(57)【要約】  本発明は、細胞内浸透能を有する抗ＳＴＡＴ３二重特異性抗体およびこれを含む薬学的組成物に関するものであって、より具体的には、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する部位および細胞内浸透能を付与するＤＮＡ結合部位を含む抗ＳＴＡＴ３二重特異性抗体およびこれを有効成分として含む薬学的組成物に関するものである。本発明によるＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体は、細胞内に浸透して、核内ＤＮＡに特異的に結合するＤＮＡ結合部位を含むことにより、従来の細胞に加えて存在するタンパク質のみを標的とする抗体医薬品の限界点を克服することができ、リン酸化した活性化形態のＳＴＡＴ３にのみ特異的に結合し、これらの転写因子活性を抑制することができることを確認したところ、ＳＴＡＴ３の活性化によって発病する関連疾患の副作用のない治療剤の開発、一例として、ＳＴＡＴ３の活性化と関連する様々な癌腫に対する治療剤の開発、ＳＴＡＴ３の活性化によって進行する癌転移を抑制することができる薬物の開発およびＳＴＡＴ３の活性化によって発病する関節リウマチを含む炎症性疾患に対する副作用のない治療剤開発に効率的に用いられることができる。
2021509022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＴＡＴ３（Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３）に特異的に結合する第１抗原結合部位とＤＮＡに特異的に結合する第２抗原結合部位とを含む、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片。
【請求項２】
前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列で示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号４〜６のいずれかのアミノ酸配列で示される重鎖相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその断片。
【請求項３】
前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号７〜９のいずれかのアミノ酸配列で示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号１０〜１２のいずれかのアミノ酸配列で示される重鎖相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその断片。
【請求項４】
前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号１３〜１５のいずれかのアミノ酸配列で示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号１６〜１８のいずれかのアミノ酸配列で示される重鎖相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその断片。
【請求項５】
前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号１９〜２１のいずれかのアミノ酸配列で示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号２２〜２４のいずれかのアミノ酸配列で示される重鎖相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその断片。
【請求項６】
前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号２５〜２７のいずれかのアミノ酸配列で示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号２８〜３０のいずれかのアミノ酸配列で示される重鎖相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその断片。
【請求項７】
前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号３１〜３３のいずれかのアミノ酸配列で示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号３４〜３６のいずれかのアミノ酸配列で示される重鎖相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその断片。
【請求項８】
前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号３７〜３９のいずれかのアミノ酸配列で示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号４０〜４２のいずれかのアミノ酸配列で示される重鎖相補性決定領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその断片。
【請求項９】
前記ＳＴＡＴ３は、７０５番目のチロシン残基がリン酸化したことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその断片。
【請求項１０】
前記抗体またはその断片は、細胞内浸透能を有することを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその断片。
【請求項１１】
前記断片は、ジアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖからなる群から選択される断片であることを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその断片。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体またはその断片をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターにより形質転換された、細胞。
【請求項１５】
（ａ）請求項１４に記載の細胞をポリヌクレオチドが発現される条件下で培養する段階と、
（ｂ）前記細胞から軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階と、および
（ｃ）前記細胞またはその培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階を含む、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片の生産方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗体またはその断片を試料と接触させる段階と、前記抗体またはその断片を検出する段階とを含む、ＳＴＡＴ３特異的検出方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の抗体またはその断片を有効成分として含む、癌治療用薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の抗体またはその断片を有効成分として含む、癌転移抑制用薬学的組成物。
【請求項１９】
前記癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管癌種、結腸直腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、甲状腺癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、潤滑膜肉腫、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ）肉腫、平滑筋肉腫、悪性線維性組織球腫、繊維肉腫、急性骨髄性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、膠芽腫、性状細胞腫、メラノーマ、中皮腫、ウィルムス腫瘍、および明細胞肉腫（ＣＣＳ）、胞巣状軟部肉腫（ＡＳＰＳ）、および転座−関連腎細胞癌を含むＭｉＴ腫瘍からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の抗体またはその断片を有効成分として含む、炎症性疾患治療用薬学的組成物。
【請求項２１】
