(57)【要約】  腫瘍ホーミングペプチドが環化して、ヒ素含有抗癌剤が得られるように、2個のシステイン残基を、その間のヒ素原子と共に、有するか、又はこれを呈するように修飾された腫瘍ホーミングペプチドを含む抗癌剤が提供される。これは、所与の癌の治療に適した腫瘍ホーミングペプチドの選択を可能にし、それにより、後続の薬剤では、腫瘍微小環境へのヒ素の更に標的化された送達が可能になる。
2021509394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2個のシステイン残基に結合したヒ素原子を有する環化腫瘍ホーミングペプチドを含む、抗癌剤。
【請求項２】
腫瘍ホーミングペプチドの2個のヒ素結合システイン残基が、20個未満のアミノ酸残基により分離される、請求項1に記載の抗癌剤。
【請求項３】
環化前、ヒ素原子を結合している2個のシステイン残基の少なくとも1つが腫瘍ホーミングペプチドの末端残基である、請求項1又は2に記載の抗癌剤。
【請求項４】
環化前、ヒ素原子に結合している2個のシステイン残基が、腫瘍ホーミングペプチドの各N末端及びC末端ペプチド残基を形成する、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗癌剤。
【請求項５】
N末端システインがその末端アミノ窒素に結合したキャッピング基を含む、請求項4に記載の抗癌剤。
【請求項６】
ヒ素原子に結合した安定化基を更に含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗癌剤。
【請求項７】
安定化基がヒドロキシル、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、アリール、シクロアルキル及び複素環からなる群から選択され、前記基各々が適当な場合置換又は非置換であってよい、請求項6に記載の抗癌剤。
【請求項８】
腫瘍ホーミングペプチドが少なくとも1個のアルギニン及び/又はリジン残基を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗癌剤。
【請求項９】
式I
【化１】
2021509394.tif 000041
(式中、ヒ素に結合している図示の硫黄原子は各システイン残基のチオール硫黄であり、
式Iのシステイン残基は曲線により表される20個未満のアミノ酸残基により分離され、
Rは、ヒドロキシル、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C1〜C6アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環、及び短鎖ペプチドからなる群から選択される安定化基であり、前記基各々が置換又は非置換であってよい)
で示される構造を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗癌剤。
【請求項１０】
式I
【化２】
2021509394.tif 000042
(式中、原子及び基は式Iに記載した通りであり、
キャッピング基はアミノ反応化合物から形成され、
Wは2〜20個のアミノ酸残基である)
で示される構造を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗癌剤。
【請求項１１】
ヒ素原子が2個のシステイン残基間に結合して架橋を形成する腫瘍ホーミングペプチドが、
1.  CAYHRLRRC;
2.  CDCRGDCFC;
3.  CPIEDRPMC;
4.  CNRRTKAGC;
5.  CGTKRKC;
6.  CRGDGWC;
7.  CVSNPRWKC;
8.  CHVLWSTRC;
9.  CLDGGRPKC;
10.  GCSVSSVGALCTHV;
11.  CRGDGWC;
12.  CDCRGDCFC;
13.  CVNHPAFAC;
14.  CRGDRGPDC;
15.  CRGDKTTNC;
16.  CRGDHAGDC;
17.  CLSYYPSYC;
18.  CTPSPPFSHC;
19.  CPHSKPCLC;
20.  CSDSWHYWC;
21.  CSDWQHPWC;
22.  CSDYNHHWC;
23.  CSDGQHYWC;
24.  CYDSWHYWC;
25.  CFDGNHIWC;
26.  CTDFPRSFC;
27.  CTQDRQHPC;
28.  CLSRYLDQC;
29.  CRGDCF;
30.  CGNSNPKSC;
31.  CPHNLTKLC;及び
からなる群から選択され得、
前記ヒ素原子が、第1の態様の形成された抗癌剤中に存在する場合、上記のペプチド配列のシステイン残基のうち2個に結合して、これらの間で架橋する、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗癌剤。
【請求項１２】
請求項1から11のいずれか一項に記載の抗癌剤、並びに薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１３】
患者の癌を治療する方法であって、請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗癌剤又は請求項12に記載の医薬組成物を前記患者に投与する工程を含み、それにより前記患者の癌を治療する、前記方法。
【請求項１４】
癌が血液学的悪性疾患又は固形腫瘍である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
癌が白血病、多発性骨髄腫及びリンパ腫から選択される、請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１６】
癌が扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、黒色腫、線又は管の上皮内層の腫瘍、腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、肝及び胆道の腫瘍、肝細胞癌、消化管の腫瘍、食道の扁平上皮細胞癌、食道の腺癌、結腸直腸癌(結腸癌)、胃癌(gastric carcinoma、stomach caner)、気道の腫瘍、気管支原生癌、小細胞癌、大細胞癌、泌尿生殖器管の腫瘍、卵巣の移行上皮癌、卵巣の扁平上皮細胞癌、前立腺癌、頸癌、血液細胞及び関連細胞(白血病)、急性及び慢性リンパ球性白血病、真性多血症、リンパ系組織の癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む悪性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、大細胞型リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、結合組織の腫瘍、骨肉腫癌、神経系の腫瘍、神経芽腫、網膜芽腫、神経膠芽腫、乏突起膠腫、発癌性ウイルスに関連する腫瘍、バーキットリンパ腫、免疫不全患者のB細胞リンパ腫、鼻咽頭癌、食道及び胃食道癌、上皮扁平上皮細胞癌、膵島腫瘍、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、網膜芽腫、肝臓癌、膵臓癌、脳癌、中皮腫並びにB型肝炎ウイルス肝細胞癌からなる群から選択される、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
癌が白血病である場合、慢性骨髄性白血病、t-細胞リンパ腫、骨髄異形成症候群、結腸癌、膵臓癌、脳癌、中皮腫及び急性前骨髄球性白血病(APL)からなる群から選択される、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
抗癌剤が、免疫療法剤、モノクローナル抗体、化学療法剤、放射線防護剤及び放射線療法剤のうち1つ以上と組み合わせて投与される、請求項13から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
抗癌剤を製造する方法であって、
(a)2個のシステイン残基を含む腫瘍ホーミングペプチドとヒ素化合物とを接触させる工程と、
(b)前記ヒ素を前記2個のシステイン残基各々に結合させ、結合したヒ素原子を含む環化腫瘍ホーミングペプチドを形成する工程と
を含み、
それにより前記抗癌剤を製造する、前記方法。
【請求項２０】
ヒ素化合物が、酸化ヒ素である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
ヒ素化合物がヒ素に結合したアルキル、ヒドロキシル又はアリール基を更に含む、請求項19又は20に記載の方法。
【請求項２２】
2個のシステイン残基を呈するように、選択された腫瘍ホーミングペプチドを修飾する工程(a)(i)を更に含む、請求項19から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項19から22のいずれか一項に記載の方法により製造された場合の抗癌剤。
【請求項２４】
治療有効量のヒ素を患者に送達する方法であって、適量の請求項1から11のいずれか一項に記載の抗癌剤又は請求項12に記載の医薬組成物を前記患者に投与する工程を含み、それにより前記治療有効量のヒ素を前記患者に送達する、前記方法。
【請求項２５】
癌を診断する方法であって、
(i)少なくとも1個の放射標識原子を含む請求項1から11のいずれか一項に記載の抗癌剤を患者に投与する工程と、
(ii)前記抗癌剤を前記癌に局在させる工程と、
(iii)前記抗癌剤の前記少なくとも1個の放射標識原子の存在を検出する工程と
を含み、
それにより前記癌を診断する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物治療の分野に関する。更に詳細には、本発明は、ペプチドに配位したヒ素及び抗癌剤としての得られた複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書におけるいずれかの背景技術への言及は、このような背景技術がオーストラリア又は他の国において共通の一般的知識を構成すると認めるものとして解釈されるべきではない。
【０００３】
三酸化ヒ素(As2O3、ATO)は周知の毒物であるが、長い間医療上用いられてきた。1865年、慢性骨髄性白血病の治療のためのヒ素化合物(ファウラー水として公知のものの1つ(1%ATO含有溶液))について記載された。その慢性毒性により、20世紀半ばにこれらは忍容性の高い薬剤に置き換えられた。しかし、大規模な臨床スクリーニング後、ATOの治療効果が、特定のヒト癌、例えば、白血病、食道癌及びリンパ腫において同定された。現在、血液学的悪性疾患、例えば、急性前骨髄球性白血病の治療に用いられている。
【０００４】
幾つかの細胞標的を含む様々な機構を介して、ヒ素はその毒性効果、逆に言うと治療効果を示す。ヒ素は、システイン又はメチオニンアミノ酸残基(これらはタンパク質/酵素中に見出される)中の硫黄と容易に結合し、それにより広範な細胞機能を破壊し、最終的に細胞死を引き起こす。三価ヒ素により標的とされるタンパク質の幾つかのよく研究された例としては、グルタチオンレダクターゼ、チオレドキシンレダクターゼ、ミトコンドリアアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ(ANT)及びチューブリンが挙げられる。これらの相互作用のいずれかは細胞死を引き起こす。例えば、ミトコンドリアは、これらの機能の破壊により細胞死が引き起こされるように細胞内でエネルギーを産生する。ヒ素とチューブリンとの相互作用は、細胞複製を防止する微小管の形成を妨害する。更に、細胞核内でのヒ素蓄積によりDNAの断片化が引き起こされる。
【０００５】
急性前骨髄球性白血病(APL)は、治療せずに放置した場合、3カ月以内に死に至る可能性がある侵攻性の白血病である。APLの最も有効な現在の治療法の1つはATOであり、他の治療後に再発した患者85%の治癒に成功している。2015年後半、ATOは、第1選択APL併用療法に認可された。これは、耐性を克服するのに有益である多面的な挙動を示す。そのため、これは広範な他の癌、特に血液学的悪性疾患の治療において大きな関心を集めた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】the Handbook of Excipients第6版、Rowe、Sheskey及びQuinn編(Pharmaceutical Press)
【非特許文献２】Carmichaelら(Cancer Res. 1987、47、936)
【非特許文献３】Mosman(J. Immunol. Methods 1983、65、55)
【非特許文献４】Tadaら(J. Immunol. Methods 1986、93、157)
【非特許文献５】Heredia-Moya及びKirk((2008)Bioorg. Med. Chem. 16、5743〜5746)
【非特許文献６】Ioannou及びTsivgoulis((2015) Main Group Chem. 14、237〜253)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
残念なことに、ATOは毒性副作用を誘発し、これにより、APL及び他の癌の治療において投与できる抗癌剤の用量が制限され得る。これは、不完全な腫瘍応答、有害心イベントの発現、薬物耐性、治療の中断、最終的には疾患の進行をもたらし得る。毒性副作用の根本的な原因は、ATO等のヒ素含有抗癌剤が癌細胞と健康な細胞の両方を無差別に死滅させるという事実に起因する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第1の態様によれば、2個のシステイン残基に結合したヒ素原子を有する環化腫瘍ホーミングペプチド(cyclised tumour homing peptide)を含む抗癌剤が提供される。
【０００９】
好適には、2個のシステイン残基に結合したヒ素原子は、腫瘍ホーミングペプチドを環状にすることができる。即ち、これは2個のシステイン間のヒ素の架橋であり、これにより環化腫瘍ホーミングペプチドが生成される。
【００１０】
一実施形態において、腫瘍ホーミングペプチドの2個のヒ素結合システイン残基は、一方と他方との間を20個未満のアミノ酸残基により分離される。
【００１１】
特定の実施形態において、腫瘍ホーミングペプチドの2個のヒ素結合システイン残基は、18個未満のアミノ酸残基、又は16個未満のアミノ酸残基、又は15個未満のアミノ酸残基、又は14個未満のアミノ酸残基により分離される。
【００１２】
諸実施形態において、環化して抗癌剤を形成する前、ヒ素原子を結合している2個のシステイン残基は、腫瘍ホーミングペプチドの各N末端及びC末端ペプチド残基である。
【００１３】
ヒ素原子を結合している2個のシステイン残基が、腫瘍ホーミングペプチドに天然に存在しない場合、これを腫瘍ホーミングペプチドに添加して、それにより各N末端及びC末端ペプチド残基を形成することができる。
【００１４】
N末端システインは、その末端アミノ窒素に結合したキャッピング基を含み得る。
【００１５】
一実施形態において、抗癌剤は、ヒ素原子に結合した安定化基を更に含む。
【００１６】
好適には、安定化基は、ヒドロキシル、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、アリール、シクロアルキル及び複素環からなる群から選択される。
【００１７】
諸実施形態において、腫瘍ホーミングペプチドは、少なくとも1個のアルギニン及び/又はリジン残基を含む。
【００１８】
一実施形態において、抗癌剤は、式I
【００１９】
【化１】
2021509394.tif 000003
【００２０】
(式中、ヒ素が結合している硫黄原子は、各システイン残基のチオール硫黄であり、
式Iのシステイン残基は、曲線で表される20個未満のアミノ酸残基により分離され、
Rは、ヒドロキシル、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C1〜C6アルコキシ、アリール、シクロアルキル、グルタチイル及び複素環からなる群から選択される安定化基であり、これらの基は各々置換又は非置換であってよい)
で示される構造を有する。
【００２１】
本発明の第2の態様によれば、第1の態様の抗癌剤、並びに薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００２２】
本発明の第3の態様によれば、患者の癌を治療する方法であって、第1の態様の抗癌剤又は第2の態様の医薬組成物を患者に投与する工程を含み、それにより癌を治療する、前記方法が提供される。
【００２３】
本発明の第4の態様は、患者の癌の治療での使用のための第1の態様の抗癌剤に属する。
【００２４】
本発明の第5の態様は、癌の治療のための薬剤の製造における第1の態様の抗癌剤の使用に属する。
【００２５】
第3〜第5の態様に関して、一実施形態において、癌は血液学的悪性疾患又は固形腫瘍である。
【００２６】
本発明の第6の態様によれば、抗癌剤を製造する方法であって、
(a)2個のシステイン残基を含む腫瘍ホーミングペプチドとヒ素化合物とを接触させる工程と、
(b)ヒ素を2個のシステイン残基各々に結合させ、結合したヒ素原子を含む環化腫瘍ホーミングペプチドを形成する工程と
を含み、
それにより抗癌剤を製造する、
前記方法が提供される。
【００２７】
抗癌剤は、第1の態様について記載した通りであり得る。
【００２８】
ヒ素化合物は酸化ヒ素であり得る。
【００２９】
一実施形態において、ヒ素化合物はヒ素に結合したアルキル、ヒドロキシル又はアリール基を含み得る。
【００３０】
一実施形態において、方法は、2個のシステイン残基を呈するように、選択された腫瘍ホーミングペプチドを修飾する工程(a)(i)を含み得る。
【００３１】
本発明の第7の態様は、第6の態様の方法により製造された場合の抗癌剤に属する。
【００３２】
本発明の第8の態様は、治療有効量のヒ素を患者に送達する方法であって、適量の第1の態様の抗癌剤又は第2の態様の医薬組成物を患者に投与する工程を含み、それにより治療有効量のヒ素を送達する、前記方法に属する。
【００３３】
第8の態様の方法は、第1の態様について記載された実施形態のいずれかを含み得る。
【００３４】
本発明の第9の態様は、癌を診断する方法であって、
(i)少なくとも1個の放射標識原子を含む第1の態様の抗癌剤を患者に投与する工程と、
(ii)抗癌剤を癌に局在させる工程と、
(iii)抗癌剤の少なくとも1個の放射標識原子の存在を検出する工程と
を含み、それにより癌を診断する、前記方法に属する。
【００３５】
上記の各項で言及された本発明の様々な特徴及び実施形態は、適当な場合、他の項にも適用される。したがって、ある項に特定された特徴を、適当な場合、他の項に特定された特徴と組み合わせることができる。
【００３６】
本発明の更なる特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００３７】
本発明が容易に理解され、実際に実施することができるように、好ましい実施形態は添付の図面を参照して例として記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】各々[LHP+3H+]3+及び[LHP+2H+]2+に帰属するm/z407.4及びm/z610.5にピークを有するLHPについての正イオンESI-質量スペクトルを示すグラフである。
【図１Ｂ】各々[HyAs(LHP)+3H+]3+及び[HyAs(LHP)+2H+]2+に帰属するm/z431.4及びm/z646.8にピークを有する(a)リン酸緩衝液(pH8)及び(b)トリエチルアミン(pH8)中でのAsl3とLHPとの8時間の反応についてのESI-MS結果を示すグラフであり、所望の生成物HyAs(LHP)の生成が確認される。m/z407.6、m/z610.5及びm/z628.8のイオンは各々遊離ペプチド[LHP+3H+]3+、[LHP+2H+]2+及び[LHP.2H2O+2H+]2+に帰属する。m/z837.9のイオンは[HyAs(LHP)2+3H+]3+として同定される。
【図１Ｃ】37℃で16時間のインキュベーション後のリン酸緩衝液(pH8)中のMMA(V)とLHPとの反応についてのESI-MS結果を示すグラフである。m/z437.1[MeAs(LHP)+3H+]3+、m/z444.8[MeAs(LHP)+Na++2H+]3+、m/z655.1[MeAs(LHP)+2H+]2+及びm/z666.4[MeAs(LHP)+Na++2H+]2+のイオンにより、所望の生成物MeAs(LHP)の生成が確認される。遊離ペプチドイオンはm/z407.6[LHP+3H+]3+、*=m/z414.9[LHP+Na++2H+]3+、m/z610.5[LHP+2H+]2+  、m/z629.6[LHP+Na++H+]2+に現れる。
【図１Ｄ】37℃で4時間のインキュベーション後のリン酸緩衝液(pH8)中のPAOとLHPとの反応からの生成物についてのESI-MS結果を示すグラフであり、m/z457.6[PhAs(LHP)+3H+]3+及びm/z685.5[PhAs(LHP)+2H+]2+のイオンにより、所望の生成物PhAs(LHP)の生成が確認される。遊離ペプチドイオンは、m/z407.6[LHP+3H+]3+及びm/z610.5[LHP+2H+]2+に現れる。
【図２Ａ】(a)LHP(最初のトレースにおいて約15分、2番目のトレースにおいて14〜17分、3番目のトレースにおいて14〜19分、及び最後のトレースにおいて15〜22分にピーク)、(b)HyAs(LHP)、(c)MeAs(LHP)、(d)PhAs(LHP)についての分析用HPLCからの一連のHPLCトレースを示すグラフである。遊離ペプチド(LHP)は全てのクロマトグラムにおいて14.5分に現れ、指定の複合体は次の時間に現れる:(b)HyAs(LHP)は17.2分に、(c)MeAs(LHP)は18.1分に及び(d)PhAs(LHP)は22.1分にピーク。
【図２Ｂ】精製後の化合物(a)HyAs(LHP);(b)MeAs(LHP);(c)PhAs(LHP)を特性評価する一連の正イオンESI質量スペクトルを示すグラフである。円形=[LHP+3H+]3+;長方形=[HyAs(LHP)+3H+]3+;星形=[LHP+2H+]2+;三角形=[HyAs(LHP)+2H+]2+;×=[MeAs(LHP)+3H+]3+;十字=[MeAs(LHP)+2H+]2+;縦菱形=[PhAs(LHP)+3H+]3+;横菱形=[PhAs(LHP)+2H+]2+。
【図３】As標準物質及びAs-LHP化合物の固体試料から得られたAs K吸収端XANESスペクトルを表すグラフであり、ヒ素LHP複合体の構造的完全性を示しており、そこで酸化状態はAs3+であり、ヒ素は2個の硫黄原子及びR基に結合している。
【図４】HyAs(LHP)の固体試料のEXAFS分析(左)及び対応するフーリエ変換(右)を表すグラフであり、Table 6(表6)に示すようにフィッティング3(2S及び10)の実験(黒)及び計算(赤)データを示している。As3+が2個の硫黄原子及び1個の酸素原子に結合していることが確認される。
【図５】MeAs(LHP)の固体試料のEXAFS分析(左)及び対応するフーリエ変換(右)を表すグラフであり、Table 7(表7)に示すようにフィッティング4(2S及び1C)についての単一散乱フィッティング(第1の配位殻)を用いた実験(黒)及び計算(赤)データを示している。As3+が2個の硫黄原子及び1個の炭素原子に結合していることが確認される。
【図６】PhAs(LHP)の固体試料のEXAFS分析(左)及び対応するフーリエ変換(右)を表すグラフであり、Table 8(表8)に示すようにフィッティング4(2S及び1C)についての単一散乱フィッティング(第1の配位殻)を用いた実験(黒)及び計算(赤)データを示している。As3+が2個の硫黄原子及び1個の炭素原子に結合していることが確認される。
【図７】37℃のMilliQ水で行われたPAO(10mM)とLHP(3mM)との反応生成物の逆相分取用HPLCクロマトグラムを示すグラフである。各主画分の同一性はESI-MSにより確認された。PAOは13.28分に溶出し、PhAs(LHP)は15.99及び16.86分に溶出した。マイナー画分の成分の同一性は確認されなかった。
