(57)【要約】  本発明者らは、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原可変領域を含む第１のドメインと、Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原可変領域を含む第２のドメインとを含む、優れた細胞傷害を示す新規な多重特異性抗原結合分子を発見した。本発明者らは、さらなる二重特異性抗体を調製し、そのＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）を評価し、それらも強いＴＤＣＣ活性を示すことを見出した。本発明の分子／抗体は、ＤＬＬ３を発現する細胞に対する強い細胞傷害を示すため、ＤＬＬ３と関連する様々ながんを処置または予防するための分子／抗体を含む新規医薬組成物を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のドメイン：
（１）ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメイン、および
（２）Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメイン
を含み、
（１）の第１の抗原結合ドメインが、ヒトＤＬＬ３中の配列番号７に定義される領域内のエピトープに結合する、多重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
下記のドメイン：
（１）ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメイン、および
（２）Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメイン
を含み、
（１）の第１の抗原結合ドメインが、以下の（ａ１）〜（ａ１２）：
（ａ１）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ２）配列番号３３のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号３５のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ３）配列番号３９のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号４０のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号４１のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号４２のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号４３のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号４４のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ４）配列番号４５のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号４６のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号４７のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号４８のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号４９のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号５０のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ５）配列番号５１のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号５２のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号５３のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号５４のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５５のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号５６のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ６）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７５のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ７）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７６のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ８）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ９）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ１０）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号８１のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ１１）（ａ１）〜（ａ１０）から選択される抗体可変断片のいずれかの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ａ１２）（ａ１）〜（ａ１０）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つを含む、多重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
下記のドメイン：
（１）ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメイン、および
（２）Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメイン
を含み、
（１）の第１の抗原結合ドメインが、以下の（ｂ１）〜（ｂ２１）：
（ｂ１）配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ２）配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ３）配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ４）配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ５）配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ６）配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ７）配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ８）配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ９）配列番号８５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号９３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号９３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号９３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１０）配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１１）配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１２）配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１３）配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１４）配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１５）配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１６）配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１７）配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１８）配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１９）配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ２０）（ｂ１）〜（ｂ１９）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ｂ２１）（ｂ１）〜（ｂ１９）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つを含む、多重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
下記のドメイン：
（１）ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメイン、および
（２）Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメイン
を含み、
（１）の第１の抗原結合ドメインが、以下の（ｃ１）〜（ｃ２２）：
（ｃ１）配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２）配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ３）配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ４）配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ５）配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ６）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ７）配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ８）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ９）配列番号８５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１０）配列番号６３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１１）配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１２）配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１３）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１４）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１５）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１６）配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１７）配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１８）配列番号７０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１９）配列番号７１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２０）（ｃ１）〜（ｃ１９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｃ１）〜（ｃ１９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２１）（ｃ１）〜（ｃ１９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｃ１）〜（ｃ１９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２２）（ｃ１）〜（ｃ１９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｃ１）〜（ｃ１９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する軽鎖可変領域
から選択される重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組合せのいずれか１つを含む、多重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
細胞傷害活性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
細胞傷害活性がＴ細胞依存性細胞傷害活性である、請求項５に記載の多重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
（２）における第２の抗原結合ドメインがＣＤ３イプシロン鎖に結合する、請求項１から６のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
（２）における第２の抗原結合ドメインがＴ細胞受容体に結合する、請求項１から６のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
第１の抗原結合ドメインもしくは第２の抗原結合ドメインが抗体可変断片であるか、または第１と第２の抗原結合ドメインの両方が抗体可変断片である、請求項１から８のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
（３）Ｆｃガンマ受容体に対する結合活性が低下したＦｃ領域を含む第３のドメイン
をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
Ｆｃ領域が、配列番号１１２〜１１５（ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４）のＦｃ領域を構成するアミノ酸のいずれかにアミノ酸変異を有するＦｃ領域である、請求項１０に記載の多重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
Ｆｃ領域が、ＥＵナンバリングによって特定される以下のアミノ酸位置：
２２０位、２２６位、２２９位、２３１位、２３２位、２３３位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４０位、２６４位、２６５位、２６６位、２６７位、２６９位、２７０位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３００位、３２５位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位、３３１位、および３３２位
から選択される少なくとも１個のアミノ酸の変異を有するＦｃ領域である、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
二重特異性抗体である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子または請求項１３に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合分子または請求項１３に記載の二重特異性抗体を含む、がんの処置または予防における使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメインと、Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメインとを含む多重特異性抗原結合分子、および、その使用などに関する。本発明はまた、ヒトＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを含む新規な単一特異性抗原結合分子、および、その使用などに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、世界の主な死因の１つである。ある特定の癌腫を除いて、腫瘍は、それらが発見されたときには手術不能であることが多い。従来のがん処置としては、放射線療法、化学療法、および免疫療法が挙げられる。これらの処置は、十分に有効ではないことが多く、最終的には、処置後にがんの再発または転移が生じる。腫瘍特異性の欠如は、最大効能を制限する因子の１つである；したがって、より腫瘍特異的な分子標的療法が、がん処置における追加の実行可能な選択肢になってきている。
【０００３】
抗体は、血漿中での安定性が高く、副作用が少ないため、医薬品として注目されている。複数の治療用抗体の中でも、一部の型の抗体は、抗腫瘍応答を発揮するにはエフェクター細胞を必要とする。抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、抗体のＦｃ領域の、ＮＫ細胞およびマクロファージ上に存在するＦｃ受容体への結合によって、エフェクター細胞が、抗体が結合した細胞に対して示す細胞傷害である。現在まで、抗腫瘍効能を発揮するためにＡＤＣＣを誘導することができる複数の治療用抗体が、がんを処置するための医薬品として開発されている（非特許文献１）。従来の治療用抗体を使用して腫瘍特異的に発現された抗原を標的とする療法は、優れた抗腫瘍活性を示すが、そのような抗体の投与は、いつも満足のいく成果をもたらすわけではなかった。
【０００４】
ＮＫ細胞またはマクロファージをエフェクター細胞として動員することによってＡＤＣＣを採用する抗体に加えて、Ｔ細胞をエフェクター細胞として動員することによって細胞傷害性を採用するＴ細胞動員（Ｔ  ｃｅｌｌ−ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ）抗体（ＴＲ抗体）も１９８０年代から知られている（非特許文献２〜４）。ＴＲ抗体は、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体を形成するサブユニットのいずれか１つ、特に、ＣＤ３イプシロン鎖と、がん細胞上の抗原とを認識し、これらに結合する二重特異性抗体である。いくつかのＴＲ抗体が、現在開発中である。ＥｐＣＡＭに対するＴＲ抗体であるカツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）は、悪性腹水の処置についてＥＵで承認されている。さらに、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）」と呼ばれる型のＴＲ抗体が、強力な抗腫瘍活性を示すことが最近見出された（非特許文献５および非特許文献６）。ＣＤ１９に対するＢｉＴＥ分子であるブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）は、２０１４年に初めてＦＤＡの承認を受けた。ブリナツモマブは、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ１９／ＣＤ２０陽性がん細胞に対するはるかに強い細胞傷害活性を示し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導することが証明された（非特許文献７）。
【０００５】
しかしながら、三官能性抗体ががん抗原非依存的様式で、Ｔ細胞と、ＮＫ細胞またはマクロファージなどの細胞との両方に同時に結合する結果、これらの細胞上で発現される受容体が架橋され、がん抗原非依存的様式で様々なサイトカインの発現が誘導されることが知られている。三官能性抗体の全身投与は、そのようなサイトカイン発現の誘導の結果として、サイトカインストームのような副作用を引き起こすと考えられる。実際、第Ｉ相臨床試験において、５マイクログラム（μｇ）／全身という非常に低い用量が、非小細胞肺がんを有する患者に対するカツマキソマブの全身投与に関する最大耐量であり、それより高い用量の投与は、様々な重篤な副作用を引き起こすことが報告されている（非特許文献８）。そのような低い用量で投与した場合、カツマキソマブは、有効血中レベルには決して到達できない。すなわち、そのような低用量でカツマキソマブを投与することによっては、期待される抗腫瘍効果を達成することはできない。
【０００６】
一方、カツマキソマブと違って、ＢｉＴＥは、Ｆｃガンマ受容体結合部位を持たないため、がん抗原非依存的様式で、Ｔ細胞と、ＮＫ細胞およびマクロファージなどの細胞に発現される受容体を架橋しない。かくして、ＢｉＴＥは、カツマキソマブが投与される場合に観察されるがん抗原非依存的サイトカイン誘導を引き起こさないことが実証されている。しかしながら、ＢｉＴＥは、Ｆｃ領域を欠く低分子量の改変抗体分子であるため、問題は、治療用抗体として従来使用されるＩｇＧ型の抗体よりも、患者への投与後のその血中半減期が著しく短いということである。事実、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたＢｉＴＥの血中半減期は、約数時間であると報告されている（非特許文献９および非特許文献１０）。ブリナツモマブの臨床試験においては、それはミニポンプを使用した連続静脈内輸注によって投与される。この投与法は、患者にとって極端に不便であるだけでなく、デバイスの故障などによる医療事故のリスクも潜在する。かくして、そのような投与法は望ましいとは言えない。
【０００７】
デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）は、Ｎｏｔｃｈリガンドファミリーのメンバーに属するＩ型膜タンパク質である。ＤＬＬ３は、正常な体節形成およびパターニングにとって必要である。ＤＬＬ３における変異は、常染色体劣性脊椎肋骨異骨症患者において肋骨欠損または脊椎分離症を引き起こす（非特許文献１１および非特許文献１２）。染色体上のＤＬＬ３遺伝子の増幅および膵がん細胞株中でのこの遺伝子の発現の増加（非特許文献１３）および一部のグリオーマ症例におけるＤＬＬ３発現の増加（非特許文献１４）を報告する以前の研究が存在する。さらに、ＤＬＬ３は、ＡＤＣＣ増強抗体、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、およびＢｉＴＥ−Ｆｃ形式を使用するＴ細胞エンゲージング二重特異性分子を使用した、ＳＣＬＣに加え、グリオーマを診断および処置する方法において以前に提案されている（特許文献１、特許文献２および特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０９３０９７
【特許文献２】ＷＯ２０１３／１２６７４６
【特許文献３】ＷＯ２０１７／０２１３４９
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １；１６（１）：１１〜２０頁
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ．１９８５  Ａｐｒ  １８〜２４；３１４（６０１２）：６２８〜３１頁
【非特許文献３】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９８８  Ａｐｒ  １５；４１（４）：６０９〜１５頁
【非特許文献４】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８６  Ｍａｒ；８３（５）：１４５３〜７頁
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９５  Ｊｕｌ  １８；９２（１５）：７０２１〜５頁
【非特許文献６】Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．２００５  Ｓｅｐ  １５；１０（１８）：１２３７〜４４頁
【非特許文献７】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００２  Ａｕｇ  ２０；１００（６）：６９０〜７頁
【非特許文献８】Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００７）５６（１０）、１６３７〜４４頁
【非特許文献９】Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００６）５５（５）、５０３〜１４頁
【非特許文献１０】Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００９）５８（１）、９５〜１０９頁
【非特許文献１１】Ｂｕｌｍａｎ，Ｍ．Ｐ．ら（２０００）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２４、４３８〜４４１頁
【非特許文献１２】Ｔｕｒｎｐｅｎｎｙ，Ｐ．Ｄ．ら（２００３）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ４０、３３３〜３３９頁
【非特許文献１３】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｈ．Ｓ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９、１５７〜１７３頁
【非特許文献１４】Ｍｕｌｌｅｄｎｄｏｒｅ，Ｍ．Ｅ．（２００９）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５、２２９１〜２３０１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、Ｔ細胞をＤＬＬ３発現細胞に近接させ、ＤＬＬ３を発現するがん細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を使用することによってがん処置を可能にする多重特異性抗原結合分子、多重特異性抗原結合分子の生産方法、およびがん細胞傷害を誘導するための活性成分としてそのような多重特異性抗原結合分子を含む治療剤を提供することである。本発明の別の目的は、活性成分として上記の抗原結合分子の１つを含む、様々ながんの処置または予防における使用のための医薬組成物、および該医薬組成物を使用する治療方法を提供することである。本発明の別の目的は、ヒトＤＬＬ３結合活性を有する新規な単一特異性抗原結合分子、活性成分としてそのような単一特異性抗原結合分子を含む治療剤、およびそのような治療剤を使用する治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメインと、Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメインとを含む多重特異性抗原結合分子が、ＤＬＬ３を発現する細胞を損傷させ、優れた細胞傷害／抗腫瘍活性を発揮することができることを見出した。本発明は、活性成分として抗原結合分子を含むことにより、様々ながん、特に、ＤＬＬ３陽性腫瘍などのＤＬＬ３と関連するがんを処置することができる、多重特異性抗原結合分子および医薬組成物を提供する。本発明はまた、ヒトＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを含む新規な単一特異性抗原結合分子、およびそのような抗原結合分子を含む医薬組成物も提供する。
【００１２】
より具体的には、本発明は、以下のものを提供する：
［１］下記のドメイン：
（１）ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメイン、および
（２）Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメイン
を含み、
（１）の第１の抗原結合ドメインが、ヒトＤＬＬ３中の配列番号７に定義される領域内のエピトープに結合する、多重特異性抗原結合分子。
［２］下記のドメイン：
（１）ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメイン、および
（２）Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメイン
を含み、
（１）の第１の抗原結合ドメインが、以下の（ａ１）〜（ａ１２）：
（ａ１）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ２）配列番号３３のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号３５のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ３）配列番号３９のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号４０のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号４１のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号４２のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号４３のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号４４のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ４）配列番号４５のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号４６のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号４７のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号４８のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号４９のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号５０のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ５）配列番号５１のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号５２のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号５３のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号５４のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５５のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号５６のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ６）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７５のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ７）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７６のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ８）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ９）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ１０）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号８１のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ１１）（ａ１）〜（ａ１０）から選択される抗体可変断片のいずれかの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ａ１２）（ａ１）〜（ａ１０）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つを含む、多重特異性抗原結合分子。
［３］下記のドメイン：
（１）ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメイン、および
（２）Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメイン
を含み、
（１）の第１の抗原結合ドメインが、以下の（ｂ１）〜（ｂ２１）：
（ｂ１）配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ２）配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ３）配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ４）配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ５）配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ６）配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ７）配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ８）配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ９）配列番号８５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号９３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号９３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号９３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１０）配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１１）配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１２）配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１３）配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１４）配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１５）配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１６）配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１７）配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１８）配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１９）配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ２０）（ｂ１）〜（ｂ１９）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ｂ２１）（ｂ１）〜（ｂ１９）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つを含む、多重特異性抗原結合分子。
［４］下記のドメイン：
（１）ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメイン、および
（２）Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメイン
を含み、
（１）の第１の抗原結合ドメインが、以下の（ｃ１）〜（ｃ２２）：
（ｃ１）配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２）配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ３）配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ４）配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ５）配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ６）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ７）配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ８）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ９）配列番号８５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１０）配列番号６３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１１）配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１２）配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１３）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１４）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１５）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１６）配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１７）配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１８）配列番号７０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１９）配列番号７１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２０）（ｃ１）〜（ｃ１９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｃ１）〜（ｃ１９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２１）（ｃ１）〜（ｃ１９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｃ１）〜（ｃ１９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２２）（ｃ１）〜（ｃ１９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｃ１）〜（ｃ１９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する軽鎖可変領域
から選択される重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組合せのいずれか１つを含む、多重特異性抗原結合分子。
［５］細胞傷害活性を有する、［１］から［４］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子。
［６］細胞傷害活性がＴ細胞依存性細胞傷害活性である、［５］に記載の多重特異性抗原結合分子。
［７］（２）における第２の抗原結合ドメインがＣＤ３イプシロン鎖に結合する、［１］から［６］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子。
［８］（２）における第２の抗原結合ドメインがＴ細胞受容体に結合する、［１］から［６］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子。
［９］（２）における第２の抗原結合ドメインが、以下の（ｄ１）〜（ｄ１２）：
（ｄ１）それぞれ、配列番号５７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号５８に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ２）それぞれ、配列番号９８に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号１０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ３）それぞれ、配列番号９９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号１０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ４）それぞれ、配列番号１００に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号１０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ５）それぞれ、配列番号１０１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号１０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ６）それぞれ、配列番号１０２に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号１０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ７）それぞれ、配列番号２９８に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号２９９に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ８）それぞれ、配列番号３００に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号３０１に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ９）それぞれ、配列番号３０２に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号３０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ１０）配列番号３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８および３９０から選択されるいずれか１つに含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、配列番号３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９および３９１から選択されるいずれか１つに含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ１１）（ｄ１）〜（ｄ１０）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ｄ１２）（ｄ１）〜（ｄ１０）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つを含む、［１］から［８］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子。
［１０］（２）における第２の抗原結合ドメインが、以下の（ｅ１）〜（ｅ１２）：
（ｅ１）配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号５８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ２）配列番号９８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ３）配列番号９９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ４）配列番号１００のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ５）配列番号１０１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ６）配列番号１０２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ７）配列番号３００のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３０１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ８）配列番号３０２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ９）表２Ａ中のアミノ酸配列の組合せのいずれか１つを有する重鎖可変領域と軽鎖可変領域；
