(57)【要約】  本発明は、非活性／非成熟細胞、特に非活性化／非成熟Ｔおよび／またはＢ細胞、任意選択的に遺伝子改変Ｔおよび／またはＢ細胞が富化された細胞の集団を製造する方法に関する。方法は、哺乳動物細胞の不均質な集団をアポトーシス誘導性リガンドと接触させることであって、前記接触させることが、非活性／成熟細胞がアポトーシスシグナルに対して抵抗性であるままとしながら、活性／成熟細胞のアポトーシスを誘導する、前記接触させることを含む。本発明はまた、富化された細胞集団の治療的使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非活性／非成熟細胞が富化された細胞の集団を製造する方法であって、
ａ．哺乳動物細胞の不均質な集団を含む生物学的試料を得ること、および
ｂ．前記得られた哺乳動物細胞の不均質な集団を容器中でアポトーシス誘導性リガンドと接触させることであって、
前記接触させることが、非活性／成熟細胞がアポトーシスシグナルに対して抵抗性であるままとしながら、活性／成熟細胞のアポトーシスを誘導し、それにより、非活性／非成熟細胞が富化された細胞の集団が単離される、前記接触させること
を含む、方法。
【請求項２】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物細胞が、免疫細胞および複能性間質／間葉幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非活性／非成熟細胞が免疫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非活性／非成熟細胞がナイーブ免疫細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ナイーブ免疫細胞が富化された細胞の集団を製造する方法であって、
ａ．哺乳動物免疫細胞の不均質な集団を含む生物学的試料を得ること、
ｂ．前記得られた哺乳動物免疫細胞の不均質な集団を容器中でアポトーシス誘導性リガンドと接触させることであって、前記接触させることが、ナイーブ細胞がアポトーシスシグナルに対して抵抗性であるままとしながら、成熟細胞のアポトーシスを誘導し、それにより、ナイーブ細胞が富化された細胞の集団が単離される、前記接触させること
を含む、方法。
【請求項７】
前記ナイーブ免疫細胞がナイーブＴ細胞またはナイーブＢ細胞である、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的試料が、動員末梢血細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、富化されたＣＤ３＋Ｔ細胞、富化されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞、富化されたＢ細胞、臍帯血細胞および骨髄細胞からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫細胞が、患者に対して自己であり、または患者に対して同種である、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アポトーシス誘導性リガンドが、前記容器の内側表面上または前記容器中に含まれるビーズもしくはフィルム上に固定化される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アポトーシス誘導性リガンドが、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬおよびＴＷＥＡＫからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
アポトーシス誘導性リガンドとの前記接触ステップが約１時間〜約４８時間行われる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触ステップが約２時間行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アポトーシス誘導性リガンドがＦａｓＬであり、かつ前記ＦａｓＬが約１〜約８００ｎｇ／ｍｌの濃度で投与される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＦａｓＬが約１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌの濃度で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記成熟細胞が、ＴＨ１／ＴＣ１、ＴＨ１７、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ、ＴＥＭ、およびＴｅｆｆ細胞集団からなる群から選択される成熟Ｔ細胞である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法により調製された、ナイーブＴ細胞が富化された細胞の集団。
【請求項１８】
前記細胞が、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−ＬＦＡ１ｌｏｗとして特徴付けられる、請求項１７に記載のナイーブＴ細胞が富化された細胞の集団。
【請求項１９】
がんおよび自己免疫疾患の治療において使用するための、請求項１７または請求項１８に記載のナイーブＴ細胞が富化された細胞の集団。
【請求項２０】
患者において自己免疫疾患を治療する方法であって、前記患者に、請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法により調製されたナイーブＴ細胞が富化された細胞の集団を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
前記成熟細胞が、メモリーおよび形質芽球Ｂ細胞集団からなる群から選択される成熟Ｂ細胞である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法により調製された、ナイーブＢ細胞が富化された細胞の集団。
【請求項２３】
前記細胞が、ＣＤ２７＋ＣＤ３８＋として特徴付けられる、請求項２２に記載のナイーブＢ細胞が富化された細胞の集団。
【請求項２４】
がんまたは自己免疫疾患、または炎症性疾患の治療において使用するための、請求項２２または請求項２３に記載のナイーブＢ細胞が富化された細胞の集団。
【請求項２５】
患者において自己免疫疾患を治療する方法であって、前記患者に、請求項１〜１５および２１〜２３のいずれか１項に記載の方法により調製されたナイーブＢ細胞が富化された細胞の集団を投与することを含む、方法。
【請求項２６】
自己免疫疾患を治療する方法であって、
ａ．ＴおよびＢ細胞を含む哺乳動物免疫細胞の不均質な集団をアポトーシス誘導性リガンドと接触させることであって、前記接触させることが、前記ＴおよびＢ細胞の活性化レベルを低減する、前記接触させること、ならびに
ｂ．前記ステップ（ａ）において得られた細胞の集団をそれを必要とする患者に投与すること
を含む、方法。
【請求項２７】
患者においてがんを治療する方法であって、請求項１７または１８のいずれか１項に記載のナイーブＴ細胞が富化された細胞の集団を投与することを含み、前記細胞がそれらの抗がん活性を保存している、方法。
【請求項２８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞を製造する方法であって、
ａ．生物学的試料から単核細胞を単離すること、
ｂ．前記細胞を少なくとも１つのＴ細胞活性化剤と接触させることにより前記細胞を活性化させること、および
ｃ．前記細胞にＣＡＲ構築物を形質導入すること
を含み、
前記方法が、前記活性化ステップ（ｂ）の前および／または前記形質導入ステップ（ｃ）の後に前記細胞をアポトーシス誘導性リガンドと接触させ、それにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞を得ることをさらに含む、
方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学的試料が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、富化されたＣＤ３＋Ｔ細胞、富化されたＣＤ４＋Ｔ細胞、富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞がＰＢＭＣである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔ細胞活性化剤が抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記アポトーシス誘導性リガンドが、ＦａｓＬ、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬおよびＴＷＥＡＫからなる群から選択される、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
アポトーシス誘導性リガンドとの前記接触ステップが約１時間〜約４８時間行われる、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記接触ステップが約２時間行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アポトーシス誘導性リガンドがＦａｓＬであり、かつ前記ＦａｓＬが約１〜約８００ｎｇ／ｍｌの濃度で投与される、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＦａｓＬが、約１０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌまたは約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で投与される、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞療法の分野におけるものである。
【背景技術】
【０００２】
本開示の主題の背景として関連すると考えられる参考文献を以下に列記する：
１．Ｗａｔｋｉｎｓら、「Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ａｆｔｅｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６、ｅ１４０（２０１７）．
２．Ｔｕｒｔｌｅら、「ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＣＤ４＋：ＣＤ８＋  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ＡＬＬ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２６（６）：２１２３−３８（２０１６）．
３．Ｌａｍｂら、「Ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ：ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ」、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５２、１２４１−１２４８（２０１７）．
４．Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎｅｕｒｏｎ、９７：７４２−７６８（２０１８）．
５．Ｍａｚａｒ  Ｊら、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ（ＦａｓＬ）−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９；２８４：２２０２２−２２０２８．
６．Ｋｎｉｇｈｔ  ＪＣ、Ｓｃｈａｒｆ  ＥＬ、Ｍａｏ−Ｄｒａａｙｅｒ  Ｙ．Ｆａｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２０１０  Ｍａｒ；８８（４）：７４６−５７．
７．Ｌｏｃｋｅら、「Ｐｈａｓｅ  １  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ＺＵＭＡ−１：Ａ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＫＴＥ−Ｃ１９  Ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２５；１（２０１７）．
８．Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒら、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＣＤ８＋  ａｎｄ  ＣＤ４＋  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｃｏｎｆｅｒ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．３０、４９２−５００（２０１６）．
９．Ｂｏｎｉｆａｎｔら、「Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ＣＡＲ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ  ２０；３：１６０１１（２０１６）．
１０．Ｋｉｍら、「Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＦＬＩＰ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；２０：１７４−１８２（２００２）．
