(57)【要約】【課題】ＣＤ１３７アゴニスト分子の臨床開発は、治療が用量制限高度肝炎（ウレルマブ）又は低い臨床的有効性（ウトミルマブ）のいずれかを伴うため、遅れている。【解決手段】本発明は、ＣＤ１３７に結合する特異的結合メンバーに関する。この特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含み、例えば、癌及び感染症の治療に利用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的結合メンバーであって、ＣＤ１３７に結合し、当該特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、前記ＣＤ１３７抗原結合部位が、前記ＣＨ３ドメインのＡＢ構造ループ中に位置する第１の配列を含み、前記第１の配列が、配列ＰＰＹ（配列番号１０）を含む、特異的結合メンバー。
【請求項２】
前記特異的結合メンバーが、前記ＡＢ構造ループ中に挿入を含む、請求項１に記載の特異的結合メンバー。
【請求項３】
前記挿入が、５アミノ酸長である、請求項２に記載の特異的結合メンバー。
【請求項４】
前記第１の配列が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１３８に記載されるＦＳ２２−１７２−００３；
（ｉｉ）配列番号１２９に記載されるＦＳ２２−１７２−００２；
（ｉｉｉ）配列番号１４７に記載されるＦＳ２２−１７２−００４；
（ｉｖ）配列番号１２０に記載されるＦＳ２２−１７２−００１；
（ｖ）配列番号１５６に記載されるＦＳ２２−１７２−００５；
（ｖｉ）配列番号１１０に記載されるＦＳ２２−１７２−００６；又は
（ｖｉｉ）配列番号１１０に記載されるＦＳ２２−１７２
の第１の配列である、請求項１から３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項５】
前記特異的結合メンバーが、前記ＣＨ３ドメインのＥＦ構造ループ中に位置する第２の配列をさらに含み、前記第２の配列が、配列番号１１１に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、又はＦＳ２２−１７２の第２の配列である、請求項１から４のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項６】
前記特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１３９に記載されるＦＳ２２−１７２−００３；
（ｉｉ）配列番号１３０に記載されるＦＳ２２−１７２−００２；
（ｉｉｉ）配列番号１４８に記載されるＦＳ２２−１７２−００４；
（ｉｖ）配列番号１２１に記載されるＦＳ２２−１７２−００１；
（ｖ）配列番号１５７に記載されるＦＳ２２−１７２−００５；
（ｖｉ）配列番号１６５に記載されるＦＳ２２−１７２−００６；又は
（ｖｉｉ）配列番号１１２に記載されるＦＳ２２−１７２
のＣＨ３ドメイン配列を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項７】
前記特異的結合メンバーが、配列番号１４１、１３２、１５０、１２３、１５９、１６７、及び１１４のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、又はＦＳ２２−１７２の配列を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項８】
前記第１の配列が、配列番号１９に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、及び又はＦＳ２２−０５３の第１の配列である、請求項１から３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項９】
前記特異的結合メンバーが、前記ＣＨ３ドメインのＥＦ構造ループ中に位置する第２の配列をさらに含み、前記第２の配列が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２０に記載されるＦＳ２２−０５３−００８；
（ｉｉ）配列番号２９に記載されるＦＳ２２−０５３−００９；
（ｉｉｉ）配列番号４７に記載されるＦＳ２２−０５３−０１１；
（ｉｖ）配列番号１０１に記載されるＦＳ２２−０５３−０１７；
（ｖ）配列番号７４に記載されるＦＳ２２−０５３−０１４；
（ｖｉ）配列番号３８に記載されるＦＳ２２−０５３−０１０；
（ｖｉｉ）配列番号５６に記載されるＦＳ２２−０５３−０１２；
（ｖｉｉｉ）配列番号６５に記載されるＦＳ２２−０５３−０１３；
（ｉｘ）配列番号８３に記載されるＦＳ２２−０５３−０１５；
（ｘ）配列番号９２に記載されるＦＳ２２−０５３−０１６；又は
（ｘｉ）配列番号１７４に記載されるＦＳ２２−０５３
の第２の配列である、請求項１から３又は８のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１０】
前記特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２１に記載されるＦＳ２２−０５３−００８；
（ｉｉ）配列番号３０に記載されるＦＳ２２−０５３−００９；
（ｉｉｉ）配列番号４８に記載されるＦＳ２２−０５３−０１１；
（ｉｖ）配列番号１０２に記載されるＦＳ２２−０５３−０１７；
（ｖ）配列番号７５に記載されるＦＳ２２−０５３−０１４；
（ｖｉ）配列番号３９に記載されるＦＳ２２−０５３−０１０；
（ｖｉｉ）配列番号５７に記載されるＦＳ２２−０５３−０１２；
（ｖｉｉｉ）配列番号６６に記載されるＦＳ２２−０５３−０１３；
（ｉｘ）配列番号８４に記載されるＦＳ２２−０５３−０１５；
（ｘ）配列番号９３に記載されるＦＳ２２−０５３−０１６；又は
（ｘｉ）配列番号１７５に記載されるＦＳ２２−０５３
のＣＨ３ドメイン配列を含む、請求項１から３及び８から９のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１１】
前記特異的結合メンバーが、配列番号２３、３２、５０、１０４、７７、４１、５９、６８、８６、９５、及び１５のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、又はＦＳ２２−０５３の配列を含む、請求項１から３及び８から１０のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１２】
前記特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３又はＦＳ２２−０５３−００８、好ましくは、ＦＳ２２−１７２−００３の第１の配列、第１及び第２の配列、ＣＨ３ドメイン配列、又は配列を含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１３】
前記特異的結合メンバーが、ＣＤＲベースの抗原結合部位をさらに含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１４】
前記特異的結合メンバーが、抗体分子である、請求項１３に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１５】
前記ＣＤＲベースの抗原結合部位が、免疫細胞抗原、腫瘍抗原、及び病原性抗原からなる群から選択される第２の抗原に結合する、請求項１５に記載の抗体分子。
【請求項１６】
前記特異的結合メンバー又は抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体への前記特異的結合メンバー又は抗体分子の結合を低減又は抑制するように修飾されている、請求項１から１５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子をコードする核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含む組み換え宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１から１６のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子を産生する方法であって、前記特異的結合メンバー又は抗体分子の産生のための条件下で、請求項１８に記載の組み換え宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２０】
治療法によるヒト又は動物身体の治療のための方法に使用するための、請求項１から１６のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【請求項２１】
前記治療が、個体における癌又は感染症の治療である、請求項２０に記載の使用のための特異的結合メンバー若しくは抗体分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＣＤ１３７に結合する特異的結合メンバーに関する。この特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含み、例えば、癌及び感染症の治療に利用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞シグナル伝達は、全ての生物の生命に不可欠な部分であり、通常、可溶性リガンド又は表面で発現されるリガンドと相互作用する細胞表面受容体を必要とする。この相互作用は、受容体、リガンド又はその両方に変化をもたらす。例えば、リガンド結合は、受容体を一緒にクラスター化させて二量体又はオリゴマーにする、受容体の構造変化を誘発し得る。次に、このクラスター化効果が、細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす。ＣＤ１３７などの、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーを含む、このように活性化される多くの受容体がある。
【０００３】
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ；ＴＮＦＲＳＦ９）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の共刺激分子である。ＣＤ１３７は、活性化の後、ＣＤ８＋  Ｔ細胞において上方制御されることが広く知られており、また、活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及び樹状細胞（ＤＣ）において発現され得る（Bartkowiak & Curran,2015）。Ｔ細胞細胞毒性の促進におけるＣＤ１３７の主な機能的役割が、１９９７年に初めて説明され（Shuford et al.,1997）、その後すぐに、抗ＣＤ１３７  ｍＡｂが、抗癌治療薬として提案された。
【０００４】
ＣＤ１３７は、ＣＲＤ１−４と呼ばれる４つの細胞外システインリッチドメイン、及びＣＤ１３７シグナル伝達に関与する細胞質領域を有する膜貫通タンパク質である。ＣＤ１３７のためのリガンドはＣＤ１３７Ｌである。結晶構造が、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ複合体には存在しないが、ＣＤ１３７が、ＣＤ１３７Ｌとともに三量体／三量体複合体を形成することが予測される（Won et al.,2010）。ＣＤ１３７Ｌのエンゲージメントは、受容体三量体の形成及びその後の複数の受容体三量体のクラスター化をもたらし、ＣＤ１３７シグナル伝達カスケードの活性化につながる。このシグナル伝達カスケードは、活性化誘導細胞死に対してＴ細胞に生存シグナルを与え（Hurtado et al.,1997）、それによって、有効なＴ細胞免疫応答を維持し、免疫記憶を生成するのに重要な役割を果たす（Bartkowiak & Curran,2015）。
【０００５】
白血球生物学におけるＣＤ１３７の役割が、腫瘍免疫学におけるその役割の陰で、明らかな生物学的合理性を有して一般に十分に理解されている。ＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞によって発現され、抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞を同定するマーカーとして使用されている。典型的に、ＣＤ１３７の発現は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞よりＣＤ８＋  Ｔ細胞においてより高い（Wen et al.,2002）。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の場合、インターフェロンγ及びインターロイキン２の産生を介した増殖、生存及び細胞傷害性エフェクター機能が、ＣＤ１３７のクラスター化に起因するとされてきた。ＣＤ１３７のクラスター化はまた、メモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞の分化及び維持に寄与する。ＣＤ４＋  Ｔ細胞のいくつかのサブセットにおいて、ＣＤ１３７のクラスター化は、同様に、増殖及び活性化につながり、インターロイキン２などのサイトカインの放出をもたらす（Makkouk et al.,2016）。
【０００６】
腫瘍標的化ｍＡｂを介したナチュラルキラー（ＮＫ）媒介性抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、インビトロ及びインビボのアゴニスト抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体を介したＣＤ１３７刺激の結果として増強されることが実証されている（Bartkowiak & Curran,2015）。ＮＫ細胞は、抗体アイソタイプに応じて、それらのＦｃ受容体を介して抗体に結合し、これは、ＮＫ細胞活性化につながり得、細胞傷害性顆粒放出及び標的細胞の溶解を引き起こす（Kohrt et al.,2012）。Kohrtらは、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体が、併用して投与される場合にＡＤＣＣを増強することによって、治療用抗体リツキシマブ、トラスツズマブ、及びセツキシマブの抗腫瘍活性を増強したことを実証した（Kohrt et al.,2014；Kohrt et al.,2011）。さらに、ヒトＮＫ細胞は、それらのＦｃγＲを介して細胞結合抗体に遭遇した後、ＣＤ１３７の発現を上方制御する。抗ＣＤ１３７抗体によるこれらのＮＫ細胞のその後の刺激は、腫瘍細胞に対してそれらのＡＤＣＣを増強することが示されている（Chester et al.,2015；Chester et al.,2016）。
【０００７】
Ｂリンパ球も、活性化時にＣＤ１３７を発現する。ＣＤ１３７リガンドの、ＣＤ１３７への結合は、Ｂ細胞増殖、生存及びサイトカイン産生を促進する。ＣＤ１３７発現はまた、ＣＤ４０の、そのリガンドＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）への結合の後、正常及び悪性ヒトＢ細胞において誘導されて、ＣＤ１３７が後に活性化される場合、Ｂ細胞生存の促進をもたらす（Vinay and Kwon,2011）。
【０００８】
ＣＤ１３７はまた、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の腫瘍反応性サブセットにおいて発現されることが実証されている。ＣＤ１３７単独療法は、ＭＣ３８、ＣＴ２６及びＢ細胞リンパ腫などのいくつかの前臨床免疫原性腫瘍モデルにおいて有効であることが示されている。化学療法、サイトカイン及び他のチェックポイント調節因子などの他の抗癌剤とのＣＤ１３７のエンゲージメントの組合せが、定着腫瘍の成長の低下を促進することが実証されている。具体的には、抗ＣＤ１３７抗体と、抗ＣＤ２０、抗ＥＧＦＲ、及び抗ＨＥＲ−２抗体の組合せが、様々な前臨床異種移植片モデルにおいて腫瘍成長の低下に対する相乗効果をもたらすことが示されている（Kohrt et al.,2014；Kohrt et al.,2012；Kohrt et al.,2011）。
【０００９】
腫瘍標的化モノクローナル抗体療法を、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体による治療と組み合わせることは、リンパ腫（Kohrt et al.,2011）、頭頸部癌、結腸直腸癌（Kohrt et al.,2014）及び乳癌（Kohrt et al.,2012）の前臨床モデルにおいて有望な結果を示した。抗ＣＤ２０  ｍＡｂリツキシマブ（ＮＣＴ０１３０７２６７、ＮＣＴ０２９５１１５６）、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂセツキシマブ（ＮＣＴ０２１１００８２）及び抗ＣＳ１  ｍＡｂエロツズマブ（ＮＣＴ０２２５２２６３）を含む、いくつかの腫瘍標的化モノクローナル抗体がまた、臨床においてＣＤ１３７アゴニスト抗体と組み合わせて試験されてきた。しかしながら、ＣＤ１３７アゴニスト抗体治療に関連する用量制限高度肝炎のため、臨床開発が遅れている。ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）、非リガンドブロッキングヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体（Chester et al,2018）が、臨床試験に入った最初の抗ＣＤ１３７抗体であったが、これらは、顕著なオンターゲット用量依存性肝毒性が観察された後、停止された（Chester et al.,2018）。より最近では、ウレルマブ治療を、放射線療法（ＮＣＴ０３４３１９４８）又は他の治療用抗体、例えば、リツキシマブ（ＮＣＴ０１７７５６３１）、セツキシマブ（ＮＣＴ０２１１００８２）、抗ＰＤ−１抗体ニボルマブ（ＮＣＴ０２２５３９９２、ＮＣＴ０２５３４５０６、ＮＣＴ０２８４５３２３）、及びニボルマブと抗ＬＡＧ−３抗体ＢＭＳ９８６０１６との組合せ（ＮＣＴ０２６５８９８１）と組み合わせた、固形癌の治療におけるウレルマブの臨床試験が再開された。しかしながら、ウレルマブ治療に関連する肝毒性を低減するために、これらの試験におけるウレルマブの投与は制限される必要があり、有効性の結果は残念なものであった（Chester et al.,2018）。
【００１０】
進行癌の第Ｉ相臨床試験において、０．０３ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまでの用量範囲のPfizerの抗ＣＤ１３７抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）、ヒトＩｇＧ２アイソタイプ抗体では、用量制限毒性が観察されなかった（Chester et al.2016；Segal et al.,2018）。しかしながら、この抗体による全客観的奏効率は、固形腫瘍を有する患者の３．８％に過ぎず、これは、ウトミルマブが、より有利な安全性プロフィールを有しつつも、ウレルマブより弱い効力及び臨床的有効性を有する可能性があることを示している（Chester et al.,2018；Segal et al.,2018）。ウトミルマブは、様々な治療の組合せの安全性、忍容性、用量制限毒性（ＤＬＴ）、最大耐量（ＭＴＤ）及び有効性を評価するために、放射線療法（ＮＣＴ０３２１７７４７）若しくは化学療法と組み合わせて、並びに他の抗体療法（抗ＰＤ−Ｌ１抗体アベルマブ（ＮＣＴ０２５５４８１２）、及び抗ＰＤ−１抗体ペンブロリズマブ（ＮＣＴ０２１７９９１８）を含む）と組み合わせて試験されてきた。これらの試験は、現在進行中であり、初期結果は、ウトミルマブ及びペンブロリズマブの組合せについて、５ｍｇ／ｋｇまでの用量についてＤＬＴがないこと及び２６％の患者の奏効率を示している。ウトミルマブと、アベルマブ及び他の癌免疫療法との３剤併用も試験されている（ＮＣＴ０２５５４８１２、ＮＣＴ０３２１７７４７）。
【００１１】
ＣＤ１３７を標的とするいくつかの二重特異的分子も、開発の初期段階にあり、その多くが、非抗体ベースの足場タンパク質又は融合タンパク質技術から得られる。ＤＡＲＰｉｎ足場タンパク質ベースの技術を用いたＣＤ１３７及びＦＡＰαを標的とする二重特異的分子の開発が報告されている（Link et al.,2018；Reichen et al.,2018）。ＨＥＲ２標的化及びＥｐｈＡ２標的化ＤＡＲＴ分子を用いたＣＤ１３７アゴニズムの腫瘍標的化によるＴ細胞活性化も示されている（Liu et al.,2017）。固形腫瘍及びリンパ腫中のＦＡＰα又はＣＤ１９を介して腫瘍を標的とするＣＤ１３７Ｌ融合タンパク質も開発されている。最も臨床的に進歩したＣＤ１３７二重特異的分子（且つ完全長抗体を含有する唯一のもの）は、ＰＲＳ−３４３、ＣＤ１３７／ＨＥＲ２二重特異的分子である。この分子において、ＣＤ１３７は、ＩｇＧ４フォーマットにおけるＨＥＲ２標的化抗体トラスツズマブのＦｃ部分に結合された人工結合タンパク質（アンチカリン）を介して結合される。ＰＲＳ−３４３は、ＨＥＲ２がヒト化マウスモデルにおいて過剰発現される部位におけるリンパ球上のＣＤ１３７の腫瘍標的依存性活性化を提供することが報告されているが、トラスツズマブ治療単独を超える腫瘍成長阻害の改善は観察されなかった（Hinner et al.,2016及び国際公開第２０１６／１７７８０２  Ａ１号）。ＰＲＳ−３４３は、最近、その安全性、忍容性及び有効性を評価するために、様々な固形腫瘍の治療のための第Ｉ相臨床試験に入った（ＮＣＴ０３３３０５６１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明の記述
上記の背景技術の項において説明されるように、ＣＤ１３７アゴニスト分子の臨床開発は、治療が用量制限高度肝炎（ウレルマブ）又は低い臨床的有効性（ウトミルマブ）のいずれかを伴うため、遅れている。
【００１３】
本発明者らは、高い活性を示すが、用量制限肝炎に関連しないＣＤ１３７アゴニスト分子が当該技術分野において必要とされていることを認識していた。このような分子は、分子の効力、及びひいては有効性を最適化する用量で個体に投与され得、免疫療法剤として癌の治療に、例えば、又は感染症の治療に用いられ得る。
【００１４】
理論に制約されるのを望むものではないが、肝臓中に存在するＴ細胞は、抗ＣＤ１３７アゴニスト分子によって活性化されて、肝炎を引き起こす可能性を有し得ると考えられる。ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、敗血症／ウイルス感染の後、肝炎及びアポトーシスを促進することが示されている（Wesche-Soldato et al.,2007）。マウスにおける抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体療法は、肝臓中へのＣＤ１３７依存性Ｔ細胞浸潤をもたらすことが示されている（Dubrot J et al.,2010）。これらの試験からの結果は、総合すると、ウレルマブなどの、高い活性を有する抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体が、肝臓中への活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞の浸潤を引き起こし、それによって、肝炎を引き起こし得ることを示す。或いは、ウレルマブ治療で観察される用量制限肝毒性は、この抗体によって結合された特定のエピトープに起因し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ＣＨ３ドメイン中のＣＤ１３７結合部位を含み、且つモノマーＣＤ１３７より高い親和性で二量体ＣＤ１３７に結合する一連の抗原結合Ｆｃ断片（本明細書において「Ｆｃａｂ」とも呼ばれる）を単離するために、幅広い選択及び親和性成熟プログラムを実施した。
【００１６】
本明細書において言及される「親和性」は、ＫＤによって測定される抗体分子とその同種抗原との間の結合相互作用の強さを指し得る。当業者に容易に明らかになるであろうように、抗体分子が、抗原と複数の結合相互作用を形成することが可能である場合（例えば、抗体分子が、抗原に２価的に結合することが可能である、任意に、抗原が二量体である場合）、ＫＤによって測定される親和性はまた、結合力によって影響され得、それによって、結合力は、抗体−抗原複合体の全体的な強さを指す。
【００１７】
Ｔ細胞によるＣＤ１３７の発現は、活性化の際に上方制御される。理論に制約されるのを望むものではないが、活性化Ｔ細胞におけるＣＤ１３７の高い発現のため、ＣＤ１３７は、このような細胞の表面上で二量体、三量体及びより高次の多量体の形態になるものと考えられる。対照的に、ナイーブなＴ細胞などのナイーブな免疫細胞は、それらの細胞表面において低い又はごくわずかなレベルのＣＤ１３７を発現するため、存在するＣＤ１３７は、モノマー形態である可能性が高い。したがって、モノマーＣＤ１３７より高い親和性で二量体ＣＤ１３７に結合するＦｃａｂが、例えば、ナイーブな免疫細胞とは対照的に、活性化Ｔ細胞などの活性化免疫細胞に優先的に結合することが予想される。
【００１８】
本発明のＦｃａｂはまた、二量体カニクイザルＣＤ１３７に結合することが可能であった。これは、それが、毒物学及び有効性試験が前臨床開発中にカニクイザルにおいて実施されるのを可能にするため、有益である。これは、肝炎がいくつかの抗ＣＤ１３７抗体で見られることを考えると、ＣＤ１３７に結合する抗体分子に関して特に有利である。単離されるＦｃａｂのうちの２つ、ＦＳ２２−０５３−０１４及びＦＳ２２−０５３−０１７が、マウスＣＤ１３７にも結合した。これは、それが、同じＦｃａｂが、カニクイザル又はヒトへの投与の前にマウスにおいて試験されるのを可能にするため、有利である。通常の状況下で、マウスＣＤ１３７に結合するＦｃａｂが、この目的のために必要とされる。
【００１９】
本発明者らは、意外なことに、モノマーＣＤ１３７より二量体に優先的に結合し、且つ親和性成熟されることが可能であった、単離された抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂ分子が全て、それらのＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、モチーフＰＰＹ、並びに５アミノ酸挿入を含んでいたことを見出した。最初のライブラリースクリーンの後に単離された抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂの別の系統は、これらの特徴を有しておらず、親和性成熟されることが可能でなかったため、さらに進めなかった。理論に制約されるのを望むものではないが、ＰＰＹモチーフの存在が、プロリン残基の限られた柔軟性の結果としてより堅固な又は露出されたループ構造を形成することによって、伸長された抗原結合領域の形成を促進し得ると考えられる。或いは、プロリンリッチ配列が、例えば、ＳＨ３ドメインタンパク質中の芳香族配列に結合することが実証されているため、ＰＰＹ配列は、ＣＤ１３７への結合に関与する特定の保存されたモチーフを示し得る。さらに、ＰＰＹ保存配列は、Ｆｃａｂの２つの別個の系統において独立して選択されているため、それは、ＣＤ１３７におけるエピトープ結合にとって重要であり得る。さらに、保存されたＬＥ又はＬＤ配列が、単離されたＦｃａｂの大部分のＣＨ３ドメインのＥＦループ中に存在しており、これは、このアミノ酸配列がまた、ＣＤ１３７結合にとって重要であり得ることを示唆している。
【００２０】
上記の背景技術の項において説明されるように、ＣＤ１３７リガンドの、その受容体、ＣＤ１３７への最初のライゲーションは、ＣＤ１３７の三量体化、続いて、受容体のクラスター化、ＮＦｋＢ細胞内シグナル伝達経路の活性化及びその後の免疫細胞活性化をもたらす一連の事象を開始させる。ＣＤ１３７を効率的に活性化する治療剤のために、いくつかのＣＤ１３７モノマーは、三量体リガンドを模倣する方法で一緒に架橋される必要がある。
【００２１】
ウトミルマブは、ＩｇＧ２分子であり、そのアゴニスト活性のためにＦｃγ受容体による架橋に依存している。ウレルマブは、構成的活性を有するＩｇＧ４分子であるため、活性のためにＦｃγ受容体による架橋を必要としないが、そのアゴニスト活性は、いくつかのＦｃγ受容体によって架橋すると促進される。Ｆｃγ受容体は、ヒトの全身にわたって見られる。したがって、ウトミルマブ及びウレルマブの免疫細胞活性化活性は、身体の特定の部位に限定されないため、肝臓中又は身体の他の箇所で発生し得る。
【００２２】
本発明者らは、本発明のＦｃａｂが、ＣＤ１３７をクラスター化し、それを活性化するために、架橋を必要とすることを示した。しかしながら、これは、ＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの固有の特徴ではないことに留意されたい。そうではなく、スクリーニングプログラム中に単離されたＦｃａｂの多くは、ＣＤ１３７に結合したが、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化のために架橋を必要としなかったか、又は架橋の非存在下で、限られたＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を誘発した。
【００２３】
上述されるように、Ｆｃγ受容体媒介性架橋は、Ｆｃγ受容体が、ヒトの全身にわたって見られるため、ＣＤ１３７の活性化が、特定の部位に限定されないという欠点を有する。したがって、本発明者らは、突然変異を、ＦｃａｂのＣＨ２ドメインに導入して、Ｆｃγ受容体結合を低減又は抑制した。したがって、Ｆｃγ受容体以外の薬剤による架橋の非存在下で、本発明のＦｃａｂは、ＣＤ１３７アゴニスト活性を示さないため、肝炎を誘発すると予想されない。
【００２４】
本発明者らは、本発明の抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂが、ＣＤ１３７に加えて、腫瘍抗原などの第２の抗原に結合する、多重特異的、例えば二重特異的分子を調製するのに使用され得ることを認識した。好ましくは、多重特異的分子は、第２の抗原に２価的に結合するが、第２の抗原が細胞結合腫瘍抗原である場合、抗原の１価結合が、特異的結合メンバー／抗体分子を架橋し、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を誘発するのに十分であることが予想される。具体的には、本発明者らは、Ｆａｂ領域を介して第２の抗原に２価的に結合する本発明の抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂを含む抗体分子を調製した。本発明者らは、このような二重特異的抗体分子が、従来の抗体分子によって必要とされる例えばＦｃγ受容体媒介性架橋を必要とせずに、前記第２の抗原の存在下で、コンディショナルでＣＤ１３７を活性化することが可能であることを示した。第２の抗原への抗体分子の結合が、前記抗原の部位における抗体分子の架橋を引き起こし、これがひいてはＴ細胞表面におけるＣＤ１３７のクラスター化及び活性化をもたらすと考えられる。したがって、抗体分子のアゴニスト活性は、存在している第２の抗原及びＣＤ１３７の両方に依存している。言い換えると、アゴニスト活性は、存在している両方の抗原次第である。さらに、第２の抗原の存在下における抗体の架橋は、抗体分子の定常ドメイン抗原結合部位を介して結合されるＣＤ１３７のクラスター化を助けると考えられる。したがって、第２の抗原が、腫瘍抗原などの疾患抗原である場合、抗体分子は、例えば腫瘍微小環境中で、疾患に依存して免疫細胞を活性化することが可能であると予想される。免疫細胞のこの標的化された活性化は、例えばウレルマブ治療で見られる肝炎を回避するのに有益であると予想される。
【００２５】
本発明者らはまた、本発明の抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂを含む二重特異的抗体分子が、インビボで腫瘍成長を抑制することが可能であることを示しており、ここで、抗体分子によって結合される第２の抗原は、免疫細胞抗原、腫瘍抗原、又は腫瘍細胞及び免疫細胞の両方において発現される抗原であった。さらに、より有効な腫瘍成長の抑制が、２つの単一特異的な抗体分子の組合せ（ここで、抗体分子の一方が、二重特異的分子と同じ定常ドメインを含み、他方の抗体分子が、二重特異的分子と同じ可変ドメイン結合部位を含んでいた）と比較して、これらの二重特異的抗体分子で観察され、これは、ＣＤ１３７の促進されたラスター化及びシグナル伝達、ひいてはＴ細胞活性化及び対応する抗腫瘍効果が、２つの結合部位が同じ分子中に存在するときに見られたことを示している。
【００２６】
本発明の抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂ及び第２の抗原に特異的なＦａｂ領域を含む抗体分子は、好ましくは、ＣＤ１３７及び第２の抗原の両方に２価的に結合する。これは、両方の標的の２価結合が、ＣＤ１３７を発現するＴ細胞と第２の抗原との間の架橋をより安定させ、それによって、Ｔ細胞が、腫瘍微小環境などの特定の部位に限局され、疾患、例えば腫瘍に作用し得る時間を延長することが予想されるため、有利である。これは、ヘテロ二量体であり、１つのＦａｂアームを介して１価的に各標的抗原に結合する従来の二重特異的抗体フォーマットの大部分と異なる。このような１価相互作用は、より不安定であるだけでなく、多くの場合、第一にＣＤ１３７などのＴＮＦ受容体のクラスター化を誘発するのに不十分であることが予想される。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、抗体分子は、ＣＤ１３７に２価的に結合することが可能な本発明の抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂ、及び単一Ｆａｂドメインなどの、第２の抗原に特異的な１価結合部位を含む。１価結合部位は、例えば腫瘍関連抗原に結合し得る。このような分子に関して、第２の抗原の１価結合は、細胞表面における抗体分子のより緊密な充填を可能にし、ＣＤ１３７の促進されたクラスター化及びひいてはＴ細胞活性化をもたらすと予想される。
【００２８】
本発明の抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂを含む抗体分子のさらなる特徴は、ＣＤ１３７及び第２の抗原のための２つの抗原結合部位が両方とも、抗体構造自体の中に含まれることである。特に、抗体分子は、その標的の両方に２価的に結合する分子をもたらすために、他のタンパク質がリンカー又は他の手段を介して抗体分子に融合される必要がない。これは、多くの利点を有する。具体的には、抗体分子は、さらなる融合された部分を含まないため、標準的な抗体の産生に用いられるものと類似の方法を用いて産生され得る。リンカーが、時間とともに分解して、抗体分子の不均一な集団をもたらし得るため、この構造はまた、改善した抗体安定性をもたらすことが予測される。１つのみのタンパク質が融合された集団中のそれらの抗体は、２つのタンパク質が融合された抗体と同じくらい効率的に、ＣＤ１３７などのＴＮＦ受容体のコンディショナルなアゴニズムを誘発することができないこともある。リンカーの切断又は分解は、患者への治療薬の投与前又は投与後に（例えば酵素的切断又は患者のインビボｐＨによって）起こり、それによって、患者の循環中でその有効性の低下をもたらし得る。抗体分子中にリンカーがない際、抗体分子は、投与前及び投与後の両方で同じ数の結合部位を保持することが予想される。さらに、融合されたタンパク質若しくはリンカー又はその両方の導入が、抗体分子が患者に投与されるときに免疫原性を誘発し、治療薬の有効性の低下をもたらし得るため、この分子の構造は、分子の免疫原性の観点からも好ましい。
【００２９】
本発明者らは、ＣＤ１３７抗原結合部位の堅固な配置及び／又は本発明のＦｃａｂ分子の堅固な構造から得られる近接性が、分子と比較してＣＤ１３７のクラスター化を誘発するのに有利であることをさらに示しており、ここで、ＣＤ１３７結合部位は、抗体構造と一体ではないが、例えば、可撓性リンカーを介して、例えば抗体分子、又はその部分に結合された結合部分によって提供される。
【００３０】
したがって、本発明は、以下を提供する：
［１］  ＣＤ１３７に結合し、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン中に位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、ＣＤ１３７抗原結合部位が、ＣＨ３ドメインのＡＢ構造ループ中に位置する第１の配列を含み、前記配列が、配列ＰＰＹ（配列番号１０）を含む、特異的結合メンバー。
【００３１】
［２］  特異的結合メンバーが、ＡＢ構造ループ中に挿入を含む、［１］に記載の特異的結合メンバー。
【００３２】
［３］  前記挿入が、１から１０アミノ酸長である、［２］に記載の特異的結合メンバー。
【００３３】
［４］  前記挿入が、４から６アミノ酸長である、［３］に記載の特異的結合メンバー。
【００３４】
［５］  前記挿入が、５アミノ酸長である、［４］に記載の特異的結合メンバー。
【００３５】
［６］  挿入が、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１０及び１９位の間に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従う、［２］から［５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００３６】
［７］  挿入が、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１４及び１７位の間に位置する、［６］に記載の特異的結合メンバー。
【００３７】
［８］  挿入が、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１６及び１７位の間に位置する、［７］に記載の特異的結合メンバー。
【００３８】
［９］  挿入が、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１６．５から１６．１位に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従う、［２］から［８］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００３９】
［１０］  ＰＰＹ配列が、ＣＨ３ドメインの１５及び１７位の間に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１］から［９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００４０】
［１１］  ＰＰＹ配列が、ＣＨ３ドメインの１６及び１７位の間に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１］から［１０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００４１】
［１２］  ＰＰＹ配列が、ＣＨ３ドメインの１６．３、１６．２及び１６．１位に位置する、［１１］に記載の特異的結合メンバー。
【００４２】
［１３］  第１の配列が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１３８に記載されるＦＳ２２−１７２−００３；
（ｉｉ）配列番号１２９に記載されるＦＳ２２−１７２−００２；
（ｉｉｉ）配列番号１４７に記載されるＦＳ２２−１７２−００４；
（ｉｖ）配列番号１２０に記載されるＦＳ２２−１７２−００１；
（ｖ）配列番号１５６に記載されるＦＳ２２−１７２−００５；
（ｖｉ）配列番号１１０に記載されるＦＳ２２−１７２−００６；又は
（ｖｉｉ）配列番号１１０に記載されるＦＳ２２−１７２
の第１の配列である、［１］から［１２］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００４３】
［１４］  第１の配列が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１３８に記載されるＦＳ２２−１７２−００３；
（ｉｉ）配列番号１２９に記載されるＦＳ２２−１７２−００２；
（ｉｉｉ）配列番号１４７に記載されるＦＳ２２−１７２−００４；
（ｉｖ）配列番号１２０に記載されるＦＳ２２−１７２−００１；
（ｖ）配列番号１５６に記載されるＦＳ２２−１７２−００５；又は
（ｖｉ）配列番号１１０に記載されるＦＳ２２−１７２−００６
の第１の配列である、［１３］に記載の特異的結合メンバー。
【００４４】
［１５］  第１の配列が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１３８に記載されるＦＳ２２−１７２−００３；
（ｉｉ）配列番号１２９に記載されるＦＳ２２−１７２−００２；又は
（ｉｉｉ）配列番号１４７に記載されるＦＳ２２−１７２−００４
の第１の配列である、［１４］に記載の特異的結合メンバー。
【００４５】
［１６］  第１の配列が、配列番号１３８に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３の第１の配列である、［１５］に記載の特異的結合メンバー。
【００４６】
［１７］  ＰＰＹ配列が、ＣＨ３ドメインの１６、１６．５及び１６．４位に位置する、［１０］に記載の特異的結合メンバー。
【００４７】
［１８］  第１の配列が、配列番号１９に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、又はＦＳ２２−０５３、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８の第１の配列である、［１］から［１０］又は［１７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００４８】
［１９］  第１の配列が、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１４及び１７位の間に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［１３］から［１６］又は［１８］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００４９】
［２０］  第１の配列が、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１５、１６、１６．５、１６．４、１６．３、１６．２、及び１６．１位に位置する、［１９］に記載の特異的結合メンバー。
【００５０】
［２１］  特異的結合メンバーが、ＣＨ３ドメインのＥＦ構造ループ中に位置する第２の配列をさらに含む、［１］から［２０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００５１】
［２２］  第２の配列が、配列番号１１１に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、又はＦＳ２２−１７２、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３の第２の配列である、［２１］に記載の特異的結合メンバー。
【００５２】
［２３］  第２の配列が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２０に記載されるＦＳ２２−０５３−００８；
（ｉｉ）配列番号２９に記載されるＦＳ２２−０５３−００９；
（ｉｉｉ）配列番号４７に記載されるＦＳ２２−０５３−０１１；
（ｉｖ）配列番号１０１に記載されるＦＳ２２−０５３−０１７；
（ｖ）配列番号７４に記載されるＦＳ２２−０５３−０１４；
（ｖｉ）配列番号３８に記載されるＦＳ２２−０５３−０１０；
（ｖｉｉ）配列番号５６に記載されるＦＳ２２−０５３−０１２；
（ｖｉｉｉ）配列番号６５に記載されるＦＳ２２−０５３−０１３；
（ｉｘ）配列番号８３に記載されるＦＳ２２−０５３−０１５；
（ｘ）配列番号９２に記載されるＦＳ２２−０５３−０１６；又は
（ｘｉ）配列番号１７４に記載されるＦＳ２２−０５３
の第２の配列である、［２１］に記載の特異的結合メンバー。
【００５３】
［２４］  第２の配列が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２０に記載されるＦＳ２２−０５３−００８；
（ｉｉ）配列番号２９に記載されるＦＳ２２−０５３−００９；
（ｉｉｉ）配列番号４７に記載されるＦＳ２２−０５３−０１１；
（ｉｖ）配列番号１０１に記載されるＦＳ２２−０５３−０１７；又は
（ｖ）配列番号７４に記載されるＦＳ２２−０５３−０１４
の第２の配列である、［２３］に記載の特異的結合メンバー。
【００５４】
［２５］  第２の配列が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２０に記載されるＦＳ２２−０５３−００８；
（ｉｉ）配列番号２９に記載されるＦＳ２２−０５３−００９；
（ｉｉｉ）配列番号４７に記載されるＦＳ２２−０５３−０１１；又は
（ｉｖ）配列番号１０１に記載されるＦＳ２２−０５３−０１７
の第２の配列である、［２４］に記載の特異的結合メンバー。
【００５５】
［２６］  第２の配列が、配列番号２０に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８の第２の配列である、［２５］に記載の特異的結合メンバー。
【００５６】
［２７］  第２の配列が、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの９２から９８位に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［２１］から［２６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００５７】
［２８］  特異的結合メンバーが、ＣＨ３ドメインのＣＤ構造ループ中に位置する第３の配列をさらに含む、［１］から［２７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００５８】
［２９］  第３の配列が、特異的結合メンバーの４３から７８位に位置し、ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う、［２８］に記載の特異的結合メンバー。
【００５９】
［３０］  第３の配列が、配列番号２に記載される配列を有する、［２８］から［２９］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００６０】
［３１］  ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインである、［１］から［３０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００６１】
［３２］  特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１３９に記載されるＦＳ２２−１７２−００３；
（ｉｉ）配列番号１３０に記載されるＦＳ２２−１７２−００２；
（ｉｉｉ）配列番号１４８に記載されるＦＳ２２−１７２−００４；
（ｉｖ）配列番号１２１に記載されるＦＳ２２−１７２−００１；
（ｖ）配列番号１５７に記載されるＦＳ２２−１７２−００５；
（ｖｉ）配列番号１６５に記載されるＦＳ２２−１７２−００６；又は
（ｖｉｉ）配列番号１１２に記載されるＦＳ２２−１７２
のＣＨ３ドメイン配列を含む、［１］から［１６］、［１９］から［２２］及び［２７］から［３１］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００６２】
［３３］  特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１３９に記載されるＦＳ２２−１７２−００３；
（ｉｉ）配列番号１３０に記載されるＦＳ２２−１７２−００２；
（ｉｉｉ）配列番号１４８に記載されるＦＳ２２−１７２−００４；
（ｉｖ）配列番号１２１に記載されるＦＳ２２−１７２−００１；
（ｖ）配列番号１５７に記載されるＦＳ２２−１７２−００５；又は
（ｖｉ）配列番号１６５に記載されるＦＳ２２−１７２−００６
のＣＨ３ドメイン配列を含む、［３２］に記載の特異的結合メンバー。
【００６３】
［３４］  特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１３９に記載されるＦＳ２２−１７２−００３；
（ｉｉ）配列番号１３０に記載されるＦＳ２２−１７２−００２；又は
（ｉｉｉ）配列番号１４８に記載されるＦＳ２２−１７２−００４
のＣＨ３ドメイン配列を含む、［３３］に記載の特異的結合メンバー。
【００６４】
［３５］  特異的結合メンバーが、配列番号１３９に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３のＣＨ３ドメイン配列を含む、［３４］に記載の特異的結合メンバー。
【００６５】
［３６］  特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２１に記載されるＦＳ２２−０５３−００８；
（ｉｉ）配列番号３０に記載されるＦＳ２２−０５３−００９；
（ｉｉｉ）配列番号４８に記載されるＦＳ２２−０５３−０１１；
（ｉｖ）配列番号１０２に記載されるＦＳ２２−０５３−０１７；
（ｖ）配列番号７５に記載されるＦＳ２２−０５３−０１４；
（ｖｉ）配列番号３９に記載されるＦＳ２２−０５３−０１０；
（ｖｉｉ）配列番号５７に記載されるＦＳ２２−０５３−０１２；
（ｖｉｉｉ）配列番号６６に記載されるＦＳ２２−０５３−０１３；
（ｉｘ）配列番号８４に記載されるＦＳ２２−０５３−０１５；
（ｘ）配列番号９３に記載されるＦＳ２２−０５３−０１６；又は
（ｘｉ）配列番号１７５に記載されるＦＳ２２−０５３
のＣＨ３ドメイン配列を含む、［１］から［１０］、［１７］から［１８］、［１９］から［２１］及び［２３］から［３１］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００６６】
［３７］  特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２１に記載されるＦＳ２２−０５３−００８；
（ｉｉ）配列番号３０に記載されるＦＳ２２−０５３−００９；
（ｉｉｉ）配列番号４８に記載されるＦＳ２２−０５３−０１１；
（ｉｖ）配列番号１０２に記載されるＦＳ２２−０５３−０１７；又は
（ｖ）配列番号７５に記載されるＦＳ２２−０５３−０１４
のＣＨ３ドメイン配列を含む、［３６］に記載の特異的結合メンバー。
【００６７】
［３８］  特異的結合メンバーが、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２１に記載されるＦＳ２２−０５３−００８；
（ｉｉ）配列番号３０に記載されるＦＳ２２−０５３−００９；
（ｉｉｉ）配列番号４８に記載されるＦＳ２２−０５３−０１１；又は
（ｉｖ）配列番号１０２に記載されるＦＳ２２−０５３−０１７
のＣＨ３ドメイン配列を含む、［３７］に記載の特異的結合メンバー。
【００６８】
［３９］  特異的結合メンバーが、配列番号２１に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８のＣＨ３ドメイン配列を含む、［３８］に記載の特異的結合メンバー。
【００６９】
［４０］  特異的結合メンバーが、配列番号１０２に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−０１７のＣＨ３ドメイン配列を含む、［３７］に記載の特異的結合メンバー。
【００７０】
［４１］  特異的結合メンバーが、配列番号７５に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−０１４のＣＨ３ドメイン配列を含む、［３７］に記載の特異的結合メンバー。
【００７１】
［４２］  特異的結合メンバーが、ＣＨ２ドメイン、好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインをさらに含む、［１］から［４１］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００７２】
［４３］  特異的結合メンバーが、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをそれぞれが含む２つの同一のポリペプチド鎖の二量体である、［１］から［４２］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００７３】
［４４］  ＣＨ２ドメインが、配列番号６又は５に記載される配列を有する、［４２］又は［４３］に記載の特異的結合メンバー。
【００７４】
［４５］  ＣＨ２ドメインのＮ末端に、免疫グロブリンヒンジ領域、又はその部分、好ましくは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、又はその部分をさらに含む、［４２］から［４４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００７５】
［４６］  ヒンジ領域が、配列番号１７９に記載される配列又はその断片を有する、［４５］に記載の特異的結合メンバー。
【００７６】
［４７］  ヒンジ領域が、配列番号７に記載される配列を有する、［４６］に記載の特異的結合メンバー。
【００７７】
［４８］  特異的結合メンバーが、配列番号１４１、１３２、１５０、１２３、１５９、１６７、及び１１４のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、又はＦＳ２２−１７２の配列を含む、［１］から［１６］、［１９］から［２２］、［２７］から［３５］、及び［４２］から［４７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００７８】
［４９］  特異的結合メンバーが、配列番号１４１、１３２、１５０、１２３、１５９及び１６７２のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、又はＦＳ２２−１７２−００６の配列を含む、［４８］に記載の特異的結合メンバー。
