(57)【要約】分析物中の所定のヌクレオシド三リン酸分子の核酸塩基が所定の化学修飾又は構造修飾を含むか否かを決定する方法であり、（１）ポリメラーゼの存在下で、前記分析物を生物学的プローブと反応させるステップであり、前記生物学的プローブは、（ａ）エキソヌクレアーゼブロッキング部位；前記ブロッキング部位の３’側に位置する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位；前記認識部位内に位置する単一ヌクレオチド捕捉部位；及び実質的に検出不可能であるように配置されたそれぞれ前記認識部位の３’側に位置する第１及び第２のフルオロフォアをそれぞれ含む、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペア、及び（ｂ）少なくとも１つの第２の一本鎖オリゴヌクレオチド及び任意選択で少なくとも１つの第３の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、それぞれ前記第１のオリゴヌクレオチドから区別され、前記ペアの第１のオリゴヌクレオチドの一方、他方、又は両方の前記捕捉部位の３’側及び５’側の相補的なフランキング領域にハイブリダイズして、（ｂ１）前記ペアの第１のオリゴヌクレオチドの一方又は他方と、（ｂ２）前記第２のオリゴヌクレオチド、前記ヌクレオシド三リン酸分子由来の修飾又は未修飾ヌクレオチドの一方又は他方、及び任意選択で前記第３のオリゴヌクレオチドを含む成分とからなる二本鎖使用プローブを作製することができ、各二本鎖は４つの可能な（ｂ１）／（ｂ２）二本鎖置換のうちの１つを含む、ステップ；（２）ステップ（１）で作製された前記二本鎖を、前記（ｂ１）鎖を前記認識部位で選択的に切断するのに適した少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを含む制限エンドヌクレアーゼ系と反応させて、元々の前記ヌクレオシド三リン酸分子における修飾の有無に応じて、（ｉ）第１のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみ、又は（ｉｉ）第２のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみ、又は（ｉｉｉ）それぞれ第１又は第２のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントの混合物を作製するステップ；（３）前記（ｂ２）成分及び前記ペアの別の第１のオリゴヌクレオチドから別の二本鎖使用プローブを作製し、その後、ステップ（２）及び（３）を繰り返すステップ；（４）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で前記第１のオリゴヌクレオチドエレメントを分解して、ステップ（２）及び（３）のいずれか又は両方の後に検出可能な状態であるフルオロフォアを生成するステップ；及び（５）ステップ（４）で放出されたフルオロフォアを検出し、観察された蛍光シグナルの性質から、元々の前記単一ヌクレオシド三リン酸分子が修飾されているか未修飾であるかを推測するステップにより特徴づけられる、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物中の所定のヌクレオシド三リン酸分子の核酸塩基が所定の化学修飾又は構造修飾を含むか否かを決定する方法であり、
（１）ポリメラーゼの存在下で、前記分析物を生物学的プローブと反応させるステップであり、前記生物学的プローブは、（ａ）エキソヌクレアーゼブロッキング部位；前記ブロッキング部位の５’側に位置する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位；前記認識部位内に位置する単一ヌクレオチド捕捉部位；及び実質的に検出不可能であるように配置されたそれぞれ前記認識部位の５’側に位置する第１及び第２のフルオロフォアをそれぞれ含む、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペア、及び（ｂ）少なくとも１つの第２の一本鎖オリゴヌクレオチド及び任意選択で少なくとも１つの第３の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、それぞれ前記第１のオリゴヌクレオチドから区別され、前記ペアの第１のオリゴヌクレオチドの一方、他方、又は両方の前記捕捉部位の３’側及び５’側の相補的なフランキング領域にハイブリダイズして、（ｂ１）前記ペアの第１のオリゴヌクレオチドの一方又は他方と、（ｂ２）前記第２のオリゴヌクレオチド、前記ヌクレオシド三リン酸分子由来の修飾又は未修飾ヌクレオチドの一方又は他方、及び任意選択で前記第３のオリゴヌクレオチドを含む成分とからなる二本鎖使用プローブを作製することができ、前記二本鎖は４つの可能な（ｂ１）／（ｂ２）二本鎖置換のうちの１つを含む、ステップ；
（２）ステップ（１）で作製された前記二本鎖を、前記（ｂ１）鎖を前記認識部位で選択的に切断するのに適した少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを含む制限エンドヌクレアーゼ系と反応させて、元々の前記ヌクレオシド三リン酸分子における修飾の有無に応じて、（ｉ）第１のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみ、又は（ｉｉ）第２のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみ、又は（ｉｉｉ）それぞれ第１又は第２のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントの混合物を作製するステップ；
（３）前記（ｂ２）成分及び前記ペアの別の第１のオリゴヌクレオチドから別の二本鎖使用プローブを作製し、その後、ステップ（２）及び（３）を繰り返すステップ；
（４）３’−５’ エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で前記第１のオリゴヌクレオチドエレメントを分解して、ステップ（２）及び（３）のいずれか又は両方の後に検出可能な状態であるフルオロフォアを生成するステップ；及び
（５）ステップ（４）で放出されたフルオロフォアを検出し、観察された蛍光シグナルの性質から、元々の前記単一ヌクレオシド三リン酸分子が修飾されているか未修飾であるかを推測するステップ
により特徴づけられる、方法。
【請求項２】
分析物中の所定のヌクレオシド三リン酸分子の核酸塩基が所定の化学修飾又は構造修飾を含むか否かを決定する方法であり、
（１）ポリメラーゼの存在下で、前記分析物を生物学的プローブと反応させるステップであり、前記生物学的プローブは、（ａ）エキソヌクレアーゼブロッキング部位；前記ブロッキング部位の３’側に位置する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位；前記認識部位内に位置する単一ヌクレオチド捕捉部位；及び実質的に検出不可能であるように配置されたそれぞれ前記認識部位の３’側に位置する第１及び第２のフルオロフォアをそれぞれ含む、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペア、及び（ｂ）少なくとも１つの第２の一本鎖オリゴヌクレオチド及び任意選択で少なくとも１つの第３の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、それぞれ前記第１のオリゴヌクレオチドから区別され、前記ペアの第１のオリゴヌクレオチドの一方、他方、又は両方の前記捕捉部位の３’側及び５’側の相補的なフランキング領域にハイブリダイズして、（ｂ１）前記ペアの第１のオリゴヌクレオチドの一方又は他方と、（ｂ２）前記第２のオリゴヌクレオチド、前記ヌクレオシド三リン酸分子由来の修飾又は未修飾ヌクレオチドの一方又は他方、及び任意選択で前記第３のオリゴヌクレオチドを含む成分とからなる二本鎖使用プローブを作製することができ、各二本鎖は４つの可能な（ｂ１）／（ｂ２）二本鎖置換のうちの１つを含む、ステップ；
（２）ステップ（１）で作製された前記二本鎖を、前記（ｂ１）鎖を前記認識部位で選択的に切断するのに適した少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを含む制限エンドヌクレアーゼ系と反応させて、元々の前記ヌクレオシド三リン酸分子における修飾の有無に応じて、（ｉ）第１のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみ、又は（ｉｉ）第２のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみ、又は（ｉｉｉ）それぞれ第１又は第２のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントの混合物を作製するステップ；
（３）前記（ｂ２）成分及び前記ペアの別の第１のオリゴヌクレオチドから別の二本鎖使用プローブを作製し、その後、ステップ（２）及び（３）を繰り返すステップ；