１１．ＳｐｒｅｎｔおよびＴｏｕｇｈ、「Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｍｏｒｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３（５５２８）：２４５−８、（２００１）．
１２．Ｓｔｒａｓｓｅｒら、「Ｔｈｅ  Ｍａｎｙ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＦＡＳ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３０（２）：１８０−９２、（２００９）
１３．Ｚｈａｎｇら、「Ｈｏｓｔ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ＣＤ８＋  ｍｅｍｏｒｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．（２００５）．
１４．Ｒｏｂｅｒｔｏら、「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｔ  ｍｅｍｏｒｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｂｌｏｏｄ、１２５：２８５５−２８６４（２０１５）．
１５．Ｎａｓｈｉら、「Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  Ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｌｕｐｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４２（４）：５４３−５５０、（２０１０）．
１６．Ｂａｋｅｒら、「Ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｒｅｌａｐｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ、１６：４１−５０、（２０１７）．
１７．Ｈａｃｋｅｔｔら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１０）１８（４）：６７４−６８３．
１８．ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ＫＰら、「Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：  ｒｅｃｅｎｔ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ」、Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９（１）：Ｓ１０−Ｓ１４、（２０１３）．
１９．Ｇｒａｈａｍら、「Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＣＡＲ−Ｔ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  Ｅａｓｅ  ｏｆ  Ａｃｃｅｓｓ？」、Ｃｅｌｌｓ（２０１８）Ｏｃｔ；７（１０）：１５５．
２０．Ｘｕ  Ｙら、「Ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔ−ｍｅｍｏｒｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＡＲ．ＣＳ１９−Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ＩＬ−７  ａｎｄ  ＩＬ−１５」、Ｂｌｏｏｄ．（２０１４）；３７５０−３７６０．
本明細書における上記の参考文献の承認は、これらが何らかの意味で本開示の主題の特許性に関連するという意味として推測されるべきではない。
【０００３】
背景
特にがん療法における、自己または同種の複数の細胞療法製品は、原材料として細胞の異種遺伝子性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃ）混合物に基づく（Ｗａｔｋｉｎｓら、２０１７；Ｔｕｒｔｌｅら、２０１６）。移植された細胞集団の毒性を低減するために現在利用されている単離および富化技術は、枯渇技術の非選択的な性質に起因して所望の生物学的活性の一部を欠いた、より定義された最終製品を結果としてもたらすことがある（Ｌａｍｂら、２０１７）。これらの単離技術は機械的なまたは表現型上の特徴を利用するが、多くの場合にあまりに大雑把で、細胞集団内の所望の細胞および望ましくない細胞を区別するために十分な感度ではない。定義された生物学的活性を有する、よく特徴付けられており、かつ再現性のある最終製品を得るために、細胞ベースの製品の生産のために使用される出発材料を標準化する新たな方法が要求される。好ましくは、この方法は、副作用を低減しかつアウトカムを向上させるために、細胞製品を用いる患者治療の前にエクスビボで使用される。
【０００４】
例えば自己免疫疾患療法の分野における、選択的な枯渇のための細胞療法における別の主要な目標は、活性化可能性および炎症促進性反応を低減するための有効な治療戦略を開発することである（Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎら、２０１８）。
【０００５】
細胞療法における追加の課題は、再生医療の分野におけるものであり、出発材料が不均質な集団である場合、有効でない細胞が細胞療法製品の効力を減少させることである（Ｍａｚａｒ  Ｊ、２００９；Ｋｎｉｇｈｔ、２０１０）。
【０００６】
細胞療法における異種遺伝子性集団の使用における困難の例は、キメラ抗原受容体遺伝子操作型Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞の場合である。様々な抗腫瘍治療のために研究されてきたＣＡＲ−Ｔ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、いくつかのがんを治療するための有効な方法を提供し得るが、何故ならば、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗原性が別個の腫瘍集団を特異的に認識するように遺伝子操作され得るからである（例えば、Ｌｏｃｋｅら、２０１７を参照）。これらのＴ細胞ベースの療法は、高度に難治性のＢ細胞悪性腫瘍に対して顕著に有望であることが臨床試験において示されている。しかしながら、ほとんどの報告された試験において、患者は、Ｔ細胞サブセットのランダムな組成を含むＴ細胞製品を与えられているため、各患者は異なる治療剤を与えられており、それがＴ細胞療法の有効性に影響を及ぼして、異なる患者間および試験間のアウトカムの比較を複雑にした可能性がある。ＡＬＬ患者におけるＲｉｄｄｌｅおよびＭａｌｏｎｅｙのグループによる最近の研究は、定義されたＴ細胞サブセットから生成されたＣＡＲ−Ｔ細胞製品は、表現型組成において異なる非選択Ｔ細胞に由来する製品と比較して均一な効力を提供できることを示唆する。（Ｔｕｒｔｌｅら、２０１６；およびＳｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒら、２０１６）。
【０００７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞免疫療法は、毒性管理において大きな課題を提示する。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を用いて最も一般的に観察される２つの毒性は、ＣＡＲ−Ｔ細胞関連脳症症候群（ＣＲＥＳ）およびサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）であり、ＣＲＳは、軽度から生命を脅かすものまでの範囲に及び、細胞投与の通常第１週以内のサイトカインの上昇および１〜２週以内のピークの結果としてもたらされ、かつＴ細胞活性化および増殖と関連付けられる、一連の炎症症状である（Ｂｏｎｉｆａｎｔら、２０１６）。毒性のリスクは、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療の広い展開を制限している。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法に関する毒性を低減するための現行の医療戦略としては、治療後の抗炎症性モダリティーが挙げられる。例えば、抗ＩＬ６受容体またはＩＬ６受容体アンタゴニスト、およびコルチコステロイドの両方のモダリティーは炎症応答を抑制し、したがって、細胞療法と関連付けられるＣＲＳおよびＣＲＥＳの管理において有効である。しかしながら、その欠点は、これらの治療は免疫応答を下方調節することであり、Ｔ細胞活性化を遮断し、臨床的利益を妨げる可能性が懸念となる。毒性管理における課題は、有効性を損なうことなく症状を制御することである（Ｂｏｎｉｆａｎｔら、２０１６）。
【０００８】
追加の課題は形質導入効率である。形質導入効率はＴ細胞の品質に影響される。Ｔ細胞の活性化は効率的な形質導入のための必要条件であり、というのも、初代ヒトＴ細胞はインビトロで分裂しない静止状態の細胞であるからである。追加的に、化学療法を受けた患者のＴ細胞の品質は損なわれる。Ｔ細胞機能障害は一般的であり、生産プロセスの間に十分に逆転し得ないことが頻繁である（Ｇｒａｈａｍら、２０１８）。
【０００９】
別の課題は、治療後の免疫下方調節に関する。ＣＡＲ改変Ｔ細胞は抑制性腫瘍微環境に入ると有効でなくなる可能性がある。これは、固形腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞療法を開発する試みにおいて殊に重要である。腫瘍環境内のアポトーシスシグナル伝達は、全ての免疫エフェクター細胞を下方調節する。
【００１０】
エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）などの成熟エフェクター細胞は、早期分化型の、より成熟していないＴ細胞、大抵はナイーブおよびセントラルメモリー（ＣＭ）から生産されたＣＡＲ−Ｔ細胞よりも、インビボでのＴ細胞の拡大増殖、生存、持続および抗腫瘍活性において効率性がより低いＣＡＲ−Ｔ細胞であることを研究は示唆している（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  Ｄ、２０１６、およびＸｕ  Ｙ、２０１４）。
【００１１】
国際公開第２０１３／１３２４７７号は、免疫細胞集団をアポトーシス誘導性リガンドに曝露することを含む、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞を選択するためのデバイスおよび方法を開示する。
【発明の概要】
【００１２】
その第１の態様では、本発明は、非活性／非成熟細胞が富化された細胞の集団を製造する方法であって、
ａ．哺乳動物細胞の不均質な集団を含む生物学的試料を得ること、
ｂ．得られた哺乳動物細胞の不均質な集団を容器中でアポトーシス誘導性リガンドと接触させることであって、前記接触させることが、非活性／成熟細胞がアポトーシスシグナルに対して抵抗性であるままとしながら、活性／成熟細胞のアポトーシスを誘導し、それにより、非活性／非成熟細胞が富化された細胞の集団が単離される、前記接触させること
を含む、方法を提供する。
【００１３】
一実施形態では、前記哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【００１４】
別の実施形態では、前記哺乳動物細胞は、免疫細胞および複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）間質／間葉幹細胞からなる群から選択される。
【００１５】
一実施形態では、前記非活性／非成熟細胞は免疫細胞である。
【００１６】
一実施形態では、前記非活性／非成熟細胞はナイーブ免疫細胞である。
【００１７】
一実施形態では、前記容器は、生理溶液および／もしくは増殖培地、ならびに／または自己もしくは非自己ヒト血漿を含む。
【００１８】
特有の実施形態では、本発明は、ナイーブ免疫細胞が富化された細胞の集団を製造する方法であって、
ａ．哺乳動物免疫細胞の不均質な集団を含む生物学的試料を得ること、および
ｂ．得られた哺乳動物免疫細胞の不均質な集団を容器中でアポトーシス誘導性リガンドと接触させることであって、前記接触させることが、ナイーブ細胞がアポトーシスシグナルに対して抵抗性であるままとしながら、成熟細胞のアポトーシスを誘導し、それにより、ナイーブ細胞が富化された細胞の集団が単離される、前記接触させること
を含む、方法を提供する。
【００１９】
一実施形態では、前記ナイーブ免疫細胞はナイーブＴ細胞またはナイーブＢ細胞である。
【００２０】
別の実施形態では、前記生物学的試料は、動員末梢血細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、富化されたＣＤ３＋  Ｔ細胞、富化されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞、富化されたＢ細胞、臍帯血細胞および骨髄細胞からなる群から選択される。
【００２１】
一実施形態では、前記免疫細胞は、患者に対して自己であり、または患者に対して同種である。
【００２２】
一実施形態では、前記容器は、生理溶液および／もしくは増殖培地、ならびに／または自己もしくは非自己ヒト血漿を含む。
【００２３】
一実施形態では、アポトーシス誘導性リガンドは、容器の内側表面上または容器中に含まれるビーズもしくはフィルム上に固定化される。
【００２４】
