(57)【要約】  ベータグロビン遺伝子（ＨＢＢ）遺伝子における変異を修正するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）組成物、および細胞におけるＨＢＢ遺伝子変異を修正するためのその使用方法が本明細書で提供される。アデノ随伴ウイルス組成物を作製するためのパッケージングシステムも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるベータグロビン（ＨＢＢ）遺伝子の変異を修正するための方法であって、前記細胞を、
ａ）ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと、
ｂ）（ｉ）標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、（ｉｉ）前記標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の５’の５’相同アームヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）前記標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の３’の３’相同アームヌクレオチド配列を含む、修正ゲノムと、を含む、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）で形質導入することを含み、
前記細胞は、外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入または共投与することなく形質導入される、方法。
【請求項２】
前記細胞が、多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、造血幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、哺乳類対象内にあり、前記ＡＡＶが、前記対象の前記細胞を形質導入するのに有効な量で、前記対象に投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＨＢＢ遺伝子変異に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法であって、
ａ）エクスビボで、前記対象由来の赤血球前駆細胞を、
（ｉ）ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと、
（ｉｉ）（Ａ）標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、（Ｂ）前記標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の５’の５’相同アームヌクレオチド配列、および（Ｃ）前記標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の３’の３’相同アームヌクレオチド配列を含む、修正ゲノムと、を含む、複製欠損ＡＡＶで形質導入して、それにより、修正されたＨＢＢ遺伝子を有する形質導入された細胞を得ることと、
ｂ）前記形質導入された細胞を前記対象に投与することと、を含み、
前記細胞は、外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入することなく形質導入される、方法。
【請求項７】
前記赤血球前駆細胞が、多能性幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記赤血球前駆細胞が、造血幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記赤血球前駆細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＢＢ遺伝子変異に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、
ａ）ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと、
ｂ）（ｉ）標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、（ｉｉ）前記標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の５’の５’相同アームヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）前記標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の３’の３’相同アームヌクレオチド配列を含む、修正ゲノムと、を含む、有効量の複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与することを含み、
外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共投与することなく投与することを含む、方法。
【請求項１１】
前記疾患または障害が、サラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、ヒト対象である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的遺伝子が、前記ＨＢＢ遺伝子である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的遺伝子座が、前記ＨＢＢ遺伝子におけるヌクレオチド点変異、挿入、または欠失にある、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＢＢ遺伝子における前記ヌクレオチド点変異または欠失が、位置−８７のＧ、位置−３１のＧ、位置−３０のＡ、位置−２９のＧ、位置−２８のＧ、位置−１０のＴ、位置１のＣ、位置１のＡ、位置２のＧ、位置１７および１８のＣおよびＴの欠失、位置１９のＡ、位置２０のＡの欠失、位置２０のＴ、位置２５および２６のＡの欠失およびＡ、位置２６の後のＧの追加、位置４７のＡ、位置４８のＡ、位置５１のＣの欠失、位置５２のＡ、位置５８のＧ、位置５９のＧ、位置７９のＡ、位置８２のＴ、位置８４の後のＣの追加、位置９３のＴ、位置９３のＡ、位置９７のＣ、位置９８のＣ、位置２０２のＧ、位置２０８のＧ、位置２２２のＣ、位置２４１または２４２のＴの欠失、位置２５４〜２５７のＴの欠失ならびにＴおよびＣおよびＴ、位置２６０のＴ、位置２６４または２６５のＣの欠失、位置３４３の後のＡの追加、位置３９９および４００のＧおよびＴの欠失、位置４０１のＴ、位置４１７の後のＡの追加、位置４４６のＡ、位置１０９９のＴ、位置１２９３のＡ、位置１３４４のＴからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記編集要素が、前記変異に対応する前記野生型ＨＢＢ遺伝子の一部分を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記編集要素が、ＨＢＢ遺伝子の１つ以上のエクソンのコード領域を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記編集要素が、エクソン１の前記コード領域、イントロン１全体、エクソン２全体、イントロン２全体、およびエクソン３の前記コード領域を含むＨＢＢ遺伝子の一部分を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記コード領域が、前記野生型ＨＢＢ遺伝子の前記対応するエクソンに１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満同一であるように沈黙（ｓｉｌｅｎｔｌｙ）改変されている、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記編集要素が、配列番号４３〜４６および１０５〜１０７からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的遺伝子座が、ＡＡＶＳ１である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記編集要素が、配列番号４８またはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１６および２１に記載のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２７のヌクレオチド４〜４４４からなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２７のヌクレオチド４〜４４４に７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％未満同一であるように沈黙改変されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４７または１００の配列からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ＨＢＢ遺伝子のスタッファー挿入コード配列からなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のヌクレオチド３とヌクレオチド４との間のヌクレオチド間結合であり、それにより、前記標的遺伝子座の前記編集要素の組み込みが、前記標的遺伝子の開始コドンで始まるＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む前記標的遺伝子座をもたらす、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記編集要素が、５’から３’に開始コドンおよび配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列からなるＨＢＢコード配列もしくはスタッファー挿入コード配列、または前記ＨＢＢコード配列もしくはスタッファー挿入コード配列の一部分を含む、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のイントロンにあり、前記編集要素が、５’から３’にスプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、およびＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的遺伝子座が、前記ＨＢＢ遺伝子のイントロン１にある、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のコードヌクレオチドに隣接して３’にあり、前記編集要素が、５’から３’にリボソームスキッピング要素、およびＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的遺伝子座が、野生型標的遺伝子の終止コドン、または変異標的遺伝子の対応するヌクレオチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記編集要素が、配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列の３’の外来性ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記編集要素が、前記標的遺伝子に存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位をさらに含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記編集要素が、配列番号２３〜２８のいずれか１つに記載の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記５’相同アームヌクレオチド配列が、前記第１のゲノム領域に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記３’相同アームヌクレオチド配列が、前記第２のゲノム領域に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１のゲノム領域が第１の編集枠に位置し、前記第２のゲノム領域が第２の編集枠に位置する、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１および第２の編集枠が異なる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１および第２の編集枠が同じである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の編集枠が、配列番号１０１、１０２、または１０３に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の編集枠が、配列番号１０１、１０２、または１０３に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１のゲノム領域が、配列番号１０１に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第２のゲノム領域が、配列番号１０２に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記５’相同アームが、配列番号１０１に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記３’相同アームが、配列番号１０２に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記５’および３’相同アームヌクレオチド配列の各々が、独立して、約１００〜約２０００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記修正ゲノムが、前記５’相同アームヌクレオチド配列の５’の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、および前記３’相同アームヌクレオチド配列の３’の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号２０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記修正ゲノムが、配列番号２９〜４２および１０４のいずれか１つに記載の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸２０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
（ａ）配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭである、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、または
（ｅ）配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記カプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３〜７３６の前記アミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸１５１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸１６０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＤであるか、配列番号２のアミノ酸２０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
（ａ）配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭである、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、または
（ｅ）配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記カプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８〜７３６の前記アミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＴであるか、配列番号２のアミノ酸６５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであるか、配列番号２のアミノ酸６８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＶであるか、配列番号２のアミノ酸７７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸１１９に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＬであるか、配列番号２のアミノ酸１５１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸１６０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＤであるか、配列番号２のアミノ酸２０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
（ａ）配列番号２のアミノ酸２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＴであり、配列番号２のアミノ酸３１２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＱである、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸６５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであり、配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＹである、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸７７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＫである、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸１１９に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＬであり、配列番号２のアミノ酸４６８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＳである、
（ｅ）配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、
（ｆ）配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭである、
（ｇ）配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、
（ｈ）配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、または
（ｉ）配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記カプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１〜７３６の前記アミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＡＡＶを、標準的なＡＡＶ形質導入条件下で、ＣＤ３４＋ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、前記標的遺伝子座への前記編集要素の組み込み効率が、少なくとも１％である、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＡＡＶを、標準的なＡＡＶ形質導入条件下で、ＣＤ３４＋ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、前記標的遺伝子座への前記編集要素の組み込みの対立遺伝子頻度が、少なくとも０．５％である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ａ）ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと、
ｂ）（ｉ）標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、（ｉｉ）前記標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の５’の５’相同アームヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）前記標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域に対して相同性を有する前記編集要素の３’の３’相同アームヌクレオチド配列を含む、修正ゲノムと、を含む、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【請求項６４】
前記標的遺伝子が、前記ＨＢＢ遺伝子である、請求項６３に記載のＡＡＶ。
【請求項６５】
前記標的遺伝子座が、前記ＨＢＢ遺伝子におけるヌクレオチド点変異または欠失にある、請求項６３または６４に記載のＡＡＶ。
【請求項６６】
前記ＨＢＢ遺伝子における前記ヌクレオチド点変異または欠失が、位置−８７のＧ、位置−３１のＧ、位置−３０のＡ、位置−２９のＧ、位置−２８のＧ、位置−１０のＴ、位置１のＣ、位置１のＡ、位置２のＧ、位置１７および１８のＣおよびＴの欠失、位置１９のＡ、位置２０のＡの欠失、位置２０のＴ、位置２５および２６のＡの欠失およびＡ、位置２６の後のＧの追加、位置４７のＡ、位置４８のＡ、位置５１のＣの欠失、位置５２のＡ、位置５８のＧ、位置５９のＧ、位置７９のＡ、位置８２のＴ、位置８４の後のＣの追加、位置９３のＴ、位置９３のＡ、位置９７のＣ、位置９８のＣ、位置２０２のＧ、位置２０８のＧ、位置２２２のＣ、位置２４１または２４２のＴの欠失、位置２５４〜２５７のＴの欠失ならびにＴおよびＣおよびＴ、位置２６０のＴ、位置２６４または２６５のＣの欠失、位置３４３の後のＡの追加、位置３９９および４００のＧおよびＴの欠失、位置４０１のＴ、位置４１７の後のＡの追加、位置４４６のＡ、位置１０９９のＴ、位置１２９３のＡ、位置１３４４のＴからなる群から選択される、請求項６５に記載のＡＡＶ。
【請求項６７】
前記編集要素が、前記変異に対応する前記野生型ＨＢＢ遺伝子の一部分を含む、請求項６５または６６に記載のＡＡＶ。
【請求項６８】
前記編集要素が、ＨＢＢ遺伝子の１つ以上のエクソンの前記コード領域を含む、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項６９】
前記編集要素が、エクソン１の前記コード領域、イントロン１全体、エクソン２全体、イントロン２全体、およびエクソン３の前記コード領域を含むＨＢＢ遺伝子の一部分を含む、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項７０】
前記コード領域が、前記野生型ＨＢＢ遺伝子の前記対応するエクソンに１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満同一であるように沈黙改変されている、請求項６８または６９に記載のＡＡＶ。
【請求項７１】
前記編集要素が、配列番号４３〜４６および１０５〜１０７からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項７０に記載のＡＡＶ。
【請求項７２】
前記標的遺伝子座が、ＡＡＶＳ１である、請求項６３に記載のＡＡＶ。
【請求項７３】
前記編集要素が、配列番号４８またはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６３〜６６および７２に記載のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項７４】
配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２７のヌクレオチド４〜４４４からなる、請求項７３に記載のＡＡＶ。
【請求項７５】
配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２７のヌクレオチド４〜４４４に７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％未満同一であるように沈黙改変されている、請求項７３に記載のＡＡＶ。
【請求項７６】
配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４７または１００の前記配列からなる、請求項７５に記載のＡＡＶ。
【請求項７７】
配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ＨＢＢ遺伝子のスタッファー挿入コード配列からなる、請求項７３に記載のＡＡＶ。
【請求項７８】
前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のヌクレオチド３とヌクレオチド４との間の前記ヌクレオチド間結合であり、それにより、前記標的遺伝子座の前記編集要素の組み込みが、前記標的遺伝子の前記開始コドンで始まるＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む前記標的遺伝子座をもたらす、請求項７３〜７７のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項７９】
前記編集要素が、５’から３’に開始コドンおよび配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列からなるＨＢＢコード配列もしくはスタッファー挿入コード配列、または前記ＨＢＢコード配列もしくはスタッファー挿入コード配列の一部分を含む、請求項７３〜７７のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項８０】
前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のイントロンにあり、前記編集要素が、５’から３’にスプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、およびＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む、請求項７９に記載のＡＡＶ。
【請求項８１】
前記標的遺伝子座が、前記ＨＢＢ遺伝子のイントロン１にある、請求項８０に記載のＡＡＶ。
【請求項８２】
前記標的遺伝子座が、前記標的遺伝子のコードヌクレオチドに隣接して３’にあり、前記編集要素が、５’から３’にリボソームスキッピング要素、およびＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む、請求項７９に記載のＡＡＶ。
【請求項８３】
前記標的遺伝子座が、野生型標的遺伝子の前記終止コドン、または変異標的遺伝子の前記対応するヌクレオチドである、請求項８２に記載のＡＡＶ。
【請求項８４】
前記編集要素が、配列番号４８をコードする前記ヌクレオチド配列の３’の外来性ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項７３〜８３のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項８５】
前記編集要素が、前記標的遺伝子に存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位をさらに含む、請求項６３〜８４のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項８６】
前記編集要素が、配列番号２３〜２８のいずれか１つに記載の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項６３〜８５のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項８７】
前記５’相同アームヌクレオチド配列が、前記第１のゲノム領域に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、請求項６３〜８６のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項８８】
前記３’相同アームヌクレオチド配列が、前記第２のゲノム領域に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、請求項６３〜８７のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項８９】
前記第１のゲノム領域が第１の編集枠に位置し、前記第２のゲノム領域が第２の編集枠に位置する、請求項６２〜８８のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項９０】
前記第１および第２の編集枠が異なる、請求項８９に記載のＡＡＶ。
【請求項９１】
前記第１および第２の編集枠が同じである、請求項８９に記載のＡＡＶ。
【請求項９２】
前記第１の編集枠が、配列番号１０１、１０２、または１０３に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項８９〜９１のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項９３】
前記第２の編集枠が、配列番号１０１、１０２、または１０３に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項９４】
前記第１のゲノム領域が、配列番号１０１に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項９５】
