(57)【要約】ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体に関するかまたはこれから得られる組成物および方法が提供される。より具体的には、ＰＤ−Ｌ１に結合する完全ヒト抗体、ＰＤ−Ｌ１結合抗体フラグメント、このような抗体の誘導体、およびこのようなフラグメントを含むＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドが提供される。本発明は、ＰＤ−Ｌ１、好ましくは、ヒトＰＤ−Ｌ１を結合する抗原結合ポリペプチド（または交換可能に「抗ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド（複数可）」、「ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド」）を提供する；上記ポリペプチドは、以下の特徴のうちの一方または両方を有する：（ａ）ＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ１と相互作用するその能力を阻害する；ならびに（ｂ）ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘発し得るアイソタイプまたは定常領域を有する。
2021534750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、ヒトＰＤ−Ｌ１エピトープに結合する抗原結合ポリペプチドであって、ここでそのそれぞれの配列は、
（ａ）配列番号１８および配列番号２０；
（ｂ）配列番号４２および配列番号４４；
または
（ｃ）配列番号３４および配列番号３６、
から本質的になる抗原結合ポリペプチド。
【請求項２】
重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、ヒトＰＤ−Ｌ１エピトープに結合する抗原結合ポリペプチドであって、ここでそのそれぞれの配列は、
（ａ）配列番号２２および配列番号２４；
（ｂ）配列番号２および配列番号４；
（ｃ）配列番号６２および配列番号６４；
または
（ｄ）配列番号８２および配列番号８４
から本質的になる抗原結合ポリペプチド。
【請求項３】
重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、ヒトＰＤ−Ｌ１エピトープに結合する抗原結合ポリペプチドであって、ここでそのそれぞれの配列は、
（ａ）配列番号７０および配列番号７２；
（ｂ）配列番号５０および配列番号５２；
（ｃ）配列番号１０２および配列番号１０４；
または
（ｄ）配列番号３０および配列番号３２
から本質的になる抗原結合ポリペプチド。
【請求項４】
重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、ヒトＰＤ−Ｌ１エピトープに結合する抗原結合ポリペプチドであって、ここでそのそれぞれの配列は、
（ａ）配列番号６および配列番号８；
（ｂ）配列番号１０および配列番号１２；
（ｃ）配列番号１４および配列番号１６；
（ｄ）配列番号２６および配列番号２８；
（ｅ）配列番号３８および配列番号４０；
（ｆ）配列番号４６および配列番号４８；
（ｇ）配列番号５４および配列番号５６；
または
（ｈ）配列番号５８および配列番号６０
から本質的になる抗原結合ポリペプチド。
【請求項５】
重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、ヒトＰＤ−Ｌ１エピトープに結合する抗原結合ポリペプチドであって、ここでそのそれぞれの配列は、
（ａ）配列番号６６および配列番号６８；
（ｂ）配列番号７４および配列番号７６；
（ｃ）配列番号７８および配列番号８０；
（ｄ）配列番号８６および配列番号８８；
（ｅ）配列番号９０および配列番号９２；
（ｆ）配列番号９４および配列番号９６；
（ｇ）配列番号９８および配列番号１００；
または
（ｈ）配列番号１０６および配列番号１０８．
から本質的になる抗原結合ポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、配列番号１８と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列および配列番号２０と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドは、完全ヒト抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載の抗原結合ポリペプチド。
【請求項８】
前記抗体は、ヒト定常領域をさらに含み、ここで前記ヒト定常領域は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を有する、請求項７に記載の抗原結合ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗原結合ポリペプチドをコードする核酸分子であって、ここで前記核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である、核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子は、（ａ）配列番号１７および配列番号１９；（ｂ）配列番号３３および配列番号３５；または（ｃ）配列番号４１および配列番号４３から本質的になる、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの実質的に同一の対を含む、ヒトＰＤ−Ｌ１エピトープに結合する抗体。
【請求項１２】
請求項１〜８に記載の抗原結合ポリペプチドまたは請求項１１に記載の抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤、キャリアまたは希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
状態に関して処置を必要とする被験体を治療的に処置する方法であって、前記方法は、治療上有効な量の請求項１２に記載の医薬組成物を前記被験体に投与することを包含する、方法。
【請求項１４】
状態に関して処置を必要とする被験体を治療的に処置する方法であって、前記方法は、治療上有効な量の請求項１３に記載の医薬組成物を、（ａ）他の免疫抑制経路を標的とする抗体；（ｂ）化学療法もしくは放射線療法；（ｃ）免疫抑制経路を遮断する他の機構；または（ｄ）他の免疫治療剤と組み合わせて前記被験体に投与することを包含する、方法。
【請求項１５】
前記状態は、卵巣がん、結腸がん、乳がん、肺がん、骨髄腫、神経芽細胞由来ＣＮＳ腫瘍、単球性白血病、Ｂ細胞に由来する白血病、Ｔ細胞に由来する白血病、Ｂ細胞に由来するリンパ腫、Ｔ細胞に由来するリンパ腫、マスト細胞に由来する腫瘍、黒色腫、膀胱がん、胃がん、肝臓がん、尿路上皮癌、皮膚癌、腎がん、頭頸部がん、膵臓がん、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される哺乳動物のがんである、請求項１３または１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物のがんは、検出可能な量のＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞の少なくとも一部を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＤＬ１への結合に関して、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドと競合するポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチドを生成する哺乳動物発現系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年８月２０日出願の同時係属中の米国仮特許出願第６２／７２０，０１５号（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）の優先権およびその利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ１を結合する抗原結合ポリペプチド、その医薬組成物およびその使用に関する。本発明の局面はまた、このような抗原結合ポリペプチドまたは抗体を生成する発現系に関する。本発明の記載される抗原結合ポリペプチドまたは医薬組成物は、病的な状態（例えば、哺乳動物のがん、感染など）に関して処置を必要とする被験体を処置するために有用である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫細胞は、それらの細胞表面上に膜結合および可溶性リガンドと相互作用する共刺激および阻害レセプターを有する。これらのレセプターは、免疫細胞活性化または阻害の閾値および継続期間を変化させることによって、免疫応答の有効性、継続期間、およびタイプを調節するように働く。これらはしばしば、まとめて、免疫チェックポイントといわれる。これらのチェックポイント分子のうちの多くは、分子のＢ７スーパーファミリーまたは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのいずれかのメンバーである。
【０００４】
そのＢ７ファミリーは、阻害および刺激共レセプターの両方を含む。例えば、一方で、プログラムされた（細胞）死タンパク質１（ＰＤ−１）および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）と、それらそれぞれのリガンド（それぞれ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＢ７−１、Ｂ７−２）とのライゲーションは、調節性Ｔ細胞の活性化または生成、アネルギー、消耗およびアポトーシスの抑制をもたらす。他方で、分化抗原群（ＣＤ２８）および誘導性Ｔ細胞共刺激（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ＣＯＳｔｉｍｕｌａｔｏｒ  （ＩＣＯＳ））レセプターとそれらそれぞれのリガンドとのライゲーションは、増殖の増加およびサイトカインの生成を生じる。対照的に、共刺激レセプターのＴＮＦファミリーは、刺激分子（例えば、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＣＤ２７）および増殖およびエフェクター機能分化に好都合であるそれらのリガンドのみを含む。さらに、これらのファミリーのうちのいずれかに属する他の共レセプター、例えば、Ｔｉｍ−３、ＬＡＧ−３、Ｃｅａｃａｍ−１などが存在する。
【０００５】
過去数十年間の間に、多くのタイプのがんが、種々の機構を通じて腫瘍内の免疫抑制環境を生成することが明らかになっている。繰り返し登場するテーマは、腫瘍内Ｔ細胞を抑制する阻害性免疫チェックポイントリガンド（特にＰＤＬ１）の異所性発現である。この腫瘍媒介性免疫抑制の遮断が、腫瘍内Ｔ細胞を抑制解除し得、それらが腫瘍を殺滅することを可能にし得るという証拠もますます増えている（Ａｄａｃｈｉ  Ｋ，  Ｔａｍａｄａ  Ｋ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ２０１５；１０６（８）：９４５−５０；  Ｒａｆｉｑ  Ｓら，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１８  Ａｕｇ  １３；Ｈａｒｇａｄｏｎ  ＫＭら，  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０１８；６２：２９−３９）。遮断は、抗体または種々の他の方法を通じて行われ得る。これは、抗体ががん細胞に結合し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を動員して、腫瘍細胞を直接殺滅する旧来の抗がん抗体療法とは異なる。
ＣＴＬＡ−４抗体は、ＦＤＡ承認を勝ち取る、免疫チェックポイント遮断に基づく免疫療法のクラスのうちの最初のものであった。他の遮断標的（例えば、ＰＤ１およびその関連分子）は、臨床状況において抗腫瘍免疫を増強するためにより多くのかつ異なる機会を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｄａｃｈｉ  Ｋ，  Ｔａｍａｄａ  Ｋ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ２０１５；１０６（８）：９４５−５０
【非特許文献２】Ｒａｆｉｑ  Ｓら，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１８  Ａｕｇ  １３
【非特許文献３】Ｈａｒｇａｄｏｎ  ＫＭら，  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０１８；６２：２９−３９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の簡単な要旨
