(57)【要約】  本発明の主題は、水チャネル蛋白質の一種であるアクアポリン３（ＡＱＰ３）の細胞外ドメインを特異的に認識する抗ＡＱＰ３抗体を提供することである。  ＡＱＰ３の細胞外ドメインの１つとしてのループＣに含まれるオリゴペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を選抜することによって、本発明において所望される抗ＡＱＰ３抗体が提供される。  本発明の抗ＡＱＰ３モノクローナル抗体は、細胞膜に存在するＡＱＰ３に細胞の外側から直接に結合することができる。さらには、本発明の抗ＡＱＰ３モノクローナル抗体は阻害活性を有し得るので、ＡＱＰ３が有する機能で、低分子量分子などを透過させる機能を抑制することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列がＡＴＹＰＳＧＨＬＤＭ（配列番号１）からなるオリゴペプチドに特異的に結合する抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片。
【請求項２】
ヒトＡＱＰ３及び／又はマウスＡＱＰ３に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項３】
ヒトＡＱＰ３の細胞外ドメイン及び／又はマウスＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片。
【請求項４】
ヒトＡＱＰ３の細胞外ドメイン及び／又はマウスＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項１又は請求項２に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項５】
ＰＡＭ２１２細胞の表面、マウスマクロファージの表面、又はＨＥＫ２９３細胞の表面に発現するＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項３又は請求項４に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項６】
ヒトＡＱＰ３及び／又はマウスＡＱＰ３の少なくとも１つの機能に対する阻害活性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項７】
ＰＡＭ２１２細胞、ＨａＣａＴ細胞及びＡ４３１細胞の１つ又は複数の増殖を阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項８】
Ｈ２Ｏ２輸送を阻害する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項９】
ｐ６５のリン酸化を阻害する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１０】
四塩化炭素により処置されたマウスにおける肝臓の炎症性応答を阻害する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１１】
表２Ａ〜表５Ｅの１つに示される配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＲＤ２）、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片。
【請求項１２】
抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ又は抗体Ｋの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む、請求項１１に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１３】
前記ＣＤＲ配列が、表１Ａ〜表１Ｊに示されるＩＭＧＴ番号表記によって定義される、請求項１２に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１４】
前記ＣＤＲ配列が、表１Ａ〜表１Ｊに示されるＫａｂａｔ番号表記によって定義される、請求項１２に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１５】
前記ＣＤＲ配列が、表１Ａ〜表１Ｊに示されるＣｈｏｔｈｉａ番号表記によって定義される、請求項１２に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１６】
前記ＣＤＲ配列が、表１Ａ〜表１Ｊに示されるＩＭＧＴ・Ｋａｂａｔ・Ｃｈｏｔｈｉａ共通配列によって定義される、請求項１２に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１７】
前記ＣＤＲ配列が、表１Ａ〜表１Ｊに示されるＩＭＧＴ・Ｋａｂａｔ・Ｃｈｏｔｈｉａ統合重複配列によって定義される、請求項１２に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１８】
抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ又は抗体Ｋの可変重鎖（ＶＨ）配列及び可変軽鎖（ＶＨ）配列を含む、請求項１１に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項１９】
ヒトＡＱＰ３及び／又はマウスＡＱＰ３への結合について請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片と競合する抗体又はその機能的断片。
【請求項２０】
ＡＱＰ３以外の１つ又は複数のヒトアクアポリン（「非ＡＱＰ３アクアポリン」）には特異的に結合しない、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片であって、前記抗体がＩｇＧの免疫グロブリン分子である、抗体又はその機能的断片。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片であって、前記抗体がモノクローナル抗体である、抗体又はその機能的断片。
【請求項２３】
ヒト抗体の定常領域を有するキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２４】
抗体である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２５】
単一特異性抗体である、請求項２４に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２６】
多重特異性抗体である、請求項２４に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２７】
抗体の機能的断片である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２８】
Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦｖから選択される機能的断片である、請求項２７に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２９】
レポーター物質により標識される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項３０】
固体支持体に固定化される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項３１】
細胞傷害性薬剤にコンジュゲート化される請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項３２】
前記細胞傷害性薬剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤又は細胞傷害性抗生物質を含む、請求項３１に記載のＡＤＣ。
【請求項３３】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む組成物。
【請求項３４】
ＡＱＰ３検出用試薬である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
ＡＱＰ３発現細胞の同定、分離又は精製のための試薬である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
ＡＱＰ３発現量測定用試薬である、請求項３３又は３４に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
【請求項３８】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片を含む組成物であって、前記モノクローナル抗体又はその機能的断片がＡＱＰ３の少なくとも１つの機能に対する阻害活性を有する、組成物。
【請求項３９】
薬学的に許容されるキャリアをさらに含む医薬組成物である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項３１又は請求項３２に記載のＡＤＣと、薬学的に許容されるキャリアとを含む組成物。
【請求項４１】
ガンの処置において使用するための請求項３９又は請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ガンが、結腸直腸ガン、子宮頸ガン、肝ガン、肺ガン、食道ガン、腎臓ガン、胃ガン、舌ガン、皮膚ガン及び乳ガンからなる群から選択されるガンである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
皮膚障害の予防及び／又は処置において使用するための請求項３９に記載の組成物。
【請求項４４】
前記皮膚障害が、乾癬、光線性角化症、魚鱗癬及び脂漏性皮膚炎からなる群から選択される、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
炎症性障害の予防及び／又は処置において使用するための請求項３９に記載の組成物。
【請求項４６】
前記炎症性障害が、アトピー性皮膚炎、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患及び肝炎からなる群から選択される、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
ＡＱＰ３を検出するための方法であって、サンプルを請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片と、又は請求項３３若しくは３４に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項４８】
ＡＱＰ３発現細胞を分離及び／又は精製するための方法であって、細胞を含むサンプルを請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項４９】
ＡＱＰ３を測定するための方法であって、サンプルを請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は請求項３３、３４若しくは３６に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項５０】
ＡＱＰ３の少なくとも１つの機能を阻害するための方法であって、ＡＱＰ３を含むサンプルを請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は請求項３８に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項５１】
膜を横断する低分子量物質の輸送を阻害するための方法であって、ＡＱＰ３を含む膜を有するサンプルを請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は請求項３８に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項５２】
抗ＡＱＰ３抗体を生成させるための方法であって、（ｉ）アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドと、（ｉｉ）ＡＱＰ３過剰発現細胞との組合せにより非ヒト哺乳動物を免疫化することを含む、方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物がマウスである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＡＱＰ３過剰発現細胞が、ＡＱＰ３を過剰発現するＣＨＯ細胞、及び／又はマウスＡＱＰ３を過剰発現するＣＨＯ細胞を含む、請求項５２又は請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
免疫細胞を前記免疫化された哺乳動物から集めること、前記免疫細胞からのｍＲＮＡを使用して抗体ライブラリーを作製すること、及び１つ又は複数の抗ＡＱＰ３抗体を前記抗体ライブラリーから同定することをさらに含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水チャネル蛋白質の一種であるアクアポリン３（ＡＱＰ３）の細胞外ドメインを特異的に認識する抗ＡＱＰ３抗体に関する。さらに、本発明は、本発明の抗ＡＱＰ３抗体を含む組成物、並びに本発明の抗ＡＱＰ３抗体を含むＡＱＰ３検出用試薬、本発明の抗ＡＱＰ３抗体を含むＡＱＰ３発現細胞同定・分離用試薬、及び本発明の抗ＡＱＰ３抗体を含むＡＱＰ３測定用試薬に関する。さらに、本発明は、ＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合し、かつ、ＡＱＰ３のチャネル機能等に対する阻害活性を有する抗ＡＱＰ３モノクローナル抗体（阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ）に関する。さらに、本発明は、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む組成物、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含むＡＱＰ３阻害剤、及び本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はＡＱＰ３検出用試薬を使用することによってＡＱＰ３を検出するための方法、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はＡＱＰ３発現細胞同定・分離用試薬を使用することによってＡＱＰ３発現細胞を分離・精製するための方法、及び本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はＡＱＰ３検出用試薬を使用することによってＡＱＰ３を測定するための方法に関する。さらに、本発明は、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む組成物、又は本発明のＡＱＰ３阻害剤を使用することによってＡＱＰ３の機能（チャネル機能等）を阻害するための方法、及び本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む組成物、又は本発明のＡＱＰ３阻害剤を使用することによって、生体膜を横断する低分子量物質（水、グリセロール又は過酸化水素等）の輸送を阻害するための方法に関する。なおもさらに、本発明は、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む組成物、又は本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む医薬組成物を使用することによってＡＱＰ３関連障害を予防／処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体膜は、脂質二重層から構成されるため、水分子に対する透過性が低い。それゆえ、生体膜を横断して水分子を速やかに、かつ大量に輸送すること（透過させること）が望まれるときには、膜蛋白質から構成される水チャネルが必要である。水チャネルとしてのアクアポリン（ＡＱＰ）は、水分子のみを通過させる微細な孔（ポア）を有する膜蛋白質であり、Ｐｅｔｅｒ  Ａｇｒｅのグループによって１９９２年に赤血球膜から発見された。それ以降、アクアポリンが、様々な細菌、動物及び植物において発見されており、アクアポリンは、生物学的系に一般に存在する水チャネルであることが知られている。多数のＡＱＰ分子種（アイソフォーム）が１つの生物種においてさえ存在することもまた確認されている。例えば、ＡＱＰ０からＡＱＰ１２までの１３種類のアクアポリン分子種がヒトにおいて確認されている。加えて、水分子を選択的に通過させる分子種（ＡＱＰ１等）、また、水分子、グリセリン又は過酸化水素等の低分子量物質を通過させる分子種（ＡＱＰ３等）のように、分子種の間での機能分化が認められている。これら１３種類のＡＱＰ分子種は様々な発現パターンを多くの臓器において示すことが明確に示されており、水輸送が盛んに行われる腎臓のような臓器では、１つの臓器における複数分子種のアクアポリンの発現が認められる。
【０００３】
アクアポリンの異常な発現及び／又は機能が、ある種の障害と関連することが徐々に明らかにされてきた。例えば、ＡＱＰ０の欠損により、先天性白内障が生じることがあることが知られている。ＡＱＰ２の発現／機能の低下は尿崩症に関連することが知られており、その一方で、ＡＱＰ２の機能亢進は、妊娠に伴う浮腫、高血圧症及びうっ血性心不全に関連することが示唆されている。脱髄性障害としての視神経脊髄炎の場合には、抗ＡＱＰ４自己抗体がその病態形成と関係することが知られている。また、ＡＱＰ５の変異と掌蹠角化症との関連が報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
アクアポリンは、細胞膜を６回横切る膜蛋白質であり、６つの膜貫通ドメインと、膜貫通ドメインをつなぐ５つのループ（ループＡ〜ループＥ）とを有する。細胞膜に存在するＡＱＰにおけるＡＱＰポリペプチドの中で、Ｎ末端領域、ループＢ、ループＤ及びＣ末端領域のそれぞれが細胞質側に存在する一方、ループＡ、ループＣ及びループＥのそれぞれが細胞外側に存在する（図１）。この６回膜貫通構造がすべてのＡＱＰ分子種において共通して見出される。
【０００５】
１分子のアクアポリンが１つの通過路を有するが、アクアポリンは生体膜において多量体（ホモ四量体）として存在する。加えて、アクアポリンは、水分子、グリセロール、過酸化水素、二酸化炭素、アンモニア及び尿素のような低分子量物質を、通過路を介して受動的に輸送する機能を担っている。
【０００６】
様々な分析がアクアポリンの各分子種の発現特性又は機能に関して行われてきているが、十分な解明には未だ至っていない。十分な解明が得られていない理由の１つとして、それぞれの分子種を同定する十分な特性を有する抗アクアポリン抗体が得られていないことを挙げることができる。現在、抗ＡＱＰ抗体の取得に関する報告がいくつかあり、市販されている抗ＡＱＰ抗体もまた存在する。しかしながら、そのような抗体のほとんどがポリクローナル抗体であり、ＡＱＰの細胞内ドメインをエピトープとしている。ポリクローナル抗体に関しては、特異的同定性が十分でない場合が多く、精度の高い検出又は測定ができないという点で限界もまた存在する。さらには、ポリクローナル抗体に関しては、ＡＱＰ発現細胞の単離及び精製を行うことが現実的に不可能であった。関連技術分野の抗ＡＱＰ抗体のほとんどが、細胞内に存在するエピトープを認識する抗体であるので、免疫組織化学的分析、又は生細胞を使用する分析を行うことに関してもまた制約されていた。
アクアポリンの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体の取得例が極めて限られていることの理由は明らかにされていないが、アクアポリンのような膜蛋白質は免疫原として取り扱いにくく、膜蛋白質を特異的に認識する抗体の取得は一般に容易でない。生物種の間では配列の保存が比較的高いため、アクアポリン蛋白質又はその断片を免疫原として使用することによって異種の動物を免疫化したときには所望の特異的抗体を産生させることが困難であることもまた考えられる。
【０００７】
アクアポリン３（ＡＱＰ３）は、ＡＱＰの他の分子種と同様、生体膜に局在化し、αへリックスからそれぞれが構成される６つの膜貫通領域（膜貫通領域Ｉ〜ＶＩ）と、それらをつなぐ５つのループ（ループＡ〜ループＥ）とから形成される水チャネル蛋白質であり、Ｎ末端及びＣ末端領域がともに細胞質側に存在する構造を有する。生体膜を横切るαへリックスは、水分子又は他の低分子量成分（グリセロール及び過酸化水素）の通過を可能にする微細な孔（ポア）を形成する。
ＡＱＰ３は、上皮細胞、免疫細胞及びガン細胞を含めて様々な細胞で発現することが知られている。ＡＱＰ３を多く発現する細胞の１つとして、ケラチノサイトが知られている。皮膚においては、ＡＱＰ３は、水及びグリセロールの輸送を促進するため、皮膚の生理的保湿及び皮膚創傷の回復において重要な役割を果たしていると考えられている（特許文献１）。一方、乾癬、光線性角化症、魚鱗癬及び脂漏性皮膚炎のような、異常なケラチノサイト増殖を伴う皮膚障害については、ケラチノサイトの細胞増殖を調節するための因子としてのＡＱＰ３を標的とすることによるＡＱＰ３産生の抑制に基づく治療法が提案されている（特許文献２）。皮膚のガン化との関連もまた報告されている。それぞれのＡＱＰ３が、皮膚における保湿、腫瘍形成及びバリア機能回復のためのグリセロール輸送活性に基づいて、又は傷ついた皮膚の回復のための水分子輸送活性に基づいてその生理的活性を果たすメカニズムが提唱されている（非特許文献２）。
ＡＱＰ３とガンとの関係性に関しては、皮膚ガンに限らず多くの事例が報告されている。結腸直腸ガン、子宮頸ガン、肝ガン、肺ガン、食道ガン、腎臓ガン、胃ガン及び舌ガン等の組織において、それぞれのＡＱＰ３の増大した発現レベルが確認されている。さらには、それらのガンでは、ＡＱＰ３の機能が、ガンの進行度、予後、腫瘍血管形成、浸潤、転移、及びガン組織のエネルギー代謝などに関連することが示唆されている。そのような理由から、ＡＱＰ３（の発現レベルを低下させること）がそれらのガンのための治療標的として提案されてきているが、良好な結果が実際の治験から未だ得られていない（非特許文献１、非特許文献３及び非特許文献４）。
大腸は、ＡＱＰ３が発現する他の主要な組織の１つとして知られており、腸管上皮におけるＡＱＰ３の発現レベルと生理学的状態との関係性が報告されている。この報告によると、大腸におけるＡＱＰ３の発現レベルがいくつかの緩下剤によって低下することが明白である。モルヒネによって引き起こされる重度の便秘には、大腸におけるＡＱＰ３の増大した発現レベルが伴う（非特許文献５）。
【０００８】
ＡＱＰ３の分析のために、水分子又はグリセロールを透過させるチャネルの活性を抑制する化合物が、ＡＱＰ３阻害剤として報告されている（非特許文献６及び非特許文献７）。このＡＱＰ３阻害剤に限らず、ほとんどのＡＱＰ阻害剤が、水銀、銅又は金のような金属を含有する金属化合物である。金属化合物であることは、細胞毒性を示す可能性が高いということを意味する。そのような理由から、ある一定の有用性がこのＡＱＰ阻害剤には認められるが、このＡＱＰ阻害剤は、培養細胞を用いた機能分析、及び実験動物への投与が行われる試験の両方においてその適用の面で制約されている。さらには、金属化合物としてのこのＡＱＰ阻害剤の、ＡＱＰに対する分子種特異性が一般に高くない。例えば、ＡＱＰ３に対する阻害だけでなく、ＡＱＰ１及びＡＱＰ４のような他のＡＱＰ分子種の機能的阻害もまた引き起こすという問題が報告されている。そのようなものとして、このＡＱＰ３阻害剤を臨床応用としてヒトに投与することが実際には実施できない。
【０００９】
ＡＱＰ３の機能分析の別のアプローチとして、ＡＱＰ３欠損細胞又はＡＱＰ３ノックダウン細胞を使用する事例が報告されている（非特許文献８）。ＡＱＰ３欠損細胞又はＡＱＰ３ノックダウン細胞では、細胞増殖性又は細胞遊走が低下し、炎症によって引き起こされる応答（炎症性応答）が低下することが見出される。アトピー性皮膚炎、乾癬又は喘息などのような炎症性障害を惹起する処置をＡＱＰ３ノックアウトマウスについて行ったときには、それらの炎症性障害の発症が、野生型マウスを用いた対照と比較して抑制されることもまた報告されている。ヒト由来のガン細胞のマウスへの移植実験において、ＡＱＰ３発現のノックダウンに応じてガン悪性化が抑制できることもまた報告されている。このノックダウンについては、ＳｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを用いた例が報告されている。しかしながら、それらの研究のすべてが基礎的段階にあるにすぎず、臨床応用可能なＡＱＰ３発現調節剤は未だ開発されていない。
【００１０】