（ｅ１０）（ｅ１）〜（ｅ９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｅ１）〜（ｅ９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｅ１１）（ｅ１）〜（ｅ９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｅ１）〜（ｅ９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｅ１２）（ｅ１）〜（ｅ９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｅ１）〜（ｅ９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する軽鎖可変領域
のいずれか１つを含む、［１］から［８］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子。
［１１］（２）における第２の抗原結合ドメインが、以下の（ｊ１）〜（ｊ５）：
（ｊ１）配列番号１３６のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１３７のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１３８のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１３９のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１４０のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１４１のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｊ２）配列番号１４２のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１４３のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１４４のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１４５のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１４６のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１４７のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｊ３）表２Ｂ中の組合せのいずれかから選択されるＨＶＲ配列を含む抗体可変断片；
（ｊ４）（ｊ１）〜（ｊ３）から選択される抗体可変断片のいずれかの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ｊ５）（ｊ１）〜（ｊ３）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つを含む、［１］から［８］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子。
［１２］第１の抗原結合ドメインもしくは第２の抗原結合ドメインが抗体可変断片であるか、または第１と第２の抗原結合ドメインの両方が抗体可変断片である、［１］から［１１］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子。
［１３］抗体可変断片がＦａｂである、［１２］に記載の多重特異性抗原結合分子。
［１４］（３）Ｆｃガンマ受容体に対する結合活性が低下したＦｃ領域を含む第３のドメインをさらに含む、［１］から［１３］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子。
［１５］下記のドメイン：
（１）ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメイン、
（２）Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメイン、および
（３）Ｆｃガンマ受容体に対する結合活性が低下したＦｃ領域を含む第３のドメイン
を含む多重特異性抗原結合分子。
［１６］第１の抗原結合ドメインもしくは第２の抗原結合ドメインが抗体可変断片であるか、または第１と第２の抗原結合ドメインの両方が抗体可変断片である、［１５］に記載の多重特異性抗原結合分子。
［１７］抗体可変断片がＦａｂである、［１６］に記載の多重特異性抗原結合分子。
［１８］Ｆｃ領域が、配列番号１１２〜１１５（ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４）のＦｃ領域を構成するアミノ酸のいずれかにアミノ酸変異を有するＦｃ領域である、［１４］から［１７］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子。
［１９］Ｆｃ領域が、ＥＵナンバリングによって特定される以下のアミノ酸位置：
２２０位、２２６位、２２９位、２３１位、２３２位、２３３位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４０位、２６４位、２６５位、２６６位、２６７位、２６９位、２７０位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３００位、３２５位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位、３３１位、および３３２位
から選択される少なくとも１個のアミノ酸の変異を有するＦｃ領域である、［１８］に記載の多重特異性抗原結合分子。
［２０］二重特異性抗体である、［１］から［１９］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子。
［２１］抗体がモノクローナル抗体である、［２０］に記載の二重特異性抗体。
［２２］［１］から［１９］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子または［２０］もしくは［２１］に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
［２３］Ｔ細胞依存性細胞傷害を誘導する、［２２］に記載の医薬組成物。
［２４］［１］から［１９］のいずれか１つに記載の多重特異性抗原結合分子または［２０］もしくは［２１］に記載の二重特異性抗体を含む、がんの処置または予防における使用のための医薬組成物。
［２５］［１］から［１９］のいずれか１つに記載の抗原結合分子または［２０］もしくは［２１］に記載の二重特異性抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを処置または予防するための方法。
［２６］がんを処置または予防するための医薬組成物の製造における、［１］から［１９］のいずれか１つに記載の抗原結合分子または［２０］もしくは［２１］に記載の二重特異性抗体の使用。
［２７］がんを処置または予防するための、［１］から［１９］のいずれか１つに記載の抗原結合分子または［２０］もしくは［２１］に記載の二重特異性抗体の使用。
［２８］がんが、肺がん（小細胞肺がんを含む）、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、肝臓がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、副腎がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、食道がん、尿路上皮がん、脳がん、リンパ腫、癌腫または肉腫である、［２５］に記載の方法。
［２９］がんが、肺がん（小細胞肺がんを含む）、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、肝臓がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、副腎がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、食道がん、尿路上皮がん、脳がん、リンパ腫、癌腫または肉腫である、［２６］または［２７］に記載の使用。
［３０］がんが、肺がん（小細胞肺がんを含む）、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、肝臓がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、副腎がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、食道がん、尿路上皮がん、脳がん、リンパ腫、癌腫または肉腫である、［２４］に記載の医薬組成物。
［３１］ヒトＤＬＬ３中の配列番号７に定義される領域内のエピトープに結合する抗原結合分子。
［３２］以下の（ｆ１）〜（ｆ１１）：
（ｆ１）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ２）配列番号３３のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号３５のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ３）配列番号３９のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号４０のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号４１のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号４２のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号４３のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号４４のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ４）配列番号４５のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号４６のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号４７のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号４８のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号４９のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号５０のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ５）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７５のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ６）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７６のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ７）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ８）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ９）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号８１のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ１０）（ｆ１）〜（ｆ９）から選択される抗体可変断片のいずれかの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ｆ１１）（ｆ１）〜（ｆ９）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つを含む抗原結合ドメインを含む抗原結合分子。
［３３］以下の（ｇ１）〜（ｇ２０）：
（ｇ１）配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ２）配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ３）配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ４）配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ５）配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ６）配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ７）配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ８）配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ９）配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１０）配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１１）配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１２）配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１３）配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１４）配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１５）配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１６）配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１７）配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１８）配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１９）（ｇ１）〜（ｇ１８）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ｇ２０）（ｇ１）〜（ｇ１８）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つを含む抗原結合ドメインを含む抗原結合分子。
［３４］以下の（ｈ１）〜（ｈ２１）：
（ｈ１）配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ２）配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ３）配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ４）配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ５）配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ６）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ７）配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ８）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ９）配列番号６３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１０）配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１１）配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１２）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１３）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１４）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１５）配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１６）配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１７）配列番号７０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１８）配列番号７１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１９）（ｈ１）〜（ｈ１８）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｈ１）〜（ｈ１８）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｈ２０）（ｈ１）〜（ｈ１８）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｈ１）〜（ｈ１８）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｈ２１）（ｈ１）〜（ｈ１８）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｈ１）〜（ｈ１８）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する軽鎖可変領域
のいずれか１つを含む抗原結合ドメインを含む抗原結合分子。
［３５］細胞傷害活性を有する、［３１］から［３４］のいずれか１つに記載の抗原結合分子。
［３６］細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害である、［３５］に記載の抗原結合分子。
［３７］内在化活性を有する、［３１］から［３６］のいずれか１つに記載の抗原結合分子。
［３８］毒性化合物にコンジュゲートされている、［３１］から［３７］のいずれか１つに記載の抗原結合分子。
［３９］抗体可変断片である、［３１］から［３８］のいずれか１つに記載の抗原結合分子。
［４０］抗体可変断片がＦａｂである、［３９］に記載の抗原結合分子。
［４１］抗体である、［３１］から［４０］のいずれか１つに記載の抗原結合分子。
［４２］モノクローナル抗体である、［４１］に記載の抗原結合分子。
［４３］［４２］に記載の抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート化合物。
［４４］［３１］から［４０］のいずれか１つに記載の抗原結合分子または［４１］もしくは［４２］に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
［４５］［３１］から［４０］のいずれか１つに記載の抗原結合分子または［４１］もしくは［４２］に記載の抗体を含む、がんの処置または予防における使用のための医薬組成物。
［４６］［３１］から［４０］のいずれか１つに記載の抗原結合分子または［４１］もしくは［４２］に記載の抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを処置または予防するための方法。
［４７］がんを処置または予防するための医薬組成物の製造における、［３１］から［４０］のいずれか１つに記載の抗原結合分子または［４１］もしくは［４２］に記載の抗体の使用。
［４８］がんを処置または予防するための、［３１］から［４０］のいずれか１つに記載の抗原結合分子または［４１］もしくは［４２］に記載の抗体の使用。
［４９］がんが、肺がん（小細胞肺がんを含む）、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、肝臓がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、副腎がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、食道がん、尿路上皮がん、脳がん、リンパ腫、癌腫または肉腫である、［４６］に記載の方法。
［５０］がんが、肺がん（小細胞肺がんを含む）、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、肝臓がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、副腎がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、食道がん、尿路上皮がん、脳がん、リンパ腫、癌腫または肉腫である、［４７］または［４８］に記載の使用。
［５１］がんが、肺がん（小細胞肺がんを含む）、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、肝臓がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、副腎がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、食道がん、尿路上皮がん、脳がん、リンパ腫、癌腫または肉腫である、［４５］に記載の医薬組成物。
［５２］［１］から［１９］のいずれか１つに記載の抗原結合分子または［２０］もしくは［２１］に記載の二重特異性抗体と、使用のための指示書とを含むキット。
［５３］［３１］から［４０］のいずれか１つに記載の抗原結合分子または［４１］もしくは［４２］に記載の抗体と、使用のための指示書とを含むキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、Ｔ細胞を、ＤＬＬ３発現細胞に接近させ、ＤＬＬ３発現がん細胞に対するＴ細胞の細胞傷害を使用することによって、がん処置を可能にする多重特異性抗原結合分子、該多重特異性抗原結合分子を製造する方法、およびがん処置の新しい手法としての、細胞傷害を誘導するための活性成分としてそのような多重特異性抗原結合分子を含有する治療剤を提供する。本発明の多重特異性抗原結合分子は、細胞傷害を誘導する強力な抗腫瘍活性を有し、ＤＬＬ３発現細胞を標的とし、これを損傷することができ、かくして、様々ながんの処置および予防を可能にする。本発明はまた、ヒトＤＬＬ３結合活性を有する新規な単一特異性抗原結合分子、活性成分としてそのような単一特異性抗原結合分子を含む治療剤、およびそのような治療剤を使用する治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、全長ヒトＤＬＬ３および実施例１で調製されるヒトＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質の構造を示す概略図である。実施例３で選択される抗ＤＬＬ３抗体のそれぞれによって認識されるエピトープも示される。ＥＧＦドメインは、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、６個の領域、ＥＧＦ１〜ＥＧＦ６を有する。
【図２】図２は、抗体の、ヒトＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質への結合を示す。試験された抗ＤＬＬ３抗体の名称を、それぞれのグラフの上部に示す。
【図３】図３は、ＳＫ−ＭＥＬ−３０（Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ１４３６（Ｂ）およびＮＣＩ−Ｈ２２２７（Ｃ）がん細胞株中でのＤＬＬ３の発現を示す。黒色の点線：第２抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）のみ、灰色の実線：対照ウサギＩｇＧ（ＣＥＬＬ  ＬＡＢ）、黒色の実線：ＤＬＬ３抗体（二価ＤＬＡ０３１６）。
【図４】図４は、ＳＫ−ＭＥＬ−３０細胞株に対する、抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体（ＤＬ３１２／Ｎｏ．１２、ＤＬＡ０３１６／Ｎｏ．１２、ＤＬＡ０５８０／Ｎｏ．１２、ＤＬＡ０８１４／Ｎｏ．１２、およびＤＬＡ０７６９／Ｎｏ．１２）のＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）を示す。
【図５】図５は、ＮＣＩ−Ｈ１４３６（Ａ）およびＮＣＩ−Ｈ２２２７（Ｂ）ＳＣＬＣ細胞株に対するカルセイン放出アッセイにより評価された抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体（ＤＬＡ０３１６／Ｎｏ．１２）のＴＤＣＣを示す。
【図６】図６は、ＳＫ−ＭＥＬ−３０腫瘍担持Ｔ細胞注入モデルにおける抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体（ＤＬＡ０３１６／Ｎｏ．１２、ＤＬＡ０５８０／Ｎｏ．１２およびＤＬＡ０８４１／Ｎｏ．１２）のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍効能を示す。使用された抗体およびその用量も示す。
【図７】図７は、ＳＣＬＣ腫瘍担持Ｔ細胞注入モデルにおける抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体（ＤＬＡ０３１６／Ｎｏ．１２）のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍効能を示す。使用したがん細胞株は、ＮＣＩ−Ｈ１４３６（Ａ）およびＮＣＩ−Ｈ２２２７（Ｂ）であった。
【図８】図８は、抗体Ｂの抗体Ａに対する競合比を示す。
【図９】図９は、ＳＫ−ＭＥＬ−３０細胞株に対するヒト化抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＴＤＣＣを示す。試験した二重特異性抗体の抗ＤＬＬ３アームは、それぞれ、ＤＬＡ０１３６またはそのヒト化バリアントＤ３０３１６ＡＥ０３（Ａ）、ならびにＤＬＡ０８４１またはそのヒト化バリアントＤ３０８４１ＡＥ０８およびＤ３０８４１ＡＥ１１（Ｂ）に由来するものであった。
【図１０】図１０は、ＳＫ−ＭＥＬ−３０細胞株に対するヒト化抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＴＤＣＣを示す。グラフは、０．００１ｎＭ〜１０ｎＭの様々な抗ＣＤ３アームを有する二重特異性ヒト化ＤＬＬ３抗体の存在下、５のＥ：Ｔ比でＰＢＭＣと共に同時培養した場合のＳＫ−ＭＥＬ−３０の細胞傷害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書で記載されるか、または参照される技術および手順は、当業者によって、一般的には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（２００１）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、（２００３））；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ（編）、（１９９５））、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、（１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（編）、（１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ（編）、１９９８）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）（編）、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ（編）、１９９３〜８）  Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（編））；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ（編）、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら（編）、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ（編）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂ���ｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ（編）、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら（編）、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）に記載された広く利用される方法などの、従来の方法を使用してよく理解され、一般的に用いられるものである。
以下の定義および詳細な説明は、本明細書で説明される本発明の理解を容易にするために提供される。
【００１６】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントさせ、必要に応じてギャップを導入して、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、最大の配列同一性パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントを、当分野における技術の範囲内にある様々な手段で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、またはＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）（Ｇｅｎｅｔｙｘ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）などの公共的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインさせるための適切なパラメータを決定することができる。
【００１７】
ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著されたものであり、そのソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９にユーザー文書と共にファイリングされており、米国著作権局登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公共的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（商標）Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較のために用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、との、または、に対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、との、または、に対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有する、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、以下のように算出される：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
（式中、Ｘは、ＡとＢとの、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のアラインメントにおける、そのプログラムによって同一の一致としてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解されるであろう。別途具体的に記述されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して直前の段落に記載されたように得られる。
【００１８】
アミノ酸
本明細書では、アミノ酸は、１文字または３文字コードまたはその両方、例えば、Ａｌａ／Ａ、Ｌｅｕ／Ｌ、Ａｒｇ／Ｒ、Ｌｙｓ／Ｋ、Ａｓｎ／Ｎ、Ｍｅｔ／Ｍ、Ａｓｐ／Ｄ、Ｐｈｅ／Ｆ、Ｃｙｓ／Ｃ、Ｐｒｏ／Ｐ、Ｇｌｎ／Ｑ、Ｓｅｒ／Ｓ、Ｇｌｕ／Ｅ、Ｔｈｒ／Ｔ、Ｇｌｙ／Ｇ、Ｔｒｐ／Ｗ、Ｈｉｓ／Ｈ、Ｔｙｒ／Ｙ、Ｉｌｅ／Ｉ、またはＶａｌ／Ｖで記載される。
【００１９】
アミノ酸の変化
抗原結合分子のアミノ酸配列におけるアミノ酸変化のために、部位特異的突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２、４８８〜４９２頁））および重複伸長ＰＣＲなどの公知の方法を適切に用いることができる。さらに、いくつかの公知の方法を、非天然アミノ酸への置換のためにアミノ酸変化法として用いることもできる（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．（２００６）３５、２２５〜２４９頁；およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００３）１００（１１）、６３５３〜６３５７頁）。例えば、終止コドンの１つ、ＵＡＧコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーｔＲＮＡに結合した非天然アミノ酸を有するｔＲＮＡを含有する無細胞翻訳系（Ｃｌｏｖｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ））を使用することが好適である。
【００２０】
本明細書では、アミノ酸変化の部位を記載する場合の用語「および／または」の意味は、「および」と「または」が好適に組み合わされた全ての組合せを含む。具体的には、例えば、「３３、５５および／または９６位のアミノ酸が置換される」は、以下のアミノ酸変化のバリエーション：（ａ）３３位、（ｂ）５５位、（ｃ）９６位、（ｄ）３３位および５５位、（ｅ）３３位および９６位、（ｆ）５５位および９６位、ならびに（ｇ）３３位、５５位および９６位のアミノ酸を含む。
【００２１】
さらに、本明細書において、アミノ酸の変化を示す表現、特定の位置を示す数字の前後を示す表現として、変化の前後のアミノ酸の１文字または３文字コードを、それぞれ、適切に使用することができる。例えば、抗体可変領域に含まれるアミノ酸を置換する場合に使用される変化Ｎ１００ｂＬまたはＡｓｎ１００ｂＬｅｕは、１００ｂ位（Ｋａｂａｔのナンバリングによる）のＡｓｎの、Ｌｅｕによる置換を示す。すなわち、数字は、Ｋａｂａｔのナンバリングによるアミノ酸位置を示し、数字の前に書かれた１文字または３文字のアミノ酸コードは、置換前のアミノ酸を示し、数字の後に書かれた１文字または３文字のアミノ酸コードは、置換後のアミノ酸を示す。同様に、抗体定常領域に含まれるＦｃ領域のアミノ酸を置換する場合に使用される変化Ｐ２３８ＤまたはＰｒｏ２３８Ａｓｐは、２３８位（ＥＵナンバリングによる）のＰｒｏの、Ａｓｐによる置換を示す。すなわち、数字は、ＥＵナンバリングによるアミノ酸位置を示し、数字の前に書かれた１文字または３文字のアミノ酸コードは、置換前のアミノ酸を示し、数字の後に書かれた１文字または３文字のアミノ酸コードは、置換後のアミノ酸を示す。
【００２２】
抗原結合分子
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合分子」とは、抗原結合ドメインを含む任意の分子を指し、さらに、約５アミノ酸以上の長さを有するペプチドまたはタンパク質などの分子を指しうる。ペプチドおよびタンパク質は、生物に由来するものに限定されず、例えば、それらは人工的に設計された配列から生産されるポリペプチドであってもよい。それらはまた、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、組換えポリペプチドなどのいずれかであってもよい。
【００２３】
本発明の抗原結合分子の好ましい例は、複数の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、異なる抗原結合特異性を有する２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、異なる抗原結合特異性を有する２つの抗原結合ドメインと、抗体Ｆｃ領域に含まれるＦｃＲｎ結合ドメインとを含む抗原結合分子である。生体に投与されたタンパク質の血中半減期を延長するための方法として、抗体のＦｃＲｎ結合ドメインを目的のタンパク質に付加し、ＦｃＲｎを介したリサイクリングの機能を利用する方法が周知である。
【００２４】
本発明の抗原結合分子の別の好ましい例は、ただ１つの型の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、同じ抗原結合特異性を有する２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、同じ抗原結合特異性を有する２つの抗原結合ドメインと、Ｆｃ領域とを含む抗原結合分子である。
【００２５】
抗原結合ドメイン
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原の全部または一部に特異的に結合し、それと相補的である領域を含む抗体部分を指す。抗原の分子量が大きい場合、抗体は、抗原の特定の部分にのみ結合することができる。その特定の部分は、「エピトープ」と呼ばれる。抗原結合ドメインを、１つまたは複数の抗体可変ドメインから提供することができる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）との両方を含有する。そのような好ましい抗原結合ドメインとしては、例えば、「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」、「単鎖抗体」、「Ｆｖ」、「単鎖Ｆｖ２（ｓｃＦｖ２）」、「Ｆａｂ」、および「Ｆ（ａｂ’）２」が挙げられる。
【００２６】
本発明の抗原結合分子の抗原結合ドメインは、同じエピトープに結合してもよい。エピトープは、配列番号９または１１１のアミノ酸配列を含むタンパク質中に存在してもよい。あるいは、本発明の多重特異性抗原結合分子の抗原結合ドメインは、異なるエピトープに個別に結合してもよい。エピトープは、配列番号９または１１１のアミノ酸配列を含むタンパク質中に存在してもよい。
【００２７】
本発明の抗原結合分子の抗原結合ドメインは、「ＤＬＬ３またはＴ細胞受容体複合体に結合する」。すなわち、ＤＬＬ３およびＴ細胞受容体複合体は、目的の好ましい抗原である。本明細書で使用される場合、語句「抗原に結合する」とは、非特異的結合またはバックグラウンド結合のレベルよりも高い特異的結合のレベルで目的の抗原に結合する、抗原結合ドメイン、抗体、抗原結合分子、抗体可変断片など（以後、「抗原結合ドメインなど」とする）の結合活性を指す。換言すれば、そのような抗原結合ドメインなどは、目的の抗原に対して「特異的に／有意に抗原に結合する」。特異性を、本明細書に記載の、または当分野で公知の、親和性または結合活性を検出するための任意の方法によって測定することができる。特異的結合の上記レベルは、有意であると当業者によって認識されるのに十分に高いものであってよい。例えば、当業者が、好適な結合アッセイにおいて抗原結合ドメインなどと、目的の抗原との間の結合の有意な、または比較的強いシグナルまたは値を検出または観察することができる場合、その抗原結合ドメインなどは、目的の抗原に対して「特異的に／有意に抗原に結合する」ということができる。語句「抗原に結合する」は、当分野では、語句「特異的に／有意に抗原に結合する」と実質的に同じ意味を有することがある。
【００２８】
ＤＬＬ３
本明細書で使用される場合、用語「ＤＬＬ３」とは、別途指摘しない限り、霊長類（例えば、ヒト）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物起源の任意の天然ＤＬＬ３（デルタ様タンパク質３）を指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＤＬＬ３ならびに細胞中でのプロセシングの結果生じる任意の形態のＤＬＬ３を包含する。この用語はまた、ＤＬＬ３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＤＬＬ３のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＲｅｆＳｅｑ）ＮＭ＿０１６９４１．３として公知であり、例示的なカニクイザルＤＬＬ３のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＸＰ＿００５５８９２５３．１として公知であり、例示的なマウスＤＬＬ３のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＭ＿００７８６６．２として公知である。実施例で使用されるカニクイザルＤＬＬ３のアミノ酸配列は、配列番号８に示される。
【００２９】
ヒトＤＬＬ３タンパク質は、Ｃ末端側に膜貫通（ＴＭ）領域および細胞内ドメインを含み、Ｎ末端側にＤＳＬ（Ｎｏｔｃｈ）ドメインを含む（例えば、図１を参照）。さらに、ＤＬＬ３は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、６個の領域、ＥＧＦ１〜ＥＧＦ６を含むＥＧＦドメインを有する。一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子または抗体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、すなわち、ＴＭ領域またはＣ末端細胞内ドメインではなく、Ｎ末端からＴＭ領域の直前までのドメイン内のエピトープに結合する。本発明の分子／抗体は、ＥＣＤ内の上記ドメイン／領域のいずれかの中のエピトープに結合してもよい。好ましい実施形態では、本発明の分子／抗体は、ＥＧＦ６からＴＭ領域の直前までの領域内のエピトープに結合する。より具体的には、本発明の分子／抗体は、ヒトＤＬＬ３中の配列番号７に定義される領域内のエピトープに結合することができる。一部の実施形態では、本発明の分子／抗体は、ヒトＤＬＬ３のＥＧＦ１、ＥＧＦ２、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５、もしくはＥＧＦ６領域またはＥＧＦ６からＴＭ領域の直前までの領域、またはヒトＤＬＬ３のＥＧＦ１、ＥＧＦ２、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５、もしくはＥＧＦ６領域またはＥＧＦ６からＴＭ領域の直前までの領域内のエピトープに結合する。
【００３０】
ヒトＤＬＬ３において、上記のドメイン／領域は、以下のアミノ酸残基（例えば、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＮＹＪ７またはＷＯ２０１３／１２６７４６を参照）を有する：
細胞外ドメイン（ＥＣＤ）：１位〜４９２位のアミノ酸残基；
ＤＳＬドメイン：１７６位〜２１５位のアミノ酸残基；
ＥＧＦドメイン：２１６位〜４６５位のアミノ酸残基；
ＥＧＦ１領域：２１６位〜２４９位のアミノ酸残基；
ＥＧＦ２領域：２７４位〜３１０位のアミノ酸残基；
ＥＧＦ３領域：３１２位〜３５１位のアミノ酸残基；
ＥＧＦ４領域：３５３位〜３８９位のアミノ酸残基；
ＥＧＦ５領域：３９１位〜４２７位のアミノ酸残基；
ＥＧＦ６領域：４２９位〜４６５位のアミノ酸残基；
ＥＧＦ６からＴＭ領域の直前までの領域：４２９位〜４９２位のアミノ酸残基；
ＴＭ領域：４９３位〜５１３位のアミノ酸残基；および
Ｃ末端細胞内ドメイン：５１６位〜６１８位（または一部のアイソフォームでは、５１６位〜５８７位）のアミノ酸残基。上記のアミノ酸位置はまた、配列番号９に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸位置も指す。かくして、本発明の抗原結合分子または抗体は、ヒトＤＬＬ３中の上記位置のアミノ酸残基を有する上記領域／ドメインに結合することができる。すなわち、本発明の抗原結合分子または抗体は、ヒトＤＬＬ３中の上記位置のアミノ酸残基を有する上記領域／ドメイン内のエピトープに結合することができる。
【００３１】
一部の実施形態では、その特異性のため、本発明の抗原結合分子／抗体は、ヒトＤＬＬ３の上記領域／ドメイン、またはヒトＤＬＬ３の上記領域／ドメイン内のエピトープに特異的に結合しない。一部の実施形態では、本発明の分子／抗体は、ヒトＤＬＬ３中の上記位置のアミノ酸残基を有する上記領域／ドメインに特異的に結合しない。一部の実施形態では、本発明の分子／抗体は、ヒトＤＬＬ３中の上記位置のアミノ酸残基を有する上記領域／ドメイン内のエピトープに特異的に結合しない。これに関連して、「特異的に」は、「実質的に」と言い換えてもよい。
