(57)【要約】  ＡＧＥ修飾細胞を死滅させる方法は、超音波を、対象に印加するステップ；及び抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、対象に投与するステップを含む。超音波を印加するステップは、抗ＡＧＥ抗体を投与するステップの前に、又はこの後でなされうる。ＡＧＥ修飾細胞は、制限部位にありうる。
2021534144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＧＥ修飾細胞を死滅させる方法であって、
超音波を、対象に印加するステップ；及び
抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、前記対象に投与するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項２】
組織培養物中又は細胞培養物中のＡＧＥ修飾細胞を死滅させる方法であって、
超音波を、前記組織培養物又は細胞培養物に印加するステップ；及び
抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、前記組織培養物又は細胞培養物に投与するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項３】
ＡＧＥ障害を治療する方法であって、
超音波を、ＡＧＥ障害を有する対象に印加するステップ；及び
抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、前記対象に投与するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項４】
神経膠腫に罹患している対象を治療する方法であって、
前記対象の血液脳関門を破壊するステップ；その後、
抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、前記対象に投与するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項５】
骨関節炎に罹患している対象を治療する方法であって、
超音波を、罹患関節に印加するステップ；その後、
抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、前記対象に投与するステップ；を含み、
前記組成物が、静脈内投与される、
前記方法。
【請求項６】
ＡＧＥ障害を治療する方法であって、
微小気泡にコンジュゲートされた抗ＡＧＥ抗体を、対象に投与するステップ；及び
超音波を、前記対象に印加するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項７】
微小気泡にコンジュゲートされた抗ＡＧＥ抗体を含む組成物。
【請求項８】
ＡＧＥ障害の治療における使用のための、微小気泡にコンジュゲートされた抗ＡＧＥ抗体を含む組成物。
【請求項９】
ＡＧＥ障害を治療するための医薬の製造のための、微小気泡にコンジュゲートされた抗ＡＧＥ抗体の使用。
【請求項１０】
超音波を印加するステップが、抗ＡＧＥ抗体を投与するステップの前になされる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
抗ＡＧＥ抗体を投与するステップが、超音波を印加するステップの前になされる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＡＧＥ修飾細胞が、制限部位にある、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
制限部位が、脳、関節、眼、精巣、及び前立腺からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
対象の血液脳関門を破壊するステップが、超音波を、前記対象に印加することを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
対象を、ＡＧＥ修飾細胞を死滅させることの有効性について調べるステップ；その後、
超音波を印加し、抗ＡＧＥ抗体を投与することを反復するステップ：
をさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
対象を、ＡＧＥ障害を治療することの有効性について調べるステップ；その後、
超音波を印加し、抗ＡＧＥ抗体を投与することを反復するステップ；
をさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、複数の抗ＡＧＥ抗体を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項１８】
組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項１９】
対象が、ヒト、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ラクダ、アルパカ、イヌ、及びネコからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
対象が、ヒトである、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
抗ＡＧＥ抗体が、ヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ラクダ、アルパカ、ウシ、ヒツジ、ブタ、及びヤギからなる群から選択される種に対して非免疫原性である、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項２２】
抗ＡＧＥ抗体が、静脈内投与される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
抗ＡＧＥ抗体が、関節内投与される、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
抗ＡＧＥ抗体が、ＦＦＩ、ピラリン、ＡＦＧＰ、ＡＬＩ、カルボキシメチルリシン、カルボキシエチルリシン、及びペントシジンからなる群から選択されるＡＧＥ修飾を呈する少なくとも１つのタンパク質又はペプチドを含むＡＧＥ修飾細胞に結合する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項２５】
抗ＡＧＥ抗体が、カルボキシメチルリシン修飾タンパク質又はカルボキシメチルリシン修飾ペプチドに結合する、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項２６】
抗ＡＧＥ抗体が、カルボキシエチルリシン修飾タンパク質又はカルボキシエチルリシン修飾ペプチドに結合する、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項２７】
ＡＧＥ修飾細胞が、老化細胞である、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
組成物が、単位投与量形態である、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項２９】
組成物が、滅菌されている、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項３０】
抗ＡＧＥ抗体が、配列番号１、配列番号３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質又はペプチドを含む、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項３１】
抗体が、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質又はペプチドを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項３２】
抗体が、
重鎖、及び
軽鎖
を含み、
前記重鎖が、配列番号１、配列番号１７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
前記軽鎖が、配列番号３、配列番号１９、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１〜３１のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項３３】
抗体が、
重鎖、及び
軽鎖
を含み、
前記重鎖が、配列番号１、配列番号１７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、
前記軽鎖が、配列番号３、配列番号１９、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１〜３２のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項３４】
抗体が、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む相補性決定領域を含み、かつ、
前記抗体が、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ラクダ、アルパカ、イヌ、及びネコからなる群から選択される種に対して、実質的に非免疫原性である、
請求項１〜３３のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項３５】
抗体が、ＡＧＥ修飾細胞の破壊を引き起こす薬剤にコンジュゲートされている、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項３６】
薬剤が、毒素、細胞毒性剤、磁気ナノ粒子、及び磁気スピンボルテックスディスクからなる群から選択される、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項３７】
抗体が、ヒト化抗体である、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項３８】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項３９】
抗体が、ヒトに対して、実質的に非免疫原性である、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項４０】
抗体が、９×１０−３／秒以下の解離速度（ｋｄ）を有する、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項４１】
抗体が、対象の免疫系による、標的とする細胞の破壊を可能とする定常領域を含む、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項４２】
抗体が、二重特異性抗体である、請求項１〜４１のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項４３】
ＡＧＥ障害が、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ又はルー・ゲーリック病）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ハンチントン舞踏病、特発性肺線維症、筋ジストロフィー（ベッカー型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、及び山本型筋ジストロフィーを含む）、黄斑変性、白内障、糖尿病網膜症、パーキンソン病、早老症（ウェルナー症候群及びハッチソン−ギルフォード早老症を含む）、白斑、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、湿疹、関節炎（骨関節炎、関節リウマチ、及び若年性関節リウマチを含む）、アテローム性動脈硬化、がん及び転移性がん（例えば、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肺がん、黒色腫、結腸がん、腎細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、直腸がん、食道がん、肝がん、口腔咽頭がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、胃がん、膵がん、及び網膜芽細胞腫を含む）、がん治療と関連する身体機能障害又はがん治療の副作用、高血圧症、緑内障、骨粗相症、サルコペニア、悪液質、脳卒中、心筋梗塞、心房細動、移植拒絶、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、放射線曝露、ＨＩＶ治療の副作用、化学兵器曝露、中毒、炎症、腎症、レビー小体認知症、プリオン病（ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト−ヤコブ病、スクレピー、慢性消耗性疾患、クールー病、及び致死性家族性不眠症を含む）、前彎後彎症、自己免疫障害、脂肪組織の減少、乾癬、クローン病、喘息、老化の生理学的影響（しわ、しみ、脱毛、皮下脂肪組織の低減、及び皮膚の菲薄化などの「美容的」影響を含む）、特発性ミオパシー（例えば、特発性炎症性筋障害、特発性炎症性筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、散発性封入体筋炎、及び若年性筋炎を含む）、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ、デビック病、又はデビック症候群）、てんかん、及び副腎皮質ジストロフィー（ＡＬＤ、Ｘ染色体連鎖型副腎白質委縮症、Ｘ−ＡＬＤ、大脳型ＡＬＤ、又はｃＡＬＤ）からなる群から選択される少なくとも１つのＡＧＥ障害を含む、請求項１〜４２のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項４４】
ＡＧＥ障害が、脳がん、脳腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、及び神経鞘腫瘍、髄膜炎、脳／大脳膿瘍、後期神経性トリパノソーマ症（睡眠障害）、脳浮腫、プリオン病、脳炎、狂犬病、関節炎／骨関節炎、変性性関節疾患、滑膜炎、滑液包炎、前立腺がん、眼がん、及び眼障害からなる群から選択される少なくとも１つのＡＧＥ障害を含む、請求項１〜４３のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項４５】
超音波が、
０．５〜１０ＭＨｚの周波数、
０．０５〜５Ｗ／ｃｍ２の強度、及び
０．０５〜１０ｋＨｚのパルス反復周波数（ＰＲＦ）
で印加される、請求項１〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
超音波を印加するステップの前に、造影剤を投与するステップをさらに含む、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
造影剤が、ガス入り微小気泡を含む、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
微小気泡が、ターゲティングリガンドにコンジュゲートされている、請求項１〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
ターゲティングリガンドが、糖化反応最終産物に結合する抗体を含む、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
「SIW01-028-WO_Sequence_Listing.txt」と名付けられ、２０１９年７月１０日に作成され、１２０キロバイトのファイルサイズを伴う、ASCIIテキストファイル内に含有される配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
老化細胞は、部分的に機能的であるか、又は非機能的な細胞であり、増殖停止の状態にある。老化とは、細胞の独特な状態をいい、バイオマーカーｐ１６Ｉｎｋ４ａの活性化、及びβ−ガラクトシダーゼの発現などのバイオマーカーと関連する。複製老化は、ＤＮＡ損傷応答をもたらす、テロメアの短縮から生じる。老化はまた、細胞の損傷又はストレス（増殖因子による過剰刺激などのストレス）によっても引き起こされうる。
【０００３】
終末糖化反応最終産物（ＡＧＥ：advanced glycation end-product；また、ＡＧＥ修飾タンパク質又は糖化反応最終産物とも称される）は、糖とタンパク質側鎖との非酵素反応から生じる（Ando, K. et al., Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999)）。この過程は、還元糖とアミノ基との可逆反応で開始してシッフ塩基を形成し、これが進行して、共有結合性のアマドリ再配列産物を形成する。形成されると、アマドリ産物は、さらなる再配列を経て、ＡＧＥを産生する。糖尿病（ＤＭ：diabetes mellitus）及び酸化ストレスにより引き起こされる高血糖症は、膜タンパク質の、この翻訳後修飾を促進する（Lindsey JB, et al., “Receptor For Advanced Glycation End-Products (RAGE) and soluble RAGE (sRAGE): Cardiovascular Implications,” Diabetes Vascular Disease Research, Vol. 6(1), 7-14, (2009)）。ＡＧＥはまた、他の方法からも形成されうる。例えば、終末糖化反応最終産物である、Ｎε−（カルボキシメチル）リシンは、脂質の過酸化反応及び糖化反応の両方の産物である。ＡＧＥは、糖尿病性合併症、炎症、網膜症、腎症、アテローム性動脈硬化、脳卒中、内皮細胞機能障害、及び神経変性障害を含む、複数の病理学的状態と関連している（Bierhaus A, “AGEs and their interaction with AGE-receptors in vascular disease and diabetes mellitus. I. The AGE concept,” Cardiovasc Res, Vol. 37(3), 586-600 (1998)）。
【０００４】