ＡＱＰ３の分析を進めるためには、ＡＱＰ３の発現部位又は発現レベルを精度良く検出することが、必要な手段の１つである。ＡＱＰ３特異的な検出が、特異的なプローブ又はプライマーを使用することによってＡＱＰ３ｍＲＮＡの蓄積レベルを検出することに基づいて広く行われている。しかしながら、核酸レベルでの分析に従えば、ＡＱＰ３がどのような分布で、どのような量で実際に存在しているかを知ることができない。一方、抗ＡＱＰ３抗体が確立され、また、数種類の抗体が市販されているので、ＡＱＰ３の発現分析もまた行うことができる。しかしながら、市販の抗ＡＱＰ３抗体のすべてがポリクローナル抗体であり、精度の高い分析のためには十分でなかった。さらには、市販の抗ＡＱＰ３抗体のすべてが、ＡＱＰ３のＮ末端部分又はＣ末端部分に存在する細胞内ドメインをエピトープとする抗体であるため、生細胞を用いた実験によるＡＱＰ３の検出が困難となっていた。さらには、ポリクローナル抗体であるため、抗体を用いたＡＱＰ３発現細胞の選別のために使用することが実際には不可能であった。このような事情から、ＡＱＰ３に対するモノクローナル抗体、特に、ＡＱＰ３の細胞外ドメインを特異的に認識するモノクローナル抗体が切望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１１−３２１９１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／０１３７２７Ａ号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｖｅｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１４）ｖｏｌ．１３、ｐｐ．２５９−２７７
【非特許文献２】Ｈａｒａ−Ｃｈｉｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（２００８）ｖｏｌ．１２８、ｐｐ．２１４５−２１５１
【非特許文献３】Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ｓａａｄｏｕｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（２０１５）ｖｏｌ．１８４８、ｐｐ．２５７６−２５８３
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１５）ｖｏｌ．１３：９６
【非特許文献５】Ｉｋａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．（２０１６）ｖｏｌ．１７、１１７２
【非特許文献６】Ｚｅｌｅｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）ｖｏｌ．２７９、ｐｐ．５１９３９−５１９４３
【非特許文献７】Ｍａｒｔｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１２）７（５）：ｅ３７４３５
【非特許文献８】Ｈａｒａ−Ｃｈｉｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１６）ｖｏｌ．４７１、ｐｐ．６０３−６０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の１つの目的が、水チャネル蛋白質の一種であるアクアポリン３（ＡＱＰ３）の細胞外ドメインを特異的に認識する抗ＡＱＰ３抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ＡＱＰ３の細胞外ドメインを特異的に認識する抗ＡＱＰ３抗体を提供するために、ＡＱＰ３の構造について、特に、細胞外ドメインを構成するループＡ、ループＣ及びループＥの構造について鋭意研究を行い、ループＣ（細胞外の２番目のループ）の一部を構成する、免疫原としての断片（オリゴペプチド）をＡＱＰ３過剰発現細胞と一緒に使用することによって宿主動物を免疫化することに従って、ＡＱＰ３を特異的に認識する所望の抗体を得ることができること、複数のハイブリドーマクローンに由来する複数の抗ＡＱＰ３モノクローナル抗体（抗ＡＱＰ３ｍＡｂ）を得ることができること、抗ＡＱＰ３ｍＡｂはＡＱＰ３ポリペプチド及び前記断片に特異的に結合すること、そして、抗ＡＱＰ３ｍＡｂは、ＡＱＰ３に基づくチャネル機能、ＡＱＰ３発現細胞の増殖活性、及び／又はＡＱＰ３発現細胞の遊走活性を特異的に阻害する活性を有することを見出した。それらの発見に基づいて、本発明者らは本発明を完成させた。
【００１５】
本発明によれば、ＡＱＰ３の細胞外ドメインを特異的に認識する抗ＡＱＰ３抗体が提供される。さらには、本発明の抗ＡＱＰ３抗体を含む組成物、本発明の抗ＡＱＰ３抗体を含むＡＱＰ３検出用試薬、本発明の抗ＡＱＰ３抗体を含むＡＱＰ３発現細胞同定・分離用試薬、及び本発明の抗ＡＱＰ３抗体を含むＡＱＰ３測定用試薬が提供される。さらには、そのような試薬のいずれかを含むキットが提供される。さらには、ＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合し、かつ、ＡＱＰ３のチャネル機能等に対する阻害活性を有する抗ＡＱＰ３モノクローナル抗体（阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ）が提供される。さらには、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む組成物、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含むＡＱＰ３阻害剤、及び本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む医薬組成物が提供される。さらには、本発明の抗ＡＱＰ３抗体と、細胞傷害性薬剤とを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、及びＡＤＣを含む医薬組成物が提供される。さらには、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はＡＱＰ３検出用試薬を使用することによってＡＱＰ３を検出するための方法、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はＡＱＰ３同定・分離用試薬を使用することによってＡＱＰ３発現細胞を分離・精製するための方法、及び本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はＡＱＰ３検出用試薬を使用することによってＡＱＰ３を測定するための方法が提供される。さらには、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む組成物、又は本発明のＡＱＰ３阻害剤を使用することによってＡＱＰ３の機能（チャネル機能等）を阻害するための方法、及び、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む組成物、又は本発明のＡＱＰ３阻害剤を使用することによって、生体膜を横断する低分子量物質（水、グリセロール又は過酸化水素等）の輸送を阻害するための方法が提供される。なおもさらには、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む組成物、又は本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂを含む医薬組成物を使用することによってＡＱＰ３関連障害を予防／処置するための方法が提供される。
【００１６】
１つの態様において、本発明は、アミノ酸配列がＡＴＹＰＳＧＨＬＤＭ（配列番号１）からなるオリゴペプチドに特異的に結合する抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片を提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、表１Ａ〜表５Ｅに示される配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＲＤ２）、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片を提供する。表１Ａ〜表５ＥにおけるＣＤＲ配列は、実施例に記載される抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ及び抗体Ｋのアミノ酸配列に由来する。表１Ａ〜表５Ｅに示されるＣＤＲ配列を有する抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片についてのフレームワーク配列は、例えば、マウスのフレームワーク配列又はヒトのフレームワーク配列であることが可能である。
【００１８】
表１Ａ〜表１Ｊに示されるＣＤＲ配列には、ＩＭＧＴ番号表記システム、Ｋａｂａｔ番号表記システム及びＣｈｏｔｈｉａ番号表記システムによって定義されるＣＤＲ配列が含まれる。Ｌｅｆｒａｎｃ他、２００３、Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐａｒａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５−７７（ＩＭＧＴ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）、Ｋａｂａｔ他、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）、及びＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ他、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２７３：９２７−９４８（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を参照のこと。これらの表にはまた、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲについての重複の共通領域である配列（「ＩＭＧＴ・Ｋａｂａｔ・Ｃｈｏｔｈｉａ共通配列」）と、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲについての重複の統合された領域である配列（「ＩＭＧＴ・Ｋａｂａｔ・Ｃｈｏｔｈｉａ統合重複配列」）とが含まれる。
【００１９】
表２Ａ〜表５Ｅにおける配列は、表１Ａ〜表１Ｊに示されるＣＤＲ配列に由来するコンセンサス配列である。具体的には、表２Ａ〜表２Ｅにおける配列は、抗体Ａ、抗体Ｄ、抗体Ｅ及び抗体Ｇ（「Ｉ群」）についてのＣＤＲに由来し、表３Ａ〜表３Ｆにおける配列は抗体Ｂ及び抗体Ｈ（「ＩＩ群」）についてのＣＤＲに由来し、表４Ａ〜表４Ｅにおける配列は抗体Ｃ及び抗体Ｆ（「ＩＩＩ群」）についてのＣＤＲに由来し、表５Ａ〜表５Ｅにおける配列は抗体Ｊ及び抗体Ｋ（「ＩＶ群」）についてのＣＤＲに由来する。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
【表２】
2021501132.tif 000003
【００２２】
【表３】
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【００２３】
【表４】
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【００２４】
【表５】
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【００２５】
【表６】
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【００２６】
【表７】
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【００２７】
【表８】
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【００２８】
【表９】
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【００２９】
【表１０】
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【００３０】
【表１１】
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【００３１】
【表１２】
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【００３２】
【表１３】
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【００３３】
【表１４】
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【００３４】
【表１５】
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【００３５】
【表１６】
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【００３６】
【表１７】
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【００３７】
【表１８】
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【００３８】
【表１９】
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【００３９】
【表２０】
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【００４０】
【表２１】
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【００４１】
【表２２】
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【００４２】
【表２３】
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【００４３】
【表２４】
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【００４４】
【表２５】
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【００４５】
【表２６】
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【００４６】
【表２７】
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【００４７】
【表２８】
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【００４８】
【表２９】
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【００４９】
【表３０】
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【００５０】
【表３１】
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【００５１】
【表３２】
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【００５２】
【表３３】
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【００５３】
【表３４】
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【００５４】
【表３５】
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【００５５】
【表３６】
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いくつかの実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片は、表１Ａ〜表１Ｊに示される配列から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列及び可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又は機能的断片は抗体ＡのＶＨ及びＶＬを含む。他の実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又は機能的断片は抗体ＢのＶＨ及びＶＬを含む。他の実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又は機能的断片は抗体ＣのＶＨ及びＶＬを含む。他の実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又は機能的断片は抗体ＤのＶＨ及びＶＬを含む。他の実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又は機能的断片は抗体ＥのＶＨ及びＶＬを含む。他の実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又は機能的断片は抗体ＦのＶＨ及びＶＬを含む。他の実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又は機能的断片は抗体ＧのＶＨ及びＶＬを含む。他の実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又は機能的断片は抗体ＨのＶＨ及びＶＬを含む。他の実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又は機能的断片は抗体ＪのＶＨ及びＶＬを含む。他の実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又は機能的断片は抗体ＫのＶＨ及びＶＬを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、抗体又はその機能的断片は、ＡＱＰ３への結合について、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨａＣａＴ細胞又はＡ４３１細胞の表面に発現するヒトＡＱＰ３、或いはＨＥＫ２９３細胞、ＰＡＭ２１２細胞又はマウスマクロファージ細胞の表面に発現するマウスＡＱＰ３への結合について、本発明の別の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片と競合することができる。競合を測定するために使用することができるアッセイには、ＥＬＩＳＡアッセイ及びＦＡＣＳアッセイが含まれる。
【００５７】
競合アッセイの一例において、ＡＱＰ３をその表面に発現する細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）が固体表面に、例えば、マイクロウエルプレートに、プレートをＡＱＰ３発現細胞の懸濁物と（例えば、４℃で一晩）接触させることによって付着させられる。プレートを洗浄し（例えば、ＰＢＳにおける０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ブロッキング処理が（例えば、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）において行われる。亜飽和量のビオチン化一次抗体（８０ｎｇ／ｍＬ）（「参照」抗体）又は競合する抗ＡＱＰ３抗体（「試験」抗体）の、ＥＬＩＳＡ緩衝液（例えば、ＰＢＳにおける１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）における連続希釈での（例えば、２．８μｇ／ｍＬ、８．３μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬの濃度での）混合物をウエルに加え、プレートを穏やかに振とうしながら１時間インキュベーションする。参照抗体は本発明の抗体が可能である（例えば、抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ、又は抗体Ｋ）。プレートを洗浄し、ＥＬＩＳＡ緩衝液で希釈される１μｇ／ｍＬのＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンをそれぞれのウエル加え、プレートを１時間インキュベーションする。プレートを洗浄し、結合した抗体を基質（例えば、ＴＭＢ、Ｂｉｏｆｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）の添加によって検出する。反応を停止緩衝液（例えば、Ｂｉｏ  ＦＸ  Ｓｔｏｐ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｂｉｏｆｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）の添加によって停止させ、吸光度を、マイクロプレートリーダー（例えば、ＶＥＲＳＡｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して６５０ｎｍで測定する。この競合アッセイでの様々な変法もまた、本発明の第１の抗ＡＱＰ３抗体と、本発明の第２のＡＱＰ３抗体との間における競合を調べるために使用することができる。競合アッセイのための他の様々な形式がこの技術分野では知られており、これらを使用することができる。
【００５８】
上記競合アッセイの様々な実施形態において、本発明の参照ＡＱＰ３抗体と競合する本発明の試験抗ＡＱＰ３抗体は、試験抗ＡＱＰ３抗体が、０．０８μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、又は前述の値のいずれかの間の範囲での濃度（例えば、２μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬにまで及ぶ濃度）で使用されるとき、参照抗ＡＱＰ３抗体の結合を、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は前述の値のいずれかの間の範囲での割合で低下させる（例えば、本発明の試験抗ＡＱＰ３抗体は本発明の標識された参照ＡＱＰ３抗体の結合を５０％〜７０％低下させる）。
【００５９】
上記競合アッセイの他の実施形態において、本発明の試験抗ＡＱＰ３抗体は、試験抗ＡＱＰ３抗体が、０．４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、又は前述の値のいずれかの間の範囲での濃度（例えば、２μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬにまで及ぶ濃度）で使用されるとき、標識された参照抗ＡＱＰ３抗体の結合を、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は前述の値のいずれかの間の範囲での割合で低下させる（例えば、本発明の試験抗ＡＱＰ３抗体は本発明の標識された参照ＡＱＰ３抗体の結合を５０％〜７０％低下させる）。
【００６０】
いくつかの態様において、本発明は以下の（１）〜（７１）に関する。
（１）アクアポリン３（ＡＱＰ３）の細胞外ドメインを特異的に認識する抗ＡＱＰ３抗体、又はその機能的断片。
（２）細胞外ドメインがループＣである、上記（１）に記載の抗体又はその機能的断片。
（３）膜貫通領域ＩＶとの境界に隣接するループＣのＣ末端側の１０アミノ酸残基から構成されるオリゴペプチドに特異的に結合する、上記（１）又は（２）に記載の抗体又はその機能的断片。
（４）膜貫通領域ＩＶとの境界に隣接するループＣのＣ末端側の１０アミノ酸残基から構成されるオリゴペプチドのアミノ酸配列がＡＴＹＰＳＧＨＬＤＭ（配列番号１）である、上記（３）に記載の抗体又はその機能的断片。
（５）マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、モルモット抗体、ヒツジ抗体、ヤギ抗体、ロバ抗体、ニワトリ抗体又はラクダ抗体である、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
（６）マウス抗体である、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
（７）レポーター物質により標識される、上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
（８）レポーター物質が、放射性同位体、金属微粒子、酵素、蛍光物質及び発光物質からなる群から選択される、上記（７）に記載の抗体又はその機能的断片。
（９）固体支持体に固定化される、上記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
（１０）固体支持体が、マイクロプレート、ガラスプレート、プラスチックプレート、シリンジ、バイアル、カラム、磁性粒子、樹脂製マイクロビーズ、多孔性メンブラン、多孔性担体及びマイクロチップからなる群から選択される、上記（９）に記載の抗体又はその機能的断片。
（１１）ヒト及び／又はマウスに由来するＡＱＰ３に特異的に結合する、上記（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
