(57)【要約】【課題】ＯＸ４０（ＣＤ１３４及びＴＮＦＲＳＦ４としても知られている）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、１型及び２型Ｔヘルパー（Ｔｈ１及びＴｈ２）細胞及び制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を含む活性化Ｔ細胞において主に発現され、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞においても発現される。【解決手段】本出願は、ＯＸ４０に結合する特異的結合メンバーに関する。この特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位を含み、例えば、癌及び感染症の治療に利用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的結合メンバーであって、ＯＸ４０に結合し、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、前記ＯＸ４０抗原結合部位が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号４３、５４及び７１のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４９；
（ｉｉ）配列番号４３、５４及び４５のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４１；
（ｉｉｉ）配列番号４３、５４及び６２のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４７；
（ｉｖ）配列番号４３、５４及び８０のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−８５；又は
（ｖ）配列番号４３、４４及び４５のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−３８
の第１、第２、及び第３の配列を含み；
前記第１、第２、及び第３の配列が、当該特異的結合メンバーの前記ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループのそれぞれに位置する、特異的結合メンバー。
【請求項２】
当該特異的結合メンバーが、配列番号７２、５５、６３、８１、及び４６のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８のＣＨ３ドメイン配列を含む、請求項１に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３】
当該特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号７４、５７、６５、８３、及び４８のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、若しくはＦＳ２０−２２−３８；又は
（ｉｉ）配列番号７６、５９、６７、８５、及び５０のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、若しくはＦＳ２０−２２−３８
の配列を含む、請求項１又は２に記載の特異的結合メンバー。
【請求項４】
特異的結合メンバーであって、ＯＸ４０に結合し、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、前記ＯＸ４０抗原結合部位が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１２２、１４２及び１３３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１１５；
（ｉｉ）配列番号１２２、１３２及び１３３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１０８；
（ｉｉｉ）配列番号９１、９２及び９３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−５８；
（ｉｖ）配列番号１１１、１１２及び１１３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−９４；
（ｖ）配列番号１２２、１２３及び１０２のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１０２；又は
（ｖｉ）配列番号９１、９２及び１０２のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−６６
の第１、第２、及び第３の配列を含み；
前記第１、第２、及び第３の配列が、前記特異的結合メンバーの前記ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループのそれぞれに位置する、特異的結合メンバー。
【請求項５】
当該特異的結合メンバーが、配列番号１４３、１３４、９４、１１４、１２４、及び１０３のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６のＣＨ３ドメイン配列を含む、請求項２又は４に記載の特異的結合メンバー。
【請求項６】
当該特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１４５、１３６、９６、１１６、１２６、及び１０５のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、若しくはＦＳ２０−３１−６６；又は
（ｉｉ）配列番号１４７、１３８、９８、１１８、１２８、及び１０７のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、若しくはＦＳ２０−３１−６６
の配列を含む、請求項４又は５に記載の特異的結合メンバー。
【請求項７】
特異的結合メンバーであって、ＯＸ４０に結合し、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、前記ＯＸ４０抗原結合部位が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１２、１３及び２３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１３１；
（ｉｉ）配列番号１２、１３及び１４のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１２７；又は
（ｉｉｉ）配列番号１２、１３及び３２のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１３４
の第１、第２、及び第３の配列を含み；
前記第１、第２、及び第３の配列が、前記特異的結合メンバーの前記ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループのそれぞれに位置する、特異的結合メンバー。
【請求項８】
当該特異的結合メンバーが、配列番号２４、１５、及び３３のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４のＣＨ３ドメイン配列を含む、請求項７に記載の特異的結合メンバー。
【請求項９】
当該特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２６、１７、及び３５のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、若しくはＦＳ２０−１１−１３４；又は
（ｉｉ）配列番号２８、１９、及び３７のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、若しくはＦＳ２０−１１−１３４
の配列を含む、請求項７又は８に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１０】
当該特異的結合メンバーが、ＣＤＲベースの抗原結合部位をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１１】
当該特異的結合メンバーが、抗体分子である、請求項１０に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１２】
前記ＣＤＲベースの抗原結合部位が、免疫細胞抗原、腫瘍抗原、及び病原性抗原からなる群から選択される第２の抗原に結合する、請求項１０又は１１に記載の抗体分子。
【請求項１３】
当該特異的結合メンバー又は抗体分子が、Ｆｃγ受容体に結合しない、請求項１から１２のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子をコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む組み換え宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子を産生する方法であって、前記特異的結合メンバー又は抗体分子の産生のための条件下で、請求項１５に記載の組み換え宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項１７】
治療法によるヒト又は動物身体の治療のための方法に使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【請求項１８】
患者における疾患又は障害を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１から１３のいずれか一項に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記治療が、個体における癌又は感染症の治療である、請求項１７に記載の使用のための特異的結合メンバー若しくは抗体分子、又は請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＯＸ４０に結合する特異的結合メンバーに関する。この特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位を含み、例えば、癌及び感染症の治療に利用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞シグナル伝達は、全ての生物の生命に不可欠な部分であり、通常、可溶性リガンド又は表面で発現されるリガンドと相互作用する細胞表面受容体を必要とする。この相互作用は、受容体、リガンド又はその両方に変化をもたらす。例えば、リガンド結合は、受容体を一緒にクラスター化させて二量体又はオリゴマーにする、受容体の構造変化を誘発し得る。次に、このクラスター化効果が、細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす。ＯＸ４０などの、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーを含む、このように活性化される多くの受容体がある。
【０００３】
ＯＸ４０（ＣＤ１３４及びＴＮＦＲＳＦ４としても知られている）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、１型及び２型Ｔヘルパー（Ｔｈ１及びＴｈ２）細胞及び制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を含む活性化Ｔ細胞において主に発現され、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞においても発現される。抗原提示細胞（ＡＰＣ）において発現される、ＯＸ４０と、そのリガンド、ＯＸ４０Ｌとの相互作用は、ＯＸ４０受容体のクラスター化をもたらす。ＯＸ４０Ｌは、他の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体のリガンドの大部分のように、三量体として細胞表面において発現される。ＯＸ４０活性化の提案されるモデルは、表面で発現される三量体ＯＸ４０Ｌとの相互作用が、細胞表面においてモノマー又は予め形成された三量体のいずれかとして存在するＯＸ４０受容体のクラスター化を誘発することである。ＯＸ４０受容体のこのクラスター化効果は、ＮＦｋＢシグナル伝達経路を活性化する（Croft,2010）。次に、ＮＦｋＢシグナル伝達経路の活性化は、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞のクローン性増殖、Ｔ細胞の分化及び生存を増大し、メモリーＴ細胞の生成を促進する。ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用の主な役割は、一次免疫応答の後期に蓄積するエフェクター（保護性又は病原性）Ｔ細胞の数を制御し、ひいては抗原が後に再度遭遇する際の二次免疫応答中に応答するのに利用可能なメモリーＴ細胞の数を増大することである（Croft,2010）。ＯＸ４０は、上述されるように直接、又はＩＬ２及びＩＦＮγなどの炎症性サイトカインの産生の促進を介して間接的に、Ｔ細胞に対するその効果を媒介し得る。ＯＸ４０シグナル伝達はまた、Ｔｒｅｇ細胞の機能を、それらの免疫抑制活性を抑制するように調節し得る（Croft,2010）。
【０００４】
ＯＸ４０アゴニストの治療効果は、マウス腫瘍モデルにおいて実証されている。具体的には、ＯＸ４０アゴニスト（ＯＸ４０Ｌ−Ｉｇ及び抗ＯＸ４０  ｍＡｂ  ＯＸ８６）は、黒色腫、神経膠腫、乳癌及び結腸癌、肉腫、腎臓癌及び前立腺癌のマウス腫瘍モデルにおいて治療的に有効であることが示されている（Weinberg et al.,2000；Morris et al.,2001；Ali et al.,2004；Sadun et al.,2008；Redmond et al.,2009）。ＯＸ４０アゴニスト単独療法の有効性は、腫瘍免疫原性と相関するようであり（Kjaergaard et al.2000）、これは、腫瘍特異的なＴ細胞におけるＯＸ４０発現が、腫瘍抗原による十分なプライミングを必要とすること、及び不十分なプライミングが、免疫原性が低い腫瘍によって提供されることを示唆する。
【０００５】
抗ＯＸ４０アゴニスト抗体の有効性はまた、単独療法として及び他のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と組み合わせて、臨床試験で調査されている。
【０００６】
単独療法としての抗ＯＸ４０  ｍＡｂの臨床試験は、３０人中１２人の患者において許容可能な毒性プロフィール及び少なくとも１つの転移性病変の退縮を示した、進行癌の患者におけるマウスモノクローナル抗ＯＸ４０  ｍＡｂの第Ｉ相試験を含む（Curti et al.,2013）。進行した固形腫瘍を有する患者におけるヒト化抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（ＭＥＤＩ０５６２；MedImmune）の第Ｉ相試験からの暫定的結果は、用量制限毒性（ＤＬＴ）を示さず、３２人中１人の患者が、客観的奏効を示した（Glisson et al.,2016）。
【０００７】
上述されるように、抗ＯＸ４０  ｍＡｂはまた、他のｍＡｂと組み合わされた癌治療において調査されている。例えば、抗ＯＸ４０  ｍＡｂは、進行した固形腫瘍において抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（デュルバルマブ）又は抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ（トレメリムマブ）（ClinicalTrials.gov識別番号：ＮＣＴ０２７０５４８２）のいずれかと組み合わせて試験されている。これらの組合せは、前臨床モデルにおいて試験されており、改善した腫瘍退縮及び生存を示した（Guo et al.,2014;Redmond et al.,2014）。
【０００８】
抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（ＭＯＸＲ０９１６；Genentech）が、局所進行性又は転移性固形腫瘍の治療において、単独療法（ＮＣＴ０２２１９７２４）として及び抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（アテゾリズマブ）と組み合わせて（ＮＣＴ０３０２９８３２）試験されている。ヒト化抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（ＧＳＫ３１７４９９８；GlaxoSmithKline）が、選択された進行性又は再発性固形腫瘍の治療において抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ペンブロリズマブ）と組み合わせて評価されている（ＮＣＴ０２５２８３５７）。ヒト抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（ＰＦ−０４５１８６００；Pfizer）が、局所進行性又は転移性癌の治療において臨床試験で試験され、忍容性良好であることが示され、４８人中２７人の患者において部分奏効（２人の患者）又は安定（２５人の患者）のいずれかを達成した（ＮＣＴ０２３１５０６６；El-Khoueiry et al.,2017）。このｍＡｂはまた、局所進行性又は転移性固形腫瘍の治療において、抗４−１ＢＢアゴニストｍＡｂ（ＰＦ−０５０８２５６６／ウトミルマブ）（ＮＣＴ０２３１５０６６）及び抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（アベルマブ）（ＮＣＴ０２５５４８１２）と組み合わせて試験されている。ヒトＩｇＧ１抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（ＢＭＳ−９８６１７８；Bristol-Myers Squibb）が、進行した又は転移した固形癌の治療において、抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ニボルマブ）若しくは抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（イピリムマブ）のいずれか又はその両方と組み合わせて、臨床試験において試験されている（ＮＣＴ０２７３７４７５）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の記述
本発明者らは、ＣＨ３ドメインに操作されたＯＸ４０抗原結合部位を含む一連の抗体Ｆｃ領域断片（Ｆｃａｂｓ（商標））を単離するために、幅広い選択及び親和性成熟プログラムを実施した。
【００１０】
Ｆｃａｂ分子は、切断型ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインをそれぞれが含む２つの同一のポリペプチド鎖からなる。２つのポリペプチド鎖は、ＣＨ３ドメイン中に存在するヒンジ領域及び疎水性領域において複数のジスルフィド結合を介して一緒に保持される。上記に説明されるように、ＯＸ４０リガンドの、その受容体、ＯＸ４０への最初のライゲーションは、ＯＸ４０受容体のクラスター化、続いて、ＮＦｋＢ細胞内シグナル伝達経路の活性化及びその後の強力なＴ細胞活性の開始をもたらす一連の事象を開始させる。治療剤が効率的に活性化を達成するために、いくつかのＯＸ４０モノマーは、表面で発現される三量体リガンドを模倣するように一緒に架橋される必要がある。ＯＸ４０に結合するそれらの能力に基づいて本発明者らによって単離される抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂのサブセットが、Ｔ細胞表面におけるＯＸ４０のクラスター化及び活性化を引き起こすことが可能であることが示された。これは、抗ＯＸ４０抗体分子のＦａｂアームがそれらの標的に移動し、それに結合することを可能にする、ヒンジ領域における抗体分子の公知の柔軟性と対照的に、Ｆｃａｂ分子の定常ドメイン、特に２つのＣＨ３ドメイン間の堅固な構造及び小さい分子距離を考えると意外であった。Ｆｃａｂ分子の定常ドメイン結合部位の堅固な幾何学形状を考慮すると、これらの結合部位が、最初はＴ細胞表面上で近接していないことがあるＯＸ４０分子のクラスター化及びアゴニズム（agonism）を誘発することが可能であることは予想されていなかった。しかしながら、予想に反して、本明細書に記載される、本発明者らによって得られた結果は、抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂが、インビトロ及びインビボの両方でＯＸ４０のクラスター化及び活性化を誘発することが可能であることを明らかに示す。
【００１１】
高い親和性で二量体ＯＸ４０に結合する、すなわち、高い結合力（avidity）でＯＸ４０に結合することが予想されるＦｃａｂを選択した。二量体ＯＸ４０に対する高い親和性が、ＯＸ４０のクラスター化、及び活性化を誘発するのに有益であると考えられる。
【００１２】
本明細書において言及される「親和性」は、ＫＤによって測定される抗体分子とその同種抗原との間の結合相互作用の強さを指し得る。当業者に容易に明らかになるであろうように、抗体分子が、抗原と複数の結合相互作用を形成することが可能である場合（例えば、抗体分子が、抗原に２価的に結合することが可能である、任意に、抗原が二量体である場合）、ＫＤによって測定される親和性はまた、結合力によって影響され得、それによって、結合力は、抗体−抗原複合体の全体的な強さを指す。
【００１３】
ＯＸ４０のクラスター化及び活性化を誘発することが可能であると本発明者らによって確認されたＦｃａｂを、２つの群に分類した。Ｆｃａｂの第１の群（ＦＳ２０−１１系統）は、ＯＸ４０のクラスター化及び活性化のための例えば抗ＣＨ２ドメイン抗体による架橋に依存していた一方、第２の群（ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１系統）は、架橋の非存在下でさえ、低いレベルのＯＸ４０のクラスター化及び活性化を示した。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、臨床においてＤＬＴを示さなかった。したがって、架橋の非存在下におけるＯＸ４０アゴニスト活性は、臨床治療にとって問題となることは予想されない。それとは反対に、治療される病態に応じて、架橋の非存在下におけるＦｃａｂによる低いレベルのＯＸ４０アゴニスト活性は、有利であり得る。理論に制約されるのを望むものではないが、この特性を有する抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂは、例えば、腫瘍微小環境中の架橋されたＦｃａｂ分子によってその後さらに活性化され得る腫瘍反応性Ｔ細胞のより大きいプールにつながる、架橋の非存在下における腫瘍反応性Ｔ細胞の限られた活性化及び増殖を誘発することによって、癌治療に関して有用であり得るものと考えられる。
【００１４】
ＯＸ４０などのＴＮＦ受容体に特異的な従来の抗体は、典型的に、固有のアゴニスト活性を有さないか又はごくわずかな固有のアゴニスト活性を有するに過ぎず、より高いレベルのＴＮＦ受容体メンバーのクラスター化及び活性化を誘発するために、プロテインＡ又はＧ又は二次抗体などの外部の架橋剤を用いた抗体−ＴＮＦＲＳＦメンバー複合体の二次的な架橋、又は細胞膜に限局されるＦｃγ受容体への抗体の結合を必要とする（Wajant,2015）。架橋の非存在下におけるＴＮＦ受容体に特異的な抗体の低いレベルのアゴニスト活性又はアゴニスト活性の欠如は、通常の２価抗体が、最大で２つのモノマーＴＮＦ受容体を架橋させ得、これはＴＮＦ受容体活性化に不十分であることによって説明可能である。したがって、インビボ有効性のために、ＯＸ４０を標的とする単一特異的な抗体は、ＯＸ４０特異的な抗体の架橋並びにその後のＯＸ４０受容体のクラスター化及び活性化を達成するために、ＯＸ４０発現Ｔ細胞に近接するＦｃγ受容体発現細胞の存在を必要とする。しかしながら、Ｆｃγ受容体媒介性架橋は、非効率的であると考えられる。さらに、Ｆｃγ受容体を発現する細胞が、全身に存在し、したがって、抗体の架橋及びＯＸ４０を発現するＴ細胞の活性化が、例えば腫瘍微小環境などの特定の部位に制限されない。さらに、架橋のためにＦｃγ受容体への有効な結合を媒介するように、このようなＯＸ４０抗体のアイソタイプが選択される必要がある。しかしながら、これは、ＡＤＣＣなどのＦｃγ受容体によって媒介されるエフェクター機能を引き起こす抗体をもたらし、それによって、抗体によって活性化されることが意図されるＴ細胞を除去し得る。
【００１５】
本発明者らは、架橋されたＦｃａｂ−ＯＸ４０複合体（ｍＡｂ２フォーマットにおけるＦｃａｂ）の質量分析法による分析を実施し、これは、複合体の１７％が２つのＯＸ４０部分を含んでいたことを示し、これは、本発明の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂが、ＯＸ４０に２価的に結合し得ることを実証している。
【００１６】
本発明者らは、本発明の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂが、腫瘍抗原などのＯＸ４０に加えて第２の抗原に結合する、多重特異的、例えば二重特異的分子を調製するのに使用され得ることを認識した。好ましくは、多重特異的分子はまた、第２の抗原に２価的に結合するが、第２の抗原が細胞結合腫瘍抗原である場合、抗原の１価結合が、特異的結合メンバー／抗体分子を架橋し、ＯＸ４０のクラスター化及び活性化を誘発するのに十分であることが予想される。
【００１７】
本発明者らは、Ｆａｂ領域を介して第２の抗原に２価的に結合し得る、本発明の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂを含む抗体分子を調製した。本発明者らは、このような二重特異的抗体分子が、従来の抗体分子によって必要とされる例えばＦｃγ受容体の架橋を必要とせずに、前記第２の抗原の存在下で、コンディショナルでＯＸ４０を活性化することが可能であることを示した。同じ効果は、第２の抗原が細胞表面受容体又は多量体可溶性因子であったかどうかにかかわらず観察された。第２の抗原への抗体分子の結合が、前記抗原の部位における抗体分子の架橋を引き起こし、これがひいてはＴ細胞表面におけるＯＸ４０のクラスター化及び活性化をもたらすと考えられる。したがって、抗体分子のアゴニスト活性は、存在している第２の抗原及びＯＸ４０の両方に依存し、又は両方が存在する場合に促進される。言い換えると、アゴニスト活性はコンディショナルである。さらに、抗体分子のアゴニスト活性の増大が、抗体分子の両方の結合部位がそれらのそれぞれの標的に結合されたときに観察され、１つのみの結合部位が結合されたときに観察されなかったため、第２の抗原の存在下における抗体の架橋は、抗体分子の定常ドメイン抗原結合部位を介して結合されるＯＸ４０のクラスター化を助けると考えられる。したがって、本発明の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂを含む多重特異的分子は、例えば腫瘍微小環境中で、疾患に依存して免疫細胞を活性化するのに有効であると予想される。
【００１８】
本発明者らは、本発明の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂを含む二重特異的抗体分子が、インビボで腫瘍成長を抑制することが可能であることを示した。さらに、より有効な腫瘍成長の抑制が、２つの単一特異的な抗体分子の組合せ（ここで、抗体分子の一方が、二重特異的分子と同じ定常ドメインを含み、他方の抗体分子が、二重特異的分子と同じ可変ドメイン結合部位を含んでいた）と比較して、これらの二重特異的抗体分子で観察され、これは、ＯＸ４０の促進されたクラスター化及びシグナル伝達、ひいてはＴ細胞活性化及び対応する抗腫瘍効果が、２つの結合部位が同じ分子中に存在するときに見られたことを示している。
【００１９】
上記に説明されるように、従来の抗体と対照的に、本発明の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂを含む抗体分子は、ＯＸ４０のクラスター化及び活性化を引き起こすためにＦｃγ受容体の架橋に依存しない。Ｆｃγ受容体結合を阻害する突然変異は、当該技術分野において公知であり、本発明の分子に含まれ得る。しかしながら、癌治療などのある状況において、Ｆｃγ受容体結合を保持することが有益であり得る。例えば、抗体分子が、そのＦａｂ領域を介して腫瘍抗原に結合され、ＯＸ４０抗原結合部位が、関与しなかった場合、腫瘍細胞の抗体依存的な細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が誘発されるであろう。このＡＤＣＣ効果は、Ｔ細胞活性化及びその後の、抗体分子によって誘発される腫瘍細胞のＴ細胞媒介性の殺滅に加えて生じるものであろう。
【００２０】
本発明の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂ及び第２の抗原に特異的なＦａｂ領域を含む抗体分子は、好ましくは、ＯＸ４０及び第２の抗原の両方に２価的に結合する。これは、両方の標的の２価結合が、ＯＸ４０を発現するＴ細胞と第２の抗原との間の架橋をより安定させ、それによって、Ｔ細胞が、腫瘍微小環境などの特定の部位に限局され、疾患、例えば腫瘍に作用し得る時間を延長することが予想されるため、有利である。これは、ヘテロ二量体であり、１つのＦａｂアームを介して１価的に各標的抗原に結合する従来の二重特異的抗体フォーマットの大部分と異なる。このような１価相互作用は、より不安定であるだけでなく、多くの場合、第一にＯＸ４０などのＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化を誘発するのに不十分であることが予想される。
【００２１】
本発明の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂを含む抗体分子のさらなる特徴は、ＯＸ４０及び第２の抗原のための２つの抗原結合部位が両方とも、抗体構造自体の中に含まれることである。特に、抗体分子は、その標的の両方に２価的に結合する分子をもたらすために、他のタンパク質がリンカー又は他の手段を介して抗体分子に融合される必要がない。これは、多くの利点を有する。具体的には、抗体分子は、さらなる融合された部分を含まないため、標準的な抗体の産生に用いられるものと類似の方法を用いて産生され得る。リンカーが、時間とともに分解して、抗体分子の不均一な集団をもたらし得るため、この構造はまた、改善した抗体安定性をもたらすことが予測される。１つのみのタンパク質が融合された集団中のそれらの抗体は、２つのタンパク質が融合された抗体と同じくらい効率的に、ＯＸ４０などのＴＮＦＲＳＦ受容体のコンディショナルなアゴニズムを誘発することができないであろう。リンカーの切断又は分解は、患者への治療薬の投与前又は投与後に（例えば酵素的切断又は患者のインビボｐＨによって）起こり、それによって、患者の循環中でその有効性の低下をもたらし得る。本発明の抗体分子中にリンカーがない際、抗体分子は、投与前及び投与後の両方で同じ数の結合部位を保持することが予想される。さらに、融合されたタンパク質若しくはリンカー又はその両方の導入が、抗体分子が患者に投与されるときに免疫原性を誘発し、治療薬の有効性の低下をもたらし得るため、本発明の抗体分子の構造は、分子の免疫原性の観点からも好ましい。
【００２２】
したがって、本発明は、以下を提供する：
［１］  ＯＸ４０に結合し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、ＯＸ４０抗原結合部位が、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８の第１、第２、及び／又は第３、好ましくは、第１及び第３の配列、より好ましくは、第１、第２及び第３の配列を含み、ここで、特異的結合メンバーの第１、第２及び第３の配列が以下のとおりであり：
（ｉ）ＦＳ２０−２２−４９が、配列番号４３、５４及び７１のそれぞれに記載され；
（ｉｉ）ＦＳ２０−２２−４１が、配列番号４３、５４及び４５のそれぞれに記載され；
（ｉｉｉ）ＦＳ２０−２２−４７が、配列番号４３、５４及び６２のそれぞれに記載され；
（ｉｖ）ＦＳ２０−２２−８５が、配列番号４３、５４及び８０のそれぞれに記載され；
（ｖ）ＦＳ２０−２２−３８が、配列番号４３、４４及び４５のそれぞれに記載され；
ここで、第１、第２、及び第３の配列が、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループのそれぞれに位置する、特異的結合メンバー。
【００２３】
［２］  ＯＸ４０に結合し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、ＯＸ４０抗原結合部位が、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６の第１、第２、及び／又は第３、好ましくは、第１及び第３の配列、より好ましくは、第１、第２及び第３の配列を含み、ここで、特異的結合メンバーの第１、第２及び第３の配列が以下のとおりであり：
（ｉ）ＦＳ２０−３１−１１５が、配列番号１２２、１４２及び１３３のそれぞれに記載され；
（ｉｉ）ＦＳ２０−３１−１０８が、配列番号１２２、１３２及び１３３のそれぞれに記載され；
（ｉｉｉ）ＦＳ２０−３１−５８が、配列番号９１、９２及び９３のそれぞれに記載され；
（ｉｖ）ＦＳ２０−３１−９４が、配列番号１１１、１１２及び１１３のそれぞれに記載され；
（ｖ）ＦＳ２０−３１−１０２が、配列番号１２２、１２３及び１０２のそれぞれに記載され；
（ｖｉ）ＦＳ２０−３１−６６が、配列番号９１、９２及び１０２のそれぞれに記載され；
ここで、第１、第２、及び第３の配列が、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループのそれぞれに位置する、特異的結合メンバー。
【００２４】
［３］  ＯＸ４０に結合し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、ＯＸ４０抗原結合部位が、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４の第１、第２、及び／又は第３、好ましくは、第１及び第３の配列、より好ましくは、第１、第２及び第３の配列を含み、ここで、特異的結合メンバーの第１、第２及び第３の配列が以下のとおりであり：
（ｉ）ＦＳ２０−１１−１３１が、配列番号１２、１３及び２３のそれぞれに記載され；
（ｉｉ）ＦＳ２０−１１−１２７が、配列番号１２、１３及び１４のそれぞれに記載され；
（ｉｉｉ）ＦＳ２０−１１−１３４が、配列番号１２、１３及び３２のそれぞれに記載され；
ここで、第１、第２、及び第３の配列が、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループのそれぞれに位置する、特異的結合メンバー。
【００２５】
［４］  第３の配列が、ＣＨ３ドメインの９２及び１０２位の間に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従う、［１］に記載の特異的結合メンバー。
【００２６】
［５］  第３の配列が、ＣＨ３ドメインの９１及び１０２位の間に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従う、［２］に記載の特異的結合メンバー。
【００２７】
［６］  第３の配列が、ＣＨ３ドメインの９６及び１０２位の間に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従う、［３］に記載の特異的結合メンバー。
【００２８】
［７］  特異的結合メンバーが、ＣＨ３ドメインの１４、１５、１６、１７、又は１８位にアミノ酸欠失を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［３］又は［６］に記載の特異的結合メンバー。
【００２９】
［８］  第１の配列が、ＣＨ３ドメインの１３及び１９位の間に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従う、［１］から［７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００３０】
［９］  第２の配列が、ＣＨ３ドメインの４５及び７８位の間に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従う、［１］から［８］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００３１】
［１０］  ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインである、［１］から［９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００３２】
［１１］  特異的結合メンバーが、配列番号７２、５５、６３、８１、及び４６のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８のＣＨ３ドメイン配列を含む、［１］、［４］、及び［８］から［１０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００３３】
［１２］  特異的結合メンバーが、配列番号７２に記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９のＣＨ３ドメイン配列を含む、［１１］に記載の特異的結合メンバー。
【００３４】
［１３］  特異的結合メンバーが、配列番号１４３、１３４、９４、１１４、１２４、及び１０３のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６のＣＨ３ドメイン配列を含む、［２］、［５］、及び［８］から［１０のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００３５】
［１４］  特異的結合メンバーが、配列番号２４、１５、及び３３のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４のＣＨ３ドメイン配列を含む、［３］、［６］、［７］及び［８］から［１０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００３６】
［１５］  特異的結合メンバーが、ＣＨ２ドメイン、好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインをさらに含む、［１］から［１４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００３７】
［１６］  ＣＨ２ドメインが、配列番号５、６又は７に記載される配列を有する、［１５］に記載の特異的結合メンバー。
【００３８】
［１７］  ＣＨ２ドメインのＮ末端に、免疫グロブリンヒンジ領域、又はその部分をさらに含む、［１５］から［１６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００３９】
［１８］  ヒンジ領域、又はその部分が、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、又はその部分である、［１］に記載の特異的結合メンバー。
【００４０】
［１９］  ヒンジ領域が、配列番号１７０に記載される配列又はその断片を有する、［１８］に記載の特異的結合メンバー。
【００４１】
［２０］  ヒンジ領域が、配列番号１７１に記載される配列を有する、［１８］又は［１９］に記載の特異的結合メンバー。
【００４２】
［２１］  特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号７４、５７、６５、８３、及び４８のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、若しくはＦＳ２０−２２−３８；又は
（ｉｉ）配列番号７６、５９、６７、８５、及び５０のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、若しくはＦＳ２０−２２−３８
の配列を含む、［１］、［４］、［８］から［１０］、［１１］から［１２］及び［１５］から［２０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００４３】
［２２］  特異的結合メンバーが、配列番号７４又は配列番号７６に記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９の配列を含む、［２１］に記載の特異的結合メンバー。
【００４４】
［２３］  特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１４５、１３６、９６、１１６、１２６、及び１０５のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、若しくはＦＳ２０−３１−６６；又は
（ｉｉ）配列番号１４７、１３８、９８、１１８、１２８、及び１０７のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、若しくはＦＳ２０−３１−６６
の配列を含む、［２］、［５］、［８］から［１０］、［１３］、及び［１５］から［２０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００４５】
［２４］  特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２６、１７、及び３５のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、若しくはＦＳ２０−１１−１３４；又は
（ｉｉ）配列番号２８、１９、及び３７のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、若しくはＦＳ２０−１１−１３４
の配列を含む、［３］、［６］、［７］から［１０］、及び［１４］から［２０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００４６】
［２５］  特異的結合メンバーが、ヒトＯＸ４０に結合する、［１］から［２４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００４７】
［２６］  ヒトＯＸ４０が、配列番号１６１に記載される配列を有するか、それを含むか又はそれからなる、［２５］に記載の特異的結合メンバー。
【００４８】
［２７］  特異的結合メンバーが、カニクイザルＯＸ４０に結合する、［１］、［２］、［４］、［５］、［８］から［１３］、［１５］から［２３］、及び［２５］から［２６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００４９】
［２８］  カニクイザルＯＸ４０が、配列番号１６６に記載される配列を有するか、それを含むか又はそれからなる、［２７］に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【００５０】
［２９］  特異的結合メンバーが、多重特異的分子である、［１］から［２８］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００５１】
［３０］  特異的結合メンバーが、二重特異的、三重特異的、又は四重特異的分子である、［２９］に記載の特異的結合メンバー。
【００５２】
［３１］  特異的結合メンバーが、二重特異的分子である、［３０］に記載の特異的結合メンバー。
【００５３】
［３２］  特異的結合メンバーが、第２の抗原結合部位をさらに含む、［１］から［３１］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００５４】
［３３］  第２の抗原結合部位が、ＣＤＲベースの抗原結合部位である、［３２］に記載の特異的結合メンバー。
【００５５】
［３４］  第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、［３３］に記載の特異的結合メンバー。
【００５６】
［３５］  第２の抗原結合部位が、重鎖可変及び軽鎖可変ドメインを含む、［３３］から［３４］に記載の特異的結合メンバー。
【００５７】
［３６］  特異的結合メンバーが、抗体分子である、［３２］から［３５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００５８】
［３７］  抗体分子が、ヒトＩｇＧ１分子である、［３６］に記載の抗体分子。
【００５９】
［３８］  抗体分子のＣＤＲベースの抗原結合部位が、免疫細胞抗原、及び疾患抗原からなる群から選択される第２の抗原に結合する、［３３］から［３７］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００６０】
［３９］  疾患抗原が、腫瘍抗原又は病原性抗原である、［３８］に記載の抗体分子。
【００６１】
［４０］  免疫細胞抗原が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである、［３８］に記載の抗体分子。
【００６２】
［４１］  腫瘍抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、［３９］に記載の抗体分子。
【００６３】
［４２］  病原性抗原が、細菌又はウイルス抗原である、［３９］に記載の抗体分子。
【００６４】
［４３］  抗体分子が、第２の抗原の存在下で、Ｔ細胞上に存在するＯＸ４０を活性化することが可能である、［３２］から［４２］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００６５】
［４４］  ＯＸ４０及び第２の抗原への抗体分子の結合が、免疫細胞上のＯＸ４０のクラスター化を引き起こす、［３２］から［４３］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００６６】
［４５］  免疫細胞が、Ｔ細胞である、［４３］又は［４４］に記載の抗体分子。
【００６７】
［４６］  腫瘍抗原が、癌細胞上の細胞表面抗原である、［３８］、［４１］、及び［４３］から［４５］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００６８】
［４７］  腫瘍抗原が、可溶性多量体である、［３８］、［４１］、及び［４３］から［４５］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【００６９】
［４８］  可溶性多量体が、少なくとも二量体である、［４７］に記載の抗体分子。
【００７０】
［４９］  可溶性多量体が、少なくとも三量体である、［４８］に記載の抗体分子。
【００７１】
［５０］  特異的結合メンバー又は抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体への特異的結合メンバー又は抗体分子のＣＨ２ドメインの結合を低減又は抑制するように修飾されている、［１］から［４９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【００７２】
［５１］  特異的結合メンバー又は抗体分子が、Ｆｃγ受容体に結合しない、［１］から［５０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【００７３】
［５２］  Ｆｃγ受容体が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択される、［５０］又は［５１］に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【００７４】
［５３］  特異的結合メンバー又は抗体分子が、生物活性分子にコンジュゲートされる、［１］から［５２］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【００７５】
［５４］  特異的結合メンバー又は抗体分子が、検出可能な標識にコンジュゲートされる、［１］から［５２］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【００７６】
［５５］  ［１］から［５２］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子をコードする核酸分子。
【００７７】
［５６］  核酸分子が、
（ｉ）配列番号７３、５６、６４、８２及び４７のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、若しくはＦＳ２０−２２−３８のＣＨ３ドメイン核酸配列；
（ｉｉ）配列番号１４４、１３５、９５、１１５、１２５、及び１０４のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、若しくはＦＳ２０−３１−６６のＣＨ３ドメイン核酸配列；又は
（ｉｉｉ）配列番号２５、１６、及び３４のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、若しくはＦＳ２０−１１−１３４のＣＨ３ドメイン核酸配列
を含む、［５５］に記載の核酸分子。
【００７８】
［５７］  核酸分子が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号７５、５８、６６、８４及び４９のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、若しくはＦＳ２０−２２−３８；
（ｉｉ）配列番号１４６、１３７、９７、１１７、１２７、及び１０６のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、若しくはＦＳ２０−３１−６６；又は
（ｉｉｉ）配列番号２７、１８、及び３６のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、若しくはＦＳ２０−１１−１３４
の核酸配列を含む、［５５］又は［５６］に記載の核酸分子。
【００７９】
［５８］  核酸分子が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号７７、６０、６８、８６、及び５１のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８；
（ｉｉ）配列番号１４８、１３９、９９、１１９、１２９、及び１０８のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６
（ｉｉ）配列番号２９、２０、及び３８のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４
の核酸配列を含む、［５５］又は［５６］に記載の核酸分子。
【００８０】
［５９］  ［５５］から［５８］のいずれか１つに記載の核酸を含むベクター。
【００８１】
［６０］  ［５５］から［５８］のいずれか１つに記載の核酸、又は［５９］に記載のベクターを含む組み換え宿主細胞。
【００８２】
［６１］  ［１］から［５２］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子を産生する方法であって、特異的結合メンバー又は抗体分子の産生のための条件下で、［６０］に記載の組み換え宿主細胞を培養することを含む、方法。
【００８３】
［６２］  特異的結合メンバー又は抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含む、［６１］に記載の方法。
【００８４】
［６３］  ［１］から［５４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【００８５】
［６４］  治療法によるヒト又は動物身体の治療のための方法に使用するための、［１］から［５４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【００８６】
［６５］  個体における疾患又は障害を治療する方法であって、治療有効量の、［１］から［５４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子を個体に投与することを含む、方法。
【００８７】
［６６］  治療が、個体における癌又は感染症の治療である、［６４］に記載の使用のための特異的結合メンバー若しくは抗体分子、又は［６５］に記載の方法。
【００８８】
［６７］  治療の方法が、第２の治療薬と組み合わせて、特異的結合メンバー又は抗体分子を個体に投与することを含む、［６４］又は［６６］に記載の使用のための特異的結合メンバー又は抗体分子、又は［６５］又は［６６］に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
