(57)【要約】ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６および腫瘍関連抗原（例えば、Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５）に結合する多重特異性結合タンパク質、ならびにがんの処置に有用な医薬組成物および治療方法が記載される。ある特定の実施形態では、本発明は、例えば、がん細胞上のＢ７−Ｈ３、ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合して、ナチュラルキラー細胞を活性化するタンパク質（例えば、多重特異性結合タンパク質）を提供する。
2021534096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片を含む第１の抗原結合部位と；
（ｂ）Ｂ７−Ｈ３に結合する一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含む第２の抗原結合部位と；
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項２】
前記ｓｃＦｖが、Ａｌａ−ＳｅｒまたはＧｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する前記第３の抗原結合部位に連結しており、前記ｓｃＦｖが重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記ｓｃＦｖが前記抗体Ｆｃドメインに連結している、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項２または３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記ジスルフィド架橋が前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記ｓｃＦｖが前記抗体Ｆｃドメインに連結しており、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインのＮ末端に位置し、フレキシブルリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（（Ｇ４Ｓ）４）（配列番号１２６）を介して、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインに連結しており、前記Ｆａｂが前記抗体Ｆｃドメインに連結している、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、フレキシブルリンカーを介して、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインに連結している、請求項２から６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記フレキシブルリンカーが（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（（Ｇ４Ｓ）４）（配列番号１２６）を含む、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置する、請求項２から８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインのＮ末端に位置する、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する前記第３の抗原結合部位に連結している、請求項１から１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記Ｆａｂ断片の重鎖部分が重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインが前記ＣＨ１ドメインに連結している、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記Ｆａｂが前記抗体Ｆｃドメインに連結している、請求項１１または１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と；
（ｂ）腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３に結合する第２の抗原結合部位と；
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項１５】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、
（１）それぞれ、配列番号３４７、８８および３５２のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（２）それぞれ、配列番号３４７、８８および３４８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（３）それぞれ、配列番号３４１、６４および３４２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号６６、６７および６８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（４）それぞれ、配列番号３４３、７２および３４４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号７４、７５および７６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（５）それぞれ、配列番号３４５、８０および３４６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号８２、８３および８４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（６）それぞれ、配列番号８７、８８および８９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（７）それぞれ、配列番号３４９、９６および３５０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９８、９９および１００のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（８）それぞれ、配列番号３４７、８８および３５５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（９）それぞれ、配列番号３４７、８８および３５８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（１０）それぞれ、配列番号３４７、８８および３６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（１１）それぞれ、配列番号３４７、８８および３６４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（１２）それぞれ、配列番号３４７、８８および３６７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（１３）それぞれ、配列番号８７、８８および３５４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、
（１）配列番号３５１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（２）配列番号８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（３）配列番号７７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号７８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（４）配列番号６９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（５）配列番号６１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号６２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（６）配列番号９３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号９４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（７）配列番号３５３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（８）配列番号３５６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（９）配列番号３５９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（１０）配列番号３６２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（１１）配列番号３６５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
Ｂ７−Ｈ３に結合する前記第２の抗原結合部位が、重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）および重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）を含む重鎖可変ドメイン、ならびに軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）および軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含む軽鎖可変ドメインを含み、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１１０、１１１、１１２、１１４、１１５および１１６；１１８、１１９、１２０、１２２、１２３および１２４；３７１、３７２、３７３、３７４、３７５および３７６；または３７９、３８０、３８１、３８２、３８３および３８４に示される、請求項１から１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
Ｂ７−Ｈ３に結合する前記第２の抗原結合部位が、
（ａ）配列番号１０９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号１１３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号１１７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号１２１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｃ）配列番号３６９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｄ）配列番号３７７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３７８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｅ）配列番号３８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３８７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｆ）配列番号３８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３８９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（ｇ）配列番号３９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
配列番号３２９、３３０、３３３、３３４、３３５および３３６から選択される配列を含む、請求項１から１３または１５から１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
配列番号３３０、配列番号３３４および配列番号３３６から選択される配列によって表される、抗体Ｆｃドメインに連結したｓｃＦｖを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２１】
配列番号３２９、配列番号３３３または配列番号３３５の配列を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
配列番号３２９、配列番号３３３または配列番号３３５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含むタンパク質。
【請求項２３】
配列番号３２９、配列番号３３３または配列番号３３５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含むタンパク質。
【請求項２４】
配列番号３２９、配列番号３３３または配列番号３３５のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の配列を含むタンパク質。
【請求項２５】
配列番号３３０、配列番号３３４または配列番号３３６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含むタンパク質。
【請求項２６】
配列番号３３０、配列番号３３４または配列番号３３６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含むタンパク質。
【請求項２７】
配列番号３３０、配列番号３３４または配列番号３３６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の配列を含むタンパク質。
【請求項２８】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と；
（ｂ）腫瘍関連抗原Ｌ１ＣＡＭに結合する第２の抗原結合部位と；
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項２９】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と；
（ｂ）ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１およびＳＬＣ１Ａ５からなる群から選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部位と；
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項３０】
前記第２の抗原結合部位と同じ腫瘍関連抗原に結合する追加の抗原結合部位をさらに含む、請求項１４、２８または２９に記載のタンパク質。
【請求項３１】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）であり、腫瘍関連抗原に結合する前記第２のおよび／または前記追加の抗原結合部位がＦａｂ断片である、請求項１４、２８、２９または３０に記載のタンパク質。
【請求項３２】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、腫瘍関連抗原に結合する前記第２のおよび／または前記追加の抗原結合部位がｓｃＦｖである、請求項１４、２８、２９または３０に記載のタンパク質。
【請求項３３】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がＦａｂ断片であり、腫瘍関連抗原に結合する前記第２の抗原結合部位がｓｃＦｖである、請求項１４、２８または２９に記載のタンパク質。
【請求項３４】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、腫瘍関連抗原に結合する前記第２の抗原結合部位がＦａｂ断片である、請求項１４、２８または２９に記載のタンパク質。
【請求項３５】
前記第１の抗原結合部位がヒトのＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１４および２８から３４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３６】
前記第１の、前記第２のおよび／または前記追加の抗原結合部位が重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から３５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３７】
前記腫瘍関連抗原に結合する前記ｓｃＦｖ前記ｓｃＦｖおよび／またはＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、Ａｌａ−ＳｅｒまたはＧｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常ドメインまたはその部分に連結しており、前記ｓｃＦｖが重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項３１から３４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３８】
前記重鎖可変ドメインが、前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項３６または３７に記載のタンパク質。
【請求項３９】
前記ジスルフィド架橋が前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００との間に形成される、請求項３８に記載のタンパク質。
【請求項４０】
前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが、フレキシブルリンカーを介して、前記軽鎖可変ドメインに連結している、請求項３７から３９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４１】
前記ｓｃＦｖ内で、前記フレキシブルリンカーが（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（（Ｇ４Ｓ）４）（配列番号１２６）を含む、請求項４０に記載のタンパク質。
【請求項４２】
前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが前記軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置する、請求項３７から４１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４３】
前記ｓｃＦｖ内で、前記ヒンジがアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙをさらに含む、請求項３７から４２のずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４４】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、配列番号３５１、配列番号３５３、配列番号３５６、配列番号３５９、配列番号３６２、配列番号３６５および配列番号９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４５】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号３５１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号８６と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４６】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号３６５と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号８６と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４７】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号４１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号４２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４８】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号４９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号５０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４９】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号５７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号５８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５０】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号５９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号６０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５１】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号６１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号６２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５２】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号６９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号７０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５３】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号７７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号７８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５４】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号８５と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号８６と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５５】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号９３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号９４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５６】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号１０２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５７】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインおよび配列番号１０４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４および２８から４３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５８】
前記第２の抗原結合部位がＢ７−Ｈ３に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１０９または３８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１１３または３８７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４および３０から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５９】
前記第２の抗原結合部位がＢ７−Ｈ３に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１１７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１２１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４および３０から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６０】
前記第２の抗原結合部位がＢ７−Ｈ３に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号３６９または３８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号３７０または３８９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４および３０から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６１】
前記第２の抗原結合部位がＢ７−Ｈ３に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号３７７または３９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号３７８または３９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４および３０から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６２】
前記第２の抗原結合部位がＬ１ＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１３３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１３７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２８および３０から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６３】
前記第２の抗原結合部位がＬ１ＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１４１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１４５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２８および３０から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６４】
前記第２の抗原結合部位がＦＬＴ１に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１５０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１５４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６５】
前記第２の抗原結合部位がＦＬＴ１に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１５８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１６２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６６】
前記第２の抗原結合部位がＫＤＲに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６７】
前記第２の抗原結合部位がＫＤＲに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１７４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１７８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６８】
前記第２の抗原結合部位がＴＮＣに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１８２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６９】
前記第２の抗原結合部位がＴＮＣに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１９４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７０】
前記第２の抗原結合部位がＣＳＰＧ４に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１９８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２０２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７１】
前記第２の抗原結合部位がＣＳＰＧ４に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２０６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２１０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７２】
前記第２の抗原結合部位がＢＳＴ１に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２１４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７３】
前記第２の抗原結合部位がＢＳＴ１に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２２２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７４】
前記第２の抗原結合部位がＳＥＬＰに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２３０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２３４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７５】
前記第２の抗原結合部位がＳＥＬＰに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２３８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２４２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７６】
前記第２の抗原結合部位がＣＤ２００に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２４６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２５０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７７】
前記第２の抗原結合部位がＩＮＳＲに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２５４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２５８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７８】
前記第２の抗原結合部位がＩＮＳＲに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２６２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７９】
前記第２の抗原結合部位がＩＴＧＡ６に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２７４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８０】
前記第２の抗原結合部位がＭＥＬＴＦに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２８４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８１】
前記第２の抗原結合部位がＭＥＬＴＦに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号２９２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２９６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８２】
前記第２の抗原結合部位がＳＬＣ１Ａ５に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号３００と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号３０４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８３】
前記第２の抗原結合部位がＳＬＣ１Ａ５に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号３０８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号３１２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８４】
前記第２の抗原結合部位がＬ１ＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号１３４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号１３５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号１３６のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号１３８のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号１３９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号１４０のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および６２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８５】
前記第２の抗原結合部位がＬ１ＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号１４２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号１４３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号１４４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号１４６のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号１４７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号１４８のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および６３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８６】
前記第２の抗原結合部位がＦＬＴ１に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号１５１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号１５２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号１５３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号１５５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号１５６のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号１５７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および６４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８７】
前記第２の抗原結合部位がＦＬＴ１に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号１５９のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号１６０のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号１６１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号１６３のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号１６４のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号１６５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および６５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８８】
前記第２の抗原結合部位がＫＤＲに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号１６７のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号１６８のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号１６９のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号１７１のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号１７２のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号１７３のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および６６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８９】
前記第２の抗原結合部位がＫＤＲに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号１７５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号１７６のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号１７７のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号１７９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号１８０のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号１８１のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および６７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９０】
