(57)【要約】  本開示は顆粒球コロニー刺激因子活性を示すポリペプチドに関する。このポリペプチドは、SEQ ID NO: 2に記載の配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列において、T1CP2 (SEQ ID NO: 25), P2CL3 (SEQ ID NO: 26), L3CG4 (SEQ ID NO: 27), G4CP5 (SEQ ID NO: 28), P5CA6 (SEQ ID NO: 29), A6CS7 (SEQ ID NO: 30),S96CP97 (SEQ ID NO: 31), P97CE98 (SEQ ID NO: 32), L99CG100 (SEQ ID NO: 33), P101CT102 (SEQ ID NO: 34), E122CE123 (SEQ ID NO: 35), L124CG125 (SEQ ID NO: 36), M126CA127 (SEQ ID NO: 37), P138CA139 (SEQ ID NO: 39), A143CF144 (SEQ ID NO: 40), R146CR147 (SEQ ID NO: 41), R169CH170 (SEQ ID NO: 42), H170CL171 (SEQ ID NO: 43), L171CA172 (SEQ ID NO: 44), A172CQ173 (SEQ ID NO: 45), and Q173CP174(SEQ ID NO: 46)からなるグループから選択される部位に少なくとも一つの非天然なシステイン残基を備える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子活性を示すポリペプチドであって、配列番号: 2に記載の配列に対して少なくとも９０％の配列相同性を有し、かつ、T1CP2 (配列番号: 25), P2CL3 (配列番号: 26), L3CG4 (配列番号: 27), G4CP5 (配列番号: 28), P5CA6 (配列番号: 29), A6CS7 (配列番号: 30), S96CP97 (配列番号: 31), P97CE98 (配列番号: 32), L99CG100 (配列番号: 33), P101CT102 (配列番号: 34), E122CE123 (配列番号: 35), L124CG125 (配列番号: 36), M126CA127 (配列番号: 37), P138CA139 (配列番号: 39), A143CF144 (配列番号: 40), R146CR147 (配列番号: 41), R169CH170 (配列番号: 42), H170CL171 (配列番号: 43), L171CA172 (配列番号: 44), A172CQ173 (配列番号: 45)およびQ173CP174(配列番号: 46)からなるグループから選択される部位に少なくとも一つの非天然のシステイン残基を有するアミノ酸配列を備え、システインの挿入を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
顆粒球コロニー刺激因子活性を示すポリペプチドであって、配列番号: 2に記載の配列に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を備え、配列番号: 3に記載のセリン／アラニン残基によるC17の置換を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドであって、N末端および／またはC末端に、(G)nC (配列番号: 47), (GGS)nC (配列番号: 48), (GGGGS)nC (配列番号: 49)および(SGGSGG)nC (配列番号: 50)からなるグループから選択される短いリンカー配列をさらに備えることを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、少なくとも１分子のポリエチレングリコールに結合されていることを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリペプチドであって、ポリエチレングリコールがメトキシPEGマレイミド誘導体であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
請求項４または５に記載のポリペプチドであって、ポリエチレン分子のサイズが5,000〜40,000ダルトンの範囲に及ぶことを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
配列番号: 58 (IMT8), 配列番号: 59 (IMT9)および配列番号: 60 (IMT10)のオリゴデオキシヌクレオチド配列であって、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）タンパク質およびその変異体の発現を増大させるためにG-CSFの5'プライム配列にあり、核酸構築物が顆粒球コロニー刺激因子活性を示すポリペプチドをコードし、その構築物が配列番号: 1に記載の配列を備えることを特徴とするオリゴデオキシヌクレオチド配列。
【請求項８】
発現ベクターであって、請求項７に記載の核酸構築物を備えることを特徴とする発現ベクター。
【請求項９】
宿主細胞であって、請求項8に記載の発現ベクターを備えることを特徴とする宿主細胞。
【請求項１０】
好中球減少症を患う患者を治療する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの治療量を患者に投与するステップを備えることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用であって、好中球減少症を治療するための医薬組成物の調製のための使用。
【請求項１２】
医薬組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドと、少なくとも一つの薬学的に許容できる担体または賦形剤とを備えることを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）の変異体に関し、G-CSFの変異体の結合体に関し、そのような変異体および結合体の調製方法に関し、特に好中球減少症および白血球減少症の治療におけるそのような変異体および結合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学療法は、さまざまな形態のリンパ腫および転移癌の治療に必須の要素を構成している。化学療法は造血系を抑制するため、宿主の免疫系を弱めると考えられている。好中球減少症は、化学療法に関係する最も重大な血液毒性である（Crawford, J.ら, Cancer, 2004. 100(2): p. 228-37）。化学療法によって誘発された好中球減少症は、好中球の数の減少によって特徴づけられ、これはがん患者が致死的な感染症や敗血症にかかりやすくなる原因となる（Lyman, G.H., Clin Cornerstone, 2006. 