(57)【要約】  本発明の主題は、抗体、抗体断片及び／又は非Ｉｇ足場を含む群から選択される抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）結合剤での処置下にある対象において治療をモニタリングするための方法であって、前記対象から得られた体液中の、中央領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）、Ｃ−末端プロアドレノメデュリン（ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ）及び／若しくはプロアドレノメデュリンＮ−末端２０ペプチド（ＰＡＭＰ）、又はそれらの断片を含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片のレベルを決定すること；並びにプレプロアドレノメデュリンの前記断片のレベルを、該対象の臨床的／医療的健康状態及び／又は有害転帰のリスク及び／又は治療方針を適合させるための要件と相関させること、を含む、方法である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（アミノ酸１−５２）に結合する抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体、抗体断片及び／又は非Ｉｇ足場を含む群から選択される結合剤での処置下にある対象における治療をモニタリングするための方法であって、
・  前記対象から得られた体液中の、中央領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）、Ｃ−末端プロアドレノメデュリン（ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ）及び／若しくはプロアドレノメデュリンＮ−末端２０ペプチド（ＰＡＭＰ）、又はそれらの断片を含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片のレベルを決定すること；並びに
・  ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＰＡＭＰを含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片の前記レベルを、前記対象の臨床的／医療的健康状態及び／又は有害転帰のリスク及び／又は治療方針を適合させるための要件と相関させること、
を含み、
・  そこで、前記断片のレベルの前記決定のために、少なくとも１種の結合剤が、それぞれ配列番号３、配列番号４及び配列番号５を含む群から選択されるアミノ酸配列内の領域に結合する、
方法。
【請求項２】
前記処置のための前記結合剤が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場であり、前記抗体又は断片又は足場が、アドレノメデュリンのＮ−末端部分ａａ１−２１：
ＹＲＱＳＭＮＮＦＱＧＬＲＳＦＧＣＲＦＧＴＣ；  配列番号１９
に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処置のための前記結合剤が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場であり、前記抗体又は断片又は足場が、アドレノメデュリンのＣ−末端部分ａａ４２−５２：
ＡＰＲＳＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ2；  配列番号２０
に結合する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記処置のための前記結合剤が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場であり、前記抗体又は断片又は足場が、アドレノメデュリンの中央領域部分ａａ２１−４２：
ＣＴＶＱＫＬＡＨＱＩＹＱＦＴＤＫＤＫＤＮＶＡ；  配列番号２１
に結合する、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記断片のレベルの決定が、少なくとも１回実施される、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記有害転帰が、臓器機能の増悪などの臨床状態の増悪、及び致死を含む群から選択される、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象が、疾患又は病気、例えば慢性又は急性疾患又は急性病に罹患している、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が罹患している前記疾患が、例えば髄膜炎、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症のような重度感染；糖尿病、癌のような他の疾患、例えば心不全、心筋梗塞、卒中、アテローム性硬化症のような急性及び慢性血管疾患；例えば敗血症性ショックのようなショック、並びに例えば腎機能障害、肝機能障害、灼熱感、手術、外傷のような臓器機能障害を含む群から選択されてもよい、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記治療方針が、補液蘇生、昇圧剤／変力物質、腎置換療法、抗生物質、ヒドロコルチゾン、インスリン、経腸栄養／非経口栄養を含む群から選択される、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも５アミノ酸であるＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＰＡＭＰを含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの前記断片のレベルが、それぞれＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ若しくはその断片及び／又はＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ若しくはその断片及び／又はＰＡＭＰ若しくはその断片を含む群から選択される少なくとも１種の結合剤を用いた免疫測定法により決定される、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記相関に関して、特定の閾値を超える、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／若しくはＰＡＭＰ、又はそれらの断片を含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの前記断片の高レベルが、有害転帰の高リスクの予報となり、そして／或いは特定の閾値未満のプレプロアドレノメデュリン又はその断片の前記断片のレベルが、有害転帰の低リスクの予報となる、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
プレプロアドレノメデュリンの断片のレベルの前記相関に関して、前記断片の前記レベルの前記決定が、少なくとも２回実施され、前記断片の測定された第一のレベルに比較した前記断片の第二の測定レベルの低下が、有害転帰の低リスクの予報となる、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
プレプロアドレノメデュリンの断片のレベルの前記相関に関して、前記断片の前記レベルの前記決定が、少なくとも２回実施され、前記断片の測定された第一のレベルに比較した前記断片の第二の測定レベルの上昇が、有害転帰の高リスクの予報となる、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記体液が、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び唾液を含む群から選択されてもよい、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象をリスク群に層別化するための、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、抗体、抗体断片及び／又は非Ｉｇ足場を含む群から選択される抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）結合剤での処置下にある対象において治療をモニタリングするための方法であって、前記対象から得られた体液中の、中央領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）、Ｃ−末端プロアドレノメデュリン（ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ）及び／若しくはプロアドレノメデュリンＮ−末端２０ペプチド（ＰＡＭＰ）、又はそれらの断片を含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片のレベルを決定すること；並びにプレプロアドレノメデュリンの前記断片のレベルを、該対象の臨床的／医療的健康状態及び／又は有害転帰のリスク及び／又は治療方針を適合させるための要件と相関させること、を含む、方法である。
【０００２】
発明の記載
ＡＤＭは、血管拡張及び血管の完全性を調節することが知られた循環ペプチドである。高い血漿ＡＤＭ濃度が、心血管疾患及び敗血症性ショックをはじめとする複数の生命を脅かす病気に関して記載されている。生物活性ＡＤＭ（バイオ−ＡＤＭ）の検出及び定量のための方法が、国際公開第２０１３０７２５０９号パンフレットにより記載されている。その中で、バイオ−ＡＤＭのアミド化Ｃ−末端及び中央部分に対するモノクローナル抗体が作製され、血漿中の生物活性ＡＤＭの定量のための免疫測定法に用いられた。
【０００３】
その上、ＡＤＭに結合する抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇ足場の投与が、重度の急性疾患又は急性病を有する患者において致死のリスクをかなり低下させ得ることが見いだされている。
【０００４】
近年の試験において、敗血症の誘導が動物実験で血漿バイオ−ＡＤＭの増加に導くことを、示すことができた。驚くべきことに、抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体の投与により、見かけの血漿ＡＤＭ濃度が、ビヒクル動物よりもかなり急速かつ高レベルに上昇した。内因性バイオ−ＡＤＭを上回る抗ＡＤＭ抗体の大幅なモル過剰を考慮すると、抗ＡＤＭ抗体の投与後に測定された血漿ＡＤＭ濃度は、実際には主に抗ＡＤＭ抗体と複合体化されたバイオ−ＡＤＭを表すと推定されなければならない。しかしビヒクル動物に比較した、抗ＡＤＭ抗体の投与後に観察された血漿バイオ−ＡＤＭの不釣り合いな増加は、より悪い転帰に関連しなかった。
【０００５】
事実、抗ＡＤＭ抗体での処置下では、（驚くべきことに）バイオ−ＡＤＭの測定が対象の有害転帰のリスクをモニタリングするのに適さないことが、見出された。対照的に、前記抗ＡＤＭ抗体が結合しないＡＤＭ前駆体ペプチドに由来する断片の測定は、抗ＡＤＭ抗体の投与により直後に影響を受けず、前記抗ＡＤＭ抗体での処置下の患者の臨床転帰と時間を経て相関するため、そのような条件でのＡＤＭ系の刺激又は下方制御をモニタリングするのに適する。
【背景技術】
【０００６】
該ペプチドアドレノメデュリン（ＡＤＭ）は、ヒト褐色細胞腫から単離された５２のアミノ酸；配列番号：１を含む新奇な血圧降下ペプチドとして、１９９３年に最初に記載された（Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  ”Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ：  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｖｏｌ．  １９２  （２）、  ｐｐ．  ５５３−５６０）。同年に、１８５のアミノ酸を含む前駆体ペプチドをコードするｃＤＮＡと、この前駆体ペプチドの完全なアミノ酸配列も、記載された。とりわけＮ−末端に２１アミノ酸のシグナル配列を含む該前駆体ペプチドは、「プレプロアドレノメデュリン」（ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭ）と称される。本明細書において、明記された全てのアミノ酸位置は通常、１８５のアミノ酸を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２による配列を有する、ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭに関係する。
【０００７】
成熟型アドレノメデュリンペプチドは、アミド化ペプチド（ＡＤＭ−ＮＨ2）であり、それは５２のアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）を含み、タンパク質分解切断により形成されるｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭのアミノ酸９５−１４６を含む。成熟型ＡＤＭ、バイオ−ＡＤＭ及びＡＤＭ−ＮＨ2は、本出願全体で同義語として用いられ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１による分子である。
【０００８】
今日まで、ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭの切断で形成されたペプチド断片のうちの実質的にわずかの断片のみ、詳細には生理学的活性ペプチドのアドレノメデュリン（ＡＤＭ）と、ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭ中のシグナルペプチドの２１アミノ酸に続く２０アミノ酸（２２−４１）を含むペプチドである「ＰＡＭＰ」のみが、より厳密に研究された。１９９３年のＡＤＭの発見及び特徴づけが、徹底した調査活動のきっかけとなり、その結果が、様々な批評文献で要約されており、本明細書の文脈では、特にＡＤＭに充てられる「ペプチド」の議論に見出されることが、それらの文献が参照される（Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．  ２００１．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｖｏｌ．  ２２：  １６９１、及びＥｔｏ，  Ｔ．  ２００１．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｖｏｌ．  ２２：１６９３−１７１１  ）。さらなる批評は、（Ｈｉｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  ２０００．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｖｏｌ．  ２１（２）：  １３８−１６７）である。
【０００９】
さらに、循環内及び他の生体液中で測定され得るＡＤＭの濃度が、複数の病的状況において、健常な対照人で見出される濃度を有意に上回ることが、見出された。したがってショックの急性期、並びに敗血症及び敗血症性ショックにおいて、うっ血性心不全、心筋梗塞、腎臓疾患、高血圧障害、糖尿病の患者におけるＡＤＭレベルが、異なる程度ではあるが有意に上昇する。ＰＡＭＰ濃度もまた、前記病的状況の一部で上昇するが、血漿レベルは、ＡＤＭに比較して低い（Ｅｔｏ  Ｔ．  ２００１．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｖｏｌ．  ２２：  １６９３−１７１１）。
【００１０】
さらに、通常は高濃度のＡＤＭが、敗血症又は敗血症性ショックで観察されるはずであることが知られている（Ｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２２：１６９３−１７１１；  Ｈｉｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ８１（４）：１４４９−１４５３；  Ｅｈｌｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １０５：  １５６−１６２；  Ｔｏｍｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２２：  １７８３−１７９４；  Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６０：  １３２−１３６；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２２：  １８３５−１８４０）。この知見は、敗血症及び他の重度症候群、例えばＳＩＲＳなどの患者の疾患経過の典型的現象として知られる典型的な血行力学的変動に関係する。アドレノメデュリンは、敗血症発症の際（Ｗａｎｇ，  Ｓｈｏｃｋ  １９９８，  １０（５）：３８３−３８４；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｓｕｒｇｅｒｙ  １３３（１２）：  １２９８−１３０４）、並びに数多くの急性及び慢性疾患において（Ｐａｒｌａｐｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３：５３−６１；  Ｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２１（２）：１３８−１６７）中心的役割を果たす。
【００１１】
今日までの科学的研究において、とりわけ、ＡＤＭが多機能的調節ペプチドと見なされ得ることが、見出された。ＡＤＭは、一部がグリシンにより伸長された不活性形態で、循環に放出される  （Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２４４（２）：  ５５１−５５５）。ＡＤＭに特異的で、その上、おそらくＡＤＭの効果を調整する結合タンパク質も、存在する（Ｐｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６（１５）：  １２２９２−１２３００）。
【００１２】
