(57)【要約】【課題】動物（特に、哺乳動物、そして最も詳細には、ヒト）の癌性および非癌性の腫瘍の処置における使用のための化合物および組成物を提供すること。【解決手段】ノルジヒドログアイアレチン酸誘導体、および腫瘍の処置のためのその使用方法。腫瘍を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、本明細書化１に示される式の少なくとも１つのノルジヒドログアイアレチン酸誘導体を含み、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ3、またはアミノ酸残基を示すが、各々は、同時に−ＯＨではない、組成物。本発明はまた、真核生物細胞周期においてＣＤ２を阻害するための薬学的組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶによって誘導される腫瘍を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、以下の式：
【化１】
2008019278.tif 000018
の少なくとも１つのノルジヒドログアイアレチン酸誘導体および薬学的に受容可能なキャリアを含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基、またはアミノ酸残基の置換基、またはそれらの塩を示すが、各々は、同時に−ＯＨではない、組成物。
【請求項２】
前記腫瘍が、頚部の腫瘍、口の癌、ペニスの腫瘍、頭部および首の腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、髄芽腫、乳頭腫、奇形腫および腺腫からなる群より選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記腫瘍が哺乳動物中に存在する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記腫瘍が、悪性腫瘍および良性腫瘍からなる群より選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記ＮＤＧＡ誘導体が、テトラ−Ｏ−メチルＮＤＧＡである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記ＮＤＧＡ誘導体が、テトラグリシナルＮＤＧＡである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
局所適用のために処方される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記ＮＤＧＡ誘導体が、塩酸塩である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記腫瘍が、癌性腫瘍または非癌性腫瘍である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記腫瘍が、固形腫瘍である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記腫瘍への注射のために処方される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記腫瘍への標的化された送達のために処方される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのノルジヒドログアイアレチン酸誘導体が約７５ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で前記組成物中に存在する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記誘導体が、テトラ−Ｏ−メチルノルジヒドログアイアレチン酸である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記誘導体が、テトラグリシニルノルジヒドログアイアレチン酸である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、被験体への注射のために処方される、請求項１４〜１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、局所適用のために処方される、請求項１４〜１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、前記腫瘍部位への標的化された送達のために処方される、請求項１４〜１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記腫瘍が、頚部、口、ペニス、または頭部および首の腫瘍である、請求項１４〜１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記腫瘍が、癌性腫瘍または非癌性腫瘍である、請求項１４〜１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記腫瘍が、固形腫瘍である、請求項１４〜１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
迅速に分裂する細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物であって、該組成物は、以下の式：
【化２】
2008019278.tif 000019
の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基、またはアミノ酸残基の置換基、またはそれらの塩を示すが、各々は、同時に−ＯＨではない、組成物。
【請求項２４】
腫瘍を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、以下の式：
【化３】
2008019278.tif 000020
の少なくとも１つのノルジヒドログアイアレチン酸誘導体および薬学的に受容可能なキャリアを含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、
−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基、またはアミノ酸残基の置換基、またはそれらの塩を示すが、各々は、同時に−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３ではなく、該誘導体は、７５ｍｇ／ｍｌまたは２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、組成物。
【請求項２５】
細胞分裂またはアポトーシスに関連する遺伝子の発現のアップレギュレーションのための薬学的組成物であって、該組成物は、以下の式：
【化４】
2008019278.tif 000021
の少なくとも１つのノルジヒドログアイアレチン酸誘導体および薬学的に受容可能なキャリアを含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基、またはアミノ酸残基の置換基、またはそれらの塩を示し、ここで、該細胞分裂またはアポトーシスに関連する遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼインヒビター、アポトーシス（ＡＰＯ−１）抗原、デスドメイン３（ＤＲ３）、Ｒａｓ関連タンパク質ＲＡＰ−１、およびヒトＭＡＰキナーゼからなる群より選択される、組成物。
【請求項２６】
細胞分裂またはアポトーシスに関連する遺伝子の発現のダウンレギュレーションのための薬学的組成物であって、該組成物は、以下の式：
【化５】
2008019278.tif 000022
の少なくとも１つのノルジヒドログアイアレチン酸誘導体および薬学的に受容可能なキャリアを含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基、またはアミノ酸残基の置換基、またはそれらの塩を示し、ここで、該細胞分裂またはアポトーシスに関連する遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ７、ヒトサイトカインレセプター、増殖細胞核抗原ＰＣＮＡ、ヒトＴＮＦ関連アポトーシス（ＡＰＯ２）、およびシステインプロテアーゼからなる群より選択される、組成物。
【請求項２７】
Ｇ２期で細胞を停止させるための薬学的組成物であって、該組成物は、以下の式：
【化６】
2008019278.tif 000023
の少なくとも１つのノルジヒドログアイアレチン酸誘導体および薬学的に受容可能なキャリアを含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基、またはアミノ酸残基の置換基、またはそれ
らの塩を示す、組成物。
【請求項２８】
増殖する細胞においてＳｐ１により調節される遺伝子の発現を阻害するための薬学的組成物であって、該組成物は、以下の式：
【化７】
2008019278.tif 000024
の少なくとも１つのノルジヒドログアイアレチン酸誘導体および薬学的に受容可能なキャリアを含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基、またはアミノ酸残基の置換基、またはそれらの塩を示す、組成物。
【請求項２９】
ＳＰ１結合部位を含むＤＮＡへのＳｐ１タンパク質の結合を阻害するための薬学的組成物であって、テトラグリシナルＮＤＧＡを含む、組成物。
【請求項３０】
前記ＤＮＡがウイルスプロモーターを含む、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記ウイルスプロモーターが、ＨＩＶまたはＨＳＶまたはＨＰＶのウイルスプロモーターである、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記Ｓｐ１タンパク質結合の阻害は、ウイルス複製の阻害を引き起こす、請求項３１に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
前記アミノ酸残基、またはアミノ酸残基の置換基、またはそれらの塩が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、チロキシン、３−メチルヒスチジン、ε−Ｎ−メチルリジン、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、アミノアジピン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、Ｎ−メチルアルギニン、Ｎ−アセチルリジン、およびＮ，Ｎ−ジメチル置換アミノ酸残基からなる群より選択される、請求項１および２３〜２８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
前記キャリアが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、リン酸緩衝化生理食塩水、脂質ベースの処方物、および生理学的生理食塩水からなる群より選択される、請求項１および２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が同一であり、かつ−ＯＣＨ３または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２Ｎ＋Ｈ（ＣＨ３）２Ｃｌ−のいずれかである、請求項１および２３〜２７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２３、２５、２６、２７、および２８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