一実施形態では、アポトーシス誘導性リガンドは、ＴＮＦ−α、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＴＲＡＩＬおよびＴＷＥＡＫからなる群から選択される。
【００２５】
一実施形態では、アポトーシス誘導性リガンドとの前記接触ステップは約１時間〜約４８時間行われる。
【００２６】
一実施形態では、前記接触ステップは約２時間行われる。
【００２７】
一実施形態では、前記アポトーシス誘導性リガンドはＦａｓＬであり、かつ前記ＦａｓＬは約１〜約８００ｎｇ／ｍｌの濃度で投与される。
【００２８】
一実施形態では、ＦａｓＬは約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で投与される。
【００２９】
一実施形態では、ＦａｓＬは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で投与される。
【００３０】
一実施形態では、前記成熟細胞は、ＴＨ１／ＴＣ１、ＴＨ１７、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ、ＴＥＭ、およびＴｅｆｆ細胞集団からなる群から選択される成熟Ｔ細胞である。
【００３１】
別の態様では、本発明は、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法により調製されたナイーブＴ細胞が富化された細胞の集団を提供する。
【００３２】
一実施形態では、ナイーブＴ細胞が富化された前記細胞は、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−ＬＦＡ１ｌｏｗとして特徴付けられる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、がんおよび自己免疫疾患の治療において使用するための、本発明のナイーブＴ細胞が富化された細胞の集団を提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、がんおよび自己免疫疾患の治療において使用するための、遺伝子改変の必要条件としての活性化可能性を維持するＴ細胞が富化された細胞の集団を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、患者において自己免疫疾患を治療する方法であって、前記患者に、本発明の方法により調製されたナイーブＴ細胞が富化された細胞の集団を投与することを含む、方法を提供する。
【００３６】
一実施形態では、前記成熟細胞は、メモリーおよび形質芽球Ｂ細胞集団からなる群から選択される成熟Ｂ細胞集団である。
【００３７】
別の態様では、本発明は、本発明の方法により調製されたナイーブＢ細胞が富化された細胞の集団を提供する。
【００３８】
一実施形態では、前記ナイーブＢ細胞は、ＣＤ２７＋ＣＤ３８＋として特徴付けられる。
【００３９】
別の態様では、本発明は、がん、自己免疫疾患、または炎症性疾患の治療において使用するための、本発明のナイーブＢ細胞が富化された細胞の集団を提供する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、患者において自己免疫疾患を治療する方法であって、前記患者に、本明細書に記載の発明の方法により調製されたナイーブＢ細胞が富化された細胞の集団を投与することを含む、方法を提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、自己免疫疾患を治療する方法であって、
ａ．ＴおよびＢ細胞を含む哺乳動物免疫細胞の不均質な集団をアポトーシス誘導性リガンドと接触させることであって、前記接触させることが、前記ＴおよびＢ細胞の活性化レベルを低減する、前記接触させること、ならびに
ｂ．ステップ（ａ）において得られた細胞の前記集団をそれを必要とする患者に投与すること
を含む、方法を提供する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、患者においてがんを治療する方法であって、本発明の非成熟Ｔ細胞が富化された細胞の集団を投与することを含み、前記細胞がそれらの抗がん活性を保存している、方法を提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を製造する方法であって、
ａ．生物学的試料から単核細胞を単離すること、
ｂ．前記細胞を少なくとも１つのＴ細胞活性化剤と接触させることにより前記細胞を活性化させること、および
ｃ．前記細胞にＣＡＲ構築物を形質導入すること
を含み、
前記方法が、前記活性化ステップ（ｂ）の前および／または前記形質導入ステップ（ｃ）の後に前記細胞をアポトーシス誘導性リガンドと接触させ、それにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞を得ることをさらに含む、
方法を提供する。
【００４４】
一実施形態では、前記哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【００４５】
一実施形態では、前記生物学的試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、富化されたＣＤ３＋Ｔ細胞、富化されたＣＤ４＋Ｔ細胞、富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００４６】
一実施形態では、前記細胞はＰＢＭＣである。
【００４７】
一実施形態では、前記Ｔ細胞活性化剤は抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体である。
【００４８】
一実施形態では、アポトーシス誘導性リガンドは、ＦａｓＬ、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬおよびＴＷＥＡＫからなる群から選択される。
【００４９】
一実施形態では、アポトーシス誘導性リガンドとの前記接触ステップは約１時間〜約４８時間行われる。
【００５０】
一実施形態では、前記接触ステップは約２時間行われる。
【００５１】
一実施形態では、前記アポトーシス誘導性リガンドはＦａｓＬであり、かつ前記ＦａｓＬは約１〜約８００ｎｇ／ｍｌの濃度で投与される。
【００５２】
一部の実施形態では、ＦａｓＬは、約１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌの濃度で投与される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
本明細書に開示される主題をより良好に理解するためおよびそれがどのように実施され得るのかを例示するために、添付の図面を参照して、単に非限定的な例として実施形態がこれより記載される。
【図１】図１は、Ｔ細胞サブタイプの表面上のＣＤ９５（ＦａｓＲ）の発現レベルを示すグラフのセット（１Ａ〜１Ｇ）である。Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血細胞（ＭＰＢＣ）移植片に由来するＴ細胞（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーにより特徴付けた。（Ａ）ＣＤ３＋細胞；（Ｂ）ＣＤ４＋細胞；（Ｃ）様々なＣＤ４＋サブタイプ：ナイーブ、Ｔ幹細胞メモリー（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリー（ＣＭ）、エフェクターメモリー（ＥＭ）、エフェクター（ｅｆｆ）；（Ｄ）サブタイプＴＨ１、ＴＨ１７の成熟Ｔ細胞；（Ｅ）ＣＤ８＋細胞；（Ｆ）様々なＣＤ８＋サブタイプ：ナイーブ、ＴＳＣＭ、ＣＭ、ＥＭ、ｅｆｆ；（Ｇ）サブタイプＴＣ１の成熟Ｔ細胞。
【図２】図２は、グラフのセット（２Ａ〜２Ｑ）であり、（Ａ〜Ｇ）において、ＭＰＢＣ対照と比較したＦａｓ−Ｌ処理ＭＰＢＣにおけるＴ細胞サブタイプ集団パーセンテージの免疫表現型ベースのプロファイリングを示す。７ＡＡＤ＋（壊死／後期アポトーシス）細胞は解析から除外した。（Ａ）ＣＤ４＋Ｔヘルパー（ＴＨ）；（Ｂ）様々なＣＤ４＋サブタイプ：ナイーブ、ＴＳＣＭ、ＣＭ、ＥＭおよびｅｆｆ；成熟炎症促進性Ｔ細胞（Ｃ）ＴＨ１（Ｄ）ＴＨ１７；（Ｅ）ＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性（ＴＣ）；（Ｆ）様々なＣＤ８＋サブタイプ；（Ｇ）成熟炎症促進性Ｔ細胞：ＴＣ１。（Ｈ〜Ｎ）は、アネキシンＶ＋７ＡＡＤ−染色を使用してフローサイトメトリーにより評価し、対照ＭＰＢＣと比較したＦａｓ−Ｌ処理細胞の早期アポトーシスレベルを示すグラフである。３連での３つの独立した実験からの代表的な実験の平均＋ＳＤとして結果を提示している。（Ｈ）ＣＤ４＋細胞；（Ｉ）様々なＣＤ４＋サブタイプ：ナイーブ、ＴＳＣＭ、ＣＭ、ＥＭ、ｅｆｆ；（Ｊ）サブタイプＴＨ１の成熟Ｔ細胞；（Ｋ）サブタイプＴＨ１７の成熟Ｔ細胞；（Ｌ）ＣＤ８＋細胞；（Ｍ）様々なＣＤ８＋サブタイプ：ナイーブ、ＴＳＣＭ、ＣＭ、ＥＭ、ｅｆｆ；（Ｎ）サブタイプＴＣ１の成熟Ｔ細胞。（Ｏ）および（Ｐ）は、フローサイトメトリーを使用し、ＭＰＢＣ対照と比較して、ＦａｓＬ処理Ｔヘルパー（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）細胞（Ｏ）、およびＴ細胞傷害性（ＣＤ８＋ＣＤ２５＋）細胞（Ｐ）において測定した場合のＣＤ２５受容体（活性化マーカー）の発現を示すグラフである。（Ｑ）ＭＰＢＣ対照と比較した、ＦａｓＬ処理後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋活性化ヘルパーＴ細胞のうちの制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（ＣＤ１２７−）のパーセンテージ。平均＋ＳＥＭ、ｎ＝１１の独立した移植片。統計解析は、ノンパラメトリックな、対応のあるスチューデントのＴ検定を使用して行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図３】図３は、インビトロ活性化に応答したＦａｓ−Ｌ処理Ｔリンパ球の活性化の低減を示すグラフのセットである。Ｆａｓリガンド処理された動員末梢血細胞および対照細胞から単離されたＴリンパ球を０．７５×１０６細胞／ｍｌでインキュベートし、１：１０のビーズ：細胞比でＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズを使用して２４または４８時間刺激した。ＣＤ２５ｈｉｇｈ受容体発現をＦａｓ−Ｌ処理Ｔヘルパー（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ）（Ａ）およびＴ細胞傷害性（ＣＤ８＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ）細胞（Ｂ）において測定し、フローサイトメトリーを使用してＭＰＢＣ対照と比較した。（Ｃ）Ｆａｓ−Ｌ処理および対照細胞によるＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡを使用して測定した。結果は、２つの独立した研究の代表的なものである。平均＋ＳＤ、ｎ＝３の複製物として提示したデータ。対応のないパラメトリックｔ検定を使用して統計解析を行った。（Ｄ）Ｆａｓ−Ｌ処理ヒトＭＰＢＣ（５×１０６）を３コホートの亜致死照射（２Ｇｙ）ＮＳＧマウスに移植し、ＭＰＢＣ対照（ｎ＝８〜１０／群）またはビヒクル（移植緩衝液、ｎ＝２／群）と比較した。３つの終了時点（移植後３、７および１４日目）における脾臓中の絶対的なｈＣＤ３＋  Ｔ細胞数（フローサイトメトリーにより検出された場合のｈＣＤ３＋  Ｔ細胞パーセンテージを、各組織から回収された細胞の絶対数と掛け合わせることにより算出した）。（Ｅ）カプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ  Ｍａｉｅｒ）生存曲線（移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の生存曲線）。（Ｆ）移植後１４日目におけるＩＦＮ−γの血清レベル。結果は、２つの独立した研究の代表的なものである（ｎ＝８〜１０のレシピエント／群）。平均＋ＳＥＭとして提示したデータ。マン・ホイットニー検定を使用して行った統計解析；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図４】図４は、Ｆａｓ−Ｌ処理、それに続く成熟細胞集団の低減は、インビトロおよびインビボの両方で移植片対白血病活性に影響しないことを示すグラフのセットである。（Ａ）Ｕ９３７（Ｂ）ＭＶ４−１１白血病細胞系に対するＭＰＢＣ対照またはＦａｓ−Ｌ処理ＭＰＢＣの細胞傷害活性アッセイ。２×１０４個のＣＦＳＥ標識化白血病細胞／ウェルを９６ウェルプレート中で培養し、拡大増殖したＴ細胞（抗ＣＤ３および組換えＩＬ２と共に１２日間培養）を上昇させた白血病：Ｔ細胞の比で加えた。生存ＣＦＳＥ白血病細胞をＦＡＣＳにより共培養の２４時間後に評価した。平均＋ＳＤ、ｎ＝３の複製物として提示したデータ。（Ｃ）ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマ−ヌル（ＮＳＧ）マウスを（−１）日目にγ照射（２００ｃＧｙ）し、１０×１０＾６個のＭＶ４−１１白血病細胞を０日目に静脈内（ＩＶ）ボーラス注射により投与した。４〜６時間後に、３×１０＾６個のＭＰＢＣまたはＦａｓＬ処理ＭＰＢＣをＩＶボーラス注射により投与した。動物を週に２回スコア付けした。ヒト造血細胞生着（ＣＤ４５＋ＣＤ１２３−）および白血病負荷（ＣＤ４５＋ＣＤ１２３＋）の評価を（Ｄ）脾臓、（Ｅ）骨髄および（Ｆ）血液においてフローサイトメトリーにより移植後３週目に評価した。平均±ＳＥＭ、ｎ＝７の雌ＮＳＧマウス／群として提示したデータ。２つの独立した実験のうちの１つの代表的な結果。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対ビヒクル処理群および＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、対ＭＰＢＣ対照群（マン・ホイットニー検定）。