前記炎症性疾患は、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）であることを特徴とする、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内浸透能を有する抗ＳＴＡＴ３二重特異性抗体およびこれを含む薬学的組成物に関するものであって、より具体的には、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する部位および細胞内浸透能を与えるＤＮＡ結合部位を含む抗ＳＴＡＴ３二重特異性抗体およびこれを有効成分として含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、ＤＮＡ上の遺伝情報により転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）および翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）の過程を経て作られる。作られたタンパク質は、細胞を構成する成分として、細胞骨格を形成するなどの機能もするが、ほとんどのタンパク質は、活性を有しており、タンパク質の活性調節は、細胞内機能を調節するための細胞シグナル伝達において、非常に重要な役割を担っている。
【０００３】
タンパク質による細胞内シグナル伝達の調節は、タンパク質活性のｏｎ／ｏｆｆを通じて行われることができ、タンパク質の活性化または不活性化の誘導のためには、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質間相互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）など、多様な修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方式が用いられている。このように、翻訳後修飾（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、細胞内シグナル伝達において非常に重要な役割を果たしており、中でも、タンパク質リン酸化（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、細胞の外部環境と内部環境から誘導されるシグナル（ｓｉｇｎａｌ）が核内の遺伝子発現に影響を及ぼす主な作用機序である（Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｇ,等、ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１９１２−１９３４（２００２））。
【０００４】
このようなタンパク質リン酸化は、タンパク質の活性、構造、他のタンパク質との結合力などに影響を及ぼすことにより、細胞内シグナル伝達を担うことが知られている。分子生物学的知識が発達するにつれて、このような機序に基づいた新規な薬物が開発されつつある。代表的なのが、このようなタンパク質のリン酸化部位と結合するタンパク質の活性を抑制する方式である。
【０００５】
細胞の増殖を誘導するシグナル伝達タンパク質であるＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３）は、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、ＩＬ）またはインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）のような外部シグナル（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ）によってリン酸化が誘導されると、対をなして（同種二量体（ｈｏｍｏ−ｄｉｍｅｒ）または異種二量体（ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒ）の形成）の核内に移動し、特定の遺伝子の発現を誘導する。特に、ＳＴＡＴ３は、癌誘発因子として知られ、多くの注目が集められており、実際には、様々な癌組織において、ＳＴＡＴ３の異常活性化が報告されている。特に過度に活性化されたＳＴＡＴ３は、癌細胞の生存、増殖および成長に関連するＢｃｌ−ＸＬ、ｃ−ｍｙｃ、そしてサイクリンＤ１などのような標的遺伝子発現を促進させることで、変異した細胞の癌細胞化を促進させることが知られている。これにより、ＳＴＡＴ３の異常活性化を抑制することができる抗癌剤の開発に多くの研究者が参与している。しかし、未だ効果的にＳＴＡＴ３を抑制させることができる薬物開発の水準は、微々たるものである。
【０００６】
一方、炎症性疾患は、炎症反応が主病変として現れる疾患の総称であり、このうち、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）は、多発性関節炎を特徴とする原因不明の慢性炎症性疾患である。初期には関節を包んでいる滑膜に炎症が発生するが、徐々に周囲の軟骨と骨に炎症が広まり、関節の破壊と変形をもたらし、関節のみならず、関節外症状として貧血、乾燥症候群、皮下結節、肺繊維化症、血管炎、皮膚潰瘍など全身を侵しうる疾患である。
【０００７】
関節リウマチの正確な原因は、まだ明らかに解明されていないが、自己免疫現象が主な機序として知られている。自己免疫（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ）とは、外部からヒトの身体を守る免疫系の異常により、逆に自分の体を攻撃する現象である。一般的には、遺伝的素因、細菌やウイルス感染などが関節リウマチの原因と考えられており、身体的または精神的ストレスを受けた後、発症しやすいと言われている。また、閉経初期にも発症率が高いと報告されているが、これは、関節リウマチがホルモンの影響を受けることを示す例である。
【０００８】
このような関節リウマチの治療方法としては、免疫病理学的メカニズムと関連付けられている治療戦略が知られており、いくつかの生物療法（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ）が利用されているが、臨床的に持続可能な、かつ、効果的な治療法はないのが実情である。
【０００９】
一方、最近まで、様々な研究を通じてＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３）が関節リウマチを含む自己免疫疾患において、ＮＦ−κＢとはまた別の重要な転写因子としての役割をすることが報告されてきた。特に、ＳＴＡＴ３は、炎症反応を媒介とするサイトカインであるインターロイキン−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６、ＩＬ−６）によって活性化されることが広く知られており、これにより、持続的に活性化したＳＴＡＴ３が、関節リウマチの発症と密接した関連があることが報告されている（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）、２０１５  Ｊｕｎ；５４（６）：１１０３−１３）。
【００１０】
抗体は、すべての哺乳動物の血清や組織体液中に存在する糖タンパク質であり、生体内で外来抗原を認識する。抗体は、補体系の活性化や、細胞表面に存在する受容体（ＦｃＲ）への結合を通じて、ＦｃＲ発現細胞の貧食能、抗体依存性細胞傷害能、媒介因子の遊離能および抗原提示能のようなエフェクター機能を活性化し、生体防御に関与する。このような抗体の抗原特異的な結合能に基づいて、様々な医薬品は、細胞内の疾病の原因となる物質に結合し、これらの活性を抑制する組換え抗体の形態で開発されており、他の類型の薬物、いわゆる低分子薬物に比べて生産の容易性、特異性、および生体−耐久性などのため、効果的な薬物形態で実証された。
【００１１】
しかし、一般的な抗体は、唯一細胞外分子だけを標的とすることができるが、疾患の治療、および疾患を診断するための数多くの重要な標的が細胞内にある。例えば、多くの転写因子、特にＳＴＡＴ３は、その中でも、様々な疾患を治療するための最も核心的で、かつ、挑戦的な標的として認識されている。
【００１２】
そこで、本発明は、前記活性化されたＳＴＡＴ３のみを標的とする細胞内浸透が可能な抗体を開発し、これを通じて前記のような従来の限界を解決し、癌の治療、癌の転移を抑制する用途およびＳＴＡＴ３関連疾患の治療に用いる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上述したような従来の限界点を克服すべく想到されたものであり、本発明者等は、リン酸化したＳＴＡＴ３および細胞内ＤＮＡに特異的に結合し、細胞浸透能を有する二重特異性抗体を開発することにより、本発明を完成した。
【００１４】
そこで、本発明は、ＳＴＡＴ３（Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３）に特異的に結合する第１抗原結合部位およびＤＮＡに特異的に結合する第２抗原結合部位を含む、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を提供することを目的とする。