明細書中に記載の、化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載されそして特許請求される本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金のもとで一部行われた。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、腫瘍およびウイルス感染の処置のための、ノルジヒドログアイアレチン酸誘導体の使用、特に、天然に存在しているアミノ酸の置換基を含有している誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（２．背景情報）
発癌は、種々の遺伝的な因子および後成的因子による影響を受ける多段式の事象であり、そして種々の組織に起源する制御されない細胞の増殖の勃発によって象徴される。抗癌研究についての普遍的な目標は、腫瘍の増殖の減少において非常に有効であり、宿主に対して無毒性であり、そしてほとんどの患者について与えることができる、臨床的な処置の開発にある。分裂している細胞に対して固有である標的の阻害に焦点を当てる薬物が、実質的な副作用の危険性を伴わずに有効な化学療法剤であるはずである。
【０００４】
細胞は、それらが細胞周期を進行する際に、多くのチェックポイントを通過する。特定の基準が、これらのチェックポイントのそれぞれを通過するために満たされなければならない。Ｇ２／Ｍ移行においては、最も必須の調節因子は、サイクリン依存性キナーゼであるＣＤＣ２である。このキナーゼは、調節タンパク質であるサイクリンＢに対して強固に結合し、そして成熟促進因子（ＭＰＦ）と呼ばれる、この複合体はまた、細胞が初期分裂前期に入るように導く多くの事象を刺激する役割を果たす（１）。驚くべきことではないが、ＭＰＦのいずれかの成分の欠失または脱活性化（ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）は、細胞のＧ２への進行をブロックする。
【０００５】
ＭＰＦの発現および活性は、種々のレベルで調節される。サイクリンＢタンパク質のレベルは、細胞周期のＧ１期およびＳ期を通じてゆっくりと上昇し、Ｇ２期からＭ期への移行の間にピークとなり、そして有糸分裂の間に急激に減少する（２）。一方、ＣＤＣ２タンパク質は、通常は、細胞周期の間に存在するが、レベルは、Ｇ２期の最後の段階でわずかに上昇する（３）。タンパク質の活性は、適切なサイクリンとの会合、ならびにホスファターゼであるＣＤＣ２５Ｃによるその阻害部位の脱リン酸化に依存する（４、５）。この脱リン酸化の不全が、放射線または化学的な作用によるＤＮＡの損傷に応答して、Ｇ２停止を開始することが示されている。最近の証拠はまた、任意の残存している活性なＣＤＣ２が、ＤＮＡの損傷の後で核の外側に輸送され得ることを示唆する（６）。
【０００６】
植物のリグナンのノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）の多数の天然に存在している誘導体が、ウイルスの転写の阻害を通じてウイルスの複製をブロックすることが示されている。この初期の研究は、ＮＤＧＡ誘導体（元々、Ｌａｒｒｅａ  Ｔｒｉｄｅｎｔａｔａから単離され、そしてその後、化学的に合成された）が、ＨＩＶ（７、８）、ＨＳＶ（９）、およびＨＰＶ（１０）のＳｐ１依存性プロモーターの脱活性化によって、そのＨＩＶ、ＨＳＶ、およびＨＰＶの転写物の産生を阻害し得ることを示した。予想外に、これらの誘導体の１つであるテトラ−Ｏ−メチルＮＤＧＡもまた、哺乳動物の細胞株中での細胞周期の停止を誘導するようである。本明細書中で以下に示される証拠は、Ｍ4Ｎが検出可能な毒性を伴うことなく哺乳動物細胞中でＧ２停止を誘導し得ることを実証し、そしてこのことは、この停止が、サイクリン依存性キナーゼＣＤＣ２の阻害に起因するという観察を支持する。
【０００７】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染は、多くの型の扁平上皮細胞において調節されない細胞増殖を引き起こし、それによって良性の乳頭腫（ｐａｌｌｉｌｏｍａｅ）（いぼ）から、頚部（ｃｅｒｖｉｃａｌ）、ペニスおよび口の癌までの範囲の苦痛を生じる。ＨＰＶとのこれらの癌の強力な関係、および感染の広範囲での出現は、抗ＨＰＶ治療を開発することの重要性を示す。
【０００８】
全てではないがほとんどのウイルス（それらの複製的に活性な変異体を含む）が、宿主依存性である。これらは、ウイルスの増殖をサポートするために特定の細胞性の因子の関与を必要とする。宿主の細胞性因子は、ウイルスタンパク質とは異なり、変異の圧力下にはなく、そして一般的には、構造的に不変性である。従って、ウイルスの生活環の異なる段階でこれらの細胞性因子の利用をブロックする化合物は、おそらく、変異に感受性でない抗ウイルス剤としての良好な候補である。ＨＩＶ−１の阻害のための別の標的として細胞性の因子を使用するいくつかの研究が、概説されている（１１）。
【０００９】
出願人らは、最初に、クレオソートノキ（Ｃｒｅｏｓｏｔｅ  ｂｕｓｈ）（Ｌａｒｒｅａ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔａ）から単離した３’−Ｏ−メチル化ＮＤＧＡ（すなわち、Ｍａｌ．４）が、基底のＨＩＶの転写、Ｔａｔ調節性のトランス活性化、およびヒトの細胞培養物中でのＨＩＶの複製を、特異的にブロックし得ることを報告した（１２、１３、１４）。Ｍａｌ．４は、ＨＩＶプロウイルス性テンプレートのプロモーターに対する転写因子Ｓｐ１の結合を妨害することによってその効果を発揮する。Ｍａｌ．４の標的は、ＨＩＶの長末端反復（ＬＴＲ）のＳｐ１結合部位である、ヌクレオチド−８７〜−４０にマップされる。改変されていないＮＤＧＡは、インビトロで、ＨＩＶの転写を阻害せず、そしてＳｐ１の結合に対して影響を有さない（１２）。
【００１０】
しかし、植物のリグナンの単離および精製は、骨の折れる、そしてコストの高い作業である。ヒトにおけるＳｐ１調節性のウイルスおよび腫瘍の増殖の制御における植物のリグナンの可能性のある臨床的用途の予測において、９個の異なるメチル化ＮＤＧＡの活性が、低いコストで、大量に、親基質としてメチル化されていないＮＤＧＡを使用して化学的に合成された（１５）。３０μＭ以下の薬物の濃度で、テトラ−Ｏ−メチルＮＤＧＡが、Ｓｐ１調節性のプロウイルスの転写およびトランス活性化の阻害によるＨＩＶの複製の制御において、最も有効であることが見出された（１５）。この研究は、それ以降、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）の増殖の制御にまで拡大されている（１６）。単純ヘルペスウイルス最初期（ＩＥ）ＩＣＰ４遺伝子は、ＨＳＶの複製に必須である（１７）。そのプロモーター領域は、８個のＳｐ１コンセンサス結合部位を保有しており（１８）、そのうちの５個が、ＩＣＰ４遺伝子の発現に必要である。従って、このことは、ＩＣＰ４遺伝子を、このような試験のための良好な候補にする。出願人らは、３−Ｏ−メチルＮＤＧＡ（Ｍａｌ．４）およびテトラ−Ｏ−メチルＮＤＧＡ（Ｍ4Ｎ）の両方ともが、電気泳動の移動度シフトアッセイによって示されるようなＩＣＰ４プロモーターへのＳｐ１タンパク質の結合のブロックによる、Ｖｅｒｏ細胞におけるＨＳＶ  ＩＣＰ４遺伝子の発現の有効な転写インヒビターであることを見出した。
【００１１】
感染させたＶｅｒｏ細胞において、Ｍ4ＮおよびＭａｌ．４の抗ＨＳＶ活性を試験し、そしてアシクログアノシン（アシクロビル、ＡＣＶ）の活性と比較した場合に、出願人らは、Ｍ4ＮについてのＩＣ50が、ＨＳＶ−１の１０回の継代およびＨＳＶ−２の４回の継代について１１．７μＭから４μＭの間で変化し、は、高い薬物濃度の必要性を明らかに増大する傾向を伴わなかったことを観察した。しかし、ＡＣＶについてのＩＣ50は、最初のウイルスの継代についての７μＭから、ＨＳＶ−１の１０回目の継代については４４４μＭにまで、そしてＨＳＶ−２の４回目の継代については＞８８μＭにまで増大した。このことは、それらの、Ｖｅｒｏ細胞におけるＡＣＶに対する薬物耐性の迅速な増強を示している。結果として、選択指数Ｓ．Ｉ．（ＴＣ50／ＩＣ50）は、Ｍ4Ｎについては比較的安定なままであるが、ＡＣＶについてのＳ．Ｉ．は、Ｖｅｒｏ細胞中でのウイルスの継代後に６０倍低下した（１６）。従って、Ｍ4Ｎは、変異に感受性でない薬物である。これは、ＡＣＶ耐性ＨＳＶを有効に阻害し得る（１６）。
【００１２】
Ｓｐ１が重要な細胞性の転写因子であるという事実（１９）に起因して、Ｓｐ１調節性の細胞遺伝子の発現に対する、このクラスの化合物の可能性のある阻害効果に、取り組むべきである。Ｍａｌ．４は、一旦それがその結合部位に安定に結合すると、Ｓｐ１と置換し得ない（１２）。従って、おそらく、ＮＤＧＡ誘導体は、定常期の細胞中のＳｐ１調節性のハウスキーピング遺伝子の発現に対するよりも、増殖している細胞中のＳｐ１調節性の遺伝子に対してより大きな影響を有するようである。後者の場合においては、この薬物は、ＤＮＡの合成の間に遺伝子のプロモーター中のＳｐ１部位に対してＳｐ１タンパク質と競合することが可能であり、一方、前者の場合においては、この薬物は、それらのプロモーターに対してすでに安定に結合したＳｐ１タンパク質を有する、ハウスキーピング遺伝子の転写クロマチンに対してほとんど影響を有さない。実際に、そのようなケースにあることが示されている。以下に実証されるように、９６００個の発現された遺伝子を含む遺伝子アレイ研究を使用することによって、出願人らは、ほとんどのＳｐ１調節性遺伝子の産物が、同様のレベルで存在し、そして培養物中の頚癌細胞Ｃ３の薬物での処置によっては影響されなかったことを見出した（図５）。それでもなお、確かに、Ｍ4Ｎの比較的低い選択指数は、薬物が全身的に使用されなければならない場合に、最も低い有効濃度にその使用を制限する。一方、ヒトパピローマウイルスは、固形の頚部および口の腫瘍を、ＨＰＶ  Ｅ6／Ｅ7遺伝子のＳｐ１調節性の発現によって最初に誘導する（２０）。出願人らは、薬物が、インサイチュで送達され得、そして腫瘍の領域でのみ維持され得る場合には、高濃度の薬物が、患者に対する損傷をほとんど伴うことなく、腫瘍を効率良く破壊するために使用され得ると考えた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）腫瘍を処置するための薬学的組成物であって、その組成物は、以下の式：
（化１）
2008019278.tif 000002
の少なくとも１つのノルジヒドログアイアレチン酸誘導体を含み、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ3、またはアミノ酸残基を示すが、各々は、同時に−ＯＨではない、組成物。
（項目２）  上記腫瘍がＨＰＶによって誘導される、項目１に記載の組成物。
（項目３）  上記腫瘍が頚部または口の癌である、項目２に記載の組成物。
（項目４）  上記腫瘍が哺乳動物中に存在する、項目１に記載の組成物。
（項目５）  上記腫瘍が悪性である、項目４に記載の組成物。
（項目６）  上記腫瘍が、扁平上皮癌、腺癌および髄芽腫からなる群より選択される、項目５に記載の組成物。
（項目７）  上記腫瘍が良性である、項目４に記載の組成物。
（項目８）  上記腫瘍が、乳頭腫、奇形腫および腺腫からなる群より選択される、項目７に記載の組成物。
（項目９）  上記腫瘍が固形腫瘍である、項目４に記載の組成物。
（項目１０）  上記哺乳動物がヒトである、項目４に記載の組成物。
（項目１１）  上記腫瘍が、形質転換された細胞に由来する、項目４に記載の組成物。