【図５】図５は、インビトロおよびインビボの両方での抗原提示細胞（ＡＰＣ）−Ｂ細胞および骨髄細胞に対するＦａｓ−Ｌ処理の効果を示すグラフのセットである。（Ａ）ＭＰＢＣ対照細胞のＦａｓＲ（ＣＤ９５＋）発現のレベルをフローサイトメトリーを使用して測定した（ｎ＝３）。（Ｂ）アポトーシス細胞パーセンテージ（アネキシンＶ＋染色細胞、ｎ＝８）およびＨＬＡ−ＤＲｈｉ発現細胞のパーセンテージ（３連、ｎ＝１）を対照ＭＰＢＣと比較してＦａｓＬ処理ＭＰＢＣにおいて検出した。（Ｃ）ＣＤ１９＋細胞のうちのＨＬＡ−ＤＲ＋のパーセンテージおよびＤ）ＣＤ３３＋細胞のうちのＨＬＡ−ＤＲ＋のパーセンテージ。（Ｅ〜Ｌ）ＮＳＧマウスにＦａｓＬ処理ＭＰＢＣまたはＭＰＢＣ対照（５×１０６個の総有核細胞（ＴＮＣ）／マウス）を移植した（ｎ＝８〜１０／群）。各指し示した終了時点（３／７／１４日目）において、脾臓および骨髄を収集し、Ｂ細胞および骨髄細胞の絶対数を脾臓（Ｅ）および（Ｆ）、ならびに骨髄（Ｉ）および（Ｊ）において検出した。ＭＰＢＣ対照移植マウスと比較した、ＦａｓＬ処理ＭＰＢＣ移植マウスの脾臓（Ｇ）および（Ｈ）ならびに骨髄（Ｋ）および（Ｌ）におけるＨＬＡ−ＤＲｈｉ発現Ｂおよび骨髄細胞のパーセンテージ。平均＋ＳＥＭとして提示したデータ。スチューデントのｔ検定を使用して統計解析を行った：（Ｂ、対応のあるノンパラメトリック）；（Ｃ、Ｄ  対応のないパラメトリック）（Ｅ〜Ｌ、対応のないノンパラメトリック）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図６】図６は、Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＣ移植片におけるＢ細胞サブタイプの分布、それらのＦａｓＲの発現およびＦａｓ−Ｌによるアポトーシス誘導に対する応答を示すグラフのセットである。（Ａ）Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血試料において成熟ステージ（移行期／ナイーブ／メモリーおよび形質芽球）によるＢ細胞サブタイプ上のＦａｓＲ（ＣＤ９５＋）発現のレベルをフローサイトメトリーを使用して測定した。（Ｂ）Ｆａｓ−Ｌ処理ＭＰＢＣにおけるＢ細胞サブタイプの早期アポトーシスレベルをアネキシンＶ＋７ＡＡＤ−染色を使用してフローサイトメトリーにより評価し、対照ＭＰＢＣと比較した。（Ｃ）Ｆａｓ−Ｌ処理ＭＰＢＣおよび対照ＭＰＢＣの両方のＢ細胞サブタイプの免疫表現型プロファイリング。７ＡＡＤ＋（壊死／後期アポトーシス）細胞は解析から除外した。３連の平均＋ＳＤとして提示したデータ。対応のないパラメトリックｔ検定を使用して統計解析を行った；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】図７は、異なる処理後の漸増用量のＦａｓＬを用いて処理された末梢血単核細胞を示すグラフのセットである。ＦａｓＬとの２ｈのインキュベーション  −  単核（ｍｏｎｕｎｕｃｌｅａｒ）細胞を異なる濃度のＦａｓＬと２時間インキュベートした。ＦａｓＬとの２ｈのインキュベーション＋４８ｈの活性化−単核細胞を異なる濃度のＦａｓＬと２時間インキュベートし、次に抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化させた。４８ｈの活性化＋ＦａｓＬとの２ｈのインキュベーション−単核細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いて４８時間活性化させ、次にＦａｓＬと２ｈインキュベートした。（Ａ）異なる処理後の生存ＣＤ３＋細胞、（Ｂ）異なる処理後のＣＤ２５＋を発現する活性化ＣＤ３＋細胞（％ＣＤ３＋／ＣＤ２５＋）、（Ｃ）ＣＤ３＋細胞の早期アポトーシス（％ＣＤ３＋／アネキシンＶ＋）。
【図８】図８は、全ＣＤ３＋細胞集団のうちの生存ＧＦＰ＋細胞のパーセントにより測定された場合の形質導入効率および形質導入Ｔ細胞の生存に対するＦａｓ−Ｌの効果を示すグラフである。３つの異なる細胞群：活性化前にＦａｓ−Ｌを与えられたもの、活性化後にＦａｓ−Ｌを与えられたものおよび形質導入後にＦａｓ−Ｌを与えられたものにおいて、５０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの２つの濃度のＦａｓ−Ｌを調べ、Ｆａｓ−Ｌ無し（０ｎｇ／ｍｌ）と比較した。標準ＣＡＲ−Ｔは、ＣＡＲ−Ｔ細胞生産の標準的な手順の通りに処理された細胞である。
【図９】図９は、それらの抗原ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への曝露により刺激されたＥｒｂＢ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）およびＧＦＰ＋発現により測定された場合の形質導入効率を示すグラフである。１−活性化前の０ｎｇ／ｍｌのＦａｓ−Ｌ；２−活性化前の５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓ−Ｌ；３−活性化前の１００ｎｇ／ｍｌのＦａｓ−Ｌ；４−活性化後の０ｎｇ／ｍｌのＦａｓ−Ｌ；５−活性化後の５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓ−Ｌ；６−活性化後の１００ｎｇ／ｍｌのＦａｓ−Ｌ；７−形質導入後の０ｎｇ／ｍｌのＦａｓ−Ｌ；８−標準ＣＡＲ−Ｔ；ＵＴ−対照非処理細胞。
【図１０】図１０は、全ＣＤ３＋細胞集団のうちの生存ＧＦＰ＋細胞の％により測定された場合のＣＡＲ−Ｔ細胞の数（Ａ）および細胞集団のうちの生存ＧＦＰ＋ＣＤ２５＋細胞の％により測定された場合のそれらの活性化状態（Ｂ）に対する、１、１０、および５０ｎｇ／ｍｌの濃度での形質導入後のＦａｓ−Ｌ処理の効果を示すグラフのセットである。グラフは、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞における結果を比較している。
【図１１】図１１は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞サブタイプナイーブ、セントラルメモリー（ＣＭ）、エフェクターメモリー（ＥＭ）およびエフェクター（ｅｆｆ）細胞に対する形質導入後に加えられた漸増濃度のＦａｓ−Ｌ（０、１、１０、５０ｎｇ／ｍｌ）の効果を示すグラフのセットである。（Ａ）生存ＣＤ８＋形質導入細胞（ＧＦＰ＋  ＣＤ８＋）サブタイプの組成；（Ｂ）生存ＣＤ８＋  ＴＣ１細胞；（Ｃ）生存ＣＤ４＋形質導入細胞（ＧＦＰ＋  ＣＤ４＋）サブタイプの組成。（Ｄ）生存ＣＤ４＋  ＴＨサブタイプＴＨ１およびＴＨ１７。全ての細胞は、Ｆａｓ−Ｌ処理およびＩＬ−２を用いた４日の回復後に、ＣＡＲ−Ｔ製造プロセスの終わりに解析した。２連の平均＋ＳＤとして結果を提示している。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明は、免疫細胞、例えば、ヒトドナーのＧ−ＣＳＦ動員末梢血試料から得られた細胞の不均質な集団の、アポトーシス誘導性リガンドＦａｓ−Ｌへの曝露は、試料中に存在する細胞の組成および活性化状態におけるシフトを引き起こすという驚くべき発見に基づく。特に、処理により影響される細胞は、いずれも可変レベルのＦａｓ（ＣＤ９５）受容体を発現する、成熟したアポトーシス感受性のＴ細胞サブタイプ、Ｂ細胞および骨髄細胞である。
【００５５】
アポトーシスは、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＦａｓＬ（ＦａｓＬおよびＦａｓ−Ｌという用語は本明細書において交換可能に使用される）、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫを含む）の特有の受容体により媒介され得るプログラム細胞死である。これらの受容体は様々な細胞集団上、大抵は成熟した活性化細胞上に発現され、それらにおけるこれらの特有の受容体の発現は、制御された細胞死と相関し、それらをアポトーシス感受性細胞とするが、ナイーブ細胞は非感受性である。他の細胞種は、細胞内機構に起因して、デスリガンド受容体発現にもかかわらず、デスリガンド誘導性のアポトーシスに対して抵抗性であり得る（Ｋｉｍら、２００２）。誘導性の細胞死に対する差次的な感受性は、選択ツールとして使用され得る。
【００５６】
成熟ＴおよびＢ細胞はＦａｓ受容体を発現し、Ｆａｓリガンドのアポトーシス効果に対して感受性である（ＳｐｒｅｎｔおよびＴｏｕｇｈ、２００１；Ｓｔｒａｓｓｅｒら、２００９）。本発明において提唱されるように、Ｆａｓ−Ｌ処理は、健常ドナーの血液中に定常状態でより低いレベルにおいて見出される他に、自己免疫患者または炎症性疾患を有する患者の血液中に高いレベルにおいて見出されるこれらのアポトーシス感受性の反応性細胞を排除するためにこのＦａｓ−Ｆａｓリガンド機構を使用し、それにより、急性の、望ましくない、炎症促進性反応を低減し得る。
【００５７】
Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血細胞中のＴ細胞の中で、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）（すなわち、ＣＤ４＋細胞）は細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）（すなわち、ＣＤ８＋）よりも高いレベルのＦａｓ受容体（ＦａｓＲ）を発現すること、ならびにＴＨおよびＴＣ細胞の両方の成熟サブタイプ（メモリーおよびエフェクターＴ細胞、およびＴＨ１／ＴＣ１およびＴＨ１７細胞を含む）の他に、Ｔ幹細胞メモリー（ＴＳＣＭ）細胞は、ナイーブＴ細胞と比較した場合に大規模なレベルのＦａｓＲを発現することを本発明の発明者らは実証する。
【００５８】
さらには、アポトーシス誘導因子（例えば、ＦａｓＬ）とインキュベートされたＧ−ＣＳＦ動員末梢血細胞中で、ＣＤ４＋ＴＨ細胞およびＣＤ８＋ＴＣ細胞の両方の有意な低減が起こったことを本発明者らは示す。さらには、ＦａｓＬは、ＴＨおよびＴＣ細胞の両方の特有のサブタイプ、すなわち、ヘルパーおよび細胞傷害性ＴＳＣＭ集団を選択的に枯渇させた。
【００５９】
ナイーブＴ細胞由来のＴＳＣＭ細胞は、ナイーブＴ細胞の特有のサブタイプである。ＴＳＣＭは、活性化されると、Ｔ細胞の再構成および炎症促進性応答において重大な役割を果たすメモリーおよびエフェクターＴ細胞にさらに分化することを現行の研究は指し示している（Ｚｈａｎｇら、２００５、およびＲｏｂｅｒｔｏら、２０１５）。ＴＳＣＭサブタイプは、高いレベルのＦａｓＲを発現し、それにより、大抵はＦａｓ−Ｌ処理に対して感受性であるナイーブ集団の画分であることが本発明者らにより示された。
【００６０】
Ｔ細胞に加えて、Ｂ細胞および骨髄細胞などの他の免疫細胞もまた、ＦａｓＬ処理により影響される。
【００６１】
よって、本発明は、免疫細胞集団などの混合細胞集団を、より低分化の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞）を含むように改変する方法であって、免疫細胞集団をアポトーシス誘導性リガンドに曝露することによる、方法を提供する。そのような改変された免疫細胞集団は、移植片からのアポトーシス感受性細胞の排除が、アポトーシス感受性細胞、例えば、ＴまたはＢまたは骨髄細胞の炎症促進性反応を低減することにより移植の有用性を増加させ得る免疫細胞移植を含む任意の方法において使用することができる。
【００６２】
したがって、その第１の態様では、本発明は、非活性／非成熟細胞が富化された細胞の集団を製造する方法であって、
ａ．哺乳動物細胞の不均質な集団を含む生物学的試料を得ること、および
ｂ．得られた哺乳動物細胞の不均質な集団を容器中でアポトーシス誘導性リガンドと接触させることであって、前記接触させることが、非活性／成熟細胞がアポトーシスシグナルに対して抵抗性であるままとしながら、活性／成熟細胞のアポトーシスを誘導し、それにより、非活性／非成熟細胞が富化された細胞の集団が単離される、前記接触させること
を含む、方法を提供する。
【００６３】
一実施形態では、哺乳動物細胞の前記不均質な集団は、免疫細胞の集団である。前記不均質な集団は、アポトーシス感受性Ｔ細胞および／またはアポトーシス感受性Ｂ細胞を含む、アポトーシス抵抗性およびアポトーシス感受性免疫細胞を含む。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「アポトーシス感受性Ｔ細胞」という用語はＣＤ９５＋Ｔ細胞サブタイプを包含し、これには、ＴＨ１／ＴＣ１、ＴＨ１７、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ、ＴＥＭ、およびＴｅｆｆが含まれるがそれに限定されない。ある特定の実施形態では、これらのＴ細胞サブタイプは、以下のようにある特定のマーカーの発現プロファイルにより定義される：
ＴＳＣＭ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＬＦＡ１ｈｉｇｈ）、
ＴＣＭ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ−  ＣＤ９５＋ＬＦＡ１ｈｉｇｈ）、
ＴＥＭ（ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−  ＣＤ９５＋ＬＦＡ１ｈｉｇｈ），
Ｔｅｆｆ（ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ９５＋ＬＦＡ１ｈｉｇｈ）、
