(57)【要約】  本発明は、含タンパク質沈殿物からタンパク質、特に、血漿などのヒトまたは非ヒト起源由来の免疫グロブリンを高収率で抽出する方法およびシステムに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とするタンパク質を沈殿物から抽出するための方法であって、
ａ．第１の槽（１）で沈殿物と液体を混合して第１の希釈係数を有する懸濁液を形成する工程と；
ｂ．第１の保持液および目的とするタンパク質に富む第１の透過液を生成するのに適合されている動的フィルターエレメントを含む第１の濾過ユニット（５）へ懸濁液を送液する工程と；
ｃ．場合により第１の保持液（１３）を第１の槽へ流すことによって、液体を添加することにより第２の希釈係数まで第１の槽（１）の懸濁液を希釈する工程と；
ｄ．目的とするタンパク質に富む第１の透過液を第２の槽（７）で回収する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
ｅ．第２の槽（７）の第１の透過液を、クロスフローフィルターエレメントを含む第２の濾過ユニットで連続濃縮プロセスに供し、それによって目的とするタンパク質に富む第２の保持液、および目的とするタンパク質が枯渇した第２の透過液を生成する工程と；
ｆ．場合により第２の透過液を第１の槽（１）に流すことによって、第１の槽（１）の懸濁液を希釈し、それによって第２の希釈係数まで懸濁液を希釈する、工程と；
ｇ．目的とするタンパク質に富む第２の保持液を第２の槽（７）に戻す、および／または目的とするタンパク質に富む第２の保持液を収集する工程と、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的とするタンパク質を沈殿物から高収率で抽出するための工業規模の方法であって、
ａ．第１の槽で沈殿物と液体を混合して第１の希釈係数を有する懸濁液を形成する工程と；
ｂ．平均孔径が５ｎｍ〜５０００ｎｍの間のセラミック膜を有するフィルターディスクを含む回転式クロスフローフィルターエレメントを含む第１の濾過ユニットへ懸濁液を連続的に送液する工程であって、フィルターエレメントは、第１の保持液、および目的とするタンパク質に富む第１の透過液を生成するのに適合されている、工程と；
ｃ．部分的に第１の保持液を第１の槽へ流すことによって、液体を添加することにより第２の希釈係数まで第１の槽の懸濁液を希釈する工程と；
ｄ．目的とするタンパク質に富む第１の透過液を第２の槽で回収する工程と；
ｅ．第２の槽の第１の透過液を、クロスフローフィルターエレメントを含む第２の濾過ユニットで連続濃縮プロセスに供し、それによって目的とするタンパク質に富む第２の保持液、および目的とするタンパク質が枯渇した第２の透過液を生成する工程と；
ｆ．場合により第２の透過液を第１の槽に連続的に流すことによって、第１の槽の懸濁液を希釈し、それによって第２の希釈係数まで懸濁液を希釈する、工程と；
ｇ．目的とするタンパク質に富む第２の保持液を第２の槽に戻す、および／または目的とするタンパク質に富む第２の保持液を収集する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項４】
第１の透過液は濃縮プロセスへ連続的に送液される、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
濃縮プロセスは、第２の濾過ユニットで行われる限外濾過である、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
第１の透過液は第２の槽に収集され、第１の槽の懸濁液が完全に濾過されると、第２の槽からの第１の透過液は連続濃縮プロセスに供される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第１の槽の懸濁液の第２の希釈係数またはタンパク質濃度の所定の値のどちらかが達成されるまで、工程ｂ）〜ｃ）または工程ｂ）〜ｆ）のどちらかが繰り返される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第１の希釈係数は、少なくとも３（１：３；タンパク質を含む組成物の部分：全体）、好ましくは１〜１０の間、好ましくは３〜９の間、好ましくは３〜５の間、好ましくは約３、５、６、９または１０である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
所定の第２の希釈係数（全希釈液の重量に対する含タンパク質沈殿物の重量）は、６〜７０の間、１０〜７０の間、２０〜５０の間、好ましくは３０〜４０の間、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、または約７０（１：７０；沈殿物部分：全体）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質濃度の所定の値は、０．１ｇ／Ｌ未満、好ましくは約０．００１〜０．１ｇ／Ｌの間である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
沈殿物は、アルコール分画プロセスの、好ましくは血漿の、より好ましくはヒト血漿の中間生成物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
中間生成物は、Ｃｏｈｎ画分Ｉ（Ｆｒ  Ｉ）、Ｃｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩ（Ｆｒ  ＩＩ＋ＩＩＩ）、Ｃｏｈｎ画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（Ｆｒ  Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）、またはＫｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ａ（ＫＮ  Ａ）、またはＫＮ  Ａならびに１つもしくはそれ以上のＦｒ  Ｉ、Ｆｒ  ＩＩ＋ＩＩＩおよびＦｒ  Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの組合せからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
沈殿物は培養上清または発酵生成物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
目的とするタンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、好ましくはヒト血漿由来のような免疫グロブリンＧまたは組換え生成された免疫グロブリンＧである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
第１の濾過ユニットは圧力容器を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
動的フィルターエレメントは、動的クロスフローフィルターエレメント、好ましくは回転式クロスフローフィルターエレメントである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
回転式クロスフィルターエレメントの回転速度は、約６００ｒｐｍ〜約１２００ｒｐｍの間、好ましくは約８００ｒｐｍ〜約１２００ｒｐｍの間、好ましくは約８００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍまたは約１２００ｒｐｍである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第１の濾過ユニットは、セラミック膜を含む回転フィルターディスク、および場合により第１の濾過ユニットの内容物の乱流混合のためのバッフルを備え、好ましくはディスクの接線速度は約１〜７ｍ／秒の間である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
第１の濾過ユニットの温度は、好ましくは２℃〜２５℃の間、より好ましくは約２℃〜１０℃に制御される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
動的フィルターエレメントまたはクロスフローフィルターエレメントは、５ｎｍ〜５０００ｎｍの間、好ましくは５ｎｍ〜２０００ｎｍの間、５ｎｍ〜５００ｎｍの間、５ｎｍ〜２００ｎｍの間、より好ましくは７ｎｍ〜１００ｎｍの間、さらにより好ましくは７ｎｍ〜８０ｎｍの間の平均孔径を有する濾過膜を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
沈殿物は濾過助剤を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
濾過助剤は第１の濾過の前に除去される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第２の槽（７）は、第１の透過液（１４）および／または第２の保持液（１６）を受け取るために提供され、第１の透過液および第２の透過液の流速は、実質的に一定の生成物体積が第２の槽（７）で維持されるように制御される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
膜透過圧力は、０．１バール〜２．５バール、好ましくは０．２バール〜２．４バール、好ましくは０．４バール〜２．０バール、最も好ましくは０．４バール〜１．５バールである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
抽出プロセスは、第１の濾過ユニットの懸濁液の流量および／もしくは滞留時間、ならびに／または第１の保持液の流量、および／もしくは第１の透過液の流量を調節することによってさらに促進される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
懸濁液は、約３．０〜９．０の間、好ましくは約４．０〜７．０の間、約４．０〜６．０の間、約４．０〜５．０の間、約４．３〜４．９の間、約４．４〜４．８の間、より好ましくは約５．０のｐＨを有する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
沈殿物は、約０．５〜６．５％ｗ／ｖ、より好ましくは約１．０〜４．０％ｗ／ｖ、さらにより好ましくは約１．５〜３．０％ｗ／ｖ、最も好ましくは約１．８〜２．５％ｗ／ｖ、例えば約２．０％ｗ／ｖの総タンパク質濃度を有する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
液体は、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびクエン酸の１つまたはそれ以上を含む緩衝液を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
沈殿物は、懸濁液、ペレットまたは好ましくはペーストの形態で第１の槽に添加される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
方法の生成物は、最終生成物が対象への投与に適するように、クロマトグラフィー工程、ウイルス不活性化工程、濃縮および製剤化の１つまたはそれ以上を含むさらなる処理に供される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
目的とするタンパク質を沈殿物から抽出するためのクローズドシステム（１００）であって、
ａ．第１の希釈係数を有する懸濁液の形態で沈殿物を含有するのに適合されている第１の槽と；
ｂ．目的とするタンパク質に富む第１の透過液および目的とするタンパク質が枯渇した第１の保持液を生成するのに適合されている動的フィルターエレメントを含み、懸濁液を受け取るために第１の槽と接続している、第１の濾過ユニットであって、第１の保持液を第１の槽に戻すのに適合されている、第１の濾過ユニットと；
ｃ．目的とするタンパク質に富む第１の透過液を回収するために、第１の濾過ユニットと接続している第２の槽と；
ｄ．目的とするタンパク質に富む第２の保持液および目的とするタンパク質が枯渇した第２の透過液を生成するのに適合されている、第１の透過液を第２の槽で濃縮するための第２の濾過ユニットであって、第２の保持液を第２の槽におよび／または第２の透過液を第１の槽に戻すのに適合されている、第２の濾過ユニットと、
を含む、前記クローズドシステム。
【請求項３２】
動的フィルターエレメントが、１つまたはそれ以上のフィルターディスクを含む回転フィルターエレメントである、請求項３１に記載のクローズドシステム（１００）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、沈殿物からタンパク質、特に、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）などの免疫グロブリン（Ｉｇ）を含む組換えタンパク質および／または血漿由来タンパク質を抽出するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
特異的抗体などの精製タンパク質の需要がかなり増加している。そのような精製タンパク質は、治療および／または診断目的のために使用される。
【０００３】
ヒト血漿は、例えばヒトアルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリン（ＩｇＧ）、凝固因子濃縮製剤（凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＩＸ、プロトロンビン複合体等）および阻害剤（アンチトロンビン、Ｃ１阻害剤等）などの、広く確立され受け入れられている血漿タンパク質製品の生産に数十年にわたって工業的に利用されてきた。そのような血漿由来薬の開発の過程で、ある特定のタンパク質画分に富み、次いで血漿タンパク質製品の出発組成物として役立つ中間生成物をもたらす血漿分画方法が確立された。典型的なプロセスは、例えば非特許文献１に概説されており、そのようなプロセスの簡略図が示されている。これらの種類の分離技術は、同じ血漿ドナープールからのいくつかの治療的血漿タンパク質製品の生産を可能にする。これは、１つのドナープールから１つの血漿タンパク質製品のみを生産するよりも経済的に有利であり、それ故に血漿分画の工業規格として採用されている。
【０００４】
特に、血漿の低温エタノール分画は、第二次世界大戦中、主にアルブミンを精製するためにＥ．Ｊ  Ｃｏｈｎおよび彼のチームによって開発された（非特許文献２）。Ｃｏｈｎ分画法は、ｐＨを中性（ｐＨ７）から約４．８に低下させながらエタノール濃度を０％から４０％に段階的に上昇させ、アルブミンの沈殿物を生じさせることを伴う。Ｃｏｈｎ分画は、過去およそ７０年間にわたって進化してきたが、ほとんどの商業的血漿分画方法は、最初の方法またはその変形（例えばＫｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）に基づいており、ｐＨ、イオン強度、溶媒極性およびアルコール濃度の差を利用して血漿を一連の主な沈殿タンパク質画分（Ｃｏｈｎの画分Ｉ〜Ｖなど）に分離する。
【０００５】
Ｃｏｈｎ分画の変形は、多価ＩｇＧ回収率を改善する目的で開発されてきた。例えばＯｎｃｌｅｙおよび共同研究者は、Ｃｏｈｎによって記載されたものとは異なる組合せの低温エタノール、ｐＨ、温度およびタンパク質濃度によりＣｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩを出発材料として使用して、活性な免疫グロブリン血清画分を生成した（非特許文献３）。現在、Ｏｎｃｌｅｙ法は、多価ＩｇＧの生成に使用される古典的な方法となっている。それにもかかわらず、ガンマグロブリン（抗体リッチ部分）の約５％が画分Ｉと共沈殿し、血漿中に存在する全ガンマグロブリンの約１５％が、画分ＩＩ＋ＩＩＩ工程によって失われることが知られている（非特許文献２、表ＩＩＩ参照）。Ｋｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法は、いくつかの沈殿工程のエタノール含量を低減することによりＩｇＧ回収率を改善することを目指した（沈殿物Ｂ  ｖｓ  画分ＩＩＩ）。しかし、収量の増加は純度を犠牲にする（非特許文献４）。
【０００６】
当初、これらの分画方法から得られる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）調製物は、様々な感染症の予防および治療に成功裏に使用された。しかし、エタノール分画は比較的粗い方法であるため、ＩｇＧ生成物は筋肉内投与しかできないほど不純物および凝集体を含有した。そのとき以来、精製プロセスのさらなる改善は、静脈内（ＩＶＩｇと呼ばれる）および皮下（ＳＣＩｇと呼ばれる）投与に適したＩｇＧ調製物をもたらした。
【０００７】