【図８】(a)画分1及び(b)画分2の正イオンESI質量スペクトルを示すグラフである。ピークは、m/z407.5=[LHP+3H+]3+、m/z414.1=[LHP+2H++Na+]3+、m/z457.4=[PhAs(LHP)+3H+]3+、m/z463.5=[PhAs(LHP)+3H++H2O]3+、m/z610.7=[LHP+2H+]2+、m/z619.8=[LHP+2H++H2O]2+、m/z685.5=[PhAs(LHP)+2H+]3+及びm/z696.7=[PhAs(LHP)+H++Na+]2+として同定され、同じ化合物PhAs(LHP)として各画分が確認される。
【図９】PhAs(LHP)として同定された単離された画分の逆相分析用HPLCクロマトグラムを示すグラフである。(a)画分1:15.97及び16.85分に溶出したPhAs(LHP)、(b)画分2:15.97及び16.87分に溶出したPhAs(LHP)により、2つの異性体の自発的な相互変換が立証される。
【図１０】0時間(青、一番左のトレース及びピーク)及び4時間(赤、亜ヒ酸塩のトレースに追随し、ピーク値が低い)でのMilli-Q水中のHyAs(LHP)のAs K吸収端XANESスペクトルを示すグラフであり、この期間にわたって安定性の欠如を示している。4時間のスペクトルは、亜ヒ酸塩のスペクトル(緑)に類似している。
【図１１】0時間(青、14時間のスペクトルとの重複により不可視)及び14時間(赤)でのMilli-Q水中のMeAs(LHP)のAs K吸収端XANESスペクトルを示すグラフであり、この期間にわたって良好な安定性を示している。2つのスペクトル間の残差は、緑で示されている。
【図１２】0時間(青、14時間のスペクトルとの重複により不可視)及び14時間(赤)でのMilli-Q水中のPhAs(LHP)のAs K吸収端XANESスペクトルを示すグラフであり、この期間にわたって優れた安定性を示している。2つのスペクトル間の残差は、緑で示されている。
【図１３】0時間(青、重複するトレースのわずかに高いピーク及び低い谷)及び24時間(赤)でのIMDM(細胞培地)中のMeAs(LHP)のAs K吸収端XANESスペクトルを示すグラフであり、この期間にわたって妥当な安定性を示している。2つのスペクトル間の残差(緑)は、2つのスペクトル間、特に吸収端後の谷の領域における異常を示している。
【図１４】0時間(青、24時間のスペクトルとの重複によりごくわずかに可視、重複するトレースのわずかに低いピーク及び低い谷)及び24時間(赤)でのIMDM中のPhAs(LHP)のAs K吸収端XANESスペクトルを示すグラフであり、この期間にわたって良好な安定性を示している。2つのスペクトル間の残差は、緑で示されている。
【図１５】24時間の処理後、K562細胞に対するMTTアッセイのために作成された一連の濃度反応曲線を示すグラフである。試験した化合物としては:(A)現行のヒ素剤:アセタルゾール、亜ヒ酸塩、ATO、(B)出発物質及びペプチド:Asl3、PAO、LHP、sLHP、(C)ヒ素ペプチド:HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)及びPhAs(sLHP)が挙げられる。これらの曲線は、各化合物のIC50を計算するために用いられ、そこで、低いIC50は、化合物の毒性が高いことを示している。
【図１６】24時間の処理後、K562細胞に対するMTTアッセイから得られた指定のAs化合物のIC50値の比較結果を示すグラフであり、ヒ素ペプチド複合体の毒性の改善を示している。
【図１７】24時間の処理後、HL-60細胞に対するMTTアッセイから得られた指定のAs化合物のIC50値の比較結果を表すグラフであり、標的ペプチドを含有するPhAs(LHP)の良好な毒性及びスクランブル化ペプチド(もはや標的ではない)を含有するPhAs(sLHP)の毒性の大幅な低下を示している。
【図１８】24時間の処理後、Kasumi-1細胞に対するMTTアッセイから得られた指定のAs化合物のIC50値の比較を示すグラフであり、PhAs(LHP)の誘導体PhAs(sLHP)、亜ヒ酸塩、ATO及びPAOに対してPhAs(LHP)の毒性の実質的な改善を示している。
【図１９】24時間の処理後、KARPAS45細胞に対するMTTアッセイから得られた指定のAs化合物のIC50値の比較結果を表すグラフであり、標的ペプチドを含有するPhAs(LHP)の良好な毒性及びスクランブル化ペプチド(もはや標的ではない)を含有するPhAs(sLHP)の毒性の大幅な低下を示している。
【図２０】24時間の処理後、HepG2細胞に対するMTTアッセイから得られた指定のAs化合物のIC50値の比較結果を表すグラフであり、PhAs(LHP)が、ペプチドにより標的とされないこれらの増殖の早い癌細胞に対して毒性が低いことを示している。
【図２１】24時間の処理後、チャイニーズハムスター(CH)の固形腫瘍細胞に対するMTTアッセイから得られた指定のAs化合物のIC50値の比較結果を表すグラフであり、PhAs(LHP)が、ペプチドにより標的とされないこれらの増殖の早い癌細胞に対して毒性が低いことを示している。
【図２２】24時間の処理後、hPBMCに対するMTTアッセイから得られた指定のAs化合物のIC50値の比較結果を表すグラフであり、PhAs(LHP)がこれらの正常細胞に対して毒性が低いことを示している。
【図２３】24時間の処理後、細胞株全体でのPhAs(LHP)のIC50値の比較を示すグラフであり、白血病細胞株(ペプチドにより標的とされるK562、HL-60、Kasumi-1及びKARPAS45)に対するPhAs(LHP)の良好な毒性、接着性の増殖の早い癌細胞株(ペプチドにより標的とされないHepG2、A549及びCH固形腫瘍細胞)の毒性の大幅な低下、また正常な血液細胞(同様に、ペプチドにより標的とされないhPBMC)における毒性の低下を示している。
【図２４】24時間の処理後、指定の細胞株に関連する細胞As濃度(As 1.5μM)を要約するグラフである。結果は、3連の試料の平均及び標準偏差として表される。結果は、PhAs(LHP)での処理後の白血病細胞株における選択的なAsの取り込みを示しており、非白血病細胞におけるAsの取り込みは検出できない。
【図２５】Milli-Q水中のPhAs(LHP)(1mM)及びPhAs(LHP)処理K562細胞(4時間及び24時間、重複するトレースの下の線)のAs K吸収端XANESスペクトルを示すグラフであり、AsがAs(III)のままであるが、As-S結合が細胞内で修飾されることを示している。
【図２６】Milli-Q水中のPhAs(LHP)(1mM)及びPhAs(LHP)処理HL-60細胞(4時間及び24時間、重複するトレースの下の線)のAs K吸収端XANESスペクトルを示すグラフであり、AsはAs(III)のままであるが、As-S結合が細胞内修飾されることを示している。
【図２７】トルイジンブルーで染色し薄切した対照細胞及びPhAs(LHP)処理K562細胞の一連の顕微鏡写真の画像である。(a)K562対照細胞、(b)PhAs(LHP)処理K562細胞(10μM、4時間)、(c)PhAs(LHP)処理K562細胞(10μM、24時間)であり、PhAs(LHP)処理後のストレス及び細胞死を示している。
【図２８】トルイジンブルーで染色し薄切した対照細胞及びPhAs(LHP)処理K562細胞の一連の顕微鏡写真の画像及び相関するマイクロプローブSR-XRF元素マップである。(a)K562対照細胞、(b)PhAs(LHP)処理K562細胞(10μM、4時間)、(c)PhAs(LHP)処理K562細胞(10μM、24時間)。動作条件としては:ビームエネルギー=11.9keV;ビームサイズ=0.3×0.3μm2;ステップサイズ=0.3μm;滞留時間2.5秒/ポイント;及び走査次元(H×V)=(a)20×21μm2;(b)26×18μm2;(c)23×21μm2が挙げられる。これは、PhAs(LHP)処理後の細胞核におけるAsの局在を示している。
【図２９】PhAs(LHP)(10μM、24時間)に暴露された、トルイジンブルーで染色した薄切片のK562細胞の(a)相関する光学顕微鏡写真の画像(b)P、Zn及びAsの対応するマイクロプローブSR-XRFマップ及び3個の元素の共局在マップである。これは、PhAs(LHP)処理後の細胞核におけるAsの局在を示している。
【図３０】トルイジンブルーで染色し薄切した対照細胞及びPhAs(LHP)処理HL-60細胞の一連の顕微鏡写真の画像である。(a)HL-60対照細胞、(b)PhAs(LHP)処理HL-60細胞(10μM、4時間)、(c)PhAs(LHP)処理HL-60細胞(10μM、24時間)であり、PhAs(LHP)処理後のストレス及び細胞死を示している。
【図３１】トルイジンブルーで染色し薄切した対照細胞及びPhAs(LHP)処理HL-60細胞の顕微鏡写真の画像及び相関するマイクロプローブSR-XRF元素マップである。(a)HL-60対照細胞、(b)PhAs(LHP)処理HL-60細胞(10μM、4時間)、(c)PhAs(LHP)処理HL-60細胞(10μM、24時間)。動作条件としては:ビームエネルギー=11.9keV;ビームサイズ=0.3×0.3μm2;ステップサイズ=0.3μm;滞留時間2.5秒/ポイント;及び走査次元(H×V)=(a)15×11μm2;(b)13×14μm2;(c)16×14μm2。これは、4〜24時間の処理でのAsの取り込みの増加と核における有意な蓄積とを示している。
【図３２】PhAs(LHP)(10μM、24時間)に暴露された、トルイジンブルーで染色した薄切片のHL-60細胞の(a)相関する光学顕微鏡写真の画像、(b)P、Zn及びAsの対応するマイクロプローブSR-XRFマップ及び3個の元素の共局在マップである。これは、PhAs(LHP)での処理後の核におけるAsの有意な蓄積を示している。
【図３３】ピーク:m/z184.0、[NH2-Ph-As=O+H]+;m/z202.0、[NH2-Ph-As-(OH)2+H]+;m/z220.0、未同定;m/z259.0、[NH2-Ph-As-Cl2+Na]+;m/z279.1、[P(Ph)3O+H]+を示す、Milli-Q水に溶解した合成NH2PhAs(III)の正イオンESI質量スペクトル(m/z160〜400)を示すグラフであり、NH2PHAs(III)の生成が確認される。
【図３４】固体標準物質及び合成NH2PhAs(LHP)及びNH2PhAs(III)のAs K吸収端XANESスペクトルを示すグラフである。スペクトルは、亜ヒ酸塩、p-アルサニル酸、PhAs(Gs)2、PAO及びNH2PhAs(LHP)について得られたデータを含み、NH2PhAs(LHP)中のAsがAs(III)であり、Sに結合している可能性が高いことを示している。
【図３５】ピーク:m/z259.1、[NH2-Ph-As-Cl2+Na]+;m/z407.2、[LHP+3H]3+;m/z462.4, [NH2-Ph-As(LHP)+3H]3+;m/z610.1、[LHP+2H]2+;m/z693.0、[NH2-Ph-As(LHP)+2H]2+を示す、16時間後、37℃のMilli-Q水中での合成p-アミノフェニルジクロロアルシン/p-アミノフェニルアルシンオキシド(3mM)とLHP(1mM)との反応から得られた生成物の正イオンESI質量スペクトル(m/z240〜1500)を示すグラフであり、NH2PhAs(LHP)の生成が確認される。
【図３６】単一散乱フィッティング(第1の配位殻)を用いた実験(--)及び計算(---)データを示す、NH2PhAs(LHP)のEXAFS分析(左)及び対応するフーリエ変換(右)を示すグラフである。これにより、Asが2S及び1Cに結合していることが確認される。
【図３７】ピーク:m/z219.0、[OH-Ph-AsH2O3+H]+;m/z236.9、[Cl-Ph-AsH2O3+H]+;m/z141.0、夾雑物;m/z158.0、夾雑物を示す、メタノールに溶解した合成p-クロロフェニルアルソン酸の正イオンESI質量スペクトル(m/z160〜600)を示すグラフであり、Cl-Ph-AsH2O3の生成が確認される。
【図３８】固体標準物質、並びに合成ClPhAs(LHP)(下部のシリーズのトレースにおいて最初にピークまで上昇するトレース)及びClPhAs(V)のAs K吸収端XANESスペクトルを示すグラフである。標準物質としては、亜ヒ酸塩、p-アルサニル酸(中間のシリーズのトレースにおいて後から上昇するトレース)、PhAs(Gs)2及びPAOが挙げられる。これは、ClPhAs(LHP)中のAsがAs(III)であり、Sに結合している可能性が高いことを示している。
【図３９】ピーク:m/z406.8、[酸化LHP+3H]3+;m/z468.8、[Cl-Ph-As(LHP)+3H]3+;m/z609.5、[酸化LHP+2H]2+;m/z702.5、[Cl-Ph-As(LHP)+2H]2+を示す、37℃のMilli-Q水中でのClPhAs(V)(1mM)とLHP(3mM)との72時間の反応から得られた生成物の正イオンESI質量スペクトル(m/z240〜1400)を示すグラフであり、ClPhAs(LHP)の生成が確認される。
【図４０】単一散乱フィッティング(第1の配位殻)を用いた実験(--)及び計算(---)データを示す、分取用HPLCから得られた第1のClPhAs(LHP)画分のEXAFS分析(左)及び対応するフーリエ変換(右)を示すグラフである。これにより、Asが2S及び1Cに結合していることが確認される。
【図４１】メタノールに溶解した合成p-ヨードフェニルアルソン酸の正イオンESI質量スペクトル(m/z100〜600)を示すグラフである。ピークはm/z328.8、[I-Ph-AsH2O3+H]+;m/z141.0、夾雑物;m/z158.0、夾雑物として帰属された。これによりIPhAsH2Oの生成が確認される。
【図４２】固体標準物質、並びに合成IPhAs(LHP)(下部の対のトレースで最初にピークまで上昇するトレース)及びIPhAs(V)のAs K吸収端XANESスペクトルを示すグラフである。標準物質としては、亜ヒ酸塩、p-アルサニル酸(中間のシリーズのトレースで後からピークまで上昇するトレース)、PhAs(Gs)2及びPAOを含む。これは、IPhAs(LHP)中のAsがAs(III)であり、同様にSに結合していることを示している。
【図４３】72時間後、37℃のMilli-Q水中での合成p-ヨードフェニルアルソン酸(1mM)とLHP(3mM)との反応から得られた生成物の正イオンESI質量スペクトル(m/z240〜1400)を示すグラフである。ピーク:m/z406.8、[酸化LHP+3H]3+;m/z499.3、[I-Ph-As(LHP)+3H]3+;m/z609.5、[酸化LHP+2H]2+;m/z748.5、[I-Ph-As(LHP)+2H]2+により、IPhAs(LHP)の生成が確認される。
【図４４】単一散乱フィッティング(第1の配位殻)を用いた実験(--)及び計算(---)データを示す、分取用HPLCから得られた第1のIPhAs(LHP)画分のEXAFS分析(左)及び対応するフーリエ変換(右)を示すグラフである。これにより、Asが2S及び1Cに結合していることが確認される。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、少なくとも部分的には、腫瘍ホーミングペプチドが環化して、高度に選択的なヒ素含有抗癌剤が得られるように、ヒ素原子が、2個のシステイン残基を有するか、又はこれを呈するように修飾された腫瘍ホーミングペプチド、好ましくはN及びC末端システイン残基を有する腫瘍ホーミングペプチドに安定に結合できることの実現を含意する。これは、所与の癌の治療に適した腫瘍ホーミングペプチドの選択を可能にし、それにより、後続の薬剤では、腫瘍微小環境へのヒ素の更に標的化された送達が可能になる。
【００４０】
驚くべきことに、腫瘍ホーミングペプチドがヒ素に結合すると、ヒ素含有抗癌剤は、高度に特異的及び選択的な方式で配合され、腫瘍部位に送達され得るように極めて安定である。同時に、ヒ素原子は生物学的に利用可能であり、腫瘍細胞に対してその損傷作用を発揮する。結合したヒ素に対する腫瘍ホーミングペプチドのサイズ、またヒ素へのシステインチオール基の結合強度を考慮すると、このような結果は予測できなかった。これは、癌型に対して高度に選択的な薬剤中でヒ素を効率的かつ効果的な方式で送達する機会を提供する。腫瘍ホーミングペプチドを選択する能力により、広範な癌がこの選択的な方式で標的とされ得る。
【００４１】
定義
次に、本明細書において総称的に用いられる専門用語について言及すると、用語「アルキル」は、例えば、1〜約6個の炭素原子、好ましくは1〜約4個の炭素原子、更により好ましくは1〜2個の炭素原子を含有する直鎖又は分枝鎖のアルキル置換基を意味する。これらの範囲内に含まれると考えられるこのような置換基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル等が挙げられる。言及した炭素数は炭素主鎖及び炭素分枝に関するが、任意の置換基に属する炭素原子、例えば、主炭素鎖から枝分かれしたアルコキシ置換基の炭素原子は含まない。
【００４２】
本明細書で使用する用語「アルケニル」は、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合、及び例えば、2〜6個の炭素原子(分枝鎖アルケニルは3〜6個の炭素原子)、好ましくは2〜5個の炭素原子(分枝鎖アルケニルは好ましくは3〜5個の炭素原子)、より好ましくは2〜4個の炭素原子を含有する直鎖アルケニル置換基を意味する。これらの範囲内に含まれると考えられるこのような置換基の例としては、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、n-ブテニル、sec-ブテニル、イソブテニル、tert-ブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル等が挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用する用語「アルキニル」は、少なくとも1個の炭素-炭素三重結合、及び例えば、2〜6個の炭素原子(分枝鎖アルキニルは3〜6個の炭素原子)、好ましくは2〜5個の炭素原子(分枝鎖アルキニルは好ましくは3〜5個の炭素原子)、より好ましくは2〜4個の炭素原子を含有する直鎖アルキニル置換基を意味する。これらの範囲内に含まれると考えられるこのような置換基の例としては、エチニル、プロピニル、イソプロピニル、n-ブチニル、sec-ブチニル、イソブチニル、tert-ブチニル、ペンチニル、イソペンチニル、ヘキシニル等が挙げられる。
【００４４】
用語「シクロアルキル」は、任意で置換される飽和の単環式、2環式又は3環式炭素基を指す。適当な場合、シクロアルキル基は指定の数の炭素原子を有し得、例えば、C3〜C6シクロアルキルは、3、4、5又は6個の炭素原子を有する炭素環基である。非限定的例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられ得る。
【００４５】
用語「アリール」は、当技術分野で一般に理解されるような、非置換又は置換の芳香族炭素環の置換基を指す。用語アリールは、平面的で、ヒュッケル則に基づく4n+2π電子を含む環状置換基に適用されることが理解される。置換又は非置換であってよいフェニルは、ヒ素原子に結合した安定化基として好ましいアリール基である。
【００４６】
「複素環式」又は「複素環」は、環の中に5〜7個の原子を好ましくは有し、これらの原子のうち1〜4個はヘテロ原子である芳香族又は非芳香族環を指し、前記環は単離されるか、又は第2の環に縮合され、前記ヘテロ原子は、0、N及びSから独立に選択される。複素環式は部分的に及び完全に飽和された複素環式基を含む。複素環式系は、基の任意の数の炭素原子又はヘテロ原子を介して別の部分に結合されてもよく、飽和でも非飽和でもよい。複素環式環としては、窒素複素環が挙げられる。複素環式の非限定的例としては、インドリン、ピロリジニル、ピロリニル、ピラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピラゾリニル、ジチオリル、オキサチオリル、ジオキサニル、ジオキシニル、オキサジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、オキセピニル及びチアピニル、イミダゾリニル、チオモルホリニル等が挙げられる。
【００４７】
記載される実施形態のいずれかにおいて、用語「置換」(「置換」又は「非置換」又は「任意で置換された」等として本明細書で言及されるもの等)は、C1〜C6アルキル、アリール(それ自体メチル、エチル、プロピル、ハロ、ニトロ、C1〜C6アルコキシ及びグルタチイルで置換され得るフェニルを含む)、シクロアルキル、カルボキシル、グルタチイル、ハロ、ニトロ及びハロアルキルからなる群から選択される基を有する部分の置換を指し得る。これらの基は各々それ自体同じ又は異なる基で置換されていてもよい。
【００４８】
本明細書で使用する用語「腫瘍ホーミングペプチド」は、腫瘍細胞又は組織、腫瘍血管、リンパ管及び他の腫瘍関連微小環境を認識し、これらに結合し、及び/又は任意でこれらに取り込まれる能力を有する比較的短いペプチドを指す。これらは、当技術分野において「腫瘍特異的な内部移行ペプチド」及び「腫瘍透過性ペプチド」とも称され得る。腫瘍ホーミングペプチドは、1個のヒ素原子に結合できる少なくとも2個のシステイン残基を呈する必要があるか、又は2個のこのようなシステイン残基を呈するように適応させることが可能でなくてはならないが、腫瘍ホーミングペプチドの性質は、特に限定されない。広範なこのようなペプチドが市販されており、実際に注文に応じて生産され得る。
【００４９】
本明細書で全般的に使用する用語「投与する(administering)」又は「投与(administration)」等は、例えば、特定の経路又はビヒクルによる哺乳動物への抗癌剤又は組成物の導入を示す。投与経路としては、局所、非経口及び経腸が挙げられ得、これは、経口、口腔、舌下、経鼻、経肛門、胃腸管、皮下、静脈内、筋肉内及び皮内投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
「治療する(treat)」、「治療(treatment)」又は「治療している(treating)」は、対象が経験した疾患、障害又は状態、例えば、癌の既存の徴候又は症状を少なくとも寛解、軽減又は抑制するための抗癌剤又は組成物の対象への投与を意味する。
【００５１】
本明細書で使用する「有効量」は、治療する状態の症状の発現を予防するか、又は症状の悪化を停止させるか、又は症状の重症度を治療及び緩和するか、若しくは少なくとも軽減するのに十分な関連の抗癌剤又は組成物の投与の量を指す。有効量は、当業者により理解される方式で、患者の年齢、性別、体重等により変更されるであろう。適当な用量又は用量計画は、ルーチン的な試行を介して決定され得る。
【００５２】
抗癌剤
一形態において、2個のシステイン残基に結合したヒ素原子を有する環化腫瘍ホーミングペプチドを含む抗癌剤が提供される。
【００５３】
好適には、2個のシステイン残基に結合したヒ素原子は、腫瘍ホーミングペプチドを環状にすることができる。即ち、ヒ素は各システインの硫黄に結合し、それによりヒ素架橋を有する環状ペプチド構造が形成される。ヒ素とジチオール(各システインの1つのチオール)との相互作用により、モノチオール-ヒ素結合で得られ得るものより安定な抗癌剤が得られると考えられる。
【００５４】
天然に存在するヒ素ペプチド種は、典型的な精製及び特性評価プロセス中のこれらの複合体の不安定性により、単離及び精製が困難であることが証明された。これは、ヒ素-ペプチド複合体の治療的使用を著しく制限している。したがって、本発明の抗癌剤は、有効性を依然として維持しながら、精製、特性評価及び貯蔵できるという点で顕著な利点を提供する。
【００５５】
一実施形態において、腫瘍ホーミングペプチドの2個のヒ素結合システイン残基は、一方と他方との間を20個未満のアミノ酸残基により分離される。
【００５６】
特定の実施形態において、腫瘍ホーミングペプチドの2個のヒ素結合システイン残基は、18個未満のアミノ酸残基、又は16個未満のアミノ酸残基、又は15個未満のアミノ酸残基、又は14個未満のアミノ酸残基により分離される。これらの上限値のいずれかを、下端の範囲の1個又は2個のアミノ酸残基と結合させてもよい。
【００５７】