その上、ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭから形成された上述のさらなる生理学的活性ペプチドＰＡＭＰは、ＡＤＭと異なる作用機序を有するよう思えても、同様に血圧降下作用を呈することが見出されている（Ｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２２：１６９３−１７１１；  Ｈｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２１（２）：１３８−１６７；  Ｋｕｗａｓａｋｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４１４（１）：  １０５−１１０；  Ｋｕｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ａｎｎ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３６：  ６２２−６２８；  Ｔｓｕｒｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６９（２）：  ２３９−２４５；  Ｋａｎｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許第０  ６２２  ４５８号明細書）。
【００１３】
ＡＤＭを直接的に、又は同族前駆体ペプチドのより安定した断片を決定することにより間接的に、の何れかでＡＤＭの循環レベルを測定する複数の方法が、記載された。近年になり、循環する成熟型ＡＤＭを測定するアッセイを記載した方法が、発表された（Ｍａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４．  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  １８：  Ｒ３４）。
【００１４】
ＡＤＭ前駆体に由来する断片を定量するための他の方法、例えばＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５１（１０）：１８２３−９）、ＰＡＭＰ（Ｗａｓｈｉｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０２（２）：１０８１−７）及びＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ（欧州特許第２  １１１  ５５２号明細書）の測定が、記載された。全自動システムでの血漿中ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの測定のための市販の均一時間分解蛍光免疫測定法が、利用可能である（ＢＲＡＨＭＳ  ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ  ＫＲＹＰＴＯＲ；  ＢＲＡＨＭＳ  ＧｍｂＨ，  Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｃａｒｕｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４２（７−８）：７２５−８）。これらのペプチドは、同じ前駆体から化学量論比で作製されるため、それらの血漿レベルは、特定の度合いまで相関される。
【００１５】
ＡＤＭの血漿濃度は、心不全患者では上昇し、疾患の重症度に相関する（Ｈｉｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １６０：  ２９７−３０３；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｈｅａｒｔ  ８６：  １５５−１６０）。高度の血漿ＡＤＭは、これらの対象における非依存的な負の予後指標である（Ｐｏｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ５４：  ２３３−２４６）。
【００１６】
心不全におけるＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの役割が、複数の試験で探索された。ＢＡＣＨ試験（Ｍａｉｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ５５：  ２０６２−２０７６）において、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、９０日目の死亡に関して強力な予兆となり、ナトリウム利尿ペプチドを超える予兆的価値を加えた。続くＰＲＩＤＥ試験のデータ（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２．  Ｅｕｒ．  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  ３３：  ２１９７−２２０５）  は、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのための潜在的な予兆的役割を強化し、患者の間ではＭＲ−ｐｒｏＡＤＭが、１年目の致死について最良の曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。同様に、慢性心不全（ＣＨＦ）患者におけるＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルは、疾患の重症度に強く相関され、高レベルのペプチドが、追跡調査１２ヶ月目の高い死亡リスクに強く関連づけられた（ｖａｎ  Ｈａｅｈｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ  １２：  ４８４−４９１；  Ａｄｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ  １１：  ３６１−３６６）。
【００１７】
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、急性非代償性心不全の患者における処置の際に研究され（Ｂｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２．  Ｃｏｎｇｅｓｔ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  １８  （２）：  ９１−９７）、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭレベルが急性治療の際に上昇する傾向がある患者は、持続的うっ血に関連する所見を有した。治療後１２〜２４時間の期間に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ上昇を有する患者は、末梢浮腫を増加させた。Ｋａｉｓｅｒらは、単心室患者においてＭＲ−ｐｒｏＡＤＭを測定した（Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４．  Ｅｕｒｏｐ  Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ  １６：  １０８２−１０８８）。フォンタン循環術ができない（腹水及び末梢浮腫を示す）患者におけるレベルは、フォンタン術が不能でない患者に比較して有意に高かった。その上、Ｅｉｓｅｎｈｕｔは、アドレノメデュリンレベルの低下に導く処置が肺炎及び敗血症における肺胞浮腫の重症度及び度合いを低下させ得るか否かを思索した（Ｅｉｓｅｎｈｕｔ  ２００６．  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  １０：  ４１８）。
【００１８】
敗血症の診断及び予後におけるＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの役割が、幾つかの試験で研究された。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、敗血症患者とＳＩＲＳを有する非敗血症患者とを識別するためのバイオマーカーとして記載された（Ｃｈｒｉｓｔ−Ｃｒａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  ９：  Ｒ８１６−８２４；  Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ５１：  １０５９−１０６７）。その上、複数の試験で、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭを敗血症、重度敗血症及び敗血症性ショックにおける予後バイオマーカーとして報告された（Ｃｈｒｉｓｔ−Ｃｒａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  ９：  Ｒ８１６−８２４；  Ｓｕｂｅｒｖｉｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２．  Ｓｗｉｓｓ  Ｍｅｄ  Ｗｋｌｙ  １４２：  ｗ１３５４２；  Ｇｕｉｇｉｎａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ３５：１８５９−１８６７；  ＤＥ  ＬＡ  Ｔｏｒｒｅ−Ｐｒａｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６．  Ｍｉｎｅｒｖａ  Ａｎｅｓｔｅｓｉｏｌ  ８２：  ７６０−７６６；  Ａｎｄａｌｕｚ−Ｏｊｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  ７１：１３６−１３９）。
【００１９】
国際公開第２００４／０９７４２３（Ａ１）号パンフレットには、心血管障害の診断、予後及び処置のための、アドレノメデュリンに対する抗体の使用が記載されている。ＡＤＭ受容体を遮断することによる疾患の処置もまた、当該技術分野で記載されており（例えば、国際公開第２００６／０２７１４７（Ａ１）号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／欧州特許第２００５／０１２８４４号明細書）、前記疾患は、敗血症、敗血症性ショック、心血管疾患、感染、皮膚科学的疾患、内分泌性疾患、代謝疾患、胃腸病学的疾患、癌、炎症、血液疾患、呼吸器疾患、筋骨格疾患、神経疾患、泌尿器疾患であり得る。
【００２０】
ＡＤＭに結合する抗ＡＤＭ抗体又は抗ＡＤＭ抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇ足場の投与が、重度の急性疾患又は急性病を有する患者において致死のリスクをかなり低下させ得ることが、見出された（国際公開第２０１３／０７２５１０号パンフレット、国際公開第２０１３０７２５１１号パンフレット、国際公開第２０１３０７２５１２号パンフレット、国際公開第２０１３０７２５１３号パンフレット、国際公開第２０１３０７２５１４号パンフレット）。
【発明の概要】
【００２１】
本出願の主題は、配列番号１（アミノ酸１−５２）に結合する抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体、抗体断片及び／又は非Ｉｇ足場を含む群から選択される結合剤での処置下にある対象において治療をモニタリングするための方法であって、
・  前記対象から得られた体液中の、中央領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）、Ｃ−末端プロアドレノメデュリン（ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ）及び／若しくはプロアドレノメデュリンＮ−末端２０ペプチド（ＰＡＭＰ）、又はそれらの断片を含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片のレベルを決定すること；並びに
・  ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＰＡＭＰを含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片の前記レベルを、該対象の臨床的／医療的健康状態及び／又は有害転帰のリスク及び／又は治療方針を適合させるための要件と相関させること、
を含み、
・  そこで、前記断片のレベルの決定のために、少なくとも１種の結合剤が、それぞれ配列番号３、配列番号４及び配列番号５を含む群から選択されるアミノ酸配列内の領域に結合する、
方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】２ヒットブタモデルにおける試験タイムスケジュール
【図２Ａ】血漿バイオ−ＡＤＭ（Ａ）及びＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（Ｂ）：両群について、平均値±ＳＥＭが、示されている。バイオ−ＡＤＭ（Ａ）では、相互作用（７時間〜１９時間、多変量、時間*群）：０．００３
【図２Ｂ】血漿バイオ−ＡＤＭ（Ａ）及びＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（Ｂ）：両群について、平均値±ＳＥＭが、示されている。バイオ−ＡＤＭ（Ａ）では、相互作用（７時間〜１９時間、多変量、時間*群）：０．００３
【図３】補液蘇生：両群について、平均値±ＳＥＭが、示されている。
【図４】ノルアドレナリン要求の頻度。標的ＭＡＰ／群に達するために補液蘇生に加えてノルアドレナリンを要求した動物のパーセンテージが、示される。カイ二乗検定（１９時間）：０．０１４。
【図５】血漿ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭと治療の成功の依存性：示されるのは、３群：ＨＡＭ８１０１処置とノルアドレナリン要求（ショック）、ＨＡＭ８１０１処置とノルアドレナリン要求せず（非ショック）、ビヒクル（全てがノルアドレナリンを要求）、での平均値±ＳＥＭである。
【図６】２０ｍｇ／ｋｇ  ＨＡＭ２３０２注射の３時間後のアドレノメデュリン濃度の比較（ｎ＝３）。処置動物での平均Ａｂ濃度が、以下のグラフに表されている。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書で用いられる用語「対象」は、生存するヒト又は非ヒトの生物体をいい、好ましくは本明細書における対象は、ヒト対象であり、前記対象は、疾患又は病気、例えば慢性又は急性疾患又は急性病に罹患している。そのような疾患は、例えば髄膜炎、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症のような重度感染；糖尿病、癌のような他の疾患、例えば心不全、心筋梗塞、卒中、アテローム性硬化症のような急性及び慢性血管疾患；例えば敗血症性ショックのようなショック、並びに例えば腎機能障害、肝機能障害、灼熱感、手術、外傷のような臓器機能障害を含む群から選択されてもよい。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「ＰＡＭＰ」は、ＰＡＭＰの両方の循環形態、即ち生物学的に不活性のＣ−末端グリシン伸長ＰＡＭＰ（ＰＡＭＰ−Ｇｌｙ）及び生物学的に活性のＣ−末端アミド化ＰＡＭＰ（ＰＡＭＰ−アミド）を含む。
【００２５】
本明細書全体で、本発明による「抗ＡＤＭ抗体」又は「抗ＡＤＭ抗体断片」又は「抗ＡＤＭ非Ｉｇ足場」は、ＡＤＭに結合することが可能であり、したがってＡＤＭに向けられ、したがって「抗ＡＤＭ抗体」又は「抗ＡＤＭ抗体断片」又は「抗ＡＤＭ非Ｉｇ足場」と称することができる。
本発明によれば、ＡＤＭに結合する抗ＡＤＭ抗体若しくは抗ＡＤＭ抗体断片、又はＡＤＭに結合する抗ＡＤＭ非Ｉｇ足場の投与は、好ましくは全身適用である。
【００２６】
本出願の別の実施形態において、体液中で決定され得るプレプロアドレノメデュリンの断片は、
配列番号３（プロアドレノメデュリンＮ−２０末端ペプチド、ＰＡＭＰ）：ｐｒｅｐｒｏＡＤＭのアミノ酸２２−４４
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
配列番号４（中央領域プロアドレノメデュリン、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）：ｐｒｅｐｒｏＡＤＭのアミノ酸４５−９２
ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
配列番号５（Ｃ−末端プロアドレノメデュリン、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ）：ｐｒｅｐｒｏＡＤＭのアミノ酸１４８−１８５
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL 
を含む群から選択される。
【００２７】
本出願の別の実施形態において、少なくとも５個のアミノ酸を有するプレプロアドレノメデュリンの前記断片は、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（配列番号４）、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ（配列番号５）及び／又はＰＡＭＰ（配列番号３）を含む群から選択される。
【００２８】
本出願の一実施形態において、ｐｒｅｐｒｏＡＤＭの断片及び／又はその断片のレベルは、少なくとも１種の結合剤を使用することにより決定され、前記結合剤は、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの配列（配列番号４）内に含まれる領域に結合する。
【００２９】
本出願の別の実施形態において、ｐｒｅｐｒｏＡＤＭの断片及び／又はその断片のレベルは、少なくとも１種の結合剤を使用することにより決定され、前記結合剤は、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭの配列（配列番号５）内に含まれる領域に結合する。
【００３０】
本出願の別の実施形態において、ｐｒｅｐｒｏＡＤＭの断片及び／又はその断片のレベルは、少なくとも１種の結合剤を使用することにより決定され、前記結合剤は、ＰＡＭＰの配列（配列番号３）内に含まれる領域に結合する。
【００３１】
本出願の特別な実施形態における主題は、前記断片が配列番号：４によるＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又は配列番号：５によるＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又は配列番号：３によるＰＡＭＰから選択され得る、方法である。
【００３２】
本出願の別の実施形態は、アドレノメデュリンのＮ−末端部分ａａ１−２１に結合する対象の処置のための該抗ＡＤＭ抗体が、ＡＤＭに結合するヒトＣＤＲグラフト化抗体又はその抗体断片であり、該ヒトＣＤＲグラフト化抗体又はその抗体断片が、
配列番号６：
GYTFSRYW配列番号７：
ILPGSGST
及び／若しくは
配列番号８：
TEGYEYDGFDY
を含む抗体重鎖（Ｈ鎖）を含み、そして／又は
配列番号９：
QSIVYSNGNTY
配列番号２８：（３アミノ酸の長さのため配列表に挙げられていない）
RVS
及び／若しくは
配列番号１０：
FQGSHIPYT
を含む抗体軽鎖（Ｌ鎖）をさらに含む、
先行の実施形態による方法に関する。
【００３３】
本出願の別の具体的実施形態において、該対象の処置のための抗ＡＤＭ抗体は、該重鎖が、
配列番号６：
GYTFSRYW
配列番号７：
ILPGSGST
配列番号８：
TEGYEYDGFDY