前記第２のゲノム領域が、配列番号１０２に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項８９〜９４のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項９６】
前記５’相同アームが、配列番号１０１に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項６３〜９５のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項９７】
前記３’相同アームが、配列番号１０２に記載の前記ヌクレオチド配列からなる、請求項６３〜９６のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項９８】
前記５’および３’相同アームヌクレオチド配列の各々が、独立して、約１００〜約２０００ヌクレオチドの長さを有する、請求項６３〜９７のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項９９】
前記修正ゲノムが、前記５’相同アームヌクレオチド配列の５’の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、および前記３’相同アームヌクレオチド配列の３’の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項６３〜９８のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項１００】
前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項９９に記載のＡＡＶ。
【請求項１０１】
前記５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号２０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項９９に記載のＡＡＶ。
【請求項１０２】
前記修正ゲノムが、配列番号２９〜４２および１０４のいずれか１つに記載の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項６３〜１０１のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項１０３】
前記ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸２０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、請求項６３〜１０２のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項１０４】
（ａ）配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭである、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、または
（ｅ）配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣである、請求項１０３に記載のＡＡＶ。
【請求項１０５】
前記カプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３〜７３６の前記アミノ酸配列を含む、請求項１０３に記載のＡＡＶ。
【請求項１０６】
前記ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸１５１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸１６０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＤであるか、配列番号２のアミノ酸２０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、請求項６３〜１０５のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項１０７】
（ａ）配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭである、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、または
（ｅ）配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣである、請求項１０６に記載のＡＡＶ。
【請求項１０８】
前記カプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８〜７３６の前記アミノ酸配列を含む、請求項１０６に記載のＡＡＶ。
【請求項１０９】
前記ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＴであるか、配列番号２のアミノ酸６５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであるか、配列番号２のアミノ酸６８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＶであるか、配列番号２のアミノ酸７７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸１１９に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＬであるか、配列番号２のアミノ酸１５１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸１６０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＤであるか、配列番号２のアミノ酸２０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸が、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、請求項６３〜１０８のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項１１０】
（ａ）配列番号２のアミノ酸２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＴであり、配列番号２のアミノ酸３１２に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＱである、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸６５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであり、配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＹである、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸７７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６９０に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＫである、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸１１９に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＬであり、配列番号２のアミノ酸４６８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＳである、
（ｅ）配列番号２のアミノ酸６２６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＧである、
（ｆ）配列番号２のアミノ酸２９６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＭである、
（ｇ）配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、
（ｈ）配列番号２のアミノ酸３４６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲである、または
（ｉ）配列番号２のアミノ酸５０１に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応する前記カプシドタンパク質の前記アミノ酸がＣである、請求項１０９に記載のＡＡＶ。
【請求項１１１】
前記カプシドタンパク質が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１〜７３６の前記アミノ酸配列を含む、請求項１０９に記載のＡＡＶ。
【請求項１１２】
前記ＡＡＶを、標準的なＡＡＶ形質導入条件下で、ＣＤ３４＋ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、前記標的遺伝子座への前記編集要素の組み込み効率が、少なくとも１％である、請求項６３〜１１１のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項１１３】
前記ＡＡＶを、標準的なＡＡＶ形質導入条件下で、ＣＤ３４＋ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、前記標的遺伝子座への前記編集要素の組み込みの対立遺伝子頻度が、少なくとも０．５％である、請求項６３〜１１２のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
【請求項１１４】
請求項６２〜１１１のいずれか一項に記載のＡＡＶを含む、医薬組成物。
【請求項１１５】
ＡＡＶの組換え調製のためのパッケージングシステムであって、
ａ）１つ以上のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質をコードするＲｅｐヌクレオチド配列と、
ｂ）請求項１０３〜１１１のいずれか一項に記載の１つ以上のＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質をコードするＣａｐヌクレオチド配列と、
ｃ）請求項６３〜１０２のいずれか一項に記載の修正ゲノムと、を含み、前記パッケージングシステムが、前記修正ゲノムを前記カプシドに封入して前記ＡＡＶを形成するために細胞内で作動可能である、パッケージングシステム。
【請求項１１６】
前記パッケージングシステムが、前記Ｒｅｐヌクレオチド配列および前記Ｃａｐヌクレオチド配列を含む第１のベクターと、前記修正ゲノムを含む第２のベクターと、を含む、請求項１１５に記載のパッケージングシステム。
【請求項１１７】
前記Ｒｅｐヌクレオチド配列が、ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質をコードする、請求項１１５または１１６に記載のパッケージングシステム。
【請求項１１８】
前記ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質が、７８／６８またはＲｅｐ６８／５２である、請求項１１７に記載のパッケージングシステム。
【請求項１１９】
前記ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質が、配列番号２２の前記ＡＡＶ２  Ｒｅｐアミノ酸配列に対して最小パーセント配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記最小パーセント配列同一性が、前記ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質をコードする前記アミノ酸配列の長さにわたって少なくとも７０％である、請求項１１７または１１８のパッケージングシステム。
【請求項１２０】
第３のベクターをさらに含み、前記第３のベクターが、ヘルパーウイルスベクターである、請求項１１５〜１１９のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
【請求項１２１】
前記ヘルパーウイルスベクターが、独立した第３のベクターである、請求項１２０に記載のパッケージングシステム。
【請求項１２２】
前記ヘルパーウイルスベクターが、前記第１のベクターと統合される、請求項１２０に記載のパッケージングシステム。
【請求項１２３】
前記ヘルパーウイルスベクターが、前記第２のベクターと統合される、請求項１２０に記載のパッケージングシステム。
【請求項１２４】
前記第３のベクターが、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１２０〜１２３のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
【請求項１２５】
前記ヘルパーウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からなる群から選択される、請求項１２０〜１２４のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
【請求項１２６】
前記ヘルパーウイルスが、アデノウイルスである、請求項１２５に記載のパッケージングシステム。
【請求項１２７】
前記アデノウイルスゲノムが、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、およびＶＡからなる群から選択される１つ以上のアデノウイルスＲＮＡ遺伝子を含む、請求項１２６に記載のパッケージングシステム。
【請求項１２８】
前記ヘルパーウイルスが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である、請求項１２５に記載のパッケージングシステム。
【請求項１２９】
前記ＨＳＶゲノムが、ＵＬ５／８／５２、ＩＣＰＯ、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、およびＵＬ３０／ＵＬ４２からなる群から選択されるＨＳＶ遺伝子のうちの１つ以上を含む、請求項１２８に記載のパッケージングシステム。
【請求項１３０】
前記第１のベクターおよび前記第３のベクターが、第１のトランスフェクトプラスミド内に含まれる、請求項１２０〜１２９のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
【請求項１３１】
前記第２のベクターおよび前記第３のベクターの前記ヌクレオチドが、第２のトランスフェクトプラスミド内に含まれる、請求項１２０〜１２９のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
【請求項１３２】
前記第１のベクターおよび前記第３のベクターの前記ヌクレオチドが、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる、請求項１２０〜１２９のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
【請求項１３３】
前記第２のベクターおよび前記第３のベクターの前記ヌクレオチドが、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる、請求項１２０〜１２９のいずれか一項に記載のパッケージングシステム。
【請求項１３４】
ＡＡＶの組換え調製のための方法であって、前記修正ゲノムを前記カプシドに封入して前記ＡＡＶを形成するように作動可能である条件下で、請求項１１５〜１３３のいずれか一項に記載のパッケージングシステムを細胞内に導入することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月１８日出願の米国仮特許出願第６２／５７４，１６３号、および２０１８年１月２４日出願の同第６２／６２１，１０２号の利益を主張し、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、２０１８年１０月１２日に作成され、６０６１０７＿ＨＭＴ−０２３ＰＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられた、サイズが２００，６３０バイトの、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含む。配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
政府の権利に関する記述
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された助成番号Ｐ３０ＣＡ０３３５７２の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
異常ヘモグロビン症は、ヘモグロビンタンパク質の産生、構造、および／または機能が異常である遺伝性障害のファミリーに含まれる。ヘモグロビンタンパク質は、赤血球の乾燥重量のおよそ９７％を構成し、血液の酸素運搬能を約７０倍増加させる。主な成人ヘモグロビンタンパク質は、２つのアルファグロビン（ＨＢＡ）サブユニット、２つのベータグロビン（ＨＢＢ）サブユニット、および各サブユニットに関連するヘム基から構成される。染色体１１のＨＢＢにおける遺伝子欠損は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）およびベータサラセミアなどのある特定の異常ヘモグロビン症を引き起こす場合がある。
【０００５】
鎌状赤血球症は、鎌状赤血球貧血とも呼ばれ、およそ１００，０００人のアメリカ人が罹患している常染色体劣性遺伝疾患である。これは、アフリカ系アメリカ人の間で蔓延しているが、他の民族にも存在する。西および中央アフリカでは、全乳児の１〜２％がＳＣＤを持って生まれる。ＳＣＤは、ＨＢＢのコード配列のヌクレオチド２０のホモ接合変異によって引き起こされる。この変異は、成熟ベータグロビンの第６アミノ酸の負に帯電したアミノ酸グルタメート（ＧＡＧによってコードされる）を中性の疎水性残基バリン（ＧＵＧによってコードされる）に置き換える。ＳＣＤ変異を有するベータグロビン鎖を含むヘモグロビンは、赤血球の形状を歪め、これらの細胞を脆弱にし、三日月のような形または鎌状にする多重鎖ポリマーに凝集する傾向がある。これらの異常な赤血球は、より溶血する傾向があり、組織および臓器への酸素送達が少ない。さらに、ヘモグロビンの凝集により、赤血球が硬くなり、微小血管にとどまり、それにより、血流が減少し、血管閉塞を引き起こす。結果的に、ＳＣＤ患者は貧血および「クリーゼ」と呼ばれる痛みの発作に悩まされ、クリーゼ中の臓器損傷は、ＳＣＤに関連する死亡率および罹患率の主な原因である。特に、骨、脾臓、腎臓、および肺の梗塞（すなわち、不十分な血液供給による組織の壊死）が特に一般的である。対照的に、鎌状細胞変異がヘテロ接合の人は、主に無症状である。
【０００６】
全世界では１００，０００人の個人に約１人、欧州連合では１０，０００人に約１人がベータサラセミアに罹患している。ベータサラセミアは、ベータグロビンの発現を低減する、ＨＢＢにおける様々な変異によって引き起こされる疾患群である。今までに、置換、挿入、および欠失を含む８８４の異なる変異がベータサラセミアにおいて同定されている（ＨｂＶａｒデータベース）。これらの変異は、ＨＢＢのゲノム遺伝子座全体にわたって位置する。置換、挿入、および小さい欠失の中で、病原性変異型は、５’ＵＴＲの上流から３’ＵＴＲ内に見られる。これらの既知の８８４の変異に加えて、さらなる変異型は、ＨＢＢ配列の具体的な変化と組み合わせてのみ病原性であり得る。ベータサラセミア変異は、遺伝子転写、ＲＮＡプロセシング、転写後修飾、ｍＲＮＡの翻訳等に影響を及ぼし得る。ベータサラセミアは重症度の変動が大きく、ＨＢＢの変異はベータグロビン産生の完全な喪失をもたらす場合もあれば、ＨＢＢ変異は単にベータグロビンの量を低減させるのみの場合もある。しばしば両対立遺伝子にＨＢＢ変異（複数可）を有する重度のベータサラセミア（すなわち、重症型サラセミア）の患者は、貧血、発達遅延、および異常な臓器発達を患う。軽度から中程度のベータサラセミア（すなわち、軽症型サラセミアまたは中等症型サラセミア）の患者は、比較的軽度の症状を現す。
【０００７】
異常ヘモグロビン症は輸血および支持療法によって管理され、ＳＣＤおよび重症型ベータサラセミアは長期輸血を必要とする。しかしながら、輸血を繰り返すと鉄過剰となり、合併症の発生を低減するためにキレート療法が必要となる。ＳＣＤおよびベータサラセミアの罹患率および死亡率は、ＳＣＤの唯一のＦＤＡ承認薬物であるヒドロキシ尿素によって低下させることもできる。しかしながら、この治療は、その処方率が低く、コンプライアンスが悪いため広く使用されていない。
【０００８】
ＳＣＤまたはベータサラセミアを治癒させるために、患者は、適切に発現され得る少なくとも１つの機能性ベータヘモグロビンのコピーを保有する造血幹細胞を受け取る必要がある。アプローチの１つは、骨髄移植により同種ドナーから野生型造血幹細胞を得ることである。しかしながら、適合ドナーの利用可能性は主な制限要因であり、骨髄移植は、しばしば、５〜１０％の死亡率をもたらす重度の合併症に関係する。ごく最近になって、エクスビボでポリヌクレオチドを発現するベータグロビンを患者から単離した変異造血幹細胞内に導入するための、遺伝子療法アプローチが用いられている。
【０００９】
今まで、すべてのＨＢＢ遺伝子療法臨床試験は、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターの使用を伴ってきた。しかしながら、レトロウイルスベースの遺伝子療法は、いくつかの安全性および有効性の懸念をもたらす。例えば、レトロウイルスベクターのヒトゲノムへの挿入は標的化されないため、ベクターが腫瘍抑制遺伝子を破壊する、または癌遺伝子を活性化させ、それにより悪性腫瘍を引き起こすリスクがある。実際、ガンマレトロウイルスベクターでＣＤ３４＋骨髄前駆細胞を形質導入することによりＸ連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を治療するための臨床試験において、１０人の患者のうち４人が白血病を発症した（Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．（２００８）１１８（９）：３１３２−４２）。さらに、これらの安全性の懸念により、レンチウイルス遺伝子療法はエクスビボでのみ行うことができる。エクスビボ療法のために対象から抽出され得る造血幹細胞の数は対象に存在する造血幹細胞のほんのわずかでしかなく、エクスビボで造血幹細胞を拡大するための現在の臨床使用において信頼できる方法は存在しないため、このエクスビボでの使用では療法の有効性は低減される。
【００１０】
ヌクレアーゼベースの遺伝子編集技術、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）技術を使用して、ＳＣＤおよびベータサラセミア患者におけるＨＢＢ遺伝子の欠損を修正することが可能であるとも推測されている。しかしながら、これらの技術の各々は、意図される標的部位に配列が類似するヒトゲノムにおける部位のオフターゲット変異の可能性により、安全性の懸念をもたらす。
【００１１】
したがって、当該技術分野において、ＳＣＤおよびベータサラセミア患者のＨＢＢ遺伝子機能を効率かつ安全に回復させることができる遺伝子療法の組成物および方法の改善の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１２】
ＨＢＢ遺伝子における変異を修正するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）組成物、および細胞におけるＨＢＢ遺伝子変異を修正するためのその使用方法が本明細書で提供される。アデノ随伴ウイルス組成物を作製するためのパッケージングシステムも提供される。
【００１３】
本明細書に開示されるＡＡＶ組成物および方法は、外来性ヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９）を使用したゲノムＤＮＡの切断を必要とすることなく、インビボでＨＢＢ遺伝子の変異を非常に効率的に修正することができるという点で、特に有利である。
【００１４】
したがって、一態様では、本開示は、（ａ）ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと、（ｂ）（ｉ）標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、（ｉｉ）標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域に対して相同性を有する編集要素の５’の５’相同アームヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域に対して相同性を有する編集要素の３’の３’相同アームヌクレオチド配列を含む修正ゲノムとを含む、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。
【００１５】
別の態様では、本開示は、細胞におけるベータグロビン（ＨＢＢ）遺伝子の変異を修正するための方法を提供し、本方法は、細胞を、（ａ）ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと、（ｂ）（ｉ）（ｉ）標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、（ｉｉ）標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域に対して相同性を有する編集要素の５’の５’相同アームヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域に対して相同性を有する編集要素の３’の３’相同アームヌクレオチド配列を含む修正ゲノムとを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）で形質導入することを含み、細胞は、外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入または共投与することなく形質導入される。
【００１６】
ある特定の実施形態では、細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、哺乳類対象内にあり、ＡＡＶは、対象の細胞を形質導入するのに有効な量で、対象に投与される。
【００１７】
別の態様では、本開示は、ＨＢＢ遺伝子変異に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法を提供し、本方法は、（ａ）エクスビボで、対象由来の赤血球前駆細胞を、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと、（ｉ）標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、（ｉｉ）標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域に対して相同性を有する編集要素の５’の５’相同アームヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域に対して相同性を有する編集要素の３’の３’相同アームヌクレオチド配列を含む修正ゲノムとを含む複製欠損ＡＡＶで形質導入することと、（ｂ）形質導入された細胞を対象に投与することとを含み、細胞は、外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入または共投与することなく形質導入される。
【００１８】
ある特定の実施形態では、赤血球前駆細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、赤血球前駆細胞は、造血幹細胞である。ある特定の実施形態では、赤血球前駆細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である。
【００１９】
別の態様では、本開示は、ＨＢＢ遺伝子変異に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法を提供し、本方法は、対象に、（ａ）ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと、（ｂ）（ｉ）標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、（ｉｉ）標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域に対して相同性を有する編集要素の５’の５’相同アームヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域に対して相同性を有する編集要素の３’の３’相同アームヌクレオチド配列を含む修正ゲノムとを含む、有効量の複製欠損ＡＡＶを投与することを含み、細胞は、外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入または共投与することなく形質導入される。
【００２０】
ある特定の実施形態では、疾患または障害は、サラセミアまたは鎌状赤血球症である。ある特定の実施形態では、対象はヒト対象である。
【００２１】
以下の実施形態は、前述の態様の各々に適用される。
【００２２】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、ＨＢＢ遺伝子である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ＨＢＢ遺伝子におけるヌクレオチド点変異または欠失にある。ある特定の実施形態では、ＨＢＢ遺伝子におけるヌクレオチド点変異または欠失は、位置−８７のＧ、位置−３１のＧ、位置−３０のＡ、位置−２９のＧ、位置−２８のＧ、位置−１０のＴ、位置１のＣ、位置１のＡ、位置２のＧ、位置１７および１８のＣおよびＴの欠失、位置１９のＡ、位置２０のＡの欠失、位置２０のＴ、位置２５および２６のＡの欠失およびＡ、位置２６の後のＧの追加、位置４７のＡ、位置４８のＡ、位置５１のＣの欠失、位置５２のＡ、位置５８のＧ、位置５９のＧ、位置７９のＡ、位置８２のＴ、位置８４の後のＣの追加、位置９３のＴ、位置９３のＡ、位置９７のＣ、位置９８のＣ、位置２０２のＧ、位置２０８のＧ、位置２２２のＣ、位置２４１または２４２のＴの欠失、位置２５４〜２５７のＴの欠失ならびにＴおよびＣおよびＴ、位置２６０のＴ、位置２６４または２６５のＣの欠失、位置３４３の後のＡの追加、位置３９９および４００のＧおよびＴの欠失、位置４０１のＴ、位置４１７の後のＡの追加、位置４４６のＡ、位置１０９９のＴ、位置１２９３のＡ、位置１３４４のＴからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、編集要素は、変異に対応する野生型ＨＢＢ遺伝子の一部分を含む。
