(57)【要約】  本発明は、レナラーゼに結合し且つ阻害する組成物及び方法に関する。一実施態様において、レナラーゼ結合分子は、レナラーゼ活性を阻害する。従ってレナラーゼ活性の減少が恩恵のある疾患及び状態において、そのような阻害性レナラーゼ結合分子は、治療薬として作用することができる。
2021508709.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レナラーゼに特異的に結合する抗体又はその結合部位を含有する、組成物。
【請求項２】
前記抗体又はその結合部位が、少なくとも１０-6Ｍの親和性でレナラーゼへ特異的に結合する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体又はその結合部位が、配列番号：１−８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドへ特異的に結合する、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記レナラーゼが、ヒトレナラーゼである、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体又はその結合部位が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、免疫複合体、脱フコシル化抗体、及び二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫複合体が、治療薬又は検出部分を含む、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体又はその結合部位が、ヒト化抗体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、及び抗体模倣体からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体又はその結合部位が、ａ）配列番号：１５５のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ｂ）配列番号：１５６、配列番号：１６２、及び配列番号：１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２、ｃ）配列番号：１５７、及び配列番号：１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３、ｄ）配列番号：１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ｅ）配列番号：１５３のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２、並びにｆ）配列番号：１５４、及び配列番号：１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：からなる群から選択される、少なくとも一つを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体又はその結合部位が、配列番号：１５５のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号：１５６のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２、配列番号：１５７のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３、配列番号：１５２のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号：１５３のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２、及び配列番号：１５４のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗体又はその結合部位が、配列番号：２１９のアミノ酸配列を含むＶH、及び配列番号：２２１のアミノ酸配列を含むＶLを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体又はその結合部位が、ａ）配列番号：１９７及び配列番号：２０３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１、ｂ）配列番号：１９８及び配列番号：２０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２、ｃ）配列番号：１９９及び配列番号：２０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３、ｄ）配列番号：１９４及び配列番号：２００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１、ｅ）配列番号：１９５のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２、並びに、ｆ）配列番号：１９６のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：からなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体又はその結合部位が、配列番号：１９７のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号：１９８のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２、配列番号：１９９のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３、配列番号：１９４のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号：１９５のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２、及び配列番号：１９６のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体又はその結合部位が、配列番号：２２３のアミノ酸配列を含むＶH及び配列番号：２２５のアミノ酸配列を含むＶLを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項記載のアミノ酸配列の少なくとも一つをコードしている配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１５】
前記分子が、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、及び配列番号：２２４からなる群から選択される核酸配列の少なくとも一つと少なくとも８０％同一である核酸配列の少なくとも一つを含む、請求項１４記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１４記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１４記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項１８】
請求項１記載の組成物を対象へ投与することを含む、それを必要とする対象において疾患又は障害を治療する方法。
【請求項１９】
少なくとも一つの追加の薬剤を対象へ投与する工程を更に含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患又は障害が、腎疾患、心血管疾患、膵炎、肝炎、腎臓の炎症障害、及び癌からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患又は障害が、癌であり、且つこの癌が、膵臓癌又はメラノーマである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、ヒトである、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患及び障害の治療及び予防のための抗レナラーゼ抗体に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／６１１，６０９号の恩恵を主張するものであり、この仮出願はその全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
レナラーゼ（ＲＮＬＳ）は、主に腎臓、心臓、骨格筋、精巣において、及び他の組織においてより少ない程度で生成されるタンパク質である(Xuら、2005 J Clin Invest. 115 (5):1275-80、及びWangら、2008 Mol Biol Rep. 35(4):613-20)。レナラーゼの２つのアイソフォームバリアントであるレナラーゼ−１及びレナラーゼ−２が説明されている。これらのレナラーゼの２つの型は、最終エキソンの差次的スプライシングが原因で異なる。レナラーゼは、カテコールアミンのエピネフリン、ノルエピネフリン及びドパミンを選択的に脱アミノ化する活性を持つ、新規フラビンアデニンジヌクレオチド−含有モノアミンオキシダーゼとして説明されている。健常個体と比べた、末期腎疾患患者の血漿中のレナラーゼの欠乏が説明されている。カテコールアミンは、心臓拍出及び血管抵抗に対する作用を通じ、病的なものを含む、血圧の維持及び調節において大きな役割を果たす。ラットへのレナラーゼ組換え型の注入は、心収縮性、心拍数、及び血圧の低下を引き起こす。腎不全患者は、循環カテコールアミンの上昇したレベルにより特徴付けられ、これは高血圧及び心臓血管系合併症によるより大きい死亡率と相関している。従ってタンパク質レナラーゼは、血圧のカテコールアミン−誘導した変化の制御及び維持において役割を果たすことができ、且つ腎疾患患者において認められるレナラーゼの欠乏は、有害な転帰をもたらし得る。
【０００４】
健常個体と比べた、末期腎疾患患者の血漿中のレナラーゼの欠乏が、説明されている。腎不全患者は、循環カテコールアミンの上昇したレベルにより特徴付けられ、これは高血圧及び心臓血管系合併症によるより大きい死亡率と相関している。従ってタンパク質レナラーゼは、血圧のカテコールアミン−誘導した変化の制御及び維持において役割を果たすことができ、且つ腎疾患患者において認められるレナラーゼの欠乏は、有害な転帰をもたらし得る。しかし、癌におけるレナラーゼの役割についてはほとんど分かっていない。
【０００５】
癌の本質的特徴は、細胞の老化及び死滅の異常調節である。レナラーゼ（ＲＮＬＳ）は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路、及びＭＡＰＫ経路を活性化するための細胞膜カルシウムＡＴＰａｓｅ  ＰＭＣＡ４ｂを介したシグナル伝達による虚血性及び毒性細胞傷害から保護する、分泌型フラボタンパク質である。
【０００６】
皮膚癌は、一般的ヒト悪性腫瘍であり、その発生率は、発展途上国において上昇しつつある(Gray-Schopferら、2007 Nature. 445:851-7；Loweら、2014 Mayo Clinic Proceedings. 89:52-9；Lesinskiら、2013 Future oncology. 9:925-7)。メラノーマは、皮膚癌の最悪型であり、一旦切除不可能となると、生存率は低い(Loweら、2014 Mayo Clinic Proceedings. 89:52-9)。これは、分子が不均一性を示す疾患であり、疾患の発達及び進行に加担するシグナル伝達経路のいくつかの重要な改変が、同定されている。Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路は、メラノーマの発症機序において重要な役割を果たす(Gray-Schopferら、2007 Nature. 445:851-7；Lesinskiら、2013 Future oncology. 9:925-7；Yajimaら、2012 Dermatology research and practice. 2012:354191)。Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＰＩ３Ｋ又はＰＴＥＮ（ＰＩ３Ｋインヒビター）の変異は、ＥＲＫ及びＡＫＴの持続的活性化へ繋がることができ、これは次に細胞の生存及び増殖を促進する。Dankortらは、このことを、メラノーマを発症していないマウスにおけるＢＲａｆV600Eのコンディショナルメラニン形成細胞−特異的発現により、よく実証したが、しかしＰｔｅｎ腫瘍抑制因子遺伝子のサイレンシングと組合せられた場合、メラノーマ発達の１００％表現率(penetrance)を明らかにした(Dankortら、2009 Nature genetics. 41:544-52)。これらの発症経路の解明は、活性化過剰のキナーゼを標的化する特異的インヒビターの開発を促進している。これらの物質は、転移性メラノーマ患者の選択群の治療において、有効であることが証明されているが、それらの有益な作用は、短命であることが多く、そのため追加の治療的標的の同定が、差し迫って必要である。
【０００７】
ＲＮＬＳ発現は、メラノーマ腫瘍において、及び具体的にはＣＤ１６３+腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）において、顕著に増加している。原発性メラノーマ患者のコホートにおいて、疾患−特異的生存は、腫瘍塊中のＲＮＬＳ発現と逆相関し、このことはＲＮＬＳの発症機序における役割を示唆していた。ｓｉＲＮＡ、抗ＲＮＬＳ抗体、又はＲＮＬＳ由来の阻害ペプチドを使用するＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、インビトロにおいてメラノーマ細胞の生存を著しく減少する。モノクローナル抗体による抗ＲＮＬＳ療法は、異種移植マウスモデルにおいてメラノーマ腫瘍成長を顕著に阻害する。ｍ２８−ＲＮＬＳ（これまでは１Ｄ−２８−４としても公知）による治療は、内因性ＲＮＬＳ発現の顕著な減少、並びにＣＤ１６３+ＴＡＭにおける総及びリン酸化されたＳＴＡＴ３の顕著な減少を引き起こした。腫瘍細胞において増大したアポトーシスは、Ｂ細胞リンパ腫２関連タンパク質Ｂａｘのｐ３８  ＭＡＰＫ媒介した活性化に一過性に関連していた。細胞周期阻害物質ｐ２１の発現は増大し、且つ細胞周期の停止が報告された。これらの結果は、ＣＤ１６３+ＴＡＭによる増大したＲＮＬＳ生成は、ＳＴＡＴ３を活性化することにより、メラノーマ成長を促進すること、並びにＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、メラノーマの管理における可能性のある治療的適用であることを指摘している。
【０００８】
体液及び組織中のレナラーゼ検出の改善された方法は、腎疾患、心血管疾患及び／又は癌の診断及び予後判定の助けとなり得る。しかし、関連バイオマーカーとしてのレナラーゼのバリデーションは、その検出のための高度に選択的な試薬を必要としている。抗体-ベースの技術は、バイオマーカーの検出に関して広範に使用されている。現在まで、特徴決定されていないか最少であるレナラーゼに対し生じた少数の試薬抗体のみが存在する。
【０００９】
膵臓癌は、最も致命的な新生物の一つであり、世界中でおよそ３３０，０００名の、米国で４０，０００名の死因である(World Cancer Report 2014. WHO Press; 2014)。膵臓癌は、検出が困難であり、且つほとんどの症例は末期で診断される(Nolenら、2014 PLoS ONE. 9(4):e94928)。この癌の化学療法の使用においていくらかの進歩が存在するが、この疾患は、全ての薬物療法に対し極めて抵抗性であり続けている(Hidalgoら、2010 New England Journal of Medicine. 362(17):1605-17)。膵臓癌の個人の全５年生存率は、＜５％であり(Hidalgoら、2010 New England Journal of Medicine. 362(17):1605-17)、追加の治療的標的が必要とされている。
【００１０】
膵臓癌の発達は、遺伝子変異の段階的蓄積に頼っており(Jonesら、2008 Science. 321(5897):1801-6)、その一部は異常なＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ及びＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達を引き起こす。最少の異形成性上皮から異形成症への、侵襲性癌腫への進展は、癌遺伝子（例えばＫＲＡＳ２）の活性化、あるいは腫瘍抑制因子遺伝子（例えばＣＤＫＮ２ａ／ＩＮＫ４ａ、ＴＰ５３及びＤＰＣ４／ＳＭａＤ４）の不活化のいずれかである、遺伝子変異の段階的蓄積を反映している(Hidalgoら、2012 Annals of Oncology. 23(補遺10):x135-x8)。膵臓腫瘍の９５、９０及び７５％は、各々、ＫＲＡＳ２、ＣＤＫＮ２ａ、及びＴＰ５３に変異を有する。これらの変異は、癌成長を特徴付ける、持続され且つ調節されない増殖を生じる。膵管腺癌（ＰＤＡＣ）におけるこの変異を見通す中心のシグナル伝達経路は、２４の進行したＰＤＡＣの包括的遺伝子解析により、規定されている(Jonesら、2008 Science. 321(5897):1801-6)。これらのデータは、ほとんどのＰＤＡＣは、主に点変異であり、且つおよそ１２種の細胞シグナル伝達経路に影響を及ぼす、多数の遺伝子の変化を含むことを指摘している。
【００１１】
その研究はまた、腫瘍の９０％において少なくとも１０倍、ＰＤＡＣにおいて過剰発現された５４１遺伝子を同定した。これは、腫瘍における又は腫瘍由来の細胞株における、最近特徴付けられたタンパク質であるレナラーゼ（ＲＮＬＳ）の２〜４倍の増加を含んだ。新規の分泌型フラボタンパク質であるＲＮＬＳ(Xuら、2005 J Clin Invest. 115(5):1275-80；Desirら、2012 J Am Heart Assoc. 1(e002634；Desirら、2012 J Am Soc Hypertens. 6(6):417-26；Liら、2008 Circulation. 117(10):1277-82)は、ＮＡＤＨオキシダーゼ活性を持ち(Farzaneh-Farら、2010 PLoS One. 5(10):e13496；Beaupreら、2015 Biochemistry. 54(3):795-806)、これは、その固有の酵素活性(Wangら、2014 Journal of the American Society of Nephrology. DOI:10.1681/asn.2013060665)とは無関係である受容体−媒介したプロセスを通じて、細胞及び臓器の生存を促進する(Leeら、2013 J Am Soc Nephrol. 24(3):445-55)。ＲＮＬＳは、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）、細胞外シグナル−制御キナーゼ（ＥＲＫ）、及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８）を、迅速に活性化する。ＥＲＫ又はＡＫＴのいずれかの化学阻害は、ＲＮＬＳの保護的作用を無効にする(Wangら、2014 Journal of the American Society of Nephrology. DOI:10.1681/asn.2013060665)。
【００１２】
従って、腎疾患、心血管疾患、及び癌を含む疾患又は障害の検出、診断、予防及び治療のための、抗体などの、レナラーゼに結合する、改善された方法及び組成物の必要性が存在する。本発明はこの必要性に対処している。
【発明の概要】
【００１３】
発明の概要
一実施態様において、本発明は、レナラーゼに特異的に結合する抗体又はその結合部位を含有する、組成物に関する。
【００１４】
一実施態様において、この抗体又はその結合部位は、少なくとも１０-6Ｍの親和性でレナラーゼへ特異的に結合する。
【００１５】
一実施態様において、この抗体又はその結合部位は、配列番号：１−８から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドへ特異的に結合する。
【００１６】
一実施態様において、レナラーゼは、ヒトレナラーゼである。
【００１７】
一実施態様において、この抗体又はその結合部位は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、免疫複合体、脱フコシル化抗体、及び二重特異性抗体である。
【００１８】
一実施態様において、この免疫複合体は、治療薬又は検出部分を含む。
【００１９】
一実施態様において、この抗体又はその結合部位は、ヒト化抗体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、及び抗体模倣体から選択される。
【００２０】
一実施態様において、この抗体又はその結合部位は、ａ）配列番号：１５５のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ｂ）配列番号：１５６、配列番号：１６２、及び配列番号：１６８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２、ｃ）配列番号：１５７、及び配列番号：１６３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３、ｄ）配列番号：１５２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ｅ）配列番号：１５３のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２、並びにｆ）配列番号：１５４、及び配列番号：１６０から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：の少なくとも一つを含む。
【００２１】
一実施態様において、この抗体又はその結合部位は、配列番号：１５５のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号：１５６のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２、配列番号：１５７のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３、配列番号：１５２のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号：１５３のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２、及び配列番号：１５４のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００２２】
一実施態様において、この抗体又はその結合部位は、配列番号：２１９のアミノ酸配列を含むＶH、及び配列番号：２２１のアミノ酸配列を含むＶLを含む。
【００２３】
一実施態様において、この抗体又はその結合部位は、ａ）配列番号：１９７及び配列番号：２０３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１、ｂ）配列番号：１９８及び配列番号：２０４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２、ｃ）配列番号：１９９及び配列番号：２０５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３、ｄ）配列番号：１９４及び配列番号：２００から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１、ｅ）配列番号：１９５のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２、並びに、ｆ）配列番号：１９６のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：の少なくとも一つを含む。
【００２４】
一実施態様において、この抗体又はその結合部位は、配列番号：１９７のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号：１９８のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２、配列番号：１９９のアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３、配列番号：１９４のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号：１９５のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２、及び配列番号：１９６のアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：を含む。
【００２５】
一実施態様において、この抗体又はその結合部位は、配列番号：２２３のアミノ酸配列を含むＶH及び配列番号：２２５のアミノ酸配列を含むＶLを含む。
【００２６】
一実施態様において、本発明は、レナラーゼに特異的に結合する少なくとも一つの抗体又はその結合部位をコードしている配列を含む、単離された核酸分子に関する。
【００２７】
一実施態様において、この分子は、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、及び配列番号：２２４から選択される少なくとも一つの核酸配列と少なくとも８０％同一である核酸配列の少なくとも一つを含む。
【００２８】
一実施態様において、本発明は、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、及び配列番号：２２４から選択された、少なくとも一つの核酸配列を含む発現ベクターに関する。
【００２９】
一実施態様において、本発明は、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、及び配列番号：２２４から選択された、少なくとも一つの核酸配列を含む細胞に関する。
【００３０】
一実施態様において、本発明は、レナラーゼに特異的に結合する抗体又はその結合部位を含有する組成物を対象へ投与することを含む、それを必要とする対象において疾患又は障害を治療する方法に関する。
【００３１】
一実施態様において、本方法は、少なくとも一つの追加の薬剤を対象へ投与する工程を更に含む。
【００３２】
一実施態様において、この疾患又は障害は、腎疾患、心血管疾患、膵炎、肝炎、腎臓の炎症障害、及び癌から選択される少なくとも一つである。
【００３３】
一実施態様において、この疾患又は障害は、癌であり、且つこの癌は、膵臓癌又はメラノーマである。
【００３４】
一実施態様において、この対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
図面の簡単な説明
以下の本発明の実施態様の詳細な説明は、添付図面と結びつけて解読する場合に、より良く理解されるであろう。本発明は、図面に示された実施態様の正確な配置及び手段に限定されないことは理解されるべきである。
【００３６】
【図１】図１は、ウサギを免疫化するために使用したペプチド抗原（配列番号：１−７）を示す。
【００３７】
【図２】図２は、完全長レナラーゼ−１タンパク質配列（配列番号：８）を示す。
【００３８】
【図３】図３は、レナラーゼタンパク質（配列番号：８及び配列番号：５０）内の抗原の位置を示す。抗原１Ａ／１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、及び３Ａ５を示す。
【００３９】
【図４−１】図４−１は、抗１Ｄエピトープモノクローナル１Ｄ−２８−４重鎖のコード配列（配列番号：５２）及びアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。
【図４−２】図４−２は、抗１Ｄエピトープモノクローナル１Ｄ−２８−４重鎖のコード配列（配列番号：５２）及びアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。
【００４０】
【図５−１】図５−１は、抗１Ｄエピトープモノクローナル１Ｄ−２８−４軽鎖のコード配列（配列番号：５３）及びアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。
【図５−２】図５−２は、抗１Ｄエピトープモノクローナル１Ｄ−２８−４軽鎖のコード配列（配列番号：５３）及びアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。
【００４１】
【図６−１】図６−１は、抗１Ｄエピトープモノクローナル１Ｄ−３７−１０重鎖のコード配列（配列番号：６０）及びアミノ酸配列（配列番号：１７）を示す。
【図６−２】図６−２は、抗１Ｄエピトープモノクローナル１Ｄ−３７−１０重鎖のコード配列（配列番号：６０）及びアミノ酸配列（配列番号：１７）を示す。
【図６−３】図６−３は、抗１Ｄエピトープモノクローナル１Ｄ−３７−１０重鎖のコード配列（配列番号：６０）及びアミノ酸配列（配列番号：１７）を示す。
【００４２】
【図７】図７は、抗１Ｄエピトープモノクローナル１Ｄ−３７−１０軽鎖のコード配列（配列番号：６１）及びアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【００４３】
【図８−１】図８−１は、抗１Ｆエピトープモノクローナル１Ｆ−２６−１重鎖のコード配列（配列番号：６８）及びアミノ酸配列（配列番号：２５）を示す。
【図８−２】図８−２は、抗１Ｆエピトープモノクローナル１Ｆ−２６−１重鎖のコード配列（配列番号：６８）及びアミノ酸配列（配列番号：２５）を示す。
【００４４】
【図９】図９は、抗１Ｆエピトープモノクローナル１Ｆ−２６−１軽鎖のコード配列（配列番号：６９）及びアミノ酸配列（配列番号：２６）を示す。
【００４５】
【図１０−１】図１０−１は、  抗１Ｆエピトープモノクローナル１Ｆ−４２−７重鎖のコード配列（配列番号：７６）及びアミノ酸配列（配列番号：３３）を示す。
【図１０−２】図１０−２は、  抗１Ｆエピトープモノクローナル１Ｆ−４２−７重鎖のコード配列（配列番号：７６）及びアミノ酸配列（配列番号：３３）を示す。
【００４６】
【図１１】図１１は、抗１Ｆエピトープモノクローナル１Ｆ−４２−７軽鎖のコード配列（配列番号：７７）及びアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【００４７】
【図１２−１】図１２−１は、抗レナラーゼ−２エピトープモノクローナル３Ａ−５−２重鎖のコード配列（配列番号：８４）及びアミノ酸配列（配列番号：４１）を示す。
【００４８】
【図１２−２】図１２−２は、抗レナラーゼ−２エピトープモノクローナル３Ａ−５−２重鎖のコード配列（配列番号：８４）及びアミノ酸配列（配列番号：４１）を示す。
【００４９】
【図１３】図１３は、抗レナラーゼ−２エピトープモノクローナル３Ａ−５−２軽鎖のコード配列（配列番号：８５）及びアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す。
【００５０】
【図１４】図１４は、ＥＬＩＳＡアッセイにおける、完全長レナラーゼタンパク質に対して産生された抗レナラーゼポリクローナル抗体は、結合したレナラーゼタンパク質へ特異的に結合することを示す。
【００５１】
【図１５】図１５は、１Ｄペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体１Ｄ  ２８−４及び１Ｄ  ３７−１０は、濃度依存様式でレナラーゼ−１に結合したことを示す。１Ｄペプチドは、レナラーゼ−１及びレナラーゼ−２の両方に存在する。モノクローナル抗体１Ｆ  ４２−７及び１Ｆ  ２６−１は、１Ｆペプチドに対して産生され、これは，レナラーゼ−１においてのみ存在する。１Ｆ  ｍＡｂは、濃度依存様式でレナラーゼ−１に結合した。
【００５２】
【図１６】図１６は、抗体は、ウェスタンブロッティングにより、レナラーゼを検出するために使用することができるかどうかを確立するために、細菌もしくは哺乳動物起源の、組換えレナラーゼタンパク質の連続希釈物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を流し、及びウェスタンブロッティングは、Ｒｅｎ１Ｄ  ２８−４抗体を用いて行ったことを示す。いずれかを起源とする組換えタンパク質は、この方法により明確に同定された。
【００５３】
【図１７】図１７は、ＥＬＩＳＡアッセイ（図１５）により、抗体１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−４２−７及び１Ｆ−２６−１は、濃度依存様式で、レナラーゼ−１タンパク質へ結合したことを示す。しかし、ＥＬＩＳＡプレートアッセイにおいて、組換えレナラーゼ−２を検出するために同じ抗体が使用される場合、１Ｄ−２８−４及び１Ｄ−３７−１０のみが、頑強な、濃度依存的結合を示した。抗体３Ａ５−２は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、レナラーゼ−２アイソフォームへの結合が、認められた。従って１種又は他のレナラーゼアイソフォームに対応するペプチドに対して産生された抗体は、関連する完全長タンパク質に関する特異性を示すことを認めることができる。
【００５４】
【図１８】図１８は、１Ｄエピトープに対し産生されたモノクローナル抗体１Ｄ  ２８−４及び１Ｄ  ３７−１０は、濃度依存様式で１Ｄ−ＢＳＡタンパク質へ結合したことを示す（黒丸は１Ｄ  ２８−４、白丸は１Ｄ  ３７−１０）。
【００５５】
【図１９】図１９は、ビオチン化されたモノクローナル抗体１Ｄ  ２８−４（黒丸）、１Ｄ  ３７−１０（白丸）、１Ｆ  ４２−７（黒三角）、及び１Ｆ  ２６−１（白三角）は、濃度依存様式でレナラーゼ−１へ結合したことを示す。
【００５６】