【００３２】
本明細書で使用される場合、語句「に特異的に結合する」とは、特異的結合を含む結合レベルで目的の抗原／領域／ドメイン／エピトープに結合する抗原結合分子／抗体の活性を指す。本明細書で使用される場合、語句「に特異的に結合する」とは、非特異的結合またはバックグラウンド結合を含むが、特異的結合を含まない結合レベルで、目的のものではない抗原／領域／ドメイン／エピトープに結合する抗原結合分子／抗体の活性を指す。特異性を、本明細書に記載の、または当分野で公知の任意の方法、例えば、本明細書に記載のエピトープマッピングまたは競合アッセイによって測定することができる。非特異的結合またはバックグラウンド結合の上記レベルは、０であってよいか、または０ではないが、０に近いものであってもよいか、または当業者が技術的に無視するのに十分な非常に低いものであってもよい。例えば、当業者が、好適な結合アッセイにおいて前記分子／抗体と、目的のものではない抗原／領域／ドメイン／エピトープとの結合に関する有意な、または相対的に強いシグナルを検出または観察できない場合、その分子／抗体は目的のものではない抗原／領域／ドメイン／エピトープ「に特異的に結合しない」ということができる。語句「に特異的に結合しない」は、当分野では、語句「に結合しない」と実質的に同じ意味を有することもある。
【００３３】
本発明において使用されるＤＬＬ３は、上記の配列を有するＤＬＬ３タンパク質であってよいか、または１つもしくは複数のアミノ酸の改変によって上記配列に由来する配列を有する改変タンパク質であってもよい。１つまたは複数のアミノ酸の改変によって上記配列に由来する配列を有する改変タンパク質の例は、上記アミノ酸配列との７０％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらにより好ましくは、９５％以上の同一性を有するポリペプチドを含んでもよい。あるいは、これらのＤＬＬ３タンパク質の部分ペプチドを使用することができる。
【００３４】
本発明において使用されるＤＬＬ３タンパク質は、その起源が限定されず、好ましくは、ヒトまたはカニクイザルＤＬＬ３タンパク質である。
【００３５】
一部の実施形態では、ＤＬＬ３タンパク質について、ＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質（またはＥＣＤバリアント）を使用することができる。トランケーションの部位に応じて、断片／バリアントは、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ＤＳＬドメインからＥＧＦ６まで、ＥＧＦ１からＥＧＦ６まで、ＥＧＦ２からＥＧＦ６まで、ＥＧＦ３からＥＧＦ６まで、ＥＧＦ４からＥＧＦ６まで、ＥＧＦ５およびＥＧＦ６、またはＥＧＦ６を含んでもよい。断片／バリアントは、ＥＧＦ６領域の直後から、ＴＭ領域の直前までに及ぶ領域をさらに含んでもよい。Ｆｌａｇタグを、当分野で周知の技術を使用して、断片／バリアントのＣ末端に結合することができる。
【００３６】
親和性
「親和性」とは、ある分子（例えば、抗原結合分子または抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との非共有的相互作用の総和の強度を指す。別途指摘しない限り、本明細書で使用される「結合親和性」とは、結合ペア（例えば、抗原結合分子と抗原、または抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性を、本明細書に記載のものを含む、当分野で公知の一般的方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特異的な実証的および例示的実施形態は、以下に記載される。
【００３７】
親和性を決定するための方法
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗原結合分子または抗体の抗原結合ドメインは、その抗原について１μＭ以下、１２０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、ＤＬＬ３に関する抗体／抗原結合分子の第１の抗原結合ドメインのＫｄ値は、１〜４０、１〜５０、１〜７０、１〜８０、３０〜５０、３０〜７０、３０〜８０、４０〜７０、４０〜８０、または６０〜８０ｎＭの範囲内にある。
【００３８】
一実施形態では、Ｋｄは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施形態では、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識抗原の滴定系列の存在下で、Ｆａｂと、最小濃度の（１２５Ｉ）標識化された抗原とを平衡化させた後、抗Ｆａｂ抗体でコーティングされたプレートを用いて結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５〜８８１頁（１９９９）を参照）。アッセイのための条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングした後、室温（約２３℃）で２〜５時間、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を、目的のＦａｂの連続希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３〜４５９９頁（１９９７）における、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一貫する）。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかしながら、インキュベーションは、平衡に達するのを確保するために、より長い期間（例えば、約６５時間）にわたって継続してもよい。その後、混合物を、室温でのインキュベーションのために捕捉プレートに移す（例えば、１時間にわたって）。次いで、溶液を除去し、ＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））でプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥した時、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上で１０分間、プレートを計測する。２０％未満またはそれと等しい最大結合を与えるそれぞれのＦａｂの濃度が、競合結合アッセイにおける使用のために選択される。
【００３９】
別の実施形態によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用するアッセイを、約１０応答単位（ＲＵ）の固相化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施する。一実施形態では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を達成するために、抗原を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８を用いて、５μＬ／分の流量での注入前に５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応の基をブロックする。反応速度論測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、約２５μＬ／ｍｉｎの流量で、２５℃にて０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に注入する。結合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を、結合および解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより、単純な１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比Ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５〜８８１頁（１９９９）を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイにより、結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、撹拌キュベットを備えた、ストップフローを装備した分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの、分光光度計中で測定された場合に、高濃度の抗原の存在下、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎＭ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定する蛍光クエンチング技術を使用することによって、結合速度を決定することができる。
【００４０】
抗体の抗原結合ドメインの親和性を測定するための方法は、上に記載されており、当業者であれば、他の抗原結合ドメインに関する親和性測定を実行することができる。
【００４１】
抗体
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含む様々な抗体構造を包含する。
【００４２】
ある態様では、本発明は、多重特異性抗原結合分子または抗体を提供する。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子は、
（１）ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメイン、および
（２）Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメイン
を含み、
（１）の第１の抗原結合ドメインは、ヒトＤＬＬ３中の配列番号７に定義される領域内のエピトープに結合する。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子中の、（１）の第１の抗原結合ドメインは、以下の（ａ１）〜（ａ１２）：
（ａ１）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ２）配列番号３３のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号３５のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ３）配列番号３９のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号４０のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号４１のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号４２のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号４３のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号４４のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ４）配列番号４５のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号４６のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号４７のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号４８のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号４９のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号５０のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ５）配列番号５１のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号５２のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号５３のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号５４のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５５のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号５６のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ６）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７５のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ７）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７６のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ８）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ９）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ１０）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号８１のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ａ１１）（ａ１）〜（ａ１０）から選択される抗体可変断片のいずれかの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ａ１２）（ａ１）〜（ａ１０）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つである。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子中の、（１）の第１の抗原結合ドメインは、以下の（ｂ１）〜（ｂ２１）：
（ｂ１）配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ２）配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ３）配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ４）配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ５）配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ６）配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ７）配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ８）配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ９）配列番号８５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号８５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号９３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号９３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号９３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１０）配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１１）配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１２）配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１３）配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１４）配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１５）配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１６）配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１７）配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１８）配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ１９）配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｂ２０）（ｂ１）〜（ｂ１９）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ｂ２１）（ｂ１）〜（ｂ１９）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つである。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子中の、（１）の第１の抗原結合ドメインは、以下の（ｃ１）〜（ｃ２２）：
（ｃ１）配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２）配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ３）配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ４）配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ５）配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ６）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ７）配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ８）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ９）配列番号８５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号９３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１０）配列番号６３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１１）配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１２）配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１３）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１４）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１５）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１６）配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１７）配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１８）配列番号７０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ１９）配列番号７１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２０）（ｃ１）〜（ｃ１９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｃ１）〜（ｃ１９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２１）（ｃ１）〜（ｃ１９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｃ１）〜（ｃ１９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｃ２２）（ｃ１）〜（ｃ１９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｃ１）〜（ｃ１９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する軽鎖可変領域
から選択される重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組合せのいずれか１つを含む。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子は、細胞傷害活性を有する。より具体的には、細胞傷害活性は、Ｔ細胞依存性細胞傷害活性（Ｔ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ））である。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子中の、（２）における第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３に結合する。より具体的には、一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子中の、（２）における第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖に結合する。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子中の、（２）における第２の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体に結合する。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子中の、（２）における第２の抗原結合ドメインは、以下の（ｄ１）〜（ｄ１２）：
（ｄ１）それぞれ、配列番号５７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号５８に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ２）それぞれ、配列番号９８に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号１０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ３）それぞれ、配列番号９９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号１０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ４）それぞれ、配列番号１００に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号１０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ５）それぞれ、配列番号１０１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号１０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ６）それぞれ、配列番号１０２に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号１０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ７）それぞれ、配列番号２９８に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号２９９に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ８）それぞれ、配列番号３００に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号３０１に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ９）それぞれ、配列番号３０２に含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、それぞれ、配列番号３０３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ１０）配列番号３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８および３９０から選択されるいずれか１つに含まれるＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２およびＨＶＲ−Ｈ３配列と、配列番号３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９および３９１から選択されるいずれか１つに含まれるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３配列とを含む抗体可変断片；
（ｄ１１）（ｄ１）〜（ｄ１０）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ｄ１２）（ｄ１）〜（ｄ１０）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つである。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子中の、（２）における第２の抗原結合ドメインは、以下の（ｅ１）〜（ｅ１２）：
（ｅ１）配列番号５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号５８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ２）配列番号９８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ３）配列番号９９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ４）配列番号１００のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ５）配列番号１０１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ６）配列番号１０２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ７）配列番号３００のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３０１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ８）配列番号３０２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３０３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ９）表２Ａ中のアミノ酸配列の組合せのいずれか１つを有する重鎖可変領域と軽鎖可変領域；
（ｅ１０）（ｅ１）〜（ｅ９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｅ１）〜（ｅ９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｅ１１）（ｅ１）〜（ｅ９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｅ１）〜（ｅ９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｅ１２）（ｅ１）〜（ｅ９）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｅ１）〜（ｅ９）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する軽鎖可変領域
のいずれか１つである。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子中の、（２）における第２の抗原結合ドメインは、以下の（ｊ１）〜（ｊ５）：
（ｊ１）配列番号１３６のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１３７のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１３８のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１３９のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１４０のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１４１のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｊ２）配列番号１４２のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１４３のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１４４のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１４５のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１４６のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１４７のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｊ３）表２Ｂ中の組合せのいずれかから選択されるＨＶＲ配列を含む抗体可変断片；
（ｊ４）（ｊ１）〜（ｊ３）から選択される抗体可変断片のいずれかの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ｊ５）（ｊ１）〜（ｊ３）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つである。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子は、
（３）Ｆｃガンマ受容体に対する結合活性が低下したＦｃ領域を含む第３のドメイン
をさらに含む。
一部の実施形態では、本発明は、
（１）ヒトＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインを含む第１のドメイン、
（２）Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のドメイン、および
（３）Ｆｃガンマ受容体に対する結合活性が低下したＦｃ領域を含む第３のドメイン
を含む多重特異性抗原結合分子を提供する。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子中の、Ｆｃ領域は、配列番号１１２〜１１５（ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４）のＦｃ領域を構成するアミノ酸のいずれかにアミノ酸変異を有するＦｃ領域である。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子中の、Ｆｃ領域は、ＥＵナンバリングによって特定される以下のアミノ酸位置：
２２０位、２２６位、２２９位、２３１位、２３２位、２３３位、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２４０位、２６４位、２６５位、２６６位、２６７位、２６９位、２７０位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３００位、３２５位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位、３３１位、および３３２位
から選択される少なくとも１個のアミノ酸の変異を有するＦｃ領域である。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗体である。
一部の実施形態では、二重特異性抗体は、モノクローナル抗体である。
好ましい実施形態では、上記の多重特異性抗原結合分子／二重特異性抗体／モノクローナル抗体は、ＤＬＬ３を発現する細胞に対するＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）活性を有する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、ヒトＤＬＬ３中の配列番号７に定義される領域内のエピトープに結合する抗原結合分子を提供する。
一部の実施形態では、抗原結合分子は、以下の（ｆ１）〜（ｆ１１）：
（ｆ１）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ２）配列番号３３のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号３４のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号３５のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ３）配列番号３９のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号４０のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号４１のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号４２のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号４３のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号４４のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ４）配列番号４５のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号４６のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号４７のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号４８のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号４９のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号５０のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ５）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７５のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ６）配列番号２７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７６のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３０のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３１のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３２のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ７）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７９のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ８）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号３８のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ９）配列番号７７のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７８のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号８０のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号３６のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号３７のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号８１のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｆ１０）（ｆ１）〜（ｆ９）から選択される抗体可変断片のいずれかの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ｆ１１）（ｆ１）〜（ｆ９）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つを含む抗原結合ドメインを含む。
一部の実施形態では、抗原結合分子は、以下の（ｇ１）〜（ｇ２０）：
（ｇ１）配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１６に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ２）配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２６に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ３）配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１９に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２０に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ４）配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ５）配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ６）配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ７）配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号１７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号１８に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ８）配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号２１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号２２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ９）配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６３に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１０）配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６４に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１１）配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６５に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７２に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１２）配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６６に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１３）配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１４）配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６７に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７４に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１５）配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６８に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１６）配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号６９に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１７）配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７０に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１８）配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ１配列、配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ２配列、配列番号７１に含まれるＨＶＲ−Ｈ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｈ３配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ１領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ２配列、および配列番号７３に含まれるＨＶＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列と同一のＨＶＲ−Ｌ３配列を含む抗体可変断片；
（ｇ１９）（ｇ１）〜（ｇ１８）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの同じエピトープに結合する抗体可変断片；
（ｇ２０）（ｇ１）〜（ｇ１８）から選択される抗体可変断片のいずれか１つの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか１つを含む抗原結合ドメインを含む。
一部の実施形態では、抗原結合分子は、以下の（ｈ１）〜（ｈ２１）：
（ｈ１）配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ２）配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ３）配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ４）配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ５）配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ６）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ７）配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ８）配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ９）配列番号６３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１０）配列番号６４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１１）配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１２）配列番号６６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１３）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１４）配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１５）配列番号６８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１６）配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１７）配列番号７０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１８）配列番号７１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
