(57)【要約】ｃｒＲＮＡ誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼを使用して植物細胞のＤＮＡを標的化修飾するための方法、並びにそれを行うための組成物及びキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡをｃｒＲＮＡ誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼと接触させることを含む、植物細胞のＤＮＡを標的化修飾するための方法。
【請求項２】
ＭＡＤ７−ヌクレアーゼが２つの触媒的に活性なエンドヌクレアーゼドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＡＤ７−ヌクレアーゼが少なくとも１つの触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＭＡＤ７−ヌクレアーゼが機能性ドメイン、好ましくはデアミナーゼドメインに融合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＭＡＤ７−ヌクレアーゼが、前記ＭＡＤ７−ヌクレアーゼをコードする核酸構築物で細胞をトランスフェクトすることによって細胞に導入される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＭＡＤ７−ヌクレアーゼが、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼで細胞をトランスフェクトすることによって細胞に導入される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ｃｒＲＮＡが、前記ｃｒＲＮＡをコードする核酸構築物で細胞をトランスフェクトすることによって細胞に導入される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｃｒＲＮＡが、ｃｒＲＮＡで細胞をトランスフェクトすることによって細胞に導入され、好ましくはｃｒＲＮＡが化学的に修飾されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞がテンプレートオリゴヌクレオチドでさらにトランスフェクトされ、好ましくはテンプレートオリゴヌクレオチドが化学的に修飾されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞がドナー構築物でさらにトランスフェクトされ、好ましくはドナー構築物が化学的に修飾されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ、及び／又は任意選択でテンプレートオリゴヌクレオチド若しくはドナー構築物が、ポリエチレングリコール媒介性トランスフェクションを使用して、好ましくはＰＥＧを含む水性媒体を使用して、植物細胞に導入される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
標的化修飾を含む植物又はその子孫を再生するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
好ましくはＭＡＤ７−ヌクレアーゼがｃｒＲＮＡと複合体を形成している、植物細胞のＤＮＡを標的化修飾するための、請求項１〜１２のいずれか一項に定義したＭＡＤ７−エンドヌクレアーゼ、又はそれをコードする１つ若しくは複数の構築物。
【請求項１４】
ｉ）請求項１３に記載のＭＡＤ７−エンドヌクレアーゼを含む容器；及び
ｉｉ）請求項１３に記載の１つ又は複数の構築物を含む容器、
のうちの少なくとも１つ、並びに任意選択で、１つ若しくは複数のｃｒＲＮＡ及び／又はそれをコードする構築物を含む容器
を含む、植物細胞のＤＮＡを標的化修飾するためのキット。
【請求項１５】
植物細胞のＤＮＡを標的化修飾するための、請求項１３で定義したｃｒＲＮＡ誘導型ＭＡＤ７−エンドヌクレアーゼ、又はそれをコードする１つ若しくは複数の構築物、又は請求項１４で定義したキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び植物生物学の分野におけるものである。本発明は、標的化ＤＮＡ修飾に関し、そのような修飾を生成するための方法及び組成物を含む。
【背景技術】
【０００２】
生細胞の遺伝物質に故意に変化を生成させるプロセスは、その細胞、又はその細胞が一部を形成するか若しくはその細胞から再生され得る生物体の１つ又は複数の遺伝的にコードされた生物学的特性を修飾するという目的を有する。これらの変化は、例えば、遺伝物質の一部の欠失、外因性遺伝物質の付加、又は遺伝物質の既存のヌクレオチド配列の変化の形態をとる。真核生物の遺伝物質を改変する方法は２０年以上にわたり公知であり、農業、人間の健康、食品の品質及び環境の保護の分野における改善のために、植物、ヒト及び動物の細胞、並びに微生物において広く適用されることがわかっている。最も一般的な方法は、外因性ＤＮＡ断片を細胞のゲノムに加えることからなり、これが、既存の遺伝子の発現がそれにより抑制される適用を含め、既存の遺伝子によりコードされている特性に加えて、その細胞又はその生物体に新しい特性が付与される。多くのこのような例は望ましい特性を得るのに効果的であるが、これらの方法はいくつかの欠点を有する。例えば、これらの従来の方法はそれほど正確ではなく、その理由としては、外因性ＤＮＡ断片が挿入されるゲノム位置について（したがって、最終的な発現レベルにて）常にコントロールできるものでなく、また望ましい効果が、元の十分にバランスがとれたゲノムによってコードされている自然の特性を超えて出現しなければならないからである。対照的に、所定のゲノム遺伝子座におけるヌクレオチドの付加、欠失又は変換をもたらすゲノム編集の方法は、既存の遺伝子の正確な修飾を可能にする。
【０００３】
部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ、ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼを使用することによって、標的化ＤＮＡ改変の分野が急速に発展している。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート）は、複数の短い直接配列リピートを含む遺伝子座であり、配列決定された細菌の４０％及び配列決定された古細菌の９０％で確認されている。ＣＲＩＳＰＲリピートは、遺伝的病原体、例えばバクテリオファージ及びプラスミドに対して獲得された細菌免疫のシステムを形成する。細菌が病原体により攻撃された場合、病原体のゲノムの小さな断片がＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）によってプロセシングされ、ＣＲＩＳＰＲリピート間の細菌ゲノムに組み込まれる。次いで、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は転写され、プロセシングされて、病原体ゲノムと同一の約３０ｂｐの配列を含む、いわゆるｃｒＲＮＡを形成する。これらのＲＮＡ分子は、その後、感染の際に病原体を認識するベースを形成し、病原体ゲノムの直接消化を介して病原体の遺伝要素のサイレンシングをもたらす。Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの必須成分であり、ｃｒＲＮＡと、ｃｒＲＮＡにより規定されるゲノムの位置にＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することによって、分解のため侵入病原性ＤＮＡを標的とするトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる第２のＲＮＡと組み合わされた場合にエンドヌクレアーゼを形成する。このＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、二本鎖切断の標的化導入及びその後の内因性修復メカニズムの活性化によって、目的の部位の真核生物ゲノムに修飾を導入することができる、生化学における便利で有効なツールであることが証明されている。Ｊｉｎｅｋら（２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６〜８２０）は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの必須配列を単一ＲＮＡ分子に結合させることにより生成される単鎖キメラＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）が、Ｃａｓ９との組合せで機能性エンドヌクレアーゼを形成できることを証明した。多くの様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが異なる細菌種から同定されている（Ｚｅｔｓｃｈｅら  ２０１５  Ｃｅｌｌ  １６３，  ７５９〜７７１；Ｋｉｍら  ２０１７，  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８，  １〜７；Ｒａｎら  ２０１５．  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，  １８６〜１９１）。
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、幅広い様々な生物体及び細胞タイプにおけるゲノム編集に使用することができる。最初に、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＳＢを誘導するゲノム配列が同定され、次いでこれがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在についてスクリーニングされる。ＰＡＭ配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性にとって不可欠であり、比較的短く、したがって、通常、ある程度の長さの任意の所定の配列に複数回存在する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質のＰＡＭモチーフはＮＧＧであり、これにより確実に、任意の所定のゲノム配列について複数のＰＡＭモチーフが存在し、多くの異なるガイドＲＮＡが設計され得る。さらに、同一の二本鎖配列の反対鎖を標的とするガイドＲＮＡも設計され得る。ＰＡＭに直接隣接する配列がガイドＲＮＡに組み込まれる。これは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに応じて長さが異なり得る。例えば、Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡのターゲティング配列の最適な長さは２０ｎｔであり、ほとんどの場合、この長さの配列は植物ゲノム内で固有である。植物細胞における発現については、ガイドＲＮＡをコードする遺伝子をＲＮＡポリメラーゼ−ＩＩＩプロモーターに、例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＵ６プロモーター、又は実験が実施される細胞タイプ、生物体、植物の種若しくはファミリー由来の対応する若しくは機能的に類似したｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターに連結させることができる。
【０００６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、実験が実施される生物体又は細胞タイプに適した構成的プロモーター又は誘導性プロモーターの任意の形態から細胞において発現され得る。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのタンパク質発現レベルは、特定の細胞タイプ又は生物体に対するそのコドン使用頻度の最適化により改善することができる。
【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの２つの構成要素であるエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（複数可）は、異所性ゲノム要素、例えば、（非複製）プラスミド構築物、ウイルスベクターから細胞において発現され得るか、又は細胞若しくは生物体においてタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）及びＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）として直接導入され得る。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが使用可能である。プラスミド又はウイルスベクターが形質転換細胞において複製できない場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びガイドＲＮＡ（複数可）は短時間発現又は存在した後、細胞から除去される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの安定的発現はトランスジェニック手法を使用して達成することができ、それにより、それらをコードする遺伝子が宿主ゲノムに組み込まれる。
【０００８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが細胞内において存在／発現した場合、２つの構成要素の複合体が、ガイドＲＮＡ及び隣接するＰＡＭ配列のターゲティング配列に相補的な配列についてゲノムＤＮＡをスキャンする。使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに応じて、複合体はその後、ＰＡＭから様々な距離で両方のＤＮＡ鎖においてニックを誘発する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列の３ｂｐ上流の両ＤＮＡ鎖にニックを導入し、平滑ＤＮＡ  ＤＳＢを生成する。
【０００９】
ＤＮＡ  ＤＳＢが生成されると、細胞のＤＮＡ修復機構、特に非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）経路に属するタンパク質がＤＮＡ末端の再連結に関与する。このＤＳＢが正確に修復されたならば、その後、配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ガイドＲＮＡ複合体による切断の標的を形成する。しかし、一部の再連結事象は不正確であり、切断時に数個のヌクレオチドがランダム欠失したり又は付加されたりする可能性があり、その結果、ゲノムＤＮＡにインデル変異が生じる。これが、ガイドＲＮＡの結合を阻止し、したがって任意のさらなるＤＳＢ誘導を阻止する標的配列の改変をもたらす。
【００１０】
最近、ＤＳＢのプログラムされた導入が可能な第２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、すなわち、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１（またＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａとしても知られている）が特徴付けられた。Ｃｐｆ１とＣａｓ９の間の主たる違いは、Ｃｐｆ１はｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方ではなくｃｒＲＮＡのみを必要とし、Ｃｐｆ１の最適なスペーサーは少なくとも２１ヌクレオチドであり、Ｃｐｆ１はＣａｓ９のＧリッチＰＡＭではなくＴリッチＰＡＭを認識することである。さらに、ＰＡＭはガイド配列の上流に配置されており、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９により生成されるＰＡＭに近位の平滑末端ＤＳＢではなく、ＰＡＭの遠位の互い違いのＤＳＢ（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ＤＳＢ）を生成する。参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８／１１５３９０号では、植物細胞プロトプラストにおける効果的なゲノム編集が明示されている。
【００１１】
本発明者らは、このたび、植物細胞で驚くほどに効果的であるＶ型ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼシステムを見出した。今までに、ＭＡＤ７と呼ばれるこのシステムは、原核生物の宿主細胞で有効であることのみ報告されている（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９８２，２７９号を参照されたい）。