（４）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で前記第１のオリゴヌクレオチドエレメントを分解して、ステップ（２）及び（３）のいずれか又は両方の後に検出可能な状態であるフルオロフォアを生成するステップ；及び
（５）ステップ（４）で放出されたフルオロフォアを検出し、観察された蛍光シグナルの性質から、元々の前記単一ヌクレオシド三リン酸分子が修飾されているか未修飾であるかを推測するステップ
により特徴づけられる、方法。
【請求項３】
前記制限エンドヌクレアーゼ系が、（ｉ）前記第１のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチドを含む（ｂ１）−（ｂ２）二本鎖のみを切断することが可能な第１の制限エンドヌクレアーゼ、及び、前記第２のオリゴヌクレオチドと、前記分析物に由来する修飾されたヌクレオシド三リン酸分子と、前記第３のオリゴヌクレオチドとを含む成分、並びに、（ｉｉ）前記第２のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチドを含む（ｂ１）−（ｂ２）二本鎖のみを切断することが可能な第２の制限エンドヌクレアーゼ、及び、前記第２のオリゴヌクレオチドと、前記分析物に由来する未修飾のヌクレオシド三リン酸分子と、前記第３のオリゴヌクレオチドとを含む成分を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記制限エンドヌクレアーゼ系が、（ｉ）前記第１のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチドを含む（ｂ１）−（ｂ２）二本鎖、及び、前記第２のオリゴヌクレオチドと、前記分析物に由来する修飾されたヌクレオシド三リン酸分子と、前記第３のオリゴヌクレオチドとを含む成分、並びに、（ｉｉ）前記第２のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチドを含む（ｂ１）−（ｂ２）二本鎖、及び、前記第２のオリゴヌクレオチドと、前記分析物に由来する未修飾のヌクレオシド三リン酸分子と、前記第３のオリゴヌクレオチドとを含む成分を切断することができない制限エンドヌクレアーゼを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）前記制限エンドヌクレアーゼ系が、全ての（ｂ１）−（ｂ２）二本鎖を切断することが可能な第１の制限エンドヌクレアーゼ、前記第２のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチドを含む（ｂ１）−（ｂ２）二本鎖のみを切断することが可能な第２の制限エンドヌクレアーゼ、及び、前記第２のオリゴヌクレオチドと、前記分析物に由来する未修飾のヌクレオシド三リン酸分子と、前記第３のオリゴヌクレオチドとを含む成分を含むこと、及び、（ｉｉ）前記第２のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチドの認識部位が第１の制限エンドヌクレアーゼブロッキング部位を更に含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記制限エンドヌクレアーゼ系が、前記第１のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチドを含む（ｂ１）−（ｂ２）二本鎖以外の全ての（ｂ１）−（ｂ２）二本鎖を切断することが可能な制限エンドヌクレアーゼ、及び、前記第２のオリゴヌクレオチドと、前記分析物に由来する修飾されたヌクレオシド三リン酸分子と、前記第３のオリゴヌクレオチドとを含む成分を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記制限エンドヌクレアーゼ系が、少なくとも１つのニッキングエンドヌクレアーゼを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記エキソヌクレアーゼブロッキング部位が、各第１のオリゴヌクレオチドを閉ループにすることにより得られることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（１）がリガーゼの存在下で行われて、１つの前記第１のオリゴヌクレオチドと、前記第２及び第３のオリゴヌクレオチド及び前記分析物に由来する前記所定のヌクレオシド三リン酸分子を含む相補的な第４のオリゴヌクレオチドとを含む二本鎖を作製し、ステップ（４）が前記第４のオリゴヌクレオチドから別の使用プローブ二本鎖を作製することを含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のオリゴヌクレオチド及び前記第３のオリゴヌクレオチドが、それ自体が任意選択でオリゴヌクレオチドであってもよいリンカー領域で結合していることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第４のオリゴヌクレオチドが、制限エンドヌクレアーゼによる切断に耐性があることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペアの第１のオリゴヌクレオチドの一方又は両方が、前記フルオロフォアを消光する１つ又は複数の消光剤を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記分析物が、修飾及び未修飾の単一ヌクレオシド三リン酸分子の両方を含み、前記方法が、それぞれの量及び相対比率をステップ（５）の結果から決定する追加のステップを更に含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（２）がステップ（１）よりも高い温度で行われ、且つ／又は、ステップ（３）がステップ（２）よりも高い温度で行われることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレオシド三リン酸が、対応する微小液滴に含まれ、ステップ（１）〜（４）が、前記微小液滴内で行われることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）エキソヌクレアーゼブロッキング部位；前記ブロッキング部位の５’側に位置する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位；前記認識部位内に位置する単一ヌクレオチド捕捉部位；及び実質的に検出不可能であるように配置されたそれぞれ前記認識部位の５’側に位置する第１及び第２のフルオロフォアをそれぞれ含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペア、及び（ｉｉ）それぞれ前記第１のオリゴヌクレオチドから区別され、前記捕捉部位の３’側及び５’側の相補的なフランキング領域にハイブリダイズすることが可能な少なくとも１つの第２の一本鎖オリゴヌクレオチド及び任意選択で少なくとも１つの第３の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる（ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペアを含むことにより特徴づけられる、多成分生物学的プローブ。
【請求項１７】
（ｉ）エキソヌクレアーゼブロッキング部位；前記ブロッキング部位の３’側に位置する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位；前記認識部位内に位置する単一ヌクレオチド捕捉部位；及び実質的に検出不可能であるように配置されたそれぞれ前記認識部位の３’側に位置する第１及び第２のフルオロフォアをそれぞれ含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペア、及び（ｉｉ）それぞれ前記第１のオリゴヌクレオチドから区別され、前記捕捉部位の３’側及び５’側の相補的なフランキング領域にハイブリダイズすることが可能な少なくとも１つの第２の一本鎖オリゴヌクレオチド及び任意選択で少なくとも１つの第３の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる（ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペアを含むことにより特徴づけられる、多成分生物学的プローブ。
【請求項１８】
前記エキソヌクレアーゼブロッキング部位が、前記第１のオリゴヌクレオチドの閉ループ又は二本鎖領域により得られることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の多成分生物学的プローブ。
【請求項１９】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、フルオロフォア領域の前記フルオロフォアを消光する消光剤を含むこと、及び／又は、前記第２のオリゴヌクレオチド及び前記第３のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドリンカー領域で結合していることを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の多成分生物学的プローブ。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の多数の生物学的プローブタイプのアセンブリを含み、前記アセンブリ中の各第１のオリゴヌクレオチドのペアが、異なる性質の核酸塩基及び異なる性質のフルオロフォアに選択的な異なる捕捉部位を有することにより特徴づけられる、多成分生物学的プローブキット。