２０１０年には世界中で約３，０００万リットルの血漿が処理され、アルブミン約５００トンおよびＩＶＩＧ１００トンを含む一連の治療用製品を提供したと推定されている。ＩＶＩＧ市場は、血漿分画市場全体の約４０〜５０％を占める（非特許文献５）。故に、ＩＶＩＧに対する需要は強いままであり（ＳＣＩＧに対する需要の高まりと共に）、血漿および関連する画分からの免疫グロブリン回収率を改善する必要性が残っている。好ましくは、これは、他の血漿由来治療用タンパク質の回収率が悪影響を受けないことを確実にする方法で達成されなければならない。
【０００８】
商業的観点から、最初の分画プロセスは、治療用タンパク質、特に血漿由来タンパク質の生産に関連する全生産時間およびコストにとって極めて重要である。その理由は、その後の精製工程が、これらの最初の画分内の目的とするタンパク質の収量および純度に依存することになるためである。より低い運転コストでタンパク質収量を改善するために、低温エタノール分画法のいくつかの変形形態が血漿由来タンパク質に関して開発されているが、より高いタンパク質収量は、典型的にはより低い純度を伴う。本発明は、より大きな収量を達成する、タンパク質含有沈殿物、特に免疫グロブリンＧを分画する方法を提供する。特定の実施形態において、不純物のレベルおよび／または他の治療用タンパク質の損失を最小限にしながら、目的とするタンパク質の回収率の改善が達成される。
【０００９】
血漿分画／バイオテクノロジー分野で広く使用されている分離手法の１つが膜濾過である。膜濾過は、サイズおよび／または電荷に基づき成分を分離するための圧力駆動分離プロセスである。２つの主な膜濾過方法、すなわち、ｉ）シングルパスまたはダイレクトフロー濾過；およびｉｉ）クロスフローまたは接線流濾過がある。
【００１０】
従来の接線流システムは、固定膜表面から離れ、供給液のバルクに戻る保持溶質の輸送を高めるために、供給流の流体流パターンを制御するように設計されている。このようにして供給流は、膜の平面に対して接線のベクトルで高速で再循環されて物質移動係数を高めて逆拡散を可能にし、膜表面を洗浄して目詰まりを防ぐことができる。そのような濾過プロセスでは、流体および濾過可能な溶質にフィルターを通して流れさせるために膜の長さに沿って差圧が適用される。溶液は、膜を繰り返し通過することができ、一方フィルターを通過する前記流体は、分離ユニットへ連続的に取り除かれる。しかし、主に濃度分極、目詰まり、大抵の膜の孔径が比較的広く分布していることといった現象のために、達成可能なタンパク質濾過の程度には限界がある。したがって、血漿タンパク質のような高分子混合物の大規模な分離に、限外濾過膜の高分子分画能力を有効利用することは、一般的に実用的でないということが知られている。
【００１１】
特許文献１は、従来の接線流濾過および精密濾過の方法を使用して、免疫グロブリンを含む分子を乳汁（典型的には８７％水および１３％固形物を含有する）などの複合混合物から分離するための方法および器具を開示している。該方法は、３つの濾過ユニット運転を使用する清澄化、濃縮／濾過および無菌濾過工程を含む。清澄化工程は生成物からより大きな微粒子を除去し、濃縮／濾過工程は、得られた生成物組成の純度を高め、体積を低下させるために最も小さな分子を除去する。清澄化および濃縮／濾過工程は、供給液をループで圧送して保持液または透過液のどちらかを濃縮することによって行われる。第１および第２の工程は、一緒に処理されるサイズおよびタイミングで行われ、第２の工程からの透過液は第１の工程に戻され、第１の工程の保持液と混合される。生成物の９５％が限外濾過の保持液に蓄積されたら、清澄化が止められ、限外濾過材料の濃縮／透析濾過が開始される。生成物は濃縮され、緩衝液が限外濾過供給液槽に添加されて低分子量タンパク質の大部分を洗い流す。
【００１２】
特許文献２は、１つまたはそれ以上の微細孔膜濾過工程を使用する、分泌免疫グロブリンＡ（Ｓ−ＩｇＡ）組成物をＳ−ＩｇＡ含有乳汁から生産するための方法を開示している。該方法は、いくつかの透析濾過サイクルを通じた脱脂、精密濾過および限外濾過の工程を含み、精密濾過された保持液が透析濾過液体と混ぜ合わされる。精密濾過された保持液と透析濾過液体との組合せは、次いでその後の精密濾過および濃縮工程に供される。使用される方法は連続透析濾過である。開示された方法は、本質的な特徴が、液体供給流に懸濁される粒子がそのサイズに基づいて分離されることである膜濾過法に基づく。
【００１３】
特許文献３は、それを通って１つの液体が別の液体の中に連続的に分散されて連続相を達成する、１つまたはそれ以上の膜を使用する、エマルジョンの生産のための連続システムを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＵＳ  ２００４／０１６７３２０
【特許文献２】ＵＳ  ２０１１／０１３０５４５  Ａ１
【特許文献３】ＥＰ１２６２２２５
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｓｃｈｕｌｔｚｅ  Ｈ．Ｅ．、Ｈｅｒｅｍａｎｓ  Ｊ．Ｆ．；第Ｉ巻：Ｎａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９６６、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ；２３６〜３１７頁）
【非特許文献２】Ｃｏｈｎ  ＥＪら  １９４６、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ６２：４５９〜４７５頁
【非特許文献３】Ｏｎｃｌｅｙ  ら、（１９４９）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ７１、５４１〜５５０頁
【非特許文献４】ＫｉｓｔｌｅｒおよびＮｉｔｓｃｈｍａｎｎ、（１９６２）Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  ７、４１４〜４２４頁
【非特許文献５】Ｐ．  Ｒｏｂｅｒｔ、Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｓｕｐｐｌｙ  ａｎｄ  ｄｅｍａｎｄ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ（２０１１）Ｊ．  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ、３、１１１〜１２０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
厳格な安全性基準を満たさなければならない、例えば血漿または血清から得られる含免疫グロブリン沈殿物（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）材料からの免疫グロブリンなどのタンパク質の工業規模生産のための、改善された方法およびシステムが必要である。現在使用されている下流側技術は比較的高価であり、その収量は最適ではない。さらに、固定膜を用いた従来の濾過システムは、再懸濁されたタンパク質沈殿物を含有する溶液の存在下で急速に目詰まりを起こす傾向があり、これらは、克服されなければならない問題の一部である。したがって、免疫グロブリンなどのタンパク質をタンパク質含有懸濁液から抽出および精製するための、より効率的、経済的および迅速な方法を開発する重要な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の発明者らは、本明細書に請求されている新たな方法および新たなシステム、特に第１のプロセスユニットを導入することによって、上で論じられた問題の有効な解決策を見出した。本発明による方法は、既存の問題に対して費用対効果の高い、高効率で信頼できる解決策を提供する。
【００１８】
本発明の第１の態様によれば、目的とするタンパク質を沈殿物から抽出するための方法であって、
ａ．第１の槽で沈殿物と液体を混合して第１の希釈係数を有する懸濁液を形成する工程と；
ｂ．第１の保持液および目的とするタンパク質に富む第１の透過液を生成するのに適合されている動的フィルターエレメントを含む第１の濾過ユニットへ懸濁液を送液する工程と；
ｃ．場合により第１の保持液を第１の槽へ流すことによって、液体を添加することにより第２の希釈係数まで第１の槽の懸濁液を希釈する工程と；
ｄ．目的とするタンパク質に富む第１の透過液を第２の槽で回収する工程と、
を含む、前記方法が提供される。
【００１９】
タンパク質沈殿は、タンパク質を濃縮し、様々な夾雑物からこれを精製するために生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）の下流処理で広く使用されている。沈殿の根底にあるメカニズムは、より具体的には、試薬を添加および／または条件（例えばｐＨまたは導電率のような）をモジュレートして溶質（すなわちタンパク質）の溶解度を低下させることにより溶媒の溶媒和能を変えることである。結果として生じる沈殿物は、目的とするタンパク質を含む不溶性の固体である。しばしばこれは、ペレットまたはペーストの形態である。時として沈殿物は、懸濁液として現れる場合がある。固体部分は、次いで例えば濾過および／または遠心分離によって収集される。あるいは、そのような懸濁液は、第１の槽に直接添加されて第１の希釈係数を形成する。別の選択肢は、懸濁液を第１の槽に添加し、次いで液体を第１の槽に添加して第１の希釈係数を形成することである。故に、特定の実施形態において目的とする含タンパク質沈殿物は、第１の槽に添加されるときに懸濁液の形態である。
【００２０】
この方法は、目的とするタンパク質を得るための工業規模に特に適している。本発明の第１の態様の１つの実施形態によれば、タンパク質を抽出する方法は工業規模のプロセスである。
【００２１】
さらなる実施形態において、目的とする含タンパク質沈殿物は、アルコール分画プロセスの、好ましくは血漿の、より好ましくはヒト血漿の中間生成物である。好ましい実施形態において沈殿物は、ヒト血漿出発材料から得られる。さらにより好ましくは、沈殿物は、ヒト血漿出発材料２５００Ｌ〜６０００Ｌから得られる。
【００２２】
本発明の第１の態様の別の実施形態によれば、沈殿物は、血漿画分（中間体）である。特定の実施形態において画分は、Ｃｏｈｎ画分である。好ましい実施形態において血漿画分は、Ｃｏｈｎ画分Ｉ（Ｆｒ  Ｉ）、Ｃｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩ（Ｆｒ  ＩＩ＋ＩＩＩ）、Ｃｏｈｎ画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（Ｆｒ  Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）、Ｃｏｈｎ画分ＩＩ（Ｆｒ  ＩＩ）、Ｃｏｈｎ画分ＩＩＩ（Ｆｒ  ＩＩＩ）、Ｃｏｈｎ画分ＩＶ（Ｆｒ  ＩＶ）、Ｃｏｈｎ画分Ｖ（Ｆｒ  Ｖ）、Ｋｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ａ（ＫＮ  Ａ）、Ｋｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ｂ（ＫＮ  Ｂ）、Ｋｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ｃ（ＫＮ  Ｃ）からなる群から選択される。特に好ましい実施形態において血漿画分は、Ｃｏｈｎ画分Ｉ（Ｆｒ  Ｉ）、Ｃｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩ（Ｆｒ  ＩＩ＋ＩＩＩ）、Ｃｏｈｎ画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（Ｆｒ  Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）、またはＫｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ａ（ＫＮ  Ａ）からなる群から選択される。血漿画分は、異なる画分の組合せであってもよい。例えば、血漿画分は、ＫＮ  Ａならびに１つまたはそれ以上のＦｒ  Ｉ、Ｆｒ  ＩＩ＋ＩＩＩおよびＦｒ  Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの組合せであってもよい。別の実施形態において沈殿物は、オクタン酸沈殿物である。
【００２３】
別の実施形態において、含タンパク質沈殿物（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）は、培養上清または発酵出発材料から得られる。いくつかの実施形態において出発材料は、目的とするタンパク質を含む乳汁である。他の実施形態において出発材料は、乳汁ではない。
【００２４】
さらなる実施形態によれば、目的とするタンパク質は、免疫グロブリン、好ましくは、ヒト血漿由来の免疫グロブリンＧのようなヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）または組換え生成された免疫グロブリンＧである。
【００２５】
本発明の別の実施形態によれば、懸濁液は、含タンパク質沈殿物を緩衝液または水などの液体と混合し、それによって第１の希釈係数を有する出発組成物を得ることにより生成される。含タンパク質沈殿物がほぼ固体（例えば、極めて濃いペースト、ペレット等）である場合、含タンパク質沈殿物に液体を添加することにより、懸濁液を出発組成物として形成できるようになる。
【００２６】
工程ａ）の第１の希釈係数を有する懸濁液は、時として本明細書では固体と呼ばれる溶質様粒子が溶液中に存在する混合物である。粒子のサイズは異なってもよく、溶液が混合されなければ最終的に沈降することになるより大きな粒子、または沈降しない（すなわち、コロイドの形態の）より小さなサイズの粒子を含む。
【００２７】
第１の希釈係数は、時として固体重量パーセント（％ｗ／ｖ）と呼ばれる場合がある。これは、懸濁液の所与の体積中の乾燥固体の重量を、懸濁液のその体積の総重量で割り、１００を乗じたものとして定義される。特定の実施形態において、工程ａ）の懸濁液の重量あたりの固体パーセントは、少なくとも５％（すなわち、約１：２０の第１の希釈係数）、または少なくとも７．５％もしくは少なくとも１０％、または少なくとも１２．５％、または少なくとも１５％、または少なくとも１７．５％、または少なくとも２０％もしくは少なくとも２２．５％もしくは少なくとも２５％もしくは少なくとも２７．５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％である。いくつかの実施形態において、工程ａ）の懸濁液の重量あたりの固体パーセントは、１０％〜３０％である。いくつかの実施形態において、工程ａ）の懸濁液の重量あたりの固体パーセントは、１５％〜２５％である。好ましい実施形態において、工程ａ）の懸濁液の重量あたりの固体パーセントは、１７．５％〜２２．５％である。特定の実施形態において、工程ａ）の懸濁液の重量あたりの固体パーセントは、２０％である。
【００２８】
本発明の別の実施形態によれば、第１の希釈係数は、少なくとも３（１：３；沈殿物部分：全体）、好ましくは１〜１０の間、好ましくは３〜９の間、好ましくは３〜５の間、好ましくは約３、５、６、７、９または１０である。例えば、含タンパク質沈殿物がペレットまたはペースト、および特に極めて濃いペースト（極めて高い粘度を有する）である場合、ペーストまたはペレットを懸濁させるために液体が必要とされる。
【００２９】
例えば、第１の希釈係数が３（１：３；含タンパク質沈殿物１：全体）である場合、これは１：２の希釈比に等しい（１単位体積の溶質（希釈される材料）と２単位体積の希釈液で、３合計単位の全体積となる）。
【００３０】
別の実施形態において、第１の槽における第１の希釈係数（含タンパク質沈殿物：全体）は、少なくとも４０、または少なくとも３０、または少なくとも２０、または少なくとも１７．５、または少なくとも１５、または少なくとも１２．５、または少なくとも１０、または少なくとも９、または少なくとも８、または少なくとも７、または少なくとも６、または少なくとも５．５、または少なくとも５、または少なくとも４．５、または少なくとも４、または少なくとも３．５、または少なくとも３、または少なくとも２．５、または少なくとも２、または少なくとも１．５、または少なくとも１．２５である。好ましくは、第１の槽における第１の希釈係数（含タンパク質沈殿物：全体）は、少なくとも４である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、第１の槽における第１の希釈係数（含タンパク質沈殿物：全体）は、１：１〜１：２０の間、または１：２〜１：２０の間、または１：３〜１：２０の間、または１：４〜１：２０の間、または１：５〜１：２０の間、または１：６〜１：２０の間、または１：７〜１：２０の間、または１：８〜１：２０の間、または１：１０〜１：２０の間、または１：１〜１：１５の間、または１：２〜１：１５の間、または１：３〜１：１５の間、または１：４〜１：１５の間、または１：５〜１：１５の間、または１：６〜１：１５の間、または１：７〜１：１５の間、または１：８〜１：１５の間、または１：１０〜１：１５の間、または１：１〜１：１０の間、または１：２〜１：１０の間、または１：３〜１：１０の間、または１：４〜１：１０の間、または１：５〜１：１０の間、または１：６〜１：１０の間、または１：７〜１：１０の間、または１：８〜１：１０の間、または１：９〜１：１０の間、または１：３〜１：７の間、または１：３〜１：８の間、または１：３〜１：９の間、または１：４〜１：７の間、または１：４〜１：８の間、または１：４〜１：９の間、または１：５〜１：７、または１：５〜１：８の間、または１：５〜１：９の間、または１：３．５〜１：５の間、または１：４〜１：５の間、または１：１〜１：３、好ましくは１：９、１：７、１：５またはより好ましくは１：３もしくは１：１である。