を含む群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含み、
そして該軽鎖が、
配列番号９：
QSIVYSNGNTY
配列番号２８：
RVS
配列番号１０：
FQGSHIPYT
を含む群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、
ＡＤＭに結合するヒトモノクローナル抗体又はその抗体断片である。
【００３４】
本出願の別の実施形態において、該対象の処置のための抗ＡＤＭ抗体は、該重鎖が、配列
配列番号６：
GYTFSRYW
配列番号７：
ILPGSGST
配列番号８：
TEGYEYDGFDY
を含み、
そして該軽鎖が、配列
配列番号９：
QSIVYSNGNTY
配列番号２８：
RVS
配列番号１０：
FQGSHIPYT
を含む、
ＡＤＭに結合するヒトモノクローナル抗体又はその抗体断片である。
【００３５】
本出願の別の実施形態は、該処置のための前記抗体又は断片が、ＡＤＭに結合するヒトモノクローナル抗体若しくは断片、又はその抗体断片であり、該重鎖が、配列
ＣＤＲ１：配列番号６：
GYTFSRYW
ＣＤＲ２：配列番号７：
ILPGSGST
ＣＤＲ３：配列番号８：
TEGYEYDGFDY
を含み、
そして該軽鎖が、配列
ＣＤＲ１：配列番号９：
QSIVYSNGNTY
ＣＤＲ２：配列番号２８：
RVS
ＣＤＲ３：配列番号１０：
FQGSHIPYT
を含む、
先行の実施形態の方法に関する。
【００３６】
本出願の別の実施形態は、該処置のための前記抗体又は断片が、ＶＨ領域として以下の配列：
配列番号１１（ＡＭ−ＶＨ−Ｃ）：
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILP
GSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
配列番号１２（ＡＭ−ＶＨ１）：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
配列番号１３（ＡＭ−ＶＨ２−Ｅ４０）：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
配列番号１４（ＡＭ−ＶＨ３−Ｔ２６−Ｅ５５）：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK；又は
配列番号１５（ＡＭ−ＶＨ４−Ｔ２６−Ｅ４０−Ｅ５５）：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK;
を含み、
そしてＶＬ領域として以下の配列：
配列番号１６（ＡＭ−ＶＬ−Ｃ）：
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYR
VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLE
IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C
配列番号１７（ＡＭ−ＶＬ１）：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYR
VSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKL
EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN
SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG
EC
配列番号１８（ＡＭ−ＶＬ２−Ｅ４０）：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
を含む、
先行の実施形態の方法に関する。
【００３７】
本出願の別の実施形態は、該処置のための前記抗体又は断片が、重鎖として以下の配列：
配列番号２６：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGS
TNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTT
VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHT 
FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 
を含み、
そして軽鎖として以下の配列：
配列番号２７
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNR
FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAP
SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD
STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
を含む、
先行の実施形態の方法に関する。
【００３８】
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（配列番号４）、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ（配列番号５）及び／又はＰＡＭＰ（配列番号３）を含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片のレベルが、少なくとも１種のアミノ酸が損失しているそれらの断片も包含し、前記断片が、少なくとも５アミノ酸、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸、最も好ましくは少なくとも１５アミノ酸の長さを有することが、理解されるであろう。
【００３９】
本出願の一実施形態は、プレプロアドレノメデュリンの断片（少なくとも５アミノ酸の）のレベルが、前記断片（少なくとも５アミノ酸の）への結合剤を使用することにより決定される、先行の実施形態の方法に関する。
【００４０】
本出願の別の実施形態は、該結合剤が、プレプロアドレノメデュリン又はその断片（少なくとも５アミノ酸の）の断片に結合する抗体、抗体断片又は非Ｉｇ足場を含む群から選択される、先行の実施形態の方法に関する。
【００４１】
本出願による体液は、血液試料である。血液試料は、全血、血清及び血漿を含む群から選択されてもよい。本出願の一実施形態において、前記試料は、ヒトクエン酸血漿、ヘパリン血漿及びＥＤＴＡ血漿を含む群から選択される。
【００４２】
本発明による抗体は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされた１つ又は複数のポリペプチドを含むタンパク質である。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ）、ガンマ（ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4）、デルタ（ＩｇＤ）、イプシロン（ＩｇＥ）及びミュー（ＩｇＭ）定常領域遺伝子に加え、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。全長免疫グロブリン軽鎖は、一般に約２５Ｋｄ又は２１４アミノ酸の長さである。全長免疫グロブリン重鎖は、一般に約５０Ｋｄ又は４４６アミノ酸の長さである。軽鎖は、ＮＨ2−末端の可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸の長さ）と、ＣＯＯＨ−末端のカッパ又はラムダ定常領域遺伝子と、によりコードされる。重鎖は同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸の長さ）と他の定常領域遺伝子の内の１つと、によりコードされる。
【００４３】
抗体の基本構造単位は、一般に、免疫グロブリン鎖の２つの同一対のからなる四量体であり、各対は、１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する。各対において、該軽鎖及び重鎖可変領域は、抗原に結合し、該定常領域は、エフェクター機能を仲介する。免疫グロブリンはまた、例えばＦｖ、Ｆａｂ及び（Ｆａｂ’）2に加え、二機能性ハイブリッド抗体及び一本鎖をはじめとする種々の他の形態で存在する（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７：１０５；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８５：５８７９−５８８３；  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；  Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８４  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  Ｎ．Ｙ．，  ２ｎｄ  ｅｄ．；  Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｏｄ  １９８６．  Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：１５−１６）。免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域により中断されたフレームワーク領域を含む（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｅ．  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  １９８３参照）。先に述べられた通り、該ＣＤＲは、主として抗原のエピトープへの結合を担う。免疫複合体が、抗原に特異的に結合されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体、又は機能性抗体断片などの抗体である。
【００４４】
キメラ抗体は、軽鎖及び重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン可変及び定常領域遺伝子から、典型的には遺伝子操作により、構築されている抗体である。例えばマウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変セグメントが、カッパ及びガンマ１又はガンマ３などのヒト定常セグメントに接続され得る。したがって一例において、治療性キメラ抗体は、マウス抗体からの可変又は抗原結合ドメインと、ヒト抗体からの定常又はエフェクタードメインとで構成されたハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳動物種が用いられ得る、又は可変領域が分子技術により生成され得る。キメラ抗体を作る方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，８０７，７１５号明細書を参照されたい。「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（マウス、ラット又は合成など）免疫グロブリンからの１種又は複数のＣＤＲと、を含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と称される。一実施形態において、ＣＤＲの全てが、ヒト化免疫グロブリン内のドナー免疫グロブリンからのものである。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、即ち、約９５％以上同一など、少なくとも８５〜９０％同一でなければならない。このため、ことによるとＣＤＲ以外の、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分が、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリン又は抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから獲得されたアミノ酸による限定された数の置換を有していてもよい。ヒト化又は他のモノクローナル抗体は、追加の保存的アミノ酸置換を有し得るが、それは、抗原結合又は他の免疫グロブリン機能に及ぼす影響を実質的に有さない。好ましい保存的置換は、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；及びｐｈｅ、ｔｙｒなどの置換である。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子操作により構築され得る（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書参照）。ヒト抗体は、軽鎖及び重鎖遺伝子がヒト起源のものである抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の方法を利用して作製され得る。ヒト抗体は、該当する抗体を分泌するヒトＢ細胞を不死化することにより生成され得る。不死化は、例えばＥＢＶ感染により、又はヒトＢ細胞を骨髄腫若しくはハイブリドーマ細胞と融合してトリオーマ細胞を生成することにより、遂行され得る。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法によっても生成され得る（例えば、Ｄｏｗｅｒら、国際出願ＰＣＴ公報の国際公開第９１／１７２７１号パンフレット；  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際出願ＰＣＴ公報の国際公開第９２／００１０４７号パンフレット；及びＷｉｎｔｅｒ、国際出願ＰＣＴ公報の国際公開第９２／２０７９１号パンフレット参照）、又はヒトコンビナトリアルモノクロ���ナル抗体ライブラリーから選択され得る（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓのウェブサイト参照）。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子を宿したトランスジェニック動物を使用することにより調製され得る（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際出願ＰＣＴ公報の国際公開第９３／１２２２７号パンフレット；及びＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、国際出願ＰＣＴ公報の国際公開第９１／１０７４１号パンフレット参照）。
【００４５】
したがって該抗体は、当該技術分野で公知のフォーマットを有していてもよい。例は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体である。好ましい実施形態において、本発明による抗体は、例えばＩｇＧなどの組換え技術で生成された抗体、典型的な全長免疫グロブリン、又は例えば化学的カップリング抗体（断片抗原が結合した）などの重鎖及び／若しくは軽鎖のＦ−可変ドメインを少なくとも含む抗体断片、例えば非限定的にＦａｂミニ抗体、一本鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価Ｆａｂ抗体、例えばＦａｂ−Ｖ５Ｓ×２；ＣＨ３ドメインと共に二量体化された二価Ｆａｂ（ミニ抗体）；例えばｄＨＬＸドメインの二量体化を介して、例えば異種ドメインの補助による多量体化を介して形成された、二価Ｆａｂ又は多価Ｆａｂ、例えばＦａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳ×２；例えばＧと異なるクラスからの、Ｆ（ａｂ‘）２断片、ｓｃＦｖ断片、多量体化された多価又は／及び多重特異性ｓｃＦｖ断片、二価及び／又は二重特異性ダイアボディー、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）、三機能性抗体、多価抗体；シングルドメイン抗体、例えばラクダ又は魚免疫グロブリンに由来するナノボディー、並びに多数の他のものなどのＦａｂ断片などである。
【００４６】
抗体に加え、標的分子と複合体化する他のバイオポリマー足場が、当該技術分野で周知であり、高度に標的特異性のバイオポリマーの作製に用いられてきた。例は、アプタマー、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ及びコノトキシンである。
【００４７】
好ましい実施形態において、該抗体フォーマットは、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦａｂ断片、（Ｆａｂ）２断片及びｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を含む群から選択される。別の好ましい実施形態において、該抗体フォーマットは、ｓｃＦａｂ断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、及びＰＥＧ化断片などの生物学的利用性を最適化されたそれらのコンジュゲートを含む群から選択される。
【００４８】
非Ｉｇ足場は、タンパク質足場であってもよく、リガンド又は抗原に結合することが可能であるため、抗体模倣体として用いられてもよい。非Ｉｇ足場は、テトラネクチンに基づく非Ｉｇ足場（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２８９９５号明細書）、フィブロネクチン足場（例えば、欧州特許第１２６６  ０２５号明細書に記載；リポカリンに基づく足場（（例えば、国際公開第２０１１／１５４４２０号パンフレットに記載）；ユビキチン足場（例えば、国際公開第２０１１／０７３２１４号パンフレットに記載）、導入足場（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）（例えば、米国特許出願公開第２００４／００２３３３４号明細書に記載）、プロテインＡ足場（例えば、欧州特許第２２３１８６０号明細書に記載）、アンキリンリピートに基づく足場（例えば、国際公開第２０１０／０６０７４８号パンフレットに記載）、マイクロタンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、好ましくはシスチンノットを形成するマイクロタンパク質の足場（例えば、欧州特許第２３１４３０８号明細書に記載）、Ｆｙｎ  ＳＨ３ドメインに基づく足場（例えば、国際公開第２０１１／０２３６８５号パンフレットに記載）、ＥＧＦＲ−Ａドメインに基づく足場（例えば、国際公開第２００５／０４０２２９号パンフレットに記載）、及びクーニッツドメインに基づく足場（例えば、欧州特許第１９４１８６７号明細書に記載）を含む群から選択されてもよい。
【００４９】
本出願の一実施形態は、該対象の処置のための結合剤が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場であり、前記抗体又は断片又は足場が、アドレノメデュリンのＮ−末端部分ａａ１−２１：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC；  配列番号１９