【００１５】
また、本発明は、前記抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、および該ベクターにより形質転換された細胞を提供することをもう一つの目的とする。
【００１６】
また、本発明は、前記抗体またはその断片の生産方法、並びにＳＴＡＴ３特異的検出方法を提供することをもう一つの目的とする。
【００１７】
また、本発明は、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を有効成分として含む、癌治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
【００１８】
また、本発明は、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を有効成分として含む、癌転移抑制用薬学的組成物を提供することを目的とする。
【００１９】
また、本発明は、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を有効成分として含む、炎症性疾患治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
【００２０】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、上述した課題に制限されるものではなく、言及されていないもう一つの課題は、以下の記載により当業者に明確に理解できるものである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、ＳＴＡＴ３（Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３）に特異的に結合する第１抗原結合部位およびＤＮＡに特異的に結合する第２抗原結合部位を含む、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を提供する。
【００２２】
本発明の一実施例として、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号１〜３のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号４〜６のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００２３】
本発明のもう一つの実施例として、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号７〜９のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号１０〜１２のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００２４】
本発明のもう一つの実施例として、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号１６〜１８のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００２５】
本発明のもう一つの実施例として、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号１９〜２１のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号２２〜２４のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００２６】
本発明のもう一つの実施例として、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号２５〜２７のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号２８〜３０のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００２７】
本発明のもう一つの実施例として、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号３１〜３３のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号３４〜３６のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００２８】
本発明のもう一つの実施例として、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号３７〜３９のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号４０〜４２のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００２９】
本発明のもう一つの実施例として、前記ＳＴＡＴ３は、７０５番目のチロシン残基がリン酸化したものであってもよい。
【００３０】
本発明のもう一つの実施例として、前記抗体またはその断片は、細胞内浸透能を有するものであってもよい。
【００３１】
本発明のもう一つの実施例として、前記断片は、ジアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖからなる群から選択される断片的なものであってもよい。
【００３２】
また、本発明は、前記抗体またはその断片をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。
【００３４】
また、本発明は、前記ベクターにより形質転換された、細胞を提供する。
【００３５】
また、本発明は、（ａ）前記細胞をポリヌクレオチドが発現される条件下で培養する段階と、
（ｂ）前記細胞から軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階と、および
（ｃ）前記細胞またはその培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階と、を含む、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片の生産方法を提供する。
【００３６】
また、本発明は、前記抗体またはその断片を試料と接触させる段階と、前記抗体またはその断片を検出する段階と、を含む、ＳＴＡＴ３特異的検出方法を胞肉腫提供する。
【００３７】
また、本発明は、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を有効成分として含む、癌治療用薬学的組成物を提供する。
【００３８】
また、本発明は、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を有効成分として含む、癌転移抑制用薬学的組成物を提供する。
【００３９】
本発明の一実施例として、前記癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管癌種、結腸直腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、甲状腺癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、潤滑膜肉腫、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ）肉腫、平滑筋肉腫、悪性線維性組織球腫、繊維肉腫、急性骨髄性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、膠芽腫、星細胞腫、メラノーマ、中皮腫、ウィルムス腫瘍、および明細胞肉腫（ＣＣＳ）、胞巣状軟部肉腫（ＡＳＰＳ）と転座−関連腎細胞癌を含むＭｉＴ腫瘍からなる群から選択される一つ以上のものであってもよい。
【００４０】
また、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。
【００４１】
また、本発明は、前記薬学的組成物の、癌治療用途を提供する。
【００４２】
また、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、癌転移抑制方法を提供する。
【００４３】
また、本発明は、前記薬学的組成物の、癌転移抑制用途を提供する。
【００４４】
また、本発明は、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を有効成分として含む、炎症性疾患治療用薬学的組成物を提供する。
【００４５】
本発明の一実施例として、前記炎症性疾患は、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）であってもよい。