【００２３】
ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢ遺伝子の１つ以上のエクソンのコード領域を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢ遺伝子の１つ以上のエクソンのコード領域からなる。
【００２４】
ある特定の実施形態では、編集要素は、エクソン１のコード領域、イントロン１全体、エクソン２全体、イントロン２全体、およびエクソン３のコード領域を含むＨＢＢ遺伝子の一部分を含む。ある特定の実施形態では、コード領域は、野生型ＨＢＢ遺伝子の対応するエクソンに１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満同一であるように沈黙（ｓｉｌｅｎｔｌｙ）改変されている。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号４３〜４６および１０５〜１０７からなる群から選択されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ＡＡＶＳ１である。
【００２６】
ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢ遺伝子またはその一部分のコード配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号４８をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号４８をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２７のヌクレオチド４〜４４４からなる。ある特定の実施形態では、配列番号４８をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２７のヌクレオチド４〜４４４に７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％未満同一であるように沈黙改変されている。ある特定の実施形態では、配列番号４８をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４７または１００の配列からなる。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢ遺伝子のスタッファー挿入コード配列を含む。
【００２７】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、標的遺伝子のヌクレオチド３とヌクレオチド４との間のヌクレオチド間結合であり、それにより、標的遺伝子座の編集要素の組み込みは、標的遺伝子の開始コドンで始まるＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む標的遺伝子座をもたらす。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’に開始コドンおよび配列番号４８をコードするヌクレオチド配列からなるＨＢＢコード配列もしくはスタッファー挿入コード配列、またはＨＢＢコード配列もしくはスタッファー挿入コード配列の一部分を含む。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、標的遺伝子のイントロンにあり、編集要素は、５’から３’にスプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、およびＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ＨＢＢ遺伝子のイントロン１にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、標的遺伝子のコードヌクレオチドに隣接して３’にあり、編集要素は、５’から３’にリボソームスキッピング要素、およびＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列を含む。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、野生型標的遺伝子（例えば、ＨＢＢ遺伝子）の終止コドン、または変異標的遺伝子（例えば、ＨＢＢ遺伝子）の対応するヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、野生型標的遺伝子（例えば、ＨＢＢ遺伝子）の終止コドンに隣接して５’のヌクレオチド間結合、または変異標的遺伝子（例えば、ＨＢＢ遺伝子）の対応するヌクレオチド間結合である。
【００２８】
ある特定の実施形態では、５’相同アームヌクレオチド配列は、第１のゲノム領域に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。ある特定の実施形態では、３’相同アームヌクレオチド配列は、第２のゲノム領域に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。ある特定の実施形態では、第１のゲノム領域は第１の編集枠に位置し、第２のゲノム領域は第２の編集枠に位置する。ある特定の実施形態では、第１と第２の編集枠は異なる。ある特定の実施形態では、第１と第２の編集枠は同じである。ある特定の実施形態では、第１の編集枠は、配列番号１０１、１０２、または１０３に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第２の編集枠は、配列番号１０１、１０２、または１０３に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第１のゲノム領域は、配列番号１０１に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第２のゲノム領域は、配列番号１０２に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、５’相同アームは、配列番号１０１に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、３’相同アームは、配列番号１０２に記載のヌクレオチド配列からなる。
【００２９】
ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号４８をコードするヌクレオチド配列の３’の外来性ポリアデニル化配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、標的遺伝子に存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位をさらに含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号２３〜２８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
ある特定の実施形態では、５’および３’相同アームヌクレオチド配列の各々は、独立して、約１００〜約２０００ヌクレオチドの長さを有する。
【００３１】
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、５’相同アームヌクレオチド配列の５’の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、および３’相同アームヌクレオチド配列の３’の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号２０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、配列番号２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号２９〜４２および１０４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意に、配列番号２のアミノ酸２０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸は、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧである。
【００３３】
ある特定の実施形態では、（ａ）配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧである、（ｂ）配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭである、（ｃ）配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである、（ｄ）配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである、または（ｅ）配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣである。
【００３４】
ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意に、配列番号２のアミノ酸１５１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸１６０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＤであるか、配列番号２のアミノ酸２０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸は、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧである。
【００３６】
ある特定の実施形態では、（ａ）配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧである、（ｂ）配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭである、（ｃ）配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである、（ｄ）配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである、または（ｅ）配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣである。
【００３７】
ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意に、配列番号２のアミノ酸２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＴであるか、配列番号２のアミノ酸６５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸がＩであるか、配列番号２のアミノ酸６８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＶであるか、配列番号２のアミノ酸７７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸１１９に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＬであるか、配列番号２のアミノ酸１５１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸１６０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＤであるか、配列番号２のアミノ酸２０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸は、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧである。
【００３９】
ある特定の実施形態では、（ａ）配列番号２のアミノ酸２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＴであり、配列番号２のアミノ酸３１２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＱである、（ｂ）配列番号２のアミノ酸６５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであり、配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＹである、（ｃ）配列番号２のアミノ酸７７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＫである、（ｄ）配列番号２のアミノ酸１１９に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＬであり、配列番号２のアミノ酸４６８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＳである、（ｅ）配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸がＧである、（ｆ）配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭである、（ｇ）配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸がＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである、（ｈ）配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである、または（ｉ）配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣである。
【００４０】
ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶを、標準的なＡＡＶ形質導入条件下で、ＣＤ３４＋ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、標的遺伝子座への編集要素の組み込み効率は、少なくとも１％である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶを、標準的なＡＡＶ形質導入条件下で、ＣＤ３４＋ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、標的遺伝子座への編集要素の組み込みの対立遺伝子頻度は、少なくとも０．５％である。
【００４２】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶを含む医薬組成物を提供する。
【００４３】
別の態様では、本開示は、ＡＡＶの組換え調製のためのパッケージングシステムを提供し、パッケージングシステムは、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（ａ）１つ以上のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質をコードするＲｅｐヌクレオチド配列と、（ｂ）本明細書に記載される１つ以上のＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質をコードするＣａｐヌクレオチド配列と、（ｃ）本明細書に開示される修正ゲノムとを含み、パッケージングシステムは、修正ゲノムをカプシドに封入してＡＡＶを形成するために細胞内で作動可能である。
【００４４】
ある特定の実施形態では、パッケージングシステムは、Ｒｅｐヌクレオチド配列およびＣａｐヌクレオチド配列を含む第１のベクターと、修正ゲノムを含む第２のベクターとを含む。ある特定の実施形態では、Ｒｅｐヌクレオチド配列は、ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質は、７８／６８またはＲｅｐ６８／５２である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質は、配列番号２２のＡＡＶ２  Ｒｅｐアミノ酸配列に対して最小パーセント配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、最小パーセント配列同一性は、ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質をコードするアミノ酸配列の長さにわたって少なくとも７０％である。
【００４５】
ある特定の実施形態では、パッケージングシステムは、第３のベクターをさらに含み、第３のベクターは、ヘルパーウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは、独立した第３のベクターである。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは、第１のベクターと統合される。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは、第２のベクターと統合される。ある特定の実施形態では、第３のベクターは、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００４６】
ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルスである。ある特定の実施形態では、アデノウイルスゲノムは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、およびＶＡからなる群から選択される１つ以上のアデノウイルスＲＮＡ遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）である。ある特定の実施形態では、ＨＳＶゲノムは、ＵＬ５／８／５２、ＩＣＰＯ、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、およびＵＬ３０／ＵＬ４２からなる群から選択されるＨＳＶ遺伝子のうちの１つ以上を含む。
【００４７】
ある特定の実施形態では、第１のベクターおよび第３のベクターは、第１のトランスフェクトプラスミド内に含まれる。ある特定の実施形態では、第２のベクターおよび第３のベクターのヌクレオチドは、第２のトランスフェクトプラスミド内に含まれる。ある特定の実施形態では、第１のベクターおよび第３のベクターのヌクレオチドは、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる。ある特定の実施形態では、第２のベクターおよび第３のベクターのヌクレオチドは、組換えヘルパーウイルスにクローニングされる。
【００４８】
別の態様では、本開示は、ＡＡＶの組換え調製のための方法を提供し、本方法は、修正ゲノムをカプシドに封入してＡＡＶを形成するように作動可能である条件下で、本明細書に記載されるパッケージングシステムを細胞内に導入することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１ＡＢ】ＧＭ１６２６５細胞のゲノムへのＡＡＶＳ１−ＦＰの組み込みのフローサイトメトリーの結果を示すグラフであり、ＡＡＶＳ１−ＦＰベクターは、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ１５、およびＡＡＶＨＳＣ１７にパッケージングされた。
【図１Ｃ】ＡＡＶＨＳＣ１７カプシドにパッケージングされたＡＡＶＳ１−ＦＰベクターで形質導入された初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）におけるＦＰコード配列の組み込みを有する対立遺伝子の割合を示すグラフである。
【図２】１２ｂｐのリンカーを含むＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４のプラスミドマップを示す。この図では、ＨＢＢの黒い領域は、ヒトＨＢＢタンパク質をコードするエクソンのヌクレオチド配列を表し、黒い領域間の破線は、エクソン間のイントロンを表す。
【図３Ａ】ＡＡＶＨＳＣ１５およびＡＡＶＨＳＣ１７カプシドにパッケージングされたｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ベクターで形質導入されたＧＭ１６２６５細胞のゲノムＤＮＡから増幅したＤＮＡの編集特異的サイズを示すＤＮＡ電気泳動の画像である。
【図３Ｂ】ＡＡＶＨＳＣ１７カプシドにパッケージングされたｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ベクターで形質導入されたＧＭ１６２６５、ＧＭ１６２６６、およびＧＭ１６２６７ＬＣＬのゲノムＤＮＡから増幅したＤＮＡの編集特異的サイズを示すＤＮＡ電気泳動の画像である。
【図４】それぞれ、ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬ−００１、ｈＨＢＢ−ｈＬＷ−０１３、ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１１、およびｈＨＢＢ−ｈＬＷ−０１２の２つのＡＡＶ  ＩＴＲ間の遺伝要素を示すベクターマップである。これらの図では、ＨＢＢの黒い領域は、ヒトＨＢＢタンパク質をコードするエクソンのヌクレオチド配列を表し、黒い領域間の破線は、エクソン間のイントロンを表す。
【図５】ＡＡＶＨＳＣ１７カプシドにパッケージングされた図に示されるベクターで形質導入された、初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣのゲノムＤＮＡから増幅したＤＮＡの編集特異的サイズを示すＤＮＡ電気泳動の画像である。
【図６】示される試料にわたって、編集されたＣＤ３４＋細胞の画分を示すグラフである。
【図７】それぞれ、ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＡ−００９、ｈＨＢＢ−ｈＡＷ−００２、ｈＨＢＢ−ｈ１−０１０、ｈＨＢＢ−ｈ１Ｗ−００８、およびｈＨＢＢ−ｈＥ３Ｃ−００１の２つのＡＡＶ  ＩＴＲ間の遺伝要素を示すベクターマップである。図７Ａ〜Ｄでは、「ＨＢＢコード領域」または「ＨＢＢコード領域（６６％）」と表示される黒い領域は、開始コドンから終止コドン（図７Ｃおよび７Ｄ）、または第２のコドンから終止コドン（図７および７Ｂ）までのいずれかのヒトＨＢＢタンパク質をコードするヌクレオチド配列を表す。
【図８】ＡＡＶＨＳＣ７カプシドにパッケージングされた図に示されるベクターで形質導入されたＲＫＯおよびＧＭ１６２６５ＬＣＬ細胞のゲノムＤＮＡから増幅されたＤＮＡの編集特異的サイズ（１，８７４ｂｐ）および非特異的サイズ（１，１８０ｂｐ）を示すＤＮＡ電気泳動の画像である。
【図９】ＡＡＶＨＳＣ７およびＡＡＶＨＳＣ１７カプシドにパッケージングされたＡＡＶＳ１−ＦＰベクターの投与後、ヒトＨＳＣで異種移植されたＮＳＧマウス由来の血液、骨髄（「ＢＭ」）、および脾臓細胞におけるＦＰコード配列の組み込みを有する対立遺伝子の割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本開示は、ＨＢＢ遺伝子における変異を修正するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）組成物、および細胞におけるＨＢＢ遺伝子変異を修正するためのその使用方法を提供する。アデノ随伴ウイルス組成物を作製するためのパッケージングシステムも提供される。
【００５１】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「複製欠損アデノ随伴ウイルス」という用語は、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を欠くゲノムを含むＡＡＶを指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ＨＢＢ遺伝子」という用語は、野生型または変異ヒトベータグロビン遺伝子を指し、ＨＢＢ遺伝子のコード領域、エクソン、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および転写調節領域を含むがこれらに限定されない。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「ＨＢＢ遺伝子における変異の修正」という用語は、野生型ＨＢＢタンパク質またはその機能等価物を発現することができる遺伝子座を創出するために、標的遺伝子（例えば、変異ＨＢＢ遺伝子）の標的遺伝子座での１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を指す。ある特定の実施形態では、「ＨＢＢ遺伝子における変異の修正」は、ＨＢＢ遺伝子の変異を野生型配列に戻すことを伴う。ある特定の実施形態では、「ＨＢＢ遺伝子における変異の修正」は、任意に、内在性標的遺伝子プロモーター（例えば、ＨＢＢ遺伝子プロモーター）の制御下で、野生型ベータグロビンタンパク質またはその機能等価物が標的遺伝子の遺伝子座（例えば、変異ＨＢＢ遺伝子の遺伝子座）から発現されるように、野生型ベータグロビンタンパク質またはその機能等価物の少なくとも一部分をコードするヌクレオチド配列を標的遺伝子（例えば、変異ＨＢＢ遺伝子）に挿入することを伴う。本明細書で使用される場合、「機能等価物」は、野生型ベータグロビンとして機能することができる遺伝子またはその断片の産物を指す。ある特定の実施形態では、ＨＢＢの機能等価物は、エプシロングロビン（ＨＢＥ）、デルタグロビン（ＨＢＤ）、ガンマグロビン１（ＨＢＧ１）、ガンマグロビン２（ＨＢＧ２）、およびＨＢＢ偽遺伝子ＨＢＢＰなどの他のグロビン遺伝子または偽遺伝子を含み得る。ある特定の実施形態では、ＨＢＢの機能等価物は、修飾されたベータグロビンタンパク質であってよく、修飾は、野生型ベータグロビンに見られない少なくとも１つの特徴、例えば、ＳＣＤ変異を保有するベータグロビンの凝集を阻害する能力を付与する。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「修正ゲノム」という用語は、相同組換えにより編集要素（例えば、１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合）を標的遺伝子座に組み込み、ＨＢＢ遺伝子の遺伝子欠損を修正することができる組換えＡＡＶゲノムを指す。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ヒトＨＢＢ遺伝子にある。当業者は、５’相同アーム、編集要素、および３’相同アームを含む修正ゲノムの一部分が標的遺伝子座（例えば、ヒトＨＢＢ遺伝子）に対してセンスまたはアンチセンス配向にあってもよいことを理解するであろう。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「編集要素」という用語は、標的遺伝子座に組み込まれたとき、標的遺伝子座を修飾する修正ゲノムの一部分を指す。編集要素は、標的遺伝子座における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を媒介することができる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「標的遺伝子座」という用語は、編集要素によって修飾される染色体またはヌクレオチド間結合の領域を指す。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ＨＢＢ遺伝子のある領域またはヌクレオチド間結合であり、任意に、標的遺伝子座は、ベータグロビンタンパク質の発現または機能を損なう少なくとも１つの遺伝子変異を含む。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ＡＡＶＳ１である。ＡＡＶＳ１遺伝子座は、Ｇｉｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（１９９４）９１（２１）：１００３９−４３、Ｌｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（１９９６）９３（２１）：１１２８８−９４、およびＬｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（１９９６）９３（１５）：７９６６−７２（それらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、染色体１９  ｑｔｅｒ１３．３〜１３．４、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＣ＿００００１９．１０のヌクレオチド５５，０９０，９１３〜５５，１１７，６００上にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。セーフハーバー遺伝子座は、新しく挿入された遺伝子材料が、（１）予想通りに機能する、かつ（２）宿主細胞または生物にリスクを生じさせる可能性がある宿主ゲノムの変化を引き起こさないことを確実にする方法で、新しい遺伝子材料の組み込みを順応させることができるゲノムの部位である。したがって、ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、宿主ゲノムとの望ましくない相互作用のリスクを最小限に抑えながら、予想可能な導入遺伝子発現を支持することができる当該技術分野で既知の任意のセーフハーバー遺伝子座であり得る。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」という用語は、標的遺伝子座またはその一部分が位置する遺伝子を指す。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、完全に標的遺伝子にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、ＨＢＢである。ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、ヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃである。ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、赤血球前駆細胞において発現される。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「相同アーム」という用語は、標的遺伝子座に隣接するゲノムに実質的に同一である編集要素の５’または３’に位置付けられる修正ゲノムの一部分を指す。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ヒトＨＢＢ遺伝子にあり、相同アームは、標的遺伝子座に隣接するゲノムに実質的に同一である配列を含む。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「クレードＦカプシドタンパク質」という用語は、それぞれ、本明細書の配列番号１のアミノ酸１〜７３６、１３８〜７３６、および２０３〜７３６に記載のＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間の同一性は、合致する同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数を完全長のより長いヌクレオチドまたはアミノ酸配列で除することによって決定される。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「ＨＢＢ遺伝子変異と関連する疾患または障害」という用語は、ＨＢＢ遺伝子の変化によって引き起こされる、それにより悪化する、またはそれと遺伝的に関連付けられる任意の疾患または障害を指す。ある特定の実施形態では、ＨＢＢ遺伝子変異と関連する障害または疾患は、異常ヘモグロビン症、例えば、鎌状赤血球症またはベータサラセミアである。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「沈黙改変された」という用語は、コード配列またはスタッファー挿入コード配列によってコードされるポリヌクレオチドのアミノ酸配列を変更することなく、遺伝子のコード配列またはスタッファー挿入コード配列を改変すること（例えば、ヌクレオチド置換により）を指す。そのような沈黙改変は、標的遺伝子にパラロガスな他の遺伝子または偽遺伝子の遺伝子座（例えば、別のグロビン遺伝子の遺伝子座またはベータグロビン偽遺伝子の遺伝子座）への修正ゲノムの組み込みの可能性を低減するという点で有利である。そのような沈黙改変は、編集要素と標的遺伝子との間の相同性も低減し、それにより、相同アームによってではなく編集要素によって媒介される望ましくない組み込みを低減する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「コード配列」という用語は、開始コドンで始まり、終止コドンで終わるポリペプチドをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の一部分またはその沈黙改変された配列を指す。遺伝子は、選択的スプライシングおよび／または選択的翻訳開始により、１つ以上の野生型コード配列を有し得る。例示的な野生型ＨＢＢコード配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００５１８．４のヌクレオチド５１〜４９４に記載されている。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「コードヌクレオチド」という用語は、終止コドンの３’ヌクレオチドを除く、遺伝子のコード配列のヌクレオチドに対応する遺伝子のヌクレオチドを指す。したがって、ある特定の実施形態では、ＨＢＢ遺伝子のコードヌクレオチドは、ＨＢＢ遺伝子のヌクレオチド１〜４４３のいずれか１つである。
