(57)【要約】  本発明は、コリネ型細菌由来のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ、それをコードする核酸配列、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの上昇した発現および／または活性を有するＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを含有する該当する生体、好ましくはコリネ型細菌、ならびに該当する使用に関する。本発明はさらに、コリネ型細菌由来のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いたＤ−キシロネートの生産方法にも関する。
2021524262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が、配列番号２によるアミノ酸配列またはその断片に対して少なくとも７０％の同一性を有することを特徴とする、コリネ型細菌から単離されたＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
配列番号２によるアミノ酸配列またはその断片を含有する、請求項１に記載のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１に記載のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子によってコードされる、請求項１または２に記載のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
好ましくはコリネ型細菌中で、Ｄ−キシロネートを生産するための、
ａ）配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列、
ｂ）ストリンジェントな条件下に配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子、および
ｄ）ａ）〜ｃ）による核酸の各々に応じて、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列であって、遺伝暗号の縮重または機能的中立突然変異により、ａ）〜ｃ）によるそれらの核酸配列とは異なる核酸配列、
を含む群から選択される、請求項１〜４のいずれか一つに記載のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする、コリネ型細菌から単離された核酸配列。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一つに記載のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードするｉｏｌＧを含有するｉｏｌＣ遺伝子クラスターの非コード調節領域内にある作動可能に連結された１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位が部分的もしくは完全に欠失していることを特徴とする、請求項５に記載の核酸配列。
【請求項７】
好ましくは配列番号７および配列番号８による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の群から選択される、ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位に１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有することを特徴とする、請求項５または６に記載の核酸配列。
【請求項８】
好ましくは配列番号６３および配列番号６４による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の群から選択される、ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位に１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有することを特徴とする、請求項５または６に記載の核酸配列。
【請求項９】
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特にコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）を含む群から選択されるコリネ型細菌から単離された、請求項１〜４のいずれか一つに記載のタンパク質または請求項５〜８のいずれか一つに記載の核酸配列。
【請求項１０】
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）  ＡＴＣＣ１３０３２
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）  ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）  ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９
ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）  ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）  ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）  ＡＴＣＣ１４０２０
を含む群から選択されるコリネ型細菌から単離された、請求項１〜４のいずれか一つに記載のタンパク質または請求項５〜８のいずれか一つに記載の核酸配列。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一つに記載の相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼまたはその断片の上昇した発現および／または高まった活性を有することを特徴とする、Ｄ−キシロネート生産のためのコリネ型細菌細胞。
【請求項１２】
ｉｏｌＣ遺伝子クラスター中の、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の非コード調節領域内にある作動可能に連結された１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位が部分的もしくは完全に欠失している、請求項５〜８のいずれか一つに記載の核酸配列を有することを特徴とする、請求項１１に記載のコリネ型細菌細胞。
【請求項１３】
好ましくは配列番号７および配列番号８による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を含む群から選択される、ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位に１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を含む核酸配列を有することを特徴とする、請求項１１または１２に記載のコリネ型細菌細胞。
【請求項１４】
好ましくは配列番号６３および配列番号６４による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を含む群から選択される、ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位に１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を含む核酸配列を有することを特徴とする、請求項１１または１２に記載のコリネ型細菌細胞。
【請求項１５】
好ましくは配列番号９および配列番号１０の核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の群から選択される、ｉｏｌＴ１遺伝子の作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位に１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を含む核酸配列を有することを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
【請求項１６】
コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、特にコリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムまたはブレビバクテリウム・ディバリカタムを含む群から選択される、請求項１１〜１５のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
【請求項１７】
コリネバクテリウム・グルタミクム  ＡＴＣＣ１３０３２
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム  ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム  ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９
ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・ディバリカタム  ＡＴＣＣ１４０２０
を含む群から選択される細菌細胞であることを特徴とする、請求項１１〜１６のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
【請求項１８】
本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の増加したコピー数が、染色体上にコードされて存在する、請求項１１〜１７のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
【請求項１９】
非組換え的に改変されていることを特徴とする、請求項１１〜１８のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
【請求項２０】
本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の増加したコピー数が、染色体外にコードされて、好ましくはプラスミドにコードされて、またはベクターにコードされて存在する、請求項１１〜１９のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
【請求項２１】
ａ）請求項１〜４、９または１０のいずれか一つに記載のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇している、
ｂ）請求項５〜１０のいずれか一つに記載の核酸配列の発現が増強している、
ｃ）配列番号３によるミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ１）またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、
ｄ）配列番号４によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１の活性が上昇している、
ｅ）好ましくは配列番号９および配列番号１０の核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の群から選択される、ｉｏｌＴ１遺伝子の作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位に１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ１）をコードする核酸配列を有する、
ｆ）配列番号５によるミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ２）またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、
ｇ）配列番号６によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ２の活性が上昇している、
ｈ）ｃ）およびｆ）によるミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１／２をコードする両核酸配列の発現が上昇している、
ｉ）ｄ）およびｇ）による両ミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１／２の活性が上昇している、
ｊ）請求項１〜４または５〜１０のいずれか一つに記載のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードするｉｏｌＧを含有するｉｏｌＣ遺伝子クラスターの非コード調節領域内にある作動可能に連結された１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位が部分的もしくは完全に欠失している、請求項５〜１０のいずれか一つに記載の核酸配列を有する、
ｋ）好ましくは配列番号７、配列番号８、配列番号６３および配列番号６４による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を含む群から選択される、ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位に１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有する、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を有する、または
ｌ）ａ）〜ｋ）の組合せである、
請求項１１〜２０のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
【請求項２２】
ａ）水およびＣ５炭素源を含有する溶液を準備するステップ、
ｂ）相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の発現が増強している、および／または相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇しているコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップａ）による溶液中で、Ｃ５炭素源をＤ−キシロネートへ微生物変換するステップ、および
ｃ）任意選択的に、前記溶液からＤ−キシロネートを単離および／または調製するステップ
を含む、Ｄ−キシロネートを生産するための方法。
【請求項２３】
請求項１１〜２１のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞を使用する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップｂ）でのＤ−キシロースデヒドロゲナーゼが、配列番号２によるアミノ酸配列またはその断片に対して少なくとも７０％の同一性のアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされている、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
水、ならびに
ａ）Ｄ−キシロース単位を含有するオリゴ糖類または多糖類、
ｂ）好ましくは少なくとも１０ｇＬ−１の濃度の、Ｄ−キシロース、
ｃ）リグノセルロース、セルロースもしくはヘミセルロースを含有するバイオマス、その加水分解物、またはその加水分解物から得られる、Ｄ−キシロース単位を含有する抽出物、および
ｄ）ａ）〜ｃ）の組合せ
を含む群から選択されるＣ５炭素源を含有する溶液中で微生物変換を行うことを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
Ｃ５炭素源が、バガス、好ましくはスクロースバガス、その加水分解物、またはその加水分解物から得られる、Ｄ−キシロース単位を含有する抽出物である、請求項２２〜２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２７】
培養を断続的または連続的、好ましくはバッチモード、流加モード、反復流加モードで、またはワンポット加水分解・発酵プロセスとして行うことを特徴とする、請求項２２〜２６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２８】
前記溶液が、炭素源およびエネルギー源として、培養開始時に、Ｄ−キシロースの他に好ましくは少なくとも８〜１０ｇＬ−１の、Ｄ−グルコースを含有することを特徴とする、請求項２２〜２７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２９】
培養を流加モードで、好ましくはＤ−キシロースの補給により、行うことを特徴とする、請求項２２〜２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３０】
非組換え的に改変されている（ｎｏｎ−ＧＭＯ）コリネ型細菌細胞を使用することを特徴とする、請求項２２〜２９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３１】
Ｄ−キシロネートを生産するための、請求項１〜４、９もしくは１０のいずれか一つに記載のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ、または請求項５〜１０のいずれか一つに記載の核酸配列、または請求項１１〜２１のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞の使用。
【請求項３２】
コリネ型細菌、好ましくはコリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム、酵母、好ましくはサッカロミセス、および真菌、好ましくはアスペルギルスの群から選択される宿主系を製造するための、請求項１〜４、９もしくは１０のいずれか一つに記載のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ、または請求項５〜１０のいずれか一つに記載の核酸配列の使用。
【請求項３３】
コリネバクテリウム・グルタミクムを用いてＤ−キシロネートを微生物生産するための、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
Ｄ−キシロネート生産のためのコリネ型細菌を製造するための、請求項５〜１０のいずれか一つに記載の核酸配列または配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０を含む群から選択されるヌクレオチド配列の使用。
【請求項３５】
Ｄ−キシロネート生産のためのコリネ型細菌を製造するための、請求項５〜１０のいずれか一つに記載の核酸配列または配列番号６３および配列番号６４を含む群から選択されるヌクレオチド配列の使用。
【請求項３６】
請求項１〜４、９もしくは１０のいずれか一つに記載の酵素、請求項５〜１０のいずれか一つに記載の核酸配列によりコードされる酵素、請求項１１〜２１のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞、または請求項２２〜３０のいずれか一つに記載の方法を用いて生産されたＤ−キシロネートを含有する組成物。
【請求項３７】
医薬品、食品、飼料、溶媒、着色剤および／または建設資材産業の構成要素、好ましくはセメントまたはコンクリートを製造するための、請求項１〜４、９もしくは１０のいずれか一つに記載の酵素、請求項５〜１０のいずれか一つに記載の核酸配列によりコードされる酵素、請求項１１〜２１のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞、もしくは請求項２２〜３０のいずれか一つに記載の方法を用いて生産されたＤ−キシロネートの使用、または請求項３６に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネ型細菌由来のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ、それをコードする核酸配列、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの上昇した発現および／または活性を有するＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを含有する該当する生体、好ましくはコリネ型細菌、ならびに該当する使用に関する。本発明はさらに、コリネ型細菌由来のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いたＤ−キシロネートの生産方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−キシロン酸（Ｃ５Ｈ１０Ｏ６）は、ポリアミド、ポリエステルおよび１，２，４−ブタントリオール用の前駆体として利用できる有機酸であり（Ｔｏｉｖａｒｉら、２０１２；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５３−０１２−４２８８−５（非特許文献１））、それゆえ、製薬産業、食品産業および化学産業において幅広い適用潜在性を有する。
【０００３】
Ｄ−キシロン酸の塩であるＤ−キシロネートは、第２世代の再生可能資源に基づく潜在的に高価値のプラットフォームケミカルのトップ３０に数えられる（Ｗｅｒｐｙら、２００４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｔｉｃ．ｍｉｌ／ｄｔｉｃ／ｔｒ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ／ｕ２／ａ４３６５２８．ｐｄｆ（非特許文献２））。Ｄ−キシロネートは、世界市場で１００ｋｔ／年を占めるＤ−グルコネート（Ｃ６Ｈ１１Ｏ７）を代替する可能性を有する。
【０００４】
Ｄ−キシロネートは、生来、いくつかの細菌中において２段階の反応より形成される。第１の反応では、Ｄ−キシロースがＤ−キシロノラクトンへと酸化され、ただし、その場合、生物に応じて特異的デヒドロゲナーゼが触媒活性を有する。Ｄ−キシロノラクトンは、続いて、特異的ラクトナーゼによるか、または自発的に（酵素触媒なしに）Ｄ−キシロネートへと変換可能である。例えば、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）種およびシュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）種に関しては、Ｄ−キシロネートの高い生成物力価が報告されている（Ｔｏｉｖａｒｉら、２０１２；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５３−０１２−４２８８−５（非特許文献１）；Ｂｕｃｈｅｒｔら、１９８８、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ＢＦ０１０２８０７９（非特許文献３））。
【０００５】
その上、例えばカウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）由来のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの異種発現により、代替的なＤ−キシロネート産生株（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種の酵母、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）種の細菌およびアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）種の真菌）が生成された（Ｔｏｉｖａｒｉら、２０１２；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５３−０１２−４２８８−５（非特許文献１）；Ｌｉｕら、２０１２；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｒｔｅｃｈ．２０１１．０８．０６５（非特許文献４）；米国特許出願公開第２０１２／０００５７８８（Ａ１）号（特許文献１））。