【発明の概要】
【００１２】
定義
本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関する各種用語は、本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって使用される。そのような用語には、特段の明示のない限り、本発明が関係する技術分野における通常の意味が付与されるものとする。他の詳細に定義された用語は、本明細書で提供された定義と一致する方法で解釈されるものとする。本明細書に記載のものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を本発明の試験の実施において使用することができ、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。
【００１３】
本発明に記載されているものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施に使用できることは、当業者には明らかである。
【００１４】
本発明の方法において使用される従来の技術を実施する方法は、当業者には明らかである。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、配列決定及び関連する分野における従来の技術の実施は、当業者には周知であり、例えば、以下の文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７及び定期的更新；並びにｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏで論じられている。
【００１５】
「Ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」：これらの単数形の用語は、文脈で特に明示されていない限り、複数の指示物を含む。したがって、不定冠詞の「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。したがって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ以上の細胞の組合せなどを含む。
【００１６】
「約」及び「およそ」：これらの用語は、測定可能な値、例えば、量、一時的な期間などに言及する場合、そのような変動は開示した方法を実施するのに適切であるので、指定値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％の変動を含むことを意味する。さらに、量、比率、及び他の数値が本明細書において範囲形式で示されている場合がある。そのような範囲形式は、便宜的かつ簡潔にするために使用されており、範囲の制限として明示的に示した数値を含むように柔軟に理解されるべきであるが、あたかも各数値及び部分的範囲が明示的に示されているように、その範囲内に含まれるすべての個々の数値又は部分的範囲もまた含むように理解されたい。例えば、約１〜約２００の範囲の比は、約１〜約２００の明示的に記載された範囲を含むが、約２、約３、及び約４などの個々の比、並びに約１０〜約５０、約２０〜約１００などの部分的範囲も含むものと理解されたい。
【００１７】
「及び／又は」：用語の「及び／又は」とは、１つ又は複数の記載した事例が単独で、又は記載した事例の少なくとも１つと組み合わせて、記載したすべての事例に至るまで起こり得る状況を意味する。
【００１８】
「含む」：この用語は、包括的で制限はなく、排他的ではないと解釈される。詳しくは、この用語及びその変化形は、指定した特徴、ステップ、又は構成要素が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ、又は構成要素の存在を排除するものと解釈されるべきではない。
【００１９】
「例示的」：この用語は「例、事例、又は実例として有用である」ことを意味し、本明細書で開示されている他の構成を排除するものと解釈されるべきではない。
【００２０】
「植物」とは、植物全体又は植物の一部、例えば、植物から得ることができる細胞、組織培養物又は器官（例えば、花粉、種子、胚珠、配偶子、根、葉、花、花芽、枝、葯、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根端、粒、胚など）、並びにこれらのいずれかの誘導物、及び自家受粉又は交配によりそのような植物に由来する後代を意味する。植物の非限定的な例としては、作物及び栽培植物、例えば、大麦、キャベツ、キャノーラ、キャッサバ、カリフラワー、チコリ、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、アブラナ、ジャガイモ、カボチャ、コメ、ライムギ、モロコシ、カボチャ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ピーマン、トマト、スイカ、小麦、及びズッキーニなどが挙げられる。
【００２１】
「植物細胞（複数可）」は、分離の、又は組織、器官若しくは生物内のプロトプラスト、配偶子、懸濁培養物、小胞子、花粉粒などを含む。植物細胞は、多細胞構造の一部、例えば、カルス、分裂組織植物器官又は外植片などであり得る。
【００２２】
用語の「構築物」、「核酸構築物」、「ベクター」、及び「発現ベクター」とは、本明細書では互換的に使用され、本明細書では、組換えＤＮＡ技術の使用によって得られる人工的核酸分子として定義される。これらの構築物及びベクターは、したがって、天然に存在する核酸分子を含まないが、核酸構築物は天然に存在する核酸分子（の一部）を含むことができる。
【００２３】
ベクター骨格は、例えば、バイナリーベクター若しくはスーパーバイナリーベクター（例えば、米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許出願公開第２００２１３８８７９号及び国際公開第９５／０６７２２号を参照されたい）、当技術分野において公知であるような、また本明細書の他の箇所に記載されているような、共組み込みベクター又はＴ−ＤＮＡベクターであってもよく、これにキメラ遺伝子が組み込まれるか、又は適切な転写調節配列が既に存在している場合には、所望のヌクレオチド配列（例えば、コード配列、アンチセンス配列又は逆方向反復配列）のみが転写調節配列の下流に組み込まれる。ベクターは、分子クローニングにおける使用を容易にするために、遺伝要素、例えば、選択可能なマーカー、複数のクローニング部位などをさらに含むことができる。
【００２４】
用語の「遺伝子」とは、細胞においてＲＮＡ分子（例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。転写領域は、本明細書で定義した遺伝子の一部を形成する、適切な調節領域（例えばプロモーター）に作動可能に連結され得る。遺伝子は、５’リーダー配列、コード領域、及びポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）など、いくつかの作動可能に連結された断片を含むことができる。
【００２５】
「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域がＲＮＡに転写され、ＲＮＡが生物学的に活性なタンパク質又はペプチドをコードする場合、続いて生物学的に活性なタンパク質又はペプチドに翻訳されるプロセスを意味する。
【００２６】
用語の「作動可能に連結された」とは、機能的な関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を意味する。核酸は、別のヌクレオチド配列と機能的な関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター、又はむしろ転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼすのであれば、コード配列に作動可能に連結されている。動作可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接していることを意味し得る。
【００２７】
「プロモーター」とは、１つ又は複数の核酸の転写を制御するように機能する核酸断片を意味する。プロモーター断片は、遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流（５’）に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位である転写開始部位（複数可）の存在により構造的に同定され、また、限定するものではないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位を含む他の任意のＤＮＡ配列、並びに直接的又は間接的に作用してプロモーターからの転写量を調節することが当業者に公知である任意の他のヌクレオチド配列をさらに含むことができる。
【００２８】
任意選択で、用語の「プロモーター」はまた、５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）を含んでいてもよい（例えば、プロモーターは、本明細書では、転写領域の翻訳開始コドンの上流の１つ又は複数の部分を含んでいてもよく、その理由は、この領域が転写及び／又は翻訳の調節において役割を果たし得るからである）。「構成的」プロモーターは、大半の生理学的及び発生学的条件下で、大部分の組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理学的に（例えば、ある特定の化合物の外部適用により）又は発生的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの組織又は細胞においてのみ活性がある。
【００２９】
用語の「タンパク質」又は「ポリペプチド」は互換的に使用され、特定の作用機序、サイズ、三次元構造又は起源に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を意味する。したがって、タンパク質の「断片」又は「一部」は、依然として「タンパク質」と呼ばれ得る。本明細書で定義され、本明細書で定義した任意の方法において使用されるようなタンパク質は、単離されたタンパク質であり得る。「単離されたタンパク質」は、もはやその自然環境に存在しない、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、又は組換え細菌若しくは植物宿主細胞におけるタンパク質を意味するように使用される。
【００３０】
用語の「再生」とは、本明細書では、単一の植物細胞、カルス、外植片、組織又は器官からの新しい組織及び／又は新しい器官の形成として定義される。好ましくは、再生は、シュート再生、異所性頂端分裂組織形成、及び根再生のうちの少なくとも１つである。再生は、体細胞胚形成又は器官形成によって発生し得る。再生は、単一の植物細胞からの、又は、例えばカルス、外植片、組織若しくは器官からの、新しい植物の形成をさらに含んでいてもよい。再生のための植物細胞は、未分化の植物細胞であり得る。したがって、再生プロセスは、親組織から直接的に、又は、例えばカルスの形成を介して間接的に発生し得る。
【００３１】
「再生を可能にする条件」とは、本明細書では、植物細胞又は組織が再生することができる環境として理解される。このような条件としては、少なくとも、適切な温度、栄養、昼／夜リズム、及び灌漑が挙げられる。
【００３２】
用語の「デアミナーゼ」とは、脱アミノ化反応を触媒する酵素を意味する。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、シトシンのウラシルへの加水分解性脱アミノ化を触媒する、シトシンデアミナーゼである。またデアミナーゼは、アデニンの脱アミノ化を触媒することにより、それをイノシンに変換する、アデニンデアミナーゼであってもよい。
【００３３】
「配列」又は「ヌクレオチド配列」：これは、核酸の又は核酸内のヌクレオチドの順序を意味する。言い換えると、核酸のヌクレオチドの任意の順序は、配列又はヌクレオチド配列と呼ばれ得る。
【００３４】
用語の「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書では互換的に使用される。配列同一性は、本明細書では、配列を比較することにより決定した場合に、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）配列間、又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。当技術分野では、「同一性」はまた、そのような配列のストリング間の一致により決定される事例のように、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の配列関係性の程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。
【００３５】
用語の「相補性」とは、本明細書では、完全に相補的な鎖（本明細書で以下に定義したもの、例えば、第２の鎖）に対する配列の配列同一性として定義される。例えば、１００％相補的（又は完全に相補的）である配列は、本明細書では、相補鎖と１００％の配列同一性を有するものと理解され、例えば、８０％相補的である配列は、本明細書では、（完全に）相補的な鎖に対して８０％の配列同一性を有するものと理解される。
【００３６】
「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に算出することができる。「配列同一性」及び「配列類似性」は、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用し、２つの配列の長さに応じて、２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。同様の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたり最適に整列するグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して整列されるが、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して整列される。配列は、（例えば、デフォルトパラメータを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合に）、（下記で定義した）配列同一性の少なくとも特定のパーセンテージを共有する場合、「実質的に同一の」又は「本質的に類似の」と呼ばれ得る。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をその全長（完全長）にわたり整列し、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。グローバルアライメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合に配列の同一性を決定するのに適切に使用される。一般的には、ＧＡＰデフォルトパラメータは、ギャップ作成ペナルティ（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）とともに使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ  ８９、９１５〜９１９）。配列アラインメント及び配列同一性パーセンテージのスコアは、コンピュータープログラム、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，  ９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３を使用し、又はオープンソースソフトウェア、例えば、上記のＧＡＰと同じパラメータを使用するか、若しくはデフォルト設定を使用するＥｍｂｏｓｓＷＩＮ  バージョン２．１０．０のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）を使用して決定することができる（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方、並びにタンパク質アラインメント及びＤＮＡアライメントの両方において、デフォルトギャップ作成ペナルティは１０．０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは０．５である；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてはＢｌｏｓｕｍ６２であり、ＤＮＡについてはＤＮＡＦｕｌｌである）。配列が実質的に異なる全長を有する場合は、ローカルアラインメント、例えばＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴ���ズムを使用するものが好ましい。