8 Suppl 5: p. S12-8）。好中球減少症の臨床管理には、ハイエンドの抗生物質の投与とともに長期にわたる入院を含み、このことはがん治療の費用を途方もなく上昇させる原因となる（Kuderer, N.M.ら, Cancer, 2006. 106(10): p. 2258-66）。コロニー刺激因子（CSFs）の予防的かつ治療的な投与は、用量強化化学療法を受けている患者における、好中球減少症のリスクを著しく減少させる点で非常に効果的であることが証明されている（Lyman, G.H.ら, Am J Med,2002. 112(5): p. 406-11）。CSFsは、特定のタイプの白血球細胞を生成させるように造血系を導くサイトカインである（Metcalf, D., Cancer, 1990. 65(10): p. 2185-95）。これらの因子は、インビトロで骨髄細胞を増殖させようと努力する中で発見された（Bradley,T.R.ら、Nature, 1967.213(5079): p. 926-7; Pluznik, D.H.ら、 Experimental cell research, 1966. 43(3): p.553-63 and Bradley, T.R.ら、 The Australian journal of experimental biology and medical science,1966. 44(3): p. 287-99）。好中球減少症の予防のために２つのタイプのCSFsが用いられた。すなわち、顆粒球マクロファージ‐CSF（GM-CSF）とG-CSFである。最も一般的に使用されるCSFは遺伝子組換えヒトG-CSF（rHuG-CSF）である。rHuG-CSFの投与により、成熟した機能的好中球の生成を刺激するため、好中球減少症のリスクを低減させる（Welte, K., ら, Blood, 1996. 88(6): p. 1907-29）。１９６０年代にCSFsが発見されたにも関わらず、Mooreおよびその同僚たちによって膀胱癌細胞株５６３７からヒトG-CSFが最初に精製され、特徴づけられたのは１９８５年であった（Welte, K.,ら, Blood, 1996. 88(6): p. 1907-29）。この天然に生成された膀胱癌細胞株５６３７由来のG-CSFはO-グリコシル化されており、分子量が１９．６ｋＤａであり、O-グリカナーゼで処理すると１８．８ｋＤａの生成物が得られる（Souza, L.M.,ら,Science, 1986. 232(4746): p. 61-5）。Nagataとその同僚は、Ｎ末端アミノ酸シーケンシングを利用してG-CSFのcDNA配列を同定した（Nagata,Sら, Nature, 1986. 319(6052): p. 415-8）。Souzaらは、同定された配列をさらにクローン化し、配列決定し、発現させた。Escherichia coliにおいてG-CSFのcDNAの発現によって生じた組換えタンパク質は、ヒト骨髄細胞の増殖と分化とを誘導できることわかった（Souza,L.M.ら, Science, 1986. 232(4746): p. 61-5.）。1991年にアメリカ食品医薬品局（FDA）によってrHuG-CSFの投与が承認され、それ以来、化学療法を受けている患者だけでなく、白血球減少症、AIDS、敗血症の患者および骨髄移植を受けた患者にも、好中球減少症の予防のために積極的に使用されてきた（Keating,G.M., Drugs. 71(6): p. 679-707）。G-CSFは、顆粒球コロニー刺激因子受容体（G-CSFR）の細胞外免疫グロブリン様ドメインと、サイトカイン受容体相同ドメインとに結合する。この結合により、G-CSFRのホモ二量体化をもたらし、JAK-STAT経路および分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ経路の活性化を開始し、G-CSFの効果を達���する（Vande Geijn, G.J.ら, Rev Physiol Biochem Pharmacol, 2003. 149: p. 53-71）。組換えG-CSFは、多くの場合、非グリコシル化の形態（例えばフィルグラスチム）でE. coliにおいて生成されるが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）で生成されるグリコシル化タンパク質（例えばレノグラスチム）も使用される（Fernandez-Varon, E. ら VetJ, 2007. 174(1): p. 33-41）。カニクイザルにおいて、非グリコシル化形態およびグリコシル化形態の両方は同等の活性を有し、同様の薬物動態を有することが報告されている（Tanaka,H.ら, Cytokine, 1997. 9(5): p. 360-9）。フィルグラスチムおよび、CHO由来のG-CSFであるグリコシル化レノグラスチムは、好中球前駆体の増殖および分化を促進し、血液および組織における好中球の移動を増強し、成熟好中球の活動を増加させて好中球減少症を予防する。しかしながら、フィルグラスチムは３〜４時間の半減期を有し、毎日投与される必要がある（Kuwabara, T.ら.Drug metabolism reviews, 1996. 28(4): p. 625-58）。
【０００３】
G-CSFは、受容体依存性エンドサイトーシス（Kuwabara, T.,ら, The Americanjournal of physiology, 1995. 269(1 Pt 1): p. E1-9.）、腎クリアランス（Kuwabara, T., ら,Pharmaceutical research, 1995. 12(10): p. 1466-9）および酵素分解機構（El Ouriaghli, F.ら, Blood, 2003. 101(5): p. 1752-8.）を含む、いくつかの異なる機構を利用して消失されると考えられる。rHuG-CSFの血清半減期を延長するためにいくつかのアプローチが採用されてきた。PEG化として知られるポリエチレングリコール（「PEG」）との結合（Molineux, G., Current pharmaceuticaldesign, 2004. 10(11): p. 1235-44）、シアル酸との結合（Andersen, D.C. et al. Biotechnology and bioengineering, 1995. 47(1):p. 96-105）、ヒト血清アルブミンとの結合（Halpern,W.ら, Pharmaceuticalresearch, 2002. 19(11): p. 1720-9）などの様々な修飾が用いられてきた。しかしながら、PEG化がこの目的のための選択肢の方法として浮上した。PEG化は、治療タンパク質の血清半減期を延長する。これには、タンパク質の表面をマスキングしてそれをプロテアーゼ、抗体および抗原処理細胞から保護すること、および、分子サイズを大きくして腎限外濾過を減らすことを含む。さらに、PEGはポリペプチドに好ましい特性を与えて、生体内分布と溶解性を改善する（Harris, J.M.ら. Drug discovery, 2003. 2(3): p. 214-21）。２００２年、FDAは化学療法における予防薬として、PEG化rHuG-CSFまたはペグフィルグラスチムの使用を承認した。PEG化G-CSFの血清半減期は著しく改善されたため、フィルグラスチムの一日用量に対して、化学療法のサイクルごとに１回投与されている（Crawford, J., Drugs, 2002. 62 Suppl 1: p.89-98）。