ＡＧＥ修飾タンパク質はまた、老化細胞のマーカーでもある。当技術分野では、この糖化反応最終産物と老化との関連が周知である。例えば、Gruber, L. （国際公開第２００９／１４３４１１号パンフレット、２００９年１１月２６日）、Ando, K. et al. （Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999)）、Ahmed, E.K. et al. （“Protein Modification and Replicative Senescence of WI-38 Human Embryonic Fibroblasts” Aging Cells, vol. 9, 252, 260 (2010)）、Vlassara, H. et al. （Advanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell Surface Induce Receptor-Mediated Phagocytosis by Macrophages, J. Exp. Med., Vol. 166, 539, 545 (1987)）；及びVlassara et al. （“High-affinity-receptor-mediated Uptake and Degradation of Glucose-modified Proteins: A Potential Mechanism for the Removal of Senescent Macromolecules” Proc. Natl. Acad. Sci. USAI, Vol. 82, 5588, 5591 (1985)）を参照されたい。さらに、Ahmed, E.K. et al.は、糖化反応最終産物が、「細胞内タンパク質及び細胞外タンパク質に対する自発的損傷の主要原因のうちの１つ」であることを指し示す（Ahmed, E.K. et al.、上記、３５３頁を参照されたい）。したがって、糖化反応最終産物の蓄積は、老化及び機能の欠如と関連する。
【０００５】
細胞の老化を引き起こす損傷又はストレスはまた、細胞内のミトコンドリアＤＮＡに負の影響も与えて、これらにフリーラジカルを産生させ、これが、細胞内の糖と反応して、メチルグリオキサール（ＭＧ：methyl glyoxal）を形成する。続いてＭＧは、タンパク質又は脂質と反応して、終末糖化反応最終産物を発生させる。タンパク質成分であるリシンの場合、ＭＧは、ＡＧＥであるカルボキシメチルリシンを形成するように反応する。
【０００６】
ミトコンドリアＤＮＡに対する損傷又はストレスはまた、細胞周期をブロックするタンパク質を産生するように細胞を誘導するＤＮＡ損傷応答も誘発する。これらのブロックするタンパク質は、細胞分裂を阻害する。損傷又はストレスの持続は、ｍＴＯＲの産生を引き起こし、今度はこれが、タンパク質の合成を活性化させ、タンパク質の分解を不活化させる。細胞のさらなる刺激は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）をもたらす。
【０００７】
ｐ１６とは、Ｓ期（合成期）を阻害することにより、細胞周期の調節に関与するタンパク質である。ｐ１６は、老化時に活性化される場合もあり、又はＤＮＡ損傷、酸化ストレス、若しくは薬物への曝露など、多様なストレスに応答して活性化される場合もある。ｐ１６は、典型的に、細胞を、ＤＮＡ損傷に応答して老化させ、細胞が過剰増殖状態に入ることを不可逆的に防止する腫瘍抑制タンパク質であると考えられている。しかし、一部の腫瘍は、ｐ１６の過剰発現を示すが、他の腫瘍は、発現の下方調節を示すので、この点には、ある程度の両義性が存在している。一部の腫瘍におけるｐ１６の過剰発現が、不全性網膜芽細胞腫タンパク質（「Ｒｂ」：retinoblastoma protein）の結果生じることを示唆する証拠がある。ｐ１６は、Ｓ期を阻害するように、Ｒｂに作用し、Ｒｂは、ｐ１６を下方調節し、負のフィードバックを創出する。不全性Ｒｂは、Ｓ期の阻害及びｐ１６の下方調節のいずれにも失敗するので、過剰増殖細胞内の、ｐ１６の過剰発現を結果としてもたらす（Romagosa, C. et al., p16Ink4a overexpression in cancer: a tumor suppressor gene associated with senescence and high-grade tumors, Oncogene, Vol. 30, 2087-2097 (2011)）。
【０００８】
老化細胞は、炎症促進性因子を含む、細胞間シグナル伝達に関与する多くの因子の分泌と関連し；これらの因子の分泌は、老化関連分泌現象又はＳＡＳＰ（senescence-associated secretory phenotype）と称されている（Freund, A. “Inflammatory networks during cellular senescence: causes and consequences” Trends Mol Med. 2010 May;16(5):238-46）。クローン病及び関節リウマチなどの自己免疫疾患は、慢性炎症と関連する（Ferraccioli, G. et al. “Interleukin-1β and Interleukin-6 in Arthritis Animal Models: Roles in the Early Phase of Transition from Acute to Chronic Inflammation and Relevance for Human Rheumatoid Arthritis” Mol Med. 2010 Nov-Dec; 16(11-12): 552-557）。慢性炎症は、病理部位近傍における、ベースラインより高レベルであるが、急性炎症において見出されるレベルより低レベルの炎症促進性因子の存在により特徴づけられうる。これらの因子の例は、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ５補体タンパク質、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＩｇＥ、α４β１インテグリン、及びα４β７インテグリンを含む。老化細胞はまた、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＣＡＭ１、ＴＮＦＡＰ３、ＥＳＭ１、及びＣＣＬ２を含む、炎症において役割を伴う遺伝子も上方調節する（Burton, D.G.A. et al., “Microarray analysis of senescent vascular smooth muscle cells: a link to atherosclerosis and vascular calcification”, Experimental Gerontology, Vol. 44, No. 10, pp. 659-665 (October 2009)）。
【０００９】
老化細胞は、ＳＡＳＰの一部として、反応性酸素分子種（「ＲＯＳ」：reactive oxygen species）を分泌する。ＲＯＳは、細胞の老化の維持において、重要な役割を果たすと考えられる。ＲＯＳの分泌は、老化細胞が、近隣細胞内の老化を誘導するバイスタンダー効果を創出する：ＲＯＳは、ｐ１６の発現を活性化させ、老化をもたらすことが公知である、細胞の損傷そのものを創出する（Nelson, G., A senescent cell bystander effect: senescence-induced senescence, Aging Cell, Vo. 11, 345-349 (2012)）。ｐ１６／Ｒｂ経路は、ＲＯＳの誘導をもたらし、これは、タンパク質キナーゼＣデルタを活性化させ、ＲＯＳをさらに増強する正のフィードバックループを創出し、細胞周期の不可逆的な停止の維持の一助となり；がん細胞を、ＲＯＳに曝露すれば、過剰増殖細胞内の細胞期の停止を誘導することにより、がんを治療するのに効果的でありうることが示唆されてさえいる（Rayess, H. et al., Cellular senescence and tumor suppressor gene p16, Int J Cancer, Vol. 130, 1715-1725 (2012)）。
【００１０】
近年の研究は、老化細胞を除去することの治療的利益を裏付けている。Mayo Clinic in Rochester、Minnesotaにおけるインビボ動物研究は、老化細胞の消失についてのバイオマーカーを保有するトランスジェニックマウスにおける老化細胞の消失は、細胞の老化と関連する老化関連障害を遅延させることを見出した。脂肪組織内及び筋肉組織内の老化細胞の消失は、サルコペニア及び白内障の発症を実質的に遅延させ、骨格筋及び眼における老化指標を低減した（Baker, D. J. et al., “Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders”, Nature, Vol. 479, pp. 232-236, (2011)）。老化細胞の消失を誘導するように治療されたマウスは、筋線維の直径が、非治療マウスと比較して大きいことが見出された。トレッドミル運動試験は、治療がまた、筋肉の機能も保存することも指し示した。老化細胞の除去のための、トランスジェニックマウスの持続的治療は、負の副作用を及ぼさず、細胞に依存する老化関連現象を、選択的に遅延させた。このデータは、老化細胞の除去が、有益な治療効果をもたらすことを裏付け、これらの利益が、有害作用を伴わずに達成されうることを示す。
【００１１】
マウスにおける、さらなるインビボ動物研究は、老化細胞溶解剤を使用する、老化細胞の除去が、老化関連障害、アテローム性動脈硬化、及び肺線維症を治療することを見出した。高齢マウス又は早老マウスにおける、老化細胞溶解薬による短期治療は、複数の老化関連現象を緩和した（Zhu, Y. et al., “The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs”, Aging Cell, vol. 14, pp. 644-658 (2015)）。老化細胞溶解薬による長期治療は、アテローム性動脈硬化が確立されたマウスにおいて、血管運動機能を改善し、血管内膜プラークの石灰化を低減した（Roos, C.M. et al., “Chronic senolytic treatment alleviates established vasomotor dysfunction in aged or atherosclerotic mice”, Aging Cell (2016)）。老化細胞溶解剤の投与による、老化細胞の除去は、マウスにおける放射線誘導性肺線維症を回復させた（Pan, J. et al., “Inhibition of Bcl-2/xl with ABT-263 selectively kills senescent type II pneumocytes and reverses pulmonary fibrosis induced by ionizing radiation in mice”, International Journal of Radiation Oncology Biology Physics, Vol. 99, No. 2, pp. 353-361 (2017)）。このデータは、老化細胞を除去することの利益を、さらに裏付けている。
【００１２】
老化細胞は、ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドなど、老化の細胞表面マーカーに結合する抗体を使用してもまた、特異的にターゲティングされ、除去されうる。抗体は、２つの重鎖と、２つの軽鎖とから構成されるＹ字形タンパク質である。Ｙ字形の２つアームが、抗体の抗原結合性断片（Ｆａｂ：fragment antigen-binding）領域を形成するのに対し、Ｙ字形の基部又はテール部は、抗体のＦｃ（結晶性断片：fragment crystallizable）領域を形成する。抗原への結合は、相補性決定領域（また、ＣＤＲ又は超可変領域としても公知である）のセットである、パラトープと称される場所にある、抗原結合性断片領域（Ｙ字形のアームの先端部分）の末端部分で生じる。相補性決定領域は、異なる抗体間で異なり、所与の抗体に、所与の抗原との結合のための特異性を与える。抗体のＦｃ（結晶性断片）領域は、抗原への結合の結果を決定し、補体カスケードを誘発するか、又は抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）を誘起することなどにより、免疫系と相互作用しうる。抗体ベースの免疫療法は、抗体が結合する抗原を発現する細胞を、特異的にターゲティングし、これらを死滅させる一方で、抗原を発現しない細胞を回避するそれらの能力のために、特に、所望である。
【００１３】
終末糖化反応最終産物（ＡＧＥ：advanced glycation end-product）に結合する抗体（抗ＡＧＥ抗体）は、サルコペニア（国際公開第２００９／１４３４１１号パンフレット、米国公開第２０１６／０２１５０４３号明細書、米国公開第２０１６／０１７５４１３号明細書）、アテローム性動脈硬化（米国公開第２０１３／０２４３７８５号明細書）、炎症及び自己免疫障害（国際公開第２０１６／０４４２５２号パンフレット）、神経変性障害（国際公開第２０１７／１８１１１６号パンフレット）、並びにがん（国際公開第２０１７／１４３０７３号パンフレット）を含む、多様なＡＧＥ障害の治療において効果的であることが示されている。ＡＧＥ修飾細胞に結合する抗体は、当技術分野で公知である。例は、Bucalaによる米国特許第５，７０２，７０４号明細書、及びAl-Abed et al.による米国特許第６，３８０，１６５号明細書において記載されている例を含む。抗ＡＧＥ抗体は、市販されているが、市販されている抗体は、治療的使用の対象とならない。
【００１４】
超音波は、細胞の特異的なターゲティングにおいてもまた効果的な、機械的技法である。超音波は、細胞構造の物理的差違に基づき、細胞を特異的にターゲティングする。超音波は、標的とする細胞又は標的組織を、熱的効果（加熱）により損傷又は破壊する場合もあり、キャビテーション、マイクロストリーミング、及び音響流など、非熱的効果により損傷又は破壊する場合もある。非破壊的超音波もまた、炎症過程との相互作用など、治療的利益をもたらしうる（Aviles Jr., F. et al., “Contact low-frequency ultrasound used to accelerate granulation tissue proliferation and rapid removal of nonviable tissue in colonized wounds: a case study”, Ostomy Wound Management, available online at www.o-wm.com/content/contact-low-frequency-ultrasound-used-accelerate-granulation-tissue-proliferation-and-rapid (2011)）。周波数、強度、波長、速度、波形、連続性（パルス状印加又は定常印加）、及び印加の持続時間などの超音波パラメータは、特異的治療効果をもたらすように変動させうる。
【００１５】
超音波は、がん性細胞及び腫瘍のターゲティングにおいて、特に、効果的である。悪性細胞は、超音波による損傷を、正常な健常細胞より受けやすい（Lejbkowicz, F. et al., “Distinct sensitivity of normal and malignant cells to ultrasound in vitro”, Environmental Health Perspectives, Vol. 105, Supplement 6, pp. 1575-1578 (1997)）。低強度の超音波は、音響力学療法（感作分子と共に施される超音波）、超音波媒介型化学療法、音響穿孔、超音波媒介型遺伝子送達、及び抗血管超音波療法などの形態でがんを治療するのに、治療的に使用されうる（Wood, A. K. W. et al., “A review of low-intensity ultrasound for cancer therapy”, Ultrasound in Medicine & Biology, Vol. 41, No. 4, pp. 905-928 (2015)）。
【００１６】
超音波は、多様な種類のがんに対して効果的であることが示されている。１．１ＭＨｚの周波数における、連続超音波の印加は、ヒト白血病細胞において、強度依存的な細胞膜の損傷及び細胞生存率の低下を引き起こす（Wang, P. et al., “Membrane damage effect of continuous wave ultrasound on K562 human leukemia cells”, Journal of Ultrasound Medicine, Vol. 31, pp. 1977-1986 (2012)）。低周波数及び低強度の超音波は、インビトロ及びインビボのいずれの神経膠腫細胞においても、アポトーシスを誘導しうる（Zhang, Z. et al., “Low frequency and intensity ultrasound induces apoptosis of brain glioma in rats mediated by caspase-3 Bcl-2, and survivin”, Brain Research, Vol. 1473, pp. 25-34 (2012)）。５−アミノレブリン酸、プロトポルフィリンIX、及びタラポルフィンナトリウムを、音響増感剤として含む、ポルフィリン誘導体を使用する、音響力学療法は、インビトロの悪性神経膠腫細胞に対して、細胞毒性である（Endo, S. et al., “Porphyrin derivatives-mediated sonodynamic therapy for malignant gliomas in vitro”, Ultrasound in Medicine and Biology, Vol. 41, No. 9, pp. 2458-2465 (2015)）。
【００１７】
細胞及び組織を、直接損傷することに加えて、超音波は、他の治療剤と組み合わせて施されうる。超音波媒介型キャビテーションは、低分子、抗体、又はウイルスベース薬の活性を減少させない（Myers, R. et al., “Ultrasound-mediated cavitation does not decrease the activity of small molecule, antibody or viral-based medicines”, International Journal of Nanomedicine, Vol. 13, pp. 337-349 (2018)）。超音波は、治療剤の、標的細胞又は標的組織への送達を、容易とするか、又は増強するのに使用されうる。超音波は、リポソームナノ粒子の蓄積、及び上皮腫瘍内の腫瘍透過性を増大させる（Watson, K. D. et al., “Ultrasound increases nanoparticle delivery by reducing intratumoral pressure and increasing transport in epithelial and epithelial-mesenchymal transition tumors”, Cancer Research, Vol. 72, No. 6, pp. 1485-1493 (2012)）。同様に、音響力学療法は、がん細胞に特異的なタンパク質で修飾された二酸化チタンナノ粒子の、標的とする細胞への取込みを増大させる（Ninomiya, K. et al., “Targeted sonodynamic therapy using protein-modified TiO2 nanoparticles”, Ultrasonics Sonochemistry, Vol. 19, pp. 607-614 (2012)）。
