(57)【要約】ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物を使用する方法が提供される。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、ヒトトランスサイレチンタンパク質、またはその断片がヒトトランスサイレチンに由来するキメラトランスサイレチンタンパク質を発現する。ヒトＴＴＲ標的化試薬、例えばヒトＴＴＲを標的にするように設計されたヌクレアーゼ剤の効能をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するために、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含むそのような非ヒト動物を使用する方法が提供される。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含むそのような非ヒト動物を作製するための方法も提供される。
2021500867.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む、非ヒト動物。
【請求項２】
Ｔｔｒコード配列と非コード配列の両方を含む前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座のある領域が欠失し、ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含む対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が内因性Ｔｔｒプロモーターを含み、前記ヒトＴＴＲ配列が前記内因性Ｔｔｒプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１または２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の少なくとも１つのイントロンおよび少なくとも１つのエクソンが欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項５】
前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の前記Ｔｔｒコード配列全体が欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項６】
Ｔｔｒ開始コドンからＴｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、請求項５に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座がヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項８】
内因性Ｔｔｒ  ５’非翻訳領域は欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項９】
前記Ｔｔｒ開始コドンから前記Ｔｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列およびヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含むヒトＴＴＲ配列で置き換えられており、
前記内因性Ｔｔｒ  ５’非翻訳領域は欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、
前記内因性Ｔｔｒプロモーターは欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、
前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
（ｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座の前記ヒトＴＴＲ配列が、配列番号１８に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか；または
（ｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号１に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むタンパク質をコードし；
（ｉｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号９０に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むコード配列を含むか；または、
（ｉｖ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号１４または１５に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、
請求項９に記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座がシグナルペプチドを含むトランスサイレチン前駆体タンパク質をコードし、前記シグナルペプチドをコードする前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、請求項１から４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンが欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、請求項１１に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンおよび第１のイントロンが欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、請求項１２に記載の非ヒト動物。
【請求項１４】
第２のＴｔｒエクソンの開始からＴｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座がヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１６】
前記第２のＴｔｒエクソンから前記Ｔｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列およびヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含むヒトＴＴＲ配列で置き換えられており、
前記内因性Ｔｔｒ  ５’非翻訳領域が欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、
前記内因性Ｔｔｒプロモーターが欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、
請求項１１から１５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１７】
（ｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座の前記ヒトＴＴＲ配列が、配列番号１９に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか；または
（ｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号２に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むタンパク質をコードし；
（ｉｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号９１に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むコード配列を含むか；または
（ｉｖ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号１６または１７に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、
請求項１６に記載の非ヒト動物。
【請求項１８】
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が選択カセットもレポーター遺伝子も含まない、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項１９】
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座についてホモ接合性である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２０】
哺乳動物である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２１】
ラットまたはマウスである、請求項２０に記載の非ヒト動物。
【請求項２２】
マウスである、請求項２１に記載の非ヒト動物。
【請求項２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価する方法であって、
（ａ）請求項１から２２のいずれか一項に記載の非ヒト動物に前記ヒトＴＴＲ標的化試薬を投与すること；および
（ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価すること
を含む方法。
【請求項２４】
前記投与することが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達または流体力学的送達（ＨＤＤ）を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記投与することがＬＮＰ媒介性送達を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＬＮＰの用量が約０．１ｍｇ／ｋｇから約２ｍｇ／ｋｇの間にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記投与することがＡＡＶ８媒介性送達を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から肝臓を単離し、前記肝臓における前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価することを含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ｂ）が、前記肝臓以外の臓器または組織における前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬がゲノム編集剤であり、前記評価することが前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座の改変を評価することを含む、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記評価することが、前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記評価することが、前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座によってコードされるＴｔｒメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、請求項２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記評価することが、前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座によってコードされるＴＴＲタンパク質の発現を測定することを含む、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＴＴＲタンパク質の発現を評価することが、前記非ヒト動物における前記ＴＴＲタンパク質の血清レベルを測定することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記活性が前記非ヒト動物の前記肝臓で評価される、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬が、ヒトＴＴＲ遺伝子のある領域を標的にするように設計されたヌクレアーゼ剤を含む、請求項２３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質、および前記ヒトＴＴＲ遺伝子におけるガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬が外因性ドナー核酸をさらに含み、前記外因性ドナー核酸が前記ヒトＴＴＲ遺伝子と組み換わるように設計されている、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記外因性ドナー核酸が一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を最適化する方法であって、
（Ｉ）ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む第１の非ヒト動物において、請求項２３から４０のいずれか一項に記載の方法を１回目に実行すること、
（ＩＩ）ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含む前記ヒトＴＴＲ配列を含む前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む第２の非ヒト動物において、変数を変更し、ステップ（Ｉ）の方法を変更した前記変数で２回目に実行すること；および
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）の前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性をステップ（ＩＩ）の前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択すること
を含む方法。
【請求項４２】
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、前記ヒトＴＴＲ標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記投与することがＬＮＰ媒介性送達を含み、ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数がＬＮＰ製剤である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、前記ヒトＴＴＲ標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の濃度または量である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の形態である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ヒトＴＴＲ標的化試薬である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬が、Ｃａｓタンパク質、およびヒトＴＴＲ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、ガイドＲＮＡ配列または前記ガイドＲＮＡ標的配列である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｃａｓタンパク質および前記ガイドＲＮＡの各々がＲＮＡの形態で投与され、ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数がＣａｓ  ｍＲＮＡのガイドＲＮＡに対する比である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数がガイドＲＮＡの改変である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に：
（ｉ）前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の標的配列を標的にするヌクレアーゼ剤；および
（ｉｉ）前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同アームおよび前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同アームによって挟まれた前記ヒトＴＴＲ配列を含む核酸挿入断片を含む標的化ベクター
を導入するステップであって、前記標的化ベクターは、前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座で組み換えて、前記ヒトＴＴＲ配列を含む前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む遺伝子改変非ヒトＥＳ細胞を生成する、ステップと；
（ｂ）前記遺伝子改変非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主の胚に導入するステップと；
（ｃ）代理母で前記非ヒト動物宿主の胚を懐胎させるステップであって、前記代理母が、前記ヒトＴＴＲ配列を含む前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含むＦ０後代の遺伝子改変非ヒト動物を生成するステップと
を含む方法。
【請求項５３】
前記ヌクレアーゼ剤がＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的化ベクターは、長さが少なくとも１０ｋｂであるか、または前記５’および３’相同アームの長さの合計が少なくとも１０ｋｂである、大きな標的化ベクターである、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記非ヒト動物がマウスまたはラットである、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む、非ヒト動物細胞。
【請求項５９】
ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム。
【請求項６０】
内因性非ヒト動物Ｔｔｒ遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同アームおよび前記内因性非ヒト動物Ｔｔｒ遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同アームによって挟まれた、ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む核酸挿入断片を含む標的化ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その各々はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年９月２９日に出願の米国特許出願第６２／５６５，９８０号、２０１８年６月１日に出願の米国特許出願第６２／６７９，１４２号および２０１８年８月２１日に出願の米国特許出願第６２／７２０，２９２号の利益を請求する。
【０００２】
ＥＦＳ  ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
ファイル５１９８３２ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載された配列表は１３９キロバイトであり、２０１８年９月２５日に作成され、本明細書に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、甲状腺ホルモンおよびレチノールの対するレチノール結合タンパク質を運ぶ血清および脳脊髄液において見出されるタンパク質である。肝臓が血液中にＴＴＲを分泌し、脈絡叢がそれを脳脊髄液中に分泌する。ＴＴＲは、網膜の色素沈着上皮においても生成され、硝子体液中に分泌される。アミロイド疾患老人性全身性アミロイド症（ＳＳＡ）、家族性アミロイド多発性ニューロパシー（ＦＡＰ）および家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）では、誤って折り畳まれて凝集したＴＴＲが複数の組織および臓器に蓄積する。
【０００４】
ＴＴＲアミロイド症疾患のための１つの有望な治療アプローチは、患者においてＴＴＲ負荷を低減することである。しかし、内因性Ｔｔｒ遺伝子座でヒトＴＴＲ標的化試薬の真のヒト標的または真のヒト標的にごく近いものを提供し、それによって、生きている動物におけるそのような薬剤の効能および作用様式の試験、ならびにヒト化タンパク質およびヒト化遺伝子が存在するＴＴＲの唯一のバージョンである状況における薬物動態学的および薬力学研究を可能にする、適する非ヒト動物の必要性がまだある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物を使用する方法が提供される。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物のゲノムまたは細胞も提供される。
【０００６】
一態様では、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物が提供される。そのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含むことができる。一部のそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座を含むことができ、ここで、Ｔｔｒコード配列と非コード配列の両方を含む内因性Ｔｔｒ遺伝子座のある領域は欠失し、ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含む対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている。必要に応じて、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、内因性Ｔｔｒプロモーターを含む。必要に応じて、ヒトＴＴＲ配列は、内因性Ｔｔｒプロモーターに作動可能に連結されている。必要に応じて、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の少なくとも１つのイントロンおよび少なくとも１つのエクソンが欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている。
【０００７】
一部のそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、内因性Ｔｔｒ遺伝子座のＴｔｒコード配列全体が欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている。必要に応じて、Ｔｔｒ開始コドンからＴｔｒ停止コドンまでの内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域は欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている。
【０００８】
一部のそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座はヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含む。一部のそのような非ヒト動物では、内因性Ｔｔｒ  ５’非翻訳領域は欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない。
【０００９】
一部のそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、Ｔｔｒ開始コドンからＴｔｒ停止コドンまでの内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域は欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列およびヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含むヒトＴＴＲ配列で置き換えられ、内因性Ｔｔｒ  ５’非翻訳領域は欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、内因性Ｔｔｒプロモーターは欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない。必要に応じて、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座のヒトＴＴＲ配列は、配列番号１８に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。必要に応じて、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、配列番号１に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。必要に応じて、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、配列番号９０に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるコード配列を含む。必要に応じて、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、配列番号１４または１５に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００１０】
一部のそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、シグナルペプチドを含むトランスサイレチン前駆体タンパク質をコードし、シグナルペプチドをコードする内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域は欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない。必要に応じて、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンは欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない。必要に応じて、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンおよび第１のイントロンは欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない。必要に応じて、第２のＴｔｒエクソンの開始からＴｔｒ停止コドンまでの内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域は欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている。必要に応じて、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、ヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含む。
【００１１】
一部のそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、第２のＴｔｒエクソンからＴｔｒ停止コドンまでの内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域は欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列およびヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含むヒトＴＴＲ配列で置き換えられており、内因性Ｔｔｒ  ５’非翻訳領域は欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、内因性Ｔｔｒプロモーターは欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない。必要に応じて、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座のヒトＴＴＲ配列は、配列番号１９に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。必要に応じて、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、配列番号２に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。必要に応じて、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、配列番号９１に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるコード配列を含む。必要に応じて、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、配列番号１６または１７に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００１２】
一部のそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、選択カセットもリポーター遺伝子も含まない。一部のそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、選択カセットまたはリポーター遺伝子を含む。一部のそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座についてホモ接合性である。一部のそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座についてヘテロ接合性である。
【００１３】
一部のそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物では、非ヒト動物は哺乳動物である。必要に応じて、哺乳動物は齧歯動物である。必要に応じて、齧歯動物は、ラットまたはマウスである。必要に応じて、非ヒト動物はマウスである。
【００１４】
別の態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価するために、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物を使用する方法が提供される。そのような方法は：（ａ）上記の非ヒト動物のいずれかにヒトＴＴＲ標的化試薬を投与すること；および（ｂ）非ヒト動物におけるヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価することを含むことができる。
【００１５】
一部のそのような方法では、投与することは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達または流体力学的送達（ＨＤＤ）を含む。必要に応じて、投与することはＬＮＰ媒介性送達を含み、必要に応じて、ＬＮＰ用量は約０．１ｍｇ／ｋｇから約２ｍｇ／ｋｇの間にある。必要に応じて、投与することは、ＡＡＶ８媒介性送達を含む。
【００１６】
一部のそのような方法では、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物から肝臓を単離し、肝臓におけるヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価することを含む。必要に応じて、ステップ（ｂ）は、肝臓以外の臓器または組織におけるヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価することをさらに含む。
【００１７】
一部のそのような方法では、ヒトＴＴＲ標的化試薬はゲノム編集剤であり、評価することは、遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座の改変を評価することを含む。必要に応じて、評価することは、遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む。一部のそのような方法では、評価することは、遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座によってコードされるＴｔｒメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む。一部のそのような方法では、評価することは、遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座によってコードされるＴＴＲタンパク質の発現を測定することを含む。必要に応じて、ＴＴＲタンパク質の発現を測定することは、非ヒト動物におけるＴＴＲタンパク質の血清レベルを測定することを含む。必要に応じて、活性は、非ヒト動物の肝臓において評価される。
【００１８】
一部のそのような方法では、ヒトＴＴＲ標的化試薬は、ヒトＴＴＲ遺伝子のある領域を標的にするように設計されたヌクレアーゼ剤を含む。必要に応じて、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質、およびヒトＴＴＲ遺伝子におけるガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含む。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。必要に応じて、ヒトＴＴＲ標的化試薬は外因性ドナー核酸をさらに含み、ここで、外因性ドナー核酸はヒトＴＴＲ遺伝子と組み換わるように設計されている。必要に応じて、外因性ドナー核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である。
【００１９】
別の態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を最適化する方法が提供される。そのような方法は：（Ｉ）ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む第１の非ヒト動物において、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価する上記の方法のいずれかを１回目に実行すること、（ＩＩ）ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む第２の非ヒト動物において、変数を変更し、ステップ（Ｉ）の方法を変更した変数で２回目に実行すること、および（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）のヒトＴＴＲ標的化試薬の活性をステップ（ＩＩ）のヒトＴＴＲ標的化試薬の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することを含むことができる。必要に応じて、ステップ（ＩＩＩ）は、より高い効能、より高い精度、より高い一貫性またはより高い特異性をもたらす方法を選択することを含むことができる。
【００２０】
必要に応じて、ステップ（ＩＩ）で変更した変数は、ヒトＴＴＲ標的化試薬を非ヒト動物に導入する送達方法である。必要に応じて、投与することはＬＮＰ媒介性送達を含み、ステップ（ＩＩ）で変更した変数はＬＮＰ製剤である。必要に応じて、ステップ（ＩＩ）で変更した変数は、ヒトＴＴＲ標的化試薬を非ヒト動物に導入する投与経路である。必要に応じて、ステップ（ＩＩ）で変更した変数は、非ヒト動物に導入されるヒトＴＴＲ標的化試薬の濃度または量である。必要に応じて、ステップ（ＩＩ）で変更した変数は、非ヒト動物に導入されるヒトＴＴＲ標的化試薬の形態である。必要に応じて、ステップ（ＩＩ）で変更した変数は、非ヒト動物に導入されるヒトＴＴＲ標的化試薬である。
【００２１】
一部のそのような方法では、ヒトＴＴＲ標的化試薬は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）、およびヒトＴＴＲ遺伝子におけるガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含む。必要に応じて、ステップ（ＩＩ）で変更した変数は、ガイドＲＮＡ配列またはガイドＲＮＡ標的配列である。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの各々はＲＮＡの形態で投与され、ステップ（ＩＩ）で変更した変数は、Ｃａｓ  ｍＲＮＡのガイドＲＮＡに対する比である。必要に応じて、ステップ（ＩＩ）で変更した変数は、ガイドＲＮＡの改変である。
【００２２】
別の態様では、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物の作製方法が提供される。一部のそのような方法は以下を含む：（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に：（ｉ）内因性Ｔｔｒ遺伝子座の標的配列を標的にするヌクレアーゼ剤；および（ｉｉ）内因性Ｔｔｒ遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同アームおよび内因性Ｔｔｒ遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同アームによって挟まれたヒトＴＴＲ配列を含む核酸挿入断片を含む標的化ベクターを導入するステップであって、標的化ベクターは、内因性Ｔｔｒ遺伝子座で組み換えて、ヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む遺伝子改変非ヒトＥＳ細胞を生成する、ステップ；（ｂ）遺伝子改変非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主の胚に導入するステップ；および（ｃ）代理母で非ヒト動物宿主の胚を懐胎させるステップであって、代理母はヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含むＦ０後代の遺伝子改変非ヒト動物を生成するステップ。
【００２３】
一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）およびガイドＲＮＡを含む。一部のそのような方法では、標的化ベクターは長さが少なくとも１０ｋｂであるか、または５’および３’相同アームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである、大きな標的化ベクターである。一部のそのような方法では、非ヒト動物は、マウスまたはラットである。一部のそのような方法では、非ヒト動物は、マウスである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトおよびマウスのトランスサイレチン（ＴＴＲ）前駆体タンパク質（それぞれ、配列番号１および６）のアラインメントを示す。シグナルペプチド、Ｔ４結合ドメイン、相０エクソン／イントロン境界、および相１／２エクソン／イントロン境界を表す。
【００２５】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトおよびマウスのトランスサイレチン（ＴＴＲ）コード配列（それぞれ、配列番号９０および９２）のアラインメントを示す。
【００２６】
【図２】図２は、野生型マウスのＴｔｒ遺伝子座の概略図（スケール通りでない）、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョンおよびヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第２のバージョンを示す。エクソン、イントロン、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、開始コドン（ＡＴＧ）、停止コドン（ＴＧＡ）および選択カセットからのｌｏｘＰ瘢痕（loxP  scar）を表す。白色のボックスはマウスの配列を示し、黒色のボックスはヒトの配列を示す。
【００２７】
【図３】図３は、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョンを作製するための標的化の概略図（スケール通りでない）を示す。野生型マウスＴｔｒ遺伝子座、自己欠失ネオマイシン（ＳＤＣ−Ｎｅｏ）選択カセットを有するヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座のＦ０対立遺伝子（ＭＡＩＤ７５７６）、およびＳＤＣ−Ｎｅｏ選択カセットの除去からのｌｏｘＰ瘢痕を有するヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座のＦ１対立遺伝子（ＭＡＩＤ７５７７）を示す。白色のボックスはマウスの配列を示し、黒色のボックスはヒトの配列を示す。
【００２８】
【図４】図４は、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第２のバージョンを作製するための標的化の概略図（スケール通りでない）を示す。野生型マウスＴｔｒ遺伝子座、ＳＤＣ−Ｎｅｏ選択カセットを有するヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座のＦ０対立遺伝子、およびＳＤＣ−Ｎｅｏ選択カセットの除去からのｌｏｘＰ瘢痕を有するヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座のＦ１対立遺伝子を示す。白色のボックスはマウスの配列を示し、黒色のボックスはヒトの配列を示す。
【００２９】
【図５Ａ】図５Ａは、対立遺伝子喪失アッセイ（７５７６ｍＴＵ、９０９０ｍＴＭおよび９０９０ｍＴＤ）、対立遺伝子獲得アッセイ（７５７６ｈＴＵ、７５７６ｈＴＤ、Ｎｅｏ）、保持アッセイ（９０９０ｒｅｔＵ、９０９０ｒｅｔＵ２、９０９０ｒｅｔＵ３、９０９０ｒｅｔＤ、９０９０ｒｅｔＤ２、９０９０ｒｅｔＤ３）およびＣＲＩＳＰＲガイドによって破壊される領域を包含するように設計されたＣＲＩＳＰＲアッセイ（９０９０ｍＴＧＵ、ｍＧＵ、９０９０ｍＴＧＤおよびｍＧＤ）を含む、第１の標的化マウスＴｔｒ遺伝子座のスクリーニングのための戦略の概略図（スケール通りでない）を示す。白色のボックスはマウスの配列を示し、黒色のボックスはヒトの配列を示す。
【００３０】
【図５Ｂ】図５Ｂは、対立遺伝子喪失アッセイ（４５５２ｍＴＵ、９２１２ｍＴＵ、９０９０ｍＴＭ、９２１２ｍＴＤ）、対立遺伝子獲得アッセイ（７６５５ｈＴＵ、７５７６ｈＴＤ、Ｎｅｏ）、保持アッセイ（９２０４ｍｒｅｔＵ、９２０４ｍｒｅｔＤ）およびＣＲＩＳＰＲガイドによって破壊される領域を包含するように設計されたＣＲＩＳＰＲアッセイ（ｍＧＵ、ｍＧＤおよび９２１２ｍＴＧＤ）を含む、第２の標的化マウスＴｔｒ遺伝子座のスクリーニングのための戦略の概略図（スケール通りでない）を示す。白色のボックスはマウスの配列を示し、黒色のボックスはヒトの配列を示す。
【００３１】
【図６】図６は、（１）ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ０対立遺伝子）についてホモ接合性であるＦ０世代マウスからの肝臓試料、（２）野生型マウスからの肝臓試料、（３）ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョンについてホモ接合性であるＦ０世代マウスからの脾臓試料、および（４）野生型マウスからの脾臓試料における、ベータ−アクチン（Ａｃｔｂ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓトランスサイレチン（Ｍｍ  Ｔｔｒ）、およびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓトランスサイレチン（Ｈｓ  ＴＴＲ）のｍＲＮＡ発現を示す。より低いＣｔ値は、より高い発現を示す。
【００３２】
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるヒトＴＴＲタンパク質レベル（図７Ａ）およびマウスＴＴＲタンパク質レベル（図７Ｂ）のためのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。試験した試料には、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ０対立遺伝子）についてホモ接合性であるＦ０世代マウスからの血清およびＣＳＦ、ヒト血清およびＣＳＦ対照、ならびにマウス（Ｆ１Ｈ４）血清およびＣＳＦ対照が含まれる。
【００３３】
【図７Ｃ】図７Ｃは、血清における（１）ヒトＴＴＲおよび（２）マウスＴＴＲタンパク質レベルのためのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。試験した試料には、第１のクローン（クローン７５７６Ｃ−Ｇ７）から生成したヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ０対立遺伝子）についてホモ接合性であるＦ０世代マウス、第２のクローン（クローン７５７６Ａ−Ａ５）から生成したヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ０対立遺伝子）についてホモ接合性であるＦ０世代マウス、および野生型マウス（Ｆ１Ｈ４）からの血清試料が含まれる。マウス血清およびヒト血清を対照として使用した。
【００３４】
【図８】図８は、野生型マウス（Ｆ１Ｈ４）、第１のクローン（クローン７５７６Ｃ−Ｇ７）から生成したヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ０対立遺伝子）についてホモ接合性であるＦ０世代マウス、および第２のクローン（７５７６Ａ−Ａ５）から生成したヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョンについてホモ接合性であるＦ０世代マウスからの血清試料における、ウエスタンブロットによって決定したヒトＴＴＲタンパク質発現を示す。マウス血清は陰性対照として使用し、ヒト血清は陽性対照として使用した。マウスＩｇＧを、負荷対照（loading  control）として使用した。
【００３５】
【図９】図９は、野生型マウス（Ｆ１Ｈ４）、第１のクローン（クローン７５７６Ｃ−Ｇ７）から生成したヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ０対立遺伝子）についてホモ接合性であるＦ０世代マウス、および第２のクローン（７５７６Ａ−Ａ５）から生成したヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョンについてホモ接合性であるＦ０世代マウスからの肝臓および腎臓試料における、ウエスタンブロットによって決定したヒトＴＴＲタンパク質発現を示す。マウス血清は陰性対照として使用し、ヒト血清は陽性対照として使用した。ＧＡＰＤＨを、負荷対照として使用した。
【００３６】
【図１０】図１０は、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ０対立遺伝子）についてホモ接合性であるＦ０世代マウスから単離された初代肝細胞における次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって決定された、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座におけるゲノム編集パーセント（溶解細胞のプールからＰＣＲ反応において読み取った配列の総数に対して観察された挿入または欠失の総数）を示す。試験した試料には、未処置の肝細胞、ならびにＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびヒトＴＴＲを標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子で処置した肝細胞が含まれた。
【００３７】
【図１１Ａ−１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｈは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびヒトＴＴＲを標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ０対立遺伝子）についてホモ接合性であるＦ０世代マウスへの注射から１４日後の、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）（図１１Ａ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）（図１１Ｂ）、トリグリセリド（図１１Ｃ）、コレステロール（図１１Ｄ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）（図１１Ｅ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（図１１Ｆ）、非エステル型脂肪酸（ＮＥＦＡ）（図１１Ｇ）およびアルブミン（図１１Ｈ）の血清化学分析を示す。Ｕ／Ｌは１リットルあたりの単位を指し、ｍｇ／ｄＬは１デシリットルあたりのミリグラムを指し、ｍＥｑ／Ｌは１リットルあたりのミリ当量を指し、ｇ／ｄＬは１デシリットルあたりのグラムを指す。
