(57)【要約】ステロイド受容体コアクチベーター−３（ＳＲＣ−３）の小分子刺激因子及び心臓保護剤としてのそれらの使用方法が提供される。小分子刺激因子は、心筋梗塞後の心臓の保護及び修復ならびに血管再生を促進するのに有用である。化合物はまた、心臓肥大及びコラーゲン沈着を防ぎ、心臓の梗塞後の機能を改善するのに有用である。【選択図】図１
2021534221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物、
【化４１】
2021534221.tif 000045
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグであって、式中、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０が各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１が、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、
Ｒ２が、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルである、前記化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ。
【請求項２】
前記化合物が、以下の式を有し、
【化４２】
2021534221.tif 000046
式中、
ｍ及びｎが各々独立して、１、２、３、４、または５である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が、以下の式を有し、
【化４３】
2021534221.tif 000047
式中、
ｍ及びｎが各々独立して、１、２、３、または４である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が、以下の式を有し、
【化４４】
2021534221.tif 000048
式中、
ｍ及びｎが各々独立して、１、２、３、または４である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が、以下の式を有し、
【化４５】
2021534221.tif 000049
式中、
ｍ及びｎが各々独立して、１、２、３、または４である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物が、
【化４６】
2021534221.tif 000050
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物が、
【化４７】
2021534221.tif 000051
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
【化４８】
2021534221.tif 000052
からなる群から選択される、化合物、
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ。
【請求項１０】
対象において虚血性損傷を治療するための方法であって、
有効量の以下の式の化合物、
【化４９】
2021534221.tif 000053
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを前記対象に投与することを含み、式中、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０が各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１が、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、
Ｘが、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、前記方法。
【請求項１１】
前記化合物が、
【化５０】
2021534221.tif 000054
からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記虚血性損傷が、心筋梗塞または脳卒中を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
虚血性損傷に罹患した対象を選択することをさらに含み、前記虚血性損傷が、心筋梗塞または脳卒中を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
心筋梗塞に罹患した対象において心筋梗塞サイズを低減する方法であって、
有効量の以下の式の化合物、
【化５１】
2021534221.tif 000055
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを前記対象に投与することを含み、式中、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０が各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１が、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、
Ｘが、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、前記方法。
【請求項１５】
前記化合物が、
【化５２】
2021534221.tif 000056
からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記心筋梗塞サイズが、心筋梗塞に罹患した未治療の対象における心筋梗塞サイズと比較して、少なくとも５％低減される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記心筋梗塞サイズが、心筋梗塞に罹患した未治療の対象における心筋梗塞サイズと比較して、少なくとも１５％低減される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
心筋梗塞または脳卒中に罹患した対象において、心筋細胞の喪失を予防もしくは低減し、心臓血管灌流を改善し、及び／または中枢神経系血管灌流を改善する方法であって、
有効量の以下の式の化合物、
【化５３】
2021534221.tif 000057
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを前記対象に投与することを含み、式中、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０が各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１が、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、
Ｘが、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、前記方法。
【請求項１９】
前記化合物が、
【化５４】
2021534221.tif 000058
からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象における心血管機能及び／または中枢神経系血管機能を改善するための方法であって、
有効量の以下の式の化合物、
【化５５】
2021534221.tif 000059
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを前記対象に投与することを含み、式中、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０が各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１が、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、
Ｘが、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、前記方法。
【請求項２１】
前記化合物が、
【化５６】
2021534221.tif 000060
からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、虚血性損傷に罹患している、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記虚血性損傷が、心筋梗塞または脳卒中である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、高齢の対象である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
対象において創傷治癒を促進する方法であって、有効量の以下の式の化合物、
【化５７】
2021534221.tif 000061
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを前記対象に投与することを含み、式中、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０が各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１が、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、
Ｘが、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、前記方法。
【請求項２６】
前記化合物が、
【化５８】
2021534221.tif 000062
からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
対象における肥大型心筋症を治療または予防するための方法であって、
有効量の以下の式の化合物、
【化５９】
2021534221.tif 000063
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを前記対象に投与することを含み、式中、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０が各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１が、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、
Ｘが、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、前記方法。
【請求項２８】
前記化合物が、
【化６０】
2021534221.tif 000064
からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が、虚血性損傷に罹患している、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記虚血性損傷が、心筋梗塞または脳卒中である、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年８月２９日に出願された米国仮出願第６２／７２４，２８１号及び２０１９年３月２８日に出願された第６２／８２５，３５８号に対する優先権を主張し、これらはそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞（ＭＩ）誘発性心不全の決定要因は、筋細胞の喪失、炎症、線維症、及び心臓駆出率の大うつ病に関連する心臓組織の進行性リモデリングである。心臓機能を改善するための有望な治療アプローチの１つは、機能的な心筋を直接保存することにより、ｉｎ  ｓｉｔｕで心臓組織の有害なリモデリングを防止することである。梗塞後の心臓機能を維持するための主なハードルには、組織の破壊と、組織の再プログラミング及び修復を促進するように設計された治療への障壁となる成人の心臓の限られた制限された再生能力とが含まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
ステロイド受容体コアクチベーター−３（ＳＲＣ−３）の小分子刺激因子ならびに心臓保護剤及び／または血管再生剤としてのそれらの使用方法が本明細書に記載される。本明細書に記載される化合物は、心筋梗塞後の心臓の保護及び修復ならびに血管再生を促進するために有用である。方法は、本明細書に記載される化合物を対象に投与することを含む。
【０００４】
小分子ＳＲＣ−３刺激因子には、以下の式の化合物、
【化１】
2021534221.tif 000003
及びその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグが含まれる。これらの化合物において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０は各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１は、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、かつＲ２は、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルである。任意に、化合物は以下の式を有し、
【化２】
2021534221.tif 000004
式中、ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、４、または５である。
【０００５】
任意に、化合物は以下の式を有し、
【化３】
2021534221.tif 000005
式中、ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、または４である。
【０００６】
本明細書に記載の化合物において、Ｒ２は、任意に、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルからなる群から選択される。任意に、化合物は、
【化４】
2021534221.tif 000006
からなる群から選択される。
【０００７】
任意に、化合物は、
【化５】
2021534221.tif 000007
からなる群から選択されるか、
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグである。
【０００８】
有効量の以下の式の化合物、
【化６】
2021534221.tif 000008
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを対象に投与することを含む、対象における虚血性損傷（例えば、心筋梗塞または脳卒中）を治療するための方法もまた本明細書に記載される。この方法での使用のための化合物において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０は各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１は、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、Ｘは、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。任意に、化合物は、
【化７】
2021534221.tif 000009
からなる群から選択される。
【０００９】
任意に、方法は、心筋梗塞に罹患したか、または脳卒中もしくは中枢神経系への他の血管障害に罹患した対象を選択することをさらに含み得る。
【００１０】
心筋梗塞に罹患した対象における心筋梗塞サイズを低減する方法が本明細書にさらに記載される。方法は、有効量の以下の式の化合物、
【化８】
2021534221.tif 000010
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを対象に投与することを含み得る。本明細書に記載される方法での使用のための化合物において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０は各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１は、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、Ｘは、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。任意に、化合物は、
【化９】
2021534221.tif 000011
からなる群から選択される。
【００１１】
任意に、心筋梗塞サイズは、心筋梗塞に罹患した未治療の対象における心筋梗塞サイズと比較して、少なくとも５％（例えば、少なくとも１５％）低減される。
【００１２】
心筋梗塞または脳卒中に罹患した対象において、心筋細胞の喪失を予防もしくは低減し、心臓血管灌流を改善し、及び／または中枢神経系血管灌流を改善する方法もまた本明細書に記載され、有効量の以下の式の化合物、
【化１０】
2021534221.tif 000012
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを対象に投与することを含む。この方法での使用のための化合物において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０は各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１は、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、Ｘは、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。任意に、化合物は、
【化１１】
2021534221.tif 000013
からなる群から選択される。
【００１３】
対象における心臓血管機能及び／または中枢神経系血管機能を改善するための方法もまた本明細書に記載され、有効量の以下の式の化合物、
【化１２】
2021534221.tif 000014
