(57)【要約】【課題】試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する方法及び装置を提供する。【解決手段】データセットに対する非線形関数のフィッティング正確度をターゲット分析物分析のための直接の指標として用いて、偽陽性及び偽陰性結果、特に偽陽性結果無しでターゲット分析物を分析することができる。
2021500869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含む試料内ターゲット分析物の分析方法：
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階；前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットを補正する段階；
前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成する段階；
前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のフィッティング正確度を決定する段階；及び
前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階。
【請求項２】
前記非線形関数は、シグモイド（ｓｉｇｍｏｉｄ）関数であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シグモイド関数は、次の式３で表示される４個のパラメータを含むシグモイド関数であることを特徴とする、請求項２に記載の方法：
【数１】
2021500869.tif 000038
前記式で、ｆ（ｘ）はフィッティング関数としてシグモイド関数を表し；ｘは前記信号−発生反応のサイクル番号を表し；そしてａ１、ａ２、ａ３及びａ４はそれぞれ独立して前記シグモイド関数のパラメータを表す。
【請求項４】
前記フィッティング正確度は、前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のｘ２値（ｃｈｉ  ｓｑｕａｒｅ  ｖａｌｕｅ）又はＲ２値（Ｒ−ｓｑｕａｒｅ  ｖａｌｕｅ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在の決定は、前記フィッティング正確度を前記フィッティング正確度に対する閾値と比較して行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在の決定は、前記フィッティング正確度を前記フィッティング正確度に対する閾値と比較し、前記フィッティング正確度が前記閾値を超えるか否か判断して行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在の決定は、（ｉ）前記データセット、前記補正されたデータセット又は前記非線形関数の変位（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）及び（ｉｉ）前記非線形関数の最大勾配から構成された群から選ばれる少なくとも一つのパラメータをさらに用いて行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在の決定は、（ｉ）前記データセット、前記補正されたデータセット又は前記４個のパラメータを含むシグモイド関数の変位及び（ｉｉ）前記４個のパラメータを含むシグモイド関数の最大勾配及びａ４から構成された群から選ばれる少なくとも一つのパラメータをさらに用いて行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲット分析物は、ターゲット核酸分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記信号−発生反応は、前記ターゲット核酸分子の増幅によって又は増幅無しで信号値を増幅する過程であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記信号−発生手段は、二合体の形成に依存して信号を生成させることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記信号−発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存して信号を生成させることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記データセットの補正は、次を含む段階によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法：
（ｉ）基準サイクルにおける信号値又は（ｉｉ）前記基準サイクルにおける前記信号値の変形値を用いて標準化係数を生成する段階；及び
前記標準化係数を前記データセットの信号値に適用して前記補正されたデータセットを生成する段階。
【請求項１４】
前記信号−発生反応は、異なる反応環境（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）で同一のターゲット分析物に対する複数の信号−発生反応を含み、前記データセットは複数のデータセットであり、
前記複数のデータセットは前記複数の信号−発生反応の複数のセットから得られ、前記基準サイクル又は前記基準サイクルと前記基準値は、前記複数のデータセットに同一に適用されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の信号−発生反応は、異なる機器、異なる反応チューブ又はウェル、異なる試料、異なる量のターゲット分析物、若しくは異なるプライマー又はプローブを含む異なる反応環境で行われることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記補正されたデータセットは、（ｉ）前記データセットに前記標準化係数を適用して標準化されたデータセットを生成するか、（ｉｉ）前記データセット又は前記標準化されたデータセットをベースライニングして生成されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記データセットは、（ｉ）相対的高温検出温度で検出された信号である第１ターゲット核酸配列に対する信号及び／又は（ｉｉ）相対的低温検出温度で検出された信号から抽出された第２ターゲット核酸配列に対する信号を含み、そして前記第１ターゲット核酸配列及び前記第２ターゲット核酸配列は１つの反応容器から検出されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１ターゲット核酸配列に対する信号及び前記第２ターゲット核酸配列に対する信号は次の段階によって得られることを特徴とする、請求項１７に記載の方法：
（ａ）前記反応容器で前記第１ターゲット核酸配列に対する信号を発生可能な第１信号−発生手段及び前記第２ターゲット核酸配列に対する信号を発生可能な第２信号−発生手段を前記試料と共にインキュベーションし、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で信号を検出する段階；前記第１ターゲット核酸配列及び第２ターゲット核酸配列のそれぞれは、相応する信号−発生手段によって検出され、前記第１信号−発生手段は、前記第１ターゲット核酸配列が前記試料に存在する場合に、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で信号を発生させ、前記第２信号−発生手段は、前記第２ターゲット核酸配列が前記試料に存在する場合に、前記相対的低温検出温度で信号を発生させ、
（ｂ）前記相対的低温検出温度で検出された信号が、第１閾値、又は第１信号変位によって定義された第１基準を満たすか否かを識別する段階；前記相対的低温検出温度で検出された信号が前記第１基準を満たすとき、次の段階（ｃ）を進行し、前記相対的低温検出温度で検出された信号が前記第１基準を満たさないとき、前記第１ターゲット核酸配列及び前記第２ターゲット核酸配列が前記試料内に存在しないと決定され、次の段階（ｃ）を進行しなく；及び
（ｃ）（ｉ）前記相対的低温検出温度で検出された信号から前記第１ターゲット核酸配列に対する信号を除去するための基準値及び（ｉｉ）前記相対的低温検出温度で検出された信号を用いて前記相対的低温検出温度で検出された信号から前記第２ターゲット核酸配列に対する信号を抽出する段階。
【請求項１９】
前記第２ターゲット核酸配列に対する信号は次の式６によって提供されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法：
【数２】
2021500869.tif 000039
【請求項２０】
前記ベースライニングは、対称軸を有する二次関数を用いて行われることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
次を含む試料内ターゲット分析物の分析装置：
メモリー；及び
プロセッサ；
前記メモリーは、前記ターゲット分析物に対するデータセットを保存し、前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、そして
前記プロセッサは、前記データセットを補正し、前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成し、前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のフィッティング正確度を決定し、前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する。
【請求項２２】
次の段階を含む方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取り可能な記録媒体：
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階；前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットを補正する段階；
前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成する段階；
前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のフィッティング正確度を決定する段階；及び
前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階。
【請求項２３】
次の段階を含む試料内ターゲット分析物の分析方法：
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階；前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットにフィッティングされた二次関数を生成する段階；及び
前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する段階。
【請求項２４】
前記二次関数は対称軸を有することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記フィッティング区間は、開始フィッティングサイクル（Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＳＦＣ）から最小フィッティングサイクル（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＭＦＣ）までであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記データセットの変位が前記変位に対する閾値を超える場合、前記フィッティング区間は、開始フィッティングサイクル（Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＳＦＣ）から最小フィッティングサイクル（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＭＦＣ）までであることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法は、前記フィッティング区間で二次関数を生成する段階前に、全領域で前記データセットにフィッティングされた第１二次関数を生成する段階をさらに含み；そして前記フィッティング区間は、前記第１二次関数が最小信号値を有するサイクルに基づいて決定されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法は、前記二次関数のフィッティング正確度を決定する段階をさらに含み；前記フィッティング正確度が前記フィッティング正確度に対する閾値を超える場合、前記二次関数を差し引く段階が行われることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
次を含む試料内ターゲット分析物の分析装置：
メモリー；及び
プロセッサ；
前記メモリーは、前記ターゲット分析物に対するデータセットを保存し、前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、そして
前記プロセッサは、前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットに対してフィッティングされた二次関数を生成し、前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する。
【請求項３０】
次の段階を含む方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取り可能な記録媒体：
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階；前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットに対する二次関数を生成する段階；及び
前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料内ターゲット分析物を分析する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅のために最も多用されている重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）は、二本鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング及びＤＮＡ重合酵素によるプライマー延長の反復したサイクル過程を含む（Ｍｕｌｌｉｓ等、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号；Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３５０−１３５４（１９８５））。
【０００３】
実時間ＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）は試料からターゲット核酸分子を実時間で検出するためのＰＣＲ基盤技術の一つである。特定ターゲット分析物を検出するために、実時間ＰＣＲは、ターゲット分子の量に比例して検出可能な蛍光信号を発生する信号−発生手段を用いる。各測定地点及び当該測定地点における信号値を含むデータセットが得られる。蛍光信号の強度はターゲット分子の量に比例する。データセットから測定地点に対する蛍光信号の強度を表示した増幅曲線（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）又は増幅プロファイル曲線（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｃｕｒｖｅ）が得られる。
【０００４】
一般に、実時間ＰＣＲによる増幅曲線は、ベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）領域、指数（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）領域、停滞（ｐｌａｔｅａｕ）領域に区分される。指数領域は、ＰＣＲ増幅産物の増加に比例して放出される蛍光信号が増加する領域であり、停滞領域は、ＰＣＲ増幅産物の増加及び蛍光信号の放出が飽和状態に達し、それ以上蛍光信号の増加を示さない領域である。ベースライン領域は、ＰＣＲ初期サイクル中に蛍光信号における変化がほとんどない領域を意味する。ベースライン領域は、ＰＣＲ反応産物の放出する蛍光信号が検出される程度に十分でないため、反応試料自体のの蛍光信号と測定システム自体の蛍光信号である背景信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌ）がベースライン領域の蛍光信号の大部分を占めることがある。
【０００５】
実時間ＰＣＲのデータセットからターゲット分析物の増幅が存在するか否かを判断する様々な方法が開発されている。例えば、閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｖａｌｕｅ）を用いる方法がある。閾値を用いる方法は、分析すべき全ての反応に対する特定の信号閾値（ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ａｌｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｅ  ａｎａｌｙｚｅｄ）をあらかじめ決定し、データセットの信号値が前記特定の信号閾値に到達（ｒｅａｃｈ）するか又は渡過（ｅｘｃｅｅｄ）するかを判断する方法である。しかし、特定の信号閾値を用いて増幅の有無を判断する方法は、次のような判断誤りを有することがある：（ｉ）増幅による信号値ではなく異常信号値又はノイズ信号値が閾値に到達して発生する偽陽性判断；（ｉｉ）ベースライニング（ｂａｓｅｌｉｎｉｎｇ）誤りによる偽陰性判断；及び（ｉｉｉ）異常信号値又はノイズ信号値による誤ったＣｔ（Ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値の算出。また、閾値を用いる方法は、各反応に適用する特定の信号閾値を導出するために、実反応データセットを最大に収集しなければならないという短所もある。
【０００６】
Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｌｅｒｎｅｒは米国登録特許第８，５６０，２４７号において、データに対してフィッティングされる関数を得、該関数の勾配（ｓｌｏｐｅ）が最大増幅勾配境界（ｍａｘｉｍｕｍ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｌｏｐｅ  ｂｏｕｎｄ）を超えるか否かによって、ジャンプエラー（ｊｕｍｐ  ｅｒｒｏｒ）が存在するか否かを決定する方法を開示する。前記方法は、データにフィッティングされた関数を計算する時に、全データではなくベースライン領域で一部のデータにフィッティングされる関数を計算する。前記方法は、データのベースライン領域にフィッティングされた関数の勾配が最大増幅勾配境界を超えるとジャンプエラーが存在すると決定する。したがって、前記方法は、関数の最大増幅勾配を用いて試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定することはできず、ジャンプエラーの存在有無だけを決定することができる。
【０００７】
Ｒｏｎａｌｄ  Ｔ．Ｋｕｒｎｉｋ等は、米国公開特許第２００９−０１１９０２０号においてＰＣＲカーブのような成長曲線（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｕｒｖｅ）のデータが有効（ｖａｌｉｄ）又は有意（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）の成長を示すかを判断する方法を開示した。前記方法は、データと二次関数をフィッティングし、フィッティングされた二次関数を得、二次関数の統計学的に有意な値（例えば、Ｒ−ｓｑｕａｒｅ値）を求めた後に、統計学的に有意な値があらかじめ定められた特定閾値（例えば、０．９０〜０．９９）を超えるか否かを判断する。前記方法では統計学的に有意な値があらかじめ定められた閾値を超える場合には、データに有効又は有意な成長（ｇｒｏｗｔｈ）が存在しないと決定する。前記方法は、データが二次関数と正確にフィッティングされるほどターゲット分析物が不存在する確率が高いので、Ｒ−ｓｑｕａｒｅ（Ｒ２）値が閾値よりも大きい場合、データを切り捨てる（ｄｉｓｃａｒｄ）構成を開示する。しかし、前記方法は、二次関数のフィッティングを用いてターゲット分析物が不存在することだけを決定するので、ターゲット分析物が存在するか否かを判断するためには、Ｃｔ値を求める別の段階を行う必要がある。
【０００８】
実時間ＰＣＲから得られたデータに有意のターゲット分析物の増幅が存在するか否かを判断するための方法としてより効果的な方法が要求される。
【０００９】
蛍光信号を用いた試料の分析は次のように行われる。まず、ＬＥＤなどの光源を用いて発光体にエネルギーを供給し、供給されたエネルギーによって発光体の電子が励起状態から基底状態に戻りながら発光体が特定波長の光を放出（ｅｍｉｔ）する。分析機器は光ダイオード（Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ）又はＣＣＤなどを用いて特定波長の光を電気的信号に変換し、試料分析に必要な情報を提供する。
【００１０】
同一量の発光体が試料から発生しても、機器間光源（例、ＬＥＤ）の光量の差（ｕｎｅｖｅｎ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）、光−電気変換装置の性能偏差（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）によって分析機器ごとに異なる信号値を提供する。機器間の信号差を機器間信号偏差という。
【００１１】
機器間信号偏差だけでなく、単一の同一分析機器によって同種、同量のターゲット分析物に対して行われた複数の反応の分析結果は、信号の偏差を有することもある。なぜなら、反応が行われる機器上の反応ウェルの位置差、又は反応混合物組成又は濃度の微細な差のような様々な反応環境における差異のためである。同一機器内で反応中の信号差を機器内信号偏差という。
【００１２】
測定データの正確且つ高信頼度の分析のためには信号偏差のような問題の解決が必要であり、問題を解決するために様々な方法が用いられている。
【００１３】
最も基本的な方法として、ハードウェア補正方法が用いられる。例えば、分析機器の生産に当たり、ＬＥＤ光源の強度のような各分析機器の一部部品の特性は、同一試料に対する機器間信号偏差が減少し、適切な範囲内で維持されるように補正又は調節される。他の方法は、基準染色剤（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｙｅ）を用いる方法である。一定量の信号を生産する基準染色剤（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｙｅ；例えば、ＲＯＸＴＭ又はフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ））を反応に共に含め、基準染色剤から発生する信号を用いて試料から発生した信号を補正する。
【００１４】
既存の方法はいくつかの限界を有する。ハードウェア補正は正確度に限界があり、分析機器の老朽化によって発生する偏差を除去するために追加の補正が必要である。しかも、ハードウェア補正は機器間信号偏差を減少できるだけで、機器内信号偏差を減少させることはできない。
【００１５】
基準染色剤を用いた信号の補正は、反応当たりの費用が増加し、また各反応に用いられる基準染色剤における量的及び質的偏差（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は他の誤差（ｅｒｒｏｒ）を引き起こすことがある。また、基準染色剤の利用は、前記基準染色剤と反応混合物においてターゲット分析物の存在を決定するために用いられる他の染色剤（ｄｙｅ）間の干渉現象の可能性を増加させることがある。特に、多数の染色剤が用いられ、それらの蛍光を検出しなければならないマルチプレクスＰＣＲでは、干渉現象が非常に重要な問題である。一方、信号補正のために一つの染色剤及び一つの検出チャネルを割り当てると、同時検出可能なターゲットが１つ減るため、製品競争力の側面においてかなりの短所が発生する。
【００１６】
したがって、ハードウェアに対する直接制御、又は追加の基準染色剤の使用無しにデータセットを補正し、機器間及び機器内信号偏差を減少できる新しい方法の開発が必要である。