【０００４】
現在使用されているPEG化G-CSFは、還元的アルキル化法を用いてヒトG-CSFタンパク質のN末端の第一アミノ酸に２０kDaのPEG分子が結合されている（US 5,824,784）。この方法はG-CSFの効率的なPEG化をもたらすが、それはN末端のアミノ基でのPEG化に加え、タンパク質に存在するリシン残基のアミノ基での不均一なPEG化と関連する。また、化学療法誘発性の好中球減少症の同日治療での投与のために、複数のPEG化を有するG-CSF変異体も作成された（US 20090203601）。しかしながら、この方法およびN末端のアミノ基でのPEG分子の結合を用いる他の方法は、PEG化の可変のレベルに起因して、結合G-CSFの不均一集団をもたらす。そのような薬物分子の不均一集団は、生物活性を正確に予測するのを困難にしている。近年、より均質的にPEG化タンパク質を生成する、部位特異的なPEG化の新たな方法が説明された（Crawford,J., Drugs, 2002. 62 Suppl 1: p. 89-98,  Goodson, R.J. and N.V. Katre, Bio/technology, 1990. 8(4): p. 343-6-30およびXiong, C.Y.ら, Proteinengineering, design & selection : PEDS, 2006. 19(8): p. 359-67）。PEG化の一般的な方法の一つは、PEG化のためにタンパク質のシステインを使用するか、または適切に導入されたシステイン残基を使用する（US 5766897A）。
【０００５】
多重PEG化（multiple PEGylation）を有するG-CSFの変異体はまた、化学療法誘発性の好中球減少症の同日治療での投与のために作成された（US 20090203601）。しかしながら、この方法では、PEG化の可変のレベルに起因して、結合G-CSFの不均一集団をもたらす。そのような薬物分子の不均一集団は、生物活性を正確に予測することを困難にする。
【０００６】
このアプローチを用いれば、G-CSFのシステイン１７は、G-CSFのPEG化バージョンを生成するために利用される（Ishikawa, M.ら, Cell structure and function, 1992. 17(1): p. 61-5）。しかしながら、システイン１７は疎水性ポケット内に部分的に埋め込まれているため、この方法では変性の後にPEG化およびタンパク質の再生が必要となる。
【０００７】
そこで、G-CSF活性を示し、治療に用いることのできる新規かつ改善されたポリペプチドおよびその複合体が必要とされており、例えば好中球減少症および白血球減少症の治療において使用することができ、同時に、現在利用可能なポリペプチドとその複合体の不利益を被らないものが必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本開示はG-CSF活性を示すポリペプチドに関する。このポリペプチドは、配列番号: 2に記載の配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列において、T1CP2 (配列番号: 25), P2CL3 (配列番号: 26), L3CG4 (配列番号: 27), G4CP5 (配列番号: 28), P5CA6 (配列番号: 29), A6CS7 (配列番号: 30), S96CP97 (配列番号: 31), P97CE98 (配列番号: 32), L99CG100(配列番号: 33), P101CT102 (配列番号: 34), E122CE123 (配列番号: 35), L124CG125(配列番号: 36), M126CA127 (配列番号: 37), P138CA139 (配列番号: 39), A143CF144(配列番号: 40), R146CR147 (配列番号: 41), R169CH170 (配列番号: 42), H170CL171(配列番号: 43), L171CA172 (配列番号: 44), A172CQ173 (配列番号: 45), およびQ173CP174(配列番号: 46)からなるグループから選択される部位に少なくとも一つの非天然のシステイン残基を備える。
【０００９】
本開示の一実施例として、そのポリペプチドはさらに、Ｎ末端やＣ末端に短いリンカー配列を備える。その短いリンカー配列の例として、これに限定されないが、Ｃ末端にGC, GGSC, GGGGSCおよびSGGSGGCを含む。そのリンカー配列は、配列番号: 3に記載の配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列におけるＮ末端やＣ末端に(G)nC (配列番号: 47), (GGS)nC (配列番号: 48), (GGGGS)nC(配列番号: 49)および(SGGSGG)nC (配列番号: 50)からなるグループからなる。
【００１０】
本開示は、顆粒球コロニー刺激因子活性を示し、かつ、配列番号. 1に記載の配列を有する、ポリペプチドをコードする核酸構築物にも関する。
【００１１】
本開示は、少なくとも一つのポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）分子に共有結合された上記ポリペプチドを備えるポリペプチド複合体にも関する。
【００１２】
本開示はさらに、上記核酸構築物を備える発現ベクターに関する。
【００１３】
本開示はまた、上記発現ベクターを備える宿主細胞に関する。
【００１４】
本開示はまた、好中球減少症の患者を治療する方法に関する。この方法は、治療量の上記ポリペプチドまたは上記複合体をその患者に投与することを含む。
【００１５】
本開示はまた、好中球減少症を治療するための医薬組成物の調製のために上記ポリペプチドまたは上記複合体を使用することに関する。
【００１６】
本開示はまた、上記ポリペプチドまたは上記複合体および少なくとも一つの薬学的に許容できる担体または賦形剤を備える医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、精製されたrHuG-CSFとPEG化rHuG-CSFとを示す。改変ヒトG-CSF構築物を、E. coli細胞において過剰発現させた。精製されたrHuG-CSFタンパク質は、２０kDaのPEGアルデヒド誘導体と結合された。その後、陽イオン交換クロマトグラフィーに続いて、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用することによって結合生成物を精製した。精製されたrHuG-CSF（細い矢印で示されている）とPEG結合rHuG-CSF（太い矢印で示されている）を非変性PAGEで解析し、クマシーブリリアントブルーで染色した。精製されたG-CSFとN末端の２０kDaのPEG化rHuG-CSFとは、SDS-PAGEによって解析したとき、純度９５％以上であることがわかった。