【００３７】
或いは、類似性又は同一性のパーセンテージは、アルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどを使用して、公共データベースに対して検索することにより決定することができる。したがって、本発明の核酸配列及びタンパク質配列は、「クエリ配列」としてさらに使用することができ、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公共データベースに対して検索を実施することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３〜１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施し、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップを加えたアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：  ３３８９〜３４０２に記載のように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴのプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）を使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページを参照されたい。
【００３８】
遺伝子の「ホモログ」は、共通の先祖ＤＮＡ配列からの系統によるさらなる遺伝子である。用語のホモログとは、種分化の事象（オルソログ）によって分離される遺伝子間の関係、又は遺伝子重複の事象（パラログ）によって分離される遺伝子間の関係に適用され得る。遺伝子の「オルソログ」は、種分化により共通の先祖遺伝子から進化した異なる種の遺伝子であり、本明細書では、進化の間、同じ機能を保持していたと理解される。
【００３９】
「標的配列」は、標的とされる核酸内のヌクレオチドの順序を示すものであり、例えば、改変は導入されるか、又は検出される。例えば、標的配列は、ＤＮＡ二重鎖の第１の鎖に含まれるヌクレオチドの順序である。
【００４０】
「エンドヌクレアーゼ」は、その認識部位に結合した際に、二重鎖ＤＮＡの少なくとも１つの鎖を加水分解する酵素である。エンドヌクレアーゼは、本明細書では、部位特異的エンドヌクレアーゼと理解されたく、用語の「エンドヌクレアーゼ」及び「ヌクレアーゼ」は、本明細書では互換的に使用される。制限エンドヌクレアーゼは、本明細書では、二重鎖の両鎖を同時に加水分解し、ＤＮＡに二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼとして理解されたい。「ニッキング」エンドヌクレアーゼは、二重鎖の１つの鎖のみを加水分解し、切断されるというよりはむしろ「切れ目が入れられた」ＤＮＡ分子を生成するエンドヌクレアーゼである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＭＡＤ７とＡｓＣｐｆ１の比較。標的領域でインデルを示す読み取りのパーセンテージをｙ軸に示す。各サンプルにおいて、ＡｓＣｐｆ１（Ｃｐｆ１）又はＭＡＤ７酵素のいずれかは、表１に挙げたそれぞれの標的部位を標的とするための適切なｃｒＲＮＡと一緒に発現された。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明者らは、部位特異的な方法で、すなわち、ＭＡＤ７又はＭＡＤ７−ヌクレアーゼとして知られている、新しいＶ型ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼを植物細胞において初めて使用することによって、植物細胞のＤＮＡを効果的に修飾するための新規な方法を発見した。驚いたことに、植物細胞においては、ｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ対応物、すなわち、アシドミノコックス属種（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）と比較して、合計４つの異なる植物遺伝子内の７つの独立した植物標的部位のうち６つで、より効果的であり、また残りの標的部位で同様に有効であるようであった。今まで、Ｃｐｆ１は、植物において最も、又は極めて最も効果的なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの１つと見なされてきた。それ故、本発明者らは、植物細胞のＤＮＡ修飾のためのより効果的な新しいＶ型ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼを発見した。
【００４３】
したがって、ＤＮＡをｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼと接触させることを含む、植物細胞のＤＮＡを標的化修飾するための方法が提供される。ＤＮＡは、細胞に対して内因性又は外因性の任意のタイプのＤＮＡであってよく、例えば、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、人工染色体、プラスミドＤＮＡ、又はエピソームＤＮＡであってよい。ＤＮＡは、核又はオルガネラＤＮＡであり得る。好ましくは、ＤＮＡは染色体ＤＮＡであり、好ましくは細胞にとって内因性である。本発明の方法は、好ましくは目的の遺伝子内にあり、好ましくは植物の内因性染色体ＤＮＡの遺伝子内にあり、標的配列としてもまた本明細書で示されている目的の部位での改変されたＤＮＡをもたらす。言い換えると、本発明の方法は、好ましくは、エピジェネティックな修飾及び／又は遺伝子修飾を意味し得るゲノム修飾をもたらす。用語の「改変」及び「修飾」とは、本明細書では互換的に使用される。エピジェネティックな修飾は、ヌクレオチド配列を変化させずに、遺伝子の機能又は活性を変化させる遺伝的修飾である。一実施形態では、修飾は遺伝子修飾である。遺伝子修飾は、本明細書では、ＤＮＡのヌクレオチド配列の改変、例えば、１つ又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入、置換又は変換として理解される。
【００４４】
好ましくは、本明細書に詳述されるようなＤＮＡを標的化修飾するための方法であって、ＤＮＡをｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼと接触させるステップを含む方法は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼがｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼの代わりに使用されるということを除き、同一の方法又はほぼ同一の方法と比較して少なくとも同様に効率的である。好ましくは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。したがって、好ましくは、植物ゲノムにおいて１つ又は複数のインデル変異を生成する効率は、ＭＡＤ７とＣｐｆ１との間に相当する。ＭＡＤ７は、植物ゲノムでインデルを生成する場合にＣｐｆ１よりも効率的であり得、好ましくは、ＭＡＤ７ヌクレアーゼは、好ましくはＭＡＤ７及びＣｐｆ１が植物ゲノムの同じ配列を標的とする場合、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼよりも、少なくとも１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０倍効率的である。
【００４５】
植物ゲノムでインデル変異を生成する効率は、標的領域でインデルを示す読み取りのパーセンテージとして表され得る。
【００４６】
本発明の方法は、ヌクレオチド改変をスクリーニング又は試験するために、当技術分野で公知の任意の従来の方法を使用する増殖及び／又は遺伝子型同定のステップをさらに含むことができる。本発明の方法は、したがって、ＤＮＡをｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７ヌクレアーゼと接触させた後のそのようなステップを含む。好ましい実施形態では、本明細書で定義した標的化修飾を含む細胞、好ましくは、植物細胞は、ディープ配列決定技術、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ又は４５４配列決定などを使用して遺伝子型が同定され得る。好ましくは、本発明の方法を使用する場合、配列読み取りの総数の少なくとも０．５％、０．８％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％又はそれ以上が標的領域にインデルを有する。
【００４７】
標的化ＤＮＡ修飾は、植物ゲノムのコード配列内にあることにより、修飾タンパク質、例えば、１つ若しくは複数のアミノ酸改変を含むタンパク質、又はトランケーションを含むタンパク質が生じ得る。標的化ＤＮＡ修飾は、植物ゲノムの非コード配列内、例えば、イントロン配列又は非コード（ｎｃ）ＲＮＡをコードする配列内にあり得る。非コード配列の標的化修飾は、例えば、修飾されたスプライス部位又は非コードＲＮＡの調節機能の改変をもたらし得る。標的化ヌクレオチドの改変はまた、遺伝子発現のダウンレギュレーション又はアップレギュレーションをもたらし、任意選択で遺伝子発現をノックアウトする調節配列内にあってもよい。本発明の方法は、タンパク質修飾及び／又はタンパク質発現のレベルについてスクリーニング又は試験するステップを含み得る。そのようなスクリーニング又は試験は、タンパク質自体に対して直接的に、又は任意の従来の手段を使用して改変された機能性に対して行われ得る。さらに、又は或いは、ＤＮＡ修飾は、植物細胞又は植物の表現型の改変をもたらし得る。したがって、本方法は、植物細胞又は植物における表現型の改変又は特徴についてスクリーニング又は試験するステップ、好ましくは、本明細書で定義した表現型の特徴についてスクリーニング又は試験するステップを含み得  
【００４８】
好ましくは、本発明の方法は、目的の遺伝子の遺伝子修飾をもたらす。
【００４９】
目的の遺伝子
好ましくは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、特徴、好ましくは表現型の特徴を付与又は改変する遺伝子である。植物ＧＯＩは、したがって、好ましくは、植物の特徴、好ましくは表現型の植物の特徴を付与又は改変する。用語の「植物の特徴」とは、植物、植物細胞又は植物組織の任意の特徴を意味する。好ましくは、植物の特徴は、植物の発達、植物の成長、収量、バイオマス生産、植物の構造、植物生化学、植物生理学、代謝、生存能力、及びストレス耐性からなる群から選択される。或いは、又はさらに、植物の特徴は、ＤＮＡ合成、ＤＮＡ修飾、核内倍加、細胞期、細胞壁生合成、転写調節、シグナル伝達、貯蔵脂質動員、及び光合成からなる群から選択される。
【００５０】
本明細書で使用される用語の「植物の特徴を改変する」とは、植物の特徴、例えば時間又は場所における増加、減少又は変化などの任意の変化を包含する。本明細書では、植物ＧＯＩは、ＧＯＩの発現を導入、増加、減少若しくは除去することによって、及び／又は、例えばコード配列を改変することによりコードタンパク質の機能性を修飾し、それにより修飾されたコードタンパク質の発現をもたらすことによって、植物の特徴を改変することができると理解される。植物の特徴が、ＧＯＩの発現の導入、ＧＯＩの発現の増加、ＧＯＩの発現の減少、ＧＯＩの発現の除去、及び／又はコードタンパク質の機能性の修飾により改変されたかどうかは、ＧＯＩのタイプ及び／又は植物の特徴のタイプに依存する。
【００５１】
一実施形態では、標的化修飾は、植物の特徴を改変する遺伝子修飾である。そのような修飾は、早期停止であり得る。そのような修飾はまた、翻訳されたタンパク質のアミノ酸変化をもたらす単一ヌクレオチド修飾（ＳＮＰ）であってもよく、これは単一アミノ酸変化をもたらし得る。
本明細書で以下に詳述するのは、本明細書に記載された本発明の方法によって修飾することができる植物の特徴の非限定的な例である：
「成長」とは、バイオマスを拡大及び増加させる植物又は植物部分の能力を意味する。改変された成長とは、中でも、改変された成長速度、周期の時間、サイズ、植物の増殖又は増加を意味する。さらに及び／又は或いは、成長の特徴は、限定するものではないが、細胞周期（入口、進行、出口）、細胞分裂、細胞壁生合成及び／又はＤＮＡ合成、ＤＮＡ修飾及び／又は核内倍加を含む、細胞プロセスを意味し得る。
【００５２】
「収量」とは、植物の収穫可能な部分を意味する。「バイオマス」とは、植物の任意の部分を意味する。またこれらの用語は、それぞれ対応する野生型の植物と比較した、種子のバイオマス（種子重量）の増加並びに／又は（入っている）種子の数及び／若しくは種子のサイズ及び／若しくは種子のサイズの増加並びに／又は種子の体積の増加を含む、種子収量の増加を包含する。種子のサイズ及び／又は体積の増加もまた、種子の組成に影響を及ぼし得る。種子収量の増加は、花の数及び／又はサイズの増加による可能性がある。収量の増加はまた、バイオマス全体の収穫可能な部分、例えば種子などの収量に対する比率として表される、収穫指数を増加させ得る。
【００５３】
「植物の発達」とは、植物細胞の発達運命、特に前駆細胞が発達する特定の組織又は器官のタイプの決定に関わる植物の任意の細胞プロセスを意味する。本発明による典型的な植物の特徴は、したがって、植物の発達、例えば、形態形成、光形態形成、シュートの発達、根の発達、栄養の発達、生殖の発達、茎の伸長、開花、細胞運命の決定に関与する調節メカニズム、パターン形成、分化、老化、開花期及び／又は開花までの時間などに関連する細胞プロセスに関する特徴である。
【００５４】
本明細書で使用される「植物構造」は、任意の１つ若しくは複数の構造的特徴又はそれらの構造的特徴の組合せを含む、植物の外観を意味する。そのような構造的特徴には、中でも、根、茎、葉、シュート、葉柄、毛状突起、花、花弁、柱頭、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、種子、胚、胚乳、種皮、アリューロン、繊維、果実、形成層、木部、心材、柔組織、気孔、篩要素、師部又は維管束組織を含む、植物の任意の細胞、組織若しくは器官、又は植物の細胞、組織若しくは器官の群の形状、サイズ、数、位置、色、テクスチャー、配置、及びパターン化が含まれる。
【００５５】
用語の「ストレス耐性」とは、生物的又は非生物的であり得る、ストレス条件、例えば環境ストレスにおいて、より良好な生存及び／又はより良好な性能の能力として理解される。塩分、干ばつ、熱、冷却、及び凍結は、すべて、浸透圧ストレスを誘導する状態の例として説明されている。本発明で使用される用語の「環境ストレス」とは、無生物又は非生物学的な環境的ストレス要因によって生じる、細胞、組織、種子、器官又は植物全体の代謝、成長又は生存能力に対する任意の悪影響を意味する。より詳しくは、環境要因、例えば、水ストレス（洪水、水検層、干ばつ、脱水）、嫌気性ストレス（低レベル酸素、ＣＯ２など）、好気性ストレス、浸透圧ストレス、塩ストレス、温度ストレス（高温／熱、冷却、凍結、霜）又は栄養素欠乏、汚染物質ストレス（重金属、有毒化学物質）、オゾン、高輝度、病原体（ウイルス、細菌、真菌、昆虫及び線虫を含む）、並びにこれらの組合せを包含することができる。生物的ストレスは、植物に対する生物体の影響の結果としてのストレスである。例としては、病原体（ウイルス、細菌、線虫、昆虫など）によって引き起こされるストレスである。別の例は、植物にとって必ずしも有害ではない生物体によって引き起こされるストレスであり、例えば、共生又は着生植物によって引き起こされるストレスである。したがって、ＧＯＩの修飾によって得られる特定の植物の特徴は、初期の強勢、生存率、ストレス耐性を包含し得る。
【００５６】
「植物生理学」に関連する特徴は、発達プロセス、例えば、中でも、成長、増殖及び分化、性的発達、有性生殖、種子セット、種子発達、登熟、無性生殖、細胞分裂、休眠、発芽、明順応、光合成、葉拡大、繊維生産、二次成長又は木材生産を含む植物の機能的プロセスの特徴を包含することができ；外部的に加えられた因子、例えば金属、化学物質、ホルモン、成長因子、環境因子及び環境ストレス因子（例えば、中でも、無酸素、低酸素、高温、低温、脱水、光、日長、洪水、塩、重金属など）への植物の反応を、前記の外部的に加えられた因子への植物の適応反応を含めて、包含することができる。本発明の方法で同定されたＧＯＩにより改変される特定の植物生理学的な特徴は、改変された貯蔵脂質動員、光合成、転写調節及びシグナル伝達をさらに包含することができる。