【０００６】
微生物生産に加えて、Ｄ−キシロネートは、電気化学的（Ｊｏｋｉｃら、１９９１；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ＢＦ０１０２０２１６（非特許文献５））、酵素的（Ｐｅｚｚｏｔｔｉ  ＆  Ｔｈｅｒｉｓｏｄ  ２００６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃａｒｒｅｓ．２００６．０５．０２３（非特許文献６））、または化学酸化により（Ｉｓｂｅｌｌ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ  １９３２；Ｉｓｂｅｌｌ  ＨＳ、Ｈｕｄｓｏｎ  ＣＳ（１９３２）Ｔｈｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｄｏｓｅ  ｓｕｇａｒｓ  ｂｙ  ｂｒｏｍｉｎｅ  ｗａｔｅｒ．  Ｂｕｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｊ  Ｒｅｓ  ８：３２７〜３３８頁；ｈｔｔｐｓ：／／ａｒｃｈｉｖｅ．  ｏｒｇ／ｄｅｔａｉｌｓ／ｃｏｕｒｓｅｏｆｏｘｉｄａｔｉｏ８３３２７ｉｓｂｅ（非特許文献７））生産可能である。
【０００７】
Ｄ−キシロネートは、コリネ型細菌株、特にコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の発酵によって生産され得ることが公知である（Ｙｉｍら、２０１７；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｂｉｏｔ．２０１７０００４０（非特許文献８）、Ｃｈｏｉら、２０１８；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５３−０１７−８６５３−２（非特許文献９））。その際、Ｄ−キシロースからＤ−キシロネートへの酸化は、カウロバクター・クレセンタスのキシロースデヒドロゲナーゼの異種発現により仲介される。ただし、異種系の発現は、医薬品産業または食品産業での適用に目を向けると不利であり望ましくない。なぜなら、Ｄ−キシロネート合成能力を有するこれまで公知のすべての産生株、例えばグルコノバクター・オキシダンスは、その増殖に複合培地を必要とするため、培養に明らかにより手間がかかり、より高価、したがってより不経済になるからである。
【０００８】
コリネ型細菌を用いた、アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンおよびＬ−グルタメート）ならびに産業バイオテクノロジーのその他の前駆体の微生物生産が進行する中での基質最適化の研究において、生来は代謝されない基質、例えばＤ−キシロースの摂取能力が調査された。ミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ１）が、コリネバクテリウム・グルタミクムにおけるＤ−キシロースの摂取に貢献することが示せた（Ｂｒｕｅｓｓｅｌｅｒら、２０１８；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｒｔｅｃｈ．２０１７．１０．０９８（非特許文献１０））。もっとも、Ｄ−キシロースは、コリネ型細菌によって生来は代謝されないため、培地中に蓄積する。
【０００９】
国際公開第２０１７／２２００５９号（特許文献２）は、調節タンパク質ＩｏｌＲをコードするｉｏｌＲ遺伝子の不活性化または欠失が、炭素源およびエネルギー源としてＤ−グルコースおよびＤ−キシロースを有する合成培地上においてＤ−キシロネートの形成をもたらすことを開示する。
【００１０】
調節因子ＩｏｌＲをコードする遺伝子ｃｇ０１９６は、アミノ酸Ｌ−リジンの生産との関連でＫｌａｆｆｌら（２０１３；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＪＢ．００２６５−１３（非特許文献１１））に記載されている。ｉｏｌＲの欠失は、ミオイノシトール遺伝子クラスター、ならびにこれまでのところ未知または明確にはアノテーションされていない機能を有するさらなるおよそ２２個の遺伝子の発現をもたらす（Ｋｌａｆｆｌら、２０１３（非特許文献１１））。これらのおよそ２２個の遺伝子の脱調節の結果としての不利な生理学的作用は排除できない。したがって、そのようなｉｏｌＲ欠失を有する細菌株だけでは、遺伝学的に明確に定義されているべきである、産業的に興味を引く産生株の役立つプラットフォームではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０００５７８８（Ａ１）号
【特許文献２】国際公開第２０１７／２２００５９号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｔｏｉｖａｒｉら、２０１２；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５３−０１２−４２８８−５
【非特許文献２】Ｗｅｒｐｙら、２００４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｔｉｃ．ｍｉｌ／ｄｔｉｃ／ｔｒ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ／ｕ２／ａ４３６５２８．ｐｄｆ
【非特許文献３】Ｂｕｃｈｅｒｔら、１９８８、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ＢＦ０１０２８０７９
【非特許文献４】Ｌｉｕら、２０１２；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｒｔｅｃｈ．２０１１．０８．０６５
【非特許文献５】Ｊｏｋｉｃら、１９９１；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ＢＦ０１０２０２１６
【非特許文献６】Ｐｅｚｚｏｔｔｉ  ＆  Ｔｈｅｒｉｓｏｄ  ２００６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃａｒｒｅｓ．２００６．０５．０２３
【非特許文献７】Ｉｓｂｅｌｌ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ  １９３２；Ｉｓｂｅｌｌ  ＨＳ、Ｈｕｄｓｏｎ  ＣＳ（１９３２）Ｔｈｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｄｏｓｅ  ｓｕｇａｒｓ  ｂｙ  ｂｒｏｍｉｎｅ  ｗａｔｅｒ．  Ｂｕｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｊ  Ｒｅｓ  ８：３２７〜３３８頁；ｈｔｔｐｓ：／／ａｒｃｈｉｖｅ．  ｏｒｇ／ｄｅｔａｉｌｓ／ｃｏｕｒｓｅｏｆｏｘｉｄａｔｉｏ８３３２７ｉｓｂｅ
【非特許文献８】Ｙｉｍら、２０１７；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｂｉｏｔ．２０１７０００４０
【非特許文献９】Ｃｈｏｉら、２０１８；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５３−０１７−８６５３−２
【非特許文献１０】Ｂｒｕｅｓｓｅｌｅｒら、２０１８；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｒｔｅｃｈ．２０１７．１０．０９８
【非特許文献１１】Ｋｌａｆｆｌら、２０１３；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＪＢ．００２６５−１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、コリネ型細菌中でＤ−キシロネートを微生物生産（ｍｉｋｒｏｂｉｅｌｌｅ  Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ）するために異種遺伝子発現に依存しないこと、または異種遺伝子発現を回避することである。さらに、本発明の課題は、細胞内の多数の遺伝子またはタンパク質に対して影響を及ぼす中心的に作用する１つまたは複数の（例えば、調節タンパク質ＩｏｌＲの）調節因子をスイッチオフした場合に例えばそうであるように、広範に未定義の生理学的影響を有し得るような、コリネ型細菌の代謝への介入を回避することである。それゆえ、本発明のさらなる課題は、コリネ型細菌を用いたＤ−キシロネートの微生物生産を可能にすると同時に公知の欠点を克服する相同系（ｈｏｍｏｌｏｇｅｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）および１つまたは複数の相同構造要素の提供である。本発明のさらなる課題は、コリネ型細菌中でＤ−キシロネートを微生物生産するための、公知の欠点が克服される方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
それらの課題は、以下で説明するように、本発明により、有利なやり方で解決される。
【００１５】
まず、本発明を手短に説明するが、それにより本発明の主題を限定するものではない。
【００１６】
本発明の主題は、コリネ型細菌由来のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質の提供である。
【００１７】
さらに、本発明は、その、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの、Ｄ−キシロネートを生産するための使用にも関する。本発明の一変形形態では、Ｄ−キシロネートの生産を、相同系、好ましくはコリネ型細菌中で行う。
【００１８】
本発明の主題は、本発明による相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの上昇した発現および／または高まった活性を有することを特徴とする、Ｄ−キシロネート生産用のコリネ型細菌でもある。
【００１９】
コリネバクテリウムおよびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含む群から選択されるコリネ型細菌が好ましい。
【００２０】
本発明の主題は、コリネ型細菌細胞由来の本発明によるＤ−キシロネートデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列でもある。
【００２１】
本発明の主題は、本発明によりコードする核酸配列の高まった発現が存在するコリネ型細菌細胞でもある。本発明は、上述の特性を有する、非組換え的に改変されている、それゆえ非遺伝子改変系（ｎｏｎ−ＧＭＯ）である、Ｄ−キシロネート生産用のコリネ型細菌細胞も含む。
【００２２】
それゆえ本発明によれば、Ｄ−キシロネート生産に関する相同系であり、かつ調節タンパク質ＩｏＬＲそれ自体の発現および／または活性は改変させることなくＤ−キシロースデヒドロゲナーゼのＩｏｌＲ仲介脱調節が存在するコリネ型細菌細胞が含まれる。それゆえ、本発明の主題は、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の非コード調節領域内にある作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖ−ｖｅｒｋｎｕｅｐｆｔ）１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位が部分的もしくは完全に欠失していることを特徴とするコリネ型細菌細胞でもある。
【００２３】
本発明の主題はさらに、好ましくはコリネ型細菌を用いてＤ−キシロネートを微生物生産するための方法であって、ａ）水およびＣ５炭素源を含有する溶液を準備するステップ、
ｂ）相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の発現が増強している、および／または相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇している本発明によるコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップａ）による溶液中で、Ｃ５炭素源をＤ−キシロネートへ微生物変換するステップ、および
ｃ）任意選択的に、該溶液からＤ−キシロネートを単離および／または調製するステップ
を含む方法である。
【００２４】
本発明の主題は、水および
ａ）Ｄ−キシロース単位を含有するオリゴ糖類または多糖類、
ｂ）好ましくは少なくとも１０ｇＬ−１の濃度の、Ｄ−キシロース、
ｃ）リグノセルロース、セルロース、もしくはヘミセルロースを含有するバイオマス、その加水分解物、またはその加水分解物から得られる、Ｄ−キシロース単位を含有する抽出物、および
ｄ）ａ）〜ｃ）の組合せ
を含む群から選択されるＣ５炭素源を含有する溶液中でＤ−キシロネートへの微生物変換を行う方法でもある。
【００２５】
本発明による方法の好ましい一変形形態では、Ｃ５炭素源としてバガス、好ましくはスクロースバガス、その加水分解物、またはその加水分解物から得られる、Ｄ−キシロース単位を含有する抽出物を使用する。
【００２６】
本発明はさらに、好ましくはコリネ型細菌細胞を用いてＤ−キシロネートを生産するための、コリネ型細菌由来の本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの使用、そのようなＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする本発明による核酸配列の使用、ならびに本発明によるコリネ型細菌細胞にも関する。相同系（コリネ型細菌）中でのＤ−キシロネート生産に加えて、本発明によると、異種系中での、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを利用したＤ−キシロネート生産も同じく含まれる。
【００２７】
本発明はさらに、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ、本発明によるコリネ型細菌細胞を用いて、または本発明の方法により、または本発明による組成物を用いて生産されたＤ−キシロネートの、医薬品、食品、飼料、溶媒、着色剤および／または建設資材産業の構成要素、好ましくはセメントまたはコンクリートを製造するための使用にも関する。
【００２８】
以下では本発明の主題を例によりおよび図をもとにさらに詳細に説明するが、それにより本発明の主題を限定はしない。
【００２９】
実施例を説明する前に本発明の理解に重要であるいくつかの定義を先行させる。
【００３０】
本発明の主題は、コリネ型細菌から単離したＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを提供することおよびコリネ型細菌由来のそのようなタンパク質をコードする核酸配列を提供することである。
【００３１】
本発明は、アミノ酸配列が、配列番号２によるアミノ酸配列またはその断片に対して少なくとも７０％の同一性を有するＤ−キシロースデヒドロゲナーゼに関する。
【００３２】
本発明はまた、配列番号２によるアミノ酸配列またはその断片に対して少なくとも７５もしくは８０％、好ましくは少なくとも８１、８２、８３、８４、８５もしくは８６％の同一性、特に好ましくは８７、８８、８９、９０％の同一性、とりわけ好ましくは少なくとも９１、９２、９３、９４、９５％の同一性または最も好ましくは９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするタンパク質も含む。さらに、本発明は、配列番号２によるアミノ酸配列またはその断片を含有するＤ−キシロースデヒドロゲナーゼに関する。
【００３３】
本発明の主題はさらに、配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼでもある。本発明はまた、配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７５％もしくは８０％、好ましくは少なくとも８１、８２、８３、８４、８５もしくは８６％の同一性、特に好ましくは８７、８８、８９、９０％の同一性、とりわけ好ましくは少なくとも９１、９２、９３、９４、９５％の同一性または非常に好ましくは９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する核酸配列も含む。さらに、本発明は、配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子によってコードされるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼに関する。
【００３４】
本発明のさらなる一変形形態では、本発明によるタンパク質または本発明による核酸配列を、コリネバクテリウムおよびブレビバクテリウム、特にコリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、またはブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）を含む群から選択されるコリネ型細菌から単離する。
【００３５】
本発明の好ましい一実施形態では、本発明によるタンパク質または本発明による核酸配列を、コリネバクテリウム・グルタミクム  ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム  ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９、またはブレビバクテリウム・ディバリカタム  ＡＴＣＣ１４０２０を含む群から選択されるコリネ型細菌から単離する。
【００３６】
本発明によれば、それを用いるとコリネ型細菌中、つまり相同系中での、Ｄ−キシロースからのＤ−キシロネートの生産が初めて可能になる、コリネ型細菌由来のタンパク質が提供される。イノシトール−２−デヒドロゲナーゼ（ＩｏｌＧ  ＥＣ  １．１．１．１８、ｉｏｌＧによりコードされる；Ｋｌａｆｆｌら、２０１３；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＪＢ．００２６５−１３（非特許文献１１））と記載されるアノテーションとは異なり、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼは、注目すべきことにはイノシトール−２−デヒドロゲナーゼ活性を有さない。思いがけず、本発明によりコリネ型細菌中でのＤ−キシロースからのＤ−キシロネートの生産を可能にする本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼは、その上、例えばカウロバクター・クレセンタス由来のｘｙｌＢのような別の公知のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼに対する著しい相同性を有さない。コリネ型細菌由来の本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの構造および特異的機能を有するタンパク質は、これまでのところ公知でない。ｉｏｌＧ／ＩｏｌＧの構造特性および機能特性に関する一般的な専門知識に反して、本発明に基づいて、コリネ型細菌中（それゆえ相同系中）でＤ−キシロースからＤ−キシロネートを生産するための、コリネ型細菌由来の具体的な相同標的配列（相同「ターゲット」）が同定かつ準備される。それゆえ、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする本発明による核酸配列の単離および準備により、それらを用いて、好ましくは、相同系であるコリネ型細菌中で、Ｄ−キシロースからＤ−キシロネートを生産できる１つまたは複数の新規構造要素およびその変種が提供される。本発明によれば、Ｄ−キシロネート生産をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、好ましくは、単離された本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いて酵素的に、または生体中、好ましくは、細菌、酵母もしくは真菌中で微生物により行う。特に好ましくは、Ｄ−キシロネート生産を、コリネ型細菌、またはサッカロミセス属もしくはアスペルギルス属の生物中で行う。本発明は、一変形形態において、初めて、コリネ型細菌を用いたＤ−キシロネート生産用の相同系を提供する。
【００３７】
それゆえ、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする本発明による核酸配列の単離および準備により、それを用いてＤ−キシロースからＤ−キシロネートを生産できる１つまたは複数の新規構造要素が提供される。本発明によれば、Ｄ−キシロネート生産をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、好ましくは、単離された本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを用いて酵素的に、または生体中、好ましくは、細菌、酵母もしくは真菌中で微生物により行う。特に好ましくは、Ｄ−キシロネート生産を、コリネ型細菌、またはサッカロミセス属もしくはアスペルギルス属の生物中で行う。本発明はさらに、ＩｏｌＴ１およびＩｏｌＧをコードする遺伝子配列の５’−上流調節領域における本発明により最低限かつきわめて確定的なヌクレオチド置換により、明らかに高まったＤ−キシロネート生産を達成できることを明確に示す。つまり、それを、望ましくないであろう、異種生物由来の遺伝子または構造の、コリネ型細菌株内への導入の必要なしに可能にし、さらには、中心的に作用する調節因子（ＩｏｌＲ）において、広範に未定義の生理学的影響を生物中で引き起こし得る極端な欠失を行う必要なしに可能にする。その際、本発明により少数の特異的なヌクレオチド置換は、自然界においても大いに起こるような範囲にあるため、本発明によるコリネ型細菌株をｎｏｎ−ＧＭＯとして特徴付ける。それゆえ、本発明は、一変形形態において、初めて、コリネ型細菌を用いたＤ−キシロネート生産用の相同系を提供する。
【００３８】
本発明の主旨での「相同」とは、本発明によるＤ−キシロネートデヒドロゲナーゼおよびそれをコードする核酸配列が、系統的に（ｖｅｒｗａｎｄｔｓｃｈａｆｔｌｉｃｈ）、コリネ型細菌細胞の共通の親株に由来することと理解される。「相同」は、本発明により用語「非異種」と同義に使用する。
【００３９】
注目すべきは、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼまたはそれをコードする本発明による核酸配列が、最もよく記載されている、カウロバクター・クレセンタス由来のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ（遺伝子ｘｙｌＢによってコードされるＸｙｌＢ）に対しておよそ１５％の同一性しか有さないことである（図１）。
【００４０】
本発明の主題は、コリネ型細菌から単離された、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列である。本発明の一変形形態は、コリネ型細菌から単離された、Ｄ−キシロネート生産用のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列に関し、ただし、その生産は、本発明によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ同様に生体中でも行われる。
【００４１】
本発明によるさらなる変形形態は、Ｄ−キシロネートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産に関し、その場合、好ましくは、単離型の本発明よるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを利用した酵素的生産に関する。本発明によれば、生体中でのＤ−キシロネートの生産が好ましく、コリネ型細菌、酵母および真菌を含む群から選択される宿主細胞中でのＤ−キシロネートの微生物生産が特に好ましい。本発明によれば、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、サッカロミセスおよびアスペルギルスを含む群から選択される属の宿主細胞中でのＤ−キシロネートの微生物生産が、特に好ましい。本発明によれば、コリネバクテリウム中でのＤ−キシロネートの微生物生産が、とりわけ好ましい。サッカロミセス・セレビシエ、アスペルギルス・ニゲルまたはコリネバクテリウム・グルタミクムを用いたＤ−キシロネート生産も本発明により含まれる。