に結合する、
先行の実施形態の方法に関する。
【００５０】
本出願の別の実施形態は、該対象の処置のための結合剤が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場であり、前記抗体又は断片又は足場が、アドレノメデュリンのＣ−末端部分ａａ４２−５２−アミド：
APRSKISPQGY-NH2；配列番号２０
に結合する、
先行の実施形態の方法に関する。
【００５１】
本出願の別の実施形態は、該対象の処置のための結合剤が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場であり、前記抗体又は断片足場が、アドレノメデュリンの中央領域部分ａａ２１−４２：
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA；  配列番号２１
に結合する、
先行の実施形態の方法に関する。
【００５２】
本出願の別の実施形態は、前記断片のレベルの決定が少なくとも１回実施される、先行の実施形態による方法に関する。
【００５３】
本出願の別の実施形態は、前記断片のレベルの決定が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場での処置を開始した後に少なくとも１回実施される、先行の実施形態による方法に関する。
【００５４】
本出願の別の実施形態は、前記断片のレベルの決定が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場での処置を開始した後に患者１名において１回より多く実施される、先行の実施形態による方法に関する。
【００５５】
本出願の別の実施形態は、前記断片のレベルの決定が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場での処置を開始した後に患者１名において２回より多く実施される、先行の実施形態による方法に関する。
【００５６】
本出願の別の実施形態は、前記断片のレベルの決定が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場での処置を開始した後に３回より多く実施される、先行の実施形態による方法に関する。
【００５７】
本出願の別の実施形態は、有害転帰が、臓器機能の増悪などの臨床状態の増悪、及び致死を含む群から選択される、先行の実施形態による方法に関する。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「臨床状態の増悪」は、症状の増悪（例えば、疾患の進行を定義する臨床パラメータの変化）、入院の必要性又は死亡に関係し、医療スコア（例えば、急性生理学と慢性健康評価（ＡＰＡＣＨＥ、ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ））により評価されてもよい。
【００５９】
本発明による用語「臓器機能の増悪」は、腎機能の増悪（ＷＲＦ）、心血管機能の増悪、肝機能の増悪及び呼吸器機能の増悪を包含し、逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコア、多臓器障害スコア（ＭＯＤＳ）又は簡易急性生理学的スコア（ＳＡＰＳ、ＳＡＰＳＩＩ）の上昇により評価されてもよい。
【００６０】
本出願の別の実施形態は、前記対象が敗血症又は敗血症性ショックに罹患している、先行の実施形態による方法に関する。
【００６１】
全身性炎症宿主反応（ＳＩＲＳ）のための以下の臨床基準において、敗血症、敗血症性ショックが、定義されるであろう：
１）以下の症状の少なくとも２つにより特徴づけられる全身性炎症宿主反応（ＳＩＲＳ）：
・  患者が低血圧を呈している（平均動脈圧が＜６５ｍｍＨｇ未満である）
・  ＞４ｍｍｏｌ／Ｌである高い血清乳酸レベル
・  血糖値＞７．７ｍｍｏｌ／Ｌ（糖尿病がない）
・  中心静脈圧が範囲８〜１２ｍｍＨｇ内でない
・  尿量が＜０．５ｍＬ×ｋｇ-1×ｈｒ-1である
・  中心静脈（上大静脈）酸素飽和度が＜７０％、又は混合静脈で＜６５％である
・  心拍数が＞９０拍／分である
・  体温＜３６℃又は＞３８℃
・  呼吸数２０／分
白血球細胞数＜４又は＞１２×１０9／Ｌ（白血球）；＞１０％未熟好中球
【００６２】
２）敗血症
・  １）に挙げられた症状の少なくとも２つ、そして追加的に新しい感染の臨床上の疑いがあることに続いて、患者が低血圧を呈している（平均動脈圧が＜６５ｍｍＨｇである）
・  ＞４ｍｍｏｌ／Ｌである高い血清乳酸レベル
・  血糖値＞７．７ｍｍｏｌ／Ｌ（糖尿病がない）
・  中心静脈圧が範囲８〜１２ｍｍＨｇ内でない
・  尿量が＜０．５ｍＬ×ｋｇ-1×ｈｒ-1である
・  中心静脈（上大静脈）酸素飽和度が＜７０％、又は混合静脈＜６５％である
・  心拍数が＞９０拍／分である
・  体温＜３６℃又は＞３８℃
・  呼吸数＞２０／分
・  白血球細胞数＜４又は＞１２×１０9／Ｌ（白血球）；＞１０％未熟好中球
そして追加的に新しい感染の臨床上の疑いが：
・  咳／痰／胸部痛
・  腹痛／膨満感／下痢
・  線状感染（ｌｉｎｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）
・  心内膜炎
・  排尿障害
・  頸部硬直を伴う頭痛
・  蜂巣炎／創傷／関節感染
・  任意の感染について陽性の微生物検査
である。
【００６３】
３）重度敗血症
敗血症が患者において症状発現されていることを条件とし、任意の臓器機能障害の臨床上の疑いが：
・  収縮期血圧＜９０／平均未満；＜６５ｍｍＨｇ
・  乳酸＞２ｍｍｏｌ／Ｌ
・  ビリルビン＞３４μｍｏｌ／Ｌ
・  尿量＜２時間で０．５ｍＬ／ｋｇ／ｈ
・  クレアチニン＞１７７μｍｏｌ／Ｌ
・  血小板数＜１００×１０9／Ｌ
・  Ｏ2が与えられない場合にＳｐＯ2＞９０％
である。
【００６４】
４）敗血症性ショック
３）で挙げられた末端器官の機能障害の少なくとも１つの兆候が、症状発現されている。処置に応答しない難治性低血圧があり、静脈内流体投与のみで患者の血圧が低血圧になるのを防ぐのに不充分である場合に、敗血症性ショックが指摘される。
【００６５】
ごく最近になり、敗血症及び敗血症性ショックの定義が、敗血症定義特別委員会により再検査及び更新されており（Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６．  ＪＡＭＡ  ３１５（８）：  ８０１−８１０）、それは参照により本明細書に援用される。敗血症は、感染への体の応答が自身の組織及び臓器を傷害する場合の、下方制御された感染への宿主応答により誘発された生命を脅かす臓器機能障害と定義される。臓器機能障害は、感染の結果として２ポイント以上の総ＳＯＦＡスコアの急性変動として同定され得る。ベースラインＳＯＦＡスコアは、先在の臓器機能障害を有することが分かっていない患者では零であると仮定され得る。２以上のＳＯＦＡスコアは、感染の疑いがある一般的病院人口におけるおよそ１０％の全致死リスクを表す。中等度の機能障害を示した患者であっても、さらに悪化する可能性があり、この病気の重篤性と、まだ開始されてないならば迅速かつ適当な介入の必要性が強調される。
【００６６】
敗血症性ショックは、根底にある循環及び細胞／代謝異常が致死率を実質的に高めるのに充分、顕著である敗血症のサブセットである。敗血症性ショックの患者は、適度な緊急輸液療法を行っても６５ｍｍＨｇ以上のＭＡＰを維持するのに昇圧剤を必要とし、２ｍｍｏｌ／Ｌ（１８ｍｇ／ｄＬ）を超える血清乳酸レベルを有する、持続的な低血圧を伴う敗血症の臨床構成概念により同定され得る。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ（「急性生理学と慢性健康評価ＩＩ」）は、疾患重症度分類システムであり（Ｋｎａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８５．  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １３  （１０）：  ８１８−２９）、集中治療室の１つである。それは、ＩＣＵへの患者入院の２４時間以内に適用され、０〜７１の整数スコアが、複数の尺度に基づいて計算され；高いスコアほど、より重度の疾患及びより高い死亡リスクに対応する。
【００６９】
ＳＡＰＳＩＩは、疾患重症度の分類システムである（Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３．  ＪＡＭＡ  ２７０：２９５７−２９６３）。その名前は、「簡易急性生理学的スコア」を表し、複数の集中治療室（ＩＣＵ）スコアリングシステムの１つであり、ＩＣＵに入院した患者の疾患重症度を測定するように設計された。
【００７０】
本出願の別の実施形態は、前記治療方針が、補液蘇生、昇圧剤／変力物質、腎置換療法、抗生物質、ヒドロコルチゾン、インスリン、経腸栄養／非経口栄養を含む群から選択される、先行の実施形態による方法に関する。
【００７１】
本出願の別の実施形態は、前記抗ＡＤＭ抗体又は抗体断片又は非Ｉｇ足場が、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＰＡＭＰを含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片に結合しない、先行の実施形態による方法に関する。
【００７２】
本出願の別の実施形態は、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＰＡＭＰを含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの前記断片が、それぞれ少なくとも５アミノ酸の長さである、先行の実施形態による方法に関する。
【００７３】
本出願の別の実施形態は、少なくとも５アミノ酸であるＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＰＡＭＰを含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの前記断片のレベルが、それぞれＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ若しくはその断片及び／又はＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ若しくはその断片及び／又はＰＡＭＰ若しくはその断片を含む群から選択される少なくとも１種の結合剤を用いた免疫測定法により決定される、先行の実施形態による方法に関する。
【００７４】
本出願の具体的実施形態において、免疫測定法は、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はその断片（少なくとも５アミノ酸を有する）のレベルを決定するために用いられ、そのような免疫測定法は、サンドイッチアッセイ、好ましくは全自動アッセイである。
【００７５】
本出願の具体的実施形態において、免疫測定法は、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はその断片（少なくとも５アミノ酸を有する）のレベルを決定するために用いられ、そのような免疫測定法は、サンドイッチアッセイ、好ましくは全自動アッセイである。
【００７６】
本出願の具体的実施形態において、免疫測定法は、ＰＡＭＰ及び／又はその断片（少なくとも５アミノ酸を有する）のレベルを決定するために用いられ、そのような免疫測定法は、サンドイッチアッセイ、好ましくは全自動アッセイである。
【００７７】
本出願の一実施形態において、それぞれＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＰＡＭＰのレベルを決定するために用いられる該免疫測定法は、全自動アッセイシステムを要求せずにテストを患者の付近で１時間未満で実施することが可能なテスト技術である、いわゆるＰＯＣテスト（ポイント・オブ・ケア）であってもよい。この技術の一例が、イムノクロマトグラフィーテスト技術である。
【００７８】
本出願の一実施形態において、そのような免疫測定法は、制限ではないが、酵素標識、化学発光標識、電気化学的発光標識、好ましくは全自動アッセイをはじめとする検出技術の任意種類を利用したサンドイッチ免疫測定法である。
【００７９】
本発明の一実施形態において、そのような免疫測定法は、酵素標識サンドイッチアッセイである。自動又は全自動アッセイの例は、以下のシステムの１つに用いられ得るアッセイを含む：Ｒｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｃｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、Ｂｒａｈｍｓ  Ｋｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、ＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘＶｉｄａｓ（登録商標）、Ａｌｅｒｅ  Ｔｒｉａｇｅ（登録商標）。
【００８０】
種々の免疫測定法が、公知であり、本発明のアッセイ及び方法に用いられてもよく、これらとして、放射性免疫測定法（「ＲＩＡ」）、均一型競合的酵素免疫分析法（「ＥＭＩＴ」）、酵素免疫測定法（「ＥＬＩＳＡ」）、アポ酵素再活性化免疫測定法（「ＡＲＩＳ」）、ディップスティック免疫測定法及びイムノクロマトグラフィーアッセイが挙げられる。
【００８１】
本発明の具体的実施形態は、前記２種の結合剤の少なくとも一方が、検出されるために標識されている。
【００８２】
好ましい検出方法は、例えば放射性免疫測定法（「ＲＩＡ」）、化学発光−及び蛍光−免疫測定法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づくビーズアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイなどの様々なフォーマット、及び例えばイムノクロマトグラフィーストリップテストなどの迅速なテストフォーマットの免疫測定法を含む。
【００８３】
好ましい実施形態において、前記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される。
【００８４】
該アッセイは、均一型又は不均一型アッセイ、拮抗型及び非拮抗型アッセイであり得る。一実施形態において、該アッセイは、非拮抗型免疫測定法であるサンドイッチアッセイの形態であり、そこでは検出及び／又は定量される分子が第一の抗体及び第二の抗体に結合される。第一の抗体は、固相、例えばビーズ、ウェル若しくは他のコンテナの表面、チップ又はストリップに結合されてもよく、第二の酵素は、例えば色素、放射性同位体、又は反応性若しくは触媒活性のある部分で、標識された抗体である。その後、被分析物に結合された標識された抗体の量が、適当な方法により測定される。「サンドイッチアッセイ」に含まれる一般的組成物及び手順は、確立されており、当業者に公知である（Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｅｄ．  Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ＬＴＤ，  Ｏｘｆｏｒｄ；  ３ｒｄ  ｅｄ．  （Ｍａｙ  ２００５），  ＩＳＢＮ−１３：  ９７８−００８０４４５２６７；  Ｈｕｌｔｓｃｈｉｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ２００６  Ｆｅｂ；１０（１）：４−１０．  ＰＭＩＤ：  １６３７６１３４）。
【００８５】
別の実施形態において、該アッセイは、２種の捕捉分子、好ましくは抗体を含み、両者とも液体反応混合物中の分散体として存在し、第一の標識成分は、第一の捕捉分子に付着され、前記第一の標識成分は、蛍光−又は化学発光−クエンチング又は増幅に基づく標識システムの一部であり、前記マーキングシステムの第二の標識成分は、第二の捕捉分子に付着されているため、被分析物への両捕捉分子の結合により、試料を含む溶液中で形成されたサンドイッチ複合体の検出を可能にする測定可能なシグナルが発生される。
【００８６】
別の実施形態において、前記標識システムは、希土類クリプテート又は希土類キレートを蛍光色素又は化学発光色素、特にシアニンタイプの色素との組み合わせで含む。
【００８７】
本発明の文脈において、蛍光に基づくアッセイは、例えばＦＡＭ  （５−又は６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、Ｃｙ７などのシアニン色素、キサンテン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ｄｉｍｅｔｈｏｄｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲなどのＢＯＤＩＰＹ色素、オレゴングリーン、ウンベリフェロンなどのクマリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８などのベンズイミド、テキサスレッドなどのフェナントリジン、ヤキマイエロー、アレクサフルオル、ＰＥＴ、臭化エチジウム、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素などを含む群から選択され得る色素の使用を含む。
【００８８】
本発明の文脈において、化学発光に基づくアッセイは、（５５１−５６２ページの引用を含む、参照により本明細書に援用されるＫｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｊ．  Ｉ．  Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ；  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｍ．  Ｈｏｗｅ−Ｇｒａｎｔ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９３，  ｖｏｌ．１５，  ｐ．  ５１８−５６２）の中の化学発光材料について記載された物理的原理に基づく色素の使用を含む。好ましい化学発光色素は、アクリジニウムエステルである。
【００８９】
本明細書に挙げられた「アッセイ」又は「診断アッセイ」は、診断の分野で適用される任意のタイプのものであり得る。そのようなアッセイは、検出される分析物を、特定の親和性を有する１種又は複数の捕捉プローブに結合させることに基づいていてもよい。捕捉分子と標的分子又は該当する分子との相互作用に関して、親和定数は、好ましくは１０8Ｍ-1より大きい。
【００９０】