【００５７】
「植物生化学」に関連する植物の特徴は、好ましくは、代謝の特徴を意味するように当業者によって理解されるものである。「代謝」は、生化学と互換的に使用され得る。代謝及び／又は生化学は、一次代謝及び二次代謝を含む植物の触媒又は同化又は他の代謝プロセス、並びに、植物によって生成される、任意の要素、小分子、高分子又は化学化合物を含むそれらの生成物、例えば限定するものではないが、デンプン、糖、タンパク質、ペプチド、酵素、ホルモン、成長因子、核酸分子、セルロース、ヘミセルロース、カロース、レクチン、繊維、アントシアニンなどの色素、ビタミン、ミネラル、微量栄養素、又は多量栄養素を包含する。
【００５８】
ＧＯＩの修飾は、改変された植物の特徴を決定することによって、好ましくは、本明細書で上記に定義した少なくとも１つ又は複数の改変された植物の特徴を決定することによって同定され得る。一実施形態では、好ましく改変された植物の特徴を有する植物細胞が選択され、改変された植物の特徴を有していない植物細胞から単離される。植物細胞は、改変された植物の特徴を有する植物を選択する前に、まず、植物に生成することができる。
【００５９】
改変された植物の特徴を有する植物細胞又は植物を配列決定し、目的の遺伝子を同定及び／又はさらに分析することができる。当業者は、植物ゲノム全体を配列決定することができること、又は植物ゲノムの一部を配列決定できることを理解する。一実施形態では、少なくとも改変された配列が決定される。
【００６０】
好ましくは、ＧＯＩの修飾が改変された植物の特徴をもたらす場合、その修飾は目的の遺伝子を同定する。したがって、本発明の方法は、遺伝子の機能性をスクリーニングするために使用され得る。
【００６１】
ｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ
ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ又はｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ複合体のタンパク質は、ユウバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ）から得ることができるＭＡＤ７−ヌクレアーゼ、又はその任意のホモログ若しくはオルソログであり得る。好ましくは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、配列番号１と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、配列番号２と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質である。好ましくは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、配列番号７４と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質である。
【００６２】
ｃｒＲＮＡは、ＭＡＤ７−エンドヌクレアーゼと複合体を形成することが可能であり、標的配列とハイブリダイズすることにより、ヌクレアーゼを標的配列に向けることができる。ガイド核酸と複合体を形成することが可能な対象のヌクレアーゼは、ガイド核酸と適合性のあるヌクレアーゼと呼ぶことができる。同様に、ヌクレアーゼと複合体を形成することが可能なガイド核酸は、ヌクレアーゼと適合性のあるガイド核酸と呼ぶことができる。好ましくは、ｃｒＲＮＡはＲＮＡであるが、ＤＮＡを含んでいてもよい。ＭＡＤ７−エンドヌクレアーゼは、したがって、ｃｒＲＮＡと複合体を形成し、ｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼをもたらし得る。
【００６３】
ｃｒＲＮＡは、非修飾ヌクレオチド又は天然に存在するヌクレオチドを含み得るか、又はそれからなり得る。或いは、ｃｒＲＮＡは、修飾ヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含み得るか、又はそれからなり得、好ましくは、そのような化学修飾されたヌクレオチドは、分解からｃｒＲＮＡを保護するためのものである。
【００６４】
本発明の一実施形態では、ｃｒＲＮＡは、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。ｃｒＲＮＡは、１つ又は複数のリボヌクレオチドと１つ又は複数のデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。
【００６５】
ｃｒＲＮＡは、１つ又は複数の天然に存在しないヌクレオチド又はヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチド、リボース環の２’炭素と４’炭素の間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−メチル類似体、２’−デオキシ類似体、２’−フルオロ類似体又はそれらの組合せを含むことができる。修飾ヌクレオチドは、限定するものではないが、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、プソイドウリジン、イノシン、及び７−メチルグアノシンからなる群から選択される修飾塩基を含み得る。
【００６６】
ｃｒＲＮＡは、１つ又は複数の末端ヌクレオチドで、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ（ホスホノアセテート）（ＭＳＰ）、又はそれらの組合せを組み込むことにより化学的に修飾することができる。そのような化学的に修飾されたｃｒＲＮＡは、未修飾のｃｒＲＮＡと比較して、増加した安定性及び／又は増加した活性を含み得る。（Ｈｅｎｄｅｌら，  ２０１５，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）；９８５〜９８９）。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡに結合する領域内のリボヌクレオチドと、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼに結合する領域内の１つ又は複数のデオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を含む。本発明の一実施形態では、デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体は、操作されたｃｒＲＮＡ構造に組み込まれ得、例えば、限定するものではないが、ガイド配列、足場配列に、及び／又はガイド配列と足場配列との間に組み込まれ得る。或いは、又はさらに、化学的に修飾されたヌクレオチドは、足場配列の５’及び／又は３’又はガイド配列に位置し得る。
【００６７】
好ましくは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼをＤＮＡの標的配列に誘導又は標的化するためのｃｒＲＮＡは、足場及びガイド配列を含むか、又はそれらからなり、好ましくは、前記足場配列はその５’末端にあるか、又はその近くにあり、ガイド配列はその３’末端にあるか、又はその近くにある。好ましくは、前記足場配列は、配列番号２１〜２４のいずれか１つと、好ましくは配列番号２４と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を有する。或いは、足場配列は、配列番号７３と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を有する。
【００６８】
ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、複合体化されたＭａｄ−７ヌクレアーゼが標的配列に直接、配列特異的に結合するように、標的配列との十分な相補性を有するよう設計されている。前記標的配列は、好ましくは、本明細書で定義したＧＯＩ内にある。標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接しており、これは、好ましくは、Ｔリッチモチーフ、好ましくはＴＴＴＮであり、ここで、ＮはＴ、Ｇ、Ａ又はＣのいずれか１つであり得る。当業者は、任意の所望の標的配列にハイブリダイズするために、好ましくは、ガイド配列を任意の所望の標的配列に相補的であるように操作することによって、任意の所望の標的配列を標的とするようにｃｒＲＮＡを操作することが可能である。好ましくは、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適に整列される場合、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％である。ガイド配列は、少なくとも約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又はそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０ヌクレオチド未満の長さである。好ましくは、ガイド配列は、約１０〜３０ヌクレオチドの長さであるか、又は約１５〜２０ヌクレオチドの長さである。好ましくは、ガイド配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドの長さであり、好ましくは２１ヌクレオチドである。
【００６９】
ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、内因性触媒活性を含み得ることによりＤＳＢを導入することができ、又は少なくとも１つの触媒的に不活性なドメイン、例えば１つの活性ドメインと１つの不活性ドメインを含むように操作することができる。前記ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、ＭＡＤ７−ニッカーゼ、例えばＭＡＤ７−Ｒ１１７３Ａをレンダリングする不活性Ｎｕｃドメインを有するか、又は触媒的に不活性なＭＡＤ７、例えばＭＡＤ７−Ｄ１２１３Ａをレンダリングする不活性ＲｕｖＣドメインを有するか、又は類似の若しくは同等の位置に変異を有するＭＡＤ７の任意のホモログ若しくはオルソログを有するように修飾され得る。そのような触媒的に不活性なＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、本明細書で以下に詳述するような（融合された）機能性ドメインを、ｃｒＲＮＡにより決定されるＤＮＡの特定の部位に誘導するのに有用であり得る。
【００７０】
ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ、又はＭＡＤ７−ニッカーゼ又は触媒的に不活性なＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、機能性ドメインに融合させることができる。任意選択で、そのような機能性ドメインは、エピジェネティック修飾のためのものであり、例えばヒストン修飾ドメインである。エピジェネティック修飾のドメインは、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、デアセチラーゼ、メチラーゼ、デアセチラーゼ、デオキシゲナーゼ、グリコシラーゼ、及びアセチラーゼからなる群から選択され得る（Ｃａｎｏ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ  Ｒｅｐ  （２０１６）  ４：１７０〜１７９）。メチルトランスフェラーゼは、Ｇ９ａ、Ｓｕｖ３９ｈ１、ＤＮＭＴ３、ＰＲＤＭ９及びＤｏｔ１Ｌからなる群から選択され得る。デメチラーゼは、ＬＳＤ１であり得る。デアセチラーゼは、ＳＩＲＴ６又はＳＩＲＴ３であり得る。メチラーゼは、ＫＹＰ、ＴｇＳＥＴ８及びＮＵＥのうちの少なくとも１つであり得る。デアセチラーゼは、ＨＤＡＣ８、ＲＰＤ３、Ｓｉｒ２ａ及びＳｉｎ３ａからなる群から選択され得る。デオキシゲナーゼは、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２及びＴＥＴ３のうちの少なくとも１つであってもよく、好ましくはＴＥＴ１ｃｄであり得る（Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ  Ｊら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（２０１８）；  １１５（９）：Ｅ２１２５〜Ｅ２１３４）。グリコシラーゼは、ＴＤＧであり得る。アセチラーゼは、ｐ３００であり得る。
【００７１】
任意選択で、機能性ドメインは、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼ、活性化誘導型シトシンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ、及びＡＤＡＴファミリーデアミナーゼからなる群から選択される、デアミナーゼ又はその機能的断片である。或いは、又はさらに、デアミナーゼ又はその機能的断片は、ＡＤＡＲ１若しくはＡＤＡＲ２、又はそれらのバリアントであり得る。
【００７２】
シトシンデアミナーゼ酵素のアポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーは、制御された有益な方法で変異誘発を開始するのに有用な１１個のタンパク質を包含する。好ましくは、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４及び活性化誘導型（シチジン）デアミナーゼからなる群から選択される。好ましくは、ＡＰＯＢＥＣファミリーのシトシンデアミナーゼは、活性化誘導型シトシン（若しくはシチジン）デアミナーゼ（ＡＩＤ）又はアポリポタンパク質Ｂ編集複合体３（ＡＰＯＢＥＣ３）である。これらのタンパク質は、すべて、Ｚｎ２＋−配位モチーフ（Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｘ２３−２６−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｘ２＿４−Ｃｙｓ）と触媒活性用の結合水分子を必要とする。好ましくは、本発明の方法において、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼに融合されるデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ１ファミリーデアミナーゼである。好ましくは、デアミナーゼドメインは、配列番号２５又は３７、好ましくは配列番号３７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列によってコードされているラットデアミナーゼ（ｒＡＰＯＢＥＣ１）である。さらに、又は或いは、ラットデアミナーゼドメインのアミノ酸配列は、配列番号２６と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。好ましくは、デアミナーゼドメインは、デアミナーゼ活性を有する。
【００７３】
ＭＡＤ７−ヌクレアーゼに融合され得るデアミナーゼドメインの別の例示的な適切なタイプは、アデニン（又はアデノシン）デアミナーゼ、例えばＡＤＡＴファミリーのアデニンデアミナーゼである。さらに、アデニンデアミナーゼは、好ましくはＧａｕｄｅｌｌｉら，２０１７（Ｇａｕｄｅｌｌｉら  ２０１７  Ｎａｔｕｒｅ  ５５１：  ４６４〜４７１）に記載されているように、ＴａｄＡ又はそのバリアントであり得る。好ましくは、デアミナーゼドメインは、配列番号２７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列によってコードされているＴａｄＡである。さらに、又は或いは、ＴａｄＡのアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。好ましくは、デアミナーゼドメインは、デアミナーゼ活性を有する。さらに、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、例えばＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２に由来する、アデニンデアミナーゼドメインに融合され得る。本発明のデアミナーゼドメインは、触媒活性を有するデアミナーゼタンパク質全体又はその断片を含み得るか、又はそれらからなり得る。
