(57)【要約】  本発明は免疫療法の分野に関する。本発明は、自己免疫障害又は疾患の治療及び/又は予防のために好適な新たな抗SIRPg化合物を提供する。
2021534204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
T細胞が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療における使用のための特異的抗SIRPg化合物であって、配列番号1の配列のポリペプチドからなる又はその中に局在化したヒトSIRPgのエピトープに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストである、抗体、その抗原結合断片及び抗原結合抗体模倣物からなる群から選択される、化合物。
【請求項２】
T細胞の増殖及び/若しくは活性化及び/若しくは遊走並びに/又はT細胞による組織浸潤が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療における、請求項1に記載の使用のための化合物。
【請求項３】
疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害が、
・自己免疫疾患、特に、関節リウマチ、I型糖尿病、ループス、乾癬、
・慢性炎症性疾患、特に、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、
・慢性神経炎症性疾患、特に、多発性硬化症、脳脊髄炎、
・免疫代謝疾患、特に、II型糖尿病、
・全身炎症により引き起こされる心臓血管疾患、特に、アテローム性動脈硬化症、
・移植片機能障害又は拒絶、特に、移植片対宿主病、並びに
・リンパ増殖性疾患、特に、T細胞リンパ腫又は移植後リンパ増殖性疾患
からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の使用のための化合物。
【請求項４】
ヒトSIRPaのヒトCD47への結合を予防も阻害もしない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項５】
ヒトSIRPaに特異的に結合しない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
ヒトSIRPbに特異的に結合しない、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
陰性対照と比較してT細胞の増殖を減少させ又は阻害し、特に、T細胞の増殖の減少又は阻害が20%を上回る、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
特に、医薬としての同時の、別々の又は逐次的な使用のための、
・請求項1〜7のいずれか一項に記載の少なくとも1つの特異的抗SIRPg化合物、並びに
・免疫療法剤、免疫抑制剤、アポトーシス促進剤、抗生物質及びプロバイオティクスからなる群から選択される少なくとも1つの第2の治療剤
を含む、組合せ製品。
【請求項９】
前記免疫抑制剤が、シクロスポリンA、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、ステロイド、抗TNF剤、抗IL-23剤からなる群から選択される、請求項8に記載の組合せ製品。
【請求項１０】
抗SIRPg化合物が、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズするために好適であるかどうかを評価するための、配列番号1からなる又はその中に局在化したポリペプチドの使用。
【請求項１１】
ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズするために好適である特異的抗SIRPg抗体を生産する方法であって、配列番号1からなるポリペプチド内に局在化したエピトープ配列からなる又はそれを含む抗原を用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程を含む、方法。
【請求項１２】
抗原が、配列番号1の少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、又は29個の連続するアミノ酸残基から構成される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
抗原が、配列番号1と少なくとも80%の同一性を共有し、但し、配列番号1の位置9及び10にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「E」及び「N」、並びに/又は配列番号1の位置17に局在化したアミノ酸残基「P」、並びに/又は配列番号1の位置21〜24にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「M」、「A」、「L」及び「G」、並びに/又は配列番号45のアミノ酸残基が存在する、少なくとも10個の連続するアミノ酸残基からなる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズするために好適である抗SIRPg化合物を精製する方法であって、
i)配列番号1のアミノ酸残基からなる又はその中に局在化したポリペプチドで表面をコーティングする工程、
ii)抗SIRPg化合物を、コーティングされた表面と共にインキュベートする工程、
iii)抗SIRPg化合物のポリペプチドへの結合を測定する工程
を含む、方法。
【請求項１５】
治療に対する対象の応答を予測するインビトロの方法であって、
-  請求項1〜7のいずれか一項に記載の特異的抗SIRPg化合物を用いて、対象、特にヒト対象から以前に得られた試料中のSIRPgの発現レベルを決定する工程、及び
- SIRPgの発現レベルを非応答対象集団におけるSIRPgの発現レベルの代表的な値と比較する工程
を含み、対象の試料中のSIRPgのより高い発現レベルが、治療に応答する対象を示す、方法。
【請求項１６】
・ヒトSIRPgに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズし、
・ヒトSIRPaのヒトCD47への結合を予防も阻害もせず、特に、ヒトSIRPaに特異的に結合せず、
・任意選択的に、ヒトSIRPbに特異的に結合しない、
特異的抗SIRPg化合物を選択する方法であって、
配列番号1からなる又はその中に局在化したポリペプチドに結合する化合物の能力を試験する工程を含み、化合物は、前記ポリペプチドに特異的に結合する場合に特異的抗SIRPg化合物である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫療法の分野に関する。本発明は、SIRPファミリーの他のメンバー及びそれらの標的の間の相互作用、例えば、SIRPa及びCD47の間の相互作用を減少させることなくSIRPgのCD47への結合をアンタゴナイズすることができる、新たな特異的抗SIRPg化合物、特に抗体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
シグナル調節タンパク質(SIRP)は、免疫系及び中枢神経系において広く発現され、異なるシグナルを伝達する、膜貫通糖タンパク質のファミリーを構成する。
【０００３】
SIRPファミリーの原型的なメンバーはSIRP-アルファ(SIRPa、SIRPα、CD172a又はSHPS-1とも呼称される)である。ヒトSIRPaをコードする遺伝子は多型遺伝子であり、いくつかのバリアントがヒト集団において記載された。最も一般的なタンパク質バリアントはSIRPa v1(アクセッション番号NP_542970及びP78324)並びにSIRPa v2(アクセッション番号CAA71403)である。SIRPaは、単球、組織マクロファージの殆どの亜集団、顆粒球、リンパ系組織中の樹状細胞のサブセット、一部の骨髄前駆細胞、及び様々なレベルでニューロン上に発現され、小脳及び海馬の顆粒層等の脳のシナプスリッチ区画において著しく高い発現を有する。SIRPaは、CD47に結合し、マクロファージ及び樹状細胞機能の他に、増殖因子及び細胞接着により誘導されるシグナル伝達経路をモジュレートする阻害受容体である。
【０００４】
SIRPファミリーの別のメンバー、SIRP-ベータ(SIRPb、SIRPβ、CD172b又はSIRPベータ-1とも呼称される-アクセッション番号NM_001083910又はアクセッションQ5TFQ8)もまた同定された。SIRPファミリーの他のメンバーとは異なり、SIRPbはCD47に結合しないようであり、そのリガンドは未だ知られていない。それにもかかわらず、SIRPbは、キラー細胞免疫グロブリン様受容体ファミリーと関連付けられるようであり、活性化シグナル伝達エレメントとして作用しうる。SIRPbはチロシンキナーゼSYKの動員に参加することもまた報告されている。
【０００５】
SIRPファミリーの第3のメンバー、SIRP-ガンマ(SIRPg、SIRPγ、CD172g又はSIRPベータ2とも呼称される-アクセッション番号NM_018556又はアクセッション番号Q9P1W8)もまた後に同定された。SIRPgは多くのヒト組織において変動的に発現されるが、特にT細胞の表面において発現される。著者らは、SIRPg-CD47相互作用は細胞-細胞接着を媒介し、スーパー抗原依存性のT細胞媒介性の増殖を増強し、T細胞活性化を共刺激すると結論付けており(Piccioら、Blood、105:6、2005)、SIRPgはNK細胞の活性化に関与する。しかしながら、抗SIRPg抗体は、一部の条件では、T細胞の増殖を部分的に阻害できるようである。SIRPg-CD47相互作用はまた、抗原提示細胞-T細胞接触をサポートして、抗原提示、結果としてのT細胞増殖、及びサイトカイン分泌を増強する。
【０００６】
この文脈において、本発明者らは、ヒトSIRPgを認識してそれに特異的に結合する、特に、SIRPgのCD47への結合を予防又は阻害する、特に、SIRPファミリーの他のメンバー、即ちヒトSIRPa及びヒトSIRPbに結合しない、新たな抗SIRPg化合物を提供する。実際に、SIRPファミリーの他のメンバー、即ちヒトSIRPa及びSIRPbを全く又は殆ど認識せずにヒトSIRPgに選択的に結合することができ、且つヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストである、化合物の必要性が存在する。そのような化合物は、ヒトSIRPg及びヒトCD47の間の相互作用の阻害剤であり、それにより、特に、SIRPファミリーの他のメンバーにより誘発又はモジュレートされるシグナル化、特に、SIRPaにより誘発されるシグナル化を損なうことなく、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合を阻害又は予防する。本発明のそのような特異的抗SIRPg化合物は、SIRPg及びSIRPaの両方を認識する交差反応性抗体、又は同じ局在性でSIRPgに結合しない抗SIRPg抗体よりもT細胞増殖の阻害に対する強い効果を有しうる。本発明のそのような特異的抗SIRPg化合物はまた、交差反応性抗SIRP抗体(即ち、SIRPファミリーのいくつかのメンバーを認識する抗体)よりも低い副作用を呈しうる。
【０００７】
そのような化合物は特に、いくつかの疾患、特に、T細胞が関与する(T細胞が有害効果を有する)疾患の予防及び/又は治療における使用のために、特に、T細胞の増殖及び/若しくは活性化及び/若しくは遊走並びに/又はT細胞による組織浸潤をモジュレートするために、特に、T細胞の増殖及び/若しくは活性化及び/若しくは遊走並びに/又はT細胞による組織浸潤に対する作用が、疾患のアウトカムを向上させうる場合に好適である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2008068637
【特許文献２】EP特許第1270725号明細書
【特許文献３】米国特許第8536307号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Piccioら、Blood、105:6、2005
【非特許文献２】Krehenbrinkら、J. mol. Biol.、383:5、2008
【非特許文献３】Skerra、Febs J.、275:11、2008
【非特許文献４】Schlehuber及びSkerra、Biophys. Chem.、96:2〜3、2002
【非特許文献５】http://tools.iedb.org/main/tcell/
【非特許文献６】Durancel及びMuller、mAb 4:4、445〜457頁;2012年7月/8月; doi.org/10.4161/mabs.20776
【非特許文献７】Bakerら、Methods in Molecular Biology、2009年2月  - DOI: 10.1007/978-1-59745-554-1_21
【非特許文献８】Nissim A、Hoogenboom HR、Tomlinson IM、Flynn G、Midgley C、Lane D、Winter G、EMBO J. 1994年2月1;13(3):692〜8頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第1の態様では、本発明は、配列番号1の配列のポリペプチドからなる又はその中に局在化したヒトSIRPgのエピトープに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストであり、且つT細胞が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療において使用するために好適である、抗体、その抗原結合断片及び抗原結合抗体模倣物からなる群から選択される特異的抗SIRPg化合物に関する。本発明の特定の実施形態では、抗SIRPg化合物は、T細胞の増殖及び/若しくは活性化及び/若しくは遊走並びに/又はT細胞による組織浸潤が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の治療及び/又は予防において有用である。本発明の特定の実施形態では、「局在化した」という用語は、「存在する」又は「含まれる」(comprised)又は「含まれる」(included)という用語のいずれか1つにより置換されてよい。より特定の態様では、本発明は、配列番号1と少なくとも80%の同一性を共有し、但し、配列番号1の位置9及び10にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「E」及び「N」、並びに/又は配列番号1の位置17に局在化したアミノ酸残基「P」、並びに/又は配列番号1の位置21〜24にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「M」、「A」、「L」及び「G」、並びに/又は配列番号45のアミノ酸残基が存在する、少なくとも10個の連続するアミノ酸残基からなるヒトSIRPgのエピトープ配列に特異的に結合し、特に、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストである、抗体、その抗原結合断片、又は抗原結合抗体模倣物からなる群から選択される抗SIRPg化合物に関する。
【００１１】