図面の簡単な説明
【図１Ａ−Ｃ】Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−１１、ＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１３４、ＦＳ２０−２２、ＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−８５、ＦＳ２０−３１、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−１０８、及びＦＳ２０−３１−１１５、並びに野生型（ＷＴ）ＦｃａｂのＣＨ３ドメインの配列のアラインメントを示す。ＷＴ配列と比較される、ＦｃａｂのＣＨ３ドメイン中に存在するＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ、並びにいずれかのアミノ酸置換、欠失（波形符号「〜」によって示される）又は挿入の位置が示される。ＩＭＧＴ、ＩＭＧＴエクソン（連続した番号付け）、ＥＵ及びＫａｂａｔ番号付け方式に従う残基の番号が示される。
【図２】抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ−２放出を示す。各系統（ＦＳ２０−１１、ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１）中の１つの抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂについての代表的なプロットが、図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃのそれぞれに示される。抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂを、モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットで試験した。ＩＬ−２放出を、架橋剤（Ｘｌｉｎｋ）の存在下及び非存在下で試験した。それぞれヒトＩｇＧ１骨格（Ｇ１／４４２０及びＧ１／１１Ｄ４）中の抗ＦＩＴＣ抗体４４２０及び抗ＯＸ４０抗体１１Ｄ４はそれぞれ、陰性対照及び陽性対照として含まれていた。ＩＬ−２放出に対する抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂ及び対照抗体の影響を、増加する濃度で試験した。ＩＬ−２放出の増加によって証明される、Ｔ細胞の活性化の濃度依存性の増加が、架橋された陽性対照ｍＡｂ（Ｇ１／１１Ｄ４）及び抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂによって観察されたが、非架橋の陽性対照ｍＡｂ又は陰性対照ｍＡｂ（Ｇ１／４４２０）によって観察されなかった。モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットのＦＳ２０−１１−１３１  Ｆｃａｂは、架橋の非存在下で活性を示さなかった。モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットのＦＳ２０−２２−４９及びＦＳ２０−３１−１１５  Ｆｃａｂは、架橋の非存在下でいくらかの活性を示し、この活性は、架橋により増加した。
【図３】ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるモック（ＨＥＬ  Ｄ１．３  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットの抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂのインビボ抗腫瘍活性を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスコホート中のＣＴ２６同系モデルの腫瘍成長曲線が示される。ＬＡＬＡ突然変異を有するモック（ＨＥＬ  Ｄ１．３）ｍＡｂ２フォーマットの抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂ（ＯＸ４０／モックｍＡｂ２  ＬＡＬＡ）及びＬＡＬＡ突然変異を有さないモック（ＨＥＬ  Ｄ１．３）ｍＡｂ２フォーマットの抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂ（ＯＸ４０／モックｍＡｂ２）のインビボ抗腫瘍活性を、陽性対照抗マウスＯＸ４０  ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ１骨格中のＯＸ８６；なし／ＯＸ４０ｍＡｂ）及び陰性対照抗体（ヒトＩｇＧ１骨格中の４４２０抗体；なし／ＦＩＴＣ）と比較した。異なる分子を、腫瘍接種の１０、１２及び１４日後に１ｍｇ／ｋｇで投与した。平均腫瘍体積±標準誤差平均がプロットされる。
【図４Ａ−Ｄ】ＨＰＡＣ細胞の存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。ｍＡｂ／ｍＡｂ２を、このアッセイにおいて増加する濃度で使用し、それらのＦｃａｂ／Ｆａｂクローン名に従って標識した。結果は、架橋剤（抗ヒトＣＨ２抗体又はＦＩＴＣ−デキストラン）又はＴＡＡ＋  ＨＰＡＣ細胞のいずれかによって架橋される場合、ＯＸ４０標的化ｍＡｂ／ｍＡｂ２によるＴ細胞の活性化の濃度依存性の増加があることを示す。
【図５Ａ−Ｂ】ＨＰＡＣ細胞の存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。ｍＡｂ／ｍＡｂ２を、このアッセイにおいて増加する濃度で使用し、それらのＦｃａｂ／Ｆａｂクローン名に従って標識した。結果は、架橋剤（抗ヒトＣＨ２抗体又はＦＩＴＣ−デキストラン）又はＴＡＡ＋  ＨＰＡＣ細胞のいずれかによって架橋される場合、ＯＸ４０標的化ｍＡｂ／ｍＡｂ２によるＴ細胞の活性化の濃度依存性の増加があることを示す。
【図６Ａ】ＯＸ４０及びＥｐｈＡ２を標的とするｍＡｂ２が存在している場合、ＥｐｈＡ２発現細胞（ＨＰＡＣ）の存在下でのＴ細胞活性化の増加があったが、ＯＸ４０を標的とする他の抗体が存在しているが、架橋されていない場合にはこのような増加はなかったことを示す。これは、ｍＡｂ２が、２つの標的、ＯＸ４０及びＥｐｈＡ２への結合によって架橋されることを示す。
【図６Ｂ】非生理的架橋剤（抗Ｆｃ抗体又はＦＩＴＣ−デキストラン）の存在下でＯＸ４０活性化Ｔ細胞を標的とする抗体を示す。抗ＥｐｈＡ２及び抗ＦＩＴＣ抗体は、予想どおり、架橋剤の存在下でＴ細胞活性化を誘発しなかった。抗マウスＯＸ４０抗体（Ｇ１／ＯＸ８６）は、抗Ｆｃ抗体によって架橋される場合、いくらかのＴ細胞活性化を誘発した。モックｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０）における抗ＦＩＴＣ  Ｆａｂと対合される際の抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂは、抗ＯＸ４０抗体Ｇ１／ＯＸ８６より低いＥＣ５０及びより高い最大応答で、ＦＩＴＣ−デキストランによって架橋される場合、Ｔ細胞を活性化した。ｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａ）における抗ＥｐｈＡ２  Ｆａｂと対合される際の同じ抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂは、抗ＯＸ４０／抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２と比較してより低いＥＣ５０及び同等の最大応答で、ＨＰＡＣ細胞の存在下でＴ細胞を活性化した。
【図７】Ｇ１／４４２０、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０＋Ｇ１／Ｅ２Ａ、及びＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａで処理されたＢａｌｂ／ｃマウスコホート中のＣＴ２６同系モデルの腫瘍成長曲線を示す。平均腫瘍体積±標準誤差平均がプロットされる。最終日の腫瘍体積を、両側ｔ検定を用いて異なる群間で比較した。抗ｍＯＸ４０／抗ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａ）で処理された群は、対照抗体（Ｇ１／４４２０）で処理された群と比較して、統計的に有意な腫瘍体積減少を示した。
【図８】可溶性ＶＥＧＦの存在下でのＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。ｍＡｂ／ｍＡｂ２を、このアッセイにおいて増加する濃度で試験し、それらのＦｃａｂ／Ｆａｂクローン名に従って標識した。結果は、それらの架橋剤（抗ｈＣＨ２、ＦＩＴＣ−デキストラン又はＶＥＧＦ）によって架橋される場合、ＯＸ４０標的化ｍＡｂ／ｍＡｂ２によるＴ細胞の活性化の濃度依存性の増加があることを示す。
【図９】様々なｍＡｂ／ｍＡｂ２の存在下でのＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。５つの異なるｍＡｂ／ｍＡｂ２を、このアッセイにおいて増加する濃度で試験し、それらのＦｃａｂ／Ｆａｂクローン名（Ｇ１／４４２０、Ｇ１／Ｒ８４、Ｇ１／ＯＸ８６、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０、及びＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｒ８４）に従って標識した。結果は、ＶＥＧＦの存在下で、抗マウスＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｒ８４）によるＴ細胞の活性化の増加があることを示す。この結果は、Ｔ細胞の活性化を増加させるために、架橋がＯＸ４０標的化抗体に必要とされること及び抗ＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２が、Ｆａｂ標的ＶＥＧＦによって架橋され得ることを実証する。
【図１０】Ｇ１／４４２０、Ｇ１／Ｒ８４、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０＋Ｇ１／Ｒ８４、及びＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｒ８４で処理されたＢａｌｂ／ｃマウスコホート中のＣＴ２６同系モデルの腫瘍成長曲線を示す。平均腫瘍体積±標準誤差平均がプロットされ、最終日の腫瘍体積を、両側ｔ検定を用いて異なる群間で比較した。抗ｍＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２抗体処理群は、対照抗体なし／ＦＩＴＣ処理群と比較して、統計的に有意な腫瘍体積減少を示した。この結果は、抗ｍＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２抗体が、モックｍＡｂ２−フォーマットのＯＸ４０  Ｆｃａｂ及びＶＥＧＦ抗体の組合せより、その微小環境中で増加したＶＥＧＦ濃度を有することが示される腫瘍に対してインビボでより良好な抗腫瘍有効性を有することを実証し、これは、抗ｍＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２によって媒介されるＯＸ４０及びＶＥＧＦの二重特異的な嵌合によるＯＸ４０のインビボ架橋が、腫瘍成長を制御するのに有効であることを示す。
【図１１Ａ−Ｃ】Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。抗体を、このアッセイにおいて増加する濃度で使用し、それらのＦｃａｂ／Ｆａｂクローン名に従って標識した。結果は、それらの架橋剤（抗ｈＣＨ２；ＦＩＴＣ−デキストラン）によって架橋される場合、ＯＸ４０標的化抗体によるＴ細胞の活性化の濃度依存性の増加があること、及び抗ＯＸ４０／抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂ２（ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／ＩＣＯＳｊ）、抗ＯＸ４０／抗ＣＤ２７  ｍＡｂ２（ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／６９５）及び抗ＯＸ４０／抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ２（ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／６Ｃ８）は全て、さらなる架橋剤の非存在下で、モックｍＡｂ２フォーマット（ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０）の非架橋の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂのものより優れたアゴニスト活性を有することを示す。
【図１２】Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。抗体を、このアッセイにおいて増加する濃度で使用し、それらのＦｃａｂ／Ｆａｂクローン名に従って標識した。結果は、それらの架橋剤（抗ｈＣＨ２；ＦＩＴＣ−デキストラン）によって架橋される場合、ＯＸ４０標的化抗体によるＴ細胞の活性化の濃度依存性の増加があること、及びさらなる架橋剤を用いない抗ＯＸ４０／抗ＰＤ１  ｍＡｂ２（ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／５Ｃ４）が、架橋された抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂ（ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０  Ｘｌｉｎｋ）のものと同等のアゴニスト活性を有することを示す。
【図１３】Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。抗体を、このアッセイにおいて増加する濃度で使用し、それらのＦｃａｂ／Ｆａｂクローン名に従って標識した。結果は、それらの架橋剤（抗ｈＣＨ２；ＦＩＴＣ−デキストラン）によって架橋される場合、ＯＸ４０標的化抗体によるＴ細胞の活性化の濃度依存性の増加があること、及びさらなる架橋剤を用いない抗ＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２（ＦＳ２０−２２−４１ＡＡ／２５Ｆ７）が、架橋された抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂ（ＦＳ２０−２２−４１ＡＡ／４４２０  Ｘｌｉｎｋ）のものと同等のアゴニスト活性を有することを示す。
【図１４】Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。抗体を、このアッセイにおいて増加する濃度で使用し、それらのＦｃａｂ／Ｆａｂクローン名に従って標識した。結果は、それらの架橋剤（抗ｈＣＨ２；ＦＩＴＣ−デキストラン）によって架橋される場合、ＯＸ４０標的化抗体によるＴ細胞の活性化の濃度依存性の増加があること、及びさらなる架橋剤を用いない抗ＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｃ９Ｂ７Ｗ）が、非架橋の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂ（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０）のものより高いアゴニスト活性を有することを示す。これは、ＬＡＧ３結合Ｆａｂが、抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂを架橋し、Ｔ細胞を活性化することを示す。
【図１５】抗ｍＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２で処理されたＢａｌｂ／ｃマウスコホート中のＣＴ２６同系モデルの腫瘍成長曲線を示す。平均腫瘍体積±標準誤差平均がプロットされ、最終日の腫瘍体積を、両側ｔ検定を用いて異なる群間で比較した。抗ＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２で処理された群は、ＰＢＳで処理された対照群と比較して、統計的に有意な腫瘍体積減少を示した。この結果は、抗ＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２抗体が、ＯＸ４０及びＬＡＧ３発現Ｔ細胞を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含むことが示される腫瘍に対してインビボで抗腫瘍有効性を有することを実証し、これは、抗ＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２によって媒介されるＯＸ４０及びＬＡＧ３の二重特異的な嵌合によるＯＸ４０のインビボクラスター化が、腫瘍成長を制御するのに有効であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
詳細な説明
本発明は、ＯＸ４０に結合する特異的結合メンバーに関する。ＯＸ４０は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）又はＣＤ１３４としても知られている。具体的には、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位を含む。特異的結合メンバーは、好ましくは、ＯＸ４０に２価的に結合することが可能である。特異的結合メンバーは、好ましくは、ヒトＯＸ４０、より好ましくは、ヒト及びカニクイザルＯＸ４０に結合する。特異的結合メンバーによって結合されるＯＸ４０の部分は、好ましくは、ＯＸ４０細胞外ドメインである。ヒト及びカニクイザルＯＸ４０の細胞外ドメインは、配列番号１６１及び１６２のそれぞれに記載される配列を含むか又はそれからなり得る。特異的結合メンバーは、好ましくは、細胞、好ましくは、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、１型Ｔヘルパー（Ｔｈ１）細胞、２型Ｔヘルパー（Ｔｈ２）細胞、又は制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、又は腫瘍浸潤Ｔ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面において発現されるＯＸ４０に結合することが可能である。腫瘍浸潤Ｔ細胞は、多くの癌に見られる一連の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
【００９１】
特異的結合メンバーは、好ましくは、ＯＸ４０に特異的に結合する。「特異的」という用語は、特異的結合メンバーがその特異的結合パートナー以外の分子への顕著な結合を示さない状況をさし得る。「特異的」という用語はまた、特異的結合メンバーが、いくつかの抗原によって保有される、ＯＸ４０上のエピトープなどの特定のエピトープに対して特異的である場合に該当し、その場合、特異的結合メンバーは、エピトープを保有する様々な抗原に結合することが可能であろう。特異的結合メンバーは、好ましくは、結合しないか、又はＣＤ４０、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＮＧＦＲ及び／又はＣＤ１３７への顕著な結合を示さない。
【００９２】
本発明の特異的結合メンバーを、二量体ＯＸ４０に結合するそれらの能力のために選択した。特異的結合メンバーは、モノマーＯＸ４０より高い親和性で二量体ＯＸ４０に結合し得る。二量体ＯＸ４０に対する高い親和性は、ＯＸ４０のクラスター化、ひいてはＴ細胞活性化を誘発するのに有益であると考えられる。高い親和性でＴＮＦ受容体Ｆａｓに結合する抗体は、低下したアゴニスト活性を有することが示された。ＯＸ４０と同様に、Ｆａｓは、活性化のために三量体化を必要とする。ＩｇＧ抗体などの２価アゴニストが、Ｆａｓに結合し、次に、Ｆａｓモノマーをさらに動員するために部分的に解離し、活性なシグナル伝達複合体を形成することが可能でなければならないと考えられる。高い親和性でＦａｓモノマーに結合する抗体は、非シグナル伝達状態に陥っていると考えられる（Chodorge et al.,2012）。
【００９３】
特異的結合メンバーは、好ましくは、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、若しくは１ｎＭの親和性（ＫＤ）又はより高い親和性で二量体ヒトＯＸ４０に結合する。好ましくは、特異的結合メンバーは、１ｎＭの親和性（ＫＤ）、又はより高い親和性でヒトＯＸ４０に結合する。
【００９４】
ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１系統の特異的結合メンバーはまた、二量体カニクイザルＯＸ４０に結合することが示された。カニクイザルＯＸ４０並びにヒトＯＸ４０への結合は、ヒトへの投与前に有効性及び毒性についてカニクイザルにおける特異的結合メンバーの試験を可能にするため有益である。ＦＳ２０−１１系統からの特異的結合メンバーは、二量体カニクイザルＯＸ４０への結合を示したがより親和性が低く、これは、それらがカニクイザルにおける前臨床試験にあまり適していないことを示唆している。
【００９５】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、１５０ｎＭ、１４０ｎＭ、１２０ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、若しくは２ｎＭの親和性（ＫＤ）又はより高い親和性で二量体カニクイザルＯＸ４０に結合し得る。好ましくは、特異的結合メンバーは、２ｎＭの親和性（ＫＤ）、又はより高い親和性でカニクイザルＯＸ４０に結合する。
【００９６】
本発明の実施例に記載されるように、ヒト及びカニクイザル抗原への結合の類似性は、カニクイザル試験におけるｍＡｂ２の挙動をヒトに当てはめることができるであろうと期待され得るため有利であり得ると考えられる。カニクイザルにおける特異的結合メンバーを用いて有効性及び毒性試験を行うことは有益であると考えられ、これは、ヒトにおける特異的結合メンバーの有効性及び毒性の予測であり得る。
【００９７】
したがって、好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーが二量体ヒトＯＸ４０に結合する親和性より１０倍以下、好ましくは、５倍以下低いか又は高い親和性で二量体カニクイザルＯＸ４０に結合する。
【００９８】
ヒト又はカニクイザルＯＸ４０などの同種抗原への特異的結合メンバーの結合親和性は、例えばBiacoreなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定され得る。
【００９９】
特異的結合メンバーは、ＯＸ４０及びそのリガンド、ＯＸ４０Ｌ、好ましくは、ヒトＯＸ４０及びヒトＯＸ４０Ｌの間の相互作用を阻止することが可能であり得る。ＯＸ４０Ｌの、ＯＸ４０への結合を阻止する特異的結合メンバーの能力は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定され得る。
【０１００】
「特異的結合メンバー」という用語は、ＯＸ４０抗原結合部位を含む定常ドメインを含む、免疫グロブリン、又はその断片を表す。したがって、本明細書において使用される際の「特異的結合メンバー」という用語は、抗原結合断片が、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位を含む場合、前記抗原結合断片を含む。定常ドメインは、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＨ４ドメインであり得、好ましくは、定常ドメインは、ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメイン、より好ましくは、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、ＣＨ３ドメインである。特異的結合メンバーは、部分的に、又は完全に、合成的に産生され得る。
【０１０１】
好ましくは、特異的結合メンバーは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメインは、ＯＸ４０抗原結合部位を含む。特異的結合メンバーは、好ましくは、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、２つの（同一の）ポリペプチド鎖の二量体である。好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインのＮ末端に、免疫グロブリンヒンジ領域、又はその部分をさらに含む。このような分子は、本明細書において、抗原結合Ｆｃ断片、又はＦｃａｂ（商標）とも呼ばれる。ヒンジ領域は、配列番号１７０に記載される配列又はその断片からなるか又はそれを含み得る。好ましくは、断片は、配列番号１７０に記載される配列のＣ末端断片である。断片は、最大で２０、最大で１０、最大で８又は最大で６アミノ酸長であり得る。断片は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６アミノ酸長であり得る。好ましい実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号１７１に記載される配列を有する。
【０１０２】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、抗体分子、好ましくは、モノクローナル抗体、又はその断片である。抗体分子は、好ましくは、ヒト又はヒト化抗体である。抗体分子は、免疫グロブリンＧ分子、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４分子、より好ましくは、ＩｇＧ１分子、又はその断片であり得る。
【０１０３】
抗体は、いくつかの方法で修飾され得るため、「抗体分子」という用語は、天然であるか又は完全に若しくは部分的に合成であるかにかかわらず、抗体断片、抗体の誘導体、機能的同等物及びホモログを包含するものと解釈されるべきである。ＣＨ３ドメインを含む抗体断片の一例は、抗体のＦｃドメインである。ＣＤＲ配列及びＣＨ３ドメインの両方を含む抗体断片の一例は、ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディである（Hu et al.,1996）。
【０１０４】
特異的結合メンバーは、ＯＸ４０抗原結合部位を含む。ＯＸ４０抗原結合部位は、特異的結合メンバーの定常ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメイン中に位置する。ＯＸ４０抗原結合部位は、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に１つ以上の修飾された構造ループを含む。標的抗原のための抗原結合部位を形成するための抗体定常ドメイン構造ループの操作は、当該技術分野において公知であり、例えば、Wozniak-Knopp G et al.,2010及び特許公開番号国際公開第２００６／０７２６２０号及び国際公開第２００９／１３２８７６号に記載されている。
【０１０５】
好ましくは、ＯＸ４０抗原結合部位は、修飾されたＡＢ、ＣＤ、及び／又はＥＦ構造ループを含む。本発明者らは、ある場合に、ＡＢ及びＥＦループ配列が、ＣＤループ配列より抗原結合に大きな役割を果たすことを認識している。これは、Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−１１が、ＯＸ４０に結合したが、それらのＣＤループ配列中に修飾を含んでいなかったことから明らかである（図１を参照）。したがって、好ましい実施形態において、ＯＸ４０抗原結合部位は、修飾されたＡＢ及びＥＦ構造ループを含む。別の好ましい実施形態において、ＯＸ４０抗原結合部位は、修飾されたＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループを含む。
【０１０６】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの９５及び９６位における残基は、野生型であり、すなわち、好ましくは、それぞれアルギニン（Ｒ）及びトリプトファン（Ｗ）である。これらの残基は両方とも、ＥＦ構造ループ中に位置する。特に示されない限り、アミノ酸残基の位置は、本明細書において、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従って番号付けされる。ＩＭＧＴ番号付けスキームは、Lefranc et al.,2005に記載されている。
【０１０７】
したがって、特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位は、第１、第２、及び／又は第３の配列、好ましくは、第１及び第３の配列、又は第１、第２、及び第３の配列を含んでいてもよく、ここで、第１、第２及び第３の配列はそれぞれ、特異的結合メンバーの定常ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ構造ループ中に位置する。
【０１０８】
第１、第２及び第３の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、又はＦＳ２０−２２−８５、さらにより好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、又はＦＳ２０−２２−４７、最も好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９のＣＨ３ドメインの第１、第２及び第３の配列であり得る。
【０１０９】
或いは、第１、第２及び第３の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、又はＦＳ２０−３１−１０２、さらにより好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、又はＦＳ２０−３１−１０８、さらにより好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５のＣＨ３ドメインの第１、第２及び第３の配列であり得る。
【０１１０】
さらなる代替例として、第１、第２及び第３の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１のＣＨ３ドメインの第１、第２及び第３の配列であり得る。
【０１１１】
特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−８５、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、及びＦＳ２０−１１−１３４のＣＨ３ドメイン配列は、配列番号４６、５５、６３、７２、８１、９４、１０３、１１４、１２４、１３４、１４３、１５、２４及び３３のそれぞれに示される。
【０１１２】
特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、及びＦＳ２０−２２−３８の第１、第２及び第３の配列は、ＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、及びＦＳ２０−２２−３８のそれぞれのＣＨ３ドメインの以下の位置：
（ｉ）１４から１８、４５．１から７７及び９７から１０１位；又は
（ｉｉ）１４から１８、４５．１から７７及び９３から１０１位
における配列であり得る。
【０１１３】
ＯＸ４０に結合したＦＳ２０−３１系統の親和性成熟の後に確認される７６の特異的結合メンバーの全てが、ＣＨ３ドメインの７７位にアスパラギン酸（Ｄ）残基を含んでおり、これは、この残基が、これらの分子におけるＯＸ４０結合にとって重要である可能性が高いことを示唆している。同様に、ＦＳ２０−３１中の特異的結合メンバーの全てが、ＣＨ３ドメインの４５．３位に野生型グルタミン酸（Ｅ）残基を保持しており、これは、この残基がまた、これらの分子におけるＯＸ４０結合にとって重要であり得ることを示唆している。したがって、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６の第１の配列及び第３の配列を含んでいてもよく、ここで、第１の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６のＣＨ３ドメインの、１４から１８位に位置する配列であり、第２の配列は、９２から１０１、又は９７から１０１位に位置する配列であり、特異的結合メンバーは、ＣＨ３ドメインの７７位におけるアスパラギン酸（Ｄ）残基、及び任意に、ＣＨ３ドメインの４５．３位におけるグルタミン酸（Ｅ）残基をさらに含む。特異的結合メンバーは、ＣＨ３ドメインの４５．１、４５．２及び／又は４５．４位におけるアミノ酸置換を任意にさらに含み得る。
【０１１４】
或いは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、及びＦＳ２０−３１−６６の第１、第２及び第３の配列は、ＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、及びＦＳ２０−３１−６６のそれぞれのＣＨ３ドメインの以下の位置：
（ｉ）１４から１８、４５．１から７７、及び９７から１０１位；又は
（ｉｉ）１４から１８、４５．１から７７、及び９２から１０１位
における配列であり得る。
【０１１５】
特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、及びＦＳ２０−１１−１３４の第１、第２及び第３の配列は、ＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、及びＦＳ２０−１１−１３４のそれぞれのＣＨ３ドメインの以下の位置の間：
（ｉ）１３及び１９、４５．２及び７８、並びに９６及び１０２；
（ｉｉ）１１及び１９、４５．２及び７８、並びに９６及び１０２；
（ｉｉｉ）１３及び１９、４５及び７８、並びに９６及び１０２；又は
（ｉｖ）１１及び１９、４５及び７８、並びに９６及び１０２
の配列であり得る。
【０１１６】
第１、第２及び第３の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、ＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４のそれぞれの完全なＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ構造ループ配列であり得る。例えば、ＩＭＧＴ、ＩＭＧＴエクソン、ＥＵ、又はＫａｂａｔ番号付け方式による、ＣＨ３ドメイン配列におけるＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ構造ループの位置の決定は、当業者の能力の範囲内であり、Hasenhindl et al.(2013)に記載されている。好ましい実施形態において、ＩＭＧＴ番号付け方式によるＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループはそれぞれ、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１０及び１９、４２及び７９、並びに９１及び１０２位の間に位置する。したがって、好ましい実施形態において、第１、第２及び第３の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、ＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４のそれぞれのＣＨ３ドメインの１０及び１９、４２及び７９、並びに９１及び１０２位の間の配列である。
【０１１７】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位は、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号４３、５４及び７１のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４９；
（ｉｉ）配列番号４３、５４及び４５のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４１；
（ｉｉｉ）配列番号４３、５４及び６２のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４７；
（ｉｖ）配列番号４３、５４及び８０のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−８５；又は
（ｖ）配列番号４３、４４及び４５のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−３８
の第１、第２、及び第３の配列を含み；
ここで、第１、第２及び第３の配列はそれぞれ、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１４から１８、４５．１から７７、及び９３から１０１位に位置する。
【０１１８】
より好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位は、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号４３、５４及び７１のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４９；
（ｉｉ）配列番号４３、５４及び４５のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４１；
（ｉｉｉ）配列番号４３、５４及び６２のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４７；又は
（ｉｖ）配列番号４３、５４及び８０のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−８５
の第１、第２、及び第３の配列を含む。
【０１１９】
さらにより好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位は、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号４３、５４及び７１のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４９；
（ｉｉ）配列番号４３、５４及び４５のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４１；又は
（ｉｉｉ）配列番号４３、５４及び６２のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４７
の第１、第２、及び第３の配列を含む。
【０１２０】
さらにより好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位は、配列番号４３、５４及び７１のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９の第１、第２、及び第３の配列を含む。
【０１２１】
特異的結合メンバーは、特異的結合のＣＨ３ドメインの９１位にロイシン（Ｌ）をさらに含み得る。特に、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−８５の第１、第２、及び第３の配列を含むＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの９１位にロイシンを含み得る。
【０１２２】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位は、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１２２、１４２及び１３３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１１５；
（ｉｉ）配列番号１２２、１３２及び１３３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１０８；
（ｉｉｉ）配列番号９１、９２及び９３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−５８；
（ｉｖ）配列番号１１１、１１２及び１１３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−９４；
（ｖ）配列番号１２２、１２３及び１０２のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１０２；又は
（ｖｉ）配列番号９１、９２及び１０２のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−６６
の第１、第２、及び第３の配列を含み；
ここで、第１、第２、及び第３の配列はそれぞれ、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１４から１８、４５．１から７７、及び９２から１０１位に位置する。
【０１２３】
より好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位は、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１２２、１４２及び１３３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１１５；
（ｉｉ）配列番号１２２、１３２及び１３３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１０８；
（ｉｉｉ）配列番号９１、９２及び９３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−５８；
（ｉｖ）配列番号１１１、１１２及び１１３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−９４；又は
（ｖ）配列番号１２２、１２３及び１０２のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１０２
の第１、第２、及び第３の配列を含む。
【０１２４】
さらにより好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位は、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１２２、１４２及び１３３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１１５；又は
（ｉｉ）配列番号１２２、１３２及び１３３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−３１−１０８
の第１、第２、及び第３の配列を含む。
【０１２５】
さらにより好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位は、配列番号１２２、１４２及び１３３のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５の第１、第２、及び第３の配列を含む。
【０１２６】
さらなる代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位は、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１２、１３及び２３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１３１；
（ｉｉ）配列番号１２、１３及び１４のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１２７；又は
（ｉｉｉ）配列番号１２、１３及び３２のそれぞれに記載されるＦＳ２０−１１−１３４
の第１、第２、及び第３の配列を含み；
ここで、第１、第２、及び第３の配列は、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１３及び１９、４５及び７８、並びに９６及び１０２位の間に位置する。
【０１２７】
より好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位は、配列番号１２、１３及び２３のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１の第１、第２、及び第３の配列を含む。
【０１２８】
特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１２位におけるグルタミン酸（Ｅ）、９４位におけるアスパラギン（Ｎ）、及び／又は１０３位におけるロイシン（Ｌ）をさらに含み得る。特に、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４の第１、第２、及び第３の配列を含むＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１２位におけるグルタミン酸、及び１０３位におけるロイシンをさらに含み得る。さらに、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１の第１、第２、及び第３の配列を含むＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの９４位におけるアスパラギンを含み得る。
【０１２９】
特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４のＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ配列を含むＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１０３位におけるロイシンをさらに含み得る。
【０１３０】
特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位が、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４の第１、第２、及び第３の配列、又はＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ配列を含む場合、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１３及び１９位の間、例えば、１４、１５、１６、１７、又は１８位にアミノ酸欠失を含み得る。これらの特異的結合メンバー中に存在する欠失は、プライマーエラーの結果として生じたものと考えられ、したがって、欠失の正確な位置は、不明である。図１Ａにおいて、欠失は、１８位に示されているが、同様に、ＣＨ３ドメインの１４、１５、１６、又は１７位に位置していてもよい。
【０１３１】
ＩＭＧＴ番号付けの代替例として、本明細書に記載されるアミノ酸配列、置換、欠失及び挿入の位置を含むアミノ酸残基位置は、ＩＭＧＴエクソン番号付け（連続した番号付けとも呼ばれる）、ＥＵ番号付け、又はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされ得る。ＣＨ３ドメインの残基位置の、ＩＭＧＴ番号付け、ＩＭＧＴエクソン番号付け、ＥＵ番号付け、及びＫａｂａｔ番号付けの間の一致が、図１に示される。したがって、例えば、図１に示されるように、本出願が、それぞれ特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１４から１８、４５．１から７７、及び９３から１０１位に位置している第１、第２及び第３の配列を指す（ここで、残基位置がＩＭＧＴ番号付けスキームに従って番号付けされる）場合、第１、第２及び第３の配列は、ＣＨ３ドメインの１８から２２、４６から５０、及び７４から８２位に位置する（ここで、残基位置が、ＩＭＧＴエクソン番号付けスキームに従って番号付けされる）。或いは、本明細書に記載されるＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸配列、置換、欠失及び挿入の位置を含む、ＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基の位置は、配列番号４に記載される野生型ＣＨ３ドメイン配列におけるそれらの位置への言及によって規定され得る。ＩＭＧＴ番号付け及び野生型ＣＨ３ドメイン配列の間の一致も、図１に示される。
【０１３２】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８のＣＨ３ドメイン配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、又はＦＳ２０−２２−８５のＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、又はＦＳ２０−２２−４７のＣＨ３ドメイン配列、最も好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９のＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含み、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−４９、及びＦＳ２０−２２−８５のＣＨ３ドメイン配列は、配列番号４６、５５、６３、７２、及び８１のそれぞれに記載される。
【０１３３】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６のＣＨ３ドメイン配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、又はＦＳ２０−３１−１０２のＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、又はＦＳ２０−３１−１０８のＣＨ３ドメイン配列、最も好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５のＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含み、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−１０８、及びＦＳ２０−３１−１１５のＣＨ３ドメイン配列は、配列番号９４、１０３、１１４、１２４、１３４、及び１４３のそれぞれに記載される。
【０１３４】
さらなる代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４のＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１のＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含み、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、及びＦＳ２０−１１−１３４のＣＨ３ドメイン配列は、配列番号１５、２４及び３３のそれぞれに記載される。
【０１３５】
特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメイン配列の直近のＣ末端にさらなるリジン残基（Ｋ）を任意に含み得る。
【０１３６】
モノクローナル及び他の抗体を取り、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生するために組み換えＤＮＡ技術の技術を使用することが可能である。このような技術は、ＣＤＲ、又は可変領域を、異なる免疫グロブリン中に導入することを必要とし得る。１つの免疫グロブリンのＣＤＲの、別の免疫グロブリン中への導入が、例えば、欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号及び欧州特許出願公開第Ａ−２３９４００号に記載されている。同様の技術を用いて、本発明に係る特異的結合メンバーのＯＸ４０抗原結合部位を構成する定常ドメイン配列を、別の特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメイン中に導入し、それによって、その定常ドメイン中にＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーをもたらすことができるであろう。或いは、特異的結合メンバーの定常ドメイン配列全体が、本発明に係る特異的結合メンバーの定常ドメイン配列で置換されて、その定常ドメイン中にＯＸ４０抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを調製することができるであろう。同様に、特異的結合メンバーの定常ドメイン配列の断片が、ＯＸ４０抗原結合部位を含む本発明に係る特異的結合メンバーの定常ドメイン配列の対応する断片で置換され得る。