【請求項２１】
前記第３のオリゴヌクレオチド、並びに、ポリメラーゼ、リガーゼ、請求項３〜５のいずれか一項に記載の制限エンドヌクレアーゼ系、及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の１つ又は複数を含む、請求項１６、１８、１９、及び２０のいずれか一項に記載の生物学的プローブを含むことにより特徴づけられる、多成分生物学的プローブキット。
【請求項２２】
前記第３のオリゴヌクレオチド、並びに、ポリメラーゼ、リガーゼ、請求項３〜５のいずれか一項に記載の制限エンドヌクレアーゼ系、及び５’ −３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の１つ又は複数を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の生物学的プローブを含むことにより特徴づけられる、多成分生物学的プローブキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ、天然に存在するＤＮＡ及びＲＮＡの核酸塩基における修飾を検出するための方法及び関連する生物学的プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
我々の以前の特許出願である国際公開第２０１５／１２１６７５号において、我々は、一本鎖及び二本鎖オリゴヌクレオチド領域を有する第１の成分と、消光状態において異なるフルオロフォアを含む第２の成分のペアとを含む３成分生物学的プローブを用いて、ポリヌクレオチド分析物中の所定の単一ヌクレオチドのメチル化状態を決定することについて記載した。この方法では、消光されていない状態のフルオロフォアがエキソヌクレアーゼ分解により放出される前に、メチル化依存性又はメチル化感受性エンドヌクレアーゼにより使用プローブを切断する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１２１６７５号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
今回、我々は、この方法の別のバージョンを開発した。これは、一連の核酸塩基修飾及び現在利用可能な制限エンドヌクレアーゼにより広く適用可能なだけでなく、はるかに簡単でより感度が高く、より強いシグナル及びより高いシグナル対ノイズ比を生成する。従って、本発明の第１の態様によれば、分析物中の所定のヌクレオシド三リン酸分子の核酸塩基が所定の化学修飾又は構造修飾を含むか否かを決定する方法であり、（１）ポリメラーゼの存在下で、前記分析物を生物学的プローブと反応させるステップであり、前記生物学的プローブは、（ａ）エキソヌクレアーゼブロッキング部位；前記ブロッキング部位の５’側に位置する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位；前記認識部位内に位置する単一ヌクレオチド捕捉部位；及び実質的に検出不可能であるように配置されたそれぞれ前記認識部位の５’側に位置する第１及び第２のフルオロフォアをそれぞれ含む、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペア、及び（ｂ）少なくとも１つの第２の一本鎖オリゴヌクレオチド及び任意選択で少なくとも１つの第３の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、それぞれ前記第１のオリゴヌクレオチドから区別され、前記ペアの第１のオリゴヌクレオチドの一方、他方、又は両方の前記捕捉部位の３’側及び５’側の相補的なフランキング領域にハイブリダイズして、（ｂ１）前記ペアの第１のオリゴヌクレオチドの一方又は他方と、（ｂ２）前記第２のオリゴヌクレオチド、前記ヌクレオシド三リン酸分子由来の修飾又は未修飾ヌクレオチドの一方又は他方、及び任意選択で前記第３のオリゴヌクレオチドを含む成分とからなる二本鎖使用プローブを作製することができ、前記二本鎖は４つの可能な（ｂ１）／（ｂ２）二本鎖置換（ｄｕｐｌｅｘ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）のうちの１つを含む、ステップ；（２）ステップ（１）で作製された前記二本鎖を、前記（ｂ１）鎖を前記認識部位で選択的に切断するのに適した少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを含む制限エンドヌクレアーゼ系と反応させて、元々の前記ヌクレオシド三リン酸分子における修飾の有無に応じて、（ｉ）第１のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみ、又は（ｉｉ）第２のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみ、又は（ｉｉｉ）それぞれ第１又は第２のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントの混合物を作製するステップ；（３）前記（ｂ２）成分及び前記ペアの別の第１のオリゴヌクレオチドから別の二本鎖使用プローブを作製し、その後、ステップ（２）及び（３）を繰り返すステップ；（４）３’−５’ エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で前記第１のオリゴヌクレオチドエレメントを分解して、ステップ（２）及び（３）のいずれか又は両方の後に検出可能な状態であるフルオロフォアを生成するステップ；及び（５）ステップ（４）で放出されたフルオロフォアを検出し、観察された蛍光シグナルの性質から、元々の前記単一ヌクレオシド三リン酸分子が修飾されているか未修飾であるかを推測するステップにより特徴づけられる方法を提供する。
【０００５】
本発明の第２の関連する態様において、分析物中の所定のヌクレオシド三リン酸分子の核酸塩基が所定の化学修飾又は構造修飾を含むか否かを決定する方法であり、（１）ポリメラーゼの存在下で、前記分析物を生物学的プローブと反応させるステップであり、前記生物学的プローブは、（ａ）エキソヌクレアーゼブロッキング部位；前記ブロッキング部位の３’側に位置する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位；前記認識部位内に位置する単一ヌクレオチド捕捉部位；及び実質的に検出不可能であるように配置されたそれぞれ前記認識部位の３’側に位置する第１及び第２のフルオロフォアをそれぞれ含む、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペア、及び（ｂ）少なくとも１つの第２の一本鎖オリゴヌクレオチド及び任意選択で少なくとも１つの第３の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、それぞれ前記第１のオリゴヌクレオチドから区別され、前記ペアの第１のオリゴヌクレオチドの一方、他方、又は両方の前記捕捉部位の３’側及び５’側の相補的なフランキング領域にハイブリダイズして、（ｂ１）前記ペアの第１のオリゴヌクレオチドの一方又は他方と、（ｂ２）前記第２のオリゴヌクレオチド、前記ヌクレオシド三リン酸分子由来の修飾又は未修飾ヌクレオチドの一方又は他方、及び任意選択で前記第３のオリゴヌクレオチドを含む成分とからなる二本鎖使用プローブを作製することができ、各二本鎖は４つの可能な（ｂ１）／（ｂ２）二本鎖置換のうちの１つを含む、ステップ；（２）ステップ（１）で作製された前記二本鎖を、前記（ｂ１）鎖を前記認識部位で選択的に切断するのに適した少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを含む制限エンドヌクレアーゼ系と反応させて、元々の前記ヌクレオシド三リン酸分子における修飾の有無に応じて、（ｉ）第１のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみ、又は（ｉｉ）第２のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみ、又は（ｉｉｉ）それぞれ第１又は第２のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントの混合物を作製するステップ；（３）前記（ｂ２）成分及び前記ペアの別の第１のオリゴヌクレオチドから別の二本鎖使用プローブを作製し、その後、ステップ（２）及び（３）を繰り返すステップ；（４）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で前記第１のオリゴヌクレオチドエレメントを分解して、ステップ（２）及び（３）のいずれか又は両方の後に検出可能な状態であるフルオロフォアを生成するステップ；及び（５）ステップ（４）で放出されたフルオロフォアを検出し、観察された蛍光シグナルの性質から、元々の前記単一ヌクレオシド三リン酸分子が修飾されているか未修飾であるかを推測するステップにより特徴づけられる方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本方法が適用可能な分析物は、進行性酵素的分解により、核酸前駆体から便利に調製することができる。