システイン残基間のアミノ酸の数は、ペプチドが環化し、ヒ素架橋を形成するかどうかを予測するのに重要であることが判明した。ヒ素に結合するであろうシステインの間のアミノ酸残基の好ましい範囲は、2〜15残基、3〜15残基、4〜15残基、5〜15残基、2〜14残基、3〜14残基、4〜14残基及び5〜14残基から選択され得る。
【００５８】
諸実施形態において、環化前、ヒ素原子を結合している2個のシステイン残基は、腫瘍ホーミングペプチドの各N末端及びC末端ペプチド残基を形成する。腫瘍ホーミングペプチドの各末端アミノ酸がシステインであることは、環化を改善し、各システインチオール間でのヒ素の架橋を促進するため好ましい。環化ペプチドの形成は、大抵の場合、これが、関連の受容体により認識されるペプチドの環化立体構造であるため、不可欠な工程である。
【００５９】
N末端システインは、その遊離アミノ窒素に結合したキャッピング基を含み得る。いずれかの特定の理論に拘束されることは望まないが、キャッピング基は、ヒ素原子の挿入前、腫瘍ホーミングペプチドの環化及び/若しくは重合を防止するように本質的に作用するか、又はN末端及びC末端残基の会合を少なくとも制限して、ヒ素の結合をより良好に促進すると考えられる。したがって、キャッピング基は、効率的なヒ素の取り込み及び結合に重要であり得る。キャッピング基は、アミノ窒素と反応し、比較的非反応性/安定なキャッピング基を形成することができる、任意のN末端キャッピング化合物から形成され得る。
【００６０】
したがって、一実施形態において、キャッピング基はアミノ反応基である。システインアミノ基との反応に対してカルボン酸を呈する任意の化合物が好適であり得る。カルボン酸を呈するこのような化合物はまた非反応性部分を有することが好ましい。好ましい実施形態において、キャッピング基はアルカノイル基、例えば、C2〜C6アルカノイル基であり、これは任意で置換されていてもよい。様々なクラスの適当なキャッピング剤の具体例としては、アセチル、ピログルタミン酸、インドール、ベンゾイミダゾール、ベンゾイミダゾロン、Fmoc等が挙げられ得る。より小さい不活性なキャッピング基が好ましく、したがって、1つの好ましい実施形態において、キャッピング基はアセチル基である。当業者であれば、このようなN末端キャッピング基は、腫瘍ホーミングペプチドの所望される位置にこれらを配置する手段であるとして当技術分野で公知であることを認識されるであろう。
【００６１】
一実施形態において、抗癌剤は、ヒ素原子に結合した安定化基を更に含む。安定化基は、典型的には、腫瘍ホーミングペプチドに接触させるために用いられるヒ素化合物中のヒ素原子に既に結合している。安定化基の選択は、抗癌剤の安定性に顕著なプラスの効果、したがって治療方法におけるその継続的な有効性を有し得ることが判明した。
【００６２】
好適には、安定化基はヒドロキシル、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C1〜C6アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びグルタチイルを含む短鎖ペプチドからなる群から選択され、これらの基は各々置換又は非置換であってよい。
【００６３】
一実施形態において、安定化基はヒドロキシル、C1〜C4アルキル、C2〜C4アルケニル、C1〜C4アルコキシ、C5又はC6アリール、C5又はC6シクロアルキル、C5又はC6複素環及びグルタチイルからなる群から選択され、これらの基は各々置換又は非置換であってよい。
【００６４】
特定の実施形態において、安定化基はヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル及び置換又は非置換フェニルからなる群から選択される。
【００６５】
安定化基が置換フェニルである場合、置換は、ヒドロキシル、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、グルタチイル、アルギニン、リジン、ハロ、C1〜C4ハロアルキル、ニトロ、アミノ、第2級又は第3級アミン、アミド、エーテル及びエステルとの置換であり得る。
【００６６】
好ましい置換はアミノ(即ち、NH2)、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ及びヨードを含む。
【００６７】
フェニル基の置換はヒ素原子の結合点に対してオルト、メタ又はパラであり得る。好ましくは、置換は、ヒ素原子に対してパラ一置換である。
【００６８】
諸実施形態において、腫瘍ホーミングペプチドは、少なくとも1個のアルギニン及び/又はリジン残基を含む。正に荷電したアミノ酸が、負に荷電した細胞表面タンパク質と相互作用して、腫瘍ホーミングペプチドの内部移行を改善することができるため、アルギニン及びリジンが好まれ得る。
【００６９】
第1の態様の特定の抗癌剤は、(R)又は(S)配置のいずれかであり得るキラル中心を含有し得るか、又は使用時、その混合物として投与され得る。したがって、本発明は、適当な場合、単独で又は任意の割合で混合した本明細書に記載の薬剤の立体異性体も含む。このような立体異性体は、例に記載される従来の技術、例えば、HPLCを用いて分離され得る。
【００７０】
特に、ヒ素原子はキラル中心であり得、そこに結合した環状ペプチドにより、R及びS異性体が形成され得る。本明細書の構造は、R異性体とS異性体の両方を明確に包含すると考えられる。鏡像異性体が合成中に自発的に形成され得、ラセミ混合物として使用できることが判明した。しかし、幾つかの実施形態において、分離して鏡像的に純粋な形態を使用するか、又は少なくとも、1つの異性体に富む組成物にするかのいずれかが望まれ得る。
【００７１】
一実施形態において、抗癌剤は式I
【００７２】
【化２】
2021509394.tif 000004
【００７３】
(式中、ヒ素が結合している図示の硫黄原子は、各システイン残基のチオール硫黄であり、
式Iのシステイン残基は、曲線で表される20個未満のアミノ酸残基により分離され、
Rはヒドロキシル、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C1〜C6アルコキシ、アリール、シクロアルキル、複素環及びグルタチイル(glutathiyl)を含む短鎖ペプチドからなる群から選択される部分を含む安定化基であり、これらの基は各々置換又は非置換であってよい)
で示される構造を有する。
【００７４】
安定化基「R」は先に記載したこれらの安定化基を含み得るか、又はこれらから選択され得る。
【００７５】
「R」に適した短鎖ペプチドは、4〜20個、好ましくは4〜16個又は4〜10個のアミノ酸残基を有するものであり得るか、又はこれらを含み得る。
【００７６】
2個のシステイン残基を結合しているアミノ酸鎖は、アミノ酸残基長に関して先に記載した通りであり得る。N末端システインはまた、先に記載したようにキャッピング基を有し得る。
【００７７】
したがって、一実施形態において、式Iの抗癌剤は、式II
【００７８】
【化３】
2021509394.tif 000005
【００７９】
(式中、様々な原子及び基は式Iに記載した通りであり、
キャッピング基はアミノ反応化合物から形成され、
Wは2〜20個のアミノ酸残基である)
に示す構造を有し得る。
【００８０】
キャッピング基とシステイン残基との間の「-NH」基は、それ自体システイン残基の一部である-NHであり得ることが認識されるであろう。即ち、-NHは標準的なシステイン-NH2部分であり得、キャッピング基はそこに結合して「-NHキャッピング基」を形成する。
【００８１】
「W」で表されるアミノ酸残基の数は、18個未満のアミノ酸残基、又は16個未満のアミノ酸残基、又は15個未満のアミノ酸残基、又は14個未満のアミノ酸残基を含む先に考察されたこれらの値のいずれかから選択され得る。これらの上限値のいずれかを、下端の範囲の2個のアミノ酸残基と結合させてもよい。
【００８２】
式I及びIIの構造が好まれ得るが、これらが本発明での使用に適当と考えられる唯一の構造ではないことが認識されるであろう。詳細には、ペプチドが末端システイン残基を有するが、2個のこのようなアミノ酸が存在しているにすぎず、これらが、ヒ素原子と環化できるように十分な数の残基により分離されることは必要とされない。
【００８３】
一実施形態において、ヒ素原子が2個のシステイン残基間に結合して架橋を形成する腫瘍ホーミングペプチドは:
1.CAYHRLRRC;
2.CDCRGDCFC;
3.CPIEDRPMC;
4.CNRRTKAGC;
5.CGTKRKC;
6.CRGDGWC;
7.CVSNPRWKC;
8.CHVLWSTRC;
9.CLDGGRPKC;
10.GCSVSSVGALCTHV;
11.CRGDGWC;
12.CDCRGDCFC;
13.CVNHPAFAC;
14.CRGDRGPDC;
15.CRGDKTTNC; 
16.CRGDHAGDC; 
17.CLSYYPSYC; 
18.CTPSPPFSHC; 
19.CPHSKPCLC; 
20.CSDSWHYWC; 
21.CSDWQHPWC; 
22.CSDYNHHWC; 
23.CSDGQHYWC; 
24.CYDSWHYWC; 
25.CFDGNHIWC; 
26.CTDFPRSFC; 
27.CTQDRQHPC; 
28.CLSRYLDQC; 
29.CRGDCF; 
30.CGNSNPKSC;及び
31.CPHNLTKLC 
からなる群から選択され得、
ヒ素原子は、第1の態様の形成された抗癌剤中に存在する場合、上記のペプチド配列のシステイン残基のうち2個に結合して、これらの間で架橋する。システイン残基の1つ又は両方は、末端残基であり得るが、必ずしもそうではない。
【００８４】
まとめて、これらの腫瘍ホーミングペプチドは、以下:白血病/リンパ腫、結腸癌、食道及び胃食道癌、上皮扁平上皮細胞癌、黒色腫、膵島腫瘍、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、網膜芽腫、腫瘍転移、肝臓癌、膵臓癌、脳癌、中皮腫、黒色腫、卵巣癌及び胃癌を含むが、これらに限定されない癌の選択を標的とし得る。
【００８５】
他のこのような腫瘍ホーミングペプチドは別の癌標的用に市販されており、しばしば指定された標的用に「注文に応じて」設計され得ることが認識されるであろう。この点において、抗癌剤の腫瘍ホーミングペプチド成分は、特に限定されず、標的とされる所望の癌に基づき公知のペプチドから選択される。
【００８６】
一つの好ましい実施形態において、ヒ素原子が結合して架橋を形成する腫瘍ホーミングペプチドは、CAYHRLRRC(モチーフ:CAY);CDCRGDCFC(モチーフ:RGD)又はCPIEDRPMCである。これらのペプチドは、各々、白血病及びリンパ腫細胞、血管新生脈管構造並びに結腸癌を標的とするのに有用であり、したがって、先に記載したようにヒ素原子と環化して、これらの標的に対して有効な抗癌剤を形成することができる。
【００８７】
一実施形態において、抗癌剤のヒ素はヒ素(III)原子である。
【００８８】
一つの特定の好ましい実施形態において、第1の態様の抗癌剤は以下の構造
【００８９】
【化４】
2021509394.tif 000006
【００９０】
(式中、Rはヒドロキシル、メチル及び置換又は非置換フェニルから選択される安定化基である)
を有する。
【００９１】
後続する実験の項において、HyAs(LHP)、MeAs(LHP)及びPhAs(LHP)についての言及は、Rが各々ヒドロキシル、メチル及び非置換フェニルである上記の構造についての言及である。
【００９２】
本発明の第2の態様によれば、第1の態様の抗癌剤、並びに薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００９３】
好適には、薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤は希釈剤、溶媒、pH緩衝液、結合剤、充填剤、乳化剤、崩壊剤、ポリマー、潤滑剤、油、脂肪、蝋、コーティング剤、粘度調整剤、滑り剤等のうち1つ以上であり得るか、又はこれらを含み得る。
【００９４】
希釈剤は微結晶セルロース、ラクトース、マンニトール、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、カオリン、乾燥デンプン、粉糖等のうち1つ以上を含み得る。結合剤はポビドン、デンプン、ステアリン酸、ガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のうち1つ以上を含み得る。崩壊剤はデンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム等のうち1つ以上を含み得る。溶媒はエタノール、メタノール、イソプロパノール、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン、水、生理食塩水等のうち1つ以上を含み得る。潤滑剤はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、ステアリルフマル酸ナトリウム、水素化植物油、ベヘン酸グリセリル等のうち1つ以上を含み得る。滑り剤はコロイド状二酸化ケイ素、タルク又はコーンスターチ等のうち1つ以上であり得る。緩衝液はリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液を含み得るが、これらに限定されない。充填剤はゼラチン、デンプン及び合成ポリマーゲルを含む1つ以上のゲルを含み得るが、これらに限定されない。コーティング剤はフィルム形成剤、溶媒、可塑剤等のうち1つ以上を含み得る。好適なフィルム形成剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポビドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレングリコール、アクリレート等のうち1つ以上であり得る。好適な溶媒は水、エタノール、メタノール、イソプロパノール、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン等のうち1つ以上であり得る。可塑剤はプロピレングリコール、ヒマシ油、グリセリン、ポリエチレングリコール、ポリソルベート等のうち1つ以上であり得る。
【００９５】
本発明に従って有用であり得る賦形剤の非限定的な例を提供するthe Handbook of Excipients第6版、Rowe、Sheskey及びQuinn編(Pharmaceutical Press)が参照される。
【００９６】
薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤の選択は、少なくとも部分的には、製剤の投与様式に依存することが認識されるであろう。単に例証として、組成物はIV投与用溶液、注射可能な液体、坐剤、徐放性製剤、浸透圧ポンプ製剤の形態、又は投与に有効かつ安全な任意の他の形態であり得る。IV投与用の生理食塩水は、有利な溶解度プロファイルにより特に好ましい。
【００９７】
本発明の第3の態様によれば、患者の癌を治療する方法であって、第1の態様の抗癌剤又は第2の態様の医薬組成物を患者に投与する工程を含み、それにより癌を治療する、前記方法が提供される。
【００９８】
本発明の第4の態様は、患者の癌の治療での使用のための第1の態様の抗癌剤に属する。
【００９９】
本発明の第5の態様は、癌の治療のための薬剤の製造における第1の態様の抗癌剤の使用に属する。
【０１００】
第3〜第5の態様に関して、一実施形態において、癌は血液学的悪性疾患又は固形腫瘍であり得る。
【０１０１】
更なる実施形態において、癌は白血病、多発性骨髄腫及びリンパ腫から選択される。
【０１０２】
癌は扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、黒色腫、線又は管の上皮内層の腫瘍、腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、肝及び胆道の腫瘍、肝細胞癌、消化管の腫瘍、食道の扁平上皮細胞癌、食道の腺癌、結腸直腸癌(結腸癌)、胃癌(gastric carcinoma、stomach caner)、気道の腫瘍、気管支原生癌、小細胞癌、大細胞癌、泌尿生殖器管の腫瘍、卵巣の移行上皮癌、卵巣の扁平上皮細胞癌、前立腺癌、頸癌、血液細胞及び関連細胞(白血病)、急性及び慢性リンパ球性白血病、真性多血症、リンパ系組織の癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む悪性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、大細胞型リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、結合組織の腫瘍、骨肉腫癌、神経系の腫瘍、神経芽腫、網膜芽腫、神経膠芽腫、乏突起膠腫、発癌性ウイルスに関連する腫瘍、バーキットリンパ腫、免疫不全患者のB細胞リンパ腫、鼻咽頭癌、食道及び胃食道癌、上皮扁平上皮細胞癌、膵島腫瘍、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、網膜芽腫、肝臓癌、膵臓癌、脳癌、中皮腫並びにB型肝炎ウイルス肝細胞癌からなる群から選択され得る。
【０１０３】
癌が白血病である場合、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性リンパ芽球性B細胞白血病、急性リンパ芽急性T細胞白血病、急性骨髄芽球性白血病(AML)、急性前骨髄球性白血病(APL)、急性単芽球性白血病、急性赤白血病性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性未分化白血病、慢性骨髄球性白血病及び慢性リンパ球性白血病からなる群から選択される形態であり得る。
【０１０４】
好ましくは、癌は、慢性骨髄性白血病、t-細胞リンパ腫、骨髄異形成症候群、結腸癌、膵臓癌、脳癌、中皮腫、急性前骨髄球性白血病(APL)及び急性骨髄性白血病(AML)からなる群から選択される。
【０１０５】
諸実施形態において、急性骨髄性白血病は、治療が困難であることが公知の癌であるため、急性骨髄性白血病の治療は非常に好ましいであろう。特にKasumi-1細胞に関する本明細書に記載の結果は、第1の態様の抗癌剤がAMLに対して非常に有効であり得ることを示している。
【０１０６】
癌が固形腫瘍である場合、様々な肉腫を含むがこれに限定されない消化管、食道、肝臓、胃、結腸、皮膚、脳、骨、乳房、肺、中皮及び軟部組織の癌、並びに前立腺癌のうち1つ以上であり得る。
【０１０７】
一実施形態において、癌は、臨床的に利用可能な三酸化ヒ素溶液による治療の適応とされ得るか、又は三酸化ヒ素溶液が有効性を示すことが示された任意の癌であり得る。一実施形態において、患者におけるリンパ腫、白血病又は固形腫瘍は、標準的な治療方法に不応であるか、又は白血病の再発症例である。
【０１０８】
抗癌剤は、単独で又は他の公知の治療剤、例えば、免疫療法剤、モノクローナル抗体、化学療法剤、放射線防護剤及び放射線療法剤等と組み合わせて用いられ得る。特に、抗癌剤の送達は、低メチル化剤、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、マスタード化合物、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、メトトレキセート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、エトポシド、テミポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、リン酸エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、BCNU、プロカルバシン、VM-26、インターフェロン、及び全トランスレチノイン酸(ATRA)又は他のレチノイドを含むがこれらに限定されない1つ以上の公知の抗腫瘍剤の投与前、投与中又は投与後に行われ得る。好適な低メチル化剤としては、デシタビン、グアデシタビン、アザシチジン等が挙げられ得る。PD-1阻害剤の好適な例としては、ペンブロリズマブ及びニボルマブが挙げられ、適当なPD-L1阻害剤としては、アテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブが挙げられる。
【０１０９】
様々な癌の治療における抗癌剤の治療用量及び投与頻度は癌の種類、状態の重症度、並びに個々の患者の年齢、体重、状態及び応答に依存する。重要なことに、このような投与は標準的な方法に基づき、かつ三酸化ヒ素の送達についての現在の投与計画の指針に従って好都合に決定され得る。送達効率により、本発明の抗癌剤を使用する投与レベルは、三酸化ヒ素の送達の現在の投与計画を若干下回るが、これらは依然として有用なガイドであり、最終投与は標準的な試験モデルに基づき調整され得る。
【０１１０】
本明細書で使用する用語「対象」又は「個人」又は「患者」は、ヒ素治療が所望される任意の対象、特に脊椎動物対象、更により特に哺乳動物対象を指し得る。好適な脊椎動物としては霊長類、鳥類、家畜動物(例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ)、臨床検査動物(例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター)、伴侶動物(例えば、ネコ、イヌ)及び捕獲された野生動物(例えば、キツネ、シカ、ディンゴ)が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい患者は、癌のヒ素治療を必要とするヒトである。しかし、前述の用語は、症状が必ずしも存在することを意味するものではないことが理解されるであろう。
【０１１１】
本発明の第6の態様によれば、抗癌剤を製造する方法であって:
(a)2個のシステイン残基を含む腫瘍ホーミングペプチドとヒ素化合物とを接触させる工程と、
(b)ヒ素を2個のシステイン残基各々に結合させて、結合したヒ素原子を含む環化腫瘍ホーミングペプチドを形成する工程と
を含み、それにより抗癌剤を製造する、前記方法が提供される。
【０１１２】
抗癌剤及びヒ素化合物は、第1の態様の任意の実施形態について記載した通りであり得る。
【０１１３】
ヒ素化合物は、酸化ヒ素又はハロゲン化ヒ素であり得る。好適な酸化ヒ素の非限定的な一例としては、フェニルアルシンオキシドがある。
【０１１４】
一実施形態において、ヒ素化合物は、ヒ素に結合したアルキル、ヒドロキシル又はアリール基を含み得る。
【０１１５】
一実施形態において、方法は2個のシステイン残基を呈するように、選択された腫瘍ホーミングペプチドを修飾する工程(a)(i)を含み得る。これは、所望の腫瘍ホーミングペプチドが2個の適当なシステイン残基をまだ呈していない場合に有用であり得る。本発明は、システイン残基を天然に含む腫瘍ホーミングペプチドのみに限定されない。システイン残基は、当技術分野で周知の幾つかの化学的方法のいずれかで腫瘍ホーミングペプチドに結合され得る。これは、方法の工程(b)においてヒ素にその後結合するこれらの2個の追加のシステイン残基である。
【０１１６】
2個のシステイン残基を呈するように腫瘍ホーミングペプチドを修飾する工程は、腫瘍ホーミングペプチドがN末端システイン残基とC末端システイン残基の両方を呈するような修飾であり得る。
【０１１７】
方法は、腫瘍ホーミングペプチドとヒ素化合物とを接触させる工程の前に、キャッピング化合物と腫瘍ホーミングペプチドのN末端システイン残基の遊離アミノ基とを反応させて、前記アミノ基の窒素に結合したキャッピング基を形成する工程も含み得る。
【０１１８】
本発明の第7の態様は、第6の態様の方法により製造された場合の抗癌剤に属する。
【０１１９】
本発明の第8の態様は、治療有効量のヒ素を患者に送達する方法であって、適量の第1の態様の抗癌剤又は第2の態様の医薬組成物を患者に投与する工程を含み、それにより治療有効量のヒ素を送達する、前記方法に属する。
【０１２０】
第8の態様の方法は、第1〜5の態様に記載された実施形態のいずれかに従って行われ得、かつこれらを含み得る。
【０１２１】
本発明の第9の態様は、癌を診断する方法であって:
(iv)少なくとも1個の放射標識原子を含む第1の態様の抗癌剤を患者に投与する工程と、
(v)抗癌剤を癌に局在させる工程と、