【００４６】
また、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、炎症性疾患治療方法を提供する。
【００４７】
また、本発明は、前記薬学的組成物の、炎症性疾患治療用途を提供する。
【発明の効果】
【００４８】
本発明に係るＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体は、細胞内に浸透して、核内ＤＮＡに特異的に結合するＤＮＡ結合部位を含むことにより、従来の細胞外に存在するタンパク質のみを標的とする抗体医薬品の限界を克服することができる。リン酸化した活性化形態のＳＴＡＴ３にのみ特異的に結合し、これらの転写因子活性を抑制することができることが確認されたところ、ＳＴＡＴ３の活性化によって発病する関連疾患に対する副作用がない治療剤の開発、一例として、ＳＴＡＴ３の活性化と関連するさまざまな癌腫の治療剤の開発、ＳＴＡＴ３の活性化によって進行する癌転移を抑制することができる薬物の開発およびＳＴＡＴ３の活性化と関連する関節リウマチを含む炎症性疾患の副作用がない治療剤の開発に効率的に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１ａ】リン酸化したＳＴＡＴ３に特異的に結合する二重抗体（以下、ｐＳＴＡＴ３抗体）の構造を簡略に示すものである。
【図１ｂ】本発明の前記抗体構造およびこれらの配列を示すものである。
【図２】本発明のｐＳＴＡＴ３二重特異性抗体を生産した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、リン酸化したＳＴＡＴ３に対する結合能を確認した結果である。
【図３】免疫細胞化学染色により、本発明のｐＳＴＡＴ３二重特異性抗体の細胞浸透能を確認した結果である。
【図４ａ】本発明のｐＳＴＡＴ３二重特異性抗体のｐＳＴＡＴ３抑制能を確認したものである。マウスマクロファージ細胞株（ＲＡＷ２６４．７）と滑膜細胞（Ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）それぞれにＬＰＳまたはＴＮＦαを処理し、ＳＴＡＴ３の活性を誘導した後、前記抗体を処理し、ｐＳＴＡＴ３タンパク質の発現レベルを観察した結果である。
【図４ｂ】本発明のｐＳＴＡＴ３二重特異性抗体のｐＳＴＡＴ３抑制能を確認したものである。マウスマクロファージ細胞株（ＲＡＷ２６４．７）と滑膜細胞（Ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）それぞれにＬＰＳまたはＴＮＦαを処理し、ＳＴＡＴ３の活性を誘導した後、前記抗体を処理し、ｐＳＴＡＴ３タンパク質の発現レベルを観察した結果である。
【図４ｃ】本発明のｐＳＴＡＴ３二重特異性抗体のｐＳＴＡＴ３抑制能を確認したものである。マウスマクロファージ細胞株にＬＰＳとｐＳＴＡＴ３抗体を処理した後、ｐＳＴＡＴ３とＣＯＸ−２の発現レベルを測定して、本発明に係る抗体のｐＳＴＡＴ３に対する特異的結合を確認した結果である。
【図５】ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株において、ＩＬ−６刺激時、ＳＴＡＴ３−ＲＥの調節下でルシフェラーゼレポーター（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子が発現される条件下において、本発明のｐＳＴＡＴ３二重特異性抗体処理により、前記遺伝子発現が抑制されることを確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明者等は、リン酸化したＳＴＡＴ３および細胞内ＤＮＡに特異的に結合し、細胞内浸透能を有する二重特異性抗体を開発することにより、本発明を完成した。
【００５１】
そこで、本発明は、ＳＴＡＴ３（Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３）に特異的に結合する第１抗原結合部位と、ＤＮＡに特異的に結合する第２抗原結合部位とを含む、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を提供する。
【００５２】
本発明者等は、実施例を通じて前記ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を製造し、これらの機能を検証した。
【００５３】
本発明の一実施例では、ファージディスプレイ法でヒトｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリを用いてｐＹ７０５  ＳＴＡＴ３ペプチド抗原に結合する合計２４個の特異性抗体配列を導き出し、これに対して親和性（ＫＤ）を測定し、ｐＹ７０５  ＳＴＡＴ３に対する親和度が高い抗体候補７個を最終的に選別した（実施例１参照）。
【００５４】
本発明のもう一つの実施例では、前記７個の候補のうち、３つの配列を用いて、組換え抗体を作製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、このうち一つの配列を用いて作製した抗体がｐＳＴＡＴ３を効果的に検出できることを確認した（実施例２参照）。
【００５５】
本発明のもう一つの実施例では、大腸癌細胞株において細胞免疫化学染色を通じて前記抗体の細胞内浸透能を検証した結果、ＤＮＡ結合ドメインを含むｐＳＴＡＴ３抗体が効果的な細胞内浸透能を有することを確認した（実施例３参照）。
【００５６】
本発明のもう一つの実施例では、マウスマクロファージ細胞株および滑膜細胞に、本発明に係る抗体を処理し、ウエスタンブロットでｐＳＴＡＴ３の発現レベルを測定して、前記抗体のｐＳＴＡＴ３抑制能を確認し、このような機能は、他のシグナル伝達分子には影響を及ぼさないことを確認した（実施例４−１参照）。
【００５７】
本発明のもう一つの実施例では、ＳＴＡＴ３−ＲＥの調節下で発現されるルシフェラーゼレポーター（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子を用いてＩＬ−６刺激条件において、前記抗体が前記ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を抑制することを確認した（実施例４−２参照）。
【００５８】
前記実施例の結果は、本発明に係るＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体が細胞浸透能を有し、ｐＳＴＡＴ３機能を効果的に抑制することを実証するものである。さらに、ＳＴＡＴ３の活性化と関連する様々な癌腫の治療、癌転移抑制および炎症性疾患の治療に有効に用いられ得ることを実証するものである。
【００５９】
本発明にて使用される用語、「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、免疫学的に、特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含み、ポリクローナル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体とモノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体の両方を含む。また、前記用語は、キメラ性抗体（例えば、ヒト化ミュリン抗体）、異種結合抗体（例えば、二特異性抗体）、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体のような遺伝子工学によって生産された形態を含む。本発明において、抗体は、二重特異性抗体であり、これは一つの抗体が互いに異なる抗原に特異的な２つの結合部位を有する抗体を意味するもので、本発明の抗体は、好ましくはＳＴＡＴ３および細胞内ＤＮＡにそれぞれ結合することができる。
【００６０】
本発明における「抗体」、「抗ＳＴＡＴ３二重特異性抗体」、「ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体」および「ＳＴＡＴ３二重特異的ｓｃＦｖ抗体」は、本発明において、最も広義の意味で使用され、具体的にはＳＴＡＴ３に特異的に結合する結合部位およびＤＮＡに特異的に結合する結合部位を含む。
【００６１】
典型的抗体は、重鎖および軽鎖を有し、それぞれの重鎖および軽鎖は、不変領域および可変領域（当該部位は、「ドメイン」としても知られている）を含む。軽鎖と重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下、「ＣＤＲ」）と呼ばれる３つの超可変領域と、４つの「フレームワーク領域」（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割をする。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端から順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と名付けられ、さらに特定のＣＤＲが位置する鎖によって識別される。しかし、すべてのＣＤＲが抗原結合に直接関与する必要はない。