（ｈ１９）（ｈ１）〜（ｈ１８）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｈ１）〜（ｈ１８）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して８０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｈ２０）（ｈ１）〜（ｈ１８）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｈ１）〜（ｈ１８）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９０％を超える同一性を有する軽鎖可変領域；
（ｈ２１）（ｈ１）〜（ｈ１８）の重鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する重鎖可変領域と、（ｈ１）〜（ｈ１８）の軽鎖可変領域のいずれか１つに対して９５％を超える同一性を有する軽鎖可変領域
のいずれか１つを含む抗原結合ドメインを含む。
一部の実施形態では、抗原結合分子は、細胞傷害活性を有する。
一部の実施形態では、抗原結合分子における、細胞傷害活性は、抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害である。
一部の実施形態では、抗原結合分子は、内在化活性を有する。
一部の実施形態では、抗原結合分子は、毒性化合物にコンジュゲートされている。
一部の実施形態では、抗原結合分子は、抗体である。
一部の実施形態では、抗原結合分子は、モノクローナル抗体である。
一部の実施形態では、本発明は、抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート化合物を提供する。
【００４４】
抗体のクラス
抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの主要な抗体クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ型抗体である。
【００４５】
フレームワーク
「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的には、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は一般に、ＶＨ（またはＶＬ）中に以下の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００４６】
ヒトコンセンサスフレームワーク
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、選択されたヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列中に最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、それらの選択されたヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般的には、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１）、ｖｏｌｓ．１−３に記載されたようなサブグループである。一実施形態では、ＶＬについて、サブグループは、Ｋａｂａｔら、上掲に記載のようなサブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨについて、サブグループは、Ｋａｂａｔら、上掲に記載のようなサブグループＩＩＩである。
【００４７】
ＨＶＲ
本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」とは、配列において超可変性である（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）、および／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含有する、抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般に、抗体は、３個はＶＨ中に（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３個はＶＬ中に（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、６個のＨＶＲを含む。本明細書における例示的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、および９３〜１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５頁（１９９６））；ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、および９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組合せ
を含む。
別途指摘しない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、Ｋａｂａｔら、上掲に従ってナンバリングされる。
【００４８】
可変領域
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は、一般に、類似する構造を有し、それぞれのドメインは、４個の保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３個の超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、９１頁（２００７）を参照）。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分なものでありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体に由来するＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ、相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０〜８８７頁（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８頁（１９９１）を参照。
【００４９】
キメラ抗体
用語「キメラ」抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の供給源または種に由来するが、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が、異なる供給源または種に由来する抗体を指す。同様に、用語「キメラ抗体可変ドメイン」とは、重鎖および／または軽鎖可変領域の一部が、特定の供給源または種に由来するが、重鎖および／または軽鎖可変領域の残りの部分が、異なる供給源または種に由来する抗体可変領域を指す。
【００５０】
ヒト化抗体
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基と、ヒトＦＲに由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全部または実質的に全部が非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全部または実質的に全部がヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むであろう。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。「ヒト化型」の抗体、例えば、非ヒト抗体とは、ヒト化を受けた抗体を指す。「ヒト化抗体可変領域」とは、ヒト化抗体の可変領域を指す。
【００５１】
ヒト抗体
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト起源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。「ヒト抗体可変領域」とは、ヒト抗体の可変領域を指す。
【００５２】
所望の結合活性を有する抗体を製造する方法
所望の結合活性を有する抗体を製造する方法は、当業者には公知である。以下は、上記のＤＬＬ３に結合する抗体（抗ＤＬＬ３抗体）を製造する方法を記載する例である。Ｔ細胞受容体複合体などに結合する抗体を、以下に記載のように生産することもできる。
【００５３】
抗ＤＬＬ３抗体を、公知の方法を使用して、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。好ましく生産される抗ＤＬＬ３抗体は、哺乳動物に由来するモノクローナル抗体である。そのような哺乳動物由来モノクローナル抗体は、遺伝子工学技術によって抗体遺伝子を担持する発現ベクターで形質転換されたハイブリドーマまたは宿主細胞により産生される抗体を含む。
【００５４】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、例えば、以下に記載されるような公知の技術を使用して生成することができる。具体的には、哺乳動物を、感作抗原としてＤＬＬ３タンパク質を使用して従来の免疫化方法によって免疫化する。得られる免疫細胞を、従来の細胞融合方法により公知の親細胞と融合する。次いで、抗ＤＬＬ３抗体を産生するハイブリドーマを、従来のスクリーニング方法を使用するモノクローナル抗体産生細胞のスクリーニングによって選択することができる。
【００５５】
具体的には、モノクローナル抗体は、以下に記載されるように調製される。まず、ヌクレオチド配列がＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＭ＿０１６９４１．３またはＸＰ００５５８９２５３．１に開示されたＤＬＬ３遺伝子を発現させて、抗体調製のための感作抗原として使用されるＤＬＬ３タンパク質を生産することができる。あるいは、ＤＬＬ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするポリヌクレオチドを発現させて、ＤＬＬ３  ＥＣＤ含有タンパク質を生産することができる。すなわち、全長ＤＬＬ３またはＤＬＬ３  ＥＣＤをコードする遺伝子配列を、公知の発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞をこのベクターで形質転換する。所望の全長ＤＬＬ３またはＤＬＬ３  ＥＣＤタンパク質は、公知の方法によって宿主細胞またはその培養上清から精製される。あるいは、感作抗原として精製された天然のＤＬＬ３タンパク質を使用することができる。
精製された全長ＤＬＬ３またはＤＬＬ３  ＥＣＤタンパク質を、哺乳動物の免疫化における使用のための感作抗原として使用することができる。全長ＤＬＬ３またはＤＬＬ３  ＥＣＤの部分ペプチドを、感作抗原として使用することもできる。この事例では、部分ペプチドを、ＤＬＬ３アミノ酸配列からの化学的合成によって得ることもできる。さらに、それらを、ＤＬＬ３遺伝子の一部を発現ベクター中に組み込み、それを発現させることによって得ることもできる。さらに、それらを、プロテアーゼを使用してＤＬＬ３タンパク質を分解することによって得ることもできるが、部分ペプチドとして使用されるＤＬＬ３ペプチドの領域およびサイズは、特定の実施形態に特に限定されない。好ましい領域として、アミノ酸配列に由来する任意の配列を選択することができる。感作抗原として使用されるペプチドを構成するアミノ酸の数は、少なくとも５つ以上、または好ましくは、例えば、６つ以上、または７つ以上である。より具体的には、８〜５０個の残基または好ましくは、１０〜３０個の残基からなるペプチドを、感作抗原として使用することができる。
【００５６】
あるいは、感作抗原として、全長ＤＬＬ３またはＤＬＬ３  ＥＣＤタンパク質の所望の部分ポリペプチドまたはペプチドと、異なるポリペプチドとを融合することによって調製される融合タンパク質を使用することができる。例えば、抗体Ｆｃ断片およびペプチドタグが、感作抗原として使用される融合タンパク質を生産するために好ましく使用される。そのような融合タンパク質の発現のためのベクターを、２つ以上の所望のポリペプチド断片をコードする遺伝子を、インフレームで融合し、融合遺伝子を上記の発現ベクター中に挿入することによって構築することができる。融合タンパク質を製造する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、９．４７〜９．５８（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。感作抗原として使用されるＤＬＬ３を調製するための方法、およびＤＬＬ３を使用する免疫化方法も、後に本明細書の実施例に記載される。
【００５７】
感作抗原で免疫化される哺乳動物に関しては特に制限はない。しかしながら、細胞融合のために使用される親細胞との適合性を考慮することによって哺乳動物を選択することが好ましい。一般に、マウス、ラット、およびハムスター、ウサギなどの齧歯類、およびサルが好ましく使用される。
【００５８】
上記動物は、公知の方法によって感作抗原で免疫化される。一般に、実施される免疫化方法としては、例えば、感作抗原の哺乳動物への腹腔内または皮下注射が挙げられる。具体的には、感作抗原を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、生理食塩水などで適切に希釈する。必要に応じて、完全フロイントアジュバントなどの従来のアジュバントを、抗原と混合し、混合物を乳化する。次いで、感作抗原を、４〜２１日間隔で数回、哺乳動物に投与する。適切な担体を、感作抗原による免疫化において使用することができる。特に、感作抗原として低分子量の部分ペプチドを使用する場合、免疫化のために、感作抗原ペプチドを、アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンなどの担体タンパク質にカップリングさせることが望ましいことがある。
【００５９】
あるいは、所望の抗体を産生するハイブリドーマを、以下に記載されるＤＮＡ免疫化を使用して調製することができる。ＤＮＡ免疫化は、動物における抗原タンパク質をコードする遺伝子の発現を可能にするように構築されたベクターＤＮＡを投与する結果として免疫化された動物において感作抗原を発現させることによって免疫刺激を提供する免疫化方法である。タンパク質抗原が、免疫化される動物に投与される従来の免疫化方法と比較して、ＤＮＡ免疫化は、
−  ＤＬＬ３などの膜タンパク質の構造を保持しながら、免疫刺激を提供することができる；および
−  免疫化のために抗原を精製する必要がない、
といった点で優れていると期待される。
【００６０】
ＤＮＡ免疫化を使用して本発明のモノクローナル抗体を調製するために、まず、ＤＤＬ３タンパク質を発現するＤＮＡを、免疫化しようとする動物に投与する。ＤＬＬ３をコードするＤＮＡを、ＰＣＲなどの公知の方法によって合成することができる。得られるＤＮＡを、適切な発現ベクターに挿入した後、これを、免疫化しようとする動物に投与する。好ましく使用される発現ベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１などの市販の発現ベクターが挙げられる。ベクターを、従来の方法を使用して生物に投与することができる。例えば、ＤＮＡ免疫化を、免疫化しようとする動物の体内の細胞に発現ベクターでコーティングされた金粒子を導入するための遺伝子銃を使用することによって実施する。ＤＬＬ３を認識した抗体を、ＷＯ２０１１／０９３０９７に記載の方法によって生産することもできる。
【００６１】
上記の哺乳動物を免疫化した後、ＤＬＬ３結合抗体の力価の増加を、血清中で確認する。次いで、免疫細胞を哺乳動物から収集した後、細胞融合にかける。特に、脾細胞が、免疫細胞として好ましく使用される。
【００６２】
哺乳動物ミエローマ細胞を、上記免疫細胞と融合される細胞として使用する。ミエローマ細胞は、好ましくは、スクリーニングのための好適な選択マーカーを含む。選択マーカーは、特定の培養条件下でのその生存（または死滅）に関する特徴を細胞に付与する。ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以後、ＨＧＰＲＴ欠損と省略される）およびチミジンキナーゼ欠損（以後、ＴＫ欠損と省略される）が、選択マーカーとして公知である。ＨＧＰＲＴまたはＴＫ欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以後、ＨＡＴ感受性と省略される）を有する。ＨＡＴ感受性細胞は、ＨＡＴ選択培地中でＤＮＡを合成することができず、かくして殺傷される。しかしながら、細胞を正常細胞と融合した場合、それらは正常細胞のサルベージ経路を使用してＤＮＡ合成を継続することができ、したがって、それらはＨＡＴ選択培地中でも増殖することができる。
【００６３】
ＨＧＰＲＴ欠損およびＴＫ欠損細胞を、それぞれ、６−チオグアニン、８−アザグアニン（以後、８ＡＧと省略される）、または５’−ブロモデオキシウリジンを含有する培地中で選択することができる。正常細胞は、これらのピリミジンアナログをそのＤＮＡ中に組み込むため、殺傷される。一方、これらの酵素が欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを組み込むことができないため、選択培地中で生存することができる。さらに、ネオマイシン耐性遺伝子によって提供されるＧ４１８耐性と呼ばれる選択マーカーは、２−デオキシストレプトアミン抗生物質（ゲンタマイシンアナログ）に対する耐性を付与する。細胞融合にとって好適である様々な型のミエローマ細胞が公知である。
【００６４】
例えば、以下の細胞を含むミエローマ細胞を、好ましく使用することができる：
Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３（４）、１５４８〜１５５０頁）；
Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１、１〜７頁）；
ＮＳ−１（Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６（７）、５１１〜５１９頁）；
ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ（１９７６）８（３）、４０５〜４１５頁）；
ＳＰ２／０（Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６（５６８５）、２６９〜２７０頁）；
ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５（１−２）、１〜２１頁）；
Ｓ１９４／５．ＸＸＯ．ＢＵ．１（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８（１）、３１３〜３２３頁）；
Ｒ２１０（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７（５６９２）、１３１〜１３３頁）など。
【００６５】
免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、本質的には公知の方法、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３〜４６頁）による方法を使用して実行される。
より具体的には、細胞融合を、例えば、細胞融合促進剤の存在下、従来の培養培地中で実行することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびセンダイウイルス（ＨＶＪ）が挙げられる。必要に応じて、融合効率を改善するために、ジメチルスルホキシドなどの補助物質も添加する。
免疫細胞のミエローマ細胞に対する比を、当業者自身の裁量で決定してもよく、例えば、１〜１０個の免疫細胞ごとに１個のミエローマ細胞が好ましい。細胞融合のために使用される培養培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地およびＭＥＭ培地などの、ミエローマ細胞株の増殖にとって好適な培地、ならびにこの型の細胞培養のために使用される他の従来の培養培地が挙げられる。さらに、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）などの血清添加物を、培養培地に添加することが好ましい。
【００６６】
細胞融合のために、上記の免疫細胞およびミエローマ細胞の所定量を、上記の培養培地中でよく混合する。次いで、約３７℃に予め温めたＰＥＧ溶液（例えば、平均分子量が約１，０００〜６，０００である）を、一般的には、３０％〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度でそれに添加する。これを穏やかに混合して、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）を生成する。次いで、上記の適切な培養培地を徐々に細胞に添加し、これを繰り返し遠心分離して、上清を除去する。かくして、ハイブリドーマの増殖にとって好ましくない細胞融合剤などを除去することができる。
【００６７】
かくして得られたハイブリドーマを、従来の選択培地、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培養培地）を使用する培養によって選択することができる。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）を、十分な期間にわたって、上記のＨＡＴ培地中での培養を継続することによって殺傷することができる。典型的には、その期間は、数日から数週間である。次いで、所望の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、従来の限界希釈法によって単一にクローニングする。
【００６８】
かくして得られたハイブリドーマを、細胞融合に使用されるミエローマが有する選択マーカーに基づく選択培地を使用して選択することができる。例えば、ＨＧＰＲＴまたはＴＫ欠損細胞を、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培養培地）を使用する培養によって選択することができる。具体的には、ＨＡＴ感受性ミエローマ細胞を細胞融合のために使用する場合、正常細胞と上手く融合した細胞は、ＨＡＴ培地中で選択的に増殖することができる。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）を、十分な期間にわたって、上記のＨＡＴ培地中での培養を継続することによって殺傷することができる。具体的には、所望のハイブリドーマを、一般的には数日から数週間にわたる培養によって選択することができる。次いで、所望の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、従来の限界希釈法によって単一にクローニングする。
【００６９】
好ましくは、所望の抗体を、既知の抗原／抗体反応に基づくスクリーニング方法によって選択し、単一にクローニングすることができる。例えば、ＤＬＬ３結合モノクローナル抗体は、細胞表面上に発現されるＤＬＬ３に結合することができる。そのようなモノクローナル抗体を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってスクリーニングすることができる。ＦＡＣＳは、レーザー光線を使用して、蛍光抗体と接触させた細胞を分析すること、および個々の細胞から放出された蛍光を測定することによって、抗体の細胞表面への結合を評価するシステムである。
【００７０】
ＦＡＣＳにより本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするために、ＤＬＬ３発現細胞を最初に調製する。スクリーニングに好ましく使用される細胞は、ＤＬＬ３が強制的に発現される哺乳動物細胞である。対照として、細胞表面ＤＬＬ３に結合する抗体の活性を、宿主細胞として非形質転換哺乳動物細胞を使用して選択的に検出することができる。具体的には、抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ＤＬＬ３を強制的に発現する細胞には結合するが、宿主細胞には結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって単離することができる。
【００７１】
あるいは、固相化されたＤＬＬ３発現細胞に結合する抗体の活性を、ＥＬＩＳＡの原理に基づいて評価することができる。例えば、ＤＬＬ３発現細胞を、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに固相化する。ハイブリドーマの培養上清を、ウェル中の固相化された細胞と接触させ、固相化された細胞に結合する抗体を検出する。モノクローナル抗体がマウスに由来する場合、細胞に結合した抗体を、抗マウス免疫グロブリン抗体を使用して検出することができる。抗原結合能力を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを、上記のスクリーニングによって選択し、それらを限界希釈法などによってクローニングすることができる。
【００７２】
かくして調製されたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、従来の培養培地中で継代し、長期間にわたって液体窒素中で保存することができる。
【００７３】
上記のハイブリドーマを、従来の方法によって培養し、所望のモノクローナル抗体を、培養上清から調製することができる。あるいは、ハイブリドーマを適合する哺乳動物に投与し、そこで増殖させ、モノクローナル抗体を、腹水中で調製する。前者の方法は、高純度の抗体を調製するのに好適である。
【００７４】
好ましくは、上記ハイブリドーマなどの抗体産生細胞からクローニングされる抗体遺伝子によりコードされる抗体を使用することもできる。クローニングされた抗体遺伝子を、適切なベクター中に挿入し、これを宿主中に導入して、遺伝子によってコードされる抗体を発現させる。抗体遺伝子を単離し、遺伝子をベクターに挿入し、宿主細胞を形質転換するための方法は、例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２（３）、７６７〜７７５頁）によって既に確立されている。組換え抗体を製造する方法も、以下に記載の通り公知である。
【００７５】
好ましくは、本発明は、本発明の多重特異性抗原結合分子または単一特異性抗原結合分子をコードする核酸を提供する。本発明はまた、多重特異性抗原結合分子または単一特異性抗原結合分子をコードする核酸が導入されるベクター、すなわち、核酸を含むベクターも提供する。さらに、本発明は、核酸またはベクターを含む細胞を提供する。本発明はまた、細胞を培養することによって多重特異性抗原結合分子または単一特異性抗原結合分子を製造する方法も提供する。本発明はさらに、前記方法によって生産された多重特異性抗原結合分子または単一特異性抗原結合分子を提供する。
【００７６】
例えば、抗ＤＬＬ３抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡを、抗ＤＬＬ３抗体を発現するハイブリドーマ細胞から調製する。このために、全ＲＮＡを最初にハイブリドーマから抽出する。細胞からｍＲＮＡを抽出するために使用される方法としては、例えば、
−  グアニジン超遠心分離法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８（２４）、５２９４〜５２９９頁）、および
−  ＡＧＰＣ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２（１）、１５６〜１５９頁）
が挙げられる。
【００７７】
抽出されたｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ精製キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などを使用して精製することができる。あるいは、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ精製キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などの、細胞から直接的に全ｍＲＮＡを抽出するためのキットも市販されている。ｍＲＮＡを、そのようなキットを使用してハイブリドーマから調製することができる。抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡを、逆転写酵素を使用して、調製されたｍＲＮＡから合成することができる。ｃＤＮＡを、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｃｏ．）などを使用して合成することができる。さらに、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＰＣＲに基づく５’−ＲＡＣＥ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５（２３）、８９９８〜９００２頁；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７（８）、２９１９〜２９３２頁）を適切に使用して、ｃＤＮＡを合成し、増幅することができる。そのようなｃＤＮＡ合成プロセスにおいて、以下に記載される適切な制限酵素部位を、ｃＤＮＡの両末端に導入することができる。
【００７８】
目的のｃＤＮＡ断片を、得られたＰＣＲ産物から精製した後、これをベクターＤＮＡにライゲーションする。かくして、組換えベクターを構築し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などに導入する。コロニー選択の後、所望の組換えベクターを、コロニー形成大腸菌から調製することができる。次いで、組換えベクターが目的のｃＤＮＡヌクレオチド配列を有するかどうかを、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法などの公知の方法によって試験する。
【００７９】
可変領域遺伝子を増幅するためのプライマーを使用する５’−ＲＡＣＥ法が、可変領域をコードする遺伝子を単離するために都合よく使用される。まず、ハイブリドーマ細胞から抽出されたＲＮＡを鋳型として使用するｃＤＮＡ合成によって、５’−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡライブラリーを構築する。ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キットなどの市販のキットを適切に使用して、５’−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡライブラリーを合成する。
【００８０】
調製された５’−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用するＰＣＲによって、抗体遺伝子を増幅する。既知の抗体遺伝子配列に基づいて、マウス抗体遺伝子を増幅するためのプライマーを設計することができる。プライマーのヌクレオチド配列は、免疫グロブリンサブクラスに応じて変化する。したがって、Ｉｓｏ  Ｓｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）などの市販のキットを使用して、前もってサブクラスを決定することが好ましい。
【００８１】
具体的には、例えば、ガンマ１、ガンマ２ａ、ガンマ２ｂ、およびガンマ３重鎖ならびにカッパおよびラムダ軽鎖をコードする遺伝子の増幅を可能にするプライマーを使用して、マウスＩｇＧをコードする遺伝子を単離する。一般に、可変領域に近い定常領域部位にアニーリングするプライマーを、ＩｇＧ可変領域遺伝子を増幅するための３’側プライマーとして使用する。一方、５’ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡライブラリー構築キットに結合したプライマーを、５’側プライマーとして使用する。
【００８２】
かくして増幅されたＰＣＲ産物を使用して、重鎖と軽鎖の組合せから構成される免疫グロブリンを再形成させる。再形成された免疫グロブリンのＤＬ３結合活性を指標として使用して、所望の抗体を選択することができる。例えば、目的がＤＬＬ３に対する抗体を単離することである場合、抗体のＤＬＬ３への結合が特異的であることがより好ましい。ＤＬＬ３結合抗体を、例えば、以下のステップ：
（１）ＤＬＬ３発現細胞と、ハイブリドーマから単離されたｃＤＮＡによりコードされるＶ領域を含む抗体とを接触させるステップ；
（２）抗体の、ＤＬＬ３発現細胞への結合を検出するステップ；および
（３）ＤＬＬ３発現細胞に結合する抗体を選択するステップによってスクリーニングすることができる。
【００８３】
抗体のＤＬＬ３発現細胞への結合を検出するための方法が公知である。具体的には、抗体のＤＬＬ３発現細胞への結合を、ＦＡＣＳなどの上記の技術によって検出することができる。ＤＬＬ３発現細胞の固相化された試料を、適切に使用して、抗体の結合活性を評価する。
【００８４】
結合活性を指標として使用する好ましい抗体スクリーニング方法はまた、ファージベクターを使用するパンニング法を含む。ファージベクターを使用するスクリーニング方法は、抗体遺伝子がポリクローナル抗体を発現する細胞集団に由来する重鎖および軽鎖サブクラスライブラリーから単離される場合に有利である。重鎖および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を、適切なリンカー配列によって連結して、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。ｓｃＦｖを表面上に提示するファージを、ｓｃＦｖをコードする遺伝子をファージベクター中に挿入することによって生成することができる。ファージを、目的の抗原と接触させる。次いで、目的の結合活性を有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを、抗原に結合したファージを収集することによって単離することができる。このプロセスを、必要に応じて繰り返して、所望の結合活性を有するｓｃＦｖを濃縮することができる。
【００８５】
目的の抗ＤＬＬ３抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡを単離した後、ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの両末端に導入された制限部位を認識する制限酵素で消化する。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子のヌクレオチド配列中に低頻度で存在するヌクレオチド配列を認識し、切断するものである。さらに、好ましくは、付着末端をもたらす酵素の制限部位をベクター中に導入して、正確な向きで単一コピーの消化断片を挿入する。抗ＤＬＬ３抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡを上記のように消化し、これを適切な発現ベクター中に挿入して、抗体発現ベクターを構築する。この場合、抗体定常領域（Ｃ領域）をコードする遺伝子および上記のＶ領域をコードする遺伝子がインフレームで融合された場合、キメラ抗体が得られる。本明細書で、「キメラ抗体」は、定常領域の起源が可変領域のものと異なることを意味する。かくして、マウス／ヒト異種キメラ抗体に加えて、ヒト／ヒト同種キメラ抗体も、本発明のキメラ抗体に含まれる。上記のＶ領域遺伝子を、定常領域を既に有する発現ベクター中に挿入することによって、キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。具体的には、例えば、上記のＶ領域遺伝子を切り出す制限酵素の認識配列を、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを担持する発現ベクターの５’側に適切に置くことができる。キメラ抗体発現ベクターを、制限酵素の同じ組合せで消化された２つの遺伝子をインフレームで融合することによって構築する。
【００８６】
抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体を生産するために、抗体遺伝子を、遺伝子が発現調節領域の制御下で発現されるように、発現ベクター中に挿入する。抗体発現のための発現調節領域は、例えば、エンハンサーおよびプロモーターを含む。さらに、発現される抗体が細胞の外部に分泌されるように、適切なシグナル配列を、アミノ末端に結合させてもよい。一方、他の適切なシグナル配列を結合させることができる。発現されるポリペプチドは、上記配列のカルボキシル末端で切断され、得られるポリペプチドは、成熟ポリペプチドとして細胞の外部に分泌される。次いで、適切な宿主細胞を、発現ベクターで形質転換し、抗ＤＬＬ３抗体をコードするＤＮＡを発現する組換え細胞を得る。
【００８７】
抗体重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを、異なる発現ベクター中に別々に挿入して、抗体遺伝子を発現させる。ＨおよびＬ鎖を有する抗体分子を、同じ宿主細胞に、Ｈ鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子をそれぞれ挿入したベクターを同時にトランスフェクトすることによって発現させることができる。あるいは、宿主細胞を、ＨおよびＬ鎖をコードするＤＮＡを挿入した単一の発現ベクターで形質転換することができる（ＷＯ９４／１１５２３を参照）。
【００８８】
単離された抗体遺伝子を適切な宿主に導入することによる抗体調製のための様々な公知の宿主細胞／発現ベクターの組合せがある。これらの発現系は全て、本発明の抗体可変領域を含むドメインの単離に適用可能である。宿主細胞として使用される適切な真核細胞としては、動物細胞、植物細胞、および真菌細胞が挙げられる。具体的には、動物細胞は、例えば、以下の細胞を含む。
（１）哺乳動物細胞：ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏなど；
（２）両性類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など；および
（３）昆虫細胞：ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５など。
【００８９】
さらに、植物細胞として、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）などのタバコ属に由来する細胞を使用する抗体遺伝子発現系が公知である。カルス培養細胞を適切に使用して、植物細胞を形質転換することができる。
【００９０】
さらに、以下の細胞を真菌細胞として使用することができる：
酵母：サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属、およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピチア属；ならびに
糸状菌：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属。
【００９１】
さらに、原核細胞を利用する抗体遺伝子発現系も公知である。例えば、細菌細胞を使用する場合、大腸菌細胞、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞などを、本発明において好適に利用することができる。目的の抗体遺伝子を担持する発現ベクターを、トランスフェクションによってこれらの細胞に導入する。トランスフェクトされた細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、所望の抗体を、形質転換された細胞の培養物から調製することができる。
【００９２】
上記の宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を使用して、組換え抗体を生産することもできる。すなわち、目的の抗体をコードする遺伝子が導入された動物から、抗体を得ることができる。例えば、ミルク中に特異的に産生されるタンパク質をコードする遺伝子をインフレームで挿入することによって、融合遺伝子として抗体遺伝子を構築することができる。例えば、ヤギベータカゼインなどを、ミルク中に分泌されるタンパク質として使用することができる。抗体遺伝子と共に挿入された融合遺伝子を含有するＤＮＡ断片を、ヤギ胚に注入した後、この胚をメスのヤギに導入する。胚のレシピエントヤギ（またはその子孫）から生まれたトランスジェニックヤギによって産生されるミルクから、ミルクタンパク質と融合したタンパク質として、所望の抗体を得ることができる。さらに、トランスジェニックヤギによって産生される所望の抗体を含有するミルクの容量を増加させるために、必要に応じてトランスジェニックヤギにホルモンを投与してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２（７）、６９９〜７０２頁）。
【００９３】
ヒト化抗体を製造する方法
本明細書に記載の抗原結合分子をヒトに投与する場合、ヒトなどに対する異種抗原性を低下させるために人工的に改変された遺伝子組換え抗体に由来するドメインを、抗体可変領域を含む抗原結合分子のドメインとして適切に使用することができる。そのような遺伝子組換え抗体としては、例えば、ヒト化抗体が挙げられる。これらの改変抗体は、公知の方法によって適切に生産される。さらに、一般に、ある特定の抗体の結合特異性を、ＣＤＲ移植によって別の抗体に導入することができる。
【００９４】
具体的には、マウス抗体などの非ヒト動物抗体のＣＤＲ（または本明細書に定義される「ＨＶＲ」）を、ヒト抗体などに移植することによって調製されるヒト化抗体が公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子工学技術も公知である。具体的には、例えば、重複伸長ＰＣＲが、マウス抗体ＣＤＲをヒトＦＲに移植するための方法として公知である。重複伸長ＰＣＲでは、移植しようとするマウス抗体ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を、ヒト抗体ＦＲを合成するためのプライマーに付加する。プライマーは、４つのＦＲのそれぞれについて調製される。マウスＣＤＲをヒトＦＲに移植する場合、マウスＦＲに対して高い同一性を有するヒトＦＲの選択が、ＣＤＲ機能を維持するのに有利であると一般的に考えられる。すなわち、移植しようとするマウスＣＤＲに隣接するＦＲのアミノ酸配列に対して高い同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＦＲを使用することが一般に好ましい。
【００９５】
ライゲーションしようとするヌクレオチド配列は、それらが互いにインフレームに接続されるように設計される。ヒトＦＲを、それぞれのプライマーを使用して個別に合成する。結果として、マウスＣＤＲをコードするＤＮＡが個々のＦＲをコードするＤＮＡに結合した生成物が得られる。それぞれの生成物のマウスＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は、それらが互いに重複するように設計される。次いで、相補鎖合成反応を行って、ヒト抗体遺伝子を鋳型として使用して合成された生成物の重複ＣＤＲ領域をアニーリングさせる。ヒトＦＲを、この反応によってマウスＣＤＲ配列を介してライゲーションする。
【００９６】
３個のＣＤＲと４個ＦＲとが最終的にライゲーションされた全長Ｖ領域遺伝子を、好適な制限酵素認識配列と共に付加された、その５’または３’末端にアニーリングするプライマーを使用して増幅する。上記のように得られたＤＮＡおよびヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡを、それらがインフレームにライゲーションされるように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト化抗体の発現ベクターを生成することができる。組換えベクターを宿主にトランスフェクトして組換え細胞を確立した後、組換え細胞を培養し、ヒト化抗体をコードするＤＮＡを発現させて、細胞培養物中でヒト化抗体を産生させる（欧州特許出願公開第ＥＰ２３９４００号および国際特許出願公開第ＷＯ１９９６／００２５７６号を参照）。
【００９７】