（１２）ヒトに由来するＡＱＰ３に特異的に結合する、上記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片であって、抗体がＩｇＧ又はＩｇＭの免疫グロブリン分子である、抗体又はその機能的断片。
（１４）上記（１）〜（１３）のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片であって、抗体がＩｇＧの免疫グロブリン分子である、抗体又はその機能的断片。
【００６１】
（１５）ＡＱＰ３の機能に対する阻害活性を有する、上記（１）〜（１４）のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
（１６）ＡＱＰ３の機能が、低分子量物質をＡＱＰ３によって輸送する（透過させる）活性、ＡＱＰ３発現細胞の細胞増殖を促進させる活性、ＡＱＰ３発現細胞の細胞遊走を促進させる活性、並びに炎症性応答及びＡＱＰ３関連障害応答を誘発する活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性である、上記（１５）に記載の抗体又はその機能的断片。
【００６２】
（１７）上記（１）〜（１６）のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片であって、抗体がモノクローナル抗体である、抗体又はその機能的断片。
（１８）重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２によってそれぞれ表されるアミノ酸配列から構成され、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５によってそれぞれ表されるアミノ酸配列から構成される、上記（１７）に記載の抗体又はその機能的断片。
（１９）重鎖可変領域が、配列番号４によって表されるアミノ酸配列から構成され、軽鎖可変領域が、配列番号５によって表されるアミノ酸配列から構成される、上記（１７）又は（１８）に記載の抗体又はその機能的断片。
（２０）重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８によってそれぞれ示されるアミノ酸配列から構成され、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１によってそれぞれ示されるアミノ酸配列から構成される、上記（１７）に記載の抗体又はその機能的断片。
（２１）重鎖可変領域が、配列番号６によって表されるアミノ酸配列から構成され、軽鎖可変領域が、配列番号７によって表されるアミノ酸配列から構成される、上記（１７）又は（２０）に記載の抗体又はその機能的断片。
（２２）重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４によってそれぞれ示されるアミノ酸配列から構成され、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７によってそれぞれ示されるアミノ酸配列から構成される、上記（１７）に記載の抗体又はその機能的断片。
（２３）重鎖可変領域が、配列番号８によって表されるアミノ酸配列から構成され、軽鎖可変領域が、配列番号９によって表されるアミノ酸配列から構成される、上記（１７）又は（２２）に記載の抗体又はその機能的断片。
（２４）ヒト抗体の定常領域を有するキメラ抗体又はヒト化抗体である、上記（１）、（７）、（１８）、（２０）及び（２２）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体。
【００６３】
（２５）上記（１）〜（２４）のいずれか１つに記載の抗体又はその断片を含む組成物。
（２６）ＡＱＰ３検出用試薬である、上記（２５）に記載の組成物。
（２７）ＡＱＰ３発現細胞の同定、分離又は精製のための試薬である、上記（２５）に記載の組成物。
（２８）ＡＱＰ３発現量測定用試薬である、上記（２５）又は（２６）に記載の組成物。
（２９）上記（２５）〜（２８）のいずれか１つに記載の組成物を含むキット。
【００６４】
（３０）上記９又は１０に記載のモノクローナル抗体又はその断片を含む組成物であって、前記モノクローナル抗体又はその機能的断片がＡＱＰ３の機能に対する阻害活性を有する、組成物。
（３１）ＡＱＰ３の機能が、低分子量物質をＡＱＰ３によって輸送する活性、ＡＱＰ３発現細胞の細胞増殖を促進させる活性、及びＡＱＰ３発現細胞の細胞遊走を促進させる活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性である、上記（３０）に組成物。
（３２）薬学的に許容されるキャリアをさらに含む医薬組成物である、上記（３０）又は（３１）に記載の組成物。
（３３）ガンの処置において使用するための上記（３１）又は（３２）に記載の組成物。
（３４）ガンが、結腸直腸ガン、子宮頸ガン、肝ガン、肺ガン、食道ガン、腎臓ガン、胃ガン、舌ガン、皮膚ガン及び乳ガンからなる群から選択されるガンである、上記（３３）に記載の組成物。
（３５）処置が、ガンの進行（増殖）の抑制、腫瘍血管形成の抑制、浸潤の抑制、転移の抑制、ガン組織におけるエネルギー代謝の抑制、及び患者の予後の改善からなる群から選択される、上記（３３）又は（３４）に記載の組成物。
（３６）皮膚障害の予防及び／又は処置において使用するための上記（３１）又は（３２）に記載の組成物。
（３７）皮膚障害が、乾癬、光線性角化症、魚鱗癬及び脂漏性皮膚炎からなる群から選択される、上記（３６）に記載の組成物。
（３８）炎症性障害の予防及び／又は処置において使用するための上記（３１）又は（３２）に記載の組成物。
（３９）炎症性障害が、アトピー性皮膚炎、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患及び肝炎（例えば、急性肝炎又は急性肝障害）からなる群から選択される、上記（３８）に記載の組成物。
（４０）便通異常の処置において使用するための上記（３１）又は（３２）に記載の組成物。
（４１）便通異常が便秘である、上記（４０）に記載の組成物。
【００６５】
（４２）サンプルを上記（１）〜（２４）のいずれか１つに記載の抗体若しくはその断片と、又は上記（２５）若しくは（２６）に記載の組成物と接触させる工程を含む、ＡＱＰ３を検出するための方法。
（４３）上記（２９）に記載のキットを使用することによって行われる、上記（４２）に記載の方法。
（４４）サンプルが、細胞、生体組織、臓器又は個体対象を含む、上記（４２）又は（４３）に記載の方法。
（４５）サンプルが、細胞、生体組織又は臓器を含み、インビトロで行われる、上記（４４）に記載の方法。
（４６）インビボで行われる（但し、ヒト個体又は動物個体をサンプルとする場合を除く）、上記（４４）に記載の方法。
（４７）ＡＱＰ３発現細胞を、ＡＱＰ３発現細胞を含むサンプルから分離及び／又は精製するための方法であって、サンプルを上記（１）〜（２４）のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は上記（２５）若しくは（２７）に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
（４８）上記（２９）に記載のキットを使用することによって行われる、上記（４７）に記載の方法。
（４９）サンプルが、生細胞を含むサンプルである、上記（４７）又は（４８）に記載の方法。
（５０）サンプルを上記（１）〜（２４）のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は上記（２５）、（２６）若しくは（２８）に記載の組成物と接触させる工程を含む、ＡＱＰ３を測定するための方法。
（５１）上記（２９）に記載のキットを使用することによって行われる、上記（４６）に記載の方法。
（５２）サンプルが細胞又は細胞抽出物を含む、上記（５０）又は（５１）に記載の方法。
（５３）ＡＱＰ３の少なくとも１つの機能の阻害するための方法であって、ＡＱＰ３を含むサンプルを上記（１）〜（２４）のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は上記（２５）に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
（５４）ＡＱＰ３を含むサンプルが、組換え体ＡＱＰ３を含む再構成膜、又はＡＱＰ３発現細胞を含む細胞群、生体組織、臓器若しくは個体である、上記（５３）に記載の方法。
（５５）接触させる工程が、サンプルを上記（１７）〜（２４）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体若しくはその機能的断片と、又は上記（１７）〜（２４）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体を含む組成物と接触させる工程である、上記（５３）又は（５４）に記載の方法。
（５６）上記（１７）〜（２４）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片が、ＡＱＰ３の少なくとも１つの機能を阻害する活性を有する、上記（５５）に記載の方法。
（５７）ＡＱＰ３の機能が、低分子量物質をＡＱＰ３によって輸送する活性、ＡＱＰ３発現細胞の細胞増殖を促進させる活性、ＡＱＰ３発現細胞の細胞遊走を促進させる活性、並びに炎症性応答及びＡＱＰ３関連障害応答を誘発する活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性である、上記（５６）に記載の方法。
（５８）膜を横断する低分子量物質の輸送を阻害するための方法であって、ＡＱＰ３を含む膜を有するサンプルを上記（１）〜（２４）のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は上記（２５）に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
（５９）ＡＱＰ３を含む膜が、組換え体ＡＱＰ３を含む再構成膜、又はＡＱＰ３発現細胞の生体膜である、上記（５８）に記載の方法。
（６０）接触させる工程が、上記（１７）〜（２４）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体若しくはその機能的断片と、又は上記（１７）〜（２４）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体を含む組成物と接触させる工程である、上記（５８）又は（５９）に記載の方法。
（６１）上記（１７）〜（２４）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片が、ＡＱＰ３の機能を阻害する活性を有する、上記（６０）に記載の方法。
（６２）ＡＱＰ３の機能が、低分子量物質をＡＱＰ３によって輸送する活性である、上記（６１）に記載の方法。
（６３）低分子量物質が、水分子、グリセロール及び過酸化水素からなる群から選択される、上記（５８）〜（６２）のいずれか１つに記載の方法。
（６４）ＡＱＰ３関連障害の予防及び／又は処置のための方法であって、処置を必要としている対象に対して上記（３０）〜（３９）のいずれか１つに記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
（６５）ＡＱＰ３関連障害には、ＡＱＰ３の増大した発現レベルが伴う、上記（６４）に記載の方法。
（６６）ＡＱＰ３関連障害が、ガン、皮膚障害及び炎症性障害からなる群から選択される、上記（６５）に記載の方法。
（６７）便通異常を改善する方法であって、便通異常を有し、便通異常が便秘である対象に対して、上記（３０）〜（３２）、（４０）又は（４１）に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
（６８）ＡＱＰ３関連障害を処置する方法において使用するためのものである、上記（３１）又は（３２）に記載の組成物。
（６９）ＡＱＰ３関連障害を処置する方法において使用するためのものである、上記（１７）〜（２４）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片。
（７０）ＡＱＰ３関連障害の予防及び／又は処置のための医薬組成物を製造するための、上記（３１）又は（３２）に記載の組成物の使用。
（７１）ＡＱＰ３関連障害の予防及び／又は処置のための医薬組成物を製造するための、上記（１７）〜（２４）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又はその機能的断片の使用。
【発明の効果】
【００６６】
ＡＱＰ３の細胞外ドメインを特異的に認識する本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片により、ＡＱＰ３発現細胞の検出又はＡＱＰ３発現レベルの測定を行うことができる。さらには、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片は、生細胞の細胞膜に存在するＡＱＰ３に特異的に結合することができるので、ＡＱＰ３発現細胞を含む組織又は臓器の染色、或いはＡＱＰ３発現細胞の分離及び精製を行うことができる。さらには、いくつかの実施形態において、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片は、ＡＱＰ３のループＣに含まれるペプチドを特異的に認識することができるだけでなく、ＡＱＰ３に特異的に結合することができるので、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片はＡＱＰ３の１つ又は複数の機能を阻害することもできる。ＡＱＰ３の１つ又は複数の機能を阻害することによって、ＡＱＰ３発現レベルの上昇が伴うＡＱＰ３関連障害を予防及び／又は処置することが可能である。ＡＱＰ３関連障害がガンである場合には、ガンの進行（増殖）の抑制、腫瘍血管形成の抑制、浸潤の抑制、転移の抑制、ガン組織におけるエネルギー代謝の抑制、ガン患者の予後改善、又は前記の組合せを行うことが可能である。ＡＱＰ３発現レベルの上昇が伴う便通異常を緩和することもまた可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、アクアポリンの分子構造を例示する図である。アクアポリンは、Ｎ末端からＣ末端まで膜を６回横切る膜貫通構造を有しており、膜貫通ドメインＩから膜貫通ドメインＶＩまでの６つの膜貫通ドメインの間でつながれる５つの領域において、５つのループ（ループＡ〜ループＥ）が含まれる。それらのループの中で、ループＡ、ループＣ及びループＥがそれぞれ細胞外側に存在し、一方、ループＢ及びループＤが細胞内側にそれぞれ存在する。Ｎ末端領域及びＣ末端領域がすべて、細胞内ドメインに含まれる。図に示される２つのＮＰＡは、アスパラギン−プロリン−アラニンの３アミノ酸残基からなるＮＰＡボックスを示している。ＮＰＡボックスはアクアポリン分子の内部に存在しており、生物種の間で広く保存されていることが知られている。
【図２】図２は、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドに対する本発明の抗ＡＱＰ３抗体の結合性を試験した結果を示す図である。左側パネルは、抗体Ｃ、抗体Ｅ、抗体Ｈ、抗体Ｊ、及び陰性対照のＩｇＧ抗体（ＩｇＧ）についての結果を示す。右側パネルは、抗体Ｂ、抗体Ｇ、抗体Ｋ、抗体Ａ、抗体Ｄ及び抗体Ｆについての結果を示す。
【図３】図３は、ＡＱＰ３を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＱＰ３）の細胞溶解物に対する本発明の抗ＡＱＰ３抗体の結合性を試験した結果を示す図である。ＡＱＰ３を過剰発現していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物を対照として使用した（Ｎ．Ｃ．）。
【図４】図４は、マウスマクロファージ細胞に対する本発明の抗ＡＱＰ３抗体の結合性を試験した結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体の１つである抗体Ｊが使用される。
【図５Ａ】図５Ａは、マウス上皮細胞（ＰＡＭ２１２細胞）に対する本発明の抗ＡＱＰ３抗体の結合性を試験した結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体の１つである抗体Ｊが使用される。
【図５Ｂ】図５Ｂは、抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ及び抗体Ｊの、マウス上皮細胞（ＰＡＭ２１２細胞）に対する結合性を試験した結果を示す図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ及び抗体Ｊの、ヒト上皮細胞（ＨａＣａＴ細胞）に対する結合性を試験した結果を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の抗ＡＱＰ３抗体の１つである抗体Ｇの、ヒト上皮細胞（ＨａＣａＴ細胞）に対する結合性を試験した結果を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の抗ＡＱＰ３抗体の１つである抗体Ｈの、ヒト上皮細胞（ＨａＣａＴ細胞）に対する結合性を試験した結果を示す図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明の抗ＡＱＰ３抗体の１つである抗体Ｊの、ヒト上皮細胞（ＨａＣａＴ細胞）に対する結合能を試験した結果を示す図である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、マウスＡＱＰ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対する抗体Ｅの結合性を試験した結果を示す図である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、マウスＡＱＰ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対する抗体Ｈの結合性を試験した結果を示す図である。
【図６Ｆ】図６Ｆは、マウスＡＱＰ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対する抗体Ｊの結合性を試験した結果を示す図である。
【図６Ｇ】図６Ｇは、マウスＡＱＰ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対する抗体Ｅの結合性を試験した結果を示す図である。
【図６Ｈ】図６Ｈは、ヒトＡＱＰ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対する抗体Ｅの結合性を試験した結果を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の抗ＡＱＰ３抗体を使用することによってＡＱＰ３発現細胞（マウスマクロファージ）についての免疫染色を行った結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｈ及び抗体Ｊを使用した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明の抗ＡＱＰ３抗体を使用することによってＡＱＰ３発現細胞（マウスマクロファージ）（上段パネル）及びＡＱＰ３ノックアウト細胞についての免疫染色を行った結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｊを使用した。
【図８Ａ】図８Ａは、マウス上皮細胞（ＰＡＭ２１２細胞）を使用することによって本発明の抗ＡＱＰ３抗体の細胞増殖に対する活性を試験した結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｇ及び抗体Ｊを使用した。
【図８Ｂ】図８Ｂは、マウス上皮細胞（ＰＡＭ２１２細胞）を使用することによって本発明の抗ＡＱＰ３抗体の細胞増殖に対する活性を試験した結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｊを使用した。
【図８Ｃ】図８Ｃは、マウス上皮細胞（ＰＡＭ２１２細胞）を使用することによって本発明の抗ＡＱＰ３抗体の細胞増殖に対する活性を試験した結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ及び抗体Ｊを使用した。
【図９】図９は、ヒト上皮細胞（ＨａＣａＴ細胞）を使用することによって本発明の抗ＡＱＰ３抗体の細胞増殖に対する活性を試験した結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｇ、抗体Ｈ及び抗体Ｊを使用した。
【図１０】図１０は、ヒト類上皮ガン細胞（Ａ４３１細胞）を使用することによって本発明の抗ＡＱＰ３抗体の細胞増殖に対する活性を試験した結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｇ、抗体Ｈ及び抗体Ｊを使用した。
【図１１】図１１は、ＡＱＰ３発現細胞としてのマウスマクロファージ細胞における過酸化水素透過機能に対する本発明の抗ＡＱＰ３抗体の機能的阻害作用を試験した結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｊを使用した。
【図１２】図１２は、ＡＱＰ３発現細胞としてのマウスマクロファージ細胞における過酸化水素透過機能に対する本発明の抗ＡＱＰ３抗体の機能的阻害作用を試験した結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ及び抗体Ｊを使用した。
【図１３】図１３は、ＡＱＰ３発現細胞としてのマウスマクロファージ細胞におけるＬＰＳ応答性のｐ６５活性化（ｐ６５リン酸化）に対する本発明の抗ＡＱＰ３抗体の機能的阻害作用を試験した結果を示す図である。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｊを使用した。
【図１４Ａ】図１４Ａは、四塩化炭素処置によってマウスにおいて引き起こされた急性肝障害（炎症性応答及び障害応答）に対する本発明の抗ＡＱＰ３抗体の抑制作用を試験した結果を示す図である。試験を、血清中のＡＳＴレベルを指標とすることによって行った。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｊを使用した。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、四塩化炭素処置によってマウスにおいて引き起こされた急性肝障害（炎症性応答及び障害応答）に対する本発明の抗ＡＱＰ３抗体の抑制作用を試験した結果を示す図である。試験を、血清中のＡＬＴレベルを指標とすることによって行った。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｊを使用した。
【図１５Ａ】図１５Ａは、四塩化炭素処置によってマウスにおいて引き起こされた急性肝障害（炎症性応答及び障害応答）に対する本発明の抗ＡＱＰ３抗体の抑制作用を試験した結果を示す図である。試験を、肝臓に由来するＲＮＡサンプルにおけるＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現レベルを指標とすることによって行った。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｊを使用した。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、四塩化炭素処置によってマウスにおいて引き起こされた急性肝障害（炎症性応答及び障害応答）に対する本発明の抗ＡＱＰ３抗体の抑制作用を試験した結果を示す図である。試験を、肝臓に由来するＲＮＡサンプルにおけるＩＬ−６のｍＲＮＡ発現レベルを指標とすることによって行った。本発明の抗ＡＱＰ３抗体として、抗体Ｊを使用した。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
（１）ＡＱＰ３の細胞外ドメインを特異的に認識する抗ＡＱＰ３抗体の調製
３つの細胞外ドメインがＡＱＰ３には存在するので（例えば、ループＡ、ループＣ及びループＥなど）、それらの少なくとも１つのＡＱＰ３断片を免疫原とすることによって宿主動物を免疫化することができる。ヒトＡＱＰ３の場合、全長２９２アミノ酸残基からなるポリペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｑ９２４８２）において、５０位〜５３位（ループＡ）、１３１位〜１５７位（ループＣ）及び２１０位〜２４４位（ループＥ）（すべての位置がＮ末端側からの位置を表す）が細胞外ドメインのそれぞれを形成する。免疫原は好ましくはループＣのＡＱＰ３断片である。特に好ましくは、ループＣのＣ末端部分であり、かつ、膜貫通ドメインＩＶとの境界に隣接する１０アミノ酸残基から構成されるポリペプチドが免疫原として使用される。膜貫通ドメインＩＶの境界に隣接するループＣのＣ末端部分はヒト及びマウスの両方においてアミノ酸配列ＡＴＹＰＳＧＨＬＤＭ（配列番号１）を有する。