（項目１２）  上記細胞がＣ3細胞である、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）  少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１４）  上記賦形剤またはキャリアが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）  上記誘導体が、テトラ−Ｏ−メチルノルジヒドログアイアレチン酸（Ｍ4Ｎ）およびテトラグリシニルノルジヒドログアイアレチン酸（Ｇ4Ｎ）である、項目１に記載の組成物。
（項目１６）  上記誘導体が、テトラ−Ｏ−メチルノルジヒドログアイアレチン酸であり、そして上記組成物が、少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１７）  少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアとともに、テトラ−Ｏ−メチルノルジヒドログアイアレチン酸を含む、薬学的組成物。
（項目１８）  上記賦形剤またはキャリアが、ＤＭＳＯである、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）  以下の式：
（化２）
2008019278.tif 000003
の化合物であって、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、同一であり、そしてアミノ酸残基を示す、化合物。
（項目２０）  項目１９に記載の化合物を合成する方法であって、以下の工程：
ジクロロメタン溶液中で、ＮＤＧＡおよびＮ，Ｎ，−ジメチルグリシンを混合する工程；
その溶液にＤＣＣおよびＤＭＡＰを添加する工程；
アセトンを添加しそして過剰のＨＣｌでその溶液を泡立てて、その化合物を得る工程、
を包含する、方法。
（項目２１）  項目１９に記載の化合物を合成する方法であって、以下の工程：
ジクロロメタン溶液中で、ＮＤＧＡおよびアミノ酸のＮ，Ｎ，−ジメチル誘導体を混合する工程；
その溶液にＤＣＣおよびＤＭＡＰを添加する工程；
アセトンを添加しそして過剰のＨＣｌでその溶液を泡立てて、その化合物を得る工程、
を包含する、方法。
（項目２２）    少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアとともに、テトラグリシニルノルジヒドログアイアレチン酸を含む、薬学的組成物。
（項目２３）  上記賦形剤またはキャリアが生理学的生理食塩水である、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）  テトラグリシニルノルジヒドログアイアレチン酸。
（項目２５）  真核生物細胞周期においてＣＤ２を阻害するための薬学的組成物であって、その組成物は、以下の式：
（化３）
2008019278.tif 000004
の化合物を含み、ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ3、またはアミノ酸残基を示すが、各々は、同時に−ＯＨではない、組成物。
（項目２６）  上記細胞が動物細胞である、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）  上記細胞が哺乳動物細胞である、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）  上記細胞がヒト細胞である、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）  医薬としての項目１９に記載の化合物の使用。
（項目３０）  腫瘍の処置のための医薬の製造のための項目１９に記載の化合物の使用。
（発明の要旨）
従って、本発明の１つの目的は、動物（特に、哺乳動物、そして最も詳細には、ヒト）の癌性および非癌性の腫瘍の処置における使用のための化合物および組成物を提供することである。本発明のこの局面に従って、腫瘍の増殖を阻害する新規のノルジヒドログアイアレチン酸誘導体が、提供される。
【００１４】
ノルジヒドログアイアレチン酸誘導体によって、以下の構造の化合物が意味される：
【００１５】
【化４】
2008019278.tif 000005
ここでは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ3、またはアミノ酸残基を示すが、それぞれが同時に−ＯＨではない。アミノ酸置換基は、とりわけ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、チロキシン、３−メチルヒスチジン、ε−Ｎ−メチルリジン、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、アミノアジピン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、Ｎ−メチルアルギニン、およびＮ−アセチルリジンを含むことが意図される。
【００１６】
本発明に従う使用に特に好ましい化合物は、Ｍ4ＮおよびＧ4Ｎであり、これらは図１に示される。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、これらの新規の誘導体の使用によって、および当該分野で公知であったが以前には腫瘍の処置のためには使用されていなかった類似の誘導体によって、癌性の腫瘍および非癌性の腫瘍を処置するための方法を提供することである。この方法は、サイクリン依存性キナーゼＣＤＣ２を含有している、迅速に増殖する細胞型に対して、特に有効であるはずである。本発明のさらなる目的は、特に、動物細胞、より詳細には、哺乳動物細胞、そして最も詳細には、ヒト細胞の、真核生物細胞周期においてＣＤＣ２を阻害する方法を提供することである。
【００１８】
処置される腫瘍として、本発明の方法に従って使用される上記の化合物に対して感受性である任意の腫瘍が挙げられる。詳細には、これは、サイクリン依存性キナーゼＣＤＣ２サイクルの阻害に対して感受性である、迅速に分裂する癌性の腫瘍および良性の腫瘍を含む。
【００１９】
用語「癌性の腫瘍」は、任意の悪性の腫瘍（転移していても、転移していなくてもよい）を含むことが意図される。用語「非癌性の腫瘍」は、任意の良性の腫瘍を含むように意図される。これらの用語は、当業者によって習慣的に理解されているように使用される。
【００２０】
本発明の組成物および方法によって処置され得る良性の腫瘍および悪性の腫瘍の例は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（本明細書中で参考として援用されている、Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｗ．Ｒｕｄｄｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、１９９５）の表１−１に見出され得る。処置される腫瘍は、ウイルス起源であることが公知の腫瘍、ならびにウイルスに起源しないことが公知の腫瘍を含む。本発明の組成物および方法は、固形腫瘍の処置において特に有用であると予想される。
【００２１】
本発明のなお別の目的は、サイクリン依存性キナーゼＣＤＣ２サイクルの阻害方法を提供することである。この方法は、細胞増殖（特に、迅速に分裂する細胞型）を阻害することにおいて有用である。
【００２２】
好ましい実施態様においては、本明細書中に記載されている化合物および組成物は、ＨＰＶ誘導性の腫瘍の処置において使用される。ＨＰＶによって誘導される腫瘍としては、特に、ＨＰＶ感染に関係する、頚部、口、ペニスならびに頭部および首の癌が挙げられるが、これらに限定されない。この方法は、癌性および非癌性のＨＰＶ誘導性腫瘍に対する、ノルジヒドログアイアレチン酸誘導体、特に、テトラ−Ｏ−メチルノルジヒドログアイアレチン酸（Ｍ4Ｎ）およびテトラグリシニルノルジヒドログアイアレチン酸（Ｇ4Ｎ）の局所的な適用を含む。
【００２３】
本発明のなお別の目的は、アミノ酸置換基を含有している式Ｉの化合物の投与によって、ウイルスの複製および増殖を阻害する方法を提供することである。アミノ酸置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が同一である化合物が、この方法における使用に好ましい。
【００２４】
Ｍ4Ｎ、Ｇ4Ｎ、および他の誘導体が、腫瘍内への局所的な注射によって、一般的には、薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤およびキャリアとともに、投与されることが、意図される。好ましい実施態様においては、Ｍ4Ｎは、ＤＭＳＯ溶液の形態で腫瘍中に注射され、そしてＧ4Ｎは、ＰＢＳ溶液中で投与される。Ｇ4Ｎの使用は、特に、大きな腫瘍（＞２ｃｍ3）において、Ｍ4Ｎの使用を補完する。これは、腫瘍のより大きな領域に拡散することを可能にする、その水溶性に起因する。他の水溶性および水不溶性のノルジヒドログアイアレチン酸誘導体が、本発明に従って同様に使用され得る。これらはまた、当該分野で公知でありそして使用されているような、全身的な送達のための脂質ベースの処方物中で使用され得る。
【００２５】
薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤およびキャリアによって、Ｍ4Ｎ、Ｇ4Ｎおよび他の類似の誘導体と適合性であるとして当業者に公知であり、そして本発明に従うヒトまたは他の哺乳動物への局所的な投与に適切であるこのような化合物が、意味される。本明細書中の以下の実施例は、局所的な注射の手段による投与を記載するが、他の局所投与の手段（例えば、局所的な塗布、または腫瘍部位への標的化された送達）もまた使用され得る。
【００２６】
所望の処置効果を得るために投与される化合物の量は様々であるが、当業者によって容易に決定され得る。投与量、投与の頻度、および処置の長さは、環境、主に、腫瘍の大きさおよびタイプに依存する。しかし、毎日〜１週間毎の間隔またはそれよりも少ない頻度での、１ｇの腫瘍の重量あたり１０ｍｇから２０ｍｇのＭ4Ｎ単独または同様の量のＧ4Ｎとともにのいずれかでの投与が、例示目的のために記載され得る。単独でまたはＧ4Ｎと組み合せてのいずれかで、２００ｍｇ／ｍｌ濃度のＤＭＳＯ中に溶解した、５０μｌ〜１００μｌのＭ4Ｎの投与が、１〜１．５ｃｍ3の腫瘍の多くの症例において有効であると予想される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
（実験方法）
ＮＤＧＡ誘導体は、化学的に合成された（１５）。細胞株Ｃ３は、Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ  Ｋａｓｔ  ｏｆ  Ｌｏｙｏｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．によって提供された、Ｃ５７  ＢＬ／６ｋｈ起源の、ＨＰＶ１６Ｅ＋Ｌおよび活性化されたＲａｓで形質転換された細胞株である。これは、Ｇｒｅｅｎｓｔｏｎｅら（２１）およびＦｅｌｔｋａｍｐら（２２、２３）によって記載されているように維持され、そして培養される。
【００２８】
（Ｇ4Ｎの合成：）