【００３２】
適切には、再懸濁後の含タンパク質沈殿物中のタンパク質は、約５〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５０ｇ／Ｌまたはより好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌの濃度である。これには、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５および１００ｇ／Ｌ、およびこれらの量の間の任意の範囲が含まれる。他の実施形態において、タンパク質は、約５〜２０ｇ／Ｌ、例えば約８〜１２ｇ／Ｌの濃度であってもよい。
【００３３】
好ましい実施形態によれば、第１の槽の懸濁液は、約３．０〜９．０の間、好ましくは約４．０〜７．０の間、約４．０〜６．０の間、約４．０〜５．０の間、約４．３〜４．９の間、約４．４〜４．８の間、より好ましくは約５．０のｐＨを有する。一般に、ｐＨは、タンパク質沈殿物を溶液に添加する前；またはタンパク質沈殿物を溶液と混合した直後のどちらかの溶液で測定される。典型的には、溶液のｐＨは、前駆体成分の混合後すぐに測定される。あるいは、ｐＨは、混合物中の成分の予測される量および濃度に基づき計算によって決定することもできる。
【００３４】
本発明の第１の態様の一実施形態によれば、懸濁液は第１の濾過ユニットに連続的に送液される。好ましい実施形態において懸濁液は、懸濁液が少なくとも第２の希釈係数に希釈されるまで第１の濾過ユニットに連続的に送液される。本発明の別の実施形態において、連続分離プロセスは、１つもしくはそれ以上の濾過膜または異なるタイプの濾過膜が使用される連続濾過プロセスである。動的クロスフロー濾過などの連続濾過プロセスは、濾過部材が閉塞されるリスクを最小限にすることができる。
【００３５】
本発明の第１の態様の方法は、追加の液体を第１の槽の懸濁液に添加する工程を伴うことから、第２の希釈係数は、第１の希釈係数より大きい。
【００３６】
本発明の第１の態様の一実施形態によれば、第２の希釈係数（全再循環液の体積に対する含タンパク質沈殿物の体積）は、６〜７０の間、１０〜７０の間、約１０、約２０、約３０、約４０、好ましくは約２０〜５０である。他の実施形態において第２の希釈係数は、約６０、または約７０（１：７０；含タンパク質沈殿物部分：全体）である。特定の実施形態において第２の希釈係数は、少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、または少なくとも６０、または少なくとも７０である。本発明の発明者らは、そのような高い希釈係数が抽出効率を高め、故に収量の向上をもたらし得ることを見出した。
【００３７】
さらに別の実施形態において、懸濁液中のタンパク質濃度の所定の値は、０．１ｇ／Ｌ未満、好ましくは約０．００１〜０．１ｇ／Ｌの間；典型的には約０．０５〜０．１ｇ／Ｌの間である。そのような値は、非効率的な抽出および濾過プロセスを回避するために、そのような閾値に達すると分離プロセスが直ちに終了するように提供される。例えば、懸濁液または溶液中の総タンパク質濃度が０．１ｇ／Ｌ未満である場合、ＩｇＧの総量は、目的とする生成物の連続抽出および濾過を継続することがあまり経済的でなくなる約４０〜５０ｍｇ／Ｌ未満と推定される。
【００３８】
本発明の第１の態様の一実施形態によれば、第１の濾過ユニットの動的フィルターエレメントは、動的クロスフローフィルターエレメントである。好ましい実施形態において動的クロスフローフィルターエレメントは、回転式クロスフローフィルターエレメントである。より好ましくは、回転式クロスフローフィルターエレメントはフィルターディスクを含む。フィルターディスクは、通常、軸部材に取り付けられる。一実施形態において回転式クロスフローフィルターエレメントは、少なくとも１つのフィルターディスクと少なくとも１つの軸部材とを含む。
【００３９】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、フィルターディスク膜はセラミック膜である。より好ましくは、セラミック膜は５０ｎｍ以上〜１００ｎｍ以下の範囲の孔径を有する。そのようなフィルターディスクは、ＫｅｒａｆｏｌおよびＦｌｏｗｓｅｒｖｅによって供給される。
【００４０】
好ましい実施形態における第１の濾過ユニットは、圧力容器を含む。第１の槽からの懸濁液は、注入口を通って圧力容器に連続的に送液される。容器中の懸濁液の均一な分布は、分配マニホールドを使用して達成することができる。よって、特定の実施形態において圧力容器は、分配マニホールドを含む。いくつかの実施形態において第１の濾過ユニットは、回転式クロスフローフィルターエレメントを含む。好ましくは、フィルターエレメントは、少なくとも１つの中空の中心収集軸に沿って等間隔に配置された１つを超えるフィルターディスクを含有する。フィルターディスクは、水平または垂直に配置される。水平配向の場合、フィルターディスクは、垂直に配向された中空収集軸に沿って間隔をあけて配置される。収集軸およびディスクは回転可能である。圧力容器中の懸濁液は、次いで、ディスクの中空中心部分の中へ通過するように回転フィルターディスクの外膜を透過することができ、今度は中心収集軸へと注がれる。典型的には濾液（すなわち、目的とするタンパク質に富む第１の透過液）は、次いで、フランジ付きポートを通って第１の濾過ユニットの軸部分から除去される。一方、圧力ハウジングに残っている保持液は、排出口を通って容器から送液される。一般的に、保持液は、懸濁液を希釈するために第１の槽に再循環される。このようにして第１の濾過ユニットからの保持液は、第１の槽の懸濁液を第２の希釈係数まで希釈するのに利用することができる。
【００４１】
回転式濾過などの動的クロスフロー濾過は、最大濾過効率をもたらす。クロスフロー効果（フィルター表面の接線流洗浄（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｃｌｅａｎｉｎｇ））は、フィルターディスクを回転させることによって発生し、従来の（静的）クロスフロー濾過システムで使用されるような固定膜を通した大容量の圧送によっては発生しない。回転フィルターディスクの表面で発生する極限クロスフロー速度（ｅｘｔｒｅｍｅ  ｃｒｏｓｓ  ｆｌｏｗ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）は、従来のクロスフロー法と比べて極めて低量のエネルギーを消費する一方、フィルター表面の高効率洗浄を確実にする。
【００４２】
温度はタンパク質溶液の粘度に影響を与え、また膜を用いた濾過時の流束にも影響を与える。本発明の方法において使用される出発懸濁液は、０℃から当該タンパク質が変性される温度までの範囲内の温度を有するべきである。温度は、適切には約１０℃から約５０℃までの範囲内である。特定の実施形態において温度は、約１８℃から約３５℃までの範囲内である。１つの好ましい実施形態によれば、第１のプロセスユニットの温度は、好ましくは２〜２５℃の間、より好ましくは約２〜１０℃に制御される。そのような温度は、プロセス全体を通じて目的とするタンパク質の生体反応性を維持しながら、最適な抽出プロセスおよび分離プロセスを確実にする。
【００４３】
濾過は、本明細書で使用される膜の材料に応じて、膜が耐えられるレベルと同じまたはそれ以下の膜透過濾過圧力（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、例えば約０．２〜約３バールの圧力で行われる。膜透過圧力は、典型的には０．１〜２．５バール、好ましくは０．２〜２．４バール、より好ましくは０．４〜２．０バール、０．５〜１．８バール、０．６〜１．６バール、０．６〜１．５バール、０．７〜１．５バール、最も好ましくは０．８〜１．５バールである。別の実施形態によれば、最大２バール、好ましくは０．１〜２．０バールの間、または約１．５バール、１．０バールもしくは０．５バールの圧力が第１のプロセスユニットに提供される。
【００４４】
別の実施形態によれば、連続抽出プロセスは、第１のプロセスユニットへの懸濁液または溶液の流量および／もしくは滞留時間、ならびに／または第１の保持液／抽残液の流量、および／または第１の透過液／抽出液の流量を調節することによってさらに促進される。例えば、１つの実施形態において、圧力容器（第１のプロセスユニット）への懸濁液または溶液の線速度は約０．２７〜１．６６ｍ／ｓであってもよい。別の例において、第１の保持液の線速度は０．２５〜１．３３ｍ／ｓであってもよい。別の例において、第１の透過液／抽出液の線速度は０．０３〜０．３３ｍ／ｓであってもよい。断面積を乗じた線速度は体積流量を与える。さらに、回転フィルターディスクの速度の結果、乱流が第１のプロセスユニットで作られる場合があり、該速度（時として接線速度（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｓｐｅｅｄ）と呼ばれる）は約１〜７ｍ／ｓの間であり得る。本発明の一実施形態によれば、回転ディスクフィルターの速度は１〜１０ｍ／ｓの間である。本発明の好ましい実施形態において、回転ディスクフィルターの速度は５〜７ｍ／ｓの間である。より好ましくは、回転ディスクフィルターの速度は６０ヘルツ（８００ｒｐｍ）で７ｍ／ｓである。回転式クロスフィルターエレメントの回転速度は、約６００ｒｐｍ（５０Ｈｚ）〜約１６００ｒｐｍ（１００Ｈｚ）の間、好ましくは約８００ｒｐｍ（６０Ｈｚ）〜約１２００ｒｐｍ（８０Ｈｚ）の間、好ましくは約８００ｒｐｍ（６０Ｈｚ）、約１０００ｒｐｍ（７０Ｈｚ）または約１２００ｒｐｍ（８０Ｈｚ）である。本明細書で使用される場合、回転速度Ｈｚは、モーターの速度を指すことが意図される。これは、適当な検量線を使用して速度ｒｐｍと相関させることができる。
【００４５】
この方法により、出発沈殿物／材料からの目的とするタンパク質の回収率を最大化するための連続抽出および分離プロセスを実現できるようになる。該抽出プロセスのおかげで、ほぼ全ての目的とするタンパク質が含タンパク質沈殿物から抽出され、その後の段階で回収される。また、この方法により、液体または希釈液、例えば緩衝液または水をクローズドシステムで再循環できるようになり、よって、フットプリント（すなわち、大きな槽の体積）は低減することができる一方、液体の量はプロセス全体を通じて維持される。本明細書に開示された方法およびシステムは、含タンパク質沈殿物中に最初に存在する目的とするタンパク質の少なくとも９５％、または典型的には少なくとも９８％を回収することが推定される。よって、本発明の第１の態様の特定の実施形態において、方法は、沈殿物からの目的とするタンパク質の少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％または少なくとも９９％の回収率を提供する。好ましい実施形態において回収率は、沈殿物からの目的とするタンパク質の少なくとも９７％である。
【００４６】
第２の槽で第１の透過液は濃縮工程に供される。本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、濃縮プロセスは、第２のプロセスユニットで行われる限外濾過である。
【００４７】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、方法は、第２の槽の第１の透過液を第２の濾過ユニットで連続濃縮プロセスに供し、それによって目的とするタンパク質に富む第２の保持液、および目的とするタンパク質が枯渇した第２の透過液を生成する工程をさらに含む。
【００４８】
本発明の第１の態様の一実施形態によれば、第２の濾過ユニットは、動的クロスフローフィルターエレメントを含む。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、動的クロスフローフィルターエレメントまたは限外濾過フィルター装置は、目的とするタンパク質の分子量未満の分子量カットオフを有する膜を含む。これらの実施形態において膜カットオフは、目的とするタンパク質を第２の保持液に保持するように選択される。一般的な目安として、タンパク質が保持液に保持されることを確実にするために、目的とするタンパク質の分子量より少なくとも３倍低い公称膜カットオフ（ｎｏｍｉｎａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｕｔｏｆｆ）が選択される。一実施形態において動的クロスフローフィルターエレメントまたは静的限外濾過フィルターエレメントは、目的とするタンパク質の分子量より大きい分子量カットオフを有する膜を含む。そのような実施形態において公称膜カットオフは、目的とするタンパク質が膜を通過し、第２の透過液に収集されることを確実にするように選択される。
【００５０】
本発明の第１の態様の一実施形態によれば、方法は、目的とするタンパク質が枯渇した第２の透過液または第２の保持液を第１の槽に連続的に流すことによって第１の槽の懸濁液を希釈し、それによって第２の希釈係数まで懸濁液が希釈されるのに寄与する、工程をさらに含む。
【００５１】
本発明の第１の態様の一実施形態によれば、方法は、第１の濾過ユニットからの保持液、および第２の濾過ユニットからの第２の透過液を第１の槽へ連続的に流すことによって第１の槽の懸濁液を希釈し、それによって第２の希釈係数まで懸濁液を希釈する、工程をさらに含む。
【００５２】
さらなる好ましい実施形態によれば、第２の槽は、第１の透過液および／または第２の保持液を受け取るために提供され、第１の透過液および第２の透過液の流速は、実質的に一定の生成物体積が第２の槽で維持されるように制御される。特定の実施形態において、第１の透過液および／または第２の保持液に加えて新鮮な緩衝液が第１の槽に添加される。
【００５３】
本発明の第１の態様の一実施形態によれば、第１の透過液／抽出液は保持槽（第２の槽）に収集され、第１の槽の懸濁液が完全に濾過／抽出されると、保持槽からの第１の透過液／抽出液は連続濃縮プロセスに供される。そのような方法工程は、生産設備および配管中のデッドボリュームが、目的とするタンパク質の収量に著しく影響を与え得るより小規模の工業プロセスに特に適している。一例は、高力価免疫グロブリン（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）生成物である。
【００５４】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、目的とするタンパク質を沈殿物から高収率で抽出するための工業規模の方法であって、
ａ．第１の槽で沈殿物と液体を混合して第１の希釈係数を有する懸濁液を形成する工程と；
ｂ．平均孔径が５ｎｍ〜５０００ｎｍの間のセラミック膜を有するフィルターディスクを含む回転式クロスフローフィルターエレメントを含む第１の濾過ユニットへ懸濁液を送液する工程であって、フィルターエレメントは、第１の保持液、および目的とするタンパク質に富む第１の透過液を生成するのに適合されている、工程と；
ｃ．部分的に第１の保持液を第１の槽へ流すことによって、液体を添加することにより第２の希釈係数まで第１の槽の懸濁液を希釈する工程と；
ｄ．目的とするタンパク質に富む第１の透過液を第２の槽で回収する工程と；
ｅ．第２の槽の第１の透過液を、クロスフローフィルターエレメントを含む第２の濾過ユニットで連続濃縮プロセスに供し、それによって目的とするタンパク質に富む第２の保持液、および目的とするタンパク質が枯渇した第２の透過液を生成する工程と；
ｆ．場合により第２の透過液を第１の槽に連続的に流すことによって、第１の槽の懸濁液を希釈し、それによって第２の希釈係数まで懸濁液を希釈する、工程と；
ｇ．目的とするタンパク質に富む第２の保持液を第２の槽に戻す、および／または目的とするタンパク質に富む第２の保持液を収集する工程と、
を含む、前記方法が提供される。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態によれば、第１の保持液および第２の透過液は、懸濁液を第２の希釈係数まで希釈するために第１の槽へ連続的に流される。
【００５６】
本発明の一実施形態によれば、第１の濾過ユニットは、セラミックフィルターディスク膜の外面の濾過助剤および／または沈殿物材料の層高を制御するのに適合されている調整可能な掻き取り装置をさらに含む。