本発明は、ＰＤ−Ｌ１、好ましくは、ヒトＰＤ−Ｌ１を結合する抗原結合ポリペプチド（または交換可能に「抗ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド（複数可）」、「ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド」）を提供する；上記ポリペプチドは、以下の特徴のうちの一方または両方を有する：（ａ）ＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ１と相互作用するその能力を阻害する；ならびに（ｂ）ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘発し得るアイソタイプまたは定常領域を有する。得られる抗体は、２つの相乗作用的経路−−Ｔ細胞抑制解除および直接的細胞傷害性を通じて、腫瘍細胞を殺滅し得る。本発明のポリペプチドは、腫瘍を単独で、あるいは（ａ）他の免疫抑制経路を標的とする抗体；（ｂ）化学療法もしくは放射線療法；（ｃ）免疫抑制経路を遮断する他の機構、例えば、アプタマーもしくはＲＮＡｉ；または（ｄ）他の免疫治療剤、例えば、サイトカイン、標的治療剤などとの組み合わせにおいて処置するために使用され得る。
【０００８】
１つの局面において、本発明は、抗原結合ポリペプチド、例えば、抗体、そのフラグメント誘導体またはアナログであって、ＩｇＧ１アイソタイプのものでありかつＰＤ−Ｌ１エピトープに、好ましくは少なくとも１０−６Ｍの結合親和性で結合し、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、配列番号７８、配列番号８２、配列番号８６、配列番号９０、配列番号９４、配列番号９８、配列番号１０２、配列番号１０６、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列「から本質的になる」（本明細書において、前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、またはより好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくはさらには１００％同一であることを意味する）重鎖可変ドメイン配列、ならびに、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号８８、配列番号９２、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１０４、配列番号１０８、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる（前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、またはより好ましくは８５％、９０％、９５％、もしくはさらには１００％同一であることを意味する）軽鎖可変ドメイン配列、を有する抗原結合ポリペプチドを提供する。
【０００９】
好ましい実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の対であって、ここでそれらそれぞれの配列は、以下の対合：（ａ）配列番号１８および配列番号２０；（ｂ）配列番号４２および配列番号４４；または（ｃ）配列番号３４および配列番号３６から本質的になる対を含む。
【００１０】
他の好ましい実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の対であって、ここでそれらそれぞれの配列は、以下の対合：（ａ）配列番号２２および配列番号２４；（ｂ）配列番号２および配列番号４；（ｃ）配列番号６２および配列番号６４；または（ｄ）配列番号８２および配列番号８４から本質的になる対を含む。
【００１１】
他の好ましい実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の対であって、ここでそれらそれぞれの配列は、以下の対合：（ａ）配列番号７０および配列番号７２；（ｂ）配列番号５０および配列番号５２；（ｃ）配列番号１０２および配列番号１０４；または（ｄ）配列番号３０および配列番号３２から本質的になる対を含む。
【００１２】
他の好ましい実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の対であって、ここでそれらそれぞれの可変領域配列は、以下の対合：（ａ）配列番号６および配列番号８；（ｂ）配列番号１０および配列番号１２；（ｃ）配列番号１４および配列番号１６；（ｄ）配列番号２６および配列番号２８；（ｅ）配列番号３８および配列番号４０；（ｆ）配列番号４６および配列番号４８；（ｇ）配列番号５４および配列番号５６；または（ｈ）配列番号５８および配列番号６０から本質的になる対を含む。
【００１３】
他の好ましい実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の対であって、ここでそれらそれぞれの可変領域配列は、以下の対合：（ａ）配列番号６６および配列番号６８；（ｂ）配列番号７４および配列番号７６；（ｃ）配列番号７８および配列番号８０；（ｄ）配列番号８６および配列番号８８；（ｅ）配列番号９０および配列番号９２；（ｆ）配列番号９４および配列番号９６；（ｇ）配列番号９８および配列番号１００；または（ｈ）配列番号１０６および配列番号１０８から本質的になる対を含む。
【００１４】
好ましくは、上記抗原結合ポリペプチドは、完全ヒトまたはそうでなければヒト化されている。好ましい実施形態において、上記抗原結合ポリペプチドは、ヒト定常領域をさらに含む。１つの特徴において、上記ヒト定常領域は、ＩｇＧ１である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、例えば、上記第１の対と実質的に同一である、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の第２の対をさらに含む。
【００１５】
好ましいバージョンにおいて、ＰＤ−Ｌ１への抗ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの結合は、ＰＤ１とのＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断する。これは、ＰＤ−Ｌ１上の結合のためのエピトープが、ＰＤ１相互作用境界面にまたはその付近にあるか、またはＰＤ１相互作用境界面のコンホメーションのアロステリック変化が存在するかのいずれかが原因であり得る。
【００１６】
別の局面において、本発明は、上述のポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。上記核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。好ましい実施形態において、上記核酸分子は、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子であって、ここで上記ＤＮＡ配列はそれぞれ、以下の対合：（ａ）配列番号１７および配列番号１９；（ｂ）配列番号３３および配列番号３５；（ｃ）配列番号４１および配列番号４３から本質的になる。
【００１７】
他の好ましい実施形態において、上記核酸分子は、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子であって、ここで上記ＤＮＡ配列はそれぞれ、以下の対合：（ａ）配列番号２１および配列番号２３；（ｂ）配列番号１および配列番号３；（ｃ）配列番号６１および配列番号６３；または（ｄ）配列番号８１および配列番号８３から本質的になる。
【００１８】
他の好ましい実施形態において、上記核酸分子は、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子であって、ここで上記ＤＮＡ配列はそれぞれ、以下の対合：（ａ）配列番号６９および配列番号７１；（ｂ）配列番号４９および配列番号５１；（ｃ）配列番号１０１および配列番号１０３；または（ｄ）配列番号２９および配列番号３１から本質的になる。
【００１９】
他の好ましい実施形態において、上記核酸分子は、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子であって、ここで上記ＤＮＡ配列はそれぞれ、以下の対合：（ａ）配列番号５および配列番号７；（ｂ）配列番号９および配列番号１１；（ｃ）配列番号１３および配列番号１５；（ｄ）配列番号２５および配列番号２７；（ｅ）配列番号３７および配列番号３９；（ｆ）配列番号４５および配列番号４７；（ｇ）配列番号５３および配列番号５５；または（ｈ）配列番号５７および配列番号５９から本質的になる。
【００２０】
他の好ましい実施形態において、上記核酸分子は、本発明の抗原結合ポリペプチドまたは抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子であって、ここで上記ＤＮＡ配列はそれぞれ、以下の対合：（ａ）配列番号６５および配列番号６７；（ｂ）配列番号７３および配列番号７５；（ｃ）配列番号７７および配列番号７９；（ｄ）配列番号８５および配列番号８７；（ｅ）配列番号８９および配列番号９１；（ｆ）配列番号９３および配列番号９５；（ｇ）配列番号９７および配列番号９９；または（ｈ）配列番号１０５および配列番号１０７から本質的になる。
【００２１】
別の局面において、本発明は、抗原結合ポリペプチド、例えば、本明細書で開示されるとおりの抗ＰＤ−Ｌ１抗体、フラグメント、誘導体またはアナログを含む医薬組成物を提供する。上記医薬組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤、キャリア、または希釈剤をさらに含む。
【００２２】
関連する局面において、本発明は、病的状態に関して処置を必要とする被験体を治療的に処置する方法であって、上記方法は、治療上有効な量の本明細書で開示される抗ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドまたは抗体を上記被験体に投与することを包含する方法を提供する。上記方法は、上記状態を示す少なくとも１個の細胞表面抗原に対する第２の異なる治療用抗体を投与するステップをさらに包含し得る。処置されている状態は、哺乳動物のがん、感染などであり得る。種々の実施形態において、上記抗ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体または抗体アナログであり得る。
【００２３】
好ましくは、処置されるべき哺乳動物のがんの範囲は、卵巣がん、結腸がん、乳がん、肺がん、骨髄腫、神経芽細胞由来ＣＮＳ腫瘍、単球性白血病、Ｂ細胞に由来する白血病、Ｔ細胞に由来する白血病、Ｂ細胞に由来するリンパ腫、Ｔ細胞に由来するリンパ腫、マスト細胞に由来する腫瘍、黒色腫、膀胱がん、胃がん、肝臓がん、尿路上皮癌、皮膚癌、腎がん、頭頸部がん、膵臓がん、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。より広くは、腫瘍細胞の少なくとも有意な割合が検出可能な量のＰＤ−Ｌ１を発現する任意のがんが、本発明の組成物によって処置されるべき標的として企図される。
【００２４】
なお別の局面において、本発明は、類似の状態に関して処置を必要とする被験体を予防的に処置する方法であって、上記方法は、予防上有効な量の本発明の医薬組成物を上記被験体に投与することを包含する方法を提供する。上記方法は、上記状態に対するワクチンを投与するステップをさらに包含し得る。１つの実施形態において、上記状態は、がんである。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、上記抗原結合ポリペプチド、例えば、本明細書で記載されるＰＤ−Ｌ１エピトープに結合する抗体、そのフラグメント、誘導体またはアナログを生成する哺乳動物発現系を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に従って、固相ファージパニング技術での、具体的には、イムノチューブへの試験タンパク質の間接的コーティングを使用する、抗原結合ポリペプチドのスクリーニングを模式的に示す。
【００２７】
【図２】図２は、本発明の一実施形態に従って、固相ファージパニング技術での、具体的には、イムノチューブへの試験タンパク質の直接的コーティングを使用する、抗原結合ポリペプチドのスクリーニングを模式的に示す。
【００２８】
【図３】図３は、間接ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて本発明の一実施形態を通じて得た代表的な単鎖可変フラグメント（ｓｃｆｖ）のｈＰＤＬ１を結合する能力を特徴づけるデータを列挙するチャートである。「ＮＣ」は、陰性コントロールを表す。
【００２９】
【図４】図４は、ＦＡＣＳ結合アッセイにおいて本発明の一実施形態を通じて得た代表的な単鎖可変フラグメント（ｓｃｆｖ）のｈＰＤＬ１を結合する能力を特徴づけるデータを列挙するチャートである。「ＰＣ」は、抗ｈＰＤＬ１−ＡＰＣ（１０μｇ／ｍｌ）で染色したｈＰＤＬ１／２９３Ｔ細胞を使用する陽性コントロールを表す。「ＮＣ」は、染色していないｈＰＤＬ１／２９３Ｔ細胞による陰性コントロールを表す。