【００６２】
本発明において、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号１〜３のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号４〜６のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００６３】
また、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号７〜９のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号１０〜１２のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００６４】
また、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号１６〜１８のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００６５】
また、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号１９〜２１のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号２２〜２４のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００６６】
また、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号２５〜２７のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号２８〜３０のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００６７】
また、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号３１〜３３のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号３４〜３６のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００６８】
また、前記ＳＴＡＴ３に特異的に結合する第１抗原結合部位は、配列番号３７〜３９のアミノ酸配列で表示される軽鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）および配列番号４０〜４２のアミノ酸配列で表示される重鎖相補性決定領域を含むものであってもよい。
【００６９】
本発明における断片は、ジアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖからなる群から選択される断片であることができるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
本発明における抗体の断片は、抗体全体の抗原の特異的結合力を維持する抗体の断片を意味し、好ましくは、断片は、親抗体のＳＴＡＴ３およびＤＮＡ親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上を保有する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖなどの形態であってもよい。
【００７１】
本発明の目的上、抗体の断片は、ヒト由来ＳＴＡＴ３タンパク質およびＤＮＡのそれぞれに対する結合特異性を維持するものであれば、構造や形態の制限を受けないが、好ましくは、ｓｃＦｖであることができる。本発明に係るｓｃＦｖは、前記のようなＳＴＡＴ３タンパク質およびＤＮＡに特異的なＣＤＲの構成、またはＶＨとＶＬの構成を有するものであって、ＶＨのＣ−末端とＶＬのＮ−末端がリンカーを介して接続されたものであれば、その配列が特に制限されない。前記リンカーは、当業界でｓｃＦｖに適用されるリンカーとして知られているものであれば、その種類は特に制限されない。
【００７２】
本発明の抗体またはその断片は、これらの生物学的活性を実質的に変更しない保存的なアミノ酸置換（抗体の保存的変異体と呼ばれる）を含むことができる。
【００７３】
前記ＳＴＡＴ３は、ＳＴＡＴ３遺伝子によってコードされる転写因子（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）であり、様々なサイトカインおよび成長因子の刺激時、ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅｓ（ＪＡＫ）によってリン酸化すると、同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）または異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成し、核内へ移動し、様々な遺伝子発現を調節する転写因子として作用する。インターフェロン、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）がリガンドと結合する場合には、ＳＴＡＴ３の７０５番目のチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基にリン酸化が起こるとして知られており、Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ（ＭＡＰＫ）またはｃ−ｓｒｃ  ｎｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅによっては、７２７番目のセリン（ｓｅｒｉｎｅ）残基にリン酸化が起こると言われている。このような過程で活性化されたＳＴＡＴ３は、細胞の刺激に反応して、様々な遺伝子発現を媒介とし、細胞の成長および細胞の死滅のようなあらゆる細胞の反応において重要な役割を果たすとして知られている。
【００７４】
本発明において、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片が結合するＳＴＡＴ３は、好ましくは７０５番目のチロシン残基がリン酸化したＳＴＡＴ３であることを特徴とする。
【００７５】
一方、前記ＤＮＡに特異的に結合する第２抗原結合部位は、ループス（ｌｕｐｕｓ）患者から発見される自己抗体（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ）である３Ｅ１０のＤＮＡ結合ドメインであって（Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  １９９８  Ｏｃｔ；  １１（５）：５３９−  ４６．  １９９８．１０）、特異的に「Ｖａｒｉａｎｔ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ」の３１番目のアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）がアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）に置き換えれた（Ｄ３１Ｎ）ことを特徴とするが、これに制限されるものではない。
【００７６】
また、本発明は、前記抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００７７】
本発明で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドまたは核酸と記載することができ、ＤＮＡ分子等（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を用いて生成された前記ＤＮＡまたはＲＮＡの類似体等（例えば、ペプチド核酸および非−自然に発生するヌクレオチド類似体）およびこれらのハイブリッドが含まれる。前記ポリヌクレオチドは、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）または二本鎖（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄ）になることができる。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体またはその断片をコードするものであれば、その配列が特に制限されるものではない。
【００７９】