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを対象に投与することを含む。この方法での使用のための化合物において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０は各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１は、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、Ｘは、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。任意に、化合物は、
【化１３】
2021534221.tif 000015
からなる群から選択される。
【００１４】
任意に、対象は、虚血性損傷（例えば、心筋梗塞または脳卒中）に罹患している。任意に、対象は、高齢の対象である。
【００１５】
対象において創傷治癒を促進する方法もまた本明細書に記載され、有効量の以下の式の化合物、
【化１４】
2021534221.tif 000016
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを対象に投与することを含む。この方法での使用のための化合物において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０は各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１は、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、Ｘは、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。任意に、化合物は、
【化１５】
2021534221.tif 000017
からなる群から選択される。
【００１６】
任意に、対象は、虚血性損傷（例えば、心筋梗塞または脳卒中）に罹患している。任意に、対象は、高齢の対象である。
【００１７】
有効量の以下の式の化合物、
【化１６】
2021534221.tif 000018
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを対象に投与することを含む、対象における肥大型心筋症を治療または予防するための方法が本明細書にさらに記載される。この方法での使用のための化合物において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０は各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択され、各Ｒ１は、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、または置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキルであり、Ｘは、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、及び置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。任意に、化合物は、
【化１７】
2021534221.tif 000019
からなる群から選択される。
【００１８】
任意に、対象は、虚血性損傷（例えば、心筋梗塞または脳卒中）に罹患している。
【００１９】
１つ以上の実施形態の詳細は、図面及び以下の説明において述べられる。他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、ならびに請求項から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】正常なヒトの心臓（左パネル）及び筋肉組織（右パネル）におけるＮＣＯＡ３の発現を示すグラフを含む。
【図２】採取前にアデノ−ＳＲＣ３を注射したマウスの心臓の画像である。
【図３】Ａは、心筋梗塞（ＭＩ）後の薬物治療及び心エコー図測定の実験的タイムラインを示す。Ｂは、心筋梗塞後のマウスの心臓重量及び脛骨の長さの比（ＨＷ／ＴＬ）を示すグラフである。Ｃは、心筋梗塞後のマウスにおけるＭＣＢ−６１３処置の効果を示すグラフである。Ｄは、心筋梗塞後に採取され、コラーゲン線維を視覚化するために染色されたマウスの心臓の画像を含む。
【図４】心筋梗塞後のマウスにおける化合物１０−１処置の効果を示すグラフである。
【図５Ａ】成体マウスの心臓における非筋細胞の包括的な単一細胞転写プロファイリングを示すプロットである。
【図５Ｂ】心筋梗塞後のＭＣＢ−６１３で処置した心臓に存在する異なる細胞型を示すグラフである。
【図５Ｃ】内皮の特徴を有する３つの細胞クラスターのベン分析である。
【図６Ａ】心筋梗塞後のマウスの心臓における長鎖脂肪酸のメタボロミクスを示すヒートマップである。
【図６Ｂ】心筋梗塞後のマウスの心臓におけるメチルグルタリルカルニチンのメタボロミクスを示すヒートマップである。
【図７】上部パネルは、ＭＣＢ−６１３がＳＲＣの固有の転写活性を選択的に刺激することを示す。中心パネルは、化合物１０−１がＳＲＣの固有の転写活性を選択的に刺激することを示す。下部パネルは、化合物１０−２がＳＲＣの固有の転写活性を選択的に刺激することを示す。
【図８】心筋梗塞後及び化合物１０−１による治療後の乳頭筋のレベルでの心臓断面の写真を含む。
【図９】生理食塩水で処置したマウス（「生理食塩水」）、ＭＣＢ−６１３で処置したマウス（「ＭＣＢ−６１３」）、及び梗塞のない野生型マウス（「ＷＴ」）における漸増最大運動試験の結果を示すグラフを含む。上部パネルは、二酸化炭素の呼気を示し、下部パネルは、酸素消費量を示す。
【図１０】ＭＣＢ−６１３が、ＭＩの３日後の鶏卵及びマウスの心臓における血管新生を刺激することを示す。Ａでは、心臓線維芽細胞をＤＭＳＯまたはＭＣＢ−６１３で２４時間処理した。次に、総タンパク質を単離し、ＳＲＣ−１、−２、及び−３について免疫ブロットした。Ｈｓｐ９０をローディング対照として使用した。Ｂについて、心臓線維芽細胞にＧＡＬ４  ＤＮＡ結合部位−ルシフェラーゼレポーター（ｐＧ５−ｌｕｃ）及びＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメイン−全長ＳＲＣ−１、−２、もしくは−３融合（ｐＢＩＮＤ−ＳＲＣ）または対照ｐＢＩＮＤ発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をＤＭＳＯまたはＭＣＢ−６１３で２４時間処理した。総タンパク質を単離し、ルシフェラーゼ活性について測定した。相対光単位（ＲＬＵ）は、ルシフェラーゼ活性を総タンパク質濃度（ｎ＝３）に正規化することによって計算された（＊Ｐ＜０．０５）。Ｃでは、心臓線維芽細胞をＤＭＳＯまたはＭＣＢ−６１３で２４時間処理し、次いで、薬物を含まない内皮増殖培地でさらに２４時間コンディショニングした。次に、コンディショニングされた細胞をマトリゲルに播種して、一晩チューブ形成させ、次いで、チューブをカルセインＡＭ色素で染色して画像化した。Ｄでは、鶏卵をＤＭＳＯまたはＭＣＢ−６１３で処理し、１日目及び３日目に血管面積を測定した。マウスの胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＭＣＢ−６１３で２４時間処理し、次いで、鶏卵の膜に配置した。血管面積は１日目及び３日目に測定された。データは、各条件の対照に対する増加パーセントとして表される。各条件で６個の卵を使用した（＊Ｐ＜０．０５）。Ｅでは、ＭＩの２時間後にマウスをＭＣＢ−６１３または対照で処置した。心臓を固定し、内皮細胞特異的ＣＤ３１について免疫染色した。３匹の対照マウス及びＭＣＢ−６１３で処置した３匹のマウスからの梗塞境界ゾーンの代表的な画像を示す。また、境界ゾーンごとの２つのフィールドについての組織の領域ごとの定量化ＣＤ３１免疫染色密度を示す棒グラフを含む（＊Ｐ＜０．０５）。
【図１１Ａ】ＭＣＢ−６１３が心筋梗塞後の心臓機能を改善することを示す。実験手順の概略図である。マウスを、左冠動脈前下行枝の永久結紮の２時間後、及びさらに６日間、ならびに示されるように８週目及び１６週目に、ＭＣＢ−６１３または対照で処置した。
【図１１Ｂ】ＭＣＢ−６１３が心筋梗塞後の心臓機能を改善することを示す。駆出率は、示された時間に心エコー図によって測定され、心臓は、２４時間及び１２週間で採取された（＊Ｐ＜０．０５）。
【図１１Ｃ】ＭＣＢ−６１３が心筋梗塞後の心臓機能を改善することを示す。ＭＩ後１２週間の脛骨の長さと心臓重量を比較した。
【図１１Ｄ】ＭＣＢ−６１３が心筋梗塞後の心臓機能を改善することを示す。対照（ＭＩなし）、ＭＩ、ならびにＭＩ及びＭＩ後２週間でのＭＣＢ−６１３の間における形態学及び１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みの差を示す、軸位断（短軸）、冠状断（長軸）、及び矢状断でのマウスの心臓の中心スライスの代表的な画像を示す。矢印は梗塞ゾーンを示す。ｎ＝６対照ＭＩなし、ｎ＝６  ＭＩ及びビヒクル対照、ｎ＝４  ＭＩ及びＭＣＢ−６１３。
【図１１Ｅ】ＭＣＢ−６１３が心筋梗塞後の心臓機能を改善することを示す。ＭＣＢ−６１３で処置した心臓（ｎ＝２；梗塞サイズ４４％及び３１％）及び１２週間でのＭＣＢ−６１３で処置した心臓（ｎ＝４；梗塞サイズ２２％、３％、２０％、及び１４％）を固定し、ピクロシリウスレッドで染色した。また、各心臓の境界ゾーンにおける線維症パーセントの定量化を示す棒グラフを含む。スケールバー：２０００μｍ及び２０μｍ。
【図１１Ｆ】ＭＣＢ−６１３が心筋梗塞後の心臓機能を改善することを示す。ＭＩ後７２時間の境界領域の代表的な電子顕微鏡写真を示す。Ｍｙ＝筋原線維。Ｍｉ＝ミトコンドリア。スケールバー：１μｍ。
【図１１Ｇ】ＭＣＢ−６１３が心筋梗塞後の心臓機能を改善することを示す。ＭＩ後の２４時間の対照及びＭＣＢ−６１３で処置した心臓からの代表的なＴＵＮＥＬ染色を示す。群あたりｎ＝４つの心臓。スケールバー：２０００μｍ及び２０μｍ。
【図１２】生理食塩水で処置した非梗塞野生型マウス（「ＷＴ生理食塩水」）、ＭＣＢ−６１３で処置した非梗塞野生型マウス（「ＷＴ  ＭＣＢ−６１３」）、ＭＩ後に生理食塩水で処置したマウス（「ＭＩ生理食塩水」）、及びＭＩ後にＭＣＢ−６１３で処置したマウス（「ＭＩ  ＭＣＢ−６１３」）における漸増最大運動試験の結果を示すグラフを含む）。左パネルは、酸素消費量を示し、右パネルは、二酸化炭素の呼気を示す。
【図１３Ａ】ＭＣＢ−６１３保護応答が、酸化的リン酸化の改善、炎症の減少、及び免疫細胞の減少に関連することを明らかにする、ＭＩ後１２週間の心筋細胞のＲＮＡ転写プロファイリング及び間質細胞の単一細胞分析を示す。ＭＩ後１２週間の対照処置及びＭＣＢ−６１３処置マウスからの全ＲＮＡ配列決定のための心筋細胞及び単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ分析のための非心筋細胞を得るための単離手順の概略図である。ｎ＝２つの心臓／群。
【図１３Ｂ】ＭＣＢ−６１３保護応答が、酸化的リン酸化の改善、炎症の減少、及び免疫細胞の減少に関連することを明らかにする、ＭＩ後１２週間の心筋細胞のＲＮＡ転写プロファイリング及び間質細胞の単一細胞分析を示す。ＲＮＡ−ｓｅｑによって識別され、ＭＣＢ−６１３で処置した２匹のマウス対ＭＩ後１０週間の生理食塩水で処置した２匹のマウスの心筋細胞で差次的に発現される遺伝子のヒートマップ分析である。
【図１３Ｃ】ＭＣＢ−６１３保護応答が、酸化的リン酸化の改善、炎症の減少、及び免疫細胞の減少に関連することを明らかにする、ＭＩ後１２週間の心筋細胞のＲＮＡ転写プロファイリング及び間質細胞の単一細胞分析を示す。ＭＣＢ−６１３対対照処置心臓の心筋細胞における上方制御及び下方制御された遺伝子の遺伝子セット濃縮分析である。
【図１３Ｄ】ＭＣＢ−６１３保護応答が、酸化的リン酸化の改善、炎症の減少、及び免疫細胞の減少に関連することを明らかにする、ＭＩ後１２週間の心筋細胞のＲＮＡ転写プロファイリング及び間質細胞の単一細胞分析を示す。教師なしクラスタリングによって識別された細胞集団を示す。各点は単一の細胞を示す。
【図１３Ｅ】ＭＣＢ−６１３保護応答が、酸化的リン酸化の改善、炎症の減少、及び免疫細胞の減少に関連することを明らかにする、ＭＩ後１２週間の心筋細胞のＲＮＡ転写プロファイリング及び間質細胞の単一細胞分析を示す。各クラスターを特異的に特定するために使用される確立された細胞型マーカーを示すヒートマップである。
【図１３Ｆ】ＭＣＢ−６１３保護応答が、酸化的リン酸化の改善、炎症の減少、及び免疫細胞の減少に関連することを明らかにする、ＭＩ後１２週間の心筋細胞のＲＮＡ転写プロファイリング及び間質細胞の単一細胞分析を示す。ＭＩ後の２４時間の対照及びＭＣＢ−６１３で処置した心臓からの代表的なＴＵＮＥＬ染色を示す。群あたりｎ＝４つの心臓。スケールバー：２０００μｍ及び２０μｍ。
【図１４】Ａは、線維芽細胞クラスター遺伝子発現のベン分析である。Ｂは、内皮クラスター遺伝子発現のベン分析である。Ｃは、マクロファージ遺伝子発現のベン分析である。Ｄは、対照で処置した心臓上のＭＣＢ−６１３の顆粒球における上方制御及び下方制御された遺伝子の遺伝子セット濃縮分析である。
【図１５Ａ】ＭＣＢ−６１３が、ＭＩ後１２週間で持続的な免疫及び内皮細胞応答を調節することを示す。ＭＣＢ−６１３で処置したマウスと比較した、対照マウスからの非筋細胞における上方制御及び下方制御された遺伝子の数を示す。
【図１５Ｂ】ＭＣＢ−６１３が、ＭＩ後１２週間で持続的な免疫及び内皮細胞応答を調節することを示す。心筋細胞を除く心臓細胞型間の細胞間コミュニケーションの受容体−リガンド分析を含む。線は、２つの細胞型間のコミュニケーションを示す。図の凡例に示されるように、リガンド−受容体の対合の方向性は、ノードで始まり、同族の受容体で終わる。線の太さは、リガンド−受容体の対合の数を反映している。ループは、オートクリンシグナル伝達回路を表す。
【図１５Ｃ】ＭＣＢ−６１３が、ＭＩ後１２週間で持続的な免疫及び内皮細胞応答を調節することを示す。顆粒球、線維芽細胞クラスター、及びマクロファージＣ４の間のリガンド−受容体対合のヒートマップである。
【図１５Ｄ】ＭＣＢ−６１３が、ＭＩ後１２週間で持続的な免疫及び内皮細胞応答を調節することを示す。それぞれ対照及びＭＣＢ−６１３で処置した心臓からの２７７及び３１０の顆粒球について、上位５０の上方制御及び下方制御された薬物応答性遺伝子を示すヒートマップである。
【図１６】ＭＣＢ−６１３がＢリンパ球及び単球を減少させ、ＭＩ後２４時間で早くも顆粒球遺伝子及びリゾチームを上方制御することを示す。Ａは、対照及びＭＣＢ−６１３処置マウスからのＭＩ後２４時間の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）免疫表現型分析による心臓免疫細胞の定量化を示す。Ｂは、ＭＩ及びＭＣＢ  ６１３処置後の２４時間の骨髄から単離された顆粒球及び好中球におけるｍＲＮＡ発現を示す。全ＲＮＡは、骨髄の好中球が豊富な画分及び好中球が枯渇した画分から単離され、ｃＤＮＡに変換された。Ｓ１００ａ９、Ｔｌｒ７、及びＬｃｎ２の遺伝子発現変化をｑＰＣＲで測定し、１８ｓ  ＲＮＡ発現を対照として使用した。各群Ｎ＝６＊Ｐ＜０．０５。Ｃは、ＭＩ後２４時間の対照及びＭＣＢ−６１３で処置した心臓からの代表的なＬＹＺ染色を示す。Ｃの上部パネルは、低倍率の心内膜から心外膜を示し、下部パネルは、高倍率の心内膜下領域を示す。矢印はＬＹＺ＋細胞を示す。Ｃの棒グラフは、ＬＹＺ＋細胞のＬＶ密度の定量化を示す。ｎ＝３つの心臓／群、＞１０ｍｍ２画像／心臓、ＭＩ手術後２４時間＊Ｐ＜０．０３９。
【図１７】ＣＤ−１マウスにおけるＭＣＢ−６１３、化合物１、及び化合物２について得られた薬物動態データのグラフ表示を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ステロイド受容体コアクチベーター（ＳＲＣ）タンパク質の刺激因子及びそれらの使用方法が本明細書に記載される。ステロイド受容体コアクチベーターは、核内受容体コアクチベーターのｐ１６０ファミリーのメンバーであり、ＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２（ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ１）、及びＳＲＣ−３（ＡＩＢ１／ＲＡＣ３／ＡＣＴＲ／ｐＣＩＰ）を含む。本明細書に記載される小分子は、ＳＲＣ−３の刺激因子であり、心臓保護剤及び／または血管再生剤として有用である。特に、化合物は、心筋梗塞または脳卒中後の心臓の保護及び修復ならびに血管再生を促進するために有用である。化合物はまた、心臓肥大及びコラーゲン沈着を防ぎ、心臓の梗塞後の機能を改善するのに有用である。化合物は、血管新生を増加させ、心臓及び中枢神経系において血管灌流を増加させ、心臓のベータ酸化を促進することが示されている。本明細書に記載される化合物の投与はまた、拡張型心筋症に関連する代謝産物であるメチルグルタリルカルニチンの存在を著しく減少させる。
【００２２】
Ｉ．化合物
本明細書に記載されるＳＲＣ刺激因子のクラスは、式Ｉによって表され、
【化１８】
2021534221.tif 000020
その薬学的に許容される塩またはプロドラッグである。
【００２３】
式Ｉにおいて、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０は各々独立して、ＣＲ１及びＮから選択される。式Ｉに存在する各Ｒ１基は独立して、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、トリフルオロメチル、及び置換または非置換Ｃ１−６アルキルから選択される。
【００２４】
また、式Ｉにおいて、Ｘは、ＮＲ２、ＣＲ３Ｒ４、またはＯであり、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々独立して、水素、置換または非置換Ｃ１−６アルキル、置換または非置換シクロアルキル、及び置換または非置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、アルキル、アルケニル、及びアルキニルという用語は、直鎖及び分岐鎖の一価置換基を含む。例には、メチル、エチル、イソブチル、３−ブチニルなどが含まれる。本明細書に記載される化合物及び方法で有用なこれらの基の範囲には、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、及びＣ２−Ｃ２０アルキニルが含まれる。本明細書に記載される化合物及び方法で有用なこれらの基の追加の範囲には、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、及びＣ２−Ｃ４アルキニルが含まれる。
