(57)【要約】メチルマロン酸血症の処置のための方法と技術。いくつかの実施形態において、本開示は、対象中の組織内の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に導入遺伝子を組み込む方法であって、前記組織内の細胞が遺伝子産物によってコードされる機能的タンパク質をその中で発現していない対象に、前記機能的タンパク質をコードする導入遺伝子を送達する組成物を投与するステップを含み、前記組成物を投与した後に、細胞の前記集団のゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれる、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中の組織内の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に導入遺伝子を組み込む方法であって、
前記組織内の細胞が遺伝子産物によってコードされる機能的タンパク質を発現することができない対象に、前記機能的タンパク質をコードする導入遺伝子を送達する組成物を投与することを含み、ここで、
前記組成物が、ポリヌクレオチドカセットであって、
第１の核酸配列および第２の核酸配列と（ここで、前記第１の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する）、
前記ポリヌクレオチドに対して５’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して３’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、
を含むポリヌクレオチドカセットを含み、
前記組成物を投与した後に、前記細胞の前記集団の前記ゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれる、方法。
【請求項２】
前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組換えウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組換えウイルスベクターが、ＬＫ０３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＬＫ０３またはＡＡＶＮＰ５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記導入遺伝子がＭＵＴ導入遺伝子である、またはＭＵＴ導入遺伝子を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物がＡＡＶ２  ＩＴＲ配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織が肝臓である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の核酸配列が、
ａ）２Ａペプチド；
ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
ｃ）Ｎ末端インテインスプライシング領域およびＣ末端インテインスプライシング領域；または
ｄ）スプライスドナーおよびスプライスアクセプター；
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第３および第４の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第２の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ３’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ５’側にポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＵＴ導入遺伝子が、ｗｔヒトＭＵＴ、コドン最適化されたＭＵＴ、合成ＭＵＴ、ＭＵＴバリアント、ＭＵＴ変異体またはＭＵＴ断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
ある期間にわたって組織中の導入遺伝子の発現のレベルを増加させる方法であって、
それを必要とする対象に、前記対象の前記組織中の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に組み込む導入遺伝子を送達する組成物を投与することを含み、
前記組成物が、
第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第１の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドと、
前記ポリヌクレオチドに対して５’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して３’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、
を含み、
前記組成物を投与した後に、細胞の前記集団のゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれ、前記組織中の前記導入遺伝子の発現の前記レベルがある期間にわたって増加する、方法。
【請求項１８】
前記導入遺伝子の前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
発現の前記レベルの増加が、前記導入遺伝子を発現する前記組織中の細胞のパーセントの増加を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換えウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えウイルスベクターが、ＬＫ０３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＬＫ０３またはＡＡＶＮＰ５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記導入遺伝子がＭＵＴ導入遺伝子である、またはＭＵＴ導入遺伝子を含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物がＡＡＶ２  ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記組織が肝臓である、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の核酸配列が、
ａ）２Ａペプチド；
ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
ｃ）Ｎ末端インテインスプライシング領域およびＣ末端インテインスプライシング領域；または
ｄ）スプライスドナーとスプライスアクセプター；
を含む、請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第３および第４の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第２の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、請求項１７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ３’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ５’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＭＵＴ導入遺伝子が、ｗｔヒトＭＵＴ、コドン最適化されたＭＵＴ、合成ＭＵＴ、ＭＵＴバリアント、ＭＵＴ変異体またはＭＵＴ断片である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に導入遺伝子を組み込むための組換えウイルスベクターであって、
（ｉ）第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドカセットであって、前記第１の核酸配列がＭＵＴ導入遺伝子を含み、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドカセットと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドカセットベクターに対して５’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、
（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドカセットウイルスベクターの３’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、
を含み、
前記ウイルスベクターが、ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシドを含む、組換えウイルスベクター。
【請求項３５】
前記第３の核酸が８００〜１，２００ヌクレオチドである、請求項３４に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項３６】
前記第４の核酸が８００〜１，２００ヌクレオチドである、請求項３４または請求項３５に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項３７】
前記組換えウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項３８】
前記組換えウイルスベクターが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＬＫ０３またはＡＡＶ−ＮＰ５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、請求項３７に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項３９】
ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記ＭＵＴ導入遺伝子が前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４２】
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、請求項４１のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４３】
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記ＭＵＴ導入遺伝子が、内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項４１に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４４】
前記２つの独立した遺伝子産物が、前記ＭＵＴ導入遺伝子から発現されるＭＵＴタンパク質および内因性アルブミン遺伝子から発現される内因性アルブミンタンパク質である、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４５】
前記細胞が肝細胞である、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４６】
前記第２の核酸配列が、
ａ）２Ａペプチド；
ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
ｃ）Ｎ末端インテインスプライシング領域およびＣ末端インテインスプライシング領域；または
ｄ）スプライスドナーとスプライスアクセプター；
を含む、請求項３４〜４５のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４７】
前記第３および第４の核酸配列が、前記ＭＵＴ導入遺伝子および前記第２の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、請求項３４〜４６のいずれかに記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４８】
前記第３および第４の核酸配列が、前記内因性アルブミンプロモーターおよび前記内因性アルブミン遺伝子とインフレームに、前記ＭＵＴ導入遺伝子および前記第２の核酸配列を内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、請求項４７に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４９】
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ３’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ５’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、請求項４７または請求項４８に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項５０】
前記ＭＵＴ導入遺伝子が、ｗｔヒトＭＵＴ、コドン最適化されたＭＵＴ、合成ＭＵＴ、ＭＵＴバリアント、ＭＵＴ変異体またはＭＵＴ断片である、請求項３４〜４９のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項５１】
対象の組織中の細胞に、投与前には前記細胞によって機能的に発現されていない関心対象の産物をコードする導入遺伝子を送達する組成物の用量を前記対象に投与するステップを含む方法であって、前記導入遺伝子が、（ｉ）前記関心対象の産物をコードし、（ｉｉ）複数の前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位に組み込み、（ｉｉｉ）組み込まれると、前記関心対象の産物を機能的に発現し、（ｉｖ）時間の経過につれて、前記組織が、他の方法では同等の投与によって達成されるものより高いことが決定されている前記関心対象の産物の機能的発現のレベルを達成するように、前記組織中の他の細胞と比べて選択的有利性を前記複数の細胞に付与し、その中に前記導入遺伝子が組み込まれた前記細胞が、前記投与するステップ前に、前記関心対象の産物を機能的に発現し、
前記組成物が、
第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第１の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置しており、前記導入遺伝子が前記標的組み込み部位に組み込まれたときに、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドと、
前記ポリヌクレオチドに対して５’側に位置し、前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列に実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して３’側に位置し、前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列に実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、
を含む、方法。
【請求項５２】
前記導入遺伝子の前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記選択的有利性が、前記導入遺伝子を発現する前記組織中の細胞のパーセント増加を含む、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記組換えウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記組換えウイルスベクターが、ＬＫ０３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＬＫ０３またはＡＡＶＮＰ５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記導入遺伝子がＭＵＴ導入遺伝子である、またはＭＵＴ導入遺伝子を含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物がＡＡＶ２  ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、請求項５１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記組織が肝臓である、請求項５１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記第２の核酸配列が、
ａ）２Ａペプチド；
ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
ｃ）Ｎ末端インテインスプライシング領域およびＣ末端インテインスプライシング領域；または
ｄ）スプライスドナーとスプライスアクセプター；
を含む、請求項５１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記第３および第４の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第２の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、請求項５１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ３’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ５’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＭＵＴ導入遺伝子が、ｗｔヒトＭＵＴ、コドン最適化されたＭＵＴ、合成ＭＵＴ、ＭＵＴバリアント、ＭＵＴ変異体またはＭＵＴ断片である、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年８月１０日に出願された米国仮出願第６２／７１７，７７１号の優先権を主張し、その内容の全体が、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
連邦により資金援助された研究または開発に関する記述
本発明は、米国保健福祉省の機関である国立衛生研究所との共同研究開発契約の履行において、および国立衛生研究所、国立ヒトゲノム研究所によるプロジェクト番号ＺＩＡ  ＨＧ２００３１８  １４の下での政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年１０月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１２５３８＿００６２＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズは７８，２０３バイトである。
【背景技術】
【０００４】
背景
遺伝するかまたは胚発生の初期に獲得されるＤＮＡの変化に端を発し得る一群のヒト疾患が存在する。遺伝子治療の開発者にとって特に興味深いのは、単一遺伝子疾患として知られている、単一遺伝子の変異によって引き起こされる疾患である。６，０００を超える単一遺伝子疾患が存在すると考えられている。通例、遺伝された変異によって引き起こされる特定の遺伝性疾患は比較的まれであるが、総合すると、遺伝関連疾患の犠牲者数は多い。周知の遺伝性疾患には、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハンチントン病、および鎌状赤血球症が挙げられる。他のクラスの遺伝性疾患には、有機酸血症ならびに機能不全の遺伝子が代謝過程の欠陥および短期および長期の両方で深刻な罹患率および死亡率をもたらし得る有毒な副産物の蓄積をもたらすリソソーム蓄積症などの代謝性障害が含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
概要
単一遺伝子疾患は、これらの疾患の病理が単純であると認識されていたため、生物医学の革新者にとって特に興味深いものであった。しかしながら、これらの疾患および障害の大部分は、実質的には処置不能なままである。したがって、当技術分野において長年感じられてきたこのような疾患の処置に対する要望がなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施形態において、本開示は、対象中の組織内の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に導入遺伝子を組み込む方法であって、前記組織内の細胞が遺伝子産物によってコードされる機能的タンパク質をその中で発現していない対象に、前記機能的タンパク質をコードする導入遺伝子を送達する組成物を投与するステップを含み、前記組成物が、第１の核酸配列と第２の核酸配列とを含むポリヌクレオチドカセットと（ここで、前記第１の核酸配列は前記導入遺伝子をコードし、前記第２の核酸配列は、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する）、前記ポリヌクレオチドに対して５’側に位置する第３の核酸配列であって、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、前記ポリヌクレオチドに対して３’側に位置する第４の核酸配列であって、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列とを含み、前記組成物を投与した後に、細胞の前記集団のゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれる、方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本開示は、ある期間にわたって組織中の導入遺伝子の発現のレベルを増加させる方法であって、それを必要とする対象に、前記対象の前記組織中の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に組み込む導入遺伝子を送達する組成物を投与するステップを含み、前記組成物が、第１の核酸配列と第２の核酸配列とを含むポリヌクレオチドと（ここで、前記第１の核酸配列は前記導入遺伝子をコードし、前記第２の核酸配列は、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する）、前記ポリヌクレオチドに対して５’側に位置する第３の核酸配列であって、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、前記ポリヌクレオチドに対して３’側に位置する第４の核酸配列であって、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、を含み、前記組成物を投与した後に、細胞の前記集団のゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれ、前記組織中の前記導入遺伝子の発現の前記レベルがある期間にわたって増加する、方法を提供する。いくつかの実施形態において、発現のレベルの増加は、導入遺伝子を発現する組織内の細胞のパーセントの増加を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本開示は、対象の組織中の細胞に、投与前には前記細胞によって機能的に発現されていない関心対象の産物をコードする導入遺伝子を送達する組成物の用量を前記対象に投与するステップを含む方法であって、前記導入遺伝子が、（ｉ）前記関心対象の産物をコードし、（ｉｉ）複数の前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位に組み込まれ、（ｉｉｉ）組み込まれた時点で前記関心対象の産物を機能的に発現し、（ｉｖ）時間の経過につれて、前記組織が、他の方法では同等の投与によって達成されるものより高いことが決定された前記関心対象の産物の機能的発現のレベルを達成するように、前記組織中の他の細胞と比較して前記複数の細胞に選択的有利性を付与し、その中に導入遺伝子が組み込まれた前記細胞が、投与前に、前記関心対象の産物を機能的に発現し、前記組成物が、第１の核酸配列と第２の核酸配列とを含むポリヌクレオチドと（ここで、前記第１の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置しており、前記導入遺伝子が前記標的組み込み部位に組み込まれたときに、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する）、前記ポリヌクレオチドに対して５’側に位置する第３の核酸配列であって、前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列に実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、前記ポリヌクレオチドに対して３’側に位置する第４の核酸配列であって、前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列に実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、選択的有利性は、導入遺伝子を発現する組織中の細胞のパーセントの増加を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、組成物は、組換えウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、組換えＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、ＬＫ０３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＬＫ０３またはＡＡＶＮＰ５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列をさらに含む。