【００７９】
［５０］  特異的結合メンバーが、配列番号１４１、１３２及び１５０のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、又はＦＳ２２−１７２−００４の配列を含む、［４９］に記載の特異的結合メンバー。
【００８０】
［５１］  特異的結合メンバーが、配列番号１４１に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３の配列を含む、［５０］に記載の特異的結合メンバー。
【００８１】
［５２］  特異的結合メンバーが、配列番号２３、３２、５０、１０４、７７、４１、５９、６８、８６、９５及び１７５のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、又はＦＳ２２−０５３の配列を含む、［１］から［１０］、［１７］から［１８］、［１９］から［２１］、［２３］から［３１］、及び［３６］から［４７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００８２】
［５３］  特異的結合メンバーが、配列番号２３、３２、５０、１０４、及び７７のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、又はＦＳ２２−０５３−０１４の配列を含む、［５２］に記載の特異的結合メンバー。
【００８３】
［５４］  特異的結合メンバーが、配列番号２３、３２、５０、及び１０３のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、又はＦＳ２２−０５３−０１７の配列を含む、［５３］に記載の特異的結合メンバー。
【００８４】
［５５］  特異的結合メンバーが、配列番号２３に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８の配列を含む、［５４］に記載の特異的結合メンバー。
【００８５】
［５６］  特異的結合メンバーが、ヒトＣＤ１３７に結合する、［１］から［５５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００８６】
［５７］  ヒトＣＤ１３７が、配列番号１８１に記載される配列を有するか、それを含むか又はそれからなる、［５６］に記載の特異的結合メンバー。
【００８７】
［５８］  特異的結合メンバーが、モノマーＣＤ１３７に対するより高い親和性で二量体ＣＤ１３７に結合する、［１］から［５５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００８８】
［５９］  特異的結合メンバーが、カニクイザルＣＤ１３７に結合する、［１］から［５８］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００８９】
［６０］  カニクイザルＣＤ１３７が、配列番号１８３に記載される配列を有するか、それを含むか又はそれからなる、［５９］に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【００９０】
［６１］  特異的結合メンバーが、第２の抗原結合部位をさらに含む、［１］から［６０］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００９１】
［６２］  特異的結合メンバーが、多重特異的分子である、［６１］に記載の特異的結合メンバー。
【００９２】
［６３］  特異的結合メンバーが、二重特異的、三重特異的、又は四重特異的分子である、［６２］に記載の特異的結合メンバー。
【００９３】
［６４］  特異的結合メンバーが、二重特異的分子である、［６３］に記載の特異的結合メンバー。
【００９４】
［６５］  第２の抗原結合部位が、ＣＤＲベースの抗原結合部位である、［６１］から［６４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００９５】
［６６］  第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、［６５］に記載の特異的結合メンバー。
【００９６】
［６７］  第２の抗原結合部位が、重鎖可変及び軽鎖可変ドメインを含む、［６１］から［６６］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００９７】
［６８］  特異的結合メンバーが、抗体分子である、［６１］から［６７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー。
【００９８】
［６９］  抗体分子が、ヒトＩｇＧ１分子である、［６８］に記載の抗体分子。
【００９９】
［７０］  抗体分子のＣＤＲベースの抗原結合部位が、免疫細胞抗原、及び疾患抗原からなる群から選択される第２の抗原に結合する、［６５］から［６９］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【０１００】
［７１］  疾患抗原が、腫瘍抗原又は病原性抗原である、［７０］に記載の抗体分子。
【０１０１】
［７２］  免疫細胞抗原が、ＰＤ−Ｌ１などの免疫調節分子である、［７０］に記載の抗体分子。
【０１０２】
［７３］  免疫細胞抗原が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである、［７０］に記載の抗体分子。
【０１０３】
［７４］  腫瘍抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、［７１］に記載の抗体分子。
【０１０４】
［７５］  腫瘍抗原が、癌細胞上の細胞表面抗原である、［７１］又は［７４］に記載の抗体分子。
【０１０５】
［７６］  腫瘍抗原が、可溶性多量体である、［７１］に記載の抗体分子。
【０１０６】
［７７］  可溶性多量体が、少なくとも二量体である、［７６］に記載の抗体分子。
【０１０７】
［７８］  可溶性多量体が、少なくとも三量体である、［７７］に記載の抗体分子。
【０１０８】
［７９］  病原性抗原が、細菌又はウイルス抗原である、［７１］に記載の抗体分子。
【０１０９】
［８０］  抗体分子が、第２の抗原の存在下で、免疫細胞上に存在するＣＤ１３７を活性化することが可能である、［７０］から［７９］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【０１１０】
［８１］  ＣＤ１３７及び第２の抗原への抗体分子の結合が、免疫細胞上のＣＤ１３７のクラスター化を引き起こす、［７０］から［８０］のいずれか１つに記載の抗体分子。
【０１１１】
［８２］  免疫細胞が、Ｔ細胞である、［８０］又は［８１］に記載の抗体分子。
【０１１２】
［８３］  特異的結合メンバー又は抗体分子が、１つ以上のＦｃγ受容体への特異的結合メンバー又は抗体分子のＣＨ２ドメインの結合を低減又は抑制するように修飾されている、［１］から［８２］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【０１１３】
［８４］  特異的結合メンバー又は抗体分子が、Ｆｃγ受容体を活性化しない、［１］から［８３］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【０１１４】
［８５］  Ｆｃγ受容体が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択される、［８３］又は［８４］に記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【０１１５】
［８６］  特異的結合メンバー又は抗体分子が、生物活性分子にコンジュゲートされる、［１］から［８５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【０１１６】
［８７］  特異的結合メンバー又は抗体分子が、検出可能な標識にコンジュゲートされる、［１］から［８５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【０１１７】
［８８］  ［１］から［８５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子をコードする核酸分子。
【０１１８】
［８９］  核酸分子が、
（ｉ）配列番号２２、３１、４９、１０３、７６、４０、５８、６７、８５、９４、及び１７６のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、若しくはＦＳ２２−０５３のＣＨ３ドメイン核酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１４０、１３１、１４９、１２２、１５８、１６６、及び１１３のそれぞれに記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、若しくはＦＳ２２−１７２のＣＨ３ドメイン核酸配列
を含む、［８８］に記載の核酸分子。
【０１１９】
［９０］  核酸分子が、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２４、３３、５１、１０５、７８、４２、６０、６９、８７、９６、及び１７７のそれぞれに記載されるＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、若しくはＦＳ２２−０５３；又は
（ｉｉ）配列番号１４２、１３３、１５１、１２４、１６０、１６８、及び１１５のそれぞれに記載されるＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、若しくはＦＳ２２−１７２
の核酸配列を含む、［８８］又は［８９］に記載の核酸分子。
【０１２０】
［９１］  核酸分子が、特異的結合メンバー：
（ｉ）ＦＳ２２−１７２−００３；又は
（ｉｉ）ＦＳ２２−０５３−００８
のＣＨ３ドメイン核酸配列、又は核酸配列を含む、［８９］又は［９０］に記載の核酸分子。
【０１２１】
［９２］  ［８８］から［９１］のいずれか１つに記載の核酸を含むベクター。
【０１２２】
［９３］  ［８８］から［９１］のいずれか１つに記載の核酸、又は［９２］に記載のベクターを含む組み換え宿主細胞。
【０１２３】
［９４］  ［１］から［８５］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子を産生する方法であって、特異的結合メンバー又は抗体分子の産生のための条件下で、［９３］に記載の組み換え宿主細胞を培養することを含む、方法。
【０１２４】
［９５］  特異的結合メンバー又は抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含む、［６１］に記載の方法。
【０１２５】
［９６］  ［１］から［９４］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【０１２６】
［９７］  治療法によるヒト又は動物身体の治療のための方法に使用するための、［１］から［８７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子。
【０１２７】
［９８］  個体における疾患又は障害を治療する方法であって、治療有効量の、［１］から［８７］のいずれか１つに記載の特異的結合メンバー又は抗体分子を個体に投与することを含む、方法。
【０１２８】
［９９］  治療が、個体における癌又は感染症の治療である、［９７］に記載の使用のための特異的結合メンバー若しくは抗体分子、又は［９８］に記載の方法。
【０１２９】
［１０］  治療の方法が、第２の治療薬と組み合わせて、特異的結合メンバー又は抗体分子を個体に投与することを含む、［９７］又は［９９］に記載の使用のための特異的結合メンバー又は抗体分子、又は［９８］又は［９９］に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００５及びＦＳ２２−１７２−００６並びに野生型（ＷＴ）ＦｃａｂのＣＨ３ドメインの配列のアラインメントを示す。ＩＭＧＴ、ＩＭＧＴエクソン（連続した番号付け）、ＥＵ及びＫａｂａｔ番号付け方式に従う残基の番号が示される。
【図１Ｂ】Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００５及びＦＳ２２−１７２−００６並びに野生型（ＷＴ）ＦｃａｂのＣＨ３ドメインの配列のアラインメントを示す。ＩＭＧＴ、ＩＭＧＴエクソン（連続した番号付け）、ＥＵ及びＫａｂａｔ番号付け方式に従う残基の番号が示される。
【図１Ｃ】Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００５及びＦＳ２２−１７２−００６並びに野生型（ＷＴ）ＦｃａｂのＣＨ３ドメインの配列のアラインメントを示す。ＩＭＧＴ、ＩＭＧＴエクソン（連続した番号付け）、ＥＵ及びＫａｂａｔ番号付け方式に従う残基の番号が示される。
【図１Ｄ】親ＦＳ２２−０５３  ＣＨ３ドメインと比較してクローンＦＳ２２−０５３−００８からＦＳ２２−０５３−０１６及びＦＳ２２−０５３−０１７（実施例１０．１を参照）のＣＨ３ドメインの配列同一性パーセンテージを示す。
【図１Ｅ】親ＦＳ２２−０５３  ＣＨ３ドメインと比較してクローンＦＳ２２−１７２−００１からＦＳ２２−１７２−００６のＣＨ３ドメインの配列同一性パーセンテージを示す。
【図２】ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化によって引き起こされるルシフェラーゼ産生の尺度としての発光値によって決定されるＮＦ−ｋＢシグナル伝達を示す。ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２フォーマットにおける抗ヒトＣＤ１３７親Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２は、ＨＥＫ  ｈＣＤ１３７  ＮＦ−ｋＢレポーターアッセイにおいてプロテインＬと架橋される場合、限られたＣＤ１３７のクラスター化及びＮＦ−ｋＢシグナル伝達を駆動する（白丸及び黒丸）。ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２フォーマットにおける親和性成熟した抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００８、−００９、−０１１（白色の四角、三角、及び菱形）及びＦＳ２２−１７２−００２、−００３、−００４（黒色の四角、三角、及び菱形）は、親クローンと比較して、ＨＥＫ  ｈＣＤ１３７  ＮＦ−ｋＢレポーターアッセイにおいてプロテインＬと架橋される場合、より強いＣＤ１３７のクラスター化及びＮＦ−ｋＢシグナル伝達を駆動する。陽性対照抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂ、２０Ｈ４．９は、プロテインＬと架橋される場合、発光の増加（点線）を示し、親和性成熟した抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂと比較してより小さいＥＣ５０値を有していた。
【図３】抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおけるＩＬ−２放出を示す。ＰＤ−Ｌ１（Ｓ７０  ＬＡＬＡ）ｍＡｂ２フォーマットにおけるＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１及びＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００４は、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ細胞と架橋される場合にのみ、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を駆動して（白色及び黒色の塗りつぶされた記号）、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいてマウスインターロイキン−２（ｍＩＬ−２）の放出をもたらす。増加する濃度で、陽性対照抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂ、２０Ｈ４．９は、ｍＩＬ−２放出の増加（点線）を示したが、最大放出は、抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂのものより著しく低かった。架橋するためにＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ細胞を用いないＰＤ−Ｌ１モデルｍＡｂ２フォーマットにおける全ての抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂ（塗りつぶされた灰色の記号）は、架橋される場合と比較して著しく低いｍＩＬ−２放出を示す（白色及び黒色の塗りつぶされた記号）。
【図４】ヒト初代ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の放出を示す。ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２フォーマットにおける親和性成熟した抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００３及びＦＳ２２−１７２−００４は、ｍＡｂ２が、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ細胞によって架橋された場合、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＣＤ１３７の活性化を駆動して、ヒトＩＬ−２の放出をもたらした。親和性成熟したＦｃａｂの活性は、親Ｆｃａｂ、ＦＳ２２−０５３（白丸）及びＦＳ２２−１７２（黒丸）の活性より良好であった。陽性対照抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂ、２０Ｈ４．９（点線）は、ｈＩＬ−２放出の増加を示し、Ｆｃａｂによるより多い、ＩＬ−２の放出があったが、ＥＣ５０値は、いくつかの抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂのものより大きく、これは、良好な活性が、いくつかの抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂで達成されたことを示している。
【図５】ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化によって引き起こされるルシフェラーゼ産生の尺度としての発光値によって決定されるＮＦ−ｋＢシグナル伝達を示す。ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  ＦＳ２２ｍ−０６３は、ＨＥＫ  ｍＣＤ１３７  ＮＦ−ｋＢレポーターアッセイにおいて、プロテインＬと架橋される場合（黒丸）、ＣＤ１３７のクラスター化及びＮＦ−ｋＢシグナル伝達を駆動した。１００ｎＭを超える濃度で、且つプロテインＬと架橋されない場合、ＦＳ２２ｍ−０６３は、いくらかのＣＤ１３７のクラスター化及びＮＦ−ｋＢシグナル伝達を駆動したが、架橋される場合（白丸）よりはるかに低いレベルであった。陽性対照抗マウスＣＤ１３７  ｍＡｂ、Ｌｏｂ１２．３は、架橋なしの場合（白色の四角）と比較して、プロテインＬと架橋される場合（黒色の四角）、発光の増加を示したが、最も高い抗体濃度で達成された最大応答は、抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂのものより著しく少なかった。予想どおり、アイソタイプ対照は、活性を示さなかった。
【図６】Ｇ１−ＡＡ／４４２０（ＩｇＧ対照）、Ｇ１−ＡＡ／Ｓ７０（ＰＤ−Ｌ１陽性対照）、Ｇ１−ＡＡ／Ｌｏｂ１２．３（ＣＤ１３７陽性対照）、Ｇ１−ＡＡ／Ｓ７０プラスＧ１−ＡＡ／Ｌｏｂ１２．３とＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｓ７０との組合せ（ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  ＦＳ２２ｍ−０６３）で処理されたＣ５７ＢＬ６マウスにおいて、皮下で成長されたＭＣ３８同系腫瘍モデルの腫瘍体積測定を示す。平均腫瘍体積［ｍｍ３］±９５％信頼区間が示される。ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｓ７０は、ＩｇＧ対照処理マウス、抗ＰＤ−Ｌ１陽性対照ｍＡｂ処理マウス、抗ＣＤ１３７陽性対照処理マウスと比較して、ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を有意に低減することができた。混合モデル分析を用いて、試験の全時間にわたる成長速度についてペアワイズで示される統計的有意性。＊＊＊＊≦０．０００１  ｐ−値。
【図７Ａ】Ｇ１−ＡＡ／４４２０（ＩｇＧ対照）、Ｇ１−ＡＡ／Ｆ２（ＰＤ−１陽性対照）、Ｇ１／Ｌｏｂ１２．３（ＣＤ１３７陽性対照）、Ｇ１−ＡＡ／Ｆ２プラスＧ１−ＡＡ／Ｌｏｂ１２．３とＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｆ２との組合せ（ＰＤ−１  ｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  ＦＳ２２ｍ−０６３）で処理されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、皮下で成長されたＭＣ３８同系腫瘍モデルの腫瘍体積測定を示す。平均腫瘍体積［ｍｍ３］±９５％信頼区間が示される。ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｆ２は、ＩｇＧ対照処理マウスと比較して、ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を有意に低減することができた。混合モデル分析を用いて、試験の全時間にわたる成長速度についてペアワイズで示される統計的有意性。＊＊＊＊≦０．０００１  ｐ−値。
【図７Ｂ】処理された各マウスにおける腫瘍体積が別々に示されることを除いて、図７Ａと同じデータを示す。これは、１匹のマウスを別にして、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｆ２で処理されたマウスのいずれも、試験の過程で腫瘍の再成長を示さなかったことを強調する。対照的に、腫瘍再成長が、試験の終わり頃に、Ｇ１−ＡＡ／Ｌｏｂ１２．３及びＧ１−ＡＡ／Ｆ２で処理されたマウスにおいて見られた。
【図８】皮下メソテリン陽性ＣＴ２６同系腫瘍モデル（Ｂａｌｂ／ｃ）における平均腫瘍体積測定を示す。マウスを、Ｇ１−ＡＡ／４４２０（ＩｇＧ対照）又はＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８  ｍＡｂ2のいずれかで処理した。ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８で処理されたマウスは、ＩｇＧ対照処理マウスと比較して、有意な腫瘍成長阻害を示した。平均腫瘍体積［ｍｍ３］±９５％信頼区間がプロットされる。混合モデル分析を用いてペアワイズで、試験の全時間にわたる成長速度を比較して示される統計的有意性。＊＊＊＊≦０．０００１  ｐ−値。
【図９】Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（ヒトＩｇＧ１対照）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（モックｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０（モックｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ）、Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（抗マウスＭＳＬＮ  ｍＡｂ）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３とＧ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０との組合せ（抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂプラス抗マウスＭＳＬＮ  ｍＡｂ）、及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（抗マウスＣＤ１３７／ＭＳＬＮ  ｍＡｂ２）で処理されたＣＴ２６．Ｇ１０同系腫瘍モデルにおける個々の腫瘍体積測定を示す。ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０は、アイソタイプ対照、並びに他の処理群と比較して、低減された腫瘍成長を示した。
【図１０】Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（ＩｇＧ対照）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（ｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０（ｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ）、Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（抗マウスＭＳＬＮ  Ｆａｂ）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３とＧ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０との組合せ（抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂプラス抗マウスＭＳＬＮ  Ｆａｂ）、及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（抗マウスＣＤ１３７／ＭＳＬＮ  ｍＡｂ２）で処理されたＣＴ２６．Ｇ１０同系腫瘍モデルについてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。結果は、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０処理が、アイソタイプ対照で処理されたマウス又は他の処理群と比較して有意に改善された生存をもたらしたことを示す。
【図１１】プロテインＬと架橋される場合の、モックｍＡｂ２フォーマットにおけるマウス及びヒト交差反応性ＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１４及びＦＳ２２−０５３−０１７を試験するＤＯ１１．１０ヒトＣＤ１３７  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるマウスＩＬ−２放出を示す。両方のＦｃａｂは、プロテインＬと架橋される場合、ＣＤ１３７を活性化することができた。陽性対照抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂ、２０Ｈ４．９は、ＦＳ２２−０５３−０１７モックｍＡｂ２と一致して、ｍＩＬ−２放出の増加を示した。架橋するプロテインＬなし（白色の記号）のモックｍＡｂ２フォーマットにおける両方の抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂは、架橋される場合（黒色の記号）と比較して、ごくわずかなｍＩＬ−２放出を示した。
【図１２】プロテインＬと架橋される場合の、モックｍＡｂ２フォーマットにおけるマウス及びヒト交差反応性ＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１４及びＦＳ２２−０５３−０１７を試験するＤＯ１１．１０マウスＣＤ１３７  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるマウスＩＬ−２放出を示す。全てＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２フォーマットにおける、ＦＳ２２−０５３−０１４及びＦＳ２２−０５３−０１７、及び抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  ＦＳ２２ｍ−０６３は、プロテインＬと架橋される場合、ＣＤ１３７を活性化して、ｍＩＬ−２の放出をもたらした。陽性対照抗マウスＣＤ１３７  ｍＡｂ、Ｌｏｂ１２．３は、予想どおり、ｍＩＬ−２放出の増加を示した。架橋するプロテインＬなし（点線）のモックｍＡｂ２フォーマットにおける全ての抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂは、架橋される場合と比較して、大きく減少したｍＩＬ−２放出を示した。ＦＳ２２−０５３−０１７は、このアッセイにおいてより低い活性を有していた（ＦＳ２２−０５３−０１４と比較して８倍劣っているＥＣ５０）が、アッセイにおいて依然として活性を示した。
【図１３】野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ＣＨ３ドメインを含有する構造テンプレート（ＰＤＢ  ＩＤ  ５ＪＩＩ）と比較した、ＦＳ２２  Ｆｃａｂのホモロジーモデルを示す。画像は、５ＪＩＩ  Ｆｃ（Ａ）、並びにＦＳ２２−０５３−００８（Ｂ）及びＦＳ−１７２−００３（Ｃ）Ｆｃａｂの代表的な構造を示す。各構造の１つのＣＨ３ドメインは、灰色のリボンダイヤグラム表示を用いて表されている。ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループが、リボンの黒色の陰影によって示され、それに応じて表示される。ＡＢループの予測される構造は、比較のために点線で強調され、結合に重要な役割を果たす可能性が高いＰＰＹモチーフによって生じる突起を示す。
【図１４】ｍＡｂ2フォーマット（１つのＣＤ１３７結合ＣＨ３ドメイン及び１つの野生型ＣＨ３ドメインを含有する）におけるヘテロ二量体Ｆｃａｂと比較した、ｍＡｂ2フォーマット（すなわち、２つのＣＤ１３７結合ＣＨ３ドメインを含有する）におけるホモ二量体Ｆｃａｂ（ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ）の結合速度のセンサーグラムを示す。このセンサーグラムは、両方の分子が、１つのみの結合鎖でも、ＣＤ１３７に結合したことを示す。オフレートは、異なっており、ホモ二量体Ｆｃａｂは、ヘテロ二量体Ｆｃａｂと比較して、はるかに遅い解離プロフィールを示す。これらのセンサーグラムは、抗ＣＤ１３７  ＦｃａｂがＣＤ１３７に２価的に結合し得ることを示す。
【図１５】陰性対照細胞株（ｈＣＤ１３７ｎｅｇ  ＤＯ１１．１０）（Ａ）を含む様々なＣＤ１３７レベルを発現する細胞への抗ヒトＣＤ１３７  ＦｃａｂモックｍＡｂ2フォーマット（ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）陽性対照抗体（Ｇ１−ＡＡ／２０Ｈ４．９）及びアイソタイプ対照抗体（Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）の結合を示す。結合を、フローサイトメトリーによって決定した。結果は、Ｇ１−ＡＡ／２０Ｈ４．９が、ＣＤ１３７を発現する全ての細胞株に結合することができた（Ｂ〜Ｅ）一方、ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３が、低いレベルのＣＤ１３７を発現するＤＯ１１．１０細胞株に結合しなかったこと（Ｂ）、及び陽性対照と比較した結合の倍数差（fold-difference）が、細胞株によって発現されるＣＤ１３７の量に反比例していたことを示した。
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
詳細な説明
本発明は、ＣＤ１３７に結合する特異的結合メンバーに関する。ＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）又は４−１ＢＢとしても知られている。特異的結合メンバーは、好ましくは、ヒトＣＤ１３７、より好ましくは、ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７、さらにより好ましくは、二量体ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７に結合する。特異的結合メンバーによって結合されるＣＤ１３７の部分は、好ましくは、ＣＤ１３７細胞外ドメインである。ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７の細胞外ドメインは、配列番号１８１及び１８３のそれぞれに記載される配列を含むか又はそれからなり得る。特異的結合メンバーは、好ましくは、細胞の表面において発現されるＣＤ１３７に結合することが可能である。細胞は、好ましくは、免疫細胞、例えば、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞又は制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、好ましくは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、又はＢ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
【０１３２】
特異的結合メンバーは、好ましくは、ＣＤ１３７に特異的に結合する。「特異的」という用語は、特異的結合メンバーがその特異的結合パートナー以外、ここではＣＤ１３７の分子への顕著な結合を示さない状況をさし得る。「特異的」という用語はまた、特異的結合メンバーが、いくつかの抗原によって保有される、ＣＤ１３７上のエピトープなどの特定のエピトープに対して特異的である場合に該当し、その場合、特異的結合メンバーは、エピトープを保有する様々な抗原に結合することが可能であろう。特異的結合メンバーは、好ましくは、結合しないか、又はＣＤ４０、ＯＸ４０及び／又はＧＩＴＲへの顕著な結合を示さない。
【０１３３】
上記の背景技術の項において説明されるように、抗ＣＤ１３７抗体ウレルマブによる患者の治療は、用量制限高度肝炎を伴っていた。理論に制約されるのを望むものではないが、ウレルマブ治療で見られる肝炎が、肝臓中に存在するＴ細胞の活性化、又は患者の肝臓における活性化Ｔ細胞の浸潤及び蓄積に起因していた可能性があると考えられる。軽減された肝炎を伴うか又は肝炎を伴わない分子を選択するために、本発明者らは、ＣＤ１３７に対する高い結合力を有するＦｃａｂを選択した。具体的には、本発明者らは、モノマーＣＤ１３７より高い親和性で二量体ＣＤ１３７に結合したＦｃａｂを選択した。Ｔ細胞によるＣＤ１３７の発現は、プライミング及び活性化の際に上方制御される。活性化Ｔ細胞におけるＣＤ１３７のより高い発現のため、ＣＤ１３７は、このような細胞の表面において二量体、三量体及びより高次の多量体の形態になるものと考えられる。対照的に、不活性Ｔ細胞によるＣＤ１３７発現は、低く発現し、或いは検出不可能である。したがって、ＣＤ１３７は、これがこのようなＴ細胞の表面において発現される限り、モノマー形態である可能性が高いものと考えられる。したがって、高い結合力でＣＤ１３７に結合するＦｃａｂは、肝臓中に存在する不活性Ｔ細胞などの不活性Ｔ細胞と対照的に、活性化Ｔ細胞に優先的に結合し、したがって、軽減された肝炎を示すか又は肝炎を示さないものと考えられる。
【０１３４】
特異的結合メンバーは、好ましくは、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、若しくは２ｎＭの親和性（ＫＤ）、又はより高い親和性で二量体ヒトＣＤ１３７に結合する。
【０１３５】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、モノマーＣＤ１３７より高い親和性で二量体ＣＤ１３７に結合する。好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、モノマーＣＤ１３７に対する特異的結合メンバーの親和性より少なくとも５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍又は２００倍高い親和性で二量体ＣＤ１３７に結合する。
【０１３６】
ヒトＣＤ１３７は、例えば、配列番号１８３に記載される配列を有し得る。抗原がモノマーであるか又は二量体形態であるかにかかわらず、配列は同一である。
【０１３７】
ＦＳ２２−５３及びＦＳ２２−１７２系統からの特異的結合メンバーはまた、二量体カニクイザルＣＤ１３７に結合することが示された。カニクイザルＣＤ１３７並びにヒトＣＤ１３７への結合は、ヒトへの投与前に有効性及び毒性についてカニクイザルにおける特異的結合メンバーの試験を可能にするため有益である。
【０１３８】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１４０ｎＭ、１２０ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、若しくは２ｎＭの親和性（ＫＤ）又はより高い親和性で二量体カニクイザルＣＤ１３７に結合し得る。好ましくは、特異的結合メンバーは、２ｎＭの親和性（ＫＤ）、又はより高い親和性でカニクイザルＣＤ１３７に結合する。
【０１３９】
特異的結合メンバーは、同様の親和性で二量体ヒトＣＤ１３７及び二量体カニクイザルＣＤ１３７に結合し得る。これは、カニクイザルにおける特異的結合メンバーを用いて有効性及び毒性試験を行うことは有益であると考えられ、これは、ヒトにおける特異的結合メンバーの有効性及び毒性の予測であり得る。
【０１４０】
したがって、好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーが二量体ヒトＣＤ１３７に結合する親和性より１０倍以下、好ましくは、５倍以下低いか又は高い親和性で二量体カニクイザルＣＤ１３７に結合する。
【０１４１】
特異的結合メンバーは、二量体マウスＣＤ１３７、二量体カニクイザルＣＤ１３７及び二量体ヒトＣＤ１３７に結合し得る。同じ特異的結合メンバーが、マウスにおける初期の有効性試験、カニクイザルにおける毒性試験及びヒトにおける臨床試験を行うのに使用され得るため、これは有益であると考えられ、したがって、臨床への道を簡単にする可能性がある。具体的には、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−０１４及びＦＳ２２−０５３−０１７は、意外なことに、二量体マウス、ヒト及びカニクイザルＣＤ１３７に結合することが分かった。
【０１４２】
ヒト又はカニクイザルＣＤ１３７などの同種抗原への特異的結合メンバーの結合親和性は、例えばBiacoreなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定され得る。
【０１４３】
「特異的結合メンバー」という用語は、ＣＤ１３７抗原結合部位を含む定常ドメインを含む、免疫グロブリン、又はその断片を表す。したがって、本明細書において使用される際の「特異的結合メンバー」という用語は、抗原結合断片が、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含む場合、前記抗原結合断片を含む。定常ドメインは、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＨ４ドメインであり得、好ましくは、定常ドメインは、ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメイン、より好ましくは、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、ＣＨ３ドメインである。特異的結合メンバーは、部分的に、又は完全に、合成的に産生され得る。
【０１４４】
好ましくは、特異的結合メンバーは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメインは、ＣＤ１３７抗原結合部位を含む。特異的結合メンバーは、好ましくは、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、２つの（同一の）ポリペプチド鎖の二量体である。好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインのＮ末端に、免疫グロブリンヒンジ領域、又はその部分をさらに含む。このような分子は、本明細書において、抗原結合Ｆｃ断片、又はＦｃａｂ（商標）とも呼ばれる。ヒンジ領域は、配列番号１７９に記載される配列又はその断片からなるか又はそれを含み得る。好ましくは、断片は、配列番号１７９に記載される配列のＣ末端断片である。断片は、最大で２０、最大で１０、最大で８又は最大で６アミノ酸長であり得る。断片は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６アミノ酸長であり得る。好ましい実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号７に記載される配列を有する。
【０１４５】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、抗体分子、好ましくは、モノクローナル抗体、又はその断片である。抗体分子は、好ましくは、ヒト又はヒト化抗体である。抗体分子は、免疫グロブリンＧ分子、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４分子、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４分子、より好ましくは、ＩｇＧ１分子、又はその断片であり得る。
【０１４６】
抗体は、いくつかの方法で修飾され得るため、「抗体分子」という用語は、天然であるか又は完全に若しくは部分的に合成であるかにかかわらず、抗体断片、抗体の誘導体、機能的同等物及びホモログを包含するものと解釈されるべきである。ＣＨ３ドメインを含む抗体断片の一例は、抗体のＦｃドメインである。ＣＤＲ配列及びＣＨ３ドメインの両方を含む抗体断片の一例は、ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディである
(Hu et al. (1996), Cancer Res., 56(13):3055-61)。
【０１４７】
特異的結合メンバーは、ＣＤ１３７抗原結合部位を含む。ＣＤ１３７抗原結合部位は、特異的結合メンバーの定常ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメイン中に位置する。ＣＤ１３７抗原結合部位は、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に１つ以上の修飾された構造ループを含む。標的抗原のための抗原結合部位を形成するための抗体定常ドメイン構造ループの操作は、当該技術分野において公知であり、例えば、Wozniak-Knopp G et al.,(2010)、国際公開第２００６／０７２６２０号及び国際公開第２００９／１３２８７６号に記載されている。
【０１４８】
幅広い選択及び親和性成熟プログラムの後、本発明者らは、モノマーヒトＣＤ１３７より二量体に優先的に結合した２つのパネルのＦｃａｂを単離した。意外なことに、単離されたＦｃａｂは全て、それらのＡＢ構造ループ中に、配列ＰＰＹ、並びに５アミノ酸挿入を含んでいた。２つのパネルのＦｃａｂは、異なる選択作業（campaign）から独立して選択され、それぞれが、構造ＡＢループ中に５アミノ酸挿入を含むライブラリーを用いる。したがって、ＰＰＹ配列は、独立して２回選択され、これは、ＣＤ１３７結合にとってのこの配列の重要性を示している。ＡＢ構造ループ中に５アミノ酸挿入を含まないＦｃａｂライブラリーから単離された抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂは、例えば選択されたＦｃａｂが親和性成熟することができなかったため、さらに進めなかった。これは、ＡＢ構造ループ中に存在するアミノ酸挿入も、ＣＤ１３７結合にとって重要であり得ることを示す。したがって、ＡＢ構造ループ中の配列ＰＰＹ及び５アミノ酸挿入（ここで、ＰＰＹ配列は、任意に、５アミノ酸挿入内に完全に又は部分的に存在し得る）の存在は、ＣＤ１３７結合にとって重要であり得る。
【０１４９】
したがって、特異的結合メンバーのＣＤ１３７抗原結合部位は、第１及び／又は第２の配列、好ましくは、第１及び第２の配列を含んでいてもよく、ここで、第１及び第２の配列はそれぞれ、特異的結合メンバーの定常ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメインのＡＢ及びＥＦ構造ループ中に位置する。
【０１５０】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの９５及び９６位における残基は、野生型であり、すなわち、好ましくは、それぞれアルギニン（Ｒ）及びトリプトファン（Ｗ）である。これらの残基は両方とも、ＥＦ構造ループ中に位置する。特に示されない限り、アミノ酸残基の位置は、本明細書において、ImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従って番号付けされる。ＩＭＧＴ番号付けスキームは、Lefranc et al.,2005に記載されている。
【０１５１】
第１の配列は、好ましくは、配列ＰＰＹ（配列番号１０）を含む。
【０１５２】
ＰＰＹ配列は、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１０及び１９位の間、好ましくは、１５及び１７位の間に位置し得る。好ましい実施形態において、ＰＰＹ配列は、ＣＨ３ドメインの１６、１６．５及び１６．４位に位置する。或いは、ＰＰＹ配列は、ＣＨ３ドメインの１６及び１７位の間に位置し得る。別の好ましい実施形態において、ＰＰＹ配列は、ＣＨ３ドメインの１６．３、１６．２及び１６．１位に位置する。ＩＭＧＴ番号付けスキームにおいて、挿入される残基は、それらが位置するループの方向に従って番号付けされる。ループが「上がる」場合、挿入される残基は、挿入の直前の残基の番号を取り、配列中の挿入される残基の番号は、昇順の小数、例えば１６、１６．１、１６．２、１６．３によって示され、この場合、残基１６の後に３つの突然変異がある。ループが「下がる」場合、挿入される残基は、挿入の直前の残基の番号を取り、配列中の挿入される残基の番号は、降順の小数、例えば１６、１６．３、１６．２、１６．１によって示され、この場合、残基１６の後に３つの突然変異がある（LeFranc et al.,2005,及びLeFranc et al.2015）。
【０１５３】
好ましい実施形態において、ＡＢ構造ループは、アミノ酸挿入を含む。挿入は、１から１０、２から９、３から７、４から６又は５アミノ酸長であり得る。好ましくは、挿入は、５アミノ酸長である。
【０１５４】
挿入は、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１０及び１９位の間、好ましくは、１４及び１７位の間、より好ましくは、１６及び１７位の間に位置し得る。好ましい実施形態において、挿入は、図１に示されるように、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１６．５から１６．１位に位置する。
【０１５５】
親和性成熟の後に同定された特異的結合メンバーの大部分は、ＣＨ３ドメインの９７位にロイシン（Ｌ）残基を含んでいた。特異的結合メンバーの多くは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの９８位にアスパラギン酸（Ｄ）残基又はグルタミン酸（Ｅ）残基も含んでいた。これらのアミノ酸変化は両方とも、ＥＦ構造ループ中に位置する。これらの結果は、これらの残基の一方又は両方が、ＣＤ１３７結合にとって重要であり得ることを示唆する。したがって、第２の配列は、好ましくは、配列ＬＤ又はＬＥを含み、ここで、ＬＤ又はＬＥ配列は、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの９７及び９８位に位置する。
【０１５６】
第１の配列及び第２の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、又はＦＳ２２−１７２、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、又はＦＳ２２−１７２−００６、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、又はＦＳ２２−１７２−００４、さらにより好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３のＣＨ３ドメインの第１及び第２の配列であり得る。
【０１５７】
或いは、第１の配列及び第２の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、又はＦＳ２２−０５３−０１６、又はＦＳ２２−０５３、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、又はＦＳ２２−０５３−０１４、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、又はＦＳ２２−０５３−０１７、さらにより好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８のＣＨ３ドメインの第１及び第２の配列であり得る。別の好ましい実施形態において、第１の配列及び第２の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−０１７又はＦＳ２２−０５３−０１４、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−０１７のＣＨ３ドメインの第１及び第２の配列である。
【０１５８】
特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００５、及びＦＳ２２−１７２−００６のＣＨ３ドメイン配列は、配列番号１７５、２１、３０、３９、４９、５８、６６、７５、８４、９３、１０２、１１２、１２１、１３０、１３９、１４８、１５７及び１６６のそれぞれに記載される。
【０１５９】
特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００５、及びＦＳ２２−１７２−００６の第１及び第２の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００５、及びＦＳ２２−１７２−００６のそれぞれのＣＨ３ドメインの１４及び１７位の間、並びに９１及び９９位の間の配列であり得る。
【０１６０】
或いは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２、及びＦＳ２２−０５３−０１６の第１及び第２の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２、及びＦＳ２２−０５３−０１６のそれぞれのＣＨ３ドメインの１４及び１７位の間、並びに９２及び９９位の間の配列であり得る。
【０１６１】
特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−０１５の第１及び第２の配列は、或いは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−０１５のそれぞれのＣＨ３ドメインの１４及び１７位の間、並びに９２及び９８位の間の配列であり得る。
【０１６２】
特異的結合メンバーのＣＤループ配列は、好ましくは、非修飾、すなわち野生型である。したがって、ＣＤループ配列は、好ましくは、配列番号２に記載される配列を有する。ＣＤループ配列は、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの４３から７８位に位置する。
【０１６３】
第１及び第２の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、又はＦＳ２２−０５３のそれぞれの完全なＡＢ及びＥＦ構造ループ配列であり得る。例えば、ＩＭＧＴ、ＩＭＧＴエクソン、ＥＵ、又はＫａｂａｔ番号付け方式による、ＣＨ３ドメイン配列におけるＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ構造ループの位置の決定は、当業者の能力の範囲内であり、Hasenhindl et al.(2013)に記載されている。好ましい実施形態において、ＩＭＧＴ番号付け方式によるＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループはそれぞれ、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１０及び１９、４２及び７９、並びに９１及び１０２位の間に位置する。好ましい実施形態において、したがって、第１、第２及び第３の配列は、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、ＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、又はＦＳ２２−１７２のそれぞれのＣＨ３ドメインの１０及び１９、４２及び７９、並びに９１及び１０２位の間の配列である。
【０１６４】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１４１に記載されるＦＳ２２−１７２−００３；
（ｉｉ）配列番号１３２に記載されるＦＳ２２−１７２−００２；
（ｉｉｉ）配列番号１５０に記載されるＦＳ２２−１７２−００４；
（ｉｖ）配列番号１２３に記載されるＦＳ２２−１７２−００１；
（ｖ）配列番号１５９に記載されるＦＳ２２−１７２−００５；
（ｖｉ）配列番号１６７に記載されるＦＳ２２−１７２−００６；又は