【図２０】図２０Ａ及び図２０Ｂを含む、図２０は、重複エピトープは、競合ＥＬＩＳＡにより検出することができることを示す。（図２０Ａ）ビオチン化された１Ｄ  ３７−１０は、コンジュゲートされない１Ｄ  ２８−４により競合され（黒丸）；同様に、１Ｆペプチドに対して産生された抗体も、互いに競合され；ビオチン化された１Ｆ  ２６−１は、コンジュゲートされない１Ｆ  ４２−７により競合され（黒三角）：ビオチン化されたモノクローナル抗体からのシグナルは、免疫化されないウサギ由来のコンジュゲートされない抗体とインキュベーションされた場合に、減少しなかった（白丸及び白三角）。（図２０Ｂ）更なる実施例において、完全長レナラーゼ−１に対して産生されたポリクローナル抗体Ｅ２９３０は、各ビオチン化されたモノクローナル抗体１Ｄ  ３７−１０、１Ｆ  ２６−１、並びにこれら２種のビオチン化されたｍＡｂの混合物との競合を示した（黒丸、黒四角、及び白菱形）；再度、２種のビオチン化された抗体の混合物は、免疫化されないウサギ由来のコンジュゲートされない抗体によっては競合せず（黒三角）；２種のビオチン化されたモノクローナル抗体に対し、ポリクローナル抗体Ｅ２９３０で認められた競合は、このポリクローナル抗体は、レナラーゼポリペプチド上の複数のエピトープに結合することを示唆している。
【００５７】
【図２１−１】図２１−１は、抗体１Ｄ−２８−４、１Ｆ−４２−７、１Ｄ−３７−１０及び１Ｆ−２６−１は全て、高い親和性でレナラーゼへ結合したことを示す−ＫD値は、２．６７ｎＭ〜０．３１６ｎＭの間。幅のある会合速度及び解離速度が、これらの抗体間で認められ、これは異なる抗体組成物の異なる貢献を明らかにしている。
【図２１−２】図２１−２は、抗体１Ｄ−２８−４、１Ｆ−４２−７、１Ｄ−３７−１０及び１Ｆ−２６−１は全て、高い親和性でレナラーゼへ結合したことを示す−ＫD値は、２．６７ｎＭ〜０．３１６ｎＭの間。幅のある会合速度及び解離速度が、これらの抗体間で認められ、これは異なる抗体組成物の異なる貢献を明らかにしている。
【００５８】
【図２２】図２２は、抗レナラーゼ抗体結合親和性のまとめを示す。
【００５９】
【図２３】図２３は、ＲＮＬＳに対して作出された２種のモノクローナル抗体［クローン＃  ２８−４（ｍ２８−ＲＮＬＳ）、３７−１０（ｍ３７−ＲＮＬＳ）］は、試験した全ての（合計５種）メラノーマ細胞株の生存度を低下したことを示し、且つ代表例が示されている。
【００６０】
【図２４】図２４は、ｍ２８−ＲＮＬＳは、増大する治療濃度と相関して、細胞傷害性レベルが増加する（ｐ＜０．０５）ことを実証することを示す。
【００６１】
【図２５】図２５は、対照（ウサギＩｇＧ）と抗レナラーゼ（ｍ２８−ＲＮＬＳ）処置群の間の、時間の関数としての腫瘍容積を示す。インビボ試験に関して、Ａ３７５．Ｓ２（ヒトメラノーマ）細胞を、無胸腺ヌードマウスへ皮下注射し、腫瘍を作製した。一旦腫瘍が容積〜５０ｍｍ3に達したならば、次に動物を、対照ウサギＩｇＧ又はＲＮＬＳ中和モノクローナル抗体であるｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで処置した。全般的な動物の健康及び活動は本試験を通じて維持されたので、この抗体処置は、毒性があるようには見えなかった。腫瘍サイズは、隔日で測定し、且つｍ２８−ＲＮＬＳによる処置は、試験した全ての時点で、腫瘍容積を減少した（ｐ＜０．０５）。
【００６２】
【図２６】図２６は、細胞増殖マーカーＫｉ６７による異種移植した腫瘍由来の切片のＩＨＣ染色は、抗ＲＮＬＳ抗体で処置した腫瘍内の細胞増殖の、ウサギＩｇＧで処置したものに対する、有意な減少を明らかにし：対照群における３５．１±２．３陽性細胞／高倍率視野、対、ＲＮＬＳ  Ａｂ処置群における１３．４±３．０、ｎ＝１４、ｐ＝０．０００４であることを示す。
【００６３】
【図２７】図２７は、ｍ２８−ＲＮＬＳ投与は、ウサギＩｇＧと比較して、腫瘍容積の有意な減少を引き起こしたことを示す。
【００６４】
【図２８】図２８は、ｍ２８−ＲＮＬＳ、ｍ３７−ＲＮＬＳの、及び市販のポリクローナル（ＲＰ−２２０の部分配列に対する）の、ヒト膵臓腺癌細胞の成長に対する阻害作用を示す。
【００６５】
【図２９】図２９は、ｍ２８−ＲＮＬＳ、ｍ３７−ＲＮＬＳの、及び市販のポリクローナル（ＲＰ−２２０の部分配列に対する）の、ヒト膵臓腺癌細胞の成長に対する阻害作用を示す。
【００６６】
【図３０】図３０は、ｍ２８−ＲＮＬＳ、ｍ３７−ＲＮＬＳの、及び市販のポリクローナル（ＲＰ−２２０の部分配列に対する）の、ヒト膵臓腺癌細胞の成長に対する阻害作用を示す。
【００６７】
【図３１】図３１は、ウサギＩｇＧと比べ、ｍ２８−ＲＮＬＳ処置が、腫瘍容積の有意な減少を引き起こしたことを示す。
【００６８】
【図３２】図３２は、５種のヒト化されたｍ２８バリアント（ｍ２８−Ｋ２、ｍ２−Ｋ５、ｍ２８−Ｋ１３、ｍ２８−Ｋ１４及びｍ２８−Ｋ１６、表２）は、ヒト及びマウスの両方のＲＮＬＳへの増大した結合を示したことを示す。
【００６９】
【図３３】図３３は、５種のヒト化されたｍ２８バリアント（ｍ２８−Ｋ２、ｍ２−Ｋ５、ｍ２８−Ｋ１３、ｍ２８−Ｋ１４及びｍ２８−Ｋ１６、表２）は、ヒト及びマウスの両方のＲＮＬＳへの増大した結合を示したことを示す。
【００７０】
【図３４】図３４は、５種のヒト化されたｍ２８バリアント（ｍ２８−Ｋ２、ｍ２−Ｋ５、ｍ２８−Ｋ１３、ｍ２８−Ｋ１４及びｍ２８−Ｋ１６、表２）はまた、メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）及び膵臓腺癌（ＢｘＰＣ３）のヒト細胞株の生存度を減少したことを示し（代表例を示した）、このことはヒト癌におけるｍ２８バリアントの治療的有用性の可能性を指摘している。
【００７１】
【図３５】図３５は、５種のヒト化されたｍ２８バリアント（ｍ２８−Ｋ２、ｍ２−Ｋ５、ｍ２８−Ｋ１３、ｍ２８−Ｋ１４及びｍ２８−Ｋ１６、表２）はまた、メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）及び膵臓腺癌（ＢｘＰＣ３）のヒト細胞株の生存度を減少したことを示し（代表例を示した）、このことはヒト癌におけるｍ２８バリアントの治療的有用性の可能性を指摘している。
【００７２】
【図３６】図３６は、ヒト化されたｍ２８バリアントの用量反応及びＩＣ５０を評価する例証的実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
詳細な説明
本発明は、レナラーゼに結合する物質を使用する、レナラーゼの少なくとも一つの生物活性の阻害に関する。様々な実施態様において、本発明は、レナラーゼのインヒビターをそれを必要とする対象へ投与することによる、個体におけるレナラーゼ−関連した病理又はレナラーゼ−関連した状態を治療する、組成物及び方法に向けられている。様々な実施態様において、本発明の組成物及び方法を用いて診断可能、予防可能及び治療可能な疾患及び障害は、急性腎不全（すなわち、急性尿細管壊死、又はＡＴＮ、腎臓の虚血状態）、心血管疾患、膵炎、肝炎、腎臓の炎症障害、及び癌を含む。
【００７４】
一実施態様において、本発明は、癌などの、レナラーゼ−関連した状態の治療、予防及び診断に広く関連している。一実施態様において、本発明は、癌の診断、治療、阻害、予防、又は軽減のための方法及び組成物に向けられている。一実施態様において、本発明は、レナラーゼのレベル、生成、及び活性の１又は複数を調節する組成物及び方法を提供する。癌並びに関連疾患及び障害の状況において、本発明は、レナラーゼのレベル、生成、及び活性の１又は複数を減少する組成物及び方法を提供する。本発明の一部の態様は、癌転移の治療、予防、診断又は予後判定の方法及び組成物を提供する。
【００７５】
定義
別に定義しない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書記載のものに類似又は同等の方法及び材料を、本発明の実践又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料が説明されている。
【００７６】
一般に、本明細書において使用される命名、並びに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、及び核酸化学における実験手法及びハイブリダイゼーションは、当該技術分野において周知であり且つ一般に利用されるものである。
【００７７】
核酸及びペプチド合成に関して、標準技術が使用される。これらの技術及び手法は、一般に当該技術分野及び本文書を通じて提供される様々な一般的参考文献(例えば、Sambrook及びRussell, 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY、並びにAusubelら、2012, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY)における従来の方法に従い、実行される。
【００７８】
本明細書において使用される命名並びに以下に説明される分析化学及び有機合成の実験手法は、当該技術分野において周知であり且つ一般に利用されるものである。化学合成及び化学分析に関して、標準技術又はその改変が使用される。
【００７９】
冠詞「ある(“a”及び“an”)」は、その冠詞の文法上の目的語の１又は２以上（すなわち、少なくとも１）を指すように、本明細書において使用される。例として、「ある要素(an element)」は、1つの要素又は２以上の要素を意味する。
【００８０】
本明細書において使用される「約」は、量、持続期間、及び同類のものなどの測定可能な値を指す場合、特定の値の±２０％、±１０％、±５％、±１％、又は±０．１％の変動を包含し、そのようなものとして変動は開示された方法を実行する上で適切であることを意味する。
【００８１】
用語「異常」は、生物、組織、細胞又はそれらの成分の文脈において使用される場合、少なくとも一つの観察可能な又は検出可能な特徴（例えば、年齢、処置、日時など）において、「正常」（予想される／恒常的）な各特徴を示すそれらの生物、組織、細胞又はそれらの成分とは異なる生物、組織、細胞又はそれらの成分を指す。一つの細胞、組織型、又は対象について正常であるか又は予想される特徴は、異なる細胞又は組織型について異常であることがある。
【００８２】
本明細書において使用される用語「アナログ」とは概して、それがアナログである化合物、又は「親」化合物に、一般に構造的に類似した化合物を指す。一般にアナログは、親化合物の特定の特徴、例えば生物活性又は薬理活性を維持するであろう。アナログは、他の余り望ましくない特徴、例えば抗原性、タンパク質分解不安定性、毒性などを欠いてよい。アナログは、親の特定の生物活性は減少されるが、親の１又は複数の別の生物学的活性はその「アナログ」において影響されていない化合物を含む。ポリペプチドに適用される場合、用語「アナログ」は、親化合物に対する変動する範囲のアミノ酸配列同一性、例えば、親の所与のアミノ酸配列又は親の選択された部分もしくはドメインの中のアミノ酸の少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％又は約８６％〜８９％、並びに更により好ましくは少なくとも約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％又は約９９％の同一性を有してよい。ポリペプチドへ適用される際、用語「アナログ」は一般に、少なくとも結合ドメイン融合タンパク質の一部と実質的に同一である、少なくとも約３個のアミノ酸のセグメントで構成されるポリペプチドを指す。アナログは典型的には、少なくとも５個のアミノ酸長、少なくとも２０個のアミノ酸長又はそれよりも長い、少なくとも５０個のアミノ酸長又はそれよりも長い、少なくとも１００個のアミノ酸長又はそれよりも長い、少なくとも１５０個のアミノ酸長又はそれよりも長い、少なくとも２００個のアミノ酸長又はそれよりも長く、及びより典型的には少なくとも２５０個のアミノ酸長又はそれよりも長い。一部のアナログは、実質的生物活性を欠くが、依然予め決定されたエピトープに対する抗体産生、アフィニティクロマトグラフィーによる反応性抗体の検出及び／又は精製のための免疫学的試薬としての、あるいは結合ドメイン融合タンパク質機能の競合性又は非競合性アゴニスト、アンタゴニスト、もしくは部分アゴニストとしてなど、様々な用途に利用され得る。
【００８３】
本明細書において使用される用語「抗体」は、結合パートナー分子の特定のエピトープへ特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然の給源由来、又は組換え給源由来のインタクトな免疫グロブリンであることができ、且つインタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。本発明における抗体は、様々な形で存在してよく、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（「イントラボディ」）、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２及びＦ（ａｂ’）２、並びに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ラクダ科の抗体などの重鎖抗体、及びヒト化抗体を含む(Harlowら、1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlowら、1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houstonら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Birdら、1988, Science 242:423-426)。
【００８４】
用語「抗体断片」は、インタクトな抗体の少なくとも一部分を指し、且つインタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、ｓｄＡｂ（ＶL又はＶHのいずれか）、ラクダ科ＶHHドメイン、ｓｃＦｖ抗体、及び抗体断片から形成された多特異性抗体を含むが、これらに限定されるものではない。用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも一つの抗体断片及び重鎖の可変領域を含む少なくとも一つの抗体断片を含む融合タンパク質を指し、ここで軽鎖及び重鎖の可変領域は、短い可動性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、且つ一本鎖ポリペプチドとして発現されることが可能であり、且つここでｓｃＦｖは、それが誘導されたインタクトな抗体の特異性を保持している。特定しない限りは、本明細書において使用されるｓｃＦｖは、いずれかの順で、例えばそのポリペプチドのＮ−末端及びＣ−末端に対して、ＶL及びＶH可変領域を有してよく、ｓｃＦｖは、ＶL−リンカー−ＶHを含むか、又はＶH−リンカー−ＶLを含んでよい。
【００８５】
本明細書において使用される「抗体重鎖」は、それらの天然に生じる高次構造において抗体分子に存在する、二種のポリペプチド鎖のより大きいものを指し、且つその抗体が属するクラスを通常決定する。
【００８６】
本明細書において使用される「抗体軽鎖」は、天然に生じる高次構造において抗体分子に存在する、二種のポリペプチド鎖のより小さいものを指す。カッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【００８７】
本明細書において使用される用語「合成抗体」により、例えば、本明細書記載のようにバクテリオファージにより発現された抗体などの、組換えＤＮＡ技術を用いて作製された抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードしているＤＮＡ分子の合成により作製される抗体、並びにそのＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する抗体、あるいは抗体を特定するアミノ酸配列を意味するように解釈されるべきであり、ここでＤＮＡ配列又はアミノ酸配列は、当該技術分野において利用可能であり且つ周知である合成ＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を用いて得られる。
【００８８】
「キメラ抗体」は、アクセプター抗体から誘導された軽鎖及び重鎖定常領域と結合された、ドナー抗体から誘導された天然に生じる可変領域（軽鎖及び重鎖）を含む、操作された抗体型を指す。
【００８９】
「ヒト化抗体」は、非−ヒトドナー免疫グロブリンから誘導されたそのＣＤＲを有し、その分子の残りの免疫グロブリン−誘導された部分は１つの（又は複数の）ヒト免疫グロブリン（複数可）から誘導されている、操作された抗体型を指す。加えて、フレームワークサポート残基は、結合親和性を保存するように変更されてよい(例えば、1989, Queenら、Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032；1991, Hodgsonら、Bio/Technology, 9:421参照)。好適なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列への相同性により、従来のデータベース、例えばKABATデータベース、Los Alamosデータベース、及びSwiss Proteinデータベースなどから選択されたものであってよい。ドナー抗体のフレームワーク領域への相同性（アミノ酸ベース）により特徴付けられるヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための、重鎖定常領域及び／又は重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適している。軽鎖定常及び可変フレームワーク領域を供与することが可能な好適なアクセプター抗体は、同様の様式で選択されてよい。アクセプター抗体重鎖及び軽鎖は、同じアクセプター抗体を起源とする必要はないことは、注意すべきである。先行技術は、そのようなヒト化抗体を作製するいくつかの方式を説明している(例えば、EP-A-0239400及びEP-A-054951参照)。
【００９０】
用語「ドナー抗体」は、ドナー抗体に特徴的な結合特異性及び中和活性を持つ変更された免疫グロブリンコード領域及び結果的に発現された変更された抗体を提供するために、第一の免疫グロブリンパートナーへ、その可変領域、ＣＤＲ、もしくは他の機能断片のアミノ酸配列、又はそれらのアナログをもたらす、抗体（モノクローナル、及び／又は組換え）を指す。
【００９１】
用語「アクセプター抗体」は、第一の免疫グロブリンパートナーへ、その重鎖及び／もしくは軽鎖フレームワーク領域並びに／又はその重鎖及び／もしくは軽鎖定常領域をコードしているアミノ酸配列の全て（又は任意の部分であるが、一部の実施態様においては全て）をもたらす、ドナー抗体と異種の抗体（モノクローナル及び／又は組換え）を指す。いくつかの実施態様において、ヒト抗体は、アクセプター抗体である。
【００９２】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変領域である、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版、U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)参照。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲ（又はＣＤＲ領域）が存在する。従って本明細書において使用される「ＣＤＲ」は、３つの重鎖ＣＤＲ全て、又は３つの軽鎖ＣＤＲ全て（又は、適切ならば、全ての重鎖及び全ての軽鎖の両方のＣＤＲ）を指す。抗体の構造及びタンパク質フォールディングは、他の残基は、結合領域の一部と考えられることを意味してよく、且つ当業者によりそのように理解されるであろう。例えば、Chothiaら、(1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883を参照。
【００９３】
用語「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、可変領域からＣＤＲを除いた残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は、異なるシステムにより決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、それに応じて異なるよう解釈される。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、及び−Ｌ３、及び重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２、及び−Ｈ３）はまた、軽鎖及び重鎖上のフレームワーク領域を、４つのサブ−領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）へ分け、ここでＣＤＲ１は、ＦＲ１とＦＲ２の間、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間、及びＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に配置される。特定のサブ−領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４と特定することはなく、フレームワーク領域は、別に言及されるように、単独の天然に生じる免疫グロブリン鎖の可変領域内のＦＲ組合せを表す。ＦＲは、４つのサブ−領域の一つを表し、ＦＲは、フレームワーク領域を構成する４つのサブ−領域の２つ以上を表す。
【００９４】
本明細書において使用される「免疫学的検定」は、標的分子の検出及び定量のために、標的分子へ特異的に結合することが可能である抗体を使用する任意の結合アッセイを指す。
【００９５】
抗体に関して本明細書において使用される用語「特異的結合」とは、特異的に結合するパートナー分子を認識するが、試料中の他の分子は実質的に認識も結合もしない抗体を意味する。例えば、１つの種由来の結合パートナー分子に特異的に結合する抗体はまた、１又は複数の種由来のその結合パートナー分子に結合することもできる。しかしそのような異種間反応性は、特定された抗体の分類をそれ自身は変更しない。別の例において、結合パートナー分子に特異的に結合する抗体はまた、結合パートナー分子の異なるアレル型に結合することもできる。しかしそのような交差反応性は、特定された抗体の分類をそれ自身は変更しない。
【００９６】
場合によっては用語「特異的結合」又は「特異的に結合」は、第二の結合パートナー分子との抗体、タンパク質、又はペプチドの相互作用に関して使用することができ、その相互作用は、結合パートナー分子上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在によって左右されることを意味し；例えば、抗体は、タンパク質全般よりもむしろ、特異的タンパク質構造を認識及び結合する。抗体がエピトープ「Ａ」について特異的である場合、標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応物中の、エピトープＡ（又は遊離の非標識のＡ）を含む分子の存在は、抗体に結合した標識されたＡの量を減少するであろう。場合によっては、用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、選択的結合を指し、ここでは抗体は、結合パートナー分子に結合する親和性増強にとって重要である、配列又は高次構造エピトープを認識する。
【００９７】
本明細書において使用される用語「中和する」は、結合タンパク質がレナラーゼへ特異的に結合する場合の、レナラーゼの生物活性の中和を指す。好ましくは、中和結合タンパク質は、中和抗体であり、そのレナラーゼへの結合は、レナラーゼの生物活性の阻害を生じる。好ましくは、中和結合タンパク質は、レナラーゼへ結合し、レナラーゼの生物学的活性を、少なくとも約２０％、４０％、６０、８０％、８５％又はそれ以上減少する。一部の実施態様において、レナラーゼは、ヒトレナラーゼである。
【００９８】
用語「エピトープ」は、抗体により認識された結合パートナー分子上の部位、又はその結合部位もしくは他の結合分子、例えばｓｃＦｖなどの、その通常の意味を有する。エピトープは、全タンパク質又はポリペプチドの小さい部分を表すセグメントを含む、アミノ酸の分子又はセグメントであってよい。エピトープは、高次構造的（すなわち、不連続）であってよい。すなわち、これらは、タンパク質フォールディングにより並置されている、一次配列の非隣接部分によりコードされたアミノ酸から形成されてよい。
【００９９】
本明細書において使用される語句「生物学的試料」は、その中での核酸又はポリペプチドの発現が検出される、細胞、組織、又は体液を含む任意の試料を含むことが意図される。そのような生物学的試料の例は、血液、リンパ液、骨髄、生検及びスメアを含むが、これらに限定されるものではない。本来は液体である試料は、本明細書においては「体液」と称される。生物学的試料は、例えば、ある領域の擦り又は拭いによるか、あるいは体液を得るための針の使用によることを含む、様々な技術により、患者から得ることができる。様々な生体試料を収集する方法は、当該技術分野において周知である。
【０１００】
本明細書において使用される用語「癌」は、異所性細胞の異常な成長により特徴付けられる疾患として定義される。癌細胞は、局所的に、又は血流及びリンパ系を通じて体の他の部位へ拡散され得る。様々な癌の例は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌（例えばメラノーマ）、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌、肉腫及び同類のものを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
本明細書において使用される「コンジュゲートされた」は、一つの分子の第二の分子への共有的結合を指す。
【０１０２】
遺伝子の「コード領域」は、遺伝子の転写により作製されるｍＲＮＡ分子のコード領域に、各々、相同であるか又は相補的である、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基及び遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる。
【０１０３】
ｍＲＮＡ分子の「コード領域」はまた、ｍＲＮＡ分子の翻訳時に、転写ＲＮＡ分子のアンチコドン領域にマッチするか、又は停止コドンをコードしている、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基からなる。従ってこのコード領域は、ｍＲＮＡ分子によりコードされた成熟タンパク質には存在しないアミノ酸残基（例えばタンパク質輸送シグナル配列中のアミノ酸残基）のコドンを含む、ヌクレオチド残基を含んでよい。
【０１０４】
核酸を言及して本明細書において使用される「相補的」は、２つの核酸鎖の領域間の、又は同じ核酸鎖の２つの領域間の、配列相補性の広範な概念を指す。第一の核酸領域のアデニン残基は、第一の領域と逆平行である第二の核酸領域の残基と、残基がチミン又はウラシルである場合には、特異的水素結合（“塩基対”）を形成することが可能であることがわかっている。同様に、第一の核酸領域のシトシン残基は、第一の領域と逆平行である第二の核酸領域の残基と、残基がグアニンである場合には、塩基対を形成することが可能であることがわかっている。２つの領域が逆平行様式で配置された際に、第一の領域の少なくとも一つのヌクレオチド残基が、第二の領域の残基と塩基対形成することが可能である場合、核酸の第一の領域は、同じ又は異なる核酸の第二の領域と相補的である。好ましくは、第一の領域は、第一部分を含み、及び第二の領域は、第二部分を含み、これにより、第一部分及び第二部分が逆平行様式で配置された場合に、第一部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、及び好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％は、第二部分のヌクレオチド残基と塩基対形成することが可能である。より好ましくは、第一部分の全てのヌクレオチド残基は、第二部分のヌクレオチド残基と塩基対形成することが可能である。
【０１０５】
本明細書において使用される用語「誘導体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は他の分子の化学修飾を含む。本発明の状況において、例えば、グリコシル化、ペグ化、又は任意の類似プロセスにより修飾されたものなどの「誘導体ポリペプチド」は、結合活性を保持している。例えば、用語結合ドメインの「誘導体」は、例えば１又は複数のポリエチレングリコール分子、糖、リン酸、及び／又は他のそのような分子の追加などにより、化学的に修飾された、結合ドメインの融合タンパク質、バリアント、又は断片を含み、ここでこれらの１又は複数の分子は、野生型の結合ドメイン融合タンパク質には天然には結合されない。ポリペプチドの「誘導体」は更に、参照ポリペプチドに対し、例えばアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有することにより、参照ポリペプチドから「誘導され」ているそれらのポリペプチドを含む。従って、ポリペプチドは、野生型ポリペプチドから、又は任意の他のポリペプチドから「誘導され」てよい。本明細書において使用される、ポリペプチドを含む化合物はまた、特定の給源から、例えば特定の生物、組織型から、又は特定の生物又は特定の組織型中に存在する、特定のポリペプチド、核酸、もしくは他の化合物から「誘導され」てよい。
【０１０６】
本明細書において使用される用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸として定義される。
【０１０７】
「コードする」は、定義されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）、又は定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び高分子の合成の鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の特性、並びにそれらから生じる生物学的特性を指す。従って、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生体系中でタンパク質を生成する場合に、その遺伝子は、タンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり且つ配列表において通常提供されるコード鎖、並びに遺伝子又はｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方は、タンパク質又は遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の生成物をコードしていると称されることができる。
【０１０８】
別に特定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重型であるヌクレオチド配列及び同じアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列の全てを含む。語句タンパク質又はＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部の型においてイントロン（複数可）を含み得る程度に、イントロンを含む。
【０１０９】
「疾患」とは、動物がホメオスタシスを維持することができず、且つその疾患が改善されない場合、動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。
【０１１０】
対照的に、動物の「障害」は、動物は、ホメオスタシスを維持することはできるが、その動物の健康状態が、障害のないときよりも好ましくないような、健康状態である。治療されずに放置されたとしても、障害は、動物の健康状態の更なる低下を必ずしも引き起こさない。
【０１１１】
疾患又は障害の徴候又は症状の重症度、そのような徴候又は症状を患者が経験する頻度、又は両方が、減少される場合に、疾患又は障害は、「軽減される」。
【０１１２】
化合物の「有効量」又は「治療的有効量」は、化合物が投与される対象に有益な作用を提供するのに十分である、その化合物の量である。
【０１１３】
本明細書記載の結合ドメインポリペプチドに関する用語「高親和性」とは、少なくとも約１０-6Ｍ、好ましくは少なくとも約１０-7Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０-8Ｍ又はそれよりも強い、より好ましくは少なくとも約１０-9Ｍ又はそれよりも強い、より好ましくは少なくとも約１０-10Ｍ又はそれよりも強い、例えば最大１０-12Ｍ又はそれよりも強い解離定数（Ｋｄ）を指す。しかし「高親和性」結合は、他の結合ドメインポリペプチドに関しては変動することができる。
【０１１４】
本明細書において使用される用語「阻害する」とは、活性又は機能を、例えば対照値に対し約１０％、抑制又はブロックすることを意味する。好ましくは、活性は、対照値と比べ５０％だけ、より好ましくは７５％だけ、及び更により好ましくは９５％だけ、抑制又はブロックされる。本明細書において使用される「阻害する」はまた、分子、反応、相互作用、遺伝子、ｍＲＮＡ、及び／又はタンパク質の発現、安定性、機能又は活性のレベルを測定可能な量だけ減少すること、あるいは全体的に妨害することを意味する。インヒビターは、例えば、結合する、部分的もしくは全体的に活性をブロックする、活性化を減少、妨害、遅延する、失活する、脱感作する、又はタンパク質、遺伝子及びｍＲＮＡの安定性、発現、機能及び活性をダウンレギュレーションする、化合物であり、例えばアンタゴニストなどである。
【０１１５】
本明細書において使用される関心対象の分子の用語「モジュレーター」及び「調節」は、その様々な型において、関心対象のプロテアーゼに関連した活性の拮抗、作動、部分的拮抗及び／又は部分的作動を包含することを意図される。様々な実施態様において、「モジュレーター」は、プロテアーゼの発現又は活性を阻害又は刺激してよい。そのようなモジュレーターは、プロテアーゼ分子の小型分子アゴニスト及びアンタゴニスト、アンチセンス分子、リボザイム、三重鎖(triplex)分子、及びＲＮＡｉポリヌクレオチド、及びその他のものを含む。
【０１１６】
本明細書において使用される「指示書(instruction material)」とは、本明細書に列挙された様々な疾患又は障害の軽減に作用するためのキット中の本発明の化合物、組成物、ベクター、又は送達システムの有用性を伝える為ため使用することができる、刊行物、記録、略図、又は任意の他の表現媒体を含む。任意に又は代わりに、指示書は、哺乳動物の細胞又は組織中の疾患又は障害を軽減する1又は複数の方法を説明することができる。本発明のキットの指示書は、例えば、本発明の同定された化合物、組成物、ベクター、もしくは送達システムを含む容器に添付されるか、又は同定された化合物、組成物、ベクター、もしくは送達システムを含む容器と一緒に出荷されることができる。あるいは、指示書及び化合物は、レシピエントにより協同して使用されることを意図して、指示書は、容器とは別に出荷されることができる。
