(57)【要約】  本明細書には、非混和相（例えば、滴状物）内で懸濁された固相粒子（例えば、小滴担体粒子）に関連付けられた別個の容積を形成する系及び方法が説明される。系の一実施形態は、各小滴担体粒子内に水相の流体の小滴を保持するマイクロスケールの空隙又は空洞を包含する複数のヒドロゲル基の小滴担体粒子を含む。水相に関連付けられた複数のヒドロゲル小滴担体粒子は、非混和性油相の別個の要素として懸濁される。空隙又は空洞を包含するマイクロスケールのヒドロゲル小滴担体粒子は、マイクロ流体小滴生成器を使用して製造されてもよい。滴状物は、単一体（例えば、単一分子及び単一細胞）及び検体を分析するために使用されてもよい。【選択図】図２
2021534402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非混和性流体内に懸濁された固相粒子に関連付けられた容積を用いる小滴ベース系であって、
架橋されたヒドロゲルから形成された複数の３次元親水性小滴担体粒子であって、各前記親水性小滴担体粒子が、その内部に形成された空隙又は空洞を有する、複数の３次元親水性小滴担体粒子と、
前記３次元親水性小滴担体粒子に結合され、かつ、前記複数の３次元親水性小滴担体粒子の前記空隙又は空洞内に配置された水性流体と、を備え、
前記水性流体に結合された前記複数の３次元親水性小滴担体粒子は油相で配置又は懸濁される、系。
【請求項２】
前記３次元親水性小滴担体粒子の前記空隙又は空洞内に配置された前記水性流体が実質的に同じ容積を有している、請求項１に記載の系。
【請求項３】
前記空隙又は空洞が前記３次元親水性小滴担体粒子の表面に開口する、請求項１に記載の系。
【請求項４】
前記空隙又は空洞が、前記３次元親水性小滴担体粒子のエンベロープの総表面積の３３％未満の面積を有する開口部で、前記３次元親水性小滴担体粒子の表面に開口する、請求項３に記載の系。
【請求項５】
前記空隙又は空洞が、前記３次元親水性小滴担体粒子のエンベロープの総表面積の１０％未満の面積を有する開口部で、前記３次元親水性小滴担体粒子の表面に開口する、請求項３に記載の系。
【請求項６】
前記空隙又は空洞が、前記３次元親水性小滴担体粒子のエンベロープの総表面積の５％未満の面積を有する開口部で、前記３次元親水性小滴担体粒子の表面に開口する、請求項３に記載の系。
【請求項７】
前記空隙又は空洞が、前記３次元親水性小滴担体粒子の完全に内側に配置され、かつ、前記３次元親水性小滴担体粒子の表面と交差しない、請求項１に記載の系。
【請求項８】
前記複数の３次元親水性小滴担体粒子がＰＥＧ基の架橋ヒドロゲルから形成される、請求項１に記載の系。
【請求項９】
前記複数の３次元親水性小滴担体粒子が、その上又はその内部に形成された固有のしるしを備える、請求項１に記載の系。
【請求項１０】
前記複数の３次元親水性小滴担体粒子の少なくとも一部の前記空隙又は空洞が、その内部に細胞又はビーズを包含する、請求項１に記載の系。
【請求項１１】
前記複数の３次元親水性小滴担体粒子の前記空隙又は空洞が、約１００ｆＬ〜約１０ｎＬの範囲内の容積を有している、請求項１に記載の系。
【請求項１２】
前記複数の３次元親水性小滴担体粒子の前記空隙又は空洞が、約５μｍ及び約２５０μｍの範囲内の長さ寸法を有している、請求項１に記載の系。
【請求項１３】
前記複数の３次元親水性小滴担体粒子が、その内部又はその上に包含されるバーコード材料をさらに備える、請求項１に記載の系。
【請求項１４】
前記複数の３次元親水性小滴担体粒子が、その内部に包含される磁性粒子をさらに備える、請求項１に記載の系。
【請求項１５】
前記複数の３次元親水性小滴担体粒子が、その内部に包含される光散乱粒子をさらに備える、請求項１に記載の系。
【請求項１６】
前記複数の３次元親水性小滴担体粒子が、様々な強度の１以上の染料を備える、請求項
１に記載の系。
【請求項１７】
前記複数の３次元親水性小滴担体粒子が、異なるサイズの粒子を備える、請求項１に記載の系。
【請求項１８】
非混和性流体内に懸濁された固相粒子に関連付けられた容積を用いる小滴ベースの系であって
架橋されたヒドロゲルから形成された複数の３次元親水性小滴担体粒子であって、各前記親水性小滴担体粒子が、その内部に形成された空隙又は空洞を有する、複数の３次元親水性小滴担体粒子と、
前記３次元親水性小滴担体粒子に結合され、かつ、前記複数の３次元親水性小滴担体粒子の前記空隙又は空洞内に配置された水性流体と、を備え、
前記水性流体に結合された前記複数の３次元親水性小滴担体粒子は、油相で配置又は懸濁されて滴状物のエマルションを形成し、実質的にすべての前記滴状物は、その内部に包含される単一の親水性小滴担体粒子を備える、系。
【請求項１９】
前記３次元親水性小滴担体粒子の前記空隙又は空洞内に配置された前記水性流体が実質的に同じ容積を有している、請求項１８に記載の系。
【請求項２０】
前記空隙又は空洞が前記３次元親水性小滴担体粒子の表面に開口する、請求項１８に記載の系。
【請求項２１】
前記空隙又は空洞が、前記３次元親水性小滴担体粒子のエンベロープの総表面積の３３％未満の面積を有する開口部で前記３次元親水性小滴担体粒子の表面に開口する、請求項２０に記載の系。
【請求項２２】
前記空隙又は空洞が、前記３次元親水性小滴担体粒子のエンベロープの総表面積の１０％未満の面積を有する開口部で前記３次元親水性小滴担体粒子の表面に開口する、請求項２０に記載の系。
【請求項２３】
前記空隙又は空洞が、前記３次元親水性小滴担体粒子のエンベロープの総表面積の５％未満の面積を有する開口部で前記３次元親水性小滴担体粒子の表面に開口する、請求項２０に記載の系。
【請求項２４】
前記空隙又は空洞が、前記３次元親水性小滴担体粒子の完全に内側に配置され、かつ、前記３次元親水性小滴担体粒子の表面と交差しない、請求項１８に記載の系。
【請求項２５】
前記複数の３次元親水性小滴担体粒子がＰＥＧ基の架橋ヒドロゲルから形成される、請求項１８に記載の系。
【請求項２６】
親水性小滴担体粒子を製造する方法であって、
複数の入口を有するマイクロ流体小滴生成器デバイスを提供することと、
前記複数の入口のうちの１つの入口に光開始剤を包含する水性二相系の架橋可能な第１成分の溶液を流すことであって、前記架橋可能な第１成分はポリ（エチレングリコール）ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体である、流すことと、
前記複数の入口のうちの別の入口に架橋剤を包含する前記水性二相系の第２成分の溶液を流すことと、
前記複数の入口のうちの別の入口に油相を流し、それによって水滴が前記マイクロ流体デバイス内に形成され、各水滴が、それぞれの小滴内で別個の領域に分かれ、前記別個の領域は、ＰＥＧ成分の富化相及び前記水性二相系の第２成分の富化相を包含する、流すことと、
光に暴露することによって前記ＰＥＧ成分の富化相を架橋して親水性小滴担体粒子を形成することと、を含む方法。
【請求項２７】
前記架橋が紫外線（ＵＶ）への曝露によって開始される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記油及び前記第２成分の富化相を前記小滴担体粒子から除去することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
別個の水溶液に前記親水性小滴担体粒子をローディングすることをさらに含み、前記親水性小滴担体粒子は前記別個の水溶液の小滴に結合される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記別個の水溶液が、前記親水性小滴担体粒子内に形成された空隙又は空洞内にさらに配置される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２成分の前記富化相がデキストランを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
親水性小滴担体粒子を製造する方法であって、
複数の入口を有するマイクロ流体小滴生成器デバイスを提供することと、
架橋剤を包含する水性二相系の架橋可能な第１成分の溶液を複数の入口のうちの１つの入口に流すことであって、前記架橋可能な第１成分はポリ（エチレングリコール）ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体である、流すことと、
前記複数の入口のうちの別の入口に、前記水性二相系の第２成分の溶液を流すことと、
前記複数の入口のうちの別の入口に油相を流し、それによって小滴がマイクロ流体デバイス内で形成され、各小滴は、ＰＥＧ成分の富化相及び前記水性二相系の前記第２成分の富化相を包含するそれぞれの前記小滴内で別個の領域に分かれる、流すことと、
ｐＨを増加させることによって前記ＰＥＧ成分の前記富化相を架橋して親水性小滴担体粒子を形成することと、を含む方法。
【請求項３３】
小滴担体粒子を用いて細胞分泌物アッセイを実行する方法であって、
ａ．複数の３次元親水性小滴担体粒子を提供することであって、各粒子は、その内部に形成された空隙又は空洞を有する、提供することと、
ｂ．前記複数の３次元親水性小滴担体粒子の前記空隙又は空洞内に細胞をローディングすることと、
ｃ．対象の細胞分泌物に特異的な前記複数の３次元親水性小滴担体粒子に親和性剤を添加することと、
ｄ．前記細胞及び前記親和性剤を包含する前記複数の３次元親水性小滴担体粒子を乳化して複数の滴状物を形成することと、
ｅ．前記複数の滴状物をインキュベートすることと、
ｆ．水溶液内で前記複数の３次元親水性小滴担体粒子を得るために前記滴状物のエマルションを破壊することと、
ｇ．前記複数の３次元親水性小滴担体粒子のうちの１以上に対象の分泌物に特異的な染色剤、色素又は他の２次親和性試薬を添加することと、
ｈ．前記複数の３次元親水性小滴担体粒子のうちの１以上の親水性小滴担体粒子上の前記対象の細胞分泌物に特異的な染色剤、染料又は他の２次親和性試薬によって形成又は生成されたシグナルについて、工程（ｇ）の前記複数の３次元親水性小滴担体粒子を分析することと、を含む方法。
【請求項３４】
前記親和性剤を添加する前に、ローディングされた前記細胞を包含する前記複数の３次元親水性小滴担体粒子を洗浄することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｇ）の前記複数の３次元親水性小滴担体粒子を分析することが、フローサイトメータを通じて前記複数の３次元親水性小滴担体粒子を流すことを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｇ）の前記複数の３次元親水性小滴担体粒子を分析することが、ウェルプレート又は他のホルダ内で前記複数の３次元親水性小滴担体粒子を観察又は読み取ることを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記フローサイトメータで測定された閾値蛍光強度又は色に基づいて、前記複数の３次元親水性小滴担体粒子をソーティングすることをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記親和性剤のみが、前記複数の３次元親水性小滴担体粒子の前記空隙又は空洞内に配置されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記親和性剤が、前記複数の３次元親水性小滴担体粒子の前記表面の実質的にすべての上に配置されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記工程は連続して実行される、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]  本出願は、２０１８年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７１９，４７６号の優先権を主張し、当該出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許法第１１９条及びその他の適用法令にしたがって優先権が主張される。
【０００２】
連邦政府資金による研究開発の記載
[0002]  本発明は、米国国立衛生研究所から付与された認可番号ＧＭ１２６４１４の下で政府の支援を得てなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
[0003]  本技術分野は、概して、その中に形成された規定の空隙又は空洞を有するミリメートル未満の小さな粒子に関し、規定の空隙又は空洞は、流体を保持し、かつ、別個の非混和性流体中に懸濁される。より具体的には、本技術分野は、その中に形成された空隙又は空洞内に流体を保持する小滴担体粒子から形成された滴状物（dropicle）構造に関する。好適な一実施形態では、小滴担体粒子は、親水性のヒドロゲル材料から形成され、かつ、空隙又は空洞内に水溶液を保持する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]  マイクロ流体工学は、単分散エマルション（流体の別の連続相中の非混和性流体の分散小滴の懸濁液）を形成するための至適基準のアプローチである。マイクロ流体技術はより利用可能となったが、デバイスや機器は、高価であり、専門知識を必要とする。ある用途では、（例えば、固相反応を実行するため、又は、表面に付着する細胞を増殖させるため）粒子を包含する小滴を生成することも有利である。小滴ごとに単一粒子を包含する小滴を生成することは、小滴中の粒子カプセル化が確率過程であるために、現在は困難である。無作為に混合されたエマルションと比較して、単分散性が増大した水滴を生成するための代替のアプローチは、「Single-Cell Multiplex Gene Detection and Sequencing with Microfluidically Generated Agarose Emulsions」、Angewandte Chemie International Edition、50（2）、390-395（2011）でNovakらによって説明された。
【０００５】
[0005]  Novakらでは、油水懸濁液内への分散粒子を包含する水相の単純な攪拌（ボルテックス／ピペット）を用いて小滴が形成された。Novakらは、ＰＣＲ増幅のための単離された区画を形成するために、細胞カプセル化アガロースビーズの再乳化を利用した。この研究は、アガロースゲル小滴中での細胞及びプライマー官能化ビーズのカプセル化のためのマイクロ流体デバイスに依存した。ＰＣＲ後の下流分析は、放出されたプライマービーズについてサイトメトリにより実行されたが、より大きなアガロースビーズについては実行されなかった。
【０００６】
[0006]  小滴に包含された粒子は、最小の小滴サイズを規定するための鋳型として機能することができる。しかしながら、流体は、薄い層内でのみ粒子を取り囲むので、このアプローチには顕著な欠点がある。このアプローチによって形成された小滴は、ヒドロゲル粒子の周囲に形成される「薄い」容積に大きな変動を有し、マイクロスケール物体（例えば、細胞、ビーズ）のカプセル化のための空間を提供せず、また、粒子マトリックス内で自由に拡散することができない大きな分子との反応に理想的ではない。
【発明の概要】
【０００７】
[0007]  一実施形態では、粒子表面に接続された又は粒子表面と連通した空隙又は空洞領域を包含する微小粒子の使用が、顕著に改良された粒子鋳型として機能して、小滴の均一な分布を生成する一方で、反応を実行し又は細胞、ビーズ及び他の小さな微小物体をカプセル化するための開放空間も包含することができる。これらの空洞包含粒子はまた、非空洞包含粒子と比較してより大量の液体試料（小滴当たり及び複数の粒子についての総試料容積）をカプセル化する能力を向上させ、これは細胞培養、細胞分泌物分析及び大量の試料の診断分析に重要である。
【０００８】
[0008]  微小粒子の形状及び空隙の設計は、これらの粒子によって鋳型化された均一な容積エマルションを達成することを制御するための重要なパラメータである。集合して互いにネスト／連結することができる粒子の形状は、二流体相系との混合時に形成された小滴の均一性を減少させる凝集粒子を導く。好適な実施形態では、微小粒子の形状は、球形エンベロープ内に内接して取り去られた空隙容積を有する球形エンベロープによって規定される。取り去られた空隙又は空洞は、粒子の外面と連結する、連通する又は粒子の外面に開口する球体の形状をとり、三日月形の断面を有する最終粒子を生成することができる。内接した空隙は、流体充填のための経路を生成するために、その表面で球形エンベロープと交差する。好適な一態様において、空隙は、狭い開口部（すなわち、球形エンベロープの表面積の小さい画分）で球形エンベロープと交差する。ある実施形態では、開口部によって規定されるこの画分の面積は、粒子の球形エンベロープ全体の３３％未満であり、他の実施形態では１０％未満であり、さらなる実施形態では、画分の面積は５％未満である。代替的に、ある実施態様では、取り去られた空隙は、球形エンベロープの表面と交差しない。こうした実施形態では、細胞又は大きな分子は、粒子によって鋳型化された小滴によって単離されることはできないが、水及び小分子の拡散は、空隙の充填及び分子分析又は他の下流アッセイを可能にするヒドロゲル又は他の多孔質材料から形成された微小粒子について可能である。関連の実施形態では、空隙の容積は、微小粒子材料と比較して高い空隙率／分子拡散率を有するポリマー材料を含む。他の実施形態では、粒子のエンベロープ形状は、より大きな接触表面積を伴わない楕円形又は他の形状であってもよいことに留意されたい。空隙の容積は、粒子容積から取り去られた１以上の空隙領域を備えてもよい。
【０００９】
[0009]  微小粒子の表面特性及び材料は、小滴の形成を支援するように制御されるべきである。例えば、親水性表面（例えば、油相と比較して水相との低い界面張力）を有する微小粒子を使用して、水性系の小滴を鋳型化することができる。代替的に、疎水性／フルオロフィリック（fluorophilic）の粒子（例えば、水相と比較して油／フッ素オイル相との低い界面張力）を使用して、別個の非混和性連続相の油系の小滴を鋳型化することができる。油系の小滴中の油相は、フッ素オイル、鉱油、シリコーン油、植物由来油、動物由来油、原油、炭化水素又は燃料、有機溶媒などを含んでもよい。好適な一実施形態では、微小粒子は、フッ素オイル連続相に包含される内接した空隙容積に基づいて均一な容積の水性小滴の形成を鋳型化する親水性ヒドロゲル材料から形成される。
【００１０】
[0010]  例示的な一実施形態では、空洞又は空隙包含ヒドロゲル粒子は、小滴マイクロ流体力学と組み合わせられた水性二相系を使用して均一な空洞を生成するように製造される。例示的な実施形態では、ＰＥＧ／デキストラン水性二相系が開示されているが、ＰＥＧ／ポリビニルアルコール又はＰＥＧ／高イオン強度塩系（又は３−非混和性相系）のような他の水性二相系が使用されることもできる。特定の一実施形態では、ＰＥＧ及びデキストランは、フローフォーカシング小滴生成器内で同時に流され、各小滴中に２つの別個の領域を生成するために相分離する混合材料からエマルションを生成する。外部ＰＥＧ領域が架橋され（例えば、紫外光励起と光開始剤及び架橋剤の存在とを介して）、内部デキストラン層が洗浄除去されて、微小粒子内に大きな空隙空間を残す。ＰＥＧ及びデキストランの両方の相対濃度を調節することによって、マイクロゲル粒子内の空隙空間又は空洞の形態及び／又は容積を調節することができる。空洞包含粒子の油内への乳化の最初の試験は小滴サイズの均一な範囲を示している。さらに、粒子内の空隙空間又は空洞は、空隙又は空洞に進入する高分子量ＦＩＴＣデキストラン溶液（５００ｋＤａ）のような大きな分子に自由にアクセス可能であることが示されている。
【００１１】
[0011]  一実施形態では、非混和性流体中に懸濁された固相粒子に結合された容積を用いる小滴ベース系は、架橋されたヒドロゲルから形成された複数の３次元親水性小滴担体粒子を含み、各親水性小滴担体粒子は、その中に形成された空隙又は空洞を有している。水性流体は、３次元親水性小滴担体粒子に結合され、かつ、複数の３次元親水性小滴担体粒子の空隙又は空洞内に配置される。水性流体に結合された複数の３次元親水性小滴担体粒子はさらに油相で配置される。ある実施形態では、３次元親水性小滴担体粒子の空隙又は空洞内に配置された水性流体は、実質的に同じ容積（例えば、実質的に単分散容積）を有している。したがって、系は、第１流体をその中に保持し、かつ、第２の別個の非混和性流体中に懸濁される、規定の空隙又は空洞がその中に形成された複数の固体粒子を含む。ある実施形態では、第１流体は水性流体であってもよい一方で、第２の別個の非混和性流体は油系流体である。他の実施形態では、第１流体は油系流体である一方で、第２の別個の非混和性流体は水性流体である。
【００１２】
[0012]  別の実施形態では、非混和性流体中に懸濁された固相粒子に結合された容積を用いる小滴ベース系は、架橋されたヒドロゲルから形成された複数の３次元親水性小滴担体粒子を含み、各親水性小滴担体粒子は、その中に形成された空隙又は空洞を有する。水性流体は、３次元親水性小滴担体粒子に結合され、かつ、複数の３次元親水性小滴担体粒子の空隙又は空洞内に配置される。水性流体に結合された複数の３次元親水性小滴担体粒子は、さらに、油相で配置又は懸濁されて滴状物エマルションを形成する。好適には、形成される滴状物エマルションの実質的にすべては、その中に単一の小滴担体粒子を包含する。
【００１３】
[0013]  別の実施形態では、親水性小滴担体粒子を製造する方法は、複数の入口を有するマイクロ流体小滴生成器デバイスを提供することを含む。光開始剤を包含する水性二相系の架橋可能な第１成分を包含する流体溶液は、複数の入口のうちの１つの入口に流され、架橋可能な第１成分はポリ（エチレングリコール）ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体である。架橋剤を包含する水性二相系の第２成分の溶液が複数の入口のうちの別の入口に流される。油相が複数の入口のうちの別の入口においてデバイス内に流され、それにより、小滴がマイクロ流体デバイス内に形成され、各小滴は、それぞれの小滴内を別個の領域に分離し、別個の領域は、架橋可能な第１成分（例えば、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体）の富化相、及び、水性二相系の第２成分の富化相（例えば、デキストランのようなポリマー）を包含している。その後、架橋可能な第１成分の富化相が、光に暴露されることによって架橋され、親水性小滴担体粒子を形成する。
【００１４】
[0014]  別の実施形態では、親水性小滴担体粒子を製造する方法は、複数の入口を有するマイクロ流体小滴生成器デバイスを提供することを含む。架橋剤を包含する水性二相系の架橋可能な第１成分の溶液は、複数の入口のうちの１つの入口において小滴生成器デバイス内に流され、架橋可能な第１成分は、ポリ（エチレングリコール）ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体である。水性二相系の第２成分の溶液は、複数の入口のうちの別の入口において小滴生成器デバイス内に流される。油相が複数の入口のうちの別の入口において小滴生成器デバイス内に流され、それによって小滴がマイクロ流体デバイス内に形成され、各小滴は、架橋可能な第１成分（例えば、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体）の富化相及び水性二相系の第２成分の富化相を包含する、それぞれの小滴内の別個の領域に分かれる。その後、架橋可能な第１成分の富化相が、ｐＨを増加させることによって架橋され、親水性小滴担体粒子を形成する。
【００１５】
