(57)【要約】  抗体はヒトクローディン−１８．２を特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体。前記抗体をエンコードする核酸、発現ベクター、宿主細胞、および前記抗体を発現するための方法も提供される。本開示は、前記抗体を含む、免疫複合体、二重特異性分子、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス、および医薬組成物、ならびに本開示の抗クローディン−１８．２抗体を使用する診断法または治療法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローディン−１８．２に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域、ならびに前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域が、（１）それぞれ、配列番号：１、４、７、１０、１３、および１６、（２）それぞれ、配列番号：２、４、８、１１、１３、および１６、（３）それぞれ、配列番号：２、４、９、１０、１４、および１６、（４）それぞれ、配列番号：２、５、９、１２、１３、および１６、または（５）それぞれ、配列番号：３、６、８、１０、１５、および１６のアミノ酸配列を含む、
モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
前記重鎖可変領域が、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域が、配列番号：５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、または６６に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域が、（１）それぞれ、配列番号：１７および５０；（２）それぞれ、配列番号：１８および５１；（３）それぞれ、配列番号：１９および５２；（４）それぞれ、配列番号：２０および５３；（５）それぞれ、配列番号：２１および５４；（６）それぞれ、配列番号：２２および５５；（７）それぞれ、配列番号：２３および５５；（８）それぞれ、配列番号：２４および５５；（９）それぞれ、配列番号：２５および５５；（１０）それぞれ、配列番号：２６および５５；（１１）それぞれ、配列番号：２７および５５；（１２）それぞれ、配列番号：２７および５６；（１３）それぞれ、配列番号：２７および５７；（１４）それぞれ、配列番号：２８および５６；（１５）それぞれ、配列番号：２８および５７；（１６）それぞれ、配列番号：２９および５８；（１７）それぞれ、配列番号：３０および５８；（１８）それぞれ、配列番号：３１および５８；（１９）それぞれ、配列番号：３２および５８；（２０）それぞれ、配列番号：３３および５８；（２１）それぞれ、配列番号：３４および５８；（２２）それぞれ、配列番号：３４および５９；（２３）それぞれ、配列番号：３４および６０；（２４）それぞれ、配列番号：３５および５８；（２５）それぞれ、配列番号：３５および５９；（２６）それぞれ、配列番号：３５および６０；（２７）それぞれ、配列番号：３６および６１；（２８）それぞれ、配列番号：３７および６１；（２９）それぞれ、配列番号：３８および６１；（３０）それぞれ、配列番号：３９および６１；（３１）それぞれ、配列番号：４０および６１；（３２）それぞれ、配列番号：４１および６１；（３３）それぞれ、配列番号：４１および６２；（３４）それぞれ、配列番号：４１および６３；（３５）それぞれ、配列番号：４２および６１；（３６）それぞれ、配列番号：４２および６２；（３７）それぞれ、配列番号：４２および６３；（３８）それぞれ、配列番号：４３および６４；（３９）それぞれ、配列番号：４４および６４；（４０）それぞれ、配列番号：４５および６４；（４１）それぞれ、配列番号：４６および６４；（４２）それぞれ、配列番号：４７および６４；（４３）それぞれ、配列番号：４８および６４；（４４）それぞれ、配列番号：４８および６５；（４５）それぞれ、配列番号：４８および６６；（４６）それぞれ、配列番号：４９および６５；または（４７）それぞれ、配列番号：４９および６６に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
配列番号：６７または８９に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域と、配列番号：６８または９０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域とをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
（ａ）ヒトクローディン−１８．２を結合する、（ｂ）クローディン−１８．１を結合しない、（ｃ）ヒトクローディン−１８．２発現細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘導する、かつ（ｄ）ヒトクローディン−１８．２発現細胞に対する補体依存性細胞傷害活性を誘導する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
マウス、ヒト、キメラ、またはヒト化抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
非フコシル化抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、二重特異性分子、免疫複合体、キメラ抗原受容体、操作されたＴ細胞受容体、または腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１１】
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をエンコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
抗腫瘍薬剤をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
クローディン−１８．２発現に関連付けられた癌疾患の治療における使用のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
前記癌疾患が、膵臓癌、胃癌、大腸癌、食道癌、肝癌、卵巣癌、肺癌、および膀胱癌からなる群より選択される、請求項１４に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、免疫賦活性抗体、共刺激抗体、化学療法剤、γδＴ細胞を刺激する薬剤、および／またはクローディン−１８．２の発現を安定化または増大する薬剤と共に投与される、請求項１４に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
前記免疫賦活性抗体が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体、および抗ＲＯＲ１抗体からなる群より選択される、請求項１６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
前記γδＴ細胞を刺激する薬剤がゾレドロン酸である、請求項１６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１９】
クローディン−１８．２の発現を安定化または増大する前記薬剤が、（ｉ）エピルビシン、オキサリプラチン、および５−フルオロウラシル、（ｉｉ）エピルビシン、オキサリプラチン、およびカペシタビン、（ｉｉｉ）エピルビシン、シスプラチン、および５−フルオロウラシル、（ｉｖ）エピルビシン、シスプラチン、およびカペシタビン、（ｖ）フォリン酸、オキサリプラチン、および５−フルオロウラシルを含む、請求項１６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ヒトクローディン−１８．２に特異的に結合する抗体、その調製および使用に関し、特に、腫瘍（膵臓癌、胃癌、大腸癌、食道癌、肝癌、卵巣癌、肺癌、および膀胱癌など）を含む、クローディン−１８．２を発現する細胞に関連付けられた疾病の診断、予防、および治療における、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
［癌および抗体療法］
【０００３】
癌は今日の社会において死亡数の最も高い疾病の１つである。２０１４年世界癌報告によると、毎年約１４１０万の新たな癌の症例（黒色腫以外の皮膚癌は含まない）が発生している。癌により年間約８８０万人が死亡した（ＧＢＤ  ２０１５  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ，（２０１６）Ｌａｎｃｅｔ  ３８８（１００５３）：１５４５−１６０２）。たとえば、先進国において胃癌は、癌関連の死亡で多く見られる原因として、男性で第４位、女性で第５位である。
【０００４】
多くの癌、特に進行期の癌は、治癒が困難なままである。たとえば、胃食道癌の５年全生存率は、実質的な副作用とそれ自体が関連付けられた現在の標準的な治療の攻撃性にもかかわらず、２０〜２５％に過ぎない。膵臓癌では、被験体は通常、進行期で診断されるため、予後は極めて悪く、生存期間中央値は６ヵ月未満であり、５年生存率は５．５％未満である。
【０００５】
抗体療法は幅広い癌種を治療することを様々な管轄で認可されており、患者転帰が著しく向上している（Ｋｏｍｅｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８９：１２７−１３５）。抗体は、癌抗原に結合されると、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘導するか、補体系を活性化するか、または受容体がそのリガンドと相互作用することを妨害する場合があり、いずれによっても癌細胞死に至らせることができる。米国ＦＤＡ認可の抗体医薬として、アレムツズマブ、ニボルマブ、リツキシマブ、およびデュルバルマブが挙げられる。
【０００６】
［クローディン−１８．２］
【０００７】
クローディンは、１９９８年、Ｓｈｏｒｉｃｈｉｒｏ  Ｔｓｕｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．により初めて報告され（Ｆｕｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４１（７）：１５３９−１５５０）、傍細胞バリアを確立し、細胞間の分子の流れを制御する細胞表面タンパク質のファミリーである（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０：５４１９５７）。クローディンは、上皮細胞極性の維持、傍細胞拡散の制御、ならびに細胞増殖および分化の調節において重要な役割を果たす密着結合の不可欠な構成要素である。他の２つの主な密着結合ファミリータンパク質は、オクルディンおよび接合部接着分子（ＪＡＭ）である。各クローディン分子は、細胞膜に４回伸びており、Ｎ末端およびＣ末端がいずれも細胞質にある。
【０００８】
現在まで、哺乳類でクローディンは２４メンバーが報告されており、クローディン−１３はヒトには存在しない。異なるクローディンのメンバーは異なる組織上に発現し、それらの改変された機能は癌の形成に関連づけられてきた。クローディン−１、クローディン−１８、およびクローディン−１０の発現レベルの変化はそれぞれ、大腸癌、胃癌、および肝細胞癌と関連付けられてきており、したがって、クローディンは治療計画にとって期待の持てる標的となっている（Ｓｗｉｓｓｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５７（６）：９１９−９２８）。
【０００９】
クローディン−１８はＣＬＤ１８としても知られており、２つのアイソフォームを有する。クローディン−１８．１は、正常な肺および胃の上皮において選択的に発現する。クローディン−１８．２も、極めて制限された発現パターンを正常な組織において有し、胃上皮の短命の分化細胞上にのみ限られており、胃幹細胞ゾーンには明白に不在である。
【００１０】
しかしながら、クローディン−１８．２は原発性胃癌およびその転移のかなりの割合において大量に存在し、その悪性形質転換において重要な役割を果たす。たとえば、クローディン−１８．２の異所性活性化が、膵臓腫瘍、食堂腫瘍、卵巣腫瘍、および肺腫瘍において見出された（Ｎｉｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１（２１）：７３８０−７３９０、Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ５９（１０）：９４２−９５２、Ｍｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １３５（９）：２２０６−２２１４、Ｓｈｉｍｏｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８６３（６  Ｐｔ  Ａ）：１１７０−１１７８、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７）Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １０（１）：１０５、Ｔｏｋｕｍｉｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７）Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２８（２）：１１６−１２１）。
【００１１】
クローディン−１８．２は、モノクローナル抗体結合に利用可能な露出した細胞外ループを有し、ＣＬＤＮ１８．２抗体は癌を治療するための研究において使用されてきた。たとえば、Ｇａｎｙｍｅｄ社によって開発されたキメラ抗クローディン−１８．２ＩｇＧ１抗体であるクローディキシマブ（ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ）（ＩＭＡＢ３６２）は、進行した胃食道癌の臨床試験第１段階および第２段階において期待の持てる有効性を示している（Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１８）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １００：１７−２６）。
【００１２】
多くの悪性腫瘍において医療ニーズが満たされていないため、より望ましい医薬的特徴を有するさらなる抗クローディン−１８．２モノクローナル抗体がさらに必要とされる。
【発明の概要】
【００１３】
本開示は単離されたモノクローナル抗体、たとえば、クローディン−１８．２（たとえばヒトクローディン−１８．２、およびサルクローディン−１８．２）に結合し、従来技術と比較してより高いＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、および／またはクローディン−１８．２結合安定性を有する、マウス、ヒト、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体を提供する。
【００１４】
本開示の抗体は、クローディン−１８．２タンパク質の検出、およびクローディン−１８．２に関連する癌の診断、治療、または予防を含む、様々な用途に使用することができる。
【００１５】
したがって、一態様において、本開示は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を有するクローディン−１８．２を結合する、単離されたモノクローナル抗体（たとえば、ヒト化抗体）またはその抗原結合部分に関係し、ここで、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域は、
（１）それぞれ、配列番号：１、４および７；
（２）それぞれ、配列番号：２、４および８；
（３）それぞれ、配列番号：２、４および９；
（４）それぞれ、配列番号：２、５および９；もしくは
（５）それぞれ、配列番号：３、６および８；に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、または上記配列番号に記載されるアミノ酸配列を含み、
ここで、抗体またはその抗原結合性部分はクローディン−１８．２に結合する。
【００１６】
一態様において、本開示の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、もしくは４９に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、または上記配列番号に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ここで、抗体またはその抗原結合性部分はクローディン−１８．２に結合する。
【００１７】
一態様において、本開示の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域は、
（１）それぞれ、配列番号：１０、１３および１６；
（２）それぞれ、配列番号：１１、１３および１６；
（３）それぞれ、配列番号：１０、１４および１６；
（４）それぞれ、配列番号：１２、１３および１６；もしくは
（５）それぞれ、配列番号：１０、１５および１６；に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、または上記配列番号に記載されるアミノ酸配列を含み、
ここで、抗体またはその抗原結合性部分はクローディン−１８．２に結合する。
【００１８】
一態様において、本開示の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、もしくは６６に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、または上記配列番号に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、抗体またはその抗原結合性部分はクローディン−１８．２に結合する。
【００１９】
一態様において、本開示の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、それぞれがＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域、ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域は、（１）それぞれ、配列番号：１、４、７、１０、１３および１６；（２）それぞれ、配列番号：２、４、８、１１、１３および１６；（３）それぞれ、配列番号：２、４、９、１０、１４および１６；（４）それぞれ、配列番号：２、５、９、１２、１３および１６；もしくは（５）それぞれ、配列番号：３、６、８、１０、１５および１６に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、または上記配列番号に記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、抗体またはその抗原結合性部分はクローディン−１８．２に結合する。
【００２０】
一実施形態において、本開示の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、（１）それぞれ、配列番号：１７および５０；（２）それぞれ、配列番号：１８および５１；（３）それぞれ、配列番号：１９および５２；（４）それぞれ、配列番号：２０および５３；（５）それぞれ、配列番号：２１および５４；（６）それぞれ、配列番号：２２および５５；（７）それぞれ、配列番号：２３および５５；（８）それぞれ、配列番号：２４および５５；（９）それぞれ、配列番号：２５および５５；（１０）それぞれ、配列番号：２６および５５；（１１）それぞれ、配列番号：２７および５５；（１２）それぞれ、配列番号：２７および５６；（１３）それぞれ、配列番号：２７および５７；（１４）それぞれ、配列番号：２８および５６；（１５）それぞれ、配列番号：２８および５７；（１６）それぞれ、配列番号：２９および５８；（１７）それぞれ、配列番号：３０および５８；（１８）それぞれ、配列番号：３１および５８；（１９）それぞれ、配列番号：３２および５８；（２０）それぞれ、配列番号：３３および５８；（２１）それぞれ、配列番号：３４および５８；（２２）それぞれ、配列番号：３４および５９；（２３）それぞれ、配列番号：３４および６０；（２４）それぞれ、配列番号：３５および５８；（２５）それぞれ、配列番号：３５および５９；（２６）それぞれ、配列番号：３５および６０；（２７）それぞれ、配列番号：３６および６１；（２８）それぞれ、配列番号：３７および６１；（２９）それぞれ、配列番号：３８および６１；（３０）それぞれ、配列番号：３９および６１；（３１）それぞれ、配列番号：４０および６１；（３２）それぞれ、配列番号：４１および６１；（３３）それぞれ、配列番号：４１および６２；（３４）それぞれ、配列番号：４１および６３；（３５）それぞれ、配列番号：４２および６１；（３６）それぞれ、配列番号：４２および６２；（３７）それぞれ、配列番号：４２および６３；（３８）それぞれ、配列番号：４３および６４；（３９）それぞれ、配列番号：４４および６４；（４０）それぞれ、配列番号：４５および６４；（４１）それぞれ、配列番号：４６および６４；（４２）それぞれ、配列番号：４７および６４；（４３）それぞれ、配列番号：４８および６４；（４４）それぞれ、配列番号：４８および６５；（４５）それぞれ、配列番号：４８および６６；（４６）それぞれ、配列番号：４９および６５；もしくは（４７）それぞれ、配列番号：４９および６６に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、または上記配列番号に記載されるアミノ酸配列を含み、
抗体またはその抗原結合性部分はクローディン−１８．２に結合する。
【００２１】
一実施形態において、本開示の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および軽鎖を含み、重鎖は重鎖可変領域および重鎖定常領域を含み、軽鎖は軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含み、ここで、重鎖定常領域および軽鎖定常領域は、それぞれ、配列番号：６７および６８、もしくはそれぞれ、配列番号：８９および９０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するか、または上記配列番号に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は上記のアミノ酸配列を含み、ここで、抗体またはその抗原結合性部分はクローディン−１８．２に結合する。
【００２２】