前記第２の抗原結合部位がＴＮＣに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号１８３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号１８４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号１８５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号１８７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号１８８のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号１８９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および６８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９１】
前記第２の抗原結合部位がＴＮＣに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号１９１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号１９２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号１９３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号１９５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号１９６のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号１９７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および６９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９２】
前記第２の抗原結合部位がＣＳＰＧ４に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号１９９のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２００のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２０１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２０３のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２０４のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２０５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および７０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９３】
前記第２の抗原結合部位がＣＳＰＧ４に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２０７のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２０８のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２０９のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２１１のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２１２のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２１３のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および７１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９４】
前記第２の抗原結合部位がＢＳＴ１に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２１５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２１６のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２１７のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２１９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２２０のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２２１のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および７２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９５】
前記第２の抗原結合部位がＢＳＴ１に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２２３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２２４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２２５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２２７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２２８のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２２９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および７３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９６】
前記第２の抗原結合部位がＳＥＬＰに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２３１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２３２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２３３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２３５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２３６のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２３７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および７４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９７】
前記第２の抗原結合部位がＳＥＬＰに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２３９のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２４０のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２４１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２４３のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２４４のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２４５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および７５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９８】
前記第２の抗原結合部位がＣＤ２００に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２４７のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２４８のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２４９のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２５１のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２５２のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２５３のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および７６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９９】
前記第２の抗原結合部位がＩＮＳＲに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２５５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２５６のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２５７のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２５９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２６０のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２６１のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および７７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１００】
前記第２の抗原結合部位がＩＮＳＲに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２６３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２６４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２６５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２６７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２６８のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２６９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および７８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０１】
前記第２の抗原結合部位がＩＴＧＡ６に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２７１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２７２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２７３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２７５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２７６のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２７７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および７９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０２】
前記第２の抗原結合部位がＩＴＧＡ６に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２７８のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２７９のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２８０のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２８１のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２８２のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２８３のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０３】
前記第２の抗原結合部位がＭＥＬＴＦに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２８５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２８６のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２８７のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２８９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２９０のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２９１のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および８０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０４】
前記第２の抗原結合部位がＭＥＬＴＦに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号２９３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号２９４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号２９５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号２９７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号２９８のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号２９９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および８１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０５】
前記第２の抗原結合部位がＳＬＣ１Ａ５に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号３０１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号３０２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号３０３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号３０５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号３０６のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号３０７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および８２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０６】
前記第２の抗原結合部位がＳＬＣ１Ａ５に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
（ａ）配列番号３０９のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列；
（ｂ）配列番号３１０のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｃ）配列番号３１１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含み、
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
（ｄ）配列番号３１３のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列；
（ｅ）配列番号３１４のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列；および
（ｆ）配列番号３１５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項２９から５７および８３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０７】
ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインまたはその部分を含み、前記抗体ＦｃドメインがヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、請求項１４および２８から１０６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０８】
前記抗体ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、請求項１０７に記載のタンパク質。
【請求項１０９】
前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１０７または１０８に記載のタンパク質。
【請求項１１０】
前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｑ３５２、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で異なる、請求項１０９に記載のタンパク質。
【請求項１１１】
前記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む製剤。
【請求項１１２】
請求項１から１１０のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含む細胞。
【請求項１１３】
腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍細胞およびナチュラルキラー細胞を、有効量の請求項１から６１および１０７から１１０のいずれか一項に記載のタンパク質に曝露するステップを含み、前記腫瘍細胞がＢ７−Ｈ３を発現する、方法。
【請求項１１４】
腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍細胞およびナチュラルキラー細胞を、有効量の請求項１から１１０のいずれか一項に記載のタンパク質に曝露するステップを含み、前記腫瘍細胞が、Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１およびＳＬＣ１Ａ５から選択される腫瘍関連抗原を発現する、方法。
【請求項１１５】
がんを処置する方法であって、有効量の請求項１から１１０のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項１１１に記載の製剤を患者に投与するステップを含む方法。
【請求項１１６】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＢ７−Ｈ３に結合し、前記がんが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、肺がん、肝臓がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、腎がん、結腸直腸がん、胃がん、神経芽細胞腫、扁平上皮癌および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＬ１ＣＡＭに結合し、前記がんが、膀胱がん、腎がん、乳がん、子宮頸がん、肉腫、肺がん、頭頸部がん、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、卵巣がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胆管癌、結腸直腸がん、膵臓がんおよび前立腺がんからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＦＬＴ１に結合し、処置される前記がんが、腎がん、胃がん、神経膠腫、結腸直腸がん、胆道がん、前立腺がん、肉腫および乳がんからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１９】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＫＤＲに結合し、処置される前記がんが、腎がん、胃がん、神経膠腫、結腸直腸がん、胆道がん、肺がん、黒色腫、肝臓がん、肉腫、乳がん、中皮腫および甲状腺がんからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２０】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＴＮＣに結合し、処置される前記がんが、子宮頸がん、乳がん、膵臓がん、肺がん、非ホジキンリンパ腫、頭頸部がん、結腸直腸がん、食道がん、神経膠腫および前立腺がんからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２１】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＴＮＮに結合し、処置される前記がんが、子宮頸がん、乳がん、膵臓がん、肺がん、非ホジキンリンパ腫、頭頸部がん、結腸直腸がん、食道がん、神経膠腫および前立腺がんからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２２】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＣＳＰＧ４に結合し、処置される前記がんが、黒色腫、腎がん、肉腫、神経膠腫、頭頸部がん、乳がん、膀胱がん、肺がんおよび子宮頸がんからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２３】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＢＳＴ１に結合し、処置される前記がんが、急性骨髄性白血病、中皮腫、膀胱がんおよび肉腫からなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２４】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＳＥＬＰに結合し、処置される前記がんが、骨髄増殖性腫瘍、急性骨髄性白血病、乳がん、膀胱がん、甲状腺がん、腎がんおよび膵臓がんからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２５】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＣＤ２００に結合し、処置される前記がんが、乳がん、結腸直腸がん、Ｂ細胞悪性腫瘍、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、リンパ腫および中皮腫からなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２６】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＩＮＳＲに結合し、処置される前記がんが、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、乳がん、子宮内膜がん、肝臓がんおよび腎がんからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＩＴＧＡ６に結合し、処置される前記がんが、乳がん、白血病、前立腺がん、結腸直腸がん、腎がん、頭頸部がん、卵巣がん、胃がんおよび肺がんからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２８】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＭＥＬＴＦに結合し、処置される前記がんが、乳がん、肺がん、黒色腫、膀胱がん、腎がん、肉腫、頭頸部がん、中皮腫、膵臓がんからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２９】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＰＥＣＡＭ１に結合し、処置される前記がんが、固形腫瘍である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３０】
前記固形腫瘍が有意な新生血管を有する、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記タンパク質の前記第２の抗原結合部位がＳＬＣ１Ａ５に結合し、処置される前記がんが、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、腎がん、頭頸部がん、神経芽細胞腫、胃がんおよび卵巣がんからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その各々の開示全体があらゆる目的のためにこれにより参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年８月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７１６，１０６号；２０１８年８月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７１６，１０９号；２０１８年８月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７１６，１１３号の利益および優先権を主張する。
配列表
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年８月７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＤＦＹ−０５９ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、サイズが３６７，９０１バイトである。
【０００３】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６および腫瘍関連抗原（例えば、Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５）に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００４】
がんは、この疾患を処置するための文献で報告されている相当な研究努力および科学の進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんの一部には、前立腺がん、乳がん、肺がんおよび結腸直腸がんが含まれる。前立腺がんは、男性で最も一般的ながん形態である。乳がんは女性の死亡の主な原因のままである。多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫を含む血液および骨髄のがんも頻繁に診断されるがん型である。これらのがんのための現在の処置選択肢は、全ての患者に有効ではない、および／または相当な有害副作用を有する場合がある。他の種類のがんも、既存の治療選択肢を使用して処置するのが困難なままである。
【０００５】
がん免疫療法は、高度に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進することができるので、望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、腫瘍細胞およびＴ細胞に結合して、腫瘍細胞の破壊を促進する、文献に記載されているがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原およびある特定の免疫細胞に結合する抗体が文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１およびＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。
【０００６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の成分であり、循環リンパ球のおよそ１５％を構成する。ＮＫ細胞は、事実上全ての組織に浸潤し、元々、事前の感作の必要性なしに腫瘍細胞を有効に死滅させる能力によって特徴付けられた。活性化ＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と類似の手段によって−すなわち、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  ｇｒａｎｕｌｅ）を介して、ならびにデスレセプター経路を介して、標的細胞を死滅させる。活性化ＮＫ細胞はまた、ＩＦＮ−γなどの炎症性サイトカインおよび他の白血球の標的組織への動員を促進するケモカインを分泌する。
【０００７】
ＮＫ細胞は、その表面上のさまざまな活性化受容体および抑制性受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇した場合、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化を介してその活性が阻害される。あるいは、ＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇した場合、その活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、その表面上のＣＤ１６受容体を介して一部の免疫グロブリンの定常領域によっても活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感度は、刺激シグナルと抑制シグナルの合計に依存する。
【０００８】
ＣＤ２７６としても知られているＢ７−Ｈ３は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現される主要な糖タンパク質である。これは、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ４などの免疫チェックポイントと一緒に、Ｔ細胞活性の共抑制分子として作用する。Ｂ７−Ｈ３は、大部分は腫瘍および腫瘍関連細胞、例えば、肺がん、乳がん、脳がん、腎臓がんおよび前立腺がん上で発現される。Ｂ７−Ｈ３は、がん遊走、浸潤および血管新生に寄与する異なるタンパク質に広く関連しているように見える（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１７；  ６（４）：  ６６−７５参照）。
【０００９】
Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの２００〜２２０ｋＤａ膜貫通糖タンパク質であり、６つのＩｇ様ドメインおよび５つのフィブロネクチンＩＩＩ型リピート、ならびにこれに続く膜貫通領域および高度に保存された細胞質尾部で構成される。Ｌ１ＣＡＭは、密接に関連する神経細胞接着分子（ＣＡＭ）のＬ１ファミリーのプロトタイプメンバーであり、神経細胞接着および遊走で必須の役割を果たす。さらに、Ｌ１ＣＡＭは、予後不良、腫瘍進行およびリンパ節への転移を含む、ヒトがんの進行に関連することが分かっている。Ｌ１ＣＡＭは、多くのがん、例えば、膀胱がん、腎がん、乳がん、子宮頸がん、肉腫、肺がん、頭頸部がん、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、卵巣がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胆管癌、結腸直腸がん、膵臓がんおよび前立腺がんで発現される（例えば、Ａｌｔｅｖｏｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１６；  １３８：  １５６５−１５７６参照）。
【００１０】
ＦＬＴ１とも呼ばれる血管内皮成長因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂおよび胎盤成長因子（ＰＧＦ）に結合する受容体チロシンキナーゼである。ＶＥＧＦＲ１は、血管内皮細胞、胎盤栄養膜細胞および末梢血単球で発現され、血管新生および脈管形成で重要な役割を果たす。ＦＬＴ１の完全長膜貫通型受容体アイソフォームおよび短縮型可溶性アイソフォームが見つかっている。可溶性アイソフォームは、子癇前症の開始に関連している。
【００１１】
キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄに結合する受容体チロシンキナーゼである。ＫＤＲは、血管内皮細胞で発現され、ＶＥＧＦによって誘導される内皮増殖、生存、遊走、管腔形態形成および発芽で重要な役割を果たす。ＫＤＲの変異は、乳児毛細血管腫に関係している。
【００１２】
テネイシンＣ（ＴＮＣ）は、ジスルフィド連結サブユニットを有するホモ六量体構造を有する細胞外基質タンパク質である。ＴＮＣは、基質成分、可溶性因子および病原体を含む多くの細胞外結合パートナー、ならびに細胞表面受容体を有する。ＴＮＣタンパク質合成は厳密に調節されており、胚組織には広範なタンパク質分布があるが、成体組織では分布が制限される。ＴＮＣは、慢性炎症およびがんの間にも発現される。
【００１３】
テネイシンＮ（ＴＮＮ）は、ホモ六量体細胞外基質タンパク質である。ＴＮＮは、正常な成体哺乳動物組織でも脳でも検出されないが、乳房腫瘍および脳腫瘍、例えば神経膠芽腫、星細胞腫および乏突起神経膠腫で発現される。脳腫瘍では、これは血管の内皮細胞層の周りで検出される。
【００１４】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）は、ヒト悪性黒色腫細胞によって発現される膜内在性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。ＣＳＰＧ４は、その細胞外Ｎ末端を介して成長因子および細胞外基質プロテアーゼに結合する。ＣＳＰＧ４は、内皮基底膜への黒色腫細胞拡散の早期イベント中に細胞−基層相互作用の安定化で役割を果たす。
【００１５】
骨髄間質細胞抗原１（ＢＳＴ１）は、セカンドメッセンジャー環状ＡＤＰリボースおよびニコチン酸アデニンジヌクオチドリン酸を合成するためのグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー酵素である。ＢＳＴ１発現は、関節リウマチの患者に由来する骨髄間質細胞系で増強される。関節リウマチにおけるポリクローナルＢ細胞異常は、少なくとも部分的には、間質細胞集団におけるＢＳＴ１過剰発現に起因し得る。ＢＳＴ１はまた、プレＢ細胞成長を促進する。
【００１６】
セレクチンＰ（ＳＥＬＰ）は、好中球および単球上のルイス式血液型糖鎖抗原のシアル酸付加形態に結合するカルシウム依存性受容体である。ＳＥＬＰは、血小板のアルファ顆粒および内皮細胞のバイベル・パラーデ小体に貯蔵されるが、活性化内皮細胞または血小板と白血球の相互作用を媒介するために血小板活性化および脱顆粒中に形質膜に再分布する。
【００１７】
ＣＤ２００は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの２つの細胞外免疫グロブリンドメインを含有するＩ型膜糖タンパク質である。ＣＤ２００は、Ｂ細胞、Ｔ細胞のサブセット、胸腺細胞、内皮細胞およびニューロンを含むさまざまな細胞型で発現される。ＣＤ２００は、免疫抑制および抗腫瘍活性の調節で重要な役割を果たす。
【００１８】
インスリン受容体（ＩＮＳＲ）は受容体チロシンキナーゼである。ＩＮＳＲは、プレプロタンパク質として翻訳され、タンパク質分解処理されて、ヘテロ四量体受容体を形成するアルファおよびベータサブユニットを生成する。ＩＮＳＲは、肝臓、脂肪組織および骨格筋で主に発現される。ＩＮＳＲへのインスリンまたは他のリガンドの結合によって、グルコース取り込みおよび放出、ならびに炭水化物、脂質およびタンパク質の合成および貯蔵を調節するインスリンシグナル伝達経路が活性化される。
【００１９】
インテグリンサブユニットアルファ６（ＩＴＧＡ６）は、インテグリンアルファ鎖ファミリーのメンバーである。インテグリンは、細胞表面接着およびシグナル伝達で機能する、アルファ鎖およびベータ鎖で構成されるヘテロ二量体膜内在性タンパク質である。ＩＴＧＡ６は、プレプロタンパク質として翻訳され、タンパク質分解処理されて、アルファ６サブユニットを構成する軽鎖および重鎖を生成する。このサブユニットは、ベータ１またはベータ４サブユニットと会合して、ラミニンファミリーのメンバーを含む細胞外基質タンパク質と相互作用するインテグリンを形成し得る。アルファ６ベータ４インテグリンは腫瘍形成を促進し得るが、アルファ６ベータ１インテグリンはｅｒｂＢ２／ＨＥＲ２シグナル伝達を負に調節し得る。
【００２０】
メラノトランスフェリン（ＭＥＬＴＦ）は、トランスフェリンスーパーファミリーの細胞表面糖タンパク質である。ＭＥＬＴＦは、黒色腫細胞およびある特定の胎児組織で発現される。ＭＥＬＴＦは鉄に結合するが、その鉄結合活性の重要性は不明なままである。
血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ１）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面タンパク質である。ＰＥＣＡＭ１は、血小板、単球、好中球およびＴ細胞の一部の型の表面上に見られ、内皮細胞の細胞間結合の大部分を構成する。ＰＥＣＡＭ１は、白血球遊走、血管新生およびインテグリン活性化におそらく関与している。
溶質輸送体ファミリー１メンバー５（ＳＬＣ１Ａ５）は、双性イオン性アミノ酸を好む、広範な基質特異性を有するナトリウム依存性アミノ酸輸送体である。ＳＬＣ１Ａ５は、グルタミン、アスパラギンならびに分岐鎖および芳香族アミノ酸を含む全ての中性アミノ酸を基質として受け入れ、メチル化アミノ酸、アニオン性アミノ酸およびカチオン性アミノ酸を排除する。ＳＬＣ１Ａ５は、脂肪、前立腺、肺、腎臓、結腸および胎盤などの多くの組織で発現される。ＳＬＣ１Ａ５は、ＲＤ１１４／Ｄ型レトロウイルスの受容体としても作用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１３４３７１号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０９５４１２号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１７；  ６（４）：  ６６−７５
【非特許文献２】Ａｌｔｅｖｏｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１６；  １３８：  １５６５−１５７６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、１種より多くのＮＫ活性化受容体と結合することができ、ＮＫＧ２Ｄへの天然リガンドの結合を遮断し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質はヒトのＮＫ細胞を刺激することができる。一部の実施形態では、タンパク質は、ヒトならびにげっ歯類およびカニクイザルなどの他の種のＮＫ細胞を刺激することができる。本発明のさまざまな態様および実施形態を以下でさらに詳細に説明する。
【００２４】