【０１１７】
「単離された」は、天然の状態から変更又は除去されることを意味する。例えば、生存動物中にその正常な状況で天然に存在する核酸又はペプチドは、「単離され」ていないが、その天然の状況の同時に存在する物質から部分的に又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは、「単離されている」。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形で存在することができるか、又は例えば宿主細胞などの、非天然(non-native)の環境中に存在することができる。
【０１１８】
「単離された核酸」は、天然に生じる状態でそれに隣接する配列から分離されている、核酸セグメント又は断片、すなわち通常その断片に隣接している配列、すなわち天然に生じるゲノム中でその断片に隣接している配列から除去されているＤＮＡ断片を指す。この用語はまた、天然に核酸を随伴する他の成分から、すなわち天然にそれを細胞内で随伴しているＲＮＡ又はＤＮＡ又はタンパク質から実質的に精製されている核酸に適用される。従ってこの用語は、例えば、ベクターへ、自己複製プラスミドもしくはウイルスへ、又は原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡへ、組み入れられた組換えＤＮＡ、あるいは他の配列から独立した個別の分子として（すなわち、ＰＣＲもしくは制限酵素消化により生成されるｃＤＮＡもしくはゲノムもしくはｃＤＮＡ断片として）存在する、組換えＤＮＡを含む。これはまた、追加のポリペプチド配列をコードしているハイブリッド遺伝子の一部である、組換えＤＮＡも含む。
【０１１９】
本発明の状況において、通常生じる核酸塩基に関して、以下の略語が使用される。“Ａ”はアデノシンを指し、“Ｃ”はシトシンを指し、“Ｇ”はグアノシンを指し、“Ｔ”はチミジンを指し、且つ“Ｕ”はウリジンを指す。
【０１２０】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として定義される。更に、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。従って本明細書において使用される核酸及びポリヌクレオチドは、互換性がある。当業者は、核酸及びポリヌクレオチドは、モノマー性「ヌクレオチド」へ加水分解され得るという一般的知識を有する。モノマー性ヌクレオチドは、ヌクレオシドへ加水分解され得る。本明細書において使用されるポリヌクレオチドは、非限定的に組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術及びＰＣＲを使用する組換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングなどを含む、当該技術分野において利用可能な任意の手段により、並びに合成手段により、得られる全ての核酸配列を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２１】
本明細書において使用される用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、且つペプチド結合により共有的に連結されたアミノ酸残基で構成された化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含まなければならず、且つ非限定的に、タンパク質配列又はペプチド配列を構成することができる最大数のアミノ酸で配置されなければならない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合により連結された、２個又はそれよりも多いアミノ酸を含む、任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書において使用されるこの用語は、例えば、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとして同じく当該技術分野において通常言及される短鎖、並びに多くの種類が存在する、一般に当該技術分野においてタンパク質と称される長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、例えば、生物学的活性断片、とりわけ実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然のペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はそれらの組合せを含む。
【０１２２】
用語「保存的置換」は、ポリペプチドを説明する場合、実質的にポリペプチドの活性を変更しないポリペプチドのアミノ酸組成の変化、すなわちアミノ酸の類似の特性を有する他のアミノ酸による置換を指す。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野において周知である。以下の６群は各々、互いに保存的置換を表すと一般に理解されるアミノ酸を含む：（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び、（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）(同じく、Creighton、1984、Proteins、W.H. Freeman and Company参照)。先に定義した保存的置換に加え、アミノ酸残基の他の修飾も、「保存的に修飾されたバリアント」を生じることができる。例えば、全ての帯電されたアミノ酸を、それらが正又は負のいずれかにかかわらず、互いに置換とみなすことができる。加えて、保存的に修飾されたバリアントもまた、コードされた配列中の単独のアミノ酸又は小さい割合、例えば多くは５％未満のアミノ酸を改変、付加又は欠失する、個々の置換、欠失又は付加から生じることができる。更に保存的に修飾されたバリアントは、未変性又は野生型遺伝子により利用されるアミノ酸のコドンを、同じアミノ酸の異なるコドンによる置換することにより、組換えポリペプチドから作製することができる。
【０１２３】
本明細書において使用される用語「ＲＮＡ」は、リボ核酸として定義される。
【０１２４】
本明細書において使用される用語「組換えＤＮＡ」は、様々な給源からのＤＮＡの小片を連結することにより作製されるＤＮＡとして定義される。
【０１２５】
本明細書において使用される用語「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ法を用いることにより作製されるポリペプチドとして定義される。
【０１２６】
「医薬として許容し得る」により、製剤の他の構成成分と適合性があり、且つそのレシピエントへの投与に関して一般に安全である、例えば、担体、希釈剤又は賦形剤を意味する。本明細書において使用される「担体」は、コンジュゲートと一緒にした場合に、コンジュゲートの活性を保持し、且つ対象の免疫系と非反応性である、任意の物質を含む。例としては、リン酸緩衝食塩水、水などの標準の医薬担体、水中油型乳剤などの乳剤、及び様々な種類の湿潤剤のいずれかを含むが、これらに限定されるものではない。他の担体はまた、無菌の液剤、コート錠を含む錠剤、及びカプセル剤も含んでよい。典型的にはそのような担体は、デンプン、乳糖、特定型のクレイ、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩、ステアリン酸マグネシウム又はカルシウム、タルク、植物性油脂又は油、ガム、グリコールなどの賦形剤、又は他の公知の賦形剤を含む。そのような担体はまた、芳香剤もしくは着色剤又は他の構成成分も含んでよい。そのような担体を含有する組成物は、周知の常法により製剤化される。
【０１２７】
用語「患者」、「対象」、「個人」及び同類のものは、本明細書において互換的に使用され、且つ補体系を有する、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指し、状態又はその続発症に療法を必要とすえるヒト、易罹患性のヒトを含む。従って個体は、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、サル、及びマウス及びヒトを含んでよい。
【０１２８】
２つ以上の核酸配列又はポリペプチド配列の状況において本明細書において使用される「同一の」又は「同一性」は、それらの配列が、特定された領域にわたり同じである残基を特定された割合で有することを意味する。この割合は、２つの配列を最適にアラインメントし、特定の領域にわたり２つの配列を比較し、両配列中で同一残基が生じる位置の数を決定しマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を特定の領域中の位置の総数で除算し、この結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を得ることにより、計算することができる。２つの配列が異なる長さであるか、又はアラインメントが１又は複数の付着末端を生じ、及び比較される特定領域が単独の配列のみ有する場合において、単独配列の残基は、この計算の分母には含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡ及びＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は、同等と見なすことができる。同一性は、手作業により、又はＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などの、コンピュータ配列アルゴリズムを使用することにより、実行することができる。
【０１２９】
語句「パーセント（％）同一性」又は「パーセント同一」とは、２つ以上のアミノ酸配列の比較において認められる配列類似性の割合を指す。％同一性は、任意の好適なソフトウェアを使用し、電子的に決定することができる。同様に２つのポリペプチド（又はそれらのいずれか又は両方の１又は複数の部分）の間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第二のポリペプチドのアミノ酸配列と比較することにより決定される。そのような比較に適した任意の好適なアルゴリズムは、本発明の状況における適用に適合させることができる。
【０１３０】
「治療的」処置は、病理の徴候を示す対象へ、それらの徴候の縮小又は除去を目的として、投与された処置である。
【０１３１】
「治療的有効量」は、患者へ投与された場合に、疾患の症状を改善する本発明の化合物の量である。「治療的有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、病態及びその重症度、治療される患者の年齢、及び同類のものに応じて変動するであろう。治療的有効量は、自身の知識及び本開示を考慮し、当業者により慣習的に決定することができる。
【０１３２】
用語「治療する」、「治療している」及び「治療」は、本明細書において説明された治療的又は予防的手段を指す。「治療」の方法は、障害の１もしくは複数の症状又は障害の再発を予防、治癒、遅延、重症度の軽減、又は改善するため、あるいはそのような治療が存在しない場合に予想されるものよりも対象の生存を延長するために、そのような処置を必要とする対象、例えば、疾患もしくは障害に罹患した対象、又は最終的にそのような疾患もしくは障害を獲得する対象への、本発明の組成物の投与を利用する。
【０１３３】
「バリアント」が本明細書において使用される場合、この用語は、各々、参照の核酸配列又はペプチド配列とは配列が異なるが、参照分子の必須の生物学的特性を保持している、核酸配列又はペプチド配列である。核酸バリアントの配列の変更は、参照核酸によりコードされたペプチドのアミノ酸配列を改変しないか、又はアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断を生じることがある。ペプチドバリアントの配列の変更は制限又は保存され、典型的には、参照ペプチド及びバリアントの配列が、全体的に非常に類似しており、並びに多くの領域において同一である。バリアント及び参照ペプチドは、任意の組合せの１又は複数の置換、付加、欠失により、アミノ酸配列が異なることができる。核酸又はペプチドのバリアントは、アレルバリアントなど、天然に生じることができるか、あるいは天然に生じることがわかっていないバリアントであることができる。核酸及びペプチドの天然に生じないバリアントは、変異誘発技術又は直接合成により作製されてよい。
【０１３４】
範囲：本開示を通じて、本発明の様々な態様は、範囲のフォーマットで提示することができる。範囲フォーマットの説明は、単に便宜上及び簡潔さのためであることは理解されるべきであり、且つ本発明の範囲を確固として限定するものとして解釈されるべきではない。従って、範囲の説明は、可能な小範囲全て、並びにその範囲内の個々の数値を、具体的に明らかにしていると考えられるべきである。例えば、１から６までのような範囲の説明は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどの小範囲、並びにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６などを、具体的に明らかにしていると考えられるべきである。これは、範囲の幅とは無関係に適用する。
【０１３５】
説明
本発明は、レナラーゼに特異的に結合する物質を使用する、レナラーゼの結合及び阻害に関する。様々な実施態様において、本発明は、レナラーゼのインヒビターをそれを必要とする対象へ投与することにより、個体においてレナラーゼ−関連した疾患又は障害を治療する組成物及び方法に向けられる。一部の実施態様において、レナラーゼインヒビターは、レナラーゼ結合分子である。一部の実施態様において、レナラーゼ結合分子は、抗体である。様々な実施態様において、本発明の組成物及び方法を用いて診断可能、予防可能及び治療可能な疾患及び障害は、急性腎不全（すなわち、急性尿細管壊死、又はＡＴＮ、腎臓の虚血状態）、心血管疾患、膵炎、肝炎、腎臓の炎症障害、及び癌を含む。
【０１３６】
一実施態様において、本発明は広範に、癌の治療、予防、及び診断に関する。一実施態様において、本発明は、癌の診断、病期決定、治療、阻害、予防又は軽減のための方法及び組成物に向けられる。一実施態様において、本発明は、レナラーゼのレベル、生成、及び活性の1又は複数を調節する組成物及び方法を提供する。癌並びに関連する疾患及び障害の状況において、本発明は、レナラーゼのレベル、生成、及び活性の1又は複数を減少する組成物及び方法を提供する。本発明の一部の態様は、癌転移の治療、予防、診断又は予後判定のための方法及び組成物を提供する。
【０１３７】
レナラーゼインヒビター組成物及び使用方法
様々な実施態様において、本発明は、レナラーゼインヒビター組成物、並びにレナラーゼのレベル又は活性の減少が望ましい疾患又は障害を治療又は予防する方法を含む。本発明の組成物及び方法により治療又は予防され得る、レナラーゼのレベル又は活性の減少が望ましい疾患又は障害の非限定的例の一つは、癌を含む。様々な実施態様において、レナラーゼインヒビター組成物及び本発明の治療又は予防の方法は、活性レナラーゼポリペプチドの量、活性レナラーゼペプチド断片の量、レナラーゼ酵素活性の量、レナラーゼ基質結合活性の量、レナラーゼ受容体結合活性の量、又はそれらの組合せを減少する。
【０１３８】
当業者により、本明細書に提供される開示を基に、活性レナラーゼのレベルの減少は、転写、翻訳、又は両方を含む、レナラーゼ発現の減少を包含し、且つ同じくＲＮＡレベル（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡなど）及びタンパク質レベル（例えば、ユビキチン化など）を含む、レナラーゼの分解を促進することを包含していることは理解されるであろう。当業者は、一旦本発明の内容が作動可能になれば(armed)、活性レナラーゼのレベルの減少は、レナラーゼ活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）の減少を含むことも理解するであろう。従って、レナラーゼのレベル又は活性の減少は、レナラーゼをコードしている核酸の転写、翻訳又は両方を減少することを含むが、これらに限定されるものではなく；同じくこれは、レナラーゼポリペプチド、又はそのペプチド断片の任意の活性の減少もまた含む。本発明のレナラーゼインヒビター組成物及び方法は、レナラーゼを選択的に阻害することができるか、又はレナラーゼ及び別の分子を両方共阻害することができる。
【０１３９】
レナラーゼの阻害は、本明細書に開示されたもの、並びに当該技術分野において公知の方法、又は今後開発される方法を含む、多種多様な方法を用いて評価することができる。すなわち日常作業者(routineer)は、本明細書に提供される開示を基に、レナラーゼのレベル又は活性の減少は、生物学的試料中に存在する、レナラーゼをコードすえる核酸（例えばｍＲＮＡ）のレベル、レナラーゼポリペプチド又はそのペプチド断片のレベル、レナラーゼ活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）のレベル、又はそれらの組合せを評価する方法を使用することにより、容易に評価し得ることを理解するであろう。
【０１４０】
本明細書に提供される開示を基に、当業者は、対象が他の薬物療法又は療法により治療されるかどうかにかかわらず、本発明は、それを必要とする対象における治療又は予防において有用であることを理解するであろう。更に当業者は、本明細書に提供される内容を基に、本明細書記載の組成物及び方法により治療可能な疾患又は障害は、レナラーゼが役割を果たし、且つ減少されたレナラーゼのレベル又は活性が、正の治療的転帰を促進する、任意の疾患又は障害を包含することを更に理解するであろう。様々な実施態様において、本発明の化合物及び方法を使用し治療可能又は予防可能な疾患又は障害は、急性腎不全（すなわち、急性尿細管壊死、又はＡＴＮ、腎臓の虚血状態）、心血管疾患又は障害（例えば、高血圧、肺高血圧症、収縮期高血圧、糖尿病性高血圧、非症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律異常、アテローム性動脈硬化症など）、癌、心疾患又は障害、腎疾患又は障害、消化管疾患又は障害、肝疾患又は障害、肺疾患又は障害、膵疾患又は障害（例えば膵炎）、精神疾患又は障害（例えばうつ病、不安症など）、又は神経疾患又は障害を含む。
【０１４１】
別の実施態様において、本発明のレナラーゼインヒビターは、患者における内因性及び／又は外因性レナラーゼのレベル又は活性を制御、用量設定(titrate)、減少、又は安定化するために、外因性レナラーゼ、組換えレナラーゼ、レナラーゼ断片、及び／又はレナラーゼアクチベーターにより治療される患者へ投与され得る。
【０１４２】
レナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベル又は活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を減少する本発明のレナラーゼインヒビター組成物及び方法は、化学化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、抗体断片、抗体模倣体、リボザイム、小型分子化学化合物、短いヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、アンチセンス核酸分子をコードしている核酸、タンパク質をコードしている核酸配列、レナラーゼ受容体、レナラーゼ受容体断片、又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されると解釈されるべきではない。一部の実施態様において、このインヒビターは、アロステリックインヒビターである。当業者は、本明細書に提供される開示を基に、レナラーゼインヒビター組成物は、レナラーゼ又はその断片のレベル又は活性を減少する任意の化学化合物を包含していることを容易に理解するであろう。加えて、レナラーゼインヒビター組成物は、化学技術分野の業者には周知であるように、化学修飾された化合物、及び誘導体を包含する。
【０１４３】
レナラーゼ又はレナラーゼ断片のレベル又は活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を減少する本発明のレナラーゼインヒビター組成物及び方法は、抗体及びその断片を含む。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（“イントラボディ”）、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖抗体（ラクダ科の抗体など）、合成抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体を含む、様々な形の抗体を含む。一実施態様において、本発明の抗体は、レナラーゼに特異的に結合する抗体である。一部の実施態様において、本発明の抗体は、第一の特異性はレナラーゼに対してであり、及び第二の特異性は、二重特異性抗体を標的分子が存在し且つレナラーゼ結合が望ましい解剖学的位置に導くための、細胞又は組織上の標的分子に対してである、二重特異性抗体である。一部の実施態様において、本発明の抗体は、第一の特異性はレナラーゼに対してであり、及び第二の特異性は、抗体の二次的特異性により運搬され、且つレナラーゼ結合が望ましい解剖学的位置へ配備される第二の結合パートナー分子（すなわちペイロード）に対してである、二重特異性抗体である。
【０１４４】
一部の実施態様において、癌の治療のための、本発明のレナラーゼインヒビター（例えば、レナラーゼ結合分子）の対象への投与は、癌に対する対象の免疫系により免疫応答を開始及び／又は補足するのに役立つ。癌に対する対象の免疫応答は、自然免疫応答、体液性免疫応答、細胞性免疫反応、又はそれらの組合せを含む、何らかの宿主防御又は応答であることができる。
【０１４５】
更に当業者は、本開示及び本明細書に例証される方法を備える場合、レナラーゼインヒビター組成物は、本明細書において詳述され及び／又は当該技術分野において公知のレナラーゼの阻害の生理的結果のように、薬理学の技術分野において周知の基準により同定され得るような、今後発見されるそのようなインヒビターを含むことを理解するであろう。従って本発明は、本明細書において例示されるか又は開示される特定のレナラーゼインヒビター組成物に、いかなる様式においても限定されず；むしろ本発明は、当該技術分野において公知の及び今後発見されるような有用であることが日常作業者により理解されるそれらのインヒビター組成物を包含する。
【０１４６】
レナラーゼインヒビター組成物を同定及び生成する更なる方法は、当業者に周知であり、天然に生じる給源（例えば、ストレプトマイセス種、シュードモナス種、スチロテラ・アウランチウム(Stylotella aurantium)など）からインヒビターを得ることを含むが、これに限定されるものではない。あるいは、レナラーゼインヒビターは、化学的に合成することができる。更に日常作業者は、本明細書に提供される内容を基に、レナラーゼインヒビター組成物は、組換え生物から得ることができることを理解するであろう。レナラーゼインヒビターを学的に合成するため、並びにそれらを天然の給源から得るための組成物及び方法は、当該技術分野において周知であり、且つ当該技術分野において説明されている。
【０１４７】
当業者は、インヒビターは、化学化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、抗体断片、抗体模倣体、リボザイム、小型分子化学化合物、短いヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、アンチセンス核酸分子をコードしている核酸、タンパク質をコードしている核酸配列、レナラーゼ受容体、レナラーゼ受容体断片、又はそれらの組合せとして投与することができることを理解するであろう。多くのベクター並びに他の組成物及び方法は、タンパク質又はタンパク質をコードしている核酸構築体を、細胞又は組織へ投与することに関して、周知である。従って、本発明は、レナラーゼのインヒビターであるタンパク質又はタンパク質をコードしている核酸を投与する方法を含む(Sambrookら、2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York；Ausubelら、1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)。
【０１４８】
当業者は、それ自身レナラーゼのレベル又は活性を増加する分子の量又は活性を減弱することは、レナラーゼのレベル又は活性を減少するための本発明の組成物及び方法において役立つことができることを、認めるであろう。
【０１４９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子の一部分に相補的である、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。細胞中に存在する場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、存在するＲＮＡ分子へハイブリダイズし、且つ遺伝子産物への翻訳を阻害する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する遺伝子発現の阻害は、細胞においてアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現する方法(Inoue、米国特許第5,190,931号)のように、当該技術分野において周知である(Marcus-Sekura、1988, Anal. Biochem. 172:289)。本発明の方法は、レナラーゼの量を減らすため、又はレナラーゼの量又は活性の増加を引き起こす分子の量を減らし、それによりレナラーゼの量又は活性を減少するための、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【０１５０】
本発明において、当業者に周知の方法により、合成され且つ細胞へ提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドが企図される。例として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜約１００、より好ましくは約１５〜約５０のヌクレオチド長であるように合成することができる。核酸分子の合成は、未修飾のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比べ、生物活性を改善するように修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成であるように、当該技術分野において周知である(Tullis、1991、米国特許第5,023,243号)。
【０１５１】
同様に、遺伝子の発現は、アンチセンス分子のプロモーター又は他の遺伝子の制御要素へのハイブリダイゼーション、それによる遺伝子の転写に影響することにより阻害されてよい。関心対象の遺伝子と相互作用するプロモーター又は他の制御要素の同定方法は、当該技術分野において周知であり、且つ酵母ツーハイブリッドシステム(Bartel及びFields編集、The Yeast Two Hybrid System, Oxford University Press, Cary, N.C.)のような方法を含む。
【０１５２】
あるいは、レナラーゼを発現する遺伝子、又はレナラーゼのレベルもしくは活性を増加するタンパク質を発現する遺伝子の阻害は、リボザイムの使用により達成することができる。遺伝子発現の阻害のためのリボザイムの使用は、当業者に周知である(例えば、Cechら、1992, J. Biol. Chem. 267:17479；Hampelら、1989, Biochemistry 28: 4929；Altmanら、米国特許第5,168,053号参照)。リボザイムは、他の１本鎖ＲＮＡ分子を切断する能力を持つ触媒性ＲＮＡ分子である。リボザイムは、配列特異性があることが公知であり、従って特異的ヌクレオチド配列を認識するように修飾することができ(Cech、1988, J. Amer. Med. Assn. 260:3030)、特異的ｍＲＮＡ分子の選択的切断を可能にする。この分子のヌクレオチド配列が与えられるならば、当業者は、本開示及び本明細書に組み込まれた参考文献で提供されるよう、過度な実験を伴わずに、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムを合成することができる。
【０１５３】
あるいは、レナラーゼを発現する遺伝子、又はレナラーゼのレベルもしくは活性を増加するタンパク質を発現する遺伝子の阻害は、短いヘアピン型ＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＲＮＡｉを含むアンチセンスＲＮＡの使用を通じて達成することができる。この分子のヌクレオチド配列が与えられるならば、当業者は、本開示及び本明細書に組み込まれた参考文献で提供されるよう、過度な実験を伴わずに、短いヘアピン型ＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡを合成することができる。
【０１５４】
当業者は、レナラーゼ又はレナラーゼ断片のインヒビターは、急性的に（例えば、１日、１週間又は１ヶ月など、短期間にわたり）又は慢性的に（例えば、数ヶ月又は１年以上など、長期間にわたり）投与することができることを理解するであろう。当業者は、レナラーゼのインヒビターは、単独で、又は他の薬剤と組合せて投与することができることを理解するであろう。更にレナラーゼインヒビターは、単独で、又は互いに同時に、もしくは前に及び／もしくは後に投与されるという点において、時間の意味合い(temporal sense)の何らかの組合せで、投与することができる。当業者は、本明細書に提供される開示を基に、レナラーゼインヒビター組成物は、それを必要とする対象における疾患又は障害の治療又は予防に使用することができること、並びにインヒビター組成物は、単独で又は治療的結果に作用する別のインヒビターとの任意の組合せで使用することができることを理解するであろう。
【０１５５】
様々な実施態様において、本明細書に説明された本明細書のレナラーゼ又はレナラーゼ断片の任意のインヒビターは、単独で又は癌に関連した他の分子の他のインヒビターと組合せて投与することができる。
【０１５６】
当業者により、本明細書記載の方法を含む本開示で作動可能にした場合、本発明は、既に確立された癌などの疾患又は障害の治療に限定されないことは理解されるであろう。特に、この疾患又は障害は、対象に有害な点に対し症状発現される必要はなく；実際、この疾患又は障害は、治療が投与される前に、対象において検出される必要はない。すなわち、著しい疾患又は障害は、本発明が恩恵を提供する前には生じていない。従って本発明は、本明細書別所において先に考察されたように、レナラーゼインヒビター組成物は、疾患又は障害の開始前に、対象へ投与することができ、これにより疾患又は障害が発症することを予防するという点で、対象において疾患又は障害を予防する方法を含む。本明細書記載の予防的方法はまた、疾患又は障害の再発の予防に関して寛解にある対象の治療を含む。
【０１５７】
当業者は、本明細書の開示で作動可能にした場合に、疾患又は障害の予防は、癌を含む、疾患又は障害に対する予防的手段として、レナラーゼインヒビター組成物を対象へ投与することを包含していることを理解するであろう。本明細書別所でより完全に考察したように、レナラーゼのレベル又は活性を減少する方法は、レナラーゼ活性を減少するのみではなく、転写の減少、翻訳の減少のいずれか又は両方を含む、レナラーゼをコードしている核酸の発現も減少する広く過剰な技術を包含している。
【０１５８】
加えて、本明細書別所に開示されたように、当業者は、一旦本明細書に提供される内容により作動可能にされたならば、本発明は、レナラーゼの発現及び／又は活性の減少が、疾患、障害又は病理を媒介、治療又は予防するような、多種多様な疾患、障害及び病理の予防方法を包含することを理解するであろう。疾患がレナラーゼのレベル又は活性に関連するかどうかを評価する方法は、当該技術分野において公知である。更に本発明は、今後発見されるそのような疾患の治療又は予防を包含している
【０１５９】
本発明は、本発明の方法を実践するための、レナラーゼのインヒビターの投与を包含しており；当業者は、本明細書に提供される開示を基に、好適なレナラーゼインヒビターをどのように製剤化し且つ対象へ投与するかを理解するであろう。しかし、本発明は、いずれか特定の投与方法又は治療レジメンに限定されない。
【０１６０】
本発明は、レナラーゼに結合する組成物を提供する。一実施態様において、レナラーゼ結合剤は、レナラーゼのレベル又は活性を阻害する。従って、レナラーゼ活性の低下が有益であるような疾患及び状態において、そのような阻害性レナラーゼ結合剤は、潜在的に治療薬として作用し得る。
【０１６１】
場合によっては、その潜在的治療的役割に加え、レナラーゼは、急性腎不全（すなわち、急性尿細管壊死、又はＡＴＮ、腎臓の虚血状態）、心血管疾患、膵炎、肝炎、腎臓の炎症障害、及び癌を含むが、これらに限定されるものではない、疾患又は障害の診断マーカーとして使用することができる。適切に機能する腎臓を持たない患者は、より低いレベルのレナラーゼを有する。従って本発明のレナラーゼ結合剤を使用するレナラーゼの検出及び／又は定量を基に、癌を含む、心臓血管系、心臓、腎臓、胃腸、肝臓、肺、膵臓及び精神及び神経に関連した状態、障害及び疾患への易罹患性を診断する方法も、本発明に含まれる。例えば、高血圧、非症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律異常、アテローム性動脈硬化症などの心臓血管系の状態、障害及び疾患；うつ病及び不安症などの、精神の状態、障害及び疾患；肺高血圧症などの、心臓の状態、障害及び疾患は全て、レナラーゼタンパク質レベルなどのレナラーゼレベルを決定することにより、診断され、評価され且つモニタリングされることができる。例えば、レナラーゼタンパク質の低下したレベルは、増加した症候性の結果に関連した障害の診断マーカーであろう。本発明の組成物及び方法は、収縮期高血圧、孤立性収縮期高血圧及び糖尿病性高血圧を含む、高血圧の治療、予防、軽減又は改善のために使用することができる。更に同じ恩恵が、より稀な高血圧障害、肺高血圧症、並びに膵炎について予測される。肺高血圧症は、肺動脈（心臓から肺へ繋がる血管）中の圧力が正常レベルを上回って上昇し、且つ生命を脅かすことがある、肺の稀な血管障害である。糖尿病性高血圧における及び孤立性収縮期高血圧における全身血圧の上昇を伴う、肺血管床(pulmonary bed)中の上昇した血圧の同様の発達も、類似の機序が関与することを示唆している。