【図２】図２は、G-CSF変異体のPEG化の代表的な分析結果を示す。rHuG-CSF変異体をE.coli細胞内で過剰発現させ、先に述べた方法を用いて精製した。精製したタンパク質は、PEG-マレイミド誘導体を使って２０kDaのPEGと結合された。その後、結合生成物を、陽イオン交換クロマトグラフィー（ａ）に続いて、HICまたはサイズ排除クロマトグラフィー（ｂ）を使用することによって精製した。その後、精製されたPEG結合G-CSFを、MALDI-TOF質量分析法（ｃ）を使って分析した。大半のG-CSFが２０kDaのPEGと結合し、約４０kDaの分子量を有することが観察された。（ｄ）その後、２０kDaとPEG化した精製G-CSFを非変性PAGEで分析し、PEGを特異的に染色するヨウ化バリウムで染色した（パネルI）。PEG結合なしの天然G-CSFが検出されなかった一方で、PEG結合タンパク質は明確に目に見えた。その試料についてもクマシーブリリアントブルー染色して分析した（パネルII）。天然G-CSFは、クマシー染色でのみ検出された。分子量の増加は、２０kDaのPEGとの結合ではっきりと目に見えた。２０kDaと結合した精製G-CSFは、４０kDaの予想されるサイズで流れたことが観察された。
【図３】図３は、G-CSF変異体と２０kDa、３０kDaおよび４０kDaのPEGとの結合の代表的な分析結果を示す。上述のように、新規のG-CSF変異体を、PEG-マレイミド誘導体を使って２０kDa、３０kDaおよび４０kDaのPEGと結合させた。PEG結合変異体は、陽イオン交換クロマトグラフィーに続いて、HICまたはサイズ排除クロマトグラフィーによる精製ステップで精製した。その後、精製した結合生成物を、無修飾のコントロールとともに１２％の非還元PAGEで流し、PEGを視覚化するためにヨウ化バリウムで染色（ａ）するか、または、タンパク質用にクマシーブリリアントブルーで染色した（ｂ）。分子量の対応する増加は、２０kDa、３０kDaおよび４０kDaのPEGとの結合で観察され、非PEG化コントロールは、クマシー染色ゲルでのみ検出された。
【図４】図４は、基準（standard）と、２０kDa、３０kDaおよび４０kDaのメトキシPEGマレイミドと結合したG-CSF変異体との間のインビボ活性の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、G-CSF活性を示すポリペプチド、当該ポリペプチドの結合体および当該ポリペプチドをコードする核酸配列に関する。本開示はさらに、当該ポリペプチドおよび結合体を含む医薬組成物、当該ポリペプチド、結合体および組成物を用いる治療方法、好中球減少症を治療するための医薬組成物の調製物の製造における当該ポリペプチドの利用に関する。
【００１９】
本開示においてアミノ酸名はIUPAC命名法に基づき、蛋白質データバンク（PDB）(www.pdb.org)によって定義されるように使用されている（IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides（残基の名称、原子名など），Eur. J. Biochem.,138, 9-37 (1984) およびそれらのEur. J. Biochem., 152, 1 (1985) における修正と併せて参照）。
【００２０】
したがって、アミノ酸に以下の記号を用いた。
2021509805.tif 000002
【００２１】
アミノ酸の位置／置換を特定するための用語は以下のように示される。
【００２２】
P5は、開示したポリペプチドのアミノ酸配列の位置番号５がプロリンによって占められていることを示す。
【００２３】
P5CA6は、配列番号３（SEQ IN NO: 3）のアミノ酸配列の位置番号５のプロリンと位置番号６のアラニンとの間に、非天然のシステイン残基が挿入されていることを示す。
【００２４】
システイン誘導体、システイン変異体やG-CSF変異体という用語は、システイン１７がセリンまたはアラニンで置換されたポリペプチドに使用され、選択された部位（site/s）でのシステインの置換または付加から構成される。
【００２５】
「G-CSF活性を示す」という用語は、ポリペプチドまたは結合体が天然G-CSFの一つ以上の機能を有することを示し、特に配列番号２（配列番号: 2）に示されるアミノ酸配列を有するrHuG-CSFは、G-CSF受容体に結合する能力を含む（Fukunagaら, J. Bio. Chem,265:14008, 1990）。
【００２６】
本開示はG-CSF活性を示すポリペプチドに関する。このポリペプチドは、配列番号: 3に記載された配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列において、T1CP2 (配列番号: 25), P2CL3 (配列番号: 26), L3CG4 (配列番号: 27), G4CP5 (配列番号: 28), P5CA6 (配列番号: 29), A6CS7 (配列番号: 30), S96CP97(配列番号: 31), P97CE98(配列番号: 32), L99CG100(配列番号: 33), P101CT102(配列番号: 34), E122CE123(配列番号: 35), L124CG125(配列番号: 36), M126CA127(配列番号: 37), P138CA139(配列番号: 39), A143CF144(配列番号: 40), R146CR147(配列番号: 41), R169CH170(配列番号: 42), H170CL171(配列番号: 43), L171CA172(配列番号: 44), A172CQ173(配列番号: 45),およびQ173CP174(配列番号: 46)からなるグループから選択される部位に、少なくとも一つの非天然システイン残基を備える。
【００２７】
本開示の一実施例として、２つ以上の非天然システイン残基が２つ以上の上記部位に挿入されている。挿入されるシステイン残基の具体的な数は、所望の性質および結合の程度に依存する。
【００２８】
一実施例として、アミノ酸配列がC17でのシステインとセリン残基との置換を含む。
【００２９】
別の一実施例として、ポリペプチドがさらにN末端やC末端に短いリンカー配列をさらに含む。短いリンカー配列の例として、これに限定されないがGC, GGSC, GGGGSCおよびSGGSGGCを含む。これらのリンカー配列の重要性については、後の例で取り扱う。
【００３０】
本開示はまた、ポリペプチド結合体にも関する。このポリペプチド結合体は少なくとも１分子のPEGに共有結合されるポリペプチドを含む。
【００３１】