ｍｅｓｏ−１，４−ビス［３，４−（ジメチルアミノアセトキシ）フェニル］（２Ｒ，３Ｓ）−ジメチルブタン塩酸塩テトラグリシニルＮＤＧＡ、Ｇ4Ｎの調製のための標準的な手順。ＮＤＧＡ（１２．８ｇ、４２．３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮ，Ｎ，−ジメチルグリシン（２６．２ｇ、２５４ｍｍｏｌ、６．０当量）を含有しているジクロロメタン（２５０ｍｌ）の溶液に対して、ＤＣＣ（５２．４ｇ、２５４ｍｍｏｌ、６．０当量）およびＤＭＡＰ（２．３２ｇ、１８．９ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。反応混合物を、室温で窒素下で２４時間攪拌した。反応混合物が濾過された後、溶液は、減圧下で濃縮された。次いで、アセトン（２５０ｍｌ）が反応フラスコ中に添加され、そして溶液は、過剰のＨＣＬ（ｇ）で泡立てられた。水溶性の沈殿がＨ2Ｏ中に溶解され、そしてアセトンから室温で２回再沈殿されて、（１）（２９．２ｇ、３６．８ｍｍｏｌ）が、８７％の収率で白色の固体として得られた。プロトンＮＭＲスペクトルが、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ−４００（４００ＭＨｚ）スペクトル分析計上で、Ｄ2Ｏ溶媒およびＴＳＰを内部標準として使用することによって得られた。炭素−１３ＮＭＲスペクトルが、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ−４００（４００ＭＨｚ）スペクトル分析計上で、溶媒としてＤ2Ｏを使用することによって得られた。炭素−１３化学シフトは、ＴＳＰの一重線に対して照合される（δ０．０ｐｐｍ）。
【００２９】
合成はスキーム１に示される。
【００３０】
【化５】
2008019278.tif 000006
一般的な手順。全ての反応は、他に特に示されない限りは、窒素雰囲気下でオーブンで乾燥させたガラス容器（１２０℃）の中で行われた。アセトン、ジクロロメタン、１，４−ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、およびテトラヒドロフランは、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入された。アセトンは、４Ａモレキュラーシーブで乾燥され、そして蒸留された。ジクロロメタン、酢酸エチル、およびヘキサンは乾燥させられ、そしてＣａＨ2から蒸留された。１，４−ジオキサンおよびテトラヒドロフランは、窒素雰囲気下でナトリウムおよびベンゾフェノンからの蒸留によって乾燥された。ノルジヒドログアイアレチン酸は、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入された。Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、モルヒネ、トリエチルアミン、および炭酸カリウムは、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｃ．から購入された。１−ブロモ−３−クロロプロパン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、およびメチルホスホロジクロリデートは、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入された。
【００３１】
分析用の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｃ．から購入された、予めコーティングされたプレート（シリカゲル６０  Ｆ−２５４）上で行われた。ガスクロマトグラフィー分析は、２５ｍの架橋したメチルシリコーンガムキャピラリーカラム（０．３２ｍｍ  ｉ．ｄ．）を備えた、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ機器上で行われた。窒素ガスが、キャリアガスとして使用され、そして流速は１４．０ｍＬ／分で一定に維持された。保持時間ｔRは、以下の条件下で測定された：インジェクター温度  ２６０℃、等温カラムの温度  ２８０℃。ガスクロマトグラフィーおよび低分解能質量スペクトル分析が、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ５９７１Ａ  Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＤｅｔｅｃｔｏｒおよびキャピラリーＨＰ−１カラムを備えた、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ機器上で行われた。中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）による分離は、Ｊａｓｃｏ  Ｍｏｄｅｌ  ８８０−ＰＵインテリジェントＨＰＬＣポンプの使用によって１２０ｍＬ／時間の流速で行われた。ＭＰＬＣパッキング材料、Ｒｅｖｅｒｓｅｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  Ｃ１８（粒子の大きさ  ０．０３５〜０．０７０ｍｍ）は、Ｋｎａｕｅｒ  Ｃｏ．から購入された。重量カラムクロマトグラフィーによる精製が、Ｍｅｒｅｋ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（粒子の大きさ  ０．０６３〜０．２００ｍｍ、７０〜２３０メッシュＡＳＴＭ）の使用によって行われた。
【００３２】
赤外（ＪＲ）スペクトルが、Ｂｏｍｅｍ  Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ  Ｓｅｒｉｅｓ
ＦＴ−ＩＲスペクトル分析計上で測定された。報告される波数は、ポリスチレン１６０１ｃｍ〜１吸収について言及される。吸収強度は、以下の略号によって記録される：ｓ、強い；ｍ、中程度；ｗ、弱い。プロトンＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ−４００（４００ＭＨｚ）スペクトル分析計上で、溶媒としてのＤ2Ｏ、ならびに内部標準としての３−（トリメチルシリル）プロピオン酸、ナトリウム塩の使用によって得られた。炭素−１３ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ−４００（１００ＭＨｚ）スペクトル分析計上で、溶媒としてＤ2Ｏを使用することによって得られた。炭素−１３化学シフトは、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸、ナトリウム塩の一重線（６０．０ｐｐｍ）の中心に対して参照される。多重線は、以下の略号によって記録される：ｓ、一重線；ｄ、二重線；ｔ、三重線；ｑ、四重線；ｍ、多重線；Ｊ、カップリング定数（ヘルツ）。高分解能質量スペクトルは、ＪＥＯＬ  ＪＭＸ−ＨＸ１１０質量スペクトル分析計によって得られた。
【００３３】
ｍｅｓｏ−１，４ビス［３，４（ジメチルアミノアセトキシ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｍｉｎｏａｃｅｔｏｘｙ））フェニル］−２Ｒ，３Ｓ−ジメチルブタン塩酸塩（２）。ジクロロメタン（２５０ｍＬ）中のＮＤＧＡ（１、１２．８１ｇ、４２．３７ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮ，Ｎ−ジメチルグリシン（２６．２１ｇ、２５４．２ｍｍｏｌ、６．０当量）の溶液に対して、ＤＣＣ（５２．４５ｇ、２５４．２ｍｍｏｌ、６．０当量）およびＤＭＡＰ（５．１７６ｇ、４２．３７ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。反応混合物を、室温、窒素下で２４時間攪拌した。反応混合物中のジシクロヘキシル尿素が濾過された後、得られた溶液は、減圧下で濃縮された。次いで、アセトン（２５０ｍＬ）が残渣に添加され、得られた溶液は、過剰のＨＣｌ（ｇ）で泡立てられた。沈殿を水中に溶解し、そして室温でアセトンの使用によって２回再度沈殿されて、２（２８．９７ｇ、３６．８６ｍｍｏｌ）が、８７％の収率で白色の固体として得られた：1Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ，４００ＭＨｚ）δ０．７８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，６Ｈ．２×ＣＨ3）、１．７３（ｍ，２Ｈ．２×ＣＨ）、２．３８（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，９．６Ｈｚ，２Ｈ．２×ＡｒＣＨ）、２．７８（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，４．４Ｈｚ，２Ｈ．２×ＡｒＣＨ）、３．０３（ｓ，２４Ｈ．８×ＣＨ3Ｎ）、４．５３（ｓ，８Ｈ，４×ＣＨ2Ｎ）、７．２２（ｍ，４Ｈ．４×ＡｒＨ）、７．２９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ．２×ＡｒＨ）；13Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ，１００ＭＨｚ）δ１８．１１、４０．８２、４１．７３、４６．７５、５９．５９、１２５．７９、１２６．５８、１３１．６３、１４０．６６、１４２．４７、１４６．１１、１６７．８４；ＩＲ（ＫＢｒ）３４６１（ｂｒ）、２９６３（ｍ）、１７７７（ｓ，Ｃ＝Ｏ）、１６２０（ｍ）、１４７８（ｍ）、１３７７（ｍ）、１２１０（ｍ）、１１０６（ｍ）、９６１（ｗ）、８５２（ｗ）ｃｍ-1；（２−４ＨＣｌ）のＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ（相対強度）６４３（Ｍ＋，３０）、６００（２０）、５８８（４３）、５１５（２０）、４７３（４２）、４３０（１３）、３８８（２６）、１８５（１８）、９３（３８）、５８（１００）、４４（２２）；（２−４ＨＣｌ）のＨＲＭＳ（ＦＡＢ）Ｃ34Ｈ50Ｎ4Ｏ8についての計算値６４２．３６２８、実測値６４２．３６１４；分析．Ｃ34Ｈ54Ｎ4Ｏ8Ｃｌ4についての計算値：Ｃ，５１．７８；Ｈ．６．９０；Ｎ．７．１０；Ｏ．１６．２３。実測値：Ｃ，５１．７０；Ｈ．６．８５；Ｎ．７．０５；Ｏ．１６．２１。
【００３４】
他のＮ，Ｎ−ジメチル置換されたアミノ酸の適切な置換により、本発明のさらなるアミノ酸置換された化合物が合成され得ることが、理解される。
【実施例】
【００３５】
（実施例１）
（ＳＰ１によって調節されるＨＰＶ  Ｅ6／Ｅ7プロモーター活性を有するＭ4Ｎおよびいくつかの他のＮＤＧＡ誘導体の効果）
ＳＰ１によって調節されるＨＰＶ  Ｅ6／Ｅ7プロモーター活性を有するＭ4Ｎおよびいくつかの他のＮＤＧＡ誘導体の効果を、レポーターとしてルシフェラーゼを使用して試験した。アッセイは、リン酸カルシウム法によって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合したＨＰＶ１６ＬＣＲ（Ｐ97プロモーター）の、Ｃ３３Ａ細胞へのＤＮＡトランスフェクションに依存する。Ｃ３３Ａは、頸部腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ登録番号第ＨＴＢ−３１）である。これは、任意の組み込まれたＨＰＶ  ＤＮＡは含有しないが、ＨＰＶ初期遺伝子プロモーターの強力な発現のために必須の転写因子を有する。ＤＮＡトランスフェクションの１日後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の助けを用いて溶解させた種々の薬物濃度を、細胞に対して添加した。薬物での処理の３０時間後（その結果、アッセイは、一時的なトランスフェクション実験については、標準的には４８時間内に完了する）、細胞を溶解させ、そして特異的なルシフェラーゼ活性を決定した（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ、米国特許第５，２８３，１７９号）。Ｍ4Ｎ薬物濃度が増大するに伴って、特異的なルシフェラーゼ活性が低下した。