上記のように生産されたヒト化抗体の抗原結合活性を定性的または定量的に測定および評価することによって、ＣＤＲが、ＣＤＲを介してライゲーションした場合に好ましい抗原結合部位を形成することができるヒト抗体ＦＲを好適に選択することができる。再形成されるヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、ＦＲ中のアミノ酸残基を、必要に応じて置換してもよい。例えば、マウスＣＤＲをヒトＦＲに移植するために使用されるＰＣＲ法を適用することによって、アミノ酸配列変異をＦＲ中に導入することができる。より具体的には、部分的ヌクレオチド配列変異を、ＦＲにアニーリングするプライマー中に導入することができる。ヌクレオチド配列変異は、そのようなプライマーを使用することによって合成されたＦＲ中に導入される。上記の方法によって、抗原に結合するアミノ酸置換された抗体変異体の活性を測定および評価することにより、望ましい特徴を有するＦＲ配列変異体を選択することができる（Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３：８５１〜８５６頁）。
【００９８】
ヒト抗体を製造する方法
あるいは、ヒト抗体遺伝子の全レパートリーを有するトランスジェニック動物を、ＤＮＡ免疫化によって免疫化することによって、所望のヒト抗体を得ることができる（ＷＯ１９９３／０１２２２７；ＷＯ１９９２／００３９１８；ＷＯ１９９４／００２６０２；ＷＯ１９９４／０２５５８５；ＷＯ１９９６／０３４０９６；ＷＯ１９９６／０３３７３５を参照）。
【００９９】
さらに、ヒト抗体ライブラリーを使用してパンニングすることによってヒト抗体を調製するための技術も公知である。例えば、ヒト抗体のＶ領域を、ファージディスプレイ法によってファージ表面上に単鎖抗体（ｓｃＦｖ）として発現させる。抗原に結合するｓｃＦｖを発現するファージを選択することができる。抗原に結合するヒト抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列を、選択されたファージの遺伝子を分析することによって決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列を決定する。Ｖ領域配列をインフレームに所望のヒト抗体のＣ領域配列と融合すること、およびこれを適切な発現ベクターに挿入することによって、発現ベクターを調製する。発現ベクターを、上記のものなどの発現にとって適切な細胞中に導入する。細胞中でヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることによって、ヒト抗体を生産することができる。これらの方法は既に公知である（ＷＯ１９９２／００１０４７；ＷＯ１９９２／０２０７９１；ＷＯ１９９３／００６２１３；ＷＯ１９９３／０１１２３６；ＷＯ１９９３／０１９１７２；ＷＯ１９９５／００１４３８；ＷＯ１９９５／０１５３８８を参照）。
【０１００】
ベクター
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、それが連結される別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクターならびにそれが導入された宿主細胞のゲノム中に組み込まれるベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【０１０１】
宿主細胞
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、初代形質転換細胞および継代回数に関係なく、それに由来する子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」を含む。子孫は、核酸含量において親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。元々形質転換された細胞中でスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫も、本明細書に含まれる。
【０１０２】
エピトープ
「エピトープ」は、抗原中の抗原決定基を意味し、本明細書に開示される抗原結合分子または抗体の抗原結合ドメインが結合する抗原部位を指す。かくして、例えば、エピトープは、その構造に従って定義することができる。あるいは、エピトープを、エピトープを認識する抗原結合分子または抗体の抗原結合活性に従って定義することができる。抗原がペプチドまたはポリペプチドである場合、エピトープを、エピトープを形成するアミノ酸残基によって特定することができる。あるいは、エピトープが糖鎖である場合、エピトープを、その特定の糖鎖構造によって特定することができる。
【０１０３】
線状エピトープは、一次アミノ酸配列が認識されるエピトープを含有するエピトープである。そのような線状エピトープは、その特定の配列中に、典型的には、少なくとも３個、最も一般的には、少なくとも５個、例えば、約８〜１０個または６〜２０個のアミノ酸を含有する。
【０１０４】
線状エピトープとは対照的に、「立体的エピトープ」は、エピトープを含有する一次アミノ酸配列が、認識されるエピトープの唯一の決定基ではないエピトープである（例えば、立体的エピトープの一次アミノ酸配列は、エピトープを定義する抗体によって必ずしも認識されない）。立体的エピトープは、線状エピトープと比較してより多数のアミノ酸を含有してもよい。立体的エピトープを認識する抗原結合ドメインは、ペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれ、三次元構造を形成する場合、立体的エピトープを形成するアミノ酸および／またはポリペプチド主鎖はアラインされるようになり、エピトープは抗原結合ドメインによって認識可能になる。エピトープコンフォメーションを決定するための方法としては、例えば、限定されるものではないが、Ｘ線結晶分析、二次元核磁気共鳴、部位特異的スピン標識、および電子常磁性共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）、Ｖｏｌ．６６、Ｍｏｒｒｉｓ（編）を参照。
【０１０５】
抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体によってエピトープ結合を評価するための方法の例を、以下に記載する。以下の例によれば、ＤＬＬ３以外の抗原のための抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体によってエピトープ結合を評価するための方法も、適切に行うことができる。
【０１０６】
例えば、抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体がＤＬＬ分子中の線状エピトープを認識するかどうかを、例えば、以下に記載されるように確認することができる。ＤＬＬ３の細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む線状ペプチドは、上記の目的のために合成される。ペプチドを化学的に合成するか、またはＤＬＬ３  ｃＤＮＡ中の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列をコードする領域を使用する遺伝子工学技術によって得ることができる。次いで、抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体を、細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む線状ペプチドに対するその結合活性について評価する。例えば、固相化された線状ペプチドを、ＥＬＩＳＡによる抗原として使用して、ペプチドに対するポリペプチド複合体の結合活性を評価することができる。あるいは、線状ペプチドに対する結合活性を、線状ペプチドが、抗原結合分子または抗体の、ＤＬＬ３発現細胞への結合を阻害するレベルに基づいて評価することができる。これらの試験は、線状ペプチドに対する抗原結合分子または抗体の結合活性を証明することができる。
【０１０７】
抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体が立体的エピトープを認識するかどうかを、以下のように評価することができる。ＤＬＬ３発現細胞は、上記の目的のために調製される。抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体を、立体的エピトープが接触時にＤＬＬ３発現細胞に強く結合し、ＤＬＬ３の細胞外ドメインを形成するアミノ酸配列を含む固相化された線状ペプチドに実質的に結合しない場合にそれを認識すると決定することができる。本明細書で、「実質的に結合しない」とは、ＤＬＬ３を発現する細胞に対する結合活性と比較して、結合活性が８０％以下、一般的には、５０％以下、好ましくは、３０％以下、特に、好ましくは１５％以下であることを意味する。
【０１０８】
ＤＬＬ３発現細胞に対する抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体の結合活性をアッセイするための方法としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）３５９〜４２０頁）に記載された方法が挙げられる。具体的には、ＤＬＬ３発現細胞を抗原として使用するＥＬＩＳＡまたは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の原理に基づいて、評価を実施することができる。
【０１０９】
ＥＬＩＳＡ形式では、ＤＬＬ３発現細胞に対する抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体の結合活性を、酵素反応により生成されるシグナルのレベルを比較することによって、定量的に評価することができる。具体的には、試験ポリペプチド複合体を、ＤＬＬ３発現細胞が固相化されたＥＬＩＳＡプレートに添加する。次いで、細胞に結合した試験抗原結合分子または抗体を、試験抗原結合分子または抗体を認識する酵素標識化された抗体を使用して検出する。あるいは、ＦＡＣＳを使用する場合、試験抗原結合分子または抗体の希釈系列を調製し、ＤＬＬ３発現細胞に関する抗体結合力価を決定して、ＤＬＬ３発現細胞に対する試験抗原結合分子または抗体の結合活性を比較することができる。
【０１１０】
緩衝液などに懸濁された細胞の表面上に発現される抗原に対する試験抗原結合分子または抗体の結合を、フローサイトメーターを使用して検出することができる。公知のフローサイトメーターとしては、例えば、以下の装置：
ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ  ＩＩ
ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭ
ＦＡＣＳＡｒｒａｙＴＭ
ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＴＭ  ＳＥ
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの商標名である）
ＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡ  ＨｙＰｅｒＳｏｒｔ
Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００
ＥＰＩＣＳ  ＸＬ−ＭＣＬ  ＡＤＣ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬ  ＡＤＣ
Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｑｕａｎｔａ／Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｑｕａｎｔａ  ＳＣ（全てＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒの商標名である）
が挙げられる。
【０１１１】
抗原に対する抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体の結合活性をアッセイするための好ましい方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。まず、ＤＬＬ３発現細胞を、試験抗原結合分子または抗体と反応させた後、これを、抗原結合分子または抗体を認識するＦＩＴＣ標識二次抗体で染色する。試験抗原結合分子または抗体を、好適な緩衝液で適切に希釈して、所望の濃度の抗原結合分子または抗体を調製する。例えば、抗原結合分子または抗体を、１０μｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で使用することができる。次いで、蛍光強度および細胞数を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を使用して決定する。ＣＥＬＬ  ＱＵＥＳＴ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）を使用する分析によって得られる蛍光強度、すなわち、幾何平均値は、細胞に結合した抗体の量を反映する。すなわち、結合した試験抗原結合分子または抗体の量によって表される、試験抗原結合分子または抗体の結合活性を、幾何平均値を測定することによって決定することができる。
【０１１２】
抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体が別の抗原結合分子または抗体と共通のエピトープを共有するかどうかを、同じエピトープについての２つの抗原結合分子または抗体の間の競合に基づいて評価することができる。抗原結合分子または抗体の間の競合を、交差ブロッキングアッセイなどによって検出することができる。例えば、競合的ＥＬＩＳＡアッセイが、好ましい交差ブロッキングアッセイである。
【０１１３】
具体的には、交差ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェルに固相化されたＤＬＬ３タンパク質を、候補競合剤抗原結合分子または抗体の存在下または非存在下で予備インキュベートした後、試験抗原結合分子または抗体をそれに添加する。ウェル中のＤＬＬ３タンパク質に結合した試験抗原結合分子または抗体の量は、同じエピトープへの結合について競合する候補競合剤抗原結合分子または抗体の結合能力と間接的に相関する。すなわち、同じエピトープに対する競合剤抗原結合分子または抗体の親和性が高いほど、ＤＬＬ３タンパク質でコーティングされたウェルに対する試験抗原結合分子または抗体の結合活性は低い。
【０１１４】
ＤＬＬ３タンパク質を介してウェルに結合した試験抗原結合分子または抗体の量を、前もって抗原結合分子または抗体を標識化することによって容易に決定することができる。例えば、ビオチン標識化された抗原結合分子または抗体を、アビジン／ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび適切な基質を使用して測定する。特に、ペルオキシダーゼなどの酵素標識を使用する交差ブロッキングアッセイは、「競合ＥＬＩＳＡアッセイ」と呼ばれる。抗原結合分子または抗体を、検出または測定を可能にする他の標識物質で標識化することもできる。具体的には、放射標識、蛍光標識などが公知である。
【０１１５】
候補競合剤抗原結合分子または抗体が、競合剤抗原結合分子または抗体の非存在下で行われる対照実験における結合活性と比較して、抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体による結合を少なくとも２０％、好ましくは、すくなくとも２０〜５０％、より好ましくは少なくとも５０％ブロックできる場合、試験抗原結合分子または抗体は、競合剤抗原結合分子もしくは抗体が結合した同じエピトープに実質的に結合する、または同じエピトープへの結合について競合すると決定される。
【０１１６】
抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインを含有する試験抗原結合分子または抗体が結合したエピトープの構造が既に同定されている場合、試験および対照の抗原結合分子または抗体が共通のエピトープを共有するかどうかを、アミノ酸変異を、エピトープを形成するペプチドに導入することによって調製されるペプチドに対する２つの抗原結合分子または抗体の結合活性を比較することによって評価することができる。
【０１１７】
上記の結合活性、例えば、変異が導入される線状ペプチドに対する試験および対照の抗原結合分子または抗体の結合活性を測定することを、上記のＥＬＩＳＡ形式で比較する。ＥＬＩＳＡ法の他に、試験および対照の抗原結合分子または抗体をカラムに流した後、溶出溶液中に溶出した抗原結合分子または抗体を定量することによって、カラムに結合したペプチド変異体に対する結合活性を決定することができる。例えば、ＧＳＴ融合ペプチドの形態で、ペプチド変異体をカラムに吸着させるための方法が公知である。
【０１１８】
あるいは、同定されたエピトープが立体的エピトープである場合、試験および対照の抗原結合分子または抗体が共通のエピトープを共有するかどうかを、以下の方法によって評価することができる。まず、ＤＬＬ３発現細胞およびエピトープに導入された変異を有するＤＬＬ３を発現する細胞を調製する。試験および対照の抗原結合分子または抗体を、ＰＢＳなどの適切な緩衝液中にこれらの細胞を懸濁することによって調製された細胞懸濁液に添加する。次いで、細胞懸濁液を、緩衝液で適切に洗浄し、試験および対照の抗原結合分子または抗体を認識するＦＩＴＣ標識抗体をそれに添加する。蛍光強度および標識化された抗体で染色された細胞数を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を使用して決定する。試験および対照の抗原結合分子または抗体を、好適な緩衝液を使用して適切に希釈し、所望の濃度で使用する。例えば、それらを、１０μｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で使用することができる。ＣＥＬＬ  ＱＵＥＳＴ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）を使用する分析によって決定される蛍光強度、すなわち、幾何平均値は、細胞に結合した標識抗体の量を反映する。すなわち、結合した標識抗体の量によって表される、試験および対照の抗原結合分子または抗体の結合活性を、幾何平均値を測定することによって決定することができる。
【０１１９】
上記方法では、抗原結合分子または抗体が「ＤＬＬ３変異体（またはＤＬＬ３バリアント）を発現する細胞に実質的に結合しない」かどうかを、例えば、以下の方法によって評価することができる。まず、ＤＬＬ３変異体を発現する細胞に結合した試験および対照の抗原結合分子または抗体を、標識抗体で染色する。次いで、細胞の蛍光強度を決定する。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒをフローサイトメトリーによる蛍光検出のために使用する場合、決定される蛍光強度を、ＣＥＬＬ  ＱＵＥＳＴ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析することができる。抗原結合分子または抗体の存在下および非存在下での幾何平均値から、比較値（デルタ幾何平均）を、以下の式に従って算出して、抗原結合分子または抗体による結合の結果としての蛍光強度の増大の比率を決定することができる。
【０１２０】
デルタ幾何平均＝幾何平均（抗原結合分子または抗体の存在下での）／幾何平均（抗原結合分子または抗体の非存在下での）。
【０１２１】
ＤＬＬ３変異体を発現する細胞に結合した試験抗原結合分子または抗体の量を反映する、上記の分析によって決定される幾何平均比較値（ＤＬＬ３変異体分子に関するデルタ幾何平均値）を、ＤＬＬ３発現細胞に結合した試験抗原結合分子または抗体の量を反映するデルタ幾何平均比較値と比較する。この場合、ＤＬＬ３発現細胞およびＤＬＬ３変異体を発現する細胞に関するデルタ幾何平均比較値を決定するために使用される試験抗原結合分子または抗体の濃度は、特に好ましくは、等しいか、または実質的に等しくなるように調整される。ＤＬＬ３中のエピトープを認識することが確認された抗原結合分子または抗体を、対照の抗原結合分子または抗体として使用する。
【０１２２】
ＤＬＬ３変異体を発現する細胞に関する試験抗原結合分子または抗体のデルタ幾何平均比較値が、ＤＬＬ３発現細胞に関する試験抗原結合分子または抗体のデルタ幾何平均比較値よりも、少なくとも８０％、好ましくは５０％、より好ましくは３０％、特に好ましくは１５％小さい場合、試験抗原結合分子または抗体は、「ＤＬＬ３変異体（またはＤＬＬ３バリアント）を発現する細胞に実質的に結合しない」。幾何平均値（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅａｎ）を決定するための式は、ＣＥＬＬ  ＱＵＥＳＴ  Ｓｏｆｔｗａｒｅのユーザーガイド（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に記載されている。比較が、比較値が実質的に等価であることを示す場合、試験および対照の抗原結合分子または抗体のエピトープを、同じであると決定することができる。
【０１２３】
同じエピトープに結合する抗体
参照抗体と「同じエピトープに結合する」抗原結合ドメインを含む抗原結合分子または抗体とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子または抗体を指し、逆に、参照抗体は競合アッセイにおいて抗原結合分子または抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする。交差ブロッキングアッセイなどの例示的な競合アッセイは、上で提供されている。
【０１２４】
特異性
「特異的」とは、１つまたは複数の結合パートナーに特異的に結合する分子が、パートナー以外の分子に有意な結合を示さないことを意味する。さらに、「特異的」はまた、抗原結合ドメインが抗原に含まれる複数のエピトープの特定のエピトープに特異的である場合にも使用される。抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異なる抗原中に含まれる場合、抗原結合ドメインを含有する抗原結合分子は、エピトープを有する様々な抗原に結合することができる。
【０１２５】
抗体断片
「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される単一特異性または多重特異性抗体が挙げられる。
【０１２６】
用語「全長抗体」、「インタクト抗体」および「全抗体」は、本明細書では互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似する構造を有する、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
【０１２７】
可変断片（Ｆｖ）
本明細書で、用語「可変断片（Ｆｖ）」とは、一対の抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とから構成される抗体由来抗原結合ドメインの最小単位を指す。１９８８年に、ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎは、細菌シグナル配列の下流に抗体遺伝子を挿入し、大腸菌中で遺伝子の発現を誘導することによって、大腸菌ペリプラズム画分から均一かつ活性な抗体を調製することができることを見出した（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０（４８５５）、１０３８〜１０４１頁）。ペリプラズム画分から調製されたＦｖ中で、ＶＨは、抗原に結合する様式でＶＬと会合する。本明細書で、用語「抗体可変断片」とは、少なくとも１個の軽鎖可変領域（ＶＬ）と、少なくとも１個の抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む任意の断片を指す。
【０１２８】
ｓｃＦｖ、単鎖抗体、およびｓｃ（Ｆｖ）２
本明細書で、用語「ｓｃＦｖ」、「単鎖抗体」、および「ｓｃ（Ｆｖ）２」は全て、重鎖および軽鎖に由来する可変領域を含有するが、定常領域は含有しない単一のポリペプチド鎖の抗体断片を指す。一般に、単鎖抗体はまた、抗原結合を可能にすると考えられる所望の構造の形成を可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーも含有する。単鎖抗体は、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｖｏｌ．１１３、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４）」中で、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎによって詳細に考察されている。また、国際特許出願公開第ＷＯ１９８８／００１６４９号；米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号も参照されたい。特定の実施形態では、単鎖抗体は、二重特異性であってもよい、および／またはヒト化されていてもよい。
【０１２９】
ｓｃＦｖは、Ｆｖを形成するＶＨおよびＶＬがペプチドリンカーによって一緒に連結された抗原結合ドメインである（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５（１６）、５８７９〜５８８３頁）。ＶＨおよびＶＬを、ペプチドリンカーによってごく近接して保持することができる。
【０１３０】
ｓｃ（Ｆｖ）２は、２個のＶＬと２個のＶＨの４個の可変領域が、ペプチドリンカーなどのリンカーによって連結されて、一本の鎖を形成する単鎖抗体である（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９９）２３１（１−２）、１７７〜１８９頁）。２個のＶＨと２個のＶＬは、異なるモノクローナル抗体に由来するものであってもよい。そのようなｓｃ（Ｆｖ）２は、好ましくは、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１５２（１１）、５３６８〜５３７４頁に開示された単一抗原中に存在する２個のエピトープを認識する二重特異性ｓｃ（Ｆｖ）２を含む。ｓｃ（Ｆｖ）２を、当業者には公知の方法によって生産することができる。例えば、ｓｃ（Ｆｖ）２を、ペプチドリンカーなどのリンカーによってｓｃＦｖを連結することによって生産することができる。
【０１３１】
本明細書で、ｓｃ（Ｆｖ）２を形成する抗原結合ドメインの形態は、２個のＶＨユニットと２個のＶＬユニットが、単鎖ポリペプチドのＮ末端から開始して、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨおよびＶＬの順序で配置される（［ＶＨ］−リンカー−［ＶＬ］−リンカー−［ＶＨ］−リンカー−［ＶＬ］）抗体を含む。２個のＶＨユニットと２個のＶＬユニットの順序は、上記の形態に限定されず、それらは任意の順序で配置されていてもよい。その形態の例は、以下に列挙される。
［ＶＬ］−リンカー−［ＶＨ］−リンカー−［ＶＨ］−リンカー−［ＶＬ］
［ＶＨ］−リンカー−［ＶＬ］−リンカー−［ＶＬ］−リンカー−［ＶＨ］
［ＶＨ］−リンカー−［ＶＨ］−リンカー−［ＶＬ］−リンカー−［ＶＬ］
［ＶＬ］−リンカー−［ＶＬ］−リンカー−［ＶＨ］−リンカー−［ＶＨ］
［ＶＬ］−リンカー−［ＶＨ］−リンカー−［ＶＬ］−リンカー−［ＶＨ］
【０１３２】
ｓｃ（Ｆｖ）２の分子形態は、ＷＯ２００６／１３２３５２にも詳細に記載されている。これらの説明によれば、当業者であれば、本明細書に開示されるポリペプチド複合体を生産するために所望のｓｃ（Ｆｖ）２を適切に調製することができる。
【０１３３】
さらに、本発明の抗原結合分子または抗体を、ＰＥＧなどの担体ポリマーまたは抗がん剤などの有機化合物とコンジュゲートすることができる。あるいは、糖鎖が所望の効果をもたらすように、糖鎖付加配列を抗原結合分子または抗体に挿入することが好ましい。
【０１３４】
抗体の可変領域を連結するのに使用されるリンカーは、遺伝子工学によって導入することができる任意のペプチドリンカー、合成リンカー、および例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９（３）、２９９〜３０５頁、１９９６に開示されたリンカーを含む。しかしながら、ペプチドリンカーが、本発明においては好ましい。ペプチドリンカーの長さは、特に限定されず、当業者であれば、目的に応じて好適に選択することができる。その長さは、好ましくは５アミノ酸以上（特に限定されないが、上限は一般的には３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下である）、特に好ましくは、１５アミノ酸である。ｓｃ（Ｆｖ）２が３個のペプチドリンカーを含有する場合、それらの長さは、全て同じであるか、または異なっていてもよい。
【０１３５】
例えば、そのようなペプチドリンカーとしては、
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ  Ｓｅｒ
Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ
Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  （配列番号１１６）
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （配列番号１１７）
Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  （配列番号１１８）
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （配列番号１１９）
Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  （配列番号１２０）
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （配列番号１２１）
Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  （配列番号１２２）
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （配列番号１２３）
（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  （配列番号１１８））ｎ
（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （配列番号１１９））ｎ
（式中、ｎは、１またはそれより大きい整数である）が挙げられる。当業者であれば、ペプチドリンカーの長さまたは配列を、目的に応じて選択することができる。
【０１３６】
合成リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドを架橋するために日常的に使用されており、その例としては、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、
スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、
スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）（ＢＳ３）、
ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＳＰ）、
ジチオビス（プロピオン酸スルホスクシンイミジル）（ＤＴＳＳＰ）、
エチレングリコールビス（コハク酸スクシンイミジル）（ＥＧＳ）、
エチレングリコールビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）（スルホ−ＥＧＳ）、
酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）、酒石酸ジスルホスクシンイミジル（スルホ−ＤＳＴ）、
ビス［２−（スクシンイミドキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、および
ビス［２−（スルホスクシンイミドキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）が挙げられる。これらの架橋剤は、市販されている。
【０１３７】
一般に、４個の抗体可変領域を一緒に連結するためには、３個のリンカーが必要である。使用されるリンカーは、同じ型または異なる型のものであってもよい。
【０１３８】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂ’
「Ｆａｂ」は、１個の軽鎖、ならびに１個の重鎖に由来するＣＨ１ドメインおよび可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【０１３９】
「Ｆ（ａｂ’）２」または「Ｆａｂ」は、免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を、ペプシンおよびパパインなどのプロテアーゼで処理することによって生成され、２個のＨ鎖のそれぞれにおけるヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近くで免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を消化することによって生成される抗体断片を指す。例えば、パパインは、２個のＨ鎖のそれぞれにおけるヒンジ領域の間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断して、ＶＬ（Ｌ鎖可変領域）およびＣＬ（Ｌ鎖定常領域）を含むＬ鎖が、それらのＣ末端領域のジスルフィド結合によりＶＨ（Ｈ鎖可変領域）およびＣＨガンマ１（Ｈ鎖定常領域中のガンマ１領域）を含むＨ鎖断片に連結された、２個の相同な抗体断片を生成する。これらの２個の相同な抗体断片はそれぞれ、Ｆａｂ’と呼ばれる。
【０１４０】
「Ｆ（ａｂ’）２」は、ＣＨ１ドメインの定常領域およびＣＨ２ドメインの一部を含む２個の軽鎖および２個の重鎖からなり、ジスルフィド結合が２個の重鎖間で形成される。本明細書に開示されるＦ（ａｂ’）２は、好ましくは、以下のように生成することができる。所望の抗原結合ドメインを含む全モノクローナル抗体などを、ペプシンなどのプロテアーゼで部分的に消化し、Ｆｃ断片を、プロテインＡカラム上への吸着によって除去する。プロテアーゼは、それがｐＨなどの適切に設定された酵素反応条件下でＦ（ａｂ’）２を生成する選択的様式で全抗体を切断することができる限り、特に限定されない。そのようなプロテアーゼとしては、例えば、ペプシンおよびフィシンが挙げられる。
【０１４１】
Ｆｃ領域
本明細書における用語「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列のＦｃ領域およびＦｃ領域バリアントを含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に向かって伸びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）またはグリシン−リシン（残基４４６〜４４７）は、存在しても、しなくてもよい。本明細書で別途特定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、ＥＵナンバリングシステムによるものであり、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されたように、ＥＵインデックスとも呼ばれる。
【０１４２】
天然配列Ｆｃ領域
「天然配列Ｆｃ領域」は、自然において見つかるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域；および天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ならびに天然に存在するそのバリアントを含む。
【０１４３】
バリアントＦｃ領域
「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１個のアミノ酸改変、好ましくは、１個または複数のアミノ酸置換により天然配列Ｆｃ領域のものと異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域内に約１〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域との少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは、それとの少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは、それとの少なくとも約９５％の配列同一性を有するであろう。
【０１４４】
Ｆｃ受容体
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。一部の実施形態では、ＦｃＲは、天然ヒトＦｃＲである。一部の実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩ、およびＦｃガンマＲＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられ、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的にスプライスされた形態を含む。ＦｃガンマＲＩＩ受容体は、主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似するアミノ酸配列を有する、ＦｃガンマＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃガンマＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体であるＦｃガンマＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体であるＦｃガンマＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（例えば、Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３〜２３４頁（１９９７）を参照）。ＦｃＲは、例えば、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜９２頁（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４頁（１９９４）；ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１頁（１９９５）に総説されている。将来同定されるものを含む、他のＦｃＲも、本明細書の用語「ＦｃＲ」によって包含される。
【０１４５】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、新生児受容体、ＦｃＲｎも含み、これは、母体ＩｇＧの胎児への移動（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７頁（１９７６）；およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９頁（１９９４））および免疫グロブリンの恒常性の調節を担う。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は公知である（例えば、ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８（１２）：５９２〜５９８頁（１９９７）；Ｇｈｅｔｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５（７）：６３７〜６４０頁（１９９７）；Ｈｉｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３〜６２１６頁（２００４）；ＷＯ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎら）を参照）。
【０１４６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＦｃＲｎへの結合およびヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血漿半減期を、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトされたヒト細胞株において、またはバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドが投与される霊長類においてアッセイすることができる。ＷＯ２０００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲへの結合が増加または減少した抗体バリアントを記載している。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４頁（２００１）も参照。
【０１４７】
Ｆｃガンマ受容体
Ｆｃガンマ受容体とは、モノクローナルＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のＦｃドメインに結合することができる受容体を指し、Ｆｃガンマ受容体遺伝子により実質的にコードされるタンパク質のファミリーに属する全てのメンバーを含む。ヒトにおいては、このファミリーは、アイソフォームＦｃガンマＲＩａ、ＦｃガンマＲＩｂおよびＦｃガンマＲＩｃを含むＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃガンマＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃガンマＲＩＩｂ（ＦｃガンマＲＩＩｂ−１およびＦｃガンマＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃガンマＲＩＩｃを含むＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）；およびアイソフォームＦｃガンマＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃガンマＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃガンマＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃガンマＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）；ならびに全ての未同定のヒトＦｃガンマ受容体、Ｆｃガンマ受容体アイソフォーム、およびそのアロタイプを含む。しかしながら、Ｆｃガンマ受容体は、これらの例に限定されない。それに限定されるものではないが、Ｆｃガンマ受容体としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルに由来するものが挙げられる。Ｆｃガンマ受容体は、任意の生物に由来するものであってよい。マウスＦｃガンマ受容体としては、限定されるものではないが、ＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃガンマＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに全ての未同定のマウスＦｃガンマ受容体、Ｆｃガンマ受容体アイソフォーム、およびそのアロタイプが挙げられる。そのような好ましいＦｃガンマ受容体としては、例えば、ヒトＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃガンマＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃガンマＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）、および／またはＦｃガンマＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６）が挙げられる。ＦｃガンマＲＩのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＭ＿０００５６６．３（配列番号１２４）およびＮＰ＿０００５５７．１（配列番号１２５）に示される；ＦｃガンマＲＩＩＡのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＢＣ０２０８２３．１（配列番号１２６）およびＡＡＨ２０８２３．１（配列番号１２７）に示される；ＦｃガンマＲＩＩＢのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＢＣ１４６６７８．１（配列番号１２８）およびＡＡＩ４６６７９．１（配列番号１２９）に示される；ＦｃガンマＲＩＩＩＡのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＢＣ０３３６７８．１（配列番号１３０）およびＡＡＨ３３６７８．１（配列番号１３１）に示される；ならびにＦｃガンマＲＩＩＩＢのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＢＣ１２８５６２．１（配列番号１３２）およびＡＡＩ２８５６３．１（配列番号１３３）に示される（ＲｅｆＳｅｑ受託番号）。Ｆｃガンマ受容体がモノクローナルＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のＦｃドメインに対する結合活性を有するかどうかを、上記のＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡ形式に加えて、ＡＬＰＨＡスクリーン（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくＢＩＡＣＯＲＥ法、その他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００６）１０３（１１）、４００５〜４０１０頁）によって評価することができる。