【０１６２】
レナラーゼのレベル又は活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を減少する本発明のレナラーゼインヒビター組成物は、化学化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、抗体断片、抗体模倣体、リボザイム、小型分子化学化合物、短いヘアピン型ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、アンチセンス核酸分子をコードしている核酸、タンパク質をコードしている核酸配列、レナラーゼ受容体、レナラーゼ受容体断片、又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものとして解釈されるべきではない。一部の実施態様において、インヒビターは、アロステリックインヒビターである。当業者は、本明細書に提供される開示を基に、レナラーゼインヒビター組成物は、レナラーゼのレベル又は活性を減少する化学化合物を包含することを容易に理解するであろう。加えて、レナラーゼインヒビター組成物は、化学技術分野の業者に周知であるように、化学的に修飾された化合物、及び誘導体を包含している。
【０１６３】
レナラーゼのレベル又は活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を減少する本発明のレナラーゼインヒビター組成物は、抗体及びその断片を含む。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（“イントラボディ”）、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖抗体（ラクダ科の抗体など）、合成抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体を含む、抗体の様々な形を含む。一実施態様において、本発明の抗体は、レナラーゼに特異的に結合する抗体である。一部の実施態様において、本発明の抗体は、第一の特異性はレナラーゼに対してであり、及び第二の特異性は、二重特異性抗体をレナラーゼ結合が望ましい解剖学的位置に導くための標的分子に対してである、二重特異性抗体である。一部の実施態様において、本発明の抗体は、第一の特異性はレナラーゼに対してであり、及び第二の特異性は、レナラーゼ結合が望ましい解剖学的位置へ運搬され且つ配備される第二の結合パートナー分子に対してである、二重特異性抗体である。
【０１６４】
そのレナラーゼ結合断片を含む本発明の抗体は、いくつかの実施態様において、任意の好適なポリヌクレオチドによりコード化された、本明細書に開示された抗体アミノ酸配列、又は任意の単離されたもしくは製剤化された抗体を含む。更に、本開示の抗体は、本明細書記載の抗レナラーゼ抗体の構造的及び／又は機能的特徴を有する抗体を含む。一実施態様において、抗レナラーゼ抗体は、レナラーゼに結合し、これにより部分的に又は実質的に、レナラーゼの少なくとも一つの生物活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を改変する。一部の実施態様において、レナラーゼは、ヒトレナラーゼである。
【０１６５】
一実施態様において、本発明の抗レナラーゼ抗体は、レナラーゼのタンパク質、ペプチド、サブユニット、断片、一部又はそれらの任意の組合せに特異的な、少なくとも一つの特定されたエピトープへ免疫特異的に結合し、且つ他の種由来の、レナラーゼ以外の、他のポリペプチドには特異的に結合しない。少なくとも一つのエピトープは、レナラーゼタンパク質の少なくとも一つの部分を含む、少なくとも一つの抗体結合領域を含むことができる。本明細書において使用される用語「エピトープ」は、抗体への結合が可能であるタンパク質決定基を指す。エピトープは、通常アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的活性のある表面基からなり、且つ通常特異的三次元構造特徴、並びに特異的荷電特徴を有する。高次構造的及び非−高次構造的エピトープは、前者への結合は、変性溶媒の存在下で喪失されるが、後者はそうではない点で、区別される。
【０１６６】
一部の実施態様において、本発明は、レナラーゼへ特異的に結合する抗体（例えば、抗体の結合部分）を含有する組成物を含む。一実施態様において、抗レナラーゼ抗体は、ポリクローナル抗体である。別の実施態様において、抗レナラーゼ抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施態様において、抗レナラーゼ抗体は、キメラ抗体である。更なる実施態様では、抗レナラーゼ抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施態様において、レナラーゼは、ヒトレナラーゼである。一部の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号：１−７、８、５０、９２、９４、及びそれらの断片の少なくとも一つへ特異的に結合する。
【０１６７】
抗体の結合部分は、結合パートナー分子（例えばレナラーゼ）へ特異的に結合する能力を保持する抗体の１又は複数の断片を含む。抗体の結合機能は、完全長抗体の断片により実行され得ることが、示されている。用語抗体の「結合部分」に包含される結合断片の例は、（ｉ）ＶL、ＶH、ＣL及びＣH１ドメインからなる一価の断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む、二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶH及びＣH１ドメインからなる、Ｆｄ断片；（ｉｖ）抗体の１本アームの、ＶL及びＶHドメインからなる、Ｆｖ断片；（ｖ）ＶHドメインからなる、ｄＡｂ断片(Wardら、1989 Nature 341:544-546)；並びに、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。更に、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶL及びＶHは個別の遺伝子によりコードされているが、これらは、その中でＶL及びＶH領域が対形成し、一価の分子を形成する（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Birdら、(1988) Science 242:423-426；及び、Hustonら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)、１本鎖タンパク質として作製されることが可能である合成リンカーによる、組換え法を用いて、繋ぐことができる。そのような単鎖抗体はまた、用語抗体の「結合部分」に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の常法を用いて得られ、且つそれらの断片は、インタクトな抗体と同じ様式で、利用のために分泌される。結合部分は、組換えＤＮＡ技術によるか、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断により、作製することができる。
【０１６８】
本発明のレナラーゼへ結合する抗体は、インビトロ、インサイチュ及び／又はインビボにおいて、少なくとも一つのレナラーゼ活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を、阻害、ブロック、又は干渉する、抗体である。好適な抗レナラーゼ抗体、特定部分、又はバリアントもまた、非限定的に、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質の合成、タンパク質放出、レナラーゼシグナル伝達、レナラーゼ切断、レナラーゼ活性、レナラーゼ受容体結合、レナラーゼ生成及び／又は合成などの、少なくとも一つのレナラーゼ活性又は機能に任意に影響を及ぼすことができる。
【０１６９】
一実施態様において、本発明の抗体は、レナラーゼへ結合する。一実施態様において、抗体は、レナラーゼ−１へ特異的に結合する。別の実施態様において、抗体は、レナラーゼ−２へ特異的に結合する。更に別の実施態様において、抗体は、レナラーゼ−１及びレナラーゼ−２の両方へ特異的に結合する。加えて、エピトープ特異性抗体が、作製されている。本発明の好ましい抗体は、モノクローナル抗体１Ｃ−２２−１、１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７及び３Ａ−５−２を含む。二重特異性抗体、例えばレナラーゼ−１及びレナラーゼ−２を認識する抗体の例は、抗体１Ｃ−２２−１、１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、及び本明細書記載のポリクローナル抗体を含む。レナラーゼ−型特異性抗体の例は、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７を含み、これらはレナラーゼ−１に特異的である。３Ａ−５−２は、レナラーゼ−２に特異的である。本発明の抗体断片は、配列番号：２１９、２２１、２２３、及び２２５に示したような、ヒト化された重鎖及び軽鎖Ｆｖ領域を含む。本発明の様々な実施態様において、抗レナラーゼ抗体又は抗体断片は、配列番号：２１９、２２１、２２３、及び２２５に示したような、ヒト化された重鎖及び軽鎖Ｆｖ領域、又はそれらの断片もしくは部分を含む。抗レナラーゼモノクローナル抗体をコードしている配列は、図４から図１３、及び実施例２に示されている。
【０１７０】
モノクローナル抗体１Ｄ−２８−４の重鎖コード配列の核酸（配列番号：５２）及びアミノ酸配列（配列番号：９）は、図４に認められる。モノクローナル抗体１Ｄ−２８−４の軽鎖コード配列の核酸（配列番号：５３）及びアミノ酸配列（配列番号：１０）は、図５に認められる。
【０１７１】
モノクローナル抗体１Ｄ−３７−１０重鎖コード配列の核酸（配列番号：６０）及びアミノ酸配列（配列番号：１７）は、図６に認められる。モノクローナル抗体１Ｄ−３７−１０の軽鎖コード配列の核酸（配列番号：６１）及びアミノ酸配列（配列番号：１８）は、図７に認められる。
【０１７２】
モノクローナル抗体１Ｆ−２６−１の重鎖コード配列の核酸（配列番号：６８）及びアミノ酸配列（配列番号：２５）は、図８に認められる。モノクローナル抗体１Ｆ−２６−１の軽鎖コード配列の核酸（配列番号：６９）及びアミノ酸配列（配列番号：２６）は、図９に認められる。
【０１７３】
モノクローナル抗体１Ｆ−４２−７の重鎖コード配列の核酸（配列番号：７６）及びアミノ酸配列（配列番号：３３）は、図１０に認められる。モノクローナル抗体１Ｆ−４２−７の軽鎖コード配列の核酸（配列番号：７７）及びアミノ酸配列（配列番号：３４）は、図１１に認められる。
【０１７４】
モノクローナル抗体３Ａ−５−２の重鎖コード配列の核酸（配列番号：８４）及びアミノ酸配列（配列番号：４１）は、図１２に認められる。モノクローナル抗体３Ａ−５−２の軽鎖コード配列の核酸（配列番号：８５）及びアミノ酸配列（配列番号：４２）は、図１３に認められる。．
【０１７５】
いくつかのモノクローナル抗体が、レナラーゼタンパク質へ結合することができるならば、それらのＶH及びＶL配列は、本開示の他の抗レナラーゼ結合分子を作製するために、「混合され及びマッチされる」ことができる。そのような「混合され及びマッチされる」抗体のレナラーゼ結合は、先に説明された及び実施例の結合アッセイ（例えば、免疫ブロット法、Ｂｉａ−Ｃｏｒｅなど）を用い、試験することができる。好ましくは、ＶH及びＶL鎖が混合され且つマッチされる場合、特定のＶH／ＶL対形成由来のＶH配列は、構造的に類似したＶH配列により置き換えられる。同様に好ましくは、特定のＶH／ＶL対形成由来のＶL配列は、構造的に類似したＶL配列により置き換えられる。
【０１７６】
従って一部の実施態様において、本発明は、抗体又は抗体断片が、新規重鎖可変配列をコードする少なくとも一つのポリペプチド配列を含む、抗体又は抗体断片である。他の実施態様において、本発明は、抗体又は抗体断片が、新規軽鎖可変配列をコードする少なくとも一つのポリペプチド配列を含む、抗体又は抗体断片である。
【０１７７】
一実施態様において、第一のＶH相補性決定領域（ＨＣ  ＣＤＲ１）は、配列番号：１５５に示したアミノ酸配列を含み；第二のＶH相補性決定領域（ＨＣ  ＣＤＲ２）は、配列番号：１５６、配列番号：１６２、及び配列番号：１６８の群から選択されたアミノ酸配列を含み；第三のＶH相補性決定領域（ＨＣ  ＣＤＲ３）は、配列番号：１５７、及び配列番号：１６３の群から選択されたアミノ酸配列を含み；第一のＶL相補性決定領域（ＬＣ  ＣＤＲ１）は、配列番号：１５２に示したアミノ酸配列を含み；第二のＶL相補性決定領域（ＬＣ  ＣＤＲ２）は、配列番号：１５３に示したアミノ酸配列を含み；第三のＶL相補性決定領域（ＬＣ  ＣＤＲ３）は、配列番号：１５４、及び配列番号：１６０の群から選択されたアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ１は、配列番号：１５５を含み；ＨＣ  ＣＤＲ２は、配列番号：１５６を含み；ＨＣ  ＣＤＲ３は、配列番号：１５７を含み；ＬＣ  ＣＤＲ１は、配列番号：１５２を含み；ＬＣ  ＣＤＲ２は、配列番号：１５３を含み；ＬＣ  ＣＤＲ３は、配列番号：１５４を含む。一実施態様において、ＶHは、配列番号：２１９を含み；ＶLは、配列番号：２２１を含む。一実施態様において、これら２つのポリペプチドは、リンカーにより連結され、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を形成し、ここでリンカーに対するポリペプチドの配置は、ＶH−リンカー−ＶL、及びＶL−リンカー−ＶHの群から選択される。
【０１７８】
一実施態様において、第一のＶH相補性決定領域（ＨＣ  ＣＤＲ１）は、配列番号：１９７、及び配列番号：２０３の群から選択されたアミノ酸配列を含み；第二のＶH相補性決定領域（ＨＣ  ＣＤＲ２）は、配列番号：１９８、及び配列番号：２０４の群から選択されたアミノ酸配列を含み；第三のＶH相補性決定領域（ＨＣ  ＣＤＲ３）は、配列番号：１９９、及び配列番号：２０５の群から選択されたアミノ酸配列を含み；第一のＶL相補性決定領域（ＬＣ  ＣＤＲ１）は、配列番号：１９４、及び配列番号：２００の群から選択されたアミノ酸配列を含み；第二のＶL相補性決定領域（ＬＣ  ＣＤＲ２）は、配列番号：１９５に示したアミノ酸配列を含み；第三のＶL相補性決定領域（ＬＣ  ＣＤＲ３）は、配列番号：１９６に示したアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＨＣ  ＣＤＲ１は、配列番号：１９７を含み；ここでＨＣ  ＣＤＲ２は配列番号：１９８を含み；ここでＨＣ  ＣＤＲ３は配列番号：１９９を含み；ここでＬＣ  ＣＤＲ１は配列番号：１９４を含み；ここでＬＣ  ＣＤＲ２は配列番号：１９５を含み；ここでＬＣ  ＣＤＲ３は配列番号：１９６を含む。一実施態様において、ＶHは、配列番号：２２３を含み；ＶLは、配列番号：２２５を含む。一実施態様において、これら２つのポリペプチドは、リンカーにより連結され、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を形成し、ここでリンカーに対するポリペプチドの配置は、ＶH−リンカー−ＶL、及びＶL−リンカー−ＶHの群から選択される。
【０１７９】
様々な実施態様において、新規重鎖可変配列は更に、少なくとも一つの追加ポリペプチド配列を含む。様々な実施態様において、新規軽鎖可変配列は更に、少なくとも一つの追加ポリペプチド配列を含む。一実施態様において、ＶHポリペプチドは更に、重鎖ＣH１ドメインを含み；ＶLポリペプチドは更に、軽鎖ＣLドメインを含む。一実施態様において、ＶHポリペプチドは更に、重鎖ＣH１ドメイン、重鎖ＣH２ドメイン、及び重鎖ＣH３ドメインを含み、抗体重鎖を形成し；ＶLポリペプチドは更に、軽鎖ＣLドメインを含み、抗体軽鎖を形成する。一実施態様において、抗体重鎖及び抗体軽鎖は連結され、半抗体を形成する。一実施態様において、この半抗体は、別の半抗体へ連結され、抗体を形成する。様々な実施態様において、重鎖の軽鎖への連結は、半抗体を形成し、且つこれら２つの半抗体の連結は、ジスルフィド結合を用いて達成される。他の実施態様において、半抗体を形成する重鎖の軽鎖への連結、及び２つの半抗体の連結は、ジスルフィド結合でない結合又は連結を用いて達成される。
【０１８０】
別の態様において、本開示は、（ａ）配列番号：９、１７、２５、３３及び４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；並びに、（ｂ）配列番号：１０、１８、２６、３４及び４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域：を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその結合部位であって、ここで抗体がレナラーゼタンパク質へ特異的に結合するものを提供する。
【０１８１】
好ましい重鎖及び軽鎖の組合せは、（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は、（ｂ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は、（ｃ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は、（ｄ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は、（ｅ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号：４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域：を含む。
【０１８２】
別の態様において、本開示は、１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７又は３Ａ−５−２又はそれらの組合せの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体を提供する。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７及び３Ａ−５−２のＶH  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、各々、配列番号：１１、１９、２７、３５、及び４３に示された配列へ組み込まれている。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７及び３Ａ−５−２のＶH  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、各々、配列番号：１２、２０、２８、３６、及び４４に示された配列へ組み込まれている。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７及び３Ａ−５−２のＶH  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、各々、配列番号：１３、２１、２９、３７、及び４５に示された配列へ組み込まれている。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７及び３Ａ−５−２のＶＫ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、各々、配列番号：１４、２２、３０、３８、及び４６に示された配列へ組み込まれている。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７及び３Ａ−５−２のＶＫ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号：１５、２３、３１、３９及び４７に示された配列へ組み込まれている。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７及び３Ａ−５−２のＶＫ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、各々、配列番号：１６、２４、３２、４０及び４８に示された配列へ組み込まれている。ＣＤＲ領域は、Kabatシステム(Kabat、E. A.、(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. 91-3242)を用いて、示される。
【０１８３】
これらの各抗体は、レナラーゼファミリーメンバーに結合することができ、且つ結合特異性は、主にＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域により提供されるとするならば、ＶH  ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列並びにＶL  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、「混合され且つマッチされ」（すなわち、異なる抗体由来のＣＤＲは、混合及びマッチされ得るが、各抗体は、ＶH  ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３並びにＶL  ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含まなければならない）、本開示の他の抗レナラーゼ結合分子を作製する。そのような「混合され且つマッチされた」抗体のレナラーゼ結合は、先に及び実施例において説明された結合アッセイ（例えば、免疫ブロット法、Biacore（登録商標）分析など）を使用し、試験することができる。好ましくは、ＶH  ＣＤＲ配列が混合され且つマッチされた場合には、特定のＶH配列由来のＣＤＲｌ、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、構造が類似したＣＤＲ配列（複数可）と置き換えられる。同様に、ＶL  ＣＤＲ配列が混合され且つマッチされた場合には、特定のＶL配列由来のＣＤＲｌ、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、好ましくは構造が類似したＣＤＲ配列（複数可）と置き換えられる。当業者には、新規ＶH及びＶL配列は、１又は複数のＶH及び／又はＶL  ＣＤＲ領域配列を、モノクローナル抗体１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７又は３Ａ−５−２について本明細書に開示されたＣＤＲ配列由来の構造が類似した配列と置換することにより、作製することができることは容易に明らかであろう。
【０１８４】
従って別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号：１１、１９、２７、３５、及び４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号：１２、２０、２８、３６、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：１３、２１、２９、３７、及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：１４、２２、３０、３８、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号：１５、２３、３１、３９及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；並びに、（ｆ）配列番号：１６、２４、３２、４０及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３：から選択される少なくとも一つを含む、単離されたモノクローナル抗体又はその結合部位を提供し、ここで抗体は、レナラーゼに特異的に結合する。
【０１８５】
別の実施態様において、この抗体は、（ａ）配列番号：１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号：１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号：１５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；並びに、（ｆ）配列番号：１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３：から選択されたＣＤＲの少なくとも一つを含む。
【０１８６】
別の実施態様において、この抗体は、（ａ）配列番号：１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号：２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号：２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；並びに、（ｆ）配列番号：２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３：から選択されたＣＤＲの少なくとも一つを含む。
【０１８７】
別の実施態様において、この抗体は、（ａ）配列番号：２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号：２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号：３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；並びに、（ｆ）配列番号：３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３：から選択されたＣＤＲの少なくとも一つを含む。
【０１８８】
別の他の実施態様において、この抗体は、（ａ）配列番号：３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号：３６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：３７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号：３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；並びに、（ｆ）配列番号：４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３：から選択されたＣＤＲの少なくとも一つを含む。
【０１８９】
別の実施態様において、この抗体は、（ａ）配列番号：４３を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号：４４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：４５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：４６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号：４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；並びに、（ｆ）配列番号：４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３：から選択されたＣＤＲの少なくとも一つを含む。
【０１９０】
前述の単離された抗レナラーゼ抗体ＣＤＲ配列は、本発明に従い単離され、且つ列挙されたＣＤＲ配列を含むポリペプチドを含む、レナラーゼ結合タンパク質の新規ファミリーを確立する。レナラーゼ結合及び／又はレナラーゼ検出及び／又はレナラーゼ中和活性を有する、本発明のＣＤＲを作製し且つ選択するために、本発明の結合タンパク質を作製する、並びにレナラーゼ及び／もしくはレナラーゼ結合及び／又はそれらの結合タンパク質の検出及び／もしくは中和の特徴を評価する当該技術分野において公知の標準方法を、使用することができ、これは本明細書に具体的に説明された方法を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１９１】
好ましくは、本発明のレナラーゼ結合分子（例えば抗体など）は、例えば、当該技術分野において公知のいくつかのインビトロ及びインビボアッセイのいずれか一つにより評価される、塩、化合物及び他のポリペプチドの複合混合物中のレナラーゼを検出し及び結合する高い能力を発揮する。当業者は、疾患の診断及び治療及び予防の方法において有用なものとして本明細書に説明されるレナラーゼ結合分子（例えば抗体など）は、免疫クロマトグラフィーアッセイ、イムノドットアッセイ、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、質量分析アッセイ、放射免疫測定（ＲＩＡ）、放射免疫拡散アッセイ、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析アッセイ、オークタロニー免疫拡散アッセイ、逆相タンパク質マイクロアレイ、ロケット免疫電気泳動アッセイ、免疫組織染色アッセイ、免疫沈降アッセイ、補体結合アッセイ、ＦＡＣＳ、タンパク質チップアッセイ、分離及び精製プロセス、並びにアフィニティクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されるものではない、本発明の手法及び方法においても有用であることを理解するであろう(同じく、2007, Van Emon、Immunoassay and Other Bioanalytical Techniques, CRC Press；2005, Wild、Immunoassay Handbook, Gulf Professional Publishing；1996, Diamandis及びChristopoulos、Immunoassay, Academic Press；2005, Joos、Microarrays in Clinical Diagnosis, Humana Press；2005, Hamdan及びRighetti、Proteomics Today, John Wiley and Sons; 2007参照)。
【０１９２】
より好ましくは、本発明のレナラーゼ結合分子（例えば抗体など）は、当該技術分野において公知のいくつかのインビトロ及びインビボアッセイのいずれか一つにより評価される、レナラーゼ活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）を中和する高い能力を発揮する。例えば、これらのレナラーゼ結合分子（例えば抗体など）は、レナラーゼ−関連した又はレナラーゼ−媒介した疾患又は障害を中和する。好ましくは、本発明のレナラーゼ結合分子（例えば抗体など）はまた、レナラーゼ活性を減少又は中和する高い能力を発揮する。一部の実施態様において、レナラーゼは、ヒトレナラーゼである。
【０１９３】
本明細書において使用されるように、「レナラーゼタンパク質へ特異的に結合する」レナラーゼ結合分子（例えば抗体など）は、任意の動物のレナラーゼタンパク質に結合するレナラーゼ結合分子（例えば抗体など）を指すことが意図される。一部の実施態様において，その抗体は、ヒトレナラーゼに結合する。好ましくは、レナラーゼ結合分子（例えば抗体など）は、１×１０-6Ｍ以下、より好ましくは１×１０-7Ｍ以下、より好ましくは１×１０-8Ｍ以下、より好ましくは５×１０-9Ｍ以下、より好ましくは１×１０-9Ｍ以下、又は更により好ましくは３×１０-10Ｍ以下のＫＤで、レナラーゼタンパク質へ結合する。本明細書において使用される用語タンパク質又は細胞へ「実質的に結合しない」とは、タンパク質又は細胞へ結合しない又は高い親和性で結合しないこと、すなわち、タンパク質又は細胞へ、１×１０6Ｍ以上、より好ましくは１×１０5Ｍ以上、より好ましくは１×１０4Ｍ以上、より好ましくは１×１０3Ｍ以上、更により好ましくは１×１０2Ｍ以上よりも大きいＫＤで結合することを意味する。本明細書において使用される用語「ＫＤ」は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）により得られ、並びにモル濃度（Ｍ）として表される、解離定数を指すことが意図される。レナラーゼ結合分子（例えば抗体など）に関するＫＤ値は、当該技術分野において良く確立された方法を用いて決定することができる。結合分子（例えば抗体など）のＫＤを決定する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用することにより、好ましくはBiacore(登録商標)システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる。
【０１９４】
本明細書において使用される用語ＩｇＧ抗体に関する「高親和性」は、標的の結合パートナー分子に関して、１×ｌ０-7Ｍ以下、より好ましくは５×１０-8Ｍ以下、更により好ましくは１×１０-8Ｍ以下、更により好ましくは５×１０-9Ｍ以下、及び更により好ましくは１×１０-9Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかし「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに関して変動することができる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに関する「高親和性」結合は、１０-6Ｍ以下、より好ましくは１０-7Ｍ以下、更により好ましくは１０-8Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【０１９５】