【００６４】
本明細書で使用される場合、遺伝子の「スタッファー挿入コード配列」という用語は、遺伝子のコード配列に挿入された１つ以上のイントロンを含むヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、非天然のイントロン、すなわち、遺伝子の天然イントロンとは異なる配列を有する。ある特定の実施形態では、スタッファー挿入コード配列のイントロンのすべてが非天然イントロンである。非天然イントロンは、異なる種由来のイントロンの配列、または同じ種由来の異なる遺伝子のイントロンの配列を有し得る。代替的にまたは加えて、非天然イントロン配列の少なくとも一部分は合成であり得る。当業者は、非天然イントロン配列が当該技術分野で既知の任意のコンセンサススプライシングモチーフを導入することによりＲＮＡスプライシングを媒介するように設計され得ることを理解するであろう。例示的なコンセンサススプライシングモチーフは、Ｓｉｂｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７，４０７−２１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に提供されている。スタッファー配列は、ベクターが最適なサイズ（例えば、４．５〜４．８ｋｂ）に達するための調整を可能にするため、非天然イントロンの挿入は、ベクターパッケージングの効率および頑健性を促進し得る。ある特定の実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、遺伝子の天然イントロンである。ある特定の実施形態では、スタッファー挿入コード配列のイントロンのすべてが遺伝子の天然イントロンである。非天然または天然イントロンは、コード配列の任意のヌクレオチド間結合に挿入することができる。ある特定の実施形態では、１つ以上の非天然または天然イントロンが、効率的なスプライシングを促進すると予想されるヌクレオチド間結合に挿入される（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｔｉｃｓ，７（５）：９１９−３２を参照されたい）。ある特定の実施形態では、１つ以上の非天然または天然イントロンは、２つの内在性エクソンを連結するヌクレオチド間結合に挿入される。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「リボソームスキッピング要素」という用語は、１つのｍＲＮＡ分子の翻訳から２つのペプチド鎖を生成させることができる短いペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される場合、「リボソームスキッピングペプチド」という用語は、リボソームスキッピング要素によってコードされるペプチドを指す。ある特定の実施形態では、リボソームスキッピングペプチドは、Ｘ１Ｘ２ＥＸ３ＮＰＧＰのコンセンサスモチーフを含み、ここで、Ｘ１はＤまたはＧであり、Ｘ２はＶまたはＩであり、Ｘ３は任意のアミノ酸（配列番号４９）である。ある特定の実施形態では、リボソームスキッピングペプチドは、ｔｈｏｓｅａ−ａｓｉｇｎａウイルス２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、ブタテシオウイルス−１  ２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａペプチド（ＢｍＣＰＶ  ２Ａ）、およびＢ．ｍｏｒｉの軟化病ウイルス２Ａペプチド（ＢｍＩＦＶ  ２Ａ）からなる群から選択される。Ｔ２ＡペプチドおよびＰ２Ａペプチドの例示的なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７１および７３に記載されている。Ｔ２Ａ要素およびＰ２Ａ要素の例示的なヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号７２および７４に記載されている。ある特定の実施形態では、リボソームスキッピング要素は、Ｎ末端にＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙの配列をさらに含むペプチドをコードし、任意に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙの配列は、ＧＧＣＡＧＣＧＧＡ（配列番号７５）のヌクレオチド配列によってコードされる。理論によって拘束されることを望むものではないが、リボソームスキッピング要素は、第１のペプチド鎖の翻訳を終結させ、第２のペプチド鎖の翻訳を再度開始させることによって、またはコードされたペプチドの内因性プロテアーゼ活性により、もしくは環境中の別のプロテアーゼにより（例えば、サイトゾル）リボソームスキッピングペプチドのペプチド結合を切断することによって機能すると仮定される。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化配列」という用語は、ＲＮＡに転写されたとき、ポリアデニル化シグナル配列を構築するＤＮＡ配列を指す。
【００６７】
本開示において、遺伝子のヌクレオチド位置は、開始コドンの第１のヌクレオチドに対して指定される。開始コドンの第１のヌクレオチドは位置１であり、開始コドンの第１のヌクレオチドの５’のヌクレオチドは負の数を有し、開始コドンの第１のヌクレオチドの３’のヌクレオチドは正の数を有する。例えば、本明細書で使用されるＨＢＢ遺伝子のヌクレオチド１は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０００００７．３のヌクレオチド７０，５９５である。開始コドンに隣接して５’のヌクレオチドは、ヌクレオチド−１である。
【００６８】
本開示において、遺伝子のエクソンおよびイントロンは、開始コドンの第１のヌクレオチドを包含するエクソンに対して指定される。開始コドンの第１のヌクレオチドを包含するエクソンは、エクソン１である。エクソン１の３’のエクソンは、５’から３’に、エクソン２、エクソン３等である。エクソン１の３’のイントロンは、５’から３’に、イントロン１、イントロン２等である。したがって、遺伝子は、５’から３’に、エクソン１、イントロン１、エクソン２、イントロン２、エクソン３等を含む。ヒトＨＢＢ遺伝子の例示的なエクソン１は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０００００７．３のヌクレオチド７０，５４５〜７０，６８６である。ヒトＨＢＢ遺伝子の例示的なイントロン１は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０００００７．３のヌクレオチド７０，６８７〜７０，８１６である。当業者は、遺伝子が複数の異なるｍＲＮＡに転写され得ることを理解するであろう。そのため、遺伝子（例えば、ＨＢＢ）は、複数の異なるセットのエクソンおよびイントロンを有し得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「組み込み」という用語は、修正ゲノムと標的遺伝子との間の相同組換えにより、編集要素を標的遺伝子座に導入することを指す。編集要素の組み込みは、標的遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、および／または欠失をもたらし得る。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「標的遺伝子座への編集要素の組み込み効率」という用語は、標的遺伝子座への編集要素の組み込みが生じた形質導入された集団の細胞の割合を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「標的遺伝子座への編集要素の対立遺伝子頻度」という用語は、標的遺伝子座への編集要素の組み込みが生じた形質導入された細胞の集団の対立遺伝子の割合を指す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「標準的なＡＡＶ形質導入条件」という用語は、１．５×１０５の感染多重度（ＭＯＩ）のＡＡＶで２×１０５ＣＤ３４＋ヒト幹細胞を形質導入することを指し、細胞は、５％の二酸化炭素（ＣＯ２）のインキュベータ環境中で、３７℃で２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６、および１ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦで補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で培養され、ＡＡＶは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に配合され、ＡＡＶは、培養培地の体積の９分の１以下の体積でＣＤ３４＋細胞を含む細胞培養培地に添加される。
【００７３】
本明細書で使用される場合、ＡＡＶを対象に投与する文脈において、「有効量」という用語は、所望の予防または治療効果を達成するＡＡＶの量を指す。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「赤血球前駆細胞」という用語は、赤血球に分化することができる細胞を指す。ある特定の実施形態では、赤血球前駆細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、赤血球前駆細胞は、誘導多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、赤血球前駆細胞は、造血幹細胞である。ある特定の実施形態では、赤血球前駆細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である。ある特定の実施形態では、赤血球前駆細胞は、骨髄球系前駆細胞である。ある特定の実施形態では、赤血球前駆細胞は、巨核球・赤芽球前駆細胞である。ある特定の実施形態では、赤血球前駆細胞は、赤芽球前駆細胞である。
【００７５】
ＩＩ．アデノ随伴ウイルス組成物
一態様では、本開示は、ＨＢＢ遺伝子における変異を修正するのに有用な新規複製欠損ＡＡＶ組成物を提供する。本明細書に開示されるＡＡＶは一般に、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドと、ＨＢＢ遺伝子の標的遺伝子座を編集するための修正ゲノムとを含む。
【００７６】
任意のＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質またはその誘導体は、本明細書に開示されるＡＡＶ組成物において使用することができる。例えば、ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸２０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸は、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸がＧである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列を含む。
【００７７】
例えば、ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸１５１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸１６０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＤであるか、配列番号２のアミノ酸２０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸は、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列を含む。
【００７８】
例えば、ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＴであるか、配列番号２のアミノ酸６５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであるか、配列番号２のアミノ酸６８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＶであるか、配列番号２のアミノ酸７７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸１１９に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＬであるか、配列番号２のアミノ酸１５１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸１６０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＤであるか、配列番号２のアミノ酸２０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであるか、配列番号２のアミノ酸３１２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＱであるか、配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであるか、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであるか、配列番号２のアミノ酸４６８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＳであるか、配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであるか、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸５９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸は、ＧまたはＹであるか、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭであるか、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであるか、配列番号２のアミノ酸６９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＫであるか、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣであるか、または配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＴであり、配列番号２のアミノ酸３１２に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＱである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸６５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであり、配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＹである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸７７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６９０に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＫである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸１１９に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＬであり、配列番号２のアミノ酸４６８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＳである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸６２６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧであり、配列番号２のアミノ酸７１８に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＧである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸２９６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＨであり、配列番号２のアミノ酸４６４に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＮであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６８１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＭである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸６８７に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸３４６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＡであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲである。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸５０１に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＩであり、配列番号２のアミノ酸５０５に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＲであり、配列番号２のアミノ酸７０６に対応するカプシドタンパク質のアミノ酸はＣである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列を含む。
【００７９】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、（ａ）配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、（ｂ）配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質のうちの２つ以上を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、（ａ）配列番号２、３、４、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸２０３〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質、（ｂ）配列番号２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１３８〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、または１７のアミノ酸１〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質を含む。
【００８０】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、（ａ）配列番号８のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号８のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、（ａ）配列番号８のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号８のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質のうちの２つ以上を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、（ａ）配列番号８のアミノ酸２０３〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸１３８〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号８のアミノ酸１〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質を含む。
【００８１】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質のうちの２つ以上を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸２０３〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１３のアミノ酸１３８〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸１〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質を含む。
【００８２】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１〜７３６のアミノ酸配列を含むクレードＦカプシドタンパク質のうちの２つ以上を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸２０３〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質、（ｂ）配列番号１６のアミノ酸１３８〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質、および（ｃ）配列番号１６のアミノ酸１〜７３６からなるアミノ酸配列を有するクレードＦカプシドタンパク質を含む。
【００８３】
本明細書に開示されるＡＡＶ組成物に有用な修正ゲノムは一般に、（ｉ）標的遺伝子における標的遺伝子座を編集するための編集要素、（ｉｉ）標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域に対して相同性を有する編集要素の５’の５’相同アームヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域に対して相同性を有する編集要素の３’の３’相同アームヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、５’相同アームヌクレオチド配列の５’の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、および３’相同アームヌクレオチド配列の３’の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
本明細書に開示される修正ゲノムに使用される編集要素は、標的遺伝子座における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を媒介することができる。標的遺伝子座は、赤血球前駆細胞において発現されるＨＢＢ遺伝子または別の遺伝子であり得る、標的遺伝子に完全にまたは部分的に位置し得る。
【００８５】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に相同組換えによって正しく組み込まれた場合、編集要素は、ＨＢＢ遺伝子における変異を修正して、野生型ＨＢＢ配列または野生型ＨＢＢタンパク質もしくはその機能等価物をコードする沈黙改変された配列に戻す。ＨＢＢ遺伝子における大半の変異は、本明細書に開示される編集要素によって修正することができる。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢ遺伝子における置換または欠失変異を修正する１つ以上のヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢ遺伝子における挿入変異を削除するヌクレオチド間結合である。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢ遺伝子の１つ以上のコードエクソンを含む。例えば、編集要素は、エクソン１のコード領域、イントロン１全体、エクソン２全体、イントロン２全体、およびエクソン３のコード領域を包含するＨＢＢ遺伝子の一部分を含み得る。エクソンは、本明細書に開示される野生型であるか、または沈黙改変され得る。
【００８６】
ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢ遺伝子のコード配列またはスタッファー挿入コード配列の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢ遺伝子のコード配列またはスタッファー挿入コード配列のすべて、または実質的にすべてを含む。例えば、ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢコード配列のヌクレオチド４〜４４４、またはヌクレオチド４から終止コドンのＨＢＢスタッファー挿入コード配列の一部分を含み、任意に、ＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列の一部分の３’の外来性ポリアデニル化配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号４８をコードするヌクレオチド配列を含み、任意に、配列番号４８をコードするヌクレオチド配列の３’の外来性ポリアデニル化配列をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、そのような編集要素は、相同組換えによりＨＢＢ遺伝子の内在性開始コドンの直後のエクソン１（例えば、ＨＢＢ遺伝子のヌクレオチド３とヌクレオチド４との間）に組み込むことができ、それにより、編集要素の組み込みは、内在性ＨＢＢ遺伝子の開始コドンとインフレームの完全なＨＢＢコード配列の生成をもたらす。ある特定の実施形態では、そのような編集要素は、相同組換えにより非ＨＢＢ遺伝子の内在性開始コドンの直後のエクソン１（例えば、標的遺伝子のヌクレオチド３とヌクレオチド４との間）に組み込むことができ、それにより、編集要素の組み込みは、内在性標的遺伝子の開始コドンとインフレームの完全なＨＢＢコード配列の生成をもたらす。編集要素のＨＢＢコード配列の一部分は、本明細書に開示される野生型であるか、または沈黙変異され得る。編集要素によりコードされるＨＢＢアミノ酸配列の一部分は、野生型またはその機能等価物であり得る。