ＴＨ１／ＴＣ１（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＸＣＲ３＋）、
ＴＨ１７（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３−）。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「ナイーブＴ細胞」という用語は、ＣＤ９５−である細胞を包含する。一実施形態では、ナイーブＴ細胞は、以下の発現プロファイルにより定義される：ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−ＬＦＡ１ｌｏｗ。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「アポトーシス感受性Ｂ細胞」という用語は、ＣＤ９５＋Ｂ細胞サブタイプを包含し、これには、形質芽球（Ｐｌａｓｍａ  ｂｌａｓｔ）、メモリー細胞、移行期またはナイーブＢ細胞が含まれるがそれに限定されない。ある特定の実施形態では、これらのＢ細胞サブタイプは、以下のようにある特定のマーカーの発現プロファイルにより定義される：
Ｂ移行期（ＣＤ２７−ＣＤ３８＋）
Ｂナイーブ（ＣＤ２７−ＣＤ３８−）
Ｂメモリー細胞（ＣＤ２７＋ＣＤ３８−）
Ｂ形質芽球（ＣＤ２７＋ＣＤ３８＋）
【００６７】
一実施形態では、前記容器は生体適合性材料から作られている。一実施形態では、前記アポトーシス誘導性リガンドは、容器の内側表面に固定化されている。
【００６８】
別の実施形態によれば、前記アポトーシス誘導性リガンドは、容器内に存在するビーズの表面に固定化されている。
【００６９】
別の実施形態によれば、容器は、バッグ、カラム、チューブ、ボトル、バイアルおよびフラスコからなる群から選択される。
【００７０】
一実施形態では、アポトーシス誘導性リガンドは、ＴＮＦ−α、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＴＲＡＩＬおよびＴＷＥＡＫからなる群から選択される。
【００７１】
特有の実施形態では、アポトーシス誘導性リガンドはＦａｓ−Ｌである。
【００７２】
養子細胞療法の既存の技術は、改変、活性化または操作された自己細胞を使用する。自己ベースの療法の制限の１つは、各個々の患者のために腫瘍特異的リンパ球を生成する必要があることであり、これは技術的および経済的に課題となっている。しかしながら、同種養子導入は移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の危険に直面する。ＧｖＨＤ惹起性細胞を低減するための、投与される活性化Ｔ細胞の予備選択は、オフ腫瘍損傷のリスクが無い、腫瘍特異的な治療を結果としてもたらし得る。
【００７３】
したがって、一実施形態では、本発明の方法は、高いレベルのサイトカイン放出のリスクを低減しながら、組換えＢ細胞抗原受容体を発現する自己細胞集団の調製、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞移植において用いることができる。
【００７４】
別の実施形態では、本発明の方法は、高いレベルのサイトカイン放出のリスクを低減し、かつ追加的にＧｖＨＤのリスクを軽減しながら、組換えＢ細胞抗原受容体を発現する同種細胞集団の調製、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞移植において用いることができる。
【００７５】
別の実施形態では  本発明の方法は、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫糖尿病、１型および２型糖尿病、ＳＬＥ（全身性ループスエリテマトーデス）、重症筋無力症（Ｍｙｅｓｔｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）、進行性全身性硬化症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、原発性胆汁性胆管炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症、痛風性関節炎、関節炎状態、炎症性関節、湿疹、炎症性皮膚状態、炎症性眼状態、結膜炎、発熱、炎症の結果としてもたらされる組織壊死、アトピー性皮膚炎、Ｂ型肝炎抗原陰性慢性活動性肝炎、気道炎症、喘息ならびに気管支炎が挙げられるがそれに限定されない、Ｔ細胞媒介性自己免疫および炎症性疾患などにおいて、自己反応性を有する炎症惹起性細胞を低減するために用いることができる。
【００７６】
一実施形態では、本発明の方法は、自己免疫性多発性硬化症（ＭＳ）において自己免疫反応を上昇させることが公知（Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎら、２０１８）である炎症促進性ＴＨ１およびＴＨ１７集団を低減することにより免疫学的活性を減少させるために用いることができる。すなわち、本発明の一実施形態によれば、ＭＳ患者の末梢単核細胞は一時的に除去され、アポトーシス誘導性リガンド（例えば、ＦａｓＬ）を用いて処理されて自己免疫負荷の低下が結果としてもたらされ、自己反応性クローンが除去されたものが患者に再移植される。
【００７７】
別の実施形態では、本発明の方法は、ループスエリテマトーデス（Ｎａｓｈｉら、２０１０）、多発性硬化症（Ｂａｋｅｒら、２０１７）などであるがそれに限定されない自己免疫疾患において、自己抗体産生性Ｂ細胞またはＢ細胞抗原提示を低減するために用いることができる。
【００７８】
一実施形態では、本発明の方法は、選択された集団の投与に起因するアウトカムの向上において、再生医療において複能性間質／間葉幹細胞、神経前駆細胞および内皮前駆細胞などの前駆細胞を使用するために用いることができる。
【００７９】
別の実施形態では、本発明の方法は、造血幹細胞移植の方法としての二重臍帯血の使用の促進、すなわち、ＧｖＨＤおよび１つの臍帯単位（ｃｏｒｄ  ｕｎｉｔ）の細胞の他の臍帯単位の細胞への相互攻撃の低下において用いることができる。
【００８０】
別の実施形態では、ドナー細胞の不均質な集団（例えば、健常な、同意している幹細胞ドナーのアフェレーシスから得られるＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）動員末梢血細胞）が得られる。細胞は、アポトーシス誘導性リガンド（例えば、Ｆａｓリガンド）とインキュベートされる。ＦａｓＬは、例えば、１つまたはより多くの洗浄ステップにより、細胞培養物から除去される。一実施形態では、さらなる単離ステップは行われない。
【００８１】
ある特定の実施形態では、アポトーシス誘導性リガンド（例えば、ＦａｓＬ）とのインキュベーションは、その表面にＦａｓＬが取り付けられたデバイス中で行われてもよい。
【００８２】
本発明は、アポトーシス感受性細胞の特有のサブタイプが枯渇した細胞集団を製造する方法を開示する。方法は、不均質な細胞集団からの、生着、抗腫瘍活性などの所望の活性をサポートする免疫細胞、組織再生をサポートする細胞の陽性選択、および、生命を脅かすレベルのサイトカインの放出などの有害な効果を有する細胞、自己抗原を標的とする細胞、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こす鍵となるプレーヤーである細胞、炎症惹起性プロファイルまたは他の効果を有する細胞の陰性選択を同時に可能にする。
【００８３】
免疫細胞集団は、アポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞およびアポトーシスシグナル伝達感受性細胞を含む。方法は、不均質な細胞集団を含む試料を提供すること、該細胞をアポトーシス誘導性リガンドとインキュベートし、それにより、試料からより高いアポトーシス感受性の細胞（例えば、成熟エフェクター細胞）を排除し、かつアポトーシスシグナル伝達抵抗性細胞（例えば、ナイーブＴもしくはＢもしくは骨髄もしくはＣＤ３４細胞または他の前駆体）を含む集団を富化することを含む。
【００８４】
より低い毒性およびＧｖＨＤまたは他の毒性の活性を有する、遺伝子改変Ｔ細胞、例えば、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞、または一部の他の活性化Ｔ細胞などの、細胞の集団を調製する方法が記載される。方法は、例えば、治療用細胞調製の様々なステップの間に、例えば、組換え抗原受容体を発現するＴ細胞集団の培養および拡大増殖の前または後に、細胞をアポトーシス誘導性リガンドと接触させることを伴う。
【００８５】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的細胞の細胞表面上に存在する標的分子、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に特異的に結合できる組換え生体分子である。ＣＡＲ分子の非限定的な例としては、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体または遺伝子操作型受容体が挙げられる。これらの受容体は、所望の細胞、例えば、Ｔ細胞へのモノクローナル抗体またはその結合性部分の特異性を賦与するために使用することができる。ＣＡＲは、ＭＨＣ拘束とは独立して、抗原に結合し、Ｔ細胞活性化を伝達することができる。そのため、ＣＡＲは、ＨＬＡ遺伝子型にかかわらず抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を治療できる「普遍的」な免疫受容体である。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を使用する養子免疫療法は、がんの治療のための強力な治療戦略であり得る。
【００８６】
ＣＡＲコーディング配列は、当該技術分野において公知の任意の手段により製造することができるが、好ましくは、組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当該技術分野において公知の分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助ライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）により調製し、完全なコーディング配列にアセンブルさせることができる。結果としてもたらされるコーディング領域は、好ましくは、発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞、好ましくはＴリンパ球を形質転換するために使用される。ウイルスまたは非ウイルストランスフェクションベクターを使用して遺伝子を宿主ゲノムに挿入するためのいくつかの利用可能な技術がある。例えば、核酸は、遺伝子改変細胞を製造するために、細胞の核エンベロープを通じて直接的に核内に注入されてもよく、またはウイルスベクターを使用して細胞に投与されてもよい。
【００８７】
ウイルスベクターを用いるトランスフェクションは、Ｔ細胞などの遺伝子改変細胞を製造するための一般的な技術である。この技術は、ウイルス形質導入として公知である。核酸は、当該技術分野において周知の方法を使用して、担体としてレンチウイルスもしくはアデノウイルスなどのウイルス、またはプラスミドを使用して細胞に導入される。
【００８８】
末梢血単核細胞の他に、富化されたＴ細胞集団（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞）は、様々な方法により単離し、ＣＡＲ発現用のベクターを用いて形質導入し、本明細書に記載の方法により培養することができる。
【００８９】
本明細書において使用される場合、「ＣＡＲ−Ｔ」または「ＣＡＲ−Ｔ細胞」という用語は、ＣＡＲ構築物を形質導入されたＴ細胞を指す。
【００９０】
本明細書において使用される場合、「ＣＡＲ構築物」という用語は、所望のＣＡＲをコードする遺伝子を含み、任意選択的に前記遺伝子の発現のために要求される追加の核酸配列をさらに含み、かつ任意選択的にＣＡＲ機能を増進するためのアクセサリー分子をコードする追加の成分をさらに含む、ベクターを指す。
【００９１】
本明細書において使用される場合、「単核細胞」という用語は、丸い核を有する任意の血液細胞を指す。これらの細胞は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）および単球からなる。「末梢血単核細胞」という用語は、末梢血中に見出される単核細胞を指す。
【００９２】
ＰＢＭＣは、当該技術分野において周知の方法を使用して、例えば、フィコール、血液の層を分離する親水性多糖、ならびに血液を血小板を含む血漿の上層、続いて単核細胞の層および多形核細胞（例えば、好中球および好酸球）および赤血球の底画分に分離する勾配遠心分離を使用して、全血から単離することができる。
【００９３】
例えば、Ｔ細胞は、勾配分離、エルトリエーションまたはアフィニティー精製により末梢血から単離することができる。細胞はアポトーシス誘導性リガンドとインキュベートされ、それにより、細胞集団はより未熟な状態にシフトする。次に、例えば、ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９またはＨＥＲ２特異的ＣＡＲ）の発現を指令するＳＩＮレンチウイルスベクターを用いて、細胞への形質導入を行うことができる。遺伝子改変Ｔ細胞をインビトロで拡大増殖させ、次に凍結保存することができ、または即時の使用のために新鮮なまま提供することができる。代替的に、例えば、ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９またはＨＥＲ２特異的ＣＡＲ）の発現を指令するＳＩＮレンチウイルスベクターを用いて、Ｔ細胞への形質導入を行うことができ、次に細胞はアポトーシス誘導性リガンドとインキュベートされ、それにより、細胞集団はより未熟な状態にシフトする。選択された遺伝子改変Ｔ細胞をインビトロで拡大増殖させ、次に凍結保存することができ、または即時の使用のために新鮮なまま提供することができる。