【００２６】
ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、及びヘテロアルキニルは、アルキル、アルケニル、及びアルキニルと同様に定義されるが、骨格内にＯ、Ｓ、もしくはＮヘテロ原子またはそれらの組み合わせを含み得る。本明細書に記載される化合物及び方法で有用なこれらの基の範囲には、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ２０ヘテロアルケニル、及びＣ２−Ｃ２０ヘテロアルキニルが含まれる。本明細書に記載される化合物及び方法で有用なこれらの基の追加の範囲には、Ｃ１−Ｃ１２ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ１２ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ１２ヘテロアルキニル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ６ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ６ヘテロアルキニル、Ｃ１−Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ４ヘテロアルケニル、及びＣ２−Ｃ４ヘテロアルキニルが含まれる。
【００２７】
シクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアルキニルという用語は、単一の環状環または複数の縮合環を有する環状アルキル基を含む。例としては、シクロヘキシル、シクロペンチルエチル、及びアダマンタニルが挙げられる。本明細書に記載される化合物及び方法で有用なこれらの基の範囲には、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルケニル、及びＣ３−Ｃ２０シクロアルキニルが含まれる。本明細書に記載される化合物及び方法で有用なこれらの基の追加の範囲には、Ｃ５−Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１２シクロアルケニル、Ｃ５−Ｃ１２シクロアルキニル、Ｃ５−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ６シクロアルケニル、及びＣ５−Ｃ６シクロアルキニルが含まれる。
【００２８】
ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、及びヘテロシクロアルキニルという用語は、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアルキニルと同様に定義されるが、環状骨格内にＯ、Ｓ、もしくはＮヘテロ原子またはそれらの組み合わせを含み得る。本明細書に記載される化合物及び方法で有用なこれらの基の範囲には、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、及びＣ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキニルが含まれる。本明細書に記載される化合物及び方法で有用なこれらの基の追加の範囲には、Ｃ５−Ｃ１２ヘテロシクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１２ヘテロシクロアルケニル、Ｃ５−Ｃ１２ヘテロシクロアルキニル、Ｃ５−Ｃ６ヘテロシクロアルキル、Ｃ５−Ｃ６ヘテロシクロアルケニル、及びＣ５−Ｃ６ヘテロシクロアルキニルが含まれる。
【００２９】
アリール分子には、例えば、単一及び二重の共有結合が交互になっている場合と同じ番号の非局在化電子によって接続された、典型的には６つの炭素原子の１つ以上の平面のセットを組み込む環状炭化水素が含まれる。アリール分子の例は、ベンゼンである。ヘテロアリール分子には、Ｏ、Ｎ、またはＳなどの原子のそれらの主な環状鎖に沿った置換が含まれる。ヘテロ原子が導入されると、５つの原子のセット、例えば、４つの炭素及びヘテロ原子は、芳香族系を作成することができる。ヘテロアリール分子の例には、フラン、ピロール、チオフェン、イマダゾール、オキサゾール、ピリジン、及びピラジンが挙げられる。アリール及びヘテロアリール分子はまた、追加の縮合環、例えば、ベンゾフラン、インドール、ベンゾチオフェン、ナフタレン、アントラセン、及びキノリンを含み得る。アリール及びヘテロアリール分子は、特に記載がない限り、環の任意の位置で結合され得る。
【００３０】
本明細書で使用されるアルコキシという用語は、単一の末端エーテル結合を介して結合したアルキル基である。同様に、本明細書で使用されるアリールオキシという用語は、単一の末端エーテル結合を介して結合したアリール基である。
【００３１】
本明細書で使用されるヒドロキシルという用語は、式−ＯＨによって表される。
【００３２】
本明細書で使用されるアミンまたはアミノという用語は、式−ＮＺ１Ｚ２によって表され、Ｚ１及びＺ２は各々、上に記載される水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基などの本明細書に記載される置換基であり得る。
【００３３】
本明細書で使用されるアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル分子は、置換または非置換であり得る。本明細書で使用される場合、置換という用語は、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基の、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルの主鎖に結合した位置への付加を含み、例えば、これらの分子のうちの１つによる水素の置き換えである。置換基の例には、これらに限定されないが、ヒドロキシル、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、またはＩ）、及びカルボキシル基が挙げられる。逆に、本明細書で使用される場合、非置換という用語は、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルが、水素の完全な補体を有することを示し、すなわち、その飽和レベルに見合った、置換を含まない、例えば、直鎖デカン（−（ＣＨ２）９−ＣＨ３）である。
【００３４】
いくつかの例では、式Ｉは、構造Ｉ−Ａによって表される。
【化１９】
2021534221.tif 000021
構造Ｉ−Ａにおいて、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、及びＲ２は、式Ｉについて上に定義されるとおりである。構造Ｉ−Ａのいくつかの例では、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０の各々は、ＣＲ１であり、各Ｒ１は独立して、式Ｉについて上に定義されるように基から選択される。例えば、構造Ｉ−Ａの化合物は、構造Ｉ−Ａ１によって表され得る。
【化２０】
2021534221.tif 000022
構造Ｉ−Ａ１において、ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、４、または５である。言い換えると、分子のフェニル環は、１〜５個のＲ１基を含み得る。Ｒ１基の各々は独立して、式Ｉについて上に定義されるように基から選択され得る。
【００３５】
構造Ｉ−Ａのいくつかの例では、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０のうちの１つ以上は、Ｎであり得る。例えば、構造Ｉ−Ａの化合物は、構造Ｉ−Ａ２、構造Ｉ−Ａ３、または構造Ｉ−Ａ４によって表され得る。
【化２１】
2021534221.tif 000023
構造Ｉ−Ａ２、構造Ｉ−Ａ３、及び構造Ｉ−Ａ４において、ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、または４である。言い換えると、分子のフェニル環は、１〜４個のＲ１基を含み得る。Ｒ１基の各々は独立して、式Ｉについて上に定義されるように基から選択され得る。
【００３６】
任意に、構造Ｉ−Ａ１、構造Ｉ−Ａ２、構造Ｉ−Ａ３、及び／または構造Ｉ−Ａ４において、Ｒ２は、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルである。いくつかの例では、Ｒ２は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルからなる群から選択される。
【００３７】
いくつかの例では、式Ｉは、構造Ｉ−Ｂによって表される。
【化２２】
2021534221.tif 000024
構造Ｉ−Ｂにおいて、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ｒ３、及びＲ４は、式Ｉについて上に定義されるとおりである。構造Ｉ−Ｂのいくつかの例では、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０の各々は、ＣＲ１であり、各Ｒ１は独立して、式Ｉについて上に定義されるように基から選択される。例えば、構造Ｉ−Ｂの化合物は、構造Ｉ−Ｂ１によって表され得る。
【００３８】
【化２３】
2021534221.tif 000025
構造Ｉ−Ｂ１において、ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、４、または５である。言い換えると、分子のフェニル環は各々独立して、１〜５個のＲ１基を含み得る。Ｒ１基の各々は独立して、式Ｉについて上に定義されるように基から選択され得る。
【００３９】
構造Ｉ−Ｂのいくつかの例では、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０のうちの１つ以上は、Ｎであり得る。例えば、構造Ｉ−Ｂの化合物は、構造Ｉ−Ｂ２、構造Ｉ−Ｂ３、または構造Ｉ−Ｂ４によって表され得る。
【化２４】
2021534221.tif 000026
構造Ｉ−Ｂ２、構造Ｉ−Ｂ３、及び構造Ｉ−Ｂ４において、ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、または４である。言い換えると、分子のフェニル環は各々独立して、１〜４個のＲ１基を含み得る。Ｒ１基の各々は独立して、式Ｉについて上に定義されるように基から選択され得る。
【００４０】
いくつかの例では、式Ｉは、構造Ｉ−Ｃによって表される。
【化２５】
2021534221.tif 000027
構造Ｉ−Ｃにおいて、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０は、式Ｉについて上に定義されるとおりである。構造Ｉ−Ｃのいくつかの例では、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０の各々は、ＣＲ１であり、各Ｒ１は独立して、式Ｉについて上に定義されるように基から選択される。例えば、構造Ｉ−Ｃの化合物は、構造Ｉ−Ｃ１によって表され得る。
【００４１】
【化２６】
2021534221.tif 000028
構造Ｉ−Ｃ１において、ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、または４である。言い換えると、分子のフェニル環は各々独立して、１〜４個のＲ１基を含み得る。Ｒ１基の各々は独立して、式Ｉについて上に定義されるように基から選択され得る。
【００４２】
構造Ｉ−Ｃのいくつかの例では、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、及びＡ１０のうちの１つ以上は、Ｎであり得る。例えば、構造Ｉ−Ｃの化合物は、構造Ｉ−Ｃ２、構造Ｉ−Ｃ３、または構造Ｉ−Ｃ４によって表され得る。
【化２７】
2021534221.tif 000029
構造Ｉ−Ｃ２、構造Ｉ−Ｃ３、及び構造Ｉ−Ｃ４において、ｍ及びｎは各々独立して、１、２、３、または４である。言い換えると、分子のフェニル環は各々独立して、１〜４個のＲ１基を含み得る。Ｒ１基の各々は独立して、式Ｉについて上に定義されるように基から選択され得る。
【００４３】
式Ｉの例として、以下の化合物が挙げられる。
【化２８】
2021534221.tif 000030
【化２９】
2021534221.tif 000031
【化３０】
2021534221.tif 000032
【化３１】
2021534221.tif 000033
【化３２】
2021534221.tif 000034
【化３３】
2021534221.tif 000035
【００４４】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＳＹＣ−９４４（化合物２−８）（本明細書ではＭＣＢ−６１３とも称される）である。いくつかの実施形態では、化合物は、ＳＹＣ−９４４（化合物２−８）（本明細書ではＭＣＢ−６１３とも称される）ではない。いくつかの実施形態では、化合物は、化合物９−２、化合物９−８、化合物１０−１、または化合物１０−２である。
【００４５】
ＩＩ．化合物の作成方法
本明細書に記載される化合物は、様々な方法で調製することができる。化合物は、様々な合成方法を使用して合成することができる。これらの方法の少なくともいくつかは、有機合成化学の分野で既知である。本明細書に記載される化合物は、容易に入手可能な出発物質から調製することができる。最適な反応条件は、使用される特定の反応物または溶媒によって変化し得るが、そのような条件は、日常的な最適化の手順により、当業者により決定され得る。
【００４６】
式Ｉの変形例には、各化合物について記載される様々な構成要素の加算、減算、または移動が含まれる。同様に、１つ以上のキラル中心が分子内に存在する場合、すべての可能なキラルバリアントが含まれる。さらに、化合物合成は、様々な化学基の保護及び脱保護を伴い得る。保護及び脱保護の使用、ならびに適切な保護基の選択は、当業者によって決定され得る。保護基の化学は、例えば、Ｗｕｔｓ，Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，５ｔｈ．Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２０１４に見出され得、それは参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【００４７】
本明細書に記載される化合物を生成する反応は、有機合成の当業者によって選択され得る溶媒中で実施され得る。溶媒は、反応が実施される条件下、すなわち温度及び圧力下で、出発物質（反応物）、中間体、または生成物と実質的に非反応性であり得る。反応は、１つの溶媒または１つを超える溶媒の混合物中で実施され得る。生成物または中間体の形成は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法に従って監視され得る。例えば、生成物の形成は、核磁気共鳴分光法（例えば、１Ｈ−ＮＭＲまたは１３Ｃ−ＮＭＲ）、赤外分光法、分光光度法（例えば、ＵＶ−可視）、もしくは質量分析法などの分光手段、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もしくは薄層クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって監視され得る。
【００４８】
本明細書に記載される化合物を合成するための例示的な方法は、以下の実施例１及び参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／１０９４７０号に提供されている。
【００４９】
ＩＩＩ．薬学的製剤
本明細書に記載される化合物またはその誘導体は、薬学的組成物で提供され得る。意図される投与様式に応じて、薬学的組成物は、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル、粉末、液体、または懸濁液などの固体、半固体、または液体の剤形、好ましくは、正確な投与量の単回投与に好適な単位剤形であり得る。組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせた治療有効量の本明細書に記載される化合物またはその誘導体を含み、さらに、他の医薬剤、薬学的剤、担体、または希釈剤を含み得る。薬学的に許容されるとは、許容されない生物学的効果を引き起こすことなく、または薬学的組成物に含まれている他の構成成分と有害な様式で相互作用することなく、選択された化合物とともに個体に投与され得る、生物学的でないかまたはそうでなければ望ましくないものでない物質を意味する。
【００５０】
本明細書で使用される場合、担体という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または薬学的製剤で使用するための当該技術分野で周知の他の物質を包含する。組成物で使用するための担体の選択は、組成物の意図された投与経路に依存するであろう。これらの物質を含む薬学的に許容される担体及び製剤の調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｐａ．，２００５に記載されている。生理的に許容される担体の例には、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、及び他の有機酸を含む緩衝液などの緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＩＣＩ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）（ＢＡＳＦ；Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００５１】
非経口的注射に好適な本明細書に記載される化合物またはその誘導体を含む組成物は、生理学的に許容される水性または非水性の滅菌溶液、分散液、懸濁液または乳剤、及び滅菌注射用溶液または分散液に再構成される滅菌粉末を含み得る。好適な水性及び非水性の担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例として、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、それらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。