【００８７】
ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列（例えば、完全なＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列）の少なくとも一部分、およびリボソームスキッピング要素または外来性ポリアデニル化配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’にリボソームスキッピング要素、およびＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列（例えば、完全なＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列）の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、５から３’にリボソームスキッピング要素、完全なＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列、および外来性ポリアデニル化配列を含む。ある特定の実施形態では、前述の編集要素は、相同組換えにより標的遺伝子のコードヌクレオチドに隣接して３’に（例えば、天然ＨＢＢ遺伝子の終止コドンに隣接して５’に）組み込まれて、５’から３’にコードヌクレオチドで終わる標的遺伝子の５’部分、リボソームスキッピング要素、完全なＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列、および外来性ポリアデニル化配列を含む組換え標的遺伝子を産生することができ、リボソームスキッピング要素は、標的遺伝子のコード領域および完全なＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列とインフレームであるように位置付けられる。この組換え標的遺伝子の発現は、コードされたリボソームスキッピングペプチドの第１の部分に融合した標的遺伝子のＮ末端部分によりコードされるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および完全なＨＢＢアミノ酸配列に融合したコードされたリボソームスキッピングペプチド（例えば、単一のプロリン残基）の第２の部分を含む第２のポリペプチドを産生する。編集要素のＨＢＢコード配列またはＨＢＢスタッファー挿入コード配列のコード領域は、本明細書に開示される野生型であるか、または沈黙変異され得る。編集要素によりコードされるＨＢＢアミノ酸配列は、野生型またはその機能等価物（例えば、第１のメチオニンを欠く）であり得る。標的遺伝子座は、標的遺伝子のコードヌクレオチドに隣接して３’のヌクレオチド間結合またはヌクレオチド配列であり得る。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ＨＢＢ遺伝子の天然の終止コドンからなる。
【００８８】
ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列（例えば、完全なＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列）の少なくとも一部分、ならびにスプライスアクセプター部位、スプライスドナー部位、リボソームスキッピング要素、および外来性ポリアデニル化配列のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’にスプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、およびＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列（例えば、完全なＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列）の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、５から３’にスプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、完全なＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列、および外来性ポリアデニル化配列を含む。ある特定の実施形態では、前述の編集要素は、相同組換えにより標的遺伝子のイントロン（例えば、内在性ＨＢＢ遺伝子のイントロン１）に組み込まれて、５’から３’に標的遺伝子のイントロンの５’の１つ以上のエクソン、内在性スプライスドナー部位を含むイントロンの５’部分、スプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、完全なＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列、および外来性ポリアデニル化配列を含む組換えＨＢＢ遺伝子を産生することができ、リボソームスキッピング要素は、完全なＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列とインフレームであるように、かつ標的遺伝子の内在性スプライスドナー部位へのスプライスアクセプター部位のスプライシングが標的遺伝子のコード領域とインフレームにそれを配置するように位置付けられる。この組換え標的遺伝子の発現は、コードされたリボソームスキッピングペプチドの第１の部分に融合した挿入部位の５’の内在性エクソン（複数可）によりコードされる標的遺伝子アミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および完全なＨＢＢアミノ酸配列に融合したコードされたリボソームスキッピングペプチド（例えば、単一のプロリン残基）の第２の部分を含む第２のポリペプチドを産生する。編集要素のＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列は、本明細書に開示される野生型であるか、または沈黙変異され得る。編集要素によりコードされるＨＢＢアミノ酸配列は、野生型またはその機能等価物（例えば、第１のメチオニンを欠く）であり得る。標的遺伝子座は、標的遺伝子のイントロンのヌクレオチドに隣接して３’のヌクレオチド間結合またはヌクレオチド配列であり得る。
【００８９】
ある特定の実施形態では、編集要素内のＨＢＢコード配列またはスタッファー挿入コード配列の１つ以上の部分は、野生型ＨＢＢ遺伝子の対応するエクソンに対して非同一であるように沈黙改変され得る。そのような沈黙改変は、他のグロビン遺伝子または偽遺伝子の遺伝子座、例えば、ベータグロビン偽遺伝子の遺伝子座への修正ゲノムの組み込みの可能性を低減するという点で有利である。そのような沈黙改変は、編集要素と標的遺伝子との間の相同性も低減し、それにより、相同アームによってではなく編集要素によって媒介される望ましくない組み込みを低減する。
【００９０】
したがって、ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢ遺伝子のエクソンの対応するコード領域に１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるように沈黙改変されているＨＢＢ遺伝子の１つ以上のエクソンのコード領域を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢ遺伝子のエクソンの対応するコード領域に対して７０％未満同一であるように沈黙改変されているＨＢＢ遺伝子の１つ以上のエクソンのコード領域を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢ遺伝子のエクソンの対応するコード領域に対して８５％未満同一であるように沈黙改変されているＨＢＢ遺伝子の１つ以上のエクソンのコード領域を含む。
【００９１】
ある特定の実施形態では、編集要素は、エクソン１のコード領域、イントロン１全体、エクソン２全体、イントロン２全体、およびエクソン３のコード領域を包含するＨＢＢ遺伝子の一部分を含み、エクソン１のコード領域、エクソン２全体、およびエクソン３のコード領域のうちの１つ以上は、野生型ＨＢＢ遺伝子のエクソンの対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるように沈黙改変されている。ある特定の実施形態では、編集要素は、エクソン１のコード領域、イントロン１全体、エクソン２全体、イントロン２全体、およびエクソン３のコード領域を包含するＨＢＢ遺伝子の一部分を含み、エクソン１のコード領域、エクソン２全体、およびエクソン３のコード領域のうちの１つ以上は、野生型ＨＢＢ遺伝子のエクソンの対応する領域に対して７０％未満同一であるように沈黙改変されている。
【００９２】
ある特定の実施形態では、編集要素は、エクソン１のコード領域、イントロン１全体、エクソン２全体、イントロン２全体、およびエクソン３のコード領域を包含するＨＢＢ遺伝子の一部分を含み、エクソン１のコード領域、エクソン２全体、およびエクソン３のコード領域の各１つは、野生型ＨＢＢ遺伝子のエクソンの対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるように沈黙改変されている。ある特定の実施形態では、編集要素は、エクソン１のコード領域、イントロン１全体、エクソン２全体、イントロン２全体、およびエクソン３のコード領域を包含するＨＢＢ遺伝子の一部分を含み、エクソン１のコード領域、エクソン２全体、およびエクソン３のコード領域の各１つは、野生型ＨＢＢ遺伝子のエクソンの対応する領域に対して７０％未満同一であるように沈黙改変されている。
【００９３】
ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号４３〜４６および１０５〜１０７からなる群から選択されるヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号４３〜４６および１０５〜１０７からなる群から選択されるヌクレオチド配列のうちの２つ以上を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号４６に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号４３、４４、および４５に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号１０５、１０６、および１０７に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００９４】
ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるように沈黙改変されているＨＢＢコード配列の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して７０％未満同一であるように沈黙改変されているＨＢＢコード配列の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して８５％未満同一であるように沈黙改変されているＨＢＢコード配列の少なくとも一部分を含む。
【００９５】
ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列の少なくとも一部分が野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一のコード配列に転写およびスプライスされ得るように、沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列の少なくとも一部分が野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して７０％未満同一のコード配列に転写およびスプライスされ得るように、沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列の少なくとも一部分が野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して８５％未満同一のコード配列に転写およびスプライスされ得るように、沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列の少なくとも一部分を含む。
【００９６】
ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）であるように沈黙改変されているＨＢＢコード配列のヌクレオチド４〜４４４を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して７０％未満同一であるように沈黙改変されているＨＢＢコード配列のヌクレオチド４〜４４４を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号４７に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して８５％未満同一であるように沈黙改変されているＨＢＢコード配列のヌクレオチド４〜４４４を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号１００に記載のヌクレオチド配列を含む。そのような編集要素は、ＨＢＢ遺伝子コード配列の３’の外来性ポリアデニル化配列をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’にＨＢＢコード配列のヌクレオチド４〜４４４および外来性ポリアデニル化配列を含み、ＨＢＢコード配列のヌクレオチド４〜４４４は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるように沈黙改変されている。
【００９７】
ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列の一部分が野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるＨＢＢコード配列のヌクレオチド４〜４４４に転写およびスプライスされ得るように、沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列の一部分を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列の一部分が野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して７０％未満同一であるＨＢＢコード配列のヌクレオチド４〜４４４に転写およびスプライスされ得るように、沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列の一部分を含む。ある特定の実施形態では、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列の一部分は、配列番号４７に記載のヌクレオチド配列に転写およびスプライスされ得る。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列の一部分が野生型ＨＢＢコード配列の対応する部分に対して８５％未満同一であるＨＢＢコード配列のヌクレオチド４〜４４４に転写およびスプライスされ得るように、沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列の一部分を含む。ある特定の実施形態では、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列の一部分は、配列番号１００に記載のヌクレオチド配列に転写およびスプライスされ得る。そのような編集要素は、ＨＢＢ遺伝子コード配列の３’の外来性ポリアデニル化配列をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’に沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列の一部分および外来性ポリアデニル化配列を含み、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列の一部分は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるＨＢＢコード配列のヌクレオチド４〜４４４に転写およびスプライスされ得る。
【００９８】
ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢコード配列に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるように沈黙改変されている完全なＨＢＢコード配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢコード配列に対して７０％未満同一であるように沈黙改変されている完全なＨＢＢコード配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’に開始コドンおよび配列番号４７に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号２８に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、野生型ＨＢＢコード配列に対して８５％未満同一であるように沈黙改変されているＨＢＢ遺伝子の完全なＨＢＢコード配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’に開始コドンおよび配列番号１００に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号９９に記載のヌクレオチド配列を含む。そのような編集要素は、スプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、およびＨＢＢ遺伝子コード配列の３’の外来性ポリアデニル化配列のうちの１つ以上をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’にリボソームスキッピング要素、および任意に開始コドンを欠く完全なＨＢＢコード配列を含み、完全なＨＢＢコード配列は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるように沈黙改変されている。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’にリボソームスキッピング要素、任意に開始コドンを欠く完全なＨＢＢコード配列、および外来性ポリアデニル化配列を含み、完全なＨＢＢコード配列は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるように沈黙改変されている。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’にスプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、および任意に開始コドンを欠く完全なＨＢＢコード配列を含み、完全なＨＢＢコード配列は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるように沈黙改変されている。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’にスプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、任意に開始コドンを欠く完全なＨＢＢコード配列、および外来性ポリアデニル化配列を含み、完全なＨＢＢコード配列は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一であるように沈黙改変されている。
【００９９】
ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列が野生型ＨＢＢコード配列に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一である完全なＨＢＢコード配列に転写およびスプライスされ得るように、沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列が野生型ＨＢＢコード配列に対して７０％未満同一である完全なＨＢＢコード配列に転写およびスプライスされ得るように、沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列を含む。ある特定の実施形態では、完全なＨＢＢコード配列は、５’から３’の開始コドンおよび配列番号４７に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、完全なＨＢＢコード配列は、配列番号２８に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列は、配列番号４３〜４５に記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列が野生型ＨＢＢコード配列に対して８５％未満同一である完全なＨＢＢコード配列に転写およびスプライスされ得るように、沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列を含む。ある特定の実施形態では、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列は、５’から３’に配列番号１０５、１０６、および１０７に記載のヌクレオチド配列を含む。そのような編集要素は、スプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、およびＨＢＢ遺伝子コード配列の３’の外来性ポリアデニル化配列のうちの１つ以上をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’にリボソームスキッピング要素および沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列を含み、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一である完全なＨＢＢコード配列に転写およびスプライスされ得る。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３にリボソームスキッピング要素、沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列、および外来性ポリアデニル化配列を含み、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一である完全なＨＢＢコード配列に転写およびスプライスされ得る。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’にスプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、および沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列を含み、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一である完全なＨＢＢコード配列に転写およびスプライスされ得る。ある特定の実施形態では、編集要素は、５’から３’にスプライスアクセプター部位、リボソームスキッピング要素、沈黙改変されているＨＢＢスタッファー挿入コード配列、および外来性ポリアデニル化配列を含み、ＨＢＢスタッファー挿入コード配列は、野生型ＨＢＢコード配列の対応する領域に対して１００％未満（例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満）同一である完全なＨＢＢコード配列に転写およびスプライスされ得る。
【０１００】
本明細書に開示される編集要素のいずれかおよびすべては、標的遺伝子に存在しない固有の配列（例えば、野生型もしくは変異ＨＢＢ遺伝子、またはその機能等価物をコードする遺伝子）をさらに含み得、それにより、標的遺伝子座に編集要素を組み込んでいる細胞の同定を可能にする。そのような固有の配列は、標的遺伝子座およびその隣接領域またはそれから増幅した核酸の核酸シーケンシング分析（例えば、ＰＣＲまたは次世代シーケンシングにより）に好適な配列であり得る。そのような固有の配列はまた、標的遺伝子座およびその隣接領域またはそれから増幅した核酸の制限断片長多型分析に基づいた標的遺伝子座に編集要素を組み込んでいる細胞の同定を可能にする制限エンドヌクレアーゼ部位であってもよい。
【０１０１】
本明細書に開示される編集要素のいずれかおよびすべては、標的遺伝子座に組み込まれた場合、ベータグロビンタンパク質において１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入、または欠失）をもたらす１つ以上のヌクレオチド改変を含み得る。ある特定の実施形態では、修飾されたベータグロビンタンパク質は、野生型ベータグロビンの機能等価物である、すなわち、野生型ベータグロビンとして機能することができる。ある特定の実施形態では、機能的に等価なベータグロビンは、野生型ベータグロビンに見られない少なくとも１つの特徴、例えば、ＳＣＤ変異を保有するベータグロビンの凝集を阻害する能力をさらに含む。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される編集要素は、少なくとも０、１、２、１０、１００、２００、５００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、１〜５０００、１〜４５００、１〜４０００、１〜３０００、１〜２０００、１〜１０００、１〜５００、１〜２００、１〜１００、１〜５０、または１〜１０ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される編集要素は、エクソン、イントロン、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、プロモーター、スプライスドナー、スプライスアクセプター、リボソームスキッピング要素、非コードＲＮＡをコードする配列、インスレーター、遺伝子、またはそれらの組み合わせを含むか、またはそれらからなる。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号２３〜２８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、編集要素は、配列番号２３〜２６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列からなる。
【０１０５】
本明細書に開示される修正ゲノムにおいて使用される相同アームは、ゲノム上の標的遺伝子（例えば、ＨＢＢ遺伝子）または近くの遺伝子の任意の領域を対象とし得る。相同アームの正確な同定および位置付けは、編集要素および／または標的遺伝子座の同一性によって決定され得る。
【０１０６】
本明細書に開示される修正ゲノムに用いられる相同アームは、標的遺伝子座（例えば、ＨＢＢ遺伝子の標的遺伝子座）に隣接するゲノムに実質的に同一である。ある特定の実施形態では、５’相同アームは、標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％）のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、５’相同アームは、第１のゲノム領域に対して１００％のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、３’相同アームは、標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％）のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、３’相同アームは、第２のゲノム領域に対して１００％のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、５’および３’相同アームは、それぞれ、標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域および標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域に対して各々少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％）同一である。ある特定の実施形態では、５’および３’相同アームは、それぞれ、第１および第２のゲノム領域に対して各々１００％同一である。ある特定の実施形態では、５’相同アームおよび第１のゲノム領域のヌクレオチド配列における相違、ならびに／または３’相同アームおよび第２のゲノム領域のヌクレオチド配列における相違は、ヌクレオチド配列の非コードの相違を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。
【０１０７】
