(57)【要約】  遺伝子操作された微生物宿主細胞を用いて所望のオリゴ糖を産生するための方法、および所望のオリゴ糖の細胞内生合成中に生成される代謝性糖副産物を細胞内で分解可能である異種グリコシダーゼを発現するように遺伝子操作されてされている前記の遺伝子操作された微生物宿主細胞を開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作された微生物宿主細胞を用いて、所望のオリゴ糖を産生するための方法であって：
（ｉ）所望のオリゴ糖を産生可能であり、所望のオリゴ糖の細胞内生合成中に生成される代謝性糖副産物を細胞内で分解可能である少なくとも１つの異種グリコシダーゼを発現するように遺伝子操作されており、そして所望のオリゴ糖の産生のために前記グリコシダーゼの酵素活性から生じる分解産物をリサイクル可能である、遺伝子操作された微生物宿主細胞を提供し；
（ｉｉ）所望のオリゴ糖の産生を許容する条件下および培地中で、遺伝子操作された微生物宿主細胞を培養し、それによって所望のオリゴ糖を産生し；そして
（ｉｉｉ）随意に、所望のオリゴ糖を回収する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
所望のオリゴ糖を産生するための遺伝子操作された微生物宿主細胞であって
ａ）所望のオリゴ糖を産生可能であり；
ｂ）所望のオリゴ糖の細胞内生合成中に生成される代謝性糖副産物を細胞内で分解可能である少なくとも１つの異種グリコシダーゼを発現するように遺伝子操作されており；そして
ｃ）所望のオリゴ糖の産生のために前記グリコシダーゼの酵素活性から生じる分解産物をリサイクル可能である
前記微生物宿主細胞。
【請求項３】
異種グリコシダーゼが、フコシダーゼ、シアリダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ガラクトシダーゼおよびグルコシダーゼからなる群より選択される、請求項１記載の方法または請求項２記載の遺伝子操作された微生物宿主細胞。
【請求項４】
異種グリコシダーゼが、α−１，２−フコシダーゼ、α−１，３−フコシダーゼ、α−２，３−シアリダーゼ、α−２，６−シアリダーゼ、α−２，８−シアリダーゼ、β−１，３−ガラクトシダーゼ、β−１，４−ガラクトシダーゼ、β−１，６−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼおよびβ−１，３−グルコシダーゼからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法または遺伝子操作された微生物宿主細胞。
【請求項５】
遺伝子操作された微生物宿主細胞が、好ましくは、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼおよびグルコシルトランスフェラーゼからなる群より選択されるグリコシルトランスフェラーゼとして、異種グリコシルトランスフェラーゼを発現するように遺伝子操作されている、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法または遺伝子操作された微生物宿主細胞。
【請求項６】
微生物宿主細胞が、異種α−１，３−フコシルトランスフェラーゼおよび異種α−１，２−フコシダーゼを発現するように遺伝子操作されている、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法または遺伝子操作された微生物宿主細胞。
【請求項７】
微生物宿主細胞が、異種α−１，２−フコシルトランスフェラーゼおよび異種α−１，３−フコシダーゼを発現するように遺伝子操作されている、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法または遺伝子操作された微生物宿主細胞。
【請求項８】
微生物宿主細胞が、異種β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、異種α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ、異種β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび異種α−１，３−フコシダーゼを発現するように遺伝子操作されている、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法または遺伝子操作された微生物宿主細胞。
【請求項９】
微生物宿主細胞が、異種α−２，６−シアリルトランスフェラーゼおよび異種α−２，３−シアリダーゼを発現するように遺伝子操作されている、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法または遺伝子操作された微生物宿主細胞。
【請求項１０】
微生物宿主細胞が、異種β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、異種β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび異種β１，３−ガラクトシダーゼおよび／またはβ−１，３−グルコシダーゼおよび／またはガラクタン−β−１，３−ガラクトシダーゼを発現するように遺伝子操作されている、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法または遺伝子操作された微生物宿主細胞。
【請求項１１】
微生物宿主細胞が、異種β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、異種β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび異種β−１，３−グルコシダーゼおよび／またはガラクタン−β−１，３−ガラクトシダーゼを発現するように遺伝子操作されている、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法または遺伝子操作された微生物宿主細胞。
【請求項１２】
所望のオリゴ糖が、ヒト母乳オリゴ糖、好ましくは２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコシルヘキサオースＩＩ、パラ−ラクト−Ｎ−フコシル−ヘキサオース、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｂ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、ジシアリル−ラクト−Ｎ−フコペンタオース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、３−フコシル−６’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−ネオジフコヘキサオースＩ、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ（ＬＳＴ−ａ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ（ＬＳＴ−ｂ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ（ＬＳＴ−ｃ）、およびジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースからなる群より選択される、ヒト母乳オリゴ糖である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法または遺伝子操作された微生物宿主細胞。
【請求項１３】
所望のオリゴ糖、好ましくはＨＭＯの群より選択されるオリゴ糖の産生のための、請求項２〜１２のいずれか一項記載の遺伝子操作された微生物宿主細胞の使用。
【請求項１４】
栄養組成物の製造のための、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法によってまたは遺伝子操作された微生物宿主細胞の使用によって、産生されるオリゴ糖、好ましくはＨＭＯの群より選択されるオリゴ糖。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法によってまたは遺伝子操作された微生物宿主細胞の使用によって産生される少なくとも１つのオリゴ糖を含有する、栄養組成物であって、少なくとも１つのオリゴ糖が好ましくはＨＭＯである、前記栄養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物発酵によるオリゴ糖の産生に関する。より具体的には、本発明は、微生物発酵による所望のオリゴ糖の産生を改善するためのグリコシダーゼの使用に関する。
【発明の概要】
【０００２】
ヒトの母乳はヒト母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）と称される異なるオリゴ糖のユニークな混合物を含有する。これまでに、ヒト母乳中には１５０を超える構造的に異なるオリゴ糖が同定された。ごくまれな例外を除き、ＨＭＯは、還元端のラクトース部分によって特徴づけられ、そして多くのＨＭＯは、非還元端にフコース残基および／またはＮ−アセチルノイラミン酸残基を含有する。一般的に、ＨＭＯの単糖残基は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｌ−フコースおよびＮ−アセチルノイラミン酸に由来する。乳児栄養に関するＨＭＯの重要性は、新生児の病原体からの保護、乳児免疫系および認知能力の発展の補助を含む、そのユニークな生物学的活性に直接関連する。したがって、商業規模でのＨＭＯの調製には、非常に強い関心がある。
【０００３】
個々のＨＭＯの化学合成に加えて、異種グリコシルトランスフェラーゼを過剰発現する遺伝子修飾された微生物を用いた微生物発酵による、ＨＭＯ産生の開発にかなりの進歩があった。前記異種グリコシルトランスフェラーゼを微生物が発現することを許容する培地中および条件下でこうした微生物を培養すると、前記微生物によってＨＭＯを産生し、そして培地または細胞溶解物から回収することも可能である。
【０００４】
しかし、グリコシルトランスフェラーゼは、しばしば、所望のオリゴ糖を産生するためのその過剰発現が、典型的には望ましくない副産物を導くような、酵素副次活性を所持する。典型的には、これらの副産物もまたオリゴ糖であるが、産物の商業的使用のために、所望のオリゴ糖の調製物から除去しなければならない。しかし、所望のオリゴ糖からのこうした副産物の除去は困難であり、そして厄介である。こうした副産物を除去する１つのアプローチは、グリコシダーゼの使用を伴い、こうしたグリコシダーゼは、所望のオリゴ糖および望ましくないオリゴ糖を含有する反応混合物／細胞培地に外因性に添加されるか、あるいは所望のオリゴ糖を産生するための発酵プロセスが終了する特定の時点での誘導に際して、遺伝子操作された微生物によって産生されるかいずれかである。
【０００５】
国際公報第ＷＯ  ２０１５／０３２４１２  Ａ１号は、フコースの使用に関し、そして異種フコシルトランスフェラーゼを発現する遺伝子修飾された細胞を、ラクトースの存在下で培養して、２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）およびジフコシルラクトース（ＤＦＬ）の混合物を産生させ、そして高収率で培地の細胞外空間内に分泌させる方法を開示する。該糖を分離し、そして酸によるかまたはフコシダーゼによる加水分解に供して、高収率でフコースを産生する。
【０００６】
国際公報第ＷＯ  ２０１４／０９０２６１  Ａ１号は、２’−ＦＬおよび３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）の少なくとも１つを含有する混合物を形成する方法であって、ＤＦＬを部分的加水分解、例えば酵素的加水分解または酸加水分解に供する、前記方法を開示する。酵素的加水分解において、ＤＦＬからフコース残基の１つを放出しうるフコシダーゼにＤＦＬを曝露する。ＤＦＬ（１０ｍＭ）をキサントモナス・マニホティス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｓ）由来の１，２−α−Ｌ−フコシダーゼと、インキュベーション緩衝液中、３７℃でインキュベーションし、そしてＤＦＬの加水分解後、ＨＰＬＣを行った。１８時間後、ＤＦＬは、３−ＦＬおよびフコースに部分的に加水分解された。ラクトースは検出されなかった。
【０００７】