【００３０】
【図５】図５は、レセプター遮断アッセイ（ｈＰＤＬ１によってコーティングされたプレート）において本発明の一実施形態を通じて得た種々の単鎖可変フラグメント（ｓｃｆｖ）のｈＰＤ１とｈＰＤＬ１との間の相互作用を遮断する能力を特徴づけるデータを列挙するチャートである。「ＰＣ」は、ビオチン−ｈＰＤ１−Ｆｃが添加された陽性コントロールを表す。「ＮＣ」は、緩衝液のみが添加された陰性コントロールを表す。
【００３１】
【図６】図６は、レセプター遮断アッセイ（ｈＰＤ１によってコーティングされたプレート）において本発明の一実施形態を通じて得た種々の単鎖可変フラグメント（ｓｃｆｖ）のｈＰＤ１とｈＰＤＬ１との間の相互作用を遮断する能力を特徴づけるデータを列挙するチャートである。「ＰＣ」は、ビオチン−ｈＰＤＬ１−Ｆｃが添加された陽性コントロールを表す。「ＮＣ」は、緩衝液のみが添加された陰性コントロールを表す。
【００３２】
【図７】図７は、直接的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて本発明の実施形態を通じて得た単鎖可変フラグメント（ｓｃｆｖ）のｈＰＤＬ１−Ｆｃ、ｍＰＤＬ１−Ｆｃ（マウスＰＤＬ１）およびｈＩｇＧ１を結合する能力を示す。
【００３３】
【図８−１】図８Ａおよび８Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８Ａ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（図８Ｂ）によって特徴づけられる全長抗体４−１Ｅ８を示す。
【図８−２】同上。
【００３４】
【図９−１】図９Ａおよび９Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図９Ａ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（図９Ｂ）によって特徴づけられる全長抗体３−１Ｂ１１を示す。
【図９−２】同上。
【００３５】
【図１０−１】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０Ａ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（図１０Ｂ）によって特徴づけられる全長抗体３−１Ｅ４を示す。
【図１０−２】同上。
【００３６】
【図１１−１】図１１Ｂおよび１１Ｃは、図１１Ａに従うＥＬＩＳＡフォーマットにおいてｈＰＤＬ１への、本発明に従う全長抗体実施形態のうちのいくつかの定量的結合分析の結果を示す。
【図１１−２】同上。
【００３７】
【図１２−１】図１２Ａおよび１２Ｂは、ｈＰＤＬ１発現２９３Ｔ細胞（上のグラフ）およびｈＰＤＬ１陰性２９３Ｔ細胞（下のグラフ）に結合する、本発明に従う全長抗体実施形態のうちのいくつかの定量的ＦＡＣＳの結果を示す。
【図１２−２】同上。
【００３８】
【図１３−１】図１３Ｂは、ＲＢＡフォーマット１（図１３Ａ）（ｈＰＤＬ１−Ｆｃでコーティングおよびビオチン−ｈＰＤ１−Ｆｃを添加）において本発明のリード抗体候補のレセプター遮断アッセイの結果を示す。
【図１３−２】同上。
【００３９】
【図１４−１】図１４Ｂは、ＲＢＡフォーマット２（図１４Ａ）（ｈＰＤ１−Ｆｃでコーティングおよびビオチン−ｈＰＤＬ１−Ｆｃを添加）において本発明のリード抗体候補のレセプター遮断アッセイの結果を示す。
【図１４−２】同上。
【００４０】
【図１５】図１５は、本発明の一実施形態を通じて得た種々の全長抗体を特徴づけるデータを列挙するチャートである。
【００４１】
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＢＩＡｃｏｒｅを使用するリード抗体候補のＰＤ−Ｌ１に対する親和性を示す：図１６Ａは、本発明の一例に従って利用したＢＩＡｃｏｒｅフォーマットを模式的に示す；図１６Ｂは、ＢＩＡｃｏｒｅを使用してＰＤ−Ｌ１に対するリード抗体候補の親和性の試験からの結果を列挙する；図１６Ｃは、ＢＩＡｃｏｒｅ親和性試験の４−１Ｅ８とコードされた抗体の応答曲線を示す；そして図１６Ｄは、ＢＩＡｃｏｒｅ親和性試験の３−１Ｂ１１とコードされた抗体の応答曲線を示す。
【図１６−２】同上。
【００４２】
【図１７−１】図１７Ａは、本発明の一例に従って利用したエピトープビニングフォーマットを模式的に示す。図１７Ｂは、本発明の一実施形態に従うリード抗体候補のエピトープビンを模式的に示す。図１７Ｃは、図１７Ａに表されるフォーマットを使用するリード抗体候補のエピトープビニングマトリクスを列挙する。
【図１７−２】同上。
【００４３】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｄは、ＦＡＣＳアッセイを通じて、カニクイザルＰＤＬ１−ＧＦＰ発現構築物でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞（上）および親２９３Ｔ細胞（下）に対するコントロール（図１８Ａ）、「４−１Ｅ８」（図１８Ｂ）、「３−１Ｅ４」（図１８Ｃ）、および「３−１Ｂ１１」（図１８Ｄ）とコードされる本発明の抗体の結合親和性を示す。
【００４４】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｄは、ＦＡＣＳアッセイを通じてカニクイザルＰＤＬ１発現構築物でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞（上）および親２９３Ｔ細胞（下）に対するコントロール（図１９Ａ）、「４−１Ｅ８」（図１９Ｂ）、「３−１Ｅ４」（図１９Ｃ）、および「３−１Ｂ１１」（図１９Ｄ）とコードされる本発明の抗体の結合親和性を示す。
【００４５】
【図２０】図２０は、本発明の実施形態に従って、ＩＬ−２生成実験の代表的ＥＣ５０結果を示す。
【００４６】
【図２１】図２１は、「４−１Ｅ８」とコードされるポリペプチド実施形態のＡＤＣＣ活性を、市販の抗ＰＤＬ１抗体アテゾリズマブと比較して示す。
【００４７】
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｃは、「４−１Ｅ８」とコードされるポリペプチド実施形態のＡＤＣＣ活性を、「３−１Ｂ１１」（図２２Ａ）および「３−１Ｅ４」（図２２Ｂ）とコードされる実施形態と比較して示す。重要なデータ点をチャートにまとめた（図２２Ｃ）。
【００４８】
【図２３−１】図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃは、本発明に従うリード抗体の存在下でＰＤＬ１＋  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞と共培養したＰＢＭＣのＩＬ−２生成能力の３セットの実験データを、市販の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と比較して提供する。
【図２３−２】同上。
【００４９】
【図２４】図２４は、本発明に従うリード抗体の存在下でＰＤＬ１＋  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞と共培養したＣＤ８  Ｔ細胞のＩＦＮγ生成能力の結果を、市販の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と比較して提供する。
【００５０】
【図２５−１】図２５Ａおよび２５Ｂは、本発明の実施形態に従うリード抗体の混合リンパ球反応結果を示す。
【図２５−２】同上。
【００５１】
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂは、「４−１Ｅ８」（図２６Ａ）および「３−１Ｂ１１」（図２６Ｂ）とコードされる本発明の抗体による結合の特異性を示す。
【００５２】
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂは、本発明の抗体Ｅ８（図２７Ａ）およびＢ１１（図２７Ｂ）が、ＣＤ８０をＰＤ−Ｌ１発現細胞の結合から遮断する能力（グレーの影をつけた（ｇｒｅｙ  ｓｉｌｌｅｄ）曲線）を、ＣＤ８０単独（実線）および二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）単独（破線）と比較して示す。
【００５３】
【図２８】図２８は、Ｔｇ３２マウスを使用する本発明の抗体実施形態の半減期測定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
発明の詳細な説明
別段注記されなければ、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「１つの、ある（ａ）」または「１つの、ある（ａｎ）」は、１またはこれより多い（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）、を意味し得る。本明細書で使用される場合、語句「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるときに、語句「１つの、ある（ａ）」または「１つの、ある（ａｎ）」は、１または１より多い（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）、を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の、もう１つの（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第２のまたはさらに他（ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）を意味し得る。さらに、文脈が別段要求しなければ、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含む。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「約」とは、明示的に示されようが示されていまいが、例えば、整数、有理数、およびパーセンテージを含む数値に言及する。用語「約」は一般に、当業者が記載された値に等価である（例えば、同じ機能または結果を有する）と考える数値の範囲（例えば、記載された値の±５〜１０％）に言及する。場合によっては、用語「約」は、最も近い有効数字に丸められる数値を含み得る。別段示されなければ、「約」は、記載された値の±１０％である。
【００５７】
「抗原結合ポリペプチド」は、抗原に結合する部分を含むポリペプチドである。抗原結合ポリペプチドの例としては、抗体、抗体フラグメント（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体、および抗体アナログが挙げられる。
【００５８】
抗原結合ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、天然に存在する抗体（「免疫グロブリン」としても公知）の構造を有し得る。各天然に存在する抗体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対（各対は、１つの「軽」（約２５ｋＤａ）鎖および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する）から構成される。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、インタクトな抗体が２つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。
【００５９】
天然に存在する抗体鎖の可変領域は、３個の超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲともいわれる）によって連結された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を示す。Ｎ末端からＣ末端へと、軽鎖および重鎖の両方が、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版，  ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＰＨＳ，  ＮＩＨ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ９１−３２４２，  １９９１におけるＫａｂａｔらの定義に従う。免疫グロブリン鎖におけるアミノ酸の他の番号付けシステムとしては、ＩＭＧＴ（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム；  Ｌｅｆｒａｎｃら，  Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９：１８５−２０３；  ２００５）およびＡＨｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０９（３）：６５７−６７０；  ２００１）が挙げられる。