本発明の文脈において、「結合剤分子」は、標的分子又は該当する分子、即ち試料からの被分析物に結合するために用いられ得る分子である。したがって結合剤分子は、標的分子又は該当する分子に特異的に結合するために、空間的に、そして表面電荷、疎水性、親水性、ルイスドナー及び／又はアクセプターの存在又は非存在などの表面特性の両方に関して、適当な形状でなければならない。この結果、結合は、例えば捕捉分子と標的分子又は該当する分子の間のイオン結合、ファンデルワールス結合、パイ−パイ結合、シグマ−パイ結合、疎水性結合若しくは水素結合の相互作用、又は上述の相互作用の２つ以上の組み合わせにより仲介されてもよい。本発明の文脈において、結合剤分子は、例えば核酸分子、炭水化物分子、ＰＮＡ分子、タンパク質、抗体、ペプチド又は糖タンパク質を含む群から選択されてもよい。好ましくは該結合剤分子は、抗体であり、それは標的又は該当する分子に対して充分な親和性を有する断片を包含し、組換え抗体又は組換え抗体断片に加え、少なくとも１２アミノ酸の長さを有する変異した鎖に由来する前記抗体又は断片の化学的及び／又は生化学的に修飾された誘導体を包含する。
【００９１】
化学発光標識は、アクリジニウムエステル標識、イソルミノール標識を含むステロイド標識などであってもよい。
【００９２】
酵素標識は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、酸性ホスファターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びその他であってもよい。
【００９３】
本発明の具体的実施形態において、該閾値は、０．５〜１．５ｎｍｏｌ／Ｌの間、好ましくは０．７〜１ｎｍｏｌ／Ｌの間である血漿ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの閾値範囲内であり、最も好ましくは０．８ｎｍｏｌ／Ｌの閾値が、適用される。
【００９４】
本発明の具体的実施形態において、該閾値は、８５〜３５０ｐｍｏｌ／Ｌの間、好ましくは１００〜２５０ｐｍｏｌ／Ｌの間である血漿ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭの閾値範囲内であり、最も好ましくは１５０ｐｍｏｌ／Ｌの閾値が、適用される。
【００９５】
本発明の具体的実施形態において、０．３〜１．２ｐｍｏｌ／Ｌの間、好ましくは０．４〜１．０ｐｍｏｌ／Ｌの間である血漿ＰＡＭＰ−アミドの閾値、最も好ましくは０．８ｐｍｏｌ／Ｌの閾値が、適用される。
【００９６】
本発明の具体的実施形態において、０．５〜２．０ｐｍｏｌ／Ｌの間、好ましくは０．７〜１．８ｐｍｏｌ／Ｌの間である血漿ＰＡＭＰ−グリシンの閾値、最も好ましくは１．５ｐｍｏｌ／Ｌの閾値が、適用される。
【００９７】
本出願の別の実施形態は、該結合剤が、それぞれＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ若しくはその断片及び／又はＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ若しくはその断片及び／又はＰＡＭＰ若しくはその断片に結合する抗体、抗体断片又は非Ｉｇ足場を含む群から選択される、先行の実施形態による方法に関する。
【００９８】
本出願の別の実施形態は、アドレノメデュリンに結合する前記抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体若しくは抗ＡＤＭ抗体断、又はアドレノメデュリンに結合する抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場が、単一特異性である、先行の実施形態による方法に関する。
【００９９】
本出願の別の実施形態は、前記抗体又は断片又は足場が、少なくとも１０-7ＭのＡＤＭに対する結合親和性を呈する、先行の実施形態による方法に関する。
【０１００】
本出願の別の実施形態は、アドレノメデュリンに結合する前記抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体又は抗ＡＤＭ抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場が、少なくとも１０-7ＭのＡＤＭに対する結合親和性を呈し、前記結合親和性が、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００システムを用いた標識不含の表面プラズモン共鳴により決定される、先行の実施形態による方法に関する。
【０１０１】
本出願の別の実施形態は、相関に関して、特定の閾値を超える、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／若しくはＰＡＭＰ、又はそれらの断片を含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの前記断片の高レベルが、有害転帰の高リスクの予報となり、そして／或いは特定の閾値未満のプレプロアドレノメデュリン又はその断片の前記断片のレベルが、有害転帰の低リスクの予報となる、先行の実施形態による方法に関する。
【０１０２】
本明細書で用いられる用語「高レベル」は、特定の閾値レベルを超えるレベルを意味する。
【０１０３】
本出願の別の実施形態は、前記閾値が、９０番目、９５番目又は９９番目の百分位数など、健常な参照集団で決定されたより高い濃度である、先行の実施形態による方法に関する。
【０１０４】
本出願の別の実施形態は、プレプロアドレノメデュリンの断片のレベルの相関に関して、該レベルの決定が、少なくとも２回実施され、前記断片の測定された第一のレベルに比較した前記断片の第二の測定レベルの低下が、有害転帰の低リスクの予報となる、先行の実施形態による方法に関する。
【０１０５】
本出願の別の実施形態は、プレプロアドレノメデュリンの断片のレベルの相関に関して、該レベルの決定が、少なくとも２回実施され、前記断片の測定された第一のレベルに比較した前記断片の第二の測定レベルの上昇が、有害転帰の高リスクの予報となる、先行の実施形態による方法に関する。
【０１０６】
本明細書で用いられる用語「リスク」は、望ましくない事象又は影響（例えば、疾患）に見舞われる確率に関する。
【０１０７】
本出願の別の実施形態は、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／若しくはＰＡＭＰ、又はそれらの断片を含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片のレベルの低下が、有害転帰の低リスクの予報となる、先行の実施形態による方法に関する。
【０１０８】
本出願の別の実施形態は、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／若しくはＰＡＭＰ、又はそれらの断片を含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片のレベルの上昇が、有害転帰の高リスクの予報となる、先行の実施形態による方法に関する。
【０１０９】
本出願の別の実施形態は、前記低下が、対象の臨床的／医療的健康状態の改善、及び／又はプレプロアドレノメデュリンの前記断片の濃度の半減を特徴とする、先行の実施形態による方法に関する。
【０１１０】
本出願の別の実施形態は、前記上昇が、対象の臨床的／医療的健康状態の増悪、及び／又はプレプロアドレノメデュリンの前記断片の濃度の倍増を特徴とする、先行の実施形態による方法に関する。
【０１１１】
本出願の別の実施形態は、アッセイが、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定するために用いられ、前記アッセイのアッセイ感度が、健常対象のＭＲ−ｐｒｏＡＤＭを定量することができ、＜０．５ｎｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜０．４ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは＜０．２ｎｍｏｌ／Ｌである、先行の実施形態による方法に関する。
【０１１２】
本出願の別の実施形態は、アッセイが、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定するために用いられ、前記アッセイのアッセイ感度が、健常対象のＣＴ−ｐｒｏＡＤＭを定量することができ、＜１００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜７５ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは＜５０ｐｍｏｌ／Ｌである、先行の実施形態による方法に関する。
【０１１３】
本出願の別の実施形態は、アッセイが、ＰＡＭＰ−アミドのレベルを決定するために用いられ、前記アッセイのアッセイ感度が、健常対象のＰＡＭＰ−アミドを定量することができ、＜０．３ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜０．２ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは＜０．１ｐｍｏｌ／Ｌである、先行の実施形態による方法に関する。
【０１１４】
本出願の別の実施形態は、アッセイが、ＰＡＭＰ−グリシンのレベルを決定するために用いられ、前記アッセイのアッセイ感度が、健常対象のＰＡＭＰ−グリシンを定量することができ、＜０．５ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜０．２５ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは＜０．１ｐｍｏｌ／Ｌである、先行の実施形態による方法に関する。
【０１１５】
本出願の別の実施形態は、アッセイが、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＰＡＭＰのレベルを決定するために用いられ、該アッセイ感度が、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭでは＜０．５ｎｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜０．４ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは＜０．２ｎｍｏｌ／Ｌであり、そして／又はＣＴ−ｐｒｏＡＤＭでは＜１００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜７５ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは＜５０ｐｍｏｌ／Ｌであり、そして／又はＰＡＭＰでは＜０．３ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜０．２ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは＜０．１ｐｍｏｌ／Ｌである、先行の実施形態による方法に関する。
【０１１６】
本発明のｐｒｏＡＤＭレベル又はその断片は、実施例に概説された通り、記載されたアッセイで決定されている。先に挙げられた閾値は、他のアッセイが本発明で用いられたアッセイシステムと異なって較正されていれば、他のアッセイと異なる場合がある。それゆえ、先に挙げられたカットオフ値は、それに応じて、較正の差を考慮しながら、そのように異なって較正されたアッセイにあてはめられるであろう。較正の差を定量することの一可能性は、両方の方法を利用して試料中の各バイオマーカー（例えば、バイオ−ＡＤＭ）を測定することによる、該当するアッセイと本発明で用いられた各バイオマーカーアッセイとの比較分析（相関）の方法である。別の可能性は、このテストが充分な分析感度を有することを条件に、該当するアッセイで、代表的な正常集団の中央値バイオマーカーレベルを決定し、結果を文献に記載された中央値バイオマーカーレベルと比較して、この比較により得られた差に基づき較正を再計算することである。本発明で用いられた較正により、正常（健常）対象の試料が測定されて、中央値血漿バイオ−ＡＤＭ（成熟型ＡＤＭ−ＮＨ2）が２４．７ｐｇ／ｍｌ、最小値が１１ｐｇ／ｍｌ、９９番目の百分位値が４３ｐｇ／ｍｌとなった。或いは市販の対照試料が、異なる較正の適合に用いられ得る（例えば、ＩＣＩ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１１７】
正常（健常）対象の血漿中央値ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ濃度は、Ｃａｒｕｈｅｌら（Ｃａｒｕｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４２：７２５−８）に記載されたＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの検出のための自動サンドイッチ蛍光アッセイを利用すると、０．４１（四分位範囲０．２３〜０．６４）ｎｍｏｌ／Ｌであった（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５５：１５９３−１５９５）。
【０１１８】
正常な健常対象（ｎ＝２００）のＣＴ−ｐｒｏＡＤＭの血漿中央濃度は、７７．６ｐｍｏｌ／Ｌ（最小値４６．６ｐｍｏｌ／Ｌ、最大値１３６．２ｐｍｏｌ／Ｌ）であり、９５％百分位は、１１３．８ｐｍｏｌ／Ｌであった（欧州特許第２  １１１  ５５２（Ｂ１）号明細書）。
【０１１９】
正常な健常対象（ｎ＝５１）のＰＡＭＰ−アミドの血漿濃度は、０．５１±０．１９ｐｍｏｌ／Ｌ（平均±ＳＤ）であった（Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４．  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３７：  １４−２１）。
【０１２０】
正常な健常対象（ｎ＝５１）のＰＡＭＰ−グリシンの血漿濃度は、１．１５±０．３８ｐｍｏｌ／Ｌ（平均±ＳＤ）であった（Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４．  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３７：  １４−２１）。
【０１２１】
本出願の別の実施形態は、前記体液が、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び唾液を含む群から選択されてもよい、先行の実施形態による方法に関する。
【０１２２】
本出願の別の実施形態は、追加的に少なくとも１種の臨床パラメータが、決定され、年齢、性別、ＳＯＦＡスコア（又はそのサブスコア）、ＳＡＰＳＩＩスコア、ＢＵＮ、ナトリウム、カリウム、クレアチニン、ビリルビン、血小板数、動脈ｐＨ、ヘマトクリット、白血球数、ＨＣＯ3-、侵襲的人工換気／非侵襲的人工換気、血行力学的特徴（血圧、収縮期及び拡張期、平均動脈圧、中心静脈圧、心拍数など）、体液バランス、尿量、塩基過剰、塩化物、ＣＲＰ、ＰＣＴ、ＢＮＰ又はＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、トロポニンＴ又はトロポニンＩ、プロエンケファリン、ヘモグロビン、グルコース、乳酸、ＩＮＲ、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ガンマＧＴ、総タンパク質、アルブミン、体温、呼吸数、ＰａＯ2及びＦｉＯ2、治療方針（補液蘇生、昇圧剤／変力物質、腎置換療法、抗生物質、ヒドロコルチゾン、インスリン、経腸栄養／非経口栄養、先在の併存疾患、慢性的薬物治療を含む群から選択される相関性が追加的に検討される、先行の実施形態による方法に関する。
【０１２３】
本出願の別の実施形態は、前記対象をリスク群に層別化するための、先行の実施形態による方法に関する。
【０１２４】
本出願の別の実施形態は、前記対象が患者の群に層別化され、一群が治療を必要とする患者を含み、他の群が治療の必要がない患者を含む、先行の実施形態による方法に関する。
【０１２５】
本発明の範囲内のさらなる実施形態が、以下に述べられる：
１．配列番号１（アミノ酸１−５２）に結合する抗アドレノメデュリン（ＡＤＭ）抗体、抗体断片及び／又は非Ｉｇ足場を含む群から選択される結合剤での処置下にある対象における治療をモニタリングするための方法であって、
・  前記対象から得られた体液中の、中央領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）、Ｃ−末端プロアドレノメデュリン（ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ）及び／若しくはプロアドレノメデュリンＮ−末端２０ペプチド（ＰＡＭＰ）、又はそれらの断片を含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片のレベルを決定すること；並びに
・  ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＰＡＭＰを含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの断片の前記レベルを、該対象の臨床的／医療的健康状態及び／又は有害転帰のリスク及び／又は治療方針を適合させるための要件と相関させること、
を含み、
・  そこで、前記断片のレベルの決定のために、少なくとも１種の結合剤が、それぞれ配列番号３、配列番号４及び配列番号５を含む群から選択されるアミノ酸配列内の領域に結合する、
方法。
【０１２６】
２．該処置のための該結合剤が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場であり、前記抗体又は断片又は足場が、アドレノメデュリンのＮ−末端部分ａａ１−２１：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC；  配列番号１９
に結合する、実施形態１による方法。
【０１２７】
３．該処置のための該結合剤が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場であり、前記抗体又は断片又は足場が、アドレノメデュリンのＣ−末端部分ａａ４２−５２：
APRSKISPQGY-NH2；  配列番号２０
に結合する、実施形態１〜２による方法。
【０１２８】
４．該処置のための該結合剤が、抗ＡＤＭ抗体又は抗アドレノメデュリン抗体断片又は抗ＡＤＭ非Ｉｇタンパク質足場であり、前記抗体又は断片又は足場が、アドレノメデュリンの中央領域部分ａａ２１−４２：
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA；  配列番号２１
に結合する、実施形態１〜３による方法。
【０１２９】
５．前記断片のレベルの決定が、少なくとも１回実施される、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１３０】
６．該有害転帰が、臓器機能の増悪などの臨床状態の増悪、及び致死を含む群から選択される、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１３１】