【図１１Ｅ−１１Ｈ】図１１Ａ〜１１Ｈは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびヒトＴＴＲを標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ０対立遺伝子）についてホモ接合性であるＦ０世代マウスへの注射から１４日後の、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）（図１１Ａ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）（図１１Ｂ）、トリグリセリド（図１１Ｃ）、コレステロール（図１１Ｄ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）（図１１Ｅ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（図１１Ｆ）、非エステル型脂肪酸（ＮＥＦＡ）（図１１Ｇ）およびアルブミン（図１１Ｈ）の血清化学分析を示す。Ｕ／Ｌは１リットルあたりの単位を指し、ｍｇ／ｄＬは１デシリットルあたりのミリグラムを指し、ｍＥｑ／Ｌは１リットルあたりのミリ当量を指し、ｇ／ｄＬは１デシリットルあたりのグラムを指す。
【００３８】
【図１２】図１２は、バッファ対照またはＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびヒトＴＴＲを標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ０対立遺伝子）についてホモ接合性であるＦ０世代マウスへの注射から１４日後の肝臓からの試料において次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって決定された、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座におけるゲノム編集パーセント（溶解細胞のプールからＰＣＲ反応において読み取った配列の総数に対して観察された挿入または欠失の総数）を示す。
【００３９】
【図１３】図１３は、野生型マウス（Ｆ１Ｈ４）、ヒトＴＴＲプラスミドが流体力学的な送達（ＨＤＤ）によって導入されたマウス、およびキメラマウス／ヒトＴＴＲプラスミド（エクソン１によってコードされる領域はマウスであり、エクソン２〜４によってコードされる領域はヒトである）がＨＤＤによって導入されたマウスにおける、ヒトＴＴＲの血清レベルをアッセイするＥＬＩＳＡの結果を示す。２つの陰性対照を示し、ヒト血清は陽性対照として使用した。
【００４０】
【図１４】図１４は、バッファ対照またはＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびヒトＴＴＲを標的にするように設計されたヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  １を含有する脂質ナノ粒子の、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ１対立遺伝子；クローン７５７６Ｂ−Ｆ１０に由来する）についてホモ接合性であるＦ２世代マウスへの注射から８日後の肝臓溶解物においてヒトＴＴＲレベルをアッセイするＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００４１】
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、バッファ対照またはＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびヒトＴＴＲを標的にするように設計されたヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  １を含有する脂質ナノ粒子の、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョン（ＭＡＩＤ７５７６；図３からのＦ１対立遺伝子；クローン７５７６Ｂ−Ｆ１０に由来する）についてホモ接合性であるＦ２世代マウスへの注射から８日後の血清試料（図１５Ａでは１：５０００希釈、図１５Ｂでは１：１００００希釈）においてヒトＴＴＲレベルをアッセイするＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００４２】
【図１６】図１６は、ｈＴＴＲ７５７７／７５７７、ｈＴＴＲ７６５５／７６５５、ｈＴＴＲ７６５５／７６５６およびｈＴＴＲ７６５６／７６５６、ならびにｈＴＴＲ７６５６／ＷＴマウスの血漿試料においてヒトＴＴＲレベルをアッセイするＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００４３】
【図１７Ａ−１７Ｂ】図１７Ａおよび１７Ｂは、ｈＴＴＲＷＴ／ＷＴおよびｈＴＴＲ７５７７／７５７７マウス（３カ月齢）の血漿試料においてヒトＴＴＲおよびマウスＴＴＲレベルをアッセイするＥＬＩＳＡの結果を示す。ヒト血清を、対照として使用した。
【００４４】
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、３カ月齢ｈＴＴＲＷＴ／ＷＴおよびｈＴＴＲ７５７７／７５７７マウスからの肝臓試料におけるｍＴＴＲ（１）およびｈＴＴＲ（２）ｍＲＮＡの発現を示す。より低いＣｔ値は、より高い発現を示す。
【００４５】
【図１８】図１８は、野生型（Ｆ１Ｈ４）、ｈＴＴＲ７５７７／７５７７（ｈＴＴＲｖ１）およびｈＴＴＲ７６５６／７６５６（ｈＴＴＲｖ２）マウス（２〜３カ月齢）の血漿試料においてヒトＴＴＲレベルをアッセイするＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００４６】
【図１９】図１９は、バッファ対照またはＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびヒトＴＴＲを標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョンについてホモ接合性であるマウスへの注射後の肝臓からの試料において次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって決定された、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座におけるゲノム編集パーセントを示す。
【００４７】
【図２０】図２０は、バッファ対照またはＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびヒトＴＴＲを標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子の、ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の第１のバージョンについてホモ接合性であるマウスへの注射の後の血清試料においてヒトＴＴＲレベルをアッセイするＥＬＩＳＡの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
定義
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、コードアミノ酸および非コードアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含めた、任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を含む。この用語は、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの、修飾されたポリマーも含む。用語「ドメイン」は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。
【００４９】
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言える。「Ｎ末端」という用語は、遊離のアミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端とする、タンパク質またはポリペプチドの出発点に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を末端とする、アミノ酸の鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終了点に関する。
【００５０】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその類似体もしくは修飾バージョンを含めた、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを含む。これらの用語は、プリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにポリマーを含む。
【００５１】
核酸は、モノヌクレオチドが、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその近くの３’酸素にリン酸ジエステル連結によって一方向に付着するように反応してオリゴヌクレオチドが生じるので、「５’末端」および「３’末端」を有すると言える。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と連結していなければ、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と連結していなければ、「３’末端」と称される。核酸配列も、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にあったとしても、５’および３’末端を有すると言われ得る。直鎖状または環状ＤＮＡ分子のいずれでも、別個のエレメントは、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’側にあると称される。
【００５２】
「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノム中に組み込まれるように、細胞中に導入された核酸を指す。細胞のゲノム中への核酸の安定な組込みのために任意のプロトコールを使用することができる。
【００５３】
「発現ベクター」または「発現構築物」または「発現カセット」という用語は、特定の宿主細胞または生物中での作動可能に連結されたコード配列の発現にとって必要な適切な核酸配列に作動可能に連結された所望のコード配列を含有する組換え核酸を指す。原核生物中での発現にとって必要な核酸配列は通常、プロモーター、オペレーター（任意選択）、およびリボソーム結合部位、ならびに他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを使用することが一般に公知であるが、必要な発現を犠牲にすることなく、一部のエレメントを欠失させ、他のエレメントを付加することができる。
【００５４】
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介性ライゲーション、または細胞のゲノム中の標的位置への組換えの任意の他の手段によって導入することができる組換え核酸を指す。
【００５５】
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子へのパッケージングにとって十分な、またはそれを許容するエレメントを含む組換え核酸を指す。ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞中に移動させる目的で、ベクターおよび／または粒子を使用することができる。いくつかの形態のウイルスベクターが公知である。
【００５６】
タンパク質、核酸、および細胞に関して「単離された」という用語は、タンパク質、核酸、または細胞の実質的に純粋な調製物に至るまで、およびそれを含めた、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて通常存在し得る他の細胞性または生物性構成成分に関して比較的精製されたタンパク質、核酸、および細胞を含む。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有しないタンパク質および核酸または化学的に合成された、かくして、他のタンパク質もしくは核酸が実質的に混入していないタンパク質もしくは核酸も含む。「単離された」という用語はまた、それらが天然では付随する多くの他の細胞性構成成分または生物性構成成分（例えば、他の細胞タンパク質、核酸、または細胞性もしくは細胞外構成成分）から分離または精製されたタンパク質、核酸、または細胞も含む。
【００５７】
「野生型」という用語は、正常な状態または状況（変異体、疾患にかかっている、変更された状態または状況などとは対照的に）において見出される構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、多数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
【００５８】
「内因性配列」という用語は、細胞または非ヒト動物中に天然に存在する核酸配列を指す。例えば、非ヒト動物の内因性Ｔｔｒ配列は、非ヒト動物中のＴｔｒ遺伝子座に天然に存在する天然のＴｔｒ配列を指す。
【００５９】
「外因性」分子または配列は、通常は細胞内にその形態では存在しない分子または配列を含む。通常存在するとは、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して存在することを含む。外因性分子または配列は、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなど細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンを含んでもよく、または細胞内の内因性配列に対応するが、形態が異なる（すなわち、染色体内にない）配列を含んでもよい。対照的に、内因性分子または配列は、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞内にその形態で通常存在する分子または配列を含む。
【００６０】
「異種」という用語は、核酸またはタンパク質に関して使用される場合、その核酸またはタンパク質が、同じ分子内で天然には一緒に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関連して使用される場合、その核酸またはタンパク質が、天然では同じ互いとの関係（例えば、接合している）では見出されない２つまたはそれよりも多くの部分配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連しては見出されない、別の核酸分子内にあるかまたはそれに付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、天然ではコード配列と関連しては見出されない配列に挟まれたコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、天然では他のペプチド分子と関連しては見出されない、別のペプチド分子内にあるかまたはそれに付着したアミノ酸のセグメント（例えば、融合タンパク質、またはタグを有するタンパク質）である。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌もしくは局在化配列を含み得る。
【００６１】
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組合せの多重性によって示される通り、コドンの縮重を活用し、一般に、特定の宿主細胞における発現の増強のために、ネイティブなアミノ酸配列を維持しながらネイティブな配列の少なくとも１つのコドンを宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意の他の宿主細胞を含めた所与の原核細胞または真核細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。コドン使用表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に利用可能である。これらの表は、いくつかのやり方で適合させることができる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるNakamuraら（２０００年）Nucleic  Acids  Research  ２８巻：２９２頁を参照されたい。特定の宿主において発現させるための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
【００６２】
用語「遺伝子座」は、生物体のゲノムの遺伝子（または、重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドをコードする配列、または染色体上の位置の特異的場所を指す。例えば、「Ｔｔｒ遺伝子座」は、そのような配列が存在する場所に関して同定された生物体のゲノムのＴｔｒ遺伝子、Ｔｔｒ  ＤＮＡ配列、トランスサイレチンコード配列または染色体上のＴｔｒ位置の特異的場所を指すことができる。「Ｔｔｒ遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）またはその組合せを含む、Ｔｔｒ遺伝子の調節エレメントを含むことができる。
【００６３】
用語「遺伝子」は、生成物（例えば、ＲＮＡ生成物および／またはポリペプチド生成物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指し、非コードイントロンで中断されるコード領域および遺伝子が完全長ｍＲＮＡ（５’および３’非翻訳配列を含む）に対応するように５’および３’の両末端のコード領域に隣接して位置する配列を含む。用語「遺伝子」は、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーおよび転写因子結合性部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位、サイレンサー、遮断配列（ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）およびマトリックス付着領域を含む、他の非コード配列も含む。これらの配列は遺伝子のコード領域の近くに（例えば、１０ｋｂ以内に）、または遠隔部位にあることができ、それらは遺伝子の転写および翻訳のレベルまたは率に影響する。
【００６４】
用語「対立遺伝子」は、遺伝子のバリアント形態を指す。一部の遺伝子は様々な異なる形態を有し、それらは染色体上の同じ位置または遺伝子座に位置する。二倍体生物体は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各組は、特異的遺伝子座の遺伝子型を表す。特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合は、遺伝子型はホモ接合性と記載され、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合性と記載される。
【００６５】
遺伝子の「コード領域」または「コード配列」は、タンパク質をコードする、エクソンで構成される遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡの部分からなる。この領域は、５’末端の開始コドンから始まり、３’末端の停止コドンで終了する。
【００６６】
「プロモーター」は、ＤＮＡの制御領域であり、通常、特定のポリヌクレオチド配列に対して妥当な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向付けることができるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターは、転写開始率に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書に開示される細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはこれらの組合せ）の１つまたは複数において活性であってよい。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生制御型プロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であってよい。プロモーターの例は、例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができる。
【００６７】
「作動可能な連結」または「作動可能に連結した」とは、２つまたはそれよりも多くの構成成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）が、どちらの構成成分も正常に機能し、構成成分の少なくとも１つが他の構成成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得る可能性が許容されるように近位にあることを含む。例えば、プロモーターがコード配列の転写のレベルを１つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応答して調節する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している可能性がある。作動可能な連結は、互いと連続しているまたはトランスに作用する配列を含み得る（例えば、制御配列は、コード配列の転写を調節するための距離で作用し得る）。
【００６８】
核酸の「相補性」とは、核酸の一方の鎖内のヌクレオチド配列が、その核酸塩基群の配向に起因して、対向する核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡ内の相補的な塩基は一般にはＡとＴおよびＣとＧである。ＲＮＡでは、相補的な塩基は一般にはＣとＧおよびＵとＡである。相補性は、完全なものまたは実質的／十分なものであり得る。２つの核酸間の完全な相補性とは、２つの核酸が、２重鎖内のあらゆる塩基が相補的な塩基とワトソン・クリック対形成によって結合した２重鎖を形成できることを意味する。「実質的な」または「十分な」相補性とは、一方の鎖内の配列が対向する鎖内の配列と徹底的におよび／または完全に相補的ではないが、ハイブリダイゼーション条件のセット（例えば、塩濃度および温度）の下で２つの鎖上の塩基間に十分な結合が生じて安定なハイブリッド複合体が形成されることを意味する。そのような条件は、ハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するためのシーケンスおよび標準の数学的算出を使用することにより、または常套的な方法を使用することによってＴｍを経験的に決定することにより、予測することができる。Ｔｍは、２つの核酸鎖の間で形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる）温度を含む。Ｔｍを下回る温度ではハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であるが、Ｔｍを上回る温度ではハイブリダイゼーション複合体内の鎖の融解または分離が有利である。Ｔｍは、水性１Ｍ  ＮａＣｌ溶液中のＧ＋Ｃ含有量が分かっている核酸に関しては、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することによって推定することができるが、他の公知のＴｍコンピュータ計算では、核酸の構造特性を考慮に入れる。
【００６９】
「ハイブリダイゼーション条件」は、１つの核酸鎖が第２の核酸鎖と相補鎖相互作用および水素結合によって結合してハイブリダイゼーション複合体が生じる累積的環境を含む。そのような条件は、核酸を含有する水性または有機溶液の化学成分およびそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、ならびに混合物の温度を含む。インキュベート時間の長さまたは反応チャンバーの寸法などの他の因子が環境に寄与し得る。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSambrookら、Molecular  Cloning、A  Laboratory  Manual、第２版、１．９０〜１．９１頁、９．４７〜９．５１頁、１１．４７〜１１．５７頁（Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor,  N.Y.、１９８９年）を参照されたい。
【００７０】
ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補配列を含有することが必要であるが、塩基間にミスマッチがある可能性がある。２つの核酸間のハイブリダイゼーションのための妥当な条件は、周知の変数である核酸の長さおよび相補の度合いに依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補の度合いが大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値が大きい。短い相補性のひと続き（例えば、３５ヌクレオチドもしくはそれ未満、３０ヌクレオチドもしくはそれ未満、２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、２２ヌクレオチドもしくはそれ未満、２０ヌクレオチドもしくはそれ未満、または１８ヌクレオチドもしくはそれ未満にわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置が重要になる（Sambrookら、上記、１１．７〜１１．８頁を参照されたい）。一般には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小長としては、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、および少なくとも約３０ヌクレオチドが挙げられる。さらに、相補領域の長さおよび相補の度合いなどの因子に応じて、必要に応じて温度および洗浄溶液の塩濃度を調整することができる。
【００７１】
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸のポリヌクレオチド配列と１００％相補的である必要はない。さらに、ポリヌクレオチドは、介在するか、または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように１つまたは複数のセグメントを超えてハイブリダイズし得る（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、標的とされる標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが標的領域と相補的であり、したがって、それと特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡは、９０％の相補性になる。この例では、残りの非相補性ヌクレオチドは、密集していても相補的なヌクレオチドが散在していてもよく、互いとまたは相補的なヌクレオチドと連続している必要はない。
【００７２】
核酸内の核酸配列の特定のひと続き間のパーセント相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒ  ＢＬＡＳＴプログラム（Altschulら（１９９０年）J.  Mol.  Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁；ZhangおよびMadden（１９９７年）Genome  Res.、７巻：６４９〜６５６頁（これらの各々は、その全体がすべての目的のために本明細書において参考として援用される））を使用して、または、その全体がすべての目的のために本明細書において参考として援用されるSmithおよびWaterman（１９８１年）Adv.  Appl.  Math.２巻、４８２〜４８９頁）のアルゴリズムを使用する、デフォルト設定を使用したＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を使用することにより、常套的に決定することができる。
【００７３】
本明細書において提示される方法および組成物では、種々の異なる構成成分を使用する。説明全体を通して、一部の構成成分は、活性なバリアントおよび断片を有し得る。そのような構成成分としては、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡが挙げられる。これらの構成成分のそれぞれについての生物活性は本明細書の他の箇所に記載されている。「機能的」という用語は、生物活性または機能を示すタンパク質または核酸（またはその断片もしくはバリアント）の固有の能力を指す。そのような生物活性または機能は、例えば、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡ配列に結合するＣａｓタンパク質の能力を含んでもよい。機能的断片またはバリアントの生物機能は、元のものであるが、基本的な生物機能を保持するものと比較して、同じであってよいか、または実際には、変化していてもよい（例えば、その特異性もしくは選択性もしくは効能に関して）。
【００７４】
「バリアント」という用語は、集団中で最も優勢である配列と（例えば、１個のヌクレオチドが）異なるヌクレオチド配列または集団中で最も優勢である配列と（例えば、１個のアミノ酸が）異なるタンパク質配列を指す。
【００７５】
タンパク質を言う場合の「断片」という用語は、完全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。核酸を言う場合の「断片」という用語は、完全長核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片であってもよい。
【００７６】
「配列同一性」または「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関しては、２つの配列内の、指定の比較ウインドウにわたって最大の対応でアラインメントした場合に同じである残基に言及する。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一でない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なっており、その場合、アミノ酸残基は、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的性質は変化しない。配列が保存的置換によって異なる場合、パーセント配列同一性を上向きに調整して置換の保存的性質を補正することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言える。この調整を行う方法は周知である。一般には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングし、それにより、パーセンテージ配列同一性を増大させることを伴う。したがって、例えば、同一のアミノ酸にはスコア１を付し、非保存的置換にはスコアゼロを付す場合、保存的置換には、ゼロと１の間のスコアを付す。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行される通り算出される。
【００７７】
「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較ウインドウにわたって比較することによって決定される値を含み、ここで、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。パーセンテージは、両方の配列内に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。別段の指定がない限り（例えば、短い方の配列は連結した異種配列を含む）、比較ウインドウは、比較される２つの配列の短い方の全長である。
【００７８】
別段の指定のない限り、配列同一性／類似性値は、ＧＡＰバージョン１０を以下のパラメーターを使用して得られる値を含む：ギャップ重みづけ５０および長さ重みづけ３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング行列を使用したヌクレオチド配列についての％同一性および％類似性；ギャップ重みづけ８および長さ重みづけ２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用したアミノ酸配列についての％同一性および％類似性；またはその任意の等価のプログラム。「等価のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生じた対応するアラインメントと比較して同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生じさせる任意の配列比較プログラムを含む。
【００７９】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列内に通常存在するアミノ酸の、サイズ、電荷、または極性が同様の異なるアミノ酸による置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基による別の非極性残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、１つの極性（親水性）残基による別の極性（親水性）残基の置換、例えば、アルギニンとリシンの間の置換、グルタミンとアスパラギンの間の置換、またはグリシンとセリンの間の置換が挙げられる。さらに、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基による別の塩基性残基の置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基による別の酸性残基の置換が保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基によるシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシンなどの極性（親水性）残基の置換および／または極性残基による非極性残基の置換が挙げられる。典型的なアミノ酸カテゴリー化を以下で表１に要約する。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、公知の参照配列と同一であるかまたは実質的に類似しているかのいずれかの配列を含み、そのため、それは、例えば、公知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である。相同配列は、例えば、オルソログ配列およびパラログ配列を含むことができる。相同遺伝子は、例えば、種分化事象（オルソロガス遺伝子）または遺伝子複製事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを通して、共通先祖のＤＮＡ配列に一般的に由来する。「オルソロガス」遺伝子は、種分化によって共通の先祖遺伝子から進化した異なる種の遺伝子を含む。オルソログは、進化の過程で同じ機能を一般的に保持する。「パラロガス」遺伝子は、ゲノム内の複製に関連した遺伝子を含む。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。
【００８２】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的な環境、および人工的な環境（例えば、試験管）内で起こるプロセスまたは反応を包含する。「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、天然の環境（例えば、細胞または生物体または体）および天然の環境内で起こるプロセスまたは反応を包含する。「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、個体の体から取り出された細胞およびそのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を包含する。
【００８３】
「リポーター遺伝子」という用語は、内因性もしくは異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたリポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化にとって必要な因子を含有する（または含有するようにすることができる）細胞に導入された場合、容易かつ定量可能にアッセイされる遺伝子産物（典型的には、酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。リポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、蛍ルシフェラーゼ遺伝子、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「リポータータンパク質」は、リポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
【００８４】
本明細書で使用される「蛍光リポータータンパク質」という用語は、リポータータンパク質に直接由来する、蛍光性基質上のリポータータンパク質の活性に由来する、または蛍光タグ付き化合物への結合に対する親和性を示すタンパク質に由来するものであってよい、蛍光に基づいて検出可能であるリポータータンパク質を意味する。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、ならびに細胞中での存在をフローサイトメトリー法によって検出することができる任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。
【００８５】
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存的ＤＮＡ修復経路：相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって起こる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKasparekおよびHumphrey（２０１１年）Seminars  in  Cell  &  Dev.  Biol.、２２巻：８８６〜８９７頁を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含んでもよい。
【００８６】
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こってもよい。組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）によって起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断が生じた分子）を修復するための鋳型として「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移行を導く核酸修復の形態を含む。いかなる特定の理論にも制約されることなく、そのような移行には、切断された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または、標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される、合成に依存する鎖アニーリング、および／または関連するプロセスが伴い得る。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wangら（２０１３年）Cell、１５３巻：９１０〜９１８頁；Mandalosら（２０１２年）PLOS  ONE、７巻：ｅ４５７６８：１〜９頁；およびWangら（２０１３年）Nat  Biotechnol.、３１巻：５３０〜５３２頁を参照されたい。
【００８７】
ＮＨＥＪは、切断末端を互いとまたは外因性配列と、相同な鋳型を必要とせずに直接ライゲーションすることによる核酸の二本鎖切断の修復を含む。連続していない配列のＮＨＥＪによるライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位付近に欠失、挿入、または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪは、切断末端と外因性ドナー核酸の末端の直接ライゲーションによる外因性ドナー核酸の標的化組込みももたらし得る（すなわち、ＮＨＥＪに基づく捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介性標的化組込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用可能でない場合（例えば、非分裂細胞、初代細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復が不十分に行われる細胞において）に外因性ドナー核酸を挿入するために好ましい可能性がある。さらに、相同組換え修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知見は必要なく、これは、ゲノム配列に関する知見が限られているゲノムを有する生物体への標的化挿入を試みる場合に有益であり得る。組込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列の間の平滑末端のライゲーションによって、または、切断されるゲノム配列においてヌクレアーゼ剤によって生成されるものと適合する突出部に挟まれた外因性ドナー核酸を使用した粘着末端（すなわち、５’または３’突出部を有する）のライゲーションによって進行し得る。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびMarescaら（２０１３年）Genome  Res.、２３巻（３号）：５３９〜５４６頁を参照されたい。平滑末端をライゲーションする場合、断片接合に必要なマイクロホモロジーの生成領域に標的および／またはドナー切除が必要な場合があり、これにより、標的配列に望ましくない変更が生じる可能性がある。
【００８８】
用語「抗原結合性タンパク質」は、抗原に結合する任意のタンパク質を含む。抗原結合性タンパク質の例には、抗体、抗体の抗原結合性断片、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、ｓｃＦＶ、ビス−ｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ−ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（二重可変ドメイン抗原結合性タンパク質）、ＳＶＤ（単一可変ドメイン抗原結合性タンパク質）、二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）またはデービスボディ（Davisbody）（米国特許第８，５８６，７１３号、ここにおいてあらゆる目的のために参照により本明細書にその全体が組み込まれる）が含まれる。
【００８９】
用語「抗原」は、全体の分子であれ分子内のドメインであれ、その物質への結合特異性を有する抗体の生成を誘発することが可能である物質を指す。用語抗原は、野生型宿主生物体においては自己認識によって抗体産生を誘発しないが、免疫寛容を破壊する適当な遺伝子操作によって宿主動物においてそのような応答を誘発することができる物質も含む。
【００９０】
用語「エピトープ」は、抗原結合性タンパク質（例えば、抗体）が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、１つまたは複数のタンパク質の三次フォールディングによって近接した連続アミノ酸または非連続アミノ酸から形成することができる。連続アミノ酸から形成されるエピトープ（線状エピトープとしても公知である）は、変性溶媒に曝露されても一般的に保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープ（立体構造エピトープとしても公知である）は、変性溶媒による処理で一般的に失われる。エピトープは、特異空間高次構造に少なくとも３つ、より普通には少なくとも５つまたは８〜１０個のアミノ酸を一般的に含む。エピトープの空間高次構造を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Epitope  Mapping  Protocols,  in  Methods  in  Molecular  Biology,  Vol.  66,  Glenn  E.  Morris,  Ed.  (1996)を参照。
【００９１】
本明細書に記載される抗体パラトープは、異種エピトープを特異的に認識する相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３領域）を一般的に最低限含む。
【００９２】
用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続する４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変ドメインおよび重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖および軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が間に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各重鎖および軽鎖可変ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と略すことができ；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と略すことができる）。用語「高親和性」抗体は、その標的エピトープに関して約１０−９Ｍまたはそれより低いＫＤ（例えば、約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−１２Ｍ）を有する抗体を指す。一実施形態では、ＫＤは表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって測定され、別の実施形態では、ＫＤはＥＬＩＳＡによって測定される。
【００９３】
その標的抗原への抗原結合性タンパク質の特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０Ｍ−１の親和性を有する結合を含む。特異的結合は大きさが検出可能なほど高く、少なくとも１つの無関係な標的で起こる非特異的結合から識別可能である。特異的結合は、特定の官能基の間の結合の形成または特定の空間的適合（例えば、ロックおよびキータイプ）の結果であり得るが、非特異的結合は、通常ファンデルワールス力の結果である。しかし、特異的結合は、抗原結合性タンパク質が１つの、およびただ１つの標的に結合することを必ずしも意味するとは限らない。
【００９４】
用語「アンチセンスＲＮＡ」は、細胞内で転写されるメッセンジャーＲＮＡ鎖に相補的である一本鎖ＲＮＡを指す。
【００９５】
用語「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する一般的に二本鎖のＲＮＡ分子を指す。これらの分子は長さが異なることができ（一般的に１８〜３０塩基対）、アンチセンス鎖の中のそれらの標的ｍＲＮＡに対して様々な程度の相補性を含むことができる。全てではなく一部のｓｉＲＮＡは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’または３’末端に不対のオーバーハンギング塩基を有する。用語「ｓｉＲＮＡ」は、２つの別個の鎖の二重鎖、ならびに二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成することができる一本鎖を含む。二本鎖構造は、例えば、長さが２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド未満であってよい。例えば、二本鎖構造は、長さが約２１〜２３ヌクレオチド、長さが約１９〜２５ヌクレオチド、または長さが約１９〜２３ヌクレオチドであってよい。
【００９６】
用語「ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）」は、ヘアピン構造において自己ハイブリダイズする一本鎖のＲＮＡ塩基を指し、プロセシングの後にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導することができる。これらの分子は、長さが異なることができる（一般的に、長さが約５０〜９０ヌクレオチド、または一部の場合は、例えば、マイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡの場合、長さが最大２５０ヌクレオチド超まで）。ｓｈＲＮＡ分子は細胞内でプロセシングされてｓｉＲＮＡを形成し、それは遺伝子発現を次にノックダウンすることができる。ｓｈＲＮＡは、ベクターに組み込むことができる。用語「ｓｈＲＮＡ」は、短いヘアピンＲＮＡ分子を転写させることができるＤＮＡ分子も指す。