【００７４】
機能性ドメイン、例えばデアミナーゼドメインは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ又は触媒的に不活性なＭＡＤ７−ヌクレアーゼのＮ末端又はＣ末端に融合され得る。好ましくは、機能性ドメインは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼのＮ末端に融合される。任意選択で、本発明の方法において使用される機能性ドメイン及びＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、互いに直接的に融合されるか、又はリンカー（本明細書ではスペーサーとも呼ばれる）を介して融合される。
【００７５】
リンカーは、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、及び（Ｇ）ｎの形態の非常に柔軟なリンカーから、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号２９）、（ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ）ｎ（配列番号３０）、若しくは（ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ）ｎ（配列番号３１）、若しくは（ＫＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ）ｎ（配列番号３２）の形態又はそれらの任意のバリアントのよりリジッドなリンカーまでの範囲にある当技術分野における任意の適切なリンカーであってもよく、ここで、ｎは、好ましくは１〜７であり、すなわち、１、２、３、４、５、６、又は７である。
【００７６】
リンカーは、好ましくは、２〜３０アミノ酸の間、又は３〜２３アミノ酸の間、又は３〜１８アミノ酸の間の長さを有する。
【００７７】
任意選択で、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、ＵＤＧ阻害（ＵＧＩ）ドメインにさらに融合される。ＵＧＩドメインは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼのＮ末端又はＣ末端に融合され得る。好ましくは、デアミナーゼドメインは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼのＣ末端に融合される。融合は、上記のように、直接的であってよく、又はリンカーを介してであってもよい。好ましくは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼのＮ末端でデアミナーゼドメインに融合され、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼのＣ末端でＵＧＩドメインに融合される。
【００７８】
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は、ＤＮＡに意図せず存在するウラシルを認識し、ウラシルとデオキシリボース糖との間のＮ−グリコシド結合を切断し、ウラシルを放出し、塩基性部位（ＡＰ部位）を残すことによってウラシル除去修復経路を開始する。次いで、ＡＰ部位はプロセシングされ、引き続きＡＰ−エンドヌクレアーゼ、ｄＲＰａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼの酵素の作用によって標準塩基に復元される。ＵＧＩドメインをＭＡＤ７−ヌクレアーゼ融合タンパク質を含有するシトシンデアミナーゼに融合することによって、塩基編集の効率が増加する。好ましくは、ＵＧＩドメインは、枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージＰＢＳ１又はＰＢＳ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１４７３９）由来のＵＧＩであるか、又はそのバリアントである。好ましくは、ＵＧＩドメインのヌクレオチド配列は、配列番号３３又は３５と、好ましくは配列番号３５と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、ＵＧＩドメインのアミノ酸配列は、配列番号３４又は３６と、好ましくは配列番号３６と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、ＵＧＩドメインは、ＵＤＧを阻害する。
【００７９】
一実施形態では、ＵＤＧ阻害剤は、本明細書で定義したＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質に融合されないが、好ましくはｃｒＲＮＡ誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼとともに、さらなる機能性タンパク質として編集されるＤＮＡに接触される。この実施形態では、細胞、好ましくは、植物細胞は、ＵＤＧ阻害剤又はＵＤＧ阻害剤をコードする構築物を使用してトランスフェクトされ得る。後者の場合において、前記構築物は、本明細書で定義したＭＡＤ７−ヌクレアーゼ（融合）タンパク質をコードする配列をさらに含み得るか、或いはＵＤＧ阻害剤及びＭＡＤ７−ヌクレアーゼ（融合）タンパク質は別個の構築物にコードされ得る。
【００８０】
本発明はまた、本発明の方法において、本明細書で定義した前記ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸を誘導するための、すなわち、植物細胞ＤＮＡの修飾において使用するための、及び／又は植物細胞を安定して発現させるための、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸、及び／若しくはｃｒＲＮＡの使用に関する。
【００８１】
オリゴヌクレオチド媒介性標的化ヌクレオチド交換（ＯＤＴＮＥ）
一実施形態では、本明細書で定義したｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、一本鎖切断又は二本鎖切断を導入することが可能である。この実施形態では、本発明の方法は、標的配列に少なくとも部分的に相補的である配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを植物細胞に導入するステップをさらに含むことができる。このような一本鎖オリゴヌクレオチドはまた、テンプレートオリゴヌクレオチドとして注釈を付けることもできる。本発明の文脈では、「一本鎖」とは、その完全に相補的な鎖が存在しない、５’末端及び３’末端を有する、ヌクレオチドの直鎖ストレッチを意味する。
【００８２】
好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドは、標的配列に関して少なくとも１つのミスマッチを除き、標的配列を含む。言い換えると、一本鎖オリゴヌクレオチドは、本発明の方法で修飾されるＤＮＡの標的配列に導入しようとする改変に関する情報を含む。１つ又は複数のミスマッチを有する標的配列に加えて、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ある特定の実施形態では、１つ又は複数のミスマッチを有する標的配列に隣接するヌクレオチドの追加のストレッチを含むこともできる。しかし、好ましくは、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ二重鎖の第１の鎖に含まれる標的配列に関して１つ又は複数のミスマッチを有する標的配列から実質的になる。好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは標的配列に存在するＰＡＭ配列に関して少なくとも１つのミスマッチを含む。好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは標的配列に存在するＰＡＭ配列に関して少なくとも１つのミスマッチを含み、さらに、前記ＰＡＭ配列の外側に少なくとも１つのミスマッチを含む。好ましくは、前記ＰＡＭ配列の外側の前記少なくとも１つのミスマッチは、コドン改変をもたらし、好ましくは、コードされたタンパク質のアミノ酸変化又は早期停止をもたらす、ミスマッチである。
【００８３】
ＯＤＴＮＥの使用並びにこの技術において機能するオリゴヌクレオチドの構造及び設計は、特に、国際公開第９８／５４３３０号、国際公開第９９／２５８５３号、国際公開第０１／２４６１５号、国際公開第０１／２５４６０号、国際公開第２００７／０８４２９４号、国際公開第２００７／０７３１４９号、国際公開第２００７／０７３１６６号、国際公開第２００７／０７３１７０号、国際公開第２００９／００２１５０号、国際公開第２０１２／０７４３８５号、国際公開第２０１２／０７４３８６号、国際公開第２０１８／１１５３８９号及び国際公開第２０１５／１３９００８号に十分に説明されている。当業者は、したがって、本発明において使用するための第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを設計する方法を容易に理解する。
【００８４】
本発明で使用される変異原性オリゴヌクレオチドは、好ましくは、当技術分野で使用される他の変異原性オリゴヌクレオチドと一致する長さを有し、すなわち典型的には、１０〜６０ヌクレオチド、好ましくは２０〜５５ヌクレオチド、より好ましくは２５〜５０ヌクレオチドを有する。一本鎖オリゴヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対して少なくとも部分的に耐性にするように、化学修飾を含むことができる。
【００８５】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的配列を含むＤＮＡの少なくとも約１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８の、又は少なくとも約５０の連続するヌクレオチドとそれぞれ１００％の配列同一性を有する、好ましくは、標的配列を含むＤＮＡの少なくとも約１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８の、又は少なくとも約５０の連続するヌクレオチドとそれぞれ１００％の配列同一性を有する、少なくとも約１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８の、又は少なくとも約５０の連続するヌクレオチドを含む。
【００８６】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドの両方を含んでいてもよく、好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチドを含まない。好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、本明細書で詳述されるように、一本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの１つ又は複数は化学修飾を含む。好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドは、化学的に保護されたオリゴヌクレオチドであり、好ましくは、少なくとも１、２、３又は４個の化学的に保護されたヌクレオチドを含む。そのような化学的に保護されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼにより耐性がある可能性があり、さらにより高い結合親和性を提供することができる。
【００８７】
化学的に保護されたオリゴヌクレオチドを提供する修飾のタイプは特に限定されない。適切な修飾の例には、オリゴヌクレオチドの３’末端にリバース塩基導入（ｉｄＣ）して修復オリゴヌクレオチドに３’ブロック末端を生成すること；修復オリゴヌクレオチドの５’及び／又は３’で、１つ又は複数の２’Ｏ−メチルヌクレオチド又はハイブリダイゼーションエネルギーを増加させる塩基（国際公開第２００７／０７３１４９号を参照されたい）を導入すること；アクリジン、ソラレン、臭化エチジウムなどの色素を結合させて（５’又は３’）挿入すること；５’末端キャップ、例えばＴ／Ａクランプ、コレステロール部分、ＳＩＭＡ（ＨＥＸ）、及びｒｉｂｏＣなどを導入すること；ホスホチオエート、メチルホスホネート、ＭＯＥ（メトキシエチル）、ジＰＳ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）などの骨格修飾；又は、２’Ｏメチル及びロックド核酸（ＬＮＡ）などのリボース修飾が含まれる。好ましい化学修飾は、一本鎖オリゴヌクレオチドを分解から保護するのを助けるホスホロチオエート（ＰＳ）（ＰＳは、通常一本鎖オリゴヌクレオチドの末端に配置される）、又はヌクレアーゼに対する保護とより高い結合親和性の両方を付与するロックド核酸（ＬＮＡ）（ＬＮＡは、一本鎖オリゴヌクレオチドの末端又は内部のいずれかに配置させることができる）のいずれかである。
【００８８】
好ましくは、少なくとも１つのミスマッチは、化学的に保護されたヌクレオチドではない。別の選好によれば、化学的に保護されたヌクレオチドは、少なくとも１つのミスマッチからの少なくとも１つのヌクレオチドである。言い換えると、好ましくは、一本鎖オリゴヌクレオチドのミスマッチは、化学的に保護されたヌクレオチドではなく、ミスマッチ（のいずれかの側）に隣接するヌクレオチドはまた、化学的に保護された（又は修飾された）ヌクレオチドではない。
【００８９】
相同組換え
一実施形態では、本明細書で定義したｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、一本鎖切断又は二本鎖切断を導入することができるが、例えば、その理由は、ヌクレアーゼが好ましくは内因性のヌクレアーゼ活性を含むためである。この実施形態では、本発明の方法は、本発明の方法によって修飾され、標的配列を含むＤＮＡの配列に少なくとも部分的に相補的である配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ、又は二本鎖ＤＮＡ断片（ドナー断片）を植物細胞に導入するステップをさらに含むことができる。そのような二本鎖オリゴヌクレオチド又はＤＮＡは、「ドナー構築物」又は「ドナーヌクレオチド」として本明細書で注釈が付けられ、これらは本明細書では互換的に使用される。
【００９０】
二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、好ましくは相同組換えによって、本明細書で定義したＤＮＡの配列を修飾することができる。したがって、二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは、修飾されるＤＮＡの配列と１００％の配列同一性又は１００％の配列相補性を有する配列をその３’末端及びその５’末端に含む。好ましくは、二本鎖オリゴヌクレオチドと同一であるＤＮＡの配列は、ｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼによって生成された切断部位に直接隣接して位置している。
【００９１】
姉妹染色分体、ドナー断片又は二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかであり得る相同配列の存在下で、ＤＳＢは、相同組換え（ＨＲ）によって修復することができる。これは、修復に使用されている姉妹染色分体ではなく、情報が、細胞に導入される二本鎖オリゴヌクレオチド又はドナー断片からコピーされる、遺伝子ターゲティングのプロセスの基礎である。二本鎖オリゴヌクレオチド又はドナー断片は、元の染色体遺伝子座と比較すると改変又は外因性配列を含有しており、したがって、ＨＲのプロセスはこれらの改変又は外因性配列をゲノムに組み込む。好ましくは、ＨＲによって導入しようとする外因性配列は、ＤＮＡの配列と１００％の配列同一性又は１００％の配列相補性を有するその３’末端及びその５’末端の配列の間の二本鎖オリゴヌクレオチド又はドナー断片内に位置する。
【００９２】
二本鎖オリゴヌクレオチド又は二本鎖ＤＮＡ、又はＤＮＡ断片は、直鎖状化又は環状化することができる。好ましくは、二本鎖オリゴヌクレオチドは、直鎖状化分子である。第１及び／又は第２の二本鎖オリゴヌクレオチドは、例えば、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対して少なくとも部分的に耐性にするように化学修飾を含むことができる。好ましくは、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡを含むか、又はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドである。好ましくは、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡを含む。