本発明の抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、当業界で広く知られている方法によって得られる。例えば、前記抗体の重鎖および軽鎖の一部または全部をコードするＤＮＡ配列またはそのアミノ酸配列に基づいて、当該分野で広く知られているオリゴヌクレオチド合成技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法などを用いて合成することができる。
【００８０】
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００８１】
本発明で使用される用語、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、本発明の抗体またはその断片の組換え生産のために、本発明のポリヌクレオチドの複製または発現を目的に利用され、一般にシグナル配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列のうち、一つ以上を含む。本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターであってもよく、より好ましくは調節配列、例えばプロモーターに作動可能に接続された本発明のポリヌクレオチドを含むベクターであってもよい。
【００８２】
また、本発明は、前記ベクターにより形質転換された細胞を提供する。
【００８３】
本発明の細胞は、本発明の発現ベクターに含まれた抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを発現するのに用いることができる細胞であれば、その種類は特に制限されない。本発明に係る発現ベクターにより形質転換された細胞（宿主細胞）は、原核生物（例えば、大腸菌）、真核生物（例えば、酵母または他の菌類）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター（ｈａｍｓｔｅｒ）細胞、ラット細胞（ｒａｔ  ｃｅｌｌ）、マウス細胞（ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌ）、昆虫細胞、またはこれらに由来したハイブリドーマであることができるが、好ましくは、ヒトを含む哺乳類に由来する細胞であってもよい。
【００８４】
本発明で使用される用語「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、外来性ポリヌクレオチドが導入されることによる宿主細胞の遺伝子型の変形を意味し、その形質転換に用いられた方法に関係なく、外来性ポリヌクレオチドが宿主細胞内に導入されたことを意味する。宿主細胞内に導入された外来性ポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム内に統合されて維持されるか、または統合されずに維持されることができるが、本発明は、両者共含む。
【００８５】
本発明に係るＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を発現することができる組換え発現ベクターは、当業界に公知された方法、例えば、一過性トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、リン酸カルシウム共沈殿法、リポソーム媒介トランスフェクション（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン−媒介トランスフェクション（ＤＥＡＥ  ｄｅｘｔｒａｎ−  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン−媒介トランスフェクション（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）および細胞内に核酸を流入させるための公知方法により抗体またはその断片を生産するための細胞の内部へ導入して形質転換することができるが、形質転換方法は、これに制限されるものではない。
【００８６】
また、本発明は、前記細胞をポリヌクレオチドが発現される条件下で培養し、軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを生産する段階と、前記細胞またはこれを培養した培養培地から前記ポリペプチドを回収する段階と、を含むＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片の生産方法を提供する。
【００８７】
前記細胞の培養は、前記細胞の種類に応じて培地組成および培養条件が異なり得、これは、本技術分野における通常の技術者が適宜選択して調節することができる。
【００８８】
前記抗体分子は、細胞の細胞質内に蓄積されるか、または細胞から分泌されるか、適切なシグナル配列によってペリプラズムまたは細胞外培地（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）に標的化（ｔａｒｇｅｔｅｄ）され得、ペリプラズムまたは細胞外培地に標的化されるのが好ましい。また、生産された抗体分子を、本技術分野における通常の技術者に広く知られている方法を用いて、リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）させ、機能的形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を備えるのが好ましい。前記ポリペプチドの回収は、生産されたポリペプチドの特性および細胞の特性に応じて異なり得、これは、本技術分野における通常の知識を有する者が適宜選択および調節することができる。
【００８９】
また、本発明は、前記抗体またはその断片を試料と接触させる段階と、前記の抗体またはその断片を検出する段階と、を含むＳＴＡＴ３特異的検出方法を提供する。
【００９０】
通常の技術者は、抗体を用いて、タンパク質を検出する公知の方法を適宜選択し、選択された方法に適合するように試料を準備することができる。また、試料は、癌または癌転移有無を診断しようとする被検体から採取された生検などから得られた細胞や組織、血液、全血、血清、血漿、唾液、脳脊髄液等であってもよい。前記抗体を用いてタンパク質を検出する方法とは、これに制限されるものではないが、例えば、ウエスタンブロット、免疫ブロット、ドットブロット、免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、競争結合分析、免疫沈降などがある。
【００９１】
前記抗体またはその断片は、これの「検出」のために、一般的に検出可能な部分（ｍｏｉｅｔｙ）に標識することができる。例えば、放射性同位元素または蛍光標識で標識することができ、様々な酵素−基質標識が利用可能であり、前記酵素標識の例は、ミバエルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼ、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、マレートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ（ｕｒａｓｅ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、ヘテロサイクリックオキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等を含む。抗体に酵素を結合させる技術は、公知の技術を用いて抗体に直接または間接的に結合されることができる。例えば、抗体は、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）に結合することができ、上述した３種の広範囲なカテゴリに属する任意の標識がアビジンと、またはその逆に結合され得る。ビオチンは、アビジン（ａｖｉｄｉｎ）に選択的に結合され、よって、この標識は、このような間接的な方法で抗体に結合され得る。
【００９２】
一方、本発明は、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を有効成分として含む、癌治療用薬学的組成物を提供する。
【００９３】
また、本発明は、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を有効成分として含む、癌転移抑制用薬学的組成物を提供する。
【００９４】
一方、本発明において治療の対象とする疾病である「癌」は、細胞が正常な成長の限界を無視して、分裂および成長する攻撃的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）特性、周囲の組織に浸潤する浸潤性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）特性、および体内の他の部位に広がる転移性（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）特性を有する細胞による疾病を総称する意味である。