いくつかの実施態様において、この抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域などの、重鎖定常領域を含む。好ましくは、この重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域である。更に、この抗体は、カッパ軽鎖定常領域又はラムダ軽鎖定常領域のいずれかの、軽鎖定常領域を含むことができる。好ましくは、この抗体は、カッパ軽鎖定常領域を含む。あるいは、この抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片又は単鎖Ｆｖ断片であることができる。
【０１９６】
抗レナラーゼ抗体の作製  
本発明は、レナラーゼへ結合する組成物を提供する。本明細書で開示されたレナラーゼ分子は、本明細書で開示された他のポリペプチドと高い及び／又は有意な配列同一性を有するものを含む分子のクラスである。より具体的には、推定レナラーゼは、配列番号：４９又は５１の配列を有する核酸と、少なくとも約４０％の配列同一性を共有するであろう。より好ましくは、レナラーゼをコードしている核酸は、本明細書に開示された配列番号：４９又は５１と、少なくとも約４５％同一性、又は少なくとも約５０％同一性、又は少なくとも約５５％同一性、又は少なくとも約６０％同一性、又は少なくとも約６５％同一性、又は少なくとも約７０％同一性、又は少なくとも約７５％同一性、又は少なくとも約８０％同一性、又は少なくとも約８５％同一性、又は少なくとも約９０％同一性、又は少なくとも約９５％同一性、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。更により好ましくは、この核酸は、配列番号：４９又は５１又は９３又は９５である。用語「レナラーゼ」はまた、レナラーゼアイソフォームを含む。レナラーゼ遺伝子は、ヒトゲノムの１０番染色体において３１０１８８ｂｐに広がる９つのエクソンを含む。本明細書において開示されたレナラーゼクローン（配列番号：４９、GenBank寄託番号：BC005364）は、エクソン１、２、３、４、５、６、８を含む遺伝子である。そこには、ヒトゲノムデータベースにおいて示されたレナラーゼタンパク質の少なくとも２つの追加の選択的スプライシングされた型が存在する。一つの選択的スプライシングされた型は、その配列が引用により明確に本明細書中に組み込まれている、GenBank寄託番号AK002080及びNMJ18363としてヒトゲノムデータベースにおいてクローンにより同定された、エクソン１、２、３、４、５、６、９を含む。他方の選択的スプライシングされた型は、その配列が引用により明確に本明細書中に組み込まれている、GenBank寄託番号BX648154としてヒトゲノムデータベースにおけるクローンにより同定された、エクソン５、６、７、８を含む。別に指摘しない限りは、「レナラーゼ」は、全ての公知のレナラーゼ（例えば、ラットレナラーゼ、及びヒトレナラーゼ）、並びに発見されるべきレナラーゼを包含し、本明細書に開示されたレナラーゼの特徴及び／又は物理的特性を有する、非限定的にヒトレナラーゼ及びチンパンジーレナラーゼを含む。
【０１９７】
加えて、推定レナラーゼは、配列番号：８又は５０の配列を有するポリペプチドと、少なくとも約６０％の配列同一性を共有している。より好ましくは、レナラーゼは、本明細書において開示された配列番号：８又は５０と、少なくとも約４５％同一性、又は少なくとも約５０％同一性、又は少なくとも約５５％同一性、又は少なくとも約６０％同一性、又は少なくとも約６５％同一性、又は少なくとも約７０％同一性、又は少なくとも約７５％同一性、又は少なくとも約８０％同一性、又は少なくとも約８５％同一性、又は少なくとも約９０％同一性、又は少なくとも約９５％同一性、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。更により好ましくは、レナラーゼポリペプチドは、配列番号：８又は５０又は９２又は９４のアミノ酸配列を有する。
【０１９８】
一実施態様において、本発明の抗体は、動物を免疫化するために、レナラーゼの配列由来のペプチドを使用することにより作製され、これにより動物は、この免疫原に対する抗体を産生する。例証的免疫原は、レナラーゼ由来のペプチドを含む。すなわち、レナラーゼ配列の断片を有するペプチドは、本発明において使用することができる。ペプチドは、組換えペプチドとしての発現、大型ポリペプチドとしての発現を含む、様々な様式で作製され、及び酵素的もしくは化学的に切断されることができる。あるいは、これらは、当該技術分野において公知のように合成により作製されてよい。本発明の親和性試薬を作製するために使用される好ましいペプチドは、図１（配列番号：１−７）に認められる。
【０１９９】
本発明の抗レナラーゼ抗体は、Kohler及びMilstein (1975) Nature 256:495の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術（ハイブリドーマ法）を含む、様々な技術により、任意に産生することができる。ハイブリドーマ法において、マウス又はハムスターもしくはマカクザルなどの他の好適な宿主動物は、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか又は産生することが可能であるリンパ球を誘起するために、本明細書に説明されたように免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロにおいて免疫化されてよい。その後リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの、好適な融合剤を使用し、骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、pp. 59-103 (Academic Press、1986))。
【０２００】
ハイブリドーマ技術を用い特異的抗体を産生及びスクリーニングする方法は、慣習的であり、且つ当該技術分野において周知である。一実施態様において、本発明は、モノクローナル抗体、並びに本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法により産生された抗体を作製する方法を提供し、ここで好ましくは、このハイブリドーマは、本発明のポリペプチド又はペプチドにより免疫化したマウス又はウサギ又は他の種から単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、その後本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンの融合から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることにより作製される。簡単に述べると、マウスは、レナラーゼポリペプチド又はそのペプチドにより免疫化することができる。好ましい実施態様において、レナラーゼポリペプチド又はそのペプチドは、免疫応答を刺激するために、アジュバントと共に投与される。そのようなアジュバントは、完全又は不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）を含む。そのようなアジュバントは、局所的沈着(local deposit)中にそれを捕捉することにより、このポリペプチドを、迅速な分散から防御することができるか、又はこれらは、マクロファージ及び免疫系の他の成分について走化性である因子を分泌するように、宿主を刺激する物質を含むことができる。好ましくは、ポリペプチドが投与される場合、免疫化のスケジュールは、数週間にまたがる、ポリペプチドの２回以上の投与に関与するであろう。
【０２０１】
あるいは、ウサギは、レナラーゼポリペプチド又はそのペプチドにより免疫化することができる。この実施態様において、完全長レナラーゼタンパク質又はレナラーゼ由来のペプチドのいずれかは、免疫原として使用することができる。
【０２０２】
本発明において使用されるレナラーゼは、様々な形状をとることができる。例えばこれらは、精製されたレナラーゼタンパク質又はその断片、組換えにより生成されたレナラーゼ又はその断片を含むことができる。一部の実施態様において、レナラーゼは、ヒトレナラーゼである。組換えレナラーゼが使用される場合、これは、当該技術分野において公知のように、真核細胞又は原核細胞において生成することができる。追加免疫原は、レナラーゼ由来のペプチドを含む。すなわち、レナラーゼ配列の断片を有するペプチドは、本発明において使用することができる。ペプチドは、組換えペプチドとしての発現、より大きいポリペプチドとしての発現を含む、様々な様式で生成され、及び酵素的又は化学的に切断され得る。あるいは、これらは、当該技術分野において公知のように、合成により生成されてよい。本発明の親和性試薬を作製するために使用される好ましいペプチドは、図１（配列番号：１−７）に認められる。ヒトレナラーゼの完全長アミノ酸配列は、配列番号：８に示されており、ここで示されるように既知の多型が可能である（配列番号：９２と比較）。レナラーゼ−２のアミノ酸配列は、配列番号：５０において認められ、再度ここでも示されるように既知の多型が可能である（配列番号：９４と比較）。その他の多型が存在することは理解される。これらも同じくレナラーゼの定義に含まれる。一部の実施態様において、本発明のレナラーゼ結合分子は、配列番号：１−７、８、５０、９２、９４の少なくとも一つ、及びそれらの断片へ、特異的に結合する。
【０２０３】
この抗レナラーゼ抗体はまた任意に、本明細書に記載の及び／又は当該技術分野において公知のようにヒト抗体のレパトアを作製することが可能である、トランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、非−ヒト霊長類など）の免疫化により産生されることもできる。ヒト抗レナラーゼ抗体を産生する細胞は、そのような動物から単離され、且つ本明細書に記載された方法のような好適な方法を用い、不死化されることができる。あるいは、この抗体コード配列は、本明細書に記した方法及び当該技術分野において公知の方法により、クローニングされ、好適なベクターへ導入され、且つ抗体の発現及び単離のため、宿主細胞のトランスフェクションに使用される。
【０２０４】
それらの生殖系列配置にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの使用は、それに対し正常なヒト免疫系が寛容であるヒト自己抗原を含む様々な標的に対し向けられた、高親和性の完全ヒトモノクローナル抗体の単離を提供する(Lonberg, N.ら、米国特許第5,569,825号、米国特許第6,300,129号、並びに1994, Nature 368:856-9；Green, L.ら、1994, Nature Genet. 7:13-21；Green, L.及びJakobovits、1998, Exp. Med. 188:483-95；Lonberg, N.及びHuszar, D.、1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93；Kucherlapatiら、米国特許第6,713,610号；Bruggemann, M.ら、1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-1326；Fishwild, D.ら、1996, Nat. Biotechnol. 14:845-851；Mendez, M.ら、1997, Nat. Genet. 15:146-156；Green, L.、1999, J. Immunol. Methods 231:11-23；Yang, X.ら、1999, Cancer Res. 59:1236-1243；Bruggemann, M.及びTaussig, M J.、Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458, 1997；Tomizukaら、WO02043478)。そのようなマウスにおける内因性免疫グロブリン遺伝子座は、破壊されるか又は欠失され、内因性遺伝子によりコードされた抗体を産生する動物の能力を失わせることができる。加えて、Abgenix社(フリーモント、カリフォルニア州)及びMedarex(サンノゼ、カリフォルニア州)などの会社は、本明細書の別所記載の技術を使用し、選択された標的に結合するパートナー分子（例えば抗原など）に対し向けられたヒト抗体を提供することに携わることができる。
【０２０５】
別の実施態様において、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択され、ここでそのファージは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含み、且つライブラリーは、例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）として、Ｆａｂ、又は対をなす又は対をなさない抗体可変領域を示すいくつかの他の構築体として、ヒト抗体結合ドメインを発現している(Vaughanら、Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)；Sheetsら、PITAS (USA) 95:6157-6162 (1998))；Hoogenboom及びWinter、J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marksら、J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーのスクリーニングに関する、ファージディスプレイ法を用い、調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、当該技術分野において確立されている。例えば、Ladnerらの、米国特許第5,223,409号；第5,403,484号；及び第5,571,698号；Dowerらの、米国特許第5,427,908号及び第5,580,717号；McCaffertyらの、米国特許第5,969,108号及び第6,172,197号；並びに、Griffithsらの、米国特許第5,885,793号；第6,521,404号；第6,544,731号；第6,555,313号；第6,582,915号及び第6,593,081号を参照されたい。
【０２０６】
免疫原性抗原の調製、及びモノクローナル抗体産生は、組換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を用いて、実行することができる。免疫原性抗原は、精製したタンパク質、又は細胞全体又は細胞もしくは組織抽出物を含有するタンパク質混合物の形で、動物へ投与することができるか、あるいはこの抗原は、該抗原又はその部分をコードしている核酸から、動物の体において新たに形成されることができる。
【０２０７】
本発明の単離された核酸は、当該技術分野において周知のように、（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、又はそれらの組合せを用いて、作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、当該技術分野において公知の方法を用い、容易に単離され且つ配列決定される（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）。ハイブリドーマが生成される場合、そのような細胞は、そのようなＤＮＡの給源として役立つ。あるいは、ファージ又はリボソームディスプレイライブラリーなどの、コード配列及び翻訳産物が連結されている、ディスプレイ技術を使用し、バインダー及び核酸の選択は、簡略化される。ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域は、単離され、且つヒト抗体を含む抗体全体、又は任意の他の望ましい結合断片を作製するために使用され、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む、任意の望ましい宿主において発現される。
【０２０８】
ヒト化抗体
本発明は更に、ヒトレナラーゼに結合する、ヒト化された免疫グロブリン（又は抗体）を提供する。免疫グロブリンのヒト化された形は、実質的にヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリンと称される）由来の可変フレームワーク領域（複数可）及びレナラーゼに特異的に結合する実質的に非−ヒトｍＡｂ由来のＣＤＲを有する。定常領域（複数可）が存在するならば、これもまた、ヒト免疫グロブリンに実質的に由来する。このヒト化抗体は、レナラーゼについてのＫD、少なくとも約１０-6Ｍ（１μＭ）、約１０-7Ｍ（１００ｎＭ）以下を示す。ヒト化抗体の結合親和性は、それらが誘導されるマウス抗体の結合親和性よりも大きいか又は小さくてよい。レナラーゼに関するヒト化抗体の親和性の変化に影響を及ぼし、親和性を改善するために、ＣＤＲ残基又はヒト残基のいずれかにおける置換が行われ得る。
【０２０９】
レナラーゼに結合するヒト化抗体の生成の給源は、好ましくは１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７又は３Ａ−５−２ウサギモノクローナル抗体であり、その作製、単離及び特徴決定は、本明細書に提供される実施例に説明されているが、レナラーゼへの結合に関して、１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７又は３Ａ−５−２抗体と競合する他の抗体も、使用することができる。配列表に明記された同定されたＣＤＲは、ヒト化プロセスの出発点であることができる。例えば、以下のアミノ酸配列（及びその対応する核酸配列）のいずれか１又は複数は、ヒト化プロセスの出発点であることができる：（ａ）配列番号：１１、１９、２７、３５、及び４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号：１２、２０、２８、３６、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号：１３、２１、２９、３７、及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号：１４、２２、３０、３８、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号：１５、２３、３１、３９及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；並びに、（ｆ）配列番号：１６、２４、３２、４０及び４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３。
【０２１０】
ヒト可変ドメインフレームワークが、それにＣＤＲが起源をもつ親可変フレームワークと同じ又は類似の高次構造を採用するならば、ウサギ又はマウスＣＤＲのヒト可変ドメインフレームワークへの置換は、それらの正確な空間的配向の保持を生じる可能性が高い。これは、そのフレームワーク配列が、それからＣＤＲが誘導される親可変フレームワークドメインと高度な配列同一性を示すヒト抗体から、ヒト可変ドメインを入手することにより、達成される。重鎖及び軽鎖可変フレームワーク領域は、同じ又は異なるヒト抗体配列から誘導されることができる。ヒト抗体配列は、天然に生じるヒト抗体の配列、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された配列であることができるか、又は、いくつかのヒト抗体及び／又は生殖系列配列のコンセンサス配列であることができる。
【０２１１】
好適なヒト抗体配列は、ウサギ又はマウス可変領域のアミノ酸配列の、公知のヒト抗体の配列とのコンピュータ比較により同定される。この比較は、重鎖及び軽鎖について個別に行われるが、原理は互いに類似している。
【０２１２】
一例において、抗レナラーゼｍＡｂのアミノ酸配列を使用し、公開された抗体配列データベースからコンパイルされたヒト抗体データベースをクエリーする。重鎖可変領域は、最高の配列同一性を伴うヒト可変領域を見つけるために、使用することができる。軽鎖可変領域は同様に、最高の配列同一性を伴うヒト可変領域を見つけるために、使用することができる。親ｍＡｂドナー由来の重鎖可変領域の一つのＣＤＲをコードしている領域が、ヒト可変領域のＣＤＲの代わりに、選択されたヒト重鎖可変配列へ移行されているＤＮＡ構築体が、各親の可変領域のために調製される。
【０２１３】
ヒト可変フレームワーク領域との親ＣＤＲ領域の非天然の近位は、非天然の高次構造の拘束を生じ、これは、いくつかのアミノ酸残基の置換により補正されないならば、結合親和性の喪失に繋がる。先に注記したように、本発明のヒト化抗体は、実質的にヒト免疫グロブリン由来の可変フレームワーク領域（複数可）及び実質的に親（例えば、ウサギ又はマウス）の免疫グロブリン由来のＣＤＲを含む。親抗体のＣＤＲ及び適切なヒトアクセプター免疫グロブリン配列を同定し、次工程は、もしあれば、これらの成分に由来するどの残基が、生じるヒト化抗体の特性を最適化するために、置換されるべきかを決定することである。概して、ヒトアミノ酸残基の親との置換は、最小化されるべきであり、その理由は親残基の導入は、ヒトにおいて免疫応答を誘起する抗体のリスクを増大するからである。アミノ酸は、ＣＤＲ高次構造及び／又はパートナー分子に結合する標的への結合に対するそれらの可能性のある影響を基にした置換のために、選択される。そのような可能性のある影響の研究は、モデリング、特定の位置でのアミノ酸の特徴の試験、又は特定のアミノ酸の置換又は変異誘発の作用の経験に基づいた観察により、行うことができる。経験に基づく方法に関して、望ましい活性、結合親和性又は特異性をスクリーニングすることができる、バリアント配列のライブラリーを作製することは、特に都合が良いことが認められている。そのようなバリアントのライブラリーを作製する一つのフォーマットは、ファージディスプレイベクターである。あるいは、バリアントは、可変ドメイン内の標的化された残基をコードしている核酸配列の変動のために他の方法を用いて、作製することができる。
【０２１４】
更なる置換が必要であるかどうか、及び置換のためのアミノ酸残基の選択を決定する別の方法は、コンピュータモデリングを使用し、達成することができる。免疫グロブリン分子の三次元画像を作製するためのコンピュータのハードウェア及びソフトウェアは、広範に利用可能である。概して、分子モデルは、免疫グロブリン鎖又はそのドメインの溶解された構造から出発して、作製される。モデリングされるべき鎖は、溶解された三次元構造の鎖又はドメインと、アミノ酸配列類似性について比較され、且つ最大配列類似性を示すこれらの鎖又はドメインは、分子モデル構築の出発点として選択される。溶解された出発構造は、モデリングされる免疫グロブリン鎖又はドメイン中の実際のアミノ酸と出発構造中のアミノ酸の間の差異を可能にするように、修飾される。次に修飾された構造は、複合免疫グロブリンへ集成される。最後に、このモデルは、エネルギー最小化により、並びに全ての原子は、互いに適切な距離内にあること及び結合の長さと角度は化学的に許容し得る限界内であることの証明により、洗練される。
【０２１５】
一般にヒト化抗体中のＣＤＲ領域は、実質的に同一であり、より一般には、それからそれらが誘導される親抗体中の対応するＣＤＲ領域と同一である。通常は望ましくないが、時には、生じるヒト化免疫グロブリンの結合親和性にかなりの影響を及ぼすことなく、ＣＤＲ残基の１又は複数の保存的アミノ酸置換を行うことは可能である。場合によっては、ＣＤＲ領域の置換は、結合親和性を増強することができる。
【０２１６】
先に考察した特異的アミノ酸置換以外に、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域は、それらが誘導されるヒト抗体のフレームワーク領域と、普通には実質的に同一、より普通には同一である。当然、フレームワーク領域中のアミノ酸の多くは、抗体の特異性又は親和性にほとんど又は全く直接的には寄与しない。従って、フレームワーク残基の多くの個々の保存的置換は、生じるヒト化免疫グロブリンの特異性又は親和性のかなりの変化を伴わずに、忍容することができる。
【０２１７】
暗号縮重のために、様々な核酸配列が、各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードするであろう。所望の核酸配列は、固相ＤＮＡ合成によるか又は所望のポリヌクレオチドのより早く調製されたバリアントのＰＣＲ変異誘発により、生成され得る。本出願に説明される抗体をコードする全ての核酸は、明確に本発明に含まれる。
【０２１８】
先に説明したように産生されたヒト化抗体の可変セグメントは、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分に連結される。この抗体は、軽鎖及び重鎖定常領域の両方を含むであろう。重鎖定常領域は通常、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含み、時にはＣＨ４ドメインを含む。
【０２１９】
このヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意の抗体クラス、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のサブクラス（アイソタイプ）由来の、任意の型の定常ドメインを含んでよい。ヒト化された抗体が細胞毒性を示すことが望ましい場合は、定常ドメインは通常、補体−固定する定常ドメインであり、そのクラスは典型的にはＩｇＧ１である。そのような細胞毒性が望ましくない場合は、定常ドメインは、ＩｇＧ２クラスのものであってよい。ヒト化抗体は、２つ以上のクラス又はアイソタイプからの配列を含んでよい。
【０２２０】
任意に定常領域に連結された、ヒト化された軽鎖及び重鎖可変領域をコードしている核酸は、発現ベクターへ挿入される。軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにおいて、クローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（複数可）中の制御配列に、機能的に連結される。そのような制御配列は、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結配列を含む(Queenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86、10029 (1989)；WO 90/07861；Coら、J. Immunol. 148、1149 (1992)を参照し、これらは全ての目的に関してそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている)。
【０２２１】
レナラーゼ結合分子の使用方法
本発明のレナラーゼ結合分子（例えば抗体など）の特性を考慮し、レナラーゼ結合分子は、ヒト及び動物におけるレナラーゼ−関連状態を診断、治療又は予防するための、診断薬、治療薬及び予防薬として適している。
【０２２２】
概して、利用は、本発明の１又は複数のモノクローナル抗体又は結合断片の治療的又は予防的有効量を、易罹患性対象、又はレナラーゼ活性が腫瘍成長及び転移などの病的後遺症を有することが分かっている状態を示す対象へ投与することを含む。抗体Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を含む、レナラーゼ結合分子の活性形を、投与することができる。
【０２２３】
好ましくは、使用されるレナラーゼ結合分子は、レシピエント種と適合性があり、その結果レナラーゼ結合分子に対する免疫応答は、許容し難いほど短い循環半減期を生じないか、又は対象においてレナラーゼ結合分子に対する免疫応答を誘導する。好ましくは、投与されるレナラーゼ結合分子は、対象のＦｃ受容体への結合及びＡＤＣＣ機序の活性化などの、いくつかの二次機能を発揮する。
【０２２４】
個体の治療は、本発明のレナラーゼ結合分子の治療的有効量の投与を含んでよい。このレナラーゼ結合分子は、以下に説明するようなキットで提供され得る。レナラーゼ結合分子は、例えば、同量の混合物として使用又は投与されるか、又は個別に順番で提供されるかもしくは全て一度に投与され得る。レナラーゼ結合分子を患者へ提供する際に、投与される薬剤の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態、既往歴などの因子に応じて変動するであろう。
【０２２５】
概して、レナラーゼ結合分子の全身性投与量を投与する場合、約１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ〜５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（レシピエント体重）の範囲である、レナラーゼ結合分子の用量をレシピエントへ提供することが望ましいが、より少ない又はより多い用量が投与されてよい。約１．０ｍｇ／ｋｇと少ない用量は、若干の有効性を示すことが予想される。好ましくは、約５ｍｇ／ｋｇが、許容し得る用量であるが、最大約５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルも、特に治療上の使用について好ましい。あるいは、１μｇ〜１００μｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、又は１ｇ〜１００ｇの範囲の量など、レナラーゼ結合分子の特定量の投与が、患者の体重を基にせずに与えられてよい。例えば、部位特異的投与は、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、経膣、経直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、眼内又は経真皮手段など、体のコンパートメント又は洞へであることができる。
【０２２６】
レナラーゼ結合分子組成物は、特に液体の溶液もしくは懸濁液の形状での非経口（皮下、筋肉内又は静脈内）又は任意の他の投与での使用のため；非限定的にクリーム及び坐薬などの、特に半固形での、経膣又は経直腸投与での使用のため；非限定的に錠剤又はカプセル剤の形状などでの、口腔内、又は舌下投与のため；あるいは、非限定的に散剤、点鼻液又は噴霧剤又は特定の薬剤などでの、鼻腔内；あるいは、非限定的に点眼薬など眼内へ；あるいは、歯科疾患の治療のため；あるいは、皮膚構造を修飾するか又は経真皮貼付剤中の薬物濃度を増加するかのいずれかの、ジメチルスルホキシドなどの化学エンハンサーと共に、又は皮膚へのタンパク質及びペプチド含有製剤の塗布を可能にする酸化剤(WO 98/53847)と共に、あるいは電気穿孔法などの一過性輸送経路を作製するために電界の印加、又はイオン導入法などの皮膚を通る帯電した薬物の移動を増大するためか、もしくはソノフォレーシス(米国特許第4,309,989号及び第4,767,402号)など超音波の適用によるかで、非限定的にゲル、軟膏、ローション、懸濁液又は貼付剤送達システムなどで、経真皮に：調製することができる。
【０２２７】
類似のアプローチにおいて、本発明のレナラーゼ結合分子の別の治療上の使用は、本モノクローナル抗体の一つに対して生じた抗イディオタイプの抗体を使用する、患者の能動免疫化である。エピトープの構造を模倣する抗イディオタイプによる免疫化は、能動的抗レナラーゼ反応を誘起することができる(Linthicum、D. S及びFarid、N. R.、Anti-idiotypes、Receptors、and Molecular Mimicry (1988)、pp 1-5及び285-300)。
【０２２８】
本発明のレナラーゼ結合分子は、医薬として有用な組成物を調製するために、公知の方法に従い製剤化されることができ、これによりこれらの材料、又はそれらの機能性誘導体は、医薬として許容し得る担体ビヒクルと混合され、組み合わせられる。他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンなどを含む、好適なビヒクル及びそれらの製剤は、例えば、「レミントン薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」(第16版、Osol, A.編集、Mack Easton Pa. (1980))に説明されている。有効投与に適した医薬として許容し得る組成物を形成するために、そのような組成物は、先に説明した化合物の有効量を、適量の担体ビヒクルと一緒に含む。追加の調剤方法は、作用期間を制御するために、利用されてよい。制御放出調製品は、その化合物を複合又は吸収するポリマーの使用を通じて達成されてよい。制御放出調製品による作用持続期間を制御する別の可能性のある方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）又はエチレン酢酸ビニルコポリマーなどの、高分子材料の粒子への、本発明の化合物の混入による。あるいは、これらの物質の高分子粒子への混入の代わりに、これらの物質を、例えば界面重合で、調製されたマイクロカプセル内に、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）−マイクロカプセル内に、又は、コロイド状薬物送達システム、例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル中もしくはマクロエマルション中に、捕獲することが可能である。
【０２２９】
この治療は、単回投与量スケジュールで、又は好ましくは、治療の最初のコースは、１〜１０回の個別の投与量で、それに続き別の投与量が、その反応を維持するか又は強化するのに必要な後続の時間間隔で、例えば、第二の投与量が１〜４ヶ月、及び必要ならば、その後数ヶ月の後続の投与量（複数可）などで与えられる、反復投与量スケジュールで与えられてよい。好適な治療スケジュールの例は、以下を含む：（ｉ）０、１ヶ月及び６ヶ月、（ｉｉ）０、７日及び１ヶ月、（ｉｉｉ）０及び１ヶ月、（ｉｖ）０及び６ヶ月、又は疾患症状を軽減するか、もしくは疾患重症度を減少することが予想される、所望の反応を誘起するのに十分な、他のスケジュール。
【０２３０】
本発明はまた、本発明を実行するために有用なキットも提供する。本キットは、先に説明した抗体を含むか又はこれと関連して包装した、第一の容器を含む。このキットはまた、本発明を実行するのに必要であるか又はそれを簡便にする関連した溶液を含むか又は包装した、別の容器を含んでよい。これらの容器は、ガラス、プラスチック又は箔で製造されることができ、且つバイアル、ボトル、パウチ、チューブ、バッグなどであることができる。このキットはまた、本発明を実行する手順、又は第一の容器手段に含まれる試薬の量などの分析情報などの書面の情報を含むこともできる。この容器は、書面の情報と共に、別の容器器具内、例えば、箱又はバッグ内であってよい。