欧州特許出願第ＥＰ  ２  ８４５  ９０５  Ａ１号は、オリゴ糖の産生に関し、そしてオリゴ糖の産生および／または精製のためのプロセスにおける１つまたはそれより多いグリコシダーゼの使用を開示する。該プロセスは、ａ）所望のオリゴ糖の産生を許容する条件下および培地中で、前記の所望のオリゴ糖の産生に適した宿主微生物を培養し、それによってオリゴ糖、および適用可能な場合は生合成糖中間体および／副産物を産生し；ｂ）生合成糖中間体および／または糖副産物および／または未使用糖基質を分解するために、宿主微生物を培養している培地中でグリコシダーゼを用い；そしてｃ）所望のオリゴ糖を回収する工程を含む。１つの態様において、前記グリコシダーゼは宿主微生物において内因性に産生され、ここで、該グリコシダーゼは、宿主微生物において天然には存在しないグリコシダーゼであり、そして前記宿主微生物における前記グリコシダーゼの発現は、十分でありそして／または本質的に最大量である所望のオリゴ糖が宿主微生物の培養中に産生された後に、該発現が開始されうるように、誘導性である。
【０００８】
要約すると、先行技術は、反応混合物／細胞培地中の望ましくないオリゴ糖の加水分解によって、所望のオリゴ糖および望ましくないオリゴ糖の混合物から、望ましくないオリゴ糖を除去するための、グリコシダーゼの使用を開示する。しかし、これらのアプローチは、基質およびエネルギーの使用を含めて、微生物による望ましくないオリゴ糖の生合成を含み、そしてこれらのアプローチは、所望のオリゴ糖からの望ましくないオリゴ糖の分解産物の除去を必要とする。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、発酵させようとする微生物を含有する細胞培地において、望ましくない糖副産物、すなわち望ましくないオリゴ糖の付随する生産／集積を伴わずに、微生物発酵による所望のオリゴ糖を産生するための方法を提供することであった。
【００１０】
この目的は、所望のオリゴ糖を産生可能である遺伝子操作微生物宿主細胞であって、所望のオリゴ糖の細胞内生合成中に生成される代謝副産物を細胞内で分解可能であり、したがって、培地において、所望の糖および望ましくない糖の混合物の形成を防ぐ、異種グリコシダーゼを発現する、前記微生物宿主細胞を提供することによって解決される。前記分解産物は、次いで、例えば所望のオリゴ糖の生合成のため、微生物宿主細胞の代謝によって利用されてもよい。
【００１１】
表１は、所望のオリゴ糖、ならびに所望のオリゴ糖の産生のために添加される考えられうる前駆体および／またはその産生中に生成される望ましくない糖副産物の包括的概観を提供する。
【００１２】
【表１−１】
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【００１３】
【表１−２】
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【００１４】
【表１−３】
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【００１５】
【表１−４】
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【００１６】
【表１−５】
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【００１７】
表１：所望のオリゴ糖、ならびに所望のオリゴ糖の産生のために添加される考えられうる前駆体および／またはその産生中に生成される望ましくない糖副産物の概観。
第一の側面において、所望のオリゴ糖を産生可能である遺伝子操作された微生物宿主細胞を用いて、所望のオリゴ糖を産生するための方法であって、前記微生物宿主細胞が所望のオリゴ糖の細胞内生合成中に生成される代謝性糖副産物を細胞内で分解可能である異種グリコシダーゼを発現する、前記方法を開示する。
【００１８】
第二の側面において、所望のオリゴ糖を産生するための遺伝子操作された微生物宿主細胞であって、所望のオリゴ糖を産生可能であり、そして所望のオリゴ糖の細胞内生合成中に生成される代謝性糖副産物を細胞内で分解可能である異種グリコシダーゼを発現するように遺伝子操作されている、前記微生物宿主細胞を開示する。
【００１９】
第三の側面において、所望のオリゴ糖の産生のための第二の側面にしたがった遺伝子操作された微生物宿主細胞の使用を開示する。
第四の側面において、第一の側面にしたがった方法によって、そして／または第二の側面にしたがった遺伝子操作された微生物宿主細胞を用いることによって産生されるオリゴ糖、すなわち所望のオリゴ糖を開示する。
【００２０】
第五の側面において、栄養組成物の産生のための、第四の側面にしたがった所望のオリゴ糖の使用を開示する。
第六の側面において、第四の側面にしたがった所望のオリゴ糖を含有する栄養組成物を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、所望のオリゴ糖（２’−フコシルラクトース）の細胞内生合成中に生成される代謝性糖副産物（例えば３−フコシルラクトースおよび２’３−ジフコシルラクトース）を分解可能である異種グリコシダーゼ（例えば、アルファ−１，３−フコシダーゼ）を発現しており、そして所望のオリゴ糖の産生のために前記グリコシダーゼの酵素活性から生じる分解産物（例えばフコースおよびラクトース）をリサイクル可能である、微生物宿主細胞の態様の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
第一の側面にしたがって、遺伝子操作された微生物宿主細胞を用いて、所望のオリゴ糖を産生するための方法であって：
（ｉ）所望のオリゴ糖を産生可能であり、所望のオリゴ糖の細胞内生合成中に生成される代謝性糖副産物を細胞内で分解可能である異種グリコシダーゼを発現するように遺伝子操作されており、そして前記グリコシダーゼの酵素活性から生じる分解産物をリサイクル可能である、遺伝子操作された微生物宿主細胞を提供し；
（ｉｉ）所望のオリゴ糖の産生を許容する条件下および培地中で、遺伝子操作された微生物宿主細胞を培養し、それによって所望のオリゴ糖を産生し；そして
（ｉｉｉ）随意に、所望のオリゴ糖を回収する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００２３】
用語「所望の」は、オリゴ糖に関して本明細書で用いる場合、微生物宿主細胞によって産生されることが意図されるオリゴ糖を指す。用語「所望の」は、微生物宿主細胞が産生しうる他のオリゴ糖から、産生しようとするオリゴ糖を意図的に区別するために用いられる。前記の他のオリゴ糖は、これらの他のオリゴ糖が生物学的機能を持つかどうか、糖脂質、糖タンパク質または多糖などの他の細胞化合物の生合成に関与するかどうか、あるいは所望のオリゴ糖の生合成に関与する酵素の１つもしくはそれより多くに付随する（望ましくない）酵素活性によるか、または所望のオリゴ糖の生合成に直接は関与しないが、所望のオリゴ糖を導く代謝経路における中間体として生成されるオリゴ糖を基質として用いる１つまたはそれより多い酵素の酵素活性によるかいずれかで、所望のオリゴ糖の細胞内生合成中に生成される代謝性糖産物であるかどうかにかかわらず、「望ましくない」と見なされる。
【００２４】
用語「オリゴ糖」は、本明細書において、３〜２０の単糖残基からなり、前記単糖残基が各々、グリコシド結合によって少なくとも１つの他の前記の単糖単位に結合している糖分子を指す。オリゴ糖は、単糖残基の直鎖または単糖残基の分枝鎖であってもよい。
【００２５】
さらなるおよび／または代替態様において、所望のオリゴ糖はヒト母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）である。
さらなるおよび／または代替態様において、所望のオリゴ糖は、好ましくは２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、２’，３−ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ−Ｉ）、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ（ＬＮｎＦＰ−Ｉ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ−ＩＩ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ−ＩＩＩ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ−Ｖ）、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ（ＬＮｎＦＰ−Ｖ）、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコシルヘキサオースＩＩ、パラ−ラクト−Ｎ−フコシル−ヘキサオース、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｂ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、ジシアリル−ラクト−Ｎ−フコペンタオース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、３−フコシル−６’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−ネオジフコヘキサオースＩ、３’−シアリルラクトース（３−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（６−ＳＬ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ（ＬＳＴ−ａ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ（ＬＳＴ−ｂ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ（ＬＳＴ−ｃ）、およびジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースからなる群より選択されるＨＭＯである。
【００２６】
方法は、所望のオリゴ糖を産生可能である、遺伝子操作された微生物宿主細胞を提供する工程を含む。
用語「遺伝子操作された」は、本明細書において、分子生物学の方法を用いた、細胞の遺伝子構成の修飾を指す。細胞の遺伝子構成の修飾には、種境界内のおよび／または種境界を渡る遺伝子のトランスファー、ヌクレオチド、トリプレット、遺伝子、オープンリーディングフレーム、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターおよび遺伝子発現を仲介しそして／または調節する他のヌクレオチド配列の挿入、欠失、置換および／または修飾が含まれてもよい。細胞の遺伝子構成の修飾は、特定の所望の特性を所持する遺伝子修飾された生物を生成することを目的とする。遺伝子操作された微生物宿主細胞は、細胞の天然（遺伝子操作されていない）型には存在しない、１つまたはそれより多い遺伝子を含有してもよい。細胞の遺伝情報のヌクレオチド配列に挿入するか、該配列から欠失させるかまたは該配列を改変するため、細胞の遺伝情報内に外因性核酸分子を導入し、そして／または外因性核酸分子（組換え、異種）を挿入するための技術が、当業者に知られる。遺伝子操作された細胞は、細胞の天然型に存在する１つまたはそれより多い遺伝子を含有してもよく、ここで、前記遺伝子は、人工的手段によって修飾され、そして細胞内に再導入される。用語「遺伝子操作された」はまた、細胞に内因性である核酸分子を含有し、そして細胞から核酸分子を除去することなく修飾されている、細胞もまた含む。こうした修飾には、遺伝子置換、部位特異的突然変異、および「遺伝子編集」と一般的に称されるものを含めた関連技術によって得られるものが含まれる。
【００２７】
遺伝子操作された微生物宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。適切な微生物宿主細胞には、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞および真菌細胞が含まれる。