【００１８】
超音波はまた、抗体など、大型の治療剤の送達及び活性も増強する。超音波は、抗原の、固定化された抗体への結合を、劇的に加速化させる（Chen, R. et al., “Ultrasound-accelerated immunoassay, as exemplified by enzyme immunoassay of choriogonadotropin”, Clinical Chemistry, Vol. 30, No. 9, pp. 1446-1451 (1984)）。パルス状高強度焦点化超音波は、マウスのＩｇＧ１κモノクローナル抗体の、ヒト類表皮腫瘍内の送達を増強する（Khaibullina, A. et al., “Pulsed high-intensity focused ultrasound enhances uptake of radiolabeled monoclonal antibody to human epidermoid tumor in nude mice”, Journal of Nuclear Medicine, Vol. 49, pp. 295-302 (2008)）。微小気泡と組み合わせて施されるパルス状超音波は、マウスモデルにおいて、抗表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ：epidermal growth factor receptor）抗体の、神経膠腫細胞への送達を増強する（Liao, A-H. et al., “Enhanced therapeutic epidermal growth factor receptor (EGFR) antibody delivery via pulsed ultrasound with targeting microbubbles for glioma treatment”, Journal of Medical and Biological Engineering, Vol. 35, pp. 156-164 (2015)）。低強度の超音波は、インビトロにおいて、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）の、ヒト頭頸部がん細胞の殺滅に対する抗がん活性を増強する（Masui, T. et al., “Low-intensity ultrasound enhances the anticancer activity of cetuximab in human head and neck cancer cells”, Experimental and Therapeutic Medicine, Vol. 5, pp. 11-16 (2013)）。
【００１９】
薬物療法の著明な限界は、「制限部位」として公知である、体内の、ある特定の領域への薬物送達である。治療剤を、脳、関節、前立腺、精巣、及び眼などの制限部位に送達することは、困難又は不可能である。アクセスは、血液脳関門、血液精巣関門、血液眼関門、血液網膜関門又は血液房水関門などの血液組織関門のために制限的でありうる。例えば、血液脳関門は、脳及び中枢神経系を、循環血液から分離することから、治療剤が、脳にアクセスする能力を制限する。アクセスはまた、関節へのアクセスを制限する、滑膜などの組織によっても制限されうる。滑膜は、滑膜内関節腔内の、大半の治療剤を濾過する（Allen, K. D. et al., “Evaluating intra-articular drug delivery for the treatment of osteoarthritis in a rat model”, Tissue Engineering: Part B, Vol. 16, No. 1, pp. 81-92 (2010)）。抗体など、大型の治療剤を、制限部位に送達することは、特に、困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２００９／１４３４１１号パンフレット
【特許文献２】米国公開第２０１６／０２１５０４３号明細書
【特許文献３】米国公開第２０１６／０１７５４１３号明細書
【特許文献４】米国公開第２０１３／０２４３７８５号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１６／０４４２５２号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１７／１８１１１６号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２０１７／１４３０７３号パンフレット
【特許文献８】米国特許第５，７０２，７０４号明細書
【特許文献９】米国特許第６，３８０，１６５号明細書
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Aviles Jr., F. et al., “Contact low-frequency ultrasound used to accelerate granulation tissue proliferation and rapid removal of nonviable tissue in colonized wounds: a case study”, Ostomy Wound Management, available online at www.o-wm.com/content/contact-low-frequency-ultrasound-used-accelerate-granulation-tissue-proliferation-and-rapid (2011)
【非特許文献２】Lejbkowicz, F. et al., “Distinct sensitivity of normal and malignant cells to ultrasound in vitro”, Environmental Health Perspectives, Vol. 105, Supplement 6, pp. 1575-1578 (1997)
【非特許文献３】Wood, A. K. W. et al., “A review of low-intensity ultrasound for cancer therapy”, Ultrasound in Medicine & Biology, Vol. 41, No. 4, pp. 905-928 (2015)
【非特許文献４】Wang, P. et al., “Membrane damage effect of continuous wave ultrasound on K562 human leukemia cells”, Journal of Ultrasound Medicine, Vol. 31, pp. 1977-1986 (2012)
【非特許文献５】Zhang, Z. et al., “Low frequency and intensity ultrasound induces apoptosis of brain glioma in rats mediated by caspase-3 Bcl-2, and survivin”, Brain Research, Vol. 1473, pp. 25-34 (2012)
【非特許文献６】Endo, S. et al., “Porphyrin derivatives-mediated sonodynamic therapy for malignant gliomas in vitro”, Ultrasound in Medicine and Biology, Vol. 41, No. 9, pp. 2458-2465 (2015)
【非特許文献７】Myers, R. et al., “Ultrasound-mediated cavitation does not decrease the activity of small molecule, antibody or viral-based medicines”, International Journal of Nanomedicine, Vol. 13, pp. 337-349 (2018)
【非特許文献８】Watson, K. D. et al., “Ultrasound increases nanoparticle delivery by reducing intratumoral pressure and increasing transport in epithelial and epithelial-mesenchymal transition tumors”, Cancer Research, Vol. 72, No. 6, pp. 1485-1493 (2012)
【非特許文献９】Ninomiya, K. et al., “Targeted sonodynamic therapy using protein-modified TiO2 nanoparticles”, Ultrasonics Sonochemistry, Vol. 19, pp. 607-614 (2012)
【非特許文献１０】Chen, R. et al., “Ultrasound-accelerated immunoassay, as exemplified by enzyme immunoassay of choriogonadotropin”, Clinical Chemistry, Vol. 30, No. 9, pp. 1446-1451 (1984)
【非特許文献１１】Khaibullina, A. et al., “Pulsed high-intensity focused ultrasound enhances uptake of radiolabeled monoclonal antibody to human epidermoid tumor in nude mice”, Journal of Nuclear Medicine, Vol. 49, pp. 295-302 (2008)
【非特許文献１２】Liao, A-H. et al., “Enhanced therapeutic epidermal growth factor receptor (EGFR) antibody delivery via pulsed ultrasound with targeting microbubbles for glioma treatment”, Journal of Medical and Biological Engineering, Vol. 35, pp. 156-164 (2015)
【非特許文献１３】Masui, T. et al., “Low-intensity ultrasound enhances the anticancer activity of cetuximab in human head and neck cancer cells”, Experimental and Therapeutic Medicine, Vol. 5, pp. 11-16 (2013)
【非特許文献１４】Allen, K. D. et al., “Evaluating intra-articular drug delivery for the treatment of osteoarthritis in a rat model”, Tissue Engineering Part B Reviews, Vol. 16, No. 1, pp. 81-92 (2010)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
第１の態様では、本発明は、ＡＧＥ修飾細胞を死滅させる方法であって、超音波を、対象印加する（apply）ステップ；及び抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、対象に投与するステップを含む方法である。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、組織培養物中又は細胞培養物中のＡＧＥ修飾細胞を死滅させる方法であって、超音波を、組織培養物又は細胞培養物に印加するステップ；及び抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、組織培養物又は細胞培養物に投与するステップを含む方法である。
【００２４】
第３の態様では、本発明は、ＡＧＥ障害を治療する方法であって、超音波を、ＡＧＥ障害を有する対象に印加するステップ；及び抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、対象に投与するステップを含む方法である。
【００２５】
第４の態様では、本発明は、神経膠腫に罹患している対象を治療する方法であって、対象の血液脳関門を破壊するステップ、その後、抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、対象に投与するステップを含む方法である。
【００２６】
第５の態様では、本発明は、骨関節炎に罹患している対象を治療する方法であって、超音波を、罹患関節に印加するステップ、その後、抗ＡＧＥ抗体を含む組成物を、対象に投与するステップを含む方法である。組成物は、静脈内投与される。
【００２７】
第６の態様では、本発明は、ＡＧＥ障害を治療する方法であって、微小気泡にコンジュゲートした抗ＡＧＥ抗体を、対象に投与するステップ；及び超音波を、対象に印加するステップを含む方法である。
【００２８】
第７の態様では、本発明は、微小気泡にコンジュゲートした抗ＡＧＥ抗体を含む組成物である。
【００２９】
第８の態様では、本発明は、ＡＧＥ障害の治療における使用のための、微小気泡にコンジュゲートした抗ＡＧＥ抗体を含む組成物である。
【００３０】
第９の態様では、本発明は、ＡＧＥ障害を治療するための医薬の製造のための、微小気泡にコンジュゲートした抗ＡＧＥ抗体の使用である。
【００３１】
定義
「制限部位（restricted site）」という用語は、治療剤がアクセスすることが困難な、ヒト体内の場所を意味する。制限部位の例は、脳、関節、眼、精巣、及び前立腺を含む。
【００３２】
「ペプチド」という用語は、２〜５０アミノ酸から構成される分子を意味する。
【００３３】
「タンパク質」という用語は、５１アミノ酸以上から構成される分子を意味する。
【００３４】
「終末糖化反応最終産物」、「ＡＧＥ」、「ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチド」、及び「糖化反応最終産物」という用語は、糖が、さらに再配列され、不可逆的架橋を形成するタンパク質側鎖と反応する結果として形成される、修飾タンパク質又は修飾ペプチドを指す。この過程は、還元糖とアミノ基との可逆反応であって、シッフ塩基を形成する可逆反応で始まり、これが進行して、共有結合性のアマドリ再配列産物を形成する。形成されると、アマドリ産物は、さらなる再配列を経て、ＡＧＥを産生する。ＡＧＥ修飾タンパク質、及びＡＧＥ修飾タンパク質に対する抗体については、Bucalaによる米国特許第５，７０２，７０４号明細書（「Bucala」）、及びAl-Abed et al.による米国特許第６，３８０，１６５号明細書（「Al-Abed」）において記載されている。糖化アルブミン上で見出されるＮ−デオキシフルクトシルリシンなど、ＡＧＥを形成するのに必要な再配列を経ない、糖化タンパク質又は糖化ペプチドは、ＡＧＥではない。ＡＧＥは、２−（２−フルオイル）−４（５）−（２−フラニル）−１Ｈ−イミダゾール（「ＦＦＩ」：2-(2-furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazole）；５−ヒドロキシメチル−１−アルキルピロール−２−カルバルデヒド（「ピラリン」）；非蛍光性のモデルＡＧＥである、１−アルキル−２−ホルミル−３，４−ジグリコシルピロール（「ＡＦＧＰ」：1-alkyl-2-formyl-3,4-diglycosyl pyrrole）；カルボキシメチルリシン；カルボキシエチルリシン；及びペントシジンなどのＡＧＥ修飾（また、ＡＧＥエピトープ又はＡＧＥ部分とも称される）の存在により同定されうる。別のＡＧＥである、ＡＬＩについては、Al-Abedにおいて記載されている。
【００３５】
「ＡＧＥ抗原」という用語は、細胞のＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドに対する免疫応答を誘発する物質を意味する。細胞のＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドに対する免疫応答は、ＡＧＥが修飾されていないタンパク質又はペプチドに対する抗体の産生を含む。
【００３６】
「細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体」、「ＡＧＥ修飾細胞に結合する抗体」、「抗ＡＧＥ抗体」、又は「ＡＧＥ抗体」とは、好ましくは、抗体の定常領域を含み、ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドが、通常、細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウマ細胞、ラクダ科動物細胞（例えば、ラクダ細胞又はアルパカ細胞）、ウシ細胞、ヒツジ細胞、ブタ細胞、又はヤギ細胞の表面上に結合していることが見出される、タンパク質又はペプチドである、ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドに結合する、抗体、抗体断片、又は他のタンパク質若しくはペプチドを意味する。「細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体」、「ＡＧＥ修飾細胞に結合する抗体」、「抗ＡＧＥ抗体」、又は「ＡＧＥ抗体」は、ＡＧＥが修飾されたタンパク質又はペプチド、及びＡＧＥが修飾されていない、同じタンパク質又はペプチドの両方に、同じ特異性及び選択性で結合する（すなわち、ＡＧＥ修飾の存在は、結合を増大させない）、抗体又は他のタンパク質を含む。ＡＧＥ修飾アルブミンは、アルブミンは、通常、細胞の表面上に結合していることが見出されるタンパク質ではないため、細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質ではない。「細胞上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体」、「ＡＧＥ修飾細胞に結合する抗体」、「抗ＡＧＥ抗体」、又は「ＡＧＥ抗体」は、細胞の除去、破壊、又は死をもたらす抗体だけを含む。また、例えば、毒素、薬物、又は他の化学物質若しくは粒子にコンジュゲートした抗体も含まれる。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体もまた、可能である。