【００１０】
様々な実施形態によれば、様々な導入遺伝子のいずれもが、本明細書に記載されている方法および組成物に従って発現され得る。例えば、いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＭＵＴ導入遺伝子であるか、またはＭＵＴ導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＭＵＴ導入遺伝子は、ｗｔヒトＭＵＴ、コドン最適化されたＭＵＴ、合成ＭＵＴ、ＭＵＴバリアント、ＭＵＴ変異体またはＭＵＴ断片である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に導入遺伝子を組み込むための組換えウイルスベクターであって、第１の核酸配列と第２の核酸配列とを含むポリヌクレオチドカセットと（ここで、前記第１の核酸配列はＭＵＴ導入遺伝子を含み、前記第２の核酸配列は、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する）、前記ポリヌクレオチドカセットベクターに対して５’側に位置する第３の核酸配列であって、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、前記ポリヌクレオチドカセットウイルスベクターの３’側に位置する第４の核酸配列であって、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、を含み、前記ウイルスベクターが、ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシドを含む、組換えウイルスベクターを提供する。
【００１２】
本明細書に記載されているように、本開示は、１またはそれを超える導入遺伝子の細胞のゲノム中への組み込みに関するいくつかの有利な認識を包含する。例えば、いくつかの実施形態では、組み込みはヌクレアーゼ活性を含まない。
【００１３】
用途に適した任意の組織が標的にされ得るが、いくつかの実施形態では、組織は肝臓である。
【００１４】
本明細書に記載されているように、提供される方法および組成物は、少なくとも４つの核酸配列を有するポリヌクレオチドカセットを含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、ａ）２Ａペプチド、ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ｃ）Ｎ末端インテインスプライシング領域およびＣ末端インテインスプライシング領域、またはｄ）スプライスドナーおよびスプライスアクセプターを含む。いくつかの実施形態において、第３および第４の核酸配列は、導入遺伝子および第２の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座の中に組み込む相同性アームである。いくつかの実施形態において、相同性アームは、内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ３’側にまたは内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ５’側にポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する。
【００１５】
様々な態様によれば、第３および／または第４の核酸は、有意な長さ（例えば、少なくとも８００ヌクレオチド長）であり得る。いくつかの実施形態において、第３の核酸は、８００〜１，２００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、８００〜１，２００ヌクレオチドである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、プロモーター配列を含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、導入遺伝子は、標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態において、標的組み込み部位は、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、導入遺伝子は、内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される。
【００１７】
本願において使用される場合、「約」および「およそ」という用語は同等のものとして使用される。本明細書における刊行物、特許または特許出願のあらゆる引用は、それらの全体が参照により組み込まれる。本願において使用される任意の数字は、約／およその有無にかかわらず、当業者によって認識される任意の通常の変動を包含することが意図される。
【００１８】
本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明で明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態を示しているが、限定ではなく例示としてのみ与えられていることを理解すべきである  本発明の範囲内での様々な変更および改変は、詳細な説明から当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路を図示する。
【００２０】
【図２】図２は、組み込み前（ＡＡＶ）および標的とされたアルブミン（すなわちＡＬＢ）遺伝子座におけるゲノム中へのＨＲ媒介性組み込み後のＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の概略図を示す。前記標的とされた遺伝子座からの発現は、アルブミンおよび導入遺伝子の、別々のタンパク質として同等のレベルでの産生をもたらし、それはＡＬＢ遺伝子によってコードされている。
【００２１】
【図３】図３は、肝臓中で発現される最も豊富な遺伝子を示しており、最高（ＡＬＢ）から２，０００位まで順位付けされている。各円は個々の遺伝子を表す。肝臓中のほとんどの遺伝子は、アルブミンのレベルに対して僅かな割合で発現される。ＴＰＭ＝１００万当たりの転写物。
【００２２】
【図４】図４は、肝臓が、体内においてほぼすべてのアルブミンが発現される器官であることを示す。ＡＬＢ遺伝子座を標的とする肝臓特異的ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物は、主に肝臓中で発現される。
【００２３】
【図５】図５は、アルブミン発現レベルが、単一遺伝子疾患に関連する他の選択された肝臓遺伝子よりも１００倍高いことを示している。（ＰＡＨ：フェニルケトン尿症、Ｆ９：血友病Ｂ、ＭＵＴ：ＭＭＡ、ＵＧＴ１Ａ１：クリグラー・ナジャー症候群）。
【００２４】
【図６】図６は、ＭＵＴ中の変異が、分枝鎖アミノ酸、具体的にはメチオニン、スレオニン、バリンおよびイソロイシンの代謝経路の障害をどのようにもたらすかを示している。
【００２５】
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−１】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−２】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−３】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−４】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−５】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−６】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−７】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−８】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−９】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−１０】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−１１】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−１２】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−１３】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−１４】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−１５】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−１６】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【図７Ｂ−１７】図７Ａ〜図７Ｂは、ＬＢ−００１  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の構造を示す。図７Ａ）ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシド内のＬＢ−００１に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物。図７Ｂ）ヒトＭｕｔ配列（配列番号１５）を発現させるために、ＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる核酸。
【００２６】
【図８】図８は、ＬＢ−００１のマウスＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物での新生仔処置後の生存率の向上（上のパネル）と体重増加（下のパネル）を、Ｍｕｔ−／−マウスが示すことを示す。エラーバーは、平均の標準誤差、すなわちＳＥＭを示す。本研究では、直接比較対象（comparator）として、対照マウスを含めなかった。対照マウスのデータは、他者が行った研究から得られたものである。
【００２７】
【図９】図９は、ＬＢ−００１のマウスＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物で処置されたＭＣＫ−Ｍｕｔマウスが、新生仔投与の１ヶ月後に成長の有意な改善を示すことを示している。＊はｐ値＜０．０５を示す。
【００２８】
【図１０】図１０は、ＬＢ−００１のマウスＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物で処置されたＭＣＫ−Ｍｕｔマウスが、新生仔投与後に、１ヶ月の時点で２つの循環疾患関連代謝産物の有意な低下を示すことを示す。上のパネルは、血漿メチルマロン酸濃度の低下を示す。下のパネルは、血漿メチルシトレート濃度の低下を示す。すべての非処置マウスが直接比較対象として含まれたわけではなかった。非処置マウスデータには、過去の対照マウスが含まれる。＊はｐ値＜０．０５を示す。
【００２９】
【図１１】図１１は、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）による処置が、改変肝細胞に対して選択的有利性をもたらし得ることを示している。上のパネル：ＬＢ−００１のマウスＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物で処置されたマウスからの肝臓切片のＲＮＡｓｃｏｐｅ分析。Ｍｕｔの機能するコピーが肝臓中に存在しない（左）および存在する（右）遺伝子操作されたマウスを新生仔期に処置した。１年より後に、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物に対して特異的なＭｕｔ  ｍＲＮＡを発現する細胞（暗い染色領域）は、肝臓中にＭｕｔの自然な機能するコピーを欠如するマウス中において増加し、ＬＢ−００１のＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の有益な選択的有利性を示唆する。下のパネル：独立した病理医によって実施されたＲＮＡｓｃｏｐｅ切片の定量。
【００３０】
【図１２】図１２は、マウスにＭＵＴ  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物を単回の新生仔期投与してから１年より後に、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）特異的Ｍｕｔ遺伝子の組み込まれたコピーを含有する肝細胞のパーセントを示す。アルブミン遺伝子座に組み込まれたＭｕｔ遺伝子を用いたＤＮＡのＬＲ−ｑＰＣＲ定量。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。ＬＲ−ｑＰＣＲ＝ロングレンジ定量的ＰＣＲ。
【００３１】
【図１３】図１３は、経時的に観察された、組み込まれたＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物を有する細胞の増加を実証する。肝臓Ｍｕｔを欠損するマウスに、新生仔としてＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物を投与した。投与後１ヶ月でおよび投与後１年より後にＬＲ−ｑＰＣＲによって、アルブミン遺伝子座での組み込みに対するＤＮＡ分析を実施した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。
【００３２】
【図１４】非処置および処置Ｍｕｔ−／−；Ｍｃｋ−Ｍｕｔマウス（ＭＭＡの発現低下モデル）中での血漿メチルマロン酸レベル。処置されたマウスは、処置後１、２および１２〜１５ヶ月において、非処置マウスと比較して、有意に低下した血漿メチルマロン酸レベルを有していた（対応のないｔ検定；ｐ＞０．０４１）。血漿メチルマロン酸レベルは、処置されたＭｕｔ−／−；Ｍｃｋ−Ｍｕｔ動物中で時間とともに減少した。
【００３３】
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｂは、送達後のウイルスゲノムおよび肝細胞導入遺伝子の組み込みを示す。図１５Ａ）注射の１ヶ月（ｎ＝３）、２ヶ月（ｎ＝３）、１２〜１５ヶ月（ｎ＝５）後に肝臓中でデジタルドロップレットＰＣＲによって検出された、宿主ゲノム（Ｇａｐｄｈ）と比較したウイルスゲノム（ＭＵＴ）の数。ウイルスゲノムの急速な喪失が新生仔期遺伝子送達後に生じ、これは以前に記載されている。（１ヶ月でのウイルスゲノム対２ヶ月または１２〜１５ヶ月、一元配置分散分析、ｐ＞０．００１）。図１５Ｂ）導入遺伝子がアルブミン中に組み込まれた肝細胞のパーセント。ｑＰＣＲによって決定された組み込みの百分率は、処置されたＭＭＡマウスにおいて、１〜２ヶ月（ｎ＝６）から１２〜１５ヶ月（ｎ＝５）に有意に増加した（対応のないｔ検定；ｐ＞０．０４３）。ただし、１２〜１５ヶ月で、処置された野生型動物は、処置されたＭＭＡマウスよりも少ない組み込みを有する。
【００３４】
【図１６】図１６は、処置されたマウスにおける肝臓のＭＵＴタンパク質の発現を示す。ＡＡＶ−Ａｌｂ−２Ａ−ＭＵＴで処置されたマウス中での総肝臓ＭＵＴタンパク質発現は、ウエスタンブロットによって決定された。処置されたマウス中のＭＵＴタンパク質は、野生型対照同腹仔の百分率として表され、マウスのβアクチンに対して正規化された。処置後の１〜２ヶ月（ｎ＝６）を１２〜１５ヶ月（ｎ＝５）と比較すると、処置されたマウス中のＭＵＴタンパク質の量は時間とともに増加する（対応のないｔ検定；ｐ＞０．０１５）。
【００３５】
【図１７】図１７は、ＭＵＴ  ｍＲＮＡ陽性細胞を検出するためのＡＡＶ−Ａｌｂ−２Ａ−ＭＵＴ処置されたマウスのＲＮＡｓｃｏｐｅを示す。処置後２ヶ月と比較した場合、処置後１２〜１５ヶ月のマウスには、ＭＵＴ陽性細胞の増加が存在する。逆に、処置後１２〜１５ヶ月のＡＡＶ−Ａｌｂ−２Ａ−ＭＵＴ処置野生型マウス（ｎ＝５）は、処置後１２〜１５ヶ月のＭＭＡ同腹仔より少ないＭＵＴ陽性細胞を有する（ｎ＝５）（ｐ＞０．０３）。
【００３６】
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｂは、列記された用量のマウスＬＢ００１代用物を生後１日に顔面静脈から静脈内投与した後に、ＬＲ−ｑＰＣＲアッセイで測定されたパーセントｇＤＮＡ組み込みを示す。肝臓試料は、表記された時点で採取された。図１８Ａ）は、Ｍｕｔ−／−；Ｍｃｋ＋マウスのデータを示す。図１８Ｂ）は、ヘテロ接合体Ｍｕｔ＋／−マウスのデータを示す。
【００３７】
【図１９】図１９は、初代ヒト肝細胞からの融合ｍＲＮＡ。エクソン１２と１５は、相同性アームの外側にある。この図は、配列番号１７〜１９を、それぞれ、出現順に開示している。
【００３８】
【図２０】図２０は、初代ヒト肝細胞サンドイッチ培養系を図示する。
【００３９】
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｂは、ＤＮＡ組み込みのためのアッセイを示す。図２１Ａ）安定的ＨｅｐＧ２−２Ａ−ＰｕｒｏＲ細胞株を、ＤＮＡ組み込みアッセイにおける陽性対照として使用した。図２１Ｂ）ロングレンジ（ＬＲ）ｑＰＣＲを使用して、部位特異的組み込み率を決定した。
【００４０】
【図２２】図２２は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）におけるＭＵＴおよびＡＬＢの相対的発現を示している。
【００４１】
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｂは、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）ＬＢ−００１をアッセイするために選択された、同一のハプロタイプ１を有する３人の初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）ドナーを示す。図２３Ａ）２２人のＰＨＨドナーからのハプロタイプスクリーニング。図２３Ｂ）ハプロタイプ情報。
【００４２】
【図２４】図２４は、ＡＡＶ−ＬＫ０３−ＬＳＰ−ＧＦＰを使用した初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の形質導入条件の最適化を示している。形質導入効率は、３人の選択されたドナーから得たＰＨＨにおいて示されている。
【００４３】
【図２５】図２５は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）中でのＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）ＬＢ００１処理後のＡＬＢ−２ａおよびＭＵＴ発現のウエスタンブロッティングの結果を図示する。
【００４４】
【図２６】図２６は、ＵＧＴ１Ａ１を送達するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の新生仔期投与後におけるクリグラー・ナジャー症候群のマウスモデルでの生存率の増加を示す（Ｐｏｒｒｏら、ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２０１７）。非処置動物（ｎ＝６）はすべて、継続的な青色光療法なしに、生後２０日以内に死亡した。有毒なビリルビンレベルのクリアランスと低下を促進する処置である青色光療法は、出生から８日目まで適用された。継続的な青色光療法なしに、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物で処置された動物（ｎ＝５）は１年間生存した。
【００４５】
【図２７】ＬＢ−１０１のマウスＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物による治療的かつ安定的なレベルのヒト第ＩＸ因子（Ｂａｒｚｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１５）。新生仔期投与後の肝臓からの第ＩＸ因子産生の安定的かつ治療的なレベルは、８週齢でＰＨを実施した場合でさえ、投与後２０週間持続した（正常な第ＩＸ因子の５％〜２０％の第ＩＸ因子の治療レベルが、破線と影付きの領域によって示されている）。エラーバーは標準偏差を示す。
【００４６】
【図２８】図２８は、超活性型ｈＦＩＸをコードするＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）ベクターを使用した血友病Ｂマウスにおける出血性素因の改善を示す。ＡＡＶ−ＤＪ−ＷＴｈＦＩＸ、ビヒクルおよび野生型（ＷＴ）と比較した、指定された用量での９週齢の雄血友病Ｂ（ＦＩＸ−ＫＯ）マウスへのＡＡＶ−ＤＪ−ｈＦＩＸバリアント（Ｖ−ｈＦＩＸ）の尾静脈注射の２週間後における活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）による凝固効率の測定。三角形は、同じ用量でのＡＡＶ−ＤＪ−Ｖ−ｈＦＩＸとＷＴ−ｈＦＩＸとの間の差を表す。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。
【００４７】
【図２９】図２９は、独自の超活性型ｈＦＩＸをコードするＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）ベクターを使用した血友病Ｂ新生仔マウスの出血性素因の改善を示す。ビヒクルおよびＷＴ参照と比較したＡＡＶ−Ｖ−ｈＦＩＸの腹腔内（ＩＰ）注射の４週間後（左パネル）および１２週間後（右パネル）の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）による凝固効率の測定。血友病Ｂ新生仔マウスの処置のために、本発明者らは、２日齢のＦ９ｔｍ１Ｄｗｓノックアウト雄マウスに、キログラム（ｋｇ）当たり１．５ｅ１４、１．５ｅ１３、１．５ｅ１２および５ｅ１１ベクターゲノム（ｖｇ）のｈＦＩＸバリアントをコードするＡＡＶ−ＤＪ  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）ベクターを腹腔内（ＩＰ）注射した。本発明者らは、１．５ｅ１２  ｖｇ／ｋｇという低用量で疾患の改善を実証した。処置されたＫＯ雄マウスにおける活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）によって決定される機能的凝固は、野生型（ＷＴ）マウスと同様のレベルに回復した。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。
【００４８】
【図３０】図３０Ａ〜図３０Ｃは、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）がミスマッチの相同性アームでもなお有効であることを示している。図示されているのは、ヒトアルブミン遺伝子座中の２つの主要なハプロタイプである。これらのハプロタイプは、５’相同性アームに対応する配列中の５つのＳＮＰが異なる。図３０Ａ）終止コドンに及ぶヒトアルブミン遺伝子座のセグメントが、水平の細い長方形として描かれている。短い縦線は、ヒト集団中の最も一般的な２つのハプロタイプであるハプロタイプ１とハプロタイプ２の間のヌクレオチド多型の相対位置を表す。ヒト集団中のアルブミン対立遺伝子の９５％は、関連するセグメントにおいて、６つのヌクレオチドのみが異なるこれら２つのハプロタイプ間で均等に分布している。ハプロタイプ１および２中の多型位置における特定のヌクレオチドが、それぞれ線の上および下に示されている。図３０Ｂ）独自のヒトＦＩＸバリアント（Ｖ−ｈＦＩＸ）をマウスアルブミン遺伝子座中に標的化する２つのＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）ＡＡＶベクターが図示されている。上のベクター「野生型アーム（ＷＴＡ）」中の相同性アームは、Ｂ６マウス中のアルブミン終止コドンに及ぶゲノム配列と同一である。下のベクター「ミスマッチアーム（ＭＡ）」中の相同性アームは、ヒトハプロタイプ：ハプロタイプ１とハプロタイプ２の相違を模倣するように、ＷＴアームと異なる。短い縦線は、２つのベクター間のヌクレオチド多型の相対位置を表す。２つのベクター中の多型位置における特定のヌクレオチドは、各行の上に表示されている。図３０Ｃ）５ｅ１３／ｖｇ／ｋｇの、ＡＡＶ  Ｖ−ｈＦＩＸ−ＷＴＡ実験構築物（ｎ＝５）または３つの独立したバッチから得たハプロタイプミスマッチＡＡＶ  Ｖ−ｈＦＩＸ−ＭＡ（ｎ＝５／群）のいずれかを９週齢のＢ６マウスに尾静脈注射した後にＥＬＩＳＡによって測定されたｈＦＩＸ血漿。エラーバーは標準偏差を表す。
【００４９】
【図３１】図３１Ａ〜図３１Ｂは、ＭＭＡのマウスモデルを図示する。図３１Ａ）Ｍｕｔエクソン３ノックアウトを有するＭｕｔ−／−マウスモデル。このマウスは、新生仔期に致死的である。以前に、Ｃｈａｎｄｌｅｒら、ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．２００７に記載された。図３１Ｂ）Ｍｕｔ−／−Ｍｃｋ＋マウスモデル。このマウスモデルは筋肉特異的なＭｕｔ発現を有し、マウスは生存可能である。
【００５０】
【図３２】図３２は、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の投与後のＭＭＡマウスモデルの分析のための実験デザインを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
詳細な説明
遺伝子治療
遺伝子治療は、導入遺伝子と呼ばれる治療遺伝子を送達するプロセスである遺伝子導入によって、患者の細胞の遺伝子発現プロファイルを変化させる。薬剤開発者は、改変ウイルスをベクターとして使用して、導入遺伝子を細胞の核内に輸送し、細胞の能力を変更または増加させる。開発者は、さまざまなベクターを使用して、肝臓、目の網膜、骨髄の造血細胞などの組織内の細胞中に遺伝子を導入することに大きな進歩を遂げてきた。これらのアプローチは、承認された治療法をもたらす場合もあれば、臨床試験において非常に有望な結果を示している場合もある。
【００５２】