【０１３７】
さらに、特異的結合メンバーは、免疫グロブリンＧ分子のＣＨ２ドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子のＣＨ２ドメインを含み得る。好ましくは、特異的結合メンバーは、ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインは、配列番号５に記載される配列を有し得る。ＣＨ２ドメインは、Ｆｃγ受容体及び補体に結合することが知られている。ＣＨ２ドメインの、Ｆｃγ受容体への結合が、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に必要とされる一方、補体への結合が、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に必要とされる。ある実施形態において、特異的結合メンバーは、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを引き起こす。これは、特異的結合メンバーが、腫瘍抗原のための第２の抗原結合部位を含む状況において好ましい。理論に制約されるのを望むものではないが、特異的結合メンバーがＯＸ４０に結合されていない場合、腫瘍細胞への特異的結合メンバーの結合は、腫瘍細胞のＡＤＣＣ又はＣＤＣ媒介性の殺滅を引き起こし得ると考えられる。この効果は、腫瘍細胞のＴ細胞媒介性の殺滅に加えて生じ得、ここで、特異的結合メンバーは、腫瘍抗原及びＯＸ４０の両方に結合されて、Ｔ細胞の活性化をもたらす。
【０１３８】
特異的結合メンバーのＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどの１つ以上のＦｃγ受容体、及び／又は補体への結合を低減又は抑制する１つ以上の突然変異を含み得る。本発明者らは、Ｆｃγ受容体への結合を低減又は抑制することが、特異的結合メンバーによって媒介されるＡＤＣＣを低減するか又はなくすと仮定している。同様に、補体への結合を低減又は抑制することが、特異的結合メンバーによって媒介されるＣＤＣを低減するか又はなくすと予想される。ＣＨ２ドメインの、１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体への結合を低減又は抑制する突然変異は、当該技術分野において公知である（Wang et al.,2018）。これらの突然変異は、Bruhns et al.,2009及びHezareh et al.,2001に記載される「ＬＡＬＡ突然変異」を含み、これは、アラニン（Ｌ１．３Ａ及びＬ１．２Ａ）によるＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ位置１．３及び１．２におけるロイシン残基の置換を含む。或いは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ位置８４．４におけるアスパラギン（Ｎ）を、アラニン、グリシン又はグルタミン（Ｎ８４．４Ａ、Ｎ８４．４Ｇ又はＮ８４．４Ｑ）に変異させることによる、保存されたＮ−結合型グリコシル化部位の突然変異を介したａ−グリコシル抗体の産生は、ＩｇＧ１エフェクター機能を低下させることも知られている（Wang et al.,2018）。さらなる代替例として、補体活性化（Ｃ１ｑ結合）及びＡＤＣＣは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ位置１１４におけるプロリンの、アラニン又はグリシン（Ｐ１１４Ａ又はＰ１１４Ｇ）への突然変異によって低下されることが知られている（Idusogie et al.,2000；Klein et al.,2016）。これらの突然変異はまた、さらなる低下されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性を有するか又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性を有さない特異的結合メンバーを産生するために組み合わされてもよい。
【０１３９】
したがって、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインを含んでいてもよく、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３及び１．２位におけるアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位におけるアラニン若しくはグリシン；及び／又は
（ｉｉｉ）８４．４位におけるアラニン、グルタミン若しくはグリシン
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１４０】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、好ましくは、
（ｉ）１．３及び１．２位におけるアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位におけるアラニン若しくはグリシン
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１４１】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位におけるアラニン残基；及び
（ｉｉ）１．２位におけるアラニン残基
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１４２】
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号６に記載される配列を有し得る。
【０１４３】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位におけるアラニン残基；
（ｉｉ）１．２位におけるアラニン残基；及び
（ｉｉｉ）１１４位におけるアラニン
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１４４】
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号７に記載される配列を有し得る。
【０１４５】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、又はＦＳ２０−２２−８５のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、又はＦＳ２０−２２−４７のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、最も好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−４９、及びＦＳ２０−２２−８５のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列は、アミノ酸７から開始してそれ以降へと、配列番号４８、５７、６５、７４、及び８３のそれぞれに示される。
【０１４６】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、又はＦＳ２０−２２−８５のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、又はＦＳ２０−２２−４７のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、最も好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−４９、及びＦＳ２０−２２−８５のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列は、アミノ酸７から開始してそれ以降へと、配列番号５０、５９、６７、７６、及び８５のそれぞれに示される。
【０１４７】
さらなる代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、又はＦＳ２０−３１−１０２のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、又はＦＳ２０−３１−１０８のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、最も好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−１０８、及びＦＳ２０−３１−１１５のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列は、アミノ酸７から開始してそれ以降へと、配列番号９６、１０５、１１６、１２６、１３６、及び１４５のそれぞれに示される。
【０１４８】
さらなる代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、又はＦＳ２０−３１−１０２のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、又はＦＳ２０−３１−１０８のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、最も好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−１０８、及びＦＳ２０−３１−１１５のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列は、アミノ酸７から開始してそれ以降へと、配列番号９８、１０７、１１８、１２８、１３８、及び１４７のそれぞれに示される。
【０１４９】
さらに他の代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、又はＦＳ２０−１１−１３４のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列は、アミノ酸７から開始してそれ以降へと、配列番号１７、２６及び３５のそれぞれに示される。
【０１５０】
さらに他の代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、又はＦＳ２０−１１−１３４のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列は、アミノ酸７から開始してそれ以降へと、配列番号１９、２８及び３７のそれぞれに示される。
【０１５１】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８の配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、又はＦＳ２０−２２−８５の配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、又はＦＳ２０−２２−４７の配列、最も好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９の配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−４９、及びＦＳ２０−２２−８５の配列は、配列番号４８、５７、６５、７４、及び８３のそれぞれに記載される。
【０１５２】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８の配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、又はＦＳ２０−２２−８５の配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、又はＦＳ２０−２２−４７の配列、最も好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９の配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−４９、及びＦＳ２０−２２−８５の配列は、配列番号５０、５９、６７、７６、及び８５のそれぞれに記載される。
【０１５３】
さらなる代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６の配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、又はＦＳ２０−３１−１０２の配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、又はＦＳ２０−３１−１０８の配列、最も好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５の配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−１０８、及びＦＳ２０−３１−１１５の配列は、配列番号９６、１０５、１１６、１２６、１３６、及び１４５のそれぞれに記載される。
【０１５４】
さらなる代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６の配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、又はＦＳ２０−３１−１０２の配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５、又はＦＳ２０−３１−１０８の配列、最も好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５の配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−１０８、及びＦＳ２０−３１−１１５の配列は、配列番号９８、１０７、１１８、１２８、１３８、及び１４７のそれぞれに記載される。
【０１５５】
さらに他の代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４の配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１の配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、及びＦＳ２０−１１−１３４の配列は、配列番号１７、２６、及び３５のそれぞれに記載される。
【０１５６】
さらに他の代替的な好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４の配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１の配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、及びＦＳ２０−１１−１３４の配列は、配列番号１９、２８及び３７のそれぞれに記載される。
【０１５７】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位に加えて、１つ以上のさらなる抗原に結合する１つ以上のさらなる抗原結合部位を含む。１つ以上のさらなる抗原結合部位は、好ましくは、それらの同種抗原に特異的に結合する。
【０１５８】
１つ以上のさらなる抗原結合部位は、ＯＸ４０又は別の抗原に結合し得る。したがって、特異的結合メンバーは、多重特異的、例えば、二重特異的、三重特異的、又は四重特異的分子、好ましくは、二重特異的分子であり得る。好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＯＸ４０及び１つ以上のさらなる抗原に同時に結合することが可能である。
【０１５９】
抗体分子は、多重特異的、例えば二重特異的、三重特異的、又は四重特異的抗体フォーマットを形成するために複数の異なる方法で組み合わされ得る個別のドメインを含むモジュール構造を有することが知られている。例示的な多重特異的抗体フォーマットは、例えば、Spiess et al.(2015)及びKontermann(2012)に記載されている。本発明の特異的結合メンバーは、このような多重特異的抗体フォーマットで用いられ得る。これは、特異的結合メンバーの抗原結合部位の定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメインの存在を介して、さらなる抗原結合部位を、このような多重特異的抗体フォーマット中に導入するさらなる利点を有する。
【０１６０】
例えば、本発明の特異的結合メンバーは、ヘテロ二量体抗体分子、例えば、ヘテロ二量体完全免疫グロブリン分子、又はその断片であり得る。この場合、抗体分子の一部は、本明細書に記載される１つ又は複数の配列を有するであろう。例えば、本発明の特異的結合メンバーが、二重特異的ヘテロ二量体抗体分子である場合、特異的結合メンバーは、ＯＸ４０以外の抗原に結合する重鎖と対合される本明細書に記載されるＣＨ３ドメインを含む重鎖を含み得る。ヘテロ二量体抗体を調製するための技術は、当該技術分野において公知であり、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）技術を含み、これは、鎖のヘテロ二量体化を促進するために「ノブ」又は「ホール」のいずれかを形成するように抗体分子のＣＨ３ドメインを操作することを含む。或いは、ヘテロ二量体抗体は、静電反発力によってＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避し、静電引力によってヘテロ二量体化を指向するための、抗体分子中への電荷対の導入によって調製され得る。ヘテロ二量体抗体フォーマットの例としては、CrossMab、ｍＡｂ−Ｆｖ、ＳＥＥＤ−ボディ、及びＫＩＨ  ＩｇＧが挙げられる。
【０１６１】
或いは、本発明の多重特異的特異的結合メンバーは、完全免疫グロブリン分子又はその断片及び１つ若しくは複数のさらなる抗原結合部分を含み得る。抗原結合部分は、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体であってもよく、完全免疫グロブリン分子又はその断片に融合され得る。完全免疫グロブリン分子に融合されたさらなる抗原結合部分を含む多重特異的抗体分子の例としては、ＤＶＤ−ＩｇＧ、ＤＶＩ−ＩｇＧ、ｓｃＦｖ４−ＩｇＧ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、及びｓｃＦｖ−ＩｇＧ分子が挙げられる（Spiess et al.,2015；図１）。ＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン断片に融合されたさらなる抗原結合部分を含む多重特異的抗体分子の例としては、例えば、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ダイアボディ−ＣＨ３、及びｓｃＦｖ−ＣＨ３  ＫＩＨが挙げられる（Spiess et al.,2015；図１）。
【０１６２】
他の好適な多重特異的フォーマットは、当業者に容易に明らかになるであろう。
【０１６３】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を含み、第２の抗原結合部位は、好ましくは、ＣＤＲベースの抗原結合部位である。ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域中の抗原結合部位である。ＣＤＲベースの抗原結合部位は、６つのＣＤＲ；３つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ及び３つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲによって形成される。
【０１６４】
所与の抗原に対する抗体分子の調製及びこのような抗体分子のＣＤＲ配列の決定は、十分に確立されており、多くの好適な技術が、当該技術分野において公知である。ＣＤＲ配列は、例えば、Kabat et al.,1991又は国際免疫遺伝学情報システム（international ImMunoGeneTics information system）（ＩＭＧＴ）（Lefranc et al.,2015）に従って決定され得る。
【０１６５】
例えば、特異的結合メンバーは、ｍＡｂ２（商標）二重特異的抗体であり得る。本明細書において言及されるｍＡｂ２二重特異的抗体は、その可変領域のそれぞれにおけるＣＤＲベースの抗原結合部位及び定常ドメイン中の少なくとも１つの抗原結合部位を含むＩｇＧ免疫グロブリンである。本発明の特異的結合メンバーが、ｍＡｂ２フォーマットである場合、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメイン中のＯＸ４０抗原結合部位に加えて、その可変領域のそれぞれにおけるＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。
【０１６６】
抗原結合部位の３つのＶＨドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＨドメイン中に位置してもよく、３つのＶＬドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＬドメイン中に位置し得る。例えば、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域中に位置し得る。
【０１６７】
特異的結合メンバーは、第２の抗原のための１つ又は好ましくは２つ以上、例えば２つのＣＤＲベースの抗原結合部位を有し得る。したがって、特異的結合メンバーは、１つのＶＨ及び１つのＶＬドメインを含み得るが、好ましくは、天然のＩｇＧ分子の場合と同様に、２つのＶＨ及び２つのＶＬドメイン、すなわち、２つのＶＨ／ＶＬドメイン対を含む。
【０１６８】
ある好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、２つの可変領域を含む免疫グロブリンであり得、各可変領域は、第２の抗原のためのＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。
【０１６９】
したがって、好ましい実施形態において、抗体は、ＯＸ４０及び第２の抗原に結合する抗体であり、抗体分子は、
（ｉ）抗体分子の２つのＣＨ３ドメイン中に位置するＯＸ４０のための２つの抗原結合部位；及び
（ｉｉ）免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによってそれぞれ形成される、第２の抗原のための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位
を含む。
【０１７０】
より好ましい実施形態において、抗体は、完全免疫グロブリン分子、例えば、ＯＸ４０及び第２の抗原に結合する完全なＩｇＧ１分子であり、抗体分子は、
（ｉ）抗体分子の２つのＣＨ３ドメイン中に位置するＯＸ４０のための２つの抗原結合部位；及び
（ｉｉ）免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによってそれぞれ形成される、第２の抗原のための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位
を含み；
ここで、免疫グロブリン分子は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＬドメインをさらに含む。
【０１７１】
ＯＸ４０の活性化は、Ｔ細胞表面におけるＯＸ４０のクラスター化を必要とし、これは、次に、細胞内シグナル伝達経路及びＴ細胞活性化を刺激する。特異的結合メンバーの架橋の非存在下でのＴ細胞表面におけるＯＸ４０への特異的結合メンバーの結合は、ＯＸ４０にクラスターを形成させることはなく、又はＯＸ４０の限られたクラスター化を誘発し得るに過ぎず、その結果、Ｔ細胞活性化をもたらすことはなく、又は限られたＴ細胞活性化をもたらし得るに過ぎない。
【０１７２】
本発明者らは、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、及びＦＳ２０−１１−１３４が、特異的結合メンバーの架橋の非存在下でＴ細胞活性化を行わないことを示した。対照的に、ＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、ＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、及びＦＳ２０−３１−６６は、架橋の非存在下で限られたＴ細胞活性化を誘発する。これらの特異的結合メンバーのＯＸ４０アゴニズムは、特異的結合メンバーの架橋により誘発されるか又は増大する（実施例５を参照）。
【０１７３】
上記に説明されるように、Ｆｃγ受容体への結合による抗体分子の架橋は、非効率的であり、且つＦｃγ受容体発現細胞がヒト身体全体に存在する際、特定の位置、例えば、疾患の部位に標的化することができない。したがって、第２の抗原結合部位によって結合された第２の抗原は、好ましくは、Ｆｃγ受容体でない。
【０１７４】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を含み、ここで、第２の抗原は、複数の特異的結合メンバーに結合し、それを架橋することが可能である。
【０１７５】
例えば、本発明者らは、第２の抗原が、モノマー又は多量体であり得、且つ表面、例えば細胞表面に高濃度で存在するか及び／又はクラスター化された細胞表面抗原などの表面抗原である場合、特異的結合メンバーの、第２の抗原への結合は、Ｔ細胞活性化をもたらすか、又はＴ細胞活性化を促進することを示した。理論に制約されるのを望むものではないが、特異的結合メンバーの、豊富な細胞表面抗原への結合が、例えば、特異的結合メンバーが、ＯＸ４０のクラスター化及びＴ細胞活性化を引き起こすことが可能なほど十分に近接して配置された、細胞表面に結合された高濃度の特異的結合メンバーをもたらすと考えられる。したがって、好ましい実施形態において、第２の抗原は、表面、例えば細胞表面において高濃度で発現される表面抗原である。
【０１７６】
本発明者らは、第２の抗原が、多量体可溶性分子、例えば多量体可溶性因子である場合、特異的結合メンバーの、第２の抗原への結合が、Ｔ細胞活性化をもたらすか、又はＴ細胞活性化を促進することも示した。したがって、好ましい実施形態において、第２の抗原は、可溶性分子が多量体抗原、例えば二量体、三量体又はより高次の多量体である場合、いくつかの特異的結合メンバーに架橋することが可能である。
【０１７７】
本明細書に記載される第２の抗原に結合し、且つ第２の抗原への結合の際にのみＴ細胞を活性化するか、又はそのＴ細胞活性化活性が第２の抗原への結合の際に促進される第２の抗原結合部位を含む特異的結合メンバーは、コンディショナルなアゴニストとも呼ばれる。第２の抗原への結合の際のこのＴ細胞活性化活性は、特異的結合メンバーの、Ｆｃγ受容体及び／又は外部の架橋剤、例えばプロテインＡ又はＧ又は二次抗体への結合とは無関係であり、したがって、特異的結合メンバーのコンディショナルなアゴニスト活性が、第２の抗原が存在する部位に標的化されるのを可能にする。例えば、第２の抗原が疾患抗原である場合、特異的結合メンバーは、個体における疾患の部位で選択的にＴ細胞を活性化し得、他の箇所ではＴ細胞を活性化せず、又は個体における疾患の部位で選択的にＴ細胞の活性化を促進し得、他の箇所ではＴ細胞の活性化を促進しない。
【０１７８】
さらに、第２の抗原への結合の際にのみＴ細胞を活性化するか、又はそのＴ細胞活性化活性が第２の抗原への結合の際に促進される特異的結合メンバーは、好ましくは、外部の架橋剤などの他の機構による架橋、又はＦｃγ受容体相互作用による架橋に依存する特異的結合メンバーと比較して増加したＴ細胞活性化活性を有する。ＯＸ４０の活性化がより効率的であるため、Ｔ細胞活性化は、他の特異的結合メンバーと比べてより低い濃度の本明細書に記載される特異的結合メンバーで達成され得る。
【０１７９】
したがって、本発明の特異的結合は、好ましくは、特異的結合メンバーが架橋されていない場合より、特異的結合メンバーが、例えば第２の抗原への結合によって架橋される場合、増加したＴ細胞活性化を誘発する。
【０１８０】
Ｔ細胞を活性化する抗体分子又は特異的結合メンバーの能力は、Ｔ細胞活性化アッセイを用いて測定され得る。Ｔ細胞は、活性化の際にＩＬ−２を放出する。したがって、Ｔ細胞活性化アッセイは、抗体分子又は特異的結合メンバーによって誘発されるＴ細胞活性化のレベルを決定するためにＩＬ−２放出を測定し得る。
【０１８１】
例えば、Ｔ細胞を活性化する抗体分子又は特異的結合メンバーの能力は、特異的結合メンバー又は抗体分子が架橋される場合、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によるＩＬ−２の最大半量（half-maximal）放出を達成するのに必要な抗体分子又は特異的結合メンバーの濃度を測定することによって決定され得る。これは、以下の抗体分子又は特異的結合メンバーのＥＣ５０と呼ばれる。より低いＥＣ５０は、より低い濃度の抗体分子又は特異的結合メンバーが、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によるＩＬ−２の最大半量放出を達成するのに必要とされること、及びひいては抗体分子又は特異的結合メンバーが、より高いＴ細胞活性化活性を有することを示す。特異的結合メンバー又は抗体分子は、例えば、抗ＣＨ２抗体を用いて架橋され得る。
【０１８２】
好ましい実施形態において、抗体分子又は特異的結合メンバーは、同じアッセイにおいてＦＳ２０−２２−４９／４４２０（ＬＡＬＡ突然変異を含む）のＥＣ５０の５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１０倍、又は５倍以内である、Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＥＣ５０を有し、ここで、ＦＳ２０−２２−４９／４４２０（ＬＡＬＡ）は、配列番号７８に記載される重鎖及び配列番号１５６に記載される軽鎖からなるか又はそれを含む。
【０１８３】
好ましい実施形態において、抗体分子又は特異的結合メンバーの架橋の存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおける抗体分子又は特異的結合メンバーのＥＣ５０は、架橋の非存在下より１０倍、２０倍、３０倍、又は４０倍低い。
【０１８４】
例えば、抗体分子又は特異的結合メンバーは、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下、好ましくは、０．１ｎＭ以下の、Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＥＣ５０を有し得る。
【０１８５】
それに加えて、又はその代わりに、Ｔ細胞を活性化する抗体分子又は特異的結合メンバーの能力は、抗体分子又は特異的結合メンバーの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度を測定することによって決定され得、ここで、抗体分子又は特異的結合メンバーは、架橋されている。
【０１８６】
好ましい実施形態において、架橋の存在下で、抗体分子又は特異的結合メンバーの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度は、同じアッセイにおいてＦＳ２０−２２−４９／４４２０（ＬＡＬＡ突然変異を含む）の存在下でＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度の２０％、又は１０％以内であり、ここで、ＦＳ２０−２２−４９／４４２０（ＬＡＬＡ）は、配列番号７８に記載される重鎖及び配列番号１５６に記載される軽鎖からなるか又はそれを含む。
【０１８７】
Ｔ細胞活性化アッセイは、本発明の実施例に記載されるように、ｐａｎ−Ｔ細胞アッセイなどの、本明細書に記載されるＴ細胞アッセイであり得る。
【０１８８】
例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＴ細胞に基づくＩＬ−２放出アッセイであり得る。例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、白血球除去錐体細胞（cone）からヒトＰＢＭＣを単離することを含み得る。ＰＢＭＣを単離するための方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の実施例に記載されている。次に、Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから単離され得る。ＰＢＭＣからＴ細胞を単離するための方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の実施例に記載されている。
【０１８９】
Ｔ細胞活性化アッセイは、例えば、Ｔ細胞培地などの好適な培地中で必要数のＴ細胞を調製することを含み得る。必要数のＴ細胞は、１．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で調製され得る。次に、Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化に必要なシグナルを提供する好適なＴ細胞活性化試薬を用いて刺激され得る。例えば、Ｔ細胞活性化試薬は、ＣＤ３及びＣＤ２８を含むビーズなどの、ＣＤ３及びＣＤ２８を含む試薬であり得る。単離されたＴ細胞は、Ｔ細胞を活性化するためにＴ細胞活性化試薬とともに一晩インキュベートされ得る。この後、活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化試薬からＴ細胞を分離するために洗浄され、２．０×１０６個の細胞／ｍｌなどの好適な濃度で、Ｔ細胞培地中で再懸濁され得る。次に、活性化Ｔ細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体で被覆されたプレートに加えられ得る。
【０１９０】
各試験抗体分子又は特異的結合メンバーの好適な希釈物が、調製され、ウェルに加えられ得る。次に、Ｔ細胞は、試験抗体とともに２４時間にわたって、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートされ得る。上清が、収集され、上清中のＩＬ−２の濃度を決定するためにアッセイされ得る。溶液中のＩＬ−２の濃度を決定するための方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の実施例に記載されている。ヒトＩＬ−２の濃度は、抗体分子又は特異的結合メンバーのｌｏｇ濃度に対してプロットされ得る。得られた曲線は、ｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングされ得る。
【０１９１】
特異的結合メンバーの第２の抗原結合部位によって結合される第２の抗原は、免疫細胞抗原、又は疾患抗原であり得る。疾患抗原としては、病原性抗原及び腫瘍抗原が挙げられる。
【０１９２】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーの第２の抗原結合部位は、免疫細胞抗原に結合する。
【０１９３】
特異的結合メンバーによって結合される免疫細胞抗原は、ＯＸ４０と同じ免疫細胞又は異なる免疫細胞上に存在し得る。
【０１９４】
免疫細胞抗原は、ＯＸ４０以外の、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり得る。ＴＮＦＲＳＦ受容体は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）の１つ以上のリガンドに結合する細胞外システインリッチドメインを含む膜結合サイトカイン受容体である。
【０１９５】
ＴＮＦＲＳＦ受容体は、免疫細胞の表面上に位置し得る。ＴＮＦＲＳＦリガンドの結合の際、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、免疫細胞を活性化する免疫細胞表面上にクラスターを形成する。例えば、リガンド結合ＴＮＦＲＳＦ受容体は、三量体などの多量体、又は多量体のクラスターを形成し得る。リガンド−結合ＮＦＲＳＦ受容体のクラスターの存在は、免疫細胞を活性化する細胞内シグナル伝達経路を刺激する。
【０１９６】
理論に制約されるのを望むものではないが、免疫細胞表面上でＯＸ４０及び第２のＴＮＦＲＳＦ受容体を嵌合することによって、特異的結合メンバーは、ＯＸ４０及び第２のＴＮＦＲＳＦ受容体の両方をクラスター化させ、免疫細胞を活性化させると考えられる。言い換えると、特異的結合メンバーは、両方の標的が結合されるとき、ＴＮＦＲＳＦ受容体アゴニストとして働く。
【０１９７】
ＴＮＦＲＳＦ受容体としては、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＥＤＡ２Ｒ、ＥＤＡＲ、ＦＡＳ、ＬＴＢＲ、ＲＥＬＴ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ−１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２１及びＴＮＦＲＳＦ２５が挙げられる。
【０１９８】
好ましい実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、ＴＮＦＲＳＦ９（ＣＤ１３７；４−１ＢＢ）である。
【０１９９】
ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７：遺伝子ＩＤ  ９３９）は、ＮＰ＿００１２３３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２４２．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５：遺伝子ＩＤ  ９５８）は、ＮＰ＿００１２４１．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２５０．５の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥＤＡ２Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ２７：遺伝子ＩＤ  ６０４０１）は、ＮＰ＿００１１８６６１６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１１９９６８７．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥＤＡＲ（遺伝子ＩＤ  １０９１３）は、ＮＰ＿０７１７３１．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０２２３３６、３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＦＡＳ（ＴＮＦＲＳＦ６：遺伝子ＩＤ  ３５５）は、ＮＰ＿００００３４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００００４３．５の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＬＴＢＲ（ＴＮＦＲＳＦ３：遺伝子ＩＤ  ４０５５）は、ＮＰ＿００１２５７９１６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２７０９８７．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＲＥＬＴ（ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ：遺伝子ＩＤ  ８４９５７）は、ＮＰ＿１１６２６０．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０３２８７１．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（遺伝子ＩＤ  ７１３２）は、ＮＰ＿００１０５６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０６５．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（遺伝子ＩＤ  ７１３３）は、ＮＰ＿００１０５７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０６６．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（遺伝子ＩＤ  ８７７１）は、ＮＰ＿００３８１４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８２３．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ８（遺伝子ＩＤ  ９４３）は、ＮＰ＿００１２３４．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２４３．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ９（遺伝子ＩＤ  ３６０４）は、ＮＰ＿００１５５２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ００１５６１）の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（遺伝子ＩＤ  ８７９７）は、ＮＰ＿００３８３５．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４４．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（遺伝子ＩＤ  ８７９５）は、ＮＰ＿００３８３３．４の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４２．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（遺伝子ＩＤ  ８７９４）は、ＮＰ＿００３８３２．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４１．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（遺伝子ＩＤ  ８７９３）は、ＮＰ＿００３８３１．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４０．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（遺伝子ＩＤ  ８７９２）は、ＸＰ＿０１１５２４５４７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＸＭ＿１１５２６��４５．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（遺伝子ＩＤ  ４９８２）は、ＮＰ＿００２５３７．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００２５４６．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（遺伝子ＩＤ  ５１３３０）は、ＮＰ＿０５７７２３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１６６３９．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（遺伝子ＩＤ  ２３４９５）は、ＮＰ＿００３６５８４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１２４５２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（遺伝子ＩＤ  １１５６５０）は、ＮＰ＿４４３１７７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０５２９４５．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１４（遺伝子ＩＤ  ８７６４）は、ＮＰ＿００１２８４５３４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２９７６０５．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１７（遺伝子ＩＤ  ６０８）は、ＮＰ＿００１１８３．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１１９２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１８（遺伝子ＩＤ  ８７８４）は、ＮＰ＿００４１９５．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００４１８６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１９（遺伝子ＩＤ  ５５５０４）は、ＮＰ＿００１１９１３８７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２０４４５８．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＮＦＲＳＦ２１（遺伝子ＩＤ  ２７２４２）は、ＮＰ＿０５５２６７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１４４５２．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３：遺伝子ＩＤ  ８７１８）は、リガンドＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ）に結合し、ＮＰ＿００１０３４７５３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０３９６６４．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２００】
或いは、第２の抗原結合部位によって結合される免疫細胞抗原は、ＴＮＦＲＳＦメンバー、例えば、免疫共刺激分子又は阻害性チェックポイント分子以外の免疫系において調節機能を有する分子であり得る。このような免疫調節分子の例としては、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、Ｔ細胞免疫グロブリン、ムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）、ＣＤ４７、ＣＤ７３、Ａ２ａＲ、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、ＶＩＳＴＡ  ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＬＬＴ１、ガレクチン−９、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、及びＫＩＲが挙げられる。
【０２０１】
免疫細胞抗原が存在する免疫細胞は、任意の免疫細胞サブセットに属してもよく、Ｔ細胞、腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）、骨髄系統細胞、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ＮＫ細胞及び／又はＢ細胞であり得る。免疫細胞抗原がＴＮＦＲＳＦ受容体である場合、ＴＮＦＲＳＦ受容体が存在する免疫細胞は、好ましくは、Ｔ細胞である。
【０２０２】
或いは、第２の抗原結合部位は、上述される疾患抗原に結合し得る。理論に制約されるのを望むものではないが、特異的結合メンバーの、ＯＸ４０及び疾患抗原への結合が、疾患の近くでＴ細胞の活性化をもたらすと考えられる。次に、活性化Ｔ細胞は、免疫応答、例えば、病原体又は癌細胞に対する免疫応答を開始させ、促進し、又はそれに関与し得る。癌細胞を認識及び除去する際に免疫系が果たす役割の概説が、Chen and Mellman,2013によって提供される。
【０２０３】
特異的結合メンバーの第２の抗原結合部位は、腫瘍抗原に結合し得る。腫瘍抗原は、腫瘍の環境中に主に存在し、個体における他の箇所に遍在的に存在していない抗原である。例えば、腫瘍抗原は、腫瘍細胞の表面に存在し得、又は腫瘍微小環境の他の間質細胞若しくは腫瘍の近くの体液中に存在し得る。したがって、腫瘍抗原は、個体における腫瘍細胞の位置のマーカーである。
【０２０４】
ある実施形態において、腫瘍抗原は、癌細胞の表面に位置する抗原であり得る。腫瘍抗原は、腫瘍細胞において上方制御又は過剰発現され得る一方、それは、腫瘍の非存在下における同じ組織から対応する正常な体細胞によって多く発現されることはない。
【０２０５】
ある実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍の非存在下における対応する正常な組織の間質細胞と比較して、腫瘍微小環境の間質細胞において上方制御又は過剰発現される。
【０２０６】
腫瘍抗原は、細胞表面に存在し得、急速に内在化されることはない。
【０２０７】
特異的結合メンバーによって標的化するのに好適な腫瘍抗原は、当該技術分野において公知の方法を用いて同定され得る。例えば、ＯＸ４０受容体及び腫瘍抗原を標的とする特異的結合メンバーは、ＯＸ４０発現細胞が腫瘍抗原発現細胞とともに共培養されるアッセイにおいて使用され得、ＯＸ４０発現細胞の活性化が、例えば、Ｔ細胞活性化アッセイ、増殖アッセイ又は細胞毒性アッセイによって測定される。
【０２０８】
細胞表面腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）であり得る。
【０２０９】
癌細胞によって発現される腫瘍抗原としては、例えば、癌生殖細胞系遺伝子、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−Ｉ、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−Ｉ、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＬＡＧＥ−Ｉ、ＳＳＸ−Ｉ、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−Ｉ及びＸＡＧＥによってコードされる癌精巣（ＣＴ）抗原並びに免疫原性断片又はその変異体が挙げられ得る（Simpson et al.,2005；Gure et al.,2005；Velazquez et al.,2007；Andrade et al.,2008；Tinguely et al.,2008；Napoletano et al.,2008）。
【０２１０】
他の細胞表面腫瘍抗原としては、例えば、ＡＦＰ、αｖβ３（ビトロネクチン受容体）、αｖβ６、Ｂ細胞成熟剤（ＢＣＭＡ）、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ８０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３ガングリオシド、ＨＥＲ２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、抗イディオタイプ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、例えば癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＴＡＧ−７２、葉酸結合タンパク質、Ａ３３、Ｇ２５０、フェリチン、糖脂質、例えば、ガングリオシド、糖質、例えば、ＣＡ−１２５、ＩＬ−２受容体、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＰＤＬ１、ＣＤ２００、ＥｐｈＡ２、及びメソテリン又はその変異体が挙げられる。これらの及び他の細胞表面腫瘍抗原は、Carter et al.,2004；Scott and Renner,2001；Cheever et al.,2009；Tai and Anderson,2015；及びPodojil and Miller,2017に記載されている。
【０２１１】
他の腫瘍抗原としては、「ストレスを受けた」癌細胞によって用いられる非ＡＵＧ翻訳開始機構によって生成されるアウトオブフレームペプチド−ＭＨＣ複合体が挙げられる（Malarkannan et al.,1999）。
【０２１２】