(vi)抗癌剤の少なくとも1個の放射標識原子の存在を検出する工程と
を含み、
それにより癌を診断する、前記方法に属する。
【０１２２】
幾つかの放射標識原子又は放射標識基は第9の態様の方法においてマーカーとして使用可能であることが予想される。好ましくは、放射標識原子又は放射標識基は、安定化基であるか、又はその一部である。
【０１２３】
好ましい実施形態において、安定化基は置換フェニルであり、放射標識原子又は放射標識基はフェニル環上で置換される。1つの好ましい放射標識原子又は放射標識基は、安定化基のフェニル環に存在する放射標識フッ素原子であり得る。フッ素は、ヒ素へのフェニル環の結合点に対してオルト、メタ又はパラであり得るが、好ましくはパラである。使用するフッ素同位体は、医用画像又は検出での使用について公知のもののいずれかであり得るが、好ましくは18Fである。単光子放射型コンピューター断層撮影法(SPECT)又はポジトロン断層撮影法(PET)又は当技術分野で周知の他の方法が検出工程で用いられ得る。
【０１２４】
抗癌剤を癌に局在させる工程は、抗癌剤を癌に結合させるか、又は癌細胞内で若しくはこれに隣接して凝集させる工程であり得る。
【０１２５】
したがって、第1の態様の抗癌剤の使用についての第9の態様における言及は、第1の態様に記載したこのような薬剤全てを含み、式Iの範囲内であるが、これらの既存の原子又は基の少なくとも1個が放射標識されるように修飾されたものを含むことが認識されるであろう。
【０１２６】
以下の実験の項は、本発明の化合物の一部の特性評価及びその有効性をより詳細に記載する。意図は、本発明が決して限定されることなく本発明の化合物及びこれらの有効性のある種の具体的な実施形態を例示することである。
【０１２７】
実験
ヒ素-ペプチド複合体(As(LHP))の調製
材料
市販の試薬は、指定されたように分析等級又はより高い純度ものであった。メタ亜ヒ酸ナトリウム(NaAsO2、≧99%)、トリエチルアミン((C2H5)3N、≧99%)、第2リン酸ナトリウム(Na2HPO4、≧99%)、リン酸水素二ナトリウム二水和物(NaH2PO4.2H2O、≧99%)及びフェニルアルシンオキシド(PAO、C6H5AsO、≧97%)及びTrizma(登録商標)塩基(≧99%、Tris)をSigma Aldrich社(USA)から得た。三ヨウ化ヒ素(III)(Asl3、≧98%)をStem Chemicals社(USA)から得、モノメチルアルソン酸(MMA(V)、CH5AsO3、>97%)をWako Pure Chemical Industries社(日本)から得、ギ酸(99%)、塩酸(HCl、32%)及び水酸化ナトリウム(NaOH、>97%)をAjax Finechem社から得た。前アセチル化ペプチドAcCAYHRLRRC及びAcCARHRYLRC(>98%)並びにCAYHRRLRC(>98%)はPeptide 2.0社(USA)によりカスタム合成された。AcCAYHRLRRC(白血病ホーミングペプチド)は、本明細書においてLHPと称され、AcCARHRYLRC(スクランブル化ペプチド)は本明細書においてsLHPと称される。Milli-Q水(18.2Ω、Millipore社)を(別段の指示がない限り)全ての希釈、並びにNaOH、リン酸緩衝液及びTris.HCl緩衝液の調整に使用した。
【０１２８】
方法
pHの測定
記載される場合、Mettler Toledo社製技術緩衝液(4.0、7.0及び9.2)での較正後、Mettler Toledo社製Seven Compact S220-Micro KitでpHを測定及び/又は確認した。
【０１２９】
緩衝液の調製
Table 1(表1)に列挙された適当な体積の貯蔵液A(NaH2PO4.2H2O、0.2M)及び貯蔵液B(Na2HPO4、0.2M)を用いて、リン酸緩衝液(pH7又はpH8、0.1M、100mL)を調製した。pHを先に記載したように求め、Milli-Q水で100mLに希釈する前に(最終濃度0.1M)、必要に応じて、貯蔵液A又は貯蔵液Bのいずれかの滴下添加により、pHを調整した。
【０１３０】
【表１】
2021509394.tif 000007
【０１３１】
pHを監視しながらHCl(0.2M)約5mLをTris(0.2M)50mLに添加し、次いでMilli-Q水で100mLに希釈することにより(最終濃度0.2M)、Tris-HCl緩衝液(pH9)を調製した。
【０１３２】
エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)
As-LHP複合体形成のESI-MS分析
ESI-MSを使用してLHPへのAs種の結合を検出し、複合体形成条件を最適化した。2個のCysチオール基をAsに配位させるために、アセチル化N末端を有する、直鎖立体構造のペプチドCAYHRLRRCを購入した。本明細書に記載されるように様々な条件下で反応を行った。分析前に溶液をMilli-Q水で希釈した(40倍)。図1AはLHPのESI-質量スペクトルを示している。
【０１３３】
ESI-MSの動作条件
正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化を使用するMicromass社製Quattro Microトリプル四重極質量分析計(Micromass社、UK)で、全ての質量スペクトルを収集した。加熱した乾燥窒素は、全ての実験で霧化及び乾燥ガスであった。キャピラリー電圧3.00kV、コーン電圧35V、供給温度80℃、脱溶媒和温度120℃及び脱溶媒和ガス流量400L/時を使用してスペクトルを収集した。
【０１３４】
Milli-Q水のベースラインスペクトルを収集した。試料の注入前に、スペクトルがベースラインスペクトルに類似するまで、原料をMilli-Q水で完全に洗い流した。1mLシリンジ(SGE Analytical Science社、オーストラリア)を用いて10μL/分の流量で各試料を注入した。As-LHP生成物のスペクトルを300〜1000のm/z範囲で収集した。データの取得は、連続体モードで行って、典型的には80回の走査を合計して代表的なスペクトルを得た。スペクトルをMassLynxソフトウェア(Waters社、2003)で処理した。曲線未満40%で1次多項式によるバックグラウンド減算を行い、Savitsky-Golayアルゴリズムで平滑化した。次いで、中心関数(Top、面積)でセントロイドスペクトルを得、各ピークをその各々のm/z比及び強度でアノテートした。
【０１３５】
As-LHP複合体及び前駆体の形成のための方法開発
HyAs(LHP)の形成
Table 2(表2)は、反応物Asl3及びLHPを用いて3連で反応を行って、HyAs(LHP)を調製した条件を含有する。インキュベーション前に全ての反応バイアルにN2を流した。代表的なアリコートを指定された時点(30分、1時間、2時間、4時間、8時間、16時間、24時間、48時間)でESI-MSで分析して、反応の進行を監視した。
【０１３６】
【表２】
2021509394.tif 000008
【０１３７】
MeAs(LHP)の形成
モノメチルアルシン酸(MMA(V)、3mM)とLHP(12mM)とを混合することによりMeAs(LHP)調製物を調査した。過剰量のLHPはMMA(V)の還元においてペプチドを酸化できるようにするためであった。化合物をリン酸緩衝液(H2PO4-/HPO42-、0.1M、pH8)中で混合し、これにN2を流し、37℃又は60℃で1時間、4時間、8時間、16時間又は24時間インキュベートした。生成物をESI-MSで分析した。
【０１３８】
PhAs(LHP)の形成
HyAs(LHP)の形成の結果に基づき、PhAs(LHP)を生成するための試みには、溶解するまで加熱することにより(80〜90℃、4〜8時間)調製されるフェニルアルシンオキシド(PAO)(リン酸緩衝液中10mM、H2PO4-/HPO42-、0.1M、pH8)溶液が必要であった。室温まで冷却した後、PAO(10mM)をLHP(3mM)に添加し、バイアルにN2を流し、37℃又は60℃で1時間、4時間、8時間、16時間又は24時間インキュベートした。生成物をESI-MSで分析した。
【０１３９】
PhAs(CAYHRRLRC)の形成についての試験
PhAsの複合体形成におけるアセチル基のLHPへの影響を調査するために、非アセチル化ペプチドCAYHRRLRCを用いて反応を試みた。先に記載したように、PAO(10mM)をリン酸緩衝液(H2PO4-/HPO42-、0.1M、pH8)中で調製し、冷却した。次いで、CAYHRRLRC(3mM)を添加し、これにN2を流し、得られた溶液を37℃又は60℃で1時間、4時間、8時間、16時間又は24時間インキュベートした。アリコートをESI-MSで分析した。
【０１４０】
PhAs(sLHP)の調製
PAO(先に記載したようにリン酸緩衝液中10mM、H2PO4-/HPO42-、0.1M、pH8)とsLHP(3mM)とを反応させることにより、PhAs(sLHP)を調製した。バイアルにN2を流し、これを37℃で8〜16時間インキュベートした。生成物をESI-MSで分析した。
【０１４１】
様々なAs-LHP複合体の精製
分析用高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
SCL 10A VPシステムコントローラー、SIL 10AD VPオートインジェクター及びLC10AT VO液体クロマトグラフィーユニットを備えるShimadzu社製分析用HPLCシステムを、DGU 14A脱ガス装置及びSPD M10A VPダイオードアレイ検出器と共に使用した。H2O(0.1%TFA)で20分間の平衡化後、Waters社製Sunfire C18カラム、5μm、4.6×250mm(No.186002560)を使用した。各々0.1%TFAのACN/H2Oで勾配溶出を行った。使用前に全ての溶媒を濾過及び超音波処理により脱気した。分析前に試料を0.20μMフィルター(Sartorius社)を通して濾過した。遊離LHP溶液を分析して、その溶出時間を確立した。
【０１４２】
分取用高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
分析用HPLCから得られた溶出プロファイルに基づき、Waters社製Sunfire Prep C18、OBD5μm、19×150mmカラム(No.186002568)及びλ220nmに設定された2489紫外可視検出器と共に用いられる、Waters社製Prep LCシステムを使用する分取用HPLCを用いて、As反応生成物の精製を行った。装置のHeでスパージする前に、全ての溶媒を事前に濾過し超音波処理した。分析前に、各試料を0.20μmフィルター(Sartorius社)を通して濾過した。試料を泳動させる前に、カラムをH2O(0.1%TFA)で30分間平衡化した。流量を20mL/分で維持した。Table 3(表3)は、利用した溶媒勾配を表している。遊離LHP溶液を標準物質として分析した。画分を収集し、ESI-MSで分析した。
【０１４３】
【表３】
2021509394.tif 000009
【０１４４】
AS複合体の乾燥
精製された混合物を得るために、同定されたHPLC画分を、Alpha 1〜2 LDplus凍結乾燥機(Christ社)を用いて一晩凍結乾燥した。
【０１４５】
As-LHP複合体の特性評価
ESI-MS
As-ペプチド複合体(100μM、0.5%ギ酸)溶液を調製し、先に記載した動作条件に従ってESI-MSで分析した。
【０１４６】
XAS
XAS分析をAs-LHP固体試料及び溶液試料で行った。As-LHPと固体窒化ホウ素(Sigma Aldrich社)とを十分に混合することにより、固体試料を調製した。XAFSmassプログラムを用いて、最初に希釈率を求めたが、蛍光モードでの分析には更に10倍希釈が最適であることが判明した。この得られた混合物を厚さ1mmのアルミニウム試料ホルダーに載置し、カプトンテープで封止した。迅速凍結中の結晶化を防止するためにAs溶液(600μL)をエチレングリコール(300μL)と混合することにより、溶液試料をXAS分析用に調製した。得られた溶液(最終As濃度1mM)をカプトンテープで封止した試料ホルダーにシリンジで移した。次いで、試料を液体窒素に迅速に浸漬し、液体ヘリウムクライオスタットに移し、これを10°Kで分析した。
【０１４７】
更に、As標準物質のX線吸収スペクトルを収集した。固体及び溶液標準物質をAs-LHP複合体について記載したように調製した。標準物質としては、Asl3、As2S3、NaAsO2、NaAsO4、MMA(V)、PAO、As(GS)3、MeAs(GS)2及びPhAs(GS)2が挙げられる。Australian National Beamline Facility社(ANBF社、beamline 20B)KEK、つくば市、日本にて、ビームエネルギー2.5GeV及びビーム電流300〜400mAで、ヒ素K吸収端XASデータを収集した。Si[111]チャンネルカット分光器を50%離調して、高調波を除去した。全てのスペクトルを、36素子のGeアレイ検出器(Eurysis/Canberra Industries社)及び1mm垂直スリット幅を用いて蛍光モードで約10°K(閉サイクルHe CryoIndustries社製REF-1577-D22クライオスタットで維持)で記録した。ヒ素K吸収端EXAFSスペクトルを以下のエネルギー範囲で収集した:吸収端前領域11640〜11840eV(10eVステップ);XANES領域11840〜11890eV(0.25eVステップ);及びEXAFS領域11890〜12468eV(k空間で0.05Å-1ステップ〜14.2Å-1)。ヒ酸ナトリウム固体標準物質を、較正用の試料の下流で透過モードで同時に分析し、それにより(吸収端エネルギーに対応する)一次導関数スペクトルの第1のピークのエネルギーを11871.7eVとして定義した。全てのデータ分析に対して平均2〜3回の走査を収集した。データ処理はEXAFSPAKで行った。EXAFSPAKのDATFITモジュールを多重線形回帰分析に使用した。BACKSUBを用いてバックグラウンド減算及び正規化を達成し、FEFF8.2を用いて、理論上の位相及び振幅関数を計算し、EXAFSデータをフィッティングした。
【０１４８】
NMR分光特性評価
As-LHP試料を90%H2O/10%D2O(HClでpH約4に調整)又は100%D2O中で分析した。Varian Unity社製500MHz分光計及びVnmrj 2.1Bソフトウェアを用いて、NMR実験を行った。1.5秒長の水選択的方形パルスを用いてプリサチュレーション又は励起スカルプティングのいずれかにより、残留水シグナルを抑制した。1H及び1H COSY、TOCSY、並びにNOESY実験によりプロトン共鳴の帰属を得た。1H及び13C COSY、TOCSY並びにNOESY実験により炭素の帰属を得た。COSY及びTOCSY実験で確立されたパルスシーケンスを用いてNOESY実験を行った。ACD/NMR Processor Academic Edition(登録商標)(2013、ACD Labs社、Toronto、カナダ)を用いてスペクトル処理を行った。全てのピークを4.8ppmの水ピークに対して較正した。
【０１４９】
グラファイト炉原子吸収分光法
ゼーマン効果バックグラウンド補正、AS-800オートサンプラー及びAA Accessory 7冷却システムを組み込んだWinlab 32 AA Furnaceプログラムを備えたPerkin-Elmer社製  AAnalyst 600原子吸収分光計を用いて、溶液をAsについて分析した。波長193.7nm及びスリット幅0.7nmに設定された無電極As放電ランプ(Perkin-Elmer社)により、約54Wの装置のエネルギーの読み値が得られた。Inorganic Ventures社、USAから購入した認定マトリックスマッチングヒ素標準液(Lot# J2-AS02116)を使用して、較正曲線を作成した。Pd及びMgマトリックス修飾剤溶液(Inorganic Ventures社、USAから購入)を使用してPd/Mgマトリックス修飾剤溶液(1mg/mL Pd、1mg/mL Mg(NO3)2)を調製した。発送されたオートサンプラーの容積は化学修飾剤(5μL)及び試料(20μL)であった。Table 4(表4)に示す炉動作条件を用いて、挿入型熱分解L'vovプラットホームを備える熱分解黒鉛被覆管の表面からヒ素を原子化した。
【０１５０】
【表４】
2021509394.tif 000010
【０１５１】
結果
As-LHP複合体の形成
HyAs(LHP)の形成
試行1からの生成物の分析では、所望のAs-LHP複合体が証明されなかった。ESI-MSでは、全ての時点で両方の温度に対して遊離ペプチド(図1A)のスペクトルが得られた。同様に、試行2〜6からの生成物のスペクトル分析では、全ての濃度、温度及び時点に対して遊離ペプチドの存在のみが示され、所望のAs-LHP複合体は生成できなかった。4時間にわたる60℃での試験では、ペプチド分解の兆候が示されたため、この温度での試験を中断した。試行9ではTris.HCl緩衝液(pH9)中の全ての試料についてAs-LHP複合体の兆候が得られなかった。しかし、トリエチルアミン(試行7)中及びpH8リン酸緩衝液(試行8)中で試みられた反応では白色沈殿物が直ちに生成された。この沈殿物の試料をMilli-Q水/0.5%ギ酸に溶解すると、ESI-MS分析では、いずれの場合も所望の生成物に起因し得るイオンの小さなシグナルが示されたが、豊富なピークはやはり遊離ペプチドのものであった。反応を24℃で行った場合、得られた沈殿物は24時間後も溶解せず、これが所望の生成物ではなかったことを示唆している。反応溶液を37℃でインキュベートすると、沈殿物は30分の時点までに溶解し、この時点及び1及び2時間の時点の試料では、遊離ペプチドに帰属し得る優勢なピーク、及び所望の生成物の形成を示す小さいピークを含む、ESI-MSスペクトルが得られた。pH8で着手される反応のための37℃で4時間のインキュベーション後の試料では、図1Bのスペクトルが得られ、各々[HyAs(LHP)+3H+]3+及び[HyAs(LHP)+2H+]2+に対応する、m/z431.4の豊富な分子イオン及びm/z646.8の適度に豊富なイオンを有するHyAs(LHP)の形成が確認された。m/z837.9での小さなピークは、HyAs(LHP)2の形成を示す[HyAs(LHP)2+3H+]3+として帰属され、所望の生成物HyAs(LHP)を単離するためには、反応の精製が必要であることが示された。各々[LHP+3H+]3+及び[LHP+2H+]2+に対応するm/z407.6及びm/z610.5の遊離ペプチドに関連するイオンの存在は、イオン化プロセスにおける関連のヒ素の喪失による可能性が最も高い。HPLC精製された生成物中のヒ素濃度の分析をGFAASで行って、純度を確認した。24及び48時間の時点のESI-MSスペクトルでは、ペプチド分解の兆候が示された。
【０１５２】
MeAs(LHP)の形成
MMA(V)及びLHP反応は全体にわたって無色のままであった。MeAs(LHP)生成物を示す小さなピークが37℃で4時間のインキュベーション後に検出され、これらのピークの存在量は8時間のインキュベーション後増加した。8時間のインキュベーションと16時間のインキュベーションとの間で有意差はなかったが、より長いインキュベーション期間では、再びペプチド分解が起こった。図1Cは、37℃で一晩(16時間)のインキュベーション後の反応からのESI-MSスペクトルを示しており、m/z655.1の分子イオン[MeAs(LHP)+2H+]及びm/z437.1の分子イオン[MeAs(LHP)+3H+]3+を有する所望の生成物MeAs(LHP)の生成が確認された。遊離ペプチド[LHP+3H+]3+及び[LHP+2H+]2+を示すm/z407.6及びm/z610.5の豊富なイオンは、イオン化プロセスと一致する。存在する他のイオン(m/z414.9[LHP+Na++2H+]3+、m/z444.8[MeAs(LHP)+Na++2H+]3+、m/z629.6[LHP+Na++H+]2+及びm/z666.4[MeAs(LHP)+Na++H+]2+)は、いずれの場合にもH+イオンのうち1つを置換するNa+イオンと類似のピークとして帰属される。興味深いことに、この反応については、ジペプチド生成物が証明されなかった。
【０１５３】
PhAs(LHP)の形成
PhAs(LHP)を生成するためのPAOとLHPとの反応により、混合後即時沈殿が生じた。HyAs(LHP)の場合に観察されたように、沈殿物のESI-MS分析では、遊離ペプチドに起因し得る大きなイオンピークが示された。37℃で1時間のインキュベーション後、沈殿物は溶解し、37℃で4時間のインキュベーション後、ESI-MS分析(図1D)では、[PhAs(LHP)+2H+]2+として同定されるm/z685.5での豊富なピークと、m/z457.6([PhAs(LHP)+3H+]3+)の適度に豊富なイオンが示された。HyAs(LHP)及びMeAs(LHP)の反応について観察されたように、遊離ペプチドはまた、以下の[00148]節に記載するようにHPLC精製後に除去される、m/z407.6[LHP+3H+]3+及びm/z610.5[LHP+2H+]2+に典型的に示されるピークから明らかなように、ESI-MSスペクトル中に存在した。37℃で8時間及び16時間のインキュベーション期間では、4時間のインキュベーションと同様のESI-MS結果が得られたが、24時間では再び生成物分解の兆候があった。
【０１５４】
As-LHP複合体の精製
分析用高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
As-ペプチド反応溶液のHPLC精製により、鋭い十分に分離されたピークが得られた。各クロマトグラムにおいて、遊離ペプチドは14.5分に現れる。HyAs(LHP)のピークは(b)17.2分に現れ、MeAs(LHP)(c)及びPhAs(LHP)は18.1分及び22.1分に各々溶出する。HPLCトレースを図2Aに示す。
【０１５５】
分取用高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
分取用HPLCによる反応及び精製のアップスケールにより、分析用HPLCにより得られたものと同様の溶出プロファイルが得られ、遊離ペプチドは16.9分に溶出し、HyAs(LHP)は18.1分、MeAs(LHP)は19.6分及びPhAs(LHP)は22.8分に溶出した。所望の画分を凍結乾燥し、溶媒を除去した後、AsLHP複合体各々に対応する白色固体が得られた。
【０１５６】
As-LHP複合体の特性評価
ESI-MS
HyAs(LHP)(a)、MeAs(LHP)(b)及びPhAs(LHP)(c)のESI-質量スペクトル(図2B)は全て、LHPに帰属し得、各々[LHP+3H+]3+及び[LHP+2H+]2+として同定され得るm/z407.4及び610.5にピークを示した。遊離LHPの存在は、イオン化プロセス中の関連するAsの喪失による可能性が高い。[LHP+H++Na+]2+として同定されるm/z622.3の存在量が少ないイオンは全てのAs(LHP)反応及び最終生成物のスペクトルに存在する。HyAs(LHP)(a)は、各々[HyAs(LHP)+2H+]2+及び[HyAs(LHP)+3H+]3+に帰属するm/z647.1の豊富なイオンとm/z431.4の適度に豊富なイオンとを示し、所望の生成物の生成が確認される。MeAs(LHP)(b)及びPhAs(LHP)(c)に対応する系の分析では、各々、[MeAs(LHP)+2H+]2+として同定されるm/z655.1及び[PhAs(LHP)+2H+]2+として同定されるm/z685.5の2+電荷イオンに関連する豊富なイオンとm/z437.1([MeAs(LHP)+3H+]3+)及びm/z457.6([PhAs(LHP)+3H+]3+)の適度に豊富な3+イオンとを有することが示される。
【０１５７】
X線吸収分光法(XAS)