【０２３１】
更に別の本発明の態様は、生物学的試料中のレナラーゼを検出するためのキットである。このキットは、レナラーゼのエピトープに結合する１又は複数のレナラーゼ結合分子を保持する容器、並びに複合体を形成するためのレナラーゼへの結合を目的としてレナラーゼ結合分子を使用すること、及び複合体の形成を検出し、複合体の存在又は非存在は、試料中のレナラーゼの存在又は非存在に相関することに関する説明書を含む。容器の例は、複数の試料中のレナラーゼの同時検出を可能にする、マルチウェルプレートを含む。
【０２３２】
組合せ療法
本発明のレナラーゼ結合分子組成物は、疾患又は障害を治療するために、別の治療的処置又は薬剤と組合せて使用することができる。例えば、本発明のレナラーゼ結合分子は、単独で、又は1又は複数の治療的に有効な薬剤又は処置と組合せて投与されてよい。他の治療的に有効な薬剤は、本発明のレナラーゼ結合分子にコンジュゲートされるか、本発明のレナラーゼ結合分子と同じ組成物へ混入されるか、又は個別の組成物として投与されてよい。他の治療的薬剤又は処置は、本発明の抗体又は関連化合物の投与前、投与時及び／又は投与後に投与されてよい。
【０２３３】
いくつかの実施態様において、本発明のレナラーゼ結合分子は、１又は複数の他の治療的薬剤又は処置と同時投与される。他の実施態様において、本発明のレナラーゼ結合分子は、１又は複数の他の治療的薬剤又は処置の投与とは、独立して投与される。例えば、本発明のレナラーゼ結合分子は、最初に投与され、それに続けて１又は複数の他の治療的薬剤又は処置が投与される。あるいは、１又は複数の他の治療的薬剤が最初に投与され、引き続き本発明のレナラーゼ結合分子が投与される。別の例として、処置（例えば、手術、放射線など）が最初に実行され、引き続き本発明のレナラーゼ結合分子が投与される。
【０２３４】
他の治療的に有効な薬剤／処置は、手術、抗新生物形成物質（化学療法薬及び放射線を含む）、抗血管新生剤、他の標的に対する抗体、小型分子、光力学療法、免疫療法、免疫増強療法、細胞毒性物質、サイトカイン、ケモカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼインヒビター、心保護薬、免疫刺激薬、免疫抑制薬、及び造血細胞の増殖を促進する薬剤を含む。
【０２３５】
一実施態様において、本明細書において使用される「別の治療的薬剤」は、第二の個別の治療的薬剤又は抗癌剤、すなわち、本発明のレナラーゼ結合分子「以外の」治療的薬剤又は抗癌剤である。任意の二次的治療的薬剤は、本発明の組合せ療法において使用することができる。同じく二次的治療的薬剤又は「第二の抗癌剤」は、以下の指針に従い、相加作用、より大きい相加作用及び可能性のある相乗作用を達成する観点で選択されてよい。
【０２３６】
組合せ抗腫瘍療法を実践するために、本発明のレナラーゼ結合分子は、別の、すなわち第二の個別の抗癌剤と組合せて、動物又は患者においてそれらの組合せ抗腫瘍作用を生じるのに有効な様式で、動物又は患者へ投与されるであろう。従ってこれらの薬剤は、腫瘍又は腫瘍血管系内のそれらの組合せた、又は同時の存在、及び腫瘍環境内でそれらの組合せた作用を生じるのに、有効量で及び有効な期間で提供されるであろう。この目標を達成するために、本発明のレナラーゼ結合分子及び第二の個別の抗癌剤は、単独の組成物中、又は異なる投与経路を使用する２つの個別の組成物としてのいずれかで、実質的に同時に、動物へ投与されてよい。
【０２３７】
あるいは、本発明のレナラーゼ結合分子は、例えば数分から数週間までの範囲の間隔で、第二の個別の抗癌剤に先行するか、又はそれに連続することができる。本発明のレナラーゼ結合分子及び第二の個別の抗癌剤が、個別に動物へ適用されるいくつかの実施態様において、著しい期間は、各送達の時点の間に失効することはなく、その結果各薬剤は、依然腫瘍に有利な組合せ作用を発揮することができることは、確実であろう。そのような場合において、互いに約５分以内から約１週間までの、より好ましくは互いに約１２〜７２時間以内の、両方の薬剤と腫瘍の接触が企図され、わずか約１２〜４８時間の遅延時間が、最も好ましい。
【０２３８】
個別の時間指定型の組合せ療法のための第二の治療的薬剤は、本明細書別所に考察されたものを含む、いくつかの判定基準を基に選択されてよい。しかし、投与の前又は連続した、１又は複数の第二の個別の抗癌剤の選択に関する好ましさは、望ましい場合の実質的な同時投与におけるそれらの使用を排除しない。第二の個別の抗癌剤は、本発明の主要治療的薬剤の「前に」投与されるように選択され、且つ増大した及び潜在的に相乗的な作用を達成するようにデザインされた。
【０２３９】
本発明の主要治療的薬剤に「連続して」投与されるように選択され、且つ増大した及び潜在的に相乗的な作用を達成するようにデザインされた第二の個別の抗癌剤は、主要治療的薬剤の作用から恩恵を受ける薬剤を含む。従って、連続投与のための効果的第二の個別の抗癌剤は、転移を阻害する血管新生阻害剤；インビボにおいて悪性細胞からアクセス可能となり始める細胞内結合パートナー分子に特異的な抗体などの、壊死性腫瘍細胞を標的化する薬剤(米国特許第5,019,368号、第4,861,581号及び第5,882,626号、各々具体的に引用により本明細書中に組み込まれている)；化学療法薬；並びに、任意の腫瘍細胞を攻撃する抗腫瘍細胞免疫複合体を含む。
【０２４０】
本発明のレナラーゼ結合分子はまた、癌免疫療法と組合せて投与されることもできる。癌免疫療法は、対象の癌細胞に対する体液性免疫応答、又は対象の癌細胞に対する細胞媒介性免疫反応、又は対象の癌細胞に対する体液性反応と細胞媒介性反応の組合せを誘起するようにデザインされたものであることができる。本発明のレナラーゼ結合分子との組合せにおいて有用な癌免疫療法の非限定的例は、癌ワクチン、ＤＮＡ癌ワクチン、養子細胞療法、養子免疫療法、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法、抗体、免疫増強化合物、サイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２など）、インターフェロン（ＩＦＮ−αなど）、及びチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１インヒビター、ＣＴＬＡ−４インヒビターなど）を含む。
【０２４１】
一部の状況において、治療期間を著しく延長することが望ましいことがあり、ここでは各投与の間に、数日間（２、３、４、５、６又は７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８）、又は更に数ヶ月間（１、２、３、４、５、６、７又は８）が経過する。これは、本発明の主要治療的薬剤などの、一つの治療が、実質的に腫瘍を破壊することが意図され、並びに血管新生阻害剤の投与などの、別の治療が、微小転移又は腫瘍再成長を防止することが意図された状況において、有利であろう。しかし抗血管新生は、創傷治癒を有効にするために、術後の管理期間(careful time)に投与されるべきである。その後血管新生阻害剤は、患者の生存期間にわたり投与されてよい。
【０２４２】
また、本発明のレナラーゼ結合分子又は第二の個別の抗癌剤のいずれかの２種以上の投与が利用されることも想起される。本発明のレナラーゼ結合分子及び第二の個別の抗癌剤は、互換的に、隔日もしくは隔週で投与されてよいか；又は、一連の一つの薬剤は、一連の他方の治療が続くように与えられてよい。任意の事象において、組合せ療法を使用し、腫瘍退縮を達成するために必要とされる全ては、両方の薬剤が、投与時点に関わりなく、抗腫瘍作用を発揮するのに有効な組合せ量で送達されることである。
【０２４３】
化学療法薬は、本発明のレナラーゼインヒビターと組合せて使用することができる。化学療法薬は、増殖している腫瘍細胞を死滅させ、全般的治療により生み出される壊死領域を増強することができる。
【０２４４】
本発明の一態様は、本発明のレナラーゼインヒビターを使用し、癌を治療又は予防する方法を提供する。当業者は、患者における癌の治療又は予防は、非限定的例として、癌細胞を死滅又は破壊させ、並びに癌細胞の増殖又は細胞分裂の速度を遅くすることを含むことを理解するであろう。当業者はまた、癌細胞は、非限定的例として、原発性癌細胞、癌幹細胞、転移性癌細胞であることができることも理解するであろう。以下は、開示された方法及び組成物により治療され得る癌の非限定的例である：急性リンパ芽球；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児；虫垂癌；基底細胞癌；肝外胆管癌；膀胱癌；骨癌；骨肉腫及び悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫、小児；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児；脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、小児；中枢神経系胎児性腫瘍；小脳星状細胞腫；大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫；頭蓋咽頭腫；上衣芽細胞腫；上衣細胞腫；髄芽腫；髄上皮腫；中間分化の松果体実質腫瘍；テント上原始神経外胚葉性腫瘍及び松果体芽細胞腫；視覚伝導路及び視床下部の神経膠腫；脳及び脊髄腫瘍；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；カルチノイド腫瘍、胃腸管；中枢神経系非定型奇形様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胎児性腫瘍；中枢神経系リンパ腫；小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫、小児；子宮頸癌；脊索腫、小児；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖症候群；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞性リンパ腫；食道癌；ユーイング肉腫ファミリー腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼癌、眼内黒色腫；眼癌、網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃（胃腸）癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍(GIST)；胚細胞腫瘍、頭蓋外；胚細胞腫瘍、性腺外；胚細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛腫瘍；神経膠腫；神経膠腫、小児脳幹；神経膠腫、小児大脳星状細胞腫；神経膠腫、小児視覚伝導及び視床下部；ヘアリーセル白血病；頭頸部癌；肝細胞(肝臓)癌；ランゲルハンス細胞組織球症；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部及び視覚伝導神経膠腫；眼内黒色腫；島細胞腫；腎臓(腎細胞)癌；ランゲルハンス細胞組織球増加症；喉頭癌；白血病、急性リンパ芽球性；白血病、急性骨髄性；白血病、慢性リンパ球性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇及び口腔癌；肝臓癌；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ腫、AIDS-関連；リンパ腫、バーキット；リンパ腫、皮膚T-細胞性；リンパ腫、ホジキン；リンパ腫、非ホジキン；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ヴァルデンステローム；骨の悪性線維性組織球種及び骨肉腫；髄芽腫；メラノーマ；メラノーマ、眼球内(眼)；メルケル細胞癌；中皮腫；原発不明の転移性扁平頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腺腫症候群、(小児)；多発性骨髄腫/形質細胞腫；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成/骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、成人急性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖症候群、慢性；鼻腔及び副鼻腔癌；鼻咽腔癌；神経芽細胞腫；非-小細胞肺癌；口内癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性潜在的腫瘍；膵臓癌；膵臓癌、島細胞腫；乳頭腫症；副甲状腺癌；陰茎癌；咽頭癌；クロム親和細胞腫；傍神経節腫；中間分化の松果体実質腫瘍；松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍；下垂体腫瘍；形質細胞腫/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺癌；直腸癌；腎細胞(腎臓)癌；腎盂及び尿管、移行上皮癌；15番染色体上のNUT遺伝子が関与する気道癌腫；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫、軟組織；肉腫、子宮；セザリー症候群；皮膚癌(非メラノーマ)；皮膚癌(メラノーマ)；皮膚癌腫、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織の肉腫；扁平上皮癌、原発不明の扁平頸部癌、転移性；胃腸（胃）癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T-細胞リンパ腫、皮膚；精巣癌；咽喉癌；胸腺腫及び胸腺癌腫；甲状腺癌；腎盂及び尿管の移行上皮癌；トロホブラスト腫瘍、妊娠性；尿道癌；子宮癌、子宮内膜；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンストレームマクログロブリン血症；並びに、ウィルムス腫瘍。
【０２４５】
一実施態様において、本発明は、手術、化学療法、化学療法薬、放射線治療、もしくはホルモン療法又はそれらの組合せなどの、癌の補完療法により、本発明のレナラーゼ結合分子の投与の前に、同時に又は連続して対象を治療することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【０２４６】
化学療法薬としては、細胞毒性物質（例えば、５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、オキソルビシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シタラビンＵＳＰ、シクロホスファミド、エストラムチンリン酸ナトリウム、アルトレタミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シクロホスファミド、ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、インターフェロンα−２ａ組換え品、パクリタキセル、テニポシド、及びストレプトゾシン）、細胞毒性アルキル化剤（例えば、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、又はスルホン酸エチル）、アルキル化剤（例えば、アサリー(asaley)、ＡＺＱ、ＢＣＮＵ、ブスルファン、ビスルファン、カルボキシフタラト白金、ＣＢＤＣＡ、ＣＣＮＵ、ＣＨＩＰ、クロラムブシル、クロロゾトシン、シスプラチン、クロメソン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクロジソン、シクロホスファミド、ジアンヒドラガラクチトール、フルオロドパン、ヘプスルファム、ヒカントン、イホスファミド、メルファラン、メチルＣＣＮＵ、マイトマイシンＣ、ミトゾラミド、ナイトロジェンマスタード、ＰＣＮＵ、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、ストレプトゾトシン、テロキシロン、テトラプラチン、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシルナイトロジェンマスタード、及びＹｏｓｈｉ−８６４）、抗有糸分裂薬（例えば、アロコルヒチン、ハリコンドリンＭ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、マイタンシン、リゾキシン、パクリタキセル誘導体、パクリタキセル、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ビンブラスチン硫酸塩、及びビンクリスチン硫酸塩）、植物アルカロイド（例えば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、イダルビシン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ミトラマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、ＶＰ−１６−２１３、ＶＭ−２６、ナベルビン及びタキソテレ）、生物製剤（例えば、αインターフェロン、ＢＣＧ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びインターロイキン−２）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、カンプトテシン誘導体、及びモルホリノドキソルビシン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、ミトキサントロン、アモナフィド、ｍ−ＡＭＳＡ、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣｌ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、メノガリル、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン、オキサスラゾール(oxanthrazole)、ルビダゾン、ＶＭ−２６及びＶＰ−１６）、並びに合成品（例えば、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ｏ，ｐ’−ＤＤＤ、ダカルバジン、ＣＣＮＵ、ＢＣＮＵ、シス−ジアンミンジクロロ白金、ミトキサントロン、ＣＢＤＣＡ、レバミソール、ヘキサメチルメラミン、オールトランス型レチノイン酸、グリアデル及びポルフィマーナトリウム）が挙げられる。
【０２４７】
抗増殖剤は、細胞の増殖を減少する化合物である。抗増殖剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗薬、酵素、生物反応修飾因子、混合型(miscellaneous)薬剤、ホルモン及びアンタゴニスト、アンドロゲン阻害剤（例えば、フルタミド及びロイプロリド酢酸塩）、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェンクエン酸塩及びそのアナログ、トレミフェン、ドロロキシフェン及びロロキシフェン）が挙げられる。具体的抗増殖剤の追加例としては、レバミソール、硝酸ガリウム、グラニセトロン、サルグラモスチムストロンチウム−８９クロリド、フィルグラスチム、ピロカルピン、デキスラゾキサン、及びオンダンセトロンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２４８】
本発明のレナラーゼ結合分子は、単独で、又は細胞毒性／抗新生物形成性薬剤及び血管新生阻害剤を含む、他の抗腫瘍剤と組合せて投与することができる。細胞毒性／抗新生物形成性薬剤は、癌細胞を攻撃し且つ死滅させる薬剤として定義される。一部の細胞毒性／抗新生物形成性薬剤は、腫瘍細胞中の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、及びダカバジンがある。他の細胞毒性／抗新生物形成性薬剤は、腫瘍細胞の代謝拮抗薬、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキセート、メルカプトプリン、アザチオプリム、及びプロカルバジンがある。他の細胞毒性／抗新生物形成性薬剤は、抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトマイシンＣ、及びダウノマイシンがある。これらの化合物に関して、市販されている多くのリポソーム製剤が存在する。更に他の細胞毒性／抗新生物形成性薬剤は、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）がある。これらとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びエトポシドが挙げられる。混合型細胞毒性／抗新生物形成性薬剤としては、タキソール及びその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ−２６、イホスファミド、ミトキサントロン、及びビンデシンが挙げられる。
【０２４９】
血管新生阻害剤は、当業者に周知である。本開示の方法及び組成物において使用するのに好適な血管新生阻害剤は、ヒト化抗体及びキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の公知の血管新生のインヒビターとしては、アンギオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（α及びβを含む）、インターロイキン１２、レチノイン酸、並びにメタロプロテイナーゼ−１及び−２（ＴＩＭＰ−１及び−２）組織阻害因子が挙げられる。抗血管新生活性を伴う、ラゾキサン、トポイソメラーゼＩＩインヒビターなどの、トポイソメラーゼを含む小型分子も、使用することができる。
【０２５０】
開示された化合物と組合せて使用することができる他の抗癌剤は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシラート；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクォン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；ドロモスタノロンプロピオン酸塩；デュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミツルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロキシウリジン；フルダラビンリン酸塩；フルオロウラシル；フルオロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキンＩＩ（組換え型インターロイキンＩＩ、又はｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；マイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲステロール酢酸塩；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；アルブミン-結合型パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシ��；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフル；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；トレストロン酢酸塩；トリシリビンリン酸塩；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシネート硫酸塩；ビンロイロシン硫酸塩；ビノレルビン；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩。他の抗癌剤は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗背側化形態形成タンパク質−１；抗男性ホルモン物質、前立腺癌；抗エストロゲン剤；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィディコリン；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節因子；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；β−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦインヒビター；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリア痘ＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来インヒビター；カルゼレシン；カゼインキナーゼインヒビター（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；塩素；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェンアナログ；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチンアナログ；コナゲニン；クラムベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；キュラシンＡ；シクロペンタンセラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクフォスフェート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロダイデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクォン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；９−ジヒドロタキソール；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメネ；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチンアナログ；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドリン酸塩；エクセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルニシン塩酸塩；ホルフェニメクス；ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼインヒビター；ゲムシタビン；グルタチオンインヒビター；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫賦活性ペプチド；インスリン様増殖因子１受容体インヒビター；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；４−イポメアノール；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトールスタチン；レトロゾール；白血病阻止因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン；レバミソール；リアロゾール；線状ポリアミンアナログ；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；細胞溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシンインヒビター；マトリクスメタロプロテイナーゼインヒビター；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦインヒビター；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾ���；ミトラクトール；マイトマイシンアナログ；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子インヒビター；多発性腫瘍抑制因子１−ベース療法；マスタード抗癌剤；マイカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；窒素酸化物の抗酸化剤；ニトルリン；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導薬；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセルアナログ；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニル酢酸塩；ホスファターゼインヒビター；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子インヒビター；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニソン；プロピルビスアクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソームインヒビター；プロテインＡ−ベース免疫変調成分；プロテインキナーゼＣインヒビター；プロテインキナーゼＣインヒビター、微細藻類；タンパク質チロシンホスファターゼインヒビター；プリンヌクレオシドホスホリラーゼインヒビター；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質転移酵素インヒビター；ｒａｓインヒビター
；ｒａｓ−ＧＡＰインヒビター；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロン酸；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣体；セムスチン；老化由来インヒビター１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達インヒビター；シグナル伝達モジュレーター；単鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプタートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクアラミン；幹細胞インヒビター；幹細胞分裂インヒビター；スチピアミド；ストロメライシンインヒビター；スルフィノシン；超活性血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフル；テルラピリリウム；テロメラーゼインヒビター；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプルプリン；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣインヒビター；ウベニメクス；尿生殖洞−由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクターシステム、赤血球遺伝子治療；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；イミリムマブ(imilimumab)；ミルタザピン；ＢｒＵＯＧ  ２７８；ＢｒＵＯＧ  ２９２；ＲＡＤ０００１；ＣＴ−０１１；フォルフィリノックス；ティピファルニブ；Ｒ１１５７７７；ＬＤＥ２２５；カルシトリオール；ＡＺＤ６２４４；ＡＭＧ６５５；ＡＭＧ４７９；ＢＫＭ１２０；ｍＦＯＬＦＯＸ６；ＮＣ−６００４；セツキシマブ；ＩＭ−Ｃ２２５；ＬＧＸ８１８；ＭＥＫ１６２；ＢＢＩ６０８；ＭＥＤＩ４７３６；べムラフェニブ；イピリムマブ；イボルマブ(ivolumab)；ニボルマブ；パノビノスタット；レフルノミド；ＣＥＰ−３２４９６；アレムツズマブ；ベバシズマブ；オファツムマブ；パニツムマブ；ペムブロリズマブ；リツキシマブ；トラスツズマブ；ＳＴＡＴ３インヒビター（例えば、ＳＴＡ−２１、ＬＬＬ−３、ＬＬＬ１２、ＸＺＨ−５、Ｓ３１−２０１、ＳＦ−１０６６、ＳＦ−１０８７、ＳＴＸ−０１１９、クリプトタンシノン、クルクミン、ジフェルロイルメタン、ＦＬＬＬ１１、ＦＬＬＬ１２、ＦＬＬＬ３２、ＦＬＬＬ６２、Ｃ３、Ｃ３０、Ｃ１８８、Ｃ１８���−９、ＬＹ５、ＯＰＢ−３１１２１、ピリメタミン、ＯＰＢ−５１６０２、ＡＺＤ９１５０など）；低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）インヒビター（例えば、ＬＷ６、ジゴキシン、ローレンジテルペノール(laurenditerpenol)、ＰＸ−４７８、ＲＸ−００４７、ビテキシン、ＫＣ７Ｆ２、ＹＣ−１など）並びにジノスタチンスチマラマー。一実施態様において、抗癌剤は、５−フルオロウラシル、タキソール、又はロイコボリンである。
【０２５１】
診断方法
一部の実施態様において、比較物と比較した、対象の細胞、組織、又は体液中の、レナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルの変化（例えば増加）が、疾患又は障害の診断、疾患又は障害の重症度の評価、並びに疾患又は障害の治療の作用又は有効性のモニタリングのための、マーカーとして、本発明の方法において使用される。様々な実施態様において、疾患又は障害は、急性腎不全（すなわち、急性尿細管壊死、又はＡＴＮ、腎臓の虚血状態）、心血管疾患又は障害（例えば、高血圧、肺高血圧症、収縮期高血圧、糖尿病性高血圧、無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律異常、アテローム性動脈硬化症など）、癌、心疾患又は障害、腎疾患又は障害、消化管疾患又は障害、肝疾患又は障害、肺疾患又は障害、膵疾患又は障害（例えば膵炎）、精神疾患又は障害（例えば、うつ病、不安症など）、又は神経系疾患又は障害である。
【０２５２】