他の腫瘍抗原としては、腫瘍細胞の表面又は腫瘍微小環境の細胞の表面におけるペプチド−ＭＨＣ複合体が挙げられ、ここで、ペプチド−ＭＨＣ複合は、突然変異した細胞内腫瘍抗原の腫瘍特異的ネオアンチゲンペプチド断片を含み、ペプチドネオアンチゲンは、１つ以上の腫瘍特異的突然変異を有する（Gubin et al.,2015）。他の腫瘍抗原が、当該技術分野において周知である（例えば国際公開第００／２０５８１号；Cancer Vaccines and Immunotherapy(2000)Eds Stern,Beverley and Carroll,Cambridge University Press,Cambridgeを参照）。これらの腫瘍抗原の配列は、公開データベースから容易に入手可能であるが、国際公開第１９９２／０２０３５６  Ａ１号、国際公開第１９９４／００５３０４  Ａ１号、国際公開第１９９４／０２３０３１  Ａ１号、国際公開第１９９５／０２０９７４  Ａ１号、国際公開第１９９５／０２３８７４  Ａ１号及び国際公開第１９９６／０２６２１４  Ａ１号にも見出される。
【０２１３】
例示的な腫瘍抗原としては、ＨＥＲ２、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ２０、ＣＤ７３、ＰＳＭＡ、メソテリン、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ２００、αｖβ６、ＢＣＭＡ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４及びＥＧＦＲが挙げられる。
【０２１４】
例えば、腫瘍抗原は、メソテリン（ＭＳＬＮ）であり得る。
【０２１５】
ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２；遺伝子ＩＤ  ２０６４）は、ＮＰ＿００１００５８６２．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１００５８６２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＦＡＰ（遺伝子ＩＤ  ２１９１）は、ＮＰ＿００１２７８７３６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２９１８０７．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥｐＣＡＭ（遺伝子ＩＤ  ４０７２）は、ＮＰ＿００２３４５．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００２３５４．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＥＡＣＡＭ５（遺伝子ＩＤ  １０４８）は、ＮＰ＿００１２７８４１３．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２９１４８４．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１；遺伝子ＩＤ  ９３１）は、ＮＰ＿０６８７６９．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０２１９５０．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ；遺伝子ＩＤ  ４９０７）は、ＮＰ＿００１１９１７４２．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２０４８１３．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１；遺伝子ＩＤ  ２３４６）は、ＮＰ＿００１０１４９８６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１０１４９８６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。メソテリン（ＭＳＬＮ；遺伝子ＩＤ  １０２３２）は、ＮＰ＿００１１７０８２６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１７７３５５．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥｐｈＡ２（遺伝子ＩＤ  １９６９）は、ＮＰ＿００１３１６０１９．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１３２９０９０．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＩＧＦ１Ｒ（遺伝子ＩＤ  ３４８０）は、ＮＰ＿０００８６６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０００８７５．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ２００（遺伝子ＩＤ  ４３４５）は、ＮＰ＿００１００４１９６．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１００４１９６．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。αｖβ６は、インテグリンサブユニットαＶ及びインテグリンサブユニットβ６から構成されるヘテロ二量体である。インテグリンサブユニットαＶ（ＩＴＧＡＶ；遺伝子ＩＤ  ３６８５）は、ＮＰ＿００１１３８４７１．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１４４９９９．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。インテグリンサブユニットβ６（ＩＴＧＢ６；遺伝子ＩＤ  ３６９４）は、ＮＰ＿０００８７９．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０００８８８．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７；遺伝子ＩＤ  ６０８）は、ＮＰ＿００１１８３．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１９２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４；遺伝子ＩＤ  ２９１２６）は、ＮＰ＿００１２５４６３５．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２６７７０６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６；遺伝子ＩＤ  ８０３８���）は、ＮＰ＿００１０１９９０７．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１０２４７３６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。Ｂ７Ｈ４（ＶＴＣＮ１；遺伝子ＩＤ  ７９６７９）は、ＮＰ＿００１２４０７７８．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２５３８４９．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥＧＦＲ（遺伝子ＩＤ  １９５６）は、ＮＰ＿００１３３３８２６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１３４６８９７．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２１６】
他の実施形態において、腫瘍抗原は、可溶性腫瘍抗原、例えば、癌細胞によって、又は癌細胞に応答して産生される成長因子であり得る。可溶性因子は、腫瘍の近くの体液中で上方制御又は過剰発現され得る。可溶性腫瘍抗原は、多量体、例えば二量体又は三量体であり得る。可溶性腫瘍抗原は、個体の身体の他の箇所より、腫瘍部位又は腫瘍微小環境中により高い濃度で存在し得る。腫瘍微小環境及び関連する可溶性腫瘍抗原は、Bhome et al.(2015)により詳細に記載されている。
【０２１７】
好適な可溶性腫瘍抗原としては、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＳＤＦ１及びＴＧＦ−β、例えばＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−２、ＴＧＦ−β−３及びＴＧＦ−β−４が挙げられる。
【０２１８】
ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＡ；遺伝子ＩＤ  ７４２２）は、ＮＰ＿００１０２０５３７．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０２５３６６．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＨＧＦ（遺伝子ＩＤ  ３０８２）は、ＮＰ＿０００５９２．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０００６０１．５の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＳＤＦ１（ＣＸＣＬ１２；遺伝子ＩＤ  ６３８７）は、ＮＰ＿０００６００．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０００６０９．６の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−１（ＴＧＦＢ１；遺伝子ＩＤ  ７０４０）は、ＮＰ＿０００６５１．３の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０００６６０．６の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−２（ＴＧＦＢ２；遺伝子ＩＤ  ７０４２）は、ＮＰ＿００１１２９０７１．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１３５５９９．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−３（ＴＧＦＢ３；遺伝子ＩＤ  ７０４３）は、ＮＰ＿００１３１６８６７．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１３２９９３８．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−４（ＬＥＦＴＹ２；遺伝子ＩＤ  ７０４４）は、ＮＰ＿００１１６５８９６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１７２４２５．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２１９】
別の好ましい実施形態において、疾患抗原は、病原性抗原である。
【０２２０】
感染症の部位の近くでの特異的結合メンバーによるＴ細胞の活性化は、感染症の治療に有用であることが予想される。感染症は、急性又は持続性感染症であり得るが、好ましくは、持続性感染症である。
【０２２１】
病原性抗原は、好ましくは、ヒト病原体によって発現される抗原、例えば、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫抗原（例えば原虫抗原）、好ましくは、ウイルス又は細菌抗原である。病原性抗原は、病原体、又は感染症の部位の近くに主に存在し、個体における他の箇所に遍在的に存在していない抗原である。
【０２２２】
例えば、病原性抗原は、ウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物の表面に存在する抗原、又はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物によって発現される可溶性抗原であり得る。ウイルス、細菌、真菌、又は寄生生物は、本明細書の他の箇所で言及されるウイルス、細菌、真菌、又は寄生生物であり得る。
【０２２３】
病原性抗原が可溶性抗原である場合、抗原は、感染症の部位の近くの体液中で上方制御又は過剰発現され得る。例えば、可溶性病原性抗原は、個体の身体の他の箇所より、感染症の部位、又は感染症の部位の近くにより高い濃度で存在し得る。可溶性病原性抗原は、多量体、例えば二量体又は三量体であり得る。
【０２２４】
特異的結合メンバーによって標的化するのに好適な病原性抗原は、当該技術分野において公知の方法を用いて同定され得る。例えば、ＯＸ４０受容体及び病原性抗原を標的とする特異的結合メンバーが、ＯＸ４０発現細胞が病原体又は病原性抗原とともに共培養されるアッセイにおいて使用され得、ＯＸ４０発現細胞の活性化が、例えば、Ｔ細胞活性化アッセイ、増殖アッセイ又は細胞毒性アッセイによって測定される。
【０２２５】
特異的結合メンバーによって標的化するのに好適な多くの病原性抗原が、当該技術分野においてさらによく知られており、治療される感染症に応じて当業者によって選択され得る。ウイルス抗原の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって発現されるタンパク質ｐ２４、ｇｐ１２０、及びｇｐ４１、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって発現されるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、並びにインフルエンザウイルスによって発現されるヘマグルチニン及びノイラミニダーゼが挙げられる。細菌抗原の例としては、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）によって発現されるＲｖ１７３３、Ｒｖ２３８９及びＲｖ２４３５ｎが挙げられる。
【０２２６】
特異的結合メンバーは、本明細書に開示される第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖配列の変異体も含み得る。好適な変異体は、配列変異、又は突然変異、及びスクリーニングの方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、１つ以上の変異体配列を含む特異的結合メンバーは、親特異的結合メンバーの機能特性、例えば、ＯＸ４０に対する結合特異性及び／又は結合親和性の１つ以上を保持する。例えば、１つ以上の変異体配列を含む特異的結合メンバーは、好ましくは、（親）特異的結合メンバーと同じ親和性、又はそれより高い親和性でＯＸ４０に結合する。親特異的結合メンバーは、変異体特異的結合メンバーに組み込まれたアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含まない特異的結合メンバーである。
【０２２７】
例えば、特異的結合メンバーは、本明細書に開示される第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有する、第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖配列を含み得る。
【０２２８】
特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９のＣＨ３ドメイン配列は、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、及びＦＳ２０−２２−８５のＣＨ３ドメインに対する少なくとも９５％の配列同一性を有する。特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−１１５のＣＨ３ドメイン配列は、特異的結合メンバーＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、及びＦＳ２０−３１−１０８のＣＨ３ドメインに対する少なくとも９２％の配列同一性を有する。特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１３１のＣＨ３ドメイン配列は、特異的結合メンバーＦＳ２０−１１−１２７及びＦＳ２０−１１−１３４のＣＨ３ドメインに対する少なくとも９７％の配列同一性を有する。
【０２２９】
したがって、好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号１５、２４、３３、４６、５５、６３、７２、８１、９４、１０３、１１４、１２４、１３４、又は１４３に記載されるＣＨ３ドメイン配列に対する、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性、好ましくは、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ３ドメイン配列を有するか又はそれを含む。
【０２３０】
さらなる好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号５、６又は７に記載されるＣＨ２ドメイン配列に対する、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ２ドメイン配列を有するか又はそれを含む。
【０２３１】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号１７、１９、２６、２８、３５、３７、４８、５０、５７、５９、６５、６７、７４、７６、８３、８５、９６、９８、１０５、１０７、１１６、１１８、１２６、１２８、１３６、１３８、１４５、又は１４７に記載されるＦｃａｂ配列に対する、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を有するか、含むか、又はそれからなる。
【０２３２】
配列同一性は、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCG package,Accelerys Inc,San Diego USA）に関連して一般的に定義される。ＧＡＰは、Needleman and Wunschアルゴリズムを使用して、一致の数を最大にし、且つギャップの数を最小にする、２つの完全な配列をアラインする。一般に、１２に等しいギャップ作成ペナルティ（gap creation penalty）及び４に等しいギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）を伴うデフォルトパラメータが使用される。ＧＡＰの使用が、好ましいことがあるが、他のアルゴリズム、例えば、一般に、デフォルトパラメータを用いる、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al.,1990の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman,1988の方法を使用する）、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman,1981）、又は上記のAltschul et al.,1990のＴＢＬＡＳＴＮプログラムが使用され得る。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Altschul et al.,1997）が使用され得る。
【０２３３】
特異的結合メンバーは、本明細書に開示される第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０以下の変異、１５以下の変異、１０以下の変異、５つ以下の変異、４つ以下の変異、３つ以下の変異、２つ以下の変異、又は１つの変異を有する、第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列を含み得る。
【０２３４】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号１５、２４、３３、４６、５５、６３、７２、８１、９４、１０３、１１４、１２４、１３４、又は１４３に記載されるＣＨ３ドメイン配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０以下の変異、１５以下の変異、１０以下の変異、５つ以下の変異、４つ以下の変異、３つ以下の変異、２つ以下の変異、又は１つの変異を有するＣＨ３ドメイン配列を含み得る。
【０２３５】
さらなる好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号５、６、又は７に記載されるＣＨ２ドメイン配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０以下の変異、１５以下の変異、１０以下の変異、５つ以下の変異、４つ以下の変異、３つ以下の変異、２つ以下の変異、又は１つの変異を有するＣＨ２ドメイン配列を含む。
【０２３６】
さらなる好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号１７、１９、２６、２８、３５、３７、４８、５０、５７、５９、６５、６７、７４、７６、８３、８５、９６、９８、１０５、１０７、１１６、１１８、１２６、１２８、１３６、１３８、１４５、又は１４７に記載されるＦｃａｂ配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、４０以下の変異、３０以下の変異、２０以下の変異、１５以下の変異、１０以下の変異、５つ以下の変異、４つ以下の変異、３つ以下の変異、２つ以下の変異、又は１つの変異を有する配列を含むか又はそれからなる。
【０２３７】
特異的結合メンバーが、本明細書に開示されるＣＨ３ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃａｂ、軽鎖又は重鎖配列の変異体を含む場合、変異体は、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ中に位置する第１、第２及び第３の配列中にアミノ酸変異を含まない。例えば、変異体は、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ中にアミノ酸変異を含むことはない。
【０２３８】
１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換される好ましい実施形態において、置換は、例えば以下の表で表される保存的置換であり得る。ある実施形態において、真ん中の列における同じカテゴリーのアミノ酸が、互いに置換され、すなわち、非極性アミノ酸が、例えば別の非極性アミノ酸で置換される。ある実施形態において、最も右側の列における同じ行のアミノ酸が、互いに置換される。
【０２３９】
【表１】
2021524275.tif 000002
【０２４０】
ある実施形態において、置換は、機能的に保存的であり得る。すなわち、ある実施形態において、置換は、同等の非置換の特異的結合メンバーと比較して、置換を含む特異的結合メンバーの１つ以上の機能特性（例えば結合親和性）に影響を与えることはない（又は実質的に影響を与えることはない）。
【０２４１】
特異的結合メンバーの定常ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメイン中に位置するＯＸ４０抗原結合部位を含み、且つＯＸ４０への結合を巡って本発明の特異的結合メンバーと競合するか、又はＯＸ４０における、本発明の特異的結合メンバーと同じエピトープに結合する特異的結合メンバーも考えられる。２つの特異的結合メンバーによって抗原を巡る競合を決定するための方法が、当該技術分野において公知である。例えば、２つの特異的結合メンバーによる抗原への結合の競合が、Biacoreなどの表面プラズモン共鳴を用いて決定され得る。マッピングするための方法
【０２４２】
ある実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＤＲベースの抗原結合部位を含むことはない。
【０２４３】
特に、特異的結合メンバーは、ＣＤ１３７に結合するＣＤＲベースの抗原結合部位を含むことはない。
【０２４４】
それに加えて、又はその代わりに、特異的結合メンバーは、メソテリン（ＭＳＬＮ）に結合するＣＤＲベースの抗原結合部位を含むことはない。
【０２４５】
例えば、特異的結合メンバーは、ＣＤ１３７又はＭＳＬＮに結合するＣＤＲベースの抗原結合部位を含むことはなく、ここで、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９のＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ中に位置する第１、第２及び第３の配列、特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９のＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ配列、及び／又は特異的結合メンバーＦＳ２０−２２−４９のＣＨ３ドメイン配列を含む。
【０２４６】
例えば、特異的結合メンバーは、以下に記載される抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ  ＦＳ３０−１０−１６のＣＤＲ、及び／又はＶＨ及び／又はＶＬドメインを含むことはない。
【０２４７】
ＦＳ３０−１０−１６  ｍＡｂの重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ１（ＩＭＧＴ）  ＧＦＴＦＳＳＹＤ
ＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ）  ＳＹＤＭＳ
ＣＤＲ２（ＩＭＧＴ）  ＩＤＰＴＧＳＫＴ
ＣＤＲ２  Ｋａｂａｔ）  ＤＩＤＰＴＧＳＫＴＤＹＡＤＳＶＫＧ
ＣＤＲ３（ＩＭＧＴ）  ＡＲＤＬＬＶＹＧＦＤＹ
ＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ）  ＤＬＬＶＹＧＦＤＹ
【０２４８】
ＦＳ３０−１０−１６  ｍＡｂのＶＨドメインドメイン
【化１】
2021524275.tif 000003
【０２４９】
ＦＳ３０−１０−１６  ｍＡｂの軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ１（ＩＭＧＴ）  ＱＳＶＳＳＳＹ
ＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ）  ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
ＣＤＲ２（ＩＭＧＴ）  ＧＡＳ
ＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ）  ＧＡＳＳＲＡＴ
ＣＤＲ３（ＩＭＧＴ）  ＱＱＳＹＳＹＰＶＴ
ＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ）  ＱＱＳＹＳＹＰＶＴ
【０２５０】
ＦＳ３０−１０−１６  ｍＡｂのＶＬドメイン
【化２】
2021524275.tif 000004
【０２５１】
特に、特異的結合メンバーは、配列番号１７２及び１７３のそれぞれに記載されるＦＳ２０−２２−４９−ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６の重鎖及び軽鎖配列を含むか又はそれからなることはない。
【０２５２】
特異的結合メンバーは、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。この場合、特異的結合メンバーは、コンジュゲートと呼ばれ得る。このようなコンジュゲートは、本明細書に記載される疾患の治療に利用される。
【０２５３】
例えば、生物活性分子は、サイトカイン、好ましくは、ヒトサイトカインなどの免疫系調節剤であり得る。例えば、サイトカインは、Ｔ細胞活性化及び／又は増殖を刺激するサイトカインであり得る。特異的結合メンバーへのコンジュゲーションのためのサイトカインの例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γが挙げられる。
【０２５４】
或いは、生物活性分子は、サイトカインのリガンドトラップ、例えばＴＧＦ−β又はＩＬ−６のリガンドトラップなどのリガンドトラップであり得る。
【０２５５】
特異的結合メンバーにコンジュゲートされ得る好適な検出可能な標識は、当該技術分野において公知であり、放射性同位体、例えば、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、インジウム−１１１及びテクネチウム−９９；蛍光色素、例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、Texas Red及びシアニン色素誘導体、例えば、Cy7及びAlexa750；発色性色素、例えば、ジアミノベンジジン；ラテックスビーズ；酵素標識、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ；スペクトル的に分離された吸収若しくは発光特性を有する蛍光又はレーザー色素；及び特定の同種検出可能部分、例えば標識されたアビジンへの結合を介して検出され得る、ビオチンなどの化学部分が挙げられる。
【０２５６】
特異的結合メンバーは、任意の好適な共有結合又は非共有結合、例えば、ジスルフィド又はペプチド結合によって、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。生物活性分子がサイトカインである場合、サイトカインは、ペプチドリンカーによって特異的結合メンバーに結合され得る。好適なペプチドリンカーは、当該技術分野において公知であり、５から２５、５から２０、５から１５、１０から２５、１０から２０、又は１０から１５アミノ酸長であり得る。
【０２５７】
ある実施形態において、生物活性分子は、切断可能なリンカーによって特異的結合メンバーにコンジュゲートされ得る。リンカーは、治療の部位における特異的結合メンバーからの生物活性分子の放出を可能にし得る。リンカーは、アミド結合（例えばペプチドリンカー）、ジスルフィド結合又はヒドラゾンを含み得る。ペプチドリンカーは、例えば部位特異的プロテアーゼによって切断され得、ジスルフィド結合は、サイトゾルの還元環境によって切断され得、ヒドラゾンは、酸媒介性加水分解によって切断され得る。
【０２５８】
コンジュゲートは、特異的結合メンバー及び生物活性分子を含む融合タンパク質であり得る。この場合、生物活性分子は、ペプチドリンカー又はペプチド結合によって特異的結合メンバーにコンジュゲートされ得る。特異的結合メンバーが多連鎖分子である場合、例えば、特異的結合メンバーがＦｃａｂであるか若しくはそれを含むか又はｍＡｂ２である場合、生物活性分子は、特異的結合メンバーの１つ以上の鎖にコンジュゲートされ得る。例えば、生物活性分子は、ｍＡｂ２分子の重鎖の一方又は両方にコンジュゲートされ得る。融合タンパク質は、産生及び精製するのが容易であるという利点を有し、臨床グレードの材料の製造を容易にする。
【０２５９】
本発明はまた、本発明の特異的結合メンバーをコードする１つ又は複数の単離された核酸分子を提供する。当業者には、当該技術分野において周知の方法を用いて、このような核酸分子を調製するのに何の困難もない。
【０２６０】
好ましい実施形態において、核酸分子は、特異的結合メンバー：ＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８、好ましくは、ＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、又はＦＳ２０−２２−８５、より好ましくは、ＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、又はＦＳ２０−２２−４７、最も好ましくは、ＦＳ２０−２２−４９のＣＨ３ドメインをコードする。
【０２６１】
別の好ましい実施形態において、核酸分子は、特異的結合メンバー：ＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６、好ましくは、ＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、又はＦＳ２０−３１−１０２、より好ましくは、ＦＳ２０−３１−１１５、又はＦＳ２０−３１−１０８、最も好ましくは、ＦＳ２０−３１−１１５のＣＨ３ドメインをコードする。
【０２６２】
さらなる代替的な好ましい実施形態において、核酸分子は、特異的結合メンバー：ＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４、最も好ましくは、ＦＳ２０−１１−１３１のＣＨ３ドメインをコードする。
【０２６３】
これらの特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン配列は、本明細書に記載される。
【０２６４】
例えば、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインをコードする核酸分子：
（ｉ）ＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−４９、又はＦＳ２０−２２−８５が、配列番号４７、５６、６４、７３、及び８２のそれぞれに記載され；
（ｉｉ）ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−１０８、又はＦＳ２０−３１−１１５が、配列番号９５、１０４、１１５、１２５、１３５、及び１４４のそれぞれに記載され；又は
（ｉｉｉ）ＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、又はＦＳ２０−１１−１３４が、配列番号１６、２５、及び３４のそれぞれに記載される。
【０２６５】
好ましい実施形態において、核酸分子は、特異的結合メンバー：ＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−８５、又はＦＳ２０−２２−３８、好ましくは、ＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、又はＦＳ２０−２２−８５、より好ましくは、ＦＳ２０−２２−４９、ＦＳ２０−２２−４１、又はＦＳ２０−２２−４７、最も好ましくは、ＦＳ２０−２２−４９をコードする。
【０２６６】
別の好ましい実施形態において、核酸分子は、特異的結合メンバー：ＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、又はＦＳ２０−３１−６６、好ましくは、ＦＳ２０−３１−１１５、ＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−９４、又はＦＳ２０−３１−１０２、より好ましくは、ＦＳ２０−３１−１１５、又はＦＳ２０−３１−１０８、最も好ましくは、ＦＳ２０−３１−１１５をコードする。
【０２６７】
さらなる代替的な好ましい実施形態において、核酸分子は、特異的結合メンバー：ＦＳ２０−１１−１３１、ＦＳ２０−１１−１２７、又はＦＳ２０−１１−１３４、最も好ましくは、ＦＳ２０−１１−１３１をコードする。
【０２６８】
例えば、特異的結合メンバーの配列をコードする核酸分子：
（ｉ）ＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−４９、及びＦＳ２０−２２−８５が、配列番号４９、５８、６６、７５、及び８４のそれぞれに記載され；
（ｉｉ）ＦＳ２０−２２−３８、ＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−４９、及びＦＳ２０−２２−８５が、配列番号５１、６０、６８、７７、及び８６のそれぞれに記載される。
【０２６９】
特異的結合メンバーの配列をコードする核酸分子：
（ｉ）ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−１０８、及びＦＳ２０−３１−１１５が、配列番号９７、１０６、１１７、１２７、１３７、及び１４６のそれぞれに記載され；（ｉｉ）ＦＳ２０−３１−５８、ＦＳ２０−３１−６６、ＦＳ２０−３１−９４、ＦＳ２０−３１−１０２、ＦＳ２０−３１−１０８、及びＦＳ２０−３１−１１５が、配列番号９９、１０８、１１９、１２９、１３９、及び１４８のそれぞれに記載される。
【０２７０】
特異的結合メンバーの配列をコードする核酸分子：
（ｉ）ＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、又はＦＳ２０−１１−１３４が、配列番号１８、２７、及び３６のそれぞれに記載され；
（ｉｉ）ＦＳ２０−１１−１２７、ＦＳ２０−１１−１３１、又はＦＳ２０−１１−１３４が、配列番号２０、２９、及び３８のそれぞれに記載される。
【０２７１】
単離された核酸分子が、本発明の特異的結合メンバーを発現させるのに使用され得る。核酸は、一般に、発現のために組み換えベクターの形態で提供される。したがって、本発明の別の態様は、上述される核酸を含むベクターを提供する。必要に応じて、プロモータ配列、ターミネータ断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む適切な制御配列を含有する好適なベクターが、選択又は構築され得る。好ましくは、ベクターは、宿主細胞内の核酸の発現を引き起こすために適切な制御配列を含有する。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、又はファージミドであり得る。
【０２７２】
本明細書に記載される核酸分子又はベクターは、宿主細胞中に導入され得る。宿主細胞中への核酸又はベクターの導入のための技術は、当該技術分野において十分に確立されており、任意の好適な技術が用いられ得る。組み換え特異的結合メンバーの産生に好適な様々な宿主細胞が、当該技術分野において公知であり、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物宿主細胞を含む。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳ０、又はＨＥＫ細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞である。最も好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【０２７３】
本発明の別の態様は、本発明の特異的結合メンバーを産生する方法であって、宿主細胞内で特異的結合メンバーをコードする核酸を発現させること、及び任意に、このように産生された特異的結合メンバーを単離及び／又は精製することを含む、方法を提供する。宿主細胞を培養するための方法は、当該技術分野において周知である。本方法は、特異的結合メンバーを単離及び／又は精製することをさらに含み得る。組み換え特異的結合メンバーの精製のための技術は、当該技術分野において周知であり、例えばプロテインＡ又はプロテインＬを用いた、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又はアフィニティークロマトグラフィーを含む。ある実施形態において、精製は、特異的結合メンバー上でアフィニティータグを用いて行われ得る。本方法は、任意に、薬学的に許容される賦形剤又は後述される他の物質を用いて、特異的結合メンバーを医薬組成物へと製剤化することも含み得る。
【０２７４】
上記に説明されるように、ＯＸ４０は、活性化Ｔ細胞、特に、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、１型Ｔヘルパー（Ｔｈ１）細胞、２型Ｔヘルパー（Ｔｈ２）細胞及び制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、及び腫瘍浸潤Ｔ細胞、並びに活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、免疫系の細胞において発現される。ＯＸ４０活性化は、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞のクローン性増殖、Ｔ細胞の分化及び生存、及びメモリーＴ細胞の産生を促進するのに役割を果たすことが示された。ＯＸ４０の活性を促進する免疫応答を考慮して、ＯＸ４０アゴニスト分子は、癌治療に関して調査されている。
【０２７５】
したがって、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、治療用途、特に、癌の治療に有用であり得る。さらに、特異的結合メンバーは、持続性感染症などの感染症の治療に有用であると予想される。
【０２７６】
本明細書に記載される特異的結合メンバーは、ヒト又は動物身体の治療の方法に使用され得る。本発明の関連する態様は、以下を提供する；
（ｉ）薬剤として使用するための本明細書に記載される特異的結合メンバー、
（ｉｉ）疾患又は障害の治療の方法に使用するための本明細書に記載される特異的結合メンバー、
（ｉｉｉ）疾患又は障害の治療に使用するための薬剤の製造における、本明細書に記載される特異的結合メンバーの使用；及び
（ｉｖ）個体における疾患又は障害を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載される特異的結合メンバーを個体に投与することを含む、方法。
【０２７７】
個体は、患者、好ましくは、ヒト患者であり得る。
【０２７８】
治療は、ある所望の治療効果が達成される任意の治療又は治療法、例えば、病態の進行の阻害又は遅延であり得、進行速度の低下、進行速度の停止、病態の改善、病態の治癒若しくは緩和（部分的か若しくは全体的かにかかわらず）、病態の１つ以上の症状及び／又は兆候を予防、改善、遅延、低減若しくは停止するか、又は個体若しくは患者の生存期間を、治療しない場合に予想される生存期間を超えて延長することを含む。
【０２７９】
予防的措置（すなわち予防）としての治療も含まれる。例えば、癌などの疾患の発症又は再発を起こしやすい又はそのリスクがある個体が、本明細書に記載されるように治療され得る。このような治療は、個体における疾患の発症又は再発を予防するか又は遅延させ得る。
【０２８０】
本明細書に記載される治療の方法は、特異的結合メンバーに加えて、少なくとも１つのさらなる治療を個体に投与することを含み得る。したがって、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、単独で又は１つ以上の他の治療と組み合わせて、個体に投与され得る。特異的結合メンバーが、別の治療と組み合わせて個体に投与される場合、さらなる治療は、特異的結合メンバーの投与と同時に、投与と連続して、又は投与と別々に、個体に投与され得る。さらなる治療が、特異的結合メンバーと同時に投与される場合、特異的結合メンバー及びさらなる治療は、複合製剤として個体に投与され得る。例えば、さらなる治療法は、治療される疾患のための公知の治療法又は治療剤であり得る。
【０２８１】
特異的結合メンバーは、単独で投与され得るが、特異的結合メンバーは、通常、特異的結合メンバーに加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与されるであろう。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載される特異的結合メンバーを含む医薬組成物を提供する。特異的結合メンバーを医薬組成物へと製剤化することを含む方法も提供される。
【０２８２】
医薬組成物は、特異的結合メンバーに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。本明細書において使用される際の「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、妥当なリスク・ベネフィット比に見合う、対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。各担体、賦形剤などはまた、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容され」なければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、投与経路は、後述されるように、注入、注射又は任意の他の好適な経路によるものであり得る。
【０２８３】
例えば注射による、非経口、例えば皮下又は静脈内投与のため、特異的結合メンバーを含む医薬組成物は、パイロジェンフリーであり、且つ好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口で許容される水溶液の形態であり得る。当業者は、例えば、等張ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、ラクトリンゲル注射液を用いて好適な溶液を調製することが十分にできる。緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸及び他の有機酸；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の糖質；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（商標）、PLURONICS（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤及び／又は他の添加剤が、必要に応じて用いられ得る。
【０２８４】
ある実施形態において、特異的結合メンバーは、投与前に再構成のために凍結乾燥形態で提供され得る。例えば、凍結乾燥された特異的結合メンバーは、滅菌水で再構成され、個体への投与前に生理食塩水と混合され得る。
【０２８５】
投与は、「治療有効量」であり得、これは、個体への利益を示すのに十分なものである。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間的経過は、治療されるものの性質及び重症度、治療される特定の個体、個体の臨床症状、障害の原因、組成物の送達の部位、特異的結合メンバーのタイプ、投与の方法、投与のスケジューリング及び医師に公知の他の要因に依存する。治療の処方、例えば、投与量に関する決定などは、一般医師及び他の医師の責任に含まれ、症状の重症度及び／又は治療される疾患の進行に依存し得る。免疫グロブリンの適切な用量は、当該技術分野において周知である（Ledermann et al.(1991)Int.J.Cancer 47:659-664；及びBagshawe et al.(1991)Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922）。本明細書に、又は投与される抗体分子について適切な場合the Physician’s Desk Reference(2003)に示される特定の投与量が使用され得る。抗体分子について、特異的結合メンバーの治療有効量又は好適な用量は、動物モデルにおけるインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定され得る。マウス及び他の試験動物における有効な投与量をヒトに当てはめるための方法は公知である。正確な用量は、治療される部位のサイズ及び位置がどうであるか、並びに特異的結合メンバーの正確な性質を含むいくつかの要因に依存する。
【０２８６】
典型的な免疫グロブリン用量は、全身適用では１００μｇから１ｇの範囲であり、局所適用では１μｇから１ｍｇの範囲である。初期のより多い負荷用量、その後、１回以上のより少ない用量が投与され得る。これは、成人個体の単回の治療のための用量であり、これは、小児及び幼児のために比例的に調整され得、また、分子量に比例して他の特異的結合メンバーフォーマットのために調整され得る。
【０２８７】
治療は、医師の判断で、毎日、週に２回、１週間又は１か月間隔で繰り返され得る。個体のための治療スケジュールは、特異的結合メンバー組成物の薬物動態及び薬力学的特性、投与経路及び治療される病態の性質に依存し得る。
【０２８８】
治療は、定期的であってもよく、投与間の期間は、約２週間以上、例えば約３週間以上、約４週間以上、１か月以上で約１回、約５週間以上、又は約６週間以上であり得る。例えば、治療は、２から４週間毎又は４から８週間毎であり得る。好適な製剤及び投与の経路は、上述されている。
【０２８９】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、癌を治療する方法に使用するためのものであり得る。
【０２９０】
癌は、悪性癌細胞の異常増殖によって特徴付けられ得る。乳癌などの特定のタイプの癌が言及される場合、これは、乳房組織などの関連する組織の悪性細胞の異常増殖を指す。乳房に位置するが、卵巣組織などの別の組織の悪性細胞の異常増殖の結果である二次癌は、本明細書において言及される際、乳癌ではなく、卵巣癌である。
【０２９１】
癌は、原発性癌又は二次癌であり得る。したがって、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、個体における癌を治療する方法に使用するためのものであり得、ここで、癌は、原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である。
【０２９２】
本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される癌の腫瘍は、例えばそれらの細胞表面において、ＯＸ４０を発現する腫瘍浸潤Ｔ細胞を含み得る。一実施形態において、腫瘍は、ＯＸ４０を発現する腫瘍浸潤Ｔ細胞を含むことが決定されている場合がある。細胞表面における抗原の発現を決定するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、フローサイトメトリーを含む。
【０２９３】
例えば、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される癌は、白血病、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫；並びに固形癌、例えば、肉腫（例えば軟組織肉腫）、皮膚癌（例えばメルケル細胞癌）、黒色腫、膀胱癌（例えば尿路上皮癌）、脳腫瘍（例えば多形性膠芽腫）、乳癌、子宮／子宮内膜癌、卵巣癌（例えば卵巣漿液性嚢胞腺腫）、前立腺癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、結腸直腸癌（例えば結腸直腸腺癌）、子宮頸癌（例えば子宮頸部扁平上皮細胞癌及び子宮頚部腺癌）、肝臓癌（例えば肝細胞癌）、頭頸部癌（例えば頭頸部扁平上皮癌）、食道癌、膵臓癌、腎臓癌（例えば腎細胞癌）、副腎癌、胃癌、精巣癌、胆嚢及び胆道の癌（例えば胆管癌）、甲状腺癌、胸腺癌、骨肉腫、及び脳腫瘍からなる群から選択され得る。
【０２９４】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される癌は、固形癌である。より好ましくは、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される癌は、肉腫、黒色腫、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮癌／子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌及び胃癌からなる群から選択され得る固形癌である。
【０２９５】
癌に関して、治療は、完全な癌の寛解を含む、癌成長を阻害すること、及び／又は癌転移を阻害すること、並びに癌の再発を阻害することを含み得る。癌成長は、一般に、より発達した形態への癌内の変化を示すいくつかの指標のいずれか１つを指す。したがって、癌成長の阻害を測定するための指標としては、癌細胞生存の減少、腫瘍体積若しくは形態の減少（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、若しくは他のイメージング方法を用いて決定される際）、遅延した腫瘍成長、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏症皮膚試験の改善した成績、抗癌免疫細胞若しくは他の抗癌免疫応答の活性の増加、及び腫瘍特異的抗原のレベルの低下が挙げられる。個体における癌性腫瘍に対する免疫応答を活性化又は促進することは、癌成長、特に、対象中に既に存在する癌の成長に抵抗し、及び／又は個体における癌成長の傾向を低下させる個体の能力を向上させ得る。
【０２９６】
癌治療に関して、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、当該癌の治療のために、好適であることが示されているか、又は好適であると予想される抗癌治療法又は治療剤などの別の抗癌治療法又は治療剤と組み合わせて、個体に投与され得る。例えば、特異的結合メンバーは、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法（養子ＮＫ細胞療法など又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、若しくはγ／δ  Ｔ細胞を用いた治療法、又はホルモン療法のための薬剤と組み合わせて、個体に投与され得る。