図3はAs標準物質並びに第1の態様のAsペプチド抗癌剤HyAs(LHP)、MeAs(LHP)及びPhAs(LHP)の固体試料から得られたAs K吸収端XANESスペクトルの比較を示している。全ての固体試料についての(一次導関数スペクトルの第1のピークから得られた)吸収端の対応するエネルギー及びホワイトラインピークを以下のTable 5(表5)に列挙する。As(III)化合物である亜ヒ酸ナトリウム(11867.89eV、黒色の破線、図3)及びAs(V)化合物であるヒ酸ナトリウム(11871.38eV、黒色の点線、図3)の吸収端エネルギーは3.49eV異なった。As(III)複合体の吸収端エネルギーの調査から、硫黄結合As(III)化合物(短い破線、図3)が、酸素結合As(III)化合物(11867.89eV〜11868.64eV、破線、図3)よりも低い吸収端エネルギー(11866.09eV〜11867.07eV)を示すことが明らかである。HyAs(LHP)(緑の実線、図3)の吸収端エネルギーは11866.97eVであり、これは硫黄結合As(III)化合物の範囲の上端にあるが、酸素結合As(III)化合物である亜ヒ酸ナトリウムにより示されたものを有意に下回る。硫黄結合As(III)複合体のスペクトルのプロファイルではまた、約11871.7eVで特徴的な谷が示されたが、酸素結合As(III)化合物のスペクトルでは、吸収端後領域でこの顕著な谷は示されなかった(図3)。MeAs(LHP)(赤の実線)及びPhAs(LHP)(黒の実線)について得られたスペクトルではいずれも硫黄結合As(III)複合体の特徴的な吸収端後の谷が示された。この低下は、おそらくこの構造における酸素の存在により、HyAs(LHP)(緑の実線)のスペクトルにおいてそれほど著しくはなかった。
【０１５８】
【表５】
2021509394.tif 000011
【０１５９】
メチル化ヒ素(V)化合物MMA(V)(赤の点線)は、モノメチル化ヒ素(III)複合体MeAsIII(GS)2(11866.44eV、赤の短い破線、図3)よりも2.75eV高い11870.64eVの吸収端エネルギーを示した。MeAs(LHP)(赤の実線、図3)の吸収端エネルギーは11866.27eVに現れ、硫黄結合As複合体のものに相当する。更に、MeAs(LHP)のXASスペクトルの吸収端後プロファイルは、MeAsIII(GS)2スペクトルのものに酷似していた。PhAsO(青の破線、図3)は11868.64eVの吸収端エネルギーを示し、これは亜ヒ酸塩のものに最も近い。これは、ヒ素が、いずれの場合も電気陰性Oに結合しているという事実を表している。PhAs(LHP)化合物(黒の実線)は、C/S結合As(III)標準物質の低範囲で生じる吸収端エネルギー(11865.90eV)を示した。PhAs(LHP)スペクトルの形状は、MeAsIII(GS)2スペクトル(赤の短い破線)のもの及びPhAsIII(GS)2スペクトルの(緑の破線)のものに似ていたが、ホワイトラインピークの強度はどちらの標準物質よりも高かった。
【０１６０】
Table 6(表6)は、HyAs(LHP)から得られたEXASFSデータに対して行われたカーブフィッティングシミュレーションの概要を表している。これらは、平面三角形又は三角錐形で3個の原子に典型的には配位しているAs(III)に対応する。ヒ素に配位した3個の硫黄原子(フィッティング2)のシミュレーションでは、2個の硫黄原子(フィッティング1)のものと比較してフィッティング誤差が増加し、2個の硫黄原子がヒ素に結合している可能性が高いことが示唆された。ヒ素に対する第3の後方散乱体のフィッティングからは、第3の原子が、酸素又は炭素(フィッティング3及び4)のいずれかである可能性が高いことが示された。2個の硫黄原子及び1個の炭素原子のシナリオでは、最初に負のデバイワラー因子となった。そのため、その後因子を固定して、フィッティング4(Table 6(表6))に示す結果を得た。図4は、フィッティング3に対する実験及び計算EXAFS及びフーリエ変換分析を示しており、2.5Å未満の動径分布について合理的な一致を示している。同様に調査した他の可能性のある構造としては、1個の硫黄及び2個の酸素原子(フィッティング5)、並びに1個の硫黄及び2個の炭素原子が挙げられ、1個の硫黄及び2個の炭素原子では、物理的に実行不可能な負のデバイワラー因子となったことにより考慮されなかった。デバイワラー因子を固定して、この誤差を減少させることにより、非合理的なE0値になった。
【０１６１】
【表６】
2021509394.tif 000012
【０１６２】
Table 7(表7)(以下)は、MeAs(LHP)について得られたEXAFSスペクトルの可能性のあるモデルのシミュレーションの概要を示している。同様に、硫黄に単独に配位したヒ素の最初のフィッティングでは、3個の硫黄原子へのAsの配位によりフィッティング誤差が増加したため、2個の硫黄原子のモデルで、より近いフィッティング(フィッティング1対フィッティング2)が得られることが確認された。ヒ素に結合した1個の硫黄及び2個の酸素原子又は2個の炭素原子のいずれかの組み合わせのシナリオを調査する試みは、デバイワラー因子、E0又はこれらのパラメーターの両方について実行不可能であるという結果になった。更に、これは、パラメーターを固定することで修正できなかった。2個の硫黄原子及び1個の酸素又は1個の炭素原子のいずれかに結合したヒ素についてのフィッティングでは、実行可能な結果となった。結論として、2個の硫黄及び1個の酸素(フィッティング3)又は1個の炭素(フィッティング4、図5に図示)のいずれかに結合したAs(III)について最適なフィッティングが得られた。
【０１６３】
【表７】
2021509394.tif 000013
【０１６４】
Table 8(表8)はPhAs(LHP)のEXAFSスペクトルからのAs配位のモデルから得られたシミュレーションの概要を示す。再び、3個の硫黄原子(フィッティング2)よりも2個の硫黄原子(フィッティング1)がヒ素に配位している場合、最適なフィッティングが得られた。Asが1個の硫黄原子及び2個の酸素原子又は1個の硫黄原子及び2個の炭素原子のいずれか(フィッティングは図示せず)に配位しているモデルについては不良な結果となった。2個の硫黄原子及び1個の酸素原子又は1個の炭素原子のいずれかに結合したヒ素を含むモデルでは、最初に非合理的なデバイワラー因子となり、この因子を固定すると改善され、有望なフィッティング(フィッティング3及び4)が得られたが、2S及び1Cと比較して2S及び1Oのフィッティング誤差が有意に大きかった。そのため、フィッティング4の結果を図6に示す。
【０１６５】
【表８】
2021509394.tif 000014
【０１６６】
核磁気共鳴分光法
組み合わせた1H及び1H 2-D COSY、TOCSY並びにNOESY NMRスペクトルデータ(Table.9(表9))を用いて、遊離ペプチドAcCAYHRLRRC中の残基の1H NMR共鳴の帰属を行った。1H及び１３H 2-D COSY、TOCSY並びにNOESY NMRスペクトルデータにより、13C NMRの帰属を行った。また、ペプチドAcCAYHRLRRC中の個々のシステイン残基を具体的に同定し、帰属するために、スペクトルを同じ条件下でCAYHRRLRCから得た。
【０１６７】
【表９Ａ】
2021509394.tif 000015
【０１６８】
【表９Ｂ】
2021509394.tif 000016
【０１６９】
スルフヒドリル基へのAsの結合と一致した化学シフトが存在する2個のシステインとは別に、MeAs(LHP)及びPhAs(LHP)のNMRスペクトルでは、全てのアミノ酸残基について同じパターンの化学シフトが得られた(以下のTable.10(表10)及びTable 11(表11))。また、ピークは、MeAs(LHP)についてはメチル基及びPhAs(LHP)についてはフェニル環に帰属された。
【０１７０】
【表１０】
2021509394.tif 000017
【０１７１】
【表１１】
2021509394.tif 000018
【０１７２】
黒鉛炉原子吸光分光法
GFAASを行って、As-ペプチド生成物の純度を確認した。結果を以下のTable 12(表12)に示す。理論的及び実験的に求められたAs濃度間で良好な一致が見られる。
【０１７３】
【表１２】
2021509394.tif 000019
【０１７４】
PhAs(LHP)の異性体の調査
方法
Prominence-i LC2030Cシステムコントローラー、オートインジェクター及び液体クロマトグラフユニットを備えるShimadzu社製分析用HPLCシステムをPhAs(LHP)の精製に使用した。H2O(0.1%TFA)で20分間の平衡化後、Waters社製Sunfire C18カラム、5μm、4.6×250mm(No. 186002560)を使用した。使用前に、濾過及び超音波処理により、全ての溶媒を脱気した。37℃で一晩インキュベートしたMilli-Q水(総量1mL)中でのLHP(3mM)とPAO(10mM)との反応から、PhAs(LHP)の試料を新たに調製した。次いで、カラムへの注入及び分析前に、0.2μmフィルター(Sartorius社)を通して濾過し、目的の画分の溶出時間を求めた。最適なピーク分離に使用した逆相分析溶出勾配を以下のTable 13(表13)に列挙する。
【０１７５】
【表１３】
2021509394.tif 000020
【０１７６】
分析用HPLCから得られた溶出プロファイルに基づき、Shimadzu社製SIL-10APオートサンプラー、Shimadzu社製LC-20AP分取用液体クロマトグラフ、Shimadzu社製FCV-200AL4次バルブ、Shimadzu社製SPD-M20Aダイオードアレイ検出器、Shimadzu社製DGU-20A5R脱気ユニット、Shimadzu社製CDM-20A通信バスモジュール、LabSolutionsソフトウェア及びLuna 5u C18(2)カラム(250×21.20mm、5μ、Phenomenex社)を使用する分取用HPLCを用いて、PhAs(LHP)の精製を行った。カラムをH2O(0.1%TFA、20分)で平衡化した。最適な反応条件(方法開発の結果から決定)に従って調製したPhAs(LHP)の溶液(6mL)をカラムに注入し、Table 13(表13)に詳述された溶出勾配を用いて分離した。流量は15mL/分で維持し、画分をλ254nmで検出した。主画分を収集し、ESI-MSにより特性評価した。必要な場合、同定されたHPLC画分をAlpha 1-2 LDplus凍結乾燥器(Christ社)を用いて乾燥して、純粋な化合物を得た。
【０１７７】
結果
上記の分離方法を用いて、2つのピーク(15.99及び16.86分に溶出、分取用HPLC、図7)が明らかになった。単離及び収集したとき、各ピークはESI-MSによりPhAs(LHP)として同定された。2つの画分のスペクトル(図8)はLHP及びPhAs(LHP)に起因し得るESI-MSピークと類似していた。m/z407.5、414.1、610.7及び619.8に示されるピークはLHPに起因し、各々[LHP + 3H+]3+、[LHP+2H++Na+]3+、[LHP+2H+]2+及び[LHP+2H++H2O]2+として同定された。遊離ペプチドの存在は、イオン化プロセスの結果である。m/z457.4、463.5、685.5及び696.7に示されるピークは、PhAs(LHP)を示し、各々[PhAs(LHP)+3H+]3+、[PhAs(LHP)+3H++H2O]3+、[PhAs(LHP)+2H+]2+及び[PhAs(LHP)+H++Na+]2+として同定された。
【０１７８】
各画分からの得られた化合物(単離及び乾燥)をMilli-Q水(3mM)に溶解し、分析用HPLCにより再調査した。いずれの場合も、最初の分取用HPLCクロマトグラムで先に観察されたように、HPLCクロマトグラム(図9)から、2つのピークの存在が確認された。溶出時間はPhAs(LHP)の溶出と一致していた。これは、PhAs(LHP)の自発的に変換する異性体が存在し、3つの異なる部分(フェニル基及びペプチドの2つの非対称な末端)に結合しているAs原子のキラル中心と一致し、孤立電子対を含有することを示している。これは以下
【０１７９】
【化５】
2021509394.tif 000021
【０１８０】
(式中、(a)はR異性体であり、(b)はS異性体である)
に示される。
【０１８１】
As-LHP複合体の安定性試験
方法
As-LHP複合体の安定性をXASにより試験した。HyAs(LHP)、MeAs(LHP)又はPhAs(LHP)(1.5μm)を37℃で維持したMilli-Q水に溶解することにより、試料を調製した。分析直前に、迅速凍結中の結晶化を防止するためにヒ素-ペプチド溶液(600μL)をエチレングリコール(300μL)と混合した。得られた溶液(最終As濃度1mM)を試料ホルダーにシリンジで移し、これをカプトンテープで封止した。次いで試料を液体窒素に迅速に浸漬し、液体ヘリウムクライオスタットに移し、10°Kで分析した。
【０１８２】
Australian National Beamline Facility社(ANBF社、beamline 20B)KEK、つくば、日本にて、ビームエネルギー2.5GeV及びビーム電流300〜400mAで、ヒ素K吸収端XASデータを収集した。Si[111]チャンネルカット分光器を50%離調し、高調波を除去した。全てのスペクトルを、36素子のGeアレイ検出器(Eurysis/Canberra Industries社)及び1mm垂直スリット幅を用いて蛍光モードで約10°K(閉サイクルHe CryoIndustries社製REF-1577-D22クライオスタットで維持)で記録した。XASスペクトルを0時間の時点、次いで、4時間又は14時間のその後の時点で得た。2つの時点からのスペクトルを処理し、EXAFSPAKを用いて分析した。
【０１８３】
また、2つの最も有望なAs-LHP複合体の安定性を細胞培地(IMDM)中で試験した。MeAs(LHP)又はPhAs(LHP)(1.5mM)を37℃で維持したIMDMに溶解することにより、試料を調製した。Milli-Q水安定性試験についても同じプロトコルに従った。XASスペクトルを0時間の時点、次いで、24時間で得た。Milli-Q水試料と同様に、2つの時点からのスペクトルをEXAFSPAKを用いて処理、フィッティング、及び定量した。
【０１８４】
結果
図10は、Milli-Q水中のHyAs(LHP)の2つの時点(0時間、青及び4時間、赤)について得られたスペクトルの比較を示している。4時間の試料についてのスペクトルは、0時間の試料について得られたものと明らかに異なり、複合体がMilliQ水中で4時間安定でないことを示している。4時間の試料についてのスペクトルは、Milli-Q水中のヒ素について得られたものと類似しており、LHPがもはやヒ素に結合してないことを示唆している。吸収端のシフトは、硫黄原子よりも酸素原子に結合したヒ素を示している(硫黄原子はインタクトなHyAs(LHP)複合体の場合である)。
【０１８５】
図11は、Milli-Q水中のMeAs(LHP)の2つの時点(0時間、青及び14時間、赤)について得られたスペクトルを示している。2つのスペクトルは93%一致し、緑でプロットされた残差は2つのスペクトル間の異常が小さいことを示している。
【０１８６】
図12は、Milli-Q水中のPhAs(LHP)の2つの時点(0時間、青及び14時間、赤)について得られたスペクトルの比較を示している。2つのスペクトル間の一致は、ほぼ100%であり、残差は全体を通じて0に非常に近く、顕著な残差の特徴は示されなかった。これは、PhAs(LHP)複合体がMilli-Q水中で14時間安定であることを示している。
【０１８７】
図13は、IMDM(細胞培地)中のMeAs(LHP)の2つの時点(0時間、青及び24時間、赤)について得られたスペクトルを示している。2つのスペクトルは82%一致しており、緑でプロットされた残差は2つのスペクトル間の異常を示している。最も顕著な変化は、吸収端後の谷の減少にはっきり見られ得る。
【０１８８】
図14は、IMDM(細胞培地)中のPhAs(LHP)の2つの時点(0時間、青及び24時間、赤)について得られたスペクトルの比較を示している。2つのスペクトル間の一致は97%であり、残差(緑)はわずかな残差の特徴を含有している。これは、PhAs(LHP)複合体がIMDM中で24時間合理的に安定であることを示している。
【０１８９】
As(LHP)複合体の細胞毒性(MTT)試験
方法
細胞株及び培養手順
細胞培養及び細胞アッセイは全て、滅菌技術を用いて、安全キャビネット(クラスII、Email Westinghouse Pty Ltd社)内で行われた。
【０１９０】
ヒト慢性骨髄性白血病(K562)細胞
K562細胞は、53歳女性由来のヒト慢性骨髄性白血病細胞/骨髄細胞であり、最初にATCC社から得た。この細胞株は、LHP、したがって潜在的にAs-LHP複合体の標的であるため選択された。MTTアッセイを用いて、亜ヒ酸塩、Asl3、PAO、LHP、HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)、アセタルゾール、ATO、sLHP及びPhAs(sLHP)の毒性及びIC50値を確立した。
【０１９１】
K562細胞を半永久培養物(semi-permanent)(ATCC社から購入)から増殖させた。細胞をIMDM(イスコフ改変ダルベッコ培地、Invitrogen社、500mL)、ウシ胎児血清(FBS、Bovogen、Thermo Scientific社、10%v/v)及びペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco、Life Technologies社、10mL/500mL IMDM、各々200IU/mL及び200μg/mL)を含有する増殖培地(GM)中で増殖させた。K562培養物を37℃、5%CO2インキュベーター(Heraeus、Thermo Scientific社、USA)内の75cm2の表面積の細胞培養フラスコ(Greiner社)中で増殖させた。細胞を、典型的には1週間に2回継代培養した。細胞懸濁液を遠心分離し(1500rpm、5分、Heraeus Labofuge 300)、ペレットをGM(5mL)に再懸濁し、2滴を細胞培養フラスコ内のGM(25mL)に添加した。
【０１９２】
ヒト急性前骨髄球性白血病(HL-60)細胞
HL-60細胞は、急性前骨髄球性白血病を有する36歳コーカサス人女性由来のヒト急性前骨髄球性白血病細胞である。HL-60細胞を半永久培養物(ATCC社から最初に購入)から増殖させた。これらのAPL細胞は、CAYHRLRRCペプチドにより標的とされることが公知の別の白血病細胞株であり、現在、As療法、即ち、ATOで処理される状態を表す。細胞をIMDM(500mL)、FBS(20%v/v)及びペニシリン/ストレプトマイシン(100mL/500mL IMDM、各々200IU/mL及び200μg/mL)を含有する増殖培地(GMH)中で増殖させた。細胞を、GMHを用いてK562細胞と同じ方式で、典型的には、1週間に2回継代培養した。
【０１９３】
ヒト急性骨髄芽球性白血病(Kasumi-1)細胞
Kasumi-1細胞をCellBank Australiaから購入した。Kasumi-1細胞は、7歳日本人男性由来のヒト急性骨髄芽球性白血病細胞/骨髄細胞である。細胞株は、AMLの治療剤としてのPhAs(LHP)の可能性を調査するために選択された。Kasumi-1細胞をRPMI-1640(ロズウェルパーク記念研究所培地、Invitrogen社、500mL)、FBS(20%v/v)及びペニシリン/ストレプトマイシン(10mL/500mL IMDM、各々200IU/mL及び200μg/mL)を含有する増殖培地(GM1)中で増殖させた。Kasumi-1細胞を37℃、5%CO2インキュベーター内の75cm2の表面積の細胞培養フラスコ中で増殖させた。細胞を、典型的には1週間に2回継代培養した。簡単に言えば、半分の細胞懸濁液を新鮮なGM1と交換し、細胞密度を、3×105〜3×106細胞/mLで維持した。
【０１９４】
ヒトT細胞白血病(KARPAS45)細胞
KARPAS45細胞は、処理前の2歳男性由来のヒトT細胞白血病細胞/骨髄細胞であり、RPMI-1640、FBS(20%v/v)、グルタミン(2mM、Gibco、Life Technologies社)及びペニシリン/ストレプトマイシン(10mL/500mL IMDM、各々200IU/mL及び200μg/mL)を含有する増殖培地(GMK)中で半永久培養物(CellBank Australiaから購入)から増殖させた。KARPAS45培養物を37℃、5%CO2インキュベーター内の75cm2の表面積の細胞培養フラスコ中で増殖させた。半分の体積を新鮮なGMKと交換することにより、細胞を典型的には1週間に2回継代培養した。
【０１９５】
ヒト肝臓癌(HepG2)細胞
HepG2細胞は、15歳コーカサス人男性由来のヒト肝臓癌細胞である。これらは、接着性の上皮様細胞であり、半永久培養物(最初にATCC社から購入)から増殖させた。細胞をDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地、Life Technologies社、500mL)、FBS(50mL、10%v/v)及びペニシリン/ストレプトマイシン(10mL、各々200IU/mL及び200μg/mL)を含有する増殖培地(GMA)中で増殖させた。コンフルエンスに到達するまで、細胞を典型的には1週間に2回継代培養した。細胞培地を除去及び廃棄して、細胞をPBSで洗い流し、次いで、またこれを除去及び廃棄した。トリプシン(5mL、PBS中0.25%w/v、Gibco、Life Technologies社)を添加し、細胞が脱着するまで、フラスコをインキュベートした。GMA(5mL)をフラスコに添加し、フラスコの内容物を滅菌チューブに移し、遠心分離した(1500rpm、5分)。上清の除去後、ペレットをGMA(5mL)に再懸濁し、細胞溶液1〜2滴を細胞培養フラスコ内のGMA(25mL)に添加した。
【０１９６】
A549ヒト肺癌細胞
A549細胞は58歳男性由来のヒト肺癌細胞である。これらは、接着性の上皮様細胞であり、CellBank Australiaから購入した半永久培養物から増殖させた。上記のHepG2細胞と同じ方式で、細胞を増殖及び継代培養した。また、これらの細胞は、As-ペプチド複合体により認識されるか、又は標的とされるべきではない固形腫瘍由来の増殖の早い細胞を代表して選択された。
【０１９７】
チャイニーズハムスター固形腫瘍細胞
チャイニーズハムスター(CH)固形腫瘍細胞は、(標的とされるべきではない)非ヒト細胞株として選択された。これらは接着性の上皮様細胞であり、半永久培養物から増殖させた。上記のHepG2細胞と同じ方式で、細胞を増殖及び継代培養した。
【０１９８】
ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)
血液(40mL)を健康な志願者から抜き取った。滅菌PBS(15mL)を血液20mLに添加した。各チューブを3〜4回反転して混合した。血液を約15mLのFicoll-Paque(商標)PLUS(GE Healthcare社)で下層にし、30分間遠心分離(ブレーキオフ)した(1700rpm、Heraeus Labofuge 400 R遠心分離機)。単核細胞層を新しいチューブに移し、滅菌PBS(50mL)で2回洗浄した。チューブを静かに反転して混合し、次いで、遠心分離した(1500rpm、15分)。単核細胞を(元の血液量に等しい)PBSに再懸濁し、血球計算機で計数した。遠心分離後、細胞を十分なRPMI-1640に再懸濁し、必要な細胞集団を得た。較正アッセイを行い、hPBMCを用いたMTTアッセイの対照の最適な吸光度(1.00〜2.00)が106細胞/ウェルで得られることが判明した。
【０１９９】
MTT細胞毒性アッセイ
Carmichaelら(Cancer Res. 1987、47、936)及びMosman(J. Immunol. Methods 1983、65、55)により記載されたMTTアッセイの適応により、化合物の細胞毒性を評価した。MTTアッセイは、生細胞によるホルマザンへのテトラゾリウム塩の変換に基づくものであり、細胞の生存を比色試験により定量することを可能にする。このアッセイでは、アッセイで使用した細胞株に対する様々な化合物の毒性を比較できるように各化合物のIC50が確立される。このアッセイを使用して、ヒ素ペプチド複合体の毒性を他のヒ素化合物と比較し、抗白血病治療剤としてのこれらの標的化能力及び可能性を調査した。PhAs(LHP)の2つの異性体の細胞毒性を、先に記載したように、MTTアッセイにより、K562及びHL-60細胞について評価した。処理直前に、処理溶液をIMDM中で新たに調製し、連続的に希釈した。
【０２００】