【００９３】
ｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼの導入
本発明の方法は、植物細胞のＤＮＡをｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼと接触させるステップを含む。これは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼとＭＡＤ７−ヌクレアーゼをＤＮＡに誘導するためのｃｒＲＮＡとを植物細胞に導入することによって達成され得る。したがって、本発明の方法はまた、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼとＭＡＤ７−ヌクレアーゼをＤＮＡに誘導するためのｃｒＲＮＡとを植物細胞に導入するステップを含む、植物細胞のＤＮＡを標的化修飾するための方法として定義することができる。ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ及びｃｒＲＮＡは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ及び／若しくはｃｒＲＮＡ及び／若しくはｃｒＲＮＡ前駆体を細胞にコードするｍＲＮＡとして、又はＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質及び／若しくはｃｒＲＮＡをコードする１つ又は複数の核酸として、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質及び／若しくはｃｒＲＮＡ（好ましくは、事前に構築されたリボヌクレオ−タンパク質複合体として）の形態で、植物細胞に直接送達され得る。後者は、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ及び／又はｃｒＲＮＡをコードする遺伝子を含む１つ又は複数のベクターのトランスフェクションによって実施されてもよく、ベクターは前記遺伝子及び／又はｃｒＲＮＡの一過性発現用である。植物細胞における導入又はトランスフェクションは、当技術分野で公知の任意の従来の方法により実施され得る。任意選択で、ＭＡＤ７及び／又はｃｒＲＮＡ（複数可）をコードする配列は、植物細胞のゲノムに安定して導入される。ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ及びｃｒＲＮＡがリボヌクレオ−タンパク質複合体として細胞内に送達される場合、本発明の方法は、前記複合体を植物細胞に導入するステップの前に、前記複合体を形成するステップをさらに含む。
【００９４】
任意選択で、本方法は、本明細書で定義したＯＤＴＮＥのための一本鎖オリゴヌクレオチドを導入するステップ、又は本明細書で定義したＨＲのための二本鎖オリゴヌクレオチド若しくはドナー断片を導入するステップをさらに含む。任意選択で、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質又はそのタンパク質をコードする構築物、ｃｒＲＮＡ又はそのｃｒＲＮＡをコードする構築物、及びＯＤＴＮＥのための一本鎖オリゴヌクレオチド又はＨＲのための二本鎖オリゴヌクレオチド若しくはドナー断片は、単一ステップで、すなわち実質的に同時に、植物細胞に導入される。言い換えれば、好ましくは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質又はそのタンパク質をコードする構築物、ｃｒＲＮＡ又はそのｃｒＲＮＡをコードする構築物、及びＯＤＴＮＥのための一本鎖オリゴヌクレオチド又はＨＲのための二本鎖オリゴヌクレオチド又はドナー断片は、単一のトランスフェクションステップで植物細胞に導入される。任意選択で、これらの成分は、２つ以上のトランスフェクションステップでトランスフェクトされる。
【００９５】
ＭＡＤ７ヌクレアーゼタンパク質は、１つ又は複数の核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）、変異、欠失、改変、又はトランケーションを含むことができる。好ましくは、ＮＬＳ結合ＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質は、配列番号３と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、ＮＬＳ結合ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、配列番号４と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質である。さらに、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、植物における、例えば、発現のためにコドン最適化されていてもよく、転写調節配列を含み、また適用可能な場合、構成的、誘導的、組織特異的又は種特異的プロモーターのいずれかによって駆動することができる。好ましくは、植物細胞における発現に適している構成的、誘導的、組織特異的又は種特異的プロモーターによる。好ましくは、コドン最適化されたＮＬＳ結合ＭＡＤ７−ヌクレアーゼコード配列は、配列番号４と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。
【００９６】
例示的な転写終止及びポリアデニル化シグナルは、ＮｏｓＴ、ＲＢＣＴ、ＨＳＰ１８．２Ｔ、又は他の遺伝子特異的若しくは種特異的ターミネーターのいずれかである。ＭＡＤ７ヌクレアーゼ遺伝子カセット又はｍＲＮＡは、ネイティブで、又は遺伝子特異的プロモーター及び／若しくは合成プロモーターとの組合せでイントロンを含み得る。
【００９７】
好ましい実施形態では、細胞は、少なくとも１つのＭＡＤ７−ヌクレアーゼで形質転換され、すなわち、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質は、細胞に直接送達される。さらなる実施形態では、細胞は、少なくとも１つのｃｒＲＮＡで形質転換される。任意選択で、細胞は、１つのＭＡＤ７ヌクレアーゼ及び２つ以上のｃｒＲＮＡで形質転換され、それぞれのｃｒＲＮＡは、異なるガイド配列を含み、すなわち、植物ゲノム内の異なる配列を標的とする。好ましくは、本発明の方法は、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ及びｃｒＲＮＡを細胞に導入する前に、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質を少なくとも１つのｃｒＲＮＡと複合体化するステップを含む。そのような実施形態では、ｃｒＲＮＡ誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、複合体として植物細胞に導入される。任意選択で、前記導入ステップはまた、本明細書で定義したＯＤＴＮＥのための一本鎖オリゴヌクレオチド、又は本明細書で定義したＨＲのための二本鎖オリゴヌクレオチド若しくはドナー断片の導入を含む。
【００９８】
別の好ましい実施形態では、細胞は、少なくとも１つのＭＡＤ７−ヌクレアーゼをコードする核酸構築物でトランスフェクトされる。細胞は、少なくとも１つのｃｒＲＮＡをコードする追加の核酸構築物でさらにトランスフェクトされていてもよく、任意選択で、前記核酸構築物は、２つ以上のｃｒＲＮＡをコードしており、それぞれのｃｒＲＮＡは、異なるガイド配列を含み、すなわち、植物ゲノム内の異なる配列を標的とする。好ましくは、この実施形態内では、細胞は、本明細書で定義した少なくとも１つのＭＡＤ７−ヌクレアーゼ及び１つ又は複数のｃｒＲＮＡをコードする単一の構築物でトランスフェクトされる。好ましくは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、異なるプロモーターの制御下にある。例えば、好ましくは、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質は、好ましくは植物における発現に適している、構成的プロモーター、例えば３５Ｓプロモーター（例えばカリフラワーモザイクウイルスから促進される３５Ｓ（ＣａＭＶ；  Ｏｄｅｌｌら  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０〜８１２；  １９８５）の制御下にあってもよい。他の適切な構成的プロモーターとしては、限定するものではないが、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーター、及びサトウキビ桿状型バドナウイルス（ｓｕｇａｒｃａｎｅ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ  ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ）（ＳｃＢＶ）プロモーターが挙げられる（例えば、Ｓａｍａｃら  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ２００４  Ａｕｇ；１３（４）：３４９〜６１を参照されたい）。他の構成的プロモーターとしては、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター、及び国際公開第９９／４３８３８号及び米国特許第６０７２０５０号に開示されている他の構成的プロモーター；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２：６１９〜６３２，  １９８９及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８：６７５〜６８９，  １９９２）；ｐＥＭＵ  （Ｌａｓｔら，  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８１：５８１〜５８８，  １９９１）；ＡＡ６プロモーター（国際公開第２００７／０６９８９４号）などが挙げられる。核酸構築物はまた、転写終止領域を含むことができる。転写終止領域が使用される場合、任意の終止領域が核酸構築物の調製に使用され得る。好ましい実施形態では、核酸構築物は一過性発現のためのものである。言い換えると、植物材料における発現は、核酸構築物の非永続的な存在の結果として一時的である。構築物が宿主ゲノムに組み込まれない場合、発現は、例えば、一過性であり得る。例えば、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質及びｃｒＲＮＡは、植物細胞に一過的に提供され、続いて、成分のいずれかの又は両方の量が減少し得る。続いて、植物細胞、植物細胞の後代、及び植物細胞を含むか、又は二本鎖ＤＮＡが改変された植物プロトプラストに由来する植物は、本発明の方法において使用される成分のいずれかの若しくは両方の減少された量を含むか、又はもはや１つ若しくは複数の成分を含有しない。好ましくは、前記植物細胞、植物細胞の後代、及び植物細��を含むか、又は二本鎖ＤＮＡが改変された植物プロトプラストに由来する植物は、依然として、ＤＮＡ修飾を含む。
【００９９】
ＭＡＤ７−ヌクレアーゼをコードする核酸構築物は、形質転換された植物における増加された発現のために最適化されていてもよく、すなわち、植物細胞における発現のためにコドン最適化され得る。例えば、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、トマトにおける発現のためにコドン最適化されていてもよく、前記トマトは、好ましくはソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）である。すなわち、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸構築物は、発現の改善のために植物に好ましいコドンを使用して合成することができる。宿主に好ましいコドンの使用についての考察は、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ及びＧｏｗｒｉ（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９２：  １〜１１，  １９９０）を参照されたい。植物に好ましい遺伝子を合成するための方法は、当技術分野において利用可能である（例えば、Ｍｕｒｒａｙら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９８９）  １７：４７７〜４９８、又はＬａｎｚａら  （２０１４）  ＢＭＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：３３〜４３を参照されたい）。
【０１００】
本発明はまた、本明細書で定義したＭＡＤ７−エンドヌクレアーゼをコードする核酸及び／又は構築物であって、前記コード配列が、好ましくは、植物細胞での発現、例えば限定するものではないがソラヌム・リコペルシクムにおける発現のためにコドン最適化されていることを特徴とする、核酸及び／又は構築物に関する。好ましくは、そのコード配列は、配列番号２と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、及び／又はそのコード配列は、配列番号７４と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。
【０１０１】
本発明はまた、ガイド配列が植物ゲノムの配列、好ましくは本明細書で定義したＧＯＩ内の配列を標的とするためのものであることを特徴とする、本明細書で定義した１つ又は複数のｃｒＲＮＡをコードする核酸及び／又は構築物に関する。ｃｒＲＮＡは、本明細書で定義した足場配列を含み得る。
【０１０２】
そのような核酸は、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖；１つ又は複数の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方を含む核酸分子；及び当技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドを含み得る。本発明による発現ベクターは、細胞、好ましくは植物細胞における遺伝子発現を導入するのに適する。好ましい発現ベクターは、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体又はウイルスベクターであり、ＤＮＡ分子はプラスミドであり得る。プラスミドとは、追加のＤＮＡ断片を、例えば標準的な分子クローニング技術などによって挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。ＤＮＡ複合体は、ＤＮＡを細胞に送達するのに適した任意の担体に結合されたＤＮＡ分子であり得る。好ましい担体は、リポプレックス、リポソーム、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、無機ナノ粒子、ビロソーム及び細胞透過性ペプチドからなる群から選択される。好ましい実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、好ましくはタバコ茎壊疽ウイルス（ＴＲＶ）、豆黄萎病ウイルス（ＢｅＹＤＶ）、キャベツ巻葉ウイルス（ＣａＬＣｕＶ）、トブラウイルス、及びコムギ萎縮ウイルス（ＷＤＶ）である。好ましくは、ウイルスベクターは、本明細書の上記で定義したタバコ茎壊疽ウイルスである。
【０１０３】
本発明はさらに、本明細書で定義した１つ又は複数の、好ましくは２つ以上のｃｒＲＮＡを含む組成物に関する。好ましくは、１つ又は複数のｃｒＲＮＡは、ガイド配列が植物ゲノムの配列、好ましくは本明細書で定義したＧＯＩ内の配列を標的とするためのものであることを特徴とする。１つ又は複数のｃｒＲＮＡは、本明細書で定義した足場配列を含んでいてもよい。
【０１０４】
核酸（ＭＡＤ７−ヌクレアーゼをコードする核酸及び／若しくはｃｒＲＮＡ（をコードする）核酸）、又はタンパク質又はリボヌクレオ−タンパク質複合体を細胞に送達するための当技術分野で公知の多くの適切な手法がある。送達システムは、例えば、ウイルスベースの送達システム又は非ウイルス性の送達システムを構成し得る。
【０１０５】