アミノ酸配列にシステインを挿入することにより、後者をより結合しやすくしている。同様に、それによって結合パターンを最適化できるようにしている。一実施例として、少なくとも１分子のPEGはメトキシPEGマレイミド誘導体である。PEG分子のサイズは5,000〜40,000ダルトンである。特定の実施例に従って、そのサイズは20,000, 30,000および40,000ダルトンから選択される。
【００３２】
本開示は、開示したペプチドをコードする核酸配列にも関連する。その核酸構築物は、配列番号: 1の配列セットを備える。
【００３３】
本開示は、その核酸構築物を備える発現ベクターにも関連する。その発現ベクターは、例えばT7 RNAポリメラーゼなどの強力なプロモーターを有する宿主細胞において核酸の発現に必要な他の要素を備える。
【００３４】
本開示は、開示したポリペプチドを発現する宿主細胞にも関する。その宿主細胞は、開示した発現ベクターで適切な細胞を形質転換することにより得られる。宿主細胞を形質転換する任意の適切な方法を使用することができる。適切な宿主細胞の例としてE. coliなどの原核宿主細胞を含むが、これに限定されない。
【００３５】
別の側面として、本開示はポリペプチドまたはポリペプチド結合体、および少なくとも一つの薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物に関する。その医薬組成物は、様々な形態で処方されてもよい。そのような形態の例としては、液体若しくはゲル、または凍結乾燥されたもの、またはその他の任意の適切な形態を含む。ポリペプチドまたはポリペプチド結合体を当技術分野でそれ自体既知の方法で医薬組成物に配合することで、十分に貯蔵安定性があり、かつ、ヒトまたは動物への投与に適したポリペプチド医薬をもたらすことができる。
【００３６】
さらに別の側面として、本開示は、開示したポリペプチド、結合体または組成物を用いて様々な形態の白血球減少症または好中球減少症を治療する方法に関する。特に、開示したポリペプチド、結合体または組成物を用いて、特定のタイプの放射線治療、化学療法骨髄移植を受けるがん患者および肝臓再生における感染を防ぐことができる。
【００３７】
別の側面として、本開示は、開示したポリペプチド、結合体、または様々な形態の白血球減少症または好中球減少症を治療するための医薬組成物を調製するためのポリペプチドの利用に関する。
【００３８】
本発明は、以下の非限定的な例でさらに詳細に説明される。
【００３９】
例
例１．核酸構築物の合成，クローニングおよび発現
ヒトG-CSFのcDNA配列は、E. coli（Genescript社）における発現に最適化されたコドンであった。この配列は、配列番号: 51のフォワードプライマーIMT1: 5’ GGATCCATGACGCCGCTGGGTCCG3’と、配列番号: 52のリバースプライマーIMT2: 5’ AAGCTTTTACGGCTGTGCCAGGTGAC3’とを使って、発現ベクターpET23a（Novagen社）のBamHIおよびHindIII部位にクローニングした。この構築物を使ってNovagen社のE.coli BL21 (DE3)株を形質転換した。コドン最適化されたrHuG-CSF配列の収量を増加させるため、コドン最適化構築物のDNAおよびRNA配列のin silico解析を行った。この解析によれば、mRNA転写物の5’末端にヘアピンと高安定な二次構造とが形成されていることを示唆しており、mRNA転写物が翻訳を妨害する可能性について指摘している。5’末端で翻訳的にサイレントな突然変異が起こり、（mRNA転写物における二次構造をさらに促進する可能性が高い）GCリッチコドンを適切な位置でATリッチコドンと置換することによって、mRNA転写物の二次構造を破壊したり減少させたりする。一連の翻訳的にサイレントな突然変異を通して、いくつかの配列を生成し、天然配列のものと比較してタンパク質収量における増加について分析した。
【００４０】
IMT3: 5’ ATG ACT CCA CTG GGT CCG GCG3’ 
IMT4: 5’ ATG ACT CCA TTA GGT CCG GCGAGT 3’ 
IMT5: 5’ ATG ACT CCA TTA GGT CCA GCGAGT 3’ 
IMT6: 5’ ATG ACT CCA TTA GGT CCG GCAAGT AGC CTG 3’ 
IMT7: 5’ ATG ACT CCA TTA GGT CCA GCAAGT AGC CTG 3’ 
IMT8: 5’ ATG ACT CCA TTA GGT CCA GCATCT AGC CTG CCG CAA 3’  
IMT9: 5’ ATG ACT CCG CTG GGT CCG GCATCT AGC CTG CCG CAA 3’   
IMT10: 5’ ATG ACT CCG TTA GGT CCG GCA TCT AGC CTG CCG CAA 3’
【００４１】
(配列番号: 58の)IMT8は、mRNAにおける二次構造の最大の不安定化をもたらし、著しく高いタンパク質発現をもたらした。この配列は、発現ベクターであるpET23aおよびpET9b（Novagen社）のNdeIおよびHindIII部位にクローンニングした。この遺伝子操作された構築物では、rHuG-CSFタンパク質の収量が2.5倍に増加した。
【００４２】
2021509805.tif 000003
【００４３】
例２．G-CSFとその変異体の過剰発現および精製
5’末端にIMT8配列（配列番号: 58）を組み込んだヒトG-CSFのコドン最適化されたcDNA配列を、発現ベクターpET23aおよびpET9bのNdeIおよびHindIII部位にクローニングした。その後、この遺伝子操作された構築物（配列番号: 1）を用いてE.coliのBL21 (DE3)株を形質転換した。
【００４４】
この構築物を後のG-CSF変異体の遺伝子操作に用いた。G-CSF変異体は、標準的な部位特異的変異導入プロトコルを用いて、または、コード配列における特定の部位にてシステインを導入または置換するための所望の変更を加えたプライマーを使ったPCRによって生成した。E. coliにおいて発現させた精製rHuG-CSFについて、還元および非還元PAGEを使って分析した。この分析により、精製G-CSFが正しいサイズで単一のタンパク質バンドを示すこと、および、市販品に匹敵するということが明らかとなった（図１）。おおまかに、rHuG-CSFタンパク質の分離および精製には以下のステップが含まれる。
【００４５】
ｉ．オーバーナイトで培養した細胞を使用して１リットルの培地に植菌し、OD600が約0.4〜0.6に達したら、その細胞培養物を0.5mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導した。
ｉｉ．４時間後、その細胞を遠心分離により回収した。超音波処理を使用してその細胞を溶解し、封入体を分離した。
ｉｉｉ．ステップｉｉの封入体を次のバッファー成分（50 mM Tris-Cl,pH 8.0, 2% Triton X-100を含む1mM EDTAバッファー, 1% Na-デオキシコール酸塩または1M NaCl）で３度洗浄した。