細胞毒性アッセイを行って、様々な濃度範囲の亜ヒ酸ナトリウム(亜ヒ酸塩、Sigma Aldrich社)、フェニルアルシンオキシド(PAO、Sigma Aldrich社)、Asl3、アセタルゾール(アセタルゾン、Sigma Aldrich社)、ATO(Phebra社から得たPhenasen製剤)、スクランブル化LHP(sLHP)、LHP(Peptide 2.0社、USAからいずれも得た)、PhAs(LHP)及びPhAs(sLHP)を試験した。
【０２０１】
K562細胞に対するMTT細胞毒性アッセイのプロトコル
K-562細胞(8×105細胞)を60mm細胞培養皿内の増殖培地(5mL)に播種し、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。試験した化合物は、亜ヒ酸塩、Asl3、ATO、アセタルゾール、LHP、HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)、sLHP及びPhAs(sLHP)であった。処理直前に処理溶液をIMDM中で新たに調製した。化合物をIMDM中で連続的に希釈して、分析用に様々な濃度を得た。各皿からの細胞懸濁液を遠心分離し(1200rpm、5分、Heraeus Labofuge 300)、ペレットを、処理溶液(3mL)又は対照細胞の場合IMDM(3mL)に再懸濁し、皿に戻し、インキュベーション(37℃、5%CO2)した。24時間後、細胞溶液を遠心分離した(1200rpm、5分)。滅菌PBSの添加により細胞を2回洗浄し、次いで遠心分離した(1200rpm、5分)。細胞をIMDM(5mL)に再懸濁し、きれいな皿に戻した。MTT(400μL、2mg/mL、IMDM)を各皿に添加し、皿をインキュベートした。4時間後、溶液を遠心分離し(1200rpm、5分)、DMSO(1.8mL)をペレットに添加して、ホルマザン結晶を溶解した。各溶液を96ウェルプレート(1チューブ/カラム、Cellstar、Greiner Bio-one社、Australia)にピペットで入れた(200μL/ウェル)。
【０２０２】
HL-60細胞に対するMTT細胞毒性アッセイのプロトコル
試験した化合物は、亜ヒ酸塩、ATO、アセタルゾール、LHP、PhAs(LHP)、sLHP及びPhAs(sLHP)であった。ペプチドの費用が高く、PhAs(LHP)複合体の安定性がHyAs(LHP)及びMeAs(LHP)よりも改善されたことにより、HyAs(LHP)及びMeAs(LHP)2つの複合体の試験を中断することが決定された。処理直前に、処理溶液をIMDM中で新たに調製した。化合物をIMDM中で連続的に希釈して、分析用に様々な濃度を得た。皿とチューブとの間の移動による細胞の喪失により、Tadaら(J. Immunol. Methods 1986、93、157)による別のMTTプロトコルをK562細胞で最初に試行した。得られたIC50値が、先の方法に相当することが決定されたため、新しいプロトコルを、HL-60細胞で行われるMTTアッセイに使用した。HL-60細胞溶液(2×105細胞/50μL、IMDM)を各ウェル(列2〜7、カラムB-I、96ウェル平底プレート、Greiner社)に添加した。次いで、処理溶液(50μL)をカラム3〜11(カラム3の濃度が最も低く、カラム11の濃度が最も高い)の各ウェルに添加し、IMDM(50μL)を対照ウェル(カラム2)に添加した。プレートを24時間インキュベートし(37℃、5%CO2)、その後MTT溶液(20μL、5mg/mL、IMDM)を各ウェルに添加し、プレートをインキュベーターに戻して、ホルマザンの発現を可能にした。4時間後、可溶化溶液(100μL、0.01M HCL中10%SDS)を各ウェルに添加し、プレートを一晩インキュベートした。
【０２０３】
Kasumi-1細胞に対するMTT細胞毒性アッセイのプロトコル
Kasumi-1細胞を2×105細胞/ウェルの密度で播種した。評価した化合物には、メタ亜ヒ酸ナトリウム(亜ヒ酸塩、Sigma Aldrich社)、三酸化ヒ素(ATO、Phebra社)、フェニルアルシンオキシド(PAO、Sigma Aldrich社)、Peptide 2.0社、USAから得た白血病ホーミングペプチド(LHP)及びスクランブル化白血病ホーミングペプチド(sLHP)、並びに合成、精製及び特性評価されたPhAs(LHP)及びPhAs(sLHP)が含まれた。処理直前に、処理溶液をRPMI-1640中で新たに調製した。化合物をRPMI-1640中で連続的に希釈して、分析用に様々な濃度を得た。MTTアッセイをHL-60細胞と同じ方式で少なくとも3回行って、IC50値の平均及び標準偏差を得た。
【０２０４】
KARPAS45細胞に対するMTT細胞毒性アッセイのプロトコル
処理直前に、処理溶液をRPMI-1640中で新たに調製し、化合物をRPMI-1640中で連続的に希釈して、分析用に様々な濃度を得た。試験した化合物は亜ヒ酸塩、ATO、アセタルゾール、LHP、PhAs(LHP)、sLHP及びPhAs(sLHP)であった。KARPAS45細胞溶液(6×105細胞/50μL、RPMI-1640)を各ウェル(列2〜4、カラムB-I、96ウェル平底プレート、Greiner社)に添加した。処理溶液(50μL)をカラム3〜11(カラム3の濃度が最も低く、カラム11の濃度が最も高い)の各ウェルに添加し、RPMI-1640 (50μL)を対照ウェル(カラム2)に添加した。MTT溶液をRPMI-1640で調製したことを除いて、前節に概説したHL-60細胞と同じ方式で、残りのアッセイを行った。
【０２０５】
HepG2、A549及びチャイニーズハムスター固形腫瘍細胞に対するMTT細胞毒性アッセイのプロトコル
細胞溶液(1×104細胞/100μL GMA)を各ウェル(列2〜7、カラムB-I、96ウェル平底プレート、Greiner社)に添加し、24時間インキュベートした。GMAを除去し、新たに調製した処理溶液(100μL、DMEM中で連続的に希釈した化合物)をカラム3〜11(カラム3の濃度が最も低く、カラム11の濃度が最も高い)の各ウェルに添加し、DMEM(100μL)を対照ウェル(カラム2)に添加した。試験した化合物は亜ヒ酸塩、ATO、PAO、アセタルゾール、LHP及びPhAs(LHP)であった。DMEMを用いてMTT溶液を調製したことを除いて、HL-60細胞で使用したのと同じプロトコルを用いて、残りのアッセイを行った。
【０２０６】
hPBMCのMTT細胞毒性アッセイのプロトコル
処理溶液をHL-60細胞と同じ方式で処理日に新たに調製した。試験した化合物は亜ヒ酸塩、ATO、PAO、アセタルゾール、LHP及びPhAs(LHP)であった。hPBMC細胞溶液(1×106細胞/50μL RPMI-1640)を各ウェル(列2〜4、カラムB-I、96ウェル平底プレート、Greiner社)に添加し、HL-60細胞と同じプロトコルを用いて、残りのアッセイを行った。
【０２０７】
MTT比色試験及びIC50計算
K562細胞に対するアッセイの比色試験及び計算
吸光度を570nm及び630nm(BMG LabTech社製Polarstar Omegaマイクロプレートリーダー)で測定した。細胞生存率を方程式1
【０２０８】
【数１】
2021509394.tif 000022
【０２０９】
で求めた。
【０２１０】
計算した細胞生存率を処理濃度に対してプロットして、それぞれの種のIC50値を求めた。全てのMTTアッセイを少なくとも3回行って、統計分析を行うのに必要とされる必要な検出力を得た。一元配置ANOVA及びTukey多重比較検定(GraphPad社製Prism)を用いて、統計分析を行った。
【０２１１】
HL-60、Kasumi-1、KARPAS45、HepG2、A549、CH固形腫瘍細胞及びhPBMCに対するアッセイの比色試験及び計算
吸光度の読み値を570nm及び690nmで記録して(BMG LabTech社製Polarstar Omegaマイクロプレートリーダー)、濃度反応曲線(細胞生存率を計算するために方程式2を使用)を得、各化合物のIC50値を計算した。別段の指示がない限り、MTTアッセイを少なくとも3回行った。一元配置ANOVA及びTukey多重比較検定(GraphPad社製Prism)を用いて、統計分析を行った。
【０２１２】
【数２】
2021509394.tif 000023
【０２１３】
結果
K562及びHL60細胞に対するPhAs(LHP)の異性体のMTT結果及びIC50値
K562とHL-60細胞の両方に対するPhAs(LHP)異性体画分のMTT細胞毒性試験から得られたIC50値では、各HPLC画分から得られた生成物が同じ毒性を示すことが示されたTable 14(表14)。
【０２１４】
【表１４】
2021509394.tif 000024
【０２１５】
ラセミ化が室温以上で起こり、これが生物学的活性に影響を与えないことが明らかであったため、全ての更なる試験をラセミ混合物(非分割異性体の画分)で行った。
【０２１６】
K562細胞に対するMTT結果及びIC50値
24時間の処理後、K562細胞に対するMTTアッセイから得られた濃度反応曲線を図15に示す。細胞死を引き起こすヒ素処理により、試験した化合物の大半について典型的な濃度反応曲線が得られた。24時間の処理後、K562細胞に対して亜ヒ酸塩、Asl3、ATO、PAO、HyAs(LHP)、MeAs(LHP)、PhAs(LHP)及びPhAs(sLHP)について得られたIC50値を図16及びTable15(表15)に示す。亜ヒ酸塩及びAsl3のIC50値は酷似していた(各々18.63±0.49μM及び18.14±0.75μM)。ATO処理では、亜ヒ酸塩(NaAsO2)のIC50値の約半分の9.74±0.16μMのIC50値になり、ATOが亜ヒ酸塩の2倍のヒ素原子を含有していることと一致する。PAO(IC50:3.40±0.42μM)はATOより3倍毒性が高く、フェニル基の存在に関連する親油性の増加による、おそらくこの化合物の取り込みの増加を示している。或いは、フェニルは、細胞標的との相互作用に直接関わり得る。
【０２１７】
【表１５】
2021509394.tif 000025
【０２１８】
HyAs(LHP)はATOの半分の数のヒ素原子を含有しているにもかかわらず、HyAs(LHP)処理では、ATOのIC50の60%であるIC50(6.21±0.47μM)になったことは注目に値する。これは、ペプチドの存在が、HyAs(LHP)の取り込みに寄与し得ることを示唆しているが、複合体の安定性の低さが、毒性に影響を与えている可能性が最も高い。MeAs(LHP)(IC50:3.74±0.17μM)について得られたIC50値はHyAs(LHP)のIC50値の60%、ATOのIC50値の37%であり、これは、ヒ素のメチル基の存在によるこの化合物の更なる安定性に起因し得る。PhAs(LHP)(IC50:0.487±0.025μM)は、試験した化合物で最も毒性が高いことが証明された。フェニル環の存在もこの複合体の安定性を増加させる。これはATOよりも20倍毒性が高く、PAOよりも7倍毒性が高かった。興味深いことに、スクランブル化ペプチド(PhAs(sLHP)、IC50:790±32μM)を含むヒ素化合物は、K562細胞においてPhAs(LHP)よりも1600倍毒性が低いことが証明され、ペプチド構造は、K562細胞に対するPhAs(LHP)の毒性において重要な役割を果たすことが示された。
【０２１９】
アセタルゾールを1000μMまで試験すると、50%阻害とならず、K562細胞の60.5%がこの高濃度で依然として生存可能であった。1000μMで、アセタルゾールは溶液を酸性に変化させ(培地は黄色に変化した。pH6.87)、したがって、低いpHは、化合物それ自体よりも細胞数の減少に寄与している可能性が非常に高い。pH変化により、高濃度ではIC50を確立するための試験を行わなかった。LHP及びsLHPはK562細胞に対して1000μMまで毒性がなく、したがってAs(LHP)複合体により示された毒性に寄与できない。これらの化合物両方の細胞生存率は、全てのMTTアッセイにおいてほぼ100%又は100%超のままであった。
【０２２０】
各化合物について確立されたIC50値を統計的に比較した。PhAs(LHP)の値は、全ての他の化合物よりも統計的に高かった(p<0.0001)。PhAs(sLHP)の高いIC50値及び対応する標準偏差により、この化合物の結果を、他の化合物のIC50値間での統計的比較から除外した。Table 16(表16)は統計分析結果を含有する。
【０２２１】
亜ヒ酸塩及びAsl3のIC50値はそれぞれ統計的に異ならなかった。同様に、PAO及びMeAs(LHP)について得られた値は統計的に異ならなかった。重要なことに、分析では、全ての他の化合物のIC50値間の差が統計的に有意である(p<0.0001)ことが示された。
【０２２２】
【表１６】
2021509394.tif 000026
【０２２３】
HL-60細胞に対するMTT結果及びIC50値
24時間の処理後、HL-60細胞において亜ヒ酸塩、ATO、PAO、PhAs(LHP)及びPhAs(sLHP)について得られたIC50値を図17に示す。ATOでは、亜ヒ酸塩(20±1μM)について得られたIC50値の半分弱のIC50値(7.0±0.1μM)となり、これはATOが亜ヒ酸塩の2倍の数のヒ素原子を含有していること一致している。正確に半分でないという事実は、アニオンが、異なる取り込み機構又は毒性に対する作用モードのいずれかにより2つの細胞株において異なるモードで作用することを示唆している。PAOについて得られたIC50値(1.5±0.3μM)は亜ヒ酸塩のIC50値の約13分の一、ATOのIC50値の約4分の一である。0.5±0.1μMのIC50値を有する目的の化合物PhAs(LHP)は、HL-60細胞に対してPAO出発物質より3倍高い毒性を示し、LHPの存在が、これらの細胞における取り込み及び/又は毒性を補助し得ることを意味している。これはやはり、PAOのIC50値の130倍であり、PhAs(LHP)のIC50値の400倍超である205±4μMのIC50値を示すスクランブル化ペプチド化合物PhAs(sLHP)の結果により支持される。高いIC50値は、スクランブル化ペプチドの更に大部分が、取り込みを阻害する可能性が最も高く、したがって細胞障害活性が妨害されることを示唆している。これらの結果を更に調査するため、取り込みアッセイを行った。
【０２２４】
ペプチドLHP及びsLHPを試験したが、1000μMまでは毒性がなく、細胞生存率は試験した濃度範囲全体でほぼ100%のままであった。1000μMまで試験したアセタルゾールは、IC50値を得るのに必要とされる毒性を誘発できなかった。
【０２２５】
各化合物のIC50値をグループ全体で統計的に比較すると、当然のことながら、PhAs(LHP)の値は、アッセイした全ての他のヒ素化合物と統計的に異なった(p<0.0001)。PhAs(sLHP)のIC50値が高いため、この化合物の結果を、他の化合物に対する更なる統計分析から除外した。重要なことに、分析では、ほとんどの結果間の差が、Table 17(表17)に列挙されるように統計的に有意であることが示された。亜ヒ酸塩のIC50値は、試験した全ての他の化合物と有意差があることが判明した(全ての他の化合物に対してp<0.0001)。ATOも全ての他の化合物と有意差があることが判明した(p<0.0001)が、PAOはPhAs(LHP)と有意差があるとは見なされなかった。
【０２２６】
【表１７】
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【０２２７】
Kasumi-1細胞に対するMTT結果及びIC50値
全てのヒ素処理から典型的な濃度反応曲線が得られた。亜ヒ酸塩、ATO、PAO、PhAs(LHP)及びPhAs(sLHP)のIC50値を図18に要約する。前駆体ペプチドLHP及びsLHPはKasumi-1細胞に対して1000μmまで毒性がなかった。MTT変換率は、これらのペプチド各々に対して行われた3つのMTTアッセイ全てにおいてほぼ100%又は100%超のままであった。
【０２２８】
試験した最も毒性の低いヒ素化合物はPhAs(sLHP)(IC50=650±0.6μM)であり、試験した全ての他のヒ素化合物よりも毒性が有意に低かった(Table 18(表18))。この高いIC50値は、配位した非標的ペプチドが、これらの細胞により認識されず、その嵩高い存在により、細胞への取り込みが阻害されることを示している。PhAs(sLHP)の高いIC50値は、この高い数により分析がゆがめられないように他のAs化合物のIC50値の統計分析から除外した。目的の化合物PhAs(LHP)(IC50=1.4±0.1μM)はPAO(IC50=5.1±0.5μM、P<0.001)より3.6倍毒性が高く、ペプチドがAsのこれらの細胞への取り込みを補助している可能性が高いことを示している。これはATOより約40倍毒性が高かった(61±1μM、P<0.001)。PhAs(LHP)は、スクランブル化ペプチドを含有する類似の化合物PhAs(sLHP)より約460倍毒性が高く(P<0.001)、ペプチド構造がこれらの細胞に対するPhAs(LHP)の毒性において重要な役割を果たすことを示している。
【０２２９】
これらの結果は、現在、低い治癒率(わずか27%の生存率)を示すAMLの治療にPhAs(LHP)が用いられる可能性を示唆している。
【０２３０】
【表１８】
2021509394.tif 000028
【０２３１】
KARPAS45細胞に対するMTT結果及びIC50値
KARPAS45細胞の24時間の処理後、亜ヒ酸塩、ATO、PAO、PhAs(LHP)及びPhAs(sLHP)のIC50値を得た。IC50値を図19に示す。ATO(IC50:15.1±1.8μM)のIC50値は驚くべきことに亜ヒ酸塩(IC50:66.2±2.6μM)のIC50値の23%であり、アニオンが、取り込みモード又は作用モードのいずれかによりこの細胞株においてATOに対して異なる方法で作用することが推測される。PAO(IC50:5.1±2.3μM)はATOより約3倍毒性が高く、この化合物の取り込みに影響を与える親油性により、毒性が影響を受けることを示している。或いは、PAOは細胞内に入ると毒性がより高くなる。目的の化合物PhAs(LHP)(IC50:7.8±1.2μM)はATOの約2倍毒性が高いが、PAOよりも若干毒性が低い。これは、ヒ素スクランブル化ペプチド複合体の結果と比較した場合の文脈に置くことができる。スクランブル化ペプチドを有するヒ素化合物(PhAs(sLHP))(IC50:248±19μM)はKARPAS45細胞においてPhAs(LHP)より32倍毒性が低いことが証明され、ペプチド構造はこれらの細胞に対するPhAs(LHP)の毒性において重要な役割を果たす必要があることを示している。これは、ペプチドがマクロピノサイトーシス経路を標的とするような正しい構造でない限り、より高い分子量(ペプチドによる)により、取り込みが低下することも示している。
【０２３２】
アセタルゾールを1000μMまで試験すると、IC50値を得ることができなかった。細胞培地のpH変化により、高濃度での試験を行わなかった。LHP及びsLHPはKARPAS45細胞に対して1000μMまで毒性がなかった。これらの化合物両方の細胞生存率は3つのMTTアッセイ全てにおいてほぼ100%又は100%超のままであった。
【０２３３】
化合物のIC50値を、グループ全体で統計的に比較した。PhAs(sLHP)の値は、全ての他の化合物と統計的に異なった(P<0.0001)。PhAs(sLHP)の高いIC50値及び対応する標準偏差により、この化合物の結果を、他の化合物のIC50値間の統計的比較から除外した。重要なことに、分析では、Table 19(表19)に示すようにほとんどの結果間での差が統計的に有意であることが示された。亜ヒ酸塩のIC50値は、試験した全ての他の化合物と有意差がある(P<0.0001)ことが判明した。PAOに関連するIC50値はATOのIC50値よりも有意に低かったが(P<0.001)、PhAs(LHP)のIC50値よりも有意に低いことは判明しなかった。PhAs(LHP)のIC50値はATO(P<0.05)及び亜ヒ酸塩(P<0.0001)のIC50値よりも有意に低かった。
【０２３４】
【表１９】
2021509394.tif 000029
【０２３５】
HepG2細胞に対するMTT結果及びIC50値
図20は、HepG2細胞の24時間の処理後、MTTアッセイから亜ヒ酸塩、PAO、ATO及びPhAs(LHP)について得られたIC50値を示している。ATOでは、52±3μMのIC50値になり、89±1μMのIC50値を有する亜ヒ酸塩より1.7倍毒性が高かった。目的の化合物PhAs(LHP)では、978±11μMの非常に高いIC50値になり、ATO(IC50:52±3μM)より約19倍毒性が低く、PAO(IC50:0.63±0.01μM)より1500倍超毒性が低かった。PAOは、PhAs(LHP)の出発物質であり、これらの結果は、再び、白血病ホーミングペプチドへの結合が細胞に対するPhAs(LHP)の標的化能力及び毒性において重要な役割を果たすことを強く示しており、やはり分子量が高い複合体PhAs(LHP)はペプチドを認識しない細胞に対して毒性がないことを意味している。
【０２３６】
アセタルゾール及びLHPをいずれも1000μMまで試験したが、IC50値を得ることができなかった。その代わりに、HepG2細胞の生存率はこれらの化合物各々に対する3つのMTTアッセイ全てにおいてほぼ100%又は100%超のままであった。
【０２３７】
HepG2細胞の24時間の処理後、MTTアッセイから得られたIC50値を、グループ全体で統計的に比較し、PhAs(LHP)の値は、全ての他の化合物と比較して有意差があることが判明した。(P<0.0001)
【０２３８】
A549ヒト肺癌細胞に対するPhAs(LHP)のIC50値
A549細胞におけるPhAs(LHP)のIC50値は234±5μMである。再び、これはヒト固形腫瘍細胞対白血病細胞に対する複合体の毒性が比較的低いことを示している。
【０２３９】
CH固形腫瘍細胞に対するMTT結果及びIC50値
CH固形腫瘍細胞の24時間の処理後、亜ヒ酸塩、PAO、ATO及びPhAs(LHP)について得られたIC50値を図21示す。目的の化合物PhAs(LHP)では、770±12μMの高いIC50となり、ATO(IC50:23.3±0.9μM)より約34倍毒性が低く、PAO(IC50:1.49±0.03μM)より500倍超毒性が低かった。これは、より分子量が高いPhAs(LHP)複合体が細胞取り込みを妨害することを示唆しており、ペプチドが、これらの非ヒト腫瘍細胞のマクロピノサイトーシス経路による取り込みのための受容体により認識されるべきではないため、これは期待される。
【０２４０】
アセタルゾールを1000μMまで試験したが、IC50値を得ることができなかった。LHPはCH固形腫瘍細胞に対して1000μMまで毒性がなかった。これらの化合物両方の細胞生存率は3連のMTTアッセイにおいてほぼ100%又は100%超のままであった。
【０２４１】
各化合物のIC50値をグループ全体で統計的に比較し、PhAs(LHP)の値は、アッセイした全ての他のヒ素化合物よりも有意に高かった(P<0.0001)。
【０２４２】
hPBMCのMTT結果及びIC50値
24時間の処理後、hPBMCに対する亜ヒ酸塩、ATO、PAO、PhAs(LHP)及びPhAs(sLHP)について得られたIC50値を図22に示す。興味深いことに、ATOが亜ヒ酸塩の2倍の数のヒ素原子を含有しているにもかかわらず、ATOでは、亜ヒ酸塩(40.1±7.7μM)について得られたIC50値の約2倍のIC50値(81.7±4.0μM)になった。再び、これは、アニオンが、異なる取り込み機構又は毒性に対する作用モードのいずれかによりこれらの2つの細胞株に対して異なるモードで作用することを示唆している。PAOは、9.3±3.3μMのIC50値で最も毒性の高い化合物であり、これは、亜ヒ酸塩のIC50値の約4分の一、及びATOの値の約10分の一である。
【０２４３】
最も重要なことに、目的の化合物PhAs(LHP)では、495±6μMの高いIC50値になった。これにより、健康な細胞を上回る白血病細胞に対するペプチドの標的化能力が確認されると思われる。
【０２４４】
再び、アセタルゾール及びLHPをいずれも1000μMまで試験したが、IC50値を得ることができなかった。
【０２４５】
hPBMCの24時間の処理後、得られたIC50値について着手された統計分析の結果をTable 20(表20)に列挙する。全ての化合物の値は他の値各々と有意差がある(P<0.0001)ことが判明した。