【００９５】
一方、本発明で使用される用語、「癌転移（ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」は、癌の進行の結果として現れる現象であり、癌に起因する死因のほとんどは、原発巣ではなく、転移による、生存には欠かせない臓器の機能障害に起因するものとされている。癌転移は、細胞の組織内での移動、動脈、静脈などの血管、またはリンパ管などである脈管内での移動、他の臓器での着床、増殖と腫瘍組織の形成の複数のプロセスを経て発生する。このようなプロセスで重要な細胞の動作には、同種の細胞間の接着を低下させ、特定の他の細胞との接着性が生じる運動性を高める細胞外構造のほか、基底膜などの組織の一体性を維持する構造の破壊性を誘導する酵素を細胞表面に発現するなどの特徴がある。
【００９６】
一方、本発明において、前記癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管癌種、結腸直腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、甲状腺癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、潤滑膜肉腫、カポジ（Ｋａｐｏｓｉ）肉腫、平滑筋肉腫、悪性線維性組織球腫、繊維肉腫、急性骨髄性白血病、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、多発骨髄腫、膠芽腫、星細胞腫、メラノーマ、中皮腫、ウィルムス腫瘍、および明細胞肉腫（ＣＣＳ）、胞巣状軟部肉腫（ＡＳＰＳ）および転座−関連腎細胞癌を含むＭｉＴ腫瘍からなる群から選択される１つ以上であることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
また、本発明は、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体またはその断片を有効成分として含む、炎症性疾患治療用薬学的組成物を提供する。
【００９８】
一方、本発明において治療対象とする疾病である「炎症性疾患」は、炎症反応を主病変とする疾患を意味するもので、これに関連する様々な疾患を含むことができるが、本発明において、炎症性疾患は、好ましくは、関節リウマチを意味するものである。
【００９９】
前記関節リウマチは、原因が明確に究明されていない炎症性疾患であって、初期に関節を包んでいる滑膜で誘発された炎症が徐々に周囲の軟骨と骨に広がり、関節の破壊と変形をもたらす疾病である。関節リウマチの発症機序にＳＴＡＴ３およびその関連シグナル伝達が関与していることは、当該分野で様々な研究で報告されている。
【０１００】
一方、本発明に係る前記薬学的組成物は、ＳＴＡＴ３／ＤＮＡ二重特異性抗体を有効成分として含み、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に一般に用いられるものであり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これらに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液など、他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。適切な薬学的に許容される担体および製剤化に関しては、レミントンの文献に開示されている方法を用いて各成分に応じて好ましく製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤などに製剤化することができる。
【０１０１】
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができるが、好ましくは経口投与することができ、投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路、および時間に応じて異なるが、当業者によって適宜選択することができる。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療または診断に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療または診断するのに十分な量を意味し、有効容量水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路、および排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野で広く知られた要素に応じて決定することができる。本発明に他の薬学的組成物は、個別治療薬として投与する、または他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは、順次または同時に投与することができ、単一または複数投与することができる。前記した要素をすべて考慮して副作用なく、最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定することができる。
【０１０３】
具体的には、本発明の薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内に活性成分の吸収度、不活性率と排泄速度、疾病の種類、併用される薬物に応じて異なることができ、一般的には体重１ｋｇ当たり０．００１〜１５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇを毎日または隔日投与する、または１日１〜３回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などに応じて増減しうるので、前記投与量がいずれの方法でも、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０４】
本発明のもう一つの態様として、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。
【０１０５】
本発明のもう一つの態様として、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、癌転移抑制方法を提供する。
【０１０６】
本発明のもう一つの態様として、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、炎症性疾患治療方法を提供する。
【０１０７】
本発明における「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非−ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ネズミ（ｒａｔ）、犬、猫、馬、および牛などの哺乳類を意味する。
【０１０８】
本発明のもう一つの様態として、本発明は、前記薬学的組成物の癌治療用途を提供する。
【０１０９】
本発明のもう一つの様態として、本発明は、前記薬学的組成物の癌転移抑制用途を提供する。
【０１１０】
本発明のもう一つの様態として、本発明は、前記薬学的組成物の炎症性疾患治療用途を提供する。
【０１１１】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。
【０１１２】
［実施例］
実施例１．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙを用いたリン酸化したＳＴＡＴ３ペプチド特異性抗体配列の発掘および候補の選別
本発明者等は、７０５番目のチロシン残基がリン酸化したＳＴＡＴ３（ｐＹ７０５  ＳＴＡＴ３）に特異的に結合する抗体を作製するため、まずファージディスプレイ（Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ）を用いて、前記リン酸化したＳＴＡＴ３に結合する抗体をスクリーニングする。
【０１１３】
これのためには、先に韓国所在の五松先端医療複合団地新薬開発支援センターの候補抗体発掘チームから提供されたヒトｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリを利用し、ｐＹ７０５  ＳＴＡＴ３ペプチドを抗原として用いてファージディスプレイを実施した。具体的には、固体表面（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｒｆａｃｅ）上に固定された抗原にファージ抗体ライブラリを混ぜ与え、抗体−抗原結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ）を誘導し、結合していないファージを除去した（Ｗａｓｈｉｎｇ）。次に、抗原と結合しているファージをａｌｋａｌｉｎｅ／ａｃｉｄｉｃ  ｐＨ溶液または競合ペプチド（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ）などを用いて溶出させた後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に感染させて溶出されたファージを増幅させ、増幅されたファージは、次のラウンドのパニングに利用して、特定の抗体を濃縮させることに用いた。その結果、最終的に２４個のｐＹ７０５  ＳＴＡＴ３ペプチド特異性抗体配列を導出した。