ある特定の実施形態では、本発明は、例えば、がん細胞上のＢ７−Ｈ３、ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合して、ナチュラルキラー細胞を活性化するタンパク質（例えば、多重特異性結合タンパク質）を提供する。結合タンパク質（例えば、多重特異性結合タンパク質）は、本明細書に記載される医薬組成物および治療方法に有用である。例えば、Ｂ７−Ｈ３、ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合する抗原結合部位を含むタンパク質の結合によって、がん細胞の破壊に向けたナチュラルキラー細胞の活性が増強される。例えば、がん細胞上のＢ７−Ｈ３に結合する抗原結合部位を含むタンパク質（例えば、多重特異性結合タンパク質）の結合によって、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近づけ、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的破壊が促進される。例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる説明を以下で提供する。
【００２５】
本開示の多重特異性結合タンパク質の第１の成分は、例えば、Ｂ７−Ｈ３発現細胞に結合する。
【００２６】
本開示の多重特異性結合タンパク質の第２の成分はＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合し、該細胞は、それだけに限らないが、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋αβＴ細胞を含み得る。ＮＫＧ２Ｄに結合すると、多重特異性結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化するのを遮断し得る。
【００２７】
本開示の多重特異性結合タンパク質の第３の成分は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞および濾胞樹状細胞を含む白血球の表面上のＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。
【００２８】
本開示の一部のタンパク質は、１０ｎＭのＫＤまたはそれよりも弱い親和性でＮＫＧ２Ｄに結合する。
【００２９】
したがって、本発明の一態様は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と；腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する第２の抗原結合部位と；ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメイン、その部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを組み込むタンパク質を提供する。
【００３０】
抗原結合部位はそれぞれ、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよく（例えば、抗体のように配置される、または融合してｓｃＦｖを形成する）、または抗原結合部位の１つもしくは複数が、単一ドメイン抗体、例えばラクダ抗体のようなＶＨＨ抗体もしくは軟骨魚類で見られる抗体のようなＶＮＡＲ抗体であってもよい。
【００３１】
一態様では、本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する第２の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメイン、その部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と、腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する追加の抗原結合部位とを含む多重特異性結合タンパク質を提供する。
【００３２】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位が一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）であり、腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する第２のおよび／または追加の抗原結合部位がＦａｂ断片であるタンパク質を提供する。本開示はまた、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する第２のおよび／または追加の抗原結合部位がｓｃＦｖであるタンパク質を提供する。
【００３３】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位がＦａｂ断片であり、腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する第２の抗原結合部位がｓｃＦｖであるタンパク質を提供する。
【００３４】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位がｓｃＦｖであり、腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する第２の抗原結合部位がＦａｂ断片であるタンパク質を提供する。
【００３５】
一態様では、本発明のタンパク質は、ヒンジ配列を介して抗体定常ドメインに連結した一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態では、ヒンジはアミノ酸Ａｌａ−Ｓｅｒを含む。一部の他の実施形態では、ヒンジはアミノ酸Ａｌａ−ＳｅｒまたはまたはＧｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含む。一部の実施形態では、ヒンジはアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙをさらに含む。ｓｃＦｖは重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み得る。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＮＫＧ２Ｄ、または腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１もしくはＳＬＣ１Ａ５に結合する。ヒンジ配列は、標的抗原への結合の柔軟性を提供する。
【００３６】
一部の実施形態では、本発明のタンパク質は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片を含む第１の抗原結合部位と；（ｂ）Ｂ７−Ｈ３に結合する一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含む第２の抗原結合部位と；（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを含む。
【００３７】
ｓｃＦｖの一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と軽鎖可変ドメインのＣ１００残基との間に形成され得、アミノ酸位置はＫａｂａｔナンバリングに従って番号付けされる。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（「（Ｇ４Ｓ）４」）（配列番号１２６）のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーなどのフレキシブルリンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結している。ｓｃＦｖの一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。ｓｃＦｖの一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する。
【００３８】
一態様では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する第２の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメイン、その部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と、腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する追加の抗原結合部位とを含む上記の多重特異性結合タンパク質内で、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５および配列番号９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む。
【００３９】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、一部の実施形態では、例えば、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有する、ならびに／または配列番号１のＣＤＲ１（配列番号１０５）、ＣＤＲ２（配列番号１０６）およびＣＤＲ３（配列番号１０７）配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことによって、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。配列番号１に関連する重鎖可変ドメインをさまざまな軽鎖可変ドメインと連結して、ＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成することができる。例えば、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインが組み込まれる第１の抗原結合部位は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６および４０に関連する配列のいずれか１つから選択される軽鎖可変ドメインがさらに組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６および４０から選択される配列のいずれか１つと少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインが組み込まれる。
【００４０】
あるいは、第１の抗原結合部位は、配列番号４１に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号４２に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号４１のＣＤＲ１（配列番号４３）、ＣＤＲ２（配列番号４４）およびＣＤＲ３（配列番号４５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号４２のＣＤＲ１（配列番号４６）、ＣＤＲ２（配列番号４７）およびＣＤＲ３（配列番号４８）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４１】
他の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号４９に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号５０に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号４９のＣＤＲ１（配列番号５１）、ＣＤＲ２（配列番号５２）およびＣＤＲ３（配列番号５３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号５０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号５０のＣＤＲ１（配列番号５４）、ＣＤＲ２（配列番号５５）およびＣＤＲ３（配列番号５６）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４２】
あるいは、第１の抗原結合部位は、例えば、それぞれ、配列番号５７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列および配列番号５８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有することによって、配列番号５７に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号５８に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。
【００４３】
別の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号５９に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号６０に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号５９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号５９のＣＤＲ１（配列番号１２７）、ＣＤＲ２（配列番号１２８）およびＣＤＲ３（配列番号１２９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号６０のＣＤＲ１（配列番号１３０）、ＣＤＲ２（配列番号１３１）およびＣＤＲ３（配列番号１３２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４４】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、一部の実施形態では、配列番号６１に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号６２に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号６１のＣＤＲ１（配列番号６３または３４１）、ＣＤＲ２（配列番号６４）およびＣＤＲ３（配列番号６５または３４２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号６２のＣＤＲ１（配列番号６６）、ＣＤＲ２（配列番号６７）およびＣＤＲ３（配列番号６８）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号６９に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号７０に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号６９のＣＤＲ１（配列番号７１または３４３）、ＣＤＲ２（配列番号７２）およびＣＤＲ３（配列番号７３または３４４）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７０のＣＤＲ１（配列番号７４）、ＣＤＲ２（配列番号７５）およびＣＤＲ３（配列番号７６）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４５】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号７７に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号７８に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７７のＣＤＲ１（配列番号７９または３４５）、ＣＤＲ２（配列番号８０）およびＣＤＲ３（配列番号８１または３４６）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号７８のＣＤＲ１（配列番号８２）、ＣＤＲ２（配列番号８３）およびＣＤＲ３（配列番号８４）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４６】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号８５に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８５のＣＤＲ１（配列番号８７または３４７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）およびＣＤＲ３（配列番号８９または３４８）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）およびＣＤＲ３（配列番号９２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４７】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号３５１に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３５１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３５１のＣＤＲ１（配列番号８７または３４７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）およびＣＤＲ３（配列番号３５２または３５４）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）およびＣＤＲ３（配列番号９２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４８】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号３５３に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３５３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３５３のＣＤＲ１（配列番号８７または３４７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）およびＣＤＲ３（配列番号３５５または３８５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）およびＣＤＲ３（配列番号９２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００４９】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号３５６に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３５６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３５６のＣＤＲ１（配列番号８７または３４７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）およびＣＤＲ３（配列番号３５７または３５８）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）およびＣＤＲ３（配列番号９２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５０】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号３５９に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３５９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３５９のＣＤＲ１（配列番号８７または３４７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）およびＣＤＲ３（配列番号３６０または３６１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）およびＣＤＲ３（配列番号９２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５１】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号３６２に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３６２のＣＤＲ１（配列番号８７または３４７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）およびＣＤＲ３（配列番号３６３または３６４）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）およびＣＤＲ３（配列番号９２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５２】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号３６５に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３６５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３６５のＣＤＲ１（配列番号８７または３４７）、ＣＤＲ２（配列番号８８）およびＣＤＲ３（配列番号３６６または３６７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号８６のＣＤＲ１（配列番号９０）、ＣＤＲ２（配列番号９１）およびＣＤＲ３（配列番号９２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５３】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号９３に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号９４に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号９３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９３のＣＤＲ１（配列番号９５または３４９）、ＣＤＲ２（配列番号９６）およびＣＤＲ３（配列番号９７または３５０）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号９４のＣＤＲ１（配列番号９８）、ＣＤＲ２（配列番号９９）およびＣＤＲ３（配列番号１００）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５４】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば、それぞれ、配列番号１０１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列および配列番号１０２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有することによって、配列番号１０１に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１０２に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。一部の実施形態では、第１の抗原結合部位が、例えば、それぞれ、配列番号１０３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列および配列番号１０４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一のアミノ酸配列を有することによって、配列番号１０３に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１０４に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。
【００５５】
一部の実施形態では、Ｂ７−Ｈ３に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１０９または３８６に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１１３または３８７に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１０９もしくは３８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１０９もしくは３８６のＣＤＲ１（配列番号１１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１１）およびＣＤＲ３（配列番号１１２）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１１３もしくは３８７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１１３もしくは３８７のＣＤＲ１（配列番号１１４）、ＣＤＲ２（配列番号１１５）およびＣＤＲ３（配列番号１１６）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５６】
あるいは、Ｂ７−Ｈ３に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１１７に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１２１に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１１７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１１７のＣＤＲ１（配列番号１１８）、ＣＤＲ２（配列番号１１９）およびＣＤＲ３（配列番号１２０）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１２１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１２１のＣＤＲ１（配列番号１２２）、ＣＤＲ２（配列番号１２３）およびＣＤＲ３（配列番号１２４）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５７】
あるいは、Ｂ７−Ｈ３に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号３６９または３８８に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号３７０または３８９に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３６９もしくは３８８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３６９もしくは３８８のＣＤＲ１（配列番号３７１）、ＣＤＲ２（配列番号３７２）およびＣＤＲ３（配列番号３７３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号３７０もしくは３８９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３７０もしくは３８９のＣＤＲ１（配列番号３７４）、ＣＤＲ２（配列番号３７５）およびＣＤＲ３（配列番号３７６）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５８】
あるいは、Ｂ７−Ｈ３に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号３７７または３９０に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号３７８または３９１に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３７７もしくは３９０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３７７もしくは３９０のＣＤＲ１（配列番号３７９）、ＣＤＲ２（配列番号３８０）およびＣＤＲ３（配列番号３８１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号３７８もしくは３９１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３７８もしくは３９１のＣＤＲ１（配列番号３８２）、ＣＤＲ２（配列番号３８３）およびＣＤＲ３（配列番号３８４）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００５９】
ある特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、
（１）それぞれ、配列番号３４７、８８および３５２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（２）それぞれ、配列番号３４７、８８および３４８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（３）それぞれ、配列番号３４１、６４および３４２のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号６６、６７および６８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（４）それぞれ、配列番号３４３、７２および３４４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号７４、７５および７６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（５）それぞれ、配列番号３４５、８０および３４６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号８２、８３および８４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（６）それぞれ、配列番号８７、８８および８９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（７）それぞれ、配列番号３４９、９６および３５０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９８、９９および１００のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（８）それぞれ、配列番号３４７、８８および３５５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（９）それぞれ、配列番号３４７、８８および３５８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（１０）それぞれ、配列番号３４７、８８および３６１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（１１）それぞれ、配列番号３４７、８８および３６４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
（１２）それぞれ、配列番号３４７、８８および３６７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ、配列番号９０、９１および９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン；
を含む、ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂを含む第１の抗原結合部位と、
重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）および重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）を含む重鎖可変ドメイン、ならびに軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）および軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を含む軽鎖可変ドメインを含み、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１１０、１１１、１１２、１１４、１１５および１１６；１１８、１１９、１２０、１２２、１２３および１２４；３７１、３７２、３７３、３７４、３７５および３７６；または３７９、３８０、３８１、３８２、３８３および３８４に示される、Ｂ７−Ｈ３に結合する一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を含む第２の抗原結合部位と
を含む。
【００６０】
本開示のある特定のタンパク質は、配列番号３２９、配列番号３３３または配列番号３３５の配列を含む。
【００６１】
本開示のある特定のタンパク質は、配列番号３３０、配列番号３３４および配列番号３３６から選択される配列によって表される、抗体Ｆｃドメインに連結したｓｃＦｖを含む。
【００６２】
本開示のある特定のタンパク質は、配列番号３２９、配列番号３３３または配列番号３３５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。
【００６３】
本開示のある特定のタンパク質は、配列番号３２９、配列番号３３３または配列番号３３５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含む。
【００６４】
本開示のある特定のタンパク質は、配列番号３２９、配列番号３３３または配列番号３３５のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の配列を含む。
【００６５】
本開示のある特定のタンパク質は、配列番号３３０、配列番号３３４および配列番号３３６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。
【００６６】
本開示のある特定のタンパク質は、配列番号３３０、配列番号３３４および配列番号３３６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含む。
【００６７】
本開示のある特定のタンパク質は、配列番号３３０、配列番号３３４および配列番号３３６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の配列を含む。
【００６８】
本開示のある特定のタンパク質は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＢ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖ（配列番号３２９、配列番号３３３または配列番号３３５）（配列番号３３０、配列番号３３４および配列番号３３６によって表されるｓｃＦｖ−Ｆｃ）と；配列番号３５１を含む重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号８６）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含み、重鎖可変ドメインがＣＨ１ドメインに接続されており、ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに接続されている（重鎖部分はＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃとして表される、アミノ酸配列は配列番号３３１に示される）、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含む。
【００６９】
一部の実施形態では、Ｌ１ＣＡＭに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１３３に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１３７に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１３３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１３３のＣＤＲ１（配列番号１３４）、ＣＤＲ２（配列番号１３５）およびＣＤＲ３（配列番号１３６）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１３７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１３７のＣＤＲ１（配列番号１３８）、ＣＤＲ２（配列番号１３９）およびＣＤＲ３（配列番号１４０）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００７０】
あるいは、Ｌ１ＣＡＭに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１４１に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１４５に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１４１のＣＤＲ１（配列番号１４２）、ＣＤＲ２（配列番号１４３）およびＣＤＲ３（配列番号１４４）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１４５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１４５のＣＤＲ１（配列番号１４６）、ＣＤＲ２（配列番号１４７）およびＣＤＲ３（配列番号１４８）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００７１】
一部の実施形態では、ＦＬＴ１に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１５０に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１５４に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１５０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１５０のＣＤＲ１（配列番号１５１）、ＣＤＲ２（配列番号１５２）およびＣＤＲ３（配列番号１５３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１５４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１５４のＣＤＲ１（配列番号１５５）、ＣＤＲ２（配列番号１５６）およびＣＤＲ３（配列番号１５７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００７２】
あるいは、ＦＬＴ１に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１５８に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１６２に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１５８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１５８のＣＤＲ１（配列番号１５９）、ＣＤＲ２（配列番号１６０）およびＣＤＲ３（配列番号１６１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１６２のＣＤＲ１（配列番号１６３）、ＣＤＲ２（配列番号１６４）およびＣＤＲ３（配列番号１６５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００７３】
あるいは、ＫＤＲに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１６６に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１７０に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１６６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１６６のＣＤＲ１（配列番号１６７）、ＣＤＲ２（配列番号１６８）およびＣＤＲ３（配列番号１６９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１７０のＣＤＲ１（配列番号１７１）、ＣＤＲ２（配列番号１７２）およびＣＤＲ３（配列番号１７３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００７４】