別の特定の態様では、本発明は、配列番号1のアミノ酸残基からなる、又は配列番号45のアミノ酸残基からなるポリペプチド、例えば直鎖状ポリペプチドに特異的に結合し、特に、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストである、抗体、その抗原結合断片及び抗原結合抗体模倣物からなる群から選択される特異的抗SIRPg化合物に関する。
【００１２】
本明細書において上記に定義されるような配列番号1又は配列番号45のポリペプチドに特異的に結合し、且つ/又は本明細書において上記に定義されるようなエピトープ配列に特異的に結合する抗SIRPg化合物は、SIRPgに対する特異的結合を示し、SIRPファミリーの他のメンバー、即ちSIRPa及びSIRPbに結合せずに、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズすることができる。換言すれば、そのような特異的抗SIRPg化合物は、SIRPファミリーの他のメンバーにより誘発又はモジュレートされるシグナル化、特に、SIRPaにより誘発されるシグナル化を損なうことなく、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合を予防若しくは阻害し且つ/又はSIRPgが本発明による化合物の非存在下でCD47に結合した場合に誘導される活性化を予防し若しくはシグナル伝達経路を阻害する能力を有する。配列番号1又は配列番号45のアミノ酸残基からなる又はその中に局在化したペプチドに特異的に結合する、抗体、その抗原結合断片、その抗原結合抗体模倣物等であるがそれに限定されない抗SIRPg化合物は、SIRPgのその標的CD47への結合をアンタゴナイズする(又はSIRPgのCD47への結合を阻害する)能力を有し、SIRPg、より詳細にはヒトSIRPgに対する結合特異性を有し、SIRPa及びSIRPb、特にヒトSIRPa及びヒトSIRPbに特異的に結合しないことを本発明者らは見出した。本発明のそのような特異的抗SIRPg化合物は、SIRPg及びSIRPaの両方を認識する交差反応性抗体、又は同じ局在性でSIRPgに結合しない抗SIRPg抗体よりもT細胞増殖の阻害に対する強い効果を有しうる。本発明のそのような特異的抗SIRPg化合物はまた、交差反応性抗SIRP抗体(即ち、SIRPファミリーのいくつかのメンバーを認識する抗体)よりも低い副作用を呈しうる。
【００１３】
別の態様では、本発明は、T細胞が有害効果を有する、特に、T細胞の増殖及び/若しくは活性化及び/若しくは遊走並びに/又はT細胞による組織浸潤が有害効果を有する疾患又は障害の予防及び/又は治療における使用のための上記のような特異的抗SIRPg化合物であって、前記抗SIRPg化合物がヒトSIRPg及びヒトCD47の間の相互作用のアンタゴニストであり、換言すれば、前記化合物がヒトCD47のヒトSIRPgへの結合を阻害及び/又は予防し、前記化合物が、SIRPファミリーの任意の他のメンバー、即ちSIRPa及びSIRPbに結合せず、従って、SIRPファミリーの他のメンバーにより誘発又はモジュレートされるシグナル化、特に、SIRPaにより誘発されるシグナル化(特に、SIRPaのCD47との相互作用を介するもの)を損なわない、使用のための化合物に関する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、陰性対照と比較したT細胞の増殖及び/又は活性化及び/又は遊走及び/又は組織浸潤の減少又は阻害における使用のための上記のような特異的抗SIRPg化合物に関する。別の態様では、本発明は、陰性対照と比較したT細胞増殖の減少又は阻害における使用のための上記のような特異的抗SIRPg化合物に関する。別の態様では、本発明は、陰性対照と比較したT細胞活性化の減少又は阻害における使用のための上記のような抗SIRPg化合物に関する。別の態様では、本発明は、陰性対照と比較したT細胞遊走の減少又は阻害における使用のための上記のような特異的抗SIRPg化合物に関する。別の態様では、本発明は、陰性対照と比較したT細胞組織浸潤の減少又は阻害における使用のための上記のような特異的抗SIRPg化合物に関する。別の態様では、本発明は、陰性対照と比較したT細胞活性化の減少又は阻害及びT細胞増殖の減少又は阻害における使用のための上記のような抗SIRPg化合物に関する。別の態様では、本発明は、陰性対照と比較したT細胞遊走の減少又は阻害及びT細胞組織浸潤の減少又は阻害における使用のための上記のような抗SIRPg化合物に関する。別の態様では、本発明は、陰性対照と比較したT細胞の増殖及び活性化及び遊走並びにT細胞による組織浸潤の減少又は阻害における使用のための上記のような抗SIRPg化合物に関する。特に、本発明は、移植後又は炎症性疾患の間のT細胞、白血球及び/又はNK細胞の生着の低減における使用のための上記のような抗SIRPg化合物に関する。特に、本発明は、移植された動物、特にヒト内のT細胞の増殖及び/又は活性化及び/又は遊走及び/又は組織浸潤を阻害することにより、移植された動物の生存の増強を可能とする上記のような抗SIRPg化合物に関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、T細胞の活性化及び/又は増殖が有害効果を有する免疫系障害、又は炎症性疾患、特に移植片対宿主病(GVHD)、特に急性及び/又は慢性GVHDの治療のための上記のような特異的抗SIRPg化合物の使用に関する。同種移植は、ドナーから遺伝学的に異なるレシピエントへの細胞又は臓器の移動を伴う。そのような移植後の主な臨床的合併症は、ドナーT細胞により媒介される免疫学的障害であるGVHDの発症である。ドナーT細胞は、レシピエントにとって毒性なことがあり、同種移植されたレシピエントの複数の臓器及び組織を攻撃及び損傷して、罹病率及び死亡率について高いリスクを結果としてもたらすことがある。上記のような抗SIRPg化合物の使用は、GVHDモデル内のT細胞の増殖及び/又は活性化を低減しうる。T細胞の増殖は、様々な方法により決定されてよい。例えば、T細胞の増殖は、本発明による抗SIRPg化合物の存在下及び非存在下でのH3-チミジンの取込みにより測定することができる。特に、上記のような抗SIRPg化合物は、T細胞の増殖が、陰性対照と比較して20%を上回って、より好ましくは40%を上回って、より好ましくは50%を上回って、最も好ましくは70%を上回って低減した場合に、T細胞の増殖を減少させ又は阻害すると考えられる。陰性対照は、CD47/SIRPg結合にも、SIRPgがCD47に結合した場合に誘導されるシグナル伝達経路にも干渉しない類似した化合物(例えば、抗体、その抗原結合断片、抗原結合抗体模倣物)が、アッセイにおいて抗SIRPg化合物の代わりに類似した量で使用される同じアッセイで構成されるものであってよい。上記のような抗SIRPg化合物は、免疫抑制療法、特に、移植関連GVHD又は輸血GVHDに関する臨床的状態を予防又は治療するための免疫抑制療法の文脈内で使用されてよい。上記のような抗SIRPg化合物はまた、GVHDに対する予防的処置のために使用されてよい。別の態様では、本発明は、炎症性疾患の進行を遅延させるための上記のような抗SIRPg化合物の使用に関する。別の態様では、本発明は、移植後リンパ増殖性疾患のT細胞リンパ腫等の望ましくないリンパ増殖事象を遅延させるための上記のような抗SIRPg化合物の使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は組換え抗体を指す。
【００１７】
本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」は、異なるアミノ酸配列の抗体の混合物を含有する「ポリクローナル」抗体調製物とは対照的に、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列を共有する抗体分子、抗体の調製物を指すことが意図される。モノクローナル抗体は、ファージ、細菌、酵母又はリボソームディスプレイのようないくつかの公知の技術の他に、ハイブリドーマ由来抗体により例示される古典的な方法により生成させることができる。そのため、「モノクローナル」という用語は、1つの核酸クローンに由来する全ての抗体を指すために使用される。
【００１８】
本発明の抗体としては、組換え抗体が挙げられる。本明細書において使用される場合、「組換え抗体」という用語は、組換え手段により生産、発現、生成又は単離された抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に起因してトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離された抗体、又は特定の免疫グロブリン遺伝子配列(例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列)が他のDNA配列とアセンブルされる任意の他のやり方で生産、発現、生成若しくは単離された抗体を指す。組換え抗体としては、例えば、キメラ及びヒト化抗体が挙げられる。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「キメラ抗体」は、マウス等の哺乳動物種の生殖系列に由来する可変ドメインの配列が、ヒト等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来する定常ドメインの配列にグラフトされた抗体を指す。一実施形態では、本発明の抗体はキメラ抗体である。
【００２０】
一実施形態では、本発明の抗体はヒト化抗体である。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「ヒト化抗体」は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を指す。
【００２２】
本明細書において使用される場合、「抗体の抗原結合断片」は、場合によりその天然の形態の、SIRPgに対する抗原結合能力を呈する、抗体の部分、即ち、本発明の抗体の構造の部分に対応する分子を意味し、そのような断片は殊に、対応する4鎖抗体の抗原結合特異性と比較してSIRPgに対する同じ又は実質的に同じ抗原結合特異性を呈する。有利には、抗原結合断片は、対応する4鎖抗体と類似した結合親和性を有する。しかしながら、対応する4鎖抗体と比べて低減した抗原結合親和性を有する抗原結合断片もまた本発明に包含される。抗原結合能力は、抗体及び標的断片の間の親和性を測定することにより決定することができる。これらの抗原結合断片はまた、抗体の「機能性断片」と呼称されることがある。
【００２３】
抗体の抗原結合断片は、抗原、即ち、SIRPgの細胞外ドメイン、特に、配列番号1内に局在化した、本明細書において定義されるエピトープ配列に対する認識部位を包含し、それにより、抗原認識特異性を定義する、CDR(相補性決定領域)と呼称される超可変ドメイン又はその部分を含む断片である。
【００２４】
4鎖免疫グロブリンの各軽鎖及び重鎖可変ドメイン(それぞれVL及びVH)は、それぞれVL-CDR1(又はLCDR1)、VL-CDR2(又はLCDR2)、VL-CDR3(又はLCDR3)及びVH-CDR1(又はHCDR1)、VH-CDR2(又はHCDR2)、VH-CDR3(又はHCDR3)と呼称される3つのCDRを有する。
【００２５】
当業者は、参照ナンバリングシステム、KABATのナンバリングシステムへの参照を含む、これに関して示される標準的な定義を参照することにより、又はIMGT「collier de perle」アルゴリズムの応用により、抗体の様々な領域/ドメインの位置を決定することができる。これに関して、本発明の配列の定義について、領域/ドメインの境界は参照システム毎に変動しうることが留意される。よって、本発明において定義されるような領域/ドメインは、抗体の可変ドメインの全長配列内の関係する配列の長さ又は局在性においておおよそ+/-10%のバリエーションを示す配列を包含する。
【００２６】
フレームワーク及び定常ドメインの位置は、抗体の様々なクラス、殊にIgG、特に哺乳動物IgGについてよく定義されていることに留意して、4鎖免疫グロブリンの構造に基づいて、抗原結合断片は、そのため、利用可能なデータベース及び先行技術における抗体の配列との比較により、殊に、これらの配列中の機能ドメインの位置の比較により、定義することができる。そのような比較はまた、抗体の三次元構造に関するデータを伴う。
【００２７】
本発明の特有の実施形態の実例の目的のために、抗体のCDRを含む可変ドメインを含有する前記抗体の抗原結合断片は、Fv、dsFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2を包含する。Fv断片は、疎水性相互作用により会合して一緒になった抗体のVL及びVHドメインからなり、dsFv断片において、VH:VLヘテロ二量体はジスルフィド結合により安定化されており、scFv断片において、VL及びVHドメインは、柔軟なペプチドリンカーを介して互いに接続されて一本鎖タンパク質を形成している。Fab断片は、抗体のパパイン消化により得られうる単量体断片であり、ジスルフィド結合を通じて結合して一緒になったL鎖全体、及びH鎖のVH-CH1断片を含む。F(ab')2断片は、ヒンジジスルフィドの下の抗体のペプシン消化により生産することができ、2つのFab'断片、及び追加的に免疫グロブリン分子のヒンジ領域の部分を含む。Fab'断片は、ヒンジ領域中のジスルフィド結合を切断することによりF(ab')2断片から得ることができる。F(ab')2断片は二価であり、即ち、天然の免疫グロブリン分子のように2つの抗原結合部位を含み、他方、Fv(Fabの可変部分を構成するVH:VL二量体)、dsFv、scFv、Fab、及びFab'断片は一価であり、即ち、単一の抗原結合部位を含む。本発明のこれらの基本的な抗原結合断片を一緒に組み合わせて、ダイアボディ、トリボディ又はテトラボディ等の多価抗原結合断片を得ることができる。これらの多価抗原結合断片もまた本発明の部分である。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「二重特異性」抗体という用語は、第1の抗原に特異的な少なくとも1つの領域(例えば、第1の抗体の可変領域に由来する)、及び第2の抗原に特異的な少なくとも第2の領域(例えば、第2の抗体の可変領域に由来する)を持つことを理由にして2つの異なる抗原を認識する抗体を指す。二重特異性抗体は、2つの標的抗原に特異的に結合し、そのため、多重特異性抗体の一種である。2つ又はより多くの異なる抗原を認識する多重特異性抗体は、組換えDNA法により生産することができ、又は任意の好都合な方法により化学的に生産された抗体を挙げることができるがそれに限定されない。二重特異性抗体としては、2つの異なる抗原を認識することができる全ての抗体又は抗体のコンジュゲート、又は抗体のポリマー形態が挙げられる。二重特異性抗体としては、二価の特徴を保持するように還元及び再形成された抗体、並びに各抗原に対するいくつかの抗原認識部位を有しうるように化学的に連結された抗体、例えば、BiME(二重特異性マクロファージ増強抗体;Bispecific Macrophage Enhancing antibodies)、BiTE(二重特異性T細胞エンゲージャー;bispecific T cell engager)、DART(二重親和性再ターゲティング;Dual affinity retargeting);DNL(ドック-アンド-ロック;dock-and-lock)、DVD-Ig(二重可変ドメイン免疫グロブリン;dual variable domain immunoglobulins)が挙げられる。