【００４２】
本発明によれば、ａ）配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列、またはｂ）ストリンジェントな条件下に配列番号１による核酸配列ならびに／またはその断片および／もしくは対立遺伝子の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列、またはｃ）配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子、またはｄ）ａ）〜ｃ）による核酸の各々に応じて、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列であって、遺伝暗号の縮重または機能的中立変異により、ａ）〜ｃ）によるそれらの核酸配列とは異なる核酸配列を含む群から選択される核酸配列が含まれる。本発明の主題は、Ｄ−キシロネートを生産するための本発明による核酸配列である。本発明によれば、Ｄ−キシロネートの生産は、好ましくは生きた微生物中で、特に好ましくはコリネ型細菌中で行う。
【００４３】
本発明の主題は、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする本発明による核酸配列の非コード調節領域内にある作動可能に連結された１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または作動可能に連結された１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位が部分的もしくは完全に欠失していることを特徴とする核酸配列でもある。
【００４４】
本発明の主旨では、「低下もしくはスイッチオフされた機能性」とは、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの機能性およびそれをコードする本発明による核酸配列に関してではなく、特に、中心的に作用する調節タンパク質ＩｏｌＲが、通常、そこに結合することにより、コードする核酸配列の発現が抑制されるＩｏｌＲ結合部位の改変した機能性に関する。本発明の主旨での「低下した」または「スイッチオフされた」とは、コードする核酸配列の発現が、野生型宿主細胞での状況と比べて劣っているか、またはもはや調節因子ＩｏｌＲの発現制御下にないことを意味する。本発明の主旨では、「低下した」または「スイッチオフされた」とは、「脱調節された」または「脱抑制された」と同じ意味と理解され得る。
【００４５】
本発明の主旨での用語「核酸配列」は、遺伝情報を輸送するあらゆる相同分子単位を意味し、それに応じて、相同遺伝子、好ましくは天然に存在するおよび／または非組換えの相同遺伝子ならびに相同導入遺伝子またはコドン最適化相同遺伝子に関する。用語「核酸配列」は、本発明によれば、特異的タンパク質をコードまたは発現する核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に関する。好ましくは、用語「核酸配列」が、コード配列に先行する（アップストリーム、上流、５’−非コード配列）、および後続する（ダウンストリーム、下流、３’−非コード配列）調節配列を含有する核酸配列に関する。用語「天然に存在する」遺伝子は、自然界に見出される、例えば、コリネ型細菌細胞の野生型株に由来する、その固有の調節配列を有する遺伝子に関する。
【００４６】
用語「作動可能に連結された領域」は、本発明の主旨では、個々の核酸断片上での核酸配列の会合に関するため、一方の核酸配列の機能が他方の核酸配列の機能によって影響されることになる。プロモーターの関連または調節タンパク質の結合部位の関連では、本発明の主旨での用語「作動可能な連結」は、コード配列が、その発現を調節する調節領域（特にプロモーターまたは調節因子結合部位）の制御下にあることを意味する。
【００４７】
２２個を超える異なる遺伝子が、調節タンパク質ＩｏｌＲによって調節されると推測される。例えば、ｉｏｌＲそれ自体（負の自己調節）、ｉｏｌＴ１、ｉｏｌＣ（およびｉｏｌＣと共にクラスターまたはオペロン中で組織化されるさらなる遺伝子）が、ＩｏｌＲによって調節されることが公知である。本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする（その機能の点ではイノシトール−２−デヒドロゲナーゼとアノテーションされる、ｉｏｌＧによってコードされる）本発明による核酸配列は、コリネ型細菌においてはミオイノシトール異化作用の遺伝子クラスター中に組織化されている（Ｋｌａｆｆｌら、２０１３；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＪＢ．００２６５−１３（非特許文献１１））。この遺伝子クラスターの第１の遺伝子がｉｏｌＣ遺伝子であるため、本発明によれば、以下ではｉｏｌＣクラスターと呼ぶ。ｉｏｌＣクラスターと作動可能に連結された調節領域は、したがって、ｉｏｌＧ遺伝子の発現、それゆえ本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする本発明による核酸配列も調節する。
【００４８】
本発明は、用語「改変」により、例えば「遺伝子改変」も意味し、ただし、本発明によると、遺伝子工学的方法を使用するものの核酸分子の挿入は生じないことを意味する。本発明の主旨では、「改変」により置換および／または欠失、好ましくは置換が意味される。本発明の主旨での「改変」または「遺伝子改変」は、好ましくは本発明による核酸の非コード調節領域内で生み出される。その改変がｉｏｌＲ結合部位の機能性およびＩｏｌＲ結合に対して測定可能な、「低下」または「スイッチオフ」の主旨での影響を有する、本発明の主旨でのコードする遺伝子または遺伝子クラスターの調節領域内にある、あらゆる可能な位置が意味されかつ含まれる。
【００４９】
本発明の本発明による一変形形態は、ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位内の１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を含む核酸配列に関する。本発明の主旨での好ましい変形形態は、配列番号７および配列番号８による核酸配列の群から選択されるような核酸配列である。
【００５０】
Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの、およびコリネ型細菌細胞由来のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする本発明による核酸配列の本発明による単離および準備により、初めて、Ｄ−キシロネートの微生物生産、好ましくは発酵生産に適切である相同の、遺伝的に定義された非組換え（ｎｏｎ−ＧＭＯ）コリネ型細菌細胞を製造することができる。
【００５１】
用語「非組換え」とは、本発明の主旨では、本発明によるコリネ型細菌細胞の遺伝物質が単に、自然なやり方で、例えば、自然組換えまたは自然突然変異によって起こり得るであろうようにのみ改変していることと理解される。それゆえ、本発明によるコリネ型細菌細胞は、非遺伝子改変生物（ｎｏｎ−ＧＭＯ）であることを特徴とする。
【００５２】
それにより、組換えまたは異種の遺伝子材料を細胞に導入する必要なく、工業的に興味を引く、コリネ型細菌の産生株をさらに最適化する可能性も開かれる。それゆえ、本発明は、それを用いると明らかにより簡単、より安定、より安価、かつより経済的にＤ−キシロネートの微生物生産を行うことができる系を提供する。なぜなら、Ｄ−キシロネート合成能力を有するこれまで公知のすべての産生株、例えばグルコノバクター・オキシダンスは、その増殖に複合培地を必要とするため、培養に明らかにより手間がかかり、より高価、したがってより不経済になる。その上、これまで記載されたすべてのＤ−キシロネート生産者は、「非自然の」遺伝子改変生物（ＧＭＯ）、中でも、様々な酵母、真菌および細菌である。そのため、特定の産業分野（例えば、食品産業および医薬品産業）での使用には、より手間のかかる認可手続きゆえに欠点が生じる。
【００５３】
本発明によるコリネ型細菌細胞は、多数の利点を提供し、そのうちの選択を以下で記載する。好ましくはコリネバクテリウム属のコリネ型細菌は、あらゆる産業分野で使用可能である「Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ（一般に安全と認められている）」（ＧＲＡＳ）生物である。コリネ型細菌は、合成培地上で高い増殖速度およびバイオマス収量を達成し（Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇｅｒら、２０１２）、かつコリネ型細菌の産業上の使用においては広範囲にわたる経験が存在する（Ｂｅｃｋｅｒら、２０１２）。
【００５４】
本発明の一変形形態では、Ｄ−キシロネートを生産するための生体、好ましくは微生物、特に好ましくは細菌、酵母または真菌、とりわけ好ましくはコリネ型細菌属、例えば、コリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム、サッカロミセスまたはアスペルギルス、特にコリネバクテリウム・グルタミクム、サッカロミセス・セレビシエまたはアスペルギルス・ニゲルを製造するための上述した本発明による核酸配列の使用も含まれる。
【００５５】
本発明によれば、コリネ型細菌細胞、またはＤ−キシロネートの生産に本発明による適切な別の生物を製造するための、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号６３もしくは配列番号６４を含む群から選択される核酸配列またはそれらの断片もしくは対立遺伝子が含まれる。本発明による核酸配列の、配列番号７または配列番号６３による変形形態は、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列（ｉｏｌＧ）を含有するｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたプロモーター領域内にあるヌクレオチド変換、つまり置換を含有する。本発明による核酸配列の、配列番号８または配列番号６４による変形形態は、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列（ｉｏｌＧ）を含有するｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたプロモーター領域内にあるヌクレオチド欠失を含有する。本発明のさらなる一変形形態は、コリネ型細菌を製造するための、配列番号７または８による核酸配列の使用に関する。本発明によれば、コリネ型細菌を製造するための、配列番号６３および配列番号６４を含む群から選択される核酸配列の使用も含まれる。
【００５６】
本発明の主題は、ミオイノシトール／プロトン共輸送体（ｍｙｏ−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ／Ｐｒｏｔｏｎ−Ｓｙｍｐｏｒｔｅｒｓ）のｉｏｌＴ１遺伝子の作動可能に連結されたプロモーター領域内にあるヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を含有する核酸配列でもある。好ましい変形形態は、配列番号９または配列番号１０による核酸配列を含む。本発明の好ましい一変形形態は、コリネ型細菌を製造するための、配列番号９、または作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位が欠失している配列番号１０による核酸配列の使用に関する。
【００５７】
染色体中での１つもしくは複数の置換または１つもしくは複数の欠失を含む群から選択される１つまたは複数の改変が存在するコリネ型細菌細胞が特に好ましい。
【００５８】
本発明の主題は、本発明による相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの上昇した発現および／または高まった活性を有することを特徴とする、Ｄ−キシロネートを生産するためのコリネ型細菌細胞でもある。
【００５９】
本発明の主旨では、「上昇した」とは、「高まった」または「改善された」、「改変した」または「脱調節された」と同じ意味と理解され、同義で使用する。本発明の主旨での「上昇した」とは、例えば、ある遺伝子の、それぞれの元の遺伝子（Ａｕｓｇａｎｇｓｇｅｎ）の、未改変の、生来の上昇していない状態での発現と比べて上昇した遺伝子発現を意味する。本発明の主旨では、高まった酵素活性に関して同じことが意味される。例えば、コリネ型細菌細胞の野生型は、遺伝子非改変の元の遺伝子または酵素である。コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のコリネ型野生型細胞が好ましく、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムのコリネ型細菌細胞が特に好ましく、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のコリネ型細菌細胞がとりわけ好ましい。
【００６０】
本発明の一変形形態では、上述した変形形態の１つによる核酸配列の上昇した発現を有することを特徴とするコリネ型細菌細胞が含まれる。本発明によるコリネ型細菌細胞のさらなる一変形形態は、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの上昇した発現が、ａ）遺伝子発現に関する調節またはシグナル構造の改変、ｂ）コードする核酸配列の転写活性の改変、またはｃ）コードする核酸配列の遺伝子コピー数の上昇を含む群から選択される改変に基づくことを特徴とする。その際、本発明によれば、例えば、抑制遺伝子、活性化遺伝子、オペレーター、プロモーター、アテニュエーター、リボゾーム結合部位、開始コドン、ターミネーターの改変による、遺伝子発現のシグナル構造の改変が含まれる。例えば、ｔａｃプロモーターまたはＩＰＴＧ誘導性プロモーターのような、より強力なプロモーターの導入も同じく含まれる。より強力なプロモーターの導入、例えば、ｔａｃプロモーター（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ  １９８８  ６９：３０１〜１５頁）、またはＰａｔｅｋら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９６  １４２：１２９７）に記載されるプロモーターの群からのプロモーターが好ましいが、本発明はこれらに限定されない。さらなる例は、国際公開第９６／１５２４６号またはＢｏｙｄおよびＭｕｒｐｈｙ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７０：５９４９（１９８８））、ＶｏｓｋｕｉｌおよびＣｈａｍｂｌｉｓｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：３５４８（１９９８））、ＪｅｎｓｅｎおよびＨａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５８：１９１（１９９８））、Ｐａｔｅｋら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：１２９７（１９９６））、Ｋｎｉｐｐｅｒｓ（「Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ」、第６版、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、シュトゥットガルト、ドイツ、１９９５）に、またはＷｉｎｎａｃｋｅｒ（「Ｇｅｎｅ  ｕｎｄ  Ｋｌｏｎｅ」、ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、ワインハイム、ドイツ、１９９０にもある。本発明によりコードする核酸配列の高まった遺伝子コピー数は、本発明のさらなる変形形態では、染色体上にコードされて、またはベクターベースで、好ましくはプラスミドにコードされて存在し得る。本発明の主題は、コピー数の上昇が、染色体上にコードされて、または染色体外にコードされて、好ましくはベクターにコードされて、もしくはプラスミドにコードされて存在するコリネ型細菌細胞である。本発明によれば、プラスミドとして、コリネ型細菌中で複製されるようなものが適切である。多数の公知のプラスミドベクター、例えば、ｐＺ１（Ｍｅｎｋｅｌら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）６４：５４９〜５５４頁）、ｐＥＫＥｘ１（Ｅｉｋｍａｎｎｓら、Ｇｅｎｅ  １０２：９３〜９８頁（１９９１））、またはｐＨＳ２−１（Ｓｏｎｎｅｎら、Ｇｅｎｅ  １０７：６９〜７４頁（１９９１））が、潜在プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に基づく。例えば、ｐＣＧ４（米国特許第４，４８９，１６０（Ａ）号）、またはｐＮＧ２（Ｓｅｒｗｏｌｄ−Ｄａｖｉｓら���ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６６、１１９〜１２４頁（１９９０））、またはｐＡＧ１（米国特許第５，１５８，８９１（Ａ）号）に基づくような別のプラスミドベクターを同じやり方で使用できる（Ｏ．  Ｋｉｒｃｈｎｅｒ  ２００３、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０４：２８７〜９９頁）。同じく、調節可能な発現を有するベクター、例えば、ｐＥＫＥｘ２（Ｂ．  Ｅｉｋｍａｎｎｓら、１９９１、Ｇｅｎｅ  １０２：９３〜８頁；Ｏ．  Ｋｉｒｃｈｎｅｒ  ２００３、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０４：２８７〜９９頁）も使用可能である。同じく、染色体への挿入により遺伝子を単一コピー（Ｐ．  Ｖａｓｉｃｏｖａ  １９９９、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８１：６１８８〜９１頁）または多コピー（Ｄ．  Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  １９９４  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６０：１２６〜１３２頁）で発現してもよい。コピー数上昇用のベクターを用いた、望ましい株の形質転換は、例えば、Ｃ．グルタミクムの望ましい株の接合またはエレクトロポレーションによって行う。接合の方法は、例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒら（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）６０：７５６〜７５９頁）に記載されている。形質転換の方法は、例えば、Ｔａｕｃｈら（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９４）１２３：３４３〜３４７頁）に記載されている。
【００６１】
本発明のさらなる一変形形態は、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ活性の高まった活性が、ａ）コードする核酸配列の発現の上昇、ｂ）高まった触媒活性および／または基質特異性を有するＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列またはその断片の発現、ｃ）コードする核酸配列から導かれるｍＲＮＡの安定性の上昇、またはｄ）Ｄ−キシロースを変換するための相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの触媒活性および／または基質特異性の改変、またはａ）〜ｄ）の組合せを含む群から選択される改変に基づくことを特徴とするコリネ型細菌細胞に関する。ｍＲＮＡ安定性の上昇は、例えば、転写の中断を制御する末端位置の突然変異によって達成され得る。酵素タンパク質の触媒特性の改変、特に基質特異性の改変をもたらす措置は、従来技術から公知である。本発明による好ましい、調節構造の部分欠失または完全欠失に加えて、本発明によれば、例えば、転移、転換、または挿入のような改変、ならびに指向性進化法も含まれる。そのような改変の生成に関する指示は、公知の手引き書から読み取れる（Ｒ．  Ｋｎｉｐｐｅｒｓ「Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ」、第８版、２００１年、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、シュトゥットガルト、ドイツ）。
【００６２】
本発明の好ましい一変形形態は、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の非コード調節領域内にある作動可能に連結された１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位が部分的もしくは完全に欠失しているコリネ型細菌細胞を含む。
【００６３】
本発明の主題は、（本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列ｉｏｌＧを含有する）ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位内の１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を含む核酸配列を有するコリネ型細菌細胞でもある。本発明によれば、好ましい変形形態は、配列番号７および配列番号８の群から選択される配列を含む。本発明によるさらなる変形形態は、配列番号６３および配列番号６４を含む群から選択される配列を含む。
【００６４】
本発明はさらに、ｉｏｌＴ１遺伝子の作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位内の１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を含む核酸配列を有するコリネ型細菌細胞に関する。本発明による変形形態は、配列番号９および配列番号１０の核酸配列の群から選択される配列を含む。
【００６５】
本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする本発明による核酸配列に帰属する調節領域内にあるＩｏｌＲ結合部位の本発明による改変の利点は、それに応じて本発明によるコリネ型細菌が非組換え的に改変されていることである。特に、ＩｏｌＲ調節タンパク質それ自体または対応するコードｉｏｌＲ遺伝子が改変されていないことが有利である。このことは、ｉｏｌＲ／ＩｏｌＲの不活性化の結果としての不利な生理学的作用が排除されるという多大な利点を有する。それゆえ、本発明による細菌細胞は、ｎｏｎ−ＧＭＯとして、Ｄ−キシロネートの相同系中での大規模なまたは工業的な生産用の非常に魅力的なプラットフォームである。
【００６６】
それゆえ、本発明は、非組換え的に改変されているコリネ型細菌細胞にも関する。それゆえ、非遺伝子工学的に改変されている（ｎｏｎ−ＧＭＯ）コリネ型細菌細胞も本発明により含まれる。
【００６７】
本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の増加したコピー数が、染色体上にコードされて存在するコリネ型細菌細胞も本発明の主題である。
【００６８】
本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の増加したコピー数が、ベクターにコードされて、好ましくはプラスミドにコードされて存在するコリネ型細菌細胞も本発明の主題である。
【００６９】