【００５７】
本発明の一実施形態によれば、第１の濾過ユニットは、第１の透過液を収集するのに適合されている１つを超える中空軸を含み、各軸は、セラミック膜を含む少なくとも１つのフィルターディスクに連結されている。
【００５８】
本発明の一実施形態によれば、第２の濾過ユニットは、動的クロスフローフィルターエレメントを含む。他の実施形態において第２の濾過ユニットは、静的クロスフローフィルターエレメントを含む。好ましい実施形態において静的クロスフローフィルターエレメントは、目的とするタンパク質を第２の保持液に保持する膜を含む限外濾過装置である。
【００５９】
本発明の一実施形態によれば、第１の槽の懸濁液もしくは溶液の第２の希釈係数またはタンパク質濃度の所定の値のどちらかが達成されるまで、工程ｂ）〜ｃ）または工程ｂ）〜ｆ）のどちらかが繰り返される。槽１のタンパク質濃度の所定の値を使用して決定することもできるそのような所定の第２の希釈係数（時として最終希釈係数と呼ばれる）は、抽出プロセスを継続することが過度に非経済的となる前に最適収量が回収されることを確実にする。タンパク質濃度は、２８０ｎｍなどのＵＶ吸光度を含む当技術分野で公知の様々な方法によって槽１でモニタリングされる。
【００６０】
場合により、濾過助剤がプロセスの適当な段階で使用される。濾過助剤は、例えば、沈殿物の調製に関わる１つまたはそれ以上の工程で使用される。したがって、１つの実施形態において、沈殿物は濾過助剤を含む。１つの実施形態において、沈殿物は濾過助剤を含まない。この実施形態において、濾過助剤は、プロセスにおいて（任意の先行する工程を含む）全く使用されなかったか、または存在する場合、沈殿物を含む懸濁液を第１の濾過ユニットへ送液する前、すなわち工程ｂ）の前に除去される。好ましくは、濾過助剤は工程ｂ）の前に除去される。
【００６１】
本発明の第１の態様による方法は、固体を含有する他のタンパク質から目的とするタンパク質を抽出するのに適している。例には、目的とするタンパク質を含む凍結乾燥物および結晶化固体形態が挙げられる。
【００６２】
上記に記載された方法の生成物は、次いで、最終生成物が対象、好ましくはヒト対象への投与に適するように、クロマトグラフィー工程、ウイルス不活性化工程、濃縮および製剤化の１つまたはそれ以上を含むさらなる処理に供される。
【００６３】
本発明の第２の態様によれば、目的とするタンパク質を沈殿物から抽出するためのクローズドシステムであって、
ａ．第１の希釈係数を有する懸濁液の形態で沈殿物を含有するのに適合されている第１の槽と；
ｂ．目的とするタンパク質に富む第１の透過液および目的とするタンパク質が枯渇した第１の保持液を生成するのに適合されている動的フィルターエレメントを含み、懸濁液を受け取るために第１の槽と接続している、第１の濾過ユニットであって、第１の保持液を第１の槽に戻すのに適合されている、第１の濾過ユニットと；
ｃ．目的とするタンパク質に富む第１の透過液を回収するために、第１の濾過ユニットと接続している第２の槽と；
ｄ．目的とするタンパク質に富む第２の保持液および目的とするタンパク質が枯渇した第２の透過液を生成するのに適合されている、第１の透過液を第２の槽で濃縮するための第２の濾過ユニットであって、第２の保持液を第２の槽におよび／または第２の透過液を第１の槽に戻すのに適合されている、第２の濾過ユニットと、
を含む、前記クローズドシステムが提供される。
【００６４】
本発明のクローズドシステムは、目的とするタンパク質の分離に必要な水、緩衝液および化学薬品などの物品のコストを削減し、高収率回収を達成できるようにする一方で、他の一般的に使用されるシステムと比べて、システム全体のスペースまたはフットプリントも低減する。
【００６５】
本発明の第２の態様の一実施形態によれば、第１の濾過ユニットは、フィルターディスク膜の外面の濾過助剤および／または沈殿物材料の層高を制御するのに適合されているスクレーパー装置をさらに含む。この装置は、濾過流束速度の制御を助け、および／またはフィルター閉塞を防ぐこともできる。いくつかの実施形態において掻き取り装置は、フィルターディスク膜の表面までの距離に関して高さを調整できる。特定の実施形態において掻き取り装置は、フィルターディスク膜から少なくとも２０ｃｍ、または少なくとも１５ｃｍ、または少なくとも１０ｃｍ、または少なくとも９ｃｍ、または少なくとも８ｃｍ、または少なくとも７ｃｍ、または少なくとも６ｃｍ、または少なくとも５ｃｍ、または少なくとも４ｃｍ、または少なくとも３ｃｍ、または少なくとも２．５ｃｍ、または少なくとも２ｃｍ、または少なくとも１．５ｃｍ、または少なくとも１ｃｍ、または少なくとも０．５ｃｍ、または少なくとも０．２５ｃｍに配置される。
【００６６】
本発明の第２の態様の別の実施形態によれば、第２のプロセスユニットは限外濾過装置を含む。
【００６７】
さらなる実施形態によれば、第１の濾過プロセスユニットは、回転フィルターディスク（動的フィルターエレメント）、および場合により第１のプロセスユニットの内容物の乱流混合のためのバッフルを備え、好ましくはディスクの接線速度は約１〜７ｍ／秒の間である。乱流は、目的とするタンパク質の抽出が増加され、それによって高いタンパク質回収収率が達成されるようにバッフルによって生成される。
【００６８】
さらなる好ましい実施形態によれば、第１の濾過エレメントは、５ｎｍ〜５０００ｎｍの間、好ましくは５ｎｍ〜２０００ｎｍの間、５ｎｍ〜１０００ｎｍの間、５ｎｍ〜５００ｎｍの間、５ｎｍ〜２００ｎｍの間、７ｎｍ〜１０００ｎｍの間、より好ましくは７ｎｍ〜５００ｎｍの間、さらにより好ましくは７ｎｍ〜１００ｎｍの間、最も好ましくは７ｎｍ〜８０ｎｍの平均孔径を有する濾過膜を含む。当然ながら、平均孔径は、上記に与えられた範囲の他の組合せであってもよい。フィルター製造者は、実際の孔の幾何学的径よりむしろ粒子または微生物に関して特定の保持基準を満たすことを示す公称孔径または平均孔径レーティングのような用語を商業的フィルターに当てる場合が多い。
【００６９】
特定の実施形態において、回転式クロスフローフィルターエレメントは、フィルターディスクを含む。いくつかの実施形態においてフィルターディスクは、マイクロフィルターの平均孔径を有する膜を含む。他の実施形態においてフィルターディスクは、限外濾過膜の平均孔径を有する膜を含む。一実施形態においてフィルターディスク膜の平均孔径は、５ｎｍ以上〜２μｍ以下の範囲である。特定の実施形態においてフィルターディスク膜の平均孔径は、５０ｎｍ以上〜０．５μｍ以下の範囲である。いくつかの実施形態においてフィルターディスク膜は、５０ｎｍ以上〜１００ｎｍ以下の範囲、または６０ｎｍ以上〜９０ｎｍ以下の範囲、または６０ｎｍ以上〜８０ｎｍ以下の範囲の平均孔径を有する。いくつかの実施形態においてフィルターディスク膜は、６０ｎｍまたは８０ｎｍの平均孔径を有する。
【００７０】
好ましい実施形態において、回転式クロスフローフィルターエレメントは、セラミック膜を含むフィルターディスクを含む。
【００７１】
セラミックフィルターは、例えばＡｌ２Ｏ３、またはＺｒＯ３、ＴｉＯ２またはＭｇＡｌ２Ｏ４から成る。セラミックディスクフィルターは、濾液が収集される中空の内部チャネルへと濾液がセラミック膜を通して外側から輸送されるように典型的には設計される。
【００７２】
セラミックディスクフィルターは、３７４ｍｍ（表面積０．２ｍ２）、３１２ｍｍ（表面積０．１４ｍ２）および１５２ｍｍ（表面積３６０ｃｍ２）の外径を含む様々な径で入手可能である。典型的にはセラミックディスクフィルターは、約４．５〜６ｍｍの厚さを有する。
【００７３】
本発明の実施形態において、セラミックフィルターディスクは、マイクロフィルターの平均孔径を有する膜を有する。他の実施形態においてセラミックフィルターディスクは、限外濾過膜の平均孔径を有する膜を有する。特定の実施形態においてセラミック膜の平均孔径は、５ｎｍ以上〜２μｍ以下の範囲である。特定の実施形態においてセラミック膜は、約０．２μｍ〜２μｍの孔径を有する。特定の実施形態においてセラミック膜は、約５ｎｍ〜約１００ｎｍの平均孔径を有する。他の実施形態においてセラミック膜の平均孔径は、５０ｎｍ以上〜０．２μｍ以下の範囲である。いくつかの実施形態においてセラミックフィルター膜は、５０ｎｍ以上〜１００ｎｍ以下の範囲、または６０ｎｍ以上〜９０ｎｍ以下の範囲で平均孔径を有する。好ましい実施形態においてセラミックフィルター膜は、６０ｎｍ以上〜８０ｎｍ以下の範囲で平均孔径を有する。別の好ましい実施形態においてセラミック膜は、６０ｎｍの平均孔径を有する。別の好ましい実施形態においてセラミック膜ディスクは、８０ｎｍの平均孔径を有する。
【００７４】
さらなる好ましい実施形態によれば、第２の濾過エレメントは、５０ｋＤ未満、好ましくは３０ｋＤ未満、より好ましくは１０ｋＤ未満、または最も好ましくは５ｋＤ未満の平均分子量カットオフ値を有する膜を含む限外濾過装置を含む。
【００７５】
本発明の実施形態において、第１のプロセスユニットフィルター能力は、フィルター表面積１ｍ２あたりの出発沈殿物少なくとも２５ｋｇ、または少なくとも５０ｋｇ、または少なくとも７５ｋｇ、または少なくとも１００ｋｇ、または少なくとも２００ｋｇ、または少なくとも３００ｋｇ、または少なくとも３５０ｋｇ、または少なくとも４００ｋｇ、または少なくとも４５０ｋｇ、または少なくとも５００ｋｇ、または少なくとも５５０ｋｇ、または少なくとも６００ｋｇ、または少なくとも６５０ｋｇ、または少なくとも７００ｋｇ、または少なくとも７５０ｋｇ、または少なくとも１０００ｋｇである。
【００７６】
以下の図面は、必ずしも縮尺通りに描かれておらず、むしろ様々な実施形態の原理を例示することに概ね重点が置かれている。以下の説明において、以下の図面を参照しながら本発明の様々な実施形態が記載される：
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明のシステムのフローチャート概略図である。図１は、以下により詳細に記載される。
【図２】濾過助剤の存在下（四角）および非存在下（円）の、第１の濾過ユニットを通る経時的流量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本発明は、新規の第１のプロセスユニットを使用することによって、またはさらに第２のプロセスユニットを用いてタンパク質回収率および収量を最大化するためのシステムおよび方法に関する。タンパク質を含む固体沈殿物、すなわち中間体材料（例えば、出発材料から得られるペースト）を処理するために、抽出および分離方法の組合せが本発明で使用され、沈殿物は、液体または希釈液、例えば水または緩衝液に懸濁されて懸濁液を形成する。
【００７９】
典型的なタンパク質含有沈殿物は、エタノールなどの沈殿剤への曝露後、タンパク質の精製中に形成される。固体は、沈殿物またはペーストと呼ばれる場合が多い。沈殿物は、液体と混合されて、固体粒子が液体全体にわたって分布される懸濁液を形成する。特定の抽出条件下で、これらの粒子に含有されるタンパク質は、液相へ徐々に溶解される。
【００８０】
工業規模の製造プロセスにおける溶解比は、必要とされる大量の水または緩衝液のために問題となる。アルブミンおよび免疫グロブリンのようなタンパク質を製造するために使用される血漿分画プロセスに関して、この工程は何千リットルも必要とし得る。大きい溶解比を可能にするそのような大容量を入れることができる槽が利用可能であっても、溶液中に溶解されたタンパク質と沈殿物またはペースト中に残っているタンパク質の間の平衡（シャトリエの原理）のため、より高収量の所望の効果は実現し得ない。沈殿物に閉じ込められたそのようなタンパク質は、最終生成物までのさらなる処理のために回収することができない可能性がある。この現象は、一つには溶解度平衡に関係している。固相の化合物が溶液中に溶解された化合物と化学平衡にあるとき、公知の溶解度平衡が存在する。平衡は、溶解および析出の速度が互いに等しくなるように、一部の個々の分子が固相と液相の間を移動する動的平衡の一例である。
【００８１】
本発明は、溶解度平衡を連続的に移動させることによって沈殿物からのタンパク質回収率の問題を解決することを目指す。これは：１）密接な相接触を反復的方法で可能にする内蔵部品により抽出効率を高めること（中空回転ディスクフィルターエレメントを搭載することができる動的濾過システムを使用して）；２）溶解タンパク質をタンパク質含有沈殿物から連続的に除去すること（ル・シャトリエの原理を適用して−平衡状態の任意のシステムが、濃度（例えば体積）、温度、または圧力の変化にさらされるとき、適用された変化の影響を（部分的に）打ち消すようにシステムが再調整し、新たな平衡が確立される）によって達成される。これは、再懸濁部位で体積を連続的に増加させ、動的フィルターを通じて溶解タンパク質を連続的に除去することによって、沈殿物から液相への最大タンパク質移動を確実にするためにル・シャトリエの原理が利用できることを意味する。いくつかの例において体積の増加は、タンパク質の連続濃縮工程中に透過液をリサイクルし、それによって緩衝液の消費を低減することによって実現される。
【００８２】
本発明に関して大規模または工業規模とは、ヒト血漿などの出発材料少なくとも２００Ｌ、好ましくは少なくとも５００Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも２０００Ｌに基づく生産方法を表す。例えば、工業規模のタンパク質製造で使用される典型的な商業的血漿ドナープールサイズは、１バッチあたり血漿２５００Ｌ〜６０００Ｌにわたる。本発明の特定の実施形態において沈殿物は、血漿２５００Ｌ〜６０００Ｌから得られる。いくつかの商業的製造プロセスは、血漿最大７５００Ｌ、最大１００００Ｌ、および／または最大１５０００Ｌを含む、より大きな血漿ドナープールサイズでさえ使用することができる。
【００８３】
本発明の方法およびシステムは、大規模工業用途だけでなく、独立型システムとしておよび／またはより小規模生産用途（出発材料が２００Ｌ未満であり得る）のための方法にも使用することができる。
【００８４】
例えばｐＨ調整および／または冷却工程の組合せによる塩、アルコールおよび／またはポリエチレングリコールの添加によって、溶液からタンパク質を選択的に沈殿させるために多くの異なる方法が使用される。それ故に、本発明は、免疫グロブリンＧ含有タンパク質沈殿物などのほとんどのタンパク質沈殿物に対して、これらが初めにどう調製されるかにかかわらず、適用可能となることが予想される。本発明はまた、アルブミン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭなどの免疫グロブリン（Ｉｇ）（各タイプの免疫グロブリン単独またはその混合物のどちらか）を含む他のタイプのタンパク質の分離においても実施できることが留意されるべきである。組換えタンパク質もこの点で適していることが予見される。
【００８５】
この目的のために、方法がＩｇＧの生産に適用される場合、含タンパク質沈殿物は、任意のＩｇＧ含有材料（例えば、ペースト、沈殿物、または封入体の形態の）であってもよく、またはヒトもしくは動物起源の血漿もしくは血清、発酵ブロス、細胞培養物、タンパク質懸濁液、乳汁、もしくは他の元の供給源からであるかにかかわらず、例えば上記に説明された１つまたはそれ以上の方法によって、ＩｇＧがそこから沈殿させられる溶液などの出発材料から得られることが留意される。免疫グロブリン含有材料または溶液は、モノクローナルまたはポリクローナル免疫グロブリンを含有してもよい。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン含有出発材料は、ポリクローナル抗体を含む溶液である。他の実施形態において出発材料は、モノクローナル抗体またはその断片を含む。それ故に、用語「免疫グロブリン」は本明細書で使用される場合、天然または組換えのどちらかのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む抗体として同定することもできることは、当業者の知識の範囲内である。
【００８６】