（ｖｉｉ）配列番号１１４に記載されるＦＳ２２−１７２
の第１及び／又は第２、好ましくは、第１及び第２の配列を含み；ここで、第１及び第２の配列はそれぞれ、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１４及び１７位の間、並びに９１及び９９位の間に位置する。
【０１６５】
より好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１４１に記載されるＦＳ２２−１７２−００３；
（ｉｉ）配列番号１３２に記載されるＦＳ２２−１７２−００２；
（ｉｉｉ）配列番号１５０に記載されるＦＳ２２−１７２−００４；
（ｉｖ）配列番号１２３に記載されるＦＳ２２−１７２−００１；
（ｖ）配列番号１５９に記載されるＦＳ２２−１７２−００５；又は
（ｖｉ）配列番号１６７に記載されるＦＳ２２−１７２−００６
の第１及び／又は第２、好ましくは、第１及び第２の配列を含む。
【０１６６】
さらに好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号１４１に記載されるＦＳ２２−１７２−００３；
（ｉｉ）配列番号１３２に記載されるＦＳ２２−１７２−００２；又は
（ｉｉｉ）配列番号１５０に記載されるＦＳ２２−１７２−００４
の第１及び／又は第２、好ましくは、第１及び第２の配列を含む。
【０１６７】
さらにより好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号１４１に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３の第１及び／又は第２、好ましくは、第１及び第２の配列を含む。
【０１６８】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバー、特に、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００６の第１及び／又は第２、好ましくは、第１及び第２の配列を含む特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１９位にロイシン（Ｌ）を含み得る。
【０１６９】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２３に記載されるＦＳ２２−０５３−００８；
（ｉｉ）配列番号３２に記載されるＦＳ２２−０５３−００９；
（ｉｉｉ）配列番号５０に記載されるＦＳ２２−０５３−０１１；
（ｉｖ）配列番号１０４に記載されるＦＳ２２−０５３−０１７；
（ｖ）配列番号７７に記載されるＦＳ２２−０５３−０１４；
（ｖｉ）配列番号４１に記載されるＦＳ２２−０５３−０１０；
（ｖｉｉ）配列番号５９に記載されるＦＳ２２−０５３−０１２；
（ｖｉｉｉ）配列番号６８に記載されるＦＳ２２−０５３−０１３；
（ｉｘ）配列番号８６に記載されるＦＳ２２−０５３−０１５；
（ｘ）配列番号９５に記載されるＦＳ２２−０５３−０１６；又は
（ｘｉ）配列番号１５に記載されるＦＳ２２−０５３
の第１及び／又は第２、好ましくは、第１及び第２の配列を含み；ここで、第１及び第２の配列はそれぞれ、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１４及び１７位の間、並びに９１及び９９位の間に位置する。
【０１７０】
より好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２３に記載されるＦＳ２２−０５３−００８；
（ｉｉ）配列番号３２に記載されるＦＳ２２−０５３−００９；
（ｉｉｉ）配列番号５０に記載されるＦＳ２２−０５３−０１１；
（ｉｖ）配列番号１０４に記載されるＦＳ２２−０５３−０１７；又は
（ｖ）配列番号７７に記載されるＦＳ２２−０５３−０１４
の第１及び／又は第２、好ましくは、第１及び第２の配列を含む。
【０１７１】
さらにより好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバー：
（ｉ）配列番号２３に記載されるＦＳ２２−０５３−００８；
（ｉｉ）配列番号３２に記載されるＦＳ２２−０５３−００９；
（ｉｉｉ）配列番号５０に記載されるＦＳ２２−０５３−０１１；又は
（ｉｖ）配列番号１０４に記載されるＦＳ２２−０５３−０１７
のＣＨ３ドメインの第１及び／又は第２、好ましくは、第１及び第２の配列を含む。
【０１７２】
さらにより好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号２３に記載される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８の第１及び／又は第２、好ましくは、第１及び第２の配列を含む。
【０１７３】
ＩＭＧＴ番号付けの代替例として、本明細書に記載されるアミノ酸配列、置換、欠失及び挿入の位置を含むアミノ酸残基位置は、ＩＭＧＴエクソン番号付け（連続した番号付けとも呼ばれる）、ＥＵ番号付け、又はＫａｂａｔ番号付けに従って番号付けされ得る。ＣＨ３ドメインの残基位置の、ＩＭＧＴ番号付け、ＩＭＧＴエクソン番号付け、ＥＵ番号付け、及びＫａｂａｔ番号付けの間の一致が、図１に示される。したがって、例えば、図１に示されるように、本出願が、それぞれ特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１４〜１７位に位置している第１の配列を指す（ここで、残基位置がＩＭＧＴ番号付けスキームに従って番号付けされる）場合、第１の配列は、ＣＨ３ドメインの１８〜２１位に位置する（ここで、残基位置が、ＩＭＧＴエクソン番号付けスキームに従って番号付けされる）。或いは、本明細書に記載されるＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸配列、置換、欠失及び挿入の位置を含む、ＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基の位置は、配列番号４に記載される野生型ＣＨ３ドメイン配列におけるそれらの位置への言及によって規定され得る。ＩＭＧＴ番号付け及び野生型ＣＨ３ドメイン配列の間の一致も、図１に示される。
【０１７４】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、又はＦＳ２２−１７２のＣＨ３ドメイン配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、又はＦＳ２２−１７２−００６のＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、又はＦＳ２２−１７２−００４のＣＨ３ドメイン配列、さらにより好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３のＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含む。
【０１７５】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、又はＦＳ２２−０５３のＣＨ３ドメイン配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、又はＦＳ２２−０５３−０１４のＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、又はＦＳ２２−０５３−０１７のＣＨ３ドメイン配列、さらにより好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８のＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含む。
【０１７６】
特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメイン配列の直近のＣ末端にさらなるリジン残基（Ｋ）を任意に含み得る。
【０１７７】
モノクローナル及び他の抗体を取り、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生するために組み換えＤＮＡ技術の技術を使用することが可能である。このような技術は、ＣＤＲ、又は可変領域を、異なる免疫グロブリン中に導入することを必要とし得る。１つの免疫グロブリンのＣＤＲの、別の免疫グロブリン中への導入が、例えば、欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号及び欧州特許出願公開第Ａ−２３９４００号に記載されている。同様の技術を用いて、本発明に係る特異的結合メンバーのＣＤ１３７抗原結合部位を構成する定常ドメイン配列を、別の特異的結合メンバーの定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメイン中に導入し、それによって、その定常ドメイン中にＣＤ１３７抗原結合部位を含む特異的結合メンバーをもたらすことができるであろう。或いは、特異的結合メンバーの定常ドメイン配列全体が、本発明に係る特異的結合メンバーの定常ドメイン配列で置換されて、その定常ドメイン中にＣＤ１３７抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを調製することができるであろう。同様に、特異的結合メンバーの定常ドメイン配列の断片が、ＣＤ１３７抗原結合部位を含む本発明に係る特異的結合メンバーの定常ドメイン配列の対応する断片で置換され得る。
【０１７８】
特異的結合メンバーのＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどの１つ以上のＦｃγ受容体、及び／又は補体への結合を低減又は抑制する１つ以上の突然変異を含み得る。本発明者らは、Ｆｃγ受容体への結合を低減又は抑制することが、特異的結合メンバーによって媒介されるＡＤＣＣを低減するか又はなくすと仮定している。同様に、補体への結合を低減又は抑制することが、特異的結合メンバーによって媒介されるＣＤＣを低減するか又はなくすと予想される。ＣＨ２ドメインの、１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体への結合を低減又は抑制する突然変異は、当該技術分野において公知である（Wang et al.,2018）。これらの突然変異は、Bruhns et al.,2009及びHezareh et al.,2001に記載される「ＬＡＬＡ突然変異」を含み、これは、アラニン（Ｌ１．３Ａ及びＬ１．２Ａ）によるＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ位置１．３及び１．２におけるロイシン残基の置換を含む。或いは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ位置８４．４におけるアスパラギン（Ｎ）を、アラニン、グリシン又はグルタミン（Ｎ８４．４Ａ、Ｎ８４．４Ｇ又はＮ８４．４Ｑ）に突然変異させることによる、保存されたＮ−結合型グリコシル化部位の突然変異を介したａ−グリコシル抗体の産生は、ＩｇＧ１エフェクター機能を低下させることも知られている（Wang et al.,2018）。さらなる代替例として、補体活性化（Ｃ１ｑ結合）及びＡＤＣＣは、ＣＨ２ドメインのＩＭＧＴ位置１１４におけるプロリンの、アラニン又はグリシン（Ｐ１１４Ａ又はＰ１１４Ｇ）への突然変異によって低下されることが知られている（Idusogie et al.,2000；Klein et al.,2016）。これらの突然変異はまた、さらなる低下されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性を有するか又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ活性を有さない特異的結合メンバーを産生するために組み合わされてもよい。
【０１７９】
したがって、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインを含んでいてもよく、ここで、ＣＨ２ドメインは、好ましくは、
（ｉ）１．３及び１．２位におけるアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位におけるアラニン若しくはグリシン；及び／又は
（ｉｉｉ）８４．４位におけるアラニン、グルタミン若しくはグリシン
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１８０】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、好ましくは、
（ｉ）１．３及び１．２位におけるアラニン残基；及び／又は
（ｉｉ）１１４位におけるアラニン若しくはグリシン
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１８１】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位におけるアラニン残基；及び
（ｉｉ）１．２位におけるアラニン残基
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１８２】
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号６に記載される配列を有し得る。［ＬＡＬＡ］
【０１８３】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＨ２ドメインを含み、ここで、ＣＨ２ドメインは、
（ｉ）１．３位におけるアラニン残基；
（ｉｉ）１．２位におけるアラニン残基；及び
（ｉｉｉ）１１４位におけるアラニン
を含み；
ここで、アミノ酸残基の番号付けが、ＩＭＧＴ番号付けスキームに従う。
【０１８４】
例えば、ＣＨ２ドメインは、配列番号５に記載される配列を有し得る。［ＬＡＬＡ−ＰＡ］
【０１８５】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、又はＦＳ２２−１７２のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、又はＦＳ２２−１７２−００６のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、又はＦＳ２２−１７２−００４のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、さらにより好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、及びＦＳ２２−１７２のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列は、アミノ酸７から開始してそれ以降へと、配列番号１４１、１３２、１５０、１２３、１５９、１６７、及び１１４のそれぞれに示される。
【０１８６】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、又はＦＳ２２−０５３のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、又はＦＳ２２−０５３−０１４のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、又はＦＳ２２−０５３−０１７のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列、さらにより好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、及びＦＳ２２−０５３のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列は、アミノ酸７から開始してそれ以降へと、配列番号２３、３２、５０、１０４、７７、４１、５９、６８、８６、９５、及び１５のそれぞれに示される。
【０１８７】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、又はＦＳ２２−０５３の配列、好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、又はＦＳ２２−０５３−０１４の配列、より好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、又はＦＳ２２−０５３−０１７の配列、さらにより好ましくは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８の配列を含むか、有するか、又はそれからなり、ここで、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、及びＦＳ２２−０５３の配列は、配列番号２３、３２、５０、１０４、７７、４１、５９、６８、８６、９５、及び１５のそれぞれに記載される。
【０１８８】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメイン中に位置するＣＤ１３７抗原結合部位に加えて、１つ以上のさらなる抗原に結合する１つ以上のさらなる抗原結合部位を含み得る。１つ以上のさらなる抗原結合部位は、好ましくは、それらの同種抗原に特異的に結合する。
【０１８９】
１つ以上のさらなる抗原結合部位は、ＣＤ１３７又は別の抗原に結合し得る。したがって、特異的結合メンバーは、多重特異的、例えば、二重特異的、三重特異的、又は四重特異的分子、好ましくは、二重特異的分子であり得る。好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＤ１３７及び１つ以上のさらなる抗原に同時に結合することが可能である。
【０１９０】
抗体分子は、多重特異的、例えば二重特異的、三重特異的、又は四重特異的抗体フォーマットを形成するために複数の異なる方法で組み合わされ得る個別のドメインを含むモジュール構造を有することが知られている。例示的な多重特異的抗体フォーマットは、例えば、Spiess et al.(2015)及びKontermann(2012)に記載されている。本発明の特異的結合メンバーは、このような多重特異的抗体フォーマットで用いられ得る。これは、特異的結合メンバーの抗原結合部位の定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメインの存在を介して、さらなる抗原結合部位を、このような多重特異的抗体フォーマット中に導入するさらなる利点を有する。
【０１９１】
例えば、本発明の特異的結合メンバーは、ヘテロ二量体抗体分子、例えば、ヘテロ二量体完全免疫グロブリン分子、又はその断片であり得る。この場合、抗体分子の一部は、本明細書に記載される１つ又は複数の配列を有するであろう。例えば、本発明の特異的結合メンバーが、二重特異的ヘテロ二量体抗体分子である場合、特異的結合メンバーは、ＣＤ１３７以外の抗原に結合する重鎖と対合される本明細書に記載されるＣＨ３ドメインを含む重鎖を含み得る。ヘテロ二量体抗体を調製するための技術は、当該技術分野において公知であり、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）技術を含み、これは、鎖のヘテロ二量体化を促進するために「ノブ」又は「ホール」のいずれかを形成するように抗体分子のＣＨ３ドメインを操作することを含む。或いは、ヘテロ二量体抗体は、静電反発力によってＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避し、静電引力によってヘテロ二量体化を指向するための、抗体分子中への電荷対の導入によって調製され得る。ヘテロ二量体抗体フォーマットの例としては、CrossMab、ｍＡｂ−Ｆｖ、ＳＥＥＤ−ボディ、及びＫＩＨ  ＩｇＧが挙げられる。
【０１９２】
或いは、本発明の多重特異的特異的結合メンバーは、完全免疫グロブリン分子又はその断片及び１つ若しくは複数のさらなる抗原結合部分を含み得る。抗原結合部分は、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体であってもよく、完全免疫グロブリン分子又はその断片に融合され得る。完全免疫グロブリン分子に融合されたさらなる抗原結合部分を含む多重特異的抗体分子の例としては、ＤＶＤ−ＩｇＧ、ＤＶＩ−ＩｇＧ、ｓｃＦｖ４−ＩｇＧ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、及びｓｃＦｖ−ＩｇＧ分子が挙げられる（Spiess et al.,2015；図１）。ＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン断片に融合されたさらなる抗原結合部分を含む多重特異的抗体分子の例としては、例えば、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ダイアボディ−ＣＨ３、及びｓｃＦｖ−ＣＨ３  ＫＩＨが挙げられる（Spiess et al.,2015；図１）。
【０１９３】
他の好適な多重特異的フォーマットは、当業者に容易に明らかになるであろう。
【０１９４】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を含み、第２の抗原結合部位は、好ましくは、ＣＤＲベースの抗原結合部位である。ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域中の抗原結合部位である。ＣＤＲベースの抗原結合部位は、６つのＣＤＲ；３つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ及び３つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲによって形成される。
【０１９５】
所与の抗原に対する抗体分子の調製及びこのような抗体分子のＣＤＲ配列の決定は、十分に確立されており、多くの好適な技術が、当該技術分野において公知である。ＣＤＲ配列は、例えば、Kabat et al.,1991又は国際免疫遺伝学情報システム（international ImMunoGeneTics information system）（ＩＭＧＴ）（Lefranc et al.,2015）に従って決定され得る。
【０１９６】
例えば、特異的結合メンバーは、ｍＡｂ２（商標）二重特異的抗体であり得る。本明細書において言及されるｍＡｂ２二重特異的抗体は、その可変領域のそれぞれにおけるＣＤＲベースの抗原結合部位及び定常ドメイン中の少なくとも１つの抗原結合部位を含むＩｇＧ免疫グロブリンである。本発明の特異的結合メンバーが、ｍＡｂ２フォーマットである場合、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーの定常ドメイン中のＣＤ１３７抗原結合部位に加えて、その可変領域のそれぞれにおけるＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。
【０１９７】
抗原結合部位の３つのＶＨドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＨドメイン中に位置してもよく、３つのＶＬドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＬドメイン中に位置し得る。例えば、ＣＤＲベースの抗原結合部位は、抗体可変領域中に位置し得る。
【０１９８】
特異的結合メンバーは、第２の抗原のための１つ又は好ましくは２つ以上、例えば２つのＣＤＲベースの抗原結合部位を有し得る。したがって、特異的結合メンバーは、１つのＶＨ及び１つのＶＬドメインを含み得るが、好ましくは、天然のＩｇＧ分子の場合と同様に、２つのＶＨ及び２つのＶＬドメイン、すなわち、２つのＶＨ／ＶＬドメイン対を含む。
【０１９９】
ある好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、２つの可変領域を含む免疫グロブリンであり得、各可変領域は、第２の抗原のためのＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。
【０２００】
したがって、好ましい実施形態において、抗体分子は、ＣＤ１３７及び第２の抗原に結合する抗体であり、抗体分子は、
（ｉ）抗体分子の２つのＣＨ３ドメイン中に位置するＣＤ１３７のための２つの抗原結合部位；及び
（ｉｉ）免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによってそれぞれ形成される、第２の抗原のための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位
を含む。
【０２０１】
より好ましい実施形態において、抗体は、完全免疫グロブリン分子、例えば、ＣＤ１３７及び第２の抗原に結合する完全なＩｇＧ１分子であり、抗体分子は、
（ｉ）抗体分子の２つのＣＨ３ドメイン中に位置するＣＤ１３７のための２つの抗原結合部位；及び
（ｉｉ）免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによってそれぞれ形成される、第２の抗原のための２つのＣＤＲベースの抗原結合部位
を含み；
ここで、免疫グロブリン分子は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＬドメインをさらに含む。
【０２０２】
ＣＤ１３７の活性化は、免疫細胞表面、例えばＴ細胞表面におけるＣＤ１３７のクラスター化を必要とし、これは、次に、細胞内シグナル伝達経路及び免疫細胞活性化を刺激する。特異的結合メンバーの架橋の非存在下での免疫細胞表面におけるＣＤ１３７への特異的結合メンバーの結合は、ＣＤ１３７にクラスターを形成させることはなく、その結果、免疫細胞活性化をもたらすことはない。
【０２０３】
本発明者らは、ＦＳ２２−５３及びＦＳ２２−１７２系統の特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーの架橋の非存在下でＴ細胞活性化を行わないことを示した（実施例５を参照）。
【０２０４】
上記に説明されるように、Ｆｃγ受容体への結合による抗体分子の架橋は、非効率的であり、且つＦｃγ受容体発現細胞がヒト身体全体に存在する際、特定の位置、例えば、疾患の部位に標的化することができない。したがって、第２の抗原結合部位によって結合された第２の抗原は、好ましくは、Ｆｃγ受容体でない。
【０２０５】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の特異的結合メンバーは、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部位を含み、ここで、第２の抗原は、複数の特異的結合メンバーに結合し、それを架橋することが可能である。
【０２０６】
例えば、本発明者らは、第２の抗原が多量体分子である場合、特異的結合メンバーの、第２の抗原への結合が、Ｔ細胞活性化をもたらすか、又はＴ細胞活性化を促進することを示した。したがって、第２の抗原は、好ましくは、多量体抗原、例えば二量体、三量体又はより高次の多量体であるため、いくつかの特異的結合メンバーに架橋することが可能である。
【０２０７】
本発明者らは、ＣＤ１３７／第２の抗原ｍＡｂ２分子を用いて、第２の抗原が、モノマー又は多量体であり得、且つ表面、例えば細胞表面に高濃度で存在するか及び／又はクラスター化された細胞表面抗原などの表面抗原である場合、抗体分子の、第２の抗原への結合は、Ｔ細胞活性化をもたらすか、又はＴ細胞活性化を促進することも示した。理論に制約されるのを望むものではないが、抗体分子の、豊富な細胞表面抗原への結合が、例えば、抗体分子が、ＣＤ１３７のクラスター化及び免疫細胞活性化を引き起こすことが可能なほど十分に近接して配置された、細胞表面に結合された高濃度の抗体分子をもたらすと考えられる。したがって、好ましい実施形態において、第２の抗原は、表面、例えば細胞表面において高濃度で発現される表面抗原である。
【０２０８】
本明細書に記載される第２の抗原に結合し、且つ第２の抗原への結合の際にのみＴ細胞などの免疫細胞を活性化するか、又はその免疫細胞活性化活性が第２の抗原への結合の際に促進される第２の抗原結合部位を含む特異的結合メンバーは、コンディショナルなアゴニストとも呼ばれる。第２の抗原への結合の際のこの免疫細胞活性化活性は、特異的結合メンバーの、Ｆｃγ受容体及び／又は外部の架橋剤、例えばプロテインＡ又はＧ又は二次抗体への結合とは無関係であり、したがって、特異的結合メンバーのコンディショナルなアゴニスト活性が、第２の抗原が存在する部位に標的化されるのを可能にする。例えば、第２の抗原が疾患抗原である場合、特異的結合メンバーは、個体における疾患の部位で選択的に免疫細胞の活性化を促進し得、他の箇所ではＴ細胞の活性化を促進しない。
【０２０９】
さらに、第２の抗原への結合の際にのみＴ細胞などの免疫細胞を活性化する特異的結合メンバーは、好ましくは、外部の架橋剤などの他の機構による架橋、又はＦｃγ受容体相互作用による架橋に依存する特異的結合メンバーと比較して増加した免疫細胞活性化活性を有する。ＣＤ１３７の活性化がより効率的であるため、免疫細胞活性化は、他の特異的結合メンバーと比べてより低い濃度の本明細書に記載される特異的結合メンバーで達成され得る。
【０２１０】
したがって、本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは、特異的結合メンバーが架橋されていない場合より、特異的結合メンバーが、例えば第２の抗原への結合によって架橋される場合、増加したＴ細胞などの免疫細胞の活性化を誘発する。
【０２１１】
Ｔ細胞を活性化する抗体分子又は特異的結合メンバーの能力は、Ｔ細胞活性化アッセイを用いて測定され得る。Ｔ細胞は、活性化の際にＩＬ−２を放出する。したがって、Ｔ細胞活性化アッセイは、抗体分子又は特異的結合メンバーによって誘発されるＴ細胞活性化のレベルを決定するためにＩＬ−２放出を測定し得る。
【０２１２】
例えば、Ｔ細胞を活性化する抗体分子又は特異的結合メンバーの能力は、特異的結合メンバー又は抗体分子が架橋される場合、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によるＩＬ−２の最大半量（half-maximal）放出を達成するのに必要な抗体分子又は特異的結合メンバーの濃度を測定することによって決定され得る。これは、以下の抗体分子又は特異的結合メンバーのＥＣ５０と呼ばれる。より低いＥＣ５０は、より低い濃度の抗体分子又は特異的結合メンバーが、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によるＩＬ−２の最大半量放出を達成するのに必要とされること、及びひいては抗体分子又は特異的結合メンバーが、より高いＴ細胞活性化活性を有することを示す。特異的結合メンバー又は抗体分子は、例えば、抗ＣＨ２抗体を用いて架橋され得る。
【０２１３】
好ましい実施形態において、抗体分子又は特異的結合メンバーは、同じアッセイにおいてＦＳ２２−１７２−００３／ＨｅｌＤ１．３（ＬＡＬＡ突然変異を含む）のＥＣ５０の１０倍、５倍、４倍、３倍、又は２倍以内である、Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＥＣ５０を有し、ここで、ＦＳ２２−１７２−００３／ＨｅｌＤ１．３（ＬＡＬＡ）は、配列番号１４５に記載される重鎖及び配列番号１７３に記載される軽鎖からなるか又はそれを含む。
【０２１４】
別の好ましい実施形態において、抗体分子又は特異的結合メンバーは、同じアッセイにおいてＦＳ２２−０５３−００８／ＨｅｌＤ１．３（ＬＡＬＡ突然変異を含む）のＥＣ５０の１０倍、５倍、４倍、３倍、又は２倍以内である、Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＥＣ５０を有し、ここで、ＦＳ２２−０５３−００８／ＨｅｌＤ１．３（ＬＡＬＡ）は、配列番号２７に記載される重鎖及び配列番号１７３に記載される軽鎖からなるか又はそれを含む。
【０２１５】
例えば、抗体分子又は特異的結合メンバーは、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下の、Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＥＣ５０を有し得る。
【０２１６】
それに加えて、又はその代わりに、Ｔ細胞を活性化する抗体分子又は特異的結合メンバーの能力は、抗体分子又は特異的結合メンバーの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度を測定することによって決定され得、ここで、抗体分子又は特異的結合メンバーは、架橋されている。
【０２１７】
好ましい実施形態において、架橋の存在下で、抗体分子又は特異的結合メンバーの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度は、同じアッセイにおいてＦＳ２２−０５３−００８／ＨｅｌＤ１．３（ＬＡＬＡ突然変異を含む）又はＦＳ２２−１７２−００３／ＨｅｌＤ１．３（ＬＡＬＡ突然変異を含む）の存在下でＴ細胞によって放出されるＩＬ−２の最高濃度の３倍、２倍、又は１．５倍以内ある。
【０２１８】
Ｔ細胞活性化アッセイは、本発明の実施例に記載されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイなどの、本明細書に記載されるＴ細胞アッセイであり得る、実施例５．４を参照のこと。
【０２１９】
例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞に基づくＩＬ−２放出アッセイであり得る。例えば、Ｔ細胞活性化アッセイは、白血球除去錐体細胞（cone）からヒトＰＢＭＣを単離することを含み得る。ＰＢＭＣを単離するための方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の実施例に記載されている。次に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから単離され得る。ＰＢＭＣからＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離するための方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の実施例に記載されている。
【０２２０】
次に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体で被覆された多層プレートに加えられ得る。各試験抗体分子又は特異的結合メンバーの好適な希釈物が、調製され、ウェルに加えられ得る。次に、Ｔ細胞は、試験抗体とともに２４時間にわたって、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートされ得る。上清が、収集され、上清中のＩＬ−２の濃度を決定するためにアッセイされ得る。溶液中のＩＬ−２の濃度を決定するための方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の実施例に記載されている。ヒトＩＬ−２の濃度は、抗体分子又は特異的結合メンバーのｌｏｇ濃度に対してプロットされ得る。得られた曲線は、ｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングされ得る。
【０２２１】
特異的結合メンバーの第２の抗原結合部位によって結合される第２の抗原は、免疫細胞抗原、又は疾患抗原であり得る。疾患抗原としては、病原性抗原及び腫瘍抗原が挙げられる。
【０２２２】
特異的結合メンバーによって結合される免疫細胞抗原は、ＣＤ１３７と同じ免疫細胞又は異なる免疫細胞上に存在し得る。
【０２２３】
免疫細胞抗原は、ＣＤ１３７以外の、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり得る。ＴＮＦＲＳＦ受容体は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）の１つ以上のリガンドに結合する細胞外システインリッチドメインを含む膜結合サイトカイン受容体である。
【０２２４】
ＴＮＦＲＳＦ受容体は、免疫細胞の表面上に位置し得る。ＴＮＦＲＳＦリガンドの結合の際、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、免疫細胞を活性化する免疫細胞表面上にクラスターを形成する。例えば、リガンド結合ＴＮＦＲＳＦ受容体は、三量体などの多量体、又は多量体のクラスターを形成し得る。リガンド−結合ＮＦＲＳＦ受容体のクラスターの存在は、免疫細胞を活性化する細胞内シグナル伝達経路を刺激する。
【０２２５】
理論に制約されるのを望むものではないが、免疫細胞表面上でＣＤ１３７及び第２のＴＮＦＲＳＦ受容体を嵌合することによって、特異的結合メンバーは、ＣＤ１３７及び第２のＴＮＦＲＳＦ受容体の両方をクラスター化させ、免疫細胞を活性化させると考えられる。言い換えると、特異的結合メンバーは、両方の標的が結合されるとき、ＴＮＦＲＳＦ受容体アゴニストとして働く。
【０２２６】
ＴＮＦＲＳＦ受容体としては、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＥＤＡ２Ｒ、ＥＤＡＲ、ＦＡＳ、ＬＴＢＲ、ＲＥＬＴ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ−１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２１及びＴＮＦＲＳＦ２５が挙げられる。
【０２２７】
ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７：遺伝子ＩＤ  ９３９）は、ＮＰ＿００１２３３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２４２．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５：遺伝子ＩＤ  ９５８）は、ＮＰ＿００１２４１．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２５０．５の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥＤＡ２Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ２７：遺伝子ＩＤ  ６０４０１）は、ＮＰ＿００１１８６６１６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１１９９６８７．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥＤＡＲ（遺伝子ＩＤ  １０９１３）は、ＮＰ＿０７１７３１．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０２２３３６、３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＦＡＳ（ＴＮＦＲＳＦ６：遺伝子ＩＤ  ３５５）は、ＮＰ＿００００３４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００００４３．５の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＬＴＢＲ（ＴＮＦＲＳＦ３：遺伝子ＩＤ  ４０５５）は、ＮＰ＿００１２５７９１６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２７０９８７．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＲＥＬＴ（ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ：遺伝子ＩＤ  ８４９５７）は、ＮＰ＿１１６２６０．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０３２８７１．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（遺伝子ＩＤ  ７１３２）は、ＮＰ＿００１０５６．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０６５．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（遺伝子ＩＤ  ７１３３）は、ＮＰ＿００１０５７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０６６．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ４（遺伝子ＩＤ  ７２９３）は、ＮＰ＿００３３１８の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３３２７の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。）ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（遺伝子ＩＤ  ８７７１）は、ＮＰ＿００３８１４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８２３．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ８（遺伝子ＩＤ  ９４３）は、ＮＰ＿００１２３４．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２４３．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（遺伝子ＩＤ  ８７９７）は、ＮＰ＿００３８３５．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４４．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（遺伝子ＩＤ  ８７９５）は、ＮＰ＿００３８３３．４の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４２．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（遺伝子ＩＤ  ８７９４）は、ＮＰ＿００３８３２．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４１．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（遺伝子ＩＤ  ８７９３）は、ＮＰ＿００３８３１．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４０．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（遺伝子ＩＤ  ８７９２）は、ＸＰ＿０１１５２４５４７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＸＭ＿１１５２��２４５．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（遺伝子ＩＤ  ４９８２）は、ＮＰ＿００２５３７．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００２５４６．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（遺伝子ＩＤ  ５１３３０）は、ＮＰ＿０５７７２３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１６６３９．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（遺伝子ＩＤ  ２３４９５）は、ＮＰ＿００３６５８４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１２４５２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（遺伝子ＩＤ  １１５６５０）は、ＮＰ＿４４３１７７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０５２９４５．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１４（遺伝子ＩＤ  ８７６４）は、ＮＰ＿００１２８４５３４．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２９７６０５．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１７（遺伝子ＩＤ  ６０８）は、ＮＰ＿００１１８３．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１１９２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１８（遺伝子ＩＤ  ８７８４）は、ＮＰ＿００４１９５．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００４１８６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１９（遺伝子ＩＤ  ５５５０４）は、ＮＰ＿００１１９１３８７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２０４４５８．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＮＦＲＳＦ２１（遺伝子ＩＤ  ２７２４２）は、ＮＰ＿０５５２６７．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１４４５２．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３：遺伝子ＩＤ  ８７１８）は、リガンドＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ）に結合し、ＮＰ＿００１０３４７５３．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０３９６６４．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２２８】
或いは、第２の抗原結合部位によって結合される免疫細胞抗原は、ＴＮＦＲＳＦメンバー、例えば、免疫共刺激分子又は阻害性チェックポイント分子以外の免疫系において調節機能を有する分子であり得る。このような免疫調節分子の例としては、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、Ｔ細胞免疫グロブリン、ムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）、ＣＤ４７、ＣＤ７３、Ａ２ａＲ、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、ＶＩＳＴＡ  ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＬＬＴ１、ガレクチン−９、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、及びＫＩＲが挙げられる。
【０２２９】
免疫細胞抗原が存在する免疫細胞は、任意の免疫細胞サブセットに属してもよく、Ｔ細胞、腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）、骨髄系統細胞、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ＮＫ細胞及び／又はＢ細胞であり得る。免疫細胞抗原がＴＮＦＲＳＦ受容体である場合、ＴＮＦＲＳＦ受容体が存在する免疫細胞は、好ましくは、Ｔ細胞である。
【０２３０】
或いは、第２の抗原結合部位は、上述される疾患抗原に結合し得る。理論に制約されるのを望むものではないが、特異的結合メンバーの、ＣＤ１３７及び疾患抗原への結合が、疾患の近くでＴ細胞の活性化をもたらすと考えられる。次に、次に活性化Ｔ細胞は、免疫応答、例えば、病原体又は癌細胞に対する免疫応答を開始させ、促進し、又はそれに関与し得る。癌細胞を認識及び除去する際に免疫系が果たす役割の概説が、Chen and Mellman (2013)によって提供される。
【０２３１】
好ましい実施形態において、疾患抗原は、腫瘍抗原に結合し得る。腫瘍抗原は、腫瘍の環境中に主に存在し、個体における他の箇所に遍在的に存在していない抗原である。例えば、腫瘍抗原は、腫瘍細胞の表面に存在し得、又は腫瘍微小環境の他の間質細胞若しくは腫瘍の近くの体液中に存在し得る。したがって、腫瘍抗原は、個体における腫瘍細胞の位置のマーカーである。
【０２３２】
ある実施形態において、腫瘍抗原は、癌細胞の表面に位置する抗原であり得る。好ましくは、腫瘍抗原は、腫瘍細胞において上方制御又は過剰発現される一方、それは、腫瘍の非存在下における同じ組織から対応する正常な体細胞によって多く発現されることはない。
【０２３３】
ある実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍の非存在下における対応する正常な組織の間質細胞と比較して、腫瘍微小環境の間質細胞において上方制御又は過剰発現される。
【０２３４】
好ましい腫瘍抗原は、細胞表面に存在し、急速に内在化されることはない。
【０２３５】
特異的結合メンバーによって標的化するのに好適な腫瘍抗原は、当該技術分野において公知の方法を用いて同定され得る。例えば、ＣＤ１３７受容体及び腫瘍抗原を標的とする特異的結合メンバーは、ＣＤ１３７発現細胞が腫瘍抗原発現細胞とともに共培養されるアッセイにおいて使用され得、ＣＤ１３７発現細胞の活性化が、例えば、Ｔ細胞活性化アッセイ、増殖アッセイ又は細胞毒性アッセイによって測定される。
【０２３６】
細胞表面腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）であり得る。
【０２３７】
癌細胞によって発現される腫瘍抗原としては、例えば、癌生殖細胞系遺伝子、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−Ｉ、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−Ｉ、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＬＡＧＥ−Ｉ、ＳＳＸ−Ｉ、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−Ｉ及びＸＡＧＥによってコードされる癌精巣（ＣＴ）抗原並びに免疫原性断片又はその変異体が挙げられ得る（Simpson et al.,2005；Gure et al.,2005；Velazquez et al.,2007；Andrade et al.,2008；Tinguely et al.,2008；Napoletano et al.,2008）。
【０２３８】
他の細胞表面腫瘍抗原としては、例えば、ＡＦＰ、αｖβ３（ビトロネクチン受容体）、αｖβ６、Ｂ細胞成熟剤（ＢＣＭＡ）、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ８０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３ガングリオシド、ＨＥＲ２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、抗イディオタイプ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、例えば癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＴＡＧ−７２、葉酸結合タンパク質、Ａ３３、Ｇ２５０、フェリチン、糖脂質、例えば、ガングリオシド、糖質、例えば、ＣＡ−１２５、ＩＬ−２受容体、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２００、ＥｐｈＡ２、及びメソテリン又はその変異体が挙げられる。これらの及び他の細胞表面腫瘍抗原は、Carter et al.,2004；Scott and Renner,2001；及びCheever et al.,2009；Tai and Anderson,2015；及びPodojil and Miller,2017に記載されている。
【０２３９】
他の腫瘍抗原としては、「ストレスを受けた」癌細胞によって用いられる非ＡＵＧ翻訳開始機構によって生成されるアウトオブフレームペプチド−ＭＨＣ複合体が挙げられる（Malarkannan et al.,1999）。
【０２４０】
他の腫瘍抗原としては、腫瘍細胞の表面又は腫瘍微小環境の細胞の表面におけるペプチド−ＭＨＣ複合体が挙げられ、ここで、ペプチド−ＭＨＣ複合は、突然変異した細胞内腫瘍抗原の腫瘍特異的ネオアンチゲンペプチド断片を含み、ペプチドネオアンチゲンは、１つ以上の腫瘍特異的突然変異を有する（Gubin et al.,2015）。他の腫瘍抗原が、当該技術分野において周知である（例えば国際公開第００／２０５８１号；Cancer Vaccines and Immunotherapy(2000)Eds Stern,Beverley and Carroll,Cambridge University Press,Cambridgeを参照）。これらの腫瘍抗原の配列は、公開データベースから容易に入手可能であるが、国際公開第１９９２／０２０３５６  Ａ１号、国際公開第１９９４／００５３０４  Ａ１号、国際公開第１９９４／０２３０３１  Ａ１号、国際公開第１９９５／０２０９７４  Ａ１号、国際公開第１９９５／０２３８７４  Ａ１号及び国際公開第１９９６／０２６２１４  Ａ１号にも見出される。
【０２４１】
好ましい腫瘍抗原としては、ＨＥＲ２、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ２０、ＣＤ７３、ＰＳＭＡ、メソテリン、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ２００、αｖβ６、ＢＣＭＡ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４及びＥＧＦＲが挙げられる。