【００５２】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントも含み得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって促進することができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどもまた含まれ得る。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【００５３】
本明細書に記載される化合物またはその誘導体の経口投与のための固体剤形は、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、及び顆粒剤を含む。そのような固体剤形において、本明細書に記載される化合物またはその誘導体は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの不活性常用賦形剤（もしくは担体）、または（ａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアカシア、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定の複合ケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム、（ｅ）溶液遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、及びモノステアリン酸グリセロール、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリン及びベントナイト、ならびに（ｉ）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含んでもよい。
【００５４】
類似の種類の固形組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量のポリエチレングリコール、及び同様物としてそのような賦形剤を使用して、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。
【００５５】
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、及び顆粒剤などの固体剤形は、腸溶コーティング及び当該技術分野で既知の他のものなどのコーティング及びシェルを用いて調製することができる。これらは、鎮静剤を含んでもよく、また、腸管のある特定の部分において、活性化合物（単数または複数）を遅延様式で放出するような組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質及びワックスである。活性化合物はまた、適切な場合、上述の賦形剤のうちの１つ以上とともにマイクロカプセル化された形態であってもよい。
【００５６】
本明細書に記載される化合物またはその誘導体の経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容される乳剤、溶液、懸濁液、シロップ剤、及びエリキシル剤を含む。活性化合物に加えて、液体投与形態は、例えば、水または他の溶媒などの当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、可溶化剤、ならびに乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタン脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物などを含み得る。
【００５７】
不活性希釈剤以外に、組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味剤、香料、及び芳香剤などの追加の薬剤を含み得る。
【００５８】
活性化合物に加えて、懸濁液は、追加の薬剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガント、またはこれらの物質の混合物などを含み得る。
【００５９】
直腸投与用の本明細書に記載される化合物またはその誘導体の組成物は、任意に、常温では固体であるが体温では液体であり、したがって直腸及び膣腔内で溶融し、活性成分を放出する好適な非刺激性賦形剤または担体、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックスと、化合物とを混合することにより調製することができる坐剤である。
【００６０】
本明細書に記載される化合物またはその誘導体の局所投与のための剤形には、軟膏、粉末、スプレー、及び吸入剤が含まれる。本明細書に記載される化合物またはその誘導体は、生理学的に許容される担体、及び必要であり得る場合、任意の防腐剤、緩衝剤、または噴霧剤とともに、滅菌条件下で混合される。眼科用製剤、軟膏、粉末、及び溶液もまた、組成物の範囲内であることが企図される。
【００６１】
組成物は、本明細書に記載される化合物のうちの１つ以上及び薬学的に許容される担体を含み得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー応答などを起こさずに対象の組織と接触させて使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比と見合うものであり、それらの意図された使用に効果的である本明細書に記載される化合物の塩またはその誘導体、ならびに可能な場合、本明細書に記載される化合物の双性イオン形態を指す。塩という用語は、本明細書に記載される化合物の比較的非毒性の無機及び有機酸付加塩を指す。これらの塩は、化合物の単離及び精製中にｉｎ  ｓｉｔｕで調製され得るか、またはその遊離形態の精製された化合物を好適な有機酸もしくは無機酸と別々に反応させ、そのように形成された塩を単離することにより調製され得る。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、メシル酸ナフチル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、メタンスルホン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩などが含まれる。これらは、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及び同等物などのアルカリ及びアルカリ土類金属、ならびにこれらに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオンに基づくカチオンを含み得る。（少なくとも、そこに教示されている組成物については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｍ．Ｂａｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７７）６６，１を参照されたい。）
【００６２】
本明細書に記載される化合物及び組成物またはその薬学的に許容される塩の投与は、治療有効量の本明細書に記載される化合物及び組成物または本明細書に記載されるその薬学的に許容される塩を、障害を治療するのに有効な期間使用して実施することができる。本明細書に記載される化合物及び組成物または本明細書に記載されるその薬学的に許容される塩の有効量は、当業者によって決定され得、哺乳動物に対して、１日あたり約０．５〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物の例示的な投与量を含み、それは単回用量または１日あたり１〜４回などの個別の分割用量の形態で投与され得る。あるいは、投与量は、１日あたり約０．５〜約１５０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約０．５〜約７５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約０．０５〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約０．１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約０．５〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約２０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約２．５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日あたり約１．０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、もしくは１日あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、またはその中で導出可能な任意の範囲であり得る。任意に、投与量は、１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物である。任意に、投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。任意に、投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇである。
【００６３】
当業者は、任意の特定の対象に対する特定の用量レベル及び投与頻度が変化してもよく、用いられる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、対象の種、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事、投与の様式及び時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、ならびに特定の状態の重症度を含む様々な要因に依存することを理解するであろう。
【００６４】
製剤において用いられる正確な用量はまた、投与経路、及び疾患または障害の重篤度に依存し、専門家及び各対象の状況の判断に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導された用量反応曲線から外挿することができる。さらに、投与経路に応じて、当業者は、対象の細胞、組織、及び／または器官における所望のレベルの応答のための血漿濃度をもたらす用量を決定する方法を知っているであろう。
【００６５】
ＩＶ．使用方法
対象における心筋梗塞または他の虚血性損傷（例えば、脳卒中）を治療するための方法が本明細書に提供される。方法は、有効量の本明細書に記載される１つ以上の化合物もしくは組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを対象に投与することを含む。有効量は、方法における化合物の量を説明するために使用される場合、所望の薬理学的効果または他の生物学的効果を達成する化合物の量を指す。
【００６６】
また、インビトロで投与される濃度に対応する対象における標的細胞でのインビボ濃度が達成されるように、本明細書に記載される１つ以上の化合物のある量を対象に投与することを含む方法も企図される。
【００６７】
心筋梗塞に罹患した対象における心筋梗塞サイズを低減する方法が本明細書にさらに記載される。方法は、有効量の本明細書に記載される１つ以上の化合物または組成物を対象に投与することを含む。心筋梗塞サイズは、心筋梗塞に罹患した未治療の対象（例えば、心筋梗塞に罹患しており、かつ心筋梗塞のいかなる治療も投与されていない対象、または心筋梗塞に罹患しており、かつ本明細書に記載される化合物もしくは組成物以外の治療薬を投与されている対象）の心筋梗塞サイズと比較して、少なくとも５％低減され得る。任意に、心筋梗塞サイズは、心筋梗塞に罹患した未治療の対象の心筋梗塞サイズと比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減され得る。本明細書に記載される化合物及び組成物はまた、心筋梗塞に罹患した対象における心筋細胞の喪失を予防または低減するのに有用である。心筋梗塞に罹患した対象における心筋細胞の喪失を予防または低減するための方法は、有効量の本明細書に記載される１つ以上の化合物または組成物を対象に投与することを含む。
【００６８】
対象における心臓血管機能の改善、心臓血管灌流の改善、中枢神経系血管機能の改善、中枢神経系血管灌流の改善、創傷治癒の促進、及び／または肥大型心筋症の予防もしくは治療のための方法が本明細書にさらに記載される。方法は、有効量の本明細書に記載される１つ以上の化合物または組成物を対象に投与することを含む。任意に、対象は、心筋梗塞または脳卒中などの虚血性損傷に罹患している。任意に、対象は、高齢の個体、肥満の個体、糖尿病の個体、代謝症候群に罹患している個体、煙に晒されている個体（例えば、喫煙者及び長期間副流煙に晒されている個体）、血圧、血中コレステロール、もしくはトリグリセリドレベルの上昇に罹患している個体、または自己免疫状態に罹患している個体である。
【００６９】
対象における心筋梗塞の治療、心筋梗塞サイズの低減、心筋細胞喪失の予防もしくは低減、心臓血管機能の改善、心臓血管灌流の改善、中枢神経系血管機能の改善、中枢神経系血管灌流の改善、創傷治癒の促進、及び／または肥大型心筋症の予防もしくは治療のための方法は、１つ以上の追加の薬剤を対象に投与することをさらに含み得る。本明細書に記載される１つ以上の追加の薬剤及び化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、併用、同時、または連続投与を含む、任意の順序で投与することができる。連続投与は、最大数日間隔の時間間隔の順序での投与であり得る。方法はまた、１つ以上の追加の薬剤及び／または本明細書に記載される化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグの２回以上の投与を含み得る。１つ以上の追加の薬剤及び本明細書に記載される化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグの投与は、同じまたは異なる経路によって、同時にまたは連続であり得る。
【００７０】
追加の治療薬には、これらに限定されないが、抗血小板剤、スタチン、ベータ遮断薬、及びレニン−アンジオテンシン−アルドステロン系（ＲＡＡＳ）遮断薬（例えば、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤及びアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ））が含まれる。本明細書に記載される追加の治療薬として有用な抗血小板剤の例示的で非限定的な例には、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニスト（例えば、アブシキシマブ、エプチフィバチド、及びチロフィバン）、ジピリダモール、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、インドメタシン、及びスルフィンピラゾン）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体アンタゴニスト（例えば、クロピドグレル及びチクロピジン）、及びホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、シロスタゾール）が挙げられる。
【００７１】
本明細書に記載される追加の治療薬として有用なスタチンの例示的で非限定的な例には、アトルバスタチン、セリバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、及びピタバスタチンが挙げられる。
【００７２】
本明細書に記載される追加の治療薬として有用なベータ遮断薬の例示的な例には、これらに限定されないが、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、フマル酸ビソプロロール、カルテオロール、カルベジロール、エスモロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、及びチモロールが挙げられる。
【００７３】
本明細書に記載される追加の治療薬として有用なレニン−アンギオテンシン−アルドステロン系（ＲＡＡＳ）遮断薬（例えば、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤及びアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ））の例示的な例には、これらに限定されないが、アリスキレン、エナルキレン、レミキレム、ベナゼプリル、ベナゼプリラト、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル、フォシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、ロサルタン、バルサルタン、イルベサルタン、カンデサルタン、テルミサルサン、タソサルタン、エプロサルタン、スピロノラクトン、及びエプレレノンが挙げられる。
【００７４】
前述の治療薬のいずれも、本明細書に記載される組成物と任意の組み合わせで使用することができる。組み合わせは、併用して（例えば、混合物として）、別々であるが同時に（例えば、同じ対象への別々の静脈内ラインを介して）、または連続して（例えば、化合物または薬剤のうちの１つが最初に与えられ、次に２つ目が与えられる）のいずれかで投与される。したがって、組み合わせという用語は、２つ以上の薬剤の併用、同時、または連続投与を指すために使用される。
【００７５】
任意に、本明細書に記載される化合物または治療薬は、外科手術（例えば、冠状動脈バイパス手術）、血管形成術、ステント留置術、または別の移植手順と組み合わせて投与してもよい。
【００７６】