あるいは、ＫＤＲに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１７４に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１７８に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１７４のＣＤＲ１（配列番号１７５）、ＣＤＲ２（配列番号１７６）およびＣＤＲ３（配列番号１７７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１７８のＣＤＲ１（配列番号１７９）、ＣＤＲ２（配列番号１８０）およびＣＤＲ３（配列番号１８１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００７５】
あるいは、ＴＮＣに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１８２に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１８６に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１８２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１８２のＣＤＲ１（配列番号１８３）、ＣＤＲ２（配列番号１８４）およびＣＤＲ３（配列番号１８５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１８６のＣＤＲ１（配列番号１８７）、ＣＤＲ２（配列番号１８８）およびＣＤＲ３（配列番号１８９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００７６】
あるいは、ＴＮＣに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１９０に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１９４に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９０のＣＤＲ１（配列番号１９１）、ＣＤＲ２（配列番号１９２）およびＣＤＲ３（配列番号１９３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９４のＣＤＲ１（配列番号１９５）、ＣＤＲ２（配列番号１９６）およびＣＤＲ３（配列番号１９７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００７７】
あるいは、ＣＳＰＧ４に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１９８に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２０２に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号１９８のＣＤＲ１（配列番号１９９）、ＣＤＲ２（配列番号２００）およびＣＤＲ３（配列番号２０１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２０２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２０２のＣＤＲ１（配列番号２０３）、ＣＤＲ２（配列番号２０４）およびＣＤＲ３（配列番号２０５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００７８】
あるいは、ＣＳＰＧ４に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２０６に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２１０に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２０６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２０６のＣＤＲ１（配列番号２０７）、ＣＤＲ２（配列番号２０８）およびＣＤＲ３（配列番号２０９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２１０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２１０のＣＤＲ１（配列番号２１１）、ＣＤＲ２（配列番号２１２）およびＣＤＲ３（配列番号２１３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００７９】
あるいは、ＢＳＴ１に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２１４に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２１８に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２１４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２１４のＣＤＲ１（配列番号２１５）、ＣＤＲ２（配列番号２１６）およびＣＤＲ３（配列番号２１７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２１８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２１８のＣＤＲ１（配列番号２１９）、ＣＤＲ２（配列番号２２０）およびＣＤＲ３（配列番号２２１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００８０】
あるいは、ＢＳＴ１に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２２２に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２２６に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２２２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２２２のＣＤＲ１（配列番号２２３）、ＣＤＲ２（配列番号２２４）およびＣＤＲ３（配列番号２２５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２２６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２２６のＣＤＲ１（配列番号２２７）、ＣＤＲ２（配列番号２２８）およびＣＤＲ３（配列番号２２９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００８１】
あるいは、ＳＥＬＰに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２３０に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２３４に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２３０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２３０のＣＤＲ１（配列番号２３１）、ＣＤＲ２（配列番号２３２）およびＣＤＲ３（配列番号２３３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２３４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２３４のＣＤＲ１（配列番号２３５）、ＣＤＲ２（配列番号２３６）およびＣＤＲ３（配列番号２３７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００８２】
あるいは、ＳＥＬＰに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２３８に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２４２に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２３８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２３８のＣＤＲ１（配列番号２３９）、ＣＤＲ２（配列番号２４０）およびＣＤＲ３（配列番号２４１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２４２のＣＤＲ１（配列番号２４３）、ＣＤＲ２（配列番号２４４）およびＣＤＲ３（配列番号２４５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００８３】
あるいは、ＣＤ２００に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２４６に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２５０に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２４６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２４６のＣＤＲ１（配列番号２４７）、ＣＤＲ２（配列番号２４８）およびＣＤＲ３（配列番号２４９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２５０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２５０のＣＤＲ１（配列番号２５１）、ＣＤＲ２（配列番号２５２）およびＣＤＲ３（配列番号２５３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００８４】
あるいは、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２５４に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２５８に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２５４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２５４のＣＤＲ１（配列番号２５５）、ＣＤＲ２（配列番号２５６）およびＣＤＲ３（配列番号２５７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２５８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２５８のＣＤＲ１（配列番号２５９）、ＣＤＲ２（配列番号２６０）およびＣＤＲ３（配列番号２６１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００８５】
あるいは、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２６２に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２６６に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２６２のＣＤＲ１（配列番号２６３）、ＣＤＲ２（配列番号２６４）およびＣＤＲ３（配列番号２６５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２６６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２６６のＣＤＲ１（配列番号２６７）、ＣＤＲ２（配列番号２６８）およびＣＤＲ３（配列番号２６９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００８６】
あるいは、ＩＴＧＡ６に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２７０に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２７４に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２７０のＣＤＲ１（配列番号２７１）、ＣＤＲ２（配列番号２７２）およびＣＤＲ３（配列番号２７３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２７４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２７４のＣＤＲ１（配列番号２７５）、ＣＤＲ２（配列番号２７６）およびＣＤＲ３（配列番号２７７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００８７】
あるいは、ＩＴＧＡ６に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２７８のアミノ酸配列と同一のＣＤＲ１配列、配列番号２７９のアミノ酸配列と同一のＣＤＲ２配列および配列番号２８０のアミノ酸配列と同一のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメイン配列；ならびに配列番号２８１のアミノ酸配列と同一のＣＤＲ１配列、配列番号２８２のアミノ酸配列と同一のＣＤＲ２配列および配列番号２８３のアミノ酸配列と同一のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン配列が組み込まれていてもよい。
【００８８】
あるいは、ＭＥＬＴＦに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２８４に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２８８に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２８４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２８４のＣＤＲ１（配列番号２８５）、ＣＤＲ２（配列番号２８６）およびＣＤＲ３（配列番号２８７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２８８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２８８のＣＤＲ１（配列番号２８９）、ＣＤＲ２（配列番号２９０）およびＣＤＲ３（配列番号２９１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００８９】
あるいは、ＭＥＬＴＦに結合する第２の抗原結合部位は、配列番号２９２に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号２９６に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号２９２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２９２のＣＤＲ１（配列番号２９３）、ＣＤＲ２（配列番号２９４）およびＣＤＲ３（配列番号２９５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号２９６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号２９６のＣＤＲ１（配列番号２９７）、ＣＤＲ２（配列番号２９８）およびＣＤＲ３（配列番号２９９）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００９０】
あるいは、ＳＬＣ１Ａ５に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号３００に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号３０４に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３００と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３００のＣＤＲ１（配列番号３０１）、ＣＤＲ２（配列番号３０２）およびＣＤＲ３（配列番号３０３）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号３０４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３０４のＣＤＲ１（配列番号３０５）、ＣＤＲ２（配列番号３０６）およびＣＤＲ３（配列番号３０７）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００９１】
あるいは、ＳＬＣ１Ａ５に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号３０８に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号３１２に関連する軽鎖可変ドメインが組み込まれていてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号３０８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３０８のＣＤＲ１（配列番号３０９）、ＣＤＲ２（配列番号３１０）およびＣＤＲ３（配列番号３１１）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号３１２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であってもよい、ならびに／または配列番号３１２のＣＤＲ１（配列番号３１３）、ＣＤＲ２（配列番号３１４）およびＣＤＲ３（配列番号３１５）配列と同一のアミノ酸配列が組み込まれていてもよい。
【００９２】
一部の実施形態では、第２のおよび／または追加の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインが組み込まれる。
【００９３】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの部分を組み込み、抗体Ｆｃドメインは、ヒンジおよびＣＨ２ドメイン、ならびに／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。変異を抗体定常ドメインに導入して、別の抗体定常ドメインとのヘテロ二量体化を可能にすることができる。例えば、抗体定常ドメインがヒトＩｇＧ１の定常ドメインに由来する場合、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むことができ、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｑ３５２、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置で異なり、アミノ酸位置がＥＵナンバリングに従って番号付けされる。
【００９４】
一部の実施形態では、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むことができ、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｑ３５２Ｅ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅからなる群から選択される１つまたは複数の置換によって異なり、アミノ酸位置がＥＵナンバリングに従って番号付けされる。
【００９５】
本明細書に記載されるタンパク質のいずれか１つを含有する製剤；タンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含有する細胞；およびタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も提供される。
【００９６】
本発明の別の態様は、患者のがんを処置する方法を提供する。本方法は、投与を必要とする患者に、治療有効量の本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。多重特異性結合タンパク質を使用して処置される例示的ながんとしては、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、肺がん、肝臓がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、腎がん、結腸直腸がん、胃がん、神経芽細胞腫、扁平上皮癌および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、多重特異性結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の例示的なフォーマットを示す図である。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＢ７−Ｈ３結合ドメインのいずれかを表すことができる。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよびＢ７−Ｈ３結合ドメインは共通の軽鎖を共有することができる。
【００９８】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｅは、多重特異性結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の５つの例示的なフォーマットを示す図である。図２Ａに示されるように、ＮＫＧ２Ｄ標的化ｓｃＦｖ、Ｂ７−Ｈ３標的化Ｆａｂ断片、およびヘテロ二量体化抗体定常領域を含有する抗体は、本明細書ではＦ３−ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。図２Ｂに示されるように、Ｂ７−Ｈ３標的化ｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄ標的化Ｆａｂ断片、およびＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化抗体定常領域／ドメインを含有する抗体は、本明細書ではＦ３’−ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。図２Ｃに示されるように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとＢ７−Ｈ３結合ドメインの両方がｓｃＦｖフォーマットをとることができる。図２Ｄ〜２Ｅは、Ｂ７−Ｈ３に結合する２つの抗原結合部位およびヘテロ二量体化抗体定常領域に融合したＮＫＧ２Ｄ結合部位を含む３つの抗原結合部位を有する抗体の図である。これらの抗体フォーマットは、本明細書ではＦ４−ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。図２Ｄは、２つのＢ７−Ｈ３結合部位がＦａｂフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを示しており、本明細書ではＦ４−ＴｒｉＮＫＥＴと呼ばれる。図２Ｅは、Ｂ７−Ｈ３結合部位がｓｃＦｖフォーマットであり、ＮＫＧ２Ｄ結合部位がｓｃＦｖフォーマットであることを示している。ある特定の例示的な多重特異性結合タンパク質では、抗体定常領域上のヘテロ二量体化変異が、一方の定常ドメイン（「ＣＤドメイン」）上のＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ；ならびに反対の位置の定常ドメイン上のＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔを含む（ＣＤドメイン中に三角形の鍵と鍵穴の形状として示される）。Ｆａｂ断片の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間の太い棒はジスルフィド結合を表す。
【図２−２】同上。
【００９９】
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）の結合親和性を示す線グラフである。
【０１００】
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）の結合親和性を示す線グラフである。
【０１０１】
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるマウス組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）の結合親和性を示す線グラフである。
【０１０２】
【図６】図６は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）倍率（ＦＯＢ）を示す、フローサイトメトリーによるヒトＮＫＧ２Ｄを発現しているＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）の結合を示す棒グラフである。
【０１０３】
【図７】図７は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）倍率（ＦＯＢ）を示す、フローサイトメトリーによるマウスＮＫＧ２Ｄを発現しているＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）の結合を示す棒グラフである。
【０１０４】
【図８】図８は、天然リガンドＵＬＢＰ−６と競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
【０１０５】
【図９】図９は、天然リガンドＭＩＣＡと競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
【０１０６】
【図１０】図１０は、天然リガンドＲａｅ−１デルタと競合することによる、組換えマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
【０１０７】
【図１１】図１１は、ヒトＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）によるヒトＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。
【０１０８】
【図１２】図１２は、マウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）によるマウスＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。
【０１０９】
【図１３】図１３は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【０１１０】
【図１４】図１４は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【０１１１】
【図１５】図１５は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【０１１２】
【図１６】図１６は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【０１１３】
【図１７】図１７は、腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）の細胞傷害性効果を示す棒グラフである。
【０１１４】
【図１８】図１８は、示差走査蛍光定量法によって測定されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙）の融解温度を示す棒グラフである。
【０１１５】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃは、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄ結合を使用したＮＫ細胞の相乗的活性化の棒グラフである。図１９ＡはＣＤ１０７ａのレベルを示し；図１９ＢはＩＦＮ−γのレベルを示し；図１９ＣはＣＤ１０７ａとＩＦＮ−γのレベルを示している。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。データは、５人の異なる健康なドナーを使用した５つの独立した実験を表す。
【０１１６】
【図２０】図２０は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性二重特異性抗体であるＴｒｉｏｍａｂ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。このキメラは、２つの親抗体に由来する、それぞれ１つの軽鎖および１つの重鎖を有する２つの半抗体からなる。Ｔｒｉｏｍａｂ形態は、ラット抗体の１／２およびマウス抗体の１／２を含有するヘテロ二量体構築物であり得る。
【０１１７】
【図２１】図２１は、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）（ＫＩＨ）技術を伴う、ＫｉＨ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。ＫｉＨは、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨフォーマットのＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖および両重鎖と対形成する共通の軽鎖を含有する、標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物であり得る。
【０１１８】
【図２２】図２２は、天然に存在するフレキシブルリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせて、四価ＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、抗原２を標的化する可変ドメインが抗原１を標的化するＦａｂ断片の可変ドメインのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である。構築物は通常のＦｃを含有する。
【０１１９】
【図２３】図２３は、Ｆｃに融合した、標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、直交Ｆａｂ断片界面（Ｏｒｔｈｏ−Ｆａｂ）形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。軽鎖（ＬＣ）−重鎖（ＨＣ）対形成は直交界面によって確保される。ヘテロ二量体化はＦｃ中の変異によって確保される。
【０１２０】
【図２４】図２４は、２−ｉｎ−１  ＩｇフォーマットのＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。
【０１２１】
【図２５】図２５は、Ｆｃに融合した、標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。ヘテロ二量体化はＦｃ中の静電ステアリング変異によって確保される。
【０１２２】
【図２６】図２６は、Ｆａｂアーム交換形態におけるＴｒｉＮＫＥＴを表す図である：重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子からの重鎖−軽鎖ペアと交換することによりＦａｂ断片アームを交換する抗体は、二重特異性抗体をもたらす。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。
【０１２３】
【図２７】図２７は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である、ＳＥＥＤボディ形態（ＳＥＥＤ  Ｂｏｄｙ  ｆｏｒｍ）のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。
【０１２４】
【図２８】図２８は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーが使用される、ＬｕＺ−Ｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。ＬｕＺ−Ｙ形態は、Ｆｃに融合した、標的１および２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフによって確保される。
【０１２５】
【図２９】図２９は、Ｃｏｖ−Ｘボディ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。
【０１２６】
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｂは、抗原１を標的化する１つのＦａｂ断片がカッパＬＣを含有し、抗原２を標的化する第２のＦａｂがラムダＬＣを含有する、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κλボディ形態のＴｒｉＮＫＥＴを表す図である。図３０Ａはκλボディの一形態の例示的な図であり；図３０Ｂは別のκλボディの例示的な図である。
【０１２７】
【図３１】図３１は、共にＦｃドメインに融合している、標的１に結合するＦａｂ断片および標的２に結合するｓｃＦａｂを含む、Ｏａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体構築物を表す図である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメイン中の変異によって確保される。
【０１２８】
【図３２】図３２は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されているＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂを表す図である。Ｆａｂ断片１および２は、正しい軽鎖および重鎖の対形成を確保する示差的Ｓ−Ｓ架橋を含有する。
【０１２９】
【図３３】図３３は、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを有するヘテロ二量体構築物である、Ｃｒｏｓｓ  ｍＡｂを表す図である。ＣＬおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＶＨおよびＶＬドメインが切り替えられ、例えば、ＣＨ１がＶＬとインラインで融合しており、ＣＬがＶＨとインラインで融合している。
【０１３０】
【図３４】図３４は、抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇを表す図である。構築物は野生型Ｆｃを含有する。
【０１３１】
【図３５】図３５は、Ｂ７−Ｈ３発現ヒトがん細胞系（Ａ）７８６−Ｏ、（Ｂ）ＢＴ−４７４および（Ｃ）ＨＣＣ１９５４へのＢ７−Ｈ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴおよびその親モノクローナル抗体の結合を示す線グラフである。
【０１３２】
【図３６】図３６は、特異的溶解％を測定するためのＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイによって測定されるように、ＴｒｉＮＫＥＴが親ｍＡｂよりもＢ７−Ｈ３発現がん細胞のＮＫ細胞媒介溶解を増強することを示す棒グラフである。
【０１３３】
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｂは、特異的溶解パーセントを測定するためのＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイによって測定される、Ｂ７−Ｈ３  ＴｒｉＮＫＥＴおよび親モノクローナル抗体によって媒介されるＢＴ−４７４（図３７Ａ）およびＨＣＣ１９５４（図３７Ｂ）標的細胞のＫＨＹＧ−１  ＣＤ１６Ｖ細胞殺滅を示し、ＴｒｉＮＫＥＴが親ｍＡｂよりも強力であり（低いＥＣ５０）、高い最大溶解に到達することを示す線グラフである。
【０１３４】
【図３８】図３８Ａ〜３８Ｂは、Ｂ７−Ｈ３  ＴｒｉＮＫＥＴまたは親モノクローナル抗体の存在下でのＢＴ−４７４（図３８Ａ）および７８６−Ｏ（図３８Ｂ）細胞によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す線グラフである。ＩＦＮγおよびＣＤ１０７ａダブルポジティブＮＫ細胞のパーセンテージは、それぞれの親ｍＡｂと比較して、１０μｇ／ｍｌのＢ７−Ｈ３  ＴｒｉＮＫＥＴで処理した共培養物で高く、ＴｒｉＮＫＥＴが親ｍＡｂよりもＮＫ細胞を刺激することを示している。
【発明を実施するための形態】
【０１３５】
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、Ｂ７−Ｈ３または別の腫瘍関連抗原に結合する追加の抗原結合部位をさらに含む。本発明はまた、このような多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにがんを処置するなどの目的のために、このような多重特異性タンパク質および医薬組成物を使用する治療方法を提供する。本発明のさまざまな態様を以下の節で示すが、ある特定の節に記載される本発明の態様は、いずれの特定の節にも限定されるべきではない。
【０１３６】
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語および句を以下で定義する。
【０１３７】
本明細書で使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は「１つまたは複数」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数形を含む。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に参加する免疫グロブリン分子の部分を指す。ヒト抗体では、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様な範囲は「超可変領域」と呼ばれ、これらは「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接範囲の間に挿入されている。よって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間におよびこれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、抗原結合表面を形成するように三次元空間で互いに対して配置されている。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定の動物では、抗原結合部位が単一抗体鎖によって形成されて、「単一ドメイン抗体」をもたらす。抗原結合部位は、インタクト抗体、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片、または単一ポリペプチドで重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに接続するためのペプチドリンカーを使用したｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドに存在することができる。
【０１３９】
本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」という用語は、それだけに限らないが、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含む任意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞上、または腫瘍関連血管、細胞外基質、間葉系間質もしくは免疫浸潤物などの腫瘍微小環境中で発現され得る。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に参加する免疫グロブリン分子の部分を指す。ヒト抗体では、抗原結合部位が、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様な範囲は「超可変領域」と呼ばれ、これらは「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接範囲の間に挿入されている。よって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間におよびこれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、抗原結合表面を形成するように三次元空間で互いに対して配置されている。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定の動物では、抗原結合部位が単一抗体鎖によって形成されて、「単一ドメイン抗体」をもたらす。抗原結合部位は、インタクト抗体、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片、または単一ポリペプチドで重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに接続するためのペプチドリンカーを使用したｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドに存在することができる。本明細書に開示される重鎖可変領域または軽鎖可変領域中の全てのアミノ酸位置はＫａｂａｔナンバリングに従って番号付けされる。