[0015]  別の実施形態では、小滴担体粒子を使用して細胞分泌物アッセイを実行する方法は、複数の３次元親水性小滴担体粒子を提供することであって、各粒子は、その中に形成された空隙又は空洞を有する、提供する工程と、複数の３次元親水性小滴担体粒子の空隙又は空洞内に細胞をローディングする工程と、対象の細胞分泌物に特化した親和剤を添加する工程と、細胞及び親和剤を包含する複数の３次元親水性小滴担体粒子を乳化して複数の滴状物を形成する工程と、複数の滴状物をインキュベートする工程と、滴状物のエマルションを破壊して、水溶液中に細胞を包含する３次元親水性小滴担体粒子を再生し、複数の３次元親水性小滴担体粒子の１以上に、対象の分泌物に特化した染色剤、染料又は他の２次親和剤を添加する工程と、複数の３次元親水性小滴担体粒子の１以上への対象の細胞分泌物に特化した染色剤、染料又は他の２次親和剤によって形成された又は生成されたシグナルのための、以前の工程の複数の３次元親水性小滴担体粒子を分析する工程と、を含む。複数の３次元親水性小滴担体粒子は、親和剤を添加する前に任意選択的に洗浄されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】[0016]  滴状物の一実施形態を示している。
【図１Ｂ】[0017]  滴状物の別の実施形態を示している。
【図２】[0018]  滴状物形成の全般的な概略図を示している。乾燥又は懸濁された小滴担体粒子が取り出され、任意の界面活性剤と共に分散相が添加又は交換される。任意の界面活性剤と共に連続相が添加され、懸濁液が攪拌されて（例えば、ボルテックス、ピペットなどを介して）、サイズを減少させたエマルションを生成する。十分な攪拌後、サテライト小滴と共に均一なサイズの滴状物が形成される。
【図３】[0019]  分散相として５μＭのＦＩＴＣデキストラン（５００ｋＤａ）溶液、及び、連続相として０．５％Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）を有するＮｏｖｅｃ（商標）７５００フッ素オイルによる「滴状物」の形成を示している。蛍光画像は、滴状物の空洞内に区別可能なシグナルを示している。
【図４Ａ】[0020]  マイクロゲル粒子懸濁液によって形成されたエマルションの画像を示しており、懸濁液は、ＴＲＩＴＣチャネル（右）に示された球形の小滴担体粒子を有するＮｏｖｅｃ（商標）７５００オイル＋０．５％Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）に乳化される。
【図４Ｂ】[0021]  ほぼすべての小滴が０又は１粒子のいずれかを包含することを示す粒子／小滴の関数としての小滴の数のグラフを示している。
【図４Ｃ】[0022]  カプセル化された球形の粒子によって形成された小滴の均一領域と共に、不均一なサテライト小滴の範囲を示す小滴サイズ分布を示すグラフを示している。
【図４Ｄ】[0023]  カプセル化された三日月形の小滴担体粒子によって形成された滴状物の均一領域と共に、不均一なサテライト小滴の範囲を示す小滴サイズ分布を示すグラフを示している。
【図４Ｅ】[0024]  小滴当たりの小滴担体粒子（三日月形）の数（ｎ＝１２０７）の関数としての小滴の画分のグラフを示している。ほとんどすべての小滴は単一の小滴担体粒子を包含している。
【図５】[0025]  サテライト小滴からの滴状物の分離を概略的に示している。ある実施形態では、滴状物及びサテライト小滴が異なる力（大きさ及び／又は方向）を受けるように、外力又は外力の組み合わせ（例えば、磁力、重力、浮力、抗力、求心力など）が加えられる。
【図６】[0026]  図６Ａ及び図６Ｂは、チオール化磁性粒子（１μｍ）の存在下でゲル化され、その後、フッ素オイル中で乳化されたＰＥＧ−ビニルスルホンマイクロゲル粒子の画像を示している。図６Ａは、最初の乳化が、空のサテライト小滴の大きなバックグラウンドにおいて磁性マイクロゲル粒子をカプセル化する水性小滴をもたらしたことを示している。図６Ｂは、乳化された磁性マイクロゲル粒子が空の小滴のバックグラウンドから分離されることを可能にする磁場の作用後に撮られたものである。
【図７Ａ】[0027]  水性二相系を介して空洞包含微小粒子を製造するために使用されるプロセスの一実施形態を示している。この実施形態では、ＰＥＧ（例えば、４アームの１０ｋＤａのＰＥＧ−ノルボルネン）及びデキストラン（例えば、４０ｋＤａ）相は、マイクロ流体小滴生成器デバイス（図７Ｂ）内で同時に流され、油（例えば、Ｎｏｖｅｃ（商標）７５００＋０．２５％Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標））中に単分散エマルションを生成する。小滴が形成された時点でＰＥＧ相及びデキストラン相が分離し、その後、ＰＥＧ相が架橋される。一実施形態では、紫外光励起が使用されてゲルを架橋する。より具体的には、光開始剤（２％ｗ／ｖのリチウムフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート（ＬＡＰ））がＰＥＧ相で予備分散させられ、架橋剤（ＤＴＴ）がデキストラン相中に予備分散させられる。相分離後、紫外線が使用されて、ＰＥＧ−ノルボルネンとＤＴＴ架橋剤との間のチオール−エン反応を誘導するラジカルを生成し、ゲルマトリックスを生成する。架橋後、粒子は洗浄されて油相及びデキストラン相を除去する。小滴生成、相分離及び洗浄のそれぞれの顕微鏡画像が、マイクロ流体小滴生成デバイスのそれぞれの領域の下方に示されている。
【図７Ｂ】[0028]  図７Ａの方法を使用して小滴担体粒子を形成するために使用されるマイクロ流体小滴生成デバイスを示している。
【図８Ａ】[0029]  ＰＥＧ−デキストラン水性二相系の例の相図を示している。この実施形態では、２０ｋＤａの８アームＰＥＧビニルスルホン及び４０ｋＤａのデキストラン溶液が使用された。エマルションは、図７Ｂに示されたフローフォーカシング／小滴生成マイクロ流体デバイスを用いて形成された。ＰＥＧ及びデキストラン領域の形態は、それらの相対濃度を変化させることによって調節されることができる。希釈濃度では、デキストラン相とＰＥＧ相とは混合されたままである。低い希釈濃度では、ＰＥＧ及びデキストランは相分離を受ける。デキストラン対ＰＥＧ濃度比が最終小滴で増加すると、内部デキストラン領域の容積画分が増加する。ＰＥＧ及びデキストランの総濃度が増加すると、二相間の界面張力がデキストラン領域の突出を引き起こす（右上の画像）。図示されている小滴の直径は約１００マイクロメートルである。
【図８Ｂ】[0030]  例示的なＰＥＧ−デキストラン水性二相系の相図を示している。この実施形態では、１０ｋＤａの４アームＰＥＧ−ノルボルネン及び４０ｋＤａのデキストラン溶液が使用された。ＰＥＧ及びデキストランの濃度を調整することにより、小滴の形態及び得られた紫外光架橋粒子の両方が調節されることができる。
【図９】[0031]  水性二相系アプローチを使用して製造された小滴担体粒子の範囲を示している。架橋及び洗浄工程の後、小滴担体粒子は、それらの元の直径の約１３０％まで膨潤する。ここに示した条件については、２０％ｗ／ｖの４０ｋＤａのデキストラン及び１５％ｗ／ｖの４アームＰＥＧ−ノルボルネン（１０ｋＤａ）が使用された。チャネル高さ７０マイクロメートル、ＰＥＧ流速４マイクロリットル／分、デキストラン流量１マイクロリットル／分、並びにそれぞれ油流速１０及び２０マイクロリットル／分のマイクロ流体小滴生成デバイスを使用して、１００マイクロメートル及び８０マイクロメートルの直径の小滴担体粒子１２が製造された。直径５５、４５及び１０マイクロメートルの小滴担体粒子１２が、チャネル高さ１８マイクロメートル、ＰＥＧ流速２マイクロリットル／分、デキストラン流速０．５マイクロリットル／分、並びにそれぞれ油流速５、１０及び２０マイクロリットル／分のマイクロ流体小滴生成デバイスを使用して製造された。
【図１０Ａ】[0032]  フッ素オイル中に形成されたＰＥＧ−デキストランエマルションを示している。画像分析（右）はＰＥＧ（ＣＶ＝０．７５％）及びデキストラン相（ＣＶ＝１．４５％）の両方で高い均一性を示している。ＣＶは変動係数である。
【図１０Ｂ】[0033]  水中に分散され、蛍光顕微鏡を使用して画像化された架橋小滴担体粒子を示している（左の２つの画像）。粒子は、ＴＲＩＴＣ−マレイミド染料と共役されて、それらを蛍光チャネルで観察した−蛍光バーコーディングのために同様のフルオロフォア（蛍光色素）共役工程が使用されることができる。粒子サイズの分布は、図１０Ｂの右側に配置された直径に対する小滴担体粒子の数のグラフに見られるように均一である（ＣＶ＜５％）。
【図１０Ｃ】[0034]  図１０Ｃ及び図１０Ｄは、水中に分散され、蛍光顕微鏡を使用して画像化された小滴担体粒子を示している。
【図１０Ｄ】[0034]  図１０Ｃ及び図１０Ｄは、水中に分散され、蛍光顕微鏡を使用して画像化された小滴担体粒子を示している。図１０Ｄは、図１０Ｃの拡大領域を示している。
【図１０Ｅ】[0035]  粒子数の関数としての開口部径及び粒子径のヒストグラムを示している。相分離された小滴の紫外線架橋によって高い均一性が達成された一方で、それらはマイクロ流体チップ内に残った（外径ＣＶ＝１．５％、開口部径ＣＶ＝２．１％）。
【図１１Ａ】[0036]  小滴容積変動の理論的計算を示している。ここでは、球形の粒子及び三日月形又は中空の小滴担体粒子（すなわち、空隙又は空洞包含粒子）によって鋳型化される滴状物が考慮され、かつ、滴状物は、マイクロ流体デバイスによって形成された小滴（粒子なし）と比較される。小滴担体粒子は、一定のサイズに制限され、小滴の外径は、粒子径に対して変化させられる。グラフは、空洞を有する粒子を使用することによって、総容積に対する分散相容積の変動が直径の増加と共に減少することを示している。より具体的には、分散相容積の変動は、粒子外径に対する空洞内径の比が増加するにつれて減少し、このことは、滴状物において均一な反応を実行するのに有利である。
【図１１Ｂ】[0037]  図１１Ｂ及び図１１Ｃは、滴状物中の試薬カプセル化効率の理論的計算を示している。ここでは、球形の粒子及び三日月形又は中空の小滴担体粒子（すなわち、空隙又は空洞包含粒子）によって鋳型化された滴状物が考慮される。図１１Ｂは、比較的大きい空洞を有する粒子、及び、より厚い外側水層を有する滴状物についてカプセル化効率が増加することを実証している。
【図１１Ｃ】[0037]  図１１Ｂ及び図１１Ｃは、滴状物中の試薬カプセル化効率の理論的計算を示している。ここでは、球形の粒子及び三日月形又は中空の小滴担体粒子（すなわち、空隙又は空洞包含粒子）によって鋳型化された滴状物が考慮される。図１１Ｃは、滴状物の形成前に小滴担体粒子の濃度を増加させる（空隙率を減少させる）ことがカプセル化効率を増加させることを示している。
【図１２】[0038]  多くの標準アッセイによって粒子の官能化及び滴状物の適合性を可能にするために、小滴担体粒子が、多くの異なる反応性部分によってどのように修飾されることができるかを概略的に示している。粒子共役の３つの方法には、直交反応性化学、ビオチン−ストレプトアビジン結合又は細胞接着性ペプチドが含まれる。
【図１３】[0039]  図１３Ａ及び図１３Ｂは、ＰＣＲ（図１３Ａ）及びデジタルＥＬＩＳＡ（図１３Ｂ）のようなデジタル核酸増幅アッセイが滴状物内でどのように実行されることができるかを示している。核酸又は抗体によって官能化された小滴担体粒子は、水溶液中で適当なアッセイ試薬と混合される。対象の検体は、小滴担体粒子の表面と優先的に自己結合し、その後の洗浄がバックグラウンドシグナルを除去することを可能にする。その後、粒子は、機械的攪拌を通じて乳化され、滴状物単離反応を形成し、かつ、小滴容積内に又は小滴担体粒子自体に付着する蓄積したシグナルを形成する。その後、滴状物は、標準的な顕微鏡、フローサイトメトリ又はプレートリーダを通じて分析されることができる。
【図１４】[0040]  図１４Ａ〜図１４Ｃは、滴状物乳化が細胞生存率に影響を及ぼさないことを示している。ヘキスト（hoescht）及びカルセインによって染色されたジャーカット（Jurkat）細胞が小滴担体粒子と共に水溶液中に懸濁させられた。小滴担体粒子は、フッ素オイル中で機械的攪拌を通じて乳化されて、細胞を包含する滴状物を形成した。滴状物は、明視野における蛍光顕微鏡（細胞形態）（図１４Ａ）、ＤＡＰＩ（ヘキスト−核染色）（図１４Ｂ）及びＦＩＴＣ（カルセイン−細胞生存性）チャネル（図１４Ｃ）を介して画像化された。
【図１５Ａ】[0041]  図１５Ａ〜図１５Ｄは、バーコーディングの例示的な実施形態の概要を示している。図１５Ａは、小滴担体粒子の外径を変化させながら、内部空洞のサイズがどのように維持されるかを示している。滴状物はサイズ範囲によって識別される。
【図１５Ｂ】[0041]  図１５Ａ〜図１５Ｄは、バーコーディングの例示的な実施形態の概要を示している。図１５Ｂでは、小滴担体粒子は、様々な強度の１以上の染料によって修飾される。固有の粒子タイプは、強度又は複数の染料強度の比によって定義される。
【図１５Ｃ】[0041]  図１５Ａ〜図１５Ｄは、バーコーディングの例示的な実施形態の概要を示している。図１５Ｃでは、種々の数又は磁性包含量の磁性粒子が粒子上／粒子内に埋め込まれ／架橋され、相対的な磁力による分離を可能にする。
【図１５Ｄ】[0041]  図１５Ａ〜図１５Ｄは、バーコーディングの例示的な実施形態の概要を示している。図１５Ｄでは、様々な数及びサイズの光散乱粒子が、小滴担体粒子上又は内に埋め込まれ／架橋され、光散乱又は散乱角度の相対量／強度に基づく分離を可能にする。
【図１６】[0042]  細胞分泌物分析及び任意選択的なソーティングのための例示的な概略的ワークフローを示している。小滴担体粒子は、ウェルプレート、フラスコなど内に播種され、その後、細胞は小滴担体粒子の空隙又は空洞内に播種される。細胞が付着した後、小滴担体粒子及び結合した細胞は、油系連続相とピペット又は他の混合作用によって区画化するために滴状物内に形成される。細胞はインキュベートされ、分泌された分子は、結合した小滴担体粒子上に捕捉される。結合した細胞を有する小滴担体粒子は水相に戻され、捕捉された分泌物は、例えば、第２の親和性相互作用を通じて蛍光分子によって分類される。その後、小滴担体粒子及び結合した細胞は、フローサイトメータを使用して分析されてソーティングされることができる。
【図１７Ａ】[0043]  細胞から分泌された抗体が、細胞に結合された小滴担体粒子上に捕捉される一実施形態を概略的に示している。この例では、抗−ＩＬ−８分泌ＣＨＯ細胞が滴状物内でインキュベートされ、分泌された抗体は、小滴担体粒子に共役されたプロテインＡによって捕捉される。水相に戻した後、捕捉抗体は、可視化のために蛍光抗−ＩｇＧによって分類される。
【図１７Ｂ】[0044]  細胞に結合された小滴担体粒子上の閾値を超える高い蛍光シグナルを示す、細胞が付着していない小滴担体粒子についての蛍光シグナルを示さない又は低い蛍光シグナルを示す例示的な顕微鏡画像を示している。明視野画像（左）は、小滴担体粒子及び１つの小滴担体粒子の空洞内の細胞を示している。中央の画像は、生細胞を示す蛍光染色剤を使用した細胞の蛍光顕微鏡画像を示している。右の画像は、小滴担体粒子を覆う分泌抗体の抗−ＩｇＧ染色の蛍光顕微鏡画像を示している。
【図１８】[0045]  蛍光活性化細胞ソータを使用した、結合した分泌細胞と共に小滴担体粒子の高スループットソーティングを示している。画像の上段は、ソーティング前の小滴担体粒子及び結合した細胞を示している。明視野画像化が左側に示され、カルセインＡＭによって染色された生細胞を示す蛍光画像化が中央に示され、ＩｇＧに特化したＣｙ５共役２次抗体によって分類された捕捉された抗体分泌物を示す別個のチャネルにおける蛍光画像化が右側に示されている。３つの（上のパネル）画像はすべて、同じ視野のものである。これらの小滴担体粒子及び結合した細胞はフローソータを通過させられる。サイトメータにおける小滴担体粒子の事象に対する前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）が２次元プロットで示されている。事象の右上の四分円がゲートされ、それらの事象のための遠赤チャネルの蛍光強度がヒストグラム（蛍光強度を示す右側のグラフ）で示されている。顕微鏡画像化は、画像に「ソーティングゲート」として示されている特定の閾値を超える高い蛍光シグナル事象をソートオフすることによって、細胞を有する小滴担体粒子の蓄積と、高濃度の捕捉されたタンパク質と、を示している。スケールバーはすべて２００ミクロンである。
【図１９】[0046]  総分泌に基づいて単一細胞又は単一細胞コロニーのソーティング／分析を実行するための例示的なワークフローを示している。前述したアプローチにしたがって、単一細胞が、小滴担体粒子に単離されることができ、かつ、分泌物がクロストークなしに蓄積して小滴担体粒子に捕捉される滴状物に乳化されることができる。その後、小滴担体粒子は、水中に戻され、分泌物の量を示すために染色され、付着した細胞と共に分析／ソーティングされることができる。その後、細胞のソーティングされたサブ集団は拡張されて反復選択工程を実行することができる。所望のサブ集団の選択を改善するために、複数のサイクルにわたってスクリーニングが実行されることができる。関連の実施形態では、小滴担体粒子中に播種された単一細胞が増殖させられて、乳化前に小滴担体粒子に付着したクローン性コロニーを形成することができる。これにより、クローンの増殖及び分泌に基づく分析及びソーティングを組み合わせることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[0047]  図１Ａは滴状物１０の一実施形態を示している。本明細書で使用される用語「滴状物」は、非混和性相１６（例えば、油）中に懸濁された分散（例えば、水）相溶液又は流体１４の別個の容積に包含され、別個の容積を包含し又は別個の容積に結合される固相粒子又は小滴担体粒子１２のことを指している。小滴担体粒子１２（又は、粒子１２とも参照することもある）は、好適な一実施形態において、好適な一実施形態では親水性である架橋ヒドロゲル材料から形成される小型で、（それらの最長寸法において）サブミリメートルスケールで、球形又は楕円形の粒子である。小滴担体粒子１２の典型的な寸法範囲（直径又は最長寸法）は、約１０μｍ〜約５００μｍ、より好適には２０μｍ〜２００μｍ、さらにより好適には４０〜１２０μｍである。各小滴担体粒子１２は、その中に形成された空隙容積又は空洞１８を有している。空隙又は空洞１８は、分散相溶液又は流体１４（例えば、水相）の少なくとも一部を保持する３次元容積を規定する。空隙又は空洞１８内に保持された典型的な流体容積は、約１００ｆＬ及び約１０ｎＬの範囲の容積を含んでいる。小滴担体粒子１２内の空隙又は空洞１８の長さ寸法（例えば、球形の空隙の直径）は、数ミクロンであり、典型的には約５μｍより大きく、かつ、約２５０μｍより小さい。ある実施形態では、小滴担体粒子１２は、水相溶液又は流体１４の完全な小滴内に包含され、溶液又は流体１４の一部は空隙又は空洞１８内にも配置される。これは図１Ａに示されている。
【００１８】
[0048]  一実施形態では、非混和性流体中に懸濁された固相の小滴担体粒子１２に関連する別個の容積を採用する小滴ベースのエマルション系が提供される。この系では、一実施形態によれば、複数の水性滴状物１０は、油１６に包含されるエマルションを形成する。油１６は連続相（すなわち、エマルションの外部相）として作用する一方で、水性滴状物１０は、分散相（すなわち、エマルションの内部相、又はカプセル化される相）として作用する。油１６は、滴状物１０を取り囲んで単分散滴状物１０エマルションを生成する。単分散とは、滴状物１０の各々内に実質的に同じ容積の流体を保持する滴状物１０の能力のことを指している。
【００１９】
[0049]  別の実施形態では、複数の油性滴状物１０が、水性流体１６に包含されるエマルションを形成する。水性流体１６が、連続相（すなわち、エマルションの外部相）として作用する一方で、油性滴状物１０が、分散相（すなわち、エマルションの内部相、又はカプセル化される相）として作用する。水性流体１６は、滴状物１０を取り囲んで単分散滴状物１０エマルションを生成する。この実施形態は、小滴担体粒子１２が疎水性であって周囲の連続相が水性である先の実施形態とは逆である。
【００２０】
[0050]  図１Ａは、小滴担体粒子１２の外面と相互作用する、外面と連通する又は外面に開口する空隙又は空洞１８を含む小滴担体粒子１２の一実施形態を示している。本明細書で説明するように、空隙又は空洞１８は、球体の形状をとる取り去られた空隙又は空洞として形成されてもよく、図１Ａに図示されるもののような三日月形の断面を有する最終的な小滴担体粒子１２を生成する。内接した空隙又は空洞１８は、流体充填（並びに、細胞、ビーズ及び他の微小物体へのアクセス）のための経路を形成するためにその表面で球形又は楕円形のエンベロープと交差する。好適な一態様において、空隙又は空洞１８は、狭い開口部（すなわち、小滴担体粒子１２の球形又は楕円形のエンベロープの実際の表面積の小さい画分）で球形又は楕円形のエンベロープと交差する。ある実施形態では、開口部によって規定されるこの画分の面積は、小滴担体粒子１２の全体の球形／楕円形のエンベロープ又は表面積の３３％未満であり、他の実施態様では１０％未満であり、さらなる実施形態では５％未満である。
【００２１】
[0051]  代替的に、ある実施形態では、取り去られた空隙又は空洞１８は、球形のエンベロープの表面と交差しない。例えば、図１Ｂは、３次元の親水性小滴担体粒子１２の完全に内部に配置され、かつ、３次元の親水性小滴担体粒子１２の表面と交差しない空隙又は空洞１８を含む小滴担体粒子１２のそうした一実施形態を示している。この実施形態では、小滴担体粒子１２を形成する材料は、流体、試薬及び／又は試料が小滴担体粒子１２を通じて空隙又は空洞１８内に拡散し得るように透過性又は半透過性にされてもよい。同様に、ある実施形態における反応生成物が、サイズに応じて小滴担体粒子１２から外側に拡散することができてもよい。拡散のための特定のサイズのカットオフは、小滴担体粒子１２を形成する下地材料の多孔性を調整することによって調節されてもよい。典型的には、細胞、ビーズ又は他の微小物体のようなより大きな種は小滴担体粒子１２を通じて拡散することができない一方で、流体及び小分子及び他の種は小滴担体粒子１２を通じて拡散することができる。関連の実施形態では、空隙又は空洞１８は、試料分子及び試薬の周囲流体（例えば、非架橋デキストラン）からの分子拡散を可能にする多孔質ポリマー材料を保持又は担持している。好適には、この実施形態では、空隙又は空洞１８内に配置された多孔質ポリマー材料は、小滴担体粒子１２を形成する下地材料よりもさらに多孔質である。
【００２２】
[0052]  ある態様において、小滴担体粒子１２の表面は、図１Ａ、図１２、図１３Ａ、図１３Ｂ、図１６、図１７Ａで見られるように、滴状物１０の官能化及び多くの標準アッセイとの滴状物１０の適合性を可能にするために１以上の反応性又は結合性部分２０で修飾されてもよい。例えば、反応性又は結合性部分２０は、空隙又は空洞１８内の小滴担体粒子１２の表面に形成されてもよい。結合性又は反応性部分２０は、例として、核酸、ペプチド、細胞接着ペプチド、触媒、酵素、抗体、プライマー、抗原、アプタマー、ビオチン、又はビオチン／ストレプトアビジン複合体を含み得る。反応性又は結合性部分２０の小滴担体粒子１２への共役のために、当業者に公知の直交反応性化学物質が使用されてもよい。
【００２３】