非ウイルス性の送達システムの非限定的な例としては、化学ベースのトランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、シクロデキストリン、ポリマー、リポソーム、又はナノ粒子の使用）、非化学ベースの方法（例えば、エレクトロポレーション、細胞圧搾、ソノポレーション、光学トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、熱ショック及び流体力学的送達）、粒子ベースの方法（例えば、遺伝子銃又は磁石介在トランスフェクション）並びに細菌ベースの送達システム（例えば、アグロバクテリウム（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介送達）が挙げられる。ウイルス送達システムの非限定的な例としては、レンチウイルス及びアデノウイルスが挙げられる。
【０１０６】
好ましい実施形態では、核酸及び／又はタンパク質は、水性媒体を使用して細胞に導入され、その水性媒体はＰＥＧを含む。任意の適切な方法を使用することができ、好ましくは、媒体は５〜８の間、好ましくは６〜７．５の間のｐＨ値を有する。ＭＡＤ７ヌクレアーゼ及び任意選択でのｃｒＲＮＡの水性媒体中の存在に次いで、媒体はポリエチレングリコールを含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、工業的製造から医薬まで多くの用途を有するポリエーテル化合物である。ＰＥＧはまた、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）又はポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られている。ＰＥＧの構造は、一般に、Ｈ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨとして表される。好ましくは、使用されるＰＥＧは、２０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有するオリゴマー及び／若しくはポリマー、又はそれらの混合物である。
【０１０７】
例えば植物細胞の集団を含む水性媒体は、好ましくは１００〜４００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧを含む。そのため、ＰＥＧの最終濃度は、好ましくは１００〜４００ｍｇ／ｍｌの間であり、例えば１５０〜３００ｍｇ／ｍｌの間、例えば１８０〜２５０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましいＰＥＧは、ＰＥＧ  ４０００  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｎｏ．８１２４０である（すなわち、平均Ｍｎ  ４０００を有する（Ｍｎ、数平均分子量は、試料中のすべてのポリマー分子の総重量を試料中のポリマー分子の総数で除算したものである））。好ましくは、ＰＥＧは、約１０００〜１００００、例えば２０００〜６０００の間のＭｎとして使用される。
【０１０８】
さらに好ましい実施形態では、ＰＥＧを含む水性媒体は、約０．００１％、０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、２％、５％、１０％又は２０％（ｖ／ｖ）を超えるグリセロールを含まない。好ましくは、媒体は、約０．００１％、０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、２％、５％、１０％又は２０％（ｖ／ｖ）未満のグリセロールを含む。特にＭＡＤ７ヌクレアーゼタンパク質の導入においては、水性媒体は、約０．１％未満（例えば、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロール）を含む。任意選択で、植物細胞の集団を含む水性媒体は、グリセロールを完全に含まない。
【０１０９】
好ましくは、例えば植物細胞の細胞周期は、二重鎖ＤＮＡをｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼに曝露した場合に同調される。同調は、好ましくは、本明細書で詳述したように、ｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸（複数可）が細胞に導入された場合に起こる。同調は、好ましくは、（植物）細胞を同調剤と接触させることにより実施する。
【０１１０】
そのような（植物）細胞の細胞周期を同調する方法は、欧州特許第２５１６６５２号に詳細に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。より詳しくは、（植物）細胞、例えば植物プロトプラストを同調することにより、二重鎖ＤＮＡの改変の導入の有効性をさらに高めるために本発明の特定の実施形態では有利となり得る。したがって、特定の実施形態では、本方法は、細胞、好ましくは植物細胞の細胞周期を同調するステップを含む。
【０１１１】
同調は、好ましくは、ｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ又はｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼをコードする核酸（複数可）が本明細書に詳述されているように細胞に導入される場合に起こり、その結果、ほとんどの（植物）細胞が、二重鎖ＤＮＡが本明細書で定義した部位特異的ヌクレアーゼに曝露された際に細胞周期の同じ段階になる。これは有利であり、二重鎖ＤＮＡの改変の導入率を上昇させ得る。
【０１１２】
（植物）細胞の同調は、任意の適切な手段によって達成することができる。例えば、細胞周期の同調は、栄養枯渇、例えば、リン酸塩枯渇、硝酸塩枯渇、イオン枯渇、血清枯渇、スクロース枯渇、オーキシン枯渇によって達成され得る。
【０１１３】
同調は、同調剤を（植物）細胞に添加することによっても達成することができる。好ましくは、同調剤は、アフィディコリン（ａｐｈｉｄｏｃｏｌｉｎ）、ヒドロキシ尿素、チミジン、コルヒチン、コブトリン（ｃｏｂｔｏｒｉｎ）、ジニトロアニリン、ベネフィン、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンジメタリン、トリフルラリン、アミプロホスメチル、ブタミホスジチオピル、チアゾピルプロピザミド、テブタムＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、ミモシン、アニソマイシン、アルファアマニチン、ロバスタチン、ジャスモン酸、アブシジン酸、メナジオン、クリプトゲイン（ｃｒｙｐｔｏｇｅｉｎｅ）、過酸化水素、過マンガン酸ナトリウム、インドメタシン、エポキソマイシン、ラクタシスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｅｉｎ）、ｉｃｒｆ  １９３、オロモウシン、ロスコビチン、ボヘミン、スタウロスポリン、Ｋ２５２ａ、オカダ酸、エンドタール（ｅｎｄｏｔｈａｌ）、カフェイン、ＭＧ  １３２、サイクリン依存性キナーゼ、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、並びにそれらの標的メカニズムからなる群から選択される。量及び濃度、並びにそれらに関連する細胞周期段階は、例えば、「Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ」，  Ｊ．  Ｄｏｌｅｚｅｌ  ｃ．ｓ．  Ｅｄｓ．  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ２００７  ｐｐ  ３２７  ｆｆに記載されている。好ましくは、同調剤は、アフィディコリン及び／又はヒドロキシ尿素である。
【０１１４】
好ましくは、本発明の方法では、細胞周期の同調は、細胞周期のＳ期、Ｍ期、Ｇ１期及び／又はＧ２期に（植物）細胞を同調させる。
【０１１５】
好ましい実施形態では、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、２つの触媒的に活性なエンドヌクレアーゼドメインを含む。この実施形態内では、ｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７−ヌクレアーゼは、標的配列に二本鎖切断を導入する。修復メカニズムのその後の活性化は、植物ゲノムの標的配列の改変をもたらす。標的化改変は、少なくとも１つの塩基対の挿入、欠失又は修飾を含み得る。例えば、標的化改変は、少なくとも１つの塩基対の欠失及び少なくとも１つの塩基対の挿入を含み得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の塩基対は、本発明の方法で改変され得る。複数の修飾を単一の実験で導入することができ、及び／又は実験を繰り返して植物細胞のゲノムに、任意選択で第１の事象で標的とされた他の遺伝子若しくは同じ遺伝子で、その後の改変を導入することができる。
【０１１６】
本発明はさらに、好ましくは参照により本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７４１５０に記載されているような、二重鎖ＤＮＡのコード配列（ＣＤＳ）を標的化改変するための方法であって、二重鎖ＤＮＡを少なくとも２つのｃｒＲＮＡ−誘導型ＭＡＤ７ヌクレアーゼに曝露するステップを含み、第１の部位特異的ヌクレアーゼがＤＮＡを切断してＯＲＦ内の第１の位置で第１のインデルを生成し、第２の部位特異的ヌクレアーゼがＤＮＡを切断して同一ＣＤＳ内の第２の位置で第２のインデルを生成し、第１のインデルの前及び第２のインデルの後のＣＤＳは同一リーディングフレームのままであり、改変されたＣＤＳは終止コドンを含まない、方法に関する。
【０１１７】
植物細胞
本発明の方法は、本明細書で定義したＭＡＤ７−ヌクレアーゼ及びＭＡＤ７−ヌクレアーゼを誘導するためのｃｒＲＮＡを植物細胞に導入するステップに先行して、前記植物細胞を提供するステップをさらに含んでいてもよい。当業者は、本発明の方法が特定の植物細胞タイプに限定されないことを理解する。特に、本明細書に開示した本発明の方法は、分裂細胞及び非分裂細胞に適用することができる。細胞は、トランスジェニックであっても非トランスジェニックであってもよい。植物細胞は、例えば、植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、及び植物又は植物の一部、例えば、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯、粒などが無傷の植物細胞から得ることができる。
【０１１８】
好ましい実施形態では、植物細胞は植物プロトプラストである。当業者には、植物プロトプラストを調製及び繁殖する方法及びプロトコルは公知であり、例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （ＩＳＢＮ：  ９７８−０−１２−４１５９２０−４，  Ｒｏｂｅｒｔａ  Ｈ．  Ｓｍｉｔｈ）を参照されたい。本発明の方法で使用するための植物プロトプラストは、植物細胞プロトプラストの生成で使用される一般的手順を使用して提供することができる（例えば、細胞壁は、セルロース、ペクチナーゼ及び／又はキシラナーゼを使用して分解され得る）。
【０１１９】
植物細胞プロトプラスト系は、例えば、トマト、タバコ、及び他の多くのもの（セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃｃａ  ｓａｔｉｖａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））に対して記載されている。本発明は、一般に、限定するものではないが、以下の参考文献：Ｂａｒｓｂｙら  １９８６，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５（２）：  １０１〜１０３；  Ｆｉｓｃｈｅｒら  １９９２，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  １１（１２）：  ６３２〜６３６；  Ｈｕら  １９９９，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ５９：  １８９〜１９６；  Ｎｉｅｄｚら  １９８５，  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９：  １９９〜２０４；  Ｐｒｉｏｌｉ及びＳｏｎｄａｈｌ，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：  ５８９〜５９４；  Ｓ．  Ｒｏｅｓｔ及びＧｉｌｉｓｓｅｎ  １９８９，  Ａｃｔａ  Ｂｏｔ．  Ｎｅｅｒｌ．  ３８（１）：  １〜２３；  Ｓｈｅｐａｒｄ及びＴｏｔｔｅｎ，  １９７５，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５：  ６８９〜６９４；  Ｓｈｅｐａｒｄ及びＴｏｔｔｅｎ，  １９７７，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ６０：  ３１３〜３１６のいずれか１つに記載の系を含む任意のプロトプラスト系に適用することができ、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
植物細胞は、好ましくは、作物植物、例えば単子葉植物若しくは双子葉植物、又は作物若しくは穀物植物、例えばキャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、大豆、小麦、オート麦若しくは米から得ることができる。作物植物とは、ヒトによって栽培及び育種された植物種である。作物植物は、食用（例えば畑作物）又は観賞用（例えば、刈り取るための花、芝生用草などの生産）に栽培され得る。本明細書で定義した作物植物は、非食料品、例えば、燃料用油、プラスチックポリマー、医薬品、コルクなどが収穫される植物も含む。
【０１２１】
植物細胞はまた、藻類、樹木、又は生産の植物、果物若しくは野菜（例えば、樹木、例えば柑橘類の樹木、例えばオレンジ、グレープフルーツ若しくはレモンの樹木；桃若しくはネクタリンの樹木；リンゴ若しくはナシの樹木；堅果類の樹木、例えばアーモンド若しくはクルミ若しくはピスタチオの樹木；イヌホオヅキ植物；アブラナ属の植物；レタス属の植物；ホウレンソウ属の植物；トウガラシ属の植物；ナス属の植物、好ましくはソラヌム・リコペルシクム）であり得る。
【０１２２】
別の好ましい実施形態では、細胞は、アスパラガス、大麦、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、チコリ、ココア、コーヒー、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ、ラズベリー、コメ、ライムギ、モロコシ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ピーマン、タバコ、トマト、スイカ、小麦、及びズッキーニからなる群から選択される植物から得ることができる。
【０１２３】
好ましくは、標的化改変を含む得られた植物細胞は、植物又はそれらの子孫に再生される。したがって、本発明の好ましい実施形態である本方法は、標的化改変を含む植物又はその子孫を再生するステップをさらに含む。
【０１２４】
植物細胞及び植物又は植物産物
本方法は、標的化修飾を含む植物又はその子孫を再生するステップをさらに含み得る。好ましくは、そのような再生は、再生に適した条件を使用して実施される。当業者は、植物プロトプラストから植物を再生する方法及びプロトコルを十分に知っている。再生された植物の後代、子孫、バリアント、及び変異体もまた、これらの部分が本明細書で教示した方法で導入された標的化改変を含むならば、本発明の範囲内に含まれる。
【０１２５】
標的化修飾を含む植物細胞又は植物に加えて、本発明はまた、ＭＡＤ７−エンドヌクレアーゼを一過的又は安定的に発現する植物細胞に関する。好ましくは、植物細胞は、本明細書で定義したそのゲノムにＭＡＤ７−エンドヌクレアーゼをコードする配列を含むように修飾されたトランスジェニック植物である。本発明の範囲内に含まれるのは、そのようなトランスジェニック植物細胞及びその再生植物、好ましくは誘導性プロモーター及び／又は構成的活性分裂組織プロモーターであり得る分裂組織プロモーターの制御下にある、ＭＡＤ７−エンドヌクレアーゼをコードする配列を含む任意の後代、子孫、バリアント、及び変異体である。したがって、本発明はまた、本明細書で定義したＭＡＤ７−エンドヌクレアーゼをコードする配列をそのゲノムに組み込むステップを含む、そのようなトランスジェニック植物細胞及び／又はそれに由来する植物を生産するための方法に関する。
【０１２６】