本発明の好ましい変形形態では、ｉｏｌＧ遺伝子が染色体上にコードされて増加したコピー数で存在し、かつ対応するＩｏｌＲ結合部位が欠失しているコリネ型細菌が含まれる。さらなる好ましい一変形形態では、本発明によるコリネ型細菌細胞が、さらに、欠失により改変され、それゆえＩｏｌＲ非依存性に発現するｉｏｌＴ１遺伝子を有する。この、非組換え的、つまり相同かつその上、正確に定義されているコリネ型細菌細胞は、有利なやり方で、Ｄ−キシロースを含有する炭素源およびエネルギー源を含む溶液中でのＤ−キシロネートの大規模な微生物生産に適切である。
【００７０】
本発明によれば、キシロースデヒドロゲナーゼ活性の上昇に加えて、同じく調節タンパク質ＩｏｌＲによって調節される１つまたは複数の遺伝子またはタンパク質の発現または活性を改変させることが、Ｄ−キシロネートの生産にとって有利であり得る。
【００７１】
通常、遺伝子非改変のコリネ型細菌は、Ｄ−キシロースを唯一の炭素源およびエネルギー源として代謝できない。Ｄ−キシロースを酸化代謝するためのいわゆるイソメラーゼおよびＷｅｉｍｂｅｒｇ代謝経路をコリネ型細菌内に異種導入する必要があることが公知である。該当する、生物由来の遺伝子、例えば、カウロバクター・クレセンタス由来のｘｙｌＢの異種発現により、コリネ型細菌もＤ−キシロースを酵素的に変換できる。しかしながら、異種発現は、本発明によれば、それに伴う、工業的なＤ−キシロネート生産に対する不利な特性ゆえ優先的には望ましくない。さらに、その遺伝子がＩｏｌＲ調節タンパク質の制御下にあるミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ１）が、コリネ型細菌の細胞へのＤ−キシロースの摂取に貢献することが公知である。それゆえ、ｉｏｌＲ調節遺伝子の結合を阻止する、ｉｏｌＴ１遺伝子の調節領域内での改変、例えば、欠失またはヌクレオチド置換により、ｉｏｌＲ調節因子の調節から独立した細菌株を生成できる。本発明によるコリネ型細菌細胞のさらなる一変形形態では、脱調節されたｉｏｌＴ１遺伝子が存在し、その細胞では同じく、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの本発明により上昇した発現および／または高まった活性が存在する。遺伝子ｉｏｌＴ２も同じく、Ｄ−キシロースの異化作用にとって重要である。本発明によれば、ｉｏｌＴ２遺伝子の増強された発現および／またはミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ２の高まった活性を含有するコリネ型細菌細胞が、含まれる。
【００７２】
本発明の主題は、ａ）本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇している、ｂ）本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする本発明による核酸配列の発現が増強している、ｃ）配列番号３によるミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ１）またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、ｄ）配列番号４によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１の活性が上昇している、ｅ）配列番号９および配列番号１０の核酸配列またはその断片の群から選択される、ｉｏｌＴ１遺伝子の作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位内の１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ１）をコードする核酸配列を有する、ｆ）配列番号５によるミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ２）またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、ｇ）配列番号６によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ２の活性が上昇している、ｈ）ｃ）およびｆ）によるミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１／２をコードする両核酸配列の発現が上昇している、ｉ）ｄ）およびｇ）による両ミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１／２の活性が上昇している、ｊ）（本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードするｉｏｌＧを含有する）ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの非コード調節領域内にある作動可能に連結された１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位が部分的もしくは完全に欠失している核酸配列を有する、ｋ）好ましくは、配列番号７、配列番号８、配列番号６３、および配列番号６４による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を含む群から選択される、ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位内の１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有する核酸配列を有する、またはｌ）ａ）〜ｋ）の組合せであるコリネ型細菌細胞である。
【００７３】
本発明によるコリネ型細菌細胞の好ましい一変形形態では、該コリネ型細菌細胞が、そのゲノムの特定の改変、つまり脱調節されたｉｏｌＴ１遺伝子および脱調節されたｉｏｌＧ遺伝子の改変を含む。ｉｏｌＴ遺伝子もしくは／およびｉｏｌＧ遺伝子（またはｉｏｌＧ遺伝子を含むｉｏｌＣ遺伝子クラスター）の調節領域の改変がさらに好ましい。特にその場合、ＩｏｌＲ調節タンパク質の結合部位の置換または欠失が好ましい。欠失がさらに好ましい。それに応じて本発明による細菌細胞は、遺伝子改変されておらず、組換えＤＮＡを有さないため、Ｄ−キシロネートの大規模な生産、例えば、医薬品産業または食品産業における使用向けのｎｏｎ−ＧＭＯであることを特に有利に特徴とする。
【００７４】
本発明の一変形形態では、ミオイノシトール調節因子ＩｏｌＲまたはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列が完全もしくは部分的に欠失している、またはｉｏｌＲ遺伝子の発現が低下もしくは欠如している、またはミオイノシトール調節因子ＩｏｌＲの活性が低下もしくは完全にスイッチオフされていることも可能である。
【００７５】
コリネ型細菌細胞の好ましい変形形態は、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、特にコリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、またはブレビバクテリウム・ディバリカタムを含む群から選択される。コリネ型細菌細胞の特に好ましい変形形態は、コリネバクテリウム・グルタミクム  ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム  ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム  ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９、またはブレビバクテリウム・ディバリカタム  ＡＴＣＣ１４０２０を含む群から選択される。限定されないが、コリネバクテリウム・グルタミクムが特に好ましい。
【００７６】
本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ、それをコードする本発明による核酸配列、ならびに本発明による使用は、その上、例えば相同発現系を必ずしも必要としない、広義でのＤ−キシロネートの生産にも適切である。それゆえ、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼおよび／もしくはそれをコードする本発明による核酸配列を有する、ならびに／またはその中で上述の要素（例えば、（調節性の）配列、遺伝子、タンパク質）の本発明による使用またはＤ−キシロネートの生産方法が行われる異種の系または宿主細胞または生物も本発明により含まれる。それゆえ本発明によれば、ｉｏｌＲ遺伝子の発現が低下もしくは欠如している、またはｉｏｌＲ遺伝子が部分的もしくは完全に欠失している、またはＩｏｌＲ調節タンパク質の活性が低下もしくは完全にスイッチオフされている、コリネ型細菌細胞同様に異種宿主系も含まれる。
【００７７】
本発明によるさらなる変形形態は、Ｄ−キシロネートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産、好ましくは精製された本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼを利用した酵素的生産に関する。本発明によれば、コリネ型細菌、酵母および真菌を含む群から選択される宿主細胞中でのＤ−キシロネートの微生物生産が好ましい。本発明によれば、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、サッカロミセスおよびアスペルギルスを含む群から選択される属の宿主細胞中でのＤ−キシロネートの微生物生産が、特に好ましい。本発明によれば、コリネバクテリウム中でのＤ−キシロネートの微生物生産が、とりわけ好ましい。本発明によれば、サッカロミセス・セレビシエ、アスペルギルス・ニゲルまたはコリネバクテリウム・グルタミクムを用いたＤ−キシロネート生産も含まれる。
【００７８】
本発明は、Ｄ−キシロースからＤ−キシロネートを生物工学的に生産するための異種系またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で使用するための、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの使用またはそれをコードする本発明による核酸配列にも関する。
【００７９】
本発明の主題は、ａ）水およびＣ５炭素源を含有する溶液を準備するステップ、
ｂ）相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の発現が増強している、および／または相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇している本発明によるコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップａ）による溶液中で、Ｃ５炭素源をＤ−キシロネートへ微生物変換するステップ、および
ｃ）任意選択的に該溶液からＤ−キシロネートを単離および／または調製するステップ
を含む、Ｄ−キシロネートの生産方法である。
【００８０】
「溶液」とは、本発明によれば、「培地」、「培養培地」、「培養液」または「培養溶液」と同じ意味と理解され得る。本発明の主旨では、「微生物による」とは、「生物工学的」または「発酵性」と同じ意味で理解され得る。「変換」とは、本発明によれば、「代謝（Ｖｅｒｓｔｏｆｆｗｅｃｈｓｌｕｎｇ）」、「代謝（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｉｅｒｕｎｇ）」または「培養」と同じ意味と理解され得る。「調製」とは、本発明によると、「分離」、「濃縮」または「精製」と同じ意味と理解され得る。
【００８１】
本発明の変形形態では、本発明によるコリネ型細菌細胞を使用する。本発明によれば、ステップｂ）でのＤ−キシロースデヒドロゲナーゼが、配列番号２によるアミノ酸配列またはその断片に対して少なくとも７０％の同一性のアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号１による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされている方法が、含まれる。本発明のさらなる一変形形態は、ａ）本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇している、ｂ）本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする本発明による核酸配列の発現が増強している、ｃ）配列番号３によるミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ１）またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、ｄ）配列番号４によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１の活性が上昇している、ｅ）配列番号９および配列番号１０の核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の群から選択される、ｉｏｌＴ１遺伝子の作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位内の１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ１）をコードする核酸配列を有する、ｆ）配列番号５によるミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ２）またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、ｇ）配列番号６によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ２の活性が上昇している、ｈ）ｃ）およびｆ）によるミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１／２をコードする両核酸配列の発現が上昇している、ｉ）ｄ）およびｇ）による両ミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１／２の活性が上昇している、ｊ）（本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードするｉｏｌＧを含有する）ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの非コード調節領域内にある作動可能に連結された１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位が部分的もしくは完全に欠失している核酸配列を有する、ｋ）好ましくは、配列番号７、配列番号８、配列番号６３、および配列番号６４による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を含む群から選択される、ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位内の１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有する核酸配列を有する、またはｌ）ａ）〜ｋ）の組合せを有する本発明によるコリネ型細菌細胞を使用する方法を含む。
【００８２】
本発明による方法の一変形形態では、ミオイノシトール調節因子ＩｏｌＲをコードする核酸配列またはその、完全もしくは部分的に欠失している断片を有するか、あるいはｉｏｌＲ遺伝子の発現が低下もしくは欠如しているか、またはミオイノシトール調節因子ＩｏｌＲの活性が低下もしくは完全にスイッチオフされているコリネ型細菌細胞も使用可能である。
【００８３】
本発明の主題は、水および
ａ）Ｄ−キシロース単位を含有するオリゴ糖類または多糖類、
ｂ）好ましくは少なくとも１０ｇＬ−１の濃度のＤ−キシロース、
ｃ）リグノセルロース、セルロースもしくはヘミセルロースを含有するバイオマス、その加水分解物、またはその加水分解物から得られる、Ｄ−キシロース単位を含有する抽出物、
ｄ）ａ）〜ｃ）の組合せ
を含む群から選択されるＣ５炭素源を含有する溶液中でＤ−キシロネートへの微生物変換を行う方法である。
【００８４】
本発明による方法の好ましい一変形形態では、Ｃ５炭素源としてバガス、好ましくはスクロースバガス、その加水分解物、またはその加水分解物から得られる、Ｄ−キシロースを含有する抽出物を使用する。本発明による方法の一変形形態では、培養溶液が、炭素源およびエネルギー源として、培養開始時に、Ｄ−キシロースの他に好ましくは少なくとも８〜１０ｇＬ−１のＤ−グルコースを含有する方法が含まれる。
【００８５】
使用する培養培地は、適切なやり方で各微生物の要件を満たすべきである。様々な微生物の培養培地の記載は、ハンドブック「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１年）に含まれている。Ｄ−キシロネート形成の出発基質としてのＤ−キシロースに加えて、炭素源として糖および炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、乳糖、果糖、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例えば、ダイズ油、ヒマワリ油、落花生油およびヤシ油、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例えば、グリセロールおよびエタノール、ならびに有機酸、例えば酢酸を使用してもよい。これらの物質は、個別にまたは混合物として使用してもよい。窒素源としては、窒素含有有機化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粕および尿素、または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムを使用できる。窒素源は、個別にまたは混合物として使用してもよい。リン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩を使用できる。培養培地は、さらに、増殖に必須の金属塩、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含有するべきである。最後に、上述の物質に加えて必須生長促進物質、例えば、アミノ酸およびビタミンが使用可能である。上述の使用物質は、１回限りの混合液の形で培養に添加するか、または適切なやり方で培養最中に補給してもよい。培養のｐＨ制御には、塩基性化合物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、または酸性化合物、例えば、塩酸、リン酸もしくは硫酸を適切なやり方で使用する。発泡の制御には、消泡剤、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルを使用してもよい。プラスミドの安定性を維持するためには、適切な選択作用物質、例えば、抗生物質を培地に添加することができる。好気性条件を維持するためには、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培養へと導入する。培養の温度は、通常、２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。Ｄ−キシロネートの最大量が形成されるまで培養を継続する。この目標は、通常、１０時間〜１６０時間以内に達成される。
【００８６】
本発明は、培養を断続的または連続的、好ましくはバッチモード、流加モード、反復流加モードで、またはワンポット加水分解・発酵プロセスとして行う方法に関する。
【００８７】
本発明による方法の好ましい一変形形態は、流加モードで行う。Ｄ−キシロースの「補給（Ｚｕｆｕｅｔｔｅｒｕｎｇ）」が特に好ましい。
【００８８】
本発明によれば、本発明によるコリネ型細菌細胞の培養を、好ましくは少なくとも８〜１０ｇＬ−１の濃度で付加的にＤ−グルコースを含有する溶液中で行う方法も含まれる。本発明によれば、本発明によるコリネ型細菌細胞の培養を、群：ａ）窒素、好ましくは塩化アンモニウム、ｂ）リン酸塩、好ましくはリン酸カリウム、ｃ）ビオチン、およびｄ）ａ）〜ｃ）の組合せから選択される成分を付加的に含有する溶液中で行う方法も含まれる。その方法は、Ｃ５炭素源としてバガス、好ましくはスクロースバガス、その加水分解物、またはその加水分解物から得られる、Ｄ−キシロースを含有する抽出物を使用する、本発明によるコリネ型細菌細胞の培養時に特に好ましい。バガス、特に加水分解されたバガス上で培養する場合、ビオチンの使用は必ずしも必要ではない。
【００８９】
本発明による方法の好ましい一変形形態では、非組換え的に改変されているコリネ型細菌細胞を使用する。それゆえ本発明によれば、非遺伝子工学的に改変されている（ｎｏｎ−ＧＭＯ）コリネ型細菌細胞を使用する方法も含まれる。
【００９０】
Ｄ−キシロネートを生産するための、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼまたは本発明による核酸配列または本発明によるコリネ型細菌細胞の使用も本発明の主題である。本発明の一変形形態では、Ｄ−キシロネートの生産を、精製酵素を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。
【００９１】
本発明は、コリネ型細菌、好ましくはコリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム、酵母、好ましくはサッカロミセス、および真菌、好ましくはアスペルギルスを含む群から選択される宿主系を製造するための、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼまたは本発明による核酸配列の使用にも関する。本発明によれば、Ｄ−キシロネート生産用コリネ型細菌細胞を製造するための、好ましくは本発明による核酸配列と組み合わせた、配列番号９または配列番号１０の群から選択される核酸配列も含まれる。本発明の好ましい一変形形態は、Ｄ−キシロネートを微生物生産するためにコリネバクテリウム・グルタミクムを使用する。
【００９２】
本発明はさらに、記載される本発明の変形形態による、精製酵素、核酸配列によりコードされる酵素、コリネ型細菌細胞または方法を用いて生産されたＤ−キシロネートを含有する組成物に関する。本発明による組成物は、所望の生成物を製造する際に有利であるさらなる物質を有してもよい。選択は、当業者には従来技術から公知である。
【００９３】
記載される本発明の変形形態による、精製酵素、核酸配列によりコードされる酵素、コリネ型細菌細胞または方法を用いて生産されたＤ−キシロネートの使用、ならびに医薬品、食品、飼料、溶媒、着色剤および／または建設資材産業の構成要素、好ましくはセメントまたはコンクリートを製造するための上述の組成物の使用も本発明の主題である。その際、Ｄ−キシロネートは、セメントまたはコンクリートの特性を意図的に改善する潜在能力を有する。本発明によれば、減水剤、分散剤、またはセメントもしくはコンクリートもしくは別の建材の凝結硬化時間を延長する遅延剤として使用される。
【００９４】
表および図：
表１  本発明の細菌株およびプラスミドの一覧を示す。異なる株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ｉｏｌＧ１、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ｉｏｌＧ２およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ｉｏｌＧ３は、異なるｉｏｌＧコピー数を有する、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２の３つの挿入株を表す。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ｉｏｌＧ１は、染色体中に、相同ｉｏｌＧ遺伝子の挿入を有し、詳細にはｃｇ１１２１とｃｇ１１２２との間の遺伝子間領域内に有する。ｉｏｌＧ２は、ｉｏｌＧ１に基づき、付加的に、ｃｇ０９０１とｃｇ０９０２との間の遺伝子間領域内に相同ｉｏｌＧ遺伝子の第２の挿入を含有する。ｉｏｌＧ３は、ｉｏｌＧ２に基づき、付加的に、ｃｇ３３２７とｃｇ３３２８との間の遺伝子間領域内に相同ｉｏｌＧ遺伝子の第３の挿入を含有する。