例えば、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）は、ヒトまたは動物血液から単離され、または組換えＤＮＡ技術もしくはハイブリドーマ技術によるなどの他の手段によって生成される。好ましい実施形態において、免疫グロブリンは、血漿から、典型的には多くのドナーから得られた血漿プールから得られる。血漿から免疫グロブリンを得るために、血漿は通常、クロマトグラフィー、吸着または沈殿のような他の精製手法と組み合わされるアルコール分画に供される。しかし、他のプロセスも使用することができる。例えば、含タンパク質沈殿物は、方法６、Ｃｏｈｎら  Ｊ．  Ａｍ；Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、６８（３）、４５９〜４７５頁（１９４６）、方法  ９、Ｏｎｃｌｅｙ  ら  Ｊ．  Ａｍ；Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、７１、５４１〜５５０頁（１９４６）などのＣｏｈｎの方法によるＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、またはＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ沈殿物、方法１０、Ｃｏｈｎら  Ｊ．  Ａｍ；Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、７２、４６５〜４７４頁（１９５０）；ならびにＤｅｕｔｓｃｈら  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １６４、１０９〜１１８頁（１９４６）の方法、またはＮｉｔｓｃｈｍａｎｎおよびＫｉｓｔｌｅｒ  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  ７、４１４〜４２４頁（１９６２）；Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  ３７、８６６〜８７３頁（１９５４）の沈殿物Ａであってもよい。目的とするタンパク質を含む代替の沈殿物には、他の免疫グロブリンＧ含有Ｏｎｃｌｅｙ画分、Ｃｏｈｎ画分、米国特許第３，３０１，８４２号にＳｃｈｕｌｚｅらによって記載された血漿由来の硫酸アンモニウム沈殿物が含まれるが、これらに限定されない。目的とするタンパク質を含むさらなる代替の沈殿物には、例えば、ＥＰ８９３４５０に記載されるオクタン酸沈殿物が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
「正常血漿」、「高力価血漿」（高力価抗Ｄ、破傷風またはＢ型肝炎血漿などの）またはこれらと同等の任意の血漿が、本明細書に記載された低温エタノール分画プロセスにおいて出発材料として使用される。
【００８８】
用語「クリオ上清」（脱クリオ血漿（ｃｒｙｏ−ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）、乏クリオプレシピテート血漿（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｐｌａｓｍａ）等とも呼ばれる）は、クリオプレシピテートが除去されている血漿（全血採血または血漿交換のどちらかから得られた）を指す。寒冷沈降は、血漿タンパク質治療薬の大量生産に今日使用されているほとんどの血漿タンパク質分画方法における第１の工程である。方法は、一般的に、凍結血漿をプールし、制御された条件下で解凍し（例えば６℃以下で）、沈殿物を次いで濾過または遠心分離のどちらかによって収集することを伴う。「クリオ上清」として当業者に公知の上清画分は、一般的に使用のために保持される。得られた脱クリオ血漿は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンのレベルが低下している。ＦＶＩＩＩのレベルは大幅に低下するが、フィブリノーゲンのレベルは元のレベルの７０％であり得る。クリオ上清は、アルファ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡＰＯ）、フィブリノーゲン、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、凝固因子（ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ）を含むプロトロンビン複合体、アルブミン（ＡＬＢ）および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）などの免疫グロブリンを含む、一連の治療用タンパク質を製造するのに使用される一般的な供給原料を提供する。
【００８９】
８％エタノール−沈殿物（Ｃｏｈｎらの方法；Ｓｃｈｕｌｔｚｅら（上記参照）、２５１頁）、沈殿物ＩＩ＋ＩＩＩ（Ｏｎｃｌｅｙらの方法；Ｓｃｈｕｌｔｚｅら（上記参照）２５３頁）または沈殿物Ｂ（ＫｉｓｔｌｅｒおよびＮｉｔｓｃｈｍａｎｎの方法；Ｓｃｈｕｌｔｚｅら（上記Ｓｃｈｕｌｔｚｅ参照）、２５３頁）の上清は、工業規模の血漿分画と適合可能なＩｇＧの供給源の例である。ＩｇＧを高収率で得る精製プロセスのための出発材料は、あるいは、発酵および細胞培養物または他のタンパク質懸濁液のような異なる供給源からの任意の他の適切な材料であってもよい。
【００９０】
Ｃｏｈｎ分画法において、第１の分画工程は、主にフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンを含む画分Ｉをもたらす。この工程からの上清は、画分ＩＩ＋ＩＩＩ、ならびに次いで画分ＩＩＩおよびＩＩを沈殿させるためにさらに処理される。典型的には、画分ＩＩ＋ＩＩＩは、フィブリノーゲン、ＩｇＭ、およびＩｇＡなどの不純物と一緒に約６０％ＩｇＧを含有する。これらの不純物のほとんどは、次いで、廃棄画分とみなされ、通常は廃棄される画分ＩＩＩで除去される。上清は、次いで、９０％を超えるＩｇＧを含有し得る主なＩｇＧ含有画分、画分ＩＩを沈殿させるために処置される。上記の％値は、ＩｇＧの％純度を指す。純度は、ゲル電気泳動または免疫比濁法などの当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。Ｋｉｓｔｌｅｒ  ＆  Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法において、画分Ｉは、Ｃｏｈｎ法の画分Ｉと同等である。次の沈殿物／画分は、沈殿物Ａ（画分Ａ）と呼ばれる。この沈殿物は、Ｃｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩと同一ではないが、広義には同等である。沈殿物は、次いで再溶解され、Ｃｏｈｎ画分ＩＩＩと同等である沈殿物Ｂ（分画Ｂ）を沈殿させるために条件が調整される。この場合もやはり、これは廃棄画分とみなされ、通常は廃棄される。沈殿物Ｂ上清は、次いで、Ｃｏｈｎ画分ＩＩに相当する沈殿物ＩＩを生成するためにさらに処理される。
【００９１】
特定の含タンパク質沈殿物は、血漿タンパク質、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカインおよびポリクローナル免疫グロブリンタンパク質、血漿タンパク質（フィブリノーゲン、プロトロンビン、トロンビン、プロトロンビン複合体、ＦＸ、ＦＸａ、ＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａ、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩａ、ＦＸＩＩＩおよびＦＸＩＩＩａ、フォンヴィレブランド因子を含むヒトおよび動物血液凝固因子から選択される）、アルブミン、トランスフェリン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、ヘモグロビンおよびヘモペキシンを含む輸送タンパク質、β−アンチトロンビン、α−アンチトロンビン、α２−マクログロブリン、Ｃ１阻害剤、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、ヘパリンコファクターＩＩ、プロテインＣ阻害剤（ＰＡＩ−３）、プロテインＣおよびプロテインＳ、α１エステラーゼ阻害剤タンパク質、α１アンチトリプシンを含むプロテアーゼ阻害剤、潜在性アンチトロンビンを含む抗血管新生タンパク質、α１−酸性糖タンパク質、アンチキモトリプシン、インターα−トリプシン阻害剤、α２−ＨＳ糖タンパク質およびＣ反応性タンパク質を含む高グリコシル化タンパク質、ならびにヒスチジンリッチ糖タンパク質、マンナン結合レクチン、Ｃ４結合タンパク質、フィブロネクチン、ＧＣグロブリン、プラスミノーゲン、エリスロポエチンなどの血液因子、インターフェロン、腫瘍因子、ｔＰＡ、γＣＳＦを含む他のタンパク質を含み得る。
【００９２】
特定の実施形態において、含タンパク質沈殿物は、免疫グロブリンＧなどの免疫グロブリン、アルブミン、フィブリン、トロンビン、プロトロンビン複合体、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、アルファ１−アンチトリプシン、Ｃ１阻害剤、アポリポタンパク質Ａ１、アルファ酸性糖タンパク質、ハプトグロビン、ヘモペキシン、トランスフェリン、ならびに第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子などの凝固因子を含む血漿に由来する治療用タンパク質の製造において使用される。
【００９３】
試料中（例えば、上清またはその後に精製されたその調製物中）のタンパク質の濃度は、当業者に公知の任意の手段によって測定することができる。適切なアッセイの例には、高圧力液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および  免疫比濁法が含まれる。そのような手法は、試料の純度を評価するのに使用することができる。さらに、染色およびデンシトメトリーによるＳＤＳ−ＰＡＧＥのようなゲル電気泳動が、試料の純度を評価し、混入タンパク質の存在を検出するのに使用される。ジチオスレイトールなどの還元剤は、任意のジスルフィド結合ポリマーを切断するのにＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用される。
【００９４】
免疫グロブリンＧ含有出発材料は、好ましくは約０．５〜６．５％ｗ／ｖ、より好ましくは約１．０〜４．０％ｗ／ｖ、さらにより好ましくは約１．５〜３．０％ｗ／ｖ、最も好ましくは約１．８〜２．５％ｗ／ｖ、例えば約２．０％ｗ／ｖの総タンパク質濃度を有する。
【００９５】
１つの実施形態において、液体は、酢酸ナトリウム、リン酸塩、およびクエン酸の１つまたはそれ以上を含む緩衝液を含む。１つの実施形態においてリン酸塩は、リン酸二水素ナトリウムなどのリン酸ナトリウムである。好ましくは、導電率が５ｍＳ／ｃｍより下、好ましくは４ｍＳ／ｃｍより下、より好ましくは０．０１ｍＳ／ｃｍ〜４ｍＳ／ｃｍの間の緩衝液などの導電率が低い緩衝液が使用される。
【００９６】
本発明による方法は、含タンパク質沈殿物（例えばペースト）から目的とするタンパク質を高収率で回収できるようにする。出発材料中の免疫グロブリンＧの総量と比較した最終濾過溶液中の免疫グロブリンＧの総量として定義される濃縮段階後の回収収率（限外濾過生成物）は、典型的には少なくとも９５％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも９６％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも９７％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは最大９８％（ｗ／ｗ）である。
【００９７】
以下は、免疫グロブリンＧ含量の回収率の計算が、本発明によりどのように得られるかを示す例である。第１段階は、含タンパク質沈殿物（全溶解）中のＩｇＧ含量の決定を含み、それに続く第２段階は、本発明の連続抽出方法またはシステムを使用したＩｇＧ回収率の決定を含む。
【００９８】
第１段階として、含タンパク質沈殿物（各実験に対して約５０ｇ）を緩衝液（例えば、０．１２Ｍ〜０．２５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．６〜８．０）に溶解して最終希釈係数２０（１：２０；または最終希釈比１：１９重量）を得る。インペラーミキサーを使用した２時間の再懸濁期間の後、懸濁液を４５００Ｇで遠心分離する。これは、第１の上清および第１の沈殿物をもたらす。上清の体積は、標準的な方法によって決定することができ、上清のＩｇＧ含量は、例えば比濁法によって決定することができる。得られた沈殿物を再懸濁し、上記に記載されたのと同じ緩衝液を使用して再び処置して最終希釈係数２０を得る（得られた上清１部：新たな緩衝液１９部）。得られた上清の体積およびＩｇＧ含量を再び決定する。このプロセスを、例えば５回、または最後の上清中のＩｇＧ含量が１０ｍｇ／Ｌより下（定量限界は約３．６ｍｇ／Ｌ）となるように必要なだけ繰り返す。この手順は、含タンパク質沈殿物中のＩｇＧ含量が、緩衝液によって完全にまたは最適に溶解または抽出されることを確実にする。この実験を数回繰り返す（この場合、１２の個別の実験を繰り返した）。このプロセスを、供給源血漿の分画から生じた異なる出発沈殿物で繰り返し、同様の信頼できる結果を得た。以下の表１は、総タンパク質、および含タンパク質沈殿物から回収されたＩｇＧの含量を示す。
【００９９】
【表１】
2021524443.tif 000003
【０１００】
第２段階では、同じ含タンパク質沈殿物を、本発明による連続抽出および分離方法またはシステムを用いた実験に使用する。含タンパク質沈殿物（沈殿物Ａ）１ｋｇの総量を、緩衝液（例えば、１０ｍＭリン酸塩、１０ｍＭ酢酸塩および２ｍＭクエン酸）に３０分間溶解して、第１の希釈比５（１：６重量；または第１の希釈係数６（１：６）に等しい）を有する出発懸濁液を得る。懸濁液のｐＨは４．６である。連続抽出および分離プロセスのために、懸濁液を第１の槽から第１の濾過プロセスユニットへ移す。濾液（第１の透過液）を第２の槽に収集する。濾過した懸濁液の体積が第１の槽で一定のままであるように、１００〜２００ｍｌ収集濾液ごとに、新鮮な緩衝液（または、ＵＦ工程後の再循環緩衝液（すなわち第２の透過液））１００〜２００ｍｌを第１の槽に添加する。４時間後、濾過を終了する。これにより、懸濁液中の総タンパク質濃度は０．１ｇ／Ｌより下と予想され、および／またはＩｇＧ濃度は５０ｍｇ／Ｌより下である。以下の表２は、ＩｇＧの回収率を示す。
【０１０１】
【表２】
2021524443.tif 000004
【０１０２】
この例では、連続抽出濾過ユニットを使用した総タンパク質およびＩｇＧの収量の増加を示すために、実験をオフラインで行う。「オフライン」は、添加した緩衝液を第２の濾過ユニットから得ないことを意味する。第２の濾過ユニットにおける限外濾過は別に実行する。また、最終（第２の）希釈係数（１：３１＝７８．９ｇ／ｋｇ）の最後でのＩｇＧ量と比較して、第１の希釈係数（１：６＝６１．７ｇ／ｋｇ）でのＩｇＧ量は低いことも表２に示されている。これは、全てのＩｇＧが一度に緩衝液中に抽出または溶解されるわけではなく、むしろ一定期間または反復溶解手順にわたって抽出または溶解されるという事実によるものである。よって、ＩｇＧ収量は、本発明による連続抽出および濾過プロセスを通じて増加される。
【０１０３】
上記の表１および２によって示されているように、少なくとも９５％の回収率により本発明による免疫グロブリンＧの収量が達成される。回収率（本発明による連続抽出および濾過の）は、（連続濾液中のＩｇＧの総量：表１からの全溶解によるＩｇＧの平均量の）比に１００を乗じて計算される。
総ＩｇＧ量（最終希釈係数達成後）＝７８．９ｇ／ｋｇ
平均全ＩｇＧ抽出（表１）＝（７６．５＋８５．３）／２＝８０．９ｇ／ｋｇ
ＩｇＧの収率（回収率）＝７８．９／８０．９×１００％＝９７．５３％
よって、少なくとも９５％または約９８％の本発明によるＩｇＧ回収率が達成されることがこれにより示される。
【０１０４】
この初期のプロセス工程（さらに下流の処理工程の前の）における高い回収率が、最終バルク段階でより高収量を達成する前提条件となる。本発明は、含タンパク質沈殿物（例えばペースト）が高い希釈係数（例えば、４０〜７０；１：４０〜１：７０の間）で実際に懸濁される抽出プロセスを利用する。例として、含タンパク質沈殿物（例えばペースト）１ｋｇが液体（例えば緩衝液）３ｋｇに再懸濁され、結果として第１の希釈係数が４（１：４）の出発懸濁液になる。緩衝液の供給流６６ｋｇの再循環は、結果として最終希釈係数７０（１：７０）になる。本発明で使用される抽出プロセスは、より高量の免疫グロブリンＧを懸濁液／溶液中に放出できるようにし、故に平衡を移動させ（以下に論じられるように）、懸濁液からの免疫グロブリンＧのより効率的な分離を可能にする。
【０１０５】
好ましい実施形態において、粗免疫グロブリンＧ含有タンパク質沈殿物（すなわち、含タンパク質沈殿物）が緩衝液に懸濁されて出発懸濁液を得る。緩衝液はいくつかの実施形態において、酢酸塩またはリン酸塩、またはさらにクエン酸を含有してもよい。
【０１０６】
最も好ましい実施形態において、免疫グロブリンＧ富化懸濁液または溶液の抽出および濾過生成物は、ヒト免疫グロブリンを含み、少なくとも９５％または最大９８％免疫グロブリンＧ含量が出発沈殿物から回収され、または０．１ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ未満の免疫グロブリンＧタンパク質濃度が、第２の希釈係数に達成した後に最終懸濁液で検出される。免疫グロブリンＧサブクラスのおよその分布は、典型的にはヒト血漿における平均的なサブクラス分布に似るであろう。
【０１０７】
さらに、典型的には、沈殿物Ａ（含タンパク質沈殿物）１ｋｇは、総タンパク質１７０ｇ（範囲：１５０〜１９０ｇタンパク質／ｋｇ沈殿物）を含有する。総タンパク質は、約５０％〜６０％のＩｇＧで占められている（故に７５〜９５ｇ／ｋｇ沈殿物）。本発明の１つの方法によれば、ＩｇＧの約９８％の回収率が達成される場合、それはＩｇＧ７３．５〜９３．１ｇ／ｋｇの総量が含タンパク質沈殿物（沈殿物Ａ）から得られることを意味する。