【０２４２】
より好ましい実施形態において、腫瘍抗原は、メソテリン（ＭＳＬＮ）である。
【０２４３】
代替的なより好ましい実施形態において、腫瘍抗原は、ＰＤ−Ｌ１である。
【０２４４】
ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２；遺伝子ＩＤ  ２０６４）は、ＮＰ＿００１００５８６２．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１００５８６２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＦＡＰ（遺伝子ＩＤ  ２１９１）は、ＮＰ＿００１２７８７３６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２９１８０７．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥｐＣＡＭ（遺伝子ＩＤ  ４０７２）は、ＮＰ＿００２３４５．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００２３５４．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＥＡＣＡＭ５（遺伝子ＩＤ  １０４８）は、ＮＰ＿００１２７８４１３．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２９１４８４．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１；遺伝子ＩＤ  ９３１）は、ＮＰ＿０６８７６９．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０２１９５０．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ；遺伝子ＩＤ  ４９０７）は、ＮＰ＿００１１９１７４２．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２０４８１３．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１；遺伝子ＩＤ  ２３４６）は、ＮＰ＿００１０１４９８６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１０１４９８６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。メソテリン（ＭＳＬＮ；遺伝子ＩＤ  １０２３２）は、ＮＰ＿００１１７０８２６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１７７３５５．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥｐｈＡ２（遺伝子ＩＤ  １９６９）は、ＮＰ＿００１３１６０１９．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１３２９０９０．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＩＧＦ１Ｒ（遺伝子ＩＤ  ３４８０）は、ＮＰ＿０００８６６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０００８７５．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＤ２００（遺伝子ＩＤ  ４３４５）は、ＮＰ＿００１００４１９６．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１００４１９６．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。αｖβ６は、インテグリンサブユニットαＶ及びインテグリンサブユニットβ６から構成されるヘテロ二量体である。インテグリンサブユニットαＶ（ＩＴＧＡＶ；遺伝子ＩＤ  ３６８５）は、ＮＰ＿００１１３８４７１．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１４４９９９．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。インテグリンサブユニットβ６（ＩＴＧＢ６；遺伝子ＩＤ  ３６９４）は、ＮＰ＿０００８７９．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０００８８８．４の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７；遺伝子ＩＤ  ６０８）は、ＮＰ＿００１１８３．２の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１９２．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４；遺伝子ＩＤ  ２９１２６）は、ＮＰ＿００１２５４６３５．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２６７７０６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６；遺伝子ＩＤ  ８０３８���）は、ＮＰ＿００１０１９９０７．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１０２４７３６．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。Ｂ７Ｈ４（ＶＴＣＮ１；遺伝子ＩＤ  ７９６７９）は、ＮＰ＿００１２４０７７８．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２５３８４９．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＥＧＦＲ（遺伝子ＩＤ  １９５６）は、ＮＰ＿００１３３３８２６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１３４６８９７．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２４５】
他の実施形態において、腫瘍抗原は、可溶性腫瘍抗原、例えば、癌細胞によって、又は癌細胞に応答して産生される成長因子であり得る。可溶性因子は、腫瘍の近くの体液中で上方制御又は過剰発現され得る。可溶性腫瘍抗原は、多量体、例えば二量体又は三量体であり得る。可溶性腫瘍抗原は、個体の身体の他の箇所より、腫瘍部位又は腫瘍微小環境中により高い濃度で存在し得る。腫瘍微小環境及び関連する可溶性腫瘍抗原は、Bhome et al.(2015)により詳細に記載されている。
【０２４６】
好適な可溶性腫瘍抗原としては、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＳＤＦ１及びＴＧＦ−β、例えばＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−２、ＴＧＦ−β−３及びＴＧＦ−β−４が挙げられる。
【０２４７】
ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＡ；遺伝子ＩＤ  ７４２２）は、ＮＰ＿００１０２０５３７．２の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０２５３６６．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＨＧＦ（遺伝子ＩＤ  ３０８２）は、ＮＰ＿０００５９２．３の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０００６０１．５の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＳＤＦ１（ＣＸＣＬ１２；遺伝子ＩＤ  ６３８７）は、ＮＰ＿０００６００．１の基準アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０００６０９．６の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−１（ＴＧＦＢ１；遺伝子ＩＤ  ７０４０）は、ＮＰ＿０００６５１．３の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０００６６０．６の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−２（ＴＧＦＢ２；遺伝子ＩＤ  ７０４２）は、ＮＰ＿００１１２９０７１．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１３５５９９．３の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−３（ＴＧＦＢ３；遺伝子ＩＤ  ７０４３）は、ＮＰ＿００１３１６８６７．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１３２９９３８．１の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＴＧＦ−β−４（ＬＥＦＴＹ２；遺伝子ＩＤ  ７０４４）は、ＮＰ＿００１１６５８９６．１の基準アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１７２４２５．２の基準ヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２４８】
別の好ましい実施形態において、疾患抗原は、病原性抗原である。
【０２４９】
感染症の部位の近くでの特異的結合メンバーによるＴ細胞などの免疫細胞及び／又はマクロファージの活性化は、感染症の治療に有用であることが予想される。感染症は、急性又は持続性感染症であり得るが、好ましくは、持続性感染症である。
【０２５０】
病原性抗原は、好ましくは、ヒト病原体によって発現される抗原、例えば、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫抗原（例えば原虫抗原）、好ましくは、ウイルス又は細菌抗原である。病原性抗原は、病原体、又は感染症の部位の近くに主に存在し、個体における他の箇所に遍在的に存在していない抗原である。
【０２５１】
例えば、病原性抗原は、ウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物の表面に存在する抗原、又はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物によって発現される可溶性抗原であり得る。ウイルス、細菌、真菌、又は寄生生物は、本明細書の他の箇所で言及されるウイルス、細菌、真菌、又は寄生生物であり得る。
【０２５２】
病原性抗原が可溶性抗原である場合、抗原は、感染症の部位の近くの体液中で上方制御又は過剰発現され得る。例えば、可溶性病原性抗原は、個体の身体の他の箇所より、感染症の部位、又は感染症の部位の近くにより高い濃度で存在し得る。可溶性病原性抗原は、多量体、例えば二量体又は三量体であり得る。
【０２５３】
特異的結合メンバーによって標的化するのに好適な病原性抗原は、当該技術分野において公知の方法を用いて同定され得る。例えば、ＣＤ１３７及び病原性抗原を標的とする特異的結合メンバーが、ＣＤ１３７発現細胞が病原体又は病原性抗原とともに共培養されるアッセイにおいて使用され得、ＯＸ４０発現細胞の活性化が、例えば、Ｔ細胞活性化アッセイ、増殖アッセイ又は細胞毒性アッセイによって測定される。
【０２５４】
特異的結合メンバーによって標的化するのに好適な多くの病原性抗原が、当該技術分野においてさらによく知られており、治療される感染症に応じて当業者によって選択され得る。ウイルス抗原の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって発現されるタンパク質ｐ２４、ｇｐ１２０、及びｇｐ４１、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって発現されるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、並びにインフルエンザウイルスによって発現されるヘマグルチニン及びノイラミニダーゼが挙げられる。細菌抗原の例としては、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）によって発現されるＲｖ１７３３、Ｒｖ２３８９及びＲｖ２４３５ｎが挙げられる。
【０２５５】
特異的結合メンバーは、本明細書に開示される第１又は第２の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖配列の変異体も含み得る。好適な変異体は、配列変異、又は突然変異、及びスクリーニングの方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、１つ以上の変異体配列を含む特異的結合メンバーは、親特異的結合メンバーの機能特性、例えば、ＣＤ１３７に対する結合特異性及び／又は結合親和性の１つ以上を保持する。例えば、１つ以上の変異体配列を含む特異的結合メンバーは、好ましくは、（親）特異的結合メンバーと同じ親和性、又はそれより高い親和性でＣＤ１３７に結合する。親特異的結合メンバーは、変異体特異的結合メンバーに組み込まれたアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含まない特異的結合メンバーである。
【０２５６】
例えば、特異的結合メンバーは、本明細書に開示される第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有する、第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖及び／又は重鎖配列を含み得る。
【０２５７】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号２１、３０、４８、１０２、７５、３９、５７、６６、８４、９３、１７５、１３９、１３０、１４８、１２１、１５７、１６５、又は１１２に記載されるＣＨ３ドメイン配列に対する、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性、好ましくは、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ３ドメイン配列を有するか又はそれを含む。
【０２５８】
さらなる好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号５又は６に記載されるＣＨ２ドメイン配列に対する、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＨ２ドメイン配列を有するか又はそれを含む。
【０２５９】
別の好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号２３、３２、５０、１０４、７７、４１、５９、６８、８６、９５、１５、１４１、１３２、１５０、１２３、１５９、１６７、１１４、２５、３４、５２、１０６、７９、４３、６１、７０、８８、９７、１６、１４３、１３４、１５２、１２５、１６１、１６９、又は１１６に記載されるＦｃａｂ配列に対する、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を有するか、含むか、又はそれからなる。
【０２６０】
配列同一性は、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCG package,Accelerys Inc,San Diego USA）に関連して一般的に定義される。ＧＡＰは、Needleman and Wunschアルゴリズムを使用して、一致の数を最大にし、且つギャップの数を最小にする、２つの完全な配列をアラインする。一般に、１２に等しいギャップ作成ペナルティ（gap creation penalty）及び４に等しいギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）を伴うデフォルトパラメータが使用される。ＧＡＰの使用が、好ましいことがあるが、他のアルゴリズム、例えば、一般に、デフォルトパラメータを用いる、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al.(1990)の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman(1988)の方法を使用する）、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman(1981)）、又は上記のAltschul et al.(1990)のＴＢＬＡＳＴＮプログラムが使用され得る。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズムが使用され得る。
【０２６１】
特異的結合メンバーは、本明細書に開示される第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０以下の変異、１５以下の変異、１０以下の変異、５つ以下の変異、４つ以下の変異、３つ以下の変異、２つ以下の変異、又は１つの変異を有する、第１、第２又は第３の配列、ＡＢ、ＣＤ又はＥＦ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、Ｆｃａｂ、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖又は重鎖配列を含み得る。
【０２６２】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号２１、３０、４８、１０２、７５、３９、５７、６６、８４、９３、１７５、１３９、１３０、１４８、１２１、１５７、１６５又は１１２に記載されるＣＨ３ドメイン配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０以下の変異、１５以下の変異、１０以下の変異、５つ以下の変異、４つ以下の変異、３つ以下の変異、２つ以下の変異、又は１つの変異を有するＣＨ３ドメイン配列を含み得る。
【０２６３】
さらなる好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号５又は６に記載されるＣＨ２ドメイン配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０以下の変異、１５以下の変異、１０以下の変異、５つ以下の変異、４つ以下の変異、３つ以下の変異、２つ以下の変異、又は１つの変異を有するＣＨ２ドメイン配列を含む。
【０２６４】
さらなる好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、配列番号２３、３２、５０、１０４、７７、４１、５９、６８、８６、９５、１５、１４１、１３２、１５０、１２３、１５９、１６７、１１４、２５、３４、５２、１０６、７９、４３、６１、７０、８８、９７、１６、１４３、１３４、１５２、１２５、１６１、１６９、又は１１６に記載されるＦｃａｂ配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、４０以下の変異、３０以下の変異、２０以下の変異、１５以下の変異、１０以下の変異、５つ以下の変異、４つ以下の変異、３つ以下の変異、２つ以下の変異、又は１つの変異を有する配列を含むか又はそれからなる。
【０２６５】
特異的結合メンバーが、本明細書に開示される第１の配列、ＡＢ構造ループ配列、ＣＨ３ドメイン、Ｆｃａｂ、又は重鎖配列の変異体を含む場合、特異的結合メンバーは、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１１及び１９位の間、好ましくは、１５及び１７位の間に配列ＰＰＹを保持する。さらに、特異的結合メンバーは、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの１６及び１７位の間に挿入、好ましくは、５アミノ酸挿入を保持する。さらなる好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインの９７及び９８位に配列を保持する。
【０２６６】
特に、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３の変異体であり得（又は抗体分子は、それを含み得る）、ここで、変異体は：
（ｉ）本明細書に開示される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３の配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列変異（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０以下の変異、１５以下の変異、１０以下の変異、５つ以下の変異、４つ以下の変異、３つ以下の変異、２つ以下の変異、又は１つの変異を含み；又は
（ｉｉ）本明細書に開示される特異的結合メンバーＦＳ２２−０５３の配列に対する、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有し；
ここで、特異的結合メンバー又は抗体分子は、特異的結合メンバー又は抗体分子のＣＨ３ドメインの、１５及び１７位の間に配列ＰＰＹを含み、任意に、１６及び１７位の間に５アミノ酸挿入を含み；
ここで、残基番号付けは、ＩＭＧＴ残基番号付けスキームに従う。
【０２６７】
更に、或いは、特異的結合メンバーが、本明細書に開示されるＣＨ３ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃａｂ、軽鎖又は重鎖配列の変異体を含む場合、変異体は、好ましくは、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ中に位置する第１、第２及び第３の配列中にアミノ酸変異を含まない。例えば、変異体は、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ中にアミノ酸変異を含むことはない。
【０２６８】
１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換される好ましい実施形態において、置換は、例えば以下の表で表される保存的置換であり得る。ある実施形態において、真ん中の列における同じカテゴリーのアミノ酸が、互いに置換され、すなわち、非極性アミノ酸が、例えば別の非極性アミノ酸で置換される。ある実施形態において、最も右側の列における同じ行のアミノ酸が、互いに置換される。
【０２６９】
【表１】
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【０２７０】
ある実施形態において、置換は、機能的に保存的であり得る。すなわち、ある実施形態において、置換は、同等の非置換の特異的結合メンバーと比較して、置換を含む特異的結合メンバーの１つ以上の機能特性（例えば結合親和性）に影響を与えることはない（又は実質的に影響を与えることはない）。
【０２７１】
特異的結合メンバーの定常ドメイン、好ましくは、ＣＨ３ドメイン中に位置するＣＤ１３７抗原結合部位を含み、且つＣＤ１３７への結合を巡って本発明の特異的結合メンバーと競合するか、又はＣＤ１３７における、本発明の特異的結合メンバーと同じエピトープに結合する特異的結合メンバーも考えられる。２つの特異的結合メンバーによって抗原を巡る競合を決定するための方法が、当該技術分野において公知である。例えば、２つの特異的結合メンバーによる抗原への結合の競合が、Biacoreなどの表面プラズモン共鳴を用いて決定され得る。特異的結合メンバーによって結合されたエピトープをマッピングするための方法は、当技術分野において同様に知られている。
【０２７２】
ある実施形態において、特異的結合メンバーは、ＣＤＲベースの抗原結合部位を含むことはない。
【０２７３】
特に、特異的結合メンバーは、ＰＤ−Ｌ１に結合するＣＤＲベースの抗原結合部位を含むことはない。
【０２７４】
それに加えて、又はその代わりに、特異的結合メンバーは、メソテリン（ＭＳＬＮ）に結合するＣＤＲベースの抗原結合部位を含むことはない。
【０２７５】
例えば、特異的結合メンバーは、ＰＤ−Ｌ１又はＭＳＬＮに結合するＣＤＲベースの抗原結合部位を含むことはなく、ここで、特異的結合メンバーは、特異的結合メンバーＦＳ２２−５３−００８、又はＦＳ２２−１７２−００３のＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ及びＥＦ構造ループ中に位置する第１、第２及び第３の配列、特異的結合メンバーＦＳ２２−５３−００８、又はＦＳ２２−１７２−００３のＣＨ３ドメインの完全ＡＢ及びＥＦ構造ループ配列、及び／又は特異的結合メンバーＦＳ２２−５３−００８、又はＦＳ２２−１７２−００３のＣＨ３ドメイン配列を含む。
【０２７６】
特に、特異的結合メンバーは、以下に記載されるＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２及びＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２のＣＤＲ、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン、及び／又は重鎖及び／又は軽鎖配列を含むことはない。
【０２７７】
ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２及びＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２  ＶＨドメインＣＤＲ
ＨＣＤＲ１（ＩＭＧＴ）  ＧＹＰＦＴＳＹＧ
ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ）  ＳＹＧＩＳ
ＨＣＤＲ２（ＩＭＧＴ）  ＩＳＡＹＳＧＧＴ
ＨＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ）  ＷＩＳＡＹＳＧＧＴＮＹＡＱＫＬＱＧ
ＨＣＤＲ３（ＩＭＧＴ）  ＡＲＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ
ＨＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ）  ＤＬＦＰＴＩＦＧＶＳＹＹＹＹ
【０２７８】
ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２及びＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２  ＶＨドメイン
【化１】
2021524270.tif 000003
【０２７９】
ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２及びＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２  ＶＬドメインＣＤＲ
ＬＣＤＲ１（ＩＭＧＴ）  ＱＳＩＧＮＲ
ＬＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ）  ＲＡＳＱＳＩＧＮＲＬＡ
ＬＣＤＲ２（ＩＭＧＴ）  ＥＡＳ
ＬＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ）  ＥＡＳＴＳＥＴ
ＬＣＤＲ３（ＩＭＧＴ）  ＱＱＳＹＳＴＰＹＴ
ＬＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ）  ＱＱＳＹＳＴＰＹＴ
【０２８０】
ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２及びＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２  ＶＬドメイン
【化２】
2021524270.tif 000004
【０２８１】
重鎖ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２
【化３】
2021524270.tif 000005
【０２８２】
軽鎖ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２
【化４】
2021524270.tif 000006
【０２８３】
重鎖ＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２
【化５】
2021524270.tif 000007
【０２８４】
軽鎖ＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／Ｅ１２ｖ２
【化６】
2021524270.tif 000008
【０２８５】
それに加えて、又はその代わりに、特異的結合メンバーは、以下に記載される抗ＭＳＬＮ抗体ＦＳ２８−２５６−２７１のＣＤＲ及び／又はＶＨ及び／又はＶＬドメインを含むことはない。
【０２８６】
ＦＳ２８−２５６−２７１  ＶＨドメインＣＤＲ
ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）  ＧＦＴＦＴＨＴＹ
ＨＣＤＲ１（ＡＡ）（Ｋａｂａｔ）  ＨＴＹＭＳ
ＨＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）  ＩＳＰＴＹＳＴＴ
ＨＣＤＲ２（ＡＡ）Ｋａｂａｔ）  ＡＩＳＰＴＹＳＴＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）  ＡＲＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
ＨＣＤＲ３（ＡＡ）（Ｋａｂａｔ）  ＹＮＡＹＨＡＡＬＤＹ
【０２８７】
ＦＳ２８−２５６−２７１  ＶＨドメイン
【化７】
2021524270.tif 000009
【０２８８】
ＦＳ２８−２５６−２７１  ＶＬドメインＣＤＲ
ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）  ＱＳＶＳＳＳＹ
ＬＣＤＲ１（ＡＡ）（Ｋａｂａｔ）  ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）  ＧＡＳ
ＬＣＤＲ２（ＡＡ）（Ｋａｂａｔ）  ＧＡＳＳＲＡＴ
ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（ＩＭＧＴ）  ＱＱＴＶＰＹＰＹＴ
ＬＣＤＲ３（ＡＡ）（Ｋａｂａｔ）  ＱＱＴＶＰＹＰＹＴ
【０２８９】
ＦＳ２８−２５６−２７１  ＶＬドメイン
【化８】
2021524270.tif 000010
【０２９０】
特異的結合メンバーは、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。この場合、特異的結合メンバーは、コンジュゲートと呼ばれ得る。このようなコンジュゲートは、本明細書に記載される疾患の治療に利用される。
【０２９１】
例えば、生物活性分子は、サイトカイン、好ましくは、ヒトサイトカインなどの免疫系調節剤であり得る。例えば、サイトカインは、Ｔ細胞活性化及び／又は増殖を刺激するサイトカインであり得る。特異的結合メンバーへのコンジュゲーションのためのサイトカインの例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γが挙げられる。
【０２９２】
或いは、生物活性分子は、サイトカインのリガンドトラップ、例えばＴＧＦ−β又はＩＬ−６のリガンドトラップなどのリガンドトラップであり得る。
【０２９３】
特異的結合メンバーにコンジュゲートされ得る好適な検出可能な標識は、当該技術分野において公知であり、放射性同位体、例えば、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、インジウム−１１１及びテクネチウム−９９；蛍光色素、例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、Texas Red及びシアニン色素誘導体、例えば、Cy7及びAlexa750；発色性色素、例えば、ジアミノベンジジン；ラテックスビーズ；酵素標識、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ；スペクトル的に分離された吸収若しくは発光特性を有する蛍光又はレーザー色素；及び特定の同種検出可能部分、例えば標識されたアビジンへの結合を介して検出され得る、ビオチンなどの化学部分が挙げられる。
【０２９４】
特異的結合メンバーは、任意の好適な共有結合又は非共有結合、例えば、ジスルフィド又はペプチド結合によって、生物活性分子又は検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。生物活性分子がサイトカインである場合、サイトカインは、ペプチドリンカーによって特異的結合メンバーに結合され得る。好適なペプチドリンカーは、当該技術分野において公知であり、５から２５、５から２０、５から１５、１０から２５、１０から２０、又は１０から１５アミノ酸長であり得る。
【０２９５】
ある実施形態において、生物活性分子は、切断可能なリンカーによって特異的結合メンバーにコンジュゲートされ得る。リンカーは、治療の部位における特異的結合メンバーからの生物活性分子の放出を可能にし得る。リンカーは、アミド結合（例えばペプチドリンカー）、ジスルフィド結合又はヒドラゾンを含み得る。ペプチドリンカーは、例えば部位特異的プロテアーゼによって切断され得、ジスルフィド結合は、サイトゾルの還元環境によって切断され得、ヒドラゾンは、酸媒介性加水分解によって切断され得る。
【０２９６】
コンジュゲートは、特異的結合メンバー及び生物活性分子を含む融合タンパク質であり得る。この場合、生物活性分子は、ペプチドリンカー又はペプチド結合によって特異的結合メンバーにコンジュゲートされ得る。特異的結合メンバーが多連鎖分子である場合、例えば、特異的結合メンバーがＦｃａｂであるか若しくはそれを含むか又はｍＡｂ２である場合、生物活性分子は、特異的結合メンバーの１つ以上の鎖にコンジュゲートされ得る。例えば、生物活性分子は、ｍＡｂ２分子の重鎖の一方又は両方にコンジュゲートされ得る。融合タンパク質は、産生及び精製するのが容易であるという利点を有し、臨床グレードの材料の製造を容易にする。
【０２９７】
本発明はまた、本発明の特異的結合メンバーをコードする１つ又は複数の単離された核酸分子を提供する。当業者には、当該技術分野において周知の方法を用いて、このような核酸分子を調製するのに何の困難もない。
【０２９８】
好ましい実施形態において、核酸分子は、特異的結合メンバー：ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、又はＦＳ２２−１７２、好ましくは、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、又はＦＳ２２−１７２−００６、より好ましくは、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、又はＦＳ２２−１７２−００４、さらにより好ましくは、ＦＳ２２−１７２−００３のＣＨ３ドメインをコードする。
【０２９９】
別の好ましい実施形態において、核酸分子は、特異的結合メンバー：ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、又はＦＳ２２−０５３、好ましくは、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、又はＦＳ２２−０５３−０１４、より好ましくは、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、又はＦＳ２２−０５３−０１７、さらにより好ましくは、ＦＳ２２−０５３−００８のＣＨ３ドメインをコードする。
【０３００】
これらの特異的結合メンバーのＣＨ３ドメイン配列は、本明細書に記載されている。
【０３０１】
例えば、特異的結合メンバーのＣＨ３ドメインをコードする核酸分子：
（ｉ）配列番号２２、３１、４９、１０３、７６、４０、５８、６７、８５、９４、及び１７６のそれぞれに記載されるＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、若しくはＦＳ２２−０５３；又は
（ｉｉ）配列番号１４０、１３１、１４９、１２２、１５８、１６６、及び１１３のそれぞれに記載されるＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、若しくはＦＳ２２−１７２。
【０３０２】
好ましい実施形態において、核酸分子は、特異的結合メンバー：ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、又はＦＳ２２−１７２、好ましくは、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、又はＦＳ２２−１７２−００６、より好ましくは、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、又はＦＳ２２−１７２−００４、さらにより好ましくは、ＦＳ２２−１７２−００３をコードする。
【０３０３】
別の好ましい実施形態において、核酸分子は、特異的結合メンバー：ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、又は又はＦＳ２２−０５３、好ましくは、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、又はＦＳ２２−０５３−０１４、より好ましくは、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、又はＦＳ２２−０５３−０１７、さらにより好ましくは、ＦＳ２２−０５３−００８をコードする。
【０３０４】
例えば、特異的結合メンバーをコードする核酸分子：
（ｉ）配列番号２４、３３、５１、１０５、７８、４２、６０、６９、８７、９６、及び１７７のそれぞれに記載されるＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１７、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−０５３−０１３、ＦＳ２２−０５３−０１５、ＦＳ２２−０５３−０１６、若しくはＦＳ２２−０５３；又は
（ｉｉ）配列番号１４２、１３３、１５１、１２４、１６０、１６８、及び１１５のそれぞれに記載されるＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、若しくはＦＳ２２−１７２。
【０３０５】
単離された核酸分子が、本発明の特異的結合メンバーを発現させるのに使用され得る。核酸は、一般に、発現のために組み換えベクターの形態で提供される。したがって、本発明の別の態様は、上述される核酸を含むベクターを提供する。必要に応じて、プロモータ配列、ターミネータ断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む適切な制御配列を含有する好適なベクターが、選択又は構築され得る。好ましくは、ベクターは、宿主細胞内の核酸の発現を引き起こすために適切な制御配列を含有する。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、又はファージミドであり得る。
【０３０６】
本明細書に記載される核酸分子又はベクターは、宿主細胞中に導入され得る。宿主細胞中への核酸又はベクターの導入のための技術は、当該技術分野において十分に確立されており、任意の好適な技術が用いられ得る。組み換え特異的結合メンバーの産生に好適な様々な宿主細胞が、当該技術分野において公知であり、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物宿主細胞を含む。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳ０、又はＨＥＫ細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞である。最も好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【０３０７】
本発明の別の態様は、本発明の特異的結合メンバーを産生する方法であって、宿主細胞内で特異的結合メンバーをコードする核酸を発現させること、及び任意に、このように産生された特異的結合メンバーを単離及び／又は精製することを含む、方法を提供する。宿主細胞を培養するための方法は、当該技術分野において周知である。本方法は、特異的結合メンバーを単離及び／又は精製することをさらに含み得る。組み換え特異的結合メンバーの精製のための技術は、当該技術分野において周知であり、例えばプロテインＡ又はプロテインＬを用いた、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又はアフィニティークロマトグラフィーを含む。ある実施形態において、精製は、特異的結合メンバー上でアフィニティータグを用いて行われ得る。本方法は、任意に、薬学的に許容される賦形剤又は後述される他の物質を用いて、特異的結合メンバーを医薬組成物へと製剤化することも含み得る。
【０３０８】
上記に説明されるように、ＣＤ１３７は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、免疫系の細胞において発現される。特に、ＣＤ１３７の活性化は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖、生存及び細胞傷害性エフェクター機能、並びにＣＤ８＋  Ｔ細胞の分化及びメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞の維持を促進するのに役割を果たすことが示された。ＣＤ１３７は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞よりＣＤ４＋  Ｔ細胞において低いレベルで発現されるが、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のいくつかのサブセットの増殖及び活性化を誘発するのに関与していることも示されている。ＣＤ１３７の活性化はまた、ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ、並びにＢ細胞増殖、生存及びサイトカイン産生を促進することも実証されている。
【０３０９】
ＣＤ１３７の活性を促進する免疫応答を考慮して、ＣＤ１３７アゴニスト分子は、癌治療、並びに慢性感染症の治療に関して調査されている。
【０３１０】
したがって、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、治療用途、特に、癌の治療に有用であり得る。さらに、特異的結合メンバーは、持続性感染症などの感染症の治療に有用であると予想される。
【０３１１】
本明細書に記載される特異的結合メンバーは、ヒト又は動物身体の治療の方法に使用され得る。本発明の関連する態様は、以下を提供する；
（ｉ）薬剤として使用するための本明細書に記載される特異的結合メンバー、
（ｉｉ）疾患又は障害の治療の方法に使用するための本明細書に記載される特異的結合メンバー、
（ｉｉｉ）疾患又は障害の治療に使用するための薬剤の製造における、本明細書に記載される特異的結合メンバーの使用；及び
（ｉｖ）個体における疾患又は障害を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載される特異的結合メンバーを個体に投与することを含む、方法。
【０３１２】
個体は、患者、好ましくは、ヒト患者であり得る。
【０３１３】
治療は、ある所望の治療効果が達成される任意の治療又は治療法、例えば、病態の進行の阻害又は遅延であり得、進行速度の低下、進行速度の停止、病態の改善、病態の治癒若しくは緩和（部分的か若しくは全体的かにかかわらず）、病態の１つ以上の症状及び／又は兆候を予防、改善、遅延、低減若しくは停止するか、又は個体若しくは患者の生存期間を、治療しない場合に予想される生存期間を超えて延長することを含む。
【０３１４】
予防的措置（すなわち予防）としての治療も含まれる。例えば、癌などの疾患の発症又は再発を起こしやすい又はそのリスクがある個体が、本明細書に記載されるように治療され得る。このような治療は、個体における疾患の発症又は再発を予防するか又は遅延させ得る。
【０３１５】
本明細書に記載される治療の方法は、特異的結合メンバーに加えて、少なくとも１つのさらなる治療を個体に投与することを含み得る。したがって、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、単独で又は１つ以上の他の治療と組み合わせて、個体に投与され得る。特異的結合メンバーが、別の治療と組み合わせて個体に投与される場合、さらなる治療は、特異的結合メンバーの投与と同時に、投与と連続して、又は投与と別々に、個体に投与され得る。さらなる治療が、特異的結合メンバーと同時に投与される場合、特異的結合メンバー及びさらなる治療は、複合製剤として個体に投与され得る。例えば、さらなる治療法は、治療される疾患のための公知の治療法又は治療剤であり得る。
【０３１６】
特異的結合メンバーは、単独で投与され得るが、特異的結合メンバーは、通常、特異的結合メンバーに加えて少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与されるであろう。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載される特異的結合メンバーを含む医薬組成物を提供する。特異的結合メンバーを医薬組成物へと製剤化することを含む方法も提供される。
【０３１７】
医薬組成物は、特異的結合メンバーに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。本明細書において使用される際の「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、妥当なリスク・ベネフィット比に見合う、対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。各担体、賦形剤などはまた、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容され」なければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、投与経路は、後述されるように、注入、注射又は任意の他の好適な経路によるものであり得る。
【０３１８】
例えば注射による、非経口、例えば皮下又は静脈内投与のため、特異的結合メンバーを含む医薬組成物は、パイロジェンフリーであり、且つ好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口で許容される水溶液の形態であり得る。当業者は、例えば、等張ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、ラクトリンゲル注射液を用いて好適な溶液を調製することが十分にできる。緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸及び他の有機酸；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の糖質；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（商標）、PLURONICS（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤及び／又は他の添加剤が、必要に応じて用いられ得る。
【０３１９】
ある実施形態において、特異的結合メンバーは、投与前に再構成のために凍結乾燥形態で提供され得る。例えば、凍結乾燥された特異的結合メンバーは、滅菌水で再構成され、個体への投与前に生理食塩水と混合され得る。
【０３２０】
投与は、「治療有効量」であり得、これは、個体への利益を示すのに十分なものである。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間的経過は、治療されるものの性質及び重症度、治療される特定の個体、個体の臨床症状、障害の原因、組成物の送達の部位、特異的結合メンバーのタイプ、投与の方法、投与のスケジューリング及び医師に公知の他の要因に依存する。治療の処方、例えば、投与量に関する決定などは、一般医師及び他の医師の責任に含まれ、症状の重症度及び／又は治療される疾患の進行に依存し得る。免疫グロブリンの適切な用量は、当該技術分野において周知である（Ledermann et al.(1991)Int.J.Cancer 47:659-664；及びBagshawe et al.(1991)Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922）。本明細書に、又は投与される抗体分子について適切な場合the Physician’s Desk Reference(2003)に示される特定の投与量が使用され得る。抗体分子について、特異的結合メンバーの治療有効量又は好適な用量は、動物モデルにおけるインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定され得る。マウス及び他の試験動物における有効な投与量をヒトに当てはめるための方法は公知である。正確な用量は、治療される部位のサイズ及び位置がどうであるか、並びに特異的結合メンバーの正確な性質を含むいくつかの要因に依存する。
【０３２１】
典型的な免疫グロブリン用量は、全身適用では１００μｇから１ｇの範囲であり、局所適用では１μｇから１ｍｇの範囲である。初期のより多い負荷用量、その後、１回以上のより少ない用量が投与され得る。これは、成人個体の単回の治療のための用量であり、これは、小児及び幼児のために比例的に調整され得、また、分子量に比例して他の特異的結合メンバーフォーマットのために調整され得る。
【０３２２】
治療は、医師の判断で、毎日、週に２回、１週間又は１か月間隔で繰り返され得る。個体のための治療スケジュールは、特異的結合メンバー組成物の薬物動態及び薬力学的特性、投与経路及び治療される病態の性質に依存し得る。
【０３２３】
治療は、定期的であってもよく、投与間の期間は、約２週間以上、例えば約３週間以上、約４週間以上、１か月以上で約１回、約５週間以上、又は約６週間以上であり得る。例えば、治療は、２から４週間毎又は４から８週間毎であり得る。好適な製剤及び投与の経路は、上述されている。
【０３２４】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、癌を治療する方法に使用するためのものであり得る。
【０３２５】
癌は、悪性癌細胞の異常増殖によって特徴付けられ得る。乳癌などの特定のタイプの癌が言及される場合、これは、乳房組織などの関連する組織の悪性細胞の異常増殖を指す。乳房に位置するが、卵巣組織などの別の組織の悪性細胞の異常増殖の結果である二次癌は、本明細書において言及される際、乳癌ではなく、卵巣癌である。
【０３２６】
癌は、原発性癌又は二次癌であり得る。したがって、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、個体における癌を治療する方法に使用するためのものであり得、ここで、癌は、原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である。
【０３２７】
本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される癌の腫瘍は、例えばそれらの細胞表面において、ＣＤ１３７を発現するＴＩＬを含み得る。一実施形態において、腫瘍は、ＣＤ１３７を発現するＴＩＬを含むことが決定されている場合がある。細胞表面における抗原の発現を決定するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、フローサイトメトリーを含む。
【０３２８】
例えば、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される癌は、白血病、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫；並びに固形癌、例えば、肉腫（例えば軟組織肉腫）、皮膚癌（例えばメルケル細胞癌）、黒色腫、膀胱癌（例えば尿路上皮癌）、脳腫瘍（例えば多形性膠芽腫）、乳癌、子宮／子宮内膜癌、卵巣癌（例えば卵巣漿液性嚢胞腺腫）、前立腺癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、結腸直腸癌（例えば結腸直腸腺癌）、子宮頸癌（例えば子宮頸部扁平上皮細胞癌及び子宮頚部腺癌）、肝臓癌（例えば肝細胞癌）、頭頸部癌（例えば頭頸部扁平上皮癌）、食道癌、膵臓癌、腎臓癌（例えば腎細胞癌）、副腎癌、胃癌、精巣癌、胆嚢及び胆道の癌（例えば胆管癌）、甲状腺癌、胸腺癌、骨肉腫、及び脳腫瘍からなる群から選択され得る。
【０３２９】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される癌は、固形癌である。より好ましくは、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される癌は、肉腫、黒色腫、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮癌／子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、膵臓癌、腎臓癌及び胃癌からなる群から選択され得る固形癌である。
【０３３０】