さらなるおよび／または代替態様において、原核細胞は、細菌細胞、好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクロモノスポラ属（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロードコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）およびスポロラクトバチルス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群より選択される属の細菌より選択される細菌細胞である。適切な細菌種は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーモフィルス（Ｂ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．ラテロスポルス（Ｂ．  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ミコイデス（Ｂ．  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．  ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．レントゥス（Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ）、セレウス菌（Ｂ．  ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．シルクランス（Ｂ．  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィズス菌（Ｂ．  ｂｉｆｉｄｕｍ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・セルロリティクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、Ｃ．ルジュングダーリー（Ｃ．  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、Ｃ．アウトエタノゲヌム（Ｃ．  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、Ｃ．アセトブチリクム（Ｃ．  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．サーモフィレス（Ｅ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ヘルベティクス（Ｌ．  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．デルブルエッキー（Ｌ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．ラムノスス（Ｌ．  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．ブルガリクス（Ｌ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．クリスパトゥス（Ｌ．  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ガセリ菌（Ｌ．  ｇａｓｓｅｒｉ）、カゼイ菌（Ｌ．  ｃａｓｅｉ）、ロイテリ菌（Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ジェンセニ（Ｌ．  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．  ｌａｃｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏ��ａ  ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、緑膿菌（Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレプトコッカス・サーモフィレス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）およびキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。
【００２８】
さらなるおよび／または代替態様において、真核細胞は酵母細胞、好ましくはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、特に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）種、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、特にピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）種、およびシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種からなる群より選択される酵母細胞である。
【００２９】
遺伝子操作された微生物宿主細胞は、所望のオリゴ糖を産生可能である。用語「産生可能」は、本明細書において、微生物宿主細胞が、所望のオリゴ糖を産生することを許容する条件下および培地中で、微生物宿主細胞を培養した場合に、遺伝子操作された微生物宿主細胞が所望のオリゴ糖を産生する能力を指す。したがって、培地は、微生物宿主細胞の生存性および代謝活性を維持するために必要な、定義される範囲のｐＨ値、イオンおよび栄養素の組成、ならびに化合物の組成を含まなければならない。所望のオリゴ糖の産生に必須である場合、培地はまた、微生物宿主細胞による所望のオリゴ糖の生合成に必要ないかなる前駆体の十分量も含有しなければならない。同様に、所望のオリゴ糖を産生するため、微生物宿主細胞が、所望のオリゴ糖を産生するために代謝的に活性であるかまたは活性であり続けることが可能であるように、所望のオリゴ糖を産生するために微生物宿主細胞を培養するための条件（例えば温度、ｐＨ、酸素供給、攪拌、栄養素供給等）が維持されなければならない。
【００３０】
さらなるおよび／または代替態様において、所望のオリゴ糖を産生可能である遺伝子操作された微生物宿主細胞は、所望のオリゴ糖を産生可能であるように遺伝子操作されている微生物宿主細胞である。さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、異種グリコシルトランスフェラーゼを発現するように遺伝子操作されている。異種グリコシダーゼは、発酵中、すなわち所望のオリゴ糖の産生または生合成中に、遺伝子操作された微生物宿主細胞において発現される。さらなるおよび／または代替態様において、異種グリコシダーゼの発現は、遺伝子操作された微生物宿主細胞において恒常性である。
【００３１】
用語「異種」は、本明細書において、細胞または生物に対して外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）であるヌクレオチド配列、核酸分子またはポリペプチドを、すなわち、前記細胞または生物に天然には存在しないヌクレオチド配列、核酸分子またはポリペプチドを指す。「異種配列」または「異種核酸」または「異種ポリペプチド」は、本明細書において、特定の宿主細胞に外来性である供給源から（例えば異なる種から）生じるものであるか、または同じ供給源由来の場合、元来の型から修飾されているものである。したがって、プロモーターに機能可能であるように連結された異種核酸は、プロモーターが由来するものと異なる供給源から由来するか、または同じ供給源に由来する場合、元来の型から修飾されている。異種配列は、例えば、トランスフェクション、形質転換、コンジュゲート化または形質導入によって、宿主微生物宿主細胞のゲノム内に安定導入され、こうして遺伝子修飾された宿主細胞となってもよい。配列を導入しようとする宿主細胞に応じるであろう技術が適用されうる。多様な技術が当業者に知られ、そしてこれは例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）に開示される。したがって、「異種ポリペプチド」は、遺伝子操作された細胞が由来する野生型細胞には天然には存在しないポリペプチドであり、そして「異種グリコシルトランスフェラーゼ」は、遺伝子操作された細胞が由来する野生型細胞には天然には存在しないグリコシルトランスフェラーゼである。
【００３２】
さらなるおよび／または代替態様において、異種グリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼ、好ましくはα−１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα−１，３−フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、好ましくはβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、好ましくはα−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ、ならびにＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選択される。
【００３３】
フコシルトランスフェラーゼは、ドナー、グアノシン−二リン酸活性化Ｌ−フコース（ＧＤＰ−フコース）から、いくつかのアクセプター分子へのフコース残基のトランスファーを触媒する。フコシルトランスフェラーゼは、動物、植物、真菌および細菌において発現され、そしてこれらはアクセプター基質でのフコース連結にしたがって分類される。したがって、α−１，２−、α−１，３／４−およびα−１，６−フコシルトランスフェラーゼは、互いに区別される。遺伝子操作された微生物宿主細胞における異種発現に適したフコシルトランスフェラーゼは、例えば、欧州特許出願第１７  １８０  １７６号に開示される。
【００３４】
シアリルトランスフェラーゼは、ドナー、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃのアクセプター分子へのＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基のトランスファーを触媒する。シアリルトランスフェラーゼは、動物、植物、真菌および細菌において発現されることが見出された。シアリルトランスフェラーゼは、Ｎｅｕ５Ａｃおよびアクセプター分子の間で形成される連結にしたがって分類される。したがって、α−２，３−、α−２，６−およびα−２，８−シアリルトランスフェラーゼは、互いに区別される。遺伝子操作された微生物宿主細胞における異種発現に適したシアリルトランスフェラーゼは、例えば、欧州特許出願第１７  １８３  ３９１号に開示される。
【００３５】
ガラクトシルトランスフェラーゼは、ドナー、ＵＤＰ−ガラクトースからアクセプター基質へのガラクトース残基のトランスファーを触媒する。ガラクトシルトランスフェラーゼは、形成される、ガラクトースおよびアクセプター分子の間の連結に基づいて区別される。したがって、β−１，３−およびβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、互いに区別される。遺伝子操作された微生物宿主細胞における異種発現に適したβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）ｗｂｄＯ遺伝子によってコードされる。遺伝子操作された微生物宿主細胞における異種発現に適したβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、アグレガチバクター・アフロフィルス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ）のｌｅｘ１遺伝子によってコードされる。
【００３６】
遺伝子操作された微生物宿主細胞は、所望のオリゴ糖の細胞内生合成中に生成される代謝性糖副産物を細胞内で分解可能な異種グリコシダーゼを発現するように遺伝子操作されている。適切なグリコシダーゼは、酵素活性によって加水分解されるグリコシド連結に関して、および／またはグリコシダーゼによって加水分解される基質に関して、特異的であるグリコシダーゼである。前記特異性により、グリコシダーゼは、望ましくない副産物を加水分解するが、産生される、所望のオリゴ糖を分解しない。さらなるおよび／または代替態様において、グリコシダーゼは、所望のオリゴ糖を産生するために微生物宿主細胞によって内在化されるかまたは合成される１つまたはそれより多くの前駆体を加水分解しない。好ましくは、グリコシダーゼはエキソグリコシダーゼである。
【００３７】
エキソグリコシダーゼは、オリゴ糖構造の末端残基のグリコシド結合を分解する、グリコシドヒドロラーゼ酵素である。
さらなるおよび／または代替態様において、異種グリコシダーゼは、α−１，２−フコシダーゼおよびα−１，３−フコシダーゼを含むフコシダーゼ、シアリダーゼ、例えばα−２，３−シアリダーゼ、α−２，６−シアリダーゼ、α−２，８−シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、例えばβ−１，３−ガラクトシダーゼ、β−１，４−ガラクトシダーゼおよびβ−１，６−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、ならびにグルコシダーゼ、例えばβ−１，３―グルコシダーゼからなる群より選択される。
【００３８】
適切なフコシダーゼは、α−１，２−フコシダーゼである。α−１，２−フコシダーゼは、オリゴ糖由来の直鎖アルファ−１，２−連結Ｌ−フコピラノシル残基の加水分解を触媒する非常に特異的なエキソグリコシダーゼである。好ましいα−１，２−フコシダーゼは、ビフィズス菌のＡｆｃＡ（配列番号２）である。
【００３９】