複数の遺伝子治療アプローチが存在する。従来のＡＡＶ遺伝子治療では、導入遺伝子は宿主細胞の核内に導入されるが、染色体ＤＮＡ中に組み込まれることは意図されていない。導入遺伝子は、核内に存在するエピソームと呼ばれる、組み込まれていない遺伝要素から発現される。第二のタイプの遺伝子治療は、レンチウイルスなど、導入遺伝子とともにそれ自体を染色体ＤＮＡ中に挿入するが、任意の部位（arbitrary  site）に挿入する異なるタイプのウイルスの使用を用いる。
【００５３】
遺伝子のエピソーム発現は、外因性プロモーターによって駆動されなければならず、病状を直すまたは改善するタンパク質の産生をもたらす。
【００５４】
遺伝子治療の制約
細胞が分裂し、組織が成長するときの希釈効果。エピソーム発現に基づく遺伝子治療の場合、導入遺伝子は宿主染色体中に組み込まれることが意図されておらず、したがって細胞分裂中に複製されないので、細胞が成長または組織再生の過程で分裂すると、治療の有益性は通常低減する。したがって、新たな各世代の細胞は、標的組織中で導入遺伝子を発現する細胞の割合をさらに低下させ、時間の経過とともに治療的有用性の低下または消失をもたらす。
【００５５】
挿入の部位の制御不能。ウイルスを介した挿入を使用するいくつかの遺伝子治療の使用は、遺伝子が宿主染色体中に挿入されるので、長期的な利益をもたらす潜在性を有するが、遺伝子が挿入される場所を制御する能力がなく、不可欠な遺伝子を破壊する、または腫瘍形成などの望ましくない影響を促進し得る位置内に挿入するリスクを生じる。このため、これらの組み込み遺伝子治療アプローチは、主として、細胞が体外で処理された後に再挿入されるエクスビボアプローチに限定される。
【００５６】
外因性プロモーターの使用は、腫瘍形成のリスクを高める。両遺伝子治療アプローチの共通の特徴は、導入遺伝子が外因性プロモーターとともに細胞中に導入されることである。プロモーターは、最終的にタンパク質へと翻訳されるメッセンジャーＲＮＡすなわちｍＲＮＡへのＤＮＡの転写と増幅を開始するために必要とされる。遺伝子治療導入遺伝子からの高レベルの治療用タンパク質の発現には、強力な操作されたプロモーターが必要とされる。これらのプロモーターはタンパク質発現に不可欠であるが、動物モデルにおいて他者が行った以前の研究では、遺伝子治療ベクターの非特異的組み込みが腫瘍の発生を著しく増加させる可能性があることが示されている。プロモーターの強さは、これらの腫瘍の発生の増加に重要な役割を果たす。したがって、強力なプロモーターによって高レベルの発現を促進することを試みることは、長期の有害な結果をもたらし得る。
【００５７】
遺伝子編集
遺伝子編集とは、外因的に送達された遺伝子編集機構を使用して細胞のＤＮＡ中に切断を導入することによって、異常な遺伝子を削除、変更または増強することである。導入されたＤＮＡ切断を細胞が迅速に修復しようとすることに一部起因して、不要なオンターゲットおよびオフターゲット修飾の割合が高く、遺伝子修正の効率が低いため、現在のほとんどの遺伝子編集アプローチは、その有効性が限定されてきた。遺伝子編集の現在の焦点は、機能不全の遺伝子を無効化すること、または遺伝子内の個々の有害な変異を修正もしくはスキップすることである。起こり得る変異の数が多いため、これらのアプローチはいずれも、完全な修正遺伝子の挿入によって対処される場合のように、特定の遺伝性疾患内の変異の集団全体に対処することはできない。
【００５８】
遺伝子治療アプローチとは異なり、遺伝子編集は、正常な細胞分裂を通じて、修復された遺伝子領域を新たな世代の細胞に伝播することを可能とする。さらに、所望のタンパク質は、細胞自体の調節機構を使用して発現させることができる。遺伝子編集の従来のアプローチはヌクレアーゼベースであり、欠失を引き起こし、変更を加え、または身体のＤＮＡに修正配列を適用するために、細菌由来のヌクレアーゼ酵素を使用して特定の場所でＤＮＡを切断する。
【００５９】
ヌクレアーゼがＤＮＡを切断すると、従来の遺伝子編集技術は、相同組換え修復すなわちＨＤＲと非相同末端結合すなわちＮＨＥＪという２つの経路を使用してＤＮＡを修飾する。ＨＤＲは、ＤＮＡ損傷の部位に相補的な正しいＤＮＡ配列を極めて正確に組み込むことを含む。ＨＤＲには、ＤＮＡを極めて忠実に修復することができ、修正部位での不要な変異の導入を回避するという重要な利点がある。ＮＨＥＪは、切断されたＤＮＡの末端を迅速に結合する、選択性がより低く、より誤りがちなプロセスであり、切断部位に高頻度の挿入または欠失をもたらす。
【００６０】
ヌクレアーゼベースの遺伝子編集
ヌクレアーゼベースの遺伝子編集は、操作されたまたは最初に細菌中で同定されたＤＮＡ切断酵素であるヌクレアーゼを使用する。ヌクレアーゼベースの遺伝子編集は２段階のプロセスである。まず、二本鎖ＤＮＡ中の一方または両方の鎖を切断できる外因性ヌクレアーゼが、合成ガイドＲＮＡによって所望の部位に向けられ、特異的な切断を行う。ヌクレアーゼが所望の１または複数の切断を行った後に、細胞のＤＮＡ修復機構が活性化され、ＮＨＥＪを通じて、またはより一般的ではないがＨＤＲを通じて編集プロセスを完了する。
【００６１】
ＮＨＥＪは、細胞がＤＮＡ切断を修復するときに、細胞がコピーするＤＮＡテンプレートの不存在下で起こり得る。これは、二本鎖切断を修復するために細胞が使用する主要なまたは既定の経路である。ＮＨＥＪ機序は、インデルとして知られる小さな挿入または欠失を導入するために使用することができ、遺伝子の機能のノックアウトをもたらす。ＮＨＥＪは、その修復様式の故に、ＤＮＡ中に挿入および欠失を作製し、同じく、染色体異常を含む不要なオフターゲット変異の導入をもたらし得る。
【００６２】
ヌクレアーゼを介したＨＤＲは、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡおよび切断されたＤＮＡに類似したＤＮＡテンプレートの共送達によって起こる。その結果、細胞は、修復ＤＮＡを構築するためにこのテンプレートを使用することができ、欠陥のある遺伝子配列を正しい遺伝子配列に置き換える。本発明者らは、その忠実度が高いために、ヌクレアーゼベースのアプローチを使用して修正配列を挿入する場合、ＨＤＲ機序が好ましい修復経路であると考えている。しかしながら、ヌクレアーゼによって切断された後のゲノムに対する修復の大部分は、ＮＨＥＪ機序を引き続き使用する。より頻繁に使用されるＮＨＥＪ修復経路は、切断部位に不要な変異を引き起こす潜在性を有し、このため、任意のヌクレアーゼベースの遺伝子編集アプローチが現時点で標的とすることができる疾患の範囲を限定する。
【００６３】
ゲノム編集のために使用される相同性修復および非相同性末端結合ＤＮＡ修復経路が図１に図解されている。
【００６４】
従来の遺伝子編集は、３つのヌクレアーゼベースのアプローチの１つを使用してきた：転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼすなわちＴＡＬＥＮｓ；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連タンパク質−９すなわちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびジンクフィンガーヌクレアーゼすなわちＺＦＮ。これらのアプローチは研究および製品開発の重要な進歩にすでに貢献しているが、本発明者らは、これらのアプローチが固有の制約を有すると考える。
【００６５】
ヌクレアーゼベースの遺伝子編集の制約
ヌクレアーゼベースの遺伝子編集アプローチは、ＤＮＡを切断するための細菌ヌクレアーゼ酵素の使用と、導入遺伝子発現のための外因性プロモーターへの依存とによって制約される。これらの制約には、以下のことが含まれる。
【００６６】
ヌクレアーゼは、オンターゲットおよびオフターゲット変異を引き起こす。従来の遺伝子編集技術は、誤りがちなＮＨＥＪプロセスおよび潜在的なオフターゲットヌクレアーゼ活性に基づいて、染色体の変化を含む遺伝毒性をもたらし得る。
【００６７】
細胞への遺伝子編集成分の送達は複雑である。遺伝子編集は、複数の成分を同一の細胞中に同時に送達することを必要とする。これは技術的に困難であり、現在、複数のベクターを使用する必要がある。
【００６８】
細菌由来のヌクレアーゼは免疫原性である。従来の遺伝子編集アプローチにおいて使用されるヌクレアーゼは、ほとんどが細菌由来であるので、免疫原性の潜在性がより高く、ひいては、その有用性が制限される。
【００６９】
これらの制限のため、遺伝子編集は主に造血細胞などの細胞でのエクスビボ用途に限定されてきた。
【００７０】
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）技術プラットフォーム
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、ゲノムの忠実度を維持する天然に存在するＤＮＡ修復過程である相同組換えすなわちＨＲを利用するゲノム編集技術である。ＨＲを使用することにより、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、ＤＮＡを切断するように操作された酵素である外因性ヌクレアーゼを使用せずに、導入遺伝子として知られる治療遺伝子を特定の標的ゲノム位置中に挿入することを可能にする。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）による導入遺伝子の組み込みは、外因性プロモーターの使用に関連付けられてきた有害な問題なしに高レベルの組織特異的遺伝子発現を促進するために、これらの標的とされる位置において内因性プロモーターを活用するように設計されている。
【００７１】
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）技術は、安定した治療効果を与えるために修正遺伝子を患者のゲノム中に正確に組み込むように設計されている。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）はこの持続的な治療効果を有するように設計されているので、不可逆的な疾患の病状が発生し得る前に患者の一生の早い段階で処置を与えることが重要である小児患者におけるまれな肝障害を標的化することに適用し得る。例示的な製品候補であるＬＢ−００１は、出生時に現われる生命を脅かす疾患であるメチルマロン酸血症（Ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ  Ａｃｉｄｅｍｉａ）すなわちＭＭＡの処置に関して本明細書に記載されている。
【００７２】
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）プラットフォーム技術は、特に小児患者における遺伝性疾患を処置するのに極めて適した方法で、従来の遺伝子治療と従来の遺伝子編集アプローチの両方の主な制約のいくつかを克服する潜在性を有している。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、遺伝子を細胞の核内に送達するためにＡＡＶベクターを使用する。次に、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、内因性プロモーターによって修正遺伝子が調節される位置において、レシピエントのゲノム中に修正遺伝子を安定的に組み込むためにＨＲを使用し、身体が成長し、時間とともに変化しても、生涯にわたってタンパク質が産生される潜在性がもたらされ、これは、従来のＡＡＶ遺伝子治療によっては実現できない。
【００７３】
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、外因性プロモーターおよびヌクレアーゼに依存する遺伝子治療および遺伝子編集技術に比べて、いくつかの重要な利点を与える。ＨＲの自然に存在するプロセスを利用することにより、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、操作された細菌ヌクレアーゼ酵素に依存する遺伝子編集アプローチに付随する同じ課題に直面しない。これらの酵素の使用は、宿主細胞のＤＮＡ中での不要で、潜在的に危険な修飾の著しいリスクの増加を伴い、腫瘍形成のリスクの増加をもたらし得る。さらに、従来の遺伝子治療とは対照的に、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、宿主細胞の染色体中への修正遺伝子の正確で、部位特異的な、安定した持続的組み込みを与えることを意図する。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物を用いた前臨床動物研究では、ゲノム中の特定の位置に修正遺伝子が組み込まれることが観察されている。これにより、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）には、ゲノム中に組み込まれず、細胞が分裂するにつれてその効果を失う遺伝子治療技術よりも持久性があるアプローチを与える潜在性が与えられる。これらの利点により、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、特に小児患者の遺伝性疾患を処置するのに適している。
【００７４】
本明細書に開示されているモジュラーアプローチは、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）が、同じ組織に送達された異なる治療法にわたって再現性を有する強固な組織特異的遺伝子発現をもたらすことを可能にするために適用することができる。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物内の異なる導入遺伝子を置換することによって、この構築物の他の全ての成分を実質的に維持しながら、新しい治療適応症に対処するために、その導入遺伝子を送達することができる。このアプローチにより、さまざまなＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）製品候補にわたって共通の製造過程および分析を活用できるようになり、他の処置プログラムの開発過程を短縮できる。
【００７５】
非破壊的遺伝子標的化に関する以前の研究は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１５８３０９号に記載されている。ヌクレアーゼを使用しないゲノム編集に関する以前の研究は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１４３１７７号に記載されている。
【００７６】
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）を使用したゲノム編集：機序および特質
修正遺伝子をゲノム中のある特定の位置に送達するためにＨＲを使用するので、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）プラットフォームを用いるゲノム編集は、遺伝子編集とは異なる。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、修正遺伝子を正確に挿入し、ゲノム中での部位特異的な組み込みをもたらす。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）ゲノム編集アプローチは、外因性ヌクレアーゼまたはプロモーターの使用を要せず、代わりに、治療用導入遺伝子の転写を組み込み、開始するために、細胞の既存の機構を活用する。
【００７７】
図２は、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物が、ＨＲを使用して、アルブミン遺伝子の隣にある特定の点に導入遺伝子をどのように挿入するかを示す。
【００７８】
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）技術は３つの基本的な成分からなり、それらの各々がＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）アプローチの潜在的な利点に寄与する。
【００７９】
数百のヌクレオチドから構成される相同性アーム。相同性アームとして知られる隣接配列は、部位特異的な組み込みを指示し、構築物のオフターゲット挿入を制限する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９において使用されるガイド配列がわずか数十塩基対の長さであるのに対して、各アームは数百ヌクレオチドの長さであり、この増加した長さが改善された精度と部位特異的な組み込みを促進し得る。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）の相同性アームは、高度に発現される遺伝子のすぐ後ろに導入遺伝子の組み込みを指示し、これは、外因性プロモーターを導入する必要なしに高レベルの発現をもたらすことが動物モデルにおいて観察されている。
【００８０】
導入遺伝子。導入遺伝子として知られる修正遺伝子は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれるように選択される。これらの導入遺伝子は、患者の細胞中に見出される疾患関連遺伝子の機能的バージョンである。導入遺伝子と相同性アームの合わせたサイズを最適化して、これらの導入遺伝子がキャプシド中に効率的にパッケージされるのに適した配列長である可能性を高めることができ、これにより、導入遺伝子が最終的に患者中で適切に送達される可能性を高めることができる。
【００８１】
ポリシストロン性発現のための２Ａペプチド。２Ａペプチドをコードする短い配列は、多くの重要な役割を果たす。第一に、２Ａペプチドはポリシストロン性発現を促進し、ポリシストロン性発現とは、同一のｍＲＮＡから２つの異なるタンパク質が産生されることである。これにより、強力な内因性プロモーターによって駆動された、関心対象の組織内の高度に発現された標的遺伝子に導入遺伝子の転写を結合することにより、非破壊的な様式で導入遺伝子を組み込むことが可能になる。ＬＢ−００１を含む肝臓指向性治療プログラムの場合、アルブミン遺伝子座は組み込みの部位として機能することができる。リボソームスキッピングとして知られるプロセスを通じて、２Ａペプチドは各修飾された細胞中のアルブミンと同じレベルで治療用タンパク質の産生を促進する。第二に、導入遺伝子の組み込みおよび発現の成功の指標となる循環バイオマーカーとしての役割を果たすＣ末端タグの付加を除き、患者のアルブミンは正常に産生される。アルブミンに対するこの修飾は、他のアルブミンタンパク質融合物の臨床試験の結果に基づくと、アルブミンの機能に対して最小限の影響を有する。２Ａペプチドは、Ｔ細胞受容体キメラ抗原受容体すなわちＣＡＲ−Ｔなどの他の潜在的な治療法に組み込まれてきた（Ｑａｓｉｍら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１７）。
【００８２】
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）プラットフォームを適用する際の重要な段階は、組み込みのための標的遺伝子座を同定することである。位置は導入遺伝子発現の調節、具体的にはそのタンパク質が産生されるレベルと組織を決定するので、これは重要である。ＬＢ−００１を含む肝臓指向性治療プログラムの場合、アルブミン遺伝子座を組み込みの部位として使用することができる（図３および図４を参照）。
【００８３】
アルブミン遺伝子座を標的とすることにより、導入遺伝子の発現を最大化するために高レベルのアルブミン産生を駆動する強力な内因性プロモーターの活用が可能となる。導入遺伝子の発現をアルブミンに連結させることにより、外因性プロモーターの添加および標的細胞の大半での導入遺伝子の組み込みを必要とせずに、治療レベルでの導入遺伝子の発現が可能となり得る。
【００８４】
これは、ＭＭＡ、血友病Ｂおよびクリグラー・ナジャー症候群の動物モデルによって裏付けられる。これらのモデルでは、およそ１％の細胞中に導入遺伝子が組み込まれることによって、治療的有用性がもたらされた。アルブミンプロモーターの強度は、低いレベルの組み込みを克服して、潜在的に治療レベルの導入遺伝子発現をもたらす。
【００８５】
図５は、ＭＭＡを有する患者における欠損遺伝子であるメチルマロニル−ＣｏＡムターゼすなわちＭＵＴを含む、肝臓中の選択された疾患関連遺伝子と比較したアルブミンの相対的発現レベルを示す。
【００８６】
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、疾患の前臨床マウスモデル、非ヒト霊長類およびヒト細胞（インビトロ）において、アルブミン遺伝子座における修正遺伝子の組み込みをもたらす。さらに、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）による導入遺伝子発現のために必要とされるＨＲの効率は、活性転写部位で増強され、アルブミンが活発に発現されていない組織中では低くなる可能性がある。この機能により、組み込みのためにアルブミン遺伝子座を使用するプログラムにわたって、オンターゲットとオフターゲットの両方の組み込みがより予測可能なプロセスになるはずである。さらに、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）プラットフォームはＨＲを使用するので、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）製品候補は細菌ヌクレアーゼを一切含有せず、細菌ヌクレアーゼに関連する他の部位中へのオンターゲットまたはオフターゲット組み込みのリスクに対処する。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）治療アプローチは、他の組織およびゲノム中の標的位置に適用され得る。インビトロでの実行可能性研究では、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、ｒＤＮＡ、ＬＡＭＡ３およびＣＯＬ７Ａ１などの他のゲノム遺伝子座における組み込みに適している。
【００８７】
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）アプローチの潜在的な利点として、以下のものが挙げられる。
【００８８】
ゲノム中への導入遺伝子の標的化された組み込み。従来の遺伝子治療アプローチは、治療用導入遺伝子を標的細胞に送達する。これらのアプローチの多くが有する主な欠点は、遺伝子が細胞内に入ると、遺伝子は宿主細胞の染色体中に組み込まれず、細胞分裂の間にＤＮＡの複製と分離をもたらす自然のプロセスから恩恵を受けないことである。子供の正常な発育時における組織の急速な成長は、導入遺伝子に関連する治療的有用性を希釈し、最終的には失わせるので、これは、従来の遺伝子治療が患者の生涯の早い段階で導入された場合に特に問題となる。ＤＮＡの別の鎖上でゲノムの外側に発現された組み込まれていない遺伝子はエピソームと呼ばれる。このエピソーム発現は、形質導入された最初の細胞中で効果的であることができ、そのうちいくつかは、長期間または患者の生涯にわたって持続し得る。しかしながら、細胞の代謝回転が高く、小児患者の生涯の間にサイズがかなり大きくなる傾向がある肝臓などの標的組織においては、エピソーム発現は、通例一過性である。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）技術を用いると、導入遺伝子はゲノム中に組み込まれ、これは、細胞が分裂し、患者の組織が成長するにつれて安定的で持続的な導入遺伝子の発現を提供する潜在性を有し、持続的な治療的有用性をもたらし得る。
【００８９】
外因性プロモーターなしの導入遺伝子発現。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）技術を用いると、導入遺伝子は、強力な内因性プロモーターによって導入遺伝子が調節される位置において発現される。具体的には、長い相同性アームを使用して、アルブミンプロモーターのような強力な内因性プロモーターの制御下で発現される導入遺伝子をゲノム中の正確な部位に挿入することができる。導入遺伝子の発現を駆動するために外因性プロモーターを使用しないことによって、この技術は、がんのリスクの増加に関連付けられてきたプロモーターのオフターゲット組み込みの潜在性を回避する。強力な内因性プロモーターを選択することによって、ＨＲの非常に正確で信頼性の高いプロセスに典型的である適度な組み込み率で、導入遺伝子からの治療レベルのタンパク質発現に到達することが可能になる。導入遺伝子の正確な挿入ならびにその結果生じるインビボ動物モデル中の細胞およびインビトロでのヒト細胞による発現が、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）技術を用いて観察されている。
【００９０】
ヌクレアーゼを含まないゲノム編集。ＨＲの天然に存在するプロセスを利用することによって、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、従来の遺伝子編集技術において使用される外因性ヌクレアーゼに関連する望ましくない副作用を回避するように設計されている。これらの操作された酵素の使用は、誤りがちの二本鎖ＤＮＡ切断のＤＮＡ修復に起因する、染色体の変化を含む遺伝毒性と関連付けられてきた。ヌクレアーゼの使用を避けることは、細胞に送達される必要がある外因性成分の数も低下させる。
【００９１】
モジュール性。モジュラーアプローチにより、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は、同じ組織を標的とする異なる治療法にわたって再現性を有する、強固で組織特異的な遺伝子発現を与えることが可能になる。ＡＡＶキャプシドは、残りの成分を体内の細胞に送達できるようにする媒体としての役割を果たす。ベクターは、肝臓などの特定の標的組織にその内容物を送達する上で極めて効率的であるように設計することができる。導入遺伝子に依存しない相同性アームは、それぞれが数百塩基の長さであり、標的遺伝子の組み込みをゲノム内の正確な位置に向けるＤＮＡのセグメントである。いずれの内因性プロモーターが導入遺伝子を発現するかを決定するので、この位置は重要である。例えば、導入遺伝子の肝臓発現に基づく新しい治療法は、ＬＢ−００１と同じキャプシドおよび相同性アームを使用することができ、新しい治療法のための導入遺伝子はＬＢ−００１からのＭＵＴ遺伝子を置き換える。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物内の異なる導入遺伝子を置換することによって、この構築物の他の全ての成分を実質的に維持しながら、新しい治療適応症に対処するために、その導入遺伝子を送達することができる。このアプローチは、将来のＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）製品候補にわたって共通の製造過程および分析の活用を可能とし、潜在的に将来のプログラムの開発過程を短縮し得る。