当業者は、相同アームが相同組換えによりその標的遺伝子座への編集要素の組み込みを媒介することができるように、標的遺伝子座に隣接するゲノム配列に対して１００％同一である必要はないことを理解するであろう。当業者は、相同アームが標的遺伝子座に隣接するゲノム配列に対して１００％同一ではない場合、相同アームとゲノムとの間の相同組換えは、使用される相同アームの配列に同一となるように、標的遺伝子座に隣接するゲノム配列を改変してもよいことをさらに理解するであろう。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域は、第１の編集枠に位置し、第１の編集枠のヌクレオチド配列は、配列番号１０１〜１０３からなる群から選択される配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域は、第２の編集枠に位置し、第２の編集枠のヌクレオチド配列は、配列番号１０１〜１０３からなる群から選択される配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座の５’の第１のゲノム領域は、第１の編集枠に位置し、第１の編集枠のヌクレオチド配列は、配列番号１０１〜１０３からなる群から選択される配列からなり、標的遺伝子座の３’の第２のゲノム領域は、第２の編集枠に位置し、第２の編集枠のヌクレオチド配列は、配列番号１０１、１０２、または１０３に記載のヌクレオチド配列からなる。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、第１と第２の編集枠は異なる。ある特定の実施形態では、第１の編集枠は、第２の編集枠の５’に位置する。ある特定の実施形態では、第１の編集枠は、配列番号１０１に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第２の編集枠は、配列番号１０２に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第１の編集枠は、配列番号１０１に記載のヌクレオチド配列からなり、第２の編集枠は、配列番号１０２に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第１のゲノム領域は、第１の編集枠の配列よりも短い配列からなる。ある特定の実施形態では、第１のゲノム領域は、第１の編集枠の配列からなる。ある特定の実施形態では、第２のゲノム領域は、第２の編集枠の配列よりも短い配列からなる。ある特定の実施形態では、第２のゲノム領域は、第２の編集枠の配列からなる。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、第１と第２の編集枠は同じである。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、編集枠のヌクレオチド間結合またはヌクレオチド配列であり、第１のゲノム遺伝子座は、標的遺伝子座の５’の編集枠の第１の部分からなり、第２のゲノム遺伝子座は、標的遺伝子座の３’の編集枠の第２の部分からなる。ある特定の実施形態では、編集枠の第１の部分は、編集枠の５’端から標的遺伝子座に隣接して５’のヌクレオチドまでの配列からなる。ある特定の実施形態では、編集枠の第２の部分は、標的遺伝子座に隣接して３’のヌクレオチドから編集枠の３’端までの配列からなる。ある特定の実施形態では、編集枠の第１の部分は、編集枠の５’端から標的遺伝子座に隣接して５’のヌクレオチドまでの配列からなり、編集枠の第２の部分は、標的遺伝子座に隣接して３’のヌクレオチドから編集枠の３’端までの配列からなる。ある特定の実施形態では、編集枠は、配列番号１０３に記載のヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、編集枠の第１および第２の部分は、実質的に等しい長さを有する（例えば、より短い部分の長さとより長い部分長さとの比率が０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、または０．９９よりも大きい）。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、５’相同アームは、約５０〜約４０００ヌクレオチド（例えば、約１００〜約３０００、約２００〜約２０００、約５００〜約１０００ヌクレオチド）の長さを有する。ある特定の実施形態では、５’相同アームは、約８００ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、５’相同アームは、約１００ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、３’相同アームは、約５０〜約４０００ヌクレオチド（例えば、約１００〜約３０００、約２００〜約２０００、約５００〜約１０００ヌクレオチド）の長さを有する。ある特定の実施形態では、３’相同アームは、約８００ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、３’相同アームは、約１００ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、５’および３’相同アームの各々は、独立して、約５０〜約４０００ヌクレオチド（例えば、約１００〜約３０００、約２００〜約２０００、約５００〜約１０００ヌクレオチド）の長さを有する。ある特定の実施形態では、５’および３’相同アームは、約８００ヌクレオチドの長さを有する。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、５’および３’相同アームは、実質的に等しいヌクレオチド長さを有する。ある特定の実施形態では、５’および３’相同アームは、非対称のヌクレオチド長さを有する。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド長さの非対称は、長さが最大８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％の差などの長さが最大９０％の５’と３’との相同アーム間の差により定義される。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号２９〜４２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、５’から３’に配列番号１０１に記載の配列、リボソームスキッピング要素、野生型ＨＢＢコード配列に対して９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満同一であるように沈黙改変されているＨＢＢコード配列、外来性ポリアデニル化配列（例えば、配列番号７６、７７、７８、または７９に記載のような）、および配列番号１０２に記載の配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、５’から３’に配列番号１０１に記載の配列、リボソームスキッピング要素、配列番号９９に記載の配列、外来性ポリアデニル化配列（例えば、配列番号７６、７７、７８、または７９に記載のような）、および配列番号１０２に記載の配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、５’から３’に配列番号１０１に記載の配列、リボソームスキッピング要素、ＨＢＢの第１のエクソンの野生型コード領域に対して９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満同一であるように沈黙改変されているＨＢＢの第１のエクソンのコード領域、任意の第１の非天然イントロン、ＨＢＢの野生型の第２のエクソンに対して９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満同一であるように沈黙改変されているＨＢＢの第２のエクソン、任意の第２のイントロン、ＨＢＢの第３のエクソンの野生型コード領域に対して９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満同一であるように沈黙改変されているＨＢＢの第３のエクソンのコード領域、外来性ポリアデニル化配列（例えば、配列番号７６、７７、７８、または７９に記載のような）、および配列番号１０２に記載の配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、５’から３’に配列番号１０１に記載の配列、リボソームスキッピング要素、配列番号１０５に記載の配列、任意の第１の非天然イントロン、配列番号１０６に記載の配列、任意の第２のイントロン、配列番号１０７に記載の配列、外来性ポリアデニル化配列（例えば、配列番号７６、７７、７８、または７９に記載のような）、および配列番号１０２に記載の配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号１０４に記載のヌクレオチド配列を含む。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される修正ゲノムは、５’相同アームヌクレオチド配列の５’の５’逆位末端反復（５’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列、および３’相同アームヌクレオチド配列の３’の３’逆位末端反復（３’ＩＴＲ）ヌクレオチド配列をさらに含む。任意のＡＡＶ血清型またはその変異型由来のＩＴＲ配列が、本明細書に開示される修正ゲノムにおいて使用され得る。５’および３’ＩＴＲは、同じ血清型のＡＡＶまたは異なる血清型のＡＡＶ由来のものであり得る。本明細書に開示される修正ゲノムにおいて使用するための例示的なＩＴＲは、本明細書の配列番号１８〜２１に記載される。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列および３’ＩＴＲヌクレオチド配列は、互いに実質的に相補的である（例えば、５’または３’ＩＴＲの１、２、３、４、または５ヌクレオチド位置のミスマッチを除き、互いに相補的である）。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来のものである。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方がＡＡＶ２由来のものである。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１８に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有するか、または３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１９に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１８に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有し、かつ３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号１９に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号２３〜２８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を有する編集要素、配列番号１８の配列を有する５’ＩＴＲヌクレオチド配列、および配列番号１９の配列を有する３’ＩＴＲヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号２９〜４２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、配列番号１８の配列を有する５’ＩＴＲヌクレオチド配列、および配列番号１９の配列を有する３’ＩＴＲヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、５’から３’に配列番号１８の配列を有する５’ＩＴＲヌクレオチド配列、配列番号２９〜４２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、および配列番号１９の配列を有する３’ＩＴＲヌクレオチド配列からなる。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、ＡＡＶ５由来のものである。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方がＡＡＶ５由来のものである。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号２０に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有するか、または３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、５’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号２０に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有し、かつ３’ＩＴＲヌクレオチド配列が、配列番号２１に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号２３〜２８のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を有する編集要素、配列番号２０の配列を有する５’ＩＴＲヌクレオチド配列、および配列番号２１の配列を有する３’ＩＴＲヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号２９〜４２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、配列番号２０の配列を有する５’ＩＴＲヌクレオチド配列、および配列番号２１の配列を有する３’ＩＴＲヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、５’から３’に配列番号２０の配列を有する５’ＩＴＲヌクレオチド配列、配列番号２９〜４２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列、および配列番号２１の配列を有する３’ＩＴＲヌクレオチド配列からなる。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される修正ゲノムは、約０．５〜約８ｋｂ、およびその間に含まれる任意の範囲（例えば、約１〜約５、約２〜約５、約３〜約５、約４〜約５、約４．５〜約４．８、または約４．７ｋｂ）の長さを有する。
【０１１９】
本明細書に開示される修正ゲノムは、編集要素をＨＢＢ遺伝子の任意の所望の標的遺伝子座に組み込むように構成することができる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、対応する野生型ＨＢＢ遺伝子配列に対するＨＢＢ遺伝子配列における変異（例えば、１つ以上のヌクレオチオの挿入、欠失、または置換）である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ＨＢＢ遺伝子におけるヌクレオチド点変異または欠失にある。例示的なＨＢＢ点変異または欠失には、限定されないが、位置−８７のＧ、位置−３１のＧ、位置−３０のＡ、位置−２９のＧ、位置−２８のＧ、位置−１０のＴ、位置１のＣ、位置１のＡ、位置２のＧ、位置１７および１８のＣおよびＴの欠失、位置１９のＡ、位置２０のＡの欠失、位置２０のＴ、位置２５および２６のＡの欠失およびＡ、位置２６の後のＧの追加、位置４７のＡ、位置４８のＡ、位置５１のＣの欠失、位置５２のＡ、位置５８のＧ、位置５９のＧ、位置７９のＡ、位置８２のＴ、位置８４の後のＣの追加、位置９３のＴ、位置９３のＡ、位置９７のＣ、位置９８のＣ、位置２０２のＧ、位置２０８のＧ、位置２２２のＣ、位置２４１または２４２のＴの欠失、位置２５４〜２５７Ｔの欠失ならびにＴおよびＣおよびＴ、位置２６０のＴ、位置２６４または２６５のＣの欠失、位置３４３の後のＡの追加、位置３９９および４００のＧおよびＴの欠失、位置４０１のＴ、位置４１７の後のＡの追加、位置４４６のＡ、位置１０９９のＴ、位置１２９３のＡ、位置１３４４のＴが含まれる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、鎌状赤血球症の変異（すなわち、ＨＢＢ遺伝子の位置２０のＴ）である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、染色体の領域またはＨＢＢ遺伝子のエクソン１のヌクレオチド間結合、例えば、内在性開始コドンの直後（例えば、ＨＢＢ遺伝子のヌクレオチド３とヌクレオチド４との間のヌクレオチド間結合）である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、染色体の領域またはＨＢＢ遺伝子のイントロン１のヌクレオチド間結合である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、野生型ＨＢＢ遺伝子の天然の終止コドンまたは変異ＨＢＢ遺伝子の対応するヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、野生型ＨＢＢ遺伝子の終止コドンに隣接して５’のヌクレオチド間結合または変異ＨＢＢ遺伝子の対応するヌクレオチド間結合からなる。
【０１２０】
本明細書に開示されるＡＡＶ組成物は、インビボおよびインビトロの両方で、高効率で細胞のＨＢＢ遺伝子における変異を修正することができるという点で、特に有利である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶを、標準的なＡＡＶ形質導入条件下で、ＣＤ３４＋ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、標的遺伝子座への編集要素の組み込み効率は、少なくとも０．１％（例えば、少なくとも０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶを、標準的なＡＡＶ形質導入条件下で、ＣＤ３４＋ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、標的遺伝子座への編集要素の組み込みの対立遺伝子頻度は、少なくとも０．０５％（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）である。
【０１２１】
遺伝子編集の効率を決定する任意の方法を用いることができる。ある特定の実施形態では、個々の細胞を、形質導入された細胞集団から分離し、標的遺伝子座に正しく組み込まれた編集要素の存在を同定することができるＰＣＲプライマーを使用して、単一細胞ＰＣＲに供する。そのような方法は、未修飾の標的遺伝子座を選択的に増幅するＰＣＲプライマーを使用する、同じ細胞の単一細胞ＰＣＲをさらに含み得る。このような方法で、細胞の遺伝子型を決定することができる。例えば、細胞が編集された標的遺伝子座および未修飾の標的遺伝子座の両方を有すると単一細胞ＰＣＲが示した場合、細胞は編集されたＨＢＢ遺伝子のヘテロ接合と考えられるであろう。
【０１２２】
加えてまたは代替的に、ある特定の実施形態では、線形増幅媒介ＰＣＲ（ＬＡＭ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、またはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を、形質導入された細胞集団（例えば、組織または臓器）から抽出したＤＮＡで行い、組み込みの対立遺伝子頻度を評価することができる。ある特定の実施形態では、抽出したＤＮＡは、異なる配列を検出する少なくとも２つのプライマー対を使用して、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により分析される。例えば、ｄｄＰＣＲは、未編集および編集された標的遺伝子座を検出する第１のプライマー対、非組み込みおよび組み込まれたベクターに存在する配列を検出する第２のプライマー対、および任意に、未編集および編集された標的遺伝子座ならびに非組み込みおよび組み込まれたベクターに存在する相同アームの配列を検出する第３のプライマー対を用いることができる。未編集ゲノムＤＮＡおよび非組み込みベクターの共分配の確率を修正した後、第１および第２のプライマー対の両方に陽性の液滴の割合は、組み込みの対立遺伝子頻度に対応する。この方法の例は、本明細書の実施例１に記載される。
【０１２３】
加えてまたは代替的に、ある特定の実施形態では、ＨＢＢ遺伝子座は、修正ゲノムにより包含されるゲノム領域に隣接するＨＢＢ遺伝子の領域に結合するプライマーを使用するＰＣＲ、または修正ゲノム内の領域（例えば、遺伝子座に非天然の外来性配列を含む領域に結合するプライマーを使用する線形増幅媒介ＰＣＲ（ＬＡＭ−ＰＣＲ）のいずれかにより、形質導入された細胞集団（例えば、組織または臓器）から抽出されたＤＮＡから増幅され得る。得られるＰＣＲアンプリコンを、単一分子次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術を使用して個々にシーケンシングして、形質導入された細胞集団に存在する編集されたおよび未編集のＨＢＢ対立遺伝子の相対数を決定することができる。これらの数は、標的遺伝子座への編集要素の組み込みの対立遺伝子頻度を決定するために使用され得る。
【０１２４】
別の態様では、本開示は、薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、希釈剤、ビヒクルもしくは担体、またはそれらの組み合わせとともに、本明細書に開示されるＡＡＶを含む医薬組成物を提供する。「薬学的に許容される担体」には、組成物の活性成分と組み合わされる場合、成分が生物学的活性を保持することができ、意図しない免疫反応などの破壊的な生理学的反応を引き起こさない任意の材料が含まれる。薬学的に許容される担体には、水、リン酸緩衝食塩水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および湿潤剤が含まれる。そのような担体を含む組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．１８０４２，ＵＳＡ；Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃに記載されるものなど、周知の従来の方法によって製剤化される。
【０１２５】
ＩＩＩ．使用方法
別の態様では、本開示は、細胞のＨＢＢ遺伝子における変異を修正するための方法を提供する。本方法は一般に、本明細書に開示される複製欠損ＡＡＶで細胞を形質導入することを含む。そのような方法は、ＨＢＢ遺伝子における変異を修正するのに非常に効率的であり、外来性ヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）の作用により標的遺伝子座のゲノムを切断して、そのような修正を容易にする必要がない。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入または共投与することなく、細胞を、本明細書に開示される複製欠損ＡＡＶで形質導入することを伴う。
【０１２６】
本明細書に開示される方法は、ＨＢＢ遺伝子に変異を持つあらゆる細胞に適用することができる。当業者は、赤血球に分化することができる細胞が特に関心のものであることを理解するであろう。したがって、ある特定の実施形態では、本方法は、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および造血幹細胞（ＨＳＣ）を含むがこれらに限定されない幹細胞に適用される。本方法が適用され得る例示的なＨＳＣには、ＣＤ３４＋ＨＳＣが含まれるが、これに限定されない。
【０１２７】
本明細書に開示される方法は、研究目的のためにインビトロで行われ得るか、または治療目的のためにエクスビボもしくはインビボで行われ得る。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、形質導入される細胞は対象から採取され、本明細書に開示される方法に従いエクスビボで形質導入されて、ＨＢＢ遺伝子における変異を修正し、形質導入された細胞は、その後対象に投与し戻される。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＢ遺伝子変異に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法を提供し、本方法は、本明細書に開示される複製欠損ＡＡＶでエクスビボで幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞）を形質導入して、形質導入された細胞を得ることと、形質導入された細胞を対象に投与することとを含む。形質導入された細胞は、遺伝的組み込みを修正するために選択され、かつ／または対象に投与する前にクローン拡大のために培養され得る。ある特定の実施形態では、形質導入される幹細胞は、骨髄、臍帯血、または末梢血から得られ、幹細胞は、任意に、１つ以上の細胞マーカーに基づく方法（例えば、細胞の大きさ、細胞密度、およびＣＤ３４などの表面マーカー）により選択される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、自家性、すなわち、ＡＡＶ形質導入後に細胞が投与される対象からのものである。ある特定の実施形態では、幹細胞は、それを必要とする対象に同種である、すなわち、幹細胞は、レシピエント対象に遺伝的に非同一であるドナーから得られる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＢ遺伝子変異に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法を提供し、本方法は、本明細書に開示される複製欠損ＡＡＶでエクスビボで同種幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞）を形質導入して、形質導入された細胞を得ることと、形質導入された細胞を対象に投与することとを含む。ある特定の実施形態では、同種幹細胞は、適合ドナーに由来する。当業者は、同種用途に関して、形質導入された細胞が、投与前にさらなる修飾、例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生を予防および／または低減するための遺伝的修飾を必要とし得ることを認識するであろう。対象は、ヒト対象またはヒト赤血球前駆細胞を含むゲッ歯類対象（例えば、マウス）であり得る。好適なマウス対象は、限定してヒト幹細胞（例えば、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ）が移植されているマウスを含む。ＨＢＢ遺伝子変異に関連する任意の疾患または障害は、本明細書に開示される方法を使用して治療することができる。好適な疾患または障害は、ベータサラセミアまたは鎌状赤血球症を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞は、外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入することなく形質導入される。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、形質導入される細胞は、哺乳類対象内にあり、ＡＡＶは、対象の細胞を形質導入するのに有効な量で、対象に投与される。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＢ遺伝子変異に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法を提供し、本方法は一般に、有効量の本明細書に開示される複製欠損を対象に投与することを含む。対象は、ヒト対象、非ヒト霊長類対象（例えば、カニクイザル）、またはヒト赤血球前駆細胞を含むゲッ歯類対象（例えば、マウス）であり得る。好適なマウス対象は、ヒト幹細胞（例えば、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ）が移植されているマウスを含むが、これに限定されない。ＨＢＢ遺伝子変異に関連する任意の疾患または障害は、本明細書に開示される方法を使用して治療することができる。好適な疾患または障害は、ベータサラセミアまたは鎌状赤血球症を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞は、外来性ヌクレアーゼまたは外来性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入または共投与することなく形質導入される。
【０１３０】
本明細書に開示される方法は、インビボおよびインビトロの両方で、高効率で細胞のＨＢＢ遺伝子を修正することができるという点で、特に有利である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶを、標準的なＡＡＶ形質導入条件下で、ＣＤ３４＋ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、標的遺伝子座への編集要素の組み込み効率は、少なくとも０．１％（例えば、少なくとも０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶを、標準的なＡＡＶ形質導入条件下で、ＣＤ３４＋ヒト幹細胞集団と外来性ヌクレアーゼの不在下でインビトロで接触させた場合、標的遺伝子座への編集要素の組み込みの対立遺伝子頻度は、少なくとも０．０５％（例えば、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％）である。本明細書に記載されるものを含むがこれらに限定されない遺伝子編集の効率を決定する任意の方法を用いることができる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶ組成物での細胞の形質導入は、本明細書に提供されるように、または当業者に既知の形質導入の任意の方法により行うことができる。ある特定の実施形態では、細胞を、５０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、または５００，０００の感染多重度（ＭＯＩ）、または細胞の最適な形質導入を提供する任意のＭＯＩでＡＡＶと接触させることができる。ある特定の実施形態では、対象は、約１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５ベクターゲノム／体重ｋｇの用量でＡＡＶを投与され得る。
【０１３２】
本明細書に開示されるＡＡＶ組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、局所、または皮内経路を含むが、これらに限定されない任意の適切な経路により対象に投与され得る。ある特定の実施形態では、組成物は、静脈内注射または皮下注射による投与用に製剤化される。
【０１３３】
ＩＶ．ＡＡＶパッケージングシステム