癌に関して、治療は、完全な癌の寛解を含む、癌成長を阻害すること、及び／又は癌転移を阻害すること、並びに癌の再発を阻害することを含み得る。癌成長は、一般に、より発達した形態への癌内の変化を示すいくつかの指標のいずれか１つを指す。したがって、癌成長の阻害を測定するための指標としては、癌細胞生存の減少、腫瘍体積若しくは形態の減少（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、若しくは他のイメージング方法を用いて決定される際）、遅延した腫瘍成長、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏症皮膚試験の改善した成績、抗癌免疫細胞若しくは他の抗癌免疫応答の活性の増加、及び腫瘍特異的抗原のレベルの低下が挙げられる。個体における癌性腫瘍に対する免疫応答を活性化又は促進することは、癌成長、特に、対象中に既に存在する癌の成長に抵抗し、及び／又は個体における癌成長の傾向を低下させる個体の能力を向上させ得る。
【０３３１】
癌治療に関して、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、当該癌の治療のために、好適であることが示されているか、又は好適であると予想される抗癌治療法又は治療剤などの別の抗癌治療法又は治療剤と組み合わせて、個体に投与され得る。例えば、特異的結合メンバーは、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法（養子ＮＫ細胞療法など又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、若しくはγ／δ  Ｔ細胞を用いた治療法、又はホルモン療法のための薬剤と組み合わせて、個体に投与され得る。
【０３３２】
理論に制約されるのを望むものではないが、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、抗癌治療法において補助剤として働き得ると考えられる。具体的には、化学療法及び／又は放射線療法と組み合わせた、又は抗腫瘍ワクチンと組み合わせた、個体への特異的結合メンバーの投与は、例えば、化学療法及び／又は放射線療法で、又は抗腫瘍ワクチン単独で達成されるより大きな、癌に対する免疫応答を引き起こすと考えられる。
【０３３３】
本明細書に記載される特異的結合メンバーと組み合わせた投与のための１つ以上の化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、アルキル化剤、白金類似体、ヌクレオシド類似体、抗葉酸剤、サリドマイド誘導体、抗腫瘍性化学療法剤及びその他からなる群から選択され得る。タキサンとしては、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ−パクリタキセルが挙げられ；細胞傷害性抗生物質としては、アクチノマイシン、ブレオマイシン、及びアントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、ミトキサントロン及びバルルビシンが挙げられ；チロシンキナーゼ阻害剤としては、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コビメチニブ（cobemitinib）及びトラメチニブが挙げられ；ＰＡＲＰ阻害剤としては、ニラパリブ（piraparib）が挙げられ；Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤としては、ベムラフェニブ及びダブラフェニブが挙げられ；アルキル化剤としては、ダカルバジン、シクロホスファミド及びテモゾロミドが挙げられ；白金類似体としては、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンが挙げられ；ヌクレオシド類似体としては、アザシチジン、カペシタビン、フルダラビン、フルオロウラシル及びゲムシタビンが挙げられ；抗葉酸剤としては、メトトレキサート及びペメトレキセドが挙げられる。本発明において使用するのに好適な他の化学療法剤としては、デファクチニブ、エンチノスタット、エリブリン、イリノテカン及びビンブラスチンが挙げられる。
【０３３４】
本明細書に記載される抗体分子とともに投与するための好ましい治療剤は、ドキソルビシン、ミトキサントロン、シクロホスファミド、シスプラチン、及びオキサリプラチンである。
【０３３５】
本明細書に記載される特異的結合メンバーと組み合わせた投与のための放射線療法は、外照射放射線療法又は近接照射療法であり得る。
【０３３６】
本明細書に記載される特異的結合メンバーと組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子、核酸サイトカイン、又はサイトカインベースの治療法であり得る。例えば、治療用抗体分子は、免疫調節分子、例えば阻害性チェックポイント分子若しくは免疫共刺激分子、又は腫瘍抗原、例えば細胞表面腫瘍抗原若しくは可溶性腫瘍抗原に結合し得る。治療用抗体分子が結合し得る免疫調節分子の例としては、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＲ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、ＩＬ−１０及びＣＳＦ−１が挙げられる。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（例えばＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ−５）、及びＳＴＩＮＧが挙げられる。治療用抗体分子が結合し得る腫瘍抗原の例としては、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０及びＴＧＦ−βが挙げられる。
【０３３７】
本明細書に記載される特異的結合メンバーと組み合わせた投与のための核酸は、ｓｉＲＮＡであり得る。
【０３３８】
サイトカイン又はサイトカインベースの治療法は、ＩＬ−２、コンジュゲートされたＩＬ−２のプロドラッグ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、及びＩ型インターフェロンからなる群から選択され得る。
【０３３９】
癌の治療のための抗腫瘍ワクチンは、臨床において実現されており、且つ科学文献（Rosenberg, S. 2000など）中で詳細に説明されている。これは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とともに又はそれを伴わずに、ワクチン接種法として自己又は同種異系癌細胞を使用することによって、それらの細胞によって発現される様々な細胞マーカーに応答するように免疫系を促す手法を主に必要とする。ＧＭ−ＣＳＦは、前記手法により用いられるとき、抗原提示において強い応答を引き起こし、特によく機能する。
【０３４０】
化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤は、好ましくは、当該癌のための、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤、すなわち、当該癌の治療に有効であることが示されている、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤である。当該癌に有効であることが示されている、好適な化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤、抗腫瘍ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、ＡＣＴ療法、又はホルモン療法のための薬剤の選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３４１】
ＣＤ１３７の活性を促進する免疫応答を考慮して、ＣＤ１３７アゴニスト分子は、感染症の治療に利用されると予想される。したがって、別の好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子は、急性又は持続性感染症などの感染症を治療する方法に使用するためのものであり得る。
【０３４２】
理論に制約されるのを望むものではないが、ＣＤ１３７アゴニスト分子は、好中球及び単球などの自然免疫細胞の急速浸透及び活性化を誘発し、それによって、急性感染症の原因となる病原体の除去を促進することによって、病原体によって引き起こされる急性感染症に対する免疫応答を促進し得ると考えられる。したがって、さらなる実施形態において、本明細書に記載される抗体分子は、急性細菌性疾患などの急性感染症を治療する方法において使用するためのものであり得る。好ましい実施形態において、急性感染症は、リステリア属（Listeria）の細菌、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、又は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）などのグラム陽性菌による感染によって引き起こされる急性細菌性疾患である。
【０３４３】
感染症は、通常、免疫系によって除去されるが、一部の感染症は、数か月又は数年などの長期間にわたって持続し、免疫系によって効果的に食い止められない。このような感染症は、持続性又は慢性感染症とも呼ばれる。
【０３４４】
好ましくは、本明細書に記載される抗体分子は、持続性感染症、例えば、持続性ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫感染、好ましくは、持続性ウイルス又は細菌感染を治療するのに使用される。
【０３４５】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される持続性ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、又は水痘帯状疱疹ウイルスの持続性感染症である。
【０３４６】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される持続性細菌感染は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenza）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、チフス菌（Salmonella typhi）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、又は肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）の持続性感染症である。
【０３４７】
ＣＤ１３７アゴニズムは、グラム陽性菌による感染症の治療に関して有益であることが記載されている。したがって、好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体分子を用いて治療される持続性細菌感染は、グラム陽性菌による持続性感染症である。より好ましい実施形態において、持続性細菌感染は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、らい菌（Mycobacterium leprae）、及び肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）からなる群から選択されるグラム陽性菌による持続性感染症である。
【０３４８】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される持続性真菌感染は、カンジダ属（Candida）（例えばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans））、クリプトコッカス属（Cryptococcus）（例えばクリプトコッカス・ガッティ（Cryptococcus gattii）若しくはクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans））、タラロマイセス属（Talaromyces）（ペニシリウム属（Penicillium））（例えばタラロマイセス・マルネッフェイ（Talaromyces marneffe））、ミクロスポルム属（Microsporum）（例えばミクロスポルム・オーズアニー（Microsporum audouinii））、又はトリコフィトン・トンズランス（Trichophyton tonsurans）の持続性感染症である。
【０３４９】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される特異的結合メンバーを用いて治療される持続性寄生虫感染は、プラスモジウム属（Plasmodium）、例えば、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、又はリーシュマニア属（Leishmania）、例えば、ドノバン・リーシュマニア（Leishmania donovani）の持続性感染症である。
【０３５０】
持続性感染症の治療に関して、治療は、感染症を取り除くこと、個体病原性負荷を低減すること、感染症の再発を防止することを含み得る。例えば、治療は、持続性感染症の１つ以上の症状及び／又は兆候を予防、改善、遅延、抑制又は停止することを含み得る。或いは、治療は、感染症を予防することを含み得る。
【０３５１】
感染症の治療に関して、本明細書に記載される特異的結合メンバーは、当該感染症の治療のために、好適であることが示されているか、又は好適であると予想される治療剤などの、感染症の治療のための別の治療剤と組み合わせて、個体に投与され得る。例えば、特異的結合メンバーは、免疫療法剤と組み合わせて個体に投与され得る。本明細書に記載される抗体分子と組み合わせた投与のための免疫療法剤は、治療用抗体分子であり得る。例えば、治療用抗体分子は、自然免疫系の受容体に結合し得る。治療用抗体分子が結合し得る自然免疫系の受容体の例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（例えばＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ−５）、及びＳＴＩＮＧが挙げられる。
【０３５２】
特異的結合メンバーが、感染症を予防するのに使用される場合、特異的結合メンバーは、当該病原体に対するワクチンと組み合わせて投与され得る。理論に制約されるのを望むものではないが、本明細書に記載される特異的結合メンバーが、ワクチン接種において補助剤として働き得ると考えられる。具体的には、ワクチンと組み合わせた、個体への特異的結合メンバーの投与は、ワクチン単独で達成されるより大きな、病原体に対する免疫応答を引き起こすと考えられる。
【０３５３】
本開示が以下の実験の例示を含むことを考えると、本発明のさらなる態様及び実施形態が、当業者に明らかであろう。
【０３５４】
本明細書において言及される全ての文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０３５５】
本明細書において使用される際の「及び／又は」は、他のものを伴うか又は伴わない、２つの規定の特徴又は成分のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが本明細書に個々に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。
【０３５６】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、上記に記載される特徴の説明及び定義は、本発明のいずれかの特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
【０３５７】
本発明の他の態様及び実施形態は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「からなる」又は「から本質的になる」という用語によって置き換えられる「を含む」という用語を用いて上述される態様及び実施形態を提供する。
【０３５８】
本発明の特定の態様及び実施形態は、例として及び上述される図を参照して例示される。
【実施例】
【０３５９】
実施例
実施例１：ヒト、マウス及びカニクイザル抗原の産生、特徴付け及び選択
１．１  組み換え抗原
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーは、それらの同種リガンドに結合される場合に一緒にクラスター化する多量体を形成する傾向が知られている（Croft,M.2003）。それらの機能性のために集合するこの傾向により、ファージ及び酵母ディスプレイなどのインビトロ選択に使用するため、並びに選択されたタンパク質の特徴付けのために溶液中に集合しない可溶性組み換えタンパク質を産生することが困難になる。
【０３６０】
いくつかの市販の組み換え抗原を試験し、その大部分が、存在する集合体（aggregate）のレベルのため、これらの選択に使用するのに適していないことが分かった。試験されるもののうち、ビオチン化ヒト分泌ＣＤ１３７、ｈＦｃ−融合タンパク質（BPS Biosciences、カタログ番号７１１７１）（以後、「ｈＣＤ１３７−ｈＦｃ−Ａｖｉ−ＢＰＳ」と示される）のみが、選択に好適であるのに十分に低い集合を有しており、選択に使用されたが、限られた成功であった（実施例２を参照）。
【０３６１】
市販の抗原の大部分が、不適切であると見なされるため、以下の組み換え二量体及びモノマーＣＤ１３７抗原（表１を参照）が、選択に使用するために社内で産生された。
【０３６２】
【表２】
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【０３６３】
ヒト（配列番号１８１）又はマウスＣＤ１３７（配列番号１８５）の細胞外ドメインをコードするＤＮＡを、Ａｖｉ配列及び６つのＣ末端ヒスチジン残基とともに、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＢａｍＨＩ−ＨＦ制限酵素を用いて、修飾されたｐＦＵＳＥベクター（Invivogenカタログ番号ｐｆｕｓｅ−ｍｇ２ａｆｃ２）へとクローニングすることによって、モノマー抗原を産生した。ベクターを、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（National Research Council of Canada）へとトランスフェクトし、発現されたＣＤ１３７を、HisTrap（商標）エクセルニッケルカラム（GE LifeSciences  ２９０４８５８６）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製して、抗原が単一の種であり、且つ集合体を含まないことを確実にした。
【０３６４】
二量体抗原を産生するために、Ａｖｉ配列とともにｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインと融合されたヒト、マウス又はカニクイザルＣＤ１３７の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ構築物を、修飾されたｐＦＵＳＥベクターへとクローニングし、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞へとトランスフェクトした。組み換えＣＤ１３７を、MabSelect SuRe（商標）プロテインＡカラム（GE Healthcare、１１００３４９４）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製して、抗原が単一の種であり、且つ集合体を含まないことを確実にした。
【０３６５】
二量体及びモノマー抗原のそれぞれを、ＢｉｒＡビオチン−ビオチンタンパク質リガーゼ反応キット（Avidity LLC、BirA500）を用いてビオチン化して、単一のビオチン分子で標識されたモノマーＣＤ１３７抗原、及び２つのモノマーのそれぞれに１つずつ、２つのビオチン分子で標識された二量体ＣＤ１３７抗原を産生した。３ｍｇの抗原を、１：５０の酵素対基質のモル比になるまで７．８μｌのＢｉｒＡ酵素ミックスと混合した。次に、添加剤を、製造業者の推奨（１４２μｌのBiomix A、１４２μｌのBiomix B、１４２μのビオチン）に従って加え、反応ミックスを室温で２時間インキュベートした。反応ミックスを、直ぐに、Amicon  ３０μｍフィルタ（Merck Millipore  ＵＦＣ５０３０９６）を用いてＤＰＢＳ（Life Technologies  １４１９０−１６９）に緩衝液交換した。
【０３６６】
タンパク質を、ＳＥＣによってさらに精製して、ＢｉｒＡ酵素の除去、及び高分子量の集合体を含まない最終的な高品質単分散タンパク質製剤の産生を確実にした。さらに詳細に、同じ生産ロットからの材料を、一緒に混合し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及びサイズ排除クロマトグラフィー／多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）によって、安定性及び純度について分析した。タンパク質の完全なビオチン化を、ストレプトアビジンシフトＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて確認した。組み換えヒト及びマウス抗原は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって抗ＣＤ１３７陽性対照抗体（それぞれ、２０Ｈ４．９（米国特許第７２８８６３８号））及びＬｏｂ１２．３（University of Southampton））にインビトロで結合すること、並びにフローサイトメトリーによって、ヒト及びマウスＣＤ１３７リガンドを発現するＤＯ１１．１０細胞に結合することが確認された。細胞を、１時間にわたってＣＤ１３７抗原とともにインキュベートし、次に、蛍光標識された抗マウスＦｃ断片抗体を用いて、細胞結合を検出した。組み換えカニクイザル抗原は、上述されるようにフローサイトメトリーによって、カニクイザルＣＤ１３７リガンドを発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）に結合することが確認された。選択プロトコルに使用される材料についてできる限り高い純度を確実にするために、抗原の徹底的なタンパク質特徴付けを行って、タンパク質凝集体の存在が確実に２％を超えないようにした。
【０３６７】
１．２  細胞で発現される抗原
完全長マウスＣＤ１３７（配列番号１８４）又はヒトＣＤ１３７（配列番号１８０）を発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）（それぞれ、「ＤＯ１１．１０．ｍＣＤ１３７」及び「ＤＯ１１．１０．ｈＣＤ１３７」と示される）を、表２に列挙されるように、選択されたＦｃａｂの選択及びさらなる特徴付けのために、その天然形態に最も類似した膜結合構造で抗原を表すために産生した。
【０３６８】
Lenti-X HTX Packaging System（Takara、カタログ番号６３１２４９）を用いてヒト又はマウスＣＤ１３７受容体を過剰発現するこれらのＤＯ１１．１０細胞を生成するのに、レンチウイルス形質導入を使用した。ヒトＣＤ１３７（配列番号１８０）又はマウスＣＤ１３７（配列番号１８４）をコードするｃＤＮＡを含有するLenti-X発現ベクター（ｐＬＶＸ）（Takara、カタログ番号６３１２５３）を、Lenti-X HTX Packaging Mixとともに、Lenti-X 293Ｔ細胞株（Takara、カタログ番号６３２１８０）へと共トランスフェクトして、ウイルスを生成した。次に、ＤＯ１１．１０細胞株に、これらのレンチウイルスベクターを形質導入した。
【０３６９】
これらの細胞におけるヒトＣＤ１３７又はマウスＣＤ１３７の発現を、フローサイトメトリーによって、細胞への、２０Ｈ４．９及びＬｏｂ１２．３抗ＣＤ１３７陽性対照抗体のそれぞれの結合によって確認した。細胞を、１時間にわたってヒト又はマウス陽性対照抗体とともにインキュベートし、次に、蛍光標識された抗ヒトＦｃ検出抗体（Stratech Scientific Ltd、カタログ番号１０９−５４６−０９８−ＪＩＲ）を用いて、細胞結合を検出した。
【０３７０】
カニクイザルＣＤ１３７を発現するＤＯ１１．１０細胞（「ＤＯ１１．１０．ｃＣＤ１３７」と示される）も、同じレンチウイルス形質導入方法を用いて生成し、抗ヒトＣＤ１３７Ｆｃａｂと、カニクイザルＣＤ１３７との交差反応性を試験するのに使用した。カニクイザルＣＤ１３７の発現を、前述されるようにフローサイトメトリーによって、細胞への抗ＣＤ１３７陽性対照抗体（ＭＯＲ＿７４８０．１、米国特許出願公開第２０１２／０２３７４９８  Ａ１号）の結合によって確認した。
【０３７１】
【表３】
2021524270.tif 000012
【０３７２】
実施例２：抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂのナイーブな選択
ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂを発見し、同定された結合剤の多様性を最大にするために、酵母及びファージディスプレイ選択作業の両方を用いた。ＣＤ１３７は、いくつかの非免疫細胞型において低いレベルで発現されるため、活性化Ｔ細胞などの、ＣＤ１３７を多量に発現した細胞を選択的に標的とする抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂを選択することが決定された。理論に制約されるのを望むものではないが、高度に上方制御されたＣＤ１３７発現を有する活性化Ｔ細胞と異なり、非常に低いか又はごくわずかなレベルのＣＤ１３７発現を有する細胞は、それらの細胞表面においてモノマー状態のＣＤ１３７を有する可能性がより高いと仮定され、その場合、タンパク質の大部分が、細胞表面において二量体、三量体、又はより高次の多量体状態で存在することが予想される。
【０３７３】
ＣＤ１３７を過剰発現する細胞、又は組み換え二量体ヒトＣＤ１３７タンパク質を、高度に上方制御された多量体ＣＤ１３７を用いて細胞との結合相互作用を促進したそれらの代表的なエピトープを露出させるために、Ｆｃａｂ選択に使用した。さらに、二量体抗原を使用することは、ＣＤ１３７に強く結合し、より長く標的に嵌合された状態に保たれ、ひいては上方制御された発現レベルのＣＤ１３７を用いて細胞への優先的な結合を促進することが仮定された２価Ｆｃａｂを選択するのに有益であると見なされた。これに関して、モノマー組み換えＣＤ１３７は、ＣＤ１３７に過度に強く結合し得る非常に高い親和性の１価Ｆｃａｂ結合剤の選択を防ぐために、使用されなかった。
【０３７４】
この選択手法の目的は、活性化Ｔ細胞に優先的に結合し、モノマーＣＤ１３７のみを示すナイーブなＴ細胞、又は非常に低いレベルのＣＤ１３７を発現する他の細胞によく結合しないＦｃａｂを得ることであった。モノマー抗原と比べて二量体及び多量体抗原に２価的に及び優先的に結合するＣＤ１３７  Ｆｃａｂを選択することによって、関連する減少された毒性とともに、潜在的なオフターゲットのＴ細胞活性化が減少され得ると考えられた。
【０３７５】
ファージディスプレイ
ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを示す６つのナイーブファージライブラリーを、ファージディスプレイによる選択のために使用した。６つ全てのライブラリーは、ランダム化ＡＢループ（ＩＭＧＴ番号付けに従って１４〜１８位に残基を含む）及びランダム化ＥＦループ（ＩＭＧＴ番号付けに従って９２〜１０１位に残基を含む）を含んでいた。ライブラリーの１つは、ＥＦループの１０１位（挿入される残基は、ＩＭＧＴ番号付けに従って１０１．４〜１０１．１位にある）に２つ又は４つのアミノ酸（２つ又は４つのＮＮＫコドンによってコードされる）の挿入を伴うクローンを含んでいた。
【０３７６】
合計１２の選択作業を行って、抗ヒトＣＤ１３７結合剤を同定した。社内のｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ抗原又は商業的に供給されたｈＣＤ１３７−ｈＦｃ−Ａｖｉ−ＢＰＳ抗原及び／又はＤＯ１１．１０．ｈＣＤ１３７抗原発現細胞を、６つのファージライブラリーを用いた選択に使用した。１つのみの機能的Ｆｃａｂ配列が、ｈＣＤ１３７−ｈＦｃ−Ａｖｉ−ＢＰＳ組み換え抗原を用いて初期の選択から同定されたため、社内のｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉを、組み換えＣＤ１３７における残りの回の選択に使用した。最初の回を、１００ｎＭのビオチン化抗原を用いて行い、これは、社内で産生される５００ｎＭの非標識組み換えヒトＦｃ断片を用いた除外（deselection）工程を伴っていた。ファージ結合剤を、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンのいずれかで被覆された電磁ビーズによって捕捉した。Ｆｃ断片への非特異的結合がファージＥＬＩＳＡによって検出された選択出力（０．４より高いＡ４５０−６３０ｎｍ）のために、さらなる除外工程を導入し、それによって、ビオチン化Ｆｃ断片（社内で産生される）を、ファージ出力とともにインキュベートした。非Ｆｃ結合剤を、ビオチン化Ｆｃ結合ファージの磁気捕捉によってＦｃ結合剤から分離した。
【０３７７】
ＣＤ１３７の膜結合天然立体構造への結合剤を発見するために、細胞選択を以下のように行った：組み換え抗原選択からのファージ出力を、ヒトＣＤ１３７を欠くＤＯ１１．１０細胞とともにインキュベートして、細胞に非特異的に結合するものなどの、所望されない結合剤を廃棄した。次に、ファージを、１×１０７個のＤＯ１１．１０．ｈＣＤ１３７細胞とともにインキュベートし、結合剤を、トリプシン消化によって溶離し、次に、次の回に伝搬した。３回目は、ＤＯ１１．１０．ｈＣＤ１３７細胞の数を５×１０６個に減少させることによって、選択圧力を増加させて、同様のプロセスに従った。
【０３７８】
ファージＥＬＩＳＡを、各回の選択後に行って、抗原特異的ファージの富化を決定した。９６ウェルストレプトアビジンプレートを、１μｇ／ｍｌのビオチン化抗原で一晩被覆した。プレートを４％のmarvel  ＰＢＳでブロックした後、５０μｌのファージ含有細菌上清を、各ウェルに加え、４５０ｒｐｍで振とうしながら室温で１時間インキュベートした。ファージ溶液を、プレートを逆さにし、ＰＢＳ  ０．１％のTweenで４回及びＰＢＳで４回洗浄することによって廃棄した。次に、抗Ｍ１３ファージ−ＨＲＰコンジュゲート抗体を加えて、固定化抗原に結合されたファージを検出した。ファージ溶液を、プレート逆さにし、ＰＢＳ  ０．１％のTweenで４回及びＰＢＳで４回洗浄することによって廃棄した。ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに加え、最大で３０分間発色させた。反応を、１Ｍの硫酸を用いて停止させ、プレートを、マイクロタイタープレートリーダーにおいてＯＤ４５０〜６３０で読み取った。特異的ヒット（specific hit）を、陰性対照、すなわちＰＢＳ又は野生型ＣＨ３などの陰性非結合剤ファージによって定義されるバックグラウンドより少なくとも４倍高い、及びビオチン化組み換えＦｃ断片への結合強度より少なくとも１０倍高い、組み換えＣＤ１３７へのシグナル強度を示すものとして定義した。
【０３７９】
ファージ蛍光−活性化細胞選別（ファージＦＡＣＳ）アッセイを、２及び３回目からの細胞選択出力について行った。簡潔に述べると、２×１０５個の細胞を、丸底マイクロタイタープレートに移した。ファージ上清を細胞に加え、４℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を、氷冷したＰＢＳ  ２％のＢＳＡ緩衝液中で２回洗浄し、ＦＩＴＣとコンジュゲートされた１００μｌの抗Ｍ１３抗体及びヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）断片の溶液中で再懸濁させ、氷上で１時間にわたって細胞とともにインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中での３回の洗浄の後、フローサイトメーターにおいて分析した。ファージＦＡＣＳにおいて、特異的ヒットを、組み換えＣＤ１３７への結合シグナルより少なくとも１０倍高い、及び陰性対照（ＰＢＳ）によって定義されるバックグラウンドより少なくとも４倍高い、ＣＤ１３７陽性細胞への幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すものとして定義した。
【０３８０】
３２３０個のファージクローンを、二量体組み換えｈＣＤ１３７抗原への結合についてファージＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、組み換えＦｃを陰性対照として使用した。１１４０個のファージクローンを、ＤＯ１１．１０．ｈＣＤ１３７細胞への特異的結合についてファージＦＡＣＳによってスクリーニングした。次に、個々のヒットをシーケンシングし、得られた７６の固有の配列に、Ｆｃａｂクローン識別子を割り当て、ｍＡｂ２フォーマットにおけるＦｃａｂクローンを発現させるために、ＨｅｌＤ１．３  ＩｇＧ１重鎖発現カセットを含有するｐＴＴ５発現ベクター（National Research Council of Canada）へとサブクローニングした（実施例３．１を参照）。
【０３８１】
酵母ディスプレイ
ヒトＩｇＧ１のＣＨ１からＣＨ３ドメインを示す４つのナイーブ酵母ライブラリーを、酵母ディスプレイによる選択のために使用した。４つ全てのライブラリーが、ＣＨ３ドメイン中にランダム化ＡＢループ（ＩＭＧＴ番号付けに従って１４から１８位に残基を含む）及びランダム化ＥＦループ（ＩＭＧＴ番号付けに従って９２から１０１位に残基を含む）を含んでいた。ライブラリーのうちの２つは、ＣＨ３ドメインのＡＢループ中の１６位に５アミノ酸残基（ＩＭＧＴ番号付けに従って１６．５から１６．１位における残基）の挿入をさらに含んでいた。
【０３８２】
社内のｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ抗原又は商業的に供給されたｈＣＤ１３７−ｈＦｃ−Ａｖｉ−ＢＰＳ抗原を、４つの酵母ライブラリーを用いた選択に使用したが、ファージ選択と同様に、商業的に供給された抗原は、初期段階の選択の後、使用されず、社内の抗原が代わりに使用された。各ライブラリーについて、１回目の選択を、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を用いて行った。ライブラリーを成長させ、誘導し、１×１０１０個の細胞を、１．２５μＭの非標識ヒト又はマウスＦｃを用いた除外工程の後、２５０又は３００ｎＭのビオチン化組み換え抗原とともにインキュベートした。酵母結合剤を、ストレプトアビジン電磁ビーズを加え、ＭＡＣＳ  ＬＳカラム（Miltenyi Biotech  １３０−０４２−４０１）を使用することによって分離した。その後の回の選択を、蛍光標識された抗体を使用することによって、FACS-Aria II機器（BD Bioscience）における蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって行って、結合抗原（抗ビオチン−ＡＰＣ（Miltenyi Biotech  １３０−０９０−８５６）、ストレプトアビジン−ＡＰＣ（BD Biosciences  ３４９０２４）、若しくはニュートラアビジン−DyLight-488（Thermo Fisher  ２２８３２）、正しく折り畳まれたＩｇＧ足場（抗ヒトＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン−ＦＩＴＣ（Biorad AbD Serotec（ＭＣＡ６４７Ｆ））、又はａｇａ２−ＩｇＧ構築物（抗Ｘｐｒｅｓｓ（Life Technologies  Ｒ９１０２５）及び抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Sigma  Ｆ２６５３−．５ＭＬ））の発現を検出した。可能な限り、抗原マーカーを、構造マーカーの１つとともに使用して、酵母表面におけるＦｃａｂ発現によって結合強度シグナルを正規化した。非染色及び対照酵母集団を用いて、ソーティングゲート（sorting gate）を以下のように設定した：多重線又は出芽酵母細胞と一重線を区別するためのＦＳＣ−Ａ及びＳＳＣ−Ａプロット、ＦＳＣ−Ｗ及びＦＳＣ−Ｈプロット、並びに結合Ｆｃａｂ二重陽性を検出するためのＦＩＴＣ−Ａ及びＡＰＣ−Ａプロットにおける酵母細胞。
【０３８３】
各回に使用される抗原濃度を、前の回に使用された抗原濃度を用いて出力品質制御（output quality control）を行うことによって経験的に決定した。結合強化が前の回より増加した場合（＞５倍）、抗原濃度は１：２又は１：３に低下し、或いはそれは一定に保たれた。また、このプロセスに従って、何回の選択が必要とされたか及び選択肢を使い果たしたと見なされたかどうか（多様性がわずか数個の主要な配列まで下がるか、又は抗原結合が、２回の後に増加しない場合）を決定した。
【０３８４】
ライブラリー選択から同定された２７８４個の酵母単一クローンを、以下のように個別にスクリーニングした：各回の選択の後、単一の酵母細胞を、FACS-Aria II（BD Biosciences）機器を用いてＳＤＣＡＡ寒天プレート上にスポットし、以下のフローサイトメトリー抗原結合アッセイにおいてスクリーニングした：単一クローンコロニーを、コロニーが２ｍｍの直径に達するまで成長させ、次に、６００μｌのＳＤＣＡＡ液体培地を含むディープウェルプレート上に移した。培養物を、一晩１０００ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で成長させた。ａｇａ２−ＩｇＧタンパク質足場の発現を、１の光学密度（ＯＤ６００＝１）で増殖培地を誘導培地ＳＧＲＣＡＡと置き換えることによって誘導した。細胞を、ビオチン化組み換え二量体ヒト抗原又はマウスＦｃ断片のいずれかとともにインキュベートして、組み換えｈＣＤ１３７抗原のＦｃ部分に結合する酵母クローンに対して区別した。いずれかのタンパク質に結合した酵母細胞を、ストレプトアビジン−ＡＰＣを用いて標識した。また、抗ＣＨ２−ＦＩＴＣ抗体を、構造ＩｇＧマーカーとして使用した。スクリーニングの結果を分析するために、Ｆｃ断片への結合をプロットし、ビオチン化Ｆｃに結合したクローンを廃棄した。結合は、非染色及び陰性対照試料を用いて設置されたゲートでＡＰＣ蛍光について陽性であった０．２％より高い細胞として定義された。
【０３８５】
誘導温度を上昇させること、選択の厳密性を低下させること、又はヒット数を増加させるために回数を減少させることなどの、様々な抗原濃度及び条件を用いて、選択を繰り返した。ヒットシーケンシングは、かなり低い出力多様性を示し、固有の配列を有する９個のみのＦｃａｂクローンが同定された：ＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−１７３、ＦＳ２２−１７４、ＦＳ２２−１７５、ＦＳ２２−１７６、ＦＳ２２−１７７、ＦＳ２２−１７８及びＦＳ２２−１７９。
【０３８６】
実施例３：ナイーブな選択からの抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの特徴付け
３．１  「モック」ｍＡｂ２フォーマットにおける抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの調製
ファージから単離された７６個の抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂクローン及び酵母選択から単離された９個のクローンを含むＩｇＧ１分子からなる「モック」ｍＡｂ２抗体を、ｍＡｂ２フォーマットにおけるＦｃａｂの特徴付けを可能にするために産生した。ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループを含むＣＨ３ドメインＦｃａｂの部分を、抗ニワトリ卵リゾチーム抗体ＨｅｌＤ１．３のＣＨ３ドメインの対応する領域と置き換えることによって、モックｍＡｂ２を調製した。ＨｅｌＤ１．３抗体の生成が、Tello et al.1993に記載されている。抗体ＨｅｌＤ１．３の重鎖及び軽鎖配列はそれぞれ、配列番号１８６及び１７３に示される。モックｍＡｂ２分子を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内での一過性発現によって産生した。産生されたタンパク質の量を評価するために、ＩｇＧタンパク質含量を、PALL（１８−５０２１）製のプロテインＡ定量バイオセンサーを用いたOctet QKeプラットフォームを用いて、生体層干渉法によって定量した。タンパク質を、mAb SelectSureカラムを用いて、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。５３個のファージで駆動されたＣＤ１３７  ｍＡｂ2タンパク質が、検出閾値未満の測定を示し、したがって、さらなる分析に適していないことが分かった。３２のｍＡｂ2を、mAb Select SuReプロテインＡカラム（GE Healthcare、１１００３４９４）を用いて精製した：ＦＳ２２−００５、ＦＳ２２−００７、ＦＳ２２−０３３、ＦＳ２２−０４２、ＦＳ２２−０４９、ＦＳ２２−０５０、ＦＳ２２−０５２、ＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−０５４、ＦＳ２２−１６７、ＦＳ２２−１６９、ＦＳ２２−１７０、ＦＳ２２−１７１、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−１７３、ＦＳ２２−１７４、ＦＳ２２−１７５、ＦＳ２２−１７６、ＦＳ２２−１７７、ＦＳ２２−１７８、ＦＳ２２−１７９、ＦＳ２２−１８０、ＦＳ２２−１８１、ＦＳ２２−１８３、ＦＳ２２−１８４、ＦＳ２２−１８６、ＦＳ２２−１８７、ＦＳ２２−１９１、ＦＳ２２−１９２、ＦＳ２２−１９３、ＦＳ２２−１９４、ＦＳ２２−１９５。
【０３８７】
発現レベルを比較するために、前のＦｃａｂのいくつかもサブクローニングし、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内で可溶性Ｆｃａｂ（切断型ヒンジを含む）として発現させ、mAb Select SuReプロテインＡカラムを用いて精製した。興味深いことに、Ｆｃａｂのいくつかが、可溶性ＦｃａｂよりモックｍＡｂ２フォーマットにおいて著しく良好な生物物理学的挙動及び生産収率を有することが観察されたことが分かった。このことは、可溶性Ｆｃａｂとして非常に低い収率で産生されたナイーブなクローンＦＳ２２−０５３にも当てはまっていたが、これは、モックｍＡｂ2フォーマットにおいて発現される場合に２５倍改善され、より多くのクローンが特徴付けに利用可能になった。
【０３８８】
３．２  ＢＬＩによる組み換え抗原への結合
精製されたモックｍＡｂ2分子（クローンＦＳ２２−１７５を除く）のうちの３１個を、Octet QKeプラットフォームを用いた生体層干渉法によって、単一点結合実験においてヒト組み換え抗原への結合について試験した。ストレプトアビジンＢＬＩバイオセンサー（PALL  １８−５０２１）を用いて、キネティックバッファー（kinetic buffer）（PALL）中１０μｇ／ｍｌでビオチン化ｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ抗原を捕捉した。次に、センサーを、２４０秒間にわたって、同じキネティックバッファー中で１：１に希釈された精製されたｍＡｂ2を含むウェル中に浸漬した後、２４０秒間にわたって１×キネティックバッファーを含むウェル中に浸漬した。結合ヒットを、緩衝液及び野生型ＩｇＧ１対照ＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂ（Ｇ１／ＨｅｌＤ１．３）を超えるＢＬＩ応答によって定義される単純なBooleanのあり／なし（yes/no）基準で分類した：１２のｍＡｂ2は、結合せず、１９は、ＣＤ１３７被覆センサーに結合した（ＦＳ２２−００７、ＦＳ２２−０３３、ＦＳ２２−０４２、ＦＳ２２−０４９、ＦＳ２２−０５０、ＦＳ２２−０５２、ＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−０５４、ＦＳ２２−１６９、ＦＳ２２−１７２、ＦＳ２２−１７３、ＦＳ２２−１７４、ＦＳ２２−１７９、ＦＳ２２−１８０、ＦＳ２２−１８１、ＦＳ２２−１８３、ＦＳ２２−１８７、ＦＳ２２−１９４、ＦＳ２２−１９５）。
【０３８９】
３．３  ヒトＮＦ−κＢレポーターアッセイにおける選択された抗ＣＤ１３７モックｍＡｂ２の活性
多量体化及びクラスター化が、ＴＮＦＲシグナル伝達のために必要とされる（Bitra et al,2017）。ＣＤ１３７はクラスター化し、その同種リガンド、ＣＤ１３７Ｌと相互作用すると、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路を活性化する。アゴニスト分子は、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を引き起こし、それによって、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路を活性化する際、リガンドを模倣する。いくつかのアゴニスト抗体（例えばウレルマブ）は、結合時にＣＤ１３７のクラスター化を元々引き起こし得ることが知られている一方、ウトミルマブなどの他のものは、ＣＤ１３７のクラスター化を誘発するために抗体自体のさらなる架橋を必要とする（Fisher et al,2012）。エフェクター細胞におけるＦｃ  γ受容体は、インビボでこのような架橋を誘発することが知られているが、これは非効率的であり、治療対象の部位から離れて起こり得る。用量制限毒性は、いくつかの抗ＣＤ１３７抗体による治療に関連付けられているため、固有に作用する（agonise）能力を有さなかった抗ＣＤ１３７結合Ｆｃａｂを選択するが、ＣＤ１３７のクラスター化を誘発するためにさらなる架橋を必要とするもののみを選択することが決定された。したがって、架橋された抗体によって細胞表面において発現されるＣＤ１３７のクラスター化時に細胞内のＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化を検出し得るが、抗体が架橋されていなかった場合、活性をほとんど示さなかったアッセイを創出した。次に、このアッセイを用いて、ＦｃａｂがＢＬＩによって組み換え抗原によって結合することが分かったか否かにかかわらず、モックｍＡｂ２フォーマットにおける２７個の抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂクローン、及び抗ＣＤ２０  ｍＡｂ2フォーマットにおける６個の抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂクローンのアゴニスト機能活性を試験した。
【０３９０】
プロテインＬを、架橋剤として用いて、アッセイにおいてそれらのＦａｂ部分を介してモックｍＡｂ２の架橋を引き起こし、ＮＦ−κＢ活性化を測定した。
【０３９１】
ヒトＣＤ１３７（配列番号１８０）をコードするｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ及びＸｈｏＩ制限酵素を用いて、ｐＭＳＣＶ−ネオマイシンベクター（Takara Clontech、Ｃａｔ．６３４４０１）へとサブクローニングした。RetroPack PT67細胞株（Clontech、Ｃａｔ．６３１５１０）を用いて、製造業者のプロトコルに従ってレトロウイルス粒子を産生した。その後、このレトロウイルスを用いて、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３  ＨＥＫ細胞株（Life Technologies、Ｒ７８０−０７）に、ルシフェラーゼの発現を制御するＮＦ−κＢ感受性プロモータを含有するQiagen Cignal Lenti NFkB Reporter（ｌｕｃ）（Qiagen、カタログ番号３３６８５１）レンチウイルスを形質導入することによって前に生成されたＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞を形質導入した。これらのＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ．ｈＣＤ１３７細胞を用いて、選択において同定されたＣＤ１３７結合剤を含有するモックｍＡｂ2をスクリーニングした。
【０３９２】
各モックｍＡｂ２の２μＭの希釈物を、ＤＰＢＳ（Life Technologies、１４１９０１６９）中で調製し、レポーター細胞培地（ＤＭＥＭ（Gibco、Ｃａｔ．６１９６５−０２６）；１０％のＦＣＳ（Gibco、Ｃａｔ．１０２７０−１０６）；１×PennStrep（Gibco、Ｃａｔ．１５１４０−１２２）；ブラストサイジン１５μｇ／ｍｌ（Melford Laboratories Ltd.、Ｃａｔ．Ｂ１１０５）；ピューロマイシン５μｇ／ｍｌ（Life Technologies、Ｃａｔ．Ａ１１１１３８０３）；Zeocin  １００μｇ／ｍｌ（InvivGen、Ｃａｔ．１１００６−３３−０）；Geneticin  ５００μｇ／ｍｌ（Life Technologies、Ｃａｔ．１０１３１−０２７）中で１：３にさらに希釈した。プロテインＬ（Life Technologies、２１１８９）を、人工架橋剤として使用し、１：４のモル比でｍＡｂ2分子と混合した。２４時間のインキュベーションの後、製造業者の説明書に従って、細胞を、１００μｌのPromega Bio-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promegaカタログ番号Ｇ７９４１）で処理し、発光を、Gen5 Software、BioTekを用いて、プレートリーダーにおいて０．５秒間の積分時間で測定した。発光値は、架橋されたＦｃａｂによって誘発されるＣＤ１３７のクラスター化によるＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化に応答して産生されるルシフェラーゼの尺度である。発光値を、Ｆｃａｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。
【０３９３】
架橋されていない場合と比較して、プロテインＬと架橋される場合のルシフェラーゼシグナルの少なくとも１０倍の増加を有することによって、ヒットを同定した。これらのクローンは、ＣＤ１３７のクラスター化、及びその後の下流のシグナル伝達経路の活性化を誘発することが可能であることが分かった。試験される全てのクローンのうち、２つ、ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２は、架橋時にルシフェラーゼのこの１０倍増加を誘発することが可能であったが、ＥＣ５０は、いずれについても決定することができなかった。両方とも、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいてさらなる特徴付けのために選択された。意外なことに、ＢＬＩによるＣＤ１３７標的への結合にもかかわらず、活性が、架橋される条件で残っているクローンについて観察されず、これは、おそらく、それらが、ＣＤ１３７における無関係のエピトープにおいて結合していたか、又はこのようなクローンの親和性が、ＮＦ−κＢシグナル伝達カスケードを開始させるのに十分に強くＣＤ１３７に結合するのに十分でなかったことを示している。全体で、３０を超えるＦｃａｂを試験したが、２つのみのＦｃａｂ（ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２）が、ナイーブな選択から同定され、これは、架橋される場合、ＮＦ−κＢレポーターアッセイにおいて所望の機能を示し、架橋されていない場合、活性をほとんど有さなかった。
【０３９４】
３．４  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおける選択された抗ＣＤ１３７モックｍＡｂ２の活性
活性化Ｔ細胞におけるアゴニスト分子を介したＣＤ１３７のクラスター化は、Ｔ細胞活性化及び下流のシグナル伝達を引き起こし、それにより、限定はされないが、ＩＬ−２産生をもたらす。ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２が、ＮＦＫＢレポーターアッセイにおいて活性を有することが確認されたため、ＣＤ１３７を活性化するそれらの能力を、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験した。ヒトＣＤ１３７を過剰発現するように操作されたＤＯ１１．１０  Ｔ細胞を用いたＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイを創出し、Ｔ細胞活性化を、ＩＬ−２放出を測定することによって評価した。
【０３９５】
ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞（National Jewish Health）に、前述されるようにマウス又はヒトＣＤ１３７を過剰発現するように設計されたレンチウイルスベクターを形質導入した。ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２だけでなく、以下のクローンを、このＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験した：ＦＳ２２−００７、ＦＳ２２−０３３、ＦＳ２２−０４２、ＦＳ２２−０４９、ＦＳ２２−０５０、ＦＳ２２−０５２、ＦＳ２２−０５４（全て「モック」ＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂ２フォーマットにおける）。組み換えプロテインＬ（Life Technologies、２１１８９）架橋剤を用いた又は用いないｍＡｂ２又は２０Ｈ４．９陽性対照ｍＡｂの希釈物を調製し、０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（クローン１７Ａ２、BioLegend、１００２０８）で一晩被覆された９６ウェル丸底プレートにおいてＤＯ１１．１０．ｈＣＤ１３７細胞に加えた。１８時間のインキュベーションの後、上清を収集し、製造業者の説明書に従って、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、８８−７０２４−８６）を用いてアッセイした。プレートを、Gens Software、BioTekを用いて、プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで読み取った。５７０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータｌロジスティック曲線フィット（Gens Software、BioTek）に基づいていた。ｍｌＬ−２の濃度を、ｍＡｂ２又はベンチマークｍＡｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。