【００１７】
一方、実時間ＰＣＲデータの正確で再現性（ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ）ある分析のために得られた増幅曲線の一般化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）過程が重要である。得られた増幅曲線は、ベースライン領域を認識する過程及びベースライン領域の背景信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌ）を除去する過程を通じて一般化される。
【００１８】
背景信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌ）は、ＰＣＲ反応時に、反応条件及び環境の変化を反映することから反応ごとに異なり、試料内の核酸量とは関係ないベースライン移動（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｄｒｉｆｔ）が頻繁に現れる。ベースライン移動は、反応間増幅曲線の比較を難しくさせ、ターゲット核酸検出において偽陽性、偽陰性の結果を招きやすい。したがって、ＰＣＲデータ分析において、ベースライン領域の設定及びベースラインに基づく実験データの修正が必要である。
【００１９】
従来の一方法は、ＰＣＲ初期サイクルのうち、任意のサイクル領域（例えば、３〜１５サイクル）をベースラインとして決定するか、或いは増幅曲線を実験者が分析して、任意に、増幅が始まる前の特定サイクル領域をベースラインとして設定した。従来の他の方法は、増幅曲線の二次微分（ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を生成し、特徴を有するポイントをベースラインの端にしてベースライン領域を決定した（米国特許登録公報第８，２１９，３２４号）。
【００２０】
既存の方法はいくつかの短所がある。
【００２１】
全てのベースラインを任意サイクル領域として決定する方法は、反応ごとに異なる背景信号の変化を補正することはできるが、ベースライン移動（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｄｒｉｆｔ）が発生した場合には適切でない。また、増幅領域の開始は、初期試料に存在するターゲット核酸の量によって変わるので、ベースライン領域があらかじめ決定されている場合、あらかじめ決定されたベースライン領域を様々なサンプルに一律的に適用することは好ましくない。
【００２２】
ベースライン領域を実験者が任意に決定する場合、同一増幅曲線であっても分析する実験者によってベースライン領域設定が変わることがあり、実験者の決定によって実際増幅産物の量が変わり得るので、信頼できる結果が導出し難い。
【００２３】
または、従来の他の方法によれば、ベースラインが複雑なアルゴリズムによって決定されるが、アルゴリズムには明確に定義されない多くのパラメータが必要であり、しばしば最適化し難くなる。
【００２４】
したがって、客観的且つ正確な実験結果を算出するために、サンプル別に客観的なベースライン領域設定による新しい増幅曲線補正方法が必要である。
【００２５】
ターゲット核酸配列の検出のために、実時間方式でターゲット増幅をモニタリングしながらターゲット核酸配列を検出する実時間検出方法が広く用いられている。実時間検出方法は一般に、ターゲット核酸配列と特異的に混成化される標識されたプローブ又はプライマーを使用する。標識されたプローブとターゲット核酸配列間の混成化を用いる方法の例として、ヘアピン構造を有する二重標識されたプローブを用いたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ方法（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖ．１４ＭＡＲＣＨ  １９９６）、ＨｙＢｅａｃｏｎ方法（Ｆｒｅｎｃｈ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ，１５（６）：３６３−３７４（２００１））、供与体及び受容体でそれぞれ標識された２個のプローブを用いた混成化プローブ方法（Ｂｅｒｎａｄ  ｅｔ  ａｌ，１４７−１４８  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０００；４６）及び単一標識されたオリゴヌクレオチドを用いたＬｕｘ方法（米国特許第７，５３７，８８６号）がある。また、二重標識されたプローブとＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼの活性による前記プローブの切断を用いたＴａｑＭａｎ方法（米国特許第５，２１０，０１５号及び第５，５３８，８４８号）が本技術分野で広く用いられている。
【００２６】
標識されたプライマーを用いた方法の例には、Ｓｕｎｒｉｓｅプライマー方法（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ，２５１６−２５２１  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，ｖ．２５  ｎｏ．１２、及び米国特許第６，１１７，６３５号）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー方法（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ，８０４−８０７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖ．１７  ＡＵＧＵＳＴ  １９９９及び米国特許第６，３２６，１４５）及びＴＳＧプライマー方法（ＷＯ２０１１／０７８４４１）がある。
【００２７】
代案の方法として、ターゲット核酸配列の存在によって形成される二合体（ｄｕｐｌｅｘ）を用いた実時間検出方法が提案されてきた：Ｉｎｖａｄｅｒ分析（米国特許第５，６９１，１４２号、第６，３５８，６９１号及び第６，１９４，１４９号）、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ＡＮＤ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）方法（ＷＯ２０１２／０９６５２３）、ＰＣＥ−ＳＨ（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＷＯ２０１３／１１５４４２）、ＰＣＥ−ＮＨ（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／０１２３１２）。
【００２８】
従来の実時間検出技法はターゲット増幅と関連又は非関連している信号増幅工程において一つの選択された検出温度で蛍光標識から生成された信号を検出する。従来の実時間検出技術によって単一反応容器内で単一類型の標識を用いて多数のターゲット核酸配列を検出するとき、これらのターゲット核酸配列に対して生成された信号は互いに区別されない。したがって、従来の実時間検出技法は一般の多数のターゲット核酸配列を検出するために異なる類型の標識を用いる。Ｔｍ差を用いたメルティング分析は、単一類型の標識を用いる場合にも多数のターゲット核酸配列を検出可能にする。しかしながら、メルティング分析は実時間技術に比べて長い時間がかかり、ターゲット配列が増加するほど、異なるＴｍを有するプローブの設計がさらに難しくなるという深刻な短所がある。
【００２９】
したがって、メルティング分析に依存しない、単一反応容器内で単一類型の標識及び単一類型の検出器を用いて多数のターゲット核酸配列を検出する方法が開発されると、著しく向上した便宜性、費用効果及び効率性をもって多数のターゲット核酸配列を検出可能になるだろう。また、前記方法を他の検出方法（例えば、メルティング分析）と組み合わせると、非常に向上した効率で単一反応容器で単一類型のラベルを用いて多数のターゲット核酸配列を検出可能になるであろう。
【００３０】
本明細書全体を通じて様々な論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照として挿入され、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明者らは、信号−発生反応から得たデータセットから誤り無しで（特に、偽陽性無しで）ターゲット分析物を分析できる技術を開発しようと努力した。特に、本発明者らは、核酸増幅反応においてＣｔ値を得るための閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）の設定による従来の方法における問題点及び短所を克服しようと努力した。その結果、本発明者らは、信号−発生反応から得たデータセット又は加工されたデータセット（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｄａｔａ  ｓｅｔ）に対する非線形関数のフィッティング正確度（ｆｉｔｔｉｎｇ  ａｃｃｕｒａｃｙ）が、試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定できる指標（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）になり得ることを糾明した。本発明者らは、特に、核酸増幅反応においてＣｔ値を得るための閾値の設定なしにもフィッティング正確度を用いてターゲット分析物の存在又は不存在を決定できることを糾明し、上述した従来の問題点を解決できることを糾明した。
【００３２】
したがって、本発明の目的は、試料内ターゲット分析物の分析方法を提供することにある。
【００３３】
本発明の他の目的は、試料内ターゲット分析物の分析装置を提供することにある。
【００３４】
本発明のさらに他の目的は、試料内ターゲット分析物の分析を実行するためのコンピュータ読取り可能な記録媒体を提供することにある。
【００３５】
本発明の他の目的及び利点は、下記の実施例、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
Ｉ．非線形関数を用いて試料内ターゲット分析物を分析する方法
本発明の一態様によれば、本発明は、次の段階を含む試料内ターゲット分析物の分析方法を提供する：
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階；前記データセットは、信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットを補正する段階；
前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成する段階；
前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のフィッティング正確度を決定する段階；及び
前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階。
【００３７】
本発明は“ターゲット分析物を分析する方法”と表現されるが、分析結果が究極的にターゲット分析物の検出に用いられることから、“ターゲット分析物の分析方法”又は“ターゲット分析物の検出方法”と表現されてもよい。
【００３８】
図３は、本発明の方法に対する順序図である。図３を参照して、本発明の方法を各段階別に詳細に説明すると、次の通りである。
【００３９】
ターゲット分析物に対するデータセットを取得（段階３１０）
本発明によれば、ターゲット分析物に対するデータセットを得る。前記データセットは信号−発生手段を用いる前記ターゲット分析物に対する信号−発生反応から得られ、前記データセットは、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含む。
【００４０】
本明細書において用語“ターゲット分析物（ｔａｒｇｅｔ  ａｎａｌｙｔｅ）”は、様々な物質（例えば、化合物のような生物学的物質及び非生物学的物質）を含み、具体的に生物学的物質、より具体的に核酸分子（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、アミノ酸、生物学的化合物、ホルモン、抗体、抗原及び代謝物質である。最も具体的に、ターゲット分析物はターゲット核酸分子である。
【００４１】
本明細書において用語“ターゲット核酸分子”、“ターゲット核酸”、“ターゲット核酸配列”又は“ターゲット配列”は、分析、検出又は定量しようとする核酸配列を意味する。ターゲット核酸配列は、一本鎖又は二本鎖であり得る。ターゲット核酸配列は、試料内に初期に存在する配列だけでなく、反応過程で生成された配列も含む。
【００４２】
ターゲット核酸配列は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子及びそれらの混成体（キメラ核酸）を含む。前記配列は、二本鎖又は一本鎖の形態であり得る。出発物質として前記核酸配列が二本鎖である場合、前記二本鎖を一本鎖又は部分的一本鎖に変成させることができる。変性過程は、従来技術によって実施でき、例えば、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコキサル処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼの作用）及び結合タンパク質を含むが、これに限定されるものではない。例えば、変性は、８０〜１０５℃の温度で熱処理して達成され得る。このような処理の一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）に開示されている。
【００４３】
ターゲット核酸配列は、いかなる自然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物及びヒトを含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタイン−バーウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸又はウイロイド核酸をも含む。ターゲット核酸配列は、組換え方法又は化学的合成法で製造された又は製造可能な核酸分子を含む。したがって、ターゲット核酸配列は自然界に存在したり非存在するものであり得る。ターゲット核酸配列は公知又は非公知の配列を含む。
【００４４】
本明細書において用語“試料”とは、生物学的試料（例えば、細胞、組織及び体液）及び非生物学的試料（例えば、食べ物、水及び土壌）を含み、前記生物学的試料は、例えば、ウイルス、細菌、組織、細胞、血液（全血、血漿及び血清を含む）、リンパ、骨髄液、唾液、喀痰（ｓｐｕｔｕｍ）、スワブ（ｓｗａｂ）、吸引液（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）、牛乳、小便（ｕｒｉｎｅ）、糞便（ｓｔｏｏｌ）、眼球液、精液、脳抽出物、脊髄液、関節液、胸腺液、気管支洗浄液、腹水及び羊水である。ターゲット分析物がターゲット核酸分子である場合、前記試料は核酸抽出（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）過程を経ることができる（参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１））。前記核酸抽出過程は試料の種類によって変わり得る。また、前記抽出された核酸がＲＮＡである場合、ｃＤＮＡを合成するための逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）過程をさらに経ることができる（参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１））。
【００４５】
本明細書において用語“信号−発生反応”は、試料内ターゲット分析物の特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）に依存して信号を発生させる反応を意味する。前記特性は、例えばターゲット分析物の活性、量又は存在（又は不存在）であり、具体的に、試料内ターゲット分析物の存在又は不存在である。本発明の信号−発生反応は、生物学的反応及び化学的反応を含む。前記生物学的反応はＰＣＲ、実時間ＰＣＲ、マイクロアレイ及びインベーダー（ｉｎｖａｄｅｒ）分析のような遺伝的分析過程、免疫学的分析過程及びバクテリア成長分析を含む。前記化学的反応は、化学物質の生成、変化又は破壊を含む化学的分析過程を含む。本発明の一具現例によれば、信号−発生反応は遺伝的分析過程である。
【００４６】
本発明の一具現例によれば、前記信号−発生反応は、核酸増幅反応、酵素反応又は微生物成長である。
【００４７】
信号−発生反応は信号変化を伴う。本明細書において用語“信号”とは、測定可能なアウトプット（ｏｕｔｐｕｔ）を意味する。
【００４８】
信号−発生反応の進行程度は信号を測定して評価される。信号値又は信号変化はターゲット分析物の特性、具体的に存在又は不存在を定性的に又は定量的に示す指示子の役割を担う。前記信号変化は、信号の増加の他に減少も含む。
【００４９】
本明細書において用語“信号−発生手段”は、分析しようとするターゲット分析物の特性、具体的に存在又は不存在を示す信号の発生に用いられる物質を意味する。
【００５０】
様々な信号−発生手段が知られている。信号−発生手段は標識を含む。前記標識は、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学的標識及び金属標識を含む。単一標識、又は供与分子（ｄｏｎｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）及び受容分子（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む相互作用的な二重標識が一つ以上のオリゴヌクレオチドに結合した形態で用いられ得る。または、インターカレーティング染料（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｙｅ）自体も信号−発生手段としての役割を担うことができる。前記信号−発生手段は、信号を発生させるために、核酸切断活性を有する酵素（例えば、５’核酸切断活性を有する酵素又は３’核酸切断活性を有する酵素）及びオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー及びプローブ）をさらに含むことができる。
【００５１】
信号−発生手段としての役割を担うオリゴヌクレオチドの例には、ターゲット核酸配列に特異的に混成化するオリゴヌクレオチドを含む（例えば、プローブ及びプライマー）；ターゲット核酸配列に混成化されたプローブ又はプライマーが切断されて断片を放出した場合、信号−発生手段としての役割を担うオリゴヌクレオチドは、前記断片に特異的に混成化されるキャプチャーオリゴヌクレオチドを含む；前記キャプチャーオリゴヌクレオチドに混成化された断片が延長されて延長鎖を生成する場合に、信号−発生手段としての役割を担うオリゴヌクレオチドは、前記延長鎖に特異的に混成化されるオリゴヌクレオチドを含む；信号−発生手段としての役割を担うオリゴヌクレオチドは、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドに特異的に混成化されるオリゴヌクレオチドを含む；そして、信号−発生手段としての役割を担うオリゴヌクレオチドは、その組合せを含む。
【００５２】
本発明の一具現例によれば、前記信号−発生手段は、蛍光標識を含む。より具体的に、前記信号−発生手段は、蛍光単一標識、又は供与分子（ｄｏｎｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）及び受容分子（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む相互作用的な二重標識（例えば、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識）を含む。
【００５３】
前記信号−発生手段を用いてターゲット分析物、特にターゲット核酸分子の存在を示す信号を発生させる様々な方法が知られている。これらの方法は次を含む：ＴａｑＭａｎプローブ方法（米国特許第５，２１０，０１５号）、分子ビーコン方法（Ｔｙａｇｉ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０３（１９９６））、スコルピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）方法（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８０４−８０７（１９９９））、サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ又はＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）方法（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５（１２）：２５１６−２５２１（１９９７）、及び米国特許第６，１１７，６３５号）、ルクス（Ｌｕｘ）方法（米国特許第７，５３７，８８６号）、ＣＰＴ（Ｄｕｃｋ  Ｐ、等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９：１４２−１４８（１９９０））、ＬＮＡ方法（米国特許第６，９７７，２９５号）、プレクサー（Ｐｌｅｘｏｒ）方法（Ｓｈｅｒｒｉｌｌ  ＣＢ、等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２６：４５５０−４５５６（２００４））、Ｈｙｂｅａｃｏｎｓ方法（Ｄ．Ｊ．Ｆｒｅｎｃｈ、等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００１）１３，３６３−３７４及び米国特許第７，３４８，１４１号）、二重標識された自己−クエンシングされたプローブ方法（Ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ，ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｐｒｏｂｅ；米国特許第５，８７６，９３０号）、混成化プローブ方法（Ｂｅｒｎａｒｄ  ＰＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０００，４６，１４７−１４８）、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）方法（ＷＯ２０１２／０９６５２３）、ＰＣＥ−ＳＨ（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＷＯ２０１３／１１５４４２）、ＰＣＥ−ＮＨ（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／０１２３１２）及びＣＥＲ方法（ＷＯ２０１１／０３７３０６）。
【００５４】
本発明の一具現例によれば、前記信号−発生反応は、前記ターゲット核酸分子の増幅により又は増幅無しで信号値を増幅する反応である。
【００５５】
本明細書において用語“増幅反応”は、信号を増加又は減少させる反応を意味する。
【００５６】
本発明の一具現例によれば、前記増幅反応は、ターゲット分析物の存在に依存して前記信号−発生手段によって発生する信号の増加（又は増幅）反応を意味する。このような増幅反応はターゲット分析物（例えば、核酸分子）の増幅が伴われても伴われなくてもよい。より具体的に、本発明において増幅反応は、ターゲット分析物の増幅が伴われる信号の増幅反応を意味する。
【００５７】
本発明の一具現例によれば、ターゲット分析物（例えば、ターゲット核酸分子）の存在を示す信号を増幅させるための増幅反応は、ターゲット核酸分子が増幅されながら信号も増幅される方法で実施され得る（例えば、実時間ＰＣＲ方法）。または、前記増幅反応は、ターゲット分析物が増幅されず、信号だけが増幅される方法で実施されてもよい［例えば、ＣＰＴ方法（Ｄｕｃｋ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９：１４２−１４８（１９９０））、インベーダーアッセイ（Ｉｎｖａｄｅｒ  ａｓｓａｙ）（米国特許第６，３５８，６９１号及び第６，１９４，１４９号）］
