＬＩＳＡリーダ（ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ）で分析する。その結果を図２に示した。
【００９５】
図２に示すように、選別された抗体はいずれも、ヒトＶＩＳＴＡに結合し、そのうち、２Ｃ１２抗体はヒトＶＩＳＴＡの他にマウスＶＩＳＴＡにもよく結合することを確認した。
【００９６】
ＦＡＣＳ  ａｓｓａｙ：ＣＨＯ−Ｋ１細胞からヒト及びマウスＶＩＳＴＡ過発現を確認するために、ＦＡＣＳバッファ（２％  ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ）に５×１０６／ｍｌ（５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ＦＡＣＳ  ｔｕｂｅ）作り、選別された抗体は２μｇ／ｍｌ作って、ＦＡＣＳチューブに細胞と抗体をそれぞれ１００μｌずつ入れた後、４℃で３０分インキュベーションする。インキュベーションが終わると、各チューブにＦＡＣＳバッファ２ｍｌずつ添加した後、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離する。上澄液を捨て、Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−Ｆｃ  ＰＥ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（Ａ８０−２４８ＰＥ）１：５００作って各チューブに１００μｌずつ入れた後、４℃で２０分間反応させる。陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）はｈＶＩＳＴＡ過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）細胞（サンプルと同量）にＡＰＣ−ｃｏｎｊｕａｇｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈＶＩＳＴＡ（Ｒ＆Ｄ  ＃７１２６１Ａ）５μｌを入れ、マウスはｍＶＩＳＴＡ過発現細胞（サンプルと同量）にＡＰＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍＶＩＳＴＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃１４３７１０）１μｌを入れた後、４℃で２０分間反応させる。反応が終わると、各ウェルにＦＡＣＳバッファ２ｍｌずつ添加した後、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離する。上澄液を捨て、ＦＡＣＳバッファ２００μｌずつ入れた後、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて分析する。その結果を図３に示した。
【００９７】
図３に見られるように、ＶＩＳＴＡを過発現するように製造されたＣＨＯ−Ｋ１細胞に選別されたａｎｔｉ−ＶＩＳＴＡを処理した時、ＥＬＩＳＡと同様に、選別された抗体はいずれもヒトＶＩＳＴＡが表面に発現するＣＨＯ−Ｋ１と結合し、２Ｃ１２抗体は、マウスＶＩＳＴＡが表面に発現するＣＨＯ−Ｋ１とも結合した。
【００９８】
実施例８．抗−ＶＩＳＴＡ抗体のＡｌｌｏ−ＭＬＲ  ａｓｓａｙ
ヒトの末梢血液５０ｍｌを供与者から採取し、２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳで３倍希釈する。新しい５０ｍｌチューブにフィコールパック（ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ：ＧＥ＃１７−１４４０−０３）１５ｍｌを入れ、希釈された血液３０ｍｌを徐々に乗せた後、２，０００ｒｐｍで４０分間遠心分離する。ＰＢＭＣｓ層を回収して５０ｍｌチューブに移し、洗浄バッファ（２％  ＦＢＳと１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）を満たし、１，６００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって細胞を洗浄する。遠心分離後、上澄液を捨て、反復して洗浄する。遠心分離後に残った細胞ペレット（ｐｅｌｌｅｔｓ）は５０ｍｌの洗浄バッファで溶かして単一細胞にした後、細胞ストレーナー（ｓｔｒａｉｎｅｒ：４０ｕｍ）を用いて死んだ細胞の塊りを除去する。Ａｌｌｏ−ＭＬＲの応答者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として使用する細胞（供与者Ａ或いはＢ）は、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度でＭＬＲ培地（１０％  ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルベート、ＮＥＡＡ（１００Ｘ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％抗生物質（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、１０−５Ｍ  β−ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に希釈する。刺激剤（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）として使用する細胞（供与者Ｂ或いはＡ）は、ミトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ：ＭＭＣ）を処理して細胞増殖を抑制する。詳細な方法は次の通りである。刺激剤（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）として使用する細胞を５０ｍｌチューブに４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度でＭＬＲ培地に希釈した後、ＭＭＣを２５μｇ／ｍｌになるように添加して３７℃で３０分反応させる。反応が終わった後に洗浄バッファを５０ｍｌチューブに一杯満たした後、１２００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して洗浄する。この過程を４回反復してＭＭＣを完全に除去する。