【０２４６】
【表２０】
2021509394.tif 000030
【０２４７】
様々な細胞株全体での試験したヒ素化合物のIC50値の比較
Table 21(表21)は、6つの異なる細胞株において4つの指定のヒ素化合物での24時間の処理後、MTTアッセイから得られたIC50値の概要を示している。7つの細胞株全体で亜ヒ酸塩のIC50値はK562細胞の18.6±0.5μMからHepG2細胞の89±1μMまでの範囲である。亜ヒ酸塩での処理後、白血病と非白血病細胞型との間に明らかな差はないと思われる。驚くべきことに、亜ヒ酸塩は、静止性hPBMCに対するよりも増殖の早いHepG2細胞に対して毒性が低い。
【０２４８】
ATOでは、HL-60細胞の7.0±0.1μMからhPBMCの82±4μMの範囲のIC50値になった。hPBMCは静止性細胞であるため、亜ヒ酸塩は幾つかの細胞分裂分子、例えば、チューブリンとのその相互作用についてよく知られており、これらの標的が静止性細胞では利用できないことから、これらの値の差は当然のことである。ATOはK562細胞、HL-60細胞及びKARPAS45細胞(各々、9.7±0.2μM、7.0±0.1μM及び15±2μM)に対してわずかに高い毒性を示した。毒性は、Kasumi-1細胞(61±1μM)、HepG2細胞(52±3μM)及びhPBMC(82±4μM)に対して有意に低かった。
【０２４９】
PAOでは、0.63±0.01μM〜9±3μMの範囲の低いμMのIC50値になった。全ての細胞型に対するこの高い毒性は、フェニル基の存在による、先に言及した親油性の増加に関連する可能性が最も高い。
【０２５０】
亜ヒ酸スクランブル化ペプチド複合体PhAs(sLHP)について得られたIC50値は全て非常に高く、HL-60細胞の205±4μMからHepG2細胞の960±10μMの範囲であった(Table 21(表21))。
【０２５１】
【表２１】
2021509394.tif 000031
【０２５２】
非白血病細胞と比較して白血病細胞に対するPhAs(LHP)の選択毒性が高いことは(図23においてグラフに示される)注目に値する。PhAs(LHP)は、骨髄性白血病K562細胞及びHL-60細胞の両方に対してnM範囲のIC50値を示し、IC50値はhPBMCにおいて約1000倍高く、CH固形腫瘍細胞において約1500倍高く、HepG2細胞において約2000倍高く、A549細胞において470倍高く、骨髄性白血病の治療剤としてのこの化合物の可能性を示している。Kasumi-1細胞の結果は特に有望である。PhAs(LHP)は、リンパ性白血病KARPAS45細胞に対してnM範囲のIC50値を示さず、IC50値はhPBMCにおいて約64倍高く、これは、この化合物がまたT細胞白血病に対して可能性のある治療剤であり得るようなこの化合物の良好な治療ウインドウを示している。
【０２５３】
白血病癌細胞の結果と線維芽細胞の結果との間の大きな差により、PhAs(LHP)が組織に対して毒性が低いことが示され得る。驚くべきことに、増殖の早い非白血病HepG2細胞について得られたIC50値は、静止性hPBMCについて得られた値よりもはるかに高く、PhAs(LHP)により、増殖の早い細胞に対するヒ素処理の毒性と一般に関連する副作用が低減され得る可能性が開かれる。組織試料の動物試験及び分析は、この仮説を更に調査するために必要である。
【０２５４】
様々な細胞型の24時間のAs処理後のAsの取り込みの概要
図24は、様々なAs化合物(As 1.5μM)での24時間の処理後、様々な細胞型に関連する細胞As濃度を要約している。白血病細胞株K562、HL-60、Kasumi-1及びKARPAS45は赤で示されており(薄く塗りつぶされたブロック)、非白血病細胞型は、黒で示されており(最も暗い陰影)、癌接着性細胞HepG2は、斜め縞で、正常な細胞hPBMCは黒のブロックで示されている。
【０２５５】
PhAs(LHP)処理後、有意(P<0.001)な細胞As濃度が4つの白血病細胞株(K562、HL-60、Kasumi-1及びKARPAS45)において検出されたが、最も重要なことに、非標的悪性細胞HepG2又は非標的正常非癌hPBMCのいずれかに関連する細胞As濃度は検出できなかった。PhAs(LHP)処理から得られた細胞As濃度は、Kasumi-1細胞において最も高かった。この濃度は、K562細胞に関連する細胞As濃度より1.2倍高く(P<0.05)、HL-60細胞より1.4倍高く(P<0.001)、KARPAS45細胞に関連する細胞As濃度より4.0倍高かった(P<0.001)。
【０２５６】
PhAs(sLHP)での処理により、試験した細胞型のいずれかにおいてAsの取り込みは検出できず、As-ペプチドの取り込みがペプチドのアミノ酸配列に高度に依存することを示している。
【０２５７】
亜ヒ酸塩処理後の細胞As濃度は全て非常に低かった(<4×10-14g/細胞)。KARPAS45細胞に関連する最高細胞As濃度はHepG2細胞に関連する最低濃度の2.2倍であった。HepG2細胞における濃度は、全ての他の細胞型について観察された濃度を有意に下回った(P<0.01)。また、hPBMCについて同定可能な傾向はなかった。
【０２５８】
興味深いことに、ATO処理では、接着性癌細胞株HepG2よりも白血病細胞及び正常なhPBMCにおいて取り込みが増加した。K562、HL-60及びhPBMCに関連する細胞As濃度は類似していた(P>0.05)。最高細胞As濃度はKasumi-1細胞で見出され、他の細胞型各々に関連する細胞As濃度よりも有意に高かった(P<0.001)。これは、HepG2細胞に関連する細胞As濃度より5.5倍高かった。
【０２５９】
PAO処理後の細胞As濃度において大きな変化が明らかであり、HepG2細胞は現時点で全ての他の細胞型よりも有意に高いAs濃度を示している(P<0.001)。この濃度は、PAO処理hPBMCに関連する細胞As濃度より2.2倍高く、K562細胞より3.8倍高く、Kasumi-1細胞より3.9倍高く、KARPAS45細胞より4.8倍高く、HL-60細胞より7.6倍高い。興味深いことに、2番目に高い細胞As濃度は、hPBMCにより示され、これは、白血病細胞株に関連する細胞As濃度よりも有意に高かった(P<0.001)。
【０２６０】
白血病細胞におけるPhAs(LHP)の運命についての調査
方法
細胞株K562及びHL-60を、先に記載したように入手及び維持した。グルタルアルデヒド(25%溶液)、Spurr's低粘性包理樹脂、3mmのゴールドファインダーグリッド及びトルイジンブルーをProscitech社(Kirwan、オーストラリア)から調達した。薄切した細胞を先に記載した手順を用いてマイクロプローブSRXRF分析用に調製した。簡単に言えば、細胞をIMDM(対照細胞、4時間又は24時間)又はPhAs(LHP)(IMDM中10μM、4時間又は24時間)のいずれかで細胞培養フラスコ(75cm2)中で処理した。遠心分離を用いて細胞をPBSで洗浄し(2回)、最終細胞ペレットをグルタルアルデヒド(1mL、PBS中2%v/v)に室温で2時間固定し、エタノール(30%×2、50%×2、70%×2、80%×2、90%×2、95%×2、100%×4)で脱水した。細胞を50%エタノール/50%Spurr樹脂中で一晩振動させ、次いで100%Spurr樹脂と交換して(2日にわたって2回)、確実に水を残らず除去することにより、浸潤させた。最終日、細胞を100%Spurr樹脂に包理し、遠心分離し(8000g、1時間)、ビームカプセル内で60℃にて一晩硬化させた。細胞ペレットの薄切片(1μm)を、ウルトラミクロトーム(Leica社製EM UC7)を用いて切断した。薄切片をトルイジンブルーで染色した後、窒化ケイ素膜に載置した。
【０２６１】
ゴールドファインダーグリッドを、光学顕微鏡(Leica社製DMXRE落射蛍光/視覚顕微鏡)とX線マイクロプローブ(2-ID-D)の両方に適合するように設計されたキネマティックマウントに取り付けた。光学顕微鏡写真及びXY座標を得て、分析に適した細胞を配置した。インタクトな外観の明確に画定された核を示し、他の細胞及び細胞の残骸から離れて配置されたこれらの細胞が分析用に選択された。
【０２６２】
マイクロプローブSR-XRFは、アルゴンヌ国立研究所、the Advanced Photon Source(Lemont、IL、USA)でビームライン2-ID-Dで行われた。2つのゾーンプレートを用いて11.9-keV X線ビームを0.3×0.3μm2のスポットサイズに集光した。試料をヘリウム雰囲気に収容し、XYZ自動ステージを用いて0.3μmステップで試料をラスター走査することにより、P(2.1keV)からAs(11.9keV)までの元素分布をマッピングした。滞留時間2.5秒/ポイント及びエネルギー分散型Vortex EM(Hitachi High-Technologies Science America社、Northridge、CA)シリコンドリフト検出器を用いて蛍光X線を検出した。MAPSバージョン1.7.3.02ソフトウェアパッケージ(S. Vogt、Advanced Photon Source)を用いて元素分布マップを処理した。X線蛍光強度を薄膜標準物質NBS-1832及びNBS-1833(NIST社、Gaithersburg、MD、USA)からのものと比較することにより、元素の蛍光強度を、1平方センチメートル当たりのマイクログラム(μg/cm2)の絶対密度に変換した。
【０２６３】
結果
図25は、PhAs(LHP)標準物質及びPhAs(LHP)処理K562細胞(24時間)について得られたAs K吸収端スペクトルを示している。一定の吸収端エネルギーは、細胞内Asが24時間にわたりAs(III)のままであることを示している。吸収端後領域における変化は、As-S結合の何らかの改変を示唆している。例えば、これは、PhAsからの白血病ホーミングペプチドの解離、及び細胞内の他の生体分子へのその後の結合を反映し得る。
【０２６４】
図26は、PhAs(LHP)標準物質及びPhAs(LHP)処理HL-60細胞(24時間)について得られたAs K吸収端スペクトルを示している。PhAs(LHP)処理K562細胞について観察されたスペクトルの変化がHL-60細胞においても明らかであり、それにより吸収端エネルギーは一定のままである。これは、PhAs(LHP)が24時間にわたりAs(III)のままであることを示している。吸収端エネルギーはまた、硫黄部分に結合したAs原子と一致するが、吸収端後の傾斜は、PhAs(LHP)標準物質で観察されたものほど顕著ではなく、再び、細胞内の他の(硫黄含有)生体分子との可能性のあるリガンド交換反応を示唆している。
【０２６５】
図27は、XRF分析前のトルイジンブルーで染色し薄切したK562細胞試料の顕微鏡写真の画像を示している。K562対照細胞試料の細胞(図27a)は、全般的に、明確に画定されたインタクトな核を有する球状である。各処理時点は、PhAs(LHP)(10μM)での処理に応答する細胞のストレス及び死を示している。4時間の処理後(図27b)、細胞膜の大部分はインタクトに見えるが、核の断片化と共に細胞ストレスが明確に証明される。24時間の処理(10μM)を示す図27cは細胞膜の破壊及び断片化/分散した核物質を明確に示している。
【０２６６】
3〜4個の細胞を各処理状態について撮像した(K562及びHL-60細胞)。各々の代表的な画像を以下のデータに示す。
【０２６７】
対照細胞及びPhAs(LHP)処理(10μM、4時間及び24時間)K562細胞の薄切片から得られたマイクロプローブSR-XRF元素分布マップを図28に示す。Asよりも有意に豊富なP、S及びZnの濃度を用いて細胞領域を画定した。P及びZnは、各々DNAリン酸骨格及びDNA転写タンパク質(ジンクフィンガータンパク質)におけるその存在により核のマーカーである。対照K562細胞(図28a)は、任意の有意なレベルのAsを含有しておらず、4及び24時間のPhAs(LHP)処理細胞(各々28b及び28c)は各々細胞全体に有意なAsを含有しており、細胞核における蓄積が証明される。
【０２６８】
図29aは、PhAs(LHP)(10μM、4時間)に暴露されたK562細胞のトルイジンブルーで染色した薄切片の相関する光学顕微鏡写真を示しており、図29bはP、Zn及びAsについての対応するSR-XRFマップ並びに3つの元素についての共局在マップを示している。Sを含有し、その後細胞内S濃度に影響を与えるトルイジンブルー染色の使用によりAsとSとの共局在マップは示されない。
【０２６９】
図28及び29では、Asが核に入り、そこでAsは、共局在マップにおいてブルーの優勢により示されるように(図29b)、DNA又はDNAの複製に関連するタンパク質と潜在的に相互作用することが示された。リンが支配的な領域は、文献に報告されているようにヘテロクロマチン領域と一致する。共局在マップにおいて明確なブルーの領域により明らかなように、ヒ素は核全体に存在する。精査から、Asが核、及びヘテロクロマチン領域とユーロクロマチン領域の両方に存在する(図29b)ことが判明した。ユーロクロマチン領域は、転写が起こる、DNAが密にパッキングしていない領域と一致し、Asが転写タンパク質中によく見られる硫黄に富む領域と相互作用することを可能にする。細胞質及び核の内因性元素の濃度を比較する統計分析では、K562細胞のPhAs(LHP)処理の結果としての特異的な傾向又は変化は得られなかった。
【０２７０】
図30は、対照細胞及びPhAs(LHP)処理(10μM、4時間及び24時間)HL-60細胞の顕微鏡写真の画像を示している。対照細胞(図30a)は、典型的に、大きな十分に画定された核及び細胞膜を有する円形である。4時間のPhAs(LHP)処理後(図30b)、HL-60細胞において細胞窮迫が明らかであり、ここで細胞の大部分はもはや円形ではなく、不規則な形になり、細胞の多くの核も不規則な形になった。HL-60細胞の24時間のPhAs(LHP)処理(図30c)により、高度の細胞分解が生じ、細胞死が証明された。
【０２７１】
図31は、対照細胞及びPhAs(LHP)処理(10μM、4時間及び24時間)HL-60細胞のトルイジンブルーで染色した薄切片についての利用可能な顕微鏡写真の画像及び対応するSR-XRF元素マップを示している。K562細胞と同様に、対照細胞において有意なAsは存在しなかった(図31a)。しかし、K562細胞とは対照的に、Asのごくわずかな局在が4時間のPhAs(LHP)処理後のHL-60細胞(図31b)において明らかであり、これは、DNA密度の高い領域、おそらく核小体に関連していると思われる。有意なAsは、24時間PhAs(LHP)処理HL-60細胞(図31c、図32b)において明らかであり、ここで核は明らかに、他の細胞よりもAsを更に蓄積している。Asが集中する領域は、Znが集中する領域及びPがあまり集中していない領域と相関する細胞の左下部に位置しており、これは転写タンパク質を示し得る。
【０２７２】
K562細胞と同様に、HL-60細胞の細胞質及び核における元素濃度を比較する統計分析では、PhAs(LHP)処理に起因し得る特異的な傾向又は変化は得られなかった。
【０２７３】
新しいフェニルアルシン白血病ホーミングペプチド化合物(XPhAs(LHP))の調製のための前駆体としてのフェニルアルシンオキシド(パラ置換)の類似体の合成
方法
化学物質
このプロジェクトで使用した市販の試薬は全て分析等級以上のものであった。希釈用及び緩衝液の調製のための溶媒として、Milli-Q水(18.2Ω、Millipore社)を使用した。p-アルサニル酸(≧99%)及び活性炭(未処理、顆粒、8〜20メッシュ)をSigma Aldrich社(オーストラリア)から購入した。塩酸(HCl、32%)、メタノール(MeOH、>99.7%)、ジエチルエーテル(Et2O、>99%)、クロロホルム(CHCl3、>99.5%)、エタノール(EtOH、>99.5%)、ギ酸(99%)、ヨウ素(I2、>99.5%)及び水酸化ナトリウム(NaOH、>97.5%)は全てAjax Finechem社(オーストラリア)から得た。トリフェニルホスフィン(PPh3、99%)をAcros Organics社(オーストラリア)から購入し、亜硝酸ナトリウム(NaNO2、>99.8%)をThermo Fisher社(オーストラリア)から購入した。ヨウ化カリウム(KI、>99%)をChem Supply社(オーストラリア)から購入した。第2リン酸ナトリウム(Na2HPO4、>99%)及びリン酸二水素ナトリウム二水和物(NaH2PO4.2H2O、≧99%)をSigma Aldrich社(USA)から購入した。
【０２７４】
緩衝液の調製
Table 22(表22)に列挙する適当な体積の貯蔵液A(NaH2PO4.2H2O、0.2M)及び貯蔵液B(Na2HPO4、0.2M)を用いて、リン酸緩衝液(pH8、0.1M、100mL)を調製した。Mettler Toledo社製技術緩衝液(pH4.0、7.0及び9.2)での較正後、Mettler Toledo社製Sever Compact S220-Micro KitでpHを測定及び/又は確認し、Milli-Q水で100mLに希釈する(最終濃度0.1M)前に、pHの測定結果が出るまで、貯蔵液A又は貯蔵液Bのいずれかを必要に応じて滴下添加することによりpHを調整した。
【０２７５】
【表２２】
2021509394.tif 000032
【０２７６】
XPhAs(LHP)複合体の形成のESI-MS分析
前述の前駆体(NH2PhAs(III)、ClPhAs(V)又はIPhAs(V)、1.3.3項)とLHP(1.3.5項に記載)の配位をESI-MSを用いて監視して、反応条件、続いて生成物の形成を最適化した。反応を1.3.5項に記載の条件を用いてN2雰囲気下で行った。指定された時点で、アリコートを除去し、溶液を0.1%ギ酸で希釈して(50倍)、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)で分析した。
【０２７７】
ESI-MSの動作条件
正イオンモードのエレクトロスプレーイオン化を使用するMicromass社製Quattro Microトリプル四重極質量分析計(Micromass社、UK)で、全ての質量スペクトルを収集した。加熱した乾燥窒素を、全ての実験で霧化及び乾燥ガスとして使用した。キャピラリー電圧3.00kV、コーン電圧35V、供給温度80℃、脱溶媒和温度120℃及び脱溶媒和ガス流量400L/時を使用してスペクトルを収集した。
【０２７８】
試料の注入前に、スペクトルがベースラインスペクトルに類似するまで、原料をMilli-Q水で完全に洗い流した。次いで、1mLシリンジ(SGE Analytical Science社、オーストラリア)を用いて20μL/分の流量で各試料を注入した。データの取得は連続モードで行って、典型的には50回の走査を合計して代表的なスペクトルを得た。スペクトルをMassLynxソフトウェア(Waters社、2003)で処理した。曲線未満40%で1次多項式によるバックグラウンド減算を行い、Savitsky-Golayアルゴリズムで平滑化した。次いで、中心関数(Top、面積)でセントロイドスペクトルを得、各ピークをその各々のm/z比及び強度でアノテートした。
【０２７９】
XPhAs(LHP)複合体の精製
分析用HPLC
Prominence-i LC2030Cシステムコントローラー、オートインジェクター及び液体クロマトグラフユニットを備えるShimadzu社製分析用HPLCシステムをXPhAs(LHP)複合体の精製に使用した。H2O(0.1%TFA)で20分間の平衡化後、Waters社製Sunfire C18カラム、5μm、4.6×250mm(No.186002560)を使用した。H2O/ACN(0.1% TFA)での直線勾配溶出を、1mL/分の流量を用いて、100%H2Oから100%ACNまで適用した。使用前に、濾過及び超音波処理により、全ての溶媒を脱気した。分析前に、試料を0.20μmフィルター(Sartorius社)を通して濾過した。最適な反応条件(方法開発の結果から決定)に従って調製したXPhAs(LHP)の溶液(1mL)をカラムに注入し、分析して、溶液中のそれぞれの種の溶出時間を求めた。また、関連するAs前駆体(NH2PhAs(III)、ClPhAs(V)又はIPhAs(V))各々を分析してこれらの溶出時間を確立した。
【０２８０】
分取用HPLC
分析用HPLCから得られた溶出プロファイルに基づき、Shimadzu社製SIL-10APオートサンプラー、Shimadzu社製LC-20AP分取液体クロマトグラフ、Shimadzu社製FCV-200AL 4次バルブ、Shimadzu社製SPD-M20Aダイオードアレイ検出器、Shimadzu社製DGU-20A5R脱気ユニット、Shimadzu社製CDM-20A通信バスモジュール、LabSolutionsソフトウェア及びLuna 5u C18(2)カラム(250×21.20mm、5μ、Phenomenex社)を使用する分取用HPLCを用いて、X-PhAs(LHP)反応生成物の精製を行った。カラムをH2O(0.1%TFA、20分)で平衡化した。最適な反応条件(方法開発の結果から決定)に従って調製したXPhAs(LHP)溶液(6mL)をカラムに注入し、Table 23(表23)及びTable 24(表24)に詳述された溶出勾配を用いて分離した。流量は15mL/分で維持し、画分をλ254nmで検出した。主画分を収集し、ESI-MSにより特性評価した(動作条件は先に列挙した通り)。
【０２８１】
【表２３】
2021509394.tif 000033
【０２８２】
【表２４】
2021509394.tif 000034
【０２８３】
As複合体の乾燥
精製した化合物を得るために、同定されたHPLC画分をAlpha 1-2 LDplus凍結乾燥機(Christ社)を用いて乾燥した。
【０２８４】
前駆体(NH2PhAs(III)、ClPhAs(V)及びIPhAs(V))及びペプチド複合体(XPhAs(LHP))のX線吸収分光特性評価
X線吸収分光法(XAS)を使用して、前駆体及びペプチド複合体におけるヒ素酸化状態及びAsに直接配位した原子を求めた。
【０２８５】
XAS分析用の試料の調製
合成フェニルアルシン化合物、XPhAs(LHP)複合体及びAs標準物質に対してXAS分析を行った。試料と固体セルロース(Sigma Aldrich社)とを十分に混合することにより、固体試料を調製した。XAFSmassプログラムを用いて、最初に希釈率を求めたが、蛍光モードでの分析には更に10倍希釈が最適であることが判明した。得られた混合物を厚さ1mmのアルミニウム試料ホルダーに載置し、カプトンテープで封止した。次いで、各試料を液体窒素に迅速に浸漬し、液体ヘリウムクライオスタットに移し、これを10°Kで分析した。X線吸収スペクトルを以下のAs標準物質:PAO、フェニルアルシンビスグルタチオン(PhAs(GS)2)、p-アルサニル酸及び亜ヒ酸塩について収集した。
【０２８６】
PhAs(GS)2の調製のために、PAO(0.048g)を、一晩加熱することにより(80℃)、最初にMilli-Q水(2mL)に溶解した。次いで、得られた溶液をグルタチオン(GSH)(0.26g)に添加する前に、室温まで冷却した。反応チューブに窒素を流し、一晩、典型的には16時間反応させ放置した。メタノール(10mL)を添加して、生成物を沈殿させ、これを遠心分離(1700rpm、10分、Heraeus Labofuge 300)により分離した。得られた固体を室温で乾燥した。
【０２８７】
XAS実験装置条件及びデータ分析
XAS試料分析はThe Australian Synchrotron(AS、XAS beamline、Clayton、VIC)で着手された。ビームエネルギーは約3.0GeVであり、ビーム電流は200mAであった。Si(311)チャンネルカット分光器でビームエネルギーを制御した。スペクトルは全て、蛍光モードで約10°K(閉サイクルHeクライオスタット、OPTIPTTL4K Optistat(商標)PTR、Oxford Instruments社で維持)で記録した。スペクトルを100素子のGE蛍光検出器(Eurysis)及び0.5mmの垂直スリット幅で収集した。
【０２８８】
ヒ素K吸収端XASスペクトルを以下のエネルギー範囲で収集した:吸収端前領域11667〜11847eV(10eVステップ);XANES領域11847〜11930eV(0.25eVステップ);及びEXAFS領域11930〜12468eV(k空間で0.025Å-1ステップ〜13.0Å-1)。