【００２９】
よって、本発明の二重特異性抗体は、SIRPg、及び、特にSIRPaでもSIRPbでもない、第2の標的を標的とする。
【００３０】
一実施形態では、本発明の抗SIRPg化合物は、二重特異性であり、特に二重特異性抗体である。
【００３１】
治療抗体を開発するためのいくつかの研究は、Fc領域を操作することで抗体特性を最適化して、それらの要求される薬理学的活性により良好に適した分子の生成を可能とすることに繋がった。抗体のFc領域は、その血清半減期及びエフェクター機能、例えば、補体依存性細胞傷害性(CDC)、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)及び抗体依存性細胞食作用(ADCP)を媒介する。CH2及びCH3ドメインの間の境界面に位置するいくつかの突然変異、例えば、T250Q/M428L及びM252Y/S254T/T256E+H433K/N434Fは、インビボでFcRnへの結合親和性及びIgG1の半減期を増加させることが示されている。しかしながら、FcRn結合の増加及び半減期の向上の間に直接的な関係性が常にあるわけではない。治療抗体の有効性を向上させるための1つのアプローチは、その血清持続を増加させ、それにより、より高い循環レベル、より低い頻度の投与及び用量の低減を可能とすることである。Fc領域を操作することは、抗体のエフェクター機能を低減又は増加させるために所望されうる。細胞表面分子、殊に免疫細胞上の細胞表面分子を標的化する抗体について、エフェクター機能を妨げることが要求される。反対に、腫瘍学での使用が意図される抗体について、エフェクター機能を増加させることは、治療活性を向上させうる。4つのヒトIgGアイソタイプは、活性化Fcγ受容体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、阻害性FcγRIIb受容体、及び補体の第1成分(C1q)と異なる親和性で結合して、非常に異なるエフェクター機能をもたらす。IgGのFcγR又はC1qへの結合は、ヒンジ領域及びCH2ドメイン中に位置する残基に依存する。CH2ドメインの2つの領域はFcγR及びC1q結合のために不可欠であり、IgG2及びIgG4において独特の配列を有する。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「修飾抗体」は、抗体又はその抗原結合断片を含み、前記抗体又はその機能性断片が、機能的に異なる分子と会合した分子に対応する。本発明の修飾抗体は、化学的若しくは生物学的な基又は分子、例えば、PEGポリマー、又は、インビボでのプロテアーゼ切断に対する保護のため、抗体若しくは機能性断片の安定性及び/若しくは半減期の向上のために好適な別の保護基若しくは分子との共有結合、グラフト化、化学結合を含む、任意の好適な形態の取付けの結果としてもたらされる融合キメラタンパク質又はコンジュゲートのいずれかであってよい。類似した技術を用いて、殊に化学的カップリング又はグラフト化により、修飾抗体は、生物学的活性分子を用いて調製することができ、前記活性分子は、例えば、毒素、特に、シュードモナス(Pseudomonas)エキソトキシンA、植物毒素リシンのA鎖若しくはサポリン毒素、殊に治療活性の原料成分、抗体若しくは機能性断片をヒト身体の特有の細胞若しくは組織に標的化するために好適なベクター(殊にタンパク質ベクターを含む)の中から選択することができ、又はそれは、殊に抗体の断片が使用される場合に、標識又はリンカーと会合していてよい。抗体又はその機能性断片のPEG化は、殊に治療応用のために、宿主への活性物質の送達条件を向上させるので、特定の興味深い実施形態である。PEG化は、抗体又は機能性断片の認識部位への干渉を予防するために部位特異的であることができ、高分子量PEGを用いて行うことができる。PEG化は、抗体若しくは機能性断片の配列中に存在する遊離システイン残基を通じて又は抗体若しくは機能性断片のアミノ酸配列中に付加された遊離システイン残基を通じて達成することができる。
【００３３】
一実施形態では、本発明の抗SIRPg化合物は、修飾されており、特に修飾抗体である。
【００３４】
本発明による化合物は高分子であってよい。高分子は、通常、抗体及び/又はその断片を含むが、本明細書において抗原結合抗体模倣物とも称される、抗原に結合する抗体の能力を模倣した人工タンパク質もまた含む。
【００３５】
抗原結合抗体模倣物は、抗原に特異的に結合するが、抗体に構造的に関しない有機化合物である。それらは、通常、約3〜20kDaのモル質量を有する人工ペプチド又は小タンパク質である。核酸及び小分子は、人工抗体、抗体断片及びこれらから構成される融合タンパク質ではなく、抗体模倣物として考えられることもある。抗体を上回る一般的な利点は、より良好な溶解性、組織透過、熱及び酵素に対する安定性、並びに比較的低い生産コストである。抗体模倣物は、治療剤及び診断剤として開発されている。抗原結合抗体模倣物はまた、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、DARPin、及びモノボディを含む群の中で選択されてよい。
【００３６】
抗原結合抗体模倣物は、より優先的には、アフィチン及びアンチカリンを含む群から選択される。アフィチンは、抗原に選択的に結合する能力を有する人工タンパク質である。それらは、古細菌ドメインに属する微生物、スルホロブス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)中に見出されるDNA結合タンパク質Sac7dに構造的に由来する。Sac7dの結合表面上のアミノ酸を無作為化することにより、例えば、Sac7dの結合境界面の11残基の無作為の置換に対応するバリアントを生成することにより、アフィチンライブラリーを生成し、結果としてもたらされたタンパク質ライブラリーをリボソームディスプレイのラウンドに供してよく、親和性は、ペプチド、タンパク質、ウイルス及び細菌等の様々な標的に対するものでありうる。アフィチンは抗体模倣物であり、バイオテクノロジーにおけるツールとして開発されている。それらはまた、様々な酵素に対する特有の阻害剤として使用されてきた(Krehenbrinkら、J. mol. Biol.、383:5、2008)。当業者は、特に特許出願WO2008068637及び上記で引用される刊行物において開示されるような、当該技術分野において公知の方法、特に、ファージディスプレイ及び/又はリボソームディスプレイライブラリーの生成並びに本明細書に開示されるような抗原を使用するそれらのスクリーニングを使用して、要求される結合特性を有するアフィチンを容易に開発することができる。アンチカリンは、抗原、タンパク質又は小分子のいずれかに結合することができる人工タンパク質である。それらは、天然結合タンパク質のファミリーであるヒトリポカリンに由来する抗体模倣物である。アンチカリンは、約180アミノ酸のサイズ及び約20kDaの質量を有して約8倍小さい(Skerra、Febs J.、275:11、2008)。特に特異的結合特性を有するアンチカリンの、スクリーニング及び選択を可能とするアンチカリンファージディスプレイライブラリーが生成されている。当業者は、特に、EP特許第1270725号明細書、米国特許第8536307号明細書、Schlehuber及びSkerra、Biophys. Chem.、96:2〜3、2002並びに上記で引用される刊行物に開示されるような、当該技術分野において公知の方法、特に、ファージディスプレイ及び/又はリボソームディスプレイライブラリーの生成並びに本明細書に開示されるような抗原を使用するそれらのスクリーニングを使用して、要求される結合特性を有するアンチカリンを容易に開発することができる。アンチカリン及びアフィチンは共に、細菌発現系を含む多数の発現系において生産されてよい。そのため、本発明は、本明細書に記載の抗体の特徴、特に、SIRPgへの結合、特に、本明細書において定義されるようなポリペプチド又はエピトープ配列への結合、CD47のSIRPgへの結合の阻害、SIRPa及び/又はSIRPbへの結合の非存在に関する特徴を有するアフィチン、アンチカリン及び他の類似した抗体模倣物を含み、これらの全ては本発明の化合物として想定される。
【００３７】
抗体又はその断片について本明細書に開示される全ての実施形態は、適宜変更の上で本発明の化合物、特に、抗原結合抗体模倣物、ヒト化抗体、修飾抗体及びキメラ抗体に置き換えられる。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原の部分を意味する。タンパク質抗原のエピトープは、2つのカテゴリー、コンホメーショナルエピトープ及びリニアエピトープに分けることができる。コンホメーショナルエピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続のセクションに対応する。リニアエピトープは、抗原からのアミノ酸の連続的な配列に対応する。
【００３９】
本発明において、SIRPg内に存在する配列に対応し、抗SIRPg化合物により結合されるポリペプチドは、これらの化合物により特異的に認識されるエピトープを含む。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「SIRPg」という用語は、哺乳動物種からのSIRPg、好ましくはヒトSIRPgに関する。
【００４１】
ヒトSIRPgタンパク質の参照配列は、アクセッション番号Q9P1W8又はNM 018556に関連付けられる配列に対応する。
【００４２】
本発明の以下の記載において、抗SIRPg化合物という用語は、本明細書において上記に定義されるような抗体(例えば、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾抗体)、抗原結合断片、抗原結合抗体模倣物、又は高分子のいずれかを意味する。抗SIRPg抗体という用語が使用される場合、本発明の特定の実施形態に関して指定された場合を除いて、同じ化合物がこの用語により包含される。
【００４３】
「特異的抗SIRPg化合物」は、SIRPgに対する特異的結合を呈し、SIRPaに対する特異的結合を呈しない、特に、SIRPa及びSIRPbに対する特異的結合を呈しない、化合物であり、結合は、各場合において、Biacore分析、Blitz分析、ELISAアッセイ又はスキャッチャードプロット等であるがそれに限定されない当該技術分野において公知の方法により検出可能である。特異的「抗SIRPg化合物」はまた、SIRPaへの結合を呈さずに、特に、SIRPa及びSIRPbへの特異的結合を呈さずに、且つCD47及びSIRPaの間の相互作用を予防することなく、SIRPgに対する低い結合親和性を呈するが、それにもかかわらずSIRPgのCD47への結合をアンタゴナイズする(例えば、CD47及びSIRPgの間の相互作用を遮断する)抗体として定義されてよい。「相互作用を遮断する」により、化合物は、CD47/SIRPg相互作用に対するアンタゴニスト効果を有し、特定の実施形態では、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合を予防若しくは阻害し且つ/又はSIRPgが本発明による化合物の非存在下でCD47に結合した場合に誘導される活性化を予防し若しくはシグナル伝達経路を阻害することが理解されるべきである。特定の実施形態では、特異的結合は、段落[0046]又は[0047]に記載されるようなSIRPgについてのEC50に対応してよい。更に、そのような特異的結合はまた、段落[0044]に記載されるようなSIRPaについてのEC50、特に、段落[0044]及び[0045]に記載されるような、SIRPa及びSIRPbについてのEC50に関して定義されてよい。特定の実施形態では、特異的抗SIPRg化合物により、そのような化合物は、以下の段落([0044]〜[0051])に列記される少なくとも1つの特徴を有することが理解されるべきである。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明による特異的抗SIRPg化合物は、5μg/mlを上回る、より詳細には6μg/mlを上回る、より詳細には7μg/mlを上回る、より詳細には8μg/mlを上回る、より詳細には9μg/mlを上回る、最も詳細には10μg/mlを上回るSIRPaについてのEC50値を有する。EC50は、当該技術分野において公知の方法に従って、又は本発明の実施例に開示される方法により決定されてよい。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明による特異的抗SIRPg化合物は、5μg/mlを上回る、より詳細には6μg/mlを上回る、より詳細には7μg/mlを上回る、より詳細には8μg/mlを上回る、より詳細には9μg/mlを上回る、最も詳細には10μg/mlを上回るSIRPbについてのEC50値を有する。EC50は、当該技術分野において公知の方法に従って、又は本発明の実施例に開示される方法により決定されてよい。
【００４６】
別の特定の実施形態では、本発明による特異的抗SIRPg化合物は、100ng/ml〜1000ng/ml、より詳細には100ng/ml〜800ng/mlに含まれるSIRPgについてのEC50値を有する。EC50は、当該技術分野において公知の方法に従って、又は本発明の実施例に開示される方法により決定されてよい。
【００４７】
別の特定の実施形態では、本発明による特異的抗SIRPg化合物は、1000ng/mlより低い、より詳細には800ng/mlより低いSIRPgについてのEC50値を有する。EC50は、当該技術分野において公知の方法に従って、又は本発明の実施例に開示される方法により決定されてよい。
【００４８】
別の特定の実施形態では、本発明による特異的抗SIRPg化合物は、20ng/ml〜2000ng/ml、より詳細には20ng/ml〜1000ng/ml、より詳細には20ng/ml〜400ng/mlに含まれるSIRPg及びCD47の間の結合についてのIC50値を有する。SIRPg及びCD47の間の結合のIC50値は、当該技術分野において公知の方法に従って、又は本発明の実施例に開示される方法により評価されてよい。
【００４９】
別の特定の実施形態では、本発明による特異的抗SIRPg化合物は、2000ng/mlより低い、より詳細には1000ng/mlより低い、より詳細には400ng/mlより低いSIRPg及びCD47の間の結合についてのIC50値を有する。SIRPg及びCD47の間の結合のIC50値は、当該技術分野において公知の方法に従って、又は本発明の実施例に開示される方法により評価されてよい。
【００５０】
別の特定の実施形態では、本発明による特異的抗SIRPg化合物は、1000ng/mlより低い、より詳細には800ng/mlより低いSIRPgについてのEC50値、並びに2000ng/mlより低い、より詳細には1000ng/mlより低い、より詳細には400ng/mlより低いCD47及びSIRPgの間の結合についてのIC50値を有する。
【００５１】
別の特定の実施形態では、本発明による特異的抗SIRPg化合物は、1000ng/mlより低い、より詳細には800ng/mlより低いSIRPgについてのEC50値、及び5μg/mlを上回る、より詳細には6μg/mlを上回る、より詳細には7μg/mlを上回る、より詳細には8μg/mlを上回る、より詳細には9μg/mlを上回る、最も詳細には10μg/mlを上回るSIRPaについてのEC50値を有する。