【００６０】
抗体は、種々の抗原特異性を有する免疫グロブリンを含む血清または血漿のような供給源から得られ得る。このような抗体がアフィニティー精製に供される場合、それらは、特定の抗原特異性に関して富化され得る。抗体のこのような富化された調製物は通常、特定の抗原に対して特異的結合活性を有する約１０％未満の抗体から構成される。これらの調製物を数ラウンドのアフィニティー精製に供すると、抗原に対して特異的な結合活性を有する抗体の割合が増大し得る。この様式で調製される抗体はしばしば、「単一特異的」といわれる。単一特異的抗体調製物は、その特定の抗原に対して特異的な結合活性を有する約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または９９．９％の抗体で構成され得る。
【００６１】
用語「抗体」または「Ａｂ」（およびそれらの複数形）は、本明細書で使用される場合、４個のポリペプチド鎖である２個の重（ｈ）鎖および２個の軽（Ｌ）鎖、またはこれらの任意の機能的フラグメント（複数可）、変異体（複数可）、バリアント（複数可）、誘導体（複数可）もしくはアナログ（複数可）から構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子であって、Ｉｇ分子の本質的かつ特異的なエピトープ結合特徴を保持するものに広く言及する。このようなフラグメント、変異体、バリアント、誘導体またアナログの抗体フォーマットは、当該分野で公知であり、これらとしては、特に、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、キメラ抗体、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、およびポリペプチドに特異的抗原結合を付与するために十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。抗体フラグメント、誘導体およびアナログは、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素による切断もしくは化学的切断によって生成され得る。
【００６２】
Ｆａｂフラグメントは、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインを有する一価フラグメントであり；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２個のＦａｂフラグメントがヒンジ領域においてジスルフィド結合によって連結されている二価フラグメントである；Ｆｄフラグメントは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを有する；Ｆｖフラグメントは、抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む；そしてｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、またはＶＨドメインもしくはＶＬドメインの抗原結合フラグメントを有する（例えば、米国特許第６，８４６，６３４号；同第６，６９６，２４５号、米国出願公開２０／０２０２５１２；同２００４／０２０２９９５；同２００４／００３８２９１；同２００４／０００９５０７；同２００３／００３９９５８、およびＷａｒｄら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９を参照のこと）。
【００６３】
単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、連続するタンパク質鎖を形成するためにＶＬ領域およびＶＨ領域が、リンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して連結される抗体であって、ここで上記リンカーは、上記タンパク質鎖がそれ自体に対して折り返して、一価の抗原結合部位を形成することを可能にするために十分長いものである（例えば、Ｂｉｒｄら，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６およびＨｕｓｔｏｎら，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３を参照のこと）。ダイアボディーは、２つのポリペプチド鎖を含む二価の抗体であって、ここで各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２つのドメイン間を対形成することを可能にするには短すぎ、従って、各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的なドメインと対形成することを可能にするリンカーによって連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むものである（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−４８、およびＰｏｌｊａｋら，  １９９４，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−２３を参照のこと）。ダイアボディーの２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成から生じるダイアボディーは、２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディーを作製するために使用され得る。同様に、トリアボディーおよびテトラボディーは、それぞれ、３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ、３つおよび４つの抗原結合部位を形成し、その抗原結合部位は同じであってもことなっていてもよい抗体である。
【００６４】
所定の抗体の相補的決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔら  前出；  Ｌｅｆｒａｎｃら，  前出および／またはＨｏｎｅｇｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  前出によって記載されるシステムを使用して同定され得る。１またはこれより多くのＣＤＲは、ある分子を抗原結合タンパク質にするために共有結合的または非共有結合的のいずれかでその分子へと組み込まれ得る。抗原結合ポリペプチドは、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（複数可）を組み込んでもよいし、別のポリペプチド鎖へとＣＤＲ（複数可）を共有結合的に連結してもよいし、非共有結合的にＣＤＲ（複数可）を組み込んでもよい。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が特定の目的の抗原に対して特異的に結合することを可能にする。
【００６５】
抗原結合ポリペプチドは、１つまたはこれより多くの結合部位を有し得る。１つより多くの結合部位が存在する場合、その結合部位は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。例えば、天然に存在するヒト免疫グロブリンは、代表的には、２つの同一の結合部位を有する一方で、「二重特異的」または「二重機能的」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【００６６】
用語「ヒト抗体」または「ヒト化抗体」とは、本明細書で使用される場合、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つまたはこれより多くの可変領域および定常領域を有する全ての抗体を包含する。１つの実施形態において、その可変ドメインおよび定常ドメインの全ては、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒトまたはヒト化抗体）。これらの抗体は、ヒト重鎖および／または軽鎖のコード配列に由来する抗体を発現するように遺伝的に改変されたマウスを目的の抗原で免疫することによるものを含め、種々の方法において調製され得る。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する抗体の配列から、１つまたはこれより多くのアミノ酸置換、欠失、および／または付加によって異なる配列を有し、その結果、そのヒト化抗体は、非ヒト種抗体と比較して、ヒト被験体に投与される場合に、免疫応答を誘導する可能性が低い、および／またはそれほど重篤でない免疫応答を誘導する。１つの実施形態において、その非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン中のある特定のアミノ酸は、上記ヒト化抗体を生成するために変異される。別の実施形態において、ヒト抗体に由来する定常ドメイン（複数可）は、非ヒト種の可変ドメイン（複数可）に融合される。別の実施形態において、非ヒト抗体の１つまたはこれより多くのＣＤＲ配列中の１つまたはこれより多くのアミノ酸残基は、その非ヒト抗体がヒト被験体に投与される場合に、その非ヒト抗体の起こり得る免疫原性を低減するように変化させられ、ここでその変化したアミノ酸残基は、その抗原への抗体の免疫特異的結合にとって重要でないか、または作製されるアミノ酸配列に対する変化は、保存的変化であるかのいずれかであり、その結果、その抗原へのそのヒト化抗体の結合は、その抗原への非ヒト抗体の結合より有意に悪い訳ではない。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号に見出され得る。
【００６７】
用語「キメラ抗体」とは、本明細書で使用される場合、１つの抗体に由来する１つまたはこれより多くの領域および少なくとも別の抗体に由来する１つまたはこれより多くの領域を含む抗体に言及する。一実施形態において、１種より多くのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体に由来するＣＤＲが混合され、キメラ抗体の中で適合される。
【００６８】
活性化Ｔ細胞は、それらの細胞表面上でＰＤ１を発現する。ＰＤ１へのＰＤ−Ｌ１の結合は、ＰＤ１を活性化し、ＰＤ１＋  Ｔ細胞を抑制する。「中和抗体」または「阻害性抗体」とは、本明細書で使用される場合、過剰な抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、アッセイ（例えば、本明細書中の実施例の中で記載されるもの）を使用して、上記活性化の量を少なくとも約２０％低減する場合の、ＰＤ１の活性化を遮断する抗体に言及する。種々の実施形態において、上記抗原結合タンパク質は、ＰＤ１の活性化の量を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％低減する。
【００６９】
抗体のフラグメントまたはアナログは、本明細書の教示に従って、および当該分野で公知の技術を使用して、当業者によって容易に調製され得る。フラグメントまたはアナログの好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に存在する。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データと、公的なまたは所有権が主張されている配列データベースとを比較することによって同定され得る。コンピューター化された比較法は、公知の構造および／または機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは推定タンパク質コンホメーションドメインを同定するために使用され得る。公知の三次元構造へと折りたたまれるタンパク質配列を同定する方法は、公知である。Ｂｏｗｉｅら，  １９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４を参照のこと。
【００７０】
本明細書で使用される場合、抗原結合ポリペプチドは、１００ナノモル濃度またはこれより小さい解離定数で抗原に結合する場合に、抗原（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１）に「特異的に結合する」。
【００７１】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域、または「抗原結合部位」は、本明細書で使用される場合、抗原と相互作用しかつその抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含む抗原結合タンパク質の一部である。その抗原に特異的に結合する抗体に関して、それは、そのＣＤＲドメインのうちの少なくとも１つの少なくとも一部を含む。
【００７２】