【００９７】
１つまたは複数の記載されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分と組み合わせて含有し得る。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という移行句は、特許請求の範囲が、請求項に記載されている指定の要素ならびに特許請求された発明の基本および新規の特性（単数または複数単数または複数）に実質的に影響を及ぼさない要素を包含するものと解釈されるべきであることを意味する。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、本発明の請求項において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。
【００９８】
「必要に応じた」または「必要に応じて」とは、その後に記載されている事象または状況が生じる場合と生じない場合があること、ならびに、当該説明が、事象または状況が生じる例および事象または状況が生じない例を含むことを意味する。
【００９９】
値の範囲の明示は、範囲内のまたは範囲を規定する全ての整数、および範囲内の整数によって規定される全ての部分範囲を含む。
【０１００】
文脈からそうでないことが明らかでない限り、「約」という用語は、記載値の標準の測定の誤差限界（例えば、ＳＥＭ）の範囲内の値を包含する。
【０１０１】
「および／または」という用語は、関連する列挙されている項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能性のある組合せ、ならびに代替（「または」）として解釈される場合には組合せがないことを指し、それを包含する。
【０１０２】
「または（ｏｒ）」という用語は、特定の一覧のうちの任意の１メンバーを指し、その一覧のメンバーの任意の組合せも含む。
【０１０３】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形の冠詞は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「１つの（ａ）タンパク質」または「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）タンパク質」という用語は、それらの混合物を含めた複数のタンパク質を含み得る。
【０１０４】
統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５であることを意味する。
【０１０５】
詳細な説明
Ｉ．概要
ヒト化ＴＴＲ遺伝子座をそれらのゲノムに含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物細胞および非ヒト動物を使用する方法が本明細書に開示される。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、ヒトトランスサイレチンタンパク質またはヒトトランスサイレチンタンパク質の１つまたは複数の断片を含むキメラトランスサイレチンタンパク質を発現する。そのような非ヒト動物細胞および非ヒト動物は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化薬剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集剤）の送達または効能を評価するために使用することができ、また、そのような薬剤の送達または効能をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで最適化する方法において使用することができる。
【０１０６】
本明細書に開示される非ヒト動物細胞および非ヒト動物の一部では、ヒトＴＴＲゲノムＤＮＡのほとんどまたは全ては、対応するオルソロガス非ヒト動物Ｔｔｒ遺伝子座に挿入される。本明細書に開示される非ヒト動物細胞および非ヒト動物の一部では、非ヒト動物ＴｔｒゲノムＤＮＡのほとんどまたは全ては、対応するオルソロガスヒトＴＴＲゲノムＤＮＡによって１対１で置き換えられる。ｃＤＮＡ挿入を有する非ヒト動物と比較して、イントロン−エクソン構造およびスプライシング機構が維持される場合、発現レベルはより高いはずであり、その理由は、保存された調節因子エレメントはインタクトのままである可能性がより高く、ＲＮＡプロセシングを受けるスプライシングされた転写物はｃＤＮＡより安定しているからである。対照的に、非ヒト動物Ｔｔｒ遺伝子座へのヒトＴＴＲ  ｃＤＮＡの挿入（例えば、５’ＵＴＲにおける人工のベータグロビンイントロンの挿入と一緒の）は、非ヒト動物Ｔｔｒの第１のエクソンおよびイントロン内に含有されるものなどの、保存された調節エレメントを消滅させることになる。対応するオルソログのヒトゲノム配列によって非ヒト動物ゲノム配列を置き換えること、または対応するオルソロガス非ヒトＴｔｒ遺伝子座にヒトＴＴＲゲノム配列を挿入することは、内因性Ｔｔｒ遺伝子座からの導入遺伝子の忠実な発現をもたらす可能性がより高い。同様に、内因性非ヒト動物Ｔｔｒ遺伝子座ではなくランダムなゲノム遺伝子座にヒトＴＴＲコード配列のトランスジェニック挿入を有するトランスジェニック非ヒト動物は、Ｔｔｒ発現の内因性調節を同じくらい正確には反映しない。非ヒト動物ゲノムＤＮＡのほとんどまたは全てを対応するオルソログのヒトゲノムＤＮＡによって１対１で置き換えること、または対応するオルソロガス非ヒトＴｔｒ遺伝子座にヒトＴＴＲゲノム配列を挿入することから生じるヒト化ＴＴＲ対立遺伝子は、ヒトＴＴＲ標的化試薬（例えば、ヒトＴＴＲを標的にするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬）の真のヒト標的または真のヒト標的にごく近いものを提供し、それによって、生きている動物におけるそのような薬剤の効能および作用様式の試験、ならびにヒト化タンパク質およびヒト化遺伝子が、存在するＴＴＲの唯一のバージョンである状況における薬物動態学的および薬力学研究を可能にする。
【０１０７】
ＩＩ．ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物
本明細書に開示される細胞および非ヒト動物は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座をそれらのゲノムに含む。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む細胞または非ヒト動物は、ヒトトランスサイレチンタンパク質、または、天然のトランスサイレチンタンパク質の１つまたは複数の断片がヒトトランスサイレチンからの対応する断片で置き換えられた、部分的にヒト化されたキメラトランスサイレチンタンパク質を発現する。
【０１０８】
Ａ．トランスサイレチン（ＴＴＲ）
本明細書に記載される細胞および非ヒト動物は、ヒト化トランスサイレチン（Ｔｔｒ）遺伝子座を含む。トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、主に肝臓によって合成されるが脈絡叢によっても生成される、１２７アミノ酸、５５ｋＤａの血清および脳脊髄液輸送タンパク質である。それは、プレアルブミン、サイロキシン結合性プレアルブミン、ＡＴＴＲ、ＴＢＰＡ、ＣＴＳ、ＣＴＳ１、ＨＥＬ１１１、ＨｓＴ２６５１およびＰＡＬＢとも呼ばれている。その天然の状態では、ＴＴＲは四量体として存在する。ホモ接合体では、ホモテトラマーは、同一の１２７アミノ酸のベータシートに富むサブユニットを含む。ヘテロ接合体では、ＴＴＲ四量体は、一般的に統計的に組み合わされるバリアントおよび／または野生型サブユニットで構成することができる。ＴＴＲは、血清および脳脊髄液の両方でサイロキシン（Ｔ４）およびレチノール結合ＲＢＰ（レチノール結合性タンパク質）を運ぶ役割を担う。
【０１０９】
文脈からそうでないことが明らかでない限り、ヒトトランスサイレチン（ＴＴＲ）またはその断片もしくはドメインへの言及は、そのアイソフォームおよび対立遺伝子バリアントを含む、天然の野生型ヒトアミノ酸配列を含む。トランスサイレチン前駆体タンパク質はシグナル配列（一般的に２０アミノ酸）を含むが、成熟したトランスサイレチンタンパク質は含まない。例示的なＴＴＲポリペプチド配列は、受託番号ＮＰ＿０００３６２．１（ＮＣＢＩ）およびＰ０２７６６．１（ＵｎｉＰｒｏｔ）（同一、各々配列番号１で示される）によって指定される。残基はＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６６．１によって番号付けすることができ、成熟したタンパク質（すなわち、２０アミノ酸のシグナル配列を含まない）の第１のアミノ酸は残基１と指定される。任意の他のＴＴＲタンパク質では、残基は、最大アラインメントのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６６．１の対応する残基によって番号付けされる。
【０１１０】
ヒトＴＴＲ遺伝子は第１８染色体に位置し、４つのエクソンおよび３つのイントロンを含む。例示的なヒトＴＴＲ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００９４９０．１（配列番号３）によって指定される配列中の残基５００１〜１２２５８である。配列番号３の中の４つのエクソンは、それぞれ、残基１〜２０５、１１３０〜１２６０、３３５４〜３４８９および６８０２〜７２５８を含む。配列番号３の中のＴＴＲコード配列は、残基１３７〜２０５、１１３０〜１２６０、３３５４〜３４８９および６８０２〜６９０９を含む。例示的なヒトＴＴＲ  ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０００３７１．３（配列番号４）によって指定される。
【０１１１】
マウスＴｔｒ遺伝子は第１８染色体に位置し（is  located  and  chromosome  18）、同じく４つのエクソンおよび３つのイントロンを含む。例示的なマウスＴｔｒ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００８４．６（配列番号５）によって指定される配列中の残基２０６６５２５０〜２０６７４３２６である。配列番号５の中の４つのエクソンは、それぞれ、残基１〜２５８、１２０７〜１３３７、４７３０〜４８６５および８３８２〜９０７７を含む。配列番号５の中のＴｔｒコード配列は、残基１９０〜２５８、１２０７〜１３３７、４７３０〜４８６５および８３８２〜８４８９を含む。例示的なマウスＴＴＲタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０７３０９．１またはＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０３８７２５．１（同一、各々配列番号６で示される）によって指定される。例示的なマウスＴｔｒ  ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１３６９７．５（配列番号７）によって指定される。
【０１１２】
例示的なラットＴＴＲタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６７によって指定される。例示的なブタＴＴＲタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ５０３９０によって指定される。例示的なニワトリＴＴＲタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２７７３１によって指定される。例示的なウシＴＴＲタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ４６３７５によって指定される。例示的なヒツジＴＴＲタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１２３０３によって指定される。例示的なチンパンジーＴＴＲタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ５Ｕ７Ｉ５によって指定される。例示的なオランウータンＴＴＲタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ５ＮＶＳ２によって指定される。例示的なウサギＴＴＲタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０７４８９によって指定される。例示的なカニクイザル（マカク）ＴＴＲタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＨＸＷ１によって指定される。
【０１１３】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイド症は、病原性のミスフォールディングされたＴＴＲおよびＴＴＲで構成されるアミロイド原線維の細胞外沈着によって特徴付けられる全身性障害である。ＴＴＲアミロイド症は天然のＴＴＲ四量体形態の不安定化（環境または遺伝的条件による）によって一般的に引き起こされ、解離、ミスフォールディング、ならびに様々な臓器および組織に蓄積するアミロイド原線維へのＴＴＲの凝集に至り、進行性の機能不全を引き起こす。解離した単量体は、ミスフォールディングされたタンパク質凝集体およびアミロイド原線維を形成する傾向を有する。
【０１１４】
ヒトでは、野生型ＴＴＲ四量体ならびに変異体および野生型サブユニットで構成される混合四量体は、アミロイド形成の過程とともに、解離、ミスフォールディングおよび凝集し得、有糸分裂後の組織の変性をもたらす。したがって、ＴＴＲアミロイド症は、ＴＴＲの変異からまたは変異していないミスフォールディングされたＴＴＲからもたらされる病原性のミスフォールディングされたＴＴＲによって引き起こされる疾患を包含する。
【０１１５】
老人性全身性アミロイド症（ＳＳＡ）および老人性心臓アミロイド症（ＳＣＡ）は、心臓の心筋細胞の外部および内部での野生型ＴＴＲアミロイドの沈着から生じる加齢関連型のアミロイド症である。ＴＴＲアミロイド症は、ＴＴＲタンパク質を不安定にする変異によって引き起こされる、遺伝性（家族性）アミロイド症の最も一般的な形態でもある。ＴＴＲ遺伝子における点変異に関連したＴＴＲアミロイド症には、家族性アミロイド多発性神経炎（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）および中枢神経系選択的アミロイド症（ＣＮＳＡ）が含まれる。
【０１１６】
Ｂ．ヒト化ＴＴＲ遺伝子座
本明細書に開示されるヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、全体のＴｔｒ遺伝子が対応するオルソログのヒトＴＴＲ配列によって置き換えられるＴｔｒ遺伝子座であってよいか、または、それは、Ｔｔｒ遺伝子の一部だけが対応するオルソログのヒトＴＴＲ配列によって置き換えられる（すなわち、ヒト化）Ｔｔｒ遺伝子座であってもよい。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、対応するオルソログの内因性配列を置き換えることなく内因性Ｔｔｒ遺伝子座に挿入されたヒトＴＴＲ配列を含むこともできる。内因性Ｔｔｒ配列の特定のセグメントに対応するヒトＴＴＲ配列は、ヒトＴＴＲおよび内因性Ｔｔｒが最適に整列する場合、内因性Ｔｔｒ配列の特定のセグメントと整列するヒトＴＴＲの領域を指す。必要に応じて、ヒトＴＴＲ配列は、非ヒト動物におけるコドン利用に基づいてコドン最適化されるように改変される。置き換えられたか挿入された（すなわち、ヒト化された）領域は、エクソンなどのコード領域、イントロン、非翻訳領域または調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサーまたは転写リプレッサー結合性エレメント）などの非コード領域、または任意のその組合せを含むことができる。
【０１１７】
ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、対応するオルソログのヒトＴＴＲ配列（例えば、オルソログの野生型ヒトＴＴＲ配列）によって置き換えられたものである。あるいは、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、ヒトＴＴＲ遺伝子座の領域が対応する内因性非ヒト動物Ｔｔｒ遺伝子座に挿入されているものである。１つの例として、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の置き換えられたか挿入された領域は、コード配列（すなわち、エクソンの全部または一部）および非コード配列（すなわち、イントロンの全部または一部）の両方、例えば少なくとも１つのエクソンおよび少なくとも１つのイントロンを含むことができる。例えば、置き換えられたか挿入された領域は、少なくとも１つのエクソンおよび少なくとも１つのイントロンを含むことができる。コード配列および非コード配列の両方を含む、置き換えられたか挿入された領域は、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の連続した領域であってよく、これは、置き換えられたか挿入されたコード配列と置き換えられたか挿入された非コード配列の間に介在配列がないことを意味する。例えば、置き換えられたか挿入された領域は、少なくとも１つのエクソンおよび少なくとも１つの隣接するイントロンを含むことができる。置き換えられたか挿入された領域は、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の１つのエクソン、２つのエクソン、３つのエクソン、４つのエクソンまたは全てのエクソンを含むことができる。挿入されたヒトＴＴＲ配列は、ヒトＴＴＲ遺伝子の１つのエクソン、２つのエクソン、３つのエクソン、４つのエクソンまたは全てのエクソンを含むことができる。同様に、置き換えられた領域は、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の１つのイントロン、２つのイントロン、３つのイントロンまたは全てのイントロンを含むことができる。挿入されたヒトＴＴＲ配列は、ヒトＴＴＲ遺伝子の１つのイントロン、２つのイントロン、３つのイントロンまたは全てのイントロンを含むことができる。必要に応じて、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の１つまたは複数のイントロンおよび／または１つまたは複数のエクソンは、未改変のままである（すなわち、欠失せず、置き換えられない）。例えば、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンは、未改変のままであってよい。同様に、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンおよび第１のイントロンは、未改変のままであってよい。
【０１１８】
１つの具体例では、トランスサイレチン前駆体タンパク質の全体のコード配列が欠失し、対応するオルソログのヒトＴＴＲ配列で置き換えることができる。例えば、開始コドンから始まり停止コドンで終わる内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、対応するオルソログのヒトＴＴＲ配列で置き換えることができる。別の具体例では、ヒトトランスサイレチン前駆体タンパク質の全体のコード配列を挿入することができる。例えば、開始コドンから始まり停止コドンで終わるヒトＴＴＲ遺伝子座の領域を挿入することができる。
【０１１９】
調節配列を含む隣接する非翻訳領域を、ヒト化することもできる。Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンは、開始コドンの上流の５’非翻訳領域を一般的に含む。同様に、Ｔｔｒ遺伝子座の最後のエクソンは、停止コドンの下流の３’非翻訳領域を一般的に含む。Ｔｔｒ開始コドンの上流およびＴｔｒ停止コドンの下流の領域は、未改変であっても、欠失して対応するオルソログのヒトＴＴＲ配列で置き換えられてもよい。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方をヒト化することができるか、または５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方は内因性のままであってよい。１つの具体例では、５’ＵＴＲは、内因性のままである。別の具体例では、３’ＵＴＲはヒト化されるが、５’ＵＴＲは内因性のままである。別の具体例では、５’ＵＴＲは内因性のままであり、ヒトＴＴＲ  ３’ＵＴＲが内因性Ｔｔｒ遺伝子座に挿入される。例えば、ヒトＴＴＲ  ３’ＵＴＲは内因性３’ＵＴＲを置き換えることができるか、内因性３’ＵＴＲを置き換えることなく挿入することができる（例えば、それは内因性３’ＵＴＲの上流に挿入することができる）。
【０１２０】
トランスサイレチン前駆体タンパク質の１つまたは複数のドメインをコードする内因性Ｔｔｒ遺伝子座の１つまたは複数の領域を、ヒト化することができる。同様に、トランスサイレチン前駆体タンパク質の１つまたは複数のドメインをコードする内因性Ｔｔｒ遺伝子座の１つまたは複数の領域は、未改変のままであってよい（すなわち、欠失せず、置き換えられない）。例えば、トランスサイレチン前駆体タンパク質は、Ｎ末端にシグナルペプチドを一般的に有する。シグナルペプチドは、例えば、長さが約２０アミノ酸であってよい。シグナルペプチドをコードする内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域は未改変のままであってよく（すなわち、欠失せず、置き換えられない）、または欠失して、対応するオルソログのヒトＴＴＲ配列で置き換えられてもよい。同様に、抗ヒトＴＴＲ抗原結合性タンパク質によって認識されるエピトープをコードする内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域を、ヒト化することができる。
【０１２１】
対応するオルソログの配列による置き換えの程度またはヒトＴＴＲ配列の挿入の程度に依存して、プロモーターなどの調節配列は内因性であってよいか、または置き換えているもしくは挿入されたヒトオルソログ配列によって供給することができる。例えば、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、内因性非ヒト動物Ｔｔｒプロモーターを含むことができる。遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座のトランスサイレチン前駆体タンパク質のコード配列は、内因性Ｔｔｒプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ヒトＴＴＲ配列は、内因性Ｔｔｒプロモーターに作動可能に連結することができる。
【０１２２】
具体例として、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、対応するオルソログのヒトＴＴＲ配列によって置き換えられるか、または、挿入されるヒトＴＴＲ遺伝子座の領域が、Ｔｔｒ開始コドンから停止コドンまでの領域を含むか、それから本質的になるか、それからなるものであってよい。挿入されるヒトＴＴＲ配列は、ヒトＴＴＲ  ３’ＵＴＲをさらに含むことができる。例えば、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座のヒトＴＴＲ配列は、ＴＴＲ開始コドンから３’ＵＴＲの最後までの領域を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。必要に応じて、改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座の中のＴｔｒコード配列は、内因性のＴｔｒプロモーターに作動可能に連結されている。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座のヒトＴＴＲ配列は、配列番号１８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、配列番号１４または１５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座のコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号９０と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列（または、同じタンパク質をコードするその変性体（degenerate））を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座によってコードされる、生じるヒトトランスサイレチン前駆体タンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。
【０１２３】
別の具体例として、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、欠失し、対応するオルソログのヒトＴＴＲ配列によって置き換えられる内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域、または、挿入されるヒトＴＴＲ遺伝子座の領域が、第２のＴｔｒエクソンの開始コドンから停止コドンまでの領域を含むか、それから本質的になるか、それからなるものであってよい。挿入されるヒトＴＴＲ配列は、ヒトＴＴＲ  ３’ＵＴＲをさらに含むことができる。例えば、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座のヒトＴＴＲ配列は、第２のヒトＴＴＲエクソンの始点から３’ＵＴＲの最後までの領域を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。必要に応じて、改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座の中のＴｔｒコード配列は、内因性Ｔｔｒプロモーターに作動可能に連結されている。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座のヒトＴＴＲ配列は、配列番号１９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、配列番号１６または１７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座のコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号９１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列（または、同じタンパク質をコードするその変性体）を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座によってコードされる、生じるキメラトランスサイレチン前駆体タンパク質は、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。
【０１２４】
ヒト化ＴＴＲ遺伝子座から発現されるＴＴＲタンパク質は、完全ヒトＴＴＲタンパク質またはキメラ内因性／ヒトＴＴＲタンパク質（例えば、非ヒト動物がマウスである場合、キメラマウス／ヒトＴＴＲタンパク質）であってよい。例えば、トランスサイレチン前駆体タンパク質のシグナルペプチドは内因性であってよく、タンパク質の残りはヒトであってよい。あるいは、トランスサイレチン前駆体タンパク質のＮ末端は内因性であってよく、タンパク質の残りはヒトであってよい。例えば、Ｎ末端の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸は内因性であってよく、残りはヒトであってよい。具体例では、Ｎ末端の２３アミノ酸は内因性であり、タンパク質の残りはヒトである。
【０１２５】
必要に応じて、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、他のエレメントを含むことができる。そのようなエレメントの例は、選択カセット、レポーター遺伝子、リコンビナーゼ認識部位または他のエレメントを含むことができる。１つの例として、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、リコンビナーゼ認識配列（例えば、ｌｏｘＰ部位）によって挟まれた除去可能な選択カセット（例えば、自己欠失選択カセット）を含むことができる。あるいは、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、他のエレメントが欠失してもよい（例えば、選択カセットが欠失してもよく、および／またはレポーター遺伝子が欠失してもよい）。適するレポーター遺伝子およびレポータータンパク質の例は、本明細書の他の場所で開示される。適する選択マーカーの例には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）が含まれる。リコンビナーゼの例には、Ｃｒｅ、ＦｌｐおよびＤｒｅリコンビナーゼが含まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の１つの例はＣｒｅｉであり、そこでは、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンは、イントロンによって分離されており、原核細胞におけるその発現を防止する。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するために、核局在化シグナルをさらに含むことができる（例えば、ＮＬＳ−Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位は、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象のための基質としての役割をすることができるヌクレオチド配列を含む。リコンビナーゼ認識部位の例には、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘならびにｌｏｘ部位、例えばｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２およびｌｏｘ５１７１が含まれる。
【０１２６】
レポーター遺伝子または選択カセットなどの他のエレメントは、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれた自己欠失カセットであってよい。例えば、その各々はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，８５１およびＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照。一例として、自己欠失カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結されているＣｒｅｉ遺伝子（Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンを含み、それらはイントロンによって分離される）、およびヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されているネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。Ｐｒｍ１プロモーターを用いることによって、自己欠失カセットは、Ｆ０動物の雄生殖細胞において特異的に欠失させることができる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的とされている細胞において活性であるプロモーターに作動可能に連結させることができる。プロモーターの例は、本明細書の他の場所に記載されている。別の具体例として、自己欠失選択カセットは、１つまたは複数のプロモーター（例えば、ヒトユビキチンプロモーターおよびＥＭ７プロモーターの両方）に作動可能に連結されているハイグロマイシン耐性遺伝子コード配列、続いてポリアデニル化シグナル、続いて１つまたは複数のプロモーター（例えば、ｍＰｒｍ１プロモーター）に作動可能に連結されているＣｒｅｉコード配列、続いて別のポリアデニル化シグナルを含むことができ、ここで、カセット全体は、ｌｏｘＰ部位によって挟まれている。
【０１２７】
ヒト化ＴＴＲ遺伝子座は、条件的対立遺伝子であってもよい。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載の通り、条件的対立遺伝子は多官能性対立遺伝子であってよい。例えば、条件的対立遺伝子は、以下を含むことができる：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス配向の作動配列；（ｂ）センスまたはアンチセンス配向の薬物選択カセット（ＤＳＣ）；（ｃ）アンチセンス配向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）；および（ｄ）逆配向の反転モジュールによる条件付き（conditional）（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロンおよび可逆遺伝子トラップ様モジュールを利用する）。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照。条件的対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼに曝露されると組み換えられて、（ｉ）作動配列およびＤＳＣを欠いている；および（ｉｉ）センス配向のＮＳＩおよびアンチセンス配向のＣＯＩＮを含有する、条件的対立遺伝子を形成する組換え可能な単位をさらに含むことができる。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照。
【０１２８】
Ｃ．ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物
本明細書の他の場所に記載される、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物が提供される。ゲノム、細胞または非ヒト動物は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性であってよい。二倍体の生物体は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子が存在する場合にはホモ接合体と記載され、２つの対立遺伝子が異なる場合にはヘテロ接合体と記載される。
【０１２９】
本明細書で提供される非ヒト動物ゲノムまたは細胞は、例えば、ヒトＴＴＲ遺伝子座に相同またはオルソロガスであるＴｔｒ遺伝子座またはゲノム遺伝子座を含む、任意の非ヒト細胞であってよい。ゲノムは、真核細胞に由来することができるか、または細胞は真核細胞であってよく、それは、例えば、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物の細胞およびヒト細胞を含む。用語「動物」は、哺乳動物、魚類および鳥類を含む。哺乳動物細胞は、例えば、非ヒト哺乳動物の細胞、齧歯動物細胞、ラット細胞、マウス細胞またはハムスター細胞であってよい。他の非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、家畜（例えば、雌ウシ、去勢ウシなどのウシ属の種；ヒツジ、ヤギなどのヒツジの種；ならびにブタおよびイノシシなどのブタの種）が含まれる。飼い慣らされた動物および農業動物も含まれる。用語「非ヒト」は、ヒトを除外する。
【０１３０】
また、細胞は、任意の型の未分化または分化状態であってもよい。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞もしくはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞もしくはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であってもよい。全能性細胞は、任意の細胞型を生じさせ得る未分化細胞を含み、多能性細胞は、１種よりも多くの分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性および／または全能性細胞は、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞またはＥＳ様細胞であってよい。ＥＳ細胞は、胚に導入されると発生中の胚の任意の組織に寄与することが可能な胚由来全能性または多能性細胞を含む。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から引き出すことができ、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のいずれの細胞にも分化させることができる。
【０１３１】
本明細書で提供される細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子または卵母細胞）であってもよい。細胞は、有糸分裂性細胞または有糸分裂不活性細胞、減数分裂性細胞または減数分裂不活性細胞であってもよい。同様に、細胞はまた、初代体細胞であってもよく、または初代体細胞ではない細胞であってもよい。体細胞は、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞を含む。例えば、細胞は、肝臓細胞、例えば肝芽細胞または肝細胞であってよい。
【０１３２】
本明細書で提供される好適な細胞は、初代細胞も含む。初代細胞は、生物体、器官、または組織から直接単離された細胞または細胞培養物を含む。初代細胞は、形質転換されておらず不死でもない細胞を含む。初代細胞は、以前に組織培養物中で継代されていないかまたは以前に組織培養物中で継代されているが、組織培養物中で無制限に継代することはできない、生物体、器官、または組織から得られる任意の細胞を含む。そのような細胞は、従来の技法によって単離することができ、例えば、肝細胞を含む。
【０１３３】
本明細書で提供される他の好適な細胞は、不死化細胞を含む。不死化細胞は、通常無制限には増殖しないが、変異または変更に起因して、正常な細胞の老化を逃れ、その代わりに分裂し続け得る多細胞生物に由来する細胞を含む。そのような変異または変更は、天然に起こり得るか、または意図的に誘導され得る。不死化細胞系の具体例は、ＨｅｐＧ２ヒト肝がん細胞系である。多数の型の不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞は、組換え遺伝子またはタンパク質の培養または発現のために一般に使用される細胞を含む。
【０１３４】
本明細書で提供される細胞はまた、１細胞期胚（すなわち、受精した卵母細胞または受精卵）も含む。そのような１細胞期胚は、任意の遺伝的背景（例えば、マウスについては、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはその組合せ）に由来するものであってもよく、新鮮であるか、または凍結されていてもよく、自然交配またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精から誘導されたものであってもよい。
【０１３５】
本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であってもよく、または疾患を有するか、もしくは変異体を担持する細胞であってもよい。
【０１３６】
具体例では、非ヒト動物細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または肝臓細胞、例えばマウスまたはラットのＥＳ細胞または肝臓細胞である。
【０１３７】
本明細書に記載されるヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物は、本明細書の他の場所に記載される方法によって作製することができる。用語「動物」には、哺乳動物、魚類および鳥類が含まれる。非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウマ、ウサギ、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット）および家畜（例えば、雌ウシおよび去勢ウシなどのウシ属の種；ヒツジおよびヤギなどのヒツジの種；ならびにブタおよびイノシシなどのブタの種）が含まれる。飼い慣らされた動物および農業動物も含まれる。用語「非ヒト動物」は、ヒトを除外する。好ましい非ヒト動物には、例えば、齧歯動物、例えばマウスおよびラットが含まれる。
【０１３８】
非ヒト動物は、任意の遺伝的背景に由来するものであってもよい。例えば、好適なマウスは、１２９株、Ｃ５７ＢＬ／６株、１２９とＣ５７ＢＬ／６のミックス、ＢＡＬＢ／ｃ株、またはＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ株に由来するものであってもよい。１２９系統の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Festingら（１９９９年）Mammalian  Genome、１０巻：８３６頁を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ，Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。適切なマウスはまた、上述の１２９系統および上述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックス（例えば、５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６）に由来してよい。同様に、適切なマウスは、上述の１２９系統のミックスまたは上述のＢＬ／６系統のミックス（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）に由来してよい。
【０１３９】
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統を含めた任意のラット系統に由来してよい。ラットはまた、上記の２種またはそれよりも多くの系統のミックスに由来する系統から得ることもできる。例えば、適切なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統に由来してよい。ＡＣＩラット系統は、黒色アグーチを有し、腹部および足が白色であり、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた種々の供給源から入手可能である。Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた種々の供給源から入手可能である。いくつかの適切なラットは、近交系ラット系統に由来してよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
【０１４０】
ＩＩＩ．ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の効能を評価するためにヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物を使用する方法
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬（例えば、治療用分子または複合体）の送達または効能を評価または最適化するために、本明細書の他の場所に記載されるヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物を使用するための様々な方法が提供される。非ヒト動物はヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含むので、非ヒト動物はヒトＴＴＲ標的化試薬の効能をより正確に反映する。そのような非ヒト動物は、ヒトＴＴＲ遺伝子を標的にするように設計されたゲノム編集試薬を試験するために特に有益であるが、その理由は、本明細書に開示される非ヒト動物は、ランダムなゲノム遺伝子座のヒトＴＴＲ配列のトランスジェニック挿入ではなくヒト化内因性Ｔｔｒ遺伝子座を含み、ヒト化内因性Ｔｔｒ遺伝子座は、人工ｃＤＮＡ配列ではなくコード領域および非コード領域の両方からのオルソログのヒトゲノムＴＴＲ配列を含むからである。
【０１４１】
Ａ．ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の効能を試験する方法
本明細書の他の場所に記載されるヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の送達または効能を評価するための様々な方法が提供される。そのような方法は、以下を含むことができる：（ａ）ヒトＴＴＲ標的化試薬を非ヒト動物に導入すること（すなわち、ヒトＴＴＲ標的化試薬を非ヒト動物に投与すること）；および（ｂ）ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価すること。
【０１４２】
ヒトＴＴＲ標的化試薬は、ヒトＴＴＲ遺伝子座（ヒトＴＴＲ遺伝子）、ヒトＴＴＲ  ｍＲＮＡまたはヒトトランスサイレチンタンパク質を標的にする任意の生物学的または化学的薬剤であってよい。ヒトＴＴＲ標的化試薬の例は、本明細書の他の場所に開示され、例えば、ゲノム編集剤が含まれる。例えば、ヒトＴＴＲ標的化試薬は、ＴＴＲ標的化核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））、またはＴＴＲ標的化タンパク質（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮなどのＣａｓタンパク質）をコードする核酸であってよい。あるいは、ヒトＴＴＲ標的化試薬は、ＴＴＲ標的化抗体または抗原結合性タンパク質、または、ヒトＴＴＲを標的にする任意の他の大分子もしくは小分子であってよい。
【０１４３】
そのようなヒトＴＴＲ標的化試薬は、本明細書の他の場所でさらに詳細に開示される任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰまたはＨＤＤ）によって、および任意の投与経路によって投与することができる。治療的複合体および分子を送達する手段ならびに投与経路は、本明細書の他の場所でさらに詳細に開示される。特定の方法では、試薬はＡＡＶ媒介性送達を介して送達される。例えば、ＡＡＶ８は、肝臓を標的にするために使用することができる。他の特定の方法では、試薬は、ＬＮＰ媒介性送達によって送達される。他の特定の方法では、試薬は、流体力学的な送達（ＨＤＤ）によって送達される。用量は、任意の適する用量であってよい。例えば、試薬（例えば、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ）がＬＮＰ媒介性送達によって送達される一部の方法では、用量は、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約６ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．３〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３〜約６ｍｇ／ｋｇ；約０．３〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３〜約４ｍｇ／ｋｇ、約０．３〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．３〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．３〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇまたは約３ｍｇ／ｋｇであってよい。具体例では、用量は、約０．１〜約６ｍｇ／ｋｇ；約０．１〜約３ｍｇ／ｋｇまたは約０．１〜約２ｍｇ／ｋｇである。具体例では、ヒトＴＴＲ標的化試薬はゲノム編集試薬であり、ＬＮＰ用量は約１ｍｇ／ｋｇであり、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座のゲノム編集パーセントは約７０％〜約８０％である。別の具体例では、ヒトＴＴＲ標的化試薬はゲノム編集試薬であり、ＬＮＰ用量は約０．３ｍｇ／ｋｇであり、編集パーセントは約５０％〜約８０％である。別の具体例では、ヒトＴＴＲ標的化試薬はゲノム編集試薬であり、ＬＮＰ用量は約０．１ｍｇ／ｋｇであり、編集パーセントは約２０％〜約８０％である。別の具体例では、ＬＮＰ用量は約１ｍｇ／ｋｇであり、血清ＴＴＲレベルは、対照レベルの約０％〜約１０％または約０％〜約３５％に低減される。別の具体例では、ＬＮＰ用量は約０．３ｍｇ／ｋｇであり、血清ＴＴＲレベルは、対照レベルの約０％〜約２０％または約０％〜約９５％に低減される。別の具体例では、ＬＮＰ用量は約０．１ｍｇ／ｋｇであり、血清ＴＴＲレベルは、対照レベルの約０％〜約６０％または約０％〜約９９％に低減される。
【０１４４】
ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価する方法は周知であり、本明細書の他の場所で提供される。活性の評価は、本明細書の他の場所で開示されるように、任意の細胞型、任意の組織型または任意の臓器型においてであってよい。一部の方法では、活性の評価は、肝臓細胞においてである。ＴＴＲ標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、そのような方法はヒト化ＴＴＲ遺伝子座の改変を評価することを含むことができる。１つの例として、評価することは、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座で非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性を測定することを含むことができる。これは、例えば、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含むことができる。例えば、評価することは、非ヒト動物から単離される１つまたは複数の細胞においてヒト化ＴＴＲ遺伝子座を配列決定することを含むことができる（例えば、次世代シーケンシング）。評価は、非ヒト動物から標的臓器（例えば、肝臓）または組織を単離して、標的臓器または組織におけるヒト化ＴＴＲ遺伝子座の改変を評価することを含むことができる。評価は、標的臓器または組織内の２つまたはそれより多くの異なる細胞型におけるヒト化ＴＴＲ遺伝子座の改変を評価することを含むこともできる。同様に、評価は、非ヒト動物から非標的臓器または組織（例えば、２つまたはそれより多くの非標的臓器または組織）を単離して、非標的臓器または組織におけるヒト化ＴＴＲ遺伝子座の改変を評価することを含むことができる。
【０１４５】
そのような方法は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座によって生成されるｍＲＮＡの発現レベルを測定すること、または、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定することを含むこともできる。例えば、特定の細胞、組織または臓器タイプ（例えば、肝臓）においてタンパク質レベルを測定することができるか、または分泌されるレベルを血清において測定することができる。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座から発現されるＴｔｒ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を評価するための方法は本明細書の他の場所で提供され、周知である。
【０１４６】
本明細書の他の場所に記載されるように、ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性をｅｘ  ｖｉｖｏで評価するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を評価するための上で提供される様々な方法を使用することもできる。
【０１４７】
１つの例として、ヒトＴＴＲ標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座での編集パーセントを評価することができる（例えば、肝臓細胞において）。例えば、編集パーセント（例えば、溶解細胞のプールからＰＣＲ反応において読み取った配列の総数に対して観察された挿入または欠失の総数）は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または、例えば、約１％〜約９９％、約１０％〜約９９％、約２０％〜約９９％、約３０％〜約９９％、約４０％〜約９９％、約５０％〜約９９％、約６０％〜約９９％、約１％〜約９０％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約９０％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約１％〜約８０％、約１０％〜約８０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約８０％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約８０％、または約６０％〜約８０％であってよい。
【０１４８】
別の例として、血清ＴＴＲレベルを評価することができる。例えば、血清ＴＴＲレベルは、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または、例えば、約１％〜約９９％、約１０％〜約９９％、約２０％〜約９９％、約３０％〜約９９％、約４０％〜約９９％、約５０％〜約９９％、約６０％〜約９９％、約７０％〜約９９％、約８０％〜約９９％、約１％〜約９０％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約９０％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、または約８０％〜約９０％低減することができる。
【０１４９】
一部の方法では、ヒトＴＴＲ標的化試薬は、ヒトＴＴＲ遺伝子を標的にする、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ剤などのヌクレアーゼ剤である。そのような方法は、例えば：（ａ）非ヒト動物にヒトＴＴＲ遺伝子を切断するように設計されたヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９、およびヒトＴＴＲ遺伝子の中のガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計されたガイドＲＮＡ）を導入すること；および（ｂ）ヒト化ＴＴＲ遺伝子座の改変を評価することを含むことができる。
【０１５０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの場合、例えば、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化ＴＴＲ遺伝子座に方向付け、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体がガイドＲＮＡ標的配列を切断し、細胞による修復を誘発する（例えば、ドナー配列が存在しい場合非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して）とき、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座の改変が誘導される。
【０１５１】
必要に応じて、各々ヒトＴＴＲ遺伝子内の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計された、２つまたはそれより多くのガイドＲＮＡを導入することができる。例えば、２つのガイドＲＮＡを、２つのガイドＲＮＡ標的配列の間でゲノム配列を切除するように設計することができる。第１のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化ＴＴＲ遺伝子座に方向付け、第２のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化ＴＴＲ遺伝子座に方向付け、第１のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第１のガイドＲＮＡ標的配列を切断し、第２のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第２のガイドＲＮＡ標的配列を切断し、介在配列の切除をもたらすとき、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座の改変が誘導される。
【０１５２】
必要に応じて、ヒトＴＴＲ遺伝子で組換え、ヒトＴＴＲ遺伝子を改変することが可能な外因性ドナー核酸も、非ヒト動物に導入される。必要に応じて、本明細書の他の場所に記載されるように、ヌクレアーゼ剤またはＣａｓタンパク質は外因性ドナー核酸に係留することができる。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座の改変は、例えば、ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をヒト化ＴＴＲ遺伝子座に方向付け、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体がガイドＲＮＡ標的配列を切断し、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座が外因性ドナー核酸で組換え、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を改変するときに誘導される。外因性ドナー核酸は、例えば相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して、またはＮＨＥＪ媒介性挿入を介して、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座で組み換えることができる。任意のタイプの外因性ドナー核酸を使用することができ、その例は本明細書の他の場所に提供される。
【０１５３】
Ｂ．Ｉｎ  ＶｉｖｏまたはＥｘ  ＶｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の送達または効能を最適化する方法
細胞または非ヒト動物へのヒトＴＴＲ標的化試薬の送達を最適化するか、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＴＴＲ標的化試薬の活性または効能を最適化するための、様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、以下を含むことができる：（ａ）ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む第１の非ヒト動物または第１の細胞において上記のヒトＴＴＲ標的化試薬の効能を試験する方法を１回目に実行すること；（ｂ）変数を変更し、変更した変数によってヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む第２の非ヒト動物（すなわち、同じ種の）または第２の細胞において前記方法を２回目に実行すること；および（ｃ）ステップ（ａ）のヒトＴＴＲ標的化試薬の活性をステップ（ｂ）のヒトＴＴＲ標的化試薬の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択すること。
【０１５４】
ヒトＴＴＲ標的化試薬の送達、効能または活性を測定する方法は、本明細書の他の場所に開示される。例えば、そのような方法は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座の改変を測定することを含むことができる。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座のより有効な改変は、非ヒト動物または細胞内での所望の効果に応じた異なる物を意味することができる。例えば、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座のより有効な改変は、より高いレベルの改変、より高い精度、より高い一貫性またはより高い特異性の１つまたは複数または全てを意味することができる。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座のより高いレベルの改変（すなわち、より高い効能）は、特定の標的細胞型内で、特定の標的組織内でまたは特定の標的臓器（例えば、肝臓）内で、より高い百分率の細胞が標的にされることを指す。より高い精度は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座のより正確な改変を指す（例えば、余分の意図されない挿入および欠失（例えば、ＮＨＥＪインデル）なしで同じ改変を有するかまたは所望の改変を有する標的化細胞のより高い百分率）。より高い一貫性は、複数のタイプの細胞、組織または臓器が標的にされる場合、異なるタイプの標的化細胞、組織または臓器の間でのヒト化ＴＴＲ遺伝子座のより一貫した改変を指す（例えば、肝臓内のより多くの数の細胞型の改変）。特定の臓器が標的にされる場合、より高い一貫性は、その臓器（例えば、肝臓）内の全ての場所全体でのより一貫した改変を指すこともできる。より高い特異性は、標的にされる１つまたは複数のゲノム遺伝子座に関してより高い特異性、標的にされる細胞型に関してより高い特異性、標的にされる組織タイプに関してより高い特異性、または標的にされる臓器に関してより高い特異性を指すことができる。例えば、増加したゲノム遺伝子座特異性は、オフターゲットゲノム遺伝子座のより少ない改変を指す（例えば、標的ゲノム遺伝子座の改変の代わりに、またはそれに加えて、意図されないオフターゲットゲノム遺伝子座で改変を有する標的化細胞のより低い百分率）。同様に、細胞型、組織、または臓器型特異性の増大は、特定の細胞型、組織型、または臓器型が標的化される場合、オフターゲット細胞型、組織型、または臓器型の改変が少ない（例えば、特定の臓器（例えば、肝臓）が標的化される場合、意図した標的ではない臓器または組織中の細胞の改変が少ない）ことを指す。
【０１５５】
変更される変数は、任意のパラメータであってよい。１つの例として、変更される変数は、１つまたは複数のヒトＴＴＲ標的化試薬が細胞または非ヒト動物に導入されるパッケージングまたは送達方法であってよい。ＬＮＰ、ＨＤＤおよびＡＡＶなどの送達方法の例は、本明細書の他の場所で開示される。例えば、変更される変数は、ＡＡＶ血清型であってよい。同様に、投与はＬＮＰ媒介性送達を含み、変更される変数はＬＮＰ製剤であってよい。別の例として、変更される変数は、細胞または非ヒト動物への１つまたは複数のヒトＴＴＲ標的化試薬の導入のための投与経路であってよい。投与経路の例、例えば静脈内、硝子体内、実質内および経鼻滴注は、本明細書の他の場所に開示される。
【０１５６】
別の例として、変更される変数は、導入される１つまたは複数のヒトＴＴＲ標的化試薬の濃度または量であってよい。別の例として、変更される変数は、導入される別のヒトＴＴＲ標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質または外因性ドナー核酸）の濃度または量と比較した、導入される１つのヒトＴＴＲ標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質または外因性ドナー核酸）の濃度または量であってよい。
【０１５７】
別の例として、変更される変数は、試薬の活性または効能を評価するタイミングと比較した、１つまたは複数のヒトＴＴＲ標的化試薬を導入するタイミングであってよい。別の例として、変更される変数は、１つまたは複数のヒトＴＴＲ標的化試薬が導入される回数または頻度であってよい。別の例として、変更される変数は、導入される別のヒトＴＴＲ標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質または外因性ドナー核酸）の導入のタイミングと比較した、導入される１つのヒトＴＴＲ標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質または外因性ドナー核酸）の導入のタイミングであってよい。
【０１５８】
別の例として、変更される変数は、１つまたは複数のヒトＴＴＲ標的化試薬が導入される形態であってよい。例えば、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡの形態で、またはＲＮＡの形態で導入することができる。Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、ＤＮＡの形態で、ＲＮＡの形態で、またはタンパク質（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成した）の形態で導入することができる。外因性ドナー核酸は、一本鎖、二本鎖、線状、環状などのＤＮＡ、ＲＮＡであってもよい。同様に、それぞれの構成成分は、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどに、安定性に関する様々な組合せの改変を含んでもよい。別の例として、変更される変数は、導入される１つまたは複数のヒトＴＴＲ標的化試薬であってよい（例えば、異なる配列を有する異なるガイドＲＮＡを導入する、異なるＣａｓタンパク質を導入する（例えば、異なる配列を有する異なるＣａｓタンパク質、または異なる配列を有するが同じＣａｓタンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を導入する）、または異なる配列を有する異なる外因性ドナー核酸を導入する）。
【０１５９】
具体例では、ヒトＴＴＲ標的化試薬は、Ｃａｓタンパク質、およびヒトＴＴＲ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含む。そのような方法では、変更される変数は、ガイドＲＮＡ配列および／またはガイドＲＮＡ標的配列であってよい。一部のそのような方法では、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で各々投与することができ、変更される変数は、Ｃａｓ  ｍＲＮＡのガイドＲＮＡに対する比（例えば、ＬＮＰ製剤中の）であってよい。一部のそのような方法では、変更される変数は、ガイドＲＮＡ改変であってよい（例えば、改変を有するガイドＲＮＡを改変なしのガイドＲＮＡと比較する）。
【０１６０】
Ｃ．ヒトＴＴＲ標的化試薬
ヒトＴＴＲ標的化試薬は、ヒトＴＴＲ遺伝子、ヒトＴＴＲ  ｍＲＮＡまたはヒトＴＴＲタンパク質を標的にする任意の試薬であってよい。例えば、それは、ヒトＴＴＲ遺伝子内の標的配列を切断するヌクレアーゼ剤などのゲノム編集試薬であってよいか、それは、ヒトＴＴＲ  ｍＲＮＡを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよいか、それは、ヒトＴＴＲタンパク質のエピトープを標的にする抗原結合性タンパク質であってよいか、または、それは、ヒトＴＴＲを標的にする小分子であってよい。本明細書に開示される方法におけるヒトＴＴＲ標的化試薬は、公知のヒトＴＴＲ標的化試薬であってよいか、推定上のＴＴＲ標的化試薬（例えば、ヒトＴＴＲを標的にするように設計された候補試薬）であってよいか、または、ヒトＴＴＲ標的化活性についてスクリーニングされる試薬であってよい。
【０１６１】
（１）ヒトＴＴＲ遺伝子を標的にするヌクレアーゼ剤
ヒトＴＴＲ標的化試薬は、ヒトＴＴＲ遺伝子内の標的配列を切断するヌクレアーゼ剤などのゲノム編集試薬であってよい。ヌクレアーゼ標的配列は、ヌクレアーゼ剤によってニックまたは二本鎖切断が誘導されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ剤のための標的配列は細胞にとって内因性（または、天然）であってよいか、または標的配列は細胞にとって外因性であってもよい。細胞にとって外因性である標的配列は、細胞のゲノムに天然に存在しない。標的配列は、標的遺伝子座に配置されることが望まれる目的のポリヌクレオチドに外因性であってもよい。一部の場合には、標的配列は、宿主細胞のゲノムに一度だけ存在する。
【０１６２】
標的配列の長さは異なってよく、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対の場合約３０〜３６ｂｐである（すなわち、各ＺＦＮにつき約１５〜１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の場合約３６ｂｐである、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの場合約２０ｂｐである標的配列を含む。
【０１６３】
本明細書に開示される方法および組成物において、所望の標的配列でニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。そのヌクレアーゼ剤が所望の標的配列でニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、天然に存在するか天然のヌクレアーゼ剤を用いることができる。あるいは、改変されたか操作されたヌクレアーゼ剤を用いることができる。「操作されたヌクレアーゼ剤」には、所望の標的配列を特異的に認識してニックまたは二本鎖切断を誘導するように、その天然形態から操作される（改変または誘導される）ヌクレアーゼが含まれる。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の、天然に存在するヌクレアーゼ剤から生じることができるか、またはそれは人工的に作製もしくは合成することができる。例えば、操作されたヌクレアーゼは標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘導することができ、ここで、標的配列は天然の（非操作のまたは非改変の）ヌクレアーゼ剤によって認識されただろう配列ではない。ヌクレアーゼ剤の改変は、タンパク質切断剤におけるわずか１つのアミノ酸または核酸分解剤における１つのヌクレオチドであり得る。標的配列または他のＤＮＡにおいてニックまたは二本鎖切断を生成することは、標的配列または他のＤＮＡを「切断する（cutting）」または「切断する（cleaving）」と本明細書で呼ぶことができる。
【０１６４】
例示される標的配列の活性バリアントおよび断片も、提供される。そのような活性バリアントは、所与の標的配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を含むことができ、ここで、活性バリアントは生物活性を保持し、したがって、ヌクレアーゼ剤によって配列特異的に認識され切断され得る。ヌクレアーゼ剤による標的配列の二本鎖切断を測定するアッセイは、周知である。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Frendewey  et  al.  (2010)  Methods  in  Enzymology  476:295-307、を参照。
【０１６５】
ヌクレアーゼ剤の標的配列は、Ｔｔｒ遺伝子座またはその近くの任意の場所に配置することができる。標的配列はＴｔｒ遺伝子のコード領域内に、または遺伝子の発現に影響する調節領域内に位置することができる。ヌクレアーゼ剤の標的配列は、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、調節領域または任意の非タンパク質コード領域に位置することができる。
【０１６６】
１つのタイプのヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物の生物体のゲノム内の特異的標的配列で二本鎖切断を形成するために使用することができる、配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然または操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターまたはその機能的部分を、エンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩなどの触媒性ドメインに融合させることによって作製される。特異な、モジュール式のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、潜在的にいかなる所与のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計も可能にする。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特異的ＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、したがって、所望の標的配列で二本鎖切断を形成するために使用することができる。その各々は参照により本明細書にその全体が組み込まれる、ＷＯ２０１０／０７９４３０；Morbitzer  et  al.  (2010)  PNAS  10.1073/pnas.1013133107；Scholze  &  Boch  (2010)  Virulence  1:428-432；Christian  et  al.  Genetics  (2010)  186:757-761；Li  et  al.  (2010)  Nuc.  Acids  Res.  (2010)  doi:10.1093/nar/gkq704；およびMiller  et  al.  (2011)  Nature  Biotechnology  29:143-148を参照。
【０１６７】
適するＴＡＬヌクレアーゼの例および適するＴＡＬヌクレアーゼを調製する方法は、例えば、その各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２３９３１５Ａ１、ＵＳ２０１１／０２６９２３４Ａ１、ＵＳ２０１１／０１４５９４０Ａ１、ＵＳ２００３／０２３２４１０Ａ１、ＵＳ２００５／０２０８４８９Ａ１、ＵＳ２００５／００２６１５７Ａ１、ＵＳ２００５／００６４４７４Ａ１、ＵＳ２００６／０１８８９８７Ａ１およびＵＳ２００６／００６３２３１Ａ１に開示される。様々な実施形態では、例えば、目的の遺伝子座または目的のゲノム遺伝子座における標的核酸配列でまたはその近くで切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、ここで、標的核酸配列は標的化ベクターによって改変されるべき配列にまたはその近くにある。本明細書で提供される様々な方法および組成物で使用するのに適するＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書に記載される標的化ベクターによって改変されるべき標的核酸配列でまたはその近くで結合するように特異的に設計されるものが含まれる。
【０１６８】
一部のＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各単量体は、２つの超可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３〜３５個のＴＡＬリピートを含む。一部のＴＡＬＥＮでは、ヌクレアーゼ剤は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されているＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むことができ、ここで、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々はＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結されており、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２〜２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離される標的ＤＮＡ配列の各鎖の中の２つの連続した標的ＤＮＡ配列を認識し、ここで、ＦｏｋＩヌクレアーゼのサブユニットは二量体化して、標的配列で二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。
【０１６９】
本明細書に開示される様々な方法および組成物において用いられるヌクレアーゼ剤は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をさらに含むことができる。一部のＺＦＮでは、ＺＦＮの各単量体は３つまたはそれより多くの亜鉛フィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、ここで、各亜鉛フィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐのサブサイトに結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されている亜鉛フィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮを含むことができ、ここで、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮの各々はＦｏｋＩヌクレアーゼのサブユニットに作動可能に連結されており、第１および第２のＺＦＮは、約５〜７ｂｐのスペーサーによって分離される標的ＤＮＡ配列の各鎖の中の２つの連続した標的ＤＮＡ配列を認識し、ここで、ＦｏｋＩヌクレアーゼのサブユニットは二量体化して、二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。例えば、その各々は参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００６０２４６５６７；ＵＳ２００８０１８２３３２；ＵＳ２００２００８１６１４；ＵＳ２００３００２１７７６；ＷＯ２００２／０５７３０８Ａ２；ＵＳ２０１３０１２３４８４；ＵＳ２０１００２９１０４８；ＷＯ２０１１／０１７２９３Ａ２；およびGaj  et  al.  (2013)  Trends  in  Biotechnology,  31(7):397-405を参照。
【０１７０】
別のタイプのヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは保存された配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、これらのファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−ＨおよびＨｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位およびホスホジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼはそれらの長い標的配列について、およびそれらのＤＮＡ基質における一部の配列多型への寛容性について注目すべきである。メガヌクレアーゼのドメイン、構造および機能は公知である、例えば、Guhan  and  Muniyappa  (2003)  Crit  Rev  Biochem  Mol  Biol  38:199-248；Lucas  et  al.,  (2001)  Nucleic  Acids  Res  29:960-9；Jurica  and  Stoddard,  (1999)  Cell  Mol  Life  Sci  55:1304-26；Stoddard,  (2006)  Q  Rev  Biophys  38:49-95；およびMoure  et  al.,  (2002)  Nat  Struct  Biol  9:764を参照。一部の例では、天然に存在するバリアントおよび／または操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。カイネティクス、補因子相互作用、発現、最適な条件および／または標的配列特異性を改変するための、ならびに活性についてスクリーニングするための方法は公知である。例えば、その各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Epinat  et  al.,  (2003)  Nucleic  Acids  Res  31:2952-62；Chevalier  et  al.,  (2002)  Mol  Cell  10:895-905；Gimble  et  al.,  (2003)  Mol  Biol  334:993-1008；Seligman  et  al.,  (2002)  Nucleic  Acids  Res  30:3870-9；Sussman  et  al.,  (2004)  J  Mol  Biol  342:31-41；Rosen  et  al.,  (2006)  Nucleic  Acids  Res  34:4791-800；Chames  et  al.,  (2005)  Nucleic  Acids  Res  33:e178；Smith  et  al.,  (2006)  Nucleic  Acids  Res  34:e149；Gruen  et  al.,  (2002)  Nucleic  Acids  Res  30:e29；Chen  and  Zhao,  (2005)  Nucleic  Acids  Res  33:e154；ＷＯ２００５１０５９８９；ＷＯ２００３０７８６１９；ＷＯ２００６０９７８５４；ＷＯ２００６０９７８５３；ＷＯ２００６０９７７８４；およびＷＯ２００４０３１３４６を参照。
【０１７１】
例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃＩＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩまたはそれらの任意の活性バリアントもしくは断片を含む任意のメガヌクレアーゼを使用することができる。
【０１７２】
メガヌクレアーゼは、例えば、１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識することができる。一部の場合には、メガヌクレアーゼは、ゲノムの中の１つの完全に一致した標的配列を認識する。
【０１７３】
一部のメガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。１つのタイプのホーミングヌクレアーゼは、例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−Ｄｍｏｌを含む、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼである。
【０１７４】
ヌクレアーゼ剤は、下でより詳細に記載の通りに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をさらに含むことができる。
【０１７５】
ヌクレアーゼ剤の活性バリアントおよび断片（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）も提供される。そのような活性バリアントは、天然のヌクレアーゼ剤と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を含むことができ、ここで、活性バリアントは、所望の標的配列で切断する能力を保持し、したがって、ニックまたは二本鎖切断を誘導する活性を保持する。例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ剤のいずれも、天然のエンドヌクレアーゼ配列から改変することができ、天然のヌクレアーゼ剤によって認識されなかった標的配列を認識し、そこでニックまたは二本鎖切断を誘導するように設計することができる。したがって、一部の操作されたヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ剤標的配列と異なる標的配列において、ニックまたは二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断を誘導する活性のためのアッセイは公知であり、標的配列を含有するＤＮＡ基質の上でエンドヌクレアーゼの全体的活性および特異性を一般的に測定する。
【０１７６】
ヌクレアーゼ剤は、任意の公知の手段によって細胞または非ヒト動物に導入することができる。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞または非ヒト動物に直接的に導入することができる。あるいは、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、細胞または非ヒト動物に導入することができる。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが導入される場合、ヌクレアーゼ剤は、細胞内で一時的に、条件つきでまたは構成的に発現させることができる。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含有させることができ、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例は、本明細書の他の場所でさらに詳細に議論される。あるいは、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入することができる。
【０１７７】
ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定して組み入れること、および細胞内で活性であるプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、標的化ベクターの中にあることができる。
【０１７８】
ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入を通してヌクレアーゼ剤が細胞に提供される場合、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ剤をコードする天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、目的の細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変することができる。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞または目的の任意の他の宿主細胞を含む、所与の目的の真核細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変することができる。
【０１７９】
（２）ヒトＴＴＲ遺伝子を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
特定のタイプのヒトＴＴＲ標的化試薬は、ヒトＴＴＲ遺伝子を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であってよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、転写物、およびＣａｓ遺伝子の発現に関与する、またはＣａｓ遺伝子の活性を方向付ける他のエレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型系であり得る。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｖ型系（例えば、Ｖ−Ａ亜型またはＶ−Ｂ亜型）であり得る。本明細書に開示される組成物および方法において使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に存在しないものであり得る。「天然に存在しない」系は、それらの天然に存在する状態から変更もしくは変異させたか、自然には天然に付随する少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないか、または、天然には付随しない少なくとも１つの他の構成成分が付随する系の１つまたは複数の構成成分などの、人間の手の関与を示す任意のものを含む。例えば、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、天然には一緒に存在しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質、天然には存在しないＣａｓタンパク質、または天然には存在しないｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用することができる。
【０１８０】
Ｃａｓタンパク質およびＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド。  Ｃａｓタンパク質は、一般に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、下でより詳細に記載されている）と相互作用し得る少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体形成ドメイン、および他のドメインも含み得る。一部のそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、天然のＣａｓタンパク質に由来するものであってもよい。他のそのようなドメインを付加して、改変Ｃａｓタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む核酸切断に対する触媒活性を有する。切断により、平滑末端または付着末端が生じ得、これは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般には平滑切断生成物を創出させる。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は５ヌクレオチド５’突出部を有する切断生成物を生じさせることができ、切断は非標的化鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後ろおよび標的化鎖の２３番目の塩基の後ろで起こる。Ｃａｓタンパク質は、標的ゲノム遺伝子座に二本鎖切断（例えば、平滑末端を伴う二本鎖切断）を創出させる完全な切断活性を有してもよいか、またはそれは標的ゲノム遺伝子座において一本鎖切断を創出するニッカーゼであってもよい。
【０１８１】
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそのホモログまたは改変バージョンが挙げられる。
【０１８２】
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し、一般には、保存的アーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌ���ｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーのさらなる例は、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられる）は例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられる）は別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに由来するＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられる）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKimら（２０１７年）Nat.Comm.８巻：１４５００頁を参照されたい。ＳａＣａｓ９はＳｐＣａｓ９より小さく、ＣｊＣａｓ９はＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。例示的なＣａｓ９タンパク質配列は、配列番号９４を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。Ｃａｓ９タンパク質をコードする例示的なＤＮＡは、配列番号９３を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。
【０１８３】
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の特有のアルギニンリッチクラスターに対する対応物と一緒に、Ｃａｓ９の対応するドメインと相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかし、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠き、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列では連続しており、それとは対照的に、Ｃａｓ９ではＨＮＨドメインを含む長い挿入断片を含有する。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるZetscheら（２０１５年）Cell、１６３巻（３号）：７５９〜７７１頁を参照されたい。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＣ２０１７  １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．  ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ  ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ｑ７Ｑ２に割り当てられる）は例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
【０１８４】
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、天然に存在するもの）、改変Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは改変Ｃａｓタンパク質の断片であってよい。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して活性なバリアントまたは断片であってもよい。触媒活性に関して活性なバリアントまたは断片は、野生型または改変Ｃａｓタンパク質またはその一部に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きな配列同一性を含み得、活性なバリアントは、所望の切断部位をカットする能力を保持し、したがって、ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性についてのアッセイは公知であり、一般に、切断部位を含有するＤＮＡ基質に対するＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。
【０１８５】
Ｃａｓタンパク質を、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つまたは複数が増大または低減するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質を、安定性などの、タンパク質の任意の他の活性または性質が変化するように改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを改変するか、欠失させるか、または不活化することもでき、Ｃａｓタンパク質を、タンパク質の機能に必須ではないドメインを取り除くため、またはＣａｓタンパク質の活性または性質を最適化する（例えば、増強するか、または低下させる）ために短縮することもできる。
【０１８６】
改変Ｃａｓタンパク質の一例は、非特異的ＤＮＡ接触を低減するように設計された変更（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を担持するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９の高忠実度バリアントである改変ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１タンパク質である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKleinstiverら（２０１６年）Nature  ５２９巻（７５８７号）：４９０〜４９５頁を参照されたい。改変Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された改変ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSlaymakerら（２０１６年）Science  ３５１巻（６２６８号）：８４〜８８頁を参照されたい。他のＳｐＣａｓ９バリアントとしては、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが挙げられる。
【０１８７】
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配置にある標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインも含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは、それぞれ二本鎖ＤＮＡの異なる鎖をカットして、ＤＮＡにおける二本鎖切断を生じさせることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるJinekら（２０１２年）Science、３３７巻：８１６〜８２１頁を参照されたい。
【０１８８】