一実施形態では、これは、前駆体の進行性エキソヌクレアーゼ分解、続いて、得られた単一ヌクレオシド一リン酸に対するキナーゼの作用により達成することができる（例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｂａｏ  ａｎｄ  Ｒｙｕ（ＤＯＩ  １０．１００２／ｂｉｔ．２１４９８）を参照）。しかしながら、好ましくは、分析物中のヌクレオシド三リン酸分子は、進行性加ピロリン酸分解により前駆体から直接生成する。このステップで使用される核酸前駆体は、適切には一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドであり、その長さは原理上、無制限とすることができ、例えば、ヒト遺伝子又は染色体断片に見出される最大数百万のヌクレオチドを含む。しかしながら、典型的には、ポリヌクレオチドは少なくとも５０、好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド長であり、適切には５００を超え、１０００を超え、多くの場合、数千ヌクレオチド長である。核酸前駆体は、好ましくは天然由来のＲＮＡ又はＤＮＡ（例えば、植物、動物、細菌、又はウイルスに由来）であるが、本方法は、完全に合成の、又は合成的に製造されたものの分析にも用いることができる。ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はその関連核酸塩基が天然では一般的に見られない、即ち、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）以外の核酸塩基であるヌクレオチドで全体的又は部分的に構成される他の核酸を含む。そのような核酸塩基の例としては、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２−Ｏ−メチルシュードウリジン、２−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ウィブトキソシン、ウィブトシン、シュードウリジン、クエオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、２−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、及び２−Ｏ−メチルウリジンが挙げられる。ＤＮＡの場合、生成される単一ヌクレオシド三リン酸はデオキシリボヌクレオシド三リン酸であり、一方、ＲＮＡの場合、それらはリボヌクレオシド三リン酸である。
【０００７】
本方法の一実施形態では、分析物の生成は、核酸前駆体を基板に付着させる第１のサブステップを更に含む。典型的には、この基板は、マイクロ流体表面、マイクロビーズ、又は透過膜を含み、例えば、ガラス製又は非分解性ポリマー製である。好ましくは、基材は、核酸前駆体の受け入れに特に適した表面を更に含む。核酸前駆体をそのような表面に付着させることができる多くの方法があり、そのいずれも原則としてこのサブステップで用いることができる。例えば、ある方法では、エポキシシラン、アミノヒドロカルビルシラン、又はメルカプトシラン等の官能化シランでガラス表面をプライミングすることを含む。次いで、そのようにして生成された反応部位は、反応性末端アミン、スクシニル又はチオール基を含むように修飾された核酸前駆体の誘導体で処理することができる。
【０００８】
別の実施形態では、核酸前駆体を加ピロリン酸分解して、単一のヌクレオシド三リン酸分子のストリームを含む分析物を生成する。単一のヌクレオシド三リン酸分子の順序は分析物の配列の順序に対応する。そのような加ピロリン酸分解は、２０〜９０℃の範囲の温度で、例えば、そのような酵素作用を示す適切なポリメラーゼを含む反応媒体の存在下で行ってもよい。好ましくは、単一のヌクレオシド三リン酸分子が遊離するにつれて反応域から連続的に除去されるように、連続流の条件下で行われる。最も好ましくは、加ピロリン酸分解は、酵素及び他の典型的な添加剤を含有する水性緩衝媒体を核酸分析物が結合している表面上に流動させることにより行う。
【０００９】
更に別の実施形態では、使用する酵素は、核酸前駆体の進行性の３’−５’加ピロリン酸分解を引き起こして、高適合度で妥当な反応速度でヌクレオシド三リン酸分子のストリームを生じさせることができるものである。好ましくは、この分解速度は可能な限り速く、一実施形態では、毎秒１〜５０ヌクレオシド三リン酸分子の範囲である。ポリヌクレオチドの分解に適用される加ピロリン酸分解反応についての更なる情報は、例えば、読者が向けられるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４（１９６９）ｐｐ．３０１９−３０２８に見出すことができる。適切には、加ピロリン酸分解は、例えば、ピロリン酸アニオン及びマグネシウムカチオンを更に含む媒体の存在下で行われ、好ましくはミリモル濃度である。この分解の後、放出されたヌクレオシド三リン酸を含む溶液をピロホスファターゼで適切に処理し、任意の残留ピロリン酸をリン酸アニオンに加水分解する。
【００１０】
一実施形態では、細胞溶解、抽出、及びクロマトグラフ分離を含む既知の抽出技術を用いて、従来の生物学的又は医学的サンプルに存在する細胞物質から核酸前駆体を得る。
【００１１】
ステップ（１）では、ヌクレオシド三リン酸分子を含む分析物を、ポリメラーゼ及び任意選択でリガーゼの存在下で反応させて、二本鎖使用プローブを生成する。リガーゼを追加で用いる一実施形態では、当該二本鎖は、別の実質的に二本鎖の第四のオリゴヌクレオチド（下記参照）を含むが、そのような第四のオリゴヌクレオチドの形成は方法の有効性に重要ではない。しかしながら、使用される核酸分析物は、関連する核酸塩基が修飾されている又は未修飾であると予想されるヌクレオシド三リン酸分子のどちらか又は両方を含むと予想されるものである。用語「修飾されている」は、修飾された核酸塩基をその未修飾のペアと区別する化学的又は構造的なあらゆる修飾を意味する。このような修飾として、アルキル化、ヒドロキシアルキル化、アルコキシル化、アミノ化、ハロゲン化、アセチル化、及びグルコシル化等の化学修飾を含んでいてもよいが、この方法は一般に、修飾がこのステップで行われる捕捉を妨げない限り、あらゆる修飾／未修飾の核酸塩基ペアに適用可能であることが理解されるだろう。一実施形態では、修飾は、メチル化、ヒドロキシメチル化、及びグルコシル化ヒドロキシメチル化から選択される。別の実施形態では、未修飾ヌクレオシド三リン酸分子は、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡの構成要素である未修飾ヌクレオシド三リン酸分子からなる群から選択される。更に別の実施形態では、関連する修飾は、核酸塩基シトシン及びアデニンのいずれか又は両方のメチル化である。
【００１２】
このステップで用いるポリメラーゼは、適切には、反応条件下でエキソヌクレアーゼ活性もエンドヌクレアーゼ活性も本質的には示さないものからなる群から選択する。有利に用いることができるポリメラーゼの例としては、これらに限定されるものではないが、原核生物ｐｏｌ  １酵素、又は大腸菌（例えば、クレノウ断片ポリメラーゼ）、サーマス・アクアチクス（例えば、Ｔａｑ  Ｐｏｌ）、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・カルドベロックス、及びバチルス・カルドテナックス等の細菌から得られる酵素誘導体が挙げられる。原則として、任意の適切なリガーゼをこのステップで用いることができる。
【００１３】
ステップ（１）で用いる生物学的プローブは、２つ又は任意選択で３つの成分：（ａ）検出不可能な状態の異なる第１及び第２の特徴的なフルオロフォアで標識した第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペアと、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドの相補的なフランキング領域にハイブリダイズすることができる第２の及び任意選択で第３の非標識一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む。３成分の一実施形態では、同じ第２及び第３のオリゴヌクレオチドは、ペアの両方の第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であってもよい。リガーゼを用いない別の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドのみが共通であり、対応する第３のオリゴヌクレオチドのペアを用いる。更に別の実施形態では、第２及び第３のオリゴヌクレオチドは別個の存在であるが、更に別の実施形態では、それらはリンカー領域によって連結されたオリゴヌクレオチド領域である。この後者の場合、一実施形態では、リンカー領域は、第２及び第３のオリゴヌクレオチド領域の末端を連結する。リンカー領域は、原則として、任意の二価の基とすることができるが、それ自体が別のオリゴヌクレオチド領域であるのが便利である。一実施形態では、このオリゴヌクレオチドリンカー領域は、ペアの第１のオリゴヌクレオチドのどちらかに実質的にハイブリダイズすることができない。