さらなるおよび／または代替態様において、３−ＦＬを産生可能な遺伝子操作された微生物宿主細胞であって、α−１，２−フコシダーゼを発現する、前記の遺伝子操作された微生物宿主細胞が提供される。３−ＦＬを産生可能であるためには、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、アルファ−１，３−フコシルトランスフェラーゼを発現する。前記アルファ−１，３−フコシルトランスフェラーゼは、ＧＤＰ−フコースから、アクセプター基質としてのラクトースのグルコース部分にフコース残基をトランスファーし、それによって、所望のオリゴ糖として３−ＦＬを合成することが可能である。２’−ＦＬおよび２’３−ＤＦＬは、３−ＦＬの産生における望ましくない糖副産物である。
【００４０】
３−ＦＬを産生可能である遺伝子操作された微生物宿主細胞において異種α−１，２−フコシダーゼを発現させることによって、異種α−１，２−フコシダーゼにより、遺伝子操作された微生物宿主細胞内で副産物２’−ＦＬおよび２’３−ＤＦＬが加水分解されるため、これらの副産物の産生を消滅させるかまたは少なくとも減少させることが可能である。生じる分解産物はフコースおよびラクトースである。フコースおよびラクトースはどちらも、所望の３−ＦＬの産生のため、遺伝子操作された微生物宿主細胞によって利用されうる。
【００４１】
さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、α−１，２−フコシダーゼを発現するように遺伝子操作されている。さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、その発現のため、α−１，２−フコシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように遺伝子操作されている。好ましくは、α−１，２−フコシダーゼをコードするヌクレオチド配列は、
−配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列；
−配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
−配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
−配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
−配列番号２に示されるようなポリペプチド配列の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列であって、機能的変異体のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、前記ヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である。
【００４２】
用語「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイズしている」は、本明細書において、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されるような慣用的条件下で、好ましくはストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば：全部で約１時間の、４ｘＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイズ、および０．１ｘＳＳＣ中、６５℃での続く多数回の洗浄である。よりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件は、例えば：４ｘＳＳＣ中、３７℃でのハイブリダイズ、および１ｘＳＳＣ中、室温（約２１℃）での続く多数回の洗浄である。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」はまた：０．２５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１％ＢＳＡ中、６８℃での１６時間のハイブリダイズ、およびそれに続き、２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳでの、６８℃での２回の洗浄を意味してもよい。
【００４３】
α−１，２−フコシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現のため、前記ヌクレオチド配列は、遺伝子操作された微生物宿主細胞において、α−１，２−フコシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現を仲介する発現調節配列に機能可能であるように連結される。
【００４４】
「発現調節配列」は、タンパク質コードヌクレオチド配列の一部ではなく、タンパク質コードヌクレオチド配列の発現を仲介する、制御ヌクレオチド配列である。制御要素ヌクレオチド配列には、プロモーター、シス制御要素、エンハンサー、イントロンおよびターミネーターが含まれる。制御要素のタイプに応じて、制御要素は、タンパク質コードヌクレオチド配列の前（すなわちその３’）またはタンパク質コードヌクレオチド配列の後ろ（すなわち５’）の核酸分子上に存在する。制御要素は、微生物宿主細胞において機能性である。
【００４５】
用語「機能可能であるように連結された」は、生存細胞において、制御要素の調節下でタンパク質コードヌクレオチド配列の発現が行われうるように、例えば核酸分子上で、タンパク質コードヌクレオチド配列と制御要素が連結される、すなわちこのようにタンパク質コードヌクレオチド配列に対して制御要素が配置されることを意味する。
【００４６】
本発明の目的のため、「プロモーター」は、通常、遺伝子の５’端にあり、そして特定のＤＮＡ結合タンパク質との相互作用を通じて、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始を仲介する、遺伝子制御ヌクレオチド配列の発現である。
【００４７】
さらに、適切なプロモーターには、合成プロモーターが含まれる。これらは、分子生物学技術によって生成されている、この配置では天然には見られないプロモーターである。合成プロモーターは、最小プロモーターに加えて、１つまたはそれより多い、選択され、定義されるシス要素のみを含有する最小限のプロモーターである。これらのシス要素は、転写因子などのＤＮＡ結合タンパク質の結合部位であり、そして天然プロモーターから単離されるか、以前単離されたシス要素に由来するか、またはランダム組換え技術によって技術的に産生され、そして適切な方法によって選択され；天然プロモーターと比較した際、そのより複雑でない構成のため、合成プロモーターは、いくつかの外因性および内因性因子によってのみ活性化され、そしてしたがって、より特異的に制御される。
【００４８】
「最小プロモーター」または「コア」プロモーターは、基本転写因子複合体の結合部位を含有し、そしてＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写の正確な開始を可能にするヌクレオチド配列である。最小プロモーターの特徴的配列モチーフは、ＴＡＴＡボックス、イニシエーター要素（Ｉｎｒ）、「ＴＦＢＩＩ認識要素」（ＢＲＥ）および「下流コアプロモーター要素」（ＯＰＥ）である。最小プロモーターにおいて、これらの要素は、個々にまたは組み合わせて存在してもよい。最小プロモーターまたはその配列モチーフは、例えば細菌、真菌またはウイルス遺伝子より入手可能である。
【００４９】
「シス要素」は、発現しようとするタンパク質コードヌクレオチド配列と同じ核酸分子上に位置するヌクレオチド配列である。シス要素は、ＲＮＡまたはタンパク質をコードしている必要はなく、そして転写方向において、発現しようとするタンパク質コードヌクレオチド配列の前または後に位置していてもよい。発現しようとするタンパク質コードヌクレオチド配列の前の上流にあるシス要素は、しばしば、この遺伝子の転写制御において、分子レベルで、他方の側由来のトランス作用要素（ラテン語のトランス、「超えて」）として関与する、特に転写因子に関して必要な結合モチーフを提供する。さらに、シス要素が転写の阻害を導く場合、これらはサイレンサーと称される。転写の増進を導くシス要素は、エンハンサーと称される。プロモーター中のシス／トランス活性全体が、ＲＮＡポリメラーゼが転写を行う強度を決定する。
【００５０】
さらに、プロモーターは、キメラプロモーターおよび／またはシス要素によって修飾されているプロモーターであってもよい。プロモーターの修飾はまた、例えば、天然にすでにシス要素を有するプロモーターにおけるシス要素のさらなる取り込みも意味してもよい。さらに、修飾にはまた、シス要素の多量体化、特に天然存在シス要素の多量体化も含まれる。天然型に比較して、こうした修飾プロモーターは、例えば、特異性、発現レベルまたはバックグラウンド活性に関して、改変された特性を有しうる。
【００５１】
ターミネーターは、通常、遺伝子の終わりを示し、そして転写終結を導く、ＤＮＡ上のヌクレオチド配列である。
別の適切なフコシダーゼは、α−１，３−フコシダーゼである。α−１，３−フコシダーゼは、α−１，３−連結Ｌ−フコピラノシル残基のオリゴ糖からの加水分解を触媒する非常に特異的なグリコシダーゼである。好ましいα−１，３−フコシダーゼは、ビフィズス菌由来のＡｆｃＢ（配列番号４）である。
【００５２】
さらなるおよび／または代替態様において、２’−ＦＬを産生可能な遺伝子操作された微生物宿主細胞であって、α−１，３−フコシダーゼを発現する、前記の遺伝子操作された微生物宿主生物を提供する。２’−ＦＬを産生可能であるために、遺伝子操作された微生物宿主細胞はα−１，２−フコシルトランスフェラーゼを発現する。前記アルファ−１，２−フコシルトランスフェラーゼは、ＧＤＰ−フコースから、アクセプター基質としてのラクトースのガラクトース部分にフコース残基をトランスファーし、それによって、所望のオリゴ糖として２’−ＦＬを産生可能である。２’−ＦＬの産生において、３−ＦＬおよび２’３−ＤＦＬは望ましくない糖副産物である。
【００５３】
２’−ＦＬを産生可能である遺伝子操作された微生物宿主細胞において、異種α−１，３−フコシダーゼを発現させることによって、異種α−１，３−フコシダーゼにより、遺伝子操作された微生物宿主細胞内で副産物３−ＦＬおよび２’３−ＤＦＬが加水分解されるため、これらの副産物の産生を消滅させるかまたは少なくとも減少させることが可能である。生じる分解産物はフコースおよびラクトースである。フコースおよびラクトースはどちらも、所望の２’−ＦＬの産生のため、遺伝子操作された微生物宿主生物によって利用されうる。
【００５４】
さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、α−１，３−フコシダーゼを発現するように遺伝子操作されている。さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、その発現のため、α−１，３−フコシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように遺伝子操作されている。好ましくは、α−１，３−フコシダーゼをコードするヌクレオチド配列は、
−配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列；
−配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
−配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
−配列番号４に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
−配列番号４に示されるようなポリペプチド配列の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列であって、機能的変異体のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、前記ヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である。
【００５５】
α−１，３−フコシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現のため、前記ヌクレオチド配列は、遺伝子操作された微生物宿主細胞において、α−１，３−フコシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現を仲介する発現調節配列に機能可能であるように連結される。
【００５６】