様々なオリゴペプチドを周知の標準的な方法によって化学合成することができる。さらには、様々なオリゴペプチドを、商業的に利用可能である受託合成サービスを利用することによって簡単に得ることができる。
免疫原に関しては、オリゴペプチドそのものを免疫化のために使用することができ、又は、免疫化が、当該オリゴペプチドを含むポリペプチドを膜に与える再構成膜又は組換え体細胞を使用することによって行われ得ることもまた可能である。免疫原が、当該オリゴペプチド部分を含む膜貫通蛋白質の形態で調製されるときには、当該調製は好ましくは、バキュロウイルスディスプレイ法を使用することによって行われる。その場合、当該オリゴペプチドを含むポリペプチドをバキュロウイルスの膜表面に発現させることができ、宿主動物の免疫化を、このバキュロウイルスそのものを抗体誘発のための免疫原として使用することによって行うことができる。それらの免疫原は単独で免疫化のために使用してもよいし、又はそれらの組合せを同時に使用してもよい。
いくつかの実施形態において、宿主動物は、アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドをＡＱＰ３過剰発現細胞との組合せで用いて免疫化される。例えば、ＡＱＰ３過剰発現細胞は、ＡＱＰ３を過剰発現するＨａＣａＴ細胞、ＰＡＭ２１２細胞、マウスマクロファージ又はＨＥＫ２９３細胞、或いはそれらの組合せが可能である。別の実施形態において、ＡＱＰ３過剰発現細胞はＡＱＰ３過剰発現のＣＨＯ細胞であり、例えば、マウス又はヒトのＡＱＰ３をＣＭＶプロモーターの制御下で発現するＣＨＯ細胞である。使用することができる例示的なベクターには、ｐＣＭＶ６−ＡＣ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ｓｃ３２２４０６）（ヒトＡＱＰ３）及びｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＭＲ２０３９８９）（マウスＡＱＰ３）が含まれる。いくつかの実施形態において、ＡＱＰ３過剰発現細胞は、マウスＡＱＰ３を過剰発現するＣＨＯ細胞と、ヒトＡＱＰ３を過剰発現するＣＨＯ細胞との組合せを含む。
免疫化されることになる宿主動物の好ましい例には、特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリ及びラクダのような動物が挙げられる。より好ましくは、宿主動物はマウス又はラットであり、特に好ましくはマウスである。例えば、国際公開第２０１５／１７９３６０Ａ号に記載される方法を参照することができる。抗ＡＱＰ３抗体を含む抗血清を周知の標準的な方法によって産生させることができる。抗ＡＱＰ３抗体は、５種類の免疫グロブリン分子（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）のどのクラスであっても可能である。抗ＡＱＰ３抗体は好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭであり、より好ましくはＩｇＧである。ＩｇＧサブクラスの中で、ＩｇＧ２はＡＤＣＣ活性がより低く、ＩｇＧ４はＣＤＣ活性がより低い。そのようなものとして、細胞損傷性が低い抗体を使用したいときには、ＩｇＧの中でも、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のサブクラスの抗体を使用することが好ましい。
【００６９】
（２）抗ＡＱＰ３モノクローナル抗体（抗ＡＱＰ３ｍＡｂ）の調製
抗ＡＱＰ３ｍＡｂを、上記（１）で記載されるような調製プロセスの期間中に得られる抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させた後でのクローン化によってモノクローナル抗体として作製することができる。代替では、遺伝子工学的方法に従って、抗ＡＱＰ３ｍＡｂを、化学合成した抗体遺伝子を大腸菌などにおいて発現させることによって作製することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合するための方法、融合細胞を含む細胞群から所望の細胞をスクリーニングするための方法、スクリーニングによって選抜される細胞を単クローン化するための方法、及びｍＡｂをクローンから作製するための方法はすべて、周知の標準的な方法に従って行うことができる。配列情報に基づく所望のｍＡｂの合成もまた、周知の標準的な方法に従って行うことができる。後述の実施例において詳述されるように、本発明の抗ＡＱＰ３ｍＡｂの代表的な例であるモノクローナル抗体は、具体的に開示される重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、又は具体的に開示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する。ｍＡｂはまた、シグナル配列を重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域から除くことによって得られるアミノ酸配列からなる非分泌型の組換えｍＡｂとして調製することができる。シグナル配列が除かれた組換えｍＡｂは、当該組換えｍＡｂを発現する宿主細胞から培養上清に分泌されることなく当該宿主細胞内に蓄積することができる。シグナル配列はアミノ酸配列情報から予測することができ、例えば、シグナル配列予測ソフトウェアを使用することによって予測することができる。例示的なシグナル配列予測ソフトウェアには、Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、及びＰＲＯＲＴ  ＩＩなどが含まれる。
【００７０】
（３）阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂの調製
抗ＡＱＰ３抗体の中で、ＡＱＰ３の機能についての阻害活性を有する抗体が本明細書中では阻害性抗ＡＱＰ３抗体として示される。モノクローナル抗体の場合には、そのような抗体は、特に阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂとして示される。本明細書中において、ＡＱＰ３の機能は、低分子量物質をＡＱＰ３によって輸送する（透過させる）活性、ＡＱＰ３発現細胞の細胞増殖を促進させる活性、及びＡＱＰ３発現細胞の細胞遊走を促進させる活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を示している。本明細書中において、低分子量物質は、水分子、グリセロール及び過酸化水素からなる群から選択される少なくとも１つの物質を示している。抗ＡＱＰ３抗体の所望の阻害活性の有無を、ＡＱＰ３を構成的に発現する細胞（ＰＡＭ２１２細胞、ＨａＣａＴ細胞又はＡ４３１細胞等）に十分量の抗ＡＱＰ３抗体を細胞外に添加することに従って、非添加対照と比較して、細胞遊走活性及び／又は細胞増殖活性の少なくとも一方が１０％以上、２０％以上、又は３０％以上低下することを指標とすることによって判定することができる。代替では、この判定を、ＡＱＰ３を構成的に発現する細胞（マウスマクロファージ細胞等）に十分量の抗ＡＱＰ３抗体を細胞外に添加することに従って、非添加対照と比較して、細胞の過酸化水素透過活性が１０％以上、２０％以上、又は３０％以上低下することを指標とすることによって行うことができる。
【００７１】
（４）抗体の機能的断片
ＡＱＰ３についての十分な特異性及び親和性を示す限り、本発明の抗体は、免疫グロブリン分子の完全な構造を維持することが必ずしも要求されず、当該抗体の機能的断片（抗原結合性断片）であることが可能である。抗体の抗原結合性が抗体の可変部分によって決定されるので、免疫グロブリン分子の定常領域部分は必ずしも存在していなくてもよい。そのようなものとして、本発明の抗体の機能的断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２（これらは、免疫グロブリン分子の可変部分からなる断片である）、ＶＬをＦａｂから除くことによって得られるＦｄ、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）及びその二量体（すなわち、ダイアボディ）が含まれる。代替では、ＶＬをｓｃＦｖから除くことによって得られる単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などもまた使用することができ、しかし、抗体の機能的断片はそれらに限定されない。
抗体の機能的断片を公知の技術によって調製することができる。例えば、断片化を免疫グロブリン分子の酵素処理によって行うことができる。パパインを用いた免疫グロブリン分子の分解に従って、Ｆａｂが得られる。ペプシンを用いた分解に従って、Ｆ（ａｂ’）２が得られ、Ｆ（ａｂ’）２の還元処理に従って、Ｆａｂ’が得られる。さらには、遺伝子工学技術に従って、十分な可動性を有するリンカーペプチドを介して抗体の重鎖可変部分（ＶＨ）を軽鎖可変部分（ＶＬ）に連結することによってｓｃＦｖを作製することもまた可能である。
【００７２】
（５）レポーター物質により標識される抗体
所与の場合に応じて、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片は、レポーター物質により標識される状態で使用される。レポーター物質は、抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片を標識することができ、一方で、所望の機能が維持される限り、どのような種類であっても可能である。ＡＱＰ３の存在を定量的に測定するためのシグナルを生じさせることができる物質がより好ましい。その例には、放射性同位体、金属微粒子、酵素、蛍光物質及び発光物質が含まれる。放射性同位体、蛍光物質又は発光物質がレポーター物質として使用されるときには、それらから生じる放射能、蛍光又は発光をシグナルとして定量的に測定することができる。レポーター物質が酵素であるときには、好適な基質に加えた後で、最終的に生じる色素、蛍光物質又は発光物質に由来する色、蛍光又は発光をシグナルとして測定することができる。放射性同位体の例には、３Ｈ及び１２５Ｉが含まれる。蛍光物質の例には、フルオレセイン及びその誘導体（例えば、ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びその誘導体（例えば、ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、フィコエリトリン（ＰＥ）、並びに量子ドットが含まれる。発光物質の例には、ルミノール誘導体、アクリジニウム誘導体、エクオリン及びルテニウム錯体が含まれる。金属微粒子の例には、金ナノ粒子、並びに金及び白金の合金から構成されるナノ粒子が含まれる。レポーター酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ルシフェラーゼ及びエクオリンが含まれる。それぞれの酵素を好適な基質との組合せで使用することによって、発光法、比色法又は蛍光法に基づく分析を行うことができる。定量的分析のためには、レポーター物質により標識される本発明の抗体又はその機能的断片が好ましくは使用される。
【００７３】
（６）固体支持体に固定化される抗体
所与の場合に応じて、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片は、固体支持体に固定化される状態で使用することができる。固体支持体は、抗体又はその機能的断片を固定化することができ、一方で、所望の活性を維持する状態のままである限り、どのような物質であっても可能である。固体支持体は、抗体を用いた生物学的分析に対する影響を何ら有しない不活性な材質から構成される物質であることが好ましい。固体支持体の例には、マイクロプレート、ガラスプレート、プラスチックプレート、シリンジ、バイアル、カラム、磁性粒子、樹脂製マイクロビーズ、多孔性メンブラン、多孔性担体及びマイクロチップが含まれる。マイクロプレート、シリンジ、バイアル、カラム及びマイクロチップはすべてが好ましくは、不活性な樹脂から作製される。固体支持体はまた、ガラス製であることが可能である。
【００７４】
（７）ヒト及び／又はマウスに由来するＡＱＰ３に特異的に結合する抗体
本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片はＡＱＰ３の細胞外ドメインに結合し、いくつかの実施形態においては特にループＣ（２番目の細胞外ドメイン）に結合する。ループＣのアミノ酸配列は生物種の間での高い保存を示す。ヒトのループＣのアミノ酸配列と、マウスのループＣのアミノ酸配列との両方（ヒト及びマウスの両方についてＮ末端側から１３１位〜１５７位）が、下記に記載されるように高い相同性を有する。
ヒト：ＡＤＮＱＬＦＶＳＧＰＮＧＴＡＧＩＦＡＴＹＰＳＧＨＬＤＭ（配列番号２）
マウス：ＡＮＮＥＬＦＶＳＧＰＮＧＴＡＧＩＦＡＴＹＰＳＧＨＬＤＭ（配列番号３）
上記理由により、細胞外ドメインとしてのループＣに結合する本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片は、ヒトＡＱＰ３に対して、また、マウスＡＱＰ３に対しても特異的に結合する可能性が高い。いくつかの態様において、本発明は、ループＣのＣ末端側の１０アミノ酸残基から構成されるポリペプチド（オリゴペプチド）を免疫原として使用することによって得ることができる抗体に関する。１０アミノ酸残基から構成されるこのオリゴペプチドは、ＡＴＹＰＳＧＨＬＤＭ（配列番号１）からなるアミノ酸配列を有しており、ヒト配列及びマウス配列はその部分において完全に一致している。このため、本発明の実施例に従って得られる抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片はヒトＡＱＰ３を特異的に認識するだけでなく、マウスＡＱＰ３を特異的に認識する可能性が高い。実際、実施例に記載される個々のｍＡｂに関して実施される試験によれば、本開示のｍＡｂは一般にはそれらの両方を認識することができるようである。さらには、本発明の阻害性抗ＡＱＰｍＡｂ及びその機能的断片はいくつかの態様においては、ヒトＡＱＰ３及びマウスＡＱＰ３の両方についてＡＱＰ３の機能を阻害する。
いくつかの実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体及びその機能的断片は、ＡＱＰ３以外の１つ又は複数のヒトアクアポリンに対しては、例えば、ＡＱＰ０（アクセッション番号ＮＰ＿０３６１９６．１）、ＡＰＱ１（アクセッション番号ＮＰ＿９３２７６６．１）、ＡＱＰ２（アクセッション番号ＮＰ＿０００４７７．１）、ＡＱＰ４（アクセッション番号ＮＰ＿００１６４１．１）、ＡＱＰ５（アクセッション番号ＮＰ＿００１６４２．１）、ＡＱＰ６（アクセッション番号ＮＰ＿００１６４３．２）、ＡＱＰ７（アクセッション番号ＮＰ＿００１１６１．１）、ＡＱＰ８（アクセッション番号ＮＰ＿００１１６０．２）、ＡＱＰ９（アクセッション番号ＮＰ＿０６６１９０．２）、ＡＱＰ１０（アクセッション番号ＮＰ＿５３６３５４．２）、ＡＱＰ１１（アクセッション番号ＮＰ＿７６６６２７．１）及びＡＱＰ１２（アクセッション番号ＮＰ＿９４５３４９．１）の１つ又は複数に対しては特異的に結合しない。
【００７５】
（８）抗体分子の可変領域、及び可変領域における相補性決定領域
免疫グロブリン分子は、２つの重鎖ポリペプチドと、２つの軽鎖ポリペプチドとから基本的には構成されるヘテロ四量体分子である。重鎖及び軽鎖のそれぞれが、可変領域と、定常領域とを含む。抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、３つのＣＤＲ（相補性決定領域）と、４つのＦＲ（フレームワーク領域）とからなり、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４が、アミノ末端からカルボキシ末端にこの順で配置される。抗体分子のアミノ酸配列情報が公知の技術によって決定されるとき、可変領域又は定常領域の所在を当該配列情報に基づいて推定することができる。さらには、可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を推定することもまた、公知の方法によって同様に行うことができる。
【００７６】
（９）抗体分子の調製
本発明の代表的な抗ＡＱＰ３ｍＡｂは、重鎖可変領域が配列番号４によって表されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖可変領域が配列番号５によって表されるアミノ酸配列からなるｍＡｂ、重鎖可変領域が配列番号６によって表されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖可変領域が配列番号７によって表されるアミノ酸配列からなるｍＡｂ、又は重鎖可変領域が配列番号８によって表されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖可変領域が配列番号９によって表されるアミノ酸配列からなるｍＡｂである。
本発明の抗ＡＱＰ３抗体は、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングした後、又は抗体遺伝子を抗体ポリペプチドのアミノ酸配列情報に基づいて人工合成した後、抗体遺伝子を好適な発現ベクターに導入し、発現ベクターを、遺伝子組換え技術を使用して宿主に導入することによってモノクローナル抗体として産生させることができる。
その場合には、プロモーター、エンハンサー又はポリアデニル化シグナル等をベクターにおいて適宜配置することができる。ベクターに関しては、細菌、酵母及び動物細胞のような複製可能な宿主細胞が使用される限り、どのようなベクターであっても使用することができ、また、市販のベクターを、宿主に応じて適宜使用することができる。発現ベクターは、宿主細胞を形質転換するための公知の方法によって宿主細胞に導入することができる。当該方法の例には、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法及びリン酸カルシウム法が含まれる。
宿主細胞は特に限定されず、しかし、真核生物細胞を使用することが好ましい。その例には、酵母、及び動物由来の培養細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞及びＭＥＦ等）が含まれる。
産生された抗体の精製を、蛋白質のために一般に用いられる分離及び精製のための方法を使用することによって行うことができる。例えば、産生された抗体の精製を、アフィニティークロマトグラフィー、他のクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析及び透析等を適宜組み合わせることによって適宜行うことができる。
【００７７】
（１０）抗体の改変産物
本発明の抗ＡＱＰ３ｍＡｂは、上記節又は表１若しくは表６に記載されるアミノ酸配列を有する抗体の配列改変された産物である場合がある。例えば、重鎖可変領域が配列番号４によって表されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖可変領域が配列番号５によって表されるアミノ酸配列からなる抗体を改変のための出発点とすることによって、また、ＡＱＰ３の細胞外ドメインに対する特異的結合性が実質的に維持される範囲（元の抗体の特異的結合性と実質的に同等である特異的結合性が維持される範囲）の範囲内で、改変が重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域に存在する場合がある。上記のアミノ酸配列のそれぞれにおいて、１つ若しくは数個のアミノ酸残基が、例えば、１個〜１０個、好ましくは１個〜５個、より好ましくは１個又は２個、一層より好ましくは１個のアミノ酸残基が欠失され、置換され、挿入され、又は付加されることもまた可能である。さらには、計算が、ＢＬＡＳＴのようなツールを使用することによって行われるとき、改変が、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の配列相同性が存在する範囲の範囲内で存在する場合がある。しかしながら、どのような改変産物についても、ＣＤＲのアミノ酸配列の改変は、（それぞれのＣＤＲが、改変前の抗体のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するように）存在しないことが好ましい。すなわち、いくつかの実施形態において、配列番号４によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域の改変ポリペプチドに関して、配列に対する改変が、配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３については存在しない。同様に、いくつかの実施形態において、配列番号５によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の改変ポリペプチドに関して、配列に対する改変が、配列番号１３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３については存在しない。同じことが、配列番号６によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域の改変ポリペプチド、配列番号７によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の改変ポリペプチド、配列番号８によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域の改変ポリペプチド、及び配列番号９によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の改変ポリペプチドに対して当てはまり得る。
ＣＤＲの配列が、抗体のエピトープを決定するための主要な要因であることが広く知られている。本発明の抗ＡＱＰ３ｍＡｂは好ましくは、上記の配列改変された産物についてでさえ、完全に保存されたＣＤＲが、重鎖及び軽鎖に含まれるように総数６で存在する。そのようなものとして、配列改変された産物は、改変前の抗ＡＱＰ３ｍＡｂと同じエピトープについての特異的結合性を有することが無理なく予想される。さらには、同じエピトープに結合する限り、抗ＡＱＰ３ｍＡｂが上記の配列改変された産物であるときでさえ、配列改変された産物は、改変前の抗体のようなＡＱＰ３の機能を阻害する活性を有することもまた、無理なく予想される。
【００７８】
（１１）キメラ抗体及びヒト化抗体
本発明の抗ＡＱＰ３ｍＡｂは、ヒトなどに対する異種抗原性を低下させるという目的のための人為的に改変された遺伝子組換え型の抗体であることが可能である。そのような抗体の例には、キメラ抗体及びヒト化抗体が含まれる。これらの改変された抗体は公知の方法によって作製することができる。
キメラ抗体は、本発明の抗ＡＱＰ３ｍＡｂの可変領域（Ｖ）をコードするＤＮＡを、ヒト抗体の定常（Ｃ）領域をコードするＤＮＡに連結し、得られた構築物を発現ベクターに導入し、このベクターを宿主に導入することによって調製することができる。
ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物の抗体のＣＤＲ（例えば、マウス抗体のＣＤＲなど）をヒトのアクセプター抗体に接ぐこと（ＣＤＲグラフティング）によって得ることができる。その作製を、遺伝子組換えのための一般的な技術を適用することによって適宜実施することができる。例えば、マウス抗ＡＱＰ３ｍＡｂのそれぞれのＣＤＲと、ヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するためのアミノ酸配列をコードするように設計されるＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲの両方の末端領域における重複領域を有するように調製されているいくつかのオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することによってＰＣＲ法により合成することが可能である。例えば、これを国際公開第９８／１３３８８Ａ号に記載される方法によって行うことができる。ヒト抗体の可変領域のＦＲは、公開されているＤＮＡデータベースなどから得ることができる。
キメラ抗体及びヒト化抗体の定常領域に関しては、ヒト抗体の定常領域を使用することができる。例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３及びＣγ４が重鎖のために使用されることが好ましく、一方、Ｃκ及びＣλが軽鎖のために使用されることが好ましい。