ヌクレアーゼドメインの１つもしくは複数またはすべてを欠失させるかまたは変異させ、その結果、もはや機能的でなくなるかまたは低下したヌクレアーゼ活性を有するようにすることができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼドメインの１つを欠失させるかまたは変異させる場合、得られるＣａｓ９タンパク質は、ニッカーゼと称することができ、二本鎖ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ標的配列に一本鎖切断を生じさせることができるが、二本鎖切断を生じさせることはできない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断できるが、両方は切断できない）。ヌクレアーゼドメインの両方とも欠失するか変異する場合、結果として生じるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低減する（例えば、ヌクレアーゼが存在しない（null）もしくはヌクレアーゼ不活性のＣａｓタンパク質、または触媒的に不活発なＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位におけるアスパラギン酸からアラニンへの）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位においてヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位においてヒスチジンからアラニンへ）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸Ｎ８６３位においてアスパラギンからアラニンへ）により、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例としては、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９に対応する変異が挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSapranauskasら（２０１１年）Nucleic  Acids  Research、３９巻：９２７５〜９２８２頁およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたい。そのような変異は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介性変異誘発、または全遺伝子合成などの方法を使用して生じさせることができる。ニッカーゼを創出させる他の変異の例は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８において見出すことができる。Ｃａｓタンパク質においてヌクレアーゼドメインの全てが欠失するか変異する場合（例えば、Ｃａｓ９タンパク質においてヌクレアーゼドメインの両方とも欠失するか変異する）、結果として生じるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低減する（例えば、ヌクレアーゼが存在しないまたはヌクレアーゼ不活性のＣａｓタンパク質）。１つの具体例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ  Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９と最適に整列させたときの別の種からのＣａｓ９における、対応する二重変異体である。別の具体例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ  Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９と最適に整列させたときの別の種からのＣａｓ９における、対応する二重変異体である。
【０１８９】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメイン中の不活化変異の例も公知である。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を生成するためのＮ５８０位における置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）およびＤ１０位における置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含んでもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたい。
【０１９０】
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメイン中の不活化変異の例も公知である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ  ２３７（ＭｂＣｐｆ１、Ｃｐｆ１）に由来するＣｐｆ１タンパク質を参照すると、そのような変異は、ＡｓＣｐｆ１の９０８位、９９３位、もしくは１２６３位またはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置、またはＬｂＣｐｆ１の８３２位、９２５位、９４７位、もしくは１１８０位またはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置に変異を含んでもよい。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログ中の対応する変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログ中の対応する変異のうちの１つまたは複数を含んでもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたい。
【０１９１】
Ｃａｓタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓタンパク質またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）を異種ポリペプチドに作動可能に連結して融合タンパク質とすることもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質を切断ドメインまたはエピジェネティック改変ドメインと融合することができる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。Ｃａｓタンパク質を、安定性の増大または低減をもたらす異種ポリペプチドと融合することもできる。融合したドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
【０１９２】
一例として、Ｃａｓタンパク質を、細胞内局在化をもたらす１つまたは複数の異種ポリペプチドと融合することができる。そのような異種ポリペプチドとしては、例えば、核へのターゲティングのための単節型ＳＶ４０  ＮＬＳおよび／または双節型アルファ−インポーチンＮＬＳなどの１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアへのターゲティングのためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを挙げることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるLangeら（２００７年）J.  Biol.  Chem.、２８２巻：５１０１〜５１０５頁を参照されたい。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸のひと続きを含んでよく、また、一分配列であっても二分配列であってもよい。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端のＮＬＳ（例えば、アルファ−インポーチンＮＬＳまたは単節型ＮＬＳ）およびＣ末端のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳまたは双節型ＮＬＳ）を含む、２つまたはそれより多いＮＬＳを含んでもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端の２つもしくはそれより多いＮＬＳおよび／またはＣ末端の２つもしくはそれより多いＮＬＳを含んでもよい。
【０１９３】
Ｃａｓタンパク質を細胞透過性ドメインまたはタンパク質形質導入ドメインと作動可能に連結することもできる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来してよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。
【０１９４】
Ｃａｓタンパク質を蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの追跡または精製をしやすくするための異種ポリペプチドに作動可能に連結することもできる。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
【０１９５】
Ｃａｓタンパク質を外因性ドナー核酸または標識された核酸に係留することもできる。そのような係留（すなわち、物理的連結）は、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用によって実現することができ、係留は直接的であってもよく（例えば、直接融合またはタンパク質上のシステインもしくはリシン残基の修飾またはインテイン修飾によって実現することができる化学的なコンジュゲーションによる）、ストレプトアビジンまたはアプタマーなどの１つまたは複数の介在するリンカーまたはアダプター分子を通じて実現することもできる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Pierceら（２００５年）Mini  Rev.  Med.  Chem.、５巻（１号）：４１〜５５頁；Duckworthら（２００７年）Angew.  Chem.  Int.  Ed.  Engl.、４６巻（４６号）：８８１９〜８８２２頁；SchaefferおよびDixon（２００９年）Australian  J.  Chem.、６２巻（１０号）：１３２８〜１３３２頁；Goodmanら（２００９年）Chembiochem.、１０巻（９号）：１５５１〜１５５７頁；ならびにKhatwaniら（２０１２年）Bioorg.  Med.  Chem.、２０巻（１４号）：４５３２〜４５３９頁を参照されたい。タンパク質−核酸コンジュゲートを合成するための非共有結合性戦略としては、ビオチン−ストレプトアビジン法およびニッケル−ヒスチジン法が挙げられる。共有結合性タンパク質−核酸コンジュゲートを、適切に官能性をもたせた核酸およびタンパク質を多種多様な化学を使用して接続することによって合成することができる。これらの化学の一部は、オリゴヌクレオチドをタンパク質表面上のアミノ酸残基に直接付着させることを伴い（例えば、リシンアミンまたはシステインチオール）、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾または触媒もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質を核酸に共有結合により付着させるための方法としては、例えば、オリゴヌクレオチドとタンパク質のリシンまたはシステイン残基の化学的架橋、発現タンパク質ライゲーション、化学酵素法、および光アプタマーの使用を挙げることができる。外因性ドナー核酸または標識された核酸をＣａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、または内部の領域に係留することができる。一例において、外因性ドナー核酸または標識された核酸をＣａｓタンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留する。同様に、Ｃａｓタンパク質を外因性ドナー核酸または標識された核酸の５’末端、３’末端、または内部の領域に係留することができる。すなわち、外因性ドナー核酸または標識された核酸を任意の配向および極性で係留することができる。例えば、、Ｃａｓタンパク質を外因性ドナー核酸または標識された核酸の５’末端または３’末端に係留することができる。
【０１９６】
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質を、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供することができる。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、特定の細胞または生物体におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に導入する場合、Ｃａｓタンパク質は、細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。
【０１９７】
ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質を、安定性および／または免疫原性特性の改善のために修飾することができる。修飾を、ｍＲＮＡ内の１つまたは複数のヌクレオシドに対して行うことができる。ｍＲＮＡ核酸塩基に対する化学修飾の例としては、プソイドウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、および５−メチル−シチジンが挙げられる。例えば、Ｎ１−メチルプソイドウリジンを含有するキャップ付およびポリアデニル化されたＣａｓ  ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、Ｃａｓ  ｍＲＮＡを、同義コドンを使用するウリジンの枯渇によって修飾することができる。
【０１９８】
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定して組み入れること、および細胞の中で活性であるプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物の中のプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物は、目的の遺伝子または他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を導くことができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に移行させることができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸挿入断片を含む標的化ベクターおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターの中にあってよい。あるいは、それは、核酸挿入断片を含む標的化ベクターと別個の、および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターと別個のベクターまたはプラスミドの中にあってよい。発現構築物において使用することができるプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞または接合体のうちの１つまたは複数において活性であるプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。必要に応じて、プロモーターは、Ｃａｓタンパク質の一方向の発現およびガイドＲＮＡの他方向の発現の両方を駆動する双方向プロモーターであってよい。そのような双方向プロモーターは、（１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスを含有する完全な従来の一方向Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター；ならびに（２）ＰＳＥおよびＤＳＥの５’末端と逆配向で融合したＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターからなり得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスと隣接しており、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを創出することによってプロモーターを双方向性にすることができる。例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子およびガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させるために双方向プロモーターを使用することにより、送達を容易にするための緻密な発現カセットの生成が可能になる。
【０１９９】
ガイドＲＮＡ。  「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の場所にターゲティングするＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：「ＤＮＡ標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」を含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡ内のヌクレオチドの連続したひと続きなどの、分子の区画または領域を含む。Ｃａｓ９に対するものなどの一部のｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子：「活性化因子−ＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「標的化因子−ＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を含み得る。他のｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一のＲＮＡポリヌクレオチド）であり、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ，」または「ｓｇＲＮＡ」とも称され得る。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい。Ｃａｓ９に関しては、例えば、単一ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと融合したｃｒＲＮＡ（例えば、リンカーを介して）を含み得る。Ｃｐｆ１に関しては、例えば、標的配列への結合および／または標的配列の切断を実現するためにはｃｒＲＮＡのみが必要である。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、２重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
【０２００】
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「標的化因子−ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「活性化因子−ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）およびｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ  ２重鎖の片方を形成するヌクレオチドのひと続き（すなわち、ｃｒＲＮＡ尾部）の両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’側）に位置するｃｒＲＮＡ尾部の例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号８７）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれかを配列番号８７の５’末端に接合してｃｒＲＮＡを形成することができる。
【０２０１】
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子−ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ  ２重鎖のあとの半分を形成するヌクレオチドのひと続きを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのひと続きは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのひと続きと相補的であり、ハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ  ２重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言うことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号８８）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０２０２】
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要な系では、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡがハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要な系では、ｃｒＲＮＡがｇＲＮＡになることができる。ｃｒＲＮＡは、逆の鎖（すなわち、相補鎖）とハイブリダイズすることにより、ガイドＲＮＡ標的配列を標的とする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントをさらにもたらす。細胞内での改変に使用する場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子を使用する種に特異的になるように設計することができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Maliら（２０１３年）Science、３３９巻：８２３〜８２６頁；Jinekら（２０１２年）Science、３３７巻：８１６〜８２１頁；Hwangら（２０１３年）Nat.  Biotechnol.、３１巻：２２７〜２２９頁；Jiangら（２０１３年）Nat.  Biotechnol.、３１巻：２３３〜２３９頁；およびCongら（２０１３年）Science、３３９巻：８１９〜８２３頁を参照されたい。
【０２０３】
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ内の配列と相補的なヌクレオチド配列（すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列と逆の鎖上のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖）を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡと配列特異的にハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）によって相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、変動させることができ、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の場所を決定する。主題のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントを、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列とハイブリダイズするように改変することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および生物体に応じて異なるが、多くの場合、２１〜４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）に挟まれた２１〜７２ヌクレオチドの長さの標的化セグメントを含有する（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合では、ＤＲは３６ヌクレオチドの長さであり、標的化セグメントは３０ヌクレオチドの長さである。３’側に位置するＤＲが対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、ハイブリダイズし、それが今度はＣａｓタンパク質に結合する。
【０２０４】
ＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、または少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約８０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで、または約１２ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドまでの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで（例えば、約１７ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドまで、または約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド）であってよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６から２０ヌクレオチドの間の長さまたは１７から２０ヌクレオチドの間の長さである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１から２３ヌクレオチドの間の長さである。Ｃｐｆ１に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチドの長さまたは少なくとも１８ヌクレオチドの長さである。
【０２０５】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）および様々な長さであってよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、一次転写産物またはプロセシングされた形態を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部としてかまたは２分子ｇＲＮＡの一部としての別々の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約２６ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約３２ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約４５ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約４８ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約５４ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約６３ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約６７ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約８５ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチド）の全部または一部を含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドバージョンが挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Deltchevaら（２０１１年）Nature、４７１巻：６０２〜６０７頁；ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたい。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５バージョンに見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで、「＋ｎ」は、最大＋ｎヌクレオチドの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，６９７，３５９を参照されたい。
【０２０６】
ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、約２０個連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の５’末端では１４個連続したヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたっては０％の低さである。そのような場合では、ＤＮＡ標的化セグメントは、１４ヌクレオチドの長さとみなすことができる。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の５’末端では７個連続したヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたっては０％の低さである。そのような場合では、ＤＮＡ標的化セグメントは、７ヌクレオチドの長さとみなすことができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化セグメント内の少なくとも１７ヌクレオチドが標的ＤＮＡと相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは２０ヌクレオチドの長さであり得、ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とのミスマッチを１つ、２つ、または３つ含み得る。好ましくは、ミスマッチはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接しない（例えば、ミスマッチはＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチはＰＡＭ配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９塩基対離れている）。
【０２０７】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いと相補的な２つのヌクレオチドのひと続きを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的なヌクレオチドはハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ  ２重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。主題のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に方向付ける。
【０２０８】
単一ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよび足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）を有する。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、５’ＤＮＡ標的化セグメントおよび３’足場配列を有する。例示的な足場配列は、
【化１】
2021500867.tif 000004
【化２】
2021500867.tif 000005
を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。任意のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするガイドＲＮＡとしては、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端上の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のいずれかと融合したガイドＲＮＡの５’末端上のＤＮＡ標的化セグメントを挙げることができる。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれかを配列番号８９、８、９、または１０のいずれか１つの５’末端と接合して、単一のガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。本明細書の他の箇所で開示されるガイドＲＮＡバージョン１、２、３、および４は、それぞれ足場バージョン１、２、３、および４と接合したＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列またはガイド）を指す。
【０２０９】
ガイドＲＮＡは、追加的な望ましい特徴（例えば、改変または制御された安定性；細胞内標的化；蛍光標識を用いた追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）をもたらす改変または配列を含み得る。そのような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の制御ならびに／またはタンパク質および／もしくはタンパク質複合体による接近可能性の制御を可能にするため）；安定性調節配列；ｄｓＲＮＡ  ２重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にターゲティングする改変または配列；追跡をもたらす改変または配列（例えば、蛍光分子との直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分とのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素などを含めたＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位をもたらす改変または配列；およびこれらの組合せが挙げられる。改変の他の例としては、操作されたステムループ２重鎖構造、操作されたバルジ領域、ステムループ２重鎖構造の操作されたヘアピン３’、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたい。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される２重鎖内の対合していないヌクレオチドの領域であり得る。バルジは、２重鎖の片側に対合していない５’−ＸＸＸＹ−３’（配列中、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは逆の鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドであり得る）、および、他方の側の２重鎖に対合していないヌクレオチド領域を含み得る。
【０２１０】
非改変核酸は、分解されやすくてもよい。外因性核酸は、先天性免疫応答を誘導することもできる。改変は、安定性を導入し、免疫原性を低減させるのに役立ち得る。ガイドＲＮＡは、例えば、下記：（１）ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素および／または１つもしくは複数の連結リン酸酸素の一方または両方の変更または置換え；（２）リボース糖上の２’ヒドロキシルの変更または置換えなどのリボース糖の構成要素の変更または置換え；（３）脱ホスホリンカーとのリン酸部分の置換え；（４）天然に存在する核酸塩基の改変または置換え；（５）リボース−リン酸骨格の置換えまたは改変；（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変（例えば、末端リン酸基の除去、改変もしくは置換えまたは部分のコンジュゲーション）；ならびに（７）糖の改変のうちの１つまたは複数を含む、改変ヌクレオシドおよび改変ヌクレオチドを含んでもよい。他の可能なガイドＲＮＡ改変としては、ウラシルまたはポリ−ウラシルトラクトの改変または置換えが挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたい。同様の改変を、Ｃａｓ  ｍＲＮＡなどのＣａｓをコードする核酸に対して行うことができる。
【０２１１】
一例として、ガイドＲＮＡの５’または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を含んでもよい（例えば、塩基はホスホロチオエート基である改変リン酸基を有してもよい）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端の２、３、または４個の末端ヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結を含んでもよい。別の例として、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル改変を有してもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４個の末端ヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル改変を含んでもよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１およびFinnら（２０１８年）Cell  Reports  ２２巻：１〜９頁を参照されたい。１つの特定例では、ガイドＲＮＡは、最初の３個の５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’−Ｏ−メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。別の特定例では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用しない全ての２’ＯＨ基が２’−Ｏ−メチル類似体で置き換えられ、Ｃａｓ９と最小限に相互作用するガイドＲＮＡの尾部領域が５’および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結で改変されるように改変される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるYinら（２０１７年）Nat.  Biotech.  ３５巻（１２号）：１１７９〜１１８７頁を参照されたい。改変されたガイドＲＮＡの他の例は、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／１０７０２８Ａ１に提供される。
【０２１２】
ガイドＲＮＡは、任意の形態でもたらすことができる。例えば、ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、２つの分子（別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）としてかまたは１つの分子（ｓｇＲＮＡ）としてのいずれかでもたらすことができ、必要に応じて、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態でもたらすことができる。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態でもたらすこともできる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）をコードしていてもよく、別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしていてもよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子としてもたらすこともでき、それぞれｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別々のＤＮＡ分子としてもたらすこともできる。
【０２１３】
ｇＲＮＡをＤＮＡの形態でもたらす場合、ｇＲＮＡを細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムに安定して組み入れること、および細胞の中で活性であるプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを発現構築物中でプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの、異種核酸を含むベクター内に入れることができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別のベクターまたはプラスミド内に入れることができる。そのような発現構築物に使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚の１つまたは複数において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであってもよい。適切なプロモーターの特定の例としては、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
【０２１４】
あるいは、ｇＲＮＡを、他の様々な方法によって調製することができる。例えば、ｇＲＮＡは、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる（例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい）。ガイドＲＮＡは、化学合成によって調製された合成的に産生された分子であってもよい。
【０２１５】
ガイドＲＮＡ認識配列およびガイドＲＮＡ標的配列。  「ガイドＲＮＡ認識配列」という用語は、結合のための十分な条件が存在すればｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列を包含する。ガイドＲＮＡ認識配列という用語は、本明細書で使用される場合、標的二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（すなわち、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する非相補鎖上の対応する配列）を包含する。「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、本明細書で使用される場合、具体的には、ＰＡＭに隣接する非相補鎖上（すなわち、ＰＡＭの上流または５’側）の配列を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列に対応する非相補鎖上の配列を指す。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと等しいが、ウラシルの代わりにチミンである。一例として、Ｃａｓ９酵素に対するガイドＲＮＡ標的配列は、５’−ＮＧＧ−３’ＰＡＭに隣接する非相補鎖上の配列を指すことになる。ガイドＲＮＡ認識配列は、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計された配列を含み、ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントのハイブリダイゼーションにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、下でより詳細に記載されているＣａｓタンパク質の切断部位も含む。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る任意のポリヌクレオチドを含み得る。
【０２１６】
標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列は、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡによって標的化することができる（すなわち、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡが結合することができる、またはＣａｓタンパク質またはｇＲＮＡがハイブリダイズすることができる、またはＣａｓタンパク質またはｇＲＮＡが相補的であり得る）。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件としては、細胞において通常存在する生理的条件が挙げられる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）が公知である（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるMolecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版（Sambrookら、Harbor  Laboratory  Press、２００１年）を参照されたい）。Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡと相補的であり、それとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と称することができ、「相補鎖」と相補的な（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡとは相補的でない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「鋳型鎖」と称することができる。
【０２１７】
Ｃａｓタンパク質は、核酸を、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列の内部または外部の部位で切断し得る。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質により一本鎖切断または二本鎖切断が生じる、核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体（ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したｇＲＮＡを含む）の形成により、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列内またはその付近（例えば、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれよりも多くの塩基対の範囲内）での一方または両方の鎖の切断がもたらされ得る。切断部位が、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する核酸配列の外部にある場合、切断部位はなお「ガイドＲＮＡ認識配列」またはガイドＲＮＡ標的配列内にあるとみなされる。切断部位は、核酸の一方の鎖上のみにあってもよく、両方の鎖上にあってもよい。切断部位は、核酸の両方の鎖上の同じ位置にあってもよく（平滑末端が生じる）、各鎖上の異なる部位にあってもよい（付着末端（すなわち、突出部）が生じる）。付着末端は、例えば、それぞれが異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生じさせる２つのＣａｓタンパク質を使用し、それにより、二本鎖切断を生じさせることによって生じさせることができる。例えば、第１のニッカーゼにより、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を創出することができ、第２のニッカーゼにより、ｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を創出することができ、その結果、突出部配列が創出される。一部の場合では、第１の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、第２の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対離れている。
【０２１８】