【０３９６】
クローンＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２は、このアッセイにおいてプロテインＬと架橋される場合、有意に促進された活性を示した。ＦＳ２２−０５３は、架橋されていない場合、１２６ｎＭの活性、及び架橋される場合、２１ｎＭの活性（６倍の改善）を有していた一方、ＦＳ２２−１７２は、架橋されていない場合、９５０ｎＭの活性、及び架橋される場合、４４ｎＭの活性（２２倍の改善）を有していた。結果として、両方のクローンを、親和性成熟のために選択した。さらに、クローンＦＳ２２−０３３は、このアッセイにおいて活性を示さなかったが、それは、ＢＬＩ結合アッセイにおいて結合を巡ってクローンＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２と競合しなかったため（データは示されていない）、異なるエピトープにおいて組み換え抗原に結合する可能性が高いと考えられるため、それも親和性成熟のために選択した。ＣＤ１３７へのクローンの結合親和性の改善はまた、改善した機能活性ももたらし得る（実施例４．１を参照）。
【０３９７】
３．５  ＣＤ１３７／ＣＤ２０  ｍＡｂ２フォーマットにおける抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの調製
一連の抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂ（ＦＳ２２−０５３、ＦＳ２２−１７５、ＦＳ２２−１７６、ＦＳ２２−１７７、ＦＳ２２−１７８、ＦＳ２２−１７９）を、より生物学的に関連したｍＡｂ２フォーマットにおけるＦｃａｂの特徴付けを可能にするために産生した。ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループを含むＣＨ３ドメインＦｃａｂの部分を、抗ＣＤ２０  ２Ｆ２クローン（米国特許第８，５２９，９０２  Ｂ２号からの）のＣＨ３ドメインの対応する領域と置き換えて、ＣＤ１３７及びＣＤ２０の両方に結合したｍＡｂ２を産生することによって、ｍＡｂ２を調製した。これらのＣＤ１３７／ＣＤ２０  ｍＡｂ２を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内での一過性発現によって産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを用いて精製した。
【０３９８】
３．６  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗ＣＤ１３７／ＣＤ２０  ｍＡｂ２の活性
実施例３．４には、抗ＣＤ１３７モックｍＡｂ2がプロテインＬを用いて架橋されたＴ細胞活性化アッセイが記載されている。その設定は、かなりの数の分子をスクリーニングするために確実で且つ再現性のある方法を提供したが、架橋される場合に抗体及びｍＡｂ２によって形成されるより高次の構造は準最適であり、生理環境の代表ではない。より生物学的に関連した設定は、ｍＡｂ2分子が、生体系中に存在する標的へのそのＦａｂアームの結合によって架橋される設定である。この細胞ベースのインビトロシステムは、細胞膜に結合するＦａｂを介して抗体及びｍＡｂ２の提示を最適化し、抗体のクラスター化を引き起こし、これが、ひいてはＴ細胞におけるその標的に対するＣＤ１３７  Ｆｃａｂアームの親和性を増大する。
【０３９９】
ＣＤ２０＋  Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１３）を、実施例３．４において使用されるＤＯ１１．１０．ｈＣＤ１３７細胞とともに１：１の比率で９６ウェル丸底プレートに播種した。ＣＤ１３７／ＣＤ２０  ｍＡｂ2において実施例３．５において産生された６個のクローンを、このＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験した。組み換えプロテインＬ（Life Technologies、２１１８９）架橋剤を用いた又は用いないｍＡｂ２又は陽性対照ｍＡｂの希釈物を調製し、０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（クローン１７Ａ２、BioLegend、１００２０８）で一晩被覆された９６ウェル丸底プレートにおいてＤＯ１１．１０．ｈＣＤ１３７及びＤａｕｄｉ細胞に加えた。１８時間のインキュベーションの後、上清を収集し、製造業者の説明書に従って、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、８８−７０２４−８６）を用いてアッセイした。プレートを、Gens Software、BioTekを用いて、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。５７０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータｌロジスティック曲線フィット（Gens Software、BioTek）に基づいていた。ｍｌＬ−２の濃度を、ｍＡｂ２又はベンチマークｍＡｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。試験された全てのクローンのうち、ＦＳ２２−０５３は、０．３ｎＭのＥＣ５０（及びＣＤ２０＋細胞の非存在下で１２６ｎＭ）で、このＣＤ２０細胞ベースの架橋設定において顕著なＩＬ−２産生を示した唯一のものであった。
【０４００】
実施例３．４及び３．６は、ＦＳ２２−０５３が、プロテインＬによって、又は試験されるｍＡｂ2フォーマット（ＨｅｌＤ１．３及びＣＤ２０）において別の標的に結合するＦａｂを介した細胞ベースの架橋によって架橋される場合、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞の表面におけるＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を引き起こし得ることを示す。
【０４０１】
実施例４：抗ヒトＦｃａｂの親和性成熟
上述されるように、３つのクローンが、ＮＦ−κＢレポーターアッセイ、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２）においてそれらの機能特性に基づいて親和性成熟のために選択され、又はＣＤ１３７（ＦＳ２２−０３３）の異なる領域に結合するものと考えられた。
【０４０２】
４．１  ＦＳ２２−０３３の親和性成熟
２つの酵母及び２つのファージディスプレイされたライブラリーを、ＦＳ２２−０３３クローンから構築し、一方は、ＣＨ３ドメインのＡＢループ中の５つの残基をランダム化することによるものであり、他方は、ＥＬＬＡプライマーを用いてＣＨ３ドメインのＥＦループ中の５つの残基をランダム化することによるものである。ＥＬＬＡプライマーは、各アミノ酸に使用されるコドン及び混合物内のそれらの相対存在量を規定する。システインのみが、混合物から除外され、いずれの他のアミノ酸に対しても偏りがなかった。
【０４０３】
ファージＦＳ２２−０３３  ＡＢ及びＦＳ２２−０３３  ＥＦライブラリーについて、親和性成熟したクローンの２回の選択を、１回目に２００ｎＭのｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉを用いて、及び２回目に１０ｎＭのｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉを用いて行った。各選択出力からの９６クローンを、ファージＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。このスクリーニングは、２４個の固有のクローン（ＦＳ２２−０３３−００１からＦＳ２２−０３３−０２４）を同定し、それらは全て、ＨｅｌＤ１．３を含有するモックｍＡｂ2として産生され、次に、実施例３．２に記載されるように、ＢＬＩによって改善した結合速度について試験された。これらの２４個の親和性成熟したクローンのいずれも、このアッセイにおいて親ＦＳ２２−０３３クローンより良好に機能しなかったため、進めなかった。酵母ＦＳ２２−０３３  ＡＢ及びＦＳ２２−０３３  ＥＦライブラリーについて、３回の選択を以下のように行った：３００ｎＭのｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉを用いた１及び２回目、続いて、３００ｎＭのｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ、３００ｎＭのカニクイザルＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ、又は３００ｎＭのｈＣＤ１３７−Ａｖｉ−ｈｉｓを用いた３回目。２及び３回目の出力からの１０５６個のクローンをシーケンシングし、同定された全ての固有のクローンを、３０ｎＭのヒト二量体組み換え抗原を用いた親ＦＳ２２−０３３クローンと比較して、抗原への改善した結合について抗原結合フローサイトメトリーアッセイにおいてスクリーニングし、クローンを、結合強度と相関するＡＰＣ＋細胞のパーセンテージによってランク付けた。次に、上位５つのクローン（ＦＳ２２−０３３−０２５、ＦＳ２２−０３３−０２６、ＦＳ２２−０３３−０２７、ＦＳ２２−０３３−０２８、ＦＳ２２−０３３−０２９）を、ＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂ2（実施例３．１に記載されるように）として産生し、ヒト二量体組み換え抗原への結合を、前述されるようにＢＬＩによって試験したが、クローンのいずれも、親ＦＳ２２−０３３クローンに対する改善した動力学プロフィールを示さなかったため。これらのクローンは、さらに進めなかった。
【０４０４】
４．２  ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２の親和性成熟
４つの酵母ディスプレイされたライブラリーを、ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２  Ｆｃａｂクローンから構築した。７つの残基（ＩＭＧＴに従って１５〜１６．１位における）を、実施例４．１に記載されるものと同じトリヌクレオチド分布で、各クローンのＣＨ３ドメインのＡＢループ中のＥＬＬＡプライマーを用いてランダム化して、ライブラリーＦＳ２２−０５３  ＡＢ及びＦＳ２２−１７２  ＡＢを作成した。５つの残基（ＩＭＧＴに従って９２〜９４及び９７〜９８位における）を、ＣＨ３ドメインのＥＦループ中のＥＬＬＡプライマーを用いてランダム化して、ライブラリーＦＳ２２−０５３  ＥＦ及びＦＳ２２−１７２  ＥＦを得た。
【０４０５】
ライブラリーＦＳ２２−０５３  ＡＢ及びＦＳ２２−０５３  ＥＦ、並びにＦＳ２２−１７２  ＡＢ及びＦＳ２２−１７２  ＥＦについて、３又は４回の選択を、酵母ライブラリーにおいて行って、二量体ｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ抗原又はモノマーｈＣＤ１３７−Ａｖｉ−Ｈｉｓ抗原のいずれかを用いて親和性成熟したクローンを選択した。モノマー抗原を、二量体抗原と交互に使用して、クローンが抗原に対する親和性を保持しており、結合力のみによって結合しないことを確実にした。モノマー又は二量体抗原の使用、並びに使用される濃度は、フローサイトメトリーによって各回の間に経験的に決定され、これは、モノマー又は二量体抗原に対する富化が、前の回において観察されたかどうかによって決定された。可能な限り、親を超えるソーティングゲートを用いて、親分子と比較して、親和性成熟したクローンを単離した。選択圧力を１ｎＭの二量体抗原まで上昇させた。各選択回の間、個々のクローンを、寒天プレート上にスポットして、選択の経過を評価した。各クローンを成長させ、個々に誘発し、次に、その結合及び構造パラメータを、前述されるようにビオチン化二量体抗原並びに抗ＣＨ２構造マーカーを用いて、フローサイトメトリーによって決定した。このスクリーニングカスケードに従って、選択出力からのクローンの試料に基づいて選択の成功の決定を可能にし、可溶性タンパク質としてその後産生され得る個々のクローンの初期のスクリーニングを可能にした。
【０４０６】
合計で１１５２個の酵母単一クローンを、前述されるように抗原結合フローサイトメトリーにおいてビオチン化組み換え抗原への結合についてスクリーニングした。ＦＳ２２−０５３  ＥＦライブラリーにおける選択は、１３８の固有のループ配列の富化をもたらした。同様に、３０の固有のループ配列を、ＦＳ２２−１７２  ＡＢライブラリーから単離した。ライブラリーＦＳ２２−０５３  ＡＢ及びＦＳ２２−１７２  ＥＦは、クローンを含有しておらず、これは、親クローンを上回る結合の改善を示した。ＦＳ２２−０５３  ＥＦ及びＦＳ２２−１７２  ＡＢライブラリーからの最良の結合クローンにわたる配列分析は、ＡＢループ中の保存されたＰＰＹ配列パターンを示した。この配列は、親和性成熟の後に保存され、Ｆｃａｂの２つの別個の系統において独立して選択されたため、それは、ＣＤ１３７におけるエピトープ結合にとって重要であり得る。さらに、ＦＳ２２−０５３及びＦＳ２２−１７２系統の両方のクローンのＣＨ３ドメインのＥＦループ中の保存されたＬＥ又はＬＤ配列パターンを示し、これは、ＥＦループ中のこのアミノ酸モチーフが、改善した結合に必要とされることを示唆する。
【０４０７】
選択の経過、並びに親和性成熟したクローンの間の突然変異ＡＢ及びＥＦループを再結合することが必要であり得るかどうかを評価するために、１０ｎＭの二量体ヒト抗原への特異的結合（フローサイトメトリー結合アッセイにおいて３０％より高いＡＰＣ陽性細胞）を示すことによってランク付けされる、ＦＳ２２−０５３  ＥＦライブラリーからの上位５つの固有のクローン（ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−００９、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２）、及びＦＳ２２−１７２  ＡＢライブラリーからの上位６つの固有のクローン（ＦＳ２２−１７２−００１、ＦＳ２２−１７２−００２、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００５、ＦＳ２２−１７２−００６、これらは全て、同じアッセイにおいて１０ｎＭの二量体ヒト抗原を用いてスクリーニングされるとき、１０％を超えるＡＰＣ陽性細胞を示す）を、モックｍＡｂ２（ＨｅｌＤ１．３）及びモデルｍＡｂ２（ＰＤ−Ｌ１）ｍＡｂ2として産生して、ランダム化ループの機能及び動力学の改善を評価した。
【０４０８】
実施例５：「モック」ｍＡｂ2フォーマットにおける親和性成熟した抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの構築、発現及び特徴付け
５．１  「モック」及びモデルｍＡｂ2フォーマットにおける抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの構築
親ＦＳ２２−０５３クローンから得られた１６個の親和性成熟したクローン（ＦＳ２２−０５３−００１からＦＳ２２−０５３−０１６）、及び親ＦＳ２２−１７２クローンから得られた６つのクローン（ＦＳ２２−１７２−００１からＦＳ２２−１７２−００６）を、ｍＡｂ２フォーマットにおいて調製した。クローンＦＳ２２−０５３−００１からＦＳ２２−０５３−００７は、さらなる試験及び特徴付けのために下流の精製を可能にするレベルでｍＡｂ２フォーマットを発現しなかったため、さらに進めなかった。残っているクローンは、それが得られる親クローンのＣＨ３配列と比較した際に、それらのＣＨ３ドメインにおける少なくとも９５％の配列同一性を有していたことが分かった。配列類似性マトリックスパーセンテージを、各アミノ酸位置を、参照配列（親クローンＦＳ２２−０５３又はＦＳ２２−１７２）のものと比較することによって生成した。（図１Ｄは、親ＦＳ２２−０５３  ＣＨ３ドメインと比較した、クローンＦＳ２２−０５３−００８からＦＳ２２−０５３−０１６及びＦＳ２２−０５３−０１７（実施例１０．１を参照）のＣＨ３ドメインの配列同一性パーセンテージを示す。図１Ｅは、親ＦＳ２２−０５３  ＣＨ３ドメインと比較して、クローンＦＳ２２−１７２−００１からＦＳ２２−１７２−００６のＣＨ３ドメインの配列同一性パーセンテージを示す。
【０４０９】
ＨｅｌＤ１．３中に抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂを含む「モック」ｍＡｂ2抗体を、ｍＡｂ2フォーマットにおける親和性成熟したＦｃａｂのさらなる特徴付けのために調製した。これらのｍＡｂ2を、実施例３．１に記載されるように調製した。
【０４１０】
抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂ及びさらにＰＤ−Ｌ１結合Ｆａｂ領域（米国特許第８，２１７，１４９  Ｂ２号からのクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）を含むモデルｍＡｂ２も産生した。それらを、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループを含有する抗ＰＤ−Ｌ１結合抗体のＣＨ３の部分の、Ｆｃａｂの対応する領域での置換によって、実施例３．１に記載される方法と同様に調製した。これらのＰＤ−Ｌ１モデルｍＡｂ2は、ＣＨ２ドメイン（ＡＡ）中にＬＡＬＡ突然変異を含有する。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン中のＬＡＬＡ突然変異の導入は、Ｆｃ  γ受容体結合を低減することが知られている（Bruhns,P.,et al.(2009)及びHezareh M.,et al.(2001)）。
【０４１１】
ＣＤ１３７／ＨｅｌＤ１．３及びＣＤ１３７−ＡＡ／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ2を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内での一過性発現によって産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを用いて精製した。
【０４１２】
５．２  ヒトＮＦ−κＢレポーター細胞アッセイにおけるモックｍＡｂ２フォーマットのヒトＦｃａｂの活性
表３に列挙されるモックｍＡｂ2（ＨｅｌＤ１．３）フォーマットにおける親和性成熟した抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの機能活性を、実施例３．３に記載される同じＮＦ−κＢルシフェラーゼアッセイにおいて試験した。発光を、Gen5 Software、BioTekを用いて、プレートリーダーにおいて、０．５秒間の積分時間で測定した。このアッセイの結果が、表３及び図２に示される。予想どおり、Ｆｃａｂのいずれも、プロテインＬ架橋（−ＸＬ）なしで活性を示さなかった。全ての親和性成熟したＣＤ１３７  Ｆｃａｂは、親ＣＤ１３７  Ｆｃａｂを上回る大幅な改善を示し、親ＣＤ１３７  Ｆｃａｂは、このアッセイにおいて陽性である一方、ＥＣ５０値の計算が可能でなかった（実施例３．３を参照）。ＦＳ２２−０５３−００８及びＦＳ２２−１７２−００３は、プロテインＬ（＋ＸＬ）と架橋される場合、最も低いＥＣ５０で、各ファミリーからの最良の活性を示した。
【０４１３】
【表４】
2021524270.tif 000013
【０４１４】
５．３  ヒトＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるモデルｍＡｂ２フォーマットの親和性成熟したヒトＦｃａｂの活性
表４に列挙されるモデルｍＡｂ2（ＰＤ−Ｌ１  ＬＡＬＡ）フォーマットにおける親和性成熟したヒトＦｃａｂの機能活性を、実施例３．６に記載されるアッセイと同様の、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験した。
【０４１５】
ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩ制限部位を用いて、マウスＰＤ−Ｌ１（配列番号１８８）をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ５ＦＲＴベクター（Life Technologies）へとサブクローニングし、Lipofectamine 2000（Life Technologies、１１６６８−０１９）を用いて、ベクターをＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞株（Life Technologies、Ｒ７８０−０７）へと形質転換することによって、ＨＥＫ．ｍＰＤ−Ｌ１細胞を産生した。細胞を、安定に形質転換された細胞のコロニーが形成されるまで３〜４週間にわたって、１０％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Ｚ２４７５）及び１５μｇ／ｍｌのブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、Ｂ１１０５）を含有するＤＭＥＭ中で成長させた。これらのコロニーを、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Sigma Aldrich、Ｄ９８９１）の存在下で増幅させ、ＰＥコンジュゲートＰＥコンジュゲート抗マウスＰＤ−Ｌ１（ＭＩＨ５）抗体（BD Biosciences、５５８０９１）を用いて、ＰＤ−Ｌ１の発現について試験した。
【０４１６】
細胞を、細胞解離緩衝液を用いて分離させ、ＰＢＳで１回洗浄し、２×１０５個の細胞を、９６ウェルプレートのウェル中で平板培養し、次に、４℃で１時間にわたってＰＢＳ中で１：２０に希釈された抗体とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、次に、Accuri C6サイトメーター（BD Biosciences）において測定し、データを、FlowJoXを用いて分析した。マウスＰＤ−Ｌ１の発現を再度確認した。
【０４１７】
ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ2において実施例５．１において産生された１５個のクローンを、このＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験した。ｍＡｂ２又は陽性対照ｍＡｂの希釈物を調製し、０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（クローン１７Ａ２、BioLegend、１００２０８）で一晩被覆された９６ウェル平底プレート中で、ＤＯ１１．１０．ｈＣＤ１３７（ウェル当たり７．５×１０３個の細胞）及びＨＥＫ．ｍＰＤ−Ｌ１細胞（ウェル当たり２×１０４個の細胞）又はＤＯ１１．１０．ｈＣＤ１３７（ウェル当たり７．５×１０３個の細胞）及びｍＰＤ−Ｌ１（ウェル当たり２×１０４個の細胞）を発現するように形質導入されていないＨＥＫ細胞のいずれかに加えた。１８時間のインキュベーションの後、上清を収集し、製造業者の説明書に従って、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、８８−７０２４−８６）を用いてアッセイした。プレートを、Gens Software、BioTekを用いて、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。５７０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍのの吸光度値から減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータｌロジスティック曲線フィット（Gens Software、BioTek）に基づいていた。ｍｌＬ−２の濃度を、ｍＡｂ２又はベンチマークｍＡｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。Ｔ細胞活性化を、ＩＬ−２の放出を測定することによって検出した。
【０４１８】
このアッセイ表４及び図３に示される。Ｔ細胞活性は、ＰＤ−Ｌ１発現細胞への結合による架橋なしでは観察されなかった（細胞ベースのＸＬなしのカラム）。架橋すると、全てのｍＡｂ２は、高レベルのＩＬ−２の放出及びサブナノモルのＥＣ５０値によって分かるように、強力なＴ細胞活性を有していた。増加する濃度で、陽性対照抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂ、Ｇ１−ＡＡ／２０Ｈ４．９は、ｍＩＬ−２放出の増加を示すが、最大放出は、抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂのものより著しく低かった。ＦＳ２２−０５３−００９及びＦＳ２２−１７２−００５以外の全てのクローンは、０．３ｎＭ未満のＥＣ５０を有しており、したがって陽性対照より良好でない場合と同程度であった。最大Ｔ細胞活性化の尺度であり、インビボでより高いＴ細胞抗腫瘍活性に関連し得る、観察された最も低いＥｍａｘは、７７５８ｐｇ／ｍｌであり、これは、陽性対照より高かった。
【０４１９】
【表５】
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【０４２０】
５．４  初代ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化アッセイ
ＣＤ１３７を過剰発現するＨＥＫ細胞においてＣＤ１３７を活性化するＦｃａｂの活性が、実施例５．３に示された。ＣＤ１３７を過剰発現するように操作されていない細胞におけるＦｃａｂの活性を試験するために、初代ヒトＴ細胞アッセイが必要とされた。活性化された細胞傷害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、癌細胞を直接死滅させるのに関与し、それらの細胞表面においてＣＤ１３７を発現させる（Ye et al,2014）。ＣＤ１３７のクラスター化は、下流のシグナル伝達及びさらなるＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化を誘発するのに不可欠であることが知られている。したがって、ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化アッセイを用いて、ＣＤ１３７のクラスター化及びその後の下流のシグナル伝達を引き起こすＦｃａｂ（以下に詳述されるようにｍＡｂ２フォーマットにおける）の能力を評価した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化を、ＩＬ−２の放出によって決定した。
【０４２１】
Ｔ細胞を単離するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、血小板成分献血の副産物である白血球除去錐体細胞から単離した。簡潔に述べると、白血球錐体細胞の内容物をＰＢＳでフラッシュし、Ficoll（Sigma-Aldrich、１４４０−０２）勾配上に重ね合わせた。ＰＢＭＣを遠心分離によって単離し、Ficoll勾配を通過しなかった細胞を回収した。ＰＢＭＣをＰＢＳでさらに洗浄し、残っている赤血球を、製造業者の説明書に従って、１０ｍｌの１×赤血球溶解緩衝液（eBioscience、００−４３００−５４）の添加によって溶解させた。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、製造業者の説明書に従って、ＣＤ８＋  Ｔ細胞単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec Ltd、１３０−０９６−４９５）を用いて、溶離液中に存在するＰＢＭＣから単離した。
【０４２２】
抗ＣＤ３抗体とのインキュベーションを、第１のシグナルとして用いて、Ｔ細胞の最初の活性化を引き起こした。９６ウェル平底組織培養プレートを、４℃で一晩、ＰＢＳ中の８μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Clone UCHT1、R&D Systems、ＭＡＢ１００−ＳＰ）で被覆した。次に、プレートを、２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。
【０４２３】
ＰＤ−Ｌ１モデルｍＡｂ２フォーマットにおける親和性成熟したヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの細胞ベースの架橋のために、マウスＰＤ−Ｌ１．ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞の代わりにヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１８７）をコードするｃＤＮＡをサブクローニングすることによる以外は、本質的に実施例５．３に記載されるように、ｈＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１）を産生し、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）、１×ペニシリンストレプトマイシン（Life Technologies、１５１４０１２２）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco、１１３６０−０７０）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Sigma-Aldrich、Ｈ０８８７）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma-Aldrich、Ｇ７５１３）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Gibco、Ｍ６２５０））を含む１００μｌのＴ細胞培養培地（ＲＰＭＩ培地（Life Technologies、６１８７０−０４４）中で、抗ＣＤ３抗体で被覆された（８μｇ／ｍｌ）９６ウェル平底プレート上でウェル当たり２×１０５個の細胞で平板培養した。ｈＰＤ−Ｌ１を発現するように形質導入されていないＨＥＫ．ｈＰＤ−Ｌ１細胞又はＨＥＫ細胞が、４時間のインキュベーションの後、付着したら、全てのＴ細胞培養培地を除去し、５．０×１０５個の細胞／ｍｌの濃度でＴ細胞を含有する１００μｌのＴ細胞培養培地と交換して、５．０×１０４個の細胞／ウェルを得た。
【０４２４】
ｍＡｂ２を、５００ｎＭから開始して２×最終濃度で、Ｔ細胞培地中で希釈し、１：３の滴定を行った。１００μｌのｍＡｂ２の滴定物を、２００μｌの全アッセイ体積及び１倍濃度の抗体のために細胞に加えた。
【０４２５】
陽性対照抗ＣＤ１３７抗体（Ｇ１−ＡＡ／２０Ｈ４．９）及び陰性対照アイソタイプＩｇＧ抗体（Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）をそれぞれ、５００ｎＭの架橋剤（社内で産生される抗ヒトＣＨ２、クローンＭＫ１Ａ６（Jefferis et al.,1985及びJefferis et al.,1992））を含有する、５００ｎＭから開始して２×最終濃度で、Ｔ細胞培地中で希釈し、１：３の滴定を行った。１００μｌの希釈された陽性対照抗体／架橋剤混合物又は陰性対照ＩｇＧ抗体／架橋剤混合物を、合計で２００μｌのアッセイ体積及び１倍濃度の抗体のために細胞に加えた。
【０４２６】
アッセイを、７２時間にわたって３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。上清を収集し、製造業者の説明書に従って、ヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  Ready-SET-Go!キット（eBioscience、Ｃａｔ．８８−７０２５−８８）を用いてアッセイした。プレートを、Gen5 Software、BioTekを用いて、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータｌロジスティック曲線フィット（Gen5 Software、BioTek）に基づいていた。ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の濃度を、抗体のｌｏｇ濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいてｌｏｇ（アゴニスト）対応答の式を用いてフィッティングした。
【０４２７】
表５は、細胞ベースの架橋を用いて試験されるＰＤ−Ｌ１モデルｍＡｂ２フォーマットにおける親和性成熟したＦｃａｂクローンの存在下でのＴ細胞活性化アッセイにおいて観察された、ＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を示す。陽性対照抗ヒトＣＤ１３７  ｍＡｂ、２０Ｈ４．９は、抗ｈＣＨ２抗体と架橋される場合、０．５ｎＭのＥＣ５０で、ｈＩＬ−２放出の増加を示す。全てのクローンは、アッセイにおいて活性を有しており、大部分は、サブナノモルのＥＣ５０の良好な効力を示す。Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００７、ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−０１０、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１２、ＦＳ２２−１７２−００３、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００５を含有するｍＡｂ２は、０．１９〜０．４９ｎＭの範囲の最も低いＥＣ５０で、最も大きいＴ細胞応答を引き起こした。一連のｍＡｂ２（Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−１７３−００３及びＦＳ２２−１７２−００４を含有する）はまた、ＨＥＫ細胞において発現されるＰＤ−Ｌ１による架橋なしでも試験され、予想どおり、このアッセイにおいて活性を示さなかった。これは、ＮＦ−ｋＢアッセイ及びＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて見られる活性を確認する。図４は、ＦＳ２２−０５３−００７−ＡＡ／ＰＤ−Ｌ１、ＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／ＰＤ−Ｌ１及びＦＳ２２−１７２−００２−ＡＡ／ＰＤ−Ｌ１、ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＰＤ−Ｌ１、ＦＳ２２−１７２−００４−ＡＡ／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２についてのＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。
【０４２８】
【表６】
2021524270.tif 000015
【０４２９】
５．５  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの特異性の決定
他の関連するＴＮＦＳＦＲファミリーメンバーと比較した、ヒトＣＤ１３７に対する抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの特異性を試験した。Ｆｃａｂのうちの８つを、モックｍＡｂ２（ＨｅｌＤ１．３）フォーマットにおいて試験し、他のヒトＴＮＦＲＳＦ受容体：ＣＤ４０、ＯＸ４０及びＧＩＴＲへの結合について試験することによって、Biacore T200（GE Healthcare）においてＳＰＲによって測定した。アミンカップリング（アミンカップリングキット、GE Healthcare、ＢＲ−１０００−５０）を用いて、ヒトＣＤ４０、ＧＩＴＲ及びＯＸ４０を、Biacore CM5チップ（GE Healthcare、カタログ番号２９１４９６０３）中で約１０００ＲＵになるまで被覆した。１μＭから開始するモックｍＡｂ２フォーマット（ＦＳ２２−０５３−００８／ＨｅｌＤ１．３、ＦＳ２２−０５３−００９／ＨｅｌＤ１．３、ＦＳ２２−０５３−０１０／ＨｅｌＤ１．３、ＦＳ２２−０５３−０１１／ＨｅｌＤ１．３、ＦＳ２２−０５３−０１２／ＨｅｌＤ１．３、ＦＳ２２−０５３−０１４／ＨｅｌＤ１．３、ＦＳ２２−１７２−００３／ＨｅｌＤ１．３、ＦＳ２２−１７２−００４／ＨｅｌＤ１．３）における抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの希釈物を、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＢＲ１００６６９）中で調製し、３０μｌ／分で３分間にわたって注入し、次に、４分間にわたって緩衝液中で解離させた。３０μｌ／分で１２秒間にわたる１０ｍＭのグリシンｐＨ２．５の注入によって、チップを再生した。様々なＴＮＦＲＳＦメンバーに特異的な抗体を陽性対照として用いて、Biacoreチップコーティングを確認した。データを二重参照減算し（double reference subtracted）、BIAevaluation 3.2ソフトウェアを用いて分析した。Ｆｃａｂは、試験されるＴＮＦＲＳＦ受容体のいずれにも結合せず、これは、ＣＤ１３７に対するそれらの特異性を実証している。結果として、Ｆｃａｂがオフターゲットの結合を引き起こすことは予想されない。
【０４３０】
５．６  ＳＰＲによるヒト、カニクイザル及びマウスＣＤ１３７に対するモックｍＡｂ２フォーマットにおける抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂの結合親和性
ヒト、カニクイザル（cynomolgus）（カニクイザル（cyno））及びマウスＣＤ１３７に対する抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂ（ＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−０５３−０１１、ＦＳ２２−０５３−０１４、ＦＳ２２−１７２−００４、ＦＳ２２−１７２−００４）の親和性を、ＳＰＲによって測定して、Ｆｃａｂが動物試験において試験するのに有用であり得るかどうかを決定した。抗ヒトＦａｂ捕捉抗体を、製造業者の推奨（GE Healthcare、human Fab capture Kit、＃２８９５８３２５）に従って、６０００ＲＵの平均表面密度になるまで、CM5 series Sチップ（GE Healthcare  ＃ＢＲ−１００５−３０）の４つ全てのフローセル上に固定した。３０μｌ／分で６０秒間にわたってＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（GE Healthcare  ＃ＢＲ１００６−６９）中で希釈されたｍＡｂ2の３μｇ／ｍｌの溶液を注入することによって、約１５０ＲＵになるまで各ｍＡｂ2を捕捉した。次に、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中の様々な濃度のヒト、カニクイザル又はマウスＣＤ１３７抗原（非ビオチン化ヒト、カニクイザル又はマウスＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ又はヒトＣＤ１３７−Ａｖｉ−Ｈｉｓ）を、６０μｌ／分で３分間にわたってチップ上に流し、次に、１０分間にわたって解離させた。各抗原濃度の後、チップを、３０秒間にわたって３０μｌ／分の流量で１０ｍＭのグリシンｐＨ２．１を感染させることによって再生した。参照減算（reference subtraction）のため、最も高い濃度の抗原の前及び最も低い抗原の後、緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋を注入し、ランダムに濃度の１つを２回繰り返した。結合速度を、１：１ラングミュアモデルとフィッティングして、各試料についての平衡結合定数（ＫＤ）を生成した。データ分析を、BiaEvaluationソフトウェアバージョン３．２を用いて行った。結果は、表６に示される。
【０４３１】
結果の分析は、それぞれの親分子と比較して、全ての親和性成熟したクローンによるヒト及びカニクイザルＣＤ１３７の両方に対する改善した結合を示した。モノマーヒトＣＤ１３７抗原に対する結合親和性を、二量体ヒト及びカニクイザルＦｃ融合抗原に対するより（少なくとも１００倍）弱かった。実施例２に説明されるように、ＣＤ１３７のモノマー形態より二量体ＣＤ１３７に優先的に結合するＦｃａｂを選択し、このデータは、選択手法が成功したことを確認する。この動力学的挙動により、それらは、刺激されていないＴ細胞において最小のレベルで発現されるモノマーＣＤ１３７に結合する可能性が低くなり、いくつかの抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体療法に関連する肝臓又は全身毒性のリスクを低下させる。
【０４３２】
データはまた、抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂが、ヒト二量体ＣＤ１３７に対する同等の親和性でカニクイザル二量体ＣＤ１３７に結合したことを示す。
【０４３３】
マウス二量体ＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの能力も試験した。マウス抗原に対して２４ｎＭのＫＤを有することが意外にも分かったクローンＦＳ２２−０５３−０１４を除いて、クローンのいずれも、マウス抗原への強い結合を示さなかった（表６（ここで、Ｎ／Ａは、ＫＤを計算することができなかったことを示す）に示されるように）。マウスＣＤ１３７及びヒトＣＤ１３７が５７％未満の配列相同性を共有するため、これは予想外であった。
【０４３４】
【表７】
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【０４３５】
５．７  ヘテロ二量体及びホモ二量体Ｆｃａｂを用いたＦｃａｂ結合原子価の決定
Ｆｃａｂは、通常、ＣＨ３ドメイン中の抗原結合部位とともに２つのホモ二量体Ｆｃ鎖を含有する。２つのＣＨ３ドメイン中のこれらの抗原結合部位は、ごく近接しているため、ＣＨ３ドメインが、互いに独立してＣＤ１３７に結合し得るかどうかを決定するために、Ｆｃａｂの結合の原子価を試験した。ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）突然変異（ノブ：Ｔ２２Ｗ、ホール：Ｔ２２Ｓ  Ｌ２４Ａ  Ｙ６６Ｖ）（Atwell S et al,1997）を用いて、ＦＳ２２−１７２−００３の１つの鎖を、野生型Ｆｃの１つの鎖と組み合わせることによって、単一抗原結合ＣＨ３ドメインを含有するヘテロ二量体Ｆｃａｂを構築した。その結果として、各ヘテロ二量体は、一方の鎖中にＦＳ２２−１７２−００３（配列番号１３９）からのＣＨ３及び他方の鎖中に野生型ＣＨ３（配列番号４）を含有していた。Ｆｃａｂを、ｍＡｂ２フォーマットにおいて調製した。
【０４３６】
ヘテロ二量体Ｆｃａｂを、ＳＰＲ結合分析によって、ＦＳ２２−１７２−００３ホモ二量体分子（２つの抗原結合ＣＨ３ドメインを含有する）と比較した。この実験のために、モノマーヒトＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉは、二量体ＣＤ１３７抗原より好ましかった。実施例５．６に記載されるモノマー抗原へのより弱い結合を埋め合わせるために、ヒトＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉを、４５０ＲＵのより高い密度になるまでＣＭ５チップ上に固定した。ヘテロ二量体又はホモ二量体Ｆｃａｂを注入し、固定された抗原上に流した。図１４の結果は、１つのみのＣＤ１３７結合ＣＨ３ドメインを含有するヘテロ二量体Ｆｃａｂが、これらの準最適条件でさえ抗原に結合することが可能であったことを示す。ヘテロ二量体Ｆｃａｂについて観察されるオフレートは、ホモ二量体Ｆｃａｂのものより有意に速かった。これらの結果は、ＦＳ２２−１７２−００３  Ｆｃａｂが、ＣＨ３ドメインのいずれか又は両方を介してＣＤ１３７に結合することが可能であったことを確認し、Ｆｃａｂがその標的に２価的に嵌合することが可能であったため、実施例２に記載される選択手法は成功であったことを確認した。
【０４３７】
５．８  様々なＣＤ１３７発現レベルでの細胞への抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂの結合
実施例２に記載されるように、高いＣＤ１３７発現レベルで細胞に優先的に結合するようにＣＤ１３７に結合するＦｃａｂを選択した。ＦＳ２２−１７２−００３の２価結合、したがって強い結合を、実施例５．６においてＳＰＲによって確認した：ＦＳ２２−１７２−００３は、モノマーＣＤ１３７と比較して、二量体ＣＤ１３７への高い結合力及びより強い結合を示した。
【０４３８】
様々なレベルのＣＤ１３７を発現する一連のＤＯ１１．１０細胞を、実施例３．５に記載されるように産生した。各細胞株中のＣＤ１３７の相対的発現を決定するために、抗体結合能（ＡＢＣ）を、製造業者のプロトコル（Quantum（商標）Simply Cellular（登録商標）#816 Bangs Labs）に従って決定した。各細胞株を、バックグラウンドを減算した後、ＣＤ１３７発現レベルの順にランク付けした：ｈＣＤ１３７高（ＡＢＣ：１，２０６，２８３）、ｈＣＤ１３７中間（ＡＢＣ：４０４，５９７）、ｈＣＤ１３７中間／低（ＡＢＣ：１４３，０６５）、ｈＣＤ１３７低（ＡＢＣ：１４，２０８）、ｈＣＤ１３７陰性（ＡＢＣ：０）。
【０４３９】
上述される細胞のそれぞれへの、モックｍＡｂ2フォーマット（ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）における抗ヒトＣＤ１３７  Ｆｃａｂ、陽性対照抗体（Ｇ１−ＡＡ／２０Ｈ４．９）、又はアイソタイプ対照（Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）の結合を、以下のように試験した：ＤＯ１１．１０細胞を、Ｔ１７５細胞培養フラスコから収集し、３分間にわたって１２００ｒｐｍで遠心分離し、２×１０６個の細胞／ｍｌで、ＤＰＢＳ（Life Technologies、１４１９０１６９）及び１％のＢＳＡ（Sigma-Aldrich、Ａ７９０６）から構成される氷冷したＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させ、ウェル当たり５０μｌを、９６ウェルＶ底プレート（Costar、３８９４）中に播種した。試験される全ての抗体を、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で希釈した。次に、ＤＯ１１．１０細胞を遠心分離し、上清を除去し、細胞を、１００μｌの各抗体希釈物中で再懸濁させ、４℃で４５分間インキュベートした。細胞を、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で遠心分離によって２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１０００に希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ−鎖特異的）Ｆ（ａｂ’）２断片−Ｒ−フィコエリトリン抗体（Sigma、Ｐ８０４７）を含有する１００μｌ中で再懸濁させ、４℃で４５分間インキュベートした。細胞を、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液及び次に１５０μｌのＤＰＢＳで１回洗浄し、１：１０，０００でＤＡＰＩ（Biotium、４００４３）を含有する１５０μｌのＤＰＢＳ中で再懸濁させ、BDCantoII又はiQue（Intellicyt）において読み取った。データを、FlowJo v10を用いて分析して、各ウェル中の生細胞に対するＰＥのシグナル幾何平均を決定した。
【０４４０】
図１５に示されるように、ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３は、陽性対照Ｇ１−ＡＡ／２０Ｈ４．９と比較して、より高いＣＤ１３７発現で細胞により強く結合し（図１５Ｄ：ＣＤ１３７中間及び図１５Ｅ：ＣＤ１３７高）、ごく低いレベルのＣＤ１３７を発現した細胞に結合しなかった（図１５Ｂ：ＣＤ１３７低及び図１５Ｃ：ＣＤ１３７中間／低）。それと比較して、実施例５．６に記載されるように、二量体抗原よりモノマーＣＤ１３７抗原に対する少なくとも２００倍弱い結合を有していたＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３と異なり、陽性対照Ｇ１−ＡＡ／２０Ｈ４．９は、互いに１０倍以内の二量体又はモノマー抗原に対するＫＤで、二量体及びモノマー抗原の両方により良好に結合した。
【０４４１】
実施例６：抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂのナイーブな選択
インビボマウスモデルにおいて抗ＣＤ１３７  Ｆｃａｂの活性を試験するために、マウスＣＤ１３７に特異的に結合するＦｃａｂを生成し、特徴付けした。
【０４４２】
ファージディスプレイ
ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの選択について前に使用されたヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを示す６つのナイーブファージライブラリーを、マウスＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの選択に使用し、組み換えマウス二量体ＣＤ１３７又は完全長マウスＣＤ１３７を発現する細胞を抗原として使用した。
【０４４３】
ｍＣＤ１３７（ＤＯ１１．１０．ｍＣＤ１３７）を発現する社内のｍＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ抗原及びＤＯ１１．１０細胞を、６つのファージライブラリーを用いた選択に使用した。全ての選択回（合計３回）を１００ｎＭのビオチン化抗原を用いて行い、５００ｎＭの非標識組み換えヒトＦｃ断片を用いた除外工程が伴う、単純な選択スキームに従った。結合剤を、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンのいずれかで被覆された電磁ビーズによって捕捉した。さらに、組み換え抗原に結合した１回目の出力はまた、マウスＣＤ１３７を発現するＤＯ１１．１０．ｍＣＤ１３７細胞において選択に使用された。簡潔に述べると、ファージ出力を、マウスＣＤ１３７を欠くＤＯ１１．１０細胞とともにインキュベートして、細胞に非特異的に結合するものなどの所望されない結合剤を廃棄した。次に、ファージを、１×１０７個のＤＯ１１．１０．ｍＣＤ１３７細胞とともにインキュベートした。次に、結合剤をトリプシン消化によって溶離し、次に、２回目の選択に伝搬した。３回目は、ＤＯ１１．１０．ｍＣＤ１３７細胞の数を５×１０６個に減少させることによって、選択圧力を増加させて、同様のプロセスに従った。
【０４４４】
３回全ての組み換え抗原出力（５７６個のクローン）及び３回全ての細胞選択出力（５７６個のクローン）を、ファージＥＬＩＳＡ（上述されるように）によって及びＤＯ１１．１０．ｍＣＤ１３７細胞への細胞結合についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡについては、ほとんどのクローンが、抗原結合について高いシグナル強度を示した（ＯＤ４５０＞１）。したがって、マウス−Ｆｃへの結合と比較して抗原結合の１０倍未満の増加を示したクローンを廃棄した。細胞結合については、５×１０５より高いＦＩＴＣ  ＭＦＩは、陽性と見なされた。ファージライブラリーのうちの３つは、かなり悪化して機能し、多くのクローンが、ＤＯ１１．１０．ｍＣＤ１３７細胞及び組み換え抗原への非特異的結合を示す。３４のＦｃａｂクローンヒットをサブクローニングし、実施例３．１に記載されるようにＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂ2として産生した。
【０４４５】
酵母ディスプレイ
ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの選択について前に使用されたヒトＩｇＧ１のＣＨ１からＣＨ３ドメインを示す４つのナイーブ酵母ライブラリーを、マウスＣＤ１３７に結合するＦｃａｂの選択に使用した。
【０４４６】
合計で５３の別個の回の選択を、抗マウスＣＤ１３７結合剤を同定するために行った。社内で産生された、組み換え二量体ビオチン化マウスＣＤ１３７（ｍＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ）抗原を用いて、酵母ナイーブライブラリーから結合剤を選択した。簡潔に述べると、１回目の結合剤を、ナイーブライブラリーを、３００ｎＭの組み換え抗原とともにインキュベートすることによって選択し、２．５μＭの非標識マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ断片で除外した。出力を、ＭＡＣＳ及びストレプトアビジン電磁ビーズを用いて分離した。実施例２において前述されるように、３回のＦＡＣＳ選択を、選択及び除外にそれぞれ使用される３００ｎＭの組み換え抗原及び１．５μＭのマウスＦｃを用いて行った。
【０４４７】