本明細書に記載される方法及び化合物は、予防的処置及び治療的処置の両方に有用である。予防的使用のために、治療有効量の本明細書に記載される化合物及び組成物またはそれらの薬学的に許容される塩は、発症前（例えば、心筋梗塞の明らかな兆候の前）、早期発症中（例えば、心筋梗塞の初期兆候及び症状時）、または心筋梗塞の発生後に対象に投与される。予防的投与は、心筋梗塞の症状の出現前に数日から数年間行うことができる。治療的処置は、心筋梗塞の発生後に、治療有効量の本明細書に記載される化合物及び組成物またはそれらの薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。
【００７７】
本明細書の予防的及び治療的処置のための方法は、任意に、心筋梗塞または脳卒中などの虚血性損傷に罹患しているか、または罹患するリスクが高い対象（例えば、肥満の個体、高齢の個体、または心筋梗塞もしくは脳卒中などの虚血性損傷に以前に罹患した個体）を選択することを含む。当業者は、例えば、疾患または状態の個人歴または家族歴、臨床検査（例えば、遺伝子検査）などを含む、様々な予後及び診断方法を使用して、そのような決定を行うことができる。任意に、本明細書の方法は、心筋梗塞に罹患した対象がその後の心筋梗塞に罹患するのを防ぐために使用され得る。
【００７８】
本明細書に記載される化合物及び組成物またはその薬学的に許容される塩は、限定されないが、小児及び高齢者の集団を含むヒト、ならびに動物、例えば、獣医用途における心筋梗塞の治療、心筋梗塞サイズの低減、心筋細胞喪失の予防もしくは低減、心臓血管機能の改善、創傷治癒の促進、及び／または肥大型心筋症の予防もしくは治療に有用である。
【００７９】
Ｖ．キット
対象における心筋梗塞の治療、心筋梗塞サイズの低減、心筋細胞喪失の予防もしくは低減、心臓血管機能の改善、創傷治癒の促進、及び／または肥大型心筋症の予防もしくは治療のためのキットも本明細書に提供される。キットは、本明細書に記載される化合物または組成物のうちのいずれかを含み得る。例えば、キットは、式Ｉの１つ以上の化合物を含み得る。キットには、抗血小板剤、スタチン、ベータ遮断薬、レニン−アンジオテンシン−アルドステロン系（ＲＡＡＳ）遮断薬（例えば、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤及びアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ））、及びこれらの組み合わせなどの１つ以上の追加の薬剤をさらに含み得る。
【００８０】
キットは、本明細書に記載される化合物または組成物のうちのいずれかの経口製剤を含み得る。キットは、本明細書に記載される化合物または組成物のうちのいずれかの静脈内または腹腔内製剤を含み得る。キットはさらに、キットの使用説明書（例えば、対象を治療するための説明書）、容器、化合物もしくは組成物を投与するための手段（例えば、シリンジ）、及び／または担体を含み得る。
【００８１】
本明細書で使用される場合、治療、治療する、または治療することという用語は、疾患もしくは状態の１つ以上の症状を低減する方法を指す。したがって、開示される方法において、治療は、疾患もしくは状態の１つ以上の症状の重症度の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低減を指し得る。例えば、疾患を治療するための方法は、対照と比較して、対象における疾患の１つ以上の症状または兆候（例えば、心筋梗塞のサイズ）の５％低減がある場合に治療であると見なされる。本明細書で使用される場合、対照は、未治療の状態（例えば、心筋梗塞に罹患した未治療の対象における心筋梗塞サイズ）を指す。したがって、この低減は、自然レベルまたは対照レベルと比較して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または５％〜１００％の間の任意の低減パーセントであり得る。治療が、疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状の治癒または完全な消失を必ずしも指さないことが理解される。
【００８２】
本明細書で使用される場合、疾患もしくは障害を予防する、予防すること、及び予防という用語は、対象が疾患もしくは障害の１つ以上の症状を示し始める前、またはそれとほぼ同時に起こる、例えば、組成物または治療薬の投与の動作を指し、それは疾患もしくは障害の１つ以上の症状の発症または重症度を阻害または遅延させる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、減少、低減、または阻害に関する言及は、対照レベルと比較して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の変化を含む。このような用語は、完全な排除を含み得るが、必ずしもそれを含むとは限らない。
【００８４】
本明細書で使用される場合、対象とは、哺乳動物及び非哺乳動物の両方を意味する。哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、類人猿及びサル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ラット、マウス、ブタ、ならびにヤギが含まれる。非哺乳動物には、例えば、魚及び鳥が含まれる。
【００８５】
本出願を通じて、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物のそれらの全体における開示は、本出願に参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
以下の実施例は、本明細書に記載される方法及び組成物のある特定の態様をさらに説明することを意図しており、特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００８７】
実施例１：化合物の合成
合成用のすべての化学物質は、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）またはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。化合物の同一性は、Ｖａｒｉａｎ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）４００−ＭＲ分光計での１ＨＮＭＲによって特徴付けられた。合成された化合物の純度は、２５４ｎｍのＵＶでモニタリングして、ＺｏｒｂａｘＣ１８（またはＣ８）カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣによって決定した。報告された化合物の純度は、＞９５％であることがわかった。
【００８８】
１−シクロプロピルピペリジン−４−オンの合成：
【化３４】
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シクロプロピルアミン（６．９ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）及びアクリル酸エチル（２２．３ｍＬ、２１０ｍｍｏｌ、２．１当量）を、無水エタノール（５０ｍＬ）に溶解した。混合物を室温（ｒｔ）で４日間撹拌した。揮発物を真空中で除去して粗油を得、それをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１０：１〜１：１のｎ−ヘキサン：酢酸エチル）により精製して、ジエチル３，３’−（シクロプロピルアザンジイル）ジプロパノエートを無色の液体として得た（１５．６８ｇ、６１％）。
【００８９】
水素化ナトリウム（油中６０％分散液、３．０ｇ、７５ｍｍｏｌ、１．５当量）及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、３０ｍＬ）をオーブン乾燥フラスコに入れ、それにＴＨＦ（２０ｍＬ）中の３，３’−（シクロプロピルアザニイル）ジプロパノエート（１２．８ｇ、５０ｍｍｏｌ）ジエチルの溶液を滴下で添加した。次に、無水エタノール（２．９ｍＬ、５０ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、得られた混合物を２４時間還流で撹拌した。反応物を飽和塩化アンモニウム（５０ｍＬ）でクエンチした。混合物をジエチルエーテル（３×１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を水及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。揮発物を真空中で除去して粗油を得、それをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１０：１〜２：１のｎ−ヘキサン：酢酸エチル）により精製して、１−シクロプロピルピペリジン−４−オンを無色の液体として得た（４．５２ｇ、収率６５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ２．９２（ｔ、Ｊ＝６．２Ｈｚ、４Ｈ）、２．４２（ｔ、Ｊ＝６．２Ｈｚ、４Ｈ）、１．８０〜１．７０（ｍ、１Ｈ）、及び０．５５〜０．４７（ｍ、４Ｈ）。
【００９０】
１−イソペンチルピペリジン−４−オンの合成：
【化３５】
2021534221.tif 000037
ピペリジン−４−オン塩酸塩（１３．５６ｇ、１００ｍｍｏｌ）、１−ブロモ−３−メチルブタン（１４．４ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ、１．２当量）、及び炭酸カリウム（２７．６ｇ、２００ｍｍｏｌ、２．０当量）をアセトニトリル／水（５０／５０ｍＬ）混合溶媒に溶解した。混合物を還流で１２時間撹拌した。混合物を室温に冷却し、ジエチルエーテル（３×１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を水及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。揮発物を真空中で除去して粗油を得、それをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１０：１〜２：１のｎ−ヘキサン：酢酸エチル）により精製して、１−イソペンチルピペリジン−４−オンを無色の液体として得た（１０．３２ｇ、収率６１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ２．７１（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、４Ｈ）、２．４３（ｔ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、６Ｈ）、１．６１（セプテット、Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．４０（ｔｄ、Ｊ＝７．６、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、及び０．９０（ｄ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、６Ｈ）。
【００９１】
α，β−不飽和ケトンの一般的な合成方法：
【化３６】
2021534221.tif 000038
Ｎ−保護ピペリジン−４−オン（５ｍｍｏｌ）及びアルデヒド（１１ｍｍｏｌ、２．２当量）を酢酸（１０ｍＬ）に溶解し、それに濃縮した塩酸（３ｍＬ）を添加した。混合物を室温で１２時間撹拌した。反応物を飽和重炭酸ナトリウムによって注意深くクエンチした。混合物を酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を水及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。揮発物を真空中で除去して粗油を得、それをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、５：１〜１：１のｎ−ヘキサン：酢酸エチル）により精製して、α，β−不飽和ケトンを得た（収率６０〜７６％）。化合物９−２、９−８、１０−１、及び１０−２を含む、本明細書に記載される化合物を、一般的な方法に従って調製した。これらの化合物の各々の特性を以下に提供する。
【００９２】
（３Ｅ，５Ｅ）−１−シクロプロピル−３，５−ビス（３−メトキシベンジリデン）ピペリジン−４−オン（９−２）。
【化３７】
2021534221.tif 000039
黄色の粉末。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．７５（ｓ、２Ｈ）、７．３６（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．０３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、６．９６（ｓ、２Ｈ）、６．９３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．９９（ｓ、４Ｈ）、３．８５（ｓ、６Ｈ）、１．９６〜１．９１（ｍ、１Ｈ）、０．５１〜０．４７（ｍ、２Ｈ）、及び０．４１〜０．３８（ｍ、２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１８７．６、１５９．７、１３６．７、１３６．４、１３３．８、１２９．７、１２３．０、１１６．１、１１４．７、５４．０、５１．３、３８．１、及び６．９；ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ］＋３７６．５。
【００９３】
（３Ｅ，５Ｅ）−１−シクロプロピル−３，５−ビス（ピリジン−３−イルメチレン）ピペリジン−４−オン（９−８）。
【化３８】
2021534221.tif 000040
オレンジ色の粉末。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．６７（ｓ、２Ｈ）、８．５９（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．７３（ｓ、２Ｈ）、７．７０（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．３７（ｄｄ、Ｊ＝８．０、４．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．９９（ｓ、４Ｈ）、１．９９〜１．９４（ｍ、１Ｈ）、０．５８〜０．５１（ｍ、２Ｈ）、及び０．４７〜０．４２（ｍ、２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１８７．２、１５１．２、１４９．９、１３７．３、１３５．８、１３２．４、１３１．１、１２３．６、５５．８、４０．１、及び６．９；ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ］＋３１８．５。
【００９４】
（３Ｅ，５Ｅ）−１−イソペンチル−３，５−ビス（２−メトキシベンジリデン）ピペリジン−４−オン（１０−１）。
【化３９】
2021534221.tif 000041
化合物１０−１を塩酸塩（黄色の粉末）として調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１３．１９（ｂｒ、１Ｈ）、８．３６（ｓ、２Ｈ）、７．４５（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．１０（ｄ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．０３（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、６．９７（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、４．４９（ｄ、Ｊ＝１５．６Ｈｚ、２Ｈ）、４．２８（ｄ、Ｊ＝１５．６Ｈｚ、２Ｈ）、３．８８（ｓ、６Ｈ）、２．８７〜２．８２（ｍ、２Ｈ）、１．４３（セプテット、Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．３０（ｔｄ、Ｊ＝７．６、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、及び０．７０（ｄ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１８２．２、１５８．２、１４１．４、１３２．５、１３０．５、１２４．１、１２２．２、１２０．９、１１１．３、５５．７、５０．８、４９．６、３２．８、２６．０、及び２２．１；ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ］＋４０６．５。
【００９５】
（３Ｅ，５Ｅ）−１−イソペンチル−３，５−ビス（３−メトキシベンジリデン）ピペリジン−４−オン（１０−２）。
【化４０】
2021534221.tif 000042
化合物１０−２を塩酸塩（黄色の粉末）として調製した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１３．４６（ｂｒ、１Ｈ）、８．１７（ｓ、２Ｈ）、７．４０（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．０１（ｄｄ、Ｊ＝８．０、２．３Ｈｚ、２Ｈ）、６．８９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、６．８６（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、２Ｈ）、４．５９（ｄ、Ｊ＝１５．６Ｈｚ、２Ｈ）、４．４８（ｄ、Ｊ＝１５．６Ｈｚ、２Ｈ）、３．８４（ｓ、６Ｈ）、２．８９〜２．８４（ｍ、２Ｈ）、１．４６（セプテット、Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．３７（ｔｄ、Ｊ＝７．６、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、及び０．７２（ｄ、Ｊ＝６．６  Ｈｚ、６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１８１．８、１６０．０、１４４．８、１３４．３、１３０．４、１２３．９、１２２．２、１１６．３、１１６．１、５５．５、５０．５、５０．２、３２．７、２６．０、及び２２．１；ＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ＋Ｈ］＋４０６．５。
【００９６】
実施例２：心筋梗塞後の心臓保護の促進及び修復