ターゲット分析物、特にターゲット核酸分子は様々な方法で増幅され得る。例えば、ターゲット分析物の増幅に対する様々な方法が知られており、これらの方法は、重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ））、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ））（米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０））、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ））（Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１６９１−６（１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ３（１）：１−６（１９９３））、転写媒介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｐｈｙｆｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：８３４−８４１（１９９６）；Ｖｕｏｒｉｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：１８５６−１８５９（１９９５））、核酸配列基盤増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ））（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３５０（６３１３）：９１−２（１９９１））、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＲＣＡ）（Ｌｉｓｂｙ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（１）：７５−９９（１９９９）；Ｈａｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１５（２）：３５−４０（１９９９））及びＱ−べータレプリカーゼ（Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１１９７（１９８８））を含むが、これに限定されない。
【００５８】
本発明の一具現例によれば、前記増幅反応は、ターゲット分析物（具体的に、ターゲット核酸分子）の増幅が伴われながら信号を増幅する。本発明の一具現例によれば、前記増幅反応はＰＣＲ又は実時間ＰＣＲによって実施される。
【００５９】
本発明の一具現例によれば、前記信号−発生手段は二合体（ｄｕｐｌｅｘ）の形成に依存して信号を生成させる。信号−発生手段と共に使われる表現“二合体の形成に依存して信号を生成”は、検出される信号が２つの核酸分子の結合又は分離に依存して提供されることを意味する。具体的に、信号は、前記ターゲット核酸配列に特異的に混成化された媒介オリゴヌクレオチド（ｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の切断に依存して形成された二合体によって生成される。本明細書において用語“媒介オリゴヌクレオチド（ｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）”とは、ターゲット核酸配列を含まない二合体の生成を媒介するオリゴヌクレオチドである。本発明の一具現例によれば、前記媒介オリゴヌクレオチド自体の切断は信号を生成しなく、前記切断によって形成された断片は、前記媒介オリゴヌクレオチドの混成化及び切断後の信号生成のための連続的な反応に関与する。本発明の一具現例によれば、前記媒介オリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸配列に混成化して切断されて断片を放出して二合体の生成を媒介するオリゴヌクレオチドを含む。具体的に、前記断片は、キャプチャーオリゴヌクレオチド（ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）において前記断片の延長によって二合体の生成を媒介する。本発明の一具現例によれば、前記媒介オリゴヌクレオチドは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的な混成化ヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）及び前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位（ｔａｇｇｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）を含む。本発明の一具現例によれば、媒介オリゴヌクレオチドの切断は、断片を放出し、前記断片はキャプチャーオリゴヌクレオチドに特異的に混成化され、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド上で延長される。本発明の一具現例によれば、ターゲット核酸配列に混成化された媒介オリゴヌクレオチドは切断されて断片を放出し、前記断片はキャプチャーオリゴヌクレオチドに特異的に混成化され、前記断片は延長されて延長鎖を形成し、前記延長鎖及び前記キャプチャーオリゴヌクレオチドとの間に延長二合体を形成して、前記ターゲット核酸配列の存在を示す信号を提供する。二合体の形成に依存して信号を発生する信号−発生手段の代表例は、ＰＴＯＣＥ方法である（ＷＯ２０１２／０９６５２３）。
【００６０】
本発明の一具現例によれば、前記信号−発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存して信号を生成させる。具体的に、前記信号はターゲット核酸配列に前記検出オリゴヌクレオチドの混成化及び前記検出オリゴヌクレオチドの切断によって生成される。ターゲット核酸配列への前記検出オリゴヌクレオチドの混成化及び前記検出オリゴヌクレオチドの切断による信号は、ＴａｑＭａｎプローブ方法（米国特許第５，２１０，０１５号及び第５，５３８，８４８号）を含む様々な方法で生成され得る。
【００６１】
増幅反応によって得るデータセットには増幅サイクル又はサイクル番号が含まれる。
【００６２】
本明細書において用語“サイクル”は、一定の条件の変化を伴った複数の測定において、前記条件の変化単位を指す。前記一定の条件の変化は、例えば、温度、反応時間、反応回数、濃度、ｐＨ及び／又は測定対象（例えば、ターゲット核酸分子）の複製回数などの増加又は減少を意味する。したがって、サイクルは、時間（ｔｉｍｅ）又は過程（ｐｒｏｃｅｓｓ）サイクル、単位運営（ｕｎｉｔ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）サイクル及び再生産（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）サイクルであり得る。
【００６３】
一例として、基質の濃度による酵素の基質分解能力を測定する場合、基質濃度を異ならせて数回酵素の基質分解度合を測定した後、それによって酵素の基質分解能力を分析する。このとき、一定の条件の変化は基質濃度の増加であり、用いられた基質濃度増加単位が１サイクルに設定される。
【００６４】
他の例として、核酸の等温増幅反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の場合、一つの試料を反応時間を異ならせて数回測定でき、この場合、反応時間が条件の変化であり、反応時間単位が１サイクルに設定される。
【００６５】
より具体的に、用語“サイクル”は、一定の過程の反応を反復したり一定の時間間隔基準で反応を反復する場合、前記反復の１単位を意味する。
【００６６】
一例として、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）の場合、１サイクルは、ターゲット核酸分子の変性段階（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、前記ターゲット核酸分子及びプライマー間のアニーリング（混成化）段階及びプライマーの延長段階（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を含む反応単位を意味する。この場合、一定の条件の変化は反応の反復回数の増加であり、前記一連の段階を含む反応の反復単位が１サイクルに該当する。
【００６７】
信号−発生反応から得たデータセットは、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含む。
【００６８】
本明細書において用語“信号の値”又は“信号値”は、信号−発生反応のサイクルにおいて実際的に測定された信号の値（例えば、信号の強度）又はその変形値を意味する。前記変形値は、測定された信号値の数学的に加工された値を含むことができる。測定された信号値の数学的に加工された値の例は、測定された信号値のログ値又は導関数値（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を含むことができる。測定された信号値の導関数値は多重−導関数値を含むことができる。
【００６９】
本明細書において用語“データ地点（ｄａｔａ  ｐｏｉｎｔ）”は、サイクル番号及び信号値を含む一つの座標値（ａ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｖａｌｕｅ）を意味する。用語“データ”とは、データセットを構成する全ての情報を意味する。例えば、増幅反応のサイクル及び信号値はそれぞれデータである。
【００７０】
信号−発生反応、特に増幅反応から得られたデータ地点は、二次元直交座標系に表示可能な座標値で表示され得る。前記座標値においてＸ−軸は増幅反応の当該サイクル数を示し、Ｙ−軸は当該サイクルで測定又は加工された信号値を示す。
【００７１】
本明細書において用語“データセット”とは、前記データ地点の集合を意味する。例えば、データセットは、信号−発生手段を用いる信号−発生反応（例えば、増幅反応）から直接に得られるデータ地点の集合である生データセット（ｒａｗ  ｄａｔａ  ｓｅｔ）を含むことができる。或いは、前記信号−発生反応から直接に得られたデータ地点の集合を含むデータセットの変形によって得られる変形されたデータセットであってもよい。前記データセットは、信号−発生反応から得られるデータ地点又はその変形されたデータ地点の一部又は全体を含むことができる。
【００７２】
データセットはプロットされ得、増幅曲線は前記データセットから得ることができる。
【００７３】
本発明の一具現例によれば、本発明の方法は、データセットを得るための信号−発生反応を行う段階をさらに含む。
【００７４】
データセットを補正（段階３２０）
データセットを補正する。補正されたデータセットは、データセットを標準化（標準化過程）して生成されるか、データセットに含まれたノイズを除去（ノイズ除去過程）して提供され得る。一具現例によれば、データセットは標準化過程及びノイズ除去過程の両方を用いて補正される。標準化過程はノイズ除去過程の前に行わてもよく後に行われてもよい。
【００７５】
（Ａ）データセットの標準化
データセットは公知の様々な方法で標準化され得る。
【００７６】
一具現例によれば、前記データセットの標準化は、本出願人が既に開発したＷＯ２０１７／０８６７６２に開示されたＳＢＮ方法によって実施される。非−線形フィッティング関数を用いる本発明の方法への前記ＳＢＮ方法の適用は、ＷＯ２０１７／０８６７６２及び本特許出願の明細書を参照して当業者にとって容易に実施可能であることが、当業者には理解できよう。前記ＳＢＮ方法の詳細は後述されるだろう。
【００７７】
一具現例によれば、前記データセットの標準化は、次を含む段階によって実施される：（ｉ）基準サイクルにおける信号値又は（ｉｉ）前記基準サイクルにおける前記信号値の変形値を用いて標準化係数を生成する段階；及び前記標準化係数を前記データセットの信号値に適用して前記補正されたデータセットを生成する段階。データセットは第１データセットと表記され、標準化されたデータセットは第２データセットと表記され得る。
【００７８】
（Ａ−１）標準化係数を生成
（ｉ）基準サイクルにおける信号値又は（ｉｉ）基準サイクルにおける信号値の変形値を用いて標準化係数が生成される。
【００７９】
基準サイクルにおける信号値が標準化係数になり得る。基準サイクルにおける信号値をデータセットの信号値に適用してデータセットを標準化する。一例において、基準サイクルにおける信号値でデータセットの信号値を割ることであり得る。
【００８０】
基準サイクルにおける信号値の変形値を用いて標準化係数が生成される場合、基準サイクルにおける信号値と基準値との関係を用いて標準化係数が決定され得る。基準サイクルにおける信号値と基準値との関係は、基準サイクルにおける信号値と基準値との差であり得る。具体的に、基準サイクルにおける信号値と基準値との差は、基準サイクルにおける信号値と基準値の比（ｒａｔｉｏ）である。一具現例によれば、変形値を用いてデータセットを標準化することは、変形値でデータセットの信号値を割ることであり得る。
【００８１】
一具現例によれば、基準サイクルは１サイクル又は複数のサイクルである。具体的に、データセットのサイクル５が基準サイクルとして選択され得る。或いは、サイクル４、５及び６が前記基準サイクルとして選択されてもよい。基準サイクルが複数である場合、複数のサイクルにおける各信号値の平均値が基準サイクルにおける信号値として用いられ得る。
【００８２】
基準サイクルは、信号−発生反応において信号増幅が検出されないサイクルであり得る。例えば、核酸増幅反応から得られたデータセットの場合、基準サイクルはベースライン領域から選択され得る。
【００８３】
本発明の一具現例によれば、信号−発生反応は、ベースライン領域と信号増幅領域を含む反応であり、基準サイクルはベースライン領域に位置する。本発明の基準サイクルは、５０、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９又は８番目のサイクル以下であり得る。具体的に、基準サイクルは、サイクル１〜３０、サイクル２〜３０、サイクル２〜２０、サイクル２〜１５、サイクル２〜１０、サイクル２〜８、サイクル３〜３０、サイクル３〜２０、サイクル３〜１５、サイクル３〜１０、サイクル３〜９、サイクル３〜８、サイクル４〜８又はサイクル５〜８のいずれかと決定され得る。
【００８４】
本発明の一具現例によれば、前記基準サイクルは１サイクルである。また、前記基準サイクルは２以上のサイクルを含んでもよく、基準サイクルにおける信号値は複数の信号値を含む。
【００８５】
例えば、４、５、及び６番目のサイクルが基準サイクルと指定されてもよく、これら基準サイクルにおける信号値の平均値を、標準化係数を提供するための信号値として用いることができる。
【００８６】
標準化係数として、基準サイクルにおける信号値をそのまま用いてもよいが、また基準サイクルにおける信号値の変形値を用いてもよい。
【００８７】
一具現例によれば、変形値は、基準サイクルにおける信号値と基準値との関係を決定して提供され得る。変形値が基準サイクルにおける信号値と基準値との比（ｒａｔｉｏ）として決定される場合、変形値は次の式１によって提供され得る。
【００８８】
【数１】
2021500869.tif 000003
【００８９】
例えば、基準サイクルとして５番目のサイクルであり、５番目のサイクルにおける信号値が１３，２８５ＲＦＵであり、基準値が９０００ＲＦＵであるとき、変形値は１．４８になり得る。
【００９０】
基準値は任意に定められ得る。具体的に、基準値は０又は１以外の実数の中から任意に定められた値である。一具現例によれば、基準値は各サイクルにおける信号値の平均値±標準偏差の範囲内で決定される。
【００９１】
本発明の一具現例によれば、基準値は、（ｉ）基準総信号変化値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｔａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ  ｖａｌｕｅ）に対する標準データセットの総信号変化値（ｔｏｔａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ  ｖａｌｕｅ）の比率；前記標準データセットは、知られた濃度のターゲット分析物に対する信号−発生反応によって得られ、及び（ｉｉ）標準データセットによって決定され得る。具体的に、基準総信号変化値に対する標準データセットの総信号変化値の比率を用いて標準データセットの基準サイクルの信号値を補正し、補正された標準データセットの基準サイクルの信号値から基準値を決定する。一例において、補正された標準データセットの基準サイクルの信号値が基準値として決定される。
【００９２】
標準データセットとは、知られた濃度のターゲット分析物に対する信号−発生反応から得られたデータセットを指す。
【００９３】
本発明の一具現例によれば、前記データセットは総信号変化値を用いて補正される。本明細書において用語“総信号変化値（ｔｏｔａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ  ｖａｌｕｅ）”は、データセットにおいて（増加又は減少された）信号変化量を意味する。データセットの一区間で総信号変化値を決定する場合、データセットの一区間で最初のサイクル及び最後のサイクルにおける信号値の差又はデータセットの一区間における最大信号値と最小信号値の差が総信号変化値として決定され得る。
【００９４】
信号−発生反応が同一の条件下で同一の濃度のターゲット分析物を用いて実施される場合、同一の総信号変化値は、同一又は互いに異なる装備から理論的に算出され得る。したがって、総信号変化値を基準にデータセットを補正する場合、複数のデータセット間の偏差が減少される。
【００９５】
本発明の一具現例によれば、基準総信号変化値は、ターゲット分析物に対するデータセットとは別個の信号発生反応から得られた標準データセットの総信号変化値である。本発明の基準総信号変化値は、知られた濃度のターゲット分析物に対する信号−発生反応から得られたデータセットから決定され得る。
【００９６】
標準化しようとするデータセットにおける基準サイクルの信号値を基準値で割って標準化係数を提供することができる。
【００９７】
（Ａ−２）標準化係数をデータセットに適用
標準化係数をデータセットに適用して標準化されたデータセットを生成する。標準化係数をデータセットに適用する方式は様々である。標準化係数を比（ｒａｔｉｏ）として決定した場合、標準化係数は次式２のように適用され、標準化されたデータセットを生成する。 
【００９８】
【数２】
2021500869.tif 000004
【００９９】
式２で、第１データセットは標準化以前のデータセットであり、第２データセットは標準化以後のデータセットである。
【０１００】
本発明の一具現例によれば、前記信号−発生反応は、異なる反応環境（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）で同一ターゲット分析物に対する複数の信号−発生反応を含み；前記データセットは複数のデータセットであり、前記複数のデータセットは前記複数の信号−発生反応の複数のセットから得られ；前記基準サイクル、又は前記基準サイクル及び前記基準値は、前記複数のデータセットに同一に適用される。一具現例によれば、前記複数の信号−発生反応は、それぞれ異なる機器、異なる反応チューブ又はウェル、異なる試料、異なる量のターゲット分析物、又は異なるプライマー又はプローブを含む異なる反応環境で実施される。
【０１０１】
一具現例によれば、前記補正されたデータセットは、（ｉ）前記データセットに前記標準化係数を適用して標準化されたデータセットを生成したり、又は（ｉｉ）前記データセット又は前記標準化されたデータセットをベースライニングして生成される。
【０１０２】
（Ｂ）前記データセットにおいてノイズを除去
（Ｂ−１）ベースライニング
（Ｂ−１−ａ）従来のベースライニング方法
本発明の一具現例によれば、前記データセット又は標準化されたデータセットは、前記データセット又は標準化されたデータセットから背景信号を除去するためにベースライニングすることができる。ベースライン差し引きされたデータセット（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ｄａｔａ  ｓｅｔ）は、当業界に公知の様々な方法によって得られる（米国特許第８，５６０，２４７号及びＷＯ２０１６／０５２９９１）。
【０１０３】
（Ｂ−１−ｂ）対称軸を有する二次関数を用いてベースライニング
この接近法は、本出願人によって開発された新規のベースライニング方法である。
【０１０４】
標準化前データセット及び標準化後データセットを含むデータセットは、対称軸を有する二次関数を用いてベースライニングされ得る。二次関数を用いてデータセットをベースライニングするということは、データセットから二次関数を引くことによってデータセットを補正することを意味する。
【０１０５】
二次関数の生成は、二次関数の対称軸を決定し、フィッティング区間を決定し、フィッティング区間内でデータセットと二次関数をフィッティングして行うことができる。
【０１０６】
二次関数の対称軸は信号−発生反応の最終サイクルに基づいて決定され得る。二次関数はｙ＝ａ（ｘ−ｂ）２＋ｃ形態の関数である。ｂは二次関数の対称軸である。本発明の一具現例によれば、二次関数の対称軸は最終サイクル±１０、最終サイクル±８、最終サイクル±６、最終サイクル±５、最終サイクル±３、最終サイクル±２又は最終サイクル±１の範囲で決定され得る。
【０１０７】
二次関数によるフィッティング区間は様々な方法で決定され得る。
【０１０８】
まず、フィッティング区間は、あらかじめ設定された開始フィッティングサイクル（Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＳＦＣ）から最小フィッティングサイクル（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＭＦＣ）までの区域と決定され得る。開始フィッティングサイクルは、サイクル０、サイクル１、サイクル２、サイクル３、サイクル４、サイクル５、サイクル６、サイクル７、サイクル８又はサイクル９であり得る。最小フィッティングサイクルは、サイクル７、サイクル８、サイクル９、サイクル１０、サイクル１１、サイクル１２、サイクル１３、サイクル１４、サイクル１５、サイクル１６、サイクル１７、サイクル１８、サイクル１９、サイクル２０又はサイクル２１であり得る。
【０１０９】
或いは、フィッティング区間を決定するとき、二次関数が用いられてもよい。フィッティング区間の決定に用いられる二次関数は第１二次関数と表記され、データセットの補正に用いられる二次関数は第２二次関数と表記される。第１二次関数は全区間においてデータセットにフィッティングされ、第２二次関数はフィッティング区間においてデータセットにフィッティングされる。また、第１二次関数は対称軸を有しないが、第２二次関数は対称軸を有する。フィッティング区間の最終サイクルは、（ｉ）第１二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）及び／又は（ｉｉ）最小フィッティングサイクルに基づいて決定される。例えば、フィッティング区間の最終サイクルは、（ｉ）ＣｍｉｎからＮ［Ｎは０又は正の整数（具体的に、１〜５の整数）］を引いたサイクルと（ｉｉ）最小フィッティングサイクル（ＭＦＣ）のうち、大きいサイクルとして決定される。
【０１１０】
前記決定されたフィッティング区間内で、データセット又は標準化されたデータセットは対称軸を有する二次関数とフィッティングされ、その次の対称軸を有する二次関数によりベースライン−差し引きされる。
【０１１１】
（Ｂ−２）陰性対照群差し引き
データセットから陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を差し引いてデータセットからノイズを除去することができる。陰性対照群は、信号−発生反応のための反応物において反応の進行のための必須成分が１個以上ない実験群である。例えば、核酸増幅反応において陰性対照群は、ターゲット分析物、プライマー又は重合酵素がない実験群である。または、陰性対照群は緩衝液のみある実験群である。具体的に、本発明で用いられる陰性対照群は、核酸増幅反応においてターゲット核酸分子以外の核酸増幅のための成分がある実験群である。
【０１１２】
陰性対照群の差し引きは、ターゲット分析物に対するデータセットの信号値から陰性対照群の信号値を引いて行うことができる。具体的に、ターゲット分析物に対するデータセットの信号値と陰性対照群の信号値は、同一の反応及び測定環境で得られたものであり、例えば、１つの同一増幅及び分析装置で同一反応ラン（ｒｕｎ）で得られた信号値である。
【０１１３】
補正されたデータセットに対する非線形関数の生成（段階３３０）
補正されたデータセットに対する非線形関数（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）がフィッティング関数として生成される。
【０１１４】