【００３６】
結果（図２に示す）は、Ｍ4Ｎが、ルシフェラーゼアッセイにおいてＨＰＶ  Ｅ6／Ｅ7プロモーターで、Ｓｐ１によって調節される転写開始を劇的に減少させることを示す。
【００３７】
（実施例２）
（Ｍ4Ｎでの処理の後での、Ｅ6／Ｅ7  ｍＲＮＡ合成の阻害）
Ｍ4Ｎでの処理の後での、Ｅ6／Ｅ7  ｍＲＮＡ合成の阻害を、頸部細胞株Ｃ3中でＲＴ−ＰＣＲによって測定した。比較ＲＴ−ＰＣＲを、計数した細胞数に対して標準化した全細胞ＲＮＡの量を用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲル上で分析した。結果を、図３に示す。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、Ｅ７（３２１ｂｐ）およびＥ６（２０４ｂｐ）について予想される大きさの増幅されたｃＤＮＡが、２２サイクルの増幅のような早い段階で、ＤＭＳＯで処理された細胞中で検出されたことを示した。これらの同じ産物は、薬物で処理したＲＮＡ抽出物中では、３０サイクルの増幅後にかろうじて検出可能であった。テンプレートＰＣＲコントロールについて、またはＨＰＶ１６−ネガティブＣ３３ａ細胞株の全ＲＮＡ抽出物からは、増幅された産物は検出されなかった。
【００３８】
（実施例３）
（Ｍ4Ｎ処理による頸部Ｃ３細胞増殖の阻害）
ＨＰＶ−１６で形質転換した不死マウス上皮細胞（Ｃ３細胞）を、１つのバイアルあたり１０5個の細胞の密度でプレートした。２４時間後、バイアルの１／２に対して、１％のＤＭＳＯ中に溶解させた４０μＭのＭ4Ｎを含有している増殖培地を与え、一方、他の半分には、１％のＤＭＳＯのみを含有している増殖培地を与えた。結果を図４Ａに示す。２４時間以内に、薬物で処理したＣ３細胞とコントロールＣ３細胞との間での細胞の形態学における差異が観察された。薬物で処理した細胞の増殖および分裂は、処理していないコントロールと比較して明らかに減少し、一方、全細胞の計数と比較した生存可能な細胞の割合は、薬物で処理した細胞およびＤＭＳＯのみのコントロール細胞の両方について一定のままであった。このことは、Ｍ4Ｎが細胞分裂を劇的に減少させることを示す。
【００３９】
培地からのＭ4Ｎの除去後のＣ３の増殖に対する効果もまた、試験した。Ｃ３細胞を、１つのバイアルあたり１０4個の細胞の密度でプレートした。時間＝０で、バイアルの２／３に、１％のＤＭＳＯ中の４０μＭのＭ4Ｎを補充した増殖培地を与えた。残りのバイアルには、１％のＤＭＳＯのみを含有している増殖培地を与えた。７３時間後、それらの増殖培地中にＭ4Ｎを受容したバイアルの１／２を洗浄し、そして１％のＤＭＳＯのみを含有している培地を添加した。細胞のバイアルの他の２／３を洗浄し、そして前に投与したものと同じ培地で置き換えた。図４Ｂに示す結果は、細胞増殖の速度が、薬物を含有していない培地への交換の後には、Ｍ4Ｎで処理したサンプル中では顕著には増大しなかったことを示し、このことは、Ｍ4Ｎが細胞外環境からのその除去の後でもなお細胞分裂を有意に減少させ続けることを示す。
【００４０】
（実施例４）
（薬物での処理の前および７２時間後の、Ｃ３細胞中での細胞性遺伝子発現の分析）
９６００個の遺伝子アレイを用いて遺伝子発現を研究した（図５）。７２時間、Ｍ4Ｎ（４０μｍ）で処理した（Ｃ3  Ｍ4Ｎ）および未処理（Ｃ3ＤＭＳＯ）のものに由来するそれぞれのポリＡ+ＲＮＡの５マイクログラムを、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５１、３１３−３２４、１９９８に記載されている手順に従って、ヒトの９６００個の遺伝子アレイハイブリダイゼーション研究の対において使用した。ハイブリダイゼーション画像を、Ｎｉｋｏｎ  ５５ｍｍ  ＡＦ  ｍｉｃｒｏ  Ｎｉｋｏレンズを備えたカラービデオカメラによってキャプチャーし、そしてＭａｃｉｎｔｏｓｈ  ＬＣ６３０コンピューターによってデジタル化した。単色または２色の態様のいずれかで色素形成酵素の酵素基質反応を通じるこのような検出は再現性があり、そして非常に敏感である（１０7個の細胞に由来するＲＮＡを用いて、１個の細胞あたり転写物の５個未満のコピーを検出することができる）。
【００４１】
示差的に発現される遺伝子を示すコンピューターのプリントアウト（Ｃ3  Ｍ4Ｎ／Ｃ3  ＤＭＳＯ  ＞１０、およびＣ3  ＤＭＳＯ／Ｃ3  Ｍ4Ｎ  ＞１０）を、検査のために列挙した。ＴＩＦＦ形式での画像ファイルおよびＭＳエクセル形式でのデータファイルを、ＺＩＰディスケットに保存する。遺伝子の名称およびクローンのＩＤ番号は、将来のノーザンブロットでの確認のための画像のクローンを得るために利用可能である。
【００４２】
Ｍ4Ｎでの処理の７２時間後にアップレギュレートかまたはダウンレギュレートされるかのいずれかである遺伝子の群の中で、以下は細胞分裂およびアポトーシスに特に関係するものである。いくつかの他の細胞周期に関連する遺伝子もまた、Ｍ4Ｎに応答して大きくアップレギュレートされる。サイクリン依存性キナーゼＣＤＣ２（実施例１１）に加えて、例えば、以下である：
【００４３】
【化６】
2008019278.tif 000007
以下の細胞周期に関係している遺伝子は、Ｍ4Ｎに応答して大きくダウンレギュレートされる：
【００４４】
【化７】
2008019278.tif 000008
早い時点（例えば、薬物での処理の１時間後）で、Ｅ6／Ｅ7レベルは、コントロールの細胞中でのものと同様であることを見出し、一方、４．５時間後には、Ｅ6／Ｅ7はもはやＲＴ−ＰＣＲによっては検出不可能であった（３９）。９６００個の遺伝子アレイを用いた遺伝子発現を、薬物の最初の細胞性の効果をさらに低下させるために、これらの短期間処理した細胞（１時間および５時間）から単離したＲＮＡを用いて繰り返すことが可能である。
【００４５】
（実施例５）
（Ｍ4Ｎの局所的な注射によるマウス中でのＣ３腫瘍増殖の標的化）
３６匹のＣ５７ｂｌ−１６  ＮＣＲマウスに、マウスの背中の両肩の間に、５×１０5個のＣ３細胞を注射した。マウスのうちの２４匹が、２０日以内に腫瘍を生じた。毎日の注射（５０μｌ〜１００μｌのＭ4ＮまたはＭ4Ｎ／Ｇ4Ｎ）（ＤＭＳＯ中の２００ｍｇ／ｍｌのＭ4Ｎ、ＰＢＳ中の２００ｍｇ／ｍｌのＧ4Ｎ）は、表１および２、図６および７に示すように、動物中での腫瘍の増殖に対して重大な影響を示した。
【００４６】
（表１．マウスにおいて生じた単一腫瘍の増殖に対するＭ4ＮおよびＧ4Ｎの効果）
【００４７】
【表１】
2008019278.tif 000009
*ＤＭＳＯ＝薬物についてのビヒクル
**１５日目に採取した
***ほとんどの壊死性の細胞に含まれる病変がまた、マウス６、７、１１、１４、１５、１７、１９、２１、２８、１９に由来する病変中に見出された（図６、７）。薬物での処置の後では、マウス＃１１および＃２２においては病変は存在しなかった。コントロールのマウス＃１、２、３、４中で見出される腫瘍が、増殖している細胞を含んだ（図２）。
【００４８】
（実験手順：）
３６匹のＣ５７ｂｌ−１６ＮＣＲマウスに、５×１０5個のＣ３細胞／マウスを注射した。注射は、マウスの背中の両肩の間に皮下で１００μｌを行った。細胞を、低塩ＨＢＳＳ中に懸濁し、そして均質な懸濁物を、穏やかにボルテックスすることによって維持した。
【００４９】
２４匹のマウスが腫瘍を発症した。それらの病変の大きさを、ダイアルキャリパーによって測定した。これらのマウスを、剃毛し、体重を量り、そして処置を開始した（１日目）。４匹のマウスをコントロールとして隔離した。コントロールマウスには、５０μＬのＤＭＳＯを毎日腫瘍内注射によって受容させた。実験マウス（１０）には、ＤＭＳＯ中に溶解させた（２００ｍｇ／ｍＬ）５０μＬのＭ4Ｎを与えた。さらに１０匹のマウスには、８日間のＭ4Ｎでの処置、続いて、８日間の毎日のＧ4Ｎでの処置（５０μＬ、ＰＢＳ中の２００ｍｇ／ｍＬ）を受容させた。注射を、腫瘍のいくつかの領域に対して行った。マウスを、注射の前にエーテルまたはメタファン（ｍｅｔａｐｈａｎｅ）で麻酔した。
【００５０】
（表２．複数の腫瘍を有するマウスにおける、処置した病変の増殖に対するＭ4ＮおよびＧ4Ｎの効果）
【００５１】
【表２】
2008019278.tif 000010
*ＤＭＳＯ中の薬物を、腫瘍の領域に直接注射した
**薬物を使わない隣接している腫瘍に由来する
（表３．マウスにおけるＧ4Ｎの毒性研究）
【００５２】
【表３】
2008019278.tif 000011
ＮＣＩからのＣ５７ＢＬ−１６ＮＣＲ雌性マウスを、この実験において使用した。テトラグリシナールＮＤＧＡ（Ｇ4Ｎ）を、７５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中で毎日新しく作製した。１回の処置あたり、群１については０．０５ｍｌの注射、群２および４については０．１ｍｌの注射、そして群３については０．２ｍｌの注射を、６日間の間行った。実験は７日間続いた。体重を、注射の前および６日後に決定した。実験期間を通じて有意な体重の変化は観察されなかった。
【００５３】
全ての処置したマウス、コントロール（マウス番号（＃）１〜４）、および実験マウス（マウス番号６、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７
Ｍ4Ｎ、番号１８〜２２、２４、２６〜２９  Ｍ4Ｎ／Ｇ4Ｎ）が、腫大を示した。病変の大きさの測定を、ダイアルキャリパーによって行った。いくつかのマウスは、注射に起因して穏やかな出血を経験した。処置レジメおよび結果は以下のとおりであった：
１０日目：マウスを再び体重測定した。全てのマウスが、２グラムの成長を示した。
１２日目：処置を行わなかった。
１３日目：全てのマウスが、非常に異なる程度ではあったが、皮膚が盛り上がった。１匹のＭ4Ｎで処置したマウス（＃７）の皮膚は、割れて開き、これは「乾燥した腫瘍」になった。
１４日目：注射の容量を１００μＬに増大させた。
１５日目：１匹のＭ4Ｎで処置したマウス（＃１７）が、麻酔の過剰用量／取り扱いによって死亡した。＃１７の病変の部位の皮膚にはひびが入り、これは「乾燥した腫瘍」を示していた。これを解剖し、そして病変を切り出しそして秤量した。
１６日目：さらに４匹のＭ4Ｎで処置したマウス（＃６、１４、１５、１６）、３匹のＭ4Ｎ／Ｇ4Ｎで処置したマウス（＃１９、２１、２８）、および１匹のコントロールマウス（＃２）を安楽死させ、解剖し、そして秤量した。残りのコントロールマウス（＃１、３、４）を、非侵襲的に試験し、そしてこれらは腫瘍を保有していた。
２１日目：コントロールマウスに由来する腫瘍の大きさを、ダイアルキャリパーによって測定した。観察：マウス＃１０および＃１２（Ｍ4Ｎで処置した領域）の病変部位の皮膚にはひびが入り、そして「乾燥した腫瘍」を示していた。
【００５４】
２４日目：マウス＃７の皮膚は再び完全にカバーされた。実験を、この日で終了した。全ての残っているマウス、Ｍ4Ｎで処置したマウス（＃７、９、１０、１１、１２）、およびＭ4Ｎ／Ｇ4Ｎで処置したマウス（＃１８、２０、２４、２６、２９）を安楽死させ、解剖し、試験し、そして秤量した。
【００５５】
マウス中でのＣ３腫瘍の増殖に対するＭ4ＮおよびＭ4Ｎ／Ｇ4Ｎの効果を、表１および２、ならびに図５および６にまとめる。表１は、単一の腫瘍を保有しているマウス中でのＣ３細胞の増殖に対する薬物の影響を示す。コントロールの群の４個の切除した腫瘍の平均の重量は１．４８ｇであり、一方、Ｍ4Ｎで処置したマウスおよびＭ4Ｎ／Ｇ4Ｎで処置したマウスに由来する病変の重量は、それぞれ、０．１４２ｇおよび０．５１ｇであった。薬物で処置した病変は、主に、乾燥した壊死性の細胞から構成された（図６）。コントロールの群に由来する腫瘍は、均質であるようであり、そして活性に増殖する細胞を含んだ。表２は、複数の腫瘍を保有しているマウス中でのＣ３腫瘍の増殖に対する薬物の影響を示す。この研究においては、薬物を、腫瘍の１つに注射した。未処置の腫瘍の平均の重量は１．７７ｇであり、一方、Ｍ4Ｎで処置した病変の平均の重量は、０．１５ｇであった。同様の結果が、Ｍ4Ｎ／Ｇ4Ｎの注射の後に得られた−−未処置の腫瘍の平均の重量は１．２７ｇであり、一方、薬物で処置した病変の平均の重量は、わずか０．１０３ｇであった。