ｉｖ．ステップｉｉｉで洗浄した封入体を、尿素を使って可溶化した。好ましい尿素の濃度は約2Mから約4Mの範囲である。
ｖ．分離したG-CSFを２ステップのリフォールディング処理に供した。
ｖｉ．リフォールドされたG-CSFを、陽イオン交換クロマトグラフィーを使って精製した。
ｖｉｉ．陽イオン交換で精製した試料を疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）やサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）に供した。その樹脂とカラムはGEヘルスケアライフサイエンス社から購入した。
ｖｉｉｉ． G-CSFのシステイン変異体の場合、ステップｖｉの精製G-CSF変異体を用いて様々なサイズのPEGを結合した。
ｉｘ．５倍モル過剰のチオール特異的PEGを用いて、リン酸ナトリウムバッファーまたはトリスバッファー中でrHuG-CSF変異体を結合させた。バッファーの好ましいpHは約6.5〜約7.5である。
ｘ．リン酸ナトリウムバッファー、酢酸ナトリウムバッファーまたはクエン酸ナトリウムバッファー中でN末端のアミノ酸特異的なPEGをrHuG-CSFに結合させた。バッファーの好ましい濃度は25mM〜約100mMの範囲であった。この反応は、還元剤であるシアノ水素化ホウ素の存在下で行った（好ましい濃度は約15mM〜約25mMの範囲）。反応にとって好ましいpHは、4.0-5.5の範囲であった。両方の化学反応に用いたPEGは、JenKem Technology社（米国）のものであった。
ｘｉ．PEG化した化学種はSPセファロースまたはより好ましくはMacroCap SP樹脂（GEヘルスケアライフサイエンス社）を使った陽イオン交換クロマトグラフィーに続いてHICやSECによって精製した。
ｘｉｉ．その試料をSDSPAGEで泳動し、PEG化G-CSFを可視化するためにヨウ化バリウムで染色した（図２）。
【００４６】
例２．システイン変異体を生成するためのG-CSFタンパク質領域の選定
G-CSFは、好中球前駆細胞のエフェクター好中球（effector neutrophils）への増殖、成熟および分化の主要な成長因子である。長年にわたる豊富な構造学的および機能学的研究により、好中球の増殖において重要や役割を果たすシグナル伝達カスケードを開始するための、G-CSF受容体(G-CSFR)との結合において重要な役割を果たすG-CSFの領域についての膨大な情報を蓄積してきた。２：２立体配座において、G-CSF受容体のリガンド結合領域と複合されるG-CSFの構造が解明された（Aritomi, M.ら, Nature, 1999.401(6754): p. 713-7 and Tamada, T.ら, Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America, 2006. 103(9): p. 3135-40）。
【００４７】
G-CSFの溶液中構造は、NMRスペクトル分析を使って解明された（Zink, T.ら, Biochemistry,1994. 33(28): p. 8453-63）。G-CSFは、４つのアルファヘリカルバンドル構造を有し、これらのヘリックスにはN末端からA, B, CおよびDとラベル付けがされている。G-CSFには、G-CSFRタンパク質と相互作用する３つの主要な部位がある。G-CSFのもう一つの重要な特徴は、５つのシステイン残基の存在である。それらのうちの４つは、ジスルフィド結合に関与している。G-CSFは17位に一つの遊離システインを有し、36〜42位と64〜74位に分子内ジスルフィド結合を有する。これらのジスルフィド結合はG-CSFの生物活性に必要である。一方で、17位のシステインをセリンと置換することで、完全に機能する変異G-CSFタンパク質が得られる（U.S.4810643）。本発明において、すべてのシステイン置換変異体は、システイン17がセリンまたはアラニンに変更されたG-CSF変異体から得られた。組換えヒトG-CSFタンパク質配列には、配列番号: 2が割り当てられた。システイン17がセリン17に置換された変異タンパク質配列には、配列番号: 3が割り当てられた。後続のすべてのシステイン変異体の生成には、配列番号: 3のG-CSFテンプレートを用いた。
【００４８】
システイン変異体はPEG化に利用され、治療用タンパク質のインビボの半減期を延長させる（２８）。現在使用されているPEG化G-CSFは、還元アルキル化を用いてN末端で20kDaのPEG分子に結合されている。しかしながら、共有結合PEG修飾をG-CSFの合理的に選択された残基で行うことで、G-CSFの半減期をさらに改善することができる。G-CSFにおける特定の残基を選択したり、または、システイン置換のためにG-CSFの機能的に無関係な領域を選択したりするため、計算生物学的アプローチを利用して表面のアクセス可能なアミノ酸を発見した。また、G-CSFの構造的研究からの既存の構造情報を用いて、システイン置換に適した領域を決定した。ヘリックスAの近位にある領域においてPEG化にとって好ましい部位は、T1, P2, L3, G4, P5, A6, S7およびS8であり、ヘリックスAにおいてはR22, E33,K34であり、ABループにおいてはK40, L61であり、ヘリックスBにおいてはQ90であり、BCループにおいてはP97, E98, L99であり、ヘリックスCにおいてはP101, Q119,E122およびE123であり、CDループにおいてはP128およびP138であり、ヘリックスDにおいてはR146, R147, R169, H170, L171およびA172であり、ヘリックスDの遠位にある領域においてはQ173およびP174である。これらの、天然アミノ酸のシステイン置換にとって好ましい部位は表１に示した。
【００４９】
この例では、システイン置換に最も好ましい部位として、T1C (配列番号: 4), L3C (配列番号: 5), G4C (配列番号: 6), P5C (配列番号: 7), Q90C (配列番号: 8), P97C (配列番号: 9), E98C (配列番号: 10), P101C (配列番号: 11), Q119C (配列番号: 12), E122C (配列番号: 13), E123C (配列番号: 14), P128C (配列番号: 15), P138C (配列番号: 16), R146C (配列番号: 17) , R147C (配列番号: 18), R169C (配列番号: 19), H170C (配列番号: 20), L171C (配列番号: 21), A172C (配列番号: 22) Q173C (配列番号: 23), P141C (配列番号: 24)を挙げている。
【００５０】