２、３及び４回目のそれぞれからの単一クローンを、寒天プレート上にスポットした。出力の多様性を決定するために、各選択出力からの少なくとも９６個のクローンをシーケンシングした。１２６個の固有のクローン（ライブラリーの１つについての３回目からの５０個のクローン、ライブラリーの別のものについての３回目からの４８個のクローン、及び残りのライブラリーについての４回目からの１８個のクローン）を、フローサイトメトリーによって、組み換え抗原への結合についてスクリーニングした。組み換え抗原とともにインキュベートされる場合にＡＰＣ蛍光チャネルにおける１０％より高い陽性細胞及び組み換えｍＦｃとともにインキュベートされる場合に０．２％未満を示したクローンを、ヒットと見なした。
【０４４８】
実施例７：ナイーブな選択からの抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂの特徴付け
７．１  ＢＬＩによる抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂの特異性の決定
マウスＣＤ１３７に対する抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂの特異性を、ＨｅｌＤ１．３「モック」ｍＡｂ２フォーマットにおいて試験し、他のマウスＴＮＦＲＳＦ受容体（ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ）へのＦｃａｂの結合を試験することによって、Octet QKeシステムにおいてＢＬＩによって測定した。１０ｎｇ／μｌのマウスＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０受容体（全てR&D Systemsから入手し、Thermoscientific  ＃２１３２８からのＥＺ−Ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンキットを用いてビオチン化した）を被覆するためのストレプトアビジンバイオセンサー（PALL ForteBio  １８−５０２１）。モックｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂを、キネティックバッファー（PALL  １８−１０９２）中で、少なくとも１μＭの最終濃度になるまで１：１で希釈した。抗原で被覆されたセンサーを、１８０秒間にわたってｍＡｂ2溶液中に、続いて１８０秒間にわたって１倍キネティックバッファー中に浸漬した。ＴＮＦＲＳＦ受容体のそれぞれについての抗体を、陽性対照として使用した。ＦｃａｂクローンＦＳ２２ｍ−０５５、ＦＳ２２ｍ−０６３、ＦＳ２２ｍ−０６６、ＦＳ２２ｍ−０７５、ＦＳ２２ｍ−１３５、ＦＳ２２ｍ−０５５、ＦＳ２２ｍ−０６３、ＦＳ２２ｍ−０６６は、試験されるＴＮＦＲＳＦ受容体のいずれにも結合せず、したがって、マウスＣＤ１３７に対するそれらの特異性を実証している。
【０４４９】
７．２  マウスＮＦ−κＢレポーター細胞アッセイにおけるモックｍＡｂ２フォーマットのマウスＦｃａｂの活性
マウスＣＤ１３７配列（配列番号１８４）を発現するＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ細胞を、実施例３．３において上述されるのと同じ方法に従って産生した。前に選択された抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂを含有するｍＡｂ2を、実施例３．３に記載される方法に従って、この細胞株、ＨＥＫ．ＦＲＴ．ｌｕｃ．ｍＣＤ１３７を用いてスクリーニングした。５６のｍＡｂ２を試験し、そのうちの２９がＮＦ−ｋＢ活性について陽性であった。ＬＡＬＡ突然変異（Ｇ１ＡＡ／Ｌｏｂ１２．３）を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃを含有するＬｏｂ１２．３を、陽性対照抗マウスＣＤ１３７  ｍＡｂとして使用し、発光の増加を示し、アッセイの有効性を確認した。ＬＡＬＡ突然変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃを含有するＨｅｌＤ１．３も、このアッセイにおいてヒトＩｇＧモックＦａｂからの干渉を除外するために、陰性対照ヒトＩｇＧアイソタイプとして使用した。ＥＣ５０を、可能であれば計算し、古典的なシグモイド活性キネティクス（sigmoidal activity kinetics）を示したｍＡｂ２を優先して、活性のプラトーに達しなかったｍＡｂ２を無視した。ｍＡｂ２を、ＥＣ５０及びプロテインＬの架橋時の活性の倍率変化の順にランク付けした。ＦＳ２２ｍ−０６３を、架橋時の最良のＥＣ５０（１．４４ｎＭ）及び架橋時の活性の最も高い倍率変化（２７倍）を有するそれに基づいて選択した。図５は、ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２フォーマットにおける抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  ＦＳ２２ｍ−０６３が、ＨＥＫ  ｍＣＤ１３７  ＮＦ−ｋＢレポーターアッセイにおいてプロテインＬと架橋される場合、ＣＤ１３７のクラスター化及びＮＦ−ｋＢシグナル伝達を引き起こすことを示す。
【０４５０】
実施例８：ＦＳ２２ｍ−０６３  Ｆｃａｂ（ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２における）のインビボ抗腫瘍活性
ＦＳ２２ｍ−０６３  Ｆｃａｂが、インビトロでＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を引き起こすことが可能であることが示されたため、インビボでＣＤ１３７を活性化するそれらの能力を試験することが望ましかった。
【０４５１】
８．１  マウスにおけるインビボ試験のためのｍＡｂ２フォーマットにおけるＦＳ２２ｍ−０６３  Ｆｃａｂの調製
抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ、ＦＳ２２ｍ−０６３、及びＰＤ−Ｌ１に特異的なＦａｂ領域を含むｍＡｂ２を、実施例７．１において産生されたモデルｍＡｂ２と同様の方法を用いて調製し、ＭＣ３８同種マウス腫瘍モデルにおいてインビボ抗腫瘍活性について試験した。
【０４５２】
対照：Ｇ１−ＡＡ／Ｌｏｂ１２．３、Ｇ１−ＡＡ／Ｓ７０、Ｇ１−ＡＡ／４４２０。
【０４５３】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｓ７０（米国特許第８，２１７，１４９  Ｂ２号からのクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）の可変重鎖領域を、ＬＡＬＡ突然変異を含むヒトＩｇＧ１（Ｇ１ｍ１７）定常領域に結合することによって、インビボ実験のための対照抗体を産生し、Ｓ７０抗体からの可変軽鎖領域を、ヒトκ  Ｊ−領域を介してヒト定常領域（Ｌｍ１）に結合した。上述される再フォーマットされた構築物のＣＨ３ドメインを、ＦＳ２２ｍ−０６３で置き換えることによって、ｍＡｂ２を生成し、「ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｓ７０」と示した。
【０４５４】
８．２  ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおけるＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｓ７０  ｍＡｂ２の活性
同種マウスモデルは、治療標的を阻害する抗腫瘍効果を試験するための適切なマウスシステムとして認められ、ヒト治療薬の開発を有効にするために広く使用されている。ＭＣ３８腫瘍が、高度に免疫原性であり、且つ抗ＣＤ１３７抗体単独療法に応答し（Kocak et al,2006）、ＰＤ−Ｌ１を発現する（Juneja et al,2017）ことが知られているため、ＭＣ３８同系腫瘍モデルをこの実験において使用した。
【０４５５】
９〜１０週齢で、且つそれぞれ重量１７．９２から２３．８９ｇのＣ５７ＢＬ／６雌マウス（The Jackson Laboratory）を、試験開始前の１週間にわたって安静にさせた。全ての動物にマイクロチップを埋め込み、固有の識別子を与えた。各コホートは、１２匹のマウスを有していた。ＭＣ３８結腸癌細胞株（National Cancer Institute,USA）を最初に増殖させ、貯蔵し、次に、病原体についてプレスクリーニングし、病原体を含まないことが示された。各動物に、無血清培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中１００μｌで、右脇腹に皮下注射される１×１０６個の細胞を与えた。腫瘍細胞接種の７日後に、この時点で腫瘍を有さなかったマウスを、試験から外した。
【０４５６】
ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｓ７０  ｍＡｂ２及び対照抗体（Ｇ１−ＡＡ／Ｌｏｂ１２．３（ＣＤ１３７陽性対照）、Ｇ１−ＡＡ／Ｓ７０（陽性対照ＰＤ−Ｌ１）、Ｇ１−ＡＡ／４４２０（アイソタイプ対照））を、ＤＰＢＳ＋１ｍＭのアルギニン＋０．０５のTween 80中で、投与当たり２０μｇの一定濃度で、マウスに腹腔内注射した。各マウスに、腫瘍接種の７、９、及び１１日後に２００μｌの腹腔内（ＩＰ）注射によってｍＡｂ２分子又は対照抗体を与えた。腫瘍の正確な測定を行い、該当する日までに薬剤投与を行い、マウスを、試験の残りの時間の間、綿密に観察した。腫瘍体積測定を、キャリパーを用いて行って、腫瘍の最長軸及び最短軸を決定した。以下の式を用いて、腫瘍体積を計算した：
Ｌ×（Ｓ２）／２
（式中、Ｌ＝最長軸であり；Ｓ＝最短軸である）。
【０４５７】
図６に示されるように、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｓ７０  ｍＡｂ２は、対照抗体のいずれかで処理されたマウスと比較して、有意な腫瘍成長阻害を示した。統計的有意性は、全ての群を比較する混合モデル分析を用いて、試験の全時間にわたる成長速度についてペアワイズで示された。表７に示されるように、抗ＰＤ−Ｌ１及び抗ＣＤ１３７抗体の組合せ（Ｇ１−ＡＡ／Ｓ７０＋Ｇ１−ＡＡ／Ｌｏｂ１２．３）又はＰＤ−Ｌ１若しくはＣＤ１３７抗体単独で処理された１２匹中４匹のみのマウスと比較して、予想外にも、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｓ７０  ｍＡｂ２で処理された全てのマウスは、試験の終了時に腫瘍がなかった。
【０４５８】
【表８】
2021524270.tif 000017
【０４５９】
試験は、十分に機能する免疫系を有するマウスにおいて、おそらくＰＤ−Ｌ１を介した架橋の結果としてのＣＤ１３７アゴニズムが、おそらく腫瘍中のＣＤ８＋  Ｔ細胞の増加した細胞傷害活性によって、腫瘍成長の低下をもたらすことを示す。
【０４６０】
実施例９：ＦＳ２２ｍ−０６３  Ｆｃａｂ（ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＰＤ−１  ｍＡｂ２における）のインビボ抗腫瘍活性
ＦＳ２２ｍ−０６３  Ｆｃａｂが、インビトロでＣＤ１３７のクラスター化及び活性化を引き起こすことが可能であることが示されたため、別のＦａｂ標的、この場合、インビボで免疫細胞のみに見られる標的であるＰＤ−１を介してＣＤ１３７を活性化するそれらの能力を試験することが望ましかった。
【０４６１】
９．１  マウスにおけるインビボ試験のためのｍＡｂ２フォーマットにおけるＦＳ２２ｍ−０６３  Ｆｃａｂの調製
抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ、ＦＳ２２ｍ−０６３、及びＰＤ−１に特異的なＦａｂ領域を含むｍＡｂ２を、実施例７．１において産生されたモデルｍＡｂ２と同様の方法を用いて調製し、ＭＣ３８同種マウス腫瘍モデルにおいてインビボ抗腫瘍活性について試験した。
【０４６２】
インビボ実験のための対照抗体（Ｇ１／Ｌｏｂ１２．３、Ｇ１−ＡＡ／Ｆ２、Ｇ１−ＡＡ／４４２０）を、抗ＰＤ−１抗体Ｆ２（国際公開第２００４／０５６８７５  Ａ１号からのクローンＰＤ１−Ｆ２）の可変重鎖領域を、ＬＡＬＡ突然変異を含むヒトＩｇＧ１（Ｇ１ｍ１７）定常領域に結合することによって産生し、Ｆ２抗体からの可変軽鎖領域を、ヒトκ  Ｊ−領域を介してヒト定常領域（Ｌｍ１）に結合した。ｍＡｂ２を、上述される再フォーマットされた構築物のＣＨ３ドメインを、ＦＳ２２ｍ−０６３で置き換えることによって生成し、「ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｆ２」と示した。
【０４６３】
９．２  ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおけるＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｆ２  ｍＡｂ２の活性
以下の差異を伴い、実施例８．２に記載されるようにＭＣ３８同系腫瘍モデルをこの実験において使用した：
９〜１１週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Charles River）にマイクロチップを埋め込み、固有の識別子を与えた。各コホートは、１２匹のマウスを有していた。各動物に、１００μｌの無血清培地中で、背部右脇腹に皮下注射される１×１０６個のＭＣ３８結腸癌細胞を与えた。
【０４６４】
ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｆ２  ｍＡｂ２及び対照抗体（Ｇ１−ＡＡ／Ｌｏｂ１２．３（ＣＤ１３７陽性対照）、Ｇ１−ＡＡ／Ｆ２（陽性対照ＰＤ−１）、Ｇ１−ＡＡ／４４２０（アイソタイプ対照））を、ＤＰＢＳ＋１ｍＭのアルギニン＋０．０５のTween 80中で、投与当たり２０μｇの一定濃度で、マウスに腹腔内注射した。腫瘍体積が５０〜６０ｍｍ３に達した後（０日目）並びに最初の投与の２日後、及び４日後に、各マウスに、２００μｌの腹腔内（ＩＰ）注射によって、ｍＡｂ２分子又は対照抗体を与えた。腫瘍を、実施例８．２に記載されるように測定した。
【０４６５】
図７Ａ及びＢに示されるように、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｆ２  ｍＡｂ２は、アイソタイプ対照抗体陽性対照ＰＤ−１抗体で処理されたマウスと比較して、非常に有意な腫瘍成長阻害を示した。表８に示されるように、抗ＰＤ−１及び抗ＣＤ１３７抗体の組合せ（Ｇ１−ＡＡ／Ｆ２＋Ｇ１−ＡＡ／Ｌｏｂ１２．３）で処理された１２匹中７匹のみのマウスと比較して、予想外にも、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｆ２  ｍＡｂ２で処理された１２匹中１０匹のマウスは、試験の終了時に腫瘍がなかった。
【０４６６】
【表９】
2021524270.tif 000018
【０４６７】
試験は、十分に機能する免疫系を有するマウスにおいて、おそらくＰＤ−１阻害の追加を伴うＰＤ−１エンゲージメントによる架橋の結果としてのＣＤ１３７アゴニズムが、おそらく腫瘍中のＣＤ８＋  Ｔ細胞の増加した細胞傷害活性によって、腫瘍成長の低下をもたらすことを示す。
【０４６８】
試験はまた、ＣＤ１３７  Ｆｃａｂが、Ｆａｂアームを免疫細胞標的に結合することによってｍＡｂ２フォーマットにある場合に架橋され得、ＣＤ１３７のクラスター化及び活性化をもたらすことも示す。
【０４６９】
実施例１０：ｍＣＤ１３７／ＭＳＬＮ  ｍＡｂ２のインビボ抗腫瘍活性
ＦＳ２２ｍ−０６３  Ｆｃａｂ及びＰＤ−Ｌ１  Ｆａｂ（実施例８）を含むｍＡｂ2の有効性が示されたため、腫瘍特異的抗原（ＴＡＡ）、この場合、メソテリン（ＭＳＬＮ）へのそのＦａｂアームの結合を介してｍＡｂ２を架橋することによってＣＤ１３７を活性化するｍＡｂ２フォーマットにおけるＣＤ１３７  Ｆｃａｂの能力を試験することが望ましかった。このような腫瘍標的化手法は、ｍＡｂ２の架橋として、Ｔ細胞活性化を腫瘍微小環境に限局するのに有益であることが予想され、したがって、ＣＤ１３７のアゴニズムは、ＭＳＬＮが発現される場合にのみ起こる。
【０４７０】
マウスＭＳＬＮを発現する同種マウス腫瘍モデルを構築した。完全長マウスメソテリン（配列番号１８９）を発現するＣＴ２６結腸癌細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２６３８）を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（＋）（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号Ｖ７９０２０）を用いて、リポフェクション（Lipofectamine 3000、Thermo Fisher Scientific、カタログ番号Ｌ３０００００８）によって産生した。製造業者のプロトコルに従って、ＣＴ２６細胞を、マウスＭＳＬＮ  ｃＤＮＡを含有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターでトランスフェクトした。安定したトランスフェクションを、完全培地（ＲＰＭＩ、１０％のＦＢＳ）中で選択抗生物質（６００μｇ／ｍｌで）としてジェネティシン（geneticin）を用いて行った。
【０４７１】
ＣＴ２６細胞におけるマウスＭＳＬＮの発現を、陽性対照抗体ＭＯＲ６６２６（国際公開第２００９／０６８２０４  Ａ１号）を使用することによって、フローサイトメトリーによって確認した。具体的には、細胞を、１時間にわたって陽性対照抗体とともにインキュベートし、次に、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ検出抗体（Stratech Scientific Ltd、カタログ番号１０９−５４６−０９８−ＪＩＲ）を用いて、細胞結合を検出した。クローン集団を増殖させ、その後、同じフローサイトメトリー手順を用いて相対的発現レベルを決定するために分析し、その後、１つのクローンを選択し、ＣＴ２６．Ｇ１０と命名した。
【０４７２】
ＣＴ２６．Ｇ１０腫瘍成長を、インビボで確認した。８〜１０週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウス（Charles River）にマイクロチップを埋め込み、固有の識別子を与えた。各コホートは、１７匹のマウスを有し、各動物に、１００μｌの無血清培地中で、背部左脇腹に皮下注射される１×１０５個の細胞を与えた。腫瘍体積測定を、実施例８に記載されるように、キャリパーを用いて週に３回行った。試験を、実施例８に記載されるように、英国内務省規制（UK Home Office regulation）に従って行った。
【０４７３】
組織を、試験の終了時に採取し、膜結合メソテリンの発現を、以下のようにホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織中での免疫組織化学的染色によって確認した：４μｍのＦＦＰＥ組織切片を脱パラフィンし、抗原を、９７℃で低いｐＨ６．１を用いて回収し（Dako PT Link）、続いて、ペルオキシダーゼブロック及びタンパク質ブロックを行ってから、１μｇ／ｍｌの濃度で初代抗メソテリン抗体（LifeSpan Biosciences、カタログ番号ＬＳ−Ｃ４０７８８３）とのインキュベーションを行った。抗メソテリン抗体を、標識されたポリマー−ＨＲＰ抗ウサギ二次試薬及びＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）比色エンドポイント（chromogenic endpoint）（Dako EnVision+ System）を用いて検出した。
【０４７４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２ｍ−０６３の有効性を評価するために、以下の分子又は組合せを、インビボで試験した：ＬＡＬＡ突然変異を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプにおける抗ＭＳＬＮ  ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０抗体（Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０）、２つの「モック」ｍＡｂ２フォーマットにおけるＦｃａｂ（ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０）、ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０抗体と、ＬＡＬＡ突然変異を有するモックＣＤ１３７  ｍＡｂ２との組合せ（Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０＋ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）、ヒトアイソタイプ対照抗体（Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）、及び最後にＬＡＬＡ突然変異を有するＣＤ１３７／ＭＳＬＮ  ｍＡｂ2（ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０）。
【０４７５】
８〜１０週齢で、且つそれぞれ重量２０〜２５ｇのＢａｌｂ／ｃ雌マウス（Charles River）を、試験開始前の１週間にわたって順化させた。全ての動物にマイクロチップを埋め込み、固有の識別子を与えた。ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０（ｎ＝１０マウス）を除いて、各コホートは、２０匹のマウスを含んでいた。ＣＴ２６．Ｇ１０結腸癌細胞株を増殖させ、細胞バンクを生成した。各動物に、１００μｌの無血清培地中で、左脇腹に皮下注射される１×１０５個の細胞を与えた。腫瘍細胞接種の１２日後に腫瘍を有さなかったマウスを、試験から外した。
【０４７６】
２００μｇの用量の各抗体（約１０ｍｇ／ｋｇ）を調製し、マウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。さらに、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３及びＧ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０の両方は、併用群のために投与当たり２００μｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ）でそれぞれ調製した。２００μｌの用量を、腫瘍接種の１２、１４及び１６日後に（隔日（ｑ２ｄ）×３）マウスに投与した。腫瘍体積測定を、キャリパーを用いて週に３回行い、マウスを厳密に監視した。試験エンドポイントを、マウスの腫瘍体積及び状態に基づいて、ヒトエンドポイントによって決定した。
【０４７７】
図９に示されるように、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０  ｍＡｂ２は、Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３アイソタイプ対照と比較して、腫瘍成長を有意に阻害した。表９は、全ての群をＧ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３アイソタイプ対照と比較する、混合モデル分析を用いた試験の全過程にわたる全ての処理群についての腫瘍成長速度のペアワイズ比較を示す。
【０４７８】
【表１０】
2021524270.tif 000019
【０４７９】
試験終了時に６２．５ｍｍ３以下の腫瘍を有する全ての動物を十分に奏功した動物として計数した（表１０を参照）。抗ＣＤ１３７／ＭＳＬＮ  ｍＡｂ２で処理された動物の３５％が、Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３アイソタイプ対照、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０、及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３及びＧ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０併用群における０％と比較して、試験終了時に治療に対する完全奏功を示した。
【０４８０】
【表１１】
2021524270.tif 000020
【０４８１】
生存分析（図１０及び表１１）は、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０  ｍＡｂ２が、Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３抗体と比較して有意な生存利益を誘発した一方、成分（Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３）、又はＧ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０＋ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０が、生存利益を示さなかったことを示した。さらに、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０  ｍＡｂ２は、Ｇ１−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（２９日）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３（３０日）、ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０（２９日）、Ｇ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０（３０日）及びＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３とＧ１−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８−０１０との組合せ（２９日）と比較して４２．５日の生存期間中央値の改善をもたらした。
【０４８２】
【表１２】
2021524270.tif 000021
【０４８３】
これらのデータは、ＭＳＬＮを介したｍＡｂ２の架橋が、腫瘍におけるＣＤ１３７アゴニズム；ＣＤ１３７及び／又はＭＳＬＮ単独（及び組合せでも）を標的とするより優れた二重特異的抗体の作用を引き起こすことが可能であり、担腫瘍マウスの有意に改善された生存をもたらすことを示唆する。ＭＳＬＮ標的化Ｆａｂを用いない、モックｍＡｂ2フォーマットＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３又はＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／４４２０）におけるＦｃａｂは、この試験において固有の活性を示さなかった。
【０４８４】
実施例１１：マウス及びヒトＣＤ１３７に結合することが可能なＦｃａｂを得るための選択
ヒトＣＤ１３７に結合するＦｃａｂのいくつかが、マウスＣＤ１３７にも結合したことが意外にも分かったため（ヒト、マウス及びカニクイザルＣＤ１３７への結合の特異性については実施例５．５を参照）、これらのクローンを改善することができたかどうかを調べることが決定された。
【０４８５】
１１．１：ＦＳ２２−０５３−０１４クローンにおける潜在的な配列ライアビリティ（sequence liability）を除去するための部位特異的修飾
マウス−ヒト交差反応性クローンＦＳ２２−０５３−０１４は、それが、ＳＰＲによってマウス二量体ＣＤ１３７抗原に結合することが可能であることが示されたため、選択された（実施例５．５を参照）。しかしながら、さらなる配列分析の際、それは、ＤＧモチーフをもたらす野生型Ｇ９９位置とのＱ９８Ｄ突然変異の結果として、そのＣＨ３ドメインのＥＦループ中の翻訳後アスパラギン酸塩異性化をもたらし得る潜在的な配列ライアビリティを有していた。ＦＳ２２−０５３系統中の他の親和性成熟したクローン（表１２を参照）は、ＥＦループの同じ位置にＱ９８Ｅ修飾を代わりに含んでいた。Ｑ９８Ｄは、製造業者の推奨に従って、QuickChange II突然変異誘発キット（Agilent、カタログ番号２００５２３）を用いた部位特異的突然変異誘発によってＱ９８Ｅへと突然変異され、それにより、クローンＦＳ２２−０５３−０１７が得られた。以下の表１２は、クローンＦＳ２２−０５３−００８、ＦＳ２２−１７２−００３及びＦＳ２２−１７２−００４のＣＨ３ドメインのＥＦループ中の高い頻度で存在するＬＥモチーフ、並びにクローンＦＳ２２−０５３−０１４のＣＨ３ドメインのＥＦループ中のＤＧモチーフを示す。
【０４８６】
【表１３】
2021524270.tif 000022
【０４８７】
実施例１２：突然変異体ＦＳ２２−０５３−０１７  Ｆｃａｂクローンの特徴付け
１２．１  ヒトＣＤ１３７  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるモックｍＡｂ２フォーマットのＦＳ２２−０５３−０１７  Ｆｃａｂの活性
ＦｃａｂクローンＦＳ２２−０５３−０１７をサブクローニングし、ＨｅｌＤ１．３「モック」ｍＡｂ2として発現させ、次に、実施例３．４に記載されるようにヒトＣＤ１３７  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、同様にＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂ2フォーマットにおけるＦＳ２２−０５３−０１４クローンと比較した。Ｇ１−ＡＡ／２０Ｈ４．９を抗ＣＤ１３７陽性対照として使用し、Ｇ１−ＡＡ／Ｄ１．３をＩｇＧ対照として使用した。ｍＡｂ2を、プロテインＬ架橋なしで試験するか、又はプロテインＬと１：４の比率で架橋させた。
【０４８８】
【表１４】
2021524270.tif 000023
【０４８９】
表１３及び図１２中の結果は、モックｍＡｂ２フォーマットにおけるＦＳ２２−０５３−１７  Ｆｃａｂと、モックｍＡｂ２フォーマットにおけるＦＳ２２−０５３−０１４  Ｆｃａｂが両方とも、同じＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいてプロテインＬによって架橋される場合、同等の活性を有していたことを示す。したがって、行われた突然変異誘発は、機能活性に悪影響を与えなかった。モックｍＡｂ２フォーマットにおける両方のクローンは、架橋なしで活性を有さなかった。
【０４９０】
予想どおり、陽性対照抗ＣＤ１３７は、架橋される場合にのみ活性を有し、ＩｇＧ対照は、架橋されるか否かにかかわらず活性を有さなかった。
【０４９１】
１２．２  マウスＣＤ１３７  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるモックｍＡｂ２フォーマットの突然変異体ＦＳ２２−０５３−０１７  Ｆｃａｂの活性
また、ＦＳ２２−０５３−０１７クローン（ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ2フォーマットにおける）を、実施例３．４に記載されるようにマウスＣＤ１３７  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、マウスＣＤ１３７結合ＦｃａｂクローンＦＳ２２ｍ−０６３（同様にＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ2フォーマットにおける）、並びに親ＦＳ２２−０５３−０１４クローン（ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ2フォーマットにおける）に対して比較した。ｍＡｂ2分子を、４：１のモル比（ｍＡｂ２：プロテインＬ）でプロテインＬと架橋させた。
【０４９２】
予想どおり、試験される分子の全ては、プロテインＬによって架橋される場合、ＩＬ−２放出によって測定される際に活性を示したが、架橋されていない場合、活性を有さなかった。マウスＣＤ１３７に結合するために選択されたＦＳ２２ｍ−０６３は、架橋される場合、０．３９ｎＭのＥＣ５０で、アッセイにおいて最良の活性を有していた。ＦＳ２２−０５３−１４及びＦＳ２２−０５３−０１７は両方とも、アッセイにおいて活性を有しており、これは、機能が突然変異誘発により失われなかったことを示すが、ＦＳ２２−０５３−０１７は、プロテインＬによって架橋される場合、ＦＳ２２−０５３−１４より約８倍より劣るＥＣ５０で、活性のわずかな低下を有していた。図１２は、ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２フォーマットにおける、親和性成熟したヒト及びマウス交差反応性ＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１４及びＦＳ２２−０５３−０１７、及び抗マウスＣＤ１３７  Ｆｃａｂ  ＦＳ２２ｍ−０６３が、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、プロテインＬで架橋される場合、ＣＤ１３７を活性化して、ｍＩＬ−２の放出をもたらすことを示す。
【０４９３】
【表１５】
2021524270.tif 000024
【０４９４】
１２．３  ＦＳ２２−０５３−０１７の結合速度
ＦｃａｂクローンＦＳ２２−０５３−０１７の平衡解離定数（ＫＤ）を、Biacore T200システムにおいてＳＰＲによって、クローンＦＳ２２−０５３−０１４の平衡解離定数（ＫＤ）と比較した。ｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ抗原については、以下の方法を使用した：抗ヒトＦａｂ分子を、９，０００〜１１，０００応答単位（ＲＵ）の表面密度になるまでＣＭ５チップ上に固定した。抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で４μｇ／ｍｌになるまで希釈し、３０μｌ／秒の流量で抗Ｆａｂ分子によって捕捉した。８つの異なる濃度のｈＣＤ１３７−ｍＦｃ抗原を使用した：２００ｎＭ；６６．６７ｎＭ；２２．２２ｎＭ（２回含まれていた）、７．４１ｎＭ；２．４７ｎＭ；０．８２ｎＭ、０．２７ｎＭ：０．０９１（ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中で希釈された）を、捕捉されたｍＡｂ2上に流した。
【０４９５】
ｍＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉ結合速度の決定のために、異なる手法を使用した。マウスＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ−Ａｖｉを、２００ＲＵの表面密度になるまでＣＭ５チップ上に固定した。抗マウスＰＤ−Ｌ１  Ｆａｂ（Ｓ７０）と組み合わせてＦＳ２２−０５３−０１４及びＦＳ２２−０５３−０１７  Ｆｃａｂを含有するｍＡｂ2を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で７．５μｇ／ｍｌになるまで希釈し、６０μｌ／秒の流量で、固定されたｍＰＤ−Ｌ１タンパク質によって捕捉した。８つの異なる濃度のｍＣＤ１３７−ｍＦｃ抗原を使用した：６００ｎＭ；２００ｎＭ；６６．６７ｎＭ（２回含まれていた）、２２．２ｎＭ；７．１ｎＭ；２．４７ｎＭ；０．８２ｎＭ（ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中で希釈された）を、捕捉されたｍＡｂ2上に流した。データの分析を、Biacore T200評価ソフトウェアを用いて行った。曲線を、ブランクフローセルに対して減算し、ＲＩを定数として０に及びＲｍａｘをローカル（local）に設定して、質量移動を用いた１：１ラングミュア結合モデルを用いてフィッティングした。結果が、表１５に要約され、両方のＦｃａｂクローンについてヒト抗原に対する非常に類似した動力学プロフィールを示し、それによって、Ｑ９８ＤをＱ９８Ｅへと突然変異することは、ヒト抗原への結合に悪影響を与えなかったことを証明している。マウス抗原への結合強度の２倍の低下はまた、実施例１１．２に示される機能データと一致する。
【０４９６】
【表１６】
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【０４９７】
実施例１３：抗原結合におけるＰＰＹの関与（保存されたＰＰＹモチーフのアラニンスキャニング）
実施例５に記載されるように、ＰＰＹ配列モチーフが、２つの、独立して選択されるＦｃａｂのＡＢループにおいて同定され、このモチーフは、分析される全ての親和性成熟したクローンにおいて保存された。したがって、ＣＤ１３７及び全タンパク質構造への結合におけるこのモチーフの関与を理解することが望ましかった。アラニンスキャニングは、タンパク質−タンパク質相互作用における特定の残基の重要性を決定するのに使用される一般的な生物学的技術である。簡潔に述べると、３つのアミノ酸のそれぞれは、順に及び次に一緒に、アラニン残基で置換された。アラニンが、最も化学的に不活性な、嵩高くない残基であると考えられ、したがって結合を助ける可能性が低いと考えられる。
【０４９８】
１３．１  アラニンスキャニングのための突然変異体クローンの産生
突然変異体クローンを、親クローン（ＦＳ２２−１７２−００３及びＦＳ２２−０５３−００８）における部位特異的突然変異誘発によって産生した。ＡＢループ内のアミノ酸置換の位置は、表１６に要約され、全ての他の残基は、それらのそれぞれの親に保存される。実施例３に記載されるように、次に、ｍＡｂ2変異体を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内で一過性発現させ、mAb Select SuReプロテインＡカラムを用いて精製した。突然変異体の発現収率は、親と同様であり、したがって、これは、アラニン置換がタンパク質産生に影響を与えなかったことを示唆する。
【０４９９】
【表１７】
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【０５００】
１３．２  突然変異体クローンの結合速度
２つの親クローン及び８つの突然変異体クローンの結合速度を、ForteBio製のOctet QKeシステムを用いて比較した。二量体ビオチン化ｈＣＤ１３７−ｍＦｃ−Ａｖｉを、１０ｕｇ／ｍｌでストレプトアビジンセンサー上に捕捉し、次に、２００ｎＭの濃度での各ｍＡｂ2との相互作用を分析した。二量体抗原へのｍＡｂ2の結合は、親クローンと比較して、全てのＦＳ２２−１７２−００３突然変異体クローンについて低下しており、クローンＦＳ２２−１７２−００３＿ＡＡＡ、及びＦＳ２２−１７２−００３＿ＡＰＹは、全ての結合を喪失しており、クローンＦＳ２２−１７２−００３＿ＰＰＡ、及びＦＳ２２−１７２−００３＿ＰＡＹは、親と比較して有意に減少した（５．５倍及び４．４倍低い応答単位）いくらかの結合を保持していた。ＦＳ２２−０５３−００８の結合も影響され、変異体ＰＡＹ及びＡＡＡは、全ての結合を喪失しており、変異体ＡＰＹ及びＰＰＡは、親ＦＳ２２−０５３−００８クローンと比較した際に、抗原への減少した結合及び会合プロフィールの減速を示す。このデータは、ＰＰＹモチーフが、ＣＤ１３７抗原への両方のｍＡｂ2の結合にとって重要であることを示唆する。
【０５０１】
１３．３  ホモロジーモデリング
結合におけるＰＰＹモチーフの関与を考慮すると、ＣＨ３ドメインにおけるタンパク質構造予測を評価することは、インシリコでＦｃａｂをモデリングするのに有益であった。構造ホモロジーモデリング及びその後の立体配座探索を、ＭＯＥソフトウェアスイートの２０１９．０１０１バージョン（Chemical Computing Group ULC）を用いて行った。タンパク質データバンク［ＰＤＢ］構造５ＪＩＩにおけるＦｃ領域を、ＦＳ２２−１７２−００３及びＦＳ２２−０５３−００８の両方のＦｃａｂ領域のための構造テンプレートとして使用した。挿入が、選択された構造テンプレートに関してＡＢ及びＥＦループ領域中に存在するため、残基側鎖最適化を用いたデノボループ探索を適用して、ＡＢ及びＥＦループ構造を生成した。得られたホモロジーモデルを、エネルギー最小化し、骨格結合長さ、角度、二面角及びキラリティーを含む幾何学的基準に従って採点した。基準を合格したスコアを有する構造ホモロジーモデルを、ＭＯＥ内で実施されるような、LowModeMDシミュレーション方法を用いた立体配座サンプリングのための基礎として使用した。
【０５０２】
図１３中のホモロジーモデルは、両方のＦｃａｂのＡＢ及びＥＦループが、テンプレート５ＪＩＩと比較して異なる立体配座を採ることを示し、ＰＰＹモチーフは、ＣＨ３ドメインのコアからのＡＢループ突出に役割を果たす。ＰＰＹモチーフはまた、ループ内及びループと構造の残りの部分との間の両方の相互作用によってＡＢループ立体配座安定化をもたらす相互作用を媒介する。LowModeMDシミュレーションを用いて行われる立体配座探索はまた、ＰＰＹモチーフ中のチロシン残基が、ＣＨ３ドメイン中の同じ鎖のＣＨ３ドメイン中のＱ３（ＩＭＧＴ）及びＤ１２（ＩＭＧＴ）と相互作用し、おそらく、ＡＢループを安定させることを強調した。実施例１３．２に示される結果と総合すると、これは、ＰＰＹモチーフが、ＣＤ１３７へのＦＳ２２−１７２−００３及びＦＳ２２−０５３−００８の両方の結合にとって重要であることを示唆する。
【０５０３】
配列表
ＷＴ  Ｆｃａｂ  ＣＨ３ドメイン構造ループのアミノ酸配列
ＷＴ  Ｆｃａｂ  ＡＢループ−ＲＤＥＬＴＫＮＱ（配列番号１）
ＷＴ  Ｆｃａｂ  ＣＤループ−ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号２）
ＷＴ  Ｆｃａｂ  ＥＦループ−ＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶ（配列番号３）
【０５０４】
ＷＴ  Ｆｃａｂ  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）
ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループに下線が引かれている
【化９】
2021524270.tif 000027
【０５０５】
ＬＡＬＡ−ＰＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号５）
ＬＡＬＡ−ＰＡ突然変異に下線が引かれている
【化１０】
2021524270.tif 000028
【０５０６】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号６）
ＬＡＬＡ突然変異に下線が引かれている
【化１１】
2021524270.tif 000029
【０５０７】
切断型Ｆｃａｂヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号７）
ＴＣＰＰＣＰ
【０５０８】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＷＴ  Ｆｃａｂのアミノ酸配列（配列番号８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１２】
2021524270.tif 000030
【０５０９】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＷＴ  Ｆｃａｂのアミノ酸配列（配列番号９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１３】
2021524270.tif 000031
【０５１０】
ＰＰＹモチーフのアミノ酸配列（配列番号１０）
ＰＰＹ
【０５１１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０３３のアミノ酸配列（配列番号１１）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１４】
2021524270.tif 000032
【０５１２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０３３のアミノ酸配列（配列番号１２）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１５】
2021524270.tif 000033
【０５１３】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０３３／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１３）
ＶＨドメイン（下線）
【化１６】
2021524270.tif 000034
【０５１４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０３３／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１４）
ＶＨドメイン（下線）
【化１７】
2021524270.tif 000035
【０５１５】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３のアミノ酸配列（配列番号１５）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１８】
2021524270.tif 000036
【０５１６】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３のアミノ酸配列（配列番号１６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１９】
2021524270.tif 000037
【０５１７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０５３／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１７）
ＶＨドメイン（下線）
【化２０】
2021524270.tif 000038
【０５１８】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０５３／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）
ＶＨドメイン（下線）
【化２１】
2021524270.tif 000039
【０５１９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００８  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−０５３−００８  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号１９）
ＦＳ２２−０５３−００８  第２の配列−ＤＹＷＲＷＬＥ（配列番号２０）
【０５２０】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００８  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２１）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化２２】
2021524270.tif 000040
【０５２１】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００８  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号２２）
【化２３】
2021524270.tif 000041
【０５２２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００８のアミノ酸配列（配列番号２３）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化２４】
2021524270.tif 000042
【０５２３】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００８の核酸配列（配列番号２４）
【化２５】
2021524270.tif 000043
【０５２４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００８のアミノ酸配列（配列番号２５）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化２６】
2021524270.tif 000044
【０５２５】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００８の核酸配列（配列番号２６）
【化２７】
2021524270.tif 000045
【０５２６】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０５３−００８／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２７）
ＶＨドメイン（下線）
【化２８】
2021524270.tif 000046
【０５２７】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０５３−００８／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２８）
ＶＨドメイン（下線）
【化２９】
2021524270.tif 000047
【０５２８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００９  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−０５３−００９  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号１９）
ＦＳ２２−０５３−００９  第２の配列−ＥＨＴＲＷＬＤ（配列番号２９）
【０５２９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００９  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３０）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化３０】
2021524270.tif 000048
【０５３０】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００９  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号３１）
【化３１】
2021524270.tif 000049
【０５３１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００９のアミノ酸配列（配列番号３２）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化３２】
2021524270.tif 000050
【０５３２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００９の核酸配列（配列番号３３）
【化３３】
2021524270.tif 000051
【０５３３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００９のアミノ酸配列（配列番号３４）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化３４】
2021524270.tif 000052
【０５３４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−００９の核酸配列（配列番号３５）
【化３５】
2021524270.tif 000053
【０５３５】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０５３−００９／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号３６）
ＶＨドメイン（下線）
【化３６】
2021524270.tif 000054
【０５３６】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０５３−００９／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号３７）
ＶＨドメイン（下線）
【化３７】
2021524270.tif 000055
【０５３７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１０  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−０５３−０１０  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号１９）
ＦＳ２２−０５３−０１０  第２の配列−ＤＹＭＲＷＬＤ（配列番号３８）
【０５３８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１０  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３９）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化３８】
2021524270.tif 000056
【０５３９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１０  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号４０）
【化３９】
2021524270.tif 000057
【０５４０】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１０のアミノ酸配列（配列番号４１）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化４０】