【００１４】
個々の第１、第２、及び第３のオリゴヌクレオチドは、第２の及び任意選択で第３のオリゴヌクレオチドが、ステップ（１）において、関連する第１のオリゴヌクレオチドの３’側及び５’側のフランキング領域にそれぞれハイブリダイズすることができるように選択する。当該領域自体は、単一ヌクレオチドを含む捕捉部位のいずれかの側に並置され、当該単一ヌクレオチドの核酸塩基は、プローブによって検出されるヌクレオシド三リン酸分子により生じる（ｂｏｒｎｅ  ｂｙ）ものに相補的である。捕捉部位もまた、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の一部である。これにより、調査する特定のヌクレオシド三リン酸に対するプローブの選択性が高くなる。
【００１５】
典型的には、ペアの各第１のオリゴヌクレオチドは、最大１５０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜１００ヌクレオチドである。一実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの相補的な３’側フランキング領域よりも少なくとも１ヌクレオチドだけ短い。別の実施形態では、ヌクレオシド三リン酸がこの時点でポリメラーゼに捕捉されるのを防ぐために、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端と第２のオリゴヌクレオチド上のそれと反対のヌクレオチドとの間に少なくとも１つの単一ヌクレオチドミスマッチがある。同様に、一実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの相補的な５’側フランキング領域よりも少なくとも１ヌクレオチドだけ長く、一方、別の実施形態では、ヌクレオシド三リン酸がこの時点でポリメラーゼに捕捉されるのを防ぐために、第３のオリゴヌクレオチドの３’末端と第１のオリゴヌクレオチド上のそれと反対のヌクレオチドとの間に少なくとも１つの単一ヌクレオチドミスマッチがある。
【００１６】
ペアの各第１のオリゴヌクレオチドの共通の特徴は、特有でそれに特徴的な１つ又は複数のフルオロフォアで標識されていることである。両方の第１のオリゴヌクレオチドにおいて、これらのフルオロフォアは、プローブが未使用状態にあるときは実質的に検出不可能であるように配置される。好ましくは、それらは、フルオロフォアが検出されるように設計されている波長で本質的に非蛍光性であるように配置される。従って、フルオロフォアは、電磁スペクトルの広い部分にわたって一般的な低レベルのバックグラウンド蛍光を示すことがあるが、典型的には、蛍光強度が最大になる１つ又は少数の特定の波長又は波長エンベロープが存在するであろう。フルオロフォアが特徴的に検出されるこれらの最大値の１つ又は複数において、本質的に蛍光が生じないはずである。本特許の文脈において、用語「本質的に非蛍光性」又は同等の表現は、関連する特徴的な波長又は波長エンベロープにおける関連する第１のオリゴヌクレオチドに付着した全フルオロフォア数の蛍光強度が、同等数の遊離フルオロフォアの対応する蛍光強度の２５％未満であることを意味し、好ましくは１０％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．１％未満である。
【００１７】
原則として、第１のオリゴヌクレオチドの未使用状態においてフルオロフォアが本質的に非蛍光性であることを確実にするために、いかなる方法も使用することができる。一実施形態では、これは、フルオロフォアが互いに消光するようにそれらを互いに近接して配置することにより達成される（自己消光配置）。別の実施形態では、フルオロフォアを含む領域は、フルオロフォアに近接して別の消光剤を更に含み、それにより同じ結果を達成することができる。本特許の文脈において、フルオロフォア間又はフルオロフォアと消光剤との間の「近接」を構成するものは、特定のフルオロフォア及び恐らくは第１のオリゴヌクレオチドの構造的特徴に依存するであろう。従って、この用語は、これらの要素のいかなる特定の構造的配置よりもむしろ求められる結果を参照して解釈されるべきであることを意図している。しかしながら、例示のみを目的として、隣接するフルオロフォアが特徴的なフェルスター距離（典型的には５ｎｍ未満）に対応する距離だけ離れている場合、一般に十分な消光が達成されることが指摘される。
【００１８】
フルオロフォア自体について、それらは原則として、キサンテン部分、例えば、フルオレセイン、ローダミン、及びそれらの誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンＢ等）；クマリン部分（例えば、ヒドロキシクマリン、メチルクマリン、及びアミノクマリン）；及びシアニン部分（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、及びＣｙ７）を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で従来使用されている任意のものから選択することができる。具体例としては、以下の一般的に使用される染料：Ａｌｅｘａ染料、シアニン染料、Ａｔｔｏ  Ｔｅｃ染料、及びローダミン染料から誘導されるフルオロフォアが挙げられる。また、例として、Ａｔｔｏ  ６３３（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ）、テキサスレッド（商標）、Ａｔｔｏ  ７４０（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ）、ローズベンガル、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）７５０  Ｃ５−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）５３２  Ｃ２−マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びローダミンレッドＣ２−マレイミド及びローダミングリーン、並びにＱｕａｓａｒ  ５７０等のホスホラミダイト染料が挙げられる。或いは、量子ドット又はＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより供給されるもの等の近赤外染料を使用することができ、本特許を解釈するために「フルオロフォア」であるとみなされるべきである。フルオロフォアは、典型的には当該技術分野で既知の化学的方法を用いて核酸塩基を介して第１のオリゴヌクレオチドに付着させる。
【００１９】
適切な消光剤としては、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）メカニズムにより機能するものが挙げられる。上記のフルオロフォアと関連して使用することができる市販の消光剤の例としては、ＤＤＱ−１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ及びＲＱ、ＩＲ  Ｄｙｅ−ＱＣ１、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、−２及び−３、並びにＱＳＹ−７及び−２１が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
第１のオリゴヌクレオチドの別の共通の特徴は、少なくとも１つのエキソヌクレアーゼブロッキング部位を含むことである。これは、上記の２つの方法のどちらを用いるかに応じて、認識部位の３’側又は５’側のいずれかに位置することになる。一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、そのようなブロッキング部位を、場合によっては、両側に又は３’末端若しくは５’末端に隣接して含んでいてもよい。原則として、ブロッキング部位は、その化学的構成に基づいて、第１のオリゴヌクレオチドをその時点でエキソヌクレアーゼ分解耐性にする任意の領域とすることができる。そのような領域としては、例えば、ホスホロチオエートリンカー、オリゴヌクレオチドスペーサー（例えば、スペーサー３、スペーサー９、スペーサー１８、ｄスペーサー等）、２’−０−メチルＲＮＡ塩基、逆塩基、デスチオビオチン−ＴＥＧ、ジチオール、ヘキサンジオール、及び消光剤（例えば、ＢＨＱ）が挙げられる。
【００２１】
一実施形態では、エキソヌクレアーゼブロッキング部位は、第１のオリゴヌクレオチドを環状、即ち、閉ループにすることにより得ることができる。後述のステップ（４）で一本鎖特異的エキソヌクレアーゼを使用する別の実施形態では、当該部位は、第一のオリゴヌクレオチド上の二本鎖領域を含んでいてもよい。更に別の実施形態では、第２及び／又は第３のオリゴヌクレオチドも同様のエキソヌクレアーゼブロッキング部位を備える。
【００２２】