本明細書のデータは、心筋梗塞後の本明細書に記載される化合物の投与が、心臓の保護及び修復を促進することを示す。他の機能の中で、代表的な化合物は、梗塞サイズの増加、心肥大、及びコラーゲン沈着を予防した。化合物は、心臓の梗塞後の機能を著しく改善した。化合物はまた、血管新生を増加させ、心臓のβ酸化を促進し、拡張型心筋症に関連する代謝産物であるメチルグルタリルカルニチンのレベルを著しく減少させた。
【００９７】
方法
すべての動物研究及びプロトコルは、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認され、実験動物の管理及び使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに厳密に準拠して実行した。成体（８〜１０週齢）ＩＣＲ（ＣＤ１）マウスをすべての研究に使用した。
【００９８】
成体マウスの心不全のモデル．８〜１０週齢のマウスにおいて心筋梗塞（ＭＩ）を誘発するために、左動脈前下行枝（ＬＡＤ）を永久結紮した。簡潔には、マウスに２％イソフルランで麻酔し、次いで挿管した。４番目または５番目の肋間隙を通して開胸術を行うことによって心臓を露出させ、８−０ナイロン縫合糸をＬＡＤ動脈の周りに結んだ。力価９×１０９ｐｆｕ／ｍｌの１０ｕｌのアデノウイルスＳＲＣ−３（Ａｄ−ＳＲＣ−３）またはアデノウイルスＧＦＰ（Ａｄ−ＧＦＰ）を、左室下行冠動脈近くの前自由壁に注射した。細胞周期侵入を評価するために、類似体５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ；０．２ｇ／Ｌ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＳＣ−２８４６２８Ａ）を、９日間の実験期間飲料水に添加した。Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ１０３３９）を使用して細胞増殖を測定した。ＭＣＢ−６１３の初回用量は、手術の２時間後に２０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。その後、同じ用量の注射をさらに６日間行い、次いで、９週目及び１６週目に３日間繰り返し用量を与えた。分析のために示された時点でマウスを採取した。
【００９９】
心エコー図．心臓機能は、心エコー図（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ、Ｖｅｖｏ  ２１００、４０Ｍｈｚ−５５０Ｓプローブ）によって決定した。乳頭筋と横方向のＢモードでアラインメントした後、Ｍモード画像で心臓機能を測定した。
【０１００】
組織学的分析．心臓全体を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、７μｍ間隔で切片化した。各スライドには３または１０の切片があり、頂点から始まり、縫合結紮部位で終了した（約３０〜５０のスライド）。乳頭レベルの切片（スライド２０〜３０）をピクロシリウスレッドで染色して、線維症の領域を特定した。梗塞サイズは、長さベースのアプローチを使用して決定された。
【０１０１】
免疫染色分析．免疫組織化学及び免疫蛍光染色実験を、ＦＦＰＥ（ホルマリン固定及びパラフィン包埋切片）で行った。アポトーシス細胞を検出するためのＴＵＮＥＬ染色は、ＤｅａｄＥｎｄ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍの製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＧＳ３２５０）を使用して行った。
【０１０２】
単一細胞転写プロファイリングのための心臓細胞の単離．頸椎脱臼の前に、マウスを麻酔の手術面の下に置いた。心臓を取り出し、細胞を、１ｍｇ／ｍＬで１５分間、コラゲナーゼを含む、カルシウムを含まないｐＨ７．４のタイロード溶液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、７４．５５ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ、０．３３ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．２５ｍｍのＨＥＰＥＳ、２２ｍＭグルコース）とのランゲンドルフ逆行性灌流によって単離した。次いで、心臓を装置から取り出し、ガラスピペットで粉砕する前に、１５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む同じタイロード緩衝液で細かく刻んだ。次いで、心筋細胞を、３００ＲＰＭで３分間の分画遠心分離によってペレット化した。次いで、細胞の非心筋細胞集団を含む上清を、７０ミクロンフィルターにより濾過し、７５０Ｇでペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１．１ｍＬの２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に再懸濁した。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の「染色なし対照」のために０．１ｍＬを除去した。残りの１ｍＬを、４ｕｇ／ｍＬのカルセインブルー及び１０ｍｉｃｒｏＭのＤｙｅＣｙｃｌｅＲｕｂｙとともにインキュベートし、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、細胞を６００Ｇでスピンダウンし、Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ（３０ｎＭ）を含む０．５ｍＬの２％ＦＢＳ／ＰＢＳに再懸濁した。次に、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ｉｉセルソーターを使用して、Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ−、Ｃａｌｃｅｉｎ＋、ＤｙｅＣｙｃｌｅ  Ｒｕｂｙ＋をＰＢＳ中の０．４％ＦＢＳに細胞を分類した。次に、細胞をペレット化し、ＰＢＳ中の１００ｕＬの０．４％ＦＢＳに再懸濁し、カウントして、次いで単一細胞トランスクリプトームプロファイリングのために１０ｘ  ＧｅｎｏｍｉｃｓＣｈｒｏｍｉｕｍシステムに流した。
【０１０３】
代謝プロファイリング．４匹の対照マウス及び４匹のＭＣＢ−６１３処置マウスの心臓を、ＭＩ後２４時間で単離し、１０ｍＭ  ＫＣｌで灌流し、液体窒素で急速凍結し、−８０℃で保存した。１０ｍｇの組織を脂肪酸及びカルニチンについて分析して、３つの正常な肝臓対照試料に正規化された。脂肪酸は、内部標準Ｌ−トリプトファンによって正規化され、カルニチンは内部標準Ｌ−ゼアチンによって正規化された。
【０１０４】
ＲＥＲ、ＶＯ２、及びＶＣＯ２の測定．呼吸交換率（ＲＥＲ）、酸素消費量（ＶＯ２）及び二酸化炭素呼気（ＶＣＯ２）は、マウスが疲労に達するまで、漸増最大運動試験を使用した間接熱量測定によって測定した。
【０１０５】
結果
ＳＲＣ−３の活性化は低い毒性を有する。核内受容体コアクチベーター３（ＮＣＯＡ３）は、ヒトの成体の心臓で、低レベルで発現され、ＳＲＣ−３の活性化による副作用がほとんどないことを示す。加えて、ＭＣＢ−６１３は、インビトロ及びインビボで低い毒性プロファイルを有する。正常なヒトの心臓におけるＮＣＯＡ３の発現を測定し、約１，０００名の剖検ドナーのＧＴＥｘデータベースから分析した筋肉組織と比較した。図１は、正常なヒトの心臓（左パネル）及び筋肉組織（右パネル）におけるＮＣＯＡ３の発現を示すグラフを含む。マッピングされた読み取り１００万あたりのｋｂ遺伝子長あたりの断片（ＦＰＫＭ）を、ｙ軸に示し、データ点は試料を表す。データは、ＮＣＯＡ３の発現レベルごとに分類される。
【０１０６】
ＳＲＣ−３の発現は、心臓における非心筋細胞の増殖を誘発する。アデノウイルス由来のＳＲＣ−３（アデノ−ＳＲＣ３）を、野生型成体マウスの心臓の左室自由壁に注射した。細胞増殖マーカーとして、５−エチニル−２’−デオキシウリジン処理水（ＥｄＵ水）をマウスに与えた。９日後に心臓を採取し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（Ｄａｐｉ）で染色して、核、ＰＣＭ１心筋細胞マーカー、細胞表面マーカー、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）、及び細胞増殖マーカーＥｄＵを特定した。図２は心臓の画像であり、ＳＲＣ−３の発現が野生型成体マウスの心臓において非心筋細胞の増殖を誘発することを示す。
【０１０７】
本明細書に記載される化合物は、心筋梗塞後の心臓機能の早期かつ進行性の喪失から保護する。心筋梗塞後、マウスを本明細書に記載される代表的な化合物で処置した。図３Ａは、心筋梗塞後の薬物治療及び心エコー図測定の実験的タイムラインを示す。ＭＣＢ−６１３または生理食塩水は、結紮の２時間後、及び２４時間ごとにさらに６日間投与した。８週目及び１６週目に週に３回繰り返し注射を行った。図３Ｂに示されるように、心臓重量及び脛骨の長さを１０週目に測定した。６匹のマウスに生理食塩水を投与し、７匹のマウスにＭＣＢ−６１３を投与した。Ｐ＜０．０３。左室駆出率を心エコー図によって決定した（ｎ＝１４、最大１２週間；ｎ＝３、１９週間）（図３Ｃ）。反復測定を使用してＡＮＯＶＡによってデータを分析し、平均＋／−ＳＥＭとして表した。Ｐ＜０．００１。図３Ｄは、心筋梗塞後に採取され、コラーゲン線維を視覚化するために染色されたマウスの心臓の画像を含む。具体的には、図３Ｄは、心筋梗塞後１０週間での、梗塞境界ゾーンの４倍及び対応する２０倍の倍率の乳頭筋のレベルでの断面のピクロシリウスレッド染色を示す。梗塞サイズは長さ％として表される。データは、生理食塩水を投与された対照マウスと比較した、ＭＣＢ−６１３処置マウスの梗塞サイズの減少を示す。左室駆出率は、心筋梗塞後に化合物１０−１で処置されたマウスの心エコー図によって決定した（図４を参照されたい）。図８は、心筋梗塞後６週間の乳頭筋レベルでの断面のピクロシリウスレッド染色を示す。梗塞サイズは長さ％として表される。データは、生理食塩水を投与された対照マウスと比較した、化合物１０−１処置マウスの梗塞サイズの減少を示す。
【０１０８】
ＭＣＢ−６１３は、心筋梗塞後の心臓の主要及び副次的な非心筋細胞型の変化を誘発する。成体マウスの心臓の非筋細胞について、包括的な単一細胞転写プロファイリングを行った。単一細胞配列決定を、心筋梗塞後１０週間で心臓の非心筋細胞で行った。細胞クラスターはｔＳＮＥ分析によって生成され、遺伝子発現シグネチャーによって特定した。成体マウスの心臓における非筋細胞の包括的な単一細胞転写プロファイリングを示すプロットについては、図５Ａを参照されたい。図５Ｂは、心筋梗塞後のＭＣＢ−６１３で処置した心臓に存在する異なる細胞型を示す。図５Ｃは、内皮シグネチャーを有する３つの細胞クラスターのベン分析であり、ＭＣＢ−６１３が、心筋梗塞後１０週間で心臓における２つの異なる内皮細胞集団の内皮細胞成長を刺激することを示している。
【０１０９】
ＭＣＢ−６１３は、心臓保護カルニチン代謝産物を増加させる。図６Ａは、心筋梗塞後２４時間のマウスの心臓における長鎖脂肪酸のメタボロミクスを示すヒートマップである。図６Ｂは、心筋梗塞後のマウスの心臓におけるメチルグルタリルカルニチンのメタボロミクスを示すヒートマップである（完全なセットＦＤＲ＝１）。ヒートマップは、ＭＣＢ−６１３が心臓保護カルニチン代謝産物を増加させ、長鎖脂肪酸のβ酸化を増加させ、メチルグルタリルカルニチンを減少させることを示している。
【０１１０】
本明細書に記載される化合物は、ＳＲＣ固有の転写活性を刺激する。Ｇａｌ４応答性ルシフェラーゼレポーター（ｐＧ５−ｌｕｃ）、及びＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインと融合したＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２、またはＳＲＣ−３をコードする構築物（ｐＢＩＮＤ−ＳＲＣ−１、ｐＢＩＮＤ−ＳＲＣ−２、またはｐＢＩＮＤ−ＳＲＣ−３）でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、ＭＣＢ−６１３、化合物１０−１、及び化合物１０−２を含む本明細書に記載される化合物による処理に曝露した。図７の上部パネルは、ＭＣＢ−６１３がＳＲＣの固有の転写活性を選択的に刺激することを示す。図７の中心パネルは、化合物１０−１がＳＲＣの固有の転写活性を選択的に刺激することを示す。図７の下部パネルは、化合物１０−２がＳＲＣの固有の転写活性を選択的に刺激することを示す。
【０１１１】
化合物１０−１は、心筋梗塞後の心臓血管の持久力を改善する。図９は、生理食塩水で処置したマウス（「生理食塩水」；ｎ＝３）、ＭＣＢ−６１３で処置したマウス（「ＭＣＢ−６１３」；ｎ＝３）、及び梗塞のない野生型マウス（「ＷＴ」；ｎ＝２）における漸増最大運動試験の結果を示すグラフを含む。上部パネルは、二酸化炭素の呼気（ＶＣＯ２）を示し、下部パネルは、酸素消費量（ＶＯ２）を示す。図９から代表的な化合物１０−１に示されるように、本明細書に記載される化合物は、心筋梗塞後の心臓血管及び末梢血管の持久力を改善する。
【０１１２】
概要
本明細書に提示されるデータによって示されるように、本明細書に記載される化合物は、インビボで血管新生を刺激し、損傷した心筋の機能を改善する。したがって、本明細書に記載される化合物は、慢性創傷の修復及び予防、血管新生の促進、血管疾患における血流の回復、ならびに代謝リモデリングを予防することによる脆弱な心筋の有害な構造リモデリングの抑制に有用な例外的な治療薬である。これらの化合物は、冠動脈不全後の心臓の修復に有用である。
【０１１３】
実施例３：ステロイド受容体コアクチベーター刺激因子を使用した心筋梗塞後の心臓保護の促進及び修復
筋細胞の喪失、炎症、線維症、及び心臓駆出率の減少を伴う心臓組織の進行性リモデリングは、心筋梗塞（ＭＩ）誘発性心不全の特徴である。ＭＩ後の重要な治療目標は、心筋を保護し、梗塞サイズを最小化し、心不全への進行を予防し、機能回復を支持することである。本明細書のデータは、本明細書に記載されるステロイド受容体コアクチベーターの小分子刺激因子が、新しい血管の成長を促進し、ＭＩ後の心臓機能を改善することを示す。代表的な化合物を通して示されるように、小分子受容体コアクチベーター刺激因子の投与は、梗塞サイズ、アポトーシス、心肥大、コラーゲン沈着を減少させ、心筋細胞のエネルギー経路を活性化する。単一細胞転写プロファイリングにより、心臓機能の改善に関連する異なる間質細胞型及び転写応答が特定された。本明細書に記載される化合物は、ＭＩ後の心臓機能の早期かつ進行性の喪失を予防するための新規の治療選択肢を掲示する。
【０１１４】
方法
動物．すべての動物研究及びプロトコルは、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認され、実験動物の管理及び使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに厳密に準拠して実行した。成体（８〜１０週齢）ＩＣＲ（ＣＤ１）マウスをすべての研究に使用した。
【０１１５】
小分子刺激因子治療のための血管新生アッセイ．５〜７日齢の特定病原体除去（ＳＰＦ）認定受精鶏卵（白いレグホン）を使用して、絨毛尿膜（ＣＡＭ）にアクセスした。ＣＡＭの総血管面積は、薬物の適用前に得られた画像を使用して測定した。０．６μＭの濃度のＭＣＢ−６１３（１００μＬ）をＣＡＭの表面に局所的に適用した。ＣＡＭの血管面積を、薬物の毎日の適用後、毎日モニタリングした。実験中を通してビヒクル対照を維持した。治療を４日間継続し、その終了時に画像閾値法（ＩｍａｇｅＪ）を使用してＣＡＭの総血管面積を定量化した。血管面積における成長パーセントを、対照卵及び処理卵について比較した。条件ごとにｎ＝６個の卵。この実験を３回繰り返した。
【０１１６】
薬物処置されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いた血管新生アッセイ．５〜７日齢のＳＰＦ認定受精鶏卵（白いレグホン）を使用して、絨毛尿膜（ＣＡＭ）にアクセスした。マウスの胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、０．６μＭのＭＣＢ−６１３で２４時間処理した。処理後、２００万個のＭＥＦを、マグネシウム及びカルシウムを含む６０μＬのＰＢＳならびに４０μＬのマトリゲル（２Ｍ／卵）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に懸濁した。次いで、ＭＥＦをピペッティングにより十分に混合し、ＣＡＭの表面に移した。ＣＡＭの血管面積を、毎日モニタリングした。実験中を通してビヒクル対照を維持した。ＭＥＦを、ＣＡＭ表面で４日間成長させ、その終了時に画像閾値法（ＩｍａｇｅＪ）を使用してＣＡＭの総血管面積を定量化した。次いで、血管面積における成長パーセントを、対照卵および処理卵（ＭＥＦ処理対未処理）で比較した。条件ごとにｎ＝６個の卵。
【０１１７】
レポーターアッセイ．心臓線維芽細胞を６ウェルプレートに播種し、ＧＡＬ４応答性ルシフェラーゼレポーター（ｐＧ５−ｌｕｃ）及びＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４−ＤＢＤ）完全長ＳＲＣ−１、−２、もしくは−３融合構築物（ｐＢＩＮＤ−ＳＲＣ−１、ｐＢＩＮＤ−ＳＲＣ−２、またはｐＢＩＮＤ−ＳＲＣ−３）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用したｐＢＩＮＤ対照の発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を６μＭのＭＣＢ−６１３またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理し、一晩インキュベートした。処理後の細胞を溶解し、Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して総タンパク質を単離した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して測定した。相対光単位を測定し、総タンパク質濃度に対して正規化した。
【０１１８】