【００９５】
表２  本発明の配列番号の一覧を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】コリネバクテリウム・グルタミクム由来の本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ（ＩｏｌＧ）の１つおよびカウロバクター・クレセンタスのＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ（ＸｙｌＢ）をコードする核酸配列（図１ａ）およびアミノ酸配列（図１ｂ）の相同性比較を示す図である。
【図２】コリネバクテリウム・グルタミクムの染色体中で、ミオイノシトール輸送体遺伝子ｉｏｌＴ１の作動可能に連結された調節結合領域内の本発明によるヌクレオチド置換を生成するプラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ  ＰＯ６ｉｏｌＴ１を示す図である。
【図３】野生型と比べた、ミオイノシトール輸送体遺伝子ｉｏｌＴ１の調節結合部位内にある本発明によるヌクレオチド置換の位置を示す図である。ｉｏｌＴ１の開始コドンに対して−１１２位（Ｃ→Ｇ）および−１１３位（Ａ→Ｇ）においてそれぞれ１つのヌクレオチドを交換した。それは、図３の本発明によるｉｏｌＴ１遺伝子の全配列内の６６５位および６６６位に相当し、その遺伝子ではヌクレオチドＡＣがＧＧに置換された。その置換は、ｉｏｌＴ１遺伝子の−３５ボックスと−１０ボックスとの間にある。
【図４】コリネバクテリウム・グルタミクムの染色体中で、（ｉｏｌＧを含有するｉｏｌＣクラスターの）炭水化物キナーゼ遺伝子ｉｏｌＣの作動可能に連結された調節結合領域内の本発明によるヌクレオチド置換を生成するプラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ  ＰＯ１３ｉｏｌＣを示す図である。
【図５】野生型と比べた、ｉｏｌＣ遺伝子の調節結合部位内にある本発明によるヌクレオチド置換の位置を示す図である。この（ｉｏｌＣ前方にある）調節領域は、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の本発明による作動可能に連結された調節領域である。なぜならｉｏｌＧ遺伝子はクラスター、いわゆる、ミオイノシトール異化作用のｉｏｌＣクラスター内に組織化されているからである。ｉｏｌＣの開始コドンに対して−５９位（Ｃ→Ｇ）および−６０位（Ａ→Ｇ）においてそれぞれ１つのヌクレオチドを交換した。それは、図５の本発明によるｉｏｌＣ遺伝子の全配列内の３８３位および３８４位に相当し、その遺伝子ではヌクレオチドＡＣがＧＧに置換された。その置換は、ｉｏｌＣ遺伝子の−１０ボックスと転写開始点（ＴＳＳ）との間にある。
【図６】コリネバクテリウム・グルタミクムの染色体中で、（ｉｏｌＧを含有するｉｏｌＣクラスターの）炭水化物キナーゼ遺伝子ｉｏｌＣの作動可能に連結された調節結合領域内の本発明によるヌクレオチド置換を生成するプラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ  ＰＯ５〜Ｏ９ｉｏｌＣを示す図である。
【図７】野生型と比べた、ｉｏｌＣ遺伝子の調節結合部位内にある本発明によるヌクレオチド置換の位置を示す図である。この（ｉｏｌＣ前方にある）調節領域は、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の本発明による作動可能に連結された調節領域である。なぜならｉｏｌＧ遺伝子はクラスター、いわゆる、ミオイノシトール異化作用のｉｏｌＣクラスター内に組織化されているからである。ｉｏｌＣの開始コドンに対して−２４０位（Ａ→Ｇ）、−２３９位（Ｃ→Ｇ）、−１７４位（Ａ→Ｇ）および−１７３位（Ｃ→Ｇ）においてそれぞれ１つのヌクレオチドを交換した。それは、図７の本発明によるｉｏｌＣ遺伝子の全配列内の１４３位、１４４位、２１１位および２１２位に相当し、その遺伝子ではそれぞれヌクレオチドＡＣがＧＧに置換された。その置換は、ｉｏｌＣ遺伝子の−１０ボックスおよび転写開始点（ＴＳＳ）の５’上流にある。
【図８】コリネバクテリウム・グルタミクムの染色体中で、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列ｉｏｌＧを欠失させるプラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ＿ΔｉｏｌＧを示す図である。
【図９】コリネバクテリウム・グルタミクムの染色体中で、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列ｉｏｌＧを構成的Ｔｕｆプロモーターの制御下、ｃｇ１１２１とｃｇ１１２２との間の遺伝子間領域に挿入するプラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ  ｎｃｒ  ｃｏｎｓ  Ｐｔｕｆ  ｉｏｌＧを示す図である。
【図１０】コリネバクテリウム・グルタミクムの染色体中で、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列ｉｏｌＧを構成的Ｔｕｆプロモーターの制御下、ｃｇ０９０１とｃｇ０９０２との間の遺伝子間領域に挿入するプラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ  ＣｇＬＰ４  ＰＴｕｆ  ｉｏｌＧを示す図である。
【図１１】コリネバクテリウム・グルタミクムの染色体中で、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列ｉｏｌＧを構成的Ｔｕｆプロモーターの制御下、ｃｇ３２２７とｃｇ３２２８との間の遺伝子間領域に挿入するプラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ  ＣｇＬＰ１２  ＰＴｕｆ  ｉｏｌＧを示す図である。
【図１２】本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列ｉｏｌＧをコリネバクテリウム・グルタミクム中で増強して発現させるプラスミドｐＥＫＥｘ３  ｉｏｌＧを示す図である。
【図１３】本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列ｉｏｌＧを大腸菌ＢＬ２１中で増強して発現させるプラスミドｐＥＴ２８ｂ  ｉｏｌＧを示す図である。
【図１４】様々な変形形態のコリネ型細菌株の増殖、Ｄ−キシロースの摂取または蓄積およびＤ−キシロネート形成を示す図である。
【図１５】様々な変形形態のコリネ型細菌株の増殖、Ｄ−キシロースの摂取または蓄積およびＤ−キシロネート形成を示す図である。
【図１６】様々な変形形態のコリネ型細菌株のＤ−キシロネート形成を示す図である。
【図１７】ＮＡＤＨ濃度（ｍＭ、青色の点）に関する反応速度論的アッセイにおける３４０ｎｍでの吸光シグナルの検量線を示す図である。有効な検量線を、０〜１ｍＭのＮＡＤＨの範囲に指定し、該当する回帰直線（赤色破線）と帰属のパラメーター、その値および誤差をプロットしてある。
【図１８】基質としてＤ−キシロースを用いた本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの、使用した様々なＤ−キシロース濃度に対する変換曲線を示す図である（左上の２５ｍＭから右下の１ｍＭまで）。記録した２０分間の吸光測定を示す。
【図１９】基質としてミオイノシトールを用いたＩｏｌＧの変換曲線を示す図であり、描写は図１８に相応する。
【図２０−１】ＩｏｌＧによるＤ−キシロース変換に関する初期反応速度の算出を示す図である。およそ２．５分後から１０回の連続する測定（青色の点、およそ２分間）に関して、それぞれ２５ｍＭ（左上）から１ｍＭ（右下）までの使用した様々なＤ−キシロース濃度に対する、吸光シグナルの較正によるＮＡＤＨ形成（ｍＭ）を示す。各初期反応速度（赤色線）は、回帰直線の傾きからｍＭ／分で得られ、検量線の各パラメーターを、値および誤差と共に個々のキャプションに示す。
【図２０−２】ＩｏｌＧによるＤ−キシロース変換に関する初期反応速度の算出を示す図である。およそ２．５分後から１０回の連続する測定（青色の点、およそ２分間）に関して、それぞれ２５ｍＭ（左上）から１ｍＭ（右下）までの使用した様々なＤ−キシロース濃度に対する、吸光シグナルの較正によるＮＡＤＨ形成（ｍＭ）を示す。各初期反応速度（赤色線）は、回帰直線の傾きからｍＭ／分で得られ、検量線の各パラメーターを、値および誤差と共に個々のキャプションに示す。
【図２１】本発明のＤ−キシロネートデヒドロゲナーゼＩｏｌＧによりＤ−キシロースを変換する際の初期反応速度からのミカエリス・メンテン酵素反応速度論に関するパラメーター推定を示す図である（黒色の点）。パラメーターは、加重非線形回帰を利用して、正規分布の測定誤差を仮定して特定したため、ミカエリス・メンテン速度式のパラメーターの最尤推定に相当する。結果として生じる速度式は、黒色破線として示し、さらに、最尤推定の共分散行列による２次元正規分布に相当するランダム値に基づく速度式を陰影面としてプロットしてある。
【実施例】
【００９７】
本説明を以下の例によってより詳細に説明するが、例は限定的ではない。
【００９８】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのヌクレオチド置換による、ミオイノシトール輸送体ＩｏｌＴ１のプロモーター領域内にある調節結合部位の改変
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＰＯ６ｉｏｌＴ１を、ＮｉｅｂｉｓｃｈおよびＢｏｔｔ（２００１年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２０３０１００２６２）に基づきベクターｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢを用いて、二重相同組換え（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、１９９４年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０３７８〜１１１９（９４）９０３２４〜７）を介して構築した。そのために、第１のステップでは、２つの交換対象のヌクレオチドを有する、ｉｏｌＴ１遺伝子前方の５’領域（プライマー：ＰｒｏｍｉｏｌＴ１＿ｆｗ＿ｆｗ／ＰｒｏｍｉｏｌＴ１ｆｗ＿ｒｅｖ）または遺伝子の３’領域（プライマー：Ｐｉｏｌｔ１＿ｒｅｖ＿ｆｗ／Ｐｉｏｌｔ１＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ）を含有する２つのＰＣＲ産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の５００塩基対を増幅した。第２のステップでは、ＤＮＡ断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼｘＢａＩおよびＥｃｏＲＩで切断してあるｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．１３１８）。そのようにして得られた該プラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ＿ＰＯ６ｉｏｌＴ１を、ヒートショックを利用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーＰＣＲおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのＤＮＡ配列を特定した。プラスミドを単離後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍエレクトロコンピテントセルのアリコート１５０μｌを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド１〜４．５μｇを混合し、氷上で予冷した０．２ｃｍのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、４℃の冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロール８００μＬを覆い重ね、エレクトロポレーター（２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω、２ｍｍ）中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、４６℃に予熱したＢＨＩＳ培地４ｍＬ中に移して、６分間４６℃でインキュベーションした。続いて、細胞を２時間、３０℃において、１７０ｒｐｍでインキュベーションし、懸濁液をＢＨＩＳ−Ｋａｎ１５寒天上にまいた。続いて、クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上とに移すことによりｓａｃＢ遺伝子の機能を試験した。第２の組換え現象における成功した除去を選択するために、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５上で培養した細胞を、およそ５ｈ、ＢＨＩ培地５ｍｌ中で培養し、培養物１００μｌおよび１：１０希釈物を、１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上にまいた。クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーＰＣＲ（プライマー：ｃｈｅｃｋＰｒｏｍｉｏｌＴ１ｆｗ／ｃｈｅｃｋＰｒｏｍｉｏｌＴ１ｒｅｖ）に続きＤＮＡシークエンシングを行い、ヌクレオチド置換の成功を確認した。
【００９９】
プライマー：
ＰｒｏｍｉｏｌＴ１＿ｆｗ＿ｆｗ：ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＧＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣ
ＰｒｏｍｉｏｌＴ１ｆｗ＿ｒｅｖ：ＧＧＣＡＧＡＣＡＣＧＡＴＡＴＣＣＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＧＧＧＡＡ
Ｐｉｏｌｔ１＿ｒｅｖ＿ｆｗ：ＣＧＧＧＧＧＡＴＡＴＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＧＡＴＴＡＡＡＧ
ｐｉｏｌｔ１＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧ
ｃｈｅｃｋＰｒｏｍｉｏｌＴ１ｆｗ：ＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＣＡＣＴＴＣＧＣＡＣＣＣＴＴ
ｃｈｅｃｋＰｒｏｍｉｏｌＴ１ｒｅｗ：ＣＡＡＣＴＣＡＴＴＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣ
【０１００】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのヌクレオチド置換による、炭水化物キナーゼＩｏｌＣのプロモーター領域内にある調節結合部位の改変
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＰＯ６ｉｏｌＴ１ＰＯ１３ｉｏｌＣを、ＮｉｅｂｉｓｃｈおよびＢｏｔｔ（２００１年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２０３０１００２６２）に基づきベクターｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢを用いて、二重相同組換え（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、１９９４年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０３７８〜１１１９（９４）９０３２４〜７）を介して構築した。そのために、第１のステップでは、２つの交換対象のヌクレオチドを有する、ｉｏｌＣ遺伝子前方の５’領域（プライマー：ＰＯ１３  ｉｏｌＣ  ｆｗ／ＰＯ１３  ｉｏｌＣ  ｒｅｖ）または遺伝子の３’領域（プライマー：ＰＯ１３  ｉｏｌＣ  ｒｅｖ＿ｆｗ／ＰＯ１３  ｉｏｌＣ  ｒｅｖ＿ｒｅｖ）を含有する２つのＰＣＲ産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の５００塩基対を増幅した。第２のステップでは、ＤＮＡ断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼｘＢａＩおよびＥｃｏＲＩで切断してあるｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．１３１８）。そのようにして得られた該プラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ＿ＰＯ１３ｉｏｌＣを、ヒートショックを利用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーＰＣＲおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのＤＮＡ配列を特定した。プラスミドを単離後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＰＯ６ｉｏｌＴ１エレクトロコンピテントセルのアリコート１５０μｌを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド１〜４．５μｇを混合し、氷上で予冷した０．２ｃｍのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、４℃の冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロール８００μＬを覆い重ね、エレクトロポレーター（２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω、２ｍｍ）中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、４６℃に予熱したＢＨＩＳ培地４ｍＬ中に移して、６分間４６℃でインキュベーションした。続いて、細胞を２時間、３０℃において、１７０ｒｐｍでインキュベーションし、懸濁液をＢＨＩＳ−Ｋａｎ１５寒天上にまいた。続いて、クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上とに移すことによりｓａｃＢ遺伝子の機能を試験した。第２の組換え現象における成功した除去を選択するために、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５上で培養した細胞を、およそ５ｈ、ＢＨＩ培地５ｍｌ中で培養し、培養物１００μｌおよび１：１０希釈物を、１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上にまいた。クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーＰＣＲ（プライマー：Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｏｍ  ｉｏｌＣ  ｆｗ／Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｏｍ  ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ）に続きＤＮＡシークエンシ���グを行い、ヌクレオチド置換の成功を確認した。
【０１０１】
プライマー：
ＰＯ１３  ｉｏｌＣ  ｆｗ：ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＧＧＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＧＡＧＧＣ
ＰＯ１３  ｉｏｌＣ  ｒｅｖ：ＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＡＴＣＧＣＡＴＣＣＣＡＴＧＡＣＡＡＴＡＡＣＡＣ
ＰＯ１３  ｉｏｌＣ  ｒｅｖ＿ｆｗ：ＧＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＧＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＣＡＣＡＴＴＣ
ＰＯ１３  ｉｏｌｃ  ｒｅｖ＿ｒｅｖ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴＧＧＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＡＡＡＣＣＡＧ
Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｏｍ  ｉｏｌＣ  ｆｗ：ＴＣＴＣＧＴＴＴＴＣＴＡＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧ
Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｏｍ  ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ：ＣＧＡＣＧＧＴＴＣＧＣＡＣＧＡＧＴＡＧＴＣＡ
【０１０２】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのヌクレオチド置換による、炭水化物キナーゼＩｏｌＣのプロモーター領域内にある調節結合部位の改変
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＰＯ６ｉｏｌＴ１ＰＯ５〜Ｏ９ｉｏｌＣを、ＮｉｅｂｉｓｃｈおよびＢｏｔｔ（２００１年）（ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００２０３０１００２６２）に基づきベクターｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢを用いて、二重相同組換え（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、１９９４年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０３７８〜１１１９（９４）９０３２４〜７）を介して構築した。そのために、第１のステップでは、４つの交換対象のヌクレオチドを有する、ｉｏｌＣ遺伝子のコード領域前方の５’領域（プライマー：ＰＯ５〜ＰＯ９  ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｆｗ／ＰＯ５〜ＰＯ９  ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｒｅｖ）またはｉｏｌＣ遺伝子の３’末端（プライマー：ＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｆｗ／ＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ）を含有する２つのＰＣＲ産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の５００塩基対を増幅した。第２のステップでは、ＤＮＡ断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断してあるｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９年）（ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．１３１８）。そのようにして得られた該プラスミドを、ヒートショックを利用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーＰＣＲおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのＤＮＡ配列を特定した。プラスミドを単離後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＰＯ６ｉｏｌＴ１エレクトロコンピテントセルのアリコート１５０μｌを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド１〜４．５μｇを混合し、氷上で予冷した０．２ｃｍのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、４℃の冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロール８００μＬを覆い重ね、エレクトロポレーター（２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω、２ｍｍ）中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、４６℃に予熱したＢＨＩＳ培地４ｍＬ中に移して、６分間４６℃でインキュベーションした。続いて、細胞を２時間、３０℃において、１７０ｒｐｍでインキュベーションし、懸濁液をＢＨＩＳ−Ｋａｎ１５寒天上にまいた。続いて、クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上とに移すことによりｓａｃＢ遺伝子の機能を試験した。第２の組換え現象における成功した除去を選択するために、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５上で培養した細胞を、およそ５ｈ、ＢＨＩ培地５ｍｌ中で培養し、培養物１００μｌおよび１：１０希釈物を、１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上にまいた。クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーＰＣＲ（プライマー：ＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｃｈｅｃｋ＿ｆｗ／ＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｃｈｅｃｋ＿ｒｅｖ）に続きＤＮＡシークエンシングを行い、ヌクレオチド置換の成功を確認した。