【０１１４】
その後、表１に示すように、前記２４個の配列のうちＫＤが９０ｎＭより低くかったので、ｐＹ７０５  ＳＴＡＴ３に対する親和性が高い抗体候補７つを最終的に選別し、ＫＤが４−６ｎＭである３つの候補抗体（Ｃ４、３Ａ１０、およびＣ６）を選択して、組換え二重抗体の開発を進めた。
【０１１５】
【表１】
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実施例２．リン酸化したＳＴＡＴ３特異的組換え抗体の作製
本発明者等は、前記実施例１にて最終選別した３つの抗体候補配列を用いて、リン酸化したＳＴＡＴ３（ｐＹ７０５  ＳＴＡＴ３）に特異的な組換え二重抗体を作製する。
【０１１６】
本発明にて作製した二重抗体は、図１ａに示すように、一方の末端の抗原結合部位は、リン酸化したＳＴＡＴ３に結合する一方で、他の一方の抗原結合部位は、細胞の核内ＤＮＡに結合する構造を有するものである。より具体的には、図１ｂに示すように、リン酸化したＳＴＡＴ３に結合するｓｃＦｖ（ＳＴＡＴ３  ｓｃＦｖ）と、細胞内に浸透し、核内ＤＮＡに結合するｓｃＦｖ（３Ｅ１０  ｓｃＦｖ）がスイベル（ｓｗｉｖｅｌ）形態のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって繋がった構造である。前記３Ｅ１０  ｓｃＦｖは、ループス（ｌｕｐｕｓ）患者から検出された自己抗体（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ）のＤＮＡ結合ドメインを利用したものであり、さらに細胞内の浸透効率がさらに向上すると報告された、「Ｖａｒｉａｎｔ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ」の３１番目のアスパラギン酸（青色で表示）がアスパラギンに置き換えられた（Ｄ３１Ｎ）ドメインを用いた。
【０１１７】
さらに、前記のような構造に組み換えて作製した本発明に係るリン酸化したＳＴＡＴ３二重特異性抗体（以下、ｐＳＴＡＴ３抗体）を細胞から発現させ、生産後、リン酸化したＳＴＡＴ３に結合するか否かを調べるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。これのために、ＣＨＯ−Ｋ１  ８０Ｍ細胞に１００μｇの組換え、ｐＳＴＡＴ３抗体の発現プラスミドＤＮＡを導入して発現させて、該抗体を得た後、４〜２０％のアクリルアミドゲルに各試料を１９．５μｌずつロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、前記抗体がリン酸化したＳＴＡＴ３を標的して結合するのかを観察した。
【０１１８】
その結果、図２に示すように、それぞれ独立したプロセスを介して細胞から生産されたｐＳＴＡＴ３抗体（丸付数字の１〜４）試料全部ｐＳＴＡＴ３に効果的に結合することを確認した。
【０１１９】
実施例３．ｐＳＴＡＴ３抗体の細胞浸透能の検証
本発明に係るｐＳＴＡＴ３抗体が実際に細胞内に浸透する機能を表すのか検証するために、細胞浸透能分析を実施した。これのため、ＤＬＤ大腸癌細胞株に対して３Ｅ１０  ｓｃＦｖを含むｐＳＴＡＴ３二重抗体（ｐＳＴＡＴ３−Ｃ４）、または３Ｅ１０  ｓｃＦｖを含むが、３１番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置き換えられた（Ｄ３１Ｎ）ｐＳＴＡＴ３抗体（ＳＴＡＴ３−Ｄ３１Ｎ）を処理した後、免疫細胞化学染色を通じて前記各ｐＳＴＡＴ３抗体を用いて細胞内ＳＴＡＴ３タンパク質を標識（ＳＴＡＴ３  ｓｔａｉｎｉｎｇ）し、これと共にＰＩ染色を通じて細胞核を染色（ＰＩ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ）して比較した。
【０１２０】
その結果、図３に示すようにｐＳＴＡＴ３−Ｄ３１Ｎ抗体を処理した場合、ＳＴＡＴ３染色結果が、細胞核を染色したＰＩの結果と完全に一致することを観察し、これを通じて前記抗体が細胞に浸透し、細胞内ｐＳＴＡＴ３と結合する能力があることを確認した。これに対し、ＳＴＡＴ３−Ｃ４抗体の場合にも、細胞に浸透して細胞内ｐＳＴＡＴ３と結合する能力が示されたが、ｐＳＴＡＴ３−Ｄ３１Ｎに比べ、細胞浸透効率が優れないことが分かった。
【０１２１】
実施例４．ｐＳＴＡＴ３抗体のｐＳＴＡＴ３抑制効果の検証
４−１．ｐＳＴＡＴ３抑制効果の検証
前記実施例２の結果から、本発明のｐＳＴＡＴ３抗体がｐＳＴＡＴ３に効率的に結合することを確認したところ、さらには前記抗体のｐＳＴＡＴ３を抑制する効果を検証するためにウエスタンブロットを実施して、タンパク質発現レベルを観察した。
【０１２２】
より具体的には、マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７と滑膜細胞であるＳｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅにそれぞれＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）またはＴＮＦαを処理し、ｐＳＴＡＴ３を活性化させた後、本発明のｐＳＴＡＴ３抗体を濃度別（２０、５０、１００または１０、２０、５０ｕｇ／ｍｌ）で処理し、ｐＳＴＡＴ３タンパク質の発現レベルを観察した。その結果、図４ａおよび図４ｂに示すようにｐＳＴＡＴ３抗体（ＲＳｍｕ）を処理した場合、前記二つの細胞の両方で処理濃度に比例するように、ｐＳＴＡＴ３の発現レベルが減少することを確認した。これを通じて本発明に係るｐＳＴＡＴ３抗体がＬＰＳまたはＴＮＦαによって活性化されたｐＳＴＡＴ３タンパク質が効果的に抑制されることが分かった。
【０１２３】
さらにＲＡＷ２６４．７細胞にＬＰＳ単独またはＬＰＳとｐＳＴＡＴ３抗体５０μｇを一緒に施した後、ｐＳＴＡＴ３と一緒にＮＦ−κＢシグナル伝達によって誘導されるＣＯＸ−２の発現レベルを観察した。その結果、図４ｃに示すようにｐＳＴＡＴ３タンパク質の発現は、減少したのに対し、ＣＯＸ−２の発現レベルは、変化がないことを通じて、本発明のｐＳＴＡＴ３抗体がＣＯＸ−２タンパク質に影響を及ぼさないことを確認した。このような結果は、前記の抗体が活性化したｐＳＴＡＴ３タンパク質のみを選択的に抑制し、他のシグナル伝達に影響を及ぼさないことを示すもので、本発明の抗体の使用時に副作用を減少させることができることを立証するものである。
【０１２４】
４−２．ＳＴＡＴ３−ＲＥ媒介遺伝子発現抑制効果の検証
前記実施例４−１の結果に加えて、本発明のｐＳＴＡＴ３抗体がＳＴＡＴ３の機能を抑制することにより、ＳＴＡＴ−ＲＥ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）媒介遺伝子発現を抑制することができるか否かを検証する。これのため、ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株にＳＴＡＴ３−ＲＥの調節下に発現されるルシフェラーゼレポーター（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子ベクターを４８時間トランスフェクションした後、本発明のｐＳＴＡＴ３抗体を１時間処理して、１００ｎＭのＩＬ−６を２４時間処理した。その次にＩＬ−６刺激によるＳＴＡＴ３−ＲＥ媒介ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子発現レベルを測定した。
【０１２５】
その結果、図５に示すようにｐＳＴＡＴ３抗体（Ｄ３１Ｎ）を処理した場合、対照群（Ｃｏｎｔ）に比べて遺伝子発現がほぼ完全に抑制されたことを確認した。前記の結果から、本発明のｐＳＴＡＴ３抗体がＳＴＡＴ３媒介遺伝子発現を抑制する効果があることが分かった。
【０１２６】
上述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解することができるはずである。したがって、上述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解しなければならない。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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