「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、抗原結合タンパク質によって（例えば、抗体によって）結合される分子の一部である。エピトープは、分子の非連続部分（例えば、ポリペプチドにおいて、そのポリペプチドの一次配列において連続していないが、そのポリペプチドの三次および四次構造の文脈では、互いに抗原結合タンパク質によって結合されるために十分近いアミノ酸残基）を含み得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、全体を通じて交換可能に使用され、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して生成されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ（例えば、ペプチド核酸および天然に存在しないヌクレオチドアナログ）、およびそのハイブリッドを含む。その核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得る。１つの実施形態において、本発明の核酸分子は、抗体、またはそのフラグメント、誘導体、変異体、もしくはバリアントをコードする連続するオープンリーディングフレームを含む。
【００７４】
「ベクター」とは、本明細書で使用される場合、１つの核酸に連結される別の核酸を細胞に導入するために使用され得る核酸である。ベクターの１タイプは、「プラスミド」であり、これは、さらなる核酸セグメントがライゲーションされ得る直線状または環状の２本鎖ＤＮＡ分子に言及する。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）であり、ここでさらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムに導入され得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製し得る（例えば、細菌の複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際にその宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、その宿主ゲノムとともに複製される。「発現ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を指示し得るベクターのタイプである。
【００７５】
本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列は、調節配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、または場所）に影響を及ぼす場合、その調節配列に「作動可能に連結」される。「調節配列」は、その調節配列が作動可能に連結される核酸の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、または場所）に影響を及ぼす核酸である。その調節配列は、例えば、調節された核酸に対して直接的に、または１つもしくはこれより多くの他の分子（例えば、調節配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を通じて、その効果を発揮し得る。調節配列の例としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，  １９９０，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．およびＢａｒｏｎら，  １９９５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：３６０５−０６に記載される。
【００７６】
好ましくは、本発明の組成物によって処置されるべき哺乳動物のがんの広い範囲は、卵巣がん、結腸がん、乳がん、肺がん、骨髄腫、神経芽細胞由来ＣＮＳ腫瘍、単球性白血病、Ｂ細胞に由来する白血病、Ｔ細胞に由来する白血病、Ｂ細胞に由来するリンパ腫、Ｔ細胞に由来するリンパ腫、マスト細胞に由来する腫瘍、黒色腫、膀胱がん、胃がん、肝臓がん、尿路上皮癌、皮膚癌、腎がん、頭頸部がん、膵臓がん、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。より広く、腫瘍細胞のうちの少なくとも一部が検出可能な量のＰＤ−Ｌ１を発現する任意のがんが、潜在的には、本発明の組成物によって処置され得る。
【００７７】
本開示のポリペプチドは、当該分野で公知の任意の標準的方法を使用して生成され得る。１つの例では、そのポリペプチドは、そのポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）を組換え発現ベクターの中に挿入し、そのＤＮＡ配列を、発現を促進する条件下で発現させることによって、組換えＤＮＡ法によって生成される。
【００７８】
本明細書で開示される種々のポリペプチドをうちのいずれかをコードする核酸は、化学合成され得る。コドン使用法は、細胞における発現を改善するように選択され得る。このようなコドン使用法は、選択される細胞タイプに依存する。特別なコドン使用法のパターンが、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞のために開発されている。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ２００３  １００（２）：４３８−４２；  Ｓｉｎｃｌａｉｒら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ２００２  （１）：９６−１０５；  Ｃｏｎｎｅｌｌ  Ｎ  Ｄ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００１  １２（５）：４４６−９；  Ｍａｋｒｉｄｅｓら  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  １９９６  ６０（３）：５１２−３８；およびＳｈａｒｐら  Ｙｅａｓｔ．  １９９１  ７（７）：６５７−７８を参照のこと。
【００７９】
核酸操作の一般的技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｖｏｌｓ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  第２版，  １９８９、またはＦ．  Ａｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７）および定期的最新版（本明細書に参考として援用される）に記載される。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルス、または昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳の調節エレメントに作動可能に連結される。このような調節エレメントとしては、転写プロモーター、転写を制御する選択肢的なオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。宿主細胞の中で複製する能力（通常は、複製起点によって付与される）および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子は、さらに組み込まれる。
【００８０】
本発明の組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するために有用であり得る任意のタイプのタンパク質タグ配列を含み得る。タンパク質タグの例としては、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが挙げられるが、これらに限定されない。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主とともに使用するための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８５）に見出され得る。
【００８１】
本発明の発現構築物は、宿主細胞に適した方法を使用して、宿主細胞に導入される。核酸を宿主細胞に導入するための種々の方法が、当該分野で公知であり、それらとしては、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、もしくは他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；リポフェクション；および感染（ここではベクターは感染性因子である）が挙げられるが、これらに限定されない。適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が挙げられる。
【００８２】
本明細書で開示されるタンパク質はまた、細胞翻訳系を使用して生成され得る。このような目的のために、そのポリペプチドをコードする核酸は、インビトロ転写がｍＲＮＡを生成することを可能にし、利用される特定の無細胞システムにおけるそのｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように改変されなければならない（真核生物（例えば、哺乳動物または酵母）無細胞翻訳系または原核生物（例えば、細菌）無細胞翻訳系）。
【００８３】
ＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチドはまた、化学合成によって（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  第２版，  １９８４，  Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．に記載される方法によって）生成され得る。そのタンパク質に対する改変はまた、化学合成によって生成され得る。
【００８４】
本開示のポリペプチドは、タンパク質化学の分野で概して公知のタンパク質の単離／精製法によって精製され得る。非限定的な例としては、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムでの）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。精製後、ポリペプチドは、異なる緩衝液へと交換され得る、および／または当該分野で公知の種々の方法のうちのいずれかによって濃縮され得る（濾過および透析が挙げられるが、これらに限定されない）。
【００８５】
その精製されたポリペプチドは、好ましくは少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９０％または９５％純粋、および最も好ましくは少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値に拘わらず、そのポリペプチドは、医薬製品としての使用のために十分に精製される。
【００８６】
ポリペプチドの翻訳後修飾
ある特定の実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含み得る。例示的な翻訳後タンパク質修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）、ビオチン化またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が挙げられる。結果として、その修飾された可溶性ポリペプチドは、非アミノ酸エレメント（例えば、脂質、ポリサッカリドもしくはモノサッカリド、およびホスフェート）を含み得る。グリコシル化の好ましい形態は、シアル化であり、これは、そのポリペプチドに１つまたはこれより多くのシアル酸部分を結合体化する。シアル酸部分は、タンパク質の起こり得る免疫原性をも低減すると同時に、溶解度および血清半減期を改善する。Ｒａｊｕら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２００１  ３１；  ４０（３０）：８８６８−７６を参照のこと。ポリペプチドの機能性に対するこのような非アミノ酸エレメントの効果は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１機能のおけるその拮抗的な役割、例えば、血管新生または腫瘍成長に対するその阻害効果に関して試験され得る。
【００８７】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドの改変された形態は、本発明の可溶性ポリペプチドを非タンパク質性ポリマーに連結することを含む。１つの具体的実施形態において、そのポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示されるような様式にあるポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。
【００８８】