一実施態様において、本発明は、対象の生物学的試料中のレナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルを評価することにより、対象の疾患又は障害を診断する方法である。一実施態様において、対象の生物学的試料は、細胞、組織、又は体液である。レナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルが評価され得る体液の非限定的例は、血液、血清、血漿及び尿を含むが、これらに限定されるものではない。様々な実施態様において、対象の生物学的試料中の、レナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルは、比較物中のレナラーゼ、又はレナラーゼ断片レベルと比較される。比較物の非限定的例は、陰性対照、陽性対照、対象の予想される正常バックグラウンド値、対象の過去の正常バックグラウンド値、対象がその一員である集団の予想される正常バックグラウンド値、又は対象がその一員である集団の過去の正常バックグラウンド値を含むが、これらに限定されるものではない。様々な実施態様において、本疾患又は障害は、急性腎不全（すなわち、急性尿細管壊死、又はＡＴＮ、腎臓虚血状態）、心血管疾患又は障害（例えば、高血圧、肺高血圧症、収縮期高血圧、糖尿病性高血圧、無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律異常、アテローム性動脈硬化症など）、癌、心疾患又は障害、腎疾患又は障害、消化管疾患又は障害、肝疾患又は障害、肺疾患又は障害、膵疾患又は障害（例えば膵炎）、精神疾患又は障害（例えば、うつ病、不安症など）、又は神経系疾患又は障害である。一部の実施態様において、診断方法は、診断される疾患又は障害に関する患者の治療の更なる工程を含む。
【０２５３】
別の実施態様において、本発明は、対象の生物学的試料中のレナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルを評価することによる、対象の疾患又は障害の重症度を評価する方法である。一実施態様において、対象の生物学的試料は、細胞、組織、又は体液である。レナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルが評価され得る体液の非限定的例は、血液、血清、血漿及び尿を含むが、これらに限定されるものではない。様々な実施態様において、対象の生物学的試料中の、レナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルは、比較物中のレナラーゼ、又はレナラーゼ断片レベルと比較される。比較物の非限定的例は、陰性対照、陽性対照、対象の予想される正常バックグラウンド値、対象の過去の正常バックグラウンド値、対象がその一員である集団の予想される正常バックグラウンド値、又は対象がその一員である集団の過去の正常バックグラウンド値を含むが、これらに限定されるものではない。様々な実施態様において、本疾患又は障害は、急性腎不全（すなわち、急性尿細管壊死、又はＡＴＮ、腎臓虚血状態）、心血管疾患又は障害（例えば、高血圧、肺高血圧症、収縮期高血圧、糖尿病性高血圧、無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律異常、アテローム性動脈硬化症など）、癌、心疾患又は障害、腎疾患又は障害、消化管疾患又は障害、肝疾患又は障害、肺疾患又は障害、膵疾患又は障害（例えば膵炎）、精神疾患又は障害（例えば、うつ病、不安症など）、又は神経系疾患又は障害である。一部の実施態様において、重症度の評価方法は、その疾患又は障害に関する患者の治療の更なる工程を含む。
【０２５４】
別の実施態様において、本発明は、対象の生物学的試料中のレナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルを評価することによる、対象の疾患又は障害の治療の作用をモニタリングする方法である。一実施態様において、対象の生物学的試料は、細胞、組織、又は体液である。レナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルが評価され得る体液の非限定的例は、血液、血清、血漿及び尿を含むが、これらに限定されるものではない。様々な実施態様において、対象の生物学的試料中の、レナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルは、比較物中のレナラーゼ、又はレナラーゼ断片レベルと比較される。比較物の非限定的例は、陰性対照、陽性対照、対象の予想される正常バックグラウンド値、対象の過去の正常バックグラウンド値、対象がその一員である集団の予想される正常バックグラウンド値、又は対象がその一員である集団の過去の正常バックグラウンド値を含むが、これらに限定されるものではない。様々な実施態様において、本疾患又は障害は、急性腎不全（すなわち、急性尿細管壊死、又はＡＴＮ、腎臓虚血状態）、心血管疾患又は障害（例えば、高血圧、肺高血圧症、収縮期高血圧、糖尿病性高血圧、無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律異常、アテローム性動脈硬化症など）、癌、心疾患又は障害、腎疾患又は障害、消化管疾患又は障害、肝疾患又は障害、肺疾患又は障害、膵疾患又は障害（例えば膵炎）、精神疾患又は障害（例えば、うつ病、不安症など）、又は神経系疾患又は障害である。一部の実施態様において、治療の作用をモニタリングする方法は、その疾患又は障害に関する患者の治療の更なる工程を含む。
【０２５５】
様々な実施態様において、対象は、ヒト対象であり、且つ任意の人種、性別及び年齢であってよい。代表的対象は、疾患又は障害を経験していることが疑われるもの、疾患又は障害を経験していると診断されたもの、疾患又は障害を有すると診断されたもの、並びに疾患又は障害を発症するリスクがあるものを含む。
【０２５６】
本明細書に開示された本発明の方法から得られた情報は、単独で、又は対象からのもしくは対象から得られた生物学的試料からの他の情報（例えば、病態、病歴、生命徴候、血液化学など）と組合せて使用することができる。
【０２５７】
本発明の診断方法において、対象から得られた生物学的試料は、それらに含まれたレナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルについて評価される。一実施態様において、生物学的試料は、本明細書記載の方法において有用な少なくともレナラーゼポリペプチドの断片を含有する試料である。
【０２５８】
本発明の方法のその他の様々な実施態様において、レナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルが、比較物の対照と比較した場合に、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、又は少なくとも１０００％だけ増加した場合に、レナラーゼのレベルは増加したと決定される。様々な実施態様において、レナラーゼ、又はレナラーゼ断片の増加したレベルは、疾患又は障害の指標である。様々な実施態様において、この疾患又は障害は、急性腎不全（すなわち、急性尿細管壊死、又はＡＴＮ、腎臓虚血状態）、心血管疾患、膵炎、肝炎、腎臓の炎症障害、及び癌である。
【０２５９】
本発明の方法において、対象由来の生物学的試料は、患者から得られた生物学的試料中の、レナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルについて評価される。生物学的試料中のレナラーゼ、又はレナラーゼ断片のレベルは、生物学的試料中のレナラーゼポリペプチド又は断片の量、生物学的試料中のレナラーゼｍＲＮＡ又は断片の量、生物学的試料中のレナラーゼ活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）の量、又はそれらの組合せを評価することにより、決定することができる。一部の実施態様において、生物学的試料中のレナラーゼのレベルは、本明細書別所に記載された本発明のレナラーゼ結合分子の少なくとも一つを使用するアッセイにおいて決定される。
【０２６０】
本発明の方法の様々な実施態様において、患者から得られた生物学的試料のレナラーゼレベルを測定する方法は、イムノクロマトグラフィーアッセイ、イムノブロットアッセイ、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、質量分析アッセイ、放射免疫測定（ＲＩＡ）、放射免疫拡散アッセイ、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析アッセイ、オクタロニー免疫拡散アッセイ、逆相タンパク質マイクロアレイ、ロケット免疫電気泳動アッセイ、免疫組織染色アッセイ、免疫沈降アッセイ、補体結合アッセイ、ＦＡＣＳ、酵素−基質結合アッセイ、酵素アッセイ、発色団、発蛍光団、もしくは放射性基質などの検出可能な分子を利用する酵素アッセイ、そのような基質を利用する基質結合アッセイ、そのような基質を利用する基質置換アッセイ、並びにタンパク質チップアッセイを含むが、これらに限定されるものではない(同じく、2007、Van Emon、Immunoassay and Other Bioanalytical Techniques、CRC Press；2005、Wild、Immunoassay Handbook、Gulf Professional Publishing；1996、Diamandis及びChristopoulos、Immunoassay、Academic Press；2005、Joos、Microarrays in Clinical Diagnosis、Humana Press；2005、Hamdan及びRighetti、Proteomics Today、John Wiley and Sons; 2007も参照)。一部の実施態様において、生物学的試料中のレナラーゼのレベルは、本明細書別所に記載されている本発明のレナラーゼ結合分子の少なくとも一つを使用するアッセイにより、測定される。
【０２６１】
キット
本発明はまた、本発明のレナラーゼ結合分子（例えば抗体など）、又はそれらの組合せ、並びに例えば本明細書別所に説明されたような治療的処置又は非治療使用として、個体にレナラーゼ結合分子又はその組合せを投与することを説明する指示書を含むキットも含む。実施態様において、このキットは、例えば本発明のレナラーゼ結合分子の個体への投与前に、本発明のレナラーゼ結合分子又はその組合せを含有する治療的組成物を溶解又は懸濁するのに適している、（好ましくは無菌の）医薬として許容し得る担体を更に含む。任意に、このキットは、レナラーゼ結合分子を投与するためのアプリケーターを含む。
【実施例】
【０２６２】
実験的実施例
本発明はここで、以下の実施例を参照し説明される。これらの実施例は、例証することのみを目的として提供され、且つ本発明は、これらの実施例に限定されるとは少しも解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される内容の結果としての明らかになる任意の及び全ての変動を包含すると解釈されるべきである。
【０２６３】
更なる説明なしに、当業者は、先行する説明及び以下の例証的実施例を用い、本発明の化合物を作製及び利用し、且つ請求された方法を実践することができると考えられる。従って以下の作業実施例は、本発明の好ましい実施態様を具体的に指摘し、且つ本開示の残りの部分を決して限定するものとは解釈されない。
【０２６４】
実施例１：癌治療のための新規組成物及び方法
本明細書記載の結果は、癌を治療する新規組成物及び方法の有用性を裏付けるデータを提供する。
【０２６５】
これらの実験において利用される材料及び方法は、ここで説明される。
【０２６６】
ウサギにおける抗レナラーゼモノクローナル抗体の合成
タンパク質抗原調製：レナラーゼ−１  ｃＤＮＡを、ｐＥＴ２７発現ベクター(Novagen)へサブクローニングし、次にこれを使用し、細菌のＢＬ２１  ＤＥ３株(Novagen)を形質転換した。レナラーゼタンパク質を、標準手順により、細菌の封入体から単離した。簡単に述べると、細菌の封入体を単離し、カオトロピック塩と還元剤の組合せ中に可溶化した。このタンパク質を、この可溶化緩衝液の希釈により、リフォールディングした。可溶化し且つリフォールディングしたタンパク質の、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への最終透析後、このタンパク質を、抗原として用い、ウサギを免疫化した。
【０２６７】
ペプチド抗原調製：免疫化のためのペプチドを、レナラーゼ−１又は２ポリペプチドのいくつかの領域をカバーし、且つ後続のコンジュゲーションにおいて使用するＮ又はＣ−末端システイン残基を含むように設計した。ペプチドを、標準ペプチド合成手順を用いて作製し、システイン残基を介して、スクリーニング目的のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は動物免疫化のためのアジュバントであるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のいずれかに、コンジュゲートした。
【０２６８】
免疫化及び抗体選択：標準手順を使用し、ＫＬＨ−コンジュゲートされたペプチド抗原及び全タンパク質抗原の各々を使用し、複数用量注射プロトコールを使用し、６匹のウサギを免疫化した。各ウサギからの免疫化前及び後の試験用採血(bleeds)を、コートされた抗原としてＢＳＡ−ペプチドコンジュゲート又はリフォールディングした全タンパク質のいずれかによる、標準ＥＬＩＳＡプロトコール（下記プロトコール参照）を使用し、抗レナラーゼ力価について試験した。抗レナラーゼについて最高力価及びウェスタンブロット分析における内因性レナラーゼについての所望の検出特性を有する抗血清を持つウサギを、更なる分析のために選択した。選択した動物を、抗レナラーゼポリクローナル抗体の産生に関する終末期採血において使用するか、又は選択したウサギ脾臓はリンパ球収集の、いずれかにした。標準細胞融合後、各動物由来のハイブリドーマプールを、先に説明した同じペプチド及び全タンパク質ＥＬＩＳＡフォーマットで、条件細胞培養培地を用いて、スクリーニングした。最高抗レナラーゼ力価及び好ましい内因性レナラーゼ結合特徴を伴うハイブリドーマを選択し、サブクローニングした。クローニングしたハイブリドーマを引き続き、増量し、モノクローナル抗体を、条件細胞上清から精製した。
【０２６９】
ハイブリドーマ培養及び増量：ハイブリドーマ細胞を、５５μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充した、ハイブリドーマ−ＳＦＭ無血清培地(Gibco/Invitrogen)において培養した。抗体精製のために、１５ｍＬ培養培地中に浮遊させた１０７ハイブリドーマ細胞を、CELLine 1000バイオリアクターフラスコ(Wilson Wolf)の細胞コンパートメントに適用し、且つ上側コンパートメントを、１Ｌ培養培地で満たした。７日間連続培養した後、細胞コンパートメント内容物（細胞及び分泌された抗体を含む）を除去し、細胞を、１０００ｇで５分間の遠心分離により、ペレット化した。上清を回収し、抗体精製の前に細胞デブリを除去するために、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、濾過した（０．２μＭ）。
【０２７０】
抗体精製：抗レナラーゼモノクローナル抗体のために、予め透明化し馴化したハイブリドーマ上清を、予め平衡化したプロテインＡアフィニティカラム(GE life sciences)上に、ポンプにより定圧で送った。このカラムを、２０カラム容積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）により洗浄した。抗体を、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）中で、カラムから溶離し、トリス緩衝液を用い、直ちに中和した。純粋な抗体を、過剰量ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析し、濾過滅菌し、アリコートで、−８０℃又は４℃のいずれかで貯蔵した。ペプチド−コンジュゲート又は全レナラーゼタンパク質のいずれかの免疫原に対して産生された抗レナラーゼポリクローナル抗体に関して、終末期ウサギ採血血清を、プロテインＡアフィニティカラム上を、最初に通過させた。このプロテインＡカラムからの全精製したＩｇＧプールを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。抗レナラーゼ抗体を更に、プールを、関連ペプチド抗原又は全レナラーゼタンパク質のいずれかとコンジュゲートされたActigel ALDカラム(Sterogene)を通過させることにより精製した(Actigel-抗原コンジュゲーションは、製造業者の説明書に従い、プロトコールを完了した）。このカラムを、ＰＢＳにより洗浄し、結合したＩｇＧを、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）により溶離した。精製したＩｇＧを、トリス緩衝液を用いて中和し、ＰＢＳに対して透析した。
【０２７１】
全般的ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ：組換えレナラーゼタンパク質又はレナラーゼペプチド−ＢＳＡコンジュゲートの１００ｎｇ／ウェルを、９６ウェルマイクロタイタープレートへ、４℃で一晩のインキュベーションにより結合させた。このプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸−緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）中の５％ミルク溶液により、３３℃で１時間ブロックした。レナラーゼ抗体採血を、ＰＢＳ中に希釈し、５０μＬを各ウェルに添加した。３３℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴで３回すすいだ。抗ウサギ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた抗体（Dako、ＰＢＳＴ中０．２５μｇ／ｍＬに希釈した）５０μＬを、各ウェルに添加し、プレートを、３３℃で４５分間インキュベーションした。このプレートを、ＰＢＳＴで３回、及びＰＢＳで１回洗浄した。１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を、各ウェルに添加し、プレートを、室温でおよそ５分間インキュベーションした。この反応を停止するために、２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4の１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを、分光光度計において、４５０ｎｍで測定した。
【０２７２】
全般的サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ：典型的には、リン酸−緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４００ｎｇ／ウェルの捕獲抗体を、９６ウェルマイクロタイタープレートへ、４℃で一晩のインキュベーションにより結合させた。このプレートを、ＰＢＳ中の８％無脂肪ドライミルク（ＮＦＤＭ）の溶液により、３３℃で１時間ブロックした。レナラーゼを含有する試料を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に希釈し、５０μＬを各ウェルに添加した。３３℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴで３回すすいだ。ビオチン化された抗体プローブを、ＰＢＳＴ中で４μｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬを各ウェルに添加した。３３℃で１時間インキュベーションした後、プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄した。検出のために、０．４μｇ／ｍＬに希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲートされた（ＨＲＰ）ニュートラアビジン（ＮＡ−ＨＲＰ）の５０μＬを、各ウェルに添加し、プレートを室温で４５分間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳＴで３回、及びＰＢＳで１回洗浄した。ＨＲＰ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、１００μＬ／ウェルで添加し、プレートを、室温でおよそ５分間インキュベーションした。この反応を停止するために、２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4の１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを、分光光度計において、４５０ｎｍで測定した。
【０２７３】
ウェスタンブロッティング手順：タンパク質試料を、４〜２０％トリス−グリシン勾配ゲル(Invitrogen)上で分解した。タンパク質を、ゲルから、XCell IIブロットモジュール(Invitrogen)を使用し、ポリビニルジフッ化物（ＰＶＤＦ）メンブレンへ移した。ＰＶＤＦメンブレンを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸−緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）中の５％無脂肪粉ミルクの溶液により、室温で１時間ブロックした。その後ブロッキング緩衝液を除去し、メンブレンを、検出抗体と共にインキュベーションし、５％ミルク／ＰＢＳＴの２０ｍＬ中に希釈した。室温で１時間インキュベーションした後、メンブレンを、ＰＢＳＴで各１０分間、３回洗浄した。抗ウサギＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（Dako、５％ミルク／ＰＢＳＴ中０．２５μｇ／ｍＬに希釈）の２０ｍＬを、メンブレンに適用し、更に室温で１時間インキュベーションした。このメンブレンを、ＰＢＳＴで各１０分間、３回洗浄した。過剰なＰＢＳＴを、メンブレンから吸引し、メンブレンの表面を覆うのに十分な増強化学発光（ＥＣＬ）プラス試薬(GE Lifesciences)を適用し、１分間インキュベーションした。その後過剰なＥＣＬプラス試薬を吸引し、メンブレンを、プラスチックフィエルム中に包んだ。タンパク質バンドを、メンブレンのHyperfilm-ECL(GE Lifesciences)への曝露により、可視化し、これは自動フィルム現像装置(Konica)を用いて処理した。
【０２７４】
ペプチド−抗原特異性ＥＬＩＳＡ：ＰＢＳ中に１００ｎｇ／ウェルに希釈した、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−コンジュゲートされたレナラーゼペプチド抗原を、９６ウェルマイクロタイタープレートに、４℃で一晩のインキュベーションにより結合させた。このプレートを、ＰＢＳ中８％ＮＦＤＭの溶液により、３３℃で１時間ブロックした。ペプチド抗原を、それに対して産生された抗体、又は異なる抗原に対して産生された抗体の連続希釈物により、プローブした。抗体の出発濃度は、典型的には５μｇ／ｍＬであり、２倍希釈工程で、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に調製した。３３℃で１時間インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳＴにより３回洗浄した。抗体結合を、５０ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ−コンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧの５０μＬ／ウェルでの添加により、アッセイした。このプレートを、室温で４０分間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳＴで３回、及びＰＢＳで１回洗浄した。ＨＲＰ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、１００μＬ／ウェルで添加し、プレートを、室温でおよそ５分間インキュベーションした。この反応を停止するために、２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4の１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを、分光光度計において、４５０ｎｍで測定した。
【０２７５】
エピトープ結合の特異性：細菌で発現されたレナラーゼアイソフォームを、ＰＢＳ中１００ｎｇ／ウェルに希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートへ、４℃で一晩インキュベーションすることにより、結合させた。プレートを、ＰＢＳ中８％ＮＦＤＭの溶液により、３３℃で１時間ブロックした。レナラーゼタンパク質を、典型的には１μｇ／ｍＬで始まり、異なるビオチン化された抗体と混合した、コンジュゲートされない抗体の連続希釈物により、プローブした。ビオチン化された抗体の濃度は、１２５ｎｇ／ウェルで一定に維持した。両方の抗体を、ＰＢＳＴ中で一緒に混合し、５０μＬ／ウェルの１回添加として適用した。３３℃で１時間インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳＴにより３回すすいだ。ビオチン化された抗体のレナラーゼへの結合を、０．４ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ−コンジュゲートされたニュートラアビジン（ＨＲＰ−ＮＡ）の５０μＬ／ウェルでの添加により、アッセイした。このプレートを、室温で４０分間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートを、ＰＢＳＴで３回、及びＰＢＳで１回洗浄した。ＨＲＰ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、１００μＬ／ウェルで添加し、プレートを、室温でおよそ５分間インキュベーションした。この反応を停止するために、２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4の１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを、分光光度計において、４５０ｎｍで測定した。
【０２７６】
抗体親和性のBiacore測定：結合試験を、Biacore T100を本質的に説明されたように用いて行った(Guo Xら、2016, Scientific Reports, 6:22996)。アッセイは、流動緩衝液として、２５ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを用い、２５℃で完了した。ビオチン化された抗体を、個別のストレプトアビジンセンサーチップフローセルに捕獲し、精製し、組換えレナラーゼ−１を、チップの表面上に注入した。
【０２７７】
ヒト化抗レナラーゼモノクローナル抗体の合成及び特徴決定
ヒト化戦略及びプロトコール：Ｍ２８及びＭ４２由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、標準方法(Nelson B, 2012, Methods in molecular biology, 899:27-41)を用い、ファージミド内のＦａｂ抗体断片フォーマットの４Ｄ５（ハーセプチン）フレームワークにグラフトした。生じるアミノ酸組成物を含む、このＣＤＲグラフティングに使用したオリゴヌクレオチドは、表１に列挙している。加えて、ＨＣ−Ａ７１(Chothiaに従い番号付け(Chothia Cら、1987, Journal of molecular biology, 196(4):901-17))は、Ｋ７１又はＲ７１を、各々、Ｍ２８及びＭ４２へ変更し、親Ｍ２８及びＭ４２  ＣＤＲ−Ｈ２を収容した。オリゴヌクレオチド−方向付けた変異誘発を使用し、親和性成熟ライブラリーＭ２８及びＭ４２バリアントを構築した。個々のＭ２８  ＣＤＲ−Ｌ３、−Ｈ１、−Ｈ２、及び-Ｈ３並びにＭ４２  ＣＤＲ−Ｌ１、−Ｈ１、−Ｈ２、及び−Ｈ３を、個別のライブラリーとして、多様化(diversification)のために標的化した。適用可能なＣＤＲを最初に、表１に列挙したオリゴヌクレオチドを使用し、ＳＴＯＰコドンと置き換え、親和性成熟ライブラリーのためのＳＴＯＰ鋳型を作製した。これらのＳＴＯＰ鋳型を次に、標準プロトコール(Nelson B, 2012, Methods in molecular biology, 899:27-41)を使用し、縮重位置でのヌクレオチド比が、親のヌクレオチドの７０％及び互いのヌクレオチドの１０％に調節される、「ソフトランダム化(soft randomization)」戦略により多様化した、表１に列挙したオリゴヌクレオチドを使用し、親和性成熟ライブラリー（Ｍ２８について４及びＭ４２について４）の作製のために使用した。
【０２７８】
ヒト及びマウスのレナラーゼに対し交差反応し且つファージＥＬＩＳＡに方向付けられたより高い親和性のバリアントの選択を、説明されたように行った(Nelson B、2012, Methods in molecular biology, 899:27-41；Reshetnyak AVら、2013, Proc of Nat Acad of Sci of the USA, 110(44):17832-7)。簡単に延べると、ライブラリーファージプールを、９６−ウェルMaxisorpプレート(Nunc)上にコートされたヒトレナラーゼ（ｈＲＮＬＳ）又はマウスレナラーゼ（ｍＲＮＬＳ）の交互ラウンドを使用する、結合選択の３−５ラウンドでサイクルした。３−５ラウンドの選択後、個々のクローンの特異的結合を、説明されたような、ファージＥＬＩＳＡにより評価した(Reshetnyak AVら、2013, Proc of Nat Acad of Sci of the USA, 110(44):17832-7)。ストレプトアビジン(New England Biolabs)に比べ、ｈＲＮＬＳ及びｍＲＮＬＳ結合に関して少なくとも１０倍大きいシグナルを示したクローンを、ＤＮＡシークエンシングに供し、ファージ−ディスプレイしたＦａｂｓの配列を解読した。
【０２７９】
３つの交差反応性Ｍ２８バリアントを単離し、２つは複数のＣＤＲに対する変化を伴い、これは、ライブラリー構築又は抗体選択時の組換えを指摘している。バリアントＣＤＲは、標準方法を用い、系統的に組合せ、１のバリアントＣＤＲから４バリアントＣＤＲまでの範囲の変化を伴う、２３の独特なバリアントを誘導した。２３のバリアント全ては、溶液中競合ＥＬＩＳＡ(Reshetnyak AVら、, 2013, Proc of Nat Acad of Sci of the USA, 110(44):17832-7)を使用し、順位序列した(rank ordered)。マルチポイントＥＬＩＳＡ、及び細胞−ベースの試験、表面プラズモン共鳴、及びインビボ試験のために、６のバリアントＭ２８−Ｋ２、Ｍ２８−Ｋ５、Ｍ２８−Ｋ９、Ｍ２８−１３、Ｍ２８−１４、及びＭ２８−１９を、マウスＩｇＧ１に対する再編成（ヒトＦｖとのキメラ）のために選択した。
【０２８０】
８の交差反応性Ｍ４２バリアントを単離し、各々は、１つのＣＤＲに対する変化を伴った。マルチポイントＥＬＩＳＡを使用し、２つのＣＤＲ−Ｈ２バリアントと２つのＣＤＲ−Ｈ３バリアントの間で順位序列した。各ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３に関する１つのバリアントを選択し、ＣＤＲを、合計１１のバリアントについて組合せた。これらの１１のバリアントを、溶液中競合ＥＬＩＳＡに供し、順位序列した。３のバリアントＭ４２−Ｋ３１、Ｍ４２−Ｋ３４、及びＭ４２−３５を、マウスＩｇＧ１に対する再編成（ヒトＦｖとのキメラ）のために選択した。
【０２８１】
ＩｇＧ１の転換、発現及び精製：バリアント由来の軽鎖Ｆｖ断片を、５’ＥｃｏＲＩ部位及び３’ＢｓｔＡＰＩ部位を含むようにＰＣＲ増幅し、これをマウスＩｇＧκ軽鎖発現（ヒト−マウスキメラ）への転換のために、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｍｋベクター(InvivoGen)へのクローニングに使用した。バリアント由来の軽鎖Ｆｖ断片を、５’ＥｃｏＲＩ部位及び３’ＢｓｉＷＩ部位を含むようにＰＣＲ増幅し、これをヒトＩｇＧκ軽鎖発現への転換のために、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋベクター(InvivoGen)へのクローニングに使用した。重鎖Ｆｖ断片を、５’ＥｃｏＲＩ部位及び３’ＮｈｅＩ部位を含むようにＰＣＲ増幅し、これをマウスＩｇＧ１重鎖発現（ヒト−マウスキメラ）への転換のためにｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｍＧ１(InvivoGen)への、又はヒトＩｇＧ４重鎖発現への転換のためにｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ４(InvivoGen)への、クローニングに使用した。重鎖及び軽鎖ベクターを、製造業者の指示書に従い、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞(ThermoFisher)へ同時トランスフェクションした。細胞培養物は、５日間インキュベーションし、その後プロテインＡセファロースビーズ(GE Healthcare)を使用し、上清から精製した。
【０２８２】
ここでこれらの実験の結果を、説明する。
【０２８３】
レナラーゼ抗原選択、免疫化及び抗体作製
レナラーゼは、血圧の制御及び維持に関与するとされたＦＡＤ−含有タンパク質である(Xu, J.ら、2005, J Clin Invest, 115(5):1275-80)。高−親和性、高−特異性抗レナラーゼ抗体の不在は、レナラーゼの生物学及び可能性のあるレナラーゼ−関連療法の両方の研究開発を妨げている。今日まで、いくつかのポリクローナル研究用−試薬抗体が開発されているが、これらは低親和性であり、且つ組織又は体液のいずれかの試料中の内因性レナラーゼの堅固な検出に失敗している。従って、レナラーゼの様々なアイソフォームに対し、更にはインタクトなタンパク質内の異なるペプチド配列に対し、特異性を持つレナラーゼ抗体のセットの開発は、レナラーゼ遺伝子産物の明確な検出及び特徴決定を可能にするであろう。更に、高親和性抗体のみの選択は、可能性のある低レベルのレナラーゼの検出を可能にし、結果的にレナラーゼレベルに関するタンパク質−ベースの診断薬の開発に繋がり得る。