【００９２】
ＭＭＡ
ＭＭＡは、特定のアミノ酸の正常な代謝に関与する酵素をコードするいくつかの遺伝子中の変異によって引き起こされ得る。最も一般的な変異はＭＵＴの遺伝子中にあり、その活性に完全なまたは部分的な欠損を引き起こす。その結果、メチルマロン酸と呼ばれる物質およびその他の潜在的に毒性のある化合物が蓄積し、ＭＭＡの徴候および症状を引き起こし得る。図６は、肝細胞におけるＭＵＴ欠損の影響を示す。
【００９３】
ＭＭＡを有する患者は、代謝的不安定性の頻繁な、致命的となり得る発症に苦しみ、これが観察される重度の罹患率および早期死亡率の原因となっている。ＭＭＡの影響は通常、乳児期の初期に現れ、症状には嗜眠、嘔吐、脱水症および発育不良が含まれる。ＭＭＡの患者は、摂食障害、知的障害、腎臓病および膵炎を含む長期的な合併症を有する。処置なしでは、ＭＭＡは昏睡および死をもたらす。現在、ＭＭＡの承認された治療法は存在せず、ＭＭＡ患者の見通しは依然として明るくない。本疾患の管理は、ＭＵＴ経路によって普通に処理されるアミノ酸を欠如する低タンパク質、高カロリーの食事に限られる。食事管理と注意深い看護にもかかわらず、ＭＭＡ患者、特にＭＵＴに最も重篤な欠損を有する患者は、怪我、感染または病気が体内のタンパク質の分解を引き起こしたときの異化ストレスの期間中に悪化する神経および腎臓の損傷にしばしば苦しむ。ＭＭＡ患者の平均余命は、過去数十年にわたって増加しているが、なお、約２０〜３０年にとどまると推定されている。本疾患が学校生活と社会的機能に対して及ぼす制約のために、患者およびその家族ならびに介護者の生活の質は本疾患によって著しく影響を受ける。この脆弱な集団への早期の介入は、不可逆的な臨床的疾患病態の発現と闘うために不可欠である。
【００９４】
米国でのＭＭＡの発生率は、５０，０００の出生に１人であると報告されており、現在、米国ではおよそ１，６００〜２，４００人の患者が罹患している。Ｍｕｔ変異を有するＭＭＡ患者の割合は、総ＭＭＡ集団のおよそ６３％と推定されている。ＬＢ−００１によって標的とされる遺伝的欠損を有するＭＭＡ患者の数は、主要な世界市場で３，４００〜５，１００人と推定されており、そのうち１，０００〜１，５００人の患者が米国に存在する。
【００９５】
時間の経過とともに、ＭＭＡの患者は、通例、腎移植を必要とする末期の腎疾患を青年期に発症する。肝腎複合移植または早期肝移植が、代謝制御を改善することを目的とした介入として浮上している。しかし、肝臓ドナーの数が限られていること、手術に伴う著しいリスク、高い処置上の費用（米国では、肝移植で平均約７４万ドル、肝腎複合移植で平均１２０万ドル（Ｍｉｌｌｉｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｐｏｒｔ，２０１４年米国臓器および組織移植費用の推定））および生涯にわたる免疫抑制薬への依存は、ＭＭＡ患者における肝移植の幅広い実施を制約する。
【００９６】
ＭＵＴはミトコンドリア酵素であるので、ＭＵＴの欠損は、機能的な酵素を血流中に注入する酵素補充療法によって是正することは困難または不可能であり得る。細胞内にＭＵＴ酵素を取り込むための最も効率的な方法は、細胞内でＭＵＴ酵素を合成させることである。これを達成するために、ＭＵＴをコードするｍＲＮＡを細胞中に直接導入することまたはウイルスベクターを使用して細胞中にＭＵＴの遺伝子を導入することなど、いくつかの異なるアプローチが動物モデルにおいて調査されてきた。これらのアプローチはいずれも、機能的なＭＵＴ遺伝子の導入が症状を改善することができることを検証するのに役立つが、治療的有用性が一過性であるという点で、これらのアプローチはそれぞれ重要な制約も有する。ｍＲＮＡ治療の場合には、ＭＵＴの治療レベルを維持するためにＭＵＴ  ｍＲＮＡを毎週静脈内投与することが必要であったが、この療法をどの程度の頻度で患者に投与する必要があるかは明確でない。ＭＵＴ遺伝子治療の場合には、ＭＵＴのレベルは時間とともに減少した。持続性のある処置がなければ、複数回の投与が必要になる。しかしながら、ＭＵＴ遺伝子治療を提供するために使用されるウイルスベクターに対して患者が中和抗体を生ずることによって、その後の用量を投与する能力が制約される。さらに、強力な外因性プロモーターを有するＡＡＶベクターの投与は、新生児期の送達後の肝細胞癌と相関している。
【００９７】
ＭＵＴ遺伝子の機能的コピーをＭＭＡ患者のゲノム中に導入することは、はるかに優れたアプローチであり、潜在的に単回の投与で生涯にわたる治療的有用性がもたらされる。
【００９８】
ＭＭＡは、満たされていない医療的ニーズが高く、治療的処置が存在しない有機酸血症である。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）は治療の持続性を与えるように設計されているので、機能の不可逆的な低下が発生し得るより前に異常な遺伝子の機能を回復する処置で幼少期に介入することにより、ＭＭＡ患者に対して生涯にわたる利益をもたらし得る。いくつかの実施形態では、治療用導入遺伝子は、肝臓において最も高度に発現される遺伝子であるアルブミンをコードする遺伝子のすぐ後ろに組み込まれるように設計されたＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物を使用して送達される。導入遺伝子の発現はアルブミンの発現の上に「乗っかり」、肝臓中でのアルブミン発現のレベルが高いことを考えると、これは、十分な治療レベルの望ましいタンパク質を提供し得る。
【００９９】
ＭＭＡマウスモデル
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）によるアッセイ処置のために、ＭＭＡのマウスモデルを使用することができる。ＭＭＡの例示的なマウスモデルが、図３１Ａおよび図３１Ｂに図示されている。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の投与後におけるＭＭＡマウスモデルの分析のための例示的な実験方法が図３２に示されている。
【０１００】
ＭＭＡマウスモデルの一例では、Ｍｕｔの遺伝子は完全に非機能的とされる。Ｍｕｔのこの非機能的対立遺伝子はＭｕｔ−／−と称される。この非機能的対立遺伝子を有するマウスは、患者のＭＭＡの最も重篤な症例において見られるよりもさらに重度の欠損を有すると考えられる。処置せずに放置すると、これらのマウスは生後数日以内に死亡する。
【０１０１】
Ｍｕｔ−／−マウスの改変が、Ｍｕｔ−／−；ＴｇＩＮＳ−ＭＣＫ−Ｍｕｔと称されるＭＭＡの別のマウスモデルである。本明細書で使用される場合、Ｍｕｔ−／−；ＴｇＩＮＳ−ＭＣＫ−Ｍｕｔは、ＭＣＫ−ＭｕｔまたはＭｕｔ−／−；Ｍｃｋ−ＭｕｔまたはＭｕｔ−／−ＭＣＫ＋と表されることがある。このマウスモデルでは、クレアチンキナーゼプロモーターの制御下に置かれたマウスＭｕｔ遺伝子の機能的コピーが存在する。これにより、筋肉細胞中でのＭｕｔ発現が可能になり、ＭＭＡ患者に見られる表現型の変化の多くを呈しながらも、ひいてはマウスはより長く生存可能となる。
【実施例】
【０１０２】
［実施例１］ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）による導入遺伝子組み込みのためのゲノム遺伝子座としてのアルブミン
本実施例は、アルブミン遺伝子座が肝臓からの導入遺伝子発現のための組み込み部位となり得ることを示す。
【０１０３】
アルブミン遺伝子座は、導入遺伝子発現のための遺伝子座としていくつかの魅力的な特徴を有する。強力な内因性プロモーターは高レベルのアルブミン産生を促進し、この強力なプロモーターを利用して、外因性プロモーターを添加することなく、導入遺伝子の発現を最大化して治療レベルに到達させることができる。図４に示されているように、アルブミンは、他の組織と比較して肝臓中で高度に発現される。この肝臓関連の発現パターンは、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の発現を主に肝臓に局在化させるために使用することができる。さらに、図３に示されるように、アルブミンは肝臓で最も多く発現される遺伝子であり、関連して、肝臓中での疾患関連遺伝子の発現と比較してアルブミン発現がより高いことは、治療レベルの導入遺伝子発現に到達することに寄与することができる。例えば、図５は、アルブミン発現レベルが、ＭＭＡを含む単一遺伝子疾患に関連する他の選択された肝臓遺伝子よりも１００倍高いことを示している。
【０１０４】
［実施例２］メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）の処置のためのＬＢ−００１
本実施例は、ＭＭＡの処置のための製品候補であるＬＢ−００１を記載する。ＬＢ−００１はＭＭＡ患者において最も一般的な遺伝子欠損であるＭＵＴをコードする導入遺伝子を含有する（図６）。ＬＢ−００１は、肝細胞を標的とし、ＭＵＴ導入遺伝子をアルブミン遺伝子座の中に挿入するように設計されている。
【０１０５】
ＬＢ−００１は、ＡＡＶキャプシド中に被包されたヒトＭＵＴ酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ構築物からなる（図７Ａ）。ＭＵＴ酵素コード配列は２Ａペプチド配列に結合されており、アルブミン遺伝子の染色体遺伝子座中への、ＭＵＴ遺伝子および２Ａペプチド配列の組み込みを促進する相同性アームによって囲まれている。この構築物がアルブミン遺伝子座中に組み込まれる方法に基づいて、ＭＵＴ遺伝子が発現され、アルブミンとは別個のタンパク質としてＭＵＴ酵素が合成される。ＬＢ−００１では、ヒト肝細胞を標的とするように最適化されたＡＡＶキャプシドであるＬＫ０３が使用されている。
【０１０６】
ヒトＭｕｔ配列を発現するためにＡＡＶ−ＬＫ０３キャプシドと共に使用することができる例示的な核酸が図７Ｂに図示されている。この核酸は、ＡＡＶ２からのＩＴＲと、アルブミン配列に対応する１０００塩基長の５’および３’相同性アームと、リボソームスキッピングを促進するために２Ａペプチドが先行する合成ヒトＭｕｔ配列とを含む。この構築物の臨床的適応には、食事管理と組み合わせた重度のメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）の処置が含まれる。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）技術を使用して、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（Ｍｕｔ）遺伝子の機能的コピーをＭＭＡ患者の肝細胞に送達することは、有毒な代謝物の蓄積を取り除き、阻止することを目的とする。研究等級のＬＢ−００１は、ＨＥＫ細胞中へのトリプルトランスフェクションを用いて生成されてきた。臨床材料の製造は、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）プラットフォームを使用することを含む、当技術分野で公知の方法によって行うことができる。
【０１０７】
［実施例３］マウスの用量設定分析
本実施例は、Ｍｕｔ−ＭＣＫマウスモデルにおけるＬＢ−００１代用物の例示的な用量設定研究デザインを実証する。このような分析から得られる結果は、静脈内投与された場合のＭＵＴノックアウトマウスに対するＬＢ−００１代用物の有効用量を決定するために適用することができる。さらに、この分析から得られる結果は、非ＧＬＰ毒性学的評価を提供し、より大規模な動物研究および臨床試験に影響を及ぼし得る。この例では、評価されている適応症はメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）である。同様の研究デザインを、他の適応症のために取り入れることができる。
【０１０８】
この研究では、ＬＢ−００１代用物は１０００ｂｐの５’および３’相同性アームを含む。ベクター（Ｖｔ−２０バッチ４（ＣＭＲＩ））は、以下の３つの用量で投与される：６ｅ１２（低）、６ｅ１３（中）、６ｅ１４（高）ｖｇ／ｋｇ。マウス系統はＭｕｔ−ＭＣＫである。動物の予想される同腹仔の数は６〜８匹である。各処置群に対して、５〜６匹の同腹仔が必要であると推定される。表１は、本研究の処置群を要約したものである。
【表１】
2021534816.tif 000002
【０１０９】
本研究のための試料収集には、次のものが含まれる：（１）血清；（２）血漿（ＥＤＴＡ管）；（３）肝臓（新鮮凍結（ドライアイス）、−８０Ｃで保存））；肝臓、腎臓、心臓、肺、脳、骨格筋（一晩１０％ホルマリン固定し、７０％エタノール中にて室温で保存）。表２は、本研究のための試料収集を要約する。
【表２】
2021534816.tif 000003
【０１１０】
本研究のために読み取られたデータには、以下のものが含まれる：（１）生存；（２）体重、毎週を基本に、週に１回測定；（３）Ｄ３０、Ｄ６０およびＤ９０に始まるＭＭＡ血漿レベル；（４）研究終了時（Ｄ９０）の肝臓組織への組み込み。
【０１１１】
［実施例４］マウスモデルにおけるＭＵＴ導入遺伝子送達の有効性
本実施例は、ＭＭＡの２つのマウスモデルにおいて得られたＬＢ−００１の前臨床データを提供する。第一のモデルでは、Ｍｕｔの遺伝子は完全に非機能的となった。Ｍｕｔのこの非機能的形態は、Ｍｕｔ−／−と表される。この非機能的遺伝子を有するマウスは、患者のＭＭＡの最も重篤な症例において見られるよりもさらに重度の欠損を有すると考えられる。処置せずに放置すると、これらのマウスは生後数日以内に死亡する。図８の上パネルに示されているように、ＬＢ−００１のマウスＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物を新生仔マウス４匹中に単回腹腔内注射することによって、４匹中３匹のマウスの生存が延長され、２匹のマウスは１年より長く生存した。さらに、これらのマウスは、図８の下パネルに示されているように、自由に餌を与えると体重が増加した。
【０１１２】
ＭＣＫ−Ｍｕｔと呼ばれるＭＭＡの第二のマウスモデルは、マウスＭｕｔ遺伝子の機能的コピーがクレアチンキナーゼプロモーターの制御下に置かれているＭｕｔ−／−マウスを改変したものである。これにより、筋肉細胞中でのＭｕｔの発現が可能になり、ＭＭＡ患者に見られる表現型の変化の多くを呈しながらも、マウスはより長く生存可能となる。５匹の新生仔ＭＣＫ−Ｍｕｔマウスに、ＬＢ−００１のマウスＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物を単回注射した。これらのマウスでは、Ｍｕｔの発現が観察された。図９に示されているように、生後１ヶ月で、これらのマウスは非処置ＭＣＫ−Ｍｕｔマウスと比較して体重増加に有意な改善を有していた。これらの結果は、統計的に有意であった。ｐ値は統計的有意性の標準的な尺度であり、ｐ値が０．０５未満であれば、結果が偶然に得られた確率は２０分の１未満であることを表し、通常、統計的に有意であるとみなされる。
【０１１３】
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）で処置されたＭＣＫ−Ｍｕｔマウスは、図１０に示されているように、ＭＭＡ患者中に蓄積するメチルシトレートおよびメチルマロン酸、疾患関連の毒性代謝物および診断バイオマーカーの血漿レベルも有意に低下していた。
【０１１４】
驚くべきことに、ＡＡＶによるＨＲ遺伝子編集によって達成された染色体組み込みの率は比較的低いにもかかわらず、このような方法は、機能的なＭｕｔ酵素の治療的発現レベルをもたらす。理論に縛られることを望まないが、この成功はＬＢ−００１構築物のある種の特徴によるものであるという仮説が立てられる。
【０１１５】
第一に、利用されたＡＡＶキャプシドであるＬＫ０３は、ヒト肝細胞を標的とするように最適化されている。第二に、ゲノム挿入は、アルブミン遺伝子の遺伝子座に向けられている。アルブミンは肝臓中で最も高度に発現されるタンパク質であり、多くの他のタンパク質の通常の発現はアルブミンの発現のわずかな割合に過ぎない。したがって、若干の組み込み率でさえ、治療レベルのタンパク質を発現し得る。アルブミンがその１つである転写的に活性な遺伝子は、ＨＲを使用した導入遺伝子組み込みをより受けやすい。
【０１１６】
第三に、機能的なＭｕｔ酵素自体の存在が、Ｍｕｔを欠く肝細胞に比べて肝細胞に選択的有利性を与えることが観察されてきた。時間の経過とともに、この選択的有利性により、Ｍｕｔの機能的コピーを含有する肝細胞の割合が増加する。これは、マウスＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物が、肝臓中にＭｕｔの機能的コピーを有するおよび有さないマウス中に導入されたマウスにおいて観察することができる。両組のマウスにおける当初のＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）組み込み頻度は４％未満であった。時間が経過するにつれて、修飾された細胞の数は、肝臓中でＭｕｔを自然に発現するマウス（肝臓中でＭｕｔ＋／−）において同じままであった。しかしながら、１年を超えた後、肝臓Ｍｕｔが遺伝的に欠損しているマウス（肝臓中でＭｕｔ−／−）では、図１１に示されているように、Ｍｕｔを発現する細胞のパーセントが２４％に増加した。理論に拘束されることを望まないが、この選択的有利性は、Ｍｕｔ発現および欠損したアミノ酸代謝経路の回復の結果としてのミトコンドリア機能の改善によるものであり得る。
【０１１７】
これらのマウスにおける選択的有利性を裏付けるさらなる証拠としては、（ｉ）図１２に示されているように、オルソゴナルロングレンジ定量的ポリメラーゼ連鎖反応すなわちＬＲ−ｑＰＣＲによる、アルブミン遺伝子座に組み込まれたＭｕｔ遺伝子を有する細胞の定量、および（ｉｉ）図１３に示されているように、投与後１ヶ月と比較した１年超でのＬＲ−ｑＰＣＲによるアルブミン遺伝子座における組み込み率の増加の検出が挙げられる。
【０１１８】
細胞が複製し、ウイルスによってコードされた導入遺伝子を喪失するにつれて、ＡＡＶ遺伝子治療を含む細胞の百分率が時間とともに減少する従来のＡＡＶ遺伝子治療アプローチとは対照的に、ＭＭＡマウス研究では、Ｍｕｔ  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物を含む細胞の百分率が時間とともに増加した。これらの結果は、単回投与が生涯にわたる利益を与え得る可能性を支持する。
【０１１９】
［実施例５］マウスモデルにおけるＭＵＴ導入遺伝子送達の有効性
本実施例は、実施例４において提示された知見を確認する。実施例４と同様に、本実施例は、マウスアルブミン（Ａｌｂ）遺伝子座中へのヒトＭＵＴの部位特異的遺伝子付加を達成するために、相同組換えを用いるプロモーターレスＡＡＶベクターを使用する。このベクター（ＡＡＶ−Ａｌｂ−２Ａ−ＭＵＴ）は、ＭＵＴ遺伝子の近位に位置する２Ａ−ペプチドコード配列に隣接する相同性のアームを含有し、組み込み後に内因性ＡｌｂプロモーターからＭＵＴ発現を生成する。以前のデータは、出生時に８．６Ｅ１１〜２．５Ｅ１２ｖｇ／仔１匹の用量で送達されたＡＡＶ−Ａｌｂ−２Ａ−ＭＵＴが、ＭＭＡのマウスモデルにおいて、疾患関連代謝物を低下させ、成長および生存を増加させることを示した（Ｃｈａｎｄｌｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ  Ａｃｉｄｅｍｉａ  ｆｒｏｍ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ，Ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２６，２５（５Ｓ１）：ｐａｇｅ  １３（Ｍａｙ  ２０１７））。本実施例は、実施例４と同様に、本明細書に開示されている構築物および方法によるＭＵＴ導入遺伝子送達が、ＭＭＡマウスモデルにおいて、より長期の有効性を与えるという発見を開示している。
【０１２０】
実施例４に示されているように、本実施例は、低次形態ＭＭＡマウスモデルのＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）での処置は、メチルマロン酸の血漿レベルの低下をもたらすことを確認する（図１４）。また、実施例４に示されているように、本実施例は、ＭＵＴ導入遺伝子の組み込みが、ＭＭＡを有するマウスに肝細胞成長の有利さを与えることを確認する。例えば、肝臓の（ｈｅｐａｔｉｃｅ）ＭＵＴタンパク質発現、ＭＵＴ  ｍＲＮＡ細胞のパーセンテージおよびＡｌｂ組み込みの数は、処置されたＭＭＡマウスにおいて時間とともに増加することが観察された（図１５〜１７）。処置の１３〜１５ヶ月後の野生型マウスおよび処置の２ヶ月後のＭＭＡマウスで観察された低レベルの導入遺伝子組み込みおよび少数のＭＵＴ  ｍＲＮＡ陽性細胞（図１５および１７）は、インビボ相同組換えによる修正の特徴である。
【０１２１】
さらに、実施例４のように、本実施例は、ＡＡＶ−Ａｌｂ−２Ａ−ＭＵＴで処置されたＭＭＡマウスのＲＮＡｓｃｏｐｅが強固なＭＵＴ発現およびクローン拡大のパターンと一致し、明瞭で広く分散されたクラスターとして現れたＭＵＴ陽性肝細胞を明らかにしたことを示す。ＲＮＡｓｃｏｐｅ研究は、ＭＵＴ発現が、野生型対照の１％に対して、処置されたＭＭＡマウス中の肝細胞の約５〜４０％に存在したことも示す（図１７）。実施例４および本実施例の発見は、ＭＵＴ  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）を使用した処置後のＭＭＡのマウスモデルにおいて、修正された肝細胞に対する選択的有利性が達成され得ることを示す。この観察は、ＭＭＡ患者の処置に関して臨床的意義を有する。
【０１２２】
［実施例６］マウスモデルにおけるＭＵＴ導入遺伝子送達の有効性
本実施例は、マウスＬＢ００１でのＭＭＡマウスモデルの処置に対して実施例４に提示された知見を確認する。
【０１２３】
実施例４と同様に、本実施例は、肝臓ＭＵＴを欠損したＭＭＡマウスモデルに対して経時的なＤＮＡ組み込みの増加を開示している（図１８）。この増加は、導入遺伝子構築物の異なる用量に対して観察された。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本明細書に開示される構築物および方法を使用する導入遺伝子組み込みのこのような増加、このような観察された選択的有利性は、患者への構築物投与の安全な用量で導入遺伝子発現の治療レベルを達成する目的のために利用され得る。例えば、比較的低用量の構築物から始めて、ＭＭＡに罹患している患者は、最終的に、重症度を軽減し、または疾患を処置するのに十分なレベルのＭＵＴ導入遺伝子に到達することができる。患者における経時的な導入遺伝子組み込みの増加の観察は、モニター処置を確認するために使用することができる。
【０１２４】
［実施例７］ヒト化マウスモデルにおけるｈＬＢ００１のインビボ活性の調査
本実施例は、組換えＡＡＶ（ｈＬＢ００１）（ＬＫ−０３−ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）ＭＵＴ）およびヒト化ＦＲＧ  ＫＯ／ＮＯＤマウスモデルを使用して、ＭＵＴ導入遺伝子のヒトＡＬＢ遺伝子座中への部位特異的組み込みの有効性を評価するための例示的な分析を提供する。
【０１２５】
この分析のためのベクターは、２つの投与レベル（１ｅ１３および１ｅ１４  ｖｇ／ｋｇ）で、ヒト化肝臓を有するＦＲＧマウスに投与されたｈＬＢ００１である。この分析の評価項目には、次のものが含まれる。（１）ゲノム組み込みの百分率および（２）ＡＬＢ−２Ａ−ＭＵＴ融合ｍＲＮＡの発現。分析する時点には、感染後２１日が含まれる。
【０１２６】
材料、方法および試料採取
材料
ａ．ドナーＨＨＭ１９０２７／ＹＴＷによって８０％以上ヒト肝細胞で置換された雌のヒト化Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−ＮＯＤマウス３匹（Ｈｕ−ＦＲＧＮ）
ｂ．ドナーＨＨＦ１３０２２／ＲＭＧによって８０％以上ヒト肝細胞で置換された雌のヒト化Ｆａｈ−／−／Ｒａｇ２−／−／Ｉｌ２ｒｇ−／−ＮＯＤマウス１２匹（Ｈｕ−ＦＲＧＮ）、
ｃ．ＹｅｃｕｒｉｓヒトアルブミンＥＬＩＳＡ
ｄ．２９ｇ針付きの無菌３／１０ｃｃシリンジ
ｅ．２９ｇ針付きの無菌１ｃｃシリンジ
ｆ．クエン酸ナトリウムでコーティングされたチューブ、０．８ｍＬ
ｇ．ＰＢＳ、ビヒクル
ｈ．予備調査の段階：ｒＡＡＶ、力価：６．４３ｅ１３  ｖｇ／ｍＬ
ｉ．第１相：ｒＡＡＶ力価：９．２９ｅ１３  ｖｇ／ｍＬ
ｊ．１．５ｍＬチューブ、無菌
ｋ．マウス麻酔カクテル（７．５ｍｇ／ｍＬケタミン、１．５ｍｇ／ｍＬキシラジンおよび０．２５ｍｇ／ｍＬアセプロマジン）
ｌ．ＴｉｓｓｕｅＴｅｋカセット
ｍ．新たに調製した１０％中性（ｎｏｒｍａｌ）緩衝ホルマリン
ｎ．エタノール、７０％
ｏ．スクリューキャップ付き５ｍＬポリプロピレンチューブ
ｐ．液体窒素
【０１２７】
方法
【０１２８】
投与前のマウスの準備：
研究に使用される全てのマウスは、研究開始の２５日以上前にＮＴＢＣから、３日以上前にＳＭＸ／ＴＭＰから取り出す。ヒト化は、研究開始前７日以内に評価される。
【０１２９】
投与のためのウイルスの調製：
ウイルスは、調製中および調製後に、解凍し、氷上に保持されるべきである。ＰＢＳは、３７Ｃまたは室温で解凍され得る。調製の３０分以上前にＰＢＳを、５分以上前にウイルスを解凍することが推奨される。
【０１３０】
予備研究−パイロット：
ａ．化合物の調合：
ｉ．１ｅ１４  ｖｇ／ｋｇを与えるために、２ｅ１３ｖｇ／ｍＬのウイルスストックを必要とする
ｉｉ．レベルＩＩのバイオセーフティキャビネット内で、６．４３ｅ１３  ｖｇ／ｍＬを２ｅ１３  ｖｇ／ｍＬに希釈する。平均体重を２５ｇと仮定する
【表５】
2021534816.tif 000004
ｂ．ＨＨＭ１９０２７／ＹＴＷを移植された４匹のＨｕＦＲＧＮを２つの群に分け、下の表に概説されている表記用量で表記化合物を投与する。
【表６】
2021534816.tif 000005
ｃ．１日目に、各群に、２９ｇの針付きの無菌３／１０ｃｃ針を使用して、後眼窩洞静脈を介した静脈内送達により、指定された用量の各化合物を与える。