[0053]  本明細書で説明するように、親水性の小滴担体粒子１２を使用する実施形態では、水相の小滴担体粒子１２の懸濁液を油（及び任意の界面活性剤）と組み合わせ、図２に示すもののように混合（例えば、ボルテックス、ピペットなど）することによって、滴状物１０の形成が実現される。攪拌と混合による流体力学的剪断とが、小さいサイズを有するエマルションを生成する。継続的な攪拌の後、小滴内に包含される小滴担体粒子１２は、小滴のさらなる収縮を防止するサイズを拘束するものとして作用する。小滴担体粒子１２が空隙又は空洞１８を包含する固体鋳型小滴も熱力学的に安定化されることができる。温度又は時間の増加に伴い、滴状物１０は、水相で分散相の支持されていない小滴が凝集時の系の界面エネルギーの減少に起因して凝集する方法と同じ方法で凝集しない。ピペット及びボルテックスの両方が使用されて滴状物１０が形成されてもよい。ピペット及び／又はボルテックスによる混合を使用することによって、小滴担体粒子１２を包含しないより小さなサテライト小滴とともに滴状物１０の均一なエマルションを達成することができる。均一な粒子鋳型エマルションの一実施形態では、実質的に全ての粒子包含小滴（例えば、＞９５％、＞９９％、又は＞９９．９％）は各々、単一の小滴担体粒子１２と結合される。それらの固有のサイズ範囲に起因して、滴状物１０は、画像分析を使用して容易に識別されることができ、又は、標準的な濾過技術を使用して、周囲のより小さなサテライト小滴（すなわち、滴状物１０の形成中に生成されたバックグラウンド小滴）から容易に濾過されることができる。また、サテライト小滴は、小滴担体粒子１２に付着させられ、したがって、滴状物１０内で起きるような反応を進行させない反応性部分２０を包含しない。試料の全水量が、試料と混合された小滴担体粒子１２の各々によって支持されることができる容積の合計以下である場合、サテライト小滴は有意に減少又は除去されることができる。
【００２４】
[0054]  概して、滴状物１０の形成については、ピペットは、単一の小滴担体粒子１２のみを包含する水性エマルションの大きな画分を有する単分散滴状物１０を形成するために、ボルテックスよりも良好に実行されることが見い出された（例えば、図４Ｂ及び図４Ｅ参照）。滴状物の形成は、最初に、試料を包含する試薬チューブを機械的に攪乱／タップすることによって、又は、より大きな直径の開口部（例えば、１０００μＬピペット）を有するピペットを使用することによって、のいずれかによって油中で小滴担体粒子１２の最初の懸濁液を分解し、その後、ボルテックスによって、又は、より小さい直径を有するピペット（例えば、１００、２００μＬピペット）によるピペットによってより微細なエマルションに分解することによって、改良されることができる。
【００２５】
[0055]  有機相で存在する界面活性剤の濃度は、形成された滴状物１０の単分散性、及び、単一の小滴担体粒子１２を包含する容積の画分にも影響する。一般的な傾向として、油相の界面活性剤の濃度を増加させると、小滴担体粒子１２の単一粒子包含滴状物１０へのより良好な分散がもたらされた。Ｎｏｖｅｃ７５００中の０．５％ｖ／ｖを超えるＰｉｃｏ−Ｓｕｒｆ濃度は高い単分散性をもたらした。好適な実施形態では、Ｎｏｖｅｃ７５００中に２％ｖ／ｖのＰｉｃｏ−Ｓｕｒｆが連続相として使用され、形成された滴状物１０のほぼ完全な単分散性をもたらす。水相内で水性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の添加を通じて、滴状物の単分散性のさらなる改善が達成されることができる。一実施形態では、０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７が、粒子凝集を低減させ、界面張力を減少させ、より均一な滴状物１０をもたらすために、水相に含まれる。別の実施形態では、水性分散相に１％ｗ／ｖのＰＥＧ−５０００を添加すると、粒子１２の凝集を低減し、より均一な滴状物１０が得られた。
【００２６】
[0056]  さらに、小滴担体粒子１２のポリマー組成、又は、分散相の塩濃度などの因子が、溶液中の小滴担体粒子１２の互いに対する親和性に影響を与えることに留意すべきである。例えば、より高い重量％のＰＥＧから形成された球形の小滴担体粒子１２が好まれた。６重量％のＰＥＧは３重量％よりも好適であった。１２重量％のＰＥＧ小滴担体粒子１２がさらに好適であった。したがって、ポリマー骨格製剤は、小滴担体粒子１２を溶液中に適切に分散させて単分散滴状物１０を形成するのに必要な界面活性剤濃度に影響を与えることができる。さらに、脱イオン（ＤＩ）水のような低塩溶液を使用して滴状物の単分散性が増加させられた。
【００２７】
[0057]  油相の選択はまた、得られた滴状物１０の機能に影響し得る。例えば、Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ界面活性剤を注入されたＮｏｖｅｃ−７５００は、ＲＡＮ界面活性剤を有するＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）ＦＣ−４０油のような代替油相よりも均一な滴状物１０を形成する際に好ましかったが、この条件も滴状物１０を形成することができた。しかしながら、ＲＡＮ界面活性剤と共のＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）ＦＣ−４０は、Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆと共のＮｏｖｅｃ−７５００と比較した場合に熱安定性が改善された。したがって、ある用途は、油相の交換から利益を得ることができる。例えば、滴状物１０は、Ｎｏｖｅｃ−７５００内に形成されて単分散エマルションを生じさせることができ、その後、Ｎｏｖｅｃ油は、除去されて、ＤＮＡ増幅のためのサーモサイクリングのような高温用途のためにＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）ＦＣ−４０に置換されることができる。
【００２８】
[0058]  図２は、滴状物１０を形成する１つの方法を示している。まず、分散相で乾燥した又は懸濁された小滴担体粒子１２が提供される。これらは、ホルダ又は容器２２に包含されてもよい（例えば、エッペンチューブが図示されているが、他のホルダ又は容器が使用されることもできる）。分散相が存在しない場合、分散相（例えば、水相）がホルダ又は容器２２に添加される。別の実施形態では、図２の工程１００に見られるように、初期の分散相は、添加されるか、又は、別の分散相と交換されることができる。図２は、分散相１４中に包含される小滴担体粒子１２を示している。その後、工程１１０に見られるように、連続相２６が、任意の界面活性剤と共に添加される（例えば、油相）。その後、ホルダ又は容器２２は、ボルテックス、ピペットなどを含み得る撹拌工程１２０を受ける。攪拌工程１２０は、滴状物１０及び場合によってはサテライト小滴２８を生成する。サテライト小滴２８は、例えば、混合物の濾過を使用して除去されてもよい。サテライト小滴２８の形成は、滴状物１０の形成中に添加される分散相の容積を制御することによって最小限に抑えられてもよい。
【００２９】
[0059]  図３は、分散相１４としての５μＭのＦＩＴＣデキストラン（５００ｋＤａ）溶液と、連続相１６として添加された０．５％Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）界面活性剤を有するＮｏｖｅｃ（商標）７５００フッ素オイルと、による滴状物１０の形成を示している。図３は、乳化前（左）と滴状物１０が形成される乳化後に分散相１４中に包含される小滴担体粒子１２を示している。乳化前（左画像）及び乳化後（右画像）に対応する画像が下に提供されている。蛍光画像は、滴状物１０の空隙又は空洞１８内に明確なシグナルを示している（右画像）。
【００３０】
[0060]  図４Ａは、（０．５％Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）界面活性剤を有するＮｏｖｅｃ（商標）７５００フッ素オイルから構成された連続相の水滴を鋳型とするために球形の粒子１２を使用して）形成された結果として生じたエマルションの画像を示している。滴状物１０は、明視野画像（左画像）に示されており、球形の小滴担体粒子１２が、蛍光チャネル（右画像）で示されている。両方の非常にばらつきのあるサイズのサテライト小滴２８と、蛍光染色された小滴担体粒子１２と重なる均一な滴状物１０と、が示されている。図４Ｂは、小滴当たりの小滴担体粒子１２の関数としての小滴の数を示すグラフを示している。小滴担体粒子１２を包含する小滴のうち、ほぼすべてが単一の小滴担体粒子１２のみを包含している。図４Ｃは、カプセル化された小滴担体粒子１２（すなわち、滴状物１０）によって形成された小滴の均一領域と共に、不均一なサテライト小滴２８の範囲を示す小滴サイズ分布を示すグラフを示している。
【００３１】
[0061]  図４Ｄは、カプセル化された三日月形の小滴担体粒子１２（すなわち、滴状物１０）によって形成された小滴の均一領域と共に、不均一なサテライト小滴２８の範囲を示す小滴サイズ分布を示すグラフを示している。三日月形の小滴担体粒子１２が使用されて、０．５％Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）界面活性剤を有するＮｏｖｅｃ（商標）７５００フッ素オイルから構成された連続相の水滴を鋳型にした。図４Ｅは、小滴当たりの小滴担体粒子１２（三日月形）の関数としての小滴の数を示すグラフを示している。小滴担体粒子１２を包含する小滴のうち、ほぼすべてが単一の小滴担体粒子１２のみを包含している。
【００３２】
[0062]  図５は、代替の実施形態に係る、サテライト小滴２８からの滴状物１０の分離を示している。これらの実施形態では、滴状物１０及びサテライト小滴２８が異なる力（大きさ及び／又は方向）を受けるように、外力又は外力の組み合わせ（例えば、磁力、重力、浮力、抗力、求心力など）が加えられる。例えば、小滴担体粒子１２は、加えられた磁場に応答しないサテライト小滴２８から滴状物１０を分離するために使用される外部から加えられた磁場と共に磁性材料を包含してもよい。
【００３３】
[0063]  例えば、図６Ａ及び図６Ｂは、チオール化された磁性粒子（１μｍ）の存在下でゲル化され、続いて、フッ素オイル中で乳化され、その後、分離されたＰＥＧ−ビニルスルホンマイクロゲル粒子の画像を示している。図６Ａは、最初の乳化が、無意味（empty）なサテライト小滴２８の大きなバックグラウンドにおいて磁性マイクロゲル粒子をカプセル化する水性小滴（ＡＤ）をもたらしたことを図示している。図６Ｂは、磁場を加えた後、乳化された磁性マイクロゲル粒子が、無意味なサテライト小滴２８のバックグラウンドから分離されることができることを示している。
【００３４】
[0064]  空隙又は空洞１８を有する小滴担体粒子１２を製造するために、油相の単分散エマルションを形成するために使用されるマイクロ流体小滴生成器デバイス３０が提供され、それによって内部分散相は水性二相系を含む。水性二相系の一部は、架橋性ヒドロゲル前駆体、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体である。水性二相系の他の一部はデキストランのようなポリマーである。その後、水性二相系の二相は、形成された小滴内の別個の領域に散らばる。その後、二相系のうちの一成分（すなわち、架橋性成分）が架橋されて小滴担体粒子１２を形成する。図７Ａは、その中に形成された空隙又は空洞１８を有する小滴担体粒子１２を生成するプロセスを概略的に示している。図７Ａに見られるように、水性二相系が使用されて小滴担体粒子１２を形成する。この特定の実施形態では、水性二相系は、（架橋剤を使用して）架橋性成分であるＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体（例えば、１０ｋＤａの４アームＰＥＧ−ノルボルネン）及び架橋されていないデキストラン（例えば、４０ｋＤａ）を含む。マイクロ流体小滴生成器デバイス３０は、油相内で水性二相系のエマルションを生成するために使用される。２つの水相成分（例えば、ＰＥＧ及びデキストラン）を包含する小滴は、相分離工程における小滴形成後に分離する。相分離後、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体成分はゲル内に架橋される。例えば、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体成分内の光開始剤（例えば、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９、ＬＡＰなど）の存在下でのジオチオトレートル（ＤＴＴ）のような架橋剤は、その後、光暴露（例えば、紫外線励起）を受けて架橋を開始する。もちろん、システイン包含ペプチド又は他のジチオール又はマルチアーム架橋剤のような他の架橋剤が使用されてもよい。別の実施形態では、マルチアームＰＥＧ−ノルボルネン＋ジチオール架橋剤の間のチオール−エン反応が紫外線及び光開始剤を介して開始される。関連の実施形態では、ＰＥＧ及び／又はポリマー相のいずれかは、光開始剤及び架橋剤の一方又は両方の組み合わせを包含することができる。架橋後、小滴担体粒子１２は洗浄されて油相及びデキストラン相を除去することができる。
【００３５】
[0065]  図７Ｂは、フローフォーカシングを使用して空隙又は空洞１８を有する小滴担体粒子１２を生成するために使用されるマイクロ流体小滴生成器デバイス３０のレイアウトを示している。マイクロ流体小滴生成器デバイス３０は、エマルション（小滴）が生成される小滴生成ゾーン又は領域３８に収束／交差する多数のマイクロ流体チャネル３２、３４、３６を含む。生成された小滴は、小滴が蓄積して一時的に貯蔵され得るチャンバ又は領域４２に導くことができる別のマイクロ流体チャネル４０を下って移動する。デバイス３０の出口４４が使用されて小滴／小滴担体粒子１２を除去してもよい。各マイクロ流体チャネル３２、３４、３６は、様々な成分を入力するためのそれぞれの入口４６、４８、５０を含む。この例では、ＰＥＧ（例えば、４アームの１０ｋＤａのＰＥＧ−ノルボルネン）相及びデキストラン（例えば、４０ｋＤａ）相がマイクロ流体デバイス３０内で共に流されて、油（例えば、Ｎｏｖｅｃ（商標）７５００＋０．２５％Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標））中の単分散エマルションを生成する。一実施形態では、マイクロ流体チャネル３２につながる第１入口４６が使用されて界面活性剤と共に油相を送達する。マイクロ流体チャネル３４につながる第２入口４８がデキストランを送達するために使用される。マイクロ流体チャネル３６につながる第３入口５０がＰＥＧ並びに架橋剤及び光開始剤を送達するために使用される。別の実施形態では、マイクロ流体チャネル３２につながる第１入口４６が使用されて界面活性剤と共に油相を送達する。マイクロ流体チャネル３４につながる第２入口４８が使用されて架橋剤と共にデキストランを送達する。マイクロ流体チャネル３６につながる第３入口５０が使用されてＰＥＧ及び光開始剤を送達する。小滴生成前のポリマー前駆体及び架橋剤の分離は、試料シリンジ又はチャネル入口内で架橋し始め、流れを停止し得る高反応性化学物質を使用する場合に特に有用である。別の実施形態では、架橋剤は、ＰＥＧ又はデキストラン相に含まれないが、代わりに、それ自身の追加の入口及び接続チャネルに注入される。これは、架橋剤がデキストラン相、例えばより大きなチオール化ＰＥＧ架橋剤に容易に溶解しない場合に有用である。
【００３６】
[0066]  小滴が形成されて、その後にＰＥＧ相が架橋された時点で、ＰＥＧ相及びデキストラン相が分離する。上述したように、一実施形態では、紫外線励起が使用されてゲルを架橋する。より具体的には、光開始剤（２％ｗ／ｖのリチウムフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート（ＬＡＰ））がＰＥＧ相中に予備分散され、架橋剤（ＤＴＴ）はデキストラン相中に予備分散される。相分離後、紫外線が使用されて、ＰＥＧ−ノルボルネンとＤＴＴ架橋剤との間のチオール−エン反応を誘導するラジカルを生成し、小滴担体粒子１２を形成するゲルマトリックスを生成する。架橋は、マイクロ流体小滴生成器デバイス３０の出口４４を通じて小滴が出た後、マイクロ流体小滴生成器デバイス３０又は「オフチップ」において起こり得る。架橋後、小滴担体粒子１２が洗浄されて油相及びデキストラン相を除去した。
【００３７】
[0067]  別の実施形態では、ｐＨレベルの変化が使用されて小滴担体粒子１２を架橋する。例えば、ＰＥＧ−ビニルスルホン／マレイミド＋ジチオール架橋剤が低いｐＨで使用されて、マイクロ流体小滴生成器デバイス３０における小滴形成の前のゲル化を防止する。その後、ｐＨは、下流の油相に有機塩基（例えば、トリエチルアミン）を添加することによって分散相で増加させられて架橋反応を開始する。関連の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれるde Rutte，J.M.，Koh，L，Di Carlo，D.の「Scalable High-Throughput Production of Modular Microgels for In Situ Assembly of Microporous Tissue scafols」、Adv. Funct. Mater. 2019，29，1900071に記載されているような、並列ステップの乳化小滴発生成器マイクロ流体デバイス３０が、単一の溶液中でデキストラン相と混合されたプレポリマー相上で動作し、相分離及び重合に先立って（例えば、紫外線又はｐＨ変化を介して）単分散小滴を生成する。上述した実施形態のすべてにおいて、ＰＥＧの架橋後、デキストラン相が除去され、所望の水相が添加又は置換されて滴状物１０を形成することができる。図１Ｂに例示されるように、ある実施形態では、例えば、中空の小滴担体粒子１２を形成する場合には、内部デキストラン相が空隙又は空洞１８内に維持されることができる。
【００３８】
[0068]  図８Ａは、ＰＥＧ−デキストラン水性二相系の例の相図を示している。ＰＥＧ及びデキストランの両方の相対濃度を調節することによって、小滴担体粒子１２内の空隙空間又は空洞１８の形態及び／又は容積を調節することができる。ここでは、２０ｋＤａの８アームＰＥＧビニルスルホン及び４０ｋＤａのデキストラン溶液が使用された。エマルションは、図７Ｂのマイクロ流体小滴生成器デバイス３０を使用して形成された。ＰＥＧ及びデキストラン領域の形態は、それらの相対濃度を変化させることによって調節されることができる。希釈濃度では、デキストラン相及びＰＥＧ相は混合されたままである。希釈濃度が低い場合、ＰＥＧ及びデキストランは相分離を受ける。デキストラン対ＰＥＧ濃度比が最終小滴で増加すると、内部デキストラン領域の容積画分が増加する。ＰＥＧ及びデキストランの総濃度が増加すると、二相間の界面張力がデキストラン領域の突出を引き起こす（右上画像）。図示の小滴の直径は約１００マイクロメートルである。ＰＥＧ及びデキストランの濃度が高い条件では、相分離が急速（＜１秒）であることが分かった。バイノーダルの近傍の条件では、相分離はより長い（＞１秒）ことが分かった。
【００３９】
[0069]  図８Ｂは、ＰＥＧ−デキストラン水性二相系の例の相図を示している。この実施形態では、１０ｋＤａの４アームＰＥＧ−ノルボルネン及び４０ｋＤａのデキストラン溶液が使用された。ＰＥＧ及びデキストランの濃度を調整することによって、小滴の形態及び得られた紫外線架橋小滴担体粒子１２の両方が調節されることができる。希釈濃度では、ＰＥＧ相及びデキストラン相は単一相として混合されたままである（バイノーダル線より下）。より高い濃度（バイノーダルより上）では、ＰＥＧ及びデキストラン相は、小滴内で別個のＰＥＧリッチ相及びデキストランリッチ相に分離する。ＰＥＧ及びデキストランの総濃度が増加すると、二相間の界面張力が増加し、デキストラン相が油界面のより大きな部分と接触させられる（右上画像）。紫外線で架橋した後、得られた小滴担体粒子１２（相分離を受けなかった１つの例を除く）は、（小滴担体粒子１２の全サイズに対して）同様の空洞容積を維持するが、空洞の開口部サイズを増加させる。ＰＥＧに対するデキストランの濃度の相対比が増加すると（右下）、デキストランリッチ相の容積も増加する。紫外線架橋後、より大きな容積のデキストランリッチ相を有する小滴担体粒子１２は、比例してより大きな空洞又は空隙１８を有していた。さらに、バイノーダル曲線近傍の条件、特に高量のデキストランでは、架橋後、空洞が完全に封入されたままである（空隙が外側粒子１２のエンベロープに接触しない）ことが分かった。
【００４０】
[0070]  図９は、マイクロ流体小滴生成器デバイス３０を使用して水性二相系アプローチを使用して製造された小滴担体粒子１２の範囲を示している。架橋及び洗浄工程の後、小滴担体粒子１２は、それらの元の直径の約１３０％まで膨潤する。ここに示された条件に対して、２０％ｗ／ｖの４０ｋＤａデキストラン及び１５％ｗ／ｖの４アームＰＥＧ−ノルボルネン（１０ｋＤａ）が使用された。接合部で７０マイクロメートルのマイクロ流体チャネル高さ及び６０マイクロメートルの幅、４マイクロリットル／分のＰＥＧ流速、１マイクロリットル／分のデキストラン流速、並びに、１０及び２０マイクロリットル／分の油流速を有するマイクロ流体小滴生成器デバイス３０を使用して、１００マイクロメートル及び８０マイクロメートルの直径の小滴担体粒子１２がそれぞれ製造された。接合部で１８マイクロメートルのマイクロ流体チャネル高さ及び３５マイクロメートルの幅、２マイクロリットル／分のＰＥＧ流速、０．５マイクロリットル／分のデキストラン流速、並びに、５、１０及び２０マイクロリットル／分の油流速をそれぞれ有するマイクロ流体小滴生成器デバイス３０を使用して、５５、４５及び４０マイクロメートルの直径の小滴担体粒子１２が製造された。
【００４１】
[0071]  図１０Ａは、フッ素オイル中に形成されたＰＥＧ−デキストランエマルションの外側ＰＥＧエンベロープ及びデキストラン内部成分の直径の関数として、非架橋エマルションの画像及び小滴数のグラフを示している。画像解析は、ＰＥＧ（ＣＶ＝０．７５％）及びデキストラン相（ＣＶ＝１．４５％）の両方の直径に対して高い均一性を示した。ＣＶは変動係数である。図１０Ｂは、水中に分散された、蛍光顕微鏡を使用して画像化された架橋小滴担体粒子１２の画像を示している。小滴担体粒子１２は、ＴＲＩＴＣ−マレイミド染料と共役されて、それらを蛍光チャネル内で観察した−同様のフルオロフォア共役ステップが、小滴担体粒子１２の蛍光バーコーディングに使用されることができる。図１０Ｂはまた、架橋小滴担体粒子１２の直径の関数としての粒子数のグラフを示している。粒子サイズの分布は均一である（ＣＶ＜５％）。
【００４２】
[0072]  図１０Ｃ及び図１０Ｄは、水中に分散された、蛍光顕微鏡を使用して画像化された小滴担体粒子１２を示している。小滴担体粒子１２は、小滴生成器デバイス３０の出口領域を通過する間に紫外線で架橋された。小滴担体粒子１２は、製造プロセス中にビオチン−ＰＥＧ−チオールを添加することを通じてビオチン基を有するように修飾された。その後、小滴担体粒子１２は、小滴担体粒子１２の表面上のビオチンに結合されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（商標）５６８ストレプトアビジンで標識され、それらを蛍光的に可視化した。図１０Ｅで見られるように、蛍光画像の分析は高い均一性（外径ＣＶ＝１．５％、開口部径ＣＶ＝２．１％）を示した。
【００４３】
[0073]  図１１Ａは、滴状物１０の容積変動の理論的計算を示している。ここでは、球形の小滴担体粒子１２によって鋳型化された滴状物１０が、三日月形の小滴担体粒子１２（すなわち、空隙又は空洞包含粒子）と共に考慮され、その中に粒子１２が包含されていないマイクロ流体デバイス３０によって形成された小滴と比較される。この分析は、小滴担体粒子１２の周囲の流体の外径が、乳化プロセス中、ほとんど制御されない間に、空洞１８内の容積が十分に制御されることができるという結果に基づいている。小滴担体粒子１２は、一定のサイズに制限され、かつ、小滴の外径は粒子直径に対して変化する。空洞又は空隙１８を有する小滴担体粒子１２を使用することによって、総容積と比較した分散相容積の偏差は、直径が増加するにつれて減少する。より具体的には、分散相容積の変動は、内部空洞１８の直径と粒子の外径との比が増加するにつれて減少し、これは、滴状物１０において均一な反応を実行するのに有用である。例えば、Ｄｉｎ／Ｄｏｕｔ＝０．５０及び０．７５の場合、三日月形の粒子１２の空隙率が増加すると、挙動は、内部粒子なしの球形の小滴の理想的な状況に近づく。