【００３７】
「老化細胞」という用語は、増殖停止の状態にあり、ｐ１６Ｉｎｋ４ａの活性化、又は老化と関連するβ−ガラクトシダーゼの発現など、１又は２以上の、老化のバイオマーカーを発現する細胞を意味する。また、ＡＬＳ患者の筋肉内で見出される、一部のサテライト細胞など、インビボでは増殖しないが、ある特定の条件下にあるインビトロでは増殖しうる、１又は２以上の、老化のバイオマーカーを発現する細胞も含まれる。
【００３８】
「老化細胞溶解剤」という用語は、老化細胞を破壊する、分子量９００ダルトン未満の低分子を意味する。「老化細胞溶解剤」という用語は、抗体、抗体コンジュゲート、タンパク質、ペプチド、又は生物療法を含む。
【００３９】
「ＡＧＥ障害」という用語は、終末糖化反応最終産物（ＡＧＥ）、ＡＧＥ修飾細胞、又は細胞の老化と関連する、病理学的な状態、疾患、又は障害を意味する。
【００４０】
「バリアント」という用語は、特異的に同定された配列と異なり、１又は２以上のヌクレオチド、タンパク質又はアミノ酸の残基が、欠失するか、置換されるか、又は付加された、ヌクレオチド配列、タンパク質配列、又はアミノ酸配列を意味する。バリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントの場合もあり、天然に存在しないバリアントの場合もある。同定された配列のバリアントは、同定された配列の機能的特徴の、一部又は全部を保持しうる。
【００４１】
「配列同一性パーセント（％）」という用語は、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列をアライメントし、必要な場合に、ギャップを導入し、保存的置換を、配列同一性の一部と考えずにおいた後で、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一な、候補配列のアミノ酸残基の百分率として規定される。アミノ酸配列の同一性パーセントを決定することを目的とするアライメントは、BLASTソフトウェア、BLAST-2ソフトウェア、ALIGNソフトウェア、又はMegalign（DNASTAR社製）ソフトウェアなど、公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、多様な方式で達成されうる。好ましくは、配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムである、ALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech, Inc.社（South San Francisco、CA）から公開されているか、又は米国著作権局において、ユーザー文書と共に保管され、米国著作権登録番号第TXU510087号の下に登録されている、ソースコードからコンパイルされうる。ALIGN-2プログラムは、デジタル式のUNIX V4.0Dを含む、UNIXオペレーティングシステム上の使用のためにコンパイルされるものとする。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムにより設定され、変動しない。
【００４２】
ALIGN-2が、アミノ酸配列比較のために用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂに照らした、これとの、又はこれに対する配列同一性％（これは、代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂに照らした、これとの、又はこれに対する、ある特定のアミノ酸配列の同一性％を有するか、又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとしても言及される）は、以下：100×比X/Y［式中、Xは、配列アライメントプログラムALIGN-2により、このプログラムのＡとＢとのアライメントにおいて、同一なマッチとして評定されたアミノ酸残基の数であり、Yは、Ｂ内のアミノ酸残基の総数である］の通りに計算される。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ａの、Ｂに照らした、アミノ酸配列の同一性％は、Ｂの、Ａに照らした、アミノ酸配列の同一性％と等しくない。そうでないことが具体的に言明されない限りにおいて、本明細書で使用される、全てのアミノ酸配列の同一性％値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】抗体結合時間の時間と対比した応答についてのグラフである。
【図２Ａ】抗ＡＧＥ抗体の、ヒト膵がんＰＡＮＣ−１細胞株に由来する膵がん細胞への結合を例示する図である。
【図２Ｂ】抗ＡＧＥ抗体の、ヒト膵がんＰＡＮＣ−１細胞株に由来する膵がん細胞への結合を例示する図である。
【図２Ｃ】抗ＡＧＥ抗体の、ヒト膵がんＰＡＮＣ−１細胞株に由来する膵がん細胞への結合を例示する図である。
【図２Ｄ】抗ＡＧＥ抗体の、ヒト膵がんＰＡＮＣ−１細胞株に由来する膵がん細胞への結合を例示する図である。
【図３】抗ＡＧＥ抗体の、ＨＴＢ−１４神経膠芽腫細胞株に由来する神経膠腫細胞への結合を例示する図である。
【図４Ａ】抗ＡＧＥ抗体の、ＨＴＢ−１５神経膠芽腫細胞株に由来する神経膠腫細胞への結合を例示する図である。
【図４Ｂ】抗ＡＧＥ抗体の、ＨＴＢ−１５神経膠芽腫細胞株に由来する神経膠腫細胞への結合を例示する図である。
【図４Ｃ】抗ＡＧＥ抗体の、ＨＴＢ−１５神経膠芽腫細胞株に由来する神経膠腫細胞への結合を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
超音波は、制限部位への一時的なアクセスを可能としうることが発見されている。微小気泡の投与と組み合わせた、診断用超音波の印加は、血液脳関門を破壊する（Zhao, B. et al., “Blood-brain barrier disruption induced by diagnostic ultrasound combined with microbubbles in mice”, Oncotarget, Vol. 9, No. 4, pp. 4897-4914 (2018)）。微小気泡の存在下で印加された焦点化超音波は、ラットにおいて、血液脳関門を破壊して、化学療法薬である１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソ尿素（ＢＣＮＵ：1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea又はカルムスチン）及びドキソルビシンの、神経膠芽腫への送達を可能とする（Liu, H-L. et al., “Blood-brain barrier disruption with focused ultrasound enhances delivery of chemotherapeutic drugs for glioblastoma treatment”, Radiology, Vol. 255, No. 2, pp. 415-425 (2010)；Sun, T. et al., “Closed-loop control of targeted ultrasound drug delivery across the blood-brain/tumor barriers in a rat glioma model”, Proceedings of the National Academy of Sciences, pp. 1-10 (2017)）。微小気泡の存在下で印加された超音波は、血液脳関門を破壊して、単鎖抗体であり、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（HERCEPTIN（登録商標））を、マウスの脳にアクセスさせることが可能である（Nisbet, R. M. et al., “Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model”, Brain, Vol. 140, pp. 1220-1230 (2017)；Kinoshita, M. et al., “Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption”, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 103, No. 31, pp. 11719-11723 (2006)）。これらの研究は、超音波の印加及び抗体の投与を含む組合せ療法が、制限部位における、細胞及び組織をターゲティングするための効果的な治療レジメンであることを示唆する。
【００４５】
多数のＡＧＥ障害が、制限部位に影響を及ぼす。例えば、近年の研究は、細胞の老化と神経膠腫との関連を同定している。神経膠腫細胞は、インビトロにおいて、自発的に老化する（Stoczynska-Fidelus, E., et al., “Spontaneous in vitro senescence of glioma cells confirmed by an antibody against IDH1R132H”, Anticancer Research, Vol. 34, pp. 2859-2868 (2014)）。同様に、終末糖化反応最終産物は、インビトロの神経膠腫細胞内で、亜硝酸塩蓄積の、用量依存的増大を引き起こす結果として、一酸化窒素の放出の増大、及び対応する酸化損傷の増大をもたらす（Lin, C-H. et al., “Advanced glycosylation end products induce nitric oxide synthase expression in C6 glioma cells involvement of a p38 MAP kinase-dependent mechanism”, Life Sciences, Vol. 69, pp. 2503-2515 (2001)）。加えて、神経膠腫の侵襲性は、細胞増殖活性の低減、老化の徴候も伴う（Berens, M. E. et al., “‘...those left behind.’ Biology and oncology of invasive glioma cells”, Neoplasia, Vol. 1, No. 3, pp. 208-219 (1999)）。細胞の老化と神経膠腫との一般的連関を同定することにより、本出願は、終末糖化反応最終産物に結合する抗体が、神経膠腫に効果的な療法であることを示す。超音波の印加は、血液脳関門を破壊し、抗ＡＧＥ抗体が、神経膠腫細胞をターゲティングし、死滅させることを可能とするのに使用されうる。
【００４６】
本発明は、超音波と抗ＡＧＥ抗体との組合せを使用して、制限部位内の、ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドを発現する細胞（ＡＧＥ修飾細胞）を、特異的にターゲティングし、死滅させる。超音波は、制限部位へのアクセスをもたらし、次いで、これは、抗ＡＧＥ抗体が、制限部位内のＡＧＥ修飾細胞にアクセスすることを可能とする。超音波は、微小気泡などの造影剤を伴うか、又は伴わずに、制限部位へのアクセスをもたらす。
【００４７】
超音波と抗ＡＧＥ抗体との組合せはまた、ＡＧＥ修飾細胞の破壊を増強するのにも使用されうる。超音波は、抗体の、標的抗原への結合を増大させ、これは、抗ＡＧＥ抗体の、ＡＧＥ修飾細胞への結合を改善するであろう。結合が起きると、超音波はまた、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）機構を介する、細胞の殺滅も増強する。加えて、抗ＡＧＥ抗体が結合したＡＧＥ修飾細胞は、超音波による破壊を、より受けやすい。超音波が炎症過程に干渉する能力はまた、細胞老化の鍵となる駆動因子である炎症も軽減するであろう。超音波と抗ＡＧＥ抗体との組合せは、老化細胞などのＡＧＥ修飾細胞の殺滅において、相乗作用的であり、相加効果より大きな効果をもたらす。これらの細胞殺滅効果の増強は、体内の任意の場所又はインビトロ環境において実現されうる。
【００４８】
ＡＧＥ修飾細胞を死滅させる方法は、超音波を印加するステップ、及び糖化反応最終産物に結合する抗体（抗ＡＧＥ抗体）を投与するステップを含む。超音波は、制限部位へのアクセスを容易とするように、抗体が投与される前に印加されうる。代替的に、超音波は、抗体が投与された後及び／又は投与時に印加される場合もある。
【００４９】
ＡＧＥ修飾細胞は、体内の任意の部分に見出されうる。好ましくは、ＡＧＥ修飾細胞は、制限部位にある。制限部位の例は、脳、関節、眼、精巣、及び前立腺を含む。代替的に、ＡＧＥ修飾細胞は、組織培養物又は細胞培養物など、インビトロ環境にありうる。
【００５０】
超音波は、２０，０００Ｈｚ〜１５ＭＨｚの周波数で印加されうる。好ましくは、超音波は、０．６ＭＨｚ、０．７ＭＨｚ、０．８ＭＨｚ、０．９ＭＨｚ、１．０ＭＨｚ、１．５ＭＨｚ、２．０ＭＨｚ、２．５ＭＨｚ、３．０ＭＨｚ、３．５ＭＨｚ、４．０ＭＨｚ、４．５ＭＨｚ、５．０ＭＨｚ、５．１ＭＨｚ、５．２ＭＨｚ、５．３ＭＨｚ、５．４ＭＨｚ、５．５ＭＨｚ、５．６ＭＨｚ、５．７ＭＨｚ、５．８ＭＨｚ、５．９ＭＨｚ、６．０ＭＨｚ、６．１ＭＨｚ、６．２ＭＨｚ、６．３ＭＨｚ、６．４ＭＨｚ、６．５ＭＨｚ、６．６ＭＨｚ、６．７ＭＨｚ、６．８ＭＨｚ、６．９ＭＨｚ、７．０ＭＨｚ、７．５ＭＨｚ、８．０ＭＨｚ、８．５ＭＨｚ、９．０ＭＨｚ、及び９．５ＭＨｚを含む、０．５〜１０ＭＨｚの周波数で印加される。
【００５１】
超音波は、０．０１〜５Ｗ／ｃｍ２の強度で印加されうる。好ましくは、超音波は、０．０６Ｗ／ｃｍ２、０．０７Ｗ／ｃｍ２、０．０８Ｗ／ｃｍ２、０．０９Ｗ／ｃｍ２、０．１Ｗ／ｃｍ２、０．２Ｗ／ｃｍ２、０．３Ｗ／ｃｍ２、０．４Ｗ／ｃｍ２、０．５Ｗ／ｃｍ２、０．６Ｗ／ｃｍ２、０．７Ｗ／ｃｍ２、０．８Ｗ／ｃｍ２、０．９Ｗ／ｃｍ２、１．０Ｗ／ｃｍ２、１．１Ｗ／ｃｍ２、１．２Ｗ／ｃｍ２、１．３Ｗ／ｃｍ２、１．４Ｗ／ｃｍ２、１．５Ｗ／ｃｍ２、１．６Ｗ／ｃｍ２、１．７Ｗ／ｃｍ２、１．８Ｗ／ｃｍ２、１．９Ｗ／ｃｍ２、２．０Ｗ／ｃｍ２、２．５Ｗ／ｃｍ２、３．０Ｗ／ｃｍ２、３．５Ｗ／ｃｍ２、４．０Ｗ／ｃｍ２、及び４．５Ｗ／ｃｍ２を含む、０．０５〜５Ｗ／ｃｍ２の強度で印加される。
【００５２】
超音波は、連続超音波の場合もあり、パルス状超音波の場合もある。好ましくは、超音波は、パルス状超音波である。パルス状超音波は、０．０１〜２０ｋＨｚのパルス反復周波数（ＰＲＦ：pulse repetition frequency）を有しうる。好ましくは、パルス状超音波は、０．０６ｋＨｚ、０．０７ｋＨｚ、０．０８ｋＨｚ、０．０９ｋＨｚ、０．１ｋＨｚ、０．２ｋＨｚ、０．３ｋＨｚ、０．４ｋＨｚ、０．５ｋＨｚ、１．０ｋＨｚ、１．５ｋＨｚ、２．０ｋＨｚ、３．０ｋＨｚ、３．５ｋＨｚ、４．０ｋＨｚ、４．５ｋＨｚ、５．０ｋＨｚ、５．５ｋＨｚ、６．０ｋＨｚ、６．５ｋＨｚ、７．０ｋＨｚ、７．５ｋＨｚ、８．０ｋＨｚ、８．５ｋＨｚ、９．０ｋＨｚ、及び９．５ｋＨｚを含む、０．０５〜１０ｋＨｚのＰＲＦを有する。
【００５３】
超音波は、毎日１回又は２回以上印加されうる。例えば、超音波は、毎日１〜１００回印加されうる。超音波は、１時間当たり１回（毎日２４回）など、規則的な間隔で印加される場合もあり、１時間当たり６０回など、一定時間内に２回以上印加される場合もある。毎週１回又は毎月１回を含む、低頻度の施行もまた可能である。
【００５４】
超音波は、焦点化される場合もあり、非焦点化される場合もある。焦点化超音波は、典型的に、非焦点化超音波より、大きな強度を送達する。
【００５５】
波長、速度、波形、印加の持続時間、パルスの持続時間、空間におけるパルス長及びパルス占有率など、他の超音波パラメータも、特異的治療効果をもたらすように変動させうる。好ましくは、超音波パラメータは、ＡＧＥ修飾細胞をターゲティングする一方で、他の細胞を回避するように選択される。
【００５６】
適切な超音波パラメータは、単純な実験により決定されうる。細胞は、患者に由来する試料中、又は細胞培養物中など、単離されうる。硬化又は弾力性の変化など、細胞間の物理的差違は、標的細胞の同定を可能とする（例えば、米国特許第６，０６７，８５９号明細書及び米国特許第７，７５１，０５７号明細書を参照されたい）。超音波は、所望の転帰が達成されるまで、細胞に印加することができる。細胞は、超音波の効果を決定するように、超音波印加の前及び後に観察する。１又は２以上の超音波パラメータを変動させる場合があり、超音波を再度印加することができる。次いで、細胞を観察して、改変された超音波パラメータの効果を決定する。所望の治療効果を達成するまで、この工程を反復する。例えば、ＡＧＥ修飾細胞を単離し、超音波を印加して、細胞の破壊を結果としてもたらす、共鳴調和周波数を決定することができる。超音波の周波数は、共鳴調和周波数を決定するまで、漸増させることができる。適切な超音波パラメータの決定は、超音波は、予測可能な結果をもたらす、十分に研究された機械的技法であるので、当業者に単純な工程である。
【００５７】
造影剤は、超音波を印加する前に投与されていてもよく、同時に投与されてもよい。好ましい造影剤は、ガス入り微小気泡を含む。微小気泡は、アルブミン（ALBUNEX（登録商標）、BISPHERE（登録商標）、ECHOGEN（登録商標）、及びOPTISON（登録商標））、リン脂質（DEFINITY（登録商標）、IMAGENT（登録商標）、MICROMARKER（登録商標）、SONAZOID（登録商標）、SONOVUE（登録商標）、及びTARGESTAR（登録商標））、糖脂質（LEVOVIST（登録商標））、又はPLGA／リン脂質（IMAGIFY（登録商標））から構成される外殻を有しうる。ナノメートルスケールの直径を有する微小気泡はまた、ナノ気泡とも称される。造影剤は、超音波が印加される場所の近傍に投与されうる。
【００５８】