第１のオリゴヌクレオチドの更に別の共通の特徴は、上記の捕捉部位を更に含む制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことである。当該認識位は、上記の２つの方法のどちらを用いるかに応じて、（１）エキソヌクレアーゼブロッキング部位の５’側且つフルオロフォアの３’側、又は（２）エキソヌクレアーゼブロッキング部位の３’側且つフルオロフォアの５’側のいずれかに配置される。
【００２３】
ステップ（１）の一実施形態では、複数の生物学的プローブのセットは、異なるヌクレオチド捕捉部位並びに異なる第１及び第２のフルオロフォアを含む各ペアの第１のオリゴヌクレオチドと共に、同じ方法で使用してもよい。別の実施形態では、当該セットは、読者が向けられる我々の欧州特許出願第１７１７１１６８．２号において教示されているタイプの他の生物学的プローブを更に含むことができる。例えば、実例として、ＤＮＡ前駆体のメチル化状態を調べる場合、ヌクレオチド捕捉部位に関連する核酸塩基がチミンである場合は、１つのペアはメチル化又は非メチル化デオキシアデノシン三リン酸を捕捉することができ、捕捉部位がグアニン核酸塩基を含む場合は、別のペアがメチル化又は非メチル化デオキシシチジン三リン酸を捕捉することができるだろう。複数の第１のオリゴヌクレオチドのペアを使用するこれらのような実施形態では、最小数の制限エンドヌクレアーゼの使用が必要とされるように、それぞれ異なる標識をされた第１のオリゴヌクレオチドであっても、同じ認識部位を含むことが好ましい。従って、一実施形態では、認識部位は、修飾された核酸塩基を含むペアの認識部位の一方又は他方と共に、ＲＮＡ又はＤＮＡ（場合によって）の典型的な各ヌクレオチドの少なくとも１つを含む配列で構成されることが好ましい。
【００２４】
ステップ（１）は、分析物中の各単一ヌクレオシド三リン酸を、２０〜８０℃の範囲の温度で上記の酵素及び１つ又は複数のプローブと接触させることにより適切に実施する。
【００２５】
ステップ（１）の生成物は、１つ又は複数の二本鎖を含み、その構成部分は、それぞれ、（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドの１つ、及び（ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチド、ヌクレオシド三リン酸分子由来のヌクレオチド分子（修飾又は未修飾）の一方又は他方、及び任意選択で第３のオリゴヌクレオチドを含む成分である。上記で説明したように、ステップ（１）をリガーゼの存在下で行う場合、（ｉｉ）の種々の成分は、別個の第４のオリゴヌクレオチドも共に含み、使用プローブは、少なくとも認識部位の付近で二本鎖になるだろう。第２及び第３のオリゴヌクレオチドがリンカー領域により予め結合されている場合、これにより、閉ループでエキソヌクレアーゼ分解耐性の高い第４のオリゴヌクレオチドがもたらされることは、容易に明らかであろう。
【００２６】
同様に、修飾又は未修飾ヌクレオシド三リン酸分子のいずれか又は両方と、それぞれ第１又は第２のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチドのペアとを含む核酸分析物を含む２成分の場合、４つの可能な結果が見込まれることは明白であろう。これらの結果における置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）は、第１のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチド、及び第２のオリゴヌクレオチドと、分析物に由来する修飾ヌクレオシド三リン酸分子と、任意選択で第３のオリゴヌクレオチドとを含む成分（「第１の修飾」）；第１のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチド、及び第２のオリゴヌクレオチドと、分析物に由来する未修飾ヌクレオシド三リン酸分子と、任意選択で第三のオリゴヌクレオチドとを含む成分（「第１の未修飾」）；第２のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチド、及び第２のオリゴヌクレオチドと、分析物に由来する修飾ヌクレオシド三リン酸分子と、任意選択で第３のオリゴヌクレオチドとを含む成分（「第２の修飾」）；並びに第２のフルオロフォアを有する第１のオリゴヌクレオチド、及び第２のオリゴヌクレオチドと、分析物に由来する未修飾ヌクレオシド三リン酸分子と、任意選択で第３のオリゴヌクレオチドとを含む成分（「第２の未修飾」）を含むだろう。従って、上記の方法の種々の実施形態において、これらの二本鎖のうちの１つ、２つ、３つ、又は４つ全てが、ステップ（１）の生成物中に存在する可能性がある。当業者はまた、複数のプローブ及び複数のタイプのヌクレオシド三リン酸分子が存在するより複雑な分析では、置換の数はそれに応じて増加するが、結果として得られる置換のセットは容易に決定することができることを理解するであろう。
【００２７】
ステップ（２）では、ステップ（１）で作製された二本鎖を、２０〜１００℃の範囲の温度で、上記の置換のいくつか又は全てを区別することができる制限エンドヌクレアーゼ系と反応させる。下記で説明するように、この区別は、制限エンドヌクレアーゼ系の成分の正しい選択及び対応する制限エンドヌクレアーゼ認識部位の特徴によりもたらされる。一実施形態では、この制限エンドヌクレアーゼ系は、第１のオリゴヌクレオチドに由来する成分のみをその認識部位で切断するように設計された少なくとも１つのニッキング制限エンドヌクレアーゼを含む。別の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、両方の鎖を切断できるものであってもよく、また、第２及び／又は第３のオリゴヌクレオチドは、例えば、第２及び第３のオリゴヌクレオチドのいずれか又は両方にエンドヌクレアーゼブロッキング基を含むことにより、切断に対して耐性にしてもよい。一実施形態では、これらのブロッキング基は、ホスホロチオエート結合及び当該技術分野で一般的に使用される他の骨格修飾、オリゴヌクレオチドスペーサー、又はリン酸基等から選択することができる。リガーゼを用いない第３の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ヌクレオシド三リン酸分子の捕捉後に第２及び第３のオリゴヌクレオチド間に残る切断部位で両方の成分を切断できるものであってもよい。
【００２８】
適切な制限エンドヌクレアーゼの詳細は、本発明の方法、プローブ、及びプローブシステムと共に使用することができるニッキングエンドヌクレアーゼを含めて、ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍにて、関連するデータベースに見出すことができる。
【００２９】
一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ系は、「第１の修飾」二本鎖のみを切断することができる第１の制限エンドヌクレアーゼと、「第２の未修飾」二本鎖のみを切断することができる第２の制限エンドヌクレアーゼとを含む。この場合、ヌクレオシド三リン酸分子が修飾されている場合は第１のフルオロフォアのみが放出され、未修飾である場合は第２のフルオロフォアのみが放出される。当該実施形態では、調査中の修飾がアデニンメチル化である場合、使用することができる制限エンドヌクレアーゼのペアとしては、ＤｐｎＩ及びＨｐｙｌ８８Ｉが挙げられる。
【００３０】
別の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ系は、「第１の修飾」二本鎖を切断することができない制限エンドヌクレアーゼを含む。この場合、ヌクレオシド三リン酸分子が修飾されている場合は２番目のフルオロフォアのみが放出され、未修飾である場合は第１及び第２のフルオロフォアの両方が放出される。この例では、修飾がアデニンメチル化である場合、制限エンドヌクレアーゼは、例えば、ＣｌａＩ又はＡｌｗＩとすることができる。
【００３１】
別の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ系は、全ての二本鎖を切断することができる第１の制限エンドヌクレアーゼと、「第２の未修飾」二本鎖のみを切断することができる第２の制限エンドヌクレアーゼとを含む。この場合、第２のオリゴヌクレオチドの認識部位は、第２の制限エンドヌクレアーゼによる切断部位と同じ位置にない、第１の制限エンドヌクレアーゼによる切断部位に、制限エンドヌクレアーゼブロッキング部位を更に含む。ここで、ヌクレオシド三リン酸が修飾されている場合は第１のフルオロフォアのみが放出され、修飾されていない場合は第１及び第２のフルオロフォアの両方が放出される。アデニンメチル化に適用される当該アプローチの一例は、制限エンドヌクレアーゼＢｆｕＣＩ及びＢｓｐＥＩと、ＢｆｕＣＩの切断部位にホスホロチオエートブロッキング結合を含む第２のオリゴヌクレオチドとの併用である。
【００３２】
更に別の実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ系は、「第１の修飾」二本鎖又は「第２の未修飾」二本鎖を切断することができない制限エンドヌクレアーゼを含む。この場合、ヌクレオシド三リン酸分子が修飾されている場合は第２のフルオロフォアのみが放出され、修飾されていない場合は第１のフルオロフォアのみが放出される。