さらなるおよび／または代替態様において、ＬＮＦＰ−Ｉを産生可能な遺伝子操作された微生物宿主細胞であって、α−１，３−フコシダーゼを発現する、前記の遺伝子操作された微生物宿主細胞を提供する。ＬＮＦＰ−Ｉを産生可能であるために、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびα−１，２−フコシルトランスフェラーゼを発現する。前記β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからラクトースのガラクトース部分にＧｌｃＮＡｃ残基をトランスファーし、それによってラクト−Ｎ−トリオース−ＩＩ（ＬＮＴ−ＩＩ）を合成可能である。前記β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ガラクトースからＬＮＴ−ＩＩのＧｌｃＮＡｃ部分にガラクトース残基をトランスファーし、それによってラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）を合成可能である。前記α−１，２−フコシルトランスフェラーゼは、ＧＤＰ−フコースからＬＮＴの末端ガラクトース部分にフコース残基をトランスファーし、それによって、ＬＮＦＰ−Ｉを産生可能である。３−ＦＬおよび２’３−ＤＦＬは、ＬＮＦＰ−Ｉの産生において、望ましくない副産物である。ＬＮＦＰ−Ｉを産生可能である遺伝子操作された微生物宿主細胞において、α−１，３−フコシダーゼを発現させることによって、遺伝子操作された微生物宿主細胞内で副産物３−ＦＬおよび２’３−ＤＦＬがα−１，３−フコシダーゼによって加水分解されるため、これらの副産物の産生を消滅させるかまたは少なくとも減少させることが可能である。生じる分解産物はフコース、ラクトース、および２’−ＦＬである。フコースおよびラクトースは、所望のＬＮＦＰ−Ｉの産生のため、遺伝子操作された微生物宿主生物によって利用されうる。
【００５７】
さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、α−１，３−フコシダーゼを発現するように遺伝子操作されている。さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、その発現のため、α−１，３−フコシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように遺伝子操作されている。好ましくは、α−１，３−フコシダーゼをコードするヌクレオチド配列は、
−配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列；
−配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
−配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
−配列番号４に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
−配列番号４に示されるようなポリペプチド配列の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列であって、機能的変異体のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、前記ヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である。
【００５８】
α−１，３−フコシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現のため、前記ヌクレオチド配列は、遺伝子操作された微生物宿主細胞において、α−１，３−フコシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現を仲介する発現調節配列に機能可能であるように連結される。
【００５９】
適切なシアリダーゼは、α−２，３−シアリダーゼである。α−２，３−シアリダーゼは、オリゴ糖からの直鎖α−２，３−連結Ｌ−シアリル残基の加水分解を触媒する非常に特異的なエキソグリコシダーゼである。好ましいα−２，３−シアリダーゼは、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＮａｎＢ（配列番号６）である。
【００６０】
さらなるおよび／または代替態様において、６’−ＳＬを産生可能な遺伝子操作された微生物宿主細胞であって、α−２，３−シアリダーゼを発現する、前記の遺伝子操作された微生物宿主細胞を提供する。６’−ＳＬを産生可能であるために、遺伝子操作された微生物宿主細胞はα−２，６−シアリルトランスフェラーゼを発現する。前記α−２，６−シアリルトランスフェラーゼは、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃから、基質としてのラクトースのガラクトース部分にＮｅｕ５Ａｃ残基をトランスファーし、それによって６’−ＳＬを合成可能である。６’−ＳＬの産生において、３’−ＳＬは望ましくない糖副産物である。
【００６１】
６’−ＳＬを産生可能である遺伝子操作された微生物宿主細胞において、α−２，３−シアリダーゼを発現させることによって、遺伝子操作された微生物宿主細胞内でα−２，３−シアリダーゼにより副産物３’−ＳＬが加水分解されるため、この副産物の産生を消滅させるかまたは少なくとも減少させることが可能である。生じる分解産物はＮ−アセチルノイラミン酸およびラクトースである。Ｎ−アセチルノイラミン酸およびラクトースはどちらも、所望の６’−ＳＬの産生のため、遺伝子操作された微生物宿主生物によって利用されうる。
【００６２】
さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、α−２，３−シアリダーゼを発現するように遺伝子操作されている。さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、その発現のため、α−２，３−シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように遺伝子操作されている。好ましくは、α−２，３−シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、
−配列番号５に示されるようなヌクレオチド配列；
−配列番号５に示されるようなヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
−配列番号５に示されるようなヌクレオチド配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
−配列番号６に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
−配列番号６に示されるようなポリペプチド配列の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列であって、機能的変異体のアミノ酸配列が、配列番号６に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、前記ヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である。
【００６３】
α−２，３−シアリダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現のため、前記ヌクレオチド配列は、遺伝子操作された微生物宿主細胞において、α−２，３−シアリダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現を仲介する発現調節配列に機能可能であるように連結される。
【００６４】
適切なガラクトシダーゼは、β−１，３−ガラクトシダーゼである。β−１，３−ガラクトシダーゼは、β−１，３−連結ガラクトース残基のオリゴ糖からの加水分解を触媒する酵素である。好ましいβ−１，３−ガラクトシダーゼは、ビフィドバクテリウム・ロングム由来のＢｇａ４２Ａ（配列番号８）である。
【００６５】
さらなるおよび／または代替態様において、ＬＮｎＴを産生可能な遺伝子操作された微生物宿主細胞であって、β−１，３−ガラクトシダーゼを発現する、前記の遺伝子操作された微生物宿主細胞を提供する。ＬＮｎＴを産生可能であるために、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、β−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現する。前記β−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから、ラクトースのガラクトース部分にＧｌｃＮＡｃ残基をトランスファーし、それによって、ＬＮＴ−ＩＩを合成可能である。前記β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ガラクトースから、ＬＮＴ−ＩＩのＧｌｃＮＡｃ部分にガラクトース残基をトランスファーし、それによって、所望のオリゴ糖としてＬＮｎＴを合成可能である。
【００６６】
ＬＮｎＴの産生において、ＬＮＴは望ましくない糖副産物である。ＬＮｎＴを産生可能である遺伝子操作された微生物宿主細胞において、β−１，３−ガラクトシダーゼを発現させることによって、異種β−１，３−ガラクトシダーゼにより、遺伝子操作された微生物宿主細胞内で副産物ＬＮＴが加水分解されるため、この副産物の産生を消滅させるかまたは少なくとも減少させることが可能である。生じる分解産物はガラクトースおよびＬＮＴ−ＩＩである。ガラクトースならびにＬＮＴ−ＩＩは、所望のＬＮｎＴの産生のため、遺伝子操作された微生物宿主生物によって利用されうる。
【００６７】
さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、β−１，３−ガラクトシダーゼを発現するように遺伝子操作されている。さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、その発現のため、β−１，３−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように遺伝子操作されている。
【００６８】
さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、β−１，３−ガラクトシダーゼを発現するように遺伝子操作されている。さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、その発現のため、β−１，３−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように遺伝子操作されている。好ましくは、β−１，３−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列は、
−配列番号７に示されるようなヌクレオチド配列；
−配列番号７に示されるようなヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
−配列番号７に示されるようなヌクレオチド配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
−配列番号８に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
−配列番号８に示されるようなポリペプチド配列の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列であって、機能的変異体のアミノ酸配列が、配列番号８に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、前記ヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である。
【００６９】
β−１，３−ガラクトシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現のため、前記ヌクレオチド配列は、遺伝子操作された微生物宿主細胞において、β−１，３−ガラクトシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現を仲介する発現調節配列に機能可能であるように連結される。
【００７０】
別の適切なガラクトシダーゼは、ガラクタンβ−１，３−ガラクトシダーゼである。ガラクタンβ−１，３−ガラクトシダーゼは、ガラクトースを所持するオリゴ糖鎖からのβ−１，３−連結ガラクトース残基の加水分解を触媒する酵素である。好ましいガラクタンβ−１，３−ガラクトシダーゼは、クロストリジウム・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）のＣｔ１，３Ｇａｌ４３Ａ（配列番号１０）である。
【００７１】
さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、ガラクタンβ−１，３−ガラクトシダーゼを発現するように遺伝子操作されている。さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、その発現のため、ガラクタンβ−１，３−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように遺伝子操作されている。好ましくは、ガラクタンβ−１，３−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列は、