【０１４１】
抗原結合部位のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２，  ６６０９−６６１６  （１９７７）およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  （１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７）、およびＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６２：７３２−７４５  （１９９６）に記載される方法によって決定することができる。これらの定義の下で決定されるＣＤＲは、典型的には互いに対して比較すると、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。ある特定の実施形態では、「ＣＤＲ」という用語は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６２：７３２−７４５  （１９９６）およびＭａｒｔｉｎ  Ａ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ，  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，  ｅｄｓ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ３１，  ｐｐ．  ４２２−４３９，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ  （２００１）によって定義されるＣＤＲである。ある特定の実施形態では、「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２，  ６６０９−６６１６  （１９７７）およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  （１９９１）によって定義されるＣＤＲである。ある特定の実施形態では、抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲは、種々の規則（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）を使用して定義される。例えば、ある特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲはＭａｃＣａｌｌｕｍ（上記）に従って定義され、軽鎖ＣＤＲはＫａｂａｔ（上記）に従って定義される。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は重鎖ＣＤＲを表し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は軽鎖ＣＤＲを表す。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載される方法および組成物によって処置される生物を指す。このような生物には、好ましくは、それだけに限らないが、哺乳動物（例えば、マウス、類人猿、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、より好ましくは、ヒトが含まれる。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回または複数回の投与、塗布または投与量で投与することができ、特定の製剤に限定されることも、投与経路に限定されることも意図していない。本明細書で使用される場合、「処置する」という用語は、状態、疾患、障害などの改善をもたらす、任意の効果、例えば軽減すること、減少させること、モジュレートすること、改善することもしくは排除すること、またはその症状を改善することを含む。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性剤と、組成物をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断的または治療的使用に特に適したものにする、不活性または活性の担体の組合せを指す。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水型もしくは水／油型エマルジョンなど）、およびさまざまな種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤および保存剤を含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  ［１９７５］を参照されたい。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与すると、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残基を提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に公知のように、本発明の化合物の「塩」は、無機酸または有機酸および無機塩基または有機塩基から得られ得る。例示的な酸としては、それだけに限らないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。シュウ酸などの他の酸も、それ自体は薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびその薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に使用され得る。
【０１４７】
例示的な塩基としては、それだけに限らないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、および式ＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１〜４アルキルである）の化合物などが挙げられる。
【０１４８】
例示的な塩としては、それだけに限らないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩（ｆｌｕｃｏｈｅｐｔａｎｏａｔｅ）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられる。塩の他の例としては、Ｎａ＋、ＮＨ４＋およびＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１〜４アルキル基である）等などの適切なカチオンと複合した本発明の化合物のアニオンが挙げられる。
【０１４９】
治療的使用については、本発明の化合物の塩が、薬学的に許容されるとして企図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において用途を見出し得る。
【０１５０】
本明細書を通して、組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、さらに、列挙される成分から本質的になるまたはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびに列挙される処理ステップから本質的になるまたはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが企図される。
【０１５１】
一般に、パーセンテージを指定する組成物は、特に指定しない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の前の定義が支配する。
Ｉ．タンパク質
【０１５２】
一態様では、本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載される医薬組成物および治療方法に有用である。ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体への多重特異性結合タンパク質の結合によって、Ｂ７−Ｈ３を発現する腫瘍細胞の破壊に向けたナチュラルキラー細胞の活性が増強される。Ｂ７−Ｈ３発現細胞への多重特異性結合タンパク質の結合によって、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近づけ、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的破壊が促進される。一部の例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる説明を以下で提供する。
【０１５３】
別の態様では、本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに腫瘍関連抗原Ｌ１ＣＡＭに結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載される医薬組成物および治療方法に有用である。ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体への多重特異性結合タンパク質の結合によって、Ｌ１ＣＡＭを発現する腫瘍細胞の破壊に向けたナチュラルキラー細胞の活性が増強される。Ｌ１ＣＡＭ発現細胞への多重特異性結合タンパク質の結合によって、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近づけ、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的破壊が促進される。
【０１５４】
さらに別の態様では、本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびにＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５からなる群から選択される腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載される医薬組成物および治療方法に有用である。ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体への多重特異性結合タンパク質の結合によって、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５を発現する腫瘍細胞の破壊に向けたナチュラルキラー細胞の活性が増強される。ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５発現細胞への多重特異性結合タンパク質の結合によって、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近づけ、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的破壊が促進される。
【０１５５】
多重特異性結合タンパク質の第１の成分はＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合し、該細胞は、それだけに限らないが、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋αβＴ細胞を含み得る。ＮＫＧ２Ｄに結合すると、多重特異性結合タンパク質は、ＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合してＮＫ細胞を活性化するのを遮断し得る。
【０１５６】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の第２の成分はＢ７−Ｈ３に結合する。Ｂ７−Ｈ３発現細胞は、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、肺がん、肝臓がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、腎がん、結腸直腸がん、胃がん、神経芽細胞腫、扁平上皮癌および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で見出され得る。
【０１５７】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の第２の成分はＬ１ＣＡＭに結合する。Ｌ１ＣＡＭ発現細胞は、膀胱がん、腎がん、乳がん、子宮頸がん、肉腫、肺がん、頭頸部がん、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、卵巣がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胆管癌、結腸直腸がん、膵臓がんおよび前立腺がんで見出され得る。
【０１５８】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の第２の成分はＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する。ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５発現細胞は、白血病、例えば急性骨髄性白血病およびＴ細胞白血病で見出され得る。
【０１５９】
多重特異性結合タンパク質の第３の成分は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞および濾胞樹状細胞を含む白血球の表面上のＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。
【０１６０】
本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質はさまざまなフォーマットをとることができる。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体多重特異性抗体である（図１）。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第１の重鎖可変ドメインおよび必要に応じて、第１のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメインおよび必要に応じて、第１の軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒になって、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメインおよび必要に応じて、第２のＣＨ１重鎖ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖可変ドメインおよび必要に応じて、第２の軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒になって、Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する抗原結合部位を形成する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒になって、ＣＤ１６に結合することができる（図１）。一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖は第２の免疫グロブリン軽鎖と同一である。
【０１６１】
別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体多重特異性抗体を伴う（図２Ａおよび２Ｂ）。第１の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＢ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１もしくはＳＬＣ１Ａ５抗原に結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインで構成された一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）に融合した第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメインおよびＣＨ１重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、または腫瘍関連抗原Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１もしくはＳＬＣ１Ａ５に結合する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒になって、ＣＤ１６に結合することができる（図２Ａおよび２Ｂ）。
【０１６２】
別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖を含むヘテロ二量体多重特異性抗体を伴う（図２Ｃ）。第１の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＢ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１もしくはＳＬＣ１Ａ５抗原に結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインで構成された一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）に融合した第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、対形成し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＢ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１もしくはＳＬＣ１Ａ５に結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインで構成された一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）に融合した第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒になって、ＣＤ１６に結合することができる（図２Ｃ）。
【０１６３】
一部の実施形態では、上記の一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）はヒンジ配列を介して抗体定常ドメインに連結している。一部の実施形態では、ヒンジはアミノ酸Ａｌａ−Ｓｅｒを含む。一部の他の実施形態では、ヒンジはアミノ酸Ａｌａ−ＳｅｒおよびＴｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙを含む。ヒンジ配列は、標的抗原への結合の柔軟性を提供し、柔軟性と最適な形状寸法との間のバランスをとることができる。
【０１６４】
一部の実施形態では、上記の一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成して、ｓｃＦｖの安定性を増強する。例えば、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４残基と軽鎖可変ドメインのＣ１００残基との間に形成され得、アミノ酸位置はＫａｂａｔで番号付けされる。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインはフレキシブルリンカーを介して軽鎖可変ドメインに連結している。任意の適切なリンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）４リンカーを使用することができる。ｓｃＦｖの一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインのＮ末端に位置する。ｓｃＦｖの一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは軽鎖可変ドメインのＣ末端に位置する。
【０１６５】
本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、１つまたは複数の追加の抗原結合部位をさらに含むことができる。追加の抗原結合部位（複数可）は、必要に応じてリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ２ドメインのＮ末端または定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合し得る。ある特定の実施形態では、追加の抗原結合部位（複数可）は、必要に応じてジスルフィド安定化されている一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）の形態をとって、四価または三価多重特異性結合タンパク質をもたらす。例えば、多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位と、Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５結合部位と、腫瘍関連抗原に結合する第３の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体定常領域もしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する第４の抗原結合部位とを含む。これらの抗原結合部位のいずれか１つは、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ、例えば上記のｓｃＦｖの形態をとることができる。一部の実施形態では、第３の抗原結合部位は、Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５とは異なる腫瘍関連抗原に結合する。一部の実施形態では、第３の抗原結合部位は、Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１およびＳＬＣ１Ａ５から選択される同じ腫瘍関連抗原に結合する。一部の実施形態では、第３の抗原結合部位は、Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１およびＳＬＣ１Ａ５から選択される腫瘍関連抗原に結合する腫瘍関連抗原結合部位と同じアミノ酸配列（複数可）を有する。例示的なフォーマットを図２Ｄおよび２Ｅに示す。したがって、多重特異性結合タンパク質は、Ｂ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５の二価の結合（ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を提供することができる。多重特異性タンパク質によるＢ７−Ｈ３の二価の結合は、がん細胞表面上のＢ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５を安定化し、がん細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増強することができる。多重特異性タンパク質によるＢ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５の二価の結合は、がん細胞への多重特異性タンパク質のより強力な結合を付与し、それ���よって、がん細胞に対する、特に低レベルのＢ７−Ｈ３、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５を発現しているがん細胞に対するＮＫ細胞のより強力な細胞傷害性応答を促進することができる。
【０１６６】
多重特異性結合タンパク質は、追加のフォーマットをとることができる。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性二重特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ形態である。このキメラは、２つの親抗体に由来する、それぞれ１つの軽鎖および１つの重鎖を有する２つの半抗体からなる。
【０１６７】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＫｉＨ形態であり、ノブイントゥホール（ＫｉＨ）技術が関与する。ＫｉＨは、ＣＨ３ドメインを操作して、各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれかを作製して、ヘテロ二量体化を促進することを伴う。「ノブイントゥホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の裏にある概念は、小さな残基を嵩高い残基で置換することにより（例えば、ＥＵナンバリングのＴ３６６ＷＣＨ３Ａ）、「ノブ」を一方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に導入することであった。「ノブ」を収容するために、ノブに最も近い隣接残基を小さな残基で置き換えることにより（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶＣＨ３Ｂ）、相補的な「ホール」面が他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）上に作製された。「ホール」変異は、構造に指南されたファージライブラリークリーニングによって最適化された（Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ，  Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，  Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ，  Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．，  Ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９７）  ２７０（１）：２６−３５）。ＫｉＨ  ＦｃバリアントのＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＪＭ，  Ｕｌｔｓｃｈ  Ｍ，  Ｌｅｅ  Ｊ，  Ｔｏｎｇ  Ｒ，  Ｔａｋｅｄａ  Ｋ，  Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ  ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ＣＨ２−ＣＨ３  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （２０１４）  ４２６（９）：１９４７−５７；Ｍｉｍｏｔｏ  Ｆ，  Ｋａｄｏｎｏ  Ｓ，  Ｋａｔａｄａ  Ｈ，  Ｉｇａｗａ  Ｔ，  Ｋａｍｉｋａｗａ  Ｔ，  Ｈａｔｔｏｒｉ  Ｋ．  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ＦｃγＲｓ．  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （２０１４）  ５８（１）：１３２−８）によって、ヘテロ二量体化が、ＣＨ３ドメイン間コア界面で立体相補性によって駆動される疎水性相互作用によって熱力学的に好まれる一方で、ノブ−ノブおよびホール−ホール界面は、それぞれ、立体障害および好ましい相互作用の破壊のためにホモ二量体化を好まないことが実証された。
【０１６８】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、天然に存在するフレキシブルリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせて、四価ＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態である。
【０１６９】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交Ｆａｂ界面（Ｏｒｔｈｏ−Ｆａｂ）形態である。ｏｒｔｈｏ−Ｆａｂ  ＩｇＧ手法（Ｌｅｗｉｓ  ＳＭ，  Ｗｕ  Ｘ，  Ｐｕｓｔｉｌｎｉｋ  Ａ，  Ｓｅｒｅｎｏ  Ａ，  Ｈｕａｎｇ  Ｆ，  Ｒｉｃｋ  ＨＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｆａｂ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２０１４）  ３２（２）：１９１−８）では、構造に基づく領域設計が、他方のＦａｂ断片にいかなる変化も与えることなく、一方のＦａｂ断片のみにＬＣおよびＨＣＶＨ−ＣＨ１界面での相補的変異を導入する。
【０１７０】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２−ｉｎ−１  Ｉｇフォーマットである。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した、標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態である。ヘテロ二量体化はＦｃ中の静電ステアリング変異によって確保される。
【０１７１】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原１を標的化するＦａｂ１がカッパＬＣを含有し、抗原２を標的化する第２のＦａｂがラムダＬＣを含有する、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κλボディ形態である。図３０Ａはκλボディの一形態の例示的な図であり；図３０Ｂは別のκλボディの例示的な図である。
【０１７２】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＦａｂアーム交換形態である（重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子からの重鎖−軽鎖ペアと交換することによりＦａｂアームを交換する抗体は、二重特異性抗体をもたらす）。
【０１７３】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＳＥＥＤボディ形態である。鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）プラットフォームは、天然抗体の治療用途を拡大する機能であり、非対称および二重特異性抗体様分子を生成するために設計された。このタンパク質操作プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメイン内の免疫グロブリンの構造的に関連する配列の交換に基づく。ＳＥＥＤ設計は、ＡＧおよびＧＡ  ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を退ける一方で、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成を可能にする（Ｍｕｄａ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  （２０１１，  ２４（５）：４４７−５４））。
【０１７４】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＬｕＺ−Ｙ形態である、そこでは、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーが使用される（Ｗｒａｎｉｋ，  ＢＪ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （２０１２），  ２８７：４３３３１−９）。
【０１７５】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＣｏｖ−Ｘボディ形態である。二重特異性ＣｏｖＸボディでは、２つの異なるペプチドが分岐アゼチジノンリンカーを使用して結合されて、部位特異的に温和な条件下で足場抗体に融合されている。ファーマコフォアは機能的活性を担う一方、抗体足場は長い半減期およびＩｇ様分布を与える。ファーマコフォアは、化学的に最適化することができる、または他のファーマコフォアで置き換えて、最適化されたもしくは特有の二重特異的抗体を生成することができる（Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ  ＶＲ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  （２０１０），  １０７（５２）；２２６１１−２２６１６）。
【０１７６】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合している、標的１に結合するＦａｂ断片および標的２に結合するｓｃＦａｂを含む、Ｏａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体形態である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ中の変異によって確保される。
【０１７７】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂ形態である。Ｆａｂ断片１および２は、正しいＬＣおよびＨＣの対形成を確保する示差的Ｓ−Ｓ架橋を含有する。
【０１７８】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態である。ＣＬおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＶＨおよびＶＬドメインが切り替えられ、例えば、ＣＨ１がＶＬとインフレームで融合しており、ＣＬがＶＨとインフレームで融合している。
【０１７９】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇ形態である。構築物は野生型Ｆｃを含有する。
【０１８０】
表１は、組み合わせて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列挙している。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性が異なり得るにもかかわらず、全てヒトＮＫ細胞を活性化する。特に指示しない限り、表１に提供されるＣＤＲ配列はＫａｂａｔで決定される。
【表１−１】
2021534096.tif 000003
【表１−２】
2021534096.tif 000004
【表１−３】
2021534096.tif 000005
【表１−４】
2021534096.tif 000006
【表１−５】
2021534096.tif 000007
【表１−６】
2021534096.tif 000008
【表１−７】
2021534096.tif 000009
【表１−８】
2021534096.tif 000010
【表１−９】
2021534096.tif 000011
【表１−１０】
2021534096.tif 000012
【表１−１１】
2021534096.tif 000013
【表１−１２】
2021534096.tif 000014
【表１−１３】
2021534096.tif 000015
【０１８１】
あるいは、ＵＳ９，２７３，１３６に例示されるように、配列番号１０１によって表される重鎖可変ドメインを配列番号１０２によって表される軽鎖可変ドメインと対形成させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成することができる。
配列番号１０１
【化１】
2021534096.tif 000016
配列番号１０２
【化２】
2021534096.tif 000017
【０１８２】
あるいは、ＵＳ７，８７９，９８５に例示されるように、配列番号１０３によって表される重鎖可変ドメインを配列番号１０４によって表される軽鎖可変ドメインと対形成させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成することができる。
配列番号１０３
【化３】
2021534096.tif 000018
配列番号１０４
【化４】
2021534096.tif 000019
【０１８３】
一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに抗原Ｂ７−Ｈ３に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表２は、組み合わせて、Ｂ７−Ｈ３に結合することができる、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの一部の例示的な配列を列挙している。
【表２−１】
2021534096.tif 000020
【表２−２】
2021534096.tif 000021
【表２−３】
2021534096.tif 000022
【表２−４】
2021534096.tif 000023
【０１８４】
あるいは、配列番号１２５によって定義されるアミノ酸配列またはその成熟細胞外断片への結合についてスクリーニングすることにより、Ｂ７−Ｈ３に結合することができる新規な抗原結合部位を同定することができる。
配列番号１２５
【化５】
2021534096.tif 000024
【０１８５】
一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに抗原Ｌ１ＣＡＭに結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表３は、組み合わせて、Ｌ１ＣＡＭに結合することができる、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの一部の例示的な配列を列挙している。
【表３−１】
2021534096.tif 000025
【表３−２】
2021534096.tif 000026
【０１８６】
あるいは、配列番号１４９によって定義されるアミノ酸配列またはその成熟細胞外断片への結合についてスクリーニングすることにより、Ｌ１ＣＡＭに結合することができる新規な抗原結合部位を同定することができる。
配列番号１４９
【化６−１】
2021534096.tif 000027
【化６−２】
2021534096.tif 000028
【０１８７】
一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに抗原ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表４は、組み合わせて、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合することができる、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの一部の例示的な配列を列挙している。
【表４−１】
2021534096.tif 000029
【表４−２】
2021534096.tif 000030
【表４−３】
2021534096.tif 000031
【表４−４】
2021534096.tif 000032
【表４−５】
2021534096.tif 000033
【表４−６】
2021534096.tif 000034
【表４−７】
2021534096.tif 000035
【表４−８】
2021534096.tif 000036
【表４−９】
2021534096.tif 000037
【表４−１０】
2021534096.tif 000038
【０１８８】
あるいは、それぞれ、配列番号３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７または３２８によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることにより、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合することができる新規な抗原結合部位を同定することができる。表５は、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１およびＳＬＣ１Ａ５の例示的な配列を列挙している。一部の実施形態では、配列番号３１６〜３２８の１つまたは複数はプレプロタンパク質のアミノ酸配列である。当業者であれば、プレプロタンパク質が（例えば、シグナルペプチドを除去することおよび／または２つもしくはそれよりも多い鎖に切断することによって）哺乳動物細胞中で成熟タンパク質にプロセシングされ得ることを認識するはずである。したがって、それぞれ、配列番号３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７または３２８によって定義されるアミノ酸配列の成熟細胞外断片への結合についてスクリーニングすることにより、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合することができる新規な抗原結合部位を同定することもできる。