微小気泡はまた、超音波による薬物送達にも使用されうる。治療剤は、微小気泡の外側にコンジュゲートされる場合もあり、微小気泡の内側に、ガス入りで含有される場合もある。微小気泡は、ターゲティングリガンドにコンジュゲートされうる。好ましいターゲティングリガンドは、治療剤としてもまた作用しうる、モノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体は、それらの免疫原性を低減するように、好ましくは、ヒト化される（又は治療される種に適切であるように、同様に改変される）。特に、好ましいターゲティングリガンドは、ヒト化抗ＡＧＥモノクローナル抗体である。超音波による薬物送達のための、他の薬物担体は、リポソーム及びミセルを含む。リポソーム及びミセルもまた、抗ＡＧＥ抗体などのモノクローナル抗体にコンジュゲートされうる。
【００５９】
超音波は、任意の適切な超音波振動子を使用して発生させて印加しうる。好ましい超音波振動子は、超音波プローブである。超音波の、体内への透過を改善するように、水ベースのゲルが、治療領域に塗布されうる。代替的に、超音波発生器は、制限部位へのアクセスを、さらに容易とするように、体内に植え込まれる場合もある（例えば、U.S. Pat. No. 8,977,361を参照されたい）。
【００６０】
抗ＡＧＥ抗体は、ＦＦＩ、ピラリン、ＡＦＧＰ、ＡＬＩ、カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ：carboxymethyllysine）、カルボキシエチルリシン（ＣＥＬ：carboxyethyllysine）、及びペントシジンなど、ＡＧＥ修飾を有する、１又は２以上のＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチド、及びこのような抗体の混合物に結合しうる。好ましくは、抗体は、ヒト；ネコ、イヌ、及びウマを含む愛玩動物；並びにラクダ（又はアルパカ）、ウシ（ウシ）、ヒツジ、ブタ、及びヤギなど、商業的に重要な動物に対して非免疫原性であるなど、それが使用される動物に対して非免疫原性である。より好ましくは、抗体は、ヒト化抗体（ヒトに対する）、ネコ化抗体（ネコに対する）、イヌ化抗体（イヌに対する）、ウマ化抗体（ウマに対する）、ラクダ科動物化抗体（ラクダ又はアルパカに対する）、ウシ化抗体（ウシに対する）、ヒツジ化抗体（ヒツジに対する）、ブタ化抗体（ブタに対する）、又はヤギ化抗体（ヤギに対する）など、抗体に対する免疫応答を低減するように、動物の抗体と同種の定常領域を有する。最も好ましくは、抗体は、ヒト抗体、ネコ抗体、イヌ抗体、ウマ抗体、ラクダ抗体、ウシ抗体、ヒツジ抗体、ブタ抗体、又はヤギ抗体など、それが使用される動物の抗体と同一（可変領域を除き）である。これらの動物に対する抗体の定常領域及び他の部分の詳細については、下記に記載される。抗体は、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もある。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００６１】
好ましい抗ＡＧＥ抗体は、カルボキシメチルリシンＡＧＥ修飾又はカルボキシエチルリシンＡＧＥ修飾を呈する、タンパク質又はペプチドに結合する抗ＡＧＥ抗体を含む。カルボキシメチルリシン（また、Ｎ（イプシロン）−（カルボキシメチル）リシン、Ｎ（６）−カルボキシメチルリシン、又は２−アミノ−６−（カルボキシメチルアミノ）ヘキサン酸としても公知である）、及びカルボキシエチルリシン（また、Ｎ−イプシロン−（カルボキシエチル）リシンとしても公知である）は、酸化ストレス及び化学物質の糖化反応の結果として、タンパク質又はペプチド及び脂質において見出される。ＣＭＬ改変タンパク質又はＣＭＬ改変ペプチド及びＣＥＬ改変タンパク質又はＣＥＬ改変ペプチドは、様々な細胞上で発現される受容体である、ＲＡＧＥにより認識される。ＣＭＬ及びＣＥＬについては、十分に研究されており、ＣＭＬ関連製品及びＣＥＬ関連製品は市販されている。例えば、Cell Biolabs, Inc.社は、ＣＭＬ−ＢＳＡ抗原、ＣＭＬポリクローナル抗体、ＣＭＬ免疫ブロットキット、及びＣＭＬ競合ＥＬＩＳＡキット（www.cellbiolabs.com/cml-assays）のほか、ＣＥＬ−ＢＳＡ抗原及びＣＥＬ競合ＥＬＩＳＡキット（www.cellbiolabs.com/cel-n-epsilon-carboxyethyl-lysine-assays-and-reagents）を販売している。好ましい抗体は、キーホールリンペットヘモシアニンをコンジュゲートしたカルボキシメチルリシンに対して惹起された、市販のマウス抗糖化反応最終産物抗体であって、R&D Systems, Inc.社から入手可能であり（Minneapolis、MN；型番：MAB3247）、ヒト定常領域（又はそれが投与される動物の定常領域）を有するように修飾された抗体であるカルボキシメチルリシンＭＡｂ（クローン：318003）の可変領域を含む。R&D Systems, Inc.社の型番：MAB3247に対応するカルボキシメチルリシン抗体など、市販の抗体は、診断目的で対象となる場合があり、動物又はヒトにおける使用に適さない材料を含有しうる。好ましくは、市販の抗体は、毒素又は他の潜在的に有害な材料を除去するように、動物又はヒトにおける使用の前に、精製及び／又は単離される。
【００６２】
抗ＡＧＥ抗体は、好ましくは、抗体−抗原複合体からの解離速度又はｋｄ（また、ｋｂａｃｋ又はオフ速度とも称される）が小さい、好ましくは、９×１０−３、８×１０−３、７×１０−３、６×１０−３（１／秒）以下である。抗ＡＧＥ抗体は、好ましくは、細胞のＡＧＥ修飾タンパク質に対する高アフィニティーを有し、これは、低解離定数である、９×１０−６、８×１０−６、７×１０−６、６×１０−６、５×１０−６、４×１０−６、又は３×１０−６（Ｍ）以下のＫＤとして表されうる。好ましくは、抗ＡＧＥ抗体結合特性は、図１に例示される、R&D Systems, Inc.社（Minneapolis、MN；型番：MAB3247）から市販されているカルボキシメチルリシンＭＡｂ（クローン：318003）と、同等であるか、同じであるか、又はこれより優れている。
【００６３】
抗ＡＧＥ抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）を介して、ＡＧＥ修飾細胞を破壊しうる。ＡＤＣＣとは、免疫系のエフェクター細胞が、膜表面抗原に特異的抗体が結合した標的細胞を、能動的に溶解する、細胞媒介性免疫防御のメカニズムである。ＡＤＣＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ：natural killer）細胞、マクロファージ、好中球、又は好酸球により媒介されうる。エフェクター細胞は、結合した抗体のＦｃ部分に結合する。抗ＡＧＥ抗体はまた、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ：complement-dependent cytotoxicity）を介して、ＡＧＥ修飾細胞も破壊しうる。ＣＤＣでは、免疫系の補体カスケードは、抗体の、標的抗原に結合した抗体により誘発される。
【００６４】
抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥ修飾細胞の破壊を引き起こす薬剤にコンジュゲートされうる。このような薬剤は、毒素、細胞毒性剤、磁気ナノ粒子、及び磁気スピンボルテックスディスクでありうる。
【００６５】
ＡＧＥ修飾細胞を、選択的にターゲティングし、これらを除去するように、抗ＡＧＥ抗体にコンジュゲートした小孔形成毒素（ＰＦＴ：pore-forming toxin）（Aroian R. et al., “Pore-Forming Toxins and Cellular Non-Immune Defenses (CNIDs),” Current Opinion in Microbiology, 10:57-61 (2007)）などの毒素が、患者に注射されうる。抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥ修飾細胞を認識し、これらに結合する。次いで、毒素が、細胞表面にポア形成を引き起こし、浸透圧溶解によって、細胞を除去する。
【００６６】
抗ＡＧＥ抗体にコンジュゲートした磁気ナノ粒子を患者に注射して、ＡＧＥ修飾細胞をターゲティングし、除去することができる。ＡＧＥ修飾細胞を、選択的に除去するために、磁場を印加することにより、磁気ナノ粒子は加熱されうる。
【００６７】
代替法として、血管を遮断しうる自己凝集を回避するために、磁場が印加されたときだけ磁化される磁気スピンボルテックスディスクは、磁場が印加されると、スピンし始め、標的細胞の膜破壊を引き起こす。抗ＡＧＥ抗体にコンジュゲートした磁気スピンボルテックスディスクは、他の細胞の除去を伴わずに、ＡＧＥ修飾細胞型を、特異的にターゲティングする。
【００６８】
本発明に従うヒト化抗ＡＧＥ抗体は、配列番号２２に示されるアミノ酸の、ヒト定常領域配列を有しうる。ヒト化抗ＡＧＥ抗体の重鎖相補性決定領域は、配列番号２３（ＣＤＲ１Ｈ）、配列番号２４（ＣＤＲ２Ｈ）、及び配列番号２５（ＣＤＲ３Ｈ）に示されるタンパク質配列のうちの１又は２以上を有しうる。ヒト化抗ＡＧＥ抗体の軽鎖相補性決定領域は、配列番号２６（ＣＤＲ１Ｌ）、配列番号２７（ＣＤＲ２Ｌ）、及び配列番号２８（ＣＤＲ３Ｌ）に示されるタンパク質配列のうちの１又は２以上を有しうる。
【００６９】
ヒト化抗ＡＧＥ抗体の重鎖は、配列番号１のタンパク質配列を有しうるか、又は含みうる。重鎖の可変ドメインは、配列番号２のタンパク質配列を有しうるか、又は含みうる。重鎖可変ドメインの相補性決定領域（配列番号２）は、配列番号４１、配列番号４２、及び配列番号４３に示される。ヒト化抗ＡＧＥ抗体のカッパ軽鎖は、配列番号３のタンパク質配列を有しうるか、又は含みうる。カッパ軽鎖の可変ドメインは、配列番号４のタンパク質配列を有しうるか、又は含みうる。配列番号４の１２８位におけるアルギニン（Ａｒｇ又はＲ）残基は、省かれてもよい。軽鎖可変ドメインの相補性決定領域（配列番号４）は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６に示される。可変領域は、コドンが最適化され、合成され、ヒト免疫グロブリンＧ１定常領域を含有する発現ベクターにクローニングされうる。加えて、可変領域は、非ヒト抗ＡＧＥ抗体の調製において使用されうる。
【００７０】
抗体の重鎖は、マウス抗ＡＧＥ抗体免疫グロブリンＧ２ｂ重鎖のＤＮＡ配列である、配列番号１２によりコードされうる。配列番号１２によりコードされるマウス抗ＡＧＥ抗体免疫グロブリンＧ２ｂ重鎖のタンパク質配列は、配列番号１６に示される。マウス抗体の可変領域は、配列番号１６の２５〜１４２位に対応する、配列番号２０に示される。抗体の重鎖は、代替的に、キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒト免疫グロブリンＧ１重鎖のＤＮＡ配列である、配列番号１３によりコードされうる。配列番号１３によりコードされる、キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒト免疫グロブリンＧ１重鎖のタンパク質配列は、配列番号１７に示される。キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒト免疫グロブリンは、配列番号２０の２５〜１４２位における、マウス可変領域を含む。抗体の軽鎖は、マウス抗ＡＧＥ抗体カッパ軽鎖である、配列番号１４のＤＮＡ配列によりコードされうる。配列番号１４によりコードされる、マウス抗ＡＧＥ抗体カッパ軽鎖のタンパク質配列は、配列番号１８に示される。マウス抗体の可変領域は、配列番号２１に示され、これは配列番号１８の２１〜１３２位に対応する。抗体の軽鎖は、代替的に、キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒトカッパ軽鎖である、配列番号１５のＤＮＡ配列によりコードされうる。配列番号１５によりコードされる、キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒトカッパ軽鎖のタンパク質配列は、配列番号１９に示される。キメラ抗ＡＧＥ抗体ヒト免疫グロブリンは、配列番号２１の２１〜１３２位におけるマウス可変領域を含む。
【００７１】
本発明に従うヒト化抗ＡＧＥ抗体は、１又は２以上のヒト化重鎖又はヒト化軽鎖を有しうるか、又は含みうる。ヒト化重鎖は、配列番号３０、３２、又は３４のＤＮＡ配列によりコードされうる。配列番号３０、配列番号３２、及び配列番号３４によりコードされるヒト化重鎖のタンパク質配列は、それぞれ、配列番号２９、配列番号３１、及び配列番号３３に示される。ヒト化軽鎖は、配列番号３６、配列番号３８、又は配列番号４０のＤＮＡ配列によりコードされうる。配列番号３６、配列番号３８、及び配列番号４０によりコードされるヒト化軽鎖のタンパク質配列は、それぞれ、配列番号３５、配列番号３７、及び配列番号３９に示される。好ましくは、ヒト化抗ＡＧＥ抗体は、元の抗体特異性を保持しながら、ヒト配列の量を最大化する。配列番号２９、配列番号３１、及び配列番号３３から選び出されるタンパク質配列を有する重鎖、並びに配列番号３５、配列番号３７、及び配列番号３９から選び出されるタンパク質配列を有する軽鎖を含有する、完全ヒト化抗体が構築されうる。
【００７２】
特に好ましい抗ＡＧＥ抗体は、マウス抗ＡＧＥ抗体モノクローナル抗体をヒト化することにより得られうる。マウス抗ＡＧＥ抗体モノクローナル抗体は、配列番号４７に示される重鎖タンパク質配列（可変ドメインのタンパク質配列は、配列番号５２に示される）と、及び配列番号５７に示される、軽鎖タンパク質配列（可変ドメインのタンパク質配列は、配列番号６２に示される）とを有する。好ましいヒト化重鎖は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、又は配列番号５１に示されるタンパク質配列（ヒト化重鎖の可変ドメインのタンパク質配列は、それぞれ、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６に示される）を有しうる。好ましいヒト化軽鎖は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、又は配列番号６１に示されるタンパク質配列（ヒト化軽鎖の可変ドメインのタンパク質配列は、それぞれ、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、及び配列番号６６に示される）を有しうる。好ましくは、ヒト化抗ＡＧＥ抗体モノクローナル抗体は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１からなる群から選択されるタンパク質配列を有する重鎖、並びに配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１からなる群から選択されるタンパク質配列を有する軽鎖から構成される。これらのタンパク質配列から構成されたヒト化抗ＡＧＥ抗体モノクローナル抗体は、良好な結合及び／又は免疫系の活性化の改善を有する結果として、効能の増大をもたらしうる。
【００７３】
非ヒト種に由来する抗体のタンパク質配列は、配列番号２に示される配列を有する重鎖、又は配列番号４に示される配列を有するカッパ軽鎖の可変ドメインを含むように修飾されうる。非ヒト種は、飼いネコ又は飼いイヌなどの愛玩動物の場合もあり、ウシ、ウマ、又はラクダなどの家畜の場合もある。好ましくは、非ヒト種は、マウスではない。ウマ（Equus caballus）抗体免疫グロブリンガンマ４の重鎖は、配列番号５のタンパク質配列（EMBL/GenBank受託番号：AY445518）を有しうるか、又は含みうる。ウマ（Equus caballus）抗体免疫グロブリンデルタの重鎖は、配列番号６のタンパク質配列（EMBL/GenBank受託番号：AY631942）を有しうるか、又は含みうる。イヌ（Canis familiaris）抗体免疫グロブリンＡの重鎖は、配列番号７のタンパク質配列（GenBank受託番号：L36871）を有しうるか、又は含みうる。イヌ（Canis familiaris）抗体免疫グロブリンＥの重鎖は、配列番号８のタンパク質配列（GenBank受託番号：L36872）を有しうるか、又は含みうる。ネコ（Felis catus）抗体免疫グロブリンＧ２の重鎖は、配列番号９のタンパク質配列（DDBJ/EMBL/GenBank受託番号：KF811175）を有しうるか、又は含みうる。
【００７４】
ラクダ（ヒトコブラクダ（Camelus dromedarius）及びフタコブラクダ（Camelus bactrianus））、ラマ（llama）（ラマ（Lama glama）、アルパカ（Lama pacos及びLama vicugna））、アルパカ（Vicugna pacos）、及びグアナコ（Lama guanicoe）などのラクダ科の動物は、他の哺乳動物では見出されない、固有の抗体を有する。従来の免疫グロブリンＧ抗体から構成される重鎖及び軽鎖の四量体に加えて、ラクダ科動物はまた、軽鎖を含有せず、重鎖二量体として存在する、重鎖免疫グロブリンＧ抗体も有する。これらの抗体は、重鎖抗体、ＨＣＡｂ、単一ドメイン抗体、又はｓｄＡｂとして公知であり、ラクダ科動物の重鎖抗体の可変ドメインは、ＶＨＨとして公知である。ラクダ科動物の重鎖抗体は、重鎖ＣＨ１ドメインを欠き、他の種では見出されないヒンジ領域を有する。アラビアラクダ（ヒトコブラクダ）単一ドメイン抗体の可変領域は、配列番号１０のタンパク質配列（GenBank 受託番号：AJ245148）を有しうるか、又は含みうる。アラビアラクダ（ヒトコブラクダ）の四量体免疫グロブリン重鎖の可変領域は、配列番号１１のタンパク質配列（GenBank受託番号：AJ245184）を有しうるか、又は含みうる。
【００７５】
ラクダ科動物に加えて、重鎖抗体はまた、サメ、ガンギエイ、及びエイなどの軟骨魚においても見出される。この種類の抗体は、免疫グロブリン新抗原受容体又はＩｇＮＡＲとして公知であり、ＩｇＮＡＲの可変ドメインは、ＶＮＡＲとして公知である。ＩｇＮＡＲは、各々１つずつの可変ドメイン及び５つずつの定常ドメインから構成される、２つの同一な重鎖二量体として存在する。ラクダ科動物と同様に、軽鎖は存在しない。
【００７６】
さらなる非ヒト種のタンパク質配列は、International ImMunoGeneTics Information System（www.imgt.org）、European Bioinformatics Institute（www.ebi.ac.uk）、DNA Databank of Japan（ddbj.nig.ac.jp／arsa）、又はNational Center for Biotechnology Information（www.ncbi.nlm.nih.gov）などのオンラインデータベース内で、たやすく見出されうる。