−配列番号９に示されるようなヌクレオチド配列；
−配列番号９に示されるようなヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
−配列番号９に示されるようなヌクレオチド配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
−配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
−配列番号１０に示されるようなポリペプチド配列の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列であって、機能的変異体のアミノ酸配列が、配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、前記ヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である。
【００７２】
ガラクタンβ−１，３−ガラクトシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現のため、前記ヌクレオチド配列は、遺伝子操作された微生物宿主細胞において、ガラクタンβ−１，３−ガラクトシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現を仲介する発現調節配列に機能可能であるように連結される。
【００７３】
適切なグルコシダーゼは、β−１，３−グルコシダーゼである。β−１，３−グルコシダーゼは、オリゴ糖からのβ−１，３−連結−グルコース残基の加水分解を触媒する非常に特異的なエキソグリコシダーゼである。好ましいβ−１，３−グルコシダーゼは、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種のＰｇｌＡ（配列番号１２）である。
【００７４】
さらなるおよび／または代替態様において、ＬＮＴまたはＬＮｎＴを産生可能な遺伝子操作された微生物宿主生物であって、β−１，３−グルコシダーゼおよび／またはβ−１，３−ガラクトシダーゼを発現する、前記の遺伝子操作された微生物宿主細胞を提供する。ＬＮＴを産生可能であるために、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現する。前記β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから、ラクトースのガラクトース部分に、ＧｌｃＮＡｃ残基をトランスファーし、それによってラクト−Ｎ−トリオース−ＩＩ（ＬＮＴ−ＩＩ）を合成可能である。前記β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーは、ＵＤＰ−ガラクトースから、ＬＮＴ−ＩＩのＧｌｃＮＡｃ部分に、ガラクトース残基をトランスファーし、それによってラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）を合成可能である。ＬＮｎＴを産生可能であるために、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現する。前記β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、ＬＮＴ−ＩＩを合成可能である。前記β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ガラクトースから、ＬＮＴ−ＩＩのＧｌｃＮＡｃ部分にガラクトース残基をトランスファーし、それによって、所望のオリゴ糖としてＬＮｎＴを合成可能である。
【００７５】
当業者には、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のβ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ様ＬｇｔＡが広範囲のドナー基質を受け入れることが知られている。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから適切なアクセプター糖へのＧｌｃＮＡｃのトランスファーを主に行う一方で、ＬｇｔＡはまた、ドナー基質として、ＵＤＰ−ガラクトースまたはＵＤＰ−グルコースを用いることも可能である。記載するように、ＬＮＴまたはＬＮｎＴを産生可能である遺伝子操作された微生物宿主生物を用いると、前記β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼはまた、ラクトースのガラクトース部分に、ＵＤＰ−ガラクトースからガラクトース残基をトランスファーするとともに、ＵＤＰ−グルコースからグルコース残基をトランスファーし、それによって、それぞれ、望ましくない副産物Ｇａｌ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃおよびＧｌｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃを合成可能である。
【００７６】
ＬＮＴまたはＬＮｎＴを産生可能である遺伝子操作された微生物宿主細胞において、ガラクタンβ１，３−ガラクトシダーゼおよび／またはβ−１，３−グルコシダーゼを発現させることによって、ガラクタンβ１，３−ガラクトシダーゼおよび／またはβ−１，３−グルコシダーゼにより、遺伝子操作された微生物宿主細胞内で副産物Ｇａｌ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃおよびＧｌｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃが加水分解されるため、これらの副産物の産生を消滅させるかまたは少なくとも減少させることが可能である。生じる分解産物はガラクトースおよび／またはグルコースおよびラクトースである。単糖両方ならびにラクトースは、所望のＬＮＴまたはＬＮｎＴの産生のため、遺伝子操作された微生物宿主細胞によって利用されうる。
【００７７】
さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、β−１，３−グルコシダーゼを発現するように遺伝子操作されている。さらなるおよび／または代替態様において、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、その発現のため、β−１，３−グルコシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように遺伝子操作されている。好ましくは、β−１，３−グルコシダーゼをコードするヌクレオチド配列は、
−配列番号１１に示されるようなヌクレオチド配列；
−配列番号１１に示されるようなヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
−配列番号１１に示されるようなヌクレオチド配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
−配列番号１２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
−配列番号１２に示されるようなポリペプチド配列の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列であって、機能的変異体のアミノ酸配列が、配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、前記ヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列である。
【００７８】
β−１，３−グルコシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現のため、前記ヌクレオチド配列は、遺伝子操作された微生物宿主細胞において、β−１，３−グルコシダーゼまたはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の発現を仲介する発現調節配列に機能可能であるように連結される。
【００７９】
遺伝子操作された微生物宿主細胞は、遺伝子操作された微生物宿主細胞における異種グリコシダーゼの酵素活性から生じる分解産物の少なくとも１つをリサイクルすることが可能である。したがって、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、所望のオリゴ糖の産生のため、異種グリコシダーゼの酵素活性から生じる分解産物の少なくとも１つを用いることも可能である。例えば、異種グリコシダーゼによる望ましくない糖副産物から放出される単糖残基を再活性化して、すなわちヌクレオチドに結合させて、それぞれのグリコシルトランスフェラーゼにより、生じたヌクレオチド活性化単糖からアクセプター基質にトランスファーできるようにして、所望のオリゴ糖または所望のオリゴ糖の前駆体を生じてもよい。
【００８０】
方法は、遺伝子操作された微生物宿主生物による所望のオリゴ糖の産生を許容する培地中、そして前記の遺伝子操作された微生物宿主生物による所望のオリゴ糖の産生を許容する条件下で、前記の遺伝子操作された微生物宿主細胞を培養する工程を含む。
【００８１】
遺伝子操作された微生物宿主細胞による所望のオリゴ糖の産生を許容する培地は、栄養素、少なくとも１つのエネルギー供給源、必須金属およびミネラル、ならびに緩衝剤を含有する。培地は、随意に、所望のオリゴ糖の前駆体を含有し、前記前駆体は、遺伝子操作された微生物宿主細胞が自身で前記前駆体を合成不能であるならば、遺伝子操作された微生物宿主細胞によって内在化され、そして所望のオリゴ糖の産生のために利用されることも可能である。次いで、遺伝子操作された微生物宿主細胞は、前駆体を内在化し、そして該前駆体を所望のオリゴ糖の生合成に供する。例えば、ラクトースは、２’−フコシルラクトースの前駆体と見なされることも可能である。
【００８２】
所望のオリゴ糖を産生するための遺伝子操作された微生物宿主細胞の培養中、許容性条件が維持される。これらの条件下で培養される、遺伝子操作された微生物宿主細胞が生存し続け、そして所望のオリゴ糖を産生するならば、条件は「許容性」である。好ましくは、許容性培養条件は、遺伝子操作された微生物宿主細胞が増殖することを可能にする。特定の値で、または特定の範囲内で維持する必要がある条件には、ｐＨ、温度、酸素および栄養素の濃度、エネルギー供給源、ならびに必須金属およびミネラルが含まれる。
【００８３】
さらなるおよび／または代替態様において、方法は、所望のオリゴ糖を回収する工程を含む。所望のオリゴ糖は、発酵ブロスから、そして／または遺伝子操作された微生物宿主生物から回収されてもよい。
【００８４】
本明細書に先に記載したような方法は、所望のオリゴ糖の産生中に、副産物がより少なくしか産生されないかまたはまったく産生されない点で好適である。それによって、発酵ブロスまたは細胞溶解物から所望のオリゴ糖を回収しそして精製するために、より面倒がなくそしてよりコストがかからない。
【００８５】
さらに、基質が望ましくない副産物中に取り込まれて、これが微生物宿主細胞によって代謝不能であるために、基質が所望のオリゴ糖の産生のためにアクセス不能になるのではなく、さらに多くの基質が所望のオリゴ糖の産生に特異的に用いられる。
【００８６】
第二の側面にしたがって、所望のオリゴ糖の産生のための遺伝子操作された微生物宿主細胞であって、所望のオリゴ糖を産生可能であり、そして所望のオリゴ糖の細胞内生合成中に生成される代謝性副産物を細胞内で分解可能である異種グリコシダーゼを発現するように遺伝子操作されている、前記の遺伝子操作された微生物宿主細胞を提供する。
【００８７】
第三の側面にしたがって、本明細書に先に記載したような遺伝子操作された微生物宿主細胞を、所望のオリゴ糖の産生に用いる。これらの遺伝子操作された微生物宿主細胞を、発酵により、所望のオリゴ糖の産生に用いることは、望ましくない糖副産物の産生が防止されるかまたはさらに消滅するため、好適である。したがって、これは供給源を節約し、そして望ましくないオリゴ糖副産物からの所望のオリゴ糖の分離が回避可能であるため、発酵ブロスからの所望のオリゴ糖の回収はより面倒が少ない。さらに、異種グリコシダーゼを発現するように遺伝子操作されていない天然微生物宿主細胞に比較した際、本発明記載の遺伝子操作された微生物宿主細胞に提供される抽出物（ｅｄｕｃｔ）およびエネルギー供給源のはるかに多くが、所望の産物に変換される。
【００８８】
第四の側面にしたがって、本明細書に先に記載した方法および／または遺伝子操作された微生物宿主細胞の使用によって産生される所望のオリゴ糖は、好ましくは、ＨＭＯの群より選択される。
【００８９】