【０１４８】
一方、「Ｆｃリガンド」または「エフェクターリガンド」とは、抗体Ｆｃドメインに結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する分子、好ましくは、ポリペプチドを指す。その分子は、任意の生物に由来するものであってよい。ＦｃリガンドのＦｃへの結合は、好ましくは、１つまたは複数のエフェクター機能を誘導する。そのようなＦｃリガンドとしては、限定されるものではないが、Ｆｃ受容体、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、Ｆｃベータ受容体、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、およびＣ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、スタフィロコッカスプロテインＡ、スタフィロコッカスプロテインＧ、およびウイルスＦｃガンマ受容体が挙げられる。Ｆｃリガンドはまた、Ｆｃガンマ受容体と相同なＦｃ受容体のファミリーである、Ｆｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）（Ｄａｖｉｓら（２００２）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９０、１２３〜１３６頁）も含む。Ｆｃリガンドはまた、Ｆｃに結合する未同定の分子も含む。
【０１４９】
Ｆｃガンマ受容体結合活性
Ｆｃドメインの、Ｆｃガンマ受容体であるＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩＡ、ＦｃガンマＲＩＩＢ、ＦｃガンマＲＩＩＩＡ、および／またはＦｃガンマＲＩＩＩＢのいずれかへの結合活性の低下を、上記のＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡ形式ならびにＡＬＰＨＡスクリーン（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ）および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくＢＩＡＣＯＲＥ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００６）１０３（１１）、４００５〜４０１０頁）を使用することによって評価することができる。一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子または抗体は、Ｆｃガンマ受容体に対する結合活性が低下したＦｃ領域を含むドメインを含む。
【０１５０】
ＡＬＰＨＡスクリーンは、２つの型のビーズ：ドナービーズおよびアクセプタービーズを使用して、以下に記載される原理に基づくＡＬＰＨＡ技術によって実施される。発光シグナルは、ドナービーズに連結された分子が、アクセプタービーズに連結された分子と生物学的に相互作用する場合および２つのビーズがごく接近して位置する場合にのみ検出される。ドナービーズ中の光増感剤は、レーザー光線によって励起されると、ビーズ周囲の酸素を、励起された一重項酸素に変換する。一重項酸素がドナービーズの周囲に拡散し、ごく接近して位置するアクセプタービーズに到達する場合、アクセプタービーズ内の化学発光反応が誘導される。この反応は、最終的には光放出をもたらす。ドナービーズに連結された分子が、アクセプタービーズに連結された分子と相互作用しない場合、ドナービーズによって生成された一重項酸素は、アクセプタービーズに到達せず、化学発光反応は起こらない。
【０１５１】
例えば、ビオチン標識化された抗原結合分子または抗体はドナービーズに固相化され、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付Ｆｃガンマ受容体はアクセプタービーズに固相化される。競合的変異体Ｆｃドメインを含む抗原結合分子または抗体の非存在下では、Ｆｃガンマ受容体は、野生型Ｆｃドメインを含む抗原結合分子または抗体と相互作用し、結果として、５２０〜６２０ｎｍのシグナルを誘導する。非タグ付変異体Ｆｃドメインを有する抗原結合分子または抗体は、Ｆｃガンマ受容体との相互作用に関して野生型Ｆｃドメインを含む抗原結合分子または抗体と競合する。競合の結果としての蛍光の減少を定量することによって、相対的結合親和性を決定することができる。スルホ−ＮＨＳ−ビオチンなどを使用する抗体などの、抗原結合分子または抗体をビオチン化するための方法は公知である。ＧＳＴタグをＦｃガンマ受容体に付加するための適切な方法としては、Ｆｃガンマ受容体およびＧＳＴをコードするポリペプチドをインフレームに融合すること、融合遺伝子を担持するベクターを用いて導入される細胞を使用して、該遺伝子を発現させること、次いで、グルタチオンカラムを使用して精製することを含む方法が挙げられる。好ましくは、誘導されたシグナルを、例えば、ＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）などのソフトウェアを使用する非線形回帰分析に基づく１部位競合モデルに適合させることによって分析することができる。
【０１５２】
それらの相互作用を観察するための物質の１つを、センサーチップの金薄層上にリガンドとして固相化する。金薄層とガラスとの境界面で全反射が起こるように、センサーチップの裏面に光が当てられた時、反射光の強度は、ある特定の部位で部分的に減少する（ＳＰＲシグナル）。それらの相互作用を観察するための他の物質を、センサーチップの表面上に分析物として注入する。分析物がリガンドに結合する場合、固相化されたリガンド分子の質量は増大する。これは、センサーチップの表面上での溶媒の屈折率を変化させる。屈折率の変化は、ＳＰＲシグナルの位置シフトを引き起こす（逆に、解離は、シグナルを元の位置にシフトさせる）。Ｂｉａｃｏｒｅシステムでは、上記のシフト（すなわち、センサーチップ表面上の質量の変化）の量を、垂直軸にプロットし、かくして、経時的な質量の変化を、測定データとして示す（センサーグラム）。反応速度パラメータ（結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ））を、センサーグラムの曲線から決定し、親和性（ＫＤ）を、これらの２つの定数間の比から決定する。阻害アッセイは、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥ法において使用される。そのような阻害アッセイの例は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００６）１０３（１１）、４００５〜４０１０頁に記載されている。
【０１５３】
機能性Ｆｃ領域
「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節などが挙げられる。そのようなエフェクター機能には、一般的には、Ｆｃ領域を結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせる必要があり、例えば、本明細書の定義に開示されたような様々なアッセイを使用して評価することができる。一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子または抗体は、エフェクター機能を有する機能性Ｆｃ領域を含むドメインを含む。
【０１５４】
「エフェクター機能」とは、抗体アイソタイプと共に変化する、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；およびＢ細胞活性化が挙げられる。
【０１５５】
ヒトエフェクター細胞
「ヒトエフェクター細胞」とは、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球を指す。ある特定の実施形態では、細胞は、少なくともＦｃガンマＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球が挙げられる。エフェクター細胞を、天然の供給源、例えば、血液から単離することができる。
【０１５６】
Ｆｃガンマ受容体結合活性が低下したＦｃ領域
本明細書では、「Ｆｃガンマ受容体結合活性が低下した」とは、例えば、上記の分析方法に基づいて、試験抗原結合分子または抗体の競合活性が、対照抗原結合分子または抗体の競合活性の５０％以下、好ましくは、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２０％以下、または１５％以下、特に好ましくは、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下であることを意味する。
【０１５７】
モノクローナルＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のＦｃドメインを含む抗原結合分子または抗体を、対照抗原結合分子または抗体として適切に使用することができる。Ｆｃドメイン構造は、配列番号１１２（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＡＡＣ８２５２７．１のＮ末端にＡが付加される）、配列番号１１３（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＡＡＢ５９３９３．１のＮ末端にＡが付加される）、配列番号１１４（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＣＡＡ２７２６８．１のＮ末端にＡが付加される）、および配列番号１１５（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＡＡＢ５９３９４．１のＮ末端にＡが付加される）に示される。さらに、特定のアイソタイプの抗体の抗体のＦｃドメイン変異体を含む抗原結合分子または抗体を試験物質として使用する場合、Ｆｃガンマ受容体結合活性に対する変異体の変異の効果を、同じアイソタイプのＦｃドメインを含む抗原結合分子または抗体を対照として使用して評価する。上記のように、Ｆｃガンマ受容体結合活性が低下していると判定されたＦｃドメイン変異体を含む抗原結合分子または抗体が適切に調製される。
【０１５８】
そのような公知の変異体としては、例えば、アミノ酸２３１Ａ〜２３８Ｓ（ＥＵナンバリング）の欠失を有する変異体（ＷＯ２００９／０１１９４１）、ならびに変異体Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ、（Ｃ２２０Ｓ）（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ（２００７）３４、１１頁）；Ｃ２２６ＳおよびＣ２２９Ｓ（Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９９０）１（１）、４７〜５４頁）；Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、およびＬ２３５Ａ（Ｂｌｏｏｄ（２００７）１０９、１１８５〜１１９２頁）が挙げられる。
【０１５９】
具体的には、特定のアイソタイプの抗体のＦｃドメインを形成するアミノ酸中で、好ましい抗原結合分子または抗体としては、以下のアミノ酸位置：２２０、２２６、２２９、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２７０、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、または３３２（ＥＵナンバリング）から選択される少なくとも１個のアミノ酸の変異（置換など）を有するＦｃドメインを含むものが挙げられる。Ｆｃドメインが起源とする抗体のアイソタイプは特に限定されず、モノクローナルＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体に由来する適切なＦｃドメインを使用することができる。ＩｇＧ１抗体に由来するＦｃドメインを使用することが好ましい。
【０１６０】
好ましい抗原結合分子または抗体としては、例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃドメインを形成するアミノ酸中で、位置がＥＵナンバリングに従って特定される（それぞれの数字は、ＥＵナンバリングにおけるアミノ酸残基の位置を表し、数字の前の１文字のアミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表すが、数字の後の１文字のアミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す）、以下に示される置換：
（ａ）Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ；
（ｂ）Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ；
（ｃ）Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ；または
（ｄ）Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ
のいずれか１つを有するＦｃドメインを含むもの；ならびに２３１位〜２３８位にアミノ酸配列の欠失を有するＦｃドメインを有するものが挙げられる。
【０１６１】
さらに、好ましい抗原結合分子または抗体としては、ＩｇＧ２抗体のＦｃドメインを形成するアミノ酸中で、位置がＥＵナンバリングに従って特定される、以下に示される置換：
（ｅ）Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ；
（ｆ）Ｖ２３４Ａ；
（ｇ）Ｇ２３７Ａ；
（ｈ）Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ；
（ｉ）Ａ２３５ＥおよびＧ２３７Ａ；または
（ｊ）Ｖ２３４Ａ、Ａ２３５Ｅ、およびＧ２３７Ａ
のいずれか１つを有するＦｃドメインを含むものも挙げられる。それぞれの数字はＥＵナンバリングにおけるアミノ酸残基の位置を表し、数字の前の１文字のアミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表すが、数字の後の１文字のアミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
【０１６２】
さらに、好ましい抗原結合分子または抗体としては、ＩｇＧ３抗体のＦｃドメインを形成するアミノ酸中で、位置がＥＵナンバリングに従って特定される、以下に示される置換：
（ｋ）Ｆ２４１Ａ；
（ｌ）Ｄ２６５Ａ；または
（ｍ）Ｖ２６４Ａ
のいずれか１つを有するＦｃドメインを含むものも挙げられる。それぞれの数字はＥＵナンバリングにおけるアミノ酸残基の位置を表し、数字の前の１文字のアミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表すが、数字の後の１文字のアミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
【０１６３】
さらに、好ましい抗原結合分子または抗体としては、ＩｇＧ４抗体のＦｃドメインを形成するアミノ酸中で、位置がＥＵナンバリングに従って特定される、以下に示される置換：
（ｎ）Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、およびＥ３１８Ａ；
（ｏ）Ｌ２３５Ｅ；または
（ｐ）Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ
のいずれか１つを有するＦｃドメインを含むものも挙げられる。それぞれの数字はＥＵナンバリングにおけるアミノ酸残基の位置を表し、数字の前の１文字のアミノ酸記号は置換前のアミノ酸残基を表すが、数字の後の１文字のアミノ酸記号は置換後のアミノ酸残基を表す。
【０１６４】
他の好ましい抗原結合分子または抗体としては、例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃドメインを形成するアミノ酸中の２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、３２７、３３０、または３３１位（ＥＵナンバリング）の任意のアミノ酸が、対応するＩｇＧ２またはＩｇＧ４中のＥＵナンバリングにおける対応する位置のアミノ酸で置換された、Ｆｃドメインを含むものが挙げられる。
【０１６５】
好ましい抗原結合分子または抗体としては、例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃドメインを形成するアミノ酸中の２３４、２３５、および２９７位（ＥＵナンバリング）のアミノ酸のいずれか１つまたは複数が、他のアミノ酸で置換された、Ｆｃドメインを含むものも挙げられる。置換後のアミノ酸の型は特に限定されないが、２３４、２３５、および２９７位のアミノ酸のいずれか１つまたは複数がアラニンで置換された、Ｆｃドメインを含む抗原結合分子または抗体が特に好ましい。
【０１６６】
好ましい抗原結合分子または抗体としては、例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃドメインを形成するアミノ酸中のおよび２６５位（ＥＵナンバリング）のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、Ｆｃドメインを含むものも挙げられる。置換後のアミノ酸の型は特に限定されないが、２６５位のアミノ酸がアラニンで置換された、Ｆｃドメインを含む抗原結合分子または抗体が特に好ましい。
【０１６７】
ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメイン
本明細書で使用される場合、語句「ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメイン」または「抗ＤＬＬ３抗原結合ドメイン」とは、上記のＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合する抗原結合ドメイン、またはＤＬＬ３タンパク質の部分ペプチドの全部もしくは一部を指す。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）を含むドメインである。抗体軽鎖および重鎖可変領域を含むそのようなドメインの好適な例としては、「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」、「単鎖抗体」、「Ｆｖ」、「単鎖Ｆｖ２（ｓｃＦｖ２）」、「Ｆａｂ」、「Ｆ（ａｂ’）２」などが挙げられる。特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインは、抗体可変断片を含むドメインである。抗体可変断片を含むドメインを、１つまたは複数の抗体の可変ドメインから提供することができる。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインは、抗ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂ構造を含むドメインである。
【０１７０】
好ましくは、抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、配列番号１５、配列番号２５、および配列番号６３〜７１のいずれか１つの重鎖可変領域と、配列番号１６、配列番号２６、および配列番号７２〜７４のいずれか１つの軽鎖可変領域とを含む。
【０１７１】
一部の実施形態では、抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、ＤＬＬ３の細胞外ドメインに特異的に結合する。一部の実施形態では、抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、ＤＬＬ３の細胞外ドメイン内のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、真核細胞の表面上に発現されるＤＬＬ３タンパク質に結合する。一部の実施形態では、抗ＤＬＬ３抗原結合ドメインは、がん細胞の表面上に発現されるＤＬＬ３タンパク質に結合する。
【０１７２】
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインは、以下の表１Ａおよび表１Ｂに示される抗体可変／定常領域配列のいずれか１つを含む。
【０１７３】
表１Ａは、生成された抗ＤＬＬ３抗体の配列番号を示す。
【０１７４】
【表１Ａ】
2021509403.tif 000002
【０１７５】
表１Ｂは、生成された抗ＤＬＬ３抗体のＨＶＲ（ＣＤＲ）配列の配列番号を示す。
【０１７６】
【表１Ｂ】
2021509403.tif 000003
【０１７７】
特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインは、表１Ａに示された抗体可変領域のいずれか１つと、ＤＬＬ３への結合について競合する、または表１Ａに示された抗体可変領域のＨＶＲ領域と同一のＨＶＲ配列を含む任意の抗体可変断片と、ＤＬＬ３への結合について競合する、または表１Ｂに示されたものと同一のＨＶＲ配列を含む任意の抗体可変断片と、ＤＬＬ３への結合について競合する、抗体可変断片を含むドメインである。特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインは、表１Ａに示された抗体可変領域のいずれか１つと同じＤＬＬ３内のエピトープに結合する、または表１Ａに示された抗体可変領域のＨＶＲ領域と同一のＨＶＲ配列を含む任意の抗体可変断片と同じＤＬＬ３内のエピトープに結合する、または表１Ｂに示されたものと同一のＨＶＲ配列を含む任意の抗体可変断片と同じＤＬＬ３内のエピトープに結合する、抗体可変断片を含むドメインである。
【０１７８】
あるいは、ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインは、上記の抗体可変断片のいずれか１つと、ＤＬＬ３への結合について競合する抗体可変断片を含む。あるいは、ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインは、上記の抗体可変断片のいずれか１つがＤＬＬ３上において結合するのと同じエピトープに結合する抗体可変断片を含む。
【０１７９】
Ｔ細胞受容体複合体に結合する抗原結合ドメイン
本明細書で使用される場合、語句「Ｔ細胞受容体複合体に結合する抗原結合ドメイン」または「抗Ｔ細胞受容体複合体抗原結合ドメイン」とは、Ｔ細胞受容体複合体の部分ペプチドの全部または一部に特異的に結合する抗原結合ドメインを指す。Ｔ細胞受容体複合体は、Ｔ細胞受容体自体、またはＴ細胞受容体と共にＴ細胞受容体複合体を構成するアダプター分子であってもよい。ＣＤ３が、アダプター分子として好適である。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体複合体に結合する抗原結合ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）を含むドメインである。抗体軽鎖および重鎖可変領域を含むそのようなドメインの好適な例としては、「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」、「単鎖抗体」、「Ｆｖ」、「単鎖Ｆｖ２（ｓｃＦｖ２）」、「Ｆａｂ」、「Ｆ（ａｂ’）２」などが挙げられる。特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体複合体に結合する抗原結合ドメインは、抗体可変断片を含むドメインである。抗体可変断片を含むドメインを、１つまたは複数の抗体の可変ドメインから提供することができる。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体複合体に結合する抗原結合ドメインは、抗Ｔ細胞受容体複合体抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体複合体結合活性に結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂ構造を含むドメインである。
【０１８２】
Ｔ細胞受容体に結合する抗原結合ドメイン
本明細書で使用される場合、語句「Ｔ細胞受容体に結合する抗原結合ドメイン」または「抗Ｔ細胞受容体抗原結合ドメイン」とは、Ｔ細胞受容体の部分ペプチドの全部または一部に特異的に結合する抗原結合ドメインを指す。抗原結合ドメインが結合するＴ細胞受容体の部分は、Ｔ細胞受容体の可変領域またはＴ細胞受容体の定常領域であってよいが、定常領域中に存在するエピトープが好ましい。定常領域配列の例としては、ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＣＡＡ２６６３６．１（配列番号１０４）のＴ細胞受容体アルファ鎖、ＲｅｆＳｅｑ受託番号Ｃ２５７７７（配列番号１０５）のＴ細胞受容体ベータ鎖、ＲｅｆＳｅｑ受託番号Ａ２６６５９（配列番号１０６）のＴ細胞受容体ガンマ１鎖、ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＡＡＢ６３３１２．１（配列番号１０７）のＴ細胞受容体ガンマ２鎖、およびＲｅｆＳｅｑ受託番号ＡＡＡ６１０３３．１（配列番号１０８）のＴ細胞受容体デルタ鎖が挙げられる。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体に結合する抗原結合ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）を含むドメインである。抗体軽鎖および重鎖可変領域を含むそのようなドメインの好適な例としては、「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」、「単鎖抗体」、「Ｆｖ」、「単鎖Ｆｖ２（ｓｃＦｖ２）」、「Ｆａｂ」、「Ｆ（ａｂ’）２」などが挙げられる。特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体に結合する抗原結合ドメインは、抗体可変断片を含むドメインである。抗体可変断片を含むドメインを、１つまたは複数の抗体の可変ドメインから提供することができる。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体に結合する抗原結合ドメインは、抗Ｔ細胞受容体抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体に結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂ構造を含むドメインである。
【０１８５】
ＣＤ３に結合する抗原結合ドメイン
本明細書で使用される場合、語句「ＣＤ３に結合する抗原結合ドメイン」または「抗ＣＤ３抗原結合ドメイン」とは、ＣＤ３の部分ペプチドの全部または一部に特異的に結合する抗原結合ドメインを指す。エピトープが、ヒトＣＤ３を構成するガンマ鎖、デルタ鎖、またはイプシロン鎖配列中に存在する限り、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、任意のエピトープ結合ドメインであってもよい。ＣＤ３を構成するガンマ鎖、デルタ鎖、またはイプシロン鎖の構造に関して、そのポリヌクレオチド配列は、ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿００００７３．２、ＮＭ＿０００７３２．４およびＮＭ＿０００７３３．３に開示されており、そのポリペプチド配列は、ＮＰ＿００００６４．１（配列番号１０９）、ＮＰ＿０００７２３．１（配列番号１１０）、およびＮＰ＿０００７２４．１（配列番号１１１）（ＲｅｆＳｅｑ受託番号）に示されている。一部の実施形態では、本発明の抗原結合分子または抗体は、ＣＤ３イプシロン鎖に結合する抗原可変領域を含むドメインを含む。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）を含むドメインである。抗体軽鎖および重鎖可変領域を含むそのようなドメインの好適な例としては、「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」、「単鎖抗体」、「Ｆｖ」、「単鎖Ｆｖ２（ｓｃＦｖ２）」、「Ｆａｂ」、「Ｆ（ａｂ’）２」などが挙げられる。特定の実施形態では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、抗体可変断片を含むドメインである。抗体可変断片を含むドメインを、１つまたは複数の抗体の可変ドメインから提供することができる。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂ構造を含むドメインである。
【０１８８】
エピトープが、ヒトＣＤ３を形成するガンマ鎖、デルタ鎖、またはイプシロン鎖配列内に位置する限り、本発明の抗ＣＤ３抗原結合ドメインは、任意のエピトープに結合してもよい。本発明では、好ましい抗ＣＤ３抗原結合ドメインとしては、ヒトＣＤ３複合体のイプシロン鎖の細胞外ドメイン中のエピトープに結合する、ＣＤ３抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）とＣＤ３抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含むものが挙げられる。そのような好ましい抗ＣＤ３抗原結合ドメインとしては、ＯＫＴ３抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７、４９１４〜４９１７頁）またはＮＣＢＩ受託番号ＡＡＢ２４１３２の軽鎖可変領域（ＶＬ）と、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＢ２４１３３の重鎖可変領域（ＶＨ）とを有する抗体などの様々な公知のＣＤ３抗体（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７、４５〜５０頁（１９９２））のＣＤ３抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、ＣＤ３抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含むものが挙げられる。さらに、そのような適切な抗ＣＤ３抗原結合ドメインとしては、所望の動物を、上記方法によってヒトＣＤ３を形成するガンマ鎖、デルタ鎖、またはイプシロン鎖で免疫化することによって得られる、所望の特徴を有するＣＤ３抗体に由来するものが挙げられる。抗ＣＤ３抗原結合ドメインが由来する適切な抗ＣＤ３抗体としては、ヒト抗体および上記のように適切にヒト化された抗体が挙げられる。
【０１８９】
好ましくは、抗ＣＤ３抗原結合ドメインは、表２Ｂに示された重鎖可変領域のいずれか１つの重鎖可変領域と、表２Ｂに示された軽鎖可変領域のいずれか１つの軽鎖可変領域とを含む。
【０１９０】
一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗原結合ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖に特異的に結合する。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗原結合ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖内のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗原結合ドメインは、真核細胞の表面上に発現されるＣＤ３イプシロン鎖に結合する。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗原結合ドメインは、Ｔ細胞の表面上に発現されるＣＤ３イプシロン鎖に結合する。
【０１９１】
特定の実施形態では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、以下の表２Ａに示される抗体可変領域配列のいずれか１つを含む。特定の実施形態では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、表２Ａに示される重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組合せのいずれか１つを含む。特定の実施形態では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、表２Ａに示される抗体可変領域に含まれるＨＶＲ配列を含む。
【０１９２】
表２Ａは、抗ＣＤ３抗原結合ドメインの可変領域の配列番号を示す。
【０１９３】
【表２Ａ】
2021509403.tif 000004
【０１９４】
特定の実施形態では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、以下の表２Ｂに示されるＨＶＲ配列の組合せのいずれか１つを含む。
【０１９５】
表２Ｂは、抗ＣＤ３抗原結合ドメインのＨＶＲ（ＣＤＲ）配列の配列番号を示す。
【０１９６】
【表２Ｂ】
2021509403.tif 000005
【０１９７】
特定の実施形態では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、表２Ａに示された抗体可変領域のいずれか１つと、ＣＤ３への結合について競合する、または表２Ａに示された抗体可変領域のＨＶＲ領域と同一のＨＶＲ配列を含む任意の抗体可変断片と、ＣＤ３への結合について競合する、または表２Ｂに示されたものと同一のＨＶＲ配列を含む任意の抗体可変断片と、ＣＤ３への結合について競合する、抗体可変断片を含むドメインである。特定の実施形態では、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、表２Ａに示された抗体可変領域のいずれか１つと同じＣＤ３内のエピトープに結合する、または表２Ａに示された抗体可変領域のＨＶＲ領域と同一のＨＶＲ配列を含む任意の抗体可変断片と同じＣＤ３内のエピトープに結合する、または表２Ｂに示されたものと同一のＨＶＲ配列を含む任意の抗体可変断片と同じＣＤ３内のエピトープに結合する、抗体可変断片を含むドメインである。
【０１９８】
あるいは、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、上記の抗体可変断片／抗体可変領域のいずれか１つと、ＣＤ３への結合について競合する抗体可変断片を含む。あるいは、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、上記の抗体可変断片／抗体可変領域のいずれか１つがＣＤ３上において結合するのと同じエピトープに結合する抗体可変断片を含む。
【０１９９】
多重特異性抗原結合分子
「多重特異性抗原結合分子」とは、１つより多い抗原に特異的に結合する抗原結合分子を指す。好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗原結合分子は、２つ以上の抗原結合ドメインを含み、異なる抗原結合ドメインは、異なる抗原に特異的に結合する。
【０２００】
本発明の多重特異性抗原結合分子は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。上記の「ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメイン」に記載されたものから選択されるＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインおよび「Ｔ細胞受容体複合体に結合する抗原結合ドメイン」に記載されたものから選択されるＴ細胞受容体複合体に結合する抗原結合ドメインの、上記の「ＣＤ３に結合する抗原結合ドメイン」との組合せを使用することができる。
【０２０１】
例えば、第１の抗原結合ドメインは、抗体重鎖および軽鎖可変領域を含むドメインであり、および／または第２の抗原結合ドメインは、抗体重鎖および軽鎖可変領域を含むドメインである。あるいは、第１の抗原結合ドメインは、抗体可変断片を含むドメインであり、および／または第２の抗原結合ドメインは、抗体可変断片を含むドメインである。あるいは、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ構造を含むドメインであり、および／または第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ構造を含むドメインである。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む多重特異性抗原結合分子を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメイン、およびＦｃガンマ受容体結合活性が低下したＦｃ領域を含むドメインを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のＦｃドメインと比較して低下したＦｃガンマ受容体結合活性を有してもよい。実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号１１２〜１１５（ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４）のＦｃ領域を構成するアミノ酸のいずれかにアミノ酸変異を有するＦｃ領域である。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗体可変断片と、ＣＤ３に結合する第２の抗体可変断片とを含む二重特異性抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗体可変断片、ＣＤ３に結合する第２の抗体可変断片、およびＦｃガンマ受容体結合活性が低下したＦｃ領域を含む二重特異性抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗体可変断片、ＣＤ３イプシロン鎖に結合する第２の抗体可変断片、および天然に存在するＩｇＧ  Ｆｃ領域と比較して、Ｆｃガンマ受容体結合活性が低下したＦｃ領域を含む二重特異性抗体を提供する。
【０２０４】
本発明の「多重特異性抗原結合分子」の好ましい実施形態の例としては、多重特異性抗体が挙げられる。Ｆｃガンマ受容体結合活性が低下したＦｃ領域を多重特異性抗体Ｆｃ領域として使用する場合、多重特異性抗体に由来するＦｃ領域を適切に使用することができる。二重特異性抗体が、本発明の多重特異性抗体として特に好ましい。この場合、二重特異性抗体は、２つの異なる特異性を有する抗体である。ＩｇＧ型二重特異性抗体を、ＩｇＧ抗体を産生する２つの型のハイブリドーマを融合することによって生成されたハイブリッドハイブリドーマ（クアドローマ）から分泌させることができる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５、５３７〜５４０頁）。
【０２０５】
さらに、ＩｇＧ型二重特異性抗体は、２つの型の目的のＩｇＧを構成するＬ鎖およびＨ鎖の遺伝子、すなわち、合計４個の遺伝子を、細胞中に導入すること、およびそれらを同時に発現させることによって分泌される。しかしながら、これらの方法によって生産することができるＩｇＧのＨおよびＬ鎖の組合せの数は、理論的には、１０の組合せである。したがって、１０の型のＩｇＧからＨおよびＬ鎖の所望の組合せを含むＩｇＧを精製することは困難である。さらに、理論的には、所望の組合せを有するＩｇＧの分泌量は、顕著に減少し、したがって、大規模培養が必要であり、生産コストはさらに増大するであろう。
【０２０６】
したがって、Ｈ鎖間ならびに所望の組合せを有するＬおよびＨ鎖の間の結合を促進するための技術を、本発明の多重特異性抗原結合分子に適用することができる。
例えば、抗体Ｈ鎖の第２の定常領域または第３の定常領域（ＣＨ２またはＣＨ３）の境界面に静電反発力を導入することによって望ましくないＨ鎖結合を抑制するための技術を、多重特異性抗体結合に適用することができる（ＷＯ２００６／１０６９０５）。
【０２０７】
ＣＨ２またはＣＨ３の境界面に静電反発力を導入することによって意図しないＨ鎖結合を抑制する技術において、Ｈ鎖の他の定常領域の境界面に接触するアミノ酸残基の例としては、ＣＨ３領域中のＥＵナンバリングの３５６位、４３９位、３５７位、３７０位、３９９位、および４０９位の残基に対応する領域が挙げられる。
【０２０８】
より具体的には、例として、以下の（１）〜（３）に示されるアミノ酸残基の対から選択される、第１のＨ鎖ＣＨ３領域中の１〜３対のアミノ酸残基が同じ型の電荷を担持する、２つの型のＨ鎖ＣＨ３領域を含む抗体が挙げられる：（１）ＥＵナンバリングの３５６位および４３９位のＨ鎖ＣＨ３領域に含まれるアミノ酸残基；（２）ＥＵナンバリングの３５７位および３７０位のＨ鎖ＣＨ３領域に含まれるアミノ酸残基；ならびに（３）ＥＵナンバリングの３９９位および４０９位のＨ鎖ＣＨ３領域に含まれるアミノ酸残基。
【０２０９】
さらに、抗体は、上記の第１のＨ鎖ＣＨ３領域とは異なる第２のＨ鎖ＣＨ３領域中のアミノ酸残基の対が、（１）〜（３）のアミノ酸残基の上記対から選択され、上記の第１のＨ鎖ＣＨ３領域中の同じ型の電荷を担持する（１）〜（３）のアミノ酸残基の上記対に対応する１〜３対のアミノ酸残基が、上記の第１のＨ鎖ＣＨ３領域中の対応するアミノ酸残基に由来する反対の電荷を担持する、抗体であってもよい。
【０２１０】
上記の（１）〜（３）に示されたアミノ酸残基はそれぞれ、結合の間に互いに近くに来る。当業者であれば、市販のソフトウェアを使用する相同性モデリングなどにより、所望のＨ鎖ＣＨ３領域またはＨ鎖定常領域中の（１）〜（３）の上記アミノ酸残基に対応する位置を見出すことができ、これらの位置のアミノ酸残基を、適切に改変にかけることができる。
【０２１１】
上記の抗体において、「荷電したアミノ酸残基」は、好ましくは、例えば、以下の群：
（ａ）グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）；ならびに
（ｂ）リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、およびヒスチジン（Ｈ）
のいずれか一方に含まれるアミノ酸残基から選択される。
【０２１２】
上記抗体において、語句「同じ電荷を担持する」とは、例えば、２つ以上のアミノ酸残基が全て、上記の群（ａ）および（ｂ）のいずれか一方に含まれるアミノ酸残基から選択されることを意味する。語句「反対の電荷を担持する」とは、例えば、２つ以上のアミノ酸残基のうちの少なくとも１個のアミノ酸残基が、上記の群（ａ）および（ｂ）のいずれか一方に含まれるアミノ酸残基から選択される場合、残りのアミノ酸残基が他方の群に含まれるアミノ酸残基から選択されることを意味する。
【０２１３】
好ましい実施形態では、上記の抗体は、ジスルフィド結合によって架橋されたその第１のＨ鎖ＣＨ３領域と第２のＨ鎖ＣＨ３領域とを有してもよい。
【０２１４】
本発明では、改変を受けるアミノ酸残基は、抗体可変領域または抗体定常領域の上記アミノ酸残基に限定されない。当業者であれば、市販のソフトウェアを使用する相同性モデリングなどにより、ポリペプチド変異体またはヘテロ多量体中の境界面を形成するアミノ酸残基を同定することができる；次いで、これらの位置のアミノ酸残基を改変にかけて、結合を調節することができる。
【０２１５】
他の公知の技術を、本発明の多重特異性抗体の結合のために使用することもできる。抗体のＨ鎖Ｆｃ領域の１つに存在するアミノ酸側鎖を、長い方の側鎖（ノブ）で置換すること、および他のＨ鎖の対応するＦｃ領域に存在するアミノ酸側鎖を、小さい方の側鎖（ホール）で置換することにより、異なるアミノ酸を含むＦｃ領域含有ポリペプチドを互いに効率的に結合させて、ホール内へのノブの配置を可能にすることができる（ＷＯ１９９６／０２７０１１；Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９６）、９、６１７〜６２１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔ  Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６、６７７〜６８１頁；およびＵＳ２０１３０３３６９７３）。
【０２１６】
さらに、他の公知の技術を、本発明の多重特異性抗体の形成のために使用することもできる。抗体のＨ鎖ＣＨ３の１つの一部を、対応するＩｇＡ由来配列に変化させること、および対応するＩｇＡ由来配列を、他のＨ鎖ＣＨ３の相補的部分に導入することによって産生された鎖交換操作ドメインＣＨ３を使用するＣＨ３の相補的結合によって、異なる配列を有するポリペプチドの結合を効率的に誘導することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２３；１９５〜２０２頁、２０１０）。この公知の技術を使用して、目的の多重特異性抗体を効率的に形成させることもできる。
【０２１７】
さらに、ＷＯ２０１１／０２８９５２、ＷＯ２０１４／０１８５７２、およびＮａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｆｅｂ；３２（２）：１９１〜８頁に記載された抗体ＣＨ１とＣＬの結合およびＶＨとＶＬの結合を使用する抗体生産のための技術；ＷＯ２００８／１１９３５３およびＷＯ２０１１／１３１７４６に記載された別々に調製されたモノクローナル抗体を組み合わせて使用して二重特異的抗体を生産するための技術（Ｆａｂアーム交換）；ＷＯ２０１２／０５８７６８およびＷＯ２０１３／０６３７０２に記載された抗体重鎖ＣＨ３間の結合を調節するための技術；ＷＯ２０１２／０２３０５３に記載された２つの型の軽鎖と１つの型の重鎖とから構成される二重特異性抗体を生産するための技術；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３１、７５３〜７５８頁（２０１３））によって記載された単一のＨ鎖と単一のＬ鎖とを含む抗体の鎖の一方を個別に発現する２つの細菌細胞株を使用して二重特異性抗体を生産するための技術などを、多重特異性抗体の形成のために使用することができる。