【００９４】
以下の実施例において実証されるように、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を用いる活性化前のＦａｓＬへの末梢血単核細胞の曝露は、ＣＡＲ発現細胞の数によりおよび標的抗原への曝露でこれらの細胞により分泌されるＩＦＮγのレベルにより測定された場合に、効率的に形質導入されてＣＡＲ−Ｔ細胞となる可能性がより高い細胞の選択を結果としてもたらした。
【００９５】
したがって、ＣＡＲ−Ｔ製造の手順の間（および特に細胞の活性化ステップの前）のＦａｓＬへの曝露のステップは、以下に限定されないが特に、形質導入効率が例えば以前の化学療法治療に起因して損なわれている自己ＣＡＲ−Ｔ移植の状況において、向上した形質導入を結果としてもたらし得る。
【００９６】
追加的に、以下の実施例において実証されるように、形質導入後のＦａｓＬ処理は、潜在的な炎症促進性ＣＡＲ  Ｔ細胞およびそれらの活性化状態を減少させ得る。したがって、形質導入ステップ後のＦａｓＬへの曝露のステップは、同種ＣＡＲ−Ｔ移植の状況においてサイトカイン放出ストームの低減、またはＧｖＨＤ発症の軽減を結果としてもたらし得る。
【００９７】
したがって、その別の一態様では、本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を製造する方法であって、
ａ．生物学的試料から単核細胞を単離すること、
ｂ．前記細胞をＴ細胞活性化剤（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体）と接触させることにより前記細胞を活性化させること、
ｃ．前記細胞にＣＡＲ構築物を形質導入すること
を含み、
前記方法が、前記活性化ステップ（ｂ）の前および／または前記形質導入ステップ（ｃ）の後に前記細胞をアポトーシス誘導性リガンドと接触させ、それにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞を得ることをさらに含む、
方法を提供する。
【００９８】
ある特定の実施形態では、前記方法は、向上した形質導入効率の取得を結果としてもたらす。ある特定の実施形態では、前記方法は、同種ＣＡＲ−Ｔ移植の状況において、サイトカイン放出ストームの低減、または患者におけるＧｖＨＤの低減を結果としてもたらす。
【００９９】
一実施形態では、前記単離される単核細胞は末梢血単核細胞である。一部の実施形態では、前記単核細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞が富化されている。
【０１００】
一実施形態では、前記活性化ステップ（ｂ）は約１〜３日の期間行われる。１つの特有の実施形態では、前記活性化ステップは約４８時間（２日）行われる。
【０１０１】
「形質導入」または「形質導入する」という用語は、本明細書において使用される場合、ＣＡＲ転写物の細胞への組込みを結果としてもたらす、ベクターによってＣＡＲ構築物をＴ細胞に移入する方法を指す。一般的な技術は、ウイルスによる感染、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、トランスポゾン／トランスポザーゼシステム（例えば、Ｈａｃｋｅｔｔら（２０１０）を参照）、および細胞透過性を増加させるための化学試薬、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用する。遺伝子療法のために一般的に使用されるウイルスは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスまたはレンチウイルスである。
【０１０２】
本明細書の開示における用語は、本明細書に照らして読まれた場合に、そのままの通常の意味を与えられるべきである。当業者は、本明細書全体を考慮して使用された用語を理解する。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つより多くを意味し得る。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、値が、本来備わっている誤差の変動、例えば、１０％の変動を含むことを指し示す。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：ＦａｓＬ処理は異なるＴ細胞サブタイプに対して差次的な効果を有する
この実験は、健常な、同意している幹細胞ドナーのアフェレーシスから得られたＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）動員末梢血細胞（ＭＰＢＣ）の試料を用いて行った。白血球アフェレーシスの前に４〜５日の期間にわたりドナーにＧ−ＣＳＦ（１０〜１２μｇ／ｋｇ／日）を与えた。細胞をＥＤＴＡを含有する緩衝液を用いる２回の洗浄ステップに付し、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の組換えヒトＦａｓリガンド（Ｍｅｇａ  ＦａｓＬ、Ａｄｉｐｏｇｅｎ）を含むＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）中１００±２０×１０６細胞／ｍｌの濃度で５％のＣＯ２の加湿インキュベーター中３７℃で２時間インキュベートした。ＦａｓＬとのインキュベーション後、細胞を２回の追加の洗浄ステップに供して未結合のＦａｓＬを除去した。さらなる単離ステップは行わなかった。対照非処理試料は、同じドナーからの元々の非処理のＭＰＢＣからなるものであった。
【０１０６】
以下の抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）：ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＬＦＡ１、ＣＤ９５、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ６を使用してフローサイトメトリーによりＴ細胞サブタイプの免疫表現型解析を行った。フローサイトメーター（ＭＡＣＳｑｕａｎｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して試料からのデータを獲得した（図１）。受容体発現にしたがって以下の集団を決定した：Ｔヘルパー（ＴＨ、ＣＤ４＋）、Ｔ細胞傷害性（ＴＣ、ＣＤ８＋）、それらのサブタイプ：ナイーブＴ細胞（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−ＬＦＡ１ｌｏｗ）、ＴＳＣＭ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＬＦＡ１ｈｉｇｈ）、ＴＣＭ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ−）、ＴＥＭ（ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−）、Ｔｅｆｆ（ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ＋）、ＴＨ１／ＴＣ１（ＣＸＣＲ３＋）、ＴＨ１７（ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３−）。これらのＴ細胞サブタイプの表面上のＦａｓＲ（ＣＤ９５）の発現レベルを解析した。
【０１０７】
図１に記載のＦａｓＲ（ＣＤ９５）発現プロファイルは、ヘルパーＴ（ＴＨ）細胞（ＣＤ４＋）は細胞傷害性Ｔ（ＴＣ）細胞（ＣＤ８＋）よりも高いレベルを発現すること、ならびにＴＨおよびＴＣ細胞の両方の成熟サブタイプ（メモリーおよびエフェクターＴ細胞、およびＴＨ１／ＴＣ１およびＴＨ１７細胞を含む）の他に、ＴＳＣＭ細胞は、ナイーブＴ細胞と比較した場合に大規模なレベルのＦａｓＲを発現することを明らかにする。
【０１０８】
実施例２：Ｔ細胞サブタイプの集団パーセンテージおよびアポトーシス  
収集の２４時間以内に健常ドナーのアフェレーシスから得られたＧ−ＣＳＦ  ＭＰＢＣの試料を閉じた注入バッグシステム中でＦａｓリガンド有りまたは無しでインキュベートした。簡潔に述べれば、細胞を計数し、ＥＤＴＡを含有する緩衝液を用いて２回洗浄し、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のアポトーシスメディエーターＦａｓリガンド（ＭｅｇａＦａｓＬ、Ａｄｉｐｏｇｅｎ）の存在下でＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）中１００±２０×１０６細胞／ｍｌの濃度で５％のＣＯ２の加湿インキュベーター中３７℃で２時間インキュベートし、次に２回洗浄して未結合のＦａｓＬを除去した。製造者のプロトコールにしたがって磁気ヒトＴ細胞単離ビーズ（ＥａｓｙＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ、１７９５１）を使用して、Ｆａｓリガンドまたは対照ＭＰＢＣとのインキュベーション後のＭＰＢＣからＴ細胞を単離した。以下のＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ａｂ：ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＬＦＡ１、ＣＤ９５、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ６を使用してフローサイトメトリーにより、単離されたＴ細胞サブタイプの免疫表現型解析を行った。フローサイトメーター（ＭＡＣＳｑｕａｎｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して試料からのデータを獲得した。受容体発現にしたがって以下の集団を決定した：Ｔヘルパー（ＴＨ、ＣＤ４＋）、Ｔ細胞傷害性（ＴＣ、ＣＤ８＋）、ナイーブＴ細胞（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−ＬＦＡ１ｌｏｗ）、ＴＳＣＭ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋ＬＦＡ１ｈｉｇｈ）、ＴＣＭ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ−）、ＴＥＭ（ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−）およびＴｅｆｆ（ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ＋）、ＴＨ１／ＴＣ１（ＣＸＣＲ３＋）、ＴＨ１７（ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ３−）。追加的に、アネキシンＶ染色（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＢＭＳ５００ＦＩ）および７ＡＡＤ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ００−６９９３）染色を使用してＴ細胞サブタイプのアポトーシスおよび壊死レベルを評価し、アネキシンＶ＋７ＡＡＤ−細胞を早期アポトーシスとして定義し、７ＡＡＤ＋細胞の全てを後期アポトーシス／壊死細胞と考え、生存細胞の解析からゲートアウトした。
【０１０９】
ＦａｓＬ処理は、ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞サブセットの両方を選択的に枯渇させた。図２Ａ〜２Ｇに見ることができるように、ヘルパーおよび細胞傷害性ＴＳＣＭおよびＴＥＭ細胞のパーセンテージは、ＦａｓＬとのインキュベーションで減少した。追加的に、ＴＨ１７およびＴＨ１およびＴＣ１細胞のパーセンテージは、ＦａｓＬとのインキュベーションの結果として有意に減少し、ＦａｓＬ処理は、ＴＨ１、ＴＣ１およびＴＨ１７集団においてアポトーシスを優先的に誘導したが（それぞれ４５％、４８％および９２％、Ｐ＜０．０００１）、ナイーブＴＨおよびＴｃ細胞はより影響されなかった。
【０１１０】
図２Ａ〜２Ｇに示され、以下においてさらに詳しく述べられるように、アポトーシス誘導因子（ＦａｓＬ）とインキュベートされたＭＰＢＣは、ＣＤ４＋ＴＨ細胞（１０．７％、Ｐ＜０．００１）およびＣＤ８＋ＴＣ細胞（１４．０％、Ｐ＜０．０５）の両方の有意な低減を示した。さらには、ＦａｓＬは、ＴＨおよびＴＣ細胞の両方の特有のサブタイプを選択的に枯渇させた。本明細書において提供される結果は、ヘルパー（２３．２％  Ｐ＜０．０１）および細胞傷害性（４１．８％、Ｐ＜０．０１）ＴＳＣＭ集団の統計的に有意な低減をさらに実証する。
【０１１１】
アポトーシス誘導性リガンドＦａｓ−Ｌへの曝露は、Ｔヘルパー（ＴＨ）細胞を選択的に枯渇させ、メモリーＴＨ細胞サブセットは低減するが、ナイーブＴＨでは、細胞の小さい比率のみがＦａｓＲを発現し（すなわち、ＴＳＣＭサブセット）、この特有のサブセットはアポトーシス負荷に影響されることを結果は指し示す。さらに、Ｆａｓ−Ｌへの曝露は、炎症促進性ＴＨ１、ＴＣ１およびＴＨ１７集団においてアポトーシスを優先的に誘導するようである（図２Ｈ〜２Ｎ）。
【０１１２】
理論により縛られることを望まないが、アポトーシス誘導性リガンドＦａｓ−Ｌとのインキュベーションは、アポトーシス感受性の成熟したヘルパーＴ細胞の排除を結果としてもたらし、より低分化状態の亜集団を残すことをそのような結果は指し示す。
【０１１３】