【０２９７】
理論に制約されるのを望むものではないが、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、抗癌治療法において補助剤として働き得ると考えられる。具体的には、化学療法及び／又は放射線療法と組み合わせた、又は抗腫瘍ワクチンと組み合わせた、個体への特異的結合メンバーの投与は、例えば、化学療法及び／又は放射線療法で、又は抗腫瘍ワクチン単独で達成されるより大きな、癌に対する免疫応答を引き起こすと考えられる。
【０２９８】
本明細書に記載される特異的結合メンバーと組み合わせた投与のための１つ以上の化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、アルキル化剤、白金類似体、ヌクレオシド類似体、抗葉酸剤、サリドマイド誘導体、抗腫瘍性化学療法剤及びその他からなる群から選択され得る。タキサンとしては、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ−パクリタキセルが挙げられ；細胞傷害性抗生物質としては、アクチノマイシン、ブレオマイシン、及びアントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、ミトキサントロン及びバルルビシンが挙げられ；チロシンキナーゼ阻害剤としては、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コビメチニブ（cobemitinib）及びトラメチニブが挙げられ；ＰＡＲＰ阻害剤としては、ニラパリブ（piraparib）が挙げられ；Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤としては、ベムラフェニブ及びダブラフェニブが挙げられ；アルキル化剤としては、ダカルバジン、シクロホスファミド及びテモゾロミドが挙げられ；白金類似体としては、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンが挙げられ；ヌクレオシド類似体としては、アザシチジン、カペシタビン、フルダラビン、フルオロウラシル及びゲムシタビンが挙げられ；抗葉酸剤としては、メトトレキサート及びペメトレキセドが挙げられる。本発明において使用するのに好適な他の化学療法剤としては、デファクチニブ、エンチノスタット、エリブリン、イリノテカン及びビンブラスチンが挙げられる。
【０２９９】
本明細書に記載される抗体分子とともに投与するための好ましい治療剤は、ドキソルビシン、ミトキサントロン、シクロホスファミド、シスプラチン、及びオキサリプラチンである。
【０３００】
本明細書に記載される特異的結合メンバーと組み合わせた投与のための放射線療法は、外照射放射線療法又は近接照射療法であり得る。
【０３０１】
本明細書に記載される特異的結合メンバーと組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子、核酸サイトカイン、又はサイトカインベースの治療法であり得る。例えば、治療用抗体分子は、免疫調節分子、例えば阻害性チェックポイント分子若しくは免疫共刺激分子、又は腫瘍抗原、例えば細胞表面腫瘍抗原若しくは可溶性腫瘍抗原に結合し得る。治療用特異的結合メンバーが結合し得る免疫調節分子の例としては、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＲ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、ＩＬ−１０及びＣＳＦ−１が挙げられる。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（例えばＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ−５）、及びＳＴＩＮＧが挙げられる。治療用抗体分子が結合し得る腫瘍抗原の例としては、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０及びＴＧＦ−βが挙げられる。
【０３０２】
本明細書に記載される特異的結合メンバーと組み合わせた投与のための核酸は、ｓｉＲＮＡであり得る。
【０３０３】
サイトカイン又はサイトカインベースの治療法は、ＩＬ−２、コンジュゲートされたＩＬ−２のプロドラッグ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、及びＩ型インターフェロンからなる群から選択され得る。
【０３０４】
癌の治療のための抗腫瘍ワクチンは、臨床において実現されており、且つ科学文献（Rosenberg,2000など）中で詳細に説明されている。これは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とともに又はそれを伴わずに、ワクチン接種法として自己又は同種異系癌細胞を使用することによって、それらの細胞によって発現される様々な細胞マーカーに応答するように免疫系を促す手法を主に必要とする。ＧＭ−ＣＳＦは、前記手法により用いられるとき、抗原提示において強い応答を引き起こし、特によく機能する。
【０３０５】
化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤は、好ましくは、当該癌のための、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤、すなわち、当該癌の治療に有効であることが示されている、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤である。当該癌に有効であることが示されている、好適な化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤の選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３０６】
ＯＸ４０の活性を促進する免疫応答を考慮して、ＯＸ４０アゴニスト分子は、感染症の治療に利用されると予想される。したがって、別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、急性又は持続性感染症などの感染症を治療する方法に使用するためのものであり得る。
【０３０７】
理論に制約されるのを望むものではないが、本発明の特異的結合メンバーは、好中球及び単球などの自然免疫細胞の急速浸透及び活性化を誘発し、それによって、急性感染症の原因となる病原体の除去を促進することによって、病原体によって引き起こされる急性感染症に対する免疫応答を促進すると考えられる。したがって、さらなる実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、急性細菌性疾患などの急性感染症を治療する方法において使用するためのものであり得る。好ましい実施形態において、急性感染症は、リステリア属（Listeria）の細菌、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、又は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）などのグラム陽性菌によって引き起こされる急性細菌性疾患である。
【０３０８】
感染症は、通常、免疫系によって除去されるが、一部の感染症は、数か月又は数年などの長期間にわたって持続し、免疫系によって効果的に食い止められない。このような感染症は、持続性又は慢性感染症とも呼ばれる。
【０３０９】
好ましくは、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、持続性感染症、例えば、持続性ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫感染、好ましくは、持続性ウイルス又は細菌感染を治療するのに使用される。
【０３１０】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される持続性ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、又は水痘帯状疱疹ウイルスの持続性感染症である。
【０３１１】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される持続性細菌感染は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenza）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、大腸菌（Escherichia coli）、チフス菌（Salmonella typhi）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）、又は肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）の持続性感染症である。
【０３１２】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される持続性真菌感染は、カンジダ属（Candida）（例えばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans））、クリプトコッカス属（Cryptococcus）（例えばクリプトコッカス・ガッティ（Cryptococcus gattii）若しくはクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans））、タラロマイセス属（Talaromyces）（ペニシリウム属（Penicillium））（例えばタラロマイセス・マルネッフェイ（Talaromyces marneffe））、ミクロスポルム属（Microsporum）（例えばミクロスポルム・オーズアニー（Microsporum audouinii））、又はトリコフィトン・トンズランス（Trichophyton tonsurans）の持続性感染症である。
【０３１３】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される持続性寄生虫感染は、プラスモジウム属（Plasmodium）、例えば、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、又はリーシュマニア属（Leishmania）、例えば、ドノバン・リーシュマニア（Leishmania donovani）の持続性感染症である。
【０３１４】
持続性感染症の治療に関して、治療は、感染症を取り除くこと、個体病原性負荷を低減すること、感染症の再発を防止することを含み得る。例えば、治療は、持続性感染症の１つ以上の症状及び／又は兆候を予防、改善、遅延、抑制又は停止することを含み得る。或いは、治療は、感染症を予防することを含み得る。
【０３１５】
感染症の治療に関して、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、当該感染症の治療のために、好適であることが示されているか、又は好適であると予想される治療剤などの、感染症の治療のための別の治療剤と組み合わせて、個体に投与され得る。例えば、特異的結合メンバーは、免疫療法剤と組み合わせて個体に投与され得る。本明細書に記載される抗体分子と組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子であり得る。例えば、治療用抗体分子は、自然免疫系の受容体に結合し得る。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（例えばＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ−５）、及びＳＴＩＮＧが挙げられる。
【０３１６】
特異的結合メンバーが、感染症を予防するのに使用される場合、特異的結合メンバーは、当該病原体に対するワクチンと組み合わせて投与され得る。理論に制約されるのを望むものではないが、本明細書に記載される特異的結合メンバーが、ワクチン接種において補助剤として働き得ると考えられる。具体的には、ワクチンと組み合わせた、個体への特異的結合メンバーの投与は、ワクチン単独で達成されるより大きな、病原体に対する免疫応答を引き起こすと考えられる。
【０３１７】
本開示が以下の実験の例示を含むことを考えると、本発明のさらなる態様及び実施形態が、当業者に明らかであろう。
【０３１８】
本明細書において言及される全ての文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０３１９】
本明細書において使用される際の「及び／又は」は、他のものを伴うか又は伴わない、２つの規定の特徴又は成分のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが本明細書に個々に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。
【０３２０】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、上記に記載される特徴の説明及び定義は、本発明のいずれかの特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
【０３２１】
本発明の他の態様及び実施形態は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「からなる」又は「から本質的になる」という用語によって置き換えられる「を含む」という用語を用いて上述される態様及び実施形態を提供する。
【０３２２】
本発明の特定の態様及び実施形態は、例として及び上述される図を参照して例示される。
【実施例】
【０３２３】
実施例
実施例１−抗原選択及び特徴付け
ヒト及びマウスＯＸ４０に対して特異的なＦｃａｂの選択のため、並びに選択されたＦｃａｂとカニクイザルＯＸ４０との交差反応性を試験するために使用されるＯＸ４０抗原を、社内で調製するか、又は後述されるように商業的供給源から入手した。
【０３２４】
１．１  社内で調製される抗原
組み換え可溶性二量体ＯＸ４０抗原、並びにＯＸ４０を発現する細胞株を社内で調製した。
【０３２５】
１．１．１  組み換え可溶性ヒト、カニクイザル及びマウスＯＸ４０抗原の調製
組み換え可溶性二量体ＯＸ４０抗原を調製するために、ＯＸ４０の細胞外ドメインを、マウスＦｃに融合させ、これは、抗原の溶解度及び安定性を向上させた。具体的には、関連するＯＸ４０（ヒト、カニクイザル又はマウス）の細胞外ドメインを、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＢｇｌＩＩ制限酵素を用いてｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ２ａＦｃ２ベクター（Invivogenカタログ番号ｐｆｕｓｅ−ｍｇ２ａｆｃ２）へとクローニングして、Ｃ末端にマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインを有する抗原を産生した。次に、組み換えＯＸ４０抗原を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（National Research Council of Canada）中での一過性発現によって産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラム（GE Healthcare、１１００３４９４）、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製して、得られた抗原が１種類であり、集合体（aggregate）を含まないことを確実にした。
【０３２６】
組み換えＯＸ４０抗原のビオチン化形態を調製するために、抗原を、製造業者のプロトコルに従って、EZ-Link（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンキット（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号２１３３１）を用いてビオチン化した。ビオチン化ＯＸ４０抗原を、結合親和性測定ではなく、後述される選択実験に使用した。ビオチン化ＯＸ４０抗原の精製を、製造業者の説明書に従って、PD10脱塩カラムGE Healthcare、１７−０８５１−０１）続いて、Amicon 30kスピンカラムMillipore、ＵＦＣ９０３０２４）を用いて、２工程で行った。組み換え抗原の生物物理学的特性を、集合体が存在しないことを確実にするためにＳＥ−ＨＰＬＣ分析によって、及び分子のサイズを確認するためにＰＡＧＥによって特徴付けした。ＰＡＧＥによるサイズ決定は、可溶性抗原の推定分子量がモノマーの予測分子量の２倍であったため、可溶性抗原が二量体であることを示した。また、組み換え抗原を、ゲルシフト分析によって分析し、これは、ビオチン化の程度が９０％を超えていたことを示した。ＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、ビオチン化組み換えヒト（ｈＯＸ４０−ｍＦｃ）、マウス（ｍＯＸ４０−ｍＦｃ）及びカニクイザル（ｃＯＸ４０−ｍＦｃ）ＯＸ４０抗原が、ＯＸ４０特異的抗体（ヒト及びカニクイザルＯＸ４０に対する抗体１１Ｄ４［欧州特許第２２４２７７１号］；カニクイザルＯＸ４０に対するポリクローナルヒツジ抗ヒトＯＸ４０抗体［R&D Systemsカタログ番号ＡＦ３３８８］；ヒトＯＸ４０に対する抗体ＡＣＴ３５［Biolegendカタログ番号３５００２］及びマウスＯＸ４０に対する抗体ＯＸ８６［Biolegendカタログ番号１１９４０８］）によって結合され得ることを確認した。これらの抗原は、以下の表２に列挙される。
【０３２７】
１．１．２  ヒト、カニクイザル及びマウスＯＸ４０を発現する細胞株の調製
ヒト、カニクイザル及びマウスＯＸ４０（配列については表１を参照）を、ＳｐｅＩ−ＨＦ及びＮｏｔＩ−ＨＦ制限酵素を用いて、ベクターpLVX-EF1a-IRES-puro（Clontech、カタログ番号６３１２５３）へとクローニングした。次に、ベクターを、Lenti-X HTXパッケージングミックス（Clontechカタログ番号６３１２４９）と一緒にLenti-X 293T細胞株（Clontech、カタログ番号６３２１８０）へと形質転換して、レンチウイルスを産生した。次に、レンチウイルスを用いて、ＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）を形質導入した。ＯＸ４０を過剰発現する細胞を、約２週間によって５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Life Technologiesカタログ番号Ａ１１１１３８０３）との細胞のインキュベーションによって選択した後、連続希釈によって細胞株をクローニングした。細胞株によるＯＸ４０の発現を、蛍光標識されたＯＸ４０特異的抗体（実施例１．１．１及び表２に記載されるように、ＯＸ８６；ＡＣＴ３５；及びポリクローナルヒツジ抗ヒトＯＸ４０））を用いたフローサイトメトリーによって試験した。フローサイトメトリー分析において、全ての細胞が非形質導入細胞より少なくとも１０倍高い蛍光値を示した、ヒト（ＤＯ１１．１０−ｈＯＸ４０）、マウス（ＤＯ１１．１０−ｍＯＸ４０）又はカニクイザル（ＤＯ１１．１０−ｃＯＸ４０）ＯＸ４０を発現する細胞株を選択した。これらの細胞株が、以下の表２に列挙される。
【０３２８】
【表２】
2021524275.tif 000005
【０３２９】
１．２  市販のＯＸ４０抗原
いくつかの市販のＯＸ４０抗原を試験した。
【０３３０】
組み換えＨｉｓタグ化ヒトＯＸ４０細胞外ドメインを、SinoBiologicals（カタログ番号１０４８１−Ｈ０８Ｈ−５０）から入手した。しかしながら、この抗原のＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、抗原の５０％未満が、モノマー、非集合形態であったことを示した。したがって、この抗原は、その後の分析に使用しなかった。
【０３３１】
Ｃ末端にヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、組み換えヒトＯＸ４０／ヒトＦｃ（ｈＯＸ４０−ｈＦｃ）及び組み換えマウスＯＸ４０／ヒトＦｃ（ｍＯＸ４０−ｈＦｃ）を、R&D Systems（ｈＯＸ４０−ｈＦｃ：カタログ番号３３８８−ＯＸ−０５０；ｍＯＸ４０−ｈＦｃ：カタログ番号１２５６−ＯＸ−０５０）から入手し、社内でビオチン化した。これらの可溶性抗原の生物物理学的特性を、集合体が存在しないことを確実にするためにＳＥ−ＨＰＬＣ分析によって、及び分子のサイズを確認するためにＰＡＧＥによって特徴付けした。ＰＡＧＥによるサイズ決定は、可溶性抗原の推定分子量がモノマー抗原について予測されるものの２倍であったため、可溶性抗原が二量体であることを示した。また、可溶性抗原を、ゲルシフト分析によって分析し、これは、ビオチン化の程度が９０％を超えていたことを示した。ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲを用いて、ビオチン化組み換えヒト（ｈＯＸ４０−ｈＦｃ）及びマウス（ｍＯＸ４０−ｈＦｃ）ＯＸ４０抗原が、実施例１．１．１及び以下の表２に記載されるように、ＯＸ４０特異的抗体（１１Ｄ４；ＡＣＴ３５；及びＯＸ８６によって結合され得ることを確認した。
【０３３２】
【表３】
2021524275.tif 000006
【０３３３】
実施例２−抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの選択及び特徴付け
２．１  抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂのナイーブな選択
ナイーブファージライブラリーからヒトＯＸ４０に特異的なＦｃａｂを選択するために、組み換えビオチン化可溶性二量体ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０−ｍＦｃ；表２を参照）及び細胞で発現されるヒトＯＸ４０（ＤＯ１１．１０−ｈＯＸ４０）の両方を抗原として使用した。ヒトＯＸ４０を発現する細胞を、選択プロトコルのいくつかにおいて、組み換えビオチン化可溶性二量体ヒトＯＸ４０に加えて使用して、選択されたＦｃａｂが、細胞表面上でその天然の立体構造においてＯＸ４０に結合することが可能であることを確実にした。
【０３３４】
ＣＨ３ドメイン中に部分的にランダム化されたＡＢループ（ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って残基１４から１８）及びＥＦループ（ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って残基９２から１０１）を含むＣＨ３ドメイン（ＩＭＧＴ番号付け１．４−１３０）を示す６つのナイーブファージライブラリー。６つのライブラリーの１つは、ＣＨ３ドメインのＥＦループの１０１位（挿入された残基は、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って１０１．１から１０１．４と番号付けされる）に２つ又は４つのアミノ酸（２つ又は４つのＮＮＫコドンによってコードされる）の挿入を伴うクローンをさらに含んでいた。
【０３３５】
６つ全てのライブラリーを、組み換えビオチン化可溶性二量体ヒトＯＸ４０（ｈＯＸ４０−ｍＦｃ；表２を参照）を用いて、３回の選択に供した。具体的には、ライブラリーを、（１及び３回目で）ストレプトアビジン被覆（Thermo Fisher Scientific、１１２０６Ｄ）又は（２回目で）ニュートラアビジン被覆（Thermo Fisher Scientific、１４２０３及びＡ２６６６）Dynabeads上に捕捉されたｈＯＸ４０−ｍＦｃを用いて３回の選択に供した。
【０３３６】
また、６つ全てのライブラリーを、１回目の選択においてｈＯＸ４０−ｍＦｃ、続いて、細胞で発現されるヒトＯＸ４０（２回のさらなる選択においてＤＯ１１．１０−ｈＯＸ４０；表２を参照）を用いて、さらなる選択作業に供した。
【０３３７】
ライブラリーのうちの２つを、ＤＯ１１．１０−ｈＯＸ４０抗原発現細胞を用いて、３回の選択に供した。
【０３３８】
６つのライブラリーから３回目の選択の後に確認された２１３３個のクローンを、ヒトＯＸ４０への結合についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。これにより、３２の固有の陽性結合剤が同定され、これをサブクローニングし、ＨＥＫ  Ｅｘｐｉ２９３細胞中の可溶性Ｆｃａｂ（切断型ヒンジ［配列番号１７１］、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインからなる）として発現させた（ExpiFectamine 293 Transfection kit［Life Technologies、Ａ１４５２４］を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞［Life Technologies、Ａ１４５２７］へとトランスフェクトされたｐＴＴ５ベクター［National Research Council of Canada］へとクローニングされたＦｃａｂ）。
【０３３９】
３２の固有のＦｃａｂを、細胞で発現されるヒトＯＸ４０（ＤＯ１１．１０−ｈＯＸ４０）に結合するそれらの能力について試験した。スクリーニングされた３２のＦｃａｂのうちの１５が、ＤＯ１１．１０−ｈＯＸ４０への細胞結合を示し、これらの相互作用についてのＥＣ５０は、０．１から６２ｎＭの範囲であった。ＤＯ１１．１０−ｈＯＸ４０への結合を示した１５のＦｃａｂを、ヒトＮＦ−κＢレポーターアッセイ（以下の実施例４．４に記載される）において試験した。１５のＦｃａｂのうちの６つが、ヒトＮＦ−κＢレポーターアッセイにおいて、抗ヒトＦｃ抗体と架橋されたとき、活性の増加を示した。このアッセイにおいて最も高いレベルの活性を示し、且つ抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂ（社内で産生されるクローンＭＫ１Ａ６（Jefferis et al.,1985及びJefferis et al.,1992））と架橋されたときに活性が増加した３つのＦｃａｂ、ＦＳ２０−１１、ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１を、親和性成熟のために選択した。
【０３４０】
２．２  抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの親和性成熟
各Ｆｃａｂにつき３つずつ、９つのファージディスプレイされた親和性成熟ライブラリーを、システインを除くアミノ酸の等モルの分布を用いてELLA Biotech製のランダム化プライマーを用いてＣＨ３ドメインのＡＢループ中の５つの残基（残基１４から１８）若しくはＣＤループ中の５つの残基（残基４５．１から７７）をランダム化することによって、又はＣＨ３ドメインのＥＦループの部分（ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１の場合、残基９２から９４及び９７から１０１、並びにＦＳ２０−１１の場合、残基９７から１００及び１０１．１から１０１．４［上記の実施例２．１を参照］）（全ての残基番号付けは、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う）をランダム化することによって、実施例２．１において選択された３つのＦｃａｂ（ＦＳ２０−１１、ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１）に基づいて構築した。第４のＦｃａｂクローン、ＦＳ２０−１０の親和性成熟も試みたが、他の３つのＦｃａｂ系統と比較して劣った結合特性及び機能活性を有する子孫をもたらしたため、この系統は、さらに進めなかった。
【０３４１】
３回の選択を、（１及び３回目で）ストレプトアビジン被覆（Thermo Fisher Scientific、１１２０６Ｄ）及び（２回目で）ニュートラアビジン被覆（Thermo Fisher Scientific、１４２０３及びＡ２６６６）Dynabeads上に交互に捕捉された組み換えヒトビオチン化ｈＯＸ４０−ｍＦｃを用いて、親和性成熟ライブラリーにおいて行った。５０ｎＭ（１回目）から、１０ｎＭまで（２回目）、１ｎＭまで（３回目）（ＦＳ２０−１１及びＦＳ２０−２２系統の場合）、又は１００ｎＭ（１回目）から、５０ｎＭまで（２回目）、１０ｎＭ若しくは１ｎＭまで（３回目）減少する抗原濃度（ＦＳ２０−３１系統の場合）を用いて、高い親和性の結合剤を同定した。１ｎＭの濃度の同じ抗原及びストレプトアビジン被覆Dynabeadsを用いた４回目の選択を、３回の出力のうちの２つのみ、すなわち、ＡＢループ中でランダム化される残基１４から１８を含むＦＳ２０−１１ライブラリー及びＣＤループ中でランダム化される残基４５．１から７７を含むＦＳ２０−２２ライブラリーからの出力において行った。上記の実施例２．１に記載されるように、３回目及び４回目の選択の出力からの１４１０のＦｃａｂを、ヒトＯＸ４０への結合についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、２０４の固有の陽性結合剤を同定し、サブクローニングし、ＨＥＫ  Ｅｘｐｉ２９３細胞内で可溶性Ｆｃａｂとして発現させた。
【０３４２】
ｈＯＸ４０−ｍＦｃに結合されたときの可溶性Ｆｃａｂのオフレートを、抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６を用いて、抗ＣＨ２架橋の非存在下及び存在下で、Biacore 3000（GE Healthcare）を用いて測定した（実施例２．１を参照）。関連する親Ｆｃａｂと比較して改善したオフレートを有するＦｃａｂを、細胞で発現されるヒトＯＸ４０への結合及びヒトＴ細胞活性化アッセイにおいて活性についてさらにスクリーニングした（以下の実施例５．１を参照）。Ｆｃａｂの全てが、細胞で発現されるヒトＯＸ４０に結合した。ヒトＴ細胞活性化アッセイにおいて最も高い活性を有する、ＦＳ２０−１１系統からの２０のＦｃａｂ、ＦＳ２０−２２系統からの１０のＦｃａｂ及びＦＳ２０−３１系統からの１８のＦｃａｂを、後述されるループシャッフリングのために選択した。
【０３４３】
ＦＳ２０−１１系統について、２つのループシャッフルされたライブラリーを作成し、一方は、９つのＡＢループを、１０のＥＦループ及びＷＴ  ＣＤループとシャッフルすることによるものであり、他方は、ＡＢ及びＥＦループを、親和性成熟ＣＤループとシャッフルすることによるものである。ＦＳ２０−２２系統について、２つのループシャッフルされたライブラリーを、３つのＣＤループ、６つのＥＦループ及び親ＡＢループ又は親和性成熟ＡＢループのいずれかをシャッフルすることによって作成した。ＦＳ２０−３１系統について、４つのＡＢループ、７つのＣＤループ及び７つのＥＦループを含む、１つのループシャッフルされたライブラリーを作成した。
【０３４４】
シャッフルされた配列を、上記の実施例２．１に記載されるようにＨＥＫ  Ｅｘｐｉ２９３細胞内で可溶性Ｆｃａｂとして発現させ、Octet QKe System（Pall ForteBio）においてDip and Read（商標）ストレプトアビジンバイオセンサー（Pall ForteBio、１８−５０５０）を用いて、ビオチン化ｈＯＸ４０−ｍＦｃ抗原への結合についてスクリーニングした。親Ｆｃａｂと比較してｈＯＸ４０−ｍＦｃに結合されたときに改善したオフレートを有するＦｃａｂをシーケンシングして、ＦＳ２０−１１系統からの６６の固有のＦｃａｂ配列、ＦＳ２０−２２系統から３５及びＦＳ２０−３１系統から６２を得た。同定された固有のＦｃａｂを、Biacore 3000機器（GE Healthcare）を用いて、抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６を用いて、ＣＨ２架橋の存在下及び非存在下でｈＯＸ４０−ｍＦｃ抗原への結合について試験した。
【０３４５】
ＦＳ２０−１１系統について、ｈＯＸ４０−ｍＦｃへの最も強い結合（一定の濃度についてBiacore機器における最も高い応答を与えることによって決定される際）を有する１８のＦｃａｂを、モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットにおける発現及び後述されるさらなる特徴付けのために選択した。ＦＳ２０−２２系統について、１８のＦｃａｂを、モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットにおける発現、及びＣＨ２架橋を伴い、ｈＯＸ４０−ｍＦｃに結合される場合の、最も遅いオフレートに基づいたさらなる特徴付け、ｈＯＸ４０−ｍＦｃに結合されるときの非架橋及びＣＨ２架橋オフレートの間のオフレートの最大の差並びに上記のようなｈＯＸ４０−ｍＦｃへの結合の強度のために選択した。ＦＳ２０−３１系統について、ＣＨ２架橋を伴い、ｈＯＸ４０−ｍＦｃに結合される場合に最も遅いオフレートを有する９つのＦｃａｂ及びＣＨ２架橋なしでｈＯＸ４０−ｍＦｃに結合される場合に最も遅いオフレートを有する９つのＦｃａｂを、モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットにおける発現及びさらなる特徴付けのために選択した。いくつかのＦｃａｂが、９つのＦｃａｂの両方のこれらの群に共通であったため、ＣＨ２架橋の非存在下でｈＯＸ４０−ｍＦｃに結合される場合に遅いオフレートを示したさらなるＦｃａｂを、モックｍＡｂ２フォーマットにおける発現及びさらなる特徴付けのためのこの系統からのＦｃａｂの総数を１８にするように、ＦＳ２０−３１系統から選択した。Ｔ細胞活性化アッセイからのデータを用いて、このアッセイにおいて高い活性を示し、したがってモック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットにおいても発現され、さらに特徴付けされた、ＦＳ２０−２２系統からのさらなる６つのＦｃａｂ及びＦＳ２０−３１系統からの８つのＦｃａｂを同定した。
【０３４６】
実施例３−抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂの選択及び特徴付け
３．１．  抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂのナイーブな選択
ＣＨ３ドメインのＡＢループ（ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って残基１１〜１８）及びＥＦループ（ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って残基９２〜１０１）中にランダム化を含み、且つＡＢループの残基１６及び１７（ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って）の間に５残基ランダム化した挿入を含んでいた、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１からＣＨ３ドメインを示すナイーブ酵母ライブラリーを、選択のために使用した。酵母を、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインに融合されたビオチン化組み換えマウスＯＸ４０（ｍＯＸ４０−ｈＦｃ；表２）とともにインキュベートし、ストレプトアビジン被覆ビーズを用いてＭＡＣＳによってソートした。次に、３回のＦＡＣＳ選択を、５倍モル過剰のｈＦｃの存在下で、減少する濃度のビオチン化ｍＯＸ４０−ｈＦｃを用いて行った。細胞を、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（BD Bioscience、３４９０２４）又は抗ビオチン−ＡＰＣ（Miltenyi Biotec、１３０−０９０−８５６）で染色し、FACSAria（BD Bioscience）セルソーターを用いてソートした。豊富な集団からの１８２の個々のＦｃａｂを、抗原結合についてスクリーニングし、２つの固有の陽性結合剤をサブクローニングし、実施例２．１において上述されるように可溶性Ｆｃａｂとして発現させた。Ｆｃａｂを、ＥＬＩＳＡによってｍＯＸ４０−ｈＦｃへの結合について、及びマウスＮＦ−κＢレポーターアッセイ１において活性について特徴付けした（以下の実施例４．５を参照）。１つのみのＦｃａｂ、ＦＳ２０ｍ−２３２は、ＮＦ−κＢレポーターアッセイ１において活性であり、マウスＯＸ４０を発現する細胞への結合を示したため、このＦｃａｂを、親和性成熟のために選択した。
【０３４７】
３．２  ｍＯＸ４０  Ｆｃａｂの親和性成熟
３つのファージディスプレイ親和性成熟ライブラリーを、システインを除くアミノ酸の等モルの分布を用いて、ELLA Biotech製のランダム化プライマーを用いて、ＦＳ２０ｍ−２３２  ＦｃａｂのＡＢループ中の７つの残基（ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って残基１５〜１６．５）（ライブラリー１）、ＣＤループ中の６つの残基（ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って残基４５．１〜７８）（ライブラリー２）又はＥＦループ中の５つの残基（ＩＭＧＴ番号付けスキームに従って残基９２〜９４及び９７〜９８）（ライブラリー３）をランダム化することによって構築した。
【０３４８】
３回の選択を、ストレプトアビジン被覆（ThermoFisher Scientific、１１２０５Ｄ）及びニュートラアビジン被覆（ThermoFisher Scientific、１４２０３及びＡ２６６６）Dynabeads上に交互に捕捉された組み換えビオチン化ｍＯＸ４０−ｍＦｃを用いて、親和性成熟ライブラリーにおいて行った。５０ｎＭ（１回目）から１０ｎＭ（２回目）まで、１ｎＭ（３回目）まで減少する抗原濃度を用いて、高い親和性の結合剤を同定した。３回目の選択からの１６５５の個々のファージを、ｍＯＸ４０−ｍＦｃへの結合についてファージＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、９８の固有の陽性結合剤を同定し、サブクローニングし、実施例２．１に記載されるように、ＨＥＫ  Ｅｘｐｉ２９３細胞中の可溶性Ｆｃａｂとして発現させた。Ｆｃａｂを、細胞結合及びマウスＮＦ−κＢレポーターアッセイ２において活性についてさらにスクリーニングした（詳細については以下の実施例４．６を参照）。最も活性なＦｃａｂを、ループシャッフリングのために選択した。
【０３４９】
３７のＥＦループ（ファージＥＬＩＳＡ及びＷＴ配列においてマウスＯＸ４０への最良の結合を有するもの）とシャッフルされた２７のＣＤループ（親和性成熟及びＷＴ配列から同定された全ての２６の固有の配列）を含む、ループシャッフルされたライブラリーを作成し、ここで、全てのシャッフルされたクローンは、ＦＳ２０ｍ−２３２  ＦｃａｂのＡＢループを含有する。７５０のシャッフルされた配列を、上述されるようにＨＥＫ  Ｅｘｐｉ２９３細胞内で可溶性Ｆｃａｂ（切断型ヒンジを含む）として発現させた。Ｆｃａｂを含有するＨＥＫ上清を、Octet QKe System（Pall ForteBio）上でDip and Read（商標）ストレプトアビジンバイオセンサー（Pall ForteBio、１８−５０５０）を用いて、ビオチン化ｍＯＸ４０−ｍＦｃ（表２）へのＦｃａｂの結合を測定することによって、改善したオフレートについてスクリーニングした。１１の固有のＡＢループランダム化Ｆｃａｂ及び６０の固有のＥＦループランダム化Ｆｃａｂをサブクローニングし、上述されるようにＨＥＫ  Ｅｘｐｉ２９３細胞内で可溶性Ｆｃａｂとして発現させた。これらのＦｃａｂを、最も遅いオフレートを有する４３のシャッフルされたＦｃａｂとともに、細胞結合及びマウスＴ細胞活性化アッセイにおいて活性についてさらにスクリーニングした（以下の実施例５．２を参照）。ＦＳ２０ｍ−２３２−９１  Ｆｃａｂは、ビオチン化ｍＯＸ４０−ｍＦｃに結合される場合に最も遅いオフレート、及び抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６によって架橋される場合にマウスＴ細胞活性化アッセイにおいて最も高い活性を有しており、したがって、それを、その後の実験において使用するためのマウス（サロゲート）Ｆｃａｂとして選択した。
【０３５０】
実施例４−モックｍＡｂ２の構築、発現及び特徴付け
４．１  モックｍＡｂ２の構築及び発現
上記で同定された抗ヒトＯＸ４０及び抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂを含む「モック」ｍＡｂ２を、ｍＡｂ２フォーマットにおけるこれらのＦｃａｂの特徴付けを可能にするために調製した。これらのモックｍＡｂ２は、抗ＦＩＴＣ及び抗ＨＥＬ抗体のＣＨ３ドメインを、ヒトＩｇＧ１の非修飾ＣＨ３ドメインの配列中に存在するＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ部位内の抗ＯＸ４０  ＦｃａｂのＣＨ３ドメインで置換することによって、抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂ及びヒトＩｇＧ１骨格中の抗ＦＩＴＣ抗体４４２０の可変領域（Bedzyk et al.,1989及びBedzyk et al.,1990）（詳細については配列番号１６７、配列番号１６８、及び配列番号１５６を参照）又はヒトＩｇＧ１骨格中の抗ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）抗体Ｄ１．３の可変領域（Braden et al.,1996）（詳細については配列番号１６９及び１５７を参照）から調製した。モックｍＡｂ２は、抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  ４４２０（配列番号１５６）又は抗ＨＥＬ  ｍＡｂ  Ｄ１．３（配列番号１５７）のそれぞれの軽鎖を含んでおり、Ｆｃ−γ受容体相互作用及び潜在的なＦｃ−γ受容体誘発性架橋を低減するために、重鎖のＣＨ２ドメイン中にＬＡＬＡ突然変異も含んでいた（Hezareh et al.,2001及びBruhns et al.,2009）。これらの実施例において言及されるモックｍＡｂ２及びｍＡｂ２におけるＬＡＬＡ突然変異の存在は、それらのクローン名のＦｃａｂ部分の末端の接尾語「ＡＡ」によって示される。
【０３５１】
モックｍＡｂ２を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞における一過性発現によって産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを用いて精製した。
【０３５２】
４．２  細胞で発現されるヒト及びカニクイザルＯＸ４０に対する、モックｍＡｂ２フォーマットの抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの結合親和性
細胞で発現されるヒト又はカニクイザルＯＸ４０（ヒト［ＤＯ１１．１０−ｈＯＸ４０］又はカニクイザルＯＸ４０［ＤＯ１１．１０−ｃＯＸ４０］のいずれかを発現するＤＯ１１．１０細胞；表２を参照）に対する、モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットの抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの親和性を、フローサイトメトリーを用いて測定した。また、非特異的結合を、フローサイトメトリーによって、ＯＸ４０を発現しないＨＥＫ細胞への結合について試験することによって評価した。
【０３５３】
モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２及び対照ｍＡｂ希釈物（２×最終濃度）を、１×ＤＰＢＳ（Gibco、１４１９０−０９４）において３連で調製した。ＤＯ１１．１０−ｈＯＸ４０又はＤＯ１１．１０−ｃＯＸ４０又はＨＥＫ細胞懸濁液を、ＰＢＳ＋２％のＢＳＡ（Sigma、Ａ７９０６）中で調製し、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、３８９７）中５０μｌ／ウェルで、４×１０６個の細胞／ｍｌで播種した。５０μｌのモック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２又は対照ｍＡｂ（抗ヒトＯＸ４０  ｍＡｂ、１１Ｄ４）希釈物を、細胞を含むウェル（最終体積１００μｌ）に加え、４℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に、ＰＢＳ及び２％のＢＳＡ中で１：１０００に希釈された１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗ヒトＦｃ−４８８抗体、Jackson ImmunoResearch、１０９−５４６−０９８）を加え、暗所で、４℃で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌでＤＡＰＩ（Biotium、カタログ番号４００４３）を含む１００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させた。プレートを、Canto IIフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を取り除き、ＦＩＴＣチャネルにおける蛍光（４８８ｎｍ／５３０／３０）を測定した。GraphPad Prism Softwareにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答を用いて、データをフィッティングした。
【０３５４】
重鎖のＣＨ２ドメインにＬＡＬＡ突然変異を含む、ヒトＩｇＧ１骨格中のＦｃａｂ（全てモック［４４２０  ＬＡＬＡ］ｍＡｂ２フォーマットにおいて試験される）及び陽性対照抗ヒトＯＸ４０  ｍＡｂ、１１Ｄ４は、様々な親和性でヒトＯＸ４０に結合した。実施例２．２に記載されるモックｍＡｂ２フォーマットにおけるさらなる特徴付けのために選択されたクローンのうち、１４のＦｃａｂ（ＦＳ２０−１１系統から３つ、ＦＳ２０−２２系統から５つ、及びＦＳ２０−３１系統から６つ）は、他のＦｃａｂと比較して、ヒトＯＸ４０に対する有意に高い親和性を示した。細胞で発現されるヒト及びカニクイザルＯＸ４０に対するこれらの１４のＦｃａｂクローンの結合親和性が、表３に記載される。
【０３５５】
ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１系統からのＦｃａｂは、ヒトＯＸ４０と同等の親和性でカニクイザルＯＸ４０に結合した。これは、インビトロでカニクイザルＯＸ４０の好適な活性化を示す傾向があるため、潜在的に有利であり、これらのＦｃａｂは、カニクイザルにおける毒性試験に使用されることが可能であり得、その結果は、ヒトにおける毒物学的影響の予測であり得る。ＦＳ２０−１１系統からのＦｃａｂも、カニクイザルＯＸ４０に結合したが、より親和性が低いため、それらはカニクイザルにおける試験にあまり適していない。試験されるＦｃａｂ及び陽性対照ｍＡｂは、ＨＥＫ細胞への非特異的結合を示さなかった。
【０３５６】
【表４】
2021524275.tif 000007
【０３５７】
４．３  細胞で発現されるマウスＯＸ４０に対する、モックｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂの結合親和性
細胞で発現されるマウスＯＸ４０（ＤＯ１１．１０−ｍＯＸ４０；表２を参照）に対する、モックｍＡｂ２フォーマット（４４２０  ＬＡＬＡ）における抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂの親和性を、フローサイトメトリーを用いて測定した。また、非特異的結合を、フローサイトメトリーによって、ＯＸ４０を発現しないＨＥＫ細胞への結合を試験することによって評価した。
【０３５８】
モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２及び対照ｍＡｂ希釈物（２×最終濃度）を、１×ＤＰＢＳ（Gibco、１４１９０−０９４）中で調製した。ＤＯ１１．１０  ｍＯＸ４０又はＨＥＫ細胞懸濁液を、ＰＢＳ＋２％のＢＳＡ（Sigma、Ａ７９０６）中で調製し、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、３８９７）中５０μｌ／ウェルで、４×１０６個の細胞／ｍｌで播種した。５０μｌのモック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２又は対照ｍＡｂ（抗マウスＯＸ４０  ｍＡｂ、ＯＸ８６希釈物を、細胞を含むウェル（最終体積１００μｌ）に加え、４℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に、ＰＢＳ＋２％のＢＳＡ中で１：１０００に希釈された１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗ヒトＦｃ−４８８抗体、Jackson ImmunoResearch、１０９−５４６−０９８）を加え、暗所で、４℃で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌでＤＡＰＩ（Biotium、４００４３）を含有する１００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させた。プレートを、Canto IIフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を取り除き、ＦＩＴＣチャネルにおける蛍光（４８８ｎｍ／５３０／３０）を測定した。GraphPad Prism Softwareにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答を用いて、データをフィッティングした。
【０３５９】
ＬＡＬＡ突然変異を有するヒトＩｇＧ１骨格（配列番号１７５及び１７６）中の、モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットにおいて試験されるＦｃａｂ及び陽性対照抗マウスＯＸ４０  ｍＡｂ、ＯＸ８６は、表４に記載される親和性で、マウスＯＸ４０に特異的に結合した。細胞で発現されるマウスＯＸ４０に対する抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂの親和性は、抗マウスＯＸ４０陽性対照ｍＡｂのものと同等であった。試験されるＦｃａｂ及び陽性対照ｍＡｂは、ＨＥＫ細胞への非特異的結合を示さなかった。
【０３６０】
【表５】
2021524275.tif 000008
【０３６１】
４．４  ヒトＮＦ−κＢレポーターアッセイ
どのＦｃａｂを継続して進めるかについて迅速な決定を下せるように、ＯＸ４０アゴニスト活性について、簡単且つ迅速にナイーブな選択中に単離されたＦｃａｂを試験するためのアッセイが必要とされた。このようなアッセイの創出は、後述されるように技術的に困難であった。
【０３６２】
ＯＸ４０の、そのリガンドへの結合は、ＯＸ４０のクラスター化及びＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化をもたらす（Arch and Thompson,1998）。アゴニスト活性を有する抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂは、ＯＸ４０のクラスター化及びシグナル伝達を誘発することによってＯＸ４０リガンドを模倣する。したがって、ＯＸ４０のクラスター化の後にＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化を検出し得るアッセイを、抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂの活性を試験するために考案した。
【０３６３】
Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３  ＨＥＫ細胞株（Life Technologies、Ｒ７８０−０７）に、ルシフェラーゼの発現を制御するＮＦ−κＢ感受性プロモータを含むQiagen Cignal Lenti NFkB Reporter（ｌｕｃ）（Qiagenカタログ番号３３６８５１）レンチウイルスを形質導入した。次に、これらの細胞を、約２週間にわたって５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Life Technologiesカタログ番号Ａ１１１１３８０３）の存在下での細胞の培養、続いて、連続希釈による細胞株のクローニングによって選択した。ルシフェラーゼレポーター構築物の存在を、培養物中で２４時間にわたって１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦａ（R&D Systemsカタログ番号２１０−ＴＡ−００５）とともに細胞をインキュベートし、製造業者の説明書に従って、Promega Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promegaカタログ番号Ｇ７９４１）による処理の１５分後に発光を測定することによって試験した。発光を、Gen5 Software、BioTekを用いてプレートリーダーにおいて測定した（０．５秒間の積分時間）。
【０３６４】
ヒトＯＸ４０を、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＮｏｔＩ−ＨＦ制限酵素を用いて、ベクターｐｃＤＮＡ５ＦＲＴ（Life Technologiesカタログ番号Ｖ６０１０−２０）へとサブクローニングした。次に、ベクターを、Lipofectamine 2000（Life Technologies、１１６６８−０１９）を用いて、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３  ＨＥＫ細胞株（Life Technologies、Ｒ７８０−０７）へと形質転換した。形質転換されたＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞（ＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞株と呼ばれる）を、安定に形質転換された細胞のコロニーが見えるまで、３〜４週間にわたって、１０％のＦＢＳ（Life Technologies、１０２７０−１−６）、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Ｚ２４７５）、１５μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、Ｂ１１０５）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、６１９６５−０２６）中で成長させた。これらのコロニーを、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Sigma、Ｄ９８９１）の存在下で増幅させ、抗ＯＸ４０  ｍＡｂ  ＡＣＴ３５（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号１７−１３４７−４２）を用いたフローサイトメトリーによってヒトＯＸ４０発現について試験した。
【０３６５】
新たに生成されたＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞株におけるヒトＯＸ４０の発現は、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の構成的活性化及びルシフェラーゼの高レベルの発現を予想外にもたらした。したがって、ＯＸ４０アゴニスト抗体によってこのシグナル伝達経路の活性化差異を検出することは可能でなかった。ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の構成的活性化を低下させるために、高発現ＣＭＶプロモータを、他のプロモータ（Invivogen PromTestプラスミドからの）で置き換えることによって、ＯＸ４０の発現レベルの低下を試みた。しかしながら、予想に反して、ＯＸ４０発現レベルは、この手法により変化されず、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路は、構成的に活性なままであった。
【０３６６】
ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の構成的活性化を低減する別の試みを、ヒトＯＸ４０細胞外ドメインを、他のＴＮＦＲファミリーメンバー（ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＴＮＦＲＩＩ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３７、及びＨＶＥＭ）のうちの１つの細胞内ドメインと融合し（Song et al.,2014）、上記に詳述されるようにＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞株中で得られたキメラタンパク質を発現させることによって行った。ＯＸ４０表面発現を、ＯＸ４０特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって決定した。意外なことに、キメラｈＯＸ４０−ｈＣＤ１３７受容体発現ＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞は、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の低下されたバックグラウンド活性化及びＯＸ４０アゴニスト抗体に対する濃度依存性応答を示した。試験された他のキメラ受容体のいずれも、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の低下した構成的活性化をもたらさなかった。したがって、ｈＯＸ４０−ｈＣＤ１３７キメラ発現細胞株（ＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ．ｈＯＸ４０ｈＣＤ１３７）のみが、それらのアゴニスト活性に関してナイーブな選択の後に同定された抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂを試験し、ランク付けするのに使用され得、この効果のために使用された。
【０３６７】
抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂを、実施例２．１に記載されるように可溶性タンパク質として発現させ、以下のようにＯＸ４０アゴニスト活性について試験した。ＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ．ｈＯＸ４０ｈＣＤ１３７細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で、９６ウェル白色透明平底プレート中で、１×１０５個の細胞／ウェルの濃度で一晩、平板培養した。翌日、試験される各Ｆｃａｂ又は対照ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ１フォーマットにおける１１Ｄ４）の２μＭの希釈物を、ＤＰＢＳ（Gibco）中で調製し、レポーター細胞培地（ＤＭＥＭ（Gibcoカタログ番号６１９６５−０２６）；１０％のＦＣＳ（Gibcoカタログ番号１０２７０−１０６）；１×PennStrep（Gibcoカタログ番号１５１４０−１２２）；ハイグロマイシンＢ  １００μｇ／ｍｌ（Melford Laboratories Ltd.Ｚ２４７５）；ブラストサイジン１５μｇ／ｍｌ（Melford Laboratories Ltd.Ｂ１１０５）；ピューロマイシン５μｇ／ｍｌ（Life Technologiesカタログ番号Ａ１１１１３８０３）；及びドキシサイクリン１μｇ／ｍｌ（Sigmaカタログ番号Ｄ９８９１））（３０μｌ＋２７０μｌ）中で、１：１０でさらに希釈して、２００ｎＭの希釈物を得た。架橋剤（抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６）を、必要に応じて、試験Ｆｃａｂ又は対照ｍＡｂに関して１：１のモル比でウェルに加えた。９６ウェルプレートにおいて、架橋剤の存在下又は非存在下でのＦｃａｂ又は対照ｍＡｂの連続希釈物を調製し、１００μｌの希釈物を、プレート上の細胞に加えた。
【０３６８】
細胞を、２４時間にわたって３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートし、発光を、製造業者の説明書に従って、Promega Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promegaカタログ番号Ｇ７９４１）による処理の１５分後に測定した。ＯＸ４０への、架橋されたアゴニストＦｃａｂ又は陽性対照ｍＡｂの結合によって誘発されるヒトＯＸ４０のクラスター化によって、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化に応答して産生されたルシフェラーゼの尺度として、Gen5 Software、BioTekを用いてプレートリーダーにおいて、発光を測定した（０．５秒間の積分時間）。発光値を、Ｆｃａｂ／ｍＡｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いて、得られた曲線をフィッティングした。
【０３６９】
４．５  マウスＮＦ−κＢレポーターアッセイ１
単離された抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂが、ＯＸ４０アゴニスト活性について同様に迅速且つ簡単に試験されるのを可能にするために、マウスＮＦ−κＢレポーターアッセイを創出した。
【０３７０】
マウスＯＸ４０配列を用いて、ヒトＮＦ−κＢレポーターアッセイの創出について実施例４．４に記載されるように、最初に同様の手法に従った。しかしながら、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の構成的活性化をもたらす同様の問題に直面した。
【０３７１】
ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の構成的活性化を低減するために、マウスＯＸ４０細胞外ドメインを、ヒトＣＤ４０受容体の細胞内ドメインと融合させ（Song et al.,2014）、上記に詳述されるようにＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞株において発現させた。ＯＸ４０特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによるＯＸ４０表面発現決定を用いて、キメラ受容体の存在を試験した。キメラｍＯＸ４０−ｈＣＤ４０受容体発現ＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞（ＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ．ｍＯＸ４０ｈＣＤ４０細胞）は、完全長マウスＯＸ４０を発現する細胞と比較してＮＦ−κＢシグナル伝達経路の低下したバックグラウンド活性化を示し、ＯＸ４０アゴニスト抗体に対する濃度依存性応答を示した。したがって、この細胞株を、ナイーブな選択の後に同定された抗マウスＯＸ４０  ＦｃａｂのＯＸ４０アゴニスト活性を試験するために選択した。アッセイプロトコルは、これらのＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ．ｍＯＸ４０ｈＣＤ４０細胞及び陽性対照としてヒトＩｇＧ１フォーマットのＯＸ８６を用いてマウスＯＸ４０結合Ｆｃａｂを試験したことを除いて、実質的に実施例４．４に記載されるとおりであった。
【０３７２】
４．６  マウスＮＦ−κＢレポーターアッセイ２
改善したマウスＯＸ４０  ＮＦ−κＢレポーターアッセイを創出するために、ヒトＯＸ４０  ＮＦ−κＢレポーターアッセイのために使用される手法を用いた。実施例４．４に記載されるように、マウスＯＸ４０細胞外ドメインを、ヒトＣＤ１３７受容体の細胞内ドメインに融合させ、ＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞株中で発現させた。ＯＸ４０表面発現を、キメラ受容体の存在を検出するために、ＯＸ４０特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって決定した。キメラｍＯＸ４０−ｈＣＤ１３７受容体発現ＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞（ＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ．ｍＯＸ４０ｈＣＤ１３７細胞）は、マウスＮＦ−κＢレポーターアッセイ１において観察されたバックグラウンド活性化と比較して、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の低下したバックグラウンド活性化を示し、抗マウスＯＸ４０アゴニスト抗体に対する濃度依存性応答を示した。したがって、この細胞株は、抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂの改善した試験及びランク付けを可能にし、これを用いて、それらのマウスＯＸ４０アゴニスト活性について、親和性成熟の後に同定された抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂを試験及びランク付けした。これらの細胞を用いたアッセイプロトコルは、実質的に、実施例４．５に記載されるとおりであった。
【０３７３】
４．７  ヒト及びカニクイザルＯＸ４０に対する抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの結合親和性
ヒト及びカニクイザルＯＸ４０に対する抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂ（ＯＸ４０／ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２フォーマットにおける）の親和性を、ＳＰＲによって測定した。抗原がフローセル上を通過されるとき、ｍＡｂ又はｍＡｂ２分子の配向が結合速度に影響を与え得るため、Ｆｃａｂの親和性を測定する場合、ｍＡｂ２のＦｃａｂ部分を、Biacoreチップの結合表面から離れる向きに配置することによって、及びＦａｂの親和性を測定する場合、ｍＡｂ２のＦａｂ部分を、Biacoreチップの結合表面から離れる向きに配置することによって、これを軽減しようとした。これを達成するために、標的捕捉方法を用いて、必要に応じてｍＡｂ２分子を配向した。ＥＧＦＲを抗原として用いて、ＯＸ４０／ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２を捕捉し（表５を参照）、それを、実施例４．１に記載されるモックｍＡｂ２と同じ方法で、抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂ及び抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブの可変領域を用いて構築した（米国特許第６２１７８６６号；表５中で「Ｃｘ」によって示される）。抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂの親和性を、抗ＯＸ４０  ｍＡｂの親和性と比較するために、ＥＧＦＲ結合Ｆｃａｂ（特許公開番号国際公開第２０１８／０１５４４８  Ａ１号）を、抗ＯＸ４０  ｍＡｂ  １１Ｄ４のＦａｂ（欧州特許第２  ２４２  ７７１  Ｂ１号）と対合させ、ＥＧＦＲを抗原として用いて、得られたＥＧＦＲ／ＯＸ４０  ｍＡｂ２を捕捉した。これは、Ｆｃａｂ及び陽性対照ｍＡｂの両方が、Biacoreチップ表面から離れる向きに、且つBiacoreチップ上に流されたＯＸ４０抗原に向かって配向されることを可能にした。
【０３７４】
ＥＧＦＲ（R&D Systemsカタログ番号３４４−ＥＲ）を、BIAcore T200機器のための製造業者の説明書に従って、５０００ＲＵの表面密度になるまでのアミンカップリング（GE Healthcare、ＢＲ−１０００−５０）によって、Series S CM5チップ（GE Healthcare、ＢＲ−１００５−３０）上に固定した。ｍＡｂ２試料を、１０μｌ／分で４０秒間にわたってＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（GEカタログ番号ＢＲ１００６６９）中で希釈されたｍＡｂ２の１μｇ／ｍｌの溶液を注入することによって、約１５０ＲＵになるまで捕捉した。次に、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（GEカタログ番号ＢＲ１００６６９）中の様々な濃度のＯＸ４０抗原（社内で産生された非ビオチン化ｈＯＸ４０−ｍＦｃ又は非ビオチン化ｃＯＸ４０−ｍＦｃ；表２を参照）を、７０μｌ／分で３分間にわたってチップ上に流し、次に、６分間にわたって解離させた。各抗原濃度の後、１０秒間にわたって３０μｌ／分の流量で３０ｍＭの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を注入することによって、チップを再生した。参照減算（reference subtraction）のため、最も高い濃度の抗原の前及び最も低い濃度の抗原の後、緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋を注入した。
【０３７５】
結合速度を、１：１ラングミュアモデルとフィッティングして、各試料についての平衡結合定数（ＫＤ）を生成した。データ分析を、BiaEvaluationソフトウェアバージョン３．２を用いて行った。結果は、表５に示される。
【０３７６】
【表６】
2021524275.tif 000009
【０３７７】
ＯＸ４０  Ｆｃａｂは、ヒトＯＸ４０に対するある範囲の親和性を有することが観察された（表５を参照）。ＦＳ２０−１１系統からのＦｃａｂの、カニクイザルＯＸ４０への結合は、検出のための閾値未満であり、これは、上記の実施例４．２に記載される細胞結合実験においても観察されたように、これらのＦｃａｂが、カニクイザルＯＸ４０に対する低い親和性を有することを示している。ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１系統からの抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂは、ヒトＯＸ４０に対する同等の親和性でカニクイザルＯＸ４０に結合した。
【０３７８】
４．８  マウスＯＸ４０に対する抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂの結合親和性
１０μｌ／分で１分間にわたってＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（GEカタログ番号ＢＲ１００６６９）中で希釈されたｍＡｂ２の５ｎＭの溶液を注入することによって、ｍＡｂ２試料を約２００ＲＵになるまで捕捉したという違いを除いて、実施例４．７に記載されるのと同じ標的捕捉及びＥＧＦＲ固定化方法を用いて、ＳＰＲによって、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１抗マウスＯＸ４０  ＦｃａｂのマウスＯＸ４０に対する親和性を測定した。ＯＸ４０／ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２を、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂ（ＬＡＬＡ突然変異を有する）及び抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブの可変領域（米国特許第６，２１７，８６６  Ｂ１号；以下の表６中でＣｘによって示される）を用いて構築した。次に、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（GEカタログ番号ＢＲ１００６６９）中の様々な濃度のＯＸ４０抗原（社内で産生されたｍＯＸ４０−ｍＦｃ；詳細については表２を参照）を、７０μｌ／分で５分間にわたってチップ上に流し、次に、１０分間にわたって解離させた。各抗原濃度の後、１０秒間にわたって３０μｌ／分の流量で３０ｍＭの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を注入することによって、チップを再生した。参照減算のため、最も高い濃度の抗原の前及び最も低い濃度の抗原の後、緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋を注入した。
【０３７９】
結合速度を、１：１ラングミュアモデルとフィッティングして、試料についての平衡結合定数（ＫＤ）を生成した。データ分析を、BiaEvaluationソフトウェアバージョン３．２を用いて行った。表６は、抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂ  ＦＳ２０ｍ−２３２−９１の親和性が約０．７ｎＭであることを示す。
【０３８０】
【表７】
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【０３８１】
４．９  抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの特異性
ヒトＯＸ４０に対する抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの特異性を、モックｍＡｂ２フォーマットにおいて試験し、他のヒトＴＮＦＲファミリー受容体（ＣＤ４０、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＮＧＦＲ及びＣＤ１３７）へのＦｃａｂの結合について試験することによって、Biacore T200においてＳＰＲによって測定した。アミンカップリング（アミンカップリングキット、GE Healthcare、ＢＲ−１０００−５０）を用いて、ヒトＣＤ４０、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＮＧＦＲ、ＣＤ１３７受容体（全てR&D Systemsから入手した）を、Biacore CM5チップ（GE Healthcare、カタログ番号２９１４９６０３）中で約１０００ＲＵになるまで被覆した。１μＭから開始するモックｍＡｂ２フォーマット（表７を参照）における抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの希釈物を、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＢＲ１００６６９）中で調製し、３０μｌ／分で３分間にわたって注入し、次に、４分間にわたって緩衝液中で解離させた。３０μｌ／分で１２秒間にわたる１０ｍＭのグリシンｐＨ２．５の注入によって、チップを再生した。様々なＴＮＦＲファミリーメンバーに特異的な抗体を陽性対照として用いて、Biacoreチップコーティングを確認した。データを二重参照減算し（double reference subtracted）、BIAevaluation 3.2ソフトウェアを用いて分析した。表７に列挙されたＦｃａｂは、試験されるＴＮＦＲファミリー受容体のいずれにも結合せず、これは、ヒトＯＸ４０に対するそれらの特異性を実証している。
【０３８２】
【表８】
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【０３８３】
４．１０  抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂの特異性
モック（ＨＥＬ  Ｄ１．３  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂ（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１）の特異性を、他のマウスＴＮＦＲファミリー受容体（マウスＣＤ４０、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＮＧＦＲ及びＣＤ１３７受容体）への結合について試験することによって、Biacore T200機器においてＳＰＲによって測定した。アミンカップリング（アミンカップリングキット、GE Healthcare、ＢＲ−１０００−５０）を用いて、マウスＣＤ４０、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＮＧＦＲ、ＣＤ１３７受容体（全てR&D Systemsから入手した）を、Biacore CM5チップ（GE Healthcare、カタログ番号２９１４９６０３）中で約１０００ＲＵになるまで被覆した。１μＭから開始するモックｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／ＨＥＬ  Ｄ１．３）の希釈物を、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＢＲ１００６６９）中で調製し、３０μｌ／分で３分間にわたって注入し、次に、６分間にわたって緩衝液中で解離させた。３０μｌ／分で２０秒間にわたる１０ｍＭのグリシンｐＨ２．５の注入によって、チップを再生した。様々なＴＮＦＲファミリーメンバーに特異的な抗体を陽性対照として用いて、Biacoreチップコーティングを確認した。
【０３８４】
データを二重参照減算し、BIAevaluation 3.2ソフトウェアを用いて分析した。モック（ＨＥＬ  Ｄ１．３  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂ  ＦＳ２０ｍ−２３２−９１は、試験される関連したＴＮＦＲファミリーメンバーのいずれにも結合せず、これは、マウスＯＸ４０に対するこのＦｃａｂの特異性を実証している。
【０３８５】
実施例５から８−インビトロ及びインビボでの様々な架橋手段によってＯＸ４０活性を誘発するためのＦｃａｂの機能活性
前の実施例において、ヒトＯＸ４０又はマウスＯＸ４０に結合し得るＦｃａｂを同定した。その後、モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットにおけるこれらのＦｃａｂを、ＮＦ−κＢアッセイにおいてＯＸ４０のクラスター化及びシグナル伝達を活性化するそれらの能力について試験した。以下の実施例は、Ｆｃ領域によって又は別の標的へのＦａｂ結合によって架橋される場合の、モックｍＡｂ２及びｍＡｂ２フォーマットにおけるＦｃａｂがインビトロ及びインビボでＯＸ４０を活性化する能力を実証する。Ｆｃａｂは、様々なＦａｂを含むｍＡｂ２フォーマットにおいてＯＸ４０のクラスター化及び活性化をもたらすことが可能であるため、それらは、多くの異なる疾患を治療するのに有用性を有することが予測される。
【０３８６】
実施例５−モックｍＡｂ２フォーマットにおける抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂによるインビトロ及びインビボでのＯＸ４０の活性化
活性化Ｔ細胞は、それらの細胞表面においてＯＸ４０を発現する。三量体ＯＸ４０リガンドの、ＯＸ４０への結合は、受容体の三量体化をもたらす。ＯＸ４０リガンドが、抗原提示細胞の細胞表面においてクラスターとして発現されるため、ＯＸ４０リガンドとＯＸ４０との間の相互作用は、ＯＸ４０のクラスター化をもたらし、これは、ＯＸ４０シグナル伝達及びさらなるＴ細胞活性化に不可欠であることが知られている。ＯＸ４０に作用する（agonise）抗体は、ＯＸ４０リガンドのこのクラスター化活性を模倣しなければならない。単一特異的な抗ＯＸ４０抗体の場合、Ｆｃγ受容体は、抗体のＦｃドメインに結合し、それらを架橋し、ＯＸ４０のクラスター化をもたらす。
【０３８７】
実施例４に記載されるモック（４４２０）ＬＡＬＡフォーマットにおける抗ヒトＯＸ４０及び抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂを、架橋剤の存在下でのＦｃａｂの架橋時にＴ細胞において発現されるＯＸ４０を活性化するそれらの能力について、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験した。また、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂを、モック（ＨＥＬ  Ｄ１．３）ｍＡｂ２フォーマット（実施例４．１を参照）において、ＯＸ４０発現腫瘍浸潤リンパ球の活性化によって、ＣＴ２６同系マウス腫瘍成長モデルにおいてインビボで腫瘍成長を阻害するその能力について試験した。
【０３８８】
５．１  モックｍＡｂ２フォーマットにおける抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂを用いたヒトＴ細胞活性化アッセイ
活性化されたヒトＴ細胞は、それらの細胞表面においてヒトＯＸ４０を発現する。ＯＸ４０のクラスター化は、受容体シグナル伝達及びさらなるＴ細胞活性化を誘発するのに不可欠であることが知られている。Ｔ細胞活性化アッセイを用いて、以下の表８に詳述されるモック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２及びｍＡｂ分子の存在下でのＯＸ４０のクラスター化及びシグナル伝達を評価した。Ｔ細胞活性化を、ＩＬ−２の放出を測定することによって検出した。
【０３８９】
５．１．１  ヒトＴ細胞の単離及び活性化
Ｔ細胞を単離するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、血小板成分献血の副産物である白血球除去錐体細胞（NHS Blood and Transplant service）から単離した。簡潔に述べると、白血球錐体細胞の内容物をＰＢＳでフラッシュし、Ficoll勾配（GE Lifesciencesカタログ番号１７１４４００２）上に重ね合わせた。ＰＢＭＣを、遠心分離及びFicoll勾配を通過しなかった細胞の回収によって単離した。ＰＢＭＣをＰＢＳでさらに洗浄し、残っている赤血球を、製造業者の説明書に従って、１０ｍｌの赤血球溶解緩衝液（eBioscience）の添加によって溶解させた。Ｔ細胞を、製造業者の説明書に従って、ｐａｎ  Ｔ細胞単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec Ltd）を用いて、溶離液中に存在するＰＢＭＣから単離した。
【０３９０】
ヒトT-Activator CD3/CD28 Dynabeads（Life Technologies  １１４５２Ｄ）をボルテックスによって再懸濁させた。ビーズを、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）、１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies）、ピルビン酸ナトリウム（Gibco）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Gibco）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Gibco））を含むＴ細胞培地（ＲＰＭＩ培地（Life Technologies）で２回洗浄した。
【０３９１】
Ｔ細胞培地中で、１．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度での必要量のＴ細胞を、Ｔ−２５フラスコ（Sigma）中で、２：１の細胞対ビーズ比率で、洗浄されたヒトT-Activator CD3/CD28 Dynabeadsで刺激し、３７℃、５％のＣＯ２で、一晩インキュベートして、Ｔ細胞を活性化した。活性化Ｔ細胞を、Dynabeadsから洗浄し、２．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で、Ｔ細胞培地中で再懸濁させた。９６ウェル平底プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で２時間にわたってＰＢＳ中で希釈された２．５μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体（R&D SystemsクローンＵＨＣＴ１）とのインキュベーションによって、抗ヒトＣＤ３抗体で被覆し、次に、ＰＢＳで２回洗浄した。活性化Ｔ細胞を、２×１０５個の細胞／ウェルでプレートに加えた。モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２分子、陽性対照１１Ｄ４  ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ１骨格中、ＬＡＬＡ突然変異を含む）及び陰性対照４４２０  ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ１骨格中、ＬＡＬＡ突然変異を含む）の２μＭの希釈物を、ＤＰＢＳ（Gibco）中で調製し、Ｔ細胞培地（３０μｌ＋２７０μｌ）中で、１：１０でさらに希釈して、２００ｎＭの希釈物を得た。Ｆｃを介して陽性対照ｍＡｂの架橋に使用される抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６、又はＦａｂ結合を介してモック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマット（表８を参照）におけるＦｃａｂの架橋に使用されるＦＩＴＣ−デキストラン（Sigma）を、モックｍＡｂ２又は陽性対照ｍＡｂとともに１：１のモル比でウェルに加えた。９６ウェルプレートにおいて、それぞれ関連する架橋剤を用いて、（１）陽性対照若しくはモックｍＡｂ２又は（２）陽性対照若しくはモックｍＡｂ２の連続希釈物を調製した。１００μｌの希釈されたモックｍＡｂ２／陽性対照ｍＡｂ、又は希釈されたモックｍＡｂ２若しくは陽性対照ｍＡｂ及び架橋剤、プレート上の活性化Ｔ細胞に加えた。
【０３９２】
Ｔ細胞を、７２時間にわたって３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。上清を収集し、ＩＬ−２放出を、製造業者の説明書に従って、ヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D systems）を用いて測定した。プレートを、Gen5 Software、BioTekを用いて、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィット（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の濃度を、モックｍＡｂ２陽性対照ｍＡｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。表８は、架橋を用いて及び用いずに試験されたモックｍＡｂ２及び陽性対照ｍＡｂの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察される、ＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を示す。図２は、系統（系統ＦＳ２０−１１、ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１）のそれぞれからの代表的なクローンについてのＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。
【０３９３】
【表９】
2021524275.tif 000012
【０３９４】
表８に示されるように、Ｆａｂ標的（ＦＩＴＣ−デキストラン）によって架橋される場合のモック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットにおける抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてある範囲の活性を示した。Ｆｃａｂの全ては、抗ＣＤ３抗体の存在下でＴ細胞を共刺激し、ヒトＩＬ２の産生を誘発する能力を有していた。
【０３９５】
ＦＳ２０−１１系統Ｆｃａｂは、架橋される場合にのみ、Ｔ細胞を共刺激することが可能であり、架橋の非存在下で活性を有していなかった。架橋される場合のみのこの活性は、これらのＦｃａｂが、患者に投与される場合、Ｆａｂ標的又は他の架橋手段の存在下でのみＴ細胞を活性化することが予想されることを意味する。ＦＳ２０−１１−１３１は、この系統中の他のクローンと比較してより低いＥＣ５０を有する。しかしながら、カニクイザルＯＸ４０に対するＦＳ２０−１１系統のクローンの低い交差反応性があるため、カニクイザルＯＸ４０に対する親和性のさらなる改善が、この種における毒性試験に必要とされ得る。
【０３９６】
ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１系統からのＦｃａｂは、架橋を用いて及び用いずに活性を示した。具体的には、これらの系統からのＦｃａｂは、架橋剤の非存在下で活性を有しており、これは、架橋時に増加した。これらのＦｃａｂは、カニクイザルＯＸ４０に対する高い交差反応性（ヒトＯＸ４０への結合と同等）を有するため、毒性試験は、この種において可能であろう。ＦＳ２０−２２系統中のクローンのうち、クローンＦＳ２０−２２−４１、ＦＳ２０−２２−４７、ＦＳ２０−２２−４９及びＦＳ２０−２２−８５が、架橋される場合にそれらのアゴニスト活性について最も低いＥＣ５０値を有していたため、この系統からの好ましいクローンである。これらのうち、クローンＦＳ２０−２２−４９が、架橋時にアゴニスト活性の最も高い増加を示し、架橋の存在下でそのアゴニスト活性について最も低いＥＣ５０も有していたため、好ましいクローンである。ＦＳ２０−３１系統中のクローンのうち、クローンＦＳ２０−３１−１０８、ＦＳ２０−３１−１０８及びＦＳ２０−３１−１１５が、最も大きい最大応答を示した一方、低いＥＣ５０値、したがって良好な効力も示した。
【０３９７】
ＯＸ４０標的化分子が臨床において副作用を示さなかったため、ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１系統中のクローンが、架橋の非存在下でいくらかの限られたＴ細胞活性化を示したことは、安全性リスクを呈すると予想されない。むしろ、これらのクローンは、架橋の非存在下でＯＸ４０発現メモリーＴ細胞を活性化することが可能であり得、それによって、それらを増殖させ、したがって、より大きいＴ細胞集団を生成し、これは、その後、架橋された抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂの結合によって促されるＯＸ４０のクラスター化によってさらに活性化され得るため、架橋の非存在下でのこれらのクローンの限られたＴ細胞活性化活性は、有益であり得ると考えられる。
【０３９８】
５．２  モックｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂを用いたマウスＴ細胞活性化アッセイ
マウスＯＸ４０結合Ｆｃａｂの活性を評価するために、Ｔ細胞活性化アッセイを用いて、以下の表９に詳述されるモック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２及びｍＡｂ分子の存在下でのマウスＯＸ４０のクラスター化及びシグナル伝達を評価した。ヒトアッセイと同様に、Ｔ細胞活性化を、ＩＬ−２の放出を測定することによって検出した。
【０３９９】
５．２．１  マウスＴ細胞の単離及び活性化
Ｔ細胞を単離するために、脾臓を、４〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Charles River）から採取した。マウスを人道的に安楽死させ、脾臓を切開によって単離した。５ｍｌのプラスチックシリンジの内部を用いて、脾臓を７０μｍのセルストレーナー（Corning）に押し通すことによって、脾細胞を単離した。セルストレーナーを、１ｍｌのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Gibco）で１０回洗浄し、溶離液を、５０ｍｌの管に収集した。溶離液中に存在する赤血球を、製造業者の説明書に従って、１０ｍｌの赤血球溶解緩衝液（eBioscience）の添加によって溶解させた。Ｔ細胞を、製造業者の説明書に従って、ｐａｎ  Ｔ細胞単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec Ltd）を用いて、溶離液中に存在する脾細胞から単離した。
【０４００】
マウスT-Activator CD3/CD28 Dynabeads（Life Technologies、１１４５２Ｄ）をボルテックスによって再懸濁させた。ビーズを、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）、１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies）、ピルビン酸ナトリウム（Gibco）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Gibco）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Gibco））を含むＴ細胞培地（ＲＰＭＩ培地（Life Technologies）で２回洗浄した。
【０４０１】
Ｔ細胞培地中の１．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度の必要量のＴ細胞を、Ｔ−２５フラスコ（Sigma）中で、２：１の細胞対ビーズ比率で、洗浄されたマウスT-Activator CD3/CD28 Dynabeadsで刺激し、３７℃、５％のＣＯ２で、一晩インキュベートして、Ｔ細胞を活性化した。
【０４０２】
一晩のインキュベーションの後、活性化Ｔ細胞を、Dynabeadsから洗浄し、２．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で、Ｔ細胞培地中で再懸濁させた。９６ウェル平底プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で２時間にわたってＰＢＳ中で希釈された２．５μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３抗体（Biolegendクローン１４５−２Ｃ１１）とのインキュベーションによって、抗マウスＣＤ３抗体で被覆し、次に、ＰＢＳで２回洗浄した。活性化Ｔ細胞を、２×１０５個の細胞／ウェルでプレートに加えた。モック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２及び陽性対照抗マウスＯＸ４０  ＯＸ８６  ｍＡｂ（ＬＡＬＡ突然変異を有するヒトＩｇＧ１骨格中；配列番号１７５及び１７６）（詳細については表９を参照）の２μＭの希釈物を、ＤＰＢＳ（Gibco）中で調製し、Ｔ細胞培地（３０μｌ＋２７０μｌ）中で、１：１０でさらに希釈して、２００ｎＭの希釈物を得た。ＯＸ８６陽性対照ｍＡｂのＦｃを介して架橋に使用される抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６、及びモック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットにおけるＦｃａｂのＦａｂ結合を介して架橋に使用されるＦＩＴＣ−デキストラン（Sigma）を、モックｍＡｂ２又は陽性対照ｍＡｂとともに１：１のモル比でウェルに加えた。９６ウェルプレートにおいて、それぞれ関連する架橋剤を用いた、（１）陽性対照若しくはモックｍＡｂ２又は（２）陽性対照若しくはモックｍＡｂ２の連続希釈物を調製した。１００μｌの希釈されたモック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２／対照ｍＡｂ又はモック（４４２０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２若しくは陽性対照ｍＡｂ及び架橋抗体の混合物を、プレート上の活性化Ｔ細胞に加えた。
【０４０３】
Ｔ細胞を、７２時間にわたって３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。上清を収集し、ＩＬ−２放出を、製造業者の説明書に従って、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D systems）を用いて測定した。プレートを、Gen5 Software、BioTekを用いて、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィット（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。マウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）の濃度を、モックｍＡｂ２又は陽性対照ｍＡｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。表９は、試験されるモックｍＡｂ２及び陽性対照ｍＡｂの存在下で、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて観察される、ＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を示す。
【０４０４】
【表１０】
2021524275.tif 000013
【０４０５】
ＦＩＴＣ−デキストラン陽性対照抗体のいずれについても、ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１系統からの抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの活性は、抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂで観察されるインビボ活性より高くなり得る。
【０４０６】
５．３  モックｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂのインビボ抗腫瘍有効性
ＣＴ２６同系腫瘍モデルを用いて、インビボでモックｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂ  ＦＳ２０ｍ−２３２−９１の抗腫瘍活性を試験した。ＣＴ２６同系腫瘍モデルは、ＯＸ４０アゴニスト抗体に対して感受性であることが以前に示されており（Sadun et al.,2008）、ＣＴ２６腫瘍から単離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、ＯＸ４０を発現することが予想される。
【０４０７】
抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂ  ＦＳ２０ｍ−２３２−９１及び抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂは、Ｔ細胞活性化アッセイを用いて示されるように、Ｔ細胞活性化の強力なアゴニストである。ＦＳ２０−１１系統は、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂと同様に、架橋される場合にのみＴ細胞活性を有するため、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂを用いて行われたインビボ試験からの結果は、ヒト患者においてこのＦＳ２０−１１系統からの抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの臨床的有効性の予測であることが予想される（実施例５．１）。ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１系統からの抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂは、架橋の非存在下でＯＸ４０アゴニスト活性を示した（実施例５．１）。実施例５．２．１において説明されるように、ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１系統からのＦｃａｂが、架橋の非存在下でＯＸ４０アゴニスト活性を有さないＦｃａｂより高い臨床的有効性を示すことが予想される。したがって、ＦＳ２０−２２及びＦＳ２０−３１系統からの抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂの臨床的有効性は、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂで観察されるインビボ結果より高くなり得る。
【０４０８】
ＬＡＬＡ突然変異を有する及び有さない、モック（ＨＥＬ  Ｄ１．３）ｍＡｂ２フォーマットにおけるＦＳ２０ｍ−２３２−９１抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂが腫瘍成長を阻害する能力を、陽性対照抗マウスＯＸ４０  ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ１骨格中のＯＸ８６）及び陰性対照抗ＦＩＴＣ抗体（ヒトＩｇＧ１骨格中の４４２０）と比較した。
【０４０９】
８〜１０週齢で、且つそれぞれ重量約２０ｇのＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）を、試験開始前の１週間にわたって安静にさせた。全ての動物にマイクロチップを埋め込み、固有の識別子を与えた。各コホートは、１２匹のマウスを有していた。ＣＴ２６結腸癌細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２６３８）を最初に増殖させ、貯蔵し、次に、ＩＭＰＡＣＴ  Ｉプロトコルを用いて病原体についてIDEXX Bioresearchによってプレスクリーニングし、病原体を含まないことが示された。ＣＴ２６細胞（約３〜５×１０６個）を、−１５０℃での貯蔵から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコ中で１０％のＦＣＳ（Gibco、１０２７０−１０６）を含む２０ｍｌのＤＭＥＭ（Gibco、６１９６５−０２６）に加えた。マウスに、イソフルラン（Abbott Laboratories）を用いて麻酔をかけ、各動物に、左脇腹に皮下注射される１×１０６個の細胞を与えた。腫瘍細胞接種の１０日後に、マウスを、健康及び腫瘍成長について監視し、ソートし、試験コホートへとランダム化した。この時点で腫瘍を有さなかったマウスを、試験から外した。
【０４１０】
モック（ＨＥＬ  Ｄ１．３）ｍＡｂ２分子及び対照ｍＡｂを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイリングによって分析し、注射前の２４時間以内に不純物をチェックした。モック（ＨＥＬ  Ｄ１．３）ｍＡｂ２及びｍＡｂを、ＰＢＳ中で０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように調製し、マウス当たり２００μｌの体積を腹腔内（ＩＰ）注射によって投与して、腫瘍接種の１０、１２及び１４日後に、２０ｇのマウスに１ｍｇ／ｋｇの最終用量を与えた。動物を、盲検法で週に３回、麻酔下で健康を検査し、その間、腫瘍の正確な測定を行った。腫瘍体積測定を、キャリパーを用いて行って、腫瘍の最長軸及び最短軸を決定した。以下の式を用いて、腫瘍体積を計算した：
Ｌ×（Ｓ２）／２
（式中、Ｌ＝最長軸であり；Ｓ＝最短軸である）
【０４１１】
腫瘍量が限界に近いと見なされた２２日目に試験を停止し、全てのマウスを人道的に殺処分した。結果は、図３に示される。最終腫瘍体積の統計的分析を、GraphPad Prismソフトウェアパッケージ内で両側スチューデントｔ検定を用いて行った。
【０４１２】
腫瘍成長を抑制する際、陽性対照抗マウスＯＸ４０  ｍＡｂ（Ｇ１／ＯＸ８６）と、陰性対照抗ＦＩＴＣ対照抗体（正常な成長）との間の統計的有意差が実証された。また、腫瘍成長を抑制する際、モック（ＨＥＬ  Ｄ１．３）ｍＡｂ２と、ＬＡＬＡ突然変異を有するモック（ＨＥＬ  Ｄ１．３）ｍＡｂ２との間の統計的有意差が実証された。
【０４１３】
ＣＴ２６腫瘍モデルは、侵攻性の急成長する腫瘍モデルであり、これは、腸転移を発症しているマウスに元々発生しやすく、結果として、非常に限られた治療域を有する。腫瘍成長の抑制をもたらす、この腫瘍モデルにおいて腫瘍浸潤Ｔ細胞において発現されるＯＸ４０のクラスター化及び活性化は、モックｍＡｂ２フォーマットにおけるＦＳ２０ｍ−２３２−９１  Ｆｃａｂ及びＧ１／ＯＸ８６陽性対照のＦｃγＲ媒介性架橋によって促され、これらはいずれもＬＡＬＡ突然変異を含まない。しかしながら、ＬＡＬＡ突然変異を含む、モックｍＡｂ２フォーマットにおけるＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ  Ｆｃａｂに見られるように、ＦｃａｂのＦｃγＲ媒介性架橋がほとんど又は全くなく、したがって、ＯＸ４０のクラスター化及び活性化がない場合、腫瘍成長の抑制は観察されない。したがって、抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂが、架橋される場合にのみ、腫瘍成長の低減をもたらす活性を有することが、このことから結論付けられ得る。