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および／または切断は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡの間の塩基対合相補性および（ｉｉ）標的ＤＮＡ内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短いモチーフの両方によって決定される場所で起こり得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする鎖と逆の非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列に隣接し得る。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列の３’末端にＰＡＭが隣接し得る。あるいは、ガイドＲＮＡ標的配列の５’末端にＰＡＭが隣接し得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約１０または約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）上流または下流であり得る。一部の場合では（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９または密接に関連するＣａｓ９を使用する場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−Ｎ１ＧＧ−３’（配列中、Ｎ１は任意のＤＮＡヌクレオチドである）であり得、標的ＤＮＡの非相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列のすぐ３’側（すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列のすぐ３’側）である。したがって、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＮ２−３’（配列中、Ｎ２は任意のＤＮＡヌクレオチドである）になり、標的ＤＮＡの相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列のすぐ５’側である。一部のそのような場合では、Ｎ１とＮ２は相補的であり得、Ｎ１−Ｎ２塩基対は任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ１＝ＣおよびＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝ＧおよびＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝ＡおよびＮ２＝Ｔ；またはＮ１＝Ｔ、およびＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合では、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲ（配列中、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、ＲはＧまたはＡであり得る）であり得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合では、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列中、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであってよく、ＲはＧまたはＡであってよい）であってよい。一部の場合では（例えば、ＦｎＣｐｆ１に関して）、ＰＡＭ配列は、５’末端の上流であり得、配列５’−ＴＴＮ−３’を有し得る。
【０２１９】
ガイドＲＮＡ標的配列またはＰＡＭ配列に加えてガイドＲＮＡ標的配列の例を以下に提示する。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり得る。そのようなガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列の例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号１１）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号１２）である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたい。５’末端のグアニンにより、細胞におけるＲＮＡポリメラーゼによる転写を容易にすることができる。ガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列の他の例としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を容易にするための、５’末端の２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号１３）を挙げることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい。他のガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列は、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号１１〜１３の４〜２２ヌクレオチドの長さを有し得る。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号１１〜１３の１４から２０ヌクレオチドの間の長さを有し得る。
【０２２０】
ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列の場合もあり、非コード配列（例えば、制御配列）の場合もあり、両方を含む場合もある。
【０２２１】
（３）ヒトＴＴＲ遺伝子を標的にする外因性ドナー核酸
本明細書に開示される方法および組成物は、ヌクレアーゼ剤によるヒト化ＴＴＲ遺伝子座の切断の後にヒト化ＴＴＲ遺伝子座を改変するために、外因性ドナー核酸を利用することができる。そのような方法では、ヌクレアーゼ剤タンパク質はヒト化ＴＴＲ遺伝子座を切断して、一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断を生じさせ、外因性ドナー核酸は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介性ライゲーションを介して、または相同組換え修復事象を通してヒト化ＴＴＲ遺伝子座を組み換える。必要に応じて、外因性ドナー核酸による修復はヌクレアーゼ標的配列を除去または破壊し、そのため、標的にされた対立遺伝子をヌクレアーゼ剤が再び標的にすることができない。
【０２２２】
外因性ドナー核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖形態であっても環状形態であってもよいデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。例えば、外因性ドナー核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるYoshimiら（２０１６年）Nat.  Commun.、７巻：１０４３１頁を参照されたい。例示的な外因性ドナー核酸は、約５０ヌクレオチド〜約５ｋｂの長さであるか、約５０ヌクレオチド〜約３ｋｂの長さであるか、または約５０〜約１，０００ヌクレオチドの長さである。他の例示的な外因性ドナー核酸は、約４０〜約２００ヌクレオチドの長さである。例えば、外因性ドナー核酸は、約５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、または１９０〜２００ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー核酸は、約５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、または９００〜１０００ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー核酸は、約１〜１．５、１．５〜２、２〜２．５、２．５〜３、３〜３．５、３．５〜４、４〜４．５、または４．５〜５ｋｂの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー核酸は、例えば、５ｋｂ以下、４．５ｋｂ以下、４ｋｂ以下、３．５ｋｂ以下、３ｋｂ以下、２．５ｋｂ以下、２ｋｂ以下、１．５ｋｂ以下、１ｋｂ以下、９００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、７００ヌクレオチド以下、６００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、または５０ヌクレオチド以下の長さであってよい。また、外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）は、より長くてもよい。
【０２２３】
一例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドの間の長さのｓｓＯＤＮである。別の例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチドから約３ｋｂの間の長さのｓｓＯＤＮである。そのようなｓｓＯＤＮは、例えば、それぞれが約４０ヌクレオチドから約６０ヌクレオチドの間の長さである相同アームを有してよい。そのようなｓｓＯＤＮはまた、例えば、それぞれが約３０ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの長さである相同アームを有してもよい。相同アームは、対称的であってもよく（例えば、それぞれが４０ヌクレオチド、またはそれぞれが６０ヌクレオチドの長さである）、非対称的であってもよい（例えば、３６ヌクレオチドの長さの相同アームが１つと９１ヌクレオチドの長さの相同アームが１つ）。
【０２２４】
外因性ドナー核酸は、追加的な望ましい特徴（例えば、改変または制御された安定性；蛍光標識を用いた追跡または検出；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）をもたらす改変または配列を含み得る。外因性ドナー核酸は、１つまたは複数の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、またはこれらの組合せを含み得る。例えば、外因性ドナー核酸は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの蛍光標識などの、１つまたは複数の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質または他のフルオロフォアまたは色素）を含み得る。例示的な蛍光標識としては、フルオレセイン（例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ））、テキサスレッド、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、およびＣｙ７などのフルオロフォアが挙げられる。オリゴヌクレオチドの標識のために広範囲の蛍光色素が商業的に入手可能である（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）。そのような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）を、例えば、外因性ドナー核酸の末端と適合する突出末端を有する切断された標的核酸に直接組み込まれた外因性ドナー核酸を検出するために使用することができる。標識またはタグは、外因性ドナー核酸の５’末端、３’末端、または内部にあってよい。例えば、外因性ドナー核酸の５’末端にＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＩＲ７００フルオロフォア（５’ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）をコンジュゲートすることができる。
【０２２５】
外因性ドナー核酸はまた、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座に組み込まれるＤＮＡのセグメントを含む核酸挿入断片も含み得る。ヒト化ＴＴＲ遺伝子座への核酸挿入断片の組込みにより、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座への目的の核酸配列の付加、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座での目的の核酸配列の欠失、またはヒト化ＴＴＲ遺伝子座での目的の核酸配列の置換え（すなわち、欠失および挿入）をもたらすことができる。一部の外因性ドナー核酸は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座におけるいかなる対応する欠失も伴わずにヒト化ＴＴＲ遺伝子座に核酸挿入断片が挿入されるように設計される。他の外因性ドナー核酸は、核酸挿入断片のいかなる対応する挿入も伴わずにヒト化ＴＴＲ遺伝子座において目的の核酸配列が欠失するように設計される。さらに他の外因性ドナー核酸は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座において目的の核酸配列が欠失し、それが核酸挿入断片で置き換えられるように設計される。
【０２２６】
核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受けるヒト化ＴＴＲ遺伝子座の対応する核酸は種々の長さであってよい。例示的な核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受けるヒト化ＴＴＲ遺伝子座の対応する核酸は、約１ヌクレオチド〜約５ｋｂの長さまたは約１ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチドの長さである。例えば、核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受けるヒト化ＴＴＲ遺伝子座の対応する核酸は、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、または１９０〜１２０ヌクレオチドの長さであってもよい。同様に、核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受けるヒト化ＴＴＲ遺伝子座の対応する核酸は、１〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、または９００〜１０００ヌクレオチドの長さであってもよい。同様に、核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受けるヒト化ＴＴＲ遺伝子座の対応する核酸は、約１〜１．５、１．５〜２、２〜２．５、２．５〜３、３〜３．５、３．５〜４、４〜４．５、もしくは４．５〜５ｋｂの長さまたはそれより長くてもよい。
【０２２７】
核酸挿入断片は、置換えの標的とされる配列の全部または一部と相同またはオーソロガスである配列を含んでもよい。例えば、核酸挿入断片は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座における置換えの標的とされる配列と比較して１つもしくは複数の点変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれよりも多い）を含む配列を含んでもよい。必要に応じて、そのような点変異は、コードされたポリペプチド中での保存的アミノ酸置換（例えば、グルタミン酸［Ｇｌｕ、Ｅ］とのアスパラギン酸［Ａｓｐ、Ｄ］の置換）をもたらし得る。
【０２２８】
非相同末端結合媒介性挿入のためのドナー核酸。  一部の外因性ドナー核酸は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座におけるヌクレアーゼ媒介性切断によって創出される１つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を５’末端および／または３’末端に有する。これらの突出部は、５’および３’相同アームとも称され得る。例えば、一部の外因性ドナー核酸は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座の５’および／または３’標的配列におけるヌクレアーゼ媒介性切断によって創出される１つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を５’末端および／または３’末端に有する。一部のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を５’末端のみに有するかまたは３’末端のみに有する。例えば、一部のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座の５’標的配列において創出される突出部に相補的な５’末端のみに有するかまたはヒト化ＴＴＲ遺伝子座の３’標的配列において創出される突出部に相補的な３’末端のみに有する。他のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を５’および３’末端の両方に有する。例えば、他のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を５’および３’末端の両方に有し、これらは、例えば、それぞれヒト化ＴＴＲ遺伝子座におけるヌクレアーゼ媒介性切断によって生じる第１および第２の突出部に相補的である。例えば、外因性ドナー核酸が二本鎖である場合、一本鎖の相補的な領域を、ドナー核酸の上鎖の５’末端およびドナー核酸の下鎖の５’末端から伸長させ、それにより、各末端に５’突出部を創出することができる。あるいは、一本鎖の相補的な領域をドナー核酸の上鎖の３’末端および鋳型の下鎖の３’末端から伸長させ、それにより、３’突出部を創出することができる。
【０２２９】
相補的な領域は、外因性ドナー核酸と標的核酸の間のライゲーションを促進するのに十分な任意の長さであってよい。例示的な相補的な領域は、約１〜約５ヌクレオチドの長さ、約１〜約２５ヌクレオチドの長さ、または約５〜約１５０ヌクレオチドの長さである。例えば、相補的な領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、相補的な領域は、約５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、または１４０〜１５０ヌクレオチドの長さであってよい、またはそれより長くてよい。
【０２３０】
そのような相補的な領域は、ニッカーゼの２つの対によって創出される突出部と相補的であってよい。ＤＮＡの逆の鎖を切断して第１の二本鎖切断を創出する第１および第２のニッカーゼ、ならびにＤＮＡの逆の鎖を切断して第２の二本鎖切断を創出する第３および第４のニッカーゼを使用することにより、付着末端を有する２つの二本鎖切断を創出することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を使用して、第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡ標的配列にニックを入れることができる。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列を、第１の切断部位が創出され、その結果、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第１および第２のニッカーゼによって創出されるニックにより二本鎖切断が創出される（すなわち、第１の切断部位が第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内にニックを含む）ように位置付けることができる。同様に、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列を、第２の切断部位が創出され、その結果、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第３および第４のニッカーゼによって創出されるニックにより二本鎖切断が創出される（すなわち、第２の切断部位が第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内にニックを含む）ように位置付けることができる。好ましくは、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列ならびに／または第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックにより、突出部を創出するニックをオフセットすることができる。オフセットウインドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐであるかまたはそれよりも大きくてよい。それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ranら（２０１３年）Cell、１５４巻：１３８０〜１３８９頁；Maliら（２０１３年）Nat.  Biotech．３１巻：８３３〜８３８頁；およびShenら（２０１４年）Nat.  Methods、１１巻：３９９〜４０４頁を参照されたい。そのような場合では、二本鎖外因性ドナー核酸は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによってならびに第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによって創出される突出部に相補的である一本鎖の相補的な領域を有するように設計することができる。次いで、そのような外因性ドナー核酸を非相同末端結合媒介性ライゲーションによって挿入することができる。
【０２３１】
相同組換え修復によって挿入するためのドナー核酸。  一部の外因性ドナー核酸は、相同アームを含む。外因性ドナー核酸が核酸挿入断片も含む場合、相同アームにより核酸挿入断片が挟まれていてよい。参照しやすくするために、本明細書では、相同アームを５’および３’（すなわち、上流および下流の）相同アームと称する。この用語法は、外因性ドナー核酸内の核酸挿入断片に対する相同アームの相対的な位置に関する。５’および３’相同アームは、本明細書においてそれぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と称されるヒト化ＴＴＲ遺伝子座内の領域に対応する。
【０２３２】
相同アームおよび標的配列は、当該２つの領域が互いに対して相同組換え反応の基質としての機能を果たすのに十分なレベルの配列同一性を共有する場合、互いに「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）」または「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるかまたは配列同一性を共有するＤＮＡ配列を包含する。所与の標的配列と外因性ドナー核酸に見出される対応する相同アームの間の配列同一性は、相同組換えが起こるのを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性ドナー核酸（またはその断片）の相同アームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であってよい。さらに、相同アームと対応する標的配列の間の対応する相同領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであってよい。例示的な相同アームは、約２５ヌクレオチド〜約２．５ｋｂの長さであるか、約２５ヌクレオチド〜約１．５ｋｂの長さであるか、または約２５〜約５００ヌクレオチドの長さである。例えば、所与の相同アーム（もしくは相同アームのそれぞれ）および／または対応する標的配列は、相同アームが標的核酸内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、約２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、または４５０〜５００ヌクレオチドの長さの対応する相同領域を含み得る。あるいは、所与の相同アーム（もしくは各相同アーム）および／または対応する標的配列は、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、または約２ｋｂ〜約２．５ｋｂの長さの対応する相同領域を含み得る。例えば、相同アームはそれぞれ約７５０ヌクレオチドの長さであってよい。相同アームは対称的であってもよく（それぞれの長さがほぼ同じサイズ）、非対称的であってもよい（一方が他方よりも長い）。
【０２３３】
ヌクレアーゼ剤を外因性ドナー核酸と組み合わせて使用する場合、５’および３’標的配列は、好ましくは、ヌクレアーゼ切断部位における一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断の際の標的配列と相同アームの間の相同組換え事象の発生が促進されるように、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、ヌクレアーゼ標的配列の十分近くにある）に対して十分に近傍に位置する。「ヌクレアーゼ切断部位」という用語は、ヌクレアーゼ剤（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９タンパク質）によってニックまたは二本鎖切断が創出されるＤＮＡ配列を包含する。外因性ドナー核酸の５’および３’相同アームに対応する標的化遺伝子座内の標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位における一本鎖切断または二本鎖切断の際の５’および３’標的配列と相同アームの間の相同組換え事象の発生が促進されるような距離にあれば、ヌクレアーゼ切断部位に対して「十分に近傍に位置する」。したがって、外因性ドナー核酸の５’および／または３’相同アームに対応する標的配列は、例えば、所与のヌクレアーゼ切断部位から少なくとも１ヌクレオチドの範囲内または所与のヌクレアーゼ切断部位から少なくとも１０ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチドの範囲内であり得る。例として、ヌクレアーゼ切断部位は、標的配列の少なくとも一方または両方のすぐ隣にあり得る。
【０２３４】
外因性ドナー核酸の相同アームに対応する標的配列とヌクレアーゼ切断部位の空間的関係は変動し得る。例えば、標的配列がヌクレアーゼ切断部位の５’側に位置する場合もあり、標的配列がヌクレアーゼ切断部位の３’側に位置する場合もあり、標的配列がヌクレアーゼ切断部位を挟んでいる場合もある。
【０２３５】
（４）他のヒトＴＴＲ標的化試薬
本明細書に開示される非ヒト動物を使用して、任意の他の公知または推定上のヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価することもできる。同様に、本明細書に開示される非ヒト動物を使用して、ヒトＴＴＲ標的化活性について任意の他の分子をスクリーニングすることができる。
【０２３６】
他のヒトＴＴＲ標的化試薬の例には、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を通して作用するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはアンチセンスＲＮＡは、標的化タンパク質をコードするＲＮＡに選択的に結合し、それによって翻訳を防止することによって標的化タンパク質の発現を防止するように設計された、ヌクレオチドの短い合成ストリングである。これらの化合物は、よく特徴付けられているワトソン−クリック型塩基対合（ハイブリダイゼーション）を通して、ＲＮＡに高い親和性および選択性で結合する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合した低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の切断を媒介する、遺伝子発現を制御するための内因性細胞機構である。ヒトＴＴＲ標的化アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、公知である。例えば、その各々はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ackermann  et  al.  (2012)  Amyloid  Suppl  1:43-44およびCoelho  et  al.  (2013)  N.  Engl.  J.  Med.  369(9):819-829を参照。
【０２３７】
他のヒトＴＴＲ標的化試薬には、ヒトＴＴＲエピトープに特異的に結合するように設計された抗体または抗原結合性タンパク質が含まれる。
【０２３８】
他のヒトＴＴＲ標的化試薬には、小分子試薬が含まれる。そのような小分子試薬の１つの例はタファミディスであり、それは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質の正しくフォールディングされた四量体形態の動態学的安定化によって機能する。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hammarstrom  et  al.  (2003)  Science  299:713-716を参照。
【０２３９】
Ｄ．ヒトＴＴＲ標的化試薬を非ヒト動物または細胞に投与する
本明細書に開示される方法は、非ヒト動物または細胞に、核酸、タンパク質、核酸−タンパク質複合体またはタンパク質複合体を含む、様々な分子（例えば、治療用分子または複合体などのヒトＴＴＲ標的化試薬）を導入することを含むことができる。「導入すること」は、細胞または非ヒト動物に対して、それが細胞の内部または非ヒト動物内の細胞の内部に接近するように、分子（例えば、核酸またはタンパク質）を提示することを含む。導入は、任意の手段によって実現することができ、構成成分のうちの２つまたはそれより多く（例えば、構成成分のうちの２つまたは全部の構成成分）を任意の組合せで同時にまたは逐次的に細胞または非ヒト動物に導入することができる。例えば、ガイドＲＮＡの導入前にＣａｓタンパク質を細胞もしくは非ヒト動物に導入するか、またはガイドＲＮＡの導入後にそれを導入することができる。別の例として、外因性ドナー核酸を、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入の前に導入するか、またはＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入後にそれを導入することができる（例えば、外因性ドナー核酸を、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、または７２時間前または後に投与することができる）。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０２４０２６３およびＵＳ２０１５／０１１０７６２を参照されたい。さらに、２つまたはそれより多い構成成分を、同じ送達方法または異なる送達方法によって、細胞または非ヒト動物に導入することができる。同様に、２つまたはそれより多い構成成分を、同じ投与経路または異なる投与経路によって、非ヒト動物に導入することができる。
【０２４０】
一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成成分は、非ヒト動物または細胞に導入される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ）の形態で、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で、非ヒト動物または細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入される場合、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、非ヒト動物の細胞内で活性であるプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ガイドＲＮＡを、ＡＡＶによって送達し、Ｕ６プロモーターの下でｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができる。そのようなＤＮＡは、１つまたは複数の発現構築物中にあってよい。例えば、そのような発現構築物は、単一の核酸分子の構成成分であってよい。あるいは、それらは２つまたはそれよりも多くの核酸分子中の任意の組合せで分けることができる（すなわち、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡをコードするＤＮＡ、および１つまたは複数のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡが別々の核酸分子の構成成分であってよい）。
【０２４１】
同様に、Ｃａｓタンパク質は、任意の形態でもたらすことができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態でもたらすことができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質を、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態でもたらすことができる。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、特定の細胞または生物体におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を非ヒト動物に導入する場合、Ｃａｓタンパク質は、非ヒト動物中の細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。
【０２４２】
Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡをコードする核酸を、発現構築物中でプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物は、目的の遺伝子または他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を方向付けることができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に移行させることができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたは複数のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター中にあってもよい。あるいは、それは、１つまたは複数のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別であるベクターまたはプラスミド中にあってもよい。発現構築物に使用することができる好適なプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚の１つまたは複数において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。必要に応じて、プロモーターは、Ｃａｓタンパク質の一方向の発現およびガイドＲＮＡの他方向の発現の両方を駆動する双方向プロモーターであってよい。そのような双方向プロモーターは、（１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスを含有する完全な従来の一方向Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター；ならびに（２）ＰＳＥおよびＤＳＥの５’末端と逆配向で融合したＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターからなり得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスと隣接しており、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを創出することによってプロモーターを双方向性にすることができる。例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子およびガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させるための双方向プロモーターを使用することにより、送達を容易にするための緻密な発現カセットの生成が可能になる。
【０２４３】
非ヒト動物または細胞に導入される分子（例えば、Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡ）は、導入される分子の安定性を増加させる（例えば、所与の保存条件（例えば、−２０℃、４℃または周囲温度）の下で分解生成物が閾値未満のままである、例えば出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満である期間を延長する；または、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増加させる）担体を含む組成物の形で提供することができる。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、および脂質微小管（ｌｉｐｉｄ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）が挙げられる。
【０２４４】
核酸またはタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入を可能にするための様々な方法および組成物が本明細書で提供される。核酸を種々の細胞型に導入するための方法は公知であり、それらとして、例えば、安定トランスフェクション方法、一過性トランスフェクション方法、およびウイルス媒介性方法が挙げられる。
【０２４５】
トランスフェクションプロトコールならびに核酸配列を細胞に導入するためのプロトコールは変動し得る。非限定的なトランスフェクション方法として、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Grahamら（１９７３年）Virology、５２巻（２号）：４５６〜６７頁、Bacchettiら（１９７７年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、７４巻（４号）：１５９０〜４頁、およびKriegler,  M（１９９１年）、Transfer  and  Expression:A  Laboratory  Manual.  New  York：  W.  H.  Freeman  and  Company、９６〜９７頁）；デンドリマー；またはＤＥＡＥ−デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する、化学に基づくトランスフェクション方法が挙げられる。非化学的方法として、エレクトロポレーション、ソノポレーション、および光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子に基づくトランスフェクションとして、遺伝子銃の使用、または磁石補助トランスフェクションが挙げられる（Bertram（２００６年）Current  Pharmaceutical  Biotechnology、７巻、２７７〜２８頁）。ウイルスによる方法をトランスフェクションのために使用することもできる。
【０２４６】
核酸またはタンパク質の細胞への導入は、エレクトロポレーションによって、細胞質内注射によって、ウイルス感染によって、アデノウイルスによって、アデノ随伴ウイルスによって、レンチウイルスによって、レトロウイルスによって、トランスフェクションによって、脂質媒介性トランスフェクションによって、またはヌクレオフェクションによって媒介することもできる。ヌクレオフェクションは、核酸基体を細胞質だけでなく核膜を通って、および核内にも送達することを可能にする、改善されたエレクトロポレーション技術である。さらに、本明細書に開示される方法におけるヌクレオフェクションの使用は、一般には、通常のエレクトロポレーションよりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常のエレクトロポレーションでは７百万個であるのと比較してたった約２百万個）。一例では、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用してヌクレオフェクションを実施する。
【０２４７】
核酸またはタンパク質の細胞（例えば、接合体）への導入は、微量注射によって実現することもできる。受精卵（すなわち、１細胞期胚）中で、微量注射は、母系および／もしくは父系前核または細胞質へのものであってよい。微量注射が一方だけの前核へのものである場合、父系前核は、そのサイズがより大きいため、好ましい。ｍＲＮＡの微量注射は、細胞質内へのものであることが好ましいが（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するため）、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする、もしくはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの微量注射は核／前核へのものであることが好ましい。あるいは、核／前核と細胞質の両方への注射によって、微量注射を実行することができる：針を最初に核／前核に導入し、第１の量を注入することができ、１細胞期胚から針を除去しながら、第２の量を細胞質に注入することができる。Ｃａｓタンパク質を細胞質内に注射する場合、Ｃａｓタンパク質は、好ましくは、核／前核への送達を確実にするために、核局在化シグナルを含む。微量注射を実行するための方法は周知である。例えば、Nagyら（Nagy  A、Gertsenstein  M、Vintersten  K、Behringer  R.、２００３年、Manipulating  the  Mouse  Embryo.  Cold  Spring  Harbor、New  York：  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press）を参照されたい；Meyerら（２０１０年）Proc.Natl.  Acad.  Sci.  USA、１０７巻：１５０２２〜１５０２６頁およびMeyerら（２０１２年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１０９巻：９３５４〜９３５９頁も参照されたい。
【０２４８】
核酸またはタンパク質を細胞または非ヒト動物に導入するための他の方法としては、例えば、ベクター送達、粒子媒介性送達、エキソソーム媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、細胞透過性ペプチド媒介性送達、または埋込み型デバイス媒介性送達を挙げることができる。特定の例として、核酸またはタンパク質をポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、または脂質微小管などの担体に入れて細胞または非ヒト動物に導入することができる。非ヒト動物への送達の一部の特定例としては、流体力学的送達、ウイルス媒介性送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達）、および脂質ナノ粒子媒介性送達が挙げられる。
【０２４９】
核酸およびタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって実現することができる。流体力学的送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞内ＤＮＡ送達のための方法として出現した。実質細胞への遺伝子送達のためには、必須のＤＮＡ配列のみを、選択された血管を介して注射し、現行のウイルスおよび合成ベクターに付随する安全性の懸念を排除する必要がある。血流中に注射されると、ＤＮＡは血液が到達可能な種々の組織中の細胞に到達することが可能である。流体力学的送達では、大きく膜不浸透性の化合物が実質細胞に進入することを妨げる内皮および細胞膜の物理的関門を克服するために大きな体積の溶液を循環中の非圧縮性血液中に急速注射することによって生じる力を使用する。この方法は、ＤＮＡ送達に加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＲＮＡ、タンパク質、および他の小さな化合物の効率的な細胞内送達に有用である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bonamassaら（２０１１年）Pharm.  Res.、２８巻（４号）：６９４〜７０１頁を参照されたい。
【０２５０】
ＡＡＶ媒介性送達またはレンチウイルス媒介性送達などのウイルス媒介性送達によって、核酸の導入を達成することもできる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し得る。ウイルスは宿主ゲノムに統合することができるか、あるいは、宿主ゲノムに統合しない。そのようなウイルスを、免疫原性が低下するように操作することもできる。ウイルスは、複製能力を有してもよいか、または複製欠損性であってもよい（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングのさらなるラウンドにとって必要な１つまたは複数の遺伝子の欠損）。ウイルスは、一過的発現、長期的に続く発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、もしくは３ヶ月間）、または永続的発現（例えば、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡの）を引き起こすことができる。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。
【０２５１】
ｓｓＤＮＡ  ＡＡＶゲノムは、相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの反転末端リピートによって挟まれた、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐおよびＣａｐからなる。ＡＡＶ導入プラスミドを構築する場合、導入遺伝子は、２個のＩＴＲの間に置かれ、ＲｅｐおよびＣａｐはｉｎ  ｔｒａｎｓに供給することができる。ＲｅｐおよびＣａｐに加えて、ＡＡＶは、アデノウイルスに由来する遺伝子を含有するヘルパープラスミドを必要としてもよい。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）は、ＡＡＶ複製を媒介した。例えば、導入プラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドを、アデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含有するＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を産生することができる。あるいは、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を、単一のプラスミド中で組み合わせることができる。同様のパッケージング細胞および方法を、レトロウイルスなどの他のウイルスのために使用することができる。
【０２５２】
ＡＡＶの複数の血清型が同定されている。これらの血清型は、それらが感染する細胞型（すなわち、その向性）において異なり、特定の細胞型の選択的形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。心臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。腎臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ２が挙げられる。肺組織のための血清型としては、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が挙げられる。膵臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ８が挙げられる。光受容体細胞のための血清型としては、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が挙げられる。網膜色素上皮組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が挙げられる。骨格筋組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。肝臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９、特に、ＡＡＶ８が挙げられる。
【０２５３】
向性は、異なるウイルス血清型に由来するキャプシドとゲノムとの混合物である、偽型化によってさらに精緻化することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５に由来するキャプシド中にパッケージングされた血清型２のゲノムを含有するウイルスを示す。偽型化されたウイルスの使用は、形質導入効率を改善する、ならびに向性を変更することができる。異なる血清型から誘導されるハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルス向性を変更することもできる。例えば、ＡＡＶ−ＤＪは、８つの血清型に由来するハイブリッドキャプシドを含有し、ｉｎ  ｖｉｖｏで広範囲の細胞型にわたって高い感染性を示す。ＡＡＶ−ＤＪ８は、ＡＡＶ−ＤＪの特性を示すが、脳による取込みが増強されている別の例である。ＡＡＶ血清型を、変異によって改変することもできる。ＡＡＶ２の変異による改変の例としては、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ３の変異による改変の例としては、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ６の変異による改変の例としては、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが挙げられる。他の偽型化／改変されたＡＡＶバリアントとしては、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが挙げられる。