キメラ抗体及びヒト化抗体は、ヒト体内における異種抗原性が低下しているため、ヒトの生体における半減期が長く、本発明の医薬組成物の有効成分（予防及び／又は処置のための作用因）として有用である。抗体をヒト化する様々な方法がこの技術分野では知られている。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−７；米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号及び同第６，１８０，３７０号（Ｑｕｅｅｎ他）；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ他、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ他、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３；並びに米国特許第５，５６５，３３２号を参照のこと。
いくつかの実施形態において、抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片は、対応する野生型配列と比較して、少なくとも１つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を変化させるために配列が改変されている抗体又は抗体断片であることが可能である。
例えば、いくつかの実施形態において、本発明の抗ＡＱＰ３抗体は、非改変の抗体と比較して、少なくとも１つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を低下させるために改変することができる（例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）に対する低下した結合）。ＦｃγＲ結合を、ＦｃγＲ相互作用のために必要である特定の領域で抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを変異させることによって低下させることができる（例えば、Ｃａｎｆｆｅｌｄ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１；及びＬｕｎｄ他、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２を参照のこと）。抗体のＦｃγＲ結合能における低下はまた、ＦｃγＲ相互作用に依拠する他のエフェクター機能、例えば、オプソニン作用、食作用及び抗原依存性細胞傷害性（「ＡＤＣＣ」）などを低下させることができる。
他の実施形態において、本発明の抗ＡＱＰ３抗体は、非改変の抗体と比較して、少なくとも１つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を獲得するために、又は改善するために、例えば、ＦｃγＲ相互作用を強化するために改変することができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号を参照のこと）。例えば、本発明の抗ＡＱＰ３抗体は、対応する野生型定常領域よりも大きい親和性で、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＪＩＢ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡと結合する定常領域を有することができる。
したがって、本発明の抗体は、オプソニン作用、食作用又はＡＤＣＣの増大又は低下をもたらす生物学的活性における変化を有することができる。そのような様々な変化がこの技術分野では知られている。例えば、ＡＤＣＣ活性を低下させる抗体における様々な改変が米国特許第５，８３４，５９７号に記載される。ＡＤＣＣを低下させる例示的な変異体の１つが、米国特許第５，８３４，５９７号の図４に示される「変異体３」に対応しており、この場合、「変異体３」は、残基２３６が欠失され、かつ、残基２３４、残基２３５及び残基２３７（これらはＥＵ番号表記を使用する）がアラニンにより置換される。
【００７９】
（１２）ＡＱＰ３検出用試薬
本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片はＡＱＰ３特異的結合能を有するという観点から、当該抗体又はその機能的断片を含む組成物が提供され得る。この組成物はＡＱＰ３検出用試薬として提供され得る。本明細書中において、試薬に含まれることになる抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片はまた、上記（５）で記載されたようなレポーター物質により標識される場合がある。試薬に含まれることになる抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片がレポーター物質により標識されるときには、検出を、二次抗体を使用することなく行うことができる。別の実施形態として、試薬に含まれることになる抗体又はその機能的断片は固体支持体（例えば、磁性微粒子など）に結合又は吸着させられる場合がある。本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片が試薬における溶液として含有される場合、その濃度を試薬の目的又は使用様式に応じて適宜設定することができる。例えば、その濃度を、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、又は１μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬの範囲で設定することができる。さらには、試薬がストック溶液としてそのまま使用される場合があるが、ストック溶液はまた、目的に応じて、希釈された状態（１０倍〜１０，０００倍）で使用することができる。溶媒に関しては、水又は緩衝剤溶液を適宜使用することができる。
【００８０】
（１３）ＡＱＰ３発現細胞の同定、分離及び精製のための試薬
本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片は、ＡＱＰ３の細胞外ドメイン、より具体的には、いくつかの態様においてはループＣの内部のエピトープを特異的に認識し、これに結合する。本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片はＡＱＰ３分子の細胞外ドメインに結合することができるという観点から、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片はまた、生細胞がサンプルとして用いられるシステムのために使用することができる。免疫組織化学的染色を行う場合についてさえ、組織又は細胞の固定化又は透析を行うことは必要ない。それによれば、サンプルとなる細胞の状態に関わらず、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片はＡＱＰ３発現細胞の同定のために使用することができる。特に、血球細胞のような単離された生細胞がサンプルとして用いられるときには、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片は、フローサイトメーターのような好適な機器との組合せに従ってＡＱＰ３発現細胞の分離又は精製のために使用することができる。本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片がＡＱＰ３発現細胞の分離又は精製のために使用されるときには、上記（５）で記載されるようなレポーター物質により標識される抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片が適宜使用される。レポーター物質に関しては、蛍光性色素が好ましい。その例には、ＦＩＴＣ、ＰＥ／ＲＤ１、ＥＣＤ、ＰＣ５、ＰＣ７及びＡＰＣ／Ｃｙ３が含まれる。代替において、ＡＱＰ３発現細胞の分離又は精製のために、固相（例えば、磁性微粒子など）に固定化される抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片もまた使用することができる。固相に固定化される抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片に結合した後で、ＡＱＰ３発現細胞を、磁力等を利用することによって特異的に分離することができる。分離後、抗体又はその機能的断片を塩強度の調節などに基づいて細胞から解離させることができる。そのようなものとして、この順序に従って、ＡＱＰ３発現細胞の分離又は精製を完了させることができる。ＡＱＰ３発現細胞の同定、分離又は精製のために、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片を含む組成物が、ＡＱＰ３検出用試薬として提供される。試薬は、上記（１２）で記載されるように作製され、使用される場合がある。
【００８１】
（１４）ＡＱＰ３発現量測定用試薬
本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片は、上記（１２）で記載されるようなＡＱＰ３検出用試薬の成分として使用することができる。本明細書中において、抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片が上記（５）に記載されるようなレポーター物質により標識され、レポーター物質が、定量的測定を可能にするシグナルを生じさせるならば、標的としてのＡＱＰ３の存在の有無だけでなく、ＡＱＰ３の発現量もまた定量的に測定することができる。さらには、レポーター物質により標識される抗ＡＱＰ３抗体、又はその機能的断片が使用されない場合でさえ、定量的測定を可能にするシグナルを生じさせるレポーター物質により標識される二次抗体を併用することによって、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片はＡＱＰ３発現量の測定のために使用することができる。この目的のために、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片を含む組成物がＡＱＰ３発現量測定用試薬として提供される。試薬は、上記（１２）の例で記載されるように適宜作製され、使用される場合がある。
【００８２】
（１５）抗体薬物コンジュゲート
本発明は、細胞傷害性薬剤にコンジュゲート化される本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。ＡＤＣを作製するための様々なリンカー及びプロセスがこの技術分野では知られており、これらを、本発明のＡＤＣを作製するために使用することができる。例えば、Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ及びＡｎ、２０１８、Ｐｒｏｔｅｉｎ＆Ｃｅｌｌ、９（１）：３３−４６；Ｄｅｏｎａｒａｉｎ他、２０１５、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１０（５）：４６３−８１；Ｓｉｎｇｈ他、２０１５、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｎｏｖ；３２（１１）：３５４１−７１を参照のこと。本開示のＡＤＣは、ガンの処置において使用するための医薬組成物に含めることができる。
例示的な細胞傷害性薬剤には、例えば、アウリスタチン類、カンプトテシン類、カリケアミシン類、デュオカルマイシン類、エトポシド類、メイタンシノイド類（例えば、ＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ３、ＤＭ４）、タキサン類、ベンゾジアゼピン類（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン類、インドリノベンゾジアゼピン類及びオキサゾリジノベンゾジアゼピン類、並びにピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体、インドリノベンゾジアゼピン二量体及びオキサゾリジノベンゾジアゼピン二量体）、及びビンカアルカロイドが含まれる。
治療剤を蛋白質にコンジュゲート化するための、特に抗体にコンジュゲート化するための様々な技術が周知である。（例えば、Ａｌｌｅｙ他、２０１０、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４：１−９；Ｓｅｎｔｅｒ、２００８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．、１４（３）：１５４−１６９を参照のこと。）典型的には、治療剤はリンカーユニットを介して抗体にコンジュゲート化される。リンカーユニットは切断可能又は非切断性であることが可能である。例えば、治療剤を、ＡＱＰ３発現ガン細胞の細胞内環境における切断に対して感受性があり、しかし、細胞外環境に対しては実質的に感受性がない切断可能なリンカーを用いて抗体に取り付け、その結果、（例えば、エンドソーム環境、リソソーム環境において、又はカベオラ環境において）ＡＱＰ３発現ガン細胞によって内在化されたときにコンジュゲートが抗体から切断されるようにすることができる。別の例において、治療剤は非切断性のリンカーを介して抗体にコンジュゲート化することができ、薬物放出が、ＡＱＰ３発現ガン細胞による内在化の後での完全な抗体分解によってもたらされる。
典型的には、ＡＤＣはリンカー領域を細胞傷害性薬剤と抗ＡＱＰ３抗体との間に含むであろう。上記のように、典型的には、リンカーは、リンカーの切断により、治療剤が細胞内環境において（例えば、リソソーム又はエンドソーム又はカベオラの内部で）抗体から放出されるように、細胞内条件のもとで切断可能であることが可能である。リンカーは、例えば、リソソーム又はエンドソームのプロテアーゼを含めて細胞内のペプチダーゼ酵素又はプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであることが可能である。切断作用因として、カテプシンＢ及びカテプシンＤ、並びにプラスミンを挙げることができる（例えば、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ及びＷａｌｋｅｒ、１９９９、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３を参照のこと）。最も典型的なものが、ＡＱＰ３発現細胞に存在する酵素によって切断可能であるペプチジルリンカーである。例えば、ガン性組織において高発現するチオール依存性プロテアーゼのカテプシン−Ｂによって切断可能であるペプチジルリンカーを使用することができる（例えば、Ｐｈｅ−Ｌｅｕペプチド又はＶａｌ−Ｃｉｔペプチドを含むリンカー）。リンカーはまた、細胞内のグリコシダーゼによって切断される糖リンカー（例えば、グルクロニダーゼによって切断可能であるグルクロニドリンカー）を含めて炭水化物リンカーであることが可能である。
リンカーはまた、非切断性リンカーであることが可能であり、例えば、治療剤に直接に取り付けられ、抗体の蛋白質分解によって放出されるマレイミド−アルキレン−リンカー又はマレイミド−アリールリンカーなどであることが可能である。
抗ＡＱＰ３抗体は抗体のヘテロ原子を介してリンカーにコンジュゲート化することができる。これらのヘテロ原子はその自然の状態で抗体に存在し得るか、又は抗体に導入することができる。いくつかの態様において、抗ＡＱＰ３抗体はリジン残基の窒素原子を介してリンカーにコンジュゲート化されるであろう。他の態様において、抗ＡＱＰ３抗体はシステイン残基のイオウ原子を介してリンカーにコンジュゲート化されるであろう。システイン残基は、天然に存在するもの、又は操作によって抗体に導入されるものが可能である。リンカー及び薬物−リンカーを、リジン残基及びシステイン残基を介して抗体にコンジュゲート化する様々な方法が、この技術分野において知られている。
例示的な抗体−薬物コンジュゲートには、アウリスタチンに基づく抗体−薬物コンジュゲートが含まれる（すなわち、薬物成分がアウリスタチン薬物である）。アウリスタチンはチューブリンと結合し、微小管の動力学、並びに核及び細胞の分裂を妨害することが示されており、抗ガン活性を有する。典型的には、アウリスタチンに基づく抗体−薬物コンジュゲートはリンカーをアウリスタチン薬物と抗ＡＱＰ３抗体との間に含む。リンカーは、例えば、切断可能なリンカー（例えば、ペプチジルリンカー、炭水化物リンカー）又は非切断性のリンカー（例えば、抗体の分解によって放出されるリンカー）であることが可能である。アウリスタチンとして、ＭＭＡＦ及びＭＭＡＥが挙げられる。例示的なアウリスタチンの合成及び構造が、米国特許第７，６５９，２４１号、同第７，４９８，２９８号、米国特許出願公開第２００９−０１１１７５６号、同第２００９−００１８０８６号及び米国特許第７，９６８，６８７号に記載される。
他の例示的な抗体−薬物コンジュゲートには、メイタンシノイド抗体−薬物コンジュゲート（すなわち、薬物成分がメイタンシノイド薬物である）、及びベンゾジアゼピン抗体薬物コンジュゲート（すなわち、薬物成分がベンゾジアゼピン系化合物（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ二量体）、インドリノベンゾジアゼピン二量体及びオキサゾリジノベンゾジアゼピン二量体）である）が含まれる。
【００８３】
（１６）抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片を含む組成物を含むことによって得られるキット
上記（１２）〜（１４）で記載されるように、本発明の抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片を使用することによって、ＡＱＰ３検出用試薬、ＡＱＰ３発現細胞の同定、分離又は精製のための試薬、及びＡＱＰ３発現量測定用試薬を調製することができる。それぞれの目的に従って、それらの試薬は、キットを形成するために、さらなる成分と一緒に使用することができる。キットは、陽性対照としてのＡＱＰ３又はその断片、標準物質としての既知濃度のＡＱＰ３、二次抗体、酵素基質、補因子、補助成分、陰性対照としての非特異的な蛋白質サンプル、緩衝剤溶液、保存剤、希釈剤、或いは使用者説明書等の構成要素と適宜組み合わされる。ブロッキング処理又は洗浄のための緩衝剤溶液もまた、キットの好適な構成要素として加えることができる。
【００８４】
（１７）阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片を含む組成物、及びＡＱＰ３阻害剤としての組成物
本発明の抗ＡＱＰ３抗体、その機能的断片、又はＡＤＣは、ＡＱＰ３の細胞外ドメイン、特に、いくつかの実施形態においてはループＣにおけるエピトープを特異的に認識し、これに結合する。下記で示される実施例において具体的に記載されるように、当該エピトープに結合する本発明の抗ＡＱＰ３ｍＡｂは、ＡＱＰ３の少なくとも１つの機能、例えば、ＡＱＰ３のチャネル機能（例えば、過酸化水素透過性）、又はＡＱＰ３発現細胞におけるＡＱＰ３の細胞増殖促進機能などを阻害することができる。すなわち、本発明の抗ＡＱＰ３抗体は阻害性抗ＡＱＰ３抗体と見なすことができる。そのようなものとして、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片を含む組成物を提供することが可能である。さらには、この組成物はＡＱＰ３阻害剤として使用することができる。
【００８５】
（１８）ガン処置用組成物
ＡＱＰ３の増大した発現レベルが、皮膚ガン、結腸直腸ガン、子宮頸ガン、肝ガン、肺ガン、食道ガン、腎臓ガン、胃ガン及び舌ガン等のそれぞれで確認されている。さらには、下記で示される実施例において記載されるように、ＡＱＰ３を発現するヒトガン細胞株の増殖を阻害することができる。それに従えば、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片、本発明のＡＤＣ、或いはＡＱＰ３阻害剤を含む組成物を、上記ガンのいずれか１つを処置するための組成物として使用することができる。さらには、ＡＱＰ３の機能が、ガンの進行度、腫瘍の血管形成、浸潤性、転移、及びガン組織のエネルギー代謝などに関連することが示唆されてきたように、ガン処置用組成物はまた、ガン増殖抑制用組成物、ガンにおける血管形成の抑制用組成物、ガン浸潤抑制用組成物、及び／又はガン転移抑制／防止用組成物と見なすことができる。
本発明のガン処置用組成物は注射用溶液などの配合物で調製することができる。基本的には、そのようなガン処置用組成物は注射又は点滴によって全身投与することができる。しかしながら、ガン処置用組成物が、ガンの処置又は転移の防止などを目的として使用される場合には、局所投与もまた行うことができる。それらの製剤は公知の方法によって調製することができる。例えば、製剤が注射用製剤で調製されるときには、製造を、無菌的に保存されている本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片或いは本発明のＡＤＣを注射用の水、生理食塩水又は緩衝剤溶液に溶解し、又は希釈することによって行うことができる。
本発明の処置用組成物の有効成分となる本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片或いは本発明のＡＤＣの効果的な用量が好適には、患者の状態又は症状などを含めて様々な事情に依存して変化する。一般には、単回用量が、１ｋｇの体重あたり０．１ｍｇ〜１０ｍｇの抗ＡＱＰ３ｍＡｂの範囲内で決定され、皮下注射、静脈内注射又は腹腔内注射等によって投与される。投与間隔もまた好適には、患者の状態又は症状などを含めて様々な事情に依存して変化する。一般には、投与は１週間〜４週間にわたって１回行われる。しかし、数回の毎週の投与を行った後で、ある一定の期間にわたって投与が行われないこと、又は、１回〜数回の最初の投与の後で、投与が、用量を半減するなどしながら、同じペースで継続され得ることもまた可能である。
【００８６】
（１９）皮膚障害の予防及び／又は処置のための組成物
本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片或いはＡＱＰ３阻害剤を含む組成物は、ケラチノサイトのような皮膚組織の細胞におけるＡＱＰ３の機能を阻害するメカニズムに基づいて、皮膚障害の予防及び／又は処置のための組成物として使用することができる。皮膚障害の具体的な例には、乾癬、光線性角化症、魚鱗癬及び脂漏性皮膚炎が含まれる。それ以外に、ケラチノサイト増殖性の皮膚異常を治癒させるために、又は改善するために、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片を含む組成物、或いはＡＱＰ３阻害剤を含むことによって得られる本発明の処置用組成物を使用することができる。
【００８７】
（２０）炎症性障害の予防及び／又は処置のための組成物
本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片、或いはＡＱＰ３阻害剤を含む組成物は、ＡＱＰ３の機能を阻害することに従って炎症性応答を軽減するメカニズムに基づいて、炎症性障害の予防及び／又は処置のための組成物として使用することができる。炎症性障害の具体的な例には、アトピー性皮膚炎、乾癬、喘息及び慢性閉塞性肺疾患、並びに肝炎が含まれる。肝炎の例には、急性肝炎及び急性肝障害が含まれる。それ以外に、ＡＱＰ３の増大した発現を伴う炎症性障害を防止するために、治癒させるために、又は改善するために、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片を含む組成物、或いは本発明のＡＱＰ３阻害剤を含むことによって得られる炎症性障害の予防及び／又は処置のための組成物を使用することができる。
【００８８】
（２１）便通異常の緩和のための組成物
ＡＱＰ３が腸管の上皮細胞で発現していることが広く知られており、ＡＱＰ３の発現レベルが腸管の内外における水分の移動量に影響していることが示唆されている。具体的には、ＡＱＰ３の発現レベルの低下が、腸管内の水分を増大させることによって下痢を引き起こすことがあり、一方、ＡＱＰ３の発現レベルの増大が、腸管内の水分を低下させることによって便秘を引き起こすことがあることが示唆されている。そのようなものとして、本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片、或いはＡＱＰ３阻害剤を含む組成物は、ＡＱＰ３の機能を阻害するメカニズムに基づいて、便通異常を緩和するための組成物として、特に便秘を緩和するための組成物として使用することができる。当該組成物は、例えば、腸溶性錠剤又は座剤の形態で調製され、使用される場合がある。腸溶性錠剤又は座剤は公知の技術によって適宜調製することができる。投与を継続的又は定期的に行うことは必要でなく、投与は、症状における変化などに応じて適した間隔により行うことができる。
【００８９】
（２２）本発明の皮膚障害又は炎症性障害の予防及び／又は処置のための組成物の調製
本発明の阻害性抗ＡＱＰｍＡｂ又はその機能的断片は、薬学的に許容されるキャリアなどと一緒に、予防及び／又は処置のための組成物として提供することができる。皮膚障害又は炎症性障害が対象となっている場合についてもまた、当該組成物は基本的には、また、好適には、上記（１８）で記載されるガン処置用組成物のような医薬組成物（予防及び／又は処置のための組成物）として調製することができる。医薬組成物は、注射液などのような配合物とすることができる。医薬組成物はまた、水溶液、懸濁物又はエマルションのような形態を有する場合がある。医薬組成物は、塩、緩衝剤又は補助剤等を含めて、薬学的に許容される希釈剤、助剤又はキャリア等を含む場合がある。それらの製剤は公知の方法によって調製することができる。医薬組成物が注射用製剤の形態で調製されるとき、その製造を、無菌的に保存されている阻害性抗ＡＱＰｍＡｂ又はその機能的断片の乾燥製造物又は保存溶液を、皮下注射又は静脈内注射のための生理食塩水又は緩衝剤溶液を用いて溶解又は希釈することによって行うことができる。代替として、阻害性抗ＡＱＰｍＡｂ又はその機能的断片をシクロデキストリン類によって封入することにより水溶性を高めることもまた可能である。