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される複製欠損ＡＡＶの組換え調製のためのパッケージングシステムを提供する。そのようなパッケージングシステムは一般に、１つ以上のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質をコードするＲｅｐヌクレオチド配列、本明細書に開示される１つ以上のＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質をコードするＣａｐヌクレオチド配列、および本明細書に開示されるＨＢＢ遺伝子における変異を修正するための修正ゲノムを含み、パッケージングシステムは、カプシドに修正ゲノムを封入して、ＡＡＶを形成するために細胞内で作動可能である。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、パッケージングシステムは、Ｒｅｐヌクレオチド配列およびＣａｐヌクレオチド配列を含む第１のベクターと、修正ゲノムを含む第２のベクターとを含む。本明細書に開示されるパッケージングシステムの文脈において使用される、「ベクター」は、細胞内に核酸を導入するためのビヒクル（例えば、プラスミド、ウイルス、コスミド、人工染色体等）である核酸分子を指す。
【０１３５】
任意のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質は、本明細書に開示されるパッケージングシステムにおいて用いられ得る。パッケージングシステムのある特定の実施形態では、Ｒｅｐヌクレオチド配列は、ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質をコードする。好適なＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質には、Ｒｅｐ７８／６８またはＲｅｐ６８／５２が含まれるが、これらに限定されない。パッケージングシステムのある特定の実施形態では、ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２のＡＡＶ２  Ｒｅｐアミノ酸配列に対して最小パーセントの配列同一性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、最小パーセントの配列同一性は、ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質のアミノ酸配列の長さにわたって少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）である。パッケージングシステムのある特定の実施形態では、ＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有する。
【０１３６】
パッケージングシステムのある特定の実施形態では、パッケージングシステムは、第３のベクター、例えば、ヘルパーウイルスベクターをさらに含む。第３のベクターは、独立した第３のベクターであるか、第１のベクターと一体であるか、または第２のベクターと一体であり得る。ある特定の実施形態では、第３のベクターは、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。
【０１３７】
パッケージングシステムのある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスなど）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびバキュロウイルスからなる群から選択される。パッケージングシステムのある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスがアデノウイルスである場合、アデノウイルスゲノムは、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ４、およびＶＡからなる群から選択される１つ以上のアデノウイルスＲＮＡ遺伝子を含む。パッケージングシステムのある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスがＨＳＶである場合、ＨＳＶゲノムは、ＵＬ５／８／５２、ＩＣＰＯ、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、およびＵＬ３０／ＵＬ４２からなる群から選択されるＨＳＶ遺伝子のうちの１つ以上を含む。
【０１３８】
パッケージングシステムのある特定の実施形態では、第１、第２、および／または第３のベクターは、１つ以上のトランスフェクトプラスミド内に含まれる。ある特定の実施形態では、第１のベクターおよび第３のベクターは、第１のトランスフェクトプラスミド内に含まれる。ある特定の実施形態では、第２のベクターおよび第３のベクターは、第２のトランスフェクトプラスミド内に含まれる。
【０１３９】
パッケージングシステムのある特定の実施形態では、第１、第２、および／または第３のベクターは、１つ以上の組換えヘルパーウイルス内に含まれる。ある特定の実施形態では、第１のベクターおよび第３のベクターは、組換えヘルパーウイルス内に含まれる。ある特定の実施形態では、第２のベクターおよび第３のベクターは、組換えヘルパーウイルス内に含まれる。
【０１４０】
さらなる態様では、本開示は、本明細書に記載されるＡＡＶの組換え調製のための方法を提供し、本方法は、カプシドに修正ゲノムを封入して、本明細書に記載されるＡＡＶを形成するために作動可能である条件下で、記載されるパッケージングシステムで細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含む。ＡＡＶの組換え調製のための例示的な方法は、一過性のトランスフェクション（例えば、本明細書に記載される第１および第２、ならびに任意に第３のベクターを含む１つ以上のトランスフェクションプラスミドで）、ウイルス感染（例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスなど）、ヘルペスウイルス（本明細書に記載される第１および第２、ならびに任意で第３のベクターを含むＨＳＶ、サイトメガロウイルス、またはバキュロウイルスを含む）などの１つ以上の組換えヘルパーウイルスで、および安定した産生細胞株のトランスフェクションまたは感染（例えば、１つ以上のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質をコードするＲｅｐヌクレオチド配列および／または本明細書に記載される１つ以上のＡＡＶクレードＦカプシドタンパク質をコードするＣａｐヌクレオチド配列を含む哺乳類または昆虫細胞などの安定した産生細胞で、ならびにトランスフェクトプラスミドまたは組換えヘルパーウイルスの形態で送達される本明細書に記載される修正ゲノムで）を含む。
【０１４１】
Ｖ．実施例
本明細書に開示される組換えＡＡＶベクターは、ヌクレアーゼ不含相同性依存修復に基づく機構により、インビトロおよびインビボでの非常に効率的な遺伝子編集を媒介する。以下の実施例は、本明細書に開示されるＡＡＶベースのベクターを使用して、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）およびベータサラセミアなどのある特定のヒト疾患において変異するＨＢＢ遺伝子の効率的な修正を示す。これらの実施例は、図示のために提示され、制限するために提示されるものではない。
【０１４２】
実施例１：ＨＢＢ変異細胞の遺伝子編集のためのＡＡＶカプシドの選択
本実施例は、ＨＢＢ変異細胞における、クレードＦ  ＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ１５、およびＡＡＶＨＳＣ１７にパッケージングされた遺伝子編集ＡＡＶベクター、ＡＡＶＳ１−ＦＰの組み込み効率を特徴付ける。ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ１５、およびＡＡＶＨＳＣ１７は、それぞれ、ＡＡＶＦ７、ＡＡＶＦ１５、およびＡＡＶＦ１７としても知られ、ＷＯ２０１６／０４９２３０Ａ１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に完全に記載されている。
【０１４３】
本明細書で用いられる遺伝子編集ベクター、ＡＡＶＳ１−ＦＰは、ＷＯ２０１６／４９２３０Ａ１に完全に記載されている。これは、５’から３’にＡＡＶ２  ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、標的遺伝子座から上流のＤＮＡの配列を有する８００ヌクレオチドからなる５’相同アーム、スプライスアクセプター、２Ａ要素、蛍光タンパク質（ＦＰ）のコード配列、標的遺伝子座から下流のＤＮＡの配列を有する８００ヌクレオチドからなる３’相同アーム、およびＡＡＶ２  ３’ＩＴＲを含み、標的遺伝子座は、染色体１９上のＡＡＶＳ１遺伝子座のヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃのイントロン１にあり、ＡＡＶＳ１−ＦＰとヒトゲノムとの間の相同組換え後、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃのエクソン１、２Ａ要素、およびＦＰコード配列はインフレームにある。ベクターのＦＰコード配列は、プロモーターを有しないため、このベクターで形質導入された細胞は、ベクターがゲノムに組み込まれたときにのみＦＰを発現する。ＡＡＶ２  ＩＴＲおよび高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）に作動可能に連結されたプロモーターを含む自己相補的ＡＡＶベクターであるＡＡＶＨＳＣ−ｓｃＥＧＦＰは、形質導入効率の対照として機能した（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６２８，９６６号を参照されたい）。
【０１４４】
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の特徴であるＨＢＢのイントロン１の位置２０にＡからＴへの変異を有するリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）であるＧＭ１６２６５細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から得た。ＬＣＬを、１５％のＦＣＳおよび２ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ中で培養した。およそ２００，０００細胞／ｍｌで細胞を播種し、５００，０００〜１，０００，０００細胞／ｍｌに達したときに分けた。細胞を蒔く前に、各形質導入について必要とされるウイルス量を計算した。ウイルスの形質導入容積は、ウェルの総容積の１０％を超えなかった。形質導入日に、対数期細胞を計数し、蒔いた。１．５×１０５の感染多重度（ＭＯＩ）で細胞をウイルスで形質導入した。形質導入前に、必要であれば、パッケージングされたＡＡＶ粒子を氷上で解凍し、氷上で超音波処理し、各ウェルに個々に添加した。形質導入の４８時間後に細胞を採取した。
【０１４５】
ＧＭ１６２６５細胞を、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ１５、またはＡＡＶＨＳＣ１７カプシドにパッケージングされたＡＡＶＳ１−ＦＰベクターで形質導入した。組み込み効率は、次の方法を使用してフローサイトメトリーにより評価された：ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、２％のＦＣＳ、０．１％のアジ化ナトリウム）を使用して細胞を採取し、１２００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。およそ２００μｌが残るように、過剰な上清はデカントした。フローサイトメトリー分析の直前の１００μＭの作業用ストックから４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を添加して、最終濃度を３μＭにした。
【０１４６】
図１Ａに示されるように、ＡＡＶＨＳＣ７−ＡＡＶＳ１−ＦＰおよびＡＡＶＨＳＣ１７−ＡＡＶＳ１−ＦＰにより形質導入された全生細胞中のＦＰ陽性細胞の割合は、それぞれ、２４．３％（３４．０％−背景レベル９．７％）および７．８％（１７．５％−背景レベル９．７％）であった。図１Ｂに示されるように、ＡＡＶＨＳＣ１５−ＡＡＶＳ１−ＦＰおよびＡＡＶＨＳＣ１７−ＡＡＶＳ１−ＦＰにより形質導入された全生細胞中のＦＰ陽性細胞の割合は、それぞれ、２５．１％（２９．８％−背景レベル４．７％）および３７．６％（４２．３％−背景レベル４．７％）であった。このデータは、ＧＭ１６２６５細胞がＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ１５、およびＡＡＶＨＳＣ１７カプシドにパッケージングされたＡＡＶＳ１−ＦＰにより効率的に形質導入され得ることを示す。
【０１４７】
ＡＡＶＨＳＣ１７カプシドにパッケージングされたこのＡＡＶＳ１−ＦＰベクターの組み込み効率は、初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）においても調査された。初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ３４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄで２回濃縮することによりＳＣＤのドナー由来のヒト末梢血細胞から精製するか、または類似の２倍濃縮手順に従ったＲｅａｃｈＢｉｏ  Ｉｎｃ．から得た。２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６、および１ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦで補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で細胞を培養した。約２００，０００細胞を５００μｌの培地に蒔いた。ＡＡＶ粒子を培地に直接添加した。形質導入の４８時間後に細胞を採取した。
【０１４８】
編集効率は、ＢｉｏＲａｄ  ＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ．を使用して、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により測定された。ｄｄＰＣＲによる組み込みを定量化するために、表１に示される２セットのプライマーおよびプローブを設計した。ＡＡＶＳ１＿ゲノムのセットは、ゲノムのＡＡＶＳ１遺伝子座へのＦＰコード配列の標的組み込み後の未編集ゲノムおよび編集されたゲノムの相同アームの外側に存在したＡＡＶＳ１遺伝子座の配列を検出した。ＡＡＶＳ１＿ＦＰのセットは、ＦＰコード領域の配列を検出し、これは、ゲノムのＡＡＶＳ１遺伝子座へのＦＰコード配列の標的組み込み後の編集されたゲノムにのみ存在した。２つのプローブは、異なる波長の蛍光部分にコンジュゲートされた。
【表１】
2021500070.tif 000002
【０１４９】
１００ｐｇ／μｌのＤＮＡを有する試料を油液滴に分配した。油液滴の大半は、ＡＡＶＳ１＿ゲノムのセットにのみ陽性のＤＮＡ分子を含まないか、もしくは単一ＤＮＡ分子未編集ゲノム、ＡＡＶＳ１＿ＦＰのセットにのみ陽性の非組み込みベクター、またはプライマー／プローブのセットの両方に陽性の編集されたゲノムを含んだ。共分配の確率は、標準試料の数によって決定された（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｐｈａｓｉｎｇ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．（２０１５）１０（３）：ｅ０１１８２７０を参照されたい）。標準試料は、それぞれ、１００の未編集ゲノム／μｌ、１０００のエピソームベクター／μｌ、および１、５、１０、１５、２０、および２５の編集された対立遺伝子／μｌの様々なクローニングされた陽性対立遺伝子を含んだ。未編集対編集された対立遺伝子の比率に対する共分配の標準曲線がプロットされた（Ｒ２＝０．９７２、ピアソン相関ｐ＜０．００１）。
【０１５０】
少なくとも３つの実験において、各試料をｄｄＰＣＲにより分析し、各試料のＡＡＶＳ１＿ゲノム陽性、ＡＡＶＳ１＿ＦＰ陽性、および二重陽性液滴の量を測定し、各試料において未編集対編集された対立遺伝子の既知の比率に対してプロットした。図１Ｃに示されるように、ゲノムへのＦＰコード配列の組み込みは、初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣからのすべての対立遺伝子の約３０％において検出された。したがって、ＡＡＶＨＳＣ１７カプシドにパッケージングされたＡＡＶＳ１−ＦＰは、初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを効率的に形質導入した。
【０１５１】
実施例２：ＨＢＢ変異のインビトロ修正
図２に示されるｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４と名付けたＡＡＶベースのＨＢＢ修正ベクターを生成した。この修正ベクターは、ＨＢＢ変異、例えば、鎌状赤血球症のＨＢＢ遺伝子のエクソン１のコード領域のヌクレオチド２０（開始コドンから始まる）のＡ〜Ｔへの変異を修正するように設計された。ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ベクターは、ＨＢＢの一部分およびその近接するゲノム配列に隣接する５’および３’ＡＡＶ２  ＩＴＲを含み、エクソン１のヌクレオチド２０のＡ〜Ｔへの変異は反転された。ＨＢＢゲノム配列の一部分は、ＮＣＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂｌａｓｔ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／）を使用して設計された、表２に示される増幅プライマーを使用して野生型ＨＢＢおよびその近接する遺伝子座から得られた。ＰＣＲ産物は、ＨＢＢのすべてのエクソンおよびイントロンを網羅し、ＨＢＢ転写開始部位から上流の１６７８ヌクレオチドおよびＨＢＢポリアデニル化配列から下流の２３４ヌクレオチドをさらに含んだ。鎌状赤血球症のＨＢＢ変異に対して、このベクターは、各々長さが約１．７ｋｂの相同アーム（変異反転部位の５’および３’のゲノム配列）を含んだ。ＩＴＲの組み込みは、ＢｇｌＩＩ、ＭｓｃＩ、およびＳｍａＩを使用して制限消化スクリーニングすること、ならびにＩＴＲ特異的シーケンシングプロトコルを使用してシーケンシングすることにより確認された（Ｍｒｏｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）２３（２）：１２８−３６）。挿入断片は、本明細書の表３に示されるプライマーを使用して、制限消化およびサンガーシーケンシングにより確認された。このベクターは、ＨＢＢのエクソンおよびイントロンにおける変異だけでなく、ベータサラセミアにおいて観察されるＨＢＢ発現に影響を及ぼす５’および３’非翻訳領域における変異も修正することができた。
【表２】
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【表３】
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【０１５２】
修正遺伝子の検出を容易にするために、ＣｌａＩ制限部位およびＳｐｅＩ制限部位を含む、ＡＣＴＡＧＴＡＴＣＧＡＴ（配列番号８０）の配列を有する１２−ｂｐリンカーをＨＢＢ遺伝子に挿入した。このリンカー配列は、開始コドンから１１７ｂｐおよび変異反転部位から９７ｂｐのイントロン１に位置し、リンカーと所望の遺伝子修正との間に強い遺伝連鎖を確立した。修正されたＨＢＢのｍＲＮＡスプライシングを維持するために、イントロン１の主要ドナーおよびアクセプター部位の破壊を避けた。
【０１５３】
Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：５１−５９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるパッケージング方法を使用して、ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ベクターを、ＡＡＶＨＳＣ１５またはＡＡＶＨＳＣ１７カプシドタンパク質にパッケージングした。パッケージングされたウイルス力価は、表４に示されるプライマーおよびプローブを使用して、ｑＰＣＲにより決定された。
【表４】
2021500070.tif 000005
【０１５４】
標的組み込み（ＴＩ）アッセイを使用して、ＡＡＶＨＳＣ１５−ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４およびＡＡＶＨＳＣ１７−ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ウイルスを、ＧＭ１６２６５細胞においてＨＢＢ遺伝子を編集するそれらの能力について試験した。このアッセイにおいて、細胞を、４０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、１×ＰＢＳで洗浄し、後で使用するためにペレットを８０℃で凍結した。凍結した細胞ペレットを、１００，０００細胞に対して２００μｌに再懸濁した。１μｌのＤＮａｓｅ不含ＲＮａｓｅを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１０μｌの１０％のＳＤＳおよび１．２μｌのプロテイナーゼＫを添加し、５６℃で一晩インキュベートした。高分子量ＤＮＡを、標準フェノールおよびクロロホルム抽出により抽出した。高ＤＮＡ収量に関して、０．５×体積のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）（ｐＨ８．０）を用いて逆抽出を行い、最終チューブに添加した。２．５Ｍの最終濃度の１０Ｍの酢酸アンモニウムでＤＮＡを沈殿させた。およそ４×体積の氷冷の１００％のエタノールを添加した。ＤＮＡを、少なくとも１時間−８０℃で沈殿させた。ＤＮＡを７０％のエタノールで洗浄し、乾燥させ、およそ３０〜５０μのＴＥに再懸濁し、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより定量化した。定量化後、適切なプライマーを使用して、ＤＮＡを、ＰＣＲベースの「標的組み込み」（ＴＩ）アッセイに供して、ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ベクターとＨＢＢ遺伝子との間の正しい組換えを確認した。
【０１５５】
表５に記載の配列を有するプライマーをこの実施例のＴＩアッセイに使用した。ＨＢＢ２ＭＴＩ１００プライマーはリンカーおよびその近接領域を標的とし、ＨＢＢ３５０プライマーは相同アームの外側のゲノム配列を標的とした。ＰＣＲ反応物は、編集されたゲノムから単離したＤＮＡから２，２１９ｂｐのアンプリコンを生成するであろうが、形質導入されていない細胞またはｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ベクター単独から単離したＤＮＡから実質的に増幅しないであろう。
【０１５６】
ＰＣＲ反応物は、次のように構成された：最大５０μｌのＰＣＲ水、１０μｌの５×Ｑ５緩衝液、５μｌのベタイン、１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μｌのＨＢＢ２ＭＴＩ１００順方向プライマー（２５μＭ濃度）、１μｌのＨＢＢ  ３５０逆方向プライマー（２５μＭ濃度）、１００ｎｇ〜１μｇのゲノムＤＮＡ、１μｌのＮＥＢ  Ｑ５  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ。ＰＣＲ装置は、次のように設定された：９５℃で５分間の初期変性、９５℃で１０秒間の変性、７０℃で３０秒間のアニーリング（サイクルごとに０．５度低下させる）、そして７２℃で２分間の伸張を１５サイクル、９５℃で１０秒間の変性、６５℃で３０秒間のアニーリング、そして７２℃で２分間の伸長を２０サイクル、および７２℃で５分間の最終伸長。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動により分析された。
【０１５７】
２．２ｋｂの見かけサイズのアンプリコンを単離し、ｐＵＣ１１８骨格に平滑末端ライゲートした。得られるプラスミドを、ＣｌａＩまたはＳｐｅＩエンドヌクレアーゼを使用して制限消化により分析して、リンカーの正しい挿入を有するクローンを同定した。制限消化により同定された陽性クローンを、Ｍ１３ＦおよびＭ１３Ｒオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＤＮＡシーケンシングによりさらに分析した。
【表５】
2021500070.tif 000006
【０１５８】
図３Ａに示されるように、２．２ｋｂのＰＣＲバンド（ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ベクターによる正しい編集を示す）は、ＴＩアッセイにおいて、ＡＡＶＨＳＣ１５−ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４およびＡＡＶＨＳＣ１７−ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ウイルスで形質導入されたＧＭ１６２６５細胞において検出されたが、ＰＣＲ産物は、形質導入されていないＧＭ１６２６５細胞において検出されなかった。
【０１５９】
ＧＭ１６２６５細胞のＨＢＢ遺伝子の位置２０のＡからＴへの変異の修正は、ＴＩアッセイにおいて同定された陽性クローンのシーケンシングにより確認された。配列分析は、ＡＡＶＨＳＣ１５−ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４またはＡＡＶＨＳＣ１７−ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ウイルスでの形質導入後に、Ｔ変異がＡに修正され、近くの無症候性変異も野生型に修正されたことを示した。逆ＰＣＲ鎖のシーケンシングにより変異の修正が確認された。ＨＢＢ遺伝子座へのリンカーの挿入はすべてのクローンにおいて検出された。さらに、調査したクローンのいずれも、相同アームの末端に対応するゲノム領域において任意の望ましくない変異（例えば、さらなる挿入、欠失、または逆位）を示さなかった。
【０１６０】
ＨＢＢ遺伝子を編集するｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ベクターの能力をさらに確認するために、２つのさらなるＬＣＬ、ＧＭ１６２６６およびＧＭ１６２６７を使用した。これらのＬＣＬも、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から得、ＧＭ１６２６５のドナーとは異なるドナーから収集された。両ＬＣＬは、ＨＢＢのイントロン１の位置２０にＡ〜Ｔへの変異を有した。ＧＭ１６２６５の培養および形質導入と同じ方法に従い、細胞を、ＡＡＶＨＳＣ１７カプシドにパッケージングされたｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４で形質導入した。
【０１６１】
図３Ｂに示されるように、約２．２ｋｂのＰＣＲアンプリコンがＡＡＶＨＳＣ１７−ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４で形質導入された細胞から検出されたが、形質導入されなかった細胞からは検出されなかった。シーケンシングの結果は、ＳＣＤ変異が３つすべてのＬＣＬ（ＧＭ１６２６５細胞を含む）からの形質導入された細胞において修正され、望ましくない変異（例えば、さらなる挿入、欠失、または逆位）が相同アームの末端に対応するゲノム領域において検出されなかったことを示した。シーケンシングの結果により、適切なリンカーの挿入および相同アームからゲノムへのシームレスな移行も確認された。
【０１６２】
上記の結果は、ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ベクターが複数のＳＣＤ細胞株において変異ＨＢＢ遺伝子を野生型配列に戻すことができることを示す。したがって、ベータサラセミアなどの他の遺伝性疾患におけるＨＢＢ遺伝子のエクソン、イントロン、または調節配列における変異もｈＨＢＢ−ｈＬ−０１４ベクターを使用して修正可能なはずである。
【０１６３】
実施例３：ＨＢＢのゲノム配列を含むＨＢＢ修正ベクター
この実施例は、ＨＢＢ遺伝子における変異を修正することができるＨＢＢのゲノム配列を含むＡＡＶベースのＨＢＢ修正ベクターを提供する。
【０１６４】
ａ）ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬ−００１
図４Ａに示されるＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬ−００１は、すべてのエクソン、すべてのイントロン、およびポリアデニル化配列を含むＨＢＢゲノム配列を含む。このベクターはさらに、ＨＢＢ転写開始部位から上流の８００ｂｐを包含する５’領域（図４Ａにおいて「ＨＢＢ  ＨＡＬ」と称される）、およびＨＢＢポリアデニル化配列から下流の８００ｂｐを包含する３’領域（図４Ａにおいて「ＨＢＢ  ＨＡＲ」と称される）を含む。ｈＨＢＢ−ｈＬ−００１ベクターは、配列番号３１（ＴＩ  ＲＥリンカーを有する）または配列番号３２（ＴＩ  ＲＥリンカーを有しない）に記載のヌクレオチド配列を含み、５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１８の配列を有する）および３’ＩＴＲ（例えば、配列番号１９の配列を有する）をさらに含む。このベクターは、ＨＢＢのエクソンおよびイントロンにおける変異だけでなく、ベータサラセミアにおいて観察されるＨＢＢ発現に影響を及ぼす５’および３’非翻訳領域における変異も修正する。
【０１６５】
ｂ）ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬＷ−０１３