【０１０８】
以下、例で詳細に例示されるように、改善された方法が、緩衝液のｐＨにかかわらず、ペースト（すなわち、含タンパク質沈殿物／材料）をより大量の緩衝液で処置する工程からなる、本方法において開示された免疫グロブリンＧを抽出するための改善された抽出プロセスにより、驚くべきことに免疫グロブリンＧの約９８％という高い回収率が得られる。より低い最終希釈係数（例えば、５〜および最大１４〜１５の間）を使用することが、現在当技術分野では一般的である。例えば、ＷＯ２０１６０１２８０３では溶媒に対する廃棄画分の重量は、一般的に約１：２〜約１：１０となるであろう。好ましくは、溶媒の重量は、廃棄画分の重量の約４倍、すなわち、廃棄画分対溶媒の重量比約１：４であり得る。よって、本発明は、含免疫グロブリン沈殿物をより大容量（２０、３０、４０またはそれ以上の高い最終希釈係数）へ曝露するための手段を提供することによって回収率の改善を可能にする。同様に寄与する追加の要因には、懸濁液への乱流の導入が含まれ、第１および／または第２のプロセスユニットならびに本発明によるクローズド濾過システムにおける最大２バールの圧力は、抽出効率を高め、出発沈殿物から抽出される免疫グロブリンＧの高い回収率をもたらした。さらに、予想外に高い回収収率とは別に、本発明は他の利点、特にスケーラビリティも提供し、これにより、より小さいフットプリント、およびより低い総容量を処理することに伴うより低いコストのために、本発明の方法を既存の施設で使用できるようになる；さらに、スケーラビリティにより、免疫グロブリンＧの品質および安定性に影響を及ぼし得るパラメータの操作性が依然として可能になる。最後に、動的濾過の使用により、高固形分懸濁液を効率的に濾過できるようになる。
【０１０９】
例えばタンパク質分離の化学において、ル・シャトリエの原理または「化学平衡の法則」は、化学平衡に与える条件の変化の影響を予測するのに使用される。平衡状態にある任意のシステムが、濃度、温度、体積、または圧力の変化にさらされるとき、次いで、システムは、適用された変化の影響を打ち消す（部分的に）ように自らを再調整し、新たな平衡が確立される。言い換えれば、平衡にあるシステムが乱されるときは常に、変化の影響が無効にされるようにシステムは自らを調整する。例えば、平衡状態では、どちらの側の懸濁液中の免疫グロブリンの濃度も一定である。平衡状態では、少量の免疫グロブリンが反応から取り出される場合、免疫グロブリン濃度の変化のために、これが、濃度のその変化を低減する側に平衡を移動させる。ル・シャトリエの原理によればシステムは、元の平衡状態まで、影響を受けた変化に部分的に反対しようとするであろう。今度は、生成物の反応速度、程度および収率が、システムに対する影響に対応して変化することになる。
【０１１０】
システムが平衡状態にあり、反応に関与する種の１つの濃度が上昇する場合、システムはその種の濃度を減少させるように再調整するであろう。故に、反応は、増加した濃度の一部を消費するような方法で進行するであろう。同様に、一部の物質の濃度が減少する場合、反応は、濃度の損失の埋め合わせをするように進行するであろう。
【０１１１】
言い換えれば、システムからの免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の一定の除去の下、および同時に、懸濁液の溶媒中の免疫グロブリンの濃度を希釈により低下させると、これは、懸濁液の１つの相からの免疫グロブリンの除去の増加、すなわち液相への沈殿物の増加につながる。この手順の繰り返しにより、懸濁液の沈殿物に含まれる本質的に全ての免疫グロブリンが含タンパク質沈殿物から抽出される。特に本発明は、少なくとも３０、好ましくは例えば４０（１：４０）またはそれ以上の高い最終希釈係数を開示し、含タンパク質沈殿物からの免疫グロブリンＧ回収率を最大化するために、例えば提案された緩衝液組成を使用してさらに促進され、またはより高いｐＨを使用してさらに促進される。従来技術と比べて、本発明の方法およびシステムにより、ほぼ全ての免疫グロブリンＧを含タンパク質沈殿物（例えば、ペーストまたは沈殿物）から回収できるようになる。
【０１１２】
限外濾過生成物は、最終生成物が例えば人体に投与されるように、クロマトグラフィー工程、ウイルス不活性化工程、濃縮および製剤化などのさらなる処理に後で供することができる。最終生成物は、免疫状態、特定の自己免疫疾患およびある特定の神経疾患の治療において使用することができる。これらの状態には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質症候群、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、川崎病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、重症筋無力症（ＭＧ）、皮膚水疱形成疾患（ｓｋｉｎ  ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症候群に関連するアルツハイマー病、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉変性症または血管性認知症が含まれる。さらに、最終ＩＶＩＧおよびＳＣＩＧ生成物は、細胞移植および臓器移植などの他の医療処置において使用することができる。
【０１１３】
この目的のために、本発明による第１のプロセスユニットは、その独自の設計のおかげで連続抽出および分離プロセス、特に濾過プロセスを提供することが繰り返される。第１のプロセスユニットは、例えばセラミックベースの膜ディスクを含む動的回転濾過エレメントが備えられている。回転濾過は、極限クロスフロー速度を可能にし（フィルター表面のその高効率洗浄による）、従来のクロスフロー法と比べてエネルギー消費量が極めて低い。クロスフロー効果（フィルター表面の接線流洗浄）は、フィルターディスクの回転によって発生し、大容量の圧送によっては発生しない。セラミックフィルターディスクは、化学的ストレスおよび熱ストレスに対するより良好な耐性、高い濾過流束、および極めて長い耐用年数を有し、逆流洗浄または熱蒸気滅菌によって再生することができる。
【０１１４】
回転セラミックフィルターディスクは、典型的には加圧ハウジングで組み立てられる。ディスクの設計は、内部に排液チャネルを示す。濾液は、ディスクの外側から内側に輸送される。ディスクの回転は、膜表面で剪断力を発生させる。この手法により、濾過ケーキの増加が回避され、高い濾過流束をもたらす。回転濾過の主なパラメータのいくつかは、セラミックフィルターディスクを回転させるための回転速度および固形分（濾液の除去による液体の濃縮）である。
【０１１５】
用語「含タンパク質沈殿物」は、目的とするタンパク質を含有する任意の材料を指すことが意図される。目的とするタンパク質としての免疫グロブリンの文脈において、この用語は、血漿、血清、血漿もしくは血清から生成される沈殿物、発酵ブロス、封入体、細胞培養上清、またはそのような材料から生成される沈殿物を指し得る。典型的には、本発明の文脈において、該用語は、ＣｏｈｎもしくはＯｎｃｌｅｙエタノール沈殿物、またはＫｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物などの血漿由来の沈殿物を指す。
【０１１６】
用語「出発組成物」は、典型的には（第１の）希釈係数に従って水または緩衝液を用いた希釈により、含タンパク質沈殿物から生成される懸濁液または溶液を指す。いくつかの例において、含タンパク質沈殿物の希釈が必要とされない場合、含タンパク質沈殿物が出発懸濁液であってもよい。
【０１１７】
「高収率」とは、免疫グロブリンＧ（ならびに他のタンパク質および免疫グロブリン）などの目的とするタンパク質の収率が、含タンパク質沈殿物中の目的とするタンパク質の量の少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは９８％超であることを意味する。
【０１１８】
試料中（例えば、沈殿物中またはその医薬品グレードの精製調製物中）の免疫グロブリンの濃度は、当業者に公知の任意の手段によって測定することができる。免疫グロブリンを測定するのに使用される方法は、試料の性質に依存し得ることが理解されよう。例えば、試料が免疫グロブリン含有沈殿物である場合、測定の前に沈殿物（またはその試料）を適切な緩衝液に溶解させることが必要となり得ることが理解されよう。目的とするタンパク質を測定するための適切なアッセイの例には、高圧力液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および定量的免疫比濁法が含まれる。
【０１１９】
パーセンテージ、ｐＨ、量もしくは期間、または他の基準に対する所与の数値に関連した「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」により、指定された値の１０％内の数値を含むことが意味される。
【０１２０】
本明細書全体にわたって、文脈が特に要求しない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、記載された要素もしくは整数または要素もしくは整数群の包含を意味するが、任意の他の要素もしくは整数または要素もしくは整数群の除外を意味するものではないことが理解されよう。
【０１２１】
任意の先行刊行物（またはそれから得られた情報）、または公知である任意の事項への本明細書における言及は、その先行刊行物（またはそこから得られた情報）または公知の事項が、本明細書が関わる努力傾注分野における共通の一般的知識の一部を形成するという承諾もしくは承認または任意の形態の示唆ではなく、そう受け取られるべきではない。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明確に指示しない限り複数の態様を含むことが留意されなければならない。故に、例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は、単一のタンパク質、および２つ以上のタンパク質を含む。
【０１２３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態が、添付図面を参照しながらこれより詳細に記載される。本明細書に組み入れられた図面のあまり本質的でない、または本質的でないいくつかの特徴は、簡潔さのために省略されている。
【０１２４】
図１は、システム１００および本発明の１つの好ましい実施形態による方法のフローチャート概略図を図示する。例えば懸濁液の形態、またはペーストもしくは沈殿物の形態の含タンパク質沈殿物が液体、例えば緩衝液で懸濁される。緩衝液の組成および濃度は、第１の希釈係数、例えば３〜１０の間（１：３〜１：１０）を有する懸濁液などの出発組成物を作り出すために、上記に記載された方法に従う。懸濁液は第１の槽１に入れられる。懸濁液は、ポンプ２を通じて第１の濾過ユニット５に送液され、いくつかのタイプのポンプ（例えば、ピストンポンプ；回転ポンプ；遠心分離ポンプおよび膜ポンプ）、およびパイプ１２のフロー調節バルブ３が使用される。第１の濾過ユニット５は、フィルターディスクが取り付けられた回転中空軸が装備されている（濾液は中空軸の外側から内側に流れる）。第１の濾過ユニット５は、濾過ケーキ厚さを一定に保ち、故に一定の濾液フローを達成するための高さ調整可能なスクレーパーをさらに備えている。所望の濾過圧力は、オーバーフローバルブ（未濾過懸濁液出口）によって制御および調節される。使用されるフィルターディスクは、セラミック膜、デプスフィルター層、および焼結多孔質金属フィルターディスクであってもよい。第１の濾過ユニット５の容器が懸濁液でいっぱいになると、連続圧力抽出および分離が開始される。圧力ユニット／容器を含む第１の濾過ユニット５は、抽出効率および濾過プロセスを同時に高めるための適切な内部設定および条件が提供される。抽出効率は、ミキサーを必要とすることなくユニット５で乱流混合により高められる。それにもかかわらず、乱流を作ることによって抽出プロセスを促進するための追加のミキサーが提供されることが予見される。さらに、本発明において開示されたより高い最終希釈係数、例えば４０または７０も抽出効率を高め、高いタンパク質（例えばＩｇＧ）収量をもたらす。当然ながら、任意の他のより高い最終希釈係数（７０より高い）も想定される。
【０１２５】
濾液は、パイプ（またはチャンネル）１４に設置された流量計６を通って流れ、第２の槽７に収集される。未濾過懸濁液は、槽１のパイプ１３に設置された調節出口３を通じて還流する。第２の槽７の規定体積に達すると、ＵＦ  ８濃縮プロセスが第２の濾過ユニットで開始される。第２の槽７の濾液は、パイプ１５を通って限外濾過（ＵＦ）システム８へ流れる。膜透過圧力は、透過液流量１７が、パイプ１４の第１の濾液流量によるものと同一またはほぼ同一となるように設定される。ＵＦシステム８の透過液は、パイプ（またはラインもしくはチャンネル）１７を通って第１の槽１に還流するのに対し、ＵＦシステムの保持液（＝濃縮タンパク質）は、パイプ１６を通って第２の槽７に還流する。
【０１２６】
本発明によれば、第１のプロセスユニット５は、第１の保持液および第１の透過液を生成するための第１のプロセスユニット５の内容物を乱流混合するための１つまたはそれ以上の第１のフィルターエレメントを含む１つまたはそれ以上の回転フィルターディスクを備えている。第１の保持液は、制御バルブ３を経由しチャンネル１３を通って第１の槽１にフィードバックされるのに対し、第１の透過液は、別のチャンネル１４を経由して第２の槽７へ送液される。第１のフィルターエレメントは、く、約５ｎｍ〜５０００ｎｍの間、好ましくは２０ｎｍ〜１００ｎｍの間、またはより好ましくは３０ｎｍ〜８０ｎｍの間の孔径を有する、セラミック材料に基づく濾過膜であってもよい。無機膜または任意の他の適切な膜も、セラミックベースの膜と同様の効果を提供し得ることも予見される。第１の濾過ユニット５は、内部の圧力を調節するためにマノメーターなどの圧力制御装置４を供給される。同様に、流量計６は、懸濁液または溶液の流量を測定するために本発明のシステムに設置される。
【０１２７】
第２の槽７からの供給流は、次いで、実行されるべき第２の分離プロセスのためにチャンネル１５を通って第２の濾過ユニット８に送液される。第２の分離プロセスは、連続濃縮プロセス（例えばＵＦ）であってもよい。第２の濾過ユニット８は、１つまたはそれ以上の第２のクロスフローフィルターエレメントを備えており、第２のクロスフローフィルターエレメントは、５０ｋＤ未満の平均分子量カットオフ値を有する限外濾過膜を含んでもよい。しかし、膜は、１０ｋＤ未満またはより好ましくは５ｋＤ未満でもあってもよい。限外濾過膜は、それ故にチャンネル１６を通って第２の槽７に逆流される第２の保持液を生成するのに対し、第２の透過液はチャンネル１７を経由して第１の槽１に送液される。この目的のために、第２の濾過ユニット１０の圧力は、チャンネル１４および１７の流速が実質的に等しくなるように濃縮工程（限外濾過）中に調節されることが留意される。
【０１２８】
以下の説明では、本発明による方法の詳細な説明がいくつかの実験例において概説される。
【０１２９】
実施例１
本発明により、免疫グロブリンＧを第１のプロセスユニットで連続抽出および分離プロセスにより抽出した。
【０１３０】
１ｋｇ含タンパク質沈殿物（沈殿物Ａ）の量を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭリン酸塩および２ｍＭクエン酸緩衝液に３０分間溶解して第１の希釈係数１０（すなわち、緩衝液９ｋｇに溶解した沈殿物１ｋｇ）を得た。懸濁液のｐＨは約ｐＨ４．６であった。懸濁液を第１の槽で調製し、連続抽出および分離プロセスのために第１のプロセスユニットに送液した。第１のプロセスユニットは、平均孔径が８０ｎｍの濾過膜を有するセラミックベースの膜ディスクを含む回転濾過エレメントを備えていた。使用したセラミックフィルターは、直径Φｏ１５２ｍｍ／Φｉ２５．５ｍｍ；厚さｄ＝４．５ｍｍ；および膜表面積３６０ｃｍ２を有するセラミックフィルターディスク１５２であった。ディスクの接線速度は、６０Ｈｚ（８００ｒｐｍ）で約７ｍ／ｓであった。平均濾過率は、約２００ｍｌ／分であった。連続抽出および分離プロセス中、第２の槽に収集した各２００ｍｌ濾液（第１の透過液）につき緩衝液２００ｍｌを、第２の濾過ユニット（限外濾過）から得られた第２の透過液から第１の槽に戻した。４時間後、濾過を止めた。第１の槽の所定のタンパク質濃度は、０．１ｇ／Ｌ未満（最終希釈係数３１に等しい）であった。濾液３ｋｇの総量を、第２の濾過ユニットで２０ｇ／Ｌまでさらに濃縮した（１０ｋＤ限外濾過膜）。
【０１３１】