いくつかの実施形態における本開示の抗体は、ジスルフィド結合によって連結される２本の重鎖および２本の軽鎖を含むか、または当該重鎖および当該軽鎖からなり、ここで、各重鎖は重鎖定常領域、重鎖可変領域、または上述のＣＤＲ配列を含み、各軽鎖は軽鎖定常領域、軽鎖可変領域、または上述のＣＤＲ配列を含み、重鎖可変領域のＣ末端は重鎖定常領域のＮ末端に連結し、軽鎖可変領域のＣ末端は軽鎖定常領域のＮ末端に連結し、抗体はクローディン−１８．２に結合する。本開示の抗体は、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプの、完全長抗体であってよい。他の実施形態における本開示の抗体は、単鎖抗体であってもよく、またはＦａｂ断片もしくはＦａｂ′２断片などの抗体断片からなっていてよい。
【００２３】
本開示の例示的な抗体または抗原結合性部分は、ヒトクローディン−１８．２に結合し、クローディン−１８．２を発現する細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を誘導する。当該抗体または当該抗原結合性部分はヒトクローディン−１８．１には結合しない。本開示の例示的な抗体または抗原結合性部分はインビボ抗腫瘍効果を有する
【００２４】
本開示はまた、本開示の抗体またはその抗原結合部分を含み、細胞毒素などの治療剤に連結される免疫複合体を提供する。本開示はまた、本開示の抗体またはその抗原結合部分を含み、上記抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能性部分（たとえば第２の抗体）に連結される、二重特異性分子を提供する。別の態様において、本開示の抗体またはその抗原結合部分はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部にすることができる。本開示の抗体またはその抗原結合部分はまた、腫瘍溶解性ウイルスによってエンコードされるか、または腫瘍溶解性ウイルスと併せて使用することができる。
【００２５】
本開示の抗体またはその抗原結合部分または免疫複合体または二重特異性分子、および医薬的に許容される担体を含む組成物も提供される。
【００２６】
本開示の抗体またはその抗原結合部分をエンコードする核酸分子も、そのような核酸を含む発現ベクターおよびそのような発現ベクターを含む宿主細胞と共に、本開示によって包含される。発現ベクターを含む宿主細胞を用いて抗クローディン−１８．２抗体を調製するための方法も提供され、当該方法は、（ｉ）宿主細胞で抗体を発現させるステップ、および（ｉｉ）宿主細胞またはその細胞培養物から抗体を単離するステップを含む。
【００２７】
ある態様において、本開示は被験体の癌疾患を診断するための方法を提供し、当該方法は、被験体から関心対象の組織試料を収集するステップと、本開示の抗体またはその抗原結合部分に組織試料を接触させるステップとを含む。一定量のクローディン−１８．２が検出されている場合、被験体はある特定の癌であると診断してよい。癌は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、食道癌、肝癌、卵巣癌、肺癌、および膀胱癌からなる群より選択される固形腫瘍であってよい。
【００２８】
さらに別の態様において、本開示は被験体の癌疾患を予防し、治療し、寛解させるための方法を提供し、当該方法は、本開示の抗体またはその抗原結合部分を治療効果のある量で被験体に投与するステップを含む。癌は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、食道癌、肝癌、卵巣癌、肺癌、および膀胱癌からなる群より選択される固形腫瘍であってよい。いくつかの実施形態において、方法は、本開示の組成物、二重特異性分子、免疫複合体、ＣＡＲ−Ｔ細胞、または抗体をエンコードするもしくは抗体を持つ腫瘍溶解性ウイルスを投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体などの、少なくとも１つのさらなる抗癌抗体を、本開示の抗体またはその抗原結合部分と共に投与することができる。さらに別の実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、サイトカイン（たとえばＩＬ−２および／またはＩＬ−２１）、または共刺激抗体（たとえば抗ＣＤ１３７および／または抗ＧＩＴＲ抗体）と共に投与される。さらに別の実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、化学療法剤と共に投与され、化学療法剤は、エピルビシン、オキサリプラチン、および／または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの細胞傷害剤であってよい。本開示の抗体は、たとえばマウス、ヒト、キメラ抗体またはヒト化抗体であってよい。
【００２９】
一態様において、本開示は被験体の癌疾患を治療または予防するための方法を提供し、当該方法は、γδＴ細胞を刺激する薬剤と組み合わせて、本開示の抗体またはその抗原結合部分を治療効果のある量で被験体に投与するステップを含む。γδＴ細胞を刺激する薬剤は、本開示の抗体またはその抗原結合部分の投与前、投与と同時、投与に続いて投与してよい。γδＴ細胞は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞であってよい。一実施形態において、γδＴ細胞を刺激する薬剤は、ビスホスホネート類、具体的には、Ｎ−ビスホスホネートおよびアミノビスホスホネートなどの窒素含有ビスホスホネート類である。一実施形態において、γδＴ細胞を刺激する薬剤は、ゾレドロン酸、好ましくは、インターロイキン−２と組み合わせたゾレドロン酸である。
【００３０】
一実施形態において、本開示の癌疾患治療法は、クローディン−１８．２の発現を安定化または増大させる薬剤を投与するステップをさらに含む。クローディン−１８．２は、癌細胞の細胞表面で発現することが好ましい。クローディン−１８．２の発現を安定化または増大させる薬剤は、オキサリプラチンおよび／または５−ＦＵであってよい。
【００３１】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例から明らかとなり、これらの詳細な説明および例は限定するものと解釈されるべきではない。本出願にわたって引用されるすべての参考文献、ジェンバンクのデータ、特許および出願公開特許の内容は、参照により明白に本明細書に引用される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ヒトクローディン−１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞に対する抗クローディン−１８．２抗体の結合親和性を示す。
【００３３】
【図２】ヒトクローディン−１８．２を過剰発現するＭＣ３８細胞に対する抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【００３４】
【図３】ＥＯＦで前処理したＫＡＴＯＩＩＩ細胞（Ａ）またはＮＵＧＣ４細胞（Ｂ）に対する抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【００３５】
【図４】ヒトクローディン−１８．２（Ａ）またはヒトクローディン−１８．１（Ｂ）を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞に対する抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【００３６】
【図５】ヒトクローディン−１８．２を過剰発現するＭＣ３８細胞に対する抗クローディン−１８．２抗体のＣＤＣ活性を示す。
【００３７】
【図６】ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトクローディン−１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞に対する抗クローディン−１８．２の結合安定性を示し、ここで、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１時間、４℃で抗クローディン−１８．２抗体と共にインキュベートし、非結合の抗体を除去後、さらに０時間、３時間、または５時間、３７℃でインキュベートした。
【００３８】
【図７】ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトクローディン−１８．２またはヒトクローディン−１８．１を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞に対する抗クローディン−１８．２の結合親和性を示し、ここで、ヒト化抗クローディン−１８．２抗体は、１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−３０（Ａ）、１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３５ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−３５（Ｂ）、ならびに１８Ｆ２−５ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−５ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−５（Ｃ）を含む。
【００３９】
【図８】ヒトクローディン−１８．２を過剰発現するＭＣ３８細胞に対するヒト化抗クローディン−１８．２抗体のＣＤＣ活性を示し、ここで、ヒト化抗クローディン−１８．２抗体は、１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−３０（Ａ）、１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３５ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−３５（Ｂ）、ならびに１８Ｆ２−５ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−５ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−５（Ｃ）であった。
【００４０】
【図９】ヒトクローディン−１８．２を過剰発現するＭＣ３８細胞に対するヒト化抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性を示し、ここで、ヒト化抗クローディン−１８．２抗体は、１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−３０（Ａ）、１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３５ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−３５（Ｂ）、ならびに１８Ｆ２−５ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−５ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−５（Ｃ）であった。
【００４１】
【図１０】ＥＯＦで前処理したＮＵＧＣ４細胞（Ａ）またはＫＡＴＯＩＩＩ細胞（Ｂ）に対するヒト化抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【００４２】
【図１１】ヒトクローディン−１８．１（Ａ）またはヒトクローディン−１８．２（Ｂ）を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞に対する抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【００４３】
【図１２】ヒトクローディン−１８．１（Ａ）またはヒトクローディン−１８．２（Ｂ）を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するヒト化抗クローディン−１８．２抗体のＣＤＣ活性を示す。
【００４４】
【図１３】アッセイされた、ヒトクローディン−１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するヒト化抗クローディン−１８．２の結合安定性を示し、ここで、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１時間、４℃でヒト化抗クローディン−１８．２抗体と共にインキュベートし、非結合の抗体を除去後、さらに０時間、３時間、または５時間、３７℃でインキュベートした。
【００４５】
【図１４】ヒトクローディン−１８．２に対するヒトクローディン−１８．１のアミノ酸配列アラインメントを示し、ここで、囲われた個所は細胞外ループ１領域を表し、矢印はこの領域におけるアミノ酸の相違を表す。
【００４６】
【図１５】変異体１４を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞に対する抗クローディン−１８．２抗体の結合親和性を示す。
【００４７】
【図１６】ヒトクローディン−１８．１、変異体１５（クローディン−１８．１／Ｓ４２Ａ／Ｑ４５Ｎ／Ｑ５６Ｅ）または変異体１６（クローディン−１８．１／Ｓ４２Ａ／Ｑ４５Ｎ  Ｅ４７Ｑ／Ｑ５６Ｅ）を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞に対する抗クローディン−１８．２抗体の結合親和性を示し、ここで、抗体はＩＭＡＢ３６２（Ａ）、１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０（Ｂ）、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３（Ｃ）、および１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０（Ｄ）であった。
【００４８】
【図１７】ＰＢＭＣによる、ヒトクローディン−１８．２を発現するＭＣ３８細胞（Ａ）またはＮＵＧＣ−４細胞（Ｂ）に対するヒト化抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【００４９】
【図１８】Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞による、ヒトクローディン−１８．２を発現するＭＣ３８細胞（Ａ）またはＮＵＧＣ−４細胞（Ｂ）に対するヒト化抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【００５０】
【図１９】本開示のヒト化抗ＯＸ４０抗体または対照薬剤を投与した群における、平均腫瘍体積（Ａ）および個別の腫瘍重量（Ｂ）を示し、抗クローディン−１８．２抗体のインビボ抗腫瘍効果を表す。
【００５１】
【図２０】化学療法薬と組み合わせた場合の抗クローディン−１８．２抗体のインビボ抗腫瘍効果を示す。
【００５２】
【図２１】ＥＯＦで前処理したＮＵＧＣ４細胞に対する非フコシル化抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性を示し、ここで、非フコシル化抗クローディン−１８．２抗体は１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０ＡＦ（Ａ）および１８Ｆ２−３５ＶＨ７ＶＬ３ＡＦ（Ｂ）であった。
【００５３】
【図２２】ヒトクローディン−１８．２を発現するＭＣ３８細胞に対する非フコシル化抗クローディン−１８．２抗体のＣＤＣ活性を示し、ここで、非フコシル化抗クローディン−１８．２抗体は１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０ＡＦ（Ａ）および１８Ｆ２−３５ＶＨ７ＶＬ３ＡＦ（Ｂ）であった。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
確実に本開示がより容易に理解され得るように、まずある特定の用語を定義する。追加の定義は詳細な説明を通して記載される。
【００５５】
用語「クローディン−１８．２」はクローディン−１８、アイソフォーム２を指す。用語「クローディン−１８．２」はバリアント、ホモログ、オーソログ、およびパラログを含む。たとえば、ヒトクローディン−１８．２タンパク質に特異的な抗体はある特定の場合に、カニクイザルなどのヒト以外の種由来のクローディン−１８．２タンパク質と交差反応する場合がある。他の実施形態において、ヒトクローディン−１８．２タンパク質に特異的な抗体は、完全にヒトクローディン−１８．２タンパク質に特異的であり他の種または他の種類に対して交差反応性を示さない場合がある、またはある特定の他の種由来のクローディン−１８．２と交差反応するが他の種すべてと交差反応するわけではない場合がある。
【００５６】
用語「ヒトクローディン−１８．２」は、ジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００１００２０２６を有するアミノ酸配列などのヒト由来のアミノ酸配列を有するクローディン−１８．２タンパク質を指す。
【００５７】
本明細書において言及される用語「抗体」は、抗体全体およびその任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）または単鎖を含む。抗体全体とは、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質類である。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができ、その領域にはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、以下のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または宿主因子への免疫グロブリンの結合を仲介することができる。
【００５８】
本明細書で用いられる用語、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片（たとえばクローディン−１８．２タンパク質）を指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。用語抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ'）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域であるナノボディが挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコード化されるが、単一のタンパク質鎖としてそれらの作製を可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いてそれらを接続することができ、そのタンパク質鎖において、ＶＬ領域およびＶＨ領域は対になって（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である）１価分子を形成する。たとえば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。そのような単鎖抗体も、用語抗体の「抗原結合部分」内に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、断片はインタクトな抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００５９】
本明細書で用いられる「単離された抗体」は、実質的に異なる抗原特異性を有する他の抗体を含まない抗体を指す（たとえば、クローディン−１８．２タンパク質を特異的に結合する単離された抗体には、クローディン−１８．２タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的に含まない）。しかしながら、ヒトクローディン−１８．２タンパク質を特異的に結合する単離された抗体は、他の種由来のクローディン−１８．２タンパク質などの他の抗原に対して交差反応性を有してよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてよい。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「マウス抗体」は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がマウスの生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図されている。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もマウス生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のマウス抗体は、マウス生殖系列免疫グロブリン配列によってエンコードされていないアミノ酸残基を含むことができる（たとえば、インビトロのランダム変異もしくは部位特異的変異またはインビボの体細胞変異によって導入される変異）。しかしながら、本明細書で用いられる用語「マウス抗体」は、別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がマウスフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことは意図されていない。
【００６２】
用語「キメラ抗体」は、非ヒト源由来の遺伝子材料をヒト由来の遺伝子材料と組み合わせることによって作製された抗体を指す。あるいはより一般的に、キメラ抗体は、ある特定の種由来の遺伝子材料を別の種由来の遺伝子材料と共に有する抗体である。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「ヒト化抗体」は、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントとの類似性を高めるようにそのタンパク質配列が修飾されている非ヒト種由来の抗体を指す。
【００６４】
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書において、用語「抗原と特異的に結合する抗体」と交換可能に使用される。
【００６５】
本明細書で用いられる「ヒトクローディン−１８．２に特異的に結合する」抗体は、ヒトクローディン−１８．２タンパク質（および場合により、１つまたは複数の非ヒト種由来のクローディン−１８．２タンパク質）に結合するが、非クローディン−１８．２タンパク質には実質的に結合しない抗体を指すことが意図されている。抗体がヒトクローディン−１８．２タンパク質に「高親和性」に、つまり、好ましくは、１．０×１０−８Ｍ以下、より好ましくは、５．０×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。