７．該臨床状態の増悪が、症状の増悪（例えば、疾患の進行を定義する臨床パラメータの変化）、入院の必要性又は死亡に関係し、医療スコア（例えば、急性生理学と慢性健康評価（ＡＰＡＣＨＥ、ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ））により評価されてもよい、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１３２】
８．該臓器機能の増悪が、腎機能の増悪（ＷＲＦ）、心血管機能の増悪、肝機能の増悪及び呼吸器機能の増悪を含み、逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコア、多臓器障害スコア（ＭＯＤＳ）又は簡易急性生理学的スコア（ＳＡＰＳ、ＳＡＰＳＩＩ）の上昇により評価されてもよい、実施形態１〜６による方法。
【０１３３】
９．前記対象が、疾患又は病気、例えば慢性又は急性疾患又は急性病に罹患している、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１３４】
１０．該対象が罹患している該疾患が、例えば髄膜炎、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症のような重度感染；糖尿病、癌のような他の疾患、例えば心不全、心筋梗塞、卒中、アテローム性硬化症のような急性及び慢性血管疾患；例えば敗血症性ショックのようなショック、並びに例えば腎機能障害、肝機能障害、灼熱感、手術、外傷のような臓器機能障害を含む群から選択されてもよい、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１３５】
１１．前記治療方針が、補液蘇生、昇圧剤／変力物質、腎置換療法、抗生物質、ヒドロコルチゾン、インスリン、経腸栄養／非経口栄養を含む群から選択される、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１３６】
１２．少なくとも５アミノ酸であるＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＰＡＭＰを含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの前記断片のレベルが、それぞれＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ若しくはその断片及び／又はＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ若しくはその断片及び／又はＰＡＭＰ若しくはその断片を含む群から選択される少なくとも１種の結合剤を用いた免疫測定法により決定される、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１３７】
１３．相関に関して、特定の閾値を超える、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／若しくはＰＡＭＰ又はそれらの断片を含む群から選択されるプレプロアドレノメデュリンの前記断片の高レベルが、有害転帰の高リスクの予報となり、そして／或いは特定の閾値未満のプレプロアドレノメデュリン又はその断片の前記断片のレベルが、有害転帰の低リスクの予報となる、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１３８】
１４．前記閾値が、９０番目、９５番目又は９９番目の百分位数など、健常な参照集団で決定されたより高い濃度である、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１３９】
１５．プレプロアドレノメデュリンの断片のレベルの相関に関して、前記断片の該レベルの決定が、少なくとも２回実施され、前記断片の測定された第一のレベルに比較した前記断片の第二の測定レベルの低下が、有害転帰の低リスクの予報となる、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１４０】
１６．プレプロアドレノメデュリンの断片のレベルの相関に関して、前記断片の該レベルの決定が、少なくとも２回実施され、前記断片の測定された第一のレベルに比較した前記断片の第二の測定レベルの上昇が、有害転帰の高リスクの予報となる、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１４１】
１７．免疫測定法が、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ及び／又はＰＡＭＰのレベルを決定するために用いられ、該アッセイ感度が、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭでは＜０．５ｎｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜０．４ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは＜０．２ｎｍｏｌ／Ｌであり、そして／又はＣＴ−ｐｒｏＡＤＭでは＜１００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜７５ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは＜５０ｐｍｏｌ／Ｌであり、そして／又はＰＡＭＰでは＜０．３ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜０．２ｐｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは＜０．１ｐｍｏｌ／Ｌである、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１４２】
１８．前記体液が、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び唾液を含む群から選択されてもよい、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１４３】
１９．追加的に少なくとも１種の臨床パラメータが、決定され、年齢、性別、ＳＯＦＡスコア（又はそのサブスコア）、ＳＡＰＳＩＩスコア、ＢＵＮ、ナトリウム、カリウム、クレアチニン、ビリルビン、血小板数、動脈ｐＨ、ヘマトクリット、白血球数、ＨＣＯ3-、侵襲的人工換気／非侵襲的人工換気、血行力学的特徴（血圧、収縮期及び拡張期、平均動脈圧、中心静脈圧、心拍数など）、体液バランス、尿量、塩基過剰、塩化物、ＣＲＰ、ＰＣＴ、ＢＮＰ又はＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、トロポニンＴ又はトロポニンＩ、プロエンケファリン、ヘモグロビン、グルコース、乳酸、ＩＮＲ、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ガンマＧＴ、総タンパク質、アルブミン、体温、呼吸数、ＰａＯ2及びＦｉＯ2、治療方針（補液蘇生、昇圧剤／変力物質、腎置換療法、抗生物質、ヒドロコルチゾン、インスリン、経腸栄養／非経口栄養、先在の併存疾患、慢性的薬物治療を含む群から選択される相関性が追加的に検討される、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１４４】
２０．前記対象をリスク群に層別化するための、先行の実施形態の何れかによる方法。
【０１４５】
実施例１
抗体の作製及びそれらの親和定数の決定
複数のヒト及びネズミ抗体が、生成され、それらの親和定数が、決定された（表２参照）。
【０１４６】
免疫化のためのペプチド／コンジュゲート
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）へのペプチドのコンジュゲーションのための追加的なＮ−末端システインを有する（システインが選択されたＡＤＭ配列の中に存在しない場合）、免疫化のためのペプチドが、合成され、表２（ＪＰＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を参照されたい。該ペプチドは、Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋカップリングゲル（Ｐｅｒｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによりＢＳＡに共有結合でリンクされた。カップリング手順は、Ｐｅｒｂｉｏのマニュアルに従って実施された。
【０１４７】
ネズミ抗体は、以下の方法に従って作製された：
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、０及び１４日目に１００μｇのペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲート（１００μｌ完全フロイントアジュバント中に乳化）で、そして２１及び２８日目に５０μｇ（１００μｌ不完全フロイントアジュバント中）で免疫化された。融合実験の実施の３日前に、動物は、１００μｌ生理食塩水に溶解された５０μｇコンジュゲートを受け、１回は腹腔内注射として、１回は静脈内注射として与えられた。
【０１４８】
免疫化されたマウスからの脾臓細胞及び骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞を、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールと、３７℃で３０秒間融合した。細胞が、洗浄の後、９６ウェル細胞培養プレートに播種された。ＨＡＴ培地［２０％ウシ胎仔血清及びＨＡＴサプリメントを補充されたＲＰＭＩ１６４０培地］中で生育させることにより、ハイブリッドクローンが選択された。２週間後に、ＨＡＴ培地が、３継代の間にＨＴ培地で交換され、続いて正常細胞培地に戻される。
【０１４９】
細胞培養上清が、融合後３週間目に抗原特異性ＩｇＧ抗体に関して一次スクリーニングされた。陽性の被験マイクロカルチャーが、増殖のために２４ウェルプレートに移された。再テストの後、選択された培養物がクローニングされ、限界希釈技術を利用して再クローニングされ、アイソタイプが決定された（Ｌａｎｅ，  Ｒ．Ｄ．  １９８５．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ８１：  ２２３−２２８；  Ｚｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  ２８：  １１−１５も参照）。
【０１５０】
マウスモノクローナル抗体の生成：
抗体は、標準の抗体生成法を介して生成され（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  ＡＴＬＡ  ２５，  １２１）、プロテインＡを介して精製された。抗体純度は、ＳＤＳゲル電気泳動解析に基づけば９５％を超えていた。
【０１５１】
ヒト抗体：
ヒト抗体は、以下の手順に従ってファージディスプレイにより生成された：
ヒトナイーブ抗体遺伝子ライブラリーＨＡＬ７／８が、アドレノメデュリンペプチドに対する組換え一本鎖Ｆ−可変ドメイン（ｓｃＦｖ）の単離に用いられた。該抗体遺伝子ライブラリーは、２つの異なるスペーサーを介してアドレノメデュリンペプチド配列にリンクされたビオチンタグを含有するペプチドの使用を含むパンニング方策でスクリーニングされた。非特異的結合抗原及びストレプトアビジン結合抗原を利用したパンニングラウンド（ｐａｎｎｉｎｇ  ｒｏｕｎｄｓ）のミックスが、非特異的結合剤のバックグランドを最小化するために用いられた。第三ラウンドのパンニングから溶出されたファージが、モノクローナルｓｃＦｖ発現大腸菌株の作製に用いられている。これらのクローン株の育成での上清が、抗原ＥＬＩＳＡテストに直接用いられている（Ｈｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５２，  １５９−１７０；Ｓｃｈｕｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，  Ｅ６６２５も参照）。
【０１５２】
陽性クローンは、抗原に関する陽性ＥＬＩＳＡシグナル及びストレプトアビジンがコーティングされたマイクロタイタープレートに関する陰性に基づいて選択されている。さらなる特徴づけでは、ｓｃＦｖオープンリーディングフレームが、発現プラスミドｐＯＰＥ１０７（Ｈｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．  ２０１１）にクローニングされ、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを介して培養上清から捕捉され、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製された。
【０１５３】
親和定数：
アドレノメデュリンへの抗体の親和性を決定するために、固定された抗体へのアドレノメデュリンの結合の反応速度が、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた標識不含の表面プラズモン共鳴により決定された。抗体の可逆的固定が、製造者の使用説明書（マウス抗体捕捉キット；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従ってＣＭ５センサー表面に高密度で共有結合によりカップリングされた抗マウスＦｃ抗体を用いて実施された。（Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５５（１）：  １６５−１７３）。
【０１５４】
該モノクローナル抗体は、それぞれヒト及びネズミＡＤＭの以下に表されたＡＤＭ領域に対して増加された。以下の表は、さらなる実験で用いられた、得られた抗体の選択を表す。選択は、標的領域に基づいた：
【０１５５】
【表２】
2021500548.tif 000003
【０１５６】
酵素消化による抗体断片の作製
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）2断片の作製が、ネズミ全長抗体ＮＴ−Ｍの酵素消化により実行された。抗体ＮＴ−Ｍは、ａ）ペプシンに基づくＦ（ａｂ）2  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  ４４９８８）、及びｂ）パパインに基づくＦａｂ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  ４４９８５）を用いて消化された。断片化手順は、供給者により提供された使用説明書に従って実施された。消化は、Ｆ（ａｂ）2断片化の場合には３７℃で８時間実施された。Ｆａｂ断片化消化は、それぞれ１６時間実施された。
【０１５７】
Ｆａｂ作製及び精製の手順：
固定パパインは、樹脂を０．５ｍｌの消化緩衝液で洗浄すること、及びカラムを５０００×ｇで１分間遠心分離すること、により平衡化された。緩衝液は、その後、廃棄された。脱塩されたカラムが、保存液を除去すること、及びそれを消化緩衝液で洗浄し、それを各時間の後に１０００×ｇで２分間遠心分離すること、により調製された。０．５ｍｌの調製されたＩｇＧ試料が、平衡化された固定パパインを含有するスピンカラムチューブに添加された。消化反応のインキュベーション時間は、卓上ロッカー上、３７℃で１６時間実行された。カラムは、５０００×ｇで１分間、遠心分離されて、消化物を固定パパインから分離した。その後、樹脂が０．５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄されて、５０００×ｇで１分間遠心分離された。総試料容量が、１．０ｍｌになるように、洗浄画分が、消化抗体に添加された。ＮＡｂプロテインＡカラムが、室温でＰＢＳ及びＩｇＧ溶出緩衝液と平衡化された。カラムが、１分間遠心分離されて、保存液（０．０２％アジ化ナトリウムを含有）を除去し、２ｍｌ  ＰＢＳを添加することにより平衡化され、再度１分間遠心分離されて、通過画分が廃棄された。試料が、カラムにアプライされ、転倒により再懸濁された。インキュベーションが、回転混合により室温で１０分間実施された。カラムは、１分間遠心分離されて、通過画分をＦａｂ断片と共に保存した（参考資料：Ｃｏｕｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ  １９８３．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ５９，  １９９−２０３．；  Ｌｉｎｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７０，  ２７７−８７；  Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０．  ＰＮＡＳ．  １０７，  １８９５０−５．；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０．  ＰＮＡＳ．  １０７，  １４７２７−３２；  Ｕｙｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０６，  ４４９−６２；  Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０６，  １９１３−２７；  Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １８５，  １２７５−８４０）。
【０１５８】
Ｆ（ａｂ’）2断片の作製及び精製の手順：