この段階は非線形回帰分析方法によって実施され得る。様々な従来の非線形回帰分析方法が本発明に用いられ得る（参照：Ｓｅｂｅｒ，Ｇ．Ａ．Ｆ．；Ｗｉｌｄ，Ｃ．Ｊ．（１９８９）。Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）。例えば、多項関数、指数関数、ログ関数、三角関数又はシグモイド関数が非線形関数として用いられ得る。
【０１１５】
本発明の一具現例によれば、本発明で用いられる非線形関数はシグモイド関数（ｓｉｇｍｏｉｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）である。本明細書において用語“シグモイド関数”とは、シグモイド形態の曲線を表し得る関数を意味し、ロジスティック関数、Ｇｏｍｐｅｒｔｚ関数又はＣｈａｐｍａｎ関数を含む。
【０１１６】
補正されたデータセットにフィッティングされた非線形関数を生成する。非線形関数を生成するということは、補正されたデータセットに最も一致する（又は、補正されたデータセットを最もよく表す）非線形関数を決定することを意味できる。この段階は基本的に非線形回帰分析方法によって実施される。
【０１１７】
本発明の一具現例において、前記非線形関数は、次の式３で表示される４個のパラメータを含むシグモイド関数であり得る。
【０１１８】
【数３】
2021500869.tif 000005
【０１１９】
前記式で、ｆ（ｘ）はフィッティング関数としてシグモイド関数を表し；ｘは前記信号−発生反応のサイクル番号を表し；そしてａ１、ａ２、ａ３及びａ４はそれぞれ独立して前記シグモイド関数のパラメータを表す。
【０１２０】
一具現例によれば、前記式３で、ａ１は背景信号値を表し；ａ２−ａ１は、最大信号値と背景信号値との差を表し；ａ３は、シグモイド関数の変曲点（ｉｎｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）のｘ値を決定するパラメータを表し；ａ４はシグモイド関数の尖度（ｓｈａｒｐｎｅｓｓ）を決定するパラメータを表し；ａ３及びａ４はシグモイド関数の形態（ｓｈａｐｅ）を総合的に決定するパラメータを表す。
【０１２１】
シグモイド関数の生成は反復した計算によってａ１、ａ２、ａ３及びａ４を決定する過程を意味できる。
【０１２２】
非線形関数の生成は、前記データセットの補正後又は前に行うことができる。具体的に、前記非線形関数の生成は、前記データセットの補正後に行われる。
【０１２３】
非線形関数のフィッティング正確度を決定（段階３４０）
非線形関数が生成された後、補正されたデータセットに対する非線形関数のフィッティング正確度（ｆｉｔｔｉｎｇ  ａｃｃｕｒａｃｙ）が決定される。
【０１２４】
本明細書において用語“フィッティング正確度”は、（ａ）非線形関数が実際測定値（データセット又は補正されたデータセット）にどれくらい近接するか、すなわちフィッティングの優秀度（ｇｏｏｄｎｅｓｓ  ｏｆ  ｆｉｔ）及び（ｂ）原因変数（ｅｘｐｌａｎａｔｏｒｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ）が反応変数（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ）を予測する上でどれくらい有用かを示す値を全て包括する。
【０１２５】
フィッティングの優秀度は通常、ｘ２値（ｃｈｉ  ｓｑｕａｒｅ  ｖａｌｕｅ）であり、予測有用性値はＲ２値で示す。本発明の一具現例によれば、フィッティング正確度は、補正されたデータセットに対する非線形関数のｘ２値（ｃｈｉ  ｓｑｕａｒｅ  ｖａｌｕｅ）又はＲ２値である。より具体的に、前記フィッティング正確度はＲ２値である。
【０１２６】
Ｒ２値は、式４を用いて計算できる。式４は全サイクルに対して適用される。
【０１２７】
【数４】
2021500869.tif 000006
【０１２８】
ｙｉ：データセットの各サイクルにおける信号値
ｆｉ：シグモイド関数の各サイクルにおける関数値
ｙｍ：データセットの信号値の平均値
Ｌ：フィッティング区間の最後のサイクル
ｎ：全サイクルの数
式４は、データセットの全分散に対する誤差（ｅｒｒｏｒ）の分散を表す。誤差は、データセットとシグモイド関数との差である。式４でデータセットは標準化されたデータセット又は標準化及びベースライニングされたデータセットであり得る。
【０１２９】
フィッティング正確度を用いてターゲット分析物の存在又は不存在を決定（段階３５０）
補正されたデータセットに対する非線形関数のフィッティング正確度を用いて試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する。
【０１３０】
本発明の特徴の一つは、非線形関数のフィッティング正確度を、ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する時に直接的な指標として用いることである。試料内ターゲット分析物の存在又は不存在は、非線形関数のフィッティング正確度を利用（具体的に、直接に利用）して決定され、これは、ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する時に、特にＣｔ値を利用しなく、前記フィッティング正確度だけを利用するか、前記フィッティング正確度と他の基準（具体的に、非線形フィッティング関数に関連したパラメータ）を併せて利用することを意味する。
【０１３１】
核酸増幅曲線にシグモイド関数を適用した先行技術は存在するが、非線形関数のフィッティング正確度をターゲット分析物の存在又は不存在を決定するために直接の指標として利用した例はない。
【０１３２】
例えば、上述したように、米国公開特許第２００９／０１１９０２０号は、シグモイド関数のＲ２値を用いてデートセットが有意又は有効な成長を示すかを決定する。米国公開特許第２００９／０１１９０２０号の教示事項によれば、ターゲット分析物の不存在だけがフィッティング関数のＲ２値を用いて決定され得る。ターゲット分析物が存在することを決定するためには、Ｃｔ値を得る更なる段階が米国公開特許第２００９／０１１９０２０号では必要であり得る。本発明は、非線形関数のフィッティング正確度（例えば、Ｒ２値）を直接用いて、Ｃｔ値の助けを借りずとも試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定することができる。
【０１３３】
また、米国公開特許第２００９／０１１９０２０号は、Ｒ２値が有意性閾値（例えば、０．９０〜０．９９）を超える場合に、データセットは有意又は有効な成長を示さないもの、すなわち試料内ターゲット分析物の不存在を示すものと考慮されると教示している。このような接近法は、フィッティング正確度（例えば、Ｒ２値）が閾値（例えば、０．９０〜０．９９）を超える場合、ターゲット分析物が存在するものと決定される後述する本発明の方法の一具現例と相反する。
【０１３４】
本発明の一具現例によれば、前記ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階は、フィッティング正確度をフィッティング正確度に対する閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と比較して行う。より具体的に、前記ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階は、前記フィッティング正確度が前記閾値を超えるか否かを評価して行う。フィッティング正確度が閾値を超える場合、ターゲット分析物が試料内に存在すると決定され得る。フィッティング正確度が前記閾値以下である場合には、ターゲット分析物は試料内に存在しないと決定され得る。
【０１３５】
フィッティング正確度としてＲ２値を用いる場合、閾値は０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８又は０．９９である。
【０１３６】
ターゲット分析物の存在又は不存在は非線形関数のフィッティング正確度だけを用いて決定され得る。或いは、ターゲット分析物の存在又は不存在は特にＣｔ値を利用せず、フィッティング正確度に加えて、更なる基準（具体的に、非線形フィッティング関数と関連したパラメータ）を用いて決定されてもよい。
【０１３７】
一具現例によれば、前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在の決定は、（ｉ）前記データセット、前記補正されたデータセット又は前記非線形関数の変位（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）及び（ｉｉ）前記非線形関数の最大勾配で構成された群から選ばれる少なくとも一つのパラメータを更に用いて行う。
【０１３８】
一具現例によれば、前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在の決定は、（ｉ）前記データセット、前記補正されたデータセット又は前記４個のパラメータを含むシグモイド関数の変位及び（ｉｉ）前記４個のパラメータを含むシグモイド関数の最大勾配及びａ４から構成された群から選ばれる少なくとも一つのパラメータを更に用いて行う。
【０１３９】
更なる考慮事項（ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）は試料内ターゲット分析物の不存在を決定することに特に有用である。
【０１４０】
非線形関数のフィッティング正確度がターゲット分析物の存在又は不存在を決定する時に唯一の指標として役割するが、更なる考慮事項は、ターゲット分析物を含まない陰性サンプルをより効果的にフィルタリングすることに用いられ得る。また、陰性サンプルに対する信号値は理論的に低いフィッティング正確度を示す。しかし、時には高いフィッティング正確度を有する。したがって、偽陽性結果を招き得る陰性サンプルはフィルタリングする必要がある。
【０１４１】
前記データセット、前記補正されたデータセット又は前記非線形関数の変位（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は、試料内ターゲット分析物の不存在を決定する上で有用である。
【０１４２】
本明細書において用語“変位”とは、データセットにおいて信号変化程度、具体的に、基準信号値からの信号変化程度を意味する。ここで、基準信号値は、最小の信号値、最初のサイクル信号値、ベースライン領域の平均信号値又は増幅区域開始点での信号値であり得る。変位を計算するに当たり、最終信号値は最大の信号値、最終サイクルの信号値又は停滞（ｐｌａｔｅａｕ）領域の平均信号値であり得る。
【０１４３】
変位を考慮又は利用してターゲット分析物の存在又は不存在を決定することは、様々な方式で行うことができる。例えば、データセットの変位が変位に対する閾値未満である場合、そのデータセットは陰性と判断できる。
【０１４４】
信号−発生反応が増幅反応である場合、変位に対する閾値はＲＦＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔ）７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０である。
【０１４５】
さらに他の考慮要素は、非線形関数の最大勾配である。
【０１４６】
陽性試料に対する増幅曲線は、信号値が急に増加する増幅区間を含み、陰性試料に対する増幅曲線は、信号値が急に増加する増幅区間がない。したがって、非線形関数の最大勾配を考慮して試料に対するターゲット分析物の陽性及び陰性を判定することができる。
【０１４７】
本発明の一具現例によれば、本発明の方法は、前記非線形関数の最大勾配を生成する段階；及び前記最大勾配を閾値と比較して、前記試料内前記ターゲット分析物が不存在すると決定する段階を含む。
【０１４８】
非線形関数の最大勾配を計算する方法は様々である。例えば、非線形関数を微分し、微分された非線形関数の最大値が最大勾配と決定され得る。
【０１４９】
最大勾配に対する閾値は様々な方式で設定され得る。例えば、閾値は多数の試料を分析した結果に基づいて設定され得る。例えば、陽性又は陰性があらかじめ定められた多数の試料における非線形関数の最大勾配を分析し、適切な閾値を選択することができる。例えば、最大勾配に対する閾値は、１０〜５０、２０〜５０、３０〜５０、１０〜４０、２０〜４０又は３０〜４０であり、特に２０〜４０である。
【０１５０】
非線形関数の最大勾配が閾値以上である場合には、試料内ターゲット分析物が存在すると決定し、前記最大勾配が閾値未満である場合には、試料内ターゲット分析物が不存在すると決定する。
【０１５１】
さらに他の考慮要素は、非線形関数の形態を示すパラメータである。
【０１５２】
本発明の一具現例において、非線形関数の形態を示すパラメータを用いてターゲット核酸配列が試料内存在又は不存在するか決定する。具体的に、４個のパラメータを含むシグモイド関数である式３のａ４を用いる。
【０１５３】
ａ４が試料内ターゲット分析物の存在又は不存在の決定に用いられる場合、ａ４に対する閾値は０．０７、０．０８又は０．０９に設定され得る。ａ４が閾値を超えるとデータセットを異常信号と判断し、ターゲット分析物が試料内不存在すると決定する。
【０１５４】
本発明の一具現例によれば、本発明の方法は、前記非線形フィッティング関数に信号閾値（ｓｉｇｎａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を適用してＣｔ値を得る段階をさらに含む。本発明は、信号閾値（すなわち、Ｃｔ値）を利用することなく試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定できるが、実験者にとってＣｔ値が必要な場合がある。例えば、ターゲット分析物の定量情報が必要な場合、Ｃｔ値か通常必要である。本発明方法の分析信頼度を増加させるために、試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する時に、非線形関数のフィッティング正確度と共にＣｔ値も用いることができる。例えば、非線形フィッティング関数のフィッティング正確度がフィッティング正確度に対する閾値を超えるとともに、Ｃｔ値がＣｔ値に対する閾値を超える場合にのみ、ターゲット分析物が試料内存在すると決定される。
【０１５５】
ＩＩ．非線形関数を用いた試料内ターゲット分析物の分析装置及びコンピュータ読取り可能な記録媒体
本発明の他の態様によれば、本発明は、次のを含む試料内ターゲット分析物の分析装置を提供する：
メモリー；及び
プロセッサ；
前記メモリーは、前記ターゲット分析物に対するデータセットを保存し、前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記プロセッサは、前記データセットを補正し、前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成し、前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数フィッティング正確度を決定し、前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する。
【０１５６】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次の段階を含む試料内ターゲット分析物を分析する方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含む非−一時的（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ）コンピュータ読取り可能な記録媒体を提供する：
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階；前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットを補正する段階；
前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成する段階；
前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のフィッティング正確度を決定する段階；及び
前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階。
【０１５７】
上述した本発明の記録媒体、装置及びコンピュータプログラムは、上述した本発明の方法をコンピュータで実行可能にしたものであり、これらに共通する内容は、反復記載による本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【０１５８】
プログラム指示は、プロセッサによって実行される時、上述した本発明の方法をプロセッサに実行させる。本発明の方法を実行するプログラム指示は、次の指示を含むことができる：（ｉ）前記データセットを補正するようにする指示；（ｉｉ）前記補正されたデータセットに対する非線形関数を生成するようにする指示；（ｉｉｉ）前記補正されたデータセットに対する前記非線形関数のフィッティング正確度を決定するようにする指示；及び（ｉｖ）前記フィッティング正確度を用いて前記試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定するようにする指示。
【０１５９】
本発明の方法はプロセッサで実行され、前記プロセッサは独立実行型コンピュータ（ｓｔａｎｄ  ａｌｏｎｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ）、ネットワーク付着コンピュータ又は実時間ＰＣＲ装置のようなデータ取得装置にあるプロセッサであり得る。
【０１６０】
コンピュータ読取り可能な記録媒体は、当業界に公知の様々な記憶媒体、例えば、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリー、フロッピーディスク、ハードドライブ、ポータブルＨＤＤ、ＵＳＢ、マグネチックテープ、ＭＩＮＩＤＩＳＣ、不揮発性メモリーカード、ＥＥＰＲＯＭ、光学ディスク、光学記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、システムメモリー及びウェブサーバーを含むが、これに限定されるものではない。
【０１６１】
データセットは様々な方式で収集され得る。例えば、データセットは、ＰＣＲデータ収集装置にあるプロセッサによって収集され得る。データセットは実時間でプロセッサに提供されてもよく、或いはメモリーユニット又はバッファに保存され、実験完了後にプロセッサに提供されてもよい。類似に、データセットは、前記収集装置とのネットワーク連結（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット及びイントラネット）又は直接連結（例えば、ＵＳＢ又は他の直接有線連結又は無線連結）によってデスクトップコンピュータシステムのような別途のシステムに提供されてもよく、或いはＣＤ、ＤＶＤ、フロッピーディスク及びポータブルＨＤＤのようなポータブル媒体上に提供されてもよい。類似に、データセットは、ノートパソコン又はデスクトップコンピュータシステムのようなクライアントにネットワーク連結（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット、イントラネット及び無線通信ネットワーク）を通じてサーバーシステムに提供されてもよい。
【０１６２】
本発明を実行するプロセッサを具現する指示はロジックシステムに含まれ得る。前記指示は、たとえソフトウェア記録媒体（例えば、ポータブルＨＤＤ、ＵＳＢ、フロッピーディスク、ＣＤ及びＤＶＤ）に提供され得るが、ダウンロード可能であり、メモリーモジュール（例えば、ハードドライブ又はローカル又は付着ＲＡＭ又はＲＯＭのような他のメモリー）に保存され得る。本発明を実行するコンピュータコードは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、ＶＢＳｃｒｉｐｔ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ、Ｐｅｒｌ及びＸＭＬのような様々なコーディング言語によって実行され得る。また、様々な言語及びプロトコルは、本発明に係るデータと命令の外部及び内部保存及び伝達に用いられ得る。
【０１６３】
本発明の一具現例によれば、本発明の装置は、試料及び信号−発生手段を収容可能な反応容器、前記反応容器の温度を調節する温度調節手段及び／又はサイクル番号における信号を検出する検出器をさらに含むことができる。
【０１６４】
コンピュータプロセッサは、一つのプロセッサが上述したパフォーマンスを全て行うように構築するされ得る。或いは、プロセッサユニットはいくつかのプロセッサがそれぞれのパフォーマンスを実行するように構築されてもよい。本発明の一具現例によれば、プロセッサはターゲット分析物（例えば、ターゲット核酸分子）の検出に用いられる従来の装置（例えば、実時間ＰＣＲ装置）にソフトウェアをインストールして具現させることができる。
【０１６５】
ＩＩＩ．二次関数を用いて試料内ターゲット分析物を分析する方法
本発明の他の態様によれば、本発明は、次の段階を含む試料内ターゲット分析物の分析方法を提供する：
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階；前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットにフィッティングされた二次関数を生成する段階；及び
前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する段階。
【０１６６】
本発明の最初及び三番目の態様に共通する内容は、反復記載による本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【０１６７】
本発明者らは、上述した従来技術の問題点及び短所、特に核酸増幅反応においてＣｔ値を得るための閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）設定による従来の問題点を克服しようと努力した。その結果、本発明者らは、信号−発生反応から得たデータセットに対するフィッティング関数の様々なパラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）、具体的にフィッティング二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）、ｘ２の係数又はフィッティング正確度がターゲット分析物の存在又は不存在を決定できる指標（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）になり得ることを糾明した。また、本発明者らは、従来のベースライニング方法を改善しようと努力し、フィッティング区間でデータセットにフィッティングされた二次関数を用いて効率的に且つ容易にベースライニングできることを糾明した。
【０１６８】
本発明は、ターゲット分析物を分析する方法と表現されるが、ターゲット分析物に対するデータセットをベースライニングする方法と表現されてもよい。
【０１６９】
ターゲット分析物に対するデータセットを取得
この段階は、本発明の最初の態様に記載された内容を参照して説明され得る。
【０１７０】
データセットにフィッティングされた二次関数を生成
フィッティング関数としてデータセットに対する二次関数は前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で生成される。フィッティングのために様々な従来の非−線形回帰分析方法が本発明に用いられ得る（参照：Ｓｅｂｅｒ，Ｇ．Ａ．Ｆ．；Ｗｉｌｄ，Ｃ．Ｊ．（１９８９）。Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）。
【０１７１】
この段階は、上述した対称軸を有する二次関数を用いたベースライニングに対する内容を参照して説明され得る。
【０１７２】
補正前及び補正後のデータセットを含むデートセットは二次関数とフィッティングされ得る。
【０１７３】
一具現例によれば、前記二次関数は対称軸を有する。一具現例によれば、前記二次関数の対称軸は、信号−発生反応の最終サイクルに基づいて決定される。より具体的に、前記二次関数の対称軸は、最終サイクル±１０、最終サイクル±８、最終サイクル±６、最終サイクル±５、最終サイクル±３、最終サイクル±２又は最終サイクル±１の範囲内で決定される。
【０１７４】
二次関数の生成は、二次関数の対称軸を決定し、フィッティング区間を決定し、前記フィッティング区間で前記データセットに前記二次関数をフィッティングして行うことができる。二次関数は、ｙ＝ａ（ｘ−ｂ）２＋ｃと表現することができる（ａはｘ２の係数、ｂは対称軸、ｃはｙ軸切片である）。
【０１７５】