【００６６】
本明細書で用いられる用語タンパク質または細胞に「実質的に結合しない」は、タンパク質または細胞に結合しない、またはそれらに高親和性を持って結合しない、すなわち、ＫＤが１．０×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１．０×１０−２Ｍ以上でタンパク質または細胞に結合するという意味である。
【００６７】
用語ＩｇＧ抗体に対する「高親和性」は、標的抗原に対して、ＫＤが１．０×１０−６Ｍ以下、より好ましくは５．０×１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは１．０×１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５．０×１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは１．０×１０−９Ｍ以下である抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。たとえば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、ＫＤが１０−６Ｍ以下、より好ましくは１０−７Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−８Ｍ以下である抗体を指す。
【００６８】
用語「ＥＣ５０」は、半数効果濃度としても公知であり、特定の暴露時間の後、基線値と最大値との中間の応答を引き起こす抗体濃度を指す。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」、または「ＡＤＣＣ」は細胞媒介性の免疫防御機構を指し、これにより、その膜−表面抗原が抗クローディン−１８．２抗体などの抗体によって結合されている腫瘍細胞などの標的細胞を免疫系のエフェクター細胞が活発に溶解する。
【００７０】
用語「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は一般に、ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体のエフェクター機能を指し、それらの抗体は、表面抗原に結合されると古典的補体経路をもたらし、膜侵襲複合体の形成および標的細胞の溶解を誘導する。本開示の抗体は、クローディン−１８．２に結合することにより、癌細胞に対してＣＤＣを誘導する。
【００７１】
用語「被験体」は任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類などの、哺乳類および非哺乳類を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどの哺乳類が好ましい。
【００７２】
用語「治療効果のある量」は、（癌などの）疾患または症状に関連付けられた症状を予防または寛解し、かつ／または疾患または症状の重症度を軽減するのに十分な本開示の抗体の量を意味する。治療効果のある量は、文脈の中で治療される疾患に対するものと理解され、ここで、実際の効果のある量は当業者によって容易に見極められる。
【００７３】
用語「γδＴ細胞」は、Ｔ細胞受容体が１つのγ鎖および１つのδ鎖からなるＴ細胞を指す。ヒトγδＴ細胞は、感染性疾患でのストレス監視応答、自己免疫、および腫瘍における形質転換誘導性変化において重要な役割を果たす。抗原係合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）の際、病変部位で活性化したγδＴ細胞は、他のエフェクター細胞の動員を媒介するサイトカインおよび／またはケモカインを供給し、ＡＤＣＣなどの即時のエフェクター機能を示す。末梢血液中のほとんどのγδＴ細胞はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞受容体を発現し、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞と呼ばれる。
【００７４】
用語「γδＴ細胞を刺激する薬剤」は、具体的にはγδＴ細胞の活性化および増殖を誘導することによって、インビトロかつ／またはインビボで、γδＴ細胞、特にＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の発達を刺激する化合物を指す。この用語は、好ましくはメバロン酸経路酵素であるファルネシルピロリン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）を阻害することによって、インビトロおよび／またはインビボで、哺乳類細胞において産生されるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を増大する化合物に関することが好ましい。
【００７５】
以下のサブセクションにおいて、本開示の様々な態様をさらに詳細に説明する。
【００７６】
［ヒトクローディン−１８．２に結合特異性を有する抗クローディン−１８．２抗体および有益な機能特性］
【００７７】
本開示の例示的な抗体は、高い親和性で特異的にヒトクローディン−１８．２に結合する。具体的には、本開示の例示的な抗体は、ＩＭＡＢ３６２のＥＣ５０値と同程度のＥＣ５０値でヒトクローディン−１８．２タンパク質に結合するが、より高いＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、および／またはクローディン−１８．２結合安定性を有する。本開示の例示的な抗体は、ヒトクローディン−１８．１に結合しない。
【００７８】
本開示の好ましい抗体はモノクローナル抗体である。追加的に、または代替的に、抗体は、たとえばマウス、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体であり得る。
【００７９】
［モノクローナル抗クローディン−１８．２抗体］
【００８０】
本開示の例示的な抗体は、以下に説明するようにかつ以下の実施例において構造的かつ化学的に特徴付けられるモノクローナル抗体であるか、またはその抗原結合部分である。例示的な抗クローディン−１８．２抗体またはその抗原結合部分のＶＨアミノ酸配列は、配列番号：１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９に記載される。例示的な抗クローディン−１８．２抗体または抗原結合部分のＶＬアミノ酸配列は、配列番号：５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、または６６に示される。抗体の重鎖／軽鎖可変領域を含んでいてよい例示的な抗クローディン−１８．２抗体または抗原結合部分は、以下の表１に要約されており、クローンの一部は同じＶＨまたはＶＬを共有する。例示的な抗クローディン−１８．２抗体は、重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含んでいてもよく、重鎖定常領域および軽鎖定常領域はそれぞれ、配列番号：６７および６８に、または代替的にそれぞれ配列番号：８９および９０に記載されており、重鎖可変領域のＣ末端は重鎖定常領域のＮ末端に連結され、軽鎖可変領域のＣ末端は軽鎖定常領域のＮ末端に連結されている。
【００８１】
表１における重鎖可変領域のＣＤＲおよび軽鎖可変領域のＣＤＲはＫａｂａｔ番号付けシステムによって定義されている。しかしながら、当技術分野で周知であるように、ＣＤＲ領域は、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいた、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、またはＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステム／法などの他のシステムによって決定することもできる。
表１  重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列番号
【表１】
2021509889.tif 000002
【００８２】
ヒトクローディン−１８．２に結合する他の抗クローディン−１８．２抗体のＶＨおよび／またはＶＬ配列（またはＣＤＲ配列）は、本開示の抗クローディン−１８．２抗体のＶＨおよび／またはＶＬ配列（またはＣＤＲ配列）と「混ぜて組み合わせる」ことができる。ＶＨおよびＶＬ鎖（またはそのような鎖内のＣＤＲ）が混ぜて組み合わされる際、特定のＶＨ／ＶＬの対合由来のＶＨ配列は、構造的に類似のＶＨ配列と置き換えられることが好ましい。同様に、特定のＶＨ／ＶＬの対合由来のＶＬ配列は、構造的に類似のＶＬ配列と置き換えられることが好ましい。
【００８３】
したがって、一実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）上記表１に列挙されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）上記表１に列挙されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または別の抗クローディン−１８．２抗体のＶＬを含み、ここで、抗体はヒトクローディン−１８．２を特異的に結合する。
【００８４】
別の実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）上記表１に列挙される重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２，およびＣＤＲ３領域、および
（ｂ）上記表１に列挙される軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２，およびＣＤＲ３領域、または別の抗クローディン−１８．２抗体のＣＤＲを含み、ここで、抗体はヒトクローディン−１８．２を特異的に結合する。
【００８５】
さらに別の実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトクローディン−１８．２を結合する他の抗体のＣＤＲ、たとえば重鎖可変領域由来のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３、ならびに／または異なる抗クローディン−１８．２抗体の軽鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３、と組み合わされた抗クローディン−１８．２抗体の重鎖可変ＣＤＲ２領域を含む。
【００８６】
さらに、ＣＤＲ３ドメインは、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインから独立して単独で、同族抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができること、ＣＤＲ３配列に基づいて同じ結合特異性を有する複数の抗体を予測通りに産生することができることは、当技術分野では周知である。たとえば、Ｋｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３（２）：２５２−２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１−２１６２（１９９４）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９−２５３３（１９９５）；Ｄｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９−７４９（１９９６）；Ｂｅｒｅｚｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ  ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ８（２００１）；Ｉｇａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２−７（１９９５）；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２：８０７−１０（１９９８）；Ｌｅｖｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４−８（１９９３）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８−５３２９（１９９４）およびＸｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）を参照されたい。米国特許第６，９５１，６４６号明細書、同第６，９１４，１２８号明細書、同第６，０９０，３８２号明細書、同第６，８１８，２１６号明細書、同第６，１５６，３１３号明細書、同第６，８２７，９２５；５，８３３，９４３号明細書、同第５，７６２，９０５号明細書、および同第５，７６０，１８５号明細書も参照されたい。これらの参考文献の各々は、本明細書にその全体が参照により引用される。
【００８７】
別の実施形態において、本開示の抗体は、抗クローディン−１８．２抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２、ならびに少なくとも抗クローディン−１８．２抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ３、または別の抗クローディン−１８．２抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み、ここで、抗体はヒトクローディン−１８．２に特異的に結合することができる。これらの抗体は、（ａ）クローディン−１８．２と結合するために競合し、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、かつ／または（ｄ）本開示の抗クローディン−１８．２抗体と類似の結合親和性を有することが好ましい。さらに別の実施形態において、抗体は、抗クローディン−１８．２抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、または別の抗クローディン−１８．２抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２をさらに含んでもよく、ここで、抗体はヒトクローディン−１８．２に特異的に結合することができる。別の実施形態において、本開示の抗体は、抗クローディン−１８．２抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１、または別の抗クローディン−１８．２抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１を含んでもよく、ここで、抗体はヒトクローディン−１８．２に特異的に結合することができる。
【００８８】
［保存的修飾］
【００８９】
別の実施形態において、本開示の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列の重鎖および／または軽鎖可変領域配列を含み、当該配列は、１つまたは複数の保存的修飾分だけ本開示の抗クローディン−１８．２抗体の配列とは異なる。抗原結合を除去しないある特定の保存的配列修飾が行われ得ることは当技術分野において理解される。たとえば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２：１１８０−８；ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５−４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４−２６８７０；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５−１２；Ｋｅｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２−３５；Ａｄｉｂ−Ｃｏｎｑｕｙ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１−６およびＢｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５−４３を参照されたい。
【００９０】
したがって、一実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびに／またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、上記表１に列挙された配列、および／またはその保存的修飾を含み、かつ／または
（ｂ）重鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、上記表１に列挙された配列、およびその保存的修飾を含み、かつ／または
（ｃ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、上記表１に列挙された配列、およびその保存的修飾を含み、かつ／または
（ｄ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、上記表１に列挙された配列、および／またはその保存的修飾を含み、かつ
（ｅ）抗体はヒトクローディン−１８．２を特異的に結合する。
【００９１】
本開示の抗体は、上述した次の機能特性、ヒトクローディン−１８．２への高親和性結合、およびクローディン−１８．２を発現する細胞に対してＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を誘発する能力などのうち１つまたは複数を有する。
【００９２】
様々な実施形態において、抗体は、たとえば、マウス、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体であってよい。
【００９３】
本明細書で用いられる用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に著しく影響しない、または当該結合特性を著しく改変しないアミノ酸修飾を指すことを意図するものである。そのような保存的修飾としては、アミノ酸の置換、付加、および欠失が挙げられる。修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当技術分野で公知の標準的な技術によって本開示の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシ）、および芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含むアミノ酸が挙げられる。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換され得、改変された抗体は、本明細書に記載される機能アッセイを用いて、保持された機能（すなわち上述の機能）に関して試験することができる。
【００９４】
［操作および修飾された抗体］
【００９５】
本開示の抗体は、修飾された抗体を設計するための出発材料として本開示の抗クローディン−１８．２抗体の１つまたは複数のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗体を使用して、調製することができる。一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内の、たとえば、１つまたは複数のＣＤＲ領域内のかつ／または１つまたは複数のフレームワーク領域内の、１つまたは複数の残基を修飾することによって、結合親和性を向上させるように、かつ／またはある特定の動物種において天然に産生される抗体バリアントへの類似性を高めるように抗体を操作することができる。たとえば、フレームワーク領域は、ヒト化抗体を提供するように修飾される。追加的に、または代替的に、定常領域内の残基を修飾することによって、たとえば抗体のエフェクター機能を改変させるように抗体を操作することができる。
【００９６】
特定の実施形態において、ＣＤＲ移植法を用いて抗体の可変領域を操作することができる。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由ために、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体間でＣＤＲ外の配列よりも多種多様である。ＣＤＲ配列は大部分の抗体−抗原相互作用を担っているため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植された特定の天然に存在する抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３を参照されたい。米国特許第  ５，２２５，５３９号明細書、同第５，５３０，１０１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、および同第６，１８０，３７０号明細書も参照されたい）。
【００９７】
したがって、本開示の別の実施形態は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関係し、当該抗体は、上述の本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または上述の本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む。これらの抗体は、本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含むと同時に、異なるフレームワーク配列を含むことができる。
【００９８】