本明細書に記載した方法および／または遺伝子操作された微生物宿主細胞の使用によって産生される所望のオリゴ糖を、栄養組成物の産生に用いてもよい。
栄養組成物は、薬用組成物、食餌組成物、乳児用調製乳等である。
【００９０】
本発明は、特定の態様に関して、そして図に言及して記載されるが、本発明はこれらに限定されず、請求項によってのみ限定される。さらに、明細書および請求項における用語、第一、第二等は、類似の要素の間を区別するために用いられ、そして必ずしも、時間的、空間的、ランクにおけるまたはいかなる他の方式でも、順序を記載するためではない。こうして用いる用語は、適切な状況下で交換可能であり、そして本明細書記載の発明の態様は、本明細書に記載するかまたは例示するもの以外の順序で実施することが可能であることが理解されるものとする。
【００９１】
請求項で用いる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、その後に列挙する手段に限定されると解釈されるべきではなく；他の要素または工程を排除しないことに注目すべきである。したがって、これは、言及するような特徴、整数、工程または構成要素の存在を明記するように解釈されるものとするが、１つまたはそれより多い特徴、整数、工程または構成要素、あるいはその群の存在または追加を除外しない。したがって、表現「手段ＡおよびＢを含むデバイス」の範囲は、構成要素ＡおよびＢのみからなるデバイスに限定されるべきではない。本発明に関して、これは、デバイスに関連する（ｒｅｌｅｖａｎｔ）構成要素がＡおよびＢのみであることを意味する。
【００９２】
本明細書全体で、「１つの態様」または「単数の態様」に対する言及は、態様と関連して記載される特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの態様に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の多様な箇所における、句「１つの態様における」または「単数の態様における」の出現は、必ずしもすべてが同じ態様を指してはいないが、指していてもよい。さらに、一般の当業者には本開示から明らかであるように、１つまたはそれより多い態様において、特定の特徴、構造または特性を、任意の適切な方式で、組み合わせてもよい。
【００９３】
同様に、本発明の例示的態様の説明において、本開示を効率化し、そして本発明の多様な側面の１つまたはそれより多くの理解を補助する目的のため、本発明の多様な特徴は、ときに、その単一の態様、図、または説明に、ともにグループ化されることを理解しなければならない。しかし、開示の方法は、請求する発明が各請求項に明らかに言及されるよりも多くの特徴を必要とするという意図を示すと解釈されてはならない。むしろ、以下の請求項が示すように、本発明の側面は、単一の前述する開示態様のすべての特徴より少ない特徴で存在する。したがって、詳細な説明に続く請求項は、この詳細な説明に完全に取り込まれ、各請求項はそれ自体、本発明の別個の態様として存在する。
【００９４】
さらに、当業者に理解されるであろうように、本明細書に記載するいくつかの態様には、他の態様に含まれる特徴のいくつかが含まれるが他の特徴が含まれない一方、異なる態様の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内にあると意味され、そして異なる態様を形成する。例えば、以下の請求項において、請求する態様のいずれも、いかなる組み合わせで用いてもよい。
【００９５】
さらに、態様のいくつかは、コンピュータシステムのプロセッサにより、または機能を実行する他の手段により、実行可能である方法または方法の要素の組み合わせとして、本明細書に記載される。したがって、こうした方法または方法の要素を実行するために必要な命令を伴うプロセッサは、方法または方法の要素を実行するための手段を形成する。さらに、装置態様の本明細書記載の要素は、本発明を実行する目的のための要素によって実行される機能を実行するための手段の例である。
【００９６】
本明細書に提供する説明および図において、多くの特定の詳細が示される。しかし、本発明の態様は、これらの特定の詳細を伴わずに実行可能であることが理解される。他の例において、周知の方法、構造および技術は、本説明の理解を不明瞭にしないため、詳細には示されてきていない。
【００９７】
本発明はここで、本発明のいくつかの態様の詳細な説明によって記載されるであろう。本発明の他の態様は、本発明の真の精神または技術的解説から逸脱することなく、当業者の知識にしたがって設定可能であり、本発明は、付随する請求項の用語によってのみ限定される。
【実施例】
【００９８】
実施例１：  ２’−フコシルラクトースの産生のための大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の代謝操作
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、２’−ＦＬ産生のため、宿主株の構築のための親株として用いた。親株の遺伝子操作には、遺伝子破壊および欠失事象、ならびに異種遺伝子の組込みが含まれた。
【００９９】
２’−フコシルラクトースは、細菌培養に適用されるラクトースから、そして生存細胞から産生されるＧＤＰ−Ｌ−フコースから合成されるため、まず、内因性β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子の野生型コピーを、ミスマッチオリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発によって不活性化した（Ｅｌｌｉｓら，  “Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，  ｒｅｐａｉｒ，  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：  ６７４２−６７４６（２００１））。同じ方法を用いて、アラビノース−イソメラーゼａｒａＡの遺伝子を破壊した。
【０１００】
ｌａｃＺΩ遺伝子断片を、温度感受性転写リプレッサーｃＩ８５７の調節下で導入した。ｌａｃＺα断片遺伝子を、該株において、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｇｂＡプロモーターの調節下で発現させ、ＬａｃＺ＋株を生じた。
【０１０１】
ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｒｎｅｒ（”Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５（２０００））の方法にしたがったλ  Ｒｅｄ仲介性組換えによって、ゲノム欠失を行った。Ｌ−フコースの分解を防止するため、それぞれ、Ｌ−フコースイソメラーゼおよびＬ−フクロースキナーゼをコードする遺伝子ｆｕｃＩおよびｆｕｃＫは欠失されている。遺伝子ｗｚｘＣ−ｗｃｄ−Ｊもまた欠失された。ＷｃａＪは、おそらく、コラン酸合成の最初の工程を触媒するＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース−１−リン酸トランスフェラーゼをコードし（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，  ”Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ”，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７８：４８８５−４８９３；（１９９６））：コラン酸の産生は、ＧＤＰ−フコースに関して、フコシルトランスフェラーゼ反応と競合するであろう。
【０１０２】
異種遺伝子のゲノム組込みを転位によって行った。巨大遺伝子クラスターを、マリナートランスポザーゼＨｉｍａｒ１の高反応性Ｃ９突然変異体によって仲介してゲノム内に組み込み（Ｌａｍｐｅら，  ”Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｉｍａｒ１  ｍａｒｉｎｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１１４２８−１１４３３（１９９９））、これをＰａｒａプロモーターの転写調節下で、プラスミドｐＥｃｏｍａｒ内に挿入した。ＧＤＰ−フコースの新規合成を増進させるため、大腸菌Ｋ１２  ＤＨ５α由来のホスホマンノムターゼ（ｍａｎＢ）、マンノース−１−リン酸グアノシルトランスフェラーゼ（ｍａｎＣ）、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ｇｍｄ）、およびＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ｗｃａＧ）をコードする遺伝子を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株において過剰発現し；オペロン、ｍａｎＣＢを恒常的プロモーターＰｔｅｔの調節下にセットし、オペロンｇｍｄ、ｗｃａＧを恒常的ＰＴ５プロモーターから転写した。トリメトプリム耐性のためのジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子を含み、マリナー様要素Ｈｉｍａｒ１トランスポザーゼによって特異的に認識される末端逆位配列が隣接する、トランスポゾンカセット＜Ｐｔｅｔ−ｍａｎＣＢ−ＰＴ５−ｇｍｄ、ｗｃａＧ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ＞（配列番号１３）を、ｐＥｃｏｍａｒ  Ｃ９−ｍａｎＣＢ−ｇｍｄ、ｗｃａＧ−ｄｈｆｒから大腸菌ゲノム内に挿入した。
【０１０３】
単一遺伝子の染色体組込みのため、ＥＺ−Ｔｎ５ＴＭトランスポザーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国）を用いた。ＥＺ−Ｔｎ５トランスポゾーム（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅｓ）を産生するため、関心対象の遺伝子とともに、ＦＲＴ−部位隣接抗生物質耐性カセットを、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼに関する１９ｂｐモザイク端認識部位（５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ、配列番号２１）を両部位上に所持するプライマーを用いて、増幅した。ＥＺ−Ｔｎ５ＴＭトランスポザーゼを用いて、大腸菌Ｋ１２  ＴＧ１由来のラクトースインポーターＬａｃＹ（寄託番号ＡＢＮ７２５８３）、大腸菌Ｏ１２６由来の２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｗｂｇＬ（寄託番号ＡＤＮ４３８４７）、およびエルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）ＡＴＣＣ４３９７０由来の主要促進因子スーパーファミリーの糖流動輸送体をコードする遺伝子ｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０（寄託番号ＥＥＱ０８２９８）を、それぞれの組込みカセット：＜Ｐｔｅｔ−ｌａｃＹ−ＦＲＴ−ａａｄＡ−ＦＲＴ＞（配列番号１４）、＜Ｐｔｅｔ−ｗｂｇＬｃｏ−ＦＲＴ−ｎｅｏ−ＦＲＴ＞（配列番号１５）、および＜Ｐｔｅｔ−ｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０ｃｏ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ＞（配列番号１６）を用いて組み込んだ。遺伝子ｗｂｇＬおよびｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０を合成的に合成し、そしてＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（米国）によってコドン最適化（ｃо）した。ｌａｃＹ遺伝子の組込みに成功した後、プラスミドｐＣＰ２０上にコードされるＦＬＰレコンビナーゼによって、ストレプトマイシン耐性クローンから耐性遺伝子を除去した（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｒｎｅｒ，  ”Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５（２０００））。
【０１０４】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は機能するｇａｌオペロンを欠くため、大腸菌Ｋ由来のｇａｌＥＴＫＭオペロンの天然制御コピーを、組み込みカセット＜Ｐｇａｌ−ｇａｌＥ−ｇａｌＴ−ｇａｌＫ−ｇａｌＭ＞（配列番号１７）を用い、ＥＺ−転位によって、Ｂ株内に組み込んだ。１％ガラクトースを含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天から、赤色コロニーとして組込み体を選択した。生じた株は、ラクトース加水分解から生じる単糖、グルコースおよびガラクトースを代謝可能である。