フィッティング区間は、データセットのベースライン領域内で決定され得る。前記フィッティング区間は様々な方法で決定され得る。
【０１７６】
まず、フィッティング区間はあらかじめ決定され得る。一具現例によれば、フィッティング区間は、開始フィッティングサイクル（Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＳＦＣ）から最小フィッティングサイクル（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＭＦＣ）までである。
【０１７７】
本発明の一具現例によれば、前記データセットの変位が前記変位に対する閾値を超える場合、前記フィッティング区間は、開始フィッティングサイクル（Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＳＦＣ）から最小フィッティングサイクル（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＭＦＣ）までである。より具体的に、データセットの最大値と最小値との差が所定の閾値（例えば、ＲＦＵ  １００、２００、３００又は４００）よりも大きい場合に、又はデータセットの最終値と初期値との差が所定の閾値（例えば、ＲＦＵ  ０）よりも大きい場合には、前記フィッティング区間は開始フィッティングサイクル（Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＳＦＣ）から最小フィッティングサイクル（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｅ，ＭＦＣ）までの区間と決定される。
【０１７８】
開始フィッティングサイクルは、サイクル０、サイクル１、サイクル２、サイクル３、サイクル４、サイクル５、サイクル６、サイクル７、サイクル８又はサイクル９であり得る。最小フィッティングサイクルは、サイクル７、サイクル８、サイクル９、サイクル１０、サイクル１１、サイクル１２、サイクル１３、サイクル１４、サイクル１５、サイクル１６、サイクル１７、サイクル１８、サイクル１９、サイクル２０又はサイクル２１であり得る。
【０１７９】
本発明の一具現例によれば、フィッティング区間はデータセットのサイクル１〜２０、サイクル２〜２０、サイクル３〜２０、サイクル４〜２０、サイクル５〜２０、サイクル６〜２０、サイクル１〜１８、サイクル２〜１８、サイクル３〜１８、サイクル４〜１８、サイクル５〜１８、サイクル６〜１８、サイクル１〜１６、サイクル２〜１６、サイクル３〜１６、サイクル４〜１６、サイクル５〜１６、サイクル６〜１６、サイクル１〜１４、サイクル２〜１４、サイクル３〜１４、サイクル４〜１４、サイクル５〜１４、サイクル１〜１２、サイクル２〜１２、サイクル３〜１２サイクル又は４〜１２サイクルである。
【０１８０】
第二に、フィッティング区間は二次関数を用いて決定され得る。フィッティング区間を決定するために用いられる二次関数は本明細書で第１二次関数と命名され、補正されたデータセットに用いられる二次関数は本明細書において第２二次関数と命名される。
【０１８１】
一具現例によれば、前記方法は、前記フィッティング区間で二次関数を生成する段階の前に、全領域で前記データセットにフィッティングされた第１二次関数を生成する段階をさらに含み；そして前記フィッティング区間（具体的に、前記フィッティング区間の最終サイクル）は、前記第１二次関数が最小信号値を有するサイクル（Ｃｍｉｎ）に基づいて決定される。
【０１８２】
第１二次関数は対称軸を有しないが、第２二次関数は対称軸を有する。前記フィッティング区間の最終サイクルは、（ｉ）第１二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）及び／又は（ｉｉ）最小フィッティングサイクルに基づいて決定される。例えば、フィッティング区間の最終サイクルは、（ｉ）ＣｍｉｎからＮ［Ｎは０又は正の整数（具体的に、１〜５の整数）］を引いたサイクルと（ｉｉ）最小フィッティングサイクル（ＭＦＣ）のうち、大きいサイクルと決定される。
【０１８３】
データセットから二次関数を差し引いてデータセットを補正
前記データセットは、前記データセットから前記二次関数を差し引いて補正する。
【０１８４】
一具現例によれば、前記方法は、前記補正されたデータセットに対する前記二次関数のフィッティング正確度を決定する段階；及び前記フィッティング正確度を用いて試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階をさらに含む。
【０１８５】
前記二次関数に対するフィッティング正確度は前記フィッティング区間で決定され得る。前記データセット及び二次関数間のフィッティング正確度はフィッティング区間における信号値を用いて決定される。本発明の一具現例によれば、前記フィッティング正確度は、前記データセットと前記二次関数に対するｘ２値（ｃｈｉ  ｓｑｕａｒｅ  ｖａｌｕｅ）又はＲ２値であり、より具体的にＲ２値である。
【０１８６】
Ｒ２値は式５を用いて計算され得る。 
【０１８７】
【数５】
2021500869.tif 000007
【０１８８】
式５は、データセットの全分散に対するフィッティング区間における誤差（ｅｒｒｏｒ）の分散を表す。誤差はデータセットと二次関数との差である。
【０１８９】
ｙｉは、データセットの各サイクルにおける信号値である。
【０１９０】
ｆｉは、二次関数の値である。
【０１９１】
ｙｍは、データセットの平均値である。
【０１９２】
Ｌは、フィッティング区間の最終サイクルである。
【０１９３】
Ｓは、フィッティング区間の開始サイクルである。
【０１９４】
Ｌ−Ｓは、フィッティング区間の長さである。
【０１９５】
ｎは、全サイクルの数である。
【０１９６】
本発明の特徴の一つは、二次関数のフィッティング正確度をターゲット分析物の分析、特にターゲット分析物の存在又は不存在、特に不存在を決定する時に直接の指標として用いることである。本発明者らの知る限り（Ｔｏ  ｏｕｒ  ｂｅｓｔ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ）、フィッティング区間で二次関数のフィッティング正確度をターゲット分析物の不存在するか否かを決定する時に直接の指標として用いた例はない。
【０１９７】
本発明の一具現例によれば、試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階は、フィッティング正確度が閾値未満であると、試料内ターゲット分析物が不存在すると決定する。
【０１９８】
上述した通り、フィッティング正確度はターゲット分析物の存在又は不存在、特に不存在を決定する時に直接の指標として利用できるので、閾値とフィッティング正確度を比較することによってターゲット分析物の不存在を簡便に決定することができる。
【０１９９】
フィッティング区間におけるフィッティング正確度に対する閾値は、当業界で通常用いる閾値であり得る。例えば、フィッティング正確度としてＲ２値を用いる場合、閾値は０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６又は０．９７であり得る。
【０２００】
また、試料内ターゲット分析物の存在又は不存在は、（ｉ）第１二次関数が最小信号値を有するサイクル（Ｃｍｉｎ）及び／又は（ｉｉ）第１二次関数のｘ２の係数に基づいて決定され得る。
【０２０１】
本発明の一具現例によれば、前記決定は、試料内ターゲット分析物の不存在の決定である。
【０２０２】
本発明の一具現例によれば、前記ターゲット分析物の不存在を決定する段階は、前記Ｃｍｉｎと閾値を比較して行う。前記Ｃｍｉｎが前記閾値を超える場合、試料内ターゲット分析物は不存在すると決定される。
【０２０３】
本発明の特徴の一つは、前記Ｃｍｉｎを、ターゲット分析物が不存在するかを決定する時に直接の指標として用いることである。核酸増幅曲線にフィッティング関数を適用した先行文献はあるが、前記Ｃｍｉｎを、ターゲット分析物が不存在するかを決定する時に直接の指標として用いた例はない。
【０２０４】
上述した通り、前記Ｃｍｉｎがターゲット分析物の不存在を決定することに直接の指標として用いられ得るので、、前記ターゲット分析物の不存在は、前記閾値とＣｍｉｎを比較して容易に決定することができる。
【０２０５】
閾値は、例えば、サイクル２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０である。
【０２０６】
或いは、試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する段階は、第１二次関数のｘ２の係数が０より小さいかを評価することによって前記試料内ターゲット分析物が不存在するかを決定して行われる。本発明者の知る限り（Ｔｏ  ｏｕｒ  ｂｅｓｔ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ）、第１二次関数のｘ２の係数が０より小さいデータセットはいずれも陰性結果として取扱うことができる。
【０２０７】
上述した通り、前記Ｃｍｉｎ、第１二次関数のｘ２の係数、及び第２二次関数のフィッティング正確度は、試料内ターゲット分析物の不存在を決定する時に指標として用いられ得る。
【０２０８】
ＩＶ．本発明とＭｕＤＴ技術との組合せ
本出願人は、単一反応容器で単一類型の検出器を用いて複数のターゲット核酸配列を検出するＭｕＤＴ技術（ＷＯ２０１５／１４７４１２）を開発した。ＭｕＤＴ技術において、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、（ｉ）相対的高温検出温度及び相対的低温検出温度の両方で検出された信号及び（ｉｉ）異なる検出温度で信号の変化の関係を示す基準値によって決定される。第１ターゲット核酸配列が相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列であり、第２ターゲット核酸配列が相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列である場合に、第１ターゲット核酸配列に対する基準値を用いて第１ターゲット核酸配列に対する信号を除去することによって、第２ターゲット核酸配列に対する信号は相対的低温検出温度で検出された信号から抽出される。
【０２０９】
従来の単一類型の検出器では区別されない、第１ターゲット核酸配列に対する信号及び第２ターゲット核酸配列に対する信号を別個として得る方法により、従来方法に比べてＭｕＤＴ技術は著しく改善された。特に、相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列及び相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の両方を含むサンプル（共同−感染サンプル）からターゲット核酸配列に対する信号を抽出するとき、前記方法はかなりの正確度を示す。
【０２１０】
非線形フィッティング関数を用いる本発明はＭｕＤＴ技術とよく組み合わせられ得る。
【０２１１】
一具現例によれば、前記データセットは、（ｉ）相対的高温検出温度で検出された信号である第１ターゲット核酸配列に対する信号及び／又は（ｉｉ）相対的低温検出温度で検出された信号から抽出された第２ターゲット核酸配列に対する信号を含み、そして前記第１ターゲット核酸配列及び前記第２ターゲット核酸配列は一つの反応容器から検出される。
【０２１２】
一具現例によれば、前記第１ターゲット核酸配列に対する信号及び前記第２ターゲット核酸配列に対する信号は、次の段階によって得られる：
（ａ）前記反応容器で前記第１ターゲット核酸配列に対する信号を発生させ得る第１信号−発生手段及び前記第２ターゲット核酸配列に対する信号を発生させ得る第２信号−発生手段を前記試料と共にインキュベーションし、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で信号を検出する段階；前記第１ターゲット核酸配列及び第２ターゲット核酸配列のそれぞれは相応する信号−発生手段によって検出され、前記第１信号−発生手段は、前記第１ターゲット核酸配列が前記試料に存在する場合に、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で信号を発生させ、前記第２信号−発生手段は、前記第２ターゲット核酸配列が前記試料に存在する場合に、前記相対的低温検出温度で信号を発生させ、
（ｂ）前記相対的低温検出温度で検出された信号が第１閾値又は第１信号変位によって定義された第１基準を満たすか否かを識別する段階；前記相対的低温検出温度で検出された信号が前記第１基準を満たすとき、次の段階（ｃ）を進行し、前記相対的低温検出温度で検出された信号が前記第１基準を満たさないとき、前記第１ターゲット核酸配列及び前記第２ターゲット核酸配列が前記試料内に存在しないと決定され、次の段階（ｃ）を進行しなく；及び
（ｃ）（ｉ）前記相対的低温検出温度で検出された信号から前記第１ターゲット核酸配列に対する信号を除去するための基準値及び（ｉｉ）前記相対的低温検出温度で検出された信号を用いて前記相対的低温検出温度で検出された信号から前記第２ターゲット核酸配列に対する信号を抽出する段階。
【０２１３】
一具現例によれば、前記第２ターゲット核酸配列に対する信号は、次の式６によって提供される： 
【０２１４】
【数６】
2021500869.tif 000008
【０２１５】
本明細書で使われた用語“相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列”は、２個の検出温度のうち相対的高温検出温度で信号を発生でき、相対的低温検出温度でも信号を発生できるターゲット核酸配列を意味する。一方、“相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列”は、２個の検出温度のうち相対的低温検出温度で信号を発生するが、相対的高温検出温度では信号を発生しないターゲット核酸配列を意味する。
【０２１６】
相対的高温検出温度は、相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する信号を生成できる温度であり、相対的低温検出温度は、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する信号及び相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する信号の両方を生成できる温度である。相対的高温検出温度は第１検出温度と表現され、相対的低温検出温度は第２検出温度と表現され得る。
【０２１７】
一具現例によれば、検出が行われる相対的高温検出温度と相対的低温検出温度は決定され得る。例えば、相対的高温検出温度及び相対的低温検出温度はそれぞれ７２℃及び６０℃と決定され、その後、前記検出温度に適した信号−発生手段が構築される。
【０２１８】
一具現例によれば、前記信号−発生手段が二合体の形成に依存する方式で信号を発生するとき、前記検出温度は、前記二合体のＴｍ値を調節することによって制御することができる。
【０２１９】
信号がターゲット核酸配列の存在に依存して形成される二合体によって生成される場合、前記信号の検出は二合体のＴｍ値を調節することによって決定された温度で成功的に行われる。例えば、信号がＰＴＯＣＥ方法によって生成される場合、信号の検出はＣＴＯ上でＰＴＯ断片が延長されて形成された延長二合体のＴｍ値を調節することによって、決定された温度で成功的に行われる。
【０２２０】
基準値は、相対的低温検出温度で検出された信号から第１ターゲット核酸配列に対する信号を除去するための値である。本発明の一具現例において、基準値は相対的高温検出温度と相対的低温検出温度で試料内第１ターゲット核酸配列が存在するとき、第１信号−発生手段によって提供される信号の変化の関係を示す値である。
【０２２１】
本発明によれば、前記非−線形フィッティング関数は第２ターゲット核酸配列に対する抽出された信号に対して生成される。
【０２２２】
Ｖ．二次関数を用いて試料内ターゲット分析物を分析する方法
本発明の他の態様によれば、本発明は、次を含む試料内ターゲット分析物の分析装置を提供する：
メモリー；及び
プロセッサ；
前記メモリーは、前記ターゲット分析物に対するデータセットを保存し、前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、そして
前記プロセッサは、前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットに対してフィッティングされた二次関数を生成し、前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する。
【０２２３】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次の段階を含む方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取り可能な記録媒体を提供する：
前記ターゲット分析物に対するデータセットを得る段階；前記データセットは信号−発生手段を用いる信号−発生反応から得られ、サイクル番号及び信号値を含む複数のデータ地点を含み、
前記データセットのベースライン領域のフィッティング区間で前記データセットに対する二次関数を生成する段階；及び
前記データセットから前記二次関数を差し引いて前記データセットを補正する段階。
【０２２４】
上述した本発明の記録媒体、装置及びコンピュータプログラムは、上述したセクションＩＩＩ及びＩＶの本発明の方法をコンピュータで実施可能にしたものであり、これらに共通する内容は、反復記載による本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【０２２５】
ＶＩ．本発明の具体的具現例
本発明の具体的な具現例を詳細に説明すると、次の通りである：
図１は、一実施例に係るターゲット分析物を分析する装置を示す。図１を参照すると、分析システムは、増幅装置１１０及び分析装置１２０を含む。分析システムは、試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定し、ユーザに結果を表示することができる。
【０２２６】
増幅装置１１０は、核酸増幅反応、酵素反応又は微生物成長などを行う装置である。例えば、増幅装置１１０が核酸増幅反応を行う場合、増幅装置１１０は試料の温度を増加、減少させる動作を繰り返し行うことができる。増幅装置１１０は各サイクルごとに試料から発生する信号を測定してデータセットを得ることができる。
【０２２７】
増幅装置１１０は分析装置１２０とケーブル１３０で連結されるか、無線で連結され得る。増幅装置１１０は、得られたデータセットを有線又は無線で分析装置１２０に伝送する。
【０２２８】
分析装置１２０は増幅装置１１０からデータセットを得る。分析装置１２０はデータセットを分析し、試料内ターゲット分析物が存在又は不存在するか決定する。言い換えると、分析装置１２０は試料に対する陽性又は陰性を決定する。
【０２２９】
分析装置１２０はディスプレイ装置１２４を含む。ディスプレイ装置１２０はデータセットを表示するか、フローティングされたデータセットをグラフで表示することができる。ディスプレイ装置１２４は、シグモイド関数やステップ関数などを表示できる。また、ディスプレイ装置１２４は、ターゲット分析物が存在するか不存在するかを表示でき、各試料ごとに検出結果を表示できる。
【０２３０】
分析装置１２０は、記録媒体１２２に含まれたデータセットを読み込む（ｒｅａｄ）ことができる。記録媒体１２２は、データセットを保存するか、分析装置１２０で用いられるプログラムなどを保存することができる。記録媒体１２２はＣＤ又はＵＳＢなどであり得る。
【０２３１】
図２は、一実施例による分析装置を説明するための構成図である。図２を参照すると、分析装置２００は、プロセッサ２１０、メモリー２２０及びディスプレイ装置２３０を含む。
【０２３２】
メモリー２２０は、増幅装置１１０から受信されたデータセットを保存する。メモリー２２０は、プロセッサ２１０で処理されたデータを保存することができる。例えば、メモリー２２０は、データセット、標準化されたデータセット、ベースライニングされたベースセット、補正されたデータセット、非線形関数、フィッティング正確度及び閾値などを保存することができる。図２ではメモリー２２０がプロセッサ２１０と別個の構成として示されているが、メモリー２２０がプロセッサ２１０と一つの装置として具現されてもよい。例えば、メモリー２２０はプロセッサ２１０の内部に含まれたキャッシュのようなストレージであってもよい。
【０２３３】
プロセッサ２１０はデータセットを用いて試料内ターゲット分析物が存在又は不存在するかを決定できる。プロセッサ２１０は非線形関数を用いて、データセットと非線形関数のフィッティング正確度を計算でき、フィッティング正確度の大きさによってターゲット分析物の存在又は不存在を決定できる。
【０２３４】
図２では分析装置２００が一つのプロセッサ２１０を含むとしているが、分析装置２００は一つ以上のプロセッサ２１０を含んでもよい。
【０２３５】
ディスプレイ装置２３０はプロセッサ２１０の制御によってグラフ、テーブル又はテキストなどを表示することができる。例えば、ディスプレイ装置２３０は、データセット、非線形関数などをグラフで表示できる。ディスプレイ装置２３０はウェルの情報をテーブルで表示できる。ディスプレイ装置２３０はフィッティング正確度、陽性／陰性などをテキストで表示できる。
【０２３６】
図４は、一実施例によるターゲット分析物の存在又は不存在を決定する方法を説明するための順序図である。図４を参照すると、分析装置２００は、フィッティング正確度と閾値を比較してターゲット分析物の存在又は不存在を決定できる。図４の段階は図３の段階３４０の後に行われ得る。言い換えると、分析装置２００は、段階３４０でフィッティング正確度を決定し、段階４１０でフィッティング正確度と閾値を比較できる。
【０２３７】
段階４１０で、分析装置２００はフィッティング正確度が閾値を超えるか否か決定する。仮に、フィッティング正確度が閾値を超えると、前記プロセッサは段階４２０に進行し、フィッティング正確度が閾値を超えないと、前記プロセッサは段階４３０に進行する。閾値は実験データを用いて決定でき、一例として、閾値は０．９に設定され得る。
【０２３８】
段階４２０で、分析装置２００は試料内ターゲット分析物が存在すると決定する。フィッティング正確度が閾値よりも大きいということは、非線形関数が増幅曲線と同一又は類似の形態であることを意味する。増幅曲線とは、試料内ターゲット分析物が存在する時に得られる曲線の一般的な形態であり得る。言い換えると、試料内ターゲット分析物が存在すれば、ターゲット分析物が反復して複製されるので、二次関数や指数関数のように増加する形態の信号が試料から得られる。したがって、データセットの形態が増幅曲線の形態である場合、非線形関数とデータセットが類似する形態であり、フィッティング正確度が高くなる。
【０２３９】
段階４３０で、分析装置２００は試料内ターゲット分析物が不存在すると決定する。フィッティング正確度が閾値よりも小さいということは、非線形関数が増幅曲線から外れていることを意味する。言い換えると、試料内ターゲット分析物が不存在すれば、ターゲット分析物が複製される反応が発生しない。したがって、データセットと非線形関数が異なる形態であり、フィッティング正確度が低くなる。
【０２４０】
図５は、試料内ターゲット分析物が存在する場合、フィッティング正確度を用いて分析する方法を説明するための図である。図５で、補正されたデータセット５１０は点線で表示され、非線形関数５２０は実線で表示されている。補正されたデータセット５１０は（サイクル、信号値）の座標値の集合（不連続データ）であるので点線で表示されている。非線形関数５２０は式３のシグモイド関数であり得る。非線形関数５２０は連続関数であるので実線で表示されている。
【０２４１】
分析装置２００は、補正されたデータセット５１０と非線形関数５２０をフィッティングする。フィッティングするということは、補正されたデータセット５１０と最も類似する非線形関数５２０を探す（ｓｅａｒｃｈ）ことを意味するか、非線形関数５２０のパラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を決定することを意味する。非線形関数５２０は最小二乗法によって生成され得る。言い換えると、分析装置２００は、非線形関数５２０と補正されたデータセット５１０の誤差を最小化させるために非線形関数５２０のパラメータを修正する過程を反復する。分析装置２００は、非線形関数５２０と補正されたデータセット５１０の誤差が最小のとき、非線形関数５２０のパラメータを決定する。
【０２４２】
分析装置２００は、決定されたパラメータを有する非線形関数５２０と補正されたデータセット５１０のＲ２値を計算する。分析装置２００はＲ２値の大きさによってターゲット分析物の存在又は不存在（陽性／陰性）を決定する。Ｒ２値は、式４を用いて計算できる。