成体マウスの心不全のモデル．８〜１０週齢のマウスにおいてＭＩを誘発するために、左動脈前下行枝（ＬＡＤ）を永久結紮した。簡潔には、マウスに２％イソフルランで麻酔し、次いで挿管した。４番目または５番目の肋間隙を通して開胸術を行うことによって心臓を露出させ、８−０ナイロン縫合糸をＬＡＤの周りに結んだ。ＭＣＢ−６１３の初回用量は、手術の２時間後に２０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。その後、その日の同じ時刻に同じ用量の注射をさらに６日間行い、次いで、９週目及び１６週目に３日間繰り返し用量を与えた。分析のために示された時点でマウスを採取した。
【０１１９】
心エコー図．心臓機能は、心エコー図（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ、Ｖｅｖｏ  ２１００、４０Ｍｈｚ−５５０Ｓプローブ）によって決定した。乳頭筋と横方向のＢモードでアラインメントした後、Ｍモード画像で心臓機能を測定した。図１１Ａの心臓機能についての動物数は、０日目の対照（１７）；ＭＣＢ−６１３（１５）、１日目の対照（１０）；ＭＣＢ−６１３（１２）、１４日目のビヒクル（１９）；対照（１９）、５６日目の対照（１２）；ＭＣＢ−６１３（１５）、７０日目の対照（８）；ＭＣＢ−６１３（１０）、８０日目の対照（８）；ＭＣＢ−６１３（１１）、１３３日目の対照（３）；及びＭＣＢ−６１３（３）である。
【０１２０】
組織学的分析．心臓全体を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、７μｍ間隔で切片化した。各スライドには３〜１０の切片があり、頂点から始まり、縫合結紮部位で終了した（約３０〜５０のスライド）。乳頭レベルの切片（スライド２０〜３０）をピクロシリウスレッドで染色して、線維症の領域を特定した。梗塞サイズは、長さベースのアプローチを使用して決定された。アポトーシス細胞を検出するためのＴＵＮＥＬ染色は、ＤｅａｄＥｎｄ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＧＳ３２５０）を使用して行った。
【０１２１】
電子顕微鏡法．動物を屠殺し、心臓を素早く取り出し、冷一次固定液（２％パラホルムアルデヒド＋２．５％グルタルアルデヒド＋０．１Ｍカコジル酸緩衝液中の２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ７．４）に直接入れ、それらを断面で切片化し、次いで、冷一次固定液中で４日間保持した。固定後、組織を０．１Ｍカコジル酸緩衝液中の０．１％タンニン酸で染色し、すすぎ、１時間浸透させた、その後、組織をｄＨ２Ｏ中ですすぎ、酢酸ウラニル水溶液で対比染色した。再度、組織をｄＨ２Ｏ中ですすぎ、次いで、エタノールの勾配系列（５０、７０、８０、９０、９５、及び１００％）で脱水した。プラスチック樹脂のエタノールへの希釈をそれぞれ増加させながら、１００％のプラスチックに達するまで、組織を４日間の期間かけてゆっくりと浸潤させた。１００％のプラスチックを３回交換して丸一日浸透させた後、組織を作りたてのＳｐｕｒｒの低粘度樹脂に包埋し、６０℃で一晩重合した。ライカＵＣ７ウルトラミクロトームを使用して、５５〜６５ｎｍの超薄切片をＤｉａｔｏｍｅ  Ｕｌｔｒａ  ４５ダイヤモンドナイフで切断した。切片を１５０個の六角メッシュ銅グリッド上に収集し、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ７５００透過型電子顕微鏡で観察した。画像を、ＡＭＴＸＲ−１６デジタルカメラ及びＡＭＴＩｍａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ、ｖ６０２．６００．５１ソフトウェアを使用して取り込んだ。
【０１２２】
心臓細胞の単離．頸椎脱臼の前に、マウスを麻酔の手術面の下に置いた。心臓を取り出し、細胞を、１ｍｇ／ｍＬで１５分間、コラゲナーゼを含む、カルシウムを含まないｐＨ７．４のタイロード溶液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、７４．５５ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ、０．３３ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．２５ｍｍのＨＥＰＥＳ、２２ｍＭグルコース）とのランゲンドルフ逆行性灌流によって単離した。次いで、心臓を装置から取り出し、ガラスピペットで粉砕する前に、１５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む同じタイロード緩衝液で細かく刻んだ。次いで、心筋細胞を、３００ＲＰＭで３分間の分画遠心分離によってペレット化した。次いで、細胞の非心筋細胞集団を含む上清を、７０ミクロンフィルターにより濾過し、７５０ｇでペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１．１ｍＬの２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に再懸濁した。次いで、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の「染色なし対照」のために０．１ｍＬの混合物を除去した。残りの１ｍＬの混合物を、４μｇ／ｍＬのカルセインブルー及び１０μＭのＤｙｅＣｙｃｌｅＲｕｂｙとともにインキュベートし、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、細胞を６００ｇでスピンダウンし、Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ（３０ｎＭ）を含む０．５ｍＬの２％ＦＢＳ／ＰＢＳに再懸濁した。次に、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ｉｉセルソーターを使用して、Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ−、Ｃａｌｃｅｉｎ＋、ＤｙｅＣｙｃｌｅ  Ｒｕｂｙ＋をＰＢＳ中の０．４％ＦＢＳに細胞を分類した。次に、細胞をペレット化し、ＰＢＳ中の１００μＬの０．４％ＦＢＳに再懸濁し、カウントし、１０ｘ  ＧｅｎｏｍｉｃｓＣｈｒｏｍｉｕｍシステムに通した。
【０１２３】
単一細胞ＲＮＡ配列決定．生のｆａｓｔｑファイルを、ＳＴＡＲとのアラインメント、フィルタリング、バーコードカウント、及びＵＭＩカウントのためにＣｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒ  ２．１．１（１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）にインポートした。細胞クラスター及び差次的に発現される遺伝子を特定するために、Ｒ（バージョン３．４．３）で実装されたＳｅｕｒａｔスイートバージョン３．０．０を使用してＣｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒの結果を分析した。＜２００または＞５，０００の固有の遺伝子が発現している細胞、またはミトコンドリアにマッピングしている読み取りの＞２５％が、品質管理測定として除去された。フィルタリングされたデータを、各試料内で正規化及びスケーリングし、野生型試料と処理済み試料の両方を、統合分析のためにＳｅｕｒａｔのアラインメント手順でアラインメントした。Ｓｅｕｒａｔ内に組み込まれたウィルコクソンの順位和検定を使用して、細胞型または治療にわたって差次的に発現する遺伝子を特定した。遺伝子オントロジー分析は、超幾何分布を利用して濃縮された経路を特定するｐｙｔｈｏｎで開発されたカスタムコードを使用して行った（Ｐ値＜０．０５）。
【０１２４】
梗塞を起こした心臓の細胞間コミュニケーションに対する治療の効果を研究するために、ヒトの精選された推定上のリガンド−受容体対を得た。各細胞型について、Ｐ値＜０．０５及びｌｏｇ２ＦＣ＞０．２５または＜−０．２５のフィルターを適用することにより薬物治療の特徴が得られた。細胞間コミュニケーションは、細胞型Ａ及びＢを連結することによって構築され、リガンドは細胞型Ａで異なって発現されたが、一方で、受容体は細胞型Ｂで異なって発現される。ネットワークはｉｇｒａｐｈ  Ｒパッケージを使用してプロットされた。
【０１２５】
総ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析．配列決定読み取りは、ｔｒｉｍＧａｌｏｒｅソフトウェアを使用してトリミングした。次に、読み取りは、ＨＩＳＡＴを使用してヒトゲノムビルドＵＣＳＣ  ｍｍ１０に対してマッピングしＳｔｒｉｎｇＴｉｅを使用してＧｅｎｃｏｄｅ遺伝子モデルに対して定量化した。遺伝子発現（ＦＰＫＭ）は、Ｒ統計システムを使用して分位数正規化された。腫瘍試料及び正常試料の間で差次的に発現する遺伝子は、ｐ値＜０．０５及び倍数変化１．２５のパラメトリックｔ検定を使用して決定した。経路濃縮分析は、ＧＳＥＡソフトウェアパッケージを使用して実施し、調整されたｑ値で有意性が達成された（ｑ＜０．２５）。ヒートマップは、ｐｙｔｈｏｎでＭａｔｐｌｏｔｌｉｂ、ＮｕｍＰｙ、及びＳｃｉＰｙライブラリを使用して生成した。
【０１２６】
ＲＮＡ単離及びｑＰＣＲ．Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡ単離キットを使用して、細胞から総ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡを、ＶＩＬＯマスターミックス試薬で調製した。ｑＰＣＲ分析は、Ｔｌｒ７、Ｌｃｎ２、及び１８ｓのプライマーを含むＴａｑｍａｎキットを使用して実施した。
【０１２７】
顆粒球の単離．対照またはＭＣＢ−６１３で２４時間処理したマウスの後肢から骨髄細胞を単離した。後肢を取り除き、氷冷ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｃａ／Ｍｇなし）及び２％ＦＢＳに入れた。骨の両端を切断し、２６Ｇ針を使用して２％ＦＢＳを含む氷冷ＨＢＳＳで骨髄を洗い流した。凝集塊を１８Ｇ針で砕き、７０μｍフィルターで濾過し、４００ｇで１０分間４℃で遠心分離した。ペレットをＲＢＣ溶解緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に懸濁し、室温で２分間インキュベートした。ＨＢＳＳ緩衝液（８ｍＬ）を添加し、４００ｇで１０分間４℃でスピンさせた。トリパンブルー色素排除により生細胞をカウントし、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のマウス好中球単離キットを使用して骨髄顆粒球を単離した。
【０１２８】
フローサイトメトリー及び心臓免疫表現型決定．ＭＩ後または偽手術の後２４時間の対照及びＭＣＢ−６１３で処置したマウスから単離した心臓及び脾臓を、消化緩衝液：５００μＬのＤＮＡｓｅ  Ｉ（１０ｍｇ／ｍｌ）、５００μｌのコラゲナーゼＩＩ（５０ｍｇ／ｍｌ）中で、４ｍｌ（１倍で約１２の脾臓に十分である）のＲＰＭＩ  １６４０に消化した。細胞をＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ解離装置に入れ、「ＩＭＰＣ＿ｓｔｅｐ２」で２回実行し、２５℃で１５分間インキュベートした。「ＩＭＰＣ＿ｓｔｅｐ２」プログラムを繰り返し、試料を２５℃でさらに１５分間インキュベートし、続いて「ＩＭＰＣ＿ｓｔｅｐ２」プログラムをもう一度実行した。次いで、４００μＬの４℃停止緩衝液（１倍ＰＢＳ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ）を各試料に添加し、約１００ｇで１秒間遠心分離して、チューブの底に液体を集めた。試料をメッシュフィルターキャップを通して５０ｍＬコニカルチューブに濾過した。次いで、チューブを１ｍＬのＦＡＣ緩衝液で洗浄し、これもフィルターに通した。心臓の調製物はより粘稠であり、２０ｍＬの冷濾過生理食塩水で洗浄した。試料を５００ｇで６分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１ｍＬの４℃のＦＡＣＳ緩衝液に懸濁した。赤血球（ＲＢＣ）の溶解及びブロッキングに続いて、単一細胞懸濁液を免疫細胞パネルで染色し、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを使用して定量化した。次いで、脾臓対照の５００，０００の生存イベントをカウントし、心臓細胞のチューブ全体を記録して分析した。
【０１２９】
ウエスタンブロット．乳鉢及び乳棒器具を使用して、冷凍した心臓全体を微粉砕した。約２０ｍｇの粉末組織を、３００μＬの放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液に添加し、組織ホモジナイザーを使用してホモジナイズした。次いで、試料をローテータープラットフォーム上で、４℃で１時間インキュベートし、続いて１２，０００ｇで１０分間遠心分離して、破片を取り除いた。上清を収集し、今後の使用のために−８０℃で保管した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）試薬系を使用して決定した。細胞溶解物については、１０％グリセロールを含むＮＥＴＮ緩衝液を使用して細胞を溶解し、総タンパク質を単離した。すべての溶解緩衝液には、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤が補充された。組織溶解物タンパク質（３０〜５０μｇ）または細胞溶解物タンパク質（５０〜７０  μｇ）を、４〜１５％勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に充填し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。イムノブロッティングを、ＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２、ＳＲＣ−３、アクチン、及びＨｓｐ９０に対する抗体を使用して実施した。ＨＲＰ複合体化抗ウサギ及び抗マウス二次抗体を、１：２，５００の希釈で使用した。化学発光検出にはＰｉｅｒｃｅ  ＥＣＬを使用した。
【０１３０】
チューブ形成アッセイ．心臓線維芽細胞を、ＤＭＳＯまたは６μＭのＭＣＢ−６１３のいずれかで処理した。処理後の２４時間、ＰＢＳで細胞を２回すすぐことにより薬物を洗い流した。次いで、細胞を内皮細胞増殖培地で２４時間コンディショニングした。コンディショニング後、細胞を、成長因子を低減したマトリゲル（１０ｍｇ／ｍｌ）に播種し、一晩チューブを形成させた。翌日、チューブをＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭで染色し、Ｃｙｔａｔｉｏｎイメージングシステムを使用して画像化した。
【０１３１】
免疫染色．心臓を心臓麻痺性の２０ｍＭ  ＫＣＬ−ＰＢＳで灌流し、次いで、１０％中性緩衝ホルマリンで灌流した後、滴下固定してパラフィンワックスに処理した。次いで、切片（７ミクロン）を切り取り、スライド上に配置した。免疫蛍光法は、最初にパラフィンを除去し、次に切片を再水和することによって行った。その後、抗原賦活化を行った（抗原アンマスキング溶液、トリスベース、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓカタログ番号Ｈ−３３０１；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）。切片を０．１％ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで透過処理し、１％ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ中の１０％ロバ血清でブロッキングし、次いで、ブロッキング溶液中の一次抗体（１：２００ウサギ抗リゾチーム、ａｂｃａｍカタログ番号ＡＢ１０８５０８；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、続いて二次抗体（１：２００ロバ抗ウサギ、Ａｌｅｘａ  ６４７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ−３１５７３；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、次いでローダミン複合体化ＷＧＡ（１：２５０  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓカタログ番号ＲＬ−１０２２）、及びＤＡＰＩ（１：５００  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号６２２４８）とともにインキュベートした。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡で画像を撮影した。ＬＹＺ＋細胞を、左冠動脈前下行枝閉塞手術の下の左室の心筋全体にまたがるランダム画像から手動でカウントした。ｎ＝３つの心臓／群、＞１０ｍｍ２画像／心臓、ＭＩ手術後２４時間。
【０１３２】
ＲＥＲ、ＶＯ２、及びＶＣＯ２測定．ＲＥＲ、ＶＯ２、及びＶＣＯ２は、マウスは疲労に達するまで、漸増最大運動試験を使用した間接熱量測定により測定した。
【０１３３】
結果
ＭＣＢ−６１３は血管新生を刺激する。特に成体の心臓線維芽細胞における血管新生及び間質応答に対するＭＣＢ−６１３の効果が研究された。ＳＲＣ−１、２、及び３タンパク質は、１０週齢のマウスから単離された成体心臓線維芽細胞で発現された（図１０Ａ）。心臓線維芽細胞に、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン−ＳＲＣ−１、２、及び３融合タンパク質の発現ベクター、ならびにＧＡＬ４応答性ルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトして、ＭＣＢ−６１３処理後のＳＲＣ活性化を測定した（図１０Ｂ）。ＳＲＣ−３活性は、ＭＣＢ−６１３に応答してＳＲＣ−１及びＳＲＣ−２よりも大きな程度で誘導され、ＭＣＢ−６１３が心臓線維芽細胞のＳＲＣ−３活性を優先的に刺激することを示している。機能的には、ＭＣＢ−６１３は、インビトロで成体の心臓線維芽細胞のチューブ形成を刺激した（図１０Ｃ）。インビボでのＭＣＢ−６１３の血管新生の刺激を調査するために、ニワトリ卵血管新生アッセイを行った（図１０Ｄ）。ＭＣＢ−６１３をニワトリの卵に直接投与すると、インビボで血管新生が刺激された。さらに、ＭＣＢ−６１３で事前に刺激されたマウス胚性線維芽細胞の導入は、おそらく細胞の非自律的な様式でロバストな血管新生を促進した。理論に拘束されないが、これらの発見は、ＭＣＢ−６１３の血管新生の刺激が複数のメカニズムを介して発生し得ることを示す。