【００５２】
「IC50」という用語は、本明細書において使用される場合、生物学的又は生化学的機能(例えば、SIRPgの機能又は活性)の50%の阻害における化合物(例えば、抗SIRPg化合物)の有効性の度合を指す。例えば、IC50は、SIRPgの活性を半分阻害するためにどれほど多くの抗SIRPg化合物が必要とされるのかを指し示す。即ち、それは抗SIRPg化合物の半数最大(50%)阻害濃度(IC)(50% IC、又はIC50)である。IC50は、インビトロでの50%の阻害のために要求される薬物の濃度を表す。IC50は、当該技術分野において公知の技術により、例えば、用量応答曲線を構築すること及びSIRPg活性の逆転に対する抗SIRPg化合物の異なる濃度の効果を調べることにより決定することができる。方法は、例えば、本発明の実施例に開示されている。
【００５３】
「EC50」という用語は、本明細書において使用される場合、生物学的又は生化学的機能(例えば、SIRPgの機能又は活性)の50%の誘発における化合物(例えば、抗SIRPg化合物)の有効性の度合を指す。例えば、EC50は、SIRPgの活性を半分誘発するためにどれほど多くの抗SIRPg化合物が必要とされるのかを指し示す。即ち、それは抗SIRPg化合物の半数最大(50%)有効濃度(EC)(50% EC、又はEC50)である。EC50は、インビトロでの50%の有効性のために要求される薬物の濃度を表す。EC50は、当該技術分野において公知の技術により、例えば、用量応答曲線を構築すること及びSIRPg活性に対する抗SIRPg化合物の異なる濃度の効果を調べることにより決定することができる。方法は、例えば、本発明の実施例に開示されている。
【００５４】
T細胞増殖及びT細胞活性化は、様々な方法により決定されてよい。例えば、T細胞の増殖は、H3-チミジンの取込みにより測定することができる。特に、T細胞の増殖が陰性対照と比較して20%より多く低減した場合に化合物はT細胞の増殖を阻害すると考えられる。T細胞活性化は、T細胞を活性化させないことが既知の対照と比較して、CD25及び/又はCD69の発現を、例えば、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、及びELISA等により分析することにより、並びに/又は、IFNg及び/若しくはIL2の分泌を評価することにより、評価されてよい。CD25及び/又はCD69の発現が陰性対照と比較して少なくとも20%増加した場合に、T細胞は活性化されたと考えられうる。IFNg及び/又はIL2の分泌が陰性対照と比較して少なくとも20%増加した場合に、T細胞は活性化されたと考えられうる。T細胞の組織浸潤及び遊走は、陰性対照と比較して本発明による抗SIRPg化合物の存在下で経時的に身体内の特定の局在性(例えば、組織、臓器、液、腺)内のT細胞の数を計数することにより評価されてよい。T細胞の数が経時的に増加した場合に、T細胞の組織浸潤は陽性であると考えられうる。T細胞の数が経時的に変動した場合に、T細胞の遊走は陽性であると考えられうる。T細胞は、特異的T細胞マーカーの使用等であるがそれに限定されない公知の方法に従って計数されてよい。
【００５５】
一態様では、本発明は、配列番号1(VKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPSA)の配列からなるポリペプチドからなる又はその中に局在化したヒトSIRPgのエピトープに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストであり、且つT細胞が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療において使用するために好適である、抗体(特にキメラ及びヒト化抗体)、その抗原結合断片、抗原結合抗体模倣物からなる群から選択される特異的抗SIRPg化合物に関する。特定の実施形態では、本発明は、配列番号1(VKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPSA)の配列からなるポリペプチドからなる又はその中に局在化したヒトSIRPgのエピトープに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストであり、且つT細胞の増殖及び/若しくは活性化及び/若しくは遊走並びに/又はT細胞による組織浸潤が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療において使用するために好適である、抗体(特にキメラ及びヒト化抗体)、その抗原結合断片、抗原結合抗体模倣物からなる群から選択される特異的抗SIRPg化合物に関する。
【００５６】
特定の実施形態では、化合物は、配列番号1と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の同一性を共有する少なくとも10個の連続するアミノ酸残基からなり、又は配列番号10の少なくとも10個の連続するアミノ酸残基からなり、但し、配列番号1の位置9及び10にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「E」及び「N」、並びに/又は配列番号1の位置17に局在化したアミノ酸残基「P」、並びに/又は配列番号1の位置21〜24にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「M」、「A」、「L」及び「G」が存在する、ヒトSIRPgのエピトープ配列に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、化合物は、配列番号45のアミノ酸残基を含む又はそれからなるヒトSIRPgのエピトープ配列に特異的に結合する。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号1からなるヒトSIRPgのエピトープに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストであり、且つT細胞が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療において使用するために好適である、抗体(特にキメラ及びヒト化抗体)、その抗原結合断片、抗原結合抗体模倣物からなる群から選択される抗SIRPg化合物に関する。特定の実施形態では、本発明は、配列番号1(VKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPSA)の配列からなるポリペプチドからなる又はその中に局在化したヒトSIRPgのエピトープに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストであり、且つT細胞の増殖及び/若しくは活性化及び/若しくは遊走並びに/又はT細胞による組織浸潤が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療において使用するために好適である、抗体(特にキメラ及びヒト化抗体)、その抗原結合断片、抗原結合抗体模倣物からなる群から選択される特異的抗SIRPg化合物に関する。
【００５８】
T細胞が有害効果を有する疾患又は障害は、よって、T細胞の増殖及び/若しくは活性化及び/若しくは遊走並びに/又はT細胞による組織浸潤が有害効果を有する任意の疾患又は障害を含んでよい。
【００５９】
特に、T細胞が有害効果を有する疾患又は障害は、
・自己免疫疾患、特に、関節リウマチ、I型糖尿病、ループス、乾癬、
・慢性炎症性疾患、特に、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、
・慢性神経炎症性疾患、特に、多発性硬化症、脳脊髄炎、
・免疫代謝疾患、特に、II型糖尿病、
・全身炎症により引き起こされる心臓血管疾患、特に、アテローム性動脈硬化症、並びに
・移植片機能障害又は拒絶、特に、移植片対宿主病、
・リンパ増殖性疾患、特に、T細胞リンパ腫又は移植後リンパ増殖性疾患
からなる群から選択される。
【００６０】
アンタゴニストSIRPg化合物はT細胞の増殖を低減又は阻害できることを考慮すれば、それらは、免疫抑制環境に有利に働き、自己免疫障害若しくは疾患、移植片機能障害、又は炎症性疾患の治療のために有用でありうる。実際に、免疫応答は傷害又は疾患に対する宿主の正常且つ保護的な応答であるが、それはまた、宿主の細胞に対するものに転じた場合に望ましくない損傷を引き起こしうる。
【００６１】
一実施形態では、本発明は、
- 自己免疫疾患、特に、関節リウマチ、1型糖尿病、ループス、乾癬、
- 慢性炎症性疾患、特に、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、
- 慢性神経炎症性疾患、特に、多発性硬化症、脳脊髄炎、
- 免疫代謝疾患、特に、II型糖尿病、
- 全身炎症により引き起こされる心臓血管疾患、特に、アテローム性動脈硬化症、
- 移植片機能障害又は拒絶、特に、移植片対宿主病、並びに
- リンパ増殖性疾患、特に、T細胞リンパ腫又は移植後リンパ増殖性疾患
からなる群から選択される疾患又は障害の発症の遅延を含む、疾患又は障害の治療及び/又は予防における使用のための上記に定義されるような特異的抗SIRPg抗体又はその抗原結合断片又は抗原結合抗体模倣物に関する。
【００６２】
特に、上記に定義されるような抗SIRPg化合物は、陰性対照と比較して、インビトロ及び/又はインビボでSIRPg-CD47シグナル伝達経路を阻害し、特に、インビトロ及び/又はインビボでT細胞の増殖及び/若しくは活性化及び/若しくは遊走並びに/又はT細胞による組織浸潤を阻害し又は減少させる。
【００６３】
結合アッセイにおいて最大シグナルの50%(EC50)に達するための化合物の有効用量が1000ng/mlより低い、より詳細には800ng/mlより低い、よりいっそう詳細には400ng/mlより低い場合に、抗SIRPg化合物及び本明細書において上記に定義されるようなエピトープ配列の間の結合は特異的であると考えられうる。そのような能力は、例えば、本発明の実施例に示される方法に従って評価されてよい。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明の抗SIRPg化合物により特異的に認識されるヒトSIRPgのエピトープ配列は、配列番号1の少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、又は29個の連続するアミノ酸残基から構成される。特定の実施形態では、アミノ酸配列の長さにかかわらず、エピトープ配列は、配列番号1と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の同一性を共有し、最も好ましくは、配列番号1と100%の同一性を共有する。特定の実施形態では、本発明の抗SIRPg化合物により特異的に認識されるヒトSIRPgのエピトープ配列は、配列番号1の位置9及び10にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「E」及び「N」、配列番号1の位置17に局在化したアミノ酸残基「P」、並びに配列番号1の位置21〜24にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「M」、「A」、「L」及び「G」を含み、前記エピトープ配列は少なくとも16個のアミノ酸残基を含み、且つ配列番号1と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列番号1の他のアミノ酸残基との同一性を有し、最も好ましくは、配列番号1と100%の同一性を共有する。特定の実施形態では、本発明の抗SIRPg化合物により特異的に認識されるヒトSIRPgのエピトープ配列は、配列番号45のアミノ酸残基からなる。
【００６５】
特定の実施形態によれば、エピトープ配列は、配列番号1の位置9〜24の間に局在化したアミノ酸残基の配列を含む又はそれからなる。
【００６６】
本発明の別の特定の実施形態では、エピトープ配列は、配列番号1と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の同一性を有し、但し、配列番号1の位置9及び10にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「E」及び「N」、配列番号1の位置17に局在化したアミノ酸残基「P」、並びに配列番号1の位置21〜24にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「M」、「A」、「L」及び「G」が存在する、アミノ酸配列を含み又はそれからなり、エピトープ配列は、16〜29アミノ酸残基から構成される長さを有する。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明による抗SIRPg化合物は、CD47のSIRPgへの結合を有意に阻害し、減少させ、又はそれと競合する。
【００６８】
従って、本発明の抗SIRPg化合物は、SIRPgがCD47に結合した場合に誘導されるCD47シグナル伝達経路を阻害する能力を有する。SIRPgのCD47への結合のアンタゴニスト特性、妨害又は阻害は、例えば、本発明の実施例に記載されるように、競合ELISAアッセイにより評価されてよい。抗SIRPg化合物は、1000ng/mlより低い、より詳細には800ng/mlより低い、最も詳細には400ng/mlより低い濃度で60%を上回る、より好ましくは70%を上回る、より好ましくは80%を上回る、最も好ましくは90%を上回るCD47及びSIRPgの間の物理的結合阻害を可能とする場合に、SIRPgのCD47への結合のアンタゴニストであると考えられうる。同じ定義が、SIRPgのCD47への結合を予防又は阻害すると考えられる抗SIRPg化合物について適用される。アンタゴニスト効果は、本出願の実施例に示される方法を使用して決定することができる。
【００６９】
本発明において、抗SIRPg化合物が、例えばBlitz又はELISAによる、SIRPg結合競合アッセイにおいてCD47のKD値の1 logより優れた、好ましくは2 logより優れた、より好ましくは3 logより優れた、最も好ましくは4 logより優れた増加を誘導する場合に、前記化合物はCD47のSIRPgへの結合をアンタゴナイズすると考えることもできる。
【００７０】
そのような抗SIRPg化合物は、ヒトSIRPg及びヒトCD47の間の相互作用に対するアンタゴニスト活性を有する。そのような能力は、本明細書において上記される方法に従って、及び/又は本発明の実施例に記載の方法により評価されてよい。本発明の抗体はまた、本発明の実施例に示されるように、先行技術の抗体とは対照的に、SIRPファミリーの唯一のメンバー、即ちSIRPgに選択的に結合する特性を有し、SIRPファミリーの他のメンバー、即ち、SIRPa及びSIRPbに特異的に結合しない。本明細書に記載の特性(SIRPgのCD47への結合のアンタゴニスト、SIRPgへの特異的結合、SIRPa及びSIRPbに特異的に結合しないこと)の組合せは、配列番号1又は配列番号45の配列のアミノ酸残基からなる又はその中に局在化したエピトープへの本発明の抗SIRPg化合物の結合に起因する。