【０４１４】
これらの結果に基づいて、架橋される場合の抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂが、ヒト患者においてＯＸ４０を発現する腫瘍浸潤Ｔ細胞を含む腫瘍の成長を同様に阻害することが可能であると予想される。
【０４１５】
実施例６−細胞表面受容体結合を介したｍＡｂ２架橋
活性化Ｔ細胞は、それらの細胞表面においてＯＸ４０を発現する。三量体ＯＸ４０リガンドの、ＯＸ４０への結合は、受容体の三量体化をもたらす。ＯＸ４０リガンドが、抗原提示細胞の細胞表面においてクラスターとして発現される際、ＯＸ４０リガンドとＯＸ４０との間の相互作用は、ＯＸ４０のクラスター化をもたらし、これは、ＯＸ４０シグナル伝達及びさらなるＴ細胞活性化に不可欠であることが知られている。ＯＸ４０に作用する抗体は、ＯＸ４０リガンドのこのクラスター化活性を模倣しなければならない。単一特異的な抗ＯＸ４０抗体の場合、Ｆｃγ受容体は、抗体のＦｃドメインに結合し、それらを架橋し、ＯＸ４０のクラスター化をもたらす。二重特異的抗体は、それらの第２の抗原結合部位を介して第２の細胞表面発現受容体に結合し得、抗体の架橋及びＯＸ４０のクラスター化をもたらす。二重特異的抗体によって結合される第２の細胞表面発現受容体は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。これは、二重特異的抗体が、腫瘍の部位において架橋され、腫瘍部位におけるＯＸ４０のクラスター化及びＴ細胞活性化をもたらすという利点を有する。したがって、二重特異的抗体の使用は、免疫系の腫瘍に限局された活性化及び結果として生じる腫瘍の除去又は制御をもたらす可能性を有する。
【０４１６】
したがって、表面においてＴＡＡを発現する腫瘍細胞を、後述されるＴ細胞活性化アッセイに用いて、本発明の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂを含むｍＡｂ２及び可変領域におけるＴＡＡ抗原結合部位によるＴＡＡ結合が、ｍＡｂ２架橋をもたらし、その結果として、ＯＸ４０のクラスター化及びシグナル伝達を誘発し得るかどうかを評価した。
【０４１７】
６．１  抗ＥＧＦＲ、抗ＥｐｈＡ２、抗ＣＥＡＣＡＭ５又は抗ＥｐＣＡＭ  Ｆａｂと対合される抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂを含むｍＡｂ２を用いたヒトＴ細胞活性化アッセイ
Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験するために、実施例４．１に記載されるように、ＬＡＬＡ突然変異を有する、以下の表１０及び１１に記載される抗体分子を調製した。抗体分子を、実施例４．１に記載されるモックｍＡｂ２と同じ方法で、抗ＦＩＴＣ抗体４４２０の可変領域（配列番号１６７、１６８及び１５６）、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（米国特許第６２１７８６６号；「Ｃｘ」によって示される）、ＥｐｈＡ２抗体Ｅ２Ａ（国際公開第２００４／０１４２９２  Ａ２号）、ＥｐＣＡＭ抗体ＭＯＣ３１（米国特許第８６３７０１７号）、ＯＸ４０抗体１１Ｄ４（欧州特許第２  ２４２  ７７１  Ｂ１号）、又は抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ＣＥＡ（米国特許第８，７７１，６９０  Ｂ２号、クローンｈＭＮ１５）を用いて構築した。これらのアッセイにおいて、腫瘍細胞は、ＴＡＡへの可変領域結合部位の結合を介して、抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂ及びＴＡＡに特異的な可変領域（表１０中の抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９ＡＡの場合、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５又はＥｐＣＡＭ、及び表１１中の抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３１ＡＡの場合、ＥｐｈＡ２又はＣＥＡＣＡＭ５）を含むｍＡｂ２のための架橋剤として機能した。Ｔ細胞活性化を、ＩＬ−２の放出によって決定した。
【０４１８】
【表１１】
2021524275.tif 000014
【０４１９】
【表１２】
2021524275.tif 000015
【０４２０】
上記の実施例５．１．１に記載されるように、Ｔ細胞を単離し、活性化した。
【０４２１】
細胞表面においてＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、エフリンＡ２及びＣＥＡＣＡＭ５を発現するＨＰＡＣ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２１１９）を、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）を含むＤＭＥＭ培地（Life Technologies）中で維持した。ＨＰＡＣ細胞をＴ細胞培地中で１回洗浄し、必要に応じて２．５×１０４個の細胞／ウェルでプレートに加えた。
【０４２２】
各試験ｍＡｂ／ｍＡｂ２（詳細については表１０及び１１を参照）の２μＭの希釈物を、ＤＰＢＳ（Gibco）中で調製し、Ｔ細胞培地（３０μｌ＋２７０μｌ）中で、１：１０でさらに希釈して、２００ｎＭの希釈物を得た。
【０４２３】
架橋剤（抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６又はＦＩＴＣ−デキストラン（Sigma）；表１０及び１１を参照）を、必要に応じて試験ｍＡｂ／ｍＡｂ２とともに１：１のモル比でウェルに加えた。９６ウェルプレートにおいて、試験ｍＡｂ／ｍＡｂ２の連続希釈物を調製し、１００μｌの希釈されたｍＡｂ／ｍＡｂ２混合物を、プレート上の活性化Ｔ細胞及びＨＰＡＣ細胞に加えた。
【０４２４】
実施例５．１．１に記載されるように、Ｔ細胞をインキュベートし、上清を収集した。実施例５．１．１に記載されるように、プレートを読み取り、ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の濃度を、試験ｍＡｂ／ｍＡｂ２のｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、ｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。
【０４２５】
表１２は、架橋剤又はＨＰＡＣ細胞のいずれかによる架橋の存在下又は非存在下での、表１０に記載されるｍＡｂ／ｍＡｂ２によるＴ細胞活性化（ＥＣ５０値及び最大ＩＬ−２放出）を示す。図４は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出のプロットを示す。
【０４２６】
【表１３】
2021524275.tif 000016
【０４２７】
図４は、ＯＸ４０が、架橋された抗ＯＸ４０  ｍＡｂ／ｍＡｂ２によって結合されるとき、Ｔ細胞活性化の増加があることを示す。Ｔ細胞活性化は、予想どおり、陰性対照として用いた架橋された抗ＦＩＴＣ抗体  Ｇ１ＡＡ／４４２０で観察されなかった。抗ヒトＣＨ２抗体によって架橋される場合のＯＸ４０標的化ｍＡｂ  Ｇ１／１１Ｄ４は、ＨＰＡＣ細胞の存在下でＴ細胞活性化を誘発した。モックｍＡｂ２（４４２０  ＬＡＬＡ）フォーマットにおけるＯＸ４０標的化Ｆｃａｂ、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０は、前に示されるように、架橋の非存在下でアゴニスト活性を有しており、この活性は、モックｍＡｂ２のＦａｂアームに結合する架橋剤ＦＩＴＣ−デキストランの存在下で促進された。ＯＸ４０標的化Ｆｃａｂが、抗ＴＡＡ  Ｆａｂ（ＥＧＦＲに対するセツキシマブ、エフリンＡ２に対するＥ２Ａ、ＥｐＣＡＭに対するＭＯＣ３１及びＣＥＡＣＡＭ５に対するＣＥＡ）と対合されたとき、得られたｍＡｂ２のアゴニスト活性は、モックｍＡｂ２フォーマットにおけるＦｃａｂと比較して増加され、これは、ＨＰＡＣ細胞における細胞表面発現ＴＡＡへのＴＡＡ  Ｆａｂの結合が、ｍＡｂ２の架橋、その結果としてのＯＸ４０のクラスター化及び活性化をもたらしたことを示している。
【０４２８】
表１３は、架橋剤又はＨＰＡＣ細胞のいずれかによる架橋の存在下又は非存在下での、表１１に記載されるｍＡｂ／ｍＡｂ２を用いたＴ細胞活性化（ＥＣ５０値及び最大ＩＬ−２放出）を示す。図５は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出のプロットを示す。
【０４２９】
【表１４】
2021524275.tif 000017
【０４３０】
図５にプロットされたデータは、ＯＸ４０が、架橋された抗ＯＸ４０  ｍＡｂ／ｍＡｂ２によって結合されるとき、Ｔ細胞活性化の増加があることを示す。Ｔ細胞活性化は、予想どおり、陰性対照として用いた架橋された抗ＦＩＴＣ抗体Ｇ１／４４２０で観察されなかった。抗ヒトＣＨ２抗体によって架橋される場合のＯＸ４０標的化ｍＡｂ抗体Ｇ１／１１Ｄ４は、ＨＰＡＣ細胞の存在下でＴ細胞活性化を誘発した。モックｍＡｂ２（４４２０  ＬＡＬＡ）フォーマットにおけるＯＸ４０標的化Ｆｃａｂ、ＦＳ２０−１１−１３１ＡＡ／４４２０は、前に示されるように、架橋の非存在下でアゴニスト活性を有しておらず、モックｍＡｂ２のＦａｂアームに結合する架橋剤ＦＩＴＣ−デキストランの存在下でのみアゴニスト活性を示した。ＯＸ４０標的化Ｆｃａｂが、抗ＴＡＡ  Ｆａｂ（エフリンＡ２に対するＥ２Ａ、又はＣＥＡＣＡＭ５に対するＣＥＡ）と対合されたとき、得られたｍＡｂ２のアゴニスト活性は、ＴＡＡ発現ＨＰＡＣ細胞の存在下で、モックｍＡｂ２フォーマットにおけるＦｃａｂと比較して増加され、これは、ＨＰＡＣ細胞における細胞表面発現ＴＡＡへのＴＡＡ  Ｆａｂの結合が、ｍＡｂ２の架橋、その結果としてのＯＸ４０のクラスター化及び活性化をもたらしたことを示している。
【０４３１】
抗ＯＸ４０／抗ＥＧＦＲ、抗ＯＸ４０／抗ＣＥＡＣＡＭ５、抗ＯＸ４０／抗ＥｐｈＡ２又は抗ＯＸ４０／抗ＥｐＣＡＭ  ｍＡｂ２抗体で観察されたＴ細胞活性化は、２つ以上のタイプの細胞表面受容体が、抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂと対合され得ることを実証する。
【０４３２】
６．２  抗ＥｐｈＡ２  Ｆａｂと対合された抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂを含むｍＡｂ２用いたマウスＴ細胞活性化アッセイ
このＴ細胞活性化アッセイを用いて、以下の表１４に記載される試験ｍＡｂ／ｍＡｂ２の存在下でのＯＸ４０のクラスター化及びシグナル伝達を評価した。実施例４．１に記載されるように、ＬＡＬＡ突然変異を有するｍＡｂ２を調製した。アッセイにおいて使用される腫瘍細胞は、ＥｐｈＡ２に結合するＦａｂを介して、ＴＡＡ  ＥｐｈＡ２を標的とする陽性対照ｍＡｂ及びｍＡｂ２のための架橋剤として機能した。
【０４３３】
【表１５】
2021524275.tif 000018
【０４３４】
実施例５．２．１に記載されるように、マウスＴ細胞を単離し、活性化し、上記及び以下に記載される異なる架橋剤及び対照抗体を用いた以外は、ＨＰＡＣ細胞を用いた実施例６．１に記載されるヒトＴ細胞活性化アッセイと本質的に同じプロトコルにおいて使用し、ＩＬ−２産生を評価した。
【０４３５】
架橋剤（抗ヒトＦｃ（ａ−ｈＦｃ）、Jackson Immunoresearch；又はＦＩＴＣ−デキストラン、Sigma）を、必要に応じて試験ｍＡｂ／ｍＡｂ２とともに１：１のモル比でウェルに加えた。９６ウェルプレートにおいて、ｍＡｂ／ｍＡｂ２又はｍＡｂ／ｍＡｂ２及び架橋抗体混合物の６つの５倍連続希釈物を調製した（６０μｌ＋２４０μｌのＴ細胞培地）。１００μｌの希釈されたｍＡｂ／ｍＡｂ２又はｍＡｂ／ｍＡｂ２及び架橋抗体混合物を、プレート上の活性化Ｔ細胞に加えた。
【０４３６】
表１５は、架橋剤又はＨＰＡＣ細胞のいずれかによる架橋の存在下又は非存在下での表１４に記載されるｍＡｂ／ｍＡｂ２によるＴ細胞活性化（ＥＣ５０値及び最大ＩＬ−２放出）を示す。図６は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。
【０４３７】
【表１６】
2021524275.tif 000019
【０４３８】
図６は、様々なｍＡｂ／ｍＡｂ２の存在下でのＥｐｈＡ２発現ＨＰＡＣ細胞を含むＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。６つの異なるｍＡｂ／ｍＡｂ２又はそれらの組合せを、このアッセイにおいて増加する濃度で試験し、必要に応じてそれらのヒトＩｇＧアイソタイプ／Ｆａｂクローン又はＦｃａｂ／Ｆａｂクローン名（Ｇ１／４４２０、Ｇ１／Ｅ２Ａ、Ｇ１／ＯＸ８６、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０＋Ｇ１／Ｅ２Ａ、及びＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａ）に従って標識した。図６Ａに示される結果は、ＥｐｈＡ２発現ＨＰＡＣ細胞の存在下でＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａ  ｍＡｂ２抗体によるＴ細胞の活性化の増加があったことを実証する。これは、架橋が、Ｔ細胞活性化を増加させるためにＯＸ４０標的化抗体に必要とされること及びＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａ  ｍＡｂ２抗体が、単にＨＰＡＣ（ＥｐｈＡ２＋）細胞の存在によって架橋され得、且つさらなる非生理的架橋剤を必要としない唯一の分子であることを実証する。図６Ｂは、ＯＸ４０が標的とされ、抗ＯＸ４０  ｍＡｂ／ｍＡｂ２が架橋された場合、Ｔ細胞の活性化の増加があったことを示す。これらの結果は、架橋が、Ｔ細胞活性化を増加させるためにＯＸ４０標的化ｍＡｂ／ｍＡｂ２に必要とされることを実証する。
【０４３９】
ＥｐｈＡ２を発現するＨＰＡＣ細胞の存在下で、抗マウスＯＸ４０／抗ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａ）で観察されたＴ細胞活性化は、この受容体がまた、ＥｐｈＡ２及びＯＸ４０の両方のための結合部位を有するｍＡｂ２によって標的とされた場合、ＯＸ４０の架橋を媒介し得ることを実証する。
【０４４０】
６．３  抗ｍＯＸ４０／抗ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２が、インビボで腫瘍成長を抑制する
ＣＴ２６細胞が、ＥｐｈＡ２を発現し、ＣＴ２６腫瘍から単離されたＴＩＬが、ＯＸ４０を発現するＴ細胞を含むため、ＣＴ２６同系腫瘍モデルをこの実験において使用した。実施例６．２に記載される抗ｍＯＸ４０／抗ＥｐｈＡ２ｍＡｂ２抗体（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａ）を、ＣＴ２６同系マウス腫瘍成長モデルにおいてインビボ活性について試験した。
【０４４１】
腫瘍成長を阻害する抗ｍＯＸ４０／抗ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２の能力を、モックｍＡｂ２フォーマット（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０）における抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂ、モックｍＡｂ２フォーマット（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０）における抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂと抗ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ（Ｇ１／Ｅ２Ａ）との組合せ、及び対照としての抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ（Ｇ１／４４２０）の能力と比較した。
【０４４２】
ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにＣＴ２６細胞を注射し、健康及び腫瘍成長について監視し、ソートし、実施例５に記載されるように試験コホートへとランダム化した。この時点で腫瘍を有さなかったマウスを試験から外した。
【０４４３】
実施例５に記載されるように、ｍＡｂ２／ｍＡｂをプロファイリングし、不純物をチェックし、調製し、マウスに投与した。動物の健康を検査し、腫瘍測定を行い、腫瘍体積を、実施例５に記載されるように計算した。
【０４４４】
腫瘍量が限界に近いと見なされた２０日目に試験を停止し、全てのマウスを人道的に殺処分した。結果は、図７に示される。最終腫瘍体積の統計的分析を、GraphPad Prismソフトウェアパッケージ内で両側スチューデントｔ検定を用いて行った。
【０４４５】
腫瘍成長を抑制する際、抗ＯＸ４０／抗ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａ）と、抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ（Ｇ１／４４２０）対照（正常な成長）との間の統計的有意差が実証された。このような統計的有意差は、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０及びＧ１／Ｅ２Ａの組合せ又はＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０及びＧ１／４４２０対照群のいずれにおいても観察されなかった。
【０４４６】
意外なことに、ＯＸ４０及びＥｐｈＡ２を標的とする抗体の組合せは、ＩｇＧ１対照（Ｇ１／４４２０）コホートと比較して、腫瘍成長を有意に抑制しなかった。しかしながら、抗ｍＯＸ４０／抗ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａ）で処理されたコホートは、ＩｇＧ１対照と比較して成長の有意な抑制を示した。この試験は、観察されたインビトロ結果と同様に、腫瘍細胞において発現されるＥｐｈＡ２を標的とするｍＡｂ２及び腫瘍浸潤Ｔ細胞において発現されるＯＸ４０による、ＯＸ４０の架橋が、対照で観察されたものを上回る、Ｔ細胞活性化及びその結果としての腫瘍成長の制御をもたらしたことを示す。
【０４４７】
図７は、Ｇ１／４４２０、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０＋Ｇ１／Ｅ２Ａ、及びＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａで処理されたＢａｌｂ／ｃマウスコホート中のＣＴ２６同系モデルの腫瘍成長曲線を示す。平均腫瘍体積±標準誤差平均がプロットされ、最終日の腫瘍体積を、両側ｔ検定を用いて異なる群間で比較した。抗ｍＯＸ４０／抗ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２抗体（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｅ２Ａ）で処理された群は、対照抗体（Ｇ１／４４２０）で処理された群と比較して、統計的に有意な腫瘍体積減少を示した。この結果は、抗ｍＯＸ４０／抗ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２抗体が、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０及びＧ１／Ｅ２Ａ抗体の組合せより、ＥｐｈＡ２発現腫瘍に対してインビボでのより良好な抗腫瘍有効性を有することを実証し、これは、抗ｍＯＸ４０／抗ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２によって媒介されるＯＸ４０及びＥｐｈＡ２の二重特異的な嵌合によるＯＸ４０のインビボ架橋が、腫瘍成長を制御するのに有効であることを示している。
【０４４８】
実施例７−可溶性因子への結合を介したｍＡｂ２架橋
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、低酸素症に応答して発現され、内皮細胞における受容体に結合して、血管新生と呼ばれるプロセスである、新たな血管の形成をもたらす可溶性ホモ二量体分子である。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、低酸素であり、腫瘍細胞がその成長のために十分な栄養を供給されるように増加したレベルのＶＥＧＦを有する。モノクローナル抗体を用いたＶＥＧＦの標的化は、抗腫瘍療法の確立された形態である。細胞表面で発現されるＴＡＡは、ＯＸ４０標的化ｍＡｂ２の架橋を媒介することが可能であったため、可溶性ＶＥＧＦを用いたＯＸ４０及びＶＥＧＦ標的化ｍＡｂ２の架橋も試験した。
【０４４９】
７．１  抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂ及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂを含むｍＡｂ２を用いたヒトＴ細胞活性化アッセイ
さらなるＶＥＧＦの存在下又は非存在下でのＴ細胞活性化アッセイを用いて、以下の表１６に列挙される抗体の存在下でＯＸ４０のクラスター化及びシグナル伝達を評価した。実施例４．１に記載されるようにＬＡＬＡ突然変異を有するＯＸ４０／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２及びＯＸ４０／ＦＩＴＣモックｍＡｂ２を調製した。このアッセイにおいて、ＶＥＧＦは、ＯＸ４０／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２のための架橋剤として働き、これは、ＯＸ４０標的化Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブの可変領域（欧州特許第１３２５９３２Ｂ９号、クローンＡ４．６．１；表１６及び１７中の「Ｂｅｖ」によって示される）を用いて構築された。
【０４５０】
【表１７】
2021524275.tif 000020
【０４５１】
上記の実施例５．１．１に記載されるように、Ｔ細胞を単離し、活性化し、上述される陽性対照抗体及びｍＡｂ２及び以下の架橋剤（例えば、ＨＰＡＣ細胞の代わりに可溶性ＶＥＧＦ）を用いて、実施例６．１に記載されるヒトＴ細胞活性化アッセイと本質的に同じプロトコルにおいて使用した。ｈＩＬ−２産生を、上述されるように決定した。架橋剤（抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６、ＦＩＴＣｄｅｘ（Sigma）又はＶＥＧＦ（Peprotech、カタログ番号１００−２０）；表１６を参照）を、必要に応じて試験ｍＡｂ／ｍＡｂ２とともに１：１のモル比でウェルに加えた。
【０４５２】
表１７は、架橋剤による架橋の存在下又は非存在下での表１６に記載されるｍＡｂ／ｍＡｂ２によるＴ細胞活性化（ＥＣ５０値及び最大ＩＬ−２放出）を示す。図８は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出のプロットを示す。
【０４５３】
【表１８】
2021524275.tif 000021
【０４５４】
図８は、ＯＸ４０が標的とされ、抗ＯＸ４０  ｍＡｂ／ｍＡｂ２が架橋される場合、Ｔ細胞の活性化の増加があることを示す。Ｔ細胞活性化は、予想どおり、架橋された抗ＦＩＴＣ抗体Ｇ１／４４２０で観察されなかった。抗ヒトＣＨ２抗体によって架橋される場合のＯＸ４０標的化ｍＡｂ  Ｇ１／１１Ｄ４は、Ｔ細胞活性化を誘発した。モックｍＡｂ２（４４２０  ＬＡＬＡ）フォーマットにおけるＯＸ４０標的化Ｆｃａｂ、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０は、モックｍＡｂ２のＦａｂアームに結合する架橋剤ＦＩＴＣ−デキストランの存在下でアゴニスト活性を有していた。ＯＸ４０標的化Ｆｃａｂが、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂベバシズマブと対合されたとき、ｍＡｂ２抗体は、架橋の非存在下でいくらかのアゴニスト活性を有しており、これは、抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９で観察される架橋の非存在下でのアゴニスト活性の結果得られたものである可能性が高い。ＶＥＧＦが、ＯＸ４０／ベバシズマブｍＡｂ２抗体に加えられたとき、アゴニスト活性は、ＥＣ５０の約１００倍の減少によって示されるように増加し、これは、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂが、ＶＥＧＦの存在下でｍＡｂ２を架橋することが可能であることを示している。
【０４５５】
抗ｈＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２で観察されたＴ細胞活性化は、可溶性因子が架橋剤として使用され得ることを実証する。
【０４５６】
７．２  抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂ及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂを含むｍＡｂ２を用いたマウスＴ細胞活性化アッセイ
Ｔ細胞活性化アッセイを用いて、以下の表１８に列挙されるｍＡｂ／ｍＡｂ２の存在下でのＯＸ４０のクラスター化及びシグナル伝達を評価した。抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂ  ＦＳ２０ｍ−２３２−９１を、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ  Ｒ８４のＦａｂ領域（特許公開番号米国特許出願公開第２００９／０１７５７９１  Ａ１号）と対合させ、実施例４．１に記載されるようにＬＡＬＡ突然変異を有する全てのｍＡｂ２を調製した。このアッセイにおいて、ＶＥＧＦは、マウスＯＸ４０及びＶＥＧＦに結合するｍＡｂ２のための架橋剤として機能した。
【０４５７】
【表１９】
2021524275.tif 000022
【０４５８】
実施例５．２．１に記載されるように、マウスＴ細胞を単離し、活性化し、上述される陽性対照抗体及びｍＡｂ２並びに後述される及び架橋剤を用いた以外は、実施例７．１と本質的に同じプロトコルにおいて使用した。ｍＩＬ−２産生を、上述されるように決定した。
【０４５９】
架橋剤（抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６、ＦＩＴＣｄｅｘ、（Sigma）又はＶＥＧＦ（Peprotech、カタログ番号１００−２０）；表１８を参照）を、必要に応じて試験抗体とともに１：１のモル比でウェルに加えた。
【０４６０】
表１９は、試験されるｍＡｂ２及びｍＡｂの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察された、ＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を示す。図９は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ２放出の代表的なプロットを示す。
【０４６１】
【表２０】
2021524275.tif 000023
【０４６２】
図９は、ＯＸ４０及びＶＥＧＦ可溶性因子を標的とするｍＡｂ２が存在する場合、ＶＥＧＦの存在下でのＴ細胞の活性化の増加があるが、ＯＸ４０を標的とする他のｍＡｂ２が存在するが、架橋されていない場合にはこのような増加はなかったことを示す。これは、ｍＡｂ２が、ＯＸ４０及びＶＥＧＦへの結合によって架橋されることを示す。図９は、ＯＸ４０を標的とするｍＡｂ／ｍＡｂ２が、非生理的架橋剤（抗Ｆｃ抗体又はＦＩＴＣ−デキストラン）の存在下でＴ細胞を活性化することを示す。抗ＶＥＧＦ及び抗ＦＩＴＣ対照抗体は、予想どおり、架橋剤の存在下でＴ細胞活性化を誘発しなかった。抗マウスＯＸ４０抗体は、抗Ｆｃ抗体（Ｇ１／ＯＸ８６  Ｘｌｉｎｋ）（表１９を参照）によって架橋される場合にいくらかのＴ細胞活性化を誘発した。ｍＡｂ２において抗ＦＩＴＣ  Ｆａｂと対合される場合の抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂは、ＯＸ４０抗体Ｇ１／ＯＸ８６より低いＥＣ５０及びより高い最大応答で、ＦＩＴＣ−デキストラン（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０  Ｘｌｉｎｋ）によって架橋される場合にＴ細胞を活性化した。ｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｒ８４）において抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂと対合される場合の同じ抗ＯＸ４０  Ｆｃａｂは、おそらく活性化Ｔ細胞によるＶＥＧＦの産生のため、さらなる架橋剤の非存在下でＴ細胞を活性化した。ＶＥＧＦの添加は、さらなるＶＥＧＦの非存在下での抗ＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２抗体と比較して、より低いＥＣ５０及び同等の最大応答によって観察されるように、抗ＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｒ８４）によってＴ細胞活性化を増加させた。
【０４６３】
ＶＥＧＦの存在下で抗ｍＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２で観察されたＴ細胞活性化は、可溶性因子がまた、ＶＥＧＦ及びＯＸ４０に結合するｍＡｂ２によって標的とされる場合などに、ＯＸ４０の架橋を媒介し得ることを実証する。
【０４６４】
７．３  抗ｍＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２が、インビボで腫瘍成長を抑制する
実施例７．２に記載される抗ｍＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２抗体（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｒ８４）を、ＣＴ２６同系マウス腫瘍成長モデルにおいてインビボ活性について試験した。
【０４６５】
ＣＴ２６腫瘍が増加した濃度のＶＥＧＦを有することが記載されており（Voron et al.,2015）、ＣＴ２６腫瘍から単離されたＴＩＬが、ＯＸ４０を発現するＴ細胞を含むため、ＣＴ２６同系腫瘍モデルをこの実験において使用した。
【０４６６】
腫瘍成長を阻害する抗ｍＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２の能力を、ｍＡｂ  Ｇ１／４４２０、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０とｍＡｂ  Ｇ１／Ｒ８４との組合せ、及び対照としてのｍＡｂ  Ｇ１／Ｒ８４の能力と比較した。
【０４６７】
ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにＣＴ２６細胞を注射し、健康及び腫瘍成長について監視し、ソートし、実施例５に記載されるように試験コホートへとランダム化した。この時点で腫瘍を有さなかったマウスを試験から外した。
【０４６８】
実施例５に記載されるように、ｍＡｂ２／ｍＡｂをプロファイリングし、不純物をチェックし、調製し、マウスに投与した。動物の健康を検査し、腫瘍測定を行い、腫瘍体積を、実施例５に記載されるように計算した。腫瘍量が限界に近いと見なされた２４日目に試験を停止し、全てのマウスを人道的に殺処分した。結果は、図１０に示される。最終腫瘍体積の統計的分析を、GraphPad Prismソフトウェアパッケージ内で両側スチューデントｔ検定を用いて行った。
【０４６９】
腫瘍成長を抑制する際、抗ｍＯＸ４０／抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｒ８４）と、抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  Ｇ１／４４２０対照（正常な成長）との間の統計的有意差が実証された。このような統計的有意差は、Ｇ１／４４２０対照と比べて、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０及びＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡなし／Ｒ８４対照又は抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ  Ｇ１／Ｒ８４対照の組合せのいずれにおいても観察されなかった。
【０４７０】
ＣＴ２６腫瘍モデルは、侵攻性の急成長する腫瘍モデルである。意外なことに、ＯＸ４０及びＶＥＧＦを標的とする抗体の組合せは、ＩｇＧ１対照（Ｇ１／４４２０）コホートと比較して、腫瘍成長を有意に抑制しなかった。しかしながら、抗ｍＯＸ４０／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｒ８４）で処理されたコホートは、ＩｇＧ１対照と比較して成長の有意な抑制を示した。この試験は、観察されたインビトロ結果と同様に、腫瘍細胞によって又は腫瘍微小環境内で若しくは腫瘍微小環境において過剰発現されるＶＥＧＦを標的とするｍＡｂ２及び腫瘍浸潤Ｔ細胞において発現されるＯＸ４０による、ＯＸ４０の架橋が、対照で観察されたものを上回る、Ｔ細胞活性化及びその結果としての腫瘍成長の制御をもたらしたことを示す。
【０４７１】
実施例８−共発現される受容体への結合を介したｍＡｂ２架橋
腫瘍浸潤Ｔ細胞におけるＯＸ４０発現は、他の受容体、共刺激受容体及び免疫チェックポイント受容体の両方の発現を伴う可能性が高い。これらの共発現される受容体を、ＯＸ４０−Ｆｃａｂ含有ｍＡｂ２中のＦａｂ標的として使用することはまた、ｍＡｂ２を架橋させて、ＯＸ４０、並びにＦａｂ標的のクラスター化をもたらし、両方の受容体の活性化を引き起こす働きを果たし得る。この構想を試験するために、以下のＴ細胞活性化アッセイを行った。
【０４７２】
８．１  抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ２７又は抗ＧＩＴＲ  Ｆａｂと対合された抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂを含むｍＡｂ２を用いたヒトＴ細胞活性化アッセイ
このアッセイにおいて、ヒトＯＸ４０及び共刺激分子ＩＣＯＳ、ＣＤ２７及びＧＩＴＲの共発現を利用して、以下の表２０に記載されるｍＡｂ／ｍＡｂ２の架橋を決定した。実施例４．１に記載されるのと同じ方法で、抗ＦＩＴＣ抗体４４２０の可変領域（配列番号１６７、１６８及び１５６）、抗ＯＸ４０抗体１１Ｄ４（欧州特許第２  ２４２  ７７１  Ｂ１号）、抗ＩＣＯＳ抗体ＩＣＯＳｊ（米国特許出願公開第２０１６／０３０４６１０  Ａ１号）、抗ＣＤ２７抗体６９５（米国特許出願公開第２０１３／０２４３７９５  Ａ１号）又は抗ＧＩＴＲ抗体６Ｃ８（米国特許第７，８１２，１３５  Ｂ２号）を用いて、ＬＡＬＡ突然変異を有するｍＡｂ２を調製した。
【０４７３】
【表２１】
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【０４７４】
上記の実施例５．１．１に記載されるように、Ｔ細胞を単離し、活性化し、上述される陽性対照抗体及びｍＡｂ２並びに以下の及び架橋剤を用いて、実施例６．１に記載されるヒトＴ細胞活性化アッセイと本質的に同じプロトコルにおいて使用した。ヒトＩＬ−２産生を、上述されるように決定した。
【０４７５】
架橋剤（抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６又はＦＩＴＣ−デキストラン（Sigma）；表２０を参照）を、必要に応じて試験ｍＡｂ／ｍＡｂ２とともに１：１のモル比でウェルに加えた。
【０４７６】
表２１は、架橋剤による架橋の存在下又は非存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察された、ＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を示す。図１１は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出のプロットを示す。
【０４７７】
【表２２】
2021524275.tif 000025
【０４７８】
図１１は、ＯＸ４０が標的とされ、抗ＯＸ４０抗体が架橋される場合、Ｔ細胞の活性化の増加があることを示す。Ｔ細胞活性化は、予想どおり、架橋された抗ＦＩＴＣ抗体Ｇ１／４４２０又は架橋された抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ２７又は抗ＧＩＴＲ抗体（それぞれ、Ｇ１ＡＡ／ＩＣＯＳｊ、Ｇ１ＡＡ／６９５又はＧ１ＡＡ／６Ｃ８）で観察されなかった。抗ヒトＣＨ２抗体によって架橋される場合のＯＸ４０標的化ｍＡｂ  Ｇ１／１１Ｄ４は、前に示されるように、Ｔ細胞活性化を誘発した。モックｍＡｂ２（４４２０  ＬＡＬＡ）フォーマットにおけるＯＸ４０標的化Ｆｃａｂ、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０は、前に示されるように、架橋の非存在下でアゴニスト活性を有しており、この活性は、Ｆａｂアームに結合する架橋剤ＦＩＴＣ−デキストランの添加により促進された。ＯＸ４０標的化Ｆｃａｂが、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ２７又は抗ＧＩＴＲ  Ｆａｂ（それぞれＩＣＯＳｊ、６９５又は６Ｃ８）と対合されたとき、Ｆｃａｂのアゴニスト活性が増加され、これは、ｍＡｂ２が、Ｔ細胞表面において共発現される受容体への結合によって架橋されていたことを示している。
【０４７９】
抗ＯＸ４０／抗ＩＣＯＳ、抗ＯＸ４０／抗ＣＤ２７及び抗ＯＸ４０／抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ２抗体で観察されたＴ細胞活性化は、Ｔ細胞表面においてヒトＯＸ４０と共発現される受容体が架橋剤として使用され得ることを実証する。
【０４８０】
８．２  抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂ及び抗ＰＤ１  Ｆａｂを含むｍＡｂ２を用いたヒトＴ細胞活性化アッセイ
このアッセイにおいて、ヒトＯＸ４０及びＰＤ１の共発現を利用して、以下の表２２に記載されるｍＡｂ／ｍＡｂ２の架橋を決定した。実施例４．１．に記載されるのと同じ方法で、抗ＦＩＴＣ抗体４４２０の可変領域（配列番号１６７及び１５６）、抗ＰＤ１抗体５Ｃ４（米国特許第８，００８，４４９  Ｂ２号）又は抗ＯＸ４０抗体１１Ｄ４（欧州特許第２  ２４２  ７７１Ｂ１号）を用いて、ＬＡＬＡ突然変異を有するｍＡｂ２を調製した。
【０４８１】
【表２３】
2021524275.tif 000026
【０４８２】
上記の実施例５．１．１に記載されるように、Ｔ細胞を単離し、活性化し、上述される陽性対照抗体及びｍＡｂ２並びに後述される及び架橋剤を用いた以外は、実施例８．１と本質的に同じプロトコルにおいて使用した。ｈＩＬ−２産生を、上述されるように決定した。
【０４８３】
架橋剤（抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６又はＦＩＴＣｄｅｘ（Sigma）；表２２を参照）を、必要に応じて試験ｍＡｂ／ｍＡｂ２とともに１：１のモル比でウェルに加えた。
【０４８４】
表２３は、架橋剤による架橋の存在下又は非存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察された、ＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を示す。図１２は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出のプロットを示す。
【０４８５】
【表２４】
2021524275.tif 000027
【０４８６】
図１２は、ＯＸ４０が標的とされ、抗ＯＸ４０抗体が架橋される場合、Ｔ細胞の活性化の増加があることを示す。Ｔ細胞活性化は、予想どおり、架橋された抗ＦＩＴＣ抗体Ｇ１／４４２０又は架橋された抗ＰＤ１抗体Ｇ１ＡＡ／５Ｃ４で観察されなかった。抗ヒトＣＨ２抗体によって架橋される場合のＯＸ４０標的化ｍＡｂ  Ｇ１／１１Ｄ４は、前に示されるように、Ｔ細胞活性化を誘発した。モックｍＡｂ２（４４２０  ＬＡＬＡ）フォーマットにおけるＯＸ４０標的化Ｆｃａｂ、ＦＳ２０−２２−４９ＡＡ／４４２０は、前に示されるように、架橋の非存在下でアゴニスト活性を有しており、この活性は、ｍＡｂ２のＦａｂアームに結合する架橋剤ＦＩＴＣ−デキストランの添加により促進された。ＯＸ４０標的化Ｆｃａｂが、抗ＰＤ１  Ｆａｂ（５Ｃ４）と対合されたとき、Ｆｃａｂのアゴニスト活性が増加され、これは、ｍＡｂ２が、Ｔ細胞表面において共発現される受容体ＰＤ１への結合によって架橋されていたことを示している。
【０４８７】
抗ＯＸ４０／抗ＰＤ１  ｍＡｂ２抗体で観察されたＴ細胞活性化は、Ｔ細胞表面においてヒトＯＸ４０と共発現される受容体に特異的なＦａｂ結合部位が架橋剤として使用され得ることを実証する。
【０４８８】
８．３  抗ヒトＯＸ４０  Ｆｃａｂ及び抗ＬＡＧ３  Ｆａｂを含むｍＡｂ２を用いたヒトＴ細胞活性化アッセイ
このアッセイにおいて、ヒトＯＸ４０及びＬＡＧ−３の共発現を利用して、以下の表２４に記載されるｍＡｂ／ｍＡｂ２の架橋を決定した。実施例４．１に記載されるように、ＬＡＬＡ突然変異を有するｍＡｂ２を調製した。
【０４８９】
【表２５】
2021524275.tif 000028
【０４９０】
上記の実施例５．１．１に記載されるように、Ｔ細胞を単離し、活性化し、上述される陽性対照抗体及びｍＡｂ２並びに後述される及び架橋剤を用いた以外は、実施例８．１と本質的に同じプロトコルにおいて使用した。ｈＩＬ−２産生を、上述されるように決定した。
【０４９１】
架橋剤（抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６又はＦＩＴＣ−デキストラン（Sigma）；表２４を参照）を、必要に応じて試験ｍＡｂ／ｍＡｂ２とともに１：１のモル比でウェルに加えた。
【０４９２】
【表２６】
2021524275.tif 000029
【０４９３】
図１３は、ＯＸ４０が標的とされ、抗ＯＸ４０抗体が架橋される場合、Ｔ細胞の活性化の増加があることを示す。Ｔ細胞活性化は、予想どおり、架橋された抗ＦＩＴＣ抗体Ｇ１／４４２０又は架橋された抗ＬＡＧ３抗体Ｇ１／２５Ｆ７で観察されなかった。抗ヒトＣＨ２抗体によって架橋される場合のＯＸ４０標的化ｍＡｂ  Ｇ１／１１Ｄ４は、前に示されるように、Ｔ細胞活性化を誘発する。モックｍＡｂ２（４４２０  ＬＡＬＡ）フォーマットにおけるＯＸ４０標的化Ｆｃａｂ、ＦＳ２０−２２−４１ＡＡ／４４２０は、前に示されるように、架橋の非存在下でアゴニスト活性を有しており、この活性は、ｍＡｂ２のＦａｂアームに結合する架橋剤ＦＩＴＣ−デキストランの添加により促進される。ＯＸ４０標的化Ｆｃａｂが、抗ＬＡＧ３  Ｆａｂ（２５Ｆ７）と対合されたとき、Ｆｃａｂのアゴニスト活性が増加され、これは、ｍＡｂ２が、Ｔ細胞表面において共発現される受容体への結合によって架橋されていたことを示している。
【０４９４】
抗ＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２抗体で観察されたＴ細胞活性化は、Ｔ細胞表面においてヒトＯＸ４０と共発現される受容体に特異的なＦａｂ結合部位が架橋剤として使用され得ることを実証する。
【０４９５】
８．４  抗マウスＯＸ４０  Ｆｃａｂ及び抗ＬＡＧ３  Ｆａｂを含むｍＡｂ２を用いたマウスＴ細胞活性化アッセイ
このアッセイにおいて、マウスＯＸ４０及びＬＡＧ３受容体の共発現を利用して、表２６に記載される二重特異的抗体の架橋を決定した。実施例４．１に記載されるように、ＬＡＬＡ突然変異を有するｍＡｂ２を調製した。
【０４９６】
【表２７】
2021524275.tif 000030
【０４９７】
実施例５．２．１に記載されるように、マウスＴ細胞を単離し、活性化し、上述される陽性対照抗体及びｍＡｂ２並びに後述される及び架橋剤を用いた以外は、実施例８．３と本質的に同じプロトコルにおいて使用した。ｍＩＬ−２産生を、上述されるように決定した。
【０４９８】
架橋剤（抗ヒトＣＨ２  ｍＡｂクローンＭＫ１Ａ６又はＦＩＴＣ−デキストラン（Sigma）；表２６を参照）を、必要に応じて試験ｍＡｂ／ｍＡｂ２とともに１：１のモル比でウェルに加えた。
【０４９９】
表２７は、試験されるｍＡｂ２及びｍＡｂの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察された、ＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を示す。図１４は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ２放出の代表的なプロットを示す。
【０５００】
【表２８】
2021524275.tif 000031
【０５０１】
図１４は、ＯＸ４０が標的とされ、抗ＯＸ４０抗体が架橋される場合、Ｔ細胞の活性化の増加があることを示す。Ｔ細胞活性化は、予想どおり、架橋された抗ＦＩＴＣ抗体Ｇ１／４４２０又は架橋された抗ＬＡＧ３抗体Ｇ１／Ｃ９Ｂ７Ｗで観察されなかった。抗ヒトＣＨ２抗体によって架橋される場合のＯＸ４０標的化ｍＡｂ  Ｇ１／ＯＸ８６は、前に示されるように、Ｔ細胞活性化を誘発した。モックｍＡｂ２（４４２０  ＬＡＬＡ）フォーマットにおけるＯＸ４０標的化Ｆｃａｂ、ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／４４２０は、架橋の非存在下でアゴニスト活性を有しておらず、Ｆａｂアームに結合する架橋剤ＦＩＴＣ−デキストランの添加により架橋される場合、それは、強力なＴ細胞活性化を示した。ＯＸ４０標的化Ｆｃａｂが、抗ＬＡＧ３  Ｆａｂ（Ｃ９Ｂ７Ｗ）と対合されたとき、得られたｍＡｂ２は、さらなる架橋剤の非存在下でＴ細胞活性を示した。これは、ｍＡｂ２が、ＬＡＧ３への結合によって架橋されていたことを示す。
【０５０２】
抗ＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２抗体で観察されたＴ細胞活性化は、Ｔ細胞表面においてマウスＯＸ４０と共発現される受容体が架橋剤として使用され得ることを実証する。
【０５０３】
８．５  インビトロでのＯＸ４０アゴニズムが可能な抗ｍＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２が、インビボで腫瘍成長を抑制する
ＣＴ２６腫瘍から単離されたＴＩＬが、ＯＸ４０及びＬＡＧ３受容体を発現するＴ細胞を含むため、ＣＴ２６同系腫瘍モデルをこの実験において使用した。
【０５０４】
実施例８．４の抗ｍＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２抗体（ＦＳ２０ｍ−２３２−９１ＡＡ／Ｃ９Ｂ７Ｗ）を、ＣＴ２６同系マウス腫瘍成長モデルにおいてインビボ活性について試験した。腫瘍成長を阻害する抗ｍＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２の能力を、ＰＢＳ対照と比較した。
【０５０５】
ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにＣＴ２６細胞を注射し、健康及び腫瘍成長について監視し、ソートし、実施例５に記載されるように試験コホートへとランダム化した。この時点で腫瘍を有さなかったマウスを試験から外した。
【０５０６】
実施例５に記載されるように、ｍＡｂ２／ｍＡｂをプロファイリングし、不純物をチェックし、調製し、マウスに投与した。動物の健康を検査し、腫瘍測定を行い、腫瘍体積を、実施例５に記載されるように計算した。
【０５０７】
腫瘍量が限界に近いと見なされた２４日目に試験を停止し、全てのマウスを人道的に殺処分した。結果は、図１５に示される。最終腫瘍体積の統計的分析を、GraphPad Prismソフトウェアパッケージ内で両側スチューデントｔ検定を用いて行った。
【０５０８】
腫瘍成長を抑制する際、抗ｍＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２と、ＰＢＳ対照（正常な成長）との間の統計的有意差が実証された。
【０５０９】
意外なことに、抗ｍＯＸ４０／抗ＬＡＧ３  ｍＡｂ２で処理されたコホートは、ＰＢＳ対照と比較して、成長の有意な抑制を示した。この試験は、観察されたインビトロ結果と同様に、腫瘍浸潤Ｔ細胞において発現されるＯＸ４０と共発現されるＬＡＧ３を標的とするｍＡｂ２によるＯＸ４０の架橋が、Ｔ細胞活性化及びその結果としての腫瘍成長の制御をもたらすことを示す。
【０５１０】
配列表
ＷＴ  Ｆｃａｂ  ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＷＴ  Ｆｃａｂ  ＡＢループ−ＲＤＥＬＴＫＮＱ（配列番号１）
ＷＴ  Ｆｃａｂ  ＣＤループ−ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号２）
ＷＴ  Ｆｃａｂ  ＥＦループ−ＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶ（配列番号３）
【０５１１】
ＷＴ  Ｆｃａｂ  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）
ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループに下線が引かれている
【化３】
2021524275.tif 000032
【０５１２】
Ｆｃａｂ  ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号５）
【化４】
2021524275.tif 000033
【０５１３】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号６）
ＬＡＬＡ突然変異に下線が引かれている
【化５】
2021524275.tif 000034
【０５１４】
ＬＡＬＡ−ＰＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号７）
ＬＡＬＡ−ＰＡ突然変異に下線が引かれている
【化６】
2021524275.tif 000035
【０５１５】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＷＴ  Ｆｃａｂのアミノ酸配列（配列番号８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化７】
2021524275.tif 000036
【０５１６】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＷＴ  Ｆｃａｂのアミノ酸配列（配列番号９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化８】
2021524275.tif 000037
【０５１７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１のアミノ酸配列（配列番号１０）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化９】
2021524275.tif 000038
【０５１８】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１のアミノ酸配列（配列番号１１）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１０】
2021524275.tif 000039
【０５１９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１２７  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−１１−１２７  第１の配列−ＤＤＮＤ（配列番号１２）
ＦＳ２０−１１−１２７  第２の配列−ＩＰＩＧＰ（配列番号１３）
ＦＳ２０−１１−１２７  第３の配列−ＷＲＨＹＶＥＥＨＰ（配列番号１４）