【０２４３】
図５を参照すると、非線形関数５２０のＲ２値は０．９９８５である。閾値は０．９に設定される。したがって、Ｒ２値が閾値よりも大きいので、分析装置２００は試料内ターゲット分析物が存在すると決定する（陽性）。分析装置２００は、分析結果によって存在又は陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）というテキストをディスプレイ装置２３０に表示できる。
【０２４４】
図６は、最大勾配を用いてターゲット分析物の存在又は不存在を決定する方法を説明するための順序図である。分析装置２００は、非線形関数の最大勾配を用いて試料内ターゲット分析物の不存在を決定できる。図６の段階は、図３の段階３５０が行われた後に行われるか、図３の段階３３０が行われた後に行われ得る。
【０２４５】
段階１４１０で、分析装置２００は、非線形関数の最大勾配を生成する。分析装置２００は非線形関数を微分し、微分された非線形関数の最大値を最大勾配と決定できる。
【０２４６】
段階１４２０で、分析装置２００は、非線形関数の最大勾配が最大勾配に対する閾値を超えるか判断する。分析装置２００は最大勾配が閾値を超えると、段階１４３０に進行し、そうでないと段階１４４０に進行する。閾値は２０〜４０に設定され得る。
【０２４７】
段階１４３０で、分析装置２００は試料内ターゲット分析物が存在すると決定する。非線形関数の最大勾配が閾値を超えるので、分析装置２００は、ターゲット分析物に対する増幅反応が発生したと判断できる。
【０２４８】
段階１４４０で、分析装置２００は、試料内ターゲット分析物が不存在すると決定する。非線形関数の最大勾配が閾値を超えないので、分析装置２００は、ターゲット分析物に対する増幅反応が発生しなかったと判断できる。
【０２４９】
図７は、試料内ターゲット分析物が存在する場合、最大勾配を用いて分析する方法を説明するための図である。図７で、分析装置２００は非線形関数１５１０の最大勾配を生成する。図７で、非線形関数１５１０の最大勾配は５０である。分析装置２００は最大勾配が閾値を超えるか判断する。図７では閾値が３０に設定され、非線形関数１５１０の最大勾配（５０）が閾値（３０）を超える。したがって、分析装置２００は試料内ターゲット分析物が存在すると決定する（陽性）。
【０２５０】
試料内ターゲット分析物が存在すると、図７の非線形関数１５１０のように信号値が急に増加する区間が存在する。分析装置２００は、急に増加する区間が存在すると、試料内ターゲット分析物が存在すると決定できる。
【０２５１】
図８は、ＳＢＮ方法でデータセットを標準化する方法を説明するための図である。図８を参照すると、データセット１９００に対する基準サイクル及び基準サイクルにおける信号値が決定される。基準サイクルにおける信号値が決定されると、基準サイクルにおける信号値又は基準サイクルにおける信号値の変形値を用いて標準化係数が生成される。
【０２５２】
基準サイクルにおける信号値を用いて標準化係数が生成される場合、基準サイクルにおける信号値自体が標準化係数になり得る。したがって、基準サイクルにおける信号値をデータセット１９００の信号値に適用してデータセット１９００を標準化する。
【０２５３】
基準サイクルにおける信号値の変形値を用いて標準化係数が生成される場合、基準サイクルにおける信号値と基準値との関係を用いて標準化係数が決定され得る。基準サイクルにおける信号値と基準値との関係は、基準サイクルにおける信号値と基準値との差であり得る。一例において、基準サイクルにおける信号値と基準値との差は、基準値に対する基準サイクルにおける信号値の比（ｒａｔｉｏ）である。
【０２５４】
基準サイクルは任意に決定されたサイクルであり、基準サイクルにおける信号値は、データセット１９００の信号値である。図８に示すように、基準サイクルはデータセット１９００のサイクルの中から決定され、ベースライン領域で決定される。
【０２５５】
ｄＲＦＵはデータセット１９００の変位を表す。データセット１９００の変位は、データセットの信号値のうち、最大値と最小値との差又は最終値と初期値との差で計算され得る。
【０２５６】
ベースライン領域は、ターゲット分析物に対する増幅が発生しない区域であり、信号増幅区域は、ターゲット分析物に対する増幅が発生した区域である。基準サイクルはベースライン領域のサイクルの中から選択され得る。一例において、基準サイクルはサイクル４であり得る。図８では基準サイクルが１つである場合を示しているが、基準サイクルは２以上のサイクルであってもよい。複数の基準サイクルが選択される場合、複数の基準サイクルにおける複数の信号値が決定され、複数の信号値を用いて標準化係数が決定される。
【０２５７】
図９は、非線形関数に対する特性を説明するための図である。非線形関数２０００に対する特性は、試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定するために用いられる。具体的に、非線形関数２０００に対する特性を各特性に対する所定の閾値と比較でき、比較結果は試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定するために用いられる。
【０２５８】
本発明は、連続関数である非線形関数２０００を生成するので、一部の増幅区間で発生するジャンプエラー又はノイズによる影響を最小化できる。
【０２５９】
本発明の一具現例によれば、本発明は、非線形関数５００の変位が信号閾値を超えるか否かによってターゲット分析物の存在又は不存在を決定しない。反応の１つの基準又は特性を用いる代わりに、本発明は非線形関数５００の複数の特性を抽出し、前記特性を分析して試料内ターゲット分析物の存在を決定する。
【０２６０】
既存の方法はデータセットが閾値を超えるか否かを基準にターゲット分析物の存在又は不存在を決定するため、データセットのそれぞれの信号値がターゲット分析物の存在又は不存在の決定に影響を及ぼす。したがって、ジャンプエラー又はノイズの除去を含むデータセットを補正し、閾値を適切に設定することが非常に重要であり、データセットに対する補正が正しく行われていない場合又は閾値の設定が高精度に行われていない場合には、偽陽性又は偽陰性の危険がある。
【０２６１】
本発明は、データセット又は標準化されたデータセットにフィッティングされた非線形関数２０００を用いるので、非線形関数２０００に対する複数の特性を容易に抽出することができる。言い換えると、非線形関数２０００は連続関数であり、且つ数学式で表示されるため、非線形関数２０００の変位、最大勾配及びパラメータを含めてターゲット分析物の存在又は不存在を決定する上で有用な非線形関数２０００の複数の特性を抽出することが容易であり、正確に抽出することができる。
【０２６２】
非線形関数２０００は、標準化されたデータセットにフィッティングされた関数である。図９に示す式は非線形関数２０００の一例であり、シグモイド関数の一形態である。図９に示すシグモイド関数は４個のパラメータａ１，ａ２，ａ３，ａ４を含む。シグモイド関数は、５個以上のパラメータを含んでもよく、３個以下のパラメータを含んでもよい。
【０２６３】
非線形関数２０００の特性はパラメータａ１，ａ２，ａ３，ａ４、変位（ｄＲＦＵ）、最大勾配（ｄｆ）又はＲ２を含む。最大勾配はＦＤＭ（Ｆｉｒｓｔ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ）と表現され得る。
【０２６４】
非線形関数２０００の変位は、非線形関数２０００の最大値と最小値との差又は初期値と最終値との差であり得る。一例において、非線形関数２０００の変位はａ２−ａ１と計算され得る。非線形関数２０００の変位は、変位に対する閾値と比較され得る。例えば、変位に対する閾値は７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０又は１４０である。変位に対する閾値の単位はＲＦＵであり得る。非線形関数２０００の変位が変位に対する閾値未満である場合、試料内ターゲット分析物が不存在すると決定され得る。
【０２６５】
パラメータａ３は、非線形関数２０００の変曲点である。ｄｆは、非線形関数２０００の最大勾配である。ｄｆはａ３における勾配であり得る。非線形関数２０００の最大勾配は最大勾配に対する閾値と比較され得る。例えば、最大勾配に対する閾値は２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２である。非線形関数２０００の最大勾配が最大勾配に対する閾値未満である場合、試料内ターゲット分析物が不存在すると決定され得る。
【０２６６】
本発明の一具現例において、二次関数を用いて試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定することができる。
【０２６７】
データセットに対する二次関数（ｑｕａｄｒａｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を生成する。全区間（全サイクル）でデータセットとのフィッティングを用いて二次関数が生成される。全区間でフィッティングされた二次関数は第１二次関数と表記され得る。フィッティングのために様々な従来の非線形回帰分析方法を本発明に用いることができる（参照：Ｓｅｂｅｒ，Ｇ．Ａ．Ｆ．；Ｗｉｌｄ，Ｃ．Ｊ．（１９８９）。Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）。第１二次関数はｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃの形態の関数である。
【０２６８】
第１二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）又は第１二次関数のｘ２の係数に基づいて試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する。
【０２６９】
本発明の一具現例において、二次関数を用いて試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定できる。データセットのベースライン領域のサイクルに基づいて決定されたフィッティング区間でデータセットに対する二次関数が生成される。二次関数はフィッティング区間内でデータセットとフィッティングされた関数である。全区間でフィッティングされた二次関数は第１二次関数と表記され、フィッティング区間でフィッティングされた二次関数は第２二次関数と表記され得る。フィッティング区間で第２二次関数に対するフィッティング正確度が決定される。フィッティング正確度を用いて試料内前記ターゲット分析物の存在又は不存在が決定される。
【０２７０】
図１０は、二次関数を用いる本発明の一実施例による順序図である。
【０２７１】
段階２１１０でターゲット分析物に対するデータセットを得る。この段階は、上述した方法に記載された内容を参照されたい。段階２１２０で、データセットに対する第１二次関数を生成する。全区間（全サイクル）でデータセットとのフィッティングを用いて第１二次関数が生成される。フィッティングのために様々な従来の非線形回帰分析方法が本発明に用いられ得る（参照：Ｓｅｂｅｒ，Ｇ．Ａ．Ｆ．；Ｗｉｌｄ，Ｃ．Ｊ．（１９８９）。Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）。第１二次関数はｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃの形態の関数である。
【０２７２】
段階２１３０で、フィッティング区間でデータセットに対する第２二次関数を生成する。フィッティング区間は、第１二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）又はベースライン領域のサイクルに基づいて決定される。
【０２７３】
本明細書でフィッティング区間を言及しながら使う言葉“ベースライン領域のサイクルに基づいて決定”とは、ベースライン領域の全サイクル又は一部サイクルを選択してフィッティング区間として使用することを意味する。
【０２７４】
フィッティング区間としてベースライン領域のサイクルは、従来の方法（例えば、米国特許第８，５６０，２４７号及びＷＯ２０１６／０５２９９１）によって又は経験的に決定されたベースライン領域の全体又は一部のサイクルの中から選択され得る。
【０２７５】
第１二次関数が生成され、最小値である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）が閾値以上であるか又はｘ２の係数が０よりも大きい場合、フィッティング区間で第２二次関数が生成される。フィッティング区間はデータセットのベースライン領域のサイクルに基づいて決定され得る。或いは、フィッティング区間は第１二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）に基づいて決定されてもよい。フィッティング区間を言及しながら使う言葉“第１二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）に基づいて決定”とは、フィッティング区間の最終サイクル（ｅｎｄ  ｃｙｃｌｅ）がＣｍｉｎ又はＣｍｉｎ周辺のサイクル（具体的にＣｍｉｎ±５サイクル内のサイクル）に基づいて決定されることを意味する。フィッティング区間は、上述した開始フィッティングサイクルから最終サイクルまでと決定され、最終サイクルは、第１二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）に基づいて決定されたサイクルと決定され得る。
【０２７６】
第２二次関数は、一次関数、多次関数（例えば、二次関数及び三次関数）及び指数関数のように様々な関数を含む。線形又は非線形回帰分析方法を用いてデータセットと最も一致する第２二次関数を決定することができる。
【０２７７】
本発明の一具現例によれば、第２二次関数の代わりに指数関数が用いられ得る。第２二次関数はｙ＝ａ（ｘ−ｂ）２＋ｃ形態の関数である。指数関数はｙ＝ｄ（ｅａ（ｂ−ｘ））＋ｃ形態の関数である。ｂは、第２二次関数又は指数関数の対称軸である。
【０２７８】
データセットのベースライン領域で信号値にフィッティングされた指数関数が生成され、データセットから指数関数を差し引いて補正されたデータセットが生成される。
【０２７９】
段階２１４０で、フィッティング区間で第２二次関数に対するフィッティング正確度（ｆｉｔｔｉｎｇ  ａｃｃｕｒａｃｙ）を決定する。データセットと第２二次関数間のフィッティング正確度はフィッティング区間内の信号値を用いて決定される。
【０２８０】
本発明の特徴の一つは、第２二次関数のフィッティング正確度をターゲット分析物の分析に直接の指標として用いることである。段階２１５０で、フィッティング正確度を用いて試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定する。
【０２８１】
図１１は、本発明の一実施例によるデータセットの補正方法を説明するための順序図である。
【０２８２】
段階２２１０で、ターゲット分析物に対するデータセットを得る。この段階は、上述した方法に記載された内容を参照されたい。段階２２２０で、データセットに対する第１二次関数を生成する。第１二次関数は、全区間でデータセットにフィッティングされた二次関数である。段階２２３０で、データセットのベースライン領域のサイクルに基づいて決定されたフィッティング区間でデータセットに対する第２二次関数を生成する。第２二次関数は、フィッティング区間でデータセットにフィッティングされた二次関数である。段階２２４０で、データセットの信号値から第２二次関数の値を差し引いてデータセットを補正する。
【０２８３】
図１２は、第１二次関数を用いてフィッティング区間を設定する方法を説明するための図である。分析装置は、第１二次関数２３２０が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）に基づいてフィッティング区間を設定する。データセット２３１０は信号−発生反応から得られる。データセット２３１０は増幅装置から得られてもよく、増幅装置から得られたデータセットを補正して得られてもよい。例えば、同一チャネルにおいて高温及び低温検出温度でデータセットを得、低温検出温度で得られたデータセットから高温検出温度で得られたデータセットを差し引いてデータセット２３１０を得ることができる。また、増幅装置はチャネル間の干渉を考慮してデータセットを補正し、補正されたデータセットを出力してもよい。
【０２８４】
第１二次関数２３２０はデータセット２３１０とのフィッティングによって決定される。分析装置は、３個のパラメータを有する二次関数（ｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃ）とデータセット２３１０に最小二乗法を適用してデータセット２３１０に対する第１二次関数２３２０を生成する。
【０２８５】
分析装置は、第１二次関数２３２０を生成した後に、第１二次関数２３２０が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）を決定する。分析装置は第１二次関数２３２０を微分してＣｍｉｎを決定できる。図１２では第１二次関数２３２０に対するＣｍｉｎが１０の場合を示す。
【０２８６】
Ｃｍｉｎが閾値未満であれば、分析装置はＣｍｉｎを用いてフィッティング区間を設定する。分析装置はＣｍｉｎを用いてフィッティング区間の最終サイクルを決定できる。一例において、分析装置は、Ｃｍｉｎ、Ｃｍｉｎ−１、Ｃｍｉｎ−２、Ｃｍｉｎ−３、Ｃｍｉｎ−４又はＣｍｉｎ−５をフィッティング区間の最終サイクルとして決定できる。または、分析装置はＣｍｉｎ、Ｃｍｉｎ＋１、Ｃｍｉｎ＋２、Ｃｍｉｎ＋３、Ｃｍｉｎ＋４又はＣｍｉｎ＋５をフィッティング区間の最終サイクルとして決定できる。Ｃｍｉｎが１０であり、閾値が３０であれば、Ｃｍｉｎが閾値未満であるので、分析装置はＣｍｉｎを用いてフィッティング区間の最終サイクルを決定する。
【０２８７】
分析装置はＣｍｉｎと最小フィッティングサイクルを用いてフィッティング区間の最終サイクルを決定できる。一例において、最小フィッティングサイクルは１０、サイクル９、８、７、６、５と決定され得る。最小フィッティングサイクルは増幅反応の最終サイクルによって決定され得る。分析装置はＣｍｉｎ、Ｃｍｉｎ−１、Ｃｍｉｎ−２、Ｃｍｉｎ−３、Ｃｍｉｎ−４又はＣｍｉｎ−５のいずれか一つの値を選択し、選択された値と最小フィッティングサイクルのうち大きい値をフィッティング区間の最終サイクルとして決定することができる。最小フィッティングサイクルが９であり、Ｃｍｉｎが１０であると、分析装置は９及び１０のうち大きい値である１０をフィッティング区間の最終サイクルとして決定できる。
【０２８８】
分析装置は開始フィッティングサイクルを設定する。開始フィッティングサイクルはフィッティング区間の最小サイクルである。フィッティング区間は、最小サイクルと最大サイクルとの間になる。開始フィッティングサイクルは増幅反応の最終サイクルによって決定され得る。一例において、製品の最大サイクルが４０であれば、開始フィッティングサイクルはサイクル０、１、２になり得る。一例において、製品の最大サイクルがサイクル４０を超えると、開始フィッティングサイクルはサイクル４、５、６、７になり得る。
【０２８９】
図１３は、第１二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）を用いて試料内ターゲット分析物の不存在を決定する方法を説明するための図である。分析装置はＣｍｉｎを決定し、Ｃｍｉｎが閾値を超えると、試料内ターゲット分析物が不存在すると決定する。第１二次関数２４２０はデータセット２４１０とのフィッティングによって決定される。分析装置は、３個のパラメータを有する二次関数（ｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃ）とデータセット２４１０に最小二乗法を適用してデータセット２４１０に対する第１二次関数２４２０を生成する。
【０２９０】
図１３で、データセット２４１０は陰性試料であり、サイクルが増加するにつれて信号値の大きさが小さくなる。したがって、データセット２４１０に対する第１二次関数２４２０も減少する形態となる。第１二次関数２４２０が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）が４０になる。第１二次関数２４２０が最小である時のサイクル（サイクル４０）が閾値（サイクル３０）を超えるので、分析装置は試料内ターゲット分析物が不存在すると決定する。
【０２９１】
本発明は、データセットと第１二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）だけによって試料内ターゲット分析物が不存在するか否かを決定できる。したがって、既存の方法とは違い、データセットを補正し、閾値を用いてＣｔ値を取得する段階無しで、試料内ターゲットの不存在を正確、迅速且つ簡便に決定できる。
【０２９２】
図１４は、第２二次関数とデータセットのフィッティング正確度を用いて試料内ターゲット分析物の不存在を決定する方法を説明するための図である。
【０２９３】
分析装置は、第１二次関数２５１０を用いてフィッティング区間を設定する。分析装置はデータセット２５００に対する第１二次関数２５１０を生成する。分析装置は第１二次関数２５１０が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）を計算する。第１二次関数２５１０が最小である時のサイクル（サイクル１０）が閾値（サイクル３０）未満であるので、分析装置は、第１二次関数２５１０が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）又はベースライン領域のサイクルに基づいてフィッティング区間を決定する。
【０２９４】
分析装置は、フィッティング区間でデータセット２５００にフィッティングされた第２二次関数２５２０を生成する。分析装置はフィッティング区間で第２二次関数２５２０に対するフィッティング正確度を決定する。
【０２９５】
図１４ではフィッティング正確度としてＲ２値を利用し、Ｒ２値が０．７９２５である。Ｒ２値が閾値（０．８５）未満であるので、分析装置は試料内ターゲット分析物が不存在すると決定する。
【０２９６】
本発明は、データセットに対する第１二次関数２５１０が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）又はベースライン領域のサイクルを第２二次関数２５２０のフィッティング区間として用い、フィッティング正確度をターゲット分析物分析、特にターゲット分析物の不存在を検出する直接の指標として用いて、偽陽性及び偽陰性、特に偽陽性無しでターゲット分析物を分析できるようにする。
【０２９７】
図１５は、第２二次関数を用いてベースラインを設定する方法を説明するための図である。分析装置は、第２二次関数２６２０をベースラインとして設定できる。
【０２９８】
分析装置は、第１二次関数２６１０を用いてフィッティング区間を設定する。分析装置はデータセット２６００に対する第１二次関数２６１０を生成する。分析装置は、第１二次関数２６１０が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）を計算する。第１二次関数２６１０が最小である時のサイクル（サイクル９）が閾値（サイクル３０）未満であるので、分析装置は第１二次関数２６１０が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）又はベースライン領域のサイクルに基づいてフィッティング区間を決定する。
【０２９９】
分析装置はフィッティング区間でデータセット２６００に対するフィッティングを行う。分析装置は、フィッティング区間でデータセット２６００にフィッティングされた第２二次関数２６２０を生成する。
【０３００】
分析装置は、フィッティング区間で第２二次関数２６２０に対するフィッティング正確度を決定する。分析装置はフィッティング区間におけるデータセット２６００の信号値と第２二次関数２６２０の関数値を用いてフィッティング正確度を決定する。図１５ではフィッティング正確度としてＲ２値を利用し、Ｒ２値が０．７９２５である。Ｒ２値が閾値（０．８５）を超えるので、分析装置は第２二次関数２６２０をベースラインとして決定する。
【０３０１】
第２二次関数２６２０を決定する時にはフィッティング区間内のデータセット２６００の信号値が用いられるが、第２二次関数２６２０がベースラインとして設定されると、全サイクルにおいて第２二次関数２６２０の関数値が用いられる。
【０３０２】