【０１０５】
ホスホフルクトキナーゼＡをコードするｐｆｋＡ遺伝子の欠失によって、大腸菌株による２’−フコシルラクトースの合成に関するさらなる改善を達成した。グリセロールのような糖新生基質上で大腸菌を培養すると、ＰｆｋＡによるフルクトース−６−リン酸のリン酸化は、ＡＴＰを非常に消費する終わりのない反応であり、そしてさらに、これは基質に関してＭａｎＡと競合する。ｌоｘ７１／６６部位が隣接するゲンタマイシン耐性カセット（ａａｃＣ１）を用いて、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）にしたがって、ｐｆｋＡ遺伝子を相同組換えによって欠失させた（Ｌａｍｂｅｒｔ，  ＪＭら（２００７）  Ｃｒｅ−ｌｏｘ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  −ｍａｒｋｅｒ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｉｎ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３：１１２６−１１３５）。ｐｆｋＡ遺伝子の欠失に成功した後、Ｃｒｅレコンビナーゼを用いて、大腸菌ゲノムから抗生物質耐性遺伝子を除去し（Ａｂｒｅｍｓｋｉ，  Ｋら（１９８３）  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐ１  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｕｎｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  ３２：  １３０１−１３１１）、ｐＫＤ４６（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、２０００）外枠（ｃｈａｓｓｉｓ）中のＰａｒａプロモーターの調節下でクローニングした。
【０１０６】
トランスフェラーゼ活性に加えて異なるフコシルトランスフェラーゼ活性に関して、ＧＤＰ−Ｌ−フコースヒドロラーゼ活性が示された。また、２’−フコシルラクトース合成のために本明細書で用いるα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ、ｗｂｇＬに関してもこの加水分解活性が示された（ＥＰ３０５０９７３Ａ１を参照されたい）。２’−フコシルラクトース産生のため、遊離Ｌ−フコースをレスキューし、そして培地から混入Ｌ−フコースを除去するため、Ｐｔｅｔプロモーターの転写調節下でバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）の二機能性Ｌ−フコキナーゼ／Ｌ−フコース１−ホスファトグアニリルトランスフェラーゼをコードするｆｋｐ遺伝子とともに、ｌоｘ７１／６６隣接ａａｃＣ１遺伝子を、ＥＺ−Ｔｎ５ＴＭトランスポザーゼ＜Ｐｔｅｔ−ｆｋｐ−ｌｏｘ−ａａｃＣ１−ｌｏｘ＞（配列番号１８）を用いた転位によって、染色体に組み込んだ。組込みに成功した後、上述のように、ゲンタマイシン耐性遺伝子をゲノムから除去した。
【０１０７】
ＧＤＰ−Ｌ−フコース生合成に供給する、トリオースリン酸からフルクトース−６−リン酸の糖新生経路を通じて、代謝炭素供給源グリセロールの流動を増進させるため、フルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａＢ）およびエンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）由来の異種フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼ（ｆｂｐアーゼ）をコードする遺伝子を過剰発現させた。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）由来ｆｂａＢ遺伝子をＰｔｅｔプロモーターと融合させた。葉緑体（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｉｃ）エンドウＦＢＰアーゼの活性は、チオレドキシンによる還元によって、ジスルフィド−ジチオール交換によりアロステリックに制御される。システイン残基１５３のセリンへの交換は恒常的活性酵素を生じる。エンドウ由来の葉緑体ＦＢＰアーゼをコードする遺伝子（寄託番号ＡＡＤ１０２１３）を購入し、大腸菌における発現のためにコドン最適化し、ヘキサヒスチジンタグでＮ末端にタグ付けし、そしてＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ由来の酵素のＣ１５３Ｓ変異体をコードするように修飾した。ｆｂｐアーゼ遺伝子はＴ７プロモーターから転写される。宿主株におけるＥＺ−Ｔｎ５ＴＭトランスポザーゼ仲介性組込みのために、カセット＜Ｐｔｅｔ−ｆｂａＢ−ＰＴ７−Ｈｉｓ６−ｆｂｐａｓｅ−ｌｏｘ−ａａｃＣ１−ｌｏｘ＞（配列番号１９）を用いた。大腸菌ゲノムからゲンタマイシン耐性遺伝子を除去した後、２’−フコシルラクトース産生のために株を用いた。続いて、この株を「株Ａ」と名付ける。
【０１０８】
実施例２：高純度で２’−フコシルラクトースを産生するための大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の操作
２’−フコシルラクトース産生のための株Ａを用いた流加培養法によって、培養ブロスにおける副産物（３−フコシルラクトースおよび２’３−ジフコシルラクトース）の存在が明らかになった。これらの副産物の産生を最小限にするとともに、炭素収量を改善するため、α−１，３−フコシダーゼを恒常的プロモーターの後ろにサブクローニングし、そして株Ａのゲノム内に組み込んだ。したがって、ビフィズス菌のａｆｃＢ遺伝子（寄託番号ＡＢ４７４９６４）を恒常性Ｐａｎｄプロモーターおよびゲンタマイシン耐性遺伝子に融合させた。マリナー様要素Ｈｉｍａｒ１トランスポザーゼが特異的に認識する末端逆位配列が隣接する、生じたトランスポゾンカセット＜Ｐａｎｄ−ａｆｃＢ−ｌｏｘ−ａａｃＣ１−ｌｏｘ＞（配列番号２０）を、ｐＥｃｏｍａｒ  ａｆｃＢ−ａａｃＣ１から大腸菌ゲノム内に挿入して、「株Ｂ」を生成した。
【０１０９】
実施例３：培養上清中の２’−フコシルラクトースの検出のためのＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ系（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ）に連結された示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ）およびＷａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅアミドカラム３．５μｍ（２５０ｘ４．６ｍｍ）（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、ドイツ）を用いて、ＨＰＬＣによる分析を行った。溶出剤として、３０％Ａ：ｄｄＨ２Ｏ中、５０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＨ４ＯＨおよび７０％Ｂ：ｄｄＨ２Ｏ中、８０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＨ４ＯＨ（ｖ／ｖ）を用い、３５℃および１．４ｍｌ・ｍｉｎ−１の流速で、溶出を均一濃度で行った。ＨＰＬＣ試料を無菌濾過（０．２２μｍ孔サイズ）し、そしてイオン交換マトリックス（Ｓｔｒａｔａ  ＡＢＷ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で固相抽出によって清澄化した。１０μｌの試料をカラムに適用し、そして標準曲線にしたがって２’−フコシルラクトース濃度を計算した。Ｌ−フコースおよび／または他の単糖、ラクトースおよび／または他の二糖、３−フコシルラクトースおよび／または他の三糖、２’３−ジフコシルラクトースおよび／または他の四糖、ならびにグリセロールのような他の糖もまた、これらの分析条件を用いて検出可能である。クロマトグラム中のすべてのピークのＡＵＣ（曲線下面積）を比較することによって、検出された糖の相対量を決定することができる。水対照中にもやはり存在するピークは、この計算から除外される。
【０１１０】
実施例４：発酵プロセスにおける２’−フコシルラクトースの産生
３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１２ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３ｇ／Ｌクエン酸、２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４ｘ７・Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌおよび０．０１５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２ｘ６・Ｈ２Ｏを含有し、１ｇ／Ｌ微量元素溶液（５４．４ｇ・Ｌ−１クエン酸第二鉄アンモニウム、９．８ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２ｘ４・Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２ｘ６・Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ２ｘ２・Ｈ２Ｏ、１．９ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、９ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４ｘ７・Ｈ２Ｏ、１．１ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４ｘ２・Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＳｅＯ３、１．５ｇ／Ｌ  ＮｉＳＯ４ｘ６・Ｈ２Ｏ）を補充され、そして炭素供給源としての２％（ｖ／ｖ）グリセロール、６０ｍＭラクトースおよび抗生物質カナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含有する、１０００ｍＬ無機塩培地で出発して、３Ｌ発酵装置（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、米国エジソン）中、３３℃で発酵を行った。３Ｌ／分で通気を維持した。攪拌速度を調節することによって、溶解酸素を２０〜３０％飽和で維持した。２５％アンモニア溶液を添加することによって、ｐＨを７．０に維持した。培地を含有するがラクトースを欠く同じグリセロール中で培養したプレ培養からの２．５％（ｖ／ｖ）接種で培養を開始した。溶解酸素レベルの上昇によって示されるように、バッチ期を離れた後、出発体積を参照して、７．０〜８．０ｍＬ／ｈの流速で、グリセロール供給（６０％（ｖ／ｖ）、２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４ｘ７・Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２ｘ６・Ｈ２Ｏおよび１ｍＬ／Ｌ微量元素溶液を補充）を行った。培養全体で、ラクトース供給（０．６６Ｍ）を行い、そして培養ブロス中の一定のラクトース供給を達成するため、これを直感的に（ｉｎｔｕｉｔｉｖｅｌｙ）調節した。発酵終了に向けてラクトース供給を停止し、そしてラクトースが完全に２’−フコシルラクトースに変換されるまで培養を続けた。発酵装置に接種したおよそ９４時間後、実施例１で記載した株（株Ａ）を用いた際、細胞培地中の２’−フコシルラクトース力価は約１５０ｇ／Ｌに到達した。実施例２に記載するように遺伝子修飾した２’−フコシルラクトース産生株（株Ｂ）を比較として培養し、そしてこれもまた、約１５０ｇ／Ｌの２’−フコシルラクトース力価を生じた。しかし、副産物の量は、株Ａを培養した後よりも有意に低かった（表２）。株Ａの培養上清中の糖含量は、２’−フコシルラクトース９４．２２％しか構成しなかったが、株Ｂの培養上清中では５．５０％増加し、９９．７２％の純度を示した。
【０１１１】
【表２】
2021524232.tif 000008
【０１１２】
表２：培養９４時間後の株Ａおよび株Ｂの培養上清中の検出可能な糖の相対量の定性的ＨＰＬＣ分析（ｎ．ｄ．：検出不能）。
【図１】
2021524232.tif 000009
【配列表】
2021524232000001.app
【国際調査報告】
2021524232.tif 000010
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