【０５２０】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１２７  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１５）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化１１】
2021524275.tif 000040
【０５２１】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１２７  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１６）
【化１２】
2021524275.tif 000041
【０５２２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１２７のアミノ酸配列（配列番号１７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１３】
2021524275.tif 000042
【０５２３】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１２７の核酸配列（配列番号１８）
【化１４】
2021524275.tif 000043
【０５２４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１２７のアミノ酸配列（配列番号１９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１５】
2021524275.tif 000044
【０５２５】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１２７の核酸配列（配列番号２０）
【化１６】
2021524275.tif 000045
【０５２６】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−１１−１２７／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２１）
ＶＨドメイン（下線）
【化１７】
2021524275.tif 000046
【０５２７】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−１１−１２７／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２２）
ＶＨドメイン（下線）
【化１８】
2021524275.tif 000047
【０５２８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３１  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−１１−１３１  第１の配列−ＤＤＮＤ（配列番号１２）
ＦＳ２０−１１−１３１  第２の配列−ＩＰＩＧＰ（配列番号１３）
ＦＳ２０−１１−１３１  第３の配列−ＷＫＨＹＶＤＥＨＰ（配列番号２３）
【０５２９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３１  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化１９】
2021524275.tif 000048
【０５３０】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３１  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号２５）
【化２０】
2021524275.tif 000049
【０５３１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３１のアミノ酸配列（配列番号２６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化２１】
2021524275.tif 000050
【０５３２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３１の核酸配列（配列番号２７）
【化２２】
2021524275.tif 000051
【０５３３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３１のアミノ酸配列（配列番号２８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化２３】
2021524275.tif 000052
【０５３４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３１の核酸配列（配列番号２９）
【化２４】
2021524275.tif 000053
【０５３５】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−１１−１３１／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号３０）
ＶＨドメイン（下線）
【化２５】
2021524275.tif 000054
【０５３６】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−１１−１３１／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号３１）
ＶＨドメイン（下線）
【化２６】
2021524275.tif 000055
【０５３７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３４  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−１１−１３４  第１の配列−ＤＤＮＤ（配列番号１２）
ＦＳ２０−１１−１３４  第２の配列−ＩＰＩＧＰ（配列番号１３）
ＦＳ２０−１１−１３４  第３の配列−ＷＫＨＹＶＥＥＨＰ（配列番号３２）
【０５３８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３４  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３３）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化２７】
2021524275.tif 000056
【０５３９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３４  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号３４）
【化２８】
2021524275.tif 000057
【０５４０】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３４のアミノ酸配列（配列番号３５）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化２９】
2021524275.tif 000058
【０５４１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３４の核酸配列（配列番号３６）
【化３０】
2021524275.tif 000059
【０５４２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３４のアミノ酸配列（配列番号３７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化３１】
2021524275.tif 000060
【０５４３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−１１−１３４の核酸配列（配列番号３８）
【化３２】
2021524275.tif 000061
【０５４４】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−１１−１３４／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号３９）
ＶＨドメイン（下線）
【化３３】
2021524275.tif 000062
【０５４５】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−１１−１３４／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号４０）
ＶＨドメイン（下線）
【化３４】
2021524275.tif 000063
【０５４６】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２のアミノ酸配列（配列番号４１）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化３５】
2021524275.tif 000064
【０５４７】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２のアミノ酸配列（配列番号４２）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化３６】
2021524275.tif 000065
【０５４８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−３８  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−２２−３８  第１の配列−ＹＷＤＱＥ（配列番号４３）
ＦＳ２０−２２−３８  第２の配列−ＡＥＫＹＱ（配列番号４４）
ＦＳ２０−２２−３８  第３の配列−ＱＹＲＷＮＰＧＤＹ（配列番号４５）
【０５４９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−３８  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４６）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化３７】
2021524275.tif 000066
【０５５０】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−３８  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号４７）
【化３８】
2021524275.tif 000067
【０５５１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−３８のアミノ酸配列（配列番号４８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）及びＬＡＬＡ突然変異（太字及び斜体）
【化３９】
2021524275.tif 000068
【０５５２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−３８の核酸配列（配列番号４９）
【化４０】
2021524275.tif 000069
【０５５３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−３８のアミノ酸配列（配列番号５０）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化４１】
2021524275.tif 000070
【０５５４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−３８の核酸配列（配列番号５１）
【化４２】
2021524275.tif 000071
【０５５５】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−２２−３８／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５２）
ＶＨドメイン（下線）
【化４３】
2021524275.tif 000072
【０５５６】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−２２−３８／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５３）
ＶＨドメイン（下線）
【化４４】
2021524275.tif 000073
【０５５７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４１  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−２２−４１  第１の配列−ＹＷＤＱＥ（配列番号４３）
ＦＳ２０−２２−４１  第２の配列−ＤＥＱＦＡ（配列番号５４）
ＦＳ２０−２２−４１  第３の配列−ＱＹＲＷＮＰＧＤＹ（配列番号４５）
【０５５８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４１  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５５）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化４５】
2021524275.tif 000074
【０５５９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４１  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号５６）
【化４６】
2021524275.tif 000075
【０５６０】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４１のアミノ酸配列（配列番号５７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化４７】
2021524275.tif 000076
【０５６１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４１の核酸配列（配列番号５８）
【化４８】
2021524275.tif 000077
【０５６２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４１のアミノ酸配列（配列番号５９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化４９】
2021524275.tif 000078
【０５６３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４１の核酸配列（配列番号６０）
【化５０】
2021524275.tif 000079
【０５６４】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−２２−４１／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６１）
ＶＨドメイン（下線）
【化５１】
2021524275.tif 000080
【０５６５】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−２２−４１／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１７４）
ＶＨドメイン（下線）
【化５２】
2021524275.tif 000081
【０５６６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４７  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−２２−４７  第１の配列−ＹＷＤＱＥ（配列番号４３）
ＦＳ２０−２２−４７  第２の配列−ＤＥＱＦＡ（配列番号５４）
ＦＳ２０−２２−４７  第３の配列−ＱＹＲＷＳＰＧＤＹ（配列番号６２）
【０５６７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４７  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号６３）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化５３】
2021524275.tif 000082
【０５６８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４７  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号６４）
【化５４】
2021524275.tif 000083
【０５６９】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４７のアミノ酸配列（配列番号６５）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化５５】
2021524275.tif 000084
【０５７０】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４７の核酸配列（配列番号６６）
【化５６】
2021524275.tif 000085
【０５７１】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４７のアミノ酸配列（配列番号６７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化５７】
2021524275.tif 000086
【０５７２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４７の核酸配列（配列番号６８）
【化５８】
2021524275.tif 000087
【０５７３】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−２２−４７／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６９）
ＶＨドメイン（下線）
【化５９】
2021524275.tif 000088
【０５７４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−２２−４７／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７０）
ＶＨドメイン（下線）
【化６０】
2021524275.tif 000089
【０５７５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−２２−４９  第１の配列−ＹＷＤＱＥ（配列番号４３）
ＦＳ２０−２２−４９  第２の配列−ＤＥＱＦＡ（配列番号５４）
ＦＳ２０−２２−４９  第３の配列−ＱＹＲＷＮＰＡＤＹ（配列番号７１）
【０５７６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号７２）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化６１】
2021524275.tif 000090
【０５７７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号７３）
【化６２】
2021524275.tif 000091
【０５７８】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９のアミノ酸配列（配列番号７４）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化６３】
2021524275.tif 000092
【０５７９】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９の核酸配列（配列番号７５）
【化６４】
2021524275.tif 000093
【０５８０】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９のアミノ酸配列（配列番号７６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化６５】
2021524275.tif 000094
【０５８１】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−４９の核酸配列（配列番号７７）
【化６６】
2021524275.tif 000095
【０５８２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−２２−４９／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７８）
ＶＨドメイン（下線）
【化６７】
2021524275.tif 000096
【０５８３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−２２−４９／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７９）
ＶＨドメイン（下線）
【化６８】
2021524275.tif 000097
【０５８４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−８５  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−２２−８５  第１の配列−ＹＷＤＱＥ（配列番号４３）
ＦＳ２０−２２−８５  第２の配列−ＤＥＱＦＡ（配列番号５４）
ＦＳ２０−２２−８５  第３の配列−ＱＹＲＷＮＰＦＤＤ（配列番号８０）
【０５８５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−８５  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号８１）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化６９】
2021524275.tif 000098
【０５８６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−２２−８５  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号８２）
【化７０】
2021524275.tif 000099
【０５８７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−８５のアミノ酸配列（配列番号８３）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化７１】
2021524275.tif 000100
【０５８８】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−８５の核酸配列（配列番号８４）
【化７２】
2021524275.tif 000101
【０５８９】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−８５のアミノ酸配列（配列番号８５）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化７３】
2021524275.tif 000102
【０５９０】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−２２−８５の核酸配列（配列番号８６）
【化７４】
2021524275.tif 000103
【０５９１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−２２−８５／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８７）
ＶＨドメイン（下線）
【化７５】
2021524275.tif 000104
【０５９２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−２２−８５／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８８）
ＶＨドメイン（下線）
【化７６】
2021524275.tif 000105
【０５９３】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１のアミノ酸配列（配列番号８９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化７７】
2021524275.tif 000106
【０５９４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１のアミノ酸配列（配列番号９０）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化７８】
2021524275.tif 000107
【０５９５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−５８  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−３１−５８  第１の配列−ＹＹＳＧＥ（配列番号９１）
ＦＳ２０−３１−５８  第２の配列−ＱＰＥＮＤ（配列番号９２）
ＦＳ２０−３１−５８  第３の配列−ＰＹＷＲＷＧＳＰＲＴ（配列番号９３）
【０５９６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−５８  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号９４）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化７９】
2021524275.tif 000108
【０５９７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−５８  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号９５）
【化８０】
2021524275.tif 000109
【０５９８】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−５８のアミノ酸配列（配列番号９６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化８１】
2021524275.tif 000110
【０５９９】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−５８の核酸配列（配列番号９７）
【化８２】
2021524275.tif 000111
【０６００】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−５８のアミノ酸配列（配列番号９８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化８３】
2021524275.tif 000112
【０６０１】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−５８の核酸配列（配列番号９９）
【化８４】
2021524275.tif 000113
【０６０２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−３１−５８／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１００）
ＶＨドメイン（下線）
【化８５】
2021524275.tif 000114
【０６０３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−３１−５８／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０１）
ＶＨドメイン（下線）
【化８６】
2021524275.tif 000115
【０６０４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−６６  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−３１−６６  第１の配列−ＹＹＳＧＥ（配列番号９１）
ＦＳ２０−３１−６６  第２の配列−ＱＰＥＮＤ（配列番号９２）
ＦＳ２０−３１−６６  第３の配列−ＰＹＷＲＷＧＶＰＲＴ（配列番号１０２）
【０６０５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−６６  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０３）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化８７】
2021524275.tif 000116
【０６０６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−６６  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１０４）
【化８８】
2021524275.tif 000117
【０６０７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−６６のアミノ酸配列（配列番号１０５）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化８９】
2021524275.tif 000118
【０６０８】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−６６の核酸配列（配列番号１０６）
【化９０】
2021524275.tif 000119
【０６０９】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−６６のアミノ酸配列（配列番号１０７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化９１】
2021524275.tif 000120
【０６１０】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−６６の核酸配列（配列番号１０８）
【化９２】
2021524275.tif 000121
【０６１１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−３１−６６／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０９）
ＶＨドメイン（下線）
【化９３】
2021524275.tif 000122
【０６１２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−３１−６６／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１０）
ＶＨドメイン（下線）
【化９４】
2021524275.tif 000123
【０６１３】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−９４  Ｆｃａｂ  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−３１−９４  第１の配列−ＷＥＨＧＥ（配列番号１１１）
ＦＳ２０−３１−９４  第２の配列−ＩＲＥＨＤ（配列番号１１２）
ＦＳ２０−３１−９４  第３の配列−ＰＹＷＲＷＧＧＰＧＴ（配列番号１１３）
【０６１４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−９４  Ｆｃａｂ  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１４）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化９５】
2021524275.tif 000124
【０６１５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−９４  Ｆｃａｂ  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１１５）
【化９６】
2021524275.tif 000125
【０６１６】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−９４  Ｆｃａｂのアミノ酸配列（配列番号１１６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化９７】
2021524275.tif 000126
【０６１７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−９４  Ｆｃａｂの核酸配列（配列番号１１７）
【化９８】
2021524275.tif 000127
【０６１８】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−９４  Ｆｃａｂのアミノ酸配列（配列番号１１８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化９９】
2021524275.tif 000128
【０６１９】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−９４  Ｆｃａｂの核酸配列（配列番号１１９）
【化１００】
2021524275.tif 000129
【０６２０】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−３１−９４／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２０）
ＶＨドメイン（下線）
【化１０１】
2021524275.tif 000130
【０６２１】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−３１−９４／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２１）
ＶＨドメイン（下線）
【化１０２】
2021524275.tif 000131
【０６２２】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０２  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−３１−１０２  第１の配列−ＷＡＳＧＥ（配列番号１２２）
ＦＳ２０−３１−１０２  第２の配列−ＱＰＥＶＤ（配列番号１２３）
ＦＳ２０−３１−１０２  第３の配列−ＰＹＷＲＷＧＶＰＲＴ（配列番号１０２）
【０６２３】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０２  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２４）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化１０３】
2021524275.tif 000132
【０６２４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０２  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１２５）
【化１０４】
2021524275.tif 000133
【０６２５】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０２のアミノ酸配列（配列番号１２６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１０５】
2021524275.tif 000134
【０６２６】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０２の核酸配列（配列番号１２７）
【化１０６】
2021524275.tif 000135
【０６２７】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０２のアミノ酸配列（配列番号１２８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１０７】
2021524275.tif 000136
【０６２８】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０２の核酸配列（配列番号１２９）
【化１０８】
2021524275.tif 000137
【０６２９】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−３１−１０２／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１３０）
ＶＨドメイン（下線）
【化１０９】
2021524275.tif 000138
【０６３０】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−３１−１０２／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１３１）
ＶＨドメイン（下線）
【化１１０】
2021524275.tif 000139
【０６３１】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０８  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−３１−１０８  第１の配列−ＷＡＳＧＥ（配列番号１２２）
ＦＳ２０−３１−１０８  第２の配列−ＥＫＥＩＤ（配列番号１３２）
ＦＳ２０−３１−１０８  第３の配列−ＰＹＷＲＷＧＡＫＲＴ（配列番号１３３）
【０６３２】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０８  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１３４）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化１１１】
2021524275.tif 000140
【０６３３】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０８  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１３５）
【化１１２】
2021524275.tif 000141
【０６３４】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０８のアミノ酸配列（配列番号１３６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１１３】
2021524275.tif 000142
【０６３５】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０８の核酸配列（配列番号１３７）
【化１１４】
2021524275.tif 000143
【０６３６】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０８のアミノ酸配列（配列番号１３８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１１５】
2021524275.tif 000144
【０６３７】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１０８の核酸配列（配列番号１３９）
【化１１６】
2021524275.tif 000145
【０６３８】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−３１−１０８／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１４０）
ＶＨドメイン（下線）
【化１１７】
2021524275.tif 000146
【０６３９】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−３１−１０８／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１４１）
ＶＨドメイン（下線）
【化１１８】
2021524275.tif 000147
【０６４０】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１１５  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２０−３１−１１５  第１の配列−ＷＡＳＧＥ（配列番号１２２）
ＦＳ２０−３１−１１５  第２の配列−ＥＱＥＦＤ（配列番号１４２）
ＦＳ２０−３１−１１５  第３の配列−ＰＹＷＲＷＧＡＫＲＴ（配列番号１３３）
【０６４１】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１１５  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１４３）
第１、第２及び第３の配列に下線が引かれている
【化１１９】
2021524275.tif 000148
【０６４２】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１１５  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１４４）
【化１２０】
2021524275.tif 000149
【０６４３】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１１５のアミノ酸配列（配列番号１４５）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１２１】
2021524275.tif 000150
【０６４４】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１１５の核酸配列（配列番号１４６）
【化１２２】
2021524275.tif 000151
【０６４５】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１１５のアミノ酸配列（配列番号１４７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１２３】
2021524275.tif 000152
【０６４６】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２０−３１−１１５の核酸配列（配列番号１４８）
【化１２４】
2021524275.tif 000153
【０６４７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０−３１−１１５／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１４９）
ＶＨドメイン（下線）
【化１２５】
2021524275.tif 000154
【０６４８】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０−３１−１１５／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５０）
ＶＨドメイン（下線）
【化１２６】
2021524275.tif 000155
【０６４９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２０ｍ−２３２−９１  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１５１）
ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループに下線が引かれている
【化１２７】
2021524275.tif 000156
【０６５０】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０ｍ−２３２−９１／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５２）
ＶＨドメイン（下線）
【化１２８】
2021524275.tif 000157
【０６５１】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０ｍ−２３２−９１／４４２０モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５３）
ＶＨドメイン（下線）
【化１２９】
2021524275.tif 000158
【０６５２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２０ｍ−２３２−９１／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５４）
ＶＨドメイン（下線）
【化１３０】
2021524275.tif 000159
【０６５３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２０ｍ−２３２−９１／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５５）
ＶＨドメイン（下線）
【化１３１】
2021524275.tif 000160
【０６５４】
４４２０  ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１５６）
ＶＬドメイン（下線）
【化１３２】
2021524275.tif 000161
【０６５５】
ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１５７）
ＶＬドメイン（下線）
【化１３３】
2021524275.tif 000162
【０６５６】
ヒトＯＸ４０−ｍＦｃのアミノ酸配列（配列番号１５８）
ＩＬ−２リーダー配列（下線）、ＯＸ４０細胞外ドメイン（斜体）、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメイン（太字）
【化１３４】
2021524275.tif 000163
【０６５７】
マウスＯＸ４０−ｍＦｃのアミノ酸配列（配列番号１５９）
ＩＬ−２リーダー配列（下線）、ＯＸ４０細胞外ドメイン（斜体）、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメイン（太字）
【化１３５】
2021524275.tif 000164
【０６５８】
カニクイザルＯＸ４０−ｍＦｃのアミノ酸配列（配列番号１６０）
ＩＬ−２リーダー配列（下線）、ＯＸ４０細胞外ドメイン（斜体）、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメイン（太字）
【化１３６】
2021524275.tif 000165
【０６５９】
ヒトＯＸ４０細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１６１）
【化１３７】
2021524275.tif 000166
【０６６０】
カニクイザルＯＸ４０細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１６２）
【化１３８】
2021524275.tif 000167
【０６６１】
マウスＯＸ４０細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１６３）
【化１３９】
2021524275.tif 000168
【０６６２】
ＤＯ１１．１０−ｈＯＸ４０及びヒトＯＸ４０受容体のアミノ酸配列（配列番号１６４）
【化１４０】
2021524275.tif 000169
【０６６３】
ＤＯ１１．１０−ｍＯＸ４０及びマウスＯＸ４０受容体のアミノ酸配列（配列番号１６５）
【化１４１】
2021524275.tif 000170
【０６６４】
ＤＯ１１．１０−ｃＯＸ４０及びカニクイザルＯＸ４０受容体のアミノ酸配列（配列番号１６６）
【化１４２】
2021524275.tif 000171
【０６６５】
ＬＡＬＡ突然変異を含む抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  Ｇ１ＡＡ／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１６７）
ＣＤＲの位置に下線が引かれている。ＬＡＬＡ突然変異の位置が太字である。
【化１４３】
2021524275.tif 000172
【０６６６】
ＬＡＬＡ突然変異を有さない抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  Ｇ１／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１６８）
ＣＤＲの位置に下線が引かれている。
【化１４４】
2021524275.tif 000173
【０６６７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＧ１／ＨｅｌＤ１．３抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１６９）
【化１４５】
2021524275.tif 000174
【０６６８】
完全長ＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸（配列番号１７０）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
【０６６９】
切断型Ｆｃａｂヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号１７１）
ＴＣＰＰＣＰ
【０６７０】
ＦＳ２０−２２−４９−ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６のアミノ酸重鎖配列（配列番号１７２）
【化１４６】
2021524275.tif 000175
【０６７１】
ＦＳ２０−２２−４９−ＡＡ／ＦＳ３０−１０−１６のアミノ酸軽鎖配列（配列番号１７３）
【化１４７】
2021524275.tif 000176
【０６７２】
ＬＡＬＡ突然変異を含むＧ１／ＯＸ８６  ｍＡｂ（Ｇ１ＡＡ／ＯＸ８６）の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１７５）
【化１４８】
2021524275.tif 000177
【０６７３】
Ｇ１ＡＡ／ＯＸ８６  ｍＡｂの軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１７６）
【化１４９】
2021524275.tif 000178
【０６７４】
参照文献
本明細書において言及される全ての文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
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【図１Ａ】
2021524275.tif 000179
【図１Ｂ】
2021524275.tif 000180
【図１Ｃ】
2021524275.tif 000181
【図２】
2021524275.tif 000182
【図３】
2021524275.tif 000183
【図４−１】
2021524275.tif 000184
【図４−２】
2021524275.tif 000185
【図５】
2021524275.tif 000186
【図６】
2021524275.tif 000187
【図７】
2021524275.tif 000188
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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