【０２５４】
導入遺伝子発現を促進するために、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補鎖を合成するための細胞のＤＮＡ複製機構に依存するため、導入遺伝子発現は遅延し得る。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補配列を含有するｓｃＡＡＶを使用して、宿主細胞のＤＮＡ合成に関する要件を除去することができる。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターを使用することもできる。
【０２５５】
パッケージング能力を増大させるために、より長い導入遺伝子を、第１は３’スプライスドナーを有し、第２は５’スプライスアクセプターを有する、２つのＡＡＶ導入プラスミドの間に分裂させてもよい。細胞の同時感染の際に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これはより長い導入遺伝子発現を可能にするが、発現はあまり効率的ではない。能力を増大させるための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子を、２つの導入プラスミド間に分割することができるが、同時発現が相同組換えおよび完全長導入遺伝子の発現を誘導するように実質的な配列が重複する。
【０２５６】
核酸およびタンパク質の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって達成することもできる。例えば、ＬＮＰ媒介性送達を使用して、Ｃａｓ  ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとの組合せまたはＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡとの組合せを送達することができる。そのような方法による送達は、一過的なＣａｓ発現をもたらし、生分解性脂質は、クリアランスを改善し、許容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、その細胞取込みを改善しながら、生体分子を分解から保護することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に会合する複数の脂質分子を含む粒子である。これらのものは、ミクロスフェア（単層および多層小胞、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン、ミセル中の分散相、または懸濁液中の内部相を含む。そのような脂質ナノ粒子を使用して、送達のための１つまたは複数の核酸またはタンパク質を封入することができる。陽イオン脂質を含有する製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含有させることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がｉｎ  ｖｉｖｏで存在し得る時間の長さを増加させるステルス脂質である。好適な陽イオン脂質、中性脂質、陰イオン脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例を、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、陽イオン脂質および１つまたは複数の他の構成成分を含んでもよい。一例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含んでもよい。別の例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含んでもよい。別の例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意選択の中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含んでもよい。
【０２５７】
ＬＮＰは、下記：（ｉ）封入およびエンドソーム脱出のための脂質；（ｉｉ）安定化のための中性脂質；（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質；ならびに（ｉｖ）ステルス脂質のうちの１つもしくは複数または全部を含有してもよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFinnら（２０１８年）Cell  Reports  ２２巻：１〜９頁およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。
【０２５８】
封入およびエンドソーム脱出のための脂質は、陽イオン脂質であってもよい。脂質は、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であってもよい。好適な脂質の一例は、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートである、リピドＡまたはＬＰ０１である。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFinnら（２０１８年）Cell  Reports  ２２巻：１〜９頁およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。好適な脂質の別の例は、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）とも呼ばれる、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ）ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）である、リピドＢである。好適な脂質の別の例は、２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）である、リピドＣである。好適な脂質の別の例は、３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル３−オクチルウンデカノエートである、リピドＤである。他の好適な脂質としては、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）としても公知である）が挙げられる。
【０２５９】
本明細書に記載のＬＮＰ中での使用にとって好適な一部のそのような脂質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰとしては、少なくとも７５％の脂質が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から消失するものが挙げられる。別の例として、少なくとも５０％のＬＮＰが、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から消失する。
【０２６０】
そのような脂質は、それらが中にある培地のｐＨに応じてイオン化可能であってよい。例えば、わずかに酸性の培地中では、脂質はプロトン化され、かくして、正電荷を担持し得る。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などの、わずかに塩基性の培地中では、脂質はプロトン化されず、かくして、電荷を担持しなくてもよい。一部の実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。電荷を担持するそのような脂質の能力は、その固有のｐＫａと関連する。例えば、脂質は、独立に、約５．８〜約６．２の範囲のｐＫａを有してもよい。
【０２６１】
中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、そのプロセシングを改善するように機能する。好適な中性脂質の例としては、様々な中性非荷電または両性イオン性脂質が挙げられる。本開示における使用にとって好適な中性リン脂質の例としては、限定されるものではないが、５−ヘプタデシルベンゼン−１，３−ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミン、およびその組合せが挙げられる。例えば、中性リン脂質を、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択することができる。
【０２６２】
ヘルパー脂質としては、トランスフェクションを増強する脂質が挙げられる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強するメカニズムは、粒子安定性の増強を含んでもよい。ある特定の場合、ヘルパー脂質は、膜融合性を増強することができる。ヘルパー脂質としては、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールが挙げられる。好適なヘルパー脂質の例としては、コレステロール、５−ヘプタデシルレゾルシノール、およびコレステロールヘミスクシネートが挙げられる。一例では、ヘルパー脂質は、コレステロールまたはコレステロールヘミスクシネートであってもよい。
【０２６３】
ステルス脂質としては、ナノ粒子がｉｎ  ｖｉｖｏで存在し得る時間の長さを変更する脂質が挙げられる。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減させること、および粒径を制御することによって製剤プロセスを補助することができる。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性をモジュレートすることができる。好適なステルス脂質としては、脂質部分に親水性頭部基が連結された脂質が挙げられる。
【０２６４】
ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれることもある）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含んでもよい。ＰＥＧという用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。ある特定のＬＮＰ製剤において、ＰＥＧは、約２，０００ダルトンの平均分子量を有する、ＰＥＧ２０００とも呼ばれる、ＰＥＧ−２Ｋである。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。
【０２６５】
ステルス脂質の脂質部分を、例えば、鎖が、例えば、アミドまたはエステルなどの１つまたは複数の官能基を含んでもよい、約Ｃ４〜約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独立に含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものなどの、ジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから誘導することができる。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換されたアルキル基をさらに含んでもよい。
【０２６６】
一例として、ステルス脂質を、ＰＥＧ−ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ−ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスタ−５−エン−３［ベータ］−オキシ）カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール））、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）−２０００−ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡ）、および１，２−ジステアリールオキシプロピル−３−アミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡ）から選択することができる。１つの特定例では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧであってよい。
【０２６７】
ＬＮＰは、製剤中に異なるそれぞれのモル比の構成成分脂質を含んでもよい。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％〜約６０モル％、約３５モル％〜約５５モル％、約４０モル％〜約５０モル％、約４２モル％〜約４７モル％、または約４５％であってもよい。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％〜約６０モル％、約３５モル％〜約５５モル％、約４０モル％〜約５０モル％、約４１モル％〜約４６モル％、または約４４モル％であってもよい。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％〜約２０モル％、約５モル％〜約１５モル％、約７モル％〜約１２モル％、または約９モル％であってもよい。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％〜約１０モル％、約１モル％〜約５モル％、約１モル％〜約３モル％、約２モル％、または約１モル％であってもよい。
【０２６８】
ＬＮＰは、封入しようとする核酸の生分解性脂質の正荷電アミノ基（Ｎ）と、負荷電リン酸基（Ｐ）との異なる比を有してもよい。これは、式Ｎ／Ｐによって数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５〜約１００、約１〜約５０、約１〜約２５、約１〜約１０、約１〜約７、約３〜約５、約４〜約５、約４、約４．５、または約５であってもよい。Ｎ／Ｐ比は、約４から約７、または約４．５から約６であってもよい。具体例では、Ｎ／Ｐ比は、４．５であってもよいか、６であってもよい。
【０２６９】
一部のＬＮＰでは、カーゴは、Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含んでもよい。Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは、異なる比であってもよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１〜約１：２５の範囲、約１０：１〜約１：１０の範囲、約５：１〜約１：５の範囲、または約１：１のＣａｓ  ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１〜約１：５、または約１０：１のＣａｓ  ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５のＣａｓ  ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１から約１：２のＣａｓ  ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含むことができる。具体例では、Ｃａｓ  ｍＲＮＡのｇＲＮＡに対する比は、約１：１または約１：２であってよい。
【０２７０】
一部のＬＮＰでは、カーゴは、外因性ドナー核酸およびｇＲＮＡを含んでもよい。外因性ドナー核酸およびｇＲＮＡは、異なる比であってもよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１〜約１：２５の範囲、約１０：１〜約１：１０の範囲、約５：１〜約１：５の範囲、または約１：１の外因性ドナー核酸のｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１〜約１：５、約５：１〜約１：１、約１０：１、または約１：１０の外因性ドナー核酸のｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５の外因性ドナー核酸のｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。
【０２７１】
好適なＬＮＰの特定例は、４．５の窒素のリン酸に対する（Ｎ／Ｐ）比を有し、４５：４４：９：２のモル比で生分解性陽イオン脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを含有する。生分解性陽イオン脂質は、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートであってもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFinnら（２０１８年）Cell  Reports  ２２巻：１〜９頁を参照されたい。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して１：１の重量比であってよい。好適なＬＮＰの別の特定例は、５０：３８．５：１０：１．５のモル比でＤｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ−ＤＭＧを含有する。
【０２７２】
適するＬＮＰの別の具体例は、６の窒素対リン酸（Ｎ／Ｐ）比を有し、生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを５０：３８：９：３のモル比で含有する。生分解性カチオン性脂質は、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートであってよく、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して１：２の重量比であってよい。
【０２７３】
送達様式は、免疫原性を低下させるように選択することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡを、異なる様式（例えば、二様式送達）によって送達することができる。これらの異なる様式は、対象に送達される分子（例えば、Ｃａｓもしくは核酸をコードする、ｇＲＮＡもしくは核酸をコードする、または外因性ドナー核酸／修復鋳型）に対して異なる薬力学的特性または薬物動態特性を提供することができる。例えば、異なる様式は、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらすことができる。一部の送達様式（例えば、自己複製またはゲノム組込みによって細胞の中で持続する核酸ベクターの送達）は、この分子のより持続的な発現および存在をもたらすが、他の送達様式は、一過的であり、あまり持続的ではない（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の送達）。例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質として、より一過的な様式でのＣａｓタンパク質の送達は、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が唯一存在し、短期間にわたって活性であることを確保することができ、ＭＨＣ分子によって細胞の表面上に示される細菌由来Ｃａｓ酵素に由来するペプチドによって引き起こされる免疫原性を低下させることができる。そのような一過的送達はまた、オフターゲット改変の可能性を低減することもできる。
【０２７４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含めた任意の適切な経路によるものであってよい。全身性投与様式としては、例えば、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路の例としては、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻内、および腹腔内経路が挙げられる。特定例は、静脈内輸注である。点鼻および硝子体内注射は、他の特定例である。局部投与様式としては、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状もしくは果核中）、大脳皮質、中心前回、海馬（例えば、歯状回もしくはＣＡ３領域中）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床下部、蓋、被蓋、または黒質への局部実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、および経強膜的経路が挙げられる。有意により少量の構成成分（全身的手法と比較して）は、全身的に（例えば、静脈内）投与される場合と比較して、局部的に（例えば、実質内または硝子体内）投与される場合に効果を発揮し得る。局部投与様式はまた、治療有効量の構成成分が全身的に投与される場合に起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生を低減するか、または除去することもできる。
【０２７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、クモ膜下、腹腔内、局所、鼻腔内または筋肉内を含む任意の適する経路によることができる。具体例は、静脈内注入である。ガイドＲＮＡおよび／もしくはＣａｓタンパク質（またはガイドＲＮＡおよび／もしくはＣａｓタンパク質をコードする核酸）を含む組成物を、１つまたは複数の生理学的および薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択される投与経路に依存し得る。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、または助剤が製剤の他の成分に適合し、そのレシピエントに対して実質的に有害でないことを意味する。
【０２７６】
投与の頻度および投与回数は、他の因子の中でも、外因性ドナー核酸、ガイドＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質（またはガイドＲＮＡもしくはＣａｓタンパク質をコードする核酸）の半減期および投与経路に依存し得る。核酸またはタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入は、１回またはある期間にわたって多数回実施することができる。例えば、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回、導入を実施することができる。
【０２７７】
Ｅ．Ｉｎ  ＶｉｖｏまたはＥｘ  ＶｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の送達、活性または効能を測定する
本明細書に開示される方法は、ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を検出または測定することをさらに含むことができる。例えば、ヒトＴＴＲ標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヒトＴＴＲ遺伝子座を標的にするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）である場合、測定することは、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を改変について評価することを含むことができる。
【０２７８】
種々の方法を使用して、標的化遺伝子改変を有する細胞を同定することができる。スクリーニングは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含み得る。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲによって行うことができる。リアルタイムＰＣＲでは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的化参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅した配列を認識する蛍光プローブを含み得る。適切な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されたプローブ（単数または複数単数または複数）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
【０２７９】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）をスクリーニングに使用することもできる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」または「大規模並列処理配列決定」または「ハイスループットな配列決定」とも称され得る。ＭＯＡアッセイに加えてスクリーニング手段としてＮＧＳを使用して、標的化遺伝子改変の正確な性質およびそれが細胞型または組織型または臓器型にわたって一貫しているかどうかを定義することができる。
【０２８０】
非ヒト動物におけるヒト化ＴＴＲ遺伝子座の改変を評価することは、任意の組織または臓器からの任意の細胞型においてであってよい。例えば、評価は、同じ組織もしくは臓器からの複数の細胞型、または組織もしくは臓器内の複数の場所からの細胞においてであってよい。これは、標的組織もしくは臓器内のどの細胞型が標的にされているか、または組織もしくは臓器のどの部分にヒトＴＴＲ標的化試薬が到達しているかに関する情報を提供することができる。別の例として、評価は、複数のタイプの組織または複数の臓器においてであってよい。特定の組織、臓器または細胞型が標的にされている方法では、これは、その組織または臓器がどれくらい効果的に標的にされているか、および他の組織または臓器にオフターゲット効果があるかどうかに関する情報を提供することができる。
【０２８１】
ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を不活性化するか、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座の発現に影響を及ぼすか、ヒト化ＴＴＲ  ｍＲＮＡの翻訳を防止するか、または、ヒト化ＴＴＲタンパク質を消去するように試薬が設計される場合、測定することは、ヒト化ＴＴＲ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を評価することを含むことができる。この測定することは、肝臓内または肝臓内の特定の細胞型もしくは領域内であってよいか、または、それは分泌されるヒト化ＴＴＲタンパク質の血清レベルを測定することを含むことができる。
【０２８２】
ヒト化ＴＴＲタンパク質の生成および分泌は、任意の公知の手段によって評価することができる。例えば、発現は、公知のアッセイを使用して、非ヒト動物の肝臓においてコードされるｍＲＮＡのレベル、または非ヒト動物の肝臓においてコードされるタンパク質のレベルを測定することによって評価することができる。ヒト化ＴＴＲタンパク質の分泌は、公知のアッセイを使用して、非ヒト動物においてコードされるヒト化ＴＴＲタンパク質の血漿レベルまたは血清レベルを測定することによって評価することができる。
【０２８３】
ＩＶ．ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物の作製方法
本明細書の他の場所に開示されるヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための、様々な方法が提供される。遺伝子改変生物を産生するための任意の都合のよい方法またはプロトコールが、そのような遺伝子改変非ヒト動物を作製するのに好適である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるChoら（２００９年）Current  Protocols  in  Cell  Biology４２巻：１９．１１：１９．１１．１〜１９．１１．２２頁およびGama  Sosaら（２０１０年）Brain  Struct.  Funct.  ２１４巻（２〜３号）：９１〜１０９頁を参照されたい。そのような遺伝子改変非ヒト動物を、例えば、標的Ｔｔｒ遺伝子座での遺伝子ノックインによって生成することができる。
【０２８４】
例えば、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法は、（１）ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含むように多能性細胞のゲノムを改変するステップ；（２）ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップ；（３）遺伝子改変された多能性細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；および（４）宿主胚を代理母に埋め込み、懐胎させるステップを含んでもよい。必要に応じて、改変された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚を、胚盤胞期までインキュベートした後、代理母に埋め込み、懐胎させて、Ｆ０非ヒト動物を作製することができる。次いで、代理母は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含むＦ０世代の非ヒト動物を産むことができる。
【０２８５】
この方法は、改変された標的ゲノム遺伝子座（すなわち、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座）を有する細胞または動物を同定するステップをさらに含んでもよい。種々の方法を使用して、標的化遺伝子改変を有する細胞および動物を同定することができる。
【０２８６】
スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子（ＭＯＡ）の改変を評価するための定量的アッセイを含んでもよい。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲによって行うことができる。リアルタイムＰＣＲでは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的化参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅した配列を認識する蛍光プローブを含んでもよい。
【０２８７】
好適な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されたプローブ（単数または複数単数または複数）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
【０２８８】
好適な多能性細胞の例は、胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞）である。改変された多能性細胞を、例えば、（ａ）５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームによって挟まれた挿入核酸であって、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む、挿入核酸を含む１つまたは複数の標的化ベクターを細胞中に導入すること；ならびに（ｂ）内因性Ｔｔｒ遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノム中に含む少なくとも１つの細胞を同定することによる組換えによって生成することができる。あるいは、改変された多能性細胞を、（ａ）細胞中に、（ｉ）内因性Ｔｔｒ遺伝子座内の標的配列にニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ作用剤；ならびに（ｉｉ）標的配列の十分近くに位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームによって挟まれた挿入核酸であって、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む挿入核酸を含む１つまたは複数の標的化ベクターを導入すること；ならびに（ｃ）内因性Ｔｔｒ遺伝子座に改変（例えば、挿入核酸の組込み）を含む少なくとも１個の細胞を同定することによって生成することができる。ニックまたは二本鎖切断を所望の標的配列に誘導する任意のヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例としては、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはそのような系の構成成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ２０１５／０１５９１７５を参照されたい。
【０２８９】
具体例では、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法は、（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に：（ｉ）内因性Ｔｔｒ遺伝子座の標的配列を標的にするヌクレアーゼ剤；および（ｉｉ）内因性Ｔｔｒ遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同アームおよび内因性Ｔｔｒ遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同アームによって挟まれたヒトＴＴＲ配列を含む核酸挿入断片を含む標的化ベクターを導入するステップであって、標的化ベクターは、内因性Ｔｔｒ遺伝子座で組み換えて、ヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む遺伝子改変非ヒトＥＳ細胞を生成する、ステップ；（ｂ）遺伝子改変非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主の胚に導入するステップ；および（ｃ）代理母で非ヒト動物宿主の胚を懐胎させるステップであって、代理母はヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含むＦ０後代の遺伝子改変非ヒト動物を生成するステップを含むことができる。
【０２９０】
一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）、および内因性Ｔｔｒ遺伝子座の標的配列を標的にするガイドＲＮＡを含むことができるが、他の適するヌクレアーゼ剤を使用することもできる。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、本明細書の他の場所でより詳細に記載される。必要に応じて、２つまたはそれより多くの（例えば、３または４）ヌクレアーゼ剤（例えば、ガイドＲＮＡ）を使用することができる。標的配列（複数可）は、内因性Ｔｔｒ遺伝子座内の任意の適する標的配列であってよい。例えば、標的配列（複数可）は、開始コドンおよび／または停止コドンのうちの約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約１０００ヌクレオチド、約２０００、約３０００、約４０００または約５０００ヌクレオチド内にあってよい（例えば、開始コドンに近接している１つの標的配列および停止コドンに近接している１つの標的配列）。
【０２９１】
一部のそのような方法では、標的化ベクターは、長さが少なくとも１０ｋｂであるか、または５’および３’相同アームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである大きな標的化ベクターであるが、他のタイプの外因性ドナー核酸も使用することができ、かつ、周知である。５’および３’相同アームは、ヒトＴＴＲ挿入断片核酸で置き換えられている領域に隣接するか、ヒトＴＴＲ挿入断片核酸が挿入されるべき領域に隣接する、５’および３’標的配列にそれぞれ対応することができる。外因性ドナー核酸または標的化ベクターは、相同組換え修復を介して標的遺伝子座で組み換えることができるか、またはＮＨＥＪ媒介性挿入を介して挿入し、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を生成することができる。
【０２９２】
ドナー細胞を、胚盤胞期または桑実胚前期（すなわち、４細胞期もしくは８細胞期）などの、任意の段階で宿主胚に導入することができる。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２９４，７５４号を参照されたい。
【０２９３】
あるいは、本明細書の他の箇所に記載の非ヒト動物を作製する方法は、（１）多能性細胞を改変するための上記の方法を使用してヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含むように１細胞期胚のゲノムを改変すること；（２）遺伝子改変された胚を選択すること；および（３）遺伝子改変された胚を、代理母に埋め込み、懐胎させることを含んでもよい。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。
【０２９４】
核移植技術を使用して、非ヒト哺乳動物を生成することもできる。簡単に述べると、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核するか、または除核された卵母細胞を提供するステップ；（２）除核された卵母細胞と混合しようとするドナー細胞または核を単離または提供するステップ；（３）この細胞または核を、除核された卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成させるステップ；（４）再構成された細胞を、動物の子宮に埋め込んで、胚を形成させるステップ；および（５）胚を発生させるステップを含んでもよい。そのような方法では、卵母細胞は、一般には死んだ動物から回収されるが、それらを生きている動物の卵管および／または卵巣から単離することもできる。卵母細胞を、除核前に様々な周知の媒体中で成熟させることができる。卵母細胞の除核を、いくつかの周知の様式で実施することができる。再構成された細胞を形成するための除核された卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、融合前の透明帯下でのドナー細胞の微量注射によるものであってもよい。接触／融合平面をわたるＤＣ電気パルスの適用（電気融合）によって、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露によって、またはセンダイウイルスなどの不活化ウイルスを用いて、融合を誘導することができる。核ドナーとレシピエント卵母細胞との融合の前、間、および／または後の電気的および／または非電気的手段によって、再構成された細胞を活性化することができる。活性化法としては、電気パルス、化学誘導性ショック、精子による貫通、卵母細胞中の二価陽イオンレベルの増大、および卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化の低減（キナーゼ阻害剤を手段とする）が挙げられる。活性化された再構成された細胞、または胚を、周知の培地中で培養した後、動物の子宮に移すことができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、および米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
【０２９５】
本明細書に提供される様々な方法は、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞がヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含む、遺伝子改変された非ヒトＦ０動物の生成を可能にする。Ｆ０動物を生成するために使用される方法に応じて、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を有するＦ０動物内の細胞数は変化する。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法による、対応する生物に由来する桑実胚前期胚（例えば、８細胞期マウス胚）へのドナーＥＳ細胞の導入により、Ｆ０動物のより高いパーセンテージの細胞集団が標的化遺伝子改変を含む目的のヌクレオチド配列を含む細胞を含むようになる。例えば、非ヒトＦ０動物の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の細胞寄与が、標的化改変を有する細胞集団を含んでもよい。
【０２９６】
遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座についてヘテロ接合性であってよく、またはヒト化ＴＴＲ遺伝子座についてホモ接合性であってもよい。
【０２９７】
上文または下で引用されている全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、各項目が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されるのと同じ程度に、あらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれる。違う時間に受託番号に異なるバージョンの配列が関連付けられている場合、本出願の有効な出願日において受託番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、受託番号に関して実際の出願日または優先出願の出願日の早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り本出願の有効な出願日時点で直近に公開されたバージョンを意味する。特に他の指示がなければ、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明を明瞭さおよび理解のために図表および例によって少し詳細に記載してきたが、ある特定の変化および改変を添付の特許請求の範囲内で実施することができることが明らかになろう。
【０２９８】
配列の簡単な説明
添付の配列表に列挙されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各線の左から右に）３’末端まで進む標準の慣習に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいかなる言及にも相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントも提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各線の左から右に）カルボキシ末端まで進む標準の慣習に従う。
【０２９９】
【表２−１】
2021500867.tif 000006
【表２−２】
2021500867.tif 000007
【実施例】
【０３００】
（実施例１）
ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含むマウスの生成
ＴＴＲアミロイド症疾患のための１つの有望な治療アプローチは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術などのゲノム編集技術による遺伝子の不活性化によって患者におけるＴＴＲ負荷を低減することである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９治療薬の開発を支援するために、Ｔｔｒ遺伝子に標的化改変を有するマウスを開発した。
【０３０１】
作製した第１のＴｔｒ対立遺伝子は、マウストランスサイレチンコード配列の完全な欠失およびヒトＴＴＲ遺伝子のオルソロガス部分によるその置き換えであった。マウスＴｔｒ開始コドンからマウスＴｔｒ停止コドンまでの概ね８．３ｋｂの領域を、ヒトＴＴＲ開始コドンから最後のヒトＴＴＲエクソン（エクソン４、ヒト３’ＵＴＲを含む）の末端までの概ね７．１ｋｂのオルソロガスヒトＴＴＲ配列、およびｌｏｘＰ部位によって挟まれた自己欠失ネオマイシン選択カセット（ＳＤＣ  Ｎｅｏ）で置き換えるために、マウスＴｔｒ開始コドンの上流の３３．７ｋｂの配列およびマウスＴｔｒ停止コドンの下流の３４．５ｋｂの配列を含む５’相同アームを含む大きな標的化ベクターを生成した。図３を参照。ＳＤＣ  Ｎｅｏカセットは、５’から３’の向きに以下の構成成分を含む：ｌｏｘＰ部位、マウスプロタミン（Ｐｒｍ１）プロモーター、Ｃｒｅｉ（イントロンを含むように最適化されたＣｒｅコード配列）、ポリＡ、ヒトユビキチンプロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）コード配列、ポリＡ、ｌｏｘＰ。ヒト化対立遺伝子を生成するために、マウスＴｔｒ遺伝子座を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成成分を、大きな標的化ベクターと一緒にＦ１Ｈ４マウス胚性幹細胞に導入した。マウスＴｔｒ対立遺伝子のヒト化を確認するために、図５Ａおよび表３に示すプライマーおよびプローブを使用した、対立遺伝子喪失アッセイ、対立遺伝子獲得アッセイ、保持アッセイならびにＣＲＩＳＰＲアッセイを実行した。対立遺伝子喪失アッセイ、対立遺伝子獲得アッセイおよび保持アッセイは、例えば、その各々はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１４／０１７８８７９；ＵＳ２０１６／０１４５６４６；ＷＯ２０１６／０８１９２３；およびFrendewey  et  al.  (2010)  Methods  Enzymol.  476:295-307に記載される。ＣＲＩＳＰＲアッセイは、ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡによって破壊される領域を包含するように設計されたＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイである。ＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡが切断してインデルを生成する（挿入または欠失）場合、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイは増幅させることができず、したがってＣＲＩＳＰＲ切断を報告する。ＳＤＣ  Ｎｅｏカセットを有するバージョンおよびＳＤＣ  Ｎｅｏカセットの切除後のバージョンを、図３に示す。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を使用して、Ｆ０マウスを次に生成した。例えば、その各々はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，５７６，２５９；ＵＳ７，６５９，４４２；ＵＳ７，２９４，７５４；ＵＳ２００８／００７８００；およびPoueymirou  et  al.  (2007)  Nature  Biotech.  25(1):91-99を参照。
【０３０２】
クローン７５７６Ａ−Ａ５、７５７６Ｃ−Ｇ７および７５７６Ｂ−Ｆ１０を含む複数のヒト化ＥＳ細胞クローンから、Ｆ０世代マウス（５０％  Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃおよび５０％  １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ）を生成した。Ｆ０世代マウスにおける予想されるヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の配列は、配列番号１４に示され、ＳＤＣ  Ｎｅｏカセットを含む。次に、Ｆ１およびＦ２生成マウス（７５％  Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃおよび２５％  １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ）を、交配によって生成した。Ｆ１およびＦ２世代マウスにおける予想されるヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の配列は、配列番号１５に示され、ＳＤＣ  Ｎｅｏカセットを含まない。
【０３０３】
ヒトおよびマウスのトランスサイレチン前駆体タンパク質配列の比較を図１Ａに示し、ヒトおよびマウスのトランスサイレチンコード配列の比較を図１Ｂに示し、野生型マウスＴｔｒ遺伝子座および最終ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座（ＳＤＣ  Ｎｅｏカセットが欠失したヒト化ＴＴＲバージョン１）を示す概略図を、図２に示す。開始コドンから停止コドンまでの内因性マウスＴｔｒ遺伝子座配列は、配列番号２０に提供される。ＳＤＣ  Ｎｅｏカセットを有するおよびＳＤＣ  Ｎｅｏカセットのない予想されるヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の配列を、配列番号１４および１５にそれぞれ示す。ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座によってコードされる、予想されるトランスサイレチン前駆体タンパク質を、配列番号１に示す。この対立遺伝子は、ヒトＴＴＲ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９治療薬の真のヒト標的を提供し、それによって、生きた動物におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９治療薬の効能および作用様式の試験、ならびにヒトタンパク質が、存在するＴＴＲの唯一のバージョンである状況における薬物動態学的および薬力学的研究を可能にする。