【００７１】
本明細書はまた、ヒト化抗SIRPg抗体を開示する。実際に、ヒト化抗体である抗体又はその抗原結合断片はまた、可変鎖(VH及び/又はVL)の定常領域中に存在するアミノ酸残基を、標準的な定義及びナンバリングに従ってヒト抗体中の対応する位置を有するヒトアミノ酸残基に置換することにより誘導することができ、置換レベルは、前記フレームワーク領域中の残基の1%〜20%、特に1%〜18%である。前記定常領域は、特にKABATのナンバリングを参照することにより同定される、4鎖抗体中に定義されるフレームワーク領域(FR)の定常領域を含む。
【００７２】
本発明による修飾抗体の特定の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体及び/又は脱免疫化抗体を包含する。脱免疫化抗体は、抗体の結合能力が保たれたまま宿主の免疫系によるその認識を低下させるように一次構造が改変された親抗体に由来する抗体である。MHCクラスII受容体により認識されることが既知のエピトープ配列(即ち、T細胞エピトープ)が抗体の一次構造内で探索され、そのようなエピトープ配列が存在する場合、抗体の配列は、エピトープ配列を除去するように再モデリングされる。脱免疫化は、抗体のアミノ酸配列内のCD4+ T細胞エピトープの同定、及びそのようなエピトープが存在する場合のアミノ酸配列の改変からなる。同定工程は、いくつかのアルゴリズムを用いて行われる。例として、以下のリンク(http://tools.iedb.org/main/tcell/)は、抗体の設計において当業者により一般的に使用されるツールである。脱免疫化抗体、及びその生産方法は、例えば、Durancel及びMuller(mAb 4:4、445〜457頁;2012年7月/8月;doi.org/10.4161/mabs.20776)又はBakerら、(Methods in Molecular Biology、2009年2月  - DOI: 10.1007/978-1-59745-554-1_21)に示されている。
【００７３】
抗SIRPg抗体は、公知の方法に従ってヒト化されてよい。例として、本明細書に示される発明の方法に従って製造される特異的抗SIRPg抗体のCDRの異なる組合せは、ヒト重鎖可変ドメイン及び/又は軽鎖可変ドメインにグラフトされてよい。本発明のキメラ、ヒト化及び/又は脱免疫化抗体は、非修飾抗体のような免疫グロブリンの任意のクラスに属することができる。好ましくは、それらは、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4等のIgGクラスのサブクラスに属する。
【００７４】
抗体の可変領域を適切なリンカーと、又は別の抗体の定常領域と組み合わせることによる組換え抗体(若しくはその抗原結合断片)、又はキメラ抗体を調製する方法は当該技術分野において周知である。
【００７５】
本発明の任意の態様の特定の実施形態では、特異的抗SIRPg化合物は、ヒトSIRPaのヒトCD47への結合を予防も阻害もせず、特に、特異的抗SIRPg化合物はヒトSIRPaに特異的に結合せず、従って、ヒトSIRPa及びヒトCD47の間の相互作用を遮断しない。
【００７６】
SIRPaは、単球、組織マクロファージの殆どの亜集団、顆粒球、リンパ系組織中の樹状細胞のサブセット、一部の骨髄前駆細胞、及び様々なレベルでニューロン上に発現され、小脳及び海馬の顆粒層等の脳のシナプスリッチ区画において著しく高い発現を有する。ヒトSIRPaをコードする遺伝子は多型遺伝子であり、いくつかのバリアントがヒト集団において記載された。最も一般的なタンパク質バリアントはSIRPa v1及びv2(アクセッション番号NP_542970(P78324)及びCAA71403)である。ヒトSIRPにおける多型は、表面露出されるアミノ酸の変化に繋がるが、これはCD47への結合に影響しない。
【００７７】
CD47とのSIRPa相互作用が一般に記載され、宿主細胞食作用を阻害する下方調節シグナルを提供する。CD47は、より低いレベルで殆どの健常細胞により広く発現されるが、それはまた、一部のがん細胞において過剰発現される。従って、CD47は、「ドント・イート・ミー」(don't-eat-me)シグナルとして機能する。CD47は「ドント・イート・ミー」シグナルとして働き、そのためマクロファージによる宿主細胞食作用の重要な決定因子であるので、がん細胞クリアランスにおけるCD47-SIRPa相互作用の潜在的な寄与が近年重点的に研究されている。
【００７８】
本明細書において使用される場合、「SIRPa」という用語は、哺乳動物種からのSIRPaタンパク質、好ましくはヒトSIRPa(例えば、アクセッション番号NP_542970(P78324)及びCAA71403)を指す。
【００７９】
この特定の実施形態によれば、特異的抗SIRPg化合物は、SIRPg、特にヒトSIRPgに特異的に結合するが、SIRPa、特にヒトSIRPaに特異的に結合しない。一実施形態では、抗SIRPg化合物は、特にBlitz分析又はELISAアッセイにより、SIRPaに対して10-8Mに及ばない、好ましくは10-9Mに及ばないKD値を有する。
【００８０】
本発明の任意の態様の特定の実施形態では、特異的抗SIRPg化合物は、ヒトSIRPbに特異的に結合しない。
【００８１】
本明細書において使用される場合、「SIRPb」という用語は、哺乳動物種からのSIRPbタンパク質、好ましくはヒトSIRPb(例えば、アクセッション番号NM_001083910又はQ5TFQ8)を指す。
【００８２】
本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載の任意の特異的抗SIRPg化合物は、SIRPaに特異的に結合せず、SIRPbに特異的に結合しない。
【００８３】
本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載の任意の抗SIRPg化合物は、SIRPg-CD47相互作用に対するそのアンタゴニスト効果に起因してT細胞の増殖を減少させ又は阻害する。本発明の特定の実施形態では、そのような化合物は、陰性対照と比較してT細胞の増殖を減少させ又は阻害し、特に、T細胞の増殖の減少又は阻害は、20%を上回る、詳細には40%を上回る、より詳細には50%を上回る、最も詳細には70%を上回る。陰性対照は、SIRPg、CD47、CD47/SIRPg結合に干渉せず、SIRPgがCD47に結合した場合に誘導されるシグナル伝達経路に干渉しない類似した化合物(例えば、抗体、その抗原結合断片、抗原結合抗体模倣物)が、アッセイにおいて抗SIRPg化合物の代わりに類似した量で使用される同じアッセイで構成されるものであってよい。
【００８４】
本発明のそのような特異的抗SIRPg化合物は、SIRPg及びSIRPaの両方を認識する交差反応性抗体、又は同じ局在性でSIRPgに結合しない抗SIRPg抗体よりもT細胞増殖の阻害に対する強い効果を有しうる。本発明のそのような特異的抗SIRPg化合物はまた、交差反応性抗SIRP抗体(即ち、SIRPファミリーのいくつかのメンバーを認識する抗体)よりも低い副作用を呈しうる。従って、本発明は、CD47のSIRPgへの結合を阻害し若しくは減少させ且つ/若しくはT細胞の増殖を阻害し若しくは減少させ且つSIRPaに特異的に結合せず且つ/若しくはCD47のSIRPaへの結合を阻害しない特異的抗SIRPg化合物、又はCD47のSIRPgへの結合を阻害し、T細胞、特にCD4+ T細胞の増殖を阻害し若しくは減少させ、且つSIRPaに特異的に結合せず且つCD47のSIRPaへの結合を阻害しない、特に、SIRPbに特異的に結合しない化合物を包含する。T細胞の増殖の阻害又は減少は、そのような抗SIRPg化合物が抗CD47抗体の代わりに使用される場合により重要でありうることが留意されるべきである。本発明の特定の実施形態では、そのような特異的抗SIRPg化合物は、陰性対照と比較してT細胞の増殖を減少させ又は阻害し、特に、T細胞の増殖の減少又は阻害は、20%を上回る、より優先的には40%を上回る、より優先的には50%を上回る、最も優先的には70%を上回る。T細胞の増殖は、抗SIRPg化合物の存在下及び非存在下でのH3-チミジンの取込みの度合により評価されてよい。
【００８５】
別の態様では、本発明は、疾患の治療及び/又は予防、それにより、特に、T細胞が有害効果を有する疾患又は障害、特に、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、慢性神経炎症性疾患、免疫代謝疾患、全身炎症により引き起こされる心臓血管疾患又は移植片機能障害を阻害し、その進行を緩慢化させ、又はそれと関連付けられる症状を低減することを包含する、治療及び/又は予防における使用のための本明細書に記載の任意の抗SIRPg化合物の使用に関する。本発明の特定の実施形態では、移植片機能障害はグラフト拒絶を含まない。
【００８６】
抗SIRPg化合物は、単独で又は別の治療剤、例えば、第2のヒトモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と組み合わせて投与することができる。別の例では、抗SIRPg化合物は、別の作用剤、例えば、治療用細胞組成物と組み合わせた、免疫療法剤、免疫抑制剤、赤血球生成刺激剤(ESA)、アポトーシス促進剤、抗生物質、及びプロバイオティクス等と共に投与される。
【００８７】
一実施形態では、本発明は、抗SIRPg化合物が第2の治療剤と組み合わせられる、上記に定義されるような使用のための抗SIRPg化合物に関する。
【００８８】
第2の作用剤の投与は、特異的抗SIRPg化合物の投与と同時又は同時でなく為されうる。第2の作用剤の性質に依存して、併用投与は、「コンボ」としても公知の、組合せ薬物の形態に調製されうる。コンボは、固定用量において製造及び販売される、単一の投薬形態に組み合わせられた2つ又はより多くの活性の薬学的原料成分を含む固定用量の組合せである。但し、投薬レジメン及び/又は投与経路もまた様々でありうる。
【００８９】
好ましい実施形態では、この第2の治療剤は、免疫療法剤、免疫抑制剤、アポトーシス促進剤、抗生物質及びプロバイオティクスからなる群から選択される。
【００９０】
好ましい実施形態では、この第2の治療剤は、シクロスポリンA、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、ステロイド、抗TNF剤、抗IL-23剤からなる群から選択される免疫抑制剤である。
【００９１】
本発明はまた、医薬、特に、T細胞の活性化及び/又は増殖が有害効果を有する疾患又は障害の予防及び/又は治療用の医薬としての同時の、別々の又は逐次的な使用のための、
- 上記に定義されるような少なくとも1つの特異的抗SIRPg化合物、並びに
- 免疫療法剤、免疫抑制剤、アポトーシス促進剤、抗生物質及びプロバイオティクスからなる群から選択される少なくとも1つの第2の治療剤
を含む組合せ製品に関する。
【００９２】
化合物は、約1ng/kg体重〜約30mg/kg体重、又はより多くの有効用量で提供されてよい。特有の実施形態では、投薬量は、1μg/kg〜約20mg/kg、任意選択的に10μg/kg〜10mg/kg又は100μg/kg〜5mg/kgの範囲に及んでよい。
【００９３】
「有効用量」又は「有効投薬量」又は「有効量」という用語は、所望の効果を達成する又は少なくとも部分的に達成するために十分な量として定義される。「有効用量」という用語は、疾患を既に患っている患者において疾患及びその合併症を治癒し又は少なくとも部分的に停止させるために十分な量を包含することが意味される。この使用のために有効な量又は用量は、治療される状態、送達される抗体構築物、治療的な文脈及び目的、疾患の重症度、過去の療法、患者の臨床歴及び治療剤に対する応答、投与の経路、患者のサイズ(体重、身体表面若しくは臓器サイズ)及び/又は状態(年齢及び全般的健康)、並びに患者自身の免疫系の全般的状態に依存する。適切な用量は、最適な治療効果を得るために一度に又は一連の投与にわたり患者に投与されうるように調整することができる。
【００９４】
そのような目的のための投薬は、要求に応じて、例えば、1日毎、半週毎、週毎、半月毎、月毎、又は要求に応じて再発の間に、繰り返されてよい。
【００９５】
一態様では、本発明は、以下の工程:
a.SIRPg、及び/又は本明細書に記載の配列番号1のポリペプチド、及び/又は本明細書に記載されるような配列番号1のポリペプチドからなる若しくはその中に局在化したエピトープ配列に結合する化合物の能力を(例えば、実施例に記載の方法に従って)試験する工程、
b.SIRPgのCD47への結合のアンタゴニストである化合物の能力を(例えば、実施例に記載の方法に従って)試験する工程、
c.SIRPaに結合する化合物の能力を(例えば、実施例に記載の方法に従って)試験する工程、
d.CD47のSIRPaへの結合を減少させる抗体、抗原結合断片又はそのような抗体の模倣物の能力を(例えば、実施例に記載の方法に従って)試験する工程、
e.SIRPbに結合する化合物の能力を(例えば、実施例に記載の方法に従って)試験する工程
のうちの少なくとも1つを含み又はそれからなり、
且つ任意選択的に以下の工程:
- ヒトCD47のヒトSIRPgへの結合を有意に阻害し、SIRPaに特異的に結合せず且つ/又はCD47のSIRPaへの結合を阻害も予防もせず、且つ/又はSIRPbに特異的に結合しない化合物を選択する工程
を含む、特異的抗SIRPg化合物を選択する方法に関する。選択される抗SIRPg化合物は、本明細書に既に記載された任意の特異的抗SIRPg化合物について示される(例えば、少なくとも1つ又はいくつかの)任意の能力、例えば、SIRPg、SIRPa、SIRPbについてのEC50、並びにSIRPg及びCD47の間の結合についてのIC50を有してよい。
【００９６】
一態様では、本発明は、本明細書において上記に開示されるような特異的抗SIRPg化合物を選択する方法であって、方法の第1の工程が、
a'. SIRPg、及び/又は配列番号1の少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、若しくは29個の連続するアミノ酸残基から構成されるポリペプチドに結合する化合物の能力を(例えば、実施例に記載の方法に従って)試験する工程
である、方法に関する。
【００９７】
一態様では、本発明は、本明細書において上記に開示されるような特異的抗SIRPg化合物を選択する方法であって、方法の第1の工程が、
a''.SIRPg、並びに/又は配列番号1と少なくとも80%の同一性を共有し、但し、配列番号1の位置9及び10にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「E」及び「N」、及び/若しくは配列番号1の位置17に局在化したアミノ酸残基「P」、及び/若しくは配列番号1の位置21〜24にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「M」、「A」、「L」及び「G」、及び/若しくは配列番号45のアミノ酸残基が存在する、少なくとも10個の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチドに結合する化合物の能力を(例えば、実施例に記載の方法に従って)試験する工程
である、方法に関する。
【００９８】
一態様では、本発明は、本明細書において上記に開示されるような特異的抗SIRPg化合物を選択する方法であって、方法の第1の工程が、