2021524270.tif 000058
【０５４１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１０の核酸配列（配列番号４２）
【化４１】
2021524270.tif 000059
【０５４２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１０のアミノ酸配列（配列番号４３）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化４２】
2021524270.tif 000060
【０５４３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１０の核酸配列（配列番号４４）
【化４３】
2021524270.tif 000061
【０５４４】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０５３−０１０／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号４５）
ＶＨドメイン（下線）
【化４４】
2021524270.tif 000062
【０５４５】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０５３−０１０／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号４６）
ＶＨドメイン（下線）
【化４５】
2021524270.tif 000063
【０５４６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１１  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−０５３−０１１  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号１９）
ＦＳ２２−０５３−０１１  第２の配列−ＤＹＷＲＷＴＤ（配列番号４７）
【０５４７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１１  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４８）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化４６】
2021524270.tif 000064
【０５４８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１１  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号４９）
【化４７】
2021524270.tif 000065
【０５４９】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１１のアミノ酸配列（配列番号５０）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化４８】
2021524270.tif 000066
【０５５０】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１１の核酸配列（配列番号５１）
【化４９】
2021524270.tif 000067
【０５５１】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１１のアミノ酸配列（配列番号５２）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化５０】
2021524270.tif 000068
【０５５２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１１の核酸配列（配列番号５３）
【化５１】
2021524270.tif 000069
【０５５３】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０５３−０１１／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５４）
ＶＨドメイン（下線）
【化５２】
2021524270.tif 000070
【０５５４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０５３−０１１／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５５）
ＶＨドメイン（下線）
【化５３】
2021524270.tif 000071
【０５５５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１２  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−０５３−０１２  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号１９）
ＦＳ２２−０５３−０１２  第２の配列−ＤＨＭＲＷＬＥ（配列番号５６）
【０５５６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１２  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５７）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化５４】
2021524270.tif 000072
【０５５７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１２  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号５８）
【化５５】
2021524270.tif 000073
【０５５８】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１２のアミノ酸配列（配列番号５９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化５６】
2021524270.tif 000074
【０５５９】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１２の核酸配列（配列番号６０）
【化５７】
2021524270.tif 000075
【０５６０】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１２のアミノ酸配列（配列番号６１）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化５８】
2021524270.tif 000076
【０５６１】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１２の核酸配列（配列番号６２）
【化５９】
2021524270.tif 000077
【０５６２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０５３−０１２／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６３）
ＶＨドメイン（下線）
【化６０】
2021524270.tif 000078
【０５６３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０５３−０１２／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６４）
ＶＨドメイン（下線）
【化６１】
2021524270.tif 000079
【０５６４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１３  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−０５３−０１３  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号１９）
ＦＳ２２−０５３−０１３  第２の配列−ＧＹＥＲＷＬＥ（配列番号６５）
【０５６５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１３  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号６６）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化６２】
2021524270.tif 000080
【０５６６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１３  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号６７）
【化６３】
2021524270.tif 000081
【０５６７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１３のアミノ酸配列（配列番号６８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化６４】
2021524270.tif 000082
【０５６８】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１３の核酸配列（配列番号６９）
【化６５】
2021524270.tif 000083
【０５６９】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１３のアミノ酸配列（配列番号７０）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化６６】
2021524270.tif 000084
【０５７０】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１３の核酸配列（配列番号７１）
【化６７】
2021524270.tif 000085
【０５７１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０５３−０１３／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７２）
ＶＨドメイン（下線）
【化６８】
2021524270.tif 000086
【０５７２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０５３−０１３／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７３）
ＶＨドメイン（下線）
【化６９】
2021524270.tif 000087
【０５７３】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１４  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−０５３−０１４  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号１９）
ＦＳ２２−０５３−０１４  第２の配列−ＹＨＷＲＷＬＤ（配列番号７４）
【０５７４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１４  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号７５）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化７０】
2021524270.tif 000088
【０５７５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１４  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号７６）
【化７１】
2021524270.tif 000089
【０５７６】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１４のアミノ酸配列（配列番号７７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化７２】
2021524270.tif 000090
【０５７７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１４の核酸配列（配列番号７８）
【化７３】
2021524270.tif 000091
【０５７８】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１４のアミノ酸配列（配列番号７９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化７４】
2021524270.tif 000092
【０５７９】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１４の核酸配列（配列番号８０）
【化７５】
2021524270.tif 000093
【０５８０】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０５３−０１４／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８１）
ＶＨドメイン（下線）
【化７６】
2021524270.tif 000094
【０５８１】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０５３−０１４／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８２）
ＶＨドメイン（下線）
【化７７】
2021524270.tif 000095
【０５８２】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１５  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−０５３−０１５  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号１９）
ＦＳ２２−０５３−０１５  第２の配列−ＤＨＷＲＷＬＱ（配列番号８３）
【０５８３】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１５  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号８４）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化７８】
2021524270.tif 000096
【０５８４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１５  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号８５）
【０５８５】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１５のアミノ酸配列（配列番号８６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化７９】
2021524270.tif 000097
【０５８６】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１５の核酸配列（配列番号８７）
【化８０】
2021524270.tif 000098
【０５８７】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１５のアミノ酸配列（配列番号８８）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化８１】
2021524270.tif 000099
【０５８８】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１５の核酸配列（配列番号８９）
【化８２】
2021524270.tif 000100
【０５８９】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０５３−０１５／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号９０）
ＶＨドメイン（下線）
【化８３】
2021524270.tif 000101
【０５９０】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０５３−０１５／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号９１）
ＶＨドメイン（下線）
【化８４】
2021524270.tif 000102
【０５９１】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１６  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−０５３−０１６  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号１９）
ＦＳ２２−０５３−０１６  第２の配列−ＤＹＩＲＷＬＮ（配列番号９２）
【０５９２】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１６  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号９３）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化８５】
2021524270.tif 000103
【０５９３】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１６  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号９４）
【化８６】
2021524270.tif 000104
【０５９４】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１６のアミノ酸配列（配列番号９５）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化８７】
2021524270.tif 000105
【０５９５】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１６の核酸配列（配列番号９６）
【化８８】
2021524270.tif 000106
【０５９６】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１６のアミノ酸配列（配列番号９７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化８９】
2021524270.tif 000107
【０５９７】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１６の核酸配列（配列番号９８）
【化９０】
2021524270.tif 000108
【０５９８】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０５３−０１６／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号９９）
ＶＨドメイン（下線）
【化９１】
2021524270.tif 000109
【０５９９】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０５３−０１６／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１００）
ＶＨドメイン（下線）
【化９２】
2021524270.tif 000110
【０６００】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１７  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−０５３−０１７  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号１９）
ＦＳ２２−０５３−０１７  第２の配列−ＹＨＷＲＷＬＥ（配列番号１０１）
【０６０１】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１７  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０２）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化９３】
2021524270.tif 000111
【０６０２】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１７  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１０３）
【化９４】
2021524270.tif 000112
【０６０３】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１７のアミノ酸配列（配列番号１０４）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化９５】
2021524270.tif 000113
【０６０４】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１７の核酸配列（配列番号１０５）
【化９６】
2021524270.tif 000114
【０６０５】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１７のアミノ酸配列（配列番号１０６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化９７】
2021524270.tif 000115
【０６０６】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３−０１７の核酸配列（配列番号１０７）
【化９８】
2021524270.tif 000116
【０６０７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−０５３−０１７／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０８）
ＶＨドメイン（下線）
【化９９】
2021524270.tif 000117
【０６０８】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−０５３−０１７／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０９）
ＶＨドメイン（下線）
【化１００】
2021524270.tif 000118
【０６０９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−１７２  第１の配列−ＲＫＹＹＰＰＹ（配列番号１１０）
ＦＳ２２−１７２  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１１）
【０６１０】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化１０１】
2021524270.tif 000119
【０６１１】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１１３）
【化１０２】
2021524270.tif 000120
【０６１２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２のアミノ酸配列（配列番号１１４）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１０３】
2021524270.tif 000121
【０６１３】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２の核酸配列（配列番号１１５）
【化１０４】
2021524270.tif 000122
【０６１４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２のアミノ酸配列（配列番号１１６）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１０５】
2021524270.tif 000123
【０６１５】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２の核酸配列（配列番号１１７）
【化１０６】
2021524270.tif 000124
【０６１６】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−１７２／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１８）
ＶＨドメイン（下線）
【化１０７】
2021524270.tif 000125
【０６１７】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−１７２／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１９）
ＶＨドメイン（下線）
【化１０８】
2021524270.tif 000126
【０６１８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００１  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−１７２−００１  第１の配列−ＰＦＶＭＰＰＹ（配列番号１２０）
ＦＳ２２−１７２−００１  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１１）
【０６１９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００１  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２１）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化１０９】
2021524270.tif 000127
【０６２０】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００１  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１２２）
【化１１０】
2021524270.tif 000128
【０６２１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００１のアミノ酸配列（配列番号１２３）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１１１】
2021524270.tif 000129
【０６２２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００１の核酸配列（配列番号１２４）
【化１１２】
2021524270.tif 000130
【０６２３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００１のアミノ酸配列（配列番号１２５）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１１３】
2021524270.tif 000131
【０６２４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００１の核酸配列（配列番号１２６）
【化１１４】
2021524270.tif 000132
【０６２５】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−１７２−００１／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２７）
ＶＨドメイン（下線）
【化１１５】
2021524270.tif 000133
【０６２６】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−１７２−００１／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２８）
ＶＨドメイン（下線）
【化１１６】
2021524270.tif 000134
【０６２７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００２  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−１７２−００２  第１の配列−ＰＦＱＭＰＰＹ（配列番号１２９）
ＦＳ２２−１７２−００２  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１１）
【０６２８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００２  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１３０）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化１１７】
2021524270.tif 000135
【０６２９】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００２  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１３１）
【化１１８】
2021524270.tif 000136
【０６３０】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００２のアミノ酸配列（配列番号１３２）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１１９】
2021524270.tif 000137
【０６３１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００２の核酸配列（配列番号１３３）
【化１２０】
2021524270.tif 000138
【０６３２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００２のアミノ酸配列（配列番号１３４）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１２１】
2021524270.tif 000139
【０６３３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００２の核酸配列（配列番号１３５）
【化１２２】
2021524270.tif 000140
【０６３４】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−１７２−００２／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１３６）
ＶＨドメイン（下線）
【化１２３】
2021524270.tif 000141
【０６３５】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−１７２−００２／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１３７）
ＶＨドメイン（下線）
【化１２４】
2021524270.tif 000142
【０６３６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００３  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−１７２−００３  第１の配列−ＰＹＩＩＰＰＹ（配列番号１３８）
ＦＳ２２−１７２−００３  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１１）
【０６３７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００３  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１３９）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化１２５】
2021524270.tif 000143
【０６３８】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００３  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１４０）
【化１２６】
2021524270.tif 000144
【０６３９】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００３のアミノ酸配列（配列番号１４１）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１２７】
2021524270.tif 000145
【０６４０】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００３の核酸配列（配列番号１４２）
【化１２８】
2021524270.tif 000146
【０６４１】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００３のアミノ酸配列（配列番号１４３）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１２９】
2021524270.tif 000147
【０６４２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００３の核酸配列（配列番号１４４）
【化１３０】
2021524270.tif 000148
【０６４３】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−１７２−００３／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１４５）
ＶＨドメイン（下線）
【化１３１】
2021524270.tif 000149
【０６４４】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−１７２−００３／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１４６）
ＶＨドメイン（下線）
【化１３２】
2021524270.tif 000150
【０６４５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００４  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−１７２−００４  第１の配列−ＮＹＩＹＰＰＹ（配列番号１４７）
ＦＳ２２−１７２−００４  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１１）
【０６４６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００４  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１４８）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化１３３】
2021524270.tif 000151
【０６４７】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００４  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１４９）
【化１３４】
2021524270.tif 000152
【０６４８】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００４のアミノ酸配列（配列番号１５０）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１３５】
2021524270.tif 000153
【０６４９】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００４の核酸配列（配列番号１５１）
【化１３６】
2021524270.tif 000154
【０６５０】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００４のアミノ酸配列（配列番号１５２）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１３７】
2021524270.tif 000155
【０６５１】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００４の核酸配列（配列番号１５３）
【化１３８】
2021524270.tif 000156
【０６５２】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−１７２−００４／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５４）
ＶＨドメイン（下線）
【化１３９】
2021524270.tif 000157
【０６５３】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−１７２−００４／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５５）
ＶＨドメイン（下線）
【化１４０】
2021524270.tif 000158
【０６５４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００５  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−１７２−００５  第１の配列−ＱＱＶＹＰＰＹ（配列番号１５６）
ＦＳ２２−１７２−００５  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１１）
【０６５５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００５  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１５７）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化１４１】
2021524270.tif 000159
【０６５６】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００５  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１５８）
【化１４２】
2021524270.tif 000160
【０６５７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００５のアミノ酸配列（配列番号１５９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１４３】
2021524270.tif 000161
【０６５８】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００５の核酸配列（配列番号１６０）
【化１４４】
2021524270.tif 000162
【０６５９】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００５のアミノ酸配列（配列番号１６１）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１４５】
2021524270.tif 000163
【０６６０】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００５の核酸配列（配列番号１６２）
【化１４６】
2021524270.tif 000164
【０６６１】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−１７２−００５／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１６３）
ＶＨドメイン（下線）
【化１４７】
2021524270.tif 000165
【０６６２】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−１７２−００５／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１６４）
ＶＨドメイン（下線）
【化１４８】
2021524270.tif 000166
【０６６３】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００６  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−１７２−００６  第１の配列−ＲＫＹＹＰＰＹ（配列番号１１０）
ＦＳ２２−１７２−００６  第２の配列−ＧＡＤＲＷＬＥ（配列番号１１１）
【０６６４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００６  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１６５）
第１及び第２の配列に下線が引かれている
【化１４９】
2021524270.tif 000167
【０６６５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００６  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１６６）
【化１５０】
2021524270.tif 000168
【０６６６】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００６のアミノ酸配列（配列番号１６７）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）、ＣＨ３ドメイン（斜体）、ＬＡＬＡ突然変異（太字及び下線）
【化１５１】
2021524270.tif 000169
【０６６７】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００６の核酸配列（配列番号１６８）
【化１５２】
2021524270.tif 000170
【０６６８】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００６のアミノ酸配列（配列番号１６９）
ヒンジ領域（下線）、ＣＨ２ドメイン（太字）及びＣＨ３ドメイン（斜体）
【化１５３】
2021524270.tif 000171
【０６６９】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−１７２−００６の核酸配列（配列番号１７０）
【化１５４】
2021524270.tif 000172
【０６７０】
ＬＡＬＡ突然変異を有するＦＳ２２−１７２−００６／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１７１）
ＶＨドメイン（下線）
【化１５５】
2021524270.tif 000173
【０６７１】
ＬＡＬＡ突然変異を有さないＦＳ２２−１７２−００６／ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１７２）
ＶＨドメイン（下線）
【化１５６】
2021524270.tif 000174
【０６７２】
ＨｅｌＤ１．３モックｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１７３）
ＶＬドメイン（下線）
【化１５７】
2021524270.tif 000175
【０６７３】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３  ＣＨ３ドメイン構造ループ配列のアミノ酸配列
ＦＳ２２−０５３  第１の配列−ＮＰＰＹＬＦＳ（配列番号１９）
ＦＳ２２−０５３  第２の配列−ＹＹＮＲＷＱＤ（配列番号１７４）
【０６７４】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１７５）
（第１及び第２の配列に下線を引かれている）。
【化１５８】
2021524270.tif 000176
【０６７５】
Ｆｃａｂ  ＦＳ２２−０５３  ＣＨ３ドメインの核酸配列（配列番号１７６）
【化１５９】
2021524270.tif 000177
【０６７６】
ＬＡＬＡを有するＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３  Ｆｃａｂの核酸配列（配列番号１７７）
【化１６０】
2021524270.tif 000178
【０６７７】
ＬＡＬＡを有さないＦｃａｂ  ＦＳ２２−０５３  Ｆｃａｂの核酸配列（配列番号１７８）
【化１６１】
2021524270.tif 000179
【０６７８】
完全長免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号１７９）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
【０６７９】
ヒトＣＤ１３７のアミノ酸配列（配列番号１８０）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）
【化１６２】
2021524270.tif 000180
【０６８０】
ヒトＣＤ１３７細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８１）
【化１６３】
2021524270.tif 000181
【０６８１】
カニクイザルＣＤ１３７のアミノ酸配列（配列番号１８２）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）
【化１６４】
2021524270.tif 000182
【０６８２】
カニクイザルＣＤ１３７細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８３）
【化１６５】
2021524270.tif 000183
【０６８３】
マウスＣＤ１３７のアミノ酸配列（配列番号１８４）
細胞外ドメイン（斜体）；膜貫通及び細胞内ドメイン（太字）
【化１６６】
2021524270.tif 000184
【０６８４】
マウスＣＤ１３７細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８５）
【化１６７】
2021524270.tif 000185
【０６８５】
Ｇ１／ＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂの重鎖のアミノ酸配列（配列番号１８６）
【化１６８】
2021524270.tif 000186
【０６８６】
ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１８７）
【化１６９】
2021524270.tif 000187
【０６８７】
マウスＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１８８）
【化１７０】
2021524270.tif 000188
【０６８８】
マウスメソテリンのアミノ酸配列（配列番号１８９）
【化１７１】
2021524270.tif 000189
【０６８９】
ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８  ｍＡｂ２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９０）
【化１７２】
2021524270.tif 000190
【０６９０】
ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／ＦＳ２８ｍ−２２８  ｍＡｂ２の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１９１）
【化１７３】
2021524270.tif 000191
【０６９１】
Ｇ１ＡＡ／ＨｅｌＤ１．３  ｍＡｂ（ＬＡＬＡを有する）の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９２）
【化１７４】
2021524270.tif 000192
【０６９２】
ＦＳ２２−１７２−００４−ＡＡ／Ｓ７０（ＬＡＬＡを有する）の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９３）
【化１７５】
2021524270.tif 000193
【０６９３】
ＦＳ２２−１７２−００４−ＡＡ／Ｓ７０（ＬＡＬＡを有さない）の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９４）
【化１７６】
2021524270.tif 000194
【０６９４】
ＦＳ２２−１７２−００４−ＡＡ／Ｓ７０の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１９４）
【化１７７】
2021524270.tif 000195
【０６９５】
ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／Ｓ７０（ＬＡＬＡを有する）の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９５）
【化１７８】
2021524270.tif 000196
【０６９６】
ＦＳ２２−１７２−００３−ＡＡ／Ｓ７０（ＬＡＬＡを有さない）の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９６）
【化１７９】
2021524270.tif 000197
【０６９７】
ＦＳ２２−１７２−００２−ＡＡ／Ｓ７０（ＬＡＬＡを有する）の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９７）
【化１８０】
2021524270.tif 000198
【０６９８】
ＦＳ２２−１７２−００２−ＡＡ／Ｓ７０（ＬＡＬＡを有さない）の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９８）
【化１８１】
2021524270.tif 000199
【０６９９】
ＦＳ２２−１７２−００２−ＡＡ／Ｓ７０重鎖（ＬＡＬＡを有さない）（配列番号１９９）
【化１８２】
2021524270.tif 000200
【０７００】
ＦＳ２２−１７２−００２−ＡＡ／Ｓ７０重鎖（ＬＡＬＡを有する）（配列番号２００）
【化１８３】
2021524270.tif 000201
【０７０１】
ＦＳ２２−０５３−０１１−ＡＡ／Ｓ７０重鎖（ＬＡＬＡを有さない）（配列番号２０１）
【化１８４】
2021524270.tif 000202
【０７０２】
ＦＳ２２−０５３−０１１−ＡＡ／Ｓ７０重鎖（ＬＡＬＡを有する）（配列番号２０２）
【化１８５】
2021524270.tif 000203
【０７０３】
ＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／Ｓ７０重鎖（ＬＡＬＡを有する）（配列番号２０３）
【化１８６】
2021524270.tif 000204
【０７０４】
ＦＳ２２−０５３−００８−ＡＡ／Ｓ７０重鎖（ＬＡＬＡを有さない）（配列番号２０４）
【化１８７】
2021524270.tif 000205
【０７０５】
ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｆ２重鎖（ＬＡＬＡを有さない）（配列番号２０５）
【化１８８】
2021524270.tif 000206
【０７０６】
ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｆ２重鎖（ＬＡＬＡを有さない）（配列番号２０６）
【化１８９】
2021524270.tif 000207
【０７０７】
ＦＳ２２ｍ−０６３−ＡＡ／Ｆ２軽鎖（配列番号２０７）
【化１９０】
2021524270.tif 000208
【０７０８】
ＦＳ２２ｍ−０６３／ＦＳ２８ｍ−２２８重鎖（ＬＡＬＡを有さない）（配列番号２０８）
【化１９１】
2021524270.tif 000209
【０７０９】
参照文献
本明細書において言及される全ての文献は、全体が参照により本明細書に援用される。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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