固定ペプシンは、樹脂を０．５ｍｌ  消化緩衝液で洗浄すること、及びカラムを５０００×ｇで１分間遠心分離すること、により平衡化された。緩衝液は、その後、廃棄された。脱塩されたカラムが、保存液を除去すること、及びそれを消化緩衝液で洗浄し、それを各時間の後に１０００×ｇで２分間遠心分離すること、により調製された。０．５ｍｌの調製されたＩｇＧ試料が、平衡化された固定ペプシンを含有するスピンカラムチューブに添加された。消化反応のインキュベーション時間は、卓上ロッカー上、３７℃で１６時間実行された。カラムは、５０００×ｇで１分間、遠心分離されて、消化物を固定ペプシンから分離した。その後、樹脂が、０．５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄されて、５０００×ｇで１分間遠心分離された。総試料容量が、１．０ｍｌになるように、洗浄画分が、消化抗体に添加された。ＮＡｂプロテインＡカラムが、室温でＰＢＳ及びＩｇＧ溶出緩衝液と平衡化された。カラムが、１分間遠心分離されて、保存液（０．０２％アジ化ナトリウムを含有）を除去し、２ｍｌ  ＰＢＳを添加することにより平衡化され、再度１分間遠心分離されて、通過画分が廃棄された。試料がカラムにアプライされ、転倒により再懸濁された。インキュベーションが、回転混合により室温で１０分間実施された。カラムは、１分間遠心分離されて、通過画分をＦａｂ断片と共に保存した（参考資料：Ｍａｒｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２８：  ６９−７７；  ＢｅａｌＥ  １９８７．  Ｅｘｐ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：２８７−９６；  Ｅｌｌｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９７２．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４（３）：３１８−２２；  Ｋｅｒｂｅｌ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔ  １９８３．  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ９３：１１３−１４７；  Ｋｕｌｋａｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９８５．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  １９：２１１−４；  Ｌａｍｏｙｉ  １９８６．  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １２１：６５２−６６３；  Ｐａｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ５３：１３３−７３；  Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９８５．  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２（９）：１００９−１９；  Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．  １９８０．  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：４６９−８２；  Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．  １９８３．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ６４：１４１−６；  Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  １３８：１１１−９）。
【０１５９】
ＮＴ−Ｈ抗体断片のヒト化：
抗体断片が、ＣＤＲグラフト法によりヒト化された（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６．  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，  ５２２−５２５）。
【０１６０】
以下のステップはヒト化配列を実現するために実施された：
総ＲＮＡ抽出：総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎキットを使用してＮＴ−Ｈハイブリドーマから抽出された。
【０１６１】
第一ラウンドＲＴ−ＰＣＲ：ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．２１０２１０）が、用いられた。ＲＴ−ＰＣＲが、重鎖及び軽鎖に特異的なプライマーセットを用いて実施された。各ＲＮＡ試料では、１２の個々の重鎖及び１１の軽鎖のＲＴ−ＰＣＲ反応が、可変領域のリーダー配列をカバーするディジェネレート・フォワードプライマー混合物を用いて構成された。リバースプライマーは、重鎖及び軽鎖の定常領域内に配置されている。制限部位が、プライマー内に設計されなかった。
【０１６２】
反応の構成：５×ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５．０  μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（１０ｍＭの各ｄＮＴＰ含有）  ０．８  μｌ、プライマーセット  ０．５  μｌ、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ０．８  μｌ、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＲＮＡ  ２．０μｌ、ＲＮａｓｅ不含水で２０．０μｌにする、総容量  ２０．０  μｌ、ＰＣＲ条件：  逆転写：  ５０℃、３０分；初期ＰＣＲ活性化：  ９５℃、１５  ｍｉｎ。  サイクリング：  ９４℃で２５秒、５４℃で３０秒、７２℃で３０秒を２０サイクル；最終的伸長：  ７２℃で１０分。第二ラウンドのセミネステッドＰＣＲ：第一ラウンド反応からのＲＴ−ＰＣＲ産物が、第二ラウンドＰＣＲでさらに増幅された。１２の個々の重鎖及び１１の軽鎖のＲＴ−ＰＣＥ反応が、抗体可変領域に特異的なセミネステッドプライマーセットを用いて構成された。
【０１６３】
反応の構成：２×ＰＣＲミックス  １０μｌ；プライマーセット  ２μｌ；第一ラウンドＰＣＲ産物  ８μｌ；総容量２０μｌ；Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＰＣＲの条件：９５℃で５分の初期変性；９５℃で２５秒間、５７℃で３０秒間、６８℃で３０秒間を２５サイクル；最終伸長は６８℃で１０分間である。
【０１６４】
ＰＣＲが終了したら、ＰＣＲ反応試料をアガロースゲルで泳動して、増幅されたＤＮＡ断片を視覚化する。ネステッドＲＴ−ＰＣＲにより増幅された１５を超えるクローニングＤＮＡ断片をシーケンシングした後、複数のマウス抗体重鎖及び軽鎖が、クローニングされ、正しいと思われた。タンパク質配列アライメント及びＣＤＲ解析で、１つの重鎖及び１つの軽鎖を同定する。相同性のあるヒトフレームワーク配列とのアライメントの後、可変重鎖のための得られたヒト化配列は、以下の通りである：図５参照。可変重鎖内の２６、４０及び５５位のアミノ酸及び可変軽鎖内の４０位のアミノ酸は、結合特性にとって不可欠であるため、それらは、ネズミ本来のものに戻されてもよい。得られた候補が、以下に表されている。（Ｐａｄｌａｎ  １９９１．  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２８，  ４８９−４９８；  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｂａｊｏｒａｔｈ．１９９５．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ４，  ３０６−３１０）。
【０１６５】
抗体断片配列（配列番号：  １１−１８及び２６−２７）の注釈：太字と下線は、経時的に配列されたＣＤＲ１、２、３であり；斜体は、定常領域であり；ヒンジ領域は、太字で強調されており、ヒスチジンタグは、太字と斜体の文字である。
【０１６６】
【化１】
2021500548.tif 000004
【０１６７】
実施例２
抗ＮＴ−Ｈアドレノメデュリン抗体ＨＡＭ８１０１（アドレシズマブ）の影響が、２ヒットモデルにおける敗血症ブタの臨床的及び実験的パラメータについて探索された。第一のヒットは、出血性ショックであり、第二のヒットは、大腸菌フィブリン塊の適用による敗血症の誘導であった（腹膜汚染及び感染；ＰＣＩ）。敗血症が誘導されたら、その時点で、ＨＡＭ８１０１が投与された。
【０１６８】
材料と方法
動物の系統：Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｌａｎｄｒａｓｓｅ）、１４〜１６週齢、３０〜３５ｋｇ
群のサイズ：６匹
群：
ａ）ＰＣＩ＋ビヒクル
ｂ）ＰＣＩ＋ＨＡＭ８１０１
試験材料
２０ｍＭ  Ｈｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ  ６．０中のＨＡＭ８１０１（アドレシズマブ）ロット番号：ＨＡＭ−１６０７１４−ＦｉＢ
ビヒクル：２０ｍＭ  Ｈｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ  ６．０
【０１６９】
試験の実行
動物
本発明者らは、雌Ｇｅｒｍａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅブタ（ｎ＝１６；平均±標準偏差（ＳＤ）３３±１．５ｋｇ体重（ＢＷ））１６匹に麻酔をかけて、換気し、実験動物飼育のための標準手順に従った。この試験は、動物の飼育及び使用に関する公共機関及び地方委員会により認可されていた（Ｌａｎｄｅｓａｍｔ  ｆuｒ  Ｎａｔｕｒ，  Ｕｍｗｅｌｔ  ｕｎｄ  Ｖｅｒｂｒａｕｃｈｅｒｓｃｈｕｔｚ  Ｎｏｒｄｒｈｅｉｎ−Ｗｅｓｔｆａｌｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ８４−０２．０４．２０１５．Ａ０３７）。
【０１７０】
全身麻酔及びカテーテル処置
動物は、アザペロン（１〜２ｍｇ／ｋｇ    ＢＷ）及びケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ    ＢＷ）を予め投薬され、全身麻酔が、プロポフォール（１〜２ｍｇ／ｋｇ    ＢＷ）の静脈内注射により導入された。動物は、経口挿管されて、仰向けで配置された。全身麻酔は、プロポフォール及びフェンタニルの輸液により維持された。圧力制御モードでの換気が選択されて、吸入酸素濃度０．５、吸／呼気相比１：１．５、５ｃｍ  Ｈ2Ｏに設定されたＰＥＥＰ、及び１回換気量  ８〜１０ｍｌ／ｋｇ  ＢＷで動物を換気した。呼吸数は、ＰａＣＯ2  ３．５〜４．５ｋＰａを維持するように設定された。深部体温は、加温ブランケットで３７．５℃を超えるように維持された。２本の中心静脈カテーテルが、外頸静脈及び大腿静脈に挿入され、動脈ＰＩＣＣＯカテーテルが、経皮穿刺により大腿動脈に挿入された。
【０１７１】
試験終了時に、動物は、深い昏睡を維持しながら、獣医の存在の下で致死用量のＮａｒｃｏｒｅｎ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ、Ｈａｌｌｂｅｒｇｍｏｏｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で殺処分された。
【０１７２】
大腸菌フィブリン塊
このモデルでは、本発明者らは、大腸菌フィブリン塊を７〜９×１０11コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｋｇ／ＢＷで用いて、敗血症性ショックを誘導した。
【０１７３】
血行力学的測定
全ての血管内圧測定が、胸部中央レベルで参照され、値は、呼気終末に得られた。心拍数、平均動脈圧（ＭＡＰ）、中心静脈圧（ＣＶＰ）及び一回拍出量変化（ＳＶＶ）が、連続で記録された。心拍出量は、経肺熱希釈法（ＰＩＣＣＯ、Ｐｕｌｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｅｌｄｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して測定された。肺血管外水分量（ＥＶＬＷ）、胸腔内血液量（ＩＴＢＶ）及び拡張終期容積（ＧＥＤＶ）が、標準の式を用いて計算された。
【０１７４】
実験室
血中ガス分析が、コオキシメーターを伴う標準の血中ガス酸素飽和度測定システム（ＡＢＬ  ８００；Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を利用して実行された。血球数、電解質、クレアチニン、尿及び肝臓酵素が、標準の検査技術を利用して決定された。本発明者らは、市販のキット（Ｐｉｇ  ＮＧＡＬ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、ＢｉｏＰｏｒｔｏ、Ｈｅｌｌｅｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた酵素免疫測定法により好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）を測定した。クレアチニンクリアランスは、子宮体濾過率（ＣｌＣｒｅａ＝  Ｕｃｒｅａ×Ｕｖｏｌ／Ｐｃｒｅａ×尿回収の持続期間；Ｕｃｒｅａ＝尿クレアチニン濃度；Ｕｖｏｌ＝回収期間の尿容量；Ｐｃｒｅａ＝血清クレアチニン濃度）の推定値として測定された。本発明者らは、実験の前及び後に動物のＢＷを測定した。肺の湿／乾重量比が、実験の直後及び５日後の左上葉の部分を計量することにより決定された。血液凝固が分析されて、回転式トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ  ｄｅｌｔａ、ＴＥＭ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を実施した。血漿中のサイトカイン（ＩＬ−６及びＴＮＦ−α）のレベルが、ブタに特異的な市販のキットを利用して酵素免疫測定法により評価された。
【０１７５】
生物活性アドレノメデュリン（バイオ−ＡＤＭ）が、過去に記載された通り（Ｍａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４．  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  １８：Ｒ３４）、Ｓｐｈｉｎｇｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ（Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により提供された新規な化学発光免疫測定法を利用して測定された。手短に述べると、未加工で未希釈の血漿における生物活性ＡＤＭの検出のための、アクリジニウムＮＨＳエステルの標識に基づくワンステップサンドイッチ化学発光免疫測定法において、それは、２種のマウスモノクローナル抗体、つまりＡＤＭの中央領域に対する一方（固相）と、アミド化Ｃ−末端部分の他方（抗体標識）を使用する。アッセイでは、５０μＬの血漿試料／較正物質、及び２００μＬの標識された検出抗体を使用する。分析アッセイの感度は、２ｐｇ／ｍＬである。該アッセイは、ヒト及びブタをはじめとする数多くの哺乳動物種のバイオ−ＡＤＭを測定するのに適し、それは、遊離バイオ−ＡＤＭと、ＨＡＭ８１０１（アドレシズマブ）が結合された場合のバイオ−ＡＤＭの両方を検出する（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１７．  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、印刷中）。
【０１７６】
血漿ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、製造業者の使用説明書に従い（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｂ・Ｒ・Ａ・Ｈ・Ｍ・Ｓ  ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ  ＫＲＹＰＴＯＲアッセイで測定された。
【０１７７】
実験プロトコル
カテーテル処置の間、動物は、１０ｍｌ／ｋｇ  ＢＷ／時間の調整晶質液を受けた。出血性ショックは、大腿静脈カテーテルを介して動物を出血させることにより、導入された。動物は、ベースラインＭＡＰの半量に達するまで、出血された。出血性ショックが、４５分間維持され、続いてベースライン平均動脈圧を回復するために、調整晶質液で補液蘇生療法を行った。出血性ショックの２時間後に、出血性ショックの間に回収された血液が、再輸血された。第二のヒットとして、敗血症が、出血性ショックの６時間後に腹腔内に配置された大腸菌を含む塊を用いて誘導された。動物は、アドレノメデュリン抗体又はビヒクル溶液の何れかを受けるように無作為に割り付けられた。溶液が、中性バッグ（ｎｅｕｔｒａｌ  ｂａｇｓ）に送達され、群については、研究者に伏せられて、Ａ又はＢと表記された。抗体又はビヒクル溶液での治療が、敗血症の誘導の直後に開始した。２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの抗体／ビヒクル溶液が、３０分間かけて輸注された。敗血症の誘導の４時間後に、敗血症性ショックの治療が、調整晶質液と、要求に応じてノルアドレナリンを用いて開始した。補液補充（ｖｏｌｕｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）及び昇圧剤は、生存敗血症キャンペーン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  Ｓｅｐｓｉｓ  Ｃａｍｐａｉｇｎ）による推奨通り、８〜１２ｍｍＨｇの中心静脈圧、６５ｍｍＨｇを超える平均動脈圧及び７０％の中心静脈酸素飽和量を維持するように用量設定された。敗血症治療は、さらに８時間継続した。測定は、出血性ショック前、敗血症誘導前、及び敗血症誘導の１、２、３、４、６、８、１０及び１２時間後に実施された。出血性及び敗血症性ショックは、ＳＨＡＭ群の動物では実施されなかったが、それ以外では、動物は、全ての血管内カテーテル、正中回復術及び抗体／ビヒクル溶液のブラインド適用を含む同じ処置を受けた。
【０１７８】
結果：
予測通り、敗血症の誘導は、ビヒクル動物における血漿バイオ−ＡＤＭの増加を導いた。驚くべきことに、ＨＡＭ８１０１の投与により、見かけの血漿バイオ−ＡＤＭ濃度は、ビヒクル動物よりもかなり急速かつ高レベルに上昇した（図２Ａ）。内因性バイオ−ＡＤＭを上回るＨＡＭ８１０１の大幅なモル過剰を考慮すると、ＨＡＭ８１０１の投与後に測定された血漿ＡＤＭ濃度は、実際には主にＨＡＭ８１０１抗体と複合体化されたバイオ−ＡＤＭを表すと推定されなければならない。観察されたＨＡＭ８１０１により誘導されたより急速でより顕著な血漿バイオ−ＡＤＭの増加が、高いＡＤＭ遺伝子の発現及び／又はＡＤＭ遺伝子産物の放出によるものか否かを研究するために、ＡＤＭ前駆体ペプチドに由来する別のペプチド、即ちＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（中央領域プロアドレノメデュリン）の血漿濃度が、測定された。図２Ｂに示された通り、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの血漿レベルは、動物がＨＡＭ８１０１で処置されたか、又はビヒクルで処置されたかと非依存的に、敗血症誘導により同様に上昇した。したがって、ＨＡＭ８１０１に誘導されたより急速かつ顕著な血漿ＡＤＭの増加は、高いＡＤＭ遺伝子の発現及び／又はＡＤＭ遺伝子産物放出によるものでないと思われる。
【０１７９】
ビヒクル動物に比較して、ＨＡＭ８１０１の投与後に観察された血漿バイオ−ＡＤＭの過度の（ｏｖｅｒｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ）増加は、より悪い転帰に関連せず、ＨＡＭ８１０１を受けた動物は、標的平均動脈圧に達するために、ビヒクル動物よりも少ない緊急輸液療法を必要とした（図３）。