ｉｉｉ．各マウスの体重を測定し、体重（ＢＷ）を記録する。
ｉｖ．各マウスのＢＷ（ｇ）に、ｖｇ／ｇ単位で表した原液の濃度を乗じて、所望の用量を達成するために必要とされる化合物の総ｖｇを決定する。
ｖ．ｖｇの総数をｖｇ／μＬで表した原液の濃度で除して、投与に使用するための原液の体積を決定する。
ｖｉ．投与前に、気化したイソフルランを使用してマウスに麻酔をかける。
ｖｉｉ．各マウスに対する計算された用量のウイルスを、３／１０ｃｃシリンジの無菌２９Ｇ針へと引き込み、後眼窩洞静脈を介して送達する。
ｄ．すべての動物を、麻酔からの回復を確実にするために投与直後にモニターし、投与の間、動物には意図的でない害を与えなかった。
ｅ．すべてのマウスを、一般的な健康状態について毎日モニターする。マウスが瀕死であるまたは死亡していることが判明した場合、そのマウスに麻酔をかけ、以下の「最終の採取」のセクションに記載されているとおりに試料を収集する。
【０１３１】
最終の採取
ａ．２２日目（投与後３週）に、すべてのマウスの体重を測定し、体重に応じてマウスカクテルを使用して麻酔をかける。
ｂ．２７ｇの針付き１ｃｃシリンジを用いた心臓穿刺によって、できるだけ多くの全血を収集する。クエン酸ナトリウムでコーティングされたチューブへと全血を移し、４℃で、１５分間１５００×ｇで遠心分離することによって血漿を単離する。血漿を１００μＬの一定分量に分配し、−８０℃で保存する。
ｃ．腹膜と胸腔を開いて肝臓を露出させ、肝臓を単離して、肝臓の重量を記録する。肝臓を個々の葉に切開し、各葉を２つの等しい部分にさらに切開する。
ｄ．組織学的検査のために、各葉から１つの片をＴｉｓｓｕｅＴｅｋカセット中に配置し、新たに調製した１０％中性緩衝ホルマリン中において室温で１６〜３２時間固定した後、７０％エタノールに移して室温で保存する。
注意：４℃で固定しないこと。１６時間より前または３２時間より後に固定しないこと。固定が遅れると、ＲＮＡが分解され、シグナルが低下する、またはシグナルが発生しなくなることがある。より短い時間またはより低い温度は、固定不足をもたらす。
ｅ．生物分析のために、各葉から得た第二の片を５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、液体窒素中で瞬間冷凍して−８０℃で保存する。
【０１３２】
研究−第１相
ａ．化合物の調合：
ｉ．１ｅ１４ｖｇ／ｋｇを与えるために、２ｅ１３ｖｇ／ｍＬのウイルスストックを必要とする。１ｅ１３ｖｇ／ｋｇを与えるために、２ｅ１２ｖｇ／ｍＬを必要とする。
ｉｉ．レベルＩＩのバイオセーフティキャビネット内で、９．２９Ｅ＋１３  ｖｇ／ｍＬをを２ｅ１３  ｖｇ／ｍＬおよび２ｅ１２  ｖｇ／ｍＬのストックに希釈する。平均体重を２５ｇと仮定する
【表７】
2021534816.tif 000006
ｂ．ＨＨＦ１３０２２／ＲＭＧを移植された１２匹のＨｕＦＲＧＮを３つの群に分け、下の表に概説されている表記用量で表記化合物を投与する。
【表８】
2021534816.tif 000007
ｃ．１日目に、各群に、２９ｇの針付きの無菌３／１０ｃｃ針を使用して、後眼窩洞静脈を介した静脈内送達により、指定された用量の各化合物を与える。
ｉｉｉ．各マウスの体重を測定し、体重（ＢＷ）を記録する。
ｉｖ．各マウスのＢＷ（ｇ）に、ｖｇ／ｇ単位で表した原液の濃度を乗じて、所望の用量を達成するために必要とされる化合物の総ｖｇを決定する。
ｖ．ｖｇの総数をｖｇ／μＬで表した原液の濃度で除して、投与に使用するための原液の体積を決定する。
ｖｉ．投与前に、気化したイソフルランを使用してマウスに麻酔をかける。
ｖｉｉ．各マウスに対する計算された用量のウイルスを、３／１０ｃｃシリンジの無菌２９Ｇ針へと引き込み、後眼窩洞静脈を介して送達する。
ｄ．すべての動物を、麻酔からの回復を確実にするために投与直後にモニターし、投与の間、動物には意図的でない害を与えなかった。
ｅ．すべてのマウスを、一般的な健康状態について毎日モニターする。マウスが瀕死であるまたは死亡していることが判明した場合、そのマウスに麻酔をかけ、以下の「最終の採取」のセクションに記載されているとおりに試料を収集する。
【０１３３】
最終の採取
ａ．２２日目（投与後３週）に、マウスカクテルを使用して、全てのマウスに麻酔をかける。
ｂ．２７ｇの針付き１ｃｃシリンジを用いた心臓穿刺によって、できるだけ多くの全血を収集する。クエン酸ナトリウムでコーティングされたチューブへと全血を移し、４℃で、１５分間１５００×ｇで遠心分離することによって血漿を単離する。血漿を１００μＬの一定分量に分配し、−８０℃で保存する。
ｃ．腹膜と胸腔を開いて肝臓を露出させ、肝臓を単離して、肝臓の重量を記録する。肝臓を個々の葉に切開し、各葉を２つの等しい部分にさらに切開する。
ｄ．組織学的検査のために、各葉から１つの片をＴｉｓｓｕｅＴｅｋカセット中に配置し、新たに調製した１０％中性緩衝ホルマリン中において室温で１６〜３２時間固定した後、７０％エタノールに移して室温で保存する。
注意：４℃で固定しないこと。１６時間より前または３２時間より後に固定しないこと。固定が遅れると、ＲＮＡが分解され、シグナルが低下する、またはシグナルが発生しなくなることがある。より短い時間またはより低い温度は、固定不足をもたらす。
ｅ．生物分析のために、各葉から得た第二の片を５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、液体窒素中で瞬間冷凍して−８０℃で保存する。
【０１３４】
［実施例８］初代ヒト肝細胞に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）
サンドイッチ培養系を使用して、初代ヒト肝細胞を培養した。培地を交換する前に、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）ｈＬＢ００１によって細胞を４８時間感染させた。感染の７日後、細胞を採集し、Ｑｉａｇｅｎ  Ａｌｌｐｒｅｐキット（カタログ番号／ＩＤ：８０２０４）を使用してＲＮＡを抽出した。
【０１３５】
ＲＮＡ抽出後に、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ４３６８８１４）による逆転写のために１μｇのＲＮＡを使用した。プライマー２３５／２６７による下流ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとしてｃＤＮＡを使用した（図１９）。ＰＣＲ産物はプライマー２３５を用いて配列決定した。
【０１３６】
配列決定の結果は、ＡＬＢエクソン１２、エクソン１３、終止コドン前のエクソン１４および２ａ配列の融合ｍＲＮＡを示し、これは、初代ヒト肝細胞に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）によって媒介された正確な組み込みからの融合ｍＲＮＡの正しい発現を表す。
【０１３７】
［実施例９］初代ヒト肝細胞に対するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）
本実施例は、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）ベクターＬＢ００１がヒト初代肝細胞中のＡＬＢ遺伝子座中へのＭＵＴの効率的なゲノム編集を媒介することができるという点で、実施例８で観察された結果を確認する。
【０１３８】
方法
初代ヒト肝細胞サンドイッチ培養系を利用して、感染力、ＤＮＡ組み込みおよびタンパク質レベルを分析した（図２０）。ロングレンジ（ＬＲ）ｑＰＣＲを使用して、部位特異的組み込み率を分析した（図２１）。安定したＨｅｐＧ２−２Ａ−ＰｕｒｏＲ細胞株を、ＤＮＡにおける陽性対照として使用した。
【０１３９】
結果
ＭＵＴおよびＡＬＢの相対的発現を評価した（図２２）。さらなる研究のために、同じハプロタイプ１を有する３人の初代ヒト肝細胞ドナーを選択して、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）ＬＢ−００１を試験した（図２３〜２５）。これらの結果は、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）ＬＢ−００１が初代ヒト肝細胞中にＭＵＴ導入遺伝子を組み込み、発現することができることを確認する。
【０１４０】
［実施例１０］ＭＭＡを処置するためのＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）技術での適用のためのＭＵＴ導入遺伝子
本実施例は、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）技術での適用のために、さまざまなＭＵＴ導入遺伝子を使用できることを示す。例えば、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）用途において、ヒトメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ｓｙｎＭＵＴ）をコードする合成ポリヌクレオチドが使用され得る。ｓｙｎＭＵＴ構築物の例は、国際公開第２０１４／１４３８８４号および米国特許第９，９４４，９１８号に記載されており、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。ヒトメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ｓｙｎＭＵＴ１−４）をコードする例示的な最適化されたヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号９、１２、１３および１４として列記されている。
【０１４１】
［実施例１１］先天性代謝異常症
肝臓は、多くの代謝および解毒過程に関与する重要な器官である。ＭＭＡを含む、数十の単一遺伝子疾患は、代謝経路に関与する肝臓酵素の欠損から生じる。別の稀な先天性代謝異常症であるクリグラー・ナジャー症候群に対処するために、動物モデルにおいて、さらなる概念実証データを生成した。クリグラー・ナジャーを有する患者では、ビリルビンを代謝して循環から取り除くことができず、生涯にわたって、神経の損傷と死亡のリスクをもたらす。クリグラー・ナジャー症候群の動物モデルにおける遺伝子欠損を修正するために、同様のＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物であるが、導入遺伝子としてビリルビンウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼまたはＵＧＴ１Ａ１の遺伝子を有するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物を使用した。図２６に示されているように、マウス肝細胞中のアルブミン遺伝子座中へのＵＧＴ１Ａ１の導入は、ビリルビンレベルの正常化およびＵＧＴ１Ａ１を欠損したマウスの２０日未満から少なくとも１年への長期生存をもたらした。このカテゴリーで探求することができるさらなる適応症としては、フェニルケトン尿症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症および糖原病１Ａ型が含まれる。
【０１４２】
［実施例１２］その他の肝臓指向性治療
肝臓に対する治療品候補の特異性は、使用されるＡＡＶキャプシドと宿主細胞のＤＮＡ中への組み込みの場所の両方によって決定される。ＬＢ−００１は、ヒト肝臓の形質導入に関して非常に効率的であるように設計されたＡＡＶキャプシド、ＬＫ０３を利用する。肝臓指向型治療品候補のための導入遺伝子を、アルブミン遺伝子が最も高度に発現される遺伝子である肝臓において意味のあるレベルでのみ産生されるアルブミン遺伝子座へと挿入した。活性転写は相同組換えの割合を高め、アルブミン遺伝子の組織特異的な発現は肝臓中での導入遺伝子の産生を促すので、アルブミンを選択することは肝臓特異性を高めると考えられる。
【０１４３】
［実施例１３］インビボタンパク質工場としての肝臓の使用
本実施例は、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）の調節的設計（modulatory  design）が肝臓の外で機能するタンパク質を産生するために適用できることを示す。
【０１４４】
肝臓は、循環中に見出される多くのタンパク質を産生する主要な分泌器官である。この属性により、肝細胞は遺伝的欠損を有する患者に重要な治療用タンパク質を送達することができる。例えば、これは、凝固不全を修正するためにヒト凝固第ＩＸ因子をコードするＬＢ−１０１のマウスＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物を使用して、血友病Ｂの動物モデルにおいて実証されている。このモデルでは、ヒト凝固第ＩＸ因子の発現と血液凝固は、新生仔および成体罹患マウスでの単回処置後に正常レベルまで回復した。
【０１４５】
さらに、図２７に示されているように、部分的な肝切除またはＰＨ後でさえ、ＬＢ−１０１のマウスＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物の投与後の新生仔野生型マウスにおいて安定した治療レベルのヒト第ＩＸ因子が２０週間持続した。ＰＨは、再生する臓器の成長を誘発するために肝臓の３分の２を除去する手順である。従来のＡＡＶ遺伝子治療を用いると、ＰＨ後の導入遺伝子の発現は大幅に低下する。
【０１４６】
［実施例１４］多臓器疾患
いくつかの遺伝子変異は、タンパク質の欠損と有害なタンパク質の過剰発現の両方をもたらし、病理発生に至る。このような疾患の１つがＡ１ＡＴＤである。Ａ１ＡＴＤでは、患者は循環Ａ１ＡＴが欠乏しており、重度の肝障害を発症することがあり、このため肝移植が必要になり得る。これは、ＡＡＴＤが、正常なコピーが存在する場合でさえ遺伝子の欠陥性コピーに症状が伴うドミナントネガティブな遺伝性疾患であるからである。ＡＡＴＤは、ＬＢ−２０１のマウスＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物を使用してマウスモデルにおいて修正された別の遺伝性疾患である。マウスモデルにおいて使用されたＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物は、遺伝子の正常なコピーの他に、有害な遺伝子の発現を低下させるように設計されたマイクロＲＮＡを含んだ。導入遺伝子の発現と変異遺伝子の下方調節が、これらのマウスにおいて、少なくとも８ヶ月間明瞭であった。
【０１４７】
［実施例１５］血友病Ｂマウスでの用量反応分析
本実施例は、マウスに異なる用量で第ＩＸ因子を組み込むためのＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）法の有効性を実証する。
【０１４８】
ＡＡＶ  ＤＪ血清型を使用して、強固な肝臓特異的マウスＡｌｂプロモーターからの組み込み後における発現のためにヒトＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬを標的とした。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、組み込みが肝細胞のごく一部においてのみ起こる場合でさえ、Ａｌｂプロモーターは高レベルの凝固因子産生を可能にするはずであること、およびＡｌｂ遺伝子座での高い転写活性は、相同組換えによる導入遺伝子の組み込みをより受けやすくするはずであることが推定された。
【０１４９】
ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）技術に基づくインビボ遺伝子ターゲティングアプローチを適用して、ＦＩＸ欠損マウスモデルにおいて、ヌクレアーゼを使用せずに、プロモーターレスバージョンの治療用ｃＤＮＡをアルブミン遺伝子座へと特異的に挿入した。ヒトのＦＩＸバリアントであるＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬ（ＦＩＸ−Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ｌ）を使用した。血友病Ｂマウスにおけるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の遺伝子送達は、ＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬがＦＩＸ−ＷＴより１５倍高い特異的凝固活性を有し、この活性がＦＩＸ−Ｔｒｉｐｌｅ（１０倍）またはＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ（６倍）より有意に優れていることを示した。より低いウイルス用量で、ＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬは、ＦＩＸ活性を治療量以下のレベルから治療レベルに改善した。生理学的条件下では、長期ＡＡＶ−ＦＩＸ処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、有害な血栓性事象の徴候は観察されなかった（Ｋａｏら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ２０１３）。
【０１５０】
材料および方法：
実験デザインの要約が表３に示されている。
【表３】
2021534816.tif 000008
【０１５１】
動物の取り扱い：動物は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）と実験動物管理評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）の両方で、動物管理のガイドラインに従って飼育し、取り扱った。実験手順は、イスラエル動物実験委員会によって審査され、承認された。マウスは、１２／１２時間の明暗サイクルで、標準的な食餌と水を自由に摂取できる温度管理された環境中で飼育した。
【０１５２】
プラスミド構築：マウスゲノムＡｌｂセグメント（ＮＣＢＩ参照配列の９０４７４００３−９０４７６７２０：ＮＣ＿００００７１．６）をＰＣＲ増幅し、ＡＡＶ２  ＩＴＲの間に、改変ｐＴＲＵＦ骨格内のＢＳＲＧＩおよびＳＰＥＩ制限部位へと挿入した。ゲノムセグメントは、Ａｌｂ終止コドンの１．３Ｋｂ上流および１．４Ｋｂ下流にまたがっている。次に、本発明者らは、ＢＰＵ１０Ｉ制限部位へと、リンカーコード配列（グリシン−セリン−グリシン）が前にありＮＨＥＩ制限部位が後に続く最適化されたＰ２Ａコード配列を挿入した。最後に、本発明者らは、コドン最適化された（ベクターＮＴＩ）ｈＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬ  ｃＤＮＡをＮＨＥＩ部位へと挿入して、ＤＪベクターの構築において役割を果たすＬＢ−Ｐｍ−０００５（ｐＡＡＶ−２８８）を得た。ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、最終的なｒＡＡＶ産生プラスミドを生成した。
【０１５３】
ＡＡＶの作製：ＣｓＣｌ精製法を用いて、ＡＡＶ−ＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬ（ＬＢ−Ｖｔ−０００１）ベクターロット番号１７０８２４（１．１３Ｅ１３総ｖｇ）を作製した。
【０１５４】
マウスの注射と採血：Ｆ９ｔｍ１Ｄｗｓノックアウトマウスをジャクソン研究所から購入し、新生仔期注射用の子孫を生産するための繁殖ペアとして使用した。２日齢のＦ９ｔｍ１Ｄｗｓノックアウト雄に、マウスあたり３ｅ１１、３ｅ１０、３ｅ９および１ｅ９ベクターゲノムのＡＡＶ−ｈＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬを腹腔内注射し、ＥＬＩＳＡおよび活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ＩＤＥＸＸ  Ｃｏａｇ  Ｄｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用）のために、後眼窩採血によって生後４週目に採血を開始した。１２週目にすべてのマウスを屠殺し、ＤＮＡ／タンパク質分析のために肝臓を採取した。
【０１５５】
血漿中のＦＩＸ測定：以下の抗体を用いて、ＦＩＸに対するＥＬＩＳＡを行った；１：５００のマウス抗ヒトＦＩＸ  ＩｇＧ一次抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｆ２６４５）および１：４，２００のポリクローナルヤギ抗ヒトＦＩＸペルオキシダーゼ結合ＩｇＧ二次抗体（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＧＡＦＩＸ−ＡＰＨＲＰ）。
【０１５６】
ＬＲ−ｑＰＣＲアッセイによるＡｌｂ遺伝子座標的化の割合の評価：相同性アームの外側でアニーリングするプライマーと組み込まれたＤＮＡに対するプライマーとを用いて、組み込まれたゲノムＡｌｂの増幅が、所望されないベクター増幅ではなく、実行された。ＬＲ−ＰＣＲアンプリコンは、ＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲ定量アッセイに対するテンプレートとしての役割を果たした。本発明者らは、基準の組み込まれた試料の標準曲線（ｃａｒｖｅ）によって組み込みレベルを最後に計算した。
【０１５７】
結果：
血友病Ｂ新生仔マウスの処置のために、マウスあたり３ｅ１１、３ｅ１０、３ｅ９および１ｅ９ベクターゲノム（ｖｇ）（ｋｇ当たり１．５ｅ１４、１．５ｅ１３、１．５ｅ１２および５ｅ１１）の、ヒトＦＩＸの超活性型バリアント；ＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬをコードするＡＡＶ−ＤＪ  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）ベクターを用いて、２日齢のＦ９ｔｍ１Ｄｗｓノックアウトマウスの腹腔内（ＩＰ）注射を行った。１．５Ｅ１２  ＶＧ／ｋｇという低い用量で、疾患の改善が実証された。活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ａＰＴＴ）によって、注射後４週目での凝固時間を測定した。処置されたＫＯマウスにおける活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）によって決定される機能的凝固は、野生型（ＷＴ）マウスのレベルと同様のレベルに回復した（図２８〜２９）。これらの結果は、オンターゲット組み込みに起因する高い治療的ｈＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬ発現レベルを実証する。
【０１５８】
考察：
１．５Ｅ１２  ｖｇ／ｋｇのｈＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬは、４週間後に血友病Ｂ新生仔の出血性素因を改善し、１２週間安定な状態を保つことが観察された。これは、ヌクレアーゼなしおよびベクター媒介プロモーターなしでのインビボ遺伝子ターゲティングに対する治療効果を実証する。ｒＡＡＶに対する開示されたプロモーターレスおよびヌクレアーゼフリー遺伝子ターゲティング戦略の好ましい安全性プロファイルのため、この戦略は、血友病およびその他の遺伝的欠損の状況での臨床的評価の主要な候補となる。より一般的には、この戦略は、治療効果が分泌されるタンパク質によって伝えられるときには常に、または標的化が選択的有利性を与えるときに適用することができる。
【０１５９】
［実施例１６］相同性アームにおけるハプロタイプミスマッチ
本実施例は、異なるベクターバッチを用いて、相同性アームにミスマッチを有するＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）の有効性および再現性を実証する。
【０１６０】
上に論述されているように、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）では、天然の誤りのない相同組換え（ＨＲ）によって、治療遺伝子のプロモーターレスコード配列をアルブミン遺伝子座へと向かわせる。治療遺伝子の発現は、２Ａペプチドを介した強固な肝臓のアルブミン発現と関連している。関連するヒトアルブミン遺伝子座には、集団の９５％をカバーする２つの主要なハプロタイプが存在する。これらのハプロタイプは、５’相同性アームに対応する配列中の５つのＳＮＰが相違する（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。
【０１６１】
ＡＡＶ  ＤＪ血清型を使用して、強固な肝臓特異的マウスＡｌｂプロモーターからの組み込み後、発現のためにヒトＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬを標的とした。野生型Ｃ５７ｂｌ／６マウスにおいて、ヌクレアーゼを使用せずに、プロモーターレス様式の治療用ｃＤＮＡをアルブミン遺伝子座中に特異的に挿入するために、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）技術を使用した。野生型ヒトＦＩＸバリアント、ＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬ（ＦＩＸ−Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ｌ）および相同性アームに６つのＳＮＰを有するハプロタイプミスマッチｈＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬを使用した。これらのハプロタイプは、５’相同性アームに対応する配列中の５つのＳＮＰおよび３’相同性アームに対応する配列中の１つのＳＮＰが相違する。
【０１６２】
材料および方法：
実験デザインの要約が表４に示されている。
【表４】
2021534816.tif 000009
【０１６３】
動物の取り扱い：動物は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）と実験動物管理評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）の両方で、動物管理のガイドラインに従って飼育し、取り扱った。実験手順は、イスラエル動物実験委員会によって審査され、承認された。マウスは、１２／１２時間の明暗サイクルで、標準的な食餌と水を自由に摂取できる温度管理された環境中で飼育した。