【００３３】
ステップ（２）は、２つの別個のエレメントに切断された二本鎖の少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチド成分をもたらし、２つの別個のエレメントの１つは、第１又は第２のフルオロフォア（場合によって）と使用する場合は消光剤とを有する。これにより、３つの可能な統計結果のうちの１つが導き出される：（ｉ）第１のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみが生成される、（ｉｉ）第２のフルオロフォアを有するエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントのみが生成される、又は（ｉｉｉ）その両方の混合物が得られる。
【００３４】
上記のように、ステップ（２）の終わりに、第２のオリゴヌクレオチドと、ヌクレオシド三リン酸分子に由来する修飾又は未修飾ヌクレオチドの一方又は他方と、任意選択で第３のオリゴヌクレオチドとを含む成分（例えば、第４のオリゴヌクレオチド）を、ステップ（３）において、ペアの別の対応する第１のオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズ又は複合体化させ、それにより新しい使用プローブ二本鎖を作製する。当該二本鎖は、その後、ステップ（２）及び（３）の繰り返しを受け、それにより、検出可能な状態の更なるフルオロフォアを放出し、再び成分／第４のオリゴヌクレオチドを生成する。この方法により、ステップ（２）及び（３）が繰り返されて、原則として、実質的に全ての第１のオリゴヌクレオチドのペアが消費されるまで、蛍光シグナルが更に増強される。結果として、観察者は、他の方法で得られたものよりもはるかに大きな蛍光シグナルの増強を確認する。ステップ（１）でヌクレオシド三リン酸分子に由来するヌクレオチドの第３のオリゴヌクレオチドへの連結が起こらない一実施形態では（第３のオリゴヌクレオチドが使用されない方法の例を含むがこれに限定されない）、ステップ（２）は単に第２のオリゴヌクレオチド及びヌクレオチドを含む成分の放出をもたらしてもよい。そのような場合、新しく入ってくる第１のオリゴヌクレオチドは、それに付着した第３のオリゴヌクレオチドを既に有するか、又は第３のオリゴヌクレオチドは、その構造の一部であってもよい。
【００３５】
一実施形態では、ステップ（２）がステップ（１）よりも高い温度で行われ、且つ／又はステップ（３）がステップ（２）よりも高い温度で行われることが好ましい。
【００３６】
ステップ（４）において、ステップ（２）及び／又はステップ（３）の各反復のいずれか又は両方で作製されたエキソヌクレアーゼ分解可能な第１のオリゴヌクレオチドエレメントは、２つの方法のどちらを用いるかに応じて、３’−５’又は５’−３エキソヌクレアーゼ活性のいずれかを示す酵素により分解される。従って、エンドヌクレアーゼ分解及びそれに続くエキソヌクレアーゼ分解が起こると、観察者は蛍光シグナルの開始及び急速な増加を確認する。ステップ（４）は、３０〜１００°Ｃの範囲の温度で最も効果的に達成することができる。ステップ（４）は、反復ステップ（３）が完了した後、又はステップ（２）及び（３）が生じているときに並行して行うことができることは、当業者には理解されよう。
【００３７】
その後、ステップ（５）において、ステップ（３）又はステップ（２）〜（４）の各反復で遊離したフルオロフォアが検出され、元々の単一ヌクレオシド三リン酸分子に付着した核酸塩基の修飾状態が、推測により、例えば、上記の結果に従って決定される。対応する検出方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、この方法で使用される反応媒体は、ＬＥＤ又はレーザー等の高強度電磁放射源からの光と、種々の第１及び第２のフルオロフォアの特徴的な蛍光波長又は波長エンベロープに調整された光検出器又は蛍光分析器を使用して収集された生成蛍光とから調べることができる。次に、これにより、光検出器は、既知のアルゴリズムを使用してコンピュータで処理及び分析することができる特徴的な電気シグナルを生成する。一実施形態では、分析物は、修飾及び未修飾ヌクレオシド三リン酸分子の両方を含み、方法は、ステップ（５）の結果からそれぞれの相対比率を決定するステップ（６）を更に含む。
【００３８】
特に好適な実施形態では、本発明の方法は、少なくとも幾つかが単一ヌクレオシド三リン酸分子を含む微小液滴のストリーム、例えば、その順序が進行的に分解された核酸前駆体の元々のヌクレオチド配列を反映するストリーム中で、全体的又は部分的に行われる。こうした方法は、例えば、そのような進行性分解により生成されたヌクレオシド三リン酸分子を、順序を維持するのを助ける炭化水素又はシリコーン油等の非混和性担体溶媒中に保持された対応する水性微小液滴のストリームに１つずつ挿入することにより開始してもよい。或いは、これは、進行性分解ゾーンの微小液滴ダウンストリームを直接形成することにより、例えば、反応媒体を適切な寸法の微小液滴ヘッドから溶媒の流動ストリームに入れることにより、達成することができる。或いは、進行性分解ゾーンからの反応媒体の小さなアリコートを溶媒中に懸濁させた既存の水性微小液滴のストリームに、一定の間隔で連続的に注入することができる。この後者の方法が用いられる場合、各微小液滴は、プローブシステムの各種成分並びに酵素及びステップ（１）〜（４）を行うのに必要な任意のその他の試薬（例えば、バッファー）を既に含有していてもよい。更に別の方法では、前者の実施形態で作製した微小液滴を、続いてこのような既存の微小液滴のストリームと合体させて、同様の結果を達成することができる。これらの微小液滴法において、ステップ（５）は、次に、好ましくはインキュベーション後に、微小液滴を貯蔵領域に移送し、各微小液滴を調査して遊離したフルオロフォアを同定することを好適に含む。その後、各微小液滴から得られた結果を元々の核酸分析物のデータ特性に組み込む。
【００３９】
所定の微小液滴が２つ以上のヌクレオシド三リン酸分子を含むリスクを回避するため、各充填された微小液滴が平均して１〜２０個、好適には２〜１０個の空の液滴で離されるような速度で、進行性分解ゾーンからそれぞれ放出されることが好ましい。その後、溶媒中の充填された及び充填されていない微小液滴のストリームを、流路、適切にはマイクロ流体流路に沿って、微小液滴が離散状態に維持され、且つ互いに合体する機会を持たないような速度及び方法で、流動させる。適切には、用いられる微小液滴は１００ミクロン未満、好ましくは５０ミクロン未満、より好ましくは２０ミクロン未満、更に好ましくは１５ミクロン未満の有限直径を有する。それらの全ての直径のうち、２〜２０ミクロンの範囲が最も好ましい。一実施形態では、システム全体を通る微小液滴流量は、毎秒５０〜３０００液滴、好ましくは１００〜２０００液滴の範囲内である。
【００４０】
本発明の第３の態様では、（ｉ）エキソヌクレアーゼブロッキング部位；前記ブロッキング部位の５’側に位置する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位；前記認識部位内に位置する単一ヌクレオチド捕捉部位；及び実質的に検出不可能であるように配置されたそれぞれ前記認識部位の５’側に位置する第１及び第２のフルオロフォアをそれぞれ含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペア、及び（ｉｉ）それぞれ前記第１のオリゴヌクレオチドから区別され、前記捕捉部位の３’側及び５’側の相補的なフランキング領域にハイブリダイズすることが可能な少なくとも１つの第２の一本鎖オリゴヌクレオチド及び少なくとも１つの第３の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる（ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペアを含むことにより特徴づけられる、多成分生物学的プローブを提供する。
【００４１】
一実施形態では、エキソヌクレアーゼブロッキング部位は、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端に隣接して位置する。別の実施形態では、エキソヌクレアーゼブロッキング部位は、ペアの各第１のオリゴヌクレオチドを環状、即ち、閉ループにすることにより得られる。
【００４２】
本発明の第４の態様では、（ｉ）エキソヌクレアーゼブロッキング部位；前記ブロッキング部位の３’側に位置する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位；前記認識部位内に位置する単一ヌクレオチド捕捉部位；及び実質的に検出不可能であるように配置されたそれぞれ前記認識部位の３’側に位置する第１及び第２のフルオロフォアをそれぞれ含む第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペア、及び（ｉｉ）それぞれ前記第１のオリゴヌクレオチドから区別され、前記捕捉部位の３’側及び５’側の相補的なフランキング領域にハイブリダイズすることが可能な少なくとも１つの第２の一本鎖オリゴヌクレオチド及び少なくとも１つの第３の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる（ａ）第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのペアを含むことにより特徴づけられる、多成分生物学的プローブを提供する。