比較実験を、深層フロー濾過を使用して従来技術方法に従って行った。同じロットの沈殿物Ａをこの実験で使用し、沈殿物は０．２２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に懸濁した。最終希釈係数６（すなわち、緩衝液５ｋｇに溶解した沈殿物１ｋｇ）をこの実験に使用した。懸濁液を深層濾過の前に４時間混合した。最後に、１０ｋＤの平均分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用して、濾液を２０ｇ／Ｌまで濃縮した。
【０１３２】
免疫グロブリンＧ収量の結果を表３に示す。連続抽出方法を使用して得られるＩｇＧ収量は、従来技術方法より高かった。上で説明したように、該抽出方法は、沈殿物が液体の体積増加（または最終希釈係数）に曝露されることを確実にする。これは、次いで第１の濾過ユニットの第１の透過液中で回収される沈殿物材料からの免疫グロブリンＧの抽出の増加に有利に溶解平衡を移動させると考えられる。表３に示すように、本発明の動的濾過システムは、従来技術方法に比べて約０．６８ｇ／Ｌ血漿相当量（ＰＥＱ）のＩｇＧ収量の増加を可能にした。これは、プール血漿毎リットル中、約１０％のＩｇＧに等しい。
【０１３３】
【表３】
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【０１３４】
実施例２
この例では、実施例１に記載されたのと同様の方法および設備を使用して、異なる緩衝液組成および異なる最終希釈係数の使用から生じるＩｇＧ収量を比較した。
【０１３５】
表４に示されているように、最終希釈係数６を対照（試料Ａ）に適用した。この最終希釈係数は、当技術分野で広く実践されている一般的な最終希釈係数を表す。例えば、ＷＯ２０１６０１２８０３（１５頁、３０行）は、約１：２〜約１：１０の係数による希釈を示唆している。これに対して、本発明は、より高い希釈比を使用できるようにする実用的手段を提供する。本例では、最終希釈係数４０を試料ＢおよびＣに使用した。
【０１３６】
試料Ａの緩衝液は、０．２２Ｍ酢酸ナトリウムを含む。試料Ｂの緩衝液は、５ｍＭ酢酸塩および５ｍＭリン酸塩を含むのに対し、試料Ｃの緩衝液は、１０ｍＭ酢酸塩および１０ｍＭリン酸塩を含む。試料ＢおよびＣは両方とも、含タンパク質沈殿物の再懸濁後一定のｐＨを維持するために、２ｍＭクエン酸をさらに含有した。全試料の懸濁液の形態での出発組成物のｐＨは、約４．８であった。
【０１３７】
試料Ａの最終希釈係数６は、Ｃｏｈｎ法１０に従って最初に沈殿物Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ約１ｋｇを上記に記載された緩衝液（０．２２Ｍ酢酸塩；沈殿物１部：および緩衝液５部；１：６ｗｔ／ｗｔ；沈殿物：全体）に溶解して得た。懸濁液を周囲室温で４時間混合した。その後、懸濁液をデプスフィルター（０．２〜０．４５μｍ、ポリプロピレン）を通して濾過し、最後に１０ｋＤ膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３）を通して２０ｇタンパク質／Ｌまで限外濃縮した。
【０１３８】
１ｋｇ含タンパク質沈殿物の総量を、試料Ｂおよび試料Ｃに関して、上記に記載された緩衝液に３０分間溶解して第１の希釈係数６を得、懸濁液のｐＨは約４．６に調整した。懸濁液を第１の槽で調製し、連続抽出プロセスのために第１のプロセスユニットに送液した。連続抽出プロセス中、第２の槽に収集した各１００〜２００ｍｌ濾液につき緩衝液１００〜２００ｍｌを、第２のプロセスユニット（限外濾過）の第２の透過液から第１の槽に戻した。全希釈係数が約４０となったとき、濾過プロセスを止めた。１０ｋＤの平均分子量カットオフ値を有する限外濾過膜を使用して、濾液を第２の濾過ユニットで２０ｇ／Ｌまでさらに濃縮した。
【０１３９】
６つの異なるロットを実験（それぞれ、同じロットを各試験緩衝液と比較する）に使用した。タンパク質および免疫グロブリンＧ収量を次いで比較した。収量結果は、試料Ａと比較して試料ＢおよびＣいずれも、１Ｌ  ＰＥＱ（平均）あたり０．５６ｇ免疫グロブリンＧの増加を示した（表４参照）。
【０１４０】
【表４】
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【０１４１】
実施例３
本発明の連続抽出システムを使用した免疫グロブリンＧ、ＭおよびＡならびに他の不純物の収量に与える種々のｐＨの影響を、この例で実証する。クエン酸緩衝液およびリン酸緩衝液を使用してＩｇＧ回収率を比較する２つの実験を行った。この例で使用した含タンパク質沈殿物は、Ｃｏｈｎ法１０またはＫｉｓｔｌｅｒおよびＮｉｔｓｃｈｍａｎｎ法（１９６２、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  ７、４１４頁）に従ってエタノールで処置した血漿から得られた１ｋｇ沈殿物Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩであった。
【０１４２】
３．５〜３．９のｐＨの第１の希釈係数５（１：５）を得るために、上記沈殿物をクエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム−クエン酸）に再懸濁してより低いｐＨ試料を得た。懸濁液を２０℃で３０分間撹拌した。
【０１４３】
懸濁液を次いで第１の槽に移し、その後、実施例１に記載されている連続抽出および分離プロセスのために第１の濾過プロセスユニットに送液した。該システムが懸濁液でいっぱいになるとすぐに第１のプロセスユニットを開始した。第１の透過液／抽出液を第１のプロセスユニットから生成し、第１の透過液／第１の抽出液は、限外濃縮工程（第２の濾過ユニット）を経る前に第２の槽に収集した。限外濃縮工程から得られた目的とするタンパク質が枯渇した第２の透過液を、第１の槽にフィードバックした。第１の槽のタンパク質濃度が０．０５ｇ／Ｌ未満となり、および／または最終希釈係数が４０（１：４０）となったとき、連続抽出および濾過プロセスを止めた。
【０１４４】
第１の希釈係数５（１：５）、およびｐＨ８．０を得るために、上記沈殿物をリン酸緩衝液（リン酸水素二ナトリウムＮａ２ＨＰＯ４およびリン酸二水素ナトリウムＮａＨ２ＰＯ４）に再懸濁してより高いｐＨ試料を得た。懸濁液を２０℃で３０分間撹拌した。ｐＨ値とは別に、より高いｐＨ試料で使用した全ての他の条件および工程は、低ｐＨ懸濁液（上記に記載されている）と同一であった。
【０１４５】
表５および６は、懸濁液が第２の濾過ユニットで限外濃縮工程を経た後の結果を示している。
【０１４６】
【表５】
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【０１４７】
結果は、ｐＨ抽出条件がＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ収量に影響を与えなかったことを示している。しかし、例えば低ｐＨ緩衝液条件による他のパラメータに関しては効果が観察され、ＰＫＡおよびタンパク質分解活性のレベルが低下した調製物をもたらした。そのようなパラメータは、免疫グロブリン調製物の安定性／品質に悪影響を与える可能性がある。パラメータα１−アンチトリプシン、α２−マクログロブリン、トランスフェリン、アルブミン、アポ−ＡＩ、セルロプラスミン、ハプトグロビン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ヘモペキシンおよびＩｇＧサブクラス分布を、免疫比濁アッセイによって決定した。リン脂質、トリグリセリドおよびコレステロールレベルを、酵素試験アッセイによって決定した。タンパク質組成をアガロースゲル電気泳動によって行った。分子サイズ分布（凝集体、二量体、単量体および断片）をサイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。ＰＫＡおよびタンパク質分解活性の決定を、発色基質アッセイによって行った。
【０１４８】
【表６】
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【０１４９】
実施例４
この例では、ｉ）沈殿物を固定体積の２２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８±０．２）にし最終希釈係数６をもたらし、深層濾過を使用して溶解タンパク質を回収すること；ｉｉ）沈殿物を２２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８±０．２）に溶解し、本発明の連続抽出プロセスを使用して溶解タンパク質を回収して、最終希釈係数３１を達成すること；およびｉｉｉ）第１の槽の懸濁液が新鮮な緩衝液で連続的に補充される本発明の連続抽出プロセスを使用して、第２の希釈係数３１を達成することによって、沈殿物からのＩｇＧ回収率を比較した。
【０１５０】
パートｉ：同じロットの沈殿物１ｋｇを、同じインペラーミキサー（ＩＤ１０ｃｍ）を使用して２２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８±０．２）５ｋｇに懸濁して、最終希釈係数６（すなわち、緩衝液５ｋｇに溶解した沈殿物１ｋｇ）を得た。懸濁液を８時間混合した。深層濾過の前に、濾過助剤（ＦＡ＝Ｃｅｌｐｕｒｅ  Ｃ１００  １０ｇ／ｋｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ）を添加し、３０分間混合した。深層濾過を、フィルタープレス（２０×２０ｃｍフレーム；  Ｆｉｌｔｒｏｘ製）で複合フィルターシート（Ｄｏｌｄｅｒ  ＣＨ製ポリプロピレン、Ｆｉｌｔｒｏｘ製セルロース、ＣＨ９）を使用して２．５バールの最大圧力で行った。使用したフィルター面積は３２００ｃｍ２であった。濾過を終えた後、後洗浄を再懸濁緩衝液２．５Ｌを使用して開始した。これは、全濾液６．９Ｌおよびタンパク質濃度１８ｇ／Ｌをもたらした。タンパク質濃度を、Ｋｊｅｌｄａｈｌ、ＢｉｕｒｅｔおよびＡ２８０アッセイによって決定した。最後に、上記に記載されている１０ｋＤの平均分子量カットオフ値を有する限外濾過膜を使用して、濾液を２０ｇ／Ｌまでさらに濃縮した。最終限外濾液体積５．９  Ｌおよびタンパク質濃度２０．７ｇ／Ｌの収量（表７）。
【０１５１】
パートｉｉ：Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎプロセス（ＫＮ）からの、およそ１００ｇ濾過助剤を含有する沈殿物の形態の１ｋｇの量の凍結含タンパク質沈殿物を、インペラーミキサー（ＩＤ１０ｍｍ）を使用して２２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８±０．２）緩衝液に３０分間再懸濁して、第１の希釈係数１０（すなわち、緩衝液１８ｋｇに溶解した沈殿物２ｋｇ）を得た。第１の槽の懸濁液（２０Ｌワーキングボリューム）を、ダイヤフラムポンプを使用して流量１０００ｍＬ／分で第１の動的濾過プロセスユニットへポンピングした。プロセスユニットは、二層型セラミックベースの膜ディスク（上方膜層８０ｎｍおよび下方層１００ｎｍ）を含有した。セラミックフィルターディスク１５２（ＫＥＲＡＦＯＬ  Ｋｅｒａｍｉｓｃｈｅ  Ｆｏｌｉｅｎ  ＧｍｂＨ、９２６７６  Ｅｓｃｈｅｎｂａｃｈ）は、直径１５２ｍｍ；厚さ４．５ｍｍ；および膜表面積３６０ｃｍ２を有した。ディスクの接線速度は、６０Ｈｚ（８００ｒｐｍに等しい）で約７ｍ／ｓであった。平均濾過率は約２００ｍｌ／分に設定した。
【０１５２】
第１のプロセスユニットがいっぱいになったら、オーバーフローバルブ（第１のプロセスユニットから第１の槽への第１の保持液の還流をモジュレートする）を使用して１バール（範囲：０〜２バール）の一定圧力下で懸濁液を１０〜１５分間循環させた。この時点で、膜透過圧力（ＴＭＰ）を０．５〜１．５バールの間に維持しながら連続抽出プロセスを開始した。第１の透過液を、流量１００〜２００ｍＬ／分で第２の槽に収集した（２０Ｌワーキングボリューム）。未濾過保持液懸濁液を、調節出口バルブを通じて８００〜９００ｍＬ／分の流量で第１の槽に逆流させた。規定体積（２０００〜４８００ｍＬ）が第２の槽（＝濾液槽）に収集されたら、０．２ｍ２、カットオフ１０ｋＤ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）／またはＢｉｏｍａｘ（登録商標）フィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を使用して、限外濾過（第２の濾過ユニット）を開始した。ＵＦシステムの透過液流量が透過液濾液流量（１００〜２００ｍＬ／分）と類似するように膜透過圧力（ＴＭＰ：０．８〜１．５バール）を設定して、連続抽出プロセスを確実にした。ＵＦ−第２の濾過ユニットの透過液を、１００〜２００ｍＬ／分の流量で第１の槽に戻した。４時間後、濾過を止めた。第１の槽（懸濁液槽＝供給液槽）のタンパク質濃度の所定の値は、０．１ｇ／Ｌ未満であった。これは最終希釈比１：３１に等しい。タンパク質濃度が２０ｇ／Ｌに達するまで限外濾過プロセスを継続した。この最終濃縮中、第２の透過液を排水に送った。最終限外濾液体積は、２１．４ｇ／Ｌのタンパク質濃度で７．３Ｌであった（表７）。タンパク質濃度を、Ｋｊｅｌｄａｈｌアッセイによって決定した。
【０１５３】
パートｉｉｉ：この実験の第３部では、第１の濾過ユニットを、独立システム（すなわち、第２のＵＦシステムから切り離された）として使用した。１ｋｇの量の同じ沈殿物を５ｋｇに再懸濁して希釈係数６（すなわち、緩衝液５ｋｇに溶解した沈殿物１ｋｇ）を得た。懸濁液のｐＨは約４．６〜５．０であった。この実験の全ての他のパラメータは、ＵＦシステムからの透過液の代わりに新鮮な緩衝液を第１の槽に添加したことを除いて、パートｉｉ）に記載されているのと同じであった。第１の濾過ユニットがいっぱいになったら、連続抽出プロセスを開始する前に、オーバーフロー戻しバルブを使用して１バール（範囲：０〜２バール）の一定圧力下で懸濁液を１０〜１５分間再循環した。濾液を、流量１００〜２００ｍＬ／分で第２の槽に収集した（５０Ｌワーキングボリューム）。未濾過懸濁液を、調節戻しバルブを通じて８００〜９００ｍＬ／分の流量で第１の槽に逆流させた。規定体積（２０００〜４８００ｍＬ）が第２の槽（＝濾液槽）に収集されたら、新鮮な緩衝液を、第１の透過液濾液流量（すなわち、１００〜２００ｍＬ／分）のものと類似した流量で懸濁液槽に添加した。約４時間後、濾過を止めた。第１の槽（懸濁液槽＝供給液槽）のタンパク質濃度の所定の値は０．１ｇ／Ｌ未満であった。収集した濾液の体積は、４．８ｇ／Ｌのタンパク質濃度でおよそ３１Ｌであった。この体積は最終希釈比１：３１に等しい。濾液を２０．６ｇ／Ｌのタンパク質濃度までさらに濃縮して、最終体積７．２Ｌを得た（表７）。
【０１５４】
ＩｇＧ収量の結果を表７に示す。本発明方法によるＩｇＧ収量（連続抽出および濾過プロセスを伴う）は、従来技術方法より高い収量をもたらした。上で説明したように、本発明に開示される抽出および濾過方法を使用することによって、体積の増加（または最終希釈係数）による濃度の変化が達成され、これにより免疫グロブリンＧの抽出の増加に有利に溶解平衡を移動させてより高い全収量を達成する。
【０１５５】
【表７】
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【０１５６】
実施例５、６および７
これらの例では、第２の槽におけるタンパク質収量に対する第１のプロセスユニットの回転フィルターディスクの回転速度および全再循環体積（最終希釈係数）の影響を調査した。表８は、使用した条件の概要を示す。
【０１５７】
結果は、ディスクの回転速度が高ければ高いほどおよび再循環体積が高ければ高いほど、ＩｇＡ、ＩｇＭ、脂質および高分子量タンパク質などの望ましくない不純物の同時抽出を増加させることなく、第２の槽に回収される抽出標的タンパク質は高くなることを示している。
【０１５８】
実施例５Ａ
実験のためにＣｏｈｎ  Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩペースト（Ｃｅｌｐｕｒｅ  Ｃ１００１２０グラムを含有する１ｋｇ）を、第１の槽の１０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム二水和物、ｐＨ４．３〜４．４緩衝液に４℃、第１の希釈比１：６で懸濁した。第１の槽の懸濁液を、パドルスターラーを用いて４℃で約１５〜２０時間撹拌した。実験を開始する前、第１の濾過ユニット（０．２μｍ膜；フィルター面積＝０．１ｍ２を有する３つのセラミックフィルターを含有するＮｏｖｏｆｌｏｗ動的濾過装置）を冷水（１℃）で一晩保管した。実験の開始時にユニットから水を抜き、懸濁液を該ユニットへ送液した。濾過プロセスを始める前に、懸濁液を次いで第１の槽と第１のプロセスユニットの間で数分間再循環させた。濾過プロセス中、残りの懸濁液を第１のプロセスユニットに徐々に添加した。第１のプロセスユニットのセラミックフィルターを、１２００ｒｐｍの回転速度および１．２バールのＴＭＰで作動させた。第１のプロセスユニットからの透過液を第２の槽に収集し、次いでＵＦ／ＤＦユニットと呼ばれる第２のユニットに送液した。ＵＦ／ＤＦユニットは、７．０ｎｍ膜；フィルター面積０．２ｍ２を有する、６つのセラミックディスクを含有するＮｏｖｏｆｌｏｗ動的濾過装置であった。ＵＦ／ＤＦシステムの透過液流量は、５０〜７０ｍＬ／分であった。第１の濾液が第２の槽に収集されたら、ＵＦ／ＤＦシステムを開始した。ＵＦ／ＤＦシステムの保持液を第２の槽へ逆流させ、一方、透過液は第１の槽へ逆流させた。第１の槽へフィードバックされた透過液の体積は、ペーストと混合される全液体体積（すなわち最終希釈係数）に寄与した。この実験では、全再循環体積はペースト１ｋｇあたり１０７Ｌであった（すなわち１：１０７最終希釈係数）。