【０１６４】
プラスミド構築：マウスゲノムＡｌｂセグメント（ＮＣＢＩ参照配列の９０４７４００３−９０４７６７２０：ＮＣ＿００００７１．６）をＰＣＲ増幅し、ＡＡＶ２  ＩＴＲの間に、改変ｐＴＲＵＦ骨格内のＢＳＲＧＩおよびＳＰＥＩ制限部位へと挿入した。ゲノムセグメントは、Ａｌｂ終止コドンの１．３Ｋｂ上流および１．４Ｋｂ下流にまたがっている。次に、本発明者らは、ＢＰＵ１０Ｉ制限部位へと、リンカーコード配列（グリシン−セリン−グリシン）が前にありＮＨＥＩ制限部位が後に続く最適化されたＰ２Ａコード配列を挿入した。最後に、本発明者らは、コドン最適化された（ベクターＮＴＩ）ｈＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬ  ｃＤＮＡをＮＨＥＩ部位へと挿入して、ＤＪベクターの構築において役割を果たすＬＢ−Ｐｍ−０００５（ｐＡＡＶ−２８８）を得た。ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、最終的なｒＡＡＶ産生プラスミドを生成した。
【０１６５】
ＡＡＶの作製：ＡＡＶ−ＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬ（ＬＢ−Ｖｔ−０００１）ベクターロット＃１７１１０２は陽性対照として機能し、ＣｓＣｌ精製法を用いて、ハプロタイプミスマッチロット＃１７１１０２、１７１１１６、１７１１３０の３つの異なるベクターバッチを作製した。
【０１６６】
マウスの注射と採血：９週齢のＣ５７ｂｌ／６雌マウスに、マウスあたり１ｅ１２ベクターゲノムのミスマッチのないＡＡＶ−ｈＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬを腹腔内注射し、ＥＬＩＳＡによるタンパク質レベルの測定のために、注射の２、４、７および１０週後に、後眼窩採血により採血した。１０週目にすべてのマウスを屠殺し、ＤＮＡ組み込み率の分析のために肝臓を採取した。
【０１６７】
血漿中のＦＩＸ測定：以下の抗体を用いて、ＦＩＸに対するＥＬＩＳＡを行った；１：５００のマウス抗ヒトＦＩＸ  ＩｇＧ一次抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｆ２６４５）および１：４，２００のポリクローナルヤギ抗ヒトＦＩＸペルオキシダーゼ結合ＩｇＧ二次抗体（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＧＡＦＩＸ−ＡＰＨＲＰ）。
【０１６８】
ＬＲ−ｑＰＣＲアッセイによるＡｌｂ遺伝子座標的化の割合の評価：相同性アームの外側でアニーリングするプライマーと組み込まれたＤＮＡに対するプライマーとを用いて、組み込まれたゲノムＡｌｂの増幅が、所望されないベクター増幅ではなく、実行された。ＬＲ−ＰＣＲアンプリコンは、ＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲ定量アッセイに対するテンプレートとしての役割を果たした。本発明者らは、基準の組み込まれた試料の標準曲線（ｃａｒｖｅ）によって組み込みレベルを最後に計算した。
【０１６９】
結果：
Ｃ５７ｂｌ／６成体マウスの処置のために、マウス当たり１ｅ１２ベクターゲノム（ＶＧ）（Ｋｇ当たり５ｅ１３）のヒトＦＩＸの超活性型バリアント；ミスマッチのないＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬをコードするＡＡＶ−ＤＪ  ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）ベクターを用いて、９週齢のＣ５７ｂｌ／６マウスの静脈内（ＩＶ）注射を行った。類似の変異を持つ（ｂａｒｉｎｇ）合成マウスハプロタイプを有するベクターを設計し、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）はこのハプロタイプミスマッチによってほとんど影響を受けないことが明らかとなった。この観察は、１つのベクターデザインを患者のさまざまな集団に対して使用できることを裏付ける。独立かつ別個に作製された異なるベクター間に、高い一致性が見出された。１０週間にわたって、血漿中にｈＦＩＸタンパク質が安定に存在することが観察された。
【０１７０】
考察：
以前の結果は、１．５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの、ｈＦＩＸ−ＴｒｉｐｌｅＬバリアントをコードするＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）ベクターの成体または新生仔マウスへの単回注射後に、血友病Ｂマウスでの出血性素因の改善を実証した。本研究では、ミスマッチが一般的なヒトハプロタイプを模倣する場合、ベクター上の相同性アームと標的遺伝子座の間のミスマッチによってＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）の効率は低下しないことが示された。本研究は、強固で一貫性のあるベクター生産能力も実証した。ｒＡＡＶに対するプロモーターレスおよびヌクレアーゼフリー遺伝子ターゲティング戦略の好ましい有効性および安全性プロファイルのため、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）（商標）は、血友病およびその他の遺伝的欠損の状況での臨床評価の主要な候補となる。この治療効果は、すべての集団に適切であり得る１つのベクター設計によって達成することができる。
【０１７１】
［実施例１７］ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）技術に適用するためのキャプシド
本実施例は、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）技術の用途で使用することができる例示的なキャプシドを提供する。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）を使用した導入遺伝子発現のために使用することができる例示的なキャプシドには、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＬＫ０３およびＮＰ５９が含まれる。
【０１７２】
配列番号１は、ＡＡＶ−ＤＪのキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２は、ＡＡＶ−ＤＪのキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。ＡＡＶ−ＤＪに関するさらなる情報は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１２０５４２号に見出すことができる。
【０１７３】
配列番号５は、ＡＡＶ−ＬＫ０３のキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。配列番号６は、ＡＡＶ−ＬＫ０３のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。ＬＫ０３に関するさらなる情報は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第  ２０１３／０２９０３０号に見出すことができる。
【０１７４】
配列番号７は、ＡＡＶ−ＮＰ５９のキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。配列番号８は、ＡＡＶ−ＮＰ５９のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。ＮＰ５９に関するさらなる情報は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／１４３１００号に見出すことができる。
【０１７５】
［実施例１８］ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）プラットフォームの継続的な進化
構築物およびキャプシドの設計から商業規模での製造まで、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）プラットフォームの重要な側面は最適化することができる。
・ＡＡＶキャプシド。ＡＡＶキャプシドは、肝臓などの特定の標的組織にその内容物を送達するのに極めて効率的であるように設計されている。肝臓およびその他の適応症での臨床使用により適したキャプシドが同定されている。例えば、ＬＢ−００１中で使用されるＡＡＶキャプシドであるＬＫ０３は、肝臓選択的であるように開発された。
・相同性アームと組み込み部位。ゲノム編集技術は、１つの治療法のための相同性アームと組換え部位とを、同一の組織を標的とする他の治療法に適用することができるという潜在的な利点を有する。相同組換えの割合と遺伝子発現レベルの最適化から得られた洞察は、その後の製品候補に対して適用することができる。
・標的。標的となり得るものとして、肝臓内で通常発現される遺伝子に対応する標的、肝臓発現に関連する他の組織および中枢神経系または筋肉などのその他の組織で直接対処することが最適である標的が挙げられる。
・選択。ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）ゲノム編集技術の潜在的な利点は、染色体組み込みから生じるその持久性である。データは、遺伝子欠損の修正が選択的有利性を細胞に与え、導入遺伝子を含有する細胞の百分率の増大を促進し得る治療法が存在することを示す。導入遺伝子が細胞レベルで選択的有利性を与えない場合でさえ、処理された細胞に選択的有利性を与える方法も評価されている。このような方法の１つは、患者が外部作用物質（external  agent）で処置されたときに要素を組み込んでいない細胞が選択的に不利とならないように、ＧＥＮＥＲＩＤＥ（商標）構築物にその要素を追加することを必要とする。これらおよび関連する方法により、所望の遺伝子を含有する細胞の数を増やすことが可能となり、患者は長期的な治療的有用性を確実に得ることができる。
配列
配列番号１は、ＡＡＶ−ＤＪのキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLKTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTTNTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号２は、ＡＡＶ−ＤＪのキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttcttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctgtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtcccagaccctcaaccaatcggagaacctcccgcagccccctcaggtgtgggatctcttacaatggctgcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaagcaaatctccaacagcacatctggaggatcttcaaatgacaacgcctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgactttaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagagactcagcttcaagctcttcaacatccaggtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccaagaccatcgccaataacctcaccagcaccatccaggtgtttacggactcggagtaccagctgccgtacgttctcggctctgcccaccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtgttcatgattccccagtacggctacctaacactcaacaacggtagtcaggccgtgggacgctcctccttctactgcctggaatactttccttcgcagatgctgagaaccggcaacaacttccagtttacttacaccttcgaggacgtgcctttccacagcagctacgcccacagccagagcttggaccggctgatgaatcctctgattgaccagtacctgtactacttgtctcggactcaaacaacaggaggcacgacaaatacgcagactctgggcttcagccaaggtgggcctaatacaatggccaatcaggcaaagaactggctgccaggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagtttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctccgcctcagatcctgatcaagaacacgcctgtacctgcggatcctccgaccaccttcaaccagtcaaagctgaactctttcatcacccagtattctactggccaagtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaagcgctggaaccccgagatccagtacacctccaactactacaaatctacaagtgtggactttgctgttaatacagaaggcgtgtactctgaaccccgccccattggcacccgttacctcacccgtaatctgtaa
配列番号３は、ＡＡＶ−２のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNRGLTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号４は、ＡＡＶ−８のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号５は、ＡＡＶ−ＬＫ０３のキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
atggctgctgacggttatcttccagattggctcgaggacaacctttctgaaggcattcgagagtggtgggcgctgcaacctggagcccctaaacccaaggcaaatcaacaacatcaggacaacgctcggggtcttgtgcttccgggttacaaatacctcggacccggcaacggactcgacaagggggaacccgtcaacgcagcggacgcggcagccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggtgacaacccctacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttcttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctgtagatcagtctcctcaggaaccggactcatcatctggtgttggcaaatcgggcaaacagcctgccagaaaaagactaaatttcggtcagactggcgactcagagtcagtcccagaccctcaacctctcggagaaccaccagcagcccccacaagtttgggatctaatacaatggcttcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacgagggtgccgatggagtgggtaattcctcaggaaattggcattgcgattcccaatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcaccagaacctgggccctgcccacttacaacaaccatctctacaagcaaatctccagccaatcaggagcttcaaacgacaaccactactttggctacagcaccccttgggggtattttgactttaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcattaacaacaactggggattccggcccaagaaactcagcttcaagctcttcaacatccaagttaaagaggtcacgcagaacgatggcacgacgactattgccaataaccttaccagcacggttcaagtgtttacggactcggagtatcagctcccgtacgtgctcgggtcggcgcaccaaggctgtctcccgccgtttccagcggacgtcttcatggtccctcagtatggatacctcaccctgaacaacggaagtcaagcggtgggacgctcatccttttactgcctggagtacttcccttcgcagatgctaaggactggaaataacttccaattcagctataccttcgaggatgtaccttttcacagcagctacgctcacagccagagtttggatcgcttgatgaatcctcttattgatcagtatctgtactacctgaacagaacgcaaggaacaacctctggaacaaccaaccaatcacggctgctttttagccaggctgggcctcagtctatgtctttgcaggccagaaattggctacctgggccctgctaccggcaacagagactttcaaagactgctaacgacaacaacaacagtaactttccttggacagcggccagcaaatatcatctcaatggccgcgactcgctggtgaatccaggaccagctatggccagtcacaaggacgatgaagaaaaatttttccctatgcacggcaatctaatatttggcaaagaagggacaacggcaagtaacgcagaattagataatgtaatgattacggatgaagaagagattcgtaccaccaatcctgtggcaacagagcagtatggaactgtggcaaataacttgcagagctcaaatacagctcccacgactagaactgtcaatgatcagggggccttacctggcatggtgtggcaagatcgtgacgtgtaccttcaaggacctatctgggcaaagattcctcacacggatggacactttcatccttctcctctgatgggaggctttggactgaaacatccgcctcctcaaatcatgatcaaaaatactccggtaccggcaaatcctccgacgactttcagcccggccaagtttgcttcatttatcactcagtactccactggacaggtcagcgtggaaattgagtgggagctacagaaagaaaacagcaaacgttggaatccagagattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtagacactaatggtgtttatagtgaacctcgccccattggcacccgttaccttacccgtcccctgtaa
配列番号６は、ＡＡＶ−ＬＫ０３のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
配列番号７は、ＡＡＶ−ＮＰ５９のキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggcaagacaggccagcagcccgctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtcccagaccctcaacctctcggagaaccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccatctctacaagcaaatctccagccaatcaggagcttcaaacgacaaccactactttggctacagcaccccttgggggtattttgactttaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcattaacaacaactggggattccggcccaagaaactcagcttcaagctcttcaacatccaagttaaagaggtcacgcagaacgatggcacgacgactattgccaataaccttaccagcacggttcaagtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcgacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcagggacccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa
配列番号８は、ＡＡＶ−ＮＰ５９のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列である。
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVDTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号９は、ヒトメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｓｙｎＭＵＴ１）をコードする最適化されたヌクレオチド配列である。
atgctgagagccaaaaaccagctgttcctgctgagcccccactatctgagacaggtcaaagaaagttccgggagtagactgatccagcagagactgctgcaccagcagcagccactgcatcctgagtgggccgctctggccaagaaacagctgaagggcaaaaacccagaagacctgatctggcacactccagaggggatttcaatcaagcccctgtacagcaaaagggacactatggatctgccagaggaactgccaggagtgaagcctttcacccgcggaccttacccaactatgtatacctttcgaccctggacaattcggcagtacgccggcttcagtactgtggaggaatcaaacaagttttataaggacaacatcaaggctggacagcagggcctgagtgtggcattcgatctggccacacatcgcggctatgactcagataatcccagagtcaggggggacgtgggaatggcaggagtcgctatcgacacagtggaagatactaagattctgttcgatggaatccctctggagaaaatgtctgtgagtatgacaatgaacggcgctgtcattcccgtgctggcaaacttcatcgtcactggcgaggaacagggggtgcctaaggaaaaactgaccggcacaattcagaacgacatcctgaaggagttcatggtgcggaatacttacatttttccccctgaaccatccatgaaaatcattgccgatatcttcgagtacaccgctaagcacatgcccaagttcaactcaattagcatctccgggtatcatatgcaggaagcaggagccgacgctattctggagctggcttacaccctggcagatggcctggaatattctcgaaccggactgcaggcaggcctgacaatcgacgagttcgctcctagactgagtttcttttggggaattggcatgaacttttacatggagatcgccaagatgagggctggccggagactgtgggcacacctgatcgagaagatgttccagcctaagaactctaagagtctgctgctgcgggcccattgccagacatccggctggtctctgactgaacaggacccatataacaatattgtcagaaccgcaatcgaggcaatggcagccgtgttcggaggaacccagagcctgcacacaaactcctttgatgaggccctggggctgcctaccgtgaagtctgctaggattgcacgcaatacacagatcattatccaggaggaatccggaatcccaaaggtggccgatccctggggaggctcttacatgatggagtgcctgacaaacgacgtgtatgatgctgcactgaagctgattaatgaaatcgaggaaatggggggaatggcaaaggccgtggctgagggcattccaaaactgaggatcgaggaatgtgcagctaggcgccaggcacgaattgactcaggaagcgaagtgatcgtcggggtgaataagtaccagctggagaaagaagacgcagtcgaagtgctggccatcgataacacaagcgtgcgcaatcgacagattgagaagctgaagaaaatcaaaagctcccgcgatcaggcactggccgaacgatgcctggcagccctgactgagtgtgctgcaagcggggacggaaacattctggctctggcagtcgatgcctcccgggctagatgcactgtgggggaaatcaccgacgccctgaagaaagtcttcggagagcacaaggccaatgatcggatggtgagcggcgcttatagacaggagttcggggaatctaaagagattaccagtgccatcaagagggtgcacaagttcatggagagagaagggcgacggcccaggctgctggtggcaaagatgggacaggacggacatgatcgcggagcaaaagtcattgccaccgggttcgctgacctgggatttgacgtggatatcggccctctgttccagacaccacgagaggtcgcacagcaggcagtcgacgctgatgtgcacgcagtcggagtgtccactctggcagctggccataagaccctggtgcctgaactgatcaaagagctgaactctctgggcagaccagacatcctggtcatgtgcggcggcgtgatcccaccccaggattacgaattcctgtttgaggtcggggtgagcaacgtgttcggaccaggaaccaggatccctaaggccgcagtgcaggtcctggatgatattgaaaagtgtctggaaaagaaacagcagtcagtgtaa