【００９０】
（２３）本発明の皮膚障害又は炎症性障害の予防及び／又は処置のための組成物のための補助成分
本発明の阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片を含む組成物、或いは阻害性ＡＱＰ３ｍＡｂを含む予防及び／又は処置のための組成物は、他の抗体製剤が開発され、同時に、製剤が液体製剤であり、有効成分の濃度が高いときなどにおいては問題として現れることが多いように、抗ＡＱＰ３ｍＡｂ又はその機能的断片の凝集又は沈殿を起こす可能性があるかもしれない。凝集又は沈殿を防止するという目的のために、１つ又は２つ以上の補助成分が組成物に含まれる場合がある。補助成分の例には、糖類（例えば、単糖、二糖又はオリゴ糖など）、糖アルコール、塩及び界面活性剤が含まれる。そのより具体的な例には、スクロース、塩化ナトリウム及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートが含まれる。
【００９１】
（２４）本発明の皮膚障害又は炎症性障害の予防及び／又は処置のための組成物の投与形態
本発明の予防及び／又は処置のための組成物の有効成分となる阻害性抗ＡＱＰｍＡｂ又はその機能的断片の効果的な用量が好適には、患者の状態又は症状などを含めて様々な事情に依存して変化する。投与用量が好適には、患者の状態又は症状などを含めて様々な事情に依存して変化する。しかしながら、例えば、上記（１８）で例示されるような用量を設定することができる。投与間隔もまた、上記（１８）の例と同様に設定することができ、しかし、投与を継続的又は定期的に行うことは必要でなく、投与は、症状における変化などに応じて適した間隔により行うことができる。治癒又は寛解が１回だけの投与によって達成されるならば、複数回の投与は必要でないであろうことは、言うまでもないことである。症状の再発又は悪化が認められるときには、投与を再開することができる。
投与期間を患者の疾患状態に応じて適宜調節することができる。投与期間中の投与用量が適宜調節され得るが、一定量が継続的に投与されることが好ましく、又は、比較的大きい用量を初期の投与段階でのみ投与した後で、維持のためのより少ない量の絶え間ない投与に移行する投与形態とすることが好ましい。
【実施例】
【００９２】
以下、本発明が実施例によってより具体的に説明されるが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されない。
【００９３】
［実施例１］
免疫原として使用されるオリゴペプチドの配列決定
ＡＱＰ３の細胞外ドメインを特異的に認識する抗ＡＱＰ３抗体を得るために、本発明者らは、ＡＱＰ３の構造に関して、特に、細胞外ドメインを構成するループＡ、ループＣ及びループＥの構造に関して多数回のコンピューターモデリング研究を行い、結果として、ループＣ（細胞外の２番目のループ）の一部を構成する配列番号１のアミノ酸配列から構成される断片（オリゴペプチド）を免疫原として選択した。配列番号１のアミノ酸配列は、ヒトＡＱＰ３ポリペプチドの１４８位〜１５７位に対応する配列であり、膜貫通ドメインＩＶとの境界に隣接するループＣのＣ末端側の１０アミノ酸残基から構成される。
【００９４】
［実施例２］
免疫化及び抗体選抜
配列番号１のアミノ酸配列から構成されるオリゴペプチドを合成ペプチドとして作製した。さらには、そのアミノ酸配列を含むＡＱＰ３ポリペプチドを過剰発現する細胞（ＡＱＰ３過剰発現細胞）を別途作製した。その後、合成ペプチドをＡＱＰ３過剰発現細胞と一緒にし、免疫原として使用した。
上記免疫原の懸濁物による免疫化をＣ５７ＢＬ／６系統のマウスの腹腔内にアジュバンドと一緒に行った。その後、免疫細胞を免疫されたマウスから集め、抗体遺伝子ファージライブラリーを構築した。このファージライブラリーをＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し、組換え体抗体を形質転換されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞膜に呈示させた。最初のパターン化もまた、形質転換細胞及び合成ペプチドを使用することによって行い、ＡＱＰ３可溶性蛋白質を使用するパターン化を続いて行った。数回のスクリーニングを使用して、ＡＱＰ３結合コロニーを選択した。最後に、ＡＱＰ３特異的結合活性を有するクローンを免疫グロブリン化（ＩｇＧ）して、１０個のクローンと、それら１０個のクローンに由来する１０個の抗ＡＱＰ３ｍＡｂ（抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ及び抗体Ｋ）とを得た。
一方、ループＥに由来するオリゴペプチドを免疫原として使用したときには、ＡＱＰ３についての有意な結合活性を示すクローンは得られなかった。
【００９５】
［実施例３］
ＡＱＰ３に対する抗ＡＱＰ３抗体の結合性
Ａ．免疫原ペプチドに対する抗体結合
免疫化のために使用されるペプチド（配列番号１）に対する抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫ）の結合をＥＬＩＳＡアッセイで調べた。結果を図２に示す。抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｅ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ及び抗体Ｋがペプチドと結合することが認められた。抗体Ａ、抗体Ｄ及び抗体Ｆは、それら以外の抗体とは対照的に、このアッセイでは当該ペプチドと強く結合しなかった。このように、したがって、抗体Ａ、抗体Ｄ及び抗体Ｆは、異なるエピトープでＡＱＰ３に結合するかもしれない。
Ｂ．ＥＬＩＳＡによって測定されるＡＱＰ３含有細胞溶解物に対する抗体結合
マウスＡＱＰ３及びｍｙｃビオチン化タグを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物をＥＬＩＳＡアッセイで使用して、ＡＱＰ３に対する抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫ）の結合を測定した。ＡＱＰ３ではなくｍｙｃ−ビオチン化タグを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物を対照として使用した。結果を図３に示す。抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ及び抗体Ｋのそれぞれが、ＡＱＰ３に対する結合を示した。
Ｃ．ＡＱＰ３発現細胞に対する抗体結合
マウス上皮細胞（ＰＡＭ２１２）、マウスマクロファージ細胞、ヒト上皮細胞（ＨａＣａＴ）及びＨＥＫ２９３細胞をＡＱＰ３発現細胞として使用することによって、細胞に対する抗ＡＱＰ３抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、及びＫ）の結合性を測定した。
ＰＡＭ２１２細胞及びマクロファージ細胞を４℃で１時間、それぞれの抗ＡＱＰ３抗体（０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬ）と反応させた。細胞を洗浄した後、蛍光標識された抗マウス二次抗体を加え、反応をさらに１時間行わせた（４℃）。蛍光強度を測定することによって、細胞に対するそれぞれの抗ＡＱＰ３抗体の結合性を得た。
マウスマクロファージ細胞と抗体Ｊとを使用することによって得られた結果を図４に示す。
試験をまた、溶媒（Ｖｅｈ）又は非特異的ＩｇＧ（ＩｇＧ）対照を使用して行った。図４において、縦軸は蛍光強度を表し、それぞれのサンプルの平均蛍光強度が標準誤差と一緒に棒の高さによって表される。抗体Ｊが、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬのどのような濃度でも使用されたすべての場合から、有意に増大した蛍光強度が、対照（Ｖｅｈ及びＩｇＧ）と比較して認められた（図において、＊＊は、Ｐ＜０．０１の有意差が存在することを表す）。抗体Ｊが細胞表面のマウスＡＱＰ３を特異的に認識し、その結果、抗体Ｊとマウスマクロファージ細胞とが相互に結合することが見出された。
ＰＡＭ２１２細胞（これはマウス上皮細胞である）と抗体Ｊとを使用することによって得られた結果を図５Ａに示す。
試験をまた、溶媒（Ｖｅｈ）又は非特異的ＩｇＧ（ＩｇＧ）対照を使用して行った。図５Ａにおいて、縦軸は蛍光強度を表し、それぞれのサンプルの平均蛍光強度が標準誤差と一緒に棒の高さによって表される。抗体Ｊが、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬのどのような濃度でも使用されたすべての場合から、有意に増大した蛍光強度が、対照（Ｖｅｈ及びＩｇＧ）と比較して認められた（図において、＊＊は、Ｐ＜０．０１の有意差が存在することを表す）。抗体Ｊが細胞表面のマウスＡＱＰ３を特異的に認識し、その結果、抗体ＪとＰＡＭ２１２細胞とが相互に結合することが見出された。
アッセイをまた、ＰＡＭ２１２細胞と、１０μｇ／ｍＬの濃度での抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＪ）とを使用して行った。結果を図５Ｂに示す。抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｇ及び抗体ＪのＰＡＭ２１２細胞に対する結合は統計学的に有意であった。
アッセイをまた、ＨａＣａＴ細胞と、１０μｇ／ｍＬの濃度での抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＪ）とを使用して行った。結果を図５Ｃに示す。抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｈ及び抗体ＪのＨａＣａＴ細胞に対する結合は統計学的に有意であった。ＨａＣａＴ（これはヒト上皮細胞である）と、抗体Ｇ、抗体Ｈ又は抗体Ｊとを使用してＦＡＣＳアッセイを行うことによって得られた結果を図６Ａ〜図６Ｃにそれぞれ示す。
ＨａＣａＴ細胞を３７℃で３０分間、細胞解離緩衝液で処理し、その後、取り出し、集めた。その後、細胞を４℃で１時間、１０μｇ／ｍＬの抗ＡＱＰ３抗体と反応させた。細胞を洗浄した後、蛍光標識された抗マウス二次抗体を加え、反応をさらに１時間行わせた（４℃）。その後、フローサイトメーターを使用することによって、蛍光強度を測定した（図６Ａ〜図６Ｃ）。図６Ａは、抗体Ｇが使用された場合の結果を表す。図６Ｂは、抗体Ｈが使用された場合の結果を表す。図６Ｃは、抗体Ｊが使用された場合の結果を表す。それぞれのパネルが、横軸が蛍光強度を表し、縦軸が、最頻値を１００とするときの細胞数分布を表すヒストグラムを示す。濃い線により表されるヒストグラムは、抗ＡＱＰ３抗体が使用された場合を表し、一方、薄い灰色の線により表されるヒストグラムは、抗ＡＱＰ３抗体が使用されなかった対照としての場合（非特異的ＩｇＧの添加）を表す。図において、水平の棒によって表される範囲は、ＡＱＰ３抗体陽性細胞群によって示される蛍光強度を示している。この範囲に含まれる細胞（＝抗ＡＱＰ３抗体による陽性染色を示す細胞）の割合（％）もまた、図に示される。
抗体Ｇ、抗体Ｈ及び抗体Ｊのいずれかが使用されたすべての場合から、蛍光強度における明らかな増大が、対照と比較して認められ、したがって、これらの抗ＡＱＰ３抗体が細胞表面のヒトＡＱＰ３について結合活性を有することが見出された。
ＦＡＣＳアッセイもまた、マウスＡＱＰ３を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を使用して行った。細胞を、１０μｇ／ｍＬの濃度での抗体Ｅ、抗体Ｈ、抗体Ｊ又は陰性対照ＩｇＧと１時間インキュベーションし、その後、ＦＡＣＳによって選別した。別に、ヒトＡＱＰ３を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を１０μｇ／ｍＬの濃度での抗体Ｅと１時間インキュベーションし、その後、ＦＡＣＳによって選別した。結果を図６Ｄ〜図６Ｈに示す。抗体Ｅ、抗体Ｈ及び抗体Ｊのそれぞれが、ＨＥＫ２９３細胞の表面に過剰発現するＡＱＰ３に結合することが見出された。
上記から、本発明のいくつかの抗ＡＱＰ３抗体は、マウスマクロファージ細胞、マウス上皮細胞（ＰＡＭ２１２細胞）及びヒト上皮細胞（ＨａＣａＴ細胞）に結合することが見出された。
【００９６】
［実施例４］
免疫染色
マウスマクロファージ細胞をＡＱＰ３発現細胞として使用することによって、免疫組織化学分析を行って、抗ＡＱＰ３抗体が免疫染色のために使用できるか否かを調べた。
ブロッキング処理を、マウスマクロファージ細胞が付着したプレートについて行い、その後、１０μｇ／ｍＬの抗ＡＱＰ３抗体との反応を４℃で１時間行った。細胞を洗浄した後、蛍光標識された抗マウス二次抗体を加え、反応をさらに１時間行わせた（４℃）。対照として、抗ＡＱＰ３抗体を使用しない試験もまた行った。さらには、細胞核の場所を明確にするために、ＤＡＰＩを使用する染色もまた行った。蛍光染色の観察を共焦点蛍光顕微鏡によって行った。抗体Ｈ及び抗体Ｊを使用することによって得られた結果を、抗体を有しない対照の結果と一緒に図７Ａに示す。図７Ａにおいて、左側パネルは、抗体が存在しなかった場合（抗ＡＱＰ３抗体が存在せず、二次抗体のみが存在した場合）の観察像を示し、中央パネルは、抗体Ｈが使用された場合の観察像を示し、右側パネルは、抗体Ｊが使用された場合の観察像を示す。すべてのパネルから、ドット様形状が細胞核の場所を示すＤＡＰＩ由来のシグナルが認められた。一方、抗体Ｈ又は抗体Ｊが使用されたときには、ＤＡＰＩ染色に起因するドット様形状のシグナルを囲むことによって細胞形状の縁に巻きつくように見えるシグナルもまた認められた。しかしながら、抗体が存在しなかったときには、ＤＡＰＩ染色に起因するドット様形状のシグナルを囲むように見えるシグナルが全く認められなかった。
かすかなシグナルのみが、抗体Ｊと、ＡＱＰ３ノックアウトマウス（Ｍａ他、２０００、ＰＮＡＳ、９７（８）：４３８６−４３９１）からのマウスマクロファージ細胞とを使用して免疫染色を行ったときには認められ、このことは、抗体ＪがＡＱＰ３発現マクロファージ細胞に特異的に結合することを示した（図７Ｂ）。
上記から、本発明の試験された抗ＡＱＰ３抗体は、免疫組織化学分析のために使用することができる抗体であることが示された。
【００９７】
［実施例５］
細胞増殖阻害活性
マウス上皮細胞（ＰＡＭ２１２）、マウスＡＱＰ３発現細胞としてのマウスマクロファージ、ヒト上皮細胞（ＨａＣａＴ）、又はヒト上皮様ガン細胞（Ａ４３１）を使用することによって、抗ＡＱＰ３抗体による細胞増殖阻害活性を測定した。
ＰＡＭ２１２、ＨａＣａＴ及びＡ４３１のそれぞれを、１％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウエルプレートに播種した（５，０００細胞／ウエル）。播種の翌日に、抗ＡＱＰ３抗体（０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ培地を加え、培養をさらに２日間続けた。細胞数を、生細胞測定用試薬（ナカライテスク株式会社）を使用し、吸光度を４５０ｎｍで測定することによって比較した。
図８Ａ及び図８Ｂは、ＰＡＭ２１２  ＡＱＰ３発現細胞が使用された場合から得られる結果を表す。抗体Ｇ又は抗体Ｊを使用することによって得られた結果を、非特異的ＩｇＧを対照として試験した結果（非特異的ＩｇＧを１０μｇ／ｍＬで加えた；対照）と一緒に図８Ａに示す。図８Ａにおいて、縦軸は４５０ｎｍでの吸光度を示し、吸光度レベルを標準誤差と一緒に棒の高さによって表した（図８Ｂ、図９及び図１０についても同じ）。図におけるアスタリスク（＊）は、対照と比較して、Ｐ＜０．０１の有意差が認められることを示している。抗体Ｇ又は抗体Ｊ（１０μｇ／ｍＬ）が使用されたとき、ＰＡＭ２１２細胞増殖についての有意な阻害活性が認められた。
ＰＡＭ２１２細胞増殖についての阻害活性に対する抗ＡＱＰ３抗体Ｊの濃度依存的影響を分析し、図８Ｂに示す。抗体Ｊが、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬで使用されたときの生細胞の数を、対照としての非特異的ＩｇＧの結果（非特異的ＩｇＧを１０μｇ／ｍＬで加えた；Ｃｔ）と一緒に図８Ｂに示す。細胞増殖についての阻害活性が濃度依存的様式で抗体Ｊによって増大した。図８Ｂにおいて、抗体Ｊが１μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬで使用された場合について記載されるアスタリスク（＊）は、対照と比較して、Ｐ＜０．０１の有意差が認められることを示している。
図８Ｃは、ＰＡＭ２１２細胞成長に対する１０μｇ／ｍＬの濃度での抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ）及び陰性対照ＩｇＧ抗体の影響を示す。試験濃度において、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｅ及び抗体Ｊが細胞成長を有意に抑制した。
図９は、ＨａＣａＴ細胞がヒトＡＱＰ３発現細胞の材料として使用された場合から得られる結果を表す。抗体Ｇ、抗体Ｈ又は抗体Ｊを使用することによって得られた結果を、非特異的ＩｇＧを対照として試験した結果（非特異的ＩｇＧを１０μｇ／ｍＬで加えた；対照）と一緒に図９に示す。図９において、アスタリスク（＊）及び（＊＊）は、対照と比較して、Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１の有意差が認められることをそれぞれ示している。抗体Ｇ、抗体Ｈ又は抗体Ｊが使用されたとき（１０μｇ／ｍＬ）、ＨａＣａＴ細胞増殖についての有意な阻害活性が示された。
図１０は、Ａ４３１細胞がヒトＡＱＰ３発現細胞の材料として使用された場合から得られる結果を表す。抗体Ｇ、抗体Ｈ又は抗体Ｊを使用することによって得られた結果を、非特異的ＩｇＧを対照として試験した結果（非特異的ＩｇＧを１０μｇ／ｍＬで加えた；対照）と一緒に図１０に示す。図１０において、アスタリスク（＊）は、対照と比較して、Ｐ＜０．０５の有意差が認められることを示している。抗体Ｇ、抗体Ｈ又は抗体Ｊが使用されたとき（１０μｇ／ｍＬ）、Ａ４３１細胞増殖についての有意な阻害活性が認められた。Ａ４３１細胞はヒト扁平上皮ガン細胞株であるので、これらの抗ＡＱＰ３抗体によるＡＱＰ３発現ガン細胞の増殖抑制効果が示された。
上記から、本発明の抗ＡＱＰ３抗体の中でも、少なくとも抗体Ｇ、抗体Ｈ及び抗体Ｊに関しては、ガン細胞を含むＡＱＰ３発現細胞における細胞増殖に対する有意な阻害活性が、抗ＡＱＰ３抗体とＡＱＰ３発現細胞との共培養が行われるときに示されることが明確に示された。
【００９８】
［実施例６］
過酸化水素透過阻害活性
マウスマクロファージをマウスＡＱＰ３発現細胞として使用することによって、過酸化水素透過性（取り込み性）の抗ＡＱＰ３抗体による阻害活性を測定した。
マウスマクロファージを、１％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウエルプレートに播種した（１０，０００細胞／ウエル）。播種の翌日に、抗ＡＱＰ３抗体としての抗体Ｊ（１０μｇ／ｍＬ）、又は１０μｇ／ｍＬの対照ＩｇＧ抗体（Ｃｔ−ＩｇＧ：ＡＱＰ３に対する特異的結合性を有しないＩｇＧ抗体）を含有するＤＭＥＭ培地を加え、共培養をさらに一晩行った。培養物に対して、過酸化水素（１００μＭ）又はリポ多糖（ＬＰＳ）（３００ｎｇ／ｍＬ）を加え、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）の量を測定した。細胞内のＲＯＳ量を、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、５０μＭ、２０分間）加えることによって細胞を染色した後、ＣＭ２ＤＣＦ由来の蛍光強度を添加の前後で測定することによって評価した。ＲＯＳの一種としての過酸化水素が細胞内へ透過するならば、増大した蛍光強度が細胞内の増大したＲＯＳ量の指標として解釈される測定を行うことが可能である。ＬＰＳの添加は、細胞内のＲＯＳ量を人為的に増大させる機能を有する。
図１１は、過酸化水素が共培養系に加えられた場合（Ｈ２Ｏ２）、リポ多糖が共培養系に加えられた場合（ＬＰＳ）、又は、Ｈ２Ｏ２及びＬＰＳの両方が共培養系に加えられなかった場合（Ｃｔ）について、抗体Ｊが共培養系に加えられたとき（Ａｂ）、又は溶媒が共培養系に加えられたとき（Ｖｅｈ）のＣＭ２ＤＣＦ由来の蛍光強度を示す。縦軸は蛍光強度の相対的値を表す。溶媒を、Ｃｔ−ＩｇＧ抗体が加えられている細胞に加えた場合（図における左側の棒）を１００％で設定し、それぞれの条件における相対的蛍光強度が標準誤差と一緒に棒の高さによって表される。図において、アスタリスク（＊＊）は、Ｐ＜０．０１の有意差が比較物の間で認められることを示しており、過酸化水素添加時又はＬＰＳ添加時には、細胞内のＲＯＳ量が、溶媒が添加されたＶｅｈ群と比較して有意に増大したこと、そして、過酸化水素を加える、又はＬＰＳを加えるどのような条件においてでも、抗体Ｊが共培養時に存在するならば、細胞内のＲＯＳ量が、抗体Ｊが存在しない場合と比較して有意に低下したことが明確に示される。
図１２は、抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＪ）を使用して行われたＨ２Ｏ２輸送アッセイの結果を示す。
抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｈ及び抗体Ｊが、ＡＱＰ３発現細胞の内部への過酸化水素の取り込みを著しく抑制する活性を有する。
【００９９】
［実施例７］
細胞シグナル阻害活性
マウスマクロファージでは、ｐ６５／ＮＦκＢがＬＰＳによる刺激に応じてリン酸化され、活性化されることが知られている。ＬＰＳに応答する細胞シグナルが、マウスＡＱＰ３発現細胞であるマウスマクロファージにおいて抗ＡＱＰ３抗体によって阻害されるか否かを明らかにするために、試験を行った。
マウスマクロファージを、１％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に懸濁し、６０ｍｍディッシュに播種した（２ｘ１０６細胞／ディッシュ）。播種の翌日に、抗ＡＱＰ３抗体としての抗体Ｊ（１０μｇ／ｍＬ）、又は１０μｇ／ｍＬの対照ＩｇＧ抗体（非特異的ＩｇＧ抗体）を含有するＤＭＥＭ培地を加え、共培養をさらに一晩続けた（結果を示す図１３において、前者の条件を「抗ＡＱＰ３  ＋」として記載し、後者の条件を「抗ＡＱＰ３  −」として記載した）。両方の条件のもとでのそれぞれの培養産物をＬＰＳ処理（１００ｎｇ／ｍＬ、１時間）又はＬＰＳ非処理に供した（結果を示す図１３において、前者の条件を「ＬＰＳ  ＋」として記載し、一方、後者の条件を「ＬＰＳ  −」として記載した）。抗ＡＱＰ３抗体の添加の有無及びＬＰＳ処理の有無に従って、４つの処理群を、マウスマクロファージをサンプルとして設けた。これら４つの処理群のそれぞれの細胞から蛋白質を抽出し、ｐ６５／ＮＦκＢのリン酸化状態をそれぞれの群について免疫ブロッティングによって求めた。
図１３は、非リン酸化ｐ６５（ｐ６５）及びリン酸化ｐ６５（Ｐ−ｐ６５）のそれぞれに対して特異的である抗体を使用することによって免疫ブロッティングを行った結果を示す。
リン酸化ｐ６５が、「抗ＡＱＰ３  −」の条件でのＬＰＳ処理によって強く誘導された（最も左側のカラムの上段パネルのシグナルを右側から２番目のカラムの上段パネルのシグナルと比較のこと）。その一方で、抗ＡＱＰ３抗体が存在する「抗ＡＱＰ３  ＋」の条件では、ＬＰＳ処理によるリン酸化ｐ６５（Ｐ−ｐ６５）の誘導が阻害された（左側から２番目のカラムの上段パネルのシグナルを最も右側のカラムの上段パネルのシグナルと比較のこと、また、ＬＰＳ添加に関する条件の間での比較については、右側の２つのカラムの上段パネルのシグナルを比較のこと）。
ＬＰＳ誘導のｐ６５／ＮＦκＢがＡＱＰ３発現細胞におけるリン酸化及び活性化に関わる細胞内シグナルについて、抗体Ｊは阻害活性を有している。
【０１００】
［実施例８］
肝障害（急性肝炎及び急性肝障害）に対する阻害活性
試験を、本発明の抗ＡＱＰ３抗体の抗炎症活性（炎症阻害活性及び障害阻害活性）を動物対象において明らかにするために行った。
マウスを試験材料として使用した。マウスに抗ＡＱＰ３抗体（抗体Ｊ）（５μｇ／ｇ体重）を静脈内投与した。投与の翌日に、肝障害（急性肝炎及び急性肝障害）を誘発させるための化学物質である四塩化炭素（ＣＣｌ４）を投与した（０．５μＬ／ｇ体重）。四塩化炭素を投与した２４時間後に、血清と、肝臓のＲＮＡサンプルとを採取した。肝障害の程度の指標として、血清ＡＳＴ値、血清ＡＬＴ値、肝臓ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの蓄積レベル、及び肝臓ＩＬ−６  ｍＲＮＡの蓄積レベルを評価した。血液サンプルを使用する分析結果、及び肝臓ＲＮＡサンプルを使用する分析を図１４及び図１５にそれぞれ示す。