１つの特徴において、本発明の結合ポリペプチドのｐｅｇ化実施形態は、好ましくは改変されていないタンパク質と関連する生物学的活性のうちの少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％を保持する。１つの実施形態において、生物学的活性は、ＫＤ、ｋｏｎまたはｋｏｆｆ速度によって評価されるように、ＰＤ−Ｌ１に結合するその能力に言及する。１つの具体的実施形態において、ｐｅｇ化結合ポリペプチドタンパク質は、非ｐｅｇ化対応物に対してヒトＰＤ−Ｌ１への結合において増加を示す。別の実施形態において、その生物学的活性は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ１相互作用の遮断に言及する。
【００８９】
治療剤、ワクチンおよび投与
本開示は、ＰＤ−Ｌ１生物学的活性の阻害に応答する状態を処置するかまたは前状態（ｐｒｅ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を防止するための方法をさらに特徴とする。好ましい例は、細胞過剰増殖および感染の持続によって特徴づけられる状態である。投与のための技術および投与量は、具体的なポリペプチドのタイプおよび処置され具体的な状態に依存して変動する。規制当局は、治療剤として使用されるタンパク質試薬が、受容可能に低レベルの発熱物質とともに製剤化されることを要求することから、本発明の治療用製剤は、実質的に発熱物質がないことに関して他の製剤から区別され得るか、または適切な規制当局（例えば、米国ＦＤＡ）によって決定されるような発熱物質の受容可能なレベル以下を少なくとも含み得る。
【００９０】
本発明の医薬製剤は、少なくとも１種の薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、または賦形剤を含み得る。その製剤中に含まれる賦形剤としては、例えば、使用される遺伝子構築物またはエフェクター細胞の種類、および投与様式に依存して、異なる目的を有する。一般的に使用される賦形剤の例としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、感染用水（ｗａｔｅｒ−ｆｏｒ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、バッファーおよび保存剤、等張化剤、増量剤、および滑沢剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明の別の実施形態において、本発明の医薬製剤は、患者に投与される。例示的な投与様式としては、静脈内注射が挙げられるが、これらに限定されない。他の様式としては、腫瘍内、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液包内（滑液領域）、頭蓋内、脊髄内（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ）、および髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）（髄液）が挙げられるが、これらに限定されない。製剤の非経口注射または注入に有用な任意の公知のデバイスは、このような投与をもたらすために使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、それらの通常のおよび慣習的な意味を有し、以下のうちの１つまたはこれより多くを含む：  被験体における疾患（例えば、がん）の症状の遮断、その重篤度および／もしくは頻度の改善、または減少、ならびに／あるいは被験体におけるがん細胞の成長、分裂、拡がり、もしくは増殖、またはがんの進行（例えば、あらたな腫瘍の出現）の阻害。処置は、本発明の方法が実施されていない被験体に対して約５％〜約１００％遮断、改善、減少または阻害することを意味する。好ましくは、遮断、改善、減少または阻害は、本発明の方法が実施されていない被験体に対して、約１００％、９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％である。
【００９２】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子構築物の一定量と薬学的に受容可能な賦形剤とで満たされた１つまたはこれより多くの容器を含むキットを提供する。上記キットはまた、使用のための指示を含み得る。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって規定された形態にある通知がまた、キットとさらに関連付けられ得、その通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の当局による承認を反映する。
【実施例】
【００９３】
ファージディスプレイ技術を使用する抗原結合ポリペプチドのスクリーニング：
【００９４】
間接的コーティング：  図１を参照すると、ＰＤＬ１結合単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、標準的ファージディスプレイ技術によって同定した。ヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーを、５０名の健常ドナーに由来するＢ細胞のＰＣＲベースの再構築を通じて生成した。固相イムノチューブベースのパニングを、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体をコーティングしたイムノチューブ上に間接的に固定した、ｈＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質および無関係のＦｃ融合タンパク質を使用して行った。強い結合剤に関してパニングするために、Ｆｃ結合ｓｃＦｖを、その無関係のＦｃ融合タンパク質を使用して最初に除去し、次いで、結合していないファージを、ｈＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質との結合に関して選択した。溶離したファージを、細菌中で増幅した。これらのラウンドを３〜４回反復し、ファージ力価および複雑性を、第２ラウンド以降に決定した。配列における収束が一旦認められたら（３ラウンド目および４ラウンド目）、個々のファージクローンを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてｈＰＤＬ１を結合するそれらの能力に関して試験した。
【００９５】
直接的コーティング：  これを、抗ヒトＦｃ抗体を使用せずに、イムノチューブ上にＦｃタンパク質を直接コーティングすることによって行った（図２）。
【００９６】
ファージ結合ＥＬＩＳＡ：
【００９７】
ＥＬＩＳＡを、パニングと同じストラテジーを使用して行った。間接的パニングからのクローンに関しては、プレートを、最初に抗ヒトＦｃ抗体で、次いで、Ｆｃタンパク質でコーティングした。直接的パニングのクローンに関しては、プレートを、Ｆｃタンパク質で直接コーティングした。間接ＥＬＩＳＡアッセイでは、ファージを、ｈＰＤＬ１−Ｆｃおよび無関係のＦｃタンパク質（またはｈＩｇＧ１）を結合するそれらの能力に関して、並行アッセイにおいて試験した。無関係のＦｃタンパク質に低結合を、およびｈＰＤＬ１に高結合を示したファージを、さらなる配列決定および二次スクリーニングのために選択した。データを図３に示した。大部分のクローンの非特異的結合は低い（Ｆｃタンパク質（１：１０希釈）に対するシグナル値は、０．２未満である）。直接的ＥＬＩＳＡアッセイでは、ファージを、ｈＰＤＬ１−Ｆｃ、ｍＰＤＬ１−Ｆｃ（マウスＰＤＬ１）およびｈＩｇＧ１を結合するそれらの能力に関して並行アッセイにおいて試験した。ファージは、本発明におけるリード分子のうちのいずれによるマウスＰＤＬ１への有意な結合も存在しないことを示した。すなわち、そのリード分子はいずれも、マウスＰＤＬ１との有意な交差反応性を示さない。データを図７に示す。
【００９８】
配列決定：
【００９９】
特有のクローンを、重鎖のＣＤＲ３領域を最初に配列決定することによって同定した。これを、完全配列によっても後に確認した。クローンの小さな部分セットは、同じＣＤＲ３を共有したが、それらの配列の他の部分において有意な多様性があった。
【０１００】
ＦＡＣＳによる二次スクリーニング：  
【０１０１】
ｓｃＦｖを発現するファージ、ファージ溶解物または細菌の溶解物を、親２９３Ｔ細胞にではなく、ｈＰＤＬ１を発現する２９３Ｔ細胞に優先的に結合するそれらの能力に関して試験した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比を、陽性クローンを同定するための基準として使用した。データを図４に示した。大部分のクローンは、陽性クローンとして同定され得る高い比を示した。
【０１０２】
遮断因子同定：
【０１０３】
ｓｃＦｖを発現するファージ、ファージ溶解物または細菌の溶解物を、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１との間の相互作用を遮断するそれらの能力に関して試験した。その結合アッセイを、ｈＰＤ１−ＦｃまたはｈＰＤＬ１−Ｆｃいずれかでプレートをコーティングすることによって設定した。ビオチン化リガンド（ｈＰＤＬ１またはｈＰＤ１）の結合を、標準的方法を使用するストレプトアビジン−ＨＲＰを使用して検出した。ｓｃＦｖの存在下での結合の喪失を、潜在的遮断因子を同定するために使用した。結果を図５および図６に示す。
【０１０４】
Ｆｃ融合タンパク質の生成および特徴付け：
【０１０５】
ｓｃＦｖが比較的不安定であることから、いくつかのｓｃＦｖを、Ｆｃ融合物に変換し、哺乳動物細胞において発現させた。これらを、プロテインＡカラムを使用して精製し、ＰＤ１−ＰＤＬ１相互作用を遮断するそれらの能力およびＰＤＬ１発現２９３Ｔ細胞を結合するそれらの能力に関して試験した。
【０１０６】
全長抗体の生成：
【０１０７】
全長抗体遺伝子を、個々のｓｃＦｖクローンからＶＨ領域およびＶＬ領域をＰＣＲ増幅することによって構築し、当業者が精通する標準的方法を使用して、適切な発現ベクターへとクローニングした。全長抗体タンパク質を、懸濁成長させた２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成し、当業者が精通する標準的方法によって、プロテインＡカラムを使用して精製した。
【０１０８】
全長抗体の特徴付け：
【０１０９】
例示的な全長抗体を、以下によって特徴づけた：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー（結果を図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０Ａ、および１０Ｂに示した）、ならびに（ａ）ＥＬＩＳＡによってｈＰＤＬ１を特異的に結合する（結果を図１１Ｂおよび１１Ｃに示した）；（ｂ）ｈＰＤＬ１発現２９３Ｔ細胞および自然な（ｕｎｓｔｒａｉｎｅｄ）２９３Ｔ細胞を特異的に結合する（結果を図１２Ａおよび１２Ｂに示した）；ならびに（ｃ）遮断アッセイの両方のバージョンにおいてＰＤ１−ＰＤＬ１相互作用を遮断する、ことにおけるそれらの有効性の定量。フォーマット１およびフォーマット２における例示的なリード抗体候補に関して得られたデータを、図１３Ｂおよび１４Ｂに示す。本発明における２７の抗体実施形態に関して得られたデータを、図１５に示す。
【０１１０】
ＢＩＡｃｏｒｅによるＰＤ−Ｌ１相互作用の親和性：
【０１１１】
上記リード抗体候補を、ＢＩＡｃｏｒｅを使用して、ＰＤ−Ｌ１に対するそれらの親和性に関して試験した（図１６Ｂ〜１６Ｄ）。簡潔には、ビオチン化ｈＰＤＬ１を、センサーチップ表面上のストレプトアビジンを介して捕捉した。抗体を、そのチップの上に流し、反応パラメーターを、相互作用の安定性に基づく単一サイクル動態法（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｙｃｌｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して計算した。ＫＤ値を、二価分析物結合モデルを用いるＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ１００評価ソフトウェア２．０を使用して評価した。
【０１１２】
ＦＡＣＳによるカニクイザルＰＤ−Ｌ１結合
【０１１３】
（Ａ）２９３Ｔ細胞を、カニクイザルＰＤＬ１−ＧＦＰ発現構築物で一過性にトランスフェクトした。実施形態４−１Ｅ８、３−１Ｅ４および３−１Ｂ１１を試験し、コントロールと比較した。結果を図１８Ａ〜１８Ｄに示す：全３種の抗体は、カニクイザルＰＤＬ１を結合した。
【０１１４】
（Ｂ）２９３Ｔ細胞を、カニクイザルＰＤＬ１発現構築物で一過性にトランスフェクトした。実施形態４−１Ｅ８、３−１Ｅ４および３−１Ｂ１１を試験し、コントロールと比較した。結果を図１９Ａ〜１９Ｄに示す：全３種の抗体実施形態は、カニクイザルＰＤＬ１を結合した。
【０１１５】
ＩＬ２誘導およびＥＣ５０決定