【００７７】
抗ＡＧＥ抗体又はこのバリアントは、配列番号１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、又は配列番号５１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖であって、それらの翻訳後修飾を含みうる。少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する重鎖は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しうるが、この配列を含む抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥに結合する能力を保持する。
【００７８】
抗ＡＧＥ抗体又はこのバリアントは、配列番号２、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、又は配列番号５６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域であって、それらの翻訳後修飾を含みうる。少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する可変領域は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しうるが、この配列を含む抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥに結合する能力を保持する。置換、挿入、又は欠失は、可変領域外の領域内で生じうる。
【００７９】
抗ＡＧＥ抗体又はこのバリアントは、配列番号３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、又は配列番号６１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖であって、それらの翻訳後修飾を含みうる。少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する軽鎖は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しうるが、この配列を含む抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥに結合する能力を保持する。置換、挿入、又は欠失は、可変領域外の領域内で生じうる。
【００８０】
抗ＡＧＥ抗体又はこのバリアントは、配列番号４、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、又は配列番号６６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域であって、それらの翻訳後修飾を含みうる。少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する可変領域は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有しうるが、この配列を含む抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥに結合する能力を保持する。置換、挿入、又は欠失は、可変領域外の領域内で生じうる。
【００８１】
代替的に、抗体は、ＣＭＬ−ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニンをコンジュゲートしたカルボキシメチルリシン：carboxymethyl lysine conjugated with keyhole limpet hemocyanin）に対して惹起された、市販のマウス抗糖化反応最終産物抗体であって、R&D Systems, Inc.社から入手可能な抗体（Minneapolis、MN；型番：MAB3247）である、カルボキシメチルリシンＭＡｂ（クローン：318003）の相補性決定領域を有しうる。
【００８２】
抗体は、対象の免疫系による、標的とする細胞の破壊を可能とする定常領域を有しうるか、又は含みうる。
【００８３】
ＡＧＥ型が２以上のＡＧＥ修飾タンパク質に結合する抗体の混合物もまた、使用されうる。
【００８４】
２つの異なるエピトープに向けられた抗ＡＧＥ抗体である二重特異性抗体もまた、使用されうる。このような抗体は、１つの抗ＡＧＥ抗体の可変領域に由来する可変領域（又は相補性決定領域）、及び異なる抗体に由来する可変領域（又は相補性決定領域）を有するであろう。
【００８５】
抗体断片は、全抗体の代わりに使用されうる。例えば、免疫グロブリンＧは、酵素による消化を介して、小型断片に分解されうる。パパイン消化は、重鎖間ジスルフィド架橋のＮ末端側を切断して、Ｆａｂ断片をもたらす。Ｆａｂ断片は、軽鎖と、重鎖の、２つのＮ末端ドメインのうちの１つとを含む（また、Ｆｄ断片としても公知である）。ペプシン消化は、重鎖間ジスルフィド架橋のＣ末端側を切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は、軽鎖、及びジスルフィド架橋により連結された、２つのＮ末端ドメインの両方を含む。ペプシン消化はまた、Ｆｖ（可変断片：fragment variable）及びＦｃ断片（結晶性断片）も形成しうる。Ｆｖ断片は、２つのＮ末端可変ドメインを含有する。Ｆｃ断片は、細胞上の免疫グロブリン受容体、及び補体カスケードの最初の要素と相互作用するドメインを含有する。ペプシンはまた、重鎖の第３定常ドメイン（ＣＨ３：third constant domain of the heavy chain）の前で、免疫グロブリンＧを切断して、大型断片であるＦ（ａｂｃ）と、小型断片であるｐＦｃ’とをもたらす場合もある。抗体断片は、代替的に、組換えによりもたらされる場合もある。好ましくは、このような抗体断片は、ＡＧＥ修飾細胞の破壊を引き起こす薬剤にコンジュゲートされうる。
【００８６】
さらなる抗体が所望される場合、これらは、周知の方法を使用して作製されうる。例えば、哺乳動物宿主において、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）は、免疫原と、所望の場合、アジュバントとの、１回又は２回以上の注射により惹起されうる。典型的に、免疫原（及びアジュバント）は、哺乳動物において、皮下注射又は腹腔内注射により注射されうる。免疫原は、ＡＧＥ−抗トロンビンIII、ＡＧＥ−カルモジュリン、ＡＧＥ−インスリン、ＡＧＥ−セルロプラスミン、ＡＧＥ−コラーゲン、ＡＧＥ−カテプシンＢ、ＡＧＥ−ウシ血清アルブミン（ＡＧＥ−ＢＳＡ）、ＡＧＥ−ヒト血清アルブミン、及びオボアルブミンなどのＡＧＥ−アルブミン、ＡＧＥ−クリスタリン、ＡＧＥ−プラスミノーゲン活性化因子、ＡＧＥ−内皮細胞膜タンパク質、ＡＧＥ−アルデヒドレダクターゼ、ＡＧＥ−トランスフェリン、ＡＧＥ−フィブリン、ＡＧＥ−銅／亜鉛ＳＯＤ、ＡＧＥ−ａｐｏ  Ｂ、ＡＧＥ−フィブロネクチン、ＡＧＥ−膵リボース、ＡＧＥ−ａｐｏ  Ａ−Ｉ及びII、ＡＧＥ−ヘモグロビン、ＡＧＥ−Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ、ＡＧＥ−プラスミノーゲン、ＡＧＥ−ミエリン、ＡＧＥ−リゾチーム、ＡＧＥ−免疫グロブリン、ＡＧＥ−赤血球Ｇｌｕ輸送タンパク質、ＡＧＥ−β−Ｎ−アセチルヘキソミナーゼ、ＡＧＥ−ａｐｏ  Ｅ、ＡＧＥ−赤血球膜タンパク質、ＡＧＥ−アルドースレダクターゼ、ＡＧＥ−フェリチン、ＡＧＥ−赤血球スペクトリン、ＡＧＥ−アルコールデヒドロゲナーゼ、ＡＧＥ−ハプトグロビン、ＡＧＥ−チューブリン、ＡＧＥ−甲状腺ホルモン、ＡＧＥ−フィブリノーゲン、ＡＧＥ−β２−マイクログロブリン、ＡＧＥ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ、ＡＧＥ−α１−抗トリプシン、ＡＧＥ−炭酸デヒドラターゼ、ＡＧＥ−ＲＮアーゼ、ＡＧＥ−低密度リポタンパク質、ＡＧＥ−ヘキソキナーゼ、ＡＧＥ−ａｐｏ  Ｃ−Ｉ、ＡＧＥ−ＲＮアーゼ、ＡＧＥ−ヒトヘモグロビンなどのＡＧＥ−ヘモグロビン、ＡＧＥ−低密度リポタンパク質（ＡＧＥ−ＬＤＬ）、及びＡＧＥ−コラーゲンIVなど、細胞のＡＧＥ修飾タンパク質でありうる。ＡＧＥ修飾全赤血球、ＡＧＥ修飾溶解赤血球、又はＡＧＥ修飾部分消化赤血球などのＡＧＥ修飾細胞もまた、ＡＧＥ抗原として使用されうる。アジュバントの例は、フロイント完全、モノホスホリルリピドＡ合成トレハロースジコリノミコレート、アルミニウム水酸化物（アラム）、熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０又はＨＳＰ９６、モノホスホリルリピドＡを含有するスクアレンエマルジョン、α２−マクログロブリン、並びに油エマルジョン、プルロニック（pleuronic）ポリオール、ポリアニオン、及びジニトロフェノールを含む表面活性物質を含む。免疫応答を改善するために、免疫原は、ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、コレラ毒素、不安定性エンテロトキシン、シリカ粒子、又はダイズトリプシン阻害剤など、宿主において免疫原性のポリペプチドにコンジュゲートされうる。好ましい免疫原コンジュゲートは、ＡＧＥ−ＫＬＨである。代替的に、ｐＡｂは、ＩｇＹ分子を産生するニワトリにおいて作製されうる。
【００８７】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ：monoclonal antibody）はまた、宿主又は宿主に由来するリンパ球を免疫化し、ｍＡｂを分泌する（又はｍＡｂを潜在的に分泌する）リンパ球を採取し、これらのリンパ球を、不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞）に融合させ、所望のｍＡｂを分泌する細胞を選択することによっても作製されうる。ＥＢＶハイブリドーマ法など、他の技法も使用されうる。非ヒト抗体は、抗体を、非ヒト抗体の構成要素と、ヒト抗体の構成要素との組合せを含有するように改変することにより、ヒトに対して免疫原性でなくされうる。キメラ抗体は、非ヒト抗体の可変領域を、ヒト定常領域と組み合わせることにより作製されうる。ヒト化抗体は、ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）を、非ヒト抗体のＣＤＲで置きかえることにより作製されうる。同様に、抗体は、アミノ酸レベルで、実質的にネコ、イヌ、ウマ、ラクダ又はアルパカ、ウシ、ヒツジ、ブタ、又はヤギなど、所与の動物「化」されることにより、他の種に対しても免疫原性でなくされうる。所望の場合、ｍＡｂは、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫酸アンモニウム沈殿、又はアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の手順により、培養培地又は腹水から精製されうる。加えて、ヒトモノクローナル抗体は、第３のコピーである、ヒトＩｇＧのトランス遺伝子座と、サイレンシングされた、内因性のマウスＩｇ遺伝子座とを含有する、トランスジェニックマウスの免疫化により作出される場合もあり、ヒトトランスジェニックマウスを使用することにより作出される場合もある。ヒト化モノクローナル抗体及びその断片の作製はまた、ファージディスプレイ法を介してもなされうる。
【００８８】
「薬学的に許容される担体」は、医薬の投与に適合性のものなど、任意の溶媒及び全ての溶媒、任意の分散媒及び全ての分散媒、任意のコーティング及び全てのコーティング、任意の抗菌剤及び抗真菌剤並びに全ての抗菌剤及び抗真菌剤、任意の等張剤及び全ての等張剤、並びに任意の吸収遅延剤及び全ての吸収遅延剤を含む。好ましい、このような担体又は希釈剤の例は、水、生理食塩液、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む。補足的な活性化合物もまた、組成物に組み込まれうる。非経口投与のために使用されうる溶液及び懸濁液は、注射用水、生理食塩液溶液、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝液、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなど、等張性を調整するための薬剤を含みうる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整されうる。非経口調製物は、ガラス製又はプラスチック製の、アンプル、ディスポーザブルのシリンジ、又は複数回投与用のバイアルに封入されうる。
【００８９】
抗体は、静脈内注射などの注射により投与される場合もあり、関節への関節内注射など、局所投与される場合もある。注射に適切な医薬組成物は、滅菌注射用溶液又は滅菌注射用分散液の即席調製物のための、滅菌水溶液又は水性分散液を含む。注射に適切な抗体による医薬組成物中には、多様な賦形剤が含まれうる。適切な担体は、生理食塩液、静菌水、CREMOPHOR EL（登録商標）（BASF社製；Parsippany、NJ）、又はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ：phosphate buffered saline）を含む。いずれの場合も、組成物は、滅菌でなければならず、シリンジを使用して投与されるように、流体であるものとする。このような組成物は、製造時及び保管時に、安定であるものとし、細菌及び真菌などの微生物による汚染に対して保護されなければならない。多様な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールが、微生物汚染を封じ込めうる。組成物中には、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムなどの等張剤が含まれうる。吸収を遅延させうる組成物は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤を含む。滅菌注射用溶液は、抗体と、他の任意の治療成分とを、適切な溶媒中に、要求される成分のうちの１つ又は組合せと共に、要求量で組み込むことに続き、滅菌を行うことにより調製されうる。滅菌注射用溶液を調製するために、滅菌固体を調製する方法は、固体をもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥を含む。
【００９０】
吸入による投与のために、抗体は、噴霧器又は適切な高圧ガス、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する高圧容器からのエアゾールスプレーとして送達されうる。抗体はまた、例えば、iSPERSE（商標）吸入型薬物送達プラットフォーム（PULMATRIX社製、Lexington、Mass.）を使用する乾燥粉末として、吸入を介しても送達されうる。ニワトリ抗体（ＩｇＹ）である、抗ＡＧＥ抗体の使用は、吸入により投与された場合、ヒトを含む、様々な動物において、非免疫原性でありうる。
【００９１】
各種の抗体の、適切な投与量レベルは、一般に、患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１〜５００ｍｇであろう。好ましくは、投与量レベルは、約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ；より好ましくは、約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇであろう。適切な投与量レベルは、約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇでありうる。この範囲内で、投与量は、０．０５〜０．５、０．５〜５又は５〜５０ｍｇ／ｋｇでありうる。各種の抗体は、毎日１回又は２回など、毎日１〜４回のレジメンで投与されうるが、抗体は、典型的に、長いインビボ半減期を有する。したがって、各種の抗体は、毎日１回、毎週１回、隔週１回、３週間ごとに１回、毎月１回、又は６０〜９０日間ごとに１回投与されうる。
【００９２】
投与及び投与量の均一性を容易とするように、単位投与量形態（Unit dosage forms）が創出されうる。単位投与量形態とは、治療される対象のための、単回の投与量として適し、要求される医薬担体と会合させた、治療有効量の、１種又は２種以上の抗体を含有する、物理的に個別の単位を指す。好ましくは、単位投与量形態は、密封容器に入れられ、滅菌されている。
【００９３】
超音波の印加及び抗ＡＧＥ抗体の投与を施される対象は、治療が、ＡＧＥ修飾細胞を死滅させるのに効果的であったのかどうかを決定するように調べられうる。対象は、後続の測定の間において、又は時間経過にわたり、１又は２以上の、ＡＧＥ障害の症状の低減を裏付ける場合、効果的な治療を施されたと考えられうる。例えば、神経膠芽腫に罹患している対象は、腫瘍サイズの低減に基づき、効果的な治療を施されたと考えられうる。代替的に、老化細胞の濃度及び／又は数が、時間経過にわたり測定される場合もある。治療、及び後続の検査は、所望の治療結果が達成されるまで反復されうる。
【００９４】
本明細書に記載される方法により、任意の哺乳動物が治療されうる。ヒトは、治療に好ましい哺乳動物である。治療されうる、他の哺乳動物は、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、及びイヌ又はネコなどの愛玩動物を含みうる。代替的に、上記で同定された、哺乳動物又は対象のうちのいずれも、炎症と関連する疼痛治療を必要とする患者集団から除外されうる。方法はまた、細胞培養物又は組織培養物に適用されるなど、インビトロにおいても適用されうる。
【００９５】