最後に４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度になるようにＭＬＲ培地に希釈する。準備した細胞はそれぞれ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（５０μｌ）になるように９６ウェル細胞培養プレートに分注する。分析する抗体を、最終濃度３０μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌとなるように５０μｌを添加する。各抗体の濃度別に３ウェルずつ試験する。そして、３７℃、ＣＯ２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で５日間培養した後、５０μｌの細胞培養上澄液はＩＦＮ−γ生産量測定のために別に保管し、残りの細胞は細胞増殖を分析する。細胞増殖は、ａｌｌｏ−ＭＬＲ後に残っている細胞で生成されるＡＴＰの量を測定することによって分析する。詳細な方法は次の通りである。１００μｌ（細胞培養液と同量）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）溶液を培養された細胞に添加して室温で１０分間反応させることによって細胞を溶解させる。光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で細胞生存度（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定する。その結果を図４に示した。
【００９９】
図４に見られるように、非特異的抗体（ｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ）を処理した群に比べてより多くのインターフェロン−ガンマの発現を誘導することはｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ（陽性対照群）と１Ｂ８クローンであり、他のクローンはいずれもｗｈｏｌｅ  ＩｇＧに比べて低いインターフェロン−ガンマ発現を誘導した。すなわち、これらのクローンは、インターフェロン−ガンマの発現を抑制するクローンである。このうち、２Ｃ１２、１Ａ１２、３Ｃ５は優れたインターフェロン−ガンマの発現抑制能を示した。
【０１００】
実施例９．抗−ＶＩＳＴＡ抗体の抗腫瘍活性
抗−ＶＩＳＴＡ抗体の抗腫瘍活性を評価するためにヒト由来乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房脂肪（ｍａｍｍａｒｙ  ｆａｔ）をパッド（ｐａｄ）に移植したＮＳＧマウスにおいてヒトＰＢＭＣとＪＮＪ６１６１０５８８、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、抗−ＶＩＳＴＡ  ｍＡｂ  １Ｂ８治療剤の微静脈投与による抗癌薬効を評価しようとした。実験は、韓国生命工学研究院実験動物資源センターと共同で行った。
【０１０１】
ヒト由来乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を解凍（ｔｈａｗｉｎｇ）した後、ＣＯ２インキュベーター（Ｆｏｒｍａ，ＵＳＡ）内で温度３７℃、ＣＯ２濃度５％にして培養した。培養最終日に全ての癌細胞を回収して計数し、無血清培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ）を用いて細胞濃度を３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調節した。このように調節された細胞培養液を、マウス乳房脂肪パッドの左／右２カ所にそれぞれ０．１ｍｌ（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）ずつ注入した。
【０１０２】
癌細胞移植後、群別平均腫瘍サイズが４６．９ｍｍ３に到達した時、Ａタイプ（各群の１番マウス）、Ｂタイプ（各群の２番マウス）、Ｃタイプ（各群の３番マウス）、Ｄタイプ（各群の４番マウス）、Ｅタイプ（各群の５番マウス）及びＦタイプ（各群の６番マウス）のＰＢＭＣ（４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をマウス当たり０．１６ｍｌ（０．６４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）ずつ微静脈経路で注入した。
【０１０３】
ＰＢＭＣ分離は、ヒトの末梢血液５０ｍｌを供与者から採取し、２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳで３倍希釈後に、新しい５０ｍｌチューブにフィコールパック（ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ：ＧＥ  ＃１７−１４４０−０３）１５ｍｌを入れ、希釈された血液３０ｍｌを徐々に乗せた後、２，０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。ＰＢＭＣｓ層を回収して５０ｍｌチューブに移し、洗浄バッファ（２％  ＦＢＳと１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）を満たして１，６００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって細胞を洗浄した。遠心分離後に上澄液を捨て、４回反復して洗浄した。遠心分離後に残った細胞ペレット（ｐｅｌｌｅｔｓ）は５０ｍｌの洗浄バッファで溶かして単一細胞にした後、最後に２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度になるようにＰＢＳ培地に希釈した。
【０１０４】
マウス群構成及び投与は、ＰＢＭＣ注入後に薬物投与を開始し、１群ＰＢＭＣ＋ｈｕｍａｎ  ｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ（ｃｏｎｔｒｏｌ）、２群ＰＢＭＣ＋ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ（ＪＮＪ  ６１６１０５８８）、３群ＰＢＭＣ＋ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、４群ＰＢＭＣ＋ａｎｔｉ  ＶＩＳＴＡ  ｍＡｂ（１Ｂ８）、５群ＰＢＭＣ＋ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ＋ａｎｔｉ  ＶＩＳＴＡ  ｍＡｂ（１Ｂ８）の各群に５ｍｇ／ｋｇで微静脈投与した。