図１４Ａは血清ＡＳＴレベルの分析結果を示す。図において、縦軸はＡＳＴレベル［ＩＵ／Ｌ］を表し、「〇」によって表されるそれぞれの点が個々の測定値を示し、水平の棒が中央値を示している。Ｃｔは、四塩化炭素処置を受けなかった対照を意味する。四塩化炭素処置群（ＣＣｌ４）において、Ａｂは、事前に抗ＡＱＰ３抗体（抗体Ｊ）により処理されている群を表し、Ｖｅｈは、抗ＡＱＰ３抗体により処理されなかった群を表す。図において、アスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０１の有意差が四塩化炭素処置群（Ｖｅｈ群及びＡｂ群の両方）と対照群（Ｃｔ）との間で認められること、また、同様に、ｐ＜０．０１の有意差が四塩化炭素処置群の中においてＶｅｈ群とＡｂ群との間で認められることを示している。
図１４Ｂは血清ＡＬＴレベルの分析結果を示す。図において、縦軸はＡＬＴレベル［ＩＵ／Ｌ］を表し、「〇」によって表されるそれぞれの点が個々の測定値を示し、水平の棒が中央値を示している。Ｃｔは、四塩化炭素処置を受けなかった対照を意味する。四塩化炭素処置群（ＣＣｌ４）において、Ａｂは、事前に抗ＡＱＰ３抗体（抗体Ｊ）により処理されている群を表し、Ｖｅｈは、抗ＡＱＰ３抗体により処理されなかった群を表す。図において、アスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０１の有意差が四塩化炭素処置群（Ｖｅｈ群及びＡｂ群の両方）と対照群（Ｃｔ）との間で認められること、また、同様に、ｐ＜０．０１の有意差が四塩化炭素処置群の中においてＶｅｈ群とＡｂ群との間で認められることを示している。
血清ＡＳＴ値及び血清ＡＬＴ値の両方が肝障害（急性肝炎及び急性肝障害）の指標となり得ることが広く知られている。上記の試験結果から、本発明の抗ＡＱＰ３抗体により事前に処理されているマウスでは、四塩化炭素によって後で引き起こされる肝障害及び／又は肝臓炎症反応が防止され得る又は抑制され得ることが理解される。
図１５Ａは、肝臓ホモジネートにおけるＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの蓄積レベルの分析結果を示す。図において、縦軸は、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの蓄積レベルを、対照としての１８ｓ  ｒＲＮＡレベルによって除することによって得られたＴＮＦ−α発現レベルを表す。図において、ＴＮＦ−α発現レベルが標準誤差と一緒に棒の高さによって示される。Ｃｔは、四塩化炭素処置を受けなかった対照を意味する。四塩化炭素処置群（ＣＣｌ４）において、Ａｂは、事前に抗ＡＱＰ３抗体（抗体Ｊ）により処理されている群を表し、Ｖｅｈは、抗ＡＱＰ３抗体により処理されなかった群を表す。図において、アスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０１の有意差がＶｅｈ群と対照（Ｃｔ）群との間で、また、同様に、Ｖｅｈ群とＡｂ群との間で認められることを示している。
図１５Ｂは、肝臓ホモジネートにおけるＩＬ−６  ｍＲＮＡの蓄積レベルの分析結果を示す。図において、縦軸は、ＩＬ−６  ｍＲＮＡの蓄積レベルを、対照としての１８ｓ  ｒＲＮＡレベルによって除することによって得られたＩＬ−６発現レベルを表す。図において、ＩＬ−６発現レベルが標準誤差と一緒に棒の高さによって示される。Ｃｔは、四塩化炭素処置を受けなかった対照を意味する。四塩化炭素処置群（ＣＣｌ４）において、Ａｂは、事前に抗ＡＱＰ３抗体（抗体Ｊ）により処理されている群を表し、Ｖｅｈは、抗ＡＱＰ３抗体により処理されなかった群を表す。図において、アスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０１の有意差がＶｅｈ群と対照（Ｃｔ）群との間で、また、同様に、Ｖｅｈ群とＡｂ群との間で認められることを示している。
肝臓におけるＴＮＦ−α又はＩＬ−６の発現が肝障害（急性肝炎及び急性肝障害）の指標であることが広く知られている。上記の試験結果から、本発明の抗ＡＱＰ３抗体により事前に処理されているマウスでは、四塩化炭素によって後で引き起こされる肝障害及び／又は肝臓炎症反応が防止され得る又は抑制され得ることが理解される。
肝障害（急性肝炎及び急性肝障害）を有し得る動物個体の場合について、肝障害又は炎症応答の発生を本発明の抗ＡＱＰ３抗体によって防止することができ、又は抑制することができる。
【０１０１】
［実施例９］
抗ＡＱＰ３抗体の配列分析
本発明の実施例で得られた１０個のクローンに由来する１０個の抗ＡＱＰ３抗体（抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ及び抗体Ｋ）の中で、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれの抗体について決定した。重鎖及び軽鎖の配列（予測されたシグナル配列を有しない配列；尚、予測されたシグナル配列は、抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ及び抗体Ｋについては同じであり、抗体Ｆ、抗体Ｈ及び抗体Ｊに関しては下記で議論される）を表６に示す。
【０１０２】
【表３７】
2021501132.tif 000038
【０１０３】
【表３８】
2021501132.tif 000039
【０１０４】
【表３９】
2021501132.tif 000040
【０１０５】
【表４０】
2021501132.tif 000041
【０１０６】
【表４１】
2021501132.tif 000042
さらには、決定されたアミノ酸配列情報を既知の分析技術と組み合わせることによって、免疫グロブリン分子のそれぞれの鎖に含まれる可変領域、ＣＤＲ及びシグナルペプチドの配列を決定した。
（１）抗体Ｆ
抗体Ｆの重鎖可変領域は、配列番号４によって表されるアミノ酸配列を有する。
Ｎ末端側から数えたとき、当該アミノ酸配列において６位のメチオニン残基から始まって、２４位のセリン残基までの１９アミノ酸残基から構成される領域が、シグナルペプチドであると思われる。
この重鎖可変領域において、ＣＤＲ１（ＩＭＧＴ定義）はＧＹＴＦＴＤＹＹ（配列番号１０）のアミノ酸配列、ＣＤＲ２（ＩＭＧＴ定義）はＩＦＰＧＳＧＳＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列、ＣＤＲ３（ＩＭＧＴ定義）はＡＤＹＧＳＳＹＲＹＦＤＶ（配列番号１２）のアミノ酸配列をそれぞれ有する。
抗体Ｆの軽鎖可変領域は、配列番号５によって表されるアミノ酸配列を有する。
Ｎ末端側から数えたとき、当該アミノ酸配列において６位のメチオニン残基から始まって、２５位のグリシン残基までの２０アミノ酸残基から構成される領域が、シグナルペプチドであると思われる。
この軽鎖可変領域において、ＣＤＲ１（ＩＭＧＴ定義）はＳＳＶＳＹ（配列番号１３）のアミノ酸配列、ＣＤＲ２（ＩＭＧＴ定義）はＡＴＳ（配列番号１４）のアミノ酸配列、ＣＤＲ３（ＩＭＧＴ定義）はＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号１５）のアミノ酸配列をそれぞれ有する。
（２）抗体Ｈ
抗体Ｈの重鎖可変領域は、配列番号６によって表されるアミノ酸配列を有する。
Ｎ末端側から数えたとき、当該アミノ酸配列において６位のメチオニン残基から始まって、２４位のセリン残基までの１９アミノ酸残基から構成される領域が、シグナルペプチドであると思われる。
この重鎖可変領域において、ＣＤＲ１（ＩＭＧＴ定義）はＧＦＴＹＳＳＹＧ（配列番号１６）のアミノ酸配列、ＣＤＲ２（ＩＭＧＴ定義）はＩＳＲＲＳＩＹＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列、ＣＤＲ３（ＩＭＧＴ定義）はＡＲＬＳＬＹＤＹＤＧＡＲＹＴＭＤＹのアミノ酸配列（配列番号１８）をそれぞれ有する。
抗体Ｈの軽鎖可変領域は、配列番号７によって表されるアミノ酸配列を有する。
Ｎ末端側から数えたとき、当該アミノ酸配列において６位のメチオニン残基から始まって、２５位のグリシン残基までの２０アミノ酸残基から構成される領域が、シグナルペプチドであると思われる。
この軽鎖可変領域において、ＣＤＲ１（ＩＭＧＴ定義）はＱＤＶＧＴＡ（配列番号１９）のアミノ酸配列、ＣＤＲ２（ＩＭＧＴ定義）はＷＡＳ（配列番号２０）のアミノ酸配列、ＣＤＲ３（ＩＭＧＴ定義）はＱＱＹＳＳＹＨＴ（配列番号２１）のアミノ酸配列をそれぞれ有する。
（３）抗体Ｊ
抗体Ｊの重鎖可変領域は、配列番号８によって表されるアミノ酸配列を有する。
Ｎ末端側から数えたとき、当該アミノ酸配列において６位のメチオニン残基から始まって、２４位のセリン残基までの１９アミノ酸残基から構成される領域が、シグナルペプチドであると思われる。
この重鎖可変領域において、ＣＤＲ１（ＩＭＧＴ定義）はアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号２２）を有する。ＣＤＲ２（ＩＭＧＴ定義）はアミノ酸配列ＩＮＰＳＮＧＧＴ（配列番号２３）、ＣＤＲ３（ＩＭＧＴ定義）はＡＲＧＧＩＹＹＧＮＹＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２４）のアミノ酸配列をそれぞれ有する。
抗体Ｊの軽鎖可変領域は、配列番号９によって表されるアミノ酸配列を有する。
Ｎ末端側から数えたとき、当該アミノ酸配列において６位のメチオニン残基から始まって、２５位のグリシン残基までの２０アミノ酸残基から構成される領域が、シグナルペプチドであると思われる。
この軽鎖可変領域において、ＣＤＲ１（ＩＭＧＴ定義）はＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号２５）のアミノ酸配列、ＣＤＲ２（ＩＭＧＴ定義）はＲＶＳ（配列番号２６）のアミノ酸配列、ＣＤＲ３（ＩＭＧＴ定義）はＭＱＨＬＥＹＰＦＴ（配列番号２７）のアミノ酸配列をそれぞれ有する。
（４）結果の概要、及び考察
抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ及び抗体Ｋは、独立したクローンにそれぞれが由来する異なる抗体であることが配列情報から明白である。
これらの抗体のいくつかが、抗原としてのマウスＡＱＰ３及びヒトＡＱＰ３の両方に特異的に結合することが示された（具体的には、それらは、ループＣに含まれる配列番号１のアミノ酸配列から構成されるペプチド断片に結合することができる）。加えて、これらの抗体のいくつかは、阻害性抗ＡＱＰ３ｍＡｂであることが示された。本発明の阻害性抗ＡＱＰ３抗体は、ＡＱＰ３が担う低分子量分子透過機能（例えば、過酸化水素透過機能）を抑制すること、ＡＱＰ３発現細胞の細胞機能（例えば、細胞増殖機能）を抑制すること、及び炎症性応答又はＡＱＰ３関連障害応答を抑制することから選択される少なくとも１つの阻害活性を有する。
独立したクローンに由来する多数の阻害性抗体が首尾よく得られたことは、ＡＱＰ３の細胞外ドメインの１つとしてのループＣに含まれる、配列番号１のアミノ酸配列から構成される領域により構成されるエピトープが重要であり、そして、当該エピトープを特異的に認識することができる抗ＡＱＰ３抗体を選択することによって、一層より多くの独立した阻害性抗ＡＱＰ３抗体が選択され得ることを意味する。本発明は、ＡＱＰ３の細胞外ドメインを認識し、細胞の外側からＡＱＰ３に直接に結合することができる抗体を提供する。本発明はまた、関連技術分野においてこれまで知られていなかった抗ＡＱＰ３ｍＡｂを提供することができる。加えて、それらに限定されることはないが、本発明は複数分子の阻害性抗ＡＱＰ３抗体を提供し、また、ＡＱＰ３の細胞外ドメインに含まれるエピトープに関する明確な情報を与えており、したがって、阻害性抗ＡＱＰ３抗体を新たに得ることを可能にしている。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
ＡＱＰ３の細胞外ドメインを特異的に認識する本発明の抗ＡＱＰ３モノクローナル抗体はＡＱＰ３の高感度検出を可能にしており、また、ＡＱＰ３を発現する生細胞の同定、分離及び精製のためにもまた使用することができるという観点から、ＡＱＰ３に関連する様々な分析を可能にしており、したがって、産業上の利用可能性を有する。さらには、本発明の抗ＡＱＰ３モノクローナル抗体は、ＡＱＰ３が担う低分子量分子透過機能を阻害すること、ＡＱＰ３発現細胞の細胞機能（細胞増殖等）を阻害すること、及び肝臓等における炎症性応答の発生を阻害することのようなＡＱＰ３の少なくとも１つの機能に対する阻害活性を有し得るので、様々な障害の予防又は処置のために使用することができ、したがって、産業上の利用可能性を有する。
【０１０８】
具体的な実施形態
様々な具体的な実施形態が説明され、記載されているが、様々な変化が、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解されるであろう。本開示は、以下に示される番号つき実施形態によって例示される。
１．アミノ酸配列がＡＴＹＰＳＧＨＬＤＭ（配列番号１）からなるオリゴペプチドに特異的に結合する抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片。
２．ヒトＡＱＰ３に特異的に結合する、実施形態１に記載の抗体又はその機能的断片。
３．マウスＡＱＰ３に特異的に結合する、実施形態１又は実施形態２に記載の抗体又はその機能的断片。
４．ヒトＡＱＰ３の細胞外ドメイン及び／又はマウスＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合する抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片。
５．ヒトＡＱＰ３の細胞外ドメイン及び／又はマウスＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合する、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
６．ヒトＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合する、実施形態４又は実施形態５に記載の抗体又はその機能的断片。
７．マウスＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合する、実施形態４〜６のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
８．ＰＡＭ２１２細胞の表面に発現するＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合する、実施形態４〜７のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
９．マウスマクロファージの表面に発現するＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合する、実施形態４〜８のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１０．ＨＥＫ２９３細胞の表面に発現するＡＱＰ３の細胞外ドメインに特異的に結合する、実施形態３〜９のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１１．ヒトＡＱＰ３の少なくとも１つの機能に対する阻害活性を有する、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１２．マウスＡＱＰ３の少なくとも１つの機能に対する阻害活性を有する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１３．ＰＡＭ２１２細胞、ＨａＣａＴ細胞及びＡ４３１細胞の１つ又は複数の増殖を阻害する、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１４．ＰＡＭ２１２細胞の増殖を阻害する、実施形態１３に記載の抗体又はその機能的断片。
１５．ＨａＣａＴ細胞の増殖を阻害する、実施形態１３又は実施形態１４に記載の抗体又はその機能的断片。
１６．Ａ４３１細胞の増殖を阻害する、実施形態１３〜１５のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１７．増殖が、実施例５に記載されるアッセイに従って測定される、実施形態１３〜１６のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１８．ＡＱＰ３とは特異的に結合しないＩｇＧ対照抗体と比較して増殖を少なくとも１０％阻害する、実施形態１３〜１７のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１９．ＡＱＰ３とは特異的に結合しないＩｇＧ対照抗体と比較して増殖を少なくとも２０％阻害する、実施形態１８に記載の抗体又はその機能的断片。
２０．ＡＱＰ３とは特異的に結合しないＩｇＧ対照抗体と比較して増殖を少なくとも３０％阻害する、実施形態１９に記載の抗体又はその機能的断片。
２１．ＡＱＰ３とは特異的に結合しないＩｇＧ対照抗体と比較して増殖を約１０％〜約３０％阻害する、実施形態１８に記載の抗体又はその機能的断片。
２２．Ｈ２Ｏ２輸送を阻害する、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
２３．Ｈ２Ｏ２輸送の阻害が、実施例６に記載されるアッセイに従って測定される、実施形態２２に記載の抗体又はその機能的断片。
２４．ＡＱＰ３とは特異的に結合しないＩｇＧ対照抗体と比較してＨ２Ｏ２輸送を少なくとも１０％阻害する、実施形態２２又は実施形態２３に記載の抗体又はその機能的断片。
２５．ＡＱＰ３とは特異的に結合しないＩｇＧ対照抗体と比較してＨ２Ｏ２輸送を少なくとも２０％阻害する、実施形態２４に記載の抗体又はその機能的断片。
２６．ＡＱＰ３とは特異的に結合しないＩｇＧ対照抗体と比較してＨ２Ｏ２輸送を少なくとも３０％阻害する、実施形態２４に記載の抗体又はその機能的断片。
２７．ＡＱＰ３とは特異的に結合しないＩｇＧ対照抗体と比較してＨ２Ｏ２輸送を約１０％〜約３０％阻害する、実施形態２４に記載の抗体又はその機能的断片。
２８．ｐ６５のリン酸化を阻害する、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
２９．ｐ６５のリン酸化の阻害が、実施例７に記載されるアッセイに従って測定される、実施形態２８に記載の抗体又はその機能的断片。
３０．四塩化炭素により処置されたマウスにおける肝臓の炎症性応答を阻害する、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
３１．四塩化炭素により処置されたマウスにおける肝臓の炎症性応答が、実施例８に記載されるアッセイに従って測定される、実施形態３０に記載の抗体又はその機能断片。
３２．表２Ａ〜表５Ｅの１つに示される配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＲＤ２）、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗ＡＱＰ３抗体又はその機能的断片。
３３．表２Ａに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
３４．表２Ｂに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
３５．表２Ｃに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
３６．表２Ｄに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
３７．表２Ｅに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
３８．表３Ａに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
３９．表３Ｂに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
４０．表３Ｃに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
４１．表３Ｄに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
４２．表３Ｅに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
４３．表４Ａに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
４４．表４Ｂに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
４５．表４Ｃに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
４６．表４Ｄに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
４７．表４Ｅに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
４８．表５Ａに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
４９．表５Ｂに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
５０．表５Ｃに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
５１．表５Ｄに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
５２．表５Ｅに示されるようなＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
５３．抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ又は抗体Ｋの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
５４．抗体ＡのＣＤＲ配列を含む、実施形態５３に記載の抗体又はその機能的断片。
５５．抗体ＢのＣＤＲ配列を含む、実施形態５３に記載の抗体又はその機能的断片。
５６．抗体ＣのＣＤＲ配列を含む、実施形態５３に記載の抗体又はその機能的断片。
５７．抗体ＤのＣＤＲ配列を含む、実施形態５３に記載の抗体又はその機能的断片。
５８．抗体ＥのＣＤＲ配列を含む、実施形態５３に記載の抗体又はその機能的断片。
５９．抗体ＦのＣＤＲ配列を含む、実施形態５３に記載の抗体又はその機能的断片。
６０．抗体ＧのＣＤＲ配列を含む、実施形態５３に記載の抗体又はその機能的断片。
６１．抗体ＨのＣＤＲ配列を含む、実施形態５３に記載の抗体又はその機能的断片。
６２．抗体ＪのＣＤＲ配列を含む、実施形態５３に記載の抗体又はその機能的断片。
６３．抗体ＫのＣＤＲ配列を含む、実施形態５３による抗体又はその機能的断片。
６４．ＣＤＲ配列が、表１Ａ〜表１Ｊに示されるＩＭＧＴ番号表記によって定義される、実施形態５３〜６３のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
６５．ＣＤＲ配列が、表１Ａ〜表１Ｊに示されるＫａｂａｔ番号表記によって定義される、実施形態５３〜６３のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
６６．ＣＤＲ配列が、表１Ａ〜表１Ｊに示されるＣｈｏｔｈｉａ番号表記によって定義される、実施形態５３〜６３のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
６７．ＣＤＲ配列が、表１Ａ〜表１Ｊに示されるＩＭＧＴ・Ｋａｂａｔ・Ｃｈｏｔｈｉａ共通配列によって定義される、実施形態５３〜６３のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
６８．ＣＤＲ配列が、表１Ａ〜表１Ｊに示されるＩＭＧＴ・Ｋａｂａｔ・Ｃｈｏｔｈｉａ統合重複配列によって定義される、実施形態５３〜６３のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
６９．抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ、抗体Ｇ、抗体Ｈ、抗体Ｊ又は抗体Ｋの可変重鎖（ＶＨ）配列及び可変軽鎖（ＶＨ）配列を含む、実施形態３２に記載の抗体又はその機能的断片。
７０．表１Ａに示される抗体ＡのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む、実施形態６９による抗体又はその機能的断片。
７１．表１Ｂに示される抗体ＢのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む、実施形態６９による抗体又はその機能的断片。