追加的に、ＦａｓＬを用いる前処理もまた、エフェクターメモリーＴヘルパー（ＴＨＥＭ）サブタイプの他に、エフェクターメモリーＴ細胞傷害性（ＴＣＥＭ）およびエフェクター（ＴＣｅｆｆ）サブタイプ（それぞれ、２６．０％、Ｐ＜０．０００１、１６．４％、Ｐ＜０．０１；１３．６％、Ｐ＜０．０１）を有意に低減したが、ナイーブＴＣサブタイプでは効果は無く、ナイーブＴＨ細胞ではわずかな低減のみが示された（６．０％、Ｐ＜０．０１）。さらには、炎症促進性成熟Ｔ細胞、ＴＨ１、ＴＣ１およびＴＨ１７のレベルは、ＭＰＢＣ対照と比較した場合に大きく低減した（それぞれ、５５．１％、４７．９％および９１．８％；Ｐ＜０．０００１）。Ｔ細胞の各サブタイプの生存集団パーセンテージにおける低減に加えて、早期アポトーシスレベルがＦａｓＬ処理後に増加することが示された。図２Ｈ〜２Ｎは、ＣＤ４ヘルパーＴ（ＴＨ）早期アポトーシスレベルの１．９３倍の増加（Ｐ＜０．０５）の他に、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）の２．４８倍の増加（Ｐ＝０．０８）を提示する。追加的に、早期アポトーシスレベルは、ＭＰＢＣと比較した場合にＴＨおよびＴＣの両方のそれぞれＴＳＣＭ（２．００倍、Ｐ＜０．０１；２．４２倍、Ｐ＜０．０１）、ＣＭ（１．８７倍、Ｐ＜０．０１；３．７８倍、Ｐ＜０．００１）、およびＥＭ（２．８９倍、Ｐ＜０．０１；６．０９倍、Ｐ＜０．０１）サブタイプにおいて有意に上昇しているが、ナイーブＴ細胞の早期アポトーシスレベルにおいて変化は無かった。さらには、炎症促進性成熟Ｔ細胞、ＴＨ１、ＴＣ１およびＴＨ１７の早期アポトーシスレベルは、ＭＰＢＣ対照と比較した場合に有意に上昇した（それぞれ、３．６倍、Ｐ＜０．０１；３．４倍、Ｐ＜０．０５；および１１．４倍、Ｐ＜０．０１）。図２Ｏ〜２Ｑにおいて、ＣＤ２５活性化マーカーを発現するヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞のパーセンテージは有意に低減している。ＣＤ２５受容体は、Ｔ細胞活性化の間に上方調節されることが公知である。追加的に、全ＣＤ２５＋  Ｔヘルパー細胞中の、抗炎症反応の原因となる制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の割合は、有意な上昇を示した。
【０１１４】
全体として、現在使用されている完全なＴ細胞枯渇方法とは異なり、ＦａｓＬを用いる前処理は、特有の亜集団を選択的に枯渇させ、活性化を低減することをこれらのデータは示唆する。したがって、理論により縛られることを望まないが、ＦａｓＬなどのアポトーシス誘導性リガンドを用いる処理は、アポトーシス感受性の成熟Ｔ細胞の排除を結果としてもたらして、より低分化状態、より低い活性化のままとし、抗炎症性のＴ細胞亜集団を維持するようである。
【０１１５】
実施例３：インビトロ活性化に応答したＦａｓ−Ｌ前処理Ｔ細胞サブタイプの活性化の低減
次に、細胞活性化のマーカーであるＣＤ２５受容体の発現レベルを活性化Ｔ細胞サブタイプにおいて評価した。Ｔ細胞をＦａｓＬ前処理ＭＰＢＣ、およびＭＰＢＣ対照から単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズと１または２日インキュベートした。図３Ａ〜３Ｂに見られるように、上記の結果と合致して、活性化の１および２日後に、対照Ｔ細胞と比較した場合に、ＣＤ２５ｈｉｇｈ発現ＦａｓＬ前処理ＣＤ４＋細胞（それぞれ、３９．７％および２４．３％；Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．００１）ならびにＣＤ８＋細胞（それぞれ、５３．３％および３３．９％；Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．００１）の有意な低減があった。さらには、図３Ｃに示される炎症促進性サイトカインＩＦＮγ分泌は、インキュベーション後１および２日目に有意により低く（それぞれ、５６．１％  Ｐ＜０．０５、および５２．１％、Ｐ＜０．００１）、ＭＰＢＣ対照Ｔ細胞と比較した場合のＦａｓＬ前処理Ｔ細胞のより活性化されていない状態を指し示した。図３Ｄ〜３Ｆの結果は、ＧｖＨＤマウスモデルにおける炎症の低減を提示する。γ照射ＩＬ２Ｒγ−ヌル（ＮＳＧ）マウスにＦａｓ−Ｌ処理または対照ＭＰＢＣを移植した。移植後３、７および１４日目に、ＦａｓＬ処理ＭＰＢＣを移植されたマウスから回収された脾臓においてＣＤ３＋  Ｔリンパ球の絶対的な細胞数の低減があった（図３Ｄ）。ＧｖＨＤの進行はＭＰＢＣ移植群において致死性であり、移植後２８日目を越えて生存するマウスはいなかった。対照的に、ＦａｓＬ処理ＭＰＢＣの移植は、マウスの生存を有意に長期化させ（Ｐ＜０．０００１）、６０日のフォローアップの間に死亡が見出された動物はおらず（図３Ｅ）、ＭＰＢＣ対照マウスの血清中で検出された高いレベルのＩＦＮγと比較して、１４日目に血清中にＩＦＮγサイトカインは検出されなかった（図３Ｆ）。ＦａｓＬ処理ＭＰＢＣは、Ｔ細胞サブタイプのより低分化かつより低活性化のプロファイルを示して刺激後の活性化の低減に繋がるという図２に示される結果をこれらの結果はサポートする。
【０１１６】
これらの実験において、ＭＰＢＣ対照およびＦａｓ−ＬとインキュベートされたＭＰＢＣから単離されたＴ細胞を計数し、ＲＰＭＩ完全培地（１０％のＦＣＳ、１％のＬ−グルタミン、１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、１％の非必須アミノ酸および１％のピルビン酸ナトリウムを添加した）中で０．７５×１０６細胞／ｍｌでインキュベートし、１：１０のビーズ：細胞比で活性化ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｇｉｂｃｏ  １１１．３２Ｄ）を使用して２４／４８時間刺激した。Ｔ細胞サブタイプの解析のために、実施例２において上記した全てのＡｂを用いて細胞を染色した。追加的に、ＣＤ２５活性化受容体発現についてフローサイトメトリー分析を行った。さらには、製造者のプロトコール（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  ＤＩＦ−５０）にしたがってＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮγサイトカイン分泌を行った。
【０１１７】
上記のデータにおいて実証されるように、アポトーシス感受性の成熟細胞の排除の他に、活性化状態の低減がＴ細胞集団の他の属性に影響していないことに留意することは重要である。ＭＰＢＣのＦａｓＬ処理は移植片対白血病活性に影響しないことを図４は明らかにする（以下の実施例４における詳細を参照）。
【０１１８】
実施例４：ＦａｓＬ処理はインビトロおよびインビボで移植片対白血病細胞傷害活性に影響しない
２４ウェルプレート中の３０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１６−００３７、ＯＫＴ３）および１０００Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ２（ｈｒ−ＩＬ−２  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、２０２ＩＬ−５００）を添加した完全ＲＰＭＩ培地（１０％のＦＣＳ、１％のＬ−グルタミン、０．２％のβ−メルカプトエタノール、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％のピルビン酸ナトリウムおよび１％の非必須アミノ酸を含有する）中、１×１０＾６細胞／ｍｌの濃度でのインキュベーションによりＦａｓ−Ｌ処理ＭＰＢＣまたは対照細胞を拡大増殖させた。４日目に、培地を完全な新鮮な培地（抗ＣＤ３およびＩＬ−２を含有する）で置き換え、細胞を計数し、６ウェルプレート中に５×１０＾６細胞／ｍｌで再播種した。一日おきに細胞を計数し、培地を置き換えた。拡大増殖の１２日目に、２つの異なる種類の白血病細胞系ＭＶ４−１１およびＵ９３７細胞を２μＭのＣＦＳＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、６５−０８５０）で標識し、９６ウェルプレート中２×１０＾４／１００μｌで完全ＲＰＭＩに播種した。
【０１１９】
拡大増殖されたＦａｓ−Ｌ処理ＭＰＢＣまたは対照細胞を洗浄し、計数し、標識された白血病細胞と上昇濃度において終夜共培養した（１：１、１：５、１：１０および１：３０のＭＰＢＣ：白血病細胞比）。インキュベーションの終わりに、死細胞の検出のために細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して生存ＣＦＳＥ白血病細胞の数を解析し、ＢＤ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（バージョン３．３；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを解析した（図４Ａ〜４Ｂ）。
【０１２０】
さらには、インビボマウスモデルを使用して白血病細胞を殺傷するＭＰＢＣの能力もまた評価した。このモデルにおいて、ＭＶ４−１１白血病細胞をγ照射ＮＳＧマウスに０日目に投与し（１０×１０６細胞／マウス）、ＦａｓＬ処理および対照ＭＰＢＣ移植片（３×１０６個の総有核細胞（ＴＮＣ）／マウス）を４〜６時間以内に注射した（図４Ｃ）。移植の３週後に、両方のマウス群において、ビヒクルと比較した場合に共移植されたマウスの脾臓、ＢＭ、および血液から白血病細胞は同様に減少した（Ｐ＜０．０１）（図４Ｄ〜４Ｆ）。要約すると、ＦａｓＬ処理ＭＰＢＣおよび対照ＭＰＢＣ移植マウスは同一の移植片対白血病活性を呈する一方、ＦａｓＬ処理ＭＰＢＣは、ＧｖＨＤにおける低減を追加的に表し示す。
【０１２１】
実施例５：ＦａｓＬ処理はＡＰＣ活性化を低減する
Ｔ細胞のアロ反応性は、数ある中でも、骨髄細胞（樹状細胞および単球）の他に、抗原提示細胞として働くＢ細胞の抗原提示に依存する（ＭａｃＤｏｎａｌｄら、２０１３）。Ｔ細胞集団に加えて、ＡＰＣはＣＤ９５を発現し、ＦａｓＬに曝露もされるので、それらはＧｖＨＤにおいて役割を果たし、その低減に寄与し得るという仮説を立てた。非処理ＭＰＢＣにおけるＣＤ９５発現の評価は、Ｂ細胞集団における中等度のレベルおよび骨髄細胞における高いレベルを明らかにした（図５Ａ）。アポトーシス細胞パーセンテージの有意な上昇がＦａｓＬ処理ＭＰＢＣ中のＢおよび骨髄細胞の両方において検出され（図５Ｂ）、これは両方の細胞集団において、抗原提示の原因となるＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体、ＨＬＡ−ＤＲの有意なそれぞれ０．３６倍（Ｐ＜０．００１）および０．６２倍（Ｐ＜０．０００１）の低減と関連付けられた（図５Ｃ〜５Ｄ）。図３Ｄは、３、７および１４日目のＦａｓＬ処理ＭＰＢＣ移植マウスの脾臓における有意に低減したヒトＴ細胞数を示すインビボ実験の結果を記載した。有意に低い数のヒトＢ細胞およびヒト骨髄細胞がこれらのＦａｓＬ処理ＭＰＢＣ移植マウスの脾臓中にさらに見出され（図５Ｅ〜５Ｆ）、それは極めて低いレベルのＨＬＡ−ＤＲｈｉ抗原提示メディエーターを発現しており、これらの細胞の活性化レベルの低減を指し示した（図５Ｇ〜５Ｈ）。類似した結果は、ＦａｓＬ処理ＭＰＢＣを移植されたこれらのマウスの骨髄中でも見出され、有意に低減した数のヒトＢおよび骨髄細胞、ならびに有意により低いレベルのＨＬＡ−ＤＲｈｉ発現細胞を示した（図５Ｉ〜５Ｌ）。
【０１２２】
実施例６：Ｂ細胞サブタイプはＦａｓＲを発現し、アポトーシス誘導に応答する
抗ＣＤ９５抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、ＭＰＢＣ対照細胞のＦａｓＲ（ＣＤ９５＋）発現をＢ細胞サブタイプにおいて測定した。Ｂ細胞サブタイプの解析は、以下の抗体：抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２７および抗ＣＤ３８を使用して行った。フローサイトメーター（ＭＡＣＳｑｕａｎｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して試料からのデータを獲得した。受容体発現にしたがって以下のＢ細胞亜集団を決定した：移行期（ＣＤ２７−ＣＤ３８＋）、ナイーブ（ＣＤ２７−ＣＤ３８−）、メモリー（ＣＤ２７＋ＣＤ３８−）、および形質芽球（ＣＤ２７＋ＣＤ３８＋）。追加的に、アネキシンＶ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＢＭＳ５００ＦＩ）および７ＡＡＤ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ００−６９９３）染色を使用してＢ細胞サブタイプの早期アポトーシスを評価し、アネキシンＶ＋７ＡＡＤ−細胞を早期アポトーシスとして定義し、７ＡＡＤ＋細胞の全てを後期アポトーシス／壊死細胞と考え、生存細胞の解析からゲートアウトした。
【０１２３】
図６は、ＦａｓＬとの２時間のインキュベーション後および対照細胞におけるＦａｓＲ発現レベル（Ａ）、早期アポトーシス細胞のパーセンテージ（Ｂ）およびＢ細胞サブタイプのパーセンテージ（Ｃ）を表し示す。Ｂ細胞の最も成熟したサブタイプであり、表面上にＦａｓＲを発現する形質芽球Ｂ細胞サブタイプの割合は、早期分化型Ｂ細胞である移行期／ナイーブ細胞と比較して最も高いことを図６Ａに見ることができる。高いＦａｓＲ発現と合致して、この集団は、ＦａｓＬとのインキュベーション後に最も強い早期アポトーシスシグナルを示した（図６Ｂ）。他のＢ細胞サブタイプもまたＦａｓＬ処理により影響され、早期アポトーシス細胞のパーセンテージは上昇し、集団はＦａｓＬ処理後に低減し（図６Ｃ）、上で言及したＢ細胞サブタイプの全てにおいてアポトーシス感受性Ｂ細胞が存在することを指し示した。
【０１２４】
実施例７：ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）はＦａｓＲを発現し、アポトーシス誘導に応答する