【００４３】
一実施形態では、エキソヌクレアーゼブロッキング部位は、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に隣接して位置する。別の実施形態では、エキソヌクレアーゼブロッキング部位は、ペアの各第１のオリゴヌクレオチドを環状、即ち、閉ループにすることにより得られる。
【００４４】
これら第３及び第４の態様の両方の一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド上の種々のフルオロフォアは、自己消光するために互いに近接して配置される。別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアを消光する消光剤を含む。適切なフルオロフォア及び消光剤としては、上記のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の実施形態では、第２及び第３のオリゴヌクレオチドは、上記で説明したように、リンカー領域により結合されており、リンカー領域自体が別のオリゴヌクレオチド領域であることが好ましい。
【００４５】
上記で説明したように、ＤＮＡ又はＲＮＡシーケンスの目的で、本明細書で説明する生物学的プローブは、捕捉部位の核酸塩基の特性及び使用する第１及び第２のフルオロフォアの蛍光特性のみが異なる複数の異なる第１のオリゴヌクレオチドのペアタイプを含む対応する生物学的プローブ系に構築することができる。任意選択で、これらのプローブは、我々の欧州特許出願第１７１７１１６８．２号において教示されているタイプの他の生物学的プローブと関連して使用してもよい。一実施形態では、捕捉部位の核酸塩基の特性及び第１及び第２のフルオロフォアのみが異なる１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の異なる第１のオリゴヌクレオチドのペアタイプを使用することができる。天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡの場合、これらの核酸塩基はＡ、Ｇ、Ｃ、及びＴ又はＵで構成される。別の実施形態では、生物学的プローブシステムは、リガーゼ、ポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、及び場合によって３’−５’又は５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を示す酵素の少なくとも１つを更に含むキットとして明示される
【実施例】
【００４６】
ここで、本発明を、下記の実施例を参照しながら説明する。
【００４７】
実施例−プローブシステムの調製及び使用
それぞれ以下のヌクレオチド配列を有する第１の一本鎖オリゴヌクレオチド１ａ及び１ｂを調製する：
５’−ＴＴＴＣＧＧＧＴＧＡＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡＣＡＧＧＴＧＧＧＦＦＱＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＣＴＴＡＧＣＸ−３’
５’−ＴＴＴＣＧＡＧＴＧＡＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡＣＡＧＧＴＧＧＧＥＥＱＡＧＡＴＧＡＴＧｍＡＴＣＡＧｍＡＴＧＴＴＧＣＣＣＴＴＡＧＣＸ−３’
（配列中、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴは、ＤＮＡの特徴的な関連ヌクレオチド塩基を有するヌクレオチドを表し、Ｆは、従来のアミン付着化学作用を用いてＡｔｔｏ７００染料で標識したデオキシチミジンヌクレオチド（Ｔ）を表し、Ｅは、従来のアミン付着化学作用を用いてＡｔｔｏ５９４染料で標識したデオキシチミジンヌクレオチド（Ｔ）を表し、Ｑは、ＢＨＱ-２消光剤で標識したデオキシチミジンヌクレオチドを表し、ｍＡは、Ｎ６−メチル−デオキシアデニンヌクレオチドを表し、Ｘは、３’逆ｄＴ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ３’ｄＴ）ヌクレオチドを表す。どちらの第１の一本鎖オリゴヌクレオチドも、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物中のデオキシアデニン三リン酸ヌクレオチド（ｄＡＴＰ）の捕捉に選択的な捕捉領域（Ｔヌクレオチド）を５’末端から４３番目の塩基に、及び制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ及びＤｐｎＩＩの認識配列「ＧＡＴＣ」を更に含む。）
【００４８】
２つの第１のオリゴヌクレオチドの捕捉領域に隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）する３’領域に対し相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド領域と、ＤｐｎＩＩの切断部位にホスホロチオエート結合とを含む別の一本鎖オリゴヌクレオチド２、及び、２つの第１のオリゴヌクレオチドの捕捉領域に隣接する５’領域に対し相補的な配列を５’リン酸基と共に有するオリゴヌクレオチド領域と、３’逆ｄＴヌクレオチドとを含む一本鎖オリゴヌクレオチド３も調製する。これらは以下のヌクレオチド配列を有する：
オリゴヌクレオチド２：５’−ＴＡＡＧＧＧＣＡＡＣＡＴＣＴ＊Ｇ−３’
オリゴヌクレオチド３：５’−ＰＴＣＡＴＣＡＴＣＴＡＡＡＣＣＣＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＸ−３’
（配列中、Ｐは５’リン酸基を、Ｘは３’逆ｄＴヌクレオチドを、＊はホスホロチオエート結合を表す。）
【００４９】
次に、プローブシステムを含む反応混合物を調製する。反応混合物は、以下の配合組成に由来するものに対応する組成を有する：
２０μＬの５×バッファー、ｐＨ７．９
１０μＬのオリゴヌクレオチド１ａ、２５０ｎＭ
１０μＬのオリゴヌクレオチド１ｂ、２５０ｎＭ
１０μＬのオリゴヌクレオチド２、１０ｎＭ
１０μＬのオリゴヌクレオチド３、１０００ｎＭ
１０ＵのＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．製）
１０ＵのＤｐｎＩＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．製）
２．９ＵのＢｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔポリメラーゼ
２．７ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘポリメラーゼ
６．７Ｕの熱安定性無機ピロホスファターゼ
１０μＬのｄＡＴＰ又はＮ６−メチル−ｄＡＴＰ、１ｎＭ
１００μＬまでの水。
ここで、５×バッファーは以下の混合物を含む：
１００μＬのＴｒｉｚｍａ酢酸塩、１Ｍ、ｐＨ８．０
５０μＬの含水酢酸マグネシウム、１Ｍ
２５０μＬの含水酢酸カリウム、１Ｍ
５０μＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００界面活性剤（１０％）
５００μｇのＢＳＡ
１ｍＬまでの水。
【００５０】
次に、ｄＡＴＰ又はＮ６−メチル−ｄＡＴＰの捕捉を、混合物を３７℃で１０分間インキュベーションすることにより行う。次に、温度を３７℃で更に１２０分間保持し、第１のオリゴヌクレオチドの反復切断を行う。その後、更に１５分間かけて温度を７２℃まで上げ、フルオロフォア及び消光剤を有する切断された第１のオリゴヌクレオチド成分の分解を行う。反応の進行とともにＣＬＡＲＩＯＳｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ製）を用いて反応混合物におけるＡｔｔｏ７００染料及びＡｔｔｏ５９４染料の蛍光強度を測定する。
【００５１】
反応混合物のｄＮＴＰ成分の存在下及び非存在下で、最後の１５分間の分解ステップにおける蛍光強度の増加をモニタリングする。反応混合物にｄＮＴＰが存在しない場合、オリゴヌクレオチド１ａ及び１ｂのＡｔｔｏ７００染料及びＡｔｔｏ５９４染料はほとんど蛍光を示さない。検出混合物中にｄＡＴＰが存在した場合、ＤｐｎＩＩはオリゴヌクレオチド１ａを反復切断することができるが、ＤｐｎＩはいずれの第１のオリゴヌクレオチドも切断することができず、その結果、エキソヌクレアーゼ分解後にＡｔｔｏ７００チャンネルにおいてのみシグナルが生成する。検出混合物中にＮ６−メチル−ｄＡＴＰが存在する場合、ＤｐｎＩはオリゴヌクレオチド１ｂを反復切断することができるが、ＤｐｎＩＩはいずれの第１のオリゴヌクレオチドも切断することができず、その結果、Ａｔｔｏ５９４チャンネルにおいてのみシグナルが生成する。
【国際調査報告】
2021500073.tif 000002
2021500073.tif 000003
2021500073.tif 000004