【０２８９】
固体金ホイル標準物質を、較正用の試料の下流で透過モードで同時に分析し、それにより(吸収端エネルギーに対応する)一次導関数スペクトルの第1のピークのエネルギーを11920.0eVとして定義した。典型的には、全ての試料分析に対して3〜5回の走査を収集した。データ処理はEXAFSPAKで行った。EXAFSPAKのDATFITモジュールで多重線形回帰分析を計算した。BACKSUBを用いてバックグラウンド減算及び正規化を達成し、FEFF8.2を用いて、理論上の位相及び振幅関数を計算し、EXAFSデータをフィッティングした。
【０２９０】
p-アミノフェニルジクロロアルシン(NH2PhAs(III))の合成
【０２９１】
【化６】
2021509394.tif 000035
【０２９２】
As(V)化合物p-アルサニル酸のAs(III)への還元を行って、Clとの交換を介したペプチド結合を促進した。方法は、Heredia-Moya及びKirk((2008)Bioorg. Med. Chem. 16、5743〜5746)、並びにIoannou及びTsivgoulis((2015) Main Group Chem. 14、237〜253)により報告された手順から採用した。簡単に言えば、p-アルサニル酸(0.2535g、1.00mmol)を脱気メタノール(1mL)及び濃HCl(0.68mL)に溶解した。トリフェニルホスフィン(0.4170g、1.50mmol)及びヨウ素(0.0123g、0.05mmol)を添加し、撹拌すると、赤色の懸濁液が得られた。得られた混合物を室温で4時間撹拌して、薄黄色溶液を得た。エーテル(1mL)の添加により黄色の生成物p-アミノフェニルジクロロアルシン(NH2PhAs(III))を沈殿させ、固体を収集した。クロロホルム(2mL)とエーテル(2mL)との混合物での抽出を使用して、NH2PhAs(III)を酸化副生成物トリフェニルホスフィンオキシドから分離した。
【０２９３】
p-クロロフェニルアルソン酸(ClPhAs(V))の合成
【０２９４】
【化７】
2021509394.tif 000036
【０２９５】
p-アルサニル酸のジアゾ化及びその後のClとの交換により、p-クロロフェニルアルソン酸(ClPhAs(V))を調製した。p-アルサニル酸(0.217g、1.00mmol)をMilli-Q水(0.2mL)及び濃HCl(0.12mL)に溶解した。完全に溶解したら、更に濃縮されたHCl(0.13mL)を添加した。溶液を0〜5℃に冷却して、懸濁液を生成し、氷(0.1g)を容器に添加した。勢いよく撹拌しながら、Milli-Q水(0.2mL)中のNaNO2(0.074g、1.07mmol)溶液を酸性溶液に滴下添加して、橙色の溶液を得た。NaNO2の添加が完了すると、反応溶液は薄黄色に変化した。反応容器を50℃に昇温し、その温度で約2時間維持すると、N2ガスが放出された。溶液は暗橙色となり、沈殿物が明らかになった。次いで、懸濁液を一晩冷蔵した。得られた固体を単離し、温NaOH(10%、0.6mL)に溶解した。この溶液を濾過し、HClで酸化して、ClPhAs(V)を得た。
【０２９６】
p-ヨードフェニルアルソン酸(IPhAs(V))の合成
【０２９７】
【化８】
2021509394.tif 000037
【０２９８】
p-アルサニル酸のジアゾ化及びその後のIとの交換により、p-ヨードフェニルアルソン酸(IPhAs(V))を調製した。p-アルサニル酸(0.217g、1.00mmol)をMilli-Q水(0.2mL)及び濃HCl(0.12mL)の混合物に溶解した。完全に溶解したら、更に濃縮されたHCl(0.13mL)を添加した。溶液を0〜5℃に冷却して、氷(0.1g)を容器に添加した。勢いよく撹拌しながら、Milli-Q水(0.2mL)中のNaNO2(0.074g、1.07mmol)溶液を酸性溶液に滴下添加した。溶液を氷中に3分間放置し、次いで、Milli-Q水(1.5mL)中のヨウ化カリウム(1.076g、0.00648mol)の冷却液を徐々に添加した。反応容器を室温で3分間静置させ、次いで、ガス放出が停止するまで(約3〜4時間)45℃に昇温した。懸濁液を一晩冷蔵し、茶色の固体を収集し、冷Milli-Q水で洗浄した。固体をエタノール(1.4mL)に溶解し、活性炭を添加した。混合物を温水(0.6mL)で希釈し、沸騰させ、熱いうちに濾過した。冷水(0.8mL)を添加し、橙/茶色の結晶を収集した。
【０２９９】
NH2PhAs(LHP)の形成
反応物NH2PhAs(III)及びLHPを用いてTable 25(表25)に示す条件下で3連で反応を行って、NH2PhAs(LHP)を調製した。インキュベーション前に全ての反応バイアルにN2を流した。代表的なアリコートを指定された時点(1時間、2時間、16時間及び24時間)でESI-MSで分析して、反応の進行を監視した。
【０３００】
【表２５】
2021509394.tif 000038
【０３０１】
ClPhAs(LHP)の形成
反応物ClPhAs(V)及びLHPを用いてTable 26(表26)に示す条件下で3連で反応を行って、ClPhAs(LHP)を調製した。インキュベーション前に全ての反応バイアルにN2を流した。代表的なアリコートを指定された時点(30分、1時間、2時間、24時間、72時間及び96時間)でESI-MSで分析して、反応の進行を監視した。
【０３０２】
【表２６】
2021509394.tif 000039
【０３０３】
IPhAs(LHP)の形成
反応物IPhAs(V)及びLHPを用いて以下に示す条件下で3連で反応を行って、IPhAs(LHP)を調製した。インキュベーション前に全ての反応バイアルにN2を流した。代表的なアリコートを指定された時点(1時間、72時間)でESI-MSで分析して、反応の進行を監視した。
【０３０４】
【表２７】
2021509394.tif 000040
【０３０５】
結果
NH2PhAs(III)の合成
ESI-質量スペクトル(図33)は、NH2PhAs(III)を生成するためのp-アルサニル酸の還元から形成された反応生成物を示している。[NH2-Ph-As-Cl2+Na]+として帰属されるm/z259.0でのピークにより示されるように、所望のAs(III)化合物p-アミノフェニルジクロロアルシンの生成に成功した。更に、m/z184.0でのピークは[NH2-Ph-As=O+H]+に対応し、m/z202.0でのピークは[NH2-Ph-As-(OH)2+H]+に対応し、第2のAs(III)化合物p-アミノフェニルアルシンオキシドの形成を示唆している。m/z279.1でのピークは、トリフェニルホスフィンオキシド[P(Ph)3O+H]+の存在を示し、これは、トリフェニルホスフィンの酸化の結果として形成された予想副生成物である。
【０３０６】
1H NMRスペクトルはまた、δ=7.36〜7.76ppmの領域における2セットの多重線の存在により、2つの主生成物の形成を示唆している。Ioannou及びTsivgoulisは純粋なp-アミノフェニルジクロロアルシンの合成について報告し、そこで二重線はδ=7.19ppm及びδ=7.70ppmに存在していた。この情報から、δ=7.71ppmの多重線及びこれに関連する多重線δ=7.47ppmはp-アミノフェニルジクロロアルシンプロトンとして帰属され得ると想定することは合理的である。したがって、δ=7.42ppm及びδ=7.54ppmの大きな多重線の存在は、p-アミノフェニルアルシンオキシド又はp-アミノフェニルジヒドロキシアルシンのいずれかに関連するプロトンとして帰属され得る。ESI質量スペクトルにおけるp-アミノフェニルアルシンオキシドに関連する比較的大きな存在量のピーク(m/z184.0)により、トリフェニルホスフィン及びヨウ素によるp-アルサニル酸の還元から、2つの主生成物p-アミノフェニルジクロロアルシン及びp-アミノフェニルアルシンオキシドが形成されたと想定することは合理的である。
【０３０７】
また、XASを使用して、NH2PhAs(III)の形成からのAs反応生成物を特性評価した。図34はアミノフェニルアルシン生成物(下部のスペクトル)、並びに幾つかの関連するAs(III)固体標準物質:亜ヒ酸塩、PhAs(GS)2及びPAO、並びにAs(V)出発物質:p-アルサニル酸のAs K吸収端XANESスペクトルを示している。予想通り、AS(III)種は、As(V)化合物であるp-アルサニル酸より約3〜5eV低い吸収端エネルギー及びホワイトラインピークを示した(ホワイトラインピークエネルギー:亜ヒ酸塩、11871.54eV;PAO、11870.57eV;PhAs(GS)2、11869.55eV;p-アルサニル酸、11874.56eV)。亜ヒ酸塩対PAOから得られたXANESスペクトルを考慮すると、PAO中でのフェニル環へのAsの配位(亜ヒ酸塩中の0原子と比較)により、より低いエネルギーへの吸収端シフトが生じることが明らかである。PhAs(GS)2中でフェニル基に加えて、2個のGSリガンドへのAsの結合は、より低いエネルギーへの更なる吸収端シフトした。PhAs(GS)2の吸収端近傍後の構造の調査では、約11874eVでの吸収強度において実質的な低下が示された。NH2PhAs(III)では11871.80eVにホワイトラインピークが現れ、これはAs(III)種を示している。ピークは比較的広く、形状(吸収端前領域及び吸収端後領域)はPAOのスペクトルと異なる。吸収端後領域は、p-アルサニル酸のXANESスペクトルの吸収端後領域と高い類似性を示す。これは、吸収端後領域の広さと共に、p-アミノフェニルジクロロアルシンとp-アミノフェニルアルシンオキシドとの混合物を示し得る。
【０３０８】
NH2PhAs(LHP)の形成
p-アミノフェニルアルシン化合物(p-アミノフェニルジクロロアルシン及びp-アミノフェニルアルシンオキシドの2種を含有)の合成の成功後、幾つかの反応条件を使用して、最適な反応条件を同定し、所望のアミノフェニルアルシン-ペプチド複合体を生成した。最初に、各反応の温度を37℃定常で維持し、任意の生成物の分解の可能性を最小限に抑えた。LHPは費用がかかるので、As化合物を過度に使用した。反応は全ての反応物の化学量論比で迅速であり、理想的な化学量論は、As 3モル:LHP 1モルであることが決定された。分取用HPLCによるリン酸緩衝液中での反応の精製では、約10分の一の生成物が生成されたため、反応溶液の最適な溶媒/pHはMilli-Q水(pH7)(リン酸緩衝液(pH8)と比較)であることが決定された。反応は迅速であり、所望の複合体が容易に形成されたが、反応を37℃で約24時間インキュベートして、ペプチドへのAs化合物の完全な結合を確実にした。
【０３０９】
最適な条件を用いたNH2PhAs(III)及びLHPの反応溶液のESI-質量スペクトル(図35)は、所望のアミノフェニルアルシン(LHP)複合体の形成を示している。所望の複合体の形成は、m/z462.4([NH2-Ph-As(LHP)+3H]3+)及びm/z693.0([NH2-Ph-As(LHP)+2H]2+)でのピークにより確認される。p-アミノフェニルジクロロアルシンを過度に添加したため、未反応のp-アミノフェニルジクロロアルシン(m/z259.1)がスペクトルにおいて明らかである。少量の遊離LHPがスペクトルにおいて明らかであり(m/z407.2、610.1)、これはESI-MSプロセスによる断片化に起因し得る。
【０３１０】
NH2PhAs(LHP)の存在がESI-MSにより確認されたら、HPLCによる分離を行った。8.6分、10.5分及び12.2分に溶出した画分をESI-MSで分析し、NH2PhAs(III)に関連する種として同定した。所望のNH2PhAs(LHP)複合体は13.0分(大ピーク)に溶出した。
【０３１１】
合成NH2PhAs(LHP)をXASにより特性評価した(図34)。生成物がAs(III)種であることは吸収端エネルギー及びホワイトラインピークエネルギー(11870.04eV)の位置から明らかである。重要なことに、NH2PhAs(LHP)スペクトルの吸収端後領域、及びNH2PhAs(III)を形成するための反応の生成物から得られた吸収端後領域に有意差がある。第1に、ホワイトラインピークは狭く、より純粋な生成物を示唆している。第2に、約11874eVのショルダーは、PhAs(GS)2のものと形状が類似しており、亜ヒ酸塩又はPAOのものよりもはるかに顕著である。吸収端後の低下はSへのASの結合を示しているため、Asがペプチドに結合していると想定することも合理的であるが、これを確認するためにEXAFS分析も行った。
【０３１２】
図36は、合成NH2PhAs(LHP)について記録した最適な単一散乱フィッティング(第1の配位殻)及びEXAFSデータを示している。R+Δ(Å)>3でのピークは、As原子に結合したフェニル環と放出電子との相互作用による可能性が最も高い。As原子は2S及び1Cに結合している可能性が高い。
【０３１３】
特性評価データから、NH2PhAs(LHP)の合成の成功が確認される。
【０３１４】
ClPhAs(V)の合成
p-アルサニル酸のジアゾ化及びClのその後のカップリングにより、化合物ClPhAs(V)の合成に成功した。ESI質量スペクトル(図37)は、所望の生成物(m/z236.9、[Cl-Ph-AsH2O3+H]+)の形成を示している。m/z219.0でのピークはパラ置換されたヒドロキシフェニルアルソン酸([OH-Ph-AsH2O3+H]+)に対応しており、これは、ジアゾ化反応の副生成物として生成され得る。
【０３１５】
1H NMRによる合成p-クロロフェニルアルソン酸の分析では、1つの主要構造の存在が示され、2セットの多重線がδ=7.76ppm及びδ=7.69ppmに存在していた。
【０３１６】
p-クロロフェニルアルソン酸の収率は約24%であった。バルト反応による等、他の合成方法を、この化合物の合成に利用でき、それにより、亜ヒ酸アルカリは、p-クロロアニリンから形成されたアリールジアゾニウムにカップリングされる。収率は典型的には60〜80%である。しかし、この作業に用いられるp-アルサニル酸のジアゾ化及びその後のClのカップリングは、ヨウ化カリウム及び臭化カリウムを各々添加してわずかに修飾することで、同じ前駆体p-アルサニル酸を用いてp-ヨードフェニルアルソン酸及び場合によりp-ブロモフェニルアルソン酸を生成するためにも使用できるため、この方法が好まれた。
【０３１７】
合成p-クロロフェニルアルソン酸の更なる特性評価をXASにより行った。図38は、As(III)及びAS(V)固体標準物質、並びにp-クロロフェニルアルソン酸のAs K吸収端XANESスペクトルを示している。p-クロロフェニルアルソン酸では、11874.55eVにホワイトラインピークが現れ、これはAs(V)種を示しており、p-アルサニルのものとほぼ同一であり、Ph及びO原子へのAsの結合が確認される。
【０３１８】
ClPhAs(LHP)の形成
LHPをp-クロロフェニルアルソン酸と反応させた。所望のCl-PhAs(LHP)化合物を生成するのに最適な反応条件を同定するための全ての試行において、LHPを過度に維持した。これは、p-クロロフェニルアルソン酸が、LHPへの結合前に十分に還元されることを確実にするためであった。様々な反応物の比を試験して、最適な反応条件を求め、それにより、全ての試行で、ClPhAs(LHP)の生成が示された(ESI-MSにより確認)。重要なことに、ClPhAs(LHP)の存在は16時間前は観察されず、As(III)への還元及びその後の結合が迅速でないことを示唆している。37℃で約24時間のインキュベーション後、ClPhAs(LHP)に対応するピーク、並びに酸化LHP、即ちS-Sにより結合した環状LHPに関連するピークが、ESI質量スペクトルに存在した。72時間後のこの反応のESI質量スペクトルを図39に示す。m/z468.8及びm/z702.5でのピークは所望のクロロフェニルアルソン-ペプチド構造(各々[Cl-Ph-As(LHP)+3H]3+及び([Cl-Ph-As(LHP)+2H]2+)に対応する。m/z406.8及びm/z609.5でのピークにより示されるイオンは、酸化LHP(各々、[酸化LHP+3H]3+及び[酸化LHP+2H]2+])に対応する。
【０３１９】
ESI-MSによりCl-PhAs(LHP)の生成が確認されたら、HPLCによる分離を行った。17.1分に溶出したESI-MSの画分は酸化LHPとして同定された。2つの有意な画分は22.1分及び22.4分に溶出した。ESI-MSで分析すると、これらの画分がいずれもほぼ同一であり、それによりこれらはいずれも所望のClPhAs(LHP)複合体を含有していた。
【０３２０】
先に記載したPhAs(LHP)複合体の場合と同様に、異なる溶出時間は、2つの自発的に相互変換するAs異性体の存在を反映していると仮定される。
【０３２１】
予備細胞毒性試験では、各HPLC画分からの生成物がK562細胞(ヒト慢性骨髄性白血病)において同じ毒性を示し、これは異性体のラセミ化と一致することが示された。
【０３２２】
ClPhAs(LHP)のXAS分析を行って、Asに配位した原子の性質及びその酸化状態を求めた。図38はAs標準物質及びClPhAs(LHP)のAs K吸収端XANESスペクトルを示している。ClPhAs(LHP)複合体のホワイトラインピークエネルギーは11870.31eVであり、As(III)種を示している。約11874eVでの顕著なポストピークの低下は、このスペクトルに存在し、これは、PhAs(GS)2のものと類似しており、ペプチドへのAs(III)の配位に対して予想されるものと一致する。
【０３２３】
図40は、ClPhAs(LHP)について記録されたEXAFSデータの単一散乱フィッティング(第1の配位殻)を示しており、そこで散乱体は2S及び1Cである。NH2PhAs(LHP)EXAFSフィッティングと同様に、フィッティングと整合しないフーリエ変換実験のスペクトルにおけるR+Δ(Å)>3でのピークは、第1の配位殻を超えて生じる、Asに隣接するフェニル環と放出電子との相互作用によるものである。特性評価データにより、所望の複合体ClPhAs(LHP)の合成の成功が確認される。
【０３２４】
IPhAs(V)の合成
p-アルサニル酸のジアゾ化及びその後のIのカップリングにより、p-ヨードフェニルアルソン酸の合成に成功した。IPhAs(V)の収率は約30%であった。
【０３２５】
ESI質量スペクトル(図41)からは、所望の生成物(m/z328.8、[I-Ph-AsH2O3+H+]+)の形成が示された。合成p-ヨードフェニルアルソン酸の1H NMRによる分析では、1つの主要構造の存在が示され、ここで、2セットの多重線がδ=8.00ppm及びδ=7.51ppmに存在していた。
【０３２６】
合成p-ヨードフェニルアルソン酸もXASにより特性評価した。図42は、As(III)及びAs(V)固体標準物質、並びにp-ヨードフェニルアルソン酸のAs K吸収端XANESスペクトルを示している。p-ヨードフェニルアルソン酸の吸収端近傍X線スペクトルは11874.8eVにホワイトラインピークを示し、As(V)種を示している。吸収端エネルギーはまた、p-アルサニル酸のものに類似しており、Ph及びO原子へのAsの結合が確認される。
【０３２７】
IPhAs(LHP)の形成
ペプチドとの結合前に、ペプチド中のチオール基に依存して、As(V)種IPhAs(V)をLHPと反応させて、アルソン酸基を還元した。p-ヨードフェニルアルソン酸の還元は迅速ではなく、全般的にフェニルアルシン-ペプチド複合体が形成されるまでに少なくとも72時間かかった。この反応(72時間後)のESI質量スペクトルを図43に示す。m/z499.3及びm/z748.5でのピークは所望のヨードフェニルアルシン-ペプチド構造(各々、[I-Ph-As(LHP)+3H]3+及び([I-Ph-As(LHP)+2H]2+)に対応する。m/z406.8及びm/z609.5でのピークにより示されるイオンは、酸化LHP(各々、[酸化LHP+3H]3+及び[酸化LHP+2H]2+)に対応する。
【０３２８】
HPLC精製により、17.1分に溶出した画分が得られ、これはESI-MSにより酸化LHPであることが確認された。2つの有意な画分が溶出し(22.8分及び23.2分)、ESI-MSでは、所望のIPhAs(LHP)複合体が示された。これらは、PhAs(LHP)及びClPhAs(LHP)について先に記載したように相互変換する異性体であることが示された。
【０３２９】
p-ヨードフェニルアルソン酸の予備毒性試験では、2つの異性体がK562細胞株において同じ毒性を誘発し、これは、溶液中の複合体の自発的ラセミ化と一致していたことが示された。
【０３３０】
IPhAs(LHP)複合体をXASで分析した。図42はAs標準物質及びIPhAs(LHP)複合体のAs K吸収端XANESスペクトルを示している。IPhAs(LHP)複合体のホワイトラインピークエネルギーは11869.79eVであった。他のXPhAs(LHP)スペクトルと同様に、IPhAs(LHP)スペクトルのショルダー領域における低下は、PhAs(GS)2スペクトルのものと類似しており、SへのAs(III)複合体の結合と一致する。
【０３３１】
図44は、IPhAs(LHP)について記録されたEXAFSデータの単一散乱フィッティング(第1の配位殻)を示しており、そこで散乱体は2S及び1Cである。再び、フィッティングと整合しないフーリエ変換実験のスペクトルにおけるR+Δ(Å)>3でのピークは、(第1の配位殻を超えて)Asに隣接するフェニル環と放出電子との相互作用に起因し得る。IPhAs(LHP)の特性評価データにより、所望の複合体の合成の成功が確認される。IPhAs(LHP)複合体は溶液中で経時的に自発的にラセミ化する2つの鏡像異性体(Asのキラル中心)の混合物として存在すると結論付けられる。
【０３３２】
要約すれば、電子吸引性基、電子供与性基及び立体障害基を包含するPhAs(LHP)の幾つかのp-置換類似体が合成された。今後の実験には、可能性のある治療用途に最適な複合体を決定するために生物学的アッセイで試験する前に、これらの複合体全てを十分に精製及び特性評価することが含まれるであろう。生物学的試験には、既に上記したこれらのプロトコル及び細胞株が反映されるであろう。
【０３３３】
本発明の様々な実施形態についての上記説明は、関連分野の当業者に説明する目的で提供される。本発明を網羅することも、単一の開示された実施形態に限定することも意図するものではない。上述したように、本発明の多数の代替例及び変更例が上記教示の分野の当業者には明らかであろう。したがって、幾つかの代替実施形態が具体的に考察されており、他の実施形態も明らかであるか、又は当業者により比較的簡単に開発されるであろう。したがって、本特許明細書は、本明細書において考察された本発明の全ての代替例、修正例及び変更例、並びに上記の発明の趣旨及び範囲に含まれる他の実施形態を包含することが意図される。
【０３３４】
後続する特許請求の範囲及び先行する本発明の説明において、表現言語又は必須の暗示により文脈が明確に他を必要とする場合を除いて、用語「含む(comprise)」又は「含む(comprises)」若しくは「含んでいる(comprising)」を含むその変化形は、包括的意味、即ち、本発明の1つ以上の実施形態において、言及した整数の存在を特定するために用いられるが、更なる整数の存在又は追加を排除するものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７（ａ）】
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【図２７（ｂ）】
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【図２７（ｃ）】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０（ａ）】
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【図３０（ｂ）】
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【図３０（ｃ）】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【国際調査報告】
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