一側面として、溶媒中のG-CSFの溶媒接触性をさらに確かなものにするための方法が提供される。この方法では、プロテアーゼ分解マッピングを行った。その中で、in silico分析およびin vitro分析の両方を使用して、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼなどの、いくつかのプロテアーゼを使ってG-CSFをプロテアーゼ消化に供した。消化断片のN末端とC末端をシーケンスし、プロテアーゼ消化の最も顕著な部位を特定した。タンパク質の分解は、PEG化に関してさらにアクセスしやすい表面露出領域を明らかにした。これらの領域のいくつかの残基をこの例で用いた。この例において、PEG化効率を改善するためのG-CSF変異体を生成するため、システイン置換および付加を選択した。G-CSF変異体の構造統合性（structural integrity）については、計算生物学的アプローチによって解析した。G-CSF変異体の二次構造については、円二色性（CD）分光計を使って分析した。この変異体は、野生型のG-CSFタンパク質と類似の構造を有する。それらの構造統合性は維持され、PEG結合に使用され得る。部位特異的なPEG化に用いられるプロテアーゼ部位に極めて接近する部位またはその可能性のある部位における、システイン置換およびシステイン挿入の変異体は、プロテアーゼ耐性を付与し、in vivo循環半減期を延長する。
【００５１】
本発明の別の側面として、システイン置換の代わりにシステイン付加が好ましい方法が提供される。最も好ましくは、非構造化ループ領域においてそれがG-CSF受容体結合に関与せず、したがって生物活性を妨げない。計算生物学を用いて行われた予測をG-CSFの構造データと組み合わせて、システイン挿入変異誘発のための残基を選択した。システイン置換およびシステイン追加のための特定の残基を選択するため、絶対的な表面接触性（absolute surfaceaccessibility）の値を検討した。表2に、G-CSF変異体を生成するためのシステイン付加に最も好ましい位置についての詳細を示したものが掲載されている。これにより、G-CSFの構造統合性がシステインの置換または付加により損なわれないようにした。溶媒接触性はG-CSFのPEG結合の効率を高めるだけでなく、プロテアーゼからそのタンパク質を保護し、in vivoでの半減期を延長することができる。システイン付加に最も好ましい部位は、T1CP2 (配列番号: 25), P2CL3 (配列番号: 26), L3CG4 (配列番号: 27), G4CP5 (配列番号: 28), P5CA6 (配列番号: 29), A6CS7 (配列番号: 30), S96CP97 (配列番号: 31), P97CE98 (配列番号: 32), L99CG100 (配列番号: 33), P101CT102 (配列番号: 34), E122CE123 (配列番号: 35), L124CG125 (配列番号: 36), M126CA127 (配列番号: 37), P138CA139 (配列番号: 39), A143CF144 (配列番号: 40), R146CR147 (配列番号: 41), R169CH170 (配列番号: 42), H170CL171 (配列番号: 43), L171CA172 (配列番号: 44), A172CQ173 (配列番号: 45)およびQ173CP174(配列番号: 46)である。
【００５２】
例３．効率的なPEG化のための変異体を生成するためのG-CSFのN末端および／またはC末端の修飾
G-CSFはループで接続される４つのらせんを有し、また、NおよびC末端領域は非構造化領域を有する。重要なことは、コンピュータ分析によりG-CSFのこれらのNおよびC末端が溶媒接触性であることを示唆したということである。そのタンパク質のC末端にフレキシブルなアミノ酸リンカー配列を付加することでも、その領域の適応性および溶解性を高めることができた。そのフレキシブルなリンカーは概してグリシンやセリンなどの小さいまたは極性のアミノ酸において豊富であるが、スレオニン、アラニン、リシンおよびグルタミン酸などのアミノ酸で構成することもできる。
【００５３】
この情報を用いて、この例では、システインを含む短くフレキシブルなリンカー配列をG-CSFのN末端やC末端に付加し、PEG結合のために付加されるシステインの適応性および溶媒接触性をさらに高めた。これらのシステイン変異体は、システイン反応性メトキシPEGマレイミドを結合することによってさらに修飾された。システインを含むリンカー配列の付加では、分子の全体構造（overall conformation）を変化させないので、治療タンパク質の活性を低下させることはないであろう。しかしながら、溶媒接触性が向上することにより、これらの変異体はより高いPEG結合効率を有する可能性がある。さらに、in silico解析では、グリシンやセリンリンカーなどの小さなアミノ酸を備えるシステインは溶媒接触性を高める可能性があることが示唆された。最も好ましいシステイン含有リンカー配列は、(G)nC (配列番号: 47), (GGS)nC (配列番号: 48), (GGGGS)nC(配列番号: 49)および(SGGSGG)nC (配列番号: 50)である（表３に示されている）。これらの配列のリンカー長においてｎ＝１〜４である。これらの変異体はPEG化のためのシステインの溶媒接触性を改善する。生成されたシステイン変異体には、固有のSEQ IDが割り当てられた。表３には、G-CSF変異体を生成するためのN及びC末端システイン付加のために最も好ましい位置の詳細を提供する。
【００５４】
さらに、G-CSFの溶解構造（solved structure）によれば、NおよびC末端の非構造化ループは極めて接近していることを示唆している。２つの両末端部に２つのシステイン残基があることで、結果的に適切な条件下でジスルフィド結合を形成し得る。そのようなジスルフィド結合の形成の結果、G-CSFの環状変異体がもたらされる。以前に出版された文献によれば、タンパク質の環状化が熱安定性、プロテアーゼ耐性を高め、in vivoの半減期を延長することを示唆している。
【００５５】
例４．半減期を延長するためのPEGとrHuG-CSFとの結合
PEG化は治療タンパク質の修飾変異体を生成するために用いられる重要な方法の一つであり、invivoでのそれらの全体的な半減期を改善するためのものである。現在使用されているPEG化G-CSFは、還元アルキル化を使ってN末端に20kDaのPEG分子が結合される。システイン変異は、治療タンパク質のPEG化を促進することが示されている。本発明において、部位特異的なPEG化を促進するため、G-CSFのいくつかのシステイン変異体を提供した（表４）。G-CSF受容体との相互作用に関与するタンパク質のコアが変更されていないため、これらのG-CSF変異体は市販のG-CSFに匹敵する生物活性を有することが予想された。しかしながら、それらの設計およびPEG化に起因して、それらはゆっくりと分解するため、生物学的利用能が改善するという利点を備える。そのようなG-CSFのPEG化変異体は、より長い血清半減期を有することが予想される。
【００５６】