７２．表１Ｃに示される抗体ＣのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む、実施形態６９による抗体又はその機能的断片。
７３．表１Ｄに示される抗体ＤのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む、実施形態６９による抗体又はその機能的断片。
７４．表１Ｅに示される抗体ＥのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む、実施形態６９による抗体又はその機能的断片。
７５．表１Ｆに示される抗体ＦのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む、実施形態６９による抗体又はその機能的断片。
７６．表１Ｇに示される抗体ＧのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む、実施形態６９による抗体又はその機能的断片。
７７．表１Ｈに示される抗体ＨのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む、実施形態６９による抗体又はその機能的断片。
７８．表１Ｉに示される抗体ＪのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む、実施形態６９による抗体又はその機能的断片。
７９．表１Ｊに示される抗体ＫのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む、実施形態６９による抗体又はその機能的断片。
８０．ヒトＡＱＰ３への結合について実施形態１〜７９のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片と競合する抗体又はその機能的断片。
８１．競合が、細胞表面に発現するヒトＡＱＰ３への結合についてである、実施形態８０に記載の抗体又はその機能的断片。
８２．競合が、ＨＥＫ２９３細胞の表面に発現するヒトＡＱＰ３への結合についてである、実施形態８０に記載の抗体又はその機能的断片。
８３．マウスＡＱＰ３への結合について実施形態１〜７９のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片と競合する抗体又はその機能的断片。
８４．競合が、細胞表面に発現するマウスＡＱＰ３への結合についてである、実施形態８３に記載の抗体又はその機能的断片。
８５．競合が、ＨＥＫ２９３細胞の表面に発現するマウスＡＱＰ３への結合についてである、実施形態８４に記載の抗体又はその機能的断片。
８６．競合が、ＰＡＭ２１２細胞の表面に発現するマウスＡＱＰ３への結合についてである、実施形態８４に記載の抗体又はその機能的断片。
８７．競合が、マウスマクロファージ細胞の表面に発現するマウスＡＱＰ３への結合についてである、実施形態８４に記載の抗体又はその機能的断片。
８８．ＡＱＰ３以外の１つ又は複数のヒトアクアポリン（「非ＡＱＰ３アクアポリン」）には特異的に結合しない、実施形態１〜８７のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
８９．非ＡＱＰ３アクアポリンが、ＡＱＰ０、ＡＰＱ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、ＡＱＰ８、ＡＱＰ９、ＡＱＰ１０、ＡＱＰ１１及びＡＱＰ１２から選択される、実施形態８８に記載の抗体又はその機能的断片。
９０．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ０を含む、実施形態８９に記載の抗体又はその機能的断片。
９１．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ１を含む、実施形態８８〜９０のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
９２．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ２を含む、実施形態８８〜９１のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
９３．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ４を含む、実施形態８８〜９２のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
９４．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ５を含む、実施形態８８〜９３のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
９５．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ６を含む、実施形態８８〜９４のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
９６．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ７を含む、実施形態８８〜９５のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
９７．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ８を含む、実施形態８８〜９６のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
９８．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ９を含む、実施形態８８〜９７のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
９９．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ１０を含む、実施形態８８〜９８のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１００．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ１１を含む、実施形態８８〜９９のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１０１．１つ又は複数の非ＡＱＰ３アクアポリンがＡＱＰ１２を含む、実施形態８８〜１００のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１０２．実施形態１〜１０１のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片であって、抗体がＩｇＧの免疫グロブリン分子である、抗体又はその機能的断片。
１０３．実施形態１〜１０２のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片であって、抗体がモノクローナル抗体である、抗体又はその機能的断片。
１０４．ヒト抗体の定常領域を有するキメラ抗体又はヒト化抗体である、実施形態１〜１０３のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１０５．キメラ抗体である、実施形態１０４に記載の抗体又はその機能的断片。
１０６．ヒト抗体の定常領域を有するヒト化抗体である、実施形態１０４に記載の抗体又はその機能的断片。
１０７．抗体である、実施形態１〜１０６のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１０８．単一特異性抗体である、実施形態１０７に記載の抗体又はその機能的断片。
１０９．多重特異性抗体である、実施形態１０７に記載の抗体又はその機能的断片。
１１０．抗体の機能的断片である、実施形態１〜１０６のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１１１．Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦｖから選択される機能的断片である、実施形態１１０に記載の抗体又はその機能的断片。
１１２．レポーター物質により標識される、実施形態１〜１１１のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１１３．固体支持体に固定化される、実施形態１〜１１２のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
１１４．細胞傷害性薬剤にコンジュゲート化される実施形態１〜１１１のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
１１５．細胞傷害性薬剤がアルキル化剤を含む、実施形態１１４に記載のＡＤＣ。
１１６．アルキル化剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、ホテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、チオテパ、マイトマイシン、ジアジクオン（ＡＺＱ）、プロカルバジン又はヘキサメチルメラミンを含む、実施形態１１５に記載のＡＤＣ。
１１７．細胞傷害性薬剤が代謝拮抗剤を含む、実施形態１１４に記載のＡＤＣ。
１１８．代謝拮抗剤が、メトトレキサート、ペメトレキセド、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、アザシチジン、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン又はペントスタチンを含む、実施形態１１７に記載のＡＤＣ。
１１９．細胞傷害性薬剤が抗微小管剤を含む、実施形態１１４に記載のＡＤＣ。
１２０．抗微小管剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンフルニン、モノメチルアウリスタチンＥ又はモノメチルアウリスタチンＦを含む、実施形態１１９に記載のＡＤＣ。
１２１．細胞傷害性薬剤がトポイソメラーゼ阻害剤を含む、実施形態１１４に記載のＡＤＣ。
１２２．トポイソメラーゼ阻害剤が、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン又はアクラルビシンを含む、実施形態１２１に記載のＡＤＣ。
１２３．細胞傷害性薬剤が細胞傷害性抗生物質を含む、実施形態１１４に記載のＡＤＣ。
１２４．細胞傷害性抗生物質が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ミトキサントロン又はブレオマイシンを含む、実施形態１２３に記載のＡＤＣ。
１２５．実施形態１〜１１３のいずれか１つに記載の抗体又はその断片を含む組成物。
１２６．ＡＱＰ３検出用試薬である、実施形態１２５に記載の組成物。
１２７．ＡＱＰ３発現細胞の同定、分離又は精製のための試薬である、実施形態１２５に記載の組成物。
１２８．ＡＱＰ３発現量測定用試薬である、実施形態１２５又は１２６に記載の組成物。
１２９．実施形態１２６〜１２８のいずれか１つに記載の組成物を含むキット。
１３０．実施形態１〜１１２のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又はその断片を含む組成物であって、モノクローナル抗体又はその機能的断片がＡＱＰ３の少なくとも１つの機能に対する阻害活性を有する、組成物。
１３１．薬学的に許容されるキャリアをさらに含む医薬組成物である、実施形態１３０に記載の組成物。
１３２．実施形態１１４〜１２４のいずれか１つに記載のＡＤＣと、薬学的に許容されるキャリアとを含む組成物。
１３３．ガンの処置において使用するための実施形態１３１又は実施形態１３２に記載の組成物。
１３４．ガンが、結腸直腸ガン、子宮頸ガン、肝ガン、肺ガン、食道ガン、腎臓ガン、胃ガン、舌ガン、皮膚ガン及び乳ガンからなる群から選択されるガンである、実施形態１３３に記載の組成物。
１３５．皮膚障害の予防及び／又は処置において使用するための実施形態１３１に記載の組成物。
１３６．皮膚障害が、乾癬、光線性角化症、魚鱗癬及び脂漏性皮膚炎からなる群から選択される、実施形態１３５に記載の組成物。
１３７．炎症性障害の予防及び／又は処置において使用するための実施形態１３１に記載の組成物。
１３８．炎症性障害が、アトピー性皮膚炎、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患及び肝炎からなる群から選択される、実施形態１３７に記載の組成物。
１３９．ＡＱＰ３を検出するための方法であって、サンプルを実施形態１〜１１３のいずれか１つに記載の抗体若しくはその断片と、又は実施形態１２５若しくは１２６に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
１４０．ＡＱＰ３発現細胞を分離及び／又は精製するための方法であって、細胞を含むサンプルを実施形態１〜１１３のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は実施形態１２５〜１２７のいずれか１つに記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
１４１．ＡＱＰ３を測定するための方法であって、サンプルを実施形態１〜１１３のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は実施形態１２５、１２６若しくは１２８に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
１４２．ＡＱＰ３の少なくとも１つの機能を阻害するための方法であって、ＡＱＰ３を含むサンプルを実施形態１〜１１３のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は実施形態１３０に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
１４３．膜を横断する低分子量物質の輸送を阻害するための方法であって、ＡＱＰ３を含む膜を有するサンプルを実施形態１〜１１３のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は実施形態１３０に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
１４４．ガンを有する対象を処置する方法であって、実施形態１〜１１２のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片、実施形態１１４〜１２４のいずれか１つに記載のＡＤＣ、又は実施形態１３１若しくは実施形態１３２に記載の組成物の治療効果的な量を対象に投与することを含む、方法。
１４５．ガンが、結腸直腸ガン、子宮頸ガン、肝ガン、肺ガン、食道ガン、腎臓ガン、胃ガン、舌ガン、皮膚ガン及び乳ガンからなる群から選択されるガンである、実施形態１４４に記載の方法。
１４６．対象における皮膚障害を予防及び／又は処置する方法であって、実施形態１〜１１２のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片、又は実施形態１３１に記載の組成物の治療効果的な量を対象に投与することを含む、方法。
１４７．皮膚障害が、乾癬、光線性角化症、魚鱗癬及び脂漏性皮膚炎からなる群から選択される、実施形態１４６に記載の方法。
１４８．皮膚障害を処置する方法である、実施形態１４６又は実施形態１４７に記載の方法。
１４９．対象における炎症性障害を予防及び／又は処置する方法であって、実施形態１〜１１２のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片、又は実施形態１３１に記載の組成物の治療効果的な量を対象に投与することを含む、方法。
１５０．炎症性障害が、アトピー性皮膚炎、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患及び肝炎からなる群から選択される、実施形態１４９に記載の方法。
１５１．炎症性障害を処置する方法である、実施形態１４９又は実施形態１５０に記載の方法。
１５２．抗ＡＱＰ３抗体を生成させるための方法であって、（ｉ）アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドと、（ｉｉ）ＡＱＰ３過剰発現細胞との組合せにより非ヒト哺乳動物を免疫化することを含む、方法。
１５３．哺乳動物がマウスである、実施形態１５２に記載の方法。
１５４．ＡＱＰ３過剰発現細胞が、ＡＱＰ３を過剰発現するＨａＣａＴ細胞、ＰＡＭ２１２細胞、マウスマクロファージ若しくはＨＥＫ２９３細胞、又はそれらの組合せを含む、実施形態１５２又は実施形態１５３に記載の方法。
１５５．ＡＱＰ３過剰発現細胞が、ＡＱＰ３を過剰発現するＣＨＯ細胞を含む、実施形態１５２又は実施形態１５３に記載の方法。
１５６．ＡＱＰ３を過剰発現するＣＨＯ細胞が、マウスＡＱＰ３を過剰発現するＣＨＯ細胞を含む、実施形態１５５に記載の方法。
１５７．マウスＡＱＰ３が、ＣＭＶプロモーターを使用してＣＨＯ細胞において発現させられる、実施形態１５６に記載の方法。
１５８．ＡＱＰ３を過剰発現するＣＨＯ細胞が、ヒトＡＱＰ３を過剰発現するＣＨＯ細胞を含む、実施形態１５５〜１５７のいずれか１つに記載の方法。
１５９．ヒトＡＱＰ３が、ＣＭＶプロモーターを使用してＣＨＯ細胞において発現させられる、実施形態１５８に記載の方法。
１６０．免疫細胞を免疫化された哺乳動物から集めること、免疫細胞からのｍＲＮＡを使用して抗体ライブラリーを作製すること、及び１つ又は複数の抗ＡＱＰ３抗体を抗体ライブラリーから同定することをさらに含む、実施形態１５２〜１５９のいずれか１つに記載の方法。
本開示はさらに、以下に示されるさらなる番号つき実施形態によって例示される。
１’．アクアポリン３（ＡＱＰ３）の細胞外ドメインを特異的に認識する抗ＡＱＰ３抗体、又はその機能的断片。
２’．細胞外ドメインがループＣである、実施形態１’に記載の抗体又はその機能的断片。
３’．膜貫通領域ＩＶとの境界に隣接するループＣのＣ末端側の１０アミノ酸残基から構成されるオリゴペプチドに特異的に結合する、実施形態１’又は２’に記載の抗体又はその機能的断片。
４’．レポーター物質により標識される、実施形態１’〜３’のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
５’．固体支持体に固定化される、実施形態１’〜４’のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
６’．ヒト及び／又はマウスに由来するＡＱＰ３に特異的に結合する、実施形態１’〜５’のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
７’．実施形態１’〜６’のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片であって、抗体がＩｇＧの免疫グロブリン分子である、抗体又はその機能的断片。
８’．ＡＱＰ３の少なくとも１つの機能に対する阻害活性を有する、実施形態１’〜７’のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片。
９’．実施形態１’〜８’のいずれか１つに記載の抗体又はその機能的断片であって、抗体がモノクローナル抗体である、抗体又はその機能的断片。
１０’．抗体又はその機能的断片が、ヒト抗体の定常領域を有するキメラ抗体又はヒト化抗体である、実施形態９’に記載のモノクローナル抗体。
１１’．実施形態１’〜１０’のいずれか１つに記載の抗体又はその断片を含む組成物。
１２’．ＡＱＰ３検出用試薬である、実施形態１１’に記載の組成物。
１３’．ＡＱＰ３発現細胞の同定、分離又は精製のための試薬である、実施形態１１’に記載の組成物。
１４’．ＡＱＰ３発現量測定用試薬である、実施形態１１’又は１２’に記載の組成物。
１５’．実施形態１２’〜１４’のいずれか１つに記載の組成物を含むキット。
１６’．実施形態９’又は１０’に記載のモノクローナル抗体又はその断片を含む組成物であって、モノクローナル抗体又はその機能的断片がＡＱＰ３の少なくとも１つの機能に対する阻害活性を有する、組成物。
１７’．薬学的に許容されるキャリアをさらに含む医薬組成物である、実施形態１６’に記載の組成物。
１８’．ガンの処置において使用するための実施形態１７’に記載の組成物。
１９’．ガンが、結腸直腸ガン、子宮頸ガン、肝ガン、肺ガン、食道ガン、腎臓ガン、胃ガン、舌ガン、皮膚ガン及び乳ガンからなる群から選択されるガンである、実施形態１８’に記載の組成物。
２０’．皮膚障害の予防及び／又は処置のために使用される、実施形態１６’に記載の組成物。
２１’．皮膚障害が、乾癬、光線性角化症、魚鱗癬及び脂漏性皮膚炎からなる群から選択される、実施形態２０’に記載の組成物。
２２’．炎症性障害の予防及び／又は処置において使用するための実施形態１６’に記載の組成物。
２３’．炎症性障害が、アトピー性皮膚炎、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患及び肝炎からなる群から選択される、実施形態２２’に記載の組成物。
２４’．ＡＱＰ３を検出するための方法であって、サンプルを実施形態１’〜１０’のいずれか１つに記載の抗体若しくはその断片と、又は実施形態１１’若しくは１２’に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
２５’．ＡＱＰ３発現細胞を分離及び／又は精製するための方法であって、細胞を含むサンプルを実施形態１’〜１０’のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は実施形態１１’若しくは１２’に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
２６’．ＡＱＰ３を測定するための方法であって、サンプルを実施形態１’〜１０’のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は実施形態１１’、１２’若しくは１４’に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
２７’．ＡＱＰ３の少なくとも１つの機能を阻害するための方法であって、ＡＱＰ３を含むサンプルを実施形態１’〜１０’のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は実施形態１６’に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
２８’．膜を横断する低分子量物質の輸送を阻害するための方法であって、ＡＱＰ３を含む膜を有するサンプルを実施形態１’〜１０’のいずれか１つに記載の抗体若しくはその機能的断片と、又は実施形態１６’に記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。
【図１】
2021501132.tif 000043
【図２】
2021501132.tif 000044
【図３】
2021501132.tif 000045
【図４】
2021501132.tif 000046
【図５Ａ】
2021501132.tif 000047
【図５Ｂ】
2021501132.tif 000048
【図５Ｃ】
2021501132.tif 000049
【図６Ａ】
2021501132.tif 000050
【図６Ｂ】
2021501132.tif 000051
【図６Ｃ】
2021501132.tif 000052
【図６Ｄ】
2021501132.tif 000053
【図６Ｅ】
2021501132.tif 000054
【図６Ｆ】
2021501132.tif 000055
【図６Ｇ】
2021501132.tif 000056
【図６Ｈ】
2021501132.tif 000057
【図７Ａ】
2021501132.tif 000058
【図７Ｂ】
2021501132.tif 000059
【図８Ａ】
2021501132.tif 000060
【図８Ｂ】
2021501132.tif 000061
【図８Ｃ】
2021501132.tif 000062
【図９】
2021501132.tif 000063
【図１０】
2021501132.tif 000064
【図１１】
2021501132.tif 000065
【図１２】
2021501132.tif 000066
【図１３】
2021501132.tif 000067
【図１４Ａ】
2021501132.tif 000068
【図１４Ｂ】
2021501132.tif 000069
【図１５Ａ】
2021501132.tif 000070
【図１５Ｂ】
2021501132.tif 000071
【配列表】
2021501132000001.app
【国際調査報告】
2021501132.tif 000072
2021501132.tif 000073