分析装置は、全サイクルでデータセット２６００の信号値から第２二次関数２６２０の関数値を差し引いてデータセット２６００を補正することができる。分析装置は、補正されたデータセットを分析して試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定することができる。
【０３０３】
本発明は、陰性対照群のような別途の分析物の分析無しにもデータセット２６００を分析することだけでベースラインを設定できる長所を有する。
【０３０４】
図１６は、ＭｕＤＴ技術に基づく本発明の方法に対する順序図である。図１６を参照して、本発明の方法をそれぞれの段階別に詳細に説明すると、次の通りである。
【０３０５】
段階２７１０で、２つの異なる温度で信号を検出する。相対的に低温検出温度及び相対的に高温検出温度で信号が検出される。
【０３０６】
段階２７２０で、相対的低温検出温度で検出された信号を評価する。相対的低温検出温度で検出された信号が第１閾値によって定義された第１基準を満たすか否か決定する。
【０３０７】
相対的低温検出温度で検出された信号が第１基準を満たすとき、段階２７３０を行い、相対的低温検出温度で検出された信号が第１基準を満たさないとき、第１ターゲット核酸配列及び第２ターゲット核酸配列が試料内に存在しないと決定され、段階２７３０を行わない。
【０３０８】
相対的低温検出温度で検出された信号が第１基準を満たさないということは、試料内第１ターゲット核酸配列及び第２ターゲット核酸配列が不存在することを意味する。したがって、段階２７３０を実施する必要がなく、手順を終了する。
【０３０９】
相対的低温検出温度で検出された信号が第１基準を満たすということは、第１ターゲット核酸配列又は第２ターゲット核酸配列が試料内に存在する可能性があることを意味するので、次の段階を行う。相対的低温検出温度で検出された信号が第１基準を満たすとしても、必ずしも２個のターゲット核酸配列のうち１個以上のターゲット核酸配列が試料内に存在することを意味するわけではない。
【０３１０】
第１基準は第１閾値によって定義（ｄｅｆｉｎｅ）され得る。この段階で使われる“第１閾値”とは、相対的低温検出温度で検出された信号の有意性を決定するために用いられる閾値を意味する。“第２閾値”は、第２ターゲット核酸配列に対する信号の有意性を決定するために用いられる閾値を意味する。“第３閾値”は、第１ターゲット核酸配列に対する信号の有意性を決定するために用いられる閾値を意味する。“第３閾値”は、相対的高温検出温度で検出された信号の有意性を決定するために用いられる閾値を意味してもよい。信号の有意性は、特定温度で生成された信号が特定の閾値に対して意味のあるレベルで生成されることを意味する。信号の有意性は、特定信号−発生手段によって生成された信号とそれ以外の信号を区分するために設定された適切な閾値によって判断され得る。具体的に、信号の有意性を判断するために用いられる閾値は、関心の核酸配列から由来しない信号、例えば背景信号又はノイズ信号などを排除できる任意の値に設定される。一例として、増幅反応が進行されるにつれて信号が増幅される場合、信号が閾値以上であると、信号は有意のものと決定され得る。
【０３１１】
閾値（第１、第２、第３閾値）は通常の閾値設定方法によって定められ得る。例えば、閾値は、背景信号、敏感度、標識特性、検出器の信号変移（ｓｉｇｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）又は誤差範囲を考慮して決定することができる。の閾値は信号−発生反応の指数区域（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）に設定され得る。閾値は信号−発生反応の停滞区域（ｐｌａｔｅａｕ  ｒｅｇｉｏｎ）の信号値より大きくないとともにベースライン領域（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｒｅｇｉｏｎ）の信号値より大きい値に設定され得る。または、閾値は、ベースライン差し引きされた増幅曲線においてベースライン領域の信号値の標準偏差に一定の値（例えば、１０）を掛けた値に設定することができる。
【０３１２】
閾値は、検出器が自動で又は実施者が直接設定することができる。例えば、第１閾値は１００（ＲＦＵ）であり得る。
【０３１３】
段階２７３０で、第２ターゲット核酸配列に対する信号を抽出する。段階２７２０で、相対的低温検出温度で検出された信号が第１基準を満たすとき、第２ターゲット核酸配列に対する信号を抽出する。本発明の特徴の一つは、相対的高温検出温度で検出された信号が第３基準を満たさなくとも、第２ターゲット核酸配列に対する信号を抽出する段階を実施することである。
【０３１４】
本発明は、相対的高温検出温度で検出された信号が第３基準を満たさないときにも、すなわち、相対的高温検出温度で検出された信号に関係なく信号を抽出する段階２７３０を行う。
【０３１５】
２個の異なる検出温度で検出された信号と基準値を用いて特定ターゲット核酸配列に対する信号を抽出する過程を、本願では‘信号抽出過程（Ｓｉｇｎａｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）’と命名する。
【０３１６】
段階２７４０で、第２ターゲット核酸配列に対する信号を評価する。抽出された第２ターゲット核酸配列に対する信号が第２閾値又は第２信号変位によって定義された第２基準を満たすか否か識別する。第２ターゲット核酸配列に対する信号が第２基準を満たすとき、第２ターゲット核酸配列が試料内に存在すると決定される。第２ターゲット核酸配列に対する信号が第２基準を満たさないとき、第２ターゲット核酸配列が試料内に不存在すると決定される。第２基準は第２閾値又は第２信号変位によって定義される。
【０３１７】
非線形関数フィッティング方法を適用する前に、第２ターゲット核酸配列に対する信号を二次関数を用いて補正することができ、二次関数と第２ターゲット核酸配列に対する信号とのフィッティング正確度を用いて第２ターゲット核酸配列の不存在が決定され得る。
【０３１８】
フィッティングを行う前に、分析装置は、第２ターゲット核酸配列に対する信号に対するベースラインを設定し、第２ターゲット核酸配列に対する信号からベースラインを差し引いて、補正された第２ターゲット核酸配列に対する信号を生成できる。分析装置は、補正された第２ターゲット核酸配列に対する信号に非線形関数フィッティング方法を適用することができる。
【０３１９】
本発明の一具現例において、分析装置はフィッティング区間を設定し、フィッティング区間で第２ターゲット核酸配列に対する信号にフィッティングされた二次関数を生成し、二次関数をベースラインとして設定できる。フィッティング区間はあらかじめ設定された区間であり得る。一例において、フィッティング区間はサイクル４〜サイクル１２に設定され得る。分析装置は、サイクル４〜サイクル１２の信号値に最も一致する二次関数をフィッティングによって生成する。この時、二次関数は対称軸を有することができ、対称軸は信号−発生反応の最終サイクル±１０、最終サイクル±８、最終サイクル±６、最終サイクル±５、最終サイクル±３、最終サイクル±２、又は最終サイクル±１の範囲にあり得る。
【０３２０】
分析装置は、補正されたデータセット（又は、補正された第２ターゲット核酸配列に対する信号）と非線形関数をフィッティングし、フィッティングされた非線形関数と補正されたデータセットとのフィッティング正確度を用いて第２ターゲット核酸配列の存在又は不存在を決定できる。
【０３２１】
段階２７５０で第１ターゲット核酸配列に対する信号を評価する。
【０３２２】
分析装置は相対的高温検出温度で検出された信号が第３閾値又は第３信号変位によって定義される第３基準を満たすか否か識別する。相対的高温検出温度で検出された信号が第３基準を満たすとき、第１ターゲット核酸配列が試料内に存在すると決定され、相対的高温検出温度で検出された信号が第３基準を満たさないとき、第１ターゲット核酸配列が試料内に不存在すると決定される。
【０３２３】
本発明の一具現例において、相対的高温検出温度で検出された信号が第３基準を満たしても、第１ターゲット核酸配列が試料内に存在すると最終的に決定するために非線形関数フィッティング方法を用いることができる。
【０３２４】
段階２７５０は、段階２７１０と段階２７２０との間、段階２７２０と段階２７３０との間、段階２７３０と段階２７４０との間、又は段階２７４０の後に実施され得る。
【発明の効果】
【０３２５】
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ａ）本発明は、データセットに対する非線形関数のフィッティング正確度をターゲット分析物分析、特にターゲット分析物の検出に直接の指標として用いて、偽陽性及び偽陰性、特に偽陽性無しでターゲット分析物を検出できるようにする。
【０３２６】
（ｂ）ターゲット核酸配列を核酸増幅反応で検出する本発明の具現例において、本発明はＣｔ値を得るための閾値を設定することなく、試料内ターゲットの存在又は不存在を正確、迅速且つ簡便に決定することができる。
【０３２７】
（ｃ）ターゲット核酸配列を核酸増幅反応で検出する本発明の具現例において、非線形フィッティング関数のフィッティング正確度の他に、（ｉ）データセット、補正されたデータセット又は非線形フィッティング関数の変位、（ｉｉ）非線形フィッティング関数の最大勾配及び（ｉｉｉ）非線形フィッティング関数の形態を決定するパラメータ（特に、４個のパラメータを含むシグモイド関数のａ４）を用いてターゲット核酸配列を検出することができ、これによって、様々な臨床試料に現れる誤ったターゲット決定、特に偽陽性を完壁に除去することができる。
【０３２８】
（ｄ）本発明において、変位、最大勾配及び形態−決定的パラメータのようなターゲット分析物の存在又は不存在を決定するために用いられるパラメータに適用される閾値は、特定信号値を考慮する従来技術と違い、デートセットの信号パターン（例えば、核酸増幅反応のデータセット）を考慮して設定される。このような点で、本発明は、実験ごとに、反応ごとに、製品ごとに、装備ごとに具体的に閾値を設定する必要がない長所を有する。例えば、あらかじめ核酸増幅反応のデータセットで適切な閾値を設定すれば、設定された閾値は、以降の全ての核酸増幅反応に適用され得る。または、閾値を試料の種類ごとにそれぞれ設定し、設定された閾値は、以降の当該試料を用いる全ての核酸増幅反応に適用され得る。例えば、糞便（ｓｔｏｏｌ）を用いた核酸増幅反応に対する閾値をあらかじめ設定すれば、設定された閾値は、以降の糞便試料を用いる全ての核酸増幅反応に適用され得る。
【０３２９】
（ｅ）本発明は基本的に信号の強度ではなく信号のパターンを用いてターゲット分析物を分析するものであるから、ノイズ影響を著しく減らすことができる。
【０３３０】
（ｆ）ＳＢＮ技術を用いる一具現例において、非線形フィッティング関数は標準化係数を用いて標準化されたデータセットに適用される。
【０３３１】
（ｇ）ＳＢＮ技術を用いる一具現例において、本発明は、より便利な方式でデータセットを補正でき、機器間及び機器内信号偏差を大幅に減らすことができる。ＳＢＮ技術を用いて標準化されたデータセットは、非常に便利な方式で非線形−フィッティング関数のパラメータに対する閾値を設定可能にする。
【０３３２】
（ｈ）本発明は、標準化されたデータセットの形態（ｓｈａｐｅ）が典型的な増幅曲線の形態と一致するか否かを分析してターゲット分析物の存在又は不存在を決定するので、ノイズやジャンプエラーによって偽陽性と判断する可能性が極めて低い。
【０３３３】
（ｉ）一具現例によれば、本発明は、１つの特性ではなく非線形フィッティング関数の少なくとも２つの特性を分析して検出結果を導出するので、偽陽性又は偽陰性結果を減らすことができるという点で非常に画期的な技術である。
【０３３４】
（ｊ）ＳＢＮ技術を用いる一具現例において、適切な基準値を用いたデータ標準化をする本発明は、信号−発生手段（例えば、プライマー及びプローブ）の量を減らすことにおいてより有利である。
【０３３５】
（ｋ）一具現例において、本発明は、データセットに対する第１二次関数が最小である時のサイクルを、特にターゲット分析物の不存在を検出する直接の指標として用いて、偽陽性及び偽陰性、特に偽陽性無しでターゲット分析物を分析することができる。
【０３３６】
（ｌ）一具現例において、本発明は、（ｉ）データセットに対する第１二次関数が最小である時のサイクル又は（ｉｉ）第２二次関数のフィッティング区間としてベースライン領域のサイクルを利用し、第２二次関数のフィッティング正確度をターゲット分析物の不存在を決定する直接の指標として用いて偽陽性及び偽陰性、特に偽陽性無しでターゲット分析物を分析することができる。
【０３３７】
（ｍ）一具現例において、本発明は（ｉ）データセットに対する第１二次関数が最小である時のサイクル又は（ｉｉ）ベースライン領域のサイクルに基づいて決定された第２二次関数をデータセットを補正するために用いることができる。
【０３３８】
（ｎ）データセットに対する第１二次関数が最小である時のサイクルに対する閾値及び第２二次関数のフィッティング正確度に対する閾値は、特定の信号値を考慮する従来技術と違い、データセット（例えば、核酸増幅反応のデータセット）の信号パターンを考慮して設定される。このような点で、本発明は実験ごとに、反応ごとに、製品ごとに、装備ごとに閾値を具体的に設定しなくて済むという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【０３３９】
【図１】一実施例によるターゲット分析物を分析する装置を示す。
【図２】一実施例による分析装置を説明するための構成図である。
【図３】一実施例によるターゲット分析物の分析方法を説明するための順序図である。
【図４】一実施例によるターゲット分析物の存在又は不存在を決定する方法を説明するための順序図である。
【図５】試料内ターゲット分析物が存在する場合、フィッティング正確度を用いて分析する方法を説明するための図である。
【図６】最大勾配を用いてターゲット分析物の存在又は不存在を決定する方法を説明するための順序図である。
【図７】試料内ターゲット分析物が存在する場合、最大勾配を用いて分析する方法を説明するための図である。
【図８】ＳＢＮ方法を用いてデータセットを標準化する方法を説明するための図である。
【図９】非線形関数に対する特性を説明するための図である。
【図１０】二次関数を用いる本発明の一実施例による順序図である。
【図１１】本発明の一実施例によるデータセットを補正する方法を説明するための順序図である。
【図１２】第１二次関数を用いてフィッティング区間を設定する方法を説明するための図である。
【図１３】Ｃｍｉｎを用いて試料内ターゲット分析物の不存在を決定する方法を説明するための図である。
【図１４】第２二次関数とデータセットとのフィッティング正確度を用いて試料内ターゲット分析物の不存在を決定する方法を説明するための図である。
【図１５】第２二次関数を用いてベースラインを設定する方法を説明するための図である。
【図１６】ＭｕＤＴ技術に基づく本発明の方法を説明するための順序図である。
【図１７】標準化されていないデータセットに対する分析結果を示す図である。
【図１８】標準化されていないデータセットに対する分析結果を示す図である。
【図１９】標準化されていないデータセットに対する分析結果を示す図である。
【図２０】標準化されていないデータセットに対する分析結果を示す図である。
【図２１】標準化されたデータセットに対する分析結果を示す図である。
【図２２】標準化されたデータセットに対する分析結果を示す図である。
【図２３】標準化されたデータセットに対する分析結果を示す図である。
【図２４】標準化されたデータセットに対する分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０３４０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、添付する請求項に記載の本発明の範囲がそれらの実施例によって制限されないということは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【実施例】
【０３４１】
実施例１：胃腸管感染ウイルスの検出
データセットの取得
急性下痢の主要原因であるノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）ＧＩ、ノロウイルスＧＩＩ、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）及びロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）を検出するためにＳｅｅｇｅｎｅ社のＡｌｌｐｌｅｘＴＭＧＩ−Ｖｉｒｕｓ  Ａｓｓａｙを使用した。
【０３４２】
ＣＦＸ９６ＴＭ実時間ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて３０個のサンプルに対して核酸増幅反応を行った。核酸増幅反応は９５℃で１０秒、６０℃で１分、そして７２℃で３０秒を反復する条件で行われ、総４５サイクルを行う。ＰＴＯＣＥ（ＷＯ２０１２／０９６５２３）及びＭｕＤＴ（ＷＯ２０１５／１４７４１２）技術を用いてＣＦＸ９６からデータセットを取得した。前記データセットは全ての増幅サイクルに対する信号値を含む。
【０３４３】
３０個のサンプルは、次の表１のように臨床実験によって陽性又は陰性が確認されたサンプルである（陽性サンプル２０個、陰性サンプルが１０個）。
【０３４４】
サンプル１、２、３、６及び７はノロウイルスＧＩＩ、サンプル９、１０、１１、１３及び１４はアデノウイルス、サンプル１６、１７、１９、２０及び２１はノロウイルスＧＩ、そしてサンプル２４、２６、２７、２８及び２９はロタウイルスに感染されたサンプルである。
【０３４５】
【表１】
2021500869.tif 000009
【０３４６】
補正されたデータセットの取得
データセットを補正するために陰性対照群差し引き（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を行った。陰性対照群は、試料の添加無しでＡｌｌｐｌｅｘＴＭＧＩ−Ｖｉｒｕｓ  Ａｓｓａｙの構成（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）だけを含む。サンプルに対する核酸増幅反応を行う時、同一プレートで一緒に陰性対照群の増幅反応を行って陰性対照群に対するデータセットを取得した。各サイクルでデータセットの信号値から陰性対照群の信号値を差し引いて補正されたデータセットを取得した。各サンプルに対して陰性対照群差し引きを行い、補正されたデータセットを取得した。
【０３４７】
シグモイド関数フィッティングを用いたターゲット核酸分子の存在又は不存在を決定
（ａ）シグモイドフィッティング関数の取得
サンプルのそれぞれから得られた補正されたデータセットに対して４個のパラメータを含む式３を用いてシグモイド関数とのフィッティングを行った。ＬＭアルゴリズム（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズム；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｋａｎｚｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＣＡＭ，１７２（２）：３７５（２００４））を適用して、補正されたデータセットにフィッティングされたシグモイド関数を取得した。
【０３４８】
（ｂ）シグモイド関数の変位による陰性１次フィルタリング
シグモイド関数の変位を用いて陰性サンプルをフィルタリングした。シグモイドフィッティング関数の変位は、シグモイドフィッティング関数の最大ＲＦＵと最小ＲＦＵとの差を計算して取得した。計算された変位と変位に対する閾値（ＲＦＵ  １００）を比較して陰性サンプルをフィルタリングした。前記フィッティングされたシグモイド関数の変位が１００（ＲＦＵ）以下であるサンプルは陰性と決定した。
【０３４９】
５個のサンプルのシグモイド関数の変位が１００（ＲＦＵ）以下であり、陰性としてフィルタリングした（サンプル５、８、１２、２３及び２５）（表２）。
【０３５０】
【表２】
2021500869.tif 000010
【０３５１】
（ｃ）シグモイドフィッティング関数の最大勾配による陰性二次フィルタリング
シグモイドフィッティング関数の最大勾配を用いて残り２５個のサンプルに対して二次陰性フィルタリングを行った。最大勾配は、各サンプルに対してシグモイドフィッティング関数を微分して計算した（すなわち、前記シグモイド関数に対するＦＤＭ（ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｍａｘｉｍｕｍ）値）。最大勾配に対する閾値は２８に設定された。
【０３５２】
表３に整理したように、４個のサンプル（サンプル１５、１８、２２及び３０）のシグモイド関数の最大勾配が２８未満であるので、４個のサンプルを陰性としてフィルタリングした。
【０３５３】
【表３】
2021500869.tif 000011
【０３５４】
（ｄ）フィッティング正確度Ｒ２値による陽性又は陰性サンプルの最終決定
陰性と決定された９個のサンプルを除く、残り２１個のサンプルに対してフィッティング正確度を計算した。フィッティング正確度としてＲ２値を用いた。Ｒ２値は式４を用いて計算され、Ｒ２値に対する閾値は０．８７に設定した。Ｒ２値が０．８７以下であるサンプルは陰性と決定した。
【０３５５】
表４に見られるように、２１個のサンプルのうち１個のサンプルに対するＲ２値が０．８７未満で陰性サンプルとして確認された（サンプル４）。残り２０個のサンプルは、Ｒ２値が０．８７を超え、陽性サンプルとして確認された。
【０３５６】
【表４】
2021500869.tif 000012
【０３５７】
実施例２：従来技術による胃腸管感染ウイルスの検出（実施例１に対する比較実施例）
データセットの取得
実施例１と同じ過程によってデータセットを取得した。
【０３５８】
補正されたデータセットの取得
Ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｓｍｏｏｔｈｉｎｇアルゴリズム（Ｗｉｎｆｒｉｅｄ  Ｓｔｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，３４：６１（１９９０））を用いてノイズを除去した。生データセット（ｒａｗ  ｄａｔａ  ｓｅｔ）の差が基準閾値以上になるサイクルまで線形回帰を行ってベースラインを取得し、ベースライン差し引きによって補正されたデータセットを取得した。
【０３５９】
Ｃｔ値に対する閾値を用いてターゲット核酸分子の存在又は不存在を決定
前記補正されたデータセットがＣｔ値に対する閾値を超えるか否か判断して、サンプルのそれぞれに対する陽性又は陰性を判定した。補正されたデータセットにおいて閾値を超える信号値があると、そのサンプルを陽性と判定し、閾値を超える信号値がないと、そのサンプルを陰性と判定した。Ｃｔ値に対する閾値は、ノロウイルスＧＩ、ノロウイルスＧＩＩ、アデノウイルス及びロタウイルスに対してそれぞれ１２０、１２０、６０及び１２０が用いられた。
【０３６０】
【表５】
2021500869.tif 000013
【０３６１】
表５に整理した通り、７個陰性、及び２３個陽性と分析された。２３個の陽性サンプルのうち３個のサンプル（４、５及び８）は、臨床実験結果では陰性サンプルと確認された。したがって、閾値を適用する従来技術は本発明に比べて偽陽性結果が出る可能性が一層高いはずである。
【０３６２】
実験の結果
本発明と従来方法を適用して３０個のサンプルを分析した。サンプルは総３０個であり、臨床実験によって陽性サンプルは２０個、陰性サンプルは１０個と判定された。
【０３６３】
【表６】
2021500869.tif 000014
【０３６４】
表６に見られるように、従来技術によって３個のサンプルに対して偽陽性結果が出た。しかし、本発明は、３０個のサンプルとも臨床実験結果と同じ分析結果を示した。したがって、本発明の分析方法によれば、Ｃｔ値を得るための閾値設定無しで試料内ターゲット核酸分子の存在又は不存在を正確、迅速且つ簡便に決定できることが分かった。
【０３６５】
実施例３：データセットの標準化方法及び非線形フィッティング関数を用いた試料内ターゲット分析物の分析方法
ＳＢＮ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌ−ｂａｓｅｄ  Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）方法による標準化によってデータセットを補正した後、本発明の方法によって非線形フィッティング関数を用いて試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を分析した。
【０３６６】
データセットの取得