配列番号１０は、ヒトメチルマロニル−ＣｏＡムターゼの天然に存在する（ｗｔ）アミノ酸配列である。
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配列番号１１は、天然に存在する（ｗｔ）ヌクレオチド配列であるヒトメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ遺伝子（ｗｔＭＵＴ）である。
atgttaagagctaagaatcagctttttttactttcacctcattacctgaggcaggtaaaagaatcatcaggctccaggctcatacagcaacgacttctacaccagcaacagccccttcacccagaatgggctgccctggctaaaaagcagctgaaaggcaaaaacccagaagacctaatatggcacaccccggaagggatctctataaaacccttgtattccaagagagatactatggacttacctgaagaacttccaggagtgaagccattcacacgtggaccatatcctaccatgtatacctttaggccctggaccatccgccagtatgctggttttagtactgtggaagaaagcaataagttctataaggacaacattaaggctggtcagcagggattatcagttgcctttgatctggcgacacatcgtggctatgattcagacaaccctcgagttcgtggtgatgttggaatggctggagttgctattgacactgtggaagataccaaaattctttttgatggaattcctttagaaaaaatgtcagtttccatgactatgaatggagcagttattccagttcttgcaaattttatagtaactggagaagaacaaggtgtacctaaagagaagcttactggtaccatccaaaatgatatactaaaggaatttatggttcgaaatacatacatttttcctccagaaccatccatgaaaattattgctgacatatttgaatatacagcaaagcacatgccaaaatttaattcaatttcaattagtggataccatatgcaggaagcaggggctgatgccattctggagctggcctatactttagcagatggattggagtactctagaactggactccaggctggcctgacaattgatgaatttgcaccaaggttgtctttcttctggggaattggaatgaatttctatatggaaatagcaaagatgagagctggtagaagactctgggctcacttaatagagaaaatgtttcagcctaaaaactcaaaatctcttcttctaagagcacactgtcagacatctggatggtcacttactgagcaggatccctacaataatattgtccgtactgcaatagaagcaatggcagcagtatttggagggactcagtctttgcacacaaattcttttgatgaagctttgggtttgccaactgtgaaaagtgctcgaattgccaggaacacacaaatcatcattcaagaagaatctgggattcccaaagtggctgatccttggggaggttcttacatgatggaatgtctcacaaatgatgtttatgatgctgctttaaagctcattaatgaaattgaagaaatgggtggaatggccaaagctgtagctgagggaatacctaaacttcgaattgaagaatgtgctgcccgaagacaagctagaatagattctggttctgaagtaattgttggagtaaataagtaccagttggaaaaagaagacgctgtagaagttctggcaattgataatacttcagtgcgaaacaggcagattgaaaaacttaagaagatcaaatccagcagggatcaagctttggctgaacgttgtcttgctgcactaaccgaatgtgctgctagcggagatggaaatatcctggctcttgcagtggatgcatctcgggcaagatgtacagtgggagaaatcacagatgccctgaaaaaggtatttggtgaacataaagcgaatgatcgaatggtgagtggagcatatcgccaggaatttggagaaagtaaagagataacatctgctatcaagagggttcataaattcatggaacgtgaaggtcgcagacctcgtcttcttgtagcaaaaatgggacaagatggccatgacagaggagcaaaagttattgctacaggatttgctgatcttggttttgatgtggacataggccctcttttccagactcctcgtgaagtggcccagcaggctgtggatgcggatgtgcatgctgtgggcataagcaccctcgctgctggtcataaaaccctagttcctgaactcatcaaagaacttaactcccttggacggccagatattcttgtcatgtgtggaggggtgataccacctcaggattatgaatttctgtttgaagttggtgtttccaatgtatttggtcctgggactcgaattccaaaggctgccgttcaggtgcttgatgatattgagaagtgtttggaaaagaagcagcaatctgtataa
配列番号１２は、ヒトメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｓｙｎＭＵＴ２）をコードする最適化されたヌクレオチド配列である。
atgctgcgagcgaaaaatcagctttttctgttgagcccacactacctgaggcaggttaaagaatccagcgggagccggctgattcagcagcgactgctccaccagcagcagcctttgcatcccgaatgggctgctttggcgaagaagcagctcaaggggaagaaccctgaagatcttatttggcacaccccagagggcatcagcatcaagcctttgtattccaaaagggacaccatggatctgcctgaagaattgcccggggtcaaaccattcacacgggggccatatccaaccatgtacaccttccggccatggactatcagacagtatgcaggctttagcactgtcgaggaatccaataagttctataaagacaatatcaaagctggccagcaaggtctgtccgtggcattcgatctggctacacatagaggttatgattctgacaatccaagagtacggggagacgtcggaatggcgggagttgccattgacacagtggaggacaccaagatacttttcgatgggattccattggagaaaatgtctgtgtcaatgacgatgaacggcgctgtgattcccgttttggcgaacttcatcgtcaccggggaagagcagggcgtcccgaaggaaaagctcaccgggacaatccaaaacgacattcttaaagaattcatggtgagaaatacctacatctttcctcctgagccttccatgaagatcatcgcggacatctttgaatacacggctaaacacatgcctaaatttaactcaatcagcataagcgggtaccacatgcaggaggccggcgctgacgctatacttgagctcgcatataccctggcagatggactggaatactcaaggaccgggctccaggctggactgacaatcgacgagtttgccccccgactcagttttttctggggtatcgggatgaatttctacatggagatagcgaagatgagggcgggcagacggctttgggcgcatctgatcgagaaaatgttccagcccaagaattcaaagagtctgctgctgagagcccactgccagacctcaggctggagcctgactgaacaggacccatacaacaacattgttagaaccgccatcgaggcgatggcagcggttttcggtgggacacagtcattgcacactaactcatttgacgaagccctcggtctgcctaccgtgaagtcagctcggatcgctaggaacacacagatcatcatccaggaggagagtggcatcccaaaagtcgccgatccttggggaggaagttacatgatggaatgcctcacgaatgacgtatacgatgccgcactcaagctgattaacgagatcgaggaaatgggaggcatggcaaaagctgtcgccgagggcattccaaagctgcgcatagaggagtgtgccgcccgaagacaggcccgcattgactccggctctgaggtgatagtgggcgttaataaatatcagctagagaaggaagacgccgtcgaagttctggcgatagataatacctctgtgcgaaatagacagattgagaaactgaagaagatcaagtcaagccgagaccaggccttggccgagaggtgtctggcagccctcactgagtgcgcggcatctggggacggcaacatattggcacttgccgtcgatgcctccagggcccgatgtacggtcggcgaaattaccgatgccctcaagaaggtttttggcgagcacaaggctaacgacaggatggttagtggagcatacagacaggagtttggcgaaagcaaggaaattacttccgcgattaaaagagtgcacaaattcatggaacgggagggtaggcgaccgaggctcctcgttgccaaaatgggtcaggacggccacgaccggggcgccaaggttatcgctaccggtttcgctgacctgggcttcgatgtggatatcggaccactgtttcaaacccccagagaagttgcccaacaagccgttgacgctgacgtacacgctgtaggcatctccactctcgccgccgggcataagactctcgtcccagagctgataaaggagcttaacagcctcggaagacccgacatcctggttatgtgcggtggagtgattccgccgcaggattacgaattcctcttcgaagtaggagtgtcaaacgtgttcggcccaggcactcggatacccaaggctgccgttcaggtgcttgacgacattgaaaaatgtctggagaagaagcaacaatctgtataa
配列番号１３は、ヒトメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ｓｙｎＭＵＴ３）をコードする最適化されたヌクレオチド配列である。
atgttgagggctaaaaaccagctctttctgttgagtccacactaccttaggcaagtgaaggaatctagcggtagcaggctgatccagcagcgcctgctgcaccagcagcagcccctgcaccctgagtgggctgcattggcaaagaaacaactgaagggtaaaaatcctgaagatctgatttggcacacaccggaggggatttccataaaacctctctactctaaacgcgatactatggatctgcccgaggaattgccaggagtgaaaccctttacaagggggccctaccccactatgtacacgttcagaccctggactatacgccagtatgccggattttctaccgttgaggaatccaacaagttttataaggacaacatcaaagccgggcagcagggactgtcagtggcatttgatctcgccacccaccgcgggtacgactccgacaacccaagagtccgcggtgacgtcggcatggcaggggttgccattgacacagtagaggatactaaaattttgtttgatgggatccccctagagaagatgtccgtgtctatgacgatgaacggcgcggtaatcccagtgcttgccaacttcatagtcacaggggaagagcagggcgtaccaaaggagaagctcacaggaacaatccaaaatgacattctgaaggaattcatggtgagaaatacttatatctttcctcccgagccctctatgaagattattgccgacatttttgaatacaccgcaaaacatatgcccaagttcaattccatatctattagtggataccacatgcaagaagctggggctgatgcaatacttgagcttgcctacaccctggccgacggactggagtattctcgcactggcctgcaagccgggctgacaattgacgagttcgccccacgccttagcttcttctggggcatcggcatgaatttctatatggagatcgcaaagatgagagcagggcggcgcttgtgggcccatctgatcgaaaagatgtttcagcctaagaatagtaagagcctgctcctgcgggctcactgtcagacgtcaggctggagcctcacagagcaggatccttacaataacatcgtccggactgctattgaggcgatggctgcagtattcggaggaacacaaagcctgcacactaattctttcgatgaggctttggggctccctaccgtgaagtcagccagaattgcaagaaacacccaaataatcatccaagaagaatcagggatcccaaaagttgccgacccctggggaggaagttatatgatggagtgcctgaccaatgacgtctacgacgccgctttgaagctgattaacgagattgaagagatgggcggaatggccaaggcggtcgctgagggcattccgaaactgcgcatagaggagtgtgctgctcgcaggcaggccagaattgattccggttccgaagtgatcgtgggggttaataagtatcaactggaaaaagaggacgctgtcgaagtcctcgcaatcgataataccagcgttagaaaccgacaaattgagaagctgaaaaagatcaaaagttcaagggaccaggccttggctgagcggtgtctcgccgcactgaccgaatgtgccgccagcggcgatggtaacatcctcgccctcgctgtggacgcttccagagcccggtgcaccgtgggcgaaattacggacgcgctgaaaaaagtctttggcgaacacaaggccaatgatagaatggtgagtggcgcctataggcaggagttcggcgagagtaaagaaataacatccgccatcaagagggtccacaaatttatggagcgggaaggacgcagacctagacttctcgtggccaaaatgggtcaggacggtcatgaccggggagccaaagtcatcgcaacgggcttcgccgatttggggtttgacgtggatatcggtcccttgtttcaaacccccagggaggtggctcagcaggctgtggacgctgacgtccacgcagtgggcatttctacactggcagccgggcacaagacgttggtgccagaactgatcaaagagttgaacagcctgggacgccctgacatcctggtaatgtgcggtggggtaatccccccccaagactacgagttccttttcgaagtgggtgtttctaacgtgttcggacctggaacaagaatccctaaggcggcagtgcaggtgcttgacgatatcgagaagtgcctggagaaaaagcaacaatccgtttaa
配列番号１４は、ヒトメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ｓｙｎＭＵＴ４）をコードする最適化されたヌクレオチド配列である。
atgcttcgcgccaagaaccaactgttcctgctgtccccccactacctccgacaagtcaaggagagctcgggaagccgcctgattcagcagcggctgctgcaccagcagcagcccctgcatccggaatgggcagcgttggcaaagaagcagctgaagggaaagaaccctgaggacctgatctggcacaccccggagggaatctcgatcaagccactgtactccaaaagggacaccatggacttgcctgaagaacttccgggcgtgaagccttttacccgggggccatacccaacaatgtacactttccgcccctggaccatcagacagtacgccggtttctccaccgtcgaagaatccaacaagttctataaggacaacatcaaggccgggcagcagggactgagcgtcgcgtttgacctggcaacccatcgcggctacgactccgacaaccctcgcgtgcggggggacgtgggaatggccggagtggctatcgacaccgtggaggacaccaagattctcttcgacggaatcccgctggaaaagatgtcggtgtccatgaccatgaatggcgccgtgatcccggtgctcgcgaacttcatcgtgacgggagaggaacagggagtgccgaaagagaagctgaccgggactattcagaatgacatcctcaaggagttcatggtccgcaacacttacattttccctcctgaaccctcgatgaagatcatcgctgacatcttcgagtacaccgcgaagcacatgccgaagttcaactcgatctccatctcgggctaccacatgcaggaggccggggccgacgccattctcgaactggcgtacactctggcggatggtctggaatactcacgcaccggactgcaggccggactgacaatcgacgagttcgccccgaggctgtccttcttctggggcattgggatgaacttctatatggaaatcgcgaagatgagagctggaaggcggctgtgggcgcacctgatcgagaagatgttccagcccaagaacagcaaaagccttctcctccgcgcccactgccaaacttccggctggtcactgaccgagcaggatccgtacaacaacattgtccggactgccattgaggccatggccgctgtgttcggaggcactcagtccctccacactaactccttcgacgaggccctgggtctgccgaccgtgaagtccgcccggatagccagaaatactcaaatcattatccaggaggaaagcggaatccccaaggtcgccgacccttggggaggatcttacatgatggagtgtttgaccaatgacgtctacgacgccgccctgaagctcattaacgaaatcgaagagatgggcggaatggccaaggccgtggctgagggcatcccgaagctgagaatcgaggaatgcgccgcccggagacaggcccgcattgatagcggcagcgaggtcattgtgggcgtgaacaagtaccagcttgaaaaggaggacgccgtggaagtgctggcaatcgataacacctccgtgcgcaaccggcagatcgaaaagctcaagaagattaagtcctcacgggaccaggcactggcggagagatgcctcgccgcgctgaccgaatgcgctgcctcgggagatggcaacattctggccctggcagtggacgcctctcgggctcggtgcactgtgggggagatcaccgacgccctcaagaaagtgttcggtgaacataaggccaacgaccggatggtgtccggagcgtaccgccaggaatttggcgaatcaaaggaaatcacgtccgcaatcaagagggtgcacaaattcatggaacgggagggcagacggcccagactgctcgtggctaaaatgggacaagatggtcacgaccgcggcgccaaggtcatcgcgactggcttcgccgatctcggattcgacgtggacatcggacctctgtttcaaactccccgggaagtggcccagcaggccgtggacgcggacgtgcatgccgtcgggatctcaaccctggcggccggccataagaccctggtgccggaactgatcaaggagctgaactcgctcggccgccccgacatcctcgtgatgtgtggcggagtgattccgccacaagactacgagttcctgttcgaagtcggggtgtccaacgtgttcggtcccggaaccagaatcccgaaggctgcggtccaagtgctggatgatattgagaagtgccttgagaaaaagcaacagtcagtgtga
配列番号１６は、マウス中でＭｕｔを発現するための構築物をコードするヌクレオチド配列である。これは、ＬＢ−００１のマウス配列である。配列の成分には、以下のものが含まれる。ＩＴＲ（逆位末端配列）；相同性アーム；Ｐ２Ａ；およびＳｙｎＭｕｔ。
【化１】
2021534816.tif 000010
【化２】
2021534816.tif 000011
【化３】
2021534816.tif 000012
【図１】
2021534816.tif 000013
【図２】
2021534816.tif 000014
【図３】
2021534816.tif 000015
【図４】
2021534816.tif 000016
【図５】
2021534816.tif 000017
【図６】
2021534816.tif 000018
【図７Ａ】
2021534816.tif 000019
【図７Ｂ−１】
2021534816.tif 000020
【図７Ｂ−２】
2021534816.tif 000021
【図７Ｂ−３】
2021534816.tif 000022
【図７Ｂ−４】
2021534816.tif 000023
【図７Ｂ−５】
2021534816.tif 000024
【図７Ｂ−６】
2021534816.tif 000025
【図７Ｂ−７】
2021534816.tif 000026
【図７Ｂ−８】
2021534816.tif 000027
【図７Ｂ−９】
2021534816.tif 000028
【図７Ｂ−１０】
2021534816.tif 000029
【図７Ｂ−１１】
2021534816.tif 000030
【図７Ｂ−１２】
2021534816.tif 000031
【図７Ｂ−１３】
2021534816.tif 000032
【図７Ｂ−１４】
2021534816.tif 000033
【図７Ｂ−１５】
2021534816.tif 000034
【図７Ｂ−１６】
2021534816.tif 000035
【図７Ｂ−１７】
2021534816.tif 000036
【図８】
2021534816.tif 000037
【図９】
2021534816.tif 000038
【図１０】
2021534816.tif 000039
【図１１】
2021534816.tif 000040
【図１２】
2021534816.tif 000041
【図１３】
2021534816.tif 000042
【図１４】
2021534816.tif 000043
【図１５】
2021534816.tif 000044
【図１６】
2021534816.tif 000045
【図１７】
2021534816.tif 000046
【図１８】
2021534816.tif 000047
【図１９】
2021534816.tif 000048
【図２０】
2021534816.tif 000049
【図２１】
2021534816.tif 000050
【図２２】
2021534816.tif 000051
【図２３】
2021534816.tif 000052
【図２４】
2021534816.tif 000053
【図２５】
2021534816.tif 000054
【図２６】
2021534816.tif 000055
【図２７】
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【図２８】
2021534816.tif 000057
【図２９】
2021534816.tif 000058
【図３０】
2021534816.tif 000059
【図３１】
2021534816.tif 000060
【図３２】
2021534816.tif 000061
【配列表】
2021534816000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年10月29日(2021.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中の組織内の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に導入遺伝子を組み込むための組成物であって、
前記組成物は、前記組織内の細胞が遺伝子産物によってコードされる機能的タンパク質を発現することができない対象に投与されることを特徴とし、前記組成物は、前記機能的タンパク質をコードする導入遺伝子を送達し、ここで、
前記組成物が、ポリヌクレオチドカセットであって、
第１の核酸配列および第２の核酸配列と（ここで、前記第１の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する）、