【００５６】
全体の実験期間の間の全てのマウスの体重の変化は、些細なものであるようであった（表１および２）。
【００５７】
（実施例６）
マウスの２つの群に由来する薬物で処置した（Ｍ4Ｎ）腫瘍およびＤＭＳＯビヒクルで処置したマウスまたは未処置のマウス（ＣＯＮ）を、組織病理学的な試験のために調製した。切り出した腫瘍をすぐに固定し、次いでリン酸緩衝化生理食塩水中の４％のホルムアルデヒド中で保存した。次いで、固定した組織を、一連の段階的なアルコールおよびキシレンを通じて脱水し、そしてパラフィン中に胞埋した。パラフィン組織ブロックを薄く切片状にし、そしてヘマトキシリンおよびエオシンを用いて顕微鏡分析のために染色した。組織病理学的研究は、コントロールの腫瘍がＤＭＳＯでの処置によっては影響を受けず、そして増殖し続けることを示した。これらは、高い核／細胞質比、多形性の核の変化、高い有糸分裂形状、紡錘糸状の肉腫の形状、および癌細胞の特徴である周辺組織への浸潤を示す。
【００５８】
対照的に、Ｍ4Ｎ処置を受容けた腫瘍は、処置が開始された直後に増殖をやめる。これらは、有意な壊死を示し、そしてもはや生存可能ではない。高倍率で生存可能な少量の薬物の沈殿が存在し、そして局所的な領域は慢性の炎症および繊維症を示す。この治癒効果は、この領域からのこれらの死んだ腫瘍細胞の分離を導く。同じ結果が、Ｍ4Ｎでの処置のみを用いた場合と同様に、Ｍ4Ｎ／Ｇ4Ｎでの処置を用いて見られる。しかし、Ｇ4Ｎが水可溶性であるので、これは、Ｍ4Ｎよりも腫瘍の大きな領域に対して広がり得る。Ｍ4Ｎとともに共働で使用される場合には、Ｇ4Ｎは、大きな大きさ（すなわち、２ｃｍ3よりも大きい）の腫瘍を標的化する（ｔｒａｔｉｎｇ）際により有効であり得ることが、予想される。
【００５９】
（実施例７：モルモットでのＨＳＶ−１の皮膚感染に対するＭ4Ｎの影響）
薬物Ｍ4Ｎをまた、モルモットの皮膚感染におけるＨＳＶ−１の複製の阻害において試験した。モルモットの皮膚を針で傷つけ（ｐｉｎｃｈ）、そしてＨＳＶ抑制剤をそれぞれの穿刺した領域に感染させるように局所的に塗布した。次いで、Ｍ4Ｎを、注射後、毎日、６日間の間、穿刺して感染させた領域に対して塗布した。
【００６０】
モルモットの裸にさせた背中の皮膚の６個の領域を、５＝ＤＩＮ針で滅菌的に穴を開けた。２つの領域を、ＨＳＶ−１（ＨＳＶ−Ｃ、培養上清、または生理食塩水中に単離したＨＳＶ、ＨＳＶ−ＳＣ）で感染させた。他の４つの領域を、ＨＳＶ−ＳＣで感染させた。注射の１５分後、３０μｌの試験化合物（ＤＭＳＯ中の、ＡＢＤＳ1、ＡＢＤＳ2、ＡＣＶ、およびＭ4Ｎ（４Ｎ）  ６０ｍｇ／ｍｌ）を、１つの領域のそれぞれのパンチして感染させた領域に対して、１日に５回、６日間塗布した。ＡＢＤＳ1およびＡＢＤＳ2を、ネガティブコントロールとして含めだ。図８の写真を、６日目に撮影し、そしてこれは、薬物の非存在下（ＨＳＶ−Ｃ、ＨＳＶ−ＳＣ）、有効ではない薬物の存在下（ＨＳＶ−ＡＢＤＳ1、ＨＳＶ−ＡＢＤＳ2）、および有効な薬物の存在下（ＨＳＶ−Ｍ4Ｎ、およびＨＳＶ−ＡＣＶ）でのＨＳＶ−１の複製の程度を示す。６個の大きな融合性の水疱が、ＨＳＶ−Ｃ、ＨＳＶ−ＳＣ、ＨＳＶ−ＡＢＤＳ1、ＨＳＶ−ＡＢＤＳ2によって処置した領域中で生じ、一方、Ｍ4Ｎでの処置（４Ｎ）およびＡＣＶでの処置の後には、感染させた領域中では水疱は観察されなかった。
【００６１】
Ｍ4ＮがＨＳＶの複製をブロックし得るという明確な結果を、皮膚の病変の消失によって、そして薬物での処置の４日後にウイルスの脱殻がないことによって示されるように、このモデルシステムにおいて得た。最初の動物実験もまた、Ｍ4Ｎが、腹膜内で与えられた場合には３００ｍｇ／ｋｇ程度の高い濃度で、そして皮下またはＩＶのいずれかによって与えられた場合には３７５ｍｇ／ｋｇ程度の高い濃度で、マウスに対して無毒性であることを示した（表３）（６）。
【００６２】
（実施例８：インサイチュでの注射を使用する臨床的な処置のためのＭ4Ｎ）
薬物送達経路としての腫瘍内への直接のＭ4Ｎの投与は、いくつかの特有の欠点を提供する。１）Ｍ4Ｎは疎水性の化合物であり、そしてＤＭＳＯ中に極めて可溶性である（２００ｍｇ／ｍｌ）。従って、少量の薬物の溶液のみが、薬物の有効な投与量を達成するための注射に必要である。上記の実施例５に記載するマウスでの実験においては、数日間の間の、５０μｌから１００μｌの毎日の注射が、マウスでの腫瘍の増殖を完全に停止させるために十分であった。疾患を処置するためのＤＭＳＯの大きな投与量（１回の処置あたり３０ｍｌのＩＶ）の使用について、いくつかの以前の研究が存在している（２４）。結果は、明確ではなかった（２５）。しかし、全世界で何千万人ものヒトが、過去に大きな量のＤＭＳＯを用いて安全に試験されている（２６）ので、ＤＭＳＯは、その極少量が使用される場合には、薬物の送達のためのビヒクルとして安全であるはずである。２）インサイチュでの注射によって、薬物の残りの大部分は不溶性であり、そして腫瘍の領域で濃縮され、そして循環系には入らない。従って、全身の毒性は回避される。さらに、その増殖を抑制するために十分な薬物が腫瘍内に残っているので、薬物の持続的な注射は、比較的少ない回数の処置の後には必要はない。実施例５のマウスでの研究においては、腫瘍細胞は、Ｍ4Ｎの注射の中断の後にもなお、死滅し続けた。従って、薬物が直接標的化される場合には、腫瘍の大きさは、投与される薬物の必要とされる量についての決定的な因子となる。ヒト対マウスの全体重間での差異は、無関係となる。マウスの腫瘍の研究においては、１０日間の間の２０ｍｇ／日が、腫瘍を排除するために十分以上であった。匹敵する大きさ（１〜１．５ｃｍ3）のヒトの腫瘍を処置するためには、これよりも高い投与量を使用するための理由は存在しないはずである。このことは、ヒトでの治験においてリスクを相当減少させるはずである。
【００６３】
（実施例９：細胞のＭ4Ｎでの処理は、細胞増殖をブロックする）
Ｍ4Ｎについての本発明者らの以前の研究は、Ｓｐ１依存性のプロモーターの非活性化によってウイルスの転写を阻害することができることを示した。多くの哺乳動物の細胞周期遺伝子もまた、欠くことのできないＳｐ１プロモーターを含み、そして従って、Ｍ4Ｎはそれらの転写をブロックし得る。この仮説を、多数の種々の細胞株に対するＭ4Ｎの抗増殖効果を試験することによって試験した。本発明の化合物であるＮＤＧＡの低い濃度（１０μＭ）は、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導することが以前に示されている（２７）。しかし、この効果は、カテコール酸素の１つをブロックすること、またはＮＤＧＡに対する親水性基の付加によって回避され得る（２８）。漸増量のＮＤＧＡ誘導体であるＭ4Ｎを、増殖を阻害するために必要とされる最適な濃度を決定するために、ＨＰＶ−１６／ｒａｓで形質転換したＣ３細胞株（２９）の培養物について試験した（図９ａ）。細胞は、Ｍ4Ｎに対して十分に応答して、４０〜６０μＭまでの濃度の範囲にわたって７２時間後に細胞分裂をやめた。これらの濃度での３日後、細胞の数は、処置の開始時点（０日、図９）での数と等しいままであった。細胞の増殖におけるより穏やかな減少が、より低い薬物濃度で観察され、そしていくらかの細胞死が、６０μＭよりも大きい濃度で見られた。
【００６４】
Ｃ３細胞株に対するＭ4Ｎの抗増殖の影響は、単にＳｐ１依存性のＨＰＶ−１６  Ｅ６／Ｅ７オンコジーンプロモーターを非活性化する薬物の能力に起因するのではない。なぜなら、同様の増殖の阻害が、そのＥ６／Ｅ７オンコジーンがＳｐ１依存性ではないレトロウイルスプロモーターの制御下にある、ＨＰＶ−１６で形質転換されたＴＣ−１細胞株において観察されたからである（３０）（図９ｄ）。さらに、Ｃ３３ａ細胞株（図９ｃ）、ＨＰＶネガティブであるヒトの頚癌細胞株、およびＣＥＭ−Ｔ４株（図９ｂ）、ヒトの白血病細胞株（３１）の増殖もまた、Ｍ4Ｎでの処理によってブロックされた。薬物で処理した４つの細胞株においては、停止した細胞のほぼ全て（＞９５％）が、Ｍ4Ｎの濃度が「閾」値（Ｃ３細胞については６０μＭ、ＴＣ−１細胞については４０μＭなど）を超えるまでは、生存可能であった。これらの濃度を上回ると、生細胞の割合が、急激に減少する。興味深いことに、停止した細胞は、薬物への長期化した曝露の後にもなお、＞９５％の生存性を維持した。Ｃ３細胞は、４０μＭのＭ4Ｎでの処理の８日後に、細胞死の増大を示さなかった（図９ｅ）。
【００６５】
（実施例１０：Ｍ4Ｎで処理された細胞はＧ２期で停止する）
一旦、Ｍ4Ｎで処理された細胞が、なお生存可能でありながら増殖を停止することが確立されると、細胞ＤＮＡ内容物の分析および細胞構造の蛍光試験を、細胞が停止する細胞周期における時点を決定するために使用した。Ｍ4Ｎに対して７２時間曝露した細胞は、コントロールと比較して、増大したＧ２／Ｍ  ＤＮＡ内容物を示した（図１０ａ〜ｄ）。最も極端な応答は、Ｃ３およびＣＥＭＴ４細胞株によってら見られ、ここでは、＞９０％の細胞がＧ２／Ｍ  ＤＮＡ内容物を示す。
【００６６】
Ｇ２での停止または有糸分裂のブロックとを区別するために、αチューブリン（緑）およびγチューブリン（赤）に対する抗体を、Ｍ4Ｎでの処理の７２時間後のＣ３細胞株中での中心体の状態を決定するために使用した。図１１ａに示すように、Ｍ4Ｎで処理した細胞の中心体は、２倍であったが、細胞の核中になお互いに隣り合って配置されている。中心体は前記の初期の間に分離するので、これらの細胞は有糸分裂を開始していないと結論付けられ得る。反対に、コントロール細胞のγチューブリン染色は、Ｇ１またはＳ期に特徴的な散在性のパターンを有する（３２）。Ｍ4Ｎで処理した細胞中でのクロマチンの濃縮の欠如もまた、ＤＡＰＩ染色を用いて観察され（図１２ｂ）、これは、細胞がＧ２期から先に進めないことのさらなる証拠である（３３）。
【００６７】
（実施例１１：ＣＤＣ２の産生は４０μＭのＭ4Ｎによって阻害される）
Ｇ２からの細胞の進行は、ＭＰＦの産生に依存する。そのタンパク質成分の状態を、４０μＭのＭ4Ｎで処理したＣ３細胞中で試験した。非同期の細胞を、１％のＤＭＳＯ中にＭ4Ｎ、または１％のＤＭＳＯのみのいずれかを含有している培地中で２４時間または７２時間、増殖させた。細胞を回収し、そして等量の全細胞性タンパク質を、ウェスタンブロッティングによって分析した。ＣＤＣ２の量における明らかな減少を、Ｍ4Ｎでの処理の７２時間後に観察した（図１２ａ）。しかし、同じメンブレンを切り出し、そして再度プローブすることによって検出したサイクリンＢのレベルは、変化しないことを見出した。これらの結果は、これらの条件下で、停止はおそらく、ｐ５３に対する応答ではないようであることを示す。なぜなら、ｐ５３の過剰発現がサイクリンＢの減少を導くことが示されているからである（３４、３５）。ウェスタン分析の結果と一致して、ＣＤＣ２キナーゼ活性は、Ｍ4Ｎでの処理の７２時間で排除された（図１２ａ）。これらの実験は、薬物がＣＤＣ２タンパク質の産生を阻害することによって作用し、それによってＭＰＦの活性の喪失を生じるという見解を支持する。
【００６８】