【００４４】
[0074]  図１１Ｂ及び図１１Ｃは、滴状物１０における試薬カプセル化効率の理論的計算を示している。ここでは、球形の小滴担体粒子１２及び三日月形の小滴担体粒子１２（すなわち、空隙又は空洞包含粒子）によって鋳型化された滴状物１０が考慮される。カプセル化された試薬又は試料は、粒子マトリックス内に自由に拡散しないと仮定される。カプセル化効率は、滴状物形成後の滴状物１０に結合される小滴担体粒子１２の初期の濃縮懸濁液中の試料容積の画分として定義される。カプセル化されていない試薬は、サテライト小滴２８を形成すると予想される。初期の粒子懸濁液の空隙率は、小滴担体粒子１２のエンベロープの外側の領域を占める総容積（試料＋粒子）の画分として定義される。三日月形の粒子１２と球形の粒子１２との間の計算を正規化するため、内部空洞１８の容積は、初期の空隙率の一部とはみなされない。図１１Ｂは、比較的大きい空洞を有する粒子１２及びより厚い外側水層を有する滴状物１０について、カプセル化効率の増加を実証している。いずれの場合においても、粒子１２は、最終滴状物１０の容積のより小さい画分を取り込んで、比較的多くの試料容積のカプセル化を可能にする。図１１Ｃは、滴状物１０の形成前に小滴担体粒子１２の濃度を増加させる（空隙率を減少させる）ことが、カプセル化効率を増加させることを実証している。空隙率が増加する場合には、系内に比較的多くの試薬又は試料が存在し、滴状物１０は急速に飽和し、その結果、より大きな容積のサテライト小滴２８を形成し、及びしたがって、カプセル化効率を低下させる。
【００４５】
[0075]  図１２は、小滴担体粒子１２が、多くの異なる反応性部分によって修飾されて、粒子官能化及び多くの標準アッセイとの滴状物１０の適合性をどのように可能にするかを示している。例えば、反応性又は結合性部分２０が、空隙又は空洞１８内の小滴担体粒子１２の表面上に形成されてもよい。結合性又は反応性部分２０は、例として、核酸、ペプチド、細胞接着ペプチド、触媒、酵素、抗体、プライマー、抗原、アプタマー、ビオチン又はビオチン／ストレプトアビジン複合体を含み得る。当業者に公知の直交反応性化学物質が、反応性又は結合性部分２０の小滴担体粒子１２への共役のために使用されてもよい。
【００４６】
[0076]  一実施形態では、遊離システイン基を包含するペプチド又はより大きなタンパク質が、デキストラン相内のチオール系の架橋剤と共に添加されることができる。これらのペプチドはヒドロゲル相と融合するので、ノルボルネンを含むポリマー骨格上のチオール反応部位に共有結合的に結合することができる。小滴担体粒子１２へのＣＨＯ細胞の接着を促進するために、このアプローチは、小滴担体粒子１２の製造中に細胞接着ペプチドを含むように使用されてきた。少なくとも４ｍｇ／ｍＬの濃度のインテグリン結合ペプチドＲＧＤが、デキストラン相内で使用され、強力な機械的攪拌、遠心分離及び小滴担体粒子ソーティングの存在下でさえ、小滴担体粒子１２との細胞結合を維持するために十分な接着強度を示した。別の実施形態では、遊離システイン基を包含するペプチド又はより大きなタンパク質が、ＰＥＧ相に添加されて、デキストラン相との混合前又は混合後に架橋されることができる。
【００４７】
[0077]  例示的な第２実施形態では、小滴担体粒子１２は、小滴担体粒子１２の製造中にＰＥＧ相内に０．５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの５ｋＤａのビオチン−ＰＥＧ−チオールを任意の範囲で取り込むことによって、ビオチンによって直接修飾された。紫外線への暴露時に光開始剤の存在下で、本明細書に開示される種々の実施形態に記載されるように、これらの分子上の余分なチオール基は、ヒドロゲル骨格上のチオール反応性部分に結合し、ビオチン基で均一に修飾された小滴担体粒子１２を生じさせる。ビオチン化部位は、通常、ストレプトアビジン基によって修飾され、２次ビオチン化分子への共役を可能にする。使用されるストレプトアビジンの量は、粒子当たりの結合部位の所望の数に基づいて調整されることができる。個別の細胞からの分泌タンパク質の捕捉を中心とする多くの実施形態では、８〜１０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンが、小滴担体粒子１２の外側を被覆し、広いダイナミックレンジにわたって分泌物シグナルを生じさせるのに十分であることが実験的に特定された。しかしながら、細胞がビオチン−ストレプトアビジン反応を通じて粒子１２に付着させられ、分泌物がビオチン化捕捉抗体を用いて小滴担体粒子１２の表面上に同時に捕捉される他の実施形態では、より高い濃度のストレプトアビジンが１０μｇ／ｍＬ〜２５０μｇ／ｍＬの範囲で使用された。特に、外因性ビオチンが、細胞培養培地中の一般的な添加剤であり、かつ、利用可能な結合部位の多くを前飽和させることができるので、ストレプトアビジンは、通常、ＰＢＳ中の小滴担体粒子１２に添加される。
【００４８】
[0078]  図１３Ａ及び図１３Ｂは、ＰＣＲ（図１３Ａ）及びＥＬＩＳＡ（図１３Ｂ）のようなデジタルアッセイがどのように滴状物１０内で実行されることができるかを示している。核酸又は抗体によって官能化された小滴担体粒子１２は、水溶液中で、適切なアッセイ試薬（例えば、標的ＤＮＡ、検体、レポータ染料、２次抗体、プライマー、ＤＮＴＰ、ポリメラーゼ）と混合される。対象の検体は、小滴担体粒子１２の表面と優先的に自己結合し、その後の洗浄がバックグラウンドシグナルを除去することを可能にする。その後、小滴担体粒子１２は、機械的攪拌を通じて乳化されて、小滴容積内又は小滴担体粒子１２自体上で、（例えば、酵素増幅を通じて）検体及び生成されたシグナルを単離する滴状物１０を形成する。シグナルが小滴担体粒子１２上に直接捕捉される実施形態では、蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリを通じて（例えば、フローサイトメータ１５０を使用して）小滴担体粒子１２上の蛍光又は比色シグナルを観察することによって、エマルションが破壊されて読み出しが直接行われることができる。シグナルが滴状物１０内に蓄積するが小滴担体粒子１２と直接結合しない実施形態では、滴状物１０のエマルションは、蛍光顕微鏡又は他の蛍光画像診断法、若しくは、油連続相１６と適合性を有するいくつかの市販のフローサイトメトリシステムを通じて蛍光又は比色シグナルの変化を観察することによって直接分析されることができる。
【００４９】
[0079]  図１４Ａ〜図１４Ｃは、滴状物の乳化が細胞生存率に影響を及ぼさないことを示している。ヘキスト及びカルセインによって染色されたジャーカット細胞が、小滴担体粒子１２と共に水溶液中に懸濁された。小滴担体粒子１２は、フッ素オイル中での機械的攪拌を通じて乳化されて、細胞を包含する滴状物１０を形成した。滴状物１０は、蛍光顕微鏡を介して、細胞形態を可視化するための明視野（図１４Ａ）、ヘキスト染色された核を可視化するためのＤＡＰＩ（図１４Ｂ）、及び、カルセイン標識された生細胞を可視化するためのＦＩＴＣ（図１４Ｃ）を含む複数のチャネルで画像化された。
【００５０】
[0080]  図１５Ａ〜図１５Ｄは、小滴担体粒子１２内に組み込まれたバーコーディングの代表的な実施形態の概要を示している。図１５Ａは、小滴担体粒子１２の外形寸法を変化させながら、内部空隙又は空洞１８のサイズがどのように維持されるかを示している。固有の化学又は特性を有する滴状物１０はサイズ範囲によって識別される。図１５Ｂでは、小滴担体粒子１２は、様々な強度の１以上の染料によって修飾される（本実施形態では、２つの染料が様々な強度で示されている）。固有の小滴担体粒子のタイプは、複数の染料強度（例えば、Ｄｙｅ１：Ｄｙｅ２又はＤｙｅ２：Ｄｙｅ１）の強度又は比によって定義される。図１５Ｃでは、種々の数又は磁性包含量の磁性粒子５２が、小滴担体粒子１２上／内に埋め込まれ／架橋されて、相対的な磁力による分離を可能にする。図１５Ｄでは、様々な数及びサイズの光散乱粒子５４が、小滴担体粒子１２上又は内に埋め込まれ／架橋されて、光散乱又は散乱角度の相対量／強度に基づく固有の小滴担体粒子タイプ１２の分離又は分離分析を可能にする。
【００５１】
[0081]  滴状物系の利点
[0082]  滴状物１０を使用する系の明確な利点は、短時間（〜１分）で多数の均一な小滴を生成する能力である。例えば、１０００万個の細胞の試料が単一細胞分析のためにカプセル化される場合を考える。マイクロ流体的に生成された小滴に投入する単一のポアソン分布は１０８個の小滴の生産を必要とする（１０％のカプセル化効率を仮定する）。典型的なマイクロ流体小滴生成器デバイス３０は、１０００Ｈｚの速度で小滴を生成し、全細胞集団をカプセル化するのに２８時間を必要とする。場合によっては、２次ビーズ／粒子のカプセル化が必要である（例えば、小滴シーケンス）。この状況において、二重ポアソンの投入は、単一ビーズ及び単一細胞のカプセル化（１％のビーズ＋細胞のカプセル化効率）を確実にするために、１０９個の小滴の生産を必要とするであろう。この場合、カプセル化のための時間は約１１．７日である。しかしながら、小滴担体粒子１２は、大量に事前に短時間スケールで生産され、貯蔵され、かつ、ユーザに送られることができる。その後、ユーザは、膨大な数の細胞のカプセル化を可能にするバルク溶液中の単純な混合工程を使用して、滴状物１０を大規模に並行して形成するために乳化工程を実行することができる。
【００５２】
[0083]  界面活性剤、界面活性剤混合物、油の使用
[0084]  連続相の界面活性剤の量は、小滴の破壊及び滴状物１０の形成を最適化するために、非混和性相間の界面張力を調整するために調節されることができる。分散相の界面活性剤（非イオン性、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ又はイオン性）が添加されて、界面張力をさらに調整し、分散相の小滴担体粒子１２の凝集を減少させてもよい。滴状物１０の形成に使用される油は、意図された用途に応じて調整されることができる。例えば、フッ素オイル（Ｎｏｖｅｃ（商標）７５００  ３Ｍ社、ＦＣ−４０  ３Ｍ社など）は、滴状物の形成のために同等の界面活性剤（Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）、ＲＡＮ界面活性剤など）と共に使用されることができる。これらの油は、その高い生体適合性のために生物学的検体の分析に特に適している。他の実施形態では、異なる油（例えば、シリコーン油、鉱油、植物由来油、動物由来油、長鎖炭化水素、有機溶媒）が、滴状物１０同士の間の試薬の移動、滴状物１０内のｐＨの変化などを可能にするために所望される場合がある。他の実施形態では、小滴担体粒子１２は、疎水性材料（例えば、ポリ（プロピレングリコール）ジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、ヘキサンジオールジアクリレート、ヘキサンジオールジアクリレート＋ラウリルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，６Ｈ，６Ｈ−ペルフルオロ−１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、又はメタクリルオキシプロピル末端ポリジメチルシロキサン）から製造され、かつ、油相に分散され、その後、水中油滴状物１０のエマルションを生成する。
【００５３】
[0085]  小滴担体粒子対分散容積比
[0086]  分散相１４の小滴担体粒子１２の相対数は、サテライト小滴２８の過剰な形成を防止するだけでなく、効率的で一貫性のある滴状物１０の形成を達成するために最適化されることができる。より高い分散容積比では、滴状物に関連付けられる分散容積のより低い画分が存在し、より多くのサテライト小滴の形成につながる。より低い容積比では、試薬及び粒子（滴状物１０に関連付けられた試料からのマイクロスケール物体の画分）の滴状物１０への捕捉効率が向上する。ある容積から分析される検体の画分が、カプセル化される容積の画分に依存するマイクロ流体小滴カプセル化とは異なり、滴状物１０内の固相の存在が、分析されることが可能な検体の画分から、分析される容積を分離させる固相の表面（又はマトリックス内）上の検体の濃度を可能にすることに留意されたい。
【００５４】
[0087]  滴状物の分散相への転移
[0088]  場合によっては、追加の洗浄工程、２次共役を実行し、分析／ソーティングなどのためフローサイトメータ１５０（図１３Ａ、図１３Ｂ、図１６及び図１８）を通って小滴担体粒子１２を流すため、小滴担体粒子１２を大量の分散相１４（例えば、水相）に戻すことが望ましい。ヒドロゲル基の小滴担体粒子１２、水及びフッ素オイルを使用する系では、第２界面活性剤（ペルフルオロ−オクタノール）が油相１６に添加されて、エマルションを不安定化し、水相１４の小滴担体粒子１２を回収することができる。より具体的には、過剰な油及び界面活性剤は、滴状物１０を除去することなくピペットを介してエマルション懸濁液から除去される。その後、Ｎｏｖｅｃ（商標）７５００フッ素オイル（３Ｍ社）中のペルフルオロ−オクタノールの２０％溶液が、残りの懸濁液容積にほぼ等しい容積で懸濁液に添加される。追加の水相１４が添加されて試料を希釈し、懸濁液をより容易に取り扱い、及び／又は、小滴担体粒子１２同士の間のクロストークを防止する。懸濁液は穏やかに混合され、数分後に小滴が凝集する。粒子懸濁液は、発生する非混和性相の上部から直接除去されることができる。所望であれば、フッ素オイルと混和する低密度有機相を用いて追加の洗浄工程が実行されることができる。ヘキサンの添加によって、フッ素オイルが、水相の上方で分離されることを可能にし、かつ、ピペットを介して除去されることができる。電場を介した遠心分離及び不安定化のような他の方法が、エマルションを凝集させるために利用されており、かつ、潜在的な代替方法であり得る。
【００５５】
[0089]  生物学的アッセイのための小滴担体粒子の洗浄
[0090]  生体試料の効率的な標識又は検出には、抗体又は蛍光性小分子のような試薬の存在下でのインキュベーションが必要である。さらに、サンドイッチＥＬＩＳＡのような試薬の連続的な添加を必要とするアッセイは、以前の工程からの残留試薬を除去するための中間洗浄ステップに依存する。ここでは、滴状物１０を洗浄／単離するための種々の方法並びに油相及び水相の両方におけるソーティングについて説明する。
【００５６】
[0091]  小滴担体粒子１２を水相に戻した後、溶液中の遊離検体を除去してクロストークを防止するために洗浄工程が実行されることができる。一実施形態では、粒子懸濁液が、水相で希釈され、遠心分離されて、（水よりも高い密度を有する粒子のための）容器２２の底部で小滴担体粒子１２を濃縮する。一実施形態では、小滴担体粒子１２は、２０００ｇで１分間遠心分離される。別の実施形態では、小滴担体粒子１２は、３００ｇで３〜５分間遠心分離される。遠心分離速度がより低いと、感受性細胞が使用される場合に有利である。浮遊物が、除去されて新しい溶液で置換され、小滴担体粒子１２がこの新しい溶液内に再混合される。遠心分離及び除去のこのプロセスは、洗浄のレベルを増加させるために、複数回にわたって繰り返されることができる。新しい溶液は、洗浄溶液又は新しい試薬溶液を含んでもよい。別の実施形態では、小滴担体粒子１２は、磁性粒子（例えば、小滴担体粒子１２のゲルマトリックス内に埋め込まれた）で修飾されて、磁気特性を付与し、洗浄又は溶液置換手順を可能にするために、容器２２内のある位置における小滴担体粒子１２の磁気操作／蓄積を可能にする。別の実施形態では、小滴担体粒子１２は、マイクロバブル又は中空ガラス粒子によって修飾されてそれらの密度を低下させ、かつ、例えば、共役マイクロバブル（ＢＡＣＳ）を使用して制御される浮力を用いて洗浄／分離されることができる。
【００５７】
[0092]  サテライト小滴からの滴状物の単離
[0093]  サテライト小滴２８からのバックグラウンドシグナルを低減するために、滴状物１０は、本明細書に記載されるような種々の方法を用いてサテライト小滴２８から分離されることができる。一実施形態では、非磁性であるサテライト小滴２８から磁気的に修飾された小滴担体粒子１２を有する滴状物１０を分離するために磁場が加えられる（例えば、図５参照）。磁性粒子は、マイクロ流体製造中に溶液内にそれらを投入することによって、小滴担体粒子１２のマトリックス内に埋め込まれることができる。外部磁場を使用して、磁気的に標識された小滴担体粒子１２を容器２２内のある位置に引き寄せるか又はサテライト小滴２８から分離してスライドさせ、小滴担体粒子１２は、そこで高純度で収集され、画像化され又は他の方法で分析されることができる。別の実施形態では、当技術分野で知られた周知のサイズ／変形可能性に基づく濾過スキームを使用して、より小さなバックグラウンドのサテライト小滴２８からより大きな滴状物１０を分離してもよい。これには、粒子及び小滴のサイズに基づく分離を可能にする周知のマイクロ流体粒子分離技術の使用が含まれ得る。例示的なアプローチは、慣性マイクロ流体分離デバイス、確定的横方向変位デバイス、接線流濾過デバイス、並びに、粒子のサイズ及び／又は密度差を利用する音響又は沈降に基づく分離デバイスを含む。浮力の相違も分離に利用されることができる。例えば、滴状物１０は、抗力に対する浮力の比の増加によりエッペン管の上部に蓄積する傾向がある一方で、サテライト小滴２８は、下部に蓄積し、ピペットにより部分的に除去されることができる。
【００５８】
[0094]  小滴担体粒子を生産するための水性二相系アプローチ
[0095]  小滴マイクロ流体工学（図７Ａ及び図７Ｂ）と組み合わせた水性二相系（ＡＴＰＳ）を利用してマイクロゲル小滴担体粒子１２が製造されてもよい。これらのマイクロゲル小滴担体粒子１２は内部空隙又は空洞１８を有している。概して、ＡＴＰＳの一方の相は架橋性成分を含むべきである一方で、他方の相は架橋性成分を包含すべきでない。一実施形態では、架橋性ＰＥＧ相及びデキストラン相が、界面活性剤を包含する第３油相と共にマイクロ流体小滴生成器デバイス３０内で共に流されて、ＰＥＧ相及びデキストラン相の均一な画分が、油相に懸濁された各小滴中に存在する混合水性エマルションを生成する。ＰＥＧ及びデキストランのある濃度レジームでは、二相が、別個の形態を有する小滴内の別個の空間的位置に分離する（図８）。１つの空間的位置は、ＰＥＧ成分を包含する富化相を包含する一方で、別の空間的位置は、水性二相系（例えば、デキストランのようなポリマー）の第２成分を包含する。その後、ＰＥＧ成分を包含する富化相において架橋が誘導され、形成された小滴担体粒子１２が洗浄されて油及びデキストランを除去し、ＰＥＧ小滴担体粒子１２内に内接した空隙又は空洞１８を有する球状又は楕円形のＰＥＧ粒子を生成する。空隙又は空洞１８の形状は、各小滴の以前のデキストランリッチ領域の形状に対応する。
【００５９】
[0096]  ＰＥＧ相の架橋はある技術の範囲を用いて達成されることができる。例示的なアプローチにおいて、ＰＥＧ相の紫外線及びｐＨ開始架橋の両方が実証されてきた。例えば、ＰＥＧＤＡは、紫外線及び光開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９（１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オン）、ＬＡＰ（リチウムフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート）など）によって引き起こされる鎖成長ラジカル重合を介して架橋された。別の実施形態では、マルチアームＰＥＧ−ノルボルネン＋ジチオール又はマルチアームチオール架橋剤間のチオール−エン反応が紫外線及び光開始剤を介して開始される。関連の実施形態では、ＰＥＧ−ビニルスルホン／マレイミド＋ジチオール又はマルチアームチオール架橋剤が、小滴形成より前のゲル化を防止するために低いｐＨで使用される。ｐＨは、下流で油相の有機塩基（例えば、トリエチルアミン）を添加することによって分散相で増加させられて架橋反応を開始する。
【００６０】
[0097]  例示的な一実施形態では、小滴担体粒子１２は以下の条件を用いて生産された：２．６７μＬ／分で注入されたｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に２０％ｗ／ｖの４０ｋＤａのデキストラン及び１．３％以下のＤＴＴ架橋剤を含むデキストラン相、８μＬ／分で注入されたＰＢＳ中に、１７．５％ｗ／ｖの４アームＰＥＧ−ノルボルネン、２％ｗ／ｖのＬＡＰ（リチウムフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート）及び０．５ｍｇ／ｍｌのビオチン−ＰＥＧ−チオールを含むＰＥＧ相、並びに、チャンネル高さ７０ミクロン及び接合幅６０ミクロンのマイクロ流体小滴生成器デバイス３０内に４４μＬ／分で注入されたＮｏｖｅｃ７５００油中の０．２５％ｖ／ｖのＰｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）から構成された油相。小滴担体粒子１２は、ＤＡＰＩフィルタセット及び４Ｘ対物レンズを通じて、マイクロ流体デバイスの出口領域（高さ１３０ミクロン）付近で約１〜３秒間にわたって、５０〜２００ｍＷ／ｃｍ２の電力で、集束紫外線によって架橋された。このアプローチを用いて、小滴担体粒子１２は、高い幾何学的均一性で１０００／秒以下の速度で生産された。粒子上の粒子１２の均一性ビオチン基を特徴付けるために、８マイクログラム／ｍｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（商標）修飾ストレプトアビジン溶液によって標識された。その後、小滴担体粒子１２は、図１０Ｃ及び図１０Ｄに示すように、ＴＲＩＴＣチャネル内で蛍光画像化された。画像解析の結果、小滴担体粒子１２は、平均８２．５ミクロンの外径及び１．５％のＣＶを有していた一方で、開口部径は、平均５１．０ミクロン及び２．１％のＣＶを有していた。
【００６１】
[0098]  小滴担体粒子１２は、油及び界面活性剤の連続相内のエマルションとしてオフチップで収集される。精製された小滴担体粒子１２が水相で所望される実施形態、又は、水相の精製された小滴担体粒子１２がアッセイの開始点として役立つ実施形態では、小滴担体粒子１２は、過剰な界面活性剤、未反応生体分子、及び関連の有機相を小滴担体粒子１２から除去するためにいくつかの洗浄工程を経なければならない。一実施形態では、Ｎｏｖｅｃ−７５００油、ヘキサン、エタノール及び０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を有するＰＢＳの連続的な洗浄工程を通じて、精製された小滴担体粒子１２が単離された。より具体的には、粒子エマルション及び関連の油相がオフチップで収集され、油相の大部分が除去される。小滴担体粒子１２の１ｍＬの収集のために、Ｎｏｖｅｃ−７５００中の３〜５ミリリットルのＰＢＳ及び１ミリリットルの２０％ペルフルオロ−オクタノールが粒子エマルションに添加される。溶液は、数分間穏やかに攪拌されてエマルションを破壊し、過剰な油が再度除去される。次に、３ｍＬのＮｏｖｅｃ−７５００油が再度添加され、溶液は、攪拌されて２０００Ｇで２分間にわたって遠心分離され、その後、過剰なＮｏｖｅｃ油が除去される。このプロセスが計３回の洗浄について繰り返される。次に、３ｍＬのヘキサンが粒子懸濁液に添加され、撹拌されて遠心分離され、同様に除去される。このプロセスが、計３回の追加洗浄について繰り返される。次に、３ｍＬのエタノールが粒子懸濁液に添加され、攪拌されて遠心分離され、同様に除去される。このプロセスが合計３回の追加洗浄について繰り返される。最後に、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を有する３ｍＬのＰＢＳが粒子懸濁液に添加され、攪拌されて遠心分離され、同様に除去される。このプロセスが計３回の追加洗浄について繰り返される。これらの最後の洗浄の後、小滴担体粒子１２は、残存する有機溶媒、界面活性剤及び未反応成分を含まず、かつ、アッセイに使用されることができる。細胞を伴う用途の場合、小滴担体粒子１２は、滅菌のためにエタノールの溶液中で少なくとも８〜１０時間にわたって長期間貯蔵されるべきであり、かつ、細胞播種前に水相に戻るためにさらに洗浄されることができる。