【０１８０】
ＨＡＭ８１０１を受けた動物では１／３のみが、標的平均動脈圧に達するのに、緊急輸液療法に加えてノルアドレナリン投与を必要としたが、ビヒクル動物は全て、ノルアドレナリンを必要とした（図４）。
【０１８１】
図４に示される通り、ＨＡＭ８１０１処置動物のうち、１／３が、ノルアドレナリンを必要としたが、２／３は、必要としなかった。これらの２群は、血漿ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ濃度の展開が異なった（図５）。ショックを発症した、例えば補液蘇生に加えてノルアドレナリンを必要としたそれらの動物は、他の動物よりもかなり高いＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ濃度を有した。後者では、処置に成功した動物は、ビヒクル群よりも低いＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ濃度を有した。
【０１８２】
総括すると、データは、ＨＡＭ８１０１での処置下では、（驚くべきことに）バイオ−ＡＤＭの測定が対象の有害転帰のリスクをモニタリングするのに適さないことを実証している。対照的に、ＨＡＭ８１０１が結合しないＡＤＭ前駆体ペプチドに由来する別の断片の一例であるＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの測定は、ＨＡＭ８１０１の投与により直後に影響を受けず、時間を経て臨床転帰と相関するため、そのような条件でのＡＤＭ系の刺激又は下方制御をモニタリングするのに適する。
【０１８３】
実施例３
オスＷｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）におけるＡＤＭレベルへの、配列番号：２０（ＨＡＭ２３０２）に対して作製されたモノクローナル抗Ｃ−末端アドレノメデュリン抗体の影響が、探索された。
【０１８４】
血液採取（終末出血時のＫ3−ＥＤＴＡ血漿≦１５０μＬ、又は３〜４ｍＬ（−８０℃））が、−３日目、１２分、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間、４日、７日、１０日の時点で実施された。動物は、単回静脈内注射で処置された（５ｍＬ／ｋｇ体重）。
【０１８５】
注射及び採取は、全ての動物で成功した。抗体処置動物は、毒性作用の明白な兆候を示さなかった。
【０１８６】
【表３】
2021500548.tif 000005
【０１８７】
血漿中のＡＤＭ及び遊離ＨＡＭ２３０２の測定
ＨＡＭ２３０２を含有する血漿試料中のアドレノメデュリンを測定するために、ｔＡＤＭアッセイが、用いられた。このアッセイは、固相として配列番号：２５に対して作製されたＮ−末端抗ＡＤＭ抗体（ＨＡＭ１１１２）と、トレーサーとしてのＡＤＭのアミノ酸２７−３９（ＡＨＱＩＹＱＦＴＤＫ  ＤＫＤ；  配列番号：  ２２）に対して作製された中央領域抗ＡＤＭ抗体（ＨＡＭ  ２９０３）とを使用する。合成ラットバイオ−ＡＤＭ（１−５０）−ＮＨ2（ＹＲＱＳＭＮＱＧＳＲＳＴＧＣＲＦＧＴＣＴＭＱＫＬＡＨＱＩＹＱＦＴＤＫＤＫＤＧＭＡＰＲＮＫＩＳＰＱＧＹ−ＮＨ2、配列番号：  ２３）で構成された較正物質が、試料中のＡＤＭを定量するのに用いられた。先に挙げられたバイオ−ＡＤＭアッセイとは対照的に、ｔＡＤＭアッセイは、ＡＤＭのアミド化形形態を特異的に測定しないが、ＡＤＭの全ての形態を検出することができる。
【０１８８】
精製されたモノクローナルＨＡＭ２９０３抗体（１ｇ／Ｌ）が、１：５ｍｏｌ／Ｌ比のＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳ−エステル（１ｇ／Ｌ、ＩｎＶｅｎｔ  ＧｍｂＨ）と共に１０％標識緩衝液（５００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）中、２２℃の暗室において３０分間インキュベートすることにより標識された。５％  １ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を１０分間添加した後、ＨＡＭ２９０３抗体が、ＣｅｎｔｒｉＰｕｒｅ  Ｐ５カラム（ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）を介して、そしてタンパク質ＫＷ−８０３（Ｓｈｏｄｅｘ、Ｓｈｏｗａ  Ｄｅｎｋｏ  Ｅｕｒｏｐｅ）でのサイズ排除ＨＰＬＣにより、無標識のものから分離された。
【０１８９】
白色ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ）が、モノクローナルＨＡＭ１１１２抗体（１．５μｇ／０．２ｍＬ／ウェル、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．８）でコーティングされた（２２℃で１８時間）。洗浄し、３０ｇ／Ｌカリオン（Ｋａｒｉｏｎ）、５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（プロテアーゼ不含）、６．５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸一カリウム、３．５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ６．５）で１．５時間ブロッキングした後、プレートが真空乾燥された。
【０１９０】
合成ラットＡＤＭ（ｒＡＤＭ）（ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ＆  ｅｌｅｐｈａｎｔｓ）が、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸水素カリウム、０．５  ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、６ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡナトリウム、５０μｍｏｌ／Ｌアマスタチン、１００μｍｏｌ／Ｌロイペプチン；ｐＨ  ８を用いて系列希釈された。
【０１９１】
５０μＬの試料／較正物質が、コーティングされたマイクロタイタープレートにピペット注入された。１５０μＬの標識Ｃ−末端抗体ＨＡＭ２３０２の添加後に、マイクロタイタープレートが、撹拌されながら２〜８℃で２０時間インキュベートされた。非結合トレーサーが、洗浄溶液（４００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、１ｇ／Ｌ  Ｔｗｅｅｎ  ２０、３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で５回（それぞれ３５０μＬ／ウェル）洗浄することにより除去された。ウェルに結合された化学発光が、Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０マイクロタイタープレート発光リーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることにより１ウェルあたり１秒間測定された。
【０１９２】
遊離ＨＡＭ２３０２の決定のために、アドレノマブ−１アッセイが利用された。アミノ酸２１−３２（配列番号：  ２４）に対して作製された中央領域抗ＡＤＭ抗体は、固相として機能する。ＭＡＣＮ標識Ｃ−末端Ａｂ（ＨＡＭ  ２３０２）は、トレーサーとして機能する。試料中のＨＡＭ２３０２の定量は、拮抗アッセイの設計を利用する。一定のｈＡＤＭ濃度（１０ｎｇ／ｍＬ）と共に非標識ＨＡＭ２３０２で構成された較正物質が、未知試料中の濃度を決定する標準曲線を作成するために用いられる。試料中の較正物質／抗体の濃度を増加させると、アドレノメデュリンに結合し得るトレーサーが少なくなるため、測定された光シグナルが降下する。
【０１９３】
精製されたモノクローナルＨＡＭ２３０２抗体（１ｇ／Ｌ）が、１：４．５ｍｏｌ／Ｌ比のＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳ−エステル（１ｇ／Ｌ、ＩｎＶｅｎｔ  ＧｍｂＨ）と共に１０％標識緩衝液（５００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）中、  ２２℃の暗室において３０分間インキュベートすることにより標識された。５％  １ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を１０分間添加した後、ＨＡＭ２３０３が、ＣｅｎｔｒｉＰｕｒｅ  Ｐ１０カラム（ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）を介して、そしてタンパク質ＫＷ−８０３（Ｓｈｏｄｅｘ、Ｓｈｏｗａ  Ｄｅｎｋｏ  Ｅｕｒｏｐｅ）でのサイズ排除ＨＰＬＣにより、無標識のものから分離された。
【０１９４】
白色ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ）が、ＡＤＭのアミノ酸２１−３２に対するモノクローナル中央領域抗体（１μｇ／０．２ｍＬ／ウェル、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．８）でコーティングされた（２０℃で１８時間）。３０ｇ／Ｌカリオン、５ｇ／Ｌ  ＢＳＡ（プロテアーゼ不含）、６．５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸一カリウム、３．５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ６．５）で１．５時間ブロッキングした後、プレートが真空乾燥された。
【０１９５】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２．５ｇ／Ｌウシ血清アルブミンｐＨ７．４で調製されたＨＡＭ２３０２の系列希釈が、用いられた。
【０１９６】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５０μＬの試料／較正物質及び１００μＬの１０ｎｇ／ｍＬ  ｈＡＤＭ、２．５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン  ｐＨ７．４が、コーティングされたマイクロタイタープレートにピペット注入された。撹拌されながら２〜８℃で１時間インキュベートされた後、１００μＬの標識されたＨＡＭ２３０２が、コーティングされたマイクロタイタープレートにピペット注入された。プレートが撹拌されながら２〜８℃でさらに２．５時間インキュベートされた後、非結合トレーサーが、洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ、１ｇ／Ｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．４）で５回（それぞれ３５０μＬ／ウェル）洗浄することにより除去された。ウェルに結合された化学発光が、Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０マイクロタイタープレート発光リーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることにより１ウェルあたり１秒間測定された。
【０１９７】
結果：
ＨＡＭ２３０２処置動物の試料において、注射の３時間後に測定された遊離ＨＡＭ２３０２の血漿濃度は、４８１．９μｇ／ｍＬ（±４６．８μｇ／ｍＬ）であった。ビヒクル動物の平均ＡＤＭ濃度は、１４．６±３．７５ｐｇ／ｍｌであった。ＨＡＭ２３０２処置動物におけるアドレノメデュリンの濃度は、ビヒクル動物に比較して約１００倍高かった（１４１１±６７ｐｇ／ｍＬ）（図６）。
【０１９８】
配列表
配列番号１（成熟型アドレノメデュリン（成熟型ＡＤＭ）；アミド化ＡＤＭ；バイオ−ＡＤＭ）：ｐｒｅｐｒｏＡＤＭのアミノ酸９５−１４６−ＣＯＮＨ2
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY - CONH2
配列番号２（プレプロアドレノメデュリン（ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭ））：アミノ酸１−１８５
MKLVSVALMYLGSLAFLGADTARLDVASEFRKKWNKWALSRGKRELRMSSSYPTG
LADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRVKRYRQSMNNFQGLRSFGCRF
GTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYGRRRRRSLPEAGPGRTLVSSKPQ
AHGAPAPPSGSAPHFL
配列番号３（プロアドレノメデュリンＮ−２０末端ペプチド、ＰＡＭＰ）：ｐｒｅｐｒｏＡＤＭのアミノ酸２２−４１
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
配列番号４（中央領域プロアドレノメデュリン、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）：ｐｒｅｐｒｏＡＤＭのアミノ酸４５−９２
ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
配列番号５（Ｃ−末端プロアドレノメデュリン、ＣＴ−ｐｒｏＡＤＭ）：ｐｒｅｐｒｏＡＤＭのアミノ酸１４８−１８５
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL 
配列番号６：
GYTFSRYW
配列番号７：
ILPGSGST
配列番号８：
TEGYEYDGFDY
配列番号９：
QSIVYSNGNTY
配列番号１０：
FQGSHIPYT
配列番号１１（ＡＭ−ＶＨ−Ｃ）：
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILP
GSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
配列番号１２（ＡＭ−ＶＨ１）：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
配列番号１３（ＡＭ−ＶＨ２−Ｅ４０）：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
配列番号１４（ＡＭ−ＶＨ３−Ｔ２６−Ｅ５５）：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK 
配列番号１５（ＡＭ−ＶＨ４−Ｔ２６−Ｅ４０−Ｅ５５）：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
配列番号１６（ＡＭ−ＶＬ−Ｃ）：
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYR
VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLE
IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
C
配列番号１７（ＡＭ−ＶＬ１）：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYR
VSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKL
EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN
SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG
EC
配列番号１８（ＡＭ−ＶＬ２−Ｅ４０）：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNR
DSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAA
PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK
DSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１９（アドレノメデュリンのＮ−末端部分ａａ１−２１）
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
配列番号２０（アドレノメデュリンのＣ−末端部分ａａ４２−５２）
APRSKISPQGY-NH2
配列番号２１（アドレノメデュリンの中央領域部分ａａ２１−４２）
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA
配列番号２２（アドレノメデュリンの中央領域部分ａａ２７−３９）
AHQIYQFTDK DKD
配列番号２３（ラットアドレノメデュリンアミノ酸１−５０）
YRQSMNQGSRSTGCRFGTCTMQKLAHQIYQFTDKDKDGMAPRNKISPQGY-NH2
配列番号２４（アドレノメデュリンの中央領域部分ａａ２１−３２）
CTVQKLAHQIYQ
配列番号２５（アドレノメデュリンのＮ−末端部分ａａ  １−１９）
YRQSMNQGSRSNGCRFGTC 
配列番号２８：（３アミノ酸の長さにより配列表に挙げられていない）
RVS
配列番号２６（ＨＡＭ８１０１の重鎖）
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGS
TNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTT
VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT
FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 
配列番号２７（ＨＡＭ８１０１の軽鎖）
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNR
FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAP
SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD
STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【図１】
2021500548.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2021500548.tif 000012
【配列表】
2021500548000001.app
【国際調査報告】
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