a'''.SIRPg、及び/又は配列番号45のアミノ酸残基から構成されるポリペプチドに結合する化合物の能力を(例えば、実施例に記載の方法に従って)試験する工程
である、方法に関する。
【００９９】
一態様では、本発明はまた、特に個別化医療、より詳細にはコンパニオン診断試験における、診断試験において使用するための上記に定義されるような抗SIRPg化合物に関する。
【０１００】
一実施形態では、本発明は、上記に定義されるような抗SIRPg化合物を使用する、特に個別化医療、より詳細にはコンパニオン診断試験における、診断方法に関する。
【０１０１】
一実施形態では、本発明はまた、上記に定義されるような抗SIRPg化合物を含む、詳細には個別化医療のための、より詳細にはコンパニオン診断キットにおける、診断キットに関する。
【０１０２】
一実施形態では、本発明は、詳細には個別化医療、より詳細にはコンパニオン診断試験における、診断試験用の医薬の製造における上記に定義されるような抗SIRPg化合物に関する。
【０１０３】
一態様では、本発明はまた、対象から以前に得られた生物学的試料中のSIRPgの発現及び/又は発現のレベルの決定用の手段としての、少なくとも1つの本発明の抗SIRPg化合物の、特に、ヒトSIRPaと交差反応しない抗ヒトSIRPg抗体又はその抗原結合断片を用いる、使用に関する。
【０１０４】
本発明はまた、対象から以前に得られた生物学的試料中のSIRPg陽性細胞を決定するインビトロ又はエクスビボの方法であって、
i)本発明の抗SIRPg化合物を使用して、特に、ヒトSIRPaと交差反応しない、特に、ヒトSIRPbと交差反応しない、抗ヒトSIRPg抗体又はその抗原結合断片を用いて、前記対象の生物学的試料中のSIRPgの発現及び/又は発現のレベルをインビトロで決定する工程
を含む、方法に関する。
【０１０５】
本発明はまた、SIRPgが、対象における治療に対する応用を予測するバイオマーカーとして使用される方法における、少なくとも1つの本発明の抗SIRPg化合物、特に、ヒトSIRPaと交差反応しない、特に、ヒトSIRPa及びヒトSIRPbと交差反応しない、抗ヒトSIRPg抗体又はその抗原結合断片の使用に関する。
【０１０６】
本発明はまた、治療、特に、本発明の特異的抗SIRPg化合物を用いる治療、詳細には、ヒトSIRPaと交差反応しない、より詳細には、ヒトSIRPa及びヒトSIRPbと交差反応しない、本発明の抗ヒトSIRPg抗体又はその抗原結合断片を用いる治療に対する対象の応答を予測するインビトロの方法であって、
- 本発明の特異的抗SIRPg化合物を用いて、対象、特にヒト対象から以前に得られた試料中のSIRPgの発現レベルを決定する工程、及び
- SIRPgの発現レベルを非応答対象集団におけるSIRPgの発現レベルの代表的な値と比較する工程
を含み、対象の試料中のSIRPgのより高い発現レベルが、治療に応答する対象を示す、方法に関する。
【０１０７】
本発明はまた、ヒト対象においてT細胞が有害効果を有する疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、対象に本発明の特異的抗SIRPg化合物を投与することによるヒトCD47のヒトSIRPgへの結合のアンタゴニズム、特に予防及び/又は阻害を含む、方法に関する。より特定の実施形態では、本発明は、ヒト対象においてT細胞の増殖及び/又は活性化及び/又は遊走及び/又は組織浸潤が有害効果を有する疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、対象に本発明の特異的抗SIRPg化合物を投与することによるヒトCD47のヒトSIRPgへの結合のアンタゴニズム、特に予防及び/又は阻害を含む、方法に関する。より特定の実施形態では、T細胞が有害効果を有する疾患又は障害は、
- 自己免疫疾患、特に、関節リウマチ、I型糖尿病、ループス、乾癬、
- 慢性炎症性疾患、特に、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、
- 慢性神経炎症性疾患、特に、多発性硬化症、脳脊髄炎、
- 免疫代謝疾患、特に、II型糖尿病、
- 全身炎症により引き起こされる心臓血管疾患、特に、アテローム性動脈硬化症、
- 移植片機能障害又は拒絶、特に、移植片対宿主病、並びに
- リンパ増殖性疾患、特に、T細胞リンパ腫又は移植後リンパ増殖性疾患
からなる群から選択される。
【０１０８】
方法の特定の実施形態では、本発明の抗SIRPg化合物の投与は、T細胞の増殖を陰性対照と比較して20%を上回って、より詳細には50%より大きく、最も好ましくは70%より大きく減少させ又は阻害する。
【０１０９】
方法の特定の実施形態では、T細胞の増殖及び/又は活性化及び/又は遊走及び/又は組織浸潤が有害効果を有する疾患又は障害は、
- 自己免疫疾患、特に、関節リウマチ、I型糖尿病、ループス、乾癬、
- 慢性神経炎症性疾患、特に、多発性硬化症、脳脊髄炎
からなる群から選択される。
【０１１０】
方法の特定の実施形態では、T細胞の増殖及び/又は活性化及び/又は遊走及び/又は組織浸潤が有害効果を有する疾患又は障害は、移植片機能障害、特に移植片対宿主病、特に、T細胞リンパ腫又は移植後リンパ増殖性疾患である。
【０１１１】
本発明はまた、ヒト対象においてT細胞、より詳細には、T細胞の増殖及び/又は活性化及び/又は遊走及び/又は組織浸潤が有害効果を有する疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、対象に本発明の特異的抗SIRPg化合物を投与することによるヒトCD47のヒトSIRPgへの結合のアンタゴニズム、特に予防及び/又は阻害を含み、T細胞増殖が有害効果を有する疾患又は障害が、
- 自己免疫疾患、特に、関節リウマチ、I型糖尿病、ループス、乾癬、
- 慢性炎症性疾患、特に、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、
- 慢性神経炎症性疾患、特に、多発性硬化症、脳脊髄炎、
- 免疫代謝疾患、特に、II型糖尿病、
- 全身炎症により引き起こされる心臓血管疾患、特に、アテローム性動脈硬化症、
- 移植片機能障害又は拒絶、特に、移植片対宿主病、並びに
- リンパ増殖性疾患、特に、T細胞リンパ腫又は移植後リンパ増殖性疾患
からなる群から選択され、
本発明の特異的抗SIRPg化合物が、免疫療法剤、免疫抑制剤、抗生物質及びプロバイオティクスからなる群から選択される少なくとも1つの第2の治療剤と組み合わせて投与され、組合せでの前記投与が、同時、別々又は逐次的のいずれかである、
方法に関する。
【０１１２】
特定の実施形態では、免疫抑制剤は、シクロスポリンA、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、ステロイド、抗TNF剤、抗IL-23剤からなる群から選択される。
【０１１３】
方法の特定の実施形態では、方法は、対象における治療に対する応答のインビトロ又はエクスビボでの予測を含み、前記予測は、治療を受けている又は治療を受ける可能性がある対象からの試料中のSIRPgの発現レベルを測定する工程を含み、前記発現レベルは、本発明の抗SIRPg化合物を用いて決定され、前記予測は、SIRPgの発現のレベルを非応答対象集団におけるSIRPgの発現レベルの代表的な値と比較する工程を更に含み、対象の試料中のSIRPgのより高い発現レベルが、治療に応答する対象を示す。
【０１１４】
本発明はまた、T細胞が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療用の医薬の製造における、配列番号1の配列のポリペプチドからなる又はその中に局在化したヒトSIRPgのエピトープに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストである、抗体、その抗原結合断片及び抗原結合抗体模倣物からなる群から選択される特異的抗SIRPg化合物の使用に関する。
【０１１５】
本発明はまた、T細胞の増殖及び/若しくは活性化及び/若しくは遊走並びに/又はT細胞による組織浸潤が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療用の医薬の製造における、配列番号1の配列のポリペプチドからなる又はその中に局在化したヒトSIRPgのエピトープに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストである、抗体、その抗原結合断片及び抗原結合抗体模倣物からなる群から選択される特異的抗SIRPg化合物の使用に関する。
【０１１６】
本発明はまた、
- 自己免疫疾患、特に、関節リウマチ、I型糖尿病、ループス、乾癬、
- 慢性炎症性疾患、特に、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、
- 慢性神経炎症性疾患、特に、多発性硬化症、脳脊髄炎、
- 免疫代謝疾患、特に、II型糖尿病、
- 全身炎症により引き起こされる心臓血管疾患、特に、アテローム性動脈硬化症、
- 移植片機能障害又は拒絶、特に、移植片対宿主病、並びに
- リンパ増殖性疾患、特に、T細胞リンパ腫又は移植後リンパ増殖性疾患
からなる群から選択される疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療用の医薬の製造における、配列番号1の配列のポリペプチドからなる又はその中に局在化したヒトSIRPgのエピトープに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストである、抗体、その抗原結合断片及び抗原結合抗体模倣物からなる群から選択される特異的抗SIRPg化合物の使用に関する。
【０１１７】
本発明はまた、抗SIRPg化合物、特に、SIRPaのCD47への結合を予防も阻害もせず、且つ/又は特に、ヒトSIRPaに結合せず、且つ/又はヒトSIRPbに結合しない抗SIRPg化合物が、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズするために好適であるのかどうかを評価するための、本明細書に開示される任意のエピトープ配列に対応するポリペプチドの使用に関する。
【０１１８】
より特定の実施形態では、抗SIRPg化合物、特に、SIRPaのCD47への結合を予防も阻害もせず、且つ/又は特に、ヒトSIRPaに特異的に結合せず、且つ/又はヒトSIRPbに特異的に結合しない抗SIRPg化合物が、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズするために好適であるのかどうかを評価するために使用されるポリペプチドは、配列番号1のポリペプチドである。
【０１１９】
本発明はまた、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズするために好適である特異的抗SIRPg化合物を精製する方法であって、
- 配列番号1、又は配列番号45のアミノ酸を含む又はそれからなるポリペプチドで表面をコーティングする工程であって、例えば、ポリペプチドが、表面上にポリペプチドをコーティングするために使用される追加のヒスチジンテイルを含んでもよい、コーティングする工程、
- 化合物をポリペプチドでコーティングされた表面と共にインキュベートする工程、
- 場合により、化合物のポリペプチドへの結合を測定する工程、
- 場合により、CD47の存在下での化合物のポリペプチドへの結合を試験する工程、
- ポリペプチドに対する所望の結合能力を有する抗SIRPg化合物を取得する工程
を含む、方法に関する。結合の測定は、本発明の実施例に記載の方法に従って行われてよい。所望の結合能力は、本明細書において上記の本発明の特異的抗SIRPg化合物について定義されるものであってよい(例えば、SIRPgへの結合についてのEC50に類似したポリペプチドについてのEC50)。SIRPgのCD47への結合をアンタゴナイズする取得された化合物の能力を試験する更なる工程は、例えば、本発明の実施例に示されるように行われてよい。
【０１２０】
本発明はまた、
・ヒトSIRPgに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズし、
・ヒトSIRPaのヒトCD47への結合を予防も阻害もせず、特に、ヒトSIRPaに特異的に結合せず、
・任意選択的に、ヒトSIRPbに特異的に結合しない
特異的抗SIRPg化合物を選択する方法であって、
本明細書に開示されるような任意のエピトープ配列に結合する化合物の能力を試験する工程、より詳細には、配列番号1、又は配列番号45のポリペプチドに結合する化合物の能力を試験する工程を含み、化合物は、前記ポリペプチドに特異的に結合する場合に特異的抗SIRPg化合物である、方法に関する。
【０１２１】
本発明はまた、ヒトSIRPgに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストである、特異的抗SIRPg化合物であって、抗SIRPg化合物が、
・配列番号17又は配列番号29のVHCDR1、
・配列番号34、配列番号19又は配列番号31のVHCDR2、
・配列番号21、配列番号25又は配列番号33のVHCDR3
を含む抗体重鎖可変ドメイン、及び
・配列番号9のVLCDR1、
・配列番号11のVLCDR2、
・配列番号13のVLCDR3
を含む抗体軽鎖可変ドメイン
を含む抗体と、配列番号1、又は配列番号45からなるポリペプチドへの結合について交差競合し、
特に、抗SIRPg化合物が、
・配列番号15、配列番号23又は配列番号27のポリペプチドを含む又はそれからなる重鎖可変ドメイン、及び
・配列番号7のポリペプチドを含む又はからなる軽鎖可変ドメイン
を含む抗体と、配列番号1、又は配列番号45からなるポリペプチドへの結合について交差競合する、
抗SIRPg化合物に関する。
【０１２２】
・配列番号17又は配列番号29のVHCDR1、
・配列番号34、配列番号19又は配列番号31のVHCDR2、
・配列番号21、配列番号25又は配列番号33のVHCDR3
を含む抗体重鎖可変ドメイン、及び
・配列番号9のVLCDR1、
・配列番号11のVLCDR2、
・配列番号13のVLCDR3
を含む抗体軽鎖可変ドメイン
を含む抗体と配列番号1のポリペプチドへの結合について競合する特異的抗SIRPg化合物もまた本発明により包含され、
特に、特異的抗SIRPg化合物は、
・配列番号15、配列番号23又は配列番号27のポリペプチドを含む又はそれからなる重鎖可変ドメイン、及び
・配列番号7のポリペプチドを含む又はからなる軽鎖可変ドメイン
を含む抗体と配列番号1からなるポリペプチドへの結合について交差競合する。
【０１２３】
交差競合性抗体(又は化合物)及び配列番号1のポリペプチド内に局在化した(又は存在する若しくは含まれる)同じ又はオーバーラップするエピトープを認識する抗体(又は化合物)は、例えば、標的抗原への別の抗体の結合を遮断する1つの抗体の能力を示すことによる、イムノアッセイ等の慣用的な技術、例えば、競合結合アッセイを使用して同定することができる。競合的な結合は、本発明の実施例に記載されるようなアッセイを使用して決定されてよい。試験された抗SIRPg化合物が他の抗体の結合を、前記抗体(又は化合物)のうちの1つを欠いた陽性対照と比較して少なくとも50%、少なくとも60%、詳細には少なくとも70%、より詳細には少なくとも80%低減し、逆もまた同様である場合に、交差競合が存在する。