【０１１６】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒト血液からＦｉｃｏｌｌ勾配で、続いて、赤血球溶解によって、標準的プロトコールを使用して単離した。アッセイに関しては、ＲＰＭＩ＋培地を以下のように調製した：  １０％  ＦＢＳ、１％  ａｎｔｉ−ａｎｔｉ（Ｇｉｂｃｏ）および１％  非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を、ＡＴＣＣ変法（Ｇｉｂｃｏ）を用いてＲＰＭＩ培地に添加した。血液からの単離後に、ＰＢＭＣを１０〜２０ｍｌ  ＲＰＭＩ＋に再懸濁し、３７℃において５％  ＣＯ２で一晩培養した。次に、ＰＢＭＣを、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１００  ０００  ＰＢＭＣ／９６ウェルの濃度で播種した；最終容積／ウェルは、２００μｌであった。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ（ＳＥＢ）を、１ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、リード抗体を、２０μｇ／ｍｌにおいて（スクリーニングに関して）または５０μｇ／ｍｌ〜０．００３μｇ／ｍｌの濃度範囲において添加した。コントロールとして、ＳＥＢなし（例えば、刺激なし）の細胞；  ＳＥＢ単独ありまたはＳＥＢおよびアイソタイプコントロール（例えば、ベースライン）ありの細胞。
【０１１７】
３７℃において５％  ＣＯ２での７６時間インキュベーションの後、ＰＢＭＣを、１２００ｒｐｍにおいて１５分間、室温で遠心分離し、上清を集め、−２０℃で貯蔵した。ＩＬ２  ＥＬＩＳＡを、市販のＩＬ２−ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄまたはＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して、製造業者の指示に従って行った。ＥＬＩＳＡのために上清を１／２０〜１／８０に希釈した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３  Ｍ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して吸光度を測定し、データを、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用して分析した。そのリード抗体候補を、市販の抗ＰＤ１抗体と比較した。結果を図２０に示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞との腫瘍共培養実験（図２３Ａ〜２３Ｃを参照のこと）において、４−１Ｅ８は、３−１Ｂ１１および３−１Ｅ４より、ＩＬ２（図２３Ａ〜２３Ｃを参照のこと）およびＩＦＮγ（図２４を参照のこと）を抑制解除することにおいて一貫して有効であった。しかし、全３種の抗体は、Ｔ細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞との類似の共培養実験において、市販のＰＤＬ１抗体（例えば、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏ）およびデュルバルマブ（Ｄｕｒｖａ））生成と同程度またはそれより良好であった。
【０１１８】
ＡＤＣＣ活性
【０１１９】
図２１および図２２に示されるように、全３種のリード抗体は、強いＡＤＣＣ活性を示した一方で、アテゾリズマブ（これはＡＤＣＣ陰性であるように操作される）は活性を示さなかった。本発明のその３つの実施形態の中で、４−１Ｅ８は、ＡＤＣＣ活性の最も多い量を示した。
【０１２０】
混合リンパ球反応
【０１２１】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒト血液からＦｉｃｏｌｌ勾配で、続いて、赤血球溶解によって、標準的プロトコールを使用して単離した。細胞を、無血清ＲＰＭＩ  １６４０中で、１時間、３７℃において培養した。接着していない細胞を除去し、残っている単球を、ＲＰＭＩ  １６４０（５％  ヒトＡＢ血清、２ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ、および１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充）中で培養した。サイトカインを補充した新鮮な培地を、２〜３日ごとに添加した。成熟樹状細胞を、２０ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を６日目に添加することによって誘導し、２４時間培養した。
【０１２２】
樹状細胞を採取し、表現型決定し、後の使用のために凍結した。ＣＤ４  Ｔ細胞を、製造業者の指示に従って磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使用してＰＢＭＣから単離した。ＣＤ４  Ｔ細胞を、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で同種異系樹状細胞と一緒に、１：２．５の比においてＲＰＭＩ  １６４０（１０％  ヒトＡＢ血清を補充）を使用して培養した。樹状細胞を、添加する前に１００ｍｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）で処理した。ＣＦＳＥ（または類似の色素）希釈によって、Ｔ細胞において増殖を測定した。ＩＦＮｇ放出を、市販のＩＦＮｇ−ＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の指示に従って測定した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３  Ｍ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して吸光度を測定し、データを、ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用して分析した。これらの研究において、本発明の実施形態に従うリード抗体候補は、他の市販の抗ＰＤ１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体に匹敵する成績であった。例示的な結果を図２５Ａおよび２５Ｂに示す。
【０１２３】
結合特異性
【０１２４】
種々のＢ７ファミリーメンバーおよびそれらのレセプターを安定して発現するＥｘｐｉ２９３細胞の系統を、生成した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の能力を、蛍光抗ヒトＩｇＧを使用してＦＡＣＳによって試験した。例示的なリード抗体候補に関して得られたデータを、図２６Ａおよび２６Ｂに示す。
【０１２５】
ＣＤ８０−ＰＤＬ１結合の遮断
【０１２６】
ＰＤＬ１を発現するように操作したＤＬＤ１細胞を使用して、抗ＰＤＬ１  Ａｂｓの存在下または非存在下でのビオチン化ＣＤ８０−Ｆｃの結合、続いて、蛍光ストレプトアビジンを検出した。本発明の例示的なリード抗体候補に関して得られたデータを、図２７Ａおよび２７Ｂに示す。
【０１２７】
半減期測定
【０１２８】
血清半減期を、雄性ホモ接合性Ｔｇ３２マウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ  Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ，  Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）を使用して測定した。２ｍｇ／ｋｇの抗体を、０日目にＩＶ注射し、１日目および後の種々の時点で採血した。血漿を調製し、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して抗体力価を測定した。力価を、１日目の力価に対して正規化した。抗抗体応答も測定し、高力価を有するサンプルを分析から除去した。なぜならそれらはしばしば、ＥＬＩＳＡにおいて突然の変化を示したからである。本発明の例示的なリード抗体候補に関して得られたデータを、図２８に示す。異なる抗体の半減期は、６．９日（３−１Ｅ４。配列の詳細に関しては以下の実施例９を参照のこと）〜１０．５日（３−１Ｂ１１。配列の詳細に関しては以下の実施例１１を参照のこと）および１２．３日（４−１Ｅ８。配列の詳細に関しては以下の実施例５を参照のこと）の範囲に及んだ。
【０１２９】
ポリペプチド配列
【０１３０】
本発明に従うＰＤ−Ｌ１結合ポリペプチド配列の例は、以下のとおり列挙される：
実施例１：  抗体コード：  ４−１Ａ２
ＶＨ
【０１３１】
ＤＮＡ（配列番号１）
【化１】
2021534750.tif 000003
【０１３２】
アミノ酸（配列番号２）
【化２】
2021534750.tif 000004
ＶＬ
【０１３３】
ＤＮＡ（配列番号３）
【化３】
2021534750.tif 000005
【０１３４】
アミノ酸（配列番号４）
【化４】
2021534750.tif 000006
実施例２：  抗体コード：  ４−１Ａ１２
ＶＨ
【０１３５】
ＤＮＡ（配列番号５）
【化５−１】
2021534750.tif 000007
【化５−２】
2021534750.tif 000008
【０１３６】
アミノ酸（配列番号６）
【化６】
2021534750.tif 000009
ＶＬ
【０１３７】
ＤＮＡ  （配列番号７）
【化７】
2021534750.tif 000010
【０１３８】
アミノ酸（配列番号８）
【化８】
2021534750.tif 000011
実施例３：  抗体コード：  ４−１Ｂ９
ＶＨ
【０１３９】
ＤＮＡ（配列番号９）
【化９】
2021534750.tif 000012
【０１４０】
アミノ酸（配列番号１０）
【化１０】
2021534750.tif 000013
ＶＬ
【０１４１】
ＤＮＡ（配列番号１１）
【化１１】
2021534750.tif 000014
【０１４２】
アミノ酸（配列番号１２）
【化１２】
2021534750.tif 000015
実施例４：  抗体コード：  ４−１Ｂ１２
ＶＨ
【０１４３】
ＤＮＡ（配列番号１３）
【化１３】
2021534750.tif 000016
【０１４４】
アミノ酸（配列番号１４）
【化１４】
2021534750.tif 000017
ＶＬ
【０１４５】
ＤＮＡ（配列番号１５）
【化１５】
2021534750.tif 000018
【０１４６】
アミノ酸（配列番号１６）
【化１６】
2021534750.tif 000019
実施例５：  抗体コード：  ４−１Ｅ８
ＶＨ
【０１４７】
ＤＮＡ（配列番号１７）
【化１７】
2021534750.tif 000020
【０１４８】
アミノ酸（配列番号１８）
【化１８】
2021534750.tif 000021
ＶＬ
【０１４９】
ＤＮＡ（配列番号１９）
【化１９】
2021534750.tif 000022
【０１５０】
アミノ酸（配列番号２０）
【化２０】
2021534750.tif 000023
実施例６：  抗体コード：  ４−１Ｇ７
ＶＨ
【０１５１】
ＤＮＡ（配列番号２１）
【化２１】
2021534750.tif 000024
【０１５２】
アミノ酸（配列番号２２）
【化２２】
2021534750.tif 000025
ＶＬ
【０１５３】
ＤＮＡ（配列番号２３）
【化２３】
2021534750.tif 000026
【０１５４】
アミノ酸（配列番号２４）
【化２４】
2021534750.tif 000027
実施例７：  抗体コード：  ４−１Ｈ１０
ＶＨ
【０１５５】
ＤＮＡ（配列番号２５）
【化２５】
2021534750.tif 000028
【０１５６】
アミノ酸（配列番号２６）
【化２６】
2021534750.tif 000029
ＶＬ
【０１５７】
ＤＮＡ（配列番号２７）
【化２７−１】
2021534750.tif 000030
【化２７−２】
2021534750.tif 000031
【０１５８】
アミノ酸（配列番号２８）
【化２８】
2021534750.tif 000032
実施例８：  抗体コード：  ３−１Ｈ２
ＶＨ
【０１５９】
ＤＮＡ（配列番号２９）
【化２９】
2021534750.tif 000033
【０１６０】
アミノ酸（配列番号３０）
【化３０】
2021534750.tif 000034
ＶＬ
【０１６１】
ＤＮＡ（配列番号３１）
【化３１】
2021534750.tif 000035
【０１６２】
アミノ酸（配列番号３２）
【化３２】
2021534750.tif 000036
実施例９：  抗体コード：  ３−１Ｅ４  
ＶＨ
【０１６３】
ＤＮＡ（配列番号３３）
【化３３】
2021534750.tif 000037
【０１６４】
アミノ酸（配列番号３４）
【化３４】
2021534750.tif 000038
ＶＬ
【０１６５】
ＤＮＡ（配列番号３５）
【化３５】
2021534750.tif 000039
【０１６６】
アミノ酸（配列番号３６）
【化３６】
2021534750.tif 000040
実施例１０：  抗体コード：  ３−１Ａ８
ＶＨ
【０１６７】
ＤＮＡ（配列番号３７）
【化３７−１】
2021534750.tif 000041
【化３７−２】