【０１０３】
プライマー：
ＰＯ５〜ＰＯ９  ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｆｗ：ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＧＧＴＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＴＣ
ＰＯ５〜ＰＯ９  ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｒｅｖ：ＴＡＡＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＡＡＴＧＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡ
ＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｆｗ：ＧＧＡＡＴＧＡＧＴＡＧＣＧＡＡＡＣＴＴＡＧＴＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＴＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＧＧＴＧＣＡＡ
ＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧ
ＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｃｈｅｃｋ＿ｆｗ：ＧＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＴ
ＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｃｈｅｃｋ＿ｒｅｖ：ＧＧＧＧＴＣＴＴＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡＴＣＧＧＴＧＧ
【０１０４】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのヌクレオチド欠失による、ミオイノシトール輸送体ＩｏｌＴ１のプロモーター領域内にある調節結合部位の改変
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ΔＰＯ６ｉｏｌＴ１を、ＮｉｅｂｉｓｃｈおよびＢｏｔｔ（２００１年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２０３０１００２６２）に基づきベクターｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢを用いて、二重相同組換え（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、１９９４年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０３７８〜１１１９（９４）９０３２４〜７）を介して構築した。そのために、第１のステップでは、２つのヌクレオチドが欠失した、ｉｏｌＴ１遺伝子前方の５’領域（プライマー：ＤＰＯ６ｉｏｌＴ１＿Ｆｗ＿ｆｗ／ＤＰＯ６ｉｏｌＴ１＿Ｆｗ＿ｒｅｖ）または遺伝子の３’領域（プライマー：ＤＰＯ６ｉｏｌＴ１＿ｒｅｖ＿ｆｗ／ＤＰＯ６ｉｏｌＴ１＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ）を含有する２つのＰＣＲ産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の５００塩基対を増幅した。第２のステップでは、ＤＮＡ断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼｘＢａＩおよびＥｃｏＲＩで切断してあるｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．１３１８）。そのようにして得られた該プラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ＿ΔＰＯ６ｉｏｌＴ１を、ヒートショックを利用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーＰＣＲおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのＤＮＡ配列を特定した。プラスミドを単離後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍエレクトロコンピテントセルのアリコート１５０μｌを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド１〜４．５μｇを混合し、氷上で予冷した０．２ｃｍのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、４℃の冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロール８００μＬを覆い重ね、エレクトロポレーター（２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω、２ｍｍ）中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、４６℃に予熱したＢＨＩＳ培地４ｍＬ中に移して、６分間４６℃でインキュベーションした。続いて、細胞を２時間、３０℃において、１７０ｒｐｍでインキュベーションし、懸濁液をＢＨＩＳ−Ｋａｎ１５寒天上にまいた。続いて、クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上とに移すことによりｓａｃＢ遺伝子の機能を試験した。第２の組換え現象における成功した除去を選択するために、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５上で培養した細胞を、およそ５ｈ、ＢＨＩ培地５ｍｌ中で培養し、培養物１００μｌおよび１：１０希釈物を、１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上にまいた。クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーＰＣＲ（プライマー：ｃｈｅｃｋＰｒｏｍｉｏｌＴ１ｆｗ／ｃｈｅｃｋＰｒｏｍｉｏｌＴ１ｒｅｖ）に続きＤＮＡシークエンシングを行い、欠失の成功を確認した。
【０１０５】
プライマー：
ＤＰＯ６ｉｏｌＴ１＿Ｆｗ＿ｆｗ：ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣ
ＤＰＯ６ｉｏｌＴ１＿Ｆｗ＿ｒｅｖ：ＡＴＣＧＴＧＧＣＡＧＡＣＡＣＧＡＴＡＴＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣ
ＤＰＯ６ｉｏｌＴ１＿ｒｅｖ＿ｆｗ：ＧＡＴＡＴＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＧＡＴＴＡＡＡＧＡＣＡＴＴＧ
ＤＰＯ６ｉｏｌＴ１＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣ
ｃｈｅｃｋＰｒｏｍｉｏｌＴ１ｆｗ：ＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＣＡＣＴＴＣＧＣＡＣＣＣＴＴ
ｃｈｅｃｋＰｒｏｍｉｏｌＴ１ｒｅｖ：ＣＡＡＣＴＣＡＴＴＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣ
【０１０６】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのヌクレオチド欠失による、炭水化物キナーゼＩｏｌＣのプロモーター領域内にある調節結合部位の改変
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＰＯ６ｉｏｌＴ１  ΔＰＯ１３ｉｏｌＣを、ＮｉｅｂｉｓｃｈおよびＢｏｔｔ（２００１年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２０３０１００２６２）に基づきベクターｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢを用いて、二重相同組換え（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、１９９４年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０３７８〜１１１９（９４）９０３２４〜７）を介して構築した。そのために、第１のステップでは、２つのヌクレオチドが欠失した、ｉｏｌＣ遺伝子前方の５’領域（プライマー：ＤＰＯ１３ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｆｗ／ＤＰＯ１３ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｒｅｖ）または遺伝子の３’領域（プライマー：ＤＰＯ１３ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｆｗ／ＤＰＯ１３ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ）を含有する２つのＰＣＲ産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の５００塩基対を増幅した。第２のステップでは、ＤＮＡ断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼｘＢａＩおよびＥｃｏＲＩで切断してあるｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．１３１８）。そのようにして得られた該プラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ＿ΔＰＯ１３ｉｏｌＣを、ヒートショックを利用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーＰＣＲおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのＤＮＡ配列を特定した。プラスミドを単離後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＰＯ６ｉｏｌＴ１エレクトロコンピテントセルのアリコート１５０μｌを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド１〜４．５μｇを混合し、氷上で予冷した０．２ｃｍのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、４℃の冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロール８００μＬを覆い重ね、エレクトロポレーター（２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω、２ｍｍ）中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、４６℃に予熱したＢＨＩＳ培地４ｍＬ中に移して、６分間４６℃でインキュベーションした。続いて、細胞を２時間、３０℃において、１７０ｒｐｍでインキュベーションし、懸濁液をＢＨＩＳ−Ｋａｎ１５寒天上にまいた。続いて、クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上とに移すことによりｓａｃＢ遺伝子の機能を試験した。第２の組換え現象における成功した除去を選択するために、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５上で培養した細胞を、およそ５ｈ、ＢＨＩ培地５ｍｌ中で培養し、培養物１００μｌおよび１：１０希釈物を、１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上にまいた。クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーＰＣＲ（プライマー：Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｏｍ  ｉｏｌＣ  ｆｗ／Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｏｍ  ｉｏｌＣ  ｒｅｖ）に続きＤＮＡシークエンシングを行い、欠失の成功を確認した。
【０１０７】
プライマー：
ＤＰＯ１３ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｆｗ：ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＣＧＴＣＴＴＣＧＡＧＧＣＧＴＴＧＧ
ＤＰＯ１３ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｒｅｖ：ＧＴＧＧＣＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＡＴＣＧＣＡＴＣＣＣＡＴＧ
ＤＰＯ１３ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｆｗ：ＧＣＧＡＴＣＧＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＣＡＣＡＴＴＣＣＡＴＣ
ＤＰＯ１３ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＧＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＣＴＴＣＡＣ
Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｏｍ  ｉｏｌＣ  ｆｗ：ＴＣＴＣＧＴＴＴＴＣＴＡＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧ
Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｏｍ  ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ：ＣＧＡＣＧＧＴＴＣＧＣＡＣＧＡＧＴＡＧＴＣＡ
【０１０８】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのヌクレオチド欠失による、炭水化物キナーゼＩｏｌＣのプロモーター領域内にある調節結合部位の改変
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＰＯ６ｉｏｌＴ１  ΔＰＯ５〜Ｏ９ｉｏｌＣを、ＮｉｅｂｉｓｃｈおよびＢｏｔｔ（２００１年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２０３０１００２６２）に基づきベクターｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢを用いて、二重相同組換え（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、１９９４年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０３７８〜１１１９（９４）９０３２４〜７）を介して構築した。そのために、第１のステップでは、２つのヌクレオチドが欠失した、ｉｏｌＣ遺伝子前方の５’領域（プライマー：ΔＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｆｗ／ΔＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｒｅｖ）または遺伝子の３’領域（プライマー：ΔＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｆｗ／ΔＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ）を含有する２つのＰＣＲ産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の５００塩基対を増幅した。第２のステップでは、ＤＮＡ断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼｘＢａＩおよびＥｃｏＲＩで切断してあるｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．１３１８）。そのようにして得られた該プラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ＿ΔＰＯ５〜Ｏ９ｉｏｌＣを、ヒートショックを利用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーＰＣＲおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのＤＮＡ配列を特定した。プラスミドを単離後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ＰＯ６ｉｏｌＴ１エレクトロコンピテントセルのアリコート１５０μｌを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド１〜４．５μｇを混合し、氷上で予冷した０．２ｃｍのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、４℃の冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロール８００μＬを覆い重ね、エレクトロポレーター（２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω、２ｍｍ）中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、４６℃に予熱したＢＨＩＳ培地４ｍＬ中に移して、６分間４６℃でインキュベーションした。続いて、細胞を２時間、３０℃において、１７０ｒｐｍでインキュベーションし、懸濁液をＢＨＩＳ−Ｋａｎ１５寒天上にまいた。続いて、クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上とに移すことによりｓａｃＢ遺伝子の機能を試験した。第２の組換え現象における成功した除去を選択するために、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５上で培養した細胞を、およそ５ｈ、ＢＨＩ培地５ｍｌ中で培養し、培養物１００μｌおよび１：１０希釈物を、１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上にまいた。クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーＰＣＲ（プライマー：Ｃｈｅｃｋ  ΔＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｆｗ／Ｃｈｅｃｋ  Δ��Ｏ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ）に続きＤＮＡシークエンシングを行い、欠失の成功を確認した。
【０１０９】
ΔＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｆｗ：ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＧＧＴＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＴＣ
ΔＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｆｗ＿ｒｅｖ：ＴＡＡＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＡＡＴＧＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＡＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴ
ΔＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｆｗ：ＧＧＡＡＴＧＡＧＴＡＧＣＧＡＡＡＣＴＴＡＧＴＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＴＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＡＡＣＣＣ
ΔＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧ
Ｃｈｅｃｋ  ΔＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｆｗ：ＧＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＴ
Ｃｈｅｃｋ  ΔＰＯ５〜ＰＯ９ｉｏｌＣ＿ｒｅｖ：ＧＧＧＧＴＣＴＴＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡＴＣＧＧＴＧＧ
【０１１０】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのＤ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの欠失