そのようなフレームワーク配列は、公開されたＤＮＡデータベースまたは生殖系列抗体遺伝子配列を含む公表された参考文献から得ることができる。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネットで入手可能、ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ）ならびにＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）、上記で引用された；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；およびＣｏｘ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６；に見出すことができ、これら各々の内容は、参照により本明細書において明確に引用される。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、ジェンバンクデータベースに見出すことができる。たとえば、ＨＣｏ７ＨｕＭＡｂマウスに認められる以下の重鎖生殖系列配列は、付随のジェンバンクアクセッション番号１−６９（ＮＧ−−００１０１０９、ＮＴ−−０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ−−００１０１０９およびＮＴ−−０２４６３７）、および３−７（ＮＧ−−００１０１０９およびＮＴ−−０２４６３７）において入手可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ＨｕＭＡｂマウスに認められる以下の重鎖生殖系列配列は、付随のジェンバンクアクセッション番号１−６９（ＮＧ−−００１０１０９、ＮＴ−−０２４６３７、およびＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ−−００１０１０９およびＮＴ−−０２４６３７）、４−３４（ＮＧ−−００１０１０９およびＮＴ−−０２４６３７）、３−３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）および３−２３（ＡＪ４０６６７８）において入手可能である。
【００９９】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知であるＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９７）、上記）と呼ばれる配列類似性検索法の１つを用いて、編集されたタンパク質配列データベースに対して比較される。
【０１００】
本開示の抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似の配列である。フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に認められる配列と同一の配列を有するＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列をフレームワーク領域に移植することができる、または、生殖系列配列と比較して１つまたは複数の変異を含むＣＤＲ配列をフレームワーク領域に移植することができる。たとえば、ある特定の例において、フレームワーク領域内の残基を変異させて、抗体の抗原結合能力を維持または増強することは有益であることが見出されている（たとえば、米国特許第５，５３０，１０１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
【０１０１】
別の種類の可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それによって関心対象の抗体の１つまたは複数の結合特性（たとえば、親和性）を向上させることである。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発を実施して、変異を導入することができる、または抗体結合への効果もしくは関心対象の他の機能特性を、当技術分野で公知のインビトロまたはインビボアッセイで評価することができる。（当技術分野で公知の）保存的修飾を導入することが好ましい。変異はアミノ酸置換、付加、または欠失であってよいが、置換が好ましい。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４、または５個を超えない残基が改変される。
【０１０２】
したがって、別の実施形態において、本開示により、単離された抗クローディン−１８．２モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が提供され、単離された抗クローディン−１８．２モノクローナル抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、（ａ）本開示の配列または１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域、（ｂ）本開示の配列または１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域、（ｃ）本開示の配列または１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域、（ｄ）本開示の配列または１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域、（ｅ）本開示の配列または１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域、および（ｆ）本開示の配列または１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３域、を含む。
【０１０３】
本開示の操作された抗体は、たとえば、抗体の特性を向上させるように、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾がなされた抗体を含む。典型的に、そのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少するためになされる。たとえば、１つのアプローチは、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異させる（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」ことである。より具体的には、体細胞変異を経た抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定することができる。
【０１０４】
別の種類のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低減するために、フレームワーク領域内の、またはさらには１つまたは複数のＣＤＲ領域内の、１つまたは複数の残基を変異させることを伴う。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許公報第２００３０１５３０４３号明細書においてさらに詳細に説明されている。
【０１０５】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内の修飾に加えて、またはその代替法として、本開示の抗体を、Ｆｃ領域内の修飾を含むように、典型的には、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害などの、抗体の１つまたは複数の機能特性を改変させるように操作することができる。さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾することができる（たとえば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に結合させることができる）、またはそのグリコシル化を改変させ、さらに抗体の１つまたは複数の機能特性を改変させることができる。
【０１０６】
一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が改変されるように、たとえば、増加するかまたは減少するように、修飾される。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号明細書においてさらに説明されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、たとえば軽鎖および重鎖のアセンブリを促進するように、または抗体の安定性を増加させるかまたは減少させるように、改変される。
【０１０７】
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように変異される。より具体的には、抗体が、天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に比べて損なわれているＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌタンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を有するように、１つまたは複数のアミノ酸変異をＦｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に導入する。このアプローチは、米国特許第６，１６５，７４５号明細書においてさらに詳細に説明されている。
【０１０８】
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化は修飾される。たとえば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を有さない）。グリコシル化は、たとえば、抗原に対する抗体の親和性を高めるように、改変され得る。そのような炭水化物修飾は、たとえば、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を改変することによって達成することができる。たとえば、１つまたは複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の排除をもたらし、それによりその部位でのグリコシル化を排除する、１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。そのような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高める場合がある。たとえば、米国特許第５，７１４，３５０号明細書、同６，３５０，８６１号明細書を参照されたい。
【０１０９】
追加的に、または代替的に、フコシル残基の量が低減した低フコシル化抗体またはｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮａｃ構造が増大した抗体などの、改変された種類のグリコシル化を有する抗体を作製することができる。そのような改変されたグリコシル化パターンは抗体のＡＤＣＣ能力を増大することが実証されている。そのような炭水化物修飾は、たとえば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞内で抗体を発現することによって達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当技術分野で説明されており、本開示の組換え抗体を自身の中に発現させて、それにより改変されたグリコシル化を有する抗体を産生させる宿主細胞として使用することができる。たとえば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞株で発現された抗体がその炭水化物上のフコースを欠くように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子であるＦＵＴ８（α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ）を欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞株は、２つの置換ベクターを使用し、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞においてＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作成した（米国特許公報第２００４０１１０７０４号明細書およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−２２を参照されたい）。別の例として、欧州特許出願第１，１７６，１９５号明細書には、α−１，６結合関連酵素を低減または排除することによって、細胞株に発現された抗体が低フコシル化を示すように、機能が破壊されたＦＵＴ８遺伝子（ＦＵＴ８遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをエンコードする）を有するそのような細胞株について記載されている。欧州特許出願１，１７６，１９５号明細書にはまた、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加するための酵素活性が低い、またはその酵素活性を有さない細胞株、たとえばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）について記載されている。国際公開第０３／０３５８３５号には、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合させる能力が低減され、その宿主細胞に発現された抗体の低フコシル化ももたらす、バリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞について記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照されたい）。国際公開第０６／０８９２３１号に記載されるように、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体はまた、鶏卵中で産生させることができる。代替的には、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、アオウキクサ属などの植物細胞中で産生させることができる。国際公開第９９／５４３４２号には、操作された細胞株において発現された抗体が、ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、結果として抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらすように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（たとえば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株について記載��れている（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）も参照されたい）。代替的には、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を使用して切断することができ、たとえば、フコシダーゼであるα−Ｌ−フコシダーゼは抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３）。
【０１１０】
本開示によって企図される本明細書における抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体は、たとえば、抗体の生物学的（たとえば血清）半減期を延長するためにペグ化することができる。抗体をペグ化するに、典型的には、抗体またはその断片を、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が抗体または抗体断片に結合される条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのＰＥＧと反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性水溶性ポリマー）を用いたアシル化反応、またはアルキル化反応を介して実行することが好ましい。本明細書で用いられるように、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシもしくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために用いられてきたＰＥＧのいずれかの形態を包含することを意図するものである。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は、当技術分野で公知であり、本開示の抗体に適用することができる。たとえば、欧州特許出願０１５４３１６号明細書および欧州特許出願０４０１３８４号明細書を参照されたい。
【０１１１】
［抗体の物性］
【０１１２】
本開示の抗体は、その種々のクラスを検出および／または区別するために、その様々な物性によって特徴付けることができる。
【０１１３】
たとえば抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて、１つまたは複数のグリコシル化部位を含むことができる。そのようなグリコシル化部位により、改変された抗原結合に起因して、抗体の免疫原性が増大するか、または抗体のｐＫが改変されることになる場合がある（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２；Ｇａｌａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４；Ｗａｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９；Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４５２−７；Ｍｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、（２０００）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにおいて生じることが公知である。いくつかの場合において、可変領域グリコシル化を含まない抗クローディン−１８．２抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択するか、またはグリコシル化領域内の残基を変異させるかのいずれかによって、達成することができる。
【０１１４】
好ましい実施形態において、抗体はアスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミドは、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で起こり、結果として、ポリペプチド鎖にねじれを導入し、その安定性を減少させる（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基が作られる場合がある。
【０１１５】
各抗体は、それぞれに等電点（ｐＩ）を有することになり、等電点は一般に、６と９．５との間のｐＨ範囲になる。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的に、７〜９．５のｐＨ範囲内になり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは典型的に、６〜８のｐＨ範囲内になる。通常の範囲外にあるｐＩを有する抗体は、インビボ条件下で、アンフォールディングおよび不安定性をいくらか有する場合があるという推測がある。したがって、通常の範囲にあるｐＩ値を含む抗クローディン−１８．２抗体を有することが好ましい。これは、通常の範囲にｐＩを有する抗体を選択するか、または荷電表面残基を変異させるかのいずれかによって、達成することができる。
【０１１６】
［本開示の抗体をエンコードする核酸分子］
【０１１７】
別の態様において、本開示は、本開示の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域またはＣＤＲをエンコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞に、細胞可溶化物に、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形において、存在してよい。核酸は、標準的な手法によって、他の細胞成分または他の汚染物質、たとえば、他の細胞の核酸またはタンパク質から精製されると、「単離される」または「実質的に純粋な状態にされる」。本開示の核酸は、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、介在配列を含んでも含まなくてよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１１８】
本開示の核酸は、標準的な分子生物学的手法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（たとえば、下でさらに説明されるヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する遺伝子導入マウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体に関して、ハイブリドーマによって作製された抗体の軽鎖および重鎖をエンコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング手法によって得ることができる。（たとえば、ファージディスプレイ手法を使用して）免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られる抗体に関して、そのような抗体をエンコードする核酸は、遺伝子ライブラリーから回収することができる。
【０１１９】
本開示の好ましい核酸分子は、クローディン−１８．２モノクローナル抗体またはＣＤＲのＶＨおよびＶＬ配列をエンコードする核酸分子を含む。ＶＨおよびＶＬセグメントをエンコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、標準的な組換えＤＮＡ手法によって、たとえば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するように、さらにマニピュレートすることができる。これらのマニピュレーションにおいて、ＶＬまたはＶＨをエンコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または可動性リンカーなどの、別のタンパク質をエンコードする別のＤＮＡ断片に機能可能に連結している。この文脈で使用される用語「機能可能に連結している」は、２つのＤＮＡ断片が、その２つのＤＮＡ断片によってエンコードされたアミノ酸配列がインフレームのままであるように、接続されることを意味することを意図するものである。
【０１２０】
単離された、ＶＨ領域をエンコードするＤＮＡは、ＶＨをエンコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をエンコードする別のＤＮＡ分子に機能可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり、これらの領域を包むＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域であってよいが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨをエンコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをエンコードする別のＤＮＡ分子に機能可能に連結することができる。