【表５−１】
2021534096.tif 000039
【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
2021534096.tif 000042
【表５−５】
2021534096.tif 000043
【表５−６】
2021534096.tif 000044
【表５−７】
2021534096.tif 000045
【表５−８】
2021534096.tif 000046
【表５−９】
2021534096.tif 000047
【０１８９】
Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６結合が、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用が、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５−Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７−Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７−Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９、およびＣＨ２ドメイン中の炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに主に集中している（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０６  （６７９３）：２６７−２７３参照）。公知のドメインに基づいて、例えば、ファージディスプレイライブラリーもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーを使用することにより、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強もしくは減少させるように変異を選択することができる、または相互作用の公知の三次元構造に基づいて変異を設計することができる。
【０１９０】
ヘテロ二量体抗体重鎖の組立は、同じ細胞中で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることにより達成することができるが、これは各抗体重鎖のホモ二量体の組立ならびにヘテロ二量体の組立をもたらし得る。ヘテロ二量体の優先的な組立の促進は、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０およびＵＳ１４／８３０３３６に示されるように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン中に異なる変異を組み込むことにより達成することができる。例えば、ヒトＩｇＧ１に基づくＣＨ３ドメインで、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にするアミノ酸置換の異なるペアをこれらの２つの鎖内に組み込んで、変異を導入することができる。以下に例示されるアミノ酸置換の位置は全てＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされている。
【０１９１】
１つのシナリオでは、第１のポリペプチド中のアミノ酸置換が元のアミノ酸をアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるより大きなアミノ酸で置き換え、第２のポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸置換が元のアミノ酸（複数可）をアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）またはバリン（Ｖ）から選択されるより小さなアミノ酸（複数可）で置き換えて、結果としてより大きなアミノ酸置換（突出部）がより小さなアミノ酸置換（窪み）の表面にはまる。例えば、一方のポリペプチドがＴ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方がＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる。
【０１９２】
本発明の抗体重鎖可変ドメインを、必要に応じて、ＣＨ１ドメインを含むまたは含まない、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの抗体定常領域と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列に連結することができる。一部の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域またはＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。一部の他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスまたはウマなどの別の哺乳動物の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｑ３５２、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９で、１つまたは複数の変異を定常領域に組み込むことができる。例示的な置換としては、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｑ３４７Ｒ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｌ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅが挙げられる。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込むことができる変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１および／またはＶ１７３にあり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込むことができる変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４および／またはＴ１６４にあり得る。
【０１９４】
あるいは、アミノ酸置換を、表６に示される以下の置換のセットから選択することができる。
【表６−１】
2021534096.tif 000048
【表６−２】
2021534096.tif 000049
【０１９５】
あるいは、アミノ酸置換を、表７に示される以下の置換のセットから選択することができる。
【表７】
2021534096.tif 000050
【０１９６】
あるいは、アミノ酸置換を、表８に示される以下の置換のセットから選択することができる。
【表８】
2021534096.tif 000051
【０１９７】
あるいは、各ポリペプチド鎖中の少なくとも１つのアミノ酸置換を表９から選択することができる。
【表９−１】
2021534096.tif 000052
【表９−２】
2021534096.tif 000053
【０１９８】
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換を、第１のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられている、表１０の以下の置換のセットから選択することができる。
【表１０】
2021534096.tif 000054
【０１９９】
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換を、第１のポリペプチドの例に示される位置（複数可）が任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチドの列に示される位置（複数可）が任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられている、表１１の以下のセットから選択することができる。
【表１１】
2021534096.tif 000055
【０２００】
あるいは、アミノ酸置換を表１２の以下のセットから選択することができる。
【表１２】
2021534096.tif 000056
【０２０１】
あるいは、またはさらに、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃ、および反対側のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入して、２つのポリペプチドの界面内に人工的なジスルフィド架橋を形成することにより、ヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性を増加させることができる。
【０２０２】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、位置Ｔ３６６でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２０３】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、位置Ｔ３６６でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２０４】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２０５】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２０６】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２０７】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２０８】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２０９】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２１０】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２１１】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２１２】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２１３】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２１４】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２１５】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２１６】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２１７】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２１８】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２１９】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２２０】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
【０２２１】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。
例示的な多重特異性結合タンパク質
【０２２２】
本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、その配列が以下で提供される（ＣＤＲ（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング）には下線を引く）、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−エノブリツズマブである。
【０２２３】
Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−エノブリツズマブは、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ｂ７−Ｈ３に結合する、エノブリツズマブに由来する一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）（配列番号３２９）（ｓｃＦｖ−Ｆｃポリペプチドの配列は配列番号３３０によって表される）と；重鎖可変ドメイン（配列番号３５１）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号８６）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、Ａ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインはＣＨ１ドメインに接続されており、ＣＨ１ドメインはＦｃドメインに接続されており、Ｂ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖに連結しているＦｃドメインと二量体を形成する。
【０２２４】
Ｂ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによってエノブリツズマブの軽鎖可変ドメインに接続されたエノブリツズマブの重鎖可変ドメインを含む。ｓｃＦｖ（配列番号３２９）の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインはＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨとして接続されており；ＶＬおよびＶＨは、それぞれ、Ｑ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果として１００ＶＬ−４４ＶＨ  Ｓ−Ｓ架橋を含有する。以下の配列番号３２９および配列番号３３０のアミノ酸配列中、システイン残基は太字イタリックで下線を引いており、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号１２６）は太字で下線を引いている。
エノブリツズマブｓｃＦｖ
【化７−１】
2021534096.tif 000057
【化７−２】
2021534096.tif 000058
（配列番号：３２９）
【０２２５】
配列番号３３０は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＢ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、以下の配列中で、太字で下線を引いた、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含む。このＦｃドメインは、太字イタリックで下線を引いたＳ３５４Ｃ置換をさらに含む。
エノブリツズマブｓｃＦｖ−Ｆｃ
【化８】
2021534096.tif 000059
（配列番号：３３０）
【０２２６】
配列番号３３１は、Ｆｃドメインに接続された、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号３５１）およびＣＨ１ドメインを含む、Ａ４９ＭＩに由来するＦａｂ断片の重鎖部分を表す。配列番号３３１中のＦｃドメインは、Ｂ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖ（配列番号３３０）に連結したＦｃ上のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する、ＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ置換を含む。配列番号３３１中、ＦｃドメインはＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換も含む。
Ａ４９ＭＩ  ＶＨ
【化９】
2021534096.tif 000060
（配列番号：３５１）
Ａ４９ＭＩ  ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ
【化１０−１】
2021534096.tif 000061
【化１０−２】
2021534096.tif 000062
（配列番号：３３１）
【０２２７】
配列番号３３２は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメイン（配列番号８６）および軽鎖定常ドメインを含む配列である、Ａ４９ＭＩ由来のＦａｂ断片の軽鎖部分を表す。
Ａ４９ＭＩ  ＶＬ
【化１１】
2021534096.tif 000063
（配列番号：８６）
Ａ４９ＭＩ  ＶＬ−ＣＬ
【化１２】
2021534096.tif 000064
（配列番号：３３２）
【０２２８】
ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインがＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの置換を含み、エノブリツズマブｓｃＦｖに連結したＦｃドメインがヘテロ二量体を形成するためにマッチング置換Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含むことを除いて、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−エノブリツズマブと同一である。ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインがＣＨ３ドメイン中にＳ３５４Ｃ置換を含み、エノブリツズマブｓｃＦｖに連結したＦｃドメインがジスルフィド結合を形成するためにＣＨ３ドメイン中にマッチングＹ３４９Ｃ置換を含むことを除いて、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−エノブリツズマブと同一である。
【０２２９】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、その配列が以下で提供される（ＣＤＲ（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング）には下線を引く）、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ｈｕＭ３０である。
【０２３０】
Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ｈｕＭ３０は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ｂ７−Ｈ３に結合する、ｈｕＭ３０に由来するｓｃＦｖ（配列番号３３５）（ｓｃＦｖ−Ｆｃポリペプチドの配列は配列番号３３６によって表される）と；重鎖可変ドメイン（配列番号３５１）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号８６）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、Ａ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインはＣＨ１ドメインに接続されており、ＣＨ１ドメインはＦｃドメインに接続されており、Ｂ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖに連結しているＦｃドメインと二量体を形成する。
【０２３１】
Ｂ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによってｈｕＭ３０の軽鎖可変ドメインに接続されたｈｕＭ３０の重鎖可変ドメインを含む。ｓｃＦｖ（配列番号３３５）の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインはＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨとして接続されており；ＶＬおよびＶＨは、それぞれ、Ｑ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果として１００ＶＬ−４４ＶＨ  Ｓ−Ｓ架橋を含有する。以下の配列番号３３５および配列番号３３６のアミノ酸配列中、システイン残基は太字イタリックで下線を引いており、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号１２６）は太字で下線を引いている。
ｈｕＭ３０  ｓｃＦｖ
【化１３】
2021534096.tif 000065
（配列番号：３３５）
【０２３２】
配列番号３３６は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＢ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、以下の配列中で、太字で下線を引いた、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含む。このＦｃドメインは、太字イタリックで下線を引いたＳ３５４Ｃ置換をさらに含む。
ｈｕＭ３０  ｓｃＦｖ−Ｆｃ
【化１４】
2021534096.tif 000066
（配列番号：３３６）
【０２３３】
上記の配列番号３３１は、Ｆｃドメインに接続された、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号３５１）およびＣＨ１ドメインを含む、Ａ４９ＭＩに由来するＦａｂ断片の重鎖部分を表す。配列番号３３１中のＦｃドメインは、Ｂ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖ（配列番号３３６）に連結したＦｃ上のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する、ＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ置換を含む。配列番号３３１中、ＦｃドメインはＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換も含む。
【０２３４】
上記の配列番号３３２は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメイン（配列番号８６）および軽鎖定常ドメインを含む、Ａ４９ＭＩ由来のＦａｂ断片の軽鎖部分を表す。
【０２３５】
ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインがＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの置換を含み、ｈｕＭ３０  ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインがヘテロ二量体を形成するためにマッチング置換Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含むことを除いて、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ｈｕＭ３０と同一である。ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインがＣＨ３ドメイン中にＳ３５４Ｃ置換を含み、ｈｕＭ３０  ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインがジスルフィド結合を形成するためにＣＨ３ドメイン中にマッチングＹ３４９Ｃ置換を含むことを除いて、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ｈｕＭ３０と同一である。
【０２３６】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、その配列が以下で提供される（ＣＤＲ（Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング）には下線を引く）、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ｈｕＡｂ１３ｖ１である。
【０２３７】
Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ｈｕＡｂ１３ｖ１は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、Ｂ７−Ｈ３に結合する、ｈｕＡｂ１３ｖ１に由来するｓｃＦｖ（配列番号３３３）（ｓｃＦｖ−Ｆｃポリペプチドの配列は配列番号３３４によって表される）と；重鎖可変ドメイン（配列番号３５１）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号８６）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含む、Ａ４９ＭＩに由来するＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片とを含み、重鎖可変ドメインはＣＨ１ドメインに接続されており、ＣＨ１ドメインはＦｃドメインに接続されており、Ｂ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖに連結しているＦｃドメインと二量体を形成する。
【０２３８】
Ｂ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによってｈｕＡｂ１３ｖ１の軽鎖可変ドメインに接続されたｈｕＡｂ１３ｖ１の重鎖可変ドメインを含む。ｓｃＦｖ（配列番号３３３）の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインはＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨとして接続されており；ＶＬおよびＶＨは、それぞれ、Ｇ１００ＣおよびＧ４４Ｃ置換の結果として１００ＶＬ−４４ＶＨ  Ｓ−Ｓ架橋を含有する。以下の配列番号３３３および配列番号３３４のアミノ酸配列中、システイン残基は太字イタリックで下線を引いており、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号１２６）は太字で下線を引いている。
ｈｕＡｂ１３ｖ１  ｓｃＦｖ
【化１５】
2021534096.tif 000067
（配列番号：３３３）
【０２３９】
配列番号３３４は、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結したＢ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の完全配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、以下の配列中で、太字で下線を引いた、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換を含む。このＦｃドメインは、太字イタリックで下線を引いたＳ３５４Ｃ置換をさらに含む。
ｈｕＡｂ１３ｖ１  ｓｃＦｖ−Ｆｃ
【化１６】
2021534096.tif 000068
（配列番号：３３４）
【０２４０】
上記の配列番号３３１は、Ｆｃドメインに接続された、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号３５１）およびＣＨ１ドメインを含む、Ａ４９ＭＩに由来するＦａｂ断片の重鎖部分を表す。配列番号３３１中のＦｃドメインは、Ｂ７−Ｈ３結合ｓｃＦｖ（配列番号３３４）に連結したＦｃ上のＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する、ＣＨ３ドメイン中のＹ３４９Ｃ置換を含む。配列番号３３１中、ＦｃドメインはＫ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換も含む。
【０２４１】
上記の配列番号３３２は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメイン（配列番号８６）および軽鎖定常ドメインを含む、Ｆａｂ断片の軽鎖部分を表す。
【０２４２】
ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインがＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔの置換を含み、ｈｕＡｂ１３ｖ１  ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインがヘテロ二量体を形成するためにマッチング置換Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含むことを除いて、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ｈｕＡｂ１３ｖ１と同一である。ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインがＣＨ３ドメイン中にＳ３５４Ｃ置換を含み、ｈｕＡｂ１３ｖ１  ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインがジスルフィド結合を形成するためにＣＨ３ドメイン中にマッチングＹ３４９Ｃ置換を含むことを除いて、Ａ４９ＭＩ−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ｈｕＡｂ１３ｖ１と同一である。
【０２４３】
上記の多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができる。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベクターにクローニングすることができ；第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ；免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ；第１、第２および第３の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定的にトランスフェクトして、多量体タンパク質を生成することができる。
【０２４４】
多重特異性タンパク質の最高収量を達成するために、異なる比の第１、第２および第３の発現ベクターを調査して、宿主細胞へのトランスフェクションのための最適な比を決定することができる。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当技術分野で公知の方法を使用して、単一クローンを細胞バンク生成のために単離することができる。
【０２４５】
クローンを、バイオリアクタースケールアップおよび多重特異性タンパク質の維持された発現に適した条件下で培養することができる。遠心分離、深層濾過、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結−解凍、アフィニティ精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーを含む当技術分野で公知の方法を使用して、多重特異性タンパク質を単離および精製することができる。
ＩＩ．多重特異性タンパク質の特徴
【０２４６】
本明細書に記載される多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位に結合する抗原結合部位と、Ｂ７−Ｈ３に結合する抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する抗原結合部位とを含有する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴフォーマットで例示されるように、Ｂ７−Ｈ３に結合する追加の抗原結合部位を含有する。
【０２４７】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するＢ７−Ｈ３モノクローナル抗体、すなわち、多重特異性タンパク質に組み込まれるものと同じＢ７−Ｈ３結合部位を含有するモノクローナル抗体と類似の熱安定性を示す。
【０２４８】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＮＫ細胞などのＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６を発現している細胞とＢ７−Ｈ３を発現している腫瘍細胞に同時に結合する。ＮＫ細胞への多重特異性タンパク質の結合によって、腫瘍細胞の破壊に向けたＮＫ細胞の活性が増強され得る。
【０２４９】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するＢ７−Ｈ３モノクローナル抗体（すなわち、多重特異性タンパク質に組み込まれるものと同じＢ７−Ｈ３結合部位を含有するモノクローナル抗体）と類似の親和性でＢ７−Ｈ３に結合する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するＢ７−Ｈ３モノクローナル抗体よりも、Ｂ７−Ｈ３を発現している腫瘍細胞の殺滅において有効である。
【０２５０】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、Ｂ７−Ｈ３を発現している細胞と共培養すると、初代ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞活性化は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ−γサイトカイン産生の増加によって示される。さらに、対応するＢ７−Ｈ３モノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、Ｂ７−Ｈ３を発現している細胞の存在下で、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示すことができる。
【０２５１】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、Ｂ７−Ｈ３を発現している細胞と共培養すると、静止およびＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する。
【０２５２】
一部の実施形態では、Ｂ７−Ｈ３に結合する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、中レベルおよび低レベルのＢ７−Ｈ３を発現する腫瘍細胞の標的化において利点を提供する。
【０２５３】
一部の実施形態では、ＴｒｉＮＫＥＴの二価Ｆ４フォーマット（すなわち、ＴｒｉＮＫＥＴは、Ｂ７−Ｈ３に結合する追加の抗原結合部位を含む）は、ＴｒｉＮＫＥＴがＢ７−Ｈ３に結合する結合活性を改善し、事実上、腫瘍細胞表面上の高レベルのＢ７−Ｈ３の発現および維持を安定化する。一部の実施形態では、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴは、対応するＦ３−ＴｒｉＮＫＥＴまたはＦ３’−ＴｒｉＮＫＥＴよりも強力なＢ７−Ｈ３発現腫瘍細胞の殺滅を媒介する。
【０２５４】
一部の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位に結合する抗原結合部位と、Ｌ１ＣＡＭに結合する抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその部分、またはＣＤ１６に結合する抗原結合部位とを含有する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴフォーマットで例示されるように、Ｌ１ＣＡＭに結合する追加の抗原結合部位を含有する。
【０２５５】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するＬ１ＣＡＭモノクローナル抗体、すなわち、多重特異性タンパク質に組み込まれるものと同じＬ１ＣＡＭ結合部位を含有するモノクローナル抗体と類似の熱安定性を示す。
【０２５６】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＮＫ細胞などのＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６を発現している細胞とＬ１ＣＡＭを発現している腫瘍細胞に同時に結合する。ＮＫ細胞への多重特異性タンパク質の結合によって、腫瘍細胞の破壊に向けたＮＫ細胞の活性が増強され得る。
【０２５７】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するＬ１ＣＡＭモノクローナル抗体（すなわち、多重特異性タンパク質に組み込まれるものと同じＬ１ＣＡＭ結合部位を含有するモノクローナル抗体）と類似の親和性でＬ１ＣＡＭに結合する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するＬ１ＣＡＭモノクローナル抗体よりも、Ｌ１ＣＡＭを発現している腫瘍細胞の殺滅において有効である。
【０２５８】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、Ｌ１ＣＡＭを発現している細胞と共培養すると、初代ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞活性化は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ−γサイトカイン産生の増加によって示される。さらに、対応するＬ１ＣＡＭモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、Ｌ１ＣＡＭを発現している細胞の存在下で、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示すことができる。
【０２５９】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、Ｌ１ＣＡＭを発現している細胞と共培養すると、静止およびＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する。
【０２６０】
一部の実施形態では、Ｌ１ＣＡＭに結合する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、中レベルおよび低レベルのＬ１ＣＡＭを発現する腫瘍細胞の標的化において利点を提供する。
【０２６１】
一部の実施形態では、ＴｒｉＮＫＥＴの二価Ｆ４フォーマット（すなわち、ＴｒｉＮＫＥＴがＬ１ＣＡＭに結合する追加の抗原結合部位を含む）は、ＴｒｉＮＫＥＴがＬ１ＣＡＭに結合する結合活性を改善し、事実上、腫瘍細胞表面上の高レベルのＬ１ＣＡＭの発現および維持を安定化する。一部の実施形態では、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴは、対応するＦ３−ＴｒｉＮＫＥＴまたはＦ３’−ＴｒｉＮＫＥＴよりも強力なＬ１ＣＡＭ発現腫瘍細胞の殺滅を媒介する。
【０２６２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位、ＣＤ１６結合部位、およびＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５結合部位を含む。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＮＫ細胞などのＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６を発現している細胞とＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５を発現している腫瘍細胞に同時に結合する。ＮＫ細胞への多重特異性タンパク質の結合によって、腫瘍細胞の破壊に向けたＮＫ細胞の活性が増強され得る。
【０２６３】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５モノクローナル抗体（すなわち、多重特異性タンパク質に組み込まれるものと同じ抗原結合部位を含有するモノクローナル抗体）と類似の親和性でＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５モノクローナル抗体よりも、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５を発現している腫瘍細胞の殺滅において有効である。
【０２６４】