ヒトＭＳＣを培地中でナイーブ未分化状態に維持し、コンフルエンスに達したら継代する。ＭＳＣに対するＦａｓＬの効果を評価するために、細胞を６ウェルプレート中５×１０３細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングし、異なる用量のＦａｓＬ（１〜５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて処理する。異なる日に細胞を剥離し、血球計または自動化細胞計数器を使用して計数する。培養上清を収集し、血管新生サイトカイン（例えば、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＶＥＧＦ）ならびに炎症促進性サイトカイン／ケモカイン（ＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７およびＣＣＬ８）の分泌についてアッセイする。
【０１２５】
実施例８：インビボでのＧｖＨＤの軽減に対するＦａｓＬを用いるヒトＭＳＣのインビトロ処理の効果
ＦａｓＬ有りまたは無しでの培養で生育させたヒトＭＳＣをインビボでのＧｖＨＤの軽減について試験する。ＮＯＤ．ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスを全身γ照射（ＴＢＩ）に供する。ＧｖＨＤを動員末梢血細胞（ＭＰＢＣ）の投与により誘導する。ＦａｓＬ処理または非処理ＭＳＣを１〜１０日後に静脈内（ＩＶ）ボーラス注射により投与する。体重変化の他に、ＧｖＨＤ症状の進展を週に２回評価する。死または安楽死までマウスを追跡する。生存曲線およびメジアン生存時間を各治療群について算出する。
【０１２６】
実施例９：ＣＡＲ−Ｔ細胞の生産プロセスおよびアウトカムに対するＦａｓＬ効果の評価
先行する実施例に示されるように、アポトーシスメディエーターＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）とのＧ−ＣＳＦ動員末梢血細胞の短いインキュベーション（例えば、２時間）後に、Ｔ細胞組成は変更された。エフェクターのパーセンテージの減少およびナイーブ細胞のパーセンテージの増加により表されるように、ＦａｓＬ処理は、成熟した活性化されたＴ細胞のパーセンテージを低減した。さらに、ＦａｓＬへの曝露後に、（ＣＤ２５マーカーを発現するＴ細胞の数により認められるように、）集団中の活性細胞の割合は低減した。追加的に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用したＦａｓＬ処理Ｔ細胞のインビトロ活性化で、より低い数のＣＤ２５発現Ｔ細胞の他に、ＩＦＮγ分泌のレベルの低減および分化速度の低減が検出され、より低い成熟および活性のＴ細胞組成を指し示した。
【０１２７】
したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞生産プロセスにおいてＦａｓＬを組み合わせることが、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の可能性を低減し、キメラ抗原受容体の形質導入効率を向上させ、ＣＡＲ−Ｔの生存および抗腫瘍活性を維持しまたは寄与さえし得るかどうかを試験するために、以下の実施例に着手した。
【０１２８】
Ｉ．Ｔ細胞活性化の前および後のＰＢＭＣに対する漸増濃度のＦａｓＬの効果の試験
以下の実験は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料における、Ｔ細胞アポトーシスの誘導、分化および活性化可能性に対する効果についての、ＦａｓＬ濃度範囲の決定のために意図した予備研究であった。
【０１２９】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ勾配上でバフィコートから分離した。ＰＢＭＣを細胞の活性化の前または後に漸増用量のＦａｓＬを用いて処理した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングした２４ウェルディッシュ中で活性化を行った。調べたＦａｓＬ濃度は、０、１、５、１０、２５、５０または１００ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬであった。
【０１３０】
３群の細胞を解析した：
１）１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦａｓＬ（ＭｅｇａＦａｓＬ  Ａｄｉｐｏｇｅｎ）と２ｈインキュベートされた細胞。
２）１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦａｓＬ（ＭｅｇａＦａｓＬ  Ａｄｉｐｏｇｅｎ）と２ｈインキュベートされ、次に抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を用いる４８ｈの活性化に供された細胞（ＦａｓＬとの２ｈのインキュベーション＋４８ｈの活性化）。
３）最初に抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を用いて４８ｈ活性化され、次にＦａｓＬと２時間インキュベートされた細胞（４８ｈの活性化＋２ｈのＦａｓＬとのインキュベーション）。
【０１３１】
次に、フローサイトメトリーを使用して各群の細胞を解析した。
【０１３２】
Ｔ細胞生存能に対するＦａｓＬの効果：５０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦａｓＬを用いて処理され、続いて活性化条件中（抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体有り）で４８ｈインキュベートされたＴ細胞において、生存Ｔ細胞（ＣＤ３＋７ＡＡＤ−細胞）のパーセンテージの有意な低減が検出された（群２、図７Ａ）。
【０１３３】
Ｔ細胞の活性化状態に対するＦａｓＬの効果：ＣＤ２５発現Ｔ細胞のパーセンテージは、漸増濃度のＦａｓＬを用いて群２において有意に低減したが、大抵は２５ｎｇ／ｍｌより高い濃度において、群１においてはかろうじて有意に低減し、群３では有意に低減しなかった（図７Ｂ）。
【０１３４】
早期アポトーシス誘導に対するＦａｓＬの効果：フローサイトメトリー分析をＦａｓＬ処理の直後に行った場合に、漸増濃度のＦａｓＬを用いた処理後に早期アポトーシスレベル（アネキシンＶ＋  Ｔ細胞）における用量依存性の上昇が検出された（群１および３、図７Ｃ）。活性化条件での追加の４８ｈのインキュベーション後に、早期アポトーシスレベルは有意により低かった（群２、図７Ｃ）。
【０１３５】
これらの結果に基づいて、ＦａｓＬの濃度範囲が明確化された。
【０１３６】
ＩＩ．ＣＡＲ−Ｔ細胞生産プロセスの間の異なるステージにおけるＦａｓＬの効果の試験
ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配上でバフィコートから分離した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングされた２４ウェルディッシュ中で活性化を行った。この場合はＥｒｂＢ２  ＣＡＲを用いて、ＣＡＲ−Ｔ生産プロセスの間の異なるステージ：活性化前（群１）、活性化後（群２）、およびＣＡＲ−Ｔ形質導入後（群３）において、ＦａｓＬを用いて細胞を処理した。ＦａｓＬは、０、５０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。ＣＡＲ−Ｔ形質導入は、標準的な手順にしたがってレンチウイルスベクターを用いて行った（例えば、Ｚｈａｎｇら、２０１７  Ｂｉｏｍａｒｋ．Ｒｅｓ．５：２２；Ｆｅｓｎａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ」を参照）。
【０１３７】
ＣＡＲ形質導入プロセスの終わり（１０日のインキュベーション後）に、フローサイトメトリーにより以下のパラメーター：生存能（７ＡＡＤ−細胞）、ＣＡＲ形質導入の有効性（ＧＦＰ＋細胞のパーセントの上昇により検出）、Ｔ細胞サブタイプ（ナイーブ／ＣＭ／ＥＭ／ｅｆｆ細胞）により指し示されるような分化状態を評価し、活性化状態（ＣＤ２５＋）を解析した。
【０１３８】
追加的に、標的抗原（ヒト腫瘍細胞系：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）との各処理群のＴ細胞のインキュベーションにより特異性アッセイを行った。ＥｒｂＢ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞は腫瘍細胞を認識し、炎症促進性反応が開始され、その間に細胞はＩＦＮγを培地に放出する。培地を収集し、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮγのレベルを評価した。
【０１３９】
この実験の結果は以下を実証した：
活性化前のＦａｓＬへの細胞の曝露は、標準ＣＡＲ−Ｔと比較して向上したＣＡＲ形質導入を結果としてもたらした（図８）。この実験において、０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬ（ＦａｓＬ無し）試料は形質導入の高いバックグラウンドを与えた。
【０１４０】
ＣＡＲ形質導入後の高濃度のＦａｓＬ（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）への曝露は、５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬとインキュベートされた細胞において細胞死の上昇（生存形質導入細胞の減少）を結果としてもたらした。１００ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬを用いた形質導入後、処理後に生存した細胞は無かった（図８）。
【０１４１】
類似した発見がＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞について得られた。
【０１４２】
ＥｒｂＢ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞の形質導入後に、細胞をそれらの標的腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト細胞系）と共培養した。活性化前にＦａｓＬに曝露された細胞は、標準ＣＡＲ−Ｔおよび活性化後にＦａｓＬに曝露された細胞と比較して高いレベルのＩＦＮγを分泌した（図９）。ＩＮＦγの分泌の上昇は、ＦａｓＬの濃度の上昇と相関するようである（図９）。ＧＦＰ＋染色により測定された場合の形質導入の有効性（図８）は、ＩＮＦγ分泌と相関していた。
【０１４３】
上記の結果を要約すると、活性化前のＦａｓＬ処理は、より良好なＣＡＲ形質導入を結果としてもたらす（図８）。結果は、標準ＣＡＲ−Ｔと比較した場合にこの群におけるより高いＧＦＰ＋細胞パーセンテージを示す。
【０１４４】
ＣＡＲ形質導入における向上はまた、標的腫瘍細胞を用いるＣＡＲ−Ｔ細胞の刺激を測定したアッセイに反映される。活性化前にＦａｓＬに曝露され、標的細胞とインキュベートされた細胞は、標準ＣＡＲ−Ｔおよび活性化後にＦａｓＬに曝露された細胞と比較して高いレベルのＩＦＮγを分泌した（図９）。ＩＮＦγの分泌の上昇は、ＦａｓＬの濃度の上昇と相関しているようである（図９）。
【０１４５】
これらの結果は、活性化ステップの前のＦａｓＬとのインキュベーションがＣＡＲ−Ｔ細胞の形質導入効率、および抗原に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の応答の増加に対して有し得る有益な役割を指摘する。
【０１４６】
ＩＩＩ．ＣＡＲ−Ｔ細胞形質導入後の低いＦａｓＬ濃度の効果の試験
形質導入されたＣＡＲ−Ｔ細胞を、異なるＦａｓＬ濃度（０、１、１０、５０ｎｇ／ｍｌ）と共に２時間インキュベートした。ＦａｓＬを用いた処理後に、解析前のさらなる回復のために、ＣＡＲ−Ｔ細胞をＩＬ−２の存在下でさらに４日間インキュベートした。
【０１４７】
染色パネルは、Ｔ細胞サブタイプ（ナイーブ／ＣＭ／ＥＭ／ｅｆｆ細胞）、ならびに（ＣＲＳおよびＧｖＨＤの間の）炎症促進性反応の増悪に寄与するＩＦＮγおよびＩＬ１７を分泌するＴＨ１、ＴＨ１７、およびＴＣ１炎症促進性サブタイプの追加のパネルを含んでいた。
【０１４８】
実験ＩＩにおいて得られた結果に類似して、１０および５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬを用いた形質導入後のＣＡＲ−Ｔ細胞の処理は、用量依存的な方式で形質導入細胞（ＧＦＰ＋）の数の低減に繋がった（図１０Ａ）。回復期間の間に、細胞を活性化剤無しでＩＬ−２とインキュベートし、したがって、細胞の全般的な活性化状態は低かった（図１０Ｂ）。ＦａｓＬ処理は、標準ＣＡＲ−Ｔと比較して、形質導入ＣＤ３＋細胞の（ＣＤ２５の発現により明示された場合の）活性化状態をさらに低減し（図１０Ｂ）、この効果はＣＤ４＋亜集団において最も明らかであった。ＣＤ２５を発現するＧＦＰ＋細胞の割合により測定された場合に、５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬへの曝露後の残留ＧＦＰ＋  ＣＤ８＋細胞は高度に活性であった（図１０Ｂ）。異なるＴ細胞サブタイプ（ナイーブ、セントラルメモリー（ＣＭ）エフェクターメモリー（ＥＭ）およびエフェクター（ｅｆｆ）に対するＦａｓ処理の効果は図１１に描写される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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