【０１０５】
ＰＢＭＣ注入後に薬物を投与し始め、２回／週の投与スケジュールでマウス当たり０．２ｍｌずつ、合計７回微静脈投与した。
【０１０６】
全ての動物に対して投与開始時及び試験期間中の投与直前に一般症状観察及び体重変化、腫瘍大きさ変化を測定した。
【０１０７】
腫瘍サイズの変化は、癌細胞移植後に群別平均腫瘍サイズが４６．９ｍｍ３に到達して２５日目まで総１２回、個体別にバーニアキャリパー（ｖｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて左／右腫瘍の３方向を測定した後、長さ×幅×高さ／２の計算式で表現した。
【０１０８】
薬物投与開始２５日目に群当たり健康なマウスを３匹選抜して眼窩静脈から採血（ＥＤＴＡ  ｔｕｂｅ）した後、ＣＯ２ガスを用いてマウスを致死させた後、脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を摘出してＰＢＳに固定し、腫瘍は右側と左側に分けて分離して化学てんびん（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｌａｎｃｅ）に重さを測定した後、写真撮影後にそれぞれ液体窒素とホルマリンに固定した。
【０１０９】
その結果、試験期間中にいずれの投与群からも特異な一般症状は観察されなかったが、溶媒対照群（ＰＢＭＣ＋ＰＢＳ）２番マウスとＰＢＭＣ＋Ａｎｔｉ−ＶＩＳＴＡ  ｍＡｂ  １Ｂ８投与群５番マウスがそれぞれ、ｄａｙ１７と、ｄａｙ２１から最終日までにおいて初期体重に比べて体重減少を示した（表５及び図５）。
【０１１０】
【表５】
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【０１１１】
薬物投与開始後２５日目にＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍（ｔｕｍｏｒ）を切除してその重さを測定した結果、溶媒対照群（ＰＢＭＣ＋ｈｕｍａｎ  ｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ）と比較して、ＰＢＭＣ＋ＪＮＪ６１６１０５８８（５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＭＣ＋ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＭＣ＋Ａｎｔｉ−ＶＩＳＴＡ  ｍＡｂ  １Ｂ８（５ｍｇ／ｋｇ）及びＰＢＭＣ＋ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ＋Ａｎｔｉ−ＶＩＳＴＡ  ｍＡｂ１Ｂ８（５＋５ｍｇ／ｋｇ）投与群においてそれぞれ、１８．９％（ｐ＜０．０５）、３２．９％（ｐ＜０．００１）、３７．８％（ｐ＜０．００１）及び６０．６％（ｐ＜０．００１）の統計的に有意な腫瘍重さ減少があった（表６、図６）。
【０１１２】
【表６】
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【０１１３】
実施例１０．親和度増進のための変異体の作製及び選別
抗−ＶＩＳＴＡ抗体クローン１Ｂ８の親和度増進のために抗体最適化を行った。１Ｂ８の元のＤＮＡ配列を８０％保存してランダム化（ｒａｎｄｏｍｉｚｅ）させるソフト−ランダム化（ｓｏｆｔ−ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）法を用いて、１Ｂ８の軽鎖ＣＤＲ３と重鎖ＣＤＲ３に無作為変異を導入したプライマーを作製した。これを用いたＰＣＲによって、変異の導入された１Ｂ８の軽鎖可変領域、ＭＥ４の重鎖可変領域コードＤＮＡ断片を確保した。このＤＮＡ断片をそれぞれ１Ｂ８  ｓｃＦｖファージファージミドの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と置換し、１Ｂ８軽鎖ＣＤＲ３変異体ｓｃＦｖファージライブラリー及び重鎖ＣＤＲ３変異体ｓｃＦｖファージＤＮＡライブラリーをそれぞれ作製した。
【０１１４】
変異体ｓｃＦｖファージＤＮＡライブラリーをフェノール−クロロホルム精製後に電気穿孔法を用いて大腸菌株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに形質転換した。形質転換効率分析及びＤＮＡ配列分析によって多様性が確保されたことを確認した後、５００ｍｌ規模で培養してファージ発現を誘導し、ＰＥＧ−沈殿法を用いて１Ｂ８軽鎖ＣＤＲ３変異体ｓｃＦｖファージライブラリーを作製した。
【０１１５】
各変異体ｓｃＦｖファージライブラリーを用いて実施例１で提示した方法によってバイオパンニングを実施した。その後、選別過程では結合を維持する能力の定量的評価指標としてｓｃＦｖの解離速度定数ｋｄｉｓを測定した。その結果、選別された最適化クローン７種は１Ｂ８の重鎖可変領域を維持した。選別された最適化クローン７種に対する解離速度定数測定結果（表７）とアミノ酸配列（表８及び表９）を示した。
【０１１６】
最適化抗−ＶＩＳＴＡ抗体の７種の解離速度定数測定の結果、最も良い抗−ＶＩＳＴＡ．Ｈ２のＣＤＲ３部分のＮ（（Ａｐｓ）をＹ（Ｔｙｒ）に置換してＰＭＣ−３０９．３．３配列を確保し、ＰＭＣ−３０９．３．３の配列をＩＭＧＴソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／）を用いてヒトジャームライン（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）塩基配列と比較分析した結果、重鎖可変領域はＩＧＨＶ１−６９＊０６から由来したことが分かった。ジャームライングループのＩＧＨＶ１−６９＊０６のアミノ酸配列と比較した結果、骨格領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）のアミノ酸の４個の残基が置換されたものと分析された。これに基づいて、抗原結合性は維持しながらフォルディング効率を高めるために、ＦＲ部分を置換して効率を高めたＰＭＣ３０９．３．４を生産した。ＰＭＣ３０９．３．４の具体的配列は、表１０に示す通りである。