【０２８４】
レナラーゼに高親和性及び特異性を持つ種々の抗体を作製するために、２つの方法を利用した。第一の方法において、免疫原として完全長レナラーゼ−１タンパク質を使用し、ポリクローナル抗体が生じた。レナラーゼ−１  ｃＤＮＡを、ｐＥＴ２７発現ベクター(Novagen)へサブクローニングし、次にこれを使用し、細菌ＢＬ２１  ＤＥ３株(Novagen)を形質転換した。レナラーゼタンパク質を、細菌の封入体から、標準手順により単離した。簡単に述べると、細菌の封入体を単離し、カオトロピック塩と還元剤の組合せ中に可溶化した。このタンパク質を、この可溶化緩衝液の希釈により、リフォールディングし、引き続き、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）へ最終透析した。
【０２８５】
免疫原として使用した完全長レナラーゼタンパク質の配列は、図２に認めることができる。このタンパク質を、抗原として使用し、６匹のウサギを免疫化した。これらの動物からの抗血清を、ＥＬＩＳＡアッセイにより、レナラーゼ結合特異性についてスクリーニングし、ここで抗原は、同じリフォールディングされたレナラーゼタンパク質であった。この抗血清はまた、ウェスタンブロットにより、ヒト組織溶解液中の内因性レナラーゼを検出する能力の基準を基に選択した。最高の抗レナラーゼ力価及び最大の内因性レナラーゼに対する特異性を持つ終末期採血抗血清を、抗体精製のために選択した。総ＩｇＧを、抗血清から、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用し精製し、更に特異的抗レナラーゼ抗体を、組換えレナラーゼタンパク質とコンジュゲートされたカラム上で精製した。後者の実施例において認めることができるように、この方式で生じた抗体は、レナラーゼに結合し、更にレナラーゼ上の複数のエピトープに結合することが示されている。
【０２８６】
抗レナラーゼ抗体を生じる第二のアプローチにおいては、ペプチドを、免疫原として使用した。これらのペプチドは、９〜２１個のアミノ酸の範囲で作製され、且つレナラーゼ−１及びレナラーゼ−２タンパク質の領域に対応していた。これらのペプチド全ては、Ｎ又はＣ−末端システイン残基を有した。これらのペプチドの配列は、図１に認めることができ、ここでレナラーゼ−１又は２配列に対応するこれらのペプチドは、図３の配列アラインメントにおいて明らかにされている。認められるように、レナラーゼ−１特異的ペプチドは、１Ａ−Ｆと表示され、且つレナラーゼ−２特異的ペプチドは、３Ａ５と表示される。各ペプチドは、アジュバントＫＬＨへ、システインを介してコンジュゲートし、且つ６匹のウサギを免疫化するために使用した。各動物の抗血清を、関連ペプチド（ＢＳＡ−コンジュゲート）又は完全長レナラーゼ−１もしくは２の両方を使用する、ＥＬＩＳＡアッセイにより、抗レナラーゼ抗体力価についてスクリーニングした。抗血清はまた、ウェスタンブロットにより、組織溶解液中の内因性レナラーゼを検出するそれらの能力についても試験した。これらのスクリーニング基準を使用し、好ましい特徴を持つ抗体を産生する動物を、選択した。一部の実施例において及び一部のペプチドについて、数匹の動物は、必要な特異性を持つ抗体を産生した。これらの場合において、１匹の動物は、ポリクローナル抗体産生について最終抗血清採血を有し、且つ１又は一部の実施例においては、２匹の別の動物を、脾臓リンパ球の採取に使用した。他の実施例において、１匹の動物は、終末期採血及び脾臓摘出を有した。これらのペプチド全てに対して産生されたポリクローナル抗体を、プロテインＧクロマトグラフィーによる、終末期採血由来の総ＩｇＧの精製、引き続きのペプチドアフィニティクロマトグラフィー上の更なる精製により作製した。更に標準手順を使用し、選択した動物の脾臓由来のリンパ球を、ハイブリドーマ作製のために、骨髄腫細胞に融合した。このハイブリドーマ上清を、それに対して生じた両方のペプチドへの結合についてスクリーニングし、補助的に全レナラーゼタンパク質に対してスクリーニングした。選択されたハイブリドーマを、サブクローニングし、抗体精製のために増量した。これらのモノクローナル抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより、条件ハイブリドーマ培養上清から精製した。それについてモノクローナル抗体が生じたペプチドは、図１に認めることができる。
【０２８７】
抗レナラーゼ抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列
モノクローナル抗体１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７及び３Ａ−５−２を、それらのレナラーゼ結合特異性及び高親和性について選択した（以下の節参照）。標準ポリメラーゼ連鎖反応手法及び縮重プライマーセットを使用し、これらの抗体の抗体重鎖及び軽鎖可変領域のｃＤＮＡを、サブクローニングしたハイブリドーマから増幅した。可変領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、図４から図１３に示している。この方式において、好ましい特徴を持つ抗体の組成が、例証されている。
【０２８８】
ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットの両方において抗体はレナラーゼに対する特異性を示す
図１４に認めることができるように、完全長レナラーゼタンパク質に対して産生された抗レナラーゼポリクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて結合したレナラーゼタンパク質に、特異的に結合する。ＰＢＳ中に１００ｎｇ／ウェルで希釈された、細菌で発現されたレナラーゼ−１は、４℃で一晩のインキュベーションにより、９６ウェルマイクロタイタープレートに結合した。ＮＦＤＭによるブロック後、レナラーゼタンパク質を、濃度１μｇ／ｍＬから始まる、ポリクローナル抗体Ｅ２９３０の連続希釈物により、プローブした。抗体結合は、ＨＲＰ−コンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧの添加により、アッセイした。プレートは、ＨＲＰの基質ＴＭＢとの反応後、分光光度計において４５０ｎｍで測定した。
【０２８９】
第二の実施例において、全てのポリクローナル抗体及び選択されたモノクローナル抗体のクローンを、それに対して抗体が生じたペプチド抗原に結合させた。例えば図１５に認めることができるように、１Ｄペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体１Ｄ  ２８−４及び１Ｄ  ３７−１０は、レナラーゼ−１へ濃度依存様式で結合した。１Ｄペプチドは、レナラーゼ−１及びレナラーゼ−２の両方に存在する。モノクローナル抗体１Ｆ  ４２−７及び１Ｆ  ２６−１は、レナラーゼ−１のみに存在する、１Ｆペプチドに対して産生された。１Ｆ  ｍＡｂは、レナラーゼ−１に濃度−依存様式で結合した。
【０２９０】
更なる実施例において、抗体を使用しウェスタンブロッティングによりレナラーゼを検出することができるかどうかを確立するために、細菌又は哺乳動物起源の、組換えレナラーゼタンパク質の連続希釈物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を泳動させ、且つＲｅｎ１Ｄ  ２８−４抗体を用い、ウェスタンブロッティングを行った。いずれかを起源とする組換えタンパク質は、図１６に認めることができるように、この方法で明確に同定された。この方式において、完全長レナラーゼタンパク質（配列番号：８又は５０又は９２又は９４）もしくは配列番号：１−７に記載されたペプチド抗原に特異的な抗レナラーゼ抗体が作製された。
【０２９１】
抗体はレナラーゼ−１又はレナラーゼ−２のいずれかに特異的である
この実施例において、レナラーゼ−１又はレナラーゼ−２のいずれかの特異的ペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体は、関連する完全長レナラーゼアイソフォームについて絶対的特異性を示した。抗体１Ｄ−２８−４及び１Ｄ−３７−１０は、１Ｄペプチドに対して産生され、従ってレナラーゼ−１及びレナラーゼ−２の両方に結合するはずである。抗体１Ｆ−４２−７及び１Ｆ−２６−１は、１Ｆペプチドに対して産生され（アラインメントについては図３参照）、従ってレナラーゼ−１にのみ特異的であるはずである。抗体３Ａ５−２は、ペプチド３Ａに対して産生され、従ってレナラーゼ−２に特異的であるはずである。
【０２９２】
細菌で発現されたレナラーゼ−１及び２アイソフォームを、ＰＢＳ中１００ｎｇ／ウェルに希釈し、且つ９６ウェルマイクロタイタープレートに結合させた。このプレートを、ＰＢＳ中の８％ＮＦＤＭの溶液により、３３℃で１時間ブロックした。レナラーゼタンパク質を、抗体１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−４２−７、１Ｆ−２６−１及び３Ａ５−２の連続希釈物により、プローブした。抗体の出発濃度は、典型的には１μｇ／ｍＬであり、２倍希釈工程により、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に調製した。３３℃で１時間インキュベーションした後、プレートを、ＰＢＳＴにより３回すすいだ。抗体結合を、ＨＲＰ−コンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧの５０ｎｇ／ｍＬの、１ウェルにつき５０μＬの添加により、アッセイした。プレートを、室温で４０分間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回及びＰＢＳで１回洗浄した。ＨＲＰ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、１ウェルにつき１００μＬ添加し、プレートを室温でおよそ５分間インキュベーションした。この反応を停止するために、各ウェルへ２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4の１００μＬを添加した。プレートを、分光光度計において４５０ｎｍで測定した。
【０２９３】
ＥＬＩＳＡアッセイにより、抗体１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−４２−７及び１Ｆ−２６−１は、レナラーゼ−１タンパク質へ濃度−依存様式で結合した（図１５）。しかし、ＥＬＩＳＡプレートアッセイにおいて組換えレナラーゼ−２の検出に同じ抗体が使用される場合、１Ｄ−２８−４及び１Ｄ−３７−１０のみが、頑強な、濃度−依存様式の結合を示した（図１７）。抗体３Ａ５−２は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、レナラーゼ−２アイソフォームへ結合することが認められた（図１７）。従って、１又は他のレナラーゼアイソフォームに対応するペプチドに対して産生された抗体は、関連する完全長タンパク質に対し特異性を示すことを認めることができる。
【０２９４】
エピトープ−特異的抗レナラーゼ抗体
免疫化に使用されるレナラーゼペプチドを、合成し、次にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートした。このコンジュゲートされたペプチドを、ＰＢＳ中１００ｎｇ／ウェルで希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートへ、４℃で一晩インキュベーションすることにより、結合させた。ＮＦＤＭによるブロック後、ＢＳＡ−コンジュゲートされたペプチドを、抗体の連続希釈物により、プローブした。抗体の結合は、ＨＲＰ−コンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧを添加することにより、アッセイした。ＨＲＰの基質ＴＭＢとの反応後、このプレートを、分光光度計により４５０ｎｍで測定した。１Ｄエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体１Ｄ  ２８−４及び１Ｄ  ３７−１０は、１Ｄ−ＢＳＡタンパク質へ濃度依存様式で結合した（図１８、１Ｄ  ２８−４について黒丸、１Ｄ  ３７−１０について白丸）。しかしこれらのモノクローナルは、１Ｆ抗原への非常に弱い結合を明らかにした（１Ｄ  ２８−４、及び１Ｄ  ３７−１０について半黒菱形、挿入図）。１Ｆエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体１Ｆ  ４２−７及び１Ｆ  ２６−１は、濃度依存様式で、１Ｆ−ＢＳＡタンパク質へ結合した（１Ｆ  ２６−１について黒四角、１Ｆ  ４２−７結合について白四角）。しかし、これらの１Ｆ  ｍＡｂは、１Ｄペプチドへの非常に弱い結合を明らかにした（１Ｆ  ２６−１、及び１Ｆ  ４２−７について半黒円、挿入図）。更なる実施例において、同じエピトープ−特異性が、ペプチド３Ａにおける抗体３Ａ５−２について及びペプチド１Ｃにおける抗体１Ｃ−２２−１について、認められた。また更なる実施例において、ペプチド１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ及び３Ａに対して産生された精製したポリクローナル抗体の全ては、関連するＢＳＡ−ペプチド融合体に特異的に結合した。
【０２９５】
従って、レナラーゼタンパク質内のペプチドエピトープに対して産生された抗体の複数の例は、絶対エピトープ特異性を示した。これらのエピトープ及びそれに結合するモノクローナル抗体の両方のアミノ酸組成は、本明細書において認められ且つ説明されている。
【０２９６】
抗レナラーゼ抗体コンジュゲーション
レナラーゼ−特異的抗体は、レナラーゼの検出試薬又はレナラーゼ−指向した治療薬としての抗体使用において助けとなるいくつかの実体に、コンジュゲートされることができる。これらのコンジュゲーションは、それらの抗体の関連するエピトープ特異性又は親和性と干渉することなく、完成され得る。これらのコンジュゲートの例は、放射性イオン、着色された、金属のもしくは蛍光の標識物、タグ又は毒素を含むが、これらに限定されるものではない。本実施例において、抗レナラーゼ抗体は、ビタミンビオチンにコンジュゲートされた。ビオチンは、タンパク質アビジン、ストレプトアビジン及びそれらの変種へ極めて高い親和性で結合する、小型の天然に生じるビタミンである。コンジュゲーションは、ビオチンの抗体上の第一級アミノ基への、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル結合を介して、完了される。過剰なコンジュゲートされないビオチンは、透析により除去することができる。
【０２９７】
更なる実施例において、この方式でコンジュゲートされた抗レナラーゼ抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、レナラーゼタンパク質へ結合するそれらの能力を維持することが認められた。細菌で発現されたレナラーゼ−１を、ＰＢＳ中に１００ｎｇ／ウェルで希釈し、４℃で一晩インキュベーションすることにより、９６ウェルマイクロタイタープレートへ結合させた。ＮＦＤＭによるブロック後、レナラーゼタンパク質を、濃度１μｇ／ｍＬから出発する、ビオチン化された抗体の連続希釈物により、プローブした。結合したビオチン化された抗体の存在は、ＨＲＰ−コンジュゲートされたニュートラアビジンの添加により、アッセイした。プレートを、ＨＲＰの基質ＴＭＢとの反応後、分光光度計において４５０ｎｍで測定した。ビオチン化されたモノクローナル抗体１Ｄ  ２８−４（図１９黒丸）、１Ｄ  ３７−１０（白丸）、１Ｆ  ４２−７（黒三角）、及び１Ｆ  ２６−１（白三角）は、レナラーゼ−１へ、濃度依存様式で結合した。
【０２９８】
複数の抗体は、レナラーゼ上の同じエピトープへの結合について競合することができる
この実施例において、モノクローナル及びポリクローナル抗レナラーゼ抗体の両方の様々な組合せは、レナラーゼへの結合に関して互いに競合することが示された。これは、複数の抗体の重複するエピトープを明らかにした。更なる実施例において、ポリクローナル抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体と競合することが認められ、これはこのポリクローナルの複数のエピトープ特異性を明らかにしている。細菌で発現されたレナラーゼ−１を、ＰＢＳ中に１００ｎｇ／ウェルで希釈し、４℃で一晩インキュベーションすることにより、９６ウェルマイクロタイタープレートへ結合させた。ブロック後、このタンパク質を、典型的には濃度１μｇ／ｍＬから出発する、コンジュゲートされない抗体の連続希釈物により、プローブし、異なるビオチン化された抗体と混合した。ビオチン化された抗体の濃度は、１２５ｎｇ／ウェルで一定に維持した。両方の抗体を、ＰＢＳＴ中に一緒に混合し、５０μＬ／ウェルの１回の添加として、ブロック前のレナラーゼプレートに適用した。３３℃で１時間のインキュベーション後、ビオチン化された抗体のレナラーゼへの結合を、０．４ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ−コンジュゲートされたニュートラアビジン（ＨＲＰ−ＮＡ）の５０μＬ／ウェルでの添加により、アッセイした。ＨＲＰの基質ＴＭＢを、結合したビオチン化された抗体の可視化のために添加した。次にプレートを、分光光度計において４５０ｎｍで測定した。
【０２９９】
抗レナラーゼ抗体の特異性は、ビオチン化された抗体が、同じエピトープを共有するコンジュゲートされない抗体とインキュベーションされた場合の、シグナルの減少により示された。一例は、１Ｄペプチドに対して産生された抗体モノクローナルにより、図２０Ａに示している。ビオチン化された１Ｄ  ３７−１０は、コンジュゲートされない１Ｄ  ２８−４により、競合された（黒丸、図２０Ａ）。同様に、１Ｆペプチドに対して産生された抗体も、互いに競合し：ビオチン化された１Ｆ  ２６−１は、コンジュゲートされない１Ｆ  ４２−７により競合された（黒三角、図２０Ａ）。ビオチン化されたモノクローナル抗体からのシグナルは、免疫化されないウサギ由来のコンジュゲートされない抗体とインキュベーションした場合に、減少しなかった（白丸及び白三角、図２０Ａ）。
【０３００】
更なる実施例において、及び図２０Ｂにおいて認めることができるように、完全長レナラーゼ−１に対して産生されたポリクローナル抗体Ｅ２９３０は、ビオチン化されたモノクローナル抗体１Ｄ  ３７−１０、１Ｆ  ２６−１の各々、並びにこれら２つのビオチン化されたｍＡｂの混合物と競合することが示された（黒丸、黒四角、及び白菱形、図２０Ｂ）。再度、２つのビオチン化された抗体の混合物は、免疫化されないウサギ由来のコンジュゲートされない抗体によっては競合されなかった（黒三角、図２０Ｂ）。２つのビオチン化されたモノクローナル抗体に対するポリクローナル抗体Ｅ２９３０により認められた競合は、このポリクローナル抗体は、レナラーゼポリペプチド上の複数のエピトープに結合することを示唆している。
【０３０１】
抗体はレナラーゼへ高親和性及び異なる結合反応速度により結合する
抗体が内因性タンパク質の検出に使用される場合、その標的に対する高親和性が提示されなければならない。今日まで、抗レナラーゼ抗体に関する結合反応速度は説明されていない。本実施例において、複数の抗レナラーゼ抗体は、溶液結合アッセイにおいて、完全長レナラーゼに関して、低い又はナノモル以下の親和性を有することが明らかにされた。精製された抗レナラーゼ抗体を、ビオチン化し、且つBiacore T100装置のためのストレプトアビジンＣＭ５センサーチップへ結合した。純粋な組換えレナラーゼ−１を、チップの表面上に注入した。結合試験を、流動緩衝液として２５ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを使用し、２５℃で行った。レナラーゼの固定された抗体に対する結合反応速度は、この方式で測定することができる。図２１に認めることができ且つ図２２にまとめているように、抗体１Ｄ−２８−４、１Ｆ−４２−７、１Ｄ−３７−１０及び１Ｆ−２６−１は全て、高い親和性でレナラーゼに結合し−ＫD値は、２．６７ｎＭから０．３１６ｎＭまで変動した。広範な会合及び解離が、これらの抗体間で認められ、これは異なる抗体組成の異なる寄与を明らかにしている。
【０３０２】
異種移植マウスモデルにおいて、モノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳによる抗ＲＮＬＳ療法は、メラノーマ腫瘍成長を顕著に阻害した(Hollander Lら、2016, Cancer Research, 76(13):3884-94)
ＲＮＬＳに対して産生された２つのモノクローナル抗体［クローン＃２８−４（ｍ２８−ＲＮＬＳ）、３７−１０（ｍ３７−ＲＮＬＳ）］は、試験した全ての（合計５）メラノーマ細胞株の生存度を低下し、代表例を図２３に示している。ｍ２８−ＲＮＬＳは、処置濃度の増加に相関した細胞毒性の増加するレベルを明らかにしている（ｐ＜０．０５、図２４）。
【０３０３】
インビボ試験に関して、Ａ３７５．Ｓ２（ヒトメラノーマ）細胞を、無胸腺ヌードマウスへ、皮下注射し、腫瘍を形成した。一旦腫瘍が容積〜５０ｍｍ3に到達したならば、その後動物を、対照ウサギＩｇＧ又はＲＮＬＳ中和するモノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで処置した。全般的動物の健康及び活動は、本試験を通じて維持されたので、この抗体処置は、毒性があるようには見えなかった。腫瘍サイズは、隔日で測定し、ｍ２８−ＲＮＬＳによる処置は、試験した全ての時点で、腫瘍容積を減少した（ｐ＜０．０５、図２５）。これらの動物を、全般的腫瘍サイズ及び一部の動物における潰瘍化のために、１１日目に屠殺した。細胞増殖マーカーＫｉ６７による異種移植された腫瘍からの切片のＩＨＣ染色は、ウサギＩｇＧにより処置したものと比較して、抗ＲＮＬＳ抗体で処置した腫瘍内の細胞増殖の有意な減少を明らかにした：対照群における３５．１±２．３陽性細胞／高倍率視野、対、ＲＮＬＳ  Ａｂ処置群における１３．４±３．０、ｎ＝１４、ｐ＝０．０００４（図２６）。免疫適格性(immunocompetent)における抗ＲＮＬＳ療法の有効性を試験するために、Ｂ１６ｆ１０細胞（マウスメラノーマ株）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下投与した。一旦腫瘍が容積〜５００ｍｍ3に到達したならば、動物を、対照ウサギＩｇＧ又はＲＮＬＳ中和するモノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで処置し、対照群の非常に大きい腫瘍組織量のために、７日目に屠殺した。図２７に示すように、ｍ２８−ＲＮＬＳ投与は、ウサギＩｇＧと比べ、腫瘍容積の有意な減少を引き起こした。
【０３０４】
異種移植マウスモデルにおいて、モノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳによる抗ＲＮＬＳ療法は、膵臓腺癌の腫瘍成長を顕著に阻害する(Guo Xら、2016, Scientific Reports, 6:22996)
ＲＰ−２２０に対するウサギにおけるモノクローナル抗体のパネルから、２つのクローンｍ２８−ＲＮＬＳ及びｍ３７−ＲＮＬＳを、それらの高い結合親和性を基に選択した（各々、ＫDが０．３１６及び２．６７ｎＭ）。ヒト膵臓腺癌細胞の成長に対するｍ２８−ＲＮＬＳ、ｍ３７−ＲＮＬＳ、及び市販のポリクローナル（ＲＰ−２２０の部分配列に対する）の阻害作用を、図２８、図２９、及び図３０に示す代表例により示している。
【０３０５】
阻害性抗体の治療的可能性を評価するために、ＢｘＰＣ３細胞を、無胸腺ヌードマウスへ皮下注射し、これらを対照ウサギＩｇＧ又はｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで処置し、且つ腫瘍容積を、最大３週間測定した。図３１に示したように、ウサギＩｇＧと比べ、ｍ２８−ＲＮＬＳ処置は、腫瘍容積の有意な減少を引き起こした。
【０３０６】
ｍ２８−ＲＮＬＳヒト化バリアントによる抗ＲＮＬＳ療法は、腫瘍成長を阻害する
メラノーマ細胞（ヒト：ＳＫ−ＭＥＬ−２８、マウス：ＹＵＭＭ１．７）及び膵臓腺癌細胞（ヒト：ＢｘＰＣ３）を、６−ウェル培養プレートに、密度５×１０4個細胞／ウェルで播種した。細胞増殖及び生存度の割合を、トリパンブルーアッセイを用いて決定した。これらの細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、且つ０．５％トリパンブルー色素により染色した。Bio-Rad TC10自動細胞カウンター(ハーキュリーズ、CA、米国)を使用し、各試料中の細胞総数、生存細胞総数、及び生存細胞の割合を評価した。記録された数を用い、増殖及び生存度の割合を決定した。
【０３０７】
５つのヒト化されたｍ２８バリアント（ｍ２８−Ｋ２、ｍ２−Ｋ５、ｍ２８−Ｋ１３、ｍ２８−Ｋ１４及びｍ２８−Ｋ１６、表２）は、ヒト及びマウスの両方のＲＮＬＳへの増加した結合を示した（図３２及び図３３）。これらのｍ２８バリアントはまた、メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）及び膵臓腺癌（ＢｘＰＣ３）のヒト細胞株の生存度を減少し（代表例を図３４及び図３５に示す）、このことはヒト癌におけるｍ２８バリアントの可能性のある治療的有用性を指摘している。
【０３０８】
実施例２：配列
【表１−１】
2021508709.tif 000003
【表１−２】
2021508709.tif 000004
【表１−３】
2021508709.tif 000005
【表２】
2021508709.tif 000006
【０３０９】
配列番号：２１８
Ｍ２８−ヒト化されたＦｖ配列重鎖ヌクレオチド
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAATCTGAGCAGCTTCGCCGTTCACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAATCATCAGCAGCGTTGGCATCACCCGCTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCAAAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCTATGGCTATAGCGGCGACGTGAACCGCCTGGACCTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
配列番号：２１９
Ｍ２８−ヒト化されたＦｖ配列重鎖アミノ酸（Ｍ２８  ＣＤＲ及びＨＣ７１グラフトに下線）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLSSFAVHWVRQAPGKGLEWVAIISSVGITRYADSVKGRFTISKDTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGYSGDVNRLDLWGQGTLVTVSS
配列番号：２２０
Ｍ２８−ヒト化されたＦｖ配列軽鎖ヌクレオチド
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGAGCGTGTATGACAACAACAACGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACGGCGCCAGCACCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCTGGGCGAATTCAGCTGCAGCAGCGCTGACTGCTTCGCCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA
配列番号：２２１
Ｍ２８−ヒト化されたＦｖ配列軽鎖アミノ酸（Ｍ２８  ＣＤＲ及びＨＣ７１グラフトに下線）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVYDNNNVAWYQQKPGKAPKLLIYGASTLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGEFSCSSADCFAFGQGTKVEIKR
配列番号：２２２
Ｍ４２ヒト化されたＦｖ配列重鎖ヌクレオチド
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACCTGACCACCTACGGCGTTCACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCACTGATCGGCGATCGCGGCACCACCTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCCGCGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCGGCAGCGGCTATGGCGCTCGCATCTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
配列番号：２２３
Ｍ４２ヒト化されたＦｖ配列重鎖アミノ酸（Ｍ４２  ＣＤＲ及びＨＣ７１グラフトに下線）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVALIGDRGTTYYADSVKGRFTISRDTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGYGARIWGQGTLVTVSS
配列番号：２２４
Ｍ４２ヒト化されたＦｖ配列軽鎖ヌクレオチド
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGACCGTGTATAACAACAACTACGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACGAAACCAGCAAACTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGGGCGGCTACAGCGGCGTGGACTTCATGGCTTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA
配列番号：２２５
Ｍ４２ヒト化されたＦｖ配列軽鎖アミノ酸（Ｍ４２  ＣＤＲ及びＨＣ７１グラフトに下線）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTVYNNNYVAWYQQKPGKAPKLLIYETSKLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGGYSGVDFMAFGQGTKVEIKR
【０３１０】
本明細書において引用された特許、特許出願及び刊行物の各々の及び全ての開示は、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている。本発明は具体的実施態様を参照し明らかにされているが、本発明の他の実施態様及び変動は、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者により誘導されてよいことは明白である。添付された請求項は、そのような実施態様及び同等の変動全てを含むと解釈されることが意図される。
【図１】
2021508709.tif 000007
【図２】
2021508709.tif 000008
【図３】
2021508709.tif 000009
【図４−１】
2021508709.tif 000010
【図４−２】
2021508709.tif 000011
【図５−１】
2021508709.tif 000012
【図５−２】
2021508709.tif 000013
【図６−１】
2021508709.tif 000014
【図６−２】
2021508709.tif 000015
【図６−３】
2021508709.tif 000016
【図７】
2021508709.tif 000017
【図８−１】
2021508709.tif 000018
【図８−２】
2021508709.tif 000019
【図９】
2021508709.tif 000020
【図１０−１】
2021508709.tif 000021
【図１０−２】
2021508709.tif 000022
【図１１】
2021508709.tif 000023
【図１２−１】
2021508709.tif 000024
【図１２−２】
2021508709.tif 000025
【図１３】
2021508709.tif 000026
【図１４】
2021508709.tif 000027
【図１５】
2021508709.tif 000028
【図１６】
2021508709.tif 000029
【図１７】
2021508709.tif 000030
【図１８】
2021508709.tif 000031
【図１９】
2021508709.tif 000032
【図２０】
2021508709.tif 000033
【図２１−１】
2021508709.tif 000034
【図２１−２】
2021508709.tif 000035
【図２２】
2021508709.tif 000036
【図２３】
2021508709.tif 000037
【図２４】
2021508709.tif 000038
【図２５】
2021508709.tif 000039
【図２６】
2021508709.tif 000040
【図２７】
2021508709.tif 000041
【図２８】
2021508709.tif 000042
【図２９】
2021508709.tif 000043
【図３０】
2021508709.tif 000044
【図３１】
2021508709.tif 000045
【図３２】
2021508709.tif 000046
【図３３】
2021508709.tif 000047
【図３４】
2021508709.tif 000048
【図３５】
2021508709.tif 000049
【図３６】
2021508709.tif 000050
【配列表】
2021508709000001.app
【国際調査報告】
2021508709.tif 000051
2021508709.tif 000052
2021508709.tif 000053