【０１２１】
単離された、ＶＬ領域をエンコードするＤＮＡは、ＶＬをエンコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをエンコードする別のＤＮＡ分子に機能可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり、これらの領域を包むＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、κ定常領域またはλ定常領域であってよい。
【０１２２】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬ配列が可動性リンカーによって接続されておりＶＨおよびＶＬ配列が連続的な単一鎖タンパク質として発現され得るように、ＶＨおよびＶＬをエンコードするＤＮＡ断片は、可動性リンカーをエンコードする（たとえば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をエンコードする）別の断片に機能可能に連結される（たとえば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４を参照されたい）。
【０１２３】
［本開示のモノクローナル抗体の産生］
【０１２４】
本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）手法を用いて産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態は、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換およびファージディスプレイ手法を含む。キメラまたはヒト化抗体も当技術分野で周知である。米国特許第４，８１６，５６７号明細書、同第５，２２５，５３９号明細書、同第５，５３０，１０１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、同第６，８２７，９２５；５，８３３，９４３号明細書、同第５，７６２，９０５号明細書、および同第６，１８０，３７０号明細書も参照されたい。これらの内容はその全体を参照により本明細書に明確に引用される。
【０１２５】
［本開示のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成］
【０１２６】
本開示の抗体はまた、たとえば、組換えＤＮＡ手法と遺伝子トランスフェクション法との組み合わせを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生することができる（たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学的手法によって得られた部分的なまたは完全長の軽鎖および重鎖をエンコードするＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳調節配列に機能可能に連結されるように、１つまたは複数の発現ベクターに挿入される。この文脈において、用語「機能可能に連結される」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというそれらの所期の機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味することを意図するものである。
【０１２７】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および抗体遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御要素（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図するものである。そのような調節配列は、たとえば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０））において説明される。哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（たとえばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳類細胞中での高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素を含む。代替的には、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列を使用することができる。さらに、ＳＲαプロモーター系などの異なる源由来の配列から構成される調節要素、ＳＲαプロモーター系は、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復由来の配列を含む（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選ばれる。
【０１２８】
抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、同じまたは別々の発現ベクターに挿入することができる。好ましい実施形態において、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに機能可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに機能可能に連結されるように、可変領域を使用してそれらを所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をすでにエンコードしている発現ベクターに挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作出する。追加的に、または代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをエンコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０１２９】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を調節する配列（たとえば、複製開始点）などの追加の配列および選択可能マーカー遺伝子を保有することができる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターがそこに導入されている宿主細胞の選択を促進する（たとえば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、同第４，６３４，６６５号明細書、および同第５，１７９，０１７号明細書を参照されたい）。たとえば、典型的に選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物への抵抗性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子の例として、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅をと共にｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するため）およびネオ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。
【０１３０】
軽鎖および重鎖の発現に関して、重鎖および軽鎖をエンコードする発現ベクターは、標準的な手法によって宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の様々な形は、外来ＤＮＡを原核または真核宿主細胞に導入するために通常用いられる各種の手法、たとえば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法などを包含することを意図するものである。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現することは理論的には可能であるが、真核細胞における、最も好ましくは哺乳類宿主細胞における、抗体の発現が最も好ましく、それは、そのような真核細胞、特に哺乳類細胞は、適切に折りたたまれかつ免疫学的に活性な抗体を組み立て分泌する可能性が原核細胞より高いためである。
【０１３１】
本開示の組換え抗体を発現する好ましい哺乳類宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（たとえばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようなＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０において説明される、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。特にＮＳＯ骨髄腫細胞との使用に関して、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号、および欧州特許出願第３３８，８４１号明細書に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をエンコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される際、宿主細胞中で抗体が発現するのに、またはより好ましくは、宿主細胞が成長する培養培地へ抗体が分泌されるのに十分な時間の間、宿主細胞を培養することによって、抗体は産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。
【０１３２】
［免疫複合体］
【０１３３】
本開示の抗体は、治療剤に複合させて、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）などの免疫複合体を形成することができる。好適な治療剤としては、細胞毒、アルキル化剤、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、ヒートショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、および抗有糸分裂剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、ペプチジル、ジスルフィド、またはヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介して複合させることが好ましい。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号明細書、同第６，９８９，４５２号明細書、および同第７，１２９，２６１号明細書、国際公開第０２／０９６９１０号、同第０７／０３８，６５８号、同０７／０５１，０８１号、同第０７／０５９，４０４号、同第０８／０８３，３１２号、および同第０８／１０３，６９３号、米国特許公報第２００６００２４３１７号明細書、同第２００６０００４０８１号明細書、および同第２００６０２４７２９５号明細書に記載されるように調製することができ、これらの開示は、参照により本明細書に引用される。
【０１３４】
［二重特異性分子］
【０１３５】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの他の機能分子、たとえば、別のペプチドまたはタンパク質（たとえば、別の抗体または受容体のためのリガンド）に連結されて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成する本開示の１つまたは複数の抗体を含む、二重特異性分子を特徴とする。したがって、本明細書で用いられる「二重特異性分子」は、３つ以上の特異性を有する分子を含む。
【０１３６】
ある実施形態において、二重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗クローディン−１８．２結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。第３の特異性は、抗エンハンスメント因子（ＥＦ）、たとえば、細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を増大させる分子に関するものであってよい。たとえば、抗エンハンスメント因子は、細胞傷害性Ｔ−細胞（たとえば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、またはＩＣＡＭ−１を介して）または他の免疫細胞を結合させることができ、標的細胞に対する免疫応答を増大させる。
【０１３７】
二重特異性分子は、多くの異なる形式およびサイズであってよい。サイズスペクトルの一方の端において、二重特異性分子は、特異性が同一である２本の結合アームを有する代わりに、それぞれが異なる特異性を有する２本の結合アームを有すること以外は、伝統的な抗体形式を保持する。他方の端においては、ペプチド鎖によって連結された２つの単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）からなる二重特異性分子、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２構築物がある。中間的なサイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカーによって連結された２つの異なるＦ（ａｂ）断片を含む。これらおよび他の形式の二重特異性分子は、遺伝子操作、体細胞ハイブリダイゼーション法、または化学的方法によって調製することができる。たとえば、Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ、上記で引用された；Ｃａｏ  ａｎｄ  Ｓｕｒｅｓｈ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９（６）、６３５−６４４（１９９８）；ａｎｄ  ｖａｎ  Ｓｐｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１（８）、３９１−３９７（２０００）、およびこれに引用される参考文献を参照されたい。
【０１３８】
［抗体をエンコードするまたは抗体を持つ腫瘍溶解性ウイルス］
【０１３９】
腫瘍溶解性ウイルスは癌細胞を感染させ、死滅させることが好ましい。本開示の抗体は、腫瘍溶解性ウイルスと併せて使用することができる。代替的には、本開示の抗体をエンコードする腫瘍溶解性ウイルスは、人体に導入することができる。
【０１４０】
［医薬組成物］
【０１４１】
別の態様において、本開示は、医薬的に許容される担体と共に処方された本開示の１つまたは複数の抗体を含む医薬組成物を提供する。組成物は、別の抗体または薬物などの、１つまたは複数の追加の医薬的に活性な成分を任意選択で含有してよい。本開示の医薬組成物はまた、たとえば、別の抗癌剤、別の抗炎症剤、またはワクチンとの併用療法において投与することができる。
【０１４２】
医薬組成物は任意の数の賦形剤を含むことができる。使用できる賦形剤としては、担体、界面活性剤、増粘または乳化剤、固形バインダー、分散または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存料、等張剤、およびそれらの組み合わせが挙げられる。好適な賦形剤の選択および使用は、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０ｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００３）において教示されており、その開示は参照により本明細書に引用される。
【０１４３】
医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または上皮投与（たとえば、注射または点滴によって）に好適であることが好ましい。投与の経路に応じて、活性成分は、酸の作用、および活性成分を失活させる場合がある他の天然の条件から保護されるように、材料でコーティングすることができる。本明細書で用いられる語句「非経口投与」は、経腸および局所投与以外の通常注射による投与様式を意味し、限定することなく、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射ならびに点滴を含む。代替的には、本開示の抗体は、局所、上皮、または粘膜投与経路などの、たとえば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸に、舌下で、または局所的に、非経口ではない経路を介して投与することができる。
【０１４４】
医薬組成物は、滅菌水溶液または分散液の状態であってよい。医薬組成物はまた、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の規則構造において処方されてもよい。
【０１４５】
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分量は、治療される被験体および特定の投与様式に依存して異なることになり、一般に、治療効果を生む組成物量となる。一般に、この量は、医薬的に許容される担体と組み合わせて１００パーセント中、約０．０１％から約９９パーセントまでの有効成分、好ましくは約０．１％から約７０％までの、最も好ましくは約１％から約３０％までの有効成分の範囲となる。
【０１４６】
投与レジメンは、最適な所望の応答（たとえば、治療応答）が得られるように調整される。たとえば、１回大量投与を行うことができ、分割用量を経時的に数回投与することができ、または治療状況の緊急性に従って用量を減らすことも増やすこともできる。投与の容易性および投薬量の均一性に関して、単位剤形で非経口組成物を処方することは特に有利である。本明細書で用いられる単位剤形は、治療される被験体に対する単位投薬量として好適な、物理的に分離した単位を指す。各単位は、必要な医薬品担体と共同して、所望の治療効果を生むように計算された所定の有効成分量を含有する。代替的には、抗体は、徐放性処方として投与することができ、その場合、必要とされる投与頻度はより少ない。
【０１４７】
抗体の投与に関して、投薬量は、受容者の体重の約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であってもよく、より一般には０．０１から５ｍｇ／ｋｇであってよい。たとえば、投薬量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内のであってよい。例示的な治療体制は、週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、月１回、３ヵ月毎に１回、または３ヵ月から６ヵ月毎に１回の投与を含意する。本開示の抗クローディン−１８．２抗体の好ましい投薬レジメンとしては、静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられ、以下の投薬計画（ｉ）４週間毎に６回投薬、その後３ヵ月毎に、（ｉｉ）３週間毎に、（ｉｉｉ）３週間毎に３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、その後１ｍｇ／ｋｇ体重のうち１つを使用して抗体が与えられる。いくつかの方法において約１〜１０００μｇ／ｍｌの、いくつかの方法においては約２５〜３００μｇ／ｍｌのプラズマ抗体濃度を達成するように、投薬量は調整される。
【０１４８】
本開示の抗クローディン−１８．２抗体の「治療効果のある投薬量」は、疾病症状の重症度の低下、疾病症状がない期間の頻度および長さの増大、または疾病の苦痛による機能障害または能力障害の予防をもたらすことが好ましい。たとえば、腫瘍を持つ被験体の治療に関して、「治療効果のある投薬量」は、無治療の被験体と比べて、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、腫瘍成長を阻害することが好ましい。治療用抗体の治療効果のある有効量は、腫瘍サイズを低減することができるか、または被験体の症状を寛解し、被験体は典型的にはヒトであるか、または別の哺乳類であってよい。
【０１４９】
医薬組成物は、植込錠、経皮パッチ、マイクロカプセル化送達系を含む、放出制御処方であってよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。たとえば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０１５０】
治療用組成物は、（１）針なし皮下注射装置（たとえば、米国特許第５，３９９，１６３号明細書、同第５，３８３，８５１号明細書、同第５，３１２，３３５号明細書、同第５，０６４，４１３号明細書、同第４，９４１，８８０号明細書、同第４，７９０，８２４号明細書、および同第４，５９６，５５６号明細書）、（２）マイクロ注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号明細書）、（３）経皮性装置（米国特許第４，４８６，１９４号明細書）、（４）注入機器（米国特許第４，４４７，２３３号明細書および同第４，４４７，２２４号明細書）ならびに（５）浸透圧装置（米国特許第４，４３９，１９６号明細書および同第４，４７５，１９６号明細書）などの医療用装置を介して投与することができ、これらの開示は、参照により本明細書に引用される。
【０１５１】
特定の実施形態において、本開示のモノクローナル抗体は、インビボで確実に適切に分配されるように処方することができる。たとえば、本開示の治療用抗体が確実に血液脳関門を超えるために、抗体をリポソームに入れて処方することができ、リポソームは、特定の細胞または器官への選択的輸送を増強するためのターゲティング部分をさらに含んでよい。たとえば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書、同第５，３７４，５４８号明細書、同第５，４１６，０１６号明細書、および同第５，３９９，３３１号明細書、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５；Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８；Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０；Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０；Ｋｅｉｎａｎｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；およびＫｉｌｌｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３を参照されたい。
【０１５２】