前記ポリヌクレオチドに対して５’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して３’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、
を含むポリヌクレオチドカセットを含み、
前記組成物の投与後に、前記細胞の前記集団の前記ゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれる、組成物。
【請求項２】
前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組換えウイルスベクターが、ＬＫ０３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＬＫ０３またはＡＡＶＮＰ５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記導入遺伝子がＭＵＴ導入遺伝子である、またはＭＵＴ導入遺伝子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組織が肝臓である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記第２の核酸配列が、
ａ）２Ａペプチド；
ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
ｃ）Ｎ末端インテインスプライシング領域およびＣ末端インテインスプライシング領域；または
ｄ）スプライスドナーおよびスプライスアクセプター；
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＭＵＴ導入遺伝子が、ｗｔヒトＭＵＴ、コドン最適化されたＭＵＴ、合成ＭＵＴ、ＭＵＴバリアント、ＭＵＴ変異体またはＭＵＴ断片である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に導入遺伝子を組み込むための組換えウイルスベクターを含む組成物であって、前記組換えウイルスベクターは、
（ｉ）第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドカセットであって、前記第１の核酸配列がＭＵＴ導入遺伝子を含み、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドカセットと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドカセットベクターに対して５’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、
（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドカセットウイルスベクターの３’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、
を含み、
前記ウイルスベクターが、ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシドを含む、組成物。
【請求項１２】
前記第３および第４の核酸が独立して８００〜１，２００ヌクレオチドである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組換えウイルスベクターが、ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記２つの独立した遺伝子産物が、前記ＭＵＴ導入遺伝子から発現されるＭＵＴタンパク質および内因性アルブミン遺伝子から発現される内因性アルブミンタンパク質である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞が肝細胞である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第２の核酸配列が、
ａ）２Ａペプチド；
ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
ｃ）Ｎ末端インテインスプライシング領域およびＣ末端インテインスプライシング領域；または
ｄ）スプライスドナーとスプライスアクセプター；
を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＭＵＴ導入遺伝子が、ｗｔヒトＭＵＴ、コドン最適化されたＭＵＴ、合成ＭＵＴ、ＭＵＴバリアント、ＭＵＴ変異体またはＭＵＴ断片である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に導入遺伝子を組み込むための組換えウイルスベクターを含む組成物であって、前記組換えウイルスベクターは、
（ｉ）第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドカセットであって、前記第１の核酸配列がＭＵＴ導入遺伝子を含み、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置し、かつＰ２Ａペプチドをコードする配列を含む、ポリヌクレオチドカセットと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドカセットベクターに対して５’側に位置し、前記細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む、長さ１０００ｎｔの第３の核酸配列と、
（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドカセットベクターの３’側に位置し、前記細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子の３’側のゲノム配列と実質的に相同である、長さ１０００ｎｔの配列を含む第４の核酸配列と、
を含み、
前記ウイルスベクターが、ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシドを含む、組成物。
【請求項２０】
前記ベクターが、配列番号１５の核酸配列を含む、請求項１９に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明で明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態を示しているが、限定ではなく例示としてのみ与えられていることを理解すべきである  本発明の範囲内での様々な変更および改変は、詳細な説明から当業者に明らかになる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
対象中の組織内の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に導入遺伝子を組み込む方法であって、
前記組織内の細胞が遺伝子産物によってコードされる機能的タンパク質を発現することができない対象に、前記機能的タンパク質をコードする導入遺伝子を送達する組成物を投与することを含み、ここで、
前記組成物が、ポリヌクレオチドカセットであって、
第１の核酸配列および第２の核酸配列と（ここで、前記第１の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する）、
前記ポリヌクレオチドに対して５’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して３’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、
を含むポリヌクレオチドカセットを含み、
前記組成物を投与した後に、前記細胞の前記集団の前記ゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれる、方法。
（項目２）
前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記組換えウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記組換えウイルスベクターが、ＬＫ０３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＬＫ０３またはＡＡＶＮＰ５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記導入遺伝子がＭＵＴ導入遺伝子である、またはＭＵＴ導入遺伝子を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記組成物がＡＡＶ２  ＩＴＲ配列をさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記組織が肝臓である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記第２の核酸配列が、
ａ）２Ａペプチド；
ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
ｃ）Ｎ末端インテインスプライシング領域およびＣ末端インテインスプライシング領域；または
ｄ）スプライスドナーおよびスプライスアクセプター；
を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記第３および第４の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第２の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ３’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ５’側にポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＭＵＴ導入遺伝子が、ｗｔヒトＭＵＴ、コドン最適化されたＭＵＴ、合成ＭＵＴ、ＭＵＴバリアント、ＭＵＴ変異体またはＭＵＴ断片である、項目６に記載の方法。
（項目１７）
ある期間にわたって組織中の導入遺伝子の発現のレベルを増加させる方法であって、
それを必要とする対象に、前記対象の前記組織中の細胞の少なくとも一集団のゲノム中に組み込む導入遺伝子を送達する組成物を投与することを含み、
前記組成物が、
第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第１の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置しており、前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に組み込まれると、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドと、
前記ポリヌクレオチドに対して５’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して３’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、
を含み、
前記組成物を投与した後に、細胞の前記集団のゲノム中に、前記導入遺伝子が組み込まれ、前記組織中の前記導入遺伝子の発現の前記レベルがある期間にわたって増加する、方法。
（項目１８）
前記導入遺伝子の前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
発現の前記レベルの増加が、前記導入遺伝子を発現する前記組織中の細胞のパーセントの増加を含む、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、項目１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記組換えウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記組換えウイルスベクターが、ＬＫ０３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＬＫ０３またはＡＡＶＮＰ５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記導入遺伝子がＭＵＴ導入遺伝子である、またはＭＵＴ導入遺伝子を含む、項目１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記組成物がＡＡＶ２  ＩＴＲ配列をさらに含む、項目１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、項目１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、項目１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記組織が肝臓である、項目１７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記第２の核酸配列が、
ａ）２Ａペプチド；
ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
ｃ）Ｎ末端インテインスプライシング領域およびＣ末端インテインスプライシング領域；または
ｄ）スプライスドナーとスプライスアクセプター；
を含む、項目１７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記第３および第４の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第２の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、項目１７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ３’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ５’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ＭＵＴ導入遺伝子が、ｗｔヒトＭＵＴ、コドン最適化されたＭＵＴ、合成ＭＵＴ、ＭＵＴバリアント、ＭＵＴ変異体またはＭＵＴ断片である、項目２３に記載の方法。
（項目３４）
細胞のゲノム中の標的組み込み部位中に導入遺伝子を組み込むための組換えウイルスベクターであって、
（ｉ）第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドカセットであって、前記第１の核酸配列がＭＵＴ導入遺伝子を含み、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドカセットと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドカセットベクターに対して５’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、
（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドカセットウイルスベクターの３’側に位置し、前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列と実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、
を含み、
前記ウイルスベクターが、ＬＫ０３  ＡＡＶキャプシドを含む、組換えウイルスベクター。
（項目３５）
前記第３の核酸が８００〜１，２００ヌクレオチドである、項目３４に記載の組換えウイルスベクター。
（項目３６）
前記第４の核酸が８００〜１，２００ヌクレオチドである、項目３４または項目３５に記載の組換えウイルスベクター。
（項目３７）
前記組換えウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、項目３４〜３６のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
（項目３８）
前記組換えウイルスベクターが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＬＫ０３またはＡＡＶ−ＮＰ５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、項目３７に記載の組換えウイルスベクター。
（項目３９）
ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列をさらに含む、項目３４〜３８のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
（項目４０）
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、項目３４〜３９のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
（項目４１）
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記ＭＵＴ導入遺伝子が前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、項目３４〜４０のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
（項目４２）
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、項目４１のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
（項目４３）
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記ＭＵＴ導入遺伝子が、内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、項目４１に記載の組換えウイルスベクター。
（項目４４）
前記２つの独立した遺伝子産物が、前記ＭＵＴ導入遺伝子から発現されるＭＵＴタンパク質および内因性アルブミン遺伝子から発現される内因性アルブミンタンパク質である、項目３４〜４３のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
（項目４５）
前記細胞が肝細胞である、項目３４〜４４のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
（項目４６）
前記第２の核酸配列が、
ａ）２Ａペプチド；
ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
ｃ）Ｎ末端インテインスプライシング領域およびＣ末端インテインスプライシング領域；または
ｄ）スプライスドナーとスプライスアクセプター；
を含む、項目３４〜４５のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
（項目４７）
前記第３および第４の核酸配列が、前記ＭＵＴ導入遺伝子および前記第２の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、項目３４〜４６のいずれかに記載の組換えウイルスベクター。
（項目４８）
前記第３および第４の核酸配列が、前記内因性アルブミンプロモーターおよび前記内因性アルブミン遺伝子とインフレームに、前記ＭＵＴ導入遺伝子および前記第２の核酸配列を内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、項目４７に記載の組換えウイルスベクター。
（項目４９）
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ３’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ５’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、項目４７または項目４８に記載の組換えウイルスベクター。
（項目５０）
前記ＭＵＴ導入遺伝子が、ｗｔヒトＭＵＴ、コドン最適化されたＭＵＴ、合成ＭＵＴ、ＭＵＴバリアント、ＭＵＴ変異体またはＭＵＴ断片である、項目３４〜４９のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
（項目５１）
対象の組織中の細胞に、投与前には前記細胞によって機能的に発現されていない関心対象の産物をコードする導入遺伝子を送達する組成物の用量を前記対象に投与するステップを含む方法であって、前記導入遺伝子が、（ｉ）前記関心対象の産物をコードし、（ｉｉ）複数の前記細胞のゲノム中の標的組み込み部位に組み込み、（ｉｉｉ）組み込まれると、前記関心対象の産物を機能的に発現し、（ｉｖ）時間の経過につれて、前記組織が、他の方法では同等の投与によって達成されるものより高いことが決定されている前記関心対象の産物の機能的発現のレベルを達成するように、前記組織中の他の細胞と比べて選択的有利性を前記複数の細胞に付与し、その中に前記導入遺伝子が組み込まれた前記細胞が、前記投与するステップ前に、前記関心対象の産物を機能的に発現し、
前記組成物が、
第１の核酸配列および第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第１の核酸配列が前記導入遺伝子をコードし、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列に対して５’側または３’側に位置しており、前記導入遺伝子が前記標的組み込み部位に組み込まれたときに、２つの独立した遺伝子産物の産生を促進する、ポリヌクレオチドと、
前記ポリヌクレオチドに対して５’側に位置し、前記標的組み込み部位の５’側のゲノム配列に実質的に相同である配列を含む第３の核酸配列と、
前記ポリヌクレオチドに対して３’側に位置し、前記標的組み込み部位の３’側のゲノム配列に実質的に相同である配列を含む第４の核酸配列と、
を含む、方法。
（項目５２）
前記導入遺伝子の前記組み込みがヌクレアーゼ活性を含まない、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記選択的有利性が、前記導入遺伝子を発現する前記組織中の細胞のパーセント増加を含む、項目５１または５２に記載の方法。
（項目５４）
前記組成物が組換えウイルスベクターを含む、項目５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記組換えウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記組換えウイルスベクターが、ＬＫ０３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＬＫ０３またはＡＡＶＮＰ５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質である、または前記キャプシドタンパク質を含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記導入遺伝子がＭＵＴ導入遺伝子である、またはＭＵＴ導入遺伝子を含む、項目５１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記組成物がＡＡＶ２  ＩＴＲ配列をさらに含む、項目５１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記ポリヌクレオチドカセットがプロモーター配列を含まない、項目５１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記ポリヌクレオチドカセットが前記細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記標的組み込み部位において内因性プロモーターの制御下で発現される、項目５１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記標的組み込み部位が、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含むアルブミン遺伝子座である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ポリヌクレオチドカセットが細胞のゲノム中の前記標的組み込み部位中に組み込まれると、前記導入遺伝子が、前記内因性アルブミン遺伝子発現を破壊することなく、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記組織が肝臓である、項目５１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記第２の核酸配列が、
ａ）２Ａペプチド；
ｂ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
ｃ）Ｎ末端インテインスプライシング領域およびＣ末端インテインスプライシング領域；または
ｄ）スプライスドナーとスプライスアクセプター；
を含む、項目５１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記第３および第４の核酸配列が、前記導入遺伝子および前記第２の核酸配列を、内因性アルブミンプロモーターと内因性アルブミン遺伝子とを含む内因性アルブミン遺伝子座中に組み込む相同性アームである、項目５１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記相同性アームが、前記内因性アルブミン遺伝子の開始コドンのすぐ３’側にまたは前記内因性アルブミン遺伝子の停止コドンのすぐ５’側に前記ポリヌクレオチドカセットの組み込みを指示する、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記ＭＵＴ導入遺伝子が、ｗｔヒトＭＵＴ、コドン最適化されたＭＵＴ、合成ＭＵＴ、ＭＵＴバリアント、ＭＵＴ変異体またはＭＵＴ断片である、項目５７に記載の方法。
【国際調査報告】
2021534816.tif 000062
2021534816.tif 000063
2021534816.tif 000064