【０１３４】
ＭＣＢ−６１３が虚血誘発性心筋損傷後の回復を改善するかどうかを決定するために、ＭＣＢ−６１３またはビヒクル対照を、左冠動脈前下行枝の外科的な永久結紮によって誘発された心筋損傷の２時間後にマウスに投与した。ＭＩ後３日間で梗塞境界ゾーンにおいて血管新生の増加が観察され、ＭＣＢ−６１３が損傷組織の血管新生を促進し、血管疾患の状況で血流を回復することを示している（図１０Ｅ）。
【０１３５】
ＭＣＢ−６１３は、ＭＩ後の心臓機能の喪失を防ぐ。マウスの左前頸動脈の外科的結紮は、心臓血管治療介入を試験するために一般的に使用される前臨床ＭＩモデルである。梗塞後の初期及び後期の心臓機能及びリモデリングに対するＳＲＣ刺激の役割を調査するために、ＭＩを受けたマウスをＭＣＢ−６１３またはビヒクル対照で処置した。マウスには、ＭＩ手術の２時間後及び２４時間ごとにさらに６日間、腹腔内注射により２０ｍｇ／ｋｇのＭＣＢ−６１３または対照ビヒクルを与えた（図１１Ａ）。ＭＩ後の心臓機能の早期かつ進行性の喪失は、手術前、手術後２４時間、２、８、１２、及び１９週間で心エコー図によって測定された。駆出率は、ＭＩ後２４時間に対照処置動物で平均３０％に減少した。対照的に、ＭＩ後２時間にＭＣＢ−６１３で処置されたマウスは、４３％の平均駆出率を有し、ＭＣＢ−６１３が駆出率の早期減少を防ぎ、脆弱な心筋に対する早期保護を提供したことを示している（図１１Ｂ）。対照処置マウスの駆出率は２４時間後にさらに減少し、ＭＩ後１９週間で最低であり、経時的な心臓機能の進行性喪失を示している。対照的に、駆出率は、ＭＣＢ−６１３の投与後のＭＩ後２４時間からＭＩ後１９週間まで、４０％超に維持され、ＭＣＢ−６１３の初期の心筋保護効果が心臓機能の進行性喪失を予防することを示している。８週目及び１６週目に３日間繰り返し注射しても駆出率は変化せず、ＭＣＢ−６１３が後の時点で心臓機能にそれ以上の影響を与えなかったことを示している。ＭＩ後１９週間までの心臓機能の維持は、ＭＩ後のうっ血性心不全の予防に短期間の早期介入が効果的であり得ることを示す。心臓重量の分析は、ＭＣＢ−６１３がＭＩ後１２週間でＭＩ誘発性心臓肥大代償性反応を弱めたことを明らかにし（図１１Ｃ）、心臓機能の維持が心不全の別の重要な特徴の予防と相関していることを示している。次いで、心臓の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを使用して、心筋の生存能力を空間的に評価した。梗塞ゾーンにおける改善された１８Ｆ−ＦＤＧ取り込みは、ＭＣＢ−６１３がＭＩ後２週間健康な心筋を維持することを示す（図１１Ｄ）。心臓組織切片をピクロシリウスレッドで染色して、梗塞サイズ及び線維症の程度を評価した（図１１Ｅ）。ＭＩ後１２週間で測定された梗塞サイズは、ＭＣＢ−６１３処置マウスからの心臓（３％、１４％、２０％、及び２２％）と比較して、対照処置心臓（３１％及び４４％）においてより大きかった。さらに、心筋細胞はより小さく、梗塞境界ゾーンでの線維症の減少と関連しており、ＭＣＢ−６１３が進行性心不全の２つの追加の重要な分子的特徴を防ぐことを示している（図１１Ｅ）。心臓の代謝機能障害は心不全の一般的な特徴である。ＳＲＣは、骨格筋及び心筋を含む組織の多様な代謝要件を調整する。運動を伴う間接熱量測定を行い、対照としてＭＩを有さない年齢が一致したマウスと比較して、ＭＩ後３週間のエネルギー消費に対するＭＣＢ−６１３の影響を判定した（図１２）。ＶＣＯ２及びＶＯ２は、ＭＣＢ−６１３がＭＩ後のマウスにおける運動時のエネルギー利用を改善することができることを示す、ＭＩ後３週間のＭＣＢ−６１３処置動物において上昇する。したがって、改善された心臓機能は改善されたエネルギー消費と関連している。ＭＩ後７２時間の心臓の電子顕微鏡写真は、ＭＣＢ−６１３が筋原線維構造の崩壊及び異常なミトコンドリア結晶構造を防ぐことができることを示し、ＭＣＢ−６１３が心筋及びミトコンドリアをＭＩ誘発損傷から保護することを示している（図１１Ｆ）。早期の心筋保護を支持するために、ＭＣＢ−６１３はＭＩ後２４時間アポトーシスを防ぐ（図１１Ｇ）。これらの発見は、ＭＣＢ−６１３が機能的な心筋を直接維持し、心臓組織の有害なリモデリングを防ぐように作用することを示す。
【０１３６】
ＭＣＢ−６１３は心筋細胞の損傷応答を防ぐ。心筋リモデリングの緩和及び心臓機能の改善に関連する心筋細胞及び非心筋細胞に特異的なＭＣＢ−６１３転写機能についての洞察を得るために、ＭＩ後１２週間の対照処置及びＭＣＢ−６１３処置マウスから精製された心臓細胞でトランスクリプトームプロファイリングを行った（図１３Ａ）。心筋細胞の差次的遺伝子発現分析は、１２２個の上方制御された遺伝子及び１０７個の下方制御された遺伝子が、ＭＩ後１２週間の心臓機能の改善に関連していることを示す（図１３Ｂ）。差次的に発現する遺伝子の遺伝子セット濃縮分析は、酸化的リン酸化及び脂肪生成、ならびにアポトーシス及び炎症応答の抑制を表す遺伝子オントロジー分類の強力な濃縮を示し（図１３Ｃ）、ＭＣＢ−６１３が心筋細胞の損傷に関連するシグナル伝達を予防することに加えて心臓のエネルギー利用を改善することさらなる支持を提供する。
【０１３７】
ＭＣＢ−６１３は炎症性マクロファージを減少させる。単一細胞トランスクリプトームプロファイリングを行い、ＭＩ後１２週間のＭＣＢ−６１３処置マウスにおける心臓機能の改善に関連する細胞型及び細胞型特異的シグナル伝達応答を特定した。非心筋細胞の代謝的に活性な生単一細胞懸濁液を、ランゲンドルフ灌流後の心臓全体から調製した（図１３Ａ）。細胞型の喪失を防ぎ、転写活性への影響を最小化するために、最小限の手順操作を行った。ＲＮＡ品質管理に合格した２匹の生理食塩水処置マウスからの２１，８９４個の細胞及び２匹のＭＣＢ−６１３処置マウスからの２１，４７４個の細胞の転写プロファイルを、Ｓｅｕｒａｔ分析による１０ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームを使用して分析した。細胞発現パターン、教師なしクラスタリング、及びＳｅｕｒａｔソフトウェア分析を使用した次元削減分析に基づいて１５の異なる細胞クラスターを特定した（図１３Ｄ）。クラスターサイズは１０１〜６，０８５個の細胞の範囲であった。細胞集団を、既知のマウスの心臓細胞型マーカーに基づいて特定した（図１３Ｅ）。分析された全細胞の４２％で、マクロファージは、ＭＩ後１２週間の主要な非心筋細胞集団であり、非心筋細胞が１０％の造血由来細胞のみで構成されている正常な成体マウスの心臓とは異なる。細胞数の最大の変化の評価は、マクロファージクラスター１及びＢリンパ球の数が減少した一方で、心外膜細胞、ＮＫ／Ｔリンパ球、線維芽細胞、及びリンパ管細胞を含む内皮細胞が、ＭＣＢ−６１３処置マウスの心臓の細胞数において増加されたことを示す（図１３Ｆ）。心臓マクロファージ、線維芽細胞、及び内皮細胞集団は、転写の不均一性を示し、それぞれ４、３、及び２個のサブクラスターからなる。心臓線維芽細胞における固有の遺伝子シグネチャーの評価は、Ｐｏｓｔｎ（線維芽細胞クラスター２）を発現する損傷反応性線維芽細胞集団の存在を明らかにし、最近報告されたリモデリングされた心臓における「恒常性線維芽細胞」を支持して、クラスター３の線維芽細胞はＣｏｍｐを固有に発現する（図１４Ａ）。線維芽細胞クラスター１が固有に濃縮された遺伝子は、血管新生（Ｂｍｐ４、Ｅｃｍ１、Ｃｃｌ１１、Ｐｇｆ）及び細胞外マトリックス組織（Ｅｃｍ２及びＰｄｇｆｒａ）を促進する分泌機能に関与する線維芽細胞亜集団の存在を示す。内皮細胞の転写シグネチャーは、３つの亜集団の存在を示す。内皮クラスター２及びリンパ管内皮細胞は、内皮クラスター１と比較して、それぞれ２１８及び３０８個の固有遺伝子の転写活性化の増加を呈し、ＭＩ後１２週間の心臓維持における異なる役割を示している（図１４Ｂ）。リンパ管内皮クラスターは、リンパ管内皮遺伝子Ｐｒｏｘ１及びＬｙｖｅ１の固有の発現により定義される。増加した細胞数に加えて、血管新生促進制御因子ＨＩＦ１Ａ及びＬｒｇ１ならびにリンパ管新生制御因子Ｃｃｌ１２１ａの同時発現は、ＭＣＢ−６１３がＭＩ後１２週間でリンパ管新生を刺激することを示す。初期の心臓遺伝子Ｍｋｌ２、Ｔｅｋ、及びＨａｎｄ２の固有の発現によって定義される内皮クラスター２の遺伝子発現シグネチャーは、おそらく損傷ストレス応答による、より原始的な細胞状態への転写復帰を示す。理論に拘束���れるものではないが、最大の内皮クラスターである内皮クラスター１は、少数の固有の遺伝子、及び任意の関連するＧＯタームまたはシグナル伝達経路の不在によって特徴付けられる内因性恒常性内皮細胞を表す。４つのマクロファージサブクラスターの転写シグネチャーは明らかに分離可能であった（図１４Ｃ）。マクロファージの最大の亜集団であるマクロファージクラスター１は、心筋炎症の消散におけるこれらの遺伝子の役割と互換性のあるＣｃｌ８、Ｃｃｌ２４、及びＬｙ９６を含む炎症性遺伝子シグネチャーの発現によって定義される。クラスター２は、損傷に応答して骨髄に由来する短命の浸潤マクロファージであることが知られている炎症性遺伝子Ｃｘｃｌ１、Ｃｃｒ２、Ｃｃｒ５、及びＴｌｒ２を発現するＣｃｒ２＋単球由来マクロファージの集団を表す。対照的に、クラスター３のマクロファージは、組織修復及び筋形成において役割を果たす局所増殖によって維持されることが知られているＣｃｒ２−マクロファージを増殖する小さな集団の存在を示す１１０個の細胞周期増殖遺伝子を固有に発現する。クラスター４のマクロファージは、Ｃｄ２０９及びＣｏｒｏ１ａを含む食作用の活性化に関与する遺伝子の発現によって特定され、ＭＩ後１２週間に食作用マクロファージの小さな集団の存在を示している。驚くべきことに、心臓機能維持の改善に関連する細胞集団数のかなり小さな変化は、ＭＣＢ−６１３心臓保護が代わりに細胞機能変化の結果である可能性が高いことを示す。
【０１３８】
ＭＣＢ−６１３は、有益なパラクリンシグナル伝達を促進する。ＭＩ後１２週間のＭＣＢ−６１３を媒介した心臓機能の改善に関連する間質細胞型の機能的応答を決定するために、トランスクリプトームプロファイルを対照処置マウス及びＭＣＢ−６１３処置マウスの非心筋細胞で比較した（図１５Ａ）。細胞集団の転写応答の大きな変動は、ＭＣＢ−６１３選択的細胞応答が心臓機能の改善に寄与することを示す。リンパ及び免疫細胞集団からなる細胞のより小さな集団は、最大の薬物誘発性トランスクリプトーム変化を経験した。心臓機能の改善に寄与する潜在的な間質細胞シグナル伝達相互作用を特定するために、ＭＣＢ−６１３処置マウスの心臓と比較した対照の心臓の各細胞のリガンド及び受容体間の相互作用の数を計算した（図１５Ｂ）。相互作用の最も高い頻度は、各線維芽細胞集団のリガンド、１つのマクロファージサブタイプ、及び顆粒球受容体に散布する内皮／ＳＭＣ集団の間で起こった。顆粒球への間質細胞シグナル伝達のこのパターンは、ＭＩ後１２週間のＭＣＢ−６１３心臓保護応答における顆粒球機能の広範なパラクリン調節を意味する。リガンド−受容体対合は、ＭＭＰ９−ＬＲＰ１、ＨＳＰ９０Ｂ１−ＴＬＲ７、及びＳＥＲＰＩＮＥ１−ＴＡＵＲを含む組織構造及び抗炎症シグナル伝達経路の協調的調節を示唆している（図１５Ｃ）。これを支持して、顆粒球における上方制御及び下方制御された遺伝子シグネチャーの遺伝子セット濃縮分析は、ＭＣＢ−６１３が炎症性顆粒球機能を抑制することを示す（図１４Ｄ）。対照と比較したＭＣＢ−６１３処置マウスの心臓顆粒球における上位の上方制御及び下方制御された遺伝子は、自然防御に関与する顆粒の発現の増加ならびに炎症性シグナル伝達に関与するサイトカイン、酵素、及びケモカインの減少を明らかにする（図１５Ｄ）。これらの発見は、ＭＣＢ−６１３に対する心筋の応答が、改善された心臓機能の根底にある持続的なパラクリン抗炎症性シグナル伝達の状況によって特徴付けられることを示す。
【０１３９】
損傷時のＭＣＢ−６１３の投与は、２４時間で即時応答をもたらしたため（図１１Ｂ及び図１１Ｅ）、ＭＩ後２４時間の免疫細胞に対するＭＣＢ−６１３の効果を測定した。ＭＩ後２４時間に心臓全体から単離された単一細胞のＦＡＣＳ分析による免疫表現型決定を使用して、免疫細胞の組成を定量化した。ＭＩ後１２週間で見られたものと同様に、対照と比較して、Ｂ細胞の著しい減少、単球の減少の傾向があり、ＭＣＢ−６１３処置マウスからの心臓の顆粒球の割合の変化はなかった（図１６Ａ）。次いで、パラクリンシグナル伝達の存在によるＭＣＢ−６１３に対する急性顆粒球転写応答及びＭＩ後１２週間の顆粒球におけるロバストな転写応答を測定した。顆粒球は、急性虚血性損傷後に心筋に到達する最初の自然免疫細胞であり、急性心臓発作によって引き起こされる炎症応答の程度、及びその結果として生じる心筋への損傷の程度の重要なメディエーターである。マウスの心臓から十分な量の損傷していない顆粒球を単離することは困難であるため、顆粒球応答を調査するために、ＭＩ後２４時間の心筋顆粒球応答を反映する骨髄顆粒球を単離した。顆粒球が枯渇した骨髄と比較した顆粒球における顆粒球マーカーＳ１００Ａ９のｍＲＮＡ発現の上昇は、顆粒球の単離が成功したことを示す（図１６Ｂ）。ＭＣＢ−６１３で処置したマウスからの顆粒球におけるＴｌｒ７及びＬｃｎ２の発現の増加は、単一細胞トランスクリプトーム分析を支持し、顆粒球機能の調節がＭＣＢ−６１３に対する急性心筋応答に寄与し得ることを明らかにしている。ＭＩの不在下での外科的処置による組織外傷の結果として、ＭＣＢ−６１３が骨髄顆粒球におけるＴｌｒ７またはＬｃｎ２を調節する可能性を制御するために、対照ビヒクルまたはＭＣＢ−６１３の投与による偽手術後２４時間のマウスから顆粒球を単離した。細胞数または遺伝子発現の変化は観察されず、顆粒球遺伝子発現の変化が、ＭＣＢ−６１３を媒介した心筋損傷応答の結果であることを示している。顆粒球における強力なトランスクリプトーム応答のＭＣＢ−６１３誘導は、好中球顆粒が化合物のＭＩ後の炎症作用を調節することができることを示す。これを支持して、ＬＹＺ１顆粒発現は、ＭＩ後２４時間の対照動物と比較して、ＭＣＢ−６１３処置マウスの心筋において著しく増加した（図１６Ｃ）。
【０１４０】
実施例４：ＭＣＢ−６１３、化合物１０−１、及び化合物１０−２の薬物動態（ＰＫ）研究
ＭＣＢ−６１３、化合物１０−１、及び化合物１０−２の薬物動態をＣＤ−１マウスで試験した。３つの化合物の各々をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、３０％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンと１：９の比率で混合し、ＣＤ−１マウスに強制飼養により腹腔内（ｉｐ）または経口（ｐｏ）で投与した。化合物の投与後、血液試料（化合物あたり３匹のマウス）を９つの時点、すなわち５分、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、及び２４時間で、尾静脈から採取した。これらの血液試料から血漿を単離し、化合物の血漿濃度をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。薬物動態パラメータは、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，９９：３０６−３１４（２０１０）に記載されているように、薬物動態及び薬力学データ分析の分析に使用するアドインプログラムであるプログラムＰＫＳｏｌｖｅｒを使用して計算した。結果は表１及び２に要約し、半減期（ｔ１／２）、終末相半減期（終末相ｔ１／２）、最大濃度が到達された化合物の投与後の時間（ｔ最大）、観察された化合物の最大濃度（Ｃ最大）、最後の測定可能な濃度までの曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）、無限時間までの曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）、及び化合物のクリアランス速度（Ｃｌ）を含む。
【０１４１】
表１は、ＭＣＢ−６１３、化合物１０−１、及び化合物１０−２がＣＤ−１マウスに腹腔内投与された上記の研究からの薬物動態データを含む。
【表１】
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【０１４２】
表２は、ＭＣＢ−６１３、化合物１０−１、及び化合物１０−２がＣＤ−１マウスに経口投与された上記の研究からの薬物動態データを含む。
【表２】
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【０１４３】
薬物動態データも図１７に示す。図１７のグラフは、経時的に測定された平均血漿濃度を示す。グラフの上部の列は、ＭＣＢ−６１３（左上のグラフ）、化合物１０−１（上部中心のグラフ）、及び化合物１０−２（右上のグラフ）がＣＤ−１マウスに腹腔内投与された上記の研究からの薬物動態データを示す。グラフの下部の列は、ＭＣＢ−６１３（左下のグラフ）、化合物１０−１（下部中心のグラフ）、及び化合物１０−２（右下のグラフ）がＣＤ−１マウスに経口投与された上記の研究からの薬物動態データを示す。
【０１４４】
添付の特許請求の範囲の化合物及び方法は、本明細書に記載される特定の化合物及び方法によって範囲が限定されるものではなく、それは、特許請求の範囲のいくつかの態様の例示として意図されており、機能的に同等である任意の化合物及び方法は、この開示の範囲内である。本明細書に示され、かつ記載される修正に加えて、化合物及び方法の様々な修正が、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。さらに、ある特定の代表的な化合物、方法、ならびにこれらの化合物及び方法の態様のみが具体的に記載されているが、一方で、他の化合物及び方法は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。したがって、ステップ、要素、構成要素、または構成物の組み合わせは、本明細書で明示的に言及することができるが、しかしながら、明示的に記載されていない場合でも、ステップ、要素、構成要素、及び構成物の他のすべての組み合わせが含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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