［本開示の用途および方法］
【０１５３】
本開示の抗体（組成物、二重特異性、および免疫複合体）は、たとえば癌の診断、治療、および／または予後に関与する、数多くのインビトロおよびインビボでの有用なものを有する。抗体は、腫瘍成長を阻害するために、たとえばインビボで、ヒト被験体に投与することができる。癌の診断および予後において、関心対象の組織試料を収集して、本開示の抗体に接触させることができ、ここで、ある特定の量のクローディン−１８．２がある特定の場所または細胞の型において検出された場合、被験体は癌と診断されてもよく、クローディン−１８．２発現の増加／減少により、癌の発達／寛解が表される。
【０１５４】
癌細胞の増殖および生存を阻害するという抗クローディン−１８．２抗体の能力を考慮に入れると、本開示は、被験体における腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供し、当該方法は、腫瘍の成長が被験体において阻害されるように、本開示の抗体を被験体に投与することを含む。本開示の抗体によって治療され得る腫瘍の非限定的な例としては、これらに限定されないが、原発のかつ／または転移性の、膵臓癌、胃癌、大腸癌、食道癌、肝癌、卵巣癌、肺癌、および膀胱癌が挙げられる。さらに、その成長が本開示の抗体を使用して阻害される難治性または再発性の悪性腫瘍が挙げられる。
【０１５５】
本開示のこれらおよび他の方法は、以下でさらに詳細に論じられる。
【０１５６】
［併用療法］
【０１５７】
別の態様において、本開示は、本開示の例示的な抗クローディン−１８．２抗体（またはその抗原結合部分）が、被験体における腫瘍成長の阻害において有効な１つまたは複数の追加の抗体と同時投与される、併用治療の方法を提供する。一実施形態において、本開示は、被験体における腫瘍成長を阻害するための方法を提供し、当該方法は、抗クローディン−１８．２抗体ならびに抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＰＤ−１抗体、および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体などの１つまたは複数の追加の抗体を被験体に投与することを含む。特定の実施形態において、被験体はヒトである。別の態様において、本開示は、本開示の抗クローディン−１８．２抗体（またはその抗原結合部分）が化学療法剤と同時投与され、化学療法剤は細胞傷害剤であってよい、癌治療法を提供する。たとえば、エピルビシン、オキサリプラチン、および／または５−ＦＵを、抗クローディン−１８．２療法を受けている患者に投与することができる。オキサリプラチンおよび５−ＦＵはクローディン−１８．２発現を安定化または増大させると考えられている。
【０１５８】
本開示はまた、被験体における腫瘍成長を阻害するために方法を提供し、当該方法は、抗クローディン−１８．２抗体およびγδＴ細胞、特にＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を刺激する薬剤を被験体に投与することを含む。γδＴ細胞を刺激する薬剤は、ビスホスホネート類、具体的には、Ｎ−ビスホスホネートおよびアミノビスホスホネートなどの窒素含有ビスホスホネート類であってよい。ゾレドロン酸（ＺＡ）が、特に組換えインターロイキン−２（ＩＬ−２）と併せて投与されるとき、γδＴ細胞を刺激し、それに応じて抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性を増大することが、データにより示されている（国際公開第２０１３１７４５０９号）。
【０１５９】
本開示はまた、被験体における腫瘍成長を阻害するための方法を提供し、当該方法は、抗クローディン−１８．２抗体およびクローディン−１８．２の発現を安定化または増大させる薬剤を被験体に投与することを含む。クローディン−１８．２の発現を安定化または増大させる薬剤は、細胞傷害剤および／または細胞分裂阻害剤であってよい。クローディン−１８．２の発現を安定化または増大させる薬剤は、アントラサイクリン類、白金化合物、ヌクレオシド類似体、タキサン類、およびカンプトテシン類似体、またはそれらのプロドラッグ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される薬剤を含んでよい。クローディン−１８．２の発現を安定化または増大させる薬剤は、エピルビシン、オキサリプラチン、シスプラチン、５−フルオロウラシルからなる群より選択される薬剤を含んでよい。クローディン−１８．２の発現を安定化または増大させる薬剤は、オキサリプラチンと５−フルオロウラシルとの、もしくはそれらのプロドラッグの組み合わせ、シスプラチンと５−フルオロウラシルとの、もしくはそれらのプロドラッグの組み合わせ、少なくとも１種のタキサンとオキサリプラチンの組み合わせ、少なくとも１種のタキサンと５−フルオロウラシルとの、もしくはそれらのプロドラッグの組み合わせ、または少なくとも１種のカンプトテシン類似体と５−フルオロウラシルとの、もしくはそれらのプロドラッグの組み合わせを含んでよい。クローディン−１８．２の発現を安定化または増大させる薬剤は、免疫原性細胞死を誘導する薬剤であってよい。免疫原性細胞死を誘導する薬剤は、アントラサイクリン類、オキサリプラチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される薬剤を含んでよい。クローディン−１８．２の発現を安定化または増大させる薬剤は、エピルビシンとオキサリプラチンとの組み合わせを含んでよい。一実施形態において、本開示の方法は、少なくとも１種のアントラサイクリン、少なくとも１種の白金化合物、ならびに５−フルオロウラシルおよびそのプロドラッグのうち少なくとも１つを投与することを含む。アントラサイクリンは、エピルビシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシンおよびバルルビシンからなる群より選択されてよい。アントラサイクリンはエピルビシンであることが好ましい。白金化合物は、オキサリプラチンおよびシスプラチンからなる群より選択されてよい。ヌクレオシド類似体は、５−フルオロウラシル、およびそのプロドラッグからなる群より選択されてよい。タキサンは、ドセタキセルおよびパクリタキセルからなる群より選択されてよい。カンプトテシン類似体は、イリノテカンおよびトポテカンからなる群より選択されてよい。一実施形態において、本開示の方法は、（ｉ）エピルビシン、オキサリプラチン、および５−フルオロウラシル、（ｉｉ）エピルビシン、オキサリプラチン、およびカペシタビン、（ｉｉｉ）エピルビシン、シスプラチン、および５−フルオロウラシル、（ｉｖ）エピルビシン、シスプラチン、およびカペシタビン、または（ｖ）フォリン酸、オキサリプラチン、および５−フルオロウラシルを投与することを含む。
【０１６０】
抗クローディン−１８．２抗体と組み合わされてよい他の治療法としては、これらに限定されないが、免疫原性剤投与、インターロイキン−２（ＩＬ−２）投与、放射線照射、手術、またはホルモン剥奪が挙げられる。
【０１６１】
本明細書で論じる治療剤の組み合わせは、医薬的に許容される担体中の単一組成物として同時的に、または、各薬剤が医薬的に許容される担体中にある別々の組成物として、同時的に投与することができる。別の実施形態において、治療剤の組み合わせは、連続的に投与することができる。
【０１６２】
さらに、併用療法を１回より多く連続的に投与する場合、連続的な投与の順番は、投与する各時点で、逆にしてもよく、または同じ順番を保ってもよく、連続的な投与は、同時的な投与と、またはその任意の組み合わせと組み合わせることができる。
【０１６３】
本開示は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これらはさらに限定するものと解釈されるべきではない。本出願にわたって引用されるすべての図、すべての参考文献、ジェンバンクの配列、特許および出願公開特許の内容は、参照により明白に本明細書に引用される。
【０１６４】
［実施例］
【０１６５】
［実施例１  ヒトクローディン−１８．１またはクローディン−１８．２を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株の構築］
【０１６６】
ヒトクローディン−１８．１またはヒトクローディン−１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ社、中国）を、レンチウイルストランスフェクション系を用いて生成した。簡潔には、ヒトクローディン−１８．１（配列番号：７０）およびクローディン−１８．２（配列番号：７２）をエンコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：６９および７１）を合成し、それぞれ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位でｐＬＶ−ＥＧＦＰ（２Ａ）−Ｐｕｒｏプラスミドにクローニングした。ｐＬＶ−ＥＧＦＰ（２Ａ）−Ｐｕｒｏ−クローディン−１８．１（またはｐＬＶ−ＥＧＦＰ（２Ａ）−Ｐｕｒｏ−クローディン−１８．２）、ｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇプラスミドとの共トランスフェクションによってレンチウイルスをＨＥＫ−２９３Ｔ（Ｃｏｂｉｏｅｒ社、中国）細胞中に生成した。得られたレンチウイルスを使用してＨＥＫ２９３Ａ細胞を感染させ、ヒトクローディン−１８．１またはクローディン−１８．２を過剰発現する安定的な細胞株を生成し、次いでこの細胞株を７日間より長く、１０％ＦＢＳ（Ｃａｔ＃：ＦＮＤ５００、Ｅｘｃｅｌｌ）および０．２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｃａｔ＃：Ａ１１１３８−０３、Ｇｉｂｃｏ）と共にＤＭＥＭ培地（Ｃａｔ＃：ＳＨ３００２２．０１、Ｇｉｂｃｏ）にて培養した。
【０１６７】
市販の抗ＣＬＤＮ１８抗体（ウサギ抗クローディン−１８、Ｃａｔ＃：３８８１００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用して、クローディン−１８．１またはクローディン−１８．２の発現を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって確認した。簡潔には、１００，０００個のトランスフェクトされた細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、後に抗ヒトクローディン−１８抗体を加えた。４℃で１時間、インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、５００倍希釈した、ＰＥを結合したロバ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（ＰＥロバ抗ウサギＩｇＧ抗体、Ｃａｔ＃：４０６４２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）をプレートに加えた。４℃で１時間、インキュベートした後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＦＡＣＳ装置（ＢＤ社）を使用して細胞蛍光を観察した。
【０１６８】
［実施例２  例示的な抗クローディン−１８．２モノクローナル抗体の生成およびスクリーニング］
【０１６９】
ヒトクローディン−１８．２に結合するモノクローナル抗体を生成するためには、生後６週間のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ヒトクローディン−１８．２を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞（実施例１を参照されたい）を接種した。簡潔には、２×１０７／ｍｌのＨＥＫ２９３Ａ／ヒトクローディン−１８．２細胞をマウスに皮下的に注入し、次いで４週間間隔で３回追加免疫した。血清試料中の抗体力価を、ヒトクローディン−１８．２を発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を使用して、ＦＡＣＳによって決定した。マウスが好適な抗体力価に達したとき、細胞数５×１０７／ｍＬのＰＢＳ溶液で最後の追加免疫をマウスに与えた。３日後、マウスを安楽死させ、放血して、ｍＲＮＡ抽出およびファージディスプレイライブラリー構築のために脾臓を採取した。
【０１７０】
ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーを構築するために、トリゾールキット（Ｔｒｉｚｏｌ  ｋｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してマウスの全脾臓ＲＮＡを抽出して、逆転写酵素キット（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｋｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してｃＤＮＡを合成した。上で合成したｃＤＮＡをテンプレートとして使用してＰＣＲによって遺伝子増幅を行い、商標されたファージミド、ｐＴＧＳを使用してｓｃＦｖファージライブラリーを構築した。簡潔には、軽鎖の可変領域をＰＣＲによって増幅し、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ／精製キットを用いて精製し、制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ（ＮＥＢ社）で消化し、次いで、１６℃で、（同じ制限酵素で消化され、アガロースゲルによって精製された）ファージミドｐＴＧＳのＮｈｅＩ／Ｎｏｔ１制限部位にライゲーションした。ライゲーションに続いて、組換えＤＮＡを沈殿させ、洗浄し、蒸留水に溶解した。次いで、エレクトロポレーション法によって、組換えＤＮＡを大腸菌ＴＧ１細胞に形質転換させた。次いで、細胞を１０ｍｌのＳＯＣ培養液に懸濁させて、穏やかに振盪させながら３７℃で１時間、培養した。細胞培養物を２ＹＴ寒天／アンピシリン上で平板培養して、アンピシリン耐性コロニーの数を数えた。重鎖の可変断片のクローニングに関して、ＰＣＲ生成物をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化して、軽鎖可変領域ライブラリーにライゲーションさせ、大腸菌ＴＧ１に形質転換させた。ライブラリーを大きなプレートからこすり取り、２ＹＴＡＧ液体培養培地に接種した。およそ１０１２ｐｆｕのヘルパーファージを、ｓｃＦｖ遺伝子ライブラリーを含むＴＧ１試料に加えて、振盪させながら３７℃で１時間、インキュベートした。７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを加え、培養物を３０℃で一晩振盪した。細胞を４℃で１５分間、４０００ｒｐｍで遠心した。得られた上清を５ｍｌの２０％ＰＥＧ８０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌと混合し、氷上で３０分、インキュベートし、次いで、ファージを４℃で２０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離によって沈殿させた。ファージを、１％ＢＳＡを含有する１．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁して、ボルテックスし、ペレット破片になるまで５分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を４℃で保管するか、またはバイオパニングのために直接使用する（以下を参照されたい）。
【０１７１】
ヒトクローディン−１８．２またはクローディン−１８．１．を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を使用して、バイオパニングによって、ヒトクローディン−１８．２に対抗するがヒトクローディン−１８．１には対抗しない抗体を選択した。簡潔には、１×１０７個のＨＥＫ２９３Ａ／ヒトクローディン−１８．１細胞をまず、１０１３個のファージを含む１５ｍｌ管に加えた。細胞／ファージ混合物を、室温で９０分間、振盪機上でインキュベートし、次いで振盪なしでさらに３０分間保持した。細胞懸濁液を室温で５分間１０００ｇで遠心し、次いで上清を１×１０７個のＨＥＫ２９３Ａ／ヒトクローディン−１８．２細胞を含む管に移した。細胞培養物を室温で２時間、振盪機上でインキュベートした。結合されていないファージを、ＰＢＳを用いて洗い流し、次いで０．１Ｍのグリシン−ＨＣ１（ｐＨ２．２）を使用して抗原結合ファージを溶出した。溶出されたファージを、１．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．８）を用いてｐＨ７．０まで中和した。上記の中和されたファージを使用して、１０ｍｌのＴＧ１細菌を感染させ、ＯＤが０．６に達するまで３７℃で培養した。細菌培養物を遠心分離によってペレット化し、ペレットを培養液に再懸濁し、次回のスクリーニングのためにこれを大きな２ＹＴＡＧプレートに塗布した。そのような富化およびスクリーニングを全体で３回行った。
【０１７２】
バイオパニングを３回行った後、クローディン−１８．２に結合するファージを収集して細菌性細胞を感染させるために使用した。単一細菌コロニーをピックアップして、９６ウェルプレート内で成長させた。細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用して、ヒトクローディン−１８．２またはクローディン−１８．１を発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を用いて高いバインダーを同定した。ファージＥＬＩＳＡにおいて、高い結合能力をヒトクローディン−１８．２に特異的に示すがクローディン−１８．１には示さないクローンを選択し、次いでＤＮＡシークエンシングに供し、３８個の可読ｓｃＦｖ配列を高結合クローンから同定し、それらから１０個のｓｃＦｖ抗体をさらなる特徴付けのために選択した。
【０１７３】
［実施例３  例示的な完全長抗クローディン−１８．２モノクローナル抗体の精製および特徴付け］
【０１７４】
選択された１０個のｓｃＦｖ抗体を、さらなる特徴付けのために完全長モノクローナル抗体としてＨＥＫ２９３Ｆ（Ｃｏｂｉｏｅｒ社、中国）において発現させた。簡潔には、発現ベクターを、それぞれの重鎖／軽鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１／κ定常領域（配列番号：６７および６８）をｐcＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、米国）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩにクローニングすることによって構築した、ここで、重鎖可変領域のＣ末端はヒトＩｇＧ１定常領域のＮ末端に連結され、軽鎖可変領域のＣ末端はヒトκ定常領域のＮ末端に連結されている。
【０１７５】
ＰＥＩトランスフェクション法を、製造会社の取扱説明書に従って用いて、キメラ抗ヒトクローディン−１８．２抗体をＨＥＫ−２９３Ｆ細胞において一過性発現させた。簡潔には、ＤＮＡ：ＰＥＩ比が１：３でポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、得られたベクターでＨＥＫ−２９３Ｆ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション当たり使用された全ＤＮＡは、１．５μｇ／ｍｌであった。トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３Ｆを、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で、１２０ＲＰＭで振盪させながら培養した。１０〜１２日後、上清を採取し、モノクローナル抗体を精製した。簡潔には、細胞培養物を収集し、次に５分間、３５００ｒｐｍで遠心し、次いで０．２２μｍカプセルを用いて濾過して細胞破片を除去した。次いで、前平衡化したタンパク質Ａ親和性カラム（ＧＥ社、米国；Ｃａｔ＃：１７０４０５０１；Ｌｏｔ＃：１０２５２２５０）を用いて、モノクローナル抗体を精製し、溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０〜３．５）で溶出した。緩衝液交換後、抗体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にて保持し、抗体濃度をナノドロップ装置を用いて測定した。精製されたモノクローナル抗体をさらに特徴付けに供した。
【０１７６】
次いで、ヒトクローディン−１８．２またはクローディン−１８．１を発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を用いて、ＦＡＣＳによって、結合親和性および特異性について、１０個の完全長抗クローディン−１８．２抗体を試験した。簡潔には、１００，０００個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、段階希釈した抗クローディン−１８．２抗体をプレートに加えた。４℃で１時間、インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、５００倍希釈した、ＲＰＥを結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（（Ｔｈｅｒｍｏ社、Ｃａｔ＃：ＰＡＩ−８６０７８）をプレートに加えた。４℃で１時間、インキュベートした後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＦＡＣＳ装置（ＢＤ社）を使用して細胞蛍光を観察した。
【０１７７】