４個のターゲット核酸配列に対する実時間重合酵素連鎖反応を行った。３台のＣＦＸ９６実時間ＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて４個のターゲット核酸配列を同時に増幅し、それぞれのターゲット核酸配列に対してＴａｑＭａｎプローブを信号−発生手段として用い、増幅サイクルを５０回にして行った。同一のターゲット核酸配列が同一の濃度で含まれたサンプルを用いて各装備別、チャネル別に９６個ウェルで９６個反応を同一の条件で行い、これから１２個グループ（３個装備×４個チャネル）のデータセットを取得した。
【０３６７】
【表７】
2021500869.tif 000015
【０３６８】
データセットの標準化
装備別／チャネル別基準値を適用してデータセットを補正した。基準総信号変化値（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＴＳＣ；Ｒ−ＴＳＣ）に対する各装備別／チャネル別データセットの総信号変化値の比率を用いて装備別／チャネル別基準値を決定した。基準総信号変化値は、全ての装備／チャネルに対してＲＦＵ５，０００と任意に決定し、データセットの総信号変化値は、各装備別／チャネル別に９６個反応の平均値を基準にして決定した。前記データセットの基準サイクルの信号値を前記比率で補正し、前記基準サイクルの補正された信号値を基準値として用いて、該当する装備の該当するチャネルから得られたデータセットに適用した。
【０３６９】
下記段階１〜段階３において装備別、チャネル別データセットから基準値を決定し、段階４では、前記決定された装備別、チャネル別基準値を用いて前記データセットを補正した。
【０３７０】
＜段階１＞
基準サイクルをデータセットのサイクル５と決定し、前記サイクル５の信号値を基準値の決定に使用した。また、データセットの総信号変化値は、最後５０番目のサイクルにおける信号値から基準サイクルにおける信号値を差し引いて算出した。ＴＳＣ及び基準サイクルの信号値は、表８に整理した。
【０３７１】
【表８】
2021500869.tif 000016
【０３７２】
＜段階２＞
前記算出された総信号変化値と共に各装備及びチャネルで基準値決定に用いられる基準総信号変化値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＴＳＣ；Ｒ−ＴＳＣ）をＲＦＵ  ５，０００と指定した。
【０３７３】
＜段階３＞
前記総信号変化値、基準サイクルの信号値及び基準総信号変化値を用いて各装備に適用される基準値を次のように算出した。
【０３７４】
【数７】
2021500869.tif 000017
【０３７５】
データセットの補正に用いられる基準値は、表９のように決定された。
【０３７６】
【表９】
2021500869.tif 000018
【０３７７】
＜段階４＞
前記決定された基準値を用いて、１２個グループのデータセットを次のように標準化した：各ウェルのデータセットで基準サイクルの信号値と前記段階３で決定された基準値を用いて標準化係数（Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を計算した：標準化係数＝基準サイクルの信号値÷基準値
標準化係数を用いて全てのサイクルで信号値を標準化し、１２個グループに対して標準化されたデータセットを取得した。標準化された信号値（ＲＦＵ）＝データセットの信号値（ＲＦＵ）÷標準化係数
ベースライニング
１２個グループのデータセットと標準化されたデータセットに対するベースライニングを行った。対称軸を有する二次関数を用いてベースライニングを行った。二次関数はｙ＝ａ（ｘ−５０）２＋ｃの形態を使用した。ベースライニングに対するフィッティング区間はサイクル４〜サイクル１２と決定した。サイクル４からサイクル１２までのデータセットの信号値にフィッティングされる二次関数を生成した。データセットの信号値から二次関数の値を差し引いて１２個グループのベースライニングされたデータセットと１２個グループの標準化及びベースライニングされたデータセットを得た。
【０３７８】
非線形フィッティング関数としてシグモイド関数を取得
１２個グループのベースライニングされたデータセット（図１７〜図２０参照）及び１２個グループの標準化及びベースライニングされたデータセット（図２１〜図２４）に対して、４個のパラメータを含む式３のシグモイド関数を用いてシグモイド関数とのフィッティングを行った。
【０３７９】
Ｒ２値、変位値及び最大勾配を実施例１のように計算した。
【０３８０】
ターゲット核酸分子の存在又は不存在を決定
試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定するために、シグモイド関数での４個パラメータ、変位、Ｒ２及び最大勾配に対する閾値を下記のように設定した：変位≧ＲＦＵ１００；Ｒ２≧０．９；最大勾配≧５０；及びａ４＜２．０．
４個の基準を全て満たす場合、ターゲット分析物が試料内に存在すると決定した。４個の基準のいずれか一つでも満たさない場合、ターゲット分析物が試料内に存在しないと決定した。１２個グループの標準化されたデータセットに対する非線形フィッティング関数の分析の結果、４個の基準を全て満たし、１２個の試料内にターゲット分析物が全て存在すると決定された。
【０３８１】
【表１０】
2021500869.tif 000019
【０３８２】
したがって、データセットを標準化し、ベースライニングした後、非線形フィッティング関数で分析して試料内ターゲット分析物の存在又は不存在を決定できることが確認できた。
【０３８３】
Ｃｔ値に対する閾値を用いて定量分析が必要な場合、本発明は、非線形フィッティング関数を適用してデータセットのノイズ信号を標準化でき、ＳＢＮ方法によって変位また標準化できるので、装備別又はチャネル別信号差を考慮することなく、異なる装備又はチャネルに対する閾値を容易に又は均一に設定できるという点で優れた利点を呈する。
【０３８４】
図１７〜図２０は、それぞれ、チャネル１（ＦＡＭ）、チャネル２（ＨＥＸ）、チャネル３（ＣａｌＲｅｄ  ６１０）及びチャネル４（Ｑｕａｓａｒ  ６７０）に対する標準化されていないデータセットの結果を示す。図１７〜図２０に見られるように、標準化されていないデータセットに対する非線形フィッティング関数は、装備間信号変化量差を示す変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ，ＣＶ）が４９．５％、５１．１％、４４．７％、そして６２．６％と偏差が大きいことが確認できた。
【０３８５】
図２１〜図２４は、それぞれ、チャネル１（ＦＡＭ）、チャネル２（ＨＥＸ）、チャネル３（ＣａｌＲｅｄ  ６１０）及びチャネル４（Ｑｕａｓａｒ  ６７０）に対する標準化されたデータセットの結果を示す。図２１〜図２４に示すように、標準化されたデータセットの非線形関数は、装備間信号変化量変動係数が２．７％、４．０％、５．３％、そして３．７％と偏差が顕著に減少したことが確認できる。前記非線形関数曲線から全ての装備及びチャネルで同じ閾値であるＲＦＵ  １１０を用いてＣｔ値を計算して比較した結果、Ｃｔ値の変動係数が、標準化方法の非適用時に５．７％で、標準化方法の適用時に１．６％であった。これは、ＳＢＮ方法と共に非線形フィッティング方法が、装備及びチャネル間における変動（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が大きく減少した定量データ（例えば、Ｃｔ値）を提供できる、ということが確認できた。
【０３８６】
表１１〜表１８は、図１７〜図２４のデータを表す。
【０３８７】
【表１１】
2021500869.tif 000020
【０３８８】
【表１２】
2021500869.tif 000021
【０３８９】
【表１３】
2021500869.tif 000022
【０３９０】
【表１４】
2021500869.tif 000023
【０３９１】
【表１５】
2021500869.tif 000024
【０３９２】
【表１６】
2021500869.tif 000025
【０３９３】
【表１７】
2021500869.tif 000026
【０３９４】
【表１８】
2021500869.tif 000027
【０３９５】
Ｍｉｎ．：最小（Ｍｉｎｉｍｕｍ）
Ｍａｘ．：最大（Ｍａｘｉｍｕｍ）
Ｒａｎｇｅ  ：Ｍａｘ−Ｍｉｎ
ＳＤ：標準偏差（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）
ＣＶ：変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）
ＳＢＮ：特定背景信号基盤標準化（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｓｉｇｎａｌ−ｂａｓｅｄ  Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）
【０３９６】
【表１９】
2021500869.tif 000028
【０３９７】
興味深いことに、ＳＢＮ方法によって信号強度を調節して標準化したとき、シグモイド関数の基本形態に関連しているパラメータａ３、ａ４、及びフィッティング正確度であるＲ２値は変わらず、これは、ＳＢＮ方法の適用によって、Ｒ２値を用いた陽性又は陰性試料の決定のような本発明の非線形フィッティング分析結果及びパラメータａ４を用いた異常信号の検出に影響を与えなかったことを示す。したがって、非線形フィッティング関数を用いた本発明の方法と連動して前記ＳＢＮ方法を利用することが好適であることが分かった。
【０３９８】
実施例４：呼吸器感染ウイルスＩの検出
データセットの取得
呼吸器感染の主要原因であるインフルエンザウイルス（Ｆｌｕ  Ａ及びＦｌｕ  Ｂ）及び３種のＦｌｕ  Ａサブタイプ（Ｈ１，Ｈ１ｐｄｍ０９及びＨ３）を検出するためにＳｅｅｇｅｎｅ社のＡｌｌｐｌｅｘＴＭＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ  １を使用した。
【０３９９】
ＣＦＸ９６ＴＭ実時間ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて１０個のサンプルに対して核酸増幅反応を行った。核酸増幅反応は、９５℃で１０秒、６０℃で１分そして７２℃で１０秒を反復する条件で行われ、総４５サイクルを進行した。ＰＴＯＣＥ（ＷＯ２０１２／０９６５２３）及びＭｕＤＴ（ＷＯ２０１５／１４７４１２）技術が適用され、ＣＦＸ９６からデータセットを取得した。データセットは全ての増幅サイクルに対する信号値を含む。
【０４００】
１０個のサンプルは、次の表２０のように、臨床実験によって陽性又は陰性が確認されたサンプルである（陽性サンプル５個、陰性サンプル５個）。サンプル１はＦｌｕ  Ａ、サンプル２はＦｌｕ  Ｂ、サンプル４はＦｌｕ  Ａ−Ｈ１、そしてサンプル７及び８はＦｌｕ  Ａ−Ｈ３ウイルスに感染されたサンプルである。
【０４０１】
【表２０】
2021500869.tif 000029
【０４０２】
データセットに対する第１二次関数を生成
各サンプルのデータセットと第１二次関数をフィッティングした。第１二次関数としてｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃを使用した。データセットと第１二次関数のフィッティングは、ＬＭアルゴリズム（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズム；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｋａｎｚｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＣＡＭ，１７２（２）：３７５（２００４））が適用された。
【０４０３】
第１二次関数を用いた陰性フィルタリング
（ａ）第１二次関数の係数を用いる陰性１次フィルタリング
【０４０４】
【表２１】
2021500869.tif 000030
【０４０５】
１０個サンプルのうち２個サンプルに対する第１二次関数のｘ２の係数が０未満であり、２個のサンプル（サンプル３、６）を陰性としてフィルタリングした。
【０４０６】
（ｂ）第１二次関数のＣｍｉｎを用いる陰性二次フィルタリング
【０４０７】
【表２２】
2021500869.tif 000031
【０４０８】
１０個サンプルのうち２個サンプルは３０以上のＣｍｉｎを有し、２個のサンプル（サンプル５、１０）を陰性としてフィルタリングした。
【０４０９】
Ｃｍｉｎに基づいて決定されたフィッティング区間でデータセットに対する第２二次関数を生成
第１二次関数を用いた陰性フィルタリングを通過したデータセットに対してＣｍｉｎ値を用いてフィッティング区間を決定した。最小フィッティングサイクルを１２に決定し、Ｃｍｉｎが１２以下である場合にはフィッティング区間をサイクル１からサイクル１２まで、そしてＣｍｉｎが１２を超える場合にはフィッティング区間をサイクル１からサイクルＣｍｉｎまでと決定し、データセットのフィッティング区間で第２二次関数を生成した。第２二次関数はサイクル５０の対称軸を有する関数であり、ｙ＝ａ（ｘ−５０）２＋ｃの形態を使用した。フィッティング区間においてデータセットと第２二次関数のフィッティングにはＬＭアルゴリズムが適用された。
【０４１０】
第２二次関数を用いた陰性フィルタリング
陰性フィルタリングの結果を次表２３に整理した。
【０４１１】
【表２３】
2021500869.tif 000032
【０４１２】
第１二次関数による陰性フィルタリングにおいて陰性と決定された４個のサンプルを除く、残り６個のサンプルに対してフィッティング正確度（Ｒ２値）を計算した。フィッティング正確度は、フィッティング区間内でデータセットと第２二次関数を用いて計算された。Ｒ２値は式５を用いて計算され、Ｒ２値に対する閾値は、０．９を適用した。したがって、Ｒ２値が０．９以下であるサンプルは陰性と決定した。
【０４１３】
表２３に見られるように、６個のサンプルのうち１個のサンプルに対するＲ２値が０．９未満で陰性サンプルと確認された（サンプル９）。残り５個のサンプルは、Ｒ２値が０．９を超え、データセットの信号値から第２二次関数の値を差し引いてデータセットを補正した。
【０４１４】
また、補正されたデータセットに対するシグモイドフィッティング関数によって決定されたフィッティング正確度（Ｒ２値）を計算した結果、サンプル１、２、４、７及び８の場合、Ｒ２値が０．９以上を示し、陽性サンプルと決定した。
【０４１５】
実験の結果
本発明を適用して１０個のサンプルを分析した。それらのうち、第１二次関数のｘ２の係数を用いて２個サンプルを陰性と判定し、第１二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）を用いて２個のサンプルを陰性と判定した。データセットに対する第２二次関数のフィッティング正確度を用いて１個のサンプルを陰性判定した。残り５個サンプルに対するデータセットは、第２二次関数を用いて補正した。
【０４１６】
したがって、本発明の分析方法によれば、第１二次関数のｘ２の係数及び／又は第１二次関数が最小である時のサイクル（Ｃｍｉｎ）、そしてデータセットに対する第２二次関数のフィッティング正確度を用いて迅速且つ簡便に試料内ターゲットの不存在を決定できることが分かる。また、本発明の分析方法によれば、第２二次関数を用いてデータセットを補正してノイズの除去されたデータセットを生成することができる。
【０４１７】
実施例５：呼吸器感染ウイルスＩＩの検出
データセットの取得
呼吸器感染の主要原因であるインフルエンザウイルス（Ｆｌｕ  Ａ）及びＦｌｕ  Ａサブタイプ（Ｈ１ｐｄｍ０９及びＨ３）を検出するためにＳｅｅｇｅｎｅ社のＡｌｌｐｌｅｘＴＭＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ  １を使用した。
【０４１８】
ＣＦＸ９６ＴＭ実時間ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて４個のサンプルに対して核酸増幅反応を行った。核酸増幅反応は、９５℃で１０秒、６０℃で１分そして７２℃で１０秒を反復する条件で行われ、総４５サイクルを進行した。ＰＴＯＣＥ（ＷＯ２０１２／０９６５２３）及びＭｕＤＴ（ＷＯ２０１５／１４７４１２）技術が適用され、ＣＦＸ９６からデータセットを取得した。データセットは全ての増幅サイクルで相対的低温検出温度で６０℃及び相対的高温検出温度で７２℃での全ての信号値を含む。
【０４１９】
４個のサンプルは、次の表２４のように臨床実験によって陽性又は陰性が確認されたサンプルである（陽性サンプル３個、陰性サンプル１個）。サンプル１はＦｌｕ  Ａ（７２℃）、サンプル３はＦｌｕ  Ａ−Ｈ１ｐｄｍ０９（６０℃）、そしてサンプル４はＦｌｕ  Ａ−Ｈ３（７２℃）ウイルスに感染されたサンプルである。サンプル４は６０℃で内部対照群（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する信号値を含む。
【０４２０】
【表２４】
2021500869.tif 000033
【０４２１】
６０℃データセットに対する変位を用いた陰性フィルタリング
【０４２２】
【表２５】
2021500869.tif 000034
【０４２３】
変位は、最終サイクルにおける信号値と最小信号強度を有するサイクルにおける信号値（最小信号値）との差と計算された。サンプル２は変位が閾値１００（ＲＦＵ）を超えず、陰性としてフィルタリングした。
【０４２４】
６０℃で検出された信号から第１ターゲット核酸配列に対する信号を除去
（ｉ）第１ターゲット核酸配列に対する信号を除去するための基準値及び（ｉｉ）相対的低温検出温度で検出された信号を用いて、相対的低温検出温度で検出された信号から第２ターゲット核酸配列に対する信号を抽出した。
【０４２５】
第２ターゲット核酸配列に対する信号＝［６０℃温度で検出された信号］−［（７２℃の相対的高温検出温度で検出された信号）×（第１ターゲット核酸配列に対する基準値）］
第１ターゲット核酸配列に対する基準値は検出チャネルによって変わり、サンプル１、３及び４の基準値はそれぞれ、１．３、１．２、及び１．８だった。
【０４２６】
信号変位を用いた陰性フィルタリング
【０４２７】
【表２６】
2021500869.tif 000035
【０４２８】
第２ターゲット核酸配列に対する信号は、６０℃で検出された信号から抽出された信号である。サンプル３個のうち、１個のサンプル（サンプル１）に対して第２ターゲット核酸配列に対する最後のサイクル４５における信号値と最小信号値との差が閾値１００（ＲＦＵ）を超えず、サンプル１に対する第２ターゲット核酸配列を陰性としてフィルタリングした。
【０４２９】
フィッティング区間で信号に対する二次関数を生成
第１ターゲット核酸配列に対する信号及び第２ターゲット核酸配列に対する信号のそれぞれを二次関数とフィッティングした。フィッティング区間はサイクル４〜１２に設定し、二次関数の対称軸はサイクル５０に設定された。フィッティングはＬＭアルゴリズムを用いて行った。
【０４３０】
二次関数のフィッティング正確度を用いた陰性フィルタリング
【０４３１】
【表２７】
2021500869.tif 000036
【０４３２】
信号変位フィルタリングで陰性と決定された１つのサンプル（サンプル１）を除く、残りサンプルに対してフィッティング区間で二次関数を用いてフィッティング正確度（Ｒ２値）を計算した。Ｒ２値は式５を用いて計算され、Ｒ２値に対する閾値は０．９を適用した。０．９以下のＲ２値を有するサンプルは陰性と決定した。
【０４３３】
表２７に見られるように、０．９を超えるＲ２値を有するサンプルのデータセットを、前記データセットの信号値から二次関数の値を差し引いて補正した。
【０４３４】
非線形フィッティング関数を用いた陰性フィルタリング
【０４３５】
【表２８】
2021500869.tif 000037
【０４３６】
（ａ）シグモイド関数の生成
４個のパラメータを含む式３のシグモイド関数を用いて、前記補正されたデータセットとシグモイド関数のフィッティングを行った。ＬＭアルゴリズムを適用して補正されたデータセットにフィッティングされたシグモイド関数を生成した。
【０４３７】
（ｂ）シグモイドフィッティング関数の変位による陰性１次フィルタリング
シグモイド関数の変位を用いて陰性サンプルをフィルタリングした。シグモイドフィッティング関数の変位は、シグモイドフィッティング関数の最大信号値と最小信号値との差を計算して取得した。計算された変位と変位に対する閾値（１００ＲＦＵ）を比較して陰性サンプルをフィルタリングした。全サンプルに対する変位がいずれも閾値１００を超えた。
【０４３８】
（ｃ）シグモイドフィッティング関数の最大勾配による陰性二次フィルタリング
シグモイドフィッティング関数の最大勾配を用いて陰性二次フィルタリングを行った。最大勾配は、各サンプルに対してシグモイドフィッティング関数を微分して計算した。最大勾配に対する閾値は３０に設定された。表２８に整理された通り、サンプル３の第１ターゲット核酸配列に対する信号に対してシグモイドフィッティング関数の最大勾配が３０未満であり、よって、サンプル３の第１ターゲット核酸配列を陰性としてフィルタリングした。
【０４３９】
（ｄ）フィッティング正確度Ｒ２値による陽性又は陰性サンプルの最終決定
フィッティング正確度はＲ２値を用いた。Ｒ２値は式４を用いて計算され、Ｒ２値に対する閾値は、０．９０を適用した。Ｒ２値が０．９０を超えるサンプルは陽性と決定された。
【０４４０】
実験の結果
ＭｕＤＴ技術と共に非線形フィッティング関数を用いる本発明を適用して４個のサンプルを分析した。相対的低温検出温度で検出された信号の変位が閾値（１００ＲＦＵ）よりも小さい１個のサンプル（サンプル２）を陰性とフィルタリングした。サンプル２は、第１ターゲット核酸配列及び第２ターゲット核酸配列の両方とも存在しないと決定された。
【０４４１】
サンプル２を除く３個のサンプルに対して第２ターゲット核酸配列に対する信号を抽出し、第１ターゲット核酸配列に対する信号の変位及び第２ターゲット核酸配列に対する信号の変位と閾値（１００ＲＦＵ）を比較した。閾値を超えない変位を有するサンプル１の第２ターゲット核酸配列に対する信号を陰性としてフィルタリングした。
【０４４２】
陰性とフィルタリングされなかった信号に対するシグモイド関数を生成し、シグモイド関数の最大勾配が閾値（３０）を超えないサンプル３の第１ターゲット核酸配列に対する信号を陰性としてフィルタリングした。
【０４４３】
シグモイド関数と信号間のＲ２値を計算し、残り全ての信号のＲ２値が閾値０．９０を超えるので、陽性としてフィルタリングした。
【０４４４】
本発明の分析方法によれば、相対的低温検出温度で検出された信号の変位と閾値を比較して、異なる検出温度を有する２個のターゲット核酸配列の不存在を決定することができる。本発明の分析方法によれば、相対的高温検出温度で検出された信号の変位に関係なく第２ターゲット核酸配列に対する信号を抽出することによって、第２ターゲット核酸配列の存在又は不存在を決定できる。本発明の分析方法によれば、シグモイドフィッティング関数を用いて、第１ターゲット核酸配列及び第２ターゲット核酸配列の存在又は不存在を決定することができる。
【０４４５】
以上では本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付する請求項とその等価物によって定義されるといえよう。
【図１】
2021500869.tif 000040
【図２】
2021500869.tif 000041
【図３】
2021500869.tif 000042
【図４】
2021500869.tif 000043
【図５】
2021500869.tif 000044
【図６】
2021500869.tif 000045
【図７】
2021500869.tif 000046
【図８】
2021500869.tif 000047
【図９】
2021500869.tif 000048
【図１０】
2021500869.tif 000049
【図１１】
2021500869.tif 000050
【図１２】
2021500869.tif 000051
【図１３】
2021500869.tif 000052
【図１４】
2021500869.tif 000053
【図１５】
2021500869.tif 000054
【図１６】
2021500869.tif 000055
【図１７】
2021500869.tif 000056
【図１８】
2021500869.tif 000057
【図１９】
2021500869.tif 000058
【図２０】
2021500869.tif 000059
【図２１】
2021500869.tif 000060
【図２２】
2021500869.tif 000061
【図２３】
2021500869.tif 000062
【図２４】
2021500869.tif 000063
【国際調査報告】
2021500869.tif 000064
2021500869.tif 000065
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