【０１５９】
実施例５Ｂ
この実施例では、全再循環体積が１６Ｌ／ｋｇペーストであったことを除いて、実施例５Ａに記載されているのと同じ手順を使用した。
【０１６０】
実施例６Ａ
この実施例では、第１のプロセスユニットのセラミックフィルターの回転速度を１０００ｒｐｍで作動させ、全再循環体積が１０２Ｌ／ｋｇペーストであったことを除いて、実施例５Ａに記載されているのと同じ手順を使用した。
【０１６１】
実施例６Ｂ
この実施例では、全再循環体積が１６Ｌ／ｋｇペーストであったことを除いて、実施例６Ａに記載されているのと同じ手順を使用した。
【０１６２】
実施例７Ａ
この実施例では、第１のプロセスユニットのセラミックフィルターの回転速度を８００ｒｐｍで作動させ、全再循環体積が９３Ｌ／ｋｇペーストであったことを除いて、実施例６Ａに記載されているのと同じ手順を使用した。
【０１６３】
実施例７Ｂ
この実施例では、全再循環体積が１６Ｌ／ｋｇペーストであったことを除いて、実施例７Ａに記載されているのと同じ手順を使用した。
【０１６４】
表８は、実験パラメータおよび濾過プロセス後の第２の槽における標的タンパク質収率を示す。
【０１６５】
【表８】
2021524443.tif 000010
【０１６６】
不純物を、比濁法、ＥＬＩＳＡ（ＩｇＡ、ＩｇＭ）、または酵素試験法（脂質）によって決定した。結果は、有意な不純物の増加は観察されなかったが、表８に明確に示されているように、タンパク質収率およびＩｇＧ収率はより高い回転速度で著しく増加し、タンパク質およびＩｇＧいずれの収率も、高い最終希釈係数を使用した場合（実施例５Ａ、６Ａ、７Ａ）、低い最終希釈係数（実施例５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ）と比較して著しく高いことを示した。
【０１６７】
実施例８Ａおよび８Ｂ
この例では、濾過助剤の存在下（実施例８Ａ）および非存在下（実施例８Ｂ）で動的クロスフロー濾過プロセスを比較した。使用した濾過助剤は（Ｃｅｌｐｕｒｅ  Ｃ３００；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ）であった。
【０１６８】
実験のために、Ｃｏｈｎ  Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩペースト（実施例８Ａには１．２ｋｇおよび実施例８Ｂには１．５ｋｇ）を使用した。ペースト各１キログラムは、濾過助剤１２０グラムを含有する。ペーストを、１０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム二水和物、ｐＨ４．３〜４．４緩衝液に４℃、最初の比１：６で再懸濁した。懸濁液を、パドルスターラーを用いて４℃で約１５〜２０時間撹拌した。実験を開始する前、第１の濾過ユニット（３つのセラミックフィルター０．２μｍ膜；フィルター面積＝０．１ｍ２を含有するＮｏｖｏｆｌｏｗ動的濾過装置）を冷水（１℃）で一晩保管した。実験の開始時に水を抜き、懸濁液を動的フィルター装置へ送液した。濾過プロセスを始める前に、懸濁液を次いで第１の槽と該装置の間で数分間再循環させた。濾過プロセス中、残りの懸濁液を徐々に添加した（セラミックフィルターを、１．２〜１．６バールのＴＭＰにより１２００ｒｐｍで作動させた）。各実験で、緩衝液約６００ｍｌを１６〜１８回交換した。これは約９．６〜１０．８Ｌの緩衝液量に相当し、オンライン処理中の限外濾過／透析濾過ユニットの緩衝液回収率をシミュレートするのに役立つ。濾液を撹拌下（パドルスターラー）で氷冷容器に収集し、濾過を完了させた後、濾液をさらに１時間撹拌した。その後、Ａｋｔａ  Ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ装置を使用して２０ｇ／Ｌ（±５ｇ／Ｌ）まで濾液を濃縮した。
【０１６９】
実施例８Ｂでは、濾過助剤を、Ｍｅｃａｐｌｅｘ圧力濾過スリーブおよび第１の槽と第１の濾過ユニットの間に置かれたポリプロピレンフィルター層を使用して除去した。全ての他の条件は、実施例８Ａに記載されているのと同じであった。
【０１７０】
実験は、濾過助剤の除去が、第１の濾過ユニットを通じたより高い濾過率をもたらすことを示した（図２）。さらに、濾液中の総タンパク質およびＩｇＧ回収率は、濾過助剤の存在または非存在に関係なく類似していた。さらに、第１の濾過ユニットの前の濾過助剤の除去は、懸濁液中に存在する脂質および他の疎水性分子の濾液からの除去も促進した（データ未掲載）。故に、濾過助剤の非存在下で作動させた場合、第１の濾過ユニットから得られる濾液はより安定なままであった（すなわち、濾過助剤の存在下で作動させた第１の濾過ユニットで得られる濾液と比較して、濾液濁度は比較的低く、保管時に安定なままであった）。これらの結果は、第１の濾過ユニットの前の濾過助剤の除去が、システムのスループット能力を改善することをさらに示唆している。
【図１】
2021524443.tif 000011
【図２】
2021524443.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月28日(2021.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とするタンパク質を沈殿物から抽出するための方法であって、
ａ．第１の槽（１）で沈殿物と液体を混合して第１の希釈係数を有する懸濁液を形成する工程と；
ｂ．第１の保持液および目的とするタンパク質に富む第１の透過液を生成するのに適合されている動的フィルターエレメントを含む第１の濾過ユニット（５）へ懸濁液を送液する工程と；
ｃ．場合により第１の保持液（１３）を第１の槽へ流すことによって、液体を添加することにより第２の希釈係数まで第１の槽（１）の懸濁液を希釈する工程と；
ｄ．目的とするタンパク質に富む第１の透過液を第２の槽（７）で回収する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
ｅ．第２の槽（７）の第１の透過液を、クロスフローフィルターエレメントを含む第２の濾過ユニットで連続濃縮プロセスに供し、それによって目的とするタンパク質に富む第２の保持液、および目的とするタンパク質が枯渇した第２の透過液を生成する工程と；
ｆ．場合により第２の透過液を第１の槽（１）に流すことによって、第１の槽（１）の懸濁液を希釈し、それによって第２の希釈係数まで懸濁液を希釈する、工程と；
ｇ．目的とするタンパク質に富む第２の保持液を第２の槽（７）に戻す、および／または目的とするタンパク質に富む第２の保持液を収集する工程と、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的とするタンパク質を沈殿物から高収率で抽出するための工業規模の方法であって、ａ．第１の槽で沈殿物と液体を混合して第１の希釈係数を有する懸濁液を形成する工程と；
ｂ．平均孔径が５ｎｍ〜５０００ｎｍの間のセラミック膜を有するフィルターディスクを含む回転式クロスフローフィルターエレメントを含む第１の濾過ユニットへ懸濁液を連続的に送液する工程であって、フィルターエレメントは、第１の保持液、および目的とするタンパク質に富む第１の透過液を生成するのに適合されている、工程と；
ｃ．部分的に第１の保持液を第１の槽へ流すことによって、液体を添加することにより第２の希釈係数まで第１の槽の懸濁液を希釈する工程と；
ｄ．目的とするタンパク質に富む第１の透過液を第２の槽で回収する工程と；
ｅ．第２の槽の第１の透過液を、クロスフローフィルターエレメントを含む第２の濾過ユニットで連続濃縮プロセスに供し、それによって目的とするタンパク質に富む第２の保持液、および目的とするタンパク質が枯渇した第２の透過液を生成する工程と；
ｆ．場合により第２の透過液を第１の槽に連続的に流すことによって、第１の槽の懸濁液を希釈し、それによって第２の希釈係数まで懸濁液を希釈する、工程と；
ｇ．目的とするタンパク質に富む第２の保持液を第２の槽に戻す、および／または目的とするタンパク質に富む第２の保持液を収集する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項４】
第１の透過液は濃縮プロセスへ連続的に送液される、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
濃縮プロセスは、第２の濾過ユニットで行われる限外濾過である、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
第１の透過液は第２の槽に収集され、第１の槽の懸濁液が完全に濾過されると、第２の槽からの第１の透過液は連続濃縮プロセスに供される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第１の槽の懸濁液の第２の希釈係数またはタンパク質濃度の所定の値のどちらかが達成されるまで、工程ｂ）〜ｃ）または工程ｂ）〜ｆ）のどちらかが繰り返される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第１の希釈係数は、少なくとも３（１：３；タンパク質を含む組成物の部分：全体）、好ましくは１〜１０の間、好ましくは３〜９の間、好ましくは３〜５の間、好ましくは約３、５、６、９または１０である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
所定の第２の希釈係数（全希釈液の重量に対する含タンパク質沈殿物の重量）は、６〜７０の間、１０〜７０の間、２０〜５０の間、好ましくは３０〜４０の間、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、または約７０（１：７０；沈殿物部分：全体）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質濃度の所定の値は、０．１ｇ／Ｌ未満、好ましくは約０．００１〜０．１ｇ／Ｌの間である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
沈殿物は、アルコール分画プロセスの、好ましくは血漿の、より好ましくはヒト血漿の中間生成物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
中間生成物は、Ｃｏｈｎ画分Ｉ（Ｆｒ  Ｉ）、Ｃｏｈｎ画分ＩＩ＋ＩＩＩ（Ｆｒ  ＩＩ＋ＩＩＩ）、Ｃｏｈｎ画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（Ｆｒ  Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）、またはＫｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ沈殿物Ａ（ＫＮ  Ａ）、またはＫＮ  Ａならびに１つもしくはそれ以上のＦｒ  Ｉ、Ｆｒ  ＩＩ＋ＩＩＩおよびＦｒ  Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの組合せからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
沈殿物は培養上清または発酵生成物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
目的とするタンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、好ましくはヒト血漿由来のような免疫グロブリンＧまたは組換え生成された免疫グロブリンＧである、請求項１〜１３のい
ずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
第１の濾過ユニットは圧力容器を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
動的フィルターエレメントは、動的クロスフローフィルターエレメント、好ましくは回転式クロスフローフィルターエレメントである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
回転式クロスフィルターエレメントの回転速度は、約６００ｒｐｍ〜約１２００ｒｐｍの間、好ましくは約８００ｒｐｍ〜約１２００ｒｐｍの間、好ましくは約８００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍまたは約１２００ｒｐｍである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第１の濾過ユニットは、セラミック膜を含む回転フィルターディスク、および場合により第１の濾過ユニットの内容物の乱流混合のためのバッフルを備え、好ましくはディスクの接線速度は約１〜７ｍ／秒の間である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
第１の濾過ユニットの温度は、好ましくは２℃〜２５℃の間、より好ましくは約２℃〜１０℃に制御される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
動的フィルターエレメントまたはクロスフローフィルターエレメントは、５ｎｍ〜５０００ｎｍの間、好ましくは５ｎｍ〜２０００ｎｍの間、５ｎｍ〜５００ｎｍの間、５ｎｍ〜２００ｎｍの間、より好ましくは７ｎｍ〜１００ｎｍの間、さらにより好ましくは７ｎｍ〜８０ｎｍの間の平均孔径を有する濾過膜を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
沈殿物は濾過助剤を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
濾過助剤は第１の濾過の前に除去される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第２の槽（７）は、第１の透過液（１４）および／または第２の保持液（１６）を受け取るために提供され、第１の透過液および第２の透過液の流速は、実質的に一定の生成物体積が第２の槽（７）で維持されるように制御される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
膜透過圧力は、０．１バール〜２．５バール、好ましくは０．２バール〜２．４バール、好ましくは０．４バール〜２．０バール、最も好ましくは０．４バール〜１．５バールである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
抽出プロセスは、第１の濾過ユニットの懸濁液の流量および／もしくは滞留時間、ならびに／または第１の保持液の流量、および／もしくは第１の透過液の流量を調節することによってさらに促進される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
懸濁液は、約３．０〜９．０の間、好ましくは約４．０〜７．０の間、約４．０〜６．０の間、約４．０〜５．０の間、約４．３〜４．９の間、約４．４〜４．８の間、より好ましくは約５．０のｐＨを有する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
沈殿物は、約０．５〜６．５％ｗ／ｖ、より好ましくは約１．０〜４．０％ｗ／ｖ、さらにより好ましくは約１．５〜３．０％ｗ／ｖ、最も好ましくは約１．８〜２．５％ｗ／ｖ、例えば約２．０％ｗ／ｖの総タンパク質濃度を有する、請求項１〜２６のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項２８】
液体は、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびクエン酸の１つまたはそれ以上を含む緩衝液を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
沈殿物は、懸濁液、ペレットまたは好ましくはペーストの形態で第１の槽に添加される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
方法の生成物は、最終生成物が対象への投与に適するように、クロマトグラフィー工程、ウイルス不活性化工程、濃縮および製剤化の１つまたはそれ以上を含むさらなる処理に供される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2021524443.tif 000013
2021524443.tif 000014
2021524443.tif 000015