2021534750.tif 000042
【０１６８】
アミノ酸（配列番号３８）
【化３８】
2021534750.tif 000043
ＶＬ
【０１６９】
ＤＮＡ（配列番号３９）
【化３９】
2021534750.tif 000044
【０１７０】
アミノ酸（配列番号４０）
【化４０】
2021534750.tif 000045
実施例１１：  抗体コード：  ３−１Ｂ１１
ＶＨ
【０１７１】
ＤＮＡ（配列番号４１）
【化４１】
2021534750.tif 000046
【０１７２】
アミノ酸（配列番号４２）
【化４２】
2021534750.tif 000047
ＶＬ
【０１７３】
ＤＮＡ（配列番号４３）
【化４３−１】
2021534750.tif 000048
【化４３−２】
2021534750.tif 000049
【０１７４】
アミノ酸（配列番号４４）
【化４４】
2021534750.tif 000050
実施例１２：  抗体コード：  ４−１Ｆ３
ＶＨ
【０１７５】
ＤＮＡ（配列番号４５）
【化４５】
2021534750.tif 000051
【０１７６】
アミノ酸（配列番号４６）
【化４６】
2021534750.tif 000052
ＶＬ
【０１７７】
ＤＮＡ（配列番号４７）
【化４７】
2021534750.tif 000053
【０１７８】
アミノ酸（配列番号４８）
【化４８】
2021534750.tif 000054
実施例１３：  抗体コード：  ４−１Ｇ５
ＶＨ
【０１７９】
ＤＮＡ（配列番号４９）
【化４９】
2021534750.tif 000055
【０１８０】
アミノ酸（配列番号５０）
【化５０】
2021534750.tif 000056
ＶＬ
【０１８１】
ＤＮＡ（配列番号５１）
【化５１】
2021534750.tif 000057
【０１８２】
アミノ酸（配列番号５２）
【化５２】
2021534750.tif 000058
実施例１４：  抗体コード：  ４−１Ｃ９
ＶＨ
【０１８３】
ＤＮＡ（配列番号５３）
【化５３】
2021534750.tif 000059
【０１８４】
アミノ酸（配列番号５４）
【化５４】
2021534750.tif 000060
ＶＬ
【０１８５】
ＤＮＡ（配列番号５５）
【化５５】
2021534750.tif 000061
【０１８６】
アミノ酸（配列番号５６）
【化５６】
2021534750.tif 000062
実施例１５：  抗体コード：  １１−Ａ４
ＶＨ
【０１８７】
ＤＮＡ（配列番号５７）
【化５７】
2021534750.tif 000063
【０１８８】
アミノ酸（配列番号５８）
【化５８】
2021534750.tif 000064
ＶＬ
【０１８９】
ＤＮＡ（配列番号５９）
【化５９−１】
2021534750.tif 000065
【化５９−２】
2021534750.tif 000066
【０１９０】
アミノ酸（配列番号６０）
【化６０】
2021534750.tif 000067
実施例１６：  抗体コード：  ２１−Ａ１
ＶＨ
【０１９１】
ＤＮＡ（配列番号６１）
【化６１】
2021534750.tif 000068
【０１９２】
アミノ酸（配列番号６２）
【化６２】
2021534750.tif 000069
ＶＬ
【０１９３】
ＤＮＡ（配列番号６３）
【化６３】
2021534750.tif 000070
【０１９４】
アミノ酸（配列番号６４）
【化６４】
2021534750.tif 000071
実施例１７：  抗体コード：  ２１−Ｈ１２
ＶＨ
【０１９５】
ＤＮＡ（配列番号６５）
【化６５】
2021534750.tif 000072
【０１９６】
アミノ酸（配列番号６６）
【化６６】
2021534750.tif 000073
ＶＬ
【０１９７】
ＤＮＡ（配列番号６７）
【化６７】
2021534750.tif 000074
【０１９８】
アミノ酸（配列番号６８）
【化６８】
2021534750.tif 000075
実施例１８：  抗体コード：  ７−Ｄ１２
ＶＨ
【０１９９】
ＤＮＡ（配列番号６９）
【化６９】
2021534750.tif 000076
【０２００】
アミノ酸（配列番号７０）
【化７０】
2021534750.tif 000077
ＶＬ
【０２０１】
ＤＮＡ（配列番号７１）
【化７１】
2021534750.tif 000078
【０２０２】
アミノ酸（配列番号７２）
【化７２】
2021534750.tif 000079
実施例１９：  抗体コード：  ９−Ｅ３
ＶＨ
【０２０３】
ＤＮＡ（配列番号７３）
【化７３】
2021534750.tif 000080
【０２０４】
アミノ酸（配列番号７４）
【化７４】
2021534750.tif 000081
ＶＬ
【０２０５】
ＤＮＡ（配列番号７５）
【化７５−１】
2021534750.tif 000082
【化７５−２】
2021534750.tif 000083
【０２０６】
アミノ酸（配列番号７６）
【化７６】
2021534750.tif 000084
実施例２０：  抗体コード：  １０−Ａ６
ＶＨ
【０２０７】
ＤＮＡ（配列番号７７）
【化７７】
2021534750.tif 000085
【０２０８】
アミノ酸（配列番号７８）
【化７８】
2021534750.tif 000086
ＶＬ
【０２０９】
ＤＮＡ（配列番号７９）
【化７９】
2021534750.tif 000087
【０２１０】
アミノ酸（配列番号８０）
【化８０】
2021534750.tif 000088
実施例２１：  抗体コード：  １２−Ａ４
ＶＨ
【０２１１】
ＤＮＡ（配列番号８１）
【化８１】
2021534750.tif 000089
【０２１２】
アミノ酸（配列番号８２）
【化８２】
2021534750.tif 000090
ＶＬ
【０２１３】
ＤＮＡ（配列番号８３）
【化８３】
2021534750.tif 000091
【０２１４】
アミノ酸（配列番号８４）
【化８４】
2021534750.tif 000092
実施例２２：  抗体コード：  １４−Ｇ１０
ＶＨ
【０２１５】
ＤＮＡ（配列番号８５）
【化８５−１】
2021534750.tif 000093
【化８５−２】
2021534750.tif 000094
【０２１６】
アミノ酸（配列番号８６）
【化８６】
2021534750.tif 000095
ＶＬ
【０２１７】
ＤＮＡ（配列番号８７）
【化８７】
2021534750.tif 000096
【０２１８】
アミノ酸（配列番号８８）
【化８８】
2021534750.tif 000097
実施例２３：  抗体コード：  ２２−Ａ６
ＶＨ
【０２１９】
ＤＮＡ（配列番号８９）
【化８９】
2021534750.tif 000098
【０２２０】
アミノ酸（配列番号９０）
【化９０】
2021534750.tif 000099
ＶＬ
【０２２１】
ＤＮＡ（配列番号９１）
【化９１−１】
2021534750.tif 000100
【化９１−２】
2021534750.tif 000101
【０２２２】
アミノ酸（配列番号９２）
【化９２】
2021534750.tif 000102
実施例２４：  抗体コード：  ３５−Ｂ１
ＶＨ
【０２２３】
ＤＮＡ（配列番号９３）
【化９３】
2021534750.tif 000103
【０２２４】
アミノ酸（配列番号９４）
【化９４】
2021534750.tif 000104
ＶＬ
【０２２５】
ＤＮＡ（配列番号９５）
【化９５】
2021534750.tif 000105
【０２２６】
アミノ酸（配列番号９６）
【化９６】
2021534750.tif 000106
実施例２５：  抗体コード：  ３−１Ｆ４
ＶＨ
【０２２７】
ＤＮＡ（配列番号９７）
【化９７】
2021534750.tif 000107
【０２２８】
アミノ酸（配列番号９８）
【化９８】
2021534750.tif 000108
ＶＬ
【０２２９】
ＤＮＡ（配列番号９９）
【化９９】
2021534750.tif 000109
【０２３０】
アミノ酸（配列番号１００）
【化１００】
2021534750.tif 000110
実施例２６：  抗体コード：  ４−１Ｂ３
ＶＨ
【０２３１】
ＤＮＡ（配列番号１０１）
【化１０１】
2021534750.tif 000111
【０２３２】
アミノ酸（配列番号１０２）
【化１０２】
2021534750.tif 000112
ＶＬ
【０２３３】
ＤＮＡ（配列番号１０３）
【化１０３】
2021534750.tif 000113
【０２３４】
アミノ酸（配列番号１０４）
【化１０４】
2021534750.tif 000114
実施例２７：  抗体コード：  ２１−Ｇ１
ＶＨ
【０２３５】
ＤＮＡ（配列番号１０５）
【化１０５】
2021534750.tif 000115
【０２３６】
アミノ酸（配列番号１０６）
【化１０６】
2021534750.tif 000116
ＶＬ
【０２３７】
ＤＮＡ（配列番号１０７）
【化１０７−１】
2021534750.tif 000117
【化１０７−２】
2021534750.tif 000118
【０２３８】
アミノ酸（配列番号１０８）
【化１０８】
2021534750.tif 000119
【０２３９】
種々の改変およびバリエーションが、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本発明において行われ得ることは、当業者に明らかである。本発明の他の改変は、本明細書を考慮し、本明細書で開示される発明を実施することから当業者に明らかである。本明細書および実施例が例示として考慮されるに過ぎないとともに、発明の真の範囲および趣旨が以下の請求項によって示されることが意図される。
【０２４０】
本出願全体を通じて、種々の刊行物、特許、および／または特許出願が、本発明が関連する分野の技術水準を拠り十分に記載するために参照される。これらの刊行物、特許、および／または特許出願の開示は、各個々の刊行物、特許、および／または特許出願が具体的にかつ個々に参考として援用されることが示されるのと同程度まで、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【図１】
2021534750.tif 000120
【図２】
2021534750.tif 000121
【図３】
2021534750.tif 000122
【図４】
2021534750.tif 000123
【図５】
2021534750.tif 000124
【図６】
2021534750.tif 000125
【図７】
2021534750.tif 000126
【図８−１】
2021534750.tif 000127
【図８−２】
2021534750.tif 000128
【図９−１】
2021534750.tif 000129
【図９−２】
2021534750.tif 000130
【図１０−１】
2021534750.tif 000131
【図１０−２】
2021534750.tif 000132
【図１１−１】
2021534750.tif 000133
【図１１−２】
2021534750.tif 000134
【図１２−１】
2021534750.tif 000135
【図１２−２】
2021534750.tif 000136
【図１３−１】
2021534750.tif 000137
【図１３−２】
2021534750.tif 000138
【図１４−１】
2021534750.tif 000139
【図１４−２】
2021534750.tif 000140
【図１５】
2021534750.tif 000141
【図１６−１】
2021534750.tif 000142
【図１６−２】
2021534750.tif 000143
【図１７−１】
2021534750.tif 000144
【図１７−２】
2021534750.tif 000145
【図１８】
2021534750.tif 000146
【図１９】
2021534750.tif 000147
【図２０】
2021534750.tif 000148
【図２１】
2021534750.tif 000149
【図２２】
2021534750.tif 000150
【図２３−１】
2021534750.tif 000151
【図２３−２】
2021534750.tif 000152
【図２４】
2021534750.tif 000153
【図２５−１】
2021534750.tif 000154
【図２５−２】
2021534750.tif 000155
【図２６】
2021534750.tif 000156
【図２７】
2021534750.tif 000157
【図２８】
2021534750.tif 000158
【配列表】
2021534750000001.app
【国際調査報告】
2021534750.tif 000159
2021534750.tif 000160
2021534750.tif 000161
2021534750.tif 000162
2021534750.tif 000163
2021534750.tif 000164
2021534750.tif 000165