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ΔｉｏｌＧを、ＮｉｅｂｉｓｃｈおよびＢｏｔｔ（２００１年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２０３０１００２６２）に基づきベクターｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢを用いて、二重相同組換え（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、１９９４年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０３７８〜１１１９（９４）９０３２４〜７）を介して構築した。そのために、第１のステップでは、最初の３コドンを有する、ｉｏｌＧ遺伝子の５’領域（プライマー：ｉｏｌＧ前方ｆｗ／ｉｏｌＧ前方ｒｅｖ）または最後の６コドンを有する、ｉｏｌＧ遺伝子の３’領域（プライマー：ｉｏｌＧ後方ｆｗ／ｉｏｌＧ後方ｒｅｖ）を含有する２つのＰＣＲ産物を生成した。後の相同組換えのために、それぞれ、フランキング領域の５００塩基対を増幅した。第２のステップでは、ＤＮＡ断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼｘＢａＩおよびＥｃｏＲＩで切断してあるｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターと共に、ギブソン・アセンブリを利用して融合した（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．１３１８）。そのようにして得られた該プラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ＿ΔｉｏｌＧを、ヒートショックを利用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。プラスミド上に存在するカナマイシン耐性遺伝子により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーＰＣＲおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのＤＮＡ配列を特定した。プラスミドを単離後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍエレクトロコンピテントセルのアリコート１５０μｌを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド１〜４．５μｇを混合し、氷上で予冷した０．２ｃｍのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、４℃の冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロール８００μＬを覆い重ね、エレクトロポレーター（２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω、２ｍｍ）中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、４６℃に予熱したＢＨＩＳ培地４ｍＬ中に移して、６分間４６℃でインキュベーションした。続いて、細胞を２時間、３０℃において、１７０ｒｐｍでインキュベーションし、懸濁液をＢＨＩＳ−Ｋａｎ１５寒天上にまいた。続いて、クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上とに移すことによりｓａｃＢ遺伝子の機能を試験した。第２の組換え現象における成功した除去を選択するために、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５上で培養した細胞を、およそ５ｈ、ＢＨＩ培地５ｍｌ中で培養し、培養物１００μｌおよび１：１０希釈物を、１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上にまいた。クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーＰＣＲ（プライマー：ｃｈｅｃｋ  ｉｏｌＧ  ｆｗ／ｃｈｅｃｋ  ｉｏｌＧ  ｒｅｖ）に続き電気泳動を行い、欠失の成功を確認した。
【０１１１】
プライマー：
ｉｏｌＧ前方ｆｗ：ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣ
ｉｏｌＧ前方ｒｅｖ：ＴＡＣＴＣＣＣＧＧＧＣＡＴＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡＴ
ｉｏｌＧ後方ｆｗ：ＧＡＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＴＡＴＧＣＣＣＧＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＧＡＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＣＧＣ
ｉｏｌＧ後方ｒｅｖ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＣＣ
ｃｈｅｃｋ  ｉｏｌＧ  ｆｗ：ＣＧＡＣＧＴＴＧＣＴＧＧＴＣＴＴＧＣＴＴＣＣＡＡＧ
ｃｈｅｃｋ  ｉｏｌＧ  ｒｅｖ：ＧＧＴＴＡＧＴＧＡＴＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧ
【０１１２】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのＤ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの染色体挿入
様々なＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ挿入突然変異体Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ｉｏｌＧ１、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ｉｏｌＧ２、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２  ｉｏｌＧ３を、ＮｉｅｂｉｓｃｈおよびＢｏｔｔ（２００１年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２０３０１００２６２）に基づき、それぞれｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢベースのベクターを用いて、二重相同組換え（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、１９９４年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０３７８〜１１１９（９４）９０３２４〜７）を介して構築した。そのために、第１のステップでは、様々な挿入部位のフランキング領域、構成的プロモーターＴｕｆ、および遺伝子ｉｏｌＧを含有するＰＣＲ産物を生成した（プライマー：ＮＣＳ＿ＰＴｕｆ＿ｆｗ／ＮＣＳ＿ＰＴｕｆ＿ｒｅｖ／ＮＣＳ＿Ｐｔｕｆ＿ｉｏｌＧ＿ｆｗ／ＮＣＳ＿Ｐｔｕｆ＿ｉｏｌＧ＿ｒｅｖ／ＣｇＬＰ４＿ｆｗ＿ｆｗ／ＣｇＬＰ４＿ｆｗ＿ｒｅｖ／ＣｇＬＰ４＿ＰＴｕｆ＿ｆｗ／ＣｇＬＰ４＿ＰＴｕｆ＿ｒｅｖ／ＣｇＬＰ４＿ｉｏｌＧ＿ｆｗ／ＣｇＬＰ４＿ｉｏｌＧ＿ｒｅｖ／ＣｇＬＰ４＿ｒｅｖ＿ｆｗ／ＣｇＬＰ４＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ／ＣｇＬＰ１２＿ｆｗ＿ｆｗ／ＣｇＬＰ１２＿ｆｗ＿ｒｅｖ／ＣｇＬＰ１２＿ＰＴｕｆ＿ｆｗ／ＣｇＬＰ１２＿ＰＴｕｆ＿ｒｅｖ／ＣｇＬＰ１２＿ｉｏｌＧ＿ｆｗ／ＣｇＬＰ１２＿ｉｏｌＧ＿ｒｅｖ／ＣｇＬＰ１２＿ｒｅｖ＿ｆｗ／ＣｇＬＰ１２＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ）。第２のステップでは、ＤＮＡ断片を、すでに制限エンドヌクレアーゼｘＢａＩおよびＥｃｏＲＩで切断してあるｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターと共に、それぞれ、ギブソン・アセンブリを利用して融合した（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．１３１８）。そのようにして得られたプラスミドｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ  ｎｃｒ  ｃｏｎｓ  ＰＴｕｆｉｏｌＧ、ｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ  ＣｇＬＰ４  ＰＴｕｆｉｏｌＧ、およびｐｋ１９ｍｏｂｓａｃＢ  ＣｇＬＰ１２  ＰＴｕｆｉｏｌＧを、ヒートショックを利用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。構築されたプラスミド上に存在する各カナマイシン耐性遺伝子により、それぞれ、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーＰＣＲおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのＤＮＡ配列を特定した。プラスミドを単離後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍエレクトロコンピテントセルのアリコート１５０μｌを氷上で溶かし、そのアリコートに形質転換すべき各プラスミド１〜４．５μｇを混合し、氷上で予冷した０．２ｃｍのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、４℃の冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロール８００μＬを覆い重ね、エレクトロポレーター（２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω、２ｍｍ）中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、４６℃に予熱したＢＨＩＳ培地４ｍＬ中に移して、６分間４６℃でインキュベーションした。続いて、細胞を２時間、３０℃において、１７０ｒｐｍでインキュベーションし、懸濁液をＢＨＩＳ−Ｋ��ｎ１５寒天上にまいた。続いて、クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上とに移すことによりｓａｃＢ遺伝子の機能をそれぞれ試験した。第２の組換え現象における成功した除去を選択するために、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５上で培養した細胞を、およそ５ｈ、ＢＨＩ培地５ｍｌ中で培養し、培養物１００μｌおよび１：１０希釈物を、１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上にまいた。クローンを、ＢＨＩ−Ｋａｎ２５寒天上と１０％スクロースを含むＢＨＩ寒天上とに移した。スクロース耐性およびカナマイシン感受性のクローンから、コロニーＰＣＲ（プライマー：ＮＣＳ  ｃｈｅｃｋ  ｆｗ／ＮＣＳ  ｃｈｅｃｋ  ｒｅｖ／ＣｇＬＰ４＿Ｃｈｅｃｋ＿ｆｗ／ＣｇＬＰ４＿Ｃｈｅｃｋ＿ｒｅｖ／ＣｇＬＰ１２＿Ｃｈｅｃｋ＿ｆｗ／ＣｇＬＰ１２＿Ｃｈｅｃｋ＿ｒｅｖ）に続きＤＮＡシークエンシングを行い、それぞれ挿入の成功を確認した。
【０１１３】
プライマー：
ＮＣＳ＿ＰＴｕｆ＿ｆｗ：ＴＴＴＡＡＡＴＴＧＴＧＴＣＣＡＴＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧ
ＮＣＳ＿ＰＴｕｆ＿ｒｅｖ：ＴＣＴＴＧＣＴＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣ
ＮＣＳ＿Ｐｔｕｆ＿ｉｏｌＧ＿ｆｗ：ＡＧＧＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＴＣＧＣ
ＮＣＳ＿Ｐｔｕｆ＿ｉｏｌＧ＿ｒｅｖ：ＣＧＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣＣＣＧＧＧＡＧＴＴＴＡＡＧＣＧＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＣ
ＮＣＳ  ｃｈｅｃｋ  ｆｗ：ＣＧＧＡＡＴＧＡＴＣＴＴＧＡＣＣＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧ
ＮＣＳ  ｃｈｅｃｋ  ｒｅｖ：ＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣ
ＣｇＬＰ４＿ｆｗ＿ｆｗ：ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＣＧＧＣＧＡＴＡＣ
ＣｇＬＰ４＿ｆｗ＿ｒｅｖ：ＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＣＣＧＴＴＣ
ＣｇＬＰ４＿ＰＴｕｆ＿ｆｗ：ＴＴＴＴＴＴＧＡＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧ
ＣｇＬＰ４＿ＰＴｕｆ＿ｒｅｖ：ＴＣＴＴＧＣＴＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣ
ＣｇＬＰ４＿ｉｏｌＧ＿ｆｗ：ＡＧＧＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＴＣＧＣ
ＣｇＬＰ４＿ｉｏｌＧ＿ｒｅｖ：ＣＴＣＡＣＴＴＡＧＴＴＴＡＡＧＣＧＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＣ
ＣｇＬＰ４＿ｒｅｖ＿ｆｗ：ＣＴＡＣＧＣＴＴＡＡＡＣＴＡＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＧ
ＣｇＬＰ４＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＡＧＴＡＣＧＣＧＧＡＴＡＡＡＴＧＡＴＣ
ＣｇＬＰ４＿Ｃｈｅｃｋ＿ｆｗ：ＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＧ
ＣｇＬＰ４＿Ｃｈｅｃｋ＿ｒｅｖ：ＡＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣ
ＣｇＬＰ１２＿ｆｗ＿ｆｗ：ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＧＴＴＧＡＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＡＡＡＣ
ＣｇＬＰ１２＿ｆｗ＿ｒｅｖ：ＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＧＣＣＧＡＴＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣ
ＣｇＬＰ１２＿ＰＴｕｆ＿ｆｗ：ＡＴＣＧＧＣＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧ
ＣｇＬＰ１２＿ＰＴｕｆ＿ｒｅｖ：ＴＣＴＴＧＣＴＣＡＴＡＣＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣ
ＣｇＬＰ１２＿ｉｏｌＧ＿ｆｗ：ＡＧＧＡＡＣＧＣＧＴＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＴＣＧＣ
ＣｇＬＰ１２＿ｉｏｌＧ＿ｒｅｖ：ＡＴＴＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＧＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＣ
ＣｇＬＰ１２＿ｒｅｖ＿ｆｗ：ＣＴＡＣＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＡＴＣＡＧ
ＣｇＬＰ１２＿ｒｅｖ＿ｒｅｖ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＣＧＣＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧ
ＣｇＬＰ１２＿Ｃｈｅｃｋ＿Ｆｗ：ＣＴＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＧＧＣ
ＣｇＬＰ１２＿Ｃｈｅｃｋ＿Ｒｅｖ：ＴＴＧＧＣＴＴＴＣＣＡＴＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＴ
【０１１４】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのＤ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧのプラスミドベースの発現
ゲノムＤＮＡを単離するための第１のステップでは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞を、２％ＤＭＳＯ５０μｌ中での懸濁に続く９５℃における５分間のインキュベーションにより破砕した。細胞片を１１，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離し、上清の３μＬを、テンプレートとしてｉｏｌＧの増幅に使用した（プライマー：ｐ３＿ｉｏｌＧ＿ｆｗ／ｐ３＿ｉｏｌＧ＿ｒｅｖ）。その増幅物を、すでに制限エンドヌクレアーゼｐｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで切断してあるｐＥＫＥｘ３ベクターと共に、ギブソン・アセンブリで融合した（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９年）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．１３１８）。そのようにして得られた該プラスミドｐＥＫＥｘ３ｉｏｌＧを、ヒートショックを利用してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。プラスミドが仲介するスペクチノマイシン耐性により、プラスミドを取り込んだクローンのみが増殖できた。それらのクローンを、コロニーＰＣＲおよび続くゲル電気泳動を利用して、クローニングしたインサートの存在を点検し、そのＤＮＡ配列を特定した。プラスミドを単離後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍエレクトロコンピテントセルのアリコート１５０μｌを氷上で溶かし、そのアリコートにプラスミド１〜４．５μｇを混合し、氷上で予冷した０．２ｃｍのエレクトロポレーション用キュベット内に移した。混合物に、４℃の冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロール８００μＬを覆い重ね、エレクトロポレーター（２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω、２ｍｍ）中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、混合物を、４６℃に予熱したＢＨＩＳ培地４ｍＬ中に移して、６分間４６℃でインキュベーションした。続いて、細胞を２時間、３０℃において、１７０ｒｐｍでインキュベーションした。続いて懸濁液をＢＨＩＳ−Ｓｐｃ１００寒天上にまいた。
【０１１５】
プライマー：
ｐ３＿ｉｏｌＧ＿ｆｗ：ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＴＡＴＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＴＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＣＴＴＣＧＣ
ｐ３＿ｉｏｌＧ＿ｒｅｖ：ＣＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＴＡＡＧＣＧＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＣ
【０１１６】
培地および培養条件
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株の培養には、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ複合培地（ＢＨＩ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、米国）およびＣＧＸＩＩ合成培地を使用した。ＣＧＸＩＩ培地は、脱イオン水１リットルにつき、次の組成物：Ｋ２ＨＰＯ４  １ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、尿素５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １３．２５ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．０２ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．３１３ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｍｇ、ビオチン０．２ｍｇ、３，４−ジヒドロキシベンゾエート、０．０２％（ｖｖ−１）消泡剤ＡＦ２０４を含有した。発現ベクターｐＥＫＥｘ３を有する株の培養には、スペクチノマイシンおよびイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、１００μｇｍＬ−１または１ｍｍｏｌＬ−１の最終濃度で添加した。すべての化学製品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（シュタインハイム、ドイツ）から入手した。まず、試験管中のＢＨＩ培地上での前培養を、単一コロニーから植え付け、３０℃において８ｈ、回転式振とう培養機上、１７０ｒｐｍでインキュベートした。次いで、その培養から、第２の前培養を、ＣＧＸＩＩ合成培地５０ｍＬならびに炭素源およびエネルギー源としてのＤ−グルコース１０ｇＬ−１およびＤ−キシロース３０ｇＬ−１を含む５００ｍＬ振とうフラスコ中に植え付けて、３０℃において１５ｈ、回転式振とう培養機上、１３０ｒｐｍでインキュベートした。続いて、本培養を、炭素源およびエネルギー源としてのＤ−グルコース１０ｇＬ−１およびＤ−キシロース３０ｇＬ−１を含むＣＧＸＩＩ合成培地５０ｍＬ中に、１のＯＤ６００で植え付けて、３０℃において５６ｈ、回転式振とう培養機上、１３０ｒｐｍでインキュベートした。本培養から、バイオマス、Ｄ−キシロースおよびＤ−キシロネートの濃度を測定するための試料を採取した。
【０１１７】
バガス加水分解物の製造
バッチ法および流加法を利用したＤ−キシロネート生産には、ＣＧＸＩＩ合成培地および前処理したバガス加水分解物を使用した。粉砕バガス（０．２５〜１ｃｍ）の前処理は、０．１ｍｏｌＬ−１のＨ２ＳＯ４中、１２１℃でのインキュベーションにより行った。続く加水分解は、６００ｍＬの作業体積および前処理済みバガス１８０ｇ、５０ｍＭ  Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２および酵素ミックスＣｅｌｌｉｃ  ＣＴｅｃ２（Ｎｏｖｏｍｚｙｍｅｓ、バウスヴェア、デンマーク）１０．４ｍＬからなる溶液を含む並列バイオリアクターシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ／ＤＡＳＧＩＰ、ユーリッヒ、ドイツ）中で行った。ＫＯＨを利用してｐＨをｐＨ５に調整し、５０℃において７２ｈ、一定のスターラ回転数（４００ｒｐｍ）で加水分解を行った。続いて、ＮＨ４Ｃｌ  ８ｇおよびＫ２ＨＰＯ４  ２ｇを脱イオン水２００ｍＬ中に溶解して、加水分解物に添加した。次いで、培養目的用の培地を、５Ｍ  ＮＨ４ＯＨによりｐＨ７に調整した。いくつかの培地成分（Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、ＰＣＡ、微量元素、ＡＦ２０４）を、オートクレーブ後に無菌添加した。流加プロセスの場合、脱イオン水中の１００ｇＬ−１Ｄ−グルコース溶液を使用した。培養中、ｐＨ値を、５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４または５Ｍ  ＮＨ４ＯＨの供給により双方からｐＨ７に調節した。温度およびガス供給速度は、３０℃または０．５ｖｖｍに固定した。好気性プロセス条件（＞３０％の溶存酸素濃度）は、スターラ回転数（４００〜１，２００ｒｐｍ）の調節によって保証した。オンライン測定は、ｐＨ（４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８０／２２５、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）、ＤＯ（Ｖｉｓｉｆｅｒｍ  ＤＯ  ２２５、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）および排気組成（ＧＡ４、ＤＡＳＧＩＰ  ＡＧ）に関して行った。植え付けは、指数増殖中のＣＧＸＩＩ培地（２０ｇＬ−１Ｄ−グルコース）上の前培養から、最終ＯＤ２へと行った。本培養から、バイオマス、Ｄ−キシロースおよびＤ−キシロネートの濃度を測定するための試料を採取した。