【０２１８】
あるいは、目的の多重特異性抗体を効率的に形成させることができない場合であっても、本発明の多重特異性抗体を、産生された抗体から、目的の多重特異性抗体を分離および精製することによって得ることができる。例えば、２つの型のＨ鎖の可変領域中にアミノ酸置換を導入することによって等電点の差異を付与することによるイオン交換クロマトグラフィーによる、２つの型のホモマー型およびヘテロマー型の目的の抗体の精製を可能にするための方法が報告されている（ＷＯ２００７１１４３２５）。今まで、ヘテロマー抗体を精製するための方法として、プロテインＡに結合するマウスＩｇＧ２ａ  Ｈ鎖と、プロテインＡに結合しないラットＩｇＧ２ｂ  Ｈ鎖とを含むヘテロ二量体抗体を精製するためにプロテインＡを使用する方法が報告されている（ＷＯ９８０５０４３１およびＷＯ９５０３３８４４）。さらに、ＩｇＧ−プロテインＡ結合部位である、ＥＵナンバリングの４３５位および４３６位のアミノ酸残基の、異なるプロテインＡ親和性をもたらすアミノ酸であるＴｙｒ、Ｈｉｓなどによる置換を含むＨ鎖を使用して、または異なるプロテインＡ親和性を有するＨ鎖を使用して、それぞれのＨ鎖とプロテインＡとの相互作用を変化させること、次いで、プロテインＡカラムを使用することによって、ヘテロ二量体抗体をそのまま効率的に精製することができる。
【０２１９】
あるいは、複数の異なるＨ鎖に対する結合能力を提供することができる共通のＬ鎖を得て、多重特異性抗体の共通のＬ鎖として使用することができる。多重特異性ＩｇＧの効率的な発現を、そのような共通のＬ鎖および複数の異なるＨ鎖の遺伝子を細胞に導入して、ＩｇＧを発現させることによって達成することができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６、６７７〜６８１頁）。共通のＨ鎖を選択する場合、異なるＨ鎖のいずれかに対する強力な結合能力を示す共通のＬ鎖を選択するための方法を使用することもできる（ＷＯ２００４／０６５６１１）。
【０２２０】
さらに、Ｆｃ領域のＣ末端不均質性が改善されたＦｃ領域を、本発明のＦｃ領域として適切に使用することができる。より具体的には、本発明は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するＦｃ領域を構成する２つのポリペプチドのアミノ酸配列から、ＥＵナンバリングによって特定される４４６位のグリシンおよび４４７位のリシンを欠失させることによって産生されるＦｃ領域を提供する。
【０２２１】
２つ以上などの、複数のこれらの技術を組み合わせて使用することができる。さらに、これらの技術を、結合させようとする２つのＨ鎖に適切に、別々に適用することができる。さらに、これらの技術を、Ｆｃガンマ受容体に対する結合活性が低下した上記のＦｃ領域と組み合わせて使用することができる。さらに、本発明の抗原結合分子は、それが、上記の改変を受けた抗原結合分子に基づいて、同じアミノ酸配列を有するような、別々に生産された分子であってもよい。
【０２２２】
好ましくは、本発明の抗原結合分子は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインとを含んでもよい。実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体に結合する。別の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖に結合する。実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、ヒトＤＬＬ３に結合する。さらなる実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、真核細胞の表面上のＤＬＬ３に結合する。実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、真核細胞、好ましくは、がん細胞の表面上のヒトＤＬＬ３に結合する。
【０２２３】
本明細書における語句「抗ＤＬＬ３アーム」とは、二重特異性抗体中のＤＬＬ３に結合する抗体重鎖と抗体軽鎖とを指す。本明細書における語句「抗ＣＤ３アーム」とは、二重特異性抗体中のＣＤ３に結合する抗体重鎖と抗体軽鎖とを指す。
【０２２４】
好ましくは、本発明の抗原結合分子は、細胞性細胞傷害性（「細胞傷害性」とも呼ばれる）を有してもよい。実施形態では、細胞性細胞傷害性は、Ｔ細胞依存性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）である。別の実施形態では、細胞傷害性は、その表面上にＤＬＬ３を発現する細胞に対する細胞性細胞傷害性である。ＤＬＬ３発現細胞は、がん細胞であってもよい。
【０２２５】
好ましい態様では、本発明の抗体（または抗原結合分子）は、がん細胞などのＤＬＬ３発現細胞に対する、細胞傷害性（もしくは細胞性細胞傷害性）、または好ましくは、Ｔ細胞依存性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）を有する。ＤＬＬ３は、そのような細胞の表面上に発現され得る。本発明の抗体（または抗原結合分子）の（細胞性）細胞傷害性またはＴＤＣＣを、当分野で公知の任意の好適な方法によって評価することができる。例えば、一部の実施例に記載される方法を、ＴＤＣＣを測定するために使用することができる。この場合、細胞傷害活性は、本発明の抗体（または抗原結合分子）による細胞増殖阻害の比率によって評価される。細胞増殖は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒなどの好適な分析装置を使用して測定される。がん細胞を標的細胞として使用し、それらを好適な細胞濃度（例えば、約１０４細胞／ウェル）でマルチウェルプレート上に播種する。次の日、適切な濃度（例えば、０．００１〜１０ｎＭ）で調製された試験抗体を、プレートに添加する。反応の１５分後、Ｔ細胞（ＰＢＭＣなど）を含有する溶液を、１０の比などの、好適なエフェクター（ＰＢＭＣ）／標的（がん細胞）比でそれに添加する。反応を、二酸化炭素ガスを用いて実行する。Ｔ細胞の添加後、細胞増殖阻害（ＣＧＩ）率（％）を、式：ＣＧＩ率（％）＝（Ａ−Ｂ）×１００／（Ａ−１）（式中、Ａは、抗体（または抗原結合分子）を含まない、すなわち、標的細胞およびＴ細胞のみを含有するウェルの平均細胞指数値を表し、Ｂは、抗体（または抗原結合分子）を含むウェルの平均細胞指数値を表す）を使用して決定する。計算において使用される細胞指数値は、正規化された値である、すなわち、抗体添加の直前の時点での細胞指数値を１と定義する。抗体（または抗原結合分子）のＣＧＩ率が高い、すなわち、有意に正の値を有する場合、抗体（または抗原結合分子）はＴＤＣＣ活性を有し、本発明においてより好ましいということができる。
【０２２６】
あるいは、細胞傷害活性を、カルセイン−アセトキシメチル放出アッセイによって評価することができる。がん細胞を標的細胞として使用する。標的細胞を、カルセイン−アセトキシメチルで標識化した後、洗浄する。試験抗体（例えば、０．００１〜１０ｎＭ）をプレートにピペットで注入し、カルセイン標識化された標的細胞懸濁液をそれに添加する。室温でプレートを静置した後、エフェクター細胞（ＰＢＭＣなど）懸濁液をそれに添加する。プレートを撹拌した後、それを遠心分離し、ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートする。プレートをよく撹拌し、遠心分離した後、各ウェルに由来する培養培地を別のプレートに移す。吸光度（４９５ｎｍ、参照５１５ｎｍ）を測定する。最大放出のために、細胞を０．５％ＮＰ−４０で溶解してもよい。培養培地バックグラウンドの蛍光値を、実験放出（Ａ）、標的細胞の自発的放出（Ｂ）、および標的細胞の最大放出（Ｃ）の値から差し引く。細胞傷害を、以下の式：細胞傷害（％）＝（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００を使用して算出する。抗体（または抗原結合分子）のこの値が高い、すなわち、有意に正の値を有する場合、抗体（または抗原結合分子）はＴＤＣＣ活性を有し、本発明においてより好ましいということができる。
【０２２７】
単一特異性抗原結合分子
使用される用語「単一特異性抗原結合分子」は、ただ１つの型の抗原に特異的に結合する抗原結合分子を指す。単一特異性抗原結合分子の好ましい例は、単一の型の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。単一特異性抗原結合分子は、単一の抗原結合ドメインまたは同じ型の複数の抗原結合ドメインを含んでもよい。単一特異性抗原結合分子の好ましい例は、単一特異性抗体である。単一特異性抗原結合分子がＩｇＧ型の単一特異性抗体である場合、単一特異性抗体は、同じ抗原結合特異性を有する２つの抗体可変断片を含む。
【０２２８】
本発明の単一特異性抗原結合分子は、ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインを含む。ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメインは、上の「ＤＬＬ３に結合する抗原結合ドメイン」に記載されたもののいずれか１つであってもよい。
【０２２９】
用語「ＤＬＬ３に結合する単一特異性抗原結合分子」とは、抗体がＤＬＬ３を標的とする際の診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＤＬＬ３に結合することができる単一特異性抗原結合分子を指す。一実施形態では、ＤＬＬ３に結合する単一特異性抗原結合分子の、関連しない非ＤＬＬ３タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定された場合、ＤＬＬ３への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＤＬＬ３に結合する単一特異性抗原結合分子は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【０２３０】
一部の実施形態では、本発明におけるＤＬＬ３に結合する単一特異性抗原結合分子は、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節などの、エフェクター機能を有する機能性Ｆｃ領域を含む。
【０２３１】
抗体依存性細胞傷害
「抗体依存性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」とは、ある特定の細胞傷害細胞（例えば、ＮＫ細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌型Ｉｇにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を担持する標的細胞に特異的に結合した後、細胞毒素を用いて標的細胞を殺傷することができるようになる、細胞傷害の型を指す。ＡＤＣＣを媒介するための主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃガンマＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩ、およびＦｃガンマＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７〜９２頁（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号もしくは第５，８２１，３３７号または米国特許第６，７３７，０５６号（Ｐｒｅｓｔａ）に記載されたものなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９５：６５２〜６５６頁（１９９８）に開示されたものなどの動物モデルにおいて、評価することができる。
【０２３２】
イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤もしくは化学療法薬、増殖阻害剤、毒性化合物、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、もしくはその断片）、または放射性アイソトープなどの１つまたは複数の細胞傷害剤にコンジュゲートされた、本明細書の抗原結合分子、例えば、ＤＬＬ３に結合する単一特異性抗原結合分子を含むイムノコンジュゲートも提供する。一部の実施形態では、本発明は、毒性化合物にコンジュゲートされた抗原結合分子または抗体を提供する。換言すれば、本発明は、抗原結合分子または抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート化合物を提供する。
【０２３３】
一実施形態では、イムノコンジュゲートは、抗体が、限定されるものではないが、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号および欧州特許第ＥＰ０４２５２３５Ｂ１号を参照）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号および第５，７８０，５８８号、および第７，４９８，２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアミシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、および第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６〜３３４２頁（１９９３）；ならびにＬｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５〜２９２８頁（１９９８）を参照）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７〜５２３頁（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８〜３６２頁（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７〜７２１頁（２００５）；Ｎａｇｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９〜８３４頁（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９〜１５３２頁（２００２）；Ｋｉｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６〜４３４３頁（２００２）；および米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；ならびにＣＣ１０６５を含む１つまたは複数の薬物にコンジュゲートされた、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
【０２３４】
別の実施形態では、イムノコンジュゲートは、限定されるものではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、シャボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む、酵素学的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗原結合分子（ＤＬＬ３に結合する単一特異性抗原結合分子など）を含む。
【０２３５】
別の実施形態では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するための放射性原子にコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗原結合分子（ＤＬＬ３に結合する単一特異性抗原結合分子など）を含む。様々な放射性アイソトープが、放射性コンジュゲートの生産のために利用可能である。例としては、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２ＰｂおよびＬｕの放射性アイソトープが挙げられる。放射性コンジュゲートを検出のために使用する場合、それは、シンチグラフ検査のための放射性原子、例えば、Ｔｃ−９９ｍもしくは１２３Ｉ、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識、例えば、再度、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含んでもよい。
【０２３６】
抗原結合分子（ＤＬＬ３に結合する単一特異性抗原結合分子など）と、細胞傷害剤とのコンジュゲートを、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベリン酸など）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素を、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８頁（１９８７）に記載のように調製することができる。炭素１４で標識化された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種の抗体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照。リンカーは、細胞中での細胞傷害薬の放出を容易にする「開裂性リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７〜１３１頁（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【０２３７】
本明細書におけるイムノコンジュゲートまたはＡＤＣは、限定されるものではないが、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．から）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸）などの架橋試薬を用いて調製されたそのようなコンジュゲートを明示的に企図するが、それらに限定されない。
【０２３８】
がん
用語「がん」および「がん性」とは、典型的には、未調節の細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物における生理的病状を指す、または説明する。がんの例としては、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられる。そのようながんのより特定の例としては、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、消化管がん、膵がん、グリオーマ、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、白血病および他のリンパ増殖障害、ならびに様々な型の頭頸部がんが挙げられる。
【０２３９】
腫瘍
用語「腫瘍」とは、悪性であるにしろ、良性であるにしろ、全ての新生物性細胞成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖障害」、「増殖障害」および「腫瘍」は、本明細書で言及されるように、相互排他的ではない。
【０２４０】
好ましい実施形態では、がんは、ＤＬＬ３を発現するがん（がん組織または細胞を含む）。一部の実施形態では、がんは、膵がん、グリオーマ、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、またはメラノーマである。
【０２４１】
医薬製剤
用語「医薬製剤」とは、そこに含まれる活性成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態にあり、製剤が投与される対象にとって許容できないほどに毒性であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。
【０２４２】
薬学的に許容される担体
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性的である、活性成分以外の、医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、限定されるものではないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられる。
【０２４３】
処置
本明細書で使用される場合、「処置」（および「処置する」または「処置すること」などのその文法的変形）は、処置される個体の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を指し、予防のため、または臨床病理の過程の間に実施することができる。処置の望ましい効果としては、限定されるものではないが、疾患の出現または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理的帰結の縮小、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が挙げられる。一部の実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか、または疾患の進行を減速させるために使用される。
【０２４４】
一態様では、本発明は、ＤＬＬ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、Ｔ細胞受容体複合体に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む多重特異性抗原結合分子、およびその使用に一部基づくものである。本発明の抗原結合分子および抗体は、例えば、腫瘍、特に、結腸直腸腫瘍および胃腫瘍の診断または処置にとって有用である。
【０２４５】
医薬組成物
本発明の医薬組成物、本発明の細胞性細胞傷害を誘導するための治療剤、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤を、必要に応じて、様々な型の抗原結合分子と共に製剤化することができる。例えば、抗原を発現する細胞に対する細胞傷害作用を、本発明の複数の抗原結合分子のカクテルによって増強することができる。
【０２４６】
必要に応じて、本発明の抗原結合分子を、マイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリレート］などから作られるマイクロカプセル）中に封入し、コロイド薬物送達系（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）の成分中で作製することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  第１６版」、Ｏｓｌｏ（編）（１９８０）を参照）。さらに、薬剤を持続放出剤として調製するための方法は、公知であり、これらのものを本発明の抗原結合分子に適用することができる（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８１）１５、２６７〜２７７頁；Ｃｈｅｍｔｅｃｈ．（１９８２）１２、９８〜１０５頁；米国特許第３，７７３，７１９号；欧州特許出願第ＥＰ５８４８１号および第ＥＰ１３３９８８号；Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（１９８３）２２、５４７〜５５６頁）。
【０２４７】
本発明の医薬組成物、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤を、経口的または非経口的に患者に投与することができる。非経口投与が好ましい。具体的には、そのような投与方法としては、注射、経鼻投与、経肺投与、および経皮投与が挙げられる。注射としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および皮下注射が挙げられる。例えば、本発明の細胞性細胞傷害を誘導するための医薬組成物、治療剤、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤を、注射によって局部的または全身的に投与することができる。さらに、適切な投与方法を、患者の年齢および症状に従って選択することができる。投与される用量を、例えば、それぞれの投与につき、体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲から選択することができる。あるいは、用量を、例えば、患者の身体あたり０．００１ｍｇ〜１００，０００ｍｇの範囲から選択することができる。しかしながら、本発明の医薬組成物の用量は、これらの用量に限定されない。
【０２４８】
本発明の医薬組成物を、従来の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、最新版、Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に従って製剤化することができ、それらは薬学的に許容される担体および添加剤を含有してもよい。例としては、限定されるものではないが、界面活性剤、賦形剤、着色剤、香料、保存剤、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動促進剤、および矯味剤が挙げられ、他の一般的に使用される担体も好適に使用することができる。担体の特定例としては、軽質無水ケイ酸、ラクトース、結晶性セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノ酢酸、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖トリグリセリド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、サッカロース、カルボキシメチルセルロース、トウモロコシデンプン、無機塩などが挙げられる。
【０２４９】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、本発明の抗原結合分子を含む。実施形態では、組成物は、細胞性細胞傷害の誘導における使用のための医薬組成物である。別の実施形態では、組成物は、がんの処置または予防における使用のための医薬組成物である。好ましくは、がんは、上記のがんである。本発明の医薬組成物を、がんを処置または予防するために使用することができる。かくして、本発明は、本発明の抗原結合分子を、それを必要とする患者に投与する、がんを処置または予防するための方法を提供する。
【０２５０】
さらに、本発明は、がんを処置または予防するための医薬組成物の製造における、上記の抗原結合分子または抗体の使用を提供する。本発明はまた、がんを処置または予防するための抗原結合分子／抗体／医薬組成物の使用も提供する。
【０２５１】
本発明はまた、ＤＬＬ３を発現する細胞と、ＤＬＬ３に結合する本発明の抗原結合分子とを接触させることによって、ＤＬＬ３を発現する細胞を損傷させるため、または細胞増殖を抑制するための方法も提供する。ＤＬＬ３に結合するモノクローナル抗体は、本発明の細胞性細胞傷害を誘導するための治療剤、細胞増殖抑制剤、および抗がん剤に含まれる、本発明の抗原結合分子として上記されている。本発明の抗原結合分子が結合する細胞は、それらがＤＬＬ３を発現する限り、特に限定されない。具体的には、本発明において、好ましいがん抗原発現細胞としては、膵がん細胞、グリオーマ細胞、メラノーマ細胞、または小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）細胞が挙げられる。
【０２５２】
本発明において、「接触」は、例えば、本発明の抗原結合分子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたＤＬＬ３を発現する細胞の培養培地に添加することによって実行することができる。この場合、添加される抗原結合分子を、溶液または凍結乾燥によって調製された固体などの適切な形態で使用することができる。本発明の抗原結合分子を水性溶液として添加する場合、溶液は、抗原結合分子のみを含有する純粋な水性溶液または例えば、上記の界面活性剤、賦形剤、着色剤、香料、保存剤、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動促進剤、および矯味剤を含有する溶液であってもよい。添加される濃度は、特に限定されないが、培養培地中での最終濃度は、好ましくは、１ｐｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは、１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲にある。
【０２５３】
本発明の別の実施形態では、「接触」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＬＬ３発現細胞を移植された非ヒト動物またはＤＬＬ３を内因的に発現するがん細胞を有する動物への投与によって実行することもできる。投与方法は、経口または非経口であってもよい。非経口投与が特に好ましい。具体的には、非経口投与方法は、注射、経鼻投与、経肺投与、および経皮投与を含む。注射としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および皮下注射が挙げられる。例えば、本発明の細胞性細胞傷害を誘導するための医薬組成物、治療剤、細胞増殖抑制剤、または抗がん剤を、注射によって局部的または全身的に投与することができる。さらに、適切な投与方法を、動物対象の年齢および症状に応じて選択することができる。抗原結合分子を水性溶液として投与する場合、溶液は、抗原結合分子のみを含有する純粋な水性溶液または例えば、上記の界面活性剤、賦形剤、着色剤、香料、保存剤、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動促進剤、および矯味剤を含有する溶液であってもよい。投与される用量を、例えば、それぞれの投与につき、体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲から選択することができる。あるいは、用量を、例えば、患者の身体あたり０．００１ｍｇ〜１００，０００ｍｇの範囲から選択することができる。しかしながら、本発明の抗原結合分子の用量は、これらの例に限定されない。
【０２５４】
以下に記載される方法は、本発明の抗原結合分子と、本発明の抗原結合分子を形成する抗原結合ドメインが結合するＤＬＬ３発現細胞とを接触させることによって引き起こされる細胞性細胞傷害を評価または決定するための方法として好ましく使用される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞傷害活性を評価または決定するための方法としては、細胞傷害性Ｔ細胞などの活性を決定するための方法が挙げられる。本発明の抗原結合分子がＴ細胞媒介性細胞性細胞傷害を誘導する活性を有するかどうかを、公知の方法（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ７、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ、Ｊｏｈｎ  Ｅ、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９３）を参照）によって決定することができる。細胞傷害アッセイにおいては、抗原結合ドメインがＤＬＬ３とは異なる抗原に結合し、細胞中で発現されない抗原結合分子を、対照抗原結合分子として使用する。対照抗原結合分子は、同じ様式でアッセイされる。次いで、本発明の抗原結合分子が対照抗原結合分子のものよりも強い細胞傷害活性を示すかどうかを試験することによって、活性を評価する。
【０２５５】
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞傷害活性を、例えば、以下の手順によって評価または決定する。本発明の抗原結合分子を形成する抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する細胞を、非ヒト動物対象に、皮内または皮下移植する。次いで、移植の日またはその後から、試験抗原結合分子を、毎日、または数日の間隔で静脈または腹腔に投与する。腫瘍サイズを、経時的に測定する。腫瘍サイズの変化の差異を、細胞傷害活性と定義することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのように、対照抗原結合分子を投与する。本発明の抗原結合分子は、腫瘍サイズが、対照抗原結合分子を投与された群よりも、本発明の抗原結合分子を投与された群において小さい場合、細胞傷害活性を有すると判断することができる。
【０２５６】
好ましくは、抗原結合分子を形成する抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する細胞の増殖を抑制するために、ＭＴＴ法およびアイソトープ標識化されたチミジンの細胞への取込みの測定を使用して、本発明の抗原結合分子との接触の効果を評価または決定する。一方、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞傷害活性を評価または決定するための上記の同じ方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞増殖を抑制する活性を評価または決定することができる。
【０２５７】
本発明はまた、本発明の抗原結合分子または本発明の方法によって生産された抗原結合分子を含有する、本発明の方法における使用のためのキットも提供する。キットを、追加の薬学的に許容される担体もしくは媒体、またはキットを使用する方法を記載する取扱説明書などと共に包装することができる。
【０２５８】
さらに、本発明は、本発明の方法における使用のための、本発明の抗原結合分子または本発明の方法によって生産された抗原結合分子に関する。
【０２５９】
別の実施形態では、内在化抗体が提供される。換言すれば、本発明は、内在化活性を有する抗体または抗原結合分子を提供する。そのような抗体は、抗体の細胞中への送達を増強するある特定の特徴を有してもよいか、またはそのような特徴を有するように改変することができる。これを達成するための技術は、当分野で公知である。例えば、抗体のカチオン化は、細胞中へのその取込みを容易にすることが知られている（例えば、米国特許第６，７０３，０１９号を参照）。リポフェクションまたはリポソームを使用して、抗体を細胞中に送達することもできる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質に特異的に結合する最小の阻害断片を使用することができる。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドを化学的に合成する、および／または組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７８８９〜７８９３頁（１９９３）を参照。抗体（または抗原結合分子）の内在化活性を、例えば、欧州特許出願公開第３０１５１１５号（ＷＯ２０１４／２０８４８２）の参照例１８に記載された方法によって決定することができる。
【０２６０】
ＤＬＬ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）断片タンパク質の発現および精製
Ｃ末端上にＦｌａｇタグを有していてもよい、ＤＬＬ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）断片タンパク質（またはそのトランケートされたバリアント）を、適切なベクターおよび細胞を使用して一過的に発現させることができる。タンパク質を含有する培養上清を、親和性樹脂を充填したカラムに加え、溶出させる。タンパク質を含有する画分を収集した後、緩衝液で平衡化させた濾過カラムに加える。次いで、タンパク質を含有する画分をプールし、使用まで−８０℃で保存する。ＥＣＤ断片タンパク質を、公知の方法または本明細書に記載の方法によるエピトープマッピングまたは競合アッセイのために使用することができる。
【０２６１】
ＤＬＬ３を発現する細胞株の樹立
ＤＬＬ３を発現する細胞株を樹立するために、ＤＬＬ３  ｃＤＮＡを、発現ベクター中に挿入し、これを、例えば、エレクトロポレーションによって細胞中に導入する。導入後、選択のための薬剤（ゲネチシンなど）を添加し、細胞を培養して、それに対して耐性である細胞株を得る。トランスフェクトされた細胞株を、限界希釈によってプレート中に播種し、増殖させることができる。樹立された細胞株を、ＤＬＬ３を発現する細胞に対する本発明の抗原結合分子または抗体のＴＤＣＣ活性を評価するために使用することができる。
【０２６２】
抗ＤＬＬ３抗体（単一特異性）の生成およびスクリーニング
以下に記載されるように、抗ＤＬＬ３抗体を調製し、選択し、アッセイすることができる。ウサギなどの動物を、ＤＬＬ３またはその断片で免疫化する。最後の免疫化後、脾臓および血液を、免疫化した動物から収集する。抗原特異的Ｂ細胞を染色し、細胞選別装置を用いて選別し、例えば、ＥＬ４細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）と一緒に、ウェルあたり１個の細胞の密度でプレート中に播種し、培養する。培養後、Ｂ細胞培養上清をさらなる分析のために収集し、ペレットを凍結保存することができる。ＥＬＩＳＡスクリーニングを行って、Ｂ細胞培養上清中での抗体の特異性を試験することができる。ＤＬＬ３発現細胞を、ＢＳＡおよび細胞膜のための生体適合性アンカーで予めコーティングしたプレート上に固相化する。固相化された細胞を、Ｂ細胞培養上清と共にインキュベートする。細胞を洗浄し、例えば、ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体ＨＲＰコンジュゲートを添加する。細胞を氷上でさらにインキュベートし、基質を添加し、光密度を好適に分析する。Ｂ細胞クローンを、ＤＬＬ３発現細胞への結合についてスクリーニングし、クローンを、ＤＬＬ３特異的結合剤として選択する。選択されたクローンを、凍結保存された細胞ペレットから精製する。抗体重鎖可変領域のＤＮＡを、逆転写ＰＣＲによって増幅し、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションして、対応する重鎖を形成させる。抗体軽鎖可変領域のＤＮＡを、逆転写ＰＣＲによって増幅し、軽鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションして、対応する軽鎖を形成させる。クローニングされた抗体を細胞中で発現させ、機能的評価のために培養上清から精製する。単一特異性抗体を、公知の方法によって抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３二重特異性抗体を生産するために使用してもよい。
【０２６３】
選択された抗ＤＬＬ３抗体（単一特異性）のエピトープマッピング
ＤＬＬ３およびＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質の構造を、図１に図示する。これらのＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質を、例えば、以下に記載されるように、抗ＤＬＬ３抗体のエピトープマッピングのために使用することができる。プレートを、断片タンパク質でコーティングし、緩衝液でブロックする。ブロッキング緩衝液を除去し、抗ＤＬＬ３抗体を、固相化されたタンパク質と共にインキュベートし、緩衝液で洗浄する。抗Ｆｌａｇ抗体を含む任意の好適な検出系を使用して、抗体結合を評価することができる。例えば、モノクローナルＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ、クローンＭ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、インキュベートし、洗浄する。次いで、基質を添加し、光密度（例えば、ＯＤ４０５）を決定する。ＯＤ４０５値は、断片タンパク質に対する試験抗体の反応性を表す。どのドメインの欠失（図１を参照）が抗体結合を廃止するかを試験することによって、抗体エピトープを推論することができる。すなわち、抗体が、例えば、Ｎ末端から短縮された逐次的欠失構築物のパネル間である特定の欠失構築物に結合することができない場合（図１）、次いで、この構築物は抗体のエピトープを含有せず、抗体が結合することができるより長い欠失構築物、またはより具体的には、そのようなより長い欠失構築物間で最も短いもののＮ末端領域は、抗体のエピトープを含有するということができる。
【０２６４】
抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体の機能的評価
抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を、以下に記載されるような、異種移植モデルにおいて、そのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍効能について評価することができる。がん細胞株をＮＯＤ  ｓｃｉｄマウスに移植し、腫瘍形成が確認されたＮＯＤ  ｓｃｉｄマウスを、ヒトＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養によって増殖したＴ細胞の移植にかける。マウス（Ｔ細胞注射モデルと呼ばれる）を、二重特異性抗体の投与によって処置する。例えば、Ｔ細胞注射モデルを使用する二重特異性抗体の抗腫瘍効能試験において、以下のことを実施することができる。Ｔ細胞を、ＰＢＭＣおよびＴ細胞活性化／拡大キット／ヒト（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃ）などの好適な媒体を使用して拡大培養する。ヒトがん細胞株を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ）などの好適な支持材料と混合し、ＮＯＤ  ｓｃｉｄマウスの領域に移植する。移植の前日（移植当日を０日目と定義する場合、−１日目）に、抗アシアロ−ＧＭ１抗体をマウスに腹腔内投与する。移植後１０日目に、マウスを、その体重および腫瘍サイズに応じて群に分け、抗アシアロ−ＧＭ１抗体を再びマウスに腹腔内投与する。次の日、上記の拡大培養によって得られたＴ細胞を、マウスの腹腔内に移植する。Ｔ細胞移植の４時間後、抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を、尾静脈を介して静脈内投与する。抗腫瘍活性（腫瘍体積増加の阻害）を、溶媒を投与した対照群と比較して、二重特異性抗体を投与した群において評価することができる。
【０２６５】
抗ＤＬＬ３単一特異性抗体のヒト化および最適化
ヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を、ヒト生殖系列フレームワークを使用して設計することができる。設計された重鎖および軽鎖可変領域のポリヌクレオチドを、それぞれ、重鎖定常領域配列および軽鎖定常領域配列を含有する発現ベクター中にクローニングする。ヒト化抗体を、細胞中で一過的に発現させ、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を上記のように実行する。選択されたヒト化抗体を、さらに最適化する。ＣＤＲ領域中の脱アミド化、異性化、スクシンイミド形成、メチオニンおよびトリプトファン酸化ならびに非対システインのシステイン化などの化学的分解を回避するために、選択されたヒト化抗体の配列を、元のアミノ酸とシステインを除く、他の１８種のアミノ酸に変異させてもよい。上記の方法によって、バリアントを一過的に発現させ、精製する。精製されたモノクローナル抗体バリアントを、上記の方法を使用するＢＩＡｃｏｒｅによって評価し、親抗体としてＤＬＬ３に結合することができる目的のバリアントを選択する。次いで、ＣＤＲ中でのこれらの変異の組合せを有する抗体を生成する。
【０２６６】
抗ＤＬＬ３抗体の競合分析
ビオチン標識化された抗ＤＬＬ３抗体の調製
抗ＤＬＬ３抗体の可変重鎖および軽鎖配列（ＶＨおよびＶＬ）を、発現ベクター中にクローニングする。抗ＤＬＬ３抗体を、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンで標識化することによって、ビオチン標識化された抗ＤＬＬ３抗体を調製することができる。
【０２６７】
Ｏｃｔｅｔアッセイ
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ３８４（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を使用して、抗体のパネルのためのエピトープビニングによる競合結合アッセイを実施することができる。ビオチン化抗体を、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーにロードする。次に、センサーをＤＬＬ３に曝露した後、第２抗体に曝露する。生データを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ’ｓ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７．０を使用して処理し、抗体対を競合結合について評価する。第２抗体による追加の結合は、非占有エピトープ（非競合剤）を示すが、結合がないことは、エピトープブロッキング（競合剤）を示す。競合的抗体結合が存在するかどうかを決定するために、抗体Ａを最初にストレプトアビジンバイオセンサーに固相化し、抗原と抗体Ｂとの複合体の逐次的結合を測定する。抗体Ｂの抗体Ａに対する競合比を、以下の式：