【０１２４】
本発明はまた、ヒトSIRPgに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストである、抗SIRPg化合物を選択する方法であって、
- 選択される抗SIRPg化合物と、
-  以下:
・配列番号17又は配列番号29のVHCDR1、
・配列番号34、配列番号19又は配列番号31のVHCDR2、
配列番号21、配列番号25又は配列番号33のVHCDR3
を含む抗体重鎖可変ドメイン、及び
-  以下:
・配列番号9のVLCDR1、
・配列番号11のVLCDR2、
・配列番号13のVLCDR3
を含む抗体軽鎖可変ドメイン
を含む特異的抗SIRPg抗体との間の、配列番号1、又は配列番号45からなるポリペプチドへの結合についての交差競合を試験する工程、
- 交差競合アッセイにおいて使用された特異的抗SIRPg抗体と比較してポリペプチドへの少なくとも類似した結合能力(例えば、記載された抗体について定義された値と類似したSIRPa及びSIRPgについてのEC50)を示し、交差競合アッセイにおいて使用された特異的抗SIRPg抗体と比較してSIRPg及びCD47の間の相互作用についての少なくとも類似した阻害能力(例えば、記載された抗体について定義された値と類似したIC50)を示した抗SIRPg化合物を選択する工程
を含む、方法もまた包含する。
【０１２５】
本発明はまた、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズするために好適である特異的抗SIRPg抗体を生産する方法であって、配列番号1からなるポリペプチド内のエピトープ配列を含む抗原、特に、配列番号1からなる又はその中に局在化した抗原を用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程を含む、方法に関する。そのような方法は、動物を免疫した後にハイブリドーマを得る工程、及び必要な場合、同じ免疫原を用いて前記動物を追加免疫する工程、免疫化に応答した動物から脾臓若しくはリンパ節細胞を回収する工程及び前記細胞を骨髄腫細胞と融合させてモノクローナル抗体を単離する工程及び/又は組換え形態のヌクレオチド配列を有する本明細書に開示されるポリヌクレオチド等のそのような抗体をコードするポリヌクレオチドを細胞中で抗体の回収を可能にする条件において発現させる工程、及び/又は本明細書において定義されるようなエピトープ、若しくは配列番号1のポリペプチドを特異的に認識する抗体、特に、特に本明細書に開示される任意の抗体と比較して、SIRPg、SIRPa、特に、SIRPg、SIRPa及びSIRPbについて所望の結合親和性を有し、SIRPgのCD47への結合について所望のアンタゴニスト能力を有する抗体を回収する工程を更に含んでよい。
【０１２６】
本発明はまた、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズするために好適である特異的抗SIRPg抗体を生産する方法であって、
- 本明細書に記載されるような配列番号1のポリペプチドからなる又はその中に局在化したポリペプチド、
- 配列番号1の少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、又は29個の連続するアミノ酸残基から構成されるポリペプチド、
- 配列番号1と少なくとも80%の同一性を共有する少なくとも10個の連続するアミノ酸残基からなり、但し、配列番号1の位置9及び10にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「E」及び「N」、並びに/又は配列番号1の位置17に局在化したアミノ酸残基「P」、並びに/又は配列番号1の位置21〜24にそれぞれ局在化したアミノ酸残基「M」、「A」、「L」及び「G」、並びに/又は配列番号45のアミノ酸残基が存在する、ポリペプチド、
- 配列番号45のアミノ酸残基から構成されるポリペプチド
からなる群から選択される1つ、又はいくつかの抗原を用いる非ヒト哺乳動物の免疫化を含む、方法に関する。
【０１２７】
以下の図及び実施例は、本発明の作製及び使用の方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するように提示されるものであり、本発明者らが自身の発明であるとみなすものの範囲を限定することは意図されず、また、以下の実験が全て又は唯一の行われた実験であるとそれらが表すことは意図されない。本発明をその特有の実施形態を参照して記載してきたが、本発明の真の精神及び範囲から離れることなく様々な変更が為されてよく、均等物が置換されてよいことが当業者により理解されるべきである。追加的に、特定の状況、材料、組成物、方法、方法の1つ又は複数の工程を本発明の目的、精神及び範囲に適合させるために多くの改変が為されてよい。全てのそのような改変は、本明細書に添付される請求項の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ELISAアッセイペプチドSIRPg-Hisコーティング及び抗ヒトペルオキシダーゼ検出における配列番号1のペプチド上の結合。抗体A1、A5及びA8、並びに先行技術の抗体Kwar23の結合解析。A. 50μg/mlで固定化された特異的ペプチドSIRPg-Hisに対するKwar23(◆)、A1(△)、A5(x)及びA8(□)のELISA。B. 50μg/mlで固定化された特異的ペプチドSIRPg-Hisに対するLSB2.20(x)のELISA。顕色は、ロバ抗ヒト抗体を用いて行い、TMB基質を使用して450nmでの比色法により顕色させた。C.  抗体のEC50。EC50は、このアッセイにおいてシグナルの50%に達するための指し示される抗体の濃度である。
【図２】ELISAアッセイ(タンパク質SIRPa/b/g-Hisコーティング及び抗ヒトペルオキシダーゼ検出)におけるSIRPg、SIRPa及びSIRPb上の結合。抗体A1、A5及びA8、並びに先行技術の抗体Kwar23の結合解析。図Aにおいて固定化された1μg/mlのタンパク質SIRPg-His、図Bにおいて固定化された1μg/mlのタンパク質SIRPa-His、図Cにおいて固定化された1μg/mlのタンパク質SIRPb-Hisに対するKwar23(◆)、A1(△)、A5(x)及びA8(◇)のELISA。顕色は、ロバ抗ヒト抗体を用いて行い、TMB基質を使用して450nmでの比色法により顕色させた。
【図３】先行技術の抗体OX119のSIRPg、SIRPa、SIRPb及び配列番号1のペプチド上の結合。0.5μg〜1μgの固定化された配列番号1のペプチド、hSIRPa-His、hSIRPb-his及びhSIRPg-Hisに対する1μg/mlの濃度のOX119のELISA。顕色は、二次抗体を用いて行い、540〜630nmでの比色法により顕色させた。
【図４】CD47を用いる競合ELISAアッセイによる抗SIRPgアンタゴニスト活性。(A)抗SIRPg抗体A1、A5及びA8、並びに(B)先行技術の抗体Kwar23、LSB2.20及びOX119の結合解析。一定の濃度のビオチン化CD47-Fc(6μg/ml)と共にインキュベートされた異なる濃度のKwar23(◆)、A1(△)、A5(x)、A8(◇)並びに商用のLSB2-20(*)及びOX119(・)のELISA。顕色は、CD47分子を検出するためのストレプトアビジンペルオキシダーゼを用いて行い、TMB基質を使用して450nm又は450〜630nmでの比色法により顕色させた。IC50は、このアッセイにおいてシグナルの50%を阻害するために要求される指し示される抗体の濃度である。
【実施例】
【０１２９】
材料及び方法
抗体の生成
抗SIRPg抗体をファージディスプレイ技術に従って得た。Nissimら、(Nissim A、Hoogenboom HR、Tomlinson IM、Flynn G、Midgley C、Lane D、Winter G、EMBO J. 1994 Feb 1;13(3):692〜8頁)に記載のライブラリーに類似した半合成のscFvライブラリーを構築した。ファージディスプレイ技術に従って生成された抗体をその後に配列番号1のペプチドに対する結合親和性に従ってスクリーニングした。
【０１３０】
抗体の調製
抗SIRPガンマAbの重鎖の構築のために、A1、A5、又はA8配列からの可変ドメインVHを合成し、ヒンジ領域を安定化させるための突然変異した(S228P)ヒトIgG4のFcを含有するpFuseCHIg-hG4m発現プラスミド(pFuseCHIg-hG4mベクター、Invivogen社、Toulouse)にEcoRVによりクローニングした。抗SIRPガンマAbの軽鎖の構築のために、A1、A5、又はA8配列からの同一の可変ドメインVLを合成し、ヒトCLカッパを含有するpFuse2CLIg-hk発現プラスミド(pFuse2CLIg-hk、Invivogen社、Toulouse)にAccI/NheIによりクローニングした。HEK 293 Freestyle細胞に、VHA1-hFcG4又はVHA5-hFcG4又はVHA8-hFcG4を含有するプラスミドをVL-CLカッパを含有するプラスミドと共にリポフェクタミン法により共トランスフェクトした。48〜72hのインキュベーション後に上清を回収し、クエン酸0.1M pH3の溶出緩衝液を用いてプロテインAクロマトグラフィー(HiTrap、GeHealthcare社)で親和性により精製した。精製された抗体をPBS中で透析し、濃縮した。それらをUV(A280nm)により定量化し、SIRPg様抗原に対する活性アッセイにおいて試験した。
【０１３１】
ELISA結合抗SIRPg(ペプチド)
活性ELISAアッセイのために、ペプチドヒトSIRPガンマ(VKFRKGSPENVEFKSGPGTEMALGAKPSA-6His、Synpeptide社、Shanghai、Chinaにより合成)を炭酸緩衝液(pH9.2)中100μg/mlでプラスチック上に固定化し、精製された抗体を加えて結合を測定した。インキュベーション及び洗浄後に、ペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヒトIgG(Jackson Immunoresearch社;USA;参照  709-035-149)を加え、従来法により顕色させた。
【０１３２】
ELISA結合抗SIRPg/SIRPa(組換えタンパク質)
活性ELISAアッセイのために、組換えhSIRPg(Sino Biologicals社、Beijing、China;参照11828-H08H)又はhSIRPa(Sino Biologicals社、Beijing、China;参照11612-H08H)を炭酸緩衝液(pH9.2)中1μg/ml(hSIRPg)又は0.5μg/ml(hSIRPa)でプラスチック上に固定化し、精製された抗体を加えて結合を測定した。インキュベーション及び洗浄後に、ペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヒトIgG(Jackson Immunoresearch社;USA;参照709-035-149)を加え、従来法により顕色させた。
【０１３３】
ELISAアンタゴニスト:CD47及び抗SIRPg抗体の間の競合
競合ELISAアッセイのために、組換えhSIRPg(Sino Biologicals社、Beijing、China;参照  11828-H08H)を炭酸緩衝液(pH9.2)中1μg/mlでプラスチック上に固定化した。精製された抗体(異なる濃度)を最終6μg/ml(固定濃度)のビオチン化ヒトCD47Fc(AcroBiosystems interchim社;France;参照:#CD7-H82F6)と混合して競合的な結合を37℃で2h測定した。インキュベーション及び洗浄後に、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Vector laboratoring社;USA;参照SA-5004)を加えてビオチン-CD47Fc結合を検出し、従来法により顕色させた。
【０１３４】
Blitz法によるSIRPgについての親和性
この方法はBlitz(Forte Bio社;USA;参照C22-2 No 61010-1)を用いて行った。組換えhSIRPg-His(Sino Biologicals社、Beijing、China;参照11828-H08H)をヒスチジンテイルにより10μg/mlでNi-NTAバイオセンサー(Forte Bio社;USA;参照18-0029)に30秒間固定化した。次に、抗SIRP抗体を10又は20μg/mLで120秒間会合させた。抗SIRPa抗体の解離は、速度論緩衝液(kinetics buffer)中で120秒間行った。解析データをBlitz pro 1.2ソフトウェアを用いて作成し、会合定数(ka)及び解離定数(kd)を算出し、親和性定数KD(ka/kd)を決定した。
【０１３５】
抗SIRPg抗体の製造及び選択
本明細書において上記に記載されるような抗体の製造に従って、配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、先行技術の抗体、及び自家製抗体を含む異なる抗SIRPg化合物の能力を試験するために使用した。自家製抗体は、以下の表及び本明細書中の以下の詳細な説明に詳述される構造に対応する。
【０１３６】
【表１】
2021534204.tif 000003
【０１３７】
【表２】
2021534204.tif 000004
【０１３８】
【表３】
2021534204.tif 000005
【０１３９】
【表４】
2021534204.tif 000006
【０１４０】
ヒトSIRPgに特異的に結合する自家製抗体は、以下の構造:
・配列番号17又は配列番号29のVHCDR1、
・配列番号34、配列番号19又は配列番号31のVHCDR2、
・配列番号21、配列番号25又は配列番号33のVHCDR3
を含む抗体重鎖可変ドメイン、及び
・配列番号9のVLCDR1、
・配列番号11のVLCDR2、
・配列番号13のVLCDR3
を含む抗体軽鎖可変ドメイン
を含み、且つ
これらの抗体は、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストである。
【０１４１】
より詳細には、自家製抗体は、以下の構造:
・本発明の実施例において使用される抗体A1のVHCDRに対応する、配列番号17のVHCDR1、配列番号19のVHCDR2及び配列番号21のVHCDR3、又は
・本発明の実施例において使用される抗体A5のVHCDRに対応する、配列番号17のVHCDR1、配列番号19のVHCDR2及び配列番号25のVHCDR3、又は
・本発明の実施例において使用される抗体A8のVHCDRに対応する、配列番号29のVHCDR1、配列番号31のVHCDR2及び配列番号33のVHCDR3
を含む抗体重鎖可変ドメイン、並びに
・本発明の実施例において使用される抗体A1、A5及びA8のVLCDRに対応する、配列番号9のVLCDR1、配列番号11のVLCDR2及び配列番号13のVLCDR3を含む抗体軽鎖可変ドメイン
を有する。
【０１４２】
より詳細には、自家製抗体は、以下の構造:
・抗体A1の重鎖可変ドメインに対応する、配列番号15の重鎖可変ドメイン、又は
・抗体A5の重鎖可変ドメインに対応する、配列番号23の重鎖可変ドメイン、又は
・抗体A8の重鎖可変ドメインに対応する、配列番号27の重鎖可変ドメイン、並びに