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位およびＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５の結合部位を含む、本明細書に記載される多重特異性タンパク質は、それぞれ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５を発現している細胞と共培養すると、初代ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞活性化は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ−γサイトカイン産生の増加によって示される。さらに、対応するＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５モノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、それぞれ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５を発現している細胞の存在下で、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示すことができる。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位およびＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５の結合部位を含む、本明細書に記載される多重特異性タンパク質は、それぞれ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５を発現している細胞と共培養された、静止およびＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する。
【０２６６】
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５に結合する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、それぞれ、中レベルおよび低レベルのＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５を発現する腫瘍細胞の標的化において利点を提供する。
ＩＩＩ．治療用途
【０２６７】
本発明は、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質および／または本明細書に記載される医薬組成物を使用して、がんを処置する方法を提供する。本方法を使用して、Ｂ７−Ｈ３を発現しているさまざまながんを処置することができる。一部の実施形態では、がんは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、肺がん、肝臓がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、腎がん、結腸直腸がん、胃がん、神経芽細胞腫、扁平上皮癌または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【０２６８】
一部の他の実施形態では、処置されるがんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病または中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞性リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫または末梢性Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リンパ腫である。
【０２６９】
本発明は、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質および／または本明細書に記載される医薬組成物を使用して、がんを処置する方法を提供する。本方法を使用して、Ｌ１ＣＡＭを発現しているさまざまながんを処置することができる。一部の実施形態では、がんは、膀胱がん、腎がん、乳がん、子宮頸がん、肉腫、肺がん、頭頸部がん、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、卵巣がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胆管癌、結腸直腸がん、膵臓がんまたは前立腺がんである。
【０２７０】
本発明は、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質および／または本明細書に記載される医薬組成物を使用して、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質および／または本明細書に記載される医薬組成物を使用して、がんおよび／または新生血管を処置する方法を提供する。本方法を使用して、（例えば、腫瘍細胞および／または新生血管により）ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５を発現しているさまざまながんを処置することができる。
【０２７１】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＦＬＴ１標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＦＬＴ１標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＦＬＴ１標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、腎がん、胃がん、神経膠腫、結腸直腸がん、胆道がん、前立腺がん、肉腫および乳がんが挙げられる。
【０２７２】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＫＤＲ標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＫＤＲ標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＫＤＲ標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、腎がん、胃がん、神経膠腫、結腸直腸がん、胆道がん、肺がん、黒色腫、肝臓がん、肉腫、乳がん、中皮腫および甲状腺がんが挙げられる。
【０２７３】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＴＮＣ標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＴＮＣ標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＴＮＣ標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、子宮頸がん、乳がん、膵臓がん、肺がん、非ホジキンリンパ腫、頭頸部がん、結腸直腸がん、食道がん、神経膠腫および前立腺がんが挙げられる。
【０２７４】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＴＮＮ標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＴＮＮ標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＴＮＮ標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、子宮頸がん、乳がん、膵臓がん、肺がん、非ホジキンリンパ腫、頭頸部がん、結腸直腸がん、食道がん、神経膠腫および前立腺がんが挙げられる。
【０２７５】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＣＳＰＧ４標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＣＳＰＧ４標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＣＳＰＧ４標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、黒色腫、腎がん、肉腫、神経膠腫、頭頸部がん、乳がん、膀胱がん、肺がんおよび子宮頸がんが挙げられる。
【０２７６】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＢＳＴ１標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＢＳＴ１標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＢＳＴ１標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、急性骨髄性白血病、中皮腫、膀胱がんおよび肉腫が挙げられる。
【０２７７】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＳＥＬＰ標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＳＥＬＰ標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＳＥＬＰ標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、骨髄増殖性腫瘍、急性骨髄性白血病、乳がん、膀胱がん、甲状腺がん、腎がんおよび膵臓がんが挙げられる。
【０２７８】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＣＤ２００標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＣＤ２００標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＣＤ２００標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、乳がん、結腸直腸がん、Ｂ細胞悪性腫瘍、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、リンパ腫および中皮腫が挙げられる。
【０２７９】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＩＮＳＲ標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＩＮＳＲ標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＩＮＳＲ標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、乳がん、前立腺がん、子宮内膜がん、肝臓がんおよび腎がんが挙げられる。
【０２８０】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＩＴＧＡ６標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＩＴＧＡ６標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＩＴＧＡ６標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、乳がん、白血病、前立腺がん、結腸直腸がん、腎がん、頭頸部がん、卵巣がん、胃がんおよび肺がんが挙げられる。
【０２８１】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＭＥＬＴＦ標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＭＥＬＴＦ標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＭＥＬＴＦ標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、乳がん、肺がん、黒色腫、膀胱がん、腎がん、肉腫、頭頸部がん、中皮腫、膵臓がんが挙げられる。
【０２８２】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＰＥＣＡＭ１標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＰＥＣＡＭ１標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＰＥＣＡＭ１標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、固形腫瘍が挙げられる。一部の実施形態では、これらの固形腫瘍は、有意な新生血管に関連し、例えば、膵臓がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、神経膠芽腫および結腸直腸がんである。
【０２８３】
一部の実施形態では、本方法は、投与を必要とする患者に、ＳＬＣ１Ａ５標的化多重特異性結合タンパク質を投与するステップを含む。本明細書に開示される任意のＳＬＣ１Ａ５標的化多重特異性結合タンパク質を本方法に使用することができる。ＳＬＣ１Ａ５標的化多重特異性結合タンパク質によって処置される例示的ながんとしては、それだけに限らないが、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、腎がん、頭頸部がん、神経芽細胞腫、胃がんおよび卵巣がんが挙げられる。
【０２８４】
一部の実施形態では、がんは固形腫瘍である。一部の実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、食道がん、膀胱がんまたは胃がん、唾液腺導管癌、肺腺癌または子宮がんの攻撃的形態、例えば子宮漿液性子宮内膜癌である。一部の他の実施形態では、がんは、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、白血病、肺がん、肝臓がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、直腸がん、腎がん、胃がん、精巣がんまたは子宮がんである。さらに他の実施形態では、がんは、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん（ｂｉｌｉａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、末端黒子型黒色腫、日光角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆道がん（ｂｉｌｉａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫（ｃｈｏｎｄｏｓａｒｃｏｍａ）、脈絡叢乳頭腫／癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器系がん、十二指腸がん、内分泌系がん、卵黄嚢腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼と眼窩のがん、女性性器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、胃幽門部がん、胃底部がん、ガストリノーマ、神経膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓がん、血管芽細胞腫（ｈｅｍａｎｇｉｂｌａｓｔｏｍａ）、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸がん、インスリノーマ、上皮内腫瘍、上皮間扁平上皮腫瘍（ｉｎｔｅｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、肝内胆管がん、浸潤性扁平上皮癌、空腸がん、関節がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、リンパ腫、男性性器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽腫、髄上皮腫、髄膜がん、中皮がん、転移性癌、口腔がん、粘液性類表皮癌、多発性骨髄腫、筋がん、鼻道がん、神経系がん、神経上皮腺癌、結節型黒色腫、非上皮性皮膚がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起神経膠がん（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔がん、骨肉腫、乳頭状漿液性腺癌、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸がん、腎細胞癌、呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔がん、皮膚がん、小細胞癌、小腸がん、平滑筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁平上皮癌、横紋筋がん、中皮下がん、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌がん、未分化癌、尿管がん、尿道がん（ｕｒｅｔｈｒａ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸がん、子宮体がん、ブドウ膜黒色腫、膣がん、疣状癌、ビポーマ、外陰がん、高分化癌またはウィルムス腫瘍である。
【０２８５】
一部の実施形態では、がんは、白血病、例えば急性骨髄性白血病、Ｔ細胞白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病または有毛細胞白血病である。一部の他の実施形態では、処置されるがんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病または中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞性リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫または末梢性Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リンパ腫である。
ＩＶ．併用療法
【０２８６】
本発明の別の態様は併用療法を提供する。本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、がんを処置するための追加の治療剤と組み合わせて使用することができる。
【０２８７】
がんの処置で併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤としては、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、サイマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−２アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、コロニー刺激因子−１、コロニー刺激因子−２、デニロイキン・ジフチトクス、インターロイキン−２、黄体ホルモン放出因子、およびその同族受容体に対する示差的結合、または増加もしくは減少した血清半減期を示し得る上記薬剤のバリエーションが挙げられる。
【０２８８】
がんの処置で併用療法の一部として使用され得る薬剤の追加のクラスは免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７−Ｈ４、（ｖｉ）ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＴＮＣ、ＴＮＮ、ＣＳＰＧ４、ＢＳＴ１、ＳＥＬＰ、ＣＤ２００、ＩＮＳＲ（ＨＨＦ５）、ＩＴＧＡ６、ＭＥＬＴＦ、ＰＥＣＡＭ１またはＳＬＣ１Ａ５、（ｖｉｉ）Ｂ７−Ｈ３および（ｖｉｉｉ）ＴＩＭ３の１つまたは複数を阻害する薬剤が挙げられる。ＣＴＬＡ４阻害剤であるイピリムマブは、黒色腫の処置について米国食品医薬品局によって承認されている。
【０２８９】
がんの処置で併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的化するモノクローナル抗体剤（例えば、ハーセプチン）および非細胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。
【０２９０】
抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトンチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫとｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２−クロロ−デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１とＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ−ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤およびＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦから選択されるサイトカインが含まれる。
【０２９１】
本発明のタンパク質を、原発巣の外科的除去の補助として使用することもできる。
【０２９２】
多重特異性結合タンパク質および追加の治療剤の量ならびに相対的な投与のタイミングは、所望の組合せ治療効果を達成するために選択され得る。例えば、併用療法を、このような投与を必要とする患者に投与する場合、組合せの治療剤、または治療剤を含む１つまたは複数の医薬組成物は、例えば、逐次的に、併せて、一緒に、同時になどの任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、追加の治療剤（複数可）がその予防的もしくは治療的効果を発揮する時間の間に投与され得る、または逆もまた同様である。
Ｖ．医薬組成物
【０２９３】
本開示はまた、治療有効量の本明細書に記載されるタンパク質を含有する医薬組成物を特徴とする。組成物は、さまざまな薬物送達システムに使用するために製剤化することができる。１つまたは複数の生理学的に許容される賦形剤または担体を適切な製剤化のために組成物に含めることもできる。本開示で使用するための適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  １９８５に見出される。薬物送達のための方法の簡潔な概要については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，  １９９０）を参照されたい。
【０２９４】
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペンまたはシリンジに含有され得る。ある特定の実施形態では、バッグはチューブおよび／または針を含むチャネルに接続され得る。ある特定の実施形態では、製剤は凍結乾燥製剤または液体製剤であり得る。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライ（凍結乾燥）され得、約１２〜６０個のバイアルに含有され得る。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライされ得、４５ｍｇのフリーズドライ製剤は１個のバイアルに含有され得る。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ〜約１００ｍｇのフリーズドライ製剤は１個のバイアルに含有され得る。ある特定の実施形態では、１２、２７または４５個のバイアルのフリーズドライ製剤を合わせて、静脈内薬物製剤中の治療用量のタンパク質を得る。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であり得、約２５０ｍｇ／バイアル〜約１０００ｍｇ／バイアルとして保管され得る。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であり得、約６００ｍｇ／バイアルとして保管され得る。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であり得、約２５０ｍｇ／バイアルとして保管され得る。
【０２９５】
タンパク質は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療有効量のタンパク質を含む液体水性医薬製剤で存在することができる。
【０２９６】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得る、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装され得る、または凍結乾燥され得、凍結乾燥調製物は投与前に無菌水性担体と合わせられる。調製物のｐＨは、典型的には３〜１１の間、より好ましくは５〜９の間または６〜８の間、最も好ましくは７〜８の間、例えば７〜７．５となる。固体形態の得られた組成物は、各々が一定量の上記の１種または複数種の薬剤を含有する、複数の単回投与単位に包装され得る。固体形態の組成物はまた、柔軟な量で容器に包装することもできる。
【０２９７】
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示のタンパク質を、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水および水酸化ナトリウムと組み合わせて含む、貯蔵寿命が延長された製剤を提供する。
【０２９８】
ある特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本発明のバッファーは、約４〜約８、例えば約４．５〜約６．０、もしくは約４．８〜約５．５の範囲のｐＨを有し得る、または約５．０〜約５．２のｐＨを有し得る。上に列挙されるｐＨまでの中間の範囲も本開示の一部であることが意図される。例えば、上限および／または下限として上に列挙される値のいずれかの組合せを使用した値の範囲が含まれることが意図される。ｐＨをこの範囲内に制御するバッファーの例としては、酢酸バッファー（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸バッファー（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸バッファー、ヒスチジンバッファー、クエン酸バッファーおよび他の有機酸バッファーが挙げられる。
【０２９９】
ある特定の実施形態では、製剤は、ｐＨを約４〜約８の範囲に維持するためにクエン酸塩およびリン酸塩を含有する緩衝液系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５〜約６．０、または約ｐＨ４．８〜約５．５、または約５．０〜約５．２のｐＨ範囲であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物および／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液系は、約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６）および約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液系は、１〜１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、１．２５〜１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７〜１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物および６．０〜６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは水酸化ナトリウムで調整される。
【０３００】
等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）として作用し、抗体を安定化し得るポリオールを製剤に含めてもよい。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変えることができる量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は等張性であり得る。添加されるポリオールの量をポリオールの分子量に関して変化させてもよい。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、少量の単糖（例えば、マンニトール）が添加され得る。ある特定の実施形態では、等張化剤として製剤に使用され得るポリオールはマンニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトール濃度は約５〜約２０ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約７．５〜１５ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１０〜１４ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１２ｍｇ／ｍＬであり得る。ある特定の実施形態では、ポリオールであるソルビトールが製剤に含まれ得る。
【０３０１】
界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）または界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）を製剤に添加してもよい。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０等）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。添加される界面活性剤の量は、製剤化抗体の凝集を減少させる、および／または製剤中の微粒子の形成を最小化する、および／または吸着を減少させるようなものとする。ある特定の実施形態では、製剤はポリソルベートである界面活性剤を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は界面活性剤ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）  ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを記載するために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ，  Ｌｅｘｉｋｏｎ  ｄｅｒ  Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ，  Ｅｄｉｔｉｏ  Ｃａｎｔｏｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，  ４ｔｈ  ｅｄｉ．，  １９９６参照）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート８０を含有し得る。ある特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加され得る。
【０３０２】
実施形態では、本開示のタンパク質産物は液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉じられ、アルミニウム圧着シールクロージャーで密封されたＵＳＰ／Ｐｈ  Ｅｕｒ  Ｉ型５０Ｒバイアル中１０ｍｇ／ｍＬ濃度で提供され得る。栓は、ＵＳＰおよびＰｈ  Ｅｕｒを遵守したエラストマー製であり得る。ある特定の実施形態では、バイアルに、６０ｍＬの抽出可能な体積を可能にするために、６１．２ｍＬのタンパク質産物溶液が充填され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は０．９％食塩溶液で希釈され得る。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定化レベルの糖と組み合わせた１０ｍｇ／ｍＬ濃度溶液として調製され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は水性担体中で調製され得る。ある特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくないまたは不適切な粘度をもたらし得る量以下の量で添加され得る。ある特定の実施形態では、糖は二糖、例えばスクロースであり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、緩衝剤、界面活性剤および保存剤の１つまたは複数も含み得る。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって調節され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
【０３０５】
凝集に加えて、脱アミドが、発酵、収集／細胞清澄化、精製、原体／医薬品貯蔵中、および試料分析中に起こり得る、ペプチドおよびタンパク質の一般的な産物バリアントである。脱アミドは、タンパク質からＮＨ３が失われて、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成することである。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解によって、１８ダルトンの質量増加がもたらされる。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性のために困難である。よって、脱アミドは、典型的には１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミドは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸をもたらす。脱アミドの速度に影響を及ぼすパラメーターには、ｐＨ、温度、溶媒の誘電率、イオン強度、一次配列、局所的ポリペプチドコンフォメーションおよび三次構造が含まれる。ペプチド鎖中のＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は脱アミド速度に影響を及ぼす。タンパク質配列中のＡｓｎに続くＧｌｙおよびＳｅｒは脱アミドに対するより高い感受性をもたらす。
【０３０６】
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミドを防ぐためのｐＨおよび湿度の条件下で保存され得る。
【０３０７】
本明細書の目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与にとって安全で非毒性であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０３０８】
保存剤を必要に応じて本明細書の製剤に添加して細菌作用を減少させてもよい。保存剤の添加は、例えば、マルチユース（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。
【０３０９】
静脈内（ＩＶ）製剤は、特定の例で、例えば、患者がＩＶ経路を介して全ての薬物を受けて移植後に入院している場合に、好ましい投与経路であり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈される。ある特定の実施形態では、注射用希釈医薬品は等張性であり、静脈内注入による投与に適している。
【０３１０】
ある特定の実施形態では、塩またはバッファー成分は１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加され得る。塩および／またはバッファーは、薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いてさまざまな公知の酸（無機および有機）から得られる。ある特定の実施形態では、バッファーはリン酸バッファーであり得る。ある特定の実施形態では、バッファーは、グリシン酸バッファー、炭酸バッファー、クエン酸バッファーであり得、この場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして働き得る。
【０３１１】
保存剤を必要に応じて本明細書の製剤に添加して、細菌作用を減少させてもよい。保存剤の添加は、例えば、マルチユース（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。
【０３１２】
本明細書の目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与にとって安全で非毒性であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０３１３】
本開示のタンパク質は、タンパク質およびリオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む凍結乾燥製剤で存在し得る。リオプロテクタントは糖、例えば二糖であり得る。ある特定の実施形態では、リオプロテクタントはスクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、増量剤および／または保存剤の１つまたは複数を含み得る。
【０３１４】
凍結乾燥医薬品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質のスクロースまたはマルトースに対する重量比は１：２〜１：５であり得る。
【０３１５】
ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは、凍結乾燥前に、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって調節され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
【０３１６】
凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは６〜８の間に調整され得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥医薬品のためのｐＨ範囲は７〜８であり得る。
【０３１７】
ある特定の実施形態では、塩またはバッファー成分は１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加され得る。塩および／またはバッファーは、薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いてさまざまな公知の酸（無機および有機）から得られる。ある特定の実施形態では、バッファーはリン酸バッファーであり得る。ある特定の実施形態では、バッファーは、グリシン酸バッファー、炭酸バッファー、クエン酸バッファーであり得、この場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして働き得る。
【０３１８】
ある特定の実施形態では、「増量剤」が添加され得る。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に嵩（ｍａｓｓ）を加え、凍結乾燥ケークの物理構造に寄与する（例えば、開孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケークの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤はこのような増量剤を含有し得る。
【０３１９】
保存剤を必要に応じて本明細書の製剤に添加して、細菌作用を減少させてもよい。保存剤の添加は、例えば、マルチユース（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。
【０３２０】
ある特定の実施形態では、凍結乾燥医薬品は、水性担体で構成され得る。本明細書の目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与にとって安全で非毒性であり）、凍結乾燥後の、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な希釈剤には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、滅菌食塩溶液、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０３２１】
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥医薬品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのいずれかで復元される。復元中、凍結乾燥粉末が溶液に溶解する。
【０３２２】