【０３０４】
【表３−１】
2021500867.tif 000008
【表３−２】
2021500867.tif 000009
【０３０５】
（実施例２）
ヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含むマウスの特徴付け。
クローン７５７６Ａ−Ａ５および７５７６Ｃ−Ｇ７からのヒト化ＴＴＲマウスＦ０コホートを、次に特徴付けた。図６に示すように、ヒト化ＴＴＲ  ｍＲＮＡは、８週齢のホモ接合性Ｆ０世代ヒト化ＴＴＲマウスの肝臓において強力に発現された。各組織からのＲＮＡの等しい質量を、ＲＴ−ｑＰＣＲによって分析した。各遺伝子型につき５匹のマウスを分析し、１試料あたりのテクニカル反復数は４であった。各組織から、ＲＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは、それがｑＰＣＲ反応にカウントされないように分解した。ＲＮＡを逆転写させ、ヒトＴＴＲ転写物およびマウスＴｔｒ転写物を検出するために、ヒトＴＴＲおよびマウスＴｔｒに特異的なアッセイをそれぞれ使用した。予想通りに、ホモ接合性のヒト化ＴＴＲマウスは、肝臓におけるヒトＴＴＲの有意な発現を示した（ｃｔ値３０未満）が、ＷＴマウスは３０およびそれより高いｃｔ値を示し、ヒトＴＴＲの発現がないことを示した。対照的に、野生型マウスは肝臓におけるマウスＴｔｒの有意な発現を示したが、ホモ接合性のヒト化ＴＴＲマウスは３０およびそれより高いｃｔ値を示し、マウスＴｔｒの内因性発現がないことを示した。
【０３０６】
８週齢のホモ接合性Ｆ０世代ヒト化ＴＴＲマウスからの血清および脳脊髄液におけるヒトＴＴＲおよびマウスＴＴＲタンパク質レベルを評価するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実行した。ヒトＴＴＲレベルを評価するために、ヒトＴＴＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；カタログ番号：ＯＫＩＡ０００８１；血清の場合１：２５０の希釈；ＣＳＦの場合１：１０００の希釈）を使用した。マウスＴＴＲレベルを評価するために、マウスＴＴＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；カタログ番号：ＯＫＩＡ００１１１；血清の場合１：４０００の希釈；ＣＳＦの場合１：１００００の希釈）を使用した。ヒト血清およびヒトＣＳＦは、ヒトＴＴＲのための陽性対照として、およびマウスＴＴＲのための陰性対照として使用し、Ｆ１Ｈ４血清およびＦ１Ｈ４  ＣＳＦは、ヒトＴＴＲのための陰性対照として、およびマウスＴＴＲのための陽性対照として使用した。図７Ａに示すように、ヒトＴＴＲはヒト化ＴＴＲマウスからの血清において検出されたが、野生型（Ｆ１Ｈ４）マウスからの血清では検出されなかった。図７Ｂに示すように、マウスＴＴＲはヒト化ＴＴＲマウスからの血清において検出されなかったが、野生型マウスの血清で検出された。２つの別個のヒト化マウスＴｔｒ  ＥＳ細胞クローン：７５７６Ｃ−Ｇ７および７５７６Ａ−Ａ５に由来するヒト化ＴＴＲマウスにおいて、血清中のヒトおよびマウスＴＴＲレベルをさらに評価した。図７Ｃに示すように、ヒトＴＴＲは、クローン７５７６Ａ−Ａ５に由来するヒト化ＴＴＲマウスの血清において検出された。
【０３０７】
血清試料、肝臓試料および腎臓試料でのウエスタンブロットによって、ヒトＴＴＲタンパク質発現も８週齢のホモ接合性ヒト化ＴＴＲマウスにおいて評価した。結果を、図８〜９に示す。血清試料（１ウェルにつき５μＬの総量）をＬａｅｍｌｌｉ緩衝液（ＳＤＳおよびベータ−メルカプトエタノールを含有する）の中で沸騰させ、４〜２０％の変性勾配ゲル（抗ＴＴＲ抗体：１：１０００；Ａｂｃａｍ；ａｂ７５８１５）で分離した。負荷対照として、マウスＩｇＧ（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ：１：７５００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。ヒト化マウスＴｔｒクローン７５７６Ｃ−Ｇ７および７５７６Ａ−Ａ５のために、１群につき３匹のマウスを試験した。野生型マウス対照（Ｆ１Ｈ４）のために、１群につき５匹のマウスを試験した。マウス血清およびヒト血清をそれぞれ陰性および陽性対照として使用した。図８に示すように、ヒトＴＴＲは、両方のヒト化マウスＴｔｒクローンからの血清においてウエスタンブロットによって検出された。
【０３０８】
肝臓および腎臓試料（１ウェルにつき１００μｇの総タンパク質）をＬａｅｍｌｌｉ緩衝液（ＳＤＳおよびベータ−メルカプトエタノールを含有する）の中で沸騰させ、４〜２０％の変性勾配ゲル（抗ＴＴＲ抗体：１：１０００；Ａｂｃａｍ；ａｂ７５８１５）で分離した。ＧＡＰＤＨ（抗ＧＡＰＤＨ：１：２０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を、負荷対照として使用した。ヒト化マウスＴｔｒクローン７５７６Ｃ−Ｇ７および７５７６Ａ−Ａ５のために、１群につき３匹のマウスを試験した。野生型マウス対照（Ｆ１Ｈ４）のために、１群につき５匹のマウスを試験した。マウス血清およびヒト血清をそれぞれ陰性および陽性対照として使用した。図９に示すように、ヒトＴＴＲは、クローン７５７６Ａ−Ａ５から生成された両方のホモ接合性ヒト化ＴＴＲマウスからの血清においてウエスタンブロットによって検出された。
【０３０９】
要約すると、ＴＴＲ  ＨｕｍＩｎ（ＴＴＲ７５７６／７５７６）Ｆ０マウスは、検出可能な量の循環ｈＴＴＲを有することが見出された。さらに、クローン７５７６Ｃ−Ａ５からのマウスは、肝臓および血漿に検出可能な量のｈＴＴＲを有していた。
【０３１０】
ネオマイシン薬物選択カセットの除去がヒトＴＴＲの分泌を増加させることができると、本発明者らは仮定した。ヒトＴＴＲレベルは、ネオマイシン選択カセットを有する完全ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座についてホモ接合性の５週齢マウス（ＴＴＲ７５７６／７５７６）、ネオマイシン選択カセットを有する完全ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座についてヘテロ接合性のマウス（ＴＴＲ７５７６／ＷＴ）、ネオマイシン選択カセットを有さない完全ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座についてヘテロ接合性のマウス（ＴＴＲ７５７７／ＷＴ）、および野生型マウス（Ｆ１Ｈ４）での非末端、顎下採血（submandibular  bleed）からの血漿試料において測定した。ヒトＴＴＲレベルは、ＡｓｓａｙＰｒｏヒトＴＴＲ（ｈＴＴＲ）ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号：ＥＰ３０１０−１；１：４００００の希釈）でアッセイした。マウスＴＴＲ血清レベルは、Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＢｉｏｌｏｇｙマウスＴＴＲ（ｍＴＴＲ）ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＯＫＩＡ００１１１；１：４０００の希釈）でアッセイした。ＡｓｓａｙＰｒｏヒトＴＴＲ  ＥＬＩＳＡキットはヒトＴＴＲの検出に特異的であるが、マウスＴＴＲには特異的でないことが以前に決定され、Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＢｉｏｌｏｇｙマウスＴＴＲ  ＥＬＩＳＡキットはマウスＴＴＲの検出に特異的であるが、ヒトＴＴＲには特異的でないことが以前に決定された（データ示さず）。表４に示すように、ネオマイシン選択カセットの除去は、血清中のヒトＴＴＲレベルの統計的に有意な増加をもたらした。ＭＡＩＤ７５７６は、ネオマイシン選択カセットを有するヒト化ＴＴＲ遺伝子座を指す。ＭＡＩＤ７５７７は、ネオマイシン選択カセットが除去されたヒト化ＴＴＲ遺伝子座を指す。肝臓では、ヒトＴＴＲ  ｍＲＮＡの発現の増強も観察された（データ示さず）。おそらくヘテロマーの（例えば、ＴＴＲ交配種）相互作用からの増加した安定性のために、ｈＴＴＲおよびｍＴＴＲについてヘテロ接合性のマウス（ＴＴＲ−ＷＴ７５７６／ＷＴおよびＴＴＲ−ＷＴ７５７７／ＷＴ）は増加した循環ｈＴＴＲを有していた。
【０３１１】
【表４】
2021500867.tif 000010
【０３１２】
血清および肝臓のＴＴＲレベルは、異なるクローン：７５７６Ｂ−Ｆ１０から生成されたＦ２世代ホモ接合性ヒト化ＴＴＲマウス（１群につき３匹）においても測定した。図１４（トリス−食塩水スクロース（ＴＳＳ）対照試料）に示すように、ヒトＴＴＲは、１０００ｎｇ／ｍＬを超えるレベルで肝臓試料において検出された。図１５Ａおよび１５Ｂ（ＴＳＳ試料）に示すように、ヒトＴＴＲは、８０，０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いレベルで血清試料において検出された。
【０３１３】
別の実験では、３カ月齢のＴＴＲ  ＷＴ  ＨｕｍＩｎ（ｖ１．０、ｈＴＴＲ７５７７／７５７７、クローンＢ−Ｆ１０）Ｆ２ホモ接合性マウスから、顎下採血を介して血液を収集した。種特異的ＥＬＩＳＡキット（ｈＴＴＲ、Ａｖｉｖａ、カタログ番号ＯＫＩＡ０００８１；ｍＴＴＲ、Ａｖｉｖａ、カタログ番号ＯＫＩＡ００１１１）を使用して、血漿でｈＴＴＲレベルを決定した。図１７Ａおよび１７Ｂおよび表５に示すように、ｈＴＴＲはＴＴＲ  ＷＴ  ＨｕｍＩｎ（ｖ１．０、クローンＢ−Ｆ１０）Ｆ２ホモ接合性マウスの循環に５２．１±１０．７μｇ／ｍＬで分泌され、ｍＴＴＲの検出可能なレベルはなかった。野生型対照マウス（Ｆ１Ｈ４）およびＷＴ  ＨｕｍＩｎ（ｖ１．０、ｈＴＴＲ７５７７／７５７７、クローンＢ−Ｆ１０）マウスからの肝臓試料におけるｍＴＴＲおよびｈＴＴＲのｍＲＮＡレベルは、図１７Ｃに示す。
【０３１４】
【表５】
2021500867.tif 000011
【０３１５】
（実施例３）
Ｅｘ  ＶｉｖｏおよびＩｎ  ＶｉｖｏでヒトＴＴＲを標的にするガイドＲＮＡを試験するためのヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含むマウスの使用。
ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲを標的にするガイドＲＮＡを試験するために、Ｆ０世代ヒト化ＴＴＲマウスコホートを次に使用した。概念実証として、クローン７５７６Ｃ−Ｇ７から生成されたＦ０世代ヒト化ＴＴＲマウスから単離された初代肝細胞において、ヒトＴＴＲガイドＲＮＡを先ず試験した。ｈｕＴＴＲｈＩ／ｈＩマウスからの肝臓を、１×ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有する５０ｍＬの肝臓かん流培地で、続いて５０ｍＬの肝臓消化培地（ＨＢＳＳ、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、コラゲナーゼ）でかん流した。肝臓が消化されたようならば、１×ＰｅｎＳｔｒｅｐおよびＬ−グルタミンを含有する洗浄媒体にそれらを入れた。弱い振盪を通して肝臓から肝細胞を放出させるために、肝臓を切り離した。細胞が放出されたならば、７０μｍメッシュフィルターにそれらを通し、４℃で４分間、５０ｇで遠心回転させた。ペレットは、洗浄緩衝液で２回洗浄した。次に、ペレットを２０ｍＬの３８〜４０％パーコールに再懸濁させ、４℃で１０分間、２００ｇで遠心回転させた。ペレットを２回洗浄し、プレーティング培地（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ  Ｍｅｄｉａ、１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−グルタミン、５％ＦＢＳ）に再懸濁させた。２４ウェルコラーゲンコート組織培養プレートに、細胞を１ウェルにつき細胞数３００，０００でプレーティングした。細胞を６〜１８時間付着させた後、プレーティング培地をＦＢＳなしの培地で置き換えた。使用した試薬を表６に示す。
【０３１６】
【表６】
2021500867.tif 000012
【０３１７】
単離から２４時間後に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡとヒトＴＴＲ  ｇＲＮＡ（バージョン１および２、各々ヒトＴＴＲエクソン２を標的にする）を含有する）を肝細胞に加えた。簡潔には、各ウェルにつき、３％マウス血清を含有する５００μＬの肝細胞維持培地中５００ｎｇの濃度でＬＮＰを加え、３７℃で５分の間インキュベートした。プレーティングした細胞を洗浄し、培地中のインキュベートしたＬＮＰの５００μＬを各ウェルに加えた。４８時間後に、ＤＮＡ溶解物を細胞から調製し、試験した各ガイドＲＮＡについて次世代シーケンシングを実行した。
【０３１８】
図１０に示すように、ヒト化ＴＴＲ遺伝子における編集は、ヒト化ＴＴＲマウスから単離された初代肝細胞において、両方のガイドＲＮＡで見られた。ヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  １は２０．４％の編集効率を有し、ヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  ２は７．５３％の編集効率を有した。エクソン３を標的にするヒトＴＴＲガイドＲＮＡについて、類似の結果が観察された（１７．３７％の編集効率；データ示さず）。編集効率は、次世代シーケンシングによって決定される、溶解細胞のプールからＰＣＲ反応において読み取った配列の総数に対して観察された挿入または欠失の総数を指す。
【０３１９】
次に、ヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  １および２を、ヒト化ＴＴＲマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。クローン番号７５７６Ａ−Ａ５および７５７６Ｃ−Ｇ７からのＦ０世代ヒト化ＴＴＲマウス（ＴｔｒｈＩ／ｈＩ）を使用した。表７に示すように、新鮮なＬＮＰで３つの動物群を標的にした。
【０３２０】
【表７】
2021500867.tif 000013
【０３２１】
ヒトＴＴＲガイドＲＮＡ、および１つのＮＬＳを有し、ＨＡタグのないＣａｓ９をコードするｍＲＮＡでＬＮＰを製剤化した。このＬＮＰは、４．５の窒素対リン酸（Ｎ／Ｐ）比を有し、カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを４５：４４：９：２のモル比で含有した。本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのＬＮＰ実験で使用したカチオン性脂質は、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートであった。各々における（ガイドＲＮＡ）：（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ）比は、重量で１：１であった。さらなるＬＮＰ製剤の詳細は、表８に提供される。
【０３２２】
【表８】
2021500867.tif 000014
【０３２３】
注射の前にマウスを計量し、送達体積が１マウスにつき２００μｌであるようにトリス−食塩水スクロースに希釈することによって、ＬＮＰ（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡとヒトＴＴＲ  ｇＲＮＡとを含有する）を２ｍｇ／ｋｇの用量に調製した。送達は、尾静脈注射を通した静脈内だった。８〜１４日後、マウスを安楽死させ、血清を肝臓組織と一緒に収集した。組織を処理してＤＮＡ溶解物にし、それは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって次に分析した。
【０３２４】
肝酵素ＡＬＴ、ＡＳＴ、トリグリセリド、総コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、非エステル型脂肪酸（ＮＥＦＡ）およびアルブミンについての血清化学分析は、様々な処置群の間で統計的差を示さなかった。図１１Ａ〜１１Ｈを参照。エクソン３を標的にするヒトＴＴＲガイドＲＮＡについて、類似の結果が観察された（データ示さず）。
【０３２５】
ＮＧＳは、ヒトＴＴＲ  ｇＲＮＡ  １（平均４２．８％）およびヒトＴＴＲ  ｇＲＮＡ  ２（平均３６．０％）について、肝臓における有意な編集を示した。図１２を参照。編集効率は、溶解細胞のプールからＰＣＲ反応において読み取った配列の総数に対して観察された挿入または欠失の総数を指す。他の組織で、遺伝子編集の最小限または皆無の統計的有意レベルが観察された（データ示さず）。
【０３２６】
次に、ヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  １を、クローン番号７５７６Ｂ−Ｆ１０からのＦ２世代のホモ接合性ヒト化ＴＴＲマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。投与計算のために投与前に動物を計量し、次に福祉のために投与後２４時間モニタリングした。上記の通りヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  １およびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡで製剤化されたＬＮＰを用い、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇおよび０．１ｍｇ／ｋｇで動物に静脈内投与した。トリス−食塩水スクロースを、対照として使用した。１群につき、３匹のマウスを試験した。剖検時（投与の８日後）、肝臓および血液（血清のために）を分析のために収集した。肝臓で観察されたヒト化ＴＴＲ遺伝子座の編集パーセントは、ヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  １およびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡで製剤化されたＬＮＰの１ｍｇ／ｋｇの用量で５０．７％、０．３ｍｇ／ｋｇの用量で１３．０％、０．１ｍｇ／ｋｇの用量で２．３％であって、対照マウスでは０．１％未満の編集が観察された。投与したマウスからの肝臓溶解物および血清において、ヒトＴＴＲレベルを次に測定した。ＲＩＰＡおよび１００ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼ阻害剤で、肝臓を溶解した。ヒトＴＴＲレベルを評価するために、ヒトＴＴＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；カタログ番号：ＯＫＩＡ０００８１；肝臓溶解物の場合１：１００の希釈；血清の場合１：５０００または１：１００００の希釈）を使用した。図１４に示すように、対照動物からの肝臓溶解物において１０００ｎｇ／ｍＬを超えるヒトＴＴＲのレベルが測定され、これらのレベルは、ヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  １およびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡで製剤化したＬＮＰを１ｍｇ／ｋｇで投与した動物では５０％を超えて低下した。図１５Ａおよび１５Ｂに示すように、ヒトＴＴＲは、８０，０００ｎｇ／ｍＬまたはそれより高いレベルで対照動物からの血清において測定され、ヒトＴＴＲレベルは、ヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  １およびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡで製剤化したＬＮＰを１ｍｇ／ｋｇで投与した動物では６６％低下した。
【０３２７】
次に、３つの異なるヒトＴＴＲガイドＲＮＡ（ヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  ３、４および５）を、ホモ接合性のヒト化ＴＴＲマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。ＬＮＰ製剤は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡをガイドＲＮＡに対して１：２の重量比で含有した。ＬＮＰは、カチオン性脂質（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート、別名３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエート）、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを、それぞれ５０：３８：９：３のモル比で含有し、６のＮ：Ｐ比を有した。
【０３２８】
先ず、ヒト化ＴＴＲ遺伝子座における編集を評価した。注射の前にマウスを計量し、ＬＮＰ（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡとヒトＴＴＲ  ｇＲＮＡとを含有する）を１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇおよび０．１ｍｇ／ｋｇの用量で調製した（１群につきｎ＝５匹のマウス）。送達は、尾静脈注射を通した静脈内だった。上記のように、マウスをその後安楽死させ、血清を肝臓組織と一緒に収集した。組織を処理してＤＮＡ溶解物にし、それは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって次に分析した。ＮＧＳは、各ヒトＴＴＲ  ｇＲＮＡについて試験した全ての用量で、肝臓において有意な編集を用量依存的に示した。図１９を参照。肝臓編集結果は、ＮＧＳ分析のために目的領域を増幅するように設計されたプライマーを使用して決定した。
【０３２９】
第２に、血清ＴＴＲレベルを評価した。投与計算のために投与前にマウスを計量した。上記の通りヒトＴＴＲガイドＲＮＡ  ３、４または５およびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡで製剤化されたＬＮＰを用い、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇおよび０．１ｍｇ／ｋｇでマウス（１群につきｎ＝５匹のマウス）に静脈内投与した。ＬＮＰ製剤は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡをガイドＲＮＡに対して１：２の重量比で含有した。ＬＮＰは、カチオン性脂質（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート、別名３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエート）、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを、それぞれ５０：３８：９：３のモル比で含有し、６のＮ：Ｐ比を有した。トリス−食塩水スクロースを、対照として使用した。上記の通り、血液（血清のために）を分析のためにその後収集した。投与したマウスからの血清において、ヒトＴＴＲレベルを次に測定した。上記の通り、ヒト血清ＴＴＲレベルを評価した。図２０に示すように、各ガイドＲＮＡを投与したマウスにおいて全ての用量でヒトＴＴＲレベルは用量依存的に有意に低減した。
【０３３０】
（実施例４）
マウスシグナル配列を有するキメラマウス／ヒトＴＴＲタンパク質をコードするヒト化ＴＴＲ遺伝子座を含むマウスの生成。
ＴＴＲのマウスシグナル配列は、ｈＴＴＲ分泌をより頑強なレベルに増強することができると、本発明者らは仮定した。マウスＴｔｒ（ｍＴｔｒ）シグナル配列＋ｈＴＴＲ（「ｍ／ｈＴＴＲ」）のためのｃＤＮＡ挿入断片を含有する、流体力学的送達（ＨＤＤ）プラスミドを構築した。表９に掲載されるｃＤＮＡ挿入断片を有するｐＲＧ９７７ベクターを使用したＨＤＤ構築物を、各々５９日齢の雄Ｃ５７／ＢＬ６マウスにＨＤＤを介して注射した。ＨＤＤ後の４日目に、ＥＬＩＳＡを顎下の血液で実行した。Ｆ１Ｈ４血漿およびヒト血清を、それぞれ陰性および陽性対照としてＥＬＩＳＡに含めた。
【０３３１】
【表９】
2021500867.tif 000015
【０３３２】
結果を、図１３に示す。野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスへのＨＤＤは、ヒトシグナル配列ＴＴＲ＋ｈＴＴＲ（「ｈＴＴＲ」）と比較したとき、ＴＴＲのマウスシグナル配列の利用が血漿中へのｈＴＴＲ分泌を実際増加させたことを明らかにした。これは、頑強なｈＴＴＲ分泌をもたらすＴＴＲ構築物を予測するために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスを使用することができることを実証した。
【０３３３】
これらの結果に基づいて、第２のエクソンの開始から停止コドンまでのマウスＴｔｒ遺伝子座の領域の欠失、およびヒトＴＴＲ遺伝子のオルソロガスな部分によるその置き換えを含むが、ヒトＴＴＲ遺伝子の３’ＵＴＲも含む、第２のヒト化ＴＴＲ対立遺伝子を生成した。マウスＴｔｒ遺伝子の第２のエクソンの開始からマウスＴｔｒ停止コドンまでの概ね７．３ｋｂの領域を、ヒトＴＴＲ遺伝子の第２のエクソンの開始から最後のヒトＴＴＲエクソン（エクソン４、ヒト３’ＵＴＲを含む）の末端までの概ね６．１ｋｂのオルソロガスなヒトＴＴＲ配列、およびｌｏｘＰ部位によって挟まれた自己欠失ネオマイシン選択カセット（ＳＤＣ  Ｎｅｏ）で置き換えるために、マウスＴｔｒ遺伝子の第２のエクソンの上流の３６ｋｂの配列およびマウスＴｔｒ停止コドンの下流の３４．５ｋｂの配列を含む５’相同アームを含む大きな標的化ベクターを生成した。図４を参照。ヒト化対立遺伝子を生成するために、マウスＴｔｒ遺伝子座を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成成分を、大きな標的化ベクターと一緒にＦ１Ｈ４マウス胚性幹細胞に導入した。マウスＴｔｒ対立遺伝子のヒト化を確認するために、図５Ｂおよび表３に示すプライマーおよびプローブを使用して、対立遺伝子喪失アッセイ、対立遺伝子獲得アッセイおよび保持アッセイを実行した。ＳＤＣ  Ｎｅｏカセットを有するバージョンおよびＳＤＣ  Ｎｅｏカセットの切除後のバージョンを、図４に示す。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を使用して、Ｆ０マウスを次に生成した。
【０３３４】
ヒトおよびマウスのトランスサイレチン前駆体タンパク質配列の比較を図１Ａに示し、ヒトおよびマウスのトランスサイレチンコード配列の比較を図１Ｂに示し、野生型マウスＴｔｒ遺伝子座および最終ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座（ＳＤＣ  Ｎｅｏカセットが欠失したヒト化ＴＴＲバージョン２）を示す概略図を、図２に示す。ＳＤＣ  Ｎｅｏカセットを有するおよびＳＤＣ  Ｎｅｏカセットのない予想されるヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座の配列を、配列番号１６および１７にそれぞれ示す。ＭＡＩＤ７６５５は、ネオマイシン選択カセットを有するヒト化ＴＴＲ遺伝子座（マウスシグナル配列を保持する）を指す。ＭＡＩＤ７６５６は、ネオマイシン選択カセットが除去されたヒト化ＴＴＲ遺伝子座（マウスシグナル配列を保持する）を指す。ヒト化マウスＴｔｒ遺伝子座によってコードされる、予想されるトランスサイレチン前駆体タンパク質（キメラマウス／ヒトＴＴＲタンパク質）を、配列番号２に示す。
【０３３５】
１〜３カ月齢のヒト化ＴＴＲマウスの異なるバージョンにおける血漿ヒトＴＴＲレベルを評価するために、ヒトＴＴＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；カタログ番号：ＯＫＩＡ０００８１；１：２０００の希釈）を次に使用した。マウスには、野生型対照マウス、ならびに野生型、ＭＡＩＤ７５７７、ＭＡＩＤ７６５５およびＭＡＩＤ７６５６対立遺伝子の様々な組合せを有するマウスが含まれた。ＭＡＩＤ７５７７は、ネオマイシン選択カセットが除去されたヒト化ＴＴＲ遺伝子座を指す。ＭＡＩＤ７６５５は、ネオマイシン選択カセットを有するヒト化ＴＴＲ遺伝子座（マウスシグナル配列を保持する）を指す。ＭＡＩＤ７６５６は、ネオマイシン選択カセットが除去されたヒト化ＴＴＲ遺伝子座（マウスシグナル配列を保持する）を指す。データを、図１６および表１０に要約する。図１６に示すように、ｈＴＴＲ７５７７／７５７７マウス（クローンＢ−Ｆ１０）は約５５μｇ／ｍＬの循環ｈＴＴＲを有したが、それは有意であるが、野生型マウス血清またはヒト血清における生理的レベルより低い。ヒトＴＴＲシグナル配列を有するヒト化ＴＴＲマウス（ｈＴＴＲ７５７７／７５７７）と比較したとき、マウスＴＴＲシグナル配列を有するヒト化ＴＴＲマウス（ｈＴＴＲ７６５５／７６５５、ｈＴＴＲ７６５５／７６５６およびｈＴＴＲ７６５６／７６５６）は、分泌されたＴＴＲレベルが増加していなかった。
【０３３６】
【表１０】
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【０３３７】
別の実験で、２〜３カ月齢のヒト化ＴＴＲマウスの異なるバージョンにおける血漿ヒトＴＴＲレベルを評価するために、ヒトＴＴＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；カタログ番号：ＯＫＩＡ０００８１；１：２０００の希釈）を次に使用した。マウスには、野生型対照マウス（Ｆ１Ｈ４と表示）、およびＭＡＩＤ７５７７またはＭＡＩＤ７６５６対立遺伝子についてホモ接合性であるマウスが含まれた。ＭＡＩＤ７５７７は、ネオマイシン選択カセットが除去されたヒト化ＴＴＲ遺伝子座を指す。ＭＡＩＤ７６５６は、ネオマイシン選択カセットが除去されたヒト化ＴＴＲ遺伝子座（マウスシグナル配列を保持する）を指す。データを、図１８および表１１に要約する。図１８に示すように、ｈＴＴＲ７５７７／７５７７マウス（ｈＴＴＲ  ｖ１）は約５５μｇ／ｍＬの循環ｈＴＴＲを有したが、それは有意であるが、野生型マウス血清またはヒト血清における生理的レベルより低い。ヒトＴＴＲシグナル配列を有するヒト化ＴＴＲマウス（ｈＴＴＲ７５７７／７５７７）と比較したとき、マウスＴＴＲシグナル配列を有するヒト化ＴＴＲマウス（ｈＴＴＲ７６５６／７６５６、ｈＴＴＲｖ２）は、分泌されたＴＴＲレベルが増加していた。
【０３３８】
【表１１】
2021500867.tif 000017
（項目１）
ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む、非ヒト動物。
（項目２）
Ｔｔｒコード配列と非コード配列の両方を含む前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座のある領域が欠失し、ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含む対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が内因性Ｔｔｒプロモーターを含み、前記ヒトＴＴＲ配列が前記内因性Ｔｔｒプロモーターに作動可能に連結されている、項目１または２に記載の非ヒト動物。
（項目４）
前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の少なくとも１つのイントロンおよび少なくとも１つのエクソンが欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の前記Ｔｔｒコード配列全体が欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目６）
Ｔｔｒ開始コドンからＴｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、項目５に記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座がヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目８）
内因性Ｔｔｒ  ５’非翻訳領域は欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目９）
前記Ｔｔｒ開始コドンから前記Ｔｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列およびヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含むヒトＴＴＲ配列で置き換えられており、
前記内因性Ｔｔｒ  ５’非翻訳領域は欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、
前記内因性Ｔｔｒプロモーターは欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、
前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目１０）
（ｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座の前記ヒトＴＴＲ配列が、配列番号１８に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか；または
（ｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号１に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むタンパク質をコードし；
（ｉｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号９０に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むコード配列を含むか；または、
（ｉｖ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号１４または１５に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、
項目９に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座がシグナルペプチドを含むトランスサイレチン前駆体タンパク質をコードし、前記シグナルペプチドをコードする前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、項目１から４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１２）
前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンが欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、項目１１に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンおよび第１のイントロンが欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、項目１２に記載の非ヒト動物。
（項目１４）
第２のＴｔｒエクソンの開始からＴｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、項目１１から１３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１５）
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座がヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含む、項目１１から１４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１６）
前記第２のＴｔｒエクソンから前記Ｔｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、前記対応するヒトＴＴＲ配列およびヒトＴＴＲ  ３’非翻訳領域を含むヒトＴＴＲ配列で置き換えられており、
前記内因性Ｔｔｒ  ５’非翻訳領域が欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、
前記内因性Ｔｔｒプロモーターが欠失しておらず、前記対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、
項目１１から１５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１７）
（ｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座の前記ヒトＴＴＲ配列が、配列番号１９に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか；または
（ｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号２に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むタンパク質をコードし；
（ｉｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号９１に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むコード配列を含むか；または
（ｉｖ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号１６または１７に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、
項目１６に記載の非ヒト動物。
（項目１８）
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が選択カセットもレポーター遺伝子も含まない、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目１９）
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座についてホモ接合性である、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目２０）
哺乳動物である、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目２１）
ラットまたはマウスである、項目２０に記載の非ヒト動物。
（項目２２）
マウスである、項目２１に記載の非ヒト動物。
（項目２３）
ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価する方法であって、
（ａ）項目１から２２のいずれか一項に記載の非ヒト動物に前記ヒトＴＴＲ標的化試薬を投与すること；および
（ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価すること
を含む方法。
（項目２４）
前記投与することが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達または流体力学的送達（ＨＤＤ）を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記投与することがＬＮＰ媒介性送達を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ＬＮＰの用量が約０．１ｍｇ／ｋｇから約２ｍｇ／ｋｇの間にある、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記投与することがＡＡＶ８媒介性送達を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２８）
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から肝臓を単離し、前記肝臓における前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価することを含む、項目２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
ステップ（ｂ）が、前記肝臓以外の臓器または組織における前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価することをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬がゲノム編集剤であり、前記評価することが前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座の改変を評価することを含む、項目２３から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記評価することが、前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記評価することが、前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座によってコードされるＴｔｒメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、項目２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記評価することが、前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座によってコードされるＴＴＲタンパク質の発現を測定することを含む、項目２３から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記ＴＴＲタンパク質の発現を評価することが、前記非ヒト動物における前記ＴＴＲタンパク質の血清レベルを測定することを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記活性が前記非ヒト動物の前記肝臓で評価される、項目３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬が、ヒトＴＴＲ遺伝子のある領域を標的にするように設計されたヌクレアーゼ剤を含む、項目２３から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質、および前記ヒトＴＴＲ遺伝子におけるガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬が外因性ドナー核酸をさらに含み、前記外因性ドナー核酸が前記ヒトＴＴＲ遺伝子と組み換わるように設計されている、項目３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記外因性ドナー核酸が一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を最適化する方法であって、
（Ｉ）ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む第１の非ヒト動物において、項目２３から４０のいずれか一項に記載の方法を１回目に実行すること、
（ＩＩ）ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含む前記ヒトＴＴＲ配列を含む前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む第２の非ヒト動物において、変数を変更し、ステップ（Ｉ）の方法を変更した前記変数で２回目に実行すること；および
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）の前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性をステップ（ＩＩ）の前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択すること
を含む方法。
（項目４２）
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、前記ヒトＴＴＲ標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記投与することがＬＮＰ媒介性送達を含み、ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数がＬＮＰ製剤である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、前記ヒトＴＴＲ標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の濃度または量である、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の形態である、項目４１に記載の方法。
（項目４７）
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ヒトＴＴＲ標的化試薬である、項目４１に記載の方法。
（項目４８）
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬が、Ｃａｓタンパク質、およびヒトＴＴＲ遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４９）
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数が、ガイドＲＮＡ配列または前記ガイドＲＮＡ標的配列である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記Ｃａｓタンパク質および前記ガイドＲＮＡの各々がＲＮＡの形態で投与され、ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数がＣａｓ  ｍＲＮＡのガイドＲＮＡに対する比である、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
ステップ（ＩＩ）の変更した前記変数がガイドＲＮＡの改変である、項目４８に記載の方法。
（項目５２）
項目１から２２のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に：
（ｉ）前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の標的配列を標的にするヌクレアーゼ剤；および
（ｉｉ）前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同アームおよび前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同アームによって挟まれた前記ヒトＴＴＲ配列を含む核酸挿入断片を含む標的化ベクター
を導入するステップであって、前記標的化ベクターは、前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座で組み換えて、前記ヒトＴＴＲ配列を含む前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む遺伝子改変非ヒトＥＳ細胞を生成する、ステップと；
（ｂ）前記遺伝子改変非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主の胚に導入するステップと；
（ｃ）代理母で前記非ヒト動物宿主の胚を懐胎させるステップであって、前記代理母が、前記ヒトＴＴＲ配列を含む前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含むＦ０後代の遺伝子改変非ヒト動物を生成するステップと
を含む方法。
（項目５３）
前記ヌクレアーゼ剤がＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記標的化ベクターは、長さが少なくとも１０ｋｂであるか、または前記５’および３’相同アームの長さの合計が少なくとも１０ｋｂである、大きな標的化ベクターである、項目５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記非ヒト動物がマウスまたはラットである、項目５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記非ヒト動物がマウスである、項目５６に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｄ】
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【図１１Ｅ−１１Ｈ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021500867.tif 000044
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