Ｓｐ１依存性のウイルスの転写をブロックするＭ4Ｎの能力を実証する本発明者らの以前の研究は、ＣＤＣ２タンパク質の減少の可能性のある機構として、ＣＤＣ２  ｍＲＮＡレベルの減少を示唆する。このことは、サイクリンＢタンパク質（サイクリンＢタンパク質の遺伝子はその発現のためにはＳｐ１を必要とはしない）が、正常なレベルで産生され、一方、ＣＤＣ２タンパク質（ＣＤＣ２タンパク質の遺伝子はそのプロモーター中に２つの必須のＳｐ１部位を有している）は、その量が実質的に減少されるという知見と一致する。この仮説を試験するために、ノーザンブロット分析を、５〜７２時間の間、４０μＭのＭ4Ｎで処理したＣ３細胞から回収したＲＮＡについて行った。図１２ｂに示すように、ＣＤＣ２  ｍＲＮＡの量は、Ｍ4Ｎでの処理のわずか２４時間後に減少し、そして７２時間後にはほぼ排除された。Ｓｐ１によっては調節されないハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの産生を、ＲＮＡローディングコントロールとして使用し、そしてそのレベルは、４０μＭのＭ4Ｎによっては影響を受けなかった。
【００６９】
Ｃ３細胞株の使用は、本発明者らにとって、Ｍ4Ｎによって媒介される細胞周期の停止の機構の分析のためのさらなるコントロールとなる。なぜなら、他のＳｐ１依存性の遺伝子プロモーターもまた、おそらく、Ｍ4Ｎでの処理によって阻害されるからである。この可能性を、Ｓｐ１依存性のＨＰＶ−１６  Ｅ６／Ｅ７プロモーターからの転写物に対するＭ4Ｎの影響を分析することによって、Ｃ３細胞中で試験した。５から７２時間の間４０μＭのＭ4Ｎで処理したＣ３細胞から単離したＲＮＡのｒｔＰＣＲ分析は、Ｅ７転写物のレベルにおける明確な減少を示した（図１２ｃ）。ＧＡＰＤＨを、再び、この実験の内部コントロールとして使用し、そしてそのレベルは、薬物での処理によっては影響を受けなかった。これらの結果は、Ｍ4ＮがＳｐ１によって調節されるプロモーターの転写を減少させることのさらなる証拠を提供する。
【００７０】
（実施例１２：ゲル移動度シフトの分析における、Ｇ4ＮによるＳｐ１結合活性の阻害）
Ｓｐ１ファミリーのタンパク質は、結合の際にＤＮＡの主溝に対する湾曲を誘導する（３６）。Ｓｐ１タンパク質のｚｉｎｃフィンガードメインは、ＧＣ  Ｂｏｘ配列である５’−ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ−３’の結合を担う。コンピューターによる分析によって、ＮＤＧＡのアミノエステル誘導体であるＧ4Ｎが、主溝においてこのような配列と安定な複合体を形成し得ると決定した。Ｇ4ＮがＳｐ１ブロッカー、ならびにＳｐ１置換因子（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）として作用し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｓｐ１／エンハンサー相互作用研究を、Ｇ4Ｎの存在下または非存在下で、試験するためのＳｐ１のＤＮＡ結合ドメインのみを使用するゲル移動度シフトの分析によって行った。ブロッキング実験においては、種々の濃度のＧ4Ｎを、最初に32Ｐで標識したＤＮＡとともに結合緩衝液中で２５℃で３０分間、インキュベートした。組換えＳｐ１タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（Ｓｐ１−１６７Ｄ）を次に添加し、そしてさらに３０分間、大過剰のＢＳＡタンパク質の存在下でインキュベートした。置換実験においては、組換えＳＰ１−１６７Ｄを最初にＤＮＡに結合させ、次いでＧ4Ｎをインキュベーションの第２の工程で添加した。Ｇ4ＮおよびＳｐ１−１６７Ｄ濃度、ならびにインキュベーションおよびゲル電気泳動の条件は、両方の実験において同一であった（実験の節）。図１３に示すように、いずれの場合においても、Ｇ4Ｎは、Ｓｐ１−１６７Ｄタンパク質との相互作用からＤＮＡを維持することが可能であることを見出した。Ｓｐ１のＤＮＡ結合ドメインのみが試験される場合には、Ｇ4Ｎは、ゲル移動度シフトの分析によって示されるように、エンハンサーに対して結合することからＳｐ１をブロックするよりも、結合したＳｐ１の置換においてより有効であるようであった（図１３、Ａ、Ｂ、Ｄ）。本発明者らはまた、結合したＧ4ＮがＳｐ１−１６７Ｄによって置換され得るかどうかを試験した。この実験においては、Ｇ4ＮによるＳｐ１−１６７Ｄの結合の阻害を、最初に移動度シフトの分析によって証明した（図１３Ｃ、レーン２および５）。Ｇ4Ｎが結合した鋳型をさらなるＳｐ１−１６７Ｄでチャレンジした場合には、本発明者らは、Ｓｐ１−１６７Ｄ／ＤＮＡ複合体のバンドの強度の投与量依存性の増大を観察し（図６Ｃ、レーン６、７）、このことは、この鋳型からのＳｐ１−１６７ＤによるＧ4Ｎの置換を示す。
【００７１】
（実施例１３：Ｇ4ＮによるＨＩＶプロモーター活性のＳｐ１によって調節されるＴａｔトランス活性化の阻害）  以前に報告されているように、メチル化ＮＤＧＡ誘導体は、ＨＩＶ、ＨＳＶのＩＣＰ４、ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子を含む種々のウイルスのプロモーターのエンハンサー部位へのＳｐ１の結合をブロックし得る（３７、３８、３９）。本発明者らはさらに、以前に記載されているような、ＳＥＡＰアッセイにより、Ｃｏｓ細胞中でのＨＩＶプロモーター活性のＴａｔトランス活性化に対するＧ4Ｎの影響を試験した。基底レベルのＨＩＶ  ＬＴＲによって駆動されるＳＥＡＰの発現は、Ｃｏｓ細胞中でかろうじて検出可能であることが以前に見出された。Ｃｏｓ細胞がＣＭＶプロモーターによって駆動されるＴａｔ遺伝子で同時トランスフェクトされる場合には、ＳＲＡＰの発現において６０倍以上の増大が存在する（３７）。このような、ＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター活性のＴａｔによって駆動されるトランス活性化は、Ｓｐ１によって調節されることが以前に示されている（３７、４０）。本発明者らは、Ｇ4Ｎの存在下で、用量依存性の様式でのＨＩＶのトランス活性化の阻害を観察した（図１４）。Ｇ4Ｎについての３６μＭのＩＣ50値の平均値は、３−Ｏ−メチルＮＤＧＡであるＭａｌ．４のもの（ＩＣ50  ２５μＭ）に匹敵し、そしてテトラ−メチルＮＤＧＡであるＭ4Ｎのもの（ＩＣ50  １１μＭ）よりもいくらか高かった。この差異はおそらく、細胞への薬物の取り込みに影響を与える試験化合物の化学的な性質に起因する。
【００７２】
（実施例１４：Ｇ4Ｎによる細胞培養物中でのＳＩＶ−１およびＨＩＶ−１の産生の阻害）  ＨＩＶ−１およびＳＩＶの両方ともが、レトロウイルスであり、これらは、それらの複製を完全にするために宿主ゲノムへの組込みを必要とする。これらの両方ともが、それらのプロウイルスの転写のために宿主の転写因子に依存する。Ｓｐ１は、ほぼ同一の態様の転写の調節を共有しているこれらの２つのウイルスにおいて、このような発現のための中心的な役割を果たす。ＳＩＶに感染したアカゲザルをＧ4Ｎの抗ウイルス効果を試験するための動物モデルとして使用する予想においては、本発明者らは、１７４×ＣＥＭ細胞中のＳＩＶの阻害におけるＧ4Ｎの効果と、Ｈ９細胞中のＨＩＶの阻害における効果とを研究し、そして比較した。これら２つの細胞株におけるＧ4Ｎの細胞毒性もまた試験した。ＳＩＶの阻害の研究のために、１０7個の１７４×ＣＥＭ細胞を、高力価のＳＩＶｍａｃ  ２３９ストックとともに３７℃で２時間混合し、次いで、吸着されていないウイルスを除去するために冷却したＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞懸濁物を、３個の９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに等分した。種々の濃度のＧ4Ｎ溶液を、新しく調製したストックから作製し、そして別々に等分し、そして１つの９６ウェルプレート中の列の６個のウェルのそれぞれに入れた。培養上清を、感染後（Ｐ．Ｉ．）４日毎に回収し、そして適切な濃度の薬物を含有している新しい培地を上清の回収後に培養物に添加した。ウイルスの産生を、示すように（図１５）、改変したｐ２７コア抗原捕捉ＥＬＩＳＡによってアッセイした。５μＭより高い濃度でＧ4Ｎを使用した場合には、ＳＩＶの産生は検出されなかった。２．５μＭよりも低いＧ4Ｎ濃度では、ＳＩＶの産生は、薬物の非存在下でのウイルスの産生と比較して、４日目および８日目の感染後培養物に由来する培養上清中で検出された（図１５）。Ｇ4Ｎ（２５０μＭ以下）は、ＭＴＴアッセイによって決定した場合は、感染させていない１７４×ＣＥＭ細胞に対しては毒性の影響を示さなかった。同様の実験を、Ｈ９細胞においてＧ4ＮによるＨＩＶ−１の阻害の研究のために行った。Ｈ９細胞を、１×１０5／ｍｌで継代培養し、そしてＨＩＶ−１のＡＺＴ耐性株（ＨＩＶ−１ＲＴＭＦ）を用いて感染させた。種々の濃度のＧ4Ｎを、感染の２時間後に添加した。新しい培地との交換を、４日ごとに行った。Ｇ4Ｎの存在下での細胞の増殖を、９日の実験期間の間、注意深くモニターした。ウイルスの産生を、ｐ２４コア抗原捕捉ＥＬＩＳＡによってアッセイした。示すように（図１６）、８０μＭの濃度のＧ4Ｎは、Ｈ９細胞中でのＨＩＶの複製を完全に阻害した。ＨＩＶ−１  ＲＴＭＦの阻害については、１２μＭ  Ｇ4ＮのＩＣ50を見出した。再び、アッセイの範囲内（および２５０μＭ未満）では未感染のＨ９細胞に対する毒性は検出されなかった。
【００７３】
本明細書中に引用した参考文献を、利便性のために以下に列挙し、そして参考として本明細書によって援用する。
【００７４】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、Ｍ4ＮおよびＧ4Ｎの構造を示す。
【図２】図２Ａは、Ｅ6／Ｅ7プロモーターの領域（ｐＰＶ１６Ｐ９７）およびＳｐ１タンパク質への結合部位を示す、ＨＰＶ−１６ＬＣＲを示す。  図２Ｂは、Ｃ−３３Ａ細胞中でのＥ6／Ｅ7プロモーター活性に対するＭ4Ｎの影響を示す（種々の濃度のＭ4Ｎによるルシフェラーゼ遺伝子の転写により駆動されるＥ6／Ｅ7プロモーターの阻害）。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、４０μＭのＭ4Ｎによる、ウイルスのＥ6およびＥ7  ＲＮＡ転写物の阻害を示す。増殖培地中で７１時間、４０μＭのＭ4ＮまたはＤＭＳＯのみのいずれかで処理したＣ３細胞から単離した全ＲＮＡを、比較ＲＴＰＣＲに供した。ＲＴＰＣＲサンプルを、増加した増幅サイクルの後で取り出し、そしてアガロースゲル上で分析した。ゲル写真（３Ａおよび３Ｂ）は、これらのサイクルでの、増殖培地中でのＭ4Ｎの存在（＋）または非存在（−）を示し、そしてサイズマーカーとして使用したｐＧＭＴベクターの２つの消化物を示した。増幅マップ（２Ｃ）は、２つの予想される大きさの増幅産物を示し、これらは、初期のウイルスのＲＮＡ転写物の異なるスプライシングによって得られた。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｍ4ＮによるＣ３細胞の増殖の阻害を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｍ4Ｎの除去後のＣ３細胞の増殖の阻害を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ＧＥＮＥ  Ａｓｓａｙ分析によって試験した、Ｃ３細胞中での遺伝子発現に対するＭ4Ｎの影響を示す。５Ａ．ＤＭＳＡ処理の＞２時間後のＣ３細胞中で発現されるＧＥＮＥ（Ｃ３  ＤＭＳＯ）。５Ｂ．溶媒としてＤＭＳＯを使用するＭ4Ｎ処理の＞２時間後のＣ３細胞中で発現されるＧＥＮＥ（Ｃ３  Ｍ4Ｎ）。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、Ｍ4Ｎ処理後の腫瘍保有マウスの目視観察を示す。６Ａ．単一の腫瘍を保有しているマウスを、ＤＭＳＯ（＃３）またはＭ4Ｎ（＃７）のインサイチュでの注射で処置した。Ｍ4Ｎのインサイチュでの注射はまた、マウス＃９において増殖した２つの腫瘍のうちの１つに対してもなされた。６Ｂ．表２に記載するような、同じマウス＃９に由来する未処置の腫瘍およびＭ4Ｎで処置した腫瘍（白色の瘢痕）。