対象は、ＡＧＥ障害を有することの診断に基づき、治療を必要とする対象として同定されうる。ＡＧＥ障害の例は、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ：amyotrophic lateral sclerosis又はルー・ゲーリック病）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ：chronic obstructive pulmonary disease）、ハンチントン舞踏病、特発性肺線維症、筋ジストロフィー（ベッカー型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、及び山本型筋ジストロフィーを含む）、黄斑変性、白内障、糖尿病網膜症、パーキンソン病、早老症（ウェルナー症候群及びハッチソン−ギルフォード早老症を含む）、白斑、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、湿疹、関節炎（骨関節炎、関節リウマチ、及び若年性関節リウマチを含む）、アテローム性動脈硬化、がん及び転移性がん（例えば、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肺がん、黒色腫、結腸がん、腎細胞癌、前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、直腸がん、食道がん、肝がん、口腔咽頭がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、胃がん、膵がん、及び網膜芽細胞腫を含む）、がん治療と関連する身体機能障害又はがん治療の副作用、高血圧症、緑内障、骨粗相症、サルコペニア、悪液質、脳卒中、心筋梗塞、心房細動、移植拒絶、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、放射線曝露、ＨＩＶ治療の副作用、化学兵器曝露、中毒、炎症、腎症、レビー小体認知症、プリオン病（ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト−ヤコブ病、スクレピー、慢性消耗性疾患、クールー病、及び致死性家族性不眠症を含む）、前彎後彎症、自己免疫障害、脂肪組織の減少、乾癬、クローン病、喘息、老化の生理学的影響（しわ、しみ、脱毛、皮下脂肪組織の低減、及び皮膚の菲薄化などの「美容的」影響を含む）、特発性ミオパシー（例えば、特発性炎症性筋障害、特発性炎症性筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、散発性封入体筋炎、及び若年性筋炎を含む）、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ：neuromyelitis optica、デビック病、又はデビック症候群）、てんかん、及び副腎皮質ジストロフィー（ＡＬＤ：adrenoleukodystrophy、Ｘ染色体連鎖型副腎白質委縮症、Ｘ−ＡＬＤ、大脳型ＡＬＤ、又はｃＡＬＤ）を含む。
【００９６】
特に、好ましい治療群は、体内の制限部位に影響を及ぼすＡＧＥ障害に罹患していると診断された対象を含む。体内の制限部位に影響を及ぼすＡＧＥ障害の例は、脳腫瘍（退形成性星状細胞腫、多形性神経膠芽腫、希突起神経膠腫、及びびまん性内因性橋神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、及び神経鞘腫瘍などの神経膠腫を含む）、髄膜炎、脳／大脳膿瘍、後期神経性トリパノソーマ症（睡眠障害）、脳浮腫、プリオン病、脳炎、狂犬病、関節炎／骨関節炎、変性性関節疾患、滑膜炎、滑液包炎、前立腺がん、眼がん、及び眼障害を含む。
【００９７】
本出願は、本明細書と共に出願される配列表内の、６６のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含む。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列のバリアントが可能である。公知のバリアントは、配列番号４、配列番号１６、及び配列番号２０に示される配列に対する、置換、欠失、及び付加を含む。配列番号４では、１２８位におけるアルギニン（Ａｒｇ又はＲ）残基は、省かれてもよい。配列番号１６では、１２３位におけるアラニン残基が、セリン残基で置きかえられること、及び／又は１２４位におけるチロシン残基が、フェニルアラニン残基で置きかえられることがなされてもよい。配列番号２０は、１２３及び１２４位において、配列番号１６と同じ置換を含んでもよい。加えて、配列番号２０は、末端のバリン残基の後に、１つのさらなるリシン残基を含有してよい。
［実施例］
【実施例１】
【００９８】
抗糖化反応最終産物抗体の投与についてのインビボ研究
抗糖化反応最終産物抗体の効果について検討するために、抗体を、老齢ＣＤ１（ＩＣＲ）マウス（Charles River Laboratories社製）に、３週間にわたり、毎週１回（１、８、及び１５日目に）、１日に２回、静脈内注射により投与するのに続き、１０週間にわたる治療休止期間を設けた。被験抗体は、キーホールリンペットヘモシアニンをコンジュゲートしたカルボキシメチルリシンに対して惹起された、市販のマウス抗糖化反応最終産物抗体である、R&D Systems, Inc.社（Minneapolis、MN；型番：MAB3247）から入手可能なカルボキシメチルリシンＭＡｂ（クローン：318003）であった。生理食塩液による対照参照は、対照動物において使用した。
【００９９】
「若齢」と称されるマウスが、８週齢であったのに対し、「老齢」と称されるマウスは、８８週（±２日）齢であった。抗体の投与に由来する有害事象は、認められなかった。研究で使用した異なる動物群を、表１に示す。
【０１００】
【表１】
2021534144.tif 000003
【０１０１】
老化細胞についてのマーカーであるＰ１６ＩＮＫ４ａ  ｍＲＮＡを、群の脂肪組織内で、リアルタイムｑＰＣＲにより定量した。結果を、表２に示す。表中、ΔΔＣｔ＝対照群におけるΔＣｔ平均値（２）−被験群（１、３、５）におけるΔＣｔ平均値であり；発現倍数＝２−ΔΔＣｔである。
【０１０２】
【表２】
2021534144.tif 000004
【０１０３】
上記の表は、予測される通り、非治療老齢マウス（対照群２）が、非治療若齢マウス（対照群１）の２．５５倍のｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡを発現することを指し示す。これは、８５日目における回収の終了時に安楽死させられた、群２の非治療老齢マウスを、２２日目における治療の終了時に安楽死させられた、群１の非治療若齢マウスと比較する場合に観察された。群２の非治療老齢マウスからの結果を、８５日目に安楽死させられた、群３の治療老齢マウスからの結果と比較したところ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡは、群２において、群３の１．２３倍であることが観察された。したがって、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡの発現レベルは、老齢マウスを、１週間毎、毎日２回、１グラム当たり２．５μｇの抗体で治療した場合に低下した。
【０１０４】
群２（対照）の非治療老齢マウスからの結果を、２２日目に安楽死させられた、群５（１グラム当たり５μｇ）の治療老齢マウスからの結果と比較したところ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡは、群２（対照）において、群５（１グラム当たり５μｇ）の３．０３倍であることが観察された。この比較は、群５の動物のｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡ発現レベルが、１週間毎、毎日２回、１グラム当たり５．０μｇで治療した場合に低下することを指し示したことから、若齢非治療マウス（すなわち、群１）の発現レベルと同等な、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ  ｍＲＮＡ発現レベルを提示する。８５日目における回収の終了時に安楽死させられた、群３（１グラム当たり２．５μｇ）のマウスと異なり、群５マウスは、２２日目における治療の終了時に安楽死させられた。
【０１０５】
これらの結果は、抗体の投与が、老化細胞の殺滅を結果としてもたらしたことを指し示す。
【０１０６】
また、抗体投与の、サルコペニアに対する効果を決定するように、腓腹筋量も測定した。結果を、表３に提示する。結果は、抗体の投与が、筋肉量を、対照と比較して増大させたが、これは、１週間毎、毎日２回、１グラム当たり５．０μｇの高投与量における投与に限られたことを指し示す。
【０１０７】
【表３】
2021534144.tif 000005
【０１０８】
これらの結果は、細胞のＡＧＥに結合する抗体の投与が、老化のバイオマーカーである、ｐ１６Ｉｎｋ４ａを発現する細胞の低減を結果としてもたらしたことを裏付ける。データは、老化細胞の低減が、老齢マウスにおける筋肉量の増大を、直接もたらすことを示す。これらの結果は、サルコペニアの古典的徴候である、筋肉量の減少が、細胞のＡＧＥに結合する抗体の投与により治療されうることを指し示す。
【実施例２】
【０１０９】
被験抗体のアフィニティー及び反応速度
Ｎα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リシントリフルオロ酢酸塩（Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO）を、細胞のＡＧＥ修飾タンパク質についてのモデル基質として使用して、実施例１で使用した被験抗体の、アフィニティー及び反応速度を解析した。ブランクとして設定されたＦｃ１、及び被験抗体（分子量を１５０，０００Ｄａとする）を固定化したＦｃ２を伴う、Series S sensor chip CM5（GE Healthcare社、Pittsburgh、PA）を、BIACORE（商標）T200（GE Healthcare社、Pittsburgh、PA）上で使用して、無標識相互作用解析を実行した。ランニング緩衝液は、温度を２５℃とする、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のP-20、ｐＨ７．４）であった。ソフトウェアは、BIACORE（商標）T200 evaluation software, version 2.0であった。解析では、二重参照（Ｆｃ２−１及び緩衝液だけの注射）を使用し、データは、ラングミュア１：１結合モデルに当てはめた。
【０１１０】
【表４】
2021534144.tif 000006
【０１１１】
時間に対応する応答のグラフを、図１に例示する。以下の値：ｋａ（１／Ｍ秒）＝１．８５７×１０３；ｋｄ（１／秒）＝６．７８１×１０−３；ＫＤ（Ｍ）＝３．６５１×１０−６；Ｒｍａｘ（ＲＵ）＝１９．５２；及びχ２＝０．１１４は、解析から決定した。当てはめのχ２値が、Ｒｍａｘの１０％未満であるため、当てはめは信頼できる。
【実施例３】
【０１１２】
マウス抗ＡＧＥ抗体  ＩｇＧ２ｂ抗体及びキメラ抗ＡＧＥ抗体  ＩｇＧ１抗体の構築及び作製
マウス抗ＡＧＥ抗体及びキメラヒト抗ＡＧＥ抗体を調製した。マウス抗ＡＧＥ抗体ＩｇＧ２ｂ重鎖のＤＮＡ配列を、配列番号１２に示す。キメラヒト抗ＡＧＥ抗体ＩｇＧ１重鎖のＤＮＡ配列を、配列番号１３に示す。マウス抗ＡＧＥ抗体カッパ軽鎖のＤＮＡ配列を、配列番号１４に示す。キメラヒト抗ＡＧＥ抗体カッパ軽鎖のＤＮＡ配列を、配列番号１５に示す。遺伝子配列を合成し、高発現哺乳動物ベクターにクローニングした。配列は、コドン最適化した。完成したコンストラクトは、トランスフェクションに進む前に、配列を確認した。
【０１１３】
ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの１日前に、シェークフラスコに播種し、無血清既知組成培地を使用して増殖させた。ＤＮＡ発現コンストラクトを、０．０３リットルの懸濁ＨＥＫ２９３細胞に、一過性にトランスフェクトした。２０時間後に、細胞を採取して、生存率及び生細胞数を求め、力価を測定した（OCTET（登録商標）QKe、ForteBio社製）。一過性トランスフェクション作製工程によって、さらなる読取りを行った。５日目に、培養物を採取し、各々について、さらなる試料を、細胞密度、生存率、及び力価について測定した。
【０１１４】
マウス抗ＡＧＥ抗体及びキメラ抗ＡＧＥ抗体のための馴化培地を、一過性トランスフェクション作製工程から採取し、遠心分離及び濾過により清澄化させた。上清を、プロテインＡカラム上に流過させ、低ｐＨ緩衝液で溶出させた。アリコート分割の前に、０．２μｍ膜フィルターを使用する濾過を実施した。精製及び濾過の後、タンパク質濃度を、ＯＤ２８０及び減衰係数から計算した。収率及びアリコートの概要を、表５に示す。
【０１１５】
【表５】
2021534144.tif 000007
【０１１６】
抗体純度は、LabChip（登録商標）GXII（PerkinElmer社）を使用するキャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ：capillary electrophoresis sodium-dodecyl sulfate）解析により査定した。
【実施例４】
【０１１７】
マウス（親）抗ＡＧＥ抗体及びキメラ抗ＡＧＥ抗体の結合
実施例３で記載された、マウス（親）抗ＡＧＥ抗体及びキメラ抗ＡＧＥ抗体の結合を、直接結合ＥＬＩＳＡにより探索した。抗カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）抗体（R&D Systems社、MAB3247）を、対照として使用した。ＣＭＬを、ＫＬＨにコンジュゲートさせ（ＣＭＬ−ＫＬＨ）、ＥＬＩＳＡプレートを、ＣＭＬ及びＣＭＬ−ＫＬＨの両方で、一晩にわたりコーティングした。ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＦｃを使用して、対照抗体及びマウス（親）抗ＡＧＥ抗体を検出した。ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＦｃを使用して、キメラ抗ＡＧＥ抗体を検出した。
【０１１８】
抗原を、ｐＨ６．５の、１倍濃度リン酸緩衝液中、１μｇ／ｍＬに希釈した。９６ウェルマイクロ滴定ＥＬＩＳＡプレートを、ウェル１つ当たり１００μＬの希釈抗原でコーティングし、４℃で、一晩にわたり静置した。プレートを、１倍濃度のＰＢＳ、２．５％のＢＳＡでブロッキングし、翌朝、室温で、１〜２時間にわたり静置した。抗体試料を、１倍濃度のＰＢＳ、１％のＢＳＡを伴い、出発濃度を５０μｇ／ｍＬとする系列希釈液中で調製した。二次抗体を、１：５，０００に希釈した。１００μＬの抗体希釈液を、各ウェルにアプライした。プレートを、マイクロプレートシェーカー上、室温で、０．５〜１時間にわたりインキュベートした。プレートを、１倍濃度のＰＢＳで、３回にわたり洗浄した。ウェル１つ当たり１００μＬの、希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体を、ウェルにアプライした。プレートを、マイクロプレートシェーカー上で、１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、１倍濃度のＰＢＳで、３回にわたり洗浄した。１００μＬのＨＲＰ基質であるＴＭＢを、各ウェルに添加して、プレートを発色させた。３〜５分間の経過後、１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌを添加することにより、反応を停止させた。次に、直接結合ＥＬＩＳＡを、ＣＭＬコーティングだけを伴い実施した。マイクロプレートリーダーを使用して、ＯＤ４５０における吸光度を読み取った。
【０１１９】
ＣＭＬ  ＥＬＩＳＡ及びＣＭＬ−ＫＬＨ  ＥＬＩＳＡについてのＯＤ４５０吸光度の生データを、下記のプレートマップに示す。ウェルプレート内の９６ウェル中４８のウェルを使用した。プレートマップ内のブランクウェルは、非使用ウェルを指し示す。
【０１２０】
【表６】
2021534144.tif 000008
【０１２１】
ＣＭＬだけによるＥＬＩＳＡについてのＯＤ４５０吸光度の生データを、下記のプレートマップに示す。ウェルプレート内の９６ウェル中２４のウェルを使用した。プレートマップ内のブランクウェルは、非使用ウェルを指し示す。
【０１２２】
【表７】
2021534144.tif 000009
【０１２３】
対照抗ＡＧＥ抗体及びキメラ抗ＡＧＥ抗体は、ＣＭＬ及びＣＭＬ−ＫＬＨの両方への結合を示した。マウス（親）抗ＡＧＥ抗体はＣＭＬ又はＣＭＬ−ＫＬＨへの、極めて弱い結合を示し、乃至はＣＭＬ又はＣＭＬ−ＫＬＨへの結合を示さなかった。反復されたＥＬＩＳＡからのデータは、対照抗ＡＧＥ抗体及びキメラ抗ＡＧＥ抗体の、ＣＭＬへの結合を確認する。全ての緩衝液対照は、負のシグナルを示した。
【実施例５】
【０１２４】
ヒト化抗体
ヒト化抗体は、親（マウス）抗体配列の選択された部分を、ヒトフレームワーク配列と融合させる、複数のハイブリッド配列を創出することによりデザインした。アクセプターフレームワークは、フレームワークにわたる、全体的な配列同一性、インターフェース位置のマッチング、同様に分類された、カノニカルのＣＤＲ位置、及び除去されるＮ−グリコシル化部位の存在に基づき同定した。３つのヒト化軽鎖、及び３つのヒト化重鎖は、２つの異なる重鎖及び軽鎖の、ヒトアクセプターフレームワークに基づきデザインした。重鎖のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３０、配列番号３２、及び配列番号３４に示されるＤＮＡ配列によりコードされる、配列番号２９、配列番号３１、及び配列番号３３に示す。軽鎖のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３６、配列番号３８、及び配列番号４０に示されるＤＮＡ配列によりコードされる、配列番号３５、配列番号３７、及び配列番号３９に示す。ヒト化配列を、目視及びコンピュータモデル化により、方法に基づいて解析して、抗原への結合を保持する可能性が高い配列を取り出した。目標は、元の抗体特異性を保持しながら、最終的なヒト化抗体内のヒト配列の量を最大化することであった。ヒト化軽鎖とヒト化重鎖とを組み合わせて、９つの完全ヒト化抗体バリアントを創出することができた。
【０１２５】
３つの重鎖及び３つの軽鎖を解析して、それらのヒト性を決定した。抗体のヒト性スコアは、Gao, S. H., et al., “Monoclonal antibody humanness score and its applications”, BMC Biotechnology, 13:55 (July 5, 2013)において記載されている方法に従い計算した。ヒト性スコアは、抗体の可変領域配列が、どのくらいヒト配列に似て見えるのかを表す。重鎖スコアについて、７９以上は、ヒト配列に似て見えることを指し示し；軽鎖スコアについて、８６以上は、ヒト配列に似て見えることを指し示す。３つの重鎖、３つの軽鎖、親（マウス）重鎖、及び親（マウス）軽鎖のヒト性を、下記の表６に示す。
【０１２６】
【表８】
2021534144.tif 000010
【０１２７】
まず、可変領域配列を合成することにより、全長抗体遺伝子を構築した。配列を、哺乳動物細胞内の発現について最適化した。次いで、これらの可変領域配列を、ヒトＦｃドメインを、既に含有する発現ベクターにクローニングし、重鎖には、ＩｇＧ１を使用した。