図４Ｂに示されるＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬＷ−０１３は、エクソン１、２、および３のコード領域のＤＮＡ配列が、対応する野生型配列に完全に同一ではなく、約６７％同一であるように沈黙改変されることを除き、ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬ−００１と同じ遺伝要素を含む。低減された配列同一性は、コドン改変によって生じ、変性コドンは、コードされたアミノ酸を変更することなく、元のコドンに対して置換される。この沈黙コドン改変は、ＨＢＢの発現レベルを大幅に改変しないと予想される。実際、これは、エプシロングロビン（ＨＢＥ）、デルタグロビン（ＨＢＤ）、ガンマグロビン１（ＨＢＧ１）、ガンマグロビン２（ＨＢＧ２）、およびＨＢＢ偽遺伝子ＨＢＢＰなどの他のグロビン遺伝子または偽遺伝子との、ＨＢＢエクソンの相同性を低減し、それにより、他のゲノム遺伝子座でのこのベクターの望ましくない組換えの可能性を低減する。特定の実施例では、エクソン１、エクソン２、およびエクソン３のコード領域の沈黙改変配列は、それぞれ、配列番号４３、４４、および４５に記載される。ｈＨＢＢ−ｈＬＷ−０１３ベクターは、配列番号３３（ＴＩ  ＲＥリンカーを有する）または配列番号３４（ＴＩ  ＲＥリンカーを有しない）に記載のヌクレオチド配列を含み、５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１８の配列を有する）および３’ＩＴＲ（例えば、配列番号１９の配列を有する）をさらに含む。
【０１６６】
ｃ）ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬ−０１１
図４Ｃに示されるＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬ−０１１は、ＨＢＢポリアデニル化配列から下流の３’領域（図４Ｃにおいて、「ＨＢＢ  ＨＡＲ」と称される）が約１００ｂｐの長さであることを除き、ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬ−００１と同じ遺伝要素を含む。この修飾は、プロモーター配列が転写因子および補助因子を動員し、それにより、相同組換えの効率を低減するため、ＨＢＢポリアデニル化配列から約１００ｂｐ下流に位置する他の遺伝子の転写プロモーター配列（例えば、ＧＡＴＡ１、ＭＹＣ等）の包含を最小限に抑えるために行われる。加えて、転写プロモーター配列の包含は、ベクターからのＨＢＢの異常発現を増加させる場合がある。ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１１ベクターは、配列番号３５（ＴＩ  ＲＥリンカーを有する）または配列番号３６（ＴＩ  ＲＥリンカーを有しない）に記載のヌクレオチド配列を含み、５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１８の配列を有する）および３’ＩＴＲ（例えば、配列番号１９の配列を有する）をさらに含む。
【０１６７】
ｄ）ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬＷ−０１２
図４Ｄに示されるＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬＷ−０１２は、エクソン１、２、および３のコード領域のＤＮＡ配列が、対応する野生型配列に６７％同一であるように沈黙改変されることを除き、ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＬ−０１１と同じ遺伝要素を含む。特定の実施例では、エクソン１、エクソン２、およびエクソン３のコード領域の沈黙改変配列は、それぞれ、配列番号４３、４４、および４５に記載される。ｈＨＢＢ−ｈＬＷ−０１２ベクターは、配列番号３７（ＴＩ  ＲＥリンカーを有する）または配列番号３８（ＴＩ  ＲＥリンカーを有しない）に記載のヌクレオチド配列を含み、５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１８の配列を有する）および３’ＩＴＲ（例えば、配列番号１９の配列を有する）をさらに含む。
【０１６８】
この実施例の４つのＨＢＢ修正ベクターの各々は、修正された遺伝子の検出を容易にするために、固有の制限エンドヌクレアーゼの認識および切断部位を含むリンカー配列を含む。このリンカー配列は、開始コドンから１１７ｂｐのイントロン１に位置する。修正されたＨＢＢのｍＲＮＡスプライシングを維持するために、イントロン１の主要ドナーおよびアクセプター部位の破壊を避ける。
【０１６９】
上述の４つのＨＢＢ修正ベクターの各々を生成し、ＡＡＶＨＳＣ１７にパッケージングした。初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣは、実施例１に記載される方法を使用してウイルスで形質導入され、組み込みは、実施例２に記載されるＴＩアッセイにより評価された。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、ｈＨＢＢ−ｈＬ−００１、ｈＨＢＢ−ｈＬ−０１１およびｈＨＢＢ−ｈＬＷ−０１２はすべて、ＨＢＢ遺伝子を編集することができた。
【０１７０】
ゲノム編集の効率は、次世代ンシーケンシング（ＮＧＳ）により定量的に測定された。ＰＣＲ反応は、表６に示される、相同アームの外側のゲノムの領域に特異的なプライマーを使用して行われた。これらのプライマーは、未編集および編集された対立遺伝子から２，３４２ｂｐの産物を増幅するが、ＡＡＶベクターは増幅しない。
【表６】
2021500070.tif 000007
【０１７１】
ＰＣＲ反応物は、次のように構成された：最大５０μｌのＰＣＲ水、１０μｌの５×Ｑ５緩衝液、５μｌのベタイン、１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μｌのＨＢＢ３５０逆方向プライマー（２５μＭ）、１μｌのＨＢＢ  Ｌ  ＮＧＳ  Ｓ１プライマー（２５μＭ）、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、および１μｌの  Ｑ５  Ｈｉｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ。ＰＣＲ装置は、次のように設定された：９８℃で３０分間の初期変性、９５℃で１０秒間の変性、６５℃で３０秒間のアニーリング、そして７２℃で２分間の伸張を３０サイクル、および７２℃で５分間の最終伸長。
【０１７２】
正しいサイズのＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動により単離し、標準プロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して抽出した。ゲル抽出アンプリコンにおけるベクターゲノムの不在は、ベクター特異的プライマー、および陽性対照として既知数のベクター特異的ゲノムテンプレートを使用して、ＰＣＲにより確認した。ベクターゲノムの不在を確認するために、次のＰＣＲ条件を使用した：９８℃で３０分間の初期変性、９８℃で１０秒間の変性、６６℃で３０秒間のアニーリング、そして７２℃で１分間の伸張を３０サイクル、および７２℃で２分間の最終伸長。使用された順方向プライマーは、ＡＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＣ（配列番号１０８）であり、使用された逆方向プライマーは、ＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴ（配列番号１０９）であり、１，７９７塩基対のアンプリコンを増幅する。
【０１７３】
抽出したＰＣＲ産物は、下に記載されるように、ＮＧＳシーケンシングおよび／またはデジタルＰＣＲ定量に使用された。ＮＧＳシーケンシングの場合では、抽出したＰＣＲ産物を、表７に示されるプライマーを使用して、１回のネステッドＰＣＲに供した。各試料は、固有の順方向および逆方向プライマーの組み合わせを有し、各正しいＰＣＲ産物のサイズは約３８８ｂｐであった。ＰＣＲ装置は、次のように設定された：９８℃で３０分間の初期変性、９８℃で１０秒間の変性、７２℃で３０秒間のアニーリング、そして７２℃で３０秒間の伸張を３０サイクル、および７２℃で２分間の最終伸長。
【表７】
2021500070.tif 000008
【０１７４】
アンプリコンのサイズは、ゲル電気泳動により確認され、ＰＣＲ産物は、標準プロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して精製された。すべての試験した試料からのアンプリコンを等モル濃度で混合し、濃度をＡｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌバイオアナライザーで確認した。ＭｉＳｅｑ  Ｖ２  ３００サイクルキットを使用して、試料をシーケンシングした。
【０１７５】
表８は、ＮＧＳ分析から決定される、リンカー配列が存在する、または不在の許容リード数ならびにＨＢＢ配列を有するリード数を示す。リンカー配列の存在がＡＡＶベクター組み込みを示したため、リンカーを有する対立遺伝子の割合は、一般的に０．１％〜１％である、それらのベクターの組み込みの対立遺伝子頻度を表す。
【表８】
2021500070.tif 000009
【０１７６】
デジタルＰＣＲの場合では、ＢｉｏＲａｄ  ＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、抽出したＰＣＲ産物をデジタルＰＣＲ分析に供した。編集は、ゲノム標的と挿入したベクターペイロード（リンカー）との間の連鎖を計算することにより決定され、変異型間の遺伝連鎖に使用された方法を用いた確率による一致見込みに関して、ベクターおよびゲノムの両方を含む分配した液滴の量を検出することによって測定された（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｐｈａｓｉｎｇ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．（２０１５）１０（３）：ｅ０１１８２７０を参照されたい）。０．１ｎｇ／ｕｌの濃度のゲノムＤＮＡを、連鎖について１試料につき最低３回の実験にわたって分析し、ベクター特異的プローブセットおよびゲノム特異的プローブセットを用いて多重ｄｄＰＣＲを使用して測定した。プライマーおよびプローブセットは以下の通りである。
【表９】
2021500070.tif 000010
【０１７７】
既知量の編集された材料に対して上記の方法によりゲノム編集／連鎖を測定するために、標準的なＤＮＡシリーズを創出した。標準品は、それぞれ、１００の未編集ゲノム／ｕｌ、１０００のエピソームベクター／ｕｌ、ならびに１／ｕｌ、５／ｕｌ、１０／ｕｌ、１５／ｕｌ、２０／ｕｌ、および２５の編集された対立遺伝子／ｕｌの様々なクローニングされた陽性対立遺伝子からなった。各試料の遺伝連鎖の量が測定され、各試料の未編集対編集された対立遺伝子の既知の比率に対してプロットされた（Ｒ２＝０．９７２、ピアソン相関ｐ＜０．００１）。
【０１７８】
１．５×１０５のＭＯＩの様々なＡＡＶＨＳＣ７  ＨＢＢ編集ベクターで形質導入された初代ＣＤ３４＋混合臍帯血細胞のＨＢＢ遺伝子座の編集は、デジタルＰＣＲにより測定された。形質導入４８時間後に細胞を採取し、ＰＣＲ産物のｏｕｔ／ｏｕｔ  ＰＣＲおよびデジタルＰＣＲ分析により編集された対立遺伝子の割合についてアッセイした。図６は、示される試料にわたって編集された遺伝子座の画分を示す。
【０１７９】
実施例４：ＨＢＢコード配列またはその一部分を含むＨＢＢ修正ベクター
この実施例は、ＨＢＢコード配列またはその一部分を、ＨＢＢ遺伝子に、例えば、開始コドンの後またはイントロン１に挿入することができるＨＢＢ修正ベクターを提供する。挿入された配列は、天然の転写調節要素の制御下で、天然の遺伝子座から転写および翻訳され、それにより、機能性ＨＢＢタンパク質の発現を回復させることができる。
【０１８０】
ＨＢＢ修正ベクターの各々は、第２のコドンから終止コドンにＨＢＢコード配列またはその一部分を含んだ。ＨＢＢコード配列またはその一部分の後にはＳＶ４０ポリアデニル化配列が続き、これは、適切な発現を支持し、内在性ＨＢＢ遺伝子の残りのさらなる転写を大幅に低減するのに十分に強い。固有の制限エンドヌクレアーゼの認識および切断部位を含む標的組み込み制限カセット（「ＴＩ  ＲＥカセット」）は、任意に、ポリアデニル化配列から下流に挿入され、所望の相同組換えの検出を容易にする。
【０１８１】
ａ）ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＡ−００９
図７Ａに示されるＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＡ−００９は、第２のコドンから終止コドン（配列番号２７のヌクレオチド４〜４４４）に野生型ＨＢＢコード配列の一部分、続いて、上述のＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。ベクターは、ＨＢＢ開始コドンから上流に野生型ゲノム配列を含み、かつＨＢＢ開始コドンを含む５’相同アーム（図７Ａにおいて「ＨＢＢ  ＨＡＬ」と称される）、ならびにＨＢＢ開始コドンから下流に野生型ゲノム配列を含むが、ＨＢＢ開始コドンを含まない３’相同アーム（図７Ａにおいて「ＨＢＢ  ＨＡＲ」と称される）をさらに含む。５’相同アームおよび３’相同アームの各々は、長さが約８００ｂｐである。ｈＨＢＢ−ｈＡ−００９ベクターは、配列番号３９に記載のヌクレオチド配列を含み、５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１８の配列を有する）および３’ＩＴＲ（例えば、配列番号１９の配列を有する）をさらに含む。５’相同アームは、一部のベータサラセミア患者において観察されるＨＢＢ発現に影響を及ぼす開始コドンおよび／または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）における変異を修正する能力を有する。結果として、ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＡ−００９の組み込みは、５’ＵＴＲ、コード配列、または３’ＵＴＲにおける変異によって損なわれた野生型ＨＢＢの発現を回復させることができる。
【０１８２】
ｂ）ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＡＷ−００２
図７Ｂに示されるＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＡＷ−００２は、ＨＢＢコード配列の一部分が、野生型ｃＤＮＡ配列の対応する領域に６７％同一である配列番号４７に対して沈黙改変されることを除き、ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＡ−００９と同じ遺伝要素を含む。実施例３に記載されるように、このコドン改変は、ＨＢＢの発現レベルを大幅に改変しないと予想される。代わりに、これは、他のグロビン遺伝子および偽遺伝子とのＨＢＢエクソンの相同性を低減し、それにより、他のゲノム遺伝子座でのこのベクターの望ましくない組換えを低減する。ｈＨＢＢ−ｈＡＷ−００２ベクターは、配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を含み、５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１８の配列を有する）および３’ＩＴＲ（例えば、配列番号１９の配列を有する）をさらに含む。
【０１８３】
ｃ）ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈ１−０１０
図７Ｃに示されるＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈ１−０１０は、相同組換えにより野生型ＨＢＢコード配列をイントロン１に挿入するように設計される。具体的には、挿入部位は、ＨＢＢ遺伝子のヌクレオチド１６０と１６１との間であり、挿入は、イントロン１の主要スプライスドナー部位の破壊を避ける。このベクターの編集要素（挿入された領域）は、５’から３’にスプライスアクセプター部位（図７Ｃの「ＳＡ」、例えば、配列番号１４）、組み込みによりＨＢＢ開始コドンとインフレームのリボソームスキッピング要素（図７Ｃの「Ｔ２Ａ」、例えば、配列番号７２）、野生型ＨＢＢコード配列（配列番号２７）、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。組み込みにより、ＨＢＢ遺伝子座から転写されたｐｒｅ−ｍＲＮＡは、５から３’に：内在性ＨＢＢのエクソン１、イントロン１の最初の６８ヌクレオチド（イントロン１の５’端の内在性スプライスドナーを含む）、ｈＨＢＢ−ｈ１−０１０ベクターにより導入されたスプライスアクセプター、リボソームスキッピング要素、ＨＢＢコード配列、およびポリ（Ａ）テールを含む。スプライシング後、ｍＲＮＡは、５’から３’に内在性ＨＢＢのエクソン１、インフレームリボソームスキッピング要素、ＨＢＢコード配列、およびポリ（Ａ）テールを含む。リボソームスキッピング要素は、部分リボソームスキッピングペプチドと融合したエクソン１の末端で終結した切り詰められたＨＢＢペプチド、および完全長ＨＢＢポリペプチドのＮ末端に融合したリボソームスキッピングペプチドからのプロリンの２つのポリペプチドの生成をもたらす。
【０１８４】
ｈＨＢＢ−ｈ１−０１０ベクターは、挿入部位から上流の野生型ゲノム配列を含む５’相同アーム（図７Ｃにおいて「ＨＢＢ  ＨＡＬ」と称される）、ならびに挿入部位から下流の野生型ゲノム配列を含む３’相同アーム（図７Ｃにおいて「ＨＢＢ  ＨＡＲ」と称される）をさらに含む。５’相同アームおよび３’相同アームの各々は、長さが約８００ｂｐである。ｈＨＢＢ−ｈ１−０１０ベクターは、配列番号４１に記載のヌクレオチド配列を含み、５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１８の配列を有する）および３’ＩＴＲ（例えば、配列番号１９の配列を有する）をさらに含む。５’相同アームは、一部のベータサラセミア患者において観察されるＨＢＢ発現に影響を及ぼす５’ＵＴＲにおける変異を修正し、５’ＵＴＲ、コード配列、または３’ＵＴＲにおける変異によって損なわれた野生型ＨＢＢの発現を回復させる能力を有する。
【０１８５】
ｄ）ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈ１Ｗ−００８
図７Ｄに示されるＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈ１Ｗ−００８は、ＨＢＢコード配列が、野生型ｃＤＮＡ配列の対応する領域に６７％同一であるように沈黙改変されることを除き、ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈ１−０１０と同じ遺伝要素を含む。実施例３に記載されるように、この配列修飾は、ＨＢＢの発現レベルを大幅に改変しないと予想される。代わりに、これは、他のグロビン遺伝子および偽遺伝子とのＨＢＢエクソンの相同性を低減し、それにより、他のゲノム遺伝子座に対するこのベクターの望ましくないものを低減する。具体的な実施例では、沈黙改変されたＨＢＢコード配列は、配列番号４７に記載される。ｈＨＢＢ−ｈ１Ｗ−００８ベクターは、配列番号４２に記載のヌクレオチド配列を含み、５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１８の配列を有する）および３’ＩＴＲ（例えば、配列番号１９の配列を有する）をさらに含む。
【０１８６】
ｅ）ＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＥ３Ｃ−００１
図７Ｅに示されるＨＢＢ修正ベクターｈＨＢＢ−ｈＥ３Ｃ−００１は、相同組換えにより、終止コドンの直後に、ＨＢＢコード配列をＨＢＢ遺伝子のエクソン３に挿入するように設計される。このベクターの編集要素（挿入された領域）は、５’から３’に沈黙改変されたＨＢＢコード配列（配列番号９９、野生型ＨＢＢコード配列に８５％同一）とインフレームのリボソームスキッピング要素（図７Ｅの「Ｐ２Ａ」、例えば、配列番号７４）、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列（配列番号７７）を含む。ＨＢＢコード配列の沈黙改変は、コード配列から発現されるタンパク質のレベルを増加させる、望ましくないゲノム遺伝子座へのベクターのオフターゲットをもたらす可能性がある複雑度が低い配列を除去する、かつ／または編集要素とゲノムとの間の相同性を低減し、それにより、相同アームによってではなく、編集要素によって媒介される望ましくない組み込みを低減するように設計される。
【０１８７】
組み込みにより、ＨＢＢ遺伝子座から転写されたｍＲＮＡは、５’から３’に終止コドンに隣接して５’の天然のＨＢＢ  ｍＲＮＡの一部分、リボソームスキッピング要素、沈黙改変されたＨＢＢコード配列、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。リボソームスキッピング要素は、リボソームスキッピングペプチドのＮ末端部分と融合した天然の完全長ＨＢＢペプチド、および完全長野生型ＨＢＢポリペプチドのＮ末端に融合したリボソームスキッピングペプチドからのプロリン残基の２つのポリペプチドの生成をもたらす。
【０１８８】
ｈＨＢＢ−ｈＥ３Ｃ−００１ベクターは、挿入部位から上流の野生型ゲノム配列の配列番号１０１の配列を含む５’相同アーム（図７Ｅにおいて「ＨＡＬ」と称される）、ならびに挿入部位から下流の野生型ゲノム配列の配列番号１０２の配列含む３’相同アーム（図７Ｅにおいて「ＨＡＲ」と称される）をさらに含む。
【０１８９】
ｈＨＢＢ−ｈＥ３Ｃ−００１のヌクレオチド配列は、配列番号１０４に記載される。ベクターは、５’ＩＴＲ（例えば、配列番号１８の配列を有する）および３’ＩＴＲ（例えば、配列番号１９の配列を有する）をさらに含む。
【０１９０】
ｈＨＢＢ−ｈ１−０１０およびｈＨＢＢ−ｈ１Ｗ−００８の組み込み効率は、ＲＫＯおよびＬＣＬ細胞において評価された。ＧＭ１６２６５  ＬＣＬ細胞は、実施例１に記載される方法を使用して、ＡＡＶＨＳＣ７にパッケージングされたＨＢＢ修正ベクターで形質導入された。
【０１９１】
ＲＫＯ細胞はＡＴＣＣから得た。細胞を、１０％のＦＣＳおよび２ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＤＭＥＭ中で培養した。それらを、６ウェルプレートのウェル当たり７５０，０００細胞の密度で蒔いた。次の方法を使用して、細胞を形質導入した。蒔いた２４時間後に、（ａ）２５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭに希釈した２μｇのＨＢＢ編集プラスミド、および（ｂ）２５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭに希釈した５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を混合し、１５分間インキュベートすることによって調製されたトランスフェクション混合物を添加することにより、細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を採取した。
【０１９２】
表９に記載の配列を有するプライマーを使用して、組み込みをＴＩアッセイにより評価した。ＳＡ−２Ａ−ＦＭ１およびＳＡ−２Ａ−ＦＭ２プライマーは、ｈＨＢＢ−ｈ１−０１０またはｈＨＢＢ−ｈ１Ｗ−００８ベクターによりゲノムに挿入されたスプライスアクセプターおよびＴ２Ａ要素に特異的であり、ＨＢＢ−Ｏｕｔ−ＲＭ２プライマーは、３’相同アームから下流のゲノムの領域に特異的であった。ＨＢＢ−Ｏｕｔ−ＲＭ２とＳＡ−２Ａ−ＦＭ１またはＳＡ−２Ａ−ＦＭ２とのプライマー対は、形質導入されていない細胞の産物または修正ベクター単独からの産物を増幅しない。ＳＡ−２Ａ−ＦＭ１およびＨＢＢ−Ｏｕｔ−ＲＭ２を使用したＰＣＲ反応は、ｈＨＢＢ−ｈ１−０１０またはｈＨＢＢ−ｈ１Ｗ−００８ベクターが５’および３’相同アームを介した相同組換えにより組み込まれる場合、１，８８１ｂｐアンプリコンを生成し、ベクターが編集要素の５’相同アームおよびエクソン２配列を介した相同組換えにより組み込まれる場合、１，１８８ｂｐアンプリコンを生成するであろう。ＳＡ−２Ａ−ＦＭ２およびＨＢＢ−Ｏｕｔ−ＲＭ２を使用したＰＣＲ反応も、これら２つの組み込み方法から異なるサイズのアンプリコンを生成するであろう。
【０１９３】
ＰＣＲ反応物は、次のように構成された：最大５０μｌのＰＣＲ水、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰｓ、１μｌの５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μｌの５×Ｑ試薬、２．５μｌのＴＩ順方向プライマー（５μＭ濃度）、２．５μｌのＴＩ逆方向プライマー（５μＭ濃度）、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、および０．５μｌのＨｏｔＳｔａｒＴａｑポリメラーゼ。ＰＣＲ装置は、次のように設定された：９５℃で１５分間の初期変性、９４℃で１０秒間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、そして７２℃で３分間の伸張を４０サイクル、および６８℃で１０分間の最終伸長。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動により分析された。
【表１０】
2021500070.tif 000011
【０１９４】
図８に示されるように、ＳＡ−２Ａ−ＦＭ１およびＨＢＢ−Ｏｕｔ−ＲＭ２プライマーを使用して、１，８７４ヌクレオチドの長さを有する標的組み込みＰＣＲ産物がｈＨＢＢ−ｈ１Ｗ−００２で形質導入されたＲＫＯ細胞において検出され、所望の様式のベクターの良好な組み込みを示す。対照的に、ＨＢＢ遺伝子座での編集要素（３’相同アームではなく）のエクソン２の組換えにより生成された短縮ＰＣＲ産物は、ｈＨＢＢ−ｈ１−０１０で形質導入されたＲＫＯおよびＬＣＬ細胞において検出された。同様の結果がＳＡ−２Ａ−ＦＭ２およびＨＢＢ−Ｏｕｔ−ＲＭ２プライマーを使用したＰＣＲから得られた。この結果は、編集要素における沈黙コドン改変が望ましくない組換えを低減または排除し、それにより、ＨＢＢ遺伝子の正確な編集を確実にすることを示す。
【０１９５】
実施例５：ＨＢＢ変異のインビボ修正
この実施例は、前の実施例に記載されるものなどのＨＢＢ修正ベクターを調査するための動物モデルを提供する。ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪの遺伝子型を有するＮＳＧマウスは、亜致死的に放射線を照射され、初代ヒト野生型ＣＤ３４＋ＨＳＣを移植することにより造血再構成を受けた。ＮＳＧマウスにおけるヒトＣＤ３４＋ＨＳＣの生着レベルは、フローサイトメトリーにより、ヒトおよびマウスＣＤ４５＋細胞の存在について末梢血をアッセイすることによって移植の１２週間後に決定された。特定のＡＡＶベクターの組み込み効率を評価するために、末梢血中に２５％を超える循環ヒト細胞を有するマウスを使用して、インビボで初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを形質導入した。
【０１９６】
ＡＡＶＳ１−ＦＰベクターをＡＡＶＨＳＣ７およびＡＡＶＨＳＣ１７にパッケージングし、再構成されたＮＳＧマウスにウイルス粒子を１．２２×１０１３〜１．５４×１０１３  ベクターゲノム／ｋｇの用量で静脈内投与した。血液、骨髄、および脾臓の試料を投与の４週間後に収集した。当該技術分野で既知のフェノール／クロロホルム抽出方法により試料からＤＮＡを精製し、実施例１に記載される方法を使用して、抽出したＤＮＡをｄｄＰＣＲにより分析した。
【０１９７】
ＡＡＶＨＳＣ７およびＡＡＶＨＳＣ１７群からのデータをプールした。図９に示されるように、ＡＡＶＳ１−ＦＰベクターを投与された移植ＮＳＧマウスにおいて、組み込みの対立遺伝子頻度は、血液において約３％、骨髄において約１％であった。この結果は、ＡＡＶＨＳＣ７およびＡＡＶＨＳＣ１７カプシドがＡＡＶＳ１遺伝子座への組み込みのためのベクターを効率的に送達し、ＨＢＢ編集治療用ベクターを送達するために潜在的に使用され得ることを示唆した。
【０１９８】
ＨＢＢ欠損初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣで再構成された修飾された動物モデルは、修正ベクターまたは前述の実施例に記載される修正ベクターを使用してＨＢＢ変異の修正を試験するのに有用である。例えば、ＡＡＶクレードＦカプシド、例えば、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ１５、またはＡＡＶＨＳＣ１７カプシドにパッケージングされた修正ベクターは、再構成された動物に投与することができる。組み込み効率は、血液または骨髄試料を収集し、所望の相同組換えが広範な集団または赤血球の前駆細胞などの特定の細胞型のいずれかで生じた細胞の割合を定量化することにより測定することができる。
【０１９９】
ＨＢＢ欠損初代ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣで再構成された動物は、ＨＢＢ遺伝子の欠如により異常ヘモグロビン症を顕在化すると予想され、様々なＡＡＶカプシドにパッケージングされたＨＢＢ修正ベクターの有効性および安全性を決定するために使用され得る。有効性は、網状赤血球数、全血球数（ＣＢＣ）、血液塗抹、およびベクター配列の標的組み込みを測定することにより評価される。安全性は、肝トランスアミナーゼ、例えば、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）のレベルを測定することにより評価される。
【０２００】
このモデルを使用して、各投与後のＨＢＢ修正の寿命を評価し、それにより、投与レジメンを最適化することもできる。
＊  ＊  ＊
【０２０１】
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が前述の説明および添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【０２０２】
本明細書に列挙されるすべての参考文献（例えば、刊行物または特許または特許出願）は、その全体が参照により、また各個々の参考文献（例えば、刊行物または特許または特許出願）がすべての目的のために参照によりその全体が具体的かつ個別に本明細書に組み込まれるように示されるのと同程度まで、すべての目的において本明細書に組み込まれる。他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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