【００６２】
[0099]  サイズ及び形状の変更
[0100]  小滴担体粒子１２のサイズ及び空隙又は空洞１８の容積は、サイズ及び形状において変化し得る。マイクロ流体小滴生成器デバイス３０を使用して、油相の相対流量を水相に対して調整することによって、及び／又は、チャネル形状を変化させることによって、粒子の外径が調節されることができる。直径が１００マイクロメートルを超える及び直径が４０マイクロメートル未満の小滴担体粒子１２は、異なるチャネル高さ／流速を使用して生産されてきた。例えば、１００マイクロメートルの直径の小滴担体粒子１２は、以下の流速：油＝１０マイクロリットル／分（一実施形態では）、ＰＥＧ＝４μＬ／分、デキストラン＝１μＬ／分で、７０マイクロメートルのチャネル高さのデバイスを使用して生産された。４０マイクロメートルの直径の小滴担体粒子１２は、流速：油＝２０μＬ／分、ＰＥＧ＝２μＬ／分、デキストラン＝０．５μＬ／分（図９）で、１８マイクロメートルのチャネル高さのデバイスを使用して生産された。
【００６３】
[00101]  相対的な空洞容積及び形態は、濃度を、したがってＰＥＧ及びデキストラン領域のサイズを調整することによって調節されることができる（図８Ａ及び図８Ｂ）。バイノーダル曲線によって定義された臨界濃度では、ＰＥＧ及びデキストランは二相に分離する。二相間の界面張力はＰＥＧ及びデキストランの濃度に依存して変化し、ＰＥＧ相、デキストラン相及び油相間の接触角を変化させる。例えば、ＰＥＧ及びデキストラン濃度が増加すると、二相間の界面張力が増加し、より突出した形状になる。ＰＥＧ及びデキストランの相対比を調整することによって、形態の一貫性を維持しつつ、２つの領域の相対容積が操作されることができる。
【００６４】
[00102]  生産の均一性
[00103]  マイクロ流体（マイクロ流体小滴生成器デバイス３０）を使用した単分散小滴の生成は、空隙領域を包含する形成された小滴担体粒子１２の高い均一性を可能にする。具体的には、上述の実施形態では、非架橋ＰＥＧ−デキストランエマルションは、外径についてＣＶ＜１％、かつ、内部デキストラン相の均等な直径についてＣＶ＜２％を維持する（図１０Ａ）。デキストラン相分離領域によって規定された空隙又は空洞１８を有する形成された小滴担体粒子１２は、ＣＶ＜５％で高い均一性を維持する（図１０Ｂ）。
【００６５】
[00104]  小滴担体粒子のための三日月形状の粒子の利点
[00105]  球形の鋳型上の記述された幾何学的形状の明確な利点は、小滴担体粒子１２に使用される材料空間の外部により均一な試薬容積を有する滴状物１０を生成する能力である。これは、粒子材料マトリックス内に自由に拡散することができない大きな分子のカプセル化／定量化において特に重要である。球形の粒子によって鋳型化された小滴は、粒子の外部に小さな容積画分を包含している。この容積画分は、エマルションの分散相と小滴担体粒子１２との間の相対直径に非常に敏感である。しかしながら、内部空洞又は空隙１８を有する小滴担体粒子１２を生成することは、カプセル化された流体容積の大部分を包含する所定の幾何学的形状を有することによって、小滴担体粒子１２の外部の容積の均一性を顕著に改善する。ある実施形態では、固体の球形の粒子と比較して、空洞又は空隙１８を包含する小滴担体粒子１２を用いて形成された小滴の容積変動において３倍の減少が達成される（図１１Ａ参照）。容積の均一性が増大すると、滴状物１０内で実行される反応の均一性が増大する。空洞又は空隙１８の別の利点は、細胞、ビーズ及び他の対象のマイクロスケール物体をカプセル化するための空間を提供することである。さらに、空隙又は空洞１８の形態及びサイズの操作は、特定のサイズ、形状、剛性などを有する物体の選択的捕捉を可能にすることができる。
【００６６】
[00106]  一例では、空隙又は空洞１８のサイズは、単一細胞、ビーズ又は他のマイクロスケール物体が適合するための空間のみが存在するように調節されることができる。このようにして、複数の標的がより高い濃度でカプセル化され得る標準的なポアソン負荷と比較した場合、単一細胞（又は他の対象のマイクロスケール物体）を有するより高い画分の滴状物１０が達成されることができる。別の例では、複数の細胞型が、異なるサイズ特性（例えば、平均直径が３０ミクロンの細胞型Ａ及び平均直径が１５ミクロンの細胞型Ｂ）で存在する場合、異なる細胞型は、細胞サイズに調節された空隙又は空洞１８のサイズを有する小滴担体粒子１２を用いて選択されることができる。例えば、細胞型Ｂは、まず、２０ミクロンの空洞サイズ開口部を有する小滴担体粒子１２によって選択的に捕捉され、その後、残りの細胞集団から単離されることができる。任意選択的に、４０ミクロンの空隙又は空洞１８サイズ開口部を有する小滴担体粒子１２が、第２工程で使用されて細胞型Ａを捕捉してカプセル化することができる。
【００６７】
[00107]  小滴担体粒子を生産するための他のアプローチ
[00108]  小滴担体粒子１２として作用するのに適した空洞包含粒子は、他の犠牲カプセル化材料の使用を通じて生産されることができる。一実施形態では、単一の犠牲粒子（小滴より小さいサイズ）は、架橋性材料を包含する小滴中にカプセル化される。その後、小滴の架橋性材料は、当該技術分野において公知の種々の方法（例えば、前述の方法及び当業者に公知の他の架橋方法）を使用して架橋され、埋め込まれた犠牲粒子は洗浄及び／又は分解される。代替的に、ある実施形態では、複数の犠牲粒子／材料が、架橋性エマルション内にカプセル化されて、各々生成された小滴担体粒子１２内に空隙容積を含むマイクロ／ナノ多孔性空洞ネットワークを形成する。単一の犠牲粒子は、例えば、小滴カプセル化の前にマイクロ流体慣性オーダリング（ordering）の使用を通じて、マイクロ流体的に生成されたエマルションの各小滴中にカプセル化されることができる。犠牲粒子材料の例としては、アルギン酸塩、ゼラチン、ＭＭＰ切断可能なＰＥＧ、ポリスチレンマイクロビーズなどが含まれる。ナノ多孔性を調節するために、多孔性の小滴担体粒子１２から構成される一実施形態では、架橋前に架橋性ＰＥＧ相に非架橋性ＰＥＧが添加される。架橋後、ゲルが洗浄されて非架橋ＰＥＧを除去し、空隙空間を明らかにする。
【００６８】
[00109]  他の実施形態は、重合性流体中に空隙を形成するために三相系を利用する。例えば、３つの非混和性相エマルション：例えば、水、フッ素オイル、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート（ＥＴＰＴＡ）が使用されて、ＥＴＰＴＡ重合粒子内に空隙を生成することができる。他の実施形態は、前駆体溶液のマスク＋光開始架橋を利用して、含まれる空隙空間を有する重合性材料内に２次元／３次元突起を生成する（例えば、拡散液体成形、ストップフローリソグラフィ、連続フローリソグラフィ）。
【００６９】
[00110]  小滴担体粒子の貯蔵
[00111]  一実施形態では、小滴担体粒子１２は、分散相１４中に懸濁されている間に貯蔵される。任意選択的に、グリセロール又は他の細胞保護剤が使用されて、粒子を損傷させずに、低温（−２０又は−８０℃）で小滴担体粒子１２を貯蔵することができる。他の実施形態では、小滴担体粒子１４は、乾燥又は凍結乾燥され、その後、使用前に分散相１４内に又は分散相１４を含む試料流体内に再分散されてもよい。これにより、所定の分散相容積の滴担体粒子１２の密度を制御することができ、分散相／試料流体の高効率なカプセル化によって、小滴担体粒子１２を油連続相内に分散させることができる。凍結乾燥は、小滴担体粒子１２の長期間の貯蔵を可能にする１つの方法である。ヒドロゲル粒子の構造に損傷を与えないヒドロゲル粒子の凍結乾燥方法は、Sheikhiらによる「Microengineered emulsion-to-powder (MEtoP) technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal，and bulk properties of hydrogel suspensions」、ACS Appl. Polym. Mater.，1, 8，1935-1941 (2019)に見出されることができ、当該文献は本明細書に参照によって組み込まれる。
【００７０】
[00112]  滴状物の化学修飾
[00113]  多くの実施形態では、本明細書に記載される小滴担体粒子１２は、広く入手可能であって多くのバイオテクノロジーの用途において使用されるポリマー前駆体から製造される。したがって、種々のバイオアッセイに適合可能又は有用とするため、乳化に先立って小滴担体粒子１２に適用されることが可能な化学修飾の明確に定義された多くの方法がある。例としては、チオール−エン／チオール−インクリック化学、マイケル（Michael）付加、ＮＨＳエステル反応、アジド−アルキン化学、ビオチン−ストレプトアビジン結合、抗原−抗体相互作用などが挙げられる（図１２）。これらの変更及びそれらの用途を説明するいくつかの実施形態を以下に示す。
【００７１】
[00114]  粒子のビオチン化
[00115]  ビオチンは、タンパク質アビジン及びストレプトアビジンと強く特異的に結合するので、バイオテクノロジー産業において極めて有用であることを見い出した小分子である。さらに、ビオチンは、その機能に影響することなく、より大きなバイオ分子に容易に共役され、ストレプトアビジン被覆基質又は対象の他の生体分子へのそれらの迅速かつ効率的な共役を可能にする。ポリマーとの共役には、多数のヒドロゲル前駆体と容易に架橋される反応基を包含する短いポリマー鎖に結合された多くの市販のビオチンがある。小滴担体粒子１２をビオチン化する１つの好適な方法は、マイクロ流体小滴生成デバイス３０内のＰＥＧ溶液内にビオチンＰＥＧ−チオールを取り込むことによるものである。より具体的には、空隙構造を有するビオチン官能化ヒドロゲル小滴担体粒子１２が、ＰＢＳ中の１５重量％の１０ｋＤａのＰＥＧ−ノルボルネン及びＰＢＳ中の１．３％のＤＴＴを包含する２０重量％のデキストランを有する５ｍｇ／ｍＬのビオチンＰＥＧ−チオールを共に流すことによって達成された。界面活性剤を除去し、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣとゲルをインキュベートすることによって水相で小滴担体粒子１２を再構成した後に蛍光シグナルを観察することによって、共役が検証された。小滴担体粒子１２のビオチン化は、抗体、タンパク質、核酸、細胞、ナノ粒子及びプライマーのような多くの一般的な試薬の共役を可能にし、かつ、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、他の核酸増幅アッセイ及びフローサイトメトリを含む広範囲のアッセイにおけるそれらの使用を可能にする。
【００７２】
[00116]  細胞接着ペプチド
[00117]  細胞接着ペプチドは、粒子製造中又は製造後に小滴担体粒子１２に結合されることもできる。一実施形態では、ＲＧＤペプチド（Ａｃ−ＲＧＤＳＰＧＥＲＣＧ−ＮＨ２）［配列番号１］又は別のインテグリン結合ペプチド又は誘導体ペプチドは、前駆体溶液内に取り込まれ、ペプチド内に存在するシステイン基との反応を通じてポリマー骨格内に共有結合的に架橋されることができる。インテグリン結合ペプチドは、基質上への細胞接着を促進し、接着性細胞集団における生存性を維持するために重要である。現在、長期インキュベーション又は細胞培養を必要とする小滴アッセイは、細胞が付着することができる標準的な油中水エマルションに固体表面が存在しないため、懸濁細胞に限定されている。このプラットフォームは、液体及び小分子が固体ゲル支持体を通じて容易に拡散することができるので、細胞に利用可能な培地の総容積（総小滴容積）を制限することなく、単一細胞シグナル（内部空隙又は空洞１８の空間）の付着及び定量化のための均一サイズのポケットを提供することによって、小滴アッセイの有用性を拡大する。さらに、滴状物１０の固有の性能は、カプセル化された細胞のサイズを制限するこし器として機能するため（例えば、白血球、赤血球又は細菌を大細胞のバックグラウンドから捕捉する）、かつ、カプセル化されることができる細胞の容積及び数を制御するための両方のために内部空隙又は空洞１８の寸法を制御する能力であり、又は、接着細胞及び懸濁細胞の両方を同時に維持する能力である。このタイプの共培養は、細胞集団の対間の相互作用をプロービングするなどの現在の技術では困難であることが分かっている。例えば、患者由来腫瘍細胞への抗原特異的Ｔ細胞の検出及びその後の拡張を可能にする。
【００７３】
[00118]  ＦＳＬ修飾による細胞付着
[00119]  ビオチン化小滴担体粒子１２は、１０〜２５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンによって粒子を前処理する一方で遊離の脂質又はコレステロールに共役されたビオチン（ＦＳＬ−ビオチン、１，２−ジステロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ−ビオチン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ビオチン）、コレステロール−ＰＥＧ−ビオチン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ−ビオチン（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ−ビオチン）などとして市販されている）によって細胞を同時に修飾することによって、又は、ビオチン化粒子１２と混合する前にビオチン化脂質及びストレプトアビジンによって細胞を修飾することによって、非接着性細胞型に同様に結合するために使用されることができる。好適な実施形態では、１０〜１００μｇ／ｍＬのビオチン化脂質が、ＰＢＳ中の１００万個の細胞の懸濁液に添加され、３７℃で６０〜９０分間インキュベートされる。水性溶液からの非接着性細胞の親和性及び結合は、高度に希釈された試料の分析に重要なサテライト小滴２８ではなく、滴状物１０にカプセル化された細胞の濃度の増大を可能にする。さらに、フローサイトメトリ（フローサイトメータ１５０を使用する）のような標準的技術を使用して、細胞集団の高性能部材の良好なソーティングが、水相においてより容易に達成され、及びしたがって、油中水エマルションを破壊した後に小滴担体粒子１２内に細胞を保持する能力と、ソーティング後の小滴担体粒子１２からの細胞のその後の放出の能力との両方に高度に依存する。ＦＳＬ−ビオチンは、細胞膜に恒久的に結合されていないので、時間とともに分解され、最終的にはその基質から細胞を放出する。分解性ペプチドが、小滴担体粒子１２の形成中にペグ化された骨格鎖に取り込まれることができ、適切なプロテアーゼ酵素への曝露によってアッセイの完了時に開裂されることができる。例えば、ペプチドＡｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ−ＮＨ２［配列番号：２]は、その末端に２つのシステイン基が存在するため、架橋剤として小滴担体粒子１２の製造中に使用されることができ、かつ、マトリックスメタロプロテアーゼの基質であるペプチド配列に起因する分解性を付与する。
【００７４】
[00120]  選択的接着による細胞の分離
[00121]  小滴担体粒子１２の表面への修飾された抗体の共役又は共有結合も、水溶液中での共インキュベーションを通じて容易に達成される。表面共役抗体は、それらの表面上の特定のタンパク質の発現に基づいて、細胞集団のサブセットの選択的結合を可能にする。これにより、集団中のすべての細胞にわたって保存された表面抗原との、又は、混合集団中の外部由来細胞の大きなバックグラウンド内の細胞のサブセットを濃縮するよりまれな表面抗原との抗体相互作用を通じて直接的に対象の単一細胞の捕捉及び濃縮が可能となる。このような濃縮は、対象の小さな亜集団からのデータが、標的細胞からの測定に起因するノイズによって交絡されることが多い、多くの生物学的流体試料のアッセイにおいて重要な特徴である。保存されたタンパク質マーカを通じてすべての細胞の捕捉が望ましい態様では、ビオチン化抗体は、通常、試薬を保存しつつ、すべての利用可能な表面部分を修飾するために細胞に予め結合される。最大１０００万個のＴ細胞が、１０μｇ／ｍＬのビオチン−抗−ＣＤ３抗体で１ｍＬ容積で修飾され、小滴担体粒子１２上の遊離ストレプトアビジン部位に接着された。選択された細胞群の捕捉が必要とされる別の実施形態では、小滴担体粒子１２は、対象の表面マーカを包含しない細胞の接着を排除するために、抗体によって直接修飾されなければならない。小滴担体粒子１２のより大きな総表面積に起因して、これは、より高い濃度の抗体、例えば、標的抗原に対する抗体親和性に依存して、試料当たり１０〜２５０μｇ／ｍＬの濃度を必要とする。
【００７５】
[00122]  一実施形態では、細胞の選択的結合及び蓄積は、抗体と共役された小滴担体粒子１２を包含する水溶液を混合細胞溶液とインキュベートして積極的に混合することによって達成される。細胞表面抗原（例えば、ＣＤ８、ＣＤ４）を標的とする抗体は、対象の細胞型（例えば、Ｔ細胞サブ集団）の選択的濃縮をもたらす。混合中、標的細胞は、小滴担体粒子１２の空隙又は空洞１８内に進入し、抗体に結合し、空隙又は空洞領域１８内に付着されたままである。非標的細胞は、空隙領域に進入することができるが、選択的に付着せず、及びしたがって、溶液のその後の混合によって除去される。標的細胞は、小滴担体粒子１２の外表面に結合することもできるが、溶液の混合中の剪断は、空隙又は空洞領域１８内に維持されていないこれらの細胞を除去することもできる。一実施形態では、１０μｇ／ｍＬのビオチン−抗−ＣＤ３によって上述したように修飾されたＴリンパ球（少なくとも１０００万個の細胞／ｍＬ）の濃縮懸濁液が、５個の細胞／粒子の比率で濃縮ストレプトアビジン修飾小滴担体粒子ペレットに添加され、１００μＬ、２００μＬ又は１０００μＬピペットチップを用いて、２分間にわたって毎秒２〜４回の反復の速度でピペットされる。その後、小滴担体粒子１２は、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄの４０μｍ細胞濾過器を用いて濾過されて回収され、中央空洞１８内に付着された細胞によって高度に濃縮された小滴担体粒子１２の集団が得られる。小滴担体ポケット１２の「ポケット」１８内に結合された細胞の平均数の調整は、播種中の最初の細胞対小滴担体粒子１２の比率を調整することによって可能である。特に、空洞又は空隙領域１８は、平均して単一細胞、２つの細胞又は標的数の細胞の進入及び維持のみを可能にするサイズ（１０ミクロン未満〜２０ミクロン未満）であり得る。その後、接着された細胞は、本明細書及び後のセクションに記載されるような油相でカプセル化されて、単一細胞アッセイを実行することができる。接着された細胞は、哺乳動物細胞を含むことができるが、代わりに、細菌、藻類、真菌若しくは他の細胞又は細胞断片、例えば、微小小胞体又はエクソソームを含むことができる。
【００７６】
[00123]  架橋性分散相を介したマイクロ／ナノ物体（細胞／ビーズ／タンパク質／など）の捕捉
[00124]  別個の実施形態では、架橋性材料は、滴状物１０中の分散相１４としてカプセル化されるために試料に添加されることができる。分散相のゲル化は、下流分析／ソーティングのために、細胞、ビーズ又は他の試料をそれらのそれぞれの小滴担体粒子１２中に結合又は固定化するために、小滴担体粒子１２を水相に戻す前にトリガされることができる。一例では、温度感受性ゲル（アガロース、ゼラチンなど）が、水相に移行する前に（例えば、冷却を通じて４℃まで）、ゲルマトリックス中で細胞をゲル化してカプセル化するために使用されることができる。その後、カプセル化された細胞は、下流分析及びソーティング機器（例えば、フローサイトメトリ）を通って流されることができる。ある実施形態では、その後、アガロース（又は他のゲル材料）を溶融させる温度変化、又は、酵素、例えばアガラーゼの使用、若しくはそれらの組み合わせを介して、細胞が小滴担体粒子１２及びゲル化領域から放出されることができるように可逆的ゲル化材料が使用される。
【００７７】
[00125]  他の実施形態では、紫外線又はｐＨトリガ可能な架橋機構が、ゲル化及び捕捉（ラジカル重合、チオール−エン、マイケル付加など）を開始するために使用される。必要に応じて、可逆的架橋が可逆的架橋剤を用いて実行されることができる。ある実施形態では、ジスルフィド結合を有する架橋剤が、還元剤を用いて、酵素開裂可能な架橋剤を用いて（例えば、特定のペプチド配列を通じて）、又は、塩基（例えば、スルホン結合、アクリルアミド、エステル、チオエステルなどを包含する架橋剤と共役される分子など）の添加によって加水分解を受けやすい架橋化学を用いて、分解されることができる。
【００７８】
[00126]  小滴反応性の変化のための多孔性の変化
[00127]  各小滴担体粒子１２の多孔性は、架橋中に、ポロゲンの取り込み、前駆体鎖の長さの変化によって、又は、必要に応じて部分的な分解を可能にする２次化学的性質の追加を介して、操作されることもできる。この制御は、汎用性を有する追加の層を提供し、それにより、小滴担体粒子１２は、特定のアッセイの要件に基づいて特別に設計されることができる。より小さい孔を有する小滴担体粒子１２は、タンパク質及び他の大きな生物分子に対して不透過性であってもよく、そのようなアッセイの見かけ容積は粒子容積全体ではなく粒子空隙空間であるので、そうした種のより高感度の検出を可能にする。対照的に、より大きな孔間隔は、より大きな生体分子の拡散を可能にし、シグナル飽和前の付着のためのより多くの部位を提供し、定量可能な範囲を広げる。
【００７９】
[00128]  アッセイにおける滴状物の使用
[00129]  滴状物１０は、多くの広く使用されている小滴又は容積を区画化することに依存する他のデジタルアッセイと適合するようにされることができる。材料化学及び粒子設計における慎重な選択を通じて、滴状物１０は、多くのアッセイワークフローに直接適用されることができ、所望の細胞集団の濃縮を通じて、又は、検体検出のためのより小さい見かけ容積を提供することによって、収集されたデータを増強することができる。
【００８０】
[00130]  デジタル核酸増幅アッセイ
[00131]  遺伝子発現を監視し、遺伝性疾患を識別し、かつ、遺伝子改変ワークフローにおける適切な遺伝子導入を検証するために、核酸配列の識別及び特徴付けのための生物学において核酸増幅が広く使用されている。これらの増幅スキームの最もよく知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、小滴中での使用に適合されており、かつ、デジタルアッセイとして使用するためにＢｉｏ−Ｒａｄ社によって商品化されている。小滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、マイクロ流体小滴生成器を使用して、核酸、プライマー、ｄＮＴＰ、蛍光インターカレーション染料、及びＤＮＡ合成酵素を包含する水性容積をナノリットル容積小滴にセグメント化する。試料がヒートサイクル試験されると、標的ＤＮＡが増幅され、標的配列の欠如のために増幅が進行しなかった小滴中のバックグラウンド蛍光と容易に区別される標的配列を包含する小滴内の蛍光シグナルの増加（例えば、インターカレーション蛍光染料による）がもたらされる。この技術は、生物学的試料内の標的配列の濃度の絶対的定量を提供するという付加的な利点を有する。
【００８１】