さらに、5000ダルトンから40,000ダルトンの範囲の異なるサイズのPEGがこれらの変異体に結合されて、それらの半減期と生物学的利用能を高めることができる。新たに設計した変異体の効率的なPEG化を確かめるため、MALDI-TOF解析を行うことができる。図２および３は、タンパク質を可視化するためのクマシーブリリアントブルー、および、PEG化変異体の可視化のためのヨウ化バリウムで染色したSDS-PAGEにおいて、精製されたPEG化生成物の溶解によって見られるように、PEG化G-CSF変異体のために考案された精製ストラテジーを示す。またPEG化変異体の増加した分子量は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析計で確認した。変異体の二次構造にアクセスするため、CD分光法を実施した。
【００５７】
例５．細胞ベースアッセイによるG-CSFおよびPEG化変異体の生物活性分析
rHuG-CSFおよびその変異体の生物活性を分析するため、細胞増殖アッセイを行った。rHuG-CSFの生物活性は、マウス骨髄芽球性NFS-60細胞を増殖させる能力によって測定した。これらのアッセイにおいて、増殖細胞の代謝活性はXTTなどのテトラゾリウム試薬の還元を通して測定される。その細胞を様々な濃度の標準物質（standard）、rHuG-CSFおよびそのPEG化変異体で４８時間処理し、その後、それらの代謝活性についてXTT試薬を用いて評価した。市販のフィルグラスチムおよび実験室で生成したrHuG-CSFおよびその変異体の生物活性は同等であることがわかった。この結果は、G-CSFにおける変異により生物活性を損なわないことを示している可能性がある。
【００５８】
例６．新規のG-CSF変異体のin vivoでの生物活性および半減期
本研究において遺伝子操作した新規のG-CSFの生物活性およびin vivoでの半減期を解析するため、本研究に１２〜１４週齢の雄のBALB/cマウスを用いた。このために、マウスを１週間慣れさせ、標準的な手順に従ってシクロホスファミド（200mg/kg）の腹腔内注射を用いて好中球減少症をマウスに誘発させた。好中球減少症の誘発を確認するため、血液を採取して全白血球数（TLC）を測定した。好中球減少症の誘発の１日後、「シャム（Sham）」またはモック（バッファーのみを含む）、治療効果のあるG-CSF（市販のもの）、および遺伝子操作した変異体を、単回皮下投与として個別に投与するか（最大1 mg / Kg）、または、4〜7日間の期間に125 μg / Kgを複数回投与した。G-CSF処理後、血液試料を採取し、次の５〜１０日間、TLC数を測定した。実験室で生成した、天然様のものと、市販のフィルグラスチムとは、同等の比活性度を示した。興味深いことに、我々はPEG化G-CSF変異体（すなわち新たに構築されたPEG化システイン変異体）で好中球減少症を治療した結果、好中球減少症からの回復が早められたことを観察した。同様に、in vivoでの半減期を見積もるため、マウスの独立したグループにシャム試料、市販のG-CSFおよび新規のG-CSF変異体のいずれかを注射した。血液試料を採取し、血清中のG-CSFの存在を市販のG-CSFエライザキットを使って見積もった。これらのデータによれば、変異体が元の未修飾のG-CSFと比べてより高い生物活性およびより長期のin vivo半減期を有することを明確に示した。
【００５９】
本発明の長所
●  開示したポリペプチドは結合に対してより感受性が高い。また、開示したポリペプチドにより結合パターンを最適化することができる。開示した結合体は、治療上有利な性質である、有意に長期の血清半減期を示す。それゆえ開示した複合体は、化学療法剤の投与と同じ日に用いることができる。部位特異的なPEG化は、従来用いられたアミンPEG化に起因して発生する、生成物の不均一性と生物活性の減少といった問題を克服する。
●  部位特異的なPEG化により、そのタンパク質が固有の単一、二重またはそれ以上の所定の部位にてPEGと選択的に結合できるようになる。そのような部位は、ポリペプチドの特徴づけをより着実なものとし、生物活性を比較的正確に予測することができ、異なる治療計画に相応しいものとすることができる。さらに、PEG化の部位は溶媒接触可能な残基にあり、PEG化を高効率にしかつ生成物をより均質にする。
●  本発明ではG-CSFのシステイン変異体を提供するとともに、PEG結合変異体を生成するためのそれらの応用を提供する。これは治療上有利な性質である、有意に長期の血清半減期を有する可能性があり、したがって化学療法剤の投与と同日に使用することができる。
【００６０】
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【００６１】
特許参考文献
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US 7,824,669          11/2010    Cox,III,   et al.           424/85.1
US 8,148,500           4/2012     Cox, III,   et al.          530/399
US 7,947,655           5/2011     Cox, III,   et al.         541/21.2
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US 8,841,426           9/2014     Kang, et al.              530/399
US 5,824,784          10/1998     Kinstler, et al.           530/399
US 8,093,032           1/2012     Kumar, et al.             435/216
US 20090203601      8/2009     Soni,et al.                  514/1.1
US 20130165637      6/2013     Xiaoqiang,et al.          530/362  
US6831158                        12/2004    Nissen, et al.                      530/397
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EP0668354A1             4/1989   Shaw et al.                C12N 15/27
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2021509805.tif 000011
【配列表】
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【国際調査報告】
2021509805.tif 000012
2021509805.tif 000013
2021509805.tif 000014
2021509805.tif 000015