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質産物は、約４．５ｍＬの注射用水に構成され、０．９％食塩溶液（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。
【０３２３】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性となることなく、特定の患者、組成物および投与様式にとって所望の治療反応を達成するのに有効な有効成分の量を得るように変化させることができる。
【０３２４】
具体的な用量は、各患者に均一な用量、例えば、５０〜５０００ｍｇのタンパク質であり得る。あるいは、患者の用量を、患者のおおよその体重または表面積に適合させることができる。適切な投与量の決定における他の因子には、処置または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および健康状態が含まれ得る。処置のための適切な投与量を決定するのに必要な計算のさらなる改良は、特に投与量情報および本明細書に開示されるアッセイに照らして、当業者によって日常的に行われる。投与量はまた、適切な用量−反応データと合わせて使用される投与量を決定するための公知のアッセイの使用を通して決定することもできる。個々の患者の投与量は、疾患の進行を監視しながら調整することができる。患者における標的化可能な構築物または複合体の血中レベルを測定して、有効濃度に達するまたはこれを維持するために投与量を調整する必要があるかどうかを確かめることができる。薬理ゲノミクスを使用して、どの標的化可能な構築物および／または複合体、ならびにその投与量が所与の個体にとって十中八九有効であるかを決定することができる（Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３０８：  ４３−５３，  ２００１；  Ｓｔｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３０８：  ３３−４１，  ２００１）。
【０３２５】
一般に、体重に基づく投与量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ、例えば約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０３２６】
用量は、毎日、毎週、毎月もしくは毎年１回もしくは複数回、またはさらには２〜２０年毎に１回で与えられ得る。当業者であれば、測定された滞留時間および体液または組織中の標的化可能な構築物または複合体の濃度に基づいて、投与の反復率を容易に推定することができる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内、カテーテルを通した灌流によるまたは直接病巣内注射によることができる。これは、毎日１回または複数回、毎週１回または複数回、毎月１回または複数回、および毎年１回または複数回投与され得る。
【０３２７】
上記の説明は、本発明の複数の態様および実施形態を説明している。本出願は、態様および実施形態の全ての組合せおよび並べ替えを具体的に企図する。
【実施例】
【０３２８】
ここで一般的に説明されている本発明は、本発明のある特定の態様および実施形態の例示目的でのみ含まれ、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。
（実施例１）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄに結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは精製組換えＮＫＧ２Ｄに結合する
【０３２９】
ヒト、マウスまたはカニクイザルＮＫＧ２Ｄ外部ドメインの核酸配列を、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインをコードする核酸配列と融合し、哺乳動物細胞に導入して発現させた。精製後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させた。非特異的結合を防止するためにウェルをウシ血清アルブミンでブロッキングした後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを用量設定し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質を予め吸着させたウェルに添加した。西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた、ヒトカッパ軽鎖を特異的に認識してＦｃ交差反応性を回避する二次抗体を使用して、一次抗体結合を検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼの基質である、３，３’，５，５’ーテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェルに添加して結合シグナルを可視化し、その吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローン、アイソタイプ対照または陽性対照（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５）を各ウェルに添加した。
【０３３０】
アイソタイプ対照は組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への最小の結合を示した一方、陽性対照は組換え抗原に最も強力に結合した。全てのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、クローン間で異なる親和性であるが、ヒト、マウスおよびカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質にわたって結合を示した。概して、各抗ＮＫＧ２Ｄクローンは、類似の親和性でヒト（図３）およびカニクイザル（図４）組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに結合したが、マウス（図５）組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃには低い親和性で結合した。
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄを発現している細胞に結合する
【０３３１】
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞系を操作して、ヒトまたはマウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現させた。ＮＫＧ２Ｄ結合クローン、アイソタイプ対照または陽性対照を１００ｎＭ濃度で使用して、ＥＬ４細胞上で発現された細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色した。フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して抗体結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、親ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を計算した。
【０３３２】
全てのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄを発現しているＥＬ４細胞に結合した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５）が最良のＦＯＢ結合シグナルを与えた。ヒトＮＫＧ２Ｄ（図６）を発現している細胞とマウス（図７）ＮＫＧ２Ｄを発現している細胞との間では、各クローンについてのＮＫＧ２Ｄ結合親和性が類似であった。
（実施例２）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄへの天然リガンドの結合を遮断する
ＵＬＢＰ−６との競合
【０３３３】
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を減少させるためにウェルをウシ血清アルブミンでブロッキングした。飽和濃度のＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンをウェルに添加し、引き続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンを添加した。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃコーティングウェルに結合したままであるＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンを、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたストレプトアビジンおよびＴＭＢ基質によって検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを減算した後、ウェル中のＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への結合を遮断されたＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンのパーセンテージから、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む）およびさまざまなＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２ＤへのＵＬＢＰ−６の結合を遮断した一方、アイソタイプ対照はＵＬＢＰ−６との競合を殆ど示さなかった（図８）。
【０３３４】
ＵＬＢＰ−６配列は配列番号１０８によって表される。
【化１７】
2021534096.tif 000069
（配列番号：１０８）
ＭＩＣＡとの競合
【０３３５】
組換えヒトＭＩＣＡ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を減少させるためにウェルをウシ血清アルブミンでブロッキングした。ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、引き続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、ＭＩＣＡ−Ｆｃコーティングウェルに結合したままであるＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを減算した後、ＭＩＣＡ−Ｆｃコーティングウェルへの結合を遮断されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む）およびさまざまなＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２ＤへのＭＩＣＡの結合を遮断した一方、アイソタイプ対照はＭＩＣＡとの競合を殆ど示さなかった（図９）。
Ｒａｅ−１デルタとの競合
【０３３６】
組換えマウスＲａｅ−１デルタ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を減少させるためにウェルをウシ血清アルブミンでブロッキングした。マウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、引き続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃコーティングウェルに結合したままであるＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを減算した後、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃコーティングウェルへの結合を遮断されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を計算した。陽性対照（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５）およびさまざまなＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンがマウスＮＫＧ２ＤへのＲａｅ−１デルタの結合を遮断した一方、アイソタイプ対照抗体はＲａｅ−１デルタとの競合を殆ど示さなかった（図１０）。
（実施例３）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンはＮＫＧ２Ｄを活性化する
【０３３７】
ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄの核酸配列を、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に融合して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を得た。次いで、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ構築物を、ギブソン・アセンブリを使用してレトロウイルスベクターにクローニングし、レトロウイルス産生のためにｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。ＥＬ４細胞に、８μｇ／ｍＬポリブレンと共にＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを含有するウイルスを感染させた。感染２４時間後、ＥＬ４細胞におけるＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、細胞表面上で高レベルのＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを発現するクローンを選択した。
【０３３８】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化するかどうかを決定するために、これらをマイクロプレートのウェルに吸着させ、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ  ＥＬ４細胞を、ブレフェルジン−Ａおよびモネンシンの存在下で４時間、抗体断片コーティングウェル上で培養した。ＮＫＧ２Ｄ活性化の指標である細胞内ＴＮＦ−α産生をフローサイトメトリーによってアッセイした。ＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを、陽性対照で処理した細胞に正規化した。全てのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒトＮＫＧ２Ｄ（図１１）とマウスＮＫＧ２Ｄ（図１２）の両方を活性化した。
（実施例４）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫ細胞を活性化する
初代ヒトＮＫ細胞
【０３３９】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心法を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を、磁気ビーズによる負の選択を使用して、ＰＢＭＣから単離し、単離ＮＫ細胞の純度は典型的には９５％より高かった。次いで、単離ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２を含有する培地で２４〜４８時間培養した後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａおよびモネンシンを含有する培地で培養した。培養後、ＮＫ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ５６およびＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用してフローサイトメトリーによってアッセイした。ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γ染色をＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞で分析してＮＫ細胞活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γダブルポジティブ細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の結合を介した良好なＮＫ細胞活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（例えば、配列番号１０１または配列番号１０３によって表される重鎖可変ドメイン、および配列番号１０２または配列番号１０４によって表される軽鎖可変ドメイン）は、アイソタイプ対照よりも高いＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮ−γ＋になるＮＫ細胞のパーセンテージを示した（図１３および図１４は、それぞれＮＫ細胞調製のために異なるドナーのＰＢＭＣを使用した、２つの独立した実験からのデータを表す）。
初代マウスＮＫ細胞
【０３４０】
脾臓をＣ５７Ｂｌ／６マウスから得て、７０μｍセルストレーナーを通して粉砕して単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入  番号Ａ１０４９２０１；１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ重炭酸カリウム、０．０１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁して赤血球を除去した。残りの細胞を１００ｎｇ／ｍＬ  ｈＩＬ−２と共に７２時間培養した後、収集し、ＮＫ細胞単離の準備をした。次いで、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫ１．１＋）を、典型的には純度９０％より高く、磁気ビーズを用いた負の枯渇技術を使用して脾細胞から単離した。精製ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ  ｍＩＬ−１５を含有する培地で４８時間培養した後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａおよびモネンシンを含有する培地で培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインコーティングウェルでの培養後、ＮＫ細胞を、ＣＤ３、ＮＫ１．１およびＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用してフローサイトメトリーによってアッセイした。ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γ染色をＣＤ３−ＮＫ１．１＋細胞で分析してＮＫ細胞活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γダブルポジティブ細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の結合を介した良好なＮＫ細胞活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高いＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮ−γ＋になるＮＫ細胞のパーセンテージを示した（図１５および図１６は、それぞれＮＫ細胞調製のために異なるマウスを使用した、２つの独立した実験からのデータを表す）。
（実施例５）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは標的腫瘍細胞の細胞傷害性を可能にする
【０３４１】
ヒトおよびマウス初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとのインキュベーション後のＮＫ細胞上の細胞傷害性マーカーの増加を示した。これが腫瘍細胞溶解の増加につながるかどうかに対処するために、各ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを単一特異性抗体に発達させる細胞ベースアッセイを利用した。Ｆｃ領域を一方の標的化アームとして使用し、Ｆａｂ断片（ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン）がＮＫ細胞を活性化させるための別の標的化アームとして作用した。ヒト由来で、高レベルのＦｃ受容体を発現するＴＨＰ−１細胞を腫瘍標的として使用し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性キットを使用した。ＴＨＰ−１細胞をＢＡＴＤＡ試薬で標識し、培養培地に１０５／ｍＬで再懸濁した。次いで、標識ＴＨＰ−１細胞を、３７℃で３時間、マイクロタイタープレートのウェルでＮＫＧ２Ｄ抗体および単離マウスＮＫ細胞と合わせた。インキュベーション後、２０μＬの培養物上清を取り出し、２００μＬのユーロピウム溶液と混合し、暗所で１５分間、振盪しながらインキュベートした。時間分解蛍光測定モジュール（励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を備えたＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダーによって蛍光を経時的に測定し、キットの指示に従って、特異的溶解を計算した。
【０３４２】
陽性対照である、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドのＵＬＢＰ−６は、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解の増加を示した。ＮＫＧ２Ｄ抗体もＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解を増加させたが、アイソタイプ対照抗体は特異的溶解の減少を示した。点線は、抗体を添加していない、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１細胞の特異的溶解を示している（図１７）。
（実施例６）
ＮＫＧ２Ｄ抗体は高い熱安定性を示す
【０３４３】
示差走査蛍光定量法を使用してＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの融解温度をアッセイした。外挿された見かけの融解温度は典型的なＩｇＧ１抗体と比較して高い（図１８）。
（実施例７）
ＮＫＧ２ＤとＣＤ１６を架橋することによるヒトＮＫ細胞の相乗的活性化
初代ヒトＮＫ細胞活性化アッセイ
【０３４４】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心法を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。ＮＫ細胞を、負の磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ番号１７９５５）を使用してＰＢＭＣから精製した。フローサイトメトリーによって決定すると、ＮＫ細胞は９０％より多くがＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。次いで、細胞を、活性化アッセイに使用する前に、１００ｎｇ／ｍＬ  ｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ番号２００−０２）を含有する培地で４８時間増やした。抗体を、１００μＬ滅菌ＰＢＳ中、４℃で一晩、２μｇ／ｍＬ（抗ＣＤ１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号３０２０１３）および５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ番号ＭＡＢ１３９）の濃度で９６ウェル平底プレートにコーティングし、引き続いてウェルを徹底的に洗浄して過剰な抗体を除去した。脱顆粒を評価するために、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−２（ｈＩＬ２）および１μｇ／ｍＬ  ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号３２８６１９）を補充した培養培地に５×１０５細胞／ｍＬで再懸濁した。次いで、１×１０５細胞／ウェルを抗体コーティングプレートに添加した。タンパク質輸送阻害剤ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号４２０６０１）およびモネンシン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号４２０７０１）を、それぞれ最終希釈１：１０００および１：２７０で添加した。プレートに添加された細胞を５％ＣＯ２中３７℃で４時間インキュベートした。ＩＦＮ−γの細胞内染色のために、ＮＫ細胞を抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号３００４５２）および抗ＣＤ５６  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号３１８３２８）で標識し、その後、固定し、透過処理し、抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号５０６５０７）で標識した。ＮＫ細胞を、生ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞でゲーティングした後、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γの発現について分析した。
【０３４５】
受容体組合せの相対的効力を調査するために、プレート結合刺激による、ＮＫＧ２ＤまたはＣＤ１６の架橋、および両受容体の共架橋を実施した。図１９（図１９Ａ〜１９Ｃ）に示されるように、ＣＤ１６とＮＫＧ２Ｄの組合せ刺激は、高度に上昇したレベルのＣＤ１０７ａ（脱顆粒）（図１９Ａ）および／またはＩＦＮ−γ産生（図１９Ｂ）をもたらした。点線は、各受容体の個々の刺激の相加的効果を表す。
【０３４６】
抗ＣＤ１６、抗ＮＫＧ２Ｄまたは両モノクローナル抗体の組合せによる４時間のプレート結合刺激後、ＣＤ１０７ａレベルおよびＩＬ−２活性化ＮＫ細胞の細胞内ＩＦＮ−γ産生を分析した。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。図１９ＡはＣＤ１０７ａのレベルを示し；図１９ＢはＩＦＮ−γのレベルを示し；図１９ＣはＣＤ１０７ａとＩＦＮ−γのレベルを示している。図１９Ａ〜１９Ｃに示されるデータは、５人の異なる健康なドナーを使用した５つの独立した実験を表す。
（実施例８）
ヒトがん抗原を発現している細胞へのＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂの結合の評価
【０３４７】
Ｂ７−Ｈ３を発現しているヒトがん細胞系を使用して、Ｂ７−Ｈ３標的化クローンに由来するＴｒｉＮＫＥＴの腫瘍抗原結合を評価した。ヒト乳がん細胞系ＢＴ−４７４およびＨＣＣ１９５４ならびに腎がん細胞系７８６−Ｏを使用して、Ｂ７−Ｈ３を発現している細胞へのＴｒｉＮＫＥＴの結合を評価した。さまざまな濃度のＴｒｉＮＫＥＴまたはモノクローナル抗体を氷上で２０分間細胞に結合させ、その後、細胞を洗浄し、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して、結合したＴｒｉＮＫＥＴ／モノクローナル抗体の量を測定した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、Ｂ７−Ｈ３を発現している細胞へのＭＦＩの結合をさまざまな濃度に対してプロットした。
【０３４８】
図３５は、Ｂ７−Ｈ３発現ヒトがん細胞系（Ａ）７８６−Ｏ、（Ｂ）ＢＴ−４７４および（Ｃ）ＨＣＣ１９５４へのＢ７−Ｈ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴおよびその親モノクローナル抗体の結合を示している。３つの異なるＢ７−Ｈ３結合ドメインを一本鎖可変断片に変換し、同じＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを有するＴｒｉＮＫＥＴとして発現させた。１３ｖ１、Ｍ３０およびエノブリツズマブＢ７−Ｈ３標的化ドメインを有するＴｒｉＮＫＥＴは、Ｂ７−Ｈ３発現ヒトがん細胞系に対する結合が陽性を示した。しかしながら、３つの系全てで、Ｂ７−Ｈ３  ＴｒｉＮＫＥＴが、親モノクローナル抗体と比較して弱く結合する。結合親和性の減少は、ＦａｂからｓｃＦｖへの変換および／または１分子当たり２つのＢ７−Ｈ３結合ドメインを有する親ｍＡｂと比較したＦ３’  ＴｒｉＮＫＥＴのＢ７−Ｈ３への一価結合に起因し得る。
（実施例９）
初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ
【０３４９】
ＰＢＭＣを、密度勾配遠心法を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離し、洗浄し、ＮＫ細胞単離の準備をした。磁気ビーズによる負の選択技術を使用してＮＫ細胞を単離した。単離ＮＫ細胞の純度は典型的には９０％より高いＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離ＮＫ細胞を一晩静置し、翌日、細胞傷害性アッセイに使用した。
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ
【０３５０】
目的の標的であるＢ７−Ｈ３を発現しているヒトがん細胞系を培養物から収集し、細胞をＨＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃ１３６−１００）で標識するために成長培地に１０６／ｍＬで再懸濁した。標的細胞の標識については製造業者の指示に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、培養培地に０．５〜１．０×１０５／ｍＬで再懸濁した。バックグラウンドウェルを調製するために、標識細胞のアリコートを取っておき、遠心して細胞から培地を除いた。１００μｌの培地を３連でウェルに慎重に添加して、ペレット化細胞を乱さないようにした。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。複数のウェルを、標的細胞からの自発的放出のために保全し、標的細胞の最大溶解のために１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘを添加して調製した。Ｂ７−Ｈ３に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地に希釈し、５０μｌの希釈ｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。静止および／または活性化ＮＫ細胞を培養物から収集し；次いで、細胞を洗浄し、Ｅ：Ｔ比５：１となるよう培養培地に１０５〜２．０×１０６／ｍＬの濃度で再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞を合計２００μｌの培養体積となるようプレートの各ウェルに添加した。プレートを５％ＣＯ２で、３７℃で２〜３時間インキュベートした後、アッセイを行った。
【０３５１】
２〜３時間培養した後、プレートをインキュベーターから取り出し、２００×ｇで５分間遠心分離することにより、細胞をペレット化した。２０μｌの培養物上清を新しいマイクロプレートに移し、２００μｌの室温ユーロピウム溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃ１３５−１００）を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、２５０ｒｐｍで１５分間、プレートシェーカー上でインキュベートし、次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ機器を使用して読み取った。特異的溶解％を以下の通り計算した：
特異的溶解％＝（（実験放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出））×１００％。
【０３５２】
図３６は、７８６−Ｏ（図３６Ａ）およびＨＣＣ１９５４（図３６Ｂ）がん細胞系の初代ＮＫ細胞媒介殺滅の増強における２０ｎＭ  Ｂ７−Ｈ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴまたは親ｍＡｂの活性を示している。ＴｒｉＮＫＥＴは、親モノクローナル抗体と比較して、弱められたＢ７−Ｈ３発現がん細胞への結合を有するにもかかわらず、親ｍＡｂよりも７８６−ＯおよびＨＣＣ１９５４がん細胞のＮＫ細胞媒介溶解を増強する。
（実施例１０）
ＫＨＹＧ−１  ＣＤ１６Ｖ細胞の細胞傷害性アッセイ
【０３５３】
ＫＨＹＧ−１細胞は、ＤＳＭＺから得られる高度細胞傷害性ＮＫ白血病細胞系（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ７２５）である。親ＫＨＹＧ−１細胞は、細胞表面上でＮＫＧ２Ｄを発現するが、ＣＤ１６は発現しない。高親和性ヒトＣＤ１６を形質導入されたＫＨＹＧ−１細胞を細胞の細胞傷害性アッセイに使用した。ＫＨＹＧ−１  ＣＤ１６Ｖ細胞を一晩静置し、翌日、エフェクター細胞として細胞傷害性アッセイに使用した。
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ
【０３５４】
Ｂ７−Ｈ３を発現しているヒトがん細胞系を培養物から収集し、ＨＢＳで洗浄し、製造業者の指示に従って、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃ１３６−１００）で標識するために成長培地に１０６／ｍＬで再懸濁した。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、培養培地に０．５〜１．０×１０５／ｍＬで再懸濁した。バックグラウンドウェルを調製するために、標識細胞のアリコートを取っておき、遠心して細胞から培地を除いた。１００μｌの培地を３連でウェルに慎重に添加して、ペレット化細胞を乱さないようにした。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。複数のウェルを、標的細胞からの自発的放出のために保全し、標的細胞の最大溶解のために１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘを添加して調製した。Ｂ７−Ｈ３に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地に希釈し、５０μｌの希釈ｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。静止ＫＨＹＧ−１  ＣＤ１６Ｖ細胞を培養物から収集し、洗浄し、Ｅ：Ｔ比１０：１となるよう培養培地に１０５〜２．０×１０６／ｍＬで再懸濁した。５０μｌのＫＨＹＧ−１  ＣＤ１６Ｖ細胞を合計２００μｌの培養体積となるようプレートの各ウェルに添加した。プレートを５％ＣＯ２で、３７℃で２〜３時間インキュベートした後、アッセイを行った。
【０３５５】
２〜３時間培養した後、プレートをインキュベーターから取り出し、２００×ｇで５分間遠心分離することにより、細胞をペレット化した。２０μｌの培養物上清を新しいマイクロプレートに移し、２００μｌの室温ユーロピウム溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃ１３５−１００）を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、２５０ｒｐｍで１５分間、プレートシェーカー上でインキュベートし、次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ機器を使用して読み取った。特異的溶解を以下の通り計算した：
特異的溶解％＝（（実験放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出））×１００％。
【０３５６】
図３７Ａおよび図３７Ｂは、それぞれ、Ｂ７−Ｈ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴが、ＢＴ−４７４およびＨＣＣ１９５４がん細胞系のＫＨＹＧ−１−ＣＤ１６Ｖ細胞殺滅を有意に増強することを示している。ＴｒｉＮＫＥＴは、親ｍＡｂよりも、低いＥＣ５０値を有し強力で、高い最大溶解に到達する。
（実施例１１）
共培養活性化アッセイ
【０３５７】
ＰＢＭＣを、密度勾配遠心法を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。単離ＰＢＭＣを洗浄し、初代培養培地中１×１０６／ｍＬで一晩静置した。Ｂ７−Ｈ３を発現しているヒトがん細胞系を培養物から収集し、細胞を２×１０６／ｍＬに調整した。Ｂ７−Ｈ３  ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｂ７−Ｈ３親モノクローナル抗体またはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照を培養培地に希釈した。静止ＰＢＭＣを培養物から収集し、洗浄し、培養培地に４×１０６／ｍＬで再懸濁した。ＩＬ−２およびフルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａを、活性化培養のためにＰＢＭＣに添加した。ブレフェルジン−Ａおよびモネンシンを培養培地に希釈して、細胞内サイトカイン染色のために細胞外へのタンパク質輸送を遮断した。５０μｌの腫瘍標的、ｍＡｂ／ＴｒｉＮＫＥＴ、ＢＦＡ／モネンシンおよびＰＢＭＣを、総培養体積２００μｌになるように９６ウェルプレートに添加した。プレートを４時間培養した後、ＦＡＣＳ分析のために試料を調製した。
【０３５８】
４時間の活性化培養後、ＣＤ３、ＣＤ５６およびＩＦＮγに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによる分析のために細胞を調製した（表１３）。ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮγ染色をＣＤ３−ＣＤ５６＋集団で分析してＮＫ細胞活性化を評価した。
表１３
【表１３】
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【０３５９】
ＦＳＣ対ＳＳＣプロットを使用して目的の細胞を同定し、適切に形作られたゲートを細胞の周りに描いた。ゲーティングされた細胞内では、ＦＳＣ−Ｈ対ＦＳＣ−Ａプロットを表示することにより、ダブレット細胞を取り除いた。単一細胞集団内では、生細胞をゲーティングした。生細胞内では、ＮＫ細胞をＣＤ５６＋ＣＤ３−として同定した。ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＣ  ＩＦＮγをＮＫ細胞集団内で分析した。
【０３６０】
ＰＢＭＣを、Ｂ７−Ｈ３  ＴｒｉＮＫＥＴ、モノクローナル抗体またはアイソタイプｈＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下で、ＢＴ−４７４および７８６−Ｏ細胞と共培養した。図３８Ａおよび図３８Ｂは、それぞれ、Ｂ７−Ｈ３発現がん細胞ＢＴ−４７４および７８６−Ｏとの共培養後のＩＦＮγとＣＤ１０７ａの両方を発現しているＮＫ細胞のパーセンテージを示している。全てのＢ７−Ｈ３  ＴｒｉＮＫＥＴおよび親モノクローナル抗体が、ヒトＮＫ細胞で細胞内ＩＦＮγおよびＣＤ１０７ａ脱顆粒を誘導した。アイソタイプ対照処理はＮＫ細胞を全く活性化しなかったが、それぞれの親ｍＡｂと比較して、１０μｇ／ｍＬのＢ７−Ｈ３  ＴｒｉＮＫＥＴで処理した共培養物で、ＩＦＮγおよびＣＤ１０７ａダブルポジティブＮＫ細胞のパーセンテージが高く、ＴｒｉＮＫＥＴが親ｍＡｂよりもＮＫ細胞を刺激することを示している。
参照による組み込み
【０３６１】
本明細書で参照される特許文献および科学論文の各々の開示全体は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
均等物
【０３６２】
本発明は、その精神からも本質的な特徴からも逸脱することなく、他の具体的な形態で具体化され得る。そのため、前記実施形態は、あらゆる点で、本明細書に記載される本発明を限定するのではなく、例示的なものとみなされるべきである。よって、本発明の範囲は、前記説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価性の意味および範囲に入る全ての変更がそこに包含されることが意図される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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