[00132]  デジタル核酸増幅アプローチ（デジタルＰＣＲ、デジタルループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）又は他の等温増幅アプローチなど）は、ヒドロゲル粒子が、標的核酸配列を包含する試料と混合された水性ＰＣＲ又は他の増幅カクテル中で簡単に再構成されることができるので（図１３Ａ）、滴状物１０系に容易に移行される。その後のボルテックス又はピペットを介した試料乳化は、標準的なｄｄＰＣＲアプローチと類似して、標的配列及びカクテルミックスの分布を可能にする。その後、滴状物１０内の均一な容積がヒートサイクル又は加熱されて、標的が存在して絶対的定量化のために標的が分析される場合に蛍光シグナルを生成することができる。重要なことに、滴状物１０を支持している小滴担体粒子１２の存在は、エマルションの熱安定性を向上させ、凝集を低減させることができる。このアプローチを通じた乳化は、同様に多数のサテライト小滴２８を生成することができる。しかしながら、粒子で満たされたものに対するこれらのサテライト小滴２８の相対比は、使用された界面活性剤、初期のマイクロゲル試料の乾燥度（空隙率）、及び、試料と混合された小滴担体粒子内の利用可能な容積と比較した試料容積に基づいて調節されることができる。したがって、空のサテライト小滴２８内にカプセル化された試料の総容積を制限することができ、又は、滴状物１０に分配された総水性容積の画分を計算し、補正係数を適用して、総容積中に存在する標的核酸配列の数を定量化することができる。例えば、標的のカプセル化効率は、小滴担体粒子１２の所定の初期濃度、小滴担体粒子の幾何学的形状（粒子外径及び内部空洞容積）、及び、滴状物１０の形成後の小滴担体粒子１２を取り囲む水層の予想される厚さに対して近似されることができる（図１１Ａ〜図１１Ｃ、及び、カプセル化効率理論に関する関連の文章を参照）。
【００８２】
[00133]  関連の実施形態では、小滴担体粒子１２は、乳化に先立って、水相の小滴担体粒子１２への標的核酸結合を促進するために、標的配列（又は複数の配列）に特異的なプライマー及び／又は捕捉された核酸配列によって予め被覆されることができる。これは、小滴担体粒子１２上の検体濃度を局所的に可能にし、ヒートサイクル中のサテライト小滴２８の増幅を排除する。予想される試料標的配列に対して過度に多数の小滴担体粒子１２を利用することによって、これらの系はデジタル計数レジームで動作するが、各小滴のより高い濃度のアナログ蛍光シグナルもまた、核酸濃度に関する情報を提供することができる。絶対蛍光値（単なるオン−オフ閾値ではない）が、滴状物１０当たりの結合配列の平均数を再計算するために使用されることができ、かつ、試料中の標的配列の総数に対する絶対値を生じさせる。小滴担体粒子１２上に標的配列を濃縮し、その後、下流で増幅及び読み出しを実行する能力は滴状物系の固有の利点である。さらに、試料から核酸配列を捕捉する能力は、異なる溶液（例えば、核酸増幅混合溶液、前述の洗浄セクションを参照）による洗浄及び置換を可能にし、増幅反応と相互作用し得る試料溶液からバックグラウンド汚染物質を除去する能力を可能にする。最後に、滴状物アプローチは、デジタルアッセイが完全にデバイスフリーになるという付加的な利点を有しており、そうでなければ入手不可能である若しくは大規模な設備及び／又は専門知識を必要とし得るこれらのアッセイへのマイクロ流体の容易なアクセスに関する知識をユーザに提供しない。
【００８３】
[00134]  滴状物１０のさらなる修飾は、ＢＥＡＭ（ビーズ、エマルション、増幅、磁気）デジタルＰＣＲのようなデジタルＰＣＲアッセイの最も複雑な実施形態でさえも滴状物１０が実行することを可能にする。ＢＥＡＭでは、バイオ流体試料が再びプライマー官能化ビーズと共に小滴内に分配される。標的核酸がビーズを有する小滴内に存在する場合、核酸はＰＣＲによって増幅され、カプセル化ビーズ上のプライマーへのアンプリコンの付着につながる。ビーズ付着アンプリコンは、標的配列における突然変異に関する情報を包含することができる。ビーズの乳化はランダムであり、これは技術の欠点であるため、すべての小滴がＢＥＡＭの以前の実施において標的及び１つのビーズの両方を包含するわけではないことに留意されたい。増幅が完了すると、エマルションは破壊され、各ビーズが磁気的に回収され、異なる突然変異を含む配列に相補的である１以上のタイプの蛍光標識核酸レポータプローブによってインキュベートされる。増幅されてビーズに付着した対象の特定の突然変異は、そのビーズ上に固有の蛍光シグナルを生じさせる。その後、これらの蛍光標識ビーズはフローサイトメータ１５０に通されて、試料中に存在する標的配列における突然変異の有病率を特徴付けることができる。
【００８４】
[00135]  しかしながら、ＢＥＡＭと同様のアッセイは、さらなる利点を伴って、小滴物１０を用いて実行されることができる。一実施形態では、滴状物系は、ＢＥＡＭのためのより多くの単分散エマルションを生成するように作用し、小滴担体粒子１２内の空洞又は空隙領域１８の開口部サイズ又は容積は、単一のビーズのみが各滴状物１０内に進入することを可能にするように寸法決めされる。別の好適な実施形態では、小滴担体粒子１２自体がプライマーと共役され、ＢＥＡＭワークフローにおいて固相ビーズとして作用する。これは、各小滴が単一の付着固相（すなわち、小滴担体粒子１２）を有するという点で有意な利点を有している。その後、小滴担体粒子１２は、蛍光プローブ結合及びフローサイトメータ１５０内での分析のために水相１４内で再懸濁されることができる。各小滴担体粒子１２はまた、小滴担体粒子１２に固有の指標を提供するために、多数の方法でバーコーディングされることができる。例えば、一実施形態では、小滴担体粒子は、核酸検出アッセイの多重化を可能にするために、異なる配列を標的とする各バーコードに関連付けられた別個のプライマー／核酸捕捉配列を包含してもよい。標的配列の一方又は両方の側のプライマーが小滴担体粒子１２上に固定化されて、付着した標的核酸配列を生成することもできる。
【００８５】
[00136]  本明細書に記載されているように、小滴担体粒子１２内に磁性ナノ粒子を共有結合又は埋め込むことによって、サテライト小滴２８のバックグラウンドから滴状物１０を磁気的に分離することもできる。外部から印加された磁場の存在下で、小滴担体粒子１２は蓄積又は移動させられて洗浄されることができる。標準のフローサイトメトリの臨界サイズカットオフ値未満（＜５０マイクロメートル）の磁性小滴担体粒子１２を製造することによって、各小滴担体粒子１２に関連付けられた閾値を超える蛍光シグナルから直接、試料中の突然変異の不均一性を定量化することができる。
【００８６】
[00137]  関連の実施形態では、増幅された核酸配列は、水相のプレゲル溶液を含めて、増幅後に水性分散相をゲル化して、小滴担体粒子１２を水相に戻した時点でアンプリコンの喪失を防止することによる分析のために小滴担体粒子１２上に捕捉されることもできる。このアプローチは、長いアンプリコン（例えば、ＬＡＭＰ反応を用いて生成されたもの）の場合により好ましい。
【００８７】
[00138]  別の実施形態では、完全に閉じ込められた空洞１８を有する小滴担体粒子１２が使用される。粒子マトリックスの多孔性は、ＤＮＡ標的及び反応混合物がマトリックスを通じて拡散することができるように調節されることができる。滴状物１０の形成及び増幅後、粒子マトリックスを通じて拡散するには大きすぎる増幅産物が保持されることができる。これは、小滴担体粒子１２が、完全に閉じ込められた空洞内に保持されたままである増幅シグナルの喪失なしに、下流の分析及び定量化（例えば、フローサイトメータ）のために、水相に戻されることができるという点で有益である。
【００８８】
[00139]  小滴担体粒子１２のバーコーディングは、混合試料中の異なる標的核酸配列を同時に捕捉及び分析するために使用されることができる。別個のタイプのバーコード化された小滴担体粒子１２と別個の核酸捕捉試薬との混合物が試料に導入されて、別個の標的を収集することができる。特定の小滴担体粒子１２のためのシグナルは、その小滴担体粒子１２のためのバーコードにリンクされ、標的型を識別することができ、複数の小滴担体粒子１２を分析する場合に、マルチプレックスアッセイが実行されることができる。小滴担体粒子１２をバーコーディングするためのアプローチは本明細書でさらに説明される。
【００８９】
[00140]  デジタルＥＬＩＳＡ
[00141]  デジタルＥＬＩＳＡは、サンドイッチ免疫認識反応を使用して、少量の水性分配内の低濃度のタンパク質又は他の検体を定量化するために使用される、ｄｄＰＣＲと概念的に類似した技術である。滴状物１０内でデジタルＥＬＩＳＡを実行するために、標的タンパク質又は他の検体に特異的な捕捉抗体が、まず、小滴担体粒子１２の表面に共役される（図１３Ｂ参照）。その後、抗体被覆小滴担体粒子１２は、小滴担体粒子１２の数が検体の数よりも大きく過剰になるように、標的検体を包含する溶液内に配置され、かつ、完全な結合を可能にするようにインキュベートされる。結合後、試料溶液は洗浄されて洗浄溶液と置換される。この最初の結合反応及び洗浄工程が完了すると、標的検体の第２領域に親和性を有し、かつ、シグナル増幅成分を包含する２次抗体が溶液に添加され、小滴担体粒子１２と結合した検体に結合されることができる。余分な２次抗体は、本明細書に記載される技術を使用して、小滴担体粒子１２から再度洗浄され、溶液は、シグナル（蛍光、比色、ｐＨ変化）を生成するために抗体の増幅成分と反応する基質を包含するシグナル現像溶液と置換される。シグナル増幅成分の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＢ）、β−ガラクトシダーゼ、エステラーゼなどの酵素が含まれる。基質の例としては、フルオレセイン  ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシード（ＦＤＧ）又はβ−ガラクトシダーゼの他の蛍光発生基質、並びにＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、ＱｕａｎｔａＲｅｄ、ＱｕａｎｔａＢｌｕなどのＨＲＰの蛍光発生基質が挙げられる。シグナル現像液の添加直後、小滴担体粒子１２は油相１６で乳化されて滴状物１０を形成し、試料全体がインキュベートされて、滴状物１０によって蛍光又は他のシグナルを蓄積する。シグナルの作成に続いて、滴状物１０は、大きなリザーバ内に配置されることができ、そこで、顕微鏡又は広視野低コストの撮像装置を使用してすべての滴状物１０が同時に画像化されて定量化され、滴状物１０の総数に対して高いシグナルを有する滴状物１０の画分を決定することができる。先に特定したように、これは、試料中の検体の予想される濃度の計算を可能にする。さらに、検体が、ＥＬＩＳＡプロセスで洗浄及び再懸濁される小滴担体粒子１２に結合され、かつ、試料が乳化された後、すべてのサテライト小滴２８は、シグナル生成要素を含まず、また、問題なく廃棄されることができる。別の実施形態では、チラミドが使用されて、小滴担体粒子１２自体の表面を、増幅された局所シグナルが小滴担体粒子１２上に捕捉されることを可能にするＨＲＰ酵素代謝回転の生成物として連結することができる。その後、蛍光シグナルのようなこれらのシグナルは、滴状物１０のエマルションが破壊された後、フローサイトメトリのような下流技術を使用して（フローサイトメータ１５０を使用して）、検体が各小滴担体粒子１２上に結合されたかどうかの直接的な尺度を提供することができる。一実施形態では、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（商標）４８８−チラミドが、２次抗体上の増幅成分として作用するＨＲＰによって活性化される基質として使用され、活性化された蛍光チラミド共役体は、小滴担体粒子１２上又は内に取り込まれた近傍のタンパク質、ペプチド又は他のフェノール基に共有結合する。関連の実施形態では、ビオチン−チラミドが、多数のビオチン分子の小滴担体粒子１２への共有結合によるシグナルの増幅を導く基質として使用される。その後、ビオチンは、ストレプトアビジン共役フルオロフォアを使用して蛍光的に多数の方法で標識されることができる。
【００９０】
[00142]  核酸分析に関しては、小滴担体粒子１２のバーコーディングが使用されて、混合試料中の異なる標的検体を同時に捕捉及び分析することができる。別個のタイプのバーコード化された小滴担体粒子１２と別個の抗体捕捉試薬との混合物が試料内に導入されて別個の標的を収集することができる。特定の小滴担体粒子１２のためのシグナルは、それらが共存しているので、その小滴担体粒子１２のためのバーコードにリンクされることができる。これにより、複数の小滴担体粒子１２についての標的型を分析して、多数のタンパク質／検体についてマルチプレックスアッセイを実行することができる。小滴担体粒子１２をバーコンディングするためのアプローチは本明細書でさらに説明される。
【００９１】
[00143]  単一細胞シークエンシング
[00144]  前述のシークエンシングアプローチのコストの低減と組み合わせて、細胞遺伝子発現測定の解像度を向上させるための推進は、ＲＮＡ及びＤＮＡの小滴媒介単一細胞シークエンシングへの関心を促進した。単一細胞ＲＮＡシークエンシングアプローチでは、個々の細胞が、固有の細胞バーコード及び分子識別子を包含する結合ポリ−Ｔ捕捉核酸を有するｍＲＮＡを捕捉することができるバーコード化されたビーズと共カプセル化される。これらのバーコード化された捕捉核酸は逆転写のプライマーとしても作用する。細胞は小滴内で溶解されてｍＲＮＡが放出され、バーコード化されたビーズ上のポリ−Ｔ捕捉核酸に結合する。その後、エマルションが破壊され、各ビーズ上の捕捉ＲＮＡが逆転写される。プールされたｃＤＮＡは、集団のその細胞メンバーに対応する固有の遺伝子発現読み取り値を取得するために、各個々の細胞からのバーコードを包含する。各小滴中に単一のバーコードビーズ及び細胞が存在する場合、このプロセスは、固有の分子署名を各個々の細胞からの読み取り値に帰属させ、かつ、試料分化を維持しつつプーリング及びバルク遺伝子シークエンシング及び署名の他の分析を可能にする。これらのアプローチのいくつか一般的なバリエ−ションには、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ、ＩｎＤｒｏｐ及びＣｙｔｏＳｅｑなどがある。
【００９２】
[00145]  単一細胞核酸シークエンシングは、デバイスフリーであるという顕著な利点を有する滴状物系を使用して適合され、エンドユーザのための複雑なマイクロ流体デバイス又は機器を必要とせずに、固有の細胞からの遺伝子発現の定量化を再度可能にする。単一細胞ＲＮＡシークエンシングのために滴状物１０を使用する一実施形態では、小滴担体粒子１２の空洞又は空隙領域１８は、単一細胞を保持し、かつ、２以上の細胞が進入することを防止するように寸法決めされる。小滴担体粒子１２は、本明細書で説明するように、固有にバーコード化されたそれらの表面上にｍＲＮＡ捕捉部分を包含するようにさらに官能化される。小滴担体粒子１２は、単一細胞ＲＮＡシークエンシングの前に選択的な細胞単離を可能にするために、本明細書で説明するように、任意選択的に、接着リガンド又は細胞に対する抗体を包含するように官能化されてもよい。細胞カプセル化及び滴状物１０エマルションの形成前に、溶解試薬が小滴担体粒子１２のマトリックスに取り込まれることもできる。溶解試薬は、捕捉された細胞を溶解するためにゆっくりと放出されるか、又は、以下でさらに議論されるように放出又は活性化されるように誘発されることができる。代替的に、付着した細胞を除去することなく滴状物１０と相互作用する溶解剤を包含する追加の小滴と滴状物１０を混合することによって、溶解試薬が添加されることができる。細胞の存在下での滴状物１０のバルク乳化は、単一のマイクロ流体デバイスによって必要とされる数時間から数日ではなく、数分の時間スケールで数百万個の単一細胞をカプセル化することができる。別の実施形態では、油相１６及び水相１４の両方に混和性を有する溶解剤が使用されることができる。この場合、滴状物１０の形成後、油１６に溶解剤が添加されることができ、いくらかの画分が滴状物１０内に分配されて細胞溶解を引き起こす。別の実施形態では、不活性な溶解試薬が分散相内に添加され、その後、滴状物形成後又は滴状物形成直前に、外部刺激によって活性化されることができる。例えば、サルコシルのようなイオン界面活性剤は、あるｐＨ範囲で活性である。この例では、溶液のｐＨが低下させられてサルコシルを不活化させたままにし、その後、滴状物形成は、滴状物１０の水相内に分配される油相に溶解されたプロトン受容体（例えば、トリエチルアミン）を通じてｐＨを増加させることによって活性化されることができる。
【００９３】
[00146]
[00147]  さらに、既存の方法における微小粒子上の核酸捕捉配列をバーコード化する標準的な方法は、分割及びプール合成を通じてであり、ここで、微小粒子は、各々が１ヌクレオチドを包含する４つの異なる溶液に分割され、収集され、かつ、合計ｎ回に再度ランダムに分割され、長さｎのランダムオリゴマーを形成する。このタイプの添加は、滴状物１０を作製するために使用される小滴担体粒子１２上で直接行われることができ、第２固相の必要性をなくし、ＤＮＡ増幅を、官能化された粒子を包含する小滴のみに制限する。すなわち、滴状物１０を使用することが、ビーズ及び細胞の両方の無駄であるビーズ及び細胞負荷の確率過程を克服することによって有意な利点を提供することができる。単一細胞ではあるが、ビーズを含まない小滴はシグナルを導かず、細胞を有しないビーズを有する小滴もシグナルを導かない。滴状物１０は、単一のビーズ（小滴担体粒子１２）を包含し、空隙領域は、単一細胞を単離するように寸法付けされることができる。
【００９４】
[00148]  小滴担体マトリックスからの分子／試薬の放出の制御
[00149]  ある実施形態では、小滴担体粒子１２のマトリックス内に捕らえられた試薬は経時的に放出される。例えば、溶解試薬（すなわち、界面活性剤、洗浄剤及び／又は酵素）は、乾燥した小滴担体粒子１２内に貯蔵されることができる。水和すると、溶解試薬はゆっくりと放出され、滴状物１０内にカプセル化された細胞を溶解する。別の実施形態では、溶解試薬は、ほぼ飽和まで小滴担体マトリックス材料内でインキュベートされ、分散相は、カプセル化されるべき細胞を包含する非溶解性流体と交換され、滴状物１０が形成される。小滴担体マトリックスに貯蔵された溶解試薬は拡散によってゆっくりと放出されて、カプセル化された細胞を溶解する。小滴担体粒子１２のヒドロゲルマトリックスの多孔性は、本明細書で説明するように、試薬放出の時間経過を調節するために調整されることができ、多孔性が増加すると、より迅速な放出がもたらされ、かつ、多孔性が減少して長期間にわたる放出がもたらされる。
【００９５】
[00150]  他の実施形態では、小滴担体粒子１２のマトリックスは、環境条件（例えば、ｐＨ、温度、光など）の変化に応じて膨潤する材料から形成され、マトリックスに貯蔵されたカプセル化試薬のトリガされた放出を可能にする。例えば、小滴担体粒子１２マトリックス中のｏ−ニトロフェニル包含主鎖ポリマーの光でトリガされた劣化は、架橋密度の減少、小滴担体マトリックスの膨潤及び試薬放出をもたらし得る。別の実施形態では、小滴担体粒子１２のマトリックスは、荷電され、反対に荷電した試薬は電荷間の相互作用を介して結合される。荷電された試薬の放出は、試薬、小滴担体粒子１２又はその両方の電荷を変化させるｐＨの変化によって誘導されることができる。一実施形態では、ｐＨは、油相（例えば、酢酸、トリエチルアミン）内の有機酸／塩基の添加を通じて外部的に調節されることができる。他の実施形態では、上述のアプローチは、細胞応答をプローブするために、一定期間にわたって薬物／分子を放出するために使用されてもよい。
【００９６】
[00151]  カプセル化中の細胞生存率
[00152]  いくつかのアッセイは、単一細胞測定後でさえ細胞生存性の維持を必要とする。例えば、有用なバイオ製品の生産のためや、ある種の疾患の治療に最適な表現型を有する細胞の選択のために、ハイパフォーマを選別するためである。これらのアッセイは、高度に細胞適合性であることが知られている油及び界面活性剤を使用することによって、滴状物１０乳化系で実行されることもできる。好適な実施形態では、非イオン性細胞適合性界面活性剤を包含するフルオロカーボン連続相が使用される。このことを実証するために、ヘキスト及びカルセインの両方によって染色されたジャーカット細胞が、本明細書で説明するように製造された乾燥ＰＥＧマイクロゲル小滴担体粒子１２と混合され、０．５％Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）を有するＮｏｖｅｃ（商標）７５００内でピペットにより乳化された。乳化時、滴状物１０は顕微鏡スライド上に配置され、明視野、ＤＡＰＩ、及び蛍光顕微鏡を介したＦＩＴＣチャネルで画像化され、生存率を決定した（図１４Ａ〜図１４Ｃ参照）。滴状物１０内で乳化された細胞の大多数は、乳化前及び乳化後の両方でカルセイン陽性に染色され、提案されたカプセル化アプローチとの適合性を示した。
【００９７】
[00153]  別の例では、チャイニーズハムスター卵巣由来（ＣＨＯ）細胞が、Ｎｏｖｅｃ（商標）７５００及び２％ｖ／ｖのＰｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）を油相として用いて、培地中の滴状物１０にカプセル化された。Ｎｏｖｅｃ（商標）の２０％ｖ／ｖのＰＦＯを用いて様々な時点で細胞が回収され、生染色としてカルセインＡＭ、死染色としてヨウ化プロピジウムによって染色された。このプロセスを通じて、そして２４時間以上（＞８０％の生存率）、細胞が高い生存率を維持したことが分かった。
【００９８】
[00154]  単一細胞分泌物単離
[00155]  従来、均質であると考えられている細胞集団は、実際には、多くの一般的なアッセイにおける限定された分解によって単純にマスクされている表現型において非常に大きな不均一性を示すことがある。細胞集団動態の有用な指標を収集するために、これらのアッセイは、単一細胞レベルで実行されなければならない。例えば、生体内（in vivo）で局所微小環境の攪乱に対する大規模な免疫学的応答は、白血球間のシグナル伝達分子の分泌を通じて統合される。このシナリオにおいてタンパク質組成を決定するために体液を単純にバルクでプローブすると、総試料濃度が得られるが、どの亜集団が分泌しているかに関する情報は得られず、そのような協調的応答が理解され得る程度を制限する。
【００９９】
[00156]  滴状物１０を用いて、分泌されたタンパク質シグナルに基づいて細胞を捕捉、定量化及びソーティングするために多数のスキームが適用されることができる。図１６は、滴状物１０を使用して分泌物の捕捉及び分析を実行するための例示的なワークフローの一例を示している。細胞は、カプセル化された細胞集団の所望の構成に応じて、ビオチン化脂質、ＲＧＤ及び／又は表面マーカ特異的抗体のいずれかを使用して、上述したように、小滴担体粒子１２の表面に結合されることができる。分泌物を捕捉するために、ＥＬＩＳＡシステムについて上述したように、捕捉試薬（例えば、分泌分子を標的とする抗体）が、小滴担体粒子１２のマトリックス上及び／又はマトリックス内に固定化されることができる。カプセル化された時点で、細胞はインキュベートされる一方で、分泌されたタンパク質は、捕捉試薬に結合された粒子の表面に蓄積する。２次レポータ抗体、例えば、乳化溶液中にも存在する、又は、エマルションを破壊した時点で導入されることができる、付着したフルオロフォアを有する２次レポータ抗体が、捕捉されたタンパク質と結合する。小滴担体粒子１２上へのシグナルの局在化は、エマルションを破壊して小滴担体粒子１２を水相に再構成した後、標準的なフローサイトメトリ／ＦＡＣＳシステム１５０を通じたソーティングを可能にすることができる。さらに、粒子表面への細胞の可逆的結合は、例えば、ビオチン化脂質修飾を通じて、細胞が小滴担体粒子１２と共にソーティングされることを可能にし、その結果、単一細胞レベルでの定量的分泌物分析だけではなく、所望の表現型を有する特定の細胞を選別することができる。
【０１００】
[00157]  全般的なワークフロー
[00158]  （１）水溶液内の小滴担体粒子１２上への細胞のローディング