また、精製した抗体を、ヒトクローディン−１８．２を安定的に過剰発現するＭＣ３８細胞（ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２）（Ｃｏｂｅｒ社、中国）に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を誘導する能力に関して分析した。簡潔には、実施例１において説明されたように、ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞をレンチウイルストランスフェクション系によって生成した。ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞およびエフェクター細胞ＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ（Ｈｕａｂｏ  Ｂｉｏ社）の両方を５分間、１２００ｒｐｍで遠心した。次いで、これらの細胞を、ＡＤＣＣアッセイ培養液（ＭＥＭ培地、Ｇｉｂｃｏ社、Ｃａｔ＃：１２５６１−０５６；１％ＦＢＳ、ＥＸ−ｃｅｌｌ、Ｃａｔ＃：ＦＮＤ５００；１％ＢＳＡ、ＶＥＴＥＣ社、Ｃａｔ＃：Ｖ９００９３３−１ＫＧ）で懸濁し、細胞計数によると細胞生存率は約９０％であった。ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞密度を、４×１０５／ｍｌに調整し、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ細胞密度を２×１０６／ｍｌに調整した。次いで、５０μｌのＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞および５０μｌのＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ細胞（エフェクター−標的の比は５：１であった）を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。種々の濃度に希釈された抗体を各ウェルに別々に加え、最終濃度はそれぞれ、３２０００ｎｇ／ｍｌ、６４００ｎｇ／ｍｌ、１２８０ｎｇ／ｍｌ、２５６ｎｇ／ｍｌ、５１．２ｎｇ／ｍｌ、１０．２４ｎｇ／ｍｌ、２．０４８ｎｇ／ｍｌであった。試料を３７℃で４時間、インキュベートし、次いで、ＬＤＨ現像液（細胞傷害性検出キットＰＬＵＳ（ＬＤＨ）、Ｒｏｃｈｅ社、Ｃａｔ＃：０４７４４９２６００１）を１００μｌ／ウェルの濃度で加えた。混合液を室温で２０分間、暗所でインキュベートし、次いでＭＤ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３を使用してプレートを読み取った。抗ＨＥＬアイソタイプ制御抗体（ＬｉｆｅＴｅｉｎ、ＬＬＣ社、Ｃａｔ．＃：ＬＴ１２０３１）をネガティブコントロールのために使用し、特許出願国際公開第２０１４／１４６６７２Ａ１号に開示されるアミノ酸配列を使用して合成された参照抗クローディン−１８．２抗体である、ＩＭＡＢ３６２を、参照抗クローディン−１８．２抗体として使用した。
【０１７８】
図１に示すように、大部分の完全長抗体は、ヒトクローディン−１８．２に特異的に結合するが、ヒトクローディン−１８．１には結合しないことが示された。完全長抗体によって誘導されるＡＤＣＣのＥＣ５０値を表２に要約した。すべての抗体がＭＣ３８／ＣＬＤＮ１８．２細胞のＡＤＣＣを誘導した。結合親和性およびＡＤＣＣ効果の順位に基づいて、１８Ｆ２をさらなる検討のために選択した。
表２  抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ  ＥＣ５０
【表２】
2021509889.tif 000003
【０１７９】
［実施例４  ファージディスプレイによる１８Ｆ２の親和性成熟］
【０１８０】
結合親和性をさらに向上させるために、ファージディスプレイ手法によってクローン１８Ｆ２を親和性成熟のために選択した。簡潔には、３次元構造モデリングシミュレーションを実施して、結合親和性に重要である可能性があるクローン１８Ｆ２の重鎖および軽鎖ＣＤＲにおける潜在的な残基を同定した。同定されたＣＤＲ残基を、特異的に設計されたプライマーおよび部位特異的変異誘発の標準的なプロトコルを使用してＰＣＲによって変異誘発に供した。次いで、ファージディスプレイライブラリーを構築し、次いで、ヒトクローディン−１８．２またはクローディン−１８．１．を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞を使用して上述のようにバイオパニングに供した。３回のバイオパニング後、高いバインダーを選択し、採取し、次いで細菌性細胞を感染させるために使用した。細菌コロニーをピックアップして、９６ウェルプレートで成長させ、次いで、細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用して、後に配列される高いバインダーを同定した。重鎖および軽鎖ＣＤＲにおける有益な変異を、同定し、次に組み合わせて新たなファージディスプレイライブラリーにし、それを上述のようにさらに３回のバイオパニングおよび配列確認に供した。その親クローン１８Ｆ２と比較して、単一から複数の変異体を含む２０個を超える高いバインダーを同定し、１２個のクローンを選択して、完全長キメラヒトＩｇＧ１／κ抗体としてＨＥＫ２９３Ｆ細胞において発現させた。ヒトクローディン−１８．２またはクローディン−１８．１を発現するＨＥＫ２９３細胞を用いて、ＦＡＣＳによって、完全長抗体の結合親和性を試験した。簡潔には、１００，０００個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、段階希釈した抗クローディン−１８．２抗体をプレートに加えた。４℃で１時間、インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、５００倍希釈した、ＲＰＥを結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（（Ｔｈｅｒｍｏ社、Ｃａｔ＃：ＰＡＩ−８６０７８）をプレートに加えた。４℃で１時間、インキュベートした後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＦＡＣＳ装置（ＢＤ社）を使用して細胞蛍光を観察した。結合親和性および特異性に基づいて、親クローン１８Ｆ２より高い結合親和性を示す４個のクローン、１８Ｆ２−５、１８Ｆ２−３０、１８Ｆ２−３５、および１８Ｆ２−６６をさらなる検討のために選択した。４個の選択されたキメラモノクローナル抗体のＥＣ５０を、ＩＭＡＢ３６２と類似したＥＣ５０と共に、表３に示した。
表３  抗クローディン−１８．２抗体の結合親和性ＥＣ５０
【表３】
2021509889.tif 000004
【０１８１】
［実施例５  例示的な抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性］
【０１８２】
ヒトクローディン−１８．２（ＭＣ３８／ｈヒトクローディン−１８．２）を安定的に過剰発現するＭＣ３８細胞（Ｃｏｂｅｒ社、中国）に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を誘導する能力に関して、精製された抗体を分析した。簡潔には、実施例１において説明されたように、ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞をレンチウイルストランスフェクション系によって生成した。ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞およびエフェクター細胞ＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ（Ｈｕａｂｏ  Ｂｉｏ社）の両方を５分間、１２００ｒｐｍで遠心した。次いで、これらの細胞を、ＡＤＣＣアッセイ培養液（ＭＥＭ培地、Ｇｉｂｃｏ社、Ｃａｔ＃：１２５６１−０５６；１％ＦＢＳ、ＥＸ−ｃｅｌｌ、Ｃａｔ＃：ＦＮＤ５００；１％ＢＳＡ、ＶＥＴＥＣ社、Ｃａｔ＃：Ｖ９００９３３−１ＫＧ）で懸濁し、細胞計数によると細胞生存率は約９０％であった。ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞密度を、４×１０５／ｍｌに調整し、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ細胞密度を２×１０６／ｍｌに調整した。次いで、５０μｌのＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞および５０μｌのＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ細胞（エフェクター−標的の比は５：１であった）を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。種々の濃度に希釈された抗体を各ウェルに別々に加え、最終濃度はそれぞれ、３２０００ｎｇ／ｍｌ、６４００ｎｇ／ｍｌ、１２８０ｎｇ／ｍｌ、２５６ｎｇ／ｍｌ、５１．２ｎｇ／ｍｌ、１０．２４ｎｇ／ｍｌ、２．０４８ｎｇ／ｍｌであった。試料を３７℃で４時間、インキュベートし、次いで、ＬＤＨ現像液（細胞傷害性検出キットＰＬＵＳ（ＬＤＨ）、Ｒｏｃｈｅ社、Ｃａｔ＃：０４７４４９２６００１）を１００μｌ／ウェルの濃度で加えた。混合液を室温で２０分間、暗所でインキュベートし、次いでＭＤ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３を使用してプレートを読み取った。抗ＨＥＬアイソタイプ制御抗体（ＬｉｆｅＴｅｉｎ、ＬＬＣ社、Ｃａｔ．＃：ＬＴ１２０３１）をネガティブコントロールのために使用し、ＩＭＡＢ３６２を参照抗クローディン−１８．２抗体として使用した。図２に示すように、４個の選択されたキメラ抗体、１８Ｆ２−５、１８Ｆ２−３０、１８Ｆ２−３５、および１８Ｆ２−６６は、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａによるＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞の死滅を誘導することができた。
【０１８３】
共にヒトクローディン−１８．２の内在性発現が高いと報告されているＫＡＴＯ−ＩＩＩ（Ｃｏｂｉｏｅｒ社、中国）およびＮＵＧＣ−４細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ社、中国）に対するＡＤＣＣ活性に関して、抗クローディン−１８．２抗体をさらに試験した。簡潔には、標的細胞を１０ｎｇ／ｍｌのエピルビシン（Ａｐｅｘｂｉｏ社、Ｃａｔ＃．Ａ２４５１−１００ｍｇ）、５００ｎｇ／ｍｌのオキサリプラチン（Ａｒｋ  ｐｈａｒｍ社、Ｃａｔ＃．Ａｋ−７２８１３）、および１０ｎｇ／ｍｌの５−ＦＵ（Ａｃｒｏｓ社、Ｃａｔ＃．Ｕｎ１２８１１）（ＥＯＦ）で７２時間、前処理し、次いで薬物を除去し、通常の培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中でさらに２４時間、細胞を培養した。ＫＡＴＯ−ＩＩＩまたはＮＵＧＣ−４細胞を標的細胞として使用して、上で述べたプロトコルを使用して、ＡＤＣＣアッセイを実施した。２×１０５個のＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ細胞および２×１０４個のＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞またはＮＵＧＣ−４細胞（エフェクター−標的の比は１０：１であった）を各アッセイにおいて使用した。図３に示すように、４個のモノクローナル抗体、１８Ｆ２−５、１８Ｆ２−３０、１８Ｆ２−３５、および１８Ｆ２−６６は、ＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ細胞によるＫＡＴＯ−ＩＩＩまたはＮＵＧＣ−４細胞の死滅を誘導することができた。
【０１８４】
抗クローディン−１８．２抗体がクローディン−１８．２陽性細胞にＡＤＣＣ活性を特異的に誘導するかをさらに確認するために、ヒトクローディン−１８．２またはクローディン−１８．１を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞上のＡＤＣＣ活性を誘導する能力に関してこれらの抗体を試験した。簡潔には、１×１０５個のＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ細胞およびヒトクローディン−１８．１またはヒトクローディン−１８．２を過剰発現する２×１０４個のＨＥＫ２９３Ａ細胞（エフェクター−標的の比は５：１であった）を各アッセイにおいて使用した。図４に示すように、４個の試験された抗体、１８Ｆ２−５、１８Ｆ２−６６、１８Ｆ２−３０，および１８Ｆ２−３５は、ヒトクローディン−１８．２を発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞に対してＡＤＣＣ活性を特異的に誘導したが、一方で、クローディン−１８．１を過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞では細胞傷害効果は観察されなかった。
【０１８５】
［実施例６  例示的な抗クローディン−１８．２抗体のＣＤＣ活性］
【０１８６】
細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ社、Ｃａｔ＃：０４７４４９２６００１）を使用して、例示的な抗クローディン−１８．２抗体が、ヒトクローディン−１８．２（実施例５において生成されたＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２）を安定的に過剰発現するＭＣ３８細胞に対してＣＤＣ活性を誘導する能力を測定した。簡潔には、標的細胞ＭＣ３８／ヒトクローディン−１８．２細胞を４分間１２００ｒｐｍで遠心して、次いで、１％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地で細胞を懸濁したＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞の細胞密度を細胞数３×１０５個／ｍｌに調整し、１００μｌの細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。様々な濃度に希釈された抗体を別々に加え、それらの最終濃度はそれぞれ、２０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．１６μｇ／ｍｌ、０．０３２μｇ／ｍｌ、０．００６４μｇ／ｍｌ、および０．００１２８μｇ／ｍｌであった。正常ヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ社、Ｃａｔ＃：Ａ１１３）を、５％の最終濃度で加え、次いで、得られた混合物を３７℃で２時間、インキュベートした。ＬＤＨ現像液を１００μｌ／ウェルの濃度で加え、次いで、試料を室温で２０分間、暗所でインキュベートした。ＭＤ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３計器を使用して、プレートを読み取った。抗クローディン−１８．２抗体ＩＭＡＢ３６２を参照として使用し、抗ＨＥＬモノクローナル抗体をネガティブコントロールとして使用した。図５に示すように、すべての試験抗体、１８Ｆ２−５、１８Ｆ２−３０、１８Ｆ２−３５、および１８Ｆ２−６６は、用量依存的なやり方で、強いＣＤＣ活性を示した。
【０１８７】
［実施例７  例示的な抗クローディン−１８．２抗体のヒトクローディン−１８．２への結合安定性］
【０１８８】
ＦＡＣＳによって、ＨＥＫ２９３Ａ／ｈクローディン−１８．２細胞への結合安定性に関して精製された抗クローディン−１８．２抗体をさらに分析した。簡潔には、１０５個のＨＥＫ２９３Ａ／ｈクローディン−１８．２細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、１０μｇ／ｍｌの抗クローディン−１８．２抗体をプレートに加えた。４℃で１時間、インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、細胞を細胞培養液（ＤＭＥＭ）で懸濁した。細胞をそれぞれ、３７℃で０時間、３時間、または５時間、さらにインキュベートした。次いで、５００倍で希釈した、ＲＰＥを結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（（Ｔｈｅｒｍｏ社、Ｃａｔ＃：ＰＡＩ−８６０７８）をプレートに加えた。４℃で１時間、インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで、ＦＡＣＳ装置（ＢＤ社）を使用して細胞蛍光を観察した。
【０１８９】
図６に示すように、４個の抗体すべて（１８Ｆ２−５、１８Ｆ２−３０、１８Ｆ２−３５、および１８Ｆ２−６６）は、アッセイにおいてＩＭＡＢ３６２より高い結合安定性を示し、このことはこれらの抗体のＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性がより高いことと一貫しているように思われ、より高い結合安定性はより高いＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性に寄与する場合があることを示唆した。
【０１９０】
［実施例８  例示的な抗クローディン−１８．２抗体のヒト化］
【０１９１】
ヒト化およびさらなる検討のために、抗クローディン−１８．２抗体、１８Ｆ２−５、８Ｆ２−３０、１８Ｆ２−３５、および１８Ｆ２−６６を選択した。以下に詳細に説明される、確立されたＣＤＲ移植法を用いてマウス抗体のヒト化を行った。
【０１９２】
キメラ抗体１８Ｆ２−５、１８Ｆ２−３０、１８Ｆ２−３５、および１８Ｆ２−６６のヒト化のためのアクセプターフレームワークをスクリーニングするために、上記抗体の軽鎖および重鎖可変鎖配列を、ＮＣＢＩウェブサイト（（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）にあるヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対してブラスト検索（ｂｌａｓｔ）し、最も相同性であるヒト生殖系列ＩＧＶＨおよびＩＧＶΚをそれぞれ、ヒト化のためのアクセプターとして同定した。上記の４個の抗体に関して、選択されたヒト重鎖アクセプターはＩＧＨＶ１−４６＊０１であり、選択されたヒト軽鎖アクセプターはＩＧＫＶ４−１＊０１であった。
【０１９３】
ＣＤＲループ構造を支持することにおいて重要な役割を果たし、したがってヒト化抗体において復帰突然変異を設計する可能性があるキーフレームワーク残基を同定するために、３次元構造を上記の４個の抗体の可変ドメインのためにシミュレーションした。選択された構造テンプレートは、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３における正準ループ構造が、それぞれ、１８Ｆ２−５、８Ｆ２−３０、１８Ｆ２−３５、および１８Ｆ２−６６と同じクラスであった。構造テンプレートを使用して、マウスのフレームワークを、重鎖および軽鎖のヒトアクセプターのフレームワークで置換することによって構造モデルを構築した。次いで、３次元構造モデリングシミュレーションを実施して、ＣＤＲループ構造または重鎖および軽鎖境界を支持することにおいて重要である可能性があるキーフレームワーク残基を同定した。フレームワーク内のある特定の部位でマウスの抗体およびヒトアクセプターフレームワークの両方が、同じ残基を共有するとき、ヒト生殖系列残基が保持された。他方で、マウスの抗体およびヒト生殖系列アクセプターフレームワークが、フレームワーク内のある特定の部位で異なる残基を有するとき、この残基の重要性を構造モデリングによって評価した。マウスの抗体のフレームワークにおける残基がＣＤＲ残基と相互作用して影響を与えると見られた場合、この残基をマウスの残基に復帰変異させた。以下の表４に、抗体構造シミュレーションにおいて使用された構造テンプレートを列挙した。
表４  抗体構造シミュレーションで使用した構造テンプレート
【表４】
2021509889.tif 000005
表５  抗クローディン−１８．２抗体のために設計された復帰変異
【表５】
2021509889.tif 000006
【０１９４】
上述の構造モデリングに基づいて、１１個の潜在的な復帰変異体（Ｒ３８Ｋ、Ａ４０Ｒ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ｖ、Ｔ７４Ｋ、Ｔ７６Ｓ、Ｖ７９Ａ、Ｒ８７Ｔ、Ａ９７Ｔ）を抗クローディン−１８．２抗体の重鎖に関して同定し、６個の潜在的な復帰変異体（Ｄ９Ｓ、Ａ１２Ｔ、Ｒ１８Ｋ、Ｎ２２Ｓ、Ｖ８９Ｌ、Ｑ１０６Ｓ）を軽鎖に関して同定した。
【０１９５】
上記の表５に要約されているように、親和性が成熟した抗クローディン−１８．２抗体のそれぞれに関して、７個のヒト化重鎖可変領域および３個のヒト化軽鎖可変領域を設計した。
【０１９６】
ヒト化完全長抗体をエンコードするＤＮＡ配列（それぞれの重鎖／軽鎖可変領域（表１に要約されている）およびヒトＩｇＧ１／κ定常領域（配列番号：６７および６８））を化学的に合成し、次いで、それぞれ、ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ、Ｃｌａ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位を使用して発現ベクターｐcＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした。すべての発現構築物をＤＮＡシークエンシングによって確認した。４２個のヒト化クローディン−１８．２抗体（１０個は１８Ｆ２−５、１１個は１８Ｆ２−３０、１１個は１８Ｆ２−３５、および１０個は１８Ｆ２−６６）を一過性発現させ、実施例３において説明したようにプロトコルを使用して精製した。次いで、精製されたヒト化抗体を、以下で詳細に説明するようにさらに特徴付けした。
【０１９７】
［実施例９  ＨＥＫ２９３Ａ細胞上に発現させたヒトクローディン−１８．２に結合された例示的なヒト化抗クローディン−１８．２抗体］
【０１９８】
４２個のヒト化抗クローディン−１８．２抗体を、ＨＥＫ２９３Ａ／ｈクローディン−１８．２細胞またはＨＥＫ２９３Ａ／ｈクローディン−１８．１細胞それぞれに発現させたヒトクローディン−１８．２またはヒトクローディン−１８．１に結合する能力に関して、さらに試験した。ＦＡＣＳを実施例４において説明されるように行った。
【０１９９】
代表的なヒト化抗クローディン−１８．２抗体の結合親和性を図７に示した。すべてのヒト化抗体の結合親和性は、それらの親抗体と類似しており、ヒトクローディン−１８．１への結合親和性を有するものはなく、それらのヒトクローディン−１８．２への高い特異的な結合性を表した。結合親和性に基づいて、それらのうち６個（１８Ｆ２−５ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−５ＶＨ７ＶＬ３、１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３、１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３５ＶＨ７ＶＬ３）をさらなる検討のために選択した。
【０２００】
［実施例１０  例示的なヒト化抗クローディン−１８．２抗体のＣＤＣ活性］
【０２０１】
ヒトクローディン−１８．２を過剰発現するＭＣ３８細胞に対してＣＤＣ活性を誘導する能力に関して、ヒト化抗体をさらにアッセイした。実施例６において説明されるプロトコルに従って、ＣＤＣアッセイを実施した。抗クローディン−１８．２抗体ＩＭＡＢ３６２を参照抗体として使用し、抗ＨＥＬモノクローナル抗体をネガティブコントロールとして使用した。
【０２０２】