【０１２８】
小スケールのヒト化抗体の作製は、既知組成培地を、血清の非存在下で使用して、懸濁ＨＥＫ２９３細胞に、重鎖及び軽鎖のためのプラスミドをトランスフェクトすることにより実行した。MabSelect SuRe Protein A培地（GE Healthcare社製）を使用して、馴化培地中の全抗体を精製した。
【０１２９】
配列番号２９、配列番号３１、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する、３つの重鎖と、配列番号３５、配列番号３７、及び配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する、３つの軽鎖との各組合せから、９つのヒト化抗体を作製した。比較のためのキメラ親抗体もまた調製した。抗体及びそれらのそれぞれの力価を、下記の表７に示す。
【０１３０】
【表９】
2021534144.tif 000011
【０１３１】
ヒト化抗体の結合は、例えば、用量依存的結合ＥＬＩＳＡアッセイ又は細胞ベースの結合アッセイにより査定することができる。
【実施例６】
【０１３２】
カルボキシメチルリシンモノクローナル抗体の投与についてのインビボ研究
カルボキシメチルリシン抗体の、腫瘍増殖、転移可能性、悪液質に対する効果を探索した。マウス乳がん腫瘍モデルを使用して、マウスにおいて、インビボ研究を実行した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（BALB/cAnNCrl、Charles River社）は、研究の１日目において、１１週齢であった。
【０１３３】
４Ｔ１マウス乳腺腫瘍細胞（ATCC CRL-2539）を、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン、２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１００単位／ｍＬのペニシリンＧ  Ｎａ、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩を含有するRPMI 1640培地中で培養した。腫瘍細胞を、５％のＣＯ２及び９５％の空気による雰囲気中、３７℃の加湿型インキュベーター内の、組織培養フラスコ中で維持した。
【０１３４】
次いで、培養された乳がん細胞を、マウスに植え込んだ。４Ｔ１細胞を、対数増殖期に採取し、インプラント日において、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に、１ｍＬ当たりの細胞１×１０６個の濃度で再懸濁させた。腫瘍は、４Ｔ１細胞１×１０５個（０．１ｍＬの懸濁液）を、各被験動物の、右脇腹に、皮下インプラントすることにより誘発した。それらの体積が、８０〜１２０ｍｍ３の目標範囲に近づくのに伴い、腫瘍をモニタリングした。腫瘍体積は、式：腫瘍体積=(腫瘍幅)2(腫瘍長さ)/2を使用して決定した。腫瘍重量は、１ｍｍ３の腫瘍体積が、１ｍｇの重量を有するという仮定を使用して近似した。研究の１日目と名付ける、移植の１３日後に、マウスを、個々の腫瘍体積の範囲を、１０８〜１２６ｍｍ３とし、腫瘍体積の群平均値を、１１２ｍｍ３とする、４つの群（群１つ当たりのｎ＝１５）に区分した。４つの治療群を、下記の表８に示す。
【０１３５】
【表１０】
2021534144.tif 000012
【０１３６】
抗カルボキシメチルリシンモノクローナル抗体を、治療剤として使用した。２５０ｍｇのカルボキシメチルリシンモノクローナル抗体を、R&D Systems社（Minneapolis、MN）から得た。カルボキシメチルリシンモノクローナル抗体の投与液を、媒体（ＰＢＳ）中に、１及び０．５ｍｇ／ｍＬで調製して、１０ｍＬ／ｋｇの投与容量中、それぞれ、１０及び５μｇ／ｇの活性投与量をもたらした。投与液は、光から保護して、４℃で保管した。
【０１３７】
全ての治療は、マウスに１回の投与を行った、研究の１日目を除き、毎日２回、２１日間静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。研究の１９日目に、尾静脈分解のために、ｉ．ｖ．投与できない動物には、ｉ．ｖ．投与を、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与に変更した。投与容量は、体重２０グラム当たり０．２００ｍＬの（１０ｍＬ／ｋｇ）であり、各個別の動物の体重に照らしてスケーリングした。
【０１３８】
研究は、２３日間にわたり続いた。腫瘍は、毎週２回、キャリパーを使用して測定した。動物は、１〜５日目に毎日秤量し、次いで毎週２回ずつ、研究が完了するまで秤量した。マウスはまた、任意の副作用についても観察した。許容可能な毒性は、研究中の体重減少の群平均値が２０％未満であり、治療関連死が１０％以下であることとして規定した。治療の有効性は、研究の最終日（２３日目）からのデータを使用して決定した。
【０１３９】
抗カルボキシメチルリシン抗体が、腫瘍の増殖を阻害する能力は、腫瘍体積中央値（ＭＴＶ）を、群１〜３について比較することにより決定した。腫瘍体積は、上記で記載した通りに測定した。腫瘍増殖の阻害パーセント（ＴＧＩ％）は、対照群（群１）のＭＴＶと、薬物治療群のＭＴＶとの差として規定し、対照群のＭＴＶに対する百分率として表す。ＴＧＩ％は、式：TGI%=(1-MTVtreated/MTVcontrol)×100に従い計算することができる。
【０１４０】
抗カルボキシメチルリシン抗体が、がんの転移を阻害する能力は、肺がん病巣を、群１〜３について比較することにより決定した。阻害パーセント（阻害％）は、対照群の転移性病巣の平均値カウントと、薬物治療群の転移性病巣の平均値カウントとの差として規定し、対照群の転移性病巣の平均値カウントに対する百分率として表す。阻害％は、以下の式：阻害%=(1-病巣treatedの平均値カウント/病巣controlの平均値カウント)×100に従い計算することができる。
【０１４１】
抗カルボキシメチルリシン抗体が、悪液質を阻害する能力は、肺及び腓腹筋の重量を、群１〜３について比較することにより決定した。組織重量はまた、体重１００ｇに照らしても正規化した。
【０１４２】
治療の有効性はまた、研究中に観察された退縮応答の発生率及び大きさによっても査定した。治療は、動物において、腫瘍の部分退縮（ＰＲ：partial regression）又は完全退縮（ＣＲ：complete regression）を引き起こすことができる。ＰＲ応答では、腫瘍体積は、研究の経過中に、３回の測定で、連続して、その１日目の体積の５０％以下であり、これらの３回の測定のうちの、１又は２回以上において、１３．５ｍｍ３以上であった。ＣＲ応答では、腫瘍体積は、研究の経過中に、３回の測定で、連続して、１３．５ｍｍ３未満であった。
【０１４３】
統計学的解析は、Windows 6.07用のPrism（GraphPad社製）を使用して実行した。２つの群の、２３日目における平均値腫瘍体積（ＭＴＶ）の間の差違についての統計学的解析は、マン−ホイットニーのＵ検定を使用して達した。転移性病巣の比較は、ＡＮＯＶＡ−ダネットにより評価した。正規化された組織重量は、ＡＮＯＶＡにより比較した。両側の統計学的解析は、Ｐ＝０．０５の有意水準で行った。結果は、統計学的に有意であるか、又は統計学的に有意でないとして分類した。
【０１４４】
研究の結果を、下記の表９に示す。
【０１４５】
【表１１】
2021534144.tif 000013
【０１４６】
治療関連死を伴わない場合、全ての治療レジメンは、許容可能に忍容された。唯一の動物死は、転移に起因する非治療関連死であった。ＴＧＩ％は、５μｇ／ｇ治療群（群２）及び１０μｇ／ｇ治療群（群３）について、有意性への傾向（マン−ホイットニーによるＰは、０．０５を超える）を示した。阻害％は、５μｇ／ｇ治療群について、有意性への傾向（ＡＮＯＶＡ−ダネットによるＰは、０．０５を超える）を示した。阻害％は、１０μｇ／ｇ治療群について、統計学的に有意（Ｐは０．０１以下、ＡＮＯＶＡ−ダネット）であった。カルボキシメチルリシン抗体が、悪液質を治療する能力は、肺及び腓腹筋の臓器重量の、治療群と、対照群との間における比較に基づき、有意性への傾向（ＡＮＯＶＡによるＰは、０．０５を超える）を示した。結果は、抗カルボキシメチルリシンモノクローナル抗体の投与が、がん転移を低減することが可能であることを指し示す。このデータは、抗ＡＧＥ抗体のインビボ投与が、治療利益を、安全かつ効果的に提供しうることの、さらなる証拠を提示する。
【実施例７】
【０１４７】
イヌモデルにおける、神経膠腫の治療
自発的神経膠腫に罹患しているイヌを、治療のために選択する。神経膠腫について、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ：magnetic resonance imaging）、及び身体症状の査定により検証する。イヌを、下記の表１０において示される５つの治療群に分ける。
【０１４８】
【表１２】
2021534144.tif 000014
【０１４９】
抗ＡＧＥ抗体は、カルボキシメチルリシン抗体である。抗ＡＧＥ抗体は、キメラ抗体、イヌ化抗体、又はイヌ抗体である。対照抗体は、イヌＩｇＧ１抗体（Novus Biologicals社製）である。抗体は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。抗体は、０日目に静脈内投与し、毎週１回、３週間にわたり静脈内投与する。
【０１５０】
超音波は、抗体と同時に施す。超音波は、５．７ＭＨｚの周波数、９０ｍＷ／ｃｍ２の強度、及び６．０ｋＨｚのパルス反復周波数（ＰＲＦ）で施す。超音波は、各イヌの頭蓋の側頭窓に対して垂直に配置されたプローブにより施す。
【０１５１】
３週間にわたる投与レジメンの終了時に、全ての群を、ＭＲＩにより、神経膠腫の存在及び量、並びに身体症状について査定する。群２（抗ＡＧＥ抗体及び超音波）における動物が、最小量の神経膠腫、及び最小限の身体症状を示し、これに、群１（抗ＡＧＥ抗体）における動物、群４（超音波）における動物、及び群３（対照抗体及び超音波）における動物が続く。群５（対照）における動物は、症状の改善を示さない。超音波と抗ＡＧＥ抗体との組合せは、脳の制限部位にアクセスし、血液脳関門を越えて、最も効果的な治療をもたらすことが可能である。
【実施例８】
【０１５２】
イヌモデルにおける、変性性関節疾患（骨関節炎）の治療
スタイフル（イヌにおける、ヒト膝の同等物）関節に、自発的な変性性関節疾患（骨関節炎）に罹患しているイヌを、治療のために選択する。変性性関節疾患について、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、及び身体症状の査定により検証する。イヌを、下記の表１１において示される５つの治療群に分ける。
【０１５３】
【表１３】
2021534144.tif 000015
【０１５４】
抗ＡＧＥ抗体は、カルボキシメチルリシン抗体である。抗ＡＧＥ抗体は、キメラ抗体、イヌ化抗体、又はイヌ抗体である。対照抗体は、イヌＩｇＧ１抗体（Novus Biologicals社製）である。抗体は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。抗体は、０日目に静脈内投与し、毎週１回、３週間にわたり静脈内投与する。
【０１５５】
超音波は、抗体と同時に施す。超音波は、５．７ＭＨｚの周波数、９０ｍＷ／ｃｍ２の強度、及び６．０ｋＨｚのパルス反復周波数（ＰＲＦ）で施す。超音波は、罹患スタイフル関節上に配置されたプローブにより施す。
【０１５６】
３週間にわたる投与レジメンの終了時に、全ての群を、ＭＲＩにより、変性性関節疾患の存在及び量、並びに身体症状について査定する。群２（抗ＡＧＥ抗体及び超音波）における動物が、最小量の変性性関節疾患、及び最小限の身体症状を示し、これに、群１（抗ＡＧＥ抗体）における動物、群４（超音波）における動物、及び群３（対照抗体及び超音波）における動物が続く。群５（対照）における動物は、症状の改善を示さない。超音波と抗ＡＧＥ抗体との組合せは、関節の制限部位にアクセスして、最も効果的な治療をもたらすことが可能である。
【実施例９】
【０１５７】
インビトロにおける、抗体及び超音波の、神経膠芽腫細胞及び神経膠芽腫／星状細胞腫細胞への施行
神経膠芽腫細胞の細胞株（ＣＲＬ−１６２０）、及び神経膠芽腫／星状細胞腫細胞の細胞株（ＨＴＢ−１５）を、抗体（AB912）に曝露するのに続き、超音波を施した。AB912は、ＤＮＡ複製過程に関与するタンパク質である、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ：proliferating cell nuclear antigen）に結合する。ＰＣＮＡの発現は、増殖又は新生物性形質転換と関連する。
【０１５８】
抗体を、超音波への曝露の３０分前に、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で、細胞に加えた。細胞を、１ＭＨｚの周波数、０．４ｗ／ｃｍ２、及び５０％のパルスで、１時間にわたり、超音波に曝露した。ディッシュの底部は、超音波ヘッドから、約３ｍｍであった。曝露の後で、対照群、及びAB912を伴わない、１時間にわたる超音波群を、１ｃｍ２当たりの細胞２×１０５個で播種し、AB912を伴う、１時間にわたる超音波群を、１ｃｍ２当たりの細胞１．１×１０５個で播種した。
【０１５９】
抗体が結合したＣＲＬ−１６２０細胞のうちの、約９０％は、培養ディッシュからの著明な解離を示した。抗体が結合していない細胞のうちの約１０％だけが、培養プレートから解離した。試料を、３７℃でインキュベートし、５％のＣＯ２を補充し、約６４時間にわたり培養することを可能とした。インキュベーション時間の後、細胞培養物を、顕微鏡下で観察したところ、再付着は観察されなかった。複数の大型の細胞クラスターが、培地中に浮遊していることを観察した。これらの細胞を、手作業で破壊したところ、生細胞は、見出されなかった。結果を、下記の表１２に示す。
【０１６０】
【表１４】
2021534144.tif 000016
【０１６１】
上記で記載したのと同じ、抗体及び超音波の施行の投与手順を、ＨＴＢ−１５細胞についても反復した。抗体が結合した細胞のうちの、約８５％は、培養ディッシュからの著明な解離を示した。抗体が結合していない細胞のうちの約１０％だけが、培養プレートから解離した。６４時間にわたるインキュベーション時間の後、細胞培養物を、顕微鏡下で観察したところ、再付着は観察されなかった。結果を、下記の表１３に示す。
【０１６２】
【表１５】
2021534144.tif 000017
【０１６３】
２４時間後、抗体を結合させたが、超音波を施されていない両方の細胞株の培養物は、目視可能な毒性の徴候を示さなかった。超音波に曝露されるが、抗体を結合させていない培養物もまた、毒性を示さなかった。抗体及び超音波に曝露される細胞は、確かに、毒性を呈した。
【０１６４】
これらの結果は、抗体及び超音波の施行を併せて使用して、細胞を死滅させうることの原理証明である。組合せ療法は、インビボにおいて存在する場合、脳の制限部位において見出される、２種類のがんである、神経膠芽腫細胞及び神経膠芽腫／星状細胞腫細胞を、選択的にターゲティングし、死滅させた。結果は、抗体及び超音波の投与の組合せが、細胞の殺滅の、超音波単独の施行と比較した増強を結果としてもたらすことを裏付ける。
【実施例１０】
【０１６５】
神経膠腫細胞パネルの免疫蛍光染色
ATCC神経膠腫細胞株パネルに由来する神経膠腫細胞を、０．２５％のトリプシンＥＤＴＡ中で、約５分間にわたりトリプシン処理し、次いで、洗浄し、１ｍＬ当たりの細胞約１０５個に再懸濁させた。懸濁液のアリコート１００μＬを、丸底９６ウェルプレートに移し、遠心分離して、培地を除去した。各細胞株を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ：phosphate-buffered saline）中に０．１μｇ／ｍＬの、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ：4’,6-diamidino-2-phenylindole）２００μＬに、１０分間にわたり再懸濁させ、次いで、３回にわたり洗浄した。次いで、細胞を、ＰＢＳ中に１０μｇ／ｍＬの、AB912-T2-17G6抗体（増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）抗体）中に再懸濁させ、２〜８℃で、３０分間にわたりインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中で、３回にわたりすすぎ、次いで、Texas Red（二次抗体）にコンジュゲートした、１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧ（H&L社製）中に懸濁させた。各回の洗浄のために、細胞を、２００×ｇで、５分間にわたり遠心分離し、上清を、各ウェルから吸引した。免疫蛍光検出を使用して、抗体の、神経膠腫細胞への結合を検証した。
【実施例１１】
【０１６６】
インビトロにおける、抗ＡＧＥ抗体結合研究
インビトロ実験は、SIWA 318Hと称される、ヒト化抗終末糖化反応最終産物（抗ＡＧＥ）モノクローナル抗体（SIWA Therapeutics, Inc.社製）の、神経膠腫細胞及び膵がん細胞への結合について探索した。SIWA 318Hは、カルボキシメチルリシン修飾タンパク質に結合することが公知である。結合は、実施例１０で記載された、免疫蛍光染色により検証した。
【０１６７】
ヒト膵がんＰＡＮＣ−１細胞株に由来する膵がん細胞を、SIWA 318Hに曝露した。図２Ａ〜２Ｄは、SIWA 318H抗体の、膵がん細胞への結合を例示する。
【０１６８】
ATCC神経膠腫細胞株パネルに由来する神経膠腫細胞を、SIWA 318Hに曝露した。SIWA 318Hは、パネル内に含まれる、全ての細胞株（ＣＲＬ−１６２０ヒト神経膠芽腫細胞、ＨＴＢ−１２ヒト星状細胞腫細胞、ＨＴＢ−１４８ヒト神経膠腫細胞、ＨＴＢ−１５ヒト神経膠芽腫細胞、及びＨＴＢ−１４ヒト神経膠芽腫細胞）に結合した。SIWA 318H抗体の、神経膠腫細胞への結合は、フローサイトメトリーにより確認した。図３は、SIWA 318H抗体の、ＨＴＢ−１４神経膠芽腫細胞株に由来する神経膠腫細胞への結合を例示する。図４Ａ〜４Ｃは、SIWA 318H抗体の、ＨＴＢ−１５神経膠芽腫細胞株に由来する神経膠腫細胞への結合を例示する。
【０１６９】
これらの結果は、抗ＡＧＥ抗体であるSIWA 318Hが、膵がん細胞及び神経膠腫細胞に結合することを裏付ける。
【０１７０】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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