【図７】図７は、図７は、マウス中での腫瘍の増殖に対する、Ｍ4ＮおよびＭ4Ｎ／Ｇ4Ｎの組織病理学的な影響を示す。  パネルの第１列目は、ＤＭＳＯでの処置（ＣＯＮ）後の、マウス＃１２、１０、２７、および２０（Ｍ4Ｎ）由来の比較的少量の薬物で処置した（Ｍ4ＮまたはＭ4Ｎ／Ｇ4Ｎ）病変と比較した、マウス＃４、１０、１２由来の大きなサイズの腫瘍を示す。続く写真は、１００×の倍率で試験したこれらの腫瘍の例である（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＭＳＯで処置したマウス、Ｄ、未処置のマウス、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｍ4ＮまたはＭ4Ｎ／Ｇ4Ｎで処置したマウス）（表１および表２）。
【図８】図８は、薬物の非存在下（ＨＳＶ−Ｃ、ＨＳＶ−ＳＣ）、有効ではない薬物の存在下（ＡＢＤＳ1［「ＨＳＶ−ＡＢＤＳ1」］、ＡＢＤＳ2［「ＨＳＶ−ＡＢＤＳ2」］）、および有効な薬物の存在下（Ｍ4Ｎ［「ＨＳＶ−４Ｎ」］およびＡＣＶ［「ＨＳＶ−ＡＣＶ」］でのＨＳＶ−１の複製を示す。
【図９】図９は、Ｍ4Ｎが哺乳動物細胞中で増殖の停止を生じることを示す。（ａ〜ｄ）Ｃ３、ＣＥＭ−Ｔ４、Ｃ３３ａ、およびＴＣ−１細胞を、種々の濃度のＭ4Ｎで処理した。実験の開始時に存在する細胞の数を、０日として示す。３日後、生存可能な細胞の数を計数し、そしてＭ4Ｎの濃度に対してプロットした。（ｅ）Ｃ３細胞を、Ｔ−２５フラスコ中に分け、１つのフラスコあたり５×１０3個の細胞を有するようにし、そして培地中の１％のＤＭＳＯ中のＭ4Ｎ、または培地中の１％のＤＭＳＯのみのいずれかを入れた（最初の培地交換）。３日後、Ｍ4Ｎで処理した細胞の１／２に、１％のＤＭＳＯのみを含有している新しい培地（Ｍ−Ｄ）を入れ、一方、残りの細胞には、同じ条件で新しい培地を入れた（第２回目の培地交換）。細胞を毎日計数し、そして処理の回数に対してプロットした。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｍ4Ｎで処理した細胞はＧ２／Ｍ中で停止することを示す。Ｃ３細胞（ａ）、Ｃ３３ａ細胞（ｂ）、ＣＥＭ−Ｔ４細胞（ｃ）、およびＴＣ１細胞（ｄ）を、１％のＤＭＳＯ、またはＭ4Ｎとともに１％のＤＭＳＯ（Ｍ4Ｎ）のいずれかを含有している培地中で３日間、増殖させた。細胞をトリプシン処理し、エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、そして続いてフローサイトメトリーによって分析した。データを、細胞の数（３〜５×１０4個の全細胞）対ヨウ化プロピジウムでの染色の強度として表示した。細胞周期の示される段階が標識され、そして染色強度によって決定されるように、相対的な細胞性のＤＮＡの引き立たせ（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）に対応する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、Ｍ4Ｎで処理した細胞はＧ２／Ｍ中で停止することを示す。Ｃ３細胞（ａ）、Ｃ３３ａ細胞（ｂ）、ＣＥＭ−Ｔ４細胞（ｃ）、およびＴＣ１細胞（ｄ）を、１％のＤＭＳＯ、またはＭ4Ｎとともに１％のＤＭＳＯ（Ｍ4Ｎ）のいずれかを含有している培地中で３日間、増殖させた。細胞をトリプシン処理し、エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、そして続いてフローサイトメトリーによって分析した。データを、細胞の数（３〜５×１０4個の全細胞）対ヨウ化プロピジウムでの染色の強度として表示した。細胞周期の示される段階が標識され、そして染色強度によって決定されるように、相対的な細胞性のＤＮＡの引き立たせ（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）に対応する。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、Ｍ4Ｎで処理した細胞はＧ２／Ｍ中で停止することを示す。Ｃ３細胞（ａ）、Ｃ３３ａ細胞（ｂ）、ＣＥＭ−Ｔ４細胞（ｃ）、およびＴＣ１細胞（ｄ）を、１％のＤＭＳＯ、またはＭ4Ｎとともに１％のＤＭＳＯ（Ｍ4Ｎ）のいずれかを含有している培地中で３日間、増殖させた。細胞をトリプシン処理し、エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、そして続いてフローサイトメトリーによって分析した。データを、細胞の数（３〜５×１０4個の全細胞）対ヨウ化プロピジウムでの染色の強度として表示した。細胞周期の示される段階が標識され、そして染色強度によって決定されるように、相対的な細胞性のＤＮＡの引き立たせ（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）に対応する。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、Ｍ4Ｎで処理した細胞はＧ２／Ｍ中で停止することを示す。Ｃ３細胞（ａ）、Ｃ３３ａ細胞（ｂ）、ＣＥＭ−Ｔ４細胞（ｃ）、およびＴＣ１細胞（ｄ）を、１％のＤＭＳＯ、またはＭ4Ｎとともに１％のＤＭＳＯ（Ｍ4Ｎ）のいずれかを含有している培地中で３日間、増殖させた。細胞をトリプシン処理し、エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、そして続いてフローサイトメトリーによって分析した。データを、細胞の数（３〜５×１０4個の全細胞）対ヨウ化プロピジウムでの染色の強度として表示した。細胞周期の示される段階が標識され、そして染色強度によって決定されるように、相対的な細胞性のＤＮＡの引き立たせ（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）に対応する。
【図１１】図１１は、４０μＭのＭ4Ｎで処理したＣ３細胞がＧ２細胞の構造を実証することを示す。Ｃ３細胞を、１％のＤＭＳＯ（コントロール）、または４０μＭのＭ4Ｎとともに１％のＤＭＳＯ（Ｍ4Ｎ）のいずれかを含有している培地中で３日間、カバースライド上で増殖させた。サンプルをエタノールで固定し、そしてα（緑）およびγ（オレンジ）チューブリンに対する抗体（ａ）、またはＤＡＰＩ  ＤＮＡ染色（ｂ）とともにインキュベートした。細胞を、蛍光顕微鏡で試験した。
【図１２】図１２は、ＣＤＣ２およびウイルス癌遺伝子がＭ4Ｎによって減少されることを示す。Ｃ３細胞を、１％のＤＭＳＯ（Ｄ）、または４０μＭのＭ4Ｎを含む１％のＤＭＳＯ（Ｍ）のいずれかを含有している培地中で、種々の時間（数字は時間で）の間増殖させた。示された時間の後、全タンパク質または全ＲＮＡを細胞から単離した。ウェスタンブロット（ａ−上段の２つのパネル）を、ＣＤＣ２またはサイクリンＢに対する抗体を使用して、同じニトロセルロースフィルターを用いて行った。キナーゼアッセイ（ａ−下段の２つのパネル）を、γ−32Ｐ  ＡＴＰおよびヒストンＨ１とのインキュベーションによる、サイクリンＢに対する抗体での免疫沈降の後で行った。ＰＡＧＥゲルのクマシー染色を、ローディングのコントロールとして含んだ。２４時間および７２時間の薬物での処理についてのキナーゼアッセイを、別々に行った。  ノーザンブロット（ｂ）を、全ＲＮＡ抽出物について行った。フィルターを、ＣＤＣ２またはＧＡＰＤＨについてのランダムプライムした32Ｐ標識したＤＮＡとともに一晩インキュベートし、洗浄し、そして３日間フィルムに対して暴露した。同じフィルターを、ＣＤＣ２およびＧＡＰＤＨ  ＲＮＡを試験するために使用した。  ｒｔＰＣＲ分析（ｃ）を、ＨＰＶ−１６  Ｅ７またはＧＡＰＤＨのいずれかの領域に対してハイブリダイズするプライマーを用いて、全ＲＮＡ抽出物について行った。両方のプライマー対を、同じ条件で使用し、そして生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【図１３】図１３は、ＨＩＶ  Ｓｐ１結合部位（−８７から−４９）とのＧ4Ｎの相互作用の、電気泳動の移動度のシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を示す。（Ａ）32Ｐで標識したＨＩＶ  Ｓｐ１  ＤＮＡテンプレートへのＳｐ１−１６７Ｄの結合のＧ4Ｎによる阻害。レーン１、テンプレートのみ；レーン２、テンプレートおよび０．１μｇのＳｐ１−１６７Ｄ；レーン３〜９、漸増濃度のＧ4Ｎ（０．１μｇのＳＰ１−１６７Ｄの添加の前に、０．２５〜１．７５ｍＭ）とともにインキュベートしたテンプレート。（Ｂ）ＨＩＶテンプレートに結合したＳｐ１−１６７ＤのＧ4Ｎ置換。レーン１、テンプレートのみ；レーン２、テンプレートおよび０．１μｇのＳｐ１−１６７Ｄおよび１００倍過剰の未標識のテンプレート；レーン３、テンプレートおよび０．１μｇのＳｐ１−１６７Ｄ；レーン４〜１０、漸増濃度のＧ4Ｎ（０．２５〜１．７５ｍＭ）とともにチャレンジしたＳｐ１／ＤＮＡ複合体；レーン１１、１．７５ｍＭのＧ4Ｎを含有している反応緩衝液中でインキュベートしたテンプレート。（Ｃ）テンプレートに結合したＧ4ＮのＳｐ１−１６７Ｄ置換。レーン１、テンプレートのみ；レーン２〜４、テンプレートおよび漸増量のＳｐ１−１６７Ｄ（０．０７５、０．１５０．０．３００μｇ）；レーン５〜８、１．２ｍＭのＧ4Ｎを含有している反応緩衝液中でインキュベートし、続いて漸増量のＳｐ１−１６７Ｄ（０．０７５、０．１５０．０．３００μｇ）でチャレンジしたテンプレート、レーン８、Ｓｐ１−１６７Ｄを受容させなかった。（Ｄ）Ｇ4Ｎの漸増濃度に応答して減少するＳｐ１−１６７Ｄ／ＤＮＡ複合バンドの強度のプロットは、（Ａ）−−−・−−−および（Ｂ）――・――を使用した。使用したゲルは、５％の非変性ポリアクリルアミドであり、それぞれのレーンに、実験のセクションおよびＲｅｆ［１］に記載するように、それぞれの反応容量の５μｌを受容させた。
【図１４】図１４は、Ｇ4ＮによるＣｏｓ細胞中でのＨＩＶ  Ｔａｔによって調節されるトランス活性化の阻害を示す。
【図１５】図１５は、Ｇ4Ｎの存在を伴うＳＩＶの産生を示す。１０７  １７４×細胞を、２４時間混合し、３７℃で２時間の間、ＳＩＶ  ｍａｃ  ２３９（４ｎｇのｐ２７）のストックを回収した。細胞を再懸濁し、そして１００μｌの培地中の１×１０５細胞を、３個の９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに対して添加した。新しく作成したストックから種々の濃度のＧ4Ｎを調製し、そして６個の指定したウェルのそれぞれに添加した。培養上清を、ウイルスの産生の分析のために、４日および８日後に回収した。ウイルスの産生を、実施例のセクションに記載するように、改変したｐ２７キャプシドタンパク質抗原捕捉ＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【図１６】図１６は、Ｇ4ＮによるＨ９細胞中でのＨＩＶ  ｐ２４抗原の産生の阻害を示す。阻害の割合を、ＡＺＴ耐性ＨＩＶ株であるＨＩＶ−１ＲＴＭＦでのウイルス感染の９日後に、Ｇ4Ｎで処理したＨ９細胞、および処理していないＨ９細胞の２つの２連の培養物の平均からｐ２４レベルを比較することによって計算した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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