本発明の方法によって得ることができる細胞又は生物体は、続いて、例えば、細胞、生物体（の一部）又はその任意の子孫の培養物が得られるように増殖させることができる。
【０１２７】
好ましくは、細胞は、作物植物、例えば単子葉植物若しくは双子葉植物、又は作物若しくは穀物植物、例えばキャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、大豆、小麦、オート麦若しくは米から得ることができる植物細胞である。植物細胞はまた、藻類、樹木、又は生産の植物、果物若しくは野菜（例えば、樹木、例えば柑橘類の樹木、例えばオレンジ、グレープフルーツ若しくはレモンの樹木、桃若しくはネクタリンの樹木；リンゴ若しくはナシの樹木；堅果類の樹木、例えばアーモンド若しくはクルミ若しくはピスタチオの樹木；イヌホオヅキ植物；アブラナ属の植物；レタス属の植物；ホウレンソウ属の植物；トウガラシ属の植物；ナス属の植物、好ましくはソラヌム・リコペルシクム）であり得る。
【０１２８】
別の好ましい実施形態では、細胞は、シロイヌナズナ、アスパラガス、大麦、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、チコリ、ココア、コーヒー、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ、ラズベリー、コメ、ライムギ、モロコシ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ピーマン、タバコ、トマト、スイカ、小麦、及びズッキーニからなる群から選択される植物から得ることができる。
本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる植物細胞又は植物の後代に関する。さらに、本発明は、本明細書で定義した植物細胞又は植物から得ることができる植物産物、例えば、果実、葉、植物器官、植物油脂、植物油、植物デンプン、及び粉砕、磨砕されたか、完全なままであるか、他の材料と混合された、乾燥された、凍結された植物タンパク質画分に関する。これらの産物は繁殖しない物であり得る。好ましくは、前記植物産物は、
ｉ）修飾されたＤＮＡ、好ましくは、本明細書で定義した修飾されたＧＯＩ、又はコードされたそれらの産物、
ｉｉ）本明細書で定義したＭＡＤ７−ヌクレアーゼ、及び
ｉｉｉ）ＭＡＤ７−ヌクレアーゼをコードする配列
のうちの少なくとも１つ又は少なくとも一部を含む。
【０１２９】
好ましくは、これらの産物は、修飾されたＤＮＡの少なくとも一部、ＭＡＤ７−ヌクレアーゼ又はコード配列を含み、これは、植物産物が本明細書で定義した方法によって得られた植物に由来することを評価することを可能にする。
【０１３０】
キットオブパーツ
本発明はまた、キットオブパーツ、好ましくは、本明細書に記載した方法において使用するためのキットオブパーツに関する。好ましくは、キットオブパーツは、
本明細書で定義したＭＡＤ７−ヌクレアーゼを含む容器；
本明細書で定義したＭＡＤ７−ヌクレアーゼを誘導するためのｃｒＲＮＡ、本明細書で定義したＯＤＴＮＥのための一本鎖オリゴヌクレオチド、本明細書で定義したＨＲのための一本鎖オリゴヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを含む容器（好ましくは、容器は、異なる標的配列を標的とするための異なるガイド配列をそれぞれ含む２つ以上のｃｒＲＮＡを含む）；
本明細書で定義したＭＡＤ７−ヌクレアーゼをコードする１つ又は複数の核酸構築物又はベクターを含む容器（任意選択で、前記構築物又はベクターは、本明細書で定義した前記ＭＡＤ７−ヌクレアーゼを誘導するための１つ又は複数のｃｒＲＮＡをさらにコードする）；及び、
本明細書で定義した前記ＭＡＤ７−ヌクレアーゼを誘導するための１つ又は複数のｃｒＲＮＡをコードする１つ又は複数の核酸構築物又はベクターを含む容器
のうちの少なくとも１つを含む。
【０１３１】
キットオブパーツは、本明細書で定義したトランスフェクションのための１つ又は複数の物質を含む容器をさらに含んでいてもよい。また、本明細書で指定した植物細胞内のＤＮＡを修飾する本発明の方法を実施するためのマニュアルもキット内に含むことができる。
【０１３２】
試薬は、凍結乾燥された形態で存在していてもよく、又は適切な緩衝液中に存在していてもよい。キットはまた、本発明を実施するのに必要な任意の他の構成要素、例えば、緩衝液、ピペット、マイクロタイタープレート、及び書面の説明書を含むことができる。本発明のキットのためのそのような他の構成要素は、当業者には公知である。
【０１３３】
本発明をここで一般的に説明したが、例示として提供され、また本発明を限定することを意図するものではない以下の実施例を参照することによって、本発明はより容易に理解されよう。
【実施例】
【０１３４】
実施例１
トマトに標的化変異を生成するためのＭＡＤ７の使用
構築物
トマトでの翻訳に向けて最適化された、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＭＡＤ７及びＡｓＣｐｆ１の配列を、ＭＡＤ７及びＡｓＣｐｆ１のタンパク質配列についてはそれぞれ配列番号３及び配列番号５により示し、Ｍａｄ７及びＡｓＣｐｆ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列についてはそれぞれ配列番号４及び配列番号６により示している。これらのＯＲＦを合成し、植物細胞で発現させるためにベクターで構成的３５Ｓプロモーターの後ろにクローニングした。使用したｃｒＲＮＡカセットの配列（Ｕ６プロモーター＋ｃｒＲＮＡ）を表１に示す。これらもまた合成し、ベクターにクローニングした。すべてのプラスミド構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入し、次いで形質転換したコロニーを使用して５０ｍｌの培養物に接種した。一晩増殖させた後、プラスミドＤＮＡを、標準的な方法を使用してこれらの培養物から単離した。
【０１３５】
【表１】
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【０１３６】
トマトプロトプラスト単離及びトランスフェクション
トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）のＭｏｎｅｙｂｅｒｇ種のｉｎ  ｖｉｔｒｏシュート培養は、高プラスチック容器に０．８％寒天を含むＭＳ２０培地において、２０００ルクスの光周期１６／８ｈで、２５℃及び６０〜７０％ＲＨにて維持した。若葉（１ｇ）を主脈（ｍｉｄ  ｎｅｒｖｅ）に対して垂直方向に静かにスライスし、酵素混合物の浸透を促進した。スライスした葉を酵素混合物（２％セルラーゼＯｎｏｚｕｋａ  ＲＳ、０．４％マセロザイムＯｎｏｚｕｋａ  Ｒ１０を含むＣＰＷ９Ｍ）に移し、細胞壁消化を暗所で２５℃にて一晩進行させた。プロトプラストを５０μｍのナイロン篩で濾過し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって回収した。プロトプラストをＣＰＷ９Ｍ（Ｆｒｅａｒｓｏｎ、１９７３）培地に再懸濁し、３ｍＬのＣＰＷ１８Ｓ（Ｆｒｅａｒｓｏｎら  １９７３．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３３：１３０〜１３７）を各チューブの底に長首ガラスパスツールピペットを使用して加えた。生存プロトプラストは、８００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、ショ糖とＣＰＷ９Ｍ培地の間の界面の細胞画分として回収した。プロトプラストをカウントし、ＭａＭｇ（Ｎｅｇｒｕｔｉｕら  １９８７．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ８：３６３〜３７３）培地に１ｍＬあたり１０６個の最終密度で再懸濁した。
【０１３７】
プロトプラストトランスフェクションについては、１０μｇのＭＡＤ７又はＡｓＣｐｆ１発現プラスミドと２０μｇのｓｇＲＮＡ発現プラスミドの１つを５００μＬ（５０００００プロトプラスト）のプロトプラスト懸濁液と混合し、次いで５００μＬのＰＥＧ溶液（４００ｇ／ｌのポリ（エチレングリコール）４０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃８１２４０；０．１Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）２））を添加し、トランスフェクションを２０分間、室温で行った。対照サンプルはまた、プラスミドの一方又は両方をトランスフェクションから省くことにより生成した。次いで、０．２７５ＭのＣａ（ＮＯ３）２溶液１０ｍＬを添加し、完全に、しかし穏やかに混合した。プロトプラストを５分間８００ｒｐｍで遠心分離することにより回収し、９Ｍの培養培地に０．５×１０６／ｍｌの密度で再懸濁し、直径４ｃｍのペトリ皿に移し、等量の２％アルギン酸塩溶液（２０ｇ／ｌ  Ａｌｇｉｎａｔｅ−Ｎａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃Ａ０６８２）、０．１４ｇ／ｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、９０ｇ／ｌのマンニトール）を添加した。次いで、１ｍｌアリコート（１２５０００個のトランスフェクトされたプロトプラスト）をＣａ−Ａｇａｒプレート（７２．５ｇ／ｌ  マンニトール、７．３５ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、８ｇ／ｌ  寒天、ｐＨ５．８）に広げ、１時間重合させた。次いで、包埋されたプロトプラストを含むアルギン酸塩ディスクを、４ｍｌのＫ８ｐ（Ｋａｏら  １９７５．  Ｐｌａｎｔａ，  １２６：１０５〜１１０）培地を含む４ｃｍの組織培養皿に移した。標的配列でのインデル形成の頻度を決定するため、トランスフェクトされたプロトプラストのディスクを４８時間後に皿から取り出し、アルギン酸塩を溶解させ、プロトプラストを遠心分離により単離した。カルスを再生させるため、プロトプラストをＫ８ｐ培地中で２１日間、２８℃で暗所にてインキュベートする。この期間の後、トランスフェクトされたプロトプラストのディスクを、１ｍｇ．ｌ−１のゼアチン、０．２ｍｇ．ｌ−１のＧＡ３及び２０ｎＭのクロルスルフロンを補充した固形ＧＭ培地（Ｔａｎら  １９８７．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ６：１７２〜１７５）に移す。次いで、生存しているカルスがピンセットで採取するのに十分な大きさになるまで、ディスクを同じＧＭ培地の新しいプレートに３週間ごとに移し、その後、ＧＭ培地で遺伝子型判定するために増殖させる。標的部位に変異を含有するカルスが同定されたら、その後、繁殖力のある植物に再生される。カルスは、最初のシュートが成長するまで、除草剤を含まないＧＭ培地で維持する。次いで、シュートが成長したカルスを、２ｍｇ．ｌ−１のゼアチン及び０．１ｍｇ．ｌ−１のＩＡＡ培地を補充したＭＳ培地に置いた。しばらくした後、再生トマト苗木を切り取り、０．５ｍｇ．ｌ−１のＩＢＡを補充したＭＳ培地で根ざさせた後、温室に移した。
【０１３８】
プロトプラスト及びカルスの遺伝子型判定
全ゲノムＤＮＡを、トマトプロトプラスト（トランスフェクションの４８時間後）からＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。次いで、このｇＤＮＡをＰＣＲ反応で使用し、いずれかの標的領域を増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をテンプレートとして使用して各サンプルからライブラリーを生成し、次にこれをプールし、ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で１２６ｎｔ  ｐａｉｒｅｄ  ｒｕｎを使用して配列決定した。各サンプルは、固有の５ｂｐタグを使用して同定された。配列決定後、各サンプルから得た読み取りデータを処理して、標的部位に存在する配列変化の数及びタイプを同定した。標的部位に変異を有するカルスを同定するために、トランスフェクトされたプロトプラストを直径およそ３ｍｍのカルスに再生させる。次いで、ダイレクトＰＣＲキット（Ｐｈｉｒｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を遺伝子特異的プライマーと一緒に使用してそれぞれのカルスから標的配列を増幅する。次いで、得られたＰＣＲ産物を異なる方法で配列決定又は遺伝子型決定し、標的部位に変異を有するカルスを同定する。これらのカルスを次いで再生のために選択する。
【０１３９】
結果
本発明者らは、クラスＶ−ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＭＡＤ７がゲノム植物細胞のＩＮＤＥＬ変異を生成する能力を、トマトプロトプラストで異所的に７つの異なる配列を標的とするＭＡＤ７タンパク質及びｃｒＲＮＡを発現させることにより試験した。最初に、トマトでのコドン利用に最適化されたＭＡＤ７  ＯＲＦを、Ｃ末端で融合した核局在化シグナル（ＮＬＳ）とともに構築した。次いで、これを、植物細胞で発現させるために、構成的ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの後ろにクローニングした。ＭＡＤ７タンパク質は、標的配列に隣接するＰＡＭ配列、この場合にはＴＴＴＮ、の存在を必要とし、これは、植物細胞並びに他の真核細胞のタイプで有効であることが報告されている別のクラスＶ−ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ  ＡｓＣｐｆ１のＰＡＭと同一である。この共通のＰＡＭ配列により、ＭＡＤ７とＡｓＣｐｆ１の両方に全く同じ標的配列を含有するｃｒＲＮＡを設計することができ、その結果、それぞれのヌクレアーゼによって生成される変異誘発効率の直接比較を実施することができる。ＭＡＤ７又はＡｓＣｐｆ１のいずれかを発現するベクターを、トマト葉肉プロトプラストに、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＵ６プロモーターによって駆動されるｃｒＲＮＡを発現する第２のベクターとともに導入した。そのようなシステムにおいて、ＭＡＤ７又はＡｓＣｐｆ１  ｍＲＮＡとｃｒＲＮＡは、２４〜４８時間の短い期間で、高レベルで発現し、その時点で、導入されたプラスミドは細胞ヌクレアーゼによって分解され、ＣＲＩＳＰＲ試薬は細胞から消失する。それらが存在している間は、それらはゲノムの特定の標的部位を見つけて、ＩＮＤＥＬ変異を生成することができる。導入されたプラスミドはゲノムに組み込まれることは稀であり、そのため、この手法はトランスジェニック系統をもたらさない。次いでプロトプラストを４８時間培養した後、標的部位でのＩＮＤＥＬの存在について配列決定することにより分析した。
【０１４０】
全体で、トマトゲノムの４つの異なる遺伝子（ＰＤＳ、ＬＩＮ５、ｅＩＦ４ｅ、及びＥＴＲ１）のエクソンに位置する、７つの異なる標的部位を調査した。図１に示したように、ＭＡＤ７のクラスＶ−ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、様々な効率で７つのすべての標的部位にＩＮＤＥＬ変異を導入することができた。驚いたことに、ＭＡＤ７を使用する場合のＩＮＤＥＬ形成の効率は、ほぼすべての場合において、同じ配列がＡｓＣｐｆ１のクラスＶ−ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して標的化された場合よりも高かった。いくつかの刊行物には、植物及び他の真核細胞タイプにおけるＡｓＣｐｆ１の使用が報告されているが、本発明者らのデータは、ＭＡＤ７が予期せず優れており、したがって植物での変異誘発実験により適していることを示している。表２は、ＭＡＤ７とＡｓＣｐｆ１の両方により標的部位で導入されるＩＮＤＥＬ変異のタイプをまとめている。いずれかのヌクレアーゼにより生成されるＩＮＤＥＬのサイズ及び位置は類似しており、ほとんどの場合、コード配列でのフレームシフトの導入に基づいた遺伝子活性（ヌル対立遺伝子）の排除を引き起こす。ＭＡＤ７  ＩＮＤＥＬ変異を担持する植物を生成するために、トマト葉肉プロトプラストにＭＡＤ７発現ベクター及び適切な標的部位に関するｃｒＲＮＡ発現ベクターをトランスフェクトした後、カルスに成長させる。次いで、これらのカルスは遺伝子型判定され、ＩＮＤＥＬ変異を含有するものは無傷の植物に再生される。
【０１４１】
【表２】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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