【０１１７】
【表７】
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【０１１８】
【表８】
2021500068.tif 000011
【０１１９】
【表９】
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【０１２０】
【表１０】
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【０１２１】
実施例１１．最適化された抗−ＶＩＳＴＡ抗体の物理化学的特成分析
各最適化ｓｃＦｖファージクローンをＩｇＧ形態に変換した。具体的な形態変換のためのＤＮＡクローニング及び生産、精製方法は、実施例４及び実施例５に提示したのと同じ方法を用いた。
【０１２２】
そのうち、生産性に劣るクローンは排除し、最適化された抗−ＶＩＳＴＡ抗体の結合強度を評価するためにオクテット（Ｏｃｔｅｔ）を使用し、実験は、実施例６で提示したのと同じ方法で測定した（表１１）。表１１によれば、最適化によってヒトＶＩＳＴＡに対する結合力が大きく上昇したことが確認できた。
【０１２３】
【表１１】
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【０１２４】
実施例１２．最適化された抗−ＶＩＳＴＡ抗体のＡｌｌｏ−ＭＬＲ  ａｓｓａｙ
最適化された抗体の機能評価のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ上で末梢血液に含まれている免疫細胞の反応性を測定するために、混合リンパ球反応試験法（ｍｉｘｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＭＬＲ）を、実施例８で提示したのと同じ方法で行い、細胞の増殖とサイトカイン（ＩＦＮ−γ）誘導を確認した。
【０１２５】
その結果を図７及び図８に示した。図７及び図８によれば、ＰＭＣ−３０９．３．３薬物が比較群に比べて非常に優れており、濃度依存的細胞の増殖とサイトカイン分泌が増加することを確認した。
【０１２６】
実施例１３．最適化抗−ＶＩＳＴＡ抗体の抗腫瘍活性
抗−ＶＩＳＴＡ抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ヒト由来乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房脂肪（ｍａｍｍａｒｙ  ｆａｔ）をパッド（ｐａｄ）に移植したＮＳＧマウスにおいて実施例７に提示されたのと同じ方法を行い、ヒトＰＢＭＣとＪＮＪ６１６１０５８８、ＰＭＣ−３０９．３．３、ａｎｔｉ−ＶＩＳＴＡ３．４を含めて軽鎖可変領域を交換した薬物（ＰＭＣ−３０９．３．４Ｗ、ＰＭＣ−３０９．３．４ＳＡ）に対する微静脈投与による抗癌薬効を評価した。
【０１２７】
その結果、表１２、表１３、図９及び図１０に見られるように、混合リンパ反応における結果と一致するＰＭＣ−３０９．３．３が最も高い抗癌活性を示した。
【０１２８】
【表１２】
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【０１２９】
【表１３】
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【０１３０】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に述べてきたが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施の態様に過ぎず、それらに本発明の範囲が制限されない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月12日(2020.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、７、１３及び１９から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、８、１４及び２０から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３、９、１５及び２１から構成される群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号４、１０、１６及び２２から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１１、１７及び２３から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１２、１８、２４、３３〜４０から構成される群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＶＩＳＴＡ（Ｖ−ｄｏｍａｉｎ  Ｉｇ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、  配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号２５、２７、２９、３１及び４９から構成される群から選ばれる重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号２６、２８、３０、３２、４１〜４８及び５０から構成される群から選ばれる軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項６】
請求項５の核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項８】
次の段階を含むＶＩＳＴＡに結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
（ａ）請求項７の細胞を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む腫瘍又は自己免疫疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項の抗体又はその抗原結合断片を含む、ＰＤ−１抗体又はＰＤ−Ｌ１抗体との併用投与用組成物。
【国際調査報告】
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