ＣＤＣアッセイの結果を図８に示した。結果はすべての試験したヒト化抗クローディン−１８．２抗体が強いＣＤＣ活性を示したことを表した。
【０２０３】
［実施例１１  例示的なヒト化抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性］
【０２０４】
ＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ細胞をエフェクター細胞として使用することによって、ヒト化抗体のＡＤＣＣ効果を誘導する能力をアッセイした。実施例５におけるプロトコルに従って、ＡＤＣＣアッセイを行った。
【０２０５】
まず、ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞に対してＡＤＣＣを誘導する能力に関して、ヒト化抗クローディン−１８．２抗体を分析した。図９に示すように、ヒト化抗体１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０および１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３は、ＡＤＣＣアッセイにおいて、すべてのヒト化抗体の中でより強い効果を示した。
【０２０６】
この結果に基づいて、ＥＯＦで前処理したＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞およびＮＵＧＣ−４細胞（両方ともクローディン−１８．２タンパク質の高い内在性発現を有することが公知である）に対するこれらのヒト化抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ効果をさらに試験した。ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞およびＮＵＧＣ−４細胞を１０ｎｇ／ｍｌのエピルビシン（Ａｐｅｘｂｉｏ社，Ｃａｔ．Ａ２４５１−１００ｍｇ）、５００ｎｇ／ｍｌのオキサリプラチン（Ａｒｋ  ｐｈａｒｍ社、Ｃａｔ．Ａｋ−７２８１３）、および１０ｎｇ／ｍｌの５−ＦＵ（Ａｃｒｏｓ社、Ｃａｔ．Ｕｎ１２８１１）（ＥＯＦ）で７２時間、前処理し、次いで、薬物を除去し、細胞をさらに２４時間、通常の培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で培養した。実施例５において言及されるプロトコルを使用して、ＡＤＣＣアッセイを実施した。
【０２０７】
図１０に示すように、すべての６個の試験されたヒト化抗クローディン−１８．２抗体は、参照抗体ＩＭＡＢ３６２．と比較して、標的細胞ＫＡＴＯ−ＩＩＩまたはＮＵＧＣ−４細胞上で強いＡＤＣＣ活性を示した。
【０２０８】
［実施例１２  例示的なヒト化抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性の特異性］
【０２０９】
抗クローディン−１８．２抗体が、クローディン−１８．２を発現する標的細胞上に特異的にＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を示したが、クローディン−１８．１を発現する細胞上には示さなかったことを確認するために、実施例５および６において説明されるプロトコルに従って、ヒトクローディン−１８．１またはヒトクローディン−１８．２を発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞（ＨＥＫ２９３Ａ／ｈクローディン−１８．１細胞またはＨＥＫ２９３Ａ／ｈクローディン−１８．２）を標的細胞として使用してＡＤＣＣおよびＣＤＣアッセイを実施した。図１１（ＡＤＣＣアッセイ）および図１２（ＣＤＣアッセイ）に示すように、すべての試験された抗クローディン−１８．２抗体は、ヒトクローディン−１８．２を発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞上にのみＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を誘導し、ヒトクローディン−１８．１を発現する細胞上には誘導せず、抗クローディン−１８．２抗体によって誘導されたＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性がヒトクローディン−１８．２を発現する細胞に非常に特異的であることを示唆した。
【０２１０】
［実施例１３  例示的なヒト化抗クローディン−１８．２抗体のヒトクローディン−１８．２への結合安定性］
【０２１１】
１０個のヒト化抗クローディン−１８．２抗体を選んで、ヒトクローディン−１８．２（ＨＥＫ２９３Ａ／ｈヒトクローディン−１８．２）を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞との、それらの結合安定性を、実施例７において説明されるプロトコルに従って、ＦＡＣＳによって分析した。抗クローディン−１８．２抗体ＩＭＡＢ３６２を参照として使用し、抗ＨＥＬモノクローナル抗体をネガティブコントロールとして使用した。
【０２１２】
図１３に示すように、ヒト化抗体は種々の結合安定性を有し、結合安定性はＡＤＣＣおよびＣＤＣ試験結果と一貫している傾向がある。
【０２１３】
［実施例１４  例示的なヒト化抗クローディン−１８．２抗体のエピトープマッピング］
【０２１４】
各ヒト化抗クローディン−１８．２抗体の結合エピトープを検討した。その細胞外ループ１に様々な変異を有するヒトクローディン−１８．２またはクローディン−１８．１を発現する１６個のＨＥＫ２９３Ａ細胞株を生成した。ヒトクローディン−１８．２またはクローディン−１８．１変異体のアミノ酸配列は以下の表６に見ることができる。具体的には、細胞外ループ１にある単一のアミノ酸残基が、クローディン−１８．１．の細胞外ループ１にあるその対応物で置換された８個のヒトクローディン−１８．２変異体を設計した。実施例１におけるプロトコルに従って、これらのクローディン−１８．２またはクローディン−１８．１変異体を安定的に過剰発現するＨＥＫ−２９３Ａ細胞株をレンチウイルス感染によって生成した。次いで、ＦＡＣＳを実施して、変異体の各々への抗クローディン−１８．２抗体の結合親和性を調べた。
表６  ヒトクローディン−１８．１およびヒトクローディン−１８．２の変異体のアミノ酸配列番号ならびに抗体の変異体への結合能力
【表６】
2021509889.tif 000007
【０２１５】
表６に示すように、ＩＭＡＢ３６２を含む、すべての抗クローディン−１８．２抗体は、Ｅ５６Ｑ変異を持つ変異体６を発現する細胞に結合せず、Ｅ５６が、抗体クローディン−１８．２相互作用のために必須のアミノ酸残基であることを示唆した。加えて、データは、Ａ４２Ｓ（変異体３）またはＮ４５Ｑ（変異体４）変異を有するクローディン−１８．２が、ＩＭＡＢ３６２による結合を完全に失い、ヒト化抗クローディン−１８．２抗体１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３、または１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０による部分的な結合を失ったことを示した。総合すると、これらのデータは、ＩＭＡＢ３６２と比較して、抗体１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０が、ヒト化抗クローディン−１８．２の細胞外ループ１で異なるエピトープに結合したことを示唆した。
【０２１６】
上記の結果に基づいて、二重または複数部位の変異を有する別の５個の変異体を設計した。表６に示すように、ＩＭＡＢ３６２は、５個すべての変異体に結合せず、一方ですべてのヒト化抗体は変異体９、１０、および１１への結合親和性を完全に、または部分的に示し、ヒトクローディン−１８．２のＡ４２およびＮ４５はＩＭＡＢ３６２結合親和性のために必須のアミノ酸残基であるが、１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３、または１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０のために必須のアミノ酸残基ではないことが確認された。
【０２１７】
この結論をさらに確認するために、ヒトクローディン−１８．１変異体を過剰発現する別の３個の細胞株を生成した。上記の結果と一貫して、ＩＭＡＢ３６２を除くすべての抗体は変異体１４発現細胞に結合することができ、本開示のヒト化抗体とＩＭＡＢ３６２との間の異なる結合パターンを表す（図１５を参照されたい）。さらに、図１６から、Ｅ４７Ｑ復帰突然変異によりＩＭＡＢ３６２のクローディン−１８．２への結合親和性は向上しなかったが、１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０の結合親和性は増強されたことを見ることができ、ヒトクローディン−１８．２／Ｑ４７が、１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０のクローディン−１８．２への結合親和性のために重要なアミノ酸残基であるが、ＩＭＡＢ３６２のために重要なアミノ酸残基ではないことを示唆した。
【０２１８】
要点としては、ヒト化抗クローディン−１８．２抗体１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３、および１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０は、参照抗体ＩＭＡＢ３６２と比較して、ヒトクローディン−１８．２の細胞外ループ１において極めて異なるエピトープと結合すると結論される。
【０２１９】
［実施例１５  ヒトＰＢＭＣまたはＶγ９Ｖδ２Ｔ細による例示的なヒト化抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性］
【０２２０】
ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞（実施例５において調製された）またはＥＯＦで前処理されたＮＵＧＣ−４細胞に対してＡＤＣＣ活性を誘導する能力に関して、ヒトＰＢＭＣによって、ヒト化抗クローディン−１８．２抗体をさらに分析し、ＧＦＰタンパク質を発現したｐＬＶ−ＥＧＦＰ（２Ａ）−Ｐｕｒｏの感染によってＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞を生成した。リンパ球単離溶液を使用して、ヒトＰＢＭＣを密度勾配遠心によって調製し、培地（ＲＩＰＭ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋３００ＩＵ  ＩＬ−２）において一晩培養した。
【０２２１】
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能な死細胞染色キット（Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｓ  Ｋｉｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、米国、Ｃａｔ＃：Ｌ３４９６４）を使用することによってＡＤＣＣアッセイを行った。標的細胞およびエフェクター細胞（ＰＢＭＣ）の両方を５分間、１２００ｒｐｍで遠心した。次いで、細胞をＡＤＣＣ実験用の培養液（ＲＩＰＭ１６４０培養液＋１％ＦＢＳ）にて懸濁した。細胞計数によれば細胞生存率は約９０％であるはずである。標的細胞密度を、４×１０５／ｍｌに調整し、ＰＢＭＣ細胞密度を８×１０６／ｍｌに調整した。次いで、５０μｌのＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞および５０μｌのＰＢＭＣ（エフェクター−標的の比は２０：１であった）を各ウェルに加えた。異なる濃度の抗体を別々に加えて最終濃度を得た。ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞の抗体最終濃度は、８００ｎｇ／ｍｌ、３２ｎｇ／ｍｌ、および６．４ｎｇ／ｍｌであり、ＮＵＧＣ−４の濃度は、４０００ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ、６４ｎｇ／ｍｌ、および２．５ｎｇ／ｍｌであった。次いで、試料を３７℃で１２時間、インキュベートした。混合物をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能な死細胞染色で、３７℃で３０分間、インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＦＡＣＳによって分析した。ＧＦＰ陽性細胞（ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞）のアポトーシス比を算出した。
【０２２２】
ＮＵＧＣ−４細胞に対するアッセイに関して、ＮＵＧＣ−４細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのエピルビシン（Ａｐｅｘｂｉｏ社、Ｃａｔ．Ａ２４５１−１００ｍｇ）、５００ｎｇ／ｍｌのオキサリプラチン（Ａｒｋ  ｐｈａｒｍ社、Ｃａｔ．Ａｋ−７２８１３）、および１０ｎｇ／ｍｌの５−ＦＵ（Ａｃｒｏｓ社、Ｃａｔ．Ｕｎ１２８１１）（ＥＯＦ）で７２時間、前処理し、次いで、薬剤を除去した。細胞をさらに２４時間、通常の培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で培養した。ＮＵＧＣ−４細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、Ｃａｔ＃：Ｃ３４５５４）で製造会社の指示に従って標識した。ＡＤＣＣエフェクター細胞の標的細胞に対する比が５０：１であったことを除いては、上述のように、ＡＤＣＣアッセイを実施した。
【０２２３】
これまでの調査により、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞が、抗ヒトクローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性にとって重要であることは示されていた。本実施例において、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣ中で富化した。具体的には、ＰＢＭＣを収集し、１０％ＦＢＳ、３００ＩＵ  ＩＬ−２、および１μＭのゾレドロン酸（ＺＡ）と共に、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を誘導するＤＭＥＭ培地において培養した。１４日後、細胞を採取してＡＤＣＣアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。ＭＣ３８／ｈクローディン−１８．２細胞を標的細胞として使用するアッセイでは、Ｅ／Ｔ比は２０：１であり、一方、ＥＯＦで前処理したＮＵＧＣ−４細胞を標的細胞として使用したとき、Ｅ／Ｔ比は５０：１であった。詳細なＡＤＣＣプロトコルは、上述の説明と同じであった。
【０２２４】
図１７（エフェクター細胞としてのＰＢＭＣ）および図１８（エフェクター細胞としてのＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞）に示すように、すべての抗体は、用量依存的なやり方で、ＰＢＭＣおよびＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞によって標的細胞上の強いＡＤＣＣ活性を誘導することができる。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞によるＡＤＣＣ活性は確かに、ＰＢＭＣによるＡＤＣＣ活性より強く、これまでの調査と一貫していた。
【０２２５】
［実施例１６  例示的な抗クローディン−１８．２抗体のインビボ抗腫瘍効果］
【０２２６】
６個の抗クローディン−１８．２抗体（１８Ｆ２−５ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−５ＶＨ７ＶＬ３、１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３０ＶＨ７ＶＬ３、１８Ｆ２−３５ＶＨ０ＶＬ０、および１８Ｆ２−３５ＶＨ７ＶＬ３）を、マウス結腸腺癌を有するＣ５７マウスにおけるインビボ抗腫瘍活性の調査のために選択した。動物モデルの抗体のＡＤＣＣ活性を示させるために、抗体の可変領域をマウスＩｇＧ２ａ／κ定常領域と融合させて完全長抗体を調製した。ｍＩｇＧ２ａおよびκ定常領域アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：８９および９０に記載されていた。
【０２２７】
Ｃ５７マウスに、ヒトクローディン−１８．２（ＭＣ３８／ｈヒトクローディン−１８．２）を過剰発現する１×１０６個のＭＣ３８細胞を側腹部領域に０日目に注入した。腫瘍が約８０ｍｍ３に達したとき、動物を異なる群（ｎ＝８）に振り分け、抗体のうち１つを、５、７、１０、１２、１４、１７、および１９日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。腫瘍成長を経時的に観察し、５、７、１０、１２、１４、１７および１９日目に体積を測定した。腫瘍の測定値（幅および長さ）をノギスで取り、腫瘍体積は式ＴＶ＝（長さ×幅２）／２によって算出した。実験を腫瘍体積が３ｃｍ３に達する前に終了した。
【０２２８】
図１９に示すように、すべての試験された抗体は腫瘍成長を阻害し、抗体は、最良の抗腫瘍効果を示す１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０可変領域を有した。
【０２２９】
［実施例１７  化学療法との組み合わせにおける例示的な抗クローディン−１８．２抗体の抗腫瘍効果］
【０２３０】
Ｃ５７マウスに、ヒトクローディン−１８．２（ＭＣ３８／ｈヒトクローディン−１８．２）を過剰発現する１×１０６個のＭＣ３８細胞を側腹部領域に０日目に皮下的に注入した。腫瘍が約８０ｍｍ３に達したとき、動物を異なる群（ｎ＝１０）に振り分け、ＥＯＦ（エピルビシン（１．２５ｍｇ／ｋｇ）、オキサリプラチン（３．２５ｍｇ／ｋｇ）、および５−ＦＵ（５６．２５ｍｇ／ｋｇ））または対照ビヒクルを５日目および１２日目に腹腔内投与し、ここで、対照群はＥＯＦ前処理を受けなかった。次いで、６、８、１１、１３、１５、および１８日目に、これらのマウスに１８Ｆ２−３０−ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−５−ＶＨ０ＶＬ０、１８Ｆ２−３５−ＶＨ７ＶＬ３（３種すべてがマウスＩｇＧ２ａ／κ定常領域を有し、ｍＩｇＧ２ａおよびκ定常領域アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：８９および９０に記載されていた）、または対照薬剤を１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注入した。腫瘍成長を経時的に観察し、５、７、１０、１２、１４、１７および１９日目に体積を測定した。腫瘍の測定値（幅および長さ）をノギスで取り、腫瘍体積は式ＴＶ＝（長さ×幅２）／２によって算出した。実験を腫瘍体積が３ｃｍ３に達する前に終了した。
【０２３１】
図２０に示すように、すべての試験された抗体は、化学療法剤と相乗的な抗腫瘍効果を示し、その中で、１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０可変領域を有する抗体は、最良の相乗的な抗腫瘍効果を示した。
【０２３２】
［実施例１８  非フコシル化抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性］
【０２３３】
米国特許出願公開第２０１８／００２２８２０Ａ１号明細書において説明されるようにＳＬＣ３５ｃ１ノックアウトのＣＨＯＫ１−ＡＦ細胞がＭａｂｗｏｒｋｓ社によって生成され、この細胞株によって発現されるタンパク質は、フコシル化修飾をほとんど有さなかった。
【０２３４】
１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０および１８Ｆ２−３５ＶＨ７ＶＬ３のそれぞれの重鎖／軽鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１／κ定常領域（配列番号：６７および６８）をｐcＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カールスバッド）の適切な制御部位にクローニングすることによって、発現ベクターを構築し、次いで、発現ベクターをＳＬＣ３５ｃ１ノックアウトのＣＨＯＫ１−ＡＦに形質転換させた。１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０ＡＦおよび１８Ｆ２−３５ＶＨ７ＶＬ３ＡＦと呼ばれる２種の非フコシル化抗クローディン−１８．２抗体をＳＬＣ３５ｃ１ノックアウトのＣＨＯＫ１−ＡＦに一過性発現させ、次いで、実施例３におけるプロトコルに従って精製した。
【０２３５】
エフェクター細胞としてＮＫ９２ＭＩ−ＣＤ１６ａ細胞を、および標的細胞として、ＥＯＦで前処理したＮＵＧＣ−４細胞を使用することによって、２個の非フコシル化抗クローディン−１８．２抗体のＡＤＣＣ活性をアッセイした。実施例５におけるプロトコルに従って、ＡＤＣＣアッセイを行った。
【０２３６】
ヒトクローディン−１８．２を過剰発現するＭＣ３８細胞に対してＣＤＣ活性を誘導する能力に関して、非フコシル化抗体をさらにアッセイした。実施例６において説明されるプロトコルに従って、ＣＤＣアッセイを実施した。抗クローディン−１８．２抗体ＩＭＡＢ３６２を参照抗体として使用し、抗ＨＥＬモノクローナル抗体をネガティブコントロールとして使用した。
【０２３７】
図２１に示すように、１８Ｆ２−３０ＶＨ０ＶＬ０ＡＦおよび１８Ｆ２−３５ＶＨ７ＶＬ３ＡＦは共に、それぞれの親抗体より高いＡＤＣＣ活性を有した。図２２における結果により、これらの２個の抗体のＣＤＣ活性が親抗体と異ならないことが示唆された。
【０２３８】
例示的な抗体の重鎖／軽鎖可変領域アミノ酸配列を以下のとおり要約する。
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【０２３９】
本開示では、１つまたは複数の実施形態に関連して上に説明してきたが、本開示はそれらの実施形態に限定されるものではないことが理解されるべきであり、説明はすべての代替、改変、および均等物を包含することを意図するものであり、それらは添付した請求項の趣旨および範囲内に含まれる場合がある。本明細書において言及されるすべての参考文献は、その全体が参照により引用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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