[00159]  一実施形態では、小滴担体粒子１２は、最初に、例えば、ピペットにより、平坦な底面を有するウェルプレート、ウェル、フラスコ又は他の容器内に装填される（図１６参照−粒子播種及び細胞ローディング）。ある実施形態では小滴担体粒子１２の形状が非対称であるため、小滴担体粒子１２は、直立方向にそれらの空洞と共に沈降する（例えば、空洞１８は、重力による加速の方向とは反対の表面に開く）。これは、その後、開放した空洞１８に細胞が播種されることができる点で有利である。小滴担体粒子１２の播種の量は、球体の閉じたパッキングを仮定することによって、所定の粒子径及びウェル表面積に近似されることができる。例えば、直径８５ミクロンの粒子１２及び１２個のウェルプレート（ウェル当たりの表面積が２ｃｍ２）について、３０マイクロリットルの濃縮粒子１２がウェル表面の底部の大部分を覆うことが分かった。
【０１０１】
[00160]  小滴担体粒子１２が沈降した後（典型的には５〜１０分）、細胞は、ウェル内に慎重に播種され（例えば、ピペットを用いて）、沈降することを許容され、一部分の細胞は小滴担体粒子１２の空洞１８内に沈降する。空洞１８内に入る細胞の画分に対する空洞１８の外部にある細胞の画分は、小滴担体粒子径に対する空洞開口部幅の比を増加させることによって増加させることができる。概して、所定の数の細胞（すなわち、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の細胞）を包含する小滴担体粒子１２の画分は、ポアソン統計から計算されることができ、播種段階中の細胞密度を調整することによって制御されることができる。一例の実験では、２４個のウェルプレートの各ウェルに１５マイクロリットルの濃縮小滴担体粒子１２（外径８５ミクロン、内径５０ミクロン）が播種された。様々な量の細胞が、異なるウェルに添加され、小滴担体粒子１２内に沈降させられた。細胞及び粒子１２は画像化されて、粒子１２当たりの細胞の数を決定した。ウェル当たり１０，０００個の細胞を添加すると、粒子１２当たり約０．０９個の細胞のポアソンローディングがもたらされた。より具体的には、９３．１％の粒子１２が空であり、６．６５％が一（１）個の細胞を包含し、０．２５％が二（２）個以上の細胞を包含していた。細胞を有する粒子１２のうち、９６％は一個の細胞のみを包含していた。ウェル当たり３０，０００個の細胞を添加すると、粒子１２あたり約０．２個の細胞のポアソンローディングがもたらされた。より具体的には、粒子１２の８２．２％が空であり、１５．９％は一（１）個の細胞を包含し、１．９％は二（２）個以上の細胞を包含していた。細胞を有する粒子１２のうち、８９％が一個の細胞のみを包含していた。ウェル当たり１００，０００個の細胞を添加すると、粒子１２当たり約０．８個の細胞のポアソンローディングがもたらされた。より具体的には、粒子１２の４２．６％が空であり、３２．６％は一（１）個の細胞を包含し、２４．８％が二（２）個以上の細胞を包含していた。細胞を有する粒子１２のうち、５６．８％は一個の細胞のみを包含していた。
【０１０２】
[00161]  異なる細胞播種量が様々な用途について理想的である。アッセイの妥当性のために、粒子１２当たり一個未満の細胞を捕捉することが重要である実施形態では、より低い播種密度が理想的である（例えば、２４個のウェルプレートのウェル（表面積２ｃｍ２）当たり１０，０００個の細胞）。対照的に、細胞間の相互作用の評価のためのように、粒子１２当たり複数個の細胞が望ましい実施形態では、より高い播種密度が好ましい（例えば、１５μＬの濃縮小滴担体粒子１２が各ウェルに播種される２４個のウェルプレートのウェル（表面積２ｃｍ２）当たり１００，０００個の細胞）。他の実施形態では、細胞の喪失が有害であって制限されるべきである場合、小滴担体粒子１２の第１層の空洞１８内に沈降しない細胞が、小滴担体粒子１２の第２層又はその後の層内の空洞１８内に沈降することができるように、小滴担体粒子１２の複数の層がアレイ化されることができる。
【０１０３】
[00162]  小滴担体粒子１２と細胞を結合させる第２の方法は、小滴担体粒子１２の外表面に結合された細胞が経験する剪断力に対する、保護された小滴担体粒子の空洞１８内に結合された細胞が経験する剪断力の差を利用する。要するに、小滴担体粒子１２の表面に親和性を有する細胞の濃縮懸濁液（例えば、接着性リガンドを通じて）が、小滴担体粒子１２の濃縮懸濁液内に混合され、１００μＬ、２００μＬ又は１ｍＬピペットを使用して、毎秒５０〜１００ｘ当たり２〜４ピペットの反復で激しく攪拌されることができる。細胞は、懸濁液全体に分布し、小滴担体粒子１２の表面に急速に付着する。小滴担体粒子１２の外側に結合する細胞は、急速に剪断されて懸濁液内に戻される一方で、空隙又は空洞１８内に捕らわれる細胞は、外部流体剪断力の大部分からさらに保護され、小滴担体粒子１２の空隙又は空洞１８によって形成されるポケットの表面に付着したままとなる。粒子懸濁液が十分に攪拌された時点で、以下で説明するように粒子懸濁液は濾過されることができる。これは、小滴担体粒子の空洞１８内に見られる細胞の画分を急速に濃縮する方法を提供する。
【０１０４】
[00163]  小滴担体粒子１２の表面の修飾は、小滴担体粒子の空洞１８内での播種された細胞の接着及びその後の培養を可能にする。例えば、小滴担体粒子１２の表面内に取り込まれたＲＧＤのような一般的に使用されているインテグリン結合ペプチドは、例えばインテグリンの存在に基づいて細胞の接着を可能にし、ピペットからの激しい機械的攪拌、遠心分離及びフローソーティング手順の存在下でも、小滴担体粒子１２への細胞の付着を維持する。好適な実施形態では、ＲＧＤは、小滴担体粒子１２の製造中に、デキストラン相で少なくとも４ｍｇ／ｍＬの濃度で添加される。このアプローチでは、ＰＥＧ相の光開始剤から生成されたラジカルは、ペプチドシステイン基上の遊離チオールと小滴担体粒子１２前駆体のポリマー骨格上の非結合ノルボルネンとの間の共有結合を誘導する。そのようなＲＧＤ修飾小滴担体粒子１２上に播種されたＣＨＯ細胞は、数日間、小滴担体粒子１２の表面上に関連付けられて広がったままであった。
【０１０５】
[00164]  典型的には非接着性である細胞株は、小滴担体粒子１２の表面と結合させられることもできる。一実施形態では、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用が、小滴担体粒子１２に細胞を連結するために使用される。より具体的には、ビオチン化小滴担体粒子１２は、ストレプトアビジンによって予め修飾され、標的細胞は、小滴担体粒子１２と細胞集団又は細胞集団のサブセットとの間に親和性を生成するビオチン化脂質／コレステロール又はビオチン化抗体のいずれかによって予め修飾される。１つの好適なワークフローでは、ＰＢＳ内の１０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンによって最初にビオチン化小滴担体粒子１２を予め修飾することによって、一次Ｔ細胞がビオチン化小滴担体粒子１２に結合されることができる。同時に、１０μｇ／ｍＬのビオチン−抗−ＣＤ３抗体を１０００万個未満の細胞に混合することによってＴ細胞が修飾され、３７℃で２０分間インキュベートされる。小滴担体粒子１２及び細胞の両方が、ＰＢＳによって数回洗浄されて、結合していない材料の除去を確実にする。その後、小滴担体粒子１２は２０００Ｇで５分間遠心分離されて強固なペレットを形成し、これに濃縮抗−ＣＤ３修飾細胞懸濁液が添加される。その後、小滴担体粒子１２の細胞及び懸濁液は、少なくとも２分間、手動によるピペットによって連続的に攪拌される。その後、試料は、後述するように、細胞濾過器を使用して濾過されて、小滴担体粒子１２及びそれらの表面に結合された任意の細胞のみを収集する。ビオチン化脂質を用いる代替の実施形態は、表面タンパク質組成にかかわらず、このアプローチを用いて任意の細胞が修飾されることができるという重要な注意を払いつつ、ほぼ同じ方法で進行する。ここで、細胞は、１０〜１００μｇ／ｍＬのビオチン化脂質と共に３７℃で、合計６０〜９０分間インキュベートされた後、洗浄され、ピペットにより小滴担体粒子１２に付着させられる。
【０１０６】
[00165]  （２）結合していない細胞及び／又はバックグラウンド分泌物の洗い流し並びに対象の特定の細胞分泌物を捕捉する小滴担体粒子１２に結合するための親和性試薬の添加
[00166]  ある応用では、小滴担体粒子１２と結合されないままである細胞は、望ましくなく、ノイズ源になる場合さえある。バックグラウンドを減少させるために、小滴担体粒子１２は、滴状物１０の形成の前に洗浄されて、アッセイが実施される前に溶液から、結合していない細胞を排除することができる。１つのアプローチでは、小滴担体粒子１２の懸濁液、付着細胞を有する小滴担体粒子１２及び非結合細胞が、細胞径よりも大きいが小滴担体粒子１２の径よりも小さいメッシュサイズを有する細胞濾過器に添加される。これにより、付着細胞を有する小滴担体粒子１２がメッシュによって保持される一方、非結合細胞がメッシュを通過することを可能にする。小滴担体粒子１２は、保持される一方で、緩衝液の連続的な添加によって連続的に洗浄されることができ、小滴担体粒子１２の表面にしっかり付着していない細胞を除去することができる。その後、小滴担体粒子１２及びそれらの結合した細胞は、細胞濾過器の単純な反転、メッシュの下側からの緩衝液の添加、並びに、緩衝液及び付着細胞を有する溶出した小滴担体粒子１２を包含する得られた溶液の回収を通じて単離される。この用途のための好適な細胞濾過器の１つは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＦｉｃｈｅｒｂｒａｎｄ  ４０μｍの滅菌細胞濾過器である。
【０１０７】
[00167]  希少細胞への応用では、小滴担体粒子の空洞１８に結合されない細胞を回収することが望ましい場合がある。この場合、上述の方策が使用されることができ、小滴担体粒子１２の新しい試料内に後で播種するために収集された小滴担体粒子１２と結合していない細胞を用いることができる。
【０１０８】
[00168]  ある応用では、小滴担体粒子１２上に分泌物を捕捉することが望ましい。このような実施形態では、分泌物の分子捕捉部位として作用するために、抗体又は免疫グロブリン結合タンパク質のような親和性試薬によって小滴担体粒子１２の表面を修飾することが有益である（図１６−分泌物の捕捉及びソーティング）。ビオチン−ストレプトアビジン反応におけるように、分泌速度が遅く、小滴担体粒子１２への細胞の結合が急速である例示的な実施形態では、小滴担体粒子１２は、小滴担体粒子１２の内部又は表面上の分子捕捉部位によって予め修飾されることができ、結合した細胞から生じるシグナルを汚染することなく、滴状物１０に急速に分配されることができる。付着細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）がＲＧＤ結合ペプチドに付着する場合のような、分泌速度が急速で、細胞が小滴担体粒子１２の表面に強く付着するのに数時間を要する他の実施形態では、、細胞は、最初に、好適には２〜１２時間、小滴担体粒子１２の表面に付着することを許容される。細胞が小滴担体粒子１２に付着した時点で、試料は、遠心分離及び溶液交換を介して洗浄され、バックグラウンド分泌物及び非結合細胞を除去することができる。その後、小滴担体粒子１２は、対象の分泌物に結合して小滴担体粒子１２に付着した分子捕捉部位を形成するビオチン化プロテインＡ又はビオチン化抗体のような親和性試薬によって修飾されることができ、その後、滴状物１０に急速に乳化される。詳細なプロトコルが本明細書に開示されている。好適な一実施形態では、小滴担体粒子１２は、図１２について詳細な説明で説明したように、製造中に小滴担体粒子前駆体のデキストラン相で４ｍｇ／ｍＬのＲＧＤ及び小滴担体粒子前駆体のＰＥＧ相で０．５〜５ｍｇ／ｍＬのビオチン−ＰＥＧ−チオールの両方を取り込むことによって、ＲＧＤペプチド及びビオチン基の両方によって官能化される。細胞はこれらのペプチド及びビオチン修飾小滴担体粒子１２上に播種される。付着後、各小滴担体粒子１２の試料（１２個のウェルプレートに３０μＬの小滴担体粒子１２）は、小滴担体粒子１２の表面上のビオチン基に結合するＰＢＳの０．０２ｍｇ／ｍＬストレプトアビジンで処理される。試料は、１０分間にわたってインキュベートされ、０．５％ＢＳＡを有するＰＢＳによって数回洗浄される。その後、各濃縮小滴担体粒子１２の試料は、１０μＬの０．５ｍｇ／ｍＬストックのビオチン化プロテインＡによって修飾され、上述のように、１０分間インキュベートされる。適切な修飾後、小滴担体粒子１２は、分泌物測定用途に直接適用されることができ、後述するように乳化されることができる。
【０１０９】
[00169]  （３）滴状物１０を形成するための、付着細胞及び結合親和性試薬による小滴担体粒子１２の油連続相への乳化
[00170]  滴状物１０の最適な形成及び維持は、使用される界面活性剤のタイプ及び濃度並びに攪拌方法を含むいくつかの要因に依存する。例示的な一実施形態では、連続相としてのＮｏｖｅｃ（商標）７５００で操作された流体中の２％Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）（Ｓｐｈｅｒｅ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ社）が、それぞれ２：１容積比の分散相としてのＰＢＳ又は細胞培養培地中の小滴担体粒子１２と共に使用された。このような状況下で、手動によるピペット（１００μＬ、２００μＬ又は１ｍＬピペットを使用して、毎秒５０〜１００Ｘ、毎秒２〜４回のピペットの反復）を介した激しい攪拌が、単一小滴担体粒子１２のみを包含する高い画分を有する単分散滴状物１０を確実かつ再現性良く形成することが分かった。
【０１１０】
[00171]  （４）親和性試薬と結合する分泌物を蓄積するための滴状物１０の所定時間にわたるインキュベート
[00172]  インキュベーション中の細胞生存率を維持するため、滴状物１０は、細胞培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０／ＤＭＥＭなど）及び２％ＦＢＳによって富化されたＰＢＳの両方を使用して形成された。ほとんどの小分子は、ヒドロゲル小滴担体粒子１２の孔を通じて容易に拡散することができるので、滴状物１０の総容積は、栄養素リザーバとして役立つ。さらに、滴状物１２は、標準的な細胞インキュベータ内で約３７℃に維持されることができる。滴状物１０の層の上部に軽質又は重質鉱油の層を加えると、蒸発及び凝集を減少させることによって安定性が改善されることが分かった。
【０１１１】
[00173]  滴状物１０内にカプセル化された単一細胞によって生成されたすべての検体は、それらの関連する水相容積又は区画内に保持される。これらの比較的少量の滴状物１０は、小滴担体粒子１２の表面上の検出可能な量の分泌物の急速な結合を助ける分泌物シグナルの局所的蓄積をもたらす。予想される分泌物レベルに応じて、インキュベーション時間は、対象の細胞型及び分泌物標的に応じて調整されることができる。例えば、分泌レベルが少ないことが予想される場合には、より長いインキュベーション時間（＞１２時間）を用いることができ、分泌率が高い場合には、より短いインキュベーション時間（〜２−３時間）を用いることができる。
【０１１２】
[00174]  予想される分泌レベルに応じて、分泌物結合部位の数及び結合部位の空間的位置が調節されることができる。一例では、利用可能な結合部位は、分泌物がゲルマトリックスを通じて自由に拡散することを可能にする孔径を有するマトリックス多孔性を有する小滴担体粒子１２を製造することによって増加させられることができる。この実施形態では、小滴担体粒子１２の完全な３次元幾何学的形状が使用されて、分泌された分子を捕捉して結合部位の総数を増加させることができ、このことは、結合部位が容易に飽和されずにより良好なダイナミックレンジの検出を可能にするので、高い分泌レベルの場合に有益である。場合によっては、例えば、低分泌レベルでは、より集中したシグナルを生成するために、結合部位を空間的に局在化させることが有利である。例えば、固体小滴担体粒子１２を使用することによって、又は、分泌物が小滴担体粒子１２のマトリックスを通じて自由に拡散することができないような多孔性を有する粒子を使用することによって、アクセス可能な結合部位が小滴担体粒子１２の表面に局在化される。さらなる実施形態では、結合部位は、分泌物捕捉及び得されたシグナルをさらに局在化させるために、内部空洞又は空隙１８の表面に局在化され得る。本明細書に記載される抗−ＩＬ−８抗体を分泌するＣＨＯ細胞の詳細な例示において、小滴担体粒子の孔径は、標的分泌物、抗ＩＬ−８の自由拡散を防止するのに十分に小さい。これにより、分泌された抗−ＩＬ−８は、小滴担体粒子１２の外側（すなわち、空洞１８内及び外縁の周囲）に結合し、蓄積された蛍光シグナルの視認性を強化する。
【０１１３】
[00175]  （５）滴状物１０のエマルションを破壊して、付着細胞を有する小滴担体粒子１２を水溶液に戻す
[00176]  滴状物１０が、可視化のために小滴担体粒子１２上に十分な分泌物が蓄積及び結合するのに十分な長さでインキュベートされると、エマルションは、小滴担体粒子１２及びそれらの結合細胞を回収する安定性を失う。これは、パーフルオロオクタノール（ＰＦＯ）又はＰｉｃｏ−Ｂｒｅａｋ（商標）のような２次界面活性剤を添加することによって達成される。一実施形態では、すべての過剰な油が滴状物１０のエマルションから除去され、Ｎｏｖｅｃ（商標）−７５００油中の等量の２０％ＰＦＯに置換される。小滴が不安定化すると、水相と有機相との間に２分以内に明確な境界が見えるので、溶液は、チューブ表面を軽くたたくことによって弱く攪拌される。残りの任意の小さな有機サテライト小滴２８は、低速（〜１００ｇ）で急速に５秒以内の遠心分離を通じて水相から除去されることができる。その後、水溶液及び小滴担体粒子１２は、下流分析の前に、解離した油相から（例えば、ピペットによって）容易に除去される。
【０１１４】
[00177]  （６）分泌物に特異的な第２親和性試薬を用いた、捕捉された分泌物のために付着細胞による小滴担体粒子１２の染色
[00178]  小滴担体粒子１２に結合された分泌分子を分析するために、いくつかの異なる報告スキームが使用されることができる。好適な一実施形態では、分泌分子上の第２エピトープに対して特異的であるフルオロフォアに共役された２次抗体が添加されて、蛍光サンドイッチ免疫複合体を形成し、結合した分泌分子の存在を報告することができる。この方法は、フローサイトメータ１５０（図１３Ａ、図１３Ｂ、図１６及び図１８に図示）、プレートリーダ及び蛍光顕微鏡のような多くの一般的に使用される分析ツールを通じた定量化を可能にする。
【０１１５】
[00179]  特に低濃度で存在する分泌分子については、レポータ抗体がホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素に共役され、粒子上の遊離部位に結合する蛍光色素を切断する増幅スキームは、チラミド化学の使用などを通じて、本明細書で説明するように、シグナルを増幅することができる。関連の実施形態では、磁性ナノ粒子又は磁性微小粒子が使用されて、対象の捕捉された分泌分子を標識することができる。磁気特性の付加は、多くの方法で使用されることができる。例えば、対象の小滴担体粒子１２を濃縮するため、又は、磁力を用いて対象の試料をソーティングするため。染色は、これらの２つのモダリティ（例えば、蛍光及び磁気）に限定されず、複数のモダリティの組み合わせを含み得ることが理解されるべきである。他のモダリティには、当技術分野で公知のものの中でも、比色、燐光、光散乱粒子、プラズモニックナノ粒子が含まれ得る。
【０１１６】
[00180]  （７）付着細胞を有する染色された小滴担体粒子１２の分析（例えば、フローサイトメータ１５０を用いて）、及び、任意選択的に、分泌量／親和性に対応する染色に基づく強度の閾値に基づいて小滴担体粒子１２に付着した対象の細胞のソーティング
[00181]  染色されると、小滴担体粒子１２及びそれらの結合細胞は、市販のフローソータ１５０（図１３Ａ、図１３Ｂ、図１６及び図１８に図示）を使用して、高スループットで分析され、かつ、ソーティングされることができる。好適な実施形態では、小滴担体粒子１２は、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳなどの栄養素が豊富なＰＢＳ内に懸濁され、ソーティングプロセス中、細胞生存性を維持する。小滴担体粒子１２の相対サイズは、前方散乱シグナル及び側方散乱シグナルを使用して容易に識別することを可能にするソーティング中、汚染された塵埃、細胞残渣又は溶液中の小径油滴からの粒子の明確な識別を可能にする。細胞質トラッキング染料、核染色、生存性染色又はレポータ抗体によって染色された付着細胞も、小滴担体粒子１２上で容易に検出され、小滴担体粒子１２を包含する細胞の直接の分析を可能にする。最後に、エマルションの破壊時に小滴担体粒子１２の表面に添加されたレポータ抗体は、小滴担体粒子１２表面の相対蛍光強度から粒子空洞１８内の個別の細胞クローンからの相対的なタンパク質生産の直接的な定量化を可能にする。対象のソーティングされた細胞、例えば、高レベルの所望のタンパク質を分泌するクローンは、容易に単離され、かつ、その後の増殖のために生存可能のままであり、有益な細胞表現型の濃縮を可能にする。
【０１１７】
[00182]  他の例では、総分泌物に基づく単一細胞のスクリーニングが複数サイクルにわたって実行されて、所望の亜集団の選択を改善することができる。この全般的なワークフローが図１９に示されている。前述したアプローチに従い、単一細胞は、小滴担体粒子１２内に単離され、滴状物１０に乳化され、そこでクロストークなしに分泌物が蓄積して小滴担体粒子１２上に捕捉される。その後、小滴担体粒子１２は水中に戻され、分泌物の量を示すために染色され、付着細胞とともに分析／ソーティングされることができる。その後、ソーティングされた細胞のサブ集団が増殖されて、反復選択工程を実施することができる。一実施形態では、小滴担体粒子１２に付着したソーティングされた細胞は、ウェルプレート又はフラスコ内に播種され、小滴担体粒子１２から直接増殖させられることができる。例えば、培養の数日後、ＣＨＯ細胞が、小滴担体粒子１２の表面を横切って増殖し、最終的に、それらが播種されたウェルプレートの表面上で増殖することが分かった。これは、処理工程を減少させ、細胞のトリプシン処理を制限するという利点を有する。所望であれば、付着細胞は、標準的なトリプシン処理及び継代培養工程を用いて小滴担体粒子１２から除去されることができる。細胞の増殖後、回収された細胞を再び小滴担体粒子１２上に播種して前に概説した工程を繰り返すことによって、単一細胞の分泌及びソーティングサイクルが再度実行されることができる。関連の実施形態では、小滴担体粒子１２に播種された単一細胞が増殖させられて、乳化前に小滴担体粒子１２に付着したクローン性コロニーを形成することができる。これにより、クローンの成長及び分泌に基づく分析／ソーティングを組み合わせることが可能になる。例えば、大部分が単一細胞のみを包含するような濃度で、細胞が小滴担体粒子１２内に播種されることができる。所望であれば、最初の集団がスクリーニングされて、（例えば、フローソータ１５０を使用して）多数の細胞を有する小滴担体粒子１２を除去することができる。播種後、細胞は、単一細胞コロニーが形成されるように小滴担体粒子１２上で直接増殖させられることができる。これは、用途に応じて、様々な時間（例えば、＜２４時間、２４時間〜１週間、＞１週間）にわたって行われることができる。コロニー形成後、バックグラウンドシグナルは洗い流されることができ、小滴担体粒子１２は分泌結合部位によって修飾されることができる。その後、単一細胞について先に概説したように分泌スクリーニングが実行される。滴状物１０系は、カプセル化前に細胞が小滴担体粒子１２上で増殖させられることができ、細胞増殖中に蓄積する任意の望ましくないバックグラウンドシグナルを除去する機会を与えるので、このワークフローに一意的に適している。単一細胞が直ちにカプセル化されて増殖させられる他のアプローチでは、シグナルは、望ましくないか又はシグナルの飽和につながり得る増殖期間中全般に蓄積される。