・抗体A1、A5及びA8の軽鎖可変ドメインに対応する、配列番号7の軽鎖可変ドメイン
を有する。
【０１４３】
より詳細には、自家製抗体は、以下の構造:
・配列番号3のヒトIgG4のFcの、配列番号15、配列番号23及び配列番号27の重鎖可変ドメインのうちのいずれか1つとの組合せを含む又はそれからなる重鎖、並びに
・配列番号5のヒトCLカッパの配列番号7の軽鎖可変ドメインとの組合せを含む又はそれからなる軽鎖
を有する。
【０１４４】
そのような組合せは、本発明の実施例において使用される抗体A1、A5及びA8にそれぞれ対応する。
【０１４５】
自家製抗体をコードする核酸分子が使用され、それらは、以下の構造:
- 可変重鎖ドメインをコードし、
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号17、配列番号19及び配列番号21のCDRをそれぞれコードする配列番号16、配列番号18及び配列番号20の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド、
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号17、配列番号31及び配列番号21のCDRをそれぞれコードする配列番号16、配列番号30及び配列番号20の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド、
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号17、配列番号19及び配列番号25のCDRをそれぞれコードする配列番号16、配列番号18及び配列番号24の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド、
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号17、配列番号31及び配列番号25のCDRをそれぞれコードする配列番号16、配列番号30及び配列番号24の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド、
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号17、配列番号19及び配列番号33のCDRをそれぞれコードする配列番号16、配列番号18及び配列番号32の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド、
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号17、配列番号31及び配列番号33のCDRをそれぞれコードする配列番号16、配列番号30及び配列番号32の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド、
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号29、配列番号19及び配列番号21のCDRをそれぞれコードする配列番号28、配列番号18及び配列番号20の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド、
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号29、配列番号31及び配列番号21のCDRをそれぞれコードする配列番号28、配列番号30及び配列番号20の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド、
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号29、配列番号19及び配列番号25のCDRをそれぞれコードする配列番号28、配列番号18及び配列番号24の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド、
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号29、配列番号31及び配列番号25のCDRをそれぞれコードする配列番号28、配列番号30及び配列番号24の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド、
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号29、配列番号19及び配列番号32のCDRをそれぞれコードする配列番号28、配列番号18及び配列番号32の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド、及び
-  可変重鎖ドメインをコードし、配列番号29、配列番号31及び配列番号33のCDRをそれぞれコードする配列番号28、配列番号30及び配列番号32の配列のヌクレオチド残基を含む、ポリヌクレオチド
から選択される、第1の核酸分子、
- 並びに可変軽鎖をコードし、配列番号9、配列番号11及び配列番号13のCDRをそれぞれコードする配列番号8、配列番号10及び配列番号12の配列のヌクレオチド残基を含む、第2の核酸分子
を含む。
【０１４６】
本発明による核酸分子はまた、
- 本発明の実施例に開示される抗体A1、A5及びA8の重鎖可変ドメインにそれぞれ対応する、可変重鎖ドメインをコードし、配列番号15、配列番号23及び配列番号26の重鎖ドメインをそれぞれコードする配列番号14、配列番号22又は配列番号26の配列のヌクレオチド残基を含む又はそれからなる、ポリヌクレオチド、並びに
- 配列番号7の軽鎖可変ドメインをコードし、抗体A1、A5及びA8の軽鎖可変ドメインに対応する、可変軽鎖ドメインをコードし、配列番号6の配列のヌクレオチド残基を含む又はそれからなる、ポリヌクレオチド
から選択されてよい。
【０１４７】
本発明による核酸分子はまた、
- 全長重鎖をコードし、抗体A1、A5及びA8の重鎖をそれぞれコードする、配列番号2及び配列番号14、又は配列番号2及び配列番号22、又は配列番号2及び配列番号26の配列のヌクレオチド残基を含む又はそれからなる、ポリヌクレオチド、並びに
- 抗体A1、A5及びA8の軽鎖をコードする、全長軽鎖をコードし、配列番号4及び配列番号6の配列のヌクレオチド残基を含む又はそれからなる、ポリヌクレオチド
から選択されてよい。
【０１４８】
そのような核酸分子は、例えば、宿主細胞内でのコードされる配列の発現のために好適な、プラスミドのような発現ベクター内に挿入されてよい。
【０１４９】
(実施例1)
SIRPファミリーの異なるメンバーへの結合
結果:図1に示されるように、3つの抗体A1、A5及びA8は、配列番号1のペプチドに対する良好な親和性結合を有するが、先行技術の抗体Kwar23及びLSB2.20は配列番号1のペプチドに結合しない。
【０１５０】
図2に示されるように、3つの抗体A1、A5及びA8はSIRPgに結合するが(但し、先行技術の抗体Kwar23とは異なる結合挙動を有する)、SIRPaもSIRPbも認識せず、一方でKwar23は、SIRPa及びSIRPbにも結合する抗SIRPg抗体である。配列番号1のアミノ酸ペプチドに結合する3つの抗体A1、A5及びA8はSIRPgに選択的である一方、先行技術の抗体Kwar23は非選択的である。
【０１５１】
図3に示されるように、先行技術の抗体OX119は、予期されたように、SIRPgに結合するが、SIRPaにも結合する一方、それは、配列番号1のアミノ酸配列に対応するペプチドを認識してそれに結合することはできない。
【０１５２】
これらの結果は、製造された、及び場合により、配列番号1のアミノ酸配列からなる又はその中に局在化したエピトープ配列を用いて選択された、抗体の、SIRPファミリーの単一のメンバー、即ち、SIRPgを選択的に認識してそれに結合し、SIRPgのCD47への結合をアンタゴナイズする独特の能力を示す一方、先行技術の抗SIRPg抗体は、SIRPファミリーの少なくとも2つのメンバー、即ち、SIRPa及び/若しくはSIRPbを認識し、且つ/又はSIRPgのCD47への結合をアンタゴナイズすることができない。
【０１５３】
(実施例2)
SIRPgのCD47への結合を阻害する能力
結果:図4に示されるように、3つの抗体A1、A5及びA8は、SIRPgのCD47への結合の強力なアンタゴニストである一方、先行技術の抗体Kwar23及びLSB2.20及びOX119は同じアンタゴニスト効果を有しない。図4aに示されるように、IC50値によれば、IC50に達するために抗体A8と比較して7倍の用量(及び抗体A5と比較して50倍の用量)のLSB2.20が要求される一方、Kwar23はCD47のSIRPgへの結合を十分に阻害することができない。図4bに示されるように、SIRPgのCD47への結合はいかなる用量のOX119によっても影響されないので、OX119は、SIRPg及びCD47の間の結合に対するいかなる影響力も有しない。よって、本発明による抗SIRPg化合物は、SIRPgのCD47への結合を完全に阻害するためにより強力であり、抗SIRPg抗体のインビボ効果(例えば、Tリンパ球の増殖の阻害)との関連でより良好な効率を誘発しうるものであり、それゆえ、本発明の記載において議論されるように、疾患の治療又は予防を増強するために好適である。
【図１】
2021534204.tif 000007
【図２】
2021534204.tif 000008
【図３】
2021534204.tif 000009
【図４】
2021534204.tif 000010
【配列表】
2021534204000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月28日(2020.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
T細胞が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療における使用のための特異的抗シグナル調節タンパク質ガンマ(SIRPg)化合物であって、配列番号45の配列のポリペプチドからなるヒトSIRPgのエピトープに特異的に結合し、ヒトシグナル調節タンパク質アルファ(SIRPa)に特異的に結合せず、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合のアンタゴニストである、抗体、その抗原結合断片及び抗原結合抗体模倣物からなる群から選択され、
治療及び/又は予防される疾患又は障害が、
・自己免疫疾患、特に、関節リウマチ、I型糖尿病、ループス、乾癬、
・慢性炎症性疾患、特に、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、
・慢性神経炎症性疾患、特に、多発性硬化症、脳脊髄炎、
・免疫代謝疾患、特に、II型糖尿病、
・全身炎症により引き起こされる心臓血管疾患、特に、アテローム性動脈硬化症、
・移植片機能障害又は拒絶、特に、移植片対宿主病、並びに
・リンパ増殖性疾患、特に、T細胞リンパ腫又は移植後リンパ増殖性疾患
からなる群から選択される、化合物。
【請求項２】
T細胞の増殖及び/若しくは活性化及び/若しくは遊走並びに/又はT細胞による組織浸潤が有害効果を有する疾患又は障害、特にヒト疾患又はヒト障害の予防及び/又は治療における、請求項1に記載の使用のための化合物。
【請求項３】
1000ng/mlより低い濃度の化合物の存在下で、ヒトSIRPgのヒトCD47への物理的結合が、ELISA競合結合アッセイにおいて陰性対照と比較して60%を上回って阻害される、請求項1又は2に記載の使用のための化合物。
【請求項４】
ヒトSIRPaのヒトCD47への結合を予防も阻害もしない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項５】
ヒトシグナル調節タンパク質ベータ(SIRPb)に特異的に結合しない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
陰性対照と比較してT細胞の増殖を減少させ又は阻害し、特に、T細胞の増殖の減少又は阻害が20%を上回る、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
特に、医薬としての同時の、別々の又は逐次的な使用のための、
・請求項1〜6のいずれか一項に記載の少なくとも1つの特異的抗SIRPg化合物、並びに
・免疫療法剤、免疫抑制剤、アポトーシス促進剤、抗生物質及びプロバイオティクスからなる群から選択される少なくとも1つの第2の治療剤
を含む、組合せ製品。
【請求項８】
前記免疫抑制剤が、シクロスポリンA、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、ステロイド、抗TNF剤、抗IL-23剤からなる群から選択される、請求項7に記載の組合せ製品。
【請求項９】
抗SIRPg化合物が、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズするために好適であるかどうかを評価するための、配列番号45からなるポリペプチドの使用。
【請求項１０】
ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズするために好適である特異的抗SIRPg抗体を生産する方法であって、配列番号45のアミノ酸残基のエピトープからなる抗原を用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程を含む、方法。
【請求項１１】
ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズするために好適である抗SIRPg化合物を精製する方法であって、
i)配列番号45のアミノ酸残基からなるエピトープからなる又はそれを含むポリペプチドで表面をコーティングする工程、
ii)抗SIRPg化合物を、コーティングされた表面と共にインキュベートする工程、
iii)抗SIRPg化合物のエピトープへの結合を測定する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
治療に対する対象の応答を予測するインビトロの方法であって、
-  配列番号45からなるポリペプチドに特異的に結合する特異的抗SIRPg化合物を用いて、対象、特にヒト対象から以前に得られた試料中のSIRPgの発現レベルを決定する工程、及び
- SIRPgの発現レベルを非応答対象集団におけるSIRPgの発現レベルの代表的な値と比較する工程
を含み、
対象の試料中のSIRPgのより高い発現レベルが、治療に応答する対象を示す、方法。
【請求項１３】
・ヒトSIRPgに特異的に結合し、ヒトSIRPgのヒトCD47への結合をアンタゴナイズし、
・ヒトSIRPaのヒトCD47への結合を予防も阻害もせず、ヒトSIRPaに特異的に結合せず、
・任意選択的に、ヒトSIRPbに特異的に結合しない、
特異的抗SIRPg化合物を選択する方法であって、
配列番号45からなるエピトープを含む又はからなるポリペプチドに結合する化合物の能力を試験する工程を含み、化合物は、前記エピトープに特異的に結合する場合に特異的抗SIRPg化合物である、方法。
【国際調査報告】
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