【０１１８】
発酵の終わりごろに、公知のプロトコルに従って、Ｄ−キシロネートを培養溶液から単離および／または調製、つまり分離、精製および／または濃縮できる。生成物精製には、既存のプロトコル（Ｌｉｕら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２、１１５：２４４〜２４８頁）を、次のように使用した：１．遠心分離（４℃、１０分間、４５００ｒｐｍ）を利用した細胞分離；２．結果として生じる上清の、活性炭（ＡＣ）中での脱色；３．ＡＣ処理した上清のろ過（０．２２μｍ）および回転式蒸発装置（１００ｍｂａｒ、６０℃の水浴）を利用した濃縮；４．濃縮液のろ過（０．２２μｍ）およびＥｔＯＨの添加（３：１、ｖ／ｖ）によるＤ−キシロネートの沈殿；−１０℃における少なくとも１２ｈの、生成物の真空乾燥。
【０１１９】
バイオマスの定量は、秤量した試験管に培養上清２ｍＬを移し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．９％（ｗｖ−１）ＮａＣｌ中に再懸濁して重量測定により行った。もう一回の遠心分離ステップ後、デカントにより上清を除去した。細胞ペレットを８０℃において２４ｈ乾燥させてから細胞乾重量の重量測定を行った。基質および生成物の定量には、酢酸セルロースシリンジフィルター（０．２μｍ、ＤＩＡ−Ｎｉｅｌｓｅｎ、デューレン、ドイツ）を利用して上清をろ過した。Ｄ−グルコースとＤ−キシロネートとの分離は、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタ・クララ、ＣＡ）上でのイソクラティック交換法により行った。この方法は、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅｓｉｎ  ＨＰＬＣカラム３００ｘ８ｍｍ（ＤＩＡ−Ｎｉｅｌｓｅｎ、デューレン、ドイツ）を固定相として、０．６ｍＬ／分の流速の０．１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を移動相として、８０℃のカラム温度および１０μＬの注入量を使用する。Ｄ−グルコースの検出は、示差屈折率検出器を利用して３５℃において行った。Ｄ−キシロネートは、２１５ｎｍでのＵＶ光吸光を利用して、ダイオードアレイ検出器を用いて行った。該当する濃度値は、外部標準および加重線形回帰を利用して算出した。Ｄ−キシロースの定量には、酵素アッセイ（Ｘｙｌｏｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｍｅｇａｚｙｍｅｓ、ウィックロー、アイルランド）を利用した。すべてのピペッティングステップは、自動化Ｌｉｑｕｉｄ−Ｈａｎｄｌｉｎｇ−Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏ  ２００、Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．、メンネドルフ、スイス）を利用して行った。ＮＡＤＨの上昇は、３４０ｎｍにおいて、プレートリーダーを利用して測定した（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．、メンネドルフ、スイス）。
【０１２０】
本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの単離
ｉｏｌＧを異種遺伝子発現させるために、プラスミドｐＥＴ−２８ｂ−ｉｏｌＧを、大腸菌ＢＬ２１に形質転換し、続いて、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ（ＴＢ）培地２ｘ５０ｍＬ中で、３０℃および２５０ｒｐｍにおいて１６時間、培養した。初期炭素源としての２０ｇ／Ｌのグリセロールおよび選択圧を維持するための５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む４つのバイオリアクター培養を植え付けるために、それらの培養の各１０ｍＬを利用した。バイオリアクター培養を３０℃に調温し、アンモニア水を用いてｐＨ値をｐＨ７に滴定した。培養開始からおよそ５ｈ後ならびにおよそ３２ｈ後に改めて、２５０μＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により遺伝子発現を誘導した。初期グリセロール量が完全に代謝された後、７００ｇ／Ｌグリセロールおよび２０ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む濃縮基質溶液を、オンオフ制御装置（オン：ＤＯ＞３０％、オフ：ＤＯ＜１０％）に基づいて、２０ｍＬ／ｈの速度で自動的に計量添加した。およそ１０ｈの補給段階後、培養を回収し、２０分間の遠心分離（８０００ｒｐｍ）により培養培地から細胞を分離した。細胞塊を−２０℃において保管した。
細胞塊およそ６０ｇを、氷上の平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１５０ｍＬ中で３０分間、再懸濁した。循環式冷却室（Ｕｍｌａｕｆｋｕｅｈｌｚｅｌｌｅ）内で、超音波プローブ（超音波プロセッサーＵＰ  ２００Ｓ  Ｄｒ．  Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ  Ｓ１４Ｄ−Ｓｏｎｏｔｒｏｄｅ、サイクル０．５振幅７０）を利用して、細胞懸濁液を３０分間破砕した。破砕上清を遠心分離（２３０００ｒｐｍ、４℃、３５分間）後、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（カラム体積７０ｍＬ、流量６ｍＬ／分）上に載せた（洗浄バッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２５ｍＭイミダゾール；溶出バッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５０ｍＭイミダゾール）。溶出液を全体として６０ｍＬの画分で捕集し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５カラムを介して脱塩し（カラム体積９６０ｍＬ、流量１０ｍＬ／分、脱塩バッファー：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４）、そのうちの全体で１５０ｍＬをタンパク質含有画分として収集し、凍結乾燥させた。結果として生じる凍結乾燥物は、Ｂｒａｄｆｏｒｄのタンパク質定量によると６０％のタンパク質含有量を有した。
【０１２１】
Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ活性の測定
ＩｏｌＧ凍結乾燥物の活性測定をするための酵素テストを２００μＬの全体積で行った。酵素反応は、入れておいた基質溶液（０〜２５０ｍＭ［反応体積当たり最終０〜２５ｍＭ］のＤ−キシロースまたはミオイノシトール）２０μＬに反応混合物（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２２ｍＭ  ＮＡＤ＋、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２．５ｍｇ／ＬのＩｏｌＧ凍結乾燥物溶液１２５μＬ／ｍｌ、ｐＨ７．５、３０℃へと＞３０分予熱）１８０μＬを素早く添加して行った。３４０ｎｍにおける吸光度上昇の測定を、（３０℃へと＞３０分予熱した）マイクロタイタープレートリーダー中、およそ２０分間追跡した。全測定シグナルの短い過渡振動挙動の後、初期反応速度を２分間の測定時間にわたって、線形回帰を利用して算定した。得られた、単位［１分当たりの吸光度単位］での傾きを、基質溶液の代わりに公知のＮＡＤＨ濃度を有する標準溶液による吸光度シグナルの検量線を利用して、較正パラメーター共分散行列を考慮しつつガウスの誤差伝搬を適用し、単位［１分当たりのｍＭ  ＮＡＤＨ］でのＮＡＤＨ結合速度に算定した。酵素は、基質ミオイノシトールに対しては活性を示さない。
【０１２２】
ｄ−キシロースに対する最大酵素活性（Ｖｍａｘ）および特異的基質親和性（Ｋｍ）の算定には、非線形回帰を利用して、実験データをミカエリス・メンテン速度式にフィットさせた。実験からの酵素反応速度パラメーターは、Ｖｍａｘ＝１８．８±３．３Ｕ／ＬおよびＫｍ＝２８．０±７．１ｍＭと算定された。
【０１２３】
本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの上昇した発現による、コリネ型細菌の相同宿主系中でのＤ−キシロネート形成
コリネ型細菌株の様々な変形形態の、野生型と比べた増殖、Ｄ−キシロース摂取およびＤ−キシロネート形成に関する実験を、振とうフラスコ内の、１０ｇＬ−１Ｄ−グルコースおよび３０ｇＬ−１Ｄ−キシロースを含むＣＧＸＩＩ合成培地中で行った。以下の例は、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ活性がコリネ型細菌中でのＤ−キシロネート形成を担うことを明確に示す。図１４および１５。
【０１２４】
図１４から読み取れるように、すべての株は、炭素源およびエネルギー源としてのＤ−グルコース上で比較可能な増殖を示す。野生株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２は、非常に低い、Ｄ−キシロースの摂取およびＤ−キシロネートへの変換を有する。この場合、７２ｈ後の最大Ｄ−キシロネート力価は、４０．０ｍＭである。調節因子ＩｏｌＲの遺伝子の欠失を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＷＴΔｉｏｌＲ株は、Ｄ−キシロース輸送体ＩｏｌＴ１およびＤ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの脱調節発現に起因して、Ｄ−キシロース摂取およびＤ−キシロネート生産の明らかな上昇を示す。この場合、７２ｈ後の最大Ｄ−キシロネート力価は、２１４．７ｍＭである。本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの遺伝子の付加的な欠失を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＷＴΔｉｏｌＲΔｉｏｌＧ株は、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの発現の欠如に起因して、Ｄ−キシロース摂取およびＤ−キシロネート形成の著しい低下を示す。この場合、７２ｈ後の最大Ｄ−キシロネート力価は、１１１．９ｍＭである。本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの遺伝子の付加的なプラスミドベースの発現を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＷＴΔｉｏｌＲΔｉｏｌＧｐＥＫＥｘ３−ｉｏｌＧ株は、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの、発現の欠如（ΔｉｏｌＧ）を過補償する高い相同発現に起因して、最高のＤ−キシロネート生産を示す。この場合、７２ｈ後の最大Ｄ−キシロネート力価は、２２３．６ｍＭである。
【０１２５】
図１５は、本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の作動可能に連結された調節領域の機能性が改変されている、本発明によるコリネ型細菌株のさらなる変形形態のＤ−キシロネート形成を示す。実験は、振とうフラスコ内の、１０ｇＬ−１Ｄ−グルコースおよび３０ｇＬ−１Ｄ−キシロースを含むＣＧＸＩＩ合成培地中で行った。
【０１２６】
野生株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２は、非常に低い、Ｄ−キシロースの摂取およびＤ−キシロネートへの変換を有する。この場合、７２ｈ後の最大Ｄ−キシロネート力価は、４０．０ｍＭである。Ｄ−キシロース輸送体ＩｏｌＴ１の遺伝子領域内のプロモーター配列の改変を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＷＴＰＯ６ｉｏｌＴ１株は、Ｄ−キシロース輸送体ＩｏｌＴ１の脱調節発現に起因して、Ｄ−キシロース摂取およびＤ−キシロネート生産のわずかな上昇を示す。この場合、７２ｈ後の最大Ｄ−キシロネート力価は、８０．０ｍＭである。
【０１２７】
Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの遺伝子のプラスミドベースの発現を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＷＴｐＥＫＥｘ３−ｉｏｌＧ株は、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの相同発現に起因して、Ｄ−キシロネート生産の明らかな上昇を示す。この場合、７２ｈ後の最大Ｄ−キシロネート力価は、２１３．９ｍＭである。付加的な、Ｄ−キシロース輸送体ＩｏｌＴ１の遺伝子領域内のプロモーター配列の改変を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＷＴＰＯ６ｉｏｌＴ１ｐＥＫＥｘ３−ｉｏｌＧ株は、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの相同発現および同時のＤ−キシロース輸送体ＩｏｌＴ１の脱調節発現に起因して、最高のＤ−キシロネート生産を示す。この場合、７２ｈ後の最大Ｄ−キシロネート力価は、２１７．４ｍＭである。
【０１２８】
図１６は、作動可能に連結された調節領域の機能性が改変または欠失している、本発明によるコリネ型細菌株のさらなる変形形態のＤ−キシロネート形成を示す。Ｄ−キシロース輸送体ＩｏｌＴ１の遺伝子領域内のプロモーター配列の改変を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＷＴＰＯ６ｉｏｌＴ１株、ＰＯ６ｉｏｌＴ１に加えてＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の作動可能に連結された調節領域の機能性が改変されている（ＰＯ５〜Ｏ９ｉｏｌＣ）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＰＯ６ｉｏｌＴ１  ＰＯ５〜Ｏ９ｉｏｌＣ株、およびそれと比べた調節因子ＩｏｌＲの遺伝子の欠失を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＷＴΔｉｏｌＲ株を示す。実験は、振とうフラスコ内の、１０ｇＬ−１Ｄ−グルコースおよび３０ｇＬ−１Ｄ−キシロースを含むＣＧＸＩＩ合成培地中で行った。Ｄ−キシロース輸送体ＩｏｌＴ１の遺伝子領域内のプロモーター配列の改変を有するＷＴＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＰＯ６ｉｏｌＴ１株は、Ｄ−キシロース輸送体ＩｏｌＴ１の脱調節発現に起因して、Ｄ−キシロネート生産のわずかな上昇を示す。この場合、７２ｈ後の最大Ｄ−キシロネート力価は、７４．７３ｍＭである。調節因子ＩｏｌＲの遺伝子の欠失を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＷＴΔｉｏｌＲ株は、Ｄ−キシロース輸送体ＩｏｌＴ１およびＤ−キシロースデヒドロゲナーゼＩｏｌＧの脱調節発現に起因して、Ｄ−キシロネート生産の明らかな上昇を示す。この場合、７２ｈ後の最大Ｄ−キシロネート力価は、２０５．５３ｍＭである。Ｄ−キシロース輸送体ＩｏｌＴ１の遺伝子領域内のプロモーター配列の改変およびＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の作動可能に連結された調節領域の機能性の改変（ＰＯ５〜Ｏ９ｉｏｌＣ）を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＰＯ６ｉｏｌＴ１  ＰＯ５〜Ｏ９ｉｏｌＣ株は、Ｄ−キシロネート生産の明らかな上昇を示す。この場合、７２ｈ後の最大Ｄ−キシロネート力価は、２０６．８２ｍＭである。
【０１２９】
それゆえ、本発明は、関連するコード遺伝子配列の５’上流調節領域内における、本発明により最低限のかつ明確に定義されたヌクレオチド置換により、Ｄ−キシロネート生産の明らかな上昇が達成されることを明確に示す。つまり、異種の遺伝子または構造をコリネ型細菌株内に導入する必要なしにであり、それが本発明の課題であり、さらには、中心的に作用する調節因子において、広範に未定義の生理学的影響を生物中で引き起こす極端な欠失を行う必要なしにでもあり、それは同じく本発明により望ましい。その際、本発明による少数の特異的なヌクレオチド置換は、生来、自然界においても大いに起こるような範囲にあるため、本発明によるコリネ型細菌株をｎｏｎ−ＧＭＯとして特徴付ける。
【０１３０】
本発明の主題はさらに、以下の例示的実施形態でもある：
１．Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの上昇した発現が、
ａ）遺伝子発現に関する調節またはシグナル構造の改変、
ｂ）コードする核酸配列の転写活性の改変、
ｃ）コードする核酸配列の遺伝子コピー数の上昇、および
ｄ）ａ）〜ｃ）からの組合せ
を含む群から選択される改変に基づくことを特徴とするコリネ型細菌細胞。
【０１３１】
２．Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ活性の高まった活性が、
ａ）コードする核酸配列の発現の上昇、
ｂ）高まった触媒活性および／または基質特異性を有するＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の発現、
ｃ）コードする核酸配列から導かれるｍＲＮＡの安定性の上昇、
ｄ）Ｄ−キシロースを変換するための相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの触媒活性および／または基質特異性の改変、および
ｅ）ａ）〜ｄ）からの組合せ
を含む群から選択される改変に基づくことを特徴とする、主題１に記載のコリネ型細菌細胞。
【０１３２】
３．主題１または２に記載の、
ａ）本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇している、
ｂ）本発明による核酸配列の発現が増強している、
ｃ）配列番号３によるミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ１）またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、
ｄ）配列番号４によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１の活性が上昇している、
ｅ）好ましくは、配列番号９および配列番号１０の核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子の群から選択される、ｉｏｌＴ１遺伝子の作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位内の１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ１）をコードする核酸配列を有する、
ｆ）配列番号５によるミオイノシトール／プロトン共輸送体（ＩｏｌＴ２）またはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列の発現が増強している、
ｇ）配列番号６によるアミノ酸配列またはその断片を有するミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ２の活性が上昇している、
ｈ）ｃ）およびｆ）によるミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１／２をコードする両核酸配列の発現が上昇している、
ｉ）ｄ）およびｇ）による両ミオイノシトール／プロトン共輸送体ＩｏｌＴ１／２の活性が上昇している、
ｊ）本発明によるＤ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードするｉｏｌＧを含有するｉｏｌＣ遺伝子クラスターの非コード調節領域内にある作動可能に連結された１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位の機能性が低下もしくはスイッチオフされているか、または１つもしくは複数のＩｏｌＲ結合部位が部分的もしくは完全に欠失している核酸配列を有する、
ｋ）好ましくは、配列番号７、配列番号８、配列番号６３、および配列番号６４による核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を含む群から選択される、ｉｏｌＣ遺伝子クラスターの作動可能に連結されたＩｏｌＲ結合部位内の１つまたは複数のヌクレオチド置換またはヌクレオチド欠失を有する、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を有する、
ｌ）ミオイノシトール調節因子ＩｏｌＲまたはその断片もしくは対立遺伝子をコードする核酸配列が、完全または部分的に欠失している、
ｍ）ｉｏｌＲ遺伝子の発現が低下または欠如している、
ｎ）ミオイノシトール調節因子ＩｏｌＲの活性が低下もしくは完全にスイッチオフされている、または
ｏ）ａ）〜ｎ）からの組合せであるコリネ型細菌細胞。
【０１３３】
４．好ましくは、主題１〜３のいずれか一つに記載のコリネ型細菌を用いる、
ａ）水およびＣ５炭素源を含有する溶液を準備するステップ、
ｂ）相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列の発現が増強している、および／または相同Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼの活性が上昇しているコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップａ）による溶液中で、Ｃ５炭素源をＤ−キシロネートへ微生物変換するステップ、および
ｃ）任意選択的に該溶液からＤ−キシロネートを単離および／または調製するステップ
を含む、Ｄ−キシロネートの生産方法。
【０１３４】
【表１】
2021524262.tif 000003
【０１３５】
【表２】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図５−１】
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【図６】
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【図７】
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【図７−１】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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