【０１１８】
[00183]  ワークフロー例
[00184]  高分泌ＣＨＯ細胞を選択するためのワークフローの例を以下に詳述する。使用される細胞株の例は、ＣＨＯ−ＤＰ１２クローン＃１９３４（ＡＴＣＣ）である。細胞培地は、ＡＴＣＣにより規定されるように調製された。ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞株は、この例の実験のための標的分泌物であるヒト抗−ＩＬ−８抗体を産生する。
【０１１９】
[00185]  （１）水溶液中で小滴担体粒子１２に付着するための細胞のローディング
[00186]  この例では、外径８２．５ミクロン、内径５０ミクロンの小滴担体粒子１２が使用された。小滴担体粒子１２は、０．５ｍｇ／ｍＬのビオチン−ＰＥＧ−チオール（５０００ＭＷ、ｎａｎｏｃｓ社）及び４ｍｇ／ｍｌのＲＧＤ（前述のように製造中にデキストラン相に添加される）によって修飾された。３０μＬの濃縮小滴担体粒子１２が１ｍＬの細胞培地で希釈され、１２個のウェルプレートのうちの１つのウェル内に添加された。その後、小滴担体粒子１２は１０分間沈降することを許容された。ＣＨＯ  ＤＰ−１２細胞が、１ｍｌ当たり４００万個の細胞に濃縮された。粒子当たり〜０．３個の細胞の標的カプセル化のため、１８μＬの濃縮細胞ストックがとられ、培地で５０μＬに希釈され、その後、小滴担体粒子１２で予め播種されたウェル内に慎重に移された。粒子当たり〜０．１個の細胞の標的カプセル化のため、６μＬの濃縮細胞ストックが５０μＬに希釈され、その後、小滴担体粒子１２で予め播種されたウェル内に慎重に移された。ウェルプレートをインキュベータに移動させる前に、細胞が１０分間にわたって播種されることが許容された。４〜１２時間の範囲が、細胞が小滴担体粒子１２に強く付着するのに必要であることが分かった。
【０１２０】
[00187]  （２）結合されていない細胞及び／又はバックグラウンド分泌物を洗い流し、対象の特定の細胞分泌物を捕捉する小滴担体粒子１２に結合する親和性試薬を加える
[00188]  細胞が十分な時間にわたってインキュベートされて小滴担体粒子１２に付着した後、小滴担体粒子１２はウェルプレートから１５ｍＬのコニカルチューブに移された。これは、ウェルプレートを約３０°の角度で傾け、表面に付着した小滴担体粒子１２を剪断するために上から過剰の培地をピペットし、除去された小滴担体粒子１２及び結合した細胞を１５ｍＬのコニカルチューブにピペットすることによって行われた。小滴担体粒子１２のコニカルチューブの壁への付着を制限するために、チューブは、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を有するＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を有するＰＢＳ、又は、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を有するＰＢＳの溶液によって前処理されることができる。その後、小滴担体粒子１２及び結合した細胞は、０．５％ＢＳＡを補充したＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムイオン）で２〜３回洗浄された。この洗浄は、培地中に存在する可能性のあるビオチン及びバックグラウンド培地中に存在する可能性のある細胞からの任意のタンパク質を除去する。すべての洗浄工程について、試料は３００ｇで３分間遠心分離された。その後、小滴担体粒子１２は、小滴担体粒子１２上の利用可能なビオチン基に結合するストレプトアビジンの０．０２ｍｇ／ｍｌ溶液によって修飾される。１０分間インキュベートした後、小滴担体粒子１２及び結合した細胞は、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡによって２〜３回洗浄された。次に、小滴担体粒子１２は、分泌された抗−ＩＬ−８タンパク質の捕捉部位の例として使用されるビオチン化プロテインＡによって修飾された。この例では、ビオチン化プロテインＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の０．５ｍｇ／ｍｌストック溶液１０μＬが各試料に添加され、その後、１０分間インキュベートされた。代替的に、ビオチン化ＩｇＧ１、ＦＣマウス抗ヒトが使用されることができる。最後に、試料は、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡによって２〜３回洗浄された。最終洗浄時、ＰＢＳは細胞培養培地に置換された。
【０１２１】
[00189]  （３）付着細胞及び油連続相の結合親和性試薬によって小滴担体粒子１２を乳化して滴状物１０を形成する
[00190]  小滴担体粒子１２及び結合した細胞は、試料を遠心沈殿させることによって濃縮された。その後、約５０μＬの試料が残るまで浮遊物が除去された。その後、１００μＬのＮｏｖｅｃ（商標）油＋２％ｗ／ｖのＰｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）が試料に添加された。その後、エッペンチューブが２〜５ｘフリックされ、試料を大きな小滴に分解するのを助けた。その後、１００μＬ又は２００μＬピペットのいずれかを用いて、試料が毎秒２〜４ピペット、５０〜１００Ｘの速度で上下にピペットされて、単分散滴状物１０を生成した。その後、滴状物１０形成後、試料の蒸発を防止し、試料をインキュベートする間の凝集を減少させるために、鉱油が試料の上部に添加された（〜１００−１５０μＬ）。
【０１２２】
[00191]  （４）親和性試薬と結合する分泌物を蓄積するために滴状物１０をある期間インキュベートする
[00192]  試料は、細胞インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で２〜２４時間インキュベートすることを許容された。この工程中、分泌された抗−ＩＬ−８タンパク質は、小滴担体粒子１２上のプロテインＡ結合部位に付着する（図１７Ａ参照）。
【０１２３】
[00193]  （５）滴状物１０エマルションを破壊して、付着細胞を有する小滴担体粒子１２を水溶液内に戻す
[00194]  小滴担体粒子１２及び細胞を水相に戻すために、試料の上部に〜４−６ｍＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳが添加された。その後、添加された鉱油はピペットによって除去される。その後、Ｎｏｖｅｃ（商標）油中の５０μＬの２０％ｖ／ｖのＰＦＯが試料に添加されて小滴の凝集を助けた。エッペンチューブを軽くたたくことによって凝集が助けられる。２〜５分後、残りの小滴は、試料を１００ｇで５〜１０秒間遠心分離することによって凝集されることができる。相移動が完了した時点で、小滴担体粒子１２及び結合した細胞は、新しい１５ｍｌのコニカルチューブに移される（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ、又は、０．５％ＢＳＡ、又は、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７によって前処理される）。
【０１２４】
[00195]  （６）分泌物に特異的な第２親和性試薬を使用した、捕捉された分泌物のために付着細胞による小滴担体粒子１２の染色
[00196]  水相１４の小滴担体粒子１２試料がＰＢＳ＋２％ＦＢＳによって２〜３回洗浄された。最後の洗浄で試料が遠心沈降されて、〜１００μＬが残るまで浮遊物が吸引される。１０μＬの０．５ｍｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（Ｃｙ５）予備吸着（Ａｂｃａｍ社、ａｂ９７１７２）が試料に添加されて、小滴担体粒子１２上に捕捉された捕捉された抗−ＩＬ−８タンパク質を染色した（図１７Ａ）。３７℃で３０分間インキュベートした後、試料は、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳによって２〜３Ｘ洗浄され、共役していない染色剤をすべて除去した。その後、試料は、フローサイトメータ１５０への移送中に氷上に置かれた。
【０１２５】
[00197]  任意選択的に、この染色プロセス中、小滴担体粒子１２と結合された細胞はカルセインＡＭによって染色されることができる。図１７Ｂは、カルセインＡＭによって染色された結合した細胞を有する小滴担体粒子１２を撮った顕微鏡画像の例を示している。蛍光イメージングは、カルセインＡＭ染色生細胞が存在する小滴担体粒子１２上のＣｙ５チャネル（分泌物染色チャネル）において強いシグナルを明瞭に示している。結合した細胞を有しない他の小滴担体粒子１２上にはバックグラウンドシグナルがほとんど示されていない。これは、分泌物捕捉及び標識が成功したこと、並びに、インキュベーション工程中の滴状物１０同士の間の制限されたクロストークを示している。
【０１２６】
[00198]  （７）分泌物の量／親和性に対応する染色に基づく強度の閾値に基づいて、付着細胞によって染色された小滴担体粒子１２を（例えば、フローサイトメータ１５０を用いて）分析し、任意選択的に、小滴担体粒子１２に付着した対象の細胞をソーティングする
[00199]  試料は、オンチップバイオテクノロジーズ社（日本国東京）からのオンチップソーティングフローサイトメータ１５０を使用して高スループットで分析された。試料は、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２００μＬに希釈され、試料入口に添加された。ここでは、オンチップバイオテクノロジーズ社からの１５０μｍフローチップが使用された。ＰＢＳ＋２％ＦＢＳもシース液として使用された。前方散乱高さ（ＦＳＣ（Ｈ））及び側方散乱高さ（ＳＳＣ（Ｈ））のゲーティングが使用されて、他のバックグラウンド事象／ノイズから小滴担体粒子１２を選択した。他の事象は、溶液中にまだ存在する少量のＮｏｖｅｃ（商標）７５００油小滴、小滴担体粒子１２から解離した細胞、又は細胞破片と関連している可能性がある。ゲーティングプロットの例が図１８に示されている。この最初のゲーティングの後、ソーティング事象は、その後、相対的遠赤色蛍光シグナルから選択された。例えば、図１８において、遠赤色シグナルの上部１０％はソーティングゲートとして選択された。その後、付着細胞を有する小滴担体粒子１２を包含する試料がソーティングされて収集された。オンチップソータフローサイトメータ１５０を使用すると、事象率は、典型的には、試料について約５０〜３００事象／秒であった。収集された試料は、カルセインＡＭによって染色され、図１８に示すように蛍光顕微鏡下で可視化された。ソーティング後、カルセインＡＭ生染色シグナルによって示されるように、細胞の大部分が生存性を維持した。Ｃｙ５チャネル（捕捉された分泌物染色チャネル）のさらなる画像は、小滴担体粒子１２の明確な蓄積を示しており、ソーティング後、高レベルの捕捉された分泌物と結合する細胞を示している。これは、滴状物１０系を使用して相対的な分泌物レベルから細胞をソーティングする能力を実証する。
【０１２７】
[00200]  滴状物のバーコーディング
[00201]  多数のスキームは、多数の標的（例えば、核酸、タンパク質、細胞又は他の検体）が同じ実験手順でプローブされることができるように、一意の識別子を用いて小滴担体粒子１２のバッチをバーコーディングするために使用されることができる。これらには、上述したようなＤＮＡオリゴの生成のためのスプリットアンドプール合成を通じたもの、若しくは、複数のフルオロフォアの様々な比率を有する蛍光強度（図１５Ｂ）を通じたもの、予めカプセル化された磁性ナノ粒子５２の様々な濃度を介した磁気親和性（図１５Ｃ）を通じたもの、様々なサイズ及び量のナノ粒子５４からの固有のフローサイトメトリ側方散乱特徴（図１５Ｄ）を通じたもの、又は、均一なサイズの空洞又は空隙を維持しながら、小滴担体粒子１２の直径又は他の寸法を一意の識別子として機能させる粒子形態の変化（図１５Ａ）を通じたものが含まれる。異なるバーコーディングアプローチを組み合わせて、様々なタイプの小滴担体粒子１２の数をさらに増加させることもできる。
【０１２８】
[00202]  少数の異なる色のフルオロフォアの共有結合は、各分子の相対濃度の変動を単に通じて、膨大な量の識別可能性を提供する。例えば、８つの異なる濃度での３つの異なるフルオロフォアのみの付着又は他の方法での埋め込みは、特異的な小滴担体粒子に固有に検出されて帰属され得る、５００を超える別個のバーコードを生じさせる。小滴担体粒子１２の蛍光分析バーコーディングは、抗体、反応基、若しくは、通常は小滴担体粒子１２の表面に結合され得るか又は小滴担体粒子１２のマトリックス内に埋め込まれているか又は共有結合によってリンクされ得る任意の他の部分に共役されたフルオロフォアの付着を通じて容易に達成される。例えば、ＰＥＧ−ノルボルネン又はＰＥＧ−ＶＳのいずれかを使用して製造された小滴担体粒子１２は、製造中又は製造後に、マレイミド修飾蛍光染料（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（商標）４８８マレイミド、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（商標）５６８マレイミドなど）をチオール化架橋剤に共役させることによって標識されることができる。固有のバーコードを作成するために、これらのフルオロフォアの異なる比率が混合されることができる。別の実施形態では、ビオチン−ＰＥＧ−チオール（Ｎａｎｏｃｓ社）が、小滴担体粒子１２の架橋の前又は後に、ＰＥＧ−ノルボルネン、ＰＥＧ−ＶＳ又は任意の他のチオール反応性ＰＥＧ基のポリマーに共役されることができる。その後、ビオチン基は、様々な色、濃度及び比で、蛍光ストレプトアビジン分子（例えば、とりわけＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（商標）４８８、５６８、６４７、ストレプトアビジン）で修飾されることができる。粒子製造後に蛍光ストレプトアビジンによって修飾することによって、効率的なバーコーディングプロセスが可能になる。例えば、異なる標識ストレプトアビジン分子の予備混合物が、異なる濃度／比で予め混合されることができ、かつ、その後、製造された小滴担体粒子１２が加えられて、多くの異なるバーコードを効率的に形成することができる。別の例では、濃度及び比が異なる蛍光ナノ粒子がヒドロゲル前駆体と混合され、一実施形態での製造中に小滴担体粒子１２のヒドロゲルマトリックス内に埋め込まれることができる。水相又は滴状物１０内のバーコーディングされた小滴担体粒子１２の蛍光読み取りは、標準的な顕微鏡、フローサイトメトリ１５０、プレートリーダ、又は多くの他の実験機器の標準片を使用して実行されることができる。
【０１２９】
[00203]  印加された磁場内の磁気吸引力の変動を通じて、小滴担体粒子１２及び得られた滴状物１０をバーコーディングするために磁気が使用されることができる。小滴担体粒子１２は、異なるレベルの磁気包含量で製造されることができ、異なる磁気バーコードを生成する。種々のレベルの磁気包含量は、重合の前に小滴担体粒子前駆体溶液内に水溶性磁性ナノ粒子又は微小粒子５２を導入することによって達成されることができる。磁気バーコーディングを使用する一実施形態は、振動磁場の存在下で、磁気ピラーのアレイ上の表面上に滴状物１０又は小滴担体粒子１２を配置することを包含する。この振動は、移動の平面に沿ってますます離間されているピラーの平面を横切る正味の一方向移動をもたらす。その後、水相の滴状物１０又は小滴担体粒子１２によって覆われた総距離は、磁性包含量がより少ない小滴担体粒子１２が最終的に停止し、次のピラー配列までの距離を通過することができなくなるので、磁気官能化の程度に比例する一方で、より大きな磁化の程度を有するものは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１４４，９１１号に開示されているようなより強い引力によって移動し続ける。小滴担体粒子１２の磁気官能化はまた、連続相全体にわたってエマルションの迅速な移動を可能にする。乳化された微小粒子内にカプセル化された磁性粒子４２は、サテライト小滴２８の大きなバックグラウンドから小滴を包含する小滴担体粒子１２を分離するのに十分な力を印加磁場の存在下で提供する（図５参照）。したがって、このバーコーディングスキームの適用は、印加力の変動を通じて空間的に亜集団を分離することができるのみならず、多くのアッセイにおいてシグナルを改善するために、望ましくないサテライト小滴２８から小滴担体粒子１２を分離することもできる。
【０１３０】
[00204]  粒度は、細胞の別個のサブセットを互いに分離するためにフローサイトメトリにおいて一般的に使用される測定尺度である。小滴担体粒子１２は、異なる角度及び／又は異なる強度で光を散乱する様々なサイズ及び／又は濃度の光散乱ナノ粒子５４を添加することによってバーコーディングされることができる。ナノ粒子５４（例えば、ポリスチレンナノ粒子）は、重合前の一実施形態における前駆体ヒドロゲル溶液内にローディングされて、散乱バーコードが埋め込まれた小滴担体粒子１２を生成することができる。この代替アプローチは、例えば、補償を必要とする余分な蛍光シグナルを必要とせず、かつ、蛍光的に標識されて小滴担体粒子１２に付着した検体の分析を妨げ得る側方散乱シグナルを分析することによって、フローサイトメータ１５０における小滴担体粒子１２型の分析を可能にする。
【０１３１】
[00205]  小滴担体粒子をバーコーディングする別の方法は、小滴担体粒子１２自体のサイズを通じてのものを含む。これは図１５Ａに示されている。異なるサイズの小滴担体粒子１２は、フローサイトメータ１５０内で異なる前方散乱シグナルをもたらす。粒子径の差はまた、粒子クラス間の視覚的識別を可能にし、かつ、広視野イメージング及び顕微鏡観察を通じて容易に分類されることができる。さらに、慣性集束又は決定論的横方向変位のようなマイクロ流体技術を使用して、流動場内の各小滴担体粒子１２に加えられる累積力の変動を通じて、異なるサイズの小滴担体粒子１２を互いにソーティングすることができる。他の非蛍光バーコードと共に議論されるように、このようなサイズベースのバーコーディングは、バーコードからの干渉なしに、複数の波長にわたる蛍光シグナルを検体検出のために使用することを可能にする。さらに、フローサイトメータ１５０をイメージングするために、小滴担体粒子１２及び空隙又は空洞領域１８の形状／サイズが画像化されてバーコーディングの方法を同様に提供する。
【０１３２】
[00206]  滴状物／小滴担体粒子を読み取る及びソーティングする方法
[00207]  滴状物アッセイで生成されたシグナルを定量可能な測定値に変換するために、アッセイ出力を読み取る明確に定義された方法が滴状物系と適合しなければならない。さらに、シグナルを処理し、滴状物１０のサブセットを異なる集団にソーティングする方法を開発することは、単一細胞研究からのハイパフォーマの単離にとって重要である。特に、小滴担体粒子１２及び形成された滴状物１０は、多くの一般的に使用される実験システムと適合性があり、適切な機器によって読み取り及びソーティングの両方を比較的に容易にする。
【０１３３】
[00208]  ある実施形態では、滴状物１０内にカプセル化された容積内で行われた反応に対応するシグナルは、小滴担体粒子１２の表面に付着するか、又は、小滴担体粒子１２内及び周囲の水相１４内に蓄積する。これは、油連続相の滴状物１０と適合し得るカスタム組立マイクロ流体デバイス、及び、一旦水相に戻された小滴担体粒子１２と適合性を有する市販のフローサイトメータ１５０及びＦＡＣＳシステム、の両方におけるシグナル検出器（例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ））を通じた蛍光又は比色シグナルの変動の検出を可能にする。いくつかの市販のフローサイトメータ１５０は、日本国東京のオンチップバイオテクノロジーズ株式会社のオンチップフローやオンチップソートなどの油連続相にも適合する。小滴担体粒子１２の径は、標準的な市販のフローサイトメトリ機器１５０で使用するために、＜〜５０マイクロメートルに調節されるべきであるが、他の市販のサイトメトリシステム（例えば、オンチップバイオテクノロジー社のもの又はＵｎｉｏｎ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａ社のバイオソータ）において、最大〜５００マイクロメートルまでのより大きなサイズが使用されることができる。バーコーディングシグネチャはまた、本明細書で説明するように、蛍光及び／又は散乱シグナルを用いて同時に読み取られることもできる。その後、各バーコードについての正のシグナル小滴担体粒子１２の数は、閾値又はゲートが特定のサブ集団を識別するために使用される場合、フローサイトメトリ散乱プロットからカウントされることができ、特定のバーコードゲート内で高対低のアッセイシグナルで小滴担体粒子１２の画分をカウントすることによって多重アッセイにつながる。これらのアッセイシグナルに基づくソーティングは、さらなる細胞分析及び増殖、又は、核酸分析及び下流シークエンシングのために、高対低の小滴担体粒子１２を単離するためにも実行されることができる。他の実施形態では、捕捉された検体を包含する滴状物１０（例えば、抗体を使用する）は、捕捉された検体にも結合してサンドイッチを形成する磁性粒子／微小気泡粒子にさらに暴露されることができる。その後、正のシグナル粒子は、それぞれ、磁場又は浮力を介して分離され得る。
【０１３４】
[00209]  標準的な蛍光顕微鏡法は、アッセイ出力をプロービングする有効な方法でもある。ここでは、広視野イメージングプロトコルを適用して、試料バッチ内のすべての滴状物１０を測定し、別個のアッセイ測定値内の変動性のより良い理解を発展させることができる。ある実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０１５７３５１号公報又は米国特許第９，００７，４３３号に開示されているものと同様に、オンサイト／ポイントオブケア分析（例えば、モバイルデバイス上の広視野蛍光イメージング）を可能にするために、携帯型イメージングシステムが使用されることができる。さらに、小滴担体粒子１２の幾何学的形状の不均一性は、磁場を利用して、磁性滴状物１０の集団を同じ方向に整列させて、イメージング中又は流動中の分析中に粒子空隙又は空洞１８から均一なシグナルを得ることができることを意味している。
【０１３５】
[00210]  三日月形の小滴担体粒子１２の非対称性を利用して、浮力に基づいて小滴担体粒子１２を整列させることができる。例えば、水相よりも高い密度の三日月形の小滴担体粒子１２は、それらの空洞１８を直立に露出させて沈降して配向する傾向があることが分かった。これは典型的には５〜１０分の時間スケールで起こった。この好適な配列は、露出した空洞１８内にマイクロスケールの物体をローディングすること（例えば、細胞をローディングすること）を容易にするために使用されることができる。また、小滴担体粒子１２の形状を利用して、閉じ込められたチャネル内の流れの間に好適な配向を形成することもできる。例えば、小滴担体粒子１２の形状は、粒子が、散乱シグネチャがより均一となるように好適な方向に配向するように調節されることができる。
【０１３６】
[00211]  本発明の実施形態が図示して説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更がなされることができる。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲及びそれらの均等物を除いて、限定されるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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