競合比（抗体Ｂの抗体Ａに対する比）＝
［結合応答（抗体Ｂ−抗原）］／［結合応答（抗原−抗体Ａ）］
を使用して算出する。競合比が低い場合、すなわち、０に近い場合、抗体Ａと抗体Ｂは、同じエピトープについて互いに競合しないということができる。
【０２６８】
抗ＤＬＬ３／抗ＣＤ３二重特異性抗体の調製
抗ＤＬＬ３単一特異性抗体と、抗ＣＤ３抗体とを使用して、他の場所に公開された従来の方法を使用して抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を生成することができる。使用される抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３イプシロン鎖中の領域内のエピトープに結合することができる。生成される二重特異性抗体は、Ｆｃガンマ受容体に対する親和性が減じられたサイレントＦｃを含有してもよい。さらに、例えば、ＷＯ２０１６１５９２１３に報告されたＦａｂアーム交換技術を使用して、二重特異性抗体を作製することができる。
【０２６９】
抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体中の抗ＤＬＬ３アーム（または抗ＣＤ３アーム）の結合親和性評価のためのＢＩＡｃｏｒｅ分析
抗ＤＬＬ３／ＣＤ３抗体中の抗ＤＬＬ３アーム（または抗ＣＤ３アーム）の、ＤＬＬ３に対する結合親和性を、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅを使用して、ｐＨ７．４および３７℃で評価することができる。例えば、抗ヒトＦｃ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＣＭ４センサーチップの全てのフローセル上に固相化する。二重特異性抗体を、抗Ｆｃセンサー表面上に捕捉した後、ＤＬＬ３（またはＣＤ３）をフローセル上に注入する。抗体および分析物を、２０ｍＭ  ＡＣＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、０．００５％ＮａＮ３を含有するＡＣＥＳ  ｐＨ７．４中で調製することができる。センサー表面を、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を用いて各サイクルで再生する。データを１：１結合モデルにプロセシングし、適合させることによって、結合親和性を決定する。
【０２７０】
本明細書に引用される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２７１】
以下は、本発明の方法および組成物の例である。様々な他の実施形態を、上に提供された一般的説明を考慮して実行することができることが理解される。
【０２７２】
実施例１．ヒトＤＬＬ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）断片タンパク質およびカニクイザルＤＬＬ３  ＥＣＤタンパク質の発現および精製
ヒトＤＬＬ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）断片タンパク質として、Ｃ末端上にＦｌａｇタグ（配列番号１３５）を有するヒトＤＬＬ３  ＥＣＤ（配列番号１、以後、ｄｅｌ０と呼ぶ）およびＣ末端上にＦｌａｇタグを有するトランケートされたヒトＤＬＬ３  ＥＣＤバリアント（配列番号２〜７、以後、それぞれ、ｄｅｌ１〜ｄｅｌ６と呼ぶ）を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して一過的に発現させた。ヒトＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質を含有する培養上清を、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２親和性樹脂（Ｓｉｇｍａ）を充填したカラムに加え、Ｆｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ）を用いて溶出させた。ヒトＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質を含有する画分を収集した後、１×Ｄ−ＰＢＳで平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加えた。次いで、ヒトＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質を含有する画分をプールし、−８０℃で保存した。
【０２７３】
Ｎ末端上にＭｙｃタグおよびＣ末端上にＨｉｓタグを有するカニクイザルＤＬＬ３  ＥＣＤ（配列番号８、以後、Ｍｙｃ−ｃｙｎｏＤＬＬ３−Ｈｉｓと呼ぶ）を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して一過的に発現させた。カニクイザルＤＬＬ３  ＥＣＤタンパク質を含有する培養上清を、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加え、イミダゾールを用いて溶出させた。カニクイザルＤＬＬ３  ＥＣＤタンパク質を含有する画分を収集した後、１×Ｄ−ＰＢＳで平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加えた。次いで、カニクイザルＤＬＬ３  ＥＣＤタンパク質を含有する画分をプールし、−８０℃で保存した。
【０２７４】
実施例２．ヒトＤＬＬ３を発現するＢａ／Ｆ３細胞株の確立
デルタ様タンパク質３アイソフォーム１前駆体をコードするヒトＤＬＬ３  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０５８６３７．１、配列番号９）を、発現ベクターｐＣＸＮＤ３（ＷＯ２００８／１５６０８３に記載された）に挿入した。
【０２７５】
線状化されたヒトＤＬＬ３−ｐＣＸＮＤ３を、エレクトロポレーション（ＬＯＮＺＡ、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｘ）により、マウスＩＬ−３依存性プロＢ細胞由来細胞株Ｂａ／Ｆ３に導入した。
【０２７６】
導入後、ゲネチシンを添加し、細胞を培養して、ゲネチシンに耐性である細胞株を得た。トランスフェクトされた細胞を、限界希釈によって９６ウェルプレート中に播種し、拡大した。確立された細胞株を、ｈＤＬＬ３／ＢａＦ＿Ｈ３と命名した。
【０２７７】
実施例３．抗ＤＬＬ３抗体（単一特異性）の生成およびスクリーニング
以下に記載されるように、抗ＤＬＬ３抗体を調製し、選択し、アッセイした。
【０２７８】
１２週齢のＮＺＷウサギを、実施例１に記載されたように調製されたヒトＤＬＬ３  ＥＣＤおよびカニクイザルＤＬＬ３  ＥＣＤタンパク質を用いて、交互に皮内に免疫化した（５０〜１００マイクログラム（μｇ）／用量／ウサギ）。最後の免疫化の６日後、脾臓および血液を、免疫化したウサギから収集した。抗原特異的Ｂ細胞を、Ｍｙｃ−ｃｙｎｏＤＬＬ３−Ｈｉｓおよび抗ｃ−ｍｙｃ−ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で染色し、ＦＣＭ細胞選別装置（ＦＡＣＳ  ａｒｉａ  ＩＩＩ、ＢＤ）を用いて選別し、２５，０００細胞／ウェルのＥＬ４細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）および２０倍希釈された活性化ウサギＴ細胞馴化培地と一緒に、ウェルあたり１個の細胞の密度で９６ウェルプレート中に播種し、７〜１２日間培養した。ＥＬ４細胞を、前もってマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ４２８７）で２時間処理し、３回洗浄した。フィトヘマグルチニン−Ｍ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１  １０８２１３２−００１）、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ１５８５）および２％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中でウサギ胸腺細胞を培養することにより、活性化ウサギＴ細胞馴化培地を調製した。培養後、Ｂ細胞培養上清をさらなる分析のために収集し、ペレットを凍結保存した。
【０２７９】
ＥＬＩＳＡスクリーニングを行って、Ｂ細胞培養上清中での抗体の特異性を試験した。ヒトＤＬＬ３を発現するＢａ／Ｆ３（実施例２で樹立されたｈＤＬＬ３／ＢａＦ＿Ｈ３、２．５×１０４個の細胞）を、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および細胞膜のための生体適合性アンカー（ＹＵＫＡ  ＳＡＮＧＹＯ）としてのＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＯＥ−０８０ＣＳで予めコーティングされた、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ３８４ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）上に固相化した。固相化された細胞を、Ｂ細胞培養上清の２０マイクロリットル（μＬ）と共に１時間インキュベートした。上清を吸引し、細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．０２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１３９ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭグルコース、０．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．３４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および０．１％ＢＳＡ）で洗浄した。洗浄後、ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体ＨＲＰコンジュゲート（ＢＥＴＨＹＬ、Ａ１２０−１１１Ｐ）を添加した。細胞を、氷上で１時間、さらにインキュベートし、洗浄した。次いで、ＡＢＴＳ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、ＳＰＥＣＴＲＡＭａｘ  ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてＯＤ４０５を分析した。
【０２８０】
合計２８，８６４個のＢ細胞クローンを、ヒトＤＬＬ３を発現するＢａ／Ｆ３への結合についてスクリーニングし、８４６個のクローンを、ｈＤＬＬ３／ＢａＦ＿Ｈ３に結合するＤＬＬ３特異的結合剤として選択した。選択されたクローンを、ＤＬＡ０００１〜ＤＬＡ０８４６と命名した。ＤＬＡ０００１〜ＤＬＡ０８４６のＲＮＡを、ＺＲ−９６  Ｑｕｉｃｋ−ＲＮＡキット（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ、カタログ番号Ｒ１０５３）を使用することによって、凍結保存された細胞ペレットから精製した。抗体重鎖可変領域のＤＮＡを、逆転写ＰＣＲによって増幅し、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションして、対応する重鎖を形成させた。抗体軽鎖可変領域のＤＮＡを、逆転写ＰＣＲによって増幅し、ｈｋ０ＭＣ軽鎖定常領域をコードするＤＮＡ（アミノ酸配列は配列番号１０に示される）とライゲーションして、対応する軽鎖を形成させた。クローニングされた抗体を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で発現させ、機能性評価のために培養上清から精製した。表３に列挙されるいくつかの抗ＤＬＬ３抗体を、さらなる分析のために選択した。
また、抗ＤＬＬ３抗体（ＤＬＡ０３１６）重鎖可変領域のＤＮＡを、ウサギＩｇＧ重鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションし、抗ＤＬＬ３抗体（ＤＬＡ０３１６）軽鎖可変領域のＤＮＡを、ウサギカッパ鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションした。この抗体を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で一過的に発現させ、ＤＬＡ０３１６−ｒｂＩｇＧと命名した。
【０２８１】
表３は、選択された抗ＤＬＬ３抗体の可変領域の配列番号を示す。
【０２８２】
【表３】
2021509403.tif 000006
【０２８３】
実施例４．選択された抗ＤＬＬ３抗体（単一特異性）のエピトープマッピング
全長ＤＬＬ３タンパク質および実施例１で調製されたヒトＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質の構造図を、図１に示す。実施例１で調製されたヒトＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質を、抗ＤＬＬ３抗体のエピトープマッピングのために使用した。
【０２８４】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ３８４ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ヒトＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質ｄｅｌ０〜ｄｅｌ６のそれぞれでコーティングし、２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ＮＡＣＡＬＡＩ  ＴＥＳＱＵＥ）でブロックした。ブロッキング緩衝液を除去し、組換え抗ＤＬＬ３抗体を、室温で１時間、固相化されたタンパク質と共にインキュベートし、ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、ＨＥＰＥＳ）で洗浄した。次いで、モノクローナルＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ、クローンＭ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、室温で１時間インキュベートし、洗浄した。次いで、ＡＢＴＳ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、ＳＰＥＣＴＲＡＭａｘ  ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてＯＤ４０５を分析した。
【０２８５】
図２は、ヒトＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質への結合を示す。それぞれのバー（ＯＤ４０５値）は、ヒトＤＬＬ３  ＥＣＤ断片タンパク質のそれぞれに対する試験抗体の反応性を表す。どのドメインの欠失が、抗体結合を廃止するかを試験することによって、抗体エピトープを推測することができ、それぞれの抗体のエピトープを、図１に示す。
【０２８６】
実施例５．抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体の生成および機能性評価
実施例５．１がん細胞表面上でのＤＬＬ３発現の評価
培養がん細胞株ＳＫ−ＭＥＬ３０（ＤＳＭＺ）、ＮＣＩ−Ｈ１４３６（ＡＴＣＣ）、およびＮＣＩ−Ｈ２２２７（ＡＴＣＣ）の細胞表面上でのＤＬＬ３の発現を、フローサイトメトリーによって評価した。
【０２８７】
がん細胞（５×１０５個の細胞）を、０．５％ＢＳＡ添加ＣｅｌｌＷＡＳＨ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（以後、ＦＡＣＳ／ＰＢＳと呼ぶ）で洗浄した。二価抗ＤＬＬ３抗体（ＤＬＡ０３１６−ｒｂＩｇＧ）または対照抗体（ウサギＩｇＧ）を、５０μＬ溶液中、２０μｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。４℃で３０〜６０分間静置した後、細胞をＦＡＣＳ／ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ／ＰＢＳで５０倍希釈されたＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を、細胞に添加した。４℃でさらに３０分間静置した後、細胞をＦＡＣＳ／ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。ＤＬＬ３は、それぞれのがん細胞株上で発現されることを見出した（図３）。
【０２８８】
実施例５．２  抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体の機能的特徴
実施例５．２．１  ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）溶液の調製
初代ヒトＰＢＭＣ溶液を、健康なボランティアから新鮮に単離した。
【０２８９】
新鮮なＰＭＢＣ溶液については、１，０００ユニット／ｍＬのヘパリン溶液（Ｎｏｖｏ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、５，０００ユニット、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）１００μＬを予めロードしたシリンジを使用して、それぞれの健康なボランティア（成人の個体）から、５０ｍＬの末梢血を収集した。この末梢血を、ＰＢＳ（−）中で２倍に希釈し、４つのアリコートに分割し、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳをロードし、前もって遠心分離にかけた、リンパ球分離用のＬｅｕｃｏｓｅｐチューブ（カタログ番号２２７２９０、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に添加した。この分離チューブを遠心分離し（室温で１０分間、２，１５０ｒｐｍ）し、単核細胞画分を収集した。単核細胞画分中の細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ）で１回洗浄し、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０を使用して４×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に調整した。この細胞懸濁液を、以下の実験においてヒトＰＢＭＣ溶液として使用した。
【０２９０】
実施例５．２．２  細胞増殖阻害の比率による抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）の測定
表３に記載された一部の抗ＤＬＬ３単一特異性抗体およびＷＯ２０１１／０９３０９７Ａ１に記載された一部の抗ＤＬＬ３抗体を、抗ＣＤ３抗体（重鎖の可変領域、配列番号５７、軽鎖の可変領域、配列番号５８）と一緒に使用して、他の場所に公開された従来の方法を使用して抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を生成した。抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体中のＤＬＬ３結合アームのＣＤＲ配列を、表４に示す。
【０２９１】
生成された二重特異性抗体はそれぞれ、Ｆｃガンマ受容体に対する親和性が減じられたＦｃ領域を含有していた。
【０２９２】
表４は、抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体中のＤＬＬ３結合アームのＨＶＲ（ＣＤＲ）配列の配列番号を示す。
【０２９３】
【表４】
2021509403.tif 000007
【０２９４】
表４中の「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、および「ＬＣＤＲ３」は、それぞれ、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３に対応する。
【０２９５】
図４は、生成された抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）を示す。細胞傷害活性を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、細胞増殖阻害の比率によって評価した。ＳＫ−ＭＥＬ  ３０ヒトがん細胞株を、標的細胞として使用した。標的細胞を皿から分離させ、細胞を１×１０４細胞／ウェルに調整することによって１００μＬ／ウェルのアリコート中、Ｅプレート９６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上に播種し、細胞増殖の測定を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して開始した。２４時間後、プレートを取り出し、各濃度（０．００１、０．０１、０．１、１または１０ｎｍｏｌ／Ｌ）で調製されたそれぞれの抗体の５０μＬのアリコートをプレートに添加した。室温で１５分間反応させた後、実施例５．２．１で調製された新鮮なヒトＰＢＭＣ溶液５０μＬを、エフェクター（ＰＢＭＣ）／標的（ＳＫ−ＭＥＬ３０）比２（すなわち、２×１０４細胞／ウェル）で添加し、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、細胞増殖の測定を再開した。３７℃で５％二酸化炭素ガスの条件下で、反応を実行した。ＰＢＭＣを添加した３８時間後、細胞増殖阻害（ＣＧＩ）率（％）を、以下の式を使用して決定した。計算において使用したｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒから得られた細胞指数値は、抗体添加の直前の時点での細胞指数値を１と定義した場合の正規化された値であった。
細胞増殖阻害率（％）＝（Ａ−Ｂ）ｘ１００／（Ａ−１）。
【０２９６】
Ａは、抗体を添加しないウェル（標的細胞およびヒトＰＢＭＣのみを含有する）中での平均細胞指数値を表し、Ｂは、生成された抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体の１つを含有する標的ウェルの平均細胞指数値を表す。実験を、３回繰り返し実施した。
【０２９７】
分析した全ての抗体を、ＳＫ−ＭＥＬ−３０細胞株を使用するＴＤＣＣアッセイにかけた。全ての二重特異性抗体は、用量依存的様式で細胞増殖阻害を示し、細胞増殖阻害率は、１０ｎｍｏｌ／Ｌの抗体濃度で８０％を超えていた。二重特異性抗体ＤＬＡ０３１６／Ｎｏ．１２およびＤＬＡ０８４１／Ｎｏ．１２が、最も強いＴＤＣＣ活性を示した（図４）。
【０２９８】
実施例５．２．３  ＳＣＬＣにおけるカルセイン放出アッセイによるキメラ抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＴＤＣＣの測定
小細胞肺がん細胞株に対する抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＴＤＣＣも分析した。細胞傷害活性を、カルセイン−アセトキシメチル放出アッセイによって評価した。ＮＣＩ−Ｈ１４３６およびＮＣＩ−Ｈ２２２７ヒトがん細胞株を、標的細胞として使用した。アッセイを３組行った。標的細胞を、３７℃で２ｈ、カルセイン−アセトキシメチル（カルセイン−ＡＭ；Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）で標識化した後、洗浄した。それぞれの最終濃度（０．００１、０．０１、０．１、１または１０ｎＭ）で調製された抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を、９６ウェルＵ底プレート中にピペットで注入し、カルセイン標識化された標的細胞懸濁液（２ｘ１０５細胞／ｍＬ）を各ウェルに添加した。室温で１５分間、プレートを静置した後、エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）懸濁液（５ｘ１０６細胞／ｍＬ）をウェルに添加した。９６ウェルプレートを撹拌した後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、３７℃で約４時間、５％ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。９６ウェルプレートをよく撹拌した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各ウェルに由来する培養培地の１００μＬのアリコートを、９６ウェル平底プレートに移した。ＥｎＳｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて吸光度（４９５ｎｍ、参照５１５ｎｍ）を測定した。最大放出のために、細胞を０．５％ＮＰ−４０で溶解した。培養培地バックグラウンドの蛍光値を、実験放出（Ａ）、標的細胞の自発的放出（Ｂ）、および標的細胞の最大放出（Ｃ）の値から差し引いた。細胞傷害を、以下の式：
細胞傷害（％）＝（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）ｘ１００
を使用して算出した。
【０２９９】
図５は、小細胞肺がん細胞株に対する抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＴＤＣＣを示す。ＤＬＡ０３１６／Ｎｏ．１２は、２つの小細胞肺がん細胞株の両方に対して用量依存的様式で細胞傷害を示した。
【０３００】
実施例６．ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍効能の評価
上記の抗体の一部を、腫瘍担持モデルを使用してそれらのｉｎ  ｖｉｖｏでの効能について評価した。
【０３０１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍効能の評価を、実施例５に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて細胞傷害活性を有すると確認された、抗ヒトＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体（ＤＬＡ０３１６／Ｎｏ．１２、ＤＬＡ０８４１／Ｎｏ．１２、およびＤＬＡ０５８０／Ｎｏ．１２）を使用して実行した。がん細胞株をＮＯＤ  ｓｃｉｄマウスに移植し、腫瘍形成が確認されたＮＯＤ  ｓｃｉｄマウスを、ヒトＰＢＭＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養によって増殖したＴ細胞の移植にかけた。マウス（Ｔ細胞注入モデルと呼ぶ）を、抗ヒトＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体の投与によって処置した。
【０３０２】
より具体的には、ＳＫ−ＭＥＬ−３０（ＡＴＣＣ）移植Ｔ細胞注入モデルを使用する抗ヒトＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍効能試験において、以下の試験を実施した。購入したＰＢＭＣおよびＴ細胞活性化／拡大キット／ヒト（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、Ｔ細胞を拡大培養した。ヒトがん細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−３０（１ｘ１０７細胞）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ）と混合し、ＮＯＤ  ｓｃｉｄマウス（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ、メス、６Ｗ〜８Ｗ）の鼠径皮下領域に移植した。移植の当日を、０日目と定義した。移植の前日（０日目）に、抗アシアロ−ＧＭ１抗体（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を、０．２ｍｇ／マウスでマウスに腹腔内投与した。移植後１０日目に、マウスを、その体重および腫瘍サイズに応じて群に分け、抗アシアロ−ＧＭ１抗体を０．２ｍｇ／マウスで再びマウスに腹腔内投与した。次の日、上記の拡大培養によって得られたＴ細胞を、３ｘ１０７細胞／マウスで腹腔内に移植した。Ｔ細胞移植の４時間後、抗ヒトＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を、５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇで尾静脈を介して静脈内投与した。抗ヒトＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を、１回だけ投与した。
【０３０３】
抗腫瘍活性（腫瘍体積増加の阻害）を、溶媒を投与した対照群と比較して、抗ヒトＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を投与した群において観察した（図６）。
【０３０４】
ＮＣＩ−Ｈ１４３６移植Ｔ細胞注入モデル上でのＤＬＡ０３１６／Ｎｏ．１２に関する抗腫瘍効能試験を、同様の方法によって実施した。腫瘍移植後、１６日目に、マウスを群に分け、次の日にＴ細胞を移植した。Ｔ細胞移植の３日後、抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を、５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。
【０３０５】
抗腫瘍活性（腫瘍体積増加の阻害）を、溶媒を投与した対照群と比較して、ＤＬＡ０３１６／Ｎｏ．１２を投与した群において観察した（図７Ａ）。
【０３０６】
ＮＣＩ−Ｈ２２２７移植Ｔ細胞注入モデル上でのＤＬＡ０３１６／Ｎｏ．１２に関する抗腫瘍効能試験を、同様の方法によって実施した。腫瘍移植後、１８日目に、マウスを群に分け、１７日目にＴ細胞を移植した。Ｔ細胞移植の３日後、抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を、５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。
【０３０７】
抗腫瘍活性（腫瘍体積増加の阻害）を、溶媒を投与した対照群と比較して、ＤＬＡ０３１６／Ｎｏ．１２を投与した群において観察した（図７Ｂ）。
【０３０８】
実施例７．抗ＤＬＬ３単一特異性抗体のヒト化および最適化
ヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を、ヒト生殖系列フレームワークを使用して設計した。設計された重鎖および軽鎖可変領域のポリヌクレオチドを、それぞれ、重鎖定常領域ＳＧ１配列（配列番号５９（アミノ酸配列は配列番号６０に示される））および軽鎖定常領域ＳＫ１配列（配列番号６１（アミノ酸配列は配列番号６２に示される））を含有する発現ベクター中にクローニングした。ヒト化抗体を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で一過的に発現させ、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を上記のように実行した。ヒト化抗体およびその親抗体の配列を、以下の表５に示す。
【０３０９】
選択されたヒト化抗体を、さらに最適化した。ＣＤＲ領域中の脱アミド化、異性化、スクシンイミド形成、メチオニンおよびトリプトファン酸化ならびに非対システインのシステイン化などの化学的分解を回避するために、選択されたヒト化抗体の配列内のアミノ酸残基を、元のアミノ酸とシステインを除く、他の１８種のアミノ酸に変異させた。上記の方法によって、バリアントを一過的に発現させ、精製した。精製されたモノクローナル抗体バリアントを、上記の方法を使用するＢＩＡｃｏｒｅによって評価し、ヒトＤＬＬ３およびカニクイザルＤＬＬ３に結合することができる目的のバリアントを親抗体として選択した。次いで、ＣＤＲ中でのこれらの変異の組合せを有する抗体を生成した。これらの様々な変異を含有する抗体のＨＶＲ（ＣＤＲ）配列を、親抗体のＨＶＲ（ＣＤＲ）配列と共に、以下の表６に示す。
【０３１０】
表５は、生成された抗ＤＬＬ３抗体の配列番号を示す。
【０３１１】
【表５】
2021509403.tif 000008
【０３１２】
表６は、生成された抗ＤＬＬ３抗体のＨＶＲ（ＣＤＲ）配列の配列番号を示す。
【０３１３】
【表６】
2021509403.tif 000009
【０３１４】
表６中の「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、および「ＬＣＤＲ３」は、それぞれ、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、およびＨＶＲ−Ｌ３に対応する。
【０３１５】
実施例８．抗ＤＬＬ３抗体の競合分析
ビオチン標識化された抗ＤＬＬ３抗体の調製
以前に報告された抗ＤＬＬ３抗体の可変領域を含む抗ＤＬＬ３抗体（ＤＬ３０１−ＳＧ１、ＤＬ３０６−ＳＧ１、ＤＬ３０９−ＳＧ１、ＤＬ３１２−ＳＧ１、ＤＬＬ３−１４−ＳＧ１、ＤＬＬ３−２２−ＳＧ１、ＤＬＬ３−４−ＳＧ１およびＤＬＬ３−６−ＳＧ１）を、上記と同じ様式で調製した。可変重鎖および軽鎖配列（ＶＨおよびＶＬ）を、それぞれ、ＳＧ１（配列番号６０）およびＳＫ１（配列番号６２）を含む発現ベクター中にクローニングした。抗ＤＬＬ３抗体の配列を、以下の表７に示す。
【０３１６】
表７は、調製された抗ＤＬＬ３抗体の配列番号を示す。
【０３１７】
【表７】
2021509403.tif 000010
【０３１８】
抗ＤＬＬ３抗体（ＤＬ３０１−ＳＧ１、ＤＬ３０６−ＳＧ１、ＤＬ３０９−ＳＧ１、ＤＬ３１２−ＳＧ１、Ｄ３０３１６ＡＥ０２−ＳＧ１、およびＤ３０８４１ＡＥ０５−ＳＧ１）を、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で標識化することによって、ビオチン標識化された抗ＤＬＬ３抗体を調製した。
【０３１９】
Ｏｃｔｅｔアッセイ
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ３８４（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を使用して、抗体のパネルのためのエピトープビニングによる競合結合アッセイを実施した。４０ｎＭのビオチン化抗体（ＤＬ３０１−ＳＧ１、ＤＬ３０６−ＳＧ１、ＤＬ３０９−ＳＧ１、ＤＬ３１２−ＳＧ１、Ｄ３０３１６ＡＥ０２−ＳＧ１、およびＤ３０８４１ＡＥ０５−ＳＧ１）を最初にストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーにロードした。次に、センサーを２０ｎＭのヒトＤＬＬ３に曝露した後、８０ｎＭの第２抗体に曝露する。第２抗体は、ＤＬ３０１−ＳＧ１、ＤＬ３０６−ＳＧ１、ＤＬ３０９−ＳＧ１、ＤＬ３１２−ＳＧ１、Ｄ３０３１６ＡＥ０２−ＳＧ１、Ｄ３０８４１ＡＥ０５−ＳＧ１、ＤＬＬ３−１４−ＳＧ１、ＤＬＬ３−２２−ＳＧ１、ＤＬＬ３−４−ＳＧ１、およびＤＬＬ３−６−ＳＧ１である。生データを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ’ｓ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７．０を使用してプロセシングし、抗体対を競合結合について評価した。第２抗体による追加の結合は、非占有エピトープ（非競合剤）を示すが、結合がないことは、エピトープブロッキング（競合剤）を示す。
【０３２０】
競合的抗体結合が存在するかどうかを決定するために、抗体Ａを最初にストレプトアビジンバイオセンサーに固相化し、抗原と抗体Ｂとの複合体の逐次的結合を測定した。
【０３２１】
抗体Ｂの抗体Ａに対する競合比を、以下の式：
競合比（抗体Ｂの抗体Ａに対する比）＝
［結合応答（抗体Ｂ−抗原）］／［結合応答（抗原−抗体Ａ）］
を使用して算出した。
【０３２２】
その結果、Ｄ３０８４１ＡＥ０５−ＳＧ１がＤＬ３０６−ＳＧ１と競合し、Ｄ３０３１６ＡＥ０２−ＳＧ１は、試験した他の抗体と競合しないことが示された（図８）。
【０３２３】
実施例９．抗ヒトＤＬＬ３／抗ヒトＣＤ３二重特異性抗体の調製
表５に記載された抗ＤＬＬ３単一特異性抗体および抗ＣＤ３抗体を使用して、他の場所に公開された従来の方法を使用して、抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を生成した。抗ＤＬＬ３アームと抗ＣＤ３アームとの組合せを、表８に示す。
【０３２４】
生成される二重特異性抗体は、Ｆｃガンマ受容体に対する親和性が減じられたサイレントＦｃを含有する。これらの分子のために、Ｉｇａｗａら（ＷＯ２０１６１５９２１３）によって報告されたＦａｂアーム交換技術を使用して、二重特異性抗体を作製した。
【０３２５】
表８は、調製された抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体の可変領域の配列番号を示す。
【０３２６】
【表８】
2021509403.tif 000011
【０３２７】
実施例１０．抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体中の抗ＤＬＬ３アームの結合親和性評価のためのＢｉａｃｏｒｅ分析
ｐＨ７．４での抗ＤＬＬ３／ＣＤ３抗体中の抗ＤＬＬ３アームのヒトまたはカニクイザルＤＬＬ３への結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して３７℃で評価した。抗ヒトＦｃ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＣＭ４センサーチップの全てのフローセル上に固相化した。二重特異性抗体を、抗Ｆｃセンサー表面上に捕捉した後、組換えヒトまたはカニクイザルＤＬＬ３をフローセル上に注入した。全ての抗体および分析物を、２０ｍＭ  ＡＣＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、０．００５％ＮａＮ３を含有するＡＣＥＳ  ｐＨ７．４中で調製した。センサー表面を、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を用いて各サイクルで再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ評価ソフトウェア、バージョン２．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、データを１：１結合モデルにプロセシングし、適合させることによって、結合親和性を決定した。
【０３２８】
二重特異性抗体の抗ＤＬＬ３アームの、組換えＤＬＬ３への結合親和性を、表９に示す。
【０３２９】
表９は、二重特異性抗体の抗ＤＬＬ３アームの結合親和性を示す。
【０３３０】
【表９】
2021509403.tif 000012
【０３３１】
実施例１１．抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体の抗ＣＤ３アームの結合親和性評価のためのＢｉａｃｏｒｅ分析
ｐＨ７．４での抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体の抗ＣＤ３アームの、ＣＤ３への結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、３７℃で評価した。抗ヒトＦｃ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＣＭ４センサーチップの全てのフローセル上に固相化した。二重特異性抗体を、抗Ｆｃセンサー表面上に捕捉した後、組換えヒトＣＤ３ｅｇタンパク質（ＣＤ３イプシロン−ガンマ、ＣＤ３イプシロンとＣＤ３ガンマとのヘテロ二量体）を、フローセル上に注入した。全ての抗体および分析物を、２０ｍＭ  ＡＣＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、０．００５％ＮａＮ３を含有するＡＣＥＳ  ｐＨ７．４中で調製した。センサー表面を、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を用いて各サイクルで再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ評価ソフトウェア、バージョン２．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、データを１：１結合モデルにプロセシングし、適合させることによって、結合親和性を決定した。
【０３３２】
二重特異性抗体の様々な抗ＣＤ３アームの、組換えＣＤ３ｅｇタンパク質への結合親和性を、表１０に示す。
【０３３３】
表１０は、二重特異性抗体の抗ＣＤ３アームの結合親和性を示す。
【０３３４】
【表１０】
2021509403.tif 000013
【０３３５】
実施例１２．細胞増殖阻害の比率によるヒト化抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）の測定
ヒト化抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体に関するＴＤＣＣアッセイを、実施例５．２．２に記載されたものと同様の方法によって実施した。ＳＫ−ＭＥＬ３０ヒトがん細胞株を、標的細胞として使用し、アッセイ時間は４８または７２時間であった。図９は、ヒト化抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＴＤＣＣを示す。ヒト化抗体は、その親クローンと比較して、同レベルのＴＤＣＣ活性を示し、十分な効能と結論付けられた。
【０３３６】
実施例１３．抗ヒトＤＬＬ３／抗ヒトＣＤ３二重特異性抗体の調製
表５に記載された抗ＤＬＬ３単一特異性抗体Ｄ３０８４１ＡＥ１３−ＳＧ１および抗ＣＤ３抗体を使用して、他の場所に公開された従来の方法を使用して、抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体を生成した。配列番号を、表１１に示す。
【０３３７】
表１１は、調製された抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体の可変領域の配列番号を示す。
【０３３８】
【表１１】
2021509403.tif 000014
【０３３９】
生成される二重特異性抗体は、Ｆｃガンマ受容体に対する親和性が減じられたサイレントＦｃを含有する。これらの分子のために、Ｉｇａｗａら（ＷＯ２０１６１５９２１３）によって報告されたＦａｂアーム交換技術を使用して、二重特異性抗体を作製した。
【０３４０】
実施例１４．細胞増殖阻害の比率によるヒト化抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）の測定
実施例１３で作製された抗ＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性抗体のＴＤＣＣアッセイを、実施例５．２．２に記載されたものと同様の方法によって実施した。ＳＫ−ＭＥＬ  ３０ヒトがん細胞株を、標的細胞として使用した。エフェクター細胞に関して、凍結されたＰＢＭＣを使用した。凍結されたＰＢＭＣを調製するために、凍結バイアルを、３７℃の水浴中に入れて、凍結された細胞を解凍した。次いで、細胞を、９ｍＬの培地（標的細胞を培養するために使用した培地）を含有する１５ｍＬのファルコンチューブに分注した。次いで、細胞懸濁液を、室温で５分間、１，２００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。上清を穏やかに吸引し、新鮮な加温した培地を、再懸濁のために添加した。ＰＢＭＣを、エフェクター：標的比５でＳＫ−ＭＥＬ−３０と共に培養した。ＰＢＭＣの添加の７２時間後、細胞増殖阻害率（％）をプロットし、図１０に示した。
【０３４１】
図１０に示されるように、Ｄ３０８４１ＡＥ１３／ＴＲ０１と、Ｄ３０８４１ＡＥ１３／ｈｕ４０Ｇ５ｃとの両方が、二重特異性抗体の１および１０ｎＭの濃度でＴＤＣＣ活性を示した。
【０３４２】
前記発明は、理解を明確にするために実例および実施例によっていくらか詳細に説明されてきたが、その説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用された全ての特許文献および科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０３４３】
本発明は、強い抗腫瘍活性およびがん抗原とは無関係にサイトカインストームなどを誘導しない優れた安全性特性を有する新規な抗原結合分子を提供する。活性成分として本発明の抗原結合分子を含む細胞傷害誘導剤は、ＤＬＬ３発現細胞およびこれらの細胞を含有する腫瘍組織を標的とし、細胞傷害を誘導することができる。本発明の抗原結合分子または抗体の患者への投与は、高レベルの安全性を有するだけでなく、身体的負担も低減された望ましい処置を有することを可能にし、非常に便利である。
【図１】
2021509403.tif 000015
【図２】
2021509403.tif 000016
【図３】
2021509403.tif 000017
【図４】
2021509403.tif 000018
【図５】
2021509403.tif 000019
【図６】
2021509403.tif 000020
【図７】
2021509403.tif 000021
【図８】
2021509403.tif 000022
【図９】
2021509403.tif 000023
【図１０】
2021509403.tif 000024
【配列表】
2021509403000001.app
【